(57)【要約】  本発明は、ヒトにおけるＣＹＰ３Ａ酵素活性の新規な評価方法（フェノタイプ検査法）を提供することを目的とする。本発明は、ＣＹＰ３Ａ酵素活性の評価方法であって、被験体の血中における、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質とＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物との濃度比を、ＣＹＰ３Ａ酵素活性の指標として測定する、評価方法に関する。【選択図】図４
2016199702.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＹＰ３Ａ酵素活性の評価方法であって、
被験体の血中における、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質とＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物との濃度比を、ＣＹＰ３Ａ酵素活性の指標として定量する、評価方法。
【請求項２】
ＣＹＰ３Ａ酵素活性の評価方法であって、
（ｉ）被験体の血液から試料を採取する工程と、
（ｉｉ）前記試料中に含まれる、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質およびＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物を誘導体化して、誘導体化された基質および誘導体化された生成物を得る工程と、
（ｉｉｉ）前記誘導体化された基質と前記誘導体化された生成物の濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて定量する工程と
（ｉｖ）前記基質と前記生成物との濃度比を算出する工程と
を含み、
前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質がコルチゾールであり、前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物が６β−ヒドロキシコルチゾールであるか、または
前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質がコルチゾンであり、前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物が６β−ヒドロキシコルチゾンである、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記工程（ｉｉｉ）において、前記誘導体化された基質と前記誘導体化された生成物の濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて同時に定量する、請求項２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記誘導体化が、下記：
【化１】
2016199702.tif 000016
からなる群より選択される化学式で表される化合物を用いて行われる、請求項２または３に記載の評価方法。
【請求項５】
前記誘導体化が、ピコリン酸またはピコリン酸誘導体を用いて行われる、請求項２〜４のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項６】
前記誘導体化が、ピコリン酸を用いて行われる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項７】
前記誘導体化が、前記化学式で表される化合物と、前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質の水酸基および前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物の水酸基とを反応させることを含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項８】
前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物の水酸基が、該生成物のステロイド骨格の６位の水酸基および／または該生成物の２１位の水酸基である、請求項７に記載の評価方法。
【請求項９】
前記試料の量が、２００μＬ以下である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項１０】
前記工程（ｉ）において、血液からの試料の採取は１回のみ行われる、請求項２〜９のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項１１】
下記：
【化２】
2016199702.tif 000017
からなる群より選択される化学式で表される化合物を含む、ＣＹＰ３Ａ酵素活性を評価するための試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおけるＣＹＰ３Ａ酵素活性の評価方法（フェノタイプ検査法）および該活性の評価に用いるＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質と反応の生成物の血中濃度の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療におけるテーラーメイド薬物治療の重要性が指摘されており、薬物代謝酵素やトランスポーターの遺伝子多型から薬物動態を予測し、安全で有効な薬物療法を患者一人ひとりに提供する試みがなされている。
チトクロームＰ４５０  ３Ａ（以下、「ＣＹＰ３Ａ」とも称する）は、現在使用されている半数以上の薬物代謝に関与する重要な薬物代謝酵素である。本酵素の関与する薬物動態には５〜２０倍の個人差があると言われており、抗がん剤などの薬物動態を予測するマーカーとしての有用性が検討されている。しかし、ヒトＣＹＰ３Ａの関与する薬物代謝能は、遺伝子多型診断（ジェノタイピング）によっては予測できないため、各患者の酵素活性を評価する方法（フェノタイピング（以下、「フェノタイプ検査法」ともいう））として、テスト薬物を投与し、全身クリアランスや尿中排泄量等を指標として用いる手法が主に検討されている。【０００３】
これまでに、ヒトｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＹＰ３Ａ活性の評価法として、ＣＹＰ３Ａの基質となるテスト薬物をプローブとして投与し、全身クリアランスや尿中排泄量を指標に活性を評価する方法が提案されている。代表的な方法としては例えば、１４Ｃ−エリスロマイシン呼気テスト、催眠鎮静剤ミダゾラムの経口あるいは静脈内投与、コルチゾール製剤の静脈内投与が挙げられる（非特許文献１〜４参照）。【０００４】
しかしながら、１４Ｃ−エリスロマイシン呼気テストは、放射性物質の投与を要するため、放射性物質による放射性障害が懸念される。
また、ミダゾラムを投与する方法は、全身クリアランスを指標とするため、投与後、長時間にわたって採血が行われるために患者への負担が大きいことに加え、多数の血液試料を測定することは投与計画の遅れにもつながり、さらに医師、看護師、薬剤師、臨床検査技師等の医療従事者あるいは医薬品開発における研究者への負担も大きい。
更に、コルチゾール製剤を静脈内投与する方法は、コルチゾール製剤静注後の６位酸化代謝物の尿中排泄量（尿中６β−ヒドロキシコルチゾール）を測定するのに２４時間にわたる採尿が必要となることに加え、内因性のコルチゾール分泌の影響を回避するために大量のコルチゾール（例えば、３００ｍｇのコルチゾール）の投与が要求される。
このように、ＣＹＰ３Ａ活性の評価のために、放射性物質や催眠鎮静剤等の、治療には無関係の薬物が投与されることは患者にとって望ましい方法とは言えない。更に、これらの方法は、長時間にわたる採血、採尿を必要とするため、患者への肉体的および精神的負担が大きく、医療現場での普及を困難にしている。【０００５】
プローブ薬物を投与しない非侵襲的な方法としては、副腎皮質ホルモンである内因性コルチゾールがＣＹＰ３Ａの酸化によって６β位酸化代謝物（即ち６β−ヒドロキシコルチゾール）として尿中に排泄されることに注目し、尿中の６β−ヒドロキシコルチゾール／コルチゾール比（尿中６β−ＯＨＦ／尿中コルチゾール比）をＣＹＰ３Ａ活性評価の指標として用いる方法がある。尿中６β−ＯＨＦ／尿中コルチゾール比は、バイオマーカーとしてＣＹＰ３Ａ活性の酵素誘導や酵素阻害の評価に広範に利用されてきた。
しかしながら、近年、この指標は、コルチゾールの腎クリアランスの影響を受けることが明らかになり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＹＰ３Ａの酵素活性の正確な評価法とはなり得ない可能性があることが指摘されている（非特許文献５および非特許文献６参照）。また、ミダゾラム投与法などの他のフェノタイプ検査法との相関性も得られていない。【０００６】
以上のような背景から依然として、ＣＹＰ３Ａの活性を評価することのできる優れた新規な手法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. Hirth, P.B. Watkins, M. Strawderman, A. Schott, R. Bruno, and L.H. Baker: The effect of an individual's cytochrome CYP3A4 activity on docetaxel clearance. Clin. Cancer. Res., 6, 1255-1258 (2000).
【非特許文献２】B.C. Goh, S.C. Lee, L.Z. Wang, L. Fan, J.Y. Guo, J. Lamba, E. Schuetz, R. Lim, H.L. Lim, A.B. Ong, and H.S. Lee: Explaining interindividual variability of docetaxel pharmacokinetics and pharmacodynamics in Asians through phenotyping and genotyping strategies. J. Clin. Oncol., 20, 3683-3690 (2002).
【非特許文献３】N. Yamamoto, T. Tamura, H. Murakami, T. Shimoyama, H. Nokihara, Y. Ueda, I. Sekine, H. Kunitoh, Y. Ohe, T. Kodama, M. Shimizu, K. Nishio, N. Ishizuka, and N. Saijo: Randomized pharmacokinetic and pharmacodynamic study of docetaxel: Dosing based on body-surface area compared with individualized dosing based on cytochrome P450 activity estimated using a urinary metabolite of exogenous cortisol. J. Clin. Oncol., 23, 1061-1069 (2005).
【非特許文献４】N. Yamamoto, T. Tamura, Y. Kamiya, I. Sekine, H. Kunitoh, and N. Saijo: Correlation between docetaxel clearance and estimated cytochrome P450 activity by urinary metabolite of exogenous cortisol. J. Clin. Oncol. 18, 2301-2308 (2000).
【非特許文献５】T. Furuta, A. Suzuki, H. Shibasaki, A. Yokokawa, and Y. Kasuya: Urinary 6β-hydroxycortisol/cortisol ratio does not reflect in vivo CYP3A activity in humans. Xenobio. Metab. Dispos., 16 (Suppl): S98-S99 (2001).
【非特許文献６】T. Furuta, A. Suzuki, C. Mori, H. Shibasaki, A. Yokokawa, and Y. Kasuya: Evidence for the validity of cortisol 6β-hydroxylation clearance as a new index for in vivo cytochrome P450 3A phenotyping in humans. Drug Metab. Dispos., 31,1283-1287 (2003).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒトにおけるＣＹＰ３Ａ酵素活性の新規な評価方法（フェノタイプ検査法）および該活性の評価に用いるＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質と反応の生成物の血中濃度の定量法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、既に、米国特許第６，９０５，８３９号（参考文献１）において、ヒト生体内でコルチゾールが６β−ヒドロキシコルチゾールに代謝変換するパラメーター（６β−水酸化代謝クリアランスＣＬｍ（６β））が、コルチゾールの腎クリアランスに影響されず、ヒトｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＹＰ３Ａ活性の有用な指標として使用できることを明らかにしている（その他、参考文献２および３参照）。上記米国特許の方法は、東京大学病院、第一三共株式会社などの国内の大学病院や製薬企業に加え、ワシントン大学などの海外の大学でも用いられている（参考文献８および９参照）。【００１０】
また本発明者らは、内因性コルチゾールの６β−水酸化代謝クリアランス（ＣＬｍ（６β））をＣＹＰ３Ａ活性評価の指標として、リファンピシンによるＣＹＰ３Ａ酵素誘導や、クラリスロマイシンによる酵素阻害を評価できることも確認している。さらに、該指標を、２６〜４９名の日本人を対象とするＣＹＰ３Ａ活性の個人間変動、個人内変動（日内変動および日間変動）、経口避妊薬服用によるＣＹＰ３Ａ活性の変動の解明に応用し、国際的な評価を得ている（参考文献１０〜１２参照）。【００１１】
内因性コルチゾールの６β−水酸化代謝クリアランスは、２時間に排泄される尿中６β−ヒドロキシコルチゾール量（尿中６β−ＯＨＦ排泄量）を、同時間内における血中コルチゾール濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）で除して算出される（下記式１参照）。
【数１】
2016199702.tif 000003
【００１２】
式１に示すように、上記米国特許の方法においては、６β−水酸化代謝クリアランスの算出には、尿および血液双方から試料を得ることが必要である。具体的には、少なくとも２時間の蓄尿と１〜３点の採血が必要であり、複数の血液試料と尿試料とを別々に測定することが必要になる。しかも、特に小児、高齢者および腎障害者等の患者では、正確な２時間尿の採取は難しいことがある。
代謝クリアランスは、当該基質から当該代謝物への変換を担う酵素の活性指標として最も信頼性の高いパラメーターと言われる。ＣＹＰ３Ａは、コルチゾールを６β−ヒドロキシコルチゾールへ変換する酵素であることから、６β−水酸化代謝クリアランスはＣＹＰ３Ａ活性の最も信頼度の高い指標となるものである。そのため、内因性コルチゾールの６β−水酸化代謝クリアランスと良好な相関を示しつつも、正確かつ簡便に評価することのできる手法の開発が求められていた。【００１３】
血中においてコルチゾールは、比較的高い濃度を示すため、ＨＰＬＣ（参考文献１３および１４参照）、ＬＣ−ＭＳ法（参考文献１５および１６参照）などの分析法により広く定量されているが、６β−ヒドロキシコルチゾールについては、ヒトにおいて、コルチゾールのうちのわずか１／１００程度が、ＣＹＰ３Ａにより６β−ヒドロキシコルチゾールに変換するだけであり、血中濃度が非常に低い。
血中６β−ヒドロキシコルチゾール（以下、「６β−ＯＨＦ」ともいう）の定量法としては、放射免疫測定（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法による定量法が挙げられるが（参考文献１７および１８参照）、この定量法では、類似の化学構造をもつ他の生体成分との交差反応が問題となる。また、血中６β−ヒドロキシコルチゾールや血中６β−ヒドロキシコルチゾン（以下、「６β−ＯＨＥ」ともいう）は極めて微量であるため、ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ法は選択性および特異性に欠けた定量法である。
また、ＣＹＰ３Ａ活性の低い患者やＣＹＰ３Ａ酵素阻害薬を服用している患者を対象として血中の６β−ＯＨＦを定量する場合には、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬレベルにおいて高精度の定量方法、即ち、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍＬの血中濃度を正確に定量することができる高感度の定量方法が要求される。【００１４】
本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、血中コルチゾールに対する血中６β−ヒドロキシコルチゾールの濃度比（血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比）、または、血中コルチゾン濃度に対する血中６β−ヒドロキシコルチゾンの濃度比（血中６β−ＯＨＥ／血中コルチゾン濃度比）が、コルチゾール６β−水酸化代謝クリアランスを反映する、ＣＹＰ３Ａ活性のバイオマーカーとなることを見出した。具体的には、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比は、本発明者らによる上記米国特許でＣＹＰ３Ａ活性の指標として用いた６β−水酸化代謝クリアランスＣＬｍ（６β）と良好な相関を示すことを実証した。更に、血中６β−ＯＨＦ、コルチゾール、６β−ＯＨＥおよびコルチゾンを誘導体化した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって高い精度で定量することにより、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール比または血中６β−ＯＨＥ／血中コルチゾン濃度比を正確に求められることを見出した。【００１５】
本発明は上記知見に基づくものであり、即ち：
（１）ＣＹＰ３Ａ酵素活性の評価方法であって、
被験体の血中における、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質とＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物との濃度比を、ＣＹＰ３Ａ酵素活性の指標として定量する、評価方法；
（２）ＣＹＰ３Ａ酵素活性の評価方法であって、
（ｉ）被験体の血液から試料を採取する工程と、
（ｉｉ）前記試料中に含まれる、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質およびＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物を誘導体化して、誘導体化された基質および誘導体化された生成物を得る工程と、
（ｉｉｉ）前記誘導体化された基質と前記誘導体化された生成物の濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて定量する工程と
（ｉｖ）前記基質と前記生成物との濃度比を算出する工程と
を含み、
前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質がコルチゾールであり、前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物が６β−ヒドロキシコルチゾールであるか、または
前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質がコルチゾンであり、前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物が６β−ヒドロキシコルチゾンである、前記（１）に記載の評価方法；
（３）前記工程（ｉｉｉ）において、前記誘導体化された基質と前記誘導体化された生成物の濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて同時に定量する、前記（２）に記載の評価方法；
（４）前記誘導体化が、下記：
【化１】
2016199702.tif 000004
からなる群より選択される化学式で表される化合物を用いて行われる、前記（２）または（３）に記載の評価方法；
（５）前記誘導体化が、ピコリン酸またはピコリン酸誘導体を用いて行われる、前記（２）〜（４）のいずれか１項に記載の評価方法；
（６）前記誘導体化が、ピコリン酸を用いて行われる、前記（２）〜（５）のいずれか１項に記載の評価方法；
（７）前記誘導体化が、前記化学式で表される化合物と、前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質の水酸基および前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物の水酸基とを反応させることを含む、前記（２）〜（６）のいずれか１項に記載の評価方法；
（８）前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物の水酸基が、該生成物のステロイド骨格の６位の水酸基および／または該生成物の２１位の水酸基である、前記（７）に記載の評価方法；
（９）前記試料の量が、２００μＬ以下である、前記（２）〜（８）のいずれか１項に記載の評価方法；
（１０）前記工程（ｉ）において、血液からの試料の採取は１回のみ行われる、前記（２）〜（９）のいずれか１項に記載の評価方法；
（１１）下記：
【化２】
2016199702.tif 000005
からなる群より選択される化学式で表される化合物を含む、ＣＹＰ３Ａ酵素活性を評価するための試薬；
に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ヒトにおけるＣＹＰ３Ａ酵素活性の新規な評価方法（フェノタイプ検査法）および該活性の評価に用いるＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質と反応の生成物の血中濃度の定量法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ピコリン酸誘導体化が６β−ＯＨＦの検出感度に与える影響を示す。
【図２】ピコリン酸により誘導体化した血液中ステロイドの定量結果を示す。
【図３】血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比およびＣＬｍ（６β）の変動を示す。
【図４】血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比とＣＬｍ（６β）との相関を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
上記の通り、ＣＹＰ３Ａは、現在使用されている半数以上の医薬品代謝に関与する重要な薬物代謝酵素であり、本酵素の関与する薬物動態には個人差がある。本発明は、ＣＹＰ３Ａ酵素活性の評価方法であり、具体的には、各個体におけるＣＹＰ３Ａ酵素の活性を評価する方法である。
本発明の「ＣＹＰ３Ａ酵素活性の評価方法」には、「ＣＹＰ３Ａ酵素活性の検査方法」、「ＣＹＰ３Ａ酵素活性の測定方法」、「ＣＹＰ３Ａ酵素活性のフェノタイプ検査方法」および「ＣＹＰ３Ａ酵素活性のフェノタイプ測定方法」が包含され、これらの語は本明細書において互換可能に使用されるものとする。
【００１９】
本発明のＣＹＰ３Ａ酵素活性の評価方法では、被験体の血中における、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質とＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物との濃度比を、ＣＹＰ３Ａ酵素活性の指標として測定する。
例えば、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質がコルチゾールである場合、ＣＹＰ３Ａ酵素による反応は下記反応式（Ｉ）で示される。
【化３】
2016199702.tif 000006
【００２０】
上記反応例に示す通り、ＣＹＰ３Ａ酵素は、プレドニゾロンなどの合成ステロイド剤やコルチゾール、コルチゾンなどの内因性ステロイド類の、ステロイド骨格の６位を酸化する。
ヒトにおいてコルチゾールがＣＹＰ３Ａによって６β−ＯＨＦに変換される場合、コルチゾールのうちの約１／１００が、６β−ＯＨＦに変換される。
【００２１】
本発明の評価方法は、被験体の血中における、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質（以下、単に「反応基質」ともいう）とＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物（以下、単に「反応生成物」ともいう）との濃度比を、ＣＹＰ３Ａ酵素活性の指標として測定するものである。
具体的には、例えば上記反応式（Ｉ）で表される反応では、ＣＹＰ３Ａ酵素による反応基質はコルチゾールであり、ＣＹＰ３Ａ酵素による反応生成物は６β−ＯＨＦであり、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比が、ＣＹＰ３Ａ酵素活性の指標として測定される。
本発明は、先行特許の方法と異なり、ＡＵＣを算出しないために複数回の採血を必要としない。また、採尿も必要としない。すなわち、本発明は、血中に存在するＣＹＰ３Ａ酵素の反応基質と反応生成物比を指標としたことにより、１回の採血で先行特許と同等の精度で活性評価できる点が特徴である。また活性の経時的な追跡も容易となる。更に、従来法の尿中の生成物／尿中の基質濃度比と比べると、コルチゾールの腎クリアランスの影響を受けないため、より正確な活性評価を提供できる。また更には、血液試料中のＣＹＰ３Ａ酵素反応に関する基質とＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物を同時に定量できるため、１回の定量で活性が評価でき、簡便かつ迅速に酵素活性を評価することができる。
【００２２】
本発明の評価方法の１つの好ましい態様は、下記の工程：
（ｉ）被験体の血液から試料を採取する工程と、
（ｉｉ）前記試料中に含まれる、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質およびＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物を誘導体化して、誘導体化された基質および誘導体化された生成物を得る工程と、
（ｉｉｉ）前記誘導体化された基質と前記誘導体化された生成物の濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて定量する工程と
（ｉｖ）前記基質と前記生成物との濃度比を算出する工程と
を含む。
（ｉ）〜（ｉｖ）の各工程をそれぞれ、「試料採取工程」、「誘導体化工程」、「濃度定量工程」および「濃度比算出工程」という。以下に各工程について詳述する。
【００２３】
＜１＞試料採取工程
本工程では、被験体の血液から試料を採取する。即ち、本発明の評価方法では、試料は採血のみにより得られる。従来、ＣＹＰ３Ａ活性評価の指標として使用されていた内因性のコルチゾール６β−水酸化代謝クリアランスＣＬｍ（６β）の算出には、採尿および採血の両方が必要であったが、本発明の評価方法によれば採血のみで検査または評価できることから、患者および医療従事者双方への負担を軽減することが可能である。また、採血のみで試料が得られるため、正確な採尿が困難な患者に対しても適用することが可能である。
【００２４】
また、採血の量も少量でよい。血液から採取される血漿あるいは血清の量としては、多ければ多いほど高精度に評価を行うことができるが、本発明の評価方法によれば、１００μＬあれば十分に高精度に評価を行うことができる。該試料の量は例えば、好ましくは１００〜２００μＬの範囲内であり、より高精度に酵素活性の評価を行うことができる。試料の量は、より好ましくは３００μＬ以上である。
本工程において、血液からの試料の採取は望ましくは、１回のみ行われる。ＡＵＣを算出する方法では、複数回の採血が必要であって、ＣＹＰ３Ａ活性評価に必要となる総血液量が多くなるのに対し、本発明では、ＡＵＣを求める必要がないため、採血の量は少量でよい。また、本発明では、血漿または血清中の、ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物を高感度で定量できるため、本発明の評価方法に必要な血液量は上記のように非常に少量でよい。
このように、本発明の評価方法では、採血の量も回数も少ないため、簡便に試料を得られ、試料採取時の医療従事者の負担を軽減できるだけでなく、患者の肉体的および精神的負担も軽減することが可能である。
【００２５】
＜２＞誘導体化工程
本工程では、上記試料中に含まれる、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質およびＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物を誘導体化して、誘導体化された基質および誘導体化された生成物を得る。
【００２６】
本発明の評価方法において、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質および反応生成物はステロイド類であり、具体的には、ＣＹＰ３Ａ酵素反応による生成物は反応基質となるステロイドの６β位水酸化代謝物である。さらに具体的には、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質は、コルチゾールまたはコルチゾンであり、ＣＹＰ３Ａ酵素による反応生成物は、６β−ヒドロキシコルチゾール（以下、「６β−ＯＨＦ」とも称する）または６β−ヒドロキシコルチゾン（以下、「６β−ＯＨＥ」とも称する）である。より具体的には、反応基質がコルチゾールの場合には、反応生成物は６β−ＯＨＦであり、反応基質がコルチゾンの場合には、反応生成物は６β−ＯＨＥである。
例えば、反応基質および反応生成物がそれぞれ、コルチゾールおよび６β−ヒドロキシコルチゾールである場合の反応は上記反応式（Ｉ）で示した通りである。
【００２７】
本発明においては、反応基質及び反応生成物を誘導体化することにより、以下で説明する定量工程において、反応基質と反応生成物の検出感度を向上させることができる。
ＣＹＰ３Ａ活性が高い被験者、あるいは血中６β−ＯＨＦ濃度または血中６β−ＯＨＥ濃度が高い被験者の場合は、基質および反応生成物を誘導体化しなくてもそのまま、定量工程でＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより測定できる可能性もあるが、様々な被験者を対象に精度よく測定するためには、適切な誘導体に変換して高感度測定するのが好ましい。
【００２８】
本工程における誘導体化は、好ましくは下記：
【化４】
2016199702.tif 000007
からなる群より選択される化学式によって表される化合物を用いて行われる。即ち、誘導体化は好ましくは、ピコリン酸、ピコリン酸誘導体、２−ｈｙｄｒａｚｉｎｏ−１−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＨＭＰ）、２−ｆｌｕｏｒｏ−１−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ  ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＦＭＰ）、４-ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、２，３，４，５，６−ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｙｌ  ｂｒｏｍｉｄｅ（ＰＦＢ））またはｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ（Ｄａｎｓｙｌ）  ｃｈｌｏｒｉｄｅを用いて行われる。
誘導体化は具体的には、前記化学式で表される化合物と、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質の水酸基およびＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物の水酸基とを反応させることを含む。反応基質と反応生成物には、水酸基が多数存在し、水酸基を修飾して誘導体化することにより、分子内に電荷を保持させて、イオン化効率を高め、ＬＳ−ＭＳ／ＭＳによる定量感度を向上させることができる。
【００２９】
また、誘導体化に用いられる化合物は、特に好ましくは、下記式：
【化５】
2016199702.tif 000008
［式中、Ｒは水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリルアルコキシ基、ジアルキルアミノ基、ニトロ基、シアノ基を表し、ＣＯＸ基はカルボン酸またはその反応性官能基を表す］
で表されるピコリン酸またはピコリン酸誘導体である。
式中、Ｒは好ましくはアルキル基であり、ＣＯＸ基は好ましくはカルボン酸である。
ピコリン酸またはピコリン酸誘導体による誘導体化は、位置的及び立体的要因の影響を受けない誘導体化反応であること、反応が一段階で安定的に進むこと、市販の試薬で誘導体化できるという点で他の化合物を用いた誘導体化と比較して有利である。
また、理論に拘束されることを意図するものではないが、ピコリン酸またはピコリン酸誘導体によって誘導体化された誘導体では、ピコリン酸のピリジン基内の窒素がプロトン化しやすくなり、イオン化効率を増加させ、以下で説明する測定工程において定量感度を大きく向上させることができると考えられる。
誘導体化に用いられる化合物は、特に好ましくは、ピコリン酸である。
【００３０】
以下に一例として、ピコリン酸と、反応生成物である６β−ＯＨＦの水酸基との反応を示す。
【化６】
2016199702.tif 000009
【００３１】
上記反応式に示されるように、誘導体化は、例えば、反応生成物のステロイド骨格の６位の水酸基を誘導体化することにより行われ得る。上記例では、反応生成物において誘導体化される水酸基が、該生成物のステロイド骨格の６位の水酸基であるが、反応生成物において誘導体化される水酸基は例えば、該生成物のステロイド骨格の１１位の水酸基または１７位の水酸基であってもよい。反応生成物のステロイド骨格の水酸基を誘導体化することにより、感度が上昇し、精度の向上につなげることができる。更に、反応生成物において誘導体化される水酸基は例えば、２１位の水酸基であってもよい。反応生成物の２１位の水酸基を誘導体化することによっても感度が上昇し、精度の向上につなげることができる。
一方、反応基質の血中濃度は、反応生成物のそれと比較して高く、誘導体化しなくても定量可能であるが、反応基質と反応生成物は試料中に併存し、これらは同時に定量され得るため、両者の誘導体化が同時に行われ得る。
反応基質であるコルチゾールまたはコルチゾンは、ステロイド骨格の６位に水酸基を持たないため、誘導体化は、例えば、コルチゾールではステロイド骨格の１１位の水酸基、または１７位の水酸基を誘導体化することにより、また、コルチゾンではステロイド骨格の１７位の水酸基を誘導体化することにより、行われ得る。また例えば、これら反応基質において誘導体化される水酸基は、２１位の水酸基であってもよい。反応基質が誘導体化されると定量感度が上昇する。例えば、反応基質が２１位で誘導体化される場合には、感度が１０倍程度上昇する。
なお、誘導体化に関与する水酸基の数は特に限定されず、反応基質および反応生成物が有する水酸基のうちの２つ以上の水酸基を誘導体化してもよい。
【００３２】
＜３＞濃度定量工程
本工程では、前記誘導体化された基質と前記誘導体化された生成物との血中濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて定量する。本工程では好ましくは、前記誘導体化された基質と前記誘導体化された生成物との血中濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて同時に定量する。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）は、試料をＬＣ部で親和性の差によって成分ごとに分離し、その後、イオン化室で生じたプリカーサーイオンを１段階目の質量分離室において特定の質量数のイオンのみを通過させ、衝突室にてアルゴン等のガスにより衝突誘発解離を行い、プロダクトイオンを生成し、２番目の質量分離室で特定の質量数のイオンのみを検出する。そのため、高感度で選択性が非常に高い。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いることにより、誘導体化された基質と誘導体化された生成物の血中濃度を、生体成分由来の妨害物質の影響を受けず、高感度、高精度に定量することができる。更に、ＬＣ−ＭＳやＧＣ−ＭＳによって定量する場合と比較してより高精度、高感度、高選択的に定量することができる。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法では、誘導体化されていない試料を測定することも可能であるが、ＥＳＩ法において、イオン化効率が悪く、十分な感度が得られない物質では、誘導体化により、分子内に電荷を安定に存在させることでイオン化効率を増加させ、感度を大幅に上昇させることができる。
イオン化は、ＡＰＣＩ法およびＥＳＩ法等既知の方法で行われてよいが、好ましくは、ＥＳＩ法で行われる。ＥＳＩ法は、最もソフトで、高極性、難揮発性および熱不安定化合物にも適用可能であるためである。さらに、イオン化モードはポジティブイオン化モード、ネガティブイオン化モードのいずれでもよいが、好ましくは、ポジティブイオン化モードである。
【００３３】
本工程では、安定同位体希釈質量分析法の手法を用いることができる。安定同位体希釈質量分析法は、内標準物質として安定同位体標識体を用いる定量方法であるが、目的物質の抽出率や誘導体化率の変動を自動的に補正し、キャリアーとしての効果も期待できるため、超高感度および高精度分析を可能とする。なお、微量定量には、標識元素の脱落が無く、高い同位体純度で質量数が３〜４高い安定同位体標識体が望ましい。
例えば、安定同位体標識体としては、６β−［１，１，１９，１９，１９−２Ｈ５］ＯＨＦ、６β−［１，２，４，１９−１３Ｃ４，１，１，１９，１９，１９−２Ｈ５］ＯＨＦ等とこれに対応するコルチゾール、６β−ＯＨＥおよびコルチゾンの安定同位体標識体など既知のものが使用され、市販品および合成品のいずれが用いられてもよい。
＜４＞濃度比算出工程
本工程では、前記濃度定量工程で定量した誘導体化された基質の濃度と誘導体化された生成物の濃度との濃度比を算出する。
【００３４】
本発明の評価方法は、上記工程の他にも、下記の工程を任意で含んでもよい。
例えば、６β−水酸化代謝クリアランスのデータと照らし合わせて、反応生成物／反応基質の濃度比を算出する工程が含まれてもよい。６β−水酸化代謝クリアランスは例えば、米国特許第６，９０５，８３９号に従って算出される。
また、例えば、健常人の血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比あるいは血中６β−ＯＨＥ／血中コルチゾン濃度比を集積することにより、健常人における血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比（活性）あるいは血中６β−ＯＨＥ／血中コルチゾン濃度比（活性）の変動幅（正常値）を明らかにする工程を行ってもよい。
更に、例えば、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比あるいは血中６β−ＯＨＥ／血中コルチゾン濃度比の個人内における日内変動、または、個人内における日間変動を明らかにする工程を行ってもよい。
【００３５】
また、例えば、リファンピシンのようなＣＹＰ３Ａ誘導薬あるいはクラリスロマイシンや経口避妊薬のようなＣＹＰ３Ａ阻害薬を服用し、服用前と服用後の血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比あるいは血中６β−ＯＨＥ／血中コルチゾン濃度比が低下あるいは上昇する割合を捉え、その変化率から医薬品によるＣＹＰ３Ａの誘導効果及び阻害効果を評価する。
更に、例えば、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比あるいは血中６β−ＯＨＥ／血中コルチゾン濃度比のデータを、ＣＹＰ３Ａで代謝される薬物の全身クリアランスのデータとの相関性を検討する。
また、例えば、ＣＹＰ３Ａで代謝される薬物の服用前に、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比あるいは血中６β−ＯＨＥ／血中コルチゾン濃度比を測定し、個別化薬物投与設計に応用する。
【００３６】
本発明の第２の側面は、下記：
【化７】
2016199702.tif 000010
からなる群より選択される化学式で表される化合物を含む、ＣＹＰ３Ａ酵素活性を評価するための試薬に関する。当該試薬は、上記本発明の評価方法において使用される試薬であり、試料中に含まれる測定対象物質を誘導体化するために使用される。従って、当該試薬に関して、前記ＣＹＰ３Ａ酵素活性を評価することには、被験体の血中における、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質とＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物との濃度比を、ＣＹＰ３Ａ酵素活性の指標として測定することを含む。当該試薬は、上記群より選択される化学式で表される化合物のみからなるものであってもよく、当該化合物の他、溶媒、添加剤等を適宜含んでいてもよい。
本試薬は、より具体的には、前述した評価方法において、使用されることが好ましい。
【００３７】
本発明のＣＹＰ３Ａの活性の評価方法および試薬によれば、ＣＹＰ３Ａの酵素活性を簡便且つ高精度に評価することができる。また、連続的かつ経時的にＣＹＰ３Ａ活性を評価することが可能である。
更に、本発明では、測定試料の採取は、少量の採血で且つ１回のみの採血で行われるため、患者および医療従事者の負担を大幅に軽減することができる。特に、小児、高齢者および腎障害者等の正確な尿の採取が難しい患者においても、簡便に測定試料の採取を行うことができる。また、治療に関係ない薬物を投与することによる影響を懸念する必要がない。更には、新生児、小児、妊婦、授乳婦等の薬物の投与による影響に特に注意すべき患者においても、安全かつ有効にＣＹＰ３Ａ活性を評価することが可能である。
また更に、活性評価のために用いる血液試料中のＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質および反応生成物は、同時に定量できるため、１回の定量でＣＹＰ３Ａ活性が簡便かつ迅速に評価できる。
本発明の手法は、臨床における個別化薬物治療（テーラーメイド薬物治療）や、薬物の酵素誘導および酵素阻害を評価する医薬品開発において強力なツールとして利用できることが期待される。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
＜１＞血中ステロイド代謝物濃度の定量
６β−ＯＨＦ、６β−ＯＨＥ、コルチゾールおよびコルチゾンの血中濃度定量法として、以下に示す通り、ＧＣ−ＭＳによる定量法、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる定量法、および、誘導体化によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量法を検討した。【００３９】
＜１．１＞各種定量法の検討
（実施例１）ＧＣ−ＭＳによる定量
ＧＣ−ＭＳの高精度および高感度分析を可能にするため、６β−ＯＨＦの安定同位体希釈質量分析法を用いた。内標準物質として安定同位体標識体６β−ＯＨＦ−１３Ｃ４，２Ｈ５を使用した。
これら安定同位体標識体６β−ＯＨＦ−１３Ｃ４，２Ｈ５を添加した血液試料に、５％  ｍｅｔｈｏｘｙａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｐｙｒｉｄｉｎｅ溶液を１００μＬ加え、１００℃で３０分間加熱した。放冷後、窒素気流下で溶媒を留去し、Ｎ，Ｏ−ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ（ＢＳＡ）を５０μＬ加え、１００℃で１２０分間加熱することによりＭＯ−ＴＭＳ誘導体を得た。放冷後、窒素気流下で過剰のＢＳＡを除去し、残渣を固相カラムにて精製し、溶出液を窒素気流下で留去し、残渣をシクロヘキサンに溶解し、ＧＣ−ＭＳに注入した。
ＧＣカラムとして、Ｓｕｐｅｌｃｏ  （Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）のｆｕｓｅｄ−ｓｉｌｉｃａ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｃｏｌｕｍｎ  ＳＰＢ−１（０．２５ｍｍＩＤ×１５ｍ，ｆｉｌｍ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ０．２５μｍ）を使用し、キャリアーガスとしては、Ｈｅ（カラム圧５０ｋＰａ）を使用した。カラム温度は、初期温度５０℃を２分間保持した後、２０℃／ｍｉｎで２５０℃まで昇温し、１０℃／ｍｉｎで２８０℃まで昇温した。【００４０】
（実施例２）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる定量
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの高精度および高感度分析を可能にするため、６β−ＯＨＦ、６β−ＯＨＥ、コルチゾールおよびコルチゾンの安定同位体希釈質量分析法を用いた。ここでは６β−ＯＨＥの内標準物質として６β−ＯＨＦの安定同位体標識体を用いた。
マススペクトル分析は、ネガティブイオンモード（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳＩ（−））、測定モードは多重反応モニタリングモード（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：ＭＲＭ）とした。
Ｓｐｒａｙ  Ｖｏｌｔａｇｅを３０００Ｖ、Ｖａｐｏｒｉｚｅｒ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅを３００℃、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅを３００℃に設定した。
ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｏｎおよびｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｏｎのｍ／ｚ値は、それぞれ下記の通りである：
６β−ＯＨＦ        ：      ｍ／ｚ  ４２３→３４７（ＣＥ：２０Ｖ）、
６β−ＯＨＥ        ：      ｍ／ｚ  ４２１→３４５（ＣＥ：２０Ｖ）、
コルチゾール        ：      ｍ／ｚ  ４０７→３３１（ＣＥ：２２Ｖ）、
コルチゾン          ：      ｍ／ｚ  ４０５→３２９（ＣＥ：２１Ｖ）、
６β−ＯＨＦ−２Ｈ４  ：      ｍ／ｚ  ４２７→３５１（ＣＥ：２０Ｖ）、
コルチゾール−１３Ｃ４  ：      ｍ／ｚ  ４１１→３３５（ＣＥ：２２Ｖ）、
コルチゾン−１３Ｃ４    ：      ｍ／ｚ  ４０９→３３３（ＣＥ：２１Ｖ）。【００４１】
分離カラムとしては、Ｃ１２カラムであるＳｙｎｅｒｇｉ  ４ｕ  Ｍａｘ  ＲＰ（２５０×２．０ｍｍ  ＩＤ，４μｍ）、ガードカラムはセキュリティガードカートリッジ（４×２．０ｍｍ  ＩＤ）を使用した。
移動相Ａとして０．２％ギ酸水溶液、移動相Ｂとしてメタノ−ルを使用した。グラジエントは移動相Ｂの割合を２０％（０−４ｍｉｎ）、５０％（４．１−９ｍｉｎ）、９０％（９．１−１３ｍｉｎ）、２０％（１３．２−３０ｍｉｎ）とした。移動相の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。【００４２】
（実施例３）ピコリン酸誘導体化によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの高精度および高感度分析を可能にするため、６β−ＯＨＦ、６β−ＯＨＥ、コルチゾールおよびコルチゾンの安定同位体希釈質量分析法を用いた。ここでは６β−ＯＨＥの内標準物質として６β−ＯＨＦの安定同位体標識体を用いた。
マススペクトル分析は、ポジディブイオンモード（ＥＳＩ（＋））、測定モードはＭＲＭとした。ＥＳＩの際のｎｅｂｕｌｉｚｅｒ  ｇａｓ（１０．０Ｌ／ｍｉｎ）には窒素を、イオン開裂させるためのｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｇａｓ（５０ｐｓｉ，３５０℃）には超高純度窒素を用いる。
ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｏｎおよびｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｏｎのｍ／ｚ値は、下記の通り最適化した：
６β−ＯＨＦ        ：      ｍ／ｚ  ４８４→７８、
６β−ＯＨＥ        ：      ｍ／ｚ  ４８２→７８、
コルチゾール        ：      ｍ／ｚ  ４６８→７８、
コルチゾン          ：      ｍ／ｚ  ４６６→７８、
コルチゾン−１３Ｃ４    ：      ｍ／ｚ  ４７０→７８、
６β−ＯＨＦ−２Ｈ４  ：      ｍ／ｚ  ４８８→７８、
コルチゾール−１３Ｃ４  ：      ｍ／ｚ  ４７２→７８。
ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｏｎのｍ／ｚ値である７８は、いずれもピコリン酸から−ＣＯＯＨ基が分離した構造と推測される。カラムはＳｙｎｅｒｇｉ  ４ｕ  Ｍａｘ−ＲＰ  ８０Ａ（２５０×２．０ｍｍ，４．０μｍ）を使用した。【００４３】
移動相には１０ｍＭ酢酸アンモニウム＋０．２％ギ酸水溶液とメタノールとを使用し、グラジエント法により測定した。グラジエントは、メタノールの割合を２０％（０−４ｍｉｎ）、６５％（４．１−７ｍｉｎ）、５０％（７．１−９ｍｉｎ）、９０％（９．１−１０ｍｉｎ）、７５％（１０．２−１３ｍｉｎ）、２０％（１３．２−２５ｍｉｎ）とした。流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は３５℃に設定し、測定時間は２５分間とした。【００４４】
ピコリン酸誘導体は、抽出した血漿試料をテトラヒドロフラン５０μＬに溶解し、誘導体化試薬５０μＬを加え、室温で１０分間反応させた後、１％酢酸１ｍＬで反応を停止して作製した。
誘導体化試薬は、用時調製とし、ピコリン酸１０ｍｇ、２−ｍｅｔｈｙｌ−６−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ１０ｍｇ、４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ  ５ｍｇをテトラヒドロフラン１ｍＬに溶解して作製した。
得られた誘導体は、Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ）にて精製して測定試料とした。 
イオン化法は、最もソフトで、高極性、難揮発性および熱不安定化合物にも適用可能なＥＳＩ法で測定した。なお、安定同位体標識体は参考文献２４に従って合成したものを使用した。【００４５】
＜１．２＞各種定量法の評価
ＧＣ−ＭＳ法により６β−ＯＨＦを定量するには、適当な誘導体に変換する必要がある。６β−ＯＨＦをｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ誘導体として、ＧＣ−ＭＳ測定（ＥＩイオン化モード）した際の検出限界（ＬＬＯＤ）は２５０ｐｇ（ｓ／ｎ＝２．７）であり、血中の６β−ＯＨＦを精度よく定量するのに必要な感度が得られていない。
６β−ＯＨＦを誘導体化しないで、そのままＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ポジティブモード）にて定量した結果、６β−ＯＨＦの定量感度は、コルチゾールやコルチゾンの約１／５〜１／１０と低かった。ネガティブモードに変更すると、５倍程度の感度の上昇が見られたが、血液１ｍＬを用いても６β−ＯＨＦの血中濃度の定量に充分な感度は得られなかった。【００４６】
ピコリン酸誘導体化した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにて測定すると、６β−ＯＨＦのｍ／ｚ値は３７８から４８３へと、コルチゾールのｍ／ｚ値は３６２から４６７へと、コルチゾンのｍ／ｚ値は３６０から４６５へと、質量数はそれぞれ１０５だけ増加し、いずれのステロイドにもピコリン酸１つがエステルとして導入されていることが確認された。【００４７】
ピコリン酸誘導体化では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析（ＥＳＩポジティブモード）におけるイオン化効率が上昇する。
図１に示す通り、ピコリン酸誘導体化６β−ＯＨＦをポジティブモードにおいて０．５ｐｇ注入した際のｓｉｇｎａｌ  ｔｏ  ｎｏｉｓｅ（Ｓ／Ｎ）比は５．２であった。一方、６β−ＯＨＦを誘導体化せずに５０ｐｇをポジティブモードで注入した際（Ｓ／Ｎ比＝３．７）、および非誘導体をネガティブモードにて１０ｐｇ注入した際（Ｓ／Ｎ比＝３．７）と比較して、約１４〜２６倍の大幅な感度上昇が確認された。
これらの結果に基づき、血中濃度に換算すると、６β−ＯＨＦのピコリン酸誘導体の検出限界（ＬＬＯＤ）は１０ｐｇ／ｍＬとなり、血中６β−ＯＨＦの定量に十分な検出限界が得られた。なお、コルチゾール５０．３ｎｇの試料を、ピコリン酸誘導体化したものと誘導体化しないものとで比較したところ、誘導体化により、ピーク面積は、１０．１倍となった。また、コルチゾン１０．５ｎｇの試料を、ピコリン酸誘導体化したものと誘導体化しないものとで比較したところ、誘導体化により、ピーク面積は、９．６倍となった。これらの結果から、誘導体化により定量感度が大幅に上昇することが示された。【００４８】
検量線の範囲については、６β−ＯＨＦおよびコルチゾールのそれぞれで、０．０８２２〜２．４６ｎｇおよび２０．２２〜２５２．７５ｎｇに設定した。ｘ軸に非標識体と標識体のモル比、ｙ軸にピーク面積比をプロットしたところ、相関係数（ｒ）は、６β−ＯＨＦでは０．９９９１、コルチゾールでは０．９９９５と良好な直線性を示した。【００４９】
生体試料に既知量の６β−ＯＨＦおよびコルチゾールを添加し、日内と日間で精度及び再現性を検討した。結果を表１に示す。
表１に示される通り、日内精度では、予測値と実測値との相対誤差（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｒｒｏｒ）が−５．３〜３．４％、変動係数（Ｃ．Ｖ．）が３．８％以下であった。また、日間精度では、予測値と実測値との相対誤差（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｒｒｏｒ）が−３．３〜−０．３％、変動係数（Ｃ．Ｖ．）が３．１％以下であり、良好な精度および再現性が得られることが示された。
【表１】
2016199702.tif 000011
【００５０】
血中６β−ＯＨＥ／血中コルチゾン濃度比を用いた定量法についても、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比と同様に検討を行った。
健常成人の血漿をピコリン酸誘導体化した後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに注入したときの４種ステロイド代謝物（６β−ＯＨＦ、コルチゾール、６β−ＯＨＥおよびコルチゾン）のクロマトグラムを図２に示す。【００５１】
また、表２には、一例として健常成人４名のステロイドとその代謝物の血中濃度の定量結果を示す。
６β−ＯＨＦの血中濃度は０．４９３〜２．２０９ｎｇ／ｍＬ、６β−ＯＨＥの血中濃度は０．１９０〜０．３１１ｎｇ／ｍＬであり、いずれも約２．２ｎｇ／ｍＬ以下の低い値であった。
【表２】
2016199702.tif 000012
なお、定量限界（ＬＬＯＱ）における本法の精度を検討した結果、血中６β−ＯＨＦ０．１０３ｎｇ／ｍＬにおける相対誤差（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｒｒｏｒ）は−０．３９％、変動係数（Ｃ．Ｖ．）は２．９％であり、十分な定量限界が得られた。【００５２】
＜２＞血中ステロイド代謝物濃度比によるヒト  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＹＰ３Ａ活性の評価
ＣＹＰ３Ａ活性に影響を及ぼす経口避妊薬を服用した健常成人女性３名を対象とし、ＣＹＰ３Ａ活性の変動について本発明の方法により調査した。具体的には、経口避妊薬服用前、服用中および服用後の血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比を算出し、本発明者らの先行特許（米国特許第６，９０５，８３９号）による、内因性コルチゾール６β−水酸化代謝クリアランス（ＣＬｍ（６β））と比較することにより、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比によるＣＹＰ３Ａ活性評価法の有用性を検討した。なお、本検討は「東京薬科大学・ヒト組織を研究活用するための倫理審査委員会」より承認を得ている。【００５３】
＜２．１＞経口避妊薬服用時のＣＹＰ３Ａ活性評価
被験者は正常な月経周期を示す健常成人女性３名とし、低用量経口避妊薬を添付文書に示される方法に従い服用した。被験者は試験の約１ヶ月前からホルモン剤やＣＹＰ３Ａ活性に影響を及ぼす薬物を服用していなかった。さらに、グレープフルーツなどＣＹＰ３Ａ誘導および阻害作用のある食物も摂取していなかった。
用いた低用量経口避妊薬は、有効成分としてレボノルゲストレルとエチニルエストラジオールとを含有するものである。レボノルゲストレルおよびエチニルエストラジオールの含有量はそれぞれ、下記の通りである。
ｄａｙ  １〜  ７：レボノルゲストレル５０μｇ，エチニルエストラジオール３０μｇ，
ｄａｙ  ８〜１１：レボノルゲストレル７５μｇ，エチニルエストラジオール４０μｇ，
ｄａｙ１２〜２１：レボノルゲストレル１２５μｇ，エチニルエストラジオール３０μｇ。【００５４】
活性評価のための採血は、３名のうち２名については、服用前日（ｄａｙ０）、服用１日目（ｄａｙ１）、服用２１日目（ｄａｙ２１）および服用終了７日目（ｄａｙ２８）に行った。その他の１名については、服用前日（ｄａｙ０）、服用１日目（ｄａｙ１）、服用２日目（ｄａｙ２）、服用２１日目（ｄａｙ２１）および服用終了７日目（ｄａｙ２８）に行った。
既に本発明者らは、先行の米国特許の方法で測定されたコルチゾール６β−水酸化代謝クリアランスＣＬｍ（６β）のデータより、経口避妊薬２１日間の服用によりＣＹＰ３Ａ活性は阻害され、服用２１日目（ｄａｙ２１）のＣＹＰ３Ａ活性は、服用前日（ｄａｙ０）の約１／２に低下すること、服用終了７日目（ｄａｙ２８）では幾分回復するものの、服用前より低い値であることを明らかにしている（参考文献１２参照）。
図３には３例中１例の経口避妊薬服用前、服用中、服用後の血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比とＣＬｍ（６β）を示した。図３に示すように、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比は、経口避妊薬服用前日（ｄａｙ０）および服用初日（ｄａｙ１）と比較して、服用２１日目（ｄａｙ２１）では最も低値を示した。３名の被験者のｄａｙ２１におけるＣＹＰ３Ａ活性は、ｄａｙ０と比較して３９〜６１％に減少していた（阻害効果６１〜３９％）。服用終了７日目（ｄａｙ２８）では、ｄａｙ２１の値と比較して回復していたものの、ｄａｙ０よりやや低値を示した。このように、経口避妊薬服用時の本発明によるデータと先行米国特許によるＣＹＰ３Ａ活性の減少率はほぼ等しく、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比により、経口避妊薬服用によるＣＹＰ３Ａ活性の低下と服用終了による活性の回復が正しく評価できることが確認された。
さらに、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比とＣＬｍ（６β）の日内の挙動は、経口避妊薬服用初日（ｄａｙ１）以外では、ほぼ等しいことが示された。ｄａｙ１の血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比の変動がＣＬｍ（６β）のそれより大きいことは、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比が、よりリアルタイムにＣＹＰ３Ａ活性の変動をとらえられる可能性を示唆している。【００５５】
＜２．２＞経口避妊薬服用時における血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比とＣＬｍ（６β）データとの相関性
経口避妊薬服用の被験者３名の血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比データ（ｎ＝１３０）と、同一血液サンプルから得られたＣＬｍ（６β）データ（先行米国特許による）とを比較し、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比を指標とするＣＹＰ３Ａ活性評価法の信頼性を評価した。
ｘ軸に、先行米国特許の方法に従って得られたＣＬｍ（６β）データを、ｙ軸に、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比をプロットして得られたグラフを、図４に示す。ＣＬｍ（６β）の算出に用いた採血点３点の血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比の平均値とＣＬｍ（６β）データとの相関係数（ｒ）は０．９０５３となり、両者の間には高い相関性があることが確認された（図４参照）。【００５６】
以上より、本発明の方法に従って測定された血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比は、ヒトにおけるＣＹＰ３Ａ活性の正確な指標となることが実証された。コルチゾール６β−水酸化代謝クリアランスＣＬｍ（６β）は、３点の採血における血中コルチゾール濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）と２時間の尿中６β−ＯＨＦ排泄量から算出されるのに対して、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比は、一定期間の採尿を必要としないで１点の採血からＣＹＰ３Ａ活性を正確に評価できる点で有利である。【００５７】
（総括）
本発明は、ピコリン酸誘導体化によるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ定量法によって、血中の微量６β−ＯＨＦおよび６β−ＯＨＥの高感度且つ高精度な定量を可能とするものである。さらに、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比はヒトにおけるＣＹＰ３Ａ活性の正確な指標となることを実証し、本法の活性評価法としての信頼性は、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比が先行米国特許の方法で定量された内因性コルチゾール６β−水酸化代謝クリアランスＣＬｍ（６β）と高い相関性（ｒ＝０．９０５３）を示すことによって裏付けられた。また、同様に、血中６β−ＯＨＥ／血中コルチゾン濃度比もＣＹＰ３Ａ活性の有用な指標となる可能性が示唆された。【００５８】
これまでに、ＣＹＰ３Ａ活性評価のマーカーとして内因性のステロイドとその代謝物の尿中および血中濃度比を検討した手法も提案されているが（参考文献１９参照）、ＧＣ−ＭＳ法により定量された血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比および血中６β−ＯＨＥ／血中コルチゾン濃度比は、酵素誘導薬および酵素阻害薬を用いた場合の変化率として示されているのみである（同文献の表参照）。本文献には、血中の６β−ＯＨＦ、６β−ＯＨＥ濃度の定量値の記載はなく、定量法の精度および感度ならびに測定値の詳細については報告されていない。そして、血中６β−ＯＨＦ／血中コルチゾール濃度比は、酵素誘導薬を用いたときにわずかに上昇しているが、酵素阻害薬を用いた場合は変化していない。なお、この先行文献では、ＣＹＰ３Ａ活性評価の指標として、尿中ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ（ＤＨＥＡ）濃度、尿中７β−ｈｙｄｒｏｘｙ−ＤＨＥＡ／尿中ＤＨＥＡ濃度比、尿中６β−ＯＨＥ／尿中コルチゾン濃度比、ＣＹＰ３Ａ５  ｇｅｎｏｔｙｐｅをファクターとした予測式も推奨されている。参考文献１９の予測式による活性評価では、被検者は採血と採尿をしなければならず、医療従事者は血液試料からの遺伝子変異の検出と尿試料中の複数のステロイドおよびステロイド代謝物を分離定量しなければならない。本発明の方法では、低用量経口避妊薬によるＣＹＰ３Ａ阻害作用（６１〜３９％）と服用中止後の活性の回復が正確に捉えられており、本発明がＣＹＰ３Ａ活性の変化を確実に追跡できる信頼性の高い方法であることを示した。一方、参考文献１９において使用されている方法では、ＣＹＰ３Ａ阻害薬ケトコナゾールによる阻害の変化を示していない。また、参考文献１９において使用されたＣＹＰ３Ａ誘導薬リファンピシンが強力な誘導剤であるために、誘導作用を捉えているが、その活性の変化は小さく、定量精度を上げるべく改良の余地がある。【００５９】
また、参考文献２０および２１では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いて、６β−ＯＨＦを０．１〜５００ｎｇ／ｍＬの血中濃度の範囲で定量したことも報告されているが、定量限界（ＬＬＯＱ）付近での精度に関する記述はない。健常成人を対象とした参考文献２０および２１の先行研究では、コントロール時および併用薬使用時の血中６β−ＯＨＦ濃度は１．５〜５ｎｇ／ｍＬと示されている。本発明の方法で定量した健常人の血中６β−ＯＨＦ濃度範囲は０．１６５〜２．２０９ｎｇ／ｍＬであり、参考文献２０および２１の先行研究よりもさらに低濃度域まで高い精度で定量が可能である。すなわち、ＣＹＰ３Ａ活性が阻害され血中６β−ＯＨＦ濃度が低下した場合も正確に定量できる。【００６０】
参考文献２３では、ステロイドのＡ環還元代謝物の濃度測定に関し、尿中のステロイドのピコリン酸誘導体化およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法による測定によって、高感度且つ高精度で、再現性良く定量できることを報告している（参考文献２２参照）。更に、水酸基を有するステロイドのピリジルカルボニル誘導体化による、ＬＣ−ＭＳを用いた高感度分析法の応用性も提案されている（参考文献２３）。しかしながら、本発明で示したように、６位が水酸化されたステロイド（６β−ＯＨＦ及び６β−ＯＨＥ）を対象とした誘導体化による定量の検討は行われていない。さらには、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる、血中の６β−ＯＨＦ濃度及び６β−ＯＨＥ濃度の高精度かつ高感度の定量法の開発も行われていない。本発明では、超微量定量に有用な手段であるＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いたが、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法はＬＣで分離した目的物質ピークを１度イオン化し、さらに、その中から特定の質量数のイオンを再度イオン化するため、参考文献２３で用いられたＬＣ−ＭＳ法と比較しより選択性が高く、生体由来の妨害物質の影響を避けることができる。【００６１】
また、本発明によれば、採尿の必要なく、採血のみで測定試料を得ることが可能である。よって、血液試料のみで簡単に評価できるため、正確な尿採取が難しい患者、特に新生児、小児、高齢者および腎障害者においても臨床上有用な方法である。
更に、本発明によればテスト薬物の投与や複数回の採血および採尿の必要がなく、１点の採血で、且つ、少量（約１００〜２００μＬ）の採血によって、ＣＹＰ３Ａ活性を評価できるため、患者への負担を軽減することができる。具体的には、テスト薬物の投与が困難な妊婦や授乳婦や、新生児におけるＣＹＰ３Ａ活性の評価を安全かつ有効に行うことが可能である。
また、本法は、被験者および評価者双方の負担を軽減することができ、新生児、小児、高齢者および妊婦などの被験者のＣＹＰ３Ａ酵素活性評価も簡便に行うことが可能である点で有利である。更に、詳細な経時変化を追跡することも可能である。また、活性評価のために用いる血液試料中のＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質および反応生成物は、同時に定量できるため、１回の定量でＣＹＰ３Ａ活性が簡便かつ迅速に評価できる。即ち、本法は、採血が１回で良いだけでなく、定量も１回のみで良いことから、非常に簡便且つ迅速にＣＹＰ３Ａ酵素活性を評価することが可能である。
以上述べた利点から、本願発明の方法は、臨床のみならず、医薬品開発における酵素活性への誘導および阻害に関する研究にも有用な手段となることが期待される。【００６２】
2016199702.tif 000013
2016199702.tif 000014
2016199702.tif 000015
【図１】
2016199702.tif 000018
【図２】
2016199702.tif 000019
【図３】
2016199702.tif 000020
【図４】
2016199702.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月21日(2016.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＹＰ３Ａ酵素活性の評価方法であって、
被験体の血中における、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質とＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物との濃度比を、ＣＹＰ３Ａ酵素活性の指標として定量することを含み、
前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質が、内因性のものである、評価方法。
【請求項２】
ＣＹＰ３Ａ酵素活性の評価方法であって、
（ｉ）被験体の血液から試料を採取する工程と、
（ｉｉ）前記試料中に含まれる、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質およびＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物を誘導体化して、誘導体化された基質および誘導体化された生成物を得る工程と、
（ｉｉｉ）前記誘導体化された基質と前記誘導体化された生成物の濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて定量する工程と
（ｉｖ）前記基質と前記生成物との濃度比を算出する工程と
を含み、
前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質がコルチゾールであり、前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物が６β−ヒドロキシコルチゾールであるか、または
前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質がコルチゾンであり、前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物が６β−ヒドロキシコルチゾンである、請求項１に記載の評価方法。
【請求項３】
前記工程（ｉｉｉ）において、前記誘導体化された基質と前記誘導体化された生成物の濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて同時に定量する、請求項２に記載の評価方法。
【請求項４】
前記誘導体化が、下記：
【化１】
2016199702.tif 000022
からなる群より選択される化学式で表される化合物を用いて行われる、請求項２または３に記載の評価方法。
【請求項５】
前記誘導体化が、ピコリン酸またはピコリン酸誘導体を用いて行われる、請求項２〜４のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項６】
前記誘導体化が、ピコリン酸を用いて行われる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項７】
前記誘導体化が、前記化学式で表される化合物と、前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質の水酸基および前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物の水酸基とを反応させることを含む、請求項２〜６のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項８】
前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物の水酸基が、該生成物のステロイド骨格の６位の水酸基および／または該生成物の２１位の水酸基である、請求項７に記載の評価方法。
【請求項９】
前記試料の量が、２００μＬ以下である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項１０】
前記工程（ｉ）において、血液からの試料の採取は１回のみ行われる、請求項２〜９のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項１１】
下記：
【化２】
2016199702.tif 000023
からなる群より選択される化学式で表される化合物を含む、ＣＹＰ３Ａ酵素活性を評価するための試薬。
【手続補正書】
【提出日】平成29年8月18日(2017.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＹＰ３Ａ酵素活性の評価方法であって、
被験体の血中における、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質とＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物との濃度比を、ＣＹＰ３Ａ酵素活性の指標として定量することを含み、
（ｉ）被験体の血液から試料を採取する工程と、
（ｉｉ）前記試料中に含まれる、ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質およびＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物を誘導体化して、誘導体化された基質および誘導体化された生成物を得る工程と、
（ｉｉｉ）前記誘導体化された基質と前記誘導体化された生成物の濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて定量する工程と
（ｉｖ）前記基質と前記生成物との濃度比を算出する工程と
を含み、
前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質が内因性のコルチゾールであり、前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物が６β−ヒドロキシコルチゾールであるか、または
前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質が内因性のコルチゾンであり、前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物が６β−ヒドロキシコルチゾンであり、
前記誘導体化が、ピコリン酸またはピコリン酸誘導体を用いて行われる、評価方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
前記工程（ｉｉｉ）において、前記誘導体化された基質と前記誘導体化された生成物の濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて同時に定量する、請求項１に記載の評価方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
前記誘導体化が、ピコリン酸を用いて行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項７】
前記誘導体化が、ピコリン酸またはピコリン酸誘導体と、前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応に関与する基質の水酸基および前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物の水酸基とを反応させることを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項８】
前記ＣＹＰ３Ａ酵素反応の生成物の水酸基が、該生成物のステロイド骨格の６位の水酸基および／または該生成物の２１位の水酸基である、請求項７に記載の評価方法。
【請求項９】
前記試料の量が、２００μＬ以下である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項１０】
前記工程（ｉ）において、血液からの試料の採取は１回のみ行われる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の評価方法。
【請求項１１】
下記：
【化２】
2016199702.tif 000024
からなる群より選択される化学式で表される化合物を含む、請求項１〜１０に記載の評価方法において用いるための試薬。
【国際調査報告】
2016199702.tif 000025
2016199702.tif 000026
2016199702.tif 000027
2016199702.tif 000028
2016199702.tif 000029
2016199702.tif 000030