(57)【要約】  公知の多能性幹細胞の製造方法では達成できなかった、未分化能維持に重要な遺伝子を高発現できるナイーブ型の多能性幹細胞を製造および／または維持することにある。  本発明によれば、いわゆる初期化因子のうち、６種の遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２）を導入して、一時的に発現させることを特徴とし、さらにＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ−β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することにより、未分化能を維持できるナイーブ型の多能性幹細胞を製造することができるため、本発明の課題を解決することができる。
2016148253.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の２種の遺伝子：ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２をプライム型多能性幹細胞に一時的に発現させ、かつＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ−β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法。
【請求項２】
プライム型多能性幹細胞がプライム型誘導多能性幹細胞またはプライム型胚性幹細胞である、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞またはプライム型ヒト胚性幹細胞である、請求項１または請求項２記載のナイーブ型ヒト多能性幹細胞の製造方法。
【請求項４】
プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項５】
さらに下記の４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＳｏｘ２を一時的に発現させる工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ｃＡＭＰ産生促進剤がフォルスコリン、ＴＧＦ−β阻害剤がＡ８３−０１およびＰＫＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
培地がＮ２Ｂ２７培地である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
下記の６種の遺伝子：Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＳｏｘ２を一時的にプライム型多能性幹細胞に発現させる工程を含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法。
【請求項９】
プライム型多能性幹細胞がプライム型誘導多能性幹細胞またはプライム型胚性幹細胞である、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞またはプライム型ヒト胚性幹細胞である、請求項８または請求項９記載のナイーブ型ヒト多能性幹細胞の製造方法。
【請求項１１】
プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項１２】
下記の６種の遺伝子：Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＳｏｘ２を一時的に体細胞に発現させる工程を含む、ナイーブ型誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項１３】
下記の６種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２を一時的に体細胞に発現させ、かつＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ−β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１４】
体細胞がヒト由来の体細胞である、請求項１２または請求項１３に記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の製造方法。
【請求項１５】
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ｃＡＭＰ産生促進剤がフォルスコリン、ＴＧＦ−β阻害剤がＡ８３−０１およびＰＫＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、請求項１３または請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
培地がＮ２Ｂ２７培地である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
ナイーブ型多能性幹細胞を、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ−β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞の維持方法。
【請求項１８】
ナイーブ型多能性幹細胞がナイーブ型誘導多能性幹細胞またはナイーブ型胚性幹細胞である、請求項１７記載の維持方法。
【請求項１９】
ナイーブ型多能性幹細胞がナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞またはナイーブ型ヒト胚性幹細胞である、請求項１７または請求項１８記載のナイーブ型ヒト多能性幹細胞の維持方法。
【請求項２０】
ナイーブ型多能性幹細胞がナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の維持方法。
【請求項２１】
ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ｃＡＭＰ産生促進剤がフォルスコリン、ＴＧＦ−β阻害剤がＡ８３−０１およびＰＫＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の維持方法。
【請求項２２】
培地がＮ２Ｂ２７培地である、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の維持方法。
【請求項２３】
請求項１〜１６いずれか一項に記載の方法にしたがって製造された、ナイーブ型多能性幹細胞。
【請求項２４】
請求項１７〜２２いずれか一項に記載の方法にしたがって維持された、ナイーブ型多能性幹細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナイーブ化された多能性幹細胞の製造および/または維持方法（以下、本発明の方法と略記することがある）に関する。また、本発明の方法によって製造および/または維持された優れた分化多能化能を有するナイーブ型多能性幹細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医療の分野では、誘導多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem cells；以下、ｉＰＳ細胞と略記することがある）技術の出現により、ｉＰＳ細胞の実用化に向けた臨床研究が急速に進みつつある。例えば、ヒトｉＰＳ細胞から誘導された網膜色素上皮細胞を用いて、加齢黄斑変性患者を対象とした臨床試験は既に実施されていることに加え、ヒトｉＰＳ細胞由来の神経細胞、軟骨細胞等を用いた臨床試験が計画されている（非特許文献１参照）。【０００３】
ｉＰＳ細胞とは、多能性幹細胞の一種であり、多能性幹細胞には、ｉＰＳ細胞の他に胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記することがある）、エピブラスト幹細胞（Epiblast Stem cells）も含まれる。これら多能性幹細胞は、最近ではその由来する動物種の違いや多能性幹細胞の種類によって、基本性質が異なることが分かってきている。具体的には、マウスＥＳ細胞およびマウスｉＰＳ細胞は、発生初期の状態に近く、培養や遺伝子操作が容易で、増殖能が高く、分化誘導を効率良く行うことが可能な細胞であり、ナイーブ型と呼ばれている。一方、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞等は、より発生の段階が進んでいるエピブラストの性質を反映しているため、遺伝子操作が困難であり、３胚葉の内いずれか特定の胚葉への分化に偏った状態であり、プライム型と呼ばれている（非特許文献２参照）。したがって、再生医療等において、多能性幹細胞を実用化するためには、プライム型よりもナイーブ型の性質を有する多能性幹細胞を確実に取得できる製造方法が望まれていた。【０００４】
ヒトｉＰＳ細胞の製造方法としては、いわゆる山中４因子（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子）を体細胞に導入する方法（特許文献１参照）が知られていたが、プライム型のヒトｉＰＳ細胞しか取得できないという課題があった。そこで、これまでに、ナイーブ型のヒトｉＰＳ細胞を製造するために、様々な動物種由来のｉＰＳ細胞をナイーブ型に誘導する手法が開発されてきた。上記山中４因子にさらに他の遺伝子を導入する試みや、種々の化合物を加える培地条件の検討が行われている。例えば、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２の２因子を導入し、培地にＬＩＦ（Leukemia inhibitory factor）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤）、Ｇｏ６９８３（ＰＫＣ阻害剤）を添加する方法（非特許文献３参照）では、ナイーブ型の遺伝子マーカーとして知られているＫＬＦ４、ＴＦＣＰ２Ｌ１の発現が上昇していることから、ナイーブ型に近い状態のヒトｉＰＳ細胞が取得できたことが報告されている。【０００５】
しかしながら、上記の技術では、ナイーブ型の未分化能維持に重要な遺伝子と考えられているＥＳＲＲＢ（Estrogen-related receptor beta）（非特許文献３および４参照）の発現がほとんど認められない等の問題点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４１８３７４２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】バイオサイエンス・トレンズ（BioScience Trends）、第７巻、第３号、１５７−１５８ページ、２０１３年
【非特許文献２】セル・ステム・セル（Cell Stem Cell）、第４巻、４８７−４９２ページ、２００９年
【非特許文献３】セル（Cell）、第１５８巻、１２５４−１２６９ページ、２０１４年
【非特許文献４】ネイチャー・セル・バイオロジー（Nature Cell Biology）、第１１巻、第２号、１９７−２０３ページ、２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ナイーブ型の未分化能維持に重要な遺伝子を高発現できる多能性幹細胞を製造および／または維持することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記課題を解決するために、鋭意検討した結果、いわゆる初期化因子のうち、６種の遺伝子（Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２）を導入して、一時的に発現させることに加え、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ−β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することにより、驚くべきことにナイーブ型の未分化能を維持できる多能性幹細胞を製造する方法を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、［１］  下記の２種の遺伝子：ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２をプライム型多能性幹細胞に一時的に発現させ、かつＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ−β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法、
［２］  プライム型多能性幹細胞がプライム型誘導多能性幹細胞またはプライム型胚性幹細胞である、前記［１］に記載の製造方法、
［３］  プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞またはプライム型ヒト胚性幹細胞である、前記［１］または前記［２］記載のナイーブ型ヒト多能性幹細胞の製造方法、
［４］  プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞である、前記［１］〜［３］のいずれかに記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の製造方法、
［５］  さらに下記の４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＳｏｘ２を一時的に発現させる工程を含む、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の製造方法、
［６］  ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ｃＡＭＰ産生促進剤がフォルスコリン、ＴＧＦ−β阻害剤がＡ８３−０１およびＰＫＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、前記［１］〜［５］のいずれかに記載の製造方法、
［７］  培地がＮ２Ｂ２７培地である、前記［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法、
［８］  下記の６種の遺伝子：Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＳｏｘ２を一時的にプライム型多能性幹細胞に発現させる工程を含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法、
［９］  プライム型多能性幹細胞がプライム型誘導多能性幹細胞またはプライム型胚性幹細胞である、前記［８］に記載の製造方法、
［１０］  プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞またはプライム型ヒト胚性幹細胞である、前記［８］または前記［９］記載のナイーブ型ヒト多能性幹細胞の製造方法、
［１１］  プライム型多能性幹細胞がプライム型ヒト誘導多能性幹細胞である、前記［８］〜［１０］のいずれかに記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の製造方法、
［１２］  下記の６種の遺伝子：Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＳｏｘ２を一時的に体細胞に発現させる工程を含む、ナイーブ型誘導多能性幹細胞の製造方法、
［１３］  下記の６種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２を一時的に体細胞に発現させ、かつＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ−β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、前記［１２］記載の製造方法、
［１４］  体細胞がヒト由来の体細胞である、前記［１２］または前記［１３］に記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の製造方法、
［１５］  ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ｃＡＭＰ産生促進剤がフォルスコリン、ＴＧＦ−β阻害剤がＡ８３−０１およびＰＫＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、前記［１３］または前記［１４］に記載の製造方法、
［１６］  培地がＮ２Ｂ２７培地である、前記［１３］〜［１５］のいずれかに記載の製造方法、
［１７］  ナイーブ型多能性幹細胞を、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ−β阻害剤およびＰＫＣ阻害剤を含む培地で培養することを含む、ナイーブ型多能性幹細胞の維持方法、
［１８］  ナイーブ型多能性幹細胞がナイーブ型誘導多能性幹細胞またはナイーブ型胚性幹細胞である、前記［１７］記載の維持方法、
［１９］  ナイーブ型多能性幹細胞がナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞またはナイーブ型ヒト胚性幹細胞である、前記［１７］または前記［１８］記載のナイーブ型ヒト多能性幹細胞の維持方法、
［２０］  ナイーブ型多能性幹細胞がナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞である、前記［１７］〜［１９］のいずれかに記載のナイーブ型ヒト誘導多能性幹細胞の維持方法、
［２１］  ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１、ｃＡＭＰ産生促進剤がフォルスコリン、ＴＧＦ−β阻害剤がＡ８３−０１およびＰＫＣ阻害剤がＧｏ６９８３である、前記［１７］〜［２０］のいずれかに記載の維持方法、
［２２］  培地がＮ２Ｂ２７培地である、前記［１７］〜［２１］のいずれかに記載の維持方法、
［２３］  前記［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法にしたがって製造された、ナイーブ型多能性幹細胞、
［２４］  前記［１７］〜［２２］のいずれかに記載の方法にしたがって維持された、ナイーブ型多能性幹細胞等に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の特定の条件下で培養した多能性幹細胞の製造方法によれば、ナイーブ型の特徴を維持し、かつ分化多能性を有する多能性幹細胞を安定的に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は遺伝子導入に使用した遺伝子発現ベクターを表す。
【図２】図２Ａは、各細胞のコロニーの写真を示す。図２Ｂは、各細胞における遺伝子の発現量を示す。図中、ＤＯＸはドキシサイクリンを示す。Ｐ２はｐａｓｓａｇｅ２の細胞を、Ｐ３はｐａｓｓａｇｅ３の細胞を示す。
【図３】図３は、各培地で培養された２０１Ｂ７細胞（ｐａｓｓａｇｅ１）におけるＥＳＲＲＢ遺伝子の発現量を示す。図中、ＫＳＲ  ２ｉＬＦＡおよびＫＳＲ  ２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３は、表１に示した各表記の培地を示し、ＤＯＸはドキシサイクリンを示す。
【図４】図４Ａは、各培地で培養された２０１Ｂ７細胞（左：ｐａｓｓａｇｅ２、右：ｐａｓｓａｇｅ３）のコロニーの写真示す。図４Ｂは、各培地で培養された２０１Ｂ７細胞（左：ｐａｓｓａｇｅ２、右：ｐａｓｓａｇｅ３）におけるＥＳＲＲＢ遺伝子の発現量を示す。図中、２ｉＬ＋Ｇｏ６９８３および２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３は、表１に示した各表記の培地を示し、ＤＯＸはドキシサイクリンを示す。
【図５】図５は、各リプログラミング因子の組み合わせにおけるＥＳＲＲＢ遺伝子の発現量を示す。図中、２ＦはＮＡＮＯＧ遺伝子およびＫＬＦ２遺伝子、４Ｆは山中４因子（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子）、６ＦはＮＡＮＯＧ遺伝子、ＫＬＦ２遺伝子および山中４因子（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、およびｃ−Ｍｙｃ遺伝子）の組み合わせを示す。
【図６】図６Ａは、ＳＤＩＡ法により１０日間神経分化誘導された各ｉＰＳ細胞の細胞染色（緑：ＭＡＰ２、青：ヘキストによる核染色）の結果を示す。図６Ｂは、各ｉＰＳ細胞における分化誘導１０日目のＭＡＰ２陽性細胞が存在するコロニーの割合を示す。
【図７】図７Ａは、Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを介する方法によって神経分化誘導された各ｉＰＳ細胞の細胞染色（緑：βIIIーＴｕｂｕｌｉｎ、赤：ＧＦＡＰ）の結果を示す。図７Ｂは、各ｉＰＳ細胞のアストロサイトおよび神経細胞への分化の割合を示す。
【図８】図８は、ナイーブ化の各ステージ（Ｐ１〜Ｐ３）を示す。Ｐ１はｐａｓｓａｇｅ１の細胞を、Ｐ２はｐａｓｓａｇｅ２の細胞を、Ｐ３はｐａｓｓａｇｅ３の細胞を示す。
【図９】図９は実施例５において遺伝子導入に使用した遺伝子発現ベクターを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明において、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法とは、以下の工程にしたがって行われる。すなわち、工程（ｉ）：特定の遺伝子について、遺伝子発現ベクターを用いて体細胞またはプライム型多能性幹細胞に導入する工程；工程（ｉｉ）：工程（ｉ）において遺伝子導入された体細胞またはプライム型多能性幹細胞をプライム培地で培養し、ドキシサイクリンを添加後、遺伝子発現細胞株をクローン化する工程；工程（ｉｉｉ）：工程（ｉｉ）でクローン化された遺伝子発現細胞株に、一時的に工程（ｉ）で導入した遺伝子を発現させ、その期間、各種化合物を添加したナイーブ培地で培養する工程を通してナイーブ型多能性幹細胞を製造する。
【００１４】
また、本発明において、ナイーブ型多能性幹細胞の維持方法とは、ナイーブ型多能性幹細胞を、各種化合物を添加したナイーブ培地で培養、継代するものである。
【００１５】
本発明において、体細胞としては、特に限定されないが、任意の体細胞を利用することができる。例えば、胎児期の体細胞のほか、成熟した体細胞を用いてもよい。体細胞としては、例えば、(1) 神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、(2) 組織前駆細胞、(3) 線維芽細胞（皮膚細胞等）、上皮細胞、肝細胞、リンパ球（T細胞、B細胞）、内皮細胞、筋肉細胞、毛細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞、皮膚細胞等の分化した細胞が挙げられる。好ましくはヒト由来の体細胞である。
【００１６】
本発明において、多能性幹細胞としては、特に限定されないが、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、エピブラスト細胞、胚性生殖細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ：ＥＧ細胞）、多能性生殖幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ：ｍＧＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）が挙げられる。なかでも、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞が好ましく、さらに好ましくは、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞であり、特に好ましくはｉＰＳ細胞である。
【００１７】
ここで、これら体細胞または多能性幹細胞の由来となる生体としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、非ヒト動物（例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス）が挙げられる。好ましくは、ヒトである。
【００１８】
本発明において、プライム型多能性幹細胞としては、特に限定されないが、多能性幹細胞のうち、ナイーブ型と認識されているマウスＥＳ細胞、マウスｉＰＳ細胞を除いた細胞を意味する。例えば、ヒト、サル、ブタ、ヒツジ、イヌまたはウシに由来するＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞、ならびにヒトおよび前記非ヒト動物細胞に由来するエピブラスト幹細胞が挙げられる。好ましくは、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞であり、なかでも、ヒトｉＰＳ細胞が好ましい。
【００１９】
本発明において、プライム型多能性幹細胞として用いるヒトＥＳ細胞の細胞株としては、特に限定されないが、例えば、Ｈ１、Ｈ９、Ｓｈｅｆ６、ｋｈＥＳ−１、ｋｈＥＳ−２、ｋｈＥＳ−３、ｋｈＥＳ−４、ｋｈＥＳ−５が挙げられる。
【００２０】
本発明において、プライム型多能性幹細胞として用いるヒトｉＰＳ細胞の細胞株としては、特に限定されないが、例えば、ＷＤ３９（線維芽細胞由来）、ａＴＫＡ４（Ｔ細胞由来）、２０１Ｂ６、２０１Ｂ７、２５３Ｇ１、２５３Ｇ４が挙げられる。なかでも、ＷＤ３９、または２０１Ｂ７が好ましい。
【００２１】
本発明において、体細胞またはプライム型多能性幹細胞に導入される遺伝子としては、いわゆる初期化因子（リプログラミング因子）として知られている因子であれば特に限定されないが、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｋｌｆ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ５、Ｌｉｎ２８、Ｔｅｒｔ、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、β−カテニン、ＥＣＡＴ１、Ｅｓｇ１、Ｄｎｍｔ３Ｌ、ＥＣＡＴ８、Ｇｄｆ３、Ｓｏｘ１５、Ｆｔｈｌ１７、Ｓａｌｌ４、Ｒｅｘ１、ＵＴＦ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔａｔ３、Ｇｒｂ２、Ｐｒｄｍ１４、Ｎｒ５ａ１、Ｎｒ５ａ２、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎが挙げられる。ここで、これらの遺伝子群の中から２以上の遺伝子を選択して任意に組み合わせて導入することができる。なかでも、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＫｌｆ２の組合せが好ましい。ただし、遺伝子を導入する細胞が、プライム型多能性幹細胞である場合は、上記初期化因子のいずれかが発現しているため、それらを除いた初期化因子を導入してもよい。ヒトＥＳ細胞、またはヒトｉＰＳ細胞の場合、そのような初期化因子としては、例えば、Ｎａｎｏｇ、およびＫｌｆ２の組合せが好ましく、さらにＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ２の組み合わせが好ましい。また、導入する遺伝子の種は、導入先の細胞の種と同一であることが好ましい。例えば、ヒト由来の細胞へ導入される遺伝子はヒト遺伝子であることが好ましい。例えば、ヒト由来の体細胞、ヒトＥＳ細胞、またはヒトｉＰＳ細胞へ導入される遺伝子としては、ヒトＮａｎｏｇ（ＮＡＮＯＧ）およびヒトＫｌｆ２（ＫＬＦ２）の組合せが好ましく、さらにヒトＯｃｔ３／４（ＯＣＴ３／４）、ヒトＫｌｆ４（ＫＬＦ４）、ヒトｃ−Ｍｙｃ（ｃ−ＭＹＣ）、ヒトＳｏｘ２（ＳＯＸ２）、ヒトＮａｎｏｇ（ＮＡＮＯＧ）およびヒトＫｌｆ２（ＫＬＦ２）の組み合わせが好ましい。
【００２２】
本発明において、遺伝子発現ベクターとしては、特に限定されないが、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、人工染色体ベクター、トランスポゾンベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが挙げられる。
【００２３】
本発明において、体細胞またはプライム型多能性幹細胞に遺伝子導入を行った後、フィーダー細胞と共に培養してもよい。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ細胞）、マウス胚性線維芽細胞株（ＳＴＯ細胞）が挙げられる。
【００２４】
本発明において、プライム培地としては、特に限定されないが、例えば、基礎培地として、ＤＭＥＭ（Dulbecco Modified Eagle medium）、ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１）、KnockoutTM D-MEM（Invitrogen社）挙げられ、代替血清（ＫＳＲ；KnockoutTM Serum Replacement（Invitrogen社））、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、マイトマイシン）、ｂＦＧＦ（basic Fibroblast Growth Factor）等の添加成分を任意に組み合わせて、当該いずれかの基礎培地に添加して調製したものが挙げられる。
【００２５】
本発明において、クローン化とは、初期化因子を遺伝子導入された体細胞またはプライム型多能性幹細胞のうち、当該遺伝子の発現が確認できた細胞を選別する方法をいう。このような選別方法としては、例えば、予め遺伝子発現ベクターに組み込まれた蛍光タンパク質遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子（例えば、Ｖｅｎｕｓ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）遺伝子（例えば、Ｃｅｒｕｌｅａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子（例えば、ＴＯＭＡＴＯ）等の蛍光を蛍光顕微鏡下で確認する方法が挙げられる。この方法によって選別された細胞を、本発明では遺伝子発現細胞株という。
【００２６】
本発明において、工程（ｉｉｉ）および維持方法における各種化合物としては、ＬＩＦ（Leukemia inhibitory factor）、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ｃＡＭＰ産生促進剤、ＴＧＦ−β阻害剤、またはＰＫＣ阻害剤が挙げられる。これらの化合物をすべてナイーブ培地に添加することが好ましい。
【００２７】
本発明において、ＭＥＫ阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、ＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：３９１２１０−１０−９）、Ｕ０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエン；ＣＡＳ登録番号：１０９５１１−５８−２）、ＰＤ９８０５９（２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン；ＣＡＳ登録番号：１６７８６９−２１−８）、ＰＤ１８４３５２（２−(２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ)−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：２１２６３１−７９−３が挙げられる。なかでも、ＰＤ０３２５９０１が好ましい。
【００２８】
本発明において、ＧＳＫ３阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル；ＣＡＳ登録番号：２５２９１７−０６−９）、ＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム；ＣＡＳ登録番号：６６７４６３−６２−９）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９−ブロモ−７，１２−ジヒドロインドロ［３，２−ｄ］［１］ベンズアゼピン−６（５Ｈ）−オン；ＣＡＳ登録番号：１４２２７３−２０−９）、ＩＭ−１６（３-（４-フルオロフェニルエチルアミノ）−１−メチル−４−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル)−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；ＣＡＳ登録番号：１１２９６６９−０５−１）が挙げられる。なかでも、ＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。
【００２９】
本発明において、ｃＡＭＰ産生促進剤としては、特に限定されないが、例えば、フォルスコリン（Forskolin；ＣＡＳ登録番号：６６４２８−８９−５）が挙げられる。
【００３０】
本発明において、ＴＧＦ−β阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド；ＣＡＳ登録番号：９０９９１０−４３−６）、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド；ＣＡＳ登録番号：３０１８３６−４１−９）が挙げられる。なかでも、Ａ８３−０１が好ましい。
【００３１】
本発明において、ＰＫＣ阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、Ｇｏ６９８３（３−［１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；ＣＡＳ登録番号：１３３０５３−１９−７）、ＧＦ１０９２０３Ｘ（３−（１−（３−ジメチルアミノ）プロピル）−１Ｈ−インドール−３−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；ＣＡＳ登録番号：１３３０５２−９０−１）が挙げられる。なかでも、Ｇｏ６９８３が好ましい。
【００３２】
本発明において、ナイーブ培地としては、特に限定されないが、例えば、基礎培地として、Ｎ２Ｂ２７培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にＮ２サプリメントを添加したＮ２培地と、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地にＢ２７サプリメントを添加したＢ２７培地とを１：１に混合した培地）が好ましく、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ−グルタミン、２−メルカプトエタノール、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ピューロマイシン、マイトマイシン）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の添加成分を任意に組み合わせて、当該基礎培地に添加して調製したものが挙げられる。
【００３３】
本発明において、ナイーブ培地に添加する各種化合物の培地中の濃度は特に限定されないが、例えば、ＬＩＦの場合は１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、ＭＥＫ阻害剤の場合は５０ｎＭ〜１００μＭ、ＧＳＫ３阻害剤の場合は５０ｎＭ〜１００μＭ、ｃＡＭＰ産生促進剤の場合は５０ｎＭ〜１００μＭ、ＴＧＦ−β阻害剤の場合は１０ｎＭ〜１００μＭ、ＰＫＣ阻害剤の場合は５０ｎＭ〜１００μＭの範囲で添加されることが好ましい。
【００３４】
本発明において、ナイーブ培地を用いる培養条件について、当業者であれば自明なことであるが、低酸素（酸素濃度：５％）の条件下で培養することが好ましい。
【００３５】
本発明において、工程（ｉｉｉ）における「一時的」とは、約５日以上、または約１０日以上であり、好ましくは約１０〜２０日間、特に好ましくは約１０日〜１４日間である。
【００３６】
本発明において、工程（ｉｉｉ）における「工程（ｉ）で導入した遺伝子を発現させる」とは、例えばドキシサイクリンの添加によって導入遺伝子の発現を誘導する行為である。
【００３７】
本発明において、製造されたナイーブ型多能性幹細胞のナイーブ型の確認方法としては、当業者であれば自明なことであるが、例えば、定量的ＰＣＲにより、当該細胞のナイーブマーカーの発現量を確認する方法が挙げられる。ここで、ナイーブマーカーとしては、例えば、ＤＰＰＡ３、ＥＳＲＲＢ、ＴＦＣＰ２Ｌ１、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＴＢＸ３が挙げられる。あるいは、コロニー形態において、プライム型多能性幹細胞は主に単層の扁平なコロニーを形成するのに対して、ナイーブ型多能性幹細胞は主に重層（ドーム状）のコロニーを形成するため、その形態によって確認することもできる。
【００３８】
本発明において、製造されたナイーブ型多能性幹細胞の分化多能性の確認方法としては、当業者であれば自明なことであるが、例えば、定量的ＰＣＲにより、当該細胞の多能性マーカーの発現量を確認する方法が挙げられる。ここで、多能性マーカーとしては、ＯＣＴ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ４が挙げられる。また、別の確認方法として、胚様体（ＥＢ；Embryoid Body）法、テラトーマ（奇形腫）形成法が挙げられる。
【００３９】
本発明のナイーブ型多能性幹細胞の維持方法において、導入遺伝子の発現誘導は必須ではないため、行っても行わなくてもよい。好ましくは、導入遺伝子の発現誘導は行わずに、各種化合物を添加したナイーブ培地で培養することである。
【００４０】
本発明において、製造されたナイーブ型多能性幹細胞は、未分化状態を維持し、すなわち、ナイーブマーカーの１種であるＥＳＲＲＢを高発現し、かつ非常に高い分化多能性を有しているため、（１）所望の各種細胞への分化誘導、（２）分化誘導した細胞を用いた医薬品候補化合物のスクリーニング、（３）分化誘導した細胞から再生医療用の組織の作製、（４）作製した組織の患者への移植、（５）胚盤胞へのナイーブ化iPS細胞移植による臓器再生法等に使用することができる。
【００４１】
本発明において、ナイーブ型多能性幹細胞を分化誘導できる細胞としては、特に限定されないが、例えば、心筋細胞、神経細胞、インスリン産生細胞、糸球体内皮細胞、メサンギウム細胞、ボウマン嚢上皮細胞、血管内皮細胞が挙げられる。
【００４２】
本発明において、ナイーブ型多能性幹細胞を分化誘導する方法としては、特に限定されないが、例えば、神経細胞に分化誘導する方法としては、ＳＤＩＡ（Stromal cell-Derived Inducing Activity）法（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol.99, No.3, 1580-1585, 2002）が挙げられる。
【００４３】
本発明において、ナイーブ型多能性幹細胞を用いて分化誘導した細胞は、各種疾患の治療用医薬品候補化合物のスクリーニングに用いることができる。例えば、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、医薬品候補化合物を、当該分化誘導した細胞に添加することによって、当該細胞の形態または機能的な変化、各種因子の増減、遺伝子発現プロファイリング等を検出することにより、評価を行うことができる。ここで、当該細胞は、治療対象となる疾患と同様の表現型を有する細胞が好ましく、より好ましくは、疾患に罹患した患者に由来する体細胞から製造したナイーブ型多能性幹細胞から分化誘導した細胞である。
【００４４】
本発明において、ナイーブ型多能性幹細胞を用いて分化誘導した細胞から組織を作製して、再生医療の分野で使用することができる。例えば、損傷した神経組織を本発明に由来する正常な組織と置き換えることによって、損傷した神経組織を正常化することができる。これにより、神経細胞の損傷に由来する疾患を治療することができる。そのような疾患としては、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、網膜色素変性症、筋萎縮性側索硬化症、視神経脊髄炎、視神経炎、急性散在性（播種性）脳脊髄炎、アレルギー性脳脊髄炎、脊髄損傷、横断性脊髄炎、脊髄小脳変性症、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、ギラン・バレー（Guillain-Barre）症候群、多発性硬化症、てんかん、パーキンソン症候群、ダウン症、統合失調症、自律神経失調症、ハンチントン病、加齢黄斑変性症、内耳性難聴が挙げられる。
【００４５】
本発明において、作製した組織の患者への移植方法としては、当業者であれば自明なことであるが、例えば、神経細胞を移植する場合は、ネイチャー・ニューロサイエンス（Nature Neuroscience）、第２巻、第１２号、１１３７−１１４０ページ、１９９９年に記載の方法に準じて行うことができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４７】
以下に生物学的実験例を示し、これらの実験方法に基づいて、本発明化合物の効果を確認した。【００４８】
実施例１  ｉＰＳ細胞のナイーブ化
１．１  プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞としてＷＤ３９細胞（Imaizumi et al. Molecular Brain 2012, 5:35）およびコントロールラインとして広く使用されている２０１Ｂ７細胞（理研バイオリソースセンター）を用いた。【００４９】
ヒトｉＰＳ細胞は、表１のプライム型条件の培地を用いて、マイトマイシンＣや放射線処理したマウス胎児繊維芽細胞株（ＳＴＯ細胞）またはマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ細胞）をフィーダー細胞として培養された。５日〜７日に１回のペースで継代を行った。継代の際には解離液（０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ、１ｍｇ／ｍｌＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩＶ、２０％ＫＳＲ、１ｍＭＣａＣｌ２／ＰＢＳ）を用いてコロニーを剥がし、ピペッティングによってコロニーを細かく砕いたのちに播種した。１０ｃｍディッシュに播種したｉＰＳ細胞を遺伝子導入の試験に供した。【００５０】
１．２  遺伝子導入細胞株の作製
上記「１．１  プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養」条件で培養されたｉＰＳ細胞（１０ｃｍディッシュ）の培地を除去し７ｍＬのＰＢＳで一回洗浄後、解離液を１ｍＬ添加した。１分〜２分後に解離液を除去し、７ｍＬのＰＢＳを加えた。軽くディッシュを揺すってフィーダー細胞のみを剥がした後にＰＢＳを除去した。さらにＰＢＳで一度洗浄し、表１のプライム型条件の培地３ｍＬをディッシュに添加しスクレイパーによってｉＰＳ細胞のコロニーを剥がした後に１５ｍＬチューブに回収した。ｉＰＳ細胞を２００ｇで５分遠心して上清を除き、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１ｍＬ添加して３７℃にて５分反応させた。Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２ｍＬを加えた後に、Ｐ１０００のピペットマンで１０回〜２０回ピペッティングすることで単一細胞に解離した。７ｍＬの培地を足して容量を増やし７０μｍのセルストレイナーを通した。単一細胞となったｉＰＳ細胞を遺伝子導入に使用した。【００５１】
遺伝子導入ではＧｅｎｅ  ｊｕｉｃｅ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）発現ベクター（ｒｔＴＡ：ｃｌｏｎｔｅｃｈのｒｔＴＡ−Ａｄｖａｎｃｅｄ配列使用）、ＰｉｇｇｙＢａｃ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ発現ベクター（Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jan 25;108(4):1531-6参照）、ドキシサイクリン依存的に山中４因子、ＫＬＦ２およびＮＡＮＯＧと蛍光タンパクであるＴＯＭＡＴＯを発現するベクター（ＯＫＳＭ，ＫＬＦ２，ＮＡＮＯＧおよびＴＯＭＡＴＯ）の３種類のベクターを導入し（図１）、上記「１．１プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養」と同様に培養した。遺伝子導入の５日〜１０日後にドキシサイクリンを添加し８時間〜１２時間後に蛍光顕微鏡で観察した。ＴＯＭＡＴＯの蛍光が観察されるコロニーをドキシサイクリン依存性発現誘導システムが機能している細胞株であると判断し、コロニーピックアップによってクローン化した。以降はドキシサイクリンを添加せず、上記「１．１  プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養」と同様に培養した。【００５２】
１．３  ｉＰＳ細胞のナイーブ化
「１．２  遺伝子導入細胞株の作製」で遺伝子導入およびクローン化されたｉＰＳ細胞を解離液およびＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔを用いて単一細胞に解離し、ＭＥＦ細胞をフィーダーとして播いた６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０５／ｗｅｌｌにて播種した。その際、培地は表１の２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３の培地（以下、本発明の培地と略記することがある。）を使用し、さらにドキシサイクリン（1μｇ/ｍＬ）の添加によって導入遺伝子の発現を誘導したうえで低酸素にて培養した（Ｐａｓｓａｇｅ１；Ｐ１）。なお、ナイーブ化開始の初日は１０μＭとなるようＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を加え、細胞死を抑えた。ナイーブ化開始の５日〜７日後に継代を行った。培地を除いたのち、各ウェルに０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを３５０μＬ加え１分間３７℃で反応させた。Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒによって反応を止め、培地を５ｍＬ加えた。ピペットエイドで数回ピペッティングすることでフィーダー細胞のシートからｉＰＳ細胞のコロニーを剥がし、コロニーを１５ｍＬチューブに回収した。遠心後、上清を除いて２００μＬの培地を添加しＰ２００のピペットマンで４０回程度ピペッティングすることで単一細胞に解離した。ＭＥＦ細胞をフィーダー細胞として培養している新しい６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞全量を播種した（Ｐａｓｓａｇｅ２）。継代後もＰ１と同様に、本発明の培地にドキシサイクリンを添加した条件で培養した。継代から５日〜７日後に顕微鏡下でｉＰＳ細胞のコロニー形態を観察し２回目の継代を実施した。２回目の継代以降ドキシサイクリンは添加しなかった。２回目の継代から５日〜７日後に顕微鏡下でｉＰＳ細胞のコロニー形態を観察し、３回目の継代を実施した。４回目以降も同様に継代した。なお、２回目および３回目の継代時に、それぞれＰａｓｓａｇｅ２およびＰａｓｓａｇｅ３の細胞の一部をｑＰＣＲによる解析用に回収した（図８参照）。【００５３】
実施例２  ナイーブ化による遺伝子発現プロファイルの解析
本実験では、ｉＰＳ細胞として２０１Ｂ７細胞を使用した。
解析に使用する細胞は、プライム型条件の培地で培養された２０１Ｂ７細胞（「１．１  プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養」参照）、「１．３  ｉＰＳ細胞のナイーブ化」で作製されたＰａｓｓａｇｅ２およびＰａｓｓａｇｅ３の２０１Ｂ７細胞である。各細胞からＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを回収し、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（登録商標）を用いて逆転写した後にＳＹＢＲ（登録商標）  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑII（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｑＰＣＲを行った。プライマーセットは表２に示した。【００５４】
その結果を図２に示す。多能性マーカーであるＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ３／４の発現はナイーブ化によっても維持されていた。また、ナイーブ型の多能性幹細胞であるマウスＥＳ細胞で発現の高いＫＬＦ４、ＤＰＰＡ３、ＥＳＲＲＢ、ＴＦＣＰ２Ｌ１、ＫＬＦ５およびＴＢＸ３といった遺伝子は、ナイーブ化によって発現が上昇しており、ドキシサイクリンの添加を止めた後（Ｐａｓｓｓａｇｅ３）もプライム型と比べて高い発現を維持していた。また、プライム型の遺伝子マーカーとされるＬｅｆｔｙの発現はナイーブ化によって低下していた。以上の結果から、本発明の方法を用いることで、少なくともｐａｓｓａｇｅ２以降、ｉＰＳ細胞がナイーブ型に移行することが明らかとなった。また、ナイーブ型に移行後その維持には導入遺伝子の発現誘導は必要なく、本発明の培地のみで十分であることが分かった。【００５５】
実施例３  Ｇｏ６９８３添加タイミングによるナイーブ化への効果
本実験では、Ｇｏ６９８３添加タイミングによるナイーブ化への効果を検討した。「１．３  ｉＰＳ細胞のナイーブ化」におけるｐａｓｓａｇｅ１の２０１Ｂ７細胞培養培地（表１の２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３の培地）を、表１のＫＳＲ  ２ｉＬＦＡの培地または表１のＫＳＲ  ２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３の培地に変更し、ドキシサイクリンの添加によって導入遺伝子の発現を誘導したうえで低酸素にて培養した。それぞれの条件で培養したｐａｓｓａｇｅ１を継代から５日〜７日後に回収し、ｑＰＣＲによる解析に供した。その結果を図３に示す。図３から明らかであるように、Ｇｏ６９８３を添加した培地で培養したｉＰＳ細胞のほうが、ＥＳＲＲＢの発現は高かった。本結果から、Ｇｏ６９８３をドキシサイクリンによる導入遺伝子の発現誘導と同時に添加することにより、ｉＰＳ細胞のナイーブ化は促進されることが分かった。【００５６】
実施例４  フォルスコリンおよびＡ８３−０１の添加のナイーブ化に対する効果
ＥＳＲＲＢ遺伝子はマウスＥＳ細胞において自己複製を制御する重要な遺伝子である（Cell Stem Cell, 11,491-504 (2012)参照）。本発明では、実施例１の結果から明らかであるように、導入遺伝子の発現誘導の有無にかかわらず、ＥＳＲＲＢの発現は高い状態で維持されている。それに対し、非特許文献３に記載のリセット細胞では、ＥＳＲＲＢの発現はほとんど認められていない（非特許文献３参照）。本発明と非特許文献３に記載の条件における相違点のひとつが、本発明では非特許文献３に記載の培地条件にフォルスコリンとＡ８３−０１を加えた点である。そこで、本相違点が、ナイーブ化（ＥＳＲＲＢの発現およびコロニー形態）に及ぼす影響について検討した。【００５７】
本実験では、ナイーブ化を検討する培地として、本発明の培地（表１の２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３の培地）および比較培地として表１に記載の２ｉＬ＋Ｇｏ６９８３の培地を使用し、その他のナイーブ化方法は「１．３  ｉＰＳ細胞のナイーブ化」と同様に行った。各培地で培養したＰａｓｓａｇｅ２およびＰａｓｓａｇｅ３の２０１Ｂ７細胞におけるＥＳＲＲＢの遺伝子発現およびコロニー形態を指標に、ナイーブ化を評価した。【００５８】
その結果を図４に示す。両培地ともドキシサイクリン添加中は、ＥＳＲＲＢの発現が上昇しており、ナイーブ型のマウスＥＳ細胞と似たドーム状のコロニー形態をとっていた。しかしながら、２ｉＬ＋Ｇｏ６９８３の培地で培養したｉＰＳ細胞ではドキシサイクリンの添加を止めてしまうと、ＥＳＲＲＢの発現が顕著に低下し（ドキシサイクリン添加時の発現の約１０％）、またプライム型の特徴である扁平なコロニーが増えていた。それに対し、本発明の培地（表１の２ｉＬＦＡ＋Ｇｏ６９８３の培地）で培養したｉＰＳ細胞ではドキシサイクリンの添加を止めた後も、ＥＳＲＲＢの発現は低下するものの、その低下は２ｉＬ＋Ｇｏ６９８３条件と比べて軽微（ドキシサイクリン添加時の発現の約５０％）であり、ドーム状のコロニー形態も維持されていた。
本結果から、導入遺伝子の発現誘導を止めた後もｉＰＳ細胞のナイーブ化状態を維持するためにはフォルスコリンとＡ８３−０１の添加が必要であることが分かった。【００５９】
なお、非特許文献３では、Ｇｏ６９８３はドキシサイクリンを抜くタイミングで添加されているが、本試験ではフォルスコリンとＡ８３−０１による効果に焦点を当てるため、本発明の方法と同様にＧｏ６９８３はドキシサイクリン添加時から添加した。実施例２から明らかであるように、Ｇｏ６９８３はドキシサイクリン添加時から添加している方がＥＳＲＲＢの発現は高い。したがって、非特許文献３におけるリセット細胞におけるＥＳＲＲＢの発現は本実験結果よりもさらに低く、非特許文献３に記載されているようにその発現はほとんど認められず、リセット細胞における転写因子ネットワークは脆弱になっている（非特許文献３参照）。それに対し、本発明の方法によって製造され維持されたナイーブ型ｉＰＳ細胞では、ナイーブ型のマウスＥＳ細胞と同じ転写因子の発現が認められており、ナイーブ型のマウスＥＳ細胞と同じ転写因子ネットワークが形成されているものと考えられる。したがって、本発明方法によって製造され維持されたナイーブ型ｉＰＳ細胞は、非特許文献３に記載のリセット細胞よりもナイーブ化が進んだ状態であることがわかる。【００６０】
実施例５  リプログラミング因子の組み合わせによるリプログラミング効率の比較
本発明と非特許文献３に記載の条件における相違点のひとつが、本発明では非特許文献３に記載のリプログラミング因子（ＫＬＦ２及びＮＡＮＯＧ）に山中４因子を加えた点である。そこで、本相違点が、ナイーブ化（ＥＳＲＲＢの発現）に及ぼす影響について検討した。
上記「１．１  プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養」条件で培養されたＷＤ３９細胞に対し「１．２  遺伝子導入細胞株の作製」と同様の手技を用いて遺伝子導入した。遺伝子導入ではリバーステトラサイクリン制御性トランス活性化因子（ｒｔＴＡ）発現ベクター（ｒｔＴＡ：ｃｌｏｎｔｅｃｈのｒｔＴＡ−Ａｄｖａｎｃｅｄ配列使用）、ＰｉｇｇｙＢａｃ  Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ発現ベクター（Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jan 25;108(4):1531-6参照）、ドキシサイクリン依存的にリプログラミング因子及び蛍光タンパクを発現するベクターの３種類のベクターを導入し（図９）、上記「１．１プライム型ヒトｉＰＳ細胞の培養」と同様に培養した。なお、リプログラミング因子及び蛍光タンパクの組み合わせは（１）ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧ及びＶｅｎｕｓ、（２）山中４因子及びＣｅｒｕｌｅａｎ、（３）山中４因子、ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧ及びＴＯＭＡＴＯの三種類を用いた。遺伝子導入の翌日〜４日後にドキシサイクリンを添加し、ドキシサイクリン添加の翌日から薬剤によるセレクションを行った。セレクションとして、ドキシサイクリン依存的に発現する耐性遺伝子の種類に従い、ネオマイシン（１００μｇ／ｍＬ）又はピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）を添加した。ドキシサイクリン添加５日後に細胞を回収し、ｑＰＣＲによる遺伝子発現解析を実施したところ、（３）山中４因子、ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧ及びＴＯＭＡＴＯの遺伝子を導入した細胞では、（１）ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧ及びＶｅｎｕｓや（２）山中４因子及びＣｅｒｕｌｅａｎを導入した細胞に比べてＥＳＲＲＢの発現が相乗的に高かった（図５）。したがって、山中４因子、ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧの６遺伝子の導入によって製造されたナイーブ型ｉＰＳ細胞は、非特許文献３に記載のリセット細胞よりもナイーブ化が進んだ状態であることがわかる。【００６１】
以上実施例３〜５の結果より、以下のことが明らかとなった。
（１）ＰＫＣ阻害剤（例えば、Ｇｏ６９８３）を導入遺伝子の発現誘導時に添加することにより、ナイーブ化は促進する。
（２）ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧの２遺伝子のみの導入より、山中４因子を加えた６遺伝子の導入によってナイーブ化はより促進する。
（３）ｃＡＭＰ産生促進剤（例えば、フォルスコリン）とＴＧＦ−β阻害剤（例えば、Ａ８３−０１）の添加により、細胞はナイーブ化状態を維持する。
以上より、本発明方法によって製造され維持されたナイーブ型多能性幹細胞（例えば、ヒトiPS細胞）は、非特許文献３に記載のリセット細胞よりもナイーブ化が数段に進んだ状態であり、ナイーブ型多能性幹細胞として十分に機能する。【００６２】
実施例６  ナイーブ化したｉＰＳ細胞からの神経分化誘導
プライム型およびナイーブ化したｉＰＳ細胞をＳＤＩＡ法によって神経分化誘導した。ＳＤＩＡ法はマウスストローマ細胞株（ＰＡ６細胞、理研バイオリソースセンター）をフィーダー細胞としてｉＰＳ／ＥＳ細胞を培養することで神経への分化を誘導する方法である（Kawasaki et al. Neuron. 2000 Oct;28(1):31-40参照）。ＰＡ６細胞の通常の培養は、αＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを使用した。ＳＤＩＡ法を行う際に、培地を表１のＳＤＩＡ  ｍｅｄｉｕｍに変更した。プライム型からＳＤＩＡ法を実施する際には上記「１．２  遺伝子導入細胞株の作製」と同様の方法でコロニーを単一細胞にしたが、細胞死を抑える目的で実験開始１時間前から１０μＭとなるようＲＯＣＫ阻害剤であるＹ２７６３２を添加した。ＰＡ６細胞上に細胞を播種した後にはＹ２７６３２を添加しなかった。細胞数は１２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２×１０３〜２×１０４／ｗｅｌｌで播種した。ナイーブ型からＳＤＩＡ法を実施する際には上記「１．３  ｉＰＳ細胞のナイーブ化」で作製したＰａｓｓａｇｅ３またはＰａｓｓａｇｅ４の細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを用いた方法でコロニーを単一細胞にした。なお、細胞死を抑える目的で実験開始１時間前から１０μＭとなるようＲＯＣＫ阻害剤であるＹ２７６３２を添加した。ＰＡ６細胞上に細胞を播種した後にはＹ２７６３２を添加しなかった。細胞数は１２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに２×１０３〜２×１０４／ｗｅｌｌで播種した。ＳＤＩＡ法の１０日目に４％ＰＦＡによって細胞を固定し、ＭＡＰ２に対して免疫組織染色を実施した（抗体Ｍ４４０３、ｓｉｇｍａ）。１つ１つのコロニーを蛍光顕微鏡で観察し、ＭＡＰ２陽性の神経が誘導されているか判別した。その結果を図６に示す。【００６３】
ナイーブ化したｉＰＳ細胞はプライム型のｉＰＳ細胞に比べてＭＡＰ２陽性の細胞が存在するコロニーの割合が顕著に高かった。この結果は、使用した２０１Ｂ７細胞およびＷＤ３９細胞の両方で認められた。本結果から、本発明の方法によってナイーブ化されたｉＰＳ細胞は、優れた分化能を有していることが分かった。【００６４】
実施例７  ナイーブ化したｉＰＳ細胞からのアストロサイト分化誘導
プライム型およびナイーブ化したｉＰＳ細胞をＮｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを介する方法によって神経分化誘導した（Stem Cells. 2008 Dec;26(12):3086-98参照）。プライム型からアストロサイト分化を実施する際には解離液を用いてコロニーを塊の状態で剥がし、表１のプライム型条件の培地からｂＦＧＦを除いた培地で浮遊培養することで胚様体を形成させた。ナイーブ型からアストロサイト分化を実施する際には強くピペッティングを繰り返すことでコロニーを塊の状態で剥がし、Ｎ２Ｂ２７培地（ナイーブ培地の基礎培地）で培養することで胚様体を形成した。なお、胚様体形成時のコロニーの剥がし方と培地以外はすべてプライム型とナイーブ化したｉＰＳ細胞で全く同じ操作をした。また、胚様体形成期間には神経系への分化を促進するため、１００ｎＭとなるようＬＤＮ１９３１８９を添加した。胚様体形成の７日後に胚様体を回収し、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔを１ｍＬ添加して３７℃にて１０分反応させた。Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ２ｍＬを加えた後に、Ｐ１０００のピペットマンで２０回〜３０回ピペッティングすることで単一細胞に解離した。解離した細胞は２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調整し、２％Ｂ２７及び２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加したＭＨＭ培地で浮遊培養することで一次Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成した。一次Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成の７日後にＮｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを回収し、ＴｒｙｐＬＥＴＭ  Ｓｅｌｅｃｔを１ｍＬ添加して３７℃にて１０分反応させた。Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ２ｍＬを加えた後に、Ｐ１０００のピペットマンで２０回〜３０回ピペッティングすることで単一細胞に解離した。解離した細胞は２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう調整し、２％Ｂ２７及び２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加したＭＨＭ培地で浮遊培養することで二次Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを形成した。二次Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成の７日後にｐｏｌｙ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ及びｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎコートしたカバーガラス上に二次Ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅを播種し分化を促した。分化用の培地には２％Ｂ２７，２％ＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍｌ  ｈＬＩＦを添加したＭＨＭ培地を用いた。カバーガラス上に播種した１０日後に４％ＰＦＡによって細胞を固定し、神経マーカーであるβIIIーＴｕｂｕｌｉｎ及びアストロサイトマーカーであるＧＦＡＰに対して免疫組織染色を実施した（抗体Ｔ８６６０、ｓｉｇｍａ及び抗体２．２Ｂ１０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。
その結果を図７に示す。ナイーブ化したｉＰＳ細胞はプライム型のｉＰＳ細胞に比べてアストロサイトへ分化する細胞の割合が顕著に高かった。この結果は、使用した２０１Ｂ７細胞（図中、Ｂ７）およびＷＤ３９細胞（図中、ＷＤ）の両方で認められた。本結果から、本発明の方法によってナイーブ化されたｉＰＳ細胞は、優れた分化能を有していることが分かった。【００６５】
【表１】
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【００６６】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によれば、ナイーブ型の特徴を維持し、かつ分化多能性を有する多能性幹細胞を安定的に製造できるため、臨床利用、薬物評価等の実用的な応用が可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号１：プライマー
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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