(57)【要約】共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域の位置を発光粒子を含む試料溶液内に於いて移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して時系列光強度データを生成し、時系列光強度データ上に於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する走査分子計数法に於いて、観測対象粒子に結合して発光する発光プローブにして、観測対象粒子に結合していないときには非発光状態と発光状態との間を確率的に遷移する発光プローブを、観測対象粒子に結合させて成る発光粒子を検出する場合に、観測対象粒子に未結合の発光プローブが移動中の光検出領域に包含される場合の包含時間がその発光状態にある平均寿命よりも長くなるように光検出領域の位置の移動速度が調節される。
2017098597.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて実質的に均一に分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、
前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、
前記時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する過程と、
前記個別に検出された発光粒子の信号の数を計数し、その数に基づいて、前記試料溶液中の発光粒子の濃度を決定する過程と、
を含み、
前記発光粒子が、観測対象粒子と結合して検出光の波長帯域に於いて発光する発光プローブにして、前記観測対象粒子と結合していない状態に於いて、前記検出光の波長帯域に於いて実質的に発光しない非発光状態と、前記検出光の波長帯域に於いて実質的に発光する発光状態との間を確率的に遷移する発光プローブと前記観測対象粒子とを結合して成る粒子であり、
前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記観測対象粒子に未結合の前記発光プローブが前記移動中の光検出領域に包含される場合の包含時間が前記観測対象粒子に未結合の前記発光プローブの前記発光状態にある平均寿命よりも長くなるように前記光検出領域の位置の移動速度を調節する過程を含む方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、前記発光プローブの分子種情報に基づいて前記光検出領域の位置の移動速度が決定される方法。
【請求項３】
請求項１又は２の方法であって、前記光検出領域の位置の移動速度ｕが前記光検出領域の進行方向の寸法ｄを前記発光プローブの平均寿命τで除して得られる値よりも小さく設定される方法。
【請求項４】
請求項３の方法であって、前記光検出領域の位置の移動速度ｕが自然対数の底ｅを用いて表される条件式：
ｕ＜ｄ／（ｅτ）
を満たすように設定される方法
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかの方法であって、前記発光プローブが分子内構造変化によって発光強度が変化する分子であり、前記発光粒子の信号の各々を個別に検出する過程に於いて、前記時系列の光強度データに於いて前記光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光粒子の信号として個別に検出することにより、前記発光粒子の各々からの信号を個別に検出する方法。
【請求項６】
請求項１乃至４のいずれかの方法であって、前記発光プローブが核酸にインターカレーター蛍光分子を結合して成るプローブであり、前記発光粒子の信号の各々を個別に検出する過程に於いて、前記時系列の光強度データに於いて前記光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光粒子の信号として個別に検出することにより、前記発光粒子の各々からの信号を個別に検出する方法。
【請求項７】
請求項１乃至４のいずれかの方法であって、前記発光プローブが、蛍光エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第一のプローブと、前記蛍光エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプタと成る第二のプローブとを含み、前記検出される光が、前記第一及び第二のプローブの両方が前記粒子に結合した状態に於いて生ずる蛍光エネルギー移動現象を経て発せられる前記第二のプローブの光であり、前記発光粒子の信号の各々を個別に検出する過程に於いて、前記時系列の光強度データに於いて前記光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光粒子の信号として個別に検出することにより、前記発光粒子の各々からの信号を個別に検出する方法。
【請求項８】
請求項１乃至８のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置を移動する過程に於いて、前記光検出領域の位置が前記発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動される方法。
【請求項９】
共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、
前記試料溶液内に於いて前記光学系の光検出領域の位置を相対的に移動する光検出領域移動部と、
前記光検出領域からの光を検出する光検出部と、
前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら前記光検出部にて検出された前記光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、前記時系列の光強度データに於いて前記発光粒子の信号の各々を個別に検出する信号処理部とを含み、
前記発光粒子が、観測対象粒子と結合して検出光の波長帯域に於いて発光する発光プローブにして、前記観測対象粒子と結合していない状態に於いて、前記検出光の波長帯域に於いて実質的に発光しない非発光状態と、前記検出光の波長帯域に於いて実質的に発光する発光状態との間を確率的に遷移する発光プローブと前記観測対象粒子とを結合して成る粒子であり、
前記光検出領域移動部により移動される前記光検出領域の位置の移動速度が前記観測対象粒子に未結合の前記発光プローブが前記移動中の光検出領域に包含される場合の包含時間が前記観測対象粒子に未結合の前記発光プローブの前記発光状態にある平均寿命よりも長くなるように設定された装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析技術に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて単一の発光する粒子からの光を個別に検出して種々の光分析を可能にする光分析装置に係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、光散乱、化学発光、生物発光等であってよい。
【背景技術】
【０００２】
近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う光分析技術が種々提案されている。そのような光分析技術としては、例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence  Correlation  Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１−３参照）、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity  Distribution  Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献４)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon  Counting  Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献５）などが知られている。また、特許文献６〜８には、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。【０００３】
更に、本願出願人は、特許文献９〜１３に於いて、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いた光分析技術であって、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術とは異なる原理による新規な光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）では、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域（以下、「光検出領域」と称する。励起光が使用される場合には、励起光の集光領域に概ね一致する。）の位置を移動させながら、即ち、光検出領域により試料溶液内を走査しながら、光検出領域が試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子を包含したときに、その発光粒子から発せられる光を個別に検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子を一つずつ検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得が可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−０９８８７６
【特許文献２】特開２００８−２９２３７１
【特許文献３】特開２００９−２８１８３１
【特許文献４】特許第４０２３５２３号
【特許文献５】国際公開２００８−０８０４１７
【特許文献６】特開２００７−２０５６５
【特許文献７】特開２００８−１１６４４０
【特許文献８】特開平４−３３７４４６号公報
【特許文献９】国際公開第２０１１／１０８３６９
【特許文献１０】国際公開第２０１１／１０８３７０
【特許文献１１】国際公開第２０１１／１０８３７１
【特許文献１２】国際公開第２０１２／０１４７７８
【特許文献１３】国際公開第２０１３／０２４６５０
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ボネット・ジー他２名  Proc.Natl.Acad.Sci.USA.  1998年95巻8602-6頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の「走査分子計数法」による発光粒子の検出に於いて、観測対象となる粒子（観測対象粒子）が発光しない粒子である場合、かかる観測対象粒子を検出するための一つの手法として、観測対象粒子に発光プローブを結合させ、その観測対象粒子に結合した発光プローブの発する光を検出することにより、観測対象粒子の存在が検出されることとなる（特許文献１２、１３）。そのような発光プローブとしては、検出光の波長帯域に於いて、観測対象粒子と結合していない状態（以下、「未結合状態」と称する。）では実質的に発光しないが、観測対象粒子と結合している状態（以下、「結合状態」と称する。）にあるときのみ発光する発光プローブであることが好ましい（以下、特に断らない限り、「発光プローブが発光する。」という場合には、検出光の波長帯域に於いて光検出器で検出可能な光を発することを言い、「発光プローブが発光しない。」という場合には、検出光の波長帯域に於いて光を発しないか、発光しても、光検出器で光強度が検出できないほど低い場合をいうものとする。）。その理由は、そのような発光プローブの場合、未結合状態の発光プローブ（以下、「未結合プローブ」と称する。）が発光しないので、発光プローブを、観測対象粒子を含む又は含まれているか否かを検査される試料溶液中へ混合した後、未結合プローブが試料溶液中に存在していても、観測対象粒子に結合した発光プローブ（以下、「結合プローブ」と称する。）のみがその放出する光によって検出されることとなり、従って、光計測の際に、未結合プローブを試料溶液から除去する処理が不要となるからである。そのような発光プローブに於いては、観測対象粒子に対する結合に伴って分子構造の変化が生じて発光状態となるものが多く、そのような例として、モレキュラー・ビーコン、qBody、核酸と結合して蛍光が変化するインターカレーター分子、核酸と結合して蛍光が変化するインターカレーター分子を核酸に結合させた分子、アプタマーに発光分子と消光分子を結合させた分子などが挙げられる。また、インターカレーター分子として、Hoechst  33258、Hoechst33342、DAPI、9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine(ACMA)、acridine  homodimer(bis-(6-chloro-2-methoxy-9-acridinyl)spermine)、BOBO-1  iodide、SYTOX  Green、YOYO-1、acridine orange、TOTO-1、Ethidium  Bromide、BOBO-3  iodide、SYTOX  Red、SYBR  Green  I、SYBR  Green  II、SYBR  Glod、Pico  Greein、OliGreen、Gel  Red、Gel  Green、Ribo Green、EvaGreen、thiazol  orangeなどが挙げられる。【０００７】
しかしながら、一般に、上記の如き、未結合状態では実質的に発光せず、結合状態で発光する発光プローブに於いては、未結合状態であっても、発光する状態又は発光可能な状態（発光状態）を一時的に取ることがあるものが多い。即ち、いくつかの発光プローブの場合、未結合プローブに於いて、発光しない非発光状態（励起光を照射しても発光しない状態）と発光する発光状態との間で確率的な遷移が発生することがあり、非発光状態から発光状態への遷移が起きると、発光状態から非発光状態へ遷移するまでの間、未結合発光プローブでも光を発することとなる（結合プローブは、通常、安定的に発光状態となり、非発光状態となることは殆どない。）。従って、上記のような発光プローブを走査分子計数法に於いて使用した場合、光検出領域を試料溶液内にて移動させながら（試料溶液内を走査しながら）実行される光計測に於いて、未結合プローブが、一時的に発光状態となったままで、光検出領域内を通過したとき、即ち、光検出領域が未結合プローブの存在領域を通過するときには、未結合プローブからの光が検出されることとなり、これにより、未結合プローブが、発光粒子（結合プローブ）として誤検出されることとなる。かかる未結合プローブの誤検出は、観測対象粒子又は発光粒子の検出精度又は確度が低下の原因となるので、できるだけ回避できるようになっていることが望ましい。【０００８】
この点に関し、未結合プローブが発光状態に在る時間の長さ、即ち、非発光状態から発光状態への遷移後から発光状態から非発光状態へ遷移するまでの時間の長さ、は、発光プローブの種類によって平均的に決まっており、平均寿命として計測可能である（なお、ここで言う「平均寿命」は、分子が発光状態の分子構造を取っている時間であり、蛍光寿命を指すものではない。)。従って、上記の走査分子計数法に於いて或る種の発光プローブを使用する場合に、未結合プローブに於ける発光状態の平均寿命が分かっていれば、未結合プローブの光検出領域内を通過する時間の長さをその発光状態の平均寿命よりも長くなるように光検出領域の移動速度を調節することにより、未結合プローブが光検出領域内を通過する間、即ち、未結合プローブが光検出領域内に存在している間に、未結合プローブが一時的に発光状態となったとしても、未結合プローブが非発光状態となっている区間もほぼ確実に存在することとなり、その場合には、未結合プローブが光検出領域内に存在している間に検出される光の総量は、発光プローブが発光状態のまま光検出領域内を通過する間の場合に比して低減され、また、光が検出されている時間も大幅に短くなり、かくして、光計測の結果に於いて、発光粒子が光検出領域内を通過する場合と未結合プローブが光検出領域内を通過する場合とを区別できることとなる。本発明に於いては、かかる知見が利用される。【０００９】
かくして、本発明の主な課題は、走査分子計数法に於いて、発光粒子として、観測対象粒子に発光プローブをさせて成る粒子を検出する場合に、発光プローブが、検出光の波長帯域に於いて、観測対象粒子と結合した状態に於いて発光し、観測対象粒子と結合していない状態に於いて実質的に発光しないプローブであるが、観測対象粒子と結合していない未結合状態に於いても、検出光の波長帯域に於いて発光しない非発光状態と、検出光の波長帯域に於いて発光する発光状態との間を確率的に遷移するプローブであるときに、未結合プローブが発光粒子として誤検出されることをできるだけ回避できるよう改良された構成を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析方法であって、試料溶液内に於いて顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を移動する過程と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出領域からの光の強度を測定して時系列の光強度データを生成する過程と、時系列の光強度データ上に於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する過程とを含み、発光粒子が、観測対象粒子と結合して検出光の波長帯域に於いて発光する発光プローブにして、観測対象粒子と結合していない状態に於いて、検出光の波長帯域に於いて発光しない非発光状態と、検出光の波長帯域に於いて発光する発光状態との間を確率的に遷移する発光プローブと観測対象粒子とを結合して成る粒子であり、光検出領域の位置を移動する過程に於いて、観測対象粒子に未結合の発光プローブが移動中の光検出領域に包含される場合の包含時間が観測対象粒子に未結合の発光プローブの発光状態にある平均寿命よりも長くなるように光検出領域の位置の移動速度を調節する過程を含む方法によって達成される。なお、更に、個別に検出された発光粒子の信号の数を計数し、その数に基づいて、試料溶液中の発光粒子の濃度を決定する過程が実行されてよい。【００１１】
かかる構成に於いて、「試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。また、典型的には、上記の光強度の測定は、所定の計測単位時間（ビンタイム）毎に到来する光子数を計数するフォトンカウンティングにより光検出領域からの光を検出し、その場合、時系列の光強度データが時系列のフォトンカウントデータとなる。「発光状態」とは、励起光の照射（又は特定の物質の付与（化学発光、生物発光の場合））により発光する状態、即ち、発光能を有する状態であり、「非発光状態」とは、前記の如き発光能を有していない状態である。「発光状態にある平均寿命」とは、発光状態を取っている分子構造の平均寿命である。なお、本明細書に於いて、「発光粒子の信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。【００１２】
上記から理解される如く、本発明の基本的な構成である走査分子計数法に於いては、まず、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光の検出が行われる。そうすると、試料溶液内にて移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときには、発光粒子からの光が検出され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出される。従って、逐次的に検出された光強度データに於いて発光粒子からの光の信号を個別に検出して、これにより、粒子の存在を一つずつ個別に逐次的に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。具体的なデータ処理としては、特許文献９〜１３の記載又は本願出願人によるその他の走査分子係数法に係る特許出願に記載の処理が任意に用いられてよい。具体的には、例えば、発光粒子の信号の各々を個別に検出する過程に於いて、時系列の光強度データに於いて光検出領域内を相対的に移動する一つの発光粒子からの光に於いて想定されるプロファイルを有する光強度の時間変化を一つの発光粒子の信号として個別に検出することにより、発光粒子の各々からの光信号を個別に検出するようになっていてよく、また、時系列の光強度データに於いて発光粒子の信号に相当するプロファイルの光強度の時間変化の探索に先立って、発光粒子からの光強度のプロファイルにデータ値の欠落が無くなる程度まで、時系列の光強度データのスムージング処理が実行され、発光粒子の信号の探索は、スムージング処理された時系列の光強度データ上にて実行されてもよい。【００１３】
上記の構成に於いて、特に、本発明の方法の場合には、観測対象となる粒子、即ち、試料溶液中の有無及び／又は濃度若しくはその他の特性が検査される粒子が、例えば、検出光の波長帯域に於いて有意に発光しない粒子であり、従って、観測対象粒子と結合した状態で発光する発光プローブを観測対象粒子に結合させて「発光粒子」を形成し、かくして、形成された「発光粒子」の光を行う場合に有利に適用される。かかる観測対象粒子と結合した状態で発光する発光プローブに於いては、既に述べた如く、そのプローブの種類によっては、観測対象粒子に未結合の状態であっても、発光状態と非発光状態との間を確率的に遷移し、発光状態となった場合には、或る程度の期間に亘って、発光能を有することとなり、そうすると、もし一時的に発光状態となった未結合プローブが、発光状態のまま、光検出領域内を相対的に通過したときには、未結合プローブを観測対象粒子と発光プローブの結合体である発光粒子として誤検出してしまうこととなる。【００１４】
しかしながら、未結合プローブが発光状態となっている期間の長さは、分子種毎に、平均的な長さ、即ち、平均寿命が決まっており、未結合プローブが光検出領域内を通過する期間が、未結合プローブの発光状態の平均寿命よりも長ければ、未結合プローブが光検出領域内を通過する期間に於いて計測される光強度の総量と有意な光強度の発生時間は、光検出領域内を通過する間に亘って実質的に発光し続ける結合プローブに比して低減し、その場合には、未結合プローブからの光強度の時間変化は、発光粒子のものと区別できることとなる。この点に関し、結合プローブ（発光粒子）又は未結合プローブが光検出領域内を通過する期間の長さ、即ち、結合プローブ又は未結合プローブが光検出領域内に包含されている時間の長さは、光検出領域の位置の移動速度によって決定される。従って、本発明では、一時的に発光状態となった未結合プローブが光検出領域に包含された場合でも、かかる未結合プローブの光強度の時間変化が、結合プローブ、即ち、発光粒子が発光状態のまま光検出領域を相対的に通過した場合の光強度の時間変化と識別可能となるように、上記の如く、観測対象粒子に未結合の発光プローブが移動中の光検出領域に包含される場合の包含時間が観測対象粒子に未結合の発光プローブの発光状態にある平均寿命よりも長くなるように光検出領域の位置の移動速度を調節する過程が実行される。なお、発光プローブが未結合プローブであるときの発光状態にある「平均寿命」は、予め準備実験により計測可能であり、或いは、任意の文献値を参照して決定可能である。従って、光検出領域の位置の移動速度の調節の際には、使用する発光プローブについて、予め調べられた、未結合プローブであるときの発光状態にある平均寿命の値を参照して、具体的な移動速度が設定されてよい。そして、既に述べた如く、上記の「平均寿命」は、通常、発光プローブの分子種によって決まるので、光検出領域の位置の移動速度は、発光プローブの分子種情報に基づいて決定されてよい。【００１５】
上記の構成に於いて、発光粒子及び発光プローブは、それらの大きさについて、光検出領域に対して無限小の点として考えられるので、観測対象粒子に未結合の発光プローブが移動中の光検出領域に包含される場合の包含時間は、光検出領域がその進行方向の寸法に相当する距離だけ移動するまでの時間である。かくして、光検出領域の位置の移動速度ｕは、具体的には、光検出領域がその進行方向の寸法だけ移動する時間が未結合プローブであるときの発光状態にある「平均寿命」よりも長くなるようにするために、光検出領域の進行方向の寸法ｄを発光プローブの平均寿命τで除して得られる値よりも低く設定されてよい。また、より好適には、光検出領域の位置の移動速度ｕは、条件式：
ｕ＜ｄ／（ｅτ）      …（１）
を満たすように設定されてよい。なお、ここで、ｅは、自然対数の底である。光検出領域の位置の移動速度ｕが式（１）を満たすとき、後に説明される如く、未結合プローブが移動中の光検出領域に包含される間に平均寿命τに亘って発光したとの仮定の下でも、未結合プローブの光の総量が実効的に無視可能なレベルまで十分に小さくなることが見出されている。【００１６】
また、上記の本発明の方法に於いて、発光プローブとしては、例えば、モレキュラー・ビーコン、ｑｂｏｄｙ、核酸に結合するインターカレーター、発光分子と消光分子を結合したアプタマーなどと知られている分子内構造変化によって発光強度が変化する分子であってよい。また、発光プローブは、核酸に蛍光性インターカレーター分子を結合して成るプローブであってもよい。或いは、発光プローブとして、蛍光エネルギー移動現象に於けるエネルギー・ドナーと成る第一のプローブと、蛍光エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプタと成る第二のプローブとから成り、第一及び第二のプローブの両方が観測対象粒子に結合したときに、蛍光エネルギー移動現象を経て、第二のプローブの光が発せられるものであってもよい（即ち、第一のプローブと第二のプローブとは、観測対象粒子に未結合状態では、互いに別々に遊離した分子である。）。この場合、観測対象粒子に結合状態にあるプローブの検出される光は、第二のプローブの発する光となる。また、第一のプローブ、第二のプローブ若しくは第一及び第二のプローブの双方が、分子内の構造変化によって発光強度が変化する分子であっても良い。更に、発光プローブに発光エネルギー移動現象に於けるエネルギー・アクセプタとなる分子を結合させ、観測しやすい発光波長へ変更しても良い。【００１７】
上記の本発明の方法は、特許文献９〜１３等の記載の光分析装置に於いて、特に、光検出領域の位置の移動速度が、観測対象粒子に未結合の発光プローブが移動中の光検出領域に包含される場合の包含時間が観測対象粒子に未結合の発光プローブの発光状態にある平均寿命よりも長くなるように設定された装置により実現される。かくして、本発明のもう一つの態様に於いては、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて試料溶液中にて分散しランダムに運動する発光粒子からの光を検出する光分析装置であって、試料溶液内に於いて顕微鏡の光学系の光検出領域の位置を相対的に移動する光検出領域移動部と、光検出領域からの光を検出する光検出部と、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら光検出部にて検出された光検出領域からの光の時系列の光強度データを生成し、時系列の光強度データに於いて発光粒子の信号の各々を個別に検出する信号処理部とを含み、発光粒子が、観測対象粒子と結合して検出光の波長帯域に於いて発光する発光プローブにして、観測対象粒子と結合していない状態に於いて、検出光の波長帯域に於いて実質的に発光しない非発光状態と、検出光の波長帯域に於いて実質的に発光する発光状態との間を確率的に遷移する発光プローブと観測対象粒子とを結合して成る粒子であり、光検出領域移動部により移動される光検出領域の位置の移動速度が、観測対象粒子に未結合の発光プローブが移動中の光検出領域に包含される場合の包含時間が観測対象粒子に未結合の発光プローブの発光状態にある平均寿命よりも長くなるように設定された装置が提供される。【００１８】
上記の本発明の装置の場合も、光検出領域の位置の移動速度は、発光プローブの分子種情報に基づいて決定されてよく、具体的には、光検出領域の進行方向の寸法ｄを発光プローブの平均寿命τで除して得られる値よりも小さく設定されてよい。そして、より好適には、光検出領域の位置の移動速度ｕは、自然対数の底ｅを用いて表される条件式：
ｕ＜ｄ／（ｅτ）
を満たすように設定されてよい。例えば、複数の種類の発光プローブの分子種に於けるプローブが未結合状態であるときの発光状態の平均寿命の値のデータを予めメモリに記憶しておき、使用者が計測に使用する発光プローブの分子種情報を入力すると、その入力に対応した平均寿命の値が読み出され、光検出領域の位置の移動速度の決定に利用されるようになっていてよい。【００１９】
上記の本発明の光分析技術は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、エクソソーム、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。試料溶液に対する光検出領域の位置の移動方法及び態様、時系列光強度データに於ける光強度値から各発光粒子の信号の抽出若しくは検出する方法及び態様、絶対な濃度値を決定するためのパラメータを決定する方法及び態様等は、特許文献９〜１３等に記載されている方法及び態様と同様であってよい。
【発明の効果】
【００２０】
かくして、上記の本発明の構成によれば、発光粒子が、観測対象粒子と結合して検出光の波長帯域に於いて発光する発光プローブにして、観測対象粒子と結合していない状態に於いて、検出光の波長帯域に於いて実質的に発光しない非発光状態と、検出光の波長帯域に於いて実質的に発光する発光状態との間を確率的に遷移する発光プローブと観測対象粒子とを結合して成る粒子である場合に、移動中の光検出領域が観測対象粒子に未結合の発光プローブを包含し、その発光プローブが発光状態となっていた或いはなったとしても、光検出領域内を発光プローブが通過する時間が、かかる発光状態の平均寿命よりも長いので、発光プローブが非発光状態となる時間がほぼ確実に存在することとなる。そうすると、光検出領域内を発光プローブが通過する時間に亘る光強度の時間変化は、光検出領域内を観測対象粒子に結合し発光したまま通過する結合プローブ（発光粒子）の場合と区別できることとなるので、未結合プローブを発光粒子として誤検出する可能性が大幅に低減され、結合プローブ、即ち、発光粒子の信号を選択的に検出可能となることが期待される。そして、かかる構成によれば、未結合プローブを試料溶液から除去する処理の必要性が、更に低減されることとなり、未結合プローブの除去処理を行っていた場合に生じていた試料の損失も考慮する必要がなくなるなどの利点も得られることとなる。かかる利点は、特に、希少な又は高価な試料を使用する分析に於いて有利であろう。【００２１】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１（Ａ）は、本発明による走査分子計数法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の観察領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。図１（Ｄ）は、マイクロプレートの水平方向位置を移動して試料溶液内に於ける光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。
【図２】図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。
【図３】図３（ａ）〜（ｃ）は、観測対象粒子Ｔに結合したときに発光する発光プローブＰの反応のモデル図である。（ａ）は、発光プローブＰがモレキュラー・ビーコンである場合であり、（ｂ）は、発光プローブＰが蛍光性インターカレーター分子の付加された一本鎖核酸分子である場合であり、（ｃ）は、発光プローブが二つの第一のプローブＰ１と第二のプローブＰ２とから成る場合である。
【図４】図４（ａ）は、観測対象粒子に結合した状態ＢＣと観測対象粒子に結合した状態Ｎ−ＢＣとをそれぞれ取っている発光プローブの発光状態の時期を表しており、図４（ｂ）、（ｃ）は、それぞれの発光プローブが光検出領域に包含された場合に検出される光強度の時間変化を表している。図４（ｂ）は、発光プローブが光検出領域に包含される時間Ｔｓが、未結合プローブの発光状態の平均寿命τより短い場合であり、図４（ｃ）は、発光プローブが光検出領域に包含される時間Ｔｌが、未結合プローブの発光状態の平均寿命τより長い場合である。
【図５】図５は、本発明が適用される走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。
【図６】図６（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、発光粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより発光粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図６（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。図６（Ｄ）は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。
【図７】図７（Ａ）は、実施例１に於いて、種々の光検出領域の走査速度（位置の移動速度）にて光計測を実行した走査分子計数法により検出された発光粒子（発光プローブ単体又は発光プローブと観測対象粒子の結合体）の粒子数を示している。図に於いては、値は、光検出領域による走査を行いながら光計測を行った場合の２０秒当たりの粒子の検出数であり、ＮＣは、試料溶液中に発光プローブ単体のみを含む場合であり、ＰＣは、試料溶液中に発光プローブと観測対象粒子との結合体を含む場合（この場合、発光プローブ単体（未結合プローブ）は、殆ど含まれない。）を示している。図７（Ｂ）は、実施例１に於ける、種々の光検出領域の走査速度（位置の移動速度）にて光計測を実行した走査分子計数法により検出された発光粒子の検出数のＳＮ比を示している。なお、ここにおいて、ＳＮ比は、図７（Ａ）のＰＣの値とＮＣの値の比として算出した。比較のため、計測された光強度のＳＮ比（ＰＣの場合に対するＮＣの場合の光強度値の比）も示している。
【符号の説明】
【００２３】
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１４ａ…ダイクロイックミラー又は偏光ビームスプリッタ
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００２５】
光分析装置の構成
本発明による光分析技術を実現する光分析装置は、基本的な構成に於いて、図１（Ａ）に模式的に例示されている如き、特許文献９〜１３に記載の走査分子計数法が実行可能な共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる装置であってよい。同図を参照して、光分析装置１は、光学系２〜１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。対物レンズ８の上方には、典型的には、１〜数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、発光粒子が分散又は溶解されており、かかる発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過し、バリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。
【００２６】
上記の構成に於いて、ピンホール１３は、当業者に於いて知られている如く、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、励起領域以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１〜１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり（典型的には、光強度が領域の中心を頂点とする略釣鐘状の分布（ガウス様分布）となる。実効体積は、光強度が中心光強度の１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。）、コンフォーカル・ボリュームと称される。
【００２７】
また、本発明では、１つの発光粒子からの光、例えば、一つの蛍光色素分子からの微弱光が検出されるので、光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられる。光の検出がフォトンカウンティングによる場合、光強度の測定は、所定時間に亘って、逐次的に、計測単位時間（ＢＩＮ  ＴＩＭＥ）毎に、光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行される。従って、この場合、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータである。また、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するべきウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。かかる構成により、検体が複数在る場合にも、迅速な計測が達成可能となる。
【００２８】
更に、上記の光分析装置の光学系に於いては、試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域、即ち、光検出領域の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい（光検出領域の絶対的な位置を移動する方式）。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。或いは、別の態様として、図１（Ｄ）に例示されている如く、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動し、試料溶液内に於ける光検出領域の相対的な位置を移動するべくステージ位置変更装置１７ａが作動されてもよい（試料溶液の絶対的な位置を移動する方式）。また、上記の光路を変更して光検出領域の絶対的な位置を移動する方式によって光検出領域を走査軌道に沿って周回移動させると同時に、試料溶液の位置を移動する方式により、試料溶液内に於ける光検出領域の走査軌道の位置が所定の移動経路に沿って移動されてもよい。いずれの方式による場合も、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７又はステージ位置変更装置１７ａは、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の走査軌道は、円形、楕円形等の閉じた循環経路であってよく、試料溶液の位置の移動経路は、円形、楕円形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８又はステージを上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。
【００２９】
観測対象物となる発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、観測対象物となる発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２〜５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。更に、光分析装置１に於いては、図示の如く、複数の励起光源２が設けられていてよく、発光粒子の励起波長によって適宜、励起光の波長が選択できるようになっていてよい。同様に、光検出器１６も複数個備えられていてよく、試料中に波長の異なる複数種の発光粒子が含まれている場合に、それらから光をその波長によって別々に検出できるようになっていてよい。
【００３０】
コンピュータ１８は、ＣＰＵおよびメモリを備え、ＣＰＵが各種演算処理を実行することにより、本発明の手順を実行する。なお、各手順は、ハードウェアにより構成するようにしてもよい。本実施形態で説明される処理の全て或いは一部は、それらの処理を実現するプログラムを記憶したコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を用いて、コンピュータ１８により実行されてよい。即ち、コンピュータ１８は、記憶媒体に記憶されているプログラムを読み出して、情報の加工・演算処理を実行することにより、本発明の処理手順を実現するようになっていてよい。ここで、コンピュータ読み取り可能な記録媒体とは、磁気ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリ等であってよく、或いは、上記のプログラムを通信回線によってコンピュータに配信し、この配信を受けたコンピュータがプログラムを実行するようにしても良い。
【００３１】
なお、後に詳細に説明される如く、本発明は、上記の発光粒子が観測対象となる粒子（観測対象粒子）と発光プローブとの結合体であり、特に、発光プローブは、観測対象粒子と結合した場合に安定的に発光状態となり、観測対象粒子と結合していない場合には、基本的には、非発光状態を取るが、発光状態を一時的に取り得るプローブである場合に有利に適用される。また、後により詳細に説明される如く、本発明の走査分子計数法に於いて、上記の光検出領域の位置の移動速度、即ち、光検出領域が試料溶液内を走査する際の走査速度については、検出される発光粒子の拡散移動速度により好適な下限が設定され、また、試料溶液中に含まれる観測対象粒子に結合していない発光プローブ（未結合プローブ）の発光状態の平均寿命に基づいてより好適な上限が設定される。
【００３２】
走査分子計数法の原理と走査速度の設定
１．走査分子計数法の原理
「走査分子計数法」（特許文献９〜１３）では、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、或いは、試料溶液が注入されている容器１０（マイクロプレート９）の水平方向の位置を移動して、図２（Ａ）にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔ０〜ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如き時系列の光強度データ上に有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度の時間変化）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる走査分子計数法の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
【００３３】
２．本発明に於ける改良
上記の走査分子計数法に於ける観測対象粒子は、既に述べた如く、解された分子等の、試料溶液中にて分散し溶液中にてランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい。そして、観測対象粒子が発光しない粒子である場合には、観測対象粒子に発光プローブを結合させて発光粒子を生成し、上記の光検出の際には、発光粒子の光として観測対象粒子に結合した発光プローブ（結合プローブ）の光が検出されることとなる（例えば、特許文献１２参照）。その場合の試料溶液の調製に於いては、典型的には、例えば、溶液中に観測対象粒子と発光プローブとを混合した後、その溶液が観測対象粒子と発光プローブとの結合反応を促進させる条件下に曝され、これにより、観測対象粒子と発光プローブとの結合体、即ち、走査分子計数法に於いて検出対象となる発光粒子の生成が為されることとなる。
【００３４】
この点に関し、通常、溶液中の観測対象粒子の全てに発光プローブが結合されていることが好ましいので、発光プローブは、その数量に於いて観測対象粒子よりも多くなるように溶液中へ与えられることとなる。その場合、溶液中には、観測対象粒子に結合していない発光プローブ（未結合プローブ）が存在することとなるところ、発光プローブとして、観測対象粒子に結合したときに発光し、観測対象粒子に結合していないときには実質的に発光しない形式のものを選択すると、未結合プローブは、試料溶液中に存在していても、光検出の過程に於いて検出されず、結合プローブのみが選択的に検出できることとなる。従って、上記の如き発光プローブの場合には、試料溶液中の未結合プローブの除去処理が不要となる点で極めて有利である。そのような発光プローブの例としては、図３（ａ）〜（ｃ）に示されているタイプのものが知られている。
【００３５】
例えば、図３（ａ）に示されている例の場合、発光プローブＰとして、特定の塩基配列を有する一本鎖核酸ｓｓの両端にエネルギー移動現象のエネルギー・ドナーとなる蛍光色素Ｆ１とエネルギー・アクセプタとなる蛍光色素Ｆ２が結合された構成の分子が採用される（モレキュラー・ビーコンとして知られている。）。この場合、発光プローブＰ単体（左上）では、一本鎖核酸ｓｓの屈曲とねじれによって、エネルギー・ドナーＦ１とエネルギー・アクセプタＦ２とが近接し、エネルギー・ドナーＦ１に対する励起光を照射すると、エネルギー移動現象ｅｔが生ずるので、エネルギー・ドナーＦ１の蛍光が発せられないが（エネルギー・アクセプタＦ２の蛍光Ｌｆ２が発せられる。）、発光プローブＰの一本鎖核酸ｓｓの塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸（観測対象粒子）Ｔが存在すると、発光プローブＰは観測対象粒子Ｔと結合体を形成し（右上）、これにより、発光プローブＰのエネルギー・ドナーＦ１とエネルギー・アクセプタＦ２とが互いに離隔し、かくして、エネルギー・ドナーＦ１に対する励起光を照射すると、エネルギー・ドナーＦ１の蛍光Ｌｆ１が発せられることとなる。即ち、図３（ａ）の例では、発光プローブＰは、観測対象粒子Ｔと結合したときのみに、エネルギー・ドナーＦ１の蛍光Ｌｆ１を発することとなる。
【００３６】
また、図３（ｂ）に示されている例の場合、発光プローブＰとして、特定の塩基配列を有する一本鎖核酸ｓｓに二本鎖核酸に対する蛍光性インターカレーターＦが付加された構成の分子が採用される。蛍光性インターカレーター分子の例としては、例えば、Thiazole  Orange、Oxazole  Yellow、PicoGreen、SYBR  Green、SYBR  Goldなどが具体的に挙げられる。この場合、発光プローブＰ単体（左上）では、蛍光性インターカレーターＦは殆ど蛍光を発しないが、光プローブＰの一本鎖核酸ｓｓの塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸（観測対象粒子）Ｔが存在すると、発光プローブＰは、観測対象粒子Ｔと二本鎖核酸（結合体）を形成し（右上）、蛍光性インターカレーターＦが二本鎖核酸に挟持され、蛍光Ｌｆを発することとなる。
【００３７】
更に、図３（ｃ）に示されている例の場合、発光プローブとして、エネルギー移動現象に於いてエネルギー・ドナーとなる蛍光色素Ｆ１を有するプローブＰ１とエネルギー・アクセプタとなる蛍光色素Ｆ２を有するプローブＰ２の組が採用される。この場合、プローブＰ１とプローブＰ２とが遊離している状態（左上）では、エネルギー移動現象が発生せず、エネルギー・ドナーＦ１に対する励起光を照射しても、エネルギー・アクセプタＦ２の蛍光Ｌｆ２は発せられないが（エネルギー・ドナーＦ１の蛍光が発せられる。）、プローブＰ１とプローブＰ２とが観測対象粒子Ｔに結合すると（右上）、エネルギー・ドナーＦ１とエネルギー・アクセプタＦ２とが近接し、かくして、エネルギー・ドナーＦ１に対する励起光を照射すると、エネルギー移動現象ｅｔが生じてエネルギー・ドナーＦ２の蛍光Ｌｆ２が発せられることとなる。
【００３８】
しかしながら、上記の図３（ａ）〜（ｃ）に例示の如き、観測対象粒子に結合したときに発光し、観測対象粒子に結合していないときには実質的に発光しない形式の発光プローブの場合、未結合プローブの状態であっても、確率的に分子内構造変化等が生ずることにより、一時的に発光状態となることがある。これは、上記の如き発光プローブが観測対象粒子に結合していないときには、多くの場合、構造の安定性が、観測対象粒子に結合している状態よりも低く、ランダムな分子内の構造変化や運動によって、発光しない非発光状態と発光する発光状態との間で確率的な遷移が発生するためである。例えば、図３（ａ）の場合には、同図左下に描かれている如く、一本鎖核酸ｓｓが分子内構造のゆらぎにより伸長したときには、エネルギー・ドナーＦ１とエネルギー・アクセプタＦ２とが離隔し、エネルギー・ドナーＦ１に対する励起光を照射すると、エネルギー・ドナーＦ１の蛍光Ｌｆ１が発せられることとなる。図３（ｂ）の場合には、同図左下に描かれている如く、蛍光性インターカレーターＦが分子内構造のゆらぎにより一時的に発光プローブＰの一本鎖核酸ｓｓの塩基に結合することがあり、その場合には、蛍光Ｌｆを発することとなる。図３（ｃ）の場合には、同図左下に描かれている如く、プローブＰ１とプローブＰ２とがブラウン運動により浮遊している間に互いに接触した状態となることがあり、その場合には、エネルギー・ドナーＦ１に対する励起光を照射すると、エネルギー移動現象ｅｔが生じてエネルギー・ドナーＦ２の蛍光Ｌｆ２が発せられることとなる。従って、上記の如く、未結合プローブに於いて、非発光状態から発光状態への遷移が起きると、発光状態から非発光状態へ遷移するまでの間、未結合プローブでも結合プローブと同様の光を発することとなる。そして、走査分子計数法の光検出の過程に於いて、もし未結合プローブが一時的な発光状態となったままで移動中の光検出領域に包含された場合には、その光が、結合プローブ（発光粒子）と同様に検出され、即ち、未結合プローブが、発光粒子として誤検出されることとなってしまう。
【００３９】
この点に関し、未結合プローブが発光状態となるのは、非発光状態から発光状態への遷移が起きてから発光状態から非発光状態へ遷移するまでの間のみであり、非発光状態から発光状態への遷移後から発光状態から再び非発光状態へ遷移するまでの時間については、発光プローブの種類によって、その時間の平均的な長さ、即ち、発光状態の平均寿命が概ね決まっている。従って、走査分子計数法に於ける光検出過程に於いて、移動中の光検出領域に未結合プローブが包含されている時間、即ち、未結合プローブが相対的に光検出領域内を通過する時間が、未結合プローブの発光状態の平均寿命よりも長ければ、発光状態の未結合プローブが光検出領域に包含されたとしても、未結合プローブによる光強度の時間変化と発光粒子（結合プローブ）による光強度の時間変化とは識別可能となる。
【００４０】
より詳細には、例えば、図４（ａ）に示されている如く、発光プローブが時点Ｓにて観測対象粒子に結合することにより結合プローブＢＣとなり、非発光状態ｎ−ｅから発光状態ｌ−ｅとなった場合には、その後、安定的に発光状態ｌ−ｅが維持されるのに対し（ｘ１）、発光プローブが未結合プローブＮ−ＢＣの状態で、非発光状態ｎ−ｅから平均寿命τの間のみ発光状態ｌ−ｅとなった場合（ｘ２）、図４（ｂ）に示されている如く、光検出領域が移動しながら結合プローブＢＣ及び未結合プローブＮ−ＢＣのそれぞれを包含する時間の幅Ｔｓが平均寿命τより短いときには、図示の如く、光検出領域が未結合プローブＮ−ＢＣを包含する時期と未結合プローブＮ−ＢＣが発光状態ｌ−ｅを取っている時期とが重なると、未結合プローブＮ−ＢＣの発する光による光強度変化（ｘ４）は、結合プローブＢＣの発する光による光強度変化（ｘ３）と同様となり、両者の識別ができないこととなる。一方、図４（ｃ）に示されている如く、光検出領域が移動しながら結合プローブＢＣ及び未結合プローブＮ−ＢＣのそれぞれを包含する時間の幅Ｔｌが平均寿命τより長いときには、光検出領域が未結合プローブＮ−ＢＣを包含する時期と未結合プローブＮ−ＢＣが発光状態ｌ−ｅを取っている時期とが重なったとしても、光検出領域が未結合プローブＮ−ＢＣを包含している時間内に未結合プローブＮ−ＢＣが非発光状態ｎ−ｅとなっている時期がほぼ確実に存在することとなる。そうすると、図示の如く、未結合プローブＮ−ＢＣの発する光による光強度変化は、結合プローブＢＣの発する光による光強度変化と異なり、両者の識別が可能となる。この場合、具体的には、光検出領域が未結合プローブＮ−ＢＣを包含している時間内に検出される光の総量と時間幅が、光検出領域が結合プローブＢＣを包含している場合に比して短くなり、また、光強度変化のプロファイルも異なることとなる。
【００４１】
かくして、未結合プローブが一時的に発光状態となり得るものである場合には、光検出領域が未結合プローブＮ−ＢＣを包含している時間幅が未結合プローブの発光状態の平均寿命よりも長くなるように、光検出領域の移動の態様を調整することにより、未結合プローブが結合プローブとして誤検出されることを防止でき、或いは、その頻度を低減できることとなる。なお、光検出領域が未結合プローブＮ−ＢＣを包含している時間幅Ｔは、光検出領域の進行方向の寸法ｄと光検出領域の位置の移動速度、即ち、走査速度ｕとによって決定され、具体的には、かかる時間幅Ｔと未結合プローブの発光状態の平均寿命τとの間に於いて、
Ｔ＞τ      …（２）
が成立すればよい。ここに於いて、既に述べた如く、発光粒子及び未結合プローブは、通常、単一分子、分子の凝集体等であり、それらの大きさは、光検出領域に対して無限小の点として考えられるので、観測対象粒子に未結合の発光プローブが移動中の光検出領域に包含される場合の包含時間Ｔは、光検出領域がその進行方向の寸法ｄに相当する距離だけ移動するまでの時間であり、従って、
ｄ＝ｕＴとなるので、
光検出領域の走査速度ｕは、
ｕ＜ｄ／τ      …（３）
となるように設定される。
【００４２】
また、上記の光検出領域を移動しながらの光計測に於いて、より好適な状態は、光検出領域が発光状態にある未結合プローブＮ−ＢＣを包含した際に検出される光の総量が、光検出領域が結合プローブＢＣを包含した際に検出される光の総量に比して、十分に或いは実効的に無視できる程度まで小さく、これにより、未結合プローブＮ−ＢＣの発する光による光強度変化が実質的に結合プローブの信号として検出されない状態である。この点に関し、既に述べた如く、光検出領域（コンフォーカルボリューム）の境界を定める場合には、光検出領域内に照射される照明光又は励起光の強度が１／ｅとなると、実効的に無視できる程度であるとみなされ、これにより、照明光又は励起光の強度が１／ｅとなる面が、光検出領域の外面であると定義される。これと同様に、光検出領域が発光状態にある未結合プローブＮ−ＢＣを包含した際に検出される光の総量Ｅｎが、光検出領域が結合プローブＢＣを包含した際に検出される光の総量Ｅｐの１／ｅ未満となれば、即ち、
Ｅｎ／Ｅｐ＜１／ｅ      …（４）
を満たせば、実効的に無視できる程度まで小さいとみなすことができる。ここで、Ｅｎ／Ｅｐは、τ／Ｔとなるので、結局、上記の好適な状態、即ち、未結合プローブＮ−ＢＣの発する光による光強度変化が実質的に結合プローブの信号として検出されない状態は、
Ｔ＞ｅτ      …（５）
となる。そして、式（５）を満たす光検出領域の走査速度ｕの好適な条件は、
ｕ＜ｄ／（ｅτ）      …（１）
となる。（ｅは、自然対数の底である。）
【００４３】
かくして、光検出領域の走査速度ｕが、式（３）、より好適には、式（１）を満たすように設定されれば、未結合プローブの誤検出の頻度の低減又は回避が可能となる。ここで、未結合プローブの発光状態の平均寿命τは、任意の方法に予め検知可能であり、実際に計測されてもよく、或いは、文献値が使用されてもよい。光検出領域の寸法ｄも任意の方法により予め検知可能である。
【００４４】
処理操作過程
図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明による光分析の処理操作の実施形態は、基本的には、特許文献９〜１３の記載又は本願出願人によるその他の走査分子係数法に係る特許出願に記載の処理が任意に用いられてよい。具体的な処理操作としては、典型的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製、（２）試料溶液の光強度の測定処理、及び、（３）測定された光強度の分析処理が実行される。図５は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理を示している。かかる処理に於いて、既に述べられている如く、本発明に於いて、検出される発光粒子は、観測対象粒子と発光プローブとの結合体であり、発光プローブは、観測対象粒子と結合したときには安定的に発光状態となり、観測対象粒子と結合していないときには、非発光状態と発光状態との間で確率的に遷移し、観測対象粒子と結合していないとき、平均寿命τにて発光状態となる。そして、光検出領域の走査速度が、発光プローブが観測対象粒子と結合していないときの発光状態の平均寿命τを用いて、式（３）又は式（１）を満たすように設定されることとなる。
【００４５】
（１）試料溶液の調製
試料溶液には、観測対象粒子が存在している場合には、発光プローブとの結合体を形成するように、発光プローブが分散又は溶解される。具体的な発光プローブと観測対象粒子との結合処理及び試料溶液の調製処理は、適宜実行されてよい。しかしながら、本発明の場合には、試料溶液中に、観測対象粒子に未結合の発光プローブが存在していてもよいので、未結合プローブを除去するための処理が不要である。試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。
【００４６】
（２）試料溶液の光強度の測定（図５−ステップ１００）
本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７及び／又はステージ位置変更装置１７ａを駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行いながら実行される。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出して時系列の光強度データを生成する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測が開始される。かかる計測中、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー偏向器１７及び／又はステージ位置変更装置１７ａは、ミラー７（ガルバノミラー）及び／又は顕微鏡のステージ上のマイクロプレート９を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出が、フォトンカウンティングによる場合、時系列光強度データは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
【００４７】
光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度（光検出領域の走査速度）は、既に述べた如く、発光プローブが観測対象粒子と結合していないときの発光状態の平均寿命τを用いて、式（３）又は式（１）を満たしつつ、任意に実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行される。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
【００４８】
更に、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。発光粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図６（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（既に触れた如く、光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化を特定することが困難となる。そこで、好適には、図６（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図６（Ｃ）の最上段に例示の如く、個々の発光粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略一様となり（発光粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
【００４９】
具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ      …（６）
から、
Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ      …（７）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ      …（８）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０−１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、０．３×１０−３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その２倍以上の０．６ｍｍ／ｓなどと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
【００５０】
既に述べた如く、光検出領域の位置の移動速度は、式（３）又は（１）を満たすように設定されるので、式（３）又は（１）は、光検出領域の位置の移動速度の上限を定める条件となる。一方、光検出領域の位置の移動速度が発光粒子拡散移動速度よりも速くなるよう設定される条件は、検出領域の位置の移動速度の下限を定める条件となる。即ち、光検出領域の位置の移動速度ｕは、下記の条件を満たすように設定されることとなる。
Ｖdif＜ｕ＜ｄ／τ      …（９ａ）
又は、より好適には、
Ｖdif＜ｕ＜ｄ／ｅτ      …（９ｂ）
【００５１】
光検出領域の位置の移動速度ｕの設定処理は、光計測の実行に先立って適時実行されてよい。具体的には、走査速度ｕを、発光プローブの未結合プローブであるときの発光状態にある平均寿命の値を参照して使用者に於いて決定された値に調節するようになっていてもよい。或いは、コンピュータ１８のメモリ装置（図示せず）に、複数の種類の発光プローブの分子種に於けるプローブが未結合状態であるときの発光状態の平均寿命の値のデータを記憶しておき、使用者が計測に使用する発光プローブの分子種情報を入力すると、その入力に対応した平均寿命の値が読み出され、コンピュータ１８がかかる平均寿命の値を参照して適当な光検出領域の位置の移動速度を決定するようになっていてもよい。
【００５２】
（３）発光粒子の信号の個別検出（図５−ステップ１１０〜１６０）
時系列光強度データの生成が為されると、時系列光強度データに於ける光強度値を用いて、下記の如く、発光粒子の信号の検出、発光粒子のカウンティングが実行される。既に触れた如く、一つの発光粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図６（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける時系列光強度データ上での光強度の変化は、光学系により決定される光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する（図６（Ｃ）最上段参照）。従って、走査分子計数法では、基本的には、適宜設定される閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。そして、閾値を超える光強度が継続する時間幅が所定の範囲にない信号は、ノイズ又は異物の信号として判定される。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（−２ｔ２／ａ２）      …（１０）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（１０）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。一方、強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にある信号は、ノイズ又は異物の信号として判定され、その後の分析等に於いて無視されてよい。この点に関し、発光状態の未結合プローブの光の強度変化のプロファイルは、殆どの場合、図４（ｃ）に例示されている如く、光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルとは異なることが予想されるので、発光状態の未結合プローブの光は、ノイズ又は異物の信号として判定されることが期待される。
【００５３】
時系列光強度データからの発光粒子の検出を行う処理のより具体的な手法の一つの例としては、まず、時系列光強度データ（図６（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図５−ステップ１１０、図６（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、微小な時間に於いてデータ値の欠落が無視できるように光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ  ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
【００５４】
次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図６（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
【００５５】
しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号が検出される（ステップ１３０〜１６０）。具体的には、まず、時系列光強度データの時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図６（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）の強度Ｉpeak、パルス幅（半値全幅）Ｗpeak、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、式（１０）の如きガウス関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図６（Ｄ）左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなる。一方、図６（Ｄ）右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。既に述べた如く、発光状態の未結合プローブの光の強度変化のプロファイルは、光検出領域内の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルとは異なるので、発光状態の未結合プローブの光の強度変化の部分がパルス存在領域として認識されたとしても、ステップ１５０の判定でノイズ又は異物の信号として判定されることが期待される。なお、発光粒子の信号の検出と同時に信号数のカウンティング、即ち、発光粒子のカウンティングが実行されてよい。
【００５６】
上記のステップ１３０〜１５０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、光強度データの全域に渡って繰り返し実行されてよい（ステップ１６０）。互いに異なる波長帯域の励起光を用いて光計測を行い、それぞれの波長帯域の励起光に対応して、複数の時系列光強度データが生成されている場合には、それぞれの時系列光強度データについて、ステップ１３０〜１５０の処理が実行されてよい。なお、光強度データから発光粒子の信号を個別に検出する処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
【００５７】
また、検出された発光粒子の信号の数を計数して、発光粒子の数の決定が為されている場合、更に、任意の手法にて、光検出領域の通過した領域の総体積が算定されれば、その体積値と発光粒子の数とから試料中の発光粒子の濃度が決定可能となる。光検出領域の通過した領域の総体積は、例えば、特許文献９〜１３に記載されている要領にて決定されてよい。
【００５８】
ところで、上記の構成に於いては、光検出領域内の励起光又は照明光の光強度分布が釣鐘状のプロファイルを有するものとして、発光粒子の信号の検出に於いては、時系列光強度データに於けるパルス状の有意な光強度の増大に対して、ガウス関数等の釣鐘型関数のフィッティングが実行されるようになっているが、光検出領域内の励起光又は照明光の光強度分布のプロファイルが釣鐘状ではない場合には、かかる光強度分布のプロファイルに適合するプロファイルを有する関数が発光粒子の信号の検出のためのフィッティングに使用されてよい。例えば、光検出領域内の励起光又は照明光の光強度分布のプロファイルが台形状或いは矩形状であるときには、その形状に適合する関数が上記のフィッティング処理に用いられ、最大値強度Ｉpeak、半値全幅Ｗpeak、フィッティングに於ける相関係数等のパラメータが算出され、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあるパルス信号が発光粒子の信号として判定される。
【００５９】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００６０】
モレキュラー・ビーコンを用いた核酸の検出
観測対象粒子として特定の塩基配列の一本鎖核酸分子を用い、発光プローブとしてモレキュラー・ビーコンを用いて、本発明による走査分子係数法により、観測対象粒子とモレキュラー・ビーコンとの結合体を発光粒子として検出した。モレキュラー・ビーコンとは、図３（ａ）に関連して説明されている如く、両端にドナー色素とアクセプター色素がそれぞれ付加された核酸分子であり、単体では、ドナー色素とアクセプター色素との距離が近接しドナー色素からアクセプター色素への蛍光エネルギー移動現象が発生する一方、自身の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸又は核酸類似物に結合すると、ドナー色素とアクセプター色素との間の距離が離れ、蛍光エネルギー移動現象が発生しないよう構成された分子である。【００６１】
実験に於いては、モレキュラー・ビーコンとして、５’末端にATTO647N（ドナー色素）が付加され、３’末端にBHQ3（アクセプター色素、ただし、この場合、蛍光は殆ど発せられない。）が付加された下記の塩基配列を有する核酸を用いた。
ATTO647N-cctacgccaacagctccaactacgtagg-BHQ3
また、観測対象粒子（以下、ＴＲＧと表記する。）は、下記の塩基配列を有する核酸を用いた。
tgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggca
モレキュラー・ビーコン（以下、ＭＢと表記する。）は、末端６塩基が自己相補的な配列を有している。なお、上記の核酸は、シグマジェノシス株式会社に依頼して合成した。【００６２】
試料溶液の調製に於いては、１ｐＭ  ＭＢ、１００ｎＭ  ＴＲＧとなるように、バッファ溶液（10mM  Tris-HCl,  200mM  NaCl,  0.05%  Triton-X100）にＭＢ、ＴＲＧを溶解したものと、ＴＲＧを含まない対照用溶液とを調製した。そして、調製された溶液は、サーマルサイクラー(ＭＪ製,PTC-200)を用いて、９５℃にて１０秒間保持して、核酸の変性を行った後、１℃/分の速度にて３５℃まで温度を下げることによって、ＭＢとＴＲＧとのハイブリダイゼーション反応を行った。なお、本実施例では、ＭＢがＴＲＧと結合している状態、即ち、結合プローブとなっている状態と、ＭＢが単体で存在している状態、即ち、未結合プローブとなっている状態との結果の比較を目的としているので、ＭＢとＴＲＧとを含む溶液に於いては、全てのＭＢがＴＲＧと結合体を形成するように、（通常の観測対象粒子の検出の場合とは異なり、）ＭＢに対してＴＲＧが過剰に混合されている。【００６３】
本発明の方法による光計測に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ−２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の各試料溶液について、時系列のフォトンカウントデータを取得した。その際、励起光は、６３３ｎｍのレーザー光を用い、検出光波長は、バンドパスフィルターを用いて６６０−７７０ｎｍとした。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１００〜１２０００ｒｐｍ（０．７５〜９０ｍｍ／秒）の範囲にて種々変更し、ＢＩＮ  ＴＩＭＥを１０μ秒とし、測定時間は、２０秒間とした。光強度の測定後、上記の「（３）発光粒子の信号の個別検出」に記載された処理手順に従って、各試料溶液について取得された時系列のフォトンカウントデータから時系列データ中にて検出された光信号を計数した。ステップ１１０に於けるデータの移動平均法によるスムージングに於いては、Ｓａｖｉｎｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ法を用いて、一度に平均するデータ点は１１個とし、移動平均処理を５回繰り返した。また、ステップ１４０のフィッティングに於いては、時系列データに対してガウス関数を最小二乗法によりフィッティングし、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。更に、ステップ１５０に於ける判定処理では、
下記の条件:
２０μ秒＜パルス幅＜２００μ秒
ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）      …（Ａ）
相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを発光粒子に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視し、発光粒子に対応する光信号であると判定された信号の数を粒子数として計数した。【００６４】
図７（Ａ）は、種々の光検出領域の走査速度にて光計測を実行した場合の、ＭＢとＴＲＧを含む試料溶液（ＰＣ）と、ＭＢのみを含む対照用溶液（ＮＣ）とに於いて発光粒子の信号として検出された数（検出粒子数）を、それぞれ、示している。値は、２０秒間に亘る光計測に於ける検出数である。なお、ＰＣに於いては、実質的に全てのＭＢがＴＲＧと結合体を形成している状態であり、ＮＣに於いては、全てのＭＢが単体で存在している状態であると考えられる。かくして、同図を参照して、検出粒子数は、走査速度が高くなるとともにＰＣ、ＮＣの双方に於いて増加したところ（これは、走査速度と共に走査体積が増大するためである。）、走査速度が低いほど、検出粒子数に対するＰＣとＮＣとの間の検出粒子数の差の比が増大した。図７（Ｂ）は、上記の結果を、ＮＣの検出粒子数に対するＰＣの検出粒子数の比（ＳＮ比）に換算して示した図である。なお、比較のため、光計測時に於ける光強度の比（ＮＣの場合の光強度に対するＰＣの場合の光強度の比）が併記されている。同図から理解される如く、光強度の比から理解される如く、走査速度によらずに、ＴＲＧの存在下では、全体的に光強度が増大しており、これにより、ＭＢがＴＲＧに結合して、蛍光強度が増大したことが理解される。一方、検出粒子数のＳＮ比についてみると、走査速度が、光検出領域が発光粒子を包含する時間に換算して、２００μ秒を上回る速度よりも低い場合に、検出粒子数のＳＮ比が急激に増大していることが理解される。検出粒子数のＳＮ比は、未結合プローブが結合プローブとして誤検出される頻度が低くなるほど、高くなるので、上記の結果は、光検出領域が発光粒子を包含する時間が２００μ秒を上回ると、未結合プローブが結合プローブとして誤検出される頻度が低減されることを示している。【００６５】
ところで、本実施例で使用されたＭＢについて、非特許文献１によれば、ＭＢに於いて、一本鎖核酸が屈曲して両端が近接した状態（非発光状態）から一本鎖核酸が伸長して両端が離隔した状態（発光状態）への遷移の速度定数kopenが2000〜3000［１／秒］であり、一本鎖核酸が伸長して両端が離隔した状態（発光状態）から一本鎖核酸が屈曲して両端が近接した状態（非発光状態）への遷移の速度定数がkcloseが5000〜40000［１／秒］である。これらの値から、未結合プローブの発光状態の平均寿命は、２５〜２００μ秒であることが見積もられる。一方、上記の如く、実施例１の図７（Ｂ）の結果に於いて、光検出領域が発光粒子を包含する時間が未結合プローブの発光状態の平均寿命である２００μ秒を上回ると、ＳＮ比が増大しているので、かかるＳＮ比の増大は、光検出領域が発光粒子を包含する時間が未結合プローブの発光状態の平均寿命より長くなったときには、図４（ａ）〜（ｃ）に関連した説明から理解されるように、未結合プローブによる光強度変化がパルス信号として認識されないか（スムージング処理による強度の増大の消失）或いはパルス信号として認識されても発光粒子の信号の判定条件を満たさず、従って、発光粒子の信号として判定されにくくなったことを示唆している。即ち、上記の結果は、本発明の教示により、光検出領域が未結合プローブを包含する時間が未結合プローブの発光状態の平均寿命より長くなるように光検出領域の走査速度を設定することにより、未結合プローブを結合プローブとして誤検出する可能性が大幅に低減され、結合プローブ、即ち、発光粒子の信号の検出精度が向上されることを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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