(57)【要約】標本観察装置１は、光源２と、照明光学系３と、ステージ４と、結像光学系５と、を有し、更に、ステージ４を挟んで結像光学系５と対向する位置に配置された反射部材６を有し、照明光学系３は、光源２からの照明光を標本に照射するように配置され、結像光学系５は、照明光が標本Ｓを透過後、反射部材６にて反射して再び標本Ｓを透過した光が入射する位置に配置されると共に、標本Ｓの光学像を形成し、光学像は、標本Ｓの位置と結像光学系５の合焦位置とが異なる状態で形成され、合焦位置は、光軸上の像点の位置で標本の持つ空間周波数における０次回折光と１次回折光の位相が等しくなる位置である。
2016185619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
照明光学系と、
標本を配置可能なステージと、
結像光学系と、を有し、
更に、前記ステージを挟んで前記結像光学系と対向する位置に配置された反射部材を有し、
前記照明光学系は、前記光源からの照明光を前記標本に照射するように配置され、
前記結像光学系は、前記照明光が前記標本を透過後、前記反射部材にて反射して再び前記標本を透過した光が入射する位置に配置されると共に、前記標本の光学像を形成し、
前記光学像は、前記標本の位置と前記結像光学系の合焦位置とが異なる状態で形成され、
前記合焦位置は、光軸上の像点の位置で前記標本の持つ空間周波数における０次回折光と１次回折光の位相が等しくなる位置であることを特徴とする標本観察装置。
【請求項２】
撮像装置と、
画像処理装置と、を有し、
前記撮像装置は前記光学像が形成された位置に配置され、
前記画像処理装置は、前記標本の位置と前記結像光学系の合焦位置とが異なる状態で得られる光学像から観察画像信号を生成することを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
【請求項３】
以下の条件式（１）を満足することを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
１０≦Ｄ×ＮＡｏｂ２／λ≦１００００      （１）
ここで、
Ｄは、前記標本の位置と前記反射部材の反射面との間隔（ｍｍ）、
ＮＡｏｂは、前記結像光学系の前記標本側の開口数、
λは、照明光の波長域の中心波長（ｍｍ）、
である。
【請求項４】
以下の条件式（２）を満足することを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
４×ＮＡｉｌｌ×Ｄ＋Ａ＜Ｌ      （２）
ここで、
ＮＡｉｌｌは、前記照明光学系の前記標本側の開口数、
Ｄは、前記標本の位置と前記反射部材の反射面との間の距離（ｍｍ）、
Ａは、前記標本の位置での観察視野の直径（ｍｍ）、
Ｌは、前記標本の位置での前記照明光学系による照明範囲の直径（ｍｍ）、
前記観察視野の直径と前記照明範囲の直径は、前記標本の位置と前記結像光学系の合焦位置とが異なる状態での直径、
である。
【請求項５】
前記反射部材は、前記結像光学系の瞳と共役な位置とは異なる位置に配置されることを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
【請求項６】
前記反射部材は、正の屈折力を有することを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
【請求項７】
前記反射部材の反射率は５０％以上であることを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
【請求項８】
前記反射部材は、入射する照明光の開口数に対して反射後の照明光の開口数を小さくする反射角制限構造を有することを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
【請求項９】
以下の条件式（４）を満足することを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
０．０１＜ＮＡｉｌｌ／ＮＡｏｂ＜１      （４）
ここで、
ＮＡｉｌｌは、前記照明光学系の前記標本側の開口数、
ＮＡｏｂは、前記結像光学系の前記標本側の開口数、
である。
【請求項１０】
以下の条件式（５）を満足することを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
０．１μｍ＜ΔＺ×ＮＡｏｂ２＜３０μｍ      （５）
ここで、
ΔＺは、前記結像光学系の合焦位置と前記標本の位置との差、
ＮＡｏｂは、前記結像光学系の前記標本側の開口数、
である。
【請求項１１】
以下の条件式（６）を満足することを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
０．０５μｍ＜ΔＺ×ＮＡｉｌｌ＜１０μｍ      （６）
ここで、
ΔＺは、前記結像光学系の合焦位置と前記標本の位置との差、
ＮＡｉｌｌは、前記照明光学系の前記標本側の開口数、
である。
【請求項１２】
前記照明光が単色光であることを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
【請求項１３】
前記結像光学系を複数備えることを特徴とする請求項１に記載の標本観察装置。
【請求項１４】
標本の電子画像を取得する取得ステップと、
前記電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、
前記取得ステップは明視野観察の状態で、且つ、前記標本を透過した照明光を再び標本に向けて照射した状態で行われ、
前記減算ステップにおける前記電子画像は、所定の状態で取得された画像であって、
前記所定の状態では、前記標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっており、
前記合焦位置は、光軸上の像点の位置で前記標本の持つ空間周波数における０次回折光と１次回折光の位相が等しくなる位置であることを特徴とする標本観察方法。
【請求項１５】
前記減算ステップよりも後に増幅ステップを有し、
前記増幅ステップでは、前記減算ステップ後の電子画像の信号を増幅することを特徴とする請求項１４に記載の標本観察方法。
【請求項１６】
位相量を計算するステップを有することを特徴とする請求項１４に記載の標本観察方法。
【請求項１７】
補正用電子画像を取得するステップを有し、
前記補正用電子画像は、標本収納部に標本が存在しない状態で取得した電子画像であり、
前記減算ステップは、前記補正用電子画像の信号を、前記標本の電子画像の信号から減算することを特徴とする請求項１４に記載の標本観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本観察装置及び標本観察方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、生細胞の生命現象を細胞のレベルで解明するため、細胞培養を続けながら経時的にその動態を観察する手法、いわゆるタイムラプスイメージングが広く用いられるようになった。タイムラプスイメージングでは、インキュベータと位相差顕微鏡とを合体させた観察装置が用いられる。しかしながら、このような観察装置は透過照明での観察をベースにしているため、装置が大きくなるという問題があった。
透過照明での観察が可能で、且つ小型な観察装置が、特許文献１に開示されている。特許文献１の観察装置では、標本を収納する観察器具の底面に反射面を設けている。そして、この反射面と対向するように観察光学系を配置している。
特許文献１の観察装置では、光源は観察光学系側に配置されている。光源から出射した照明光は、観察光学系を介して標本に照射される。標本を透過した照明光は反射面で反射され、再度標本に照射される。これにより、標本に対して透過照明が行われる。特許文献１の観察装置では、標本を挟んで観察光学系と対向する側に、照明用の光源やコンデンサレンズ側に配置する必要がないので、観察装置を小型化できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−３４８１０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
特許文献１の観察装置では、標本を光線が２度透過する。これにより、標本を光線が１度だけ透過する場合に比べて、波面の変調量が２倍になる。その結果、特許文献１の観察装置では、通常の透過照明による明視野観察像に比べて、像のコントラストが高くなるという効果が得られる。
ただし、この効果を得るには、標本と反射鏡との間隔が、観察光学系の焦点深度よりも狭くなければならない。つまり、標本自身の厚さも、観察光学系の焦点探度よりも薄いことが必須である。従って、特許文献１の観察装置では、標本の厚さが観察光学系の焦点深度よりも厚い場合、標本の観察は困難になる。
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を厚みが制限されることなく観察が可能で、しかも小型な標本観察装置を提供することを目的とする。また、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を厚みが制限されることなく観察が可能な標本観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の標本観察装置は、
光源と、
照明光学系と、
標本を配置可能なステージと、
結像光学系と、を有し、
更に、ステージを挟んで結像光学系と対向する位置に配置された反射部材を有し、
照明光学系は、光源からの照明光を標本に照射するように配置され、
結像光学系は、照明光が標本を透過後、反射部材にて反射して再び標本を透過した光が入射する位置に配置されると共に、標本の光学像を形成し、
光学像は、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なる状態で形成され、
合焦位置は、光軸上の像点の位置で標本の持つ空間周波数における０次回折光と１次回折光の位相が等しくなる位置であることを特徴とする。
また、本発明の標本観察方法は、
標本の電子画像を取得する取得ステップと、
電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、
取得ステップは明視野観察の状態で、且つ、標本を透過した照明光を再び標本に向けて照射した状態で行われ、
減算ステップにおける電子画像は、所定の状態で取得された画像であって、
所定の状態では、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっており、
合焦位置は、光軸上の像点の位置で標本の持つ空間周波数における０次回折光と１次回折光の位相が等しくなる位置であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を厚みが制限されることなく観察が可能で、しかも小型な標本観察装置を提供することができる。また、無色透明な標本を厚みが制限されることなく観察が可能な標本観察方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図１は、第１実施形態の標本観察装置の構成を示す図である。
図２は、第２実施形態の標本観察装置の構成を示す図である。
図３は、本実施形態の標本観察装置で得られた標本の電子画像であって、エンハンス前の電子画像である。
図４は、本実施形態の標本観察装置で得られた標本の電子画像であって、エンハンス後の電子画像である。
図５は、反射部材の構成例を示す図である。
図６は、反射部材の別の構成例を示す図である。
図７は、別の照明方法を示す図である。
図８は、ＮＡｉｌｌ、Ｄ及びＡを示す図である。
図９Ａは、シャーレを示す図である。
図９Ｂは、マイクロウェルプレートを示す図である。
図９Ｃは、１つのマイクロウェルを示す図である。
図１０Ａは、反射部材が平面の場合の培地を通過する光線の様子を示す図である。
図１０Ｂは、反射部材が正屈折力を有する場合の培地を通過する光線の様子を示す図である。
図１１は、別の照明方法における光線の様子を示す図であって、対物レンズ側から培地を通過する光線と、反射部材側から培地を通過する光線の様子を示す図である。
図１２は、結像光学系を複数備えた標本観察装置を示す図である。
図１３は、第１実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
図１４は、第２実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
図１５は、第３実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
図１６は、第４実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
図１７Ａは、反射領域を有する標本収納部がシャーレの場合を示す図である。
図１７Ｂは、反射領域を有する標本収納部がマイクロウェルプレートの場合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のある態様にかかる実施形態の作用効果を説明する。なお、本実施形態の作用効果を具体的に説明するに際しては、具体的な例を示して説明することになる。しかし、それらの例示される態様はあくまでも本発明に含まれる態様のうちの一部に過ぎず、その態様には数多くのバリエーションが存在する。したがって、本発明は例示される態様に限定されるものではない。
実施形態の標本観察装置及び標本観察方法について説明する。以下の各実施形態の標本観察装置及び標本観察方法は、明視野観察の状態で用いられるものである。本実施形態における明視野観察では、蛍光観察のように、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、吸収フィルタからなる蛍光ミラーユニットは用いられない。よって、明視野観察の状態では、標本が無色透明の場合、標本像を形成する光（以下、適宜、「結像光」という）の波長帯域は、標本を照明する光（以下、適宜、「照明光」という）の波長帯域のうちの一部と一致しているか、又は結像光の波長帯域と照明光の波長帯域とは一致している。
また、本実施形態の標本観察装置及び標本観察方法における明視野観察では、位相差観察における位相膜や、微分干渉観察における微分干渉プリズムは用いられない。また、本実施形態における明視野観察では、変調コントラスト観察における変調器は用いられない。
本実施形態の標本観察装置は、光源と、照明光学系と、標本を配置可能なステージと、結像光学系と、を有し、更に、ステージを挟んで結像光学系と対向する位置に配置された反射部材を有し、照明光学系は、光源からの照明光を標本に照射するように配置され、結像光学系は、照明光が標本を透過後、反射部材にて反射して再び標本を透過した光が入射する位置に配置されると共に、標本の光学像を形成し、光学像は、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なる状態で形成され、合焦位置は、光軸上の像点の位置で標本の持つ空間周波数における０次回折光と１次回折光の位相が等しくなる位置であることを特徴とする。
以下、第１実施形態の標本観察装置と第２実施形態の標本観察装置について説明する。第１実施形態の標本観察装置と第２実施形態の標本観察装置は、共に、本実施形態の標本観察装置の基本構成（以下、「基本構成」という）を備えている。ここでは、第１実施形態の標本観察装置を用いて、基本構成を説明する。図１は、第１実施形態の標本観察装置の構成を示す図である。
第１実施形態の標本観察装置１は、例えば、倒立型顕微鏡を用いた装置である。標本観察装置１は、基本構成として、光源２と、照明光学系３と、ステージ４と、結像光学系５と、反射部材６と、を有する。
光源２は、ステージ４に対して、紙面内の下方向に位置する。光源２からは照明光が射出される。光源２には、例えば、ハロゲンランプ、キセノンランプ、水銀ランプ、レーザ、発光ダイオード等が用いられる。
光源２から射出された照明光は、照明光学系３に入射する。照明光学系３は、ステージ４に対して、紙面内の下方向に位置する。照明光学系３は集光光学系７と対物レンズ８とで構成されている。後述のように、対物レンズ８は、結像レンズ１１との組み合わせによって結像光学系５を構成している。このように、対物レンズ８は、照明光学系３と結像光学系５とで共通に用いられている。
図１では、集光光学系７は２枚のレンズで構成されているが、レンズの枚数は２枚に限られない。また、集光光学系７は、光学フィルタや光学絞りを備えていても良い。
照明光は、集光光学系７を通過して、ハーフミラー９に入射する。続いて、照明光はハーフミラー９で反射され、対物レンズ８に入射する。対物レンズ８を通過した照明光は、ステージ４に到達する。
照明光は、ステージ４に形成された開口部を通過する。ステージ４の開口部には、容器１０に保持された標本Ｓが載置されている。よって、ステージ４の開口部を介して、照明光が標本Ｓに照射される。標本Ｓが無色透明な場合、標本Ｓに照射され照明光は標本Ｓを透過する。標本Ｓを透過した照明光は、反射部材６に入射する。
反射部材６は、ステージ４に対して、紙面内の上方向に配置されている。ここで、照明光学系３側には、光源２や結像光学系５が配置されている。よって、反射部材６は、ステージ４を挟んで結像光学系５と対向する位置に配置されていることになる。反射部材６は、例えば、表面に反射膜６ａが形成された平行平板である。
反射部材６は、標本Ｓの上に配置されている。そして、反射部材６は、反射膜６ａが形成された面がステージ４側に向くように配置されている。標本Ｓを透過した照明光は反射部材６で反射され、反射された照明光が標本Ｓに再び照射される。その結果、標本Ｓに対して透過照明が行われる。
このように、基本構成では、従来の顕微鏡における透過照明と同様に、標本Ｓに対して透過照明を行うことができる。
標本Ｓからの光は、結像光学系５に入射する。結像光学系５は、対物レンズ８と結像レンズ１１とで構成されている。標本Ｓからの光は、対物レンズ８とハーフミラー９を通過して、結像レンズ１１で集光される。
対物レンズ８が破線で示す位置に配置されている場合、標本Ｓの位置が結像光学系５の合焦位置と一致している。この場合、結像レンズ１１によって集光された位置Ｐに、標本Ｓの像が鮮明に形成される。すなわち、ピントのあった標本Ｓの像が、位置Ｐに形成される。
標本Ｓが無色透明な場合、例えば、生きた細胞の場合、標本Ｓにはコントラストがない。よって、標本Ｓの位置が結像光学系５の合焦位置と一致した状態では、位置Ｐに形成された標本Ｓの像にもコントラストが生じない。そのため、標本Ｓの観察ができない。
そこで、標本観察装置１では、上記の基本構成において、標本Ｓの位置と結像光学系５の合焦位置（以下、「合焦位置」という）とが異なる状態で、標本Ｓの像を形成する。
標本Ｓの位置と合焦位置とを異ならせるには、例えば、合焦位置からずれていると思われる位置まで、目測で、対物レンズ８を移動させれば良い。あるいは、まず合焦位置と標本Ｓの位置とを一致させ、その後、合焦位置から離れる方向に、対物レンズ８を移動させても良い。あるいは、合焦位置が予め分かっている場合、合焦位置からずれた位置を予め決めておくことができるので、その位置まで対物レンズ８を移動させれば良い。
ステージ４が移動可能な場合、ステージ４を移動させても良い。また、対物レンズ８とステージ４の両方を移動させても良い。
図１では、対物レンズ８を破線と実線で示している。破線で示す位置は、標本Ｓの位置と合焦位置が一致しているときの対物レンズ８の位置である。実線で示す位置は、標本Ｓの位置と合焦位置とが異なるときの対物レンズ８の位置である。
このように、対物レンズ８を破線に示す位置から実線で示す位置に移動させて、標本Ｓの位置と合焦位置とを異ならせている。図１では、対物レンズ８の移動が分かるように、実線で示す位置と破線で示す位置との差を誇張しているが、実際の移動量はわずかである。また、対物レンズ８を移動させる方向は、ステージ４に近づく方向とステージ４から離れる方向のどちらでも良い。
標本Ｓが格子状の位相物体の場合、標本Ｓを平行光束で照明すると、標本Ｓからは、非回折光（以下、０次回折光という）と回折光が生じる。顕微鏡では、標本Ｓの像は、０次回折光と回折光の合成によって形成される。
像面では光の強度が観測されるため、像面における光の強度Ｉは以下の式で表される。
Ｉ＝｜Ｅ｜２＝Ａ１２＋Ａ２２＋２Ａ１Ａ２ｃｏｓψ
ここで、
Ａ１は０次回折光の振幅、
Ａ２は回折光の振幅、
φ１（ｒ）は０次回折光の位相、
φ２（ｒ）は回折光の位相、
ψは位相差であって、ψ＝φ１（ｒ）−φ２（ｒ）、
である。
以下の説明では、０次回折光と１次回折光とによって、標本Ｓの像（光学像）が形成されるものとする。
標本Ｓと光軸が交わる点（光軸上の一点）に着目すると、０次回折光は回折されないので、この点から出た０次回折光は光軸上を進んで瞳の中心に到達する。
一方、１次回折光は所定の方向に回折されるので、この点から出た１次回折光は光軸に対して所定の角度で結像光学系５に入射する。結像光学系５に入射した１次回折光は、瞳面の中心から離れた位置に到達する。
ここで、合焦状態とは、標本Ｓの位置が合焦位置と一致した状態のことであって、非合焦状態とは、標本Ｓの位置が合焦位置からずれた状態のことである。合焦位置は、光軸上の像点の位置で標本Ｓの持つ空間周波数における０次回折光と１次回折光の位相が等しくなる位置である。
合焦状態では、瞳面のどの位置においても波面収差量はゼロになっている。これは、０次回折光における波面収差量と１次回折光における波面収差量が、共にゼロであることを示している。波面収差量に（２π／λ）を乗じた値は位相量に相当するので、合焦状態では、０次回折光と１次回折光のいずれにおいても、位相に変化は生じない。
この場合、１次回折光の位相は、０次回折光の位相に対してπ／２遅れたままなので、ψ＝０−（−π／２）＝π／２となる。この場合、２Ａ１Ａ２ｃｏｓψ＝０となるので、位相情報をコントラスト情報として得られない。その結果、標本Ｓの光学像はコントラストが無い像になる。
一方、非合焦状態では、瞳面の中心では波面収差量はゼロであるが、瞳面の中心から離れた位置では波面収差が発生する。ここで、波面収差は参照波面に対する実際の波面のずれで、このずれは位相のずれになる。そのため、波面収差が発生している範囲内に、１次回折光の位置があると、１次回折光の位相は、本来持っている位相に波面収差量が加わったものになる。このように、標本Ｓの位置を合焦位置からずらすことで、１次回折光の位相を変化させられる。
そこで、０次回折光における波面収差量をゼロにしたままで、１次回折光における波面収差量を−λ／４にする。上述のように、波面収差量に（２π／λ）を乗じた値は位相量であるので、非合焦時は、０次回折光については位相に変化は生じないが、１次回折光については位相に変化が生じる。具体的には、１次回折光では、もともとの位相の遅れπ／２に加えて、更に位相がλ／４×（２π／λ）＝π／２遅れる。１次回折光の位相は、０次回折光の位相に対してπ遅れた状態になるので、ψ＝０−（−π）＝πとなる。この場合、２Ａ１Ａ２ｃｏｓψ≠０となるので、位相情報がコントラスト情報として得られる。その結果、標本Ｓの光学像は、コントラストを明らかに持った像になる。よって、観察者は標本Ｓ（標本Ｓの像）を明瞭に観察できる。
このように、基本構成では、標本Ｓの位置と合焦位置とが異なる状態で光学像を形成することで、コントラストを有する光学像が形成される。そのため、基本構成では、標本Ｓと反射部材６との間隔は、特に制限されない。
また、上述のように、基本構成では、従来の顕微鏡と同様に標本に対して透過照明を行うことができる。しかしながら、基本構成では、反射部材６のみが、ステージ４を挟んで結像光学系５と対向する位置に配置されている。すなわち、ステージ４を挟んで結像光学系５と対向する位置に、透過照明用の光源や光学系が配置されていない。
このようなことから、基本構成によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を厚みが制限されることなく観察可能で、しかも装置を小型にすることができる。
標本Ｓの観察の方法としては、例えば、光学像をそのまま目視で観察する方法や、電子画像に変換して観察する方法がある。
第１実施形態の標本観察装置では、光学像をそのまま目視で観察することができる。そのために、第１実施形態の標本観察装置は、上記の基本構成を備えると共に、プリズム１２、プリズム１３、リレー光学系１４、プリズム１５、双眼分割用プリズム１６及び接眼レンズ１７を有する。
標本Ｓからの光は、対物レンズ８とハーフミラー９を通過して、プリズム１２に入射する。プリズム１２で反射された光は結像レンズ１１で集光される。
標本Ｓの位置と合焦位置とが異なる状態では、位置Ｐにコントラストを有する光学像が形成される。標本Ｓの光学像からの光は、プリズム１３のミラー面で反射された後、リレー光学系１４とプリズム１５を通過して、双眼分割用プリズム１６に入射する。双眼分割用プリズム１６によって、右目用の光路と左目用の光路が形成される。右目用の光路と左目用の光路には、各々接眼レンズ１７が配置されている。
標本Ｓの像は、リレー光学系１４でリレーされ、リレーされた標本Ｓの像が接眼レンズ１７の近傍に形成される。これにより、観察者は標本Ｓの像を、両眼で観察することができる。
本実施形態の標本観察装置は、撮像装置と、画像処理装置と、を有し、撮像装置は光学像が形成された位置に配置され、画像処理装置は、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なる状態で得られる光学像から観察画像信号を生成することが好ましい。
図２は、第２実施形態の標本観察装置の構成を示す図である。図１と同じ構成については同じ番号を付し、詳細な説明は省略する。
第２実施形態の標本観察装置では、標本の光学像を電子画像に変換して観察することができる。そのために、標本観察装置２０は、上記の基本構成を備えると共に、ミラー２１と、撮像装置２２と、画像処理装置２３と、を有する。
標本Ｓからの光は、対物レンズ８とハーフミラー９を通過して、ミラー２１に入射する。ミラー２１で反射された光は結像レンズ１１で集光される。
標本Ｓの位置と合焦位置とが異なる状態では、位置Ｐにコントラストを有する光学像が形成される。位置Ｐには撮像装置２２が配置されているので、撮像装置２２によって標本Ｓの像が撮像される。撮像装置２２には、例えば、ＣＣＤやＣＭＯＳが用いられる。撮像装置２２によって、標本Ｓの画像データが取得される。取得された標本Ｓの画像データは、画像処理装置２３に送信される。
画像処理装置２３では、標本Ｓの画像データを用いて様々な処理を行い、観察画像信号を生成する。ここで、標本Ｓの画像データは、標本Ｓの位置と結像光学系の合焦位置とが異なる状態で取得されている。よって、画像処理装置２３では、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なる状態で得られる光学像から、観察画像信号が生成される。
第２実施形態の標本観察装置で得られた標本の電子画像を図３と図４に示す。図３は、エンハンス前の電子画像、図４は、エンハンス後の電子画像である。この電子画像の取得には、１０倍の対物レンズを使用している。また、対物レンズの開口数（ＮＡｏｂ）は０．２５、照明光の開口数（ＮＡｉｌｌ）は０．１３、波長（λ）は５５０ｎｍ、合焦位置からのずれ量は１０μｍである。また、標本の位置と反射部材の反射面との間隔（Ｄ）は１２ｍｍである。
上述のように、第１実施形態の標本観察装置や第２実施形態の標本観察装置（以下、「本実施形態の標本観察装置」という）では、反射部材が用いられている。反射部材の構成について説明する。
反射部材の構成例を図５に示す。反射部材６は、第１の保持部材２４に保持されている。第１の保持部材２４は第２の保持部材２５に保持されている。第２の保持部材２５は、ステージ４に固定されている。
第１の保持部材２４は、第２の保持部材２５に対して、紙面の上方向に移動可能になっている。よって、第１の保持部材２４を移動させることで、反射部材６と標本Ｓとの間隔を調整することができる。
また、容器１０は蓋１０ａを有していても良い。
反射部材の別の構成例を図６に示す。反射部材３０は箱状の部材であって、容器１０を覆うようにステージ４上に載置される。凹部の内面に反射膜３０ａが形成されている。凹部は、少なくとも１つの容器１０を覆う大きさを有する。図６では、３つの容器１０を覆う大きさを有している。
標本観察装置１や標本観察装置２０では、対物レンズ８を介して照明光を標本Ｓに照射している。しかしながら、対物レンズ８を介さずに照明光を標本Ｓに照射しても良い。図７は、別の照明方法を示す図である。
別の照明方法では、照明光学系４０は、光源２と、集光光学系４１と、を有する。照明光学系４０は、照明光学系４０の光軸が、標本Ｓの位置で、対物レンズ８（結像光学系）の光軸と交差するように配置されている。
対物レンズ８を介して照明光を標本Ｓに照射する場合、照明光と標本Ｓからの光（標本Ｓの光学像を形成する光）が、共にハーフミラー９で減光される。これに対して、照明光学系４０では、照明光と標本Ｓからの光は、共に減光されることがない。
本実施形態の標本観察装置は、以下の条件式（１）を満足することが好ましい。
１０≦Ｄ×ＮＡｏｂ２／λ≦１００００      （１）
ここで、
Ｄは、標本の位置と反射部材の反射面との間隔（ｍｍ）、
ＮＡｏｂは、結像光学系の標本側の開口数ｃ、
λは、照明光の波長域の中心波長（ｍｍ）、
である。
条件式（１）の下限値を下回ると、反射部材６が標本Ｓに近づきすぎてしまう。そのため、反射部材６に汚れやゴミが存在すると、これらの像が標本Ｓの像に重なってしまう。また、反射部材６の熱によって標本Ｓに損傷を与える可能性が高くなる。
条件式（１）の上限値を上回ると、反射部材６が標本Ｓから離れすぎてしまう。この場合、装置が大型化してしまう。また、照明光の光量損失が大きくなる。
なお、条件式（１）に代えて、以下の条件式（１’）を満足すると良い。
２０≦Ｄ×ＮＡｏｂ２／λ≦５０００      （１’）
さらに、条件式（１）に代えて、以下の条件式（１”）を満足するとなお良い。
４０≦Ｄ×ＮＡｏｂ２／λ≦２５００      （１”）
また、Ｄの好ましい上限値は４０ｍｍ、又は２０ｍｍである。Ｄの好ましい下限値は、１ｍｍ、２ｍｍ又は４ｍｍである。
また、本実施形態の標本観察装置は、以下の条件式（２）を満足することが好ましい。
４×ＮＡｉｌｌ×Ｄ＋Ａ＜Ｌ      （２）
ここで、
ＮＡｉｌｌは、照明光学系の標本側の開口数、
Ｄは、標本の位置と反射部材の反射面との間の距離（ｍｍ）、
Ａは、標本の位置での観察視野の直径（ｍｍ）、
Ｌは、標本の位置での照明光学系による照明範囲の直径（ｍｍ）、
観察視野の直径と照明範囲の直径は、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なる状態での直径、
である。
条件式（２）を満足することで、観察範囲を同じ開口数の照明光で照明することができる。光学像のコントラストは、照明光の開口数によって決まる。そのため、観察範囲を同じ開口数の照明光で照明できると、観察範囲内の各位置における像のコントラストにばらつきが生じることを少なくできる。
ＮＡｉｌｌ、Ｄ及びＡを図８に示す。上述のように、観察視野の直径と照明範囲の直径は、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なる状態での直径である。よって、図８に示す対物レンズ８の位置は、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なる状態での位置である。対物レンズ８の後側焦点位置ｆＲ（対物レンズ８の瞳位置）も、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なる状態になっているときの位置である。この位置ｆＲに光源の像が形成されている。
結像光学系５の視野全体が同じ開口数の照明光で照明されている場合、観察視野は結像光学系５の視野全体と一致する。よって、視野全体の像を、接眼レンズを介して観察するか、又は撮像装置２２で撮像して視野全体の画像を用いて観察を行えば良い。
一方、結像光学系５の視野のうち、一部の領域が同じ開口数の照明光で照明されている場合、この一部の領域が観察視野になる。そこで、視野全体の像を撮像装置２２で撮像し、この一部の領域に対応する画像、すなわち、条件式（２）を満足する領域の画像のみを用いて観察を行えば良い。
また、本実施形態の標本観察装置では、反射部材は、結像光学系の瞳と共役な位置とは異なる位置に配置されることが好ましい。
標本Ｓを通過した照明光を反射して、再び標本Ｓに照射する方法として、標本Ｓと反射部材６の間にレンズを配置する方法がある。この方法では、レンズの前側焦点位置と標本Ｓの位置と一致させ、レンズの後側焦点位置と反射部材６とを一致させることが好ましい。これにより、反射部材６は結像光学系５の瞳（対物レンズ８の瞳）と共役になる。よって、反射部材６で反射された後の照明光は、最初に標本Ｓを通過した照明光と同じように標本に照射される。しかしながら、この方法では、装置が大型化する。
そこで、反射部材は、結像光学系の瞳と共役な位置とは異なる位置に配置すると、レンズが不要になるので、装置を小型化することができる。すなわち、ステージ４を挟んで結像光学系５と対向する側には反射部材６のみ配置されることになるので、装置を小型化することができる。
また、本実施形態の標本観察装置では、反射部材は、正の屈折力を有することが好ましい。
上述のように、標本Ｓは容器１０に保持されている。標本Ｓが生細胞の場合、細胞は培養液のような液体と共に容器１０で保持されている。容器１０としては、シャーレやマイクロウェルプレートがある。図９Ａはシャーレを示す図である。図９Ｂはマイクロウェルプレートを示す図である。図９Ｃは１つのマイクロウェルを示す図である。
図９Ａに示すように、シャーレ１０は１つの凹部を有し、この凹部で、細胞や液体が保持される。シャーレ１０では、凹部の面積が広いため、凹部内のほとんどの位置で液面は平坦である。
これに対して、図９Ｂに示すように、マイクロウェルプレート５０は複数の凹部を有する。加えて、図９Ｃに示すように、マイクロウェルプレート５０では、凹部の面積が狭いため、１つのマイクロウェルにおける液面は凹形状になる。そのため、液体の部分（以下、「培地」という）をレンズと見なすと、培地は負レンズの作用を持つ。培地が負レンズの作用を持つと、培地から出射する光線の角度は、培地に入射したときの光線の角度と異なる。
図１０Ａは、対物レンズ側から培地を通過する光線と、反射部材側から培地を通過する光線の様子を示す図であって、反射部材が平面の場合を示す図である。図１０Ｂは、対物レンズ側から培地を通過する光線と、反射部材側から培地を通過する光線の様子を示す図であって、反射部材が正屈折力を有する揚合を示す図である。
照明光には様々な角度の光線が含まれている。図１０Ａと図１０Ｂでは、反射部材側から培地を通過する光線が光軸と平行な光線を実線で示し、光軸と交差する光線を破線で示している。また、面Ｓ１は、培地６０の２つの面のうちの対物レンズ側の面、面Ｓ２は反射部材側の面である。
反射部材が平面の場合について説明する。図１０Ａに示すように、光線Ｌ１は、対物レンズ側から培地６０に入射する光線であって、光軸と平行な光線である。面Ｓ１は平面なので、光線Ｌ１は面Ｓ１で屈折されること無く、培地６０内に入射する。よって、培地６０内を通過する光線Ｌ２も、光軸と平行な光線になっている。
光線Ｌ２は面Ｓ２を通過して培地６０から出射する。面Ｓ２は凹面なので、光線Ｌ２は面Ｓ２で屈折される。その結果、光軸から離れる方向に、光線Ｌ３が培地６０から出射する。
光線Ｌ３は反射部材６１に入射し、反射面で反射される。反射部材６１の反射面は平面なので、反射面で反射された後の光束は、光軸から更に離れる方向に出射する。反射面で反射された光線Ｌ３は面Ｓ２で屈折され、光線Ｌ４となって培地６０内を通過する。
光線Ｌ２は光軸と平行な光線であるが、光線Ｌ４は光軸と交差する光線である。よって、光線Ｌ４と光線Ｌ２とは一致しない。また、光線Ｌ４は光軸から離れる方向に出射する。
次に、光線Ｌ５は、対物レンズ側から培地６０に入射する光線であって、光軸と交差する光線である。面Ｓ１は平面であるが、光線Ｌ５は面Ｓ１に垂直に入射しない。そのため、光線Ｌ５は面Ｓ１で屈折されて培地６０内に入射する。培地６０内を通過する光線Ｌ６も、光軸と交差する光線になっている。
光線Ｌ６は面Ｓ２を通過して培地６０から出射する。面Ｓ２は凹面なので、光線Ｌ６は面Ｓ２で屈折される。その結果、光軸から離れる方向に、光線Ｌ７が培地６０から出射する。
光線Ｌ７は反射部材６１に入射し、反射面で反射される。反射部材６１の反射面は平面なので、反射面で反射された後の光束は、光軸から更に離れる方向に出射する。反射面で反射された光線Ｌ７は面Ｓ２で屈折され、光線Ｌ８となって培地６０内を通過する。
光線Ｌ６も光線Ｌ８も、共に光軸と交差する光線である。ただし、光軸とのなす角度は、光線Ｌ８の方が光線Ｌ６よりも非常に大きくなっている。よって、光線Ｌ８と光線Ｌ６とは一致しない。また、光線Ｌ８は光軸から離れる方向に出射する。
このように、反射部材が平面の場合、反射部材で反射された照明光は、反射部材に入射したときよりも広がって標本Ｓに向かう。そのため、照明効率が低下する。
これに対して、本実施形態の標本観察装置では、反射部材が正屈折力を有している。反射部材が正屈折力を有する場合について説明する。図１０Ｂに示すように、反射部材６２の反射面は曲面になっている。この場合も、光線Ｌ３は反射部材６２に入射し、反射面で反射される。ただし、反射部材６２の反射面は正屈折力を有する。そのため、反射面で反射された後の光束は、光線Ｌ３に入射方向と正反対の方向に出射する。反射面で反射された光線Ｌ３は面Ｓ２で屈折され、光線Ｌ４となって培地６０内を通過する。反射面で反射された光線Ｌ３の光路は、反射面で反射される前の光線Ｌ３の光路と同一である。よって、光線４は光線Ｌ２と一致する。
一方、光線Ｌ７は反射部材６２に入射し、反射面で反射される。反射面で反射された後の光束は、光軸から更に離れる方向に出射する。ただし、反射部材６２の反射面は正屈折力を有する。そのため、光軸から離れる度合いは、反射部材６１に比べて小さくなる。反射面で反射された光線Ｌ７は面Ｓ２で屈折され、光線Ｌ８となって培地６０内を通過する。
光線Ｌ６も光線Ｌ８も、共に光軸と交差する光線である。ただし、光軸とのなす角度は、光線Ｌ８と光線Ｌ６とで大きく異ならない。よって、光線Ｌ６と光線Ｌ８とは一致しないものの、その差は非常に小さい。
また、θ１とθ２の差を比較すると、反射部材が正屈折力を有する場合の方が、反射部材が平面の場合に比べて、小さくなっている。θ１とθ２は、面Ｓ１から出射する光線と光軸とのなす角である。
このように、本実施形態の標本観察装置では、反射部材で反射された照明光は、反射部材に入射したときと同じ広さで標本Ｓに向かう。そのため、照明効率が低下しない。
また、光軸に近い光線と遠い光線の角度変化を少なくすることができる。従って、光軸上と光軸外の両方について、反射部材へ入射する光路と反射後の光路とを、一致した状態により近づけることができる。
マイクロウェルプレート５０を図７に示す別の照明方法で照明する場合も、反射部材は正屈折力を有することが好ましい。図１１は、別の照明方法における光線の様子を示す図であって、対物レンズ側から培地を通過する光線と、反射部材側から培地を通過する光線の様子を示す図である。
図１１に示すように、光線Ｌ１と光線Ｌ５は、対物レンズ側から培地６０に入射する光線であって、光軸と交差する光線である。面Ｓ１は平面であるが、光線Ｌ１と光線Ｌ５は面Ｓ１に垂直に入射しない。そのため、光線Ｌ１と光線Ｌ５は面Ｓ１で屈折されて培地６０内に入射する。培地６０内を通過する光線Ｌ２と光線Ｌ６も、光軸と交差する光線になっている。
光線Ｌ２と光線Ｌ６は、面Ｓ２を通過して培地６０から出射する。面Ｓ２は凹面なので、光線Ｌ２と光線Ｌ６は面Ｓ２で屈折される。培地６０からは、光線Ｌ３と光線Ｌ７が出射する。このとき、光線Ｌ７は光線Ｌ３から離れる方向に進む。すなわち、面Ｓ１に入射した平行光束は、発散光束となって面Ｓ２から出射する。
光線Ｌ３と光線Ｌ７は反射部材６２に入射し、反射部材６２の反射面で反射される。反射面で反射された光線Ｌ３と光線Ｌ７は面Ｓ２で屈折され、光線Ｌ４と光線Ｌ８となって培地６０内を通過する。
ここで、反射部材６２の反射面は正屈折力を有する。そのため、反射面に入射した発散光束は、反射面における収斂作用によって、発散の度合いが小さくなる。そのため、光線Ｌ２と光軸とのなす角の絶対値と光線Ｌ４と光軸とのなす角の絶対値は、ほぼ等しくなる。光線Ｌ６と光線Ｌ８も同様である。
このように、反射部材が正屈折力を有することで、別の照明方法においても、反射部材で反射された照明光は、反射部材に入射したときと同じ広さで標本Ｓに向かう。そのため、照明効率が低下しない。
また、本実施形態の標本観察装置では、反射部材の反射率は５０％以上であることが好ましい。
このようにすることで、コントラストの高い像が得られる。
また、本実施形態の標本観察装置では、反射部材は、入射する照明光の開口数に対して反射後の照明光の開口数を小さくする反射角制限構造を有することが好ましい。
このようにすることで、照明光の開口数が制限できる。そのため、コントラストの高い像が得られる。また、迷光を防ぐこともできるので、コントラストの高い像が得られる。
また、容器１０にマイクロウェルプレートが用いられた場合、液面は凹形状になる。ウェルの縁では液面の高さが中央に比べて高くなる。そこで、この縁に照射される照明光の開口数を制限する特性を反射角制限構造に持たせれば、ウェルの縁が見やすくなる。
反射角制限構造を有する素子としては、例えば、ルーバーフィルムがある。ルーバーフィルムでは、光透過層と光遮断層が交互に積層されている。このようなルーバーフィルムを反射部材に貼り付ければ良い。
また、本実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（４）を満足することが好ましい。
０．０１＜ＮＡｉｌｌ／ＮＡｏｂ＜１      （４）
ここで、
ＮＡｉｌｌは、照明光学系の標本側の開口数、
ＮＡｏｂは、結像光学系の標本側の開口数、
である。
条件式（４）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
条件式（４）の下限値を下回ると、照明光学系の標本側の開口数が小さくなりすぎる。この場合、照明光の光量不足や、照明むらが大きくなる。また、電子画像において、カバーガラスの汚れやゴミが目立つようになる。
条件式（４）の上限値を上回ると、照明光学系の標本側の開口数が大きくなりすぎる。この場合、光軸に対して斜めから入射する照明光が増加する。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。
なお、条件式（４）に代えて、以下の条件式（４’）を満足すると良い。
０．０２＜ＮＡｉｌｌ／ＮＡｏｂ＜０．９      （４’）
さらに、条件式（４）に代えて、以下の条件式（４”）を満足するとなお良い。
０．０３＜ＮＡｉｌｌ／ＮＡｏｂ＜０．８      （４”）
また、本実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（５）を満足することが好ましい。
０．１μｍ＜ΔＺ×ＮＡｏｂ２＜３０μｍ      （５）
ここで、
ΔＺは、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差、
ＮＡｏｂは、結像光学系の標本側の開口数、
である。
条件式（５）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
条件式（５）の下限値を下回ると、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差が小さくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が小さくなる。持に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも小さくなる。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。
条件式（５）の上限値を上回ると、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差が大きくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が大きくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも大きくなる。また、光学像が大きくぼやけてしまう。その結果、解像度の高い電子画像を得るのが難しくなる。
なお、条件式（５）に代えて、以下の条件式（５’）を満足すると良い。
０．２μｍ＜ΔＺ×ＮＡｏｂ２＜２５μｍ      （５’）
さらに、条件式（５）に代えて、以下の条件式（５”）を満足するとなお良い。
０．３μｍ＜ΔＺ×ＮＡｏｂ２＜２０μｍ      （５”）
また、本実施形態の標本観察装置では、以下の条件式（６）を満足することが好ましい。
０．０５μｍ＜ΔＺ×ＮＡｉｌｌ＜１０μｍ      （６）
ここで、
ΔＺは、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差、
ＮＡｉｌｌは、照明光学系の標本側の開口数、
である。
条件式（６）を満足することで、明視野観察の状態でありながら、より明瞭に無色透明な標本を観察できる。
条件式（６）の下限値を下回ると、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差が小さくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が小さくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも小さくなる。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。
条件式（６）の上限値を上回ると、結像光学系の合焦位置と標本の位置との差が大きくなりすぎる。この場合、回折光に加わる波面収差量が大きくなる。特に、１次回折光に加わる波面収差量がλ／４よりも大きくなる。また、光学像が大きくぼやけてしまう。その結果、解像度の高い電子画像を得るのが難しくなる。また、条件式（６）の上限値を上回ると、照明光学系の標本側の開口数が大きくなりすぎる。この場合、光軸に対して斜めに入射する照明光が増加する。そのため、コントラストの良い電子画像を得るのが難しくなる。
なお、条件式（６）に代えて、以下の条件式（６’）を満足すると良い。
０．１μｍ＜ΔＺ×ＮＡｉｌｌ＜８μｍ      （６’）
さらに、条件式（６）に代えて、以下の条件式（６”）を満足するとなお良い。
０．２μｍ＜ΔＺ×ＮＡｉｌｌ＜６μｍ      （６”）
また、本実施形態の標本観察装置では、照明光が単色光であることが好ましい。
このようにすることで、結像光学系における色収差の発生を少なくすることができる。そのため、コントラストの高い像が得られる。
また、本実施形態の標本観察装置は、結像光学系を複数備えることが好ましい。
図１２は、結像光学系を複数備えた標本観察装置を示す図である。標本観察装置７０は、結像光学系を備えた観察ユニットを複数備える。１つの観察ユニットは、光源７１と、照明光学系７２と、結像光学系７３と、を有する。照明光学系７２は、集光光学系７４と、ハーフプリズム７５と、対物レンズ７６と、を有する。結像光学系７３は、対物レンズ７６と、ハーフプリズム７５と、結像レンズ７７と、を有する。更に、観察ユニットは、撮像装置７８を有する。
観察ユニットの数は、マイクロウェルプレート８０の一列に含まれるマイクロウェル８１の数と等しい。図１２では、一列に含まれるマイクロウェル８１の数は４であるので、観察ユニットの数も４である。また、観察ユニットは、マイクロウェル８１の並びと同様に、一列に配置されている。
標本観察装置７０では、観察ユニットを、観察ユニットの配列方向と直交する方向に移動させることで、全てのマイクロウェル８１を観察することができる。なお、図１２では、反射部材は図示してないが、反射部材はマイクロウェルプレート８０の上に配置されている。よって、標本観察装置７０においても、標本Ｓの位置と合焦位置とが異なる状態で光学像を形成することで、コントラストを有する光学像が形成される。
また、本実施形態の標本観察方法は、標本の電子画像を取得する取得ステップと、電子画像の信号から直流成分を減算する減算ステップと、を有し、取得ステップは明視野観察の状態で、且つ、標本を透過した照明光を再び標本に向けて照射した状態で行われ、減算ステップにおける電子画像は、所定の状態で取得された画像であって、所定の状態では、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっており、合焦位置は、光軸上の像点の位置で標本の持つ空間周波数における０次回折光と１次回折光の位相が等しくなる位置であることを特徴とする。
第１実施形態の標本観察方法について、図１３を用いて説明する。図１３は、第１実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
第１実施形態の標本観察方法は、取得ステップＳ１０と、減算ステップＳ２０とを有する。これにより、第１実施形態の標本観察方法では、明瞭な電子画像が得られる。
第１実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０の実行の前に、観察に必要な準備を行う。この準備では、標本の上方に反射部材を配置する。反射部材の配置は、図５や図６に示すようにすれば良い。
反射部材の配置が終了すると、所定の状態にする。所定の状態は、標本の位置と結像光学系の合焦位置とが異なっている状態である。合焦位置は、光軸上の像点の位置で標本の持つ空間周波数における０次回折光と１次回折光の位相が等しくなる位置である。
所定の状態にした後、取得ステップＳ１０が実行される。取得ステップＳ１０では、標本の電子画像（以下、「電子画像」という）の取得が行われる。標本の像（光学像）は、結像光学系によって形成される。電子画像の取得では、この像をＣＣＤやＣＭＯＳのような撮像素子で撮像する。撮像によって、標本の像は電子画像（デジタルデータ）に変換される。なお、標本の像は明視野観察の状態で形成されているので、電子画像の取得も明視野観察の状態で行われる。
取得ステップＳ１０が終わると、減算ステップＳ２０が実行される。減算ステップＳ２０では、電子画像の信号に対して直流成分（バイアス成分）の減算が行われる。
上述のように、取得ステップＳ１０では、標本の位置と合焦位置とが異なっている。そのため、２Ａ１Ａ２ｃｏｓψ≠０になる。この場合、像面における光の強度Ｉは以下のようになる。
Ｉ＝Ａ１２＋Ａ２２＋２Ａ１Ａ２ｃｏｓψ
ここで、Ａ１２＋Ａ２２は標本の像における直流成分（バイアス成分）、すなわち、電子画像の信号のうちの直流成分（バイアス成分）を表している。このうち、０次回折光の振幅Ａ１２は、非常に大きな値を持つ。そこで、減算ステップＳ２０で、Ａ１２の値を小さくする。このようにすることで、Ａ１２＋Ａ２２の値に対して２Ａ１Ａ２ｃｏｓψの値を相対的に大きくできる。その結果、標本（標本の像）を明瞭に観察できる。
減算ステップＳ２０における電子画像は、所定の状態で取得された画像である。所定の状態では、少なくとも、標本の位置と合焦位置とが異なっているので、この状態ではコントラストを有する電子画像が得られる。減算ステップＳ２０を実行することで、コントラストをより高めることができる。
以上のように、第１実施形態の標本観察方法によれば、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を厚みが制限されることなく、しかも明瞭に観察できる。
また、本実施形態の標本観察方法は、減算ステップよりも後に増幅ステップを有し、増幅ステップでは、減算ステップ後の電子画像の信号を増幅することが好ましい。
第２実施形態の標本観察方法について、図１４を用いて説明する。図１４は、第２実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
第２実施形態の標本観察方法は、図１４に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、増幅ステップＳ３０を有する。これにより、第２実施形態の標本観察方法では、より明瞭な電子画像が得られる。
上述のように、Ａ１２＋Ａ２２は標本の像の直流成分、すなわち、電子画像の信号のうちの直流成分を表している。減算ステップＳ２０では、Ａ１２の値を小さくすることで、２Ａ１Ａ２ｃｏｓψの値をＡ１２＋Ａ２２の値に対して相対的に大きくしている。
これに対して、第２実施形態の標本観察方法では、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０の終了後に、増幅ステップＳ３０が実行される。増幅ステップＳ３０では、２Ａ１Ａ２ｃｏｓψの値を大きくしている（増幅している）。このようにすることで、Ａ１２＋Ａ２２の値に対して２Ａ１Ａ２ｃｏｓψの値を相対的により大きくできる。その結果、標本（標本の像）をより明瞭に観察できる。
また、本実施形態の標本観察方法は、位相量を計算するステップを有することが好ましい。
第３実施形態の標本観察方法について、図１５を用いて説明する。図１５は、第３実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
第３実施形態の標本観察方法は、図１５に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、位相量を計算するステップＳ４０を有する。これにより、第３実施形態の標本観察方法では、標本における位相量を求めることができる。
また、本実施形態の標本観察方法は、補正用電子画像を取得するステップを有し、補正用電子画像は、標本収納部に標本が存在しない状態で取得した電子画像であり、減算ステップは、補正用電子画像の信号を、標本の電子画像の信号から減算することが好ましい。
第４実施形態の標本観察方法について、図１６を用いて説明する。図１６は、第４実施形態の標本観察方法のフローチャートである。
第４実施形態の標本観察方法は、図１６に示すように、取得ステップＳ１０と減算ステップＳ２０に加え、更に、補正用電子画像を取得するステップＳ５０と、電子画像から補正用電子画像を減算するステップＳ５０と、を有する。
第４実施形態の標本観察方法では、標本上に反射部材を配置する前に、補正用電子画像を取得するステップＳ５０が実行される。ステップＳ５０では、標本上に反射部材が配置されていない。この場合、照明光の大部分は標本を通過したままになるので、照明光の大部分は、再び結像光学系に入射することはない。ただし、照明光の一部は、容器の底面で反射されるので、容器の底面からの反射光が結像光学系に入射する。
容器の底面からの反射光は、標本の情報を持たない光なので、不要な光である。容器の底面からの反射光は、標本上に反射部材を配置した場合にも生じるので、標本の観察時には、バックグラウンドとして標本の像に重畳する。上述のように、容器の底面からの反射光は不要な光なので、除去することが好ましい。
そこで、ステップＳ５０を実行する。この場合、光学像は、容器の底面からの反射光だけで形成されている。そこで、この光学像を撮像して電子画像を取得し、取得した電子画像を補正用電子画像とする。
上述のように、容器の底面からの反射光は、バックグラウンドとして標本の像に重畳している。そこで、ステップＳ６０を実行する。ステップＳ６０では、標本の電子画像から補正用電子画像を減算する。このようにすることで、補正用電子画像の信号が、標本の電子画像の信号から減算されるので、標本の像に重畳していたバックグラウンドを除去することができる。その結果、標本（標本の像）をより明瞭に観察できる。また、位相量を求める場合は、より正確な位相量を求めることができる。
また、本実施形態の標本観察方法は、細胞の個数を計測するステップを有することが好ましい。
このようにすることで、細胞の個数や密度を計測することができる。
また、標本収納部は、収納容器と、保護部材と、を有し、保護部材は、収納容器の上方に位置し、保護部材は、収納容器の凹部と対向する領域に反射領域を有することが好ましい。
図１７Ａは、反射領域を有する標本収納部の例であって、標本収納部がシャーレの場合を示す図である。図１７Ｂは、反射領域を有する標本収納部の例であって、標本収納部がマイクロウェルプレートの場合を示す図である。
図１７Ａに示すように、標本収納部はシャーレであって、収納容器１０と保護部材９０とで構成されている。保護部材９０は蓋であって、収納容器１０の上に位置する。そして、保護部材９０の内側に反射領域９０ａが形成されている。
また、図１７Ｂに示すように、標本収納部はマイクロウェルプレートであって、収納容器５０と保護部材９１とで構成されている。保護部材９１は蓋であって、収納容器５０の上に位置する。そして、保護部材９１の内側に反射領域９１ａが形成されている。
また、標本収納部では、結像光学系側の面の反射率が８％以下であることが好ましい。
本実施形態の標本観察装置では、標本収納部を用いて標本観察を行う。標本収納部は、図１における容器１０である。容器１０としては、シャーレやマイクロウェルプレートがある。
標本観察時、シャーレやマイクロウェルプレートは、ステージ４上に載置される。この場合、シャーレの底面やマイクロウェルプレートの底面が、ステージ４の開口部に位置する。すなわち、シャーレの底面やマイクロウェルプレートの底面は、結像光学系５側と対向している。
照明光は、ステージ４の開口部を介して標本Ｓに照射されるので、シャーレの底面やマイクロウェルプレートの底面に照明光が照射される。このとき、照明光のほとんどは、シャーレの底面やマイクロウェルプレートの底面を透過する。
しかしながら、照明光の一部は、シャーレの底面やマイクロウェルプレートの底面で反射される。この反射光は、標本Ｓの像に重畳する。そのため、反射光の光量が多いと、標本Ｓの像のコントラストが低下する。
そこで、標本収納部の結像光学系側の面の反射率を８％以下にすることで、標本Ｓの像のコントラストの低下を防止できる。
また、標本収納部は標本を収納する凹部を有し、標本観察装置は以下の条件式（７）を満足することが好ましい。
０．７＜（｜ｆ１｜＋ｘ）／ｆ２＜  １．４      （７）
ここで、
ｆ１は、凹部に収納された液体をレンズと見なしたときのレンズの焦点距離、
ｆ２は、反射部材の反射面の焦点距離、
ｘは、凹面から反射面までの距離、
である。
上述のように、マイクロウェルプレートでは、凹部の面積が狭いため、液面は凹形状になる。そこで、液体の部分、すなわち培地をレンズと見なすと、培地は負レンズの作用を持つ。一方、反射部材は正レンズになる。
条件式（７）を満足することで、反射部材で反射された照明光は、反射部材に入射したときと同じ広さで標本Ｓに向かう。そのため、照明効率が低下しない。
また、光軸に近い光線と遠い光線の角度変化を少なくすることができる。従って、反射した照明の角度が全範囲近くなる。
また、ｆ２＝｜ｆ１｜＋ｘの時、培地と反射部材とで構成される光学系の配置は、アフォーカル光学系の配置になる。この場合、光線は反射部材に反射する前後で同じ角度になる。よって、光軸上と光軸外の両方について、反射部材へ入射する光路と反射後の光路とを、一致した状態により近づけることができる。
本実施形態の標本観察装置では、反射部材の透過率は３％以上であることが好ましい。
このようにすることで、反射部材側から照明を行うことができる。そのため、例えば、位相差観察を行うことができる。
本実施形態の標本観察装置では、反射部材は波長により透過率と反射率が変化することが好ましい。
このようにすることで、反射部材側から照明を行うことができる。そのため、例えば、反射波長帯域の光で、本実施形態の標本観察装置における標本観察ができる上に、透過波長帯域の光で位相差観察を行うことができる。
なお、本発明は、その趣旨を逸脱しない範囲で様々な変形例をとることができる。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
以上のように、本発明は、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を厚みが制限されることなく観察が可能で、しかも小型な標本観察装置に適している。また、本発明は、明視野観察の状態でありながら、無色透明な標本を厚みが制限されることなく観察が可能な標本観察方法に適している。
【符号の説明】
【００１０】
１  標本観察装置
２  光源
３  照明光学系
４  ステージ
５  結像光学系
６  反射部材
６ａ  反射膜
７  集光光学系
８  対物レンズ
９  ハーフミラー
１０  容器（シャーレ、収納容器）
１０ａ  蓋
１１  結像レンズ
１２、１３、１５  プリズム
１４  リレー光学系
１６  双眼分割用プリズム
１７  接眼レンズ
２０  標本観察装置
２１  ミラー
２２  撮像装置
２３  画像処理装置
２４  第１の保持部材
２５  第２の保持部材
３０  反射部材
３０ａ  反射膜
４０  照明光学系
４１  集光光学系
５０  マイクロウェルプレート（収納容器）
６０  培地
６１  反射部材（平面）
６２  反射部材（曲面）
７０  標本観察装置
７１  光源
７２  照明光学系
７３  結像光学系
７４  集光光学系
７５  ハーフプリズム
７６  対物レンズ
７７  結像レンズ
７８  撮像装置
８０  マイクロウェルプレート
８１  マイクロウェル
９０、９１  保護部材
９０ａ、９１ａ  反射領域
Ｓ  標本
Ｐ  位置
Ｓ１  対物レンズ側の面
Ｓ２  反射部材側の面
Ｌ１〜Ｌ８  光線
θ１、θ２  面Ｓ１から出射する光線と光軸とのなす角
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【国際調査報告】
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