(57)【要約】  本発明の解決すべき課題は、ルシフェリン溶液の安定性を高める組成を提供することである。本発明は、ルシフェリン溶液にボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、ルシフェリン溶液の安定化方法、ならびにルシフェリンを基質としてルシフェラーゼの生物発光反応を行うときに、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、生物発光強度の減衰・低下の抑制方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼの基質であるルシフェリン溶液にボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、ルシフェリン溶液の安定化方法。
【請求項２】
標識酵素としてルシフェラーゼを用い、ルシフェリンを基質として生物発光反応を測定する免疫学的測定方法において、ボロン酸誘導体又はその塩を共存させてルシフェリン溶液を安定化させる免疫学的測定方法。
【請求項３】
前記ボロン酸誘導体又はその塩がほう酸、四ほう酸ナトリウム、および下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【化１】
2017057672.tif 000021
［式中、Ｒ１は、置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合または三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。ＸはＮ−Ｒ７（窒素（Ｎ）にＲ７が結合）、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）のいずれかひとつを示す。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、同一又は異なって、Ｈ（水素）、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、（tert−ブトキシカルボニル）アミノ基、または置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合もしくは三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。］
【請求項４】
ルシフェリンを基質としてルシフェラーゼの生物発光反応を行うときに、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、生物発光強度の減衰・低下の抑制方法。
【請求項５】
標識物としてルシフェラーゼを用い、ルシフェリンを基質として生物発光反応を測定する免疫学的測定方法において、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩を共存させて生物発光強度の減衰・低下を抑制させる免疫学的測定方法。
【請求項６】
前記ボロン酸誘導体又はその塩が下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む、請求項４又は５に記載の方法。
【化２】
2017057672.tif 000022
［式中、Ｒ１は、置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合または三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。ＸはＮ−Ｒ７（窒素（Ｎ）にＲ７が結合）、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）のいずれかひとつを示す。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、同一又は異なって、Ｈ（水素）、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、（tert−ブトキシカルボニル）アミノ基、または置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合もしくは三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す+。］
【請求項７】
前記ルシフェリンがホタルルシフェリンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼであり、前記ルシフェリンがホタルルシフェリンである、請求項２、３、５及び６のいずれか１項に記載の免疫学的測定方法。
【請求項９】
請求項２、３及び５〜８のいずれか一項に記載の免疫学的測定方法に用いる免疫学的測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルシフェリンの安定化方法及びルシフェラーゼとルシフェリンによる生物発光に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素免疫測定法による高感度測定系として、ルシフェラーゼとその発光基質であるルシフェリン反応による生物発光酵素免疫測定法が用いられている。ルシフェラーゼとルシフェリンの発光反応の利用法としては、例えば、ルシフェラーゼを標識物質とした微量物質の測定が挙げられる。特に生体内に存在するホルモン等の物質を免疫学的に測定する生物発光酵素免疫測定法では、高感度であることに加えて測定範囲も広いことから、従来の酵素免疫測定法やラジオイムノアッセイに代わるものとして注目されている。【０００３】
このルシフェラーゼと酵素基質となるルシフェリンは、由来となる生物種によって異なっており、同一の発光生物由来の組合せのみに発光が認められ、その発光強度が強いことから、高感度の測定が要求されるイムノアッセイに利用されている。【０００４】
しかし、ルシフェリンを溶液の状態で保存すると、基質としての機能が低下し、測定系の発光強度が低下する。【０００５】
そこで、アデノシンモノフォスフェート、アデノシンジフォスフェート、フェニルフォスフェート等のリン酸供与体をルシフェリン溶液に共存させることにより、ルシフェリン溶液中のルシフェリンを安定化させる方法が提案されている（特許文献１）。【０００６】
また、ルシフェリン溶液のｐＨをやや酸性に保持することにより、ルシフェリン溶液中のルシフェリンを安定化させる方法が提案されている（特許文献２）。【０００７】
さらに、ルシフェリン溶液中の、ホタルルシフェリンをシクロデキストリンに包接させて、ルシフェリン溶液中のホタルルシフェリンを安定化させる方法が提案されている（特許文献３）。【０００８】
一方、ウミホタルルシフェリンでは、ギ酸、プロピオン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸性溶質を含み、ｐＨを酸性に保持することによる、溶液中のウミホタルルシフェリンを安定化させる方法が提案されている（特許文献４）。【０００９】
しかしながら、いずれの処方でも、ルシフェリン溶液の状態で長期間保存することにより、ルシフェリンの基質としての機能が低下し、十分な安定性は得られていない。【００１０】
そこで、ルシフェリン溶液の状態で長期間保存しても、ルシフェリンの基質としての機能を低下させないルシフェリン溶液の組成の確立が期待されている。【００１１】
また、ルシフェラーゼによる生物発光反応は、時間とともにその発光強度が減衰するため、発光反応の初期に高い発光強度が得られていても、発光強度を測定する時点でその発光強度が減衰し、ルシフェラーゼの生物発光反応を指標とした測定の高感度化の妨げとなっている。【００１２】
そこで、拮抗的阻害剤であるＤ−ルシフェリン類似体およびピロリン酸を共存させることにより発光強度を維持することが認められたが、拮抗的阻害剤により発光強度自体が弱く、感度は低下する（特許文献５）。【００１３】
また、トリポリリン酸、メタリン酸、ヘキサメタリン酸、ピロリン酸等のポリリン酸化合物またはその塩およびジチオスレイトール、ジチオエリトルトール、β−メルカプトエタノール、２−メルカプトプロパノール、３−メルカプトプロパノール、２，３−ジチオプロパノール、グルタチオン等のスルフヒドリル化合物の共存下で生物発光反応を行うと、発光強度の減衰を抑制し、長時間にわたって高い発光強度を維持することが提案されている（特許文献６）。【００１４】
さらに、ピロリン酸および／またはピロリン酸塩の存在下で、ルシフェリンと甲虫ルシフェラーゼを反応させると、発光半減期が５分以上の発光を生じることが示されている（特許文献７）。【００１５】
しかしながら、これらの組成を添加しても、生物発光反応による発光強度は徐々に減衰している。また、試薬の調製後から測定までの時間が長いと、生物発光反応の初期の発光強度自体も低下する。【００１６】
そこで、試薬の調製後も発光強度の低下が生じず、ルシフェラーゼの生物発光反応における発光強度の減衰が抑制される発光試薬の新たな組成の開発が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開２０００−１６６５５０号公報
【特許文献２】特開２０００−２５３８９９号公報
【特許文献３】特開２０００−３１９２８０号公報
【特許文献４】特開平０８−１５４６９９号公報
【特許文献５】特開昭５５−１３８９３号公報
【特許文献６】特開平８−４７３９９号公報
【特許文献７】国際公開ＷＯ２００６／０１３８３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを安定化させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ルシフェラーゼの生物発光反応を利用した測定を行うときに用いる、基質であるルシフェリン溶液にボロン酸誘導体又はその塩を組み合わせることにより安定化できることを見出した。また、本発明者は、試薬の組成を見出し、本発明を完成させるに至った。本発明者は、上記新規知見に基づき、ルシフェラーゼの生物発光反応を利用した測定の際の試薬組成等、試行錯誤を重ねた末、本発明を完成させた。【００２０】
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
（１Ａ）ルシフェラーゼの基質であるルシフェリン溶液にボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、ルシフェリン溶液の安定化方法。
（２Ａ）前記ボロン酸誘導体又はその塩がほう酸、四ほう酸ナトリウム、および下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む、（１Ａ）に記載のルシフェリン溶液の安定化方法。【００２１】
【化１】
2017057672.tif 000002
【００２２】
式中、Ｒ１は、置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合または三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。ＸはＮ−Ｒ７（窒素（Ｎ）にＲ７が結合）、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）のいずれかひとつを示す。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、同一又は異なって、Ｈ（水素）、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、（tert−ブトキシカルボニル）アミノ基、または置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合もしくは三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。
（３Ａ）前記ルシフェリンがホタルルシフェリンである、（１Ａ）または（２Ａ）に記載のルシフェリン溶液の安定化方法。
（４Ａ）標識酵素としてルシフェラーゼを用い、ルシフェリンを基質として生物発光反応を測定する免疫学的測定方法において、ボロン酸誘導体又はその塩を共存させてルシフェリン溶液を安定化させる免疫学的測定方法。
（５Ａ）前記ボロン酸誘導体又はその塩がほう酸、四ほう酸ナトリウム、および下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む、（４Ａ）に記載の免疫学的測定方法。【００２３】
【化２】
2017057672.tif 000003
【００２４】
式中、Ｒ１は、置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合または三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。ＸはＮ−Ｒ７（窒素（Ｎ）にＲ７が結合）、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）のいずれかひとつを示す。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、同一又は異なって、Ｈ（水素）、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、（tert−ブトキシカルボニル）アミノ基、または置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合もしくは三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。
（６Ａ）前記ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼであり、前記ルシフェリンがホタルルシフェリンである、（４Ａ）または（５Ａ）に記載の免疫学的測定方法。
（７Ａ）（４Ａ）〜（６Ａ）のいずれかに記載の免疫学的測定方法に用いる免疫学的測定試薬。
（１Ｂ）ルシフェリンを基質としてルシフェラーゼの生物発光反応を行うときに、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、生物発光強度の減衰・低下の抑制方法。
（２Ｂ）前記ボロン酸誘導体又はその塩が下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む、（１Ｂ）に記載の生物発光強度の減衰・低下の抑制方法。【００２５】
【化３】
2017057672.tif 000004
【００２６】
式中、Ｒ１は、置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合または三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。ＸはＮ−Ｒ７（窒素（Ｎ）にＲ７が結合）、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）のいずれかひとつを示す。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、同一又は異なって、Ｈ（水素）、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、（tert−ブトキシカルボニル）アミノ基、または置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合もしくは三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。
（３Ｂ）前記ルシフェリンがホタルルシフェリンである、（１Ｂ）または（２Ｂ）に記載の生物発光強度の減衰・低下の抑制方法。
（４Ｂ）標識物としてルシフェラーゼを用い、ルシフェリンを基質として生物発光反応を測定する免疫学的測定方法において、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩を共存させて生物発光強度の減衰・低下を抑制させる免疫学的測定方法。
（５Ｂ）前記ボロン酸誘導体又はその塩が下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩からなる群より選ばれる少なくとも一種を含む、（４Ｂ）に記載の免疫学的測定方法。【００２７】
【化４】
2017057672.tif 000005
【００２８】
式中、Ｒ１は、置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合または三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。ＸはＮ−Ｒ７（窒素（Ｎ）にＲ７が結合）、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）のいずれかひとつを示す。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、同一又は異なって、Ｈ（水素）、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、（tert−ブトキシカルボニル）アミノ基、または置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合もしくは三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。
（６Ｂ）前記ルシフェリンがホタルシフェリンである（４Ｂ）または（５Ｂ）に記載の免疫学的測定方法。
（７Ｂ）前記ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼであり、前記ルシフェリンがホタルルシフェリンである、（４Ｂ）から（６Ｂ）に記載の免疫学的測定方法。
（８Ｂ）（４Ｂ）〜（７Ｂ）のいずれかに記載の免疫学的測定方法に用いる免疫学的測定試薬。
【発明の効果】
【００２９】
本発明は、上記方法によれば、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリン溶液の安定化が得られることとなり、ルシフェラーゼの酵素反応に基づく測定系が、長期間にわたって安定な高感度の測定をすることが出来る。また、本発明の好ましい実施形態においては、ルシフェリンを基質としてルシフェラーゼの生物発光反応の際に、ボロン酸誘導体又はその塩にさらにピロリン酸塩を組み合わせることにより、生物発光強度の減衰・低下を抑制することができる。【００３０】
そして、この測定により得られる結果についても、信頼性が高いものとなることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】フェニルボロン酸を含まないホタルルシフェリン溶液（対照）を−３０℃で一週間保存後のＨＰＬＣ分析結果
【図２】フェニルボロン酸を含まないホタルルシフェリン溶液（対照）を３７℃で一週間保存後のＨＰＬＣ分析結果
【図３】２０ｍｍｏｌ／Ｌのフェニルボロン酸を含むホタルルシフェリン溶液を３７℃で一週間保存後のＨＰＬＣ分析結果
【図４】ピロリン酸塩および／またはブチルボロン酸を添加したときの発光強度の変化
【図５】Ｒ１および/またはＲ２にプロピルボロン酸を添加したときの発光強度の変化
【図６】発光反応中にプロピルボロン酸を添加したときの発光強度の変化
【図７】種々の濃度のプロピルボロン酸を添加したときの発光強度の変化
【図８】エチルボロン酸の有無による発光強度の変化
【図９】シクロペンチルボロン酸の有無による発光強度の変化
【図１０】フェニルボロン酸の有無による発光強度の変化
【図１１】２−クロロフェニルボロン酸の有無による発光強度の変化
【図１２】３−アミノフェニルボロン酸の有無による発光強度の変化
【図１３】４−ヒドロキシルフェニルボロン酸の有無による発光強度の変化
【図１４】４−カルボキシフェニルボロン酸の有無による発光強度の変化
【図１５】１，４−フェニレンジボロン酸の有無による発光強度の変化
【図１６】３−フリルボロン酸の有無による発光強度の変化
【図１７】（トリヒドロキシ）フェニルボロン酸の有無による発光強度の変化
【図１８】３−チオフェンボロン酸の有無による発光強度の変化
【図１９】２，５−チオフェンジイルビスボロン酸の有無による発光強度の変化
【図２０】トリヒドロキシフェニルボロン酸ナトリウムの有無による発光強度の変化
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
本発明において、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基とは、二重結合又は三重結合を（好ましくは１個又は２個、より好ましくは１個）有してもよく、炭素数が１〜１０であり、直鎖状、分枝鎖状又は環状の炭化水素基を示す。かかる二重結合又は三重結合を有してもよく、炭素数が１〜１０であり、直鎖状、分枝鎖状又は環状の炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、エチニル基、プロパ−２−イン−１−イル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
【００３３】
本発明において、二重結合を有してもよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基とは、二重結合を（好ましくは１個又は２個、より好ましくは１個）有してもよく、炭素数が１〜１０であり、直鎖状、分枝鎖状又は環状の炭化水素基を示す。かかる二重結合を有してもよく、炭素数が１〜１０であり、直鎖状、分枝鎖状又は環状の炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−ブテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
【００３４】
ハロゲンとしては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００３５】
本発明において、ルシフェリンとしては、ホタルルシフェリン、バクテリアルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン等種々のものを用いることができるが、ホタルルシフェリンが好ましい。
【００３６】
ボロン酸誘導体の塩としては、特に限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム等が挙げられ、ナトリウム塩等が好ましい。
【００３７】
本発明において、「置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合または三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基」とは、例えば、前述したＣ１〜Ｃ１０のアルキル基、ならびに置換基としてボロニル基、前述したハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有するＣ１〜Ｃ１０のアルキル基が挙げられる。本発明において、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル基が置換基を有する場合、その個数は特に限定されないが、例えば、１〜２個、好ましくは１個が挙げられる。
【００３８】
ルシフェリン溶液の安定化方法
第一の実施形態において、本発明は、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリン溶液にボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、ルシフェリン溶液の安定化方法を提供する。
【００３９】
当該実施形態において本発明は、ルシフェラーゼの酵素活性を基質であるルシフェリンを用いて測定するとき、調製したルシフェリン溶液を保存するとルシフェリンの機能が低下する現象を、ルシフェリン溶液にボロン酸誘導体又はその塩を共存させることにより抑制することに特徴がある。
【００４０】
本実施形態において本発明に用いられるボロン酸誘導体としては、ほう酸、四ほう酸ナトリウム、および下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩を選択することができる。これらは一種類で使用しても良く、また数種類を混合して使用しても良い。
【００４１】
【化５】
2017057672.tif 000006
【００４２】
上記式中、Ｒ１は、置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合または三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。ＸはＮ−Ｒ７（窒素（Ｎ）にＲ７が結合）、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）のいずれかひとつを示す。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、同一又は異なって、Ｈ（水素）、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、（tert−ブトキシカルボニル）アミノ基、または置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合もしくは三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。
本発明において、ボロン酸誘導体又はその塩として
【００４３】
【化６】
2017057672.tif 000007
【００４４】
を用いる場合、Ｒ１は、アルキル基が好ましい。
本発明において、ボロン酸誘導体又はその塩として
【００４５】
【化７】
2017057672.tif 000008
【００４６】
を用いる場合、Ｘは、Ｓ又はＯが好ましく、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、同一又は異なって、Ｈ、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、メチル基、または（tert−ブトキシカルボニル）アミノ基を示すことが好ましい。
【００４７】
ボロン酸誘導体又はその塩としては、ほう酸、四ほう酸ナトリウム、エチルボロン酸、プロピルボロン酸、ブチルボロン酸、ヘキシルボロン酸、１，４−フェニレンジボロン酸、トリヒドロキシフェニルボロン酸ナトリウム、３−チオフェンボロン酸、３−フリルボロン酸、２，５−チオフェンジイルビスボロン酸、フェニルボロン酸、４−フルオロフェニルボロン酸、４−クロロフェニルボロン酸、４−ブロモフェニルボロン酸、４−ヒドロキシフェニルボロン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、４−メチルフェニルボロン酸、３−(tert−ブトキシカルボニル)アミノフェニルボロン酸等が挙げられる。これらのボロン酸誘導体又はその塩は一種単独で、又は二種以上を組み合わせて用いることができる。
【００４８】
本実施形態において、ルシフェリン溶液におけるルシフェリン濃度は限定されないが、例えば、０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．１〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
【００４９】
また、ルシフェリン溶液におけるボロン酸誘導体又はその塩の濃度は、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
【００５０】
本発明においてルシフェリン溶液は、任意選択で、公知の安定化剤、発光増強剤等を添加することもできる。安定化剤としてはシクロデキストリン等を用いることができる。また発光増強剤としてはコエンザイムA、ピロリン酸、ジチオスレイトール、AMP等が挙げられる。
【００５１】
本実施形態において、ルシフェリン溶液は、安定剤としてシクロデキストリンをさらに含んでいてもよい。シクロデキストリンとしては、例えば、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、これらの誘導体等が挙げられる。より具体的には、例えば、メチル−α−シクロデキストリン、メチル−β−シクロデキストリン、メチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン等が含まれる。これらのシクロデキストリンは一種単独で、又は二種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５２】
シクロデキストリンを用いる場合、その配合量は特に限定されないが、ルシフェリン１モルに対し、シクロデキストリン１〜１００モルが好ましく、１〜２０モルがより好ましい。
【００５３】
本発明において、ルシフェリン溶液は、上記成分を水又は緩衝液に溶解することにより調製することができる。緩衝液としては、生化学用に一般的に用いられるものであれば特に限定はなく、例えば、りん酸緩衝液、りん酸クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリシン緩衝液、トリス緩衝液、Good's緩衝液等が挙げられる。
【００５４】
ルシフェリン溶液のｐＨは特に限定されないが、例えば、ｐＨ５．０〜７．２、好ましくはｐＨ５．５〜６．８等の範囲で適宜設定することができる。
【００５５】
本発明によれば、かかる構成をとることにより、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリン溶液を安定して保存することが可能となる。従って、ルシフェラーゼの酵素反応に基づく測定系が、長期間にわたって安定な高感度の測定をすることが出来る。
【００５６】
免疫学的測定方法１
本発明はまた、標識酵素としてルシフェラーゼを用い、ルシフェリンを基質として生物発光反応を測定する免疫学的測定方法において、ボロン酸誘導体又はその塩を共存させてルシフェリン溶液を安定化させる免疫学的測定方法を提供する。本実施形態においては、免疫学的測定方法に用いるルシフェリンとして、ルシフェリン及びボロン酸誘導体又はその塩を含む溶液を用いることを特徴とする。当該実施形態においては、免疫学的測定方法に用いるルシフェリン溶液にボロン酸誘導体又はその塩を共存させることに起因して、当該測定前のルシフェリン溶液の保存安定性が改善されており、そのため長期間にわたって安定な高感度の測定をすることが出来る。当該実施形態における、ルシフェリンの種類、ルシフェリン溶液、緩衝液、安定剤の組成等は上記「ルシフェリン溶液の安定化方法」と同様である。
【００５７】
また、本発明において、ルシフェラーゼとしては、ルシフェリンを基質として生物発光反応をするものであれば特に限定されない。典型的には、本発明において、ルシフェラーゼには、本発明の属する技術分野において用いられているものを広く使用することができ、野生型ルシフェラーゼだけでなく、遺伝子改変したもの、標識化したもの等の種々の誘導体も含まれる。また、本発明において、「ルシフェラーゼを用いる」とは、ルシフェラーゼタンパク質を用いる場合だけでなく、ルシフェラーゼ遺伝子を用いる（例えば、目的遺伝子の存在下でルシフェラーゼが発現するようプロモータの制御下にルシフェラーゼ遺伝子が配置されたベクターを用いる等）方法も包含する。本発明においてルシフェラーゼとしては種々生物由来のものを用いることができるが、ホタル由来のホタルルシフェラーゼ等が好ましい。
【００５８】
生物発光強度の減衰・低下の抑制方法
また、一実施形態において、本発明は、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩の共存下でルシフェリンを基質としてルシフェラーゼの生物発光反応を行う工程を含む、生物発光強度の減衰・低下の抑制方法を提供する。言い換えると、本発明は、ルシフェリンを基質としてルシフェラーゼの生物発光反応を行うときに、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩を共存させることを特徴とする、生物発光強度の減衰・低下の抑制方法を提供する。
【００５９】
免疫学的測定方法及び生物発光強度の減衰・低下の抑制方法の実施形態において、本発明に用いられるボロン酸誘導体又はその塩としては、例えば、下記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩を選択することができる。これらは一種類で使用しても良く、また数種類を混合して使用しても良い。
【００６０】
【化８】
2017057672.tif 000009
【００６１】
式中、Ｒ１は、置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合または三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。ＸはＮ−Ｒ７（窒素（Ｎ）にＲ７が結合）、酸素（Ｏ）及び硫黄（Ｓ）のいずれかひとつを示す。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、及びＲ７は、同一又は異なって、Ｈ（水素）、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基、チオール基、（tert−ブトキシカルボニル）アミノ基、または置換基としてボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、ニトロ基、アミノ基、スルホ基及びチオール基からなる群より選択される少なくとも一種を有してもよく、二重結合もしくは三重結合を含んでよいＣ１〜Ｃ１０のアルキル基を示す。本発明において、ボロン酸誘導体又はその塩としてＲ１−Ｂ（ＯＨ）２を用いる場合、Ｒ１は、アルキル基が好ましい。本発明において、上記式で表されるボロン酸誘導体又はその塩を用いる場合、Ｘは、Ｓ又はＯが好ましく、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、同一又は異なって、Ｈ、ボロニル基、ハロゲン基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、メチル基、または（tert−ブトキシカルボニル）アミノ基を示すことが好ましい。
【００６２】
ボロン酸誘導体又はその塩としては、エチルボロン酸、プロピルボロン酸、ブチルボロン酸、ヘキシルボロン酸、１，４−フェニレンジボロン酸、トリヒドロキシフェニルボロン酸ナトリウム、３−チオフェンボロン酸、３−フリルボロン酸、２，５−チオフェンジイルビスボロン酸、フェニルボロン酸、４−フルオロフェニルボロン酸、４−クロロフェニルボロン酸、４−ブロモフェニルボロン酸、４−ヒドロキシフェニルボロン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、４−メチルフェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、３−(tert−ブトキシカルボニル)アミノフェニルボロン酸等が挙げられる。これらのボロン酸誘導体又はその塩は一種単独で、又は二種以上を組み合わせて用いることができる。
【００６３】
本発明においては、ルシフェリンを基質としてルシフェラーゼの生物発光反応を生じさせる方法は特に限定されないが、例えば、被験サンプルに、ルシフェリン、ビオチン化ルシフェラーゼ、ビオチン化抗体、アビジンを添加してビオチン化抗体に特異的に結合する物質を定量測定する方法；被験サンプルに、ルシフェラーゼ、ルシフェリンを添加して被験サンプル中のATPの量、位置等を測定する方法；等が挙げられる。各測定方法は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応をピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩の共存下で生じさせる以外、自体公知の方法に基づき行うことができる。
典型的には、生物発光反応を用いた免疫学的測定方法は、以下の手順により行うことができる：
まず、担体固定化抗体（第一抗体）溶液に被験試料を添加する。次に、バッファを分離（洗浄）する。そしてルシフェラーゼ標識抗体（第二抗体）溶液を添加する。次に、バッファを分離（洗浄）する。そして基質を混合（ルシフェリン等）し、発光を測定する。
【００６４】
また、本実施形態において、反応系に添加する前のルシフェリン溶液におけるボロン酸誘導体又はその塩の濃度は、０．１〜３００ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌがさらに好ましい。また、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を生じさせている際のボロン酸誘導体又はその塩の濃度は、０．０５〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．２５〜２５ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．２５〜５ｍｍｏｌ／Ｌがさらに好ましい。
【００６５】
本実施形態においてピロリン酸塩としては、例えば、ピロリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸マグネシウム等が挙げられる。本実施形態において、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応の反応系中のピロリン酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば、０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌがより好ましい。
【００６６】
本実施形態においてルシフェリン溶液に配合するルシフェリン、ボロン酸誘導体又はその塩以外の成分の組成、ｐＨ、ルシフェラーゼの種類等は、「ルシフェリン溶液の安定化方法」と同様である。
【００６７】
本実施形態において、ルシフェリンを基質としたルシフェラーゼの生物発光反応の発光強度を、その測定中、長時間にわたって維持することが出来る。すなわち、生物発光反応を検出するときの測光するタイミングを発光反応のごく初期に設定しなくても十分な発光強度が得られることとなり、容易に高感度の測定が可能となる。
【００６８】
さらに、本発明を用いて作製したルシフェリン基質試薬は、調製した後も基質としての効果が低下することもなく安定であることから、安定した結果が求められる測定試薬の構成成分に用いることが可能となる。
【００６９】
すなわち、ルシフェリンを基質としたルシフェラーゼによる高感度の生物発光反応を利用した測定を行う際に、信頼性が高い測定結果が得られることが期待される。
【００７０】
免疫学的測定方法２
本発明はまた、標識物としてルシフェラーゼを用い、ルシフェリンを基質として生物発光反応を測定する免疫学的測定方法において、ピロリン酸塩およびボロン酸誘導体又はその塩を共存させて生物発光強度の減衰・低下を抑制させる免疫学的測定方法を提供する。当該実施形態においては、免疫学的測定方法に用いるルシフェリン溶液にピロリン酸塩及びボロン酸誘導体又はその塩を共存させることに起因して、免疫学的測定の際の、経時的な生物発光強度の減衰・低下を抑制することができる。当該実施形態における、ボロン酸誘導体の種類、濃度、ルシフェリンの種類、ルシフェリン溶液、緩衝液、安定剤の組成等は上記「生物発光強度の減衰・低下の抑制方法」と同様である。
【００７１】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７２】
実施例１
各種ボロン酸誘導体によるホタルルシフェリンの安定化
ホタルルシフェリン溶液に種々のボロン酸誘導体を溶解し、２５℃または３７℃で一定期間保存後にホタルルシフェラーゼの活性を測定し、ホタルルシフェリンの安定性を評価した。【００７３】
（１）試薬の調製
本実施例で用いたホタルルシフェラーゼ活性の至適ｐＨは、ｐＨ８．２〜８．３である。一方、基質であるホタルルシフェリンは弱酸性において安定である（特許文献２）。【００７４】
そこで、ホタルルシフェリンを含む溶液のｐＨを弱酸性とし、ホタルルシフェラーゼの活性を測定するときには至適ｐＨとなるように、二種類の測定試薬（Ｒ１およびＲ２）を調製し、ホタルルシフェラーゼの活性測定時にＲ１とＲ２を混合し、発光強度を測定した。【００７５】
各々の試薬の組成は、Ｒ１が３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ・２Ｎａ、および０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピロリン酸カリウム含有１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．４）、Ｒ２が０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ホタルルシフェリンおよび５ｍｍｏｌ／Ｌ  ボロン酸誘導体含有１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ６．５）とした。【００７６】
ボロン酸誘導体として、ほう酸、四ほう酸ナトリウム、エチルボロン酸、プロピルボロン酸、ブチルボロン酸、ヘキシルボロン酸、１，４−フェニレンジボロン酸、トリヒドロキシフェニルボロン酸ナトリウム、３−チオフェンボロン酸、３−フリルボロン酸、２，５−チオフェンジイルビスボロン酸、フェニルボロン酸、４−フルオロフェニルボロン酸、４−クロロフェニルボロン酸、４−ブロモフェニルボロン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、４−メチルフェニルボロン酸、３−（tert−ブトキシカルボニル)アミノフェニルボロン酸を用いた。水に難溶性なボロン酸誘導体は、有機溶媒（水溶性で難溶性ボロン酸誘導体を溶解できるもの）を適宜用いて溶解し、添加した。【００７７】
試薬を調製した後、Ｒ１は−３０℃で凍結保存し、Ｒ２は−３０℃、２５℃、および３７℃で７日間保存し、試験に用いた。【００７８】
（２）ルシフェラーゼ活性の測定
７日間保存後、凍結させたものは水浴で融解し、全ての試薬を３０℃で予備加温した。
ホタルルシエラーゼ溶液は、１×１０−１１ｍｏｌ／Ｌとなるように調製した。【００７９】
９６穴マイクロプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）の各ウエルに１０μＬのホタルルシフェラーゼ溶液をマニュアルで分注後、発光強度測定装置のＣｅｎｔｒｏＬＢ９６０（ベルトールド社）を用いてＲ１を５０μＬおよびＲ２を５０μＬ各々吐出し、４．５秒後から５秒間の発光強度を測定した。【００８０】
結果を表１、２、３、および４に示す。【００８１】
表１より、Ｒ２にボロン酸誘導体を添加しない組成（対照）の発光強度は、Ｒ２を−３０℃に保存したときの発光強度と比較すると、２５℃保存では７６％、３７℃保存では４５％に低下した。この発光強度の低下は、ホタルルシフェリンの分解産生物がホタルルシフェラーゼ活性を阻害したためと考えられる。【００８２】
一方、Ｒ２にほう酸を添加した場合、２５℃保存では８４％に、３７℃保存では５２％となり、発光強度の低下が抑制された。また、四ほう酸ナトリウムを添加した場合、各々２５℃保存では８３％に、３７℃保存では５５％となり、発光強度の低下が抑制された。これらより、ホウ酸および四ホウ酸ナトリウムがホタルルシフェリンの分解を抑制し、安定化したと考えられる。【００８３】
また、表２から４より、エチルボロン酸、プロピルボロン酸、ブチルボロン酸、ヘキシルボロン酸、１，４−フェニレンジボロン酸、トリヒドロキシフェニルボロン酸ナトリウム、３−チオフェンボロン酸、３−フリルボロン酸、２，５−チオフェンジイルビスボロン酸、フェニルボロン酸、４−フルオロフェニルボロン酸、４−クロロフェニルボロン酸、４−ブロモフェニルボロン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、４−メチルフェニルボロン酸、３−(tert−ブトキシカルボニル)アミノフェニルボロン酸をＲ２に添加した場合も、ホタルルシフェリンの分解を抑制し安定化することが明らかになった。【００８４】
すなわち、ホタルルシフェリンとボロン酸誘導体を共存させることにより、ホタルルシフェリンの機能の低下を抑制することができた。【００８５】
【表１】
2017057672.tif 000010
【００８６】
【表２】
2017057672.tif 000011
【００８７】
【表３】
2017057672.tif 000012
【００８８】
【表４】
2017057672.tif 000013
【００８９】
また、ヘキシルボロン酸、１,４−フェニレンジボロン酸、４−フルオロフェニルボロン酸、４−クロロフェニルボロン酸、４−ブロモフェニルボロン酸、４−メチルフェニルボロン酸、３−(tert−ブトキシカルボニル)アミノフェニルボロン酸等のボロン酸誘導体を５ｍｍｏｌ／Ｌ添加して使用すると、ホタルルシフェラーゼ活性の阻害が認められた。しかし、これらのボロン酸誘導体がホタルルシフェリンを安定化することは明らかであるので、５ｍｍｏｌ／Ｌ以下のホタルルシフェラーゼ活性を阻害しない濃度を添加して用いることが可能である。【００９０】
表２、３、および４の結果から、ボロン酸誘導体又はその塩の置換基の種類がホタルルシフェリンの安定化に影響し、また、ホタルルシフェラーゼ活性にも影響することが明らかになった。【００９１】
実施例２
ボロン酸誘導体の異性体によるホタルルシフェリンの安定化【００９２】
（１）試薬の調製
ボロン酸誘導体の異性体によるホタルルシフェリンの安定化に対する効果を検討した。
ボロン酸誘導体としてクロロフェニルボロン酸を用い、その異性体として、２−クロロフェニルボロン酸、３−クロロフェニルボロン酸、および４−クロロフェニルボロン酸を用いた。【００９３】
また、ボロン酸誘導体としてフリルボロン酸を用い、その異性体として、２−フリルボロン酸および３−フリルボロン酸を用いた。【００９４】
試薬の調製は、実施例１と同様に行った。なお、クロロフェニルボロン酸は、水に難溶性であるため、有機溶媒（水溶性でクロロフェニルボロン酸を溶解できるもの）を適宜用いて溶解し、添加した。【００９５】
（２）ルシフェラーゼ活性の測定
実施例１と同様に測定した結果を表５および６に示す。
−３０℃での発光強度を比較すると、クロロフェニルボロン酸は４位、３位、および２位の順で発光強度の低下が大きく、ホタルルシフェラーゼの活性を阻害した。一方、ホタルルシフェリンの安定化効果は、４位がよい傾向が認められた。しかし、その差は著しいものではないので、より高感度な測定を行うためには、ホタルルシフェラーゼ活性の阻害が小さい２−クロロフェニルボロン酸を用いることが適当である。【００９６】
また、フリルボロン酸では２位と３位の異性体で著しい差はないが、２−フリルボロン酸がホタルルシフェリンの安定化効果がやや高い結果であった。【００９７】
このように、置換基の種類だけでなく、置換基の位置もホタルルシフェリンの安定化にも影響することが明らかになった。【００９８】
【表５】
2017057672.tif 000014
【００９９】
【表６】
2017057672.tif 000015
【０１００】
実施例３
ホタルルシフェリンの安定化におけるボロン酸誘導体の濃度の影響（その１）
ボロン酸誘導体として、ブチルボロン酸およびフェニルボロン酸を用い、ボロン酸誘導体の濃度を０．２ｍｍｏｌ／Ｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ、および２０ｍｍｏｌ／Ｌとしてボロン酸誘導体の濃度の違いによる影響を検討した。【０１０１】
（１）試薬の調製
各々の試薬の組成は、Ｒ１が３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ・２Ｎａ、および０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピロリン酸カリウム含有１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）、Ｒ２が０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ホタルルシフェリンおよびボロン酸誘導体含有１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ６．５）とした。【０１０２】
（２）ルシフェラーゼ活性の測定
実施例１と同様に測定した結果を表７に示す。
ブチルボロン酸、フェニルボロン酸とも濃度に依存してホタルルシフェリンの安定化に対する効果の増強が認められた。【０１０３】
【表７】
2017057672.tif 000016
【０１０４】
なお、ボロン酸誘導体の濃度を２０ｍｍｏｌ／Ｌとしたときには、−３０℃保存のＲ２での発光強度が低く、ホタルルシフェラーゼの酵素活性を抑制した。【０１０５】
実施例４
ホタルルシフェリンの安定化におけるボロン酸誘導体の濃度の影響（その２）【０１０６】
（１）試薬の調製
ボロン酸誘導体として、ほう酸を用い、ほう酸の濃度を１ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ、および２５ｍｍｏｌ／Ｌとし、Ｔｒｉｓの濃度を２００ｍｍｏｌ／Ｌとした他は、実施例３と同様に調製した。【０１０７】
（２）ルシフェラーゼ活性の測定
実施例１と同様に測定した結果を表８に示す。
ほう酸濃度に依存してホタルルシフェリンの安定化に対する効果の増強が認められた。【０１０８】
【表８】
2017057672.tif 000017
【０１０９】
実施例５
ホタルルシフェリンの安定化におけるボロン酸誘導体の濃度の影響（その３）【０１１０】
（１）試薬の調製
ボロン酸誘導体として、プロピルボロン酸を用い、プロピルボロン酸の濃度を０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ、および１００ｍｍｏｌ／Ｌとし、Ｔｒｉｓの濃度を２００ｍｍｏｌ／Ｌとした他は、実施例３と同様に調製した。【０１１１】
（２）ルシフェラーゼ活性の測定
実施例１と同様に測定した結果を表９に示す。
ほう酸同様、プロピルボロン酸濃度に依存してホタルルシフェリンの安定化に対する効果の増強が認められた。【０１１２】
【表９】
2017057672.tif 000018
【０１１３】
実施例６
ボロン酸誘導体とシクロデキストリン誘導体を組み合わせたときのホタルルシフェリンの安定化
ボロン酸誘導体とホタルルシフェリンの安定化に効果が認められたシクロデキストリン誘導体（特許文献３）を組み合わせたときの効果の増大の有無を検討した。【０１１４】
（１）試薬の調製
ボロン酸誘導体として２ｍｍｏｌ／Ｌ  フェニルボロン酸、およびシクロデキストリン誘導体として２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ジメチル−β−シクロデキストリンを用いた他は、実施例１と同様に調製した。【０１１５】
（２）ルシフェラーゼ活性の測定
実施例１と同様に測定した結果を表１０に示す。
ボロン酸誘導体またはシクロデキストリン誘導体単独で使用したときに比較して、ボロン酸誘導体とシクロデキストリン誘導体を組み合わせて共存させたときの方が２５℃、３７℃ともにホタルルシフェラーゼの活性が高く、両者を組み合わせることによりホタルルシフェリンの安定化が高まることが認められた。【０１１６】
【表１０】
2017057672.tif 000019
【０１１７】
実施例７
ＨＰＬＣによるホタルルシフェリンの分解産生物の分析【０１１８】
（１）試薬の調製
フェニルボロン酸を含まないホタルルシフェリン溶液（対照）および２０ｍｍｏｌ／Ｌ  フェニルボロン酸を含むホタルルシフェリン溶液を調製した。なお、フェニルボロン酸の他は、実施例１と同様に調製した。【０１１９】
フェニルボロン酸を含まないホタルルシフェリン溶液（対照）は−３０℃および３７℃で保存した。また、フェニルボロン酸を含むホタルルシフェリン溶液は３７℃で７日間保存した。【０１２０】
（２）ＨＰＬＣによる分析
ＨＰＬＣとしてＷａｔｅｒｓ社のＵＰＬＣ、検出器はＰＤＡを用いて、３３０ｎｍで測定した。カラムは、ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＤ−ＲＨ（４．６×１５ｃｍ）（ダイセル化学工業社）を用いた。移動相はアセトニトリルと０．１％トリフルオロ酢酸を用いて、アセトニトリルを０〜３０分間で２５％から８５％のグラジエント分析（ＵＰＬＣパラメータ曲線増加８）を用いた。【０１２１】
ＨＰＬＣの分析結果を図１〜図３に示す。対照のホタルルシフェリン溶液の−３０℃保存（図１）および３７℃保存（図２）を比較すると、３７℃で保存することにより１４．５分、１９．４分、および２１．３分にピークの上昇が認められ、これらがホタルルシフェリンの主な分解産生物と考えられた。なお、１６．６分がホタルルシフェリンである。ホタルルシフェリンは３７℃７日間後９８％残存しており、２％が分解したと考えられた。【０１２２】
１４．５分のピークはＬ−ルシフェリン、１９．４分のピークはデヒドロルシフェリンと考えられ、２１．３分のピークは不明であった。これらのピークを分取し、ホタルルシフェラーゼ活性への影響を評価したところ、全てのピークがホタルルシフェラーゼ活性を阻害することを確認した。【０１２３】
一方、フェニルボロン酸を含むホタルルシフェリン溶液（図３）では、１４．５分のピークはやや上昇したが、１９．４分および２１．３分のピークの上昇が顕著に抑制された。【０１２４】
デヒドロルシフェリンはホタルルシフェラーゼに対する親和性が非常に大きいため、ホタルルシフェラーゼを強く阻害することが知られている。フェニルボロン酸は１９．４分（デヒドロルシフェリン）および２１．３分の分解産生を抑制することにより、ホタルルシフェリン溶液を安定化しているものと考えられた。【０１２５】
実施例８
ルシフェリン溶液にピロリン酸塩および／またはブチルボロン酸を共存させたときの発光の減衰・低下の抑制
ホタルルシフェリン溶液にピロリン酸塩および／またはブチルボロン酸を添加して、ルシフェラーゼによる発光反応を経時的に測定し、発光強度の減衰・低下の抑制効果を評価した。【０１２６】
（１）試薬の調製
本実施例のルシフェラーゼは遺伝子変異で得られたホタルルシフェラーゼを用いた。この酵素の至適ｐＨは、ｐＨ８．２〜８．３である。一方、基質であるホタルルシフェリンは弱酸性において安定である。【０１２７】
そこで、ホタルルシフェリンを含む溶液のｐＨを弱酸性とし、ホタルルシフェラーゼの活性測定時には至適ｐＨとなるように、二種類の測定試薬（Ｒ１およびＲ２）を調製し、ホタルルシフェラーゼの活性測定時にＲ１とＲ２を混合し、発光強度を測定した。【０１２８】
各々の試薬の組成は、Ｒ１が３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ・２Ｎａ含有１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）、Ｒ２が０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ホタルルシフェリン含有１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ６．５）とし（対照）、試験区にはさらに、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピロリン酸カリウムおよび／または２ｍｍｏｌ／Ｌ  ブチルボロン酸となるようにＲ２に添加した。【０１２９】
（２）ホタルルシフェラーゼ溶液
ホタルルシフェラーゼ溶液は、１×１０−１１ｍｏｌ／Ｌとなるように調製した。【０１３０】
（３）ルシフェラーゼの活性測定
９６穴マイクロプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）の各ウエルに１０μＬのホタルルシフェラーゼ溶液をマニュアルで分注した。また、全ての試薬を３０℃で予備加温した。発光強度測定装置ＣｅｎｔｒｏＬＢ９６０（ベルトールド社）を用いてＲ１を５０μＬおよびＲ２を５０μＬ各々吐出し、０秒後から３０秒後までの発光強度を連続的に測定した。【０１３１】
結果を図４に示すが、対照（ピロリン酸とブチルボロン酸を含まない場合）はフラッシュ発光であり、発光強度が速やかに低下した。これに対し、発光反応時にピロリン酸及びブチルボロン酸を共存させた場合は、ピロリン酸のみを共存させた場合に比べて、発光強度の減衰・低下が抑制された。【０１３２】
実施例９
プロピルボロン酸をＲ１またはＲ２に添加したときの発光の減衰・低下の抑制
ボロン酸誘導体としてプロピルボロン酸を用い、より高い効果を得るためには、いずれの試薬にボロン酸誘導体を添加した方が良いか、検討した。【０１３３】
（１）試薬の調製
各々の試薬の組成は、Ｒ１が３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ・２Ｎａ、および０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピロリン酸カリウム含有  １００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．４）、Ｒ２が０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ホタルルシフェリン含有  １０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ６．５）とし（対照）、試験区にはさらにＲ１またはＲ２に５ｍｍｏｌ／Ｌ  プロピルボロン酸を添加した。【０１３４】
（２）ルシフェラーゼの活性測定
実施例８と同様にホタルルシフェラーゼ溶液を調製し、測定を６０秒後まで行った他は実施例８と同様の測定を実施した。
結果を図５に示すが、Ｒ１にプロピルボロン酸を添加したとき、Ｒ２にプロピルボロン酸を添加したとき、およびＲ１とＲ２の両方にプロピルボロン酸を添加したときのいずれも同等で、プロピルボロン酸を添加しない対照に比べて発光強度の減衰・低下が小さくなった。従って、プロピルボロン酸はＲ１、Ｒ２のどちらか一方の試薬に添加してもよく、またはＲ１、Ｒ２の両方に添加してもよいことが分かった。【０１３５】
実施例１０
プロピルボロン酸を反応中に添加したときの発光の減衰低下の抑制
ボロン酸誘導体としてプロピルボロン酸を用い、発光反応中にボロン酸誘導体を添加したときの発光の減衰・低下の抑制効果を検討した。【０１３６】
（１）試薬の調製
各々の試薬の組成は、Ｒ１が３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ・２Ｎａ、および０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピロリン酸カリウム含有  １００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．４）、Ｒ２が０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ホタルルシフェリン含有１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ６．５）とし、さらにＲ３として７．５ｍｍｏｌ／Ｌ  プロピルボロン酸溶液を調製した。【０１３７】
（２）ルシフェラーゼの活性測定
実施例８と同様にホタルルシフェラーゼ溶液を調製した。
９６穴マイクロプレートの各ウエルに１０μＬのホタルルシフェラーゼ溶液をマニュアルで分注後、発光強度測定装置ＣｅｎｔｒｏＬＢ９６０を用いてＲ１を５０μＬおよびＲ２を５０μＬ各々吐出し、０秒後から１５秒後までの発光強度を連続的に測定し、その後Ｒ３を５０μＬ吐出し、さらに６０秒後まで連続的に測定した。対照のＲ３は精製水５０μＬとした。【０１３８】
結果を図６に示すが、ルシフェラーゼの発光反応中にプロピルボロン酸を添加しても、対照に比べて、発光強度の減衰・低下の抑制効果が改善された。従って、ボロン酸誘導体は構成試薬のどこに含まれてもよく、ルシフェラーゼ発光の反応時にボロン酸誘導体が存在すればよいことが分かった。【０１３９】
実施例１１
ボロン酸誘導体の濃度による影響
添加するボロン酸誘導体の濃度を変えてルシフェラーゼによる発光反応を経時的に測定し、ボロン酸誘導体の濃度の違いによる発光強度の減衰・低下の抑制効果を評価した。【０１４０】
（１）試薬の調製
各々の試薬の組成は、Ｒ１が３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ・２Ｎａ含有１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．４）、Ｒ２が０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ホタルルシフェリン、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピロリン酸カリウム含有１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ６．５）とし、さらに、Ｒ２にプロピルボロン酸が０、０．５、１、５、１０、２５、５０、および１００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。【０１４１】
（２）ルシフェラーゼの活性測定
実施例８と同様にホタルルシフェラーゼ溶液を調製し、実施例９と同様の測定を実施した。
結果を図７に示すが、プロピルボロン酸を何れの濃度で添加しても、発光強度の減衰・低下の抑制が認められた。またプロピルボロン酸濃度を５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上添加すると発光強度は低下するが、長時間にわたり発光強度を維持することができることが分かった。【０１４２】
実施例１２
種々のボロン酸誘導体の効果
ボロン酸誘導体として、エチルボロン酸、シクロペンチルボロン酸、フェニルボロン酸、２−クロロフェニルボロン酸、３−アミノフェニルボロン酸、４−ヒドロキシフェニルボロン酸、４−カルボキシフェニルボロン酸、１，４−フェニレンジボロン酸、３−フリルボロン酸、（トリヒドロキシ）フェニルボロン酸、３−チオフェンボロン酸、および２，５−チオフェンジイルビスボロン酸を用い、発光強度の減衰・低下の抑制効果を評価した。【０１４３】
（１）試薬の調製
各々の試薬の組成は、Ｒ１が３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＴＰ・２Ｎａ、および０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ピロリン酸含有１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．４）、Ｒ２が０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ホタルルシフェリン含有１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＡＤＡ緩衝液（ｐＨ６．５）とし（対照）、試験区にはさらに、ボロン酸誘導体をＲ２に１〜５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加した。【０１４４】
（２）ルシフェラーゼの活性測定
実施例８と同様にホタルルシフェラーゼ溶液を調製し、実施例９と同様の測定を実施した。
結果を図８〜図１９に示すが、何れのボロン酸誘導体を用いても、発光強度の減衰・低下が抑制されることが分かった。【０１４５】
なお、実施例１２においてボロン酸誘導体として２，５−チオフェンジイルビスボロン酸を添加したときの発光開始５５〜６０秒間の積算値を表１に示すが、発光強度の積算値が対照に比べて１．４倍であった。従って、ルシフェラーゼによる発光反応の場にボロン酸誘導体を共存させることにより、発光強度の減衰・低下が抑制されるので、高感度に発光強度を測定することができることが分かった。【０１４６】
【表１１】
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【０１４７】
発光強度の減衰・低下抑制効果の長時間での評価
ボロン酸誘導体としてトリヒドロキシフェニルボロン酸ナトリウムを１０ｍｍｏｌ／Ｌで使用し、ＡＴＰ濃度を２ｍｍｏｌ／Ｌとし、発光強度の測定時間を６０分とする以外、実施例８と同様にして、蛍光強度減衰・低下に対するピロリン酸カリウム（ＰＰｉ）及びボロン酸誘導体の影響を評価した。具体的には、マイクロプレートに検体を分注後、Ｒ１、Ｒ２をルミノメーターＣｅｎｔｒｏ  ＬＢ９６０で添加し、添加２分後から２分間隔で６０分までの発光強度を測定した。結果を図２０に示す。図２０に示すように、ピロリン酸とボロン酸誘導体を含まない場合（対照）はフラッシュ発光であり、発光強度は急激に減衰低下し２分以内に定常状態になった。ピロリン酸が存在すると、発光の減衰は緩やかではあるが、１５〜２０分で減衰し、定常状態になる。ピロリン酸とボロン酸誘導体が存在すると６０分後も強い発光強度を測定することができた。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明は、ボロン酸誘導体又はその塩をルシフェリン溶液に共存させることにより、ルシフェリン溶液の保存安定性を高める方法である。ルシフェリン溶液は分解産生物を生じ、このためルシフェラーゼの発光強度が経時的に低下する。それゆえ、ルシフェラーゼの活性を指標とした高感度な測定系を構築するとき、発光強度が経時的に低下するため、安定した値を得ることができない。本発明により、より安定なルシフェリン溶液を提供することができるので、より長期間にわたり安定に測定することができる。また、一実施形態において、本発明は、ボロン酸誘導体又はその塩をルシフェリン溶液に共存させることにより、ピロリン酸塩による発光反応の減衰・低下の抑制効果をさらに高めることを可能とする方法である。本発明により、ルシフェラーゼの発光反応の発光強度が安定することにより、高感度で安定した測定結果を得ることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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