(57)【要約】一態様において、構造体、構造体の製造方法、又は細胞の選別方法等を提供する。一態様において、本発明の構造体（１）は、第一の基板（１０）と、前記第一の基板（１０）の一方側に対向するように配置された第二の基板（２０）を含む構造体であって、前記第一の基板（１０）は、前記第一の基板の他方側に開口し、細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部（１１）を複数有し、前記凹部（１１）の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔（１２）を有し、前記第二の基板（２０）は、前記分泌物が前記連通孔（１２）を移動して蓄積する蓄積部（１３）を備えることができ、前記蓄積部（１３）は、前記凹部（１１）と対応し得る。
2017057234.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の基板と、前記第一の基板の一方側に対向するように配置された第二の基板を含む構造体であって、
前記第一の基板は、前記第一の基板の他方側に開口し、細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有し、
前記第二の基板は、前記分泌物が前記連通孔を移動して蓄積する蓄積部を備えることができ、前記蓄積部は、前記凹部と対応し得る、構造体。
【請求項２】
前記構造体は、前記細胞を分散させて、前記細胞を、前記凹部に捕捉させ、
前記細胞から分泌された分泌物を、前記連通孔を介して前記蓄積部に蓄積させ、前記蓄積部に生じる変化を検出するために用いられる、請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
前記凹部は、その直径が、１〜１００μｍであり、制御された前記連通孔を有し、
前記連通孔が円状の場合、その直径は１０〜２，０００ｎｍであり、
前記連通孔が柵状の場合、その幅は１０〜２，０００ｎｍであり、
前記連通孔が格子状の場合、一辺は１０〜２，０００ｎｍであり、前記第一の基板の厚さは、５〜１００μｍである、請求項１又は２に記載の構造体。
【請求項４】
前記構造体は、前記蓄積部に非特異的に結合した物質を除去するための流路構造を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の構造体。
【請求項５】
前記第一の基板と前記第二の基板の位置が固定されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の構造体。
【請求項６】
前記細胞が抗体産生細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の構造体。
【請求項７】
前記蓄積部が、前記分泌物と親和性を有する生体分子発現細胞を含む、前記分泌物と親和性を有する生体分子を含む、又は、前記分泌物と親和性を有する化合物を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の構造体。
【請求項８】
第一の基板と、前記第一の基板の一方側に対向するように配置された、分泌物を分泌する第一の細胞を備えることができる第二の基板を含む構造体であって、
前記第一の基板は、前記第一の基板の他方側に開口し、第二の細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記第一の細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有し、前記第二の細胞は前記第一の細胞から分泌される分泌物に応答する細胞である、構造体。
【請求項９】
前記連通孔を介して、第一の基板から第二の基板へ、及び／又は第二の基板から第一の基板へ溶液が移動可能な請求項１〜８のいずれか一項に記載の構造体。
【請求項１０】
前記構造体の少なくとも一部が、（ａ）多官能エポキシ樹脂と、（ｂ）カチオン重合開始剤と、を含む硬化性樹脂組成物の重合物を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の構造体。
【請求項１１】
前記硬化性樹脂組成物が、細胞毒性及び自家蛍光を有しない、請求項１０に記載の構造体。
【請求項１２】
前記硬化性樹脂組成物が、親水化処理された、請求項１０又は１１に記載の構造体。
【請求項１３】
第一の支持体上に、第一の硬化性樹脂組成物を塗布して第一の硬化性樹脂膜を形成し、第二の基板を得る工程１と、
第二の支持体上に、溶解可能な下地膜を形成し、該下地膜上に第二の硬化性樹脂組成物を塗布して第二の硬化性樹脂膜を形成し、該第二の硬化性樹脂膜に連通孔をパターニングして、連通孔がパターニングされた支持層を得る工程２と、
前記支持層上に、第三の硬化性樹脂組成物を塗布して第三の硬化性樹脂膜を形成し、該第三の硬化性樹脂膜に凹部をパターニングして、凹部がパターニングされた第一の基板を得る工程３と、
前記下地膜を溶解して、前記第二の支持体から前記第一の基板を剥離する工程４と、
前記第一の基板と前記第二の基板とを接合させる工程５と、
を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の構造体の製造方法。
【請求項１４】
前記工程１において、前記第一の硬化性樹脂膜を露光した後、現像して連通孔がパターニングされた支持層を得る、請求項１３に記載の構造体の製造方法。
【請求項１５】
前記工程２において、前記第二の硬化性樹脂膜を露光した後、現像して前記連通孔を有する前記凹部がパターニングされた第一の基板を得る、請求項１３又は１４に記載の構造体の製造方法。
【請求項１６】
前記工程４において、該第一の硬化性樹脂膜を露光した後、現像してピラーがパターニングされた第二の基板を得る、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の構造体の製造方法。
【請求項１７】
複数の細胞から、分泌物を分泌する目的の細胞を選別する、細胞の選別方法であって、 細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有する第一の基板に、前記細胞を分散させて、前記細胞を、前記凹部に捕捉させる工程Ａと、前記細胞から前記分泌物を分泌させ、前記分泌物を前記連通孔から移動させ、前記連通孔を介して移動した前記分泌物を第二の基板の蓄積部に蓄積させる工程Ｂと、前記蓄積部に生じる変化を検出する工程Ｃと、前記検出結果を指標に、目的の細胞を特定する工程Ｄと、を含む、細胞の選別方法。
【請求項１８】
前記細胞が抗体産生細胞である請求項１７に記載の細胞の選別方法。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載の細胞の選別方法で特定した目的の細胞を回収することを含む、目的の細胞の製造方法。
【請求項２０】
分泌物の産生方法であって、
細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有する第一の基板に、あらかじめ取得した所望の分泌物を分泌し得る細胞集団を分散させて、前記凹部に細胞を捕捉させる工程ａと、
前記細胞から前記分泌物を分泌させ、前記分泌物を前記連通孔から移動させ、前記連通孔を介して移動した前記分泌物を第二の基板の蓄積部に蓄積させる工程ｂと、
前記蓄積部に生じる変化を検出する工程ｃと、
前記検出結果を指標に、目的の細胞を特定する工程ｄと、
前記目的の細胞を回収して培養することで分泌物を産生させる工程ｅ１、又は、前記目的の細胞において前記分泌物をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、前記ポリヌクレオチドが発現するように別の宿主細胞を培養することで分泌物を産生させる工程ｅ２と、
を含む、産生方法。
【請求項２１】
前記工程ｅ２において、クローニングされたポリヌクレオチドをさらに改変してから、当該改変されたポリヌクレオチドが発現するように別の宿主細胞を培養することで分泌物を産生させる、請求項２０に記載の産生方法。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の構造体の製造における硬化性樹脂組成物の使用。
【請求項２３】
一方側に開口し、細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有する、基板であって、
前記基板は、前記分泌物が前記連通孔を移動して蓄積する蓄積部を備えることができ、前記蓄積部は、前記凹部と対応し得る第二の基板と組み合わせて使用するための、基板。
【請求項２４】
請求項２３に記載の基板を含む、構造体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一態様において、本発明は、基板、構造体、構造体の製造方法、細胞の選別方法、細胞の製造方法、又は分泌物の産生方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、特に創薬分野において、細胞解析のターゲットが細胞群レベルから単一細胞レベルへと細分化されている。細胞を１つ１つのレベルで捕捉し、特定し、選別し、回収し、培養し、遺伝子解析を行い、選別された細胞を用いる試みがなされている。細胞を特定・選別する方法としては、細胞から分泌される分泌物を分離し、目的の分泌物を検出後、目的の分泌物を分泌した細胞をスクリーニングする方法が採用されている。
このような単一細胞解析においては、細胞を網羅的に捕捉し、一括して解析する手法が望まれている。【０００３】
細胞を網羅的に捕捉する方法として、特許文献１には、大きさの異なる特定の細胞を分離する目的で、上表面と下表面に大きさの異なる開口部を有する基板を用い、開口部よりも小さい細胞を通過させ、所望の細胞を開口部に保持させる基板および方法が記載されている。【０００４】
特許文献２には、細胞を捕捉し平面上に整列するための基板として、１個の細胞を隔離して収容するための開口部を複数有し、開口部の底面に細胞が通過できない大きさの貫通孔を複数有する細胞捕捉基板が記載されている。【０００５】
従来からある、分泌物を指標として細胞を一括して解析する手法として、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ法やＣｅｌｌＳｐｏｔ法が知られている。【０００６】
ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ法では、一態様において、マイクロタイタープレートの表面に、タンパク質をコーティングし、該マイクロタイタープレートの上部に細孔を有する膜を設置後、細胞を播種し、細孔膜を介してマイクロタイタープレート表面のタンパク質と反応させ、結合の結果を蛍光標識抗体で検出することが可能である。【０００７】
ＣｅｌｌＳｐｏｔ法では、一態様において、可溶性抗原タンパク質又は膜タンパク質をポリスチレン製ビーズ又はラテックス製ビーズに結合させ、マイクロタイタープレート上に、前記タンパク質を結合させたビーズを敷き詰め、細孔を有するトランスウェルを設置後、細胞を播種し、トランスウェルの細孔膜を介してマイクロタイタープレート上のタンパク質結合ビーズと反応させ、結合の結果を蛍光標識抗体で検出することが可能である（特許文献３参照。非特許文献１〜２参照。）。【０００８】
また、多数の単一細胞解析を同時に解析する方法として、１つの細胞のみが入る大きさのウェルを有するマイクロチップを用いた方法が知られている。【０００９】
また、特許文献４には、モノクローナル抗体を製造するために、１つの細胞のみが入る大きさのウェルを有する基板で細胞を培養し、ウェル中に格納された細胞から産生される物質を検出するマイクロウェルアレイ及び該マイクロウェルアレイを用いた細胞のスクリーニング方法が記載されている。【００１０】
より詳細に、特許文献４には、ウェルの周辺の主表面の少なくとも一部を、細胞の産生物質と結合する結合性物質を含む被覆層で被覆した後、該ウェルに細胞を格納させ、産生物質と該被覆層の結合性物質とを結合させて検出することによるスクリーニング方法が記載されている。【００１１】
特許文献４に記載のマイクロウェルアレイ及び該マイクロウェルアレイを用いた細胞のスクリーニング方法は、物質を産生する細胞が格納されたウェルの周辺に該物質と結合性を有する物質の被覆層を有する、即ち、物質を産生する細胞の培養系と該物質の検出系を基板同一平面上に一体にするという構成を採用し、産生された物質が、ウェルからウェル周辺の被覆層に拡散し、被覆層を構成する結合性物質と結合し、この結合を検出することにより、チップ上に保持された多数の細胞の状態を同時に測定できるようにしたものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特公平２−３４５９７号公報
【特許文献２】特許第２６６２２１５号公報
【特許文献３】特許第５１８９２９２号公報
【特許文献４】特許第４１４８３６７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Harriman WD1, Collarini EJ, Cromer RG, Dutta A, Strandh M, Zhang F, Kauvar LM., Multiplexed Elispot assay., J Immunol Methods. 2009 Feb 28;341(1-2):127-34.
【非特許文献２】Harriman WD1, Collarini EJ, Sperinde GV, Strandh M, Fatholahi MM, Dutta A, Lee Y, Mettler SE, Keyt BA, Ellsworth SL, Kauvar LM., Antibody discovery via multiplexed single cell characterization.,J Immunol Methods. 2009 Feb 28;341(1-2):135-45.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
特許文献１、２に記載の細胞捕捉基板では、細胞を捕捉することは出来るが、細胞が分泌する分泌物を堆積させることが出来ず、目的の分泌物を分泌した細胞は選別できないという問題があった。【００１５】
ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ法やＣｅｌｌＳｐｏｔ法では、細孔を有する膜上に細胞を播種し、細胞より分泌された産生物質が膜を透過し、底面の固体表面やビーズに結合した産生物質のフットプリントを指標に、その上部に存在する分泌細胞を特定するが、膜上に播種された細胞はランダムに落下するため、必ずしも均等に単一に分散されるとは限らず、複数の細胞が細胞塊を形成することが避けられないため、細胞の単一性を確保することが困難であった。 【００１６】
また、膜上の細胞は固定されておらず、操作中に所定の位置から移動し、喪失するリスクがあるという問題があった。【００１７】
一方、細胞を膜上の確定した位置に固定させるため、メチルセルロースや任意のポリマーなどの半固形物質を使用することがあるが、ポリマーにより細胞を固定することにより、細胞生存率が減少するリスクがあるという問題があった。【００１８】
また、トランスウェルの細孔膜は、ランダムに細孔が形成されており、細孔が膜全体に均等に存在しているというわけではなく、細胞が落下した位置の直下にある細孔が均等というわけではなく、細胞が存在する位置に細孔が存在しない場合や、細孔数が偏っており、細胞から分泌された産生物質の膜透過量の均等性が確保できないという問題があった。【００１９】
また、マイクロタイタープレートの底面あるいはタンパク質を結合させたビーズが敷き詰められた底面と、トランスウェルとの距離は、数百μｍから数ｍｍ離れており、分泌物とその反応面が近接しておらず、分泌物が拡散するために、明瞭なフットプリントを形成できないという問題があった。【００２０】
また、フットプリントの分析のため一旦トランスウェルを除去し、フットプリントを確認後に再度トランスウェルを精度よく当初の位置に設置しなければ、フットプリントによるその上部の分泌細胞の特定と回収は困難であるという問題があった。【００２１】
ＣｅｌｌＳｐｏｔ法では、膜タンパク質を溶解しビーズに結合させる必要があるが、膜タンパク質を可溶性に調製するのが困難であり、膜タンパク質結合ビーズの調製が難しいという問題があった。【００２２】
また、特許文献４に記載の方法では、結合性物質として、細胞表面に存在する膜タンパク質を用いる場合には、細胞を格納したウェル周辺で膜タンパク質発現細胞を培養する必要があるが、細胞を格納したウェル上で膜タンパク質発現細胞を培養すると膜タンパク質発現細胞がウェルを塞いでしまうという問題があった。【００２３】
また、産生物質を産生する細胞と、膜タンパク質発現細胞とが混在する蓋然性や、目的とする細胞の回収時にコンタミネーションが生じる恐れも高いという問題があった。【００２４】
本発明は、少なくとも上記いずれかの事情に鑑みてなされたものであり、一態様において、目的の分泌物を分泌する細胞を簡便かつ高効率に選別可能な方法、構造体、又は該構造体の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、非限定的な具体的態様において、例えば、以下の発明に関する。
本発明の第一の態様は、第一の基板と、前記第一の基板の一方側に対向するように配置された第二の基板を含む構造体であって、前記第一の基板は、前記第一の基板の他方側に開口し、細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有し、前記第二の基板は、前記分泌物が前記連通孔を移動して蓄積する蓄積部を備えることができ、前記蓄積部は、前記凹部と対応し得る構造体である。【００２６】
本発明の第二の態様は、第一の基板と、前記第一の基板の一方側に対向するように配置された、分泌物を分泌する第一の細胞を備えることができる第二の基板を含む構造体であって、前記第一の基板は、前記第一の基板の他方側に開口し、第二の細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記第一の細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有し、前記第二の細胞は前記第一の細胞から分泌される分泌物に応答する細胞である、構造体である。【００２７】
本発明の第三の態様は、第一の支持体上に、第一の硬化性樹脂組成物を塗布して第一の硬化性樹脂膜を形成し、第二の基板を得る工程１と、第二の支持体上に、溶解可能な下地膜を形成し、該下地膜上に第二の硬化性樹脂組成物を塗布して第二の硬化性樹脂膜を形成し、該第二の硬化性樹脂膜に連通孔をパターニングして、連通孔がパターニングされた支持層を得る工程２と、前記支持層上に、第三の硬化性樹脂組成物を塗布して第三の硬化性樹脂膜を形成し、該第三の硬化性樹脂膜に凹部をパターニングして、凹部がパターニングされた第一の基板を得る工程３と、前記下地膜を溶解して、前記第二の支持体から前記第一の基板を剥離する工程４と、前記第一の基板と前記第二の基板とを接合させる工程５と、を含む、構造体の製造方法である。【００２８】
本発明の第四の態様は、複数の細胞から、分泌物を分泌する目的の細胞を選別する、細胞の選別方法であって、細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有する第一の基板に、前記細胞を分散させて、前記細胞を、前記凹部に捕捉させる工程Ａと、前記細胞から前記分泌物を分泌させ、前記分泌物を前記連通孔から移動させ、前記連通孔を介して移動した前記分泌物を第二の基板の蓄積部に蓄積させる工程Ｂと、
前記蓄積部に生じる変化を検出する工程Ｃと、前記検出結果を指標に、目的の細胞を特定する工程Ｄと、を含む、細胞の選別方法である。【００２９】
本発明の第五の態様は、本発明の細胞の選別方法で特定した目的の細胞を回収することを含む、目的の細胞の製造方法である。【００３０】
本発明の第六の態様は、分泌物の産生方法であって、細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有する第一の基板に、あらかじめ取得した所望の分泌物を分泌し得る細胞集団を分散させて、前記凹部に細胞を捕捉させる工程ａと、前記細胞から前記分泌物を分泌させ、前記分泌物を前記連通孔から移動させ、前記連通孔を介して移動した前記分泌物を第二の基板の蓄積部に蓄積させる工程ｂと、前記蓄積部に生じる変化を検出する工程ｃと、前記検出結果を指標に、目的の細胞を特定する工程ｄと、前記目的の細胞を回収して培養することで分泌物を産生させる工程ｅ１、又は、前記目的の細胞において前記分泌物をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、前記ポリヌクレオチドが発現するように別の宿主細胞を培養することで分泌物を産生させる工程ｅ２と、を含む、産生方法である。【００３１】
本発明の第七の態様は、本発明の構造体の製造における硬化性樹脂組成物の使用である。【００３２】
本発明の第八の態様は、一方側に開口し、細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有する、基板であって、前記基板は、前記分泌物が前記連通孔を移動して蓄積する蓄積部を備えることができ、前記蓄積部は、前記凹部と対応し得る第二の基板と組み合わせて使用するための、基板である。【００３３】
本発明の第九の態様は、本発明の基板を含む、構造体である。
【発明の効果】
【００３４】
一態様における本発明によれば、目的の分泌物を分泌する細胞を簡便かつ高効率に選別可能な方法、構造体、又は該構造体の製造方法等を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の構造体の一実施形態を示す概略図である。
【図２】本発明の構造体の一実施形態を示す斜視図である。
【図３】本発明の構造体の一実施形態を示す概略図である。
【図４】本発明の構造体の一実施形態を示す概略図である。
【図５】本発明の構造体の一実施形態を示す概略図である。
【図６】本発明の構造体の製造方法の一実施形態の工程を説明する図である。
【図７】本発明の細胞の選別方法の一実施形態の工程を説明する図である。
【図８】本発明の細胞の選別方法の一実施形態の工程を説明する図である。
【図９】本発明の細胞の選別方法の一実施形態の工程を説明する図である。
【図１０】本発明の細胞の選別方法の一実施形態の工程を説明する図である。
【図１１】実施例の結果を示す図である。
【図１２】実施例の結果を示す図である。
【図１３】実施例の結果を示す図である。
【図１４】実施例の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明の好ましい非限定的な態様を説明する。
【００３７】
≪構造体≫
［第一実施形態］
本実施形態の構造体１は、第一の基板１０と、前記第一の基板１０の一方側に対向するように配置された第二の基板２０を含む構造体であって、前記第一の基板１０は、前記第一の基板１０の他方側に開口し、細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部１１を複数有し、前記凹部１１の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔１２を有し、前記第二の基板２０は、前記分泌物が前記連通孔１２を移動して蓄積する蓄積部１３を備えることができ、前記蓄積部１３は、前記凹部１１と対応し得る。
【００３８】
構造体１は、細胞を分散させて、前記細胞を、前記凹部１１に捕捉させ、前記細胞から分泌された分泌物を、前記連通孔１２を介して前記蓄積部１３に蓄積させ、前記蓄積部１３に生じる変化を検出するために用いられるものであることが好ましい。
【００３９】
＜細胞を格納するための凹部を備えた第一の基板＞
図１に示すように、第一の基板１０は、凹部１１がパターニングされた層１０ａと、連通孔１２がパターニングされた層１０ｂとからなる。
構造体１は、例えば図２に示すように、複数個の凹部１１が同一間隔で縦横に配置されていてよい。
第一の基板の厚さは、５〜１００μｍが好ましく、１０〜５０μｍがより好ましい。
【００４０】
図２中、Ｂは細胞１単位を表す。図２に示すように、凹部１１の形状は、細胞１単位を捕捉可能な形状であれば特に制限はない。凹部１１の形状は、円筒形であってもよく、円筒形以外に、複数の面により構成される多面体(例えば、直方体、六角柱、八角柱等)、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であってもよく、これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状であってもよい。
【００４１】
例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であってもよい。また、逆円錐形、逆角錐形の場合、底面が凹部１１の開口となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状であってもよい（その場合、凹部の底部は平坦になる）。円筒形、直方体は、凹部１１の底部は通常、平坦であるが、曲面（凸面や凹面）であってもよい。凹部の底部を曲面とすることができるのは、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合も同様である。 
【００４２】
本実施形態において細胞１単位とは、細胞１個又は同一の形質を示す細胞の１塊を意味してよく、このような細胞の１塊には、少なくとも二以上の細胞が含まれ得る。即ち、例えば、細胞１単位は、同一の細胞に由来するコロニー１個であってもよい。
【００４３】
凹部１１の寸法は、凹部１１に格納しようとする細胞の直径と凹部１１の寸法の好適な比を考慮して適宜決定することができるが、パターニングされ、形態、その密度等が制御されていることが好ましい。
また、凹部１１の形状や寸法は、凹部１１に格納されるべき細胞の種類（細胞の形状や寸法等）を考慮して、１つの凹部に１単位の細胞が格納されるように、適宜決定することができる。
１つの凹部に、例えば１つの細胞が格納されるようにするためには、凹部１１の平面形状に内接する最大円の直径が、凹部１１に格納しようとする細胞の直径の０．５〜２倍の範囲であることが好ましく、０．８〜１．９倍の範囲であることがより好ましく、０．８〜１．８倍の範囲であることが更に好ましい。
また、凹部１１の深さは、凹部１１に格納しようとする細胞の直径の０．５〜４倍の範囲であることが好ましく、０．８〜１．９倍の範囲であることがより好ましく、０．８〜１．８倍の範囲であることが更に好ましい。
第一の基板１０が有する凹部１１の数は、特に制限はないが、１ｃｍ２当たり、例えば、２，０００〜１，０００，０００個の範囲であることが好ましい。
第一の基板１０が有する凹部１１の開口率は、特に制限はないが、例えば、１〜９０％の範囲であることが好ましい。
凹部１１が円筒形の場合、その寸法は、直径１〜１００μｍが好ましく、直径２〜５０μｍがより好ましく、直径３〜２５μｍが更に好ましく、直径４〜２０μｍが特に好ましい。
また、凹部１１が円筒形の場合、その深さは、１〜１００μｍが好ましく、２〜７０μｍがより好ましく、３〜５０μｍが更に好ましく、４〜３０μｍが特に好ましい。深さが１μｍ以上の場合、細胞が捕捉されやすく、実用化の観点から好ましい。また、１００μｍ以下の場合、複数の細胞が捕捉されるおそれがないため、好ましい。
【００４４】
第一の基板１０の凹部１１が捕捉する細胞１単位を構成する細胞は、分泌物を分泌する細胞であれば特に限定されず、例えば動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ラクダ、サル、トリ、サメ由来の細胞）；植物細胞；昆虫細胞；酵母等の真菌；大腸菌等の細菌等が挙げられる。
また、これらの細胞に分泌性タンパク質、分泌性ポリペプチド又は分泌シグナルを挿入したタンパク質、ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した発現株も挙げられる。
分泌物は天然由来であってもよいし、遺伝子工学を利用した非天然のものであってもよい。
分泌物としては、限定はされないが、単一の分泌物であることが好ましく、免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）や免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、インターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５等）、ケモカイン、インターフェロン（ＩＦＮ−γ等）、造血因子（コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン等）、細胞増殖因子（上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子等）、細胞傷害因子（腫瘍壊死因子、リンフォトキシン）、アディポカイン（脂肪組織から分泌されるレプチン、腫瘍壊死因子等）、神経栄養因子（神経成長因子等）等のサイトカイン、抗生物質や色素等微生物の代謝産物、上記分泌細胞が分泌するペプチドホルモンやステロイドホルモン、微生物ホルモン、分泌性タンパク質又は分泌シグナルを挿入したタンパク質等が挙げられてよい。あるいはこれらを遺伝子工学的に改変したものであってもよい。一実施態様において、分泌物は、抗体分子であることが好ましい。
天然由来の抗体分子としては免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）や免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）が挙げられてもよい。
また、非天然由来の抗体分子としては、ＦａｂやｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ等の抗体断片、単ドメイン抗体（Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ、９１１、２０１２）、抗体様の性質を有する人工蛋白質分子（Ｓｋｒｌｅｃ Ｋ, Ｓｔｒｕｋｅｌｊ Ｂ, Ｂｅｒｌｅｃ Ａ. Ｎｏｎ―ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ： ａ ｆｏｃｕｓｏｎ ｔｈｅｉｒ ｔａｒｇｅｔｓ., Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. 、２０１５、Ａｐｒ ２７）等が挙げられてよい。
【００４５】
本実施形態において使用できる細胞として、抗体分子を分泌する細胞、サイトカイン産生細胞やホルモン分泌細胞も挙げられる。
抗体分子を分泌する細胞としては、限定はされないが、天然由来分子の場合はＢ細胞等の抗体産生細胞やミエローマ細胞と融合したハイブリドーマ、抗体分子をコードするポリヌクレオチドを導入した発現細胞等の動物細胞が挙げられる。非天然由来分子の場合は動物細胞以外に酵母等の真菌、大腸菌等の細菌等が挙げられる。
サイトカイン産生細胞としては、限定はされないが、 マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、肝クッパー細胞、ストローマ細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞等が挙げられる。
ホルモン分泌細胞としては、限定はされないが、脳下垂体前葉細胞、ソマトトロピン産生細胞、ラクトトロピン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、コルチコトロピン産生細胞、中間下垂体細胞、メラニン細胞刺激ホルモンを分泌する細胞、オキシトシン分泌細胞、バソプレッシン分泌細胞、セロトニン分泌細胞、エンドルフィン分泌細胞、ソマトスタチン分泌細胞、ガストリン分泌細胞、セクレチン分泌細胞、コレシストキニン分泌細胞、インスリン分泌細胞、グルカゴン分泌細胞、ボンベシン分泌細胞、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸素性細胞、副腎腺細胞、クロム親和性細胞、ステロイドホルモン（鉱質コルチコイド又は糖質コルチコイド）産生細胞、テストステロン分泌細胞、エストロゲン分泌細胞、プロゲステロン分泌細胞、腎臓の傍糸球体装置の細胞、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の周血管極細胞、又は、腎臓のメサンギウム細胞等が挙げられてよい。
【００４６】
＜連通孔＞
連通孔１２の寸法は、凹部１１に格納しようとする細胞１単位の直径と凹部１１の寸法と連通孔１２を移動させるべき分泌物の寸法の好適な比を考慮して適宜決定することができるが、パターニングされ、形態、細孔の径、その密度等が制御されていることが好ましい。連通孔が制御されている場合、細胞から分泌された分泌物の透過量の均等性を確保しやすいため好ましい。
詳細には、連通孔１２の数、位置、形状、大きさ等は、細胞１単位は通過せずに格納することができ、細胞からの分泌物が移動可能な大きさであれば、特に限定されないが、パターニングされ、形態、細孔の径、その密度等が制御されたものであることが好ましい。
例えば、図２に示すように、凹部１１が円筒状である場合には、凹部１１の底部に、凹部１１の直径よりも小さい直径の円筒状の連通孔１２を複数個設けてもよい。また、図４に示すように、凹部１１が円筒状である場合には、凹部１１の底部に、図４（ａ）〜（ｄ）の１２ａ〜１２ｄに示すような形状の連通孔を設けてもよい。例えば、連通孔１２が円状の場合、その直径は１０〜２，０００ｎｍが好ましく、１００〜１，５００ｎｍがより好ましく、２００〜１，０００ｎｍが更に好ましい。連通孔１２が柵状の場合、その幅は１０〜２，０００ｎｍが好ましく、１０〜１，５００ｎｍがより好ましく、１０〜１，０００ｎｍが更に好ましい。連通孔１２が格子状の場合、一辺は１０〜２，０００ｎｍが好ましく、１０〜１，５００ｎｍがより好ましく、１０〜１，０００ｎｍが更に好ましい。連通孔のアスペクト比は１〜１０が好ましく、１〜５がより好ましい。
【００４７】
＜細胞から分泌される分泌物が蓄積する蓄積部を備えることができる第二の基板＞
本実施形態の構造体１は、図１に示すように、第一の基板１０が捕捉した細胞１単位から分泌される分泌物が蓄積する蓄積部１３を備えることができる第二の基板２０を有する。
本実施形態において、「分泌物が蓄積する」とは、分泌物が蓄積部に接触、滞留、結合、集合及び／もしくは集積することを意味してよい。分泌物が蓄積部に接触等することにより、蓄積部１３における何らかの変化を検出することが可能となる。本明細書において、分泌物と接触等することにより蓄積部１３に何らかの変化が生じることを「分泌物に応答する」といってもよい。例えば、蓄積部１３が細胞を含むものである場合、分泌物に対する応答態様としては、分泌物に接触することで、例えば、蓄積部１３に備えられた細胞の形態が変化する、細胞が死亡する、細胞の増殖能が変化する、細胞内の物質量（イオン、ｐＨ等）が変化する、細胞内の遺伝子の転写が活性化する、等の態様が挙げられてよい。
【００４８】
なお、第一の基板１０に補足される分泌細胞としては、例えば、フィーダー細胞（例えば、マウス胎仔由来線維芽細胞、ＪＫ１細胞、ＳＮＬ７６／７細胞、あるいはこれらを遺伝子工学的に改変した細胞）を使用することができ、その場合には、蓄積部１３に含められる細胞としては、例えば、分化能を有する細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞、生体由来幹細胞、あるいはこれらを遺伝子工学的に改変した細胞）を使用してもよい。
【００４９】
第二の基板２０は、基板本体２１と、第一の基板１０を支持するピラー２２と、蓄積部１３とを含む。尚、構造体１において、第一の基板１０を支持する手段があればピラーは存在しなくともよい。あるいは、ピラーが存在する場合、第一の基板１０を支持し、本発明の目的を達成できる限り、ピラーの数、位置、形状、大きさ等は特に限定されないことが当業者には理解できる。
【００５０】
本実施形態の構造体１を用いて、第一の基板１０の凹部１１に格納された細胞１単位が分泌する分泌物の評価を、第二の基板２０で迅速に行うためには、第二の基板２０における分泌物の評価位置と、分泌物を分泌する細胞の位置が（より好ましくは１対１で）対応していることが好ましい。
即ち、本実施形態の構造体１は、ピラー等の第一の基板１０を支持する手段により、第一の基板１０と第二の基板２０の位置が固定されていることが好ましい。
【００５１】
蓄積部１３は、第一の基板１０が捕捉した細胞１単位から分泌される分泌物と親和性を有する物質を含むことが好ましい。
「親和性を有する」とは、直接的、又は、別の分子を介して間接的に、結合することを意味してよい。
蓄積部１３が含む「物質」は、細胞から分泌される分泌物と結合するあらゆるものを意味してよく、細胞 、ポリヌクレオチド、抗体、ペプチド、タンパク質等の生体高分子又は種々の化学物質を含んでよい。細胞としては、＜細胞を格納するための凹部を備えた第一の基板＞で挙げたものと同様のものが挙げられる。
例えば、分泌物が抗体である場合には、蓄積部１３が含む「物質」は、抗原に該当するあらゆるものが含まれ、ペプチドやタンパク質が好ましく挙げられる。係る場合、蓄積部１３としては、抗原ペプチド又は抗原タンパク質の固定層が挙げられる。
また、蓄積部１３は、抗原を外因的又は内因的に発現している細胞を敷き詰めた細胞層であってもよい。抗原の発現部位が核内又は細胞質内である場合、細胞膜を溶解又は破砕して、抗原を露呈させたものを用いることが好ましい。また、細胞膜上に抗原を外因的又は内因的に発現している細胞を用いてもよい。係る場合、細胞膜を溶解又は破砕せずとも抗体が抗原にアクセスできるという観点から優れている。
【００５２】
本実施形態の構造体１は、膜タンパク質に対する抗体産生細胞の選別に好適に用いられる。
本実施形態において、「膜タンパク質」とは、生体膜に付着しているタンパク質を意味する。膜タンパク質は、脂質二重膜を貫通し、又は脂肪酸鎖等によって脂質二重層に結合する膜内在性タンパク質、及び非共有結合によって脂質二重層の親水性部分や他の膜タンパク質に結び付く表在性膜タンパク質を含む。本実施形態において、膜タンパク質は、複数回貫通型であってもよいし、一回貫通型であってもよい。
膜タンパク質としては、ＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役受容体）、リガンド依存性イオンチャネル、電位依存性イオンチャネル、トランスポーター等が挙げられる。
【００５３】
第二の基板２０は、蓄積部１３に非特異的に結合した物質を除去するための流路構造を有することが好ましい。例えば図３に示すように、構造体（構造体２）は、連結口４ａ及び４ｂを有していてもよい。
更に、該流路構造は、前記蓄積部に生じる変化を検出するための検出用物質、例えば、蓄積部１３に結合した分泌物を検出するための検出用物質を通液するためのものであってもよい。
例えば、分泌物を検出する際には、連結口４ａから洗浄液を通液し、蓄積部１３に非特異的に結合した物質を連結口４ｂから排出する。次いで、連結口４ａから分泌物を検出するための検出用物質を通液することにより、検出用物質を分泌物に結合させる。次いで、連結口４ａから洗浄液を通液し、未結合の検出用物質を連結口４ｂから排出する。
第二の基板２０が係る流路構造を有することにより、蓄積部１３に結合した分泌物を簡便に検出することができる。
尚、分泌物を検出するための検出用物質は、連結孔１２を介して、第一の基板から第二の基板へ、培地等とともに通液されてもよい。
検出用物質としては、蓄積部に含まれる分泌物認識部位とは異なる分泌物認識部位を有する、標識された物質であることが好ましい。例えば、分泌物が抗体である場合には、検出用物質としては、例えば抗体のＦｃ部分等に特異的な標識２次抗体が挙げられてよい。
標識としては、酵素標識、蛍光標識、ビオチンや放射性物質での標識が挙げられてよい。
【００５４】
また、蓄積部１３として、細胞を用いる場合、第二の基板２０の流路構造は、細胞を培養するための培養液の流路となり得る。
膜タンパク質を抗原とする抗体産生細胞の選別に構造体を用いる場合には、蓄積部が膜タンパク質発現細胞を含む層であることが好ましく、膜タンパク質発現細胞からなる層であることがより好ましい。
膜タンパク質に対するモノクローナル抗体を得るためには、膜タンパク質が本来の立体構造を保持したまま、実験動物を免疫する必要がある。しかし、細胞膜から膜タンパク質を抽出する際に、界面活性剤を使用すると膜タンパク質の立体構造が崩れる、一方界面活性剤を使用しないと膜タンパク質が疎水性領域同士で凝集する、などの問題が生じ得るため、抗原として立体構造を保った膜タンパク質を容易に調製することは一般にできない。
これに対して、細胞の細胞膜表面に発現している膜タンパク質自体を抗原として用いることにより、立体構造を保持したままの状態で、分泌される抗体との複合体を形成させて、分泌抗体の力価を評価することができる。
膜タンパク質発現細胞としては、目的の膜タンパク質が元々高発現している細胞を用いてもよいし、人為的に目的の膜タンパク質を強制発現させた細胞株を用いてもよい。人為的に目的の膜タンパク質を強制発現させた細胞株としては、一過的発現細胞株と安定的発現細胞株が挙げられるが、取扱いが容易である点から、安定的発現細胞株を用いることが好ましい。
【００５５】
本実施形態において、第一の基板と第二の基板は同一の液体（典型的には、例えば培地、あるいは、ＰＢＳや生理食塩水等のバッファー等であってもよい。）で満たされており、連結孔を介して、第一の基板から第二の基板へ、第二の基板から第一の基板へ液体が通液する。通液の過程で、培地中の物質（例えば、分泌物）が第一の基板と第二の基板とを行き来する。
本実施形態の構造体は、例えば図５に示す様に、第一の基板で細胞Ｂを捕捉し、細胞Ｂからの分泌物Ｃが連通孔を通過して、第二の基板に移動するため、細胞Ｂと細胞Ｂからの分泌物Ｃとの分離が可能である。そのため、第一の基板１０で捕捉する細胞Ｂと、細胞Ｂからの分泌物Ｃを結合させる膜タンパク質発現細胞Ｄとを分離して培養することが可能である。
【００５６】
従って、本実施形態の構造体によれば、分泌物と親和性を有する物質として、膜タンパク質を細胞表面に露出させた膜タンパク質発現細胞を用いる場合に、細胞Ｂと、膜タンパク質発現細胞Ｄとが混在する蓋然性が低く、培養時にコンタミネーションが生じる恐れも低いため、膜タンパク質発現細胞を用いた抗体産生細胞のスクリーニングに特に有用である。
また、膜タンパク質発現細胞と分泌物を分泌する細胞は異なる層で培養するため、即ち、従来は一体となっていた培養系と検出系を、培養系と検出系とに分離したため、従来のマイクロウェルアレイを用いたスクリーニングで問題となっていた、膜タンパク質発現細胞がウェルを塞いでしまうという現象も生じない。
【００５７】
本実施形態の構造体によれば、細胞１単位が格納可能な配列された凹部を有する場合には、播種された細胞が凹部に格納され均等に単一に配置されるため、従来のトランスウェルの膜で問題となっていた、膜上に播種された細胞を均等に単一に分散させることが出来ないという問題も生じない。
【００５８】
本実施形態の構造体によれば、細胞１単位を凹部に格納することにより、確定された位置に固定する場合には、細胞１単位を固定するための物質を必要としないため、固定するためのポリマーやメチルセルロースなどの物質を使用する方法によって問題となっていた、細胞の生存率の低下という問題も生じない。
【００５９】
本実施形態の構造体によれば、細胞１単位が格納された凹部の連通孔は、パターニングされ、形態、細孔の径、その密度等が制御される場合には、細胞１単位より分泌された分泌物の透過量の均等性が確保されるため、従来のトランスウェルの膜で問題となっていた、細胞が落下した位置の直下にある細孔が均等というわけではなく、細胞が存在する位置に細孔が存在しない場合や、細孔数が偏っており、細胞から分泌された産生物質の膜透過量の均等性が確保できないという問題も生じない。
【００６０】
また、本実施形態の構造体によれば、第一の基板と第二の基板の間隔が数μｍ〜数十μｍに固定されている場合には、拡散される分泌物が狭小領域に高濃度に集積されるため、標識物質による分泌物の検出に際しシグナルが明瞭となり、検出感度が向上する。
【００６１】
また、本実施形態の構造体によれば、第一の基板と第二の基板の位置が固定されている場合には、トランスウェルを用いたＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ法やＣｅｌｌＳｐｏｔ法で問題となっていた、操作中に細胞が移動・喪失するという問題や、分泌細胞とその産生物質によるフットプリントの位置がずれるという現象も生じない。
【００６２】
従来の構造体において、凹部への細胞の格納は、細胞の重量による自然落下や遠心力による強制的な落下によって行われていたが、格納率が低いことが問題となっていた。本実施形態の構造体によれば、凹部から連通孔への液体の流れが生じ得るため、液体の流れにより細胞が容易に凹部に格納され、格納率が向上する。 
【００６３】
従来の構造体において細胞の回収を試みる際、凹部からの吸引では細胞そのものを巻き込んだ液体の流れを作ることが難しく、目的細胞の回収の成功率が低いことが問題となっていた。一方、本実施形態の構造体によれば、凹部の連通孔を通して第二の基板からの液体の流れが生じ得るため、従来の構造体に比べて、細胞の回収成功率が向上する。
【００６４】
本実施形態の構造体の材質は、特に限定されないが、細胞の観察を容易とする観点から、透明性のある材質であることが好ましい。中でも、基板本体２１及び層２１ａの材質が透明性のある材質であることが好ましい。
あるいは、例えば、蓄積部１３に生じる何らかの変化を、蛍光観察を指標として観察する場合には、自家蛍光の少ない材質であることが好ましい。具体的には、ガラス、ＰＥＴ、ＰＭＭＡ、ＰＣ、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、エポキシ等の透明性があり、自家蛍光が少ない一般的な樹脂を用いることができる。また、本実施形態の構造体の材質は、細胞培養の観点から、細胞毒性を有さず、親水化処理されたものであることが好ましい。
本実施形態の構造体は、細胞１単位を捕捉し得る大きさの凹部、及び細胞からの分泌物が移動可能な大きさの連通孔を形成する観点から、微細加工が容易である硬化性樹脂組成物（以下、「感光性樹脂組成物」ということがある。）を用いて重合したものであることが好ましい。
【００６５】
硬化性樹脂組成物としては、紫外線等の活性エネルギー線を照射することにより架橋して硬化する性質を有するものであり、ネガタイプのフォトレジスト、ネガタイプのドライフィルムレジスト、微細な構造を有する微小樹脂成形等に使用されるものが好ましい。ここで、樹脂パターンとは、硬化性樹脂組成物をフォトリソグラフィ法によって所望の形状に硬化させた硬化物のことである。
【００６６】
硬化性樹脂組成物を、微小樹脂成形等の用途として使用する場合、まず、樹脂パターンを形成させる基材の表面に硬化性樹脂組成物を塗布し、硬化性樹脂組成物に含まれる溶剤成分を揮発させて樹脂膜を作製する。次いで、その樹脂膜の表面に、形成させるパターンの形状となるフォトマスクを載置し、紫外線等の活性エネルギー線を照射する。その後、現像工程、及び必要ならばポストベーク工程を経ることにより、基材の表面に樹脂パターンが形成される。この樹脂パターンを、本実施形態の構造体に使用することができる。
このような硬化性樹脂組成物としては、例えば、エポキシ官能性ノボラック樹脂と、トリアリールスルホニウム塩等のカチオン系光重合開始剤と、エポキシ官能基と反応可能な希釈剤とを含み、完全に硬化して、剥離しにくい樹脂となる光硬化性組成物；多官能性ビスフェノールＡホルムアルデヒド−ノボラック樹脂と、酸発生剤であるトリフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネートと、溶剤のＰＧＭＥＡとを含み、厚膜形成可能な樹脂となる光硬化性組成物等、微小樹脂成形に一般的に用いられる樹脂組成物を採用できる。
さらに、エポキシ樹脂と特定の酸発生剤とを組み合わせて感光性（硬化性）樹脂組成物を調製し、この硬化性樹脂組成物を使用して樹脂パターンを形成すれば、高感度で、加熱硬化時の体積収縮が小さく、アスペクト比が高い形状の樹脂パターンを形成できる。
【００６７】
硬化性（感光性）樹脂組成物としては、例えば、（ａ）多官能エポキシ樹脂と、（ｂ）カチオン重合開始剤と、を含む感光性樹脂組成物が挙げられる。
【００６８】
［（ａ）多官能エポキシ樹脂］
本実施形態で使用される多官能エポキシ樹脂は、一分子中に２個以上のエポキシ基を有する樹脂であり、硬化性樹脂組成物で形成された樹脂膜を硬化させるのに十分な数のエポキシ基を一分子中に含むエポキシ樹脂であれば、どのようなエポキシ樹脂でもよい。このような多官能エポキシ樹脂としては、フェノールノボラック型エポキシ樹脂、オルトクレゾールノボラック型エポキシ樹脂、トリフェニル型ノボラック型エポキシ樹脂、ビスフェノールＡノボラック型エポキシ樹脂が好ましい。
【００６９】
多官能エポキシ樹脂の一分子中に含まれるエポキシ基の数である官能性は、２以上であることが好ましく、３〜１２であることがより好ましい。多官能エポキシ樹脂の官能性が３以上であることにより、高いアスペクト比と解像性を有する樹脂パターンを形成することができるので好ましく、多官能エポキシ樹脂の官能性が１２以下であることにより、樹脂合成の制御が容易となり、また樹脂パターンの内部応力が過剰に大きくなることを抑制できるので好ましい。
【００７０】
多官能エポキシ樹脂の質量平均分子量は、３００〜５０００であることが好ましく、５００〜４０００であることがより好ましい。多官能エポキシ樹脂の質量平均分子量が３００以上であることにより、硬化性樹脂組成物が活性エネルギー線照射によって硬化する前に熱フローしてしまうことを抑制できる点で好ましく、多官能エポキシ樹脂の質量平均分子量が５０００以下であることにより、パターニング現像時の適当な溶解速度を得ることができる点で好ましい。
【００７１】
感光性樹脂組成物中における上記多官能エポキシ樹脂の含有量は、全固形分中、１０質量％〜９９．９質量％であることが好ましく、３０質量％〜９９．９質量％であることがより好ましい。これにより、基板上にコーティングした際に、高感度で適当な硬度の感光性樹脂膜が得られる。
【００７２】
［（Ｂ）カチオン重合開始剤］
次に、カチオン重合開始剤について説明する。本実施形態で使用されるカチオン重合開始剤は、紫外線、遠紫外線、ＫｒＦ、ＡｒＦ等のエキシマレーザー光、Ｘ線、電子線等といった活性エネルギー線の照射を受けてカチオンを発生し、そのカチオンが重合開始剤となり得る化合物である。
【００７３】
このようなカチオン開始剤としては、例えば、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−メチルフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−（β−ヒドロキシエトキシ）フェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−メチル−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（３−メチル−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−フルオロ４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−メチル−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２，３，５，６−テトラメチル−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２，６−ジクロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２，６−ジメチル−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２，３−ジメチル−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−メチル−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（３−メチル−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−フルオロ４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−メチル−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２，３，５，６−テトラメチル−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２，６−ジクロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２，６−ジメチル−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２，３−ジメチル−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−アセチルフ���ニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−（４−メチルベンゾイル）フェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−（４−フルオロベンゾイル）フェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−（４−メトキシベンゾイル）フェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−ドデカノイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−アセチルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−（４−メチルベンゾイル）フェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−（４−フルオロベンゾイル）フェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−（４−メトキシベンゾイル）フェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−ドデカノイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−アセチルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−（４−メチルベンゾイル）フェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−（４−フルオロベンゾイル）フェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−（４−メトキシベンゾイル）フェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−ドデカノイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムヘキサフルオロホスフェート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムテトラフルオロボレート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムパークロレート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルジフェニルスルホニウムトリフルオロメタンスルホネート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロホスフェート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムテトラフルオロボレート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムパークロレート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムトリフルオロメタ���スルホネート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムｐ−トルエンスルホネート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムカンファースルホネート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムノナフルオロブタンスルホネート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロホスフェート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムテトラフルオロボレート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムパークロレート、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−クロロフェニル）スルホニウムトリフルオロメタンスルホネート、ジフェニル［４−（フェニルチオ）フェニル］スルホニウムトリフルオロトリスペンタフルオロエチルホスファート、ジフェニル［４−（ｐ−ターフェニルチオ）フェニル］スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、ジフェニル［４−（ｐ−ターフェニルチオ）フェニル］スルホニウムトリフルオロトリスペンタフルオロエチルホスファート等が挙げられる。これらの化合物のうち、４−（２−クロロ−４−ベンゾイルフェニルチオ）フェニルビス（４−フルオロフェニル）スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート（株式会社ＡＤＥＫＡ製、アデカオプトマーＳＰ−１７２）、ジフェニル［４−（フェニルチオ）フェニル］スルホニウムトリフルオロトリスペンタフルオロエチルホスファート（サンアプロ株式会社製、ＣＰＩ−２１０Ｓ）、ジフェニル［４−（ｐ−ターフェニルチオ）フェニル］スルホニウムヘキサフルオロアンチモネート、ジフェニル［４−（ｐ−ターフェニルチオ）フェニル］スルホニウムトリフルオロトリスペンタフルオロエチルホスファート（サンアプロ株式会社製、ＨＳ−１ＰＧ）が好ましい。
【００７４】
硬化性樹脂組成物におけるカチオン重合開始剤の含有量は、０．１〜１０質量％が好ましく、０．５〜５質量％であることがより好ましい。硬化性樹脂組成物におけるカチオン重合開始剤の含有量が０．１質量％以上であれば、硬化性樹脂組成物の活性エネルギー線露光による硬化時間を適切なものとすることができるので好ましい。また、硬化性樹脂組成物におけるカチオン重合開始剤の含有量が１０質量％以下であれば、活性エネルギー線による露光後の現像性を良好なものとできるので好ましい。なお、上記含有量は、硬化性樹脂組成物が後述する溶剤成分を含まないとした場合のものである。したがって、硬化性樹脂組成物が後述する溶剤成分を含む場合には、溶剤成分の質量を除いた後におけるカチオン重合開始剤の含有量が上記含有量の範囲となるようにすればよい。
その他、硬化性樹脂組成物の詳細については、特開２００８−１８０８７７号公報、特開２０１１−１１１５８８号公報等に記載の当業者公知の方法に基づいて実施可能であることが当業者には当然に理解される。
【００７５】
第二の基板２０に蓄積部１３を形成するため、例えば基板本体２１を分泌物に親和性を有する層２１ａで被覆してもよい（図５参照。）。層２１ａとしては、表面改質剤、界面活性剤等で表面処理してなる層が挙げられる。表面改質剤の例としては、シランカップリング剤が挙げられる。
【００７６】
蓄積部１３として、タンパク質、ペプチドを用いる場合には、層２１ａとしては、アミノプロピルトリエトキシシラン等で処理して表面にアミノ基を導入してなる層が挙げられる。
【００７７】
蓄積部１３として、膜タンパク質安定発現細胞等の細胞を用いる場合には、層２１ａとしては、基板本体２１をポリリジン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン等の生体分子でコートしてなる層が挙げられる。
【００７８】
［第二実施形態］
本実施形態の構造体は、第一の基板と、前記第一の基板の一方側に対向するように配置された、分泌物を分泌する第一の細胞を備えることができる第二の基板を含む構造体であって、前記第一の基板は、前記第一の基板の他方側に開口し、第二の細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記第一の細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有し、前記第二の細胞は前記第一の細胞から分泌される分泌物に応答する細胞である。
本実施形態の構造体の構成は、第一の実施形態の構造体１における蓄積部１３が分泌物を分泌する第一の細胞に変わった点以外は同様である。本実施形態の構造体の使用時の実施形態（例えば分泌物の種類など。）についても上記以外は同様である。
【００７９】
第二の細胞としては、第一の細胞から分泌される分泌物に応答するものであれば、特に限定されず、例えば動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ラクダ、サル、トリなどに由来する細胞）；植物細胞；昆虫細胞；酵母等の真菌；大腸菌等の細菌等が挙げられる。
また、これらの細胞に分泌性タンパク質に結合する受容体タンパク質をコードする遺伝子を導入した発現株も挙げられる。
本発明においては、上記細胞のなかでも、動物細胞が好ましい。動物細胞としては、他の細胞からの分泌物に依存して形態変化、分化又は増殖等する細胞が好ましい。例えば、分泌物が分化因子であり、当該細胞の形態変化や分化が分化因子に依存し得る場合には、係る細胞としてはｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞が挙げられてよい。
【００８０】
第一の細胞としては、分泌物を分泌する細胞であれば特に限定されず、第二の細胞と同様に動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ラクダ、サル、トリなどに由来する細胞）；植物細胞；昆虫細胞；酵母等の真菌；大腸菌等の細菌等が挙げられる。
第二の細胞として分化能を有する細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞、生体由来幹細胞、あるいはこれらを遺伝子工学的に改変した細胞）を使用する場合には、第一の細胞はフィーダー細胞（例えば、マウス胎仔由来線維芽細胞、ＪＫ１細胞、ＳＮＬ７６／７細胞、あるいはこれらを遺伝子工学的に改変した細胞）であることが好ましい。
【００８１】
本実施形態においても、第一の基板と第二の基板は同一の液体で満たされており、連通孔を介して、第一の基板から第二の基板へ、第二の基板から第一の基板へ液体が通液する。通液の過程で、液体中の物質（例えば、分泌物）が第一の基板と第二の基板とを行き来する。
【００８２】
分泌物としては、第二の細胞に作用する機能を有するものであれば特に限定されず、第一実施形態で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【００８３】
本実施形態の構造体によれば、第一の基板と第二の基板の間を所定の大きさの分泌物が選択的に行き来する構成を有しているため、例えば、第二の細胞を継代する際に、第一の細胞のコンタミネーションが生じる恐れがない。
【００８４】
≪構造体の製造方法≫
［第三実施形態］
本実施形態の構造体の製造方法は、第一の支持体上に、第一の硬化性樹脂組成物を塗布して第一の硬化性樹脂膜を形成し、第二の基板を得る工程１と、第二の支持体上に、溶解可能な下地膜を形成し、該下地膜上に第二の硬化性樹脂組成物を塗布して第二の硬化性樹脂膜を形成し、該第二の硬化性樹脂膜に連通孔をパターニングして、連通孔がパターニングされた支持層を得る工程２と、前記支持層上に、第三の硬化性樹脂組成物を塗布して第三の硬化性樹脂膜を形成し、該第三の硬化性樹脂膜に凹部をパターニングして、凹部がパターニングされた第一の基板を得る工程３と、前記下地膜を溶解して、前記第二の支持体から前記第一の基板を剥離する工程４と、前記第一の基板と前記第二の基板とを接合させる工程５と、を含む。
【００８５】
＜工程１＞
本工程では、例えば図６の（ｉ）に示すように、第一の支持体２１上に、第一の硬化性樹脂組成物を塗布して、第一の硬化性樹脂膜２２ａを形成し、第一の硬化性樹脂膜２２ａを露光して現像することにより、図６（ｇ）に示すようなピラーパターン２２を形成する。
構造体において、第一の基板を支持する手段があればピラーパターン２２を形成する工程は存在しなくともよい。また、第一の硬化性樹脂組成物の硬化方法は、露光でなくともよく、公知の方法が採用される。
支持体２１としては、例えば、電子部品用の基板が使用できるが、細胞観察の観点から透明な基板であることが好ましく、具体的にはガラス基板を採用することが好ましい。
第一の硬化性樹脂組成物としては、上述の硬化性（感光性）樹脂組成物が挙げられる。
また、第二の基板は、被覆層中の細胞やタンパク質を固定化させるため、第二の基板表面全体に、ＳｉＯ２膜を形成することが好ましい。第二の基板表面全体とは、図６（ｇ）に示すように、ピラーパターン２２の表面及び支持体２１の表面を含む。ＳｉＯ２膜を形成する方法としては、例えばｔｅｔｒａｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓｉｌａｎｅで処理する方法が挙げられる。
【００８６】
＜工程２＞
本工程では、例えば図６（ａ）に示すように、第二の支持体３１上に、溶解可能な下地膜３２を形成し、該下地膜３２上に、第二の硬化性樹脂組成物を塗布して第二の硬化性樹脂膜１０Ｂを形成し、第二の硬化性樹脂膜１０Ｂを露光した後、現像して、図６（ｃ）に示すような連通孔がパターニングされた支持層１０ｂを形成する。
連通孔のパターニング方法は、露光・現像に限られず、インプリント法や誘導自己組織化（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ，ＤＳＡ）技術を用いた方法等も採用できる。また、第二の硬化性樹脂組成物の硬化方法は、露光でなくともよく、公知の方法が採用される。
第二の支持体としては、例えば、電子部品用の基板や、これに所定の配線パターンが形成されたもの等を例示することができる。より具体的には、シリコンウェーハ、銅、クロム、鉄、アルミニウム等の金属製の基板や、ガラス基板等が挙げられる。配線パターンの材料としては、例えば銅、アルミニウム、ニッケル、金等が使用可能である。第二の硬化性樹脂組成物としては、上述の硬化性（感光性）樹脂組成物が挙げられる。
下地膜には、ポリビニルアルコール樹脂、デキストリン、ゼラチン、にかわ、カゼイン、セラック、アラビアゴム、澱粉、蛋白質、ポリアクリル酸アミド、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルメチルエーテル、スチレン系エラストマー、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸との共重合体、酢酸ビニルとイタコン酸との共重合体、ポリビニルピロリドン、アセチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、又はアルギン酸ナトリウム等を用いることができる。これらの材料は、同種の液体に可溶な複数の材料の組み合わせであってもよい。下地膜の強度や柔軟性の観点から、下地膜の材料は、例えば、マンナン、キサンタンガム、又はグアーガム等のゴム成分を含んでいてもよい。
【００８７】
＜工程３＞
本工程では、例えば図６（ｄ）に示すように、支持層１０ｂ上に、第三の硬化性樹脂組成物を塗布して第三の硬化性樹脂膜１０Ａを形成し、該第三の硬化性樹脂膜１０Ａを露光した後、現像して、支持層１０ｂ上に、凹部がパターニングされた第一の基板を得る。第三の硬化性樹脂組成物としては、上述の硬化性（感光性）樹脂組成物が挙げられる。
凹部のパターニング方法は、露光・現像に限られず、インプリント法や誘導自己組織化（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ，ＤＳＡ）技術を用いた方法等も採用できる。また、第三の硬化性樹脂組成物の硬化方法は、露光でなくともよく、公知の方法が採用される。
【００８８】
＜工程４＞
本工程では、例えば剥離剤（例えば、１−メチル−４−イソプロピルシクロヘキサン（ｐ−Ｍｅｎｔｈａｎｅ））に基板ごと浸漬することにより、下地膜を溶解し、第二の支持体３１から第一の基板１０を剥離する。
【００８９】
＜工程５＞
本工程では、例えば上記工程で得られた図６（ｆ）に示す第一の基板及び図６（ｇ）に示す第二の基板を接合させる。接合する際には、支持層１０ｂが第二の基板側になるように、支持層１０ｂをピラー２２上に接合する。接合には、前記硬化性樹脂組成物を接着剤に用いて接着すればよい。
【００９０】
≪細胞の選別方法≫ 
本発明の細胞の選別方法は、複数の細胞から、分泌物を分泌する目的の細胞を選別する、細胞の選別方法であって、細胞１単位（好ましくは、細胞１個）を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有する第一の基板に、前記細胞を分散させて、前記細胞を、前記凹部に捕捉させる工程Ａと、前記細胞から前記分泌物を分泌させ、前記分泌物を前記連通孔から移動させ、前記連通孔を介して移動した前記分泌物を第二の基板の蓄積部に蓄積させる工程Ｂと、前記蓄積部に生じる変化を検出する工程Ｃと、前記検出結果を指標に、目的の細胞を特定する工程Ｄと、を含む。
【００９１】
当該方法は、場合により、更に、前記目的の細胞を回収する工程Ｅを含んでよい。回収した細胞は当業者公知の方法によって培養し、当業者公知の方法に従って、さらなる評価系や分泌物の産生系等に用いることができる。
当該方法は、更に、目的の細胞を培養することで分泌物を産生させる工程Ｆ１、又は、前記目的の細胞において前記分泌物をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、当該ポリヌクレオチドが発現するように別の宿主細胞を培養することで分泌物を産生させる工程Ｆ２を含んでもよい。なお、当該工程Ｆ２では、クローニングされたポリヌクレオチドをさらに改変してから、当該改変されたポリヌクレオチドが発現するように別の宿主細胞を培養することで分泌物を産生させてもよい。
【００９２】
以下、本発明の細胞の選別方法の好ましい実施形態について説明する。
【００９３】
［第四実施形態］
本実施形態の細胞の選別方法は、複数の抗体産生細胞から、特定の抗原に特異的に結合する抗体を分泌する目的の抗体産生細胞を選別する、細胞の選別方法であって、抗体産生細胞１単位（好ましくは、細胞１個）を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記抗体産生細胞から分泌される前記抗体が移動可能な大きさを有する連通孔を有する第一の基板に、前記抗体産生細胞を分散させて、前記抗体産生細胞を、前記凹部に捕捉させる工程Ａと、前記抗体産生細胞から前記抗体を分泌させ、前記抗体を前記連通孔から移動させ、前記連通孔を介して移動した前記抗体を第二の基板の蓄積部に蓄積させる工程Ｂと、前記蓄積部に生じる変化を検出する工程Ｃと、前記検出結果を指標に、目的の抗体産生細胞を特定する工程Ｄと、を含む。
【００９４】
本実施形態の細胞の選別方法は、場合により、該目的の抗体産生細胞を回収する工程Ｅを含んでよく、更に、該目的の細胞を培養することで抗体を産生させる工程Ｆ１、又は、前記目的の細胞において前記抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、当該抗体が発現するように別の宿主細胞を培養することで抗体を産生させる工程Ｆ２を含んでもよい。なお、当該工程Ｆ２では、クローニングされたポリヌクレオチドをさらに改変してから、当該改変されたポリヌクレオチドが発現するように別の宿主細胞を培養することで改変された抗体を産生させてもよい。
【００９５】
＜工程Ａ＞
工程Ａは、抗体産生細胞１単位（好ましくは、細胞１個）を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、該凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、該抗体産生細胞から分泌される該抗体が移動可能な大きさを有する連通孔を有する第一の基板１０に、該抗体産生細胞を分散させて、該抗体産生細胞を、該凹部に捕捉させる工程である（図７参照。）。
【００９６】
例えば、抗原を免疫したマウス、ラット、ウサギから摘出した脾臓、リンパ節、骨髄、血液から抗体産生細胞を分離し、分離した抗体産生細胞を培地に懸濁し、得られた懸濁液を構造体１の第一の基板１０に播種する（図７（ａ）参照。）。用いる培地としては、例えばＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ培地が挙げられる。播種した細胞１個は、凹部に捕捉される（図７（ｂ）参照。）。凹部に捕捉後、第一の基板１０を洗浄し、捕捉されなかった抗体産生細胞を除去することが好ましい。凹部に捕捉させる抗体産生細胞は、予め抗原あるいはサイトカインで刺激を与え免疫グロブリンである抗体を産生し得る状態にしておくことが好ましい。
【００９７】
＜工程Ｂ＞
工程Ｂは、前記抗体産生細胞から前記抗体を分泌させ、前記抗体を前記連通孔から移動させ、前記連通孔を介して移動した前記抗体を第二の基板の蓄積部に蓄積させる工程である。本実施形態において、蓄積部は、抗体と親和性を有する第一の親和性物質を含むことが好ましい。
【００９８】
抗体と親和性を有する第一の親和性物質としては、抗原又は該抗体（免疫グロブリン）と反応し得る抗免疫グロブリン抗体が挙げられ、製造が容易である点から抗原、特にペプチド抗原が好ましい。例えば、蓄積部は、基板本体２１上に層２１ａとして、活性エステルやエポキシドを修飾してなる層を形成し、アミノ基を介してペプチドを固定化する等、従来公知の方法にて容易に形成される。
【００９９】
また、ＧＰＣＲ等の膜タンパク質に対する抗体を作製する場合には、第一の親和性物質を含む蓄積部は、該膜タンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入してなる膜タンパク質発現細胞を含む層であることが好ましく、膜タンパク質発現細胞からなる層であることがより好ましい。一部の膜タンパク質は、その性質上、可溶化が難しく構造を保持したまま調製することが困難である。しかし、培養細胞の細胞膜上に発現させた場合には、安定に発現し得るため、膜タンパク質を細胞膜表面に発現させた培養細胞自体を第一の親和性物質を含む層にすることが好ましい。
【０１００】
本実施形態において、第一の基板と第二の基板は同一の液体で満たされており、連通孔を介して、第一の基板から第二の基板へ、第二の基板から第一の基板へ液体が通液する。通液の過程で、抗体産生細胞から分泌された液体中の抗体は、凹部が有する連結孔を通り第二の基板２０に移動する。移動した抗体は、蓄積部中の第一の親和性物質と接触し、抗体−第一の親和性物質複合体を形成する。
【０１０１】
＜工程Ｃ＞  
工程Ｃは、前記蓄積部に生じる変化を検出する工程であり、好ましくは、前記抗体−第一の親和性物質複合体を標識物質により標識し、前記抗体−第一の親和性物質複合体中の標識物質のシグナル強度を検出する工程である（図９参照。）。
抗体−第一の親和性物質複合体を特異的に検出するという観点から、工程Ｃにおいて、第一の親和性物質の抗体認識部位とは異なる抗体認識部位を有する、標識された第二の親和性物質を用いることが好ましい。
【０１０２】
第一の親和性物質として抗原を用いる場合には、第二の親和性物質は、ＩｇＧのＦｃ部分に特異的な標識２次抗体が好ましい。
標識としては、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ; 西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ； アルカリフォスファターゼ）等の酵素標識が挙げられる。酵素標識の場合、化学発光基質を用いると、酵素反応により化学発光が生じる。
また、標識としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ ４８８等の蛍光標識が挙げられる。抗体−第一の親和性物質複合体に蛍光標識された第二の親和性物質が結合し、複合体が形成されると、該複合体は所定の蛍光を発する。
【０１０３】
＜工程Ｄ＞
工程Ｄは、前記検出結果を指標に、好ましくは、前記標識物質のシグナル強度を指標に、目的の抗体産生細胞を特定する工程である。
本実施形態において、目的の抗体産生細胞とは、特定の抗原に特異的に結合する抗体を分泌する抗体産生細胞を意味する。
抗体産生細胞が産生する抗体の特異性は、抗体−第一の親和性物質複合体の形成の度合い、即ち工程Ｃで標識した抗体−第一の親和性物質複合体のシグナル強度に依存する。
第二の基板２０において、高いシグナル強度を示した部位に対応する凹部に存在する細胞が目的の抗体産生細胞である。
【０１０４】
＜工程Ｅ＞
工程Ｅは、目的の抗体産生細胞を回収する工程であり、好ましくは、前記標識物質のシグナル強度を指標に、目的の抗体産生細胞を回収する工程である（図１０参照。）。係る細胞を、マニュピレーター又はピペット等を用いて回収する（図１０（ａ）参照。）。
【０１０５】
＜工程Ｆ１又は工程Ｆ２＞
工程Ｆ１は、目的の細胞を培養することで抗体を産生させる工程である。工程Ｆ１で用いられる細胞としてはハイブリドーマが好ましい。ハイブリドーマは、抗体を産生しつつ増殖するため、目的の抗体が多量に得られる。
工程Ｆ２は、目的の細胞において前記抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、当該抗体が発現するように別の宿主細胞を培養することで抗体を産生させる工程である。目的の抗体産生細胞を培養後、ＲＴ−ＰＣＲ等により、抗体をコードするポリヌクレオチドをクローニングできる（図１０（ｂ）参照。）。場合により、前記抗体をコードするポリヌクレオチドをさらに改変してもよい。また、前記抗体をコードするポリヌクレオチド又は改変したポリヌクレオチドを用いて組換え体ベクターを構築してもよい。前記構築した組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株を構築してもよい。前記形質転換株を培地中で培養し、培養物中に前記抗体を生成蓄積させ、培養物から前記抗体を採取してもよい。
その他、工程Ｆ１又は工程Ｆ２は、当業者公知の方法に基づいて実施可能であることが当業者には当然に理解される。
【０１０６】
本実施形態によれば、第一の基板の抗体産生細胞の培養系と第二の基板の抗体の検出系とを分けることにより、特に、膜タンパク質を細胞膜表面に発現させた培養細胞自体を用いた評価方法において、抗体産生細胞と評価用の細胞が混ざることなく、簡便に抗体産生細胞の抗体産生能を評価できるため、目的の抗体産生細胞の回収を迅速にできる。
【０１０７】
以下、第五〜第六実施形態において、第四実施形態の構成との差異点について詳細に説明する。
【０１０８】
［第五実施形態］
本実施形態の細胞の選別方法は、サイトカイン、ホルモン等を含む複数のポリペプチド産生細胞から、特定のポリペプチドを分泌する目的のポリペプチド産生細胞を選別する、細胞の選別方法であって、ポリペプチド産生細胞１単位（好ましくは、細胞１個）を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、該凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、該ポリペプチド産生細胞から分泌される該ポリペプチドが移動可能な大きさを有する連通孔を有する第一の基板に、該ポリペプチド産生細胞を分散させて、該ポリペプチド産生細胞を、該凹部に捕捉させる工程Ａと、該ポリペプチド産生細胞から該ポリペプチドを分泌させ、該ポリペプチドを前記連通孔から移動させ、該連通孔を介して移動した該ポリペプチドを第二の基板の蓄積部に蓄積させる工程Ｂと、該蓄積部に生じる変化を検出する工程Ｃと、該検出結果を指標に、目的のポリペプチド産生細胞を特定する工程Ｄと、を含む。
【０１０９】
本実施形態の細胞の選別方法は、場合により、該目的のポリペプチド産生細胞を回収する工程Ｅを含んでよく、更に、該目的の細胞を培養することでポリペプチドを産生させる工程Ｆ１、又は、前記目的の細胞において前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをクローニングし、当該ポリペプチドが発現するように別の宿主細胞を培養することでポリペプチドを産生させる工程Ｆ２を含んでもよい。なお、当該工程Ｆ２では、クローニングされたポリヌクレオチドをさらに改変してから、当該改変されたポリヌクレオチドが発現するように別の宿主細胞を培養することで改変されたポリペプチドを産生させてもよい。
【０１１０】
＜工程Ａ＞
工程Ａは、ポリペプチド産生細胞１単位（好ましくは、細胞１個）を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、該凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、該ポリペプチド産生細胞から分泌される該ポリペプチドが移動可能な大きさを有する連通孔を有する第一の基板１０に、該ポリペプチド産生細胞を分散させて、該ポリペプチド産生細胞を、該凹部に捕捉させる工程である（図７参照。）。
ポリペプチドとしては、サイトカイン、ホルモン等が挙げられる。
【０１１１】
＜工程Ｂ＞
工程Ｂは、該ポリペプチド産生細胞から該ポリペプチドを分泌させ、該ポリペプチドを前記連通孔から移動させ、該連通孔を介して移動した該ポリペプチドを第二の基板の蓄積部に蓄積させる工程である。
【０１１２】
本実施形態において、蓄積部は、ポリペプチドと親和性を有する第一の親和性物質を含んでもよい。サイトカイン産生細胞の選別においては、サイトカインと親和性を有する第一の親和性物質としては、受容体又はサイトカインと反応し得る抗免疫グロブリン抗体が挙げられる。また、ホルモン分泌細胞の選別においては、ホルモンと親和性を有する第一の親和性物質としては、受容体が挙げられる。
第一の親和性物質として、受容体を用いる場合には、第一の親和性物質を含む蓄積部は、該受容体をコードする遺伝子を細胞に導入してなる受容体安定発現細胞を含む層であることが好ましく、当該受容体安定発現細胞からなる層であることがより好ましい。
【０１１３】
成長ホルモンなどのペプチドホルモンは、ホルモン受容体と結合して、シグナル伝達を行い、標的遺伝子を転写活性化することによりホルモン作用を発現する。本実施形態において、蓄積部は、ホルモンであるポリペプチドに応答するレポーター遺伝子導入細胞を含んでもよい。
ホルモン分泌細胞の選別においては、ホルモンに応答するレポーター遺伝子導入細胞は、係る転写活性化を利用したものであり、ホルモン応答配列をレポーター遺伝子の転写調節領域に組み込んだものを、ホルモン受容体を内在的又は外在的に高発現している細胞に安定的に導入した細胞である。
レポーター遺伝子としては、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質やルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ等の酵素をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１１４】
＜工程Ｃ＞
工程Ｃは、該蓄積部に生じる変化を検出する工程である。
サイトカイン産生細胞の選別においては、工程Ｃは、サイトカイン−第一の親和性物質複合体を標識物質により標識し、前記サイトカイン−第一の親和性物質複合体中の標識物質のシグナル強度又は有無を検出する工程であることが好ましい。
ホルモン分泌細胞の選別においては、工程Ｃは、ホルモンに応答するレポーター遺伝子導入細胞から生じる蛍光又は発光の強度又は有無を検出する工程、或いは、ホルモン−ホルモン受容体複合体を標識物質により標識し、前記ホルモン−ホルモン受容体複合体中の標識物質の強度又は有無を検出する工程であることが好ましい。
【０１１５】
＜工程Ｄ＞
工程Ｄは、前記検出結果を指標に、好ましくは、前記標識物質のシグナル強度を指標に、目的のポリペプチド産生細胞を特定する工程である。
ポリペプチドが産生するポリペプチドの特異性は、工程Ｃで標識したポリペプチド−第一の親和性物質複合体のシグナル強度、ポリペプチドに応答するレポーター遺伝子導入細胞から生じるシグナル強度等に依存する。
第二の基板２０において、高いシグナル強度を示した部位に対応する凹部に存在する細胞が目的のポリペプチド産生細胞である。
【０１１６】
＜工程Ｅ＞
工程Ｅは、目的のポリペプチド産生細胞を回収する工程であり、好ましくは、前記標識物質のシグナル強度を指標に、目的のポリペプチド産生細胞を回収する工程である（図１０参照。）。係る細胞を、マニュピレーター又はピペット等を用いて回収する（図１０（ａ）参照。）。
【０１１７】
＜工程Ｆ１又は工程Ｆ２＞
工程Ｆ１は、目的の細胞を培養することでポリペプチドを産生させる工程である。ポリペプチドサイトカイン又はホルモン、工程Ｆ１で用いられる細胞としては、上述したサイトカイン産生細胞又はホルモン分泌細胞が挙げられる。
工程Ｆ２は、目的の細胞において前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをクローニングし、当該ポリペプチドが発現するように別の宿主細胞を培養することでポリペプチドを産生させる工程である。目的のポリペプチド産生細胞を培養後、ＲＴ−ＰＣＲ等により、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをクローニングできる（図１０（ｂ）参照。）。場合により、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに改変してもよい。また、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は改変したポリヌクレオチドを用いて組換え体ベクターを構築してもよい。前記構築した組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株を構築してもよい。前記形質転換株を培地中で培養し、培養物中に前記ポリペプチドを生成蓄積させ、培養物から前記ポリペプチドを採取してもよい。
その他、工程Ｆ１又は工程Ｆ２は、当業者公知の方法に基づいて実施可能であることが当業者には当然に理解される。
【０１１８】
サイトカインは、感染症、癌、アレルギー、自己免疫疾患を含む様々な疾患において、特異的免疫応答を介してワクチンとして機能することが知られている。
本実施形態において、特定の受容体に結合するサイトカインを分泌するサイトカイン産生細胞を選別し、係るサイトカインを分析することにより、新規ワクチンの開発に役立てることができる。
また、インターフェロンのように医薬品として用いられているサイトカインを大量生産する際、本実施形態の細胞選別方法は有用である。具体的には、本実施形態の細胞選別方法を用いて、インターフェロン産生細胞を選別し、該インターフェロン産生細胞から大量のインターフェロンを分泌させることにより、効率よくワクチンを生産することができる。
【０１１９】
また、本実施形態は、特定のホルモンを分泌する細胞の選別に好適に用いられる。例えば、ホルモンをコードする遺伝子改変ライブラリーを導入した細胞集団の選別に好適に用いられる。この実施形態によれば、改変したホルモンのホルモン受容体活性化能を簡便に評価できるため、ホルモン受容体を阻害あるいは活性化するホルモンの選別を迅速にできる。
【０１２０】
［第六実施形態］
本実施形態の細胞の選別方法は、複数の分泌物産生細胞から、分泌物産生能の高い目的の分泌物産生細胞を選別する、細胞の選別方法であって、分泌物産生細胞１単位（好ましくは、細胞１個）を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、該凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、該分泌物産生細胞から分泌される該分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有する第一の基板に、該分泌物産生細胞を分散させて、該分泌物産生細胞を、該凹部に捕捉させる工程Ａと、該分泌物産生細胞から該分泌物を分泌させ、該分泌物を前記連通孔から移動させ、該連通孔を介して移動した該分泌物を第二の基板の蓄積部に蓄積させる工程Ｂと、該蓄積部に生じる変化を検出する工程Ｃと、該検出結果を指標に、分泌物産生能の高い目的の分泌物産生細胞を特定する工程Ｄと、を含む。
【０１２１】
本実施形態の細胞の選別方法は、場合により、該目的の分泌物産生細胞を回収する工程Ｅを含んでもよい。本実施形態の細胞の選別方法は、場合により、更に、当該目的の分泌物産生細胞を回収して培養することで分泌物を産生させる工程Ｆ１、あるいは、前記目的の細胞において前記分泌物をコードするポリヌクレオチドをクローニングし、当該ポリヌクレオチドが発現するように別の宿主細胞を培養することで分泌物を産生させる工程Ｆ２を含んでもよい。なお、当該工程Ｆ２では、クローニングされたポリヌクレオチドをさらに改変してから、当該改変されたポリヌクレオチドが発現するように別の宿主細胞を培養することで抗体を産生させてもよい。
【０１２２】
＜工程Ａ＞
分泌物産生細胞１単位（好ましくは、細胞１個）を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、該凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、該分泌物産生細胞から分泌される該分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有する第一の基板１０に、該分泌物産生細胞を分散させて、該分泌物産生細胞を、該凹部に捕捉させる工程である（図７参照。）。
【０１２３】
例えば、ＣＨＯ細胞、２９３細胞等の動物細胞に抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子を導入して抗体産生細胞を樹立し、培地に懸濁して得られた懸濁液を構造体１の第一の基板１０に播種する（図７（ａ）参照。）。凹部に捕捉後、第一の基板１０を洗浄し、捕捉されなかった抗体産生細胞を除去することが好ましい。
【０１２４】
＜工程Ｂ＞
工程Ｂは、該分泌物産生細胞から該分泌物を分泌させ、該分泌物を前記連通孔から移動させ、該連通孔を介して移動した該分泌物を第二の基板の蓄積部に蓄積させる工程である。
本実施形態において、蓄積部は、分泌物と親和性を有する第一の親和性物質を含む。
分泌物が抗体分子の場合、抗体と親和性を有する第一の親和性物質としては、抗原又は該抗体（免疫グロブリン）と反応し得る抗免疫グロブリン抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬが挙げられ、抗原によらず汎用に用いることができるという点から抗免疫グロブリン抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬが好ましい。例えば、蓄積部は、第二の基板２１上に層２１ａとして、活性エステルやエポキシドを修飾してなる層を形成し、アミノ基を介してペプチドを固定化する等、従来公知の方法にて容易に形成される。
【０１２５】
本実施形態において、第一の基板と第二の基板は同一の液体で満たされており、連通孔を介して、第一の基板から第二の基板へ、第二の基板から第一の基板へ液体が通液する。通液の過程で、分泌物産生細胞から分泌された液体中の分泌物は、凹部が有する連結孔を通り第二の基板２０に移動する。移動した分泌物は、蓄積部中の第一の親和性物質と接触し、分泌物−第一の親和性物質複合体を形成する。
【０１２６】
＜工程Ｃ＞
工程Ｃは、該蓄積部に生じる変化を検出する工程であり、好ましくは、前記分泌物−第一の親和性物質複合体を標識物質により標識し、前記分泌物−第一の親和性物質複合体中の標識物質のシグナル強度を検出する工程である（図９参照。）。分泌物−第一の親和性物質複合体を特異的に検出するという観点から、工程Ｃにおいて、第一の親和性物質の分泌物認識部位とは異なる分泌物認識部位を有する、標識された第二の親和性物質を用いることが好ましい。
【０１２７】
第一の親和性物質としてプロテインＡを用いる場合には、第二の親和性物質は、限定はされないが、ＩｇＧのＦａｂ部分に特異的な標識二次抗体が好ましく、二次抗体としてＦａｂやＦ（ａｂ’）２がより好ましい。
標識としては、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ Ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ; 西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ； アルカリフォスファターゼ）等の酵素標識が挙げられる。酵素標識の場合、化学発光基質を用いると、酵素反応により化学発光が生じる。
また、標識としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ ４８８等の蛍光標識が挙げられる。分泌物−第一の親和性物質複合体に蛍光標識された第二の親和性物質が結合し、複合体が形成されると、該複合体は所定の蛍光を発する。
【０１２８】
＜工程Ｄ＞
工程Ｄは、該検出結果を指標に、分泌物産生能の高い目的の分泌物産生細胞を特定する工程であり、好ましくは、前記標識物質のシグナル強度を指標に、分泌物産生能の高い目的の分泌物産生細胞を特定する工程である。
本実施形態において、分泌物産生能の高い目的の分泌物産生細胞とは、例えば抗体産生能の高い目的の抗体産生細胞においては、時間当たりに分泌する抗体産生量（もしくは抗体分子数）が高い細胞を意味する。
抗体産生能は、抗体−第一の親和性物質複合体の形成の度合い、即ち工程Ｃで標識した抗体−第一の親和性物質複合体のシグナル強度に依存する。
第二の基板２０において、高いシグナル強度を示した部位に対応する凹部に存在する細胞が分泌物産生能の高い目的の分泌物産生細胞である。
【０１２９】
＜工程Ｅ＞
工程Ｅは、該目的の分泌物産生細胞を回収する工程である。工程Ｅにおいて、第二の基板２０における高いシグナル強度を示した部位に対応する凹部に存在する細胞を目的の分泌物産生細胞として回収してよい。係る細胞を、マニュピレーター又はピペット等を用いて回収し（図１０（ａ）参照。）、培養後、抗体等の分泌物を製造できる。
【０１３０】
＜工程Ｆ１又は工程Ｆ２＞
工程Ｆ１は、目的の細胞を培養することで分泌物を産生させる工程である。分泌物が抗体である場合、工程Ｆ１で用いられる細胞としてはＣＨＯ細胞、２９３細胞等の動物細胞に抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子を導入した抗体安定発現動物細胞が好ましい。抗体安定発現動物細胞は、抗体を産生しつつ増殖するため、目的の抗体が多量に得られる。
工程Ｆ２は、前記分泌物を分泌する目的の細胞を育種または改変する工程である。育種や遺伝子導入により目的の細胞にさらなる特性や形質を付与することができる。遺伝子導入では目的の分泌物をコードする遺伝子でもよいし、他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドやノンコーディングＲＮＡを発現するポリヌクレオチドでもよい。場合により、工程Ａからの選別を繰り返すことができる。
その他、工程Ｆ１又は工程Ｆ２は、当業者公知の方法に基づいて実施可能であることが当業者には当然に理解される。
【０１３１】
本実施形態によれば、抗体医薬品のようなバイオテクノロジー応用医薬品において、目的タンパク質の高産生細胞を用いることで効率よく医薬品を生産することができる。
また、バイオテクノロジー応用医薬品の生産においては、生産細胞のクローナリティ（単一性）が求められるが（例えば、ＩＣＨ（日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議）ガイドライン  Ｑ５Ｄ）、目的タンパク質やポリペプチドの遺伝子導入後、迅速に単一細胞を起源とした医薬品高産生細胞を単離することができるため、医薬品開発においてきわめて有用である。
【０１３２】
本明細書において引用される全ての技術文献は、参照としてその全体が本明細書中に援用される。
【０１３３】
本明細書で用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられ、発明を限定する意図として理解されてはならない。異なる定義が明示されていない限り、本明細書で用いられる用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術分野における当業者によって広く理解されるものと同じ意味を有するものとして解釈され、かつ、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【０１３４】
本明細書で用いられる用語「含む」は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、工程、要素、数字等）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、工程、要素、数字等）が存在することを排除しない。
【０１３５】
本発明の実施形態は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、説明を明確にするために誇張されて表現される場合がある。
【０１３６】
本明細書及び特許請求の範囲において、特に明示されていない場合であって、文脈において矛盾しない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の各名詞が表す対象は、一又は複数存在してもよいことが意図される。
【実施例】
【０１３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１３８】
［構造体の製造］
＜第二の基板の製造＞
ガラス基板上に、感光性樹脂組成物（特開２００８−１８０８７７号公報、特開２０１１−１１１５８８号公報参照。）をスピンコータ―（１０００ｒｐｍ、２０秒）で塗布し、ホットプレートにより９０℃で５分間プリベークした。その後、平行光露光機（伯東株式会社製、型番ＭＡＴ−２５０１）を用いてパターン露光（ソフトコンタクト、ＧＨＩ線、５００ｍＪ）を行い、ホットプレートにより９０℃で５分間露光後加熱を行った。その後、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（ＰＧＭＥＡ）を用いた浸漬法により、２分間の現像処理を行った。次いで、現像後の樹脂パターンを基板ごと、オーブンを用いて１２０℃で１分間のポストベークを行い、第二の基板の樹脂パターンを得た。【０１３９】
＜第一の基板の製造＞
（連通孔パターニング）
シリコン基板上に、下地剤をスピンコータ―（１５００ｒｐｍ、２０秒）で塗布し、ホットプレートにより９０℃で１分間、１２０℃で３分間プリベークし、下地膜を形成した。【０１４０】
該下地膜上に前記感光性樹脂組成物をスピンコータ―（３０００ｒｐｍ、２０秒）で塗布し、ホットプレートにより９０℃で３分間プリベークした。その後、ＰＬＡ−５０１Ｆ（コンタクトアライナー：キャノン製）を用いてパターン露光（ソフトコンタクト、Ｉ線、１５０ｍＪ）を行い、ホットプレートのより９０℃で５分間露光後加熱を行った。その後、ＰＧＭＥＡを用いた浸漬法により、３０秒間の現像処理を行った。次いで、現像後の樹脂パターンを基板ごと、オーブンを用いて１２０℃で１分間のポストベークを行い、柵状の連通孔樹脂パターンを得た。【０１４１】
（凹部パターニング）
上記で得られた連通孔樹脂パターン上に、前記感光性樹脂組成物をスピンコータ―（１０００ｒｐｍ、２０秒）で塗布し、ホットプレートにより９０℃で５分間プリベークした。その後、平行光露光機（伯東株式会社製、型番ＭＡＴ−２５０１）を用いてパターン露光（ソフトコンタクト、ＧＨＩ線、６０ｍＪ）を行い、ホットプレートのより９０℃で５分間露光後加熱を行った。その後、ＰＧＭＥＡを用いた浸漬法により、２分間の現像処理を行なった。次いで、現像後の樹脂パターンを基板ごと、オーブンを用いて１２０℃で１分間のポストベークを行い、凹部パターンを得た。【０１４２】
（第一の基板の剥離）
上記で得られたウェル層がパターニングされた第一の基板を、剥離剤に浸漬し、前記下地膜を溶解することにより、シリコン基板から、微細孔樹脂パターン上にウェルパターンが形成された第一の基板を剥離した。【０１４３】
＜第一の基板及び第二の基板の接合＞
上記で得られた第二の基板樹脂パターンの表面全体をｔｅｔｒａｉｓｏｃｙａｎａｔｅｓｉｌａｎｅ処理した後、シリコンウェハーに接着剤を塗布したものを第二の基板樹脂パターン上部に塗布し、３５℃で１分間プレベークした。その後、上記で得られた第一の基板を連通孔パターンが下になるように第二の基板と接合し、平行光露光機（伯東株式会社製、型番ＭＡＴ−２５０１）を用いて露光（ソフトコンタクト、ＧＨＩ線、６０ｍＪ）を行い、ホットプレートにより３５℃で３分間、９０℃で１分間露光後加熱を行い、接着剤を硬化させることにより第一の基板と第二の基板を接合した。【０１４４】
第一の基板の厚さは１０μｍであり、凹部の直径は１２μｍであり、凹部間のピッチは１００μｍであり、柵状の連通孔の幅は２μｍであり、構造体の大きさは、平面図において長さが１２８ｍｍ、横幅が８６ｍｍの大きさであり、厚さは１５ｍｍであった。  【０１４５】
以上の工程より、第一の基板と、前記第一の基板の一方側に対向するように配置された第二の基板を含む構造体であって、前記第一の基板は、前記第一の基板の他方側に開口し、細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有し、前記第二の基板は、前記分泌物が前記連通孔を移動して蓄積する蓄積部を備えることができ、前記蓄積部は、前記凹部と対応し得る、構造体を製造することができた。図１１に、走査型電子顕微鏡により撮影した製造した構造体の画像と、比較例として、ランダムな細孔を有するトランスウェル（ミリポア社  Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌあーる  ２４―Ｗｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔ、細孔径；１ｕｍ、膜厚；約１０μｍ）の画像を示す。【０１４６】
［実施例１］
上記のようにして製造した構造体の第二の基板にＣＨＯ−Ｋ１細胞を播種し、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭによって染色した。第一の基板に予めＣｙｔｏＲｅｄにより染色したＮａｍａｌｗａ細胞を播種し、ＣＯ２インキュベーターに５分間静置した。構造体第一の基板側から観察した蛍光像を図１２に示す。
図１２に示すように、第一の基板と第二の基板とで細胞の播き分けが可能であることが確認された。【０１４７】
＜凹部のみの基板の製造＞
ガラス基板上に、前記感光性樹脂組成物をスピンコータ―（１０００ｒｐｍ、２０秒）で塗布し、ホットプレートにより９０℃で５分間プリベークした。その後、平行光露光機（伯東株式会社製、型番ＭＡＴ−２５０１）を用いてパターン露光（ソフトコンタクト、ＧＨＩ線、６０ｍＪ）を行い、ホットプレートのより９０℃で５分間露光後加熱を行った。その後、ＰＧＭＥＡを用いた浸漬法により、２分間の現像処理を行なった。次いで、現像後の樹脂パターンを基板ごと、オーブンを用いて１２０℃で１分間のポストベークを行い、凹部パターンを得た。
＜製造した構造体と凹部のみの基板の細胞の格納率の比較＞
上記のようにして製造した構造体と、凹部のみの基板に予めＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭにより染色した４ｘ１０５個／５００μＬのＢａ／Ｆ３細胞を播種し、３分間静置した。アスピレーターにて培地を除去し、凹部に格納されなかった細胞を除いた。培地を添加して基板上を洗浄し、アスピレーターにて培地を除去した。洗浄操作は合計３回行った。培地を添加し、構造体第一の基板側から観察した蛍光像を図１３に示す。製造した構造体の凹部への細胞格納率は、７６．３％であった。一方、凹部のみの基板の細胞格納率は、０．２％であった。製造した構造体が、高い細胞格納率を示すことが確認された。【０１４８】
［実施例２］
上記のようにして製造した構造体の第二の基板に膜タンパク質安定発現ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を播種し、接着させ、４８時間培養した。
次いで、ＰＫＨ２６赤色蛍光細胞リンカーＭｉｎｉキット（Ｓｉｇｍａ、ＭＩＮＩ２６−ＩＫＴ)で染色した、マウス抗膜タンパク質抗体安定発現Ｂａ／Ｆ３細胞を第一の基板に播種し、ウェルへ配置した。配置後３回洗浄しウェルに配置されなかったＢａ／Ｆ３細胞を除去した。ＣＯ２インキュベーターで一晩培養し、Ｂａ／Ｆ３細胞が分泌するマウス抗膜タンパク質抗体を、連通孔を介して第二の基板上の膜タンパク質安定発現ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞と反応させた。
次いで、第二の基板をＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄した。Ａｌｅｘａ４８８標識ｇｏａｔ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, ♯Ａ１１００１)を１／１０００希釈となるようＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地へ添加した。Ａｌｅｘａ ４８８標識ｇｏａｔ抗マウスＩｇＧ抗体添加ＲＰＭＩ１６４０培地を第二の基板へ添加し、マウス抗膜タンパク質抗体と１時間反応させた。第二の基板をＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、ＯＬＹＭＰＵＳ製ＣＫＸ４１により観察した。
構造体第二の基板側から観察した蛍光像を図１４に示す。第二の基板上の膜タンパク質安定発現ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の緑色の蛍光シグナルを検出し、赤色蛍光色素で染色された第一の基板上のマウス抗膜タンパク質抗体安定発現Ｂａ／Ｆ３細胞を特定した。
以上の工程より、複数の細胞から、分泌物を分泌する目的の細胞を選別する、細胞の選別方法であって、細胞１単位を捕捉可能な大きさを有する凹部を複数有し、前記凹部の少なくとも一部には、前記一方側と前記他方側とを連通し、前記細胞から分泌される分泌物が移動可能な大きさを有する連通孔を有する第一の基板に、前記細胞を分散させて、前記細胞を、前記凹部に捕捉させる工程Ａと、前記細胞から前記分泌物を分泌させ、前記分泌物を前記連通孔から移動させ、前記連通孔を介して移動した前記分泌物を第二の基板の蓄積部に蓄積させる工程Ｂと、前記蓄積部に生じる変化を検出する工程Ｃと、前記検出結果を指標に、目的の細胞を特定する工程Ｄと、を含む、細胞の選別方法を実施することができた。【０１４９】
１、２…構造体、４ａ、４ｂ…流路、１０ａ…層、１０ｂ…層、１０…第一の基板、１１…凹部、１２…連通孔、１３…蓄積部、２０…第二の基板、２１…支持体（基板本体）、２２…ピラー、Ｂ…細胞、Ｃ…分泌物、Ｄ…膜タンパク質発現細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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