(57)【要約】  判定装置であって、励起光が照射された生物細胞に含まれる検出対象からの放射光の光強度に基づいて生成された前記検出対象の一様性に関する情報を用いて、細胞の状態を判定する判定部を備える。上記判定装置において、検出対象はタンパク質であってもよい。また、上記判定装置において、情報を生成する情報生成部を備え、情報生成部は、非共鳴バックグラウンド信号に対応する情報を取り除いた情報を生成してもよい。
2016208356.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起光が照射された生物細胞に含まれる検出対象からの放射光の光強度に基づいて生成された前記検出対象の一様性に関する情報を用いて、前記細胞の状態を判定する判定部を備える判定装置。
【請求項２】
前記検出対象はタンパク質である請求項１に記載の判定装置。
【請求項３】
前記情報を生成する情報生成部を備え、
前記情報生成部は、非共鳴バックグラウンド信号に対応する情報を取り除いた前記情報を生成する請求項１または請求項２に記載の判定装置。
【請求項４】
前記情報生成部は、前記生物細胞における複数の位置で、前記検出対象の前記光強度と前記生物細胞に含まれる他の検出対象の前記光強度との差分に基づいて前記情報を生成する
請求項３に記載の判定装置。
【請求項５】
前記他の検出対象は脂質である請求項４に記載の判定装置。
【請求項６】
前記情報生成部は、前記検出対象を含むサンプルにおける屈折率分布を反映した画像に基づいて、前記放射光を検出する範囲を示す情報を更に生成する請求項４に記載の判定装置。
【請求項７】
前記判定部は、前記状態が予め判っている細胞の判定結果に基づいて決定された閾値に基づいて前記状態を判定する請求項３から６のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項８】
前記情報生成部は、前記情報を数値として生成し、
前記判定部は、数値により定義された閾値に基づいて、前記状態を判定する請求項３から７のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項９】
前記情報生成部は、前記放射光の最大強度と平均強度との強度比を生成し、
前記判定部は、前記強度比に関する前記閾値に基づいて判定する請求項７または８に記載の判定装置。
【請求項１０】
前記情報生成部は、前記光強度のヒストグラムをガウスフィッティングしたガウス関数を同定して、当該ガウス関数の予め定められた傾きとなる前記光強度までの度数の積算値を生成し、
前記判定部は、前記積算値に関する前記閾値に基づいて判定する請求項７から９のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項１１】
前記情報生成部は、前記光強度のヒストグラムをガウスフィッティングしたガウス関数を同定して、同定したガウス関数のピーク位置となる前記光強度と、前記光強度の平均値との差分を生成し、
前記判定部は、前記差分に関する前記閾値に基づいて判定する請求項７から１０のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項１２】
前記情報生成部は、前記光強度のコントラスト評価値を生成し、
前記判定部は、前記コントラスト評価値に関する前記閾値に基づいて判定する請求項７から１１のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項１３】
前記情報生成部は、前記生物細胞のひとつの領域における放射光の光強度の最大値に対する最小値の比と、当該領域の周辺領域における放射光の光強度の最大値に対する最小値の比との平均値を、前記領域における前記コントラスト評価値とする請求項１２に記載の判定装置。
【請求項１４】
前記情報生成部は、前記光強度の度数を積算したローレンツ曲線を生成して、前記ローレンツ曲線と均等分配線との面積差を生成し、
前記判定部は、前記面積差に関する前記閾値に基づいて判定する請求項７から１３のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項１５】
前記情報生成部は、前記光強度を正規化した前記ローレンツ曲線を生成する請求項１４に記載の判定装置。
【請求項１６】
前記情報生成部は、前記光強度の分布に基づいて形成された２次元画像の予め定められた領域をフーリエ変換して、予め定められた周波数成分の割合を生成し、
前記判定部は、前記割合に関する前記閾値に基づいて判定する請求項７から１５のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項１７】
前記情報生成部は、空間内の位置に対応付けられた前記光強度のそれぞれを、当該位置を含む予め定められた領域内に在る前記光強度との加重平均に置き換えて数値化した前記一様性を生成し、
前途判定部は、前記一様性に関する前記閾値に基づいて判定する
請求項７から１６のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項１８】
前記情報生成部は、前記生物細胞に固まって存在する前記検出対象に対応して検出された高輝度領域の面積割合を生成し、
前記判定部は、前記面積割合に関する前記閾値に基づいて判定する請求項７から１７のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項１９】
前記情報生成部は、前記光強度の分布に基づいて形成された２次元画像を標準偏差σの２倍の範囲で２値化した２値化画像において、連続する高輝度画素が存在する領域の割合を前記面積割合とする請求項１８に記載の判定装置。
【請求項２０】
前記放射光は、前記検出対象から放射されたアンチストークスラマン散乱光である請求項１から１９のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項２１】
前記光強度を検出する検出部を備え、
前記検出部は、前記細胞に対して非侵襲に得られた放射光の光強度を検出する請求項１から２０のいずれか一項に記載の判定装置。
【請求項２２】
励起光が照射された生物細胞に含まれる検出対象からの放射光の光強度に基づいて生成された前記検出対象の一様性に関する情報を用いて、前記細胞の状態を判定する判定ステップをプロセッサに実行させる判定プログラム。
【請求項２３】
励起光が照射された生物細胞に含まれる検出対象からの放射光の光強度に基づいて生成された前記検出対象の一様性に関する情報を用いて、前記細胞の状態を判定する判定段階を備える判定方法。
【請求項２４】
細胞を単離して細胞株を用意する用意部と、
前記細胞株を細胞シートに培養する培養部と、
請求項１から２１までのいずれか一項に記載された判定装置と
を備える細胞シート製造装置。
【請求項２５】
前記判定装置は、前記細胞シートの良否を判定する請求項２４に記載の細胞シート製造装置。
【請求項２６】
細胞を単離して細胞株を用意する用意段階と、
前記細胞株を細胞シートに培養する培養段階と、
請求項１から２１までのいずれか一項に記載された判定装置により前記細胞の状態を判定する判定段階と
を備える細胞シート製造方法。
【請求項２７】
前記判定段階は、前記細胞シートの良否を判定する段階を含む請求項２６に記載の細胞シート製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、判定装置、判定プログラム、判定方法、細胞シート製造装置、および細胞シート製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非線形光学効果により発生するＣＡＲＳ光（アンチストークスラマン散乱光）等により生体標本を非侵襲で評価する方法がある（例えば、特許文献１参照）。
特許文献１  特開２００５−０６２１５５号公報
【発明の概要】
【０００３】
生体標本をユーザが観察して生死に関する状態を判定しているので、作業効率の向上が望まれている。
【０００４】
本発明の第１の態様においては、励起光が照射された生物細胞に含まれる検出対象からの放射光の光強度に基づいて生成された検出対象の一様性に関する情報を用いて、細胞の状態を判定する判定部を備える判定装置が提供される。
【０００５】
本発明の第２の態様においては、励起光が照射された生物細胞に含まれる検出対象からの放射光の光強度に基づいて生成された検出対象の一様性に関する情報を用いて、細胞の状態を判定する判定ステップをプロセッサに実行させる判定プログラムが提供される。
【０００６】
本発明の第３の態様においては、励起光が照射された生物細胞に含まれる検出対象からの放射光の光強度に基づいて生成された検出対象の一様性に関する情報を用いて、細胞の状態を判定する判定段階を備える判定方法が提供される。
【０００７】
本発明の第４の態様においては、細胞を単離して細胞株を用意する用意部と、細胞株を細胞シートに培養する培養部と、上記の判定装置とを備える細胞シート製造装置が提供される。
【０００８】
本発明の第５の態様においては、細胞を単離して細胞株を用意する用意段階と、細胞株を細胞シートに培養する培養段階と、上記の判定装置により細胞の状態を判定する判定段階とを備える細胞シート製造方法が提供される。
【０００９】
上記した発明の概要は、本発明の特徴の全てを列挙したものではない。これらの特徴群のサブコンビネーションも発明となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】判定装置１００の模式図である。
【図２】ＣＡＲＳ過程の概念を示す模式図である。
【図３】判定装置１００のブロック図である。
【図４】判定装置１００における判定手順を示す流れ図である。
【図５】タンパク質から放射されたＣＡＲＳ光により形成された画像を示す図である。
【図６】脂質から放射されたＣＡＲＳ光により形成された画像を示す図である。
【図７】合成した画像を示す図である。
【図８】画像から細胞核の領域を抽出した様子を示す図である。
【図９】画像における細胞核のひとつを拡大して示す図である。
【図１０】タンパク質から放射されたＣＡＲＳ光により形成された画像を示す図である。
【図１１】脂質から放射されたＣＡＲＳ光により形成された画像を示す図である。
【図１２】合成した画像を示す図である。
【図１３】画像から細胞核の領域を抽出した様子を示す図である。
【図１４】画像における細胞核のひとつを拡大して示す図である。
【図１５】輝度値のコントラストの分布を示す模式図である。
【図１６】輝度値のコントラストの分布を示す模式図である。
【図１７】輝度値の発現度数を示すグラフである。
【図１８】輝度値の発現度数を示すグラフである。
【図１９】平均値を原点にシフトした様子を示すグラフである。
【図２０】ガウスフィッティングに基づく一様性の概念を示すグラフである。
【図２１】ガウスフィッティングに基づく一様性の概念を示すグラフである。
【図２２】累積輝度値に基づく一様性の概念を示すグラフである。
【図２３】累積輝度値に基づく一様性の概念を示すグラフである。
【図２４】生細胞におけるタンパク質分布を例示する図である。
【図２５】一様性に関する情報の概念を説明する図である。
【図２６】死細胞におけるタンパク質分布を例示する図である。
【図２７】一様性に関する情報の概念を説明する図である。
【図２８】細胞の生死状態の判定方法を説明する図である。
【図２９】一様性に関する情報の概念を説明する図である。
【図３０】一様性に関する情報の概念を説明する図である。
【図３１】細胞シートの製造装置２００のブロック図である。
【図３２】製造装置２００における細胞シートの製造手順を示す流れ図である。
【図３３】サンプル１０１の構造を示す模式的断面図である。
【図３４】対照サンプルの光学顕微鏡写真４０１である。
【図３５】対照サンプルの光学顕微鏡写真４０２である。
【図３６】ＣＡＲＳ過程による生細胞の観察過程を模式的に示す図である。
【図３７】ＣＡＲＳ過程による死細胞の観察過程を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、下記の実施形態は請求の範囲に係る発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【００１２】
図１は、判定装置１００の全体的な構成を示す模式図である。判定装置１００は、ステージ１１０、対物光学系１２０、レーザ装置１３０、励起部１４０、上側ラマン散乱光検出部１５０、下側ラマン散乱光検出部１６０、および制御部１７０を備える。
【００１３】
ステージ１１０は、判定装置１００の判定対象となるサンプル１０１を、サンプル１０１を収容した容器の周縁部で支持する。また、ステージ１１０は、サンプル１０１の図中下面を露出させる開口を有する。これにより、ステージ１１０に置かれたサンプル１０１に対して、図中下側からサンプル１０１に向かって励起光を照射できる。また、サンプル１０１から発生した放射光を、ステージ１１０の下側からも検出できる。
【００１４】
ステージ１１０は、ステージスキャナ１１１に結合される。ステージスキャナ１１１は、図中に矢印ｘ−ｙ−ｚにより示すように、サンプル１０１が置かれた面と平行および垂直にステージ１１０を駆動する。これにより、判定装置１００においては、光学系の光軸を固定したまま、サンプル１０１において立体的な広さを有する検出対象領域から、サンプル１０１が発生する放射光を検出できる。
【００１５】
対物光学系１２０は、ステージ１１０に対して互いに反対側に配された上側対物レンズ１２１および下側対物レンズ１２２を有する。図示の判定装置１００においては、下側対物レンズ１２２が、サンプル１０１に対して照射された励起光を、サンプル１０１の内部で集光する役割も担う。
【００１６】
なお、対物光学系１２０において、上側対物レンズ１２１および下側対物レンズ１２２は、互いに略等しい開口数を有することが好ましい。これにより、コヒーレントな励起光を照射することでサンプル１０１から発生するコヒーレントな放射光を検出する場合に、画像あるいはスペクトルにアーチファクトが重畳されて、検出精度が低下することを防止できる。より具体的には、上側対物レンズ１２１の開口数と下側対物レンズ１２２の開口数との比ＲＮＡは、右式［０．８＜ＲＮＡ＜１．２］を満たすことが好ましい。
【００１７】
レーザ装置１３０は、複数のレーザ光源１３１、１３２と、コンバイナ１３３とを有する。レーザ光源１３１、１３２が発生するパルスレーザは、互いに異なる波長λＳ、λＰを有する。レーザ光源１３１、１３２としては、例えば、モードロックピコ秒Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザ、モードロックピコ秒イットリビウムレーザー等を用いることができる。
【００１８】
なお、レーザ光源１３１、１３２の一方を、レーザ光源１３１、１３２の他方が発生したパルスレーザの波長を変換する光パラメトリック発振器に置き換えてもよい。また、判定対象となる細胞への侵襲を軽減する目的で、励起光としてのパルスレーザのパルス長は、より短くすることが好ましい。
【００１９】
レーザ光源１３１、１３２が発生したピコ秒パルスのうち、短い方の波長λＰを有するパルスレーザは、ラマン散乱光の一例として、例えばＣＡＲＳ光をサンプル１０１において発生させる場合のポンプ光として使用できる。また、レーザ光源１３１、１３２の発生するピコ秒パルスのうち、長い方の波長λＳを有するパルスレーザは、サンプル１０１を励起する励起光、例えば、ＣＡＲＳ光を発生させる場合のストークス光として使用できる。なお、判定対象となる細胞への侵襲を軽減する目的で、励起光の波長は、より長いものを用いることが好ましい。
【００２０】
レーザ光源１３１、１３２から射出されたレーザ光は、コンバイナ１３３に入射されて単一のレーザビームになる。これにより、ポンプ光とストークス光とを併せた励起光をサンプル１０１の同じ位置に同時に照射して、ＣＡＲＳ光等のラマン散乱光を発生する非線形光学効果をサンプル１０１において発生させることができる。
【００２１】
なお、レーザ装置１３０は、レーザ光源１３１、１３２が発生するポンプ光とストークス光とを位相同期させる目的で、いずれかのレーザ光を遅延させる遅延光路を備えてもよい。遅延光路は、互いの間隔を変更できる複数の反射鏡により形成できる。また、レーザ装置１３０においては、フォトニック結晶ファイバを用いてストークス光を広帯域化してもよい。
【００２２】
励起部１４０は、ガルバノスキャナ１４１およびスキャンレンズ１４２を有する。ガルバノスキャナ１４１は、互いに平行ではない２つの揺動軸の周りを揺動する反射鏡を備え、入射した励起光の光路を、光軸と交差する方向に二次元的に変位させる。
【００２３】
スキャンレンズ１４２は、ガルバノスキャナ１４１から射出された励起光を、予め定められた一次像面１４３上に合焦させる。これにより、レーザ装置１３０から射出された励起光でサンプル１０１の検出対象領域を走査させ、予め定められた広さを有する検出対象領域に励起光を照射できる。
【００２４】
上側ラマン散乱光検出部１５０は、反射鏡１５１、リレーレンズ１５２、１５３、帯域通過フィルタ１５４、および光電子増倍管１５５を有する。反射鏡１５１は、サンプル１０１において発生したラマン散乱光を反射して、リレーレンズ１５２、１５３、帯域通過フィルタ１５４、および光電子増倍管１５５に導く。なお、反射鏡１５１に換えて、ラマン散乱光の波長を選択的に反射するダイクロイックミラーを設けてもよい。
【００２５】
更に、帯域通過フィルタ１５４は、励起部１４０からの励起光を吸収または反射しつつ、サンプル１０１から発生したラマン散乱光を透過する。これにより、光電子増倍管１５５は、サンプル１０１から発生したラマン散乱光を効率よく検出できる。
【００２６】
下側ラマン散乱光検出部１６０は、ダイクロイックミラー１６１、リレーレンズ１６２、１６３、帯域通過フィルタ１６４、および光電子増倍管１６５を有する。ダイクロイックミラー１６１は、励起部１４０がサンプル１０１に向かって照射した励起光を高効率に透過させる。また、ダイクロイックミラー１６１は、サンプル１０１において発生したラマン散乱光を反射して、リレーレンズ１６２、１６３に導く。
【００２７】
帯域通過フィルタ１６４は、励起部１４０からの励起光を吸収または反射しつつ、サンプル１０１から発生したラマン散乱光を透過する。これにより、光電子増倍管１６５は、サンプル１０１から発生したラマン散乱光を効率よく検出できる。
【００２８】
制御部１７０は、処理装置１７１、マウス１７２、キーボード１７３、および表示部１７４を有する。マウス１７２およびキーボード１７３は、処理装置１７１に接続され、処理装置１７１にユーザの指示を入力する場合に操作される。表示部１７４は、マウス１７２およびキーボード１７３によるユーザの操作に対してフィードバックを返すと共に、処理装置１７１が生成した画像または文字列をユーザに向かって表示する。更に、図示の判定装置において、表示部１７４には判定結果も示される。
【００２９】
処理装置１７１は、レーザ装置１３０、ステージスキャナ１１１、およびガルバノスキャナ１４１の動作を制御する。また、処理装置１７１は、サンプル１０１において発生したＣＡＲＳ光等のラマン散乱光の光強度を検出して、サンプル１０１の状態、例えば、サンプル１０１における細胞の生死に関する状態を判定する。これにより、サンプル１０１の生死に関する状態の判定を自動化できる。なお、光強度は、用いる検出器の種類に応じて、輝度、照度、光度等として検出できる。
【００３０】
上記のような判定装置１００において、図中に点線で示すように、励起部１４０から射出された励起光は、反射鏡１４４で反射され、ダイクロイックミラー１６１を透過された後、ステージ１１０上のサンプル１０１に図中下方から照射される。励起光は、下側対物レンズ１２２によりサンプル１０１の内部で集光されるので、サンプル１０１においては、励起光が集光した位置において、サンプル１０１に含まれる分子の組成に応じた波長を有するラマン散乱光が高い確率で発生する。よって、上側ラマン散乱光検出部１５０および下側ラマン散乱光検出部１６０により、サンプル１０１において発生したラマン散乱光を検出できる。
【００３１】
なお、サンプル１０１に対して励起部１４０と同じ側に配置された下側ラマン散乱光検出部１６０により検出するラマン散乱光は、恰もサンプル１０１により反射された、言わば反射ラマン散乱光である。一方、サンプル１０１に対して励起部１４０と反対側に配置された上側ラマン散乱光検出部１５０により検出するラマン散乱光は、恰もサンプル１０１を透過した、言わば透過ラマン散乱光である。
【００３２】
多くの場合、反射ラマン散乱光による検出の分解能は、透過ラマン散乱光による検出の分解能よりも高い。換言すれば、透過ラマン散乱光による検出は、サンプル１０１の大局的な状態を把握する場合に適している。よって、目的に応じて、上側ラマン散乱光検出部１５０と下側ラマン散乱光検出部１６０とを適宜使い分けることが好ましい。
【００３３】
図２は、判定装置１００において、サンプル１０１が励起光を照射された場合に、ラマン散乱光の一例であるＣＡＲＳ光を発生するＣＡＲＳ過程を説明する模式図である。ＣＡＲＳ過程は、互いに異なる光周波数ω１、ω２を有するポンプ光およびストークス光の二つのレーザ光を含む励起光をサンプル１０１に照射して、ポンプ光の光周波数ω１とストークス光の光周波数ω２との差［ω１−ω２］が、判定対象に含まれる分子の固有振動の角振動数ω０と一致した場合に発生する。
【００３４】
ＣＡＲＳ過程により、判定対象に含まれる特定の分子構造の振動モードが励振されると、分子振動が光周波数ω３を有する第３のレーザ光であるプローブ光と相互作用することにより、三次の非線形分極に由来するＣＡＲＳ光が発生する。
【００３５】
なお、ポンプ光はプローブ光としても利用できるので、［ω１＝ω３］という条件の下で、ＣＡＲＳ光が発生する。検出対象において発生するＣＡＲＳ光は、［ωＣＡＲＳ＝ω１−ω２＋ω３］を満たす光周波数を有する。
【００３６】
よって、検出対象から射出されたＣＡＲＳ光を検出することにより、判定対象に含まれる特定の分子構造、例えば官能基の存在を非侵襲に検出できる。また、励起光を判定対象に照射する位置を変えながら繰り返しＣＡＲＳ光を検出することにより、判定対象における特定の分子構造の分布を画像化することもできる。
【００３７】
ＣＡＲＳ光は自発ラマン散乱光等に比べると光強度が高いので、光電気変換素子を用いた場合に短時間で検出できる。よって、検出に要する時間が単に短くなるばかりではなく、ビデオレートでの観察もできる。これにより、特定分子構造の分布だけではなく、分布の変化も検出できる。また、判定対象に照射する励起光の帯域を、細胞に与えるダメージが少ない赤外帯域とすることにより、判定対象の細胞を生かしたまま観察できる。
【００３８】
更に、非線形光学効果により生じるＣＡＲＳ光は、下側対物レンズ１２２により励起光が絞り込まれた極めて狭い領域において発生する。このため、ＣＡＲＳ光検出の対象となる領域は、励起光の光軸に交差する方向と、光軸と平行な方向の両方に関して狭い領域となる。よって、ＣＡＲＳ光による判定対象の観察は、立体的に高い解像度を有する。
【００３９】
よって、赤外帯域または近赤外帯域の励起光を用いて、観察平面を判定対象の内部に形成してもよい。また、観察平面を、判定対象の深さ方向に順次移動させることにより、特定の分子構造の三次元的な分布を反映した画像を生成できる。
【００４０】
なお、上記のように、コヒーレントな励起光をサンプル１０１に照射した場合に非線形光学効果を生じる現象は、ＣＡＲＳ光の他に誘導ラマン散乱等のラマン散乱光を生じる現象や、多光子励起による蛍光を生じる現象や、第二高調波、第三高調波などの高調波を生じる現象などが知られている。これらの非線形現象により生じた光のうち、ラマン散乱光を検出することにより、サンプル１０１における特定の分子構造の三次元的な分布を反映した画像を生成できる。
【００４１】
なお、ラマン散乱光ではなくても、サンプル１０１の三次元的な構造を反映した画像を生成することはできる。よって、判定装置１００は、レーザ装置１３０が射出するレーザ光の波長や各種フィルタの波長特性等を適切に調整することにより、多光子励起蛍光、第二高調波、第三高調波、誘導ラマン散乱等によりサンプル１０１から発生した放射光を検出する場合に使用することもできる。
【００４２】
図３は、判定装置１００のブロック図である。図１を参照して説明した通り、サンプル１０１に対して励起部１４０から励起光が照射されると、サンプル１０１においてＣＡＲＳ光等のラマン散乱光が発生する。サンプル１０１において発生したラマン散乱光は、上側ラマン散乱光検出部１５０および下側ラマン散乱光検出部１６０により検出される。
【００４３】
判定装置１００において上側ラマン散乱光検出部１５０および下側ラマン散乱光検出部１６０に接続された処理装置１７１には、検出部１８１、情報生成部１８２、および判定部１８３が実装されている。検出部１８１、情報生成部１８２、および判定部１８３の動作は、処理装置１７１に予め格納されたプログラム、あるいは、媒体または通信回線を通じて処理装置１７１にロードされたプログラムにより実行されてもよい。
【００４４】
検出部１８１は、上側ラマン散乱光検出部１５０および下側ラマン散乱光検出部１６０の少なくとも一方から、検出したＣＡＲＳ光等のラマン散乱光の情報として、例えば輝度値等の光強度を反映した情報を取得する。また、検出部１８１は、取得した光強度を、サンプル１０１における空間的な位置と関連付けて格納する。なお、検出部１８１は、取得した光強度をまず離散化して、デジタル化された光強度の値と位置とを関連付けて格納してもよい。
【００４５】
情報生成部１８２は、空間的な位置に関連付けて格納された光強度値に基づいて、サンプル１０１の複数の位置において検出され取得された光強度値の一様性を、例えば数値化した情報を生成する。本実施例では、一様性とは、ある時点におけるサンプル１０１内の二次元空間内または三次元空間内での検出対象の密度の様子である。空間内に検出対象が分散して検出対象の密度が均一になればなるほど一様性が高くなり、空間内で検出対象が凝集して検出対象の密度のばらつきが大きくなればなるほど一様性が低くなる。判定部１８３は、数値化された一様性を予め定めた閾値と比較する簡易な処理により、判定対象であるサンプル１０１に含まれる細胞の生死に関する状態を迅速に判定できる。
【００４６】
なお、処理装置１７１は、判定結果を、例えば表示部１７４に出力してユーザに示す。あるいは、検出対象となったサンプル１０１の個体を識別する情報と判定結果とを関連付けて、処理装置１７１に判定結果を蓄積してもよい。
【００４７】
判定装置１００で観察された細胞の状態と細胞の既知の状態とを対照させることにより判定装置１００による判定基準を決めるために、図３３に示すサンプル１０１を作成した。図３３は、サンプル１０１の構造を示す模式的断面図である。サンプル１０１は、判定対象となる単層の細胞シート１０９と、当該細胞シート１０９を封止するスライドガラス１０２、スペーサ１０３、およびカバーガラス１０４とを含む。
【００４８】
サンプル１０１においては、スライドガラス１０２とカバーガラス１０４との間に、封入液１０６に浸漬された状態で、細胞シート１０９を封入した。また、スライドガラス１０２およびカバーガラス１０４の間には、細胞シート１０９を包囲する環状のスペーサ１０３を挟み、細胞シート１０９を封入した。スペーサ１０３としては、シリコーンゴムのリングを用いた。
【００４９】
更に、サンプル１０１においては、スライドガラス１０２、スペーサ１０３、およびカバーガラス１０４の、それぞれの間隙を、封止材１０５により気密に封止した。封止材１０５としては、市販のネイルエナメルを用いた。
【００５０】
一般的に、細胞が死亡した状態では細胞膜が破壊されている。サンプル１０１に封入した細胞シート１０９は、生きている筋芽細胞すなわち細胞膜が破壊せず維持されている筋芽細胞であり、蛍光染色し易い単層の細胞シートにして封入する。封入液１０６は、細胞膜の破壊を検出する染色試薬を含むゲル状の封入液を用いた。これにより、サンプル１０１に、細胞シート１０９の細胞が死ぬことによって浮遊細胞となることによる観察環境の悪化を抑制できる。また、封入液１０６に混入した染色試薬により、蛍光を検出する場合や、色素で検出する場合がある。染色試薬は、細胞が死ぬことにより細胞膜が破壊された細胞核内に浸入し、細胞核内に豊富に存在するタンパク質を染色する。よって、サンプル１０１においては、細胞核内が染色試薬で染色されたことを光学顕微鏡で外部から検出することにより、封入された細胞シート１０９が死んだ状態であることを判定することができる。
【００５１】
図３４は、上記のように作製したサンプル１０１を、封止材１０５により封止して２０時間から４８時間の間の時間が経過した後に観察して撮影した光学顕微鏡写真４０１である。なお、サンプル１０１は、常に３７℃に保温され、顕微鏡で観察する間も、ステージ上に設けた加温機器により３７℃を維持された。光学顕微鏡写真４０１によると、観察領域に存在する染色された細胞は僅かであり、細胞シート１０９に含まれる細胞の殆どが生きている状態であることが判る。
【００５２】
図３５は、上記のサンプル１０１を、封止材１０５により封止した時刻から起算して８時間後、即ち、図３４に示した状態から７時間が経過した後に観察して撮影した光学顕微鏡写真４０２である。なお、サンプル１０１は、前の観察から後も常に３７℃に保温し、顕微鏡で観察する間も、ステージ上に設けた加温機器により３７℃を維持した。
【００５３】
光学顕微鏡写真４０２によると、染色された細胞が増加して、観察領域全体に広く分布していることが判る。これは、サンプル１０１に封入された細胞シート１０９に含まれる多くの細胞が、前の観察よりも後に、生きている細胞（「生細胞」と記載する場合がある）から死んでいる細胞（「死細胞」と記載する場合がある）に状態が変化したことを示す。細胞シート１０９の細胞の死因は、封入液１０６中の酸素の不足、封止材１０５に含まれる有機溶剤によるものであると推測される。
【００５４】
本実施の形態では、細胞膜が破壊して細胞核内のタンパク質が上記のように染色試薬により染色される状態にある細胞を死細胞とし、その状態において同じサンプル１０１をＣＡＲＳ過程により生じたラマン散乱光により検出した状態を、細胞が死んでいると判定装置１００で判断するときの基準とする。一方、細胞膜が破壊せずに維持されており、細胞核内のタンパク質が染色試薬により染色されない状態にある細胞を生細胞とし、その状態において同じサンプル１０１をＣＡＲＳ過程により生じたラマン散乱光により検出した状態を、細胞が生きていると判定装置１００で判断するときの基準とする。
【００５５】
図４は、判定装置１００における判定手順の一例を示す流れ図である。判定装置１００においては、まず、例えばユーザがサンプル１０１をステージ１１０にセットする（ステップＳ１０１）。大量のサンプル１０１を判定する場合は、ステージ１１０へのサンプル１０１のセットおよび判定後のサンプル１０１の搬出をオートメーション化してもよい。
【００５６】
次に、判定装置１００の制御部１７０は、ステージ１１０にセットされたサンプル１０１に対して、励起部１４０から励起光を照射する。これにより、下側対物レンズ１２２の焦点に集光された励起光により、サンプル１０１からラマン散乱光が発生する（ステップＳ１０２）。
【００５７】
次に、制御部１７０は、励起光を照射されたサンプル１０１において発生したＣＡＲＳ光等のラマン散乱光を、上側ラマン散乱光検出部１５０および下側ラマン散乱光検出部１６０の少なくとも一方により検出する（ステップＳ１０３）。更に、制御部１７０は、励起光が照射された位置において発生したラマン散乱光を、検出部１８１により光強度値として取得する（ステップＳ１０４）。
【００５８】
次に、制御部１７０は、判定対象における検出対象領域において、未検出の位置がないかどうかを調べる（ステップＳ１０５）。ステップＳ１０５において未検出の位置が残っていた場合（ステップＳ１０５：ＮＯ）、制御部１７０は、ステージスキャナ１１１およびガルバノスキャナ１４１のいずれかを動作させて、検出対象領域における未検出の位置に励起光が集光されるように、サンプル１０１または励起光の光路を移動させた後、制御をステップＳ１０２に戻す。
【００５９】
これにより、判定装置１００は、サンプル１０１における未検出の位置に励起光を照射して（ステップＳ１０２）、他の光強度値を検出部１８１に取得させる（ステップＳ１０４）手順を繰り返す。制御部１７０は、予め定めた検出対象領域において未検出の位置がなくなるまで上記ステップＳ１０２からステップＳ１０５までの手順を繰り返し、検出された複数の光強度値を、それぞれの光強度値が検出されたサンプル１０１における位置に対応付けて蓄積する。
【００６０】
サンプル１０１の検出対象領域において未検出の位置がなくなった場合（ステップＳ１０５：ＹＥＳ）、制御部１７０は、サンプル１０１において、未検出の検出対象が存在していないかどうかを調べる（ステップＳ１０６）。ここで、未検出の検出対象とは、例えば、サンプル１０１としての細胞におけるタンパク質を当初の検出対象とした場合に、当該細胞における脂質である。
【００６１】
なお、サンプル１０１が大きい場合には、更に、ひとつのサンプル１０１内に、他の未検出の検出領域が残っていないかどうかを調べ、残っている場合には、未検出の検出領域が無くなるまで検出を繰り返してもよい。これにより、サンプル１０１において劣化しやすいことが判っている部位、例えば、サンプル１０１の周縁、表面等の一部を選んで検出対象領域とすることにより、判定の精度とスループットとを両立できる。
【００６２】
ステップＳ１０６において、未検出の検出対象領域が残っていることが判った場合（ステップＳ１０６：ＮＯ）、制御部１７０は、ステージスキャナ１１１およびガルバノスキャナ１４１のいずれかを動作させて、未検出の検出対象領域に励起光を照射できるように、サンプル１０１または励起光の光路を移動させた後、制御をステップＳ１０２に戻す。よって、制御部１７０には、次の検出対象領域について、検出された複数の光強度値を、それぞれの光強度値が検出されたサンプル１０１における位置に対応付けて蓄積する。
【００６３】
ステップＳ１０６において、未検出の検出対象領域が残っていないことが判った場合（ステップＳ１０６：ＹＥＳ）、制御部１７０は、光強度値を取得した検出対象領域の各々について、取得した光強度値を画像化する（ステップＳ１０７）。ここで、判定装置１００における「画像化」とは、ひとつの検出対象領域に対して、複数の光強度値と、当該複数の光強度値の各々を検出した検出位置とを関連付けて蓄積した情報群を意味し、必ずしもユーザが視認できる画像を意味するものではない。また、当該情報群に含まれる検出位置は、三次元的なものである場合も含む。
【００６４】
画像化された光強度値の例として、二次元的に視覚可能な画像に変換した輝度値を図５に例示する。判定対象として、哺乳類の細胞を培養して作製し、生細胞すなわち染色試薬により細胞核が染色されない細胞により形成された細胞シートを用いた。また、判定装置１００における励起部１４０が発生する励起光の波長と、上側ラマン散乱光検出部１５０および下側ラマン散乱光検出部１６０における帯域通過フィルタ１５４、１６４の帯域特性、およびダイクロイックミラー１６１の帯域特性は、下記の表１に示す通りとして、サンプル１０１においてＣＡＲＳ光を発生させた。
【００６５】
【表１】
2016208356.tif 000003
【００６６】
図５に示す画像は、上記細胞シートにおけるタンパク質の存在に対応するＣＡＲＳ光の輝度値を画像化している。ただし、表示方法として、濃色の部分が輝度の高い領域、即ち、タンパク質がより多く存在する位置を示す。
【００６７】
図６は、同じ細胞シートについて、脂質の存在に対応するＣＡＲＳ光の輝度値を画像化した画像を示す。当該画像も、濃色の部分が輝度の高い領域、即ち、脂質がより多く存在する位置を示す。図示のように、サンプル１０１としての細胞シートにおいては、タンパク質と脂質とが略排他的に存在していることが判る。
【００６８】
図７は、図５に示した画像と、図６に示した画像とを合成して、タンパク質から発生した放射光の輝度値と、脂質から発生した放射光の輝度値との差分に基づいて生成した細胞シートの画像である。これにより、サンプル１０１としての細胞シートにおいて、細胞核が占める領域が明瞭に判り、単なる空乏等と容易に区別できる。
【００６９】
なお、本実の形態では、検出対象としてタンパク質および脂質を用いているが、これに代えて、タンパク質および脂質のように、細胞に含まれており且つ特定の波長で信号強度にピークをもつ成分であれば、そのピーク位置および強度等から成分を識別することができるので、このような条件を満たす成分であれば、タンパク質および脂質以外の成分を検出対象とし、その分布に基づいて細胞の状態を判定してもよい。検出対象としては、細胞核内に局在している成分であることがより好ましい。
【００７０】
また、ＣＡＲＳ光を検出する場合には、ＣＡＲＳ光自体と共に、屈折率情報を含む非共鳴バックグラウンド信号が不可避に検出される。光共鳴バックグラウンド信号は、ＣＡＲＳ光の検出においてはノイズとなり、生成される観察画像のコントラスト、分解能を低下させる。よって、検出対象から発生したＣＡＲＳ光により検出対象の状態を判定する場合は、非共鳴バックグラウンド信号の影響を排除することが好ましい。
【００７１】
細胞において発生するＣＡＲＳ光を検出する場合、脂質の存在を示すＣ−Ｈ振動は、非共鳴バックグラウンドと容易に区別できる高い輝度でラマン散乱光を発生する。よって、脂質により生じた例えばＣＡＲＳ光を検出して生成した情報画像は、非共鳴バックグラウンド信号の存在にもかかわらず、脂質の存在範囲を検出できる。
【００７２】
更に、細胞において、タンパク質は脂質と排他的に存在するので、タンパク質の存在により生じたＣＡＲＳ光で生成した画像と、脂質で発生したＣＡＲＳ光の画像との差分をとることにより、非共鳴バックグラウンドの影響を抑制して、タンパク質の存在を情報画像にできる。これにより、脂質が存在しないまたは脂質がタンパク質に比べて極めて少ない細胞核内においては、タンパク質の情報と脂質の情報との差分をとることにより、細胞核内において被共鳴バックグラウンドが除去されたタンパク質の情報を取り出すことができる。
【００７３】
このように、目的とする検出対象がタンパク質である場合に、敢えて脂質も検出対象とすることにより、タンパク質の検出精度を向上させることができる。ただし、目的とする検出対象を脂質とする場合は、脂質を直接に検出対象とすれば足りる。また、敢えて他の成分も検出対象とすることにより、脂質の検出精度をさらに向上することもできる。
【００７４】
なお、これら画像を合成する場合には、タンパク質と脂質とに、互いに異なる色をつけ合成してもよい。この着色は、細胞シート自体を染色するわけではないので、生きている細胞シートを侵襲することなく、染色による識別の容易性が得られる。再び図４を参照すると、上記のような画像処理により、サンプル１０１において判定の真の対象となる細胞核が画像において占める領域を検出できる（ステップＳ１０８）。
【００７５】
図８は、上記のようにして、画像化された細胞シートから抽出した細胞核が占める領域を示す画像である。図示のように、細胞核の位置と広さが判ると、制御部１７０は、いずれかの細胞核を含む領域について、ステップＳ１０７で得られた画像における輝度値の一様性を数値化する（ステップＳ１０９）。
【００７６】
図９は、図７に点線Ａで示したひとつの細胞核を含む領域を拡大して示す図である。図示のように、生きている細胞の細胞核においては、タンパク質の存在を示す輝度値が均一で、光強度値の一様性が高いことが判る。
【００７７】
図９に示す画像は、細胞核が画像の広い部分を占めている。よって、図９に示した領域を数値処理することにより、当該画像の領域における細胞核における検出対象の一様性を数値化できる（ステップＳ１０９）。本実施形態では、細胞核におけるタンパク質の存在の一様性を数値化する。
【００７８】
図１０は、死細胞から形成される細胞シートについて、タンパク質の存在に対応するＣＡＲＳ光の光強度値の一例としての輝度値を取得して生成した画像を示す。濃色の部分が輝度の高い領域、即ち、タンパク質がより多く存在する位置を示すことは、図５以降の他の図と同じである。図１１は、同じ細胞シートについて、脂質の存在に対応するＣＡＲＳ光の輝度値に基づく画像を示す。当該画像も、濃色の部分が輝度の高い領域、即ち、脂質がより多く存在する位置を示す。
【００７９】
図１２は、図１０に示した画像と、図１１に示した画像とを合成して生成した細胞シートの画像である。なお、これら画像を合成する場合も、タンパク質と脂質とに、互いに異なる色をつけてもよい。これにより、サンプル１０１としての細胞シートにおいて、細胞核が占める領域が明瞭に判り、単なる空乏等と容易に区別できる。これにより、サンプル１０１において判定の対象となる細胞核が画像において占める領域が検出される（ステップＳ１０８）。
【００８０】
図１３は、上記のようにして、画像化された細胞シートから抽出した細胞核が占める領域を示す画像である。図示のように、細胞核の位置と広さが判ると、制御部１７０は、いずれかの細胞核を含む領域から検出した輝度値に基づいて、当該細胞核を含む細胞の生死に関する状態を判定する。
【００８１】
図１４は、図１２に点線Ｂで示したひとつの細胞核を含む領域を拡大して示す図である。図示のように、死細胞の細胞核においては、タンパク質の存在を示す輝度値にムラがあり、局部的にタンパク質が少ないまたは多い領域が存在して、輝度値の一様性が低いことが判る。
【００８２】
すなわち、生細胞の細胞核においては、細胞核内でタンパク質が分散してタンパク質の密度がほぼ均一であるため、複数の位置間での輝度値の差が小さく、タンパク質の一様性が高い。一方、死細胞の細胞核においては、細胞核内でタンパク質が凝集してタンパク質の密度にばらつきが生じているため、複数の位置間での輝度値の差が大きく、タンパク質の一様性が低い。
【００８３】
図１４に示す画像は、細胞核が画像の広い部分を占めている。よって、図１４に示した領域を数値により画像処理することにより、当該画像における検出対象の一様性を数値化できる（ステップＳ１０９）。本実施形態では、細胞核におけるタンパク質の存在の一様性を数値化する。
【００８４】
図１５は、図４に示した手順のステップＳ１０９において、判定対象におけるタンパク質の存在の一様性を数値化するひとつの方法を説明する図である。図１５は、図９に示した細胞核を有する、生細胞について取得した輝度値を立体画像化した図である。
【００８５】
図中に矢印Ｘ−Ｙで示す面が、図９の面に相当する。また、図中に矢印Ｚで示す方向は、Ｘ−Ｙ平面における各位置の輝度値を示す。ただし、図５等について説明した通り、ステップＳ１０７で画像化された輝度値は、輝度値が高い方の値がマイナスになる。よって、図１５のＺ軸については、図中（−Ｚ）側が、タンパク質の存在に対応する輝度値の高さを表す。
【００８６】
情報生成部１８２は、画像化された輝度値において、輝度値の最大のピーク値と、輝度値の平均値との比を算出することにより、タンパク質の存在の一様性を数値化する。例えば、生細胞においては、タンパク質の存在について一様性が高い。このため、輝度値のピーク値と平均値との比について、例えば５倍を閾値と定め、未知の判定対象について同様の比を算出した場合に、当該比が５未満の場合に、判定部１８３は、当該判定対象が生きていると判定できる（ステップＳ１１０）。
【００８７】
図１６は、図１４に示した細胞核を有する死細胞について取得した輝度値を立体画像化した図である。図中に示すＸ−Ｙ−Ｚは、図１５と同じ意味を有する。
【００８８】
情報生成部１８２は、画像化された輝度値において、図中に矢印Ｃで指し示す最大のピーク値と、輝度値の平均値との比として一様性を数値化し、当該比を予め定めた閾値と比較する（ステップＳ１１０）。死細胞においては、タンパク質の存在について一様性が低いので、図示の画像には大きなピークが現れ、輝度値のピーク値は、例えば、閾値の一例である５倍以上になる。よって、判定部１８３は、当該判定対象が死んでいると判定できる。
【００８９】
また、情報生成部１８２は、判定対象の生物細胞のひとつの領域における最大ピーク値および最小のピーク値の比と、当該領域の周辺の領域における最大ピーク値および最小のピーク値の比との平均値を算出して、当該平均値を画像におけるコントラストを評価するコントラスト評価値としてもよい（ステップＳ１０９）。こうして生成したコントラスト評価値を、予め定めたコントラスト評価値の閾値と比較することにより（ステップＳ１１０）、未知の判定対象を、ノイズの影響を排除して容易且つ確実に判定できる。
【００９０】
また、ステップＳ１１０で得られた判定結果は、例えば、ユーザに向かって出力される（ステップＳ１１１）。判定結果の出力は、例えば、表示部１７４に表示してユーザに知らせてもよいし、判定対象に何らかのマーキングをしてもよい。また、判定装置１００に対する判定対象の搬入または搬出を自動化している場合は、判定結果に応じて異なる搬出先に判定対象を移動してもよい。これにより、判定対象が大量にある場合であっても、生死に関する状態を確実に判定して、例えば細胞シートを安全に利用できる。
【００９１】
なお、上記のように、ピーク値と平均値との比により一様性を数値化する場合、情報生成部１８２は、輝度値のノイズを低減する処理を実行してもよい。ノイズの低減は、例えば、図１５および図１６に示した空間における各々の位置に対応付けられた輝度値のそれぞれを、当該位置を含む予め定められた領域内に在る輝度値との加重平均に置き換えることにより実行できる。これにより、輝度値における突発的な値を均して、判定部１８３における判定精度を向上させることができる。
【００９２】
図１７は、図９に示した細胞核を含む、生細胞について取得した輝度値とその発現頻度のヒストグラムを示すグラフであり、一様性の数値化するステップＳ１０９の他の例を示す。なお、図５等について説明した通り、ステップＳ１０７で画像化された輝度値は、輝度値が高い方の値がマイナスになる。よって、図１７の横軸においては、原点に対して図中左側が、タンパク質の存在に対応する輝度値の高さを負数で表す。
【００９３】
既に説明した通り、図５から図９に示した、生細胞においては、細胞核におけるタンパク質の存在について一様性が高い。このため、図示のヒストグラムにおいて、輝度の絶対値が最大となる横軸の最大値と、輝度値の平均値との比が、相対的に小さくなる。
【００９４】
図示の例では、最大の輝度に対応する値（−２４３．３）と、平均値（−５１．１）との比（４．７）として、タンパク質の存在の一様性を数値化する（ステップＳ１０９）。よって、判定部１８３は、例えば、予め５と定められた閾値と、数値化された一様性とを比較することにより、未知の判定対象を容易に判定できる（ステップＳ１１０）。
【００９５】
なお、図８に示した、生細胞の複数の細胞核１〜６（細胞核３は、図中に現れていない）について、それぞれ上記の方法で輝度の一様性を数値化した。こうして数値化した細胞核の各々におけるタンパク質の存在の一様性を下記の表２に示す。下記の通り、どの細胞核についても、輝度値の最大値と平均値との比は、閾値の一例である５よりも低い。
【００９６】
【表２】
2016208356.tif 000004
【００９７】
図１８は、図１３に示した細胞核を有する死細胞について取得した輝度値とその発現頻度のヒストグラムを示すグラフである。なお、図１８においても、ステップＳ１０７で画像化された輝度値は、輝度値が高い方の値がマイナスになる。よって、図１８の横軸においては、原点に対して図中左側がタンパク質の存在に対応する輝度値の高さを負数で表す。
【００９８】
既に説明した通り、図１０から図１４に示した死んだ細胞においては、タンパク質の存在について一様性が低い。このため、図示のヒストグラムにおいて、輝度の絶対値が最大となる横軸の最大値と、輝度値の平均値との比が、相対的に大きくなる。
【００９９】
図示の例では、最大の輝度に対応する値（−１１１３．３）と、平均値（−１９８．４）との比（５．６）が、前述した閾値の一例である５以上になる。よって、判定部１８３は、数値化された一様性と比較することにより（ステップＳ１１０）、未知の判定対象を、死んだ状態の細胞と判定できる。
【０１００】
なお、図１３に示した死んだ細胞の複数の細胞核について、それぞれ上記の方法で輝度値の一様性を数値化した値を下記の表３に示す。下記の通り、どの細胞核についても、輝度値の最大値と平均値との比は、上記の閾値よりも高い。
【０１０１】
【表３】
2016208356.tif 000005
【０１０２】
図１９は、図１８に示したグラフにおいて、輝度値の平均値を横軸の原点の位置にシフトして示したグラフであり、一様性の数値化するステップＳ１０９の他の例を示す。輝度値のヒストグラムをこのようにシフトすることは、輝度値の最大値から平均値を引いた第１の値と、輝度値の最小値から平均値を引いた第２の値とをそれぞれ算出することに他ならない。よって、図１９に示したグラフの最大値と最小値との比により、サンプル１０１におけるタンパク質の存在の一様性を数値化できる。
【０１０３】
図示の例では、マイナス側の輝度値の最大値に対するプラス側の最大値の比２．５を簡単な処理で算出して、死細胞におけるタンパク質の存在の一様性を数値化できる。同様の処理を、図１７に示した、生細胞から取得した輝度値について実行すると、情報生成部１８２は、マイナス側の輝度値の最大値に対するプラス側の最大値の比０．８を算出して、生細胞におけるタンパク質の存在の一様性を数値化できる。よって、判定部１８３は、予め定めた閾値と当該比とを比較することにより、未知のサンプル１０１の生死に関する状態を判定する（ステップＳ１１０）。
【０１０４】
図２０は、ステップＳ１０９において、判定対象におけるタンパク質の存在の一様性を数値化する他の方法を説明するグラフである。なお、図５等について説明した通り、ステップＳ１０７で画像化された輝度値は、輝度値が高い方の値がマイナスになる。よって、図２０の横軸においては、原点に対して図中左側が、タンパク質の存在に対応する輝度値の高さを表す。
【０１０５】
図示のグラフにおける複雑に屈曲した細い曲線は、図９に示した細胞核を有する、生細胞について取得した輝度値のヒストグラムを示す。また、図２０において、上記ヒストグラムに重ねて記載された太く滑らかな曲線は、上記輝度値のヒストグラムにガウスフィッティングをかけた結果同定されたガウス関数を示す。このように、検出部１８１により取得された輝度値（ステップＳ１０４）に対してガスウフィッティングをかけることにより、情報生成部１８２は、サンプル１０１におけるタンパク質の存在の一様性を数値化できる（ステップＳ１０９）。
【０１０６】
更に、情報生成部１８２は、数値処理された輝度値を、例えば、ガウス関数の予め定められた傾きとなる輝度値までの度数の積算値として数値化できる。既に説明した通り、生きている細胞においては、タンパク質の存在について一様性が高い。このため、数値処理として得られたガウス関数のピークは、分布範囲の略中央に位置して正規分布に近い曲線を描く。よって、図示の例では、上記した予め定められた傾き、例えば，「ｄｙ／ｄｘ＜０．１」となる輝度値までの度数の積算値が小さい。
【０１０７】
よって、未知の判定対象について同様の処理をした場合、例えば、閾値として１０を予め定めて比較し、得られた度数の積算値が１０未満の場合に、判定部１８３は、当該判定対象が生きていると判定できる（ステップＳ１１０）。このように、励起光を照射された場合に、生物細胞に含まれる検出対象が発生するラマン散乱光の光強度を検出して、検出結果に基づいて検出対象の空間的一様性を反映した情報を生成して、生成した情報に基づいて細胞の状態を判定することができる。
【０１０８】
図２１は、図１４に示した細胞核を有する死細胞について取得した輝度値について取得した輝度値のヒストグラムを示す。図２１においても、上記ヒストグラムに重ねて記載された太く滑らかな曲線は、上記ヒストグラムにガウスフィッティングをかけた結果同定されたガウス関数を示す。
【０１０９】
既に説明した通り、死細胞においては、細胞核におけるタンパク質の存在について一様性が低い。このため、数値処理として得られたガウス関数のピークが分布範囲の中央から離れた曲線を描く。よって、図示の例では、上記した予め定められた傾きとなる輝度値までの度数の積算値が１０以上となる。よって、未知の判定対象について同様の処理をした場合、得られた度数の積算値が上記閾値である１０以上の場合に、判定部１８３は、当該判定対象が死んでいると判定できる。
【０１１０】
なお、取得した輝度値のヒストグラムにガウスフィッティングをかけて得られたガウス関数の数値化方法は、上記のような度数の積算値に限られない。例えば、情報生成部１８２は、ガウス関数のピークが形成される輝度値と、輝度値の平均値との比として数値化してもよい。
【０１１１】
生細胞においては、細胞核におけるタンパク質の存在について一様性が高いので、数値化して得られた上記の比が小さくなり、例えば５未満となる。これに対して、死細胞から検出して取得した輝度値においては、上記の比が５以上になる。よって、タンパク質の存在の一様性を、ガウス関数がピークを形成する輝度値と平均値との比として数値化することにより、判定部１８３は、閾値との比較により判定対象の生死に関する状態を判定できる。
【０１１２】
図２２は、図９に示した、生細胞を含む細胞シートについて、細胞核のひとつを含む領域の輝度を積算する数値処理して得られたローレンツ曲線を示すグラフであり、一様性の数値化するステップＳ１０９の他の例を示す。同グラフの横軸は、取得した輝度値が等しい画素の出現個数を示す。また、同グラフの縦軸は取得した輝度値の累積値を示す。
【０１１３】
なお、図示のグラフにおいて、縦軸は、最大が１となるように正規化されている。また、図中に点線で示す直線は、累積輝度値により算出されたローレンツ曲線の対照指標となる、傾きが４５度の均等配分線である。図示のグラフにおいて、ローレンツ曲線の均等配分線からの乖離は、図中に斜線で示す領域の面積により数値化できる（ステップＳ１０９）。よって、当該面積の値を、予め定めた閾値と比較することにより、サンプル１０１における細胞が生きている状態か否かを判定できる（ステップＳ１１０）。
【０１１４】
図２３は、図１４に示した、死細胞を含む細胞シートについて、ステップＳ１０９において、細胞核のひとつを含む領域の輝度値の分布を数値化して得られたローレンツ曲線を示すグラフである。図示のように、図中に斜線で示すローレンツ曲線の均等配分線からの乖離を、斜線により示す領域の面積により数値化できる（ステップＳ１０９）。また、図２３に示した斜線領域の面積は、図２２に示したグラフに対して明らかに広く、予め定めた閾値と当該領域の面積とを比較することにより、サンプル１０１に含まれる細胞の生死に関する情報を判定できる（ステップＳ１１０）。
【０１１５】
このように、未知の判定対象について、ステップＳ１０１からステップＳ１０９までのステップを実行して、当該判定対象におけるタンパク質の存在の一様性を数値化した後、当該数値を予め決定した閾値と比較する（ステップＳ１１０）ことにより、判定対象の細胞が生きているか、死んでいるか、あるいは、まだ死んではないないが死につつあるかを迅速且つ確実に判定できる。
【０１１６】
なお、上記のステップＳ１１０において用いられる閾値は、生死に関する状態が予め判っているサンプル１０１について、上記ステップＳ１０１からステップＳ１０９までを実行することにより決定できる。例えば、生きていることが予め判っている細胞シートについて、ステップＳ１０１からステップＳ１０９までを実行することにより、生細胞の細胞核におけるタンパク質の存在の一様性を数値化した場合の数値範囲を知ることができる。よって、当該数値範囲を規定する数値を閾値と定めることにより、細胞が生きていることを判定する閾値を決定できる。
【０１１７】
同様に、細胞が死んでいることが予め判っている細胞シートについて、ステップＳ１０２からステップＳ１０９まで実行することにより、細胞が死んでいることを判定する場合の閾値を得てもよい。細胞の生死に関する状態の判定結果は、必ずしも生または死のいずれか一方であるとは限らない。生物の細胞が生きている状態から死んだ状態に遷移するまでには時間がかかり、言わば、細胞が死に始めてから死に切るまでの中間的な状態もあり得る。よって、細胞が生きていることを判定する閾値とは別に、細胞が死んでいることを判定する閾値を設け、更に、それらの閾値の中間の状態も生死に関する状態として併せて判定してもよい。
【０１１８】
上記した判定方法に代えて、細胞の生死に関する状態を他の方法で判定してもよい。例えば、上記したヒストグラムの平坦部分の長さが所定値よりも大きい場合には、細胞が死んだ状態であると判定し、平坦部分の長さが所定値よりも小さい場合には、細胞が生きている状態であると判定することができる。細胞の生死を判断する平坦部分の長さの閾値は、予め生死が判っている試料を観察することにより決定してもよい。また、細胞の使用目的等に合わせて、閾値を調整してもよい。
【０１１９】
また、細胞の生死に関する状態を判定する他の方法として、上記したヒストグラムのピーク値を含む山の半値幅と、当該ヒストグラムの平坦部分の長さとを比較してもよい。この場合、平坦部分の長さが大きい場合は細胞が死んだ状態であると判定し、平坦部分の長さが小さい場合には細胞が生きた状態であると判定できる。
【０１２０】
また、上記したヒストグラムの頻度がピークとなる輝度値の位置が、全測定範囲の中心を含む予め定めた範囲の外にある場合には、細胞が死んだ状態であると判定し、ピークとなる輝度値の位置が当該範囲の内側にある場合は、細胞が生きた状態であると判定することができる。
【０１２１】
更に、ヒストグラムのピークの位置が全測定範囲の中心を含む、予め定めた第１の範囲の内側にある場合は、判定対象の細胞が生きた状態であると判定し、当該ピークの位置が上記第１の範囲とは異なる領域に定められた第２の範囲の内側にある場合には、当該細胞が死んだ状態であると判定できる。更に、当該ピークの位置が、上記第１の範囲および上記の第２の範囲のいずれの範囲でもない範囲にある場合には、判定対象の細胞が、死につつある生と死との中間的な状態であると判定できる。
【０１２２】
また更に、細胞が生きている状態、死んでいる状態、および生と死との中間的な状態とのそれぞれについて、予め状態が判っている細胞を観察して検出したヒストグラムの形状を記憶しておき、判定対象の細胞から検出したヒストグラムの形状と、記憶しているヒストグラムの形状とを比較して、形状の一致率から細胞の生死に関する状態を判定できる。
【０１２３】
図２４から図２８は、また他の判定方法を説明する図である。図２４は、判定装置１００において、生きていることが予め判っている細胞を観察して得られた観察画像を示す。図示の観察画像においては、判定対象となる細胞における核内のタンパク質分布が、ＣＡＲＳ過程を利用して可視化されている。図示のように、生きた細胞の観察画像における細胞核に対応する領域においてはタンパク質が一様に分布している。
【０１２４】
図２５は、図２４に示した観察画像を二次元フーリエ変換した結果を示す画像である。なお、観察画像を二次元フーリエ変換する場合は、原色分解またはグレースケール変換により観察画像を単色化した上で二次元フーリエ変換している。このようにして二次元フーリエ変換して得た画像を、以下、変換画像と記載する。図示のように、タンパク質が一様に分布する観察画像から得られた変換画像においては、輝度が高い領域が中央付近に集中して形成される。なお、変換画像において輝度が高い領域を、以下、フーリエ領域と記載する。
【０１２５】
図２６は、判定装置１００において、死んでいることが予め判っている細胞を観察して得られた観察画像を示す。図示の観察画像においては、判定対象となる細胞の核内に、著しく輝度が高い領域が点在することが可視化されている。図示のように、死細胞の観察画像における細胞核に対応する領域においては、局部的にタンパク質が分布する領域が観察画像に現れる。
【０１２６】
図２７は、図２６に示した観察画像を二次元フーリエ変換して得た変換画像を示す。図示の変換画像も、変換処理に先立って、原色分解またはグレースケール変換により観察画像を単色化した上で二次元フーリエ変換処理を実行している。図示のように、タンパク質が局部的に分布する観察画像から得られた変換画像においては、図２５に示した画像と比較すると、輝度が高い領域が拡がっている。
【０１２７】
図２８は、上記のようにして得られた変換画像に基づいて、観察対象の細胞の生死に関する状態を判定する場合の閾値を示す図である。図示の画像には、輝度が高い領域の内側と外側とに、それぞれ輝度が低い領域との境界が形成されている。これにより、図中で、輝度の高い領域は、一定の幅を有する環状の形状をなす。以下、図示の画像を閾値画像と記載、閾値画像における輝度の高い環状の領域を閾値領域と記載する。
【０１２８】
ここで、閾値画像と、図２５および図２７に示した変換画像とを比較すると、図２５に示した変換画像のフーリエ領域と、閾値画像における閾値領域との重なりは０．３７（相対置）となる。また、図２７に示した変換画像のフーリエ領域と、閾値画像における閾値領域との重なりは０．５２（相対置）となる。
【０１２９】
上記のようにして、生きていることが判っている細胞と、死んでいることが判っている細胞とを複数観察することにより、変換画像のフーリエ領域と閾値画像の閾値領域との重なりが０．４５の場合を閾値として、値が０．４５以下の場合は、観察対象の細胞が生きており、値が０．４５よりも大きい場合は細胞が死んでいると判定し得ることが判った。このように、判定装置１００において、核内のタンパク分布をＣＡＲＳ過程により可視化させた上で、数値処理により細胞核内のタンパクの非一様度を数値化することにより、予め定めた閾値との比較により、細胞の生死を判定して、細胞シートの品質を評価することができる。
【０１３０】
図２９は、生物細胞の細胞核におけるタンパク質の一様性に関する情報を示す情報画像の他の例を示す図である。図示の情報画像３０１は、次のようにして得られた。
【０１３１】
まず、細胞が生きていることが予め判っている生物細胞を、判定装置１００にサンプル１０１として装填し、励起光を照射することによりサンプル１０１から発生したＣＡＲＳ光を検出部１８１で検出した。励起光は、サンプル１０１に含まれるタンパク質の分子でＣＡＲＳ光を発生する波長を選んだ。これにより、サンプル１０１におけるタンパク質の分布を反映した観察画像が得られた。
【０１３２】
次に、検出部１８１において得られた観察画像を、情報生成部１８２において処理した。情報生成部１８２においては、観察画像の輝度分布における２σを閾値として観察画像を２値化して、ＣＡＲＳ光の輝度が高い領域を示す２値化画像を生成した。
【０１３３】
また、判定装置１００において、上記ＣＡＲＳ光を発生させた波長とは異なる波長の照射光をサンプル１０１に照射した。この段階でサンプル１０１に照射した照射光の波長は、サンプル１０１に含まれるタンパク質、脂質等において非線形光学効果を生じない波長を選択した。よって、サンプル１０１からラマン散乱光は射出されなかった。
【０１３４】
その代わりに、検出部１８１においては、サンプル１０１を透過した照射光を検出部１８１において検出することにより、サンプル１０１における屈折率分布を反映した観察画像が得られた。これにより、観察画像において、生物細胞の細胞核の輪郭を検出して、ＣＡＲＳ光を検出した場合に、細胞核の内部で発生したＣＡＲＳ光を選別することができる。よって、判定の対象となる生物細胞の周辺に存在する水分子等に起因する非共鳴バックグラウンドの影響を減じて、評価対象となる生物細胞の細胞核に含まれるタンパク質を集中的に検出できる。
【０１３５】
次に、ＣＡＲＳ光に由来する上記の２値画像と、非線形光学効果を生じない照射光により得られた輪郭画像とを重ねて、図２９に示した情報画像３０１が得られた。情報画像３０１においては、細胞核領域３０２の輪郭と、ＣＡＲＳ光の輝度が高い領域を輝点とする２値画像とが重なって示される。
【０１３６】
次に、情報生成部１８２は、情報画像におけるＳ／Ｎ比を改善する目的で、独立して存在する画素は除いて、２以上の複数の画素が連続した高輝度画素群の面積を計数する。図示の例では、図中に番号１〜３を付した複数の高輝度画素群が、細胞核領域３０２の輪郭の内側に分布している。
【０１３７】
情報生成部１８２は、高輝度画素群１〜３の面積を合計して、当該合計値が細胞核領域３０２全体の面積に対して占める割合を算出する。図示の例では、４８８ピクセルの画素に相当する大きさの細胞核において、高濃度のタンパク質領域であることを示す高輝度画素群は７ピクセルを占め、細胞核領域３０２全体に対して占める割合は１．４％であった。算出された値は、サンプル１０１におけるタンパク質分布の一様性を数値化した情報として判定部１８３に渡される。
【０１３８】
図３０は、生物細胞におけるタンパク質の一様性に関する情報を示す情報画像のまた他の例を示す図である。図示の情報画像３０３は、細胞が死んでいることが予め判っている生物細胞を、判定装置１００にサンプル１０１として装填し、図２９に示した情報画像３０１を得た方法と同じプロセスで得た情報画像３０３である。図示のように、情報画像３０３には、図中に番号１〜３を付した複数の高輝度画素群が、細胞核領域３０４の輪郭の内側に分布している。
【０１３９】
情報生成部１８２は、情報画像３０３についても、高輝度画素群１〜３の面積を合計して、当該合計値が細胞核領域３０４全体の面積に対して占める割合を算出する。図示の例では、５７８ピクセルの画素に相当する大きさの細胞核において、高輝度画素群は１８ピクセルを占め、細胞核領域３０４全体に対して型輝度画素群が占める面積の割合は３．１％であった。算出された値は、サンプル１０１におけるタンパク質分布の一様性を数値化した情報として判定部１８３に渡される。
【０１４０】
同時に培養した複数の細胞シートのサンプル１０１について、上記の方法でタンパク質分布の一様性を数値化した情報を蓄積した上で、各サンプル１０１の生死の状態を、他の方法でも調べた。その結果、調べたサンプル１０１においては、算出した高輝度画素群の面積比が２．５％以下の場合は細胞が生きており、細胞核領域３０２の内側でタンパク質が分散して分布していることが判った。また、算出した高輝度画素群の面積比が２．５％を超える場合は、細胞が死んでいて、細胞核領域３０２の内側でタンパク質が凝集していることが判った。よって、判定装置１００における判定部１８３は、２．５％の閾値を設定して算出された面積比と比較することにより、算出値が当該閾値を超える場合は判定対象となる細胞が死んでおり、算出値が当該閾値を超えない場合は判定対象となる細胞が生きていると判定できる。
【０１４１】
なお、上記の例では、高輝度画素群の面積が細胞核において占める割合を、タンパク質の分布の一様性を示す情報として利用した。しかしながら、例えば、単位面積当たりの高輝度画素群の数、高輝度画素群の個々の形状等を、一様性を示す情報として使用してもよい。更に、複数種類の情報を組み合わせて、細胞の状態を判定してもよい。
【０１４２】
このように、生細胞においては、細胞核に対する高輝度画素群の面積比に基づくタンパク質の一様性を示す数値が小さい。一方、死細胞においては、上記数値が大きい。よって、生死の状態が予め判っているサンプル１０１を観察することにより、細胞の生死を判定する場合の閾値を決定して、未知の細胞に対する生死の状態の判定を自動化できる。これにより、細胞シート等の品質評価を自動化できる。
【０１４３】
なお、上記の例では、サンプル１０１内のタンパク質、脂質等を励起しない照射光により細胞核領域３０２、３０４の輪郭を検出した。しかしながら、既に説明したように、サンプル１０１内の脂質において非線形光学効果を生じさせる波長の励起光を照射して、タンパク質によるラマン散乱光と、脂質によるラマン散乱光との差分により細胞核領域３０２、３０４の輪郭を検出してもよい。
【０１４４】
図３１は、細胞シートを製造する製造装置２００のブロック図である。即ち、上記した一連の判定方法を実行する判定装置１００を組み込んで、細胞シートを製造する製造装置２００を形成できる。製造装置２００は、搬送部２１０、搬入・搬出部２２０、用意部２３０、培養部２４０、および判定部２５０を備える。
【０１４５】
搬送部２１０は、気密な筐体２１２と、筐体２１２の内部に配された搬送ロボット２１４とを有する。筐体２１２の側壁は多角形をなす。
【０１４６】
搬入・搬出部２２０、用意部２３０、培養部２４０、および判定部２５０は、搬送部２１０の側壁の各面に気密に結合され、各々内部が搬送部２１０の内部に連通する。これにより、搬送ロボット２１４は、搬入・搬出部２２０、用意部２３０、培養部２４０、および判定部２５０相互の間で、汚染されることなく培養容器３００を搬送できる。
【０１４７】
搬入・搬出部２２０は、細胞シートの原料となる細胞株を採取する検体、未使用の培養容器、培養に用いる培養液、酸素ガス等の資材を搬入する場合、および、製造された細胞シートを搬出する場合に用いられる。換言すれば、搬入・搬出部２２０は、製造装置２００の内部を外部環境から遮断して、資材および細胞シートの汚染を防止する。なお、搬入・搬出部２２０に洗浄装置を設けて、搬入・搬出部２２０において搬入された資材を清浄にしてもよい。
【０１４８】
用意部２３０は、搬入された検体から、細胞シートとなる細胞株を単離する機材を備える。細胞株の単離は、用意部２３０に組み込まれたグローブボックスにおいてマニュアル操作してもよいし、大量の細胞シートを製造する場合は自動化してもよい。
【０１４９】
培養部２４０は、培養する細胞株を収容した培養容器３００の培養環境を維持する。培養環境として維持する項目としては、例えば、雰囲気の温度、湿度、二酸化炭素濃度等が例示できる。また、培養部２４０は、培養液、酸素ガス等を培養容器に循環させると共に、培養の過程で使用された培地、培養液、洗浄液等を回収する廃物、廃液タンクも備える。更に、培養部２４０は、細胞シートの培養状態を製造装置２００の外部から観察するカメラ等も備える。
【０１５０】
判定部２５０は、図１に示した判定装置１００を備え、更に、判定装置１００に培養容器３００を装填するマニピュレータ、判定装置１００を製造装置２００の外部から操作する遠隔操作部等を備える。
【０１５１】
なお、製造装置２００の搬送部２１０には、更に他の部材を結合することもできる。例えば、培養された複数の細胞シートを積層して、多層細胞シートを作製する積層部を、搬送部２１０に結合することにより、細胞シートの培養から多層細胞シートの製造までを、製造装置２００から細胞シートを取り出すことなく一貫して実行できる。
【０１５２】
図３２は、上記の製造装置２００を用いて細胞シートを製造する手順を示す流れ図である。なお、製造装置２００を稼働させる場合は、搬送部２１０、搬入・搬出部２２０、用意部２３０、培養部２４０、および判定部２５０が予め気密に結合された上で、内部が滅菌されているものとする。
【０１５３】
細胞シートを製造する場合は、まず、培養容器、培地、検体、培養液等の資材を用意して、搬入・搬出部２２０から製造装置２００に装入する（ステップＳ２０１）。次に、搬入された検体を搬送部２１０により用意部２３０に搬送して、搬入された検体から、細胞シートとなる細胞株を単離する（ステップＳ２０２）。
【０１５４】
次いで、単離した細胞株に培養用培地を添加して適切な細胞濃度の細胞懸濁液を調製し、培養容器３００に播種する（ステップＳ２０３）。この段階で、細胞懸濁液の細胞の状態を判定し、例えば、死細胞の含有量が多く、培養の見込みが少ない検体は取り除いてもよい。
【０１５５】
次に、調製された培養検体を、搬送部２１０により培養部２４０に搬送して、細胞シートの培養を開始する。培養部２４０においては、雰囲気の温度、湿度等を予め定めた範囲に維持すると共に、培養容器３００内を絶えずガス交換して、培養環境の酸素濃度、二酸化炭素濃度等を予め定めた範囲に維持する（ステップＳ２０４）。また、培養検体の培地を定期的に交換して、細胞シートの培養を促進する（ステップＳ２０５）。
【０１５６】
更に、培養検体を培養しつつ、培養容器３００がコンフルエントになったか否かを定期的に検査する（ステップＳ２０６）。培養容器３００がコンフルエントになっていない場合は（ステップＳ２０６：ＮＯ）、コンフルエントになるまで培養を継続する。
【０１５７】
一方、コンフルエントになった培養容器３００は、培養を終了して、搬送部２１０により判定部２５０に搬送され、培養された細胞シートの品質が判定される（ステップＳ２０７）。なお、コンフルエントになった細胞は著しく増殖能が低下するので、継代培養をする場合は、培養容器３００がコンフルエントになる前に培養部２４０から搬出することが好ましい。
【０１５８】
培養した検体を判定した結果、培養検体の状態が、予め定めた品質よりも低い場合（ステップＳ２０８：ＮＯ）、当該検体は細胞シートとして使用されずに破棄される。細胞シートの品質は、例えば、判定部２５０に設けられた判定装置１００を用いて判定できる。品質の判定は、例えば、当該細胞シートに含まれる生細胞または死細胞の数または割合により評価してもよい。また、判定段階では死んでいなくても、死につつある細胞の数または割合も、細胞シートを判定する指標のひとつとなり得る。
【０１５９】
培養した検体を判定した結果、培養検体の状態が、予め定めた品質よりも高い場合（ステップＳ２０８：ＹＥＳ）、当該検体を収容した培養容器は封止され（ステップＳ２０９）、搬送部２１０および搬入・搬出部２２０を通じて、製造装置２００から搬出される（ステップＳ２１０）。完成した細胞シートとして使用されずに破棄される。細胞シートの品質は、例えば、培養された細胞シートに含まれる死細胞の多寡により判定される。
【０１６０】
上記のように、製造装置２００を用いて細胞シートを製造することにより、資材の搬入から容器に封止された細胞シートの搬出まで、細胞シートを外部環境に曝すことなく完遂できる。よって、外部からの細胞シートの汚染と、細胞シートによる作業者の汚染と併せて防止できる。
【０１６１】
また、死細胞が少ない、あるいは、生細胞が多く含まれた高品質な細胞シートを効率よく製造できる。なお、上記製造装置２００において、培養検体に対する判定は、ステップＳ２０４〜２０６の培養の前後に限られず、培養途中の各段階に、繰り返し判定してもよい。これにより、培養中に培養検体の品質が劣化したと判定された場合は、当該培養検体を破棄して、製造装置２００のハードウエア資源を、他の細胞シートの培養に転用することができる。
【０１６２】
図３６は、ＣＡＲＳ過程等の非線形光学効果により生じたラマン散乱光により細胞の状態を判定する過程を模式的に示す図である。図３６に示す手順は、図１におけるステップＳ１０８から１０９に対応する。また、図３６においては、ラマン散乱光から得られた画像により、サンプル１０１に含まれる細胞の生死に関する状態を判定する各手順の内容を示す。
【０１６３】
図示の手順で細胞の状態を判定する場合は、まず、例えば、タンパク質を対象とするＣＡＲＳ過程により、タンパク質に由来するラマン散乱光を発生させてタンパク質観察画像３１０を形成する（ステップＳ３０１）。当該観察画像を二値化処理等の画像処理することにより、タンパク質観察画像３１０において細胞核が占める細胞核領域３１１を直接に検出できる（ステップＳ３０２）。
【０１６４】
サンプル１０１中の各細胞において、細胞核の内部にはタンパク質が局在し、脂質はタンパク質に比べて極めて少ない。よって、タンパク質を対象としたＣＡＲＳ過程により発生したラマン散乱光から得られたタンパク質観察画像３１０の一部を形成する非共鳴バックグラウンドは、少なくとも細胞核領域３１１においては、ノイズではなくタンパク質由来の情報と見做すことができる。
【０１６５】
そこで、例えば、図３６に示すタンパク質観察画像３１０おいて、それ自体もタンパク質により形成された核内構造体の一つである核小体を検出できる。核小体は、図中では細胞核領域３１１内に白く見えている。よって、細胞核領域３１１における核内での核小体の占有率、面積、大きさおよび形状のうちの少なくともひとつ検出して、予め定めた閾値と比較することにより、当該細胞の状態を判定できる（ステップＳ３０３）。閾値は、染色試薬による染色に基づいて生きていること、または、死んでいることが判っているサンプル１０１から得られた値に基づいて、予め定めておく。このように、ステップＳ３０１から３０３の少ないステップ数で細胞の生死に関する状態を判定できる。得られたタンパク質観察画像３１０の品質が高い場合は特に有効である。
【０１６６】
一方、タンパク質観察画像３１０から細胞核領域３１１を検出することが難しい場合は、ステップＳ３０１に続いて、例えば脂質を対象とするＣＡＲＳ過程により、脂質に由来するラマン散乱光を発生させて脂質観察画像３２０を形成する（ステップＳ３０４）。更に、得られた脂質観察画像３２０と、ステップＳ３０１で得られたタンパク質観察画像３１０との差分による差分画像３３０を生成する（ステップＳ３０５）。
【０１６７】
細胞において、タンパク質と脂質とは排他的に存在する。よって、上記の差分画像３３０からは、非共鳴バックグラウンド信号の影響を排除した細胞核領域３３１を検出できる（ステップＳ３０６）。次に、前記したタンパク質観察画像３１０において、差分画像３３０から検出した細胞核領域３３１を特定することにより、タンパク質観察画像３１０に基づいて、サンプル１０１における細胞の状態を判定できる（ステップＳ３０７）。
【０１６８】
なお、ステップＳ３０６において検出した細胞核領域３３１により、差分画像３３０自体の細胞核領域３３１におけるタンパク質の一様性に基づいて、サンプル１０１における細胞の状態を判定してもよい。このように、判定までのステップ数は増加するものの、サンプル１０１の状態、顕微鏡の性能等に応じて、判定の手順を調整してもよい。
【０１６９】
図３６では、上記した実施例で細胞核内のタンパク質の一様性を示す数値が閾値よりも小さい細胞すなわち生細胞に対して状態を判定した例を示した。図３７は、図３６に示した同じ手順によるサンプル１０１の状態判定を、一様性を示す数値が閾値よりも大きい細胞すなわち死細胞を含むサンプル１０１に対して実施した場合の例を示す図である。実行した手順は、図３６に示した場合と同じであるが、ステップＳ３０３およびステップＳ３０７において、タンパク質観察画像３１０の細胞核領域３１１、３３１において、核小体の形状、大きさ等が、図３６のタンパク質観察画像３１０に表示されている生細胞の核小体に比べて、顕著に変化していることが判る。また、ステップＳ４０８における差分画像３３０においても、タンパク質の一様性が崩れ、細胞核領域３３１の中央付近に偏在していることが判る。
【０１７０】
上記した実施の形態では、検査対象としている細胞種が筋芽細胞である例を示したが、筋芽細胞以外の細胞種を検査対象としてもよい。この場合、細胞の状態判定のための閾値は細胞種ごとに設定する。
【０１７１】
また、細胞の死因がアポトーシスである場合、死亡して間もない初期段階では細胞膜は破壊されておらず、細胞膜の表面にタンパク質が現れることがある。この場合、細胞膜の表面に現れたタンパク質は染色試薬で染色できるため、細胞核内のタンパク質の分布と表面のタンパク質の分布との関連性を予め記憶しておくことにより、細胞膜の表面のタンパク質の状態に基づいて細胞の状態を判定することができる。この場合、細胞が死亡している状態に初期段階も含まれる。
【０１７２】
更に、上記した実施の形態では、二次元空間内でのタンパク質の一様性に基づいて細胞の状態を判定する例を示したが、例えば、一つの細胞核に対して複数の高さ位置で二次元画像を取得し、それらの画像に基づいて細胞核内におけるタンパク質の三次元的な一様性を検出し、これに基づいて細胞の状態を判定してもよい。
【０１７３】
以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されない。上記実施の形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。その様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、請求の範囲の記載から明らかである。
【０１７４】
請求の範囲、明細書、および図面中において示した装置、システム、プログラム、および方法における動作、手順、ステップ、および段階等の各処理の実行順序は、特段「より前に」、「先立って」等と明示しておらず、また、前の処理の出力を後の処理で用いるのでない限り、任意の順序で実現しうることに留意すべきである。請求の範囲、明細書、および図面中の動作フローに関して、便宜上「まず、」、「次に、」等を用いて説明したとしても、この順で実施することが必須であることを意味するものではない。
【符号の説明】
【０１７５】
１００  判定装置、１０１  サンプル、１０２  スライドガラス、１０３  スペーサ、１０４  カバーガラス、１０５  封止材、１０６  封入液、１０９  細胞シート、１１０  ステージ、１１１  ステージスキャナ、１２０  対物光学系、１２１  上側対物レンズ、１２２  下側対物レンズ、１３０  レーザ装置、１３１、１３２  レーザ光源、１３３  コンバイナ、１４０  励起部、１４１  ガルバノスキャナ、１４２  スキャンレンズ、１４３  一次像面、１４４、１５１  反射鏡、１５０  上側ラマン散乱光検出部、１５２、１５３、１６２、１６３  リレーレンズ、１５４、１６４  帯域通過フィルタ、１５５、１６５  光電子増倍管、１６０  下側ラマン散乱光検出部、１６１  ダイクロイックミラー、１７０  制御部、１７１  処理装置、１７２  マウス、１７３  キーボード、１７４  表示部、１８１  検出部、１８２  情報生成部、１８３  判定部、２００  製造装置、２１０  搬送部、２１２  筐体、２１４  搬送ロボット、２２０  搬入・搬出部、２３０  用意部、２４０  培養部、２５０  判定部、３００  培養容器、３０１、３０３  情報画像、３０２、３０４、３１１、３３１  細胞核領域、３１０  タンパク質観察画像、３２０  脂質観察画像、３３０  差分画像、４０１、４０２  光学顕微鏡写真
【図１】
2016208356.tif 000006
【図２】
2016208356.tif 000007
【図３】
2016208356.tif 000008
【図４】
2016208356.tif 000009
【図５】
2016208356.tif 000010
【図６】
2016208356.tif 000011
【図７】
2016208356.tif 000012
【図８】
2016208356.tif 000013
【図９】
2016208356.tif 000014
【図１０】
2016208356.tif 000015
【図１１】
2016208356.tif 000016
【図１２】
2016208356.tif 000017
【図１３】
2016208356.tif 000018
【図１４】
2016208356.tif 000019
【図１５】
2016208356.tif 000020
【図１６】
2016208356.tif 000021
【図１７】
2016208356.tif 000022
【図１８】
2016208356.tif 000023
【図１９】
2016208356.tif 000024
【図２０】
2016208356.tif 000025
【図２１】
2016208356.tif 000026
【図２２】
2016208356.tif 000027
【図２３】
2016208356.tif 000028
【図２４】
2016208356.tif 000029
【図２５】
2016208356.tif 000030
【図２６】
2016208356.tif 000031
【図２７】
2016208356.tif 000032
【図２８】
2016208356.tif 000033
【図２９】
2016208356.tif 000034
【図３０】
2016208356.tif 000035
【図３１】
2016208356.tif 000036
【図３２】
2016208356.tif 000037
【図３３】
2016208356.tif 000038
【図３４】
2016208356.tif 000039
【図３５】
2016208356.tif 000040
【図３６】
2016208356.tif 000041
【図３７】
2016208356.tif 000042
【国際調査報告】
2016208356.tif 000043
2016208356.tif 000044
2016208356.tif 000045
2016208356.tif 000046