(57)【要約】  HCVの遺伝子型や遺伝子変異に影響しない高いHCV感染阻害効果を有するHCV感染阻害剤を開発し、提供する。  オクルディンの第２細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１で示すアミノ酸配列をエピトープとして包含するペプチドに結合する抗オクルディン抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オクルディンの第２細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１で示すアミノ酸配列をエピトープとして包含するペプチドに結合する抗オクルディン抗体。
【請求項２】
前記オクルディンの第２細胞外ドメインが以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の抗オクルディン抗体。
（ａ）配列番号４で示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号４で示すアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列番号４で示すアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
【請求項３】
前記ペプチドが配列番号１０で示すアミノ酸配列からなる、請求項１又は２に記載の抗オクルディン抗体。
【請求項４】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗オクルディン抗体。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が
配列番号１４で示すアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号１５で示すアミノ酸配列からなるCDR2、及び
配列番号１６で示すアミノ酸配列からなるCDR3
を含む重鎖可変領域と
配列番号１８で示すアミノ酸配列からなるCDR1、
配列番号１９で示すアミノ酸配列からなるCDR2、及び
配列番号２０で示すアミノ酸配列からなるCDR3
を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４に記載の抗オクルディン抗体。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が
配列番号１３で示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び
配列番号１７で示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域
を含む、請求項４又は５に記載の抗オクルディン抗体。
【請求項７】
ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、又は多重特異性抗体である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の抗オクルディン抗体。
【請求項８】
前記エピトープへの結合性を保持する請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗オクルディン抗体断片。
【請求項９】
請求項１〜７の少なくとも一項に記載の抗オクルディン抗体及び／又は請求項８に記載の抗オクルディン抗体断片を有効成分として含む、C型肝炎ウイルス感染阻害剤。
【請求項１０】
オクルディンの第２細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１で示すアミノ酸配列をエピトープとして包含するペプチドで構成されるC型肝炎ウイルス感染阻害用ワクチン。
【請求項１１】
前記オクルディンの第２細胞外ドメインが以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載のC型肝炎ウイルス感染阻害用ワクチン。
（ａ）配列番号４で示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号４で示すアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列番号４で示すアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
【請求項１２】
前記ペプチドが4〜20個のアミノ酸からなる、請求項１０又は１１に記載のC型肝炎ウイルス感染阻害用ワクチン。
【請求項１３】
前記ペプチドが配列番号６又は７で示すアミノ酸からなる、請求項１２に記載のC型肝炎ウイルス感染阻害用ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、C型肝炎ウイルスに対して感染阻害活性を有する抗体、及びそれを有効成分とするC型肝炎ウイルス感染阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝癌は、日本における部位別癌死亡数の第5位を占める疾患であり、年間3万人以上がこの癌により死亡している。そして、その80%はC型肝炎ウイルス（本明細書では、しばしば「HCV」と表記する）感染を原因とすることが知られている(非特許文献１)。【０００３】
HCVは、フラビウイルス科ヘパシウイルス（Hepacivirus）属に分類されるRNAウイルスで、A型肝炎ウイルス及びB型肝炎ウイルスと並ぶウイルス性肝炎の主要ウイルスである。宿主特異性が高いウイルスで、ヒト以外では、チンパンジーにしか感染しない。【０００４】
HCVの感染者数は、世界では1億3000万人〜1億7000万人と試算されており(非特許文献２)、日本では約190万人〜230万人と推定されている(非特許文献３)。また、これらの統計値以外にもHCVに感染していることを自覚していない無症候性ウイルスキャリアも多数存在すると考えられている。【０００５】
HCV感染者は、初期感染後の約70％が持続感染状態となり、やがて難治性疾患であるC型慢性肝炎へと移行する。その後、約60％が肝硬変に進展し、一部は肝癌に至ることが知られている。肝癌は、手術で癌を摘出しても非癌部で引き続き起こる炎症のため再発患者の多いことが知られている。【０００６】
現在、日本では、C型慢性肝炎に対する治療法として、インターフェロンと抗ウイルス薬リバビリン、及びNS3/4Aプロテアーゼ阻害剤（例えば、シメプレビル又はバニプレビル）による3剤併用療法が行われている(非特許文献４及び５)。また2014年には、直接作用型（direct-acting antivirals：DAAs）抗ウイルス剤として、経口性のNS5A複製複合体阻害剤ダクラタスビル及びNS3/4Aプロテアーゼ阻害剤アスナプレビルを併用するC型慢性肝炎／C型代償性肝硬変の新規治療法も導入されている(非特許文献６〜８)。【０００７】
しかし、上述のHCV治療法は、いずれもHCV持続感染後の増殖抑制を目的としたものである。HCVの主感染経路である血液を介した感染、例えば、母子感染のような垂直感染や針刺し事故のような水平感染を予防する上で有効なワクチンや免疫グロブリンは未だに確立されていない。その理由として、HCVのエンベロープタンパク質の産生に関連する遺伝子が変異を起こしやすいため、活性の高い中和抗体の作製が困難なことが挙げられる。【０００８】
一方で、HCVは、遺伝子型に関わらず、クラスリン依存性エンドサイトーシス機構という共通の侵入過程を経て宿主細胞である肝細胞に取り込まれる(非特許文献９及び１０)。このHCVの細胞内侵入に関与する肝細胞側の因子（ウイルス受容体）をコードする遺伝子は、HCVのエンベロープタンパク質をコードする遺伝子と比較すると遥かに変異を生じにくい。それ故に、ウイルス受容体はHCVの予防や治療の有望な標的物質となり得る。【０００９】
これまでに多くのウイルス受容体が同定されているが、図１に示すスカベンジャー受容体クラスBタイプI（SR-BI）タンパク質(非特許文献１１)、テトラスパニンファミリー分子のCD81タンパク質（非特許文献１２）、タイト結合分子のクローディン-1タンパク質（非特許文献１３）及びオクルディンタンパク質（非特許文献１４及び１５）の4因子は、HCVの感染成立に必須の因子であることが知られている。これらはいずれも膜貫通型タンパク質であり、中でもCD81タンパク質とオクルディンタンパク質は、ヒト又はチンパンジー由来のタンパク質でなければHCV侵入因子として機能しないことが明らかとなっている（非特許文献１５）。したがって、CD81タンパク質とオクルディンタンパク質は、HCV予防剤の標的物質として、特に好適であることが示唆されていた。【００１０】
実際、ヒトCD81タンパク質を標的物質としたHCV感染阻害剤として、抗CD81抗体が知られている（非特許文献１６及び１７）。この抗体は、HCVの遺伝子型や変異に影響されることなく、高いHCV感染阻害効果を有している。ところが、ヒト肝臓化キメラマウス（uPA-SCID）への抗CD81抗体投与では、トランスアミナーゼの上昇やシンシチウム形成を引き起こすなど、副作用の問題があった（非特許文献１８）。【００１１】
一方、ヒトオクルディンタンパク質では、第２細胞外ドメインがHCVの種特異性を担っていること（非特許文献１５及び１９）、及びヒトとマウスのオクルディンタンパク質第2細胞外ドメインのアミノ酸配列を比較した場合、6個の異なるアミノ酸が存在し、そのうち開始メチオニンから223番と224番目のアラニンがヒトオクルディンタンパク質のHCV感受性に重要な役割を果すことが報告されている（非特許文献２０）。しかし、オクルディンタンパク質とHCVの直接的な結合に関する報告はなく、またオクルディンタンパク質を標的物質としたHCV感染阻害剤の研究開発も未だに行われていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ministry of Health LaW. Vital Statistics Japan. 2013
【非特許文献２】Shepard CW, et al., 2005, Lancet Infect Dis, 5:558-567
【非特許文献３】公益財団法人ウイルス肝炎研究財団. Ｃ型肝炎について. 2014
【非特許文献４】Hayashi N, et al. 2014, J Hepatol, 61:219-227
【非特許文献５】林紀夫 田中宣之, 2014, 肝臓, 55:A35
【非特許文献６】Feeney ER & Chung RT., 2014, BMJ, 348:g3308
【非特許文献７】Manns M, et al. 2014, Lancet, 384:1597-1605
【非特許文献８】Webster DP, et al., 2015, Lancet, 385:1124-1135
【非特許文献９】Blanchard E, et al., 2006, J Virol, 80:6964-6972
【非特許文献１０】Fofana I, et al., 2014, Antiviral Res, 104:136-142
【非特許文献１１】Scarselli E et al., 2002, EMBO J, 21:5017-5025
【非特許文献１２】Pileri P, et al., 1998, Science, 282:938-941
【非特許文献１３】Evans MJ, et al. 2007, Nature 2007;446:801-805
【非特許文献１４】Liu S, et al., 2009, J Virol, 83:2011-2014
【非特許文献１５】Ploss A, et al., 2009, Nature, 457:882-886
【非特許文献１６】Batosch B, et al., 2003, J. Med. Exp, 197:633-642
【非特許文献１７】Zhang J, et al., 2004, J Virol, 78:1448-1445
【非特許文献１８】Zona L, et al., 2014, Viruses, 6:875-892
【非特許文献１９】Ciesek S, et al., 2011, J Virol, 85:7613-7621
【非特許文献２０】Maria L, et al., 2010, J Virol, 84:11696-11708
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、HCVの遺伝子型や遺伝子変異に影響しない高いHCV感染阻害効果を有するHCV感染阻害剤を開発し、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために、本発明者らはHCVの感染成立に必須であるオクルディンタンパク質に着目し、HCV感染阻害剤の開発を行った。オクルディンタンパク質の種特異的なHCV感受性を担う第２細胞外ドメインを標的とする抗ヒトオクルディンモノクローナル抗体を作製した。その結果、いずれも明らかな抗原結合能を示したが、通常の単層培養系ではHCV感染阻害効果は認められなかった。そこで、生体により近い細胞環境である肝細胞の三次元培養系でHCV感染阻害を評価した結果、特定のエピトープに結合する抗体で顕著なHCV感染阻害効果が認められた。また、この抗体は、HCV感染阻害を示す抗体量において、細胞への傷害性は認められなかった。本発明は、当該知見に基づくものであって以下を提供する。【００１５】
（１）オクルディンの第２細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１で示すアミノ酸配列をエピトープとして包含するペプチドに結合する抗オクルディン抗体。
（２）前記オクルディンの第２細胞外ドメインが以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、（１）に記載の抗オクルディン抗体。
（ａ）配列番号４で示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号４で示すアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列番号４で示すアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
（３）前記ペプチドが配列番号６又は７で示すアミノ酸配列からなる、（１）又は（２）に記載の抗オクルディン抗体。
（４）前記抗体がモノクローナル抗体である、（１）〜（３）のいずれかに記載の抗オクルディン抗体。
（５）前記モノクローナル抗体が配列番号１４で示すアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号１５で示すアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号１６で示すアミノ酸配列からなるCDR3を含む重鎖可変領域と配列番号１８で示すアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号１９で示すアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号２０で示すアミノ酸配列からなるCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、（４）に記載の抗オクルディン抗体。
（６）前記モノクローナル抗体が配列番号１３で示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１７で示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、（４）又は（５）に記載の抗オクルディン抗体。
（７）ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、又は多重特異性抗体である、（４）〜（６）のいずれかに記載の抗オクルディン抗体。
（８）前記エピトープへの結合性を保持する（１）〜（７）のいずれかに記載の抗オクルディン抗体断片。
（９）（１）〜（７）の少なくとも一に記載の抗オクルディン抗体及び／又は（８）に記載の抗オクルディン抗体断片を有効成分として含む、C型肝炎ウイルス感染阻害剤。
（１０）オクルディンの第２細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１で示すアミノ酸配列をエピトープとして包含するペプチドで構成されるC型肝炎ウイルス感染阻害用ワクチン。
（１１）前記オクルディンの第２細胞外ドメインが以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなる、（１０）に記載のC型肝炎ウイルス感染阻害用ワクチン。
（ａ）配列番号４で示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号４で示すアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列番号４で示すアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列
（１２）前記ペプチドが4〜20個のアミノ酸からなる、（１０）又は（１１）に記載のC型肝炎ウイルス感染阻害用ワクチン。
（１３）前記ペプチドが配列番号６又は７で示すアミノ酸からなる、（１２）に記載のC型肝炎ウイルス感染阻害用ワクチン。【００１６】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-199019号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の抗体及びその断片は、単体で医薬又は研究試薬として使用できる他、HCV感染阻害剤の有効成分として、C型肝炎の治療用又は予防用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】HCVの宿主細胞侵入経路及び本発明の抗オクルディン抗体の感染阻害を示す概念図である。図中、SR-B1はスカベンジャー受容体クラスBタイプIタンパク質を、hCD-81はヒトCD-81タンパク質を、CLDN1はクローディン-1タンパク質を、hOCLNはヒトオクルディンタンパク質を示す。また、EC1及びEC2は、それぞれオクルディンの第１細胞外ドメイン及び第２細胞外ドメインを示す。HCVはこれらのウイルス受容体又はその共役受容体を順次利用して、クラスリン依存性エンドサイトーシスによって肝細胞内へ侵入すると考えられている。本発明の抗オクルディン抗体はHCVに先立ち、又はHCVと競合してEC2に結合し、エンドサイトーシスを誘導することにより、エンドサイトーシスを介したHCVの細胞内侵入を阻害する。
【図２】実施例１で得られた抗オクルディンモノクローナル抗体クローンのうち一定のHCVpv感染阻害効果が見られた6クローン（C15、C23、C46、C67、C81、C111）の感染阻害率を示す図である。点線はcon1の50%感染阻害ラインを示している。
【図３】HCVpvで感染阻害効果が見られた前記6クローンにおけるHCVcc感染率を示す図である。HCVcc感染率はmock群を1としたときの相対値で示している。
【図４】限界希釈法によりサブクローン化した5種のハイブリドーマ培養上清に含まれる抗オクルディンモノクローナル抗体と抗原への結合性を示すELISAの結果である。図中、Pre LDは、サブクローン化前の培養上清を示す。
【図５】実施例４で用いたダブルチャンバー培養系の概念図である。
【図６】ダブルチャンバー培養系を用いた抗ヒトオクルディン抗体の15サブクローンにおけるHCVcc感染阻害効果を示す図である。感染率は、mock群を1としたときの相対値で示している。感染率の値が低いほど、感染阻害効果が高いことを意味する。矢印で示すC67におけるサブクローン2の抗体(抗オクルディン抗体67-2；本明細書ではしばしば「67-2抗体」と表記する)が陽性対照のCD81群に匹敵する強いHCVcc感染阻害効果を示した。
【図７】図６のmock群、CD81群、IgG群、及び抗オクルディン抗体67-2におけるHCVcc感染率の平均値と標準偏差を示している。*はP＜0.001（Mann-WhitneyのU検定）を示す。
【図８】実施例５で用いたマトリゲル3次元培養系の概念図である。
【図９】マトリゲル3次元培養系を用いた抗ヒトオクルディン抗体67-2のHCVcc感染阻害効果を示す図である。HCVcc感染率はmock群を1とした相対値で、平均値と標準偏差を示している。*はP＜0.001（Mann-WhitneyのU検定）を示す。
【図１０】抗オクルディン抗体67-2による細胞傷害性を示す図である。Ａ：抗オクルディンモノクローナル抗体67-2の各濃度における細胞傷害性を示す。mock群は抗体の存在しない陰性対照であり、IgG群は細胞傷害性のない陰性対照抗体の正常マウスIgGである。Ｂ：HCVcc感染の2時間後（+）及びHCVcc非存在下（-）での各抗体による細胞傷害性を示す。
【図１１】Ａ：オクルディン第２細胞外ドメイン（EC2）と、抗オクルディン抗体67-2のエピトープ解析に用いた抗原ペプチドocln1〜ocln3の位置を示す概念図である。図中の丸は、EC2を構成するアミノ酸を示し、１つの丸がアミノ酸１つに相当する。矢印を伴う数値は、開始メチオニンを1位としたときのオクルディンタンパク質における位置を示し、また数値の前のアルファベットは、その位置におけるアミノ酸の種類を示している。黒丸は、本発明の抗オクルディン抗体が認識するエピトープの位置を示している。Ｂ：Ａで示す各抗原ペプチドと抗オクルディン抗体67-2との結合性をELISAにより解析した結果を示す図である。本発明の抗オクルディン抗体作製時に用いたオクルディン第２細胞外ドメインからなる抗原ペプチド（KLH-Ocln peptide）を抗原ペプチドの陽性対照とした。
【図１２】HCV感染及び抗オクルディン抗体67-2投与に伴うオクルディンの局在変化を示すHuh7.5.1細胞の蛍光免疫染色の結果である。Ａは72時間固定群を、Ｂは2時間固定群を示している。
【図１３】抗オクルディンヒト化抗体（2D3抗体）のHCVcc感染阻害効果を示す図である。図中、mockは培地のみを加えたmock群を、CD81は陽性対照である抗CD81抗体を加えたCD81群を、IgGは正常マウスIgGをTBS bufferに加えたIgG群を、そして2D3は抗オクルディンヒト化抗体2D3抗体を加えた2D3群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．抗オクルディン抗体又はその断片
１−１．概要
本発明の第１の態様は、抗オクルディン抗体又はその断片である。本発明の抗オクルディン抗体又はその断片は、膜タンパク質オクルディンの細胞外ドメインにおける特定のエピトープを認識して結合することができる。オクルディンはHCVが宿主細胞内に感染するために必要な膜タンパク質であるが、本発明の抗オクルディン抗体又はその断片は、オクルディンのエンドサイトーシスを誘導し、HCVの細胞質への侵入を阻害する作用を有する。
【００２０】
１−２．定義
本明細書で頻用する以下の用語について定義する。
【００２１】
「C型肝炎ウイルス（Hepatitis C virus：HCV）」は、フラビウイルス科ヘパシウイルス（Hepacivirus）属に属するRNAウイルスで、非A非B肝炎の主要な原因ウイルスとして知られている（Chooら、Science、1989年、244巻、p.359-362）。宿主特異性が高く、原則としてヒト又はチンパンジーにのみに感染する。HCV感染は、通常、輸血、母子感染、針刺し事故等の血液を介して行われる。血管内に侵入したHCVは、血流によって肝臓に運ばれ、肝類洞の血管内皮細胞を通過して、宿主細胞である肝細胞膜上のウイルス受容体に結合する。その後、エンドサイトーシスによって肝細胞内に取り込まれることで初感染が成立する。感染後は肝細胞質中にHCVのゲノムRNAがHCV粒子から放出され、そのゲノムRNAにコードされたHCVタンパク質前駆体が翻訳される。続いて、HCVタンパク質前駆体のプロセッシングにより、コアタンパク質、構造タンパク（エンベロープタンパク質E1及びE2等）、並びに非構造（NS; nonstructural）タンパク質（RNA依存性RNAポリメラーゼ、プロテアーゼ及びへリカーゼ等）が生じる（Moradpour D, et al., 2007, Nat Rev Microbiol, 5:453-463；Pawlotsky JM, et al., 2007, Gastroenterology 132:1979-1998）。非構造タンパク質は、宿主細胞の因子と共に複製複合体を形成して自身のゲノムRNA複製を行い、新生されたHCVゲノムRNAは、非構造タンパク質の一つであるNS5Aタンパク質と複合体を形成し、これがコアタンパク質と結合して、ヌクレオカプシドが形成される。ヌクレオカプシドは、肝細胞内の小胞体においてエンベロープタンパク質に被覆され、ウイルス粒子の成熟を経てトランスゴルジを介した経路にて細胞膜へ到達し、細胞外へ放出される。この一連の生活環を通してHCVは感染と増殖の経路を繰り返している。
【００２２】
「C型肝炎」とは、HCV感染により発症する肝臓疾患である。炎症による肝細胞の破壊によって肝機能が低下し、全身倦怠感、発熱、食欲不振、悪心、嘔吐等の症状を呈する。感染者の約30％は自己の免疫応答によってウイルスが体外に排除され自然治癒するが、約70％は持続感染によって慢性化し、やがて肝硬変や肝癌に進展することが知られている。
【００２３】
「（ウイルス）感染」とは、広義にはウイルスの一連の生活環、すなわちウイルス粒子が宿主細胞の細胞表面に結合して、細胞内に侵入し、増殖した後、細胞外に放出されるまでの過程をいうが、狭義にはウイルス粒子が宿主細胞内に侵入するまでの初期感染過程をいう。本明細書では、いずれの意味も包含し得るが、主として狭義の感染として用いている。したがって、本明細書において「HCV（の）感染（を）阻害」とは、HCV粒子が肝細胞表面に結合して細胞内に侵入するまでの狭義の感染を阻害することをいう。
【００２４】
本明細書において「HCV感染阻害剤」とは、被験体への投与により、HCVの被験体への感染を阻害する薬剤をいう。本発明のHCV感染阻害剤は、有効成分である抗体又はその断片がHCV受容体と結合してエンドサイトーシスを誘導することによってHCVと宿主細胞表面のHCV受容体との結合を競合阻害し、HCVの細胞内への侵入を阻害することができる。
【００２５】
本明細書において「宿主細胞」とは、ウイルスが感染する標的細胞をいう。HCVの場合には、原則としてヒト又はチンパンジー由来の肝細胞を意味するが、HCV感染の成立に必須とされる4つ細胞膜タンパク質、すなわちテトラスパニンファミリー分子であるCD81、SR-BI（スカベンジャー受容体クラスBタイプI）、タイト結合分子であるクローディン-1（Claudin-1）及びオクルディン（occludin)を細胞表面に人為的に発現するように改変した細胞であれば、その限りではない。ただし、その場合、CD81及びオクルディンは、ヒト又はチンパンジー由来でなければならない。これは、CD81とオクルディンの種特異性が高く、ヒト又はチンパンジー由来でなければHCV侵入因子として機能しないためである。
【００２６】
「オクルディンタンパク質」（本明細書では、しばしば「オクルディン」と略称する。）は、細胞接着に関与するタイトジャンクションの構成因子として同定された4回膜貫通型タンパク質である。図１に示すヒトオクルディンタンパク質（hOCLN）ように、4つの膜貫通ドメインと、細胞内側に位置するN末端領域、C末端領域、及び第２及び第３膜貫通型ドメイン間の細胞内ドメインと、細胞外側に位置する第１及び第２膜貫通型ドメイン間の第１細胞外ドメイン（ＥＣ１）及び第３及び第４膜貫通型ドメイン間の第２細胞外ドメイン（ＥＣ２）で構成される(Furuse M., et al., 1993, J Cell Biol, 123:1777-1788)。オクルディンタンパク質は、CD81タンパク質と共に種特異的なHCV感受性を決定する因子でもある。それ故、本明細書で対象となるオクルディンタンパク質は、原則として配列番号２で示すアミノ酸配列からなるヒト由来のオクルディン（ヒトオクルディン）タンパク質又は配列番号５で示すアミノ酸配列からなるチンパンジー由来のオクルディン（チンパンジーオクルディン）タンパク質である。
【００２７】
１−３．構成
本発明の抗オクルディン抗体及びその断片について、以下で具体的に説明をする。
（１）抗オクルディン抗体
「抗オクルディン抗体」とは、オクルディンタンパク質に対して免疫応答性を示す抗体をいう。本明細書における抗オクルディン抗体は、特に、オクルディンタンパク質の第２細胞外ドメインに含まれ、配列番号１で示すアラニン（A)−ロイシン（L)−システイン（C)−アスパラギン（N)からなるアミノ酸配列をエピトープ（本明細書では、しばしば「ALCNエピトープ」と表記する）として認識する抗体を指す。ここで、ヒトオクルディンタンパク質の第２細胞外ドメインは、配列番号４で示す48個のアミノ酸で構成される。これは配列番号２で示す全長ヒトオクルディンタンパク質のアミノ酸配列において、開始メチオニンを1位としたときに（以下、特に断りのない限り、本明細書において同様とする）、196位から243位に相当する。また、ALCNエピトープは、214位〜217位に相当する。
【００２８】
なお、チンパンジーオクルディンの第２細胞外ドメインは、前記ヒトオクルディンの第２細胞外ドメインと同一アミノ酸配列を有する。また、全長チンパンジーオクルディンにおける第２細胞外ドメインの位置及びALCNエピトープの位置もヒトオクルディンと同じである。したがって、本明細書における抗オクルディン抗体は、ヒトオクルディン及びチンパンジーオクルディンを認識し、結合し得る。
【００２９】
本発明の抗オクルディン抗体は、オクルディンの第２細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列の一部を含む抗原ペプチドに対して免疫応答性を示す抗体であればよい。この抗原ペプチドは、ALCNエピトープを含む。上述のように第２細胞外ドメインは、原則として配列番号４で示すアミノ酸配列で構成されるが、ALCNエピトープが保持されてさえいればそれ以外のアミノ酸配列であってもよい。例えば、配列番号４で示すアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号４で示すアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
【００３０】
本明細書において「複数個」とは、例えば、2〜20個、2〜15個、2〜10個、2〜7個、2〜5個、2〜4個又は2〜3個をいう。また、「アミノ酸同一性」とは、比較する2つのアミノ酸配列の全アミノ酸残基数における一致したアミノ酸残基数の割合（％）をいう。具体的には、２つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じ、一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このとき、1ギャップは、1アミノ酸残基として全アミノ酸残基数にカウントする。アミノ酸配列の整列化は、例えば、Blast、FASTA、ClustalW等の既知プログラムを用いて行なうことができる（Karlin，S．et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877；Altschul，S．F．et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410；Pearson，W．R．et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448）。比較する２つのアミノ酸配列間で全アミノ酸残基数が異なる場合には、長い方を全アミノ酸残基数とする。比較する２つのアミノ酸配列においてアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの同一アミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除して算出される。
【００３１】
本明細書において「(アミノ酸の）置換」とは、天然のタンパク質を構成する20種類のアミノ酸間において、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似する保存的アミノ酸群内での置換をいう。例えば、低極性側鎖を有する無電荷極性アミノ酸群（Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Cys, Tyr）、分枝鎖アミノ酸群（Leu, Val, Ile）、中性アミノ酸群（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸群（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr，Cys）、酸性アミノ酸群（Asp, Glu）、塩基性アミノ酸群（Arg,Lys,His）、芳香族アミノ酸群（Phe,Tyr,Trp）内での置換が挙げられる。これらの群内でのアミノ酸置換であれば、ポリペプチドの性質に変化を生じにくいことが知られているため好ましい。
【００３２】
本発明の抗オクルディン抗体が認識する抗原ペプチドは、オクルディンの第２細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列の一部からなる領域（以下、「オクルディン第２細胞外ドメイン領域」と表記する）のみからなることが好ましいが、それ以外のペプチド又はアミノ酸からなる非オクルディン第２細胞外ドメイン領域を含んでいてもよい。そのような非オクルディン第２細胞外ドメイン領域の例として、オクルディン第１膜貫通ドメインのC末端側の一部領域等が挙げられる。非オクルディン第２細胞外ドメイン領域は、オクルディン第２細胞外ドメイン領域のN末端側若しくはC末端側、又は両末端側に配置する。
【００３３】
本発明の抗オクルディン抗体が認識する抗原ペプチドのアミノ酸の長さは、特に限定はしない。ただし、オクルディン第２細胞外ドメイン領域は、ALCNエピトープのみで構成される4アミノ酸が最短であり、第２細胞外ドメイン全長から1アミノ酸を減じた長さ、すなわち配列番号４で示すヒトオクルディン第２細胞外ドメインの場合であれば47アミノ酸が最長である。したがって、抗原ペプチドがオクルディン第２細胞外ドメイン領域のみで構成される場合、その長さは4アミノ酸（ALCNエピトープ）〜47アミノ酸の範囲内となる。通常は5〜40アミノ酸、7〜30アミノ酸、又は8〜25アミノ酸程度の長さがあればよい。
【００３４】
本発明の抗オクルディン抗体の由来生物種は、特に限定はしない。好ましくは鳥類及び哺乳動物由来の抗体である。例えば、ニワトリ、ダチョウ、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、又はヒトなどが挙げられる。
【００３５】
本発明の抗オクルディン抗体は、ALCNエピトープをエピトープとして認識し、免疫応答性を示す抗体である限り、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のいずれであってもよい。好ましくは抗体価が安定しているモノクローナル抗体である。本明細書において「ポリクローナル抗体」とは、抗原であるオクルディンに特異的に結合し、かつそれを認識することのできる異なる複数種の免疫グロブリン群をいう。また、本明細書において「モノクローナル抗体」とは、フレームワーク領域（Frame work region：以下、「FR」と表記する）及び相補性決定領域（Complementarity determining region：以下、「CDR」と表記する）を含み、抗原であるオクルディンに特異的に結合し、かつそれを認識することのできる単一種の免疫グロブリン、又は免疫グロブリンに含まれる少なくとも1組の軽鎖可変領域（VL領域）及び重鎖可変領域（VH領域）を包含する組換え抗体又は合成抗体をいう。
【００３６】
抗オクルディン抗体が免疫グロブリン分子で構成される場合、免疫グロブリンは任意のクラス（例えば、IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びIgY）、又は任意のサブクラス（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）とすることができる。
【００３７】
本発明の抗オクルディンモノクローナル抗体は、配列番号１で示すオクルディンタンパク質上のALCNエピトープに特異的に結合する。このようなモノクローナル抗体の具体例として、後述する実施例４に記載のマウス抗ヒトオクルディンモノクローナル抗体クローン67-2が挙げられる。67-2抗体は、重鎖可変領域が配列番号１３で示すアミノ酸配列からなり、また軽鎖可変領域が配列番号１７で示すアミノ酸配列からなる。Kabatのルール（Kabat E.A., et al., 1991, Sequences of proteins of immunological interest, Vol.1, eds. 5, NIH publication）によれば、67-2抗体の重鎖可変領域におけるCDR1は配列番号１４で示すアミノ酸配列からなり、CDR2は配列番号１５で示すアミノ酸配列からなり、そしてCDR3は配列番号１６で示すアミノ酸配列からなる。また、軽鎖可変領域におけるCDR1は配列番号１８で示すアミノ酸配列からなり、CDR2は配列番号１９で示すアミノ酸配列からなり、そしてCDR3は配列番号２０で示すアミノ酸配列からなる。
【００３８】
なお、67-2抗体の重鎖可変領域に相当する前記配列番号１３で示すアミノ酸配列をコードする核酸（ヌクレオチド）として、例えば、配列番号２１で示す塩基配列からなる核酸が挙げられる。また、67-2抗体の軽鎖可変領域に相当する前記配列番号１７で示すアミノ酸配列をコードする核酸として、例えば、配列番号２５で示す塩基配列からなる核酸が挙げられる。さらに、上記67-2抗体における重鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3をそれぞれコードする塩基配列として、例えば、それぞれ配列番号２２、２３、及び２４で示す塩基配列からなる核酸が挙げられる。また、上記67-2抗体における軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、及びCDR3をそれぞれコードする塩基配列として、例えば、それぞれ配列番号２６、２７、及び２８で示す塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【００３９】
「組換え抗体」とは、キメラ抗体、又はヒト化抗体をいう。「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の抗体のアミノ酸配列を組み合わせて作製される抗体で、ある抗体の定常領域（C領域）を他の抗体のC領域で置換した抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体のC領域をヒト抗体のC領域と置き換えた抗体が該当する。具体的な例を挙げると、前述の67-2抗体において配列番号１３で示すアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をヒト抗体の重鎖可変領域と置換し、また配列番号１７で示すアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をヒト抗体の軽鎖可変領域と置換してなる抗体が挙げられる。これによりヒト体内における当該抗体に対する免疫反応を軽減し得る。「ヒト化抗体」とは、ヒト抗体におけるCDRをヒト以外の哺乳動物由来の抗体におけるCDRと置換したモザイク抗体である。免疫グロブリン分子の可変領域（V領域）は、4つのFR（FR1、FR2、FR3及びFR4）と3つのCDR（CDR1、CDR2及びCDR3）がN末端側からFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4の順序で連結されて構成されている。このうちFRは可変領域の骨格を構成する相対的に保存された領域であり、CDRが抗体の抗原結合特異性に直接寄与する。ヒト化抗体は、例えば、マウス由来の抗オクルディン抗体の軽鎖又は重鎖における一組のCDR1、CDR2及びCDR3を任意の抗原に対するヒト抗体の軽鎖又は重鎖における一組のCDR1、CDR2、及びCDR3とそれぞれ置換することによって、マウス抗オクルディン抗体の抗原結合特異性を受け継いだヒト抗体として構築することができる。具体的な例を挙げると、前述の67-2抗体における重鎖由来の配列番号１４で示すアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号１５で示すアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号１６で示すアミノ酸配列からなるCDR3をヒト抗体の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3とそれぞれ置換し、また前述の67-2抗体における軽鎖由来の配列番号１８で示すアミノ酸配列からなるCDR1、配列番号１９で示すアミノ酸配列からなるCDR2、及び配列番号２０で示すアミノ酸配列からなるCDR3をヒト抗体の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3とそれぞれ置換してなる抗体が挙げられる。このようなヒト化抗体は、CDR以外はヒト抗体由来であることからヒト体内における当該抗体に対する免疫反応をキメラ抗体以上に軽減し得る。
【００４０】
「合成抗体」とは、化学的に又は組換えDNA法を用いることによって合成した抗体をいう。例えば、組換えDNA法を用いて新たに合成された抗体が挙げられる。具体的には、例えば、scFv（single chain Fragment of variable region：単鎖抗体）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ（tetrabody）等が挙げられる。免疫グロブリン分子において、機能的な抗原結合部位を形成する一組の可変領域（軽鎖可変領域VL及び重鎖可変領域VH）は、軽鎖と重鎖という別々のポリペプチド鎖上に位置する。scFvは、免疫グロブリン分子において、VL及びVHを十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、1本のポリペプチド鎖に包含した構造を有する分子量約35kDa以下の合成抗体である。scFv内において1組の可変領域は、互いに自己集合して1つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。scFvは、それをコードする組換えDNAを、公知技術を用いてベクターに組み込み、発現させることで得ることができる。ダイアボディは、scFvの二量体構造を基礎とした構造を有する分子である(Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448)。例えば、上記リンカーの長さが約12アミノ酸残基よりも短い場合、scFv内の2つの可変領域は自己集合できないが、2つのscFvを相互作用させてダイアボディを形成させることにより、一方のscFvのVLが他方のscFvのVHと集合可能となり、2つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。さらに、scFvのC末端にシステイン残基を付加させることにより、2本のscFvどうしのジスルフィド結合が可能となり、安定的なダイアボディを形成させることもできる。このようにダイアボディは二価の抗体断片である。トリアボディ、及びテトラボディは、ダイアボディと同様にscFv構造を基本とした、その三量体、及び四量体構造を有する、それぞれ、三価、及び四価の抗体である。ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディは、多重特異性抗体であってもよい。「多重特異性抗体」とは、多価抗体、すなわち抗原結合部位を一分子内に複数有する抗体において、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する抗体をいう。例えば、ダイアボディにおいて、それぞれの抗原結合部位が異なるエピトープと結合する二重特異性抗体（Bispecific抗体）が挙げられる。具体的には、例えば、本発明の抗オクルディン抗体であれば、一方の抗原結合部位がALCNエピトープと結合し、他方の抗原結合部位がALCNエピトープ以外のオクルディン細胞外ドメイン上のエピトープと結合するダイアボディが該当する。
【００４１】
本発明の抗オクルディン抗体は、修飾することもできる。ここでいう「修飾」とは、グリコシル化のような抗原特異的結合活性に必要な機能上の修飾や抗体検出に必要な標識上の修飾を含む。
【００４２】
抗オクルディン抗体上のグリコシル化修飾は、標的領域であるオクルディン第２細胞外ドメイン領域に対する抗オクルディン抗体の親和性を調整するために行われる。具体的には、例えば、抗オクルディン抗体のFRにおいて、グリコシル化を構成するアミノ酸残基に置換を導入してグリコシル化部位を除去することで、その部位のグリコシル化を喪失させる改変等が挙げられる。
【００４３】
抗オクルディン抗体の標識には、例えば、蛍光色素（FITC、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5）、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、3H、14C、35S）又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる標識が挙げられる。
【００４４】
本発明の抗オクルディン抗体は、オクルディンとの解離定数が、10-7M以下であることが好ましい。10-8M以下の高い親和性を有することが好ましく、より好ましくは10-9M以下、特に好ましくは10-10M以下である。上記解離定数は、当該分野で公知の技術を用いて測定することができる。例えば、Biacoreシステム（GE Healthcare社）により速度評価キットソフトウェアを用いて測定してもよい。
【００４５】
本発明のHCV感染阻害剤に含まれる抗オクルディン抗体は単一種であってもよいし、複数種であってもよい。複数種の抗オクルディン抗体を含む場合、少なくとも1つは本発明の抗オクルディン抗体、すなわちALCNエピトープに対して免疫応答性を示す抗体である必要がある。ただし、他の抗オクルディン抗体は、オクルディンの細胞外ドメインにおいて、ALCNエピトープ以外のエピトープを認識する抗体であってもよい。
【００４６】
（２）その断片
本明細書において「その断片」とは、抗オクルディン抗体の一部からなり、かつ抗オクルディン抗体と同様にALCNエピトープに対して免疫応答性を示す抗体断片をいう。例えば、Fab、F(ab')2、Fab'等が該当する。
【００４７】
Fabは、IgG分子がパパインによってヒンジ部のジスルフィド結合よりもN末端側で切断されて生じる抗体断片であって、H鎖定常領域（重鎖定常領域：以下CHと表記する）を構成する3つのドメイン（CH1、CH2、CH3）のうちVHに隣接するCH1とVH、及び完全長のL鎖から構成される。
【００４８】
F(ab')2は、IgG分子がペプシンによってヒンジ部のジスルフィド結合よりもC末端側で切断されて生じるFab'の二量体である。Fab'は、Fabよりもヒンジ部を含む分だけH鎖が若干長いが実質的にはFabと同等の構造を有する。Fab'は、F(ab')2をマイルドな条件下で還元し、ヒンジ領域のジスルフィド連結を切断することによって得ることができる。これらの抗体断片は、いずれも抗原結合部位を包含していることから、抗原エピトープ（本明細書所ではALCNエピトープ）と特異的に結合する能力を有している。
【００４９】
１−４．抗オクルディン抗体の作製
本発明の抗オクルディン抗体は、当該分野の常法によって得ることができる。また、モノクローナル抗体のアミノ酸配列が明らかであれば、そのアミノ酸配列に基づいて、化学的合成法や組換えDNA技術を用いることによって調製することもできる。さらに、モノクローナル抗体は、その抗体を産生するハイブリドーマから得ることもできる。
【００５０】
以下で、本発明の抗オクルディン抗体、すなわち抗オクルディンポリクローナル抗体及び抗オクルディンモノクローナル抗体、及び抗オクルディンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製方法について、具体例を挙げて説明をする。
【００５１】
（１）免疫原の調製   
免疫原としての抗原ペプチドを調製する。本発明の抗オクルディン抗体の免疫原として使用可能な抗原ペプチドは、配列番号４で示すアミノ酸配列からなるヒトオクルディンの第２細胞外ドメインの一部であって、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるALCNエピトープを包含するペプチド（以下、「オクルディン抗原ペプチド」と表記する）が挙げられる。
【００５２】
オクルディン抗原ペプチドは、例えば、化学合成法又はDNA組換え技術を用いて調製することができる。
【００５３】
（１−１）化学合成
化学合成法を用いてオクルディン抗原ペプチドを調製する場合には、例えば、配列番号４のアミノ酸配列情報に基づいて、当技術分野で公知の手法、例えば、固相ペプチド合成法等により、オクルディン抗原ペプチドを化学合成すればよい。ペプチド合成は、メーカーに委託することもできる。
【００５４】
（１−２）DNA組換え技術
DNA組換え技術を用いてオクルディン抗原ペプチドを調製する場合には、オクルディン抗原ペプチドをコードするcDNA（オクルディン抗原ペプチドcDNA）を適当な発現システムに組み込み、発現させればよい。
【００５５】
オクルディン抗原ペプチドは、例えば、オクルディン遺伝子の第２細胞外ドメインをコードする配列番号３で示す塩基配列情報に基づいて、ALCNエピトープのコード領域を含む適当な長さのヌクレオチドを選択する。例えば、オクルディン抗原ペプチドを15アミノ酸とする場合、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列領域を配列番号３の中から選択し、その45塩基からなる配列情報に基づいてオクルディン抗原ペプチドcDNAを化学合成する。ヌクレオチド合成は、メーカーに委託することもできる。あるいは、オクルディンをコードするcDNA（オクルディンcDNA）又はオクルディン第２細胞外ドメインをコードするcDNA（オクルディン第２細胞外ドメインcDNA）がある場合には、それを鋳型として、オクルディン抗原ペプチドcDNAが増幅産物として得られるように適当に設計したプライマーペアを用いて、PCR等の核酸増幅方法により調製することもできる。この時にプライマーの5′末端側には、オクルディン抗原ペプチドcDNAのクローニング用として適当な制限部位やタンパク質精製用のタグ配列（FLAG、HA、His、myc、GFP等）を導入することもできる。
【００５６】
次に、上記得られたオクルディン抗原ペプチドを適当な発現システム内に組み込んで発現させる。発現システムには、プラスミド又はウイルスを利用した発現ベクターが好ましい。発現ベクターは、宿主細胞内で複製可能なものを用いる。宿主には、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、酵母（例えば、Saccharomyces cerevisiae、又はSchizosaccharomyces pombe）、昆虫細胞（例えば、Sf細胞）、及び動物細胞（例えば、HEK293、HeLa、COS、CHO、BHK）等を利用できる。発現ベクターは、通常、調節エレメントとして、例えば、プロモータ、ターミネータ、エンハンサ、ポリアデニル化シグナル、複製開始点、選択マーカー等を含むことができる。また、目的のcDNA断片のクローニング用として、マルチクローニング部位や、精製を容易にするための標識ペプチド（タグ）との融合ポリペプチドとして発現するように、cDNA断片の挿入部位の5′末端側又は3′末端側にタグ配列を有するものを用いてもよい。さらに挿入部位の5′末端側に分泌シグナル配列をコードする配列を有するものを用いてもよい。これによって細胞外に発現した成熟ポリペプチドを分泌させることができる。このような発現ベクターや他の発現系は、TAKARA BIO社、第一化学薬品、Agilent Technologies社、Merck & Co社、Qiagen社、Promega社、Roche Diagnostics社、Thermo Fisher社、及びGE Healthcare社等から有用な製品が市販されているので、それらを利用してもよい。
【００５７】
以上によってオクルディン抗原ペプチドcDNAをコードする発現システム（例えば、オクルディン抗原ペプチド発現ベクター）を得ることができる。
【００５８】
得られたオクルディン抗原ペプチド発現システムは、宿主細胞内に導入し、必要に応じて適当な発現誘導処理を行うことによって、免疫原である抗原ペプチドを発現させることができる。発現は、無細胞翻訳系を利用してもよい。オクルディン抗原ペプチド発現ベクターを宿主細胞に導入する方法は、各宿主細胞にDNAを導入する公知の方法に従えばよく、特に限定されない。例えば、宿主が大腸菌の場合、例えば、熱ショック法、カルシウムイオン法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、宿主が動物細胞の場合、例えば、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、DEAE−Dextran法等が挙げられる。また、Lipofectamin2000（Thermo Fisher社）のような市販の核酸導入剤を利用してもよい。以上の操作により、オクルディン抗原ペプチド発現用形質転換体を得ることができる。
【００５９】
オクルディン抗原ペプチド発現用形質転換体においてオクルディン抗原ペプチドを発現させるためには、該形質転換体が包含するオクルディン抗原ペプチド発現システムに特有の遺伝子発現誘導処理を行えばよい。例えば、オクルディン抗原ペプチド発現システムが、lacリプレッサー遺伝子及びlacオペレーターからなるシステムの場合、IPTG（isopropyl-1-thio-β-D-Galactoside）処理によりシステム内にコードされたオクルディン抗原ペプチドの発現を誘導することができる。
【００６０】
発現誘導処理により形質転換体内で発現したオクルディン抗原ペプチドは、オクルディン抗原ペプチドが細胞外に分泌される場合には、培養上清から回収する。また、細胞内に蓄積される場合には、その細胞を破砕して抽出する。その後、一般的なタンパク質の精製方法を用いることによって、オクルディン抗原ペプチドを単離精製することができる。オクルディン抗原ペプチドが標識ペプチド（タグ）との融合ペプチドとして発現する場合には、例えば、各標識ペプチドに適したアフィニティークロマトグラフィー法を利用すればよい。また、標識ペプチドのないオクルディン抗原ペプチドとして発現する場合には、例えば、硫酸アンモニウム塩析法、ゲルクロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、等電点クロマトグラフィー法等を利用すればよい。あるいは、前記二以上の精製方法を適宜組み合わせて単離精製することもできる。
【００６１】
最終的に、目的のオクルディン抗原ペプチドが回収できたか否かは、SDS-PAGE等により確認すればよい。
【００６２】
上記オクルディン抗原ペプチドの調製方法の詳細については、当該分野におけるプロトコル集、例えば、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参考にすればよい。
【００６３】
（２）免疫と抗オクルディンポリクローナル抗体の作製
続いて、得られたオクルディンポリペプチド断片を免疫原として、該ポリペプチドを特異的に認識する抗オクルディンポリクローナル抗体を作製する。
【００６４】
まず、オクルディンポリペプチド断片を、緩衝液に溶解して免疫原溶液を調製する。この際、免疫を効果的に行うために、必要であればアジュバントを添加してもよい。アジュバントは、例えば、フロイント完全アジュバント（FCA）、フロイント不完全アジュバント（FIA）、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン、Titer Max Gold（Vaxel社）、GERBUアジュバント（GERBU Biotechnik社）等を、単独で又は混合して使用することができる。
【００６５】
次に、調製した免疫原溶液を哺乳動物に投与し、免疫する。免疫に用いる動物は、特に限定しない。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ及びウマ等を用いることができる。本発明においては、マウスを用いる方法を例に挙げて、以下で具体的に説明をすることにする。マウスの系統は、特に限定はしない。例えば近交系マウスのBALB/cを用いて免疫すればよい。
【００６６】
免疫原溶液の投与方法としては、例えば、FIA若しくはFCAを用いた皮下注射、FIAを用いた腹腔内注射、又は生理食塩水を用いた静脈注射が挙げられるが、この限りではなく、皮内注射や筋肉内注射で投与してもよい。免疫原の1回あたりの投与量は、免疫動物の種類、大きさ、投与経路等により適宜決定されるが、マウスの場合、4〜10週齢の個体であれば、通常約50〜200μgで投与すればよい。また、免疫の間隔は特に限定しないが、数日から数週間、好ましくは1〜4週間である。初回免疫後に追加免疫を行うのが好ましく、その回数は2〜6回、好ましくは3〜4回である。初回免疫より後に、免疫したマウスから採血して、血清中の抗体価の測定をELISA法等により行うことが好ましい。抗体価が十分に上昇していれば、免疫原溶液を静脈内又は腹腔内に注射し、最終免疫とすればよい。最終免疫ではアジュバントを使用しないことが好ましい。最終免疫後3〜10日目に、免疫したマウスより採血し、公知の方法（Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）に準じて血清を処理することで抗オクルディンポリクローナル抗体を得ることができる。
【００６７】
（３）抗オクルディンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
抗オクルディンモノクローナル抗体は、当該分野における常法で作製すればよい。例えば、前記免疫した動物から得られる抗体産生細胞と抗体産生細胞を細胞融合法によって融合した後、得られたハイブリドーマから抗オクルディンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを選択することによって調製することができる（Kohler G. & Milstein C., 1975, Nature, 256:495-497）。以下に、具体例を挙げて、抗オクルディンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製方法について説明をする。
【００６８】
まず、上記（２）において免疫したマウスから抗体産生細胞を採取する。採取は、最終免疫の日から2〜5日後が好ましい。抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。マウスからの抗体産生細胞の採取方法は、当該分野で公知の技術に従って行えばよい。
【００６９】
続いて、抗体産生細胞と骨髄腫（ミエローマ）細胞との細胞融合を行い、ハイブリドーマを作製する。
【００７０】
細胞融合に使用する骨髄腫細胞としては、マウス由来の一般に入手可能な株化細胞であって、in vitroで増殖可能な骨髄腫細胞あれば特に限定はしない。後述する工程でハイブリドーマを簡便に選抜するためには、薬剤選択性を有し、未融合の状態では選択培地で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生育できる性質を有するものが好ましい。例えば、P3(P3x63Ag8.653)(Kearney J.F. et al., 1979, J. Immunol., 123:1548-1550)、8-アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)(Yelton D.E. et al., 1978, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81:1-7)、P3-X63-Ag8(X63)、P3/NS1/1-Ag4-1(NS1)、NS-1(Kohler G. et al., 1976, Eur. J. Immunol., 6:511-519)、MPC-11 (Margulies D.H. et al., 1976, Cell, 8:405-415)、SP2/0(Shulman M. et al., 1978, Nature, 276:269-270)、FO(de St.Groth S.F. et al., 1980, J. Immunol. Methods, 35:1-21)、S194(Trowbridge I.S. 1978, J. Exp. Med., 148:313-323)、R210(Galfre G. et al., 1979, Nature, 277:131-133)等が好適に使用される。これらの細胞株は理化学研究所バイオリソースセンター、ATCC（American Type Culture Collection）又はECACC（European Collection of Cell Cultures）から入手可能であり、それらの培養及び継代については、公知の方法（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1988、Selected Methods in Cellular Immunology W.H. Freeman and Company, 1980）に従えばよい。なお、選択培地には、例えば、HAT培地（RPMI1640培地に100単位/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン及び10% 牛胎児血清(FBS)、10-4Mヒポキサンチン、1.5×10-5Mチミジン及び4×10-7Mアミノプテリンを加えた培地）が挙げられる。
【００７１】
上記骨髄腫細胞と抗体産生細胞の細胞融合には、洗浄した上記脾細胞と骨髄腫細胞を、MEM、DMEM、RPMI-1640培地等の動物細胞培養用培地，市販のクローニング用又は細胞融合用培地（血清を含まないものが好ましい）中で、骨髄腫細胞と抗体産生細胞とを混合比1：1〜1：10で混合し、細胞融合促進剤の存在下にて30〜37℃で1〜15分間接触させればよい。細胞融合促進剤としては、平均分子量1,500〜4,000Daのポリエチレングリコール（以下、「PEG」とする。）等を約10〜80％の濃度で使用することができる。その他、ポリビニルアルコール又はセンダイウイルスのような融合促進剤や融合ウイルスを使用することもできる。通常は、平均分子量1,500DaのPEGが好適に使用される。融合効率を高めるために、必要に応じてジメチルスルホキシド等の補助剤を併用してもよい。さらに、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させることもできる（Nature、1977、Vol．266、550−552）。
【００７２】
細胞融合処理後、骨髄腫細胞の融合に使用した培地（例えば、RPMI1640培地）で細胞を洗浄した後、細胞懸濁液を調製し、続いて、細胞懸濁液を、例えば、FBS含有RPMI1640培地等で適当に希釈後、96ウェルプレート上に1×104個／ウェル程度入れ、各ウェルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行えばよい。培養温度は20〜40℃、好ましくは約37℃である。骨髄腫細胞がHGPRT欠損株又はチミジンキナーゼ（TK）欠損株のものである場合には、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む選択培地（HAT培地）を用いることにより、抗体産生細胞と骨髄腫細胞のハイブリドーマのみを選択的に生育、増殖させることができるため、選択培地で培養開始後約10日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして選択することができる。
【００７３】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗オクルディンモノクローナル抗体が含まれる否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、例えば、ハイブリドーマを培養したウェル中に含まれる培養上清の一部を採取し、免疫原として使用したオクルディンポリペプチド断片に対する結合活性を指標として酵素免疫測定法（ELISA法等）、放射免疫測定法（RIA）等によってスクリーニングすることができる。さらに安定的にモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得るために、抗体産生ハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングの方法としては、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等の通常の方法で行えばよく、特に限定されない。以上のスクリーニング法とクローニング法を組み合わせることによって、最終的に抗オクルディンモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
【００７４】
必要に応じて、交差反応性の試験を行ってもよい。すなわち、オクルディン第１細胞外ドメインや他のタイトジャンクションタンパク質への結合活性を検証し、許容できる交差反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマのみを選択する。許容できる交差反応性とは、目的とする用途において無視し得る程度のモノクローナル抗体の非特異的結合活性を意味する。
【００７５】
（４）抗オクルディンモノクローナル抗体の回収
抗オクルディンモノクローナル抗体は、慣用的技術によって回収可能である。例えば、樹立したハイブリドーマから回収する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、抗オクルディンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを10％FBS含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、例えば、37℃、5％CO2濃度で2〜10日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、骨髄腫細胞由来の哺乳動物と同種系動物（上記（３）の場合はマウスとなる）の腹腔内に抗オクルディンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを約1000万個投与し、該ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水又は血清を採取することによって、回収できる。
【００７６】
抗体の精製が必要な場合には、公知の方法を適宜に用いて精製すればよい。例えば、イオン交換クロマトグラフィー法、プロテインA又はプロテインG等によるアフィニティークロマトグラフィー法、ゲルクロマトグラフィー法、硫酸アンモニウム塩析法等を用いて精製することができる。
【００７７】
２．C型肝炎ウイルス感染阻害剤
２−１．概要
本発明の第１の態様は、C型肝炎ウイルス（HCV）感染阻害剤である。本態様のHCV感染阻害剤は、有効成分として抗オクルディン抗体又はその断片を含む。抗オクルディン抗体又はその断片は、HCVが宿主細胞内に感染する足掛かりとなる膜タンパク質オクルディンのエンドサイトーシスを誘導し、HCVの細胞質への侵入を阻害する作用を有する。
２−２．構成
本発明のHCV感染阻害剤は、必須の構成成分として有効成分を、また選択成分として薬学的に許容可能な担体、又は他の薬剤を包含する。本発明のHCV感染阻害剤は、有効成分のみで構成することもできる。しかし、剤形形成を容易にし、有効成分の薬理効果及び／又は剤形を維持するためには後述する薬学的に許容可能な担体を包含した医薬組成物として構成されていることが好ましい。
【００７８】
２−２−１．構成成分
以下、本発明のHCV感染阻害剤を構成する各成分について具体的に説明をする。
（１）有効成分
本発明のHCV感染阻害剤における有効成分は、第１態様に記載の抗オクルディン抗体及び／又はその断片である。これらの構成については、第１態様で既に詳述していることから、ここではその具体的な説明を省略する。
【００７９】
（２）薬学的に許容可能な担体
「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用し得る溶媒及び／又は添加剤であって、生体に対して有害性がほとんどないか又は全くないものをいう。
【００８０】
薬学的に許容可能な溶媒には、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。これらは、殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
【００８１】
また、薬学的に許容可能な添加剤には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤等が挙げられる。
【００８２】
賦形剤としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（より具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム)、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中又は高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、カオリン、ケイ酸、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８３】
結合剤としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、単シロップ、グルコース液、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セラック及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００８４】
崩壊剤としては、例えば、前記デンプンや、乳糖、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド又はそれらの塩が挙げられる。
【００８５】
充填剤としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
【００８６】
乳化剤としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
【００８７】
流動添加調節剤及び滑沢剤としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
【００８８】
上記の添加剤の他、必要に応じて矯味矯臭剤、溶解補助剤（可溶化剤）、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤（例えば、第４級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム）、増量剤、保湿剤（例えば、グリセリン、澱粉）、吸着剤（例えば、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸）、崩壊抑制剤（例えば、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油）、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
【００８９】
（３）他の薬剤
本発明のHCV感染阻害剤は、上記有効成分が有する薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。ここで「他の薬剤」とは、かつ第１態様の抗オクルディン抗体及び／又はその断片と同様の作用機序でHCV感染を抑制する薬剤（例えば、抗hCD81抗体）や、第１態様の抗オクルディン抗体及び／又はその断片とは異なる作用機序、例えば、HCV持続感染後の増殖を抑制する薬剤（例えば、ダクラタスビル及びアスナプレビル）等が挙げられる。また、HCV感染とは無関係の薬理作用を有する薬剤であってもよい。例えば、胃粘膜保護剤や抗生物質等が挙げられる。
【００９０】
本発明のHCV感染阻害剤が他の薬剤を含む複合製剤である場合、HCV感染を多面的に抑制できる等の相乗的な効果を期待することができるので便利である。
【００９１】
２−２−２．剤形
本発明のHCV感染阻害剤の剤形は、有効成分である抗オクルディン抗体及び／又はその断片を不活化させないか、させにくく、かつ投与後に生体内でその薬理効果を十分に発揮し得る剤形であれば特に限定しない。
【００９２】
剤形は、その形態により液体剤形又は固体剤形（ゲルのような半固体剤形を含む）に分類できるが、本発明のHCV感染阻害剤は、そのいずれであってもよい。また剤形は投与方法により経口剤形と非経口剤形とに大別できるが、これに関してもいずれであってもよい。
【００９３】
具体的な剤形としては、経口剤形であれば、例えば、懸濁剤、乳剤、及びシロップ剤のような液体剤形、散剤（粉剤、粉末剤、飴粉剤を含む）、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、舌下剤、及びトローチ剤等の固体剤形が挙げられる。また、非経口剤形であれば、例えば、注射剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、及び点鼻剤等の液体剤形、クリーム剤、軟膏剤、硬膏剤、シップ剤及び座剤等の固体剤形が挙げられる。好ましい剤形は、経口剤形のいずれか、又は非経口剤形であれば液体剤形の注射剤である。
【００９４】
２−２−３．投与方法
本発明のHCV感染阻害剤は、HCV感染予防のために、有効成分である第１態様の抗オクルディン抗体及び／又はその断片を生体に有効量投与することができる方法であれば、当該分野で公知のあらゆる方法を適用することができる。
【００９５】
本明細書において「有効量」とは、有効成分がその機能を発揮する上で必要な量、すなわち、本発明ではHCV感染阻害剤がHCV感染を阻害する上で必要な量であって、かつそれを適用する生体に対して有害な副作用をほとんど又は全く付与しない量をいう。この有効量は、被験体の情報、投与経路、及び投与回数等の条件によって変化し得る。「被験体」とは、本態様のHCV感染阻害剤又は第３態様に記載のHCV感染阻害用ワクチンの適用対象となる動物個体をいう。HCVの宿主特異性から本発明のHCV感染阻害剤の被験体は、原則としてヒト又はチンパンジーである。ただし、ヒト又はチンパンジーのCD81及びオクルディンを発現可能なトランスジェニック動物も被験体になり得る。好ましい被験体はヒトである。「被験体の情報」とは、被験体の様々な個体情報であって、例えば、被験体の年齢、体重、性別、全身の健康状態、薬剤感受性、服用中の医薬品の有無等を含む。有効量、及びそれに基づいて算出される投与量は、個々の被験体の情報等に応じて医師又は獣医師の判断によって決定される。HCV感染阻害の十分な効果を得る上で、本発明のHCV感染阻害剤を大量投与する必要がある場合、被験者に対する負担軽減のために、数回に分割して投与することもできる。
【００９６】
本発明のHCV感染阻害剤の投与方法は、全身投与又は局所的投与のいずれであってもよい。全身投与の例としては、静脈注射等の血管内注射や経口投与等が挙げられる。また局所投与の例としては、局所注射等が挙げられる。本発明のHCV感染阻害剤の有効成分は、抗オクルディン抗体及び／又はその断片であるためペプチドで構成されている。したがって、経口投与の場合には、有効成分を消化酵素による分解から保護するために適当なDDS（薬剤送達システム）を用いる等、適切な処置を施すことが好ましい。また、HCV感染は肝臓で起こることから、局所注射の場合、治療すべき箇所である肝臓に本発明のHCV感染阻害剤を投与することが好ましい。侵襲性が低く、肝臓を含む全身に有効成分を隈なく行き渡らせることができる点で、血管内注射による全身投与が特に好ましい。
【００９７】
具体的な投与量の一例として、例えば、C型肝炎の発症初期のヒト成人男子（体重60kg）に投与する場合、一日当たりのHCV感染阻害剤の有効量は、通常1〜2000mg、好ましくは1〜1000mg、より好ましくは1〜500mgの範囲である。本発明のHCV感染阻害剤を被験者に投与する場合、有効成分である本発明の抗体の有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.001mg〜1000mgの範囲で選ばれる。あるいは、被験者あたり0.01〜100000mg/bodyの投与量を選ぶことができる。ただし、これらの投与量に制限されるものではない。
【００９８】
投与時期は、特に限定はしないが、本発明のHCV感染阻害剤の薬理効果は、HCVの感染阻害であることから、HCV感染により症状が重篤化する前、すなわちC型慢性肝炎の発症前が好ましい。より好ましくはHCVの初期感染後、持続感染状態に移行するまでの期間である。HCVの感染前に投与してもよい。
【００９９】
３．C型肝炎ウイルス感染阻害用ワクチン
３−１．概要
本発明の第３の態様は、HCV感染阻害用ワクチンである。本態様のHCV感染阻害用ワクチンは、オクルディン第２細胞外ドメインを構成するアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１で示すALCNエピトープとして含むペプチドからなる。本発明のHCV感染阻害用ワクチンによれば、被験体に投与することで、被験体体内で第１態様に記載の抗オクルディン抗体の産生を誘導することができ、それによって被験体をHCV感染から予防することができる。
【０１００】
３−２．構成
３−２−１．構成成分
（１）HCV感染阻害用ワクチン
「ワクチン」は、感染症の予防のために動物に接種する医薬品である。ワクチン接種された動物は、感染症の原因となる病原体に対する獲得免疫力が向上し、以降はその感染症に罹患しにくくなる。通常、ワクチンは病原体やその一部、又は毒素を利用する。例えば、病原性や毒性を弱めた生きた病原体（生ワクチン）、化学処理等により病原性や毒性を失った死んだ病原体（不活化ワクチン）、そして病原体が産生する毒素を無毒化したトキソイド等が挙げられる。ただし、本明細書のHCV感染阻害用ワクチンは、HCVに感染される宿主細胞、すなわち宿主の肝細胞上に発現するウイルス受容体タンパク質オクルディンの一部を利用する。したがって、一般のワクチンとは異なり、病原体であるHCV由来ではなく、HCV感染される宿主側のタンパク質の一部に由来する。
【０１０１】
本発明のHCV感染阻害用ワクチンの具体的な構成は、配列番号１で示すALCNエピトープを包含し、かつヒト又はチンパンジーのオクルディン第２細胞外ドメインを構成する、配列番号４で示すアミノ酸配列、配列番号４で示すアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号４で示すアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列の一部からなるペプチドである。このペプチドのアミノ酸長は、限定はしないが、4〜30アミノ酸が好ましく、4〜20アミノ酸がより好ましく、6〜18アミノ酸又は8〜15アミノ酸はさらに好ましい。
【０１０２】
本発明のHCV感染阻害用ワクチンの具体例として、配列番号６及び７で示すアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。配列番号６で示すアミノ酸配列は、ヒトオクルディン第２細胞外ドメインの一部で、ヒトオクルディン全長において214位から223位のアミノ酸配列に相当する。また、配列番号７で示すアミノ酸配列は、前記配列番号６で示すアミノ酸配列からなるペプチドを含み、ヒトオクルディン全長において214位から230位のアミノ酸配列に相当する。
【０１０３】
（２）免疫増強剤
本発明のHCV感染阻害用ワクチンは、被験体の免疫学的応答性を強化し、そのワクチンの効果を増強させる目的で、免疫増強剤と組み合わせて用いることができる。
【０１０４】
免疫増強剤の具体例として、アジュバントやサイトカインが挙げられる。
【０１０５】
アジュバントは、当該分野で多数の種類が知られているが、本発明のHCV感染阻害用ワクチンと組み合わせる場合には、いずれのアジュバントでもよい。アジュバントの具体例としては、フロイント完全及び／又は不完全アジュバント、ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ポリIC及びその誘導体（ポリICLC等）、スクアレン及び／又はトコフェロール、Quillja saponariaのサポニンに由来するQS-21、MPL（SmithKline Beecham）、QS21（SmithKline Beecham）、サルモネラ属のSalmonella minnesota R595リポ多糖類、その非毒性誘導体であるMPL（3-脱アシル化-4′-モノホスホリルリピッドA）、並びにQS-7、QS-17、QS-18及びQS-L1（So H.S., et al., 1997, Molecules and cells，7：178-186）等が挙げられる。
【０１０６】
本発明のHCV感染阻害用ワクチンとアジュバントとの混合比は、特に限定はしないが、例えば、1：10〜10：1、好ましくは1：5〜5：1の範囲であればよい。より好ましい混合比は、1：1である。
【０１０７】
サイトカインは、リンパ球や抗原提示細胞を刺激する特性を有するサイトカインであればいずれのサイトカインであってもよい。そのようなサイトカインの具体例として、IL-12、IL-18、GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-γ及びFlt3等が挙げられる。
【０１０８】
（３）薬学的に許容可能な担体
本発明のHCV感染阻害用ワクチンは、必要に応じて薬学的に許容可能な担体と組み合わせて用いることができる。
【０１０９】
薬学的に許容可能な担体の構成については、前記第２態様のHCV感染阻害剤を構成する薬学的に許容可能な担体と同一でよい。したがって、薬学的に許容可能な担体は第２態様を参照すればよく、ここではその具体的な説明を省略する。
【０１１０】
３−２−２．剤形
本発明のHCV感染阻害用ワクチンの剤形も、基本的には前記第２態様に記載のHCV感染阻害剤の剤形に準じる。したがって、ここではその具体的な説明を省略する。ただし、ワクチンの場合、通常、非経口の液体剤形として投与されることが多いため、限定はしないが、例えば、液剤、懸濁剤又は乳剤の注射剤が好適である。
【０１１１】
３−２−３．投与方法
本発明のHCV感染阻害用ワクチンの投与方法も、基本的には前記第２態様に記載のHCV感染阻害剤の投与方法に準じればよい。したがって、ここではその具体的な説明を省略する。
【０１１２】
本発明のHCV感染阻害用ワクチンと共に前記免疫増強剤を投与する場合、それらの投与順序は限定しない。例えば、HCV感染阻害用ワクチンを免疫増強剤よりも先に又は後に被験体に投与してよいし、同時に投与してもよい。
【０１１３】
本発明のHCV感染阻害用ワクチンは、前記免疫増強剤及び／又は薬学的に許容な担体と組み合わせて、必要に応じてバッファやシリンジ、注射針、使用説明者等を加えたHCV感染予防用としてキット化してもよい。
【実施例】
【０１１４】
＜実施例１＞
（目的）抗ヒトオクルディンモノクローナル抗体を作製する。【０１１５】
（方法）
ヒトオクルディンにおける第２細胞外ドメインの一部で、214位〜230位に相当する領域を抗原とし、そのアミノ酸配列情報（配列番号７：ALCNQFYTPAATGLYVD）に基づいてペプチドの合成を行った（MBL社）。次に、抗原刺激性を高めるためにキャリアタンパク質としてN末端にスカシガイのヘモシアニン(KLH：keyhole limpet hemocyanin)（MBL社）を結合させた。【０１１６】
抗体の作製は、ハイブリドーマ法により行った。基本的な方法は常法に準じた。4匹の特殊疾患マウス（MBL社）の皮下に上記抗原を1 mg/mL濃度で、マウス１匹１回につき 50μgを2週間毎に計３回免疫し、免疫後の個体から脾臓を摘出して、B細胞を回収した。回収したB細胞とマウスミエローマP6細胞を融合させ、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの培養上清を回収し、抗原ペプチドへの結合性をELISA法によってスクリーニングした。【０１１７】
（結果）
その結果、抗原結合能を有するポジティブクローンとして31個の抗オクルディンモノクローナル抗体を得た。【０１１８】
＜実施例２＞
（目的）
実施例１で得られた抗オクルディンモノクローナル抗体のHCVpv感染阻害効果を評価する。【０１１９】
（方法）
実施例１で得られた各抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、20% FBS（GIBCO社）及び1% Penicillin/Streptomycin（GIBCO社）を加えたRPMI（WAKO社）培地で37℃にて5% CO2存在下で3日間培養した。培養後に得られた培養上清を抗オクルディン抗体産生クローン含有培地とした。【０１２０】
HCVの感染用宿主細胞には、HCV複製の感受性が高い高分化型ヒト肝癌由来細胞株Huh7.5.1細胞株を用いた（大阪大学微生物病研究所の松浦教授より恵与）。Huh7.5.1細胞は、10% FBS（GIBCO社）を加えたD-MEM high Glucose（Sigma社）培地で、37℃にて5% CO2存在下で培養した。また、細胞の継代には、0.25%トリプシン-EDTA液を用いた。【０１２１】
HCVには、HCVpvを用いた。HCVpv (pseudotyped HCV)は、HCVエンベロープタンパク質を被った水泡性口炎ウイルス（VSV：Vesicular Stomatitis Virus）であり、HCVのシュードタイプウイルスとして知られている（Matsuura Y, et al., 2001, Virology, 286:263-275）。本明細書では、con1（遺伝子型1a）、H77（遺伝子型1b）、及び9-3 (遺伝子型1b)の3種のHCVpvを用いた（大阪大学微生物病研究所の松浦教授より恵与）。【０１２２】
Huh7.5.1細胞は、48 well平底プレート（Nunc社）で上記条件にて培養し、24時間後に培地交換をする際に、抗オクルディン抗体産生クローン含有培地を12.5 μL/wellで、若しくは抗オクルディン抗体産生クローン含有培地から精製した抗オクルディン抗体20 μg/well (80 μg/mL)を培地に加えた。抗体精製にはAb-Rapid PuReアフニィティゲル（プロテノバ社）を用いた。【０１２３】
陰性対照として培地のみのmock群、陽性対照として抗ヒトCD81抗体（以下、しばしば「抗CD81抗体」と表記する。)（JS-81クローン；BD Pharmingen社)1.25 μg/well (5 μg/mL)を加えたCD81群（Fofana I., et al., 2013, PLoS One, 8:e64221）をおいた。1時間後に、HCVpv（con1又はH77）を15 μL若しくは陰性対照としてHCVエンベロープタンパクを持たないGFPを15 μLを加えて、24時間後にルシフェラーゼ活性を定量した。具体的には、培地を除去した後、可溶化液100 μLを加え、15分後に20 μLを採取して、50 μLのルシフェラーゼ基質と混和し、ボルテックス後ルミノメーターで測定した。mock群に比して90%以上の低下が見られた場合には、感染阻害効果ありと判定した。【０１２４】
（結果）
実施例１で得られた31クローンの抗オクルディン抗体候補のうち50%以上の感染阻害率を示すクローンとして図２に示す6クローン（C15、C23、C46、C67、C81、C111）を得た。また、図２の結果に基づいて、mockの感染阻害率を0%とし、6種類のクローンと抗CD81抗体の感染阻害率を算出した結果を表１に示す。
【表１】
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【０１２５】
6つのクローンの感染阻害率は、抗体C15で最大83%を確認できたが、陽性対照の抗CD81抗体の99.8%と比べるといずれも低値であった。【０１２６】
＜実施例３＞
（目的）
実施例１で得られた抗オクルディンモノクローナル抗体のHCVcc感染阻害効果を評価する。【０１２７】
（方法）
HCVの感染用宿主細胞には、実施例２と同じHuh7.5.1細胞を用いた。培養は、10% FBS（GIBCO社）を加えたD-MEM high Glucose（Sigma社）培地で、37℃にて5% CO2存在下で行った。【０１２８】
また、HCVには、実験室株HCVとして樹立されているJFH-1株由来のHCVcc（cell cultured HCV；遺伝子型2a）（Matsuura Y, et al., 2001, Virology, 286:263-275）を用いた（大阪大学微生物病研究所の松浦教授より恵与）。【０１２９】
24 well平底プレートに500 μLの上記培地を準備し、Huh7.5.1細胞を1×103 cells/wellで播種した後、48時間インキュベートした。培地交換後、実施例２で選択した6クローンのそれぞれを含む抗オクルディン抗体産生クローン含有培地を25〜100 μL/wellずつ投与した。1時間後にHCVcc 10μLを投与し、2時間後に培地交換した。24時間後にRNAを抽出し、リアルタイムPCR法により細胞中のHCV RNAを定量した。【０１３０】
リアルタイムPCRは、TaqMan（登録商標）One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit （TOYOBO社）を使用して、添付のプロトコルに従い、Step one リアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher Scientific社）を用いて行った。逆転写反応は90℃ 30秒、61℃ 20分及び95℃ 1分で行い、PCRは95℃ 15秒及び60℃ 1分を1サイクルとして、45サイクルで行った。PCRに用いたプライマーペアは、NS5A Forward（配列番号８）及びNS5A Reverse（配列番号９）とした。また、TaqMan probeとして、配列番号１０で示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。なお、TaqMan probeは、5′末端がFAMで、また3′末端がTAMURAで修飾されている。【０１３１】
なお、陰性対照として培地のみのmock群を、そして陽性対照として抗CD81抗体（JS-81クローン；BD Pharmingen社)1.25 μg/wellを加えたCD81群をおいた。また、後述する表２のHCVpvによる感染阻害効果の評価では、陰性対照用抗体として正常マウスIgG（以下しばしば「IgG」と表記する。)（Jackson Immuno Lab社）20 μg加えたIgG群も加えた。【０１３２】
（結果）
図３に、HCVccの評価結果を示す。縦軸のHCVcc感染率は、mock群を1としたときの相対値である。実施例１で得られた6クローンのうち5クローンにおいて79〜85%の感染阻害率が認められた。しかし、CD81抗体では感染阻害効果が弱かった。そこで、CD81抗体を除いた残る5クローンについて限界希釈法により3クローンずつ計15クローンのサブクローンを樹立し、培養上清に含まれる抗オクルディンモノクローナル抗体の抗原への結合性をELISA法にて検討したところ、図４で示すように15クローンの全てで抗原結合能が認められた。【０１３３】
そこで、15クローンの精製抗体について、実施例２と同様の方法でHCVpvによる感染阻害効果を評価した結果を表２に示す。
【表２】
2017061599.tif 000003
【０１３４】
15クローンの感染阻害率は、抗体C67-1で最大55%を示すに留まり、陽性対照の抗CD81抗体の99%と比べると、いずれのクローンも十分な阻害効果は得られなかった。【０１３５】
＜実施例４＞
（目的）
実施例２及び３では本発明の抗オクルディン抗体による十分なHCV感染阻害効果を検出することができなかった。前記実施例のHCVpv及びHCVcc評価系では、通常の単層培養系を用いている。本発明者らは、HCV感染阻害効果が不十分な原因がこの細胞培養方法に原因があると推定し、生体における肝細胞環境やHCV感染ルートを再現したダブルチャンバー培養系を用いて抗オクルディンモノクローナル抗体のHCV感染阻害効果を再検証する。【０１３６】
（方法）
ダブルチャンバー培養系特有の細胞培養方法及び抗体等の投与方法を除けば、基本的な操作方法は、実施例３に記載した単層培養系に準じた。【０１３７】
ダブルチャンバー培養系では、24 well平底プレートにセルカルチャーインサート（セルロース混合エステル, 24 well, pore size 0.4 μm、translucent）（BD Falcon社）を設置し、外側チャンバーに950 μL、インサート内に250 μLの培地をそれぞれ加えた（図５）。Huh7.5.1細胞を各インサート内に1×103 cellsで播種し、48時間インキュベートした。培地交換後に実施例３で使用した15クローンの各抗オクルディンモノクローナル抗体100 μgを外側チャンバーに投与した。実施例３と同様に、陰性対照には培地のみのmock群を、また陰性対照用抗体にはIgG（Jackson Immuno Lab社）100 μg加えたIgG群を、そして陽性対照には抗CD81抗体（JS-81クローン；BD Pharmingen社)2.5 μgを加えたCD81群を置き、IgGや抗CD81抗体をそれぞれ外側チャンバーに投与した。抗体やIgGを投与して1時間後にHCVcc（単層培養系では5 μLを加え、2時間インキュベートした後に培地を取り除き、培地にて2回洗浄した。再度培地を加えて24時間後にRNAをRNeasy Mini kit（QIAGEN社）を用いて抽出し、実施例３と同様の方法でリアルタイムPCR法により細胞中のHCV RNAを定量した。HCVcc感染阻害実験における有意差検定は、Mann-Whitney U検定にて行い、P<0.05を有意差ありとした。【０１３８】
（結果）
図６に、15クローンによるHCVcc感染阻害の評価結果を示す。縦軸のHCVcc感染率は、mock群を1としたときの相対値である。15クローンのうちハイブリドーマC67-2から産生される67-2抗体がHCVcc感染を顕著に阻害した。図７に示すように、67-2抗体によるHCV感染阻害率は99.6%であり、mock群やIgG群に対して統計的に有意であり、CD81抗体群と同等の効果が認められた。【０１３９】
＜実施例５＞
（目的）
マトリゲルを用いた3次元培養系では、毛細胆管様管腔構造を含む肝細胞極性が構築され、アピカル（毛細胆管）面とバソラテラル（類洞）面が区別された肝細胞極性が再現され、HCVに対する感染性も有することが知られている（Furuse M., et al,. 1993, J Cell Biol, 123:1777-1788；Molina-Jimenez F, et al., 2012, Virology, 425:31-39）（図８）。そこで、マトリゲル3次元培養系を用いて抗オクルディンモノクローナル抗体のHCV感染阻害効果を検証する。【０１４０】
（方法）
マトリゲル3次元培養系ではMolina-Jimenezらの方法（Molina-Jimenez F., et al., 2012, Virology, 425:31-39.）を改変し培養した。48 well平底プレートに50 μL/wellのマトリゲル（CORNING社）を加え、Huh7.5.1細胞を1×104 cells/wellとなるよう播種した後、200 μLのDMEM培地を加えて、37℃にて5% CO2 存在下で6日間培養した。バソラテラル面から67-2抗体を50 μg投与し、対照としてmock群、抗CD81抗体2.5 μgを加えたCD81群、正常マウスIgGを50 μg加えたIgG群をおいた。抗体やIgG等を投与して1時間後にバソラテラル面からHCVcc（単層培養系では10 μL、ダブルチャンバー及びマトリゲル培養系では5 μL）を加え、2時間インキュベート後に培地を取り除き、培地で2回洗浄した。再度培地を加えて24時間インキュベートした後にRNeasy Mini kit（QIAGEN社）を用いて各細胞からRNAを抽出し、リアルタイムPCR 法により細胞中のHCV RNAを定量した。他の基本的な操作方法は、実施例３に記載した単層培養系に準じた。HCVcc感染阻害実験における有意差検定は、Mann-Whitney U検定にて行い、いずれもP<0.05を有意差ありとした。【０１４１】
（結果）
図９に、67-2抗体の評価結果を示す。縦軸のHCVcc感染率は、mock群を1としたときの相対値である。その結果、67-2抗体によるHCV感染阻害率は95%であり、mock群に対して統計的に有意であり、CD81抗体群と同等の効果が認められた。【０１４２】
前記実施例４及び本実施例の結果から、オクルディンのようなタイト結合に限局した分子を標的とするHCV感染阻害剤を評価するためには、通常の単層培養系は適切ではなく、ダブルチャンバー培養系やマトリゲル3次元培養系のような肝細胞極性と薬剤投与経路を再現可能な培養系が必要であることが明らかとなった。【０１４３】
＜実施例６：抗ヒトオクルディン抗体の細胞傷害性＞
（目的）
本発明の抗オクルディンモノクローナル抗体の細胞傷害性を検証する。【０１４４】
（方法）
抗体による細胞傷害性の評価にはXTT法を用いた。96 well 平底プレートに25 μL/wellのマトリゲル（CORNING社）を加え、Huh7.5.1細胞を5×103 cells/wellとなるよう播種した。100 μLのDMEM培地を加え、37℃にて5% CO2 存在下で6日間培養した。培地のみ（mock群）、25、50、及び100 μg/wellの67-2抗体、又は25、50、及び100 μg/wellの正常マウスIgG（IgG群）を投与した後、1時間インキュベートした。【０１４５】
また、同時にHCV感染時における細胞傷害性の影響を検討する目的で、培地のみ（mock群）、50 μg/wellの67-2抗体（67-2群）、又は50 μg/wellの正常マウスIgG（IgG群）を投与した1時間後にHCVcc 10 μL/wellを投与し、さらに2時間培養した後に細胞傷害性を評価した。解析はCell proliferation assay kit II (XTT)（Roche社）を用い、具体的な操作については添付のプロトコルに従った。【０１４６】
（結果）
結果を図１０に示す。本発明の抗オクルディンモノクローナル抗体である67-2抗体は、いずれの濃度でも細胞傷害性を示さなかった（図１０Ａ）。また、HCVcc感染の2時間後も、抗体による細胞毒性は認められなかった（図１０Ｂ）。このように抗オクルディン抗体67-2抗体は、少なくともHCV感染阻害効果を示す濃度では、重篤な細胞傷害性がなく、細胞毒性を示さないことが確認された。【０１４７】
＜実施例７＞
（目的）
67-2抗体のアイソタイプ解析とエピトープ解析を行う。【０１４８】
（方法）
（１）抗体アイソタイプ解析
67-2抗体のアイソタイプは、Iso Stripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Roche社）を用いて解析した。1 mg/mLの67-2抗体をディベロプメントチューブに滴下し、撹拌後、アイソトタイプ用ストリップを浸漬した。5分後に、ストリップ部分に検出される青色バンドから、アイソタイプを同定した。【０１４９】
（２）エピトープ解析
実施例１〜６では、ヒトオクルディンの第２細胞外ドメインの一部を抗原とした。したがって、67-2抗体のエピトープは、オクルディンの214位〜230位に相当し、配列番号７で示すアミノ酸配列からなる領域内に存在するはずである。【０１５０】
そこで、配列番号７で示すアミノ酸配列の3′末端側から７残基を削った配列番号６で示すアミノ酸配列（ALCNQFYTPA）からなるOcln1、逆に5′末端側から７残基を削った配列番号１１で示すアミノ酸配列（TPAATGLYVD）からなるOcln2、及び両末端側から3〜4残基を削った配列番号１２で示すアミノ酸配列（QFYTPAATGL）からなるOcln3を抗原ペプチドとして作製した（図１１Ａ）。抗原の陽性対照にはKLH-Ocln peptide（1 μg/well）を用いた。【０１５１】
抗原感作マイクロプレート（Nunc社）に、各抗原ペプチドを25、50、100、及び500μg/wellで加え、室温下で一晩インキュベートした。5% BSA/PBS/0.09% NaN3で37 ℃にて2時間ブロッキングを行った後、67-2抗体又は正常マウス IgGを加え、室温で１時間インキュベートした。なお、Ocln1は配列中にシステイン残基を有することから2量体を形成し得る。そのため、酸性条件下（2N HCl）においても行った。PBSにて洗浄後、二次抗体として、horseradish peroxidase (HRP)標識されたヤギ 抗マウス IgG（MBL社）を加え、室温にて1時間インキュベートした。PBSで洗浄後、TMB試薬にて呈色反応を行った。1 Mリン酸にて反応を停止させ、マイクロプレートリーダーにて450 nm/655 nmの吸光度を測定した。エピトープ解析における有意差検定は、Studentのt検定を用いて行った。【０１５２】
（結果）
（１）抗体アイソタイプ解析
ストリップ部分に検出される青色バンドから、67-2抗体のH鎖はIgG1、L鎖はλ鎖であることが明らかとなった（データは示さず）。【０１５３】
（２）エピトープ解析
図１１Ｂに67-2抗体のエピトープ解析結果を示す。67-2抗体は、酸性条件下において、25、50、及び100μg/wellの範囲内でOcln1ペプチドのみと有意に結合した。Ocln3ペプチドとの反応性が見られないことから、67-2抗体のエピトープは、ヒトオクルディン第２細胞外ドメインの一部で、214位から217位に相当するALCN（配列番号１）であることが示唆された。【０１５４】
＜実施例８＞
（目的）
蛍光免疫染色法により本発明の抗オクルディン抗体によるHCV感染阻害機序を検証する。【０１５５】
（方法）
本発明の抗オクルディンモノクローナル抗体である67-2抗体を用いて蛍光免疫染色を行った。8 wellガラスチャンバープレートに50 μL/wellのマトリゲル（CORNING社）を加え、Huh7.5.1細胞を5×103 cells/wellとなるよう播種した。200μLのDMEM培地を加え、37℃にて5% CO2存在下で6日間培養した。培地のみのmock（-67-2）及び50μg/wellの67-2抗体（+67-2）、及びHCVcc投与の有無（+HCV；-HCV）の組み合わせで区分した。【０１５６】
抗体投与1時間後にHCVcc 5 μL/wellを投与し、2時間後、及び72時間後のそれぞれでPBSで洗浄を行った後、−20℃メタノールにて10分間固定した（2時間固定群、72時間固定群）。2% BSA/PBSで室温にて1時間ブロッキングを行った。【０１５７】
2時間後固定群の一次抗体には、ラット抗オクルディン抗体（生理学研究所  古瀬教授より恵与）(Saitou M., et al., 1997, Eur J Cell Biol, 73:222-231)、及びラビット抗NS5A抗体（大阪大学微生物病研究所の松浦教授より恵与）（Hamamoto I., et al., 2005, J Virol, 79:13473-13482）を使用した。二次抗体には、蛍光標識されたロバ抗ラットIgG-Alexa Fluor 488（Molecular Probes社）を使用した。【０１５８】
72時間後固定群の一次抗体には、ラビット抗NS5A抗体をシグナルブースター（Beacle社)にて200倍に希釈して使用した。二次抗体には、蛍光標識されたロバ抗ラビットIgG-Alexa Fluor 488（Molecular Probes社）を使用した。【０１５９】
二次抗体反応には、それぞれの抗体をPBSで200倍に希釈して室温下で1時間行った。その後、DAPIによる核染色を室温下で10分間行った後、封入した。観察は共焦点レーザー顕微鏡（FV-1000, OLYMPUS）を用いて行った。【０１６０】
（結果）
図１２に蛍光免疫染色の結果を示す。図１２のＡは72時間後固定群の、また図１２のＢは2時間後固定群の結果である。【０１６１】
図１２のＡから、HCVcc存在下（+HCV）において、67-2抗体を添加していない-67-2では約5〜10％の細胞がNS5A陽性（図中の矢頭）となりHCV感染が確認された。一方、67-2抗体を添加した+67-2では、HCV感染した細胞は確認できなかった。これは本願発明の67-2抗体がタンパク質レベルにおいてもHCV感染阻害効果を有することを示唆している。【０１６２】
また図１２のＢから、-67-2/-HCV条件下では、オクルディンはタイト結合領域に局在していた（矢頭）。一方、+67-2/-HCV及び+67-2/+HCV条件下、すなわちHCVの有無に関わらず67-2抗体投与の条件下では、オクルディン局在がタイト結合領域から細胞質に変化していた。この結果は、67-2抗体がオクルディンのエンドサイトーシスを誘導して、HCVや受容体群との相互作用を回避させ、感染を阻害することを示唆している。【０１６３】
＜実施例９＞
（目的）
67-2抗体遺伝子を取得する。【０１６４】
（方法）
RNAをRNeasy Mini kit（QIAGEN社）を用いて67-2抗体を産生するハイブリドーマC67-2から総RNAを抽出した。具体的な操作は、キットに添付のプロトコルに従った。次に、Gene Racer Kit（Thermo Fisher社）を用いて得られた総RNAからcDNAライブラリーをキットに添付のプロトコルに従い調製した。続いて、調製したcDNAライブラリーを鋳型に、Gene Racer 5'primer（配列番号２９）及びmIgG1 3'primer（配列番号３０）又はmIgλ 3'primer（配列番号３１）のプライマーペアを用いてKOD plusポリメラーゼ（TOYOBO社）又はPlatinum Taqポリメラーゼ（Thermo Fisher社）によりIgGの重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子のそれぞれをPCRで増幅した。得られた増幅産物をpT7 Blue vector（Novagen社）に挿入して重鎖遺伝子クローン群及び軽鎖遺伝子クローン群を得た。それぞれの群から複数のクローンを選択し、各クローンの挿入断片の塩基配列を常法に従い決定した。【０１６５】
（結果）
重鎖遺伝子クローン、及び軽鎖遺伝子クローンのそれぞれのクローンから同一の塩基配列が確認されたため、それらを67-2抗体の重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子と決定し、配列アラインメントの結果から各鎖の可変領域をコードする塩基配列を決定した。67-2抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を配列番号２１で、また軽鎖可変領域をコードする塩基配列を配列番号２５で示す。Kabatのルールに基づいて各可変領域の塩基配列からCDR1、CDR2及びCDR3を予測した。重鎖可変領域のCDR1をコードする領域を配列番号２２で、CDR2をコードする領域を配列番号２３で、及びCDR3をコードする領域を配列番号２４で、また軽鎖可変領域のCDR1をコードする領域を配列番号２６で、CDR2をコードする領域を配列番号２７で、及びCDR3をコードする領域を配列番号２８で、示す。【０１６６】
＜実施例１０＞
（目的）
抗オクルディンヒト化抗体発現細胞株を樹立し、得られた抗オクルディンヒト化抗体のHCVcc感染阻害効果について検証する。【０１６７】
（方法及び結果）
（１）抗オクルディンヒト化抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子の構築
ヒトIgG重鎖遺伝子、及びヒトIgG軽鎖遺伝子における、CDR1、CDR2、及びCDR3をコードする塩基配列を、実施例９で得られた67-2抗体の重鎖におけるCDR1、CDR2、及びCDR3をコードする塩基配列（それぞれ配列番号２２、２３、及び２４で示す）、及び軽鎖におけるCDR1、CDR2、及びCDR3をコードする塩基配列（それぞれ配列番号２６、２７、及び２８で示す）で置換して、抗オクルディンヒト化抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子を構築した。【０１６８】
続いて、抗オクルディンヒト化抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子を発現ベクターそれぞれpEHX1.1（TOYOBO）及びpELX2.2（TOYOBO）のプロモータ制御下に挿入して、抗オクルディンヒト化抗体の重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターを構築した。【０１６９】
（２）抗オクルディンヒト化抗体発現細胞株の樹立
リポフェクタミン法を用いて前記抗オクルディンヒト化抗体における重鎖及び軽鎖の2つの発現ベクターをそれぞれCHO-K1細胞に導入し、限界希釈法により形質転換クローン株を単離した。各クローン株を常法で培養後、抗オクルディンヒト化抗体を含む培養上清を回収した。続いて、ELISA法により抗原である配列番号７のオクルディンペプチドとの結合性を確認した。【０１７０】
その結果、クローン2D3株が産生する抗オクルディンヒト化抗体（2D3抗体）が最も強い抗原結合性を有していた。そこで、クローン2D3株を抗オクルディンヒト化抗体発現CHO-K1株として樹立した。【０１７１】
（２）抗体精製
前述の2D3株を常法で培養し、2D3抗体を含む培養上清を回収した。続いて、培養上清をprotein Aベースのアフィニティーカラム（protenova社）上に積載し、Gentle Ag/Ab Elution buffer（Thermo Fisher Scientific社)を用いて、カラムから2D3抗体を溶出した。続いて、抗体溶液をTBSバッファに置換するため、PD-10カラム（GE Healthcare社）を用いてバッファ交換を行った。各フラクション中のタンパク濃度をBCA法にて測定し、抗体画分を決定した。精製抗体は、SDS-PAGE法とウェスタンブロットによりヒトIgGであることを確認した。【０１７２】
（３）抗オクルディンヒト化抗体によるHCVcc感染阻害効果の評価
抗オクルディンヒト化抗体である2D3抗体のHCVcc感染阻害効果について検証した。基本的な操作は、実施例３に記載の方法に準じた。ただし、ウェルサイズ等の条件については、以下の通り変更した。48 well 平底プレートに50μL/wellのマトリゲル（CORNING社）を加え、Huh7.5.1細胞を1×104 cells/wellとなるよう播種し、200μLの10% FBS含有DMEM培地を加えて、37oCにて、5% CO2存在下で6日間培養した。抗オクルディン抗体を50 μg添加し、陰性対照として、培地のみのmock群、陽性対照の抗CD81抗体2.5 μgを加えたCD81群、及び正常ヒトIgG 50 μgをTBS bufferに加えたIgG群をおいた。【０１７３】
抗CD81抗体、2D3抗体又はIgGを添加し、1時間後にHCVcc 5 μLを加えて、2時間インキュベートした後に培地を取り除き、培地で2回洗浄した。その後、再度培地を加え24時間インキュベートした後にRNeasy Mini kit (QIAGEN)を用いて、RNAを抽出し、リアルタイムPCR法により細胞中のHCV RNAを定量した。【０１７４】
逆転写反応とPCRは、RNA-direct（登録商標） Real-time PCR Master Mix Reagents Kit（TOYOBO社）を使用し、キット添付のプロトコルに従い、Step one リアルタイムPCRシステム（Thermo Fisher Scientific社）を用いて行った。逆転写反応は90oC、30秒、61oC、20分、95oC、1分で行い、PCR反応は、95oC、15秒、60oC、1分を45サイクルで行った。なお、リアルタイムPCRのプライマーペアとして、配列番号８で示す塩基配列からなるNS5A Forwardプライマーと配列番号９で示す塩基配列からなるNS5A Reverseプライマーを用いた。また、TaqManプローブとして配列番号１０で示す塩基配列からなるプローブを用いた。TaqMan probeは、5′末端がFAMで、また3′末端がTAMURAで修飾されている。【０１７５】
図１３に2D3抗体のHCVcc感染阻害効果の評価結果を示す。縦軸のHCVcc感染率は、mock群を1としたときの相対値である。2D3抗体は、陽性対照である抗CD81抗体と同様にHCVcc感染を顕著に阻害した。2D3抗体のHCV感染阻害率は約90%であり、mock群及びIgG群に対して統計的に有意に低い感染率であった。この結果は、本発明の抗オクルディンヒト化抗体がHCV感染阻害効果を有することを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2017061599.tif 000012
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
2017061599000001.app
【国際調査報告】
2017061599.tif 000017
2017061599.tif 000018
2017061599.tif 000019
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