(57)【要約】  本発明は、哺乳動物細胞を凍結保存し、融解した後に、細胞死を効果的に抑制できる細胞凍結保存液及び哺乳動物細胞投与用液や、該細胞凍結保存液を用いた哺乳動物細胞の凍結保存方法を提供することを課題とする。  ２．０〜６．０（ｗ／ｖ）％のトレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩と、４．０〜７．０（ｗ／ｖ）％のデキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩と、ＤＭＳＯ又はグリセリンとを含む等張液を、哺乳動物細胞凍結保存液又は哺乳動物細胞投与用液とし、当該胞凍結保存液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、従来の哺乳動物細胞凍結保存液と比べ、融解後の細胞死を効果的に抑制できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２．０〜６．０（ｗ／ｖ）％のトレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩と、４．０〜７．０（ｗ／ｖ）％のデキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩と、ジメチルスルホキシド又はグリセリンとを含む等張液からなることを特徴とする哺乳動物細胞凍結保存液。
【請求項２】
哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
【請求項３】
哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項２に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
【請求項４】
ジメチルスルホキシド又はグリセリンが、１．０〜１５（ｖ／ｖ）％のジメチルスルホキシドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
【請求項５】
等張液が乳酸リンゲル液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液からなることを特徴とする哺乳動物細胞投与用液。
【請求項７】
哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項６に記載の哺乳動物細胞投与用液。
【請求項８】
哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項７に記載の哺乳動物細胞投与用液。
【請求項９】
哺乳動物細胞を、請求項１〜５のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液中に凍結保存する工程を備えたことを特徴とする哺乳動物細胞の凍結保存方法。
【請求項１０】
哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項９に記載の凍結保存方法。
【請求項１１】
哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１０に記載の凍結保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２．０〜６．０（ｗ／ｖ）％のトレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「トレハロース類」ということがある）と、４．０〜７．０（ｗ／ｖ）％のデキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩（以下、「デキストラン類」ということがある）と、ジメチルスルホキシド（Dimethyl sulfoxide；以下、「ＤＭＳＯ」という）又はグリセリン（グリセロール）とを含む等張液からなる哺乳動物細胞凍結保存液及び哺乳動物細胞投与用液や、哺乳動物細胞をかかる哺乳動物細胞凍結保存液中に凍結保存する工程を備えた哺乳動物細胞の凍結保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の凍結保存は、細胞生物学の研究において必要不可欠な技術として広く利用されてきた。近年、細胞凍結保存技術は、世界中の細胞バンクにて種々の株化細胞の保存のみならず、畜産業界における種の保存、家畜増産のための精子、卵子、又は受精卵の凍結保存や、生殖医療における生殖細胞の凍結保存等に応用されている。【０００３】
胚性幹細胞（Embryonic Stem cell；ＥＳ細胞)や人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞は、無限の増殖能力と多様な組織細胞への多分化能を有する細胞である。ヒト多能性幹細胞は、その性質を利用して再生医療への応用が期待されており、それを実現するためには質の高い細胞凍結技術、すなわち解凍後に高い細胞生存率や未分化性を保障する細胞凍結技術の確立は必須である。【０００４】
細胞の凍結保存方法は、一般に緩慢凍結法と急速凍結法（ガラス化法）に大別される。緩慢凍結法は、グリセリン、ＤＭＳＯ、ケラチン加水分解物、加水分解ゼラチン、血清、血清アルブミン等を凍結保護剤として含む凍結保存液（特許文献１〜５）中に細胞を懸濁し、１分に１℃程度に温度を下げて徐々に凍結する方法である。緩慢に冷却することにより細胞内の水分子が凍結保護剤と置換し、脱水され、細胞内や細胞周辺部の氷結晶の成長が抑えられ、細胞膜及び細胞内構造の損傷や、タンパク質の変性及び切断を防ぐ（非特許文献１)。最近では、胚を凍結保存する場合は除き、一般的な細胞を凍結保存する場合は、プログラムフリーザーを用いて温度調節を厳密に制御しなくても、発砲スチロールの箱や市販の細胞凍結ボックスを用いて緩慢に凍結できることがわかってきた。このような方法は簡便であることから、簡易緩慢凍結法とも呼ばれ、研究室や細胞バンク等で広く用いられている。【０００５】
他方、ガラス化法は、凍結による細胞内外の氷結晶生成を抑制するため、急速な冷却によりガラス状に凍結させる方法である。ガラス化法は、１９３７年に報告されてから実用化までの技術開発に長い期間を要したが、１９８５年に高濃度のＤＭＳＯ、アセトアミド、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールからなる凍結保護剤を含むガラス化保存液を用いる方法が開発された。この方法の開発により、マウス初期胚の凍結保存や、緩慢凍結法では困難であったウシ胚やブタ胚の凍結保存が可能となった。現在、胚バンクをはじめ多くの機関でガラス化法が用いられている。【０００６】
最近、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の凍結保存液の開発や、凍結保存方法の改良が盛んに行なわれている。例えば、ヒトＥＳ細胞を５％ＤＭＳＯ、１０％ウシ胎児血清（Fetal bovine serum；ＦＢＳ）、及び１０％エチレングリコール（ＥＧ）を含む凍結保存液中に懸濁し、簡易緩慢凍結法を用いて凍結保存すると、融解後の細胞生存率が高まることが開示されている（非特許文献２）。また、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を凍結保存液（STEM-CELLBANKER［日本全薬工業社製］）中に懸濁し、簡易緩慢凍結法を用いて凍結保存すると、融解後の細胞生存率が高まることが開示されている（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００３／０６４６３４号パンフレット
【特許文献２】特開平６−４６８４０号公報
【特許文献３】特開平７−２５５４６９号公報
【特許文献４】特開平８−３２５１０１号公報
【特許文献５】特開２００２−２３３３５６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. R. Dobrinsky，Theriogenology， 45，17-26 (1996）
【非特許文献２】Y. S. Ha et al., Human Reprod., 20, 1779-1785 (2005)
【非特許文献３】F. Holm et al., Human Reprod., 25, 1271-1279 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、哺乳動物細胞を凍結保存し、融解した後に、細胞死を効果的に抑制できる細胞凍結保存液及び哺乳動物細胞投与用液や、該細胞凍結保存液を用いた哺乳動物細胞の凍結保存方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねる中で、等張液に、ＤＭＳＯ又はグリセリンを添加し、さらに、トレハロース類及びデキストラン類を、それぞれ２．０〜６．０（ｗ／ｖ）％及び４．０〜７．０（ｗ／ｖ）％となるように添加した溶液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、従来の哺乳動物細胞凍結保存液と比べ、融解後の細胞死を効果的に抑制できることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕２．０〜６．０（ｗ／ｖ）％のトレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩と、４．０〜７．０（ｗ／ｖ）％のデキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩と、ＤＭＳＯ又はグリセリンとを含む等張液からなることを特徴とする哺乳動物細胞凍結保存液。
〔２〕哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする上記〔１〕に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔３〕哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする上記〔２〕に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔４〕ＤＭＳＯ又はグリセリンが、１．０〜１５（ｖ／ｖ）％のＤＭＳＯであることを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔５〕等張液が乳酸リンゲル液であることを特徴とする上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液からなることを特徴とする哺乳動物細胞投与用液。
〔７〕哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする上記〔６〕に記載の哺乳動物細胞投与用液。
〔８〕哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする上記〔７〕に記載の哺乳動物細胞投与用液。
〔９〕哺乳動物細胞を、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液中に凍結保存する工程を備えたことを特徴とする哺乳動物細胞の凍結保存方法。
〔１０〕哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする上記〔９〕に記載の凍結保存方法。
〔１１〕哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする上記〔１０〕に記載の凍結保存方法。【００１２】
本発明の実施の他の形態として、哺乳動物細胞を凍結保存するための、トレハロース類と、デキストラン類と、ＤＭＳＯ又はグリセリンと、等張液との組合せや、哺乳動物細胞凍結保存液を調製するための、トレハロース類と、デキストラン類と、ＤＭＳＯ又はグリセリンと、等張液との組合せの使用を挙げることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、従来の哺乳動物細胞凍結保存液と比べ、凍結保存した哺乳動物細胞を融解した際の細胞死を、効果的に抑制することができるため、再生医療における良質な移植用細胞含有液を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の哺乳動物細胞凍結保存液は、「哺乳動物細胞を凍結保存するため」という用途に限定された、トレハロース類とデキストラン類とＤＭＳＯ及び／又はグリセリンとを含む等張液（以下、「本件凍結保存液」ということがある）からなる液である。
【００１５】
上記等張液としては、体液や細胞液の浸透圧とほぼ同じになるようにナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等によって塩濃度や糖濃度等を調整した等張液であれば特に制限されず、具体的には生理食塩水や、緩衝効果のある生理食塩水（リン酸緩衝生理食塩水［Phosphate buffered saline；ＰＢＳ］、トリス緩衝生理食塩水［Tris Buffered Saline；ＴＢＳ］、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水等）、リンゲル液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液、５％グルコース水溶液、動物細胞培養用基礎培地（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等）、等張剤（ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム等）などを挙げることができ、これらの中でも乳酸リンゲル液が好ましい。等張液は、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販のものとしては、大塚生食注（大塚製薬工場社製）（生理食塩液）、リンゲル液「オーツカ」（大塚製薬工場社製）（リンゲル液）、ラクテック（登録商標）注（大塚製薬工場社製）（乳酸リンゲル液）、乳酸リンゲル液「ＫＳ」（共立製薬社製）（乳酸リンゲル液）、ヴィーンＦ輸液（興和興和創薬社製）（酢酸リンゲル液）、大塚糖液５％（大塚製薬工場社製）（５％グルコース水溶液）、ビカネイト輸液（大塚製薬工場社製）（重炭酸リンゲル液）を挙げることができる。本明細書において「等張」とは、浸透圧が２５０〜３８０ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内であることを意味する。
【００１６】
上記トレハロース類におけるトレハロースとしては、２つのα-グルコースが１，１−グリコシド結合した二糖類であるα，α−トレハロースの他に、α-グルコースとβ−グルコースとが１，１−グリコシド結合した二糖類であるα，β−トレハロースや、２つのβ−グルコースが１，１−グリコシド結合した二糖類であるβ，β−トレハロースを挙げることができるが、これらの中でもα，α−トレハロースが好ましい。これらトレハロースは、化学合成、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法によっても製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、α，α−トレハロース（株式会社林原社製）、α，α−トレハロース（和光純薬社製）等の市販品を挙げることができる。
【００１７】
上記トレハロース類におけるトレハロース誘導体としては、二糖類のトレハロースに１又は複数の糖単位が結合したグリコシルトレハロース類であれば特に制限されず、グリコシルトレハロース類には、グルコシルトレハロース、マルトシルトレハロース、マルトトリオシルトレハロース等が含まれる。
【００１８】
上記トレハロース類におけるトレハロースやその誘導体の塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩や、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩や、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩などを挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用は、トレハロースの場合と同効なものが好ましい。これらの塩類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００１９】
上記デキストラン類におけるデキストランとしては、Ｄ−グルコースからなる多糖（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎであって、α１→６結合を主鎖とするものであれば特に制限されず、デキストランの重量平均分子量（Ｍｗ）としては、例えば、デキストラン４０（Ｍｗ＝４００００）、デキストラン７０（Ｍｗ＝７００００）などを挙げることができる。これらデキストランは、化学合成、微生物による生産、酵素による生産等のいずれの公知の方法で製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、デキストラン４０（東京化成工業社製）、デキストラン７０（東京化成工業社製）等の市販品を挙げることができる。
【００２０】
上記デキストラン類におけるデキストラン誘導体としては、デキストラン硫酸、カルボキシル化デキストラン、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストランなどが含まれる。
【００２１】
上記デキストラン類におけるデキストランやその誘導体の塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩や、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩や、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩などを挙げることができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用は、デキストランの場合と同効なものが好ましい。これらの塩類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００２２】
本件凍結保存液中のトレハロース類の濃度としては、２．０〜６．０（ｗ／ｖ）％の範囲内であればよく、例えば、２．０〜５．６（ｗ／ｖ）％、２．０〜５．２（ｗ／ｖ）％、２．０〜４．８（ｗ／ｖ）％、２．０〜４．４（ｗ／ｖ）％、２．０〜４．０（ｗ／ｖ）％、２．０〜３．６（ｗ／ｖ）％、２．０〜３．２（ｗ／ｖ）％、２．０〜３．０（ｗ／ｖ）％、２．４〜６．０（ｗ／ｖ）％、２．８〜６．０（ｗ／ｖ）％、３．２〜６．０（ｗ／ｖ）％、３．６〜６．０（ｗ／ｖ）％、４．０〜６．０（ｗ／ｖ）％、４．４〜６．０（ｗ／ｖ）％、４．８〜６．０（ｗ／ｖ）％、５．０〜６．０（ｗ／ｖ）％、２．４〜６．０（ｗ／ｖ）％、２．４〜５．６（ｗ／ｖ）％、２．４〜５．２（ｗ／ｖ）％、２．４〜４．８（ｗ／ｖ）％、２．４〜４．４（ｗ／ｖ）％、２．４〜４．０（ｗ／ｖ）％、２．４〜３．６（ｗ／ｖ）％、２．４〜３．２（ｗ／ｖ）％、２．４〜３．０（ｗ／ｖ）％を挙げることができ、２．４〜３．０（ｗ／ｖ）％が好ましい。
【００２３】
本件凍結保存液中のデキストラン類の濃度としては、４．０〜７．０（ｗ／ｖ）％の範囲内であればよく、例えば、４．０〜６．６（ｗ／ｖ）％、４．０〜６．２（ｗ／ｖ）％、４．０〜５．８（ｗ／ｖ）％、４．０〜５．４（ｗ／ｖ）％、４．０〜５．０（ｗ／ｖ）％、４．４〜７．０（ｗ／ｖ）％、４．８〜７．０（ｗ／ｖ）％、５．２〜７．０（ｗ／ｖ）％、５．６〜７．０（ｗ／ｖ）％、６．０〜７．０（ｗ／ｖ）％を挙げることができ、４．０〜５．０（ｗ／ｖ）％が好ましい。
【００２４】
本件凍結保存液中のＤＭＳＯの濃度は、通常０．１（ｖ／ｖ）％以上、好ましくは０．３（ｖ／ｖ）％以上、より好ましくは０．６（ｖ／ｖ）％以上、さらに好ましくは１．０（ｖ／ｖ）％以上であり、また、細胞毒性を回避する観点から、通常３０（ｖ／ｖ）％以下、好ましくは２５（ｖ／ｖ）％以下、より好ましくは２０（ｖ／ｖ）％以下、さらに好ましくは１５（ｖ／ｖ）％以下である。したがって、本件凍結保存液中のＤＭＳＯの濃度としては、通常０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の範囲内であり、好ましくは０．３〜２５（ｖ／ｖ）％であり、より好ましくは０．６〜２０（ｖ／ｖ）％であり、さらに好ましくは１．０〜１５（ｖ／ｖ）％である。ＤＭＳＯは、化学合成により製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、和光純薬工業社製、ナカライテスク社製等の市販品を挙げることができる。
【００２５】
本件凍結保存液中のグリセリンの濃度は、通常０．１（ｖ／ｖ）％以上、好ましくは０．３（ｖ／ｖ）％以上、より好ましくは０．６（ｖ／ｖ）％以上、さらに好ましくは１．０（ｖ／ｖ）％以上であり、また、本件凍結保存液の調製のしやすさを考慮すると、通常５０（ｖ／ｖ）％以下、好ましくは４０（ｖ／ｖ）％以下、より好ましくは３０（ｖ／ｖ）％以下、さらに好ましくは２０（ｖ／ｖ）％以下である。したがって、本件凍結保存液中のグリセリンの濃度としては、通常０．１〜５０（ｖ／ｖ）％の範囲内であり、好ましくは０．３〜４５（ｖ／ｖ）％であり、より好ましくは０．６〜３０（ｖ／ｖ）％であり、さらに好ましくは１．０〜２０（ｖ／ｖ）％である。グリセリンは、化学合成により製造することができるが、市販品を用いることもできる。例えば、和光純薬工業社製、ナカライテスク社製等の市販品を挙げることができる。
【００２６】
本件凍結保存液は、哺乳動物細胞を凍結保存し、その後融解したときの細胞死を抑制する有効成分（凍結保護成分）として、トレハロース類と、デキストラン類と、ＤＭＳＯ及び／又はグリセリン（以下、これらを総称して「本件凍結保護成分」ということがある）とを含むものである。本件凍結保存液が、哺乳動物細胞を凍結保存し、その後融解したときの細胞死を抑制できるものであることは、トリパンブルー（Trypan Blue）染色法、ＴＵＮＥＬ法、Ｎｅｘｉｎ法、ＦＬＩＣＡ法などの細胞死を検出できる公知の方法を用いて確認することができる。
【００２７】
本件凍結保存液における任意成分としては、本件凍結保護成分以外の凍結保護成分（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、セリシン、イソマルトオリゴ糖）、等張剤（例えば、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、ラクトース、塩化ナトリウム等）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸、サリチレート）、溶解補助剤、保存剤、酸化防止剤、アミノ酸（例えば、プロリン、グルタミン）などを挙げることができる。本明細書において「任意成分」とは、含んでもよいし含まなくてもよい成分のことを意味する。
また、本件凍結保存液は、ヒト、ウシ等由来の血清又は血清由来成分（例えば、アルブミン）を含まない。
【００２８】
本発明の哺乳動物細胞投与用液は、「哺乳動物細胞を哺乳動物に投与するため」という用途に限定された本件凍結保存液、すなわち、「哺乳動物細胞を凍結保存するため」という用途、及び「哺乳動物細胞を哺乳動物に投与するため」という用途に限定された、トレハロース類とデキストラン類とＤＭＳＯ及び／又はグリセリンとを含む等張液である。本件凍結保存液（好ましくは、上記血清又は血清由来成分がほとんど又は全く含まれないもの）は、哺乳動物の生体内へそのまま投与（例えば、静脈投与）しても、哺乳動物の生体に悪影響を及ぼさない。このため、本件凍結保存液（好ましくは、上記血清又は血清由来成分がほとんど又は全く含まれないもの）は、「哺乳動物細胞を凍結保存し、融解後に、哺乳動物細胞を哺乳動物に投与（例えば、静脈投与）するための」液として有利に用いることができる。
【００２９】
本発明の哺乳動物細胞の凍結保存方法としては、哺乳動物細胞を本件凍結保存液中に凍結保存する工程、すなわち、哺乳動物細胞を含有する本件凍結保存液を凍結保存する工程を備えたものであれば特に制限されず、緩慢凍結法であっても、急速凍結法（ガラス化法）であってもよい。かかる緩慢凍結法としては、例えば、哺乳動物細胞を含有する本件凍結保存液を、低温フリーザーや超低温フリーザー（通常−２０℃〜−１５０℃の範囲内）中で凍結し、その後、液体窒素（通常−１５０℃〜−１９６℃の範囲内）中で保存する方法を挙げることができる。上記急速凍結法としては、例えば、哺乳動物細胞を本件凍結保存液中に懸濁後、必要に応じてストロー内に移し、液体窒素（通常−１５０℃〜−１９６℃の範囲内）中で急速冷凍し、保存する方法を挙げることができる。哺乳動物細胞を凍結保存し、その後融解したときの細胞生存率は、哺乳動物細胞の種類によって異なることがある。このため、凍結保存対象の細胞に応じて、凍結融解後の細胞生存率がより高い凍結保存方法を選択することが好ましい。
【００３０】
上記哺乳動物細胞としては、再生医療等に血管経由で投与される哺乳動物幹細胞の他に、Ｉ型糖尿病患者に経静脈投与される哺乳動物の膵島細胞、がん患者に経静脈投与される哺乳動物の樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、アルファ・ベータ（αβ）Ｔ細胞、ガンマ・デルタ（γδ）Ｔ細胞、細胞障害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocyte；ＣＴＬ）等を例示することができる。本明細書において、哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を例示することができ、中でも、マウス、ブタ、ヒトを好適に例示することができる。
【００３１】
また上記「幹細胞」とは、自己複製能及び分化・増殖能を有する未熟な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem ce11）、複能性幹細胞（multipotent stem ce11）、単能性幹細胞（unipotent stem ce11）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、それ自体では個体になることができないが、生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。
【００３２】
多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ＥＧ細胞、ｉＰＳ細胞等を挙げることができる。ＥＳ細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はＬＩＦを含む培地中で培養することにより製造することができる。ＥＳ細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを含む培地中で培養することにより製造することができる（Ce11,70:841-847,1992）。ｉＰＳ細胞は、体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞等）にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（必要に応じてさらにｃ−Ｍｙｃ又はｎ−Ｍｙｃ）等のリプログラミング因子を導入することにより製造することができる（Ce11,126:p.663-676,2006;Nature,448:p.313-317,2007;Nat Biotechno1,26;p,101-106,2008;Cel1 131:p.861‐872,2007;Science,318:p.1917-1920,2007;Ce11 Stem Cells 1:p.55-70,2007;Nat Biotechnol,25:p.1177-1181,2007;Nature,448:p.318-324,2007;Cell Stem Cells 2:p.10-12,2008;Nature451:p.141-146,2008;Science,318:p.1917-1920,2007）。また、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した幹細胞も、多能性幹細胞として好ましい（Nature,385,810（1997）；Science,280,1256（1998）；Nature Biotechnology,17,456（1999）；Nature,394,369（1998）；Nature Genetics,22,127（1999）；Proc.Nat1. Acad.Sci.USA,96,14984（1999））、Rideout IIIら（Nature Genetics,24,109（2000））。
【００３３】
複能性幹細胞としては、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞等の細胞に分化可能な間葉系幹細胞；白血球、赤血球、血小板等の血球系細胞に分化可能な造血系幹細胞；ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト等の細胞に分化可能な神経系幹細胞；骨髄幹細胞、生殖幹細胞等の体性幹細胞；等を挙げることができる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞とは、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞の全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞を意味する。複能性幹細胞は、自体公知の方法により、生体から単離することができる。例えば、間葉系幹細胞は、哺乳動物の骨髄、脂肪組織、末梢血、臍帯血等から公知の一般的な方法で採取することができる。また、骨髄穿刺後の造血幹細胞等の培養、継代によりヒト間葉系幹細胞を単離することができる（Journal of Autoimmunity，30（2008）163-171）。複能性幹細胞は、上記多能性幹細胞を適切な誘導条件下で培養することによっても得ることができる。間葉系幹細胞は、好ましくはヒト脂肪由来の間葉系幹細胞である。
【００３４】
本件凍結保存液中に保存する哺乳動物細胞として、付着性の細胞を例示することができる。本明細書中、「付着性」細胞とは、足場に接着することで生存、増殖、物質の生産を行なうことができる足場依存性の細胞を意味する。付着性幹細胞としては、多能性幹細胞、間葉系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞、生殖幹細胞等を挙げることができる。付着性幹細胞は、好ましくは、間葉系幹細胞である。
【００３５】
本件凍結保存液中に保存する哺乳動物細胞（集団）は、生体内から分離されたものであっても、インビトロで継代培養されたものであってもよいが、単離又は精製されていることが好ましい。本明細書中、「単離又は精製」とは、目的とする成分以外の成分を除去する操作が施されていることを意味する。単離又は精製された哺乳動物細胞の純度（全細胞数に対する、哺乳動物幹細胞数等の目的とする細胞の割合）は、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば１００％）である。
【００３６】
本件凍結保存液中に保存する哺乳動物細胞（集団）は、単一細胞（シングルセル）の状態であることが好ましい。本明細書において、「単一細胞の状態」とは、他の細胞と寄り集まって塊を形成していないこと（即ち、凝集していない状態）を意味する。単一細胞の状態の哺乳動物細胞は、インビトロで培養した哺乳動物細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ等で酵素処理した後、ピペッティングやタッピング等の当該技術分野における周知の方法により細胞を懸濁することにより調製することができる。哺乳動物細胞中に含まれる単一細胞の状態の哺乳動物細胞の割合は、通常７０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９９％以上（例えば１００％）である。単一細胞の状態の細胞の割合は、哺乳動物細胞をＰＢＳに分散し、これを顕微鏡下で観察し、無作為に選択された複数個（例えば、１０００個）の細胞について凝集の有無を調べることにより決定することができる。
【００３７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、３（ｗ／ｖ）％トレハロース及び５（ｗ／ｖ）％デキストラン４０を含む乳酸リンゲル液を、便宜上「ＴＤＲ液」ということがある。
【実施例１】
【００３８】
１．本件凍結保存液が、哺乳動物細胞凍結保存液として有用であることの確認
本件凍結保存液が、哺乳動物細胞凍結保存液として有用であることを確認するために、哺乳動物細胞を、ＤＭＳＯ又はグリセリンと、ＴＤＲ液との混合液中に凍結保存し、融解後の細胞生存率を解析した。
１−１  材料及び方法
［哺乳動物細胞］
試験には、以下の表１に記載のヒト脂肪由来間葉系幹細胞（ｈＡＤ−ＭＳＣ；Human Adipose derived Mesenchymal Stem Cell）を用いた。【００３９】
【表１】
2018110159.tif 000002
【００４０】
［ＴＤＲ液］
ＴＤＲ液は、トレハロース（株式会社林原社製）、低分子デキストランＬ注（１０［ｗ／ｖ］％デキストラン含有ラクテック注）（大塚製薬工場社製）、及びラクテック注（大塚製薬工場社製）を用いて調製した。【００４１】
［哺乳動物細胞の培養］
ｈＡＤ−ＭＳＣは定法にしたがって培養した。すなわち、ｈＡＤ−ＭＳＣを、ヒト脂肪由来幹細胞添加因子セット（Lonza Walkersville社製、PT-4503）を含むＡＤＳＣ−ＢＭ（Adipose Derived Stem Cell Basal Medium）（Lonza Walkersville社製、PT-3273）（以下、単に「培養液」という）を添加した７５ｃｍ２フラスコに入れ、ＣＯ２インキュベーター（３７℃条件下）内で継代培養した。また、培養液の交換は３日毎行った。【００４２】
［哺乳動物細胞含有凍結保存液の調製及び凍結］
哺乳動物細胞含有凍結保存液の調製及び凍結は、以下の〔１〕〜〔１２〕の手順にしたがって行った。
〔１〕パーソナルインキュベーターを３７±２℃に加温しておいた。
〔２〕ｈＡＤ−ＭＳＣを培養している７５ｃｍ２フラスコを、ＣＯ２インキュベーターから取り出した。
〔３〕倒立顕微鏡下で細胞の状態を観察し、約９０％（８０〜１００％）コンフルエントのものを使用した。
〔４〕培養液を吸引し、ＰＢＳ（−）を各７５ｃｍ２フラスコに８ｍＬずつ添加した。
〔５〕ＰＢＳ（−）を吸引後、トリプシン／ＥＤＴＡ（CC-5012、Lonza Walkersville社製）をフラスコに４ｍＬずつ添加し、パーソナルインキュベーターにて３７±２℃条件下で５分間インキュベートした。
〔６〕細胞が９０％程度剥離するまで倒立顕微鏡下で観察しながら、ゆっくりと揺らした。
〔７〕トリプシン反応を停止させるために、トリプシン中和液（ＴＮＳ；CC-5002、LonzaWalkersville社製）を８ｍＬずつ加えて、ピペッティングにより細胞を剥離し、５０ｍＬのコニカルチューブに移した。
〔８〕遠心（遠心機の設定条件：２１０×g、遠心時間５分間、２０℃）処理後、上清を除去し、一定量（各７５ｃｍ２フラスコ当たり２ｍＬ）のＰＢＳ（−）を添加し、細胞を懸濁した。
〔９〕細胞懸濁液から一部（２０μＬ）分取し、２０μＬのトリパンブルー染色液（Gibco社製）と混合し、細胞計数盤で全細胞数及び死細胞数を計測した。なお、計測細胞数は、細胞計数盤を用いて、1ヵ所の細胞計数部における四隅の細胞計数室のエリアの合計細胞数とした。
〔１０〕残りの細胞懸濁液を、フィンピペット（１００−１０００μＬ）を用いて、１５ｍＬクラリファインドポリプロピレンコニカルチューブに一定量ずつ分注し、２１０×ｇ、５分間、２５℃で遠心処理した。
〔１１〕上清を除去し、３．０×１０６細胞／ｍＬとなるように各種細胞凍結保存液（０、０．５、１．０、２．０、５．０、若しくは１０（ｖ／ｖ）％ＤＭＳＯ（和光純薬工業社製）又は１０（ｖ／ｖ）％グリセリン（和光純薬工業社製）を含むＴＤＲ液、或いはSTEM-CELLBANKER［日本全薬工業社製］）中に細胞を懸濁した。
〔１２〕専用のバイアルに１ｍＬずつ細胞懸濁液を分注し、バイセル凍結処理容器（日本フリーザー社製）に入れて、−８０℃にて細胞を凍結（３時間以上）し、その後すみやかに液体窒素タンクに移した。【００４３】
［評価法］
哺乳動物細胞含有凍結保存液を凍結融解後、生細胞率及び細胞増殖率の評価は、以下の手順〔１〕〜〔６〕にしたがって行った。
〔１〕恒温槽を３７℃に設定し、加温しておいた。
〔２〕培養に必要な個数の７５ｃｍ２フラスコに、培養液を添加して、ＣＯ２インキュベーター内で３０分以上静置し、平衡化した。
〔３〕液体窒素タンクから凍結した細胞を含むバイアルを取り出し、素早く３７℃に設定した恒温槽に移し、軽く撹拌しながら融解した。
〔４〕緩やかに攪拌（ピペッティングを５回）し、細胞が懸濁した状態で、その一部（２０μＬ）を、予めトリパンブルー染色液２０μＬを添加した１．５ｍＬマイクロチューブに分取した。トリパンブルー染色液と混和した細胞懸濁液を、細胞計数盤に分取し、全細胞数及びトリパンブルー陽性細胞（死細胞）数を計測することにより、凍結融解直後の細胞生存率（表２［ｎ＝１］及び表４［ｎ＝３］）を算出した。
〔５〕残りの細胞懸濁液を用いて、３．０×１０６細胞／ｍＬとなるように、予め用意した培養液を含む７５ｃｍ２フラスコに播種し、ＣＯ２インキュベーター内で培養した。また、一部残った細胞懸濁液は、２５℃で６時間及び２４時間静置した後、上記［哺乳動物細胞含有凍結保存液の調製及び凍結］の項目に記載の手順〔９〕にしたがって、全細胞数及び死細胞数を計測することにより、凍結融解後に２５℃で６時間及び２４時間静置したときの細胞生存率（表５［ｎ＝３］及び表６［ｎ＝３］）を算出した。
〔６〕培養後１、３、５、及び７日目に、上記［哺乳動物細胞含有凍結保存液の調製及び凍結］の項目に記載の手順〔１〕〜〔９〕にしたがって、細胞を回収後、全細胞数を計測することにより、凍結融解後に１、３、５、及び７日間培養したときの細胞増加率（表３［ｎ＝２］及び表７［ｎ＝３］）を算出した。【００４４】
１−２  結果
まず、ＴＤＲ液に加えるＤＭＳＯの濃度について検討した。その結果、１．０〜１０％のＤＭＳＯを含むＴＤＲ液中に細胞を凍結保存すると、融解直後の細胞生存率（表２）や細胞増殖率（表３）は、いずれも高いものであった。これらの結果から、以下の実験においては、ＴＤＲ液に加えるＤＭＳＯの濃度は、１０％に固定した。【００４５】
次に既存の細胞凍結保存液であるSTEM-CELLBANKER（日本全薬工業社製）との比較実験を行った。その結果、１０％ＤＭＳＯを含むＴＤＲ液中に細胞を凍結保存したときの融解直後の細胞生存率は、STEM-CELLBANKERと同レベルの高い値を示した（表４）。また、凍結融解後に２５℃で６時間及び２４時間静置したときの細胞生存率は、１０％ＤＭＳＯを含むＴＤＲ液中に細胞を凍結保存した方が、STEM-CELLBANKER中に細胞を凍結保存した場合よりも高かった（表５及び６）。さらに、ＤＭＳＯに代えてグリセリンをＴＤＲ液に添加した細胞凍結保存液を用いた場合も同様の効果が得られた（表５及び６）。なお、ＤＭＳＯ又はグリセリンをＴＤＲ液に混合後、トレハロース濃度は２．７％であり、デキストラン濃度は４．５％であった。一方、１０％ＤＭＳＯ又は１０％グリセリンを含むＴＤＲ液中に細胞を凍結保存したときの細胞増殖効率は、STEM-CELLBANKERと同レベルの高い値を示した（表７）。
以上の結果は、２．７％前後（２．０〜６．０％）のトレハロース及び４．５％前後（４．０〜７．０％）のデキストランと、ＤＭＳＯやグリセリンとを含む等張液中に哺乳動物細胞を凍結保存すると、既存の哺乳動物細胞凍結保存液（STEM-CELLBANKER）を用いた場合と同程度の増殖効率が得られることを示すとともに、凍結融解後の細胞生存率については、既存の哺乳動物細胞凍結保存液（STEM-CELLBANKER）を用いた場合よりも高いという優れた効果が得られることを示している。【００４６】
【表２】
2018110159.tif 000003
【００４７】
【表３】
2018110159.tif 000004
表中の数値（細胞数）は、各濃度のＤＭＳＯで保存した細胞において、（凍結）融解直後の細胞数を１００としたときの相対値として示す。【００４８】
【表４】
2018110159.tif 000005
表中の数値は、凍結融解直後の細胞生存率（％）を示す。【００４９】
【表５】
2018110159.tif 000006
表中の数値は、凍結融解後に２５℃で６時間静置したときの細胞生存率（％）を示す。【００５０】
【表６】
2018110159.tif 000007
表中の数値は、凍結融解後に２５℃で２４時間静置したときの細胞生存率（％）を示す。【００５１】
【表７】
2018110159.tif 000008
表中の数値（細胞数）は、各種細胞凍結保存液において、播種時（凍結融解直後）の細胞数を１００としたときの相対値として示す。また、１日目〜７日目の値は平均値±標準偏差（ＳＤ）である。
【実施例２】
【００５２】
２．トレハロース及びデキストランの併用による凍結保護効果、並びに哺乳動物細胞凍結保存液中のトレハロース及びデキストラン濃度の検討
トレハロース及びデキストランの併用による凍結保護効果、並びに哺乳動物細胞凍結保存液中のトレハロース及びデキストラン濃度を検討するために、実施例１に記載の方法に従って、３％のトレハロース、及び０〜１０％のデキストランを含む乳酸リンゲル液と、１０％のＤＭＳＯとの混合液（表８）や、０〜１０％のトレハロース、及び５％のデキストランを含む乳酸リンゲル液と、１０％のＤＭＳＯとの混合液（表９）を調製し、これら混合液中にｈＡＤ−ＭＳＣを凍結保存し、融解後の細胞生存率（表８及び９）を算出した。
その結果、トレハロース及びデキストランを併用した方が、トレハロース又はデキストランを単独で用いた場合と比べ、凍結融解後の細胞生存率は高くなることが示された。また、トレハロース及びデキストランの濃度は、それぞれ少なくとも０．９％あれば、９割以上の細胞が生存することが示された（表８及び９）。【００５３】
【表８】
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表中のトレハロース及びデキストラン濃度は、ＤＭＳＯ混合前の濃度（％）を示し、括弧内には、ＤＭＳＯ混合後の濃度（％）を示す。また、表中の生存率は、凍結融解直後の細胞生存率（平均値±標準偏差［ＳＤ］、ｎ＝３）（％）を示す。【００５４】
【表９】
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表中のトレハロース及びデキストラン濃度は、ＤＭＳＯ混合前の濃度（％）を示し、括弧内には、ＤＭＳＯ混合後の濃度（％）を示す。また、表中の生存率は、凍結融解直後の細胞生存率（平均値±標準偏差［ＳＤ］、ｎ＝３）（％）を示す。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によると、凍結保存した哺乳動物細胞を融解した際の細胞死を、効果的に抑制することができるため、再生医療等における移植医療分野やがん治療分野で有用である。
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月20日(2018.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２．０〜６．０（ｗ／ｖ）％のトレハロース若しくはその誘導体又はそれらの塩と、４．０〜７．０（ｗ／ｖ）％のデキストラン若しくはその誘導体又はそれらの塩と、ジメチルスルホキシド又はグリセリンとを含み、かつ、血清及びアルブミンのいずれも含まない等張液からなることを特徴とする哺乳動物細胞凍結保存液。
【請求項２】
哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
【請求項３】
哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項２に記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
【請求項４】
ジメチルスルホキシド又はグリセリンが、１．０〜１５（ｖ／ｖ）％のジメチルスルホキシドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
【請求項５】
等張液が乳酸リンゲル液であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液。
【請求項６】
哺乳動物細胞を、請求項１〜５のいずれかに記載の哺乳動物細胞凍結保存液中に凍結保存する工程を備えたことを特徴とする哺乳動物細胞の凍結保存方法。
【請求項７】
哺乳動物細胞が哺乳動物間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項６に記載の凍結保存方法。
【請求項８】
哺乳動物間葉系幹細胞がヒト脂肪間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項７に記載の凍結保存方法。
【国際調査報告】
2018110159.tif 000011
2018110159.tif 000012
2018110159.tif 000013
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