(57)【要約】  本発明が解決すべき課題はこれまで抗アレルギー作用を有することが知られていなかった化合物を有効成分とする、新規抗アレルギー剤を提供することである。本発明は、式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含む、抗アレルギー剤を提供する：2016159280.tif 000015［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基を示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは１〜３の整数を示す。］。
2016159280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含む、抗アレルギー剤：
【化１】
2016159280.tif 000013
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基を示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは１〜３の整数を示す。］
【請求項２】
ｍが１〜２の整数を示す、請求項１に記載の抗アレルギー剤。
【請求項３】
ｎが２である、請求項１又は２に記載の抗アレルギー剤。
【請求項４】
対象疾患がアトピー性皮膚炎、アレルギー性気管支ぜんそく及びアレルギー性鼻炎からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗アレルギー剤。
【請求項５】
哺乳動物に対して下記式（Ｉ）
【化２】
2016159280.tif 000014
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基を示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは１〜３の整数を示す。］
で表わされる化合物又はその塩を投与する工程を含む、アレルギー性疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患を対象とする抗アレルギー剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年３月３１日に出願された、日本国特許出願第２０１５−０７２０３４号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。Thymic stromal lymphopoietin（TSLP）は、胸腺ストローマ細胞の培養上清から単離されたIL-7様のサイト力インである。TSLPはアレルギ一発症のマスタースイッチとして注目されており、TSLPが肺、皮膚等の局所で発現するとTh2の免疫反応が惹起され、喘息、アトピー性皮膚炎等のアレルギー性疾患を発症することが知られている。従って、TSLPはアレルギー性疾患の予防および増悪化防止を目指した新たな創薬ターゲットである。【０００３】
TSLPの産生を抑制することができれば抗アレルギー作用が期待されるため、これまでかかる作用を有する化合物が研究されている（非特許文献１及び２）。しかし、これらの化合物は、TSLPの産生を抑制するために非常に高濃度で投与する必要があり、その効果は十分なものではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Eur. J. Pharmacol. 671(2011)128-132
【非特許文献２】Food Chemistry 133 (2012) 76-81
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決すべき課題は、これまで抗アレルギー作用を有することが知られていなかった化合物を有効成分とする、新規抗アレルギー剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かかる状況の下、本発明者は、鋭意研究した結果、下記式で示されるカルコン骨格のうち：【０００７】
【化１】
2016159280.tif 000003
【０００８】
上記式におけるｂのベンゼン環のオルト位にアセチルアミノエチル基を有し、当該ｂのベンゼン環にさらにアルコキシ基を有する構造を有する化合物がＴＳＬＰ産生阻害効果を有することを見出した。本発明は、かかる新規の知見に基づくものである。【０００９】
従って、本発明は以下の項を提供する：
項１．下記式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含む、抗アレルギー剤：【００１０】
【化２】
2016159280.tif 000004
【００１１】
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基を示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは１〜３の整数を示す。］
項２．ｍが１〜２の整数を示す、項１に記載の抗アレルギー剤。【００１２】
項３．ｎが２である、項１又は２に記載の抗アレルギー剤。【００１３】
項４．対象疾患がアトピー性皮膚炎、アレルギー性気管支ぜんそく及びアレルギー性鼻炎からなる群より選択される少なくとも一種である、項１〜３のいずれか一項に記載の抗アレルギー剤。【００１４】
項５．哺乳動物に対して下記式（Ｉ）【００１５】
【化３】
2016159280.tif 000005
【００１６】
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基を示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは１〜３の整数を示す。］
で表わされる化合物又はその塩を投与する工程を含む、アレルギー性疾患の治療方法。【００１７】
項６．抗アレルギー剤を製造するための下記式（Ｉ）【００１８】
【化４】
2016159280.tif 000006
【００１９】
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基を示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは１〜３の整数を示す。］
で表される化合物又はその塩の使用。【００２０】
項７．アレルギー性疾患の治療に使用するための下記式（Ｉ）【００２１】
【化５】
2016159280.tif 000007
【００２２】
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基を示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは１〜３の整数を示す。］
で表される化合物又はその塩。【００２３】
項８．ｍが１〜２の整数を示す、項５〜７のいずれか一項に記載の方法、使用又は化合物もしくはその塩。【００２４】
項９．ｎが２である、項５〜８のいずれか一項に記載の方法、使用又は化合物もしくはその塩。【００２５】
項１０．対象疾患がアトピー性皮膚炎、アレルギー性気管支ぜんそく及びアレルギー性鼻炎からなる群より選択される少なくとも一種である、項５〜９のいずれか一項に記載の方法、使用又は化合物もしくはその塩。  尚、本明細書において、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物を単に化合物（Ｉ）と示すこともある。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の有効成分である化合物（Ｉ）又はその塩は、TSLPの産生抑制効果を有する。従って、本発明は、TSLPの産生抑制によりアレルギー症状を治療する新規の抗アレルギー剤を提供する。また、本発明の有効成分である化合物（Ｉ）又はその塩は、これまでTSLPの産生に寄与することが知られているNFκBおよびAP-1による転写活性は抑制せず、新たな作用機構を有していることが予想される。さらに、本発明の有効成分である化合物（Ｉ）又はその塩は、これまでに報告されている化合物より低濃度でTSLP産生を抑制する点でも有効である。また、TSLPの産生細胞は主として上皮細胞である。従って、TSLP以外の因子を標的とする抗アレルギー剤と異なり、本発明の抗アレルギー剤は、外用剤として有効であること、また作用点からこれまでの抗炎症、抗免疫薬と異なり、易感染は誘発しないことが期待される。また、ステロイド系抗炎症薬のなかには、過剰な免疫抑制作用による感染症等の副作用を生じるものもある。しかし、本発明の有効成分である化合物（Ｉ）又はその塩はＴＳＬＰに対する特異性が高く、かつ抗炎症性作用が低いため、過剰な免疫抑制作用が発現することによる感染症等の副作用が生じ難い。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１で得られたＴＳＬＰ  mＲＮＡ発現量を示す
【図２】実施例２の試験結果を示す
【図３】実施例３の試験結果を示す
【図４】実施例４の試験結果を示す
【図５】実施例５で用いた化合物の構造及び試験結果を示す
【図６】実施例５で用いた化合物の構造及び試験結果を示す
【図７】実施例５で用いた化合物の構造及び試験結果を示す
【図８】実施例６で測定した16D10の各種キナーゼに対する阻害率を示す
【図９】実施例７の試験結果を示す
【図１０】実施例８の試験結果
【図１１】実施例９の試験結果
【図１２】実施例１０で用いた化合物の構造及びＩＣ５０を示す
【図１３】実施例１１の試験結果を示す
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、下記式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含む、抗アレルギー剤を提供する：
【００２９】
【化６】
2016159280.tif 000008
【００３０】
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基を示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは１〜３の整数を示す。］。
【００３１】
一般式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２により表わされる、炭素数１〜３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基及びイソプロピル基が挙げられる。当該炭素数１〜３のアルキル基のうち、炭素数１〜２のアルキル基が好ましく、メチル基がより好ましい。本発明において、Ｒ１及びＲ２は同一でも異なってもよい。また、ｍが２以上の場合、複数のＲ１は同一でも異なっていてもよい。同様に、ｎが２以上の場合、複数のＲ２は同一でも異なっていてもよい。
【００３２】
一般式（Ｉ）において、ｍは０〜３の整数を示し、好ましくは１〜２の整数を示す。ｍが２以上の場合、複数のＯＲ１は、ベンゼン環を構成する炭素原子のうち隣り合う炭素原子に結合しないこと、言い換えると、ベンゼン環を構成する炭素原子のうち１個以上の炭素原子を隔てた炭素原子に結合することが好ましい。具体的には、例えば、ｍが２の場合、
【００３３】
【化７】
2016159280.tif 000009
【００３４】
よりも、
【００３５】
【化８】
2016159280.tif 000010
【００３６】
等の方が好ましい。
【００３７】
一般式（Ｉ）において、ｎは１〜３の整数を示し、好ましくは２である。ｎが２以上の場合、複数のＯＲ２は、ベンゼン環を構成する炭素原子のうち隣り合う炭素原子に結合しても、ベンゼン環を構成する炭素原子のうち１個以上の炭素原子を隔てた複数の炭素原子に結合してもよい。
【００３８】
本発明の有効成分である、化合物（Ｉ）は、自体公知であるか、公知の方法に準じて製造することができる。例えば、後述する実施例で用いた化合物16D10（(E)-N-[2-[2-[3-(2,5-ジメトキシフェニル)-1-オキソ-2-プロペン-1-イル]-4,5-ジメトキシフェニル]エチル]アセトアミド（(E)-N-[2-[2-[3-(2,5-dimethoxyphenyl)-1-oxo-2-propen-1-yl]-4,5-dimethoxyphenyl]ethyl]acetamide））は、CAS NO.858744-44-2で登録された公知化合物である。
【００３９】
本発明の抗アレルギー剤の対象疾患となるアレルギー性疾患としては、アトピー性皮膚炎、アレルギー性気管支ぜんそく、アレルギー性鼻炎等が挙げられ、アトピー性皮膚炎の治療薬として用いることが好ましい。
【００４０】
本発明の有効成分である化合物の塩は、酸付加塩と塩基との塩を包含する。酸付加塩の具体例として、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩等の有機酸塩、及びグルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等の酸性アミノ酸塩が挙げられる。塩基との塩の具体例としては、ナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩のようなアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩、ピリジン塩、トリエチルアミン塩のような有機塩基との塩、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。
【００４１】
本発明の有効成分である化合物（Ｉ）及びその塩は、水和物又は溶媒和物の形で存在することもあるので、これらの水和物及び溶媒和物もまた本発明の有効成分である化合物に包含される。また、化合物（Ｉ）は、２つのベンゼン環をつなぐ２価の基−ＣＨ＝ＣＨ−（Ｃ＝Ｏ）−のなかに炭素炭素二重結合を有するため、幾何異性を生じることがある。特に明記しない限り、これら幾何異性体は本発明の有効成分である化合物（Ｉ）に包含される（ただし、（Ｅ）体（トランス型）が好ましい）。
【００４２】
溶媒和物を形成する溶媒としては、水、エタノール、プロパノール等のアルコール、酢酸等の有機酸、酢酸エチル等のエステル類、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等のエーテル類、アセトン等のケトン類、ＤＭＳＯ等が例示される。
【００４３】
本発明においては、本発明の有効成分である化合物（Ｉ）又はその塩そのものを抗アレルギー剤として用いても、薬学的に許容される各種担体（例えば、例えば等張化剤、キレート剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、抗酸化剤、溶解補助剤、粘稠化剤等）と組み合わせた医薬組成物として用いてもよい。
【００４４】
等張化剤としては、例えば、グルコース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マンニトール、キシリトール、ソルビトール等の糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等の多価アルコール類、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等の無機塩類等が挙げられる。
【００４５】
キレート剤としては、例えば、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸四ナトリウム、エデト酸カルシウム等のエデト酸塩類、エチレンジアミン四酢酸塩、ニトリロ三酢酸又はその塩、ヘキサメタリン酸ソーダ、クエン酸等が挙げられる。
【００４６】
安定化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等が挙げられる。
【００４７】
ｐＨ調節剤としては、例えば、塩酸、炭酸、酢酸、クエン酸等の酸が挙げられ、さらに水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩又は炭酸水素塩、酢酸ナトリウム等のアルカリ金属酢酸塩、クエン酸ナトリウム等のアルカリ金属クエン酸塩、トロメタモール等の塩基等が挙げられる。
【００４８】
防腐剤としては、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル、グルコン酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム等の第４級アンモニウム塩、アルキルポリアミノエチルグリシン、クロロブタノール、ポリクォード、ポリヘキサメチレンビグアニド、クロルヘキシジン等が挙げられる。
【００４９】
抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、乾燥亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、濃縮混合トコフェロール等が挙げられる。
【００５０】
溶解補助剤としては、例えば、安息香酸ナトリウム、グリセリン、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、プロピレングリコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、Ｄ−マンニトール等が挙げられ、
粘稠化剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロースナトリウム、キサンタンガム、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
【００５１】
また、上記医薬組成物は、化合物（Ｉ）又はその塩以外に、抗アレルギー作用を有することが知られている化合物をさらに含んでいてもよい。
【００５２】
医薬組成物の実施形態において、組成物中の化合物（Ｉ）又はその塩の含有量は特に限定されず、化合物（Ｉ）の含有量換算で、例えば、９０質量％以上、７０質量％以上、５０質量％以上、３０質量％以上、１０質量％以上、５質量％以上、１質量％以上等の条件から適宜設定できる。
【００５３】
製剤形態は、特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等の経口投与剤； 注射剤（静脈注射、筋肉注射、局所注射等）、含嗽剤、点滴剤、外用剤（軟膏、クリーム、貼付薬、吸入薬）、座剤等の非経口投与剤等の各種製剤形態を挙げることができる。上記製剤形態のうち、好ましいものとしては、例えば、外用剤（軟膏、クリーム、貼付薬、吸入薬）等が挙げられる。本発明の有効成分である化合物（Ｉ）又はその塩は、TSLPの産生抑制効果を有する。本発明の有効成分である化合物（Ｉ）又はその塩は、リンパ球を標的とするのではなく、上皮細胞が産生するＴＳＬＰを標的とするため、外用剤として用いることにより抗アレルギー効果をもたらすことが期待できる。
【００５４】
製剤中の本発明の化合物（Ｉ）の含有量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状等によって異なり一概に規定できないが、化合物（Ｉ）の１日投与量が通常10〜5000mg程度、より好ましくは100〜1000mg程度になる量とすればよい。１日１回投与する場合は、1製剤中にこの量が含まれていればよく、１日３回投与する場合は、１製剤中にこの3分の１量が含まれていればよい。
【００５５】
本発明の抗アレルギー剤は、哺乳動物等の患者に投与される。哺乳動物としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。
【００５６】
本発明の抗アレルギー剤は、ＴＳＬＰの産生抑制によりアレルギー症状を緩和する。従って、本発明は、化合物（Ｉ）又はその塩を含むＴＳＬＰ産生抑制剤も提供する。ＴＳＬＰ産生抑制剤の有効成分、製剤形態、投与量等は、抗アレルギー剤と同様である。
【００５７】
以下に、以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００５８】
実施例１  16D10はヒトケラチノサイトにおいてもTSLPの産生を抑制する
HaCaT細胞を10%FBS含有ダルベッコMEMに懸濁して、細胞数を1.0×105cells/mLとなるように懸濁し、12-well plate(Falcon（登録商標）)の各wellに1000μlずつ播種し、37℃、飽湿、5% CO2存在下で細胞がwellを8-9割占めるまで培養した。培養液をのぞき、37℃に温めたPBSで1回washした後、16D10 10μMあるいは各種刺激薬[Poly(I:C)(50μg/ml)(A), TNF-α (100 ng/ml)(B)およびTNF-α (100 ng/ml)+IL-4 (10 ng/ml) (C)]を含む10% FBS-DMEM 1mlを加え、さらに37℃、飽湿、5%CO2存在下4時間培養した。各群のDMSOの最終濃度は0.1%とした。【００５９】
培養後、培養液をのぞき、PBSで２回洗浄後、RNAiso Plusを用いてtotal RNAを抽出した。PrimeScript（登録商標） RT Master Mix (Perfect Real Time)を用いて付属のプロトコールに準じて逆転写反応を行った。Real-time PCR反応は、SYBR（登録商標） Premix EX TaqTM II (Tli RNaseH Plus)を用いて付属のプロトコールに準じて行った。なお、以下のプライマーを用いた。Human TSLP (long) Forward: 5’-GAT TAC ATA TAT GAG TGG GAC-3’   Reverse: 5’-TTC ATT GCC TGA GTA GCA T-3’, GAPDH Forward: 5’-TGT GTC CGT CGT GGA TCT GA-3’, Reverse: 5’-TTG CTG TTG AAG TCG CAG GAG-3’, 18S rRNA forward: 5′-TTGACGGAAGGGCACCACCAG-3′、 Reverse: 5′-GCACCACCACCCACGGAATCG-3′。各サンプルの threshold cycle(Ct)値は2nd derivative maximum法により算出し、相対的検量線を作成して各遺伝子のPCR反応条件は増幅効率が100％に近いことを確認した後、Ct法によりRNA相対量に換算した。結果を図１に示す。16D10はヒトケラチノサイト細胞株で、poly(I:C), TNF-α,およびTNF-α+IL-4刺激によるTSLP mRNAの発現をいづれも抑制した。【００６０】
実施例２  マウスケラチノサイトPAM212細胞において、TNF-α刺激によるTSLP産生を抑制する
マウスケラチノサイト細胞株PAM212を10%FBS含有ダルベッコMEMに懸濁して、細胞数を1.0×105cells/mLとなるように懸濁し、12-well plate (Falcon（登録商標）)の各wellに1000μlずつ播種し、37℃、飽湿、5% CO2存在下で細胞がwellを8-9割占めるまで培養した。培養液をのぞき、37℃に温めたPBSで1回washした後、16D10 （1, 3 および10μM）あるいはTNF-α（30 ng/ml）を含む10% FBS-DMEM 1mlを加え、さらに37℃、飽湿、5%CO2存在下48時間培養した。各群のDMSOの最終濃度は0.1%とした。【００６１】
培養後、培養液中のTSLPをEILSAにより測定した。結果を図２にしめす。【００６２】
16D10はTNF-αによるTSLP産生を濃度依存的に抑制した。【００６３】
実施例３  16D10はマウスin vivoにおいてもTSLP産生を抑制する
Balb/cマウス(6週令、雄、SLC)の背部皮下に 500μlの空気を注入して空気嚢を形成した(day 1)。さらに、day2、day5、day7において空気嚢内に空気を500μlずつ注入した。その24時間後、高圧蒸気滅菌した2%(w/v) CMC-Na生理食塩水溶液に、LPSを10ng/mlとなるように溶解し、さらにpenicillin G potassiumとstreptomycin sulfateをそれぞれ0.1mg/mlとなるように溶解した溶液300μlを空気嚢内に注入し炎症を誘発した。
16D10およびデキサメサゾン(0.5μg/ml)はDMSOに溶解した後、LPS含有CMC-Na生理食塩水の中にDMSOが0.5%(v/v)となるように混合し、よく撹拌した後に空気嚢内に投与した。【００６４】
空気嚢内に溶液を投与して8時間後に、マウスを麻酔下、頸動脈切断により脱血死させた。空気嚢内に生理食塩水を300μl注入し、空気嚢内液を混合した後、空気嚢内液を回収してその重量を測定した。浸潤白血球数は回収した空気嚢内液を適宜生理食塩水で希釈後、血球計算盤を用いて算定した。残りの空気嚢内液は4℃、10分間、1490×gで遠心して上清を回収し、TSLP濃度はMouse TSLP DuoSet（登録商標） ELISA (R&D Systems)を用いて付属のプロトコールに準じて行った。結果を図３（図３左、浸潤白血球数、図３右、TSLP濃度）に示す。図３右から明らかなように、16D10は、TSLP産生を有意に抑制した。一方、図３左から明らかなように16D10は、浸潤白血球を減少させず、炎症抑制作用を示さなかった。【００６５】
実施例４  16D10はマウスにおいてIgEの産生を抑制する
ICRマウス(6週令、雄、SLC)の背部皮下に 500μlの空気を注入して空気嚢を形成した(day 1)。さらに、day2、day5、day7において空気嚢内に空気を500μlずつ注入した。その24時間後、高圧蒸気滅菌した2%(w/v) CMC-Na生理食塩水溶液に、ovalbumin (OVA) を100μg/0.3 mlとなるように溶解し、さらにpenicillin G potassiumとstreptomycin sulfateをそれぞれ0.1mg/mlとなるように溶解した溶液300μlを空気嚢内に注入し炎症を誘発した。16D10はDMSOに溶解した後、OVA含有CMC-Na生理食塩水の中にDMSOが0.5%(v/v)となるように混合し、よく撹拌した後に空気嚢内に投与した。【００６６】
空気嚢内に溶液を投与して8時間後に、マウスを麻酔下、頸動脈切断により脱血死させた。空気嚢内に生理食塩水を300μl注入し、空気嚢内液を混合した後、空気嚢内液を回収してその重量を測定した。TSLP濃度はMouse TSLP DuoSet（登録商標） ELISA (R&D Systems)を用いて付属のプロトコールに準じて行った。空気嚢内に溶液を投与して１４日後に、血液を採取し、血清中のOVA特異的IgE量をELISA キット（Anti-ovalbumin IgE (mouse) EIA kit (Cayman 500840)により測定した。【００６７】
結果を図４に示す。図４右から明らかなように、16D10は、OVAによるTSLP産生を有意に抑制した。また図４左OVA投与によるOVA特異的IgEの産生を抑制した。【００６８】
実施例５  構造活性相関
KCMH-1細胞（ J. Immunol. Methods 402: 9-14 (2013)）を10% FBS含有MEM-αに懸濁して1.0×105cells/mLとなるように懸濁した。これを24-well plate(Falcon（登録商標）)の各wellに500μl播種し、37℃、飽湿、5%CO2存在下で細胞がwellを8-9割占めるまで培養した。【００６９】
37℃に温めたPBSで1回washした後、各種濃度の薬物を含む10% FBS含有MEMαで24時間培養した。培養上清を回収し、Mouse TSLP DuoSet（登録商標） ELISA (R&D Systems)を用いてTSLP量を測定した。【００７０】
細胞の培養上清を回収した後、0.5% MTT をメディウムで10倍希釈してwellに加え、37℃、飽湿、5% CO2存在下で1-4時間培養した。その後、培養上清を取り除き、等量のDMSOを加えて細胞内のformazanを溶解した。溶解液の570nmにおける吸光度をmicroplate reader (iMarkTN, Bio-Rad)を用いて測定し、細胞のviabilityを算出した。結果を図５、図６及び図７に示す。図５及び図７に示すように、16D10は、(E)-3-(2,5-ジメトキシフェニル)-1-(3,4-ジメトキシフェニル)プロプ-2-エン-1-オン、2,5-ジメトキシシンナミン酸、N-(3,4-ジメトキシフェネチル)アセトアミド及びカルコンと比較して、非常に高いTSLP産生抑制能を示した。一方、図６に示すように、これらの化合物のviabilityには有意な差がなかった。【００７１】
実施例６  16D10は各種キナーゼを抑制しない
カルナバイオサイエンス株式会社に委託し、カルナバイオサイエンス株式会社社ホームページ（http://www.carnabio.com/output/pdf/ProfilingProfilingBook_ja.pdf）に記載のOff-chip Mobility Shift Assay (MSA)法で、試験化合物16D10  10μMでの各キナーゼ活性に対する効果を測定した。具体的には以下の方法で行った。【００７２】
試験化合物
試験化合物を、ＤＭＳＯに溶解、希釈して、１００倍濃度とする。そして、当該溶液をアッセイバッファーで２５倍に希釈して、試験化合物溶液とする。コントロールも同様に調製する。【００７３】
アッセイ試薬及び手順
Off-chip Mobility Shift Assay (MSA)
（１）5 mLの4倍化合物溶液、5 mLの４倍Substrate/ATP/Metal溶液、及び10 mLの２倍キナーゼ（kinase）溶液をアッセイバッファ (20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 2 mM DTT, pH7.5)で調製し、これらを混合し、ポリプロピレン３８４ウェル中で室温で１又は５時間※インキュベートする（※キナーゼにより反応時間を設定する）；
（２）70 mLのターミネーションバッファ(QuickScout Screening Assist MSA; Carna Biosciences)をウェルに添加する；
（３）反応混合物をLabChipTM system (PerkinElmer)にアプライし、生成物及び基質ペプチドのピークを分離し定量する。
（４）キナーゼ反応を、生成物（Ｐ）及び基質（Ｓ）ペプチドのピーク高さから算出されるproduct ratio(P/(P+S))により評価する
反応条件は表１および表２の通り。結果を図８にしめす。16D10は解析した各キナーゼの活性を抑制しなかった。【００７４】
【表１】
2016159280.tif 000011
【００７５】
【表２】
2016159280.tif 000012
【００７６】
実施例７  16D10はヒトケラチノサイトにおいてNFκBを抑制しない
Path Detect pNF-κB-Luc Plasmid (Stratagane)のトランスフェクションは、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent を用いて付属のプロトコールに準じて行った。12-well plate (Falcon（登録商標）)にヒトケラチノサイトHaCaT細胞を0.65×105cells/mlで播種し、24時間培養した。２日後、まず15-25℃のOpti-MEM 50μlに対し、500ng/μlのレポータープラスミド溶液と100ng/μlのpGL4.74[hRluc/TK] Vector溶液を1μlずつ加えた。次に1.5μlのX-tremeGENE HP DNA Transfection Reagentを加え、軽く転倒混和した後、室温で15分間静置しtransfection complexを形成した。さらに、24時間培養した細胞から培養上清を除き、PBSでwashした後、10% FBS含有MEMαを各wellに950μl加えた。先ほど調製したtransfection complex溶液を50μl滴下し、穏やかにplateを揺らした後、37℃、飽湿、5% CO2 存在下で24時間培養した。【００７７】
その後、TNF-α(100 ng/ml)および薬物(16D10, 10あるいは100μM, [5-(p-Fluorophennyl)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide(TPCA-1); IKK阻害剤)を含む10%FBS含有MEMを１ml加え、さらに2時間培養した。その後、細胞の培養上清を除き、PBSで2回washした。その後、1×Passive lysis Bufferを100μl加えて接着している細胞を剥がし、ピペッティング後、全量をサンプルとして1.5mlチューブに回収した。これを-80℃で保存し、一度凍結融解してから測定に用いた。【００７８】
ルシフェラーゼ活性の測定は、Dual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay Systemを用いて付属のプロトコールに準じて行った。測定用チューブにLuciferase assay reagent IIを50μlずつ分注し、上記方法で得られた細胞溶解サンプルを10μl加えてピペッティングし、直ちにAB-2200-R Luminescencer PSN (アトー株式会社)で10秒間のFirefly luciferase 発光積分値を計算した。その後、Stop&Glo reagent を50μl加え軽く混合したあと、10秒間のRenilla luciferase発光積分値を測定した。結果を図９に示す。NF-κBの活性化を抑制するIKK阻害薬TPCA-１はNF-κB転写活性を抑制したが、16D10は抑制しなかった。【００７９】
実施例８  16D10はヒトケラチンサイトにおいてNF-κBの活性化シグナル、STAT6のチロシンリン酸化を抑制しない
HaCaT細胞 0.25 x 105cells/mlで12 well plate の各ウェルに播種し、37℃、飽湿、5% CO2存在下で２日間培養した。培養液をのぞき、PBSで１回洗浄後、16D10 (100 μM) あるいはTNF-α(100 ng/ml)+IL-4 (10 ng/ml)を含む10% FBS-DMEM1 mlをくわえ、さらに 37℃、飽湿、5% CO2存在下10分間培養した。PBSで２回細胞を洗浄後、100 μlのlysis bufferで細胞を溶解し、Phospho-IKKα/β(Cell signaling, #2697)、IKKα/β (SantaCruz, sc-7607)、IκBα：（Cell signaling, #9242）、Phospho-Stat6（Cell signaling, #9361）およびα-tubulin (SantaCruz, sc-5286) 抗体を用いてウェスタンブロットを行った。２次抗体としてhorsradish peroxidase 標識を用い、目的タンパク質の検出は、Western Lightning（登録商標） Plus-ECLを基質として生成する化学発光をライトキャプチャーAE-6960型 (アトー株式会社) で検出した。【００８０】
結果を図１０に示す。TNF-α＋IL-4刺激で誘導されるIKKのリン酸化の増加、NF-κBの抑制タンパクIκBの減少はIKK阻害薬TPCAで抑制されたが16D10は抑制されなかった。また刺激によるSTAT6のリン酸化の増加に対しても 16D10は抑制しなかった。【００８１】
実施例９    16D10はマウスケラチノサイトにおいてもNFκBを抑制せずに、TSLP産生を抑制する
Path Detect pNF-κB-Luc Plasmid (Stratagane)のトランスフェクションは、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent を用いて付属のプロトコールに準じて行った。12-well plate (Falcon（登録商標）)にマウスケラチノサイトKCMH-1細胞を1×105cells/mlで播種し、24時間培養した。次の日、まず15-25℃のOpti-MEM 50μlに対し、500ng/μlのレポータープラスミド溶液と100ng/μlのpGL4.74[hRluc/TK] Vector溶液を1μlずつ加えた。次に1.5μlのX-tremeGENE HP DNA Transfection Reagentを加え、軽く転倒混和した後、室温で15分間静置しtransfection complexを形成した。さらに、24時間培養した細胞から培養上清を除き、PBSでwashした後、10% FBS含有MEMαを各wellに950μl加えた。先ほど調製したtransfection complex溶液を50μl滴下し、穏やかにplateを揺らした後、37℃、飽湿、5% CO2 存在下で24時間培養した。細胞の培養上清を除き、薬物(16D10, 10μM, [5-(p-Fluorophennyl)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide(TPCA-1); IKK阻害剤)を含む10%FBS含有MEMを１ml加え、さらに24時間培養した。その後、細胞の培養上清を除き、PBSで2回washした。その後、1×Passive lysis Bufferを100μl加えて接着している細胞を剥がし、ピペッティング後、全量をサンプルとして1.5mlチューブに回収した。これを-80℃で保存し、一度凍結融解してから測定に用いた。【００８２】
ルシフェラーゼ活性の測定は、Dual-Luciferase（登録商標） Reporter Assay Systemを用いて付属のプロトコールに準じて行った。測定用チューブにLuciferase assay reagent IIを50μlずつ分注し、上記方法で得られた細胞溶解サンプルを10μl加えてピペッティングし、直ちにAB-2200-R Luminescencer PSN (アトー株式会社)で10秒間のFirefly luciferase 発光積分値を計算した。その後、Stop&Glo reagent を50μl加え軽く混合したあと、10秒間のRenilla luciferase発光積分値を測定した。結果を図１１に示す。マウスのケラチノサイト細胞株でも、16D10はNF-κBの転写活性を抑制せずに、TSLP産生を抑制した。【００８３】
実施例１０  メトキシ基の位置の検討
実施例３と同様にして、図８に示す構造の化合物16D06（N-(2-{2-[(2E)-3-(2 -メトキシフェニル)プロプ-2-エノイル]-4,5-ジメトキシフェニル}エチル)アセトアミド（N-(2-{2-[(2E)-3-(2 -methoxyphenyl)prop-2-enoyl]-4,5-dimethoxyphenyl}ethyl)acetamide））、16F06（N-(2-{2-[(2E)-3-(3 -メトキシフェニル)プロプ-2-エノイル]-4,5-ジメトキシフェニル}エチル)アセトアミド（N-(2-{2-[(2E)-3-(3 -methoxyphenyl)prop-2-enoyl]-4,5-dimethoxyphenyl}ethyl)acetamide））、16C06（N-(2-{2-[(2E)-3-(2,4-ジメトキシフェニル)プロプ-2-エノイル]-4,5-ジメトキシフェニル}エチル)アセトアミド（N-(2-{2-[(2E)-3-(2,4-dimethoxyphenyl)prop-2-enoyl]-4,5-dimethoxyphenyl}ethyl)acetamide））、16E06（N-(2-{2-[(2E)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)プロプ-2-エノイル]-4,5-ジメトキシフェニル}エチル)アセトアミド （N-(2-{2-[(2E)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)prop-2-enoyl]-4,5-dimethoxyphenyl} ethyl)acetamide））及び16B06（N-(2-{2-[(2E)-3-(2,3-ジメトキシフェニル)プロプ-2-エノイル]-4,5-ジメトキシフェニル}エチル)アセトアミド（N-(2-{2-[(2E)  -3-(2,3-dimethoxyphenyl)prop-2-enoyl]-4,5-dimethoxyphenyl}ethyl)acetamide））を用いて、TSLP量を測定した。そして、TSLP量が１／２となる化合物濃度（ＩＣ５０）を算出した。結果を16D10のものと併せて図１２に示す。図１２に示されるように、16D10、16D06、16F06、16C06、16E06及び16B06はいずれも高いTSLP産生抑制効果を示した。また、これらの中でも特に16D10、16D06、16F06、16C06は高いTSLP産生抑制効果を示した。【００８４】
実施例１１
化合物16C06について、実施例３と同様に、TSLP量の測定及び上述のMTT assayによるviabilityの測定を行った。結果を図１３に示す。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
アレルギー性疾患はその患者数が年々増加しており、その治療法が切望されている。本発明は、これまで抗アレルギー作用を有することが知られていなかった化合物を有効成分とする、新規抗アレルギー剤を提供する。また、本発明の抗アレルギー剤は公知の抗アレルギー剤と異なる作用機序を有しているものと予想される。従って、本発明は、新規抗アレルギー剤を提供するものとして非常に有用である。
【図１】
2016159280.tif 000016
【図２】
2016159280.tif 000017
【図３】
2016159280.tif 000018
【図４】
2016159280.tif 000019
【図５】
2016159280.tif 000020
【図６】
2016159280.tif 000021
【図７】
2016159280.tif 000022
【図８】
2016159280.tif 000023
【図９】
2016159280.tif 000024
【図１０】
2016159280.tif 000025
【図１１】
2016159280.tif 000026
【図１２】
2016159280.tif 000027
【図１３】
2016159280.tif 000028
【配列表】
2016159280000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年8月22日(2016.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表わされる化合物又はその塩を含む、抗アレルギー剤：
【化１】
2016159280.tif 000029
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基を示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは１〜３の整数を示す。］
【請求項２】
ｍが１〜２の整数を示す、請求項１に記載の抗アレルギー剤。
【請求項３】
ｎが２である、請求項１又は２に記載の抗アレルギー剤。
【請求項４】
対象疾患がアトピー性皮膚炎、アレルギー性気管支ぜんそく及びアレルギー性鼻炎からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗アレルギー剤。
【請求項５】
哺乳動物に対して下記式（Ｉ）
【化２】
2016159280.tif 000030
［式中、Ｒ１及びＲ２は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基を示す。ｍは０〜３の整数を示す。ｎは１〜３の整数を示す。］
で表わされる化合物又はその塩を投与する工程を含む、アレルギー性疾患の治療方法。
【請求項６】
ｍが１〜２の整数を示し、ｍが２の場合、
基
【化３】
2016159280.tif 000031
が
【化４】
2016159280.tif 000032
［式中、Ｒ１は、同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基を示す。］
のいずれかを示す、請求項１に記載の抗アレルギー剤。
【請求項７】
式（Ｉ）で表わされる化合物がＮ−（２−（２，３，４’，５’−テトラメトキシカルコン−２−イル）−エチル）アセトアミドである抗アレルギー剤を除く、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗アレルギー剤。
【国際調査報告】
2016159280.tif 000033
2016159280.tif 000034
2016159280.tif 000035
2016159280.tif 000036