(57)【要約】  ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含み、両端に機能的分子を有する２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体またはＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質を融合したタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を設計する。
2017010568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の（１）および（２）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体；
（１）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含む２重鎖ＲＮＡであって、当該２重鎖ＲＮＡの両端に機能的分子を有するもの、および
（２）前記（１）のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質。
【請求項２】
前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、２０塩基対から２４塩基対、または３１塩基対から３５塩基対、または４２塩基対から４６塩基対である、請求項１に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
【請求項３】
前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、１５塩基対から１９塩基対、または２６塩基対から３０塩基対、または３７塩基対から４１塩基対である、請求項１に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
【請求項４】
前記２重鎖ＲＮＡの両端に互いに相補鎖となる６塩基対以上のオーバーハングを有する、請求項３に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
【請求項５】
前記機能的分子が、アプタマーである、請求項１から４のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体を含む、ヒト細胞。
【請求項７】
前記ＲＮＡ−タンパク質複合体における、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、２０塩基対から２４塩基対、または１５塩基対から１９塩基対である、請求項６に記載のヒト細胞。
【請求項８】
ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含み、両端に機能的分子を有する２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで、当該機能的分子の相互作用を制御する方法。
【請求項９】
前記２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を調整することで、前記相互作用を正または負へ制御する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を２０塩基対から２４塩基対、または３１塩基対から３５塩基対、または４２塩基対から４６塩基対にすることで、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで前記相互作用を正へ制御する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を１５塩基対から１９塩基対、または２６塩基対から３０塩基対、または３７塩基対から４１塩基対にすることで、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで前記相互作用を負へ制御する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記２重鎖ＲＮＡの両端に互いに相補鎖となる６塩基対以上のオーバーハングを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記機能的分子が、アプタマーである、請求項８から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記２重鎖ＲＮＡと前記融合タンパク質とをヒト細胞内で結合させる、請求項８から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
次の（１）および（２）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体；
（１）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡ、および
（２）当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質との融合タンパク質。
【請求項１６】
前記２重鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を９つ以上含む、請求項１５に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
【請求項１７】
前記被凝集タンパク質が、カスパーゼ８またはその断片である、請求項１５または１６に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
【請求項１８】
請求項１５から１７に記載のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体を含む、ヒト細胞。
【請求項１９】
ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡと、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質を融合した融合タンパク質とを結合させることで、被凝集タンパク質の凝集を制御する方法。
【請求項２０】
前記２重鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を９つ以上含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記被凝集タンパク質が、カスパーゼ８またはその断片である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記２重鎖ＲＮＡと前記融合タンパク質とをヒト細胞内で結合させる、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特的の構造を有するＲＮＡ−タンパク質複合体とその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多様なナノ構造をデザインするために核酸の特性は有用であるため、近年、核酸は、分子ロボットのツールとして利用されている（非特許文献１）。DNAナノテクノロジーは、分子ロボット（非特許文献２）、ナノ分子デバイス（非特許文献３）およびナノマシン（非特許文献４）と言った制御可能な構造と機能性を備えた構造体のプラットフォームとして期待されている。RNAもまた同様に良く知られたナノ構造の構築に有用である（非特許文献５）。RNAナノ構造体は、アプタマー、リボザイムおよびRNA干渉（siRNA）と言った機能的なRNAナノ構造体を誘導するスキャフォールドとして既に利用されており、機能的なRNAナノ構造は、ドラックデリバリーといった治療用に用いることが提案されている（非特許文献６）。RNAは、DNAをテンプレートとして細胞内で合成できることから、RNAナノテクノロジーは、in vivoへの応用という利点がある。RNAの機能性および表現特徴は、細胞内で機能する分子ロボットの構築のために有用なナノ構造体を取らせることができる。特に、RNA結合タンパク質と合成RNAは、細胞内RNAの構造および機能を制御することができるRNA-タンパク質複合体（RNP）として生物の機能を制御するために利用することが期待される。しかし、RNAナノ構造体の構造および機能をタンパク質との相互作用によって制御することは、難しい。【０００３】
これまで、発明者は、RNA kink-turn (K-turn)モチーフおよびこれに結合するL7Aeタンパク質を用いてRNP依存型のナノ構造体のデザインと構築に成功している（特許文献１、非特許文献６および非特許文献７）。K-turnモチーフを含むRNAナノ構造体は、L7Aeの結合に応答して立体配座を変化させることで構造的な変化を生じさせることが可能である（非特許文献８）。そのため、RNP相互作用を利用して、RNAナノ構造体の動的な性質を制御することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO2010/010862
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hagiya, M , et al. Accounts of chemical research 2014, 47, 1681-1690.
【非特許文献２】Wickham, S. F, et al, Nat Nanotechnol. 2012, 7, 169-173.
【非特許文献３】Liu M, et al, Nat Commun. 2013, 4, 2127.
【非特許文献４】Modi, S, et al, Nat Nanotechnol 2009, 4, 325-330.
【非特許文献５】Afonin, K, et al, Accounts of chemical research 2014, 47, 1731-1741.
【非特許文献６】Osada, E, et al, ACS nano 2014, 8, 8130-8140
【非特許文献７】Ohno, H, et al, Nature nanotechnology 2011, 6, 116-120.
【非特許文献８】Turner, B, et al, Rna 2005, 11, 1192-1200.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
RNA構造と機能を制御することができるRNAナノマシンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものである。すなわち、本発明は、一実施の形態によれば、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含み、両端に機能的分子を有する２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を用いることを特徴とする。
本発明は、別の実施の形態によれば、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質を融合したタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を用いることを特徴とする。【０００８】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
［１］次の（１）および（２）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体；
（１）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含む２重鎖ＲＮＡであって、当該２重鎖ＲＮＡの両端に機能的分子を有するもの、および
（２）前記（１）のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質。
［２］前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、２０塩基対から２４塩基対、または３１塩基対から３５塩基対、または４２塩基対から４６塩基対である、［１］に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［３］前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、１５塩基対から１９塩基対、または２６塩基対から３０塩基対、または３７塩基対から４１塩基対である、［１］に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［４］前記２重鎖ＲＮＡの両端に互いに相補鎖となる６塩基対以上のオーバーハングを有する、［３］に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［５］前記機能的分子が、アプタマーである、［１］から［４］のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［６］［１］から［５］のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体を含む、ヒト細胞。
［７］前記ＲＮＡ−タンパク質複合体における、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、２０塩基対から２４塩基対、または１５塩基対から１９塩基対である、［６］に記載のヒト細胞。
［８］ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含み、両端に機能的分子を有する２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで、当該機能的分子の相互作用を制御する方法。
［９］前記２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を調整することで、前記相互作用を正または負へ制御する、［８］に記載の方法。
［１０］前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を２０塩基対から２４塩基対、または３１塩基対から３５塩基対、または４２塩基対から４６塩基対にすることで、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで前記相互作用を正へ制御する、［９］に記載の方法。
［１１］前記ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を１５塩基対から１９塩基対、または２６塩基対から３０塩基対、または３７塩基対から４１塩基対にすることで、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで前記相互作用を負へ制御する、［９］に記載の方法。
［１２］前記２重鎖ＲＮＡの両端に互いに相補鎖となる６塩基対以上のオーバーハングを有する、［１１］に記載の方法。
［１３］前記機能的分子が、アプタマーである、［８］から［１２］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］前記２重鎖ＲＮＡと前記融合タンパク質とをヒト細胞内で結合させる、［８］から［１３］のいずれか１項に記載の方法。
［１５］次の（１）および（２）を含むＲＮＡ−タンパク質複合体；
（１）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡ、および
（２）当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質との融合タンパク質。
［１６］前記２重鎖ＲＮＡにおけるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、２０塩基対から２４塩基対、または３１塩基対から３５塩基対、または４２塩基対から４６塩基対である、［１５］に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［１７］前記２重鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を９つ以上含む、［１５］または［１６］に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［１８］前記被凝集タンパク質が、カスパーゼ８またはその断片である、［１５］から［１７］のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体。
［１９］［１５］から［１８］に記載のいずれか１項に記載のＲＮＡ−タンパク質複合体を含む、ヒト細胞。
［２０］ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡと、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質を融合した融合タンパク質とを結合させることで、被凝集タンパク質の凝集を制御する方法。
［２１］前記２重鎖ＲＮＡにおけるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が、３１塩基対から３５塩基対である、［２０］に記載の方法。
［２２］前記２重鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を９つ以上含む、［２０］または［２１］に記載の方法。
［２３］前記被凝集タンパク質が、カスパーゼ８またはその断片である、［２０］から［２２］のいずれか１項に記載の方法。
［２４］前記２重鎖ＲＮＡと前記融合タンパク質とをヒト細胞内で結合させる、［２０］から［２３］のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、本発明で提供されるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含み、両端に機能的分子を有する２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を用いることで、当該機能を対応するタンパク質の存在により制御することができるため、有利である。また、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質を融合したタンパク質を含むＲＮＡ−タンパク質複合体を用いること、当該被凝集を凝集することができるため、有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１aは、 2Kt-33bp および2Kt-28bp RNA ナノマシンのタンパク質誘因性の構造変化ならびに二つのRNA鎖（青と緑）およびL7Ae タンパク質（黄）を含むRNA-タンパク質複合体の三次元モデリング結果を示す。図１bは、 RNAの構造および機能を制御する、タンパク質駆動性RNA ナノマシンの概要図を示す。図１cは、細胞内で発現したセンシングL7AeによるRNAナノマシンの発動の模式図を示す。図１dは、細胞内RNP相互作用によって誘導される細胞死の制御の模式図を示す。
【図２】図２aは、 2Kt-33bp (lane 1-6) および2Kt-28bp (lane 7-12) RNAナノマシンならびにL7Aeとの相互作用のEMSAの結果を示す。図２bは、L7Ae結合に対応するCy3およびCy5でラベルした2Kt-33bp RNAナノマシンのFRETの模式図および蛍光測定結果を示す。L7Aeの存在（赤）および非存在（黒）における、Cy3およびCy5でラベルした2Kt-33bp (下左図) および2mKt-33bp (下中央図)の蛍光スペクトルを示し、L7Aeの存在（黒色）および非存在（白抜き）における蛍光強度比（F665/F565）を示す。図２cは、L7Aeの非存在下での2Kt-33bp（左図）およびL7Aeの存在下での2Kt-33bp（右図）RNA ナノ構造体のAFM像を示す。図２dは、L7Aeの非存在下での2Kt-28bp（左図）およびL7Aeの存在下での2Kt-28bp（右図） RNA ナノ構造体のAFM像を示す。図２eは、L7Aeの存在（赤）および非存在（黒）における2Kt-33bp RNA ナノ構造体に対する両ＲＮＡ端の距離の測定結果を示す。図２fは、L7Aeの存在（赤）および非存在（黒）における2Kt-28bp RNA ナノ構造体に対する両ＲＮＡ端の距離の測定結果を示す。
【図３】図３aは、L7Aeの存在（赤）および非存在（黒）におけるbiMGA-2Kt-33bp (左図) およびbiMGA-2Kt-33bp (右図)の蛍光スペクトルを示す。図３bは、L7Aeの存在（左図）および非存在（右図）における biMGA-2Kt-33bpRNA ナノ構造体のAFM像を示す。図３cは、L7Aeの存在（左図）および非存在（右図）における biMGA-2Kt-28bp RNA ナノ構造体のAFM像を示す。図３dは、biMGA-2Kt-33bpまたはbiMGA-2Kt-28bpの開放型（黒）および閉鎖型（赤）のナノ構造体数の測定結果を示す。
【図４】図４aは、細胞内FRET シグナルを検出するためのタンパク質駆動性RNAナノマシンの模式図を示す。図４bは、フローサイトメトリーに基づいたFRETアッセイの略図を示す。図４cは、L7Aeの存在下（赤）および非存在下（黒）における2Kt-17bp-Xbp (X = 4, 5, 6, 7, 8)の蛍光スペクトルの測定結果を示す。右下図は、ＲＮＡ二本鎖長に対するFRET シグナル、[F565/F665(+L7Ae)]/ [F565/F665 (-L7Ae)]をプロットした結果を示す。図４dは、L7Ae-K-tur相互作用による RNAナノマシンの発動におけるフローサイトメトリー解析結果を示す。MS2CP (左)またはL7Ae (右)の存在下における2Kt-10bp-7bp (赤) または2mKt-10bp-7bp (青) RNA ナノマシンをHeLa細胞にコトランスフェクトした結果を示す。図４eは、MS2CPまたはL7Aeの存在下における2Kt-10bp-7bpまたは2mKt-10bp-7bp RNA ナノマシンをHeLa細胞にコトランスフェクトした際のFRETシグナルの測定結果を示す。すべてのCy3/Cy5平均強度は、MS2CP mRNA および2mKt-10bp-7bpでコトランスフェクトした細胞のCy3/Cy5平均強度で標準化した。
【図５】図５aは、細胞内のカスパーゼ８の凝集を検出するためのタンパク質駆動性RNAナノマシンの模式図を示す。図５bは、各ナノ構造体（1Kt-33bp、3Kt-33bp、6Kt-33bp、9Kt-33bpおよび14Kt-33bp）のL7Ae-caspase-8 mRNA存在下でのAFM像を示す。図５cは、各ナノ構造体（1Kt-33bp、3Kt-33bp、6Kt-33bp、9Kt-33bpおよび14Kt-33bp）およびL7Ae-caspase-8 mRNAをトランスフェクションした細胞の顕微鏡像を示す。図５dは、各ナノ構造体（1Kt-33bp、3Kt-33bp、6Kt-33bp、9Kt-33bpおよび14Kt-33bp）（左図）および対応する変異Ktを有するナノ構造体（右図）を導入した細胞をPacific Blue Annexin V染色した後のフローサイトメトリーで解析結果を示す。図５eは、図５dの結果をK-turnモチーフ数に対する死細胞数のプロットした結果を示す。
【図６】図６aは、14 K-turn モチーフを有するRNAナノ構造体とL7Ae-caspase-8の相互作用によって誘導される細胞死を測定した結果を示す。RNA ナノ構造体とmRNAをHeLa細胞にコトランスフェクトし、Pacific Blue Annexin V染色および死細胞染色し、フローサイトメトリーで、Pacific Blue-陽性細胞を死細胞として計数した。図６bは、RNAナノ構造体(14Kt-33bp または14mKt-33bp) とmRNA(L7Ae-caspase-8, L7Ae, または caspase-8)のコトランスフェクション後の細胞の顕微鏡像を示す。
【図７】図７aは、2Kt-30bpの構造を示す。図７bは、2Kt-30bp（青）およびL7Ae タンパク質（黄）を含むRNA-タンパク質複合体の三次元モデリング結果を示す。
【図８】図８は、2Kt-33bp、2mKt-33bp、2Kt-28bpおよび2mKt-28bpの二重鎖RNANの構造を示す。
【図９】図９aは、2Kt-33bp (lane 1-6) または2mKt-33bp (lane 7-12)（左図）もしくは2Kt-28bp (lane 1-6)または2mKt-28bp (lane 7-12)（右図）のL7Aeの存在下でのL7Ae-K-turn相互作用をEMSAで確認した結果を示す。
【図１０】図１０は、L7Aeの存在下（右図）および非存在下（左図）における2Kt-33bp（上図）および（下図）2Kt-28bpのAFM像を示す。図中スケールバーは、100 nmを示す。
【図１１】図１１は、biMGA (orginal stem)-2Kt-33bp-U0、biMGA (orginal stem)-2Kt-33bp-U2、biMGA (orginal stem)-2Kt-33bp-U4およびorginal stem部分の二重鎖RNANの構造を示す。
【図１２】図１２は、biMGA (orginal stem)-2Kt-28bp-U0、biMGA (orginal stem)-2Kt-28bp-U2、biMGA (orginal stem)-2Kt-28bp-U4およびorginal stem部分の二重鎖RNANの構造を示す。
【図１３】図１３は、L7Aeの存在下（白）および非存在下（黒）における、biMGA-結合RNAナノ構造体の各ウリジンリンカーにおける蛍光強度(FI)を測定した結果を示す（上図）。biMGA-2Kt-33bp (四角) およびbiMGA-2Kt-28bp (丸)の各ウリジンリンカーFI (+L7Ae)/FI (-L7Ae)をプロットした結果を示す。
【図１４】図１４は、biMGA (stem A)-2Kt-33bp-U0、biMGA (stem B)-2Kt-33bp-U0およびbiMGA (stem C)-2Kt-33bp-U0ならびにstem A、stem Bおよびstem C部分の二重鎖RNANの構造を示す。
【図１５】図１５は、biMGA (stem D)-2Kt-33bp-U0、biMGA (stem E)-2Kt-33bp-U0およびbiMGA (stem F)-2Kt-33bp-U0ならびにstem D、stem Eおよびstem F部分の二重鎖RNANの構造を示す。
【図１６】図１６は、7Aeの存在下（白）および非存在下（黒）における、biMGA-結合RNAナノ構造体における各biMGA stem配列のごとの蛍光強度(FI)測定結果を示す。
【図１７】図１７は、biMGA-結合RNAナノ構造体における各biMGA stem配列および各ウリジンリンカーのL7Aeの存在下でのL7Ae-K-turn相互作用をEMSAで確認した結果を示す。
【図１８】図１８は、L7Aeの存在下（右図）および非存在下（左図）におけるbiMGA-2Kt-33bp（上図）およびbiMGA-2Kt-28bp（下図）のAFM像を示す。図中、スケールバーは、100 nmを示す。
【図１９】図１９は、2Kt-17bp-4bp、2Kt-17bp-5bp、2Kt-17bp-6bp、2Kt-17bp-7bp、2mKt-17bp-7bpおよび2Kt-17bp-8bpの二重鎖RNANの構造を示す。
【図２０】図２０は、14 K-turn モチーフを有するRNAナノ構造体とL7Ae-caspase-8をトランスフェクトした際のCasapase-8活性を測定した結果を示す。RNAナノ構造とmRNAをトランスフェクトしたHela細胞のcaspase-8活性は、蛍光発生基質IETD-AMCを用いて測定した。
【図２１】図２１は、14 K-turnモチーフを有するRNAナノ構造体とL7Ae-caspase-8の相互作用によって誘導される細胞死を測定した結果を示す。RNA ナノ構造体 (14Kt-33bpまたは14mKt-33bp)とmRNA(L7Ae, dcasp-8, L7Ae-dcasp-8 (L7Ae-caspase-8), L7Ae-dcasp-8-CS, DED-caspase-8, L7Ae-DED-caspase-8またはL7Ae-DED-caspase-8-CS)をHeLa細胞にコトランスフェクトし、Pacific Blue Annexin V染色および死細胞染色し、フローサイトメトリーで、Pacific Blue-陽性細胞を死細胞として計数した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。以下の実施形態は本発明を限定するものではない。
【００１２】
本発明は、ＲＮＡ−タンパク質複合体および当該ＲＮＡ−タンパク質複合体中のＲＮＡまたはタンパク質に付加された機能的分子の機能を発動するためのＲＮＡ−タンパク質複合体の設計方法を提供する。
【００１３】
本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体の一実施形態は、次の（１）および（２）を含む第一のＲＮＡ−タンパク質複合体である；（１）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含む２重鎖ＲＮＡであって、当該２重鎖ＲＮＡの両端に機能的分子を有するもの、および（２）当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質。
【００１４】
また、本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体の一実施形態は、次の（１）および（２）を含む第二のＲＮＡ−タンパク質複合体である；（１）ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡ、および（２）当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質との融合タンパク質。
【００１５】
本発明の２重鎖RNAに含まれるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列とは、天然または既知のＲＮＡ−タンパク質複合体における、ＲＮＡとタンパク質との結合モチーフに含まれるＲＮＡ配列、または試験管内進化法（ｉｎｖｉｔｒｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法）により得られた人工的なＲＮＡ−タンパク質結合モチーフに含まれるＲＮＡ配列である。
【００１６】
天然のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列は、通常、約５〜７０塩基で構成されており、当該配列を有するＲＮＡは、特定のアミノ酸配列を保有するタンパク質と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成することが知られている。このような天然のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列は、以下の表１及び表２、及びウェブサイト上で利用できるデータベース：ｈｔｔｐ：／／ｇｉｂｋ２６．ｂｓｅ．ｋｙｕｔｅｃｈ．ａｃ．ｊｐ／ｊｏｕｈｏｕ／ｉｍａｇｅ／ｄｎａ−ｐｒｏｔｅｉｎ／ＲＮＡ／ＲＮＡ．ｈｔｍｌから、所望の構造変化を生ずるモチーフから適宜選択して入手することができる。本実施形態において好ましく用いられるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフは、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲによる構造解析が既に行われているモチーフ、あるいは構造解析がなされている相同タンパク質の立体構造から立体構造を推定可能なモチーフである。さらに、タンパク質がＲＮＡの二次構造及び塩基配列を特異的に認識するモチーフであることがのぞましい。
【００１７】
【表１】
2017010568.tif 000003
【００１８】
【表２】
2017010568.tif 000004
【００１９】
人工のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を含むＲＮＡとは、人工的に設計したＲＮＡ−タンパク質複合体における、２重鎖ＲＮＡとタンパク質との結合モチーフ中の２重鎖ＲＮＡのいずれか一方に含まれるＲＮＡである。このようなＲＮＡの塩基配列は、通常、約１０〜８０塩基で構成されており、特定のタンパク質の特定のアミノ酸配列と、非共有結合的に、すなわち水素結合により、特異的な結合を形成するように設計する。このような人工的なＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を含むＲＮＡとしては、特定のタンパク質に特異的に結合するＲＮＡアプタマーが例示される。標的となる所望のタンパク質に対して特異的に結合するＲＮＡアプタマーは、例えば、in vitro selection法またはSELEX法として知られている進化工学的手法により得ることができる。このときのトリガータンパク質は、当該ＲＮＡアプタマーが結合するタンパク質となる。例えば、以下の表３に挙げるＲＮＡの配列が知られており、これらもまた本発明のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列として用いることができる。
【００２０】
【表３】
2017010568.tif 000005
【００２１】
本実施形態において、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列は、対応するタンパク質との解離定数Ｋｄが、約０．１ｎＭ〜約１μＭ程度であるものが好ましい。
【００２２】
また、これらのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列自体に加え、このような配列の変異体も本発明による当該配列に包含される。本発明でいう変異体とは、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列に特異的に結合するタンパク質との間の解離定数Ｋｄが１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以上高い変異体もしくは１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以下の変異体である。このような変異体は、ＲＮＡ−タンパク質複合体が形成できる限り、適宜選択して用いることができる。また、このような変異体の塩基配列は、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列（正鎖）に対する相補的な配列を有する核酸（相補鎖）とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の塩基配列であってもよい。ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology,Vol.152,Academic Press,San Diego CA）に教示されるように、結合する核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1％SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。相補鎖はかかる条件で洗浄しても対象とする正鎖とハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」程度の洗浄条件、さらに厳しくは「0.1×SSC、0.1％SDS、65℃」程度の洗浄条件で洗浄しても正鎖と相補鎖とがハイブリダイズ状態を維持する条件を挙げることができる。具体的には、上述のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフに含まれるＲＮＡの配列と少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、96％、97％、98％または99％の配列同一性を有する塩基配列からなる。かかる変異体は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列に特異的に結合するタンパク質との間で、一定の結合を保持し、ＲＮＡ−タンパク質複合体の形成に寄与することができる。
【００２３】
本実施形態によるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する配列の具体的な例としては、Ｌ７Ａｅ（Ｍｏｏｒｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．  １２，  ｐｐ．  ８０７−８１８  （２００４））が結合する配列である、K-turn（Kt） モチーフ（５’−ＧＧＣＧＵＧＡＵＧＡＧＣ−３’/５’−ＧＣＵＣＵＧＡＣＣ−３’）（配列番号１/配列番号２）、ｋｉｎｋ−ｌｏｏｐ（配列番号３）、ｋｉｎｋ−ｌｏｏｐ２（配列番号４）が挙げられる。Ｌ７Ａｅとの結合活性を保持したK-turn（Kt） モチーフの変異体として５’−ＮＮＣＲＵＧＡＵＮＮＮＮ−３’ /５’−ＮＮＮＮＵＧＡＮＮ−３’（Ｎは任意の塩基を意味し、ＲはＡまたはＧを意味する）の配列が例示され、例えば、５’−ＧＧＣＡＵＧＡＵＧＡＡＣ−３’/５’−ＧＵＵＣＵＧＡＣＣ−３’（配列番号５/配列番号６）、５’−ＡＧＣＧＵＧＡＵＣＧＡＵ−３’/５’−ＡＵＣＧＵＧＡＣＵ−３’（配列番号７/配列番号８）、５’−ＣＧＣＡＵＧＡＵＣＡＧＡ−３’/５’−ＵＣＵＧＵＧＡＣＧ−３’（配列番号９/配列番号１０）、５’−ＵＧＣＡＵＧＡＵＧＣＵＵ−３’/５’−ＡＡＧＣＵＧＡＣＡ−３’（配列番号１１/配列番号１２）、５’−ＵＧＣＡＵＧＡＵＣＵＣＧ−３’/５’−ＣＧＡＧＵＧＡＣＡ−３’（配列番号１３/配列番号１４）、５’−ＧＧＣＧＵＧＡＵＣＡＡＣ−３’/５’−ＧＵＵＧＵＧＡＣＣ−３’（配列番号１５/配列番号１６）、５’−ＵＧＣＧＵＧＡＵＧＡＣＡ−３’/５’−ＵＧＵＣＵＧＡＣＡ−３’（配列番号１７/配列番号１８）、５’−ＣＧＣＡＵＧＡＵＧＧＵＡ−３’/５’−ＵＡＣＣＵＧＡＣＧ−３’（配列番号１９/配列番号２０）、５’−ＡＧＣＡＵＧＡＵＣＡＣＣ−３’/５’−ＧＧＵＧＵＧＡＣＵ−３’（配列番号２１/配列番号２２）、５’−ＡＧＣＧＵＧＡＵＧＵＵＣ−３’/５’−ＧＡＡＣＵＧＡＣＵ−３’（配列番号２３/配列番号２４）、５’−ＧＧＣＡＵＧＡＵＣＣＡＵ−３’/５’−ＡＵＧＧＵＧＡＣＣ−３’（配列番号２５/配列番号２６）、５’−ＡＧＣＡＵＧＡＵＧＵＧＣ−３’/５’−ＧＣＡＣＵＧＡＣＵ−３’（配列番号２７/配列番号２８）および５’−ＵＧＣＧＵＧＡＵＣＵＧＡ−３’/５’−ＵＣＡＧＵＧＡＣＡ−３’（配列番号２９/配列番号３０）が挙げられる。
【００２４】
別の具体例としては、ＭＳ２コートタンパク質が特異的に結合する配列であるＭＳ２ステムループモチーフ（22：Keryer-Bibens C, Barreau C, Osborne HB (2008) Tethering of proteins to RNAs by bacteriophage proteins. Biol Cell 100:125-138）、バチルスのリボソームタンパク質Ｓ１５が結合する配列であるＦｒ１５（24：Batey RT, Williamson JR (1996) Interaction of the Bacillus stearothermophilus ribosomal protein S15 with 16 S rRNA: I. Defining the minimal RNA site. J Mol Biol 261:536-549）が挙げられる。
【００２５】
さらなる具体例には、アミノアシル化を行う酵素であって、自身のｍＲＮＡに結合し、翻訳を阻害するフィードバック阻害を持つことが知られているＴｈｒｅｏｎｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｃｅｌｌ  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｍａｓｓ．）  ｖ９７，  ｐｐ．３７１−３８１  （１９９９））が結合する配列である、５’−ＧＧＣＧＵＡＵＧＵＧＡＵＣＵＵＵＣＧＵＧＵＧＧＧＵＣＡＣＣＡＣＵＧＣＧＣＣ−３’（配列番号３１）、およびその変異体がある。また、癌細胞特異的な内在性タンパク質であるＢｃｌ−２ファミリーＣＥＤ−９由来のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフを形成する塩基配列である、Ｒ９−２；５’−ＧＧＧＵＧＣＵＵＣＧＡＧＣＧＵＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＵＧＣＡＧＡＵＡＡＵＧＵＡＵＡＧＣ−３’ （配列番号３２）、およびその変異体、ＮＦ−ｋａｐｐａＢに結合するＲＮＡ配列のアプタマー由来の塩基配列およびその変異体が挙げられる。
【００２６】
本発明のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる２重鎖ＲＮＡ中のＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間のＲＮＡ配列は、任意の配列であって良いが、例えば、パリンドローム等の互いに相補的な配列な配列を含まず、ＲＮＡ配列単独で３次構造を取らない配列が良い。
【００２７】
本発明において、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離とは、２重鎖ＲＮＡに含まれるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列の間の塩基対数であり、当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列に含まれる２重鎖を形成する部分も当該距離として計数する。ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列として、上述したK-turn（Kt） モチーフ（５’−ＮＮＣＲＵＧＡＵＮＮＮＮ−３’ /５’−ＮＮＮＮＵＧＡＮＮ−３’）を用いる場合、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列の間は、５’−ＮＮＣＲＵＧＡＵ−（Ｎ）ｎ−ＣＲＵＧＡＵＮＮＮＮ−３’として表記され（ｎは整数）、この場合、当該距離は、ｎ+１となる。
【００２８】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離は、第一のＲＮＡ−タンパク質複合体を三角形構造として保持するため、３３塩基対であることが例示されるが、１１塩基対で３６０°回転することから、１１塩基対および２２塩基対ならびに４４塩基、５５塩基対、およびそれ以上の１１の倍数であっても良い。さらに、２塩基対の増加および減少においても、同等の効果を有する可能性が高いことから、９塩基対から１３塩基対、２０塩基対から２４塩基対、３１塩基対から３５塩基対、４２塩基対から４６塩基対、５３塩基対から５７塩基対が例示される。
【００２９】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離の他の態様として、第一のＲＮＡ−タンパク質複合体をＺ型構造として保持するため、２８塩基対であることが例示されるが、１１塩基対で３６０°回転することから、６塩基対および１７塩基対ならびに３９塩基、５０塩基対、およびそれ以上の１１の倍数＋６塩基対であっても良い。さらに、２塩基対の増加および減少においても、同等の効果を有する可能性が高いことから、４塩基対から８塩基対、１５塩基対から１９塩基対、２６塩基対から３０塩基対、３７塩基対から４１塩基対、４８塩基対から５２塩基対が例示される。
【００３０】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体を哺乳細胞に導入することを考慮すると、インターフェロン活性を防ぐため、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離が２５塩基対以下であることが好ましい。
【００３１】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体として、Ｚ型構造と三角形構造の中間の構造を保持させるため、適宜、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間のＲＮＡ配列の距離を調整することが可能である。例えば、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間が３０塩基対である第一のＲＮＡ−タンパク質複合体の構造を図７に示す。
【００３２】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体として、Ｚ型構造を保持する場合、対応するタンパク質の非存在下において、両側の末端を結合させ、後述する機能的分子を機能的な状態にするために、ループ構造を保持するため、末端に、互いに相補鎖となる６塩基対以上のオーバーハングを付加しても良い。ここで、オーバーハングとは、２重鎖構造を有するＲＮＡにおいて、３’末端または５’末端において、突出した１重鎖構造を付加された状態を意味する。
【００３３】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体の２重鎖ＲＮＡの３’末端および５’末端は、機能的分子を付加されている。本発明において、機能的分子とは、呈色、蛍光、発光、他分子への特異的結合、分子間の特異的結合阻害、酵素活性、酵素活性阻害などを可能とする分子であり、当該分子は、低分子化合物であっても良く、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質と言った生体内で機能する高分子であってもよい。例えば、蛍光色素、抗体、ＲＮＡ干渉、ＲＮＡアプタマーが例示される。
【００３４】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体の２重鎖ＲＮＡの３’末端および５’末端へ付加する機能的分子は、３’末端へ付加された分子と５’末端へ付加された分子が、互いに相互作用することで当該機能を発揮することが好ましい。ＲＮＡ−タンパク質複合体を三角形構造として設計した場合、対応するタンパク質の存在下では、当該機能を発揮するが、対応するタンパク質の非存在下では、当該機能を発揮できないため、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって機能の発揮を制御することが可能となる。一方、ＲＮＡ−タンパク質複合体をＺ型構造として設計した場合、対応するタンパク質の存在下では、当該機能を発揮しないが、対応するタンパク質の非存在下では、当該機能を発揮するため、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって機能の発揮を制御することが可能となる。
【００３５】
一つの態様として、機能的分子として蛍光色素を用いる場合、５’末端と３’末端には、蛍光共鳴エネルギー移動が起きる蛍光色素を付加することが例示される。このような蛍光色素として、Cy3およびCy5が例示される。この場合、ＲＮＡ−タンパク質複合体を三角形構造として設計すると、対応するタンパク質の存在下では、Cy3とCy5が相互作用し、蛍光共鳴エネルギー移動が起きるが、対応するタンパク質の非存在下では、蛍光共鳴エネルギー移動が起きないため、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって機能の発揮（蛍光共鳴エネルギー移動）を制御することが可能となる。一方、ＲＮＡ−タンパク質複合体をＺ形構造として設計すると、対応するタンパク質の存在下では、Cy3とCy5が相互作用せず、蛍光共鳴エネルギー移動が起きないが、対応するタンパク質の非存在下では、Cy3とCy5が相互作用して、蛍光共鳴エネルギー移動が起きるため、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって機能の発揮（蛍光共鳴エネルギー移動）を制御することが可能となる。
【００３６】
他の態様として、機能分子としてＲＮＡアプタマーを用いる場合、当該ＲＮＡアプタマーのセンス鎖を５’末端へ付加し、アンチセンス鎖を３’末端へ付加する態様が例示される。このようなＲＮＡアプタマーとして、malachite green aptamerが挙げられ、５’末端へ配列番号４４、４６、４８、５０、５２、５４および５６から成る群より選択されるいずれか一つの配列を付加し、３’末端へ配列番号４５、４７、４９、５１、５３、５５および５７から成る群より選択されるいずれか一つの配列を付加することが例示される。この場合、ＲＮＡ−タンパク質複合体を三角形構造として設計すると、対応するタンパク質の存在下では、ＲＮＡアプタマーが形成されるが、対応するタンパク質の非存在下では、ＲＮＡアプタマーが形成されないため、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって機能の発揮（ＲＮＡアプタマーとしての結合能）を制御することが可能となる。一方、ＲＮＡ−タンパク質複合体をＺ構造として設計すると、対応するタンパク質の存在下では、ＲＮＡアプタマーが形成されないが、対応するタンパク質の非存在下では、ＲＮＡアプタマーが形成されるため、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって機能の発揮（ＲＮＡアプタマーとしての結合能）を制御することが可能となる。
【００３７】
本発明の第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる二重鎖ＲＮＡの両端に上述の通り付加された機能的分子の相互作用は、対応するタンパク質を存在させるまたは存在さないことによって制御することができる。従って、本発明は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ含み、両端に機能的分子を有する２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質を結合させることで、当該機能的分子の相互作用を制御する方法を提供する。当該方法に用いられるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡは、上述した第一のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる２重鎖ＲＮＡである。
【００３８】
当該第一のＲＮＡ−タンパク質複合体の機能的分子の相互作用の制御において、２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を調整することで、対応するタンパク質の存在下において、相互作用を正の制御または負の制御することができる。本発明において、正の制御とは、２重鎖ＲＮＡの両端に付加された機能的分子の相互作用が起きることを意味し、同様に、負の制御とは、同機能的分子の相互作用が停止することを意味する。本発明において、機能的分子の相互作用とは、例えば、上述したとおり、機能的分子が蛍光色素の場合、蛍光共鳴エネルギー移動であり、機能的分子がＲＮＡアプタマーの場合、相補鎖の結合によるＲＮＡアプタマーの形成を意味する。
【００３９】
第一のＲＮＡ−タンパク質複合体の２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を２０塩基対から２４塩基対、または３１塩基対から３５塩基対、または４２塩基対から４６塩基対にすることで、当該ＲＮＡ−タンパク質複合体を形成させた場合、相互作用を正に制御することができる。
【００４０】
一方、第一のＲＮＡ−タンパク質複合体の２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間の距離を１５塩基対から１９塩基対、または２６塩基対から３０塩基対、または３７塩基対から４１塩基対にすることで、当該ＲＮＡ−タンパク質複合体を形成させた場合、相互作用を負に制御することができる。
【００４１】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質は、被凝集タンパク質との融合タンパク質であり、融合タンパク質とは、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質とがリンカー等を介して結合した単一のタンパク質であることを意味する。
【００４２】
本発明において、被凝集タンパク質とは、凝集することによって機能を発揮するタンパク質を意味し、例えば、アポトーシス制御タンパク質、プリオンタンパク質、カスパーゼ9、カスパーゼ８、アミロイドβ、タウ、ポリグルタミンタンパク質（Gatchel  JR,  Zoghbi  HY. Nat  Rev  Gene  6, 743-755, 2005）またはこれらのタンパク質の断片、ならびにApoptosis-associated speck-like protein containing caspase recruitment domain（ASC）（Hara H, et al, Nat Immunol. 14, 1247-55, 2013）などが挙げられる。
【００４３】
本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる２重鎖ＲＮＡのＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間のＲＮＡ配列の距離は特に限定されないが、例えば、１５塩基対から５２塩基対が例示される。対応するタンパク質が結合したＲＮＡ−タンパク質複合体において三角形様の構造を基盤とする繰り返し構造を呈することが、好ましく、従って、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列間のＲＮＡ配列の距離として、９塩基対から１３塩基対、２０塩基対から２４塩基対、３１塩基対から３５塩基対、４２塩基対から４６塩基対、５３塩基対から５７塩基対が例示される。
【００４４】
被凝集タンパク質とＲＮＡ−タンパク質複合体に対応するタンパク質との融合タンパク質は、本発明の第二のＲＮＡ−タンパク質複合体を存在させるまたは存在さないことによって当該非凝集タンパク質の凝集を制御することができる。従って、本発明は、ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡと当該ＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列へ結合するタンパク質と被凝集タンパク質を融合したタンパク質を結合させることで、被凝集タンパク質の凝集を制御する方法を提供する。当該方法に用いられるＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を２つ以上含む２重鎖ＲＮＡは、上述した第二のＲＮＡ−タンパク質複合体に含まれる２重鎖ＲＮＡである。
【００４５】
被凝集タンパク質を多く凝集させることによって、当該機能を発揮させるために、本発明の被凝集タンパク質の凝集を制御する方法に用いられる２重鎖ＲＮＡはＲＮＡ−タンパク質結合モチーフ配列を９つ以上含むことが好ましく、例えば、９つまたは１４個が挙げられる。
【００４６】
本発明における、２重鎖ＲＮＡは、細胞毒性を低減させるため、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン、５−メチルシチジンなどの修飾塩基に置き換えても良い。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。
【実施例】
【００４７】
以下に、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は本発明を限定するものではない。【００４８】
＜DNAおよびRNAの調製＞
すべてのＤＮＡテンプレートは、Greiner Japanより購入した。インビトロトランスクリプションに使用するＤＮＡテンプレートは、KOD-plus DNAポリメラーゼ（Toyobo）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製した。すべてのＲＮＡは、MEGAshortscript キット（Amibion）によって転写した。転写ＲＮＡは、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって精製した。ＲＮＡの回収後、ＲＮＡ濃度をNanoDrop （Thermo Scienctific）によって測定した。本実施例に用いたＲＮＡ配列を表４に示す。2mKt-33bp、2mKt-28bpおよび2mKt-17bp-7bp中の変異K-turnは、long鎖において、表４中のmKtに適宜置き換えて作製した。また、biMGA-original stem、biMGA-stem A、biMGA-stem B、biMGA-stem C、biMGA-stem D、biMGA-stem EおよびbiMGA-stem Fを有するbiMGA-2Kt-28bpは、short鎖において、表４中の各stemに適宜置き換えて作製した。生細胞に導入するRNAナノマシン(1Kt-33bp, 3Kt-33bp, 6Kt-33bp, 9Kt-33bp, 14Kt-33bpと1mKt-33bp, 3mKt-33bp, 6mKt-33bp, 9mKt-33bp, 14mKt-33bp) 及びmRNAを調整する際には、は、免疫応答を低減させるため、転写の際にウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に替えて、それぞれシュードウリジン−5’ −三リン酸及びメチルシチジン−5’−三リン酸(TriLink BioTechnologies)を用いて調整を行った。【００４９】
【表４−１】
2017010568.tif 000006
【表４−２】
2017010568.tif 000007
【表４−３】
2017010568.tif 000008
【表４−４】
2017010568.tif 000009
【表４−５】
2017010568.tif 000010
【表４−６】
2017010568.tif 000011
【表４−７】
2017010568.tif 000012
【表４−８】
2017010568.tif 000013
【００５０】
＜RNAのCy3および Cy5のラベル化＞
Cy3または Cy5でラベルされたＲＮＡを、T4 RNAリガーゼ（Ambion）およびpCp-Cy3 (Jena Bioscience) または pCp-Cy5 (Jena Bioscience)を使用したライゲーションによって調製した。Cy3または Cy5のラベル化は、１０μｌの１０％（v/v）DMSO中、１０ＵのT4 RNAリガーゼ、３nmolのpCp-Cy3 または pCp-Cy5と、１５０pmolのＲＮＡを１６℃で３６〜４８時間混合した。Cy3またはCy5ラベルＲＮＡをRNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen)で精製した。ＲＮＡの回収後、Cy3 または Cy5およびＲＮＡ濃度をNanoDrop (Thermo Scienctific)で測定した。【００５１】
＜電気泳動移動度シフト解析（EMSA）＞
1.5 mM MgCl2 および 150 mM KClを含む20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)中、L-RNA および S-RNA (各50 nM)の混合液を８０℃で３分間加熱した後、室温で１０分間冷却した。L7Ae (100, 300, および 600 nM)を添加した後、混合液を室温で１０〜３０分インキュベートした。該混合液を10×添加液（0.25% ブロモフェノールブルー、30% グリセロール）と混合し、室温で0.5×Tris/Borate/EDTA 緩衝液を使用した未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをSYBR I および II (Lonza)で10分間染色した。Gel Doc EZ Image(画像）r (BIO-RAD) または Typhoon FLA-7000 laser scanner (GE Healthcare)を使用してゲル画像を得た。【００５２】
＜高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)＞
RNA および RNPのナノ構造体は、溶液中で観察された。本サンプルは、EMSAにおいて記載した通りに調製した。ばね定数約0.1 N/m、および水中約300-600 kHz 、気中約1500 kHzの共振振動数で、スモールカンチレバー（small cantilevers）(長さ9 μm , 幅2 μm and厚さ130 nm ; BL-AC10DS, Olympus, Tokyo, Japan)およびHS-AFM (Nano Live Vision, Research Institute of Biomolecules Metrology Co.)を使用してAFM画像を得た。シャーププローブを各カンチレバーに置き、Nano- tools instrument (Munich)を用いた電子ビーム蒸着を使用した。0.2-1.0フレーム/秒 (fps)の走査速度で320 × 240ピクセル画像を得た。新しいマイカ表面を0.1% APTES (3-aminopropyltriethoxy silane)で被覆した。本サンプル（600 nM タンパク質がある場合とない場合における50 nM RNA ナノ構造体）をRNP binding buffer中で調製し、AFM observation buffer (20 mM Tris-HCl (pH 7.6), および 10 mM MgCl2)で10倍希釈した。その後、室温で5分間マイカにアプライして緩衝液で洗浄した。画像シーケンスは、Image(画像）J および WSxM softwareで解析した。【００５３】
＜蛍光共鳴エネルギー移動解析＞
Cy3- および Cy5-標識ＲＮＡ（各50 nM）を80℃で3分間加熱し、1.5 mM MgCl2および150 mM KClを含む20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)中で室温10分間冷却した。タンパク質緩衝液（20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)、1.5 mM MgCl2、150 mM KCl、40% グリセロール）またはL7Ae (600 nM)および0.1% tween-20を混合液に添加し、室温で10〜30分間インキュベートした。励起波長は512 nmであり、放出および励起バンド幅は10 nmであった。蛍光測定はInfinite M1000 Plate-Reader (TECAN)を用いて行った。【００５４】
＜バイナリーマラカイトグリーンアプタマー(biMGA)の蛍光測定＞
biMGA-結合RNA ナノ構造体 (100 nM)を80℃で3分間加熱し、1.5 mM MgCl2および150 mM KClを含む20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)中で室温10分間冷却した。マラカイトグリーン(2 μM)、タンパク質緩衝液（20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)、1.5 mM MgCl2、150 mM KCl、40% グリセロール）またはL7Ae (600 nM)および0.1% tween-20を混合液に添加し、室温で10〜30分間インキュベートした。励起波長は610 nmであり、放出および励起バンド幅はそれぞれ10および20 nmであった。蛍光測定はInfinite M1000 Plate-Reader (TECAN)を用いて行った。【００５５】
＜細胞培養＞
HeLa細胞を、5% CO2下37℃の、10% ウシ胎児血清(Japan Bio Serum)、可欠アミノ酸(Invitrogen)、ピルビン酸ナトリウム(Sigma)、およびAntibiotic Antimycotic solution (Sigma)を含む、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）高グルコース(Nacalai tesque)で培養した。【００５６】
＜ＲＮＡトランスフェクションおよびフローサイトメトリー解析＞
5×104の細胞を１２ウエルプレートに播種した。24時間培養後、ＲＮＡナノマシン(8 pmol)およびmRNA (500 ng)を2 μLのStem Fect (STEMGENT)を使用して細胞にコトランスフェクトした。2時間後培地を交換した。トランスフェクションの12時間後に細胞をPBSで洗浄し、37℃で3分間、200 μLの0.25% Tripsin-EDTA (Nacalai tesque)中でインキュベートした。2%ウシ胎児血清を含むダルベッコPBSを100 μL添加した後、FACSAria セルソーター(BD Bioscience)で細胞を解析した。Cy3蛍光を検出するために、532 nmレーザーおよび575/25 nm光学フィルタを使用した。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に帰するCy5蛍光を検出するために、532 nmレーザーおよび670/30 nm光学フィルタを使用した。フローサイトメトリー解析において、FSCに対するSSCのドットプロットを用いて死細胞を除去した。Cy3およびCy5の蛍光強度比の平均を計算することによって、ＲＮＡナノマシンの発動によるFRETシグナル変化を評価した。得られた平均値は、MS2CP mRNAおよび2mKt-10bp-7bpでトランスフェクトしたネガティブコントロール細胞の平均値によって標準化した。【００５７】
＜細胞死測定アッセイ＞
5×104個の細胞を24-well platesに播種し、24時間培養後、RNA nanostructures (0.1 pmol)およびmRNA (10 ng)を1 μLのStem Fect (STEMGENT)を用いて、細胞に共導入した。2時間後、培地を交換した。細胞の形態分析は、RNA導入後２４時間後に行った。培養上清および細胞を回収し、Pacific Blue-labeled Annexin V (Life Technologies)を用いて染色した。死細胞は、必要に応じて、SYTOX AADvanced Dead Cell stain (Life Technologies)で追加染色した。染色された細胞は、FACSAria cell sorter (BD Bioscience)を用いて解析した。405 nmおよび488 nmのレーザーでそれぞれPacific BlueおよびSYTOX AADvanced Dead Cell stainの励起に用いた。450/50 nmおよび660/20 nmの光学フィルタを用いて、それぞれPacific BlueおよびSYTOX AADvanced Dead Cell stainを検出した。Pacific Blueの高い蛍光強度細胞を有する細胞を、アポトーシスおよび死細胞として計数した。【００５８】
［実施例１］＜タンパク質作動性のRNAナノマシンのデザインと構築＞
RNAナノマシンを構築するため、２つのL7Ae-K-turn相互モチーフを含む2種類のRNPナノ構造体をデザインした(図１a)。K-turnモチーフは、L7Aeとの結合がない状態においては、柔軟な立体構造を取るが、L7Ae-K-turn相互作用により、K-turnモチーフにおいて約60℃で屈曲することで立体構造の変化を引き起こす。3回転および2.5回転のらせん回転に対応するように33塩基対、30塩基対および28塩基対の3つの二重鎖RNAの間に2つのK-turnモチーフを設置した(それぞれ、2Kt-33bp、2Kt-30bpおよび2Kt-28bpと言う)（図１a、図７および図８）。2Kt-33bpおよび2Kt-28bpは、L7Ae導入により立体配座変化を引き起こし、それぞれ、三角形およびZ型構造を形成するようデザインされた。また、2Kt-30bpは、その中間の構造を示すことが想定された。RNAナノマシンは、互いに相互作用する長鎖（L鎖：K-turmモチーフにおいて長い）と短鎖（S鎖：K-turmモチーフにおいて短い）から成る。Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)によって、2Kt-33bpおよび2Kt-28bpのL7Ae-K-turn相互作用を調べた。この二つのRNAナノマシンは、濃度依存的に2つのバンドが呈されL7Aeと相互作用することが確認された(図２a)。一方、2つのK-turnに変異体を有するRNAナノ構造体(2mKt-33bpおよび2mKt-28bp)（図８）では、L7Aeの存在下においてもこのようなバンドシフトは見られなかった(図９)。これらの結果は、2つのK-turnモチーフにL7Aeが特異的に結合することによって、RNPナノ構造体が形成されたことを示唆している。続いて、Cy3およびCy5をラベルした2Kt-33bpを用いてForster resonance energy-transfer (フェルスター共鳴エネルギー移動、FRET)によりL7Aeによる2Kt-33bpの構造変化を確認した。2Kt-33bpのＬ鎖およびＳ鎖の3'末端をそれぞれCy3およびCy5でラベルした。L7Aeの存在下および非存在下においてCy3およびCy5でラベルした2Kt-33bpの蛍光スペクトルを測定した。その結果、L7Aeの存在下では、565 nm (F565)のCy3シグナルの減弱および665 nm (F665)のCy5でシグナルの増加が確認された(図２b左図)。一方、Cy3およびCy5ラベルした2mKt-33bpでは、L7Aeによって蛍光スペクトルの影響は確認されなかった(図２b右図)。2mKt-33bpでは、シグナル比(F665/F565)の変化はなかったが、2Kt-33bpでのシグナル比(F665/F565)は、ＲＮＰ形成前後で1.4倍の増加が見られた。以上の結果より、L7Ae-K-turn相互作用に起因する構造変化によってFRETが惹起されることが示された。【００５９】
RNAナノマシンの構造変化を観察するため、2Kt-33bpおよび2Kt-28bpへのL7Aeの添加前後で高速原子間力顕微鏡(HS-AFM)にて解析した（図２cおよびd）。L7Aeの非存在下では、2Kt-33bpおよび2Kt-28bpは、不均一なRNA構造を示したが、L7Aeの存在下では、単一の構造を示した。2Kt-33bpおよび2Kt-28bpは、L7Ae導入により立体配座変化を引き起こし、それぞれ、三角形およびZ型構造を形成するようデザインされていることから(図２c、図２dおよび図１０)、AFMを用いて、末端間の距離を測定した(図２eおよびf)。L7Aeの非存在下において、2Kt-33bpでの当該距離は、2つのK-turnモチーフに柔軟性があることから、10-44 nmに分布していた。一方、L7Aeの存在下においては、当該距離の分布は収束していた。L7Aeの非存在下と存在下における平均距離は、それぞれ24.0 nmおよび4.9 nmであった(図２e)。これは、L7Ae-K-turn相互作用により、三角形構造を取ることで構造が限定したためであると考えられる。一方、2Kt-28bpでは、Z型構造を取ると想定さており、RNPナノ構造体の当該平均距離は、20.8 nmであり、これは、３Dモデルによる想定値とよく一致している。これらの結果より、L7Ae-K-turn相互作用により、所望のRNAナノマシンの構造変化を導入できることが示唆された。【００６０】
＜タンパク質応答型RNAナノマシンによる機能性RNAの制御＞
RNAナノマシンの構造変化は、L7Ae-K-turn相互作用により制御できることが示されたため、続いて、RNAナノマシンがRNP形成応答によって分割されたRNAアプタマーの活性を制御できるかを検討した。分割したbinary malachite green aptamer (biMGA)をそれぞれ末端に付加したRNAナノマシンを構築した。biMGAプローブは、2Kt-33bpおよび2Kt-28bp 付加し、RNP形成によるアプタマーの活性化と抑制の制御を検討した。biMGA付加RNAナノマシン(それぞれ、biMGA-2Kt-33bpおよびbiMGA-2Kt-28bpと言う)をmalachite green (MG)の存在下でL7Aeの接触の前後において蛍光スペクトルを測定することで、構造変化による機能的RNAの制御の検討を行った。biMGA付加RNAナノマシンの構築のため、RNAナノマシンとbiMGA間のリンカーの長さ（0〜４塩基対）およびbiMGAのステム配列（biMGA-original stem、biMGA-stem A、biMGA-stem B、biMGA-stem C、biMGA-stem D、biMGA-stem EおよびbiMGA-stem F）を検討し、リンカーの長さは、0塩基対で、biMGA-2Kt-33bpではstem Aで、biMGA-2Kt-28bpではstem Dが最適であることを確認し（図１１から図１８)、RNP 形成によりbiMGA を活性化または抑制できるbiMGA-2Kt-33bpおよびbiMGA-2Kt-28bpの 2つのbiMGA付加RNAナノマシンを製造した(図３a)。当該biMGA-2Kt-33bpおよびbiMGA-2Kt-28bpのL7Aeの非存在下および存在下の構造をHS-AFMを用いて観察した(図３bおよびc)。L7Aeの非存在下のbiMGA-2Kt-33bpおよびbiMGA-2Kt-28bpのAFM像によれば、開放構造や閉鎖構造など不均一なRNA構造を呈した(図３bおよびcの左図)。一方、L7Aeの存在下では、biMGA-2Kt-33bpおよびbiMGA-2Kt-28bpはそれぞれ、三角形構造またはZ型構造のRNPナノ構造体を形成することが確認された(図３bおよびcの右図)。RNP形成前後における閉鎖状態の分画の変化を調べるため、L7Aeの存在下および非存在下での閉鎖および開放状態の分画を定量化した(図３d)。biMGA- 2Kt-33bpにおいて、RNP形成前後における閉鎖および開放状態の分画はそれぞれ19%および81%であった。RNP形成後、閉鎖状態のbiMGA- 2Kt-33bpの分画は92％まで増加した。一方、biMGA- 2Kt-28bpの開放状態の分画は、RNP 形成により47％から75％まで増加した。これらの結果は、biMGAの活性は、RNP相互作用に応答してRNAナノマシンの構造変化により制御できることが示された。【００６１】
＜生細胞内で発現するタンパク質によるRNAナノマシンの作動＞
L7Aeにより起動するRNAの構造および機能を活性化するナノマシンの構築を試みた。タンパク質は、機能表現を呈することができる生体適合材料として用いることができる。そこで、RNAナノマシンが細胞内で発現するL7Aeに応答して作動することができるか否かを検討した。細胞内のRNAナノマシンの構造変化を検出するため、Cy3およびCy5でラベルしたRNAナノマシンを用いてFRET解析によるフローサイトメトリーを行った(図４aおよびb)。RNAナノマシンによるインターフェロン活性を抑制するため、3つの17 bpの二重鎖RNAを含む2つのK-turnモチーフを有する2Kt-17bpを構築した。4, 5, 6, 7および8塩基対の短鎖二重鎖RNAを2Kt-17bpに取り込み、RNP相互作用により環状構造からZ様型へと変化するRNAナノマシンを製造した(それぞれ2Kt-17bp-4bp, 2Kt-17bp-5bp, 2Kt-17bp-6bp, 2Kt-17bp-7bpおよび2Kt-17bp-8bpと言う)(図４aおよび図１９)。In vitroでのRNP形成の前後におけるFRETシグナルの変化を検出するため、Cy3およびCy5でラベルしたRNAナノマシンの蛍光スペクトルを測定した(図４c)。2Kt-17bp-4bpおよび2Kt-17bp-5bpの蛍光スペクトルは、L7Aeの存在下で微小な変化を示した。一方、2Kt-17bp-6bp, 2Kt-17bp-7bpおよび2Kt-17bp-8bpの場合、RNP形成により565 nmのCy3のシグナルが増加し、665 nmのCy5のシグナルが減少した。FRETシグナルの変化は、二重鎖RNAの長さによって増加し、7塩基対で最も大きい変化に到達した。従って、RNAナノマシンとして2Kt-17bp-7bpを以後の実施例に用いた。
細胞内でのRNP相互作用を調べるため、2mKt-17bp-7bp（変異K-turnモチーフを有する陰性対照）L7AeおよびMS2CP（RNA結合タンパク質の陰性対照）mRNAを構築した。RNAナノマシン（2Kt-17bp-7bpまたは2mKt-17bp-7bp）およびL7AeまたはMS2CPをコードするmRNAをHeLa細胞へ同時導入した(図４b)。細胞内のRNAナノマシンのFRETシグナルの変化への関与をフローサイトメーターを用いて解析した(図４dおよびe)。MS2CPを発現するHeLa細胞のフローサイトリー解析結果は、2Kt-17bp-7bp and 2mKt-17bp-7bp間のFRETシグナル値に有意な違いは見られなかった。L7Aeを発現するHeLa細胞では、2Kt-17bp-7bpを導入した細胞において最も高いFRETシグナル値を示したが、2mKt-17bp-7bpを導入した細胞では、MS2CPを発現する細胞での結果と同様にFRETシグナル値に有意な違いは見られなかった(図４e)。以上の結果から、L7Aeを発現する細胞における2Kt-17bp-7bpのFRETシグナルの増加は、細胞内におけるL7Ae-K-turn相互作用に起因することが示唆された。RNAナノマシンはL7Aeを発現する細胞でL7Aeを検知し、L7Ae-K-turn相互作用により発動することができることが確認された。【００６２】
＜RNP相互作用を介した細胞内タンパク質凝集によるヒト細胞の制御＞
RNP相互作用を介した細胞内タンパク質凝集と当該凝集の感知によるヒト細胞制御を試みた。ヒト細胞の制御のため、デスエフェクタードメイン（death effector domain）欠損caspase-8をL7Aeと融合し(以下、L7Ae-caspase-8と言う) （配列番号６５および６６）、RNP相互作用によるL7Ae-caspase-8を凝集させ、当該凝集caspase-8の活性化により引き起こされる細胞死が誘導できるかを検討した（図５a）。1個、3個、6個、9個または14個のK-turnモチーフを有する RNAナノ構造体（それぞれ、1Kt-33bp, 3Kt-33bp, 6Kt-33bp, 9Kt-33bpおよび14Kt-33bpと言う）を設計した（図５b）。また、対応する変異K-turnモチーフを有する変異体（それぞれ、1mKt-33bp, 3mKt-33bp, 6mKt-33bp, 9mKt-33bpおよび14mKt-33bpという）を陰性対照として用いた。細胞死はRNAナノ構造体のK-turnモチーフ上にL7Ae-caspase-8が凝集することによって引き起こされるかを検討するため、各RNAナノ構造体とL7Ae-caspase-8 mRNAをHeLa細胞へ同時導入した。細胞形態の解析によりK-turnモチーフの数が増加するごとに細胞死が誘導されることが示された(図５cの上図)。一方、変異K-turnモチーフを有するRNAナノ構造体では細胞死が確認されなかった(図５cの下図)。細胞死を定量化するため、Pacific Blue Annexin Vで染色し、フローサイトメーターを用いて解析した。細胞死を引き起こしていると推測されるPacific Blue陽性細胞は、RNAナノ構造体中のK-turnモチーフの数と比例して増加することが確認され、14Kt-33bp導入細胞において最も多く観察された。一方、変異K-turnモチーフを有するRNAナノ構造体ではこのようなK-turnモチーフの数による細胞死の増加は見られなかった(図５dおよびe)。さらに、14Kt-33bpまたは14mKt-33bpと共にL7Aeまたはcaspase-8 mRNAを導入した場合、すべての組み合わせではほとんど細胞死が確認できなかった（図６）。以上の結果から、RNAナノ構造体上のL7Ae-K-turn相互作用を介したL7Ae-caspase-8の凝集により細胞死の制御が可能であることが示された。【００６３】
＜caspase-8活性測定＞
2×105 の細胞を6ウエルプレートに播種した。24時間培養後、RNAナノ構造(0.4 pmol)およびmRNA (40 ng)を4 μLのStem Fect (STEMGENT)を使用して細胞にコトランスフェクトした。2時間後培地を交換した。caspase-8活性測定はトランスフェクション6時間後に行った。Caspase-8活性は、APOPCYTO Caspase-8 Fluorometric Assay Kit (MBL)を用いて測定を行った。【００６４】
caspase-8の活性化を介したアポトーシスによって細胞死が誘起されるかを調べるために、14Kt-33bpまたは14mKt-33bpと L7Ae-caspase mRNA（配列番号６５）をHela細胞にトランスフェクションし、蛍光発生基質IETD-AMCを用いてcaspase-8活性を測定した。14Kt-33bpと L7Ae-caspase mRNAの組み合わせの際に最も高いcaspase-8活性を観測し、その活性は、caspase-8阻害剤の添加により明らかに減少した。【００６５】
＜アポトーシスアッセイ＞
5×104 の細胞を24ウエルプレートに播種した。24時間培養後、RNAナノ構造(0.1 pmol)およびmRNA (10 ng)を1 μLのStem Fect (STEMGENT)を使用して細胞にコトランスフェクトした。2時間後培地を交換した。細胞を回収した後、Pacific Blue-labelled Annexin V (Life Technologies)とSYTOX AADvanced Dead Cell stain (Life Technologies)で染色を行った。その染色した細胞は、FACSAria cell sorter (BD Bioscience)またはBD LSRFortessa (BD Bioscience)を用いて解析を行った。高いPacific Blueの蛍光強度を示す細胞をアポトーシス細胞としてカウントした。【００６６】
細胞死がRNA-タンパク質相互作用により起こるかどうか調べるためにRNA ナノ構造体 (14Kt-33bpまたは14mKt-33bp)とmRNA(L7Ae［配列番号９２］, dcasp-8［配列番号８７］, L7Ae-dcasp-8 (L7Ae-caspase-8) ［配列番号６５］, L7Ae-dcasp-8-CS［配列番号８８］, DED-caspase-8［配列番号８９］, L7Ae-DED-caspase-8［配列番号９０］またはL7Ae-DED-caspase-8-CS［配列番号９１］)を導入し、細胞死が起こるかどうかを調べた。L7Ae-DED-caspase-8はL7Ae-dcasp-8にDED配列を付加したmRNAである。L7Ae-dcasp-8-CS及びL7Ae-DED-caspase-8-CS は、対応するL7Ae-dcasp-8及びL7Ae-DED-caspase-8のcaspase活性化を引き起こさない変異体である。14Kt-33bpとL7Ae-dcasp-8及びL7Ae-DED-caspase-8において高い細胞死活性が観測された。一方でその他の組み合わせではほとんど細胞死が確認できなかった。以上の結果から、RNAナノ構造体上のL7Ae-K-turn相互作用を介したL7Ae-caspase-8の凝集によりcaspase-8が活性化し、細胞死を引き起こすことが示された。
【図１】
2017010568.tif 000014
【図２】
2017010568.tif 000015
【図３】
2017010568.tif 000016
【図４】
2017010568.tif 000017
【図５】
2017010568.tif 000018
【図６】
2017010568.tif 000019
【図７】
2017010568.tif 000020
【図８】
2017010568.tif 000021
【図９】
2017010568.tif 000022
【図１０】
2017010568.tif 000023
【図１１】
2017010568.tif 000024
【図１２】
2017010568.tif 000025
【図１３】
2017010568.tif 000026
【図１４】
2017010568.tif 000027
【図１５】
2017010568.tif 000028
【図１６】
2017010568.tif 000029
【図１７】
2017010568.tif 000030
【図１８】
2017010568.tif 000031
【図１９】
2017010568.tif 000032
【図２０】
2017010568.tif 000033
【図２１】
2017010568.tif 000034
【配列表】
2017010568000001.app
【国際調査報告】
2017010568.tif 000035
2017010568.tif 000036
2017010568.tif 000037
2017010568.tif 000038
2017010568.tif 000039
2017010568.tif 000040
2017010568.tif 000041