(57)【要約】  癌の治療又は予防薬の有効成分として有用な新規のペプチドを見出し、該ポリペプチドの免疫誘導剤としての使用を提供することを課題とする。  (a)配列番号３〜４５に示されるアミノ酸からなるポリペプチド、(b)前記(a)のポリペプチドのうち１〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチドを有効成分として含有する免疫誘導剤は、癌の治療又は予防薬等として有用である。
2017150595.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)又は(b)に記載のポリペプチド群から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)前記(a)に記載のいずれか一のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド、あるいは
前記いずれか一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。
【請求項２】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドがＭＨＣクラスＩ分子に結合する、請求項１に記載の免疫誘導剤。
【請求項３】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが以下の(c)〜(e)に記載のポリペプチド群から選択されるいずれか一のポリペプチドである、請求項２に記載の免疫誘導剤。
(c)配列番号３〜３６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(d)前記(c)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド
(e)前記(c)又は(d)に記載のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
【請求項４】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、請求項１に記載の免疫誘導剤。
【請求項５】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが以下の(f)〜(h)に記載のポリペプチド群から選択されるいずれか一のポリペプチドである、請求項４に記載の免疫誘導剤。
(f)配列番号３７〜４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(g)前記(f)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド
(h)前記(f)又は(g)に記載のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
【請求項６】
癌の治療又は予防薬の有効成分として用いる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
【請求項７】
前記癌がＳＣＤ１タンパク質を発現する癌である、請求項６に記載の免疫誘導剤。
【請求項８】
前記癌が悪性リンパ腫、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、悪性脳腫瘍、食道癌又は肺癌である、請求項６又は７に記載の免疫誘導剤。
【請求項９】
免疫増強剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の免疫誘導剤。
【請求項１０】
請求項１、３又は５に記載の免疫誘導活性を有するポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む単離抗原提示細胞。
【請求項１１】
請求項１、３又は５に記載の免疫誘導活性を有するポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する単離Ｔ細胞。
【請求項１２】
以下の(a)又は(b)に記載のポリペプチド群から選択され、かつ免疫誘導活性を有するいずれか一のポリペプチド。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなる免疫誘導活性を有するポリペプチド、
(b)前記(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド。
【請求項１３】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）以下の(a)又は(b)に記載のポリペプチド群から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド：
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、
(b)前記(a)に記載のいずれか一のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド； 
（ｉｉ）前記いずれか一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター；
（ｉｉｉ）前記いずれか一のポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む単離抗原提示細胞；ならびに
（ｉｖ）前記いずれか一のポリペプチドに特異的な単離Ｔ細胞、
からなる群から選択される一以上を有効成分として含む、癌の治療又は予防薬。
【請求項１４】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが以下の(c)〜(h)に記載のポリペプチド群から選択される少なくとも１つのポリペプチドである、請求項１３に記載の癌の治療又は予防薬：
(c)配列番号３〜３６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(d)前記(c)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド;
(e)前記(c)又は(d)に記載のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド;
(f)配列番号３７〜４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(g)前記(f)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド;
(h)前記(f)又は(g)に記載のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
【請求項１５】
前記癌がＳＣＤ１タンパク質を発現する癌である、請求項１３又は１４に記載の癌の治療又は予防薬。
【請求項１６】
以下の（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）以下の(a)又は(b)に記載のポリペプチド群から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド：
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、
(b)前記(a)に記載のいずれか一のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド； 
（ｉｉ）前記いずれか一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター；
（ｉｉｉ）前記いずれか一のポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む単離抗原提示細胞；ならびに
（ｉｖ）前記いずれか一のポリペプチドに特異的な単離Ｔ細胞、
からなる群から選択される一以上を、それを必要とする対象動物に投与することを含む、癌を治療又は予防する方法。
【請求項１７】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが以下の(c)〜(h)に記載のポリペプチド群から選択される少なくとも１つのポリペプチドである、請求項１６に記載の方法：
(c)配列番号３〜３６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(d)前記(c)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド;
(e)前記(c)又は(d)に記載のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド;
(f)配列番号３７〜４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(g)前記(f)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド;
(h)前記(f)又は(g)に記載のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
【請求項１８】
前記癌がＳＣＤ１タンパク質を発現する癌である、請求項１６又は１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療又は予防薬の有効成分として有用な新規な免疫誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＣＤ１（ｓｔｅａｒｏｙｌ−ＣｏＡ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  １）タンパク質は、飽和脂肪酸のＣ９−Ｃ１０位に二重結合を導入するタンパク質である。【０００３】
ＳＣＤ１タンパク質は、発癌との関連性が示唆されている。例えば、非特許文献１及び２では、肝臓癌、食道癌、大腸癌など様々な癌で発現が上昇しており、ｓｉＲＮＡや低分子阻害化合物によりＳＣＤ１の機能を阻害すると、癌細胞の増殖が抑制されたり、アポトーシスが誘導され、形成された腫瘍が縮小されることが開示されている。【０００４】
一方、特許文献１では、ＳＣＤ１タンパク質が癌細胞に対する免疫誘導活性を有しており、それ故に癌の治療や予防に有用であることが開示されている。しかし、特許文献１には、ＭＨＣ分子に結合するペプチドついての情報は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１５７７３６
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Igal RA. Carcinogenesis. Sep;31(9):1509-15（2010）
【非特許文献２】Chen L. Sci. Rep. 6, 19665 (2016)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、癌の治療又は予防薬の有効成分として有用な新規ポリペプチドを見出し、該ポリペプチドの免疫誘導剤としての使用を提供することである。【０００８】
また、本発明の課題は、前記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む単離抗原提示細胞、及び前記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する単離Ｔ細胞、並びにそれらの癌の治療又は予防薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるヒトＳＣＤ１タンパク質が悪性リンパ腫、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、悪性脳腫瘍、食道癌及び肺癌の組織又は細胞に特異的に発現しているという知見を得た。また、前記ＳＣＤ１タンパク質の特定の領域に存在する部分ペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ポリペプチドに特異的なＴ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有すること、及び該免疫誘導活性が癌の治療又は予防に有用であることを見出した。それらの結果に基づいて、該ポリペプチドが癌の治療及び／又は予防のための免疫誘導剤の有効成分となり得ること、また、該ペプチドと接触した抗原提示細胞や該抗原提示細胞と接触したＴ細胞も癌の治療又は予防に有用であることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１２）の特徴を有する。
（１）以下の(a)又は(b)に記載のポリペプチド群から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)前記(a)に記載のいずれか一のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド、あるいは
前記いずれか一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含有する免疫誘導剤。
（２）前記免疫誘導活性を有するポリペプチドがＭＨＣクラスＩ分子に結合する、（１）に記載の免疫誘導剤。
（３）前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが以下の(c)〜(e)に記載のポリペプチド群から選択されるいずれか一のポリペプチドである、（２）に記載の免疫誘導剤。
(c)配列番号３〜３６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(d)前記(c)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド
(e)前記(c)又は(d)に記載のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
（４）前記免疫誘導活性を有するポリペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する、（１）に記載の免疫誘導剤。
（５）前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが以下の(f)〜(h)に記載のポリペプチド群から選択されるいずれか一のポリペプチドである、（４）に記載の免疫誘導剤。
(f)配列番号３７〜４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(g)前記(f)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド
(h)前記(f)又は(g)に記載のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
（６）癌の治療又は予防薬の有効成分として用いる、（１）〜（５）のいずれかに記載の免疫誘導剤。
（７）前記癌がＳＣＤ１タンパク質を発現する癌である、（６）に記載の免疫誘導剤。
（８）前記癌が悪性リンパ腫、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、悪性脳腫瘍、食道癌又は肺癌である、（６）又は（７）に記載の免疫誘導剤。
（９）免疫増強剤をさらに含む、（１）〜（８）のいずれかに記載の免疫誘導剤。
（１０）（１）、（３）又は（５）に記載の免疫誘導活性を有するポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む単離抗原提示細胞。【００１１】
（１１）（１）、（３）又は（５）に記載の免疫誘導活性を有するポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する単離Ｔ細胞。
（１２）以下の(a)又は(b)に記載のポリペプチド群から選択され、かつ免疫誘導活性を有するいずれか一のポリペプチド。
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなる免疫誘導活性を有するポリペプチド、
(b)前記(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド。
（１３）以下の（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）以下の(a)又は(b)に記載のポリペプチド群から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド：
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、
(b)前記(a)に記載のいずれか一のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド； 
（ｉｉ）前記いずれか一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター；
（ｉｉｉ）前記いずれか一のポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む単離抗原提示細胞；ならびに
（ｉｖ）前記いずれか一のポリペプチドに特異的な単離Ｔ細胞、
からなる群から選択される一以上を有効成分として含む、癌の治療又は予防薬。
（１４）前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが以下の(c)〜(h)に記載のポリペプチド群から選択される少なくとも１つのポリペプチドである、（１３）に記載の癌の治療又は予防薬：
(c)配列番号３〜３６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(d)前記(c)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド;
(e)前記(c)又は(d)に記載のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド;
(f)配列番号３７〜４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(g)前記(f)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド;
(h)前記(f)又は(g)に記載のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
（１５）前記癌がＳＣＤ１タンパク質を発現する癌である、（１３）又は（１４）に記載の癌の治療又は予防薬。
（１６）以下の（ｉ）〜（ｉｖ）：
（ｉ）以下の(a)又は(b)に記載のポリペプチド群から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド：
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、
(b)前記(a)に記載のいずれか一のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド； 
（ｉｉ）前記いずれか一のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを少なくとも１つ含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター；
（ｉｉｉ）前記いずれか一のポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む単離抗原提示細胞；ならびに
（ｉｖ）前記いずれか一のポリペプチドに特異的な単離Ｔ細胞、
からなる群から選択される一以上を、それを必要とする対象動物に投与することを含む、癌を治療又は予防する方法。
（１７）前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが以下の(c)〜(h)に記載のポリペプチド群から選択される少なくとも１つのポリペプチドである、（１６）に記載の方法：
(c)配列番号３〜３６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(d)前記(c)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド;
(e)前記(c)又は(d)に記載のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド;
(f)配列番号３７〜４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド;
(g)前記(f)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド;
(h)前記(f)又は(g)に記載のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
（１８）前記癌がＳＣＤ１タンパク質を発現する癌である、（１６）又は（１７）に記載の方法。【００１２】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-040364号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、癌の治療又は予防薬の有効成分として有用な新規の免疫誘導剤が提供される。【００１４】
また、後述の実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチドによって癌細胞を殺傷する免疫細胞を誘導することができ、既に生じている癌を縮小若しくは退縮させることができる。さらに、本発明で用いられるペプチドによって癌細胞を殺傷する免疫細胞の誘導を増強することができ、既に生じている癌を縮小若しくは退縮させることもできる。したがって、本発明のポリペプチドは癌の治療や予防薬の有効成分として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＳＣＤ１遺伝子の、ヒト腫瘍組織又は癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；ヒトＳＣＤ１遺伝子の発現パターンを示す。参照番号２；ヒトのハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。
【図２】配列番号３〜２３に示すアミノ酸配列からなる各ポリペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞が、該ポリペプチドとＨＬＡ−Ａ０２０１との複合体を認識してＩＦＮ−γを産生することを示す図である。図中、横軸のレーン４〜２４は、それぞれ配列番号３〜２３のアミノ酸配列で表されるポリペプチドをパルスした樹状細胞の刺激による、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生能を示す。レーン１はポリペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果（Ｍｏｃｋ）を示し、レーン２は配列番号４６に示す本発明の範囲外の陰性コントロールポリペプチドを添加して上記処理を行った結果を示し、レーン３は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる全長ＳＣＤ１タンパク質を添加して上記処理を行った結果を示す。
【図３】配列番号２４〜３６に示すアミノ酸配列からなる各ポリペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞が、該ポリペプチドとＨＬＡ−Ａ２４との複合体を認識してＩＦＮ−γを産生することを示す図である。図中、横軸のレーン４〜１６は、それぞれ配列番号２４〜３６のアミノ酸配列で表されるポリペプチドをパルスした樹状細胞の刺激による、ＨＬＡ−Ａ２４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生能を示す。レーン１はポリペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についての結果（Ｍｏｃｋ）を示し、レーン２は配列番号４７に示す本発明の範囲外の陰性コントロールペプチドを添加して上記処理を行った結果を示し、そしてレーン３は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる全長ＳＣＤ１タンパク質を添加して上記処理を行った結果を示す。
【図４Ａ】配列番号３〜２３に示すアミノ酸配列からなる各ポリペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の、癌細胞に対する障害活性を示す図である。図中、横軸のレーン４〜２４は、それぞれ配列番号３〜２３のアミノ酸配列で表されるポリペプチドを用いて誘導したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の、Ｕ２５１細胞に対する細胞障害活性を示す。レーン１はポリペプチドを添加せずに誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ）の細胞障害活性を示し、レーン２は陰性コントロールのポリペプチド（配列番号４６）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示し、そしてレーン３は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる全長ＳＣＤ１タンパク質を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。
【図４Ｂ】配列番号３〜２３に示すアミノ酸配列からなる各ポリペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の、癌細胞に対する障害活性を示す図である。図中、横軸のレーン４〜２４は、それぞれ配列番号３〜２３のアミノ酸配列で表されるポリペプチドを用いて誘導したＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞の、ＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞に対する細胞障害活性を示す。レーン１はポリペプチドを添加せずに誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ）の細胞障害活性を示し、レーン２は陰性コントロールのポリペプチド（配列番号４６）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示し、レーン３は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる全長ＳＣＤ１タンパク質を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。
【図５Ａ】配列番号２４〜３６に示すアミノ酸配列からなる各ポリペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の、癌細胞に対する障害活性を示す図である。横軸のレーン４〜１６は、それぞれ配列番号２４〜３６のアミノ酸配列で表されるポリペプチドを用いて刺激したＨＬＡ−Ａ２４陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞のＳＷ４８０細胞に対する細胞障害活性を示す。レーン１はポリペプチドを添加せずに誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ）の細胞障害活性を示し、参照番号２は陰性コントロールのポリペプチド（配列番号４７）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示し、そしてレーン３は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳＣＤ１タンパク質を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。
【図５Ｂ】配列番号２４〜３６に示すアミノ酸配列からなる各ペプチドに特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の、癌細胞に対する障害活性を示す図である。横軸のレーン４〜１６は、それぞれ配列番号２４〜３６のアミノ酸配列で表されるポリペプチドを用いて刺激したＨＬＡ−Ａ２４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の、ＺＲ−７５−１細胞に対する細胞障害活性を示す。レーン１はポリペプチドを添加せずに誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ）の細胞障害活性を示し、参照番号２は陰性コントロールのポリペプチド（配列番号４７）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示し、そしてレーン３は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳＣＤ１タンパク質を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を示す。
【図６】配列番号３７〜４５に示すアミノ酸配列からなる各ポリペプチドに特異的なＣＤ４陽性Ｔ細胞が、該ポリペプチドとＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４との複合体を認識してＩＦＮ−γを産生することを示す図である。レーン４〜１２は、それぞれ配列番号３７〜４５のアミノ酸配列で表されるポリペプチドをパルスした樹状細胞の刺激によるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞のＩＦＮ−γ産生能を示す。レーン１はポリペプチドを添加せずに上記処理を行なった場合についてのＭｏｃｋの結果を示し、レーン２は配列番号４８に示す本発明の範囲外の陰性コントロールポリペプチドを添加して上記処理を行った結果を示し、そしてレーン３は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる全長ＳＣＤ１タンパク質を添加して上記処理を行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜ポリペプチド＞
本発明において、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいう。構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）も本発明のポリペプチドに包含される。
【００１７】
本発明の免疫誘導剤を構成するポリペプチドには、以下の(a)又は(ｂ)に記載のポリペプチド群から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチドが挙げられる。
(a)配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるヒトＳＣＤ１タンパク質において、開始メチオニンを１位としたときに３４〜５０位（１７アミノ酸）、６９〜１４８位（８０アミノ酸）、１７８〜１９５位（１８アミノ酸）、２０７〜２４２位（３６アミノ酸）、２４７〜２８０位（３４アミノ酸）、２９６〜３３２位（３７アミノ酸）の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
(b)前記(a)に記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチド。
【００１８】
なお、本発明において、「アミノ酸配列からなる」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。したがって、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」とは、配列番号２に示されるＭｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ・・・(中略)・・・Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｙのアミノ酸配列を持つ、３５９アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、本明細書では、例えば、「配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をしばしば「配列番号２のポリペプチド」と略記する。「塩基配列からなる」という表現についても同様である。
【００１９】
また、本発明で「免疫誘導活性」とは、ＳＣＤ１タンパク質を発現する癌細胞に対して反応するＴ細胞を活性化及び増殖させる能力を意味する。具体的には、ＳＣＤ１タンパク質又はその部分ポリペプチドで刺激された細胞障害性Ｔ細胞及び／又はヘルパーＴ細胞のＩＦＮ−γ産生能力が、刺激していない対照Ｔ細胞のそれよりも高いこと、ＳＣＤ１タンパク質又はその部分ポリペプチドで刺激された細胞障害性Ｔ細胞のＳＣＤ１タンパク質発現癌細胞に対する細胞障害活性が、刺激していない対照のＴ細胞のそれよりも高いこと、ＳＣＤ１タンパク質又はその部分ポリペプチドで刺激されたヘルパーＴ細胞が細胞障害性Ｔ細胞の細胞障害活性を、刺激していない対照のＴ細胞のそれよりも増強すること、又はＳＣＤ１タンパク質又はその部分ポリペプチドで刺激された細胞障害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞が、刺激していない対照のＴ細胞のそれよりもよく増殖すること、を意味する。
【００２０】
細胞の増殖は、目視観察、顕微鏡下での細胞数計測、フローサイトメトリー、培地中のトリチウムチミジンの細胞内への取り込み量等により確認することができる。また、ＩＦＮ−γ産生能力の測定は、例えば、公知のエリスポットアッセイ等を用いて確認することができる。具体的には、例えば、後述の実施例に記載されるように、まず、Ｔ細胞を、免疫誘導活性を評価すべきポリペプチド（本発明ではＳＣＤ１タンパク質又はその部分ポリペプチド）と末梢血単核球（以下、「ＰＢＭＣ」と表記する）由来の抗原提示細胞と共培養することにより、Ｔ細胞を、評価すべきポリペプチドを提示する抗原提示細胞と接触させる。続いて、Ｔ細胞から産生されたＩＦＮ−γを、ＩＦＮ−γに特異的な抗体を用いて測定する。これにより、該Ｔ細胞中の免疫細胞数を測定することができる。これらの測定結果から免疫誘導活性を評価することができる。
【００２１】
また、細胞障害活性の測定は、例えば、Ｔ細胞を、細胞障害活性を評価すべきポリペプチド（本発明ではＳＣＤ１タンパク質又はその部分ポリペプチド）及びＰＢＭＣ由来の抗原提示細胞と共培養した後、生体外で腫瘍細胞の増殖を抑制する能力又は腫瘍細胞を殺す能力（以下、「細胞障害活性」と表記する）を示すか否かを調べることによって評価することができる。Ｔ細胞と抗原提示細胞との接触は、後述するように、両者を液体培地中で共培養することで達成できる。細胞障害活性の測定は、例えば、Ｉｎｔ.Ｊ.Ｃａｎｃｅｒ，５８：Ｐ３１７，１９９４に記載された５１Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法により行なうことができる。
【００２２】
上記で誘導されたＴ細胞を担癌生体に投与することによって、そのＴ細胞の細胞障害活性により腫瘍を縮小又は退縮させることができる。よって、上記免疫誘導活性は、癌細胞の増殖を抑制し、又は癌組織（腫瘍）を縮小若しくは消滅させる能力（以下、「抗腫瘍活性」と表記する）として評価することもできる。
【００２３】
上記ポリペプチドを癌の治療又は予防用途に用いる場合には、特に限定されないが、免疫誘導活性の評価は、細胞障害活性又は抗腫瘍活性を指標とすることが好ましい。
【００２４】
この分野で公知の通り、約７アミノ酸残基以上のポリペプチドであればエピトープを包含し得ることから抗原性及び免疫原性を発揮でき、免疫誘導活性を有し得るので、本発明の免疫誘導剤として用いることができる。
【００２５】
したがって、上記(a)のポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位の領域内における連続する７個以上、好ましくは連続する８、９又は１０個以上のアミノ酸からなるポリペプチドであって、かつ免疫誘導活性を有するものである。特に好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位で示されるアミノ酸配列を有するものである。
【００２６】
癌抗原ポリペプチドを投与することによる免疫誘導の原理として、ポリペプチドが抗原提示細胞に取り込まれ、その後、該細胞内でペプチダーゼによる分解を受けてより小さな断片となり、その後、断片化された抗原ペプチドは該抗原提示細胞の表面上に提示される。細胞表面に提示された抗原を細胞障害性Ｔ細胞等が認識して、該抗原を細胞表面に提示している癌細胞を選択的に殺していくことが知られている。また、抗原提示細胞の表面上に提示された抗原をヘルパーＴ細胞が認識し、その抗原を細胞表面に提示している癌細胞を選択的に殺す細胞障害性Ｔ細胞の誘導を促進することが知られている。抗原提示細胞の表面上に提示される抗原ポリペプチドのサイズは比較的小さく、アミノ酸数で７〜３０程度である。したがって、抗原提示細胞上に提示させるという観点からは、上記(a)のポリペプチドとしては、配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位で示されるアミノ酸配列中の連続する７〜３０程度であることが好ましい。当該ポリペプチドは８〜３０程度、９〜３０程度、若しくは９〜２５程度のアミノ酸からなるものであれば十分である。これら比較的小さなサイズのポリペプチドは、抗原提示細胞内に取り込まれることなく、直接抗原提示細胞上の細胞表面に提示される場合もある。
【００２７】
また、抗原提示細胞に取り込まれたポリペプチドは、該細胞内のペプチダーゼによりランダムな位置で切断を受けて、種々のポリペプチド断片が生じ、これらのポリペプチド断片が抗原提示細胞表面上に提示されるので、配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位のように大きなサイズのポリペプチドを投与すれば、抗原提示細胞内での分解によって、抗原提示細胞を介する免疫誘導に有効なポリペプチド断片が必然的に生じる。したがって、抗原提示細胞を介する免疫誘導は、サイズの大きなポリペプチドを用いることもできる。例えば、当該ポリペプチドのアミノ酸数を３０以上、好ましくは４０以上、より好ましくは５０以上、さらに好ましくは１００以上としてもよい。
【００２８】
さらに、本発明のポリペプチドは、後述のＭＨＣ（ヒトにおいてはＨＬＡ）のクラスＩ分子又はクラスＩＩ分子との結合モチーフを有する８〜２５個、好ましくは９〜２４個、さらに好ましくは９〜２３個のアミノ酸からなるエピトープペプチドを検索しうる照合媒体、例えば、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（ＢＩＭＡＳ）のＨＬＡ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）や、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩによって照合し、エピトープペプチドとなりうるペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。具体的には、本発明のポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチドである。例えば、本発明のポリペプチドとしては、配列番号３〜４５で示されるポリペプチド、又は配列番号３〜４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜３０であるポリペプチドが挙げられる。このうち、配列番号３〜４５で示されるポリペプチド、又は配列番号３〜４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを部分配列として含み、かつアミノ酸残基数が１０〜３０であるポリペプチドのうち、配列番号３〜３６で示されるポリペプチドの免疫誘導活性はＭＨＣクラスＩ分子との結合によるもので、配列番号３７〜４５で示されるポリペプチドの免疫誘導活性はＭＨＣクラスＩＩ分子との結合によるものである。
【００２９】
一方、上記(b)のポリペプチドは、上記(a)のポリペプチドのうちの１個若しくは数個のアミノ酸残基が置換し、欠失し、挿入され及び／又は付加されたポリペプチドで、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。例えば、本発明のポリペプチドとしては、配列番号３〜４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたポリペプチドが挙げられる。
【００３０】
本明細書中の「数個」における「数」とは、２〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、より好ましくは２〜４、さらに好ましくは２又は３の整数を表す。
【００３１】
一般に、あるポリペプチドの中の１個、又は数個のアミノ酸の改変は、元のポリペプチドの機能に影響を及ぼさないと考えられ、場合によっては元のポリペプチドの所望の機能を強化することさえあると考えられている。実際、元のアミノ酸配列と比較して、１個、又は数個のアミノ酸残基が改変された（すなわち、置換、欠失、付加及び／又は挿入された）アミノ酸配列で構成される改変ペプチドは、元のペプチドの生物活性を保持することが知られている（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８１:５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．７９：６４０９−６４１３）。したがって、上記(b)のポリペプチドも免疫誘導活性を発揮し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。
【００３２】
なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ,Ｉｌｅ,Ｖａｌ，Ｌｅｕ,Ａｌａ,Ｍｅｔ,Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ,Ｇｌｎ,Ｔｈｒ,Ｓｅｒ,Ｔｙｒ，Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ,Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ,Ｌｙｓ,Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ,Ｔｙｒ,Ｔｒｐ）のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。したがって、本発明の上記(a)のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなるため好ましい。
【００３３】
また、上記(b)のポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列中の３４〜５０位、６９〜１４８位、１７８〜１９５位、２０７〜２４２位、２４７〜２８０位、２９６〜３３２位の領域内の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、例えば、配列番号３〜４５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのいずれか、と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上又は９９．５％以上のアミノ酸配列の同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドであってもよい。
【００３４】
本明細書においてアミノ酸配列（又は塩基配列）の「同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列（又は塩基配列）のアミノ酸残基（又は塩基）ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列（又は塩基配列）を整列させ、一致したアミノ酸残基数（又は一致した塩基数）を全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
【００３５】
癌治療又は予防との関連で用いられた場合、本発明のポリペプチドは、好ましくはＨＬＡの各型との複合体として、細胞又はエキソソームの表面上に提示されるべきである。したがって、本発明のポリペプチドは、免疫誘導活性を有するだけではなく、ＨＬＡの各型に対する高い結合親和性を有するペプチドを選択することが好ましい。そのために、アミノ酸残基の置換、挿入、欠失、及び／又は付加によってペプチドを改変して、結合親和性が改善された改変ペプチドとしてもよい。天然に提示されるペプチドに加えて、ＨＬＡの各型への結合によって提示されるペプチドの配列の規則性は既知であることから（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９４，１５２：３９１３；Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９５，４１：１７８；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９４，１５５：４３０７）、そのような規則性に基づいた改変を本発明の免疫原性ペプチドに導入することができる。例えば、ＨＬＡ−Ａ２４結合親和性を高めるためには、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をロイシン若しくはメチオニンで置換すること、及び／又はＣ末端のアミノ酸をバリン若しくはロイシンで置換することが望ましい可能性がある。したがって、配列番号２４〜３６のアミノ酸配列を有するペプチドであって、これらペプチドのＮ末端から２番目のアミノ酸がロイシン若しくはメチオニンで置換されている、及び／又はアミノ酸のＣ末端がバリン若しくはロイシンで置換されているペプチドは、本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
置換を、末端アミノ酸の箇所だけでなく、ペプチドのＴＣＲ認識の可能性のある位置に導入することもできる。いくつかの研究により、ペプチドのアミノ酸置換物は元のものと同等であるか又はより優れた免疫誘導活性を有することが実証されており、これには例えばＣＡＰ１、ｐ５３（２６４−２７２）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（３６９−３７７）、又はｇｐ１００（２０９−２１７）がある（Ｚａｒｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５７０−４５７７、Ｔ．Ｋ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８（３）：１３３８−４７、Ｓ．Ｏ．Ｄｉｏｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１９９−２０６、及びＳ．Ｏ．Ｄｉｏｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ,Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，５３：３０７−３１４）。
【００３７】
上記の改変に加えて、結果として生じる連結ポリペプチドが元のペプチドの必要な免疫誘導活性を保持する限り、本発明のポリペプチドを他の物質と連結させることもできる。他の物質の例として、限定はしないが、ペプチド、脂質、糖及び糖鎖、アセチル基、天然及び合成のポリマー等が含まれる。ペプチドは、改変によって元のペプチドの生物活性を損なわないことを条件として、グリコシル化、側鎖酸化又はリン酸化等の改変を含むことができる。これらの種類の改変は、付加的な機能（例えば、標的化機能及び送達機能）を付与するため、又はポリペプチドを安定化するために行うことができる。例えば、ポリペプチドのインビボ安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体又は非天然アミノ酸を導入する技術が当該分野において公知であり、この概念を本発明のポリペプチドに適用することもできる。ポリペプチドの安定性は、いくつかの方法でアッセイすることができる。例えば、ペプチダーゼ、ならびにヒトの血漿及び血清等のさまざまな生体媒質を用いて、安定性を試験することができる（例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ，１１：２９１−３０２を参照）。
【００３８】
さらに、本発明のポリペプチドを、スペーサー又はリンカーを介して他のペプチドと連結させてもよい。他のペプチドの例として、限定はしないが、他のポリペプチドに由来するエピトープペプチドが含まれる。あるいは、本発明の２つ又はそれ以上のポリペプチドをスペーサー又はリンカーを介して連結させてもよい。スペーサー又はリンカーを介して連結させるペプチドは、同じであっても互いに異なってもよい。スペーサー及びリンカーの種類は特に限定されず、ペプチドで構成されるもの、より好ましくはペプチダーゼ、プロテアーゼ及びプロテアソーム等の酵素によって切断され得る１つ又は複数の切断部位を有するペプチドで構成されるものが含まれる。リンカー又はスペーサーの例として、限定はしないが、ＡＡＹ（Ｐ．Ｍ．Ｄａｆｔａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ，２００７，５：２６）、ＡＡＡ、ＮＫＲＫ（Ｒ．Ｐ．Ｍ．Ｓｕｔｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００，１６５：７３０８−７３１５）、又は１個〜数個のリジン残基（Ｓ．Ｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃａｎ  Ｒｅｓ．６２：１４７１−１４７６、Ｋ．Ｓ．Ｋａｗａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ.,２００２,Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ.１６８：５７０９−５７１５）が挙げられる。本発明は、スペーサー又はリンカーを介して他のペプチドと連結されたポリペプチドを想定している。
【００３９】
本発明のポリペプチドがシステイン残基を含む場合、それらのポリペプチドは、システイン残基のＳＨ基間のジスルフィド結合を介して二量体を形成する傾向がある。したがって、ポリペプチドの二量体も、本発明のポリペプチドに含まれる。
【００４０】
本発明のポリペプチドは、周知の技法を用いて調製することができる。例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（t−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。
【００４１】
さらに、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入して、該宿主細胞中で目的とするポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることもできる。宿主細胞から目的とするポリペプチドを得る場合、他の天然の宿主細胞タンパク質及びそれらの断片、又は他の任意の化学物質を実質的に含まないように、精製又は単離すればよい。
【００４２】
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡは、ヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル行った後、７２℃で１分間反応させる条件等を挙げることができるが、これに限定されない。また、配列番号１に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒト等のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニング等の操作は当業者に既知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ,Ｍ.Ｒ.  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ,Ｊ.,２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ,Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ,Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ｗｗｗ．ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓ.ｃｏｍ等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、上記(a)のポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。したがって、上記した(b)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができるので、そのようなポリヌクレオチドも、市販の核酸合成機を用いて常法により合成すればよい。
【００４３】
上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよい。原核細胞の例としては、大腸菌等、真核細胞の例としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム等が例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換した後、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。
【００４５】
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換した後、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグＨＡタグ、ＧＦＰ等各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
【００４６】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の周知の方法を用いることができる。
【００４７】
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素等の変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
以上の方法によって得られるポリペプチドには、上述した通り、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＨｉｓタグとの融合タンパク質等が例示できる。したがってこのような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、本発明の範囲に含まれる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、免疫誘導活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化等が例示できる。
【００４９】
＜免疫誘導剤＞
本発明の免疫誘導活性を有するポリペプチド又は該ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターを担癌生体に投与すると、既に生じている腫瘍を退縮させることができる。また、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチド又はポリペプチドをコードする遺伝子を癌の発症前の生体に投与することで腫瘍の発生を予防することができる。したがって、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードする遺伝子は、免疫誘導剤の有効成分となり得る。
【００５０】
ここで、「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。この場合、対象となる癌としては、ＳＣＤ１タンパク質を発現している癌であることが好ましく、中でも好ましくは悪性リンパ腫、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、悪性脳腫瘍、食道癌及び肺癌である。
【００５１】
対象動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは霊長類、ペット動物、家畜類、競技用動物等を含む哺乳動物であり、さらに好ましくはヒト、イヌ又はネコであり、特に好ましくはヒトである。
【００５２】
対象となる癌罹患個体（個体がヒトの場合は癌患者）は、生体内でＳＣＤ１タンパク質を発現している癌罹患個体であることが好ましく、具体的には、ＷＯ２０１１／０２７８０７に記載される癌の検出方法によってスクリーニングされる癌罹患個体であることが好ましい。特に、対象生体から得られた試料中に含まれるＳＣＤ１タンパク質に対する抗体の発現量が、健常個体の生体から得られた試料中に含まれる当該抗体の発現量と比較して多いことによってスクリーニングされる癌罹患個体であることが好ましい。対象となる癌罹患個体のスクリーニングに供される試料としては、血液、血清、血漿、腹水、胸水等の体液、組織、細胞が挙げられるが、ＳＣＤ１タンパク質に対する抗体の発現量の測定によってスクリーニングする場合は、血清、血漿、腹水又は胸水が好ましい。
【００５３】
本発明の免疫誘導剤の投与経路は、経口投与でも、非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。癌の治療目的で該免疫誘導剤を用いる場合には、抗癌作用を高めるため、治療対象となる腫瘍の近傍の所属リンパ節に投与することもできる。投与量は、免疫誘導するのに有効な量であればよく、例えば、癌の治療又は予防に用いるのであれば、癌の治療又は予防に有効な量であればよい。癌の治療又は予防に有効な量は、腫瘍の大きさや症状、対象動物の体重、体積等に応じて適宜選択されるが、対象動物がヒトの場合、通常１日当りの有効量は、０．０００１〜１０００μｇ、好ましくは０．００１〜１０００μｇとなる。これを、１回又は数回に分けて投与することができる。１日あたり数回に分け、それを数日又は数月おきに投与するのが好ましい。後述の実施例に具体的に示されるとおり、本発明の免疫誘導剤は、既に形成されている腫瘍を退縮させることができる。したがって、発生初期の少数の癌細胞にも抗癌作用を発揮し得るので、癌の発症前や癌の治療後に用いれば、癌の発症や再発を防止することができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療と予防の双方に有用であり、癌治療又は予防薬の有効成分となり得る。
【００５４】
本発明の免疫誘導剤は、前述した本発明のポリペプチドを有効成分として含有するが、単一のポリペプチドのみから成っていてもよいし、複数のポリペプチドを組み合わせても良い。本発明のポリペプチドを複数組み合わせることにより、各ポリペプチドが有する免疫誘導活性（細胞傷害活性Ｔ細胞の誘導・活性化作用）が増強され、癌の治療又は予防をより効果的に達成することができる。
【００５５】
本発明の免疫誘導剤を公知の細胞障害性Ｔ細胞を誘導できるペプチドと組み合わせて用いることもできる。本発明のポリペプチドを組み合わせることにより、各ポリペプチドが有する免疫誘導活性（細胞傷害活性Ｔ細胞の誘導・活性化作用）が増強され、癌の治療又は予防をより効果的に達成することができる。この場合の「組み合わせ」は、本発明の免疫誘導剤と公知の細胞障害性Ｔ細胞を誘導できるペプチドを別個に、又は同時に、投与することを包含する。ここでいう「別個に投与する」とは、本発明の免疫誘導剤と公知の細胞障害性Ｔ細胞を誘導できるペプチドを、時間差をおいて別々に投与することをいう。投与する順序は問わない。一方、「同時に投与する」とは、本発明の免疫誘導剤と公知の細胞障害性Ｔ細胞を誘導できるペプチドを予め混合して一体化させた形態で投与すること、又は本発明の免疫誘導剤と公知の細胞障害性Ｔ細胞を誘導できるペプチドを個別形態で時間差なく投与することをいう。
【００５６】
本発明の免疫誘導剤は、生体内での免疫学的応答を強化することができる他の免疫増強剤と組み合わせて用いることができる。他の免疫増強剤は、本発明の免疫誘導剤に含まれていてもよいし、別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与してもよい。
【００５７】
上記「他の免疫増強剤」としては、例えばアジュバントを挙げることができる。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外又はマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、抗癌作用を高めることができる。したがって、本発明の免疫誘導剤を癌の治療又は予防薬の有効成分に用いる場合、免疫誘導剤は、有効成分たる本発明のポリペプチドに加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。多数の種類のアジュバントが当業界で周知であり、いずれのアジュバントでも用いることができる。アジュバントの具体例としては、ＭＰＬ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、サルモネラ属のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｒｅ  ５９５リポ多糖類の精製及び酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、Ｑｕｉｌｌｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６/３３７３９（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８及びＱＳ−Ｌ１（Ｓｏ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ.,１９９７，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ，７：１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｒｅｉｇ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ.,１９９５，Ｎａｔｕｒｅ３７４：５４６−５４９を参照）；ポリＩＣ及びその誘導体（ポリＩＣＬＣ等）ならびにスクアレン及び／又はトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。中でも、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体並びにＣｐＧオリゴヌクレオチドが好ましい。上記アジュバントとポリペプチドの混合比は、典型的には約１：１０〜１０：１、好ましくは約１：５〜５：１、より好ましくは約１：１である。ただし、アジュバントは上記例示に限定されず、当業界で公知の上記以外のアジュバントも本発明の免疫誘導剤を投与する際に用いることができる（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ,Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版，１９８６年を参照）。免疫誘導剤及びアジュバントの混合物又はエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。
【００５８】
また、上記他の免疫増強剤としては、上記アジュバント以外にも、対象の免疫応答を刺激する因子を用いることもできる。例えば、リンパ球や抗原提示細胞を刺激する特性を有する各種サイトカインを免疫増強剤として本発明の免疫誘導剤と組み合わせて用いることができる。そのような免疫学的応答を増強可能な多数のサイトカインは、当業者に公知であり、その例として、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、インターフェロンω（ＩＦＮ−ω）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）及びＦｌｔ３リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。このような因子も上記免疫増強剤として用いることができ、本発明の免疫誘導剤に含ませて又は別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与することができる。
【００５９】
＜癌の治療又は予防薬＞
本発明の免疫誘導剤は、癌の治療又は予防薬の有効成分として用いることができる。
【００６０】
癌の治療又は予防薬は、本発明の免疫誘導剤を各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。
【００６１】
製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。添加剤の具体例としては、生理緩衝液のような希釈剤；砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等のような賦形剤；シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等のような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等の滑沢剤等が挙げられるが、これらに限定されない。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等の経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤等の非経口剤等を挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。
【００６２】
＜抗原提示細胞＞
また、上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、上記した(a)又は(ｂ)のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理剤として利用し得る。ここで、抗原提示細胞としては、ＭＨＣクラスＩ分子及びクラスＩＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＭＨＣクラスＩ分子及びクラスＩＩ分子が同定されており、周知である。ヒトにおけるＭＨＣ分子はＨＬＡと呼ぶ。ＨＬＡクラスＩ分子としては、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃを挙げることができ、より具体的には、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０２０４、ＨＬＡ−Ａ０２０５、ＨＬＡ−Ａ０２０６、ＨＬＡ−Ａ０２０７、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ６８０１、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７０５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｃｗ０４０１、ＨＬＡ−Ｃｗ０６０２等を挙げることができる。ＨＬＡクラスＩＩ分子としては、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰを挙げることができ、より具体的には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１が挙げられる。
【００６３】
ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により血液等から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血又は患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とＩＬ−３（又はＩＬ−４）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。
【００６４】
この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい免疫応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができる。患者本来の自家細胞は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できるので好ましい。末梢血又は骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、又は遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ程度が好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｇ／ｍＬ程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である３７℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、５％ＣＯ２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常３日〜２週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。
【００６５】
上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをインビトロで接触させる方法自体は、周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより達成できる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常１〜１００μｇ／ｍＬ程度、好ましくは５〜２０μｇ／ｍＬ程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常１０３〜１０７細胞／ｍＬ程度、好ましくは５×１０４〜５×１０６細胞／ｍＬ程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。したがって、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドを３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。
【００６６】
上記したポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のＭＨＣ分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。したがって、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。このような抗原提示細胞は、生体内又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ポリペプチドを提示し、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞を誘導し、増殖させることができる。
【００６７】
上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞又はへルパーＴ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１〜１：１００程度、好ましくは１：５〜１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００〜１０００万細胞／ｍＬ程度、好ましくは１００００〜１００万細胞／ｍＬ程度である。共培養は、常法に従い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日〜３週間、好ましくは４日〜２週間程度である。また、共培養は、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７及びＩＬ−１２のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、ＩＬ−２及びＩＬ−７の濃度は、通常５〜２０Ｕ／ｍＬ程度、ＩＬ−６の濃度は通常５００〜２０００Ｕ／ｍＬ程度、ＩＬ−１２の濃度は通常５〜２０ｎｇ／ｍＬ程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回又は数回繰り返してもよい。例えば、共培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共培養を行なうという操作を、１回又は数回繰り返してもよい。各共培養の条件は、上記と同様でよい。
【００６８】
上記の共培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞が誘導され、増殖される。したがって、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞を調製することができる。
【００６９】
後述の実施例に記載される通り、ＳＣＤ１タンパク質をコードする遺伝子（ＳＣＤ１遺伝子）は、それぞれ悪性リンパ腫組織、悪性リンパ腫細胞、乳癌組織、乳癌細胞、肝臓癌組織、肝臓癌細胞、前立腺癌組織、前立腺癌細胞、卵巣癌組織、卵巣癌細胞、腎臓癌組織、腎臓癌細胞、大腸癌組織、大腸癌細胞、胃癌組織、胃癌細胞、悪性脳腫瘍組織、悪性脳腫瘍細胞、食道癌組織、食道癌細胞、肺癌組織、肺癌細胞、に特異的に発現している。したがって、これらの癌種においては、ＳＣＤ１タンパク質が正常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。癌細胞内に存在するＳＣＤ１タンパク質の一部が癌細胞表面上のＭＨＣ分子に提示され、上記のようにして調製した細胞障害性Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞が生体内に投与されると、これを目印として細胞障害性Ｔ細胞が癌細胞を障害する又は細胞傷害性Ｔ細胞の細胞障害活性を増強することができる。また、上記ポリペプチドを提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、細胞傷害性Ｔ細胞が癌細胞を障害する、又は細胞障害性Ｔ細胞の細胞障害活性を増強ことができる。すなわち、上記ポリペプチドを用いて調製された上記細胞障害性Ｔ細胞やヘルパーＴ細胞、上記抗原提示細胞もまた、本発明の免疫誘導剤と同様に、癌の治療又は予防薬として有用である。
【００７０】
上記した単離抗原提示細胞や単離Ｔ細胞を生体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように上記(a)又は(ｂ)のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。
【００７１】
抗原提示細胞又は単離Ｔ細胞を有効成分として含む癌の治療又は予防薬の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常１個〜１０兆個、好ましくは１００万個〜１０億個であり、これを数日又は数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。
【００７２】
＜遺伝子ワクチン＞
また、上記(a)又は(ｂ)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、免疫誘導、すなわち該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ、ポリペプチドを投与するのと同等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記した(a)又は(ｂ)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。後述の実施例に示されるように、このような抗原ポリペプチドを発現可能な組換えベクターは、「遺伝子ワクチン」とも呼ばれる。
【００７３】
遺伝子ワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。
【００７４】
遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で０．１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ程度である。
【００７５】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み、これを対象動物に感染させる方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
【００７６】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００７７】
本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するインビボ方法、及び対象動物からある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すエクソビボ方法があるが、インビボ方法がより好ましい。
【００７８】
インビボ方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することが出来る。インビボ方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソーム又は膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００７９】
なお、本発明において、「配列番号１に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。したがって、「配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらからなる二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。
【実施例】
【００８０】
以下、本発明を実施例に基づき、より具体的に説明する。【００８１】
＜実施例１：各組織での発現解析＞
（１）各癌細胞株でのＳＣＤ１遺伝子発現解析
ヒトＳＣＤ１タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列（配列番号１）をＧｅｎｅ  Ｂａｎｋから得た。得られた遺伝子に対しヒト各種細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０〜１００ｍｇ及び各細胞株５〜１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、海馬、精巣、結腸、胎盤）のｃＤＮＡは、ジーンプールｃＤＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（クロンテック社製）及びＬａｒｇｅ−Ｉｎｓｅｒｔ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテック社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（プライマーの塩基配列は配列番号４９及び５０に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μL、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え、全量を２５μＬとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ(ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃−３０秒、５５℃−３０秒、及び７２℃−１分のサイクルを３０回繰り返して行った。比較対照のため、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子に特異的なプライマー（ヒトＧＡＰＤＨプライマーの塩基配列は配列番号５１及び５２に記載）も同時に用いた。【００８２】
その結果、図１に示すように、ヒトＳＣＤ１遺伝子は、大部分の癌細胞株、すなわち悪性リンパ腫、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、悪性脳腫瘍、食道癌及び肺癌で発現が検出された。【００８３】
（２）ヒト癌組織におけるＳＣＤ１タンパク質の発現（免疫組織化学染色）
パラフィン包埋された多種類の癌組織アレイ（ＢＩＯＭＡＸ社製）の癌組織７２検体を用いて、免疫組織化学染色を行った。ヒト癌組織アレイを６０℃で３時間処理後、キシレンを満たした染色瓶に入れて５分ごとにキシレンを入れ替える操作を３回行った。次にキシレンの代わりにエタノール及びＰＢＳ−Ｔで同様の操作を行った。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を満たした染色瓶にヒト癌組織アレイを入れ、１２５℃で５分間処理後、室温で４０分以上静置した。切片周囲の余分な水分をキムワイプでふき取り、ＤＡＫＯＰＥＮで囲み、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｂｌｏｃｋ（ＤＡＫＯ社製）を適量滴下した。室温で５分間静置後、ＰＢＳ−Ｔを満たした染色瓶に入れて５分ごとにＰＢＳ−Ｔを入れ替える操作を３回行った。ブロッキング液として、１０％ ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液をのせ、モイストチャンバー内で室温にて１時間静置した。次にＳＣＤ１タンパク質に反応する市販ウサギポリクローナル抗体（ｓｉｇｍａ社）を、５％  ＦＢＳを含むＰＢＳ−Ｔ溶液で１０μｇ／ｍＬに調製した溶液をのせ、モイストチャンバー内で４℃にて一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ＤＡＫＯ社製）適量滴下し、モイストチャンバー内に室温で３０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、ＤＡＢ発色液（ＤＡＫＯ社製）をのせ、室温で１０分程度静置した後、発色液を捨て、ＰＢＳ−Ｔで１０分間３回洗浄を行った後、蒸留水でリンスし、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％の各エタノール溶液に順番に１分間ずつ入れた後、キシレン中で一晩静置した。スライドガラスを取り出し、Ｇｌｙｃｅｒｇｅｌ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ社製）で封入後、観察を行った。【００８４】
その結果、ＳＣＤ１タンパク質は検証したほとんどの癌、悪性リンパ腫、乳癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌、大腸癌、胃癌、悪性脳腫瘍、食道癌及び肺癌で強い発現が認められた。【００８５】
＜実施例２：ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導＞
（１）ＨＬＡ−Ａ０２０１とＨＬＡ−Ａ２４に結合するペプチドモチーフの予測
配列番号２で示されるヒトＳＣＤ１タンパク質のアミノ酸配列の情報をＧｅｎＢａｎｋから得た。ＨＬＡ−Ａ０２０１とＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフ予測のため、公知のＢＩＭＡＳソフト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／で利用可能）を用いたコンピューター予測プログラムを用いてヒトＳＣＤ１タンパク質のアミノ酸配列を解析し、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子に結合可能と予想される配列番号３〜２３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド２１種類と、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合可能と予想される配列番号２４〜３６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド１３種類を選択した。選択したすべてのポリペプチドは、株式会社グライナー・ジャパンのカスタムペプチド合成サービスに合成依頼した。なお、合成されたポリペプチドはＨＰＬＣ分析とマススペクトル分析による品質が保証されたものである。【００８６】
（２）ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導
ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性の健常人から末梢血を分離し、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ＯｒｇａｎｏｎｐＴｅｋｎｉｋａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）に重層して１，５００ｒｐｍで室温にて２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（又はそれ以上）洗浄し、ＰＢＭＣを得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｌｇｉｅｓ社製）２０ｍＬに懸濁し、培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）中に３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。【００８７】
付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍＬ）及びＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）の存在下で培養した。６日後にＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍＬ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）及びＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換して、さらに２日間培養した後、得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。【００８８】
調製した樹状細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で懸濁し、上記（１）にて選択したＨＬＡ−Ａ０２０１分子に結合可能と予想されるペプチドを１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Ｎａｂｉ社製）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ，Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞ずつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０６細胞添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ペプチドで処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Ｎａｂｉ社製）、ＩＬ−７（１０Ｕ／ｍＬ，Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）及びＩＬ−２（１０Ｕ／ｍＬ，Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し（細胞密度：１×１０５細胞／ｍＬ）、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞ずつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４回繰返した後刺激されたＴ細胞を回収し，フローサイトメトリーによりＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。【００８９】
なお、陰性コントロールとして、本発明の範囲外の配列であるペプチド（配列番号４６）及びＷＯ２０１２／１５７７３６の実施例３に基づいて作製した配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳＣＤ１タンパク質を比較例として使用し上記と同様の処理を行った。【００９０】
また、ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合可能と予想されるペプチドについても、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の健常人の末梢血から誘導した樹状細胞とＴ細胞集団を用いて上記と同様の方法にて、ペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導を試みた。なお、陰性コントロールとして、本発明の範囲外の配列であるペプチド（配列番号４７）を、前記配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳＣＤ１タンパク質を比較例として使用し同様の処理を行った。【００９１】
＜実施例３：細胞障害性Ｔ細胞抗原エピトープの決定＞
（１）ＩＦＮ−γ産生能
実施例２（２）にて誘導したＴ細胞それぞれについて、エピトープペプチド及びタンパク質に対する特異性を調べるために、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子を発現する樹状細胞に各種ポリペプチドをパルスした。前記樹状細胞は１０μｇ／ｍＬの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中各ポリペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養して調製した。また、各種ポリペプチドには、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子に結合可能と予想される配列番号３〜２３のアミノ酸配列で表される各ポリペプチド、陰性コントロールポリペプチド（配列番号４６）及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳＣＤ１タンパク質を用いた。パルス後の樹状細胞５×１０４個に対して、５×１０３個のＴ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。【００９２】
その結果、ポリペプチドをパルスしていない樹状細胞及び陰性コントロールポリペプチドを用いたレーン１及び２に比べて、配列番号３〜２３のアミノ酸配列で表されるポリペプチドをパルスした樹状細胞を用いたレーン４〜２４では、明らかに高いＩＦＮ−γ産生が確認された（図２）。この結果から、配列番号３〜２３のペプチドは特異的にＨＬＡ−Ａ０２０１陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。さらに、これらペプチドを用いたＩＦＮ−γの産生量は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる全長ＳＣＤ１タンパク質（レーン３）で刺激したＴ細胞から産生されるＩＦＮ−γよりも顕著に高いことも判明した。すなわち、配列番号３〜２３のポリペプチドは、顕著に高い免疫誘導活性を有していることを示している。また、配列番号２で表される全長ＳＣＤ１タンパク質のアミノ酸配列中には上記免疫誘導活性を有する配列番号３〜２３が含まれているにもかかわらず、配列番号２の全長ＳＣＤ１タンパク質で刺激したＴ細胞から産生されるＩＦＮ−γの産生量は低かった。これは、全長ＳＣＤ１タンパク質のアミノ酸配列中には、免疫誘導活性を抑制する配列も多く含まれることから、十分な免疫誘導活性を示さなかったと考えられる。【００９３】
さらに、上記と同様に、実施例３（２）にて配列番号２４〜３６のアミノ酸配列で表されるポリペプチドを用いて誘導したペプチドエピトープ反応性ＣＤ８陽性Ｔ細胞について、ペプチドエピトープに対する特異性を調べるために、配列番号２４〜３６ポリペプチド（レーン４〜１６）、配列番号４７のアミノ酸配列で表される陰性コントロールポリペプチド、配列番号２のアミノ酸配列で表される全長ＳＣＤ１タンパク質をパルスした、ＨＬＡ−Ａ２４分子を発現する樹状細胞に対する、Ｔ細胞のＩＦＮ−γの産生量を上記の方法に準じてＥＬＩＳＡ法により測定した。【００９４】
その結果、ポリペプチドをパルスしていない樹状細胞のレーン１及び陰性コントロールポリペプチドを用いたレーン２に比べて、配列番号２４〜３６のポリペプチドをパルスした樹状細胞を用いたレーン４〜１６では培養上清において、顕著なＩＦＮ−γ産生が確認された（図３）。【００９５】
この結果から、配列番号２４〜３６のポリペプチドは、特異的にＨＬＡ−Ａ２４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。さらに、これらポリペプチドを用いたＩＦＮ−γの産生量は配列番号２のアミノ酸配列で表される全長ＳＣＤ１タンパク質で刺激したＴ細胞から産生されるＩＦＮ−γよりも顕著に高いことも判明した。上記と同様の理由により全長ＳＣＤ１タンパク質では、十分な免疫誘導活性を示さなかったと考えられる。【００９６】
（２）細胞障害性評価
次に、本発明で用いられる配列番号３〜２３のアミノ酸配列で表されるポリペプチドが、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性でヒトＳＣＤ１タンパク質を発現する腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ０２０１分子上に提示されるものであるか、また本発明のポリペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ０２０１陽性でヒトＳＣＤ１タンパク質を発現する腫瘍細胞を障害することができるか、さらにはＳＣＤ１タンパク質で刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞と比較して腫瘍細胞を顕著に障害するかを検討した。【００９７】
ヒトＳＣＤ１タンパク質の発現が確認されているヒトグリオーマ（悪性脳腫瘍）細胞株Ｕ２５１細胞、白血病細胞株ＴＨＰ１肝臓癌細胞株ＳＫ−Ｈｅｐ−１、乳癌細胞株ＭＣＦ７、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ３、腎臓癌細胞株Ａ４９８、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、胃癌細胞株ＡＧＳ、及び肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ５２２（ＪＣＲＢ，理化学研究所およびＡＴＣＣより購入）の細胞株をそれぞれ１０６個５０ｍＬ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロム５１を加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳという、キブコ社製）を含むＲＰＭＩ培地（キブコ社製）で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加し、さらにこれに１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で懸濁された５×１０４個の配列番号３〜２３のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、陰性コントロールポリペプチド（配列番号４６）及び配列番号２のアミノ酸配列で表される全長ＳＣＤ１タンパク質による刺激で誘導されたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞をそれぞれ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロム５１の量を測定することによって、各ポリペプチド及びタンパク質の刺激で誘導されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞障害活性を算出した。【００９８】
その結果、配列番号３〜２３のアミノ酸配列で表されるポリペプチド刺激で誘導されたＨＬＡ−Ａ０２０１陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞が上記細胞全てに対して顕著な細胞障害活性を有することが判明した。代表例として、図４Ａ、及び４Ｂに、それぞれＵ２５１細胞、及びＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞に対する細胞障害活性の結果を示す。配列番号３〜２３のアミノ酸配列で表されるポリペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞（それぞれレーン４〜２４）では全長ＳＣＤ１タンパク質で刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞（レーン３）と比較して、Ｕ２５１細胞及びＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞に対して顕著に高い細胞障害活性を示している。一方、陰性コントロールのポリペプチド（レーン２）を用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞は、Ｍｏｃｋ（レーン１）と同程度であり、細胞障害活性を示さなかった。この結果は、本発明で用いられる配列番号３〜２３のポリペプチドが、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性でヒトＳＣＤ１ポリペプチドを発現する腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ０２０１分子上に提示されるものであり、さらに本発明のポリペプチドは、このような腫瘍細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることを示唆している。また、全長ＳＣＤ１タンパク質のアミノ酸配列中には配列番号３〜２３が含まれているにもかかわらず、配列番号３〜２３のポリペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞による細胞障害活性よりも顕著に弱かった（レーン３、４〜２４）。これは、ＳＣＤ１タンパク質のアミノ酸配列中には免疫誘導活性を抑制する配列が多く含まれることから、強い細胞障害活性を持つＴ細胞が誘導できなかったためと考えられる。【００９９】
同様に、配列番号２４〜３６のポリペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４陽性でヒトＳＣＤ１タンパク質を発現する腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ２４分子上に提示されるものであるか、また本発明のポリペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ２４陽性でヒトＳＣＤ１タンパク質を発現する腫瘍細胞を障害することができるか、さらにはＳＣＤ１タンパク質で刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞と比較して腫瘍細胞を顕著に障害するかを検討した。【０１００】
ＨＬＡ−Ａ２４陽性でヒトＳＣＤ１タンパク質を発現する、ヒトグリオーマ細胞株ＫＮＳ−４２、肝臓癌細胞株ＳＫ−Ｈｅｐ１、腎臓癌細胞株Ｃａｋｉ１、大腸癌細胞株ＳＷ４８０、胃癌細胞株ＭＫＮ４５、前立腺癌細胞株ＰＣ３、乳癌細胞株ＺＲ７５−１（ＪＣＲＢ，理化学研究所及びＡＴＣＣより購入）にクロム５１を取り込ませ、配列番号２４〜３６のアミノ酸配列で表されるポリペプチド、陰性コントロールポリペプチド（配列番号４７）、及び全長ＳＣＤ１タンパク質による刺激で誘導されたＨＬＡ−Ａ２４陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞を培養したときの、障害を受けた細胞から放出される培養上清中のクロム５１の量を測定した。【０１０１】
その結果、配列番号２４〜３６のアミノ酸配列で表されるポリペプチドで刺激されたＨＬＡ−Ａ２４陽性のＣＤ８陽性Ｔ細胞が、用いた全ての癌細胞に対して通常では予想し得ないほどに顕著な細胞障害活性を有することが判明した。代表例として、図５Ａ及び５ＢにそれぞれＳＷ４８０細胞、及びＺＲ７５−１細胞に対する細胞障害活性の結果を示す。配列番号２４〜３６のアミノ酸配列で表されるポリペプチドで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞（それぞれレーン４〜１６）では、全長ＳＣＤ１タンパク質で刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞（レーン３）と比較して、ＳＷ４８０細胞、及びＺＲ７５−１細胞に対して顕著に高い細胞障害活性を示している。一方、陰性コントロールのポリペプチドを用いて誘導したＣＤ８陽性Ｔ細胞は、Ｍｏｃｋ（レーン１）と同程度であり、細胞障害活性を示さなかった（レーン２）。したがって、配列番号２４〜３６は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性でヒトＳＣＤ１タンパク質を発現する細胞上のＨＬＡ−Ａ２４分子上に提示されるものであり、この結果は、本発明のポリペプチドが、このような細胞を障害することができるＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞を誘導する能力があることを示唆している。【０１０２】
一方で、上記の癌細胞に対して配列番号３〜３６のアミノ酸配列で表されるポリペプチド及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる全長ＳＣＤ１タンパク質を暴露させたところ癌細胞は全く死滅しなかった。このことから、これらポリペプチドには、直接的に癌細胞を殺す作用が無いことも確認した。【０１０３】
細胞障害活性は、上記のように、本発明で用いられる各ポリペプチドで刺激誘導されたＣＤ８陽性Ｔ細胞５×１０４個とクロム５１を取り込ませた１０３個の各腫瘍細胞とを混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出したＣＤ８陽性Ｔ細胞の各腫瘍細胞（標的細胞という）に対する細胞障害活性を示した結果である。【０１０４】
＊式：細胞障害活性（％）＝ＣＤ８陽性Ｔ細胞を加えた際の標的細胞からのクロム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロム５１遊離量×１００。【０１０５】
＜実施例４：ＳＣＤ１タンパク質由来ペプチドエピトープ反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導＞
ＣＤ４陽性Ｔ細胞抗原エピトープ予測のため、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ アルゴリズム（ラメンセー著（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ）のコンピューター予測プログラムを用いてヒトＳＣＤ１タンパク質のアミノ酸配列を解析し、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドであると予想される配列番号３７〜４５に示す９種類のペプチドを選択した。選択した全てのペプチドは株式会社グライナー・ジャパンのカスタムペプチド合成サービスに合成依頼した。【０１０６】
ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４陽性の健常人から末梢血を分離し、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ＯｒｇａｎｏｎｐＴｅｋｎｉｋａ社製）に重層して１，５００ｒｐｍで室温にて２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する画分を回収し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（又はそれ以上）洗浄してＰＢＭＣを得た。得られたＰＢＭＣを２０ｍＬのＡＩＭ−Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｌｇｉｅｓ社製）に懸濁し、培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）中に３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間付着させた。非付着細胞はＴ細胞調製に用い、付着細胞は樹状細胞を調製するために用いた。【０１０７】
一方、付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍＬ）及びＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）の存在下で培養した。６日後にＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍＬ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）及びＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地に交換してさらに２日間培養した後得られた非付着細胞集団を樹状細胞として用いた。【０１０８】
調製した樹状細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中に１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度で懸濁し、配列番号３７〜４５の各ポリペプチド、陰性コントロールポリペプチド（配列番号４８）及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＳＣＤ１タンパク質をそれぞれ１０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、９６穴プレートを用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、Ｘ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清（Ｎａｂｉ社製）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍＬ）及びＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞ずつ添加した。さらに調製したＴ細胞集団を１穴当りそれぞれ１×１０６細胞添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。７日後、それぞれの培養上清を捨て、上記と同様にして得た各ペプチド及びＳＣＤ１タンパク質で処理後Ｘ線照射した樹状細胞を１０％ヒトＡＢ血清（Ｎａｂｉ社製）及びＩＬ−２（１０Ｕ／ｍＬ、Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、２４穴プレート１穴当りにそれぞれ１×１０５細胞ずつ添加し、さらに培養した。同様の操作を７日間おきに４回繰返した後、刺激されたＴ細胞を回収し、フローサイトメトリーによりＣＤ４陽性Ｔ細胞の誘導を確認した。その結果、誘導した各穴のＴ細胞が増殖していることが確認された。 【０１０９】
＜実施例５：ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞を刺激するＳＣＤ１タンパク質由来ヘルパーＴ細胞抗原エピトープの決定＞
上記実施例４で誘導したＣＤ４陽性Ｔ細胞の各ペプチドタンパク質に対する特異性を調べるために、各種ポリペプチドでＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４分子を発現するＰＢＭＣをパルスした。前記ＰＢＭＣは１０μｇ／ｍＬの濃度でＡＩＭ−Ｖ培地中各ポリペプチドを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養して調製した。また、各種ポリペプチドには、配列番号３７〜４５のアミノ酸配列で表される各ポリペプチド、陰性コントロールポリペプチド（配列番号４８）及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる全長ＳＣＤ１タンパク質を用いた。パルス後のＰＢＭＣ５×１０４個に対して、５×１０４個のＣＤ４陽性Ｔ細胞を添加し、１０％ヒトＡＢ血清を含むＡＩＭ−Ｖ培地中で９６穴プレートにて２４時間培養した。培養後の上清を取って、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。【０１１０】
その結果、それぞれ配列番号３７〜４５の各ペプチドをパルスしたＰＢＭＣを用いた穴の培養上清において、１０００ｐｇ／ｍＬ以上のＩＦＮ−γが産生されていた。一方、陰性コントロールポリペプチド及びポリペプチドをパルスしていない樹状細胞のみ（Ｍｏｃｋ）を用いた穴の培養上清では、ＩＦＮ−γの産生はほとんど認められなかった。したがって、配列番号３７〜４５のアミノ酸配列で表される各種ポリペプチドは特異的にＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞を増殖刺激させ、ＩＦＮ−γ産生を誘導する能力を有するＴ細胞エピトープペプチドであることが判明した。なお、全長ＳＣＤ１タンパク質のアミノ酸配列中には上記免疫誘導活性を有する配列番号３７〜４５が含まれているにもかかわらず、全長ＳＣＤ１タンパク質をパルスしたＰＢＭＣ胞を用いた穴の培養上清におけるＩＦＮ−γの産生量が極めて少なかった。これは、ＳＣＤ１タンパク質のアミノ酸配列中に免疫誘導活性を抑制する配列が多く含まれるために十分な免疫誘導活性を示さなかったと考えられる。【０１１１】
次に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４陽性Ｔ細胞を増殖刺激させる能力を有する配列番号３７〜４５のポリペプチドが、ＳＣＤ１タンパク質から抗原提示細胞内でナチュラルにプロセスされてＨＬＡ−ＤＲ上に提示されるエピトープであるかどうかについて検討した。ＳＣＤ１タンパク質を一過的に発現させたＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣより購入）のライセートを未成熟樹状細胞に添加して消化させ、樹状細胞を成熟化させた後、配列番号３７〜４５のポリペプチド、陰性コントロールポリペプチド及びＳＣＤ１タンパク質で刺激されたＴ細胞が本樹状細胞によって刺激されるかを調べた。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４陽性の健常人から末梢血を分離し、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍに重層して１，５００ｒｐｍで室温にて２０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含有する相間を収穫し、冷リン酸塩緩衝液中で３回（又はそれ以上）洗浄し、ＰＢＭＣを得た。得られたＰＢＭＣをＡＩＭ−Ｖ培地２０ｍＬに懸濁し、培養フラスコ（Falcon）中に３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２時間付着させ、付着細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中でＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍＬ）及びＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）の存在下で６日間培養し、未成熟樹状細胞を作製した。上記ライセートを５×１０５個の未成熟樹状細胞に添加し、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍＬ）、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍＬ）、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地中で２日間培養した。培養後の樹状細胞をＸ線照射（３０００ｒａｄ）し、ＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄後、１０％ヒトＡＢ血清を含有するＡＩＭ−Ｖ培地で懸濁し、９６穴プレート１穴当りにそれぞれ３．３×１０４個ずつ添加した。これらに５×１０４個の配列番号３７〜４５のポリペプチド陰性コントロールポリペプチド及びＳＣＤ１タンパク質で刺激されたＴ細胞を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。培養後の上清を取って、ＩＦＮ−γの産生量をＥＬＩＳＡ法により測定した。【０１１２】
その結果、図６に示すように、配列番号３７〜４５のポリペプチドで刺激されたレーン４〜１２のＴ細胞は、ＳＣＤ１タンパク質を添加した樹状細胞の刺激によってＩＦＮ−γを産生することがわかった。一方、陰性コントロールポリペプチドで刺激したレーン２及びポリペプチドで刺激していないレーン１においては、ＩＦＮ−γの産生はほとんど認められなかった。したがって、配列番号３７〜４５のポリペプチドが、ＳＣＤ１タンパク質が抗原提示細胞内でナチュラルにプロセスされてＨＬＡ−ＤＲ上に提示されるエピトープであることが明らかになった。なお、本実験においても全長ＳＣＤ１タンパク質をパルスしたレーン３では、ＩＦＮ−γの産生量が極めて少なかった。全長ＳＣＤ１タンパク質のアミノ酸配列中には免疫誘導活性を抑制する配列が多く含まれることから、十分な免疫誘導活性を示さなかったと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明の各種癌に対して抗腫瘍活性を発揮するポリペプチドを含む免疫誘導剤は、癌の治療又は予防に、又は癌の検出に有用である。【０１１４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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