(57)【要約】  第１貫通孔を有する第１枠体を、第１貫通孔の一方の開口が閉塞されるように支持体上に配置する。第１貫通孔内に捕捉体を含む液体を提供し、第１貫通孔内に露出した支持体上に捕捉体を固定化する。支持体上から液体を除去した後、第２貫通孔を有する第２枠体を、第２貫通孔の一方の開口が閉塞されるように第１貫通孔内の支持体上に配置する。
2016170967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の被検出物質を検出するために使用される検出チップの製造方法であって、
第１貫通孔を有する第１枠体を、前記第１貫通孔の一方の開口が閉塞されるように支持体上に配置する工程と、
前記第１貫通孔内に被検出物質を捕捉するための捕捉体を含む液体を提供し、前記第１貫通孔内に露出した前記支持体上に前記捕捉体を固定化する工程と、
前記支持体上から前記液体を除去した後、第２貫通孔を有する第２枠体を、前記第２貫通孔の一方の開口が閉塞されるように前記第１貫通孔内の前記支持体上に配置する工程と、
を含む、検出チップの製造方法。
【請求項２】
前記第１枠体は、遮光性を有する、請求項１に記載の検出チップの製造方法。
【請求項３】
前記第１枠体は、前記支持体から離れるにつれて前記第１貫通孔の高さ方向に直交する方向における前記第１貫通孔の断面積が大きくなるテーパー部を有する、請求項１または請求項２に記載の検出チップの製造方法。
【請求項４】
前記第２枠体は、前記支持体から離れるにつれて前記第２貫通孔の高さ方向に直交する方向における前記第２貫通孔の断面積が大きくなるテーパー部を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出チップの製造方法。
【請求項５】
前記第２貫通孔の高さは、前記第１貫通孔の高さより高い、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出チップの製造方法。
【請求項６】
前記第２枠体の前記テーパー部の内壁面は、前記第２貫通孔内に露出した前記支持体の表面の中心から出射され、かつ２０°以内の出射角で出射された光線を遮断しないように傾斜している、請求項４に記載の検出チップの製造方法。
【請求項７】
前記第２貫通孔の内壁面をブロッキング処理する工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の検出チップの製造方法。
【請求項８】
前記支持体、前記第１枠体および前記第２枠体のうち少なくとも１つは、試薬を収容するための試薬ホルダーを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の検出チップの製造方法。
【請求項９】
前記第１枠体および前記第２枠体のうち少なくとも１つは、樹脂フィルムからなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の検出チップの製造方法。
【請求項１０】
前記支持体は、一面上に金属膜が形成された、誘電体からなるプリズムであり、
前記第１枠体および前記第２枠体は、前記一面上に配置される、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の検出チップの製造方法。
【請求項１１】
検体中の被検出物質を検出するために使用される検出チップであって、
支持体と、
第１貫通孔を有し、前記第１貫通孔の一方の開口が閉塞されるように前記支持体上に配置されている第１枠体と、
第２貫通孔を有し、前記第２貫通孔の一方の開口が閉塞されるように前記第１貫通孔内の前記支持体上に配置されている第２枠体と、
を有し、
前記第１枠体の前記第１貫通孔の内壁面の少なくとも一部と、前記第１貫通孔に露出した前記支持体の表面とに、検体中の被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている、
検出チップ。
【請求項１２】
前記第１枠体は、遮光性を有する、請求項１１に記載の検出チップ。
【請求項１３】
前記第１枠体は、前記支持体から離れるにつれて前記第１貫通孔の高さ方向に直交する方向における前記第１貫通孔の断面積が大きくなるテーパー部を有する、請求項１１または請求項１２に記載の検出チップ。
【請求項１４】
前記第２枠体は、前記支持体から離れるにつれて前記第２貫通孔の高さ方向に直交する方向における前記第２貫通孔の断面積が大きくなるテーパー部を有する、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の検出チップ。
【請求項１５】
前記第２貫通孔の高さは、前記第１貫通孔の高さより高い、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の検出チップ。
【請求項１６】
前記第２枠体の前記テーパー部の内壁面は、前記第２貫通孔内に露出した前記支持体の表面の中心から出射され、かつ２０°以内の出射角で出射された光線を遮断しないように傾斜している、請求項１４に記載の検出チップ。
【請求項１７】
前記第２貫通孔の内壁面は、ブロッキング処理されている、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の検出チップ。
【請求項１８】
前記支持体、前記第１枠体および前記第２枠体のうち少なくとも１つは、試薬を収容するための試薬ホルダーを有する、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の検出チップ。
【請求項１９】
前記第１枠体および前記第２枠体のうち少なくとも１つは、樹脂フィルムからなる、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の検出チップ。
【請求項２０】
前記支持体は、一面上に金属膜が形成された、誘電体からなるプリズムであり、
前記第１枠体および前記第２枠体は、前記一面上に配置され、
前記捕捉体は、前記第１枠体の前記第１貫通孔の内壁面の少なくとも一部と、前記第１貫通孔に露出した前記金属膜の表面とに固定化されている、
請求項１１〜１９のいずれか一項に記載の検出チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検出物質を検出するための検出チップの製造方法および検出チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査などにおいて、タンパク質やＤＮＡなどの微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出することができれば、患者の状態を迅速に把握して治療を行うことが可能となる。このため、微量の被検出物質を高感度かつ定量的に検出できる検出装置が求められている。【０００３】
被検出物質を高感度に検出できる検出装置として、表面プラズモン共鳴蛍光分析法（表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）：以下「ＳＰＦＳ」と略記する）を利用する装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。【０００４】
特許文献１に記載の検出装置では、センサー部材と、センサー部材上に固定されたウェル部材とを有する検出チップ（センサー構造体）を使用する。センサー部材は、プリズム（誘電体部材）と、プリズム上に形成された金属膜と、金属膜上に形成された、被検出物質（アナライト）を捕捉するための捕捉体（リガンド）が固定化された領域である反応場（リガンド固定領域）とを有する。ウェル部材は、反応場に対応する位置に貫通孔を有している。ウェル部材がセンサー部材上に配置されることで、試料溶液を貯めるためのウェルが形成される。この検出装置では、ウェル内の反応場において捕捉体に被検出物質を捕捉させ、捕捉された被検出物質を蛍光物質で標識する。この状態で、表面プラズモン共鳴が生じる角度で、プリズムを介して金属膜に励起光を照射すると、金属膜の表面上に局在場光を発生させることができる。この局在場光により、金属膜上に捕捉された被検出物質を標識する蛍光物質が選択的に励起され、蛍光物質から蛍光が放出される。検出装置は、この蛍光を検出することで、被検出物質の存在またはその量を検出することができる。【０００５】
この検出チップにおいて、被検出物質がウェル部材の貫通孔の内壁面に付着してしまうと、検出効率が低下してしまう。これを防ぐため、特許文献１に記載の検出チップは、金属膜上の全面に捕捉体を固定化した後に金属膜上にウェル部材を配置するか、または貫通孔を有する枠部材を使用して金属膜上の一部の面に捕捉体を固定化した後に枠部材を取り外して金属膜上にウェル部材を新たに配置することで製造される。このように検出チップを製造することで、ウェル部材の貫通孔の内壁面に捕捉体が固定化されることを防ぐことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１５７４０３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載の検出チップの製造方法において、金属膜上の全面に捕捉体を固定化する場合、過剰量の捕捉体を使用することとなり、製造コストが増大してしまう。また、枠部材を使用して金属膜上の一部の面に捕捉体を固定化する場合、検出チップを構成しない枠部材の取り外し工程が必要となるため、製造工程が煩雑になってしまう。【０００８】
本発明の目的は、検出チップを構成しない枠部材を使用することなくウェルの内壁面への捕捉体の固定化を防ぐことができる検出チップの製造方法、およびその製造方法により製造された検出チップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出チップの製造方法は、検体中の被検出物質を検出するために使用される検出チップの製造方法であって、第１貫通孔を有する第１枠体を、前記第１貫通孔の一方の開口が閉塞されるように支持体上に配置する工程と、前記第１貫通孔内に被検出物質を捕捉するための捕捉体を含む液体を提供し、前記第１貫通孔内に露出した前記支持体上に前記捕捉体を固定化する工程と、前記支持体上から前記液体を除去した後、第２貫通孔を有する第２枠体を、前記第２貫通孔の一方の開口が閉塞されるように前記第１貫通孔内の前記支持体上に配置する工程と、を含む。【００１０】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る検出チップは、検体中の被検出物質を検出するために使用される検出チップであって、支持体と、第１貫通孔を有し、前記第１貫通孔の一方の開口が閉塞されるように前記支持体上に配置されている第１枠体と、第２貫通孔を有し、前記第２貫通孔の一方の開口が閉塞されるように前記第１貫通孔内の前記支持体上に配置されている第２枠体と、を有し、前記第１枠体の前記第１貫通孔の内壁面の少なくとも一部と、前記第１貫通孔に露出した前記支持体の表面とに、検体中の被検出物質を捕捉するための捕捉体が固定化されている。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る検出チップの製造方法によれば、検出チップを構成しない枠部材を使用せずに、ウェルの内壁面に捕捉体が固定化されていない検出チップを容易に製造することができる。本発明により得られる検出チップを用いることで、ウェルの内壁面への付着による被検出物質のロスを抑えつつ、被検出物質を高感度かつ高精度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、表面プラズモン増強蛍光検出装置の構成を示す図である。
【図２】図２Ａ、Ｂは、本発明の実施の形態に係る検出チップの構成を示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施の形態に係る検出チップの製造工程の一例を示すフローチャートである。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、本発明の実施の形態に係る検出チップの製造工程の一例を示す模式図である。
【図５】図５は、表面プラズモン増強蛍光検出装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【図６】図６Ａ、Ｂは、変形例１に係る検出チップの構成を示す図である。
【図７】図７Ａ、Ｂは、変形例２に係る検出チップの構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の一実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。以下の説明では、検出装置の代表例として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して、被検出物質を検出する表面プラズモン増強蛍光検出装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」ともいう）について説明する。
【００１４】
図１は、ＳＰＦＳ装置１００の構成を示す図である。図１では、光の経路を示すためにハッチングを省略している。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、検出チップ１０を着脱可能に保持するためのチップホルダー１１０と、検出チップ１０に光を照射するための光照射ユニット１２０と、検出チップ１０から放出された光（プラズモン散乱光βまたは蛍光γ）を検出するための受光ユニット１３０と、これらを制御する制御部（処理部）１４０とを有する。ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１１０に検出チップ１０を装着した状態で使用される。そこで、検出チップ１０について先に説明し、その後にＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。
【００１５】
（検出チップの構成）
図２Ａ、Ｂは、本実施の形態に係る検出チップ１０の構成を示す図である。図２Ａは、検出チップ１０の平面図であり、図２Ｂは、図２ＡにおけるＢ−Ｂ線の断面図である。図２Ａ、Ｂに示されるように、検出チップ１０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有し、成膜面２２上に金属膜３０が形成されたプリズム（支持体）２０と、金属膜３０上に配置され、第１貫通孔４１を有する第１枠体４０と、金属膜３０上において第１貫通孔４１内に配置され、第２貫通孔５１を有する第２枠体５０とを有する。第２枠体５０が第２貫通孔５１の一方の開口を閉塞されるようにプリズム２０上に配置されることにより、液体を収容するためのウェル５３が形成される。
【００１６】
プリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなる。前述のとおり、プリズム２０は、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。
【００１７】
入射面２１は、光照射ユニット１２０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させる。成膜面２２の上には、金属膜３０が配置されている。プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０で反射する。より具体的には、励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）で反射する。出射面２３は、金属膜３０で反射した励起光αをプリズム２０の外部に出射させる。
【００１８】
プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。入射面２１は、励起光αが光照射ユニット１２０に戻らないように形成されている。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下、「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまうからである。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。
【００１９】
ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される反射光（不図示）の光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、検出チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）βの光量が最大となるときの、入射角を意味する。たとえば、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。
【００２０】
プリズム２０は、必要に応じて他の要素を有していてもよい。たとえば、プリズム２０は、励起光αの光路の妨げとならない位置に試薬を収容するための試薬ホルダーを有していてもよい。
【００２１】
プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０を構成する樹脂の例には、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、およびシクロオレフィン系ポリマーが含まれる。プリズム２０は、屈折率が１．４〜１．６であり、かつ複屈折が小さい樹脂であることが好ましい。
【００２２】
金属膜３０は、プリズム２０の一面（成膜面２２）上に形成されている。金属膜３０を設けることで、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（表面プラズモン共鳴；ＳＰＲ）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光を生じさせることができる。金属膜３０の素材は、表面プラズモン共鳴を生じさせる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の素材の例には、金、銀、銅、アルミニウム、およびこれらの合金が含まれる。本実施の形態では、金属膜３０は、金薄膜である。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内が好ましい。
【００２３】
また、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面には、被検出物質を捕捉するための捕捉体６０が固定化されている。より具体的には、捕捉体６０は、第１枠体４０の第１貫通孔４１の内壁面の少なくとも一部と、第１貫通孔４１に露出した金属膜３０の表面とに固定化されている（後述の図４Ｃ参照）。なお、図２Ｂでは、第２枠体５０を図示するために、第１貫通孔４１の内壁面に固定化されている捕捉体６０と、金属膜３０の表面のうち第２枠体５０が配置されている部分に固定化されている捕捉体６０とは、省略されている。捕捉体６０により、被検出物質を選択的に検出することが可能となる。捕捉体６０が固定化された金属膜３０の表面の少なくとも一部は、捕捉体６０および被検出物質の結合（１次反応）や、被検出物質の蛍光標識（２次反応）などの反応が行われる反応場として設定される。本実施の形態では、後述の第２枠体５０の第２貫通孔５１内に露出した金属膜３０表面が反応場として設定されている。捕捉体６０の種類は、被検出物質を捕捉することができれば特に限定されない。たとえば、捕捉体６０は、被検出物質に特異的に結合可能な抗体またはその断片である。
【００２４】
第１枠体４０は、第１貫通孔４１を有しており、第１貫通孔４１の一方の開口が閉塞されるようにプリズム２０（金属膜３０）上に配置されている。第１枠体４０は、本実施の形態に係る検出チップ１０を製造する際に、金属膜３０上において捕捉体６０が固定化されるべき領域を規定する。第１貫通孔４１の数、形状および大きさは、特に限定されず、検出チップ１０の用途に応じて適宜設定されうる。本実施の形態では、第１貫通孔４１の数は１つであり、第１貫通孔４１の形状は円柱形状である。
【００２５】
第１枠体４０は、遮光性を有することが好ましい。これにより、プリズム２０から放出される自家蛍光や外部光などのノイズ光をカットし、これらのノイズ光がＳＰＦＳ装置１００の受光ユニット１３０に到達するのを防止することができる。
【００２６】
第１枠体４０の外形の形状は、特に限定されない。たとえば、第１枠体４０の外形の平面視形状は、円形状や四角形状などである。本実施の形態では、第１枠体４０の外形の平面視形状は、四角形状である。
【００２７】
第１枠体４０は、必要に応じて他の要素を有していてもよい。たとえば、図２Ａ、Ｂに示されるように、第１枠体４０は、試薬を収容するための試薬ホルダー４３を有していてもよい。試薬ホルダー４３は、第１枠体４０と一体であってもよいし、別体であってもよい。本実施の形態では、試薬ホルダー４３は、第１枠体４０と一体化されている。
【００２８】
第１枠体４０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。たとえば、第１枠体４０は、樹脂フィルムであってもよい。これにより、製造が容易になり、製造コストを低減させ、かつ検出チップ１０を小型化することができる。
【００２９】
第２枠体５０は、第２貫通孔５１を有しており、第２貫通孔５１の一方の開口が閉塞されるように、第１貫通孔４１内のプリズム２０（金属膜３０）上に配置されている。第２枠体５０は、第１枠体４０と隙間なく接するように配置されていてもよいし、離間して配置されていてもよい。第２枠体５０は、液体を収容するためのウェル５３を規定する。また、被検出物質が捕捉体６０に捕捉される領域（反応場）が第２枠体５０により規定されるため、この第２枠体５０が目印となり、ＳＰＦＳ装置１００における励起光αの照射位置の位置調整がしやすくなる。
【００３０】
第２貫通孔５１の形状および大きさは、特に限定されず、用途に応じて適宜設定されうる。第２貫通孔５１の形状の例には、円柱台形状、円柱形状、楕円柱形状、多角柱形状およびこれらの組合せが含まれる。ウェル５３内の液体を除去しやすくする観点および第２枠体５０の加工容易性の観点からは、第２貫通孔５１の形状は、円柱形状または楕円柱形状であることが好ましい。本実施の形態では、第２貫通孔５１の形状は、円柱形状および円柱台形状の組み合わせである。
【００３１】
図２Ｂに示されるように、第２貫通孔５１の深さｈ２は、第１貫通孔４１の高さｈ１より高いことが好ましい。これにより、ウェル５３内に液体を提供するときに液体がウェル５３の外に飛散することを防止することができる。第２貫通孔５１の高さは、提供される液体の金属膜３０および第２貫通孔５１の内壁面からの跳ね返る高さや量などに応じて適宜設定されうる。
【００３２】
第２枠体５０の外形の形状は、特に限定されない。たとえば、第２枠体５０の外形の平面視形状は、円形状や四角形状などである。本実施の形態では、第２枠体５０の外形の平面視形状は、円形状である。また、第２枠体５０は、プリズム２０から離れるにつれて第２貫通孔５１の高さ方向に直交する方向における第２貫通孔５１の断面積が大きくなるテーパー部を有することが好ましい。これにより、液体を第２貫通孔５１（ウェル５３）内に提供しやすくなる。本実施の形態では、第２枠体５０は、テーパー部５２を有する。
【００３３】
第２枠体５０がテーパー部５２を有する場合、テーパー部５２の内壁面は、第２貫通孔５１内に露出した金属膜３０の表面（反応場）の中心から出射され、かつ２０°以内の出射角で出射された光線を遮断しないように傾斜していることがさらに好ましい。これにより、被検出物質を標識する蛍光物質から放出された蛍光γが遮断されてしまうことを抑制し、高精度に被検出物質を検出することができる。
【００３４】
第２貫通孔５１の内壁面は、ブロッキング処理されていることが好ましい。これにより、被検出物質の第２貫通孔５１の内壁面への非特異的結合を抑制し、被検出物質の検出効率を向上させることができる。
【００３５】
また、第２枠体５０は、必要に応じて他の要素を有していてもよい。たとえば、第２枠体５０は、試薬を収容するための試薬ホルダーを有していてもよい。
【００３６】
第２枠体５０の内壁面の形状や色などは、必要に応じて適宜設定されうる。たとえば、検出される光にノイズ光が多量に含まれる場合、余分なノイズ光を吸収する観点から、第２枠体５０の内壁面を黒色にしてもよい。また、ノイズ光に指向性がある場合には、ノイズ光を分散させてノイズを低減させる観点から、第２枠体５０の内壁面に微少な凹凸を付与してもよい。また、被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光γを受光ユニット１３０に向けて反射させる観点から、第２枠体５０の内壁面の色を白色にしてもよいし、第２枠体５０の内壁面を鏡面にしてもよい。
【００３７】
第２枠体５０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。たとえば、第２枠体５０は、樹脂フィルムであってもよい。これにより、製造が容易になり、製造コストを低減させることができ、検出チップ１０を小型化することもできる。
【００３８】
第２枠体５０は、例えば、両面テープまたは接着剤による接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。さらに第２枠体５０は、第１枠体４０に接合されていてもよい。
【００３９】
図１に示されるように、プリズム２０へ導かれた励起光αは、入射面２１でプリズム２０内に入射する。プリズム２０内に入射した励起光αは、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に全反射角度（表面プラズモン共鳴が生じる角度）となるように入射する。上記界面で反射した反射光は、出射面２３でプリズム２０外に出射される（図示省略）。このとき、表面プラズモン共鳴が生じる角度で励起光αが上記界面に入射することで、反応場からは、プラズモン散乱光βや蛍光物質からの蛍光γなどが検出チップ１０の上方に放出される。
【００４０】
（検出チップの製造方法）
次に、本実施の形態に係る検出チップ１０の製造方法の一例について説明する。図３は、本実施の形態に係る検出チップ１０の製造工程の一例を示すフローチャートである。図４Ａ〜Ｄは、本実施の形態に係る検出チップ１０の製造工程の一例を示す模式図である。
【００４１】
たとえば、本実施の形態に係る検出チップ１０は、プリズム２０を準備する第１工程（工程Ｓ１０）と、第１枠体４０をプリズム２０（金属膜３０）上に配置する第２工程（工程Ｓ２０）と、第１貫通孔４１内に露出した金属膜３０上に捕捉体６０を固定化する第３工程（工程Ｓ３０）と、第２枠体５０を第１貫通孔４１内に配置する第４工程（工程Ｓ４０）とを行うことにより製造されうる。
【００４２】
１）第１工程
第１工程では、図４Ａに示されるように、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有し、一面（成膜面２２）上に金属膜３０が形成されたプリズム２０（支持体）を準備する（工程Ｓ１０）。まず、プリズム２０を所望の形状に成形する。プリズム２０を成形する方法は、特に限定されず、例えば、金型成形法によりプリズム２０を成形すればよい。次いで、プリズム２０の成膜面２２上に金属膜３０を形成する。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着およびメッキが含まれる。また、金属膜３０が既に形成されたプリズム２０を購入してもよい。
【００４３】
２）第２工程
第２工程では、図４Ｂに示されるように、第１貫通孔４１を有する第１枠体４０を、第１貫通孔４１の一方の開口が閉塞されるように金属膜３０上に配置する（工程Ｓ２０）。また、第１枠体４０に第１貫通孔４１を形成する方法は、特に限定されず、例えば、金型成形法や切削加工などにより第１貫通孔４１を形成すればよい。
【００４４】
３）第３工程
第３工程では、図４Ｃに示されるように、第１貫通孔４１内に露出した金属膜３０上に捕捉体６０を固定化する（工程Ｓ３０）。具体的には、金属膜３０上に配置された第１枠体４０の第１貫通孔４１内に捕捉体６０を含む液体を提供する。これにより、提供された液体に接触した第１枠体４０の第１貫通孔４１の内壁面の少なくとも一部と、第１貫通孔４１内に露出した金属膜３０の表面とに、捕捉体６０を固定化することができる。
【００４５】
また、捕捉体６０を金属膜３０上に固定化する方法は、特に限定されない。たとえば、金属膜３０の上に、捕捉体６０を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、捕捉体６０に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を金属膜３０に固定化し、この高分子に捕捉体６０を結合させてもよい。
【００４６】
４）第４工程
第４工程では、金属膜３０上から捕捉体６０を含む液体を除去した後、図４Ｄに示されるように、第２貫通孔５１を有する第２枠体５０を、第２貫通孔５１の一方の開口が閉塞されるように第１貫通孔４１内の金属膜３０上に配置する（工程Ｓ４０）。通常は、捕捉体６０を含む液体を除去した後、第２枠体５０を配置する前に、緩衝液などで第１貫通孔４１内を洗浄する。なお、図４Ｄには示されていないが、第２枠体５０を第１貫通孔４１内に配置しても、第１枠体４０の第１貫通孔４１の内壁面の一部と、金属膜３０の表面とには、捕捉体６０が固定化されている。第２貫通孔５１は、例えば、第１貫通孔４１と同様の方法により形成されうる。
【００４７】
以上の工程により、検体中に含まれる被検出物質を検出するために使用される検出チップ１０を製造することができる。
【００４８】
なお、任意の工程として、第２枠体５０をブロッキング処理する工程をさらに含んでいてもよい。ブロッキング処理は、例えば、ブロッキング剤を含む液体と、第２枠体５０の内壁面とを接触させればよい。ブロッキング処理は、第２枠体５０を金属膜３０上に配置する前にあらかじめ行ってもよいし、第２枠体５０を金属膜３０上に配置した後に行ってもよい。ブロッキング剤の例には、カゼイン、スキムミルク、アルブミン（ウシ血清アルブミンを含む）、ゼラチン、ポリエチレングリコールなどの高分子化合物；リン脂質、エチレンジアミンやアセトニトリルなどの低分子化合物などが含まれる。これらは、単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００４９】
さらに、任意の工程として、捕捉体６０が乾燥するのを防ぐために保湿剤により捕捉体６０を保護する工程を含んでいてもよい。
【００５０】
このようにして製造された本実施の形態に係る検出チップ１０では、捕捉体６０は、第１枠体４０の第１貫通孔４１の内壁面の一部にも固定化されている。しかしながら、第１貫通孔４１の内部に配置された第２枠体５０がウェル５３を規定するため、ウェル５３に導入された液体は、第１貫通孔４１の内壁面に接触することはない。また、第２枠体５０の第２貫通孔５１の内壁面には、捕捉体６０は固定化されていない。このため、ウェル５３に検体を導入した場合、検体に含まれる被検出物質は、ウェル５３の底面上に固定化された捕捉体６０に効率よく捕捉される。
【００５１】
（ＳＰＦＳ装置の構成）
次に、ＳＰＦＳ装置１００の各構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、チップホルダー１１０、光照射ユニット１２０、受光ユニット１３０および制御部１４０を有する（図１参照）。
【００５２】
チップホルダー１１０は、所定の位置で検出チップ１０を保持する。検出チップ１０は、チップホルダー１１０に保持された状態で、光照射ユニット１２０から励起光αを照射される。
【００５３】
光照射ユニット１２０は、チップホルダー１１０に保持された検出チップ１０のプリズム２０の入射面２１に向けて、励起光α（シングルモードレーザー光）を照射する。より具体的には、光源ユニット１２１は、金属膜３０の裏面のうちのウェル５３に対応する領域に、励起光αを全反射角度となるように出射する。
【００５４】
光照射ユニット１２０は、励起光αを出射する光源ユニット１２１と、プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を調整する角度調整部１２２と、光源ユニット１２１に含まれる各種機器を制御する光源制御部１２３とを有する。
【００５５】
光源ユニット１２１は、励起光αを出射する。たとえば、光源ユニット１２１は、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも図示省略）を有する。
【００５６】
光源の種類は、特に限定されない。光源の種類の例には、レーザーダイオード（ＬＤ）、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。
【００５７】
また、光源から出射される励起光αがビームでない場合は、光源から出射される励起光αは、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される励起光αが単色光でない場合は、光源から出射される励起光αは、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される励起光αが直線偏光でない場合は、光源から出射される励起光αは、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
【００５８】
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。
【００５９】
コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。
【００６０】
バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。
【００６１】
直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分の光が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０の裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
【００６２】
ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
【００６３】
温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
【００６４】
角度調整部１２２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））への励起光αの入射角を調整する。角度調整部１２２は、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に所定の入射角で照射させるために、励起光αの光軸とチップホルダー１１０とを相対的に回転させる。本実施の形態では、角度調整部１２２は、光源ユニット１２１を金属膜３０上において励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心軸として回転させる。
【００６５】
光源制御部１２３は、光源ユニット１２１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１２１からの励起光αのパワーや照射時間などを調整する。光源制御部１２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００６６】
受光ユニット１３０は、チップホルダー１１０に保持された検出チップ１０の金属膜３０のプリズム２０と対向しない面に対向するように配置されている。受光ユニット１３０は、第２貫通孔５１内の金属膜３０上から出射される光（プラズモン散乱光βまたは蛍光γ）を検出する。受光ユニット１３０は、受光光学系ユニット１３１に配置された第１レンズ１３２、光学フィルター１３３、第２レンズ１３４および受光センサー１３５と、位置切替え機構１３６と、光センサー制御部１３７とを有する。
【００６７】
第１レンズ１３２は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１３４は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１３２で集光された光を受光センサー１３５の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行になっている。
【００６８】
光学フィルター１３３は、第１レンズ１３２と第２レンズ１３４との間に配置されている。光学フィルター１３３は、入射光のうち、蛍光成分のみを透過させ、励起光成分（プラズモン散乱光β）を除去する。光学フィルター１３３が励起光成分を除去することにより、高いＳ／Ｎ比で蛍光γを検出することができる。光学フィルター１３３の種類の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。
【００６９】
受光センサー１３５は、検出チップ１０から放出されるプラズモン散乱光βおよび蛍光γを検出する。受光センサー１３５の種類は、上記の目的を達成することができれば特に限定されないが、受光量が増加しても検出値のばらつきが小さいものが好ましい。受光センサー１３５は、例えば、フォトダイオード（ＰＤ）である。
【００７０】
位置切替え機構１３６は、光学フィルター１３３の位置を、受光光学系ユニット１３１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、光学ブランク値または蛍光値を測定する時には、光学フィルター１３３を受光光学系ユニット１３１における光路上に配置し、受光センサー１３５がプラズモン散乱光βを検出する時には、光学フィルター１３３を光路外に配置する。
【００７１】
光センサー制御部１３７は、受光センサー１３５の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１３５の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１３５の感度を制御する。光センサー制御部１３７は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００７２】
制御部１４０は、角度調整部１２２、光源制御部１２３、位置切替え機構１３６および光センサー制御部１３７を制御する。また、制御部１４０は、受光センサー１３５の検出結果に基づいて被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出するための処理部としても機能する。制御部１４０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００７３】
［ＳＰＦＳ装置の動作］
次に、検出チップ１０を使用したＳＰＦＳ装置１００の動作について説明する。図５は、ＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【００７４】
まず、検出の準備をする（工程Ｓ１１０）。具体的には、ＳＰＦＳ装置１００のチップホルダー１１０に検出チップ１０を設置する。また、検出チップ１０のウェル５３内に保湿剤が存在する場合は、捕捉体６０が適切に被検出物質を捕捉できるように、ウェル５３内を洗浄して保湿剤を除去する。
【００７５】
次いで、増強角を決定する（工程Ｓ１２０）。具体的には、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査して、最適な入射角を決定する。制御部１４０は、光源制御部１２３および角度調整部１２２を制御して、光源ユニット１２１から励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査する。このとき、制御部１４０は、位置切替え機構１３６を制御して、光学フィルター１３３を受光光学系ユニット１３１の光路外に移動させる。これとともに、制御部１４０は、光センサー制御部１３７を制御して、受光センサー１３５でプラズモン散乱光βを検出する。制御部１４０は、励起光αの入射角とプラズモン散乱光βの強度との関係を含むデータを得る。そして、制御部１４０は、データを解析して、プラズモン散乱光βの強度が最大となる入射角（増強角）を決定する。なお、増強角は、プリズム２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、ウェル５３内の液体の屈折率などにより決まるが、捕捉体６０の種類および量、プリズム２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、検出を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０．１°程度のオーダーで決定される。
【００７６】
次いで、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を、工程Ｓ１２０で決定した増強角に設定する（工程Ｓ１３０）。具体的には、制御部１４０は、角度調整部１２２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する。以後の工程では、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角は、増強角のままである。
【００７７】
次いで、金属膜３０上に蛍光物質が存在しない状態で蛍光γと同じ波長の光を含む光の検出を行い、光学ブランク値を測定する（工程Ｓ１４０）。ここで、「光学ブランク値」とは、検出チップ１０の上方に放出される背景光の光量を意味する。この背景光は、主として、励起光αを照射したときに検出チップ１０（プリズム２０）から放出される自家蛍光や外部光に起因する。
【００７８】
具体的には、制御部１４０は、位置切替え機構１３６を制御して、光学フィルター１３３を受光光学系ユニット１３１の光路上に移動させる。次いで、制御部１４０は、光源制御部１２３を制御して、金属膜３０上に蛍光物質が存在しない状態で、金属膜３０で表面プラズモン共鳴が発生するように、光源ユニット１２１からプリズム２０を通して金属膜３０に励起光αを照射させる。これと同時に、制御部１４０は、光センサー制御部１３７を制御して、受光センサー１３５で検出チップ１０から放出された光を検出し、光学ブランク値を得る。測定された光学ブランク値は、制御部（処理部）１４０に送信され、記憶される。
【００７９】
次いで、検体中の被検出物質と捕捉体６０とを反応させる（１次反応；工程Ｓ１５０）。具体的には、ウェル５３内に検体を注入して、検体と捕捉体６０とを接触させる。検体中に被検出物質が存在する場合は、被検出物質の少なくとも一部は捕捉体６０により捕捉される。このとき、被検出物質は、ウェル５３の底面に固定化されている捕捉体６０に適切に捕捉される。捕捉体６０は、第１枠体４０の第１貫通孔４１の内壁面の一部にも固定化されているが、ウェル５３の底面以外に固定化された捕捉体６０と検体との接触は、第２枠体５０により妨げられる。また、第２枠体５０の第２貫通孔５１の内壁面には、捕捉体６０は固定化されていない。このため、被検出物質は、ウェル５３の底面上に固定化された捕捉体６０に効率よく捕捉される。この後、ウェル５３内を緩衝液などで洗浄して、捕捉体６０に捕捉されなかった物質を除去する。検体の種類は、特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。
【００８０】
次いで、捕捉体６０に捕捉された被検出物質を蛍光物質で標識する（２次反応；工程Ｓ１６０）。具体的には、ウェル５３内に蛍光標識液を提供する。蛍光標識液は、例えば、蛍光物質で標識された抗体（２次抗体）を含む緩衝液である。蛍光標識液がウェル５３に提供されると、蛍光標識液が捕捉体６０に捕捉された被検出物質に接触し、被検出物質が蛍光物質で標識される。この後、ウェル５３内を緩衝液などで洗浄し、遊離の蛍光物質などを除去する。
【００８１】
次いで、ウェル５３内に蛍光物質で標識された被検出物質が存在する状態で、励起光αを金属膜３０（成膜面２２）に照射し、反応場の被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光γを検出して、蛍光値を測定する（工程Ｓ１７０）。具体的には、制御部１４０は、光源制御部１２３を制御して、蛍光物質で標識された被検出物質が金属膜３０上に存在する状態で、金属膜３０で表面プラズモン共鳴が発生するように、プリズム２０を通して金属膜３０に光源ユニット１２１から励起光αを出射させる。これと同時に、制御部１４０は、光センサー制御部１３７を制御して、受光センサー１３５で被検出物質を標識する蛍光物質から放出される蛍光γを検出する。測定された蛍光値は、制御部（処理部）１４０に送信され、記憶される。
【００８２】
最後に、被検出物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ１８０）。具体的には、制御部１４０は、工程Ｓ１７０で得られた蛍光値から工程Ｓ１４０で得られた光学ブランク値を引くことで、被検出物質の量に相関するシグナル値を算出する。シグナル値は、予め作成しておいた検量線により、被検出物質の量や濃度などに換算されうる。
【００８３】
以上の動作手順を行うことにより、本実施の形態に係る検出チップ１０を使用して、被検出物質を高精度に検出することができる。
【００８４】
なお、工程Ｓ１２０〜工程Ｓ１８０の順番は、上記の順番に限定されない。たとえば、１次反応（工程Ｓ１５０）を行った後に、増強角の決定（工程Ｓ１２０）、入射角の増強角への設定（工程Ｓ１３０）および光学ブランク値の測定（工程Ｓ１４０）を行ってもよい。
【００８５】
（効果）
以上のように、本実施の形態に係る検出チップ１０を使用すれば、ウェル５３の内壁面への被検出物質の付着を抑制して、検出されない被検出物質の数を低減させることができる。このため、検体中の被検出物質を高精度に検出することができる。
【００８６】
なお、上記実施の形態では、第１貫通孔４１の形状が円柱形状である第１枠体４０を有する検出チップ１０について説明した。しかし、本実施の形態に係る検出チップ１０における第１枠体４０の形状は、これに限定されない。図６Ａ、Ｂは、変形例１に係る検出チップ１０’の構成を示す図である。図６Ａは、検出チップ１０’の平面図であり、図６Ｂは、図６ＡにおけるＢ−Ｂ線の断面図である。図６Ａ、Ｂに示されるように、第１枠体４０’は、プリズム２０から離れるにつれて第１貫通孔４１’の高さ方向に直交する方向における第１貫通孔４１’の断面積が大きくなるテーパー部４２’を有していてもよい。これにより、液体（例えば、捕捉体６０を含む液体や洗浄液など）を第１貫通孔４１’内に提供しやすくなる。なお、変形例１に係る検出チップ１０’でも、第２枠体５０’は、第１枠体４０’と隙間なく接するように配置されていてもよいし、離間して配置されていてもよい。変形例１に係る検出チップ１０’では、第２枠体５０’（第２貫通孔５１’）の形状は、第１枠体４０’と隙間無く接するように形成されている。
【００８７】
また、上記実施の形態では、テーパー部を含む第２枠体５０を有する検出チップ１０について説明した。しかし、本発明に係る検出チップ１０の第２枠体の形状は、これに限定されない。図７Ａ、Ｂは、変形例２に係る検出チップ１０”の構成を示す図である。図７Ａは、検出チップ１０”の平面図であり、図７Ｂは、図７ＡにおけるＢ−Ｂ線の断面図である。図７Ａ、Ｂに示されるように、第２枠体５０”の第２貫通孔５１”は、円柱形状であってもよい。変形例２に係る検出チップ１０”では、ウェル５３”の形状は、円柱形状である。この場合も、上記実施の形態と同様に検出チップ１０”を製造することで、上記実施の形態と同様の効果を得ることができる。
【００８８】
また、上記実施の形態では、ＳＰＦＳを利用して被検出物質を検出するために検出チップ１０、１０’、１０”を使用する場合について説明した。しかし、本発明に係る検出チップは、これに限定されず、他の免疫測定にも使用されうる。この場合、一面上に金属膜３０が形成されたプリズム２０の代わりにガラス基板などの支持体を使用してもよい。
【００８９】
本出願は、２０１５年４月２２日出願の特願２０１５−０８７５８８に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明に係る検出チップによれば、被検出物質を高感度かつ高精度に検出することができるため、例えば臨床検査などに有用である。
【符号の説明】
【００９１】
１０、１０’、１０”  検出チップ
２０  プリズム
２１  入射面
２２  成膜面
２３  出射面
３０  金属膜
４０、４０’  第１枠体
４１、４１’  第１貫通孔
５０、５０’、５０”  第２枠体
５１、５１’、５１”  第２貫通孔
４２’、５２  テーパー部
４３  試薬ホルダー
５３、５３”  ウェル
６０  捕捉体
１００  表面プラズモン共鳴蛍光分析装置（ＳＰＦＳ装置）
１１０  チップホルダー
１２０  光照射ユニット
１２１  光源ユニット
１２２  角度調整部
１２３  光源制御部
１３０  受光ユニット
１３１  受光光学系ユニット
１３２  第１レンズ
１３３  光学フィルター
１３４  第２レンズ
１３５  受光センサー
１３６  位置切替え機構
１３７  光センサー制御部
１４０  制御部（処理部）
α  励起光
β  プラズモン散乱光
γ  蛍光
ｈ１  第１貫通孔の高さ
ｈ２  第２貫通孔の高さ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2016170967.tif 000011
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