(57)【要約】  本発明は、配列番号１〜１２のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ１１以下のアミノ酸残基から成るペプチド、を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１２のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ１１以下のアミノ酸残基から成るペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列中、1又は数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失又は付加しており、且つ免疫原性を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列中、第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、バリン、ロイシン又はグルタミンで、そして／あるいはＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン又はバリンで置換されている、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを含む、癌の治療又は予防のための医薬組成物。
【請求項５】
ワクチンの形態である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが１又は複数の型のＨＬＡ分子と結合することができる、請求項４又は５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを含む免疫誘導剤。
【請求項８】
細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための、請求項７に記載の免疫誘導剤。
【請求項９】
前記ペプチドが１又は複数の型のＨＬＡ分子と結合することができる、請求項７又は８に記載の免疫誘導剤。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドと抗原提示細胞とをin vitroで接触させる工程を含む、ＣＴＬ誘導活性を有する抗原提示細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＵＣ１由来のペプチド、より具体的には、ヒト白血球抗原との結合を介してＴ細胞に抗原を提示する免疫原性ペプチド、これを用いた癌の治療又は予防のための医薬組成物、免疫誘導剤及び抗原提示細胞の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内では、常時偶発的に癌細胞が発生すると考えられているが、通常は自然免疫による癌細胞由来の特異的な癌抗原の排除反応が起こり、次いで、特異的免疫応答が誘導され、リンパ球等による癌細胞の排除反応が起こると想定されている。【０００３】
癌細胞由来の抗原が認識されるためには、細胞表面上に存在するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とリンパ球が複合体を形成する必要がある。主要組織適合性抗原であるＨＬＡ分子は、クラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）と、クラスＩＩ分子（ＨＬＡ−ＤＰ型、ＤＱ型、ＤＲ型）に大別される。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による癌細胞の排除反応は、癌細胞表面のＨＬＡクラスＩ分子に提示された、８〜１１のアミノ酸からなる癌抗原（ＣＴＬエピトープ）がＣＴＬ上のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）により特異的に認識されることで誘導される。【０００４】
現在、様々な免疫関連疾患の治療又は予防への応用を期待して免疫原性ペプチドの探索が行われており、例えば、特開平８−１５１３９６号公報には、特定のアミノ酸配列から成るオリゴペプチドがＨＬＡ結合性を有する旨記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平８−１５１３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＨＬＡ結合性を有するペプチドは多数知られているが、各種の癌の治療又は予防に用いることのできるペプチドがさらに求められている。また、ＨＬＡは多型性に富む遺伝子であるため、複数のＨＬＡ型に対応したマルチタイプの免疫原性ペプチドについての要求もある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ＨＬＡクラスＩ分子に結合する免疫原性ペプチド、特に、ＣＴＬを誘導し得るペプチド、これを用いた癌の治療又は予防のための医薬組成物、免疫誘導剤、及び抗原提示細胞の製造方法等を提供することを目的とする。【０００８】
即ち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）配列番号１〜１２のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ１１以下のアミノ酸残基から成るペプチド。
（２）前記アミノ酸配列中、1又は数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失又は付加しており、且つ免疫原性を有する、（１）に記載のペプチド。
（３）前記アミノ酸配列中、第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、バリン、ロイシン又はグルタミンで、そして／あるいはＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン、メチオニン又はバリンで置換されている、（２）に記載のペプチド。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチドを含む、癌の治療又は予防のための医薬組成物。
（５）ワクチンの形態である、（４）に記載の医薬組成物。
（６）前記ペプチドが１又は複数の型のＨＬＡ分子と結合することができる、（４）又は（５）に記載の医薬組成物。
（７）（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチドを含む免疫誘導剤。
（８）細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための、（７）に記載の免疫誘導剤。
（９）前記ペプチドが１又は複数の型のＨＬＡ分子と結合することができる、（７）又は（８）に記載の免疫誘導剤。
（１０）（１）〜（３）のいずれかに記載のペプチドと抗原提示細胞とをin vitroで接触させる工程を含む、ＣＴＬ誘導活性を有する抗原提示細胞の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
近年、癌の治療法として免疫療法が注目されている。本発明のペプチドはＨＬＡ結合性が高く、且つＣＴＬ誘導能も高いため、がんワクチンとしての有用性が強く期待される。また、種々の免疫療法、特に樹状細胞療法への応用も想定される。【００１０】
ムチン(Mucin)は正常及び悪性の様々な上皮細胞に発現する、巨大な糖たんぱく質である(Devine PL and McKenzie IF: Mucins: structure, function, and associations with malignancy. Bioessays 14: 619-625, 1992.)  ムチンポリペプチドの一つMUC1は、細胞表面の細胞膜を貫通して発現するユニークな糖たんぱく質である(Gendler SJ, Lancaster CA, Taylor-Papadimitriou J, Duhig T, Peat N, Burchell J, Pemberton L, Lalani EN and Wilson D: Molecular cloning and expression of human tumor-associated polymorphic epithelial mucin. J Biol Chem 265: 15286-15293, 1990.)
がん細胞が持つMUC1の糖修飾は不完全であり(Hanisch FG, Stadie TR, Deutzmann F and Peter-Katalinic J: MUC1 glycoforms in breast cancer - cell line T47D as a model for carcinoma-associated alterations of O-glycosylation. Eur J Biochem 236: 318-327, 1996.)、MUC1に対するキラーT細胞が誘導されていることが、膵臓がん、乳がん、卵巣がん等で報告されている（20 Barnd DL, Lan MS, Metzgar RS and Finn OJ: Specific, major histocompatibility complex-unrestricted recognition of tumorassociated mucins by human cytotoxic T cells. Proc Natl Acad Sci USA 86: 7159-7163, 1989.
21 Jerome KR, Barnd DL, Bendt KM, Boyer CM, Taylor-Papadimitriou J, McKenzie IF, Bast RC Jr and Finn OJ: Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinoma recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res 51: 2908-2916, 1991.
22 Ioannides CG, Fisk B, Fan D, Biddison WE, Wharton JT and O'Brian CA: Cytotoxic T cells isolated from ovarian malignant ascites recognize a peptide derived from the HER-2/neu protooncogene. Cell Immunol 151: 225-234, 1993.)。
また、本発明のペプチドのうち特定のものについては複数のＨＬＡ型に結合することができる。よって、本発明のペプチドによれば、極めて広範な癌患者群をカバーする癌ワクチン、樹状細胞療法の提供等が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＭＵＣ１に対する樹状細胞／ＣＴＬ療法を受けた患者（ＨＬＡ型：２４：０２／３３：０３）由来のサンプルを配列番号１、３、５又は１０のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＡアッセイの結果（ＩＦＮ−γ産生細胞数）を示す。
【図２】図２は、ＭＵＣ１に対する樹状細胞／ＣＴＬ療法を受けた患者（ＨＬＡ型：２４：０２／３３：０３）由来のサンプルを配列番号１、３、５又は１０のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＡアッセイの結果（ＩＦＮ−γ産生細胞数）を示す。
【図３】図３は、ＭＵＣ１に対する樹状細胞／ＣＴＬ療法を受けた患者（ＨＬＡ型：０２：０６／２４：０２）由来のサンプルを配列番号１、３、５又は１０のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＡアッセイの結果（ＩＦＮ−γ産生細胞数）を示す。
【図４】図４は、ＭＵＣ１に対する樹状細胞／ＣＴＬ療法を受けた患者（ＨＬＡ型：０２：０１／０２：０６）由来のサンプルを配列番号１、２、３、５、１０又は１１のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＡアッセイの結果（ＩＦＮ−γ産生細胞数）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．免疫原性ペプチド
本発明に係るペプチドは配列番号１〜１２のいずれかで表されるアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ合計１１以下、好ましくは１０以下、より好ましくは９以下のアミノ酸残基から成るペプチドである。本発明のペプチドは配列番号１〜１２のいずれかで表されるアミノ酸配列から成るものであってもよい。本発明のペプチドは腫瘍関連抗原の一つであるムチン１（ＭＵＣ１）に由来する。
ＭＵＣ１を構成するアミノ酸配列に基づき、能動学習実験法（特開平１１−３１６７５４号公報）を用いて得られる仮説により予測された、ＨＬＡ分子との結合性が−ｌｏｇＫｄ値に換算して３以上であるアミノ酸配列が選択された。
【００１３】
本発明のペプチドを構成するアミノ酸配列とそのＨＬＡ結合予測スコアについて以下の表１に示す。
【表１】
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【００１４】
本発明のペプチドはＨＬＡ結合性があり、且つ免疫原性を有する（以降、単に「ＨＬＡペプチド」又は「免疫原性ペプチド」と称する場合もある）。本明細書で使用する場合、「免疫原性」とは免疫反応を誘導することができることを意味し、例えば、ＣＴＬ誘導活性を有し、延いては癌細胞に対する細胞傷害活性を有することを意味する。
【００１５】
好ましい態様において、本発明のペプチドはＨＬＡ−Ａ遺伝子Ａの対立遺伝子型の複数と結合することができるマルチＨＬＡペプチドである。例えば、配列番号１０のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子の産物（ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子）、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子の産物（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子）及びＨＬＡ−Ａ＊０２：０６遺伝子の産物（ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６分子）と強く結合するとともに、高い免疫原性を有するものである。
【００１６】
本発明のペプチドが結合し得るＨＬＡサブタイプはＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１及びＨＬＡ−Ａ＊０２：０６に限定されるものではない。しかしながら、これらのＨＬＡサブタイプは日本人を含む東洋人の８５％程度、また西洋人の５５％程度を網羅するものであるため、本発明のマルチＨＬＡペプチドは免疫療法等において広い患者カバー率を有すると考えられる。
【００１７】
本発明のペプチドは、免疫原性を保持する限り、配列番号１〜１２のアミノ酸配列を構成するアミノ酸残基又はその一部が修飾されていてもよい。配列番号１〜１２で表されるアミノ酸配列は抗原提示細胞上で提示される状態を意図しているが、本発明のペプチドを直接体内に投与した場合、投与経路によっては消化器官などでその末端が消化されるなどの変化を受けることがある。よって、本発明のペプチドは、抗原提示細胞上で所定のＨＬＡクラスＩ分子と結合する際に配列番号１〜１２で示されるアミノ酸残基が保持されているように、抗原提示細胞に取り込まれる前はＮ末端及び／又はＣ末端に１又は複数のアミノ酸残基等が付加された前駆体の状態で存在していてもよい。
【００１８】
更に、本発明のペプチドは所望の免疫原性を有する限り、本発明のペプチドを構成する１個又は数個のアミノ酸残基が置換、挿入、欠失又は付加されているか、そして／あるいは糖鎖付加、側鎖酸化、及び／又はリン酸化などの修飾がされていてもよい。本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体、誘導体を含む。本明細書においてアミノ酸は、天然タンパク性L-アミノ酸；D-アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β-アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニンなど）、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン及びα-メチル-ヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。
【００１９】
アミノ酸残基の置換等に関して、ＨＬＡに結合性を示すペプチド配列の規則性を考慮して(J. Immunol., 152: p3913, 1994; Immunogenetics, 41: p178, 1995; J. Immunol., 155: p4307, 1994)、当業者は適宜本発明のペプチドを構成するアミノ酸残基を置換することができる。
【００２０】
より具体的には、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子に結合するペプチドの場合、ペプチドを構成する第２位のアミノ酸がチロシン、フェニルアラニン、メチオニン又はトリプトファンで置換されてもよく、そして／あるいはＣ末端のアミノ酸がフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンで置換されていてもよい。また、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子に結合するペプチドの場合、第２位のアミノ酸がロイシン又はメチオニンで置換されてもよく、そして／あるいはＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンで置換されていてもよい。更に、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６分子に結合するペプチドの場合、第２位のアミノ酸がバリン又はグルタミンに置換されてもよく、そして／あるいはＣ末端のアミノ酸がバリン又はロイシンで置換されていてもよい。
【００２１】
本発明のペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて製造可能である。例えば、Ｆｍｏｃ法やｔＢｏｃ法等の固相法または液相法により人工合成してもよい。また、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド又は当該ポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを発現させることにより所望のペプチドを製造してもよい。また、こうして得られたペプチドは、いずれも当業者に公知の手法を用いて同定可能である。例えば、エドマン分解法や質量分析法などを用いて同定可能である。
【００２２】
２．医薬組成物
本発明に係る癌の治療又は予防のための医薬組成物は、有効成分として、例えば、配列番号１〜１２から成る群から選択される１種以上のアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ、合計１１以下、好ましくは１０以下、より好ましくは９以下のアミノ酸残基からなるペプチドを含む。医薬組成物に含まれるペプチドは配列番号１〜１２のいずれかで表されるアミノ酸配列から成るものであってもよい。当該ペプチドは上文で定義したとおりである。
【００２３】
本発明のペプチドは抗原提示細胞上で提示されることによりＣＴＬを誘導し、この誘導されたＣＴＬが癌細胞を傷害する。そのため、本発明の医薬組成物の有効成分は本発明のペプチドに限定されず、ＣＴＬを直接的又は間接的に誘導し得る成分、例えば同ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクター、あるいは同ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面に提示する抗原提示細胞又は抗原提示細胞から分泌されるエキソソーム、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。使用する抗原提示細胞としてマクロファージ、樹状細胞等が挙げられるが、ＣＴＬ誘導能が高い樹状細胞を使用することが好ましい。癌治療に使用されることが知られているその他の成分、例えばケモカイン、サイトカイン、腫瘍壊死因子、化学療法剤等を本発明の医薬組成物に含めてもよい。ペプチドの用量は、例えば患者が成人の場合１日当たり約１〜１０mgであってもよい。しかしながら、用量は患者の年齢、体重、投与方法等に応じて変動するため、当業者により適宜決定される。
【００２４】
限定されることを意図するものではないが、本発明の医薬組成物は以下の作用機序により癌細胞の殺傷等に有用であると考えられる。本発明の医薬組成物が特定の癌患者に投与されることにより、医薬組成物中のペプチドは抗原提示細胞表面にＨＬＡ分子と結合した状態で提示される。ＣＴＬはこのような抗原提示細胞上のペプチドを認識すると活性化し、増殖して全身循環に回る。ペプチドに特異的なＣＴＬが癌組織に侵入すると、癌細胞の表面にあるＨＬＡ分子に自然に結合している特異的癌抗原由来の同一ペプチドを認識して、その癌細胞を殺傷する。この働きにより癌の治療に寄与することができる。
【００２５】
癌の治療のみならず、本発明の医薬組成物は癌の予防に使用することができる。例えば、本発明の医薬組成物を健康な人体に投与することにより、ＣＴＬが誘導され、誘導された細胞傷害性Ｔ細胞が体内で留まるため、特定の癌細胞が発生したときに、この癌細胞を傷害することができる。同様に、癌治療後の人体に投与することにより、癌の再発を予防してもよい。
【００２６】
治療又は予防される癌としては、ＭＵＣ１を発現するあらゆる癌が想定される。限定することを意図するものではないが、より具体的には膵臓癌、肝細胞癌、前立腺癌、肺癌、乳癌、大腸癌、血液癌、脳腫瘍、腎臓癌、皮膚癌等が対象として挙げられる。例えば、本発明のペプチドの由来であるＭＵＣ１は膵臓癌で過剰発現しているため、本発明のペプチドは特に膵臓癌の治療又は予防に有効であると考えられる。治療又は予防されるべき癌が複数種類存在している場合、免疫原性ペプチド等の有効成分を複数種類本発明の医薬組成物に含有させることができる。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、水溶性溶剤に溶かして、製薬上許容される塩の形態で製剤にして、患者に投与することができる。このような製薬上許容される塩の形態としては、生理的に受け入れられる水溶性の塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、などの塩の形で生理的なｐＨにて緩衝させた形態が挙げられる。また、水溶性溶剤の他に、非水溶性溶剤を用いることもでき、このような非水溶性溶剤としては、例えばエタノール、プロピレングリコールなどのアルコールが挙げられる。
【００２８】
また、本実施形態の医薬組成物を含む製剤には、様々な目的に対する薬剤を含めてもよく、このような薬剤としては、例えば保存剤、緩衝剤などが挙げられる。保存剤としては、ナトリウム重亜硫酸、ナトリウム重硫酸、ナトリウムチオ硫酸塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、チメロサール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、メチルパラベン、ポリビニルアルコール、フェニルエチルアルコール、アンモニア、ジチオスレイトール、ベータメルカプトエタノールなどが挙げられる。また、緩衝剤としては、炭酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウムなどが挙げられる。これら薬剤は、系のｐＨを２〜９、好ましくは４〜８の間で維持することができる量で存在することができる。
【００２９】
本発明の医薬組成物の剤型も特に限定されないが、ワクチンの形態として使用される場合、その剤型は注射剤（筋肉、皮下、皮内）、経口製剤、点鼻製剤等が例示される。本発明の医薬組成物がワクチンの形態である場合、複数種類の有効成分を含む混合カクテルワクチンであってもよい。例えば、このようなワクチンは配列番号１〜１２で表されるペプチドのうちのいずれか２つ以上、又は他の有効成分との組み合わせで複数種類有効成分を含有し得る。
【００３０】
また、本発明のワクチンは、医薬組成物以外の成分であり、それ自身には活性がなく、医薬組成物のワクチンとしての効果をより一層高める効果のある成分を含んだ不活性成分含有ワクチンであってもよい。不活性成分としては、アジュバント、トキソイドなどが挙げられる。アジュバントの例としては、限定することを意図するものではないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム等の沈降性タイプのもの、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント等の油性タイプのものが挙げられる。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、ワクチンの形態で存在する場合、好ましくは皮内、皮下、静脈内、筋肉内投与などによる注射または注入、あるいは経皮、又は鼻、咽頭などの粘膜からの吸入などにより、体内に投与される。その一回投与量は、細胞傷害性Ｔ細胞を有意に誘導できる量から有意な数の非癌細胞が傷害を受けない量の間にて設定することができる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、人体への投与のみならず、体外での使用も意図される。より具体的には、本発明の医薬組成物は、抗原提示細胞をin vitro又はex vivoで刺激してＣＴＬ誘導活性を増大するために使用されてもよい。例えば、癌樹状細胞療法に使用される場合を例に説明すると、本発明の医薬組成物は、癌の治療又は予防を必要とする患者に由来する樹状細胞等の抗原提示細胞に予め接触された後、この抗原提示細胞を患者の体内に戻すことで患者に投与され得る。医薬組成物に含まれるペプチドは、例えばリポフェクション法、インジェクション法等により抗原提示細胞内に導入することができる。このような用途において本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが使用される場合、ポリヌクレオチドは当業界で公知の手法により抗原提示細胞に導入され得る。例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法等により、対象のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドをコードするベクターで患者由来の抗原提示細胞をin vitroで形質転換等してもよい。
【００３３】
３．免疫誘導剤
本発明に係る免疫誘導剤は、有効成分として、例えば、配列番号１〜１２から成る群から選択される１種以上のアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ、合計１１以下、好ましくは１０以下、より好ましくは９以下のアミノ酸残基からなるペプチドを含む。免疫誘導剤に含まれるペプチドは配列番号１〜１２のいずれかで表されるアミノ酸配列から成るものであってもよい。当該ペプチドは上文で定義したとおりである。
【００３４】
本発明のペプチドは抗原提示細胞上で提示されることにより免疫を誘導すると考えられる。そのため、本発明の免疫誘導剤の有効成分は本発明のペプチドに限定されず、免疫を直接的又は間接的に誘導し得る成分、例えば本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含む発現ベクター、あるいは同ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面に提示する抗原提示細胞又は抗原提示細胞から分泌されるエキソソーム、あるいはこれらの組み合わせであってもよい。使用する抗原提示細胞としてマクロファージ、樹状細胞等が挙げられるが、ＣＴＬ誘導能が高い樹状細胞を使用することが好ましい。
【００３５】
本発明の免疫誘導剤は、人体への投与のみならず、体外での使用も意図される。より具体的には、本発明の免疫誘導剤は、抗原提示細胞をin vitro又はex vivoで刺激してＣＴＬ誘導活性を増大するために使用されてもよい。例えば、樹状細胞療法に使用される場合を例に説明すると、本発明の免疫誘導剤は、免疫誘導を必要とする患者に由来する樹状細胞等の抗原提示細胞に予め接触された後、この抗原提示細胞を患者の体内に戻すことで患者に投与され得る。免疫誘導剤に含まれるペプチドは、例えば、リポソームを介したトランスフェクション（リポフェクション法）、インジェクション法等により抗原提示細胞内に導入することができる。このような用途において本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが使用される場合、ポリヌクレオチドは当業界で公知の手法により抗原提示細胞に導入され得る。例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法等により、対象のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを発現するベクターで患者由来の抗原提示細胞をin vitroで形質転換等してもよい。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「免疫誘導」とは免疫反応を誘導し、例えば、抗原提示細胞のＣＴＬ誘導活性を増大させ、更にはＣＴＬの癌細胞に対する細胞傷害活性を増大させることを意味する。また、本明細書で使用する場合、「ＣＴＬ誘導」とは、in vitro又はin vivoにおいて、本発明のペプチドが抗原提示細胞表面上に提示されることによりある抗原を特異的に認識するＣＴＬを誘導又は増殖するか、ナイーブＴ細胞を、癌細胞等の標的細胞を殺傷する能力（細胞傷害活性）を持つエフェクター細胞へ分化させるか、そして／あるいはＣＴＬの細胞傷害活性を増大させることを意味する。ＣＴＬ誘導活性は、ＣＴＬによるサイトカイン（例えばインターフェロン（ＩＦＮ）−γ）産生を評価することで測定することができる。例えば、本発明のペプチドで刺激された末梢血単核細胞等の抗原提示細胞により前駆細胞から誘導されたサイトカイン産生細胞の増大を、ＥＬＩＳＰＯＴ（Enzyme-Linked ImmunoSpot）法またはＥＬＩＳＡ(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法等の公知の高感度イムノアッセイを用いて評価することによりＣＴＬ誘導活性を測定してもよい。細胞傷害活性も51Ｃｒ遊離法等の公知の手法により測定できる。上記活性がコントロールと比較して有意に増大している場合、例えば５％以上、１０％以上、２０％以上、好ましくは５０％以上増大している場合、免疫又はＣＴＬが誘導されていると評価することができる。
【００３７】
４．抗原提示細胞の製造方法
本発明に係る抗原提示細胞の製造方法は、例えば、配列番号１〜１２から成る群から選択される１種以上のアミノ酸配列における連続した８以上のアミノ酸残基を含み、且つ、合計１１以下、好ましくは１０以下、より好ましくは９以下のアミノ酸残基からなるペプチドと抗原提示細胞とをin vitroで接触させる工程を含む。本発明の製造方法で使用されるペプチドは配列番号１〜１２のいずれかで表されるアミノ酸配列から成るものであってもよい。当該ペプチドは上文で定義したとおりである。
【００３８】
本発明の製造方法で使用されるペプチドは、抗原提示細胞表面のＨＬＡクラスＩ分子に結合し、抗原ペプチドとしてＣＴＬに提示され、それにより抗原提示細胞のＣＴＬ活性を誘導すると考えられる。そのため、抗原提示細胞と接触させるのは本発明のペプチドに限定されず、ＣＴＬを直接的又は間接的に誘導し得る成分、例えば同ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクター、あるいは同ペプチドとＨＬＡ分子との複合体を表面に提示する抗原提示細胞又は抗原提示細胞から分泌されるエキソソーム、あるいはそれらの組み合わせであってもよい。使用する抗原提示細胞としてマクロファージ、樹状細胞等が挙げられるが、ＣＴＬ誘導能が高い樹状細胞を使用することが好ましい。
【００３９】
本発明の製造方法で製造される抗原提示細胞は、上記医薬組成物又は免疫誘導剤の有効成分として使用されるだけではなく、免疫療法等のために使用されることが意図される。例えば、癌樹状細胞療法に使用される場合を例に説明すると、製造される抗原提示細胞は、免疫誘導を必要とする患者に由来する、ＣＴＬ誘導能の低い樹状細胞等の抗原提示細胞に予め接触させた後、この抗原提示細胞を患者の体内に戻すことで患者に投与され得る。本発明のペプチドは、例えば、リポソームを介したトランスフェクション（リポフェクション法）、インジェクション法等により抗原提示細胞内に導入することができる。このような用途において本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドが使用される場合、ポリヌクレオチドは当業界で公知の手法により抗原提示細胞に導入され得る。例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法等により、対象のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドをコードするベクターで患者由来の抗原提示細胞をin vitroで形質転換等してもよい。
【実施例１】
【００４０】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４１】
具体的に、本実施例における予測・実験・評価の手順は、国際公開２００６／００４１８２号パンフレットに記載された能動学習実験計画に基づいて行い、全体として次のステップを繰り返してルールを構築した。【００４２】
（１）後述する下位学習アルゴリズムの試行１回分を行う。すなわち、蓄積データのランダムリサンプリングから複数の仮説を発現し、ランダムに発現された質問候補点（ペプチド）に対する予測値の分散が最も大きい点を、実験すべき質問点として選ぶ。【００４３】
（２）選ばれた質問点のペプチドを、後述する合成・精製法により製造し、実際の結合能を後述する実験により測定して蓄積データに加える。【００４４】
このような能動学習法を行うことにより、本来ならば、９アミノ酸残基からなるペプチドについて、ＨＬＡ結合性ペプチドの全候補物質５０００億（＝２０9）通り以上について行う必要のある結合実験の数を削減できた。【００４５】
以上説明したようなルールにより、配列番号１〜１２に示したアミノ酸配列を抽出した。【００４６】
<ペプチド合成と精製>
配列番号１〜１２のアミノ酸配列を有するペプチドは、Ｆｍｏｃアミノ酸を用い、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相法にて、マニュアル合成をした。脱保護の後、Ｃ１８カラムを用いて逆相ＨＰＬＣ精製をし、９５％以上の純度にした。ペプチドの同定と純度の確認は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にて行った（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ５８００）。ペプチドの定量は、ＢＳＡを標準蛋白質としてＭｉｃｒｏ ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にて行った。【００４７】
<ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子への結合実験>
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２遺伝子の産物であるＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子へのペプチドの結合能の測定は、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子を発現するＣ１Ｒ−Ａ２４細胞（熊本大学、滝口雅文教授作成のものを、許可を得て愛媛大学、安川正貴助教授から供与いただいた。）を用いて行った。【００４８】
まず、Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞をｐＨ３．３の酸性条件に３０秒曝し、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子に元来結合している内因性ペプチドと、ＨＬＡクラスＩ分子に共通して会合している軽鎖β２ｍを解離、除去した。中和後、Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞に精製β２ｍを添加し、ペプチドの希釈列に加えて、氷上４時間インキュベートした。この間に再会合したＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子、ペプチド、β２ｍの３者の会合体（ＭＨＣ−ｐｅｐ）を認識する蛍光標識モノクローナル抗体１７Ａ１２を用いて染色した。【００４９】
その後、個々のＣ１Ｒ−Ａ２４細胞当たりのＭＨＣ−ｐｅｐ数（上記蛍光抗体の蛍光強度に比例する）を、蛍光細胞解析装置ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて定量測定した。１細胞当たりの平均蛍光強度から、本発明者が論文（Ｕｄａｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５１， ８１６−８２８， ２０００）に発表した方法にて、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２分子とペプチド間の結合解離定数Ｋｄ値を算出した。【００５０】
<ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子への結合実験>
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１遺伝子の産物であるＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子へのペプチドの結合能の測定は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子を発現する細胞株Ｔ２（ＡＴＣＣより購入）を用いて行った。【００５１】
結合能を測定したいペプチドの段階希釈列にＴ２細胞と精製β２ｍを加えたのち、３７℃で４時間インキュベートした。この時点までにペプチドの濃度依存性に発現量が増加したＨＬＡ−Ａ＊０２：０１分子を、会合型特異的な蛍光標識モノクローナル抗体ＢＢ７．２を用いて染色した。【００５２】
その後、１細胞あたりの蛍光量をフローサイトメーターにて測定し、本発明者が論文 （Ｕｄａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５１， ８１６−８２８， ２０００）に発表した方法にて、解離定数Ｋｄ値を算出した。【００５３】
<ペプチドのＨＬＡ−Ａ＊０２：０６分子への結合実験>
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６遺伝子の産物であるＨＬＡ−Ａ＊０２：０６分子へのペプチドの結合能の測定は、マウスのＴＡＰ（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）欠損細胞株であるＲＭＡＳに、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６遺伝子のｃＤＮＡを導入したＲＡ２．６細胞（高知大学にて新たに作成した細胞株）を用いて行った。【００５４】
まずＲＡ２．６細胞を２６℃で一晩培養し、細胞表面にペプチドを結合していないＨＬＡ−Ａ＊０２：０６分子が蓄積したところへペプチドの希釈列を加え、２６℃で６０分結合させた。【００５５】
その後３５℃で４時間培養することにより、ペプチドを結合していない空のＨＬＡ−Ａ＊０２：０６分子が変性し、立体構造が失われる。そこへ、ペプチド結合型ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６分子を特異的に認識する蛍光標識モノクローナル抗体ＢＢ７．２を加え、氷上で２０分インキュベートし、細胞を染色した。【００５６】
その後、１細胞あたりの蛍光量をフローサイトメーターにて測定し、本発明者論文（Ｕｄａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５１， ８１６−８２８， ２０００）に発表した方法にて、解離定数Ｋｄ値を算出した。【００５７】
<結合実験の評価結果>
その結果、以下の表に示すような各ＨＬＡ分子に対する本発明のペプチドの結合実験データが得られた。
【表２】
2016143814.tif 000004
【００５８】
尚、配列番号１〜１２のアミノ酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫに登録されているＭＵＣ１の所定のゲノムタンパク質の全長配列（配列番号１３）（>sp|P15941|MUC1_HUMAN Mucin-1 OS=Homo sapiens GN=MUC1 PE=1 SV=3）に由来する。【００５９】
＜ペプチド免疫誘導試験＞
（１）ペプチド刺激樹状細胞の調製
・Ｄａｙ０〜９（樹状細胞の誘導）
ＭＵＣ１に対する樹状細胞／ＣＴＬ療法を受けた患者[0]からフェレーシスにより得られた末梢血単球のうち、培養フラスコに接着した細胞画分をＡＩＭ−ＣＭ培地（Gibco社製）中で１０日間、３７℃で培養した。培養期間中、培地に対し０日目及び３日目にＩＬ−４を１５μｌ、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）を30μLそれぞれ添加し、５日目にＩＬ−４を１５μｌ、ＧＭ−ＣＳＦを３０μｌ、腫瘍壊死因子（TFN)-αを７５μｌ添加した。【００６０】
・Ｄａｙ１０（ペプチド刺激及び樹状細胞の回収）
誘導した樹状細胞を新たにＡＩＭ−ＣＭ培地中に回収し、本発明のペプチド（配列番号１〜１２）が２０μｇ／ｍｌとなるよう添加した。その後、樹状細胞を含む培地を２時間３７℃で培養した。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして以下のペプチドを使用した。
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２用ポジティブコントロール（EBV LMP2, 419-427:TYGPVFMCL（配列番号１４））
ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２用ネガティブコントロール（HIV env gp160, 584-592:RYLRDQQLL（配列番号１５））
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１用ポジティブコントロール（Flu A MP, 58-66:GILGFVFTL（配列番号１６））
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１用ネガティブコントロール（HIV gap p17, 77-85:SLYNTVATL（配列番号１７））
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６用ポジティブコントロール（EBV LMP2 453-461:LTAGFLIFL（配列番号１８））
ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６用ネガティブコントロール（HIV gap p24 341-349:ATLEEMMTA（配列番号１９））【００６１】
樹状細胞を回収し十分な量のＡＩＭ−ＣＭ培地で3回以上洗浄した後セルカウントした。【００６２】
（２）ＣＤ８Ｔ細胞の調製
・Ｄａｙ０〜９
上記ワクチンで２回以上治療された後の患者からフェレーシスにより得られた末梢血単球のうち、培養フラスコに接着しない浮遊細胞画分（リンパ球を）含む）をＡＩＭ−ＣＭ培地（Gibco社製）中で１０日間、３７℃で培養した。培養期間中、培地に対し４日目及び６日目にそれぞれＩＬ−２を４０μｌ添加した。【００６３】
・Ｄａｙ１０
CD8ネガティブセレクションキット（Miltenyi社製）を用いて培地からCD8 T細胞を分離しセルカウントした。【００６４】
（３）共培養
上記（１）及び（２）で得られた樹状細胞とＣＤ８Ｔ細胞を以下の条件にてＡＩＭ−ＣＭ培地中で３７℃で共培養した。
・ＣＤ８Ｔ細胞：5×105cells/well
・樹状細胞 ：2×105cells/well【００６５】
・Ｄａｙ１２又は１３
上記培地にＩＬ−２ ２０Ｕ／ｍｌを含んだＡＩＭ−ＣＭ培地０．４ｍｌ／ｗｅｌｌを添加した。【００６６】
（５）ＥＬＩＳＡアッセイ
・Ｄａｙ１７
Ｔ細胞と上記ペプチドでパルスした樹状細胞の共培養７日目の培養上清を、ｘ1, ｘ5, ｘ25, ｘ125の４段階に希釈し、Human IFN-γ ELISA MAX Deluxe Set (BioLegend社製)を用いて、測定限度内に収まる希釈段階を同定した。その後、同定した希釈段階にて、各サンプルにつき3回ずつ測定を行った。代表的なＥＬＩＳＡアッセイの結果として、ＨＬＡ型が２４：０２／３３：０３の患者、２４：０２／３３：０３の患者、１１：０１／２４：０２の患者、０２：０６／２４：０２の患者、０２：０１／０２：０６の患者、についてのものを順に図１〜４に示す。【００６７】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図１】
2016143814.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年8月31日(2017.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【図１】図１は、MUC１に対する樹状細胞／CTL療法を受けた患者（HLA型：２４：０２／３３：０３）由来のサンプルを配列番号１、３、５又は１０のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＡアッセイの結果（ＩＦＮ−γ産生細胞数）を示す。
【図２】図２は、MUC１に対する樹状細胞／CTL療法を受けた患者（HLA型：１１：０１／２４：０２）由来のサンプルを配列番号１、３、５又は１０のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＡアッセイの結果（ＩＦＮ−γ産生細胞数）を示す。
【図３】図３は、MUC１に対する樹状細胞／CTL療法を受けた患者（HLA型：０２：０６／２４：０２）由来のサンプルを配列番号１、３、５又は１０のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＡアッセイの結果（ＩＦＮ−γ産生細胞数）を示す。
【図４】図４は、MUC１に対する樹状細胞／CTL療法を受けた患者（HLA型：０２：０１／０２：０６）由来のサンプルを配列番号１、２、３、５、１０又は１１のペプチドで刺激した場合のＥＬＩＳＡアッセイの結果（ＩＦＮ−γ産生細胞数）を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
（５）ＥＬＩＳＡアッセイ
・Ｄａｙ１７
Ｔ細胞と上記ペプチドでパルスした樹状細胞の共培養７日目の培養上清を、ｘ１，ｘ５，ｘ２５，ｘ１２５の４段階に希釈し、Human  IFN-γ  ELISA  MAX  Deluxe  Set（BioLegend社製）を用いて、測定限度内に収まる希釈段階を同定した。その後、同定した希釈段階にて、各サンプルにつき３回ずつ測定を行った。代表的なＥＬＩＳＡアッセイの結果として、ＨＬＡ型が２４：０２／３３：０３の患者、１１：０１／２４：０２の患者、０２：０６／２４：０２の患者、０２：０１／０２：０６の患者、についてのものを順に図１~４に示す。
【国際調査報告】
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