(57)【要約】  簡易で侵襲性が低い腺癌の検出方法を提供する。本発明の腺癌の検出方法は、被検体由来試料における特定タンパク質の不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程を含む。このような特定タンパク質の不正常な切断は、例えば、特定タンパク質におけるペプチド結合に１以上の切れ目をもたらす切断および／または特定タンパク質の１以上の箇所に、１または２以上のアミノ酸残基の欠損をもたらす切断である。本発明の腺癌の検出方法は、このような不正常な切断のあるタンパク質の存在または量、あるいは、正常なタンパク質の量の減少を検知する工程などを含む。
2017142025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体由来試料中における１または２以上の特定タンパク質について、該特定タンパク質における不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程を含む腺癌の検出方法であって、
該特定タンパク質は、以下の（ｉ）〜(x)からなる群より選択されるいずれか１種のタンパク質に由来する、腺癌の検出方法：
(i)α-1-アンチトリプシン
(ii)α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体
(iii)ＣＤ５９
(iv)フィブロネクチン
(v) Ｌｅｃｔｉｎ，Ｍａｎｎｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ２
(vi)バゾリン
(vii)ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２ 
(viii)Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｍ
(ix)デオキシリボヌクレアーゼ‐１；および
(x)ＷＮＴ1-ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ-ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ２。
【請求項２】
前記特定タンパク質の不正常な切断が、該特定タンパク質におけるペプチド結合に１以上の切れ目をもたらす切断および／または該特定タンパク質の１以上の箇所に、１または２以上のアミノ酸残基の欠損をもたらす切断である、請求項１記載の腺癌の検出方法。
【請求項３】
前記被検体由来試料中における１または２以上の特定タンパク質について、該特定タンパク質における不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程が、以下の（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１または２記載の腺癌の検出方法：
（１）該被検体由来試料中における該特定タンパク質の正常な構造を有するタンパク質の相対量の減少を検知すること；
（２）該被検体由来試料中における該特定タンパク質のＣ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の存在または相対量の増加を検知すること；
（３）該被検体由来試料中における該特定タンパク質のＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の存在または相対量の増加を検知すること；および
（４）該被検体由来試料中における該特定タンパク質について、アミノ酸配列の任意の中間部位の切断又は欠損の存在または相対量の増加を検知すること。
【請求項４】
請求項１記載の腺癌の検出方法であって、
前記特定タンパク質の不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程が、以下の（ａ）〜(ｙ)からなる群より選択される少なくともいずれか１種の量または存在を検知することを含む、腺癌の検出方法：
(ａ) ＧＴＥＡＡＧＡＭＦをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｂ) ＣＶＬＦＰＹＧＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｃ) ＥＹＣＧＶＰＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｄ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｅ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｆ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｇ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｈ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｉ) ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｊ) ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰＩＬＩＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｋ) ＤＬＣＮＦＮＥＱＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｎ) ＦＧＦＣＰＭＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｐ）ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｑ) ＬＰＴＧＹＹをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｒ) ＹＬＱＧＳＳＶＱＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｓ) ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｔ) ＥＮＹＮＱＹＤＬＮをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｕ) ＧＡＶＶＰＤＳＡＬＰＦＮＦＱＡＡＹをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｖ) ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｗ）ＧＡＬＣＬＬＡＥＤＤＳをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｘ）ＥＹＣＧＶＰＧＤをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；および(ｙ）ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片。
【請求項５】
前記１または２以上の特定タンパク質が、少なくとも（ｉｉ）α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体を含み、
前記不正常な切断をインビトロで検知する工程が、
被検体試料中に存在するα‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来の正常な構造を有するタンパク質の相対量の減少、および／またはα‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来のタンパク質断片の量または存在を検知することを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の腺癌の検出方法。
【請求項６】
前記１または２以上の特定タンパク質が、少なくとも（vii）ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２を含み、
前記不正常な切断をインビトロで検知する工程が、
配列表の配列番号７の第８０位〜第９３位のアミノ酸配列中のいずれかのペプチド結合の切断、あるいは、切断部位周辺におけるアミノ酸残基の欠損を検知することを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の腺癌の検出方法。
【請求項７】
前記腺癌が、肺腺癌である、請求項１〜６のいずれか１項記載の腺癌の検出方法。
【請求項８】
前記被検体由来試料が、尿である、請求項１〜７のいずれか１項記載の腺癌の検出方法。
【請求項９】
質量分析測定法、免疫化学的測定法、およびクロマトグラフィー法からなる群より選択される少なくとも1種の方法を用いる工程を含む、請求項１〜８のいずれか１項記載の腺癌の検出方法。
【請求項１０】
請求項１記載の腺癌の検出方法であって、前記特定タンパク質における不正常な切断の有無が、該特定タンパク質の断片化率によって決定され、該断片化率が、
タンパク質断片化率（Fn）＝Cn／In
Cn：各特定タンパク質断片の量
In：各特定タンパク質断片由来の元のタンパク質の量
で表わされる数値である、腺癌の検出方法。
【請求項１１】
請求項１記載の腺癌の検出方法であって、前記特定タンパク質における不正常な切断の有無が、該被検体由来の該特定タンパク質の断片化率と健常者のタンパク質断片化率との相対比によって決定され、該相対比が、
患者と健常者のタンパク質断片化率の相対比（Rn）＝Fp／Fh
Fp：患者試料のタンパク質断片化率
Fh：健常者群のタンパク質断片化率の平均値
で表され、該数値が１を超える場合に不正常な切断があるとする、腺癌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腺癌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腺癌 (adenocarcinoma) とは、分泌腺組織の細胞から発生する上皮性悪性腫瘍の一つである。肺腺癌・肝臓腺癌・膵臓腺癌・リンパ腺癌・子宮腺癌・精のう腺癌・胃腺癌など、身体のあらゆる臓器に発生し得る。【０００３】
このうち、肺腺癌は初期症状が出づらく早期発見が困難な腺癌の一つである。肺腺癌は、肺癌の組織型の中でも最も発生頻度が高く、男性の肺癌のうち約４０％、女性では約７０％、全体では約５０％程度を肺腺癌が占めている。肺癌は国内の悪性腫瘍死亡数の第一位であることから、肺腺癌を早期に検出する技術が求められている。【０００４】
肺癌の生存率は臨床病期の進行と共に低下する。例えば手術が可能な臨床病期ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＩＡ期の非小細胞肺癌では、５年生存率がそれぞれ８２．０％、６６．１％、５４．５％、４６．１％および４２．８％であり（非特許文献１）、手術適応のない臨床病期ＩＩＩＢおよびＩＶ期の非小細胞肺癌では、生存期間中央値はそれぞれ２２．４か月（非特許文献２）および１０．３か月（非特許文献３）である。【０００５】
肺腺癌に対する既存の腫瘍マーカーとして血清Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）が臨床的な診断に用いられている。しかし、肺腺癌症例におけるＣＥＡの陽性率は３６．６〜５６．５％に過ぎず（非特許文献４、５）、特にＩ期の早期肺腺癌では陽性率が２７％と低いため（非特許文献５）、ＣＥＡでは根治可能な病期で肺腺癌を診断することは困難である。【０００６】
臨床応用に向けて開発が進められている腫瘍マーカーとして、血清ＣＹＢＰ（特許文献１）、ＵＢＥ２Ｌ３（特許文献２）等が上げられるが、患者の血液採取を条件とし、侵襲的である。このような検査ではより低侵襲であることが求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１２−５２６９７６
【特許文献２】特開２０１４−１１５１８６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sawabata N, et al., J Thorac Oncol. 6:1229-35, 2011.
【非特許文献２】Atagi S, et al., Lancet Oncol. 13:671-8, 2012.
【非特許文献３】Scagliotti GV, et al., J Clin Oncol. 26:3543-51, 2008.
【非特許文献４】Molina R, et al., Am J Respir Crit Care Med, 2015 Oct 14. [Epub ahead of print]
【非特許文献５】Matsuoka K, et al., Eur J Cardiothorac Surg. 32:435-9, 2007.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、腺癌の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、腺癌患者に特異的に見られる、体液中の特定タンパク質のアミノ酸の断片化の増加や正常な構造を有するタンパク質の減少、タンパク質の不正常な位置での切れ目や中間位置の欠損による露出部を見出し、簡易で低侵襲性または非侵襲性の腺癌検出方法を確立すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は以下の[１]〜[１１]を提供する。
[項１]
被検体由来試料中における１または２以上の特定タンパク質について、該特定タンパク質における不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程を含む腺癌の検出方法であって、
該特定タンパク質は、以下の（ｉ）〜(x)からなる群より選択されるいずれか１種のタンパク質に由来する、腺癌の検出方法：
(i)α-1-アンチトリプシン
(ii)α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体
(iii)ＣＤ５９
(ｉv)フィブロネクチン
(v)  Ｌｅｃｔｉｎ，Ｍａｎｎｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ２
(vi)バゾリン
(vii)ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２ 
(viii)Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｍ
(ｉx)デオキシリボヌクレアーゼ‐１；および
(x)ＷＮＴ1-ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ-ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ２。
[項２]
前記特定タンパク質の不正常な切断が、該特定タンパク質におけるペプチド結合に１以上の切れ目をもたらす切断および／または該特定タンパク質の１以上の箇所に、１または２以上のアミノ酸残基の欠損をもたらす切断である、項１記載の腺癌の検出方法。
[項３]
前記被検体由来試料中における１または２以上の特定タンパク質について、該特定タンパク質における不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程が、以下の（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項１または２記載の腺癌の検出方法：
（１）該被検体由来試料中における該特定タンパク質の正常な構造を有するタンパク質の相対量の減少を検知すること；
（２）該被検体由来試料中における該特定タンパク質のＣ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の存在または相対量の増加を検知すること；
（３）該被検体由来試料中における該特定タンパク質のＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の存在または相対量の増加を検知すること；および
（４）該被検体由来試料中における該特定タンパク質について、アミノ酸配列の任意の中間部位の切断又は欠損の存在または相対量の増加を検知すること。
[項４]
項１記載の腺癌の検出方法であって、
前記特定タンパク質の不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程が、以下の（ａ）〜(ｙ)からなる群より選択される少なくともいずれか１種の量または存在を検知することを含む、腺癌の検出方法：
(ａ) ＧＴＥＡＡＧＡＭＦをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｂ) ＣＶＬＦＰＹＧＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｃ) ＥＹＣＧＶＰＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｄ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｅ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｆ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｇ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｈ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｉ) ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｊ) ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰＩＬＩＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｋ) ＤＬＣＮＦＮＥＱＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｎ) ＦＧＦＣＰＭＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｐ）ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｑ) ＬＰＴＧＹＹをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｒ) ＹＬＱＧＳＳＶＱＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｓ) ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｔ) ＥＮＹＮＱＹＤＬＮをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｕ) ＧＡＶＶＰＤＳＡＬＰＦＮＦＱＡＡＹをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｖ) ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｗ）ＧＡＬＣＬＬＡＥＤＤＳをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｘ）ＥＹＣＧＶＰＧＤをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；および(ｙ）ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片。
[項５]
前記１または２以上の特定タンパク質が、少なくとも（ｉｉ）α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体を含み、
前記不正常な切断をインビトロで検知する工程が、
被検体試料中に存在するα‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来の正常な構造を有するタンパク質の相対量の減少、および／またはα‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来のタンパク質断片の量または存在を検知することを含む、項１〜４のいずれか１項記載の腺癌の検出方法。
[項６]
前記１または２以上の特定タンパク質が、少なくとも（vii）ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２を含み、
前記不正常な切断をインビトロで検知する工程が、
配列表の配列番号７の第８０位〜第９３位のアミノ酸配列中のいずれかのペプチド結合の切断、あるいは、切断部位周辺におけるアミノ酸残基の欠損を検知することを含む、項１〜５のいずれか１項記載の腺癌の検出方法。
[項７]
前記腺癌が、肺腺癌である、項１〜６のいずれか１項記載の腺癌の検出方法。
[項８]
前記被検体由来試料が、尿である、項１〜７のいずれか１項記載の腺癌の検出方法。
[項９]
質量分析測定法、免疫化学的測定法、およびクロマトグラフィー法からなる群より選択される少なくとも1種の方法を用いる工程を含む、項１〜８のいずれか１項記載の腺癌の検出方法。
[項１０]
項１記載の腺癌の検出方法であって、前記特定タンパク質における不正常な切断の有無が、該特定タンパク質の断片化率によって決定され、該断片化率が、
タンパク質断片化率（Fn）＝Cn／In
Cn：各特定タンパク質断片の量
In：各特定タンパク質断片由来の元のタンパク質の量
で表わされる数値である、腺癌の検出方法。
[項１１]
項１記載の腺癌の検出方法であって、前記特定タンパク質における不正常な切断の有無が、該被検体由来の該特定タンパク質の断片化率と健常者のタンパク質断片化率との相対比によって決定され、該相対比が、
患者と健常者のタンパク質断片化率の相対比（Rn）＝Fp／Fh
Fp：患者試料のタンパク質断片化率
Fh：健常者群のタンパク質断片化率の平均値
で表され、該数値が１を超える場合に不正常な切断があるとする、腺癌の検出方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、腺癌を尿や血液などの体液を用いて低侵襲の方法で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１（Ａ）は、ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片に対するポリクローナル抗体を用いて、尿試料をウエスタンブロッティングした結果を示す図である。図１（Ｂ）は、市販のＡＭＢＰ抗体を用いて、尿試料をウエスタンブロッティングした結果を示す図である。図１（Ｃ)は、（Ａ）／（Ｂ）の相対量を示す図である。
【図２】図２は、被検体由来試料（尿）のインビトロでの処理により、ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片が高値に見出された肺腺癌症例における胸部ＣＴ画像を示す図である。右上葉Ｓ３縦隔側に２ｃｍ大の原発巣を認める。
【図３】図３は、被検体由来試料（尿）のインビトロでの処理により、ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片が高値に見出された肺腺癌症例におけるＰＥＴ−ＣＴ胸部画像を示す図である。右上葉Ｓ３縦隔側に位置する２ｃｍ大の原発巣にPETの異常集積を認める。
【図４】図４は、被検体由来試料（尿）のインビトロでの処理により、ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片が高値に見出された肺腺癌症例における経気管支生検で採取した肺腺癌組織像（Ｈ−Ｅ染色および抗ＴＴＦ−１抗体を用いた免疫組織化学発光）である。
【図５】図５（Ａ）は、市販の抗ビクニン抗体とビクニンの正常な構造（Ｃ末端）を認識する抗体を用いて、尿試料をウエスタンブロッティングした結果を示す図である。図５（Ｂ）は、健常者と腺癌患者の尿試料中における、正常な構造（Ｃ末端）を有するタンパク質の量を比較したグラフである。
【図６】図６は、健常者と腺癌患者の被検体由来試料（尿）をインビトロで処理した後のＷＦＤＣ２の断片化率を示す図である。
【図７】図７は、健常者と腺癌患者の被検体試料（尿）をインビトロで処理した後のＷＦＤＣ２の断片化指数を示す図である。
【図８】図８（Ａ）は、ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片を可視化した図である。図８（Ｂ）は、各細胞あるいは細胞株由来細胞溶解物におけるα‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体のビクニン部分の存在量を可視化した図である。図８（Ｃ）は、各サンプルにおけるα‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体タンパク質とＣ末端アミノ酸配列をＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬとするタンパク質断片の相対存在量をプロットした図である。
【図９】図９は、ヒト腺癌細胞株におけるＡＭＢＰの発現を示す図である。
【図１０】図１０は、ヒト腺癌細胞株におけるＷＦＤＣ２の発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の腺癌の検出方法は、本発明者らによる新たな発見に基づく。すなわち、本発明者らは、腺癌患者の体内では、数種類の特定タンパク質のうちの１つまたはそれ以上が、健常者では切断されないような箇所で切断され、様々なタイプの欠損タンパク質または切れ目が生じているタンパク質が増加している場合があることを見出した。すなわち、特定のタンパク質において、Ｃ末端部またはＮ末端部の欠損、不正常な位置でのペプチド結合の切れ目あるいはそれに伴う切れ目からのアミノ酸の欠損という現象が見られることを見出した。
【００１５】
このような不正常な切断は、腺癌特異的プロテアーゼの存在によるものと考えられる。従って、本発明は、インビトロにおいて、そのような不正常な切断による特定タンパク質の切れ目や欠損を指標として健常者と腺癌患者を区別して評価することができる。一方、特定タンパク質の不正常な切断の亢進を、正常タンパク質の量（相対的な量比を含む）の減少を指標として健常者と腺癌患者を区別して評価することも可能となる。
【００１６】
本発明は、被検体由来試料中における１または２以上の特定タンパク質について、不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程を含む腺癌の検出方法である。ここで、特定タンパク質は、以下の（ｉ）〜(x)からなる群より選択されるいずれか１種のタンパク質に由来する。
(i)α-1-アンチトリプシン
(ii)α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体
(iii)ＣＤ５９
(ｉv)フィブロネクチン
(v) Ｌｅｃｔｉｎ，Ｍａｎｎｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ２
(vi)バゾリン
(vii)ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２ 
(viii)Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｍ
(ｉx)デオキシリボヌクレアーゼ‐１；および
(x)ＷＮＴ1-ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ-ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ２。
【００１７】
本明細書において、特定タンパク質の「不正常な切断」は、限定はされないが、特定タンパク質の正常な構造とは異なる一次構造、二次構造、あるいは三次構造をもたらす。例えば、特定タンパク質におけるペプチド結合に１以上の切れ目をもたらす切断、特定タンパク質の１以上の箇所に、１または２以上のアミノ酸残基の欠損をもたらす切断などが含まれる。
【００１８】
限定はされないが、「不正常な切断」によって、特定タンパク質のＣ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質、あるいは、特定タンパク質のＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質が生じ得る。あるいは、「不正常な切断」によって、タンパク質中のアミノ酸残基同士のペプチド結合の切れまたは任意の中間位置でのアミノ酸の欠損が生じる。
【００１９】
特定タンパク質の「不正常な切断」の一態様では、ペプチド結合が切れて新たな切断部位のアミノ酸残基を露出するが、ジスルフィド結合などにより、もとのタンパク質からアミノ酸を失うことのない場合がある。このような場合では、生体から取り出した未処理の試料中では当該特定タンパク質の欠損あるいは断片化が生じていない場合がある。本発明の不正常な切断は、このような切断も含む。あるいは、このように、例えば、ジスルフィド結合などにより、もとのタンパク質が結合状態を保持してはいるが、ぺプチド結合が切れて、そこからさらに、１または２以上のアミノ酸残基が欠如することで、タンパク質中のアミノ酸残基が任意の中間位置で欠損している場合が生じる。
【００２０】
特定タンパク質に関連して、本来の正常な翻訳後プロセシングは、ここでの不正常な切断ではない。
【００２１】
本明細書において、「被検体」とは、癌の検出対象となる哺乳動物を指し、限定はされないが、好ましくは、イヌ、ネコ、マウス、あるいはヒトである。
【００２２】
本明細書において、「腺癌」とは、体内の各臓器の分泌腺組織に発生する癌をいう。肺腺癌、肝臓腺癌、膵臓腺癌、リンパ腺癌、子宮腺癌、精のう腺癌、胃腺癌などが含まれるが、限定はされない。本発明の検出方法は、このうち、肺腺癌の検出に特に好ましく用いられる。本願発明において、腺癌は、臨床病期ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＩＡ期、臨床病期ＩＩＩＢおよびＩＶ期のいずれの段階のものであってもよい。早期腺癌、早期肺腺癌というときには、臨床病期ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、およびＩＩＢのいずれかを指す。
【００２３】
本明細書において、「被検体由来試料」とは、被検体に由来する体液を指し、体液そのものの他、体液の濃縮液、希釈液、あるいはその他の適宜の処理済みの液体を指す。ここで、体液は、限定はされないが、例えば、尿、血液（全血、血漿、血清）、痰、汗、髄液、消化液、腹水、を指す。好ましくは、体液は、尿または血液であり、特に好ましくは尿である。ここで、尿は、早期中間尿、蓄尿、随時尿のいずれでもあり得る。尿や血液などの体液の採取量は、１０μｌ〜２００ｍｌ、好ましくは、１００μｌ〜１００ｍｌ、さらに好ましくは、１ｍｌ〜１００ｍｌである。
【００２４】
ここで、体液の処理は、より詳細には、濃縮、希釈、分画、脱塩等の前処理、グリセリン等の保存剤、プロテアーゼ阻害剤等の安定化剤、防腐剤を加えることなどを指す。冷蔵または冷凍処理した後に常温に戻すこと、冷蔵または冷凍処理前後のいずれかで適宜の処理を行うことなども含まれる。さらに、例えば体液が血液の場合には、適宜の処理として抗凝血剤処理を行うこともできる。これらの処理を組み合わせることも可能である。
【００２５】
体液が尿の場合には、測定前に前処理として濃縮を含む操作を行うことが好ましい。この濃縮方法は特に限定されないが、分画分子量の限外ろ過膜を用いた方法、凍結濃縮、減圧または真空濃縮、加熱などが挙げられる。分画分子量としては、限定はされず、例えば、３ｋＤ、１０ｋＤ、３０ｋＤ、５０ｋＤなど任意の値を用いることができる。
【００２６】
例えば、体液が尿の場合、原尿の総タンパク質量の濃度は、０．００１ｇ／ｄＬ〜０．６ｇ／ｄＬ程度であるため、濃縮は有用な前処理である。原尿を２００〜２５０倍に濃縮して分析に用いることができる。この濃縮液をそのまま測定に供することも可能であるが、さらに総タンパク質量を希釈して調整して測定に供することもできる。例えば、ウエスタンブロットなどの測定手法によっては、０．１μｇ〜１０μｇ／μｌ程度に調整して測定に供することもできる。
【００２７】
濃縮は、Vivaspin（登録商標、サルトリウス・ジャパン株式会社製）、アミコンウルトラ（メルクミリポア社製）などを使用して、製造者の指示に従って使用することもできる。
【００２８】
希釈は、蒸留水や緩衝液を用いて行うことができ、濃縮尿の調整にも利用することができる。
【００２９】
特定タンパク質の欠損は、一次構造で比較した場合に、由来する全長タンパク質のＣ末端部、Ｎ末端部、あるいは中間位置のアミノ酸残基の欠損があれば特にその大きさや長さに限定はない。ここでＣ末端部、Ｎ末端部、あるいは中間位置に欠損があるとは、通常そのタンパク質が正常に機能する単位のタンパク質よりもＣ末端側、Ｎ末端側が短いか、中間位置に存在すべきアミノ酸残基が欠如していることを意味する。
【００３０】
本明細書において、タンパク質断片の配列が特定されている場合には、それぞれの表記記号は、アミノ酸残基の一文字表記として使用されている通常の文字を意味する。
具体的には、
Ａ    Ａｌａ    Ａｌａｎｉｎｅ  アラニン    
Ｃ    Ｃｙｓ    Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  システイン    
Ｄ    Ａｓｐ    Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  アスパラギン酸
Ｅ    Ｇｌｕ    Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  グルタミン酸
Ｆ    Ｐｈｅ    Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  フェニルアラニン
Ｇ    Ｇｌｙ    Ｇｌｙｃｉｎｅ  グリシン
Ｈ    Ｈｉｓ    Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ヒスチジン
Ｉ    Ｉｌｅ    Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ  イソロイシン
Ｋ    Ｌｙｓ    Ｌｙｓｉｎｅ  リシン
Ｌ    Ｌｅｕ    Ｌｅｕｃｉｎｅ  ロイシン
Ｍ    Ｍｅｔ    Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  メチオニン
Ｎ    Ａｓｎ    Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  アスパラギン
Ｐ    Ｐｒｏ    Ｐｒｏｌｉｎｅ  プロリン
Ｑ    Ｇｌｎ    Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  グルタミン
Ｒ    Ａｒｇ    Ａｒｇｉｎｉｎｅ  アルギニン  
Ｓ    Ｓｅｒ    Ｓｅｒｉｎｅ  セリン
Ｔ    Ｔｈｒ    Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  トレオニン
Ｖ    Ｖａｌ    Ｖａｌｉｎｅ  バリン
Ｗ    Ｔｒｐ    Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  トリプトファン
Ｙ    Ｔｙｒ    Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  チロシン    
【００３１】
本発明において、被検体由来試料中における１または２以上の特定タンパク質について、該特定タンパク質における不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程は、限定はされないが、好ましくは、以下の（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも１つを含む工程であり得る。
【００３２】
（１）該被検体由来試料中における該特定タンパク質の正常な構造を有するタンパク質の量の減少を検知すること；
（２）該被検体由来試料中における該特定タンパク質のＣ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質断片の量または存在を検知すること；
（３）該被検体由来試料中における該特定タンパク質のＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質断片の量または存在を検知すること；および
（４）該被検体由来試料中における該特定タンパク質について、アミノ酸配列の任意の中間部位の切れ目又は欠損を有するタンパク質の量または存在を検知すること。
【００３３】
限定はされないが、本発明の腺癌の検出方法の１つの態様では、被検体由来試料における１または２以上の特定タンパク質の正常な構造を有するタンパク質の量の減少を検知する。具体的には、例えば、正常な構造を有する特定タンパク質の量を、当該特定タンパク質のＣ末端部のアミノ酸配列および／またはＮ末端部のアミノ酸配列の有無によって測定し、正常な構造を有するタンパク質量が健常者と比較して相対的に減少しているか否かを検出することができる。
【００３４】
限定はされないが、本発明の腺癌の検出方法の別の態様では、被検体由来試料を用いて、インビトロにおいて、特定のタンパク質断片を検知することを含む。このような場合、特定のタンパク質断片の検知は、被検体由来試料中に断片化した状態で存在するタンパク質断片および／または例えば被検体由来試料を還元処理等に供した後に生じるタンパク質断片を検知することであり得る。
【００３５】
具体的には、１または２以上の特定タンパク質断片の量をインビトロで測定する工程では、特定タンパク質断片が、（ｉ）〜(x)からなる群より選択されるいずれか１種のタンパク質に由来し、かつ該タンパク質の全長と比較してＣ末端側に欠損があるタンパク質に由来する断片または中間部位に切れ目および／またはアミノ酸の欠損があるタンパク質に由来する断片であることが好ましい。
【００３６】
本明細書で、特定タンパク質断片のＣ末端配列が記載されている場合には、例えば、「ＧＴＥＡＡＧＡＭＦをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片」などと表現される。この場合、全長タンパク質では右端に示されるＦよりもＣ末端部側に本来存在していたアミノ酸残基は欠損（欠如）していることを示しており、ＧよりＮ末端側へはアミノ酸残基は存在していても存在していなくてもよいことを意味する。
【００３７】
特定タンパク質断片は、以下からなる群より選択される少なくとも１つ以上であることが好ましい。
(ａ) ＧＴＥＡＡＧＡＭＦをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｂ) ＣＶＬＦＰＹＧＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｃ) ＥＹＣＧＶＰＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｄ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｅ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｆ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｇ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｈ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｉ) ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｊ) ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰＩＬＩＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｋ) ＤＬＣＮＦＮＥＱＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｎ) ＦＧＦＣＰＭＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｐ）ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｑ) ＬＰＴＧＹＹをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｒ) ＹＬＱＧＳＳＶＱＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｓ) ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｔ) ＥＮＹＮＱＹＤＬＮをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｕ) ＧＡＶＶＰＤＳＡＬＰＦＮＦＱＡＡＹをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｖ) ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｗ）ＧＡＬＣＬＬＡＥＤＤＳをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｘ）ＥＹＣＧＶＰＧＤをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；および(ｙ）ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片。
【００３８】
さらに、下記特定タンパク質断片からなる群より選択される少なくとも１つ以上をインビトロで測定することによって、早期肺腺癌の検出が可能である。(ｂ) ＣＶＬＦＰＹＧＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｃ) ＥＹＣＧＶＰＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｄ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｅ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｆ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｇ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｈ) ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｉ) ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｊ) ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰＩＬＩＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｋ) ＤＬＣＮＦＮＥＱＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
；
(ｐ）ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｓ) ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｔ) ＥＮＹＮＱＹＤＬＮをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｕ) ＧＡＶＶＰＤＳＡＬＰＦＮＦＱＡＡＹをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｖ) ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｗ）ＧＡＬＣＬＬＡＥＤＤＳをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｘ）ＥＹＣＧＶＰＧＤをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；および(ｙ）ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片。
【００３９】
ここで、特定タンパク質断片におけるアミノ酸残基の数は特に限定はされないが、少なくとも６残基であり、少なくとも７残基であってもよく、好ましくは少なくとも１０残基以上、より好ましくは少なくとも５０残基以上である。タンパク質断片のサイズの上限は特に限定はされず、それぞれのタンパク質断片の由来である全長タンパク質のサイズ未満である。例えば、限定はされないが、それぞれのタンパク質断片の由来である全長タンパク質と比較して、Ｃ末端側が欠損している構造のタンパク質断片である。タンパク質断片は、全長未満であれば特に上限はないが、場合によっては、２００残基以下、好ましくは１００残基以下のような短い断片で存在することも可能である。
【００４０】
さらに、被検体由来試料中における該特定タンパク質のＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の存在または相対量の増加を検知すること；または被検体由来試料中における特定タンパク質について、アミノ酸配列の任意の中間部位の切断又は欠損の存在または相対量の増加を検知するために、Ｎ末端側が欠如したＣ末端側の遊離したタンパク質断片を検出することも可能である。このような断片を検出することで、（ａ）から（ｙ）のタンパク質断片を間接的に検出したり、Ｎ末端が生体内で欠損しているタンパク質断片の存在を検知することもできる。
【００４１】
本発明の特定タンパク質断片の分子量は、全長タンパク質未満であれば限定はされない。但し、例えば尿などの検体を用いて腺癌を検出する方法によっては、例えば３ｋＤａ以上全長未満、好ましくは１０ｋＤａ以上全長未満である。
【００４２】
さらには、これらの特定タンパク質断片は、それぞれ、上記配列を有してさえいれば、糖鎖付加やリン酸化等の翻訳後修飾を受けたものも含まれる。
【００４３】
特定タンパク質断片は、具体的には、以下に示された全長タンパク質に由来する断片であり得る。
【００４４】
(i)α-1-アンチトリプシン
(ii)α-1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体
(iii)ＣＤ５９
(iv）フィブロネクチン
(v) Ｌｅｃｔｉｎ，Ｍａｎｎｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ２
(vi) バゾリン
(vii) ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２
(viii)Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｍ
(ｉx)デオキシリボヌクレアーゼ‐１；または
(x)ＷＮＴ1-ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ-ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ２
【００４５】
これらのタンパク質は、生体内で通常は本来の長さで機能するが、特に腺癌において活性が亢進する酵素、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ群などにより切断を受けることで副次的に断片化やアミノ酸の欠損が亢進し得ると考えられる。
【００４６】
例えば(ii)α-1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体は、α-1-ミクログロブリン、インターα‐トリプシンインヒビター軽鎖、およびトリプスタチンを含む。これら３つの成熟タンパク質は、生体内で通常は本来の長さで機能するが、特に腺癌において特異的に発現するか、あるいは、活性が亢進する酵素、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ群により切断を受けることで副次的に断片化やアミノ酸の欠損が亢進し得る。
【００４７】
以下、（ｉ）〜(x)に記載のタンパク質とそれらのタンパク質由来の特定タンパク質断片の配列を特定のデータベースに含まれる特定の配列（配列表の配列番号１〜１０）で例示しながら説明する。当業者には明らかな通り、これらの配列や配列中におけるアミノ酸残基の位置およびアミノ酸残基数は、個人により変わる場合もあり、またデータベースによって掲載配列が異なる場合もある。配列は本発明の説明の為のものであり、本発明を限定するものではない。
【００４８】
（ａａ）  Ｃ末端の配列がＧＴＥＡＡＧＡＭＦのタンパク質断片はα-1-アンチトリプシン由来であり得る。α-1-アンチトリプシンは好中球エラスターゼ阻害物質であり、主な機能は、プロテアーゼを介した組織破壊から肺を守ることである。α-1-アンチトリプシンの前駆体配列として、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ０１００９（Ａ１ＡＴ＿ＨＵＭＡＮ）の配列（配列表の配列番号１）がある。特定タンパク質断片は、この配列で説明すると、３６８位のアミノ酸残基から３７６位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、３７７位からＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。
【００４９】
（ｂｂ）  Ｃ末端の配列がＣＶＬＦＰＹＧＧのタンパク質断片は、α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来であり得る。
（ｃｃ）  Ｃ末端の配列がＥＹＣＧＶＰＧのタンパク質断片は、α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来であり得る。
（ｄｄ）  Ｃ末端の配列がＥＹＣＧＶＰＧＤＧのタンパク質断片は、α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来であり得る。
（ｅｅ）  Ｃ末端の配列がＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥのタンパク質断片は、α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来であり得る。
（ｆｆ）  Ｃ末端の配列がＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥのタンパク質断片は、α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来であり得る。
（ｇｇ）  Ｃ末端の配列がＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬのタンパク質断片は、α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来であり得る。
（ｈｈ）  Ｃ末端の配列がＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬＬのタンパク質断片は、α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来であり得る。
（ｉｉ）  Ｃ末端の配列がＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰのタンパク質断片は、α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来であり得る。
（ｊｊ）  Ｃ末端の配列がＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰＩＬＩＰのタンパク質断片は、α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来であり得る。
（ｘｘ）  Ｃ末端の配列がＥＹＣＧＶＰＧＤのタンパク質断片は、α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来であり得る。
（ｙｙ）  Ｃ末端の配列がＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥのタンパク質断片は、α‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来であり得る。
【００５０】
ここで、α‐1-ミクログロブリン（α１−ｍ）は、分子量約３０，０００の糖タンパク質である。タンパク質の配列としては、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ０２７６０で示される配列（配列表の配列番号２）であり得る。正常な構造を有するタンパク質は、少なくとも配列表の配列番号２の３５２位のAsnをＣ末端とするタンパク質である。特定タンパク質断片（ｂｂ）は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ０２７６０の配列でいえば、インターαトリプシンインヒビター軽鎖またはトリプスタチンに含まれる３１２位のアミノ酸残基から３１９位のアミノ酸残基を有し、Ｃ末端側が欠損しているタンパク質断片あるいは、インターαトリプシンインヒビター軽鎖部のみ、またはトリプスタチンのみのタンパク質断片でもあり得る。（ｃｃ）〜（ｈｈ）、（ｘｘ）においては、限定はされないが、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ０２７６０で示される配列でいえば、３３５位のアミノ酸残基から３４１位のアミノ酸残基までまたは３４２位のアミノ酸残基まで、この配列の３３５位のアミノ酸残基から３４３位のアミノ酸残基まで、この配列の３３５位のアミノ酸残基から３４５位のアミノ酸残基まで、この配列の３３５位のアミノ酸残基から３４６位のアミノ酸残基まで、この配列の３３５位のアミノ酸残基から３４７位のアミノ酸残基まで、またはこの配列の３３５位のアミノ酸残基から３４８位のアミノ酸残基まで、のいずれかのアミノ酸配列を有し、Ｃ末端側に欠損があり、かつインターαトリプシンインヒビター軽鎖部のみ、あるいは、これらのＣ末端欠損がありかつトリプスタチンのみのアミノ酸配列のタンパク質断片であり得る。特定タンパク質断片（ｙｙ）、（ｉｉ）、また
は（ｊｊ）では、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ０２７６０の配列でいえば、１８６位のアミノ酸残基から１９６位または１９７位のアミノ酸残基までの配列、または１８６位のアミノ酸残基から２０１位のアミノ酸残基までの配列を有し、Ｃ末端側が欠損しているタンパク質断片であり得る。
【００５１】
（ｋｋ）  Ｃ末端の配列がＤＬＣＮＦＮＥＱＬのタンパク質断片は、ＣＤ５９由来であり得る。ここで、ＣＤ５９分子は、補体制御因子として知られており、Ｃ９に作用することで膜障害複合体の形成を阻害する分子である。タンパク質の配列としては、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ１３９８７（ＣＤ５９＿ＨＵＭＡＮ）で示される配列（配列表の配列番号３）であり得る。特定タンパク質断片（ｋｋ）としては、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ１３９８７で示される配列でいえば、９２位のアミノ酸残基から１００位のアミノ酸残基を有し、１０１位からＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であり得る。
【００５２】
(ｎｎ) Ｃ末端の配列がＦＧＦＣＰＭＡのタンパク質断片は、フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）由来であり得る。フィブロネクチンは、比較的分子量の大きな糖タンパク質で、細胞接着分子である。細胞接着分子として、細胞の細胞外マトリックスへの接着、結合組織の形成・保持、創傷治癒、胚発生での組織や器官の形態・区画の形成・維持などの機能があると考えられている。フィブロネクチンの配列として、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ０２７５１（ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ）の配列（配列表の配列番号４）がある。限定はされないが、特定タンパク質断片は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ０２７５１の配列でいえば、４５８位のアミノ酸残基から４６４位のアミノ酸残基までを有し、４６５位からＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であり得る。
【００５３】
(ｑｑ) Ｃ末端の配列がＬＰＴＧＹＹのタンパク質断片は、Ｌｅｃｔｉｎ，Ｍａｎｎｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ２由来であり得る。Ｌｅｃｔｉｎ，Ｍａｎｎｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ２は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ１２９０７  （ＬＭＡＮ２＿ＨＵＭＡＮ）の配列（配列表の配列番号５）がある。限定はされないが、特定タンパク質断片は、例えば、この配列でいえば、２４７位のアミノ酸残基から２５２位のアミノ酸残基までのアミノ酸残基を有し、Ｃ末端側が欠損しているタンパク質断片であり得る。
【００５４】
(ｒｒ) Ｃ末端の配列がＹＬＱＧＳＳＶＱＬのタンパク質断片は、バゾリン（Ｖａｓｏｒｉｎ）由来タンパク質断片であり得る。バゾリンは、血管平滑筋細胞特異的に発現している1型膜タンパク質である。バゾリンの配列として、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ６ＥＭＫ４（ＶＡＳＮ＿ＨＵＭＡＮ）の配列（配列表の配列番号６）がある。限定はされないが、特定タンパク質断片は、例えば、この配列でいえば、４８３位のアミノ酸残基から４９１位のアミノ酸残基までのアミノ酸残基を有し、Ｃ末端側が欠損しているタンパク質断片であり得る。
【００５５】
(ｓｓ) Ｃ末端の配列がＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮのタンパク質断片は、ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２ 由来タンパク質断片であり得る。(ｐｐ) Ｃ末端の配列がＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧのタンパク質断片は、ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２ 由来タンパク質断片であり得る。(ｖｖ) Ｃ末端の配列がＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧＬのタンパク質断片は、同様にＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２ 由来タンパク質断片であり得る。ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２ の配列として、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ１４５０８（ＷＦＤＣ２＿ＨＵＭＡＮ）の配列（配列表の配列番号７）がある。正常な構造を有するタンパク質は、少なくとも配列表の配列番号７の１２４位のPheをＣ末端とするタンパク質であり得る。限定はされないが、特定タンパク質断片は、例えば、この配列でいえば、７７位のアミノ酸残基から８６位のアミノ酸残基まで、９１位のアミノ酸残基まで、または９２位のアミノ酸残基までを有し、Ｃ末端側が欠損しているタンパク質断片であり得る。
【００５６】
(ｔｔ) Ｃ末端の配列がＥＮＹＮＱＹＤＬＮのタンパク質断片は、Membrane-bound carboxypeptidase M由来タンパク質断片であり得る。Membrane-bound carboxypeptidase Mは、基質のＣ末端側から1残基ずつ切断するエキソペプチダーゼである。この配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ１４３８４（ＣＢＰＭ＿ＨＵＭＡＮ）の配列（配列表の配列番号８）であり得る。限定はされないが、特定タンパク質断片は、例えば、この配列でいえば、１４５位のアミノ酸残基から１５３位のアミノ酸残基までのアミノ酸残基を有し、Ｃ末端側が欠損しているタンパク質断片であり得る。
【００５７】
(ｕｕ) Ｃ末端の配列がＧＡＶＶＰＤＳＡＬＰＦＮＦＱＡＡＹのタンパク質断片は、デオキシリボヌクレアーゼ‐１（Deoxyribonuclease-1）由来タンパク質であり得る。この配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ２４８５５（ＤＮＡＳ１＿ＨＵＭＡＮ）の配列（配列表の配列番号９）であり得る。限定はされないが、特定タンパク質断片は、例えば、この配列でいえば、２４５位のアミノ酸残基から２６１位のアミノ酸残基までのアミノ酸残基を有し、Ｃ末端側が欠損しているタンパク質断片であり得る。
【００５８】
(ｗｗ）Ｃ末端の配列がＧＡＬＣＬＬＡＥＤＤＳのタンパク質断片は、WNT1-inducible-signaling pathway protein 2由来タンパク質断片であり得る。この配列は、例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｏ７６０７６（ＷＩＳＰ２＿ＨＵＭＡＮ）の配列（配列表の配列番号１０）であり得る。限定はされないが、特定タンパク質断片は、例えば、この配列でいえば、８８位のアミノ酸残基から９８位のアミノ酸残基までのアミノ酸残基を有し、Ｃ末端側が欠損しているタンパク質断片であり得る。
【００５９】
本発明の不正常な切断を検知する方法において、正常な構造を有する特定タンパク質量またはその存在、特定タンパク質断片の量またはその存在は、被検体由来試料である体液中に含まれるそれらの質量、容量、または濃度などで検出することができる。さらには、蛍光強度、吸光度、ＭＳ／ＭＳスペクトルの強度等で表わすことも可能である。
【００６０】
さらに、本発明における検出方法は、被検体由来試料中に含まれる、不正常な切断を検知する方法または正常な構造を有するタンパク質を検出する方法であれば特に制限されるものではない。例えば、質量分析により検出する方法の他、抗体を用いた免疫化学的測定法（ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、ウェスタンブロット法など）で検出する方法を挙げることができる。
【００６１】
質量分析による方法としては、被検体由来試料中の正常な構造を有する特定タンパク質または不正常な切断に由来する特定タンパク質断片を検出する方法であれば特に制限されるものではない。具体的には、例えば、試料を採取し、前処理および／または還元処理後に酵素消化し、同位体等で標識した後、ＭＳ／ＭＳによってＣ末端由来のペプチドのみの量を測定する方法がある。より具体的には、限定はされないが、被検体由来試料が尿である場合、尿を採取し、前処理として尿検体を濃縮した検体を得、この濃縮検体を還元アルキル化した後に、Ｈ２１８Ｏ存在下でトリプシン消化することで、トリプシン消化断片由来のペプチドを安定同位体標識することができる。その後、脱塩、イオン交換クロマトグラフィーによる精製後、Ｎａｎｏ−ＬＣ−ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳにより、Ｃ末端由来のトリプシン消化ペプチドのみを測定する。このペプチド情報を解析することで、正常な構造を有するタンパク質または不正常な切断由来の特定タンパク質断片を区別して検出することができる。この他に、例えば、濃縮試料中のタンパク質をＬｙｓ−Ｃで酵素消化した後、すべての消化ペプチドのＮ末端をイソシアン酸フェニルやＴＭＰＰ試薬（N-Succinimidyloxycarbonyl-methyl)tris(2,4,6-trimethoxyphenyl)phosphonium bromide）といった試薬でブロックし、リジン以外のＣ末端を有するペプチドを得て、質量分析器によるＭＳ／ＭＳ分析を行うことで、特定タンパク質断片を測定する方法なども採用できる。
【００６２】
ＭＲＭ（Multiple Reaction Monitoring；多重反応モニタリング）により特定タンパク質断片量を測定する場合には、例えば、高速液体クロマトグラフィー／３連四重極質量分析装置（QTRAP(R) 5500 System（エービーサイエックス社））やLCMS-8030（島津製作所株式会社製）を用いることもできる。
【００６３】
ラジオイムノアッセイおよびエンザイムイムノアッセイによる方法としては、不正常な切断由来のアミノ酸露出部、特定タンパク質断片のＣ末端部、または特定のアミノ酸欠損部を特異的に認識し、対応する正常な構造を有するタンパク質と区別することができる抗体を用いることが望ましい。特定タンパク質またはそれに由来する抗原を特異的に認識する抗体は、限定はされないが、対応するＣ末端部、Ｎ末端部、その他の部分、欠損部に対応するペプチドを抗原として、ニワトリ、ラット、マウス、ウサギ等に投与し、免疫することにより作製することができる。対応する全長型タンパク質との交差結合反応性を抑えるため、抗原をカラムに固定し、免疫動物より得られたポリクローナル抗体を精製した抗体を作製してもよい。各断片のＣ末端アミノ酸または欠損部を含む部位を特異的に認識するモノクローナル抗体を作製してもよい。モノクローナル抗体の作成方法は、当業者に公知である。例えば、上記のような免疫動物から得られる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と細胞融合させることで増殖能を持つハイブリドーマを作成し、特に、Ｃ末端アミノ酸に特異性をもった抗体を産生しているクローンのみを選別する。この細胞を培養し、分泌する抗体を精製して、本発明の抗体として用いる。
【００６４】
ウェスタンブロット法では、限定はされないが、具体的には、被検体由来試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜、又はＰＶＤＦ膜に転写する。転写膜をスキムミルク等でブロッキング後、各タンパク質またはタンパク質断片のＣ末端アミノ酸、または欠損部を含む部位を特異的に認識する一次抗体で処理し、続いて前述の一次抗体を認識する西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)標識二次抗体で処理し、目的のタンパク質断片の電気泳動バンドをＨＲＰの酵素活性に由来する発色または化学発光で検出する。エンザイムイムノアッセイでは、例えば、検体を９６穴プレート中で、上述の一次抗体、及び、ＨＲＰ標識二次抗体で処理することで、目的のタンパク質断片をＨＲＰの酵素活性に由来する発色または化学発光で検出する。サンドイッチ法などを用いることも可能である。
【００６５】
被検体の代謝状態の変動による結果のばらつきを補正するため、被検体由来試料中の不正常な切断に由来する欠損やタンパク質断片は、質量分析、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、ウエスタンブロット法でその存在量を検出した後、同じく被検体由来試料中の総タンパク質の存在量と比較することができる。被検体由来試料中の総蛋白量は、ＢＣＡ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法等の市販プロテインアッセイキットを用いて定量しても良く、液体クロマトグラフィー法等を用いても良い。その他、尿検体の水分量の変動を補正するために用いられている尿中のクレアチニン量と比較してもよい。
【００６６】
被検体由来試料中の正常な構造を有する特定タンパク質の量または特定タンパク質断片の量を、試料中に共存する特定タンパク質由来のすべてのタンパク質の存在量と比較し、相対比で表すこともできる。あるいは、被検体由来試料中のタンパク質断片の存在量を、被検体由来試料中の総蛋白量と比較し、断片の量と総蛋白量の相対比で表すこともできる。
【００６７】
いずれの測定方法を用いた場合でも、特定タンパク質における不正常な切断の有無は、被検体試料中における該特定タンパク質の断片化率を算出して、その値が閾値を超えているか否かで判断することができる。すなわち、特定タンパク質の断片化率が閾値を超えている場合には、由来する被検体が腺癌であることが把握できる。
【００６８】
より具体的には、限定はされないが、例えば、各特定タンパク質の断片化率（Fn）を以下の計算式により求め、健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が、相対比（Rn）として１を超えるものを陽性とすることができる。
【００６９】
[式１]タンパク質断片化率（Fn）＝Cn／In
Cn：各特定タンパク質断片の量
In：各特定タンパク質断片由来の元のタンパク質の量
【００７０】
[式２] 患者と健常者のタンパク質断片化率の相対比（Rn）＝Fp／Fh
Fp：患者試料のタンパク質断片化率
Fh：健常者群のタンパク質断片化率の平均値
【００７１】
ここで、Cnにおける各特定タンパク質の断片の量とは、１つの特定タンパク質断片の量（例えば表３に示すような不正常なＣ末端を有するタンパク質断片のうちの１つに対応する量）を指す。
Inにおける元のタンパク質の量とは、タンパク質断片あるいは全長タンパク質に共通に含まれる、例えばトリプシン消化ペプチドの量を指す。ここで、測定方法は、実施例７記載の条件に準ずる。
ここで、共通に含まれる配列は限定はされないが、以下の配列を使用することができる。
ＡＭＢＰ：ＴＶＡＡＣＮＬＰＩＶＲ  （配列表の配列番号２  ２８３位〜２９３位）
ＷＦＤＣ２：ＣＣＳＡＧＣＡＴＦＣＳＬＰＮＤＫ  （配列表の配列番号７  ６１位〜７６位）
ＷＩＳＰ２：ＣＰＬＧＶＰＬＶＬＤＧＣＧＣＣＲ  （配列表の配列番号１０  ３９位〜５４位）
ＤＮＡＳ１：ＤＳＨＬＴＡＶＧＫ  （配列表の配列番号９  ６４位〜７２位）
ＣＢＰＭ：ＤＰＥＩＴＮＬＩＮＳＴＲ（配列表の配列番号８  １０７位〜１１８位）
ＶＡＳＮ：ＥＳＨＶＴＬＡＳＰＥＥＴＲ（配列表の配列番号６  ３１５位〜３２７位）
ＦＩＮＣ：ＹＳＦＣＴＤＨＴＶＬＶＱＴＲ（配列表の配列番号４  ３９８位〜４１１位）
ＬＭＡＮ２：ＤＨＤＴＦＬＡＶＲ（配列表の配列番号５  ２１０位〜２１８位）
ＣＤ５９：ＦＥＨＣＮＦＮＤＶＴＴＲ（配列表の配列番号３  ６７位〜７８位）
【００７２】
被検体由来試料において、正常な構造を有するタンパク質の量が、健常者の検体試料（健常試料）と比較し、有意に減少した場合、対象者は腺癌患者と判定される。ここで、有意な減少とは、健常者検体と比較して、例えば、上記正常な構造を有する上記タンパク質の相対比として、０．９倍以下、好ましくは、０．８倍以下、より好ましくは、０．６倍以下になることをいう。あるいは、抗体を用いる場合、標識の強度等から認識できる量の減少が健常者検体と比較して、０．８倍以下、好ましくは、０．６倍以下程度になることをいう。
【００７３】
被検体由来試料において、特定タンパク質の断片が、健常者の検体試料（健常試料）と比較し、有意に増加した場合、対象者は腺癌患者と判定される。ここで、有意な増加とは、健常者検体と比較して、例えば、上記断片化率の相対比として、１を超える値、１．２５倍以上、好ましくは、１．５倍以上、より好ましくは、２．０倍以上になることをいう。
【００７４】
抗体を用いる場合、標識の強度等から認識できる特定タンパク質の断片の量の増加が健常者検体と比較して、１を超える値、好ましくは１．２倍以上、より好ましくは、１．５倍以上程度になることをいう。なお、ここでの比較の数値は、内部標準等を用いた補正後の値を指すものとする。
【００７５】
健常者被検体由来試料における正常な構造を有する特定タンパク質の量または特定タンパク質断片の量などは、被検体由来試料の調製と測定方法に準じて決定することができる。
【００７６】
本発明における特に好ましい態様では、１または２以上の特定タンパク質が、少なくとも（ｉｉ）α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体を含み、
不正常な切断をインビトロで検知する工程が、被検体試料中に存在するα‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来の正常な構造を有するタンパク質の量の減少、および／またはα‐1-ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来のタンパク質断片の量または存在を検知することを含む。ここで、例えば、（ｇ）ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬのＣ末端部を認識する抗体を好適に使用することができる。
【００７７】
本発明の特に好ましい態様では、１または２以上の特定タンパク質が、少なくとも（vii）ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２を含み、
前記不正常な切断をインビトロで検知する工程が、
配列表の配列番号７の第８０位〜第９３位のアミノ酸配列中のいずれかのペプチド結合の切断、あるいは、切断部位周辺におけるアミノ酸残基の欠損を検知することを含む。
【実施例】
【００７８】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７９】
〔実施例１〕体液の採取
胸部画像検査にて原発性肺癌を疑う肺内結節影または腫瘤影が存在する患者のうち、手術、経気管支生検、リンパ節生検または細胞診により、肺腺癌と診断した患者を選定した。選定した肺腺癌患者および健常者から早朝中間尿を、滅菌コップを用いて採取した。採取した尿試料は解析までの間‐８０℃で保存した。【００８０】
肺腺癌８５例と健常者２５名の尿のＣ末端タンパク質断片を網羅的に解析した。肺腺癌症例の臨床病期の内訳はＩＡ期１８例、ＩＢ期５例、ＩＩＡ期１例、ＩＩＢ期０例、ＩＩＩＡ期６例、ＩＩＩｂ期５例およびＩＶ期５０例であった。臨床病期は、日本肺学会編「肺癌取扱い規約第７版」（金原出版株式会社）に記載された基準に従って判定した。ＩＡ期１８例、ＩＢ期５例およびＩＩＡ期１例の肺腺癌症例を早期肺腺癌症例と定義した。【００８１】
〔実施例２〕質量分析による検出
尿試料（〜５０  ｍＬ）を採取し、前処理、分析データの取得、統計解析の手順でマーカー探索を行った。前処理は、尿試料をアミコンウルトラ‐１５（１０ｋＤａ分子量カット）、及びアミコンウルトラ‐４（１０ｋＤａ分子量カット）（メルクミリポア社）を用いて２００〜２５０倍に濃縮し、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液３ｍＬを用いて３回洗浄して、低分子を除去後、濃縮検体を得た。この濃縮検体のタンパク質定量を行い、全ての検体について、全タンパク質量１０ｍｇ／ｍＬの濃度に緩衝液を用いて調整して、その後の分析行程に用いた。続いて、試料を還元アルキル化の後に、一定濃度のＨ２１８Ｏを用いて調製した緩衝液中でトリプシン消化した（ペプチドＣ末端の安定同位体標識法）。脱塩、精製後、ｉＴＲＡＱ（８−ｐｌｅｘ、エービーサイエックス社）によるラベル化を行い、８検体を混合、脱塩、精製した後、タンパク質断片由来のＣ末端トリプシン消化ペプチドのみをイオン交換クロマトグラフィーにより分画した（ＬＣカラム：ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ  ＡＴＭ（ＰｏｌｙＬＣ  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）、内径４．６ｍｍ、長さ５０ｍｍ；流速：０．４ｍＬ／分；溶媒：２０％アセトニトリル／リン酸水溶液（ｐＨ２．５５）に対して２０％アセトニトリル／５  ｍＭリン酸第１カリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ  ２．５５）の濃度を段階的に上昇（０−１００％）させて分離）。その画分を脱塩、精製後、Ｎａｎｏ−ＬＣ（ＬＣカラム：内径７５μｍ、長さ１００ｍｍ、充填剤Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  Ｃ１８（粒子径３μｍ）；流速：２５０ｎＬ／分；溶媒：０．１％トリフルオロ酢酸水中でアセトニトリル濃度勾配（３−８０％）により分離）／ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ（エービーサイエックス社）により測定を行い、Ｃ末端トリプシン消化ペプチドのみを選別、抽出した（独自開発プログラム“ｉＳｐｅｃ“；文献：Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−ｄｅ−Ｃｏｓｓｉｏ  Ｊ．，
Ｔａｋａｏ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１８，２４６５−２４７２（２００４））。アッセイ間の比較は、ＭＳ／ＭＳスペクトル中に含まれる比較定量に関わるレポーターピーク（ｍ／ｚ  １１３〜１１９，１２１）の内のコントロールピーク（ｍ／ｚ１１３、各アッセイに等量スパイクした）の強度で他のレポーターピークを規格化した後に行った。具体的な評価基準として、定性については、一定強度以上のピークの本数が５個以上のＭＳ／ＭＳスペクトルを選択し、かつ、それらのＭＳ／ＭＳスペクトルを基に同定されたタンパク質の数が５０個以上のアッセイを採用した。定量については、基準のレポーターピーク（ｍ／ｚ１１３）のピーク強度が１０より大きく、かつ、ＭＳ／ＭＳスペクトル数が３００個以上のアッセイのみの定量値を用いた。これらの定性、定量の基準を満たすデータのみを統計解析に用いることにより、アッセイ間の比較精度を向上でき、その結果、統計解析の精度を高めることができる。【００８２】
〔実施例３〕マーカーの選出
統計解析肺腺癌および健常者の尿試料  から得られた、ＭＳ／ＭＳスペクトルの各Ｃ末端トリプシン消化ペプチドのピーク強度（実施例２）について、コントロール検体のピーク強度に対する相対比をそれぞれ算出し、肺腺癌と健常者の間で比較検討した。検定方法はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ  Ｕ  ｔｅｓｔを用いた。統計解析はＪＭＰ１２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ，  Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用した。肺腺癌８５例または早期肺腺癌２４例と健常者の間で尿中タンパク質断片のピーク強度を比較し、ＲＯＣ−ＡＵＣ値が０．６以上またはｐ値が０．１未満の基準を満たしたタンパク質断片をマーカー候補とした。肺腺癌診断マーカーとして計１８種（表１）、早期肺腺癌診断マーカーとして計１３種のタンパク質断片（表２）を同定した。【００８３】
【表１】
2017142025.tif 000003
【００８４】
【表２】
2017142025.tif 000004
【００８５】
〔実施例４〕ウェスタンブロット法による検出方法
健常者  （７名）および肺腺癌患者  （１８症例）の尿濃縮検体（実施例２）から、２．５μｇのタンパク質相当をコンドロイチナーゼＡＢＣ処理（シグマ社）によってタンパク質からコンドロイチン硫酸鎖を除いた後、５−２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｄ．Ｒ．Ｃ社）を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲル中で分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレンＢＡ８５（ＧＥヘルスケア社）へ転写し、α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来のタンパク質断片ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬのＣ末端アミノ酸配列を認識する特異抗体を用いて、Ｃ末端アミノ酸配列をＥＹＣＧＶＰＧＤＤＥＥＬとするタンパク質断片を可視化した（図１Ａ）。また、α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体を認識する市販抗体（AMBP antibody, Product No.GTX101069, GeneTex社）を用いて、α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体タンパク質の尿中における存在量を可視化した（図１Ｂ）。バンドの可視化は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体による化学発光シグナルを冷却ＣＣＤカメラ（富士フィルム社）で取得することによって行い、画像解析ソフトウエアＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いてバンドの定量化を行った。各サンプルにおけるα‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体タンパク質とＣ末端アミノ酸配列をＥＹＣＧＶＰＧＤＤＥＥＬとするタンパク質断片の相対存在量をプロットした（図１（Ｃ））。この実験において、検出された当該Ｃ末端が、健常者の平均に対して２倍以上の高値を示したものは、健常者７検体中、１検体、肺腺癌患者１８検体中、１３検体であった。なお、図１（Ａ）〜（Ｃ）において、左側の電気泳動写真およびグラフの１〜３は健常人、４〜１３は、肺腺癌患者の検体由来である。図１（Ａ）〜（Ｃ）において、右側の電気泳動写真およびグラフの１〜４は健常人、５〜１２は、肺腺癌患者の検体由来である。【００８６】
〔実施例５〕肺腺癌の評価方法
胸部画像検査にて原発性肺癌を疑う肺内結節影または腫瘤影が存在する患者のうち、手術、肺生検、リンパ節生検または骨生検などの組織診断や、喀痰や胸水などの細胞診により、肺腺癌の診断を行った。肺腺癌の臨床病期の決定については、ＰＥＴ−ＣＴ検査による集積強度、頭部ＭＲＩ検査および胸部ＣＴ検査による画像検査の他、骨生検、リンパ節穿刺吸引細胞診または胸水細胞診検査を用いた。尿中におけるα‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来のＣ末端アミノ酸配列をＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬとするタンパク質断片が実施例２で高値を示した肺腺癌症例において、胸部ＣＴ検査では右上葉に２ｃｍ大の結節影を認め（図２）、同部はＰＥＴ−ＣＴ検査で異常な集積を認めた（図３）。経気管支生検で得た組織からThyroid transcription factor-1 (TTF-1)が陽性である肺腺癌を検出した(図４)。この症例におけるα‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来のＣ末端アミノ酸配列をＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬとするタンパク質断片のスペクトル面積は健常者の平均値の２．１倍であった。【００８７】
〔実施例６〕早期肺腺癌の診断におけるCEAとの有用性の比較
早期肺腺癌と診断した２４例（実施例１）のうち、血中ＣＥＡ値が確認できた１４例において、ＣＥＡと尿中タンパク質断片での有用性を比較した。例えば、α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来のＣ末端アミノ酸配列をＣＶＬＦＰＹＧＧとするタンパク質断片が、実施例２で、健常者の平均値の１．２５倍を示すものを陽性とするとした場合、早期肺腺癌１４例中１１例が陽性であると判断できた。一方、血中ＣＥＡ値の基準値を５．０ｎｇ／ｍｌとした場合、早期肺腺癌１４例中４例のみが陽性の結果であった。【００８８】
〔実施例７〕スクリーニング
実施例２と同様に検体を調製し、ＭＲＭ法に供することで、腺癌患者のスクリーニングを行った。尿試料（〜５０ｍＬ）を採取し、前処理および分析データの取得と解析を実行した。具体的には、前処理により、尿試料をアミコンウルトラ‐１５（１０ｋＤａ分子量カット）、及びアミコンウルトラ‐４（１０ｋＤａ分子量カット）（メルクミリポア社）を用いて２００〜２５０倍に濃縮し、低分子を洗浄により除去後、濃縮検体を得た。この濃縮検体のタンパク質定量を行い、全ての検体について、全タンパク質量１０ｍｇ／ｍＬの濃度に緩衝液を用いて調整して、その後の分析工程に用いた。続いて、試料を還元アルキル化の後に、緩衝液中でトリプシン消化した。脱塩、精製後、タンパク質断片由来のトリプシン消化ペプチドをイオン交換クロマトグラフィーにより分画し（ＬＣカラム：ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ  ＡＴＭ（ＰｏｌｙＬＣ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ）、内径４．６ｍｍ、長さ５０ｍｍ；流速：０．４  ｍＬ／分；溶媒：２０％アセトニトリル／リン酸水溶液（ｐＨ  ２．５５）に対して２０％アセトニトリル／５ｍＭリン酸第１カリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ  ２．５５）の濃度を段階的に上昇（０−１００％）させて分離）、タンパク質断片のＣ末端ペプチドを含むトリプシン消化ペプチド混合物を得た。このようにして得られる各試料を別々に高速液体クロマトグラフィー／３連四重極質量分析装置（ＱＴＲＡＰ（Ｒ）  ５５００  Ｓｙｓｔｅｍ（エービーサイエックス社））に供し、混合物の分離と同時にペプチドの定量をＭＲＭ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：多重反応モニタリング）により行った。各タンパク質の断片化率（Ｆｎ）を以下の計算式により求め、健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．５倍以上高いものを陽性とした。
［式１］タンパク質断片化率（Ｆｎ）＝Ｃｎ／Ｉｎ
Ｃｎ：各タンパク質断片の量  （表３中のタンパク断片配列にあるペプチドの量）
Ｉｎ：各タンパク質断片由来の元のタンパク質の量
［式２］患者と健常者のタンパク質断片化率の相対比（Ｒｎ）＝Ｆｐ／Ｆｈ
Ｆｐ：患者試料のタンパク質断片化率
Ｆｈ：健常者群のタンパク質断片化率の平均値
Ｉｎにおける元のタンパク質の量とは、タンパク質断片あるいは全長タンパク質に共通に含まれるトリプシン消化ペプチドの量を指す。ここでは、それぞれ、以下の内部配列を使用した。
ＡＭＢＰ：ＴＶＡＡＣＮＬＰＩＶＲ
ＷＦＤＣ２：ＣＣＳＡＧＣＡＴＦＣＳＬＰＮＤＫ
ＷＩＳＰ２：ＣＰＬＧＶＰＬＶＬＤＧＣＧＣＣＲ【００８９】
早期肺腺癌２８例（臨床病期ＩＡ：１９例、ＩＢ：７例、ＩＩＡ：１例、ＩＩＢ：１例）と健常者４０名の尿検体をＭＲＭ法に供することにより、早期肺腺癌と健常者間の各タンパク質の断片化率を比較し、ＲＯＣ−ＡＵＣ値が０．６以上またはｐ値が０．１未満の基準を満たしたタンパク質断片を早期肺腺癌診断マーカーとした。この解析により、早期肺腺癌診断マーカーとして計１２種（表３）を同定した。【００９０】
早期肺腺癌２８例と健常者４０名の尿検体をＭＲＭ法に供し、α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来のＣ末端アミノ酸配列をＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者７例が陽性、早期肺腺癌１７例が陽性であった。断片化率が健常者群の平均値に対して２．１８倍を基準とした場合、健常者１例が陽性、早期肺腺癌１６例が陽性であり、当該基準値における感度は５７．１％、特異度は９７．５％、ＲＯＣ−ＡＵＣ値は０．８１９であった。【００９１】
別途、早期肺腺癌２８例と健常者４０名の尿検体をＭＲＭ法に供し、ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２  タンパク質におけるＣ末端アミノ酸配列をＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者３例が陽性、早期肺腺癌１６例が陽性であった。当該基準値における感度は６９．６％、特異度は９１．４％、ＲＯＣ−ＡＵＣ値は０．８５５であった。【００９２】
【表３】
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【００９３】
さらに、表３に記載した計１２種のタンパク質断片を用いて、早期肺腺癌を予測するロジスティック回帰モデルを作成した。１２種のタンパク質断片から、ステップワイズ変数選択法を用いて、（１）α−１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来のＣ末端アミノ酸配列をＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥとするタンパク質断片（Ｘ）、（２）ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ２  蛋白質におけるＣ末端アミノ酸配列をＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧとするタンパク質断片（Ｙ）の計２種をロジスティック回帰モデルに用いる説明変数として選定した。ステップワイズ変数選択法において変数の追加および除去を行う基準はｐ値＝０．２とした。【００９４】
この結果得られたロジスティック回帰式は以下である。
［式３］Ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝６．７５９７９５３１６５
−９２．２９８２７７３８×Ｘ
−２４８．８９７８５２×Ｙ【００９５】
なお、多重ロジスティック回帰分析はＪＭＰ１２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて行い、回帰式の各係数は、健常者３５名と早期肺腺癌２３例の検体データを用いて算出した。【００９６】
この回帰式を用いて、各尿サンプルにおける予測値を算出した。予測値０．５３５８をカットオフ値とすると、当該基準値における感度は８２．６％、特異度は９４．３％、ＲＯＣ−ＡＵＣ値は０．９０１であった。【００９７】
[実施例８]ＡＭＢＰのウェスタンブロット法による検出方法
健常者（９名）および肺腺癌患者（９症例）の尿濃縮検体を実施例２と同様の方法によって得た。２．５μｇのタンパク質相当をコンドロイチナーゼＡＢＣ処理（シグマ社）によってタンパク質からコンドロイチン硫酸鎖を除いた後、５−２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｄ．Ｒ．Ｃ社）を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ゲル中で分離されたタンパク質をニトロセルロースメンブレンＢＡ８５（ＧＥヘルスケア社）へ転写し、α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来の正常タンパク質Ｃ末端アミノ酸配列ＲＦＳＮを認識する特異抗体を用いて、Ｃ末端アミノ酸配列をＲＦＳＮとする正常（全長）タンパク質を可視化した（図５Ａ；抗ビクニンＣ末端抗体）。また、α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体を認識する市販抗体（ＡＭＢＰ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．ＧＴＸ１０１０６９，  ＧｅｎｅＴｅｘ社）を用いて、α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体タンパク質の尿中における存在量を可視化した（図５Ａ；抗ビクニン抗体）。バンドの可視化は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体による化学発光シグナルをデジタルカメラ（キャノン社）で取得することによって行い、画像解析ソフトウエアＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いてバンドの定量化を行った。各サンプルにおけるα‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体タンパク質とＣ末端アミノ酸配列をＲＦＳＮとする正常タンパク質の相対存在量をプロットした（図５Ｂ）。この実験において、検出された全長の割合が、健常者の平均に対して１／２以下の低値を示したものは、肺腺癌患者９検体中、６検体であった。なお、図５（Ａ）および（Ｂ）において、１〜６は、健常人由来の試料であり、７〜１２は、ステージＩの肺腺癌患者由来の試料である。 【００９８】
〔実施例９〕ＷＦＤＣ２の切断の検知
実施例２と同様に検体を調製し、ＭＲＭ法に供することで、腺癌患者のスクリーニングを行った。尿試料（〜５０ｍＬ）を採取し、前処理および分析データの取得と解析を実行した。具体的には、前処理により、尿試料をアミコンウルトラ‐１５（１０ｋＤａ分子量カット）、及びアミコンウルトラ‐４（１０ｋＤａ分子量カット）（メルクミリポア社）を用いて２００〜２５０倍に濃縮し、低分子を洗浄により除去後、濃縮検体を得た。この濃縮検体のタンパク質定量を行い、全ての検体について、全タンパク質量１０ｍｇ／ｍＬの濃度に緩衝液を用いて調整して、その後の分析工程に用いた。続いて、試料を還元アルキル化の後に、緩衝液中でトリプシン消化した。脱塩、精製後、タンパク質断片由来のトリプシン消化ペプチドをイオン交換クロマトグラフィーにより分画し（ＬＣカラム：ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ  ＡＴＭ（ＰｏｌｙＬＣ  Ｉｎｃ．  ＵＳＡ）、内径４．６ｍｍ、長さ５０ｍｍ；流速：０．４ｍＬ／分；溶媒：２０％アセトニトリル／リン酸水溶液（ｐＨ２．５５）に対して２０％アセトニトリル／５  ｍＭリン酸第１カリウム、  ０．５  Ｍ  ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ  ２．５５）の濃度を段階的に上昇（０−１００％）させて分離）、タンパク質断片のＣ末端ペプチドを含むトリプシン消化ペプチド混合物を得た。【００９９】
このようにして得られる各試料を別々に高速液体クロマトグラフィー／３連四重極質量分析装置（ＱＴＲＡＰ（Ｒ）  ５５００  Ｓｙｓｔｅｍ（エービーサイエックス社））に供し、混合物の分離と同時にペプチドの定量をＭＲＭ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：多重反応モニタリング）により行った。【０１００】
早期肺腺癌６３例（臨床病期ＩＡ：４２例、ＩＢ：１６例、ＩＩＡ：２例、ＩＩＢ：３例）と健常者１９名の尿検体をＭＲＭ法へ供し、早期肺腺癌と健常者間におけるＷＦＤＣ２のタンパク質断片の断片化率を求め、健常者群の平均値を１としてグラフ化した（図６）。ＷＦＤＣ２の断片化率はアミノ酸配列をＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧＬとするトリプシン消化ペプチドを用いて測定した。【０１０１】
健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が相対比で１．３倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１例が陽性、早期肺腺癌２６例が陽性であった。当該基準値における感度は４１．２％、特異度は９４．７％、ＲＯＣ−ＡＵＣ値は０．７２３であった。【０１０２】
ＷＦＤＣ２の切断を効率的に検知するため、アミノ酸配列をＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧＬとするトリプシン消化ペプチドによる断片化率（Ａ）、Ｃ末端アミノ酸配列をＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮとするタンパク質断片の存在度（Ｂ）の２種を用いて、ＷＦＤＣ２の断片指数（Ｅｉ）を以下の計算式により求めた。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化指数が１．３倍以上高いものを陽性とした。（図７）
［式４］  断片化指数（Ｅｉ）＝Ｂ／Ａ【０１０３】
〔実施例１０〕
実施例９で用いた早期肺腺癌６３例（臨床病期ＩＡ：４２例、ＩＢ：１６例、ＩＩＡ：２例、ＩＩＢ：３例）と健常者１９名の尿検体をＭＲＭ法へ供し、ＷＦＤＣ２の断片化指数を求めた。健常者の平均値に対して、患者試料で断片化指数が１．３倍以上高いものを陽性とした場合、健常者５例が陽性、早期肺腺癌５２例が陽性であった。当該基準値における感度は８２．５％、特異度は７３．７％、ＲＯＣ−ＡＵＣ値は０．８８２であった。【０１０４】
［実施例１１］
正常ヒト気道上皮細胞株（ＢＥＡＳ−２Ｂ）とヒト腺癌細胞株（肺腺癌：Ａｄ−１、ＨＬＣ−１、ＰＣ−９、胃腺癌：ＭＫＮ−４５、ＫａｔｏIII、ＭＫＮ−７、膵臓癌：Ｔ３Ｍ４、乳腺癌：ＭＣＦ７）から抽出したタンパク質２０μｇ相当を、ミニプロティアンＴＧＸゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供した。ゲル中で分離されたタンパク質をイモビロンＰ  メンブレン（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）へ転写し、α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来タンパク質のＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端とする断片のＣ末端部分を認識する特異抗体を用いて、Ｃ末端アミノ酸配列をＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬとするタンパク質断片を可視化した（図８（Ａ））。また、α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体のビクニン部分を認識する市販抗体（ＡＭＢＰ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎｏ．  ＧＴＸ１０１０６９、ＧｅｎｅＴｅｘ社）を用いて、その各細胞株由来細胞溶解物における存在量を可視化した（図８（Ｂ））。バンドの可視化は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体による化学発光シグナルをＦｕｓｉｏｎ  ＦＸ７（Ｖｉｌｂｅｒ−Ｌｏｕｒｍａｔ社）で取得し、バンドの定量化を行った。各サンプルにおけるα‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体タンパク質とＣ末端アミノ酸配列をＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬとするタンパク質断片の相対存在量をプロットした（図８（Ｃ））。この実験において、検出された当該Ｃ末端が、正常ヒト気道上皮細胞株に対して１．２５倍以上の高値を示したものは、Ａｄ−１、ＨＬＣ−１、ＰＣ−９、ＭＫＮ−４５、ＫａｔｏIII、ＭＫＮ−７、Ｔ３Ｍ４、ＭＣＦ７であった。
図８において、各番号の検体は以下の通りである。
１：  ＢＥＡＳ−２Ｂ    （正常ヒト気道上皮細胞）
２：Ａｄ−１      （肺腺癌）
３：ＨＬＣ−１    （肺腺癌）
４：ＰＣ−９      （肺腺癌）
５：ＭＫＮ−４５  （胃腺癌）
６：ＫａｔｏＩＩＩ      （胃腺癌）
７：ＭＫＮ７      （胃腺癌）
８：Ｔ３Ｍ４      （膵臓癌）
９：ＭＣＦ７      （乳癌）【０１０５】
［実施例１２］
正常ヒト気道上皮細胞株（ＢＥＡＳ−２Ｂ）とヒト腺癌細胞株（肺腺癌：Ａｄ−１、胃腺癌：ＭＫＮ−４５、ＫａｔｏIII、膵臓癌：Ｔ３Ｍ４、乳腺癌：ＭＣＦ７）から、ＲｉｂｏＰｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてＲＮＡを抽出した。各サンプル由来のＲＮＡ５００ｎｇ相当を、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを、α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体  ｍＲＮＡおよびＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２  ｍＲＮＡおよびＨｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１を認識するプライマー＆プローブセット（Ａｓｓａｙ  ＩＤ：Ｈｓ００１５５６９７＿ｍ１、Ｈｓ００１９６１０９＿ｍ１、Ｈｓ０２８００６９５＿ｍ１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて定量ＰＣＲに供した。各細胞株におけるα‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体  ｍＲＮＡおよびＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２  ｍＲＮＡの発現を、Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ      Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ１  ｍＲＮＡの発現によって標準化することで比較した。この実験において、α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体  ｍＲＮＡの発現が正常ヒト気道上皮細胞株に対して４倍以上の高値を示したものは、Ａｄ−１、ＭＫＮ−４５、ＫａｔｏIII、ＭＣＦ７であった（図９）。また、ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２  ｍＲＮＡの発現が正常ヒト気道上皮細胞株に対して４倍以上の高値を示したものは、Ａｄ−１、ＭＫＮ−４５、ＫａｔｏIII、Ｔ３Ｍ４、ＭＣＦ７であった（図１０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月22日(2017.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体由来試料中における１または２以上の特定タンパク質について、該特定タンパク質における不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程を含む肺腺癌の検出方法であって、
該特定タンパク質は、以下からなる群より選択されるいずれか１種のタンパク質に由来する、肺腺癌の検出方法：
（ｉｉ）α−１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体
（ｉｉｉ）ＣＤ５９
（ｉｖ）フィブロネクチン
（ｖ）Ｌｅｃｔｉｎ，Ｍａｎｎｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ２
（ｖｉ）バゾリン；および
（ｖｉｉ）ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２。
【請求項２】
前記特定タンパク質の不正常な切断が、該特定タンパク質におけるペプチド結合に１以上の切れ目をもたらす切断および／または該特定タンパク質の１以上の箇所に、１または２以上のアミノ酸残基の欠損をもたらす切断である、請求項１記載の肺腺癌の検出方法。
【請求項３】
前記被検体由来試料中における１または２以上の特定タンパク質について、該特定タンパク質における不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程が、以下の（１）〜（４）からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１または２記載の肺腺癌の検出方法：
（１）該被検体由来試料中における該特定タンパク質の正常な構造を有するタンパク質の相対量の減少を検知すること；
（２）該被検体由来試料中における該特定タンパク質のＣ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の存在または相対量の増加を検知すること；
（３）該被検体由来試料中における該特定タンパク質のＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の存在または相対量の増加を検知すること；および
（４）該被検体由来試料中における該特定タンパク質について、アミノ酸配列の任意の中間部位の切断又は欠損の存在または相対量の増加を検知すること。
【請求項４】
請求項１記載の肺腺癌の検出方法であって、
前記特定タンパク質の不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程が、以下からなる群より選択される少なくともいずれか１種の量または存在を検知することを含む、肺腺癌の検出方法：
（ｂ）ＣＶＬＦＰＹＧＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｃ）ＥＹＣＧＶＰＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｄ）ＥＹＣＧＶＰＧＤＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｅ）ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｆ）ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｇ）ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｈ）ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｉ）ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｊ）ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥＰＩＬＩＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｋ）ＤＬＣＮＦＮＥＱＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｎ）ＦＧＦＣＰＭＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｐ）ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｑ）ＬＰＴＧＹＹをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｒ）ＹＬＱＧＳＳＶＱＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｓ）ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｖ）ＥＧＳＣＰＱＶＮＩＮＦＰＱＬＧＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
（ｘ）ＥＹＣＧＶＰＧＤをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；および
（ｙ）ＧＥＣＶＰＧＥＱＥＰＥをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片。
【請求項５】
前記１または２以上の特定タンパク質が、少なくとも（ｉｉ）α‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体を含み、
前記不正常な切断をインビトロで検知する工程が、
被検体試料中に存在するα‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来の正常な構造を有するタンパク質の相対量の減少、および／またはα‐１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体由来のタンパク質断片の量または存在を検知することを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の肺腺癌の検出方法。
【請求項６】
前記１または２以上の特定タンパク質が、少なくとも（ｖｉｉ）ＷＡＰ  ｆｏｕｒ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ２を含み、
前記不正常な切断をインビトロで検知する工程が、
配列表の配列番号７の第８０位〜第９３位のアミノ酸配列中のいずれかのペプチド結合の切断、あるいは、切断部位周辺におけるアミノ酸残基の欠損を検知することを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の肺腺癌の検出方法。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
前記被検体由来試料が、尿である、請求項１〜６のいずれか１項記載の肺腺癌の検出方法。
【請求項９】
質量分析測定法、免疫化学的測定法、およびクロマトグラフィー法からなる群より選択される少なくとも１種の方法を用いる工程を含む、請求項１〜６、又は８のいずれか１項記載の肺腺癌の検出方法。
【請求項１０】
請求項１記載の肺腺癌の検出方法であって、前記特定タンパク質における不正常な切断の有無が、該特定タンパク質の断片化率によって決定され、該断片化率が、
タンパク質断片化率（Ｆｎ）＝Ｃｎ／Ｉｎ
Ｃｎ：各特定タンパク質断片の量
Ｉｎ：各特定タンパク質断片由来の元のタンパク質の量
で表わされる数値である、肺腺癌の検出方法。
【請求項１１】
請求項１記載の肺腺癌の検出方法であって、前記特定タンパク質における不正常な切断の有無が、該被検体由来の該特定タンパク質の断片化率と健常者のタンパク質断片化率との相対比によって決定され、該相対比が、
患者と健常者のタンパク質断片化率の相対比（Ｒｎ）＝Ｆｐ／Ｆｈ
Ｆｐ：患者試料のタンパク質断片化率
Ｆｈ：健常者群のタンパク質断片化率の平均値
で表され、該数値が１を超える場合に不正常な切断があるとする、肺腺癌の検出方法。
【国際調査報告】
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