(57)【要約】  本発明は、グリコシダーゼＡＯＢＧＬ１および／またはＡＯＢＧＬ３またはその変異体と、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を反応させて、前記β１，２−グルコシド結合を切断する工程を含む、ステビオール配糖体および／またはステビオールの生産方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を反応させて、前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を切断する工程を含む、分岐のあるβ１，２−グルコシド結合を有さないステビオール配糖体の生産方法。
（ａ）配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質が、さらに、分泌シグナルペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分泌シグナルペプチドが、配列番号２８、３０、３２、３４および３６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体が、レバウジオシドA、レバウジオシドB、レバウジオシドD、レバウジオシドE、ステビオシド及びステビオールビオシドから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を有さないステビオール配糖体が、ルブソシド、レバウジオシドＡおよびステビオールノモシドから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を生成する宿主に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を有さないステビオール配糖体の生産方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３または４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項７】
前記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号２７、２９、３１、３３および３５のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記形質転換体が、形質転換麹菌、形質転換酵母または形質転換植物である、請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体と接触させて、前記β１，２−グルコシド結合を切断する工程を含む、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を有さないステビオール配糖体の生産方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３または４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項１２】
前記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが配列番号２７、２９、３１、３３および３５のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記形質転換細胞が、形質転換麹菌、形質転換細菌または形質転換酵母である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体が、レバウジオシドD、レバウジオシドE、ステビオシド及びステビオールビオシドから選択される、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を有さないステビオール配糖体が、ルブソシド、レバウジオシドＡ、ステビオシドおよびステビオールノモシドから選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、（ｄ）〜（ｆ）からなる群から選択されるタンパク質と、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を反応させる工程を含む、レバウジオシドＢおよびステビオールの少なくとも１つを製造する方法。
（ａ）配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号７または８のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｅ）配列番号７または８のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および／またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号７または８のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および／またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質
【請求項１９】
前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体が、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、ステビオシド、ルブソシド、ステビオールモノシドおよびステビオールモノグルコシルエステルから選択される１つ以上のステビオール配糖体である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ステビオール配糖体およびステビオールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キク科ステビア(Stevia rebaudiana)の葉にはジテルペノイドの一種であるステビオール(Steviol)とよばれる二次代謝産物が含まれており、ステビオールに糖が付加したステビオール配糖体の中には砂糖の約300倍もの甘味を呈するものがあり、それらはカロリーレスの甘味料として食品産業に利用されている。肥満が深刻な社会問題として国際的に発展しており、健康増進および医療費削減の観点からもカロリーレスの甘味料の要望は日々大きくなっている。現在では人工的に合成されたアミノ酸誘導体のアスパルテーム(Aspartame)やアセスルファムカリウム(Acesulfame Potassium)が人工甘味料として利用されているが、ステビオール配糖体のように天然に存在するカロリーレス甘味料がより安心で消費者理解（Public Acceptance）が得られやすいと期待される。【０００３】
ステビオール配糖体のうちステビオシドは、ステビオールに3つのグルコースが付加した化合物で、一般的なステビアの葉にもっとも多く含まれている。ステビオシドは、ショ糖のおよそ300倍の甘味度を有するが若干の苦味を呈する。ステビオール配糖体のレバウジオシドAは、ステビオールに4つのグルコースが付加された化合物で、ショ糖のおよそ400倍の甘味度を有する。ステビオシドとレバウジオシドAがステビアの甘味の中心的な物質である。また、ステビオールにグルコースが5つ付加したレバウジオシドD、グルコースが6つ付加したレバウジオシドMといった配糖体も知られている。また、甜茶には、ステビオールの13位と19位にそれぞれグルコースが1つずつ付加されたルブソシドが含まれており、これが甜茶の主な甘味成分であることが知られている。これら以外に、反応中間体と思われる配糖体や糖の種類の違う類縁体の存在が知られている（図１）。
一方、ステビオールについては、認知機能の改善効果などが知られている。【０００４】
ステビオール配糖体のうち、特定のグリコシド結合にのみ作用する酵素を利用することができれば、特定の配糖体を生産したり、不要な配糖体を除去したりすることが可能になり、ステビア抽出物の味質の改善や特定のステビオール配糖体の精製が容易になるなどのメリットが大きい。【０００５】
ステビオール配糖体を加水分解する酵素活性については、いくつかの生物種において報告されている。その中でも、アスペルギルス属糸状菌がステビオール配糖体加水分解酵素を生成することに関して、生醤油中には、ステビオシドをルブソシドに加水分解する活性があること（非特許文献１）、Pectinase酵素剤やHesperidinase酵素剤、Takadiastase酵素剤中に、ステビオシドをステビオールに加水分解する活性があることが報告されている（非特許文献２-４）。また、アスペルギルス属糸状菌由来のペクチナーゼ酵素剤とカタツムリ(Helix pomatia)由来の酵素剤を組み合わせて使用することで、ステビオシドからステビオールを製造する方法が報告されている（特許文献１）。Aspergillus aculeatus 由来酵素剤  Viscozyme Ｌ（novozyme）には、ステビオシド→ルブソシド→ステビオールモノグリコシルエステルに加水分解する活性があることが記載されている（非特許文献５）。また、Aspergillus aculeatusの個体培養抽出物にステビオシドをステビオールに変換する活性があることが記載されている（非特許文献６）。【０００６】
また、麹菌のAO090009000356遺伝子にコードされるグリコシドヒドロラーゼ（GH）3ファミリーのβ−グルコシダーゼは、β-グルコシド結合を有する二糖類を加水分解するとの報告がある（非特許文献７）。具体的には、β−1,3結合を有するラミナリビオース、β−1,6結合を有するβ−ゲンチオビオース、β−1,4結合を有するセロビオース、β−1,2結合を有するソホロースの順に加水分解の特異性が高い。しかし、ステビオール配糖体をはじめとするテルペン配糖体を加水分解する活性があるかどうかは報告されていない。
それ以外の生物でも、ステビオール配糖体を加水分解する活性を有することが報告されている。例えば、クラビバクター属細菌が、ルブソシドの１９位グルコシルエステル結合を分解するが１３位グルコシド結合は分解しない酵素を有することが開示されている（特許文献２）。また、Flavobacterium johnsonae由来のβ-グルコシダーゼに、ステビオール配糖体を分解する活性（１３位β-グルコシド結合と１９位グルコシルエステル結合を加水分解する活性）があることが報告されている。
しかしながら、これらはいずれもステビオール配糖体を加水分解する活性を見出してはいるもののその活性を担う遺伝子については特定されていない。
さらに、麹菌には、β-グルコシダーゼ様活性を有するＧＨ３ファミリー酵素やＧＨ５ファミリー酵素をコードすると考えられる遺伝子が多数存在しており、酵素活性が検出できても、どの遺伝子がその活性を担っているかを特定するのは容易ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2013-516963
【特許文献２】特開平10-276775
【特許文献３】特開平10-276775
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日本食品工業学会誌  第37巻  第5号  369-374（1990）
【非特許文献２】Phytochemistry, 6, 1107 (1967)
【非特許文献３】薬誌, 95, 1507 (1975)
【非特許文献４】日化誌, 1981, 726 (1981)
【非特許文献５】J. Agric. Food Chem., 60, 6210-6216(2012)
【非特許文献６】Wei Sheng Wu Xue Bao, 54(1), 62-68(2014)
【非特許文献７】Biochim Biophys Acta., 1764  972-978 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような状況の下、ステビオール配糖体およびステビオールの新たな生産方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＡＯＢＧＬ１遺伝子にコードされる麹菌由来のグリコシドヒドロラーゼホモログタンパク質が、ステビオール配糖体を加水分解する活性を有することを見出した。すなわち、本タンパク質はステビオール配糖体が有する分岐のないβ-1，2結合を特異的に切断する活性を有していることを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、麹菌由来のＡＯＢＧＬ３遺伝子にコードされる別のグリコシダーゼホモログタンパク質を併せて発現させることで、ステビオール配糖体および／またはステビオールを生成することができ、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を反応させて、前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を切断する工程を含む、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を有さないステビオール配糖体の生産方法。
（ａ）配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質
［２］
前記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質が、さらに、分泌シグナルペプチドを含む、前記［１］に記載の方法。
［３］
前記分泌シグナルペプチドが、配列番号２８、３０、３２、３４および３６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、前記［１］に記載の方法。
［４］
前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体が、レバウジオシドA、レバウジオシドB、レバウジオシドD、レバウジオシドE、ステビオシド及びステビオールビオシドから選択される、前記［３］に記載の方法。
［５］
前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を有さないステビオール配糖体が、ルブソシド、レバウジオシドＡおよびステビオールノモシドから選択される、前記［４］に記載の方法。
［６］
分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を生成する宿主に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換体を培養することを含む、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を有さないステビオール配糖体の生産方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３または４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
［７］
前記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド含む、前記［６］に記載の方法。
［８］
前記分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが、配列番号２７、２９、３１、３３および３５のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、前記［７］に記載の方法。
［９］
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記［６］〜［８］のいずれか一つに記載の方法。
［１０］
前記形質転換体が、形質転換麹菌、形質転換酵母または形質転換植物である、前記［６］〜［９］のいずれか一つに記載の方法。
［１１］
宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体と接触させて、前記β１，２−グルコシド結合を切断する工程を含む、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を有さないステビオール配糖体の生産方法。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３または４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
［１２］
前記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド含む、前記［１１］に記載の方法。
［１３］
前記分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが配列番号２７、２９、３１、３３および３５のいずれかに記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、前記［１２］に記載の方法。
［１４］
前記ポリヌクレオチドが、発現ベクターに挿入されたものである、前記［１１］〜［１３］のいずれか一つに記載の方法。
［１５］
前記形質転換細胞が、形質転換麹菌、形質転換細菌または形質転換酵母である、前記［１１］〜［１４］のいずれか一つに記載の方法。
［１６］
前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体が、レバウジオシドD、レバウジオシドE、ステビオシド及びステビオールビオシドから選択される、前記［１１］〜［１５］のいずれか一つに記載の方法。
［１７］
前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を有さないステビオール配糖体が、ルブソシド、レバウジオシドＡ、ステビオシドおよびステビオールノモシドから選択される、前記［１６］に記載の方法。
［１８］
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質と、（ｄ）〜（ｆ）からなる群から選択されるタンパク質と、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を反応させる工程を含む、レバウジオシドＢおよびステビオールの少なくとも１つを製造する方法。
（ａ）配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号７または８のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｅ）配列番号７または８のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および／またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号７または８のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および／またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質
［１９］
前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体が、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、ステビオシド、ルブソシド、ステビオールモノシドおよびステビオールモノグルコシルエステルから選択される１つ以上のステビオール配糖体である、前記［１８］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法により、ステビオールおよびステビオール配糖体の新たな生産方法が提供される。本発明の方法により、ステビオールを製造することができる。また、ステビオールの13位および/または19位に分岐三糖（β１，２、β１，３）が付加されたステビオール配糖体を効率よく抽出および精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】各種ステビオール配糖体の構造とステビアでの生合成経路
【図２】分泌シグナルのアミノ酸配列および塩基配列を示す図：（Ａ）ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１（ＹＰＬ１８７Ｗ）；（Ｂ）ＰＨＯ５（ＹＢＲ０９３Ｃ）；（Ｃ）ＳＵＣ２（ＹＩＬ１６２Ｗ）
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１５年１０ 月３０日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１５−２１４２５５号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１５】
「ＡＯＢＧＬ１」は、麹菌由来のβ−グルコシダーゼであり、そのｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列、アミノ酸配列、および成熟タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、および配列番号４に示される。
「ＡＯＢＧＬ３」は、麹菌由来のβ−グルコシダーゼであり、そのｃＤＮＡ配列、ゲノムＤＮＡ配列、アミノ酸配列、および成熟タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８に示される。
【００１６】
１．ステビオール配糖体の生産方法
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択されるタンパク質（以下、「本発明のタンパク質」という）と、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を反応させて、前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を切断する工程を含む、ステビオール配糖体の生産方法を提供する。
【００１７】
（ａ）配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつスステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質
【００１８】
上記（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質は、代表的には、配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質の変異体であるが、例えば、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２”、”Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７”、”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１０，６４８７（１９８２）”、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）”、”Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）”、”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１３，４４３１（１９８５）”、”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、人為的に取得することができるものも含まれる。
【００１９】
「配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質」としては、配列番号３または４のアミノ酸配列において、例えば、１〜７７個、１〜７５個、１〜７０個、１〜６５個、１〜６０個、１〜５５個、１〜５０個、１〜４９個、１〜４８個、１〜４７個、１〜４６個、１〜４５個、１〜４４個、１〜４３個、１〜４２個、１〜４１個、１〜４０個、１〜３９個、１〜３８個、１〜３７個、１〜３６個、１〜３５個、１〜３４個、１〜３３個、１〜３２個、１〜３１個、１〜３０個、１〜２９個、１〜２８個、１〜２７個、１〜２６個、１〜２５個、１〜２４個、１〜２３個、１〜２２個、１〜２１個、１〜２０個、１〜１９個、１〜１８個、１〜１７個、１〜１６個、１〜１５個、１〜１４個、１〜１３個、１〜１２個、１〜１１個、１〜１０個、１〜９個（１〜数個）、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。
【００２０】
また、このようなタンパク質としては、配列番号３または４のアミノ酸配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質が挙げられる。上記配列同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
【００２１】
ここで、「ステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性」とは、ステビオール配糖体（アグリコンであるステビオールにグルコースが結合した配糖体）において、ステビオール配糖体中の２つのグルコース残基間に形成された分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性をいう。ここで、「分岐のないβ１，２グルコシド結合」とは、β1，2グルコシド結合をしているグルコース残基がさらにβ1，3グルコシド結合のような分岐構造を持たないβ1，2グルコシド結合をいう（下記表１では「Glc-β1,2-Glu」）。反対に、β1，2グルコシド結合をしているグルコース残基がさらにβ1，3グルコシド結合のような分岐構造を持つ場合、そのβ1，2グルコシド結合は分岐のあるβ1，2グルコシド結合といえる（下記表１では「Glc-β1,2-Glu（β1,3-Glu）」）。
【００２２】
ステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性は、本発明のタンパク質と、たとえばステビオシドなどの、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を反応させて、得られた反応生成物を精製し、精製したものを液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＬＣ）等の公知の手法により分析することで確認することができる。
また、β-グルコシド結合を加水分解する活性は、本発明のタンパク質を発現するよう遺伝子組み換えした形質転換体をＸ−β−Ｇｌｃを含む培地で培養し、菌体およびその周りが青く染まるかどうかを確認することにより検出することができる。同培地中でＸ−β−Ｇｌｃが加水分解されると菌体およびその周りが青く染まるので、青色を呈する場合にはβ-グルコシド結合を加水分解する活性を有するといえる。
あるいは、p-ニトロフェニルβ-D-グルコピラノシドを基質として用いて、加水分解により生じるp-ニトロフェノール量を吸光度（A405）で測定することによりβ-グルコシド結合を加水分解する活性を測定することができる。
【００２３】
「配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加された」とは、同一配列中の任意かつ１〜７７個のアミノ酸配列中の位置において、１〜７７個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
【００２４】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
【００２５】
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
【００２６】
本発明のいくつかの態様のタンパク質は、分泌シグナルペプチドが切断されており、分泌シグナルペプチドを含まない。本発明の別のいくつかのタンパク質は、分泌シグナルペプチドが切断されずに残り、このため、さらに、分泌シグナルペプチドを含んでもよい。分泌シグナルペプチドを含む場合、好ましくは、分泌シグナルペプチドは、本発明のタンパク質のＮ末端に含まれる。分泌シグナルペプチドとは、当該分泌シグナルペプチドに結合されたタンパク質を、細胞外へ分泌させる役割を担うペプチド領域を意味する。このような分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野において周知であり、報告されている。
【００２７】
本発明のタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を適切な宿主細胞内で発現させることなどにより得ることができるが、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、ＡＡＰＰＴｅｃ  ＬＬＣ製、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．製、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００２８】
本発明において、「ステビオール配糖体」とは、アグリコンであるステビオールにグルコースが結合した配糖体である。ステビオールおよびステビオール配糖体の例は、下記一般式（I）で示される。
【化１】
2017073717.tif 000002
【００２９】
【表１】
2017073717.tif 000003
【００３０】
尚、上記において、「Glc」はグルコースを示し、「Glc-β1,2-Glu」は、β１，２−グルコシド結合を含むことを示す。「Glc-β1,2-Glu（β1,3-Glu）」は、β１，２−グルコシド結合とβ１，3−グルコシド結合を含むことを示す。
【００３１】
ここで「分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体」とは、上記一般式（I）のＲ１およびＲ２基の少なくとも１つが枝分かれのない構造を有するステビオール配糖体を意味する。例えば、レバウジオシドD、レバウジオシドE、ステビオシド及びステビオールビオシドから選択されるステビオール配糖体である。
【００３２】
本発明に係るステビオール配糖体の生産方法によって、分岐のないβ１，２−グルコシド結合が切断され、別の種類のステビオール配糖体が得られる。
本方法で得られるステビオール配糖体（以下、「本発明のステビオール配糖体」という）は、出発物質の「分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体」に応じて変わる。以下に、その例を示す。
【００３３】
【表２】
2017073717.tif 000004
【００３４】
本発明のステビオール配糖体の生産方法において、出発物質となる分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体は、ステビアや甜茶（Rubus suauissimus）から適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra （High） Performance Liquid chromatography：UPLC) 等の公知の方法によって抽出し、精製することによって入手することができる。あるいは、出発物質となる分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体は、市販のものでもよい。
本発明のいくつかの態様では、ステビオシド、レバウジオシドD及びステビオールビオシドから選択されるステビオール配糖体の分岐のないβ１，２−グルコシド結合が切断され、ルブソシド、レバウジオシドAおよびステビオールモノシドから選択されるステビオール配糖体が得られる。また、別の態様では、レバウジオシドEの分岐のないβ１，２−グルコシド結合が切断され、ルブソシドが得られる。
【００３５】
本発明に係るステビオール配糖体の生産方法は、本発明のタンパク質と、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を反応させて、前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を切断する工程を含む。本発明の方法は、さらに、前記工程で生成したステビオール配糖体を精製する工程を含んでいてもよい。
前記工程で生成したテビオール配糖体は、適切な溶媒（水等の水性溶媒、またはアルコール、エーテル、アセトン等の有機溶媒）による抽出、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＴＯＦ−ＭＳ）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ｕｌｔｒａ  （Ｈｉｇｈ）  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＵＰＬＣ）等の公知の方法によって精製することができる。
【００３６】
また、本発明のタンパク質を他の活性を有するタンパク質と組み合わせることにより、別のステビオール配糖体を製造することができる。
そこで、別の実施形態において、本発明のタンパク質と、以下の（ｄ）〜（ｆ）からなる群から選択されるタンパク質（以下、「第２の活性タンパク質」という）と、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を反応させる工程を含む、レバウジオシドＢおよびステビオールの少なくとも１つを製造する方法が提供される。
（ｄ）配列番号７または８のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｅ）配列番号７または８のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および／またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質；
（ｆ）配列番号７または８のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体のモノグルコシド結合および／またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性を有するタンパク質
【００３７】
この方法において、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、ステビオシド、ルブソシド、ステビオールモノシドおよびステビオールモノグルコシルエステルから選択される１つ以上のステビオール配糖体であってもよい。
【００３８】
ここで、ステビオール配糖体のモノグルコシド結合および／またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性とは、アグリコンであるステビオールにグルコースが結合した配糖体であるステビオール配糖体において、ステビオール配糖体中のモノグルコシド結合および／またはモノグルコシルエステル結合を意味する。ある実施形態において、切断される結合は１３位のモノグルコシド結合であるが、これに限定されるものではない。別の実施形態では切断される結合は１９位のモノグルコシルエステル結合であるが、これに限定されるものではない。
【００３９】
ステビオール配糖体のモノグルコシド結合および／またはモノグルコシルエステル結合を切断する活性は、第２の活性タンパク質と、たとえばモノグルコシド結合もしくはモノグルコシルエステル結合またはその両方の結合を有するステビオール配糖体（例えばルブソシド）を反応させて、得られた反応生成物を精製し、精製したものを液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＬＣ）等の公知の手法により分析することで確認することができる。
【００４０】
「配列番号７または８のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加された」とは、同一配列中の任意かつ１〜７７個のアミノ酸配列中の位置において、１〜７７個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。
相互に置換可能なアミノ酸残基の例は既に述べたとおりである。
【００４１】
第２の活性タンパク質は、分泌シグナルペプチドを含んでいなくとも、分泌シグナルペプチドを含んでもよい。分泌シグナルペプチドを含む場合、好ましくは、分泌シグナルペプチドは、本発明のタンパク質のＮ末端に含まれる。分泌シグナルペプチドとは、当該分泌シグナルペプチドに結合されたタンパク質を、細胞外へ分泌させる役割を担うペプチド領域を意味する。このような分泌シグナルペプチドのアミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野において周知であり、報告されている。
【００４２】
第２の活性タンパク質は、これをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号５または６の塩基配列からなるポリヌクレオチド）を適切な宿主細胞内で発現させることなどにより得ることができるが、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、ＡＡＰＰＴｅｃ  ＬＬＣ製、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．製、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．製、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００４３】
「ステビオール配糖体」については既に述べたとおりである。モノグルコシド結合および／またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体の例としては、レバウジオシドＡ、ステビオシド、ルブソシド、ステビオールモノシドおよびステビオールモノグルコシルエステルが挙げられる。
【００４４】
第２の活性タンパク質によって、モノグルコシド結合および／またはモノグルコシルエステル結合が切断されるが、得られる生成物は出発物質の「モノグルコシド結合および／またはモノグルコシルエステル結合を有するステビオール配糖体」に応じて次のように変わる。以下に、その例を示す。
【００４５】
【表３】
2017073717.tif 000005
【００４６】
上記第２の活性タンパク質の活性に基づき、本発明のタンパク質と、第2の活性タンパク質と、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、ステビオシド、ルブソシド、ステビオールモノシドおよびステビオールモノグルコシルエステルから選択される１つ以上のステビオール配糖体を反応させる工程を含む、レバウジオシドＢおよびステビオールの少なくとも１つを製造する方法では、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤおよびステビオシドから以下のようにレバウジオシドBおよびステビオールを生成物として得ることができる。
【００４７】
【表４】
2017073717.tif 000006
【００４８】
２．非ヒト形質転換体を用いた本発明のステビオール配糖体の生産方法
本発明のタンパク質は、麹菌に由来する分泌型の酵素またはその変異体であり、細胞外環境において高い活性を有することが期待される。この場合、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（後述する「本発明のポリヌクレオチド」を参照）を、細菌、真菌類、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を細胞外に発現させ、本発明のタンパク質と、β１，２−グルコシド結合を有するステビオール配糖体とを反応させることにより本発明のステビオール配糖体を生成することができる。あるいは、宿主によっては、本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させ、本発明のステビオール配糖体を生成することもできる。
【００４９】
そこで、本発明は、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を生成する宿主に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチド（以下、「本発明のポリヌクレオチド」という）が導入された非ヒト形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」という）を培養することを含む、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を有さないステビオール配糖体の生産方法を提供する。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３または４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質コードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００５０】
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００５１】
配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５２】
「配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。
【００５３】
「配列番号３または４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質」としては、前述のものが挙げられる。
【００５４】
本明細書中、「高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号３または４のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．  ４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２”、”Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９８７−１９９７”などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書中、「高ストリンジェントな条件」とは、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６２℃、または０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の条件であるが、これに限定されるものではない。これらの条件において、温度を上げるほど高い配列同一性を有するＤＮＡが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５５】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５〜６０℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。あるいは、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列、または配列番号３または４のアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列の全部または一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティクス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティクス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
【００５６】
上記以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＢＬＡＳＴの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１の塩基配列のＤＮＡ、または配列番号３または４のアミノ酸配列をコードするＤＮＡと６０％以上、６１％以上、６２％以上、６３％以上、６４％以上、６５％以上、６６％以上、６７％以上、６８％以上、６９％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、または９９．９％以上の配列同一性を有するＤＮＡをあげることができる。
【００５７】
なお、アミノ酸配列や塩基配列の配列同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの５’末端に含まれる。分泌シグナルペプチドは、前述の通りである。このような分泌シグナルペプチドは、本発明のポリヌクレオチドを導入する宿主に応じて、適宜選択することができる。例えば、宿主が酵母の場合には、酵母菌由来の分泌シグナルペプチド、例えば、ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１シグナルペプチド、ＰＨＯ５シグナルペプチド、およびＳＵＣ２シグナルペプチドが挙げられる。ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１シグナルペプチド、ＰＨＯ５シグナルペプチド、およびＳＵＣ２シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、それぞれ、配列番号３１、配列番号３３および配列番号３５の塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１シグナルペプチド、ＰＨＯ５シグナルペプチド、およびＳＵＣ２シグナルペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３２、配列番号３４および配列番号３６のアミノ酸配列である。また、宿主が麹菌の場合には、麹菌由来のシグナルペプチド、例えば、配列番号２８または配列番号３０のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。配列番号２８または配列番号３０のアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、それぞれ、配列番号２７または配列番号２９の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００５９】
上記した本発明のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法または公知の合成手法によって取得することが可能である。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。
【００６１】
適切な発現ベクターは、通常、
（ｉ）宿主細胞内で転写可能なプロモーター；
（ｉｉ）該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）ＲＮＡ分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
を含むように構成される。
【００６２】
発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージまたはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００６３】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００６４】
本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーターおよび／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の５’側に付加したｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、mouse mammary tumor virus（MMTV）プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
【００６５】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー（ｕｒａ５、ｎｉａＤ）、薬剤耐性マーカー（ハイグロマイシン、ゼオシン）、ジェネチシン耐性遺伝子（Ｇ４１８ｒ）、銅耐性遺伝子（ＣＵＰ１）（Ｍａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，ｖｏｌ．  ８１，ｐ．３３７，１９８４）、セルレニン耐性遺伝子（ｆａｓ２ｍ，  ＰＤＲ４）（それぞれ、猪腰淳嗣ら，生化学，ｖｏｌ．６４，ｐ．６６０，１９９２；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０１，ｐ．１４９，１９９１）などが利用可能である。
【００６６】
本発明の形質転換体の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。ここで用いられる宿主は、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を生成するものであれば特に限定されるものではなく、ステビアのように分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を生成する植物だけではなく、本来少なくとも分岐のない１つのβ１，２−グルコシド結合を有するステビオール配糖体を生成しない細胞または生物に分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体の生成に必要な遺伝子を導入したものを宿主として用いることができる。「分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体の生成に必要な遺伝子」は、例えば、WO 2011/093509などに記載のステビオールやステビオール配糖体合成活性を有する遺伝子が挙げられる。形質転換の対象となる細胞または生物としては、従来公知の各種細胞または生物を好適に用いることができる。形質転換の対象となる細胞としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、糸状菌（麹菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、植物細胞、ヒトを除く動物細胞等が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。また、形質転換の対象となる生物も、特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物または植物またはヒトを除く動物が挙げられる。形質転換体は、好ましくは、酵母または植物である。
【００６７】
宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法（Ｍａｃｋｅｎｘｉｅ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６６，ｐ．４６５５−４６６１，２０００）、パーティクルデリバリー法（特開２００５−２８７４０３「脂質生産菌の育種方法」に記載の方法）、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７５，ｐ．１９２９，１９７８）、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５３，ｐ．１６３，１９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０００  Ｅｄｉｔｉｏｎ：Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌなどに記載の方法）で実施可能であるが、これらに限定されない。また、植物、もしくは植物に由来する組織や細胞への遺伝子導入の際には、例えばアグロバクテリウム法（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  Ｇｅｌｖｉｎ，  Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポーレーション法などを適宜選択して用いることができる。
【００６８】
その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｖｏｌ．４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２”、”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）”等を参照することができる。
【００６９】
形質転換体が、酵母または麹菌である場合、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように酵母または麹菌中に導入することによって取得される。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された酵母または麹菌は、野生型と比べて本発明のタンパク質を多く発現する。このため、発現した本発明のタンパク質が、酵母または麹菌で生成された分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体と反応し、分岐のないβ１，２−グルコシド結合が切断され、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を有さない本発明のステビオール配糖体が酵母または麹菌の細胞内または培養液中、好ましくは、培養液中に生成される。
【００７０】
形質転換体が、植物である場合、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が発現され得るように植物中に導入することによって取得される。本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を生成する植物、または本来分岐のないβ1，2−グルコシド結合を有するステビオール配糖体を生成しない植物に必要な遺伝子を導入することで分岐のないβ1，2−グルコシド結合を有するステビオール配糖体を生成することができるようにした植物であれば特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。本発明のポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。本発明のポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物（以下、「本発明の植物」）は、その野生型と比べて本発明のタンパク質を多く含む。このため、このため、本発明のタンパク質が、本発明の植物で生成された分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体と反応し、分岐のないβ１，２−グルコシド結合が切断され、β１，２−グルコシド結合を有さない本発明のステビオール配糖体が植物中に生成される。
【００７１】
本発明のいくつかの態様の形質転換体またはその培養液は、その野生型と比べて本発明のステビオール配糖体の含有量が高く、その抽出物または培養液には、本発明のステビオール配糖体が高濃度で含まれる。本発明の形質転換体の抽出物は、形質転換体をガラスビーズ、ホモジェナイザーまたはソニケーター等を用いて破砕し、当該破砕物を遠心処理し、その上清を回収することにより、得ることができる。本発明のステビオール配糖体が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により形質転換体と培養上清とを分離することにより、本発明のステビオール配糖体を含む培養上清を得ることができる。
【００７２】
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清は、さらに精製工程に供してもよい。本発明のステビオール配糖体の精製は、通常の分離および精製方法に従って行うことができる。具体的な方法は、前記と同様である。
【００７３】
３．非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を用いた本発明のステビオール配糖体の生産方法
本発明のポリヌクレオチドを、細菌、真菌類、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を発現させ、本発明のタンパク質を発現する形質転換細胞に由来する酵素剤を用いること、すなわち、本発明のタンパク質を発現する形質転換細胞に由来する酵素剤を、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体と接触させることにより本発明のステビオール配糖体を生成することができる。「形質転換細胞に由来する酵素剤」は、形質転換細胞を用いて調製され、本発明のタンパク質を含むものであれば限定されないが、例えば、形質転換細胞自体、形質転換細胞の粉砕物自体、形質転換細胞の培養上清自体、およびこれらの精製物である。  そこで、本発明は、宿主細胞に、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドが導入された非ヒト形質転換細胞に由来する酵素剤を、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体と接触させて、前記分岐のないβ１，２−グルコシド結合を切断する工程を含む、ステビオール配糖体の生産方法を提供する。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３または４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３または４のアミノ酸配列において、１〜７７個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３または４のアミノ酸配列に対して、９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつステビオール配糖体が有する分岐のないβ１，２グルコシド結合を切断する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００７４】
上記（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択されるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドであり、前記と同様である。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチドは、さらに、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、分泌シグナルペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの５’末端に含まれる。分泌シグナルペプチドおよびそれをコードする塩基配列からポリヌクレオチドは、前記と同様である。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主細胞に導入される。適切な発現ベクターは、前記と同様である。
【００７７】
本発明の形質転換細胞の作製方法は、特に限定されないが、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換する方法が挙げられる。形質転換の対象となる細胞は、前記と同じである。
また、宿主細胞の形質転換方法は、前述の通りである。
【００７８】
本発明の形質転換細胞は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように宿主細胞に導入することによって取得される。本発明のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞は、野生型と比べて本発明のタンパク質を多く発現する。このため、本発明のタンパク質を発現する形質転換細胞に由来する酵素剤を用いること、すなわち、本発明のタンパク質を発現する形質転換細胞に由来する酵素剤を、分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体と接触させることにより本発明のステビオール配糖体を生成することができる。
【００７９】
「接触」とは、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤と分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体とを同一の反応系または培養系に存在させることを意味し、例えば、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を含む容器に分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を添加すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤と分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体とを混合すること、本発明の形質転換細胞に由来する酵素剤を分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体を含む容器に添加することが含まれる。
【００８０】
「ステビオール配糖体」および「分岐のないβ１，２−グルコシド結合を少なくとも１つ有するステビオール配糖体」は、前記と同様である。
【００８１】
このようにして得られた本発明のステビオール配糖体は、常法に従って、例えば、食品、飲料、甘味料、香料、医薬品、工業原料（化粧料、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。
【００８２】
食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、老人用食品等が挙げられる。本明細書中、食品は、固体、流動体、および液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称である。
【００８３】
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。【００８５】
１．ステビオール加水分解酵素遺伝子のクローニング
1-（1）遺伝子
AO090009000356およびAO090701000274をクローニングし、酵母で発現させて活性を確認することにした。【００８６】
1-（2）麹菌のｃＤＮＡのクローニング
麹菌  Aspergillus  oryzae  var．Brunneus（IFO30102）をＧＹプレート（２％グルコース、０．５％酵母エキス、２％  アガー）に植菌し、２５℃で３日間培養した。生育した菌体をＧＹプレートから回収し、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）でトータルＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ）により、ｃＤＮＡを合成した。
AO090009000356およびAO090701000274のＤＮＡ配列をもとに、以下のプライマーを設計した。
AO090009000356（以下ＡＯＢＧＬ１と表記）
AOBGL1-1：５’−AGATCTATGAAGCTTGGTTGGATCGAGGT−３’（配列番号９）
AOBGL1-2：５’−GTCGACTTACTGGGCCTTAGGCAGCGA−３’（配列番号１０）
AO090701000274（以下ＡＯＢＧＬ３と表記）
AOBGL3-1：５’-GCGGCCGCatggtttccggtgtctttacgaagg−３’（配列番号１１）
AOBGL3-2：５’ -GGATCCtcactgcacatagaaagtagcattgcc−３’（配列番号１２）
上述のとおり合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いて、
ＰＣＲにより増幅された約２．６ｋｂｐまたは2.3ｋｂｐのＤＮＡ断片をＴＯＰＯ−ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ）を用いてクローニングした。ここで得られたプラスミドをそれぞれ、ｐＣＲ-ＡＯＢＧＬ1、またはｐＣＲ-ＡＯＢＧＬ3とした。【００８７】
2．酵母での発現
2-（１）酵母発現用ベクターの構築と形質転換株の取得
酵母用発現ベクターｐＹＥ２２ｍ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１２２１−１２２８，１９９５）を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化して得られたＤＮＡ断片と、ｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１を制限酵素ＢｇｌＩＩとＳａｌＩで消化して得られた約２．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．１（タカラバイオ）を用いて、連結し、得られたプラスミドをｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１とした。また、ｐＹＥ２２ｍNを制限酵素NotIとBamHIで消化して得られたDNA断片とｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ3を制限酵素NotIとBamHIで消化して得られた約2.3ｋｂｐのDNA断片を同様に連結して得られたプラスミドをｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ3とした。
形質転換の親株として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＨ１３−１５株（ｔｒｐ１，ＭＡＴα）（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０，５１５−５２０，１９８９）を用いた。【００８８】
プラスミドｐＹＥ２２ｍ（コントロール）、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１（ＡＯＢＧＬ１発現用）、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ3（ＡＯＢＧＬ3発現用）をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、ＥＨ１３−１５株を形質転換した。形質転換株は、ＳＣ−Ｔｒｐ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー）上で生育するものを選抜した。
選抜した株を、０．００４％  Ｘ−β−Ｇｌｃを含むＳＣ−Ｔｒｐ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養したが、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ3いずれのプラスミドで形質転換した株も、コントロールであるｐＹＥ２２ｍで形質転換した株もどちらも青色を呈さず、Ｘ−β−Ｇｌｃ分解活性を確認できなかった。
一方、選抜した株を、１Ｍリン酸カリウムバッファーを１／１０量添加したＳＣ−Ｔｒｐ液体培地１０ｍＬに１白金耳植菌し、３０℃、１２５ｒｐｍで２日間振とう培養した。得られた培養物を遠心分離により、培養上清と菌体に分けた。菌体は、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、０．１％ＣＨＡＰＳ溶液に懸濁して、ガラスビーズにて菌体を破砕し、遠心分離して得られた上清を菌体破砕液とした。得られた培養上清または菌体破砕液のｐＮＰ−β−Ｇｌｃ活性を検討した。
その結果、コントロールを含めて、いずれの形質転換株の培養上清および菌体破砕液の両方に、ｐＮＰ−β−Ｇｌｃ分解活性があり、両者の間で、活性に大きな差はなかった。
これらのことから、プラスミドｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＡＯＢＧＬ3を酵母ＥＨ１３−１５株に導入しても、β−グルコシダーゼ活性を有する活性型のタンパク質を発現させることができないことが示唆された。また、酵母の内在性のβ−グルコシダーゼ活性を担う遺伝子を欠失させておく必要があることも分かった。【００８９】
2-（2）Δexg1 Δexg2 酵母宿主株の作成
形質転換の宿主株としては、酵母の菌体外β−グルコシダーゼ活性の大半を担っていると考えられているＥＸＧ１（ＹＬＲ３００ｗ）遺伝子とそのホモログであるＥＸＧ２（ＹＤＲ２６１ｃ）遺伝子を欠損させた株を使用することとし、以下のとおり作成した。
Δｅｘｇ１株（ＭＡＴalpha  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ2Δ０  ｕｒａ３Δ０，クローンＩＤ１５２１０、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と。Δｅｘｇ２株（ＭＡＴa  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｍｅｔ１５Δ０  ｕｒａ３Δ０，クローンＩＤ３６２０、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をそれぞれＹＰＤ寒天培地に塗布し、３０℃で２日間培養した。それぞれの菌体を白金耳でかきとり、ＳＣ-Ｍｅｔ，Ｌｙｓ１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー）上で混合し、３０℃で２日間培養した。生育してくる株は、２つの株が掛け合わされたヘテロ二倍体であると考えられた。得られた株をＹＰＤ寒天培地に塗布し、３０℃で２日間培養した後、菌体を白金耳でかきとって、0.5％  酢酸カリウム寒天培地（2％アガー）に塗布し、室温で５日間培養し、胞子を形成させた。四分子分離を行い、一倍体株を分離した。得られた株の遺伝子型をＰＣＲにより確認し、Δｅｘｇ１  Δｅｘｇ2株-1（ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ2Δ０  ｕｒａ３Δ０）であるものを選抜した。
酵母Ｓ288Ｃ株のゲノムＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーTRP1-FとプライマーTRP1-Rで、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いてＰＣＲを行った。増幅された約2.7ｋｂｐのＤＮＡ断片をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ）を用いてクローニングし、プラスミドｐＣＲ-ＴＲＰ1を得た。
TRP1-F：TACTATTAGCTGAATTGCCACTGCTATCG（配列番号１３）
TRP1-R：TCTACAACCGCTAAATGTTTTTGTTCG（配列番号１４）
【００９０】
pPRGINFRT3-103(特開2001-120276)を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた2.7ｋｂｐのＤＮＡ断片をＢblunting Kit(タカラバイオ)により末端を平滑化したのち、プラスミドｐＣＲ-ＴＲＰ1を制限酵素ＨｐａＩとＳｔｕＩで消化して得られたＳＮＡ断片とＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡）を使って連結させ、プラスミドｐＣＲ-Δｔｒｐ1：ＵＲＡ3-ＦＲＴを得た。これを鋳型として、プライマーTRP1-FとプライマーTRP1-Rで、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いてＰＣＲを行い、得られた4.4ｋｂｐのＤＮＡ断片を用いて、Δｅｘｇ１  Δｅｘｇ2-1株を酢酸リチウム法により形質転換し、ＳＣ-Ura（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー））に生育するものを、形質転換株として選抜した。形質転換株をYPGal培地（酵母エキス  2％、ポリペプトン  1％、ガラクトース  2％）で培養した後、ＳＣ+5-ＦＯＡ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、およびアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇ、ウラシル0.6ｇを混合したもの）１．３ｇを含む）寒天培地（２％アガー））に塗布し、生育してきた株を、Δｅｘｇ１  Δｅｘｇ2-2株として、以下の形質転換の宿主とした。【００９１】
2-(3)  分泌シグナル配列の置換と酵母での発現
ＡＯＢＧＬ１ｐのＮ末端の１９アミノ酸（配列番号２８）、およびＡＯＢＧＬ3のＮ末端の22アミノ酸（配列番号３０）は分泌シグナル配列であると推定される。
そこで、ＡＯＢＧＬ１、ＡＯＢＧＬ3を酵母で分泌発現させるために、推定分泌シグナル配列を酵母の分泌タンパク質の分泌シグナル配列に置換することにした。まず、以下のオリゴＤＮＡを合成し、アニーリングさせたのち、ベクターｐＹＥ２２ｍのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＹＥ−ＰａｃＮｈｅを作成した。
ＰａｃＩ−ＮｈｅＩ−Ｆ：５’−AATTAATTAAGAGCTAGCG−３’ （配列番号１５）
ＰａｃＩ−ＮｈｅＩ−Ｒ：５’−TTAATTCTCGATCGCTTAA−３’ （配列番号１６）
プラスミドｐＣＲ−ＡＯＢＧＬ１またはｐＣＲ−ＡＳＢＧＬ１を鋳型にして、以下のプライマーＢｇｌ２−ＡＯＢＧＬ１−ＦとプライマーＡＯＢＧＬ１−２で、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢｇｌＩＩとＳａｌＩで消化して得られた約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ベクターｐＹＥ−ＰａｃＮｈｅを制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩサイトに挿入し、プラスミドｐＹＥ−ＰＮ−ＡＯＢＧＬ１を構築した。
Ｂｇｌ２−ＡＯＢＧＬ１−Ｆ：
５’−TAAGATCTAAGGATGATCTCGCGTACTCCCC−３’ （配列番号１７）
ＡＯＢＧＬ１−２：
５’−GTCGACTTACTGGGCCTTAGGCAGCGA−３’ （配列番号１８）
【００９２】
プラスミドｐＣＲ−ＡＳＢＧＬ3を鋳型にして、以下のプライマーBam−ＡＳＢＧＬ3−ＦとプライマーＳａｌ-ＡＳＢＧＬ3−Ｒで、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片を制限酵素BamHＩとＳａｌＩで消化して得られた約２．3ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ベクターｐＹＥ−ＰａｃＮｈｅを制限酵素BamHＩとＳａｌＩサイトに挿入し、プラスミドｐＹＥ−ＰＮ−ＡＯＢＧＬ3を構築した。
Bam-AOBGL3-F：
５’−AAGGATCCCAAGATGAGAAGCCTCGCTACAAGG−３’ （配列番号１９）
Sal-AOBGL3-R：
５’−GGGTCGACTCACTGCACATAGAAAGTAGCATTGCC−３’ （配列番号２０）
【００９３】
ＡＯＢＧＬ１、またはＡＯＢＧＬ3の推定分泌シグナル配列を酵母の分泌タンパク質の分泌シグナル配列ＭＦ（ＡＬＰＨＡ）１（ＹＰＬ１８７Ｗ）（図２Ａに記載のアミノ酸配列の１〜１９番目の配列（配列番号３２））、ＰＨＯ５（ＹＢＲ０９３Ｃ）（図２Ｂに記載アミノ酸配列の１〜１７番目の配列（配列番号３４））、ＳＵＣ２（ＹＩＬ１６２Ｗ）（図２Ｃに記載のアミノ酸配列の１〜１９番目の配列（配列番号３６））に置き換えたタンパク質を発現させるためのプラスミドを構築するために、以下のプライマーを設計した。
ＳｃＰＨＯ５−Ｆ：
５’−TAAATGTTTAAATCTGTTGTTTATTCAATTTTAGCCGCTTCTTTGGCCAATGCAG−３’ （配列番号２１）
ＳｃＰＨＯ５−Ｒ：
５’−CTAGCTGCATTGGCCAAAGAAGCGGCTAAAATTGAATAAACAACAGATTTAAACATTTAAT−３’ （配列番号２２）
ＳｃＳＵＣ２−Ｆ：
５’−TAAATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTTGGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCAG−３’ （配列番号２３）
ＳｃＳＵＣ２−Ｒ：
５’−TAAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTG−３’ （配列番号２４）
ＳｃＭＦ１−Ｆ：
５’−TAAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTG−３’ （配列番号２５）
ＳｃＭＦ１−Ｒ：
５’−CTAGCAGCTAATGCGGAGGATGCTGCGAATAAAACTGCAGTAAAAATTGAAGGAAATCTCATTTAAT−３’ （配列番号２６）
【００９４】
ＳｃＰＨＯ５−ＦとＳｃＰＨＯ５−Ｒの組み合わせ、ＳｃＳＵＣ２−ＦとＳｃＳＵＣ２−Ｒの組み合わせ、およびＳｃＭＦ１−ＦとＳｃＭＦ１−Ｒの組み合わせでアニーリングさせたものをそれぞれ、プラスミドｐＹＥ−ＰＮ−ＡＯＢＧＬ１またはｐＹＥ−ＰＮ−ＡＳＢＧＬ１を制限酵素ＰａｃＩとＮｈｅＩで消化したものと連結し、以下のプラスミドを得た。
ｐＹＥ−ＰＨＯ５ｓ−ＡＯＢＧＬ１（ＰＨＯ５ｓ−ＡＯＢＧＬ１発現用）
ｐＹＥ−ＳＵＣ２ｓ−ＡＯＢＧＬ１（ＳＵＣ２ｓ−ＡＯＢＧＬ１発現用）
ｐＹＥ−ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ１（ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ１発現用）
ｐＹＥ−ＰＨＯ５ｓ−ＡＯＢＧＬ3（ＰＨＯ５ｓ−ＡＯＢＧＬ３発現用）
ｐＹＥ−ＳＵＣ２ｓ−ＡＯＢＧＬ3（ＳＵＣ２ｓ−ＡＯＢＧＬ３発現用）
ｐＹＥ−ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ3（ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ３発現用）
【００９５】
Δｅｘｇ１  Δｅｘｇ２-２株をこれらのプラスミドで酢酸リチウム法により形質転換し、ＳＣ-Ｔｒｐ寒天培地上で生育するものを形質転換株として選抜した。【００９６】
得られた形質転換株を０．００４％Ｘ−β−Ｇｌｃを含むＳＤ−Ｔｒｐ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養したところ、ｐＹＥ−ＰＨＯ５ｓ−ＡＯＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＳＵＣ２ｓ−ＡＯＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＭＦ１ｓ−ＡＯＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＰＨＯ５ｓ−ＡＳＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＳＵＣ２ｓ−ＡＳＢＧＬ１、ｐＹＥ−ＭＦ１ｓ−ＡＳＢＧＬ１で形質転換した株は、菌体およびその周りが青く染まり、Ｘ−β−Ｇｌｃを加水分解する活性を有することが示唆された。
一方、AOBGL3を発現させるためのプラスミドで形質転換した株は、菌体およびその周辺は青く染まらず、Ｘ−β−Ｇｌｃを加水分解する活性を確認することはできなかった。
また、コントロールベクターを導入した株でも、菌体およびその周辺は青く染まらず、Ｘ−β−Ｇｌｃを加水分解する活性はなかった。【００９７】
得られた形質転換株をＳＤ−Ｔｒｐ  液体培地１０ｍＬと１Ｍリン酸カリウムバッファー１ｍＬを混合した液体培地に１白金耳植菌し、３０℃で２日間振とう培養した。培養物を遠心分離により菌体と培養上清に分離した。
培養上清５０μＬ、０．２Ｍクエン酸ナトリウムバッファー５０μＬ、２０ｍＭｐＮＰ−βＧｌｃ水溶液５０μＬ、水５０μＬを混合し、３７℃で1時間反応させ、β-グルコシダーゼ活性による405nmの吸光度の増加を調べた。
AOBGL1を発現させた場合は、表５のとおり、β-グルコシダーゼ活性を確認できた。AOBGL1は、MF1シグナル配列に付替えた場合に最もよく発現すると考えられた。【００９８】
【表５】
2017073717.tif 000007
【００９９】
しかし、AOBGL3を発現させた場合、同様の条件ではβ-グルコシダーゼ活性を確認することができなかった。【０１００】
2-(4)  組換え酵素のステビオール配糖体に対する活性
AOBGL1が、ステビオシドをルブソシドに変換する活性を有することが確認できた。【０１０１】
3．AOBGL3の麹菌での発現
3-(1)  麹菌発現用ベクターの構築
麹菌用ベクターｐUNA（酒類総合研究所）を制限酵素SmaIで消化して得られたDNA断片と、プラスミドｐCR-AOBGL3を制限酵素NotI、BamHIで消化し末端をBlunting Kit（タカラバイオ）によって平滑化して得られた約2.3ｋｂｐのDNA断片を連結し、プラスミドｐUNA-AOBGL3を得た。【０１０２】
3-(2)  麹菌の形質転換
麹菌の形質転換は以下のとおり実施した。
宿主として、Aspergillus oryzae niaD300株（酒類総合研究所）を使用した。宿主株をPDAプレートに植菌し、30℃でおよそ1週間培養した。分生子懸濁液を得るために、0.1％  tween80, 0.8% NaClを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、0.1％  tween80, 0.8% NaClで洗浄し、滅菌水に懸濁した。
分生子をCDプレートに塗布し、パーティクルデリバリー法により、DNAの導入を行った。PDS-1000/He（バイオラッド）を使って、パーティクル：タングステンM-10、ラプチャーディスク：1100psi、距離：3ｃｍとした。形質転換株として、CDプレート（1Lあたり、NaNO3  6ｇ、KCｌ  0.52ｇ、KH2PO4 1.52g、グルコース  10ｇ、1M  MgSO4  2ｍｌ、Trace element solution（1Lあたり、FeSO4・7H2O  1ｇ、ZnSO4・7H2O  8.8ｇ、CuSO4・5H2O  0.4ｇ、NaB4O7・10H2O  0.1ｇ、（NH4）6Mo7O24・4H2O  0.05ｇ  ） 1ml、アガー  20ｇ（ｐH6.5））で生育するものを選抜した。【０１０３】
3-(3)  分生子液の調製
BGL3-1株またはC-1株をCDプレートに植菌し、30℃で7日間培養し、分生子を形成させた。分生子懸濁液を得るために、0.1％  tween80, 0.8% NaClを加え、分生子を懸濁した。ミラクロスでろ過後、遠心分離により分生子を回収し、さらに、0.1％  tween80, 0.8% NaClで洗浄し、滅菌水に懸濁し、分生子懸濁液とした。【０１０４】
3-(4)  液体培養によるAOBGL3の生産
BGL3-1株またはC-1株の分生子を、酵素生産用液体培地（１Lあたり、マルトース  １００ｇ、バクトトリプトン  １ｇ、酵母エキス  ５ｇ、NaNO3 1g、K2HPO4  ０．５ｇ、MgSO4・７H2O 0.5g、FeSO4・７H2O  0.01ｇ）  に植菌し、30℃で2日間振とう培養を行った。ミラクロスによりろ過して菌体を除き、続いてメンブレンフィルターシステム（IWAKI）によりろ過し上清を集めた。さらに、アミコンウルトラ-15  50ｋ（メルク）で、限外ろ過により濃縮し、0.1% CHAPSを含む50ｍM  リン酸ナトリウムバッファー（pH7.0）でバッファー置換することにより、祖酵素液を得た。【０１０５】
3-(5)  活性確認（液体培養）
各種基質に対する活性を検討した。
pNP-β‐Glc：BGL3-1株、C-1株ともに黄色を呈し、両者ともにpNP-β‐Glcを加水分解する活性を有していた。
X-β-Glc：BGL3-1株は青色を呈し、X-β-Glcを加水分解する活性を有していた。一方、C-1株は青くならなかったため、X-β-Glcを加水分解する活性はないと考えられた。X-β-Glcに対する活性は、AOBGL3遺伝子産物によるものと考えられた。【０１０６】
3-(6)  ステビオール配糖体の加水分解活性
BGL3-1株またはC-1株由来の酵素液（液体培養、プレート培養）の各種ステビオール配糖体（ルブソシド）に対する加水分解活性を以下のとおり検討した。【０１０７】
反応条件
基質  50μｇ/ｍｌ、酵素液  20μｌ、  50ｍMクエン酸ナトリウムバッファー（pH5.0）、全量を100μｌとし、５０℃で反応させた。反応液を、アセトニトリルで洗浄後、水で平衡化したSep-PakC18(Waters)に供し、続いて２０％アセトニトリルで洗浄したあと、50％アセトニトリルで溶出した。溶出液をスピードバックで乾固したあと、１００μLの80％アセトニトリルで再溶解し、HPLCに供した。
HPLC条件は以下のとおりである。【０１０８】
カラム：コスモシール５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ  ４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ２５０ｍｍ（ナカライテスク）
移動相：Ａ；アセトニトリル、Ｂ；
Ｂ  ｃｏｎｃ．７０％→３０％  ４０分  ｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ
流速：１ｍｌ／分
温度：４０℃
検出：ＵＶ  ２１０nm【０１０９】
すなわち、AOBGL3を発現させることで、ルブソシドの13位のグルコシド結合と19位のグルコシルエステル結合を加水分解できる酵素活性が発現した。ただし、ルブソシドと反応させた場合、ステビオールのほかに中間体のステビオールモノグルコシルエステルが検出されたことから、AOBGL3タンパク質は、ルブソシドの13位のグルコシド結合と19位のグルコシルエステル結合の両方を加水分解するが、13位のグルコシド結合をより選択的に加水分解する酵素であった。
【図１】
2017073717.tif 000008
【図２】
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【配列表】
2017073717000001.app
【国際調査報告】
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