(57)【要約】  本発明は、接着型細胞を、脂環構造含有重合体製培養容器内において液体培地中で培養し、タンパク質分解酵素を添加せず、液流によって細胞を培養容器から剥離して、培養された細胞を液体培地中に懸濁することを特徴とする接着型細胞の培養方法である。脂環構造含有重合体製培養容器への細胞接着は緩い接着であるため、ピペッティング等の弱い力で細胞を容易に剥離することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着型細胞を、脂環構造含有重合体製培養容器内において液体培地中で培養し、タンパク質分解酵素を添加せず、液流によって細胞を培養容器から剥離して、培養された細胞を液体培地中に懸濁することを特徴とする接着型細胞の培養方法。
【請求項２】
前記接着型細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１記載の接着型細胞の培養方法
【請求項３】
前記脂環構造含有重合体製培養容器の細胞と接する底面の水接触角が、８５°以上１１０°以下である、請求項１又は２に記載の接着型細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプシン等のタンパク質分解酵素を用いず、ピペッティングやボルテックス等の弱い物理作用のみで培養細胞を培地に懸濁することができる接着型細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、接着型細胞の培養においては、細胞がコンフルエントな状態になると、細胞培養容器底面に接着した細胞を、トリプシン等のタンパク質分解酵素を用いて剥離し、別の容器に移動させる操作が採用されている。しかしながら、トリプシンによる細胞へのダメージやトリプシンの由来となる動物等からのウイルス感染等の問題から、タンパク質分解酵素を用いない細胞培養方法が検討されている（特許文献１〜４）。
しかしながら、これらいずれの方法も、細胞へのダメージを低減することはできるものの、新たな培養工程を要する等、生産性に劣るものであった。このほか、スクレイパー等を用いて細胞を物理的に培養容器底面から剥がす方法も行われているが、細胞の受けるストレスが大きすぎることが懸念されている。【０００３】
ところで、特許文献５には、シクロオレフィン樹脂製容器による細胞培養では、ポリスチレン製容器を用いた場合と比べて、細胞の増殖性が向上することが報告されている。実施例においては、抗ＣＤ３抗体やレトロネクチン等のタンパク質をコートした環境下で、接着型細胞ではない血球系細胞の増殖性が向上していることが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−０９１８７２号公報
【特許文献２】特開平５−１９２１３８号公報
【特許文献３】特開平７−３１３１５１号公報
【特許文献４】特開２０１２−２３５７６４号公報
【特許文献５】特開２００８−０４８６５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上述した実情に鑑みてなされたものであり、トリプシン等のタンパク質分解酵素を用いず、ピペッティングやボルテックス等の弱い物理作用のみで培養細胞を培地に懸濁することができる接着型細胞の培養方法を提供することを目的とする。
法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決すべく、本発明者らは、より簡便に、培養された接着型細胞を別の容器に移動させることのできる方法を検討した。その結果、培養容器として、脂環構造含有重合体製培養容器を用いると、通常接着型細胞をトリプシン等のタンパク質分解酵素処理後に行っている剥離工程で実施するピペッティング操作のみで、トリプシン等のタンパク質分解酵素処理を行わずに細胞へのダメージを抑制し、細胞を別の容器に移動することができ、しかも、細胞のロスが非常に少ないことも見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
かくして本発明によれば、接着型細胞を、脂環構造含有重合体製培養容器内において液体培地中で培養し、タンパク質分解酵素を添加せず、液流によって細胞を培養容器から剥離して、培養された細胞を液体培地中に懸濁することを特徴とする接着型細胞の培養方法が提供される。
本発明においては、前記接着型細胞はＣＨＯ細胞であることが好ましい。また、前記脂環構造含有重合体製培養容器の細胞と接する底面の水接触角が、８５°以上１００°以下であることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、継代２回目を終えた時点での生細胞数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、接着型細胞を、脂環構造含有重合体製培養容器内において液体培地中で培養し、タンパク質分解酵素を添加せず、液流によって細胞を培養容器から剥離して、培養された細胞を液体培地中に懸濁することを特徴とする接着型細胞の培養方法である。
すなわち、本発明の方法は、接着型細胞を、脂環構造含有重合体製容器で培養することで、培養細胞を簡便に別の容器に移動させることができるものである。
【００１０】
本発明に係る接着型細胞は、特に限定されず、目的に応じて任意に選択することができる。本発明において、接着型細胞とは接着型細胞そのものであっても、接着型細胞由来の細胞であってもよい。接着型細胞そのものとは、通常の培養条件において、細胞外基質に接着することで生存及び増殖が可能な細胞のことで、足場依存性細胞とも言われる細胞である。接着型細胞由来の細胞とは、接着型細胞を馴化培養し浮遊状態でも生存と増殖が可能になった細胞等、接着型細胞に何らかの外的要因を与えることで細胞外基質に接着しなくても生存し、かつ増殖が可能な細胞である。
接着型細胞としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスタ−の卵巣；Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ）細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞等に代表される、遺伝子操作の宿主細胞や、ワクチン製剤や遺伝子導入用製剤のためのウイルスの増殖回収及び生産用の細胞や、各種幹細胞や幹細胞から分化誘導された非血球系細胞等が挙げられる。
【００１１】
また、本発明においては、これらの接着型細胞に、ファージやプラスミドのベクター等を用いた形質導入等によって、外来遺伝子を発現することのできる様になった接着型細胞であってもよい。  
ここで外来遺伝子は、目的に応じて任意に選択することができる。具体的には、エリスロポエチン（以下、「ＥＰＯ」という）、インターフェロン（α、β、γ）、顆粒球コロニー刺激因子Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキン、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ、人成長ホルモン、インスリン、グルカゴンＨＧＦ、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、ヒト型抗体等のサイトカインやホルモンのような生理活性タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
これらの接着型細胞のなかでも、本発明のより優れた効果が得られる観点から、ＣＨＯ細胞が好ましい。
【００１２】
本発明において、細胞を培養する際には液体培地が用いられる。
液体培地としては、通常、ｐＨ緩衝作用があり、浸透圧が細胞に好適なものであり、細胞の栄養成分を含み、かつ、細胞に対して毒性がないものが用いられる。
液体培地にｐＨ緩衝作用を付与する成分としては、トリス塩酸塩、各種リン酸塩、各種炭酸塩等が挙げられる。
液体培地の浸透圧調整は、通常、細胞の浸透圧とほぼ同じになるように、カリウムイオン、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、グルコース等の濃度を調整した水溶液を用いて行われる。かかる水溶液としては、具体的には、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝生理食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等の生理食塩水；乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液等のリンゲル液；等が挙げられる。
細胞の栄養成分としては、アミノ酸、核酸、ビタミン類、ミネラル類等が挙げられる。
液体培地としては、ＲＰＭＩ−１６４０、ＨＡＭ、α−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、
Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等の各種市販品を利用することができる。
【００１３】
液体培地には、添加剤を配合することもできる。
用いる添加剤としては、タンパク質等の誘導因子；分化誘導活性を有する低分子化合物；ペプチド；ミネラル；金属；ビタミン成分；細胞表面の受容体に作用する、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；核内受容体の、リガンド、アゴニスト、アンタゴニスト；コラーゲンやファイブネクチン等の細胞外マトリックス；細胞外マトリックスの一部分あるいは、細胞外マトリックスを模擬した化合物；細胞内の情報伝達経路に関わるタンパク質に作用する成分；細胞内の１次代謝又は２次代謝の酵素に作用する成分；細胞内の核内又はミトコンドリア内の遺伝子の発現に影響を与える成分；ウィルスベクター等と組み合わせて細胞内に導入することができるＤＮＡやＲＮＡ；等が挙げられる。
これらの添加剤は一種単独で、あるいは二種以上を組み合わせて用いることができる。
【００１４】
細胞の培養条件は特に限定されず、用いる細胞や目的に応じて適宜決定することができる。例えば、二酸化炭素濃度が５％程度で、温度が２０℃〜３７℃の範囲で一定に維持された、加湿された恒温器を用いて細胞を培養することができる。
【００１５】
本発明に用いる脂環構造含有重合体製培養容器は、脂環構造含有重合体を任意の形状に成形してなるものである。
脂環構造含有重合体は、主鎖及び／又は側鎖に脂環構造を有する樹脂であり、機械的強度、耐熱性等の観点から、主鎖に脂環構造を含有するものが好ましい。
【００１６】
前記脂環構造としては、飽和環状炭化水素（シクロアルカン）構造、不飽和環状炭化水素（シクロアルケン）構造等が挙げられるが、機械的強度、耐熱性等の観点から、シクロアルカン構造やシクロアルケン構造が好ましく、中でもシクロアルカン構造を有するものが最も好ましい。
【００１７】
脂環構造を構成する炭素原子数は、格別な制限はないが、通常４〜３０個、好ましくは５〜２０個、より好ましくは５〜１５個である。脂環構造を構成する炭素原子数がこの範囲内であるときに、機械的強度、耐熱性、及び成形性の特性が高度にバランスされ、好適である。
【００１８】
脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常３０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％である。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位の割合が過度に少ないと耐熱性に劣り好ましくない。脂環構造含有重合体中の脂環構造を有する繰り返し単位以外の残部は、格別な限定はなく、使用目的に応じて適宜選択される。
【００１９】
脂環構造含有重合体の具体例としては、（１）ノルボルネン系重合体、（２）単環の環状オレフィン系重合体、（３）環状共役ジエン系重合体、及び、（４）ビニル脂環式炭化水素系重合体等が挙げられる。これらの中でも、耐熱性、機械的強度等の観点から、ノルボルネン系重合体が好ましい。
【００２０】
（１）ノルボルネン系重合体
ノルボルネン系重合体は、ノルボルネン骨格を有する単量体であるノルボルネン系単量体を重合してなるものであり、開環重合によって得られるものと、付加重合によって得られるものに大別される。
【００２１】
開環重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の開環重合体及びノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体、並びにこれらの水素化物等が挙げられる。
付加重合によって得られるものとしては、ノルボルネン系単量体の付加重合体及びノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体等が挙げられる。
これらの中でも、ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物、ノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体、及び当該付加重合体の水素添加物等の飽和ノルボルネン系重合体が、耐熱性、機械的強度等の観点から好ましく、細胞の剥離のしやすさから、とりわけ極性基を有しないものが好ましい。ここで、極性基とは、極性のある原子団のことをいう。極性基としては、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、酸無水物基等が挙げられる。
【００２２】
ノルボルネン系単量体としては、ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン（慣用名：ノルボルネン）、５−メチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５，５−ジメチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−エチリデン−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−ビニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−プロペニルビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−シアノビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン、５−メチル−５−メトキシカルボニル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−エン等の２環式単量体；トリシクロ［４．３．０１，６．１２，５］デカ−３，７−ジエン（慣用名：ジシクロペンタジエン）、２−メチルジシクロペンタジエン、２，３−ジメチルジシクロペンタジエン、２，３−ジヒドロキシジシクロペンタジエン等の３環式単量体；テトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン（テトラシクロドデセン）、テトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−エチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−エチリデンテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８，９−ジメチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−エチル−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−エチリデン−９−メチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、８−メチル−８−カルボキシメチルテトラシクロ［４．４．０．１２，５．１７，１０］−３−ドデセン、７，８−ベンゾトリシクロ［４．３．０．１２，５］デカ−３−エン（慣用名：メタノテトラヒドロフルオレン：１，４−メタノ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレンともいう）、１，４−メタノ−８−メチル−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−クロロ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン、１，４−メタノ−８−ブロモ−１，４，４ａ，９ａ−テトラヒドロフルオレン等の４環式単量体；等が挙げられる。
【００２３】
ノルボルネン系単量体と開環共重合可能なその他の単量体としては、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン、１，４−シクロヘキサジエン、１，５−シクロオクタジエン、１，５−シクロデカジエン、１，５，９−シクロドデカトリエン、１，５，９，１３−シクロヘキサデカテトラエン等の単環のシクロオレフィン系単量体が挙げられる。
これらの単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
【００２４】
ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、エチレン、プロピレン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン等の炭素数２〜２０のα−オレフィン系単量体；シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロオクテン、テトラシクロ［９．２．１．０２，１０．０３，８］テトラデカ−３，５，７，１２−テトラエン（３ａ，５，６，７ａ−テトラヒドロ−４，７−メタノ−１Ｈ−インデンとも言う）等のシクロオレフィン系単量体；１，４−ヘキサジエン、４−メチル−１，４−ヘキサジエン、５−メチル−１，４−ヘキサジエン、１，７−オクタジエン等の非共役ジエン系単量体；等が挙げられる。
これらの中でも、ノルボルネン系単量体と付加共重合可能なその他の単量体としては、α−オレフィン系単量体が好ましく、エチレンがより好ましい。
これらの単量体は、置換基を１種又は２種以上有していてもよい。置換基としては、アルキル基、アルキレン基、アリール基、シリル基、アルコキシカルボニル基、アルキリデン基等が挙げられる。
【００２５】
ノルボルネン系単量体の開環重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと開環共重合可能なその他の単量体との開環重合体は、単量体成分を、公知の開環重合触媒の存在下で重合して得ることができる。開環重合触媒としては、例えば、ルテニウム、オスミウム等の金属のハロゲン化物と、硝酸塩又はアセチルアセトン化合物、及び還元剤とからなる触媒、あるいは、チタン、ジルコニウム、タングステン、モリブデン等の金属のハロゲン化物又はアセチルアセトン化合物と、有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
ノルボルネン系単量体の開環重合体水素化物は、通常、上記開環重合体の重合溶液に、ニッケル、パラジウム等の遷移金属を含む公知の水素化触媒を添加し、炭素−炭素不飽和結合を水素化することにより得ることができる。
【００２６】
ノルボルネン系単量体の付加重合体、又はノルボルネン系単量体とこれと共重合可能なその他の単量体との付加重合体は、単量体成分を、公知の付加重合触媒の存在下で重合して得ることができる。付加重合触媒としては、例えば、チタン、ジルコニウム又はバナジウム化合物と有機アルミニウム化合物とからなる触媒を用いることができる。
【００２７】
（２）単環の環状オレフィン系重合体
単環の環状オレフィン系重合体としては、例えば、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテン等の、単環の環状オレフィン系単量体の付加重合体等が挙げられる。
（３）環状共役ジエン系重合体
環状共役ジエン系重合体としては、例えば、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン等の環状共役ジエン系単量体を１，２−又は１，４−付加重合した重合体及びその水素化物等が挙げられる。
（４）ビニル脂環式炭化水素重合体
ビニル脂環式炭化水素重合体としては、例えば、ビニルシクロヘキセン、ビニルシクロヘキサン等のビニル脂環式炭化水素系単量体の重合体及びその水素化物；スチレン、α−メチルスチレン等のビニル芳香族系単量体の重合体の芳香環部分の水素化物；等が挙げられる。
ビニル脂環式炭化水素重合体は、これらの単量体と共重合可能な他の単量体との共重合体であってもよい。
これらの脂環構造含有重合体は、それぞれ単独で、あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００２８】
脂環構造含有重合体の分子量に格別な制限はないが、シクロヘキサン溶液（重合体が溶解しない場合はトルエン溶液）のゲル・パーミエーション・クロマトグラフィーで測定したポリスチレン換算の重量平均分子量で、通常５，０００以上であり、好ましくは５，０００〜５００，０００、より好ましくは８，０００〜２００，０００、特に好ましくは１０，０００〜１００，０００である。重量平均分子量がこの範囲内であるときに、機械的強度と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
【００２９】
脂環構造含有重合体のガラス転移温度は、使用目的に応じて適宜選択されればよいが、通常５０〜３００℃、好ましくは１００〜２８０℃、特に好ましくは１１５〜２５０℃、さらに好ましくは１３０〜２００℃である。ガラス転移温度がこの範囲内であるときに、耐熱性と成形加工性とが高度にバランスし、好適である。
本発明においてガラス転移温度は、ＪＩＳ  Ｋ  ７１２１に基づいて測定されたものである。
【００３０】
脂環構造含有重合体には、熱可塑性樹脂材料で通常用いられている配合剤、例えば、軟質重合体、酸化防止剤、紫外線吸収剤、光安定剤、近赤外線吸収剤、離型剤、染料や顔料等の着色剤、可塑剤、帯電防止剤、蛍光増白剤等の配合剤を、通常採用される量、添加することができる。
また、脂環構造含有重合体には、軟質重合体以外のその他の重合体（以下、単に「その他の重合体」という）を混合しても良い。脂環構造含有重合体に混合されるその他の重合体の量は、脂環構造含有重合体１００重量部に対して、通常２００重量部以下、好ましくは１５０重量部以下、より好ましくは１００重量部以下である。
脂環構造含有重合体に対して配合する各種配合剤やその他の重合体の割合が多すぎると細胞が浮遊し難くなるため、いずれも脂環構造含有重合体の性質を損なわない範囲で配合することが好ましい。
【００３１】
脂環構造含有重合体と、配合剤やその他の重合体との混合方法は、ポリマー中に配合剤が十分に分散する方法であれば、特に限定されない。また、配合順序に格別な制限はない。混合方法としては、例えば、ミキサー、一軸混練機、二軸混練機、ロール、ブラベンダー、押出機等を用いて樹脂を溶融状態で混練する方法、適当な溶剤に溶解して分散させた後、凝固法、キャスト法、又は直接乾燥法により溶剤を除去する方法等が挙げられる。二軸混練機を用いる場合、混練後は、通常は溶融状態で棒状に押出し、ストランドカッターで適当な長さに切り、ペレット化して用いられることが多い。
【００３２】
脂環構造含有重合体製培養容器の成形方法は、培養容器の形状に応じて任意に選択することができる。成形方法の具体例としては、射出成形法、押出成形法、キャスト成形法、インフレーション成形法、ブロー成形法、真空成形法、プレス成形法、圧縮成形法、回転成形法、カレンダー成形法、圧延成形法、切削成形法、紡糸等が挙げられ、これらの成形法を組み合わせたり、成形後必要に応じて延伸等の後処理をすることもできる。
【００３３】
本発明に用いる脂環構造含有重合体製培養容器は、少なくとも細胞が接触する面が脂環構造含有重合体で形成されたものであればよく、全体が脂環構造含有重合体で形成されたものでなくてもよい。また、脂環構造含有重合体を構成部材の一部として含む容器であってもよいし、脂環構造含有重合体で全体が構成された容器であってもよいし、脂環構造含有重合体成形体と他の重合体成形体との積層体で構成された容器であってもよい。
【００３４】
細胞が接触する脂環構造含有重合体製培養容器の形状に格別な制限はなく、板状、シート状等が挙げられ、また、その表面は平らであっても、凹凸形状を有していてもよい。具体的な容器の形状としては、ディッシュ、プレート、バッグ、チューブ、スキャホールド、カップ、ジャー・ファーメンター等が挙げられる。
【００３５】
本発明においては、脂環構造含有重合体製培養容器は、滅菌処理されたものであることが好ましい。
滅菌処理の方法に格別な制限はなく、高圧蒸気法や乾熱法等の加熱法、γ線や電子線等の放射線を照射する放射線法、高周波を照射する照射法、酸化エチレンガス（ＥＯＧ）等のガスを接触させるガス法、滅菌フィルタを用いる濾過法等、医療分野で一般的に採用される方法から、成形体の形状や用いる細胞に応じて、選択することができる。なかでも、表面状態の変化が少ないことから、ガス法が好ましい。
【００３６】
また、これらの成形体表面は、プラズマ処理、コロナ放電処理、オゾン処理、紫外線照射処理等の、培養容器に対して一般的に施す滅菌目的以外の処理を行うこともできる。ただし、これらの表面処理操作を施すことにより発生する費用を抑えることができることや、表面処理に伴う形成体表面の部分分解により清浄性が損なわれるおそれがあること、細胞の剥離性が低下するおそれがあること等の理由から、脂環構造含有重合体製培養容器の細胞と接する底面の水接触角は、８５°以上１１０°以下であることが好ましく、８５°以上１０５°以下であることがより好ましく、８５°以上１００°以下であることが特に好ましい。ここで、水接触角は、公知の全自動接触角計（例えば、協和界面科学社製「ＬＣＤ−４００Ｓ」）を用い、ディッシュ底面をφ３０ｍｍのサークルカッターで切り取って試料の中心と、そこを中央とする１辺２０ｍｍの正方形の頂点４か所、計５か所を測定点とし、液滴の半径ｒと高さｈを求め、ｔａｎθ１＝ｈ／ｒ、θ＝２ａｒｃｔａｎ（ｈ／ｒ）で求められるθである（θ／２法）。
【００３７】
培養された細胞を液体培地中に懸濁させるためには、培養容器に接着している細胞を剥離することを要する。脂環構造含有重合体製培養容器で培養された接着型細胞は、ポリスチレン製容器で培養された接着型細胞のように伸展した状態で接着しているのではなく、比較的球形を保った状態で接着しているため、小さな力を加えることで容易に剥離することができる。従って、本発明において細胞の剥離は、液流のみを用いて行う。細胞を剥離するに当たっては、タンパク質分解酵素も、細胞に直接力を与えるスクレイパー等の器具も必要としない。
【００３８】
液流は、液体培地又は液体培地を構成する液体を運動させることにより培養された細胞に加えられる作用によって発生させることができる。具体的には、ピペッティング操作等による吸入と吐出、ボルテックス操作や超音波処理等による振動や攪拌、小型ポンプ等を利用した循環等、意図的に細胞容器内の液体に力を加える方法が挙げられる。
【００３９】
液流をおこすための液体は、培養に用いている培養容器内の液体培地に限らず、生理食塩水や新たな培地、培養に用いているのとは異なる培地や、緩衝液や緩衝液に培地の一部の成分を溶解したもの等培地を構成する液体成分であっても良い。培養に用いている培養容器内の液体培地以外のものを用いる場合、培養容器に存在している元々の培地の一部又は全部を除去してもよいし、もちろん元々の培地存在下に追加してもよい。
【００４０】
本発明の方法は、自動分注装置のマルチチャンネルヘッドを用いての複数チャンネル、あるいは、単一チャンネルでピペッティングによる液体操作を行うことに適用してもよく、アーム型ロボットやヒト型ロボットでのピペッティング操作での液体操作に適用することができる。また、細胞培養用のアイソレーター装置内での細胞培養の操作に適用することができる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４２】
〔実施例１〕
脂環構造含有重合体として、ノルボルネン系開環重合体水素化物〔ゼオノア（登録商標）１０６０Ｒ（日本ゼオン社製）を用いて、射出形成法により、直径３５ｍｍのシャーレ状の培養容器を得た（以下、この培養容器を「１０６０Ｒ製ディッシュ」という）。
次いで、１０６０Ｒ製ディッシュのエチレンオキサイド滅菌処理を行った。１０６０Ｒ製ディッシュの底面（細胞と接触する側）の水接触角は、９０°であった。
培養容器として１０６０Ｒ製ディッシュを使用し、液体培地として１０％牛胎児血清を含むＨａｍ培地を使用して、ＣＨＯ細胞を２．８７８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種して、５％ＣＯ２雰囲気３７℃の条件でコンフルエントな状態になるまで培養した。この細胞を回収し、同じ条件で３日ごとに２回継代培養を行った。継代に当たっては、培養容器内の培養液を３０回（０．５ｍＬ）ピペッティングして、培養容器底面全体に液流による力を与え細胞を剥離した。細胞が懸濁している培養液を、１０倍に希釈して継代した。希釈はＨａｍ培地を用いた。
継代を２回行い３日培養した時点で、培養液を３０回（０．５ｍＬ）ピペッティングして細胞を剥離し、以下の方法により、細胞数を計測した。
（細胞数の計測）
浮遊状態にある細胞については、培養上清を試料とし、試料をトリパンブルー染色することで生細胞と死滅細胞を区別して、細胞数を計測した。
一方、１０６０Ｒ製ディッシュ底面に接着している細胞は、生理食塩水で洗浄後、トリプシン処理により、１０６０Ｒ製ディッシュから細胞を剥離した後、これらをトリパンブルー染色して生細胞と死細胞を区別して、細胞数を計測した。【００４３】
〔参考例１〕
７９０Ｒ製ディッシュに代えて、ポリスチレン製ディッシュ〔ファルコン（登録商標）ディッシュ（ベクトンデッキンソン社製、型番３５３００１）〕を使用し、ピペッティング前にトリプシン処理を行ったこと以外は、実施例１と同様にして培養を行い、細胞数を計測した。【００４４】
参考例１のポリスチレン製ディッシュの生細胞の合計数を１としたとき、実施例１の１０６０Ｒ製ディッシュの生細胞の合計数を図１に示す。
この結果から、１０６０Ｒ製ディッシュで培養したＣＨＯ細胞は、ピペッティングにより培養容器から容易に剥がれるため、継代により細胞が順調に増加し、通常の方法、即ちポリスチレン製ディッシュで培養し、トリプシン処理で細胞を剥離して継代する方法と同等の継代培養ができることが分かる。【００４５】
〔比較例１〕
１０６０Ｒ製ディッシュに代えて、ポリスチレン製ディッシュを使用したことを除き、実施例１と同様にして継代培養を行ったが、ピペッティングによっては殆ど細胞が剥離せず、１回目の継代で殆ど細胞を確保できず、２回目の継代では生細胞が確認できなかった。
【図１】
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【国際調査報告】
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