(57)【要約】  乳酸菌本来の優れた生残能を誘導発現させるべく、種々のストレスを賦与しながら培養する独自培養法により乳酸菌を育種し活性菌体とすることを特徴とし、そのような活性菌体を得ることができる培養法、及び培養により得られた菌本来の生残能を誘導発現させた乳酸菌固体発酵物の提供。  乳酸菌固体発酵物の製造方法であって、（１）  乳酸菌を、液体培地を用いて培養する液体培養工程、（２）  工程(１)で培養した乳酸菌を固形食材混合物である固体培地で培養する、１工程又は複数工程からなる固体培養工程であって、固体培地は少なくとも炭酸塩及び胚芽、並びに胚芽麹及び／又はポリフェノール含有植物体を含み、固体培養の最終工程で用いる固体培地はポリフェノール含有植物体を含む、乳酸菌を固体培地表面で増殖させる固体培養工程、を含み、乳酸菌固体発酵物が工程(２)で用いた固体培地表面に前記乳酸菌が含有されている乳酸菌固体発酵物である、製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌固体発酵物の製造方法であって、
（１）  乳酸菌を、液体培地を用いて培養する液体培養工程、
（２）  工程(１)で培養した乳酸菌を固形食材混合物である固体培地で培養する、１工程又は複数工程からなる固体培養工程であって、固体培地は少なくとも炭酸塩及び胚芽、並びに胚芽麹及び／又はポリフェノール含有植物体を含み、固体培養の最終工程で用いる固体培地はポリフェノール含有植物体を含む、乳酸菌を固体培地表面で増殖させる固体培養工程、
を含み、乳酸菌固体発酵物が工程(２)で用いた固体培地表面に前記乳酸菌が含有されている乳酸菌固体発酵物である、製造方法。
【請求項２】
工程（２）の固体培養工程を複数の工程で行い、後の固体培養工程で用いる固体培地中のポリフェノール含有植物体の含有量が、それより前の固体培養工程で用いる固体培地中のポリフェノール含有植物体の含有量よりも多い、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
工程（１）の液体培養及び工程（２）の固体培養工程を経るにつれ、段階的に強度を高くした複数のストレスを負荷し、それらのストレスに耐性を有する乳酸菌の生残率を増加させる、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
乳酸菌固体発酵物の製造方法であって、
（１）  乳酸菌を、液体培地を用いて培養する液体培養工程、
(２−i)  工程(１)で培養した乳酸菌を、少なくとも炭酸塩及び胚芽、並びに胚芽麹及び／又はポリフェノール含有植物体を含む固形食材混合物である固体培地で培養し、乳酸菌を固体培地表面で増殖させる工程、
(２−ii)  工程(２−i)で培養した乳酸菌を、少なくとも炭酸塩、胚芽、及びポリフェノール含有植物体を含む固形食材混合物である固体培地であって、ポリフェノール含有植物体の含量が工程(２−i)で用いた固体培地よりも多い固体培地で培養し、乳酸菌を固体培地表面で増殖させる工程、
の３工程を含み、乳酸菌固体発酵物が工程(２−ii)で用いた固体培地表面に前記乳酸菌が含有されている乳酸菌固体発酵物である、請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
工程（２−ii）において、固体培地にさらに胚芽麹が含まれる、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
工程(１)、(２−i)及び(２−ii)の工程を経るにつれ、段階的に強度を高くした複数のストレスを負荷し、それらのストレスに耐性を有する乳酸菌の生残率を増加させる、請求項４又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
工程(１)で用いる液体培地が、少なくとも炭酸塩、胚芽麹、窒素源及び炭素源を含む液体培地である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
工程(１)の液体培養工程が多段階の培養工程で行われ、多段階の培養工程の各段階の工程、又は多段階の培養工程のいずれか１工程において、少なくとも炭酸塩、胚芽麹、窒素源及び炭素源を含む液体培地を用いる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
工程(１)で用いる液体培地に含まれる胚芽麹が、脱脂米胚芽、脱脂小麦胚芽、脱脂コーン胚芽の１種又は２種以上を含む、請求項７又は８に記載の製造方法。
【請求項１０】
工程(１)で用いる液体培地に含まれる炭酸塩が、炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムの混合物である、請求項７又は８に記載の製造方法。
【請求項１１】
固体培養工程で用いる固体培地に含まれる胚芽が、１種又は２種以上の穀物の脱脂胚芽又は胚芽を含む脱脂穀物である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
胚芽が、脱脂米胚芽、脱脂小麦胚芽、脱脂コーン胚芽、その他の穀物由来の脱脂胚芽及びその他の穀物の胚芽を含む脱脂穀物からなる群から選択される１種又は２種である、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
胚芽を含む脱脂穀物が脱脂大豆である、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
固体培養工程で用いる固体培地に含まれるポリフェノール含有植物体が、果実、野菜、穀類、茶葉、海藻及び香辛料からなる群から選択される１種以上の植物体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
固体培養工程で用いる固体培地に含まれる胚芽麹がアスペルギルス属に属する麹菌の脱脂胚芽麹である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
工程(２−ii)で用いる固体培地に、さらに塩化ナトリウムが含まれる、請求項４〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
固体培養工程で用いる固体培地に含まれる炭酸塩が、炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムの混合物である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
固体培養工程で用いる固体培地が炭酸塩及び胚芽、並びに胚芽麹及び／又はポリフェノール含有植物体の均質混合物と水との混合固体培地である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１９】
工程(１)の液体培養により得られた乳酸菌菌体を、工程(２)で用いる固体培地の表面に接種する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２０】
工程(１)の液体培養により得られた乳酸菌菌体を、工程(２−i)で用いる固体培地の表面に接種し、さらに工程(２−i)の固体培養により得られた乳酸菌菌体を工程(２−ii)で用いる固体培地の表面に接種する、請求項４〜１９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２１】
少なくとも炭酸塩、胚芽、及びポリフェノール含有植物体を含む固形食材混合物の表面に発酵菌が含有されている、乳酸菌固体発酵物。
【請求項２２】
さらに、固形食材混合物が胚芽麹を含む、請求項２１に記載の乳酸菌固体発酵物。
【請求項２３】
胚芽が、１種又は２種以上の穀物の脱脂胚芽又は胚芽を含む脱脂穀物である、請求項２１又は２２に記載の乳酸菌固体発酵物。
【請求項２４】
胚芽が、脱脂米胚芽、脱脂小麦胚芽、脱脂コーン胚芽、その他の穀物由来の脱脂胚芽及びその他の穀物の胚芽を含む脱脂穀物から選択される１種又は２種である、請求項２３記載の乳酸菌固体発酵物。
【請求項２５】
胚芽を含む脱脂穀物が脱脂大豆である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の乳酸菌固体発酵物。
【請求項２６】
ポリフェノール含有植物体が、果実、野菜、穀類、茶葉、海藻及び香辛料からなる群から選択される１種以上の植物体である、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の乳酸菌固体発酵物。
【請求項２７】
胚芽麹がアスペルギルス属に属する麹菌の脱脂胚芽麹である、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の乳酸菌固体発酵物。
【請求項２８】
固形食材混合物に、さらに塩化ナトリウムが含まれる、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の乳酸菌固体発酵物。
【請求項２９】
炭酸塩が、炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムの混合物である、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の乳酸菌固体発酵物。
【請求項３０】
請求項２１〜２９のいずれか１項に記載の乳酸菌固体発酵物を含む、穀物、ポリフェノールを含む植物体及び乳酸菌を含む食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストレス耐性が大きくなるように、菌本来の生残能を誘導発現させた乳酸菌の培養方法に関する
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、乳酸を大量に産生する細菌群の総称であり、各種発酵食品の他、酒類、醸造製品、漬物、果実加工品などの製造に関与するなど、古くから人類は乳酸菌の恩恵を受けてきた。【０００３】
近年においては、乳酸菌は、腸内腐敗菌の抑制作用や整腸作用、免疫賦活作用など、種々の保健機能性に注目が集まっている（非特許文献１を参照）。【０００４】
乳酸菌はビフィズス菌とともに腸内細菌としてヒトの健康維持に有効であることが知られている。腸内フローラを改善して健康に有益な働きをし、安全性も保証された微生物「プロバイオティクス」に関する研究が活発化している。生活習慣病予防に対する関心の高まりから、食品の優れた保健機能性がより追求される傾向にある中、こうしたプロバイオティクスの食品への更なる活用が望まれている（非特許文献２）。【０００５】
乳酸菌の培養において現状一般的に用いられる手法として、液体培地に乳酸菌を接種し、培地pHなどを制御しながら培養し、生育の停止した定常期状態に到達後、菌体を培地から分離して回収する回分培養法（バッチ・カルチャー）がある。この方法は、培養中に生ずる培地の栄養素の減少及び乳酸などの分泌物の増加に起因して培地環境が変化するために、乳酸菌の増殖が生育途中で抑制され易く、菌体密度が培養液1ml当たり100億cfu（colony forming units）以上へ到達し難く、更にストレス抵抗力が充分に賦与され難いことが特徴であり、菌体の高密度化と優れた安定性賦与の両課題を同時に改善できる技術が切望されていた（非特許文献３）。【０００６】
こうした観点から、炭酸マグネシウム、単糖類又は２糖類、ペプトン、及び麹、麹エキス、胚芽培地、酵母、及び酵母エキスから選ばれる1種又は2種以上を含む混合物を液体培地に用い撹拌培養することを特徴とするエンテロコッカス・フェカーリス又はエンテロコッカス・フェシウムの培養法が提案されている（特許文献１）。【０００７】
また、小麦胚芽等の植物体に糸状菌を培養し、さらに炭酸マグネシウム等を添加した固体培地を用いて乳酸菌を培養する方法が提案されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第3900484号公報
【特許文献２】特許第3868346号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ali AA. et al., Research Journal of Microbiology, 5(12), pp.1213-1221(2010)
【非特許文献２】Naagpal R. et al., FEMS Microbiology Letters,334(1)、pp.1-15(2012)
【非特許文献３】Lacroix C. et al., Current Opinion in Biotechnology, 18, pp.176-183(2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ヒト腸内には細菌が約1000種類、数百兆個もの数量で棲息しているため、乳酸菌の優れた保健機能性の発現は、消費者が一度に摂取する乳酸菌の菌数がより多い程、そして、より旺盛な増殖能を持った菌体である程、より優れた保健機能性を享受できると期待される。【００１１】
乳酸菌の保健機能性を更に増強するためには、優れた生残能を菌体に賦与する必要性が重要課題として認識されている。乳酸菌の菌体調製は、一般的には液体培養法によって行われているが、この場合も同様に優れた生残能を賦与することが重要課題となっている。【００１２】
本発明は、菌本来の優れた生残能を誘導発現させるべく、種々のストレスを賦与しながら培養する独自培養法により乳酸菌を育種した活性菌体とすることを特徴とし、そのような活性菌体を得ることができる培養法、及び培養により得られた菌本来の生残能を誘導発現させた乳酸菌固体発酵物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、先に液体培養により菌本来の生残能を誘導発現した乳酸菌菌体を増殖させる方法を開発し、その培養方法を「菌株育種培養」と称した。本発明者らは、さらに、「菌株育種培養」をコア技術として活用し、ポリフェノール含有食材混合物の固体表面で増殖させて得られる固体発酵物において、菌本来の生残能を誘導発現した菌体が旺盛に増殖する培養条件を鋭意検討した。【００１４】
その結果、液体培養に引き続いて、固体培養を行うことにより、菌本来の生残能を誘導発現した菌体が旺盛に増殖することを見出した。特に、液体培養である「菌株育種培養」において、培養を繰り返す度に、直前の培養に比べてより高い強度の至適培養環境外のストレスを負荷して菌本来の生残能を誘導発現させた菌体は、一般的なMRS液体培地で培養して得られた菌体をさらに固体培養に供した場合に比較して、より大きな効果が得られた。また、固体培養を「固体環境順応」及び「乳酸菌固体発酵」の２工程の培養により、固形食材混合物である固体培地の表面において増殖させることにより、より大きな効果が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１５】
本発明の方法は、液体培養と固体培養を組合せ、固体培地に乳酸菌にストレスを負荷し得るポリフェノールを含有する植物体を用い、さらに、液体培養と固体培養の各段階を経るにつれ段階的に乳酸菌に負荷するストレスをより高くすることにより生残性の高い菌を得るという点で、従来の培養法とは異なる。【００１６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  乳酸菌固体発酵物の製造方法であって、
（１）  乳酸菌を、液体培地を用いて培養する液体培養工程、
（２）  工程(１)で培養した乳酸菌を固形食材混合物である固体培地で培養する、１工程又は複数工程からなる固体培養工程であって、固体培地は少なくとも炭酸塩及び胚芽、並びに胚芽麹及び／又はポリフェノール含有植物体を含み、固体培養の最終工程で用いる固体培地はポリフェノール含有植物体を含む、乳酸菌を固体培地表面で増殖させる固体培養工程、
を含み、乳酸菌固体発酵物が工程(２)で用いた固体培地表面に前記乳酸菌が含有されている乳酸菌固体発酵物である、製造方法。
[２]  工程（２）の固体培養工程を複数の工程で行い、後の固体培養工程で用いる固体培地中のポリフェノール含有植物体の含有量が、それより前の固体培養工程で用いる固体培地中のポリフェノール含有植物体の含有量よりも多い、[１]の製造方法。
[３]  工程（１）の液体培養及び工程（２）の固体培養工程を経るにつれ、段階的に強度を高くした複数のストレスを負荷し、それらのストレスに耐性を有する乳酸菌の生残能を増加させる、[１]又は[２]の製造方法。
[４]  乳酸菌固体発酵物の製造方法であって、
（１）  乳酸菌を、液体培地を用いて培養する液体培養工程、
(２−i)  工程(１)で培養した乳酸菌を、少なくとも炭酸塩及び胚芽、並びに胚芽麹及び／又はポリフェノール含有植物体を含む固形食材混合物である固体培地で培養し、乳酸菌を固体培地表面で増殖させる工程、
(２−ii)  工程(２−i)で培養した乳酸菌を、少なくとも炭酸塩、胚芽、及びポリフェノール含有植物体を含む固形食材混合物である固体培地であって、ポリフェノール含有植物体の含量が工程(２−i)で用いた固体培地よりも多い固体培地で培養し、乳酸菌を固体培地表面で増殖させる工程、
の３工程を含み、乳酸菌固体発酵物が工程(２−ii)で用いた固体培地表面に前記乳酸菌が含有されている乳酸菌固体発酵物である、[２]の製造方法。
[５]  工程（２−ii）において、固体培地にさらに胚芽麹が含まれる、[４]の製造方法。
[６]  工程(１)、(２−i)及び(２−ii)の工程を経るにつれ、段階的に強度を高くした複数のストレスを負荷し、それらのストレスに耐性を有する乳酸菌の生残能を増加させる、[４]又は[５]の製造方法。
[７]  工程(１)で用いる液体培地が、少なくとも炭酸塩、胚芽麹、窒素源及び炭素源を含む液体培地である、[１]〜[６]のいずれかの製造方法。
[８]  工程(１)の液体培養工程が多段階の培養工程で行われ、多段階の培養工程の各段階の工程、又は多段階の培養工程のいずれか１工程において、少なくとも炭酸塩、胚芽麹、窒素源及び炭素源を含む液体培地を用いる、[１]〜[７]のいずれかの製造方法。
[９]  工程(１)で用いる液体培地に含まれる胚芽麹が、脱脂米胚芽、脱脂小麦胚芽、脱脂コーン胚芽の１種又は２種以上を含む、[７]又は[８]の製造方法。
[１０]  工程(１)で用いる液体培地に含まれる炭酸塩が、炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムの混合物である、[７]又は[８]の製造方法。
[１１]  固体培養工程で用いる固体培地に含まれる胚芽が、１種又は２種以上の穀物の脱脂胚芽又は胚芽を含む脱脂穀物である、[１]〜[１０]のいずれかの製造方法。
[１２]  胚芽が、脱脂米胚芽、脱脂小麦胚芽、脱脂コーン胚芽、その他の穀物由来の脱脂胚芽及びその他の穀物の胚芽を含む脱脂穀物からなる群から選択される１種又は２種である、[１１]の製造方法。
[１３]  胚芽を含む脱脂穀物が脱脂大豆である、[１１]又は[１２]の製造方法。
[１４]  固体培養工程で用いる固体培地に含まれるポリフェノール含有植物体が、果実、野菜、穀類、茶葉、海藻及び香辛料からなる群から選択される１種以上の植物体である、[１]〜[１３]のいずれかの製造方法。
[１５]  固体培養工程で用いる固体培地に含まれる胚芽麹がアスペルギルス属に属する麹菌の脱脂胚芽麹である、[１]〜[１４]のいずれかの製造方法。
[１６]  工程(２−ii)で用いる固体培地に、さらに塩化ナトリウムが含まれる、[４]〜[１５]のいずれかの製造方法。
[１７]  固体培養工程で用いる固体培地に含まれる炭酸塩が、炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムの混合物である、[１]〜[１６]のいずれかの製造方法。
[１８]  固体培養工程で用いる固体培地が炭酸塩及び胚芽、並びに胚芽麹及び／又はポリフェノール含有植物体の均質混合物と水との混合固体培地である、[１]〜[１７]のいずれかの製造方法。
[１９]  工程(１)の液体培養により得られた乳酸菌菌体を、工程(２)で用いる固体培地の表面に接種する、[１]〜[１８]のいずれかの製造方法。
[２０]  工程(１)の液体培養により得られた乳酸菌菌体を、工程(２−i)で用いる固体培地の表面に接種し、さらに工程(２−i)の固体培養により得られた乳酸菌菌体を工程(２−ii)で用いる固体培地の表面に接種する、[４]〜[１９]のいずれかの製造方法。
[２１]  少なくとも炭酸塩、胚芽、及びポリフェノール含有植物体を含む固形食材混合物の表面に乳酸菌が含有されている、乳酸菌固体発酵物。
[２２]  さらに、固形食材混合物が胚芽麹を含む、[２１]の乳酸菌固体発酵物。
[２３]  胚芽が、１種又は２種以上の穀物の脱脂胚芽又は胚芽を含む脱脂穀物である、[２１]又は[２２]の乳酸菌固体発酵物。
[２４]  胚芽が、脱脂米胚芽、脱脂小麦胚芽、脱脂コーン胚芽、その他の穀物由来の脱脂胚芽及びその他の穀物の胚芽を含む脱脂穀物から選択される１種又は２種である、[２３]の乳酸菌固体発酵物。
[２５]  胚芽を含む脱脂穀物が脱脂大豆である、[２１]〜[２４]のいずれかの乳酸菌固体発酵物。
[２６]  ポリフェノール含有植物体が、果実、野菜、穀類、茶葉、海藻及び香辛料からなる群から選択される１種以上の植物体である、[２１]〜[２５]のいずれかの乳酸菌固体発酵物。
[２７]  胚芽麹がアスペルギルス属に属する麹菌の脱脂胚芽麹である、[２１]〜[２６]のいずれかの乳酸菌固体発酵物。
[２８]  固形食材混合物に、さらに塩化ナトリウムが含まれる、[２１]〜[２７]のいずれかの乳酸菌固体発酵物。
[２９]  炭酸塩が、炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムの混合物である、[２１]〜[２８]のいずれかの乳酸菌固体発酵物。
[３０]  [２１]〜[２９]のいずれかの乳酸菌固体発酵物を含む、穀物、ポリフェノールを含む植物体及び乳酸菌を含む食品。【００１７】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-226074号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の菌本来の生残能を誘導発現させた乳酸菌固体発酵物の製造方法によれば、ヨーグルトや乳酸菌飲料、韓国産キムチなどの生菌含有発酵食品の1g又は1ml当たりの菌数に比べ、最終的に得られる乳酸菌固体発酵物は10倍〜100倍以上の高密度の菌体を含有しており発酵物を少量で高菌数摂取することができる。また、固体培地として用いる固形食材混合物を構成する食材に含有されたポリフェノールや塩化ナトリウムにより負荷されるストレスの強度に応じて、菌本来の生残能を誘導発現できる。さらに、得られた乳酸菌固体発酵物は、生きた菌体（以下、「活性菌体」という）を高菌数で含むだけでなくポリフェノールや食物繊維など食材由来の生理活性物質を含む高機能の食品として利用可能である。更に用いる菌種によっては、バイオフィルム以外に、葉酸やオルニチンなどの優れた保健機能性の分泌物を含有していることも期待できる。【００１９】
従って、本発明の方法で製造される乳酸菌固体発酵物は、菌本来の生残能を誘導発現した活性菌体を高菌数に製造する培養法としての機能だけでなく、乳酸菌やポリフェノールなどの優れた保健機能性成分を一緒に摂取できる発酵物としての機能も兼ね備えている。【００２０】
本技術の効果として、菌本来の生残能を誘導発現させることが可能になるが、この要因は、菌の表層構造の変化に起因した細胞膜の安定化効果と推定される。従って、冷蔵保存、高浸透圧、高濃度食塩、凍結・融解、加熱、低pH，胆汁、あるいは乾燥に起因した菌体の損傷に対しても、ポリフェノールや塩化ナトリウムによるストレスにも菌本来の優れた抵抗力が賦与されていることを期待される。【００２１】
液体培養で得られた菌体を乾燥する場合、適切な組成の保護剤や安定化剤を用いることが必須である。これに対して、本発明の方法により製造された活性菌体を含有する乳酸菌固体発酵物は、固体発酵中に代謝産物として、保護剤や安定化剤に匹敵する安定化機能を有するバイオフィルムなどの成分が菌体外に豊富に分泌産生されていると推定されるため、保護剤や安定化剤が不要になる。従って、発酵食品の一般的な「発酵シーン」においてポリフェノール高含有食材は、その高い抗菌ストレスのために乳酸菌で発酵対象と見做されなかったが、本発明の方法によれば、菌本来の生残能を誘導発現して高密度の菌体を含有した乳酸菌固体発酵物が得られ、凍結乾燥処理や送温風などの乾燥処理によって得られた固体発酵物も提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の固体培養で用いる固体培地の各成分が均質に混合している状態の模式図である。
【図２】液体培養と２工程の固体培養を行う３工程の方法における各工程の特徴を示す図である。
【図３】各培養工程で培養して得られた菌体の菌数と耐熱性の結果を示す図である。
【図４】各培養工程で培養して得られた菌体の凍結乾燥後の生残菌数及び耐熱性を示す図である。
【図５】各培養工程で培養して得られた菌体の送風乾燥後の「生残率×耐熱性」（％）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．培養方法
本発明は、乳酸菌を増殖させて定常期に至った菌体を再び新鮮な培地環境に接種し、対数増殖期を経て定常期に至らしめる度に、負荷するストレス強度をより高くすることで菌本来の生残能を誘導発現させるための液体培養工程と固体培養工程を経ることを特徴とする培養法である。ここで、定常期とは、対数増殖期を経て、培地中の生菌数が一定の状態を維持しており、すなわち菌体の分裂速度が低下し分裂率と死滅率が平衡に達し、生菌数が一定になった状態をいい、静止期ともいう。固体培養工程は１工程でもよいが、好ましくは２工程以上の複数工程の固体培養を行う。
【００２４】
ここで、菌本来の生残能とは、特定の条件下で一定期間経過した後に菌が本来有している生き残る能力をいう。本発明の培養法により、液体培養から固体培養を経るほどに、例えば、液体培養工程と複数の固体培養工程を経るほどにストレス負荷の程度が高くなり、菌本来の生残能が誘導発現され、ストレス環境への耐性が高い菌を得ることができる。また、結果的に高い増殖能の菌体を得ることができる。
【００２５】
本発明の培養法により、優れた生残能が誘導発現された菌体を得ることができる。また、本発明の培養法により、固体培地の表面で乳酸菌が増殖し、固体培地表面に前記乳酸菌が含有されている「乳酸菌固体発酵物」を得ることができる。従って、本発明の方法は、「乳酸菌固体発酵物」を製造する方法でもある。
【００２６】
本発明の培養法においては、各工程で、培養する乳酸菌にストレスを負荷し、負荷するストレス強度を培養工程が進むにつれ高くする。ここでストレスとは、乳酸菌の菌種又は菌株の培養環境として至適域から外れた培養条件をいう。ストレスとなり得る培養条件とは、pH、浸透圧、温度、培地に含まれる資化物質の量等が挙げられる。すなわち、本発明の一連の培養工程で負荷するストレスとして、浸透圧ストレス、アルカリpHストレス、酸性pHストレス、酸化ストレス、温度ストレス、栄養ストレス、ポリフェノールによるストレス等が挙げられる。至適域からの乖離が大きいほど負荷されるストレスの強度は高い。ストレスを負荷して得られる菌体は、十分なストレス抵抗力を備えた状態へと変化し、安定性がより一層向上する。ストレスの負荷により、十分なストレス抵抗力を備えた状態へ変化することを「菌本来の生残能を誘導発現させる」という。本発明の培養工程においては、これらのストレスのうちの複数のストレスが組み合わされて乳酸菌に負荷されることになる。
【００２７】
例えば、本発明の培養工程で培地の成分として用いるアルカリ性・難溶性炭酸塩は培養液中の菌体密度の増加に伴い、分泌産生される有機酸の量が増加して、炭酸ガスを放出しながら水溶性塩類に変化する。これに伴い、培養液のイオン強度が徐々に上昇することで、浸透圧ストレスを菌体に与えることができ、菌体を高密度にする液体培養において菌体の性質を改善するために必要な負荷するストレスの種類を増やす効果が期待される。培養液のイオン強度の上昇は、電気伝導度を測定することで評価できる。一方で炭酸ガスが培養液中から放出されることにより溶存酸素を減らす効果が生じ、過酸化水素の生成を減弱できる。このことは、菌体密度が高密度化に至った状態であっても、菌体密度の増加に比例して過酸化水素の産生量も増加するのではなく、濃度が適切に制御された状態であることを意味する。従って、過酸化水素に起因した酸化ストレスの負荷を適度な望ましい状態に維持できる結果、酸化ストレスに対する耐性が賦与されると共に、培養過程における過剰な過酸化水素に起因した自己菌体損傷を抑制することができる。このように培養対象である菌体にとって許容可能な様々なストレス刺激を同時に、培養経過に応じて適切に徐々に負荷することにより、菌体の高密度化が可能になるばかりでなく、MRS液体培地の様な単に栄養素が潤沢な培地で培養した場合よりも優れた菌体安定性及び低温域や高温域における旺盛な増殖能が最大限に賦与された菌体が選択的に培養されることになる。
【００２８】
さらに、本発明の培養工程で培地の構成成分として用いるポリフェノール含有植物体、穀物胚芽、胚芽麹には、ポリフェノールが含まれており、ポリフェノールの有するイオノホアとしての抗菌作用が乳酸菌に対してストレスを負荷する。本発明においては、このストレスを「ポリフェノールによるストレス」という。
【００２９】
培養に用いる乳酸菌は限定されないが、乳酸桿菌も乳酸球菌も含み、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamonosus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ガゼリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・デルブルエキィ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）ラクトバチルス・キムチ（Lactobacillus kimchii）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ロイコノストック・シトリウム（Leuconostoc citreum）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス・ペントサス（Pediococcus pentosaceus）等が挙げられる。
【００３０】
また、用いる乳酸菌は１種類でもよいが、乳酸菌の２種類以上を含んでいてもよい。
【００３１】
液体培養工程は、液体培地を用いて乳酸菌を培養する液体培養である。この液体培養工程で得られた乳酸菌を「液体種」という。また、本発明において、液体培養工程を「工程（１）」という。液体培養工程は、さらに複数の工程を含んでいてもよい。
【００３２】
固体培養工程は、固体培地を用いて乳酸菌を固体培養により培養する工程であり、液体培養工程で得られた乳酸菌を含む液体種を固体培地に接種し、培養する工程である。固体培養は天然環境を模した培養であり、乳酸菌本来の棲息環境に近い環境で乳酸菌を増殖させる培養である。固体培養工程は、乳酸菌を液体環境から固体環境へ順応させる。この点で、固体培養工程を液体培養から固体培養への順応工程、あるいは「固体環境順応」工程という。また、固体培養工程においては、固形食材混合物に、液体培養工程よりも高いストレスが乳酸菌に負荷され、菌本来の生残能が誘導発現され、ストレス環境への耐性が高い菌を得ることができる。このようにストレス環境への耐性が高い菌を高密度で増殖させる固体培養工程を「乳酸菌固体発酵」工程という。好ましくは、「固体環境順応」工程とストレス環境への耐性が高い菌を増殖させる「乳酸菌固体発酵」工程は別の工程で行う。
【００３３】
一般的に乳酸菌の培養は液体培養で行われている。液体培養では、培養液中を拡散する栄養素を菌体内に取り込むことができれば乳酸菌は容易に増殖できる。一方、本発明の固体培養は脱脂胚芽等を主成分として含む固体培地を用いるため、液体培養に比べ低栄養環境かつ低水分環境である。固体培養の環境は液体培養よりも天然環境に近い。従って、菌が本来有する遺伝子の発現率が高まり、その結果、生残能の高い菌体を得ることができる。
【００３４】
固体培養工程は、1つ又は２つ以上の工程を含む。例えば、固体培養工程は工程（２−i)と工程（２−ii)の２つの工程を含み、工程(２−i)は、固体培地を用いて乳酸菌を固体培養により培養する工程であり、工程(１)の液体培養で得られた乳酸菌を含む液体種を固体培地に接種し、培養する工程である。工程(２−i)においては、乳酸菌を液体環境から固体環境へ順応させる。この点で、工程(２−i)を液体培養から固体培養への順応工程、あるいは固体環境順応工程という。また、工程(２−i)で得られた固体培養に順応した菌を「固体種」という。
【００３５】
工程(２−ii)は、固体培地を用いて乳酸菌を固体培養により培養する工程であり、工程(２−i)の固体培養で得られた固体種の一部をさらに固体培地に接種し培養する工程である。工程(２−ii)においては、工程(２−i)の固体培養で乳酸菌に負荷するストレスより高いストレスが乳酸菌に負荷される。また、工程(２−ii)を「乳酸菌固体発酵」工程という。
【００３６】
従来の乳酸菌の培養は、液体培地を用いた液体培養であり、炭素源、窒素源、塩類などの生育に必要な栄養素を含んだ水溶液である液体培地中で菌体を増殖させる方法であった。この方法では、乳酸菌が増殖する増殖領域の水分活性(Water Activity)が1.0である。ここで、増殖領域の水分活性とは、乳酸菌を培養している培養液中の自由水の割合をいい、液体培地を密閉した培養容器内に入れた場合の水蒸気圧（P)とその温度における純粋の水蒸気圧（PO)の比（P/PO)で求められる。
【００３７】
固体培地による培養法として、微生物を分離するため研究目的等で用いられる寒天平板培養法が知られている。本発明における固体培養は、従来の寒天平板培養とは異なり、固形状態の植物体等の食材を混合し、得られた混合物に45〜60％の水分を加えて水分活性が1.0未満、好ましくは0.95〜0.98の固体培地中で、固体培地の表面において菌体を増殖させる培養法をいう。水分活性は菌種により変えることができる。
【００３８】
以下、液体培養工程と固体培養工程について詳述する。
１−１．液体培養工程(１)
液体培養工程である工程(１)は、乳酸菌の培養に用いる公知の液体培地を用いて行うことができる。例えば、すべての種類の乳酸菌の発育を促す選択性の低い培地を用いればよい。培地組成は国際標準法NF_ISO 15214に準拠しているMRS（de Man, Rogosa, Sharpe)液体培地を用いればよい。本発明において、公知の液体培地を用いて行う液体培養を「一般的な液体培養」という。この「一般的な液体培養」は、通常は１工程で行われる。
【００３９】
また、工程(１)の液体培養を、複数の工程で行ってもよい。すなわち、前々培養から前培養、及び本培養へと複数段階の培養を行う。その都度、培養温度を前回の培養に比べて数℃ずつ変化させることにより乳酸菌に温度ストレスを負荷することができ、あるいは、培地の炭素源と窒素源の各濃度を段階的に低下させることにより栄養素ストレスを乳酸菌に負荷することができる。さらに、クエン酸濃度や塩化ナトリウムを段階的に高める条件を設定してもよい。工程(１)の液体培養において、複数段階の培養を行い、負荷するストレス強度をより高くしていく培養を「菌株育種培養」ともいう。「菌株育種培養」により、乳酸菌にストレスを負荷した結果、菌本来の生残能を誘導発現した菌体が選択され、その後の固体培養で旺盛に増殖する菌体を得ることができる。
【００４０】
「菌株育種培養」の方法を以下に詳述する。
【００４１】
「菌株育種培養」においては、ポリフェノール等の抗菌作用を有するストレスを負荷する物質の存在下、液体培養を繰り返しながら、菌体に負荷する低栄養や培養温度の変化などのストレス強度をより高く設定する。すなわち、炭素源及び窒素源などと共に、麹菌を固体培養して得られたポリフェノール含有脱脂胚芽麹及びそのエキス画分あるいは脱脂胚芽及び乾燥果物や茶葉のエキス画分、並びに難溶性の炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムを含むことを特徴とする液体培地を用いて乳酸菌を振盪又は撹拌しながら好気的に培養する際に、菌体に複数のストレスを同時に負荷する。更に「菌株育種培養」においては、前々培養から前培養、本培養へと培養工程を繰り返す度に、培養温度を前回の培養に比べて3〜5℃ずつ変化させて温度ストレスを負荷する他、培地の炭素源と窒素源の各濃度を低下させる栄養素ストレスを負荷することや、クエン酸濃度を段階的に高めることを行う。
【００４２】
培養温度に因るストレス負荷は、前々培養の温度に比較して、前培養の温度を3〜5℃ずつ上下させる他、更に前培養の温度に比較して、本培養の温度を3〜5℃ずつ上下させる。
【００４３】
低栄養に因るストレス負荷は、前々培養、前培養、及び本培養において使用する液体培地の炭素源（グルコース）と窒素源（ハイニュートAM、不二製油株式会社製  大豆ペプチド）の各濃度（％）を、液体培養を繰り返す度に、段階的に下げる条件を設定することで可能になる。例えばラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus）GG（ATCC53103）株等の乳酸桿菌を培養対象にする場合、前々培養のグルコース濃度6.0重量％/ハイニュートAM濃度3.75重量％を、前培養では2.5重量％/1.8重量％を経て、さらに本培養では1.5重量％/1.6重量％に下げればよい。また、ペディオコッカス・アシディラクティシ(P. acidilactici) ATCC25740株等の乳酸球菌を培養対象にする場合は、前々培養のグルコース濃度2.0重量％/ハイニュートAM濃度7.0重量％を、前培養では1.5重量％/4.8重量％に下げ、さらに本培養では1.0重量％/2.5重量％と、各濃度を段階的に下げればよい。
【００４４】
液体培地のクエン酸濃度は、前々培養、前培養、及び本培養の各培養工程において使用する液体培地のクエン酸ナトリウムの濃度を前々培養で24 mM、前培養で37 mM、次いで本培養で60 mMと、新鮮な液体培地で培養を繰り返す度に、より高い濃度を設定することにより増加させればよい。クエン酸の含有量を増やすことにより、乳酸菌はグルコース消費量を低下させ、クエン酸を資化するようになる。
【００４５】
「菌株育種培養」における培養温度、液体培地の炭素源や窒素源の種類と濃度、及びクエン酸塩の濃度は、使用する菌種や菌株によって適宜調整し得るものであり、上の記載は一例を示したものに過ぎない。
【００４６】
工程(１)の「菌株育種培養」で用いる液体培地は、少なくとも炭酸塩、胚芽麹、窒素源及び炭素源を含む液体培地である。さらに、胚芽麹エキス、酵母死菌体、脂肪酸、界面活性剤としてのポリソルベート類、鉄分やマンガン等を含んでいてもよい。脂肪酸としては、例えば、オレイン酸を含む動植物性油脂が挙げられる。
【００４７】
「炭酸塩」としては、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウムなどのアルカリ性・難溶性炭酸塩が好ましく、かつ至適な培地pHを実現するために炭酸カルシウムと炭酸マグネシウムの双方を混合し、かつ適切な配合比率で培地に加えることが好ましい。液体培養において炭酸塩は軽質炭酸カルシウム、重質炭酸カルシウムいずれも用いることができるが、溶解性の点で好ましくは軽質炭酸カルシウムを用いる。炭酸マグネシウムを液体培地に単独で添加すると、培地pHは大多数の乳酸菌が許容できる通常の培地pH7.0〜6.0よりもアルカリ側へ変動する一方、回分式液体培養にとって、培地のpH緩衝能を高めることが望ましく、炭酸塩の添加量を増やす方法が想定されるが、この場合には初発pHがアルカリ側へ高くなるため、アルカリpHに対する耐性力の劣る菌種や菌株にとって非常に厳しい負荷ストレスとなり（アルカリpHストレス）、種菌（seed culture）の調製段階にて旺盛な増殖能が菌体に賦与されていない場合には増殖が不可能な状態に陥る可能性がある。さらに、グルコースを含む糖質と他の培地成分を混合して同時に滅菌した場合、培地褐変化（メイラード反応）の促進に伴い過酸化水素を生成して菌の増殖阻害が見込まれる。そこで、本発明の工程(１)の「菌株育種培養」においては、アルカリ性・難溶性炭酸塩と胚芽麹とを混合し、かつ他の培地成分と分離して高温高圧滅菌処理することにより培地の初発pHを下げられ、かつ炭酸塩が液体培地中に徐放され、急激な培地pH変動を回避し得る。
【００４８】
なお、これらのアルカリ性・難溶性炭酸塩は、培養が対数増殖期から定常期へと進展するに応じて菌体が産生した乳酸や酢酸などの有機酸濃度が上昇する際、これら有機酸と反応して水溶性塩類に変化するとともに炭酸ガスが培養液中に放出され、培養液のイオン強度が上昇する。これが培養過程における菌に対する浸透圧ストレス負荷となるほか、アルカリpHストレス、酸性pHストレス、酸化ストレス、あるいは温度ストレスといった刺激が更に負荷された結果、得られる菌体は、十分なストレス抵抗力を備えた状態へと変化し、安定性がより一層向上する。
【００４９】
また、上記炭酸塩の徐放プロセスは、複数の観点において乳酸菌自身による自己菌体損傷を適度に抑制するのにも作用する。すなわち、（A）培地中に炭酸ガスが放出されることにより、培養液の溶存酸素が低下する。例えば、乳酸菌は通性嫌気性菌に属し分子状酸素（molecular oxygen）をエネルギー代謝に直接利用できず、むしろ酸素に接触すると過酸化水素、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシラジカルなどの活性酸素を生成して菌体に損傷を与える。従って培養液の溶存酸素の低下効果により培養過程における過酸化水素等の高濃度化が抑制され、自己菌体損傷を抑制できる。加えて、（B）高密度液体培養を行うことにより有機酸産生能が抑制され、自己菌体損傷が抑制される。更に、（C）アルカリ性・難溶性炭酸塩が乳酸菌の産生する乳酸などの有機酸と反応することに伴い、培養液のpH低下速度を緩和させる。これにより非解離型乳酸の生成割合が上昇し難くなり、自己菌体損傷が抑制される。
【００５０】
２つのアルカリ性・難溶性炭酸塩の混合比率は菌株の至適pHに応じ適宜設定することができるが、少なくとも重量ベースでの添加量において炭酸マグネシウムが炭酸カルシウムを超えないことが好ましい。又、どちらか一種類だけで用いた場合、得られる効果が減弱するので好ましくない。
【００５１】
「胚芽麹」は、穀類胚芽にアスペルギルス属に属する麹菌を接種して固体培養により発酵させて得られる麹である。胚芽麹にはポリフェノールが含まれる。「胚芽麹」の原料となる植物体としては米、麦、豆、トウモロコシ等の穀物、あるいはこれらから油脂分を除去した脱脂胚芽の中から適宜選択することができるが、これら原料の保存に伴い油脂の酸敗が生ずる問題を鑑み、脱脂米胚芽、脱脂小麦胚芽、及び脱脂コーン胚芽、あるいはさらに脱脂大豆で構成した固体培地組成が望ましく、更に0.5〜1.0％の重質炭酸カルシウムを添加することが望ましい。脱脂胚芽粒子の表面で固体培養を行うアスペルギルス属に属する麹菌として、黄麹菌、白麹菌、黒麹菌、カツオブシ菌が挙げられ、黄麹菌として、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、白麹菌としてアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、黒麹菌としてアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、カツオブシ菌としてアスペルギルス・グラウカス（Aspergillus glaucus）等が挙げられる。重質炭酸カルシウムと脱脂胚芽とを混合して行う「滅菌処理」としては、オートクレーブ滅菌（121℃、15分以上）、又はこれに相当する滅菌効果の処理条件であれば特段限定されない。
【００５２】
「胚芽麹エキス」は胚芽麹の抽出物（エタノール50％分画品、ただし抽出方法はこの方法に限らない）であり、胚芽麹とともにアスペルギルス属に属する麹菌の胚芽発酵成分を本発明の液体培地に添加する。例えばオリザ油化株式会社の「米胚芽発酵エキス−Ｐ」を適用することができる。
【００５３】
「窒素源」及び「炭素源」は基礎的エネルギー源として添加する。窒素源としては脱脂粉乳、大豆ペプチド、肉エキスなどを原料とすることができ、市販品としてはポリペプトン（日本製薬株式会社製）、ハイニュートAMやハイニュートDC6（不二製油株式会社製）、ラブレムコ末（オクソイド社製）などを採用することができ、これらを混合して用いることもできる。また炭素源としては菌株によって要求性が異なるが、グルコース、フルクトース、トレハロース、セロビオース、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノース、マルトース、ラクトース、スクロース等から１又は複数種を選択して混合することができる。なお、ハイニュートは分離大豆蛋白質分解物である。
【００５４】
「脂肪酸」は増殖促進因子として添加されるものであり、「オレイン酸を含む動植物性油脂」としてオリーブ油などの植物油のほかに牛脂、魚油、獣油などを採用し得る。「界面活性剤としてのポリソルベート類」とはソルビタン脂肪酸エステルにエチレンオキシドが約20分子縮合したものであり、ポリソルベート20、ポリソルベート60、ポリソルベート65、ポリソルベート80を採用し得るが、不飽和脂肪酸が主であるオリーブ油を界面活性剤の疎水性分子領域に取り込んで乳化するにあたってはポリソルベート80が特に好ましく、牛脂を用いる場合にはポリソルベート20との組合せが好ましい。「鉄分」はラクトコッカス（Lactococcus）属などの乳酸球菌の増殖促進因子としてヘム鉄を添加することが好ましい。その他、乳酸菌の菌種や菌株の中で他の乳酸菌や真菌等と共生する天然生息環境の菌を培養対象とする場合、クエン酸や酢酸、及び乾燥酵母菌体、あるいは酵母菌体の自家調製ペプチド画分ＦＹＥ等の栄養素を補充した液体培地組成へと適宜工夫する。乾燥酵母菌体としてはパン酵母、ビール酵母いずれでも良く、実施例では市販エビオス錠（アサヒフードアンドヘルスケア株式会社製）を用いたが、例えば凍結酵母菌体（オリエンタル酵母工業株式会社製）でも差し支えない。
【００５５】
「前培養」とは拡大培養の前段階として行われる少量の培地での培養をいう。また「多段階の培養工程」において本発明に係る液体培地を適用することにより、菌体の性質向上効果がみられる。すなわち本発明に係る菌体を高密度にする液体培養を用いて拡大された本培養を行うほか、それに接種する種菌の調製においても高密度液体培養を用いて行うことにより、過酷な培養条件によるストレスに対する抵抗性の高い菌体が選択的に培養され、環境順応力により菌体自体のストレス抵抗性が向上するものと推察される。なお多段階の培養にあたっては、培養条件の過酷度合いすなわちストレス負荷の度合いを培養段階の進展に伴い順次高めていくことが望ましい。
【００５６】
この種々のストレスを与えながら乳酸菌を培養する「菌株育種培養」は、一般的な液体培養法と異なり、液体培地がポリフェノールを含有した不溶性食材粒子や難溶性炭酸塩を炭素源、窒素源、無機塩、及びポリフェノール含有食材エキス画分と共に含む為、液体培養系に該当しているものの、培地環境が通常の液体培養における均質的な環境とは異なり、不均質な状態にあることが特徴である。
【００５７】
該液体培養を繰り返す度に、ポリフェノールの抗菌活性によるストレスや低栄養などの負荷ストレスによって菌本来の生残能を誘導発現させた活性菌体と生きているけれども培養できない状態（viable but non-culturable state：以下、「VBNC」と略す）へ誘導された不活性菌体とが培養液中に混在することが特徴であり、負荷ストレスの種類を段階的に増やし、かつストレス強度を段階的により一層高くする培養条件の設定が菌本来の生残能を誘導発現させる為に必須である。
１−２．固体培養工程
固体培養工程は、液体培養工程(１)で培養した乳酸菌を固形食材混合物である固体培地で培養する工程であり、1工程又は複数工程からなる。固体培養工程に用いる固体培地は少なくとも炭酸塩及び胚芽、並びに胚芽麹及び／又はポリフェノール含有植物体を含み、固体培養の最終工程で用いる固体培地はポリフェノール含有植物体を含む。すなわち、固体培養工程で用いる固体培地には、胚芽麹及びポリフェノール含有植物体の一方又は両方が含まれる。また、固体培養工程の最終工程で用いる固体培地には、必ずポリフェノール含有植物体が含まれる。固体培養工程が1工程で行われる場合は、その工程にポリフェノール含有植物体が含まれていればよい。固体培養工程が複数工程からなる場合、最終工程で用いる固体培地には、必ずポリフェノール含有植物体が含まれるが、その前段階の固体培養工程で用いる固体培地にもポリフェノール含有植物体が含まれていてもよい。但し、この場合、後の段階の固体培養工程で用いる固体培地のポリフェノール含有植物体の含量は前の段階の固体培養工程で用いる固体培地のポリフェノール含有植物体より多い。
【００５８】
固体培養工程は、好ましくは、「固体環境順応」工程とストレス環境への耐性が強い菌を増殖させる「乳酸菌固体発酵」工程からなり、以下２つの固体培養工程（２−i)及び（２−ii）からなる固体培養工程について詳述する。
工程(２−i)（固体環境順応工程）
工程(２−i)は、固体培地を用いた固体培養工程であり、工程(２−i)の固体培養は、少なくとも炭酸塩と胚芽を含み、更に胚芽麹及び/又はポリフェノール含有植物体を添加した固体培地で培養する。固体培地の含有物は食品に添加可能な物質であり、従って、該固体培地を「固形食材混合物」という。固体培養工程において、乳酸菌は固体培地の粒子表面で増殖する。工程(２−i)においては、乳酸菌を液体環境から固体環境へ順応させる。この点で、工程(２−i)を液体培養から固体培養への順応工程、あるいは「固体環境順応」工程という。ここで、固体環境順応とは、固体表面で旺盛に増殖する為に必要な、新たな形質発現を誘導した環境順応をいう。
【００５９】
「炭酸塩」としては、粒子表面に存在できる炭酸カルシウム、炭酸マグネシウムなどのアルカリ性・難溶性炭酸塩が好ましい。炭酸カルシウム、炭酸マグネシウムの一方が含まれていればよいが、固体培養における培養環境のpHを至適pHに調整するために炭酸カルシウムと炭酸マグネシウムの両方を適切な混合比率で混合し固体培地に添加することが好ましい。また、ここで用いる炭酸カルシウムは重質炭酸カルシウムが好ましい。ここで、重質炭酸カルシウムとは天然鉱物から調製した炭酸カルシウムをいう。例えば、重質炭酸カルシウムは石灰石を粉砕し分級して得ることができる。重質炭酸カルシウムは軽質炭酸カルシウムに比べて粒子形状が不定形であり、密度が大きいという特徴を有する。一方、軽質炭酸カルシウムは化学的に合成した炭酸カルシウムをいう。炭酸カルシウム、炭酸マグネシウムなどの炭酸塩は、固体培養のpH、特に乳酸菌が増殖する微小増殖領域のpHをアルカリに調整することにより乳酸菌にpHストレスを負荷する。
【００６０】
「胚芽」としては、穀物（シリアル）の胚芽を用いればよい。好ましくは、油脂の酸敗を避けるため油脂分を除いた脱脂胚芽を用いる。穀物は限定されないが、米、小麦、コーン、大豆、大麦、オーツ麦、ライ麦、粟、稗、えん麦、小豆等が挙げられる。これらの穀物の１種又は２種以上の胚芽、好ましくは脱脂胚芽を用いる。また、穀物によっては胚芽部分のみを入手することが困難なものがあり、そのような穀物については胚芽を含む全粒穀物を用いてもよい。全粒穀物を用いる場合も、好ましくは脱脂穀物を用いる。例えば、大豆は胚芽のみの入手が困難であるので、全粒大豆を用いればよい。全粒穀物を用いる場合でも、用いる穀物に胚芽が含まれる限り、本発明においては、穀物の胚芽を用いると良く、例えば、脱脂大豆は、胚芽を含む脱脂穀物であるということができる。上記穀物の中でも、米、小麦、コーン、大豆が好ましく、例えば、脱脂米胚芽、脱脂小麦胚芽、脱脂コーン胚芽に加え、脱脂大豆を用いることができる。
【００６１】
「胚芽麹」は、炭酸塩と穀物胚芽の混合物を滅菌した後、アスペルギルス属に属する麹菌を接種して、固体培養により麹菌を増殖させ、発酵させて得られる麹である。胚芽麹の胚芽としては、上記の胚芽を用いることができ、好ましくは脱脂米胚芽、脱脂小麦胚芽及び脱脂コーン胚芽、あるいは、脱脂米胚芽、脱脂小麦胚芽、脱脂コーン胚芽及び脱脂大豆を用いる。ここで用いる脱脂大豆は胚芽を含んでいるので、胚芽に含まれる。胚芽麹を製造するときには、上記の炭酸塩を添加してもよく、好ましくは重質炭酸カルシウムを0.5〜1.0％添加する。すなわち、「胚芽麹」は、１種又は２種以上の胚芽、アスペルギルス属に属する麹菌及び炭酸塩を含んでいる。アスペルギルス属に属する麹菌は、日本酒、味噌、食酢、漬物、醤油、焼酎、泡盛、鰹節などの発酵食品を製造するときに用いるアスペルギルス属に属する菌株で、黄麹菌、白麹菌、黒麹菌、カツオブシ菌が挙げられ、黄麹菌として、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、白麹菌としてアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、黒麹菌としてアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、カツオブシ菌としてアスペルギルス・グラウカス（Aspergillus glaucus）等が挙げられる。
【００６２】
ポリフェノール含有植物体としては、果物（ブルーベリー、プルーン、ブドウ、アップル、イチゴ、柿、バナナ、ラズベリー、桑の実など）、野菜（タマネギ、レタス、ブロッコリー、ケール、レタス、ナス、さつまいも、ゴボウなど）、穀物（米、麦、コーン、大豆などの胚芽画分；そば、カカオ豆、コーヒー豆、小豆、ピーナッツなど）、茶葉（緑茶、抹茶、ウーロン茶、グアバ茶葉など）、海藻（褐藻類コンブ目コンブ科のクロメやカジメなど）、香辛料（薄荷、ペパーミント、シソ、ローズマリー、カモミール、ウコン、胡椒、オリーブなど）などが挙げられ、この中でも果実、例えば、ブルーベリー、アップル、ブドウ、あるいは抹茶等が好ましい。これらの植物体は乾燥していない生の状態でもよいし、乾燥植物体でもよいが、好ましくは乾燥植物体を用い、ドライブルーベリー、ドライアップル、ドライレーズン、抹茶等が好適に用いられる。本発明の固体培地に用いる穀物胚芽、胚芽を含む全粒穀物、胚芽麹にもポリフェノールが含まれるが、本発明の固体培地の成分において、上記の穀物胚芽、胚芽を含む全粒穀物、胚芽麹とは別にポリフェノール含有植物体が含まれる。ポリフェノール含有植物体は、1種又は複数種を含ませればよい。
【００６３】
ポリフェノールは、同一分子内に複数のフェノール性水酸基を持つ化合物の総称と定義され、自然界の植物などが紫外線、病害虫や病原菌、乾燥や寒さなどから自らを守る生体防御物質「ファイトアレキシン」として機能する。ポリフェノールに属する化合物は、フェニルカルボン酸系、リグナン系、クルクミン系、クマリン系、及びフラボノイド系で構成され、例えばジフェニールプロパン構造を共通構造とするフラボノイド系にはアントシアニジン類とその配糖体（アントシアニンなど）、フラバノン類とその配糖体、フラバノール類（カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、テアフラビンなど）、イソフラボン類とその配糖体（ダイゼイン、ダイゼインの配糖体であるダイジン、ゲニステインなど）、フラボノール類とその配糖体（ケルセチン、ケルセチンの配糖体であるルチン、ケンフェロール、ミリセチンなど）、及びフラボン類（アピゲニン、ルテオリンなど）が属する。
【００６４】
ポリフェノールは抗菌活性を有し、その抗菌活性は、例えばヒドロキシ桂皮酸(hydroxycinnamic acid)の場合、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）などの乳酸菌、グラム陰性細菌のエスシェリィシャ・コリー（Escherichia coli）、グラム陽性細菌のスタフィロコッカス・オーレウス（Staphylococcus aureus）やバシラス・セレウス（Bacillus cereus）、カビの生育を阻害することが報告されており、細菌からカビや酵母の真菌類に及ぶ幅広い抗菌スペクトラムを有することを特徴とする。ポリフェノールの抗菌活性の作用機序は、ポリフェノールが被検菌の細胞膜を貫通して穴を開け、菌体内部の細胞質から核酸やタンパク質などの成分を放出させるイオノホアであり、菌体を死滅に至らしめたり、あるいはVBNCへ誘導する。抗生物質の作用機序がイオノホアである場合、微生物は該抗生物質に対する耐性を獲得し難いことが知られている。本発明においては、ポリフェノール含有植物体を固体培地の成分として用いることにより、抗菌活性の作用機序がイオノホアであるポリフェノールが乳酸菌に対してストレスとして作用し、ポリフェノールによるストレスが負荷される。その結果、菌本来のポリフェノールに対する抵抗力を誘導発現し、ストレス耐性の高い乳酸菌を育種することができる。
【００６５】
固体培養で用いる固体培地は、上記の固体培地成分を混合し、水分含量が45〜60重量％になるように加水して作製することができる。加水した固体培地の水分活性は1.0未満、好ましくは0.95〜0.98である。水分活性は菌種により変えることができる。
【００６６】
含有成分である炭酸塩、胚芽、及びポリフェノール含有植物体の含有量は、炭酸塩が1〜5重量％、胚芽が50〜90重量％、ポリフェノール含有植物体が2〜20重量％、好ましくは3〜10重量％、さらに好ましくは3〜7重量％であり、胚芽麹が含まれる場合、胚芽麹を15〜30重量％含む。各含有成分の合計は100％になる。一例として、炭酸マグネシウム1.6重量％、重質炭酸カルシウム2.66重量％、脱脂胚芽67.98重量％、胚芽を含む脱脂大豆22.66重量％、ポリフェノール含有植物体5.1重量％を含む固体培地、あるいは、炭酸マグネシウム1.6重量％、重質炭酸カルシウム2.6重量％、脱脂胚芽47.68重量％、胚芽を含む脱脂大豆22.66重量％、ポリフェノール含有植物体5.16重量％、胚芽麹20.3重量％を含む固体培地が挙げられる。
【００６７】
固体培地の含有成分である炭酸塩、胚芽、及びポリフェノール含有植物体、あるいはさらに胚芽麹は、粒状の状態で均質に含まれていればよい。ここで、粒状の状態で含まれているとは、それぞれの成分がある程度の大きさを保有した粒状物質として含まれていることをいう。例えば、胚芽は平均粒径数十μm〜数千μm程度、好ましくは数百μm〜数千μm程度の粒状物質として含まれていればよく、ある程度粉砕して用いてもよいし、胚芽部分がそのまま含まれていてもよい。また、胚芽を含む全粒穀物を用いる場合、全粒穀物をそのまま用いてもよいし、平均粒径数十μm〜数千μm程度、好ましくは数百μm〜数千μm程度の胚芽を含む粒状物質として含まれていてもよい。胚芽麹も同様に平均粒径数十μm〜数千μm程度、好ましくは数百μm〜数千μm程度の粒状物質として含まれていればよい。また、ポリフェノール含有植物体も平均粒径数十μm〜数千μm程度、好ましくは数百μm〜数千μm程度の粒状物質として含まれていればよく、抹茶等粒径が元々小さいものはそのまま含ませればよいし、果実等大きいものは適宜カット又は粉砕し、平均粒径数十μm〜数千μm程度、好ましくは数百μm〜数千μm程度の粒状物質として加工して含ませればよい。炭酸塩は粉末状であるが、難溶性であるがゆえに、胚芽麹、及びポリフェノール含有植物体の表面に付着した状態で存在している。
【００６８】
均質に含まれるとは、固体培地中にそれぞれの成分が偏らずにまんべんなく分布していることをいい、各成分の平均粒径が均一である必要はなく、成分ごとに平均粒径にばらつきがあってもよい。
【００６９】
図１に、固体培地の各成分が均質に混合している状態の模式図を示す。図１においては、乳酸菌も示されているが、乳酸菌１の存在場所がわかるように実際よりも大きく示している。乳酸菌の平均直径は、１μm〜数μm程度である。
【００７０】
図１に示すように、粒状のポリフェノール含有植物体２、粒状の胚芽３、粒状の胚芽麹４、粉末状の炭酸塩（図には示されていない）が互いに接触し、その間に間隙（ポア）を形成した状態で混合されており、堆積層内に通気性が得られるという特徴を有する。乳酸菌は間隙中で粒状の各成分の表面に付着した状態で増殖し生育するが、培地滅菌中に固体培地に含有された全ての水溶性成分は、各粒子間で均質に分布し得たと想定される。従って、乳酸菌が付着して増殖する成分は限定されず、粒状の胚芽、胚芽麹、及びポリフェノール含有植物体のいずれの表面でも同じ増殖速度で生育し得ると想定される。固体培地においては各水溶性成分が均質に混合しているが、培養する乳酸菌にとって増殖し得る環境は、変化に富んだ多様性のある環境である。また、粒状の成分と成分の間に形成される間隙は空気の通り道になるので、乳酸菌は多様性のある粒状の成分表面において好気的に増殖する。
【００７１】
固体培地の水分活性は1.0未満であり、粒状の成分と成分の間の間隙に自由水は少ないが、加水したときに各成分の栄養素が水に溶解し、固体培地全体に行き渡るので、栄養素という観点からは、多様性のある表面環境のどの表面でも比較的均一である。例えば、乳酸菌が脱脂米胚芽の表面で増殖する場合、乳酸菌は脱脂米胚芽から供給される栄養素のみに依存して増殖するのではない。加水のときに脱脂米胚芽表面に他の胚芽や植物体に含まれる栄養素が行き渡るので、乳酸菌は固体培地の含有成分の種々の栄養素に依存して増殖することができる。この点で、固体培地は乳酸菌が必要とする栄養素の観点からは均一あるいは均一に近いということができる。
【００７２】
ただし、固体培養においては、乳酸菌は水分が含有成分である粒状物質中に存在しているという水分活性が1.0未満の環境にさらされる。このため、胚芽やポリフェノール含有植物体に含まれる栄養素が行き渡るとはいっても、栄養素の菌体への取込みは不自由になり、低栄養環境となり、栄養ストレスが負荷される。
【００７３】
工程(２−i)の培養においては、上記の固体培地に、工程(１)の液体培養により得られた乳酸菌を「液体種」として接種する。接種は、工程(１)の液体培養により得られた増殖した乳酸菌が含まれる培養液を固体培地に添加すればよい。添加は、例えば、培養液を固体培地に混合することにより行えばよい。この際、工程(１)の液体培地を工程(２−i)で用いる固体培地に対して1〜10重量％、好ましくは1〜5重量％、さらに好ましくは1〜2重量％添加すればよい。添加後、スパーテル等でよく混合し、菌体の分布を均質化すればよい。好ましくは、数時間培養した後に、さらにスパーテル等で混合し、菌体の分布をさらに均質化する。
【００７４】
上記の含有量で含有成分をよく混合し、脱イオン水を水と固体培地成分の混合物の重量に対して最終含量として45〜60重量％になるように加水すればよい。その後、滅菌して用いる。冷却した後に、液体培養で得られた乳酸菌を含む培養液を接種し、固体培養を行う。培養は15〜42℃で行うことができるが、好ましくは液体培養工程と同じ温度で行う。培養温度が27℃〜42℃の場合、10時間〜30時間、好ましくは20〜30時間、さらに好ましくは24時間培養を行う。培養時の相対湿度（RH)は80％前後が好ましい。この条件で培養を行うことにより発酵菌は定常期に至る。培養温度が27℃より低い場合は、発酵時間を適宜延長する必要があるが、その場合でも40時間以内で定常期に至る。
【００７５】
なお、固体培地の組成、固体培養の条件は、使用する菌種や菌株により適宜変更することができる。
【００７６】
工程(１)の培養液には、ストレス負荷により菌本来の生残能を誘導発現させた活性菌体とVBNCへ誘導された不活性菌体が存在する。工程(２−i)以降の培養工程においては、菌本来の生残能を有する活性菌体のみが選択的に旺盛に増殖する。すなわち、工程(２−i)以降の固体培地の粒状成分の表面で増殖する菌体は、ポリフェノールの抗菌活性によってVBNCへ誘導され難い性質を有する菌体である。
【００７７】
工程(２−i)の固体培養により、固体培地１ｇ当たり、10億個以上、好ましくは20億個以上、さらに好ましくは50億個以上、特に好ましくは100億個以上の乳酸菌が生育する。すなわち、固体培養により高度に菌体高密度化する培養が可能である。
工程(２−ii)
工程(２−ii)は、工程(２−i)と同様に、固体培地を用いた固体培養工程であり、工程(２−ii)の固体培養は、少なくとも炭酸塩、胚芽、及びポリフェノール含有植物体を含む固体培地で培養する。固体培地にさらに胚芽麹が含まれていてもよい。炭酸塩、胚芽、胚芽麹、及びポリフェノール含有植物体は、工程(２−i)と同じであり、工程(２−ii)においても、固体培地の含有物は食品に添加可能な物質であり、したがって、該固体培地を「固形食材混合物」という。工程(２−ii)で用いる固体培地の状態は工程(２−i)で用いる固体培地と同様であり、粒状の含有成分が均質に混合している。また、工程(２−ii）で用いる固体培地も最終水分含量が45〜60重量％になるように加水して、水分活性が1.0未満、好ましくは0.95〜0.98になるようにして用いる。
【００７８】
工程（２−i）にポリフェノール含有植物体が含まれる場合、工程(２−ii）においては、固体培地に含まれるポリフェノール総含有量が工程(２−i)で用いる固体培地よりも多くなるように設定する。ポリフェノール総含有量を多く設定することにより乳酸菌に工程(２−i)よりも大きなポリフェノールによるストレスが負荷され、菌本来の生残能がより高い菌体が選別される。
【００７９】
このためには、ポリフェノール含有植物体の含有量を大きくすればよい。また、胚芽や胚芽麹にもポリフェノールが含まれているので、胚芽や胚芽麹の含有量を大きくしてもよい。好ましくは、ポリフェノール含有植物体の含有量を大きくする。
【００８０】
さらに工程(２−ii)においては、塩化ナトリウムを含有させてもよい。塩化ナトリウムは、高濃度で抗菌活性を有しており、塩化ナトリウムを含有させることにより、塩化ナトリウムにより乳酸菌にストレスを負荷し、菌本来の生残能がより高い菌体が選別される。
【００８１】
すなわち、工程(２−i)でストレスを負荷しつつ、固体培養に順応した乳酸菌に対して、工程（２−ii）では、さらにストレスを負荷し、固体培地に高濃度で含有されたポリフェノールや塩化ナトリウムによるストレスに対する環境順応の結果として、菌本来の生残能がさらに誘導発現される。工程(２−ii)は、含有成分の固体表面の増殖環境に添加したポリフェノールなどによるストレス強度に応じて菌本来が備え持つ生残能の誘導発現を促す育種環境となっている点に特徴がある。工程（２−ii）を「乳酸菌固体発酵」工程と呼ぶことができる。
【００８２】
含有成分である炭酸塩、胚芽、及びポリフェノール含有植物体の含有量は、炭酸塩が1〜5重量％、胚芽が50〜90重量％、ポリフェノール含有植物体が５〜30重量％、好ましくは10〜30重量％、胚芽麹が含まれる場合、胚芽麹を15〜30重量％含む。各含有成分の合計は100％になる。工程（２−i）にもポリフェノール含有植物体が含まれる場合、ポリフェノール含有植物体の含有量は、工程（２−i)よりも多くすることが必要であり、工程（２−i)の1.5倍〜10倍、好ましくは2〜8倍含有させればよい。
【００８３】
また、工程（２−ii）の固体培地に塩化ナトリウムを含有させる場合、固体培地の全重量に対して0.15〜0.60％添加すればよく、使用する菌種や菌株によってはこれより高く設定することが可能である。
【００８４】
工程(２−ii)の培養においては、上記の固体培地に、工程(２−i)の固体培養により得られた乳酸菌を「固体種」として接種する。接種は、工程(２−i)の固体培養により得られた増殖した乳酸菌が含まれる固体培地を工程(２−ii)で用いる固体培地に添加すればよい。例えば、添加は、工程(２−i)の乳酸菌を含む固体培地をスパーテル等でよく混合し、該混合物を工程(２−ii)で用いる固体培地に添加し、さらにスパーテル等でよく混合すればよい。この際、工程(２−i)の固体培地を工程(２−ii)で用いる固体培地に対して１〜10重量％、好ましくは2〜5重量％添加すればよい。
【００８５】
培養は、工程（２−i)と同じか、あるいは近似した条件で行えばよい。
【００８６】
本発明の方法の各工程において、乳酸菌が増殖していることは、顕微鏡観察により菌体の存在を確認してもよいし、菌種に応じて特異的な方法で確認することができる。例えば、培地のpHを測定し、pHが低下していることを指標にして菌の増殖を確認することができる。
【００８７】
図２に工程(１)、工程(２−i)及び工程(２−ii)の特徴を示す。
【００８８】
上記例は、固体培養工程が２つの工程からなる場合であるが、固体培養工程が１工程の場合、少なくとも炭酸塩、胚芽、及びポリフェノール含有植物体を含む固体培地で培養し、固体培地にさらに胚芽麹が含まれていてもよいという条件を満たす培養条件で行うことができる。例えば、工程（２−i）の条件に近似した条件で培養してもよいし、工程(２−ii）の条件に近似した条件で行ってもよい。また、固体培養工程が３つ以上の工程で行われる場合、各工程は少なくとも炭酸塩及び胚芽、並びに胚芽麹及び／又はポリフェノール含有植物体を含む固体培地で培養すればよく、但し、最終工程には必ずポリフェノール含有植物体が含まれるという条件を満たす培養条件で行えばよい。複数の固体培養工程のうち、複数工程の培養工程に用いる固体培地にポリフェノール含有植物体が含まれる場合、後の固体培養工程で用いる固体培地中のポリフェノール含有植物体の含有量が、それより前の固体培養工程で用いる固体培地中のポリフェノール含有植物体の含有量よりも多いことが好ましい。例えば、後の固体培養工程でその前の固体培養工程に対して、1.5倍〜10倍、好ましくは2〜8倍のポリフェノール含有植物体を含有させればよい。この条件で複数の工程の固体培養を行うことにより、複数の固体培養工程を経るにつれ、段階的に強度を高くした複数のストレスを負荷し、それらのストレスに耐性を有する乳酸菌の生残能を賦与することができる。
２．本発明の培養方法で得られる乳酸菌
最初に液体培養を行い、次いで固体培養を行うことにより、高い耐熱性を有し、増殖能が高い乳酸菌を得ることができる。液体培養は、MRS液体培地等の公知の培地を用いた１工程の「一般的な液体培地」でも複数工程の液体培養をストレス負荷を大きくしながら行う「菌株育種培養」でもよい。ただし、「菌株育種培養」を行った場合、培養を繰り返す度に、前回の培養に比べてより高い強度のストレスを負荷することにより、菌本来の生残能を誘導発現させた菌体が得られる。この「菌株育種培養」で得られた菌体を用いた場合、「一般の液体培養」で培養して得られた菌体を用いた場合に比べ、後工程である固体培地工程において、例えば、工程（２−i）の「固体環境順応」工程及び、その後の工程（２−ii）の「乳酸菌固体発酵」における２度の固体培養において、より増殖能が高い乳酸菌を得ることができる。
【００８９】
固体培養においては、液体培養で得られた乳酸菌が固体培養に順応し、かつ乳酸菌に種々のストレスが負荷される。このため、菌本来の生残能が誘導発現された菌体が旺盛に増殖する。
【００９０】
本発明の方法で得られた乳酸菌固体発酵物の表面で増殖する乳酸菌は、増殖能力が高く、各種ストレスに対する抵抗力が高いという特徴を有する。
【００９１】
各種ストレスに対する抵抗力は、そのストレスが負荷された培養条件で培養し、増殖能力を測定すればよい。
【００９２】
本発明の培養法で得られた乳酸菌固体発酵物が含有する菌体に、菌本来の生残能が誘導発現されたことに対する評価は、以下の方法によって得られる指標より判断できる。例えば、増殖能力、耐熱性、耐塩性、ポリフェノール抵抗力、および凍結乾燥処理後の生残率等が挙げられる。
【００９３】
増殖能力は、例えば、得られた発酵菌固体発酵物1ｇ当たりに含有された菌数が指標となる他、「一般的な液体培養」において生育の非許容温度となる上限と下限の各温度域における増殖が可能になる効果によって評価できる。耐熱性は、例えば、菌数測定時の段階希釈液を湯浴温度57℃で15分間、速度75rpmで振盪しながら熱処理した後の生残率が指標となる他、耐熱性に優れた菌種であれば57℃を60℃に設定することで評価でき、いずれも「一般的な液体培養」で得られた菌体の生残率より高い数値が得られることで判断できる。耐塩性は、耐熱性と同様に、菌数測定時の段階希釈液を一定濃度の塩化ナトリウムを添加した溶液中で１〜２時間処理した後の生残率が指標となる。ポリフェノール抵抗力は、ポリフェノールを高含有した乾燥果物を数％添加したMRS液体培地で培養した時の増殖度を指標に評価できる。凍結乾燥処理後の生残率は、凍結乾燥処理の前後における菌数の変化を指標に判断できる。
【００９４】
「菌株育種培養」を経ることで乳酸産生量に比較して酢酸産生量が顕著に低下した菌体が得られる。これを固体培養に供した場合、固体環境順応で得られる乳酸菌固体発酵物は、乳酸産生量に比較して酢酸産生量を著しくより多く産生してヘテロ乳酸発酵と類似した現象を呈し、さらに、クエン酸も旺盛に資化するという特徴を有する。
３．乳酸菌固体発酵物
本発明の液体培養工程と固体培養工程を含む培養工程を経て得られる、乳酸菌が含まれる固体培養物を「乳酸菌固体発酵物」という。
【００９５】
本発明の培養方法で得られた乳酸菌固体発酵物は、小分けして凍結保存したものを融解して用いることができ、また、糖アルコール、デンプン、グルタミン酸ナトリウム等の保護剤や安定化剤を全く添加しなくとも、そのままで45℃送風乾燥又は凍結乾燥することにより機能性を有したまま保存することができる。
【００９６】
該発酵物は、乳酸菌が含まれる固形食材混合物でもある。乳酸菌固体発酵物は、少なくとも炭酸塩、胚芽、及びポリフェノール含有植物体を含む固形食材混合物の表面に乳酸菌が含有されている、乳酸菌固体発酵物であり、さらに、胚芽麹や塩化ナトリウムが含まれていてもよい。
【００９７】
乳酸菌固体発酵物には、乳酸菌菌体、ポリフェノールが含まれ、さらに乳酸菌菌体外分泌成分が含まれる。
【００９８】
乳酸菌は、乳酸菌固体発酵物中に高密度で含まれ、固体培地である固形食材混合物１ｇ当たり、10億個以上、好ましくは20億個以上、さらに好ましくは50億個以上、特に好ましくは100億個以上の乳酸菌が含まれる。乳酸菌固体発酵物に含まれる乳酸菌は、本発明の培養により、菌本来の生残能を誘導発現させるようになった優れた機能を有する乳酸菌であり、菌体そのものが優れた保健機能性を示す。特にプロバイオティクスに属する菌株を用いた場合の保健機能性は顕著である。
【００９９】
例えば、以下の機能を有する。乳酸菌のヒト健康に対する有益な作用として、（１）腸のぜん動運動の促進及び便秘予防と改善、（２）肌荒れ改善、（３）腸内細菌叢の改善と有害菌繁殖の抑制、（４）花粉症予防、（５）アトピー性皮膚炎の改善、（６）口腔内齲蝕菌の抑制、（７）免疫機能の向上、（８）血糖値の上昇抑制、（９）高血圧の予防、（１０）抗生物質投与に伴う下痢症の改善、（１１）胃癌を惹起する胃内常在性病原菌ヘリコバクター・ピロリ（H．pylori）に対する抗菌活性、（１２）潰瘍性大腸炎の改善、（１３）葉酸やオルニチンなどの保健機能物質の産生が挙げられる。なお、適量を投与した場合、宿主に健康増進効果を期待できる生きた微生物は「プロバイオティクス」といわれている。
【０１００】
ポリフェノールは、固体培地に含まれるポリフェノール含有植物体、胚芽、胚芽麹に含まれているポリフェノールであり、優れた保健機能性を持つ。ポリフェノールのフェノール性水酸基は、それ自身が酸化され易く、鉄などの金属に対するキレート力が強い為、ポリフェノールに属する化合物であればいずれも抗酸化作用を示す。ポリフェノールの代表的な成分であるカテキンは、例えば緑茶に含まれる渋み成分であるが、その生理作用として、（１）抗酸化作用、（２）抗菌作用、腸内細菌叢の改善、（３）抗う蝕作用、（４）消臭作用、（５）活性酸素消去作用、（６）コレステロール上昇抑制作用、（７）血糖値上昇抑制作用、（８）血圧上昇抑制作用、（９）抗腫瘍作用、（１０）抗アレルギー作用、（１１）血小板凝集抑制作用、及び（１２）紫外線吸収作用等が知られている。ポリフェノールに属する他の成分に関しても、成分の種類によって作用の強度は異なるが、いずれもほぼ同様の作用が報告されている。一方、ポリフェノールに炭素数５個のイソプレノイド構造単位（プレニル基）が結合すると、疎水性が増して体内動態も変化する結果、元々のポリフェノールでは非常に弱かった生理作用が飛躍的に強くなることが経験的に知られており、この様な活性として、抗腫瘍活性、抗菌活性、抗ウイルス活性、抗酸化活性の外に、女性ホルモン・エストロゲン様活性、免疫増強活性、抗炎症活性、血管増強活性が挙げられる。
【０１０１】
乳酸菌の菌体外分泌成分として、多糖体や糖たんぱく質で構成されたバイオフィルムが挙げられる。例えば、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（L. kefiranofaciens）が分泌産生した高分子多糖体ケフィランに関して、分子量が100万〜400万ダルトンであり、（１）血圧上昇抑制ならびに抗動脈硬化作用、（２）脂質代謝改善作用、（３）血糖値上昇抑制作用、（４）整腸作用、（５）腸内環境改善作用、（６）肝機能改善作用等の多彩な生理作用が知られている。
【０１０２】
また、乳酸菌固体発酵物は菌体が分泌産生したバイオフィルムの他、葉酸やオルニチン、及びビタミン類などの生理活性物質を含有しており、菌本来の生残能を誘導発現した活性菌体と共に優れた保健機能性成分を併せ持っている。
【０１０３】
本発明は、上記の乳酸菌固体発酵物を含む食品も包含する。該食品は、乳酸菌、ポリフェノール、穀物等を豊富に含む滋養に富んだ優れた機能性食品である。本発明の乳酸菌固体発酵物は、穀物の胚芽そのもの、もしくは胚芽を含んだ穀物を豊富に含むシリアル食品として摂食することができる。
【０１０４】
本発明の乳酸菌固体発酵物を含む食品は、健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品、健康補助食品等を含む。ここで、特定保健用食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする食品をいう。
４．育種方法
さらに、本発明は液体培養工程と固体培養工程を含む培養法により、乳酸菌にストレスを負荷し、そのストレス強度を段階的に高くすることにより、菌本来の生残能を誘導発現させた乳酸菌を育種する方法、あるいは該乳酸菌を得る方法も包含する。
【実施例】
【０１０５】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１  工程（１）の液体培養として、「一般的な液体培養」を用いた場合の固体培養工程（２−ii）における効果の必須要素の評価
１−１  工程（１）「液体培養」
乳酸桿菌に属するラクトバチルス・ラムノサス（L. rhamnosus）GG （ATCC53103）株（以下、LGG株と略す）を用い、「一般的な液体培養」としてMRS液体培地を用いて好気的に37℃、100rpmでの振盪培養を24時間行った。得られた培養液のデータを表１に示す。【０１０６】
培養菌株の菌数測定は以下の３通りの条件で行った：
（１）  菌数測定法―I＋
0.5％凍結乾燥ブルーベリー（ポリフェノール含有植物体）及び3％塩化ナトリウムを添加したリン酸バッファ（pH6.8）に上記のMRS培養液を100倍希釈した状態で45℃、10分間インキュベーションした。その後、15回ホモゲナイズした菌懸濁液を更にリン酸バッファで段階希釈した後、菌懸濁液の0.1mlを色素ブロモチモールブルー(BTB)0.003％添加MRS寒天培地に表面塗沫して37℃、1〜3日間嫌気的に培養を行い、出現する集落数を計測した。【０１０７】
なお、菌数測定法―I＋に対して、凍結乾燥ブルーベリーを添加し、塩化ナトリウム無添加の条件でホモゲナイズを行い、出現する集落数を計測する菌数測定法を菌数測定法―I―と表示した。
（２）  菌数測定法―II
上記の菌数測定法―I＋に対して、凍結乾燥ブルーベリーと塩化ナトリウムの両方を添加せずにホモゲナイズを行い、出現する集落数を計測した。
（３）  菌数測定法―III
菌株を培養して得られたMRS培養液をリン酸バッファで直ちに段階希釈した。【０１０８】
それぞれの菌数測定法において、菌の耐熱性も調べた。耐熱性は、段階希釈液を湯浴温度57℃で15分間、速度75rpmで振盪しながら熱処理した後の生残率（％）で示した。【０１０９】
なお、菌数測定法―I＋及び―I―、並びにこれらと併用した耐熱性の測定は、培養中又は菌体保存中にVBNCへ誘導された菌数の相当量を活性菌体の菌数と同時に計測できる方法であり、更に被検菌の細胞膜の頑健性を評価し得る方法である。これらの方法は、本発明者らが独自に開発した。【０１１０】
ブルーベリーに含有されたポリフェノールによる細胞膜へのストレス負荷が特徴の菌数測定法―I＋及び―I―は、同様に45℃、10分間処理する測定法―IIに比べて、培養環境のポリフェノールによる細胞膜へのストレス負荷が原因でVBNCへ誘導された状態から寒天平板上で菌集落を形成できる活性状態へ速やかに戻す効果を推定している。更に、菌数測定法―I＋によって耐熱性が評価できるが、菌数測定法―I＋においては、ブルーベリーと共に塩化ナトリウムも添加してある為、耐塩性に関する評価もできる。耐熱性と耐塩性の評価により細胞膜の頑健性に対する評価をすることができる。【０１１１】
本発明では菌数測定法―I＋や―I―で得られた結果を菌数測定法―IIの結果と対比しながら、結果の解析を行った。【０１１２】
【表１】
2017086451.tif 000002
【０１１３】
表１において、測定法が−IIIから−II、更に−IIから−I＋へ変わると、耐熱性が5.9％から11％、更に11％から23％へ向上しており、負荷ストレスが皆無の測定法―IIIに比して、ポリフェノールと塩化ナトリウム、更に45℃加熱処理のストレス負荷の強度を高める程、菌体が菌数測定工程の短時間で環境順応したことが示唆された。なお、菌数測定法―I＋と菌数測定法―IIで評価された菌数が同じであったことから、MRS液体培地の37℃振盪培養ではVBNCに至らなかったことが示唆された。
１−２  工程（２−i）「固体培養」
工程（２−i）で用いた固体培地の組成を表２に示した。固体培地乾物の全重量15.5g当たり、加水量として脱イオン水14.2mlを添加（14.2/（14.2+15.5）×100＝47.8％）して、滅菌して固形食材混合物の粒状物質表面の増殖環境を調製した。表２中、「2-i/果物０％」は果実（ポリフェノール含有植物体）を含まない工程（２−i）の固体培養を指し、「2-i/果物５−」は果実を約5重量％含み、胚芽麹を含まない工程（２−i）の固体培養を指し、「2-i/果物５＋」は果実を約5重量％含み、胚芽麹を約20重量％含む（２−i）の固体培養を指す。【０１１４】
【表２】
2017086451.tif 000003
【０１１５】
なお、アスペルギルス・オリゼー（A. oryzae）の脱脂胚芽麹DG(-)Pは、調製に用いた固体培地の組成が、重質炭酸カルシウム0.7重量％、脱脂米胚芽45.1重量％、脱脂小麦胚芽38.9重量％、脱脂コーン胚芽（食用グレード）15.3重量％であり、30℃、41時間固体培養した後、50℃送風乾燥した麹である（DG(-)P：Defatted Grain(-)without MgCO3 ,Protease rich Kojiの略）。【０１１６】
また固体培地の性質の一つとして抗酸化活性を調べた。抗酸化活性は総ポリフェノール量を定量する方法に準拠して行い（津志田藤二郎  他、日本食品工業学会誌、1994,41巻（9号）：ｐ.611-618.）、同様にアスコルビン酸（以下、AsAと略す）について反応させて標準曲線を作成し、測定値をAsA相当量として算出した。該測定法は、ポリフェノールの抗酸化活性を評価する以外に、固体培地に含有された還元末端を有する単糖類やトリプトファンの様な抗酸化性アミノ酸とも反応する。従って、固体培養中、増殖環境に含有されたこれらの抗酸化性栄養素を菌体が資化する為、乳酸菌固体発酵物の抗酸化活性は固体発酵を経ることで低下する。【０１１７】
ここでの工程（２−i）として、凍結乾燥ブルーベリーを添加した固体培地・２−i/果物５−（DG(-)P麹無添加区）へMRS液体培地の培養液1.2mlを接種し、39℃、80％相対湿度にセットした恒温恒湿器において、恒温恒湿器において、22時間固体培養を行った。固体培養の途中に２度、培地の手入れを兼ねて培地pHを測定した。得られた活性LGG含有固体発酵物の評価結果を表３に示す。【０１１８】
【表３】
2017086451.tif 000004
【０１１９】
１−３  工程（２−ii）  「固体培養」
固体培地をスパーテルで十分混合して粒子成分の分布均質化を図った後、加水量として固形食材混合物（乾物）の全重量15.5ｇ当たり脱イオン水15.4ｍｌを添加して滅菌し、食材粒子表面の増殖環境を調製した。【０１２０】
なお、アスペルギルス・オリゼー（A．oryzae）の脱脂胚芽麹UK（UK：Umami Kojiの略）は、調製に用いた固体培地の組成（UK-1）が、重質炭酸カルシウム0.7重量％、脱脂米胚芽39.3重量％、脱脂小麦胚芽33.0重量％、脱脂コーン胚芽（食用グレード）15.3重量％、及び脱脂大豆11.7重量％であり、30℃、80％ＲＨ、41時間固体培養した後、50℃送風乾燥して得られた独自製造した麹である。工程（２−ii）で使用した固体培地の組成及び抗酸化活性を表４に示す。【０１２１】
【表４】
2017086451.tif 000005
【０１２２】
また、工程（２−ii）として、工程（２−i）で得られた活性LGG含有固体発酵物の-20℃凍結保存品を融解した後、固体発酵物0.90gを表４に示した組成の固体培地へ接種し、39.5℃、80％RHにセットした恒温恒湿器において23時間培養を行った。【０１２３】
得られた活性LGG含有固体発酵物の評価結果を表５に示す。【０１２４】
【表５】
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【０１２５】
工程（２−ii）の固体培養で得られた活性LGG含有固体発酵物は、本発明の固形食材混合物―I〜−VIにおいて、以下の効果が得られた。
効果―１  固体培養23時間後の培地ｐＨの低下度は-1.68〜-2.03となり、工程（２−i）の固体発酵物のpH低下度-1.13に比べてより大きくなり、食材粒子表面における増殖がより旺盛化した可能性が示唆された。
効果―２  乳酸産生能は+2.07〜+2.76となり、工程（２−i）の+1.24に比べてより活性化した。酢酸産生能は+0.16〜+0.009となり、工程（２-i）の+0.511に比べて著しく低下した。一方、工程（２−ii）の対照の固体培地における酢酸産生能は+1.46〜+0.50であり、低下し難かった。【０１２６】
菌が培養環境からストレスが負荷された状態にあると認識した際の応答の一つとして、乳酸産生に比較して、酢酸産生を亢進させる結果、過酷環境に応答して菌体構造を変化するために必要なATPエネルギーをより多く産生する必要が生じる。これに対して、菌体に優れたストレス抵抗力が賦与されていた場合、通常の乳酸産生経路で得られるATPエネルギーで十分と想定される。酢酸産生能の低下、乳酸産生能の上昇は、このストレス応答の菌体状態を示唆している。
比較例１「一般的な液体培養」の後の工程（２−i）の質的相違（ポリフェノール植物体を含まない固体培地での培養）による工程（２−ii）への影響
ポリフェノール含有植物体である果物（凍結乾燥ブルーベリー）を添加しない固形食材混合物-0％に工程（１）で得られた液体種を接種して固体培養を行った後、得られた固体種を工程（２−ii）へ接種して固体培養を行うことで、工程（２−ii）への影響を確認した。結果を表６に示す。【０１２７】
【表６】
2017086451.tif 000007
【０１２８】
工程（２−i）の活性LGG含有固体発酵物の菌数とpHは、実施例１表３の270×10８cfu/gとpH6.15であったのに対して、18×10８cfu/gとpH6.95となり、食材粒子表面における増殖が不十分な結果であった。【０１２９】
増殖が不十分であった本比較例１の方が、乳酸と酢酸の両方において産生能がより亢進した。従って、実施例１の工程（２−i）は、固体培地にブルーベリーを添加したことに因り、増殖が顕著に旺盛化したことが示唆された。
１−３  工程（２−ii）  「固体培養」
工程（２−ii）として、工程（２−i）で得られた活性LGG含有固体発酵物の-20℃凍結保存品を融解した後、固体発酵物0.90gを表４に示した本発明の固形食材混合物―IVへ接種した。40℃、80％RHで4時間固体培養した後、39℃で24時間に至るまで、引き続き80％RHにセットした恒温恒湿器で培養を続けた。得られた活性LGG含有固体発酵物の評価結果を表７に示す。【０１３０】
【表７】
2017086451.tif 000008
【０１３１】
表７に示した工程（２−ii）の結果は、実施例１表５における本発明の固形食材混合物―IVの結果と同じ組成において得られたデータであり、両方の結果を比較することで、工程（２−i）の質的な相違による工程（２−ii）への影響を解析できた。【０１３２】
すなわち、工程（２−ii）の活性LGG含有固体発酵物の菌数とpHは、実施例１表５（本発明の固体培地IV）が菌体測定法-IIにおいて260×10８cfu/gとpH5.28であったのに対して、比較例１では130×10８cfu/gとpH5.94であった。この様に、工程（２−i）の固体種の質的相違による影響は工程（２−ii）において発現した為、本発明の十分な効果を得る為には、工程（２−i）における増殖をより旺盛化させた条件が必要であった。
実施例２  「菌株育種培養」による工程（２−ii）における菌本来の生残能の誘導発現
工程（１）において、一般的な液体培養であるMRS液体培養を用いるのではなく、「菌株育種培養」による液体培養にて得られた液体種を用いた際の、工程（２−ii）への影響を確認した。
２−１  工程（１）  「液体培養」
先に本発明者が開発した液体培養法（「菌株育種培養」と称す）に準拠して、LGG株を表８に示す３通りの液体培地組成で前々培養、前培養、及び本培養の各培養工程をこの順序で行った。これらの液体培地の組成を表８に示す。なお、BTBを0.003％添加したMRS寒天培地で37℃一夜培養して形成された菌集落の一白金耳を1％軽質炭酸カルシウム添加MRS液体培地10mlへ接種して、37℃一夜静置培養を行い、得られた培養液0.15mlを用いて前々培養を開始した。【０１３３】
【表８】
2017086451.tif 000009
【０１３４】
前々培養で得られた培養液を1％接種して前培養を行い、さらに、前培養で得られた培養液1％接種して本培養を行った。各培養工程を各々24時間行い、培養液を評価した。
評価結果を表９に示す。【０１３５】
【表９】
2017086451.tif 000010
【０１３６】
前々培養から前培養で得られた菌の耐熱性は低かった。しかしながら、本培養へ培養を繰り返す度に菌体への負荷ストレスをより高めた結果、「菌株育種培養」によって得られた本培養液は、（１）培養菌の耐熱性が28％へ向上する効果が見出された他、（２）培地pHの低下度がより小さく、更に、（３）乳酸産生量が減少、酢酸産生量が顕著に増加、（４）クエン酸資化能が著しく発達したという特徴が認められた。【０１３７】
菌体が液体培養のストレス環境に順応する時の形質変化は、順応に必要な菌体構造の変化に費やす分のATPエネルギーを新たに確保するため、例えば、乳酸産生量を抑えつつ、酢酸産生量を増加させる。本実施例においても、酢酸産生能が著しく亢進しており、これは菌が環境順応に努めた証しと理解される。同様に、クエン酸代謝過程においてもATPエネルギーの産生を伴うため、クエン酸資化能も亢進することで、優れた生残能の賦与に必要なATPエネルギーを潤沢に生成でき、ATPエネルギーの消費量増加に応答することが可能となる。なお、増加した酢酸産生能がこの後の固体培養工程（２−ii）において低下した場合、菌体は優れた生残能を獲得できたと理解され、有機酸産生とリンクしない他の代謝経路を誘導発現した可能性が考えられる。
２−２  工程（２−i）  「固体培養」
工程（２−i）として、ポリフェノール含有植物体である凍結乾燥ブルーベリーを5.2重量％及び脱脂胚芽麹DG(-)Pを20.3重量％含有した固体培地・２−i/果物５＋へ工程（１）で得られた本培養液1.2mlを接種し、39℃、80％RHにセットした恒温恒湿器において、24時間固体培養を行った。【０１３８】
更に、工程（１）の質的相違による工程（２−i）への影響を考察する為、固体培地・２−i/果物５−に対しても本培養液を接種し、同条件で固体培養を行った。培養の途中に２度、固体培地の手入れを兼ねて培地pHを測定し、得られた生状態（凍結乾燥前の状態）の活性LGG含有固体培養物の評価結果を表１０及び表１１に示す。【０１３９】
【表１０】
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【０１４０】
【表１１】
2017086451.tif 000012
【０１４１】
実施例２表１１に示した工程（２−i）の結果は、実施例１表３に示した工程（２-i）の結果と同じ組成の固形食材混合物を用いて得られたデータであり、両者を比較することで、工程（１）の液体種の質的相違による工程（２−i）への影響を以下の（A）及び（B）のように解析できた。
（A)  「菌株育種培養」で得られた液体種を固形食材混合物へ接種して固体培養を行った場合、「一般的な液体培養」の液体種を接種した固体培養に比べて、培養開始から2.5時間で培地pHの低下度が-0.26に至った他、培養6.5時間目のpHが培養22時間目とほぼ同水準に至った。しかも、培養終了時のpHの両者の相違が-0.17と大きく相違しており、「菌株育種培養」を経た固体培養の方がより低いpHに至った。従って、「菌株育種培養」によって得られた菌体は、工程（２−i）の固形食材混合物へ接種された際、増殖再開までの誘導期の時間がほとんどゼロに近く、更にその後の固体表面における増殖が極めて旺盛であった為、6.5時間の培養時間で定常期に到達した。食材粒子表面における旺盛な増殖能の賦与が「菌株育種培養」によって改変できた性質の一つと示唆された。ちなみに、液体培地のクエン酸ナトリウムの濃度をより高く設定した場合、その濃度に依存して、培地のグルコース消費量を低下、乳酸産生量を低下、酢酸産生量を増加、グルコース消費量当たりの菌体量を増加、そしてATP産生量当たりの菌体量増加がラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）CRL264株で報告されている（Sanchez C. et al., Applied and Environmental Microbiology, 2008 Feb.,74巻（4号）:p.1136-1144.）。したがって、液体培地に含有されたクエン酸を資化して旺盛に代謝する活性を工程（１）において十分学習させておくことが上記の結果につながった可能性が考えられる。
（B)  「菌株育種培養」を経た工程（２−i）の固体培養は、「一般的な液体培養」を経た工程（２−i）の固体培養に比べて、クエン酸資化量が同等であったが、乳酸産生量の49％に相当する酢酸産生量を呈しており、「一般的な液体培養」を経た場合の41％に比べて、酢酸産生が若干旺盛化した。したがって、「菌株育種培養」を経た菌体の方が工程（２−i）の固体培養で順応に必要なATPエネルギーがより多く産生された結果、より充分に構造変化ができた可能性が示唆された。
２−３  工程（２−ii)  「固体培養」
工程（２−ii)として、固形食材混合物・２−i/果物５＋を用いて得られた工程（２−i)の活性LGG含有固体発酵物の-20℃凍結保存品を融解した後、固体発酵物0.90gを表４に示した本発明の固形食材混合物―IV及び―VIIへ接種した。40℃で4時間固体培養した後、39℃で24時間に至るまで、80％RHにセットした恒温恒湿器で培養を続けた。得られた活性LGG含有固体培養物の評価結果を表１２に示す。【０１４２】
【表１２】
2017086451.tif 000013
【０１４３】
実施例２表１２に記載の活性LGG固体発酵物を、実施例１表５に記載した固体発酵物と比較すると、いずれも工程（２−i）（実施例１、固形食材混合物・２−i/果物５―；実施例２、固形食材混合物・２−i/果物５＋）及び工程（２−ii）（両方とも固形食材混合物―IV）においてほぼ同じ培養条件に設定した為、工程（１）の相違が及ぼす工程（２−ii）への影響を以下の（A)及び（B)のように解析できた。
（A)  「菌株育種培養」を経た工程（２−ii）の固体培養は、「一般的な液体培養」を経た工程（２−ii)の固体培養に比較して、固形食材混合物のｐＨ低下速度、到達菌数、耐熱性、固体発酵に伴う乳酸及び酢酸産生量の変化、乳酸及び酢酸の産生能がいずれもほぼ同水準であった。
(B)  しかしながら、「菌株育種培養」を経た工程（２−i）の固体発酵物と同様、「菌株育種培養」を経た場合、引き続き工程（２−ii）においてもクエン酸を資化した。これらの特異的な変化は、菌本来の生残能の誘導発現した効果と関連している可能性が示唆された（実施例３で詳細を示す）。【０１４４】
図３に、各培養工程で培養して得られた菌体の菌数と耐熱性を示す。図３には、各培養工程（試験区）１〜５の培養条件を示す表（図３Ａ）及び菌数及び耐熱性のグラフ（図３Ｂ）を示す。図３Ａには、各条件のデータが含まれる表番号も記載してある。試験区３及び４が本発明の培養条件を満たす試験区であり、本発明の工程（２−i）及び工程（２−ii）の培地を用いれば、菌数も著しく高く、耐熱性も他の試験区に比べ高い。
実施例３  活性LGG固体発酵物を凍結乾燥、及び保存安定性評価
工程（２−i）又は工程（２−ii）における乳酸菌固体発酵物の評価を行った。
３−１  凍結乾燥
活性LGG含有固体発酵物に対して、保護剤や安定化剤を全く添加せず、固体培養して得られたそのままの状態で、棚式凍結乾燥機FD-550P（東京理化器械株式会社製）を用いて凍結乾燥を24時間行った。一般的に液体培養で得られた乳酸菌の菌体を凍結乾燥、噴霧乾燥、又は凍結保存する場合、適切な組成の保護剤や安定化剤で菌体を懸濁してからこれ等の処理を開始することが必須であり、乳酸菌の各メーカーにとって保護剤や安定化剤の独自組成は重要なノウハウとなっている。【０１４５】
これに対して、本発明の方法で得られる乳酸菌固体発酵物は、乳酸菌が固形食材混合物の粒子表面にバイオフィルムと呼ばれる多糖体や糖タンパク質を分泌産生している他、固形食材混合物がポリフェノールを著量含有しており、高い抗酸化活性を有しているので、固体発酵物を凍結乾燥や凍結保存する上で、保護剤や安定化剤が全く不要と思われた。したがって、LGG活性含有固体発酵物に保護剤や安定化剤をまったく添加せず、凍結乾燥して得られた結果を表１３に示す。【０１４６】
【表１３】
2017086451.tif 000014
【０１４７】
図４に各培養工程で培養して得られた菌体の凍結乾燥後の生残菌数及び耐熱性を示す。図４には、各培養工程（試験区）１〜５の培養条件を示す表（図４Ａ）及び生残菌数及び耐熱性のグラフ（図４Ｂ）を示す。凍結乾燥後の高い生残菌数及び耐熱性は試験区３及び４において得られた。特に試験区４で良好であった。この結果は、固体培養工程（工程（２−i）及び工程（２−ii））において、ポリフェノール含有植物体が存在することの効果を示す他、胚芽麹が工程（２−i）及び工程（２−ii）の両方に含まれることが好ましいことを示す。また、液体培養工程において「菌株育種培養」を行うことが好ましいことを示す。【０１４８】
凍結乾燥の結果、工程（１）における「菌株育種培養」（実施例２）と「一般的な液体培養」（実施例１）の質的違いによる工程（２−ii）（いずれも本発明の固形食材混合物―IV）への影響は、「菌株育種培養」を経た場合が生残菌数220×10８cfu/g、耐熱性26％となり、「一般的な液体培養」を経た場合が生残菌数97×10８cfu/g，耐熱性14％となった。すなわち、工程（１）において「菌株育種培養」を経た効果として、工程（２−ii）の固体発酵において菌本来の生残能が誘導発現された活性菌体がより高菌数で得られた。【０１４９】
更に、本発明の菌本来の生残能を誘導発現した活性菌体を高菌数で含有した乳酸菌固体発酵物が得られる効果は、工程（２−i）における固形食材混合物に含有されたポリフェノールによるストレスに対する抵抗力の賦与された固体種を工程（２−ii）に接種することの重要性が、凍結乾燥の結果から示唆された。つまり、工程（２−i）における固体培地がポリフェノール植物体を含まなかった場合、比較例１表７に示した工程（２−ii）、固形食材混合物−IVの固体発酵物は、凍結乾燥を経た結果、表１３に示したように、生残菌数59×108cfu/g、及び耐熱性2.0％と低かった。これに対して工程（２−i）における固体培地がポリフェノール含有植物体を含んでいた場合、表１３に示した工程（２−ii）、固形食材混合物−IVの固体発酵物は、凍結乾燥を経た結果、生残菌数97×108cfu/g、及び耐熱性14％と上昇した。この結果より工程（２−ii）において、菌本来の生残能を誘導発現した活性菌体を高菌数で含有する乳酸菌固体発酵物を得る為には、工程（２−i）の固体培地のポリフェノール含有量をドライフルーツ及び/又は胚芽麹の添加によって増やすことが必須要素であることが示唆された。【０１５０】
一方、表１３の菌数測定法―I＋において、本発明の固形食材混合物―VIを用いた固体発酵物の生残菌数が90×10８cfu/gとなり、菌数測定法―IIの200×10８cfu/gに比べて半減した。この現象は、菌数測定法―I＋においてホモゲナイズする際、固体発酵物の高濃度ポリフェノールが菌数評価系のブルーベリー及び塩化ナトリウムの抗菌活性と合わさった結果、更により強いストレスが菌体に負荷されて死滅したことに起因した可能性がある。
３−２  凍結乾燥物の保存安定性
評価系のポリフェノールや塩化ナトリウムによる細胞膜へのダメージによって、膜の頑健性を評価できる菌数測定法―I＋を用いて、活性LGG含有固体発酵物の凍結乾燥品を4℃で42日間保存した後の菌数及び耐熱性を評価した。得られた結果を表１４Ａ及び比較例を表１４Ｂに示す。【０１５１】
【表１４】
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【０１５２】
この結果、表１４Ａでは、固体発酵物の凍結乾燥品を4℃で42日間保存した後でも高い生残菌数及び耐熱性はほぼ同水準が維持されており、著しく菌体が不安定化した表１４Ｂと比較して、菌本来の生残能を誘導発現する効果が示された。
実施例４  乳酸桿菌を乳酸球菌に変更した場合の本発明で得られる効果の共通性
４−１   PA株を用いた工程（１）（「一般的な液体培養」及び「菌株育種培養」）
乳酸球菌に属するペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）（ATCC25740）株（以下、PA株と略す）を用い、「一般的な液体培養」として、MRS液体培地を用いて培養温度を段階的に高めた他、実施例２に記載の本発明者らが先に開発した液体培養法に準拠して「菌株育種培養」として3３通りの液体培地組成の改変仕様で前々培養、前培養及び本培養の各培養工程をこの順序で行った。液体培地の組成を表１５に示す。BTBを0.003％添加したMRS寒天培地で37℃一夜培養して形成された菌集落の一白金耳を1％軽質炭酸カルシウム添加MRS液体培地10mlへ接種して、37℃一夜静置培養を行い、得られた培養液0.15mlを用いて前々培養を開始した。【０１５３】
【表１５】
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【０１５４】
前々培養で得られた培養液を1％接種して前培養を行い、更に、前培養で得られた培養液を1％接種して本培養を行った。各培養工程を各々24時間行い、培養液を評価した。得られた培養液の評価結果を表１６Ａ及び表１６Ｂに示す。【０１５５】
【表１６Ａ】
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【０１５６】
【表１６Ｂ】
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【０１５７】
PA株の液体培地No.1は、「菌株育種培養」において、段階的に培養温度を上昇、糖質と窒素源の濃度を低下、クエン酸濃度上昇の少なくとも３つのストレス要素を同時に負荷した結果、本培養において増殖が著しく抑制された。液体培地No.1に比較して、クエン酸濃度上昇のストレス要素を負荷しなかった培地No.2の場合、実施例２におけるLGG株の「菌株育種培養」における応答と同様に、培地pHの低下度が非常に小さく、そして乳酸産生量が減少した。しかしながら、LGG株と逆に、酢酸産生量も著しく減少した他、クエン酸資化能が誘導発現しなかった。一方、液体培地No.1に比較して糖質と窒素源の濃度低下のストレスを負荷しなかった液体培地No.3の場合、実施例２におけるLGG株の「菌株育種培養」における応答とは逆に、到達菌数が若干増加した他、酢酸産生量の低下が少なく、そしてクエン酸資化能が誘導発現しなかった。以上、工程（１）の「菌株育種培養」において、PA株とLGG株は著しく相違した応答を呈した。
４−２  PA株を用いた工程（２−i）「固体培養」
工程（２−i）として、表１７に示した組成の固形食材混合物へ工程（１）の本培養で得られた培養液1.2mlを接種し、42℃、80％RHにセットした恒温恒湿器において、24時間固体培養を行った。固体培養の途中に２度、手入れを兼ねて固体培地のpHを測定した。得られた活性PA含有固体発酵物の評価結果を表１８に示す。【０１５８】
【表１７】
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【０１５９】
【表１８】
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【０１６０】
工程（２−i）で得られた活性PA含有固体発酵物の２−i（A)は、「菌株育種培養」の本培養培地No.１において増殖が非常に抑制されていたにもかかわらず、培養8時間以降、培養24時間までに増殖の遅れを取り戻して他の培養条件レベルとほぼ同程度に至ったことがpHや到達菌数の評価結果から示唆された。【０１６１】
工程（２−i）で得られた活性PA含有固体発酵物は、乳酸産生量に比べて酢酸産生量がより多く、クエン酸が量的に少ないものの分泌産生された点が工程（２−i）で得られた活性LGG含有固体発酵物と相違した。工程（１）において液体培地のクエン酸濃度を増加させた培養条件のNo.3を経たPA株の工程（２−i）の固体発酵物２−i（C)は、耐熱性が若干低下した。
４−３  PA株を用いた工程（２−ii）「固体培養」
工程（２−ii）として、工程（２−i）で得られた活性PA含有固体発酵物の-20℃凍結保存品を融解した後、固体発酵物0.90gを表１９に示した組成の固体培地２−ii塩化ナトリウム0〜1.2重量％へ接種した。42℃で24時間、80％RHにセットした恒温恒湿器で固体培養を行った。得られた生状態（乾燥前の状態）の活性PA含有固体発酵物の評価結果を表２０Ａ及び、表２０Ｂに示す。【０１６２】
【表１９】
2017086451.tif 000021
【０１６３】
【表２０Ａ】
2017086451.tif 000022
【０１６４】
【表２０Ｂ】
2017086451.tif 000023
【０１６５】
工程（２−ii）で得られたPA株の固体発酵物は、LGG株を用いて得られた実施例２の表１２に記載した結果と比べて、菌数が低かったが、耐熱性が著しく高かった。特筆される点は、PA株の工程（２−i）で得られた固体発酵物に比べて、工程（２−ii）で得られた活性PA含有固体発酵物は、乳酸産生能が著しく亢進し、逆に酢酸産生能がほぼ半減しており、LGG株と同様にマロラクティック乳酸発酵に類似した効果の発酵シーンの様相を呈した。
実施例５  工程（２−ii）で得られた活性PA含有固体発酵物の送風乾燥、及び乾燥菌体の生残能に及ぼす工程（１）の影響
工程（２−ii）で得られた活性PA含有固体発酵物を濾紙の上に薄く広げ、産業恒温器VTFH-216-2T（株式会社いすゞ製作所製）において、45℃、6時間送風乾燥を行った。得られた乾燥物の生残菌数及び耐熱性を菌数測定法―IIで評価した他、乾燥物を密栓ガラス瓶に入れ、4℃、18日間経過した後、同様に生残菌数及び耐熱性を評価した。その際、表２０Ａに示した培養直後に得られた菌数で各々の生残菌数を割り算して得られた数値に耐熱性（％）を掛け算した数値を「生残率×耐熱性（％）」で表現した。【０１６６】
なお、「生残率×耐熱性（％）」で表現した理由は、PA株はLGG株と異なり元々送風乾燥に優れた抵抗性を示し、更に耐熱性においても優れている為、両方のパラメーターを掛け合わせることで、菌本来の生残能が誘導発現されている状態をより高感度に評価できる尺度となるからである。すなわち、送風乾燥に伴い、全く死滅しなかった場合、生残率100％が得られ、送風乾燥した菌体が、送風乾燥に伴い、細胞膜が頑健に維持できた場合、生状態（乾燥前の状態）の菌体と同じ数値の耐熱性が得られる。従って、「生残率×耐熱性（％）」は、その数値がより高くなる程、細胞膜が頑健であり、菌本来の生残能が誘導発現された状態の安定化効果が想定される。【０１６７】
【表２１】
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【０１６８】
得られた結果を表２１に示す。工程（１）の「菌株育種培養」の本培養において負荷ストレスが高過ぎて増殖の抑制された培地No.1の液体種を接種して得られた工程（２−i）の固体発酵物２−i（A)を固体種として工程（２−ii）の固体培養を行った結果、固形食材混合物に塩化ナトリウム添加量が皆無の場合、工程（１）でMRS液体培地の「一般的な液体培養」で得られた液体種を接種した固体発酵物２−i MRSと同様の結果、すなわち「生残率×耐熱性（％）」は送風乾燥の直後、及び乾燥物を4℃、18日間保存した後の両方において、21〜34％及び、11〜12％といずれも低かった。ところが、工程（２−ii）の本発明の固形食材混合物に乾物換算で塩化ナトリウムを0.3重量％添加した固体において、工程（２−i）の固体発酵物２−i（A)を固体種として接種した固体発酵物２−ii 塩化ナトリウム0.3重量％の「生残率×耐熱性（％）」は、送風乾燥の直後、及び乾燥物を4℃、18日間保存した後の両方において78％及び32％と高く、菌本来の生残能が誘導発現された状態の固体発酵物が得られたことが示唆された。【０１６９】
一方、工程（１）の「菌株育種培養」で低栄養及び培養温度を段階的に高める両方のストレスを負荷した液体培地Ｎｏ．２の液体種を接種して得られた工程（２−i）の固体発酵物２−i（B)を固体種として工程（２−ii）の固体培養を行った場合、乾物換算で塩化ナトリウムを1.2重量％添加した固体培地で増殖させた固体発酵物２−ii 塩化ナトリウム 1.2重量％の「生残率×耐熱性（％）」は、送風乾燥の直後、及び乾燥物を4℃、18日間保存した後の両方において42％及び35％と高かった。【０１７０】
上記の結果は、工程（１）の「菌株育種培養」において、負荷ストレスの強度が非常に強く、本培養では増殖が抑制される程のストレス負荷を経た菌体は、固体培養工程（２−ii）において、塩化ナトリウムによるストレスの負荷強度が若干低くても、菌本来の生残能を誘導発現できた。即ち、負荷ストレスに対する応答のセンサーが「敏感型」へ変化した可能性が想定された。【０１７１】
一方、工程（１）の「菌株育種培養」において、上記の負荷ストレスの中からクエン酸濃度の段階的増加を削除した液体培地No.2の液体種を接種した場合、工程（２−i）を経た後の、工程（２−ii）の固体培養では、高い塩化ナトリウム濃度のストレス強度をより高く設定した場合に菌本来の生残能を誘導発現できる可能性が示唆された。即ち、負荷ストレスに対する応答のセンサーが上記と比較してやや劣った「普通型」へ変化した可能性が推定された。【０１７２】
これに対して、工程（１）の「菌株育種培養」において、上記の３種類の負荷ストレスの中から低栄養ストレスを削除した条件を経た菌体を接種して得られた工程（２−i）の固体発酵物２−i（C)を塩化ナトリウム1.2重量％添加した固体培地で培養して得られた固体発酵物２−ii 塩化ナトリウム 1.2重量％の「生残率×耐熱性（％）」は、乾燥直後だけが43％と高かったものの、乾燥物を4℃、18日間保存した後では23％に低下した。塩化ナトリウム0重量％の固体発酵物２−iiの11〜12％に比べて高かった。この知見は、工程（１）の液体培養において、できるだけ多種類のストレスを負荷し、それらの抵抗力を誘導発現させておくことが、固体培養を２回経たときでも優れた生残能が誘導発現された状態の固体発酵物を得るためには重要であることを示唆する。【０１７３】
図５に各培養工程で培養して得られた菌体の送風乾燥後の「生残率×耐熱性」（％）を示す。図５には、各培養工程（試験区）１〜５の培養条件を示す表（図５Ａ）及び「生残率×耐熱性」（％）のグラフ（図５Ｂ）を示す。「生残率×耐熱性」（％）は送風乾燥後の値と４℃、１８日間保存後の値を示す。【０１７４】
試験区１〜５の違いは、固体培養工程（２−ii）における塩化ナトリウム濃度及び液体培養工程（１）の培養法（一般的な液体培養又は菌株育種培養）である。図５の結果は、液体培養工程として菌株育種培養を行い、固体培養工程（２−ii)において、塩化ナトリウムを添加した場合に、より「生残率×耐熱性」（％）が良好であったことを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１７５】
液体培養により増殖させた乳酸菌を、さらに固形食材を適量含有した固形食材混合物を固体培地として用いて培養することにより、菌本来の生残能を誘導発現して高密度の菌体を含有した乳酸菌固体発酵物が得られ、凍結乾燥処理や送温風などの乾燥処理によって得られた固体発酵物も提供できる。
【符号の説明】
【０１７６】
１  乳酸菌
２  粒状のポリフェノール含有植物体
３  粒状の胚芽
４  粒状の胚芽麹
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月19日(2017.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌固体発酵物の製造方法であって、
（１）  乳酸菌を、液体培地を用いて培養する液体培養工程、
（２）工程（１）で培養した乳酸菌を固形食材混合物である固体培地で培養する、複数工程からなる固体培養工程であって、固体培地は少なくとも炭酸塩及び胚芽、並びに胚芽麹及び／又はポリフェノール含有植物体を含み、固体培養の最終工程で用いる固体培地はポリフェノール含有植物体を含む乳酸菌を固体培地表面で増殖させる固体培養工程
を含み、工程（２）の固体培養工程を複数の工程で行い、後の固体培養工程で用いる固体培地中のポリフェノール含有植物体の含有量が、それより前の固体培養工程で用いる固体培地中のポリフェノール含有植物体の含有量よりも多く、乳酸菌固体発酵物が工程（２）で用いた固体培地表面に前記乳酸菌が含有されている乳酸菌固体発酵物である、製造方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
工程（１）の液体培養及び工程（２）の固体培養工程を経るにつれ、段階的に強度を高くした複数のストレスを負荷し、それらのストレスに耐性を有する乳酸菌の生残率を増加させる、請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
乳酸菌固体発酵物の製造方法であって、
（１）  乳酸菌を、液体培地を用いて培養する液体培養工程、
（２−ｉ）  工程（１）で培養した乳酸菌を、少なくとも炭酸塩及び胚芽、並びに胚芽麹及び／又はポリフェノール含有植物体を含む固形食材混合物である固体培地で培養し、乳酸菌を固体培地表面で増殖させる工程、
（２−ｉｉ）  工程（２−ｉ）で培養した乳酸菌を、少なくとも炭酸塩、胚芽、及びポリフェノール含有植物体を含む固形食材混合物である固体培地であって、ポリフェノール含有植物体の含量が工程（２−ｉ）で用いた固体培地よりも多い固体培地で培養し、乳酸菌を固体培地表面で増殖させる工程、
の３工程を含み、乳酸菌固体発酵物が工程（２−ｉｉ）で用いた固体培地表面に前記乳酸菌が含有されている乳酸菌固体発酵物である、請求項１記載の製造方法。
【請求項５】
工程（２−ｉｉ）において、固体培地にさらに胚芽麹が含まれる、請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
工程（１）、（２−ｉ）及び（２−ｉｉ）の工程を経るにつれ、段階的に強度を高くした複数のストレスを負荷し、それらのストレスに耐性を有する乳酸菌の生残率を増加させる、請求項４又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
工程（１）の液体培養工程が多段階の培養工程で行われ、多段階の培養工程の各段階の工程、又は多段階の培養工程のいずれか１工程において、少なくとも炭酸塩、胚芽麹、窒素源及び炭素源を含む液体培地を用いる、請求項１及び３〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
固体培養工程で用いる固体培地に含まれる胚芽麹がアスペルギルス属に属する麹菌の脱脂胚芽麹である、請求項１、３〜６及び８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
工程（２−ｉｉ）で用いる固体培地に、さらに塩化ナトリウムが含まれる、請求項４〜６、８及び１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
固体培養工程で用いる固体培地が炭酸塩及び胚芽、並びに胚芽麹及び／又はポリフェノール含有植物体の均質混合物と水との混合固体培地である、請求項１、３〜６、８、１５及び１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１９】
工程（１）の液体培養により得られた乳酸菌菌体を、工程（２）で用いる固体培地の表面に接種する、請求項１、３〜６、８、１５、１６及び１８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２０】
工程（１）の液体培養により得られた乳酸菌菌体を、工程（２−ｉ）で用いる固体培地の表面に接種し、さらに工程（２−ｉ）の固体培養により得られた乳酸菌菌体を工程（２−ｉｉ）で用いる固体培地の表面に接種する、請求項４〜６、８、１５、１６、１８及び１９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２１】
請求項１、３〜６、８、１５、１６及び１８〜２０に記載の製造方法で製造される、少なくとも以下の（ｉ）〜（ｖ）の成分を含む固形食材混合物の表面に乳酸菌が含有されている乳酸菌固体発酵物：
（ｉ）  炭酸塩；
（ｉｉ）  １種若しくは２種以上の穀物の脱脂胚芽又は胚芽を含む脱脂穀物；
（ｉｉｉ）  胚芽麹；
（ｉｖ）  塩化ナトリウム；並びに
（ｖ）  果実、野菜、穀類、茶葉、海藻及び香辛料からなる群から選択される１種以上の植物体であるポリフェノール含有植物体。
【請求項２２】
（削除）
【請求項２３】
（削除）
【請求項２４】
胚芽が、脱脂米胚芽、脱脂小麦胚芽、脱脂コーン胚芽、その他の穀物由来の脱脂胚芽及びその他の穀物の胚芽を含む脱脂穀物から選択される１種又は２種であり、胚芽を含む脱脂穀物が脱脂大豆であり、胚芽麹がアスペルギルス属に属する麹菌の脱脂胚芽麹であり、炭酸塩が、炭酸カルシウム及び炭酸マグネシウムの混合物である、請求項２１記載の乳酸菌固体発酵物。
【請求項２５】
（削除）
【請求項２６】
（削除）
【請求項２７】
（削除）
【請求項２８】
（削除）
【請求項２９】
（削除）
【請求項３０】
請求項２１及び２４のいずれか１項に記載の乳酸菌固体発酵物を含む、穀物、ポリフェノールを含む植物体及び乳酸菌を含む食品。
【国際調査報告】
2017086451.tif 000030
2017086451.tif 000031
2017086451.tif 000032
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