(57)【要約】  この人工三次元組織製造方法は、側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、対向する側壁を貫いて培養空間に所定方向に沿って懸架された流路形成部材とを備えた灌流デバイスを準備することと、培養空間で第１細胞を培養して、流路形成部材が貫く第１組織層を形成することと、第１組織層から流路形成部材を抜去して第１組織層を貫通する灌流流路を形成することと、灌流流路に培地を灌流させながら第１組織層上に配置した第２細胞を培養して第２組織層を形成することと、少なくとも第２細胞の培養時に、第１組織層および第２組織層に伸展と圧縮との少なくとも一方の刺激を付与することと、を含む。
2017126532.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（灌流流路＋伸展or圧縮）
所定方向に延びる人工三次元組織の製造方法であって、
側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、対向する前記側壁を貫いて前記培養空間に前記所定方向に沿って懸架された流路形成部材とを備えた灌流デバイスを準備することと、
前記培養空間で第１細胞を培養して、前記流路形成部材が貫く第１組織層を形成することと、
前記第１組織層から前記流路形成部材を抜去して前記第１組織層を貫通する灌流流路を形成することと、
前記灌流流路に培地を灌流させながら前記第１組織層上に配置した第２細胞を培養して第２組織層を形成することと、
少なくとも前記第２細胞の培養時に、前記第１組織層および前記第２組織層に伸展と圧縮との少なくとも一方の刺激を付与することと、
を含むことを特徴とする人工三次元組織の製造方法。
【請求項２】
前記刺激を所定の周波数で付与することを特徴とする請求項１記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項３】
前記対向する側壁にそれぞれ設けた係合部に前記第１組織層の一部を係合させて前記所定方向への収縮を抑えながら前記第１組織層を形成することを特徴とする請求項１または２記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項４】
前記培養槽を可撓性材料で形成し、
前記対向する側壁を前記所定方向に撓ませることにより、前記係合部を介して前記刺激を付与することを特徴とする請求項３記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項５】
前記第１細胞を培養して前記第１組織層を形成することは、細胞外マトリックス成分中の真皮細胞を培養して真皮組織層を形成することを含み、
前記第２細胞を培養して前記第２組織層を形成することは、前記真皮組織層上に表皮細胞を配置し表皮層を形成することを含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項６】
前記刺激を付与することにより、前記表皮層の表面に前記刺激の付与方向に応じた方向に延びる皺部を形成することを特徴とする請求項５記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項７】
前記培養槽の底部に、前記所定方向に沿って延びる生体モデルの一部である曲面部を設け、
前記人工三次元組織を前記曲面部上に形成することを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の製造方法で人工三次元組織を製造することと、
薬剤を前記人工三次元組織に接触させることと、
前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工三次元組織の応答、または前記人工三次元組織に対する前記薬剤の浸透性を測定することと、
を含むことを特徴とする人工三次元組織を用いた薬剤評価方法。
【請求項９】
所定方向に延びる人工三次元組織に灌流が行われる人工三次元組織灌流デバイスであって、
側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、
対向する前記側壁を貫いて前記培養空間における前記人工三次元組織を配置する領域に前記所定方向に沿って懸架される流路形成部材を取り付けおよび取り外し自在に支持する支持部と、
前記対向する側壁のそれぞれに設けられ、前記人工三次元組織に係合して前記人工三次元組織の前記所定方向への収縮を抑える係合部と、
前記人工三次元組織に伸展と圧縮との少なくとも一方の刺激を付与する刺激付与部と、
を備えることを特徴とする人工三次元組織灌流デバイス。
【請求項１０】
前記培養槽の底部に、前記所定方向に沿って延びる生体モデルの一部である曲面部が設けられ、
前記人工三次元組織は前記曲面部上に配置されることを特徴とする請求項９記載の人工三次元組織灌流デバイス。
【請求項１１】
所定方向に延びる人工三次元組織であって、
内部を貫通し前記所定方向に延びる灌流流路と、
表面に前記所定方向に応じた方向に延びる皺部と、
を有することを特徴とする人工三次元組織。
【請求項１２】
細胞外マトリックス成分および真皮細胞を含む真皮組織層と、
表皮細胞を含み前記真皮組織層上に形成された表皮組織層とを含み、
前記灌流流路は、前記真皮組織層の内部を貫通し前記所定方向に延び、
前記皺部は、前記表皮組織層の表面に前記所定方向に応じた方向に延びて形成されていることを特徴とする請求項１１記載の人工三次元組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法に関する。
本願は、２０１６年１月２０日に出願された米国特許仮出願６２／２８０，７８４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
化粧品や薬品の試験、皮膚移植、ロボットへの搭載等に人工三次元組織の一つである人工皮膚組織は広く用いられている。特許文献１には、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、および真皮組織層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成して人工皮膚モデルを製造する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−２０５５１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
人工皮膚組織の構築には、気液界面における培養が必須であるが、特許文献１に記載された培養は、表皮層とは最も離れた位置に配置されたメンブレンフィルタを介して培地が供給されるため、養分供給の効率が十分とはいえず、例えば、生体移植時の生着率が低い低品質の人工皮膚組織が製造される可能性がある。また、上記の培養では、表皮層を厚くすることは困難であった。【０００５】
本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、高品質で表皮層が厚い人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様に従えば、所定方向に延びる人工三次元組織の製造方法であって、側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、対向する前記側壁を貫いて前記培養空間に前記所定方向に沿って懸架された流路形成部材とを備えたデバイスを準備することと、前記培養空間で第１細胞を培養して、前記流路形成部材が貫く第１組織層を形成することと、前記第１組織層から前記流路形成部材を抜去して前記第１組織層を貫通する灌流流路を形成することと、前記灌流流路に培地を灌流させながら前記第１組織層上に配置した第２細胞を培養して第２組織層を形成することと、少なくとも前記第２細胞の培養時に、前記第１組織層および前記第２組織層に伸展と圧縮との少なくとも一方の刺激を付与することと、を含むことを特徴とする人工三次元組織の製造方法が提供される。
伸展と圧縮との少なくとも一方の刺激を付与する方向としては、流路形成部材が懸架された方向（灌流流路方向）や、第１組織層と第２組織層とを積層方向に屈曲した場合の第１組織層および第２組織層の層方向を選択することができる。流路形成部材が懸架された方向に伸展と圧縮との少なくとも一方の刺激を付与する場合は、伸展と圧縮との少なくとも一方の刺激を直線に沿って付与する構成や、例えば、生体モデルの湾曲する表面に沿って流路形成部材を曲線状に配置して曲線状の灌流流路を形成し、伸展と圧縮との少なくとも一方の刺激を当該曲線に沿って付与する構成としてもよい。第１組織層と第２組織層とを屈曲させた場合、あるいは湾曲させた場合には、第１組織層および第２組織層のうち、例えば、屈曲中心あるいは湾曲中心に近い側の層に圧縮の刺激が付与され、遠い側の層に伸展の刺激が付与される。【０００７】
本発明の第２の態様に従えば、本発明の第１の態様の製造方法で人工三次元組織を製造することと、薬剤を前記人工三次元組織に接触させることと、前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工三次元組織の応答、または前記人工三次元組織に対する前記薬剤の浸透性を測定することと、を含むことを特徴とする人工三次元組織を用いた薬剤評価方法が提供される。【０００８】
本発明の第３の態様に従えば、所定方向に延びる人工三次元組織に灌流が行われる人工三次元組織灌流デバイスであって、側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、対向する前記側壁を貫いて前記培養空間における前記人工三次元組織を配置する領域に前記所定方向に沿って懸架される流路形成部材を取り付けおよび取り外し自在に支持する支持部と、前記対向する側壁のそれぞれに設けられ、前記人工三次元組織に係合して前記人工三次元組織の前記所定方向への収縮を抑える係合部と、前記人工三次元組織に伸展と圧縮との少なくとも一方の刺激を付与する刺激付与部と、を備えることを特徴とする人工三次元組織灌流デバイスが提供される。【０００９】
本発明の第４の態様に従えば、所定方向に延びる人工三次元組織であって、内部を貫通し前記所定方向に延びる灌流流路と、表面に前記所定方向に応じた方向に延びる皺部と、を有することを特徴とする人工三次元組織が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、高品質で表皮層が厚い人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法を提供することことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施の形態に係る人工皮膚組織１を模式的に示した斜視断面図である。
【図２】人工皮膚組織製造システム３０の概略的な構成図である。
【図３】灌流デバイス４０の第１実施形態の外観斜視図である。
【図４】伸展装置８０の図示を省略した灌流デバイス４０の外観斜視図である。
【図５】係合部４２ｃを軸方向で視た正面図である。
【図６】図５におけるＡ−Ａ線視断面図である。
【図７】人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図８】人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図９】人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図１０】人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図１１】人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図１２】人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図１３】人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図１４】人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図１５】人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図１６】伸展の刺激を付与した場合の結果と、付与しなかった場合の結果とを示す写真図である。
【図１７】培養された人工皮膚組織１の断面を示す写真図である。
【図１８】培養された人工皮膚組織１の断面を示す蛍光画像である。
【図１９】人工皮膚組織１の反発力測定を説明するための図である。
【図２０】表皮層に３００μｍの変位を生じさせた際の反発力を測定した結果を示す図である。
【図２１】表皮層に５００μｍの変位を生じさせた際の反発力を測定した結果を示す図である。
【図２２】本実施形態に係る人工皮膚組織１における表皮層２０の表面状態を示す写真図である。
【図２３】人工皮膚組織１の経皮吸収特性を計測する機構を概略的に示す図である。
【図２４】人工皮膚組織１の経皮吸収特性を計測した結果を示す図である。
【図２５】第２実施形態の灌流デバイス４０Ａの概略的な斜視図である。
【図２６】生体モデルＦの長さ方向を含む鉛直面で断面した図である。
【図２７】第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図２８】第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図２９】第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図３０】第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【図３１】第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法の実施の形態を、図１ないし図３１を参照して説明する。
本実施形態では、人工三次元組織として人工皮膚組織を製造する例を用いて説明する。
【００１３】
なお、以下の実施の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等を異ならせている。
【００１４】
（人工皮膚組織）
まず、本発明に係る人工皮膚組織について、図１を参照して説明する。
図１は、人工三次元組織である人工皮膚組織１を模式的に示した斜視断面図である。
人工皮膚組織１は、真皮組織層（第１組織層）１０と表皮層（第２組織層）２０とを含む。人工皮膚組織１は、真皮組織層１０と表皮層２０とが積層された方向（図１における上下方向、以下、積層方向と称する）と直交する平面に沿った所定方向（図１における左右方向、以下、第１方向と称する）に延びて形成されている。
【００１５】
表皮層２０は、真皮組織層１０上に表皮細胞（第２細胞）２１を播種して培養することにより形成されたものである。表皮細胞２１としては、例えば、表皮角化細胞が使用できる。
【００１６】
表皮細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来表皮細胞が好ましい。ヒト由来表皮細胞としては、表皮角化細胞、表皮メラノサイトが挙げられ、表皮角化細胞が好ましい。表皮角化細胞としては、正常ヒト表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocytes：NHEK） が挙げられる。表皮メラノサイトとしては、正常ヒト表皮メラノサイト（Normal Human Epidermal Melanocytes：NHEM）が挙げられる。
【００１７】
真皮組織層１０は、細胞外マトリックス成分１１中の真皮細胞（第１細胞）１２を培養することにより形成されたものである。細胞外マトリックス成分１１としては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。真皮細胞１２としては、例えば、線維芽細胞を用いることができる。
【００１８】
線維芽細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来線維芽細胞が好ましい。ヒト由来線維芽細胞としては、ヒト皮膚線維芽細胞（Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF）、ヒト肺線維芽細胞：Human Pulmonary Fibroblasts (HPF)、ヒト心臓線維芽細胞：Human Cardiac Fibroblasts (HCF)、ヒト大動脈外膜線維芽細胞：Human Aortic Adventitial Fibroblasts (HAoAF)、ヒト子宮線維芽細胞：Human Uterine Fibroblasts (HUF)、ヒト絨毛間葉系線維芽細胞：Human Villous Mesenchymal Fibroblasts (HVMF)等が挙げられ、ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）が好ましい。
【００１９】
真皮組織層１０は、真皮組織層１０の内部を貫通し第１方向のに延びる灌流流路１３を有している。灌流流路１３は、表皮細胞２１を培養する際に培地（詳細は後述）が灌流する流路である。灌流流路１３の表面には、血管系細胞１４を用いて形成された管腔層１５が設けられている。血管系細胞１４としては、例えば、内皮細胞を用いることができる。
【００２０】
血管系細胞としては、血管上皮細胞、血管内皮細胞等が挙げられ、血管内皮細胞が好ましい。血管内皮細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来血管内皮細胞が好ましい。ヒト由来血管内皮細胞としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC）、 ヒト臍帯動脈内皮細胞（Human Umbilical Artery Endothelial Cells：HUAEC） 、ヒト冠状動脈内皮細胞（Human Coronary Artery Endothelial Cells：HCAEC）、 ヒト伏在静脈内皮細胞（Human Saphenous Vein Endothelial Cells：HSaVEC）、 ヒト肺動脈内皮細胞（Human Pulmonary Artery Endothelial Cells：HPAEC）、 ヒト大動脈内皮細胞（Human Aortic Endothelial Cells：HAoEC）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（Human Dermal Microvascular Endothelial Cells：HDMEC）、 ヒト皮膚血管内皮細胞（Human Dermal Blood Endothelial Cells：HDBEC）、 ヒト皮膚リンパ管内皮細胞（Human Dermal Lymphatic Endothelial Cells：HDLEC）、 ヒト肺微小血管内皮細胞（Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells：HPMEC）、 ヒト心臓微小血管内皮細胞（Human Cardiac Microvascular Endothelial Cells：HCMEC）、 ヒト膀胱微小血管内皮細胞（Human Bladder Microvascular Endothelial Cells：HBdMEC）、 ヒト子宮微小血管内皮細胞（Human Uterine Microvascular Endothelial Cells：HUtMEC）等が挙げられ、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）が好ましい。
【００２１】
（人工皮膚組織製造装置）
次に、上記の人工皮膚組織１を製造する人工皮膚組織製造装置について、図２乃至図６を参照して説明する。
図２は、人工皮膚組織製造装置３０の概略的な構成図である。
【００２２】
人工皮膚組織製造装置３０は、灌流デバイス（人工三次元組織灌流デバイス）４０、培養皿５０およびポンプ６０を備えている。培養皿５０は、内部空間に灌流デバイス４０が載置される。ポンプ６０は、配管６１を介して灌流デバイス４０に培地を供給する。ポンプ６０は、灌流デバイス４０を介して培養空間４５に排出された培地Ｍを、配管６２を介して回収する。
【００２３】
（灌流デバイス４０の第１実施形態）
図３は、灌流デバイス４０の第１実施形態の外観斜視図である。灌流デバイス４０は、培養槽４１、コネクタ（支持部）４２、ワイヤー（線状部材、流路形成部材）４３および伸展装置８０を備えている。図２に示すように、培養槽４１は、培養皿５０の内部に配置されている。図４は、伸展装置８０の図示を省略した灌流デバイス４０の外観斜視図である。
【００２４】
図３および図４に示すように、培養槽４１は、側壁４４に囲まれ上下方向に貫通する培養空間４５を有する四角筒状に形成されている。側壁４４は、平面視で矩形状に設けられている。培養槽４４は、シリコンゴム等の可撓性材料で形成されている。培養空間４５の下端部は、底板４７（図７参照）によって閉塞・開放が切り替え可能である。底板４７は、後述するように、対向する側壁４４ａ、４４ｂの間に取り付け・取り外し自在に設けられている。培養空間４５は、底板４７を取り外すことで下端部が開放され、底板４７を取り付けることで下端部が閉塞される。
【００２５】
図２に示すように、コネクタ４２は、装着部（筒部）４２ａ、接続部４２ｂ、係合部４２ｃおよび内部を貫通する貫通孔４２ｄを有している。装着部４２ａは軸状に形成され培養槽４１の側壁４４を貫通して装着されている。接続部４２ｂは、装着部４２ｂの一端に設けられている。接続部４２ｂは、培養槽４１の外側に配置され配管６１または配管６３（後述）に接続可能である。
【００２６】
係合部４２ｃは、装着部４２ｂの他端に設けられている。係合部４２ｃは、培養槽４１の培養空間４５に側壁４４と隙間をあけて配置されている。図５は、係合部４２ｃを軸方向で視た正面図である。図６は、図５におけるＡ−Ａ線視断面図である。図５および図６に示すように、係合部４２ｃは、装着部４２ａの外周面と隙間をあけて同軸で配置された第２筒部４２ｅと、装着部４２ａの周方向に間隔をあけて配置された複数のリブ部４２ｆとを備えている。リブ部４２ｆは、装着部４２ａの外周面と第２筒部４２ｅの内周面とを接続する。リブ部４２ｆは、９０度間隔で４つ設けられている。装着部４２ａ、第２筒部４２ｅおよびリブ部４２ｆで囲まれた隙間４２ｇは、係合部４２ｃを軸方向に貫通している。
【００２７】
コネクタ４２は、対向する側壁４４のそれぞれに貫通孔４２ｄが同軸となる位置に複数対（図４では６対）装着される。３対のコネクタ４２は、第１方向に沿って配置され、他の３対のコネクタ４２は、第１方向とで水平方向で直交する第２方向に沿って配置されている。コネクタ４２のうち、少なくとも培養空間４５に露出する領域には、細胞外マトリックス成分１１に対する親液化処理が施されている。親液化処理としては、例えば、Ｏ２プラズマ処理を採用できる。この親液化処理は、細胞の接着性を向上させる処理を兼ねている。
【００２８】
ワイヤー４３は、灌流流路１３を形成するために用いられる線状部材である。ワイヤー４３は、対向する側壁４４に同軸で装着されたコネクタ４２に取り付けおよび取り外し自在に支持される。ワイヤー４３は、コネクタ４２の貫通孔４２ｄに挿通（支持）されて培養空間４５の真皮組織層１０を配置する領域に懸架可能である。ワイヤー４３は、例えば、ポリアミド樹脂で形成されている。
【００２９】
図２および図３に示すように、伸展装置８０は、挟持部８１、８２、クランク部８３、回転モータ８４および基台８５を備えている。基台８５は、培養皿５０の上部に一体的に固定されている。
【００３０】
挟持部８１は、互いに対向する一対の側壁４４のうち、一方の側壁４４ａを厚さ方向の両側から挟持するように一体的に設けられている。挟持部８１は、側壁４４ａを高さ方向の全体に亘って挟持している。挟持部８１は、コネクタ４２が配置される領域に開口部８１ａを有している。挟持部８１に開口部８１ａが形成されていることにより、コネクタ４２は挟持部８１との干渉が回避されている。挟持部８１は、上端において基台８５に固定されている。
【００３１】
挟持部８２は、互いに対向する一対の側壁４４のうち、側壁４４ａと対向する側壁４４ｂを厚さ方向の両側から挟持するように一体的に設けられている。挟持部８２は、側壁４４ｂを高さ方向の全体に亘って挟持している。挟持部８２は、コネクタ４２が配置される領域に開口部８２ａを有している。挟持部８２に開口部８２ａが形成されていることにより、コネクタ４２は挟持部８２との干渉が回避されている。挟持部８２は、上端においてクランク部８３と連結されている。
【００３２】
クランク部８３は、長さ方向の一端側において、挟持部８２と、上下方向に延びる軸線周りに回転（揺動）可能に連結されている。クランク部８３は、長さ方向の他端側において、基台８５に固定された回転モータ８４と一体的に回転する回転部８４ａに、回転中心に対して偏心した位置で上記長さ方向について一体的に移動可能に連結されている。
【００３３】
従って、伸展装置８０は、回転モータ８４が回転することにより、クランク部８３が回転部８４ａとの連結部の長さ方向の位置に応じて当該長さ方向に往復移動可能である。クランク部８３が長さ方向に移動することにより、クランク部８３と連結され側壁４４ｂを挟持する挟持部８２は、上記長さ方向に移動する。一方、側壁４４ａを挟持する挟持部８１は、基台８５に固定されている。そのため、可撓性材料で形成された培養槽４１は、挟持部８２の移動に応じて側壁４４ａ、４４ｂが対向する方向（以下、単に対向方向と称する）に弾性変形することにより、側壁４４ｂが対向方向に移動する。側壁４４ｂが対向方向に移動することにより、側壁４４ａ、４４ｂに対向して設けられたコネクタ４２同士の距離が増減することになる。
【００３４】
（人工皮膚組織１の製造方法）
次に、人工皮膚組織１の製造方法について、図７乃至図１５を参照して説明する。
本発明に係る人工皮膚組織（人工三次元組織）１の製造方法は、所定方向に延びる人工三次元組織１の製造方法であって、側壁４４に囲まれた培養空間４５を有する培養槽４１と、対向する側壁４４を貫いて培養空間４５に所定方向に沿って懸架されたワイヤー（線状部材、流路形成部材）４３とを備えた灌流デバイス（人工三次元組織灌流デバイス、デバイス）４０を準備することと、培養空間４５で細胞外マトリックス成分１１中の真皮細胞１２を培養して、ワイヤー４３が貫く真皮組織層１０を形成することと、真皮組織層１０からワイヤー４３を抜去して真皮組織層１０を貫通する灌流流路１３を形成することと、灌流流路１３に培地を灌流させながら真皮組織層１０上に配置した表皮細胞２１を培養して表皮層２０を形成することと、少なくとも表皮細胞２１の培養時に、真皮組織層１０および表皮層２０に所定方向に沿った伸展と圧縮との少なくとも一方の刺激を付与することと、を含む。
【００３５】
以下、人工皮膚組織１の製造方法について詳細に説明する。
図７乃至図１５においては、適宜、灌流デバイス４０のみを図示し、培養皿５０、ポンプ６０等の図示を省略している。また、図７以降においては、便宜上、伸展装置８０における挟持部８１、８２の図示を適宜省略し、底板４７についても理解を容易にするために、側壁４４に対して取り付けまたは取り外すものとして図示および説明する。
【００３６】
（灌流デバイス４０の準備）
灌流デバイス４０の準備としては、図７に示すように、上記の培養槽４１の対向する側壁４４に貫通孔４２ｄが同軸となるようにコネクタ４２を装着するとともに、側壁４４の下端部に底板４７を取り付けて培養空間４５の下端側開口を閉塞する。同軸となっている貫通孔４２ｄにワイヤー４３を挿通し、培養空間４５にワイヤー４３を懸架させる。
【００３７】
コネクタ４２のうち、少なくとも培養空間４５に露出する領域に親液化処理を施す。親液化処理は、培養槽４１に装着する前にコネクタ４２に実施してもよいし、側壁４４に装着したコネクタ４２に対して実施してもよい。
【００３８】
側壁４４へのコネクタ４２の装着部の隙間、および底壁４６への底板４７の取付部の隙間をシールするために、シール材で培養空間４５に臨む培養槽４１の表面を被膜する。シール材としては、細胞外マトリックス成分１１、真皮細胞１２、表皮細胞２１に悪影響を与えない材料、一例として、ポリパラキシリレン（以下、パリレンと称する）が蒸着等の成膜方法により成膜される。シール材の膜厚としては、上記装着部の隙間および取付部の隙間に対して１／１００〜１／１０であることが好ましい。また、シール材の膜厚は、上記装着部の隙間および取付部の隙間に対して１／５０〜１／１０であることが好ましく、１／５０〜１／２０であることがより好ましい。本実施形態では、約５０μｍの隙間に対して２μｍの膜厚（１／２５）でシール材を成膜した。
【００３９】
（真皮組織層１０の形成）
灌流デバイス４０の準備が完了すると、真皮組織層１０を形成する。
真皮組織層１０の形成は、まず、図８に示すように、細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物を培養槽４１の培養空間４５に注ぎ込む。混合物は、ワイヤー４３が浸漬される高さとなる量で注ぎ込まれる。本実施形態では、細胞外マトリックス成分１１としてコラーゲンが用いられている。
【００４０】
細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物が培養槽４１に注ぎ込まれると、混合物を所定条件で培養（インキュベーション）する。培養条件としては、真皮組織層１０の密度がヒトの真皮相当となる条件で行う。培養条件は、一例として、３７℃の温度下で２日間（４８時間）行った。
【００４１】
培養によって細胞外マトリックス成分１１は収縮する。細胞外マトリックス成分１１は、係合部４２ｃに係合しているため、積層方向の収縮は拘束されないが、第１方向および第２方向の収縮は拘束される。より詳細には、図６に示されるように、細胞外マトリックス成分１１は、培養空間４５の中心とは逆側から係合部４２ｃの第２筒部４２ｅ、リブ部４２ｆに係合しているため、第２筒部４２ｅ、リブ部４２ｆが障壁となって中心側への収縮が抑制される。また、細胞外マトリックス成分１１は、積層方向への収縮により、第２筒部４２ｅの外周面、装着部４２ａの先端側の外周面に圧着されることになる。従って、細胞外マトリックス成分１１と係合部４２ｃとの間の摩擦力が大きくなり、第１方向および第２方向への収縮に対する抵抗力が大きくなる。特に、本実施形態では、係合部４２ｃが細胞外マトリックス成分１１に対する親液化処理が施されているため、細胞外マトリックス成分１１は、より大きな密着力で係合部４２ｃに密着し第１方向および第２方向への収縮に対する抵抗力が大きくなる。
【００４２】
細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物の培養が完了することにより、図９に示すように、積層方向が収縮し、第１方向および第２方向の収縮が抑制され、内部をワイヤー４３が貫く真皮組織層１０が形成される。
【００４３】
（灌流流路１３および管腔層１５の形成）
次に、コネクタ４２に支持されているワイヤー４３を抜去する。これにより、図１０に示すように、真皮組織層１０には、第１方向に延びる空洞である灌流流路１３が形成される。このとき、真皮組織層１０は、両端部において係合部４２ｃに係合しているため、ワイヤー４３の抜去時にコネクタ４２から脱離することなく安定してコネクタ４２に支持される。
【００４４】
次に、図１１に示すように、コネクタ４２の貫通孔４２ｄを介して、灌流流路１３に臨む真皮組織層１０の表面に血管系細胞１４を注入（播種）し一定時間培養することにより、管腔層１５を形成する。これにより、灌流流路１３は、管腔層１５に囲まれた状態となる。
【００４５】
（表皮層２０の形成）
次に、表皮層２０を形成するための準備を行う。
図１２に示すように、培養槽４１から底板４７を取り外すとともに、図２に示したように、培養槽４１を培養皿５０の内部に載置する。次いで、第１方向の一方側のコネクタ４２の接続部４２ｂに配管６１を接続し、第１方向の他方側のコネクタ４２の接続部４２ｂに配管６３を接続する。各側の接続部４２ｂに接続する配管６１または配管６３については３つのコネクタ４２全てに接続してもよいし、一部のみに接続してもよい。
【００４６】
表皮層２０を形成するための準備が完了すると、真皮組織層１０上に表皮細胞２１を播種する。表皮細胞２１が播種されると、ポンプ６０から配管６１および貫通孔４２ｄを介して培地Ｍを灌流流路１３に灌流させながら表皮細胞２１を培養する。表皮細胞２１の培養は、表皮細胞２１を気体に曝しながら、灌流流路１３の培地Ｍを真皮組織層１０を介して拡散させる気液培養により行われる。これにより、図１３に示すように、表皮細胞２１が分化誘導されて表皮層２０を形成することができる。表皮層２０を形成する際の培養条件は、一例として、３７℃の温度下で９日間行った。
【００４７】
一方のコネクタ４２を介して灌流流路１３に灌流された培地Ｍは、他方のコネクタ４２および配管６３を介して培養皿５０の内部空間に排出される。また、灌流流路１３から真皮組織層１０に拡散した培地Ｍの一部は、培養槽４１の開口部４６ａおよび溝部４６ｃを介して培養皿５０の内部空間に排出される。培養皿５０に排出された培地Ｍは、配管６２を介して回収される。ポンプ６０からの培地Ｍの供給量と、配管６２を介しての培地Ｍの回収量とは、表皮層２０の培養時に真皮組織層１０の下側が培地Ｍに浸漬され、表皮細胞２１が空気に曝されるように培養皿５０内の培地Ｍの液位が保たれる値に設定される。
【００４８】
表皮層２０を形成する際には、上述したように、伸展装置８０における回転モータ８４が回転しクランク部８３、挟持部８２および側壁４４ｂが長さ方向に移動することにより、側壁４４ｂに設けられたコネクタ４２が、固定状態の側壁４４ａに設けられたコネクタ４２に対して離間または接近する方向に移動する。回転モータ８４が回転したときにクランク部８３と回転部８４ａとの連結部が側壁４４ａから離れる方向に移動する際には、図１４に示すように、側壁４４ｂに設けられたコネクタ４２は、固定状態の側壁４４ａに設けられたコネクタ４２に対して離間する方向に移動するため、コネクタ４２に支持された真皮組織層１０および表皮層２０に対しては伸展の刺激が付与される。
【００４９】
一方、回転モータ８４が回転したときにクランク部８３と回転部８４ａとの連結部が側壁４４ａに接近する方向に移動する際には、図１５に示すように、側壁４４ｂに設けられたコネクタ４２は、固定状態の側壁４４ａに設けられたコネクタ４２に対して接近する方向に移動するため、コネクタ４２に支持された真皮組織層１０および表皮層２０に対しては、伸展の状態からの圧縮の刺激が付与される。
【００５０】
上記の真皮組織層１０および表皮層２０に対する伸展の刺激と、圧縮（または伸展からの解放）の刺激とは、所定の周波数で付与される。当該周波数としては、例えば、０．０３Ｈｚ以上、０．２５Ｈｚ以下が好ましい。周波数が上記下限値を下回る場合には、周期が長くなり刺激を付与した効果が十分に得られない可能性がある。周波数が上記上限値を上回る場合には、周期が短くなり所定厚さの表皮層２０が得られない可能性がある。
【００５１】
上記の真皮組織層１０および表皮層２０に対する伸展または圧縮させる量としては、側壁４４ａ、４４ｂに設けられたコネクタ４２間の距離に対して±２０％の歪量が好ましく、±１０％の歪量がより好ましい。
【００５２】
（評価方法）
本発明は、さらにその他の態様として、本発明の人工皮膚組織１を用いた薬剤の皮膚に対する刺激性を評価する方法に関する。本発明における薬剤とは、医薬品等の薬物、化粧品や医薬部外品等を含む。１本発明の評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して実際の皮膚に近い環境で薬剤の評価を行うことができる。また、本発明の評価方法は、例えば、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用である。
【００５３】
本発明の評価方法は、例えば、薬剤を前記人工皮膚組織と接触させること、及び、薬剤の接触による刺激に対する応答を測定することにより行うことができる。応答の測定は、例えば、経皮電気抵抗を測定すること等によって行うことができる。薬剤は、評価対象となる物質のことをいい、例えば、無機化合物及有機化合物等が挙げられる。
【００５４】
［実施例］
図１６（ａ）、（ｂ）は、上述の製造方法により真皮組織層１０上に表皮層２０が培養された人工皮膚組織１の断面を示す写真図である。図１６（ａ）は、上述した伸展の刺激を０．１Ｈｚ、歪量を±５％で付与した場合の結果を示す写真図である。図１６（ｂ）は、上述した伸展の刺激を付与しなかった場合の結果を示す写真図である。
【００５５】
図１６（ａ）、（ｂ）に示されるように、伸展の刺激を付与しなかった場合には、厚さが約２２μｍの表皮層が培養されたのに対して、伸展の刺激を付与した場合には、厚さが約５３μｍの表皮層が培養されたことを確認できた。
【００５６】
図１７（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、培地Ｍの灌流を行わない状態で真皮組織層１０上に表皮層２０を培養した人工皮膚組織１の断面を示す写真図である。図１７（ａ）は、伸展の刺激を０．０６Ｈｚ、歪量を±１０％で付与した場合の結果を示す写真図である。図１７（ｂ）は、伸展の刺激を０．１Ｈｚ、歪量を±１０％で付与した場合の結果を示す写真図である。図１７（ｃ）は、伸展の刺激を０．２Ｈｚ、歪量を±１０％で付与した場合の結果を示す写真図である。
【００５７】
図１７（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示されるように、伸展の刺激を０．０６Ｈｚで付与した場合には約１２４μｍの厚さで表皮層が培養され、伸展の刺激を０．１Ｈｚで付与した場合には約３９μｍの厚さで表皮層が培養され、伸展の刺激を０．２Ｈｚで付与した場合には約４３μｍの厚さで表皮層が培養されたことを確認できた。
【００５８】
図１８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、培地Ｍの灌流を行わない状態で真皮組織層１０上に表皮層２０を培養した人工皮膚組織１の断面を示す蛍光画像である。図１８（ａ）は、伸展の刺激を０．０６Ｈｚ、歪量を±１０％で付与した場合の結果を示す蛍光画像である。図１８（ｂ）は、伸展の刺激を０．１Ｈｚ、歪量を±１０％で付与した場合の結果を示す蛍光画像である。図１８（ｃ）は、伸展の刺激を０．２Ｈｚ、歪量を±１０％で付与した場合の結果を示す蛍光画像である。
【００５９】
図１８（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示されるように、表皮層２０のうち真皮組織層１０側にケラチン１５（Keratin15）で形成された基底部２０ａが培養され、表皮層２０のうち表面側にケラチン１０（Keratin10）で形成された表層部２０ｂが培養されたことを観察できた。
【００６０】
上述の製造方法により形成した人工皮膚組織１について、ロバスト性として反発力を測定した。反発力の測定は、図１９に示すように、灌流デバイス４０に支持された人工皮膚組織１の裏面側を支持し、表皮層２０を圧縮するフォースゲージＦＧを用い、人工皮膚組織１を所定量圧縮した際の反発力を測定した。
【００６１】
図２０は、上述した伸展の刺激を付与して形成した表皮層と、伸展の刺激を付与せずに形成した表皮層について、フォースゲージＦＧにより圧縮して３００μｍの変位を生じさせた際の反発力を測定した結果である。図２１は、上述した伸展の刺激を付与して形成した表皮層と、伸展の刺激を付与せずに形成した表皮層について、フォースゲージＦＧにより圧縮して５００μｍの変位を生じさせた際の反発力を測定した結果である。図２０に示されるように、伸展の刺激を付与して形成した表皮層は、変位３００μｍでは伸展の刺激を付与せずに形成した表皮層よりも２倍以上の反発力が計測された。また、図２１に示されるよに、伸展の刺激を付与して形成した表皮層は、変位５００μｍでは伸展の刺激を付与せずに形成した表皮層よりも１．６倍程度の反発力が計測された。いずれの場合についても、伸展の刺激を付与して表皮層を形成した場合は、伸展の刺激を付与しない場合と比較して大きな頑健性を有することが確認できた。
【００６２】
図２２は、培地Ｍの灌流を行わない状態で、伸展の刺激を０．２Ｈｚ、歪量を±１０％で付与して真皮組織層１０上に表皮層２０を培養した人工皮膚組織１における表皮層２０の表面状態を示す写真図である。図２２に示されるように、本実施形態の製造法で形成された表皮層２０の表面には、伸展方向および当該伸展方向と直交する方向に延びる皺部が形成されたことを確認できた。従って、本実施形態に係る人工皮膚組織１は、より人体に近い表皮層２０を有するものとなる。
【００６３】
図２３は、灌流デバイス４０を用いて人工皮膚組織１の経皮吸収特性を計測する機構を概略的に示す図である。図２３に示すように、人工皮膚組織１における表皮層２０上にはリザーバー４９が載置されている。経皮吸収特性の計測には、一例として、カフェインおよびＩＳＤＮ（二硝酸イソソルビド）を含む溶液Ｌを用いる。溶液Ｌには、一例として、９．４μｍｏｌのカフェインおよび３．８μｍｏｌのＩＳＤＮが含まれている。この溶液Ｌは、リザーバー４９に貯留される。
【００６４】
人工皮膚組織１の経皮吸収特性は、リザーバー４９から人工皮膚組織１を浸透して人工皮膚組織１の下方に到達した培地ＭＡと、リザーバー４９から人工皮膚組織１および灌流流路１３を浸透して灌流によりコネクタ４２の貫通孔４２ｄに到達した培地ＭＢとについて、カフェインおよびＩＳＤＮの物質量を計測した。また、灌流流路１３の内皮機能性を確認するために、血管内皮増殖因子の有無のそれぞれの状態で計測した。
【００６５】
図２４は、人工皮膚組織１の経皮吸収特性を計測した結果を示す図であり、灌流開始からの経過時間を横軸とし、培地ＭＡ、ＭＢの初期量を基準としたカフェインまたはＩＳＤＮの物質量を縦軸として示している。図２４（Ａ）には、培地ＭＡにおいて計測されたカフェインの物質量と時間との関係が示されている。図２４（Ｂ）には、培地ＭＡにおいて計測されたＩＳＤＮの物質量と時間との関係が示されている。図２４（Ｃ）には、培地ＭＢにおいて計測されたカフェインの物質量と時間との関係が示されている。図２４（Ｄ）には、培地ＭＢにおいて計測されたＩＳＤＮの物質量と時間との関係が示されている。各図においては、血管内皮増殖因子の有無毎（無；-□-、有；-●-で示されている）の関係が示されている。
【００６６】
図２４に示されるように、培地ＭＡ、ＭＢのいずれについてもカフェインおよびＩＳＤＮが計測されたことから、真皮組織層１０、表皮層２０、灌流流路１３のいずれも経皮吸収特性を有することが確認できた。また、培地ＭＡにおいては、血管内皮増殖因子が無い状態の方が有る状態よりも多くのカフェインおよびＩＳＤＮが計測され、培地ＭＢにおいては、血管内皮増殖因子が有る状態の方が無い状態よりも多くのカフェインおよびＩＳＤＮが計測されたことから灌流流路１３が内皮機能性を有することが確認できた。
【００６７】
（灌流デバイス４０Ａの第２実施形態）
続いて、灌流デバイス４０Ａの第２実施形態について、図２５乃至図３１を参照して説明する。
これらの図において、図１乃至図２４に示す第１実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略または簡略化する。
第１実施形態では平面状の人工皮膚組織１を製造する場合を例示したが、第２実施形態では、断面形状が曲面の人工皮膚組織１を製造する例を用いて説明する。
【００６８】
図２５は、培養槽４１に生体モデルＦが設けられた灌流デバイス４０Ａの概略的な斜視図である。生地モデルＦは、指を模したモデルである。図２６は、生体モデルＦの長さ方向（所定方向、第１方向）を含む鉛直面で断面した図である。図２７〜図３１は、生体モデルＦの長さ方向と直交する面で断面した図である。
【００６９】
図２６および図２７に示されるように、生体モデルＦは、背側の表面を曲面部７０として培養槽４１の底壁４６から培養空間４５に露出して設けられている。培養槽４１の底壁４６と生体モデルＦとの接合部は、細胞外マトリックス成分１１、真皮細胞１２、表皮細胞２１に悪影響を与えない材料、一例として、ポリパラキシリレン（以下、パリレンと称する）が蒸着等の成膜方法により成膜されてシールされている。ワイヤー４３は、第１方向に関する曲面部７０の傾斜に応じて、指先側が低くなるように懸架されている。図２７に示されるように、ワイヤー４３は、生体モデルＦの周方向に間隔をあけて複数（図２７では５本）設けられている。各ワイヤー４３と生体モデルＦとの距離は、ワイヤー４３と生体モデルＦとの間に形成される真皮組織層１０の厚さが所定値を確保できる距離に設定されている。なお、ワイヤー４３の本数は、表皮層２０の幅（周方向の長さ）に応じて適宜決定される。
【００７０】
なお、図２６および図２７では図示を省略しているが、ワイヤー４３の数に応じてコネクタ４２は、側壁４４に５対（合計１０本）設けられている。また、伸展装置８０における挟持部８１、８２は、図２６に示すように、対向する側壁４４ａ、４４ｂの上部をそれぞれ挟持している。
他の構成は、上記第１実施形態の灌流デバイス４０と同様である。
【００７１】
（人工皮膚組織１の製造方法）
続いて、上記の灌流デバイス４０Ａを用いて人工皮膚組織１を製造する方法について説明する。ここでは、灌流デバイス４０Ａの準備は完了しているものとして説明する。
まず、真皮組織層１０を形成するために、図２７に示すように、細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物を培養槽４１の培養空間４５に注ぎ込む。混合物は、ワイヤー４３が浸漬される高さとなる量で注ぎ込まれる。
【００７２】
細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物が培養槽４１に注ぎ込まれると、混合物を所定条件で培養する。培養された細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物は、ワイヤー４３が懸架された方向の収縮が抑えられ、他の方向については収縮するため、図２８に示されるように、曲面部７０に沿った形状の真皮組織層１０が形成される。
【００７３】
次に、ワイヤー４３を抜去することにより、図２９に示されるように、真皮組織層１０に複数（本実施形態では５つ）の灌流流路１３が形成される。続いて、灌流流路１３に臨む真皮組織層１０の表面に血管系細胞１４を注入（播種）し一定時間培養することにより、管腔層１５を形成する。
【００７４】
次に、図３０に示すように、真皮組織層１０上に表皮細胞２１を播種する。表皮細胞２１が播種されると、培地Ｍを灌流流路１３に灌流させながら表皮細胞２１を気液培養する。表皮細胞２１の培養中には、側壁４４ｂを挟持する挟持部８２が側壁４４ａに対して離間または接近する方向に移動することにより、コネクタ４２に支持された真皮組織層１０および表皮層２０に対しては、伸展の状態からの圧縮の刺激が付与される。
【００７５】
これにより、図３１に示されるように、表皮細胞２１が分化誘導されて表皮層２０を形成することができる。本実施形態では、真皮組織層１０および表皮層２０が曲面部７０に沿った曲面形状の人工皮膚組織１が得られる。本実施形態では、伸展の刺激を付与しなかった場合と比較して厚い表皮層２０を有する人工皮膚組織１が得られる。
【００７６】
このように、本実施形態では、上記第１実施形態の灌流デバイス４０を用いた場合と同様の作用・効果が得られることに加えて、生体モデルＦの曲面部７０に沿った形状で厚い表皮層２０を有する高品質の人工皮膚組織１を容易に製造することができる。従って、本実施形態では、所望部位の生体モデルＦを用意して用いることにより、所望部位の形状で厚い表皮層２０を有する高品質の人工皮膚組織１を容易に得ることができる。
【００７７】
本実施形態では、伸展方向および当該伸展方向と直交する方向に延びる皺部が形成されより人体に近く大きな反発力の表皮層２０を有するとともに、内皮機能性を有する灌流流路１３を備える人工皮膚組織１を容易に得ることができる。
【００７８】
以上、本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明はかかる特定の実施の形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲内に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
【００７９】
例えば、上記実施形態では、人工皮膚組織１として指の皮膚組織を例示して説明したが、上述したように、他の部位の皮膚組織を人工的に製造する際にも本発明を適用可能である。
【００８０】
また、上記実施形態では、人工三次元組織として人工皮膚組織を例示したが、この構成に限定されるものではなく、他の人工組織についても本発明を適用可能である。
【００８１】
また、上記実施形態では、係合部４２ｃの親液化処理としてＯ２プラズマ処理を処理を例示したが、これに限定されるものではなく、他の親液化処理を採ってもよい。係合部４２ｃへの細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物の密着性を高める方法として、親液化処理ではなく、例えば皮膚用の接着剤を用いてもよい。皮膚用の接着剤を用いる場合には、細胞外マトリックス成分１１および真皮細胞１２に悪影響が及ばない材料のものを選択することが好ましい。
【００８２】
また、上記実施形態では、灌流流路１３を形成するための流路形成部材として線状部材であるワイヤー４３を用いる構成を例示したが、ワイヤー４３の他に、例えば、ゲル材またはポリマーで作製した細胞付きあるいは細胞入り３のファイバーを用いる構成であってもよい。この構成を採って、例えば、細胞として血管系細胞１４を含む流路形成部材を用いることにより、血管系細胞１４を注入する工程を別途設ける必要がなくなり、製造効率を向上させることが可能となる。灌流流路１３としては、線状である構成に限られない。例えば、面状部材を流路形成部材として用いることにより、面状の灌流流路を形成することも可能である。この場合、灌流させる培地の流量を多くすることが可能となり、養分供給効率を高めることで一層高品質の人工皮膚組織を製造することができる。面状の流路形成部材としては、例えば、メッシュ材を用いることができる。
【００８３】
また、上記実施形態では、真皮組織層１０および表皮層２０に対してワイヤー４３あるいは灌流流路１３が延びる方向に伸展・圧縮の刺激を付与する構成を例示したが、この構成に限定されない。例えば、図２６に示した生体モデルＦの背側の曲面部７０に沿って、図３１に示した真皮組織層１０および表皮層２０を培養する際には、真皮組織層１０および表皮層２０に対して曲面部７０に沿って伸展・圧縮の刺激を付与する構成としてもよい。さらに、真皮組織層１０および表皮層２０を積層方向に屈曲させることにより伸展・圧縮の刺激を付与する構成としてもよい。上記の場合には、真皮組織層１０および表皮層２０のうち、湾曲中心あるいは屈曲中心に近い側の層に圧縮の刺激を付与し、遠い側の層に伸展の刺激を付与することができる。
【００８４】
上記実施形態では、表皮細胞２１を培養して表皮層２０を形成するための培地を灌流させるために灌流流路１３を用いる構成を例示したが、この構成に限定されるものではない。例えば、組織表面（例えば表皮層２０）に薬剤を塗布し、当該薬剤の灌流流路１３への取り込みを評価するために灌流流路１３を用いる等の構成であってもよい。また、灌流流路１３を流れる培地中に薬剤を混入させ、当該薬剤が灌流流路１３から真皮組織層１０または表皮層２０への拡散を評価するために灌流流路１３を用いる等の構成であってもよい。このような構成で灌流流路１３を用いる場合には、表皮層２０を形成する前に灌流流路１３を形成する必要はなく、表皮層２０を形成した後に灌流流路１３を形成する手順であっててもよい。また、評価対象を、例えば、真皮組織層１０のみとする場合には、表皮層２０を形成する必要もなくなる。
【００８５】
また、上記実施形態では、人工三次元組織として人工皮膚組織１を例示したが、これに限定されるものではない。人工三次元組織としては、例えば、上述した線維芽細胞の代わりに、骨格筋細胞または心筋細胞を用いた筋組織であってもよい。さらに、肝細胞を用いた肝臓組織や膵臓系細胞を用いた膵臓組織等の消化器系組織、腎臓系細胞を用いた腎臓組織等の泌尿器系組織、神経系細胞を用いた神経組織であってもよい。このような組織に本発明を適用する場合には、上記実施形態で用いた細胞外マトリクスは必ずしも存在していなくてもよく、各種細胞のみを集積したものであってもよい。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によれば、高品質の人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法を提供できる。このため、本発明は、例えば、化粧品、医薬、製薬等の分野において有用である。
【符号の説明】
【００８７】
１…人工皮膚組織（人工三次元組織）、  １０…真皮組織層（第１組織層）、  １１…細胞外マトリックス成分、  １２…真皮細胞（線維芽細胞、第１細胞）、  １３…灌流流路、  １４…血管系細胞、  １５…管腔層、  ２０…表皮層（第２組織層）、  ２１…表皮細胞（第２細胞）、  ４０、４０Ａ…灌流デバイス（人工三次元組織灌流デバイス）、  ４１…培養槽、  ４２…コネクタ（支持部）、  ４２ａ…装着部（筒部）、  ４２ｃ…係合部、  ４２ｅ…第２筒、  ４２ｆ…リブ部、  ４３…ワイヤー（線状部材、流路形成部材）、  ４４…側壁、  ４５…培養空間、  ４６…底壁（底部）、  ７０…曲面部、  Ｆ…生体モデル、  Ｍ…培地
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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