(57)【要約】  本発明は、基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、前記孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される生体分子を捕捉する生体分子捕捉体を前記基板内部に備えた生体分子捕捉領域とを備えた二次元アレイと；前記基板の一面に対し面に平行な第１の方向から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流す流路と；前記一細胞捕捉孔のそれぞれの前記第１の方向の下流側の面上であって、前記第１の方向と対面するように設けられた構造体と；前記第一の流れを印加する第一の印加手段、及び第一の制御手段と；前記一細胞捕捉孔側から前記生体分子捕捉領域へ向かって前記基板の一面に対し面に垂直な第二の流れを印加する第二の印加手段、及び第二の制御手段とを有し、前記第一及び第二の制御手段は、細胞捕捉時には第二の流れの流量よりも第一の流れの流量が大きくなるように制御し、生体分子捕捉時には第一の流れの流量よりも第二の流れの流量が大きくなるように制御することを特徴とする一細胞内生体分子捕捉用システムを提供する。
2017168493.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一細胞内生体分子捕捉用デバイスであって、
基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、前記孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される生体分子を捕捉する生体分子捕捉体を前記基板内部に備えた生体分子捕捉領域とを備えた二次元アレイと、
前記基板の一面に対し面に平行な第１の方向から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流す流路と、
前記一細胞捕捉孔のそれぞれの前記第１の方向の下流側の面上であって、前記第１の方向と対面するように設けられた構造体と
を有することを特徴とする一細胞内生体分子捕捉用デバイス。
【請求項２】
前記構造体の高さ及び幅がそれぞれ２０μｍ以下である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記生体分子が核酸である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記生体分子捕捉体が、前記生体分子と特異的に結合するプローブを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記生体分子捕捉体が磁性ビーズである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
一細胞内生体分子捕捉用システムであって、
基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、前記孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される生体分子を捕捉する生体分子捕捉体を前記基板内部に備えた生体分子捕捉領域とを備えた二次元アレイと、
前記基板の一面に対し面に平行な第１の方向から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流す流路と、
前記一細胞捕捉孔のそれぞれの前記第１の方向の下流側の面上であって、前記第１の方向と対面するように設けられた構造体と、
前記第一の流れを印加する第一の印加手段、及び第一の制御手段と、
前記一細胞捕捉孔側から前記生体分子捕捉領域へ向かって前記基板の一面に対し面に垂直な第二の流れを印加する第二の印加手段、及び第二の制御手段と
を有し、
前記第一及び第二の制御手段は、細胞捕捉時には第二の流れの流量よりも第一の流れの流量が大きくなるように制御し、生体分子捕捉時には第一の流れの流量よりも第二の流れの流量が大きくなるように制御することを特徴とする一細胞内生体分子捕捉用システム。
【請求項７】
前記構造体の高さ及び幅がそれぞれ２０μｍ以下である、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
第一の流れによって第１の方向の下流側に排出された前記複数の細胞を再び前記複数の細胞を含むサンプルを流す流路に戻す手段をさらに有する、請求項６に記載のシステム。
【請求項９】
複数の細胞を含むサンプルから各一細胞内の生体分子を捕捉する方法であって、
請求項１に記載のデバイス又は請求項６に記載のシステムを準備する工程、
前記デバイス又はシステムの流路から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流し、二次元アレイの基板の一面に対し平行な流れを発生させ、前記二次元アレイ上の一細胞捕捉孔に細胞を捕捉する工程、
前記基板の一面に対し平行な流れを発生させ、前記二次元アレイ上を洗浄する工程、
前記基板の一面に対し垂直な流れを発生させ、前記捕捉された細胞を溶解し、生体分子を二次元アレイの生体分子捕捉体に捕捉する工程
を含むことを特徴とする一細胞内生体分子捕捉方法。
【請求項１０】
前記生体分子が核酸である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現解析、細胞機能解析、生体組織の解析方法及び病気の診断、創薬などの分野に関するものである。詳しくは、一細胞レベルで生体分子（例えばｍＲＮＡ）を捕捉するためのデバイス、システム及び方法、並びに一細胞レベルで生体分子を解析するためのシステム及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、多数の細胞から構成される生体組織のゲノム解析や遺伝子発現解析、タンパク解析を行う際に、一細胞レベルでのゲノムや遺伝子発現、タンパク質の違いに注目した解析の重要性が認識され始めている。従来の解析では、生体組織からサンプリングした多数の細胞から、生体分子であるＤＮＡやＲＮＡ、あるいはタンパク質を抽出して解析を行うため、サンプル中の平均的な解析を行っていた。そのため、ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質の個々の細胞中の存在量が平均値から乖離していたとしても、評価することが困難であった。単一細胞解析はこのような平均化の問題を解決する解析方法として重要である。【０００３】
単一細胞解析は、単一細胞毎の細胞中の生体分子を高精度に検出又は定量する技術である。単一細胞解析、特に生体分子としてｍＲＮＡ解析を行うためには、細胞を個別処理するために単離し、細胞中の計測対象となるｍＲＮＡを効率良く抽出し、ｃＤＮＡを合成(逆転写)し、必要に応じてＰＣＲ増幅して得られた産物を配列解析する必要がある。【０００４】
単一細胞解析では、一細胞中に含まれる生体分子（特にｍＲＮＡ）は極微量であるため、効率の良い生体分子の捕捉方法が求められる。また、個々の細胞の遺伝子発現量は時間的・空間的にランダムに変動しているので、統計的に生物学的・医学的指標を最終データとして抽出するために、個々の細胞を多数計測する必要がある。さらに、解析に使用する試薬は、酵素など高価なものが多いため、使用試薬量を低減して、解析コストを低減する必要がある。【０００５】
特許文献１には、前記課題を解決する手段として、個々の細胞を捕捉するための細胞捕捉部と、その下部に配置された核酸を捕捉するためのＤＮＡが固定されたビーズ若しくは多孔質膜で形成された核酸捕捉部と、前記２種の捕捉部を繋げる流路を備え、細胞捕捉部と流路と核酸捕捉部が上下方向に対を成し、この対が２次元的に複数配置された一細胞解析用のデバイスが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１４／１４１３８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一細胞レベルでのＤＮＡ配列解析や遺伝子発現解析を同時に多数の細胞に対して低コストに行うためには、特許文献１で示す多孔質膜や２次元的に配置したビーズを備えたデバイスを使うことが有効である。特許文献１記載のデバイスでは、デバイス下部から吸引による負圧を生じさせる。デバイス上部に細胞を含んだ細胞懸濁液を導入し、デバイスの上から下方向に細胞懸濁液を流す。この流れにより、個々の細胞は、細胞捕捉部に捕捉される。細胞捕捉部は細胞の直径（およそ１０μｍ程度）よりも小さい（数μｍ程度）ため、細胞が捕捉されると、細胞捕捉部を前記細胞が栓をする形で細胞懸濁液の流れを止め、前記細胞捕捉部に細胞がそれ以上捕捉されないよう設計されている。次いで、細胞膜破壊液をデバイス上部に導入し、細胞膜を破壊し、細胞内生体分子を溶出する。細胞膜破壊液はデバイスの上から下方向に流れるため、細胞捕捉部下部に設置された核酸捕捉部に溶出された生体分子は流入し、核酸捕捉部にて捕捉される。【０００８】
細胞内生体分子を効率良く捕捉するためには、生体分子を捕捉する核酸捕捉部の表面積を増大させる必要がある。より具体的には、核酸捕捉部である多孔質膜を構成する平均的な孔の直径を数μｍ以下にする必要がある。また、多孔質膜の膜厚は数十μｍ以上にすることが望ましい。しかし、前記条件のような多孔質膜を用いると、細胞懸濁液を通過させる際の圧力損失が大きくなってしまい、細胞懸濁液の流速が低下する、又は流速の制御が難しくなることもある。流速が遅くなる場合、比較的多くの細胞が重力や拡散の影響により、細胞捕捉部以外に吸着する。細胞膜を破壊し、細胞内生体分子を溶出する際に、細胞捕捉部以外に吸着した細胞の生体分子は複数の核酸捕捉部に流入してしまい、解析の精度を低下させる要因となる。細胞捕捉後に細胞捕捉部周辺を洗浄する場合でも、流速が遅いため、その洗浄効率は大幅に低下し、結果上述のような解析精度の低下が生じることもある。【０００９】
細胞懸濁液の流れが速すぎても、細胞は柔らかいため、細胞捕捉部を通過してしまい、複数の細胞が核酸捕捉部内に導入されてしまう可能性がある。１つの細胞捕捉部に２つ以上の細胞が流入してしまった場合でも、２つ以上入ったことが顕微鏡画像などで確認できれば、該細胞捕捉部で得られたデータを省くことで全体の解析精度程度を防ぐことも可能だが、核酸捕捉部まで流入してしまった細胞を観察するのは困難である。また、細胞捕捉時にリアルタイムで観察し、細胞捕捉部にいくつの細胞が流入したか計測することも可能だが、細胞懸濁液の流れが速い場合には、その計測も困難となることがある。【００１０】
細胞内生体分子を溶出する際に、生体分子を含む溶液は細胞捕捉部下部に設置された核酸捕捉部に流入するが、拡散などの影響により、生体分子が隣り合う核酸捕捉部にも流入する（クロストーク）可能性がある。クロストークが発生すると、本来の核酸組成と異なる組成で配列解析を行うことになり、解析精度の低下が生じることがある。【００１１】
そこで本発明の目的は、同時に複数の細胞から一細胞レベルで生体分子を解析する際に、さらなる改善を目的として、効率良く生体分子を捕捉する条件を維持したまま、細胞を細胞捕捉部領域のみに効率的に捕捉させ、細胞膜破壊時に発生するクロストークを低減する手段及び方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明に係るデバイス及びシステムは以下のような構成をとる。すなわち、本発明に係る一細胞内生体分子捕捉用デバイスは、基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、前記孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される生体分子を捕捉する生体分子捕捉体を前記基板内部に備えた生体分子捕捉領域とを備えた二次元アレイと；前記基板の一面に対し面に平行な第１の方向から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流す流路と；前記一細胞捕捉孔のそれぞれの前記第１の方向の下流側の面上であって、前記第１の方向と対面するように設けられた構造体とを有する。また本発明に係る一細胞内生体分子捕捉用システムは、基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、前記孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される生体分子を捕捉する生体分子捕捉体を前記基板内部に備えた生体分子捕捉領域とを備えた二次元アレイと；前記基板の一面に対し面に平行な第１の方向から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流す流路と；前記一細胞捕捉孔のそれぞれの前記第１の方向の下流側の面上であって、前記第１の方向と対面するように設けられた構造体と；前記第一の流れを印加する第一の印加手段、及び第一の制御手段と；前記一細胞捕捉孔側から前記生体分子捕捉領域へ向かって前記基板の一面に対し面に垂直な第二の流れを印加する第二の印加手段、及び第二の制御手段とを有し、前記第一及び第二の制御手段は、細胞捕捉時には第二の流れの流量よりも第一の流れの流量が大きくなるように制御し、生体分子捕捉時には第一の流れの流量よりも第二の流れの流量が大きくなるように制御する。【００１３】
また、本発明に係る一細胞内生体分子捕捉方法は、複数の細胞を含むサンプルから各一細胞内の生体分子を捕捉する方法であり、本発明に係るデバイス又はシステムを準備する工程；前記デバイス又はシステムの流路から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流し、二次元アレイの基板の一面に対し平行な流れを発生させ、前記二次元アレイ上の一細胞捕捉孔に細胞を捕捉する工程；前記基板の一面に対し平行な流れを発生させ、前記二次元アレイ上を洗浄する工程；前記基板の一面に対し垂直な流れを発生させ、前記捕捉された細胞を溶解し、生体分子を二次元アレイの生体分子捕捉体に捕捉する工程を含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、同時に複数の細胞から一細胞レベルで生体分子を解析する際に、効率良く生体分子を捕捉する条件を維持したまま、細胞を細胞捕捉部領域のみに効率的に捕捉させ、細胞膜破壊時に発生するクロストークを低減することが可能となる。結果として、本発明に係るデバイス、システム及び方法は、一細胞内生体分子を効率的かつ確実に捕捉して、一細胞内生体分子を高精度に解析することができ、遺伝子発現解析、細胞機能解析、生体組織の解析、病気の診断、創薬などの分野で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】一細胞内核酸捕捉用チップの平面図を示す。
【図２】一細胞内核酸捕捉用チップの断面図を示す。
【図３】磁性ビーズの概略図を示す。
【図４】ｍＲＮＡ捕捉用ＤＮＡプローブの概略図を示す。
【図５】一細胞内核酸捕捉用デバイスの概略図を示す。
【図６】一細胞内核酸捕捉用システムの概略図を示す。
【図７】一細胞内核酸捕捉方法の細胞捕捉からｍＲＮＡ捕捉までの工程を示す。
【図８】一細胞内核酸捕捉方法を実施した後、１ｓｔ  ｓｔａｒｎｄ合成から遺伝子発現プロファイルを得るまでの工程を示す。
【図９】細胞捕捉構造体の平面図を示す。
【図１０】細胞捕捉構造体の平面図（ａ）及び正面図（ｂ）を示す。
【図１１】一細胞内核酸捕捉用デバイスの概略図を示す。
【図１２】一細胞内核酸捕捉用システムの概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、生体組織から一細胞レベルの分解能で生体分子（例えばｍＲＮＡ）のライブラリ（例えばｃＤＮＡライブラリ）を作製し、次世代ＤＮＡシーケンサ又は解析対象の遺伝子に特異的なプローブを利用したハイブリダイゼーションによって、一細胞レベルの分解能でその生体分子の発現解析を行うことを最終目的として、複数の細胞を含むサンプルから一細胞内の生体分子をそれぞれ高効率かつ高精度に捕捉するためのデバイス、システム及び方法を提供する。
【００１７】
本発明において、「一細胞内生体分子」とは、単一細胞内に含まれる生体分子を指し、複数の細胞を含むサンプルにおいてそれぞれの一細胞に由来する生体分子である。同様に、「一細胞レベルの分解能」とは、複数の細胞を含むサンプルにおいて、それぞれの一細胞について、具体的には一細胞内生体分子について解析する能力を意味する。
【００１８】
本発明において、「生体分子の捕捉」とは、細胞内に含まれる分子を抽出して、他の細胞成分と分離することを意味し、好ましくはそのような分子を固定することを意味する。また、「遺伝子発現解析」とは、遺伝子発現に関連する生体分子を解析することであって、具体的には、サンプル（細胞、組織切片など）における遺伝子又は生体分子、例えばターゲットとなる被検核酸の発現を定量的に分析すること、サンプルにおける遺伝子（被検核酸）又は生体分子の発現分布を分析すること、サンプルにおける特定の位置と遺伝子（被検核酸）又は生体分子発現量との相関データを得ることを意味する。
【００１９】
本発明において捕捉又は解析する対象となる生体分子は、細胞内に含まれる生体分子であれば特に限定されるものではなく、核酸（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及びそれらの断片など）、タンパク質（例えば、酵素、抗体など）、低分子化合物などが含まれる。
【００２０】
一態様において、本発明に係る、サンプルに含まれる複数の細胞を一細胞ずつ捕捉し、捕捉された一細胞それぞれから生体分子を抽出して捕捉するためのデバイス（「一細胞内生体分子捕捉用デバイス」という）は、
基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、前記孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される生体分子を捕捉する生体分子捕捉体を前記基板内部に備えた生体分子捕捉領域とを備えた二次元アレイと、
前記基板の一面に対し面に平行な第１の方向から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流す流路と、
前記一細胞捕捉孔のそれぞれの前記第１の方向の下流側の面上であって、前記第１の方向と対面するように設けられた構造体と
を有する。
【００２１】
二次元アレイは、基板に形成され、基板の一面には複数の一細胞捕捉孔が設けられ、基板内部には生体分子捕捉領域が設けられている。このような二次元アレイは、特許文献１などに記載の通り、当該技術分野において公知である。
【００２２】
例えば基板は、当該技術分野で一般的に使用されている材料で作製されたものであれば特に限定されるものではない。その材料としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン、クロム、白金、チタン、ニッケル等の金属；ステンレス、ハステロイ、インコネル、モネル、ジュラルミン等の合金；シリコン；ガラス、石英ガラス、溶融石英、合成石英、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト及び感光性ガラス等のガラス材料；ポリエステル樹脂、ポリスチレン、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂（Acrylonitrile Butadiene Styrene樹脂）、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）、サイクリックポリオレフィン、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂及び塩化ビニル樹脂等のプラスチック；アガロース、デキストラン、セルロース、ポリビニルアルコール、ニトロセルロース、キチン、キトサンが挙げられる。基板に用いる材料は、疎水性材料であることが好ましく、それにより細胞や試薬などの吸着を低減することができる。
【００２３】
基板の一面に一細胞捕捉孔を設け、基板内部に生体分子捕捉体を備えた生体分子捕捉領域を設ける方法も公知である。生体分子の捕捉効率を上げるためには、生体分子捕捉体を備えた生体分子捕捉領域として、表面積の大きい材料を用いることが好ましく、例えば、多数のビーズが充填された構造、多孔質構造、メッシュ構造などを採用することが好ましい。生体分子捕捉体としてビーズを用いる場合には、樹脂材料（ポリスチレンなど）、酸化物（ガラスなど）、金属（鉄など）、セファロース、及びこれらの組み合わせなどからビーズを作製することができる。操作の簡便性から、磁性ビーズを使用することが好ましい。一細胞捕捉孔の大きさは、捕捉しようとする細胞のサイズよりも小さく、かつ後述するように基板の面に対して垂直な流を発生させることができる程度の大きさを備えている必要がある。例えば５〜１０μｍ、好ましくは８〜１０μｍとすることができるが、捕捉対象の細胞の種類に応じて適宜変更する。基板上の一細胞捕捉孔の配置及び間隔もまた捕捉対象の細胞の種類に応じて適宜変更することができ、各孔への単一細胞の捕捉を確実にかつ促進するために、互い違いに配置されることが好ましい（例えば、図１及び５）。
【００２４】
生体分子捕捉体は、捕捉対象の生体分子の種類に応じて適当なプローブ、好ましくは生体分子と特異的に結合するプローブを有することができる。例えば、生体分子がｍＲＮＡである場合には、ポリＴ配列を含むＤＮＡプローブを用いることができる。ポリＴ配列を含むＤＮＡプローブ、すなわちオリゴ（ｄＴ）は、常法により合成することができ、オリゴ（ｄＴ）の重合度は、ｍＲＮＡのポリＡ配列とハイブリダイズして、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）が固定された生体分子捕捉体に捕捉しうる重合度であればよい。例えば、１０〜３０塩基、１０〜２０塩基、１０〜１５塩基程度とすることができる。生体分子が非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ又はゲノムＤＮＡである場合には、ランダム配列からなるＤＮＡプローブ、特定の標的配列に対して相補的な配列を有するＤＮＡプローブを用いることができる。また、生体分子がタンパク質や低分子化合物である場合には、該生体分子と特異的に結合する第１の結合性分子（抗体、アプタマー等）と、第１の結合性分子に結合した第１のＤＮＡプローブを利用することができる。上記結合性分子とサンドイッチ状態で上記生体分子と結合する第２の結合性分子（上記結合性分子と同じ種類の分子であることが好ましく、例えば抗体、アプタマー等である）と、第２の結合性分子に結合した第２のＤＮＡプローブを添加し、ターゲットとなる生体分子が存在する場合には、上記ＤＮＡプローブと第２のＤＮＡプローブとがライゲーションし、その生体分子に特異的なリングプローブが形成される。この方法は近接ライゲーション法（Proximity Ligation Method）と呼ばれ（例えば、Malin Jarvius et al. Molecular & Cellular Proteomics 6 (9) p.1500, 2007）、タンパク質に対応したＤＮＡライブラリの構築に有用である。
【００２５】
プローブは、当技術分野で公知の任意の方法により生体分子捕捉体に固定する。例えばビーズ表面、多孔質膜の表面又は内部などに、共有結合、イオン結合、物理吸着、生物学的結合（例えば、ビオチンとアビジン又はストレプトアビジンとの結合、抗原と抗体との結合など）を利用してプローブを固定することができる。また、スペーサー配列を介してプローブを生体分子捕捉体に固定することも可能である。前記近接ライゲーションを用いた生体分子としてタンパク質や低分子化合物を処理する場合，前記第１の結合性分子を前記生体分子捕捉体に固定することも可能である。
【００２６】
なお、二次元アレイや基板には、他の物質（核酸やタンパク質など）が吸着しないように、表面コーティングを行うことが好ましい。
【００２７】
流路もまた、当該技術分野で公知であり、基板又は二次元アレイと一体化して設けてもよいし、又は別々に作製した後で接続してもよい。この流路から、基板の一面に対し面に平行な第１の方向で、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流すことになる。
【００２８】
二次元アレイの基板には、構造体が設けられる。構造体は、一細胞捕捉孔のそれぞれの第１の方向の下流側の面上であって、第１の方向と対面するように設けられる。構造体の形状は、細胞の捕捉に適した形状であれば特に限定されるものではなく、例えばコの字状（図１）、三角柱（図９（ａ））、円柱（図９（ｂ））、凹型（図９（ｃ）、図１０（ａ））などの形状とすることができる。構造体の大きさは、一細胞のみの捕捉が確実となるように、高さ及び幅がそれぞれ２０μｍ以下、好ましくは１０〜１８μｍ、より好ましくは１０〜１５μｍとする。細胞以外のサンプル液体は容易に排出されるように、構造体には、特に第１の流れの下流側に、スリットや孔が設けられていることが好ましい。構造体は、二次元アレイに一体的に形成してもよいし、別々に作製した後で接着してもよい。
【００２９】
上記構成を有する本発明のデバイスは、構造体を備えるため、複数の細胞を含むサンプルから個々の一細胞捕捉孔に一細胞のみを捕捉することができ、また捕捉された細胞から溶出した生体分子（ｍＲＮＡなど）が拡散などの影響で他の部位、特に他の生体分子捕捉領域に導入される影響を物理的に低減することができる。
【００３０】
別の態様において、本発明に係る一細胞内生体分子捕捉用システムは、
基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、前記孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される生体分子を捕捉する生体分子捕捉体を前記基板内部に備えた生体分子捕捉領域とを備えた二次元アレイと、
前記基板の一面に対し面に平行な第１の方向から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流す流路と、
前記一細胞捕捉孔のそれぞれの前記第１の方向の下流側の面上であって、前記第１の方向と対面するように設けられた構造体と、
前記第一の流れを印加する第一の印加手段、及び第一の制御手段と、
前記一細胞捕捉孔側から前記生体分子捕捉領域へ向かって前記基板の一面に対し面に垂直な第二の流れを印加する第二の印加手段、及び第二の制御手段と
を有し、
前記第一及び第二の制御手段は、細胞捕捉時には第二の流れの流量よりも第一の流れの流量が大きくなるように制御し、生体分子捕捉時には第一の流れの流量よりも第二の流れの流量が大きくなるように制御する。
【００３１】
流れを印加する印加手段は、当技術分野で公知であり、例えばシリンジ、ポンプ、吸引装置、加圧装置などを用いることができる。制御手段もまた、流れの流量を計測・制御する手段であれば特に限定されるものではない。本発明では、第一の印加手段によって印加される第一の流れ（平行な流れ）の流量と、第二の印加手段によって印加される第二の流れ（垂直な流れ）の流量とを第一の制御手段及び第二の制御手段で制御することによって、細胞捕捉時に個々の一細胞捕捉孔への捕捉を確実にすることができ、一細胞捕捉孔に捕捉された細胞が保持されたまま基板又は二次元アレイの洗浄を行うことができ、並びに／あるいは生体分子捕捉領域への生体分子の捕捉を効率的かつクロストークなく行うことができる。具体的には、細胞捕捉時及び二次元アレイ洗浄時には垂直な流れの流量よりも平行な流れの流量が大きくなるように制御し、生体分子捕捉時には平行な流れの流量よりも垂直な流れの流量が大きくなるように制御する。
【００３２】
また本発明に係る一細胞内生体分子捕捉用システムは、第一の流れによって第１の方向の下流側に排出された前記複数の細胞を再び前記複数の細胞を含むサンプルを流す流路に戻す手段をさらに有するものであってもよい。例えば、基板又は二次元アレイ上の排出口と上記流路とを接続するチューブ、パイプなどを利用することができる。
【００３３】
本発明に係る一細胞内生体分子捕捉用システムはさらに、試薬導入手段、温度調節手段、光学観察手段、移動ステージなどを有してもよい。
【００３４】
上記構成を有する本発明のシステムは、構造体を備えるため、複数の細胞を含むサンプルから個々の一細胞捕捉孔に一細胞のみを捕捉することができ、また捕捉された細胞から溶出した生体分子（ｍＲＮＡなど）が拡散などの影響で他の部位、特に他の生体分子捕捉領域に導入される影響を物理的に低減することができる。また、細胞捕捉時と生体分子捕捉時の基板上に流れを印加する手段及びその流量を制御する手段を備えるため、構造体に捕捉された細胞以外の基板に吸着した細胞を効率的に洗浄し、また捕捉された細胞から溶出した生体分子（ｍＲＮＡなど）を高い捕捉効率でかつクロストークを低減して生体分子捕捉領域に捕捉することができる。
【００３５】
また別の態様において、本発明に係る、複数の細胞を含むサンプルから各一細胞内の生体分子を捕捉する方法（「一細胞内生体分子捕捉方法」ともいう）は、
本発明に係る上記デバイス又はシステムを準備する工程、
前記デバイス又はシステムの流路から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流し、二次元アレイの基板の一面に対し平行な流れを発生させ、前記二次元アレイ上の一細胞捕捉孔に細胞を捕捉する工程、
前記基板の一面に対し平行な流れを発生させ、前記二次元アレイ上を洗浄する工程、
前記基板の一面に対し垂直な流れを発生させ、前記捕捉された細胞を溶解し、生体分子を二次元アレイの生体分子捕捉体に捕捉する工程
を含む。
【００３６】
サンプルは、複数の細胞を含む生体由来サンプルであれば特に限定されるものではない。サンプルの由来となる生体も特に限定されるものではなく、脊椎動物（例えば哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、両生類など）、無脊椎動物（例えば昆虫、線虫、甲殻類など）、原生生物、植物、真菌、細菌、ウイルスなどの任意の生体に由来するサンプルを用いることができる。サンプルは、本発明に係るデバイス、システム又は方法において使用する際に、流路を流れる形態である必要がある。そのため、サンプルが固形サンプル（例えば組織切片など）である場合には、固形サンプルを溶媒に溶解又は懸濁させることにより液体サンプルとすることが好ましい。また、サンプルが気体サンプル（例えば空気、呼気など）である場合には、気体サンプルに含まれる細胞を溶媒に懸濁させることにより液体サンプルとすることが好ましい。サンプルの調製方法は、当該技術分野において慣用的に行われており、当業者であれば容易に理解することができる。
【００３７】
前記デバイス又はシステムの流路から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流す。その際、二次元アレイの基板の一面に対し平行な流れを発生させて、二次元アレイ上の一細胞捕捉孔に細胞を捕捉する。二次元アレイには、構造体が設けられているため、サンプルに含まれる複数の細胞が、それぞれ１個ずつ一細胞捕捉孔に捕捉される。
【００３８】
次に、適当な溶媒、緩衝液等を流して基板の一面に対し平行な流れを発生させて、前記二次元アレイ上を洗浄する。細胞は構造体が存在するため一細胞捕捉孔に捕捉されたまま、基板に吸着した不要な細胞及び成分を洗浄することができる。
【００３９】
そして、細胞溶解試薬を流して基板の一面に対し垂直な流れを発生させて、捕捉された細胞を溶解し、生体分子を二次元アレイの生体分子捕捉体に捕捉する。例えば、当技術分野で公知の細胞溶解試薬を用いて細胞を溶解し、細胞に含まれる核酸を抽出することができる。例えば、プロテイナーゼＫのようなタンパク質分解酵素、チオシアン酸グアニジン・グアニジン塩酸といったカオトロピック塩、Ｔｗｅｅｎ及びＳＤＳといった界面活性剤、あるいは市販の細胞溶解用試薬を用いて、細胞を溶解し、それに含まれる核酸、すなわちＤＮＡ及びＲＮＡを溶出することができる。生体分子としてｍＲＮＡを捕捉する場合には、ＤＮＡをＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）により分解してからＲＮＡのみを捕捉するようにしてもよい。
【００４０】
本発明に係る一細胞内生体分子捕捉方法は、本発明に係るデバイス又はシステムを用いることにより、複数の細胞を含むサンプルから個々の一細胞捕捉孔に一細胞のみを捕捉し、捕捉された細胞から、一細胞由来の生体分子を高効率かつ確実に捕捉することができる。
【００４１】
以下、図面を参照しながら本発明の具体的な実施の形態を説明する。
【実施例１】
【００４２】
本実施例では、サンプルである複数の細胞から一細胞内の生体分子として核酸を捕捉するための、本発明の構成を有するデバイス及びシステムを説明する。【００４３】
図１に一細胞内核酸捕捉用チップ１００の平面図を、図２に図１の一細胞内核酸捕捉用チップのＡ−Ａ断面図を示す。一細胞内核酸捕捉用チップ１００として、ジメチルポリシロキサン（ＰＤＭＳ）製基板の形状を、射出成形及びレーザ加工により以下の構成で作製した、細胞捕捉孔１０１と核酸捕捉孔１０３が上下に配置された反応槽２０７と細胞捕捉孔１０１近傍に設けられた細胞捕捉構造体１０２を含む一細胞内核酸捕捉領域１０４が互い違いに２次元アレイ状に配置した構成を持つチップを使用した。一細胞内核酸捕捉領域１０４はｘｙ方向に２００μｍ間隔にｘ軸方向に互い違いに配置され、１つの一細胞内核酸捕捉用チップ１００に計１８個の一細胞内核酸捕捉領域１０４が配置されている。細胞捕捉時には、細胞懸濁液（サンプル）は図１のｘ軸方向の左側から右側方向へと流れる。【００４４】
１つの反応槽には、図２に示すように、上方に細胞捕捉孔１０１が、下方に核酸捕捉孔１０３が設けられている。細胞捕捉構造体１０２はコの字形状であり、細胞捕捉孔１０１の近傍における細胞懸濁液が流れる際の下流方向に設置されている。細胞捕捉構造体１０２の細胞懸濁液が流れる際の下流方向にはスリットが形成されており、捕捉された細胞が構造体から流れ出ないように、スリット幅を細胞よりも小さい５μｍとした。複数の細胞が同一細胞構造体に捕捉されないように、細胞捕捉構造体１０２の高さは細胞２個分よりも小さな値である必要がある。細胞の大きさはおよそ１０μｍ程度であるため、細胞捕捉構造体の高さは２０μｍ以下が好ましい。本実施例では細胞捕捉構造体１０２の高さを１５μｍとした。また、細胞捕捉構造体１０２のコの字のｘ軸方向の窪み深さは細胞１個分よりも小さな値である１０μｍとした。さらに、捕捉された細胞の生体分子であるｍＲＮＡを効率良く核酸捕捉孔１０３に流入させるために、細胞捕捉構造体１０２を、捕捉された細胞の直下に細胞捕捉孔１０１が位置するように配置することが望ましく、本実施例では、図１のＢで示した細胞捕捉構造体１０２の面と細胞捕捉孔１０１の中心との距離が１０μｍになるよう配置した。細胞捕捉構造体のｙ軸方向の幅は、複数の細胞が同一細胞構造体に捕捉されないように、細胞２個分よりも小さな値である必要、つまり２０μｍ以下にする必要がある。本実施例では、１８μｍとした。【００４５】
核酸捕捉孔１０３には、直径１μｍの磁性ビーズ２０５を充填してあり，核酸捕捉領域２０８を形成する。細胞捕捉孔１０１の開口直径を５μｍ、核酸捕捉孔１０３の開口直径を７０μｍとした。磁性ビーズ２０５が図２下方から漏出しないように、５００ｎｍ程度の開口を持ったアルミナ製の細孔シート２０６を配置した。ＰＤＭＳ製基板と細孔シート２０６はプラズマ接着によって接着した。ここで、ＰＤＭＳ製基板の代わりに他の樹脂（ポリカーボネート、サイクリックポリオレフィン、ポリプロピレンなど）を用いた射出成形により得られた樹脂チップを用いてもよく、あるいはナノインプリント技術や半導体プロセスを用いたものを使用することもできる。【００４６】
なお、本実施例では一細胞内核酸捕捉用デバイスとして、ｍＲＮＡ捕捉用ＤＮＡプローブが修飾された磁性ビーズを２次元アレイ状に配置したシートを使用したが、特許文献１に記載されているような公知の多孔質膜を使用しても良い。また、本実施例では磁性ビーズを使用したが、これ以外に、樹脂材料（ポリスチレンなど）、酸化物（ガラスなど）、金属（鉄など）、セファロース、及びこれらの組み合わせなどからビーズを作製することができる。【００４７】
図３に核酸捕捉用の磁性ビーズ２０５の概略図を示す。磁性ビーズ２０５の周りにはストレプトアビジン３０９が多数修飾されており、ストレプトアビジン３０９を介して５’末端にビオチン３１０が結合したｍＲＮＡ捕捉用ＤＮＡプローブ３１１が結合している。【００４８】
図４にｍＲＮＡ捕捉用ＤＮＡプローブ３１１の一例の概略図を示す。ＤＮＡプローブの５’末端にビオチン３１０が結合したｍＲＮＡ捕捉用ＤＮＡプローブ３１１は、５’末端方向から、ＰＣＲ増幅用共通配列（Ｆｏｒｗａｒｄ）４１２、細胞認識用タグ配列４１３、及び核酸捕捉配列４１４で構成される。ここでは核酸捕捉配列としてオリゴ（ｄＴ）を用いた。オリゴ（ｄＴ）用いることでｍＲＮＡのポリＡ配列とハイブリダイズして、サンプル細胞のｍＲＮＡを捕捉することが可能となる。オリゴ（ｄＴ）の重合度として、ｍＲＮＡのポリＡ配列とハイブリダイズして、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）を含む核酸プローブが固定された磁性ビーズ２０５に捕捉しうる重合度であればよい。例えば、１０〜３０塩基、１０〜２０塩基、１０〜１５塩基程度とすることができる。また、本実施例では捕捉する核酸をｍＲＮＡとしたが、例えば捕捉する核酸がｍｉｃｒｏＲＮＡやゲノムＤＮＡである場合には、核酸捕捉配列として、ランダム配列、ターゲット被検核酸の一部に相補的な配列を用いることができる。ＰＣＲ増幅用共通配列４１２をｍＲＮＡ捕捉用ＤＮＡプローブ３１１へ導入することで、後続のＰＣＲ増幅工程においてこの配列を共通プライマーとして利用することができる。また、細胞認識用タグ配列４１３（例えば５塩基）をｍＲＮＡ捕捉用ＤＮＡプローブ３１１へ導入することによって、４５＝１０２４の位置又は領域（例えば４５＝１０２４個の単一細胞）を認識することが可能となり、最終的に得られる次世代シーケンサの配列データが、どの細胞（又は位置若しくは領域）由来であるかを認識することが可能となる。このタグ配列については、例えばＷＯ２０１４／１４１３８６に詳細が記載されている。【００４９】
図５（ａ）に本発明を適用した一細胞内核酸捕捉用デバイス５００の一細胞内核酸捕捉用チップ１００面に垂直な断面図を示す。また、一細胞内核酸捕捉用チップ１００面に平行で図５（ａ）一点鎖線Ｃの位置での断面図を図５（ｂ）に示す。一細胞内核酸捕捉用デバイス５００には、細胞懸濁液（サンプル）、試薬、洗浄バッファを導入する導入口５０１、一細胞内核酸捕捉用チップ１００が設置された細胞捕捉と核酸捕捉がなされる反応場５０２、溶液を排出する第一の排出口５０３と第二の排出口５０４から構成される。【００５０】
本実施例では一細胞内核酸捕捉用デバイス５００の材質としてアクリル樹脂を使用したが、それ以外の樹脂、金属であっても良い。細胞捕捉時の細胞観察の容易性を考慮すると、好ましくは光学的に透明な材質を用いることが好ましい。また、流路を構成する材質は、核酸捕捉やｃＤＮＡ合成反応の阻害となる材質を避ける必要がある。例えば、アルミなどはｃＤＮＡ合成反応の阻害となるために避けることが好ましい。一細胞内核酸捕捉用デバイス５００の反応場５０２直上には、一細胞内核酸捕捉用チップ１００を光学観察できるように光学的な透明な材質である窓５０５を設置した。本実施例では石英製のガラス板を使用した。一細胞内核酸捕捉用デバイスの材質が光学的に透明な材質であれば、あえて反応場５０２直上に別の材質を使用する必要はない。また、一細胞内核酸捕捉用チップ１００を光学観察する必要がなければ、一細胞内核酸捕捉用デバイスの材質が光学的に透明な材質でなくても、反応場５０２直上に別の材質を使用する必要はない。対物レンズと一細胞内核酸捕捉用チップ１００の表面との距離が対物レンズの作動距離以下にする必要があり、一細胞内核酸捕捉用デバイス５００の反応場直上の厚さは、流路の高さを含めて対物レンズの作動距離以下にする必要がある。【００５１】
図６に一細胞内核酸捕捉用システム６００の概略図を示す。一細胞内核酸捕捉用デバイスを含めた送液ユニット６２１、試薬分注ユニット６０１、一細胞内核酸捕捉用デバイスの温度調整を行う温調ユニット６０２、一細胞内核酸捕捉用チップ１００の光学観察を行う光学観察ユニット６０３、一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を所望の位置に移動させる移動ステージユニット６０４から構成される。【００５２】
送液ユニット６２１は以下のように構成されている。一細胞内核酸捕捉用デバイスの第一の排出口５０３及び第二の排出口５０４に、それぞれ第一排出チューブ６０５、第二排出チューブ６０６を介して第一シリンジ６０７と第二シリンジ６０８が接続されている。前記各排出チューブには各排出チューブの流量を測定し、制御できる第一、第二マスフローコントローラ６０９、６１０が設置されている。第一シリンジ６０７により一細胞内核酸捕捉用チップ１００面に平行な流れ（平行流）を発生させ、第二シリンジ６０８により前記面と垂直な流れ（垂直流）を発生させることができる。【００５３】
試薬分注ユニット６０１は、試薬やサンプルを収容、分注する試薬収容分注器６１１、試薬やサンプルを分注させるために試薬収容分注器６１１を特定の時間加圧するための分注用加圧器６１２を備え、試薬収容分注器はポリプロピレン樹脂とガラス製のキャピラリから構成され、サンプルや試薬が収容されているポリプロピレン樹脂製の収容部上部から一定の圧力、時間で加圧されると、キャピラリの先端からサンプルや試薬が分注される。各試薬収容分注器６１１には、個別に加圧することが可能である。本実施例では試薬収容分注器６１１を温調していないが、試薬の劣化を防ぐため（特に低い温度（４℃など）で）温調しても良い。【００５４】
温調ユニット６０２は、一細胞内核酸捕捉用デバイス５００内の温度を４℃から８５℃まで調整可能にするため、ペルチェとヒータを組み合わせた構成とした。より具体的には、ペルチェ素子の表面に熱伝導の良い金属（例えば銅）を熱伝導の良い接着剤で接着し、前記金属内部にヒータを導入した構成とした。前記金属を熱伝導シートを介して一細胞内核酸捕捉用デバイス５００に接続した。【００５５】
光学観察ユニット６０３は、後述するサンプルである細胞に標識した蛍光体ＧＦＰ（Ｅｘ／Ｅｍ＝４８３／５０６ｎｍ）を励起するためのハロゲンランプを使った光源６１３、集光レンズ６１４、光学フィルタ６２０、ダイクロイックミラー６１５、対物レンズ６１６、光学フィルタ６１７、結像レンズ６１８、ＣＣＤカメラ６１９から構成される。光源６１３からの光は集光レンズ６１４によって並行光束に変換され、４８０ｎｍを中心波長とするバンドパスフィルタである光学フィルタ６２０によって４８０ｎｍ周辺波長が除外され、５００ｎｍ以下を反射するダイクロイックミラー６１５によって反射され、対物レンズ６１６によって集光され、一細胞内核酸捕捉用デバイス５００内の一細胞内核酸捕捉用チップ１００に捕捉された細胞に照射される。前記照射された細胞からの蛍光は、対物レンズ６１６によって集光され、ダイクロイックミラー６１５を透過し、５００ｎｍ以下をカットする光学フィルタ６１７によって背景光が除去され、結像レンズ６１８によってＣＣＤカメラ６１９に結像される。本実施例では落射式蛍光顕微鏡の構成を用いたが、細胞を直接観察する落射式明視野、暗視野顕微鏡の構成でも良い。また、一細胞内核酸捕捉用チップ１００が光学的に透明な材料で構成されていれば、一細胞内核酸捕捉用デバイス５００の下方から励起光や照明光を照射した観察方式や位相差顕微鏡の構成による観察方式であっても良い。【００５６】
移動ステージユニット６０４は自動移動ステージから構成されており、前記移動ステージの上に温調ユニット６０２と一細胞内核酸捕捉用デバイス５００が設置されている。温調ユニット６０２の温度の影響を受けないように、前記移動ステージと温調ユニット６０２の間には断熱材を介して接続してある。移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を試薬分注器６１１から試薬を分注できる位置、細胞を計測する位置に移動させることが可能となる。
【実施例２】
【００５７】
本実施例では、本発明の構成を有するデバイス又はシステムを用いて、サンプルである複数の細胞から一細胞内の生体分子として核酸を捕捉し、一細胞レベルの分解能で遺伝子発現解析を行う方法を説明する。【００５８】
まず、サンプルである細胞懸濁液導入から、細胞内ｍＲＮＡ捕捉までの工程を説明する。主な工程を図７に示すように、一細胞内核酸捕捉用チップ１００への細胞捕捉（図７（ａ））、一細胞内核酸捕捉用チップ１００表面の洗浄（図７（ｂ））、細胞溶解とｍＲＮＡの捕捉（図７（ｃ））、一細胞内核酸捕捉領域１０４の洗浄（図７（ｄ））から成る。【００５９】
より具体的には以下の工程を行う。５０個程度以下の細胞を５００μＬの１×ＰＢＳで細胞を傷つけないように洗浄し、できる限りＰＢＳが残らないように溶液を除去し、１×ＰＢＳバッファを２０μＬ加えた細胞懸濁液を調製した。細胞にはあらかじめ蛍光体ＧＦＰが組込まれている。前記細胞懸濁液が充填された試薬収容分注器６１１の下方に導入口５０１が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６１２によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６１１を加圧し、細胞懸濁液を導入口５０１に導入する。第一シリンジ６０７を引いて平行流を発生させ、細胞を一細胞内核酸捕捉用チップ１００上の核酸捕捉構造体１０２に捕捉させる（図７（ａ））。この時、第二シリンジ６０８を引いて垂直流を発生させても良いが、第一、第二マスフローコントローラ６０９、６１０で平行流の流量が垂直流の流量よりも多くなるように調整する。次いで、洗浄バッファである１×ＰＢＳバッファが充填された試薬収容分注器６１１の下方に導入口５０１が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６１２によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６１１を加圧し、細胞懸濁液を導入口５０１に導入する。第一シリンジ６０７を引いて平行流を作り、一細胞内核酸捕捉用チップ１００の表面を洗浄し、細胞捕捉構造体以外に吸着した細胞を洗い流す（図７（ｂ））。この時、第二シリンジ６０８を引いて垂直流を形成させても良いが、第一、第二マスフローコントローラ６０９、６１０で平行流の流量が垂直流の流量よりも多くなるように調整する。ここで、一細胞内核酸捕捉用チップ１００直上に対物レンズ６１６が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、各細胞捕捉孔１０１と細胞捕捉数の関係を確認する。【００６０】
次いで、ＲｅａｌＴｉｍｅ  ｒｅａｄｙ  Ｌｙｓｉｓバッファ（Ｒｏｃｈｅ）３９．５μＬ、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）３９．５μＬ、Ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）０．５μＬで調整したＬｙｓｉｓ溶液が充填された試薬収容分注器６１１の下方に導入口５０１が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６１２によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６１１を加圧し、Ｌｙｓｉｓ溶液を導入口５０１に導入する。第二シリンジ６０８を引いて垂直流を発生させる。細胞は前記Ｌｙｓｉｓ溶液によって溶解され、細胞内に存在したｍＲＮＡが溶出する。溶出したｍＲＮＡは、垂直流によって細胞捕捉孔１０１から核酸捕捉孔１０３へ向かって流れ続ける。この過程でｍＲＮＡは磁性ビーズ２０５に固定されたｍＲＮＡ捕捉用ＤＮＡプローブのオリゴ（ｄＴ）部分に捕捉される（図７（ｃ））。この時、第一シリンジ６０７を引いて平行流を発生させても良いが、第一、第二マスフローコントローラ６０９、６１０で垂直流の流量が平行流の流量よりも多くなるように調整する。本発明では、細胞捕捉構造体が存在するため、捕捉された細胞から溶出したｍＲＮＡが拡散などの影響で捕捉した細胞捕捉孔以外に導入される影響を物理的に低減できる。【００６１】
次いで、洗浄バッファである１×ＰＢＳバッファが充填された試薬収容分注器６１１の下方に導入口５０１が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６１２によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６１１を加圧し、細胞懸濁液を導入口５０１に導入する。第二シリンジ６０８を引いて垂直流を発生させ、核酸捕捉領域２０８を洗浄し、余剰なｍＲＮＡやｍＲＮＡ以外の生体物質、Ｌｙｓｉｓ溶液を洗い流す（図７（ｄ））。【００６２】
次に図７で示した工程以降から次世代（大規模）シーケンサで遺伝子発現プロファイルを得るためまでの工程を説明する。主な工程を図８に示すように、１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ（ｃＤＮＡ）の合成（図８（ａ））、核酸捕捉領域の洗浄（図８（ｂ））、ｍＲＮＡの分解（図８（ｃ））、２ｎｄ  ｓｔａｒｎｄ合成（図８（ｃ））、ＰＣＲ反応による増幅（図８（ｄ））、増幅産物の精製（図８（ｅ））、ｅｍＰＣＲと次世代ＤＮＡシーケンサによる解析（図９（ｆ））から成る。【００６３】
より具体的には以下の工程を行う。５×Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μＬ、ＩＩ（逆転写酵素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μＬ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μＬとを混和した逆転写溶液が充填された試薬収容分注器６１１の下方に導入口５０１が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６１２によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６１１を加圧し、細胞懸濁液を導入口５０１に導入する。第二シリンジ６０８を引いて垂直流を発生させ、一細胞内核酸捕捉用チップ１００の各反応槽２０７に前記溶液を通過させる。前記溶液が、まだ一細胞内核酸捕捉用チップ１００上に残存している状態で第二シリンジ６０８による溶液吸引を停止し、温調ユニット６０２によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００内温度を３７℃に上げて１０分間静置した後に、５０℃に上げて４５分間保つことよって逆転写反応を完了させ、ｍＲＮＡと相補的配列を有する１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した（図８（ａ））。【００６４】
ｃＤＮＡ鎖を合成した後に、温調ユニット６０２によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００内温度を８５℃に上げて９０秒間保ち逆転写酵素を失活させた。逆転写酵素失活後に４℃に冷却後、洗浄バッファである１×ＰＢＳバッファが充填された試薬収容分注器６１１の下方に導入口５０１が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６１２によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６１１を加圧し、細胞懸濁液を導入口５０１に導入し、第二シリンジ６０８を引いて垂直流を発生させ、核酸捕捉領域２０８を洗浄する（図８（ｂ））。【００６５】
洗浄した一細胞内核酸捕捉用チップ１００を一細胞内核酸捕捉用デバイス５００から取り外し、樹脂製のチューブ（一般に用いられる０．２ｍＬや１．５ｍＬ容量などのチューブ）挿入し、ＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μＬ、１０×ＲＮａｓｅＨバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１μＬを混和したＲＮａｓｅＨ溶液をそれぞれの前記チューブに導入し、前記チューブを３７℃３０分間静置することで、ｍＲＮＡを分解した（図８（ｃ））。【００６６】
ｍＲＮＡ分解後に前記チューブにＴｒｉｓ−ｔｗｅｅｎバッファ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１％Ｔｗｅｅｎ溶液）５０μＬを導入し、一細胞内核酸捕捉用チップ１００を洗浄し、マグネットを使用して磁性ビーズ２０５のみ前記チューブ内に残し、前記Ｔｒｉｓ−ｔｗｅｅｎバッファ  １μＬで再懸濁した。前記チューブに１０×Ｐｌａｔｎｕｍバッファ１μＬ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ１μＬ、５０ｍＭ  ＭｇＳＯ４０．４μＬ、各１０μＭの遺伝子特異的配列プライマー２．５μＬ、Ｐｌａｔｎｕｍ  Ｔａｑ  Ｈ．Ｆ．０．１μＬ、滅菌水５μＬを混和した２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ合成試薬１０μＬを加えてＰＣＲ装置で９８℃１０秒、４３℃１分、６８℃３分の順に反応を行い２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄの合成を行った（図８（ｄ））。本実施例では、遺伝子特異的配列プライマーとしてＰＣＲ増幅用共通配列（Ｒｅｖｅｒｓｅ）が付加された２０種（ＡＴＰ５Ｂ、ＧＡＰＤＨ、ＧＵＳＢ、ＨＭＢＳ、ＨＰＲＴ１、ＲＰＬ４、ＲＰＬＰ１、ＲＰＳ１８、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＳ２０、ＡＬＤＯＡ、Ｂ２Ｍ、ＥＥＦ１Ｇ、ＳＤＨＡ、ＴＢＰ、ＶＩＭ、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ２、ＲＰＬＰ２７、及びＯＡＺ１）の遺伝子特異的配列を持ったＤＮＡプローブを使用した。遺伝子特異的配列として、ターゲット遺伝子のポリＡテールから１０９±８塩基上流部分の２０±５塩基を使用した。前記２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ合成を行ったチューブを４℃に保管した状態でマグネットを近接させ、磁性ビーズ２０５のみ前記チューブ内に残した状態で２ｎｄ  ｓｔｒａｎｄ合成試薬を取り除く。次いで前記チューブを４℃に、またマグネットに近接した状態で、Ｔｒｉｓ  ｔｗｅｅｎバッファ５０μＬで２回前記磁性ビーズを洗浄し、最後にＴｒｉｓ  ｔｗｅｅｎバッファ１μＬで前記ビーズを懸濁した。前記チューブ内の前記磁性ビーズを洗浄した後に、Ｇｆｌｅｘ（ＴａＫａＲａ）７μＬ、ＰＣＲ増幅用共通配列（Ｆｏｒｗａｒｄ）を持つプライマー２μＬ、ＰＣＲ増幅用共通配列（Ｒｅｖｅｒｓｅ）を持つプライマー２μＬ、Ｇｆｌｅｘ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）０．３μＬ、滅菌水３μＬを混和したＰＣＲ用試薬１４．３μＬを前記チューブに導入する。前記チューブを３０秒間９４℃に保ち、９４℃３０秒間→５５℃３０秒間→６８℃３０秒間の３段階工程を４０サイクル繰り返し、最後に６８℃３分間保った後に、４℃に冷却してＰＣＲ増幅工程を行った（図８（ｅ））。前記工程により、２０種のターゲット遺伝子の目的部分が増幅されるが、いずれもＰＣＲ産物サイズは２００±８塩基とほぼ均一となる。ＰＣＲ反応の後に、溶液中に含まれるフリーのＰＣＲ増幅用共通配列プライマーや酵素などの残留試薬を除去する目的で、前記工程で増幅した増幅産物をＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した（図８（ｆ））。前記精製した溶液をｅｍＰＣＲ増幅又はブリッジ増幅に適用した後に、各社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｏｌｉｄ／Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｈｉｇｈ  Ｓｅｑ）など）の次世代ＤＮＡシーケンサに適用して解析する（図８（ｇ））。【００６７】
なお、本実施例では、ｍＲＮＡ分解（図８（ｃ））以降の工程を別のチューブに一細胞内核酸捕捉用チップ１００を移して行ったが、図８（ｅ）のＰＣＲ反応による増幅までを一細胞内核酸捕捉用デバイス５００内で行い、前記一細胞内核酸捕捉用デバイスからの反応液を回収して、図８（ｆ）増幅産物の精製以降の反応を別チューブで行っても良い。【００６８】
本実施例によって、高い核酸捕捉効率を維持したまま、細胞捕捉構造体に捕捉された細胞以外に吸着した細胞を効率的に洗浄し、細胞溶解時に溶出するｍＲＮＡを細胞捕捉構造体によって周辺に流れ出るのが防ぐことができるため、クロストークを低減し、解析精度向上が図れる。また、細胞捕捉孔に捕捉された細胞数を計測できるため、一つの細胞が捕捉された反応槽のみをデータに用いることが可能となり、解析精度の更なる向上が図れる。
【実施例３】
【００６９】
本実施例では、種々の形状の細胞捕捉構造体を説明する。図９に実施例１で使用したコの字型の細胞捕捉構造体以外の形状の平面図を示す。矢印は細胞捕捉時に発生させる平行流の流れの方向を示す。【００７０】
細胞構造体の形状としては、三角柱（図９（ａ））や円柱（図９（ｂ））を２本並べた構成であっても良い。三角柱や円柱の高さは細胞が２個以上捕捉されないように、細胞２個の大きさよりも低くする必要があり、望ましくは１０〜１５μｍ程度が良い。また、二つの柱の隙間は細胞が通過しないサイズである５μｍ程度が良い。さらに、細胞懸濁液が流れる方向とは垂直方向の２本の柱を合わせた合計サイズは、細胞が複数捕捉されないように、細胞２個以下の大きさが望ましい。三角柱や円柱にすることにより、構造体作製が容易となる。細胞捕捉構造体として図９（ｃ）に示す形状のようにスリットが無い形状であっても良い。細胞捕捉構造体９０３によって、細胞捕捉孔１０３直上の細胞懸濁液の流れが妨げられ、細胞捕捉効率が低下する可能性はあるが、ｍＲＮＡ溶出時のｍＲＮＡの拡散を抑えられ、よりクロストーク低減効果が得られる。図９で示した以外に、図１０で示すように細胞懸濁液の流れの方向から見たときに、三角形の形状の細胞捕捉構造体１００１であっても良い。細胞捕捉構造体１００１の高さは細胞が２個以上捕捉されないように、細胞２個の大きさよりも低くする必要があり、望ましくは１０〜１５μｍ程度が良い。また、細胞懸濁液が流れる方向とは垂直方向のサイズは、細胞が複数捕捉されないように、細胞２個以下の大きさが望ましい。細胞捕捉構造体として図１０に示す構造でも良い。図１０（ａ）は前記構造体の平面図である。細胞懸濁液は図１０（ａ）の左から右へ流れる。１０（ｂ）は前記構造体の細胞懸濁液が流れる上流から見た正面図である。前記構造体の形状であれば，細胞が図１０（ｂ）で示した三角形の中心に捕捉される以外には細胞懸濁液の流れによって細胞が流れやすくなるため、細胞が２個以上捕捉されることを抑えることが可能となる。【００７１】
実施例１では、細胞捕捉構造体を一細胞内核酸捕捉用チップ１００と一体として製作しているが、一細胞内核酸捕捉用チップ１００の直上の構造体、例えば窓５０５上に製作しても良い。これにより、一細胞内核酸捕捉用チップ１００の製造が容易になり、つまりコストを低減できる。また、一細胞内核酸捕捉用チップ１００以外の一細胞内核酸捕捉用デバイス５００若しくは窓５０５のみを繰り返し使用すれば、全体のコスト低減が可能となる。
【実施例４】
【００７２】
本実施例では、細胞懸濁液中の細胞を無駄無く捕捉できる方式を採用した一細胞内核酸捕捉用デバイス又はシステムを用いて、サンプルである複数の細胞から一細胞内の生体分子として核酸を捕捉し、一細胞レベルの分解能で遺伝子発現解析を行う方法を説明する。【００７３】
図１１に本実施例に係る一細胞内核酸捕捉用デバイス１１００の概略図を示す。一細胞内核酸捕捉用チップ１００も含めた基本構成は実施例１と同等である。以下、実施例１と異なる部分のみを示す。本実施例における一細胞内核酸捕捉用デバイスには、溶液を一時的に保管できる溶液保存領域１１０３に、細胞懸濁液（サンプル）、試薬、洗浄バッファを導入する第一の導入口１１０１と第二の導入口１１０２が接続されている。【００７４】
図１２に本実施例に係る一細胞内核酸捕捉用システム１２００の概略図を示す。一細胞内核酸捕捉用デバイスを含めた送液ユニット１２０１、試薬分注ユニット６０１、一細胞内核酸捕捉用デバイスの温度調整を行う温調ユニット６０２、一細胞内核酸捕捉用チップ１００の光学観察を行う光学観察ユニット６０３、一細胞内核酸捕捉用デバイス１１００を所望の位置に移動させる移動ステージユニット６０４から構成される。【００７５】
送液ユニット１２０１は以下のように構成されている。一細胞内核酸捕捉用デバイス１１００の第一の排出口５０３に接続された第一排出チューブ６０５には、三方活栓１２０２が接続されており、三方活栓１２０２の一端には再送液チューブ１２０３が接続されている。再送液チューブ１２０３の片端は、一細胞内核酸捕捉用デバイス５００の第二の導入口１１０２に接続されている。それ以外の構成、試薬分注ユニット６０１、温調ユニット６０２、光学観察ユニット６０３、移動ステージユニット６０４は、実施例１と同等である。【００７６】
細胞捕捉時の工程を以下で説明する。５０個程度以下の細胞を５００μＬの１×ＰＢＳで細胞を傷つけないように洗浄し、できる限りＰＢＳが残らないように溶液を除去し、１×ＰＢＳバッファを１００μＬ加えた細胞懸濁液を作製した。細胞にはあらかじめ蛍光体ＧＦＰが組込まれている。前記細胞懸濁液が充填された試薬収容分注器６１１の下方に第一の導入口１１０１が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス１１００を移動させ、分注用加圧器６１２によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６１１を加圧し、細胞懸濁液を導入口１１０１より溶液保存領域１１０３に導入する。三方活栓１２０２により第一の排出口５０３と第一のシリンジ６０７を流路的に接続させる。シリンジ６０７を引いて平行流を発生させ、細胞を一細胞内核酸捕捉用チップ１００上の核酸捕捉構造体１０２に捕捉させる。この時、第二シリンジ６０８を引いて垂直流を発生させても良いが、第一、第二マスフローコントローラ６０９、６１０で平行流の流量が垂直流の流量よりも多くなるように調整する。次いで、三方活栓１２０２により第一シリンジ６０７と再送液チューブ１２０３を流路的に接続させる。シリンジ６０７を押し、シリンジ６０７に導入された細胞懸濁液を再送液チューブ１２０３を介して、溶液保存領域１１０３に導入する。その後、三方活栓１２０２により第一の排出口５０３と第一シリンジ６０７を流路的に接続させ、シリンジ６０７を引いて平行流を発生させ、細胞を一細胞内核酸捕捉用チップ１００上の核酸捕捉構造体１０２に捕捉させる。上記工程を繰り返すことにより、細胞懸濁液中の細胞を無駄なく細胞捕捉構造体に捕捉することが可能となる。これ以降から次世代（大規模）シーケンサで遺伝子発現プロファイルを得るためまでの工程は実施例２と同等である。【００７７】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全文を参考として本明細書中に取り入れるものとする。
【符号の説明】
【００７８】
１００  一細胞内核酸捕捉用チップ
１０１  細胞捕捉孔
１０２  細胞捕捉構造体
１０３  核酸捕捉孔
１０４  一細胞内核酸捕捉領域
２０５  磁性ビーズ
２０６  細孔シート
２０７  反応槽
２０８  核酸捕捉領域
３０９  ストレプトアビジン
３１０  ビオチン
３１１  ｍＲＮＡ捕捉用ＤＮＡプローブ
４１２  ＰＣＲ増幅用共通配列（Ｆｏｒｗａｒｄ）
４１３  細胞認識用タグ配列
４１４  核酸捕捉配列
５００  一細胞内核酸捕捉用デバイス
５０１  導入口
５０２  反応場
５０３  第一の排出口
５０４  第二の排出口
５０５  窓
６００  一細胞内核酸捕捉用システム
６０１  試薬分注ユニット
６０２  温調ユニット
６０３  光学観察ユニット
６０４  移動ステージユニット
６０５  第一排出チューブ
６０６  第二排出チューブ
６０７  第一シリンジ
６０８  第二シリンジ
６０９  第一マスフローコントローラ
６１０  第二マスフローコントローラ
６１１  試薬収容分注器
６１２  分注用加圧器
６１３  光源
６１４  集光レンズ
６１５  ダイクロイックミラー
６１６  対物レンズ
６１７  光学フィルタ
６１８  結像レンズ
６１９  ＣＣＤカメラ
６２０  光学フィルタ
６２１  送液ユニット
９０１  細胞捕捉構造体
９０２  細胞捕捉構造体
９０３  細胞捕捉構造体
１００１  細胞捕捉構造体
１１００  一細胞内核酸捕捉用デバイス
１１０１  第一の導入口
１１０２  第二の導入口
１１０３  溶液保存領域
１２００  一細胞内核酸捕捉用システム
１２０１  送液ユニット
１２０２  三方活栓
１２０３  再送液チューブ
【図１】
2017168493.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2017168493.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月20日(2018.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
より具体的には以下の工程を行う。５０個程度以下の細胞を５００μＬの１×ＰＢＳで細胞を傷つけないように洗浄し、できる限りＰＢＳが残らないように溶液を除去し、１×ＰＢＳバッファを２０μＬ加えた細胞懸濁液を調製した。細胞にはあらかじめ蛍光体ＧＦＰが組込まれている。前記細胞懸濁液が充填された試薬収容分注器６１１の下方に導入口５０１が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６１２によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６１１を加圧し、細胞懸濁液を導入口５０１に導入する。第一シリンジ６０７を引いて平行流を発生させ、細胞を一細胞内核酸捕捉用チップ１００上の核酸捕捉構造体１０２に捕捉させる（図７（ａ））。この時、第二シリンジ６０８を引いて垂直流を発生させても良いが、第一、第二マスフローコントローラ６０９、６１０で平行流の流量が垂直流の流量よりも多くなるように調整する。次いで、洗浄バッファである１×ＰＢＳバッファが充填された試薬収容分注器６１１の下方に導入口５０１が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６１２によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６１１を加圧し、ＰＢＳバッファを導入口５０１に導入する。第一シリンジ６０７を引いて平行流を作り、一細胞内核酸捕捉用チップ１００の表面を洗浄し、細胞捕捉構造体以外に吸着した細胞を洗い流す（図７（ｂ））。この時、第二シリンジ６０８を引いて垂直流を形成させても良いが、第一、第二マスフローコントローラ６０９、６１０で平行流の流量が垂直流の流量よりも多くなるように調整する。ここで、一細胞内核酸捕捉用チップ１００直上に対物レンズ６１６が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、各細胞捕捉孔１０１と細胞捕捉数の関係を確認する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
次いで、洗浄バッファである１×ＰＢＳバッファが充填された試薬収容分注器６１１の下方に導入口５０１が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６１２によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６１１を加圧し、ＰＢＳバッファを導入口５０１に導入する。第二シリンジ６０８を引いて垂直流を発生させ、核酸捕捉領域２０８を洗浄し、余剰なｍＲＮＡやｍＲＮＡ以外の生体物質、Ｌｙｓｉｓ溶液を洗い流す（図７（ｄ））。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
より具体的には以下の工程を行う。５×Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄバッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μＬ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μＬ、ＩＩ（逆転写酵素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μＬ、ＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μＬとを混和した逆転写溶液が充填された試薬収容分注器６１１の下方に導入口５０１が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６１２によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６１１を加圧し、逆転写溶液を導入口５０１に導入する。第二シリンジ６０８を引いて垂直流を発生させ、一細胞内核酸捕捉用チップ１００の各反応槽２０７に前記溶液を通過させる。前記溶液が、まだ一細胞内核酸捕捉用チップ１００上に残存している状態で第二シリンジ６０８による溶液吸引を停止し、温調ユニット６０２によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００内温度を３７℃に上げて１０分間静置した後に、５０℃に上げて４５分間保つことよって逆転写反応を完了させ、ｍＲＮＡと相補的配列を有する１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した（図８（ａ））。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
ｃＤＮＡ鎖を合成した後に、温調ユニット６０２によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００内温度を８５℃に上げて９０秒間保ち逆転写酵素を失活させた。逆転写酵素失活後に４℃に冷却後、洗浄バッファである１×ＰＢＳバッファが充填された試薬収容分注器６１１の下方に導入口５０１が配置されるように移動ステージユニット６０４によって一細胞内核酸捕捉用デバイス５００を移動させ、分注用加圧器６１２によって所定の圧力と時間で試薬収容分注器６１１を加圧し、ＰＢＳバッファを導入口５０１に導入し、第二シリンジ６０８を引いて垂直流を発生させ、核酸捕捉領域２０８を洗浄する（図８（ｂ））。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一細胞内生体分子捕捉用デバイスであって、
基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、前記孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される生体分子を捕捉する生体分子捕捉体を前記基板内部に備えた生体分子捕捉領域とを備えた二次元アレイと、
前記基板の一面に対し面に平行な第１の方向から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流す流路と、
前記一細胞捕捉孔のそれぞれの前記第１の方向の下流側の面上であって、前記第１の方向と対面するように設けられた構造体と
を有することを特徴とする一細胞内生体分子捕捉用デバイス。
【請求項２】
前記構造体の高さ及び幅がそれぞれ２０μｍ以下である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記生体分子が核酸である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
前記生体分子捕捉体が、前記生体分子と特異的に結合するプローブを有する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記生体分子捕捉体が磁性ビーズである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項６】
一細胞内生体分子捕捉用システムであって、
基板の一面に設けられた複数の一細胞捕捉孔と、前記孔それぞれについて捕捉される一細胞から抽出される生体分子を捕捉する生体分子捕捉体を前記基板内部に備えた生体分子捕捉領域とを備えた二次元アレイと、
前記基板の一面に対し面に平行な第１の方向から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流す流路と、
前記一細胞捕捉孔のそれぞれの前記第１の方向の下流側の面上であって、前記第１の方向と対面するように設けられた構造体と、
第一の流れを印加する第一の印加手段、及び第一の制御手段と、
前記一細胞捕捉孔側から前記生体分子捕捉領域へ向かって前記基板の一面に対し面に垂直な第二の流れを印加する第二の印加手段、及び第二の制御手段と
を有し、
前記第一及び第二の制御手段は、細胞捕捉時には前記第二の流れの流量よりも前記第一の流れの流量が大きくなるように制御し、生体分子捕捉時には前記第一の流れの流量よりも前記第二の流れの流量が大きくなるように制御することを特徴とする一細胞内生体分子捕捉用システム。
【請求項７】
前記構造体の高さ及び幅がそれぞれ２０μｍ以下である、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
前記第一の流れによって前記第１の方向の下流側に排出された前記複数の細胞を再び前記複数の細胞を含むサンプルを流す流路に戻す手段をさらに有する、請求項６に記載のシステム。
【請求項９】
複数の細胞を含むサンプルから各一細胞内の生体分子を捕捉する方法であって、
請求項１に記載のデバイス又は請求項６に記載のシステムを準備する工程、
前記デバイス又はシステムの流路から、測定対象の複数の細胞を含むサンプルを流し、二次元アレイの基板の一面に対し平行な流れを発生させ、前記二次元アレイ上の一細胞捕捉孔に細胞を捕捉する工程、
前記基板の一面に対し平行な流れを発生させ、前記二次元アレイ上を洗浄する工程、
前記基板の一面に対し垂直な流れを発生させ、前記捕捉された細胞を溶解し、生体分子を二次元アレイの生体分子捕捉体に捕捉する工程
を含むことを特徴とする一細胞内生体分子捕捉方法。
【請求項１０】
前記生体分子が核酸である、請求項９に記載の方法。
【国際調査報告】
2017168493.tif 000015
2017168493.tif 000016
2017168493.tif 000017
2017168493.tif 000018