(57)【要約】【課題】  優れた標的遺伝子発現抑制効果を有する核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を提供すること。【解決手段】  転写産物、例えば標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸を含む活性部分と、該核酸に相補的であり、かつ、少なくとも１つのバルジ構造を有する核酸を含むキャリアー部分とを含む核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を用いることにより、上記課題は解決される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）デオキシリボヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドを含む活性部分、および
（ｉｉ）ヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含む核酸複合体であって、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含む、核酸複合体。
【請求項２】
二本鎖核酸複合体である、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項３】
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが１〜３つのバルジを含む、請求項１または２に記載の核酸複合体。
【請求項４】
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが１つのバルジを含む、請求項３に記載の核酸複合体。
【請求項５】
上記（ｉ）活性部分のポリヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチドの一部または全部が修飾されている、請求項１〜４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項６】
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項７】
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが１つまたは複数のヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログの少なくとも１つが修飾されていてもよい、請求項１〜６のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項８】
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドを含み、そして
当該ポリヌクレオチドが、
（ａ）上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む５’ウィング領域、および／または、
（ｂ）上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む３’ウィング領域、
を含む、
請求項１〜７のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項９】
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ａ）５’ウィング領域および（ｂ）３’ウィング領域を含む、請求項８に記載の核酸複合体。
【請求項１０】
上記５’ウィング領域が２〜５個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み、上記３’ウィング領域が２〜５個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む、請求項８または９に記載の核酸複合体。
【請求項１１】
上記５’ウィング領域が１個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み、上記３’ウィング領域が１個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む、請求項８または９に記載の核酸複合体。
【請求項１２】
上記５’ウィング領域および３’ウィング領域が、糖修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとして架橋化ヌクレオチドを含む、請求項８〜１１のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項１３】
上記架橋化ヌクレオチドが、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される、請求項１２に記載の核酸複合体。
【請求項１４】
上記架橋化ヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、請求項１３に記載の核酸複合体。
【請求項１５】
上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドが、ホスホロチオエート化されている、請求項８〜１４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項１６】
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、ホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる５’ウィング領域、ホスホロチオエート化されているデオキシリボヌクレオチドおよびホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる３’ウィング領域からなる、請求項８〜１５のいずれか一つに記載の核酸複合体。
【請求項１７】
上記５’ウィング領域が１〜５個の糖修飾リボヌクレオチドからなり、上記３’ウィング領域が１〜５個の糖修飾リボヌクレオチドからなり、そして、糖修飾リボヌクレオチドはさらにホスホロチオエート化されていてもよい、請求項８または９に記載の核酸複合体。
【請求項１８】
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、ホスホロチオエート化された糖修飾リボヌクレオチドからなる５’ウィング領域、ホスホロチオエート化されている少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドおよびホスホロチオエート化された糖修飾リボヌクレオチドからなる３’ウィング領域からなる、請求項１７に記載の核酸複合体。
【請求項１９】
上記糖修飾が、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化および２’−フルオロ化からなる群から選択される、請求項１７または１８に記載の核酸複合体。
【請求項２０】
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、ホスホロチオエート化された少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドからなる、請求項１〜５のいずれか一つに記載の核酸複合体。
【請求項２１】
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、構成単位としてデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１〜２０のいずれか一つに記載の核酸複合体。
【請求項２２】
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドからなる、請求項２１に記載の核酸複合体。
【請求項２３】
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、構成単位としてリボヌクレオチドを含む、請求項１〜２１のいずれか一つに記載の核酸複合体。
【請求項２４】
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドからなる、請求項２１または２３に記載の核酸複合体。
【請求項２５】
上記リボヌクレオチドが修飾されていない、請求項２３または２４に記載の核酸複合体。
【請求項２６】
上記デオキシリボヌクレオチドが修飾されていない、請求項２１〜２５のいずれか一つに記載の核酸複合体。
【請求項２７】
上記デオキシリボヌクレオチドの一部または全部が修飾されている、請求項２１〜２５のいずれか一つに記載の核酸複合体。
【請求項２８】
上記修飾デオキシリボヌクレオチドが、塩基修飾デオキシリボヌクレオチドである、請求項２７に記載の核酸複合体。
【請求項２９】
上記塩基修飾デオキシリボヌクレオチドが、脱塩基デオキシリボヌクレオチドである、請求項２８に記載の核酸複合体。
【請求項３０】
上記修飾デオキシリボヌクレオチドが塩基修飾以外の修飾を受けていない、請求項２７〜２９のいずれか一つに記載の核酸複合体。
【請求項３１】
バルジが、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドから形成される、請求項１〜３０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項３２】
バルジが、デオキシリボヌクレオチドから形成される、請求項３１に記載の核酸複合体。
【請求項３３】
バルジが、修飾されていないデオキシリボヌクレオチドから形成される、請求項３２に記載の核酸複合体。
【請求項３４】
バルジが、塩基修飾デオキシリボヌクレオチドから形成される、請求項３２に記載の核酸複合体。
【請求項３５】
バルジが、リボヌクレオチドから形成される、請求項３１に記載の核酸複合体。
【請求項３６】
バルジが、修飾されていないリボヌクレオチドから形成される、請求項３５に記載の核酸複合体。
【請求項３７】
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対しておよび／または標的転写産物に対して少なくとも１つのミスマッチを含む、請求項１〜３６のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項３８】
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対するおよび／または標的転写産物に対するミスマッチを含まない、請求項１〜３６のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項３９】
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む、請求項１〜３８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項４０】
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対するミスマッチを含まない、請求項１〜３８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項４１】
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの長さが８〜１００塩基である、請求項１〜４０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項４２】
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さが、８〜１００塩基である、請求項１〜４１のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項４３】
上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドからバルジ部分を除いて比較した場合に、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドと同じ長さを有する、請求項１〜４２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項４４】
上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドからバルジ部分を除いて比較した場合に、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの長さが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さと異なる、請求項１〜４２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項４５】
上記（ｉｉ）キャリアー部分が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分をさらに含む、請求項１〜４４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項４６】
上記（ｉｉ）キャリアー部分が標的への送達機能を有する機能性部分を含み、当該機能性部分が、脂質、ペプチド、タンパク質、糖鎖、低分子および生体分子／生体活性分子からなる群から選択される分子である、請求項４５に記載の核酸複合体。
【請求項４７】
上記機能性部分が、環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール）、ステアリン酸、ドコサン酸、アニスアミド、葉酸、アナンダミドまたはスペルミンである、請求項４６に記載の核酸複合体。
【請求項４８】
上記（ｉｉ）キャリアー部分が標的への送達機能を有する機能性部分を含まない、請求項１〜４４のいずれか一つに記載の核酸複合体。
【請求項４９】
（ｉ）ホスホロチオエート化されている少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチド、上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる５’ウィング領域および上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる３’ウィング領域を構成単位として含むポリヌクレオチドを含む活性部分、ならびに
（ｉｉ）構成単位としての修飾されていないリボヌクレオチドおよび修飾されていないデオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含む、二本鎖核酸複合体であって、
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含み、当該バルジは修飾されていないリボヌクレオチドから形成され、
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対するおよび／または標的転写産物に対するミスマッチを含まず、かつ
上記（ｉｉ）キャリアー部分が標的への送達機能を有する機能性部分を含まない、二本鎖核酸複合体。
【請求項５０】
哺乳動物において標的遺伝子の発現を減少させるための、請求項１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項５１】
活性部分におけるポリヌクレオチドが、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、請求項５０に記載の核酸複合体。
【請求項５２】
哺乳動物においてタンパク質をコードしない転写産物の発現を減少させるための、請求項１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
【請求項５３】
活性部分におけるポリヌクレオチドが、転写産物のいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、請求項５２に記載の核酸複合体。
【請求項５４】
請求項１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項５５】
請求項１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体を細胞と接触させる工程を含む、細胞内の転写産物レベルを低減する方法であって、
活性部分におけるポリヌクレオチドが該転写産物のいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、方法。
【請求項５６】
上記転写産物が、タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
上記転写産物が、タンパク質をコードしない転写産物である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減させるための、請求項１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体の使用。
【請求項５９】
哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減させるための薬剤を製造するための、請求項１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体の使用。
【請求項６０】
請求項１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において標的遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
活性部分におけるポリヌクレオチドが、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、方法。
【請求項６１】
上記投与が経腸管的投与である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
上記投与が非経腸管的投与である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
上記核酸複合体の投与量が、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項６０〜６２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６４】
上記哺乳動物がヒトある、請求項６０〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えばアンチセンス効果によって、標的遺伝子の発現を抑制する活性を有する核酸、好ましくは二本鎖核酸に関し、より詳しくは、標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸と、該核酸に相補的な核酸とを含み、この相補的核酸が少なくとも１つのバルジ構造を有する核酸、好ましくは二本鎖核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、オリゴヌクレオチドは、核酸医薬と称される医薬品としての開発が進められており、特に標的遺伝子の選択性の高さや低毒性の観点から、アンチセンス法を利用した核酸医薬の開発が精力的に進められている。アンチセンス法は、標的遺伝子のｍＲＮＡ（センス鎖）の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ））を細胞内に導入することにより、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を選択的に阻害する方法である。【０００３】
ＡＳＯとしてＲＮＡからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合には、標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）と当該ＡＳＯとが結合して、部分的に二本鎖が形成される。そして、この二本鎖が蓋の役割をして、リボソームによる翻訳を生じさせず、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害されることが知られている。【０００４】
一方、ＡＳＯとしてＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合には、部分的にＤＮＡ−ＲＮＡのヘテロオリゴヌクレオチドが形成される。そして、ＲＮａｓｅＨによってこの部分が認識され、標的遺伝子のｍＲＮＡが分解されるため、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害される。また、ＡＳＯとしてＤＮＡを用いた方（ＲＮａｓｅＨ依存的経路）がＲＮＡを用いるよりも、多くの場合において遺伝子発現の抑制効果が高いことも明らかになっている。【０００５】
ＡＳＯとしてＤＮＡを用いた場合のアンチセンス効果に関連して、特許文献１には、ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマーとそれに対するＲＮＡからなる相補鎖とをアニーリングさせた二本鎖核酸複合体が開示されている。ここでは、当該二本鎖核酸のアンチセンス効果が、１本鎖のＬＮＡ／ＤＮＡギャップマーのそれと概して変わらないことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１５−５０２１３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、優れた標的遺伝子発現抑制効果を有する核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を提供することである。【０００８】
本発明のさらに別の目的は、優れた特異性と効率で、標的部位に送達可能な核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を提供することである。【０００９】
本発明の他の目的は、以下の記載から明らかとなろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者等は、転写産物、例えば標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸を含む活性部分と、該核酸に相補的であり、かつ、少なくとも１つのバルジ構造を有する核酸を含むキャリアー部分とを含む核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を用いることにより、該転写産物の発現を著しく抑制できることを見出した。【００１１】
従って、本発明は以下に関する：
１．（ｉ）デオキシリボヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドを含む活性部分、および
（ｉｉ）ヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含む核酸複合体であって、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含む、核酸複合体。
２．二本鎖核酸複合体である、上記１に記載の核酸複合体。
３．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが１〜３つのバルジを含む、上記１または２に記載の核酸複合体。
４．上記（ｉ）活性部分のポリヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチドの一部または全部が修飾されている、上記１〜３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
５．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む、上記１〜４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
６．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドを含み、そして
当該ポリヌクレオチドが、
（ａ）上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む５’ウィング領域、および／または、
（ｂ）上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む３’ウィング領域、
を含む、
上記１〜５のいずれか１つに記載の核酸複合体。
７．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ａ）５’ウィング領域および（ｂ）３’ウィング領域を含み、該５’ウィング領域は少なくとも２つの修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み、該３’ウィング領域は、少なくとも２つの修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む、上記６に記載の核酸複合体。
８．上記５’ウィング領域が２〜５個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み、上記３’ウィング領域が２〜５個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む、上記７に記載の核酸複合体。
９．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが１つまたは複数のヌクレオチドアナログを有し、該ヌクレオチドアナログの少なくとも１つが修飾されている、上記１〜８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１０．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、１つまたは複数のヌクレオチドアナログを有し、該ヌクレオチドアナログの少なくとも１つが修飾されている、上記１〜９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１１．上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドが、ホスホロチオエート化されている、上記６〜１０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１２．上記５’ウィング領域および３’ウィング領域が、修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとして架橋化ヌクレオチドを含む、上記７〜１１のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１３．上記架橋化ヌクレオチドが、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される、上記１２に記載の核酸複合体。
１４．上記架橋化ヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、上記１２または１３に記載の核酸複合体。
１５．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む、上記１〜１４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１６．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの長さが８〜１００塩基である、上記１〜１５のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１７．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さが、８〜１００塩基である、上記１〜１６のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１８．上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドからバルジ部分を除いて比較した場合に、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドと同じ長さを有する、上記１〜１７のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１９．上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドからバルジ部分を除いて比較した場合に、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの長さが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さと異なる、上記１〜１８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２０．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、構成単位のヌクレオチドとして、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む、上記１〜１９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２１．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含まない、上記１〜９、１１〜２０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２２．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、ヌクレオチドアナログを含まない、上記１〜９、１１〜２１のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２３．バルジが、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドから形成される、上記１〜２２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２４．バルジが、リボヌクレオチドから形成される、上記２３に記載の核酸複合体。
２５．上記（ｉｉ）キャリアー部分が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分をさらに含む、上記１〜２４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２６．上記機能性部分が、脂質、ペプチド及びタンパク質から選択される分子である、上記２５に記載の核酸複合体。
２７．哺乳動物において標的遺伝子の発現を減少させるための、上記１〜２６のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２８．活性部分におけるポリヌクレオチドが、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、上記２７に記載の核酸複合体。
２９．上記１〜２８のいずれか１つに記載の核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
３０．上記１〜２６のいずれか１つに記載の核酸複合体を細胞と接触させる工程を含む、細胞内の転写産物レベルを低減する方法であって、
活性部分におけるポリヌクレオチドが該転写産物のいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、方法。
３１．上記転写産物が、タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物である、上記３０に記載の方法。
３２．上記転写産物が、タンパク質をコードしない転写産物である、上記３０に記載の方法。
３３．哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減させるための、上記１〜２６のいずれか１つに記載の核酸複合体の使用。
３４．哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減させるための薬剤を製造するための、上記１〜２６のいずれか１つに記載の核酸複合体の使用。
３５．上記１〜２６のいずれか１つに記載の核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において標的遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
活性部分におけるポリヌクレオチドが、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、方法。
３６．上記投与が経腸管的投与である、上記３５に記載の方法。
３７．上記投与が非経腸管的投与である、上記３５に記載の方法。
３８．上記核酸複合体の投与量が、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である、上記３５〜３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．上記哺乳動物がヒトある、上記３５〜３８のいずれか１つに記載の方法。【００１２】
また、本発明はさらなる態様として以下も包含し得る：
１．（ｉ）デオキシリボヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドを含む活性部分、および
（ｉｉ）ヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含む核酸複合体であって、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含む、核酸複合体。
２．二本鎖核酸複合体である、上記１に記載の核酸複合体。
３．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが１〜３つのバルジを含む、上記１または２に記載の核酸複合体。
４．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが１つのバルジを含む、上記３に記載の核酸複合体。
５．上記（ｉ）活性部分のポリヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチドの一部または全部が修飾されている、上記１〜４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
６．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む、上記１〜５のいずれか１つに記載の核酸複合体。
７．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが１つまたは複数のヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログの少なくとも１つが修飾されていてもよい、上記１〜６のいずれか１つに記載の核酸複合体。
８．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドを含み、そして
当該ポリヌクレオチドが、
（ａ）上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む５’ウィング領域、および／または、
（ｂ）上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む３’ウィング領域、
を含む、
上記１〜７のいずれか１つに記載の核酸複合体。
９．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ａ）５’ウィング領域および（ｂ）３’ウィング領域を含む、上記８に記載の核酸複合体。
１０．上記５’ウィング領域が２〜５個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み、上記３’ウィング領域が２〜５個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む、上記８または９に記載の核酸複合体。
１１．上記５’ウィング領域が１個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み、上記３’ウィング領域が１個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む、上記８または９に記載の核酸複合体。
１２．上記５’ウィング領域および３’ウィング領域が、糖修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとして架橋化ヌクレオチドを含む、上記８〜１１のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１３．上記架橋化ヌクレオチドが、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択される、上記１２に記載の核酸複合体。
１４．上記架橋化ヌクレオチドがホスホロチオエート化されている、上記１３に記載の核酸複合体。
１５．上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドが、ホスホロチオエート化されている、上記８〜１４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１６．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、ホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる５’ウィング領域、ホスホロチオエート化されているデオキシリボヌクレオチドおよびホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる３’ウィング領域からなる、上記８〜１５のいずれか一つに記載の核酸複合体。
１７．上記５’ウィング領域が１〜５個の糖修飾リボヌクレオチドからなり、上記３’ウィング領域が１〜５個の糖修飾リボヌクレオチドからなり、そして、糖修飾リボヌクレオチドはさらにホスホロチオエート化されていてもよい、上記８または９に記載の核酸複合体。
１８．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、ホスホロチオエート化された糖修飾リボヌクレオチドからなる５’ウィング領域、ホスホロチオエート化されている少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドおよびホスホロチオエート化された糖修飾リボヌクレオチドからなる３’ウィング領域からなる、上記１７に記載の核酸複合体。
１９．上記糖修飾が、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化および２’−フルオロ化からなる群から選択される、上記１７または１８に記載の核酸複合体。
２０．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、ホスホロチオエート化された少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドからなる、上記１〜５のいずれか一つに記載の核酸複合体。
２１．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、構成単位としてデオキシリボヌクレオチドを含む、上記１〜２０のいずれか一つに記載の核酸複合体。
２２．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドからなる、上記２１に記載の核酸複合体。
２３．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、構成単位としてリボヌクレオチドを含む、上記１〜２１のいずれか一つに記載の核酸複合体。
２４．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドからなる、上記２１または２３に記載の核酸複合体。
２５．上記リボヌクレオチドが修飾されていない、上記２３または２４に記載の核酸複合体。
２６．上記デオキシリボヌクレオチドが修飾されていない、上記２１〜２５のいずれか一つに記載の核酸複合体。
２７．上記デオキシリボヌクレオチドの一部または全部が修飾されている、上記２１〜２５のいずれか一つに記載の核酸複合体。
２８．上記修飾デオキシリボヌクレオチドが、塩基修飾デオキシリボヌクレオチドである、上記２７に記載の核酸複合体。
２９．上記塩基修飾デオキシリボヌクレオチドが、脱塩基デオキシリボヌクレオチドである、上記２８に記載の核酸複合体。
３０．上記修飾デオキシリボヌクレオチドが塩基修飾以外の修飾を受けていない、上記２７〜２９のいずれか一つに記載の核酸複合体。
３１．バルジが、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドから形成される、上記１〜３０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３２．バルジが、デオキシリボヌクレオチドから形成される、上記３１に記載の核酸複合体。
３３．バルジが、修飾されていないデオキシリボヌクレオチドから形成される、上記３２に記載の核酸複合体。
３４．バルジが、塩基修飾デオキシリボヌクレオチドから形成される、上記３２に記載の核酸複合体。
３５．バルジが、リボヌクレオチドから形成される、上記３１に記載の核酸複合体。
３６．バルジが、修飾されていないリボヌクレオチドから形成される、上記３５に記載の核酸複合体。
３７．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対しておよび／または標的転写産物に対して少なくとも１つのミスマッチを含む、上記１〜３６のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３８．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対するおよび／または標的転写産物に対するミスマッチを含まない、上記１〜３６のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３９．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む、上記１〜３８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
４０．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対するミスマッチを含まない、上記１〜３８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
４１．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの長さが８〜１００塩基である、上記１〜４０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
４２．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さが、８〜１００塩基である、上記１〜４１のいずれか１つに記載の核酸複合体。
４３．上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドからバルジ部分を除いて比較した場合に、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドと同じ長さを有する、上記１〜４２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
４４．上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドからバルジ部分を除いて比較した場合に、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの長さが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さと異なる、上記１〜４２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
４５．上記（ｉｉ）キャリアー部分が、標識機能、精製機能及び標的への送達機能から選択される機能を有する機能性部分をさらに含む、上記１〜４４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
４６．上記（ｉｉ）キャリアー部分が標的への送達機能を有する機能性部分を含み、当該機能性部分が、脂質、ペプチド、タンパク質、糖鎖、低分子および生体分子／生体活性分子からなる群から選択される分子である、上記４５に記載の核酸複合体。
４７．上記機能性部分が、環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール）、ステアリン酸、ドコサン酸、アニスアミド、葉酸、アナンダミドまたはスペルミンである、上記４６に記載の核酸複合体。
４８．上記（ｉｉ）キャリアー部分が標的への送達機能を有する機能性部分を含まない、上記１〜４４のいずれか一つに記載の核酸複合体。
４９．（ｉ）ホスホロチオエート化されている少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチド、上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる５’ウィング領域および上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる３’ウィング領域を構成単位として含むポリヌクレオチドを含む活性部分、ならびに
（ｉｉ）構成単位としての修飾されていないリボヌクレオチドおよび修飾されていないデオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含む、二本鎖核酸複合体であって、
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含み、当該バルジは修飾されていないリボヌクレオチドから形成され、
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対するおよび／または標的転写産物に対するミスマッチを含まず、かつ
上記（ｉｉ）キャリアー部分が標的への送達機能を有する機能性部分を含まない、二本鎖核酸複合体。
５０．哺乳動物において標的遺伝子の発現を減少させるための、上記１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
５１．活性部分におけるポリヌクレオチドが、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、上記５０に記載の核酸複合体。
５２．哺乳動物においてタンパク質をコードしない転写産物の発現を減少させるための、上記１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
５３．活性部分におけるポリヌクレオチドが、転写産物のいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、上記５２に記載の核酸複合体。
５４．上記１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
５５．上記１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体を細胞と接触させる工程を含む、細胞内の転写産物レベルを低減する方法であって、
活性部分におけるポリヌクレオチドが該転写産物のいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、方法。
５６．上記転写産物が、タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物である、上記５５に記載の方法。
５７．上記転写産物が、タンパク質をコードしない転写産物である、上記５５に記載の方法。
５８．哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減させるための、上記１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体の使用。
５９．哺乳動物において標的遺伝子の発現を低減させるための薬剤を製造するための、上記１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体の使用。
６０．上記１〜４９のいずれか１つに記載の核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において標的遺伝子の発現レベルを低減する方法であって、
活性部分におけるポリヌクレオチドが、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、方法。
６１．上記投与が経腸管的投与である、上記６０に記載の方法。
６２．上記投与が非経腸管的投与である、上記６０に記載の方法。
６３．上記核酸複合体の投与量が、０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である、上記６０〜６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．上記哺乳動物がヒトある、上記６０〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の少なくとも１つのバルジ構造を有する核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を用いることにより、標的転写産物、典型的には標的遺伝子の転写産物または標的ノンコーディングＲＮＡの発現を極めて特異的かつ効率的に抑制することが可能である。また、当該核酸複合体に機能性部分を結合させることにより、生体の標的部位に極めて選択的かつ効率的に送達することが可能である。【００１４】
本発明では、ＤＮＡをベースとする核酸と、それに相補的な核酸とを含む二本鎖核酸複合体に少なくとも１つのバルジ構造を導入することにより、より優れたアンチセンス効果を達成できること、例えば、実施例でも実証されているように、動物組織内において一本鎖構造を有するＡＳＯよりも非常に優れた標的ＲＮＡ発現阻害効果を示すことが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、Ａ４３１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図２】図２は、ＡｓＰＣ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図３】図３は、Ａ５４９細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図４】図４は、ＨＣＴ１１６細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図５】図５は、Ａ４３１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図６】図６は、ＡｓＰＣ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図７】図７は、Ａ５４９細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図８】図８は、ＨＣＴ１１６細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図９】図９は、ＰＡＮＣ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１０】図１０は、Ｃａｐａｎ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１１】図１１は、Ｌｓ１７４Ｔ細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１２】図１２は、ＨＰＡＣ細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１３】図１３は、ＡｓＰＣ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１４】図１４は、ＨＣＴ１１６細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１５】図１５は、Ａ５４９細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１６】図１６は、Ａ４３１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１７】図１７は、ＰＡＮＣ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１８】図１８は、Ａ５４９細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図１９】図１９は、Ａ４３１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図２０】図２０は、ＡｓＰＣ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図２１】図２１は、ＨＣＴ１１６細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図２２】図２２は、Ｃａｋｉ−１細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図２３】図２３は、ＭＣＦ−７細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図２４】図２４は、ＤＵ１４５細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図２５】図２５は、ＬＮＣａＰ細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図２６】図２６は、ＰＣ−３細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図２７】図２７は、ＨＧＣ２７細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図２８】図２８は、ＭＫＮ−４５細胞を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図２９】図２９は、ＯＶＣＡＲ−３細胞を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図３０】図３０は、ＨｅｐＧ２細胞を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図３１】図３１は、Ｔ２４細胞を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。
【図３２】図３２は、Ａ５４９細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。
【図３３】図３３は、ＤＮＡ−バルジを基本骨格とする２本鎖核酸の膵癌細胞株肝臓転移マウスモデルにおける薬効評価結果を示す。
【図３４】図３４は、ＤＮＡ−バルジ構造を基本骨格とする２本鎖核酸のマウス肝臓におけるＭＡＬＡＴ１遺伝子ノックダウン効果の検証結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
上述のように、本発明の核酸複合体は、（ｉ）アンチセンス核酸（ＤＮＡをベースとする核酸）を含む活性部分と（ｉｉ）少なくとも１つのバルジ構造を有し、かつ、該アンチセンス核酸に少なくとも一部が相補的な核酸を含むキャリアー部分とを含む核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体であり、本発明の１つの実施態様において、上記核酸複合体は、精製又は単離された核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体である。当該核酸複合体は、標的遺伝子の発現や転写産物（タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物またはタンパク質をコードしない転写産物）のレベルをアンチセンス効果によって抑制する活性を有する。
【００１７】
ここで、「活性部分」とは、上記核酸複合体の構成要素の１つであって、上記核酸複合体に関して意図する主要な効果、すなわち、標的遺伝子や標的転写産物（以下、両者をまとめて「標的転写産物」とも呼ぶ）の発現を抑制する効果を達成するための機能を主として担うと考えられる部分、換言すると、標的転写産物の発現抑制活性を有する部分である。
【００１８】
上記活性部分は、標的転写産物に対するアンチセンス核酸としてのポリヌクレオチドを含む。本発明の１つの実施態様において、上記活性部分はポリヌクレオチドであり、すなわち、ポリヌクレオチドのみからなる。
【００１９】
また、活性部分におけるポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとを構成単位として少なくとも含む。本発明の１つの実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログのみを構成単位として含む。
【００２０】
本発明において、「キャリアー部分」とは、上記核酸複合体の構成要素の１つであって、上記活性部分が標的転写産物に到達するまでの適切な期間、当該活性部分のキャリアーとしての機能を有すると考えられる部分である。
【００２１】
上記キャリアー部分は、活性部分のポリヌクレオチドに対して少なくとも一部が相補的なポリヌクレオチドを含む。このような相補性により、当該キャリアー部分は、そこにおけるポリヌクレオチドが上記活性部分のポリヌクレオチドと二本鎖を形成し、それによってキャリアーとしての機能を果たす。本発明の１つの実施態様において、上記キャリアー部分はポリヌクレオチドであり、すなわち、ポリヌクレオチドのみからなる。
【００２２】
また、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、ヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとを構成単位として少なくとも含む。本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、ヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログのみを構成単位として含む。
【００２３】
上記核酸複合体は、上記核酸複合体の所望の機能に応じて、上記の活性部分やキャリアー部分とは別のさらなる部分（例えば、機能性部分）を含むこともできる。上記核酸複合体は、このようなさらなる部分を、活性部分やキャリアー部分とは別の独立した部分として含むことも可能であり、あるいは、活性部分またはキャリアー部分に組み込む形で含むことも可能である。
【００２４】
１つの実施態様において、上記核酸複合体は、活性部分およびキャリアー部分のみからなる。
【００２５】
「アンチセンス効果」とは、標的転写産物（ＲＮＡセンス鎖）と、例えば、その部分配列に相補的なＤＮＡ鎖、又は通常アンチセンス効果が生じるように設計された鎖等とがハイブリダイズすることによって生じる、標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルの抑制を意味する。ある場合において、ハイブリダイゼーション産物により前記転写産物を被覆することによって生じ得る翻訳の阻害又はエキソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果、及び／又は、ハイブリダイズした部分が認識されることにより生じ得る前記転写産物の分解によって生じる、前記抑制を意味する。
【００２６】
アンチセンス効果によって発現が抑制される「標的遺伝子」又は「標的転写産物」としては、特に制限はなく、例えば、各種疾患において発現が亢進している遺伝子が挙げられる。また「標的遺伝子の転写産物」とは、標的遺伝子をコードするゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのことであり、塩基の修飾を受けていないｍＲＮＡや、スプライシングを受けていないｍＲＮＡ前駆体等も含まれる。通常、「転写産物」は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって合成される、いかなるＲＮＡでもよく、例えばノンコーディングＲＮＡも含まれる。
【００２７】
「精製又は単離された核酸複合体」という文言は、ここでは少なくとも２のポリヌクレオチド鎖を含む核酸複合体であって、天然では生じないもの、および／または、天然に生じる核酸物質を実質的に含まないものを意味する。
【００２８】
本発明の１つの態様において、上記核酸複合体は二本鎖核酸複合体である。
【００２９】
「相補的」という文言は、ヌクレオチドの塩基が他のヌクレオチドの塩基と、水素結合を介して、いわゆるワトソン−クリック型塩基対（天然型塩基対）や非ワトソン−クリック型塩基対（フーグスティーン型塩基対等）を形成できる関係のことを意味する。例えば、ＤＮＡにおいては、アデニン（Ａ）がチミジン（Ｔ）に対して相補的であり、ＲＮＡにおいては、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）に対して相補的である。
【００３０】
例えば、活性部分のポリヌクレオチドのある位置のヌクレオチドが、標的遺伝子の転写産物のある位置のヌクレオチドと水素結合を介して塩基対を形成できる場合、上記ポリヌクレオチドと上記転写産物は、当該水素結合の位置において相補的であると考えられる。
【００３１】
あるポリヌクレオチドが他のポリヌクレオチドとハイブリダイズもしくはアニーリング（本明細書では、これらの語を互換的に使用する）するためには、両ポリヌクレオチドは、塩基配列の全ての位置において相補的である必要はない。そして、本発明に関しても、核酸複合体が機能を発揮するためには、塩基配列の全ての位置において相補的である必要はなく、一部の位置におけるミスマッチが許容される。
【００３２】
例えば、標的転写産物の塩基配列と、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの塩基配列とは、完全に相補的である必要はなく、すなわち、両者は全ての位置で相補的である必要はない。
【００３３】
本発明では、活性部分におけるポリヌクレオチドは、その少なくとも一部が、標的転写産物に対して相補的である。本発明の１つの実施態様において、標的転写産物の塩基配列と活性部分におけるポリヌクレオチドの塩基配列は、その少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上、または１００％）が相補的であればよい。例えば、７０％のヌクレオチドが相補的な場合、両者は７０％の「相補性」を有する。本発明の好ましい１つの実施態様において、両者は完全に相補的であり、すなわち、１００％の相補性を有する。
【００３４】
なお、２つのポリヌクレオチドの相補性（例えば、標的転写産物と活性部分のポリヌクレオチドとの相補性）は、両者が異なる長さを有する場合には、二本鎖形成領域（ミスマッチを含む場合にはそれらを含めた二本鎖形成領域全体）における相補性として算出することができる。
【００３５】
配列の相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム等を利用することにより決定することができる。そして、当業者であれば、例えば、標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することができる。
【００３６】
本発明では、活性部分におけるポリヌクレオチドとキャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、上述の相補性に基づいて「アニーリング」し、二本鎖を形成することができる。当業者であれば、２本の核酸鎖がアニーリングできる条件（温度、塩濃度等）を容易に決定することができる。
【００３７】
ここでは、「核酸」とはモノマーヌクレオチドを意味する場合もあり、複数のモノマーから構成されるオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドを意味する場合もある。「核酸鎖」という文言は、ここではオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドを称するためにも用いられる。核酸鎖は、その全部又は一部を、自動合成機の使用といった化学合成法によって調製してもよく、ポリメラーゼ、ライゲース又は制限酵素反応に限定されるわけではないが、酵素処理により調製してもよい。
【００３８】
本発明では、活性部分におけるポリヌクレオチドは「デオキシリボヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ」を構成単位として少なくとも含む。この文言は、上記ポリヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチドを有し、また任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを更に有していてもよいということを意味する。
【００３９】
キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、「ヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ」を構成単位として少なくとも含む。この文言は、上記ポリヌクレオチドが、ヌクレオチドを有し、また任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを更に有していてもよいということを意味する。ここで、必須の構成単位である上記ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであっても、リボヌクレオチドであっても、これらの組み合わせであってもよい。また、当該ヌクレオチドはそれぞれ独立に、修飾されていても、修飾されていなくてもよい。
【００４０】
活性部分におけるポリヌクレオチドの長さは特に制限はないが、好ましくは少なくとも８塩基であり、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、少なくとも１３塩基であり、少なくとも１４塩基であり、又は少なくとも１５塩基である。前記長さは、好ましくは１００塩基以下、３５塩基以下、２５塩基以下、２０塩基以下、１９塩基以下、１８塩基以下または１７塩基以下であることができる。前記長さの範囲は、好ましくは１０〜３５塩基であり、より好ましくは１２〜２５塩基であり、さらに好ましくは１３〜２０塩基である。通常、前記標的に対する核酸鎖によるアンチセンス効果の強さや、費用、合成収率等の他の要素に応じて、前記長さは選択される。
【００４１】
本発明の１つの実施形態において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、標的転写産物に少なくとも一部が相補的なアンチセンスポリヌクレオチドであって、少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドを含む領域を有するポリヌクレオチドであることができる。
【００４２】
「少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチド」は、４〜２０塩基の連続したデオキシリボヌクレオチドを含む領域であることができ、好ましくは５〜１６塩基の連続したデオキシリボヌクレオチドを含む領域であり、より好ましくは６〜１４塩基、例えば７〜１３塩基の連続しデオキシリボヌクレオチドを含む領域である。この領域には、天然型ＤＮＡのような、リボヌクレオチドにハイブリダイズした際に、ＲＮＡ鎖を切断するＲＮａｓｅＨによって認識されるヌクレオチドを用いることができる。また、本発明の１つの実施態様において、上記デオキシリボヌクレオチドにおいて、各ヌクレオチドは互いに独立に修飾されていてもよく、デオキシリボヌクレオチドに関して利用可能な修飾はこの分野において知られている。
【００４３】
本明細書において、「ヌクレオチド」とはヌクレオシドの糖部分がリン酸とエステルをつくっている化合物を意味し、ここで「ヌクレオシド」とは、プリン塩基またはピリミジン塩基のような窒素を含む有機塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。
【００４４】
また、「デオキシリボヌクレオチド」は、糖部分がＤ−２−デオキシリボースからなるヌクレオチドであり、「リボヌクレオチド」は、糖部分がＤ−リボースからなるヌクレオ
チドである。
【００４５】
「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドを基本単位とし、リン酸が各ヌクレオチド間で糖の３’と５’位炭素の間にジエステル結合の橋をつくって結ばれた、複数のヌクレオチドが重合した鎖状の物質を意味する。これは、いわゆるオリゴヌクレオチドも包含する。なお、本明細書では、このようなポリヌクレオチドにその構成単位として含まれるヌクレオチド（重合した状態にある）についても同様に「ヌクレオチド」と呼ぶ。
【００４６】
ここで、上記「デオキシリボヌクレオチド」は、天然に存在するデオキシリボヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているデオキシリボヌクレオチドを意味する。同様に、「リボヌクレオチド」は、天然に存在するリボヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているリボヌクレオチドを意味する。塩基、糖又はリン酸塩結合のサブユニットの修飾とは、１の置換基の付加、又は、サブユニット内における１の置換のことであり、サブユニット全体を異なる化学基に置換することではない。ＤＮＡ分解酵素等に対する耐性が高いという観点から、デオキシリボヌクレオチドからなる領域はその一部または全部が修飾されたヌクレオチドであってもよい。このような修飾としては、例えば、シトシンの５−メチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、Ｎ４−メチル化、チミジンの５−デメチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、アデニンのＮ６−メチル化、８−ブロモ化、グアニンのＮ２−メチル化、８−ブロモ化、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル−メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、２’−Ｏ−メチル化、２’−メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’−アミノプロピル（ＡＰ）化、２’−フルオロ化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が好ましい（チオリン酸結合）。なお、ホスホロチオエート化結合は、天然の核酸間結合であるホスホジエステル結合と、リン酸基の酸素原子の一つを硫黄原子に置換した構造を有し、以下の式で表される（この式中、Ｂは塩基を表す）：
【００４７】
【化１】
2017068791.tif 000002
【００４８】
また、同様の効果を奏するために、本発明では、ポリヌクレオチドがリボヌクレオチドを含む場合、リボヌクレオチドに同様の修飾を施してもよい。なお、天然に存在するリボヌクレオチド／デオキシリボヌクレオチドとしては、通常、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドが連結したＲＮＡ、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが連結したＤＮＡが該当するが、本発明におけるリボヌクレオチド／デオキシリボヌクレオチドは、上記の塩基以外の塩基、例えばイノシンやデオキシイノシンを塩基として有することもできる。
【００４９】
従って、本発明の１つの実施態様において、上記活性部分におけるポリヌクレオチドは、塩基としてイノシンを有するリボヌクレオチドまたはデオキシイノシンを有するデオキシリボヌクレオチドを少なくとも１つ、好ましくは１〜６個、例えば１つ、含むことができる。同様に、上記キャリアー部分におけるポリヌクレオチドも、塩基としてイノシンを有するリボヌクレオチドまたはデオキシイノシンを有するデオキシリボヌクレオチドを少なくとも１つ、好ましくは１〜６個、例えば３〜５個、含むことができる。
【００５０】
本発明のさらなる実施態様において、上記活性部分におけるポリヌクレオチドは、塩基としてイノシンを有するリボヌクレオチドも、デオキシイノシンを有するデオキシリボヌクレオチドも含まない。本発明の別の実施態様において、上記キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、塩基としてイノシンを有するリボヌクレオチドも、デオキシイノシンを有するデオキシリボヌクレオチドも含まない。
【００５１】
当業者であれば、ヌクレオチドの種類（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド）に応じて、適宜、それぞれにおいて可能な修飾を選択して施すことが可能である。
【００５２】
さらに、かかる修飾は同一のヌクレオチドに対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。
【００５３】
通常、上記のような修飾は、塩基対形成には影響を及ぼさず、従って、ヌクレオチド間の相補性やポリヌクレオチド間の相補性には影響を及ぼさないと考えられる。すなわち、通常、相補的な２つのヌクレオチドは、修飾された後も塩基対を形成する能力を維持することができ、従って依然として相補的であることができる。
【００５４】
しかしながら、ある場合において、修飾の数や位置によっては、ここで開示する二本鎖核酸が奏するアンチセンス効果等に影響を与えることになるかもしれない。これらの態様は、標的遺伝子の配列等によっても異なるため、一概には言えないが、当業者であれば、前記アンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、決定することができる。また、修飾後の核酸複合体が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、修飾前の核酸複合体のそれよりも有意に低下していなければ（例えば、修飾後の核酸複合体の測定値が修飾前の核酸複合体の測定値の３０％以上であれば）、当該修飾は評価することができる。アンチセンス効果の測定は、例えば、後述の実施例において示されているように、細胞等に被検核酸化合物を導入し、該被検核酸化合物が奏するアンチセンス効果によって抑制された該細胞等における標的遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量、ｃＤＮＡ量、タンパク質量等）を、ノザンブロッティング、定量的ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング等の公知の手法を適宜利用することによって行うことができる。
【００５５】
ここで「ヌクレオチドアナログ」は天然には存在しないヌクレオチドを意味し、ヌクレオチドの塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットにおいて、２以上の置換基が付加されており、若しくは、サブユニット内が２以上置換されており、又はサブユニット全体を異なる化学基に置換されていることを意味する。２以上の置換を伴うアナログの例としては、架橋化核酸が挙げられる。架橋化核酸は、糖環における２箇所の置換に基づいて架橋ユニットが付加されるヌクレオチドアナログであり、典型的には、２’位の炭素と４’位の炭素とが結合しているヌクレオチドアナログが挙げられる。ある実施形態における活性部分におけるポリヌクレオチドにおいては、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性及び／又は核酸分解酵素に対する耐性が増大させるという観点から、活性部分におけるポリヌクレオチドはヌクレオチドアナログをさらに含む。「ヌクレオチドアナログ」としては、上記定義を満たし、修飾（架橋、置換等）により、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性及び／又は核酸分解酵素に対する耐性が増大されているヌクレオチドであればよく、例えば、特開平１０−３０４８８９号公報国際公開第２００５／０２１５７０号、特開平１０−１９５０９８号公報、特表２００２−５２１３１０号公報、国際公開第２００７／１４３３１５号、国際公開第２００８／０４３７５３号、国際公開第２００８／０２９６１９号、国際公開第２００８／０４９０８５号（以下、これら文献を「アンチセンス法に関する文献」とも称する）において、アンチセンス法に好適に用いられるとして開示されている核酸が挙げられる。すなわち、前記文献に開示されている核酸：ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ−ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’−Ｏ−メチル化核酸、２’−ＭＯＥ（２’−Ｏ−メトキシエチル）化核酸、２’−ＡＰ（２’−Ｏ−アミノプロピル）化核酸、２’−フルオロ化核酸、２’Ｆ‐アラビノ核酸（２’−Ｆ−ＡＮＡ）、ＢＮＡ（架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）が挙げられる。本明細書では、これらについても「修飾」または「修飾ヌクレオチド」と称することがある。
【００５６】
ＢＮＡ（本明細書では、「架橋化ヌクレオチド」とも呼ぶ）としては、例えば、２’位の炭素と４’位の炭素とが、２以上の原子によって架橋されているリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを使用することができる。架橋化核酸の例は当業者に知られている。このようなＢＮＡの一のサブグループとしては、２’位の炭素と４’位の炭素とが、４’−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）ｐ−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ２）ｐ−ＯＣＯ−２’、４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ３）−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−２’によって架橋されているＢＮＡを挙げることができる（ここで、ｐ、ｍ及びｎは、各々１〜４、０〜２及び１〜３の整数である。Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基（蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は細胞内若しくは核内移行シグナルペプチド等）を示す）。さらに、本発明のさらなる１つの実施態様におけるＢＮＡにおいて、３’位の炭素における置換基：ＯＲ２及び５’位の炭素における置換基：ＯＲ１のＲ１及びＲ２は、典型的には水素原子であるが、同一又は異なっていてもよく、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５（式中、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基、又は、炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す）であってもよい。このようなＢＮＡとしては、例えば、ＬＮＡ（ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（登録商標）、２’，４’−ＢＮＡ）とも称される、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ）又はβ−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ）、β−Ｄ−チオ（４’−ＣＨ２−Ｓ−２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ３）−２’）ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、３’アミノ−２’，４’−ＢＮＡ、５’−メチルＢＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡとも称される（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、ｃＭＯＥ−ＢＮＡとも称される（４’−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、ＡｍＮＡとも称されるアミドＢＮＡ（４’−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ（Ｒ＝Ｈ、Ｍｅ）、当業者に知られた他のＢＮＡが挙げられる。
【００５７】
本発明の１つの実施態様において、修飾ヌクレオチドは、塩基部位が修飾されていてもよい。塩基部位の修飾としては、例えば、シトシンの５−メチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、Ｎ４−メチル化、チミジンの５−デメチル化、５−フルオロ化、５−ブロモ化、５−ヨード化、アデニンのＮ６−メチル化、８−ブロモ化、グアニンのＮ２−メチル化、８−ブロモ化が挙げられる。さらにまた、ある実施態様における修飾ヌクレオチドにおいては、リン酸ジエステル結合部位が修飾されていてもよい。リン酸ジエステル結合部位の修飾としては、例えば、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル−メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が好ましい。また、このような塩基部位の修飾やリン酸ジエステル結合部位の修飾は同一のヌクレオチドに対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。
【００５８】
本発明の１つの実施態様では、ヌクレオチドアナログが、デオキシリボヌクレオチドの修飾に関して上述したような修飾（または修飾の組み合わせ）を、受けていてもよい。
【００５９】
当業者であれば、ヌクレオチドアナログの種類に応じて、適宜、それぞれにおいて可能な修飾を選択して施すことが可能である。
【００６０】
修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドアナログは、ここで例示したものに限定されるわけではない。多数の修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドアナログが当該分野では知られており、例えば、Ｔａｃｈａｓらの米国特許第８２９９０３９号明細書の記載、特に１７〜２２欄の記載を、本願の実施態様として利用することもできる。
【００６１】
当業者であれば、このような修飾ヌクレオチドやヌクレオチドアナログの中から、アンチセンス効果、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性、核酸分解酵素に対する耐性等の観点を考慮し、適宜修飾ヌクレオチドやヌクレオチドアナログを選択して利用することができる。ある実施形態において、下記式（１）で表わされるＬＮＡが用いられる。
【００６２】
【化２】
2017068791.tif 000003
【００６３】
［式（１）中、Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基若しくは芳香族炭化水素環基、例えば、天然型ヌクレオシドの塩基部位（プリン塩基、ピリミジン塩基）又は非天然型（修飾）ヌクレオシドの塩基部位を示す。なお、塩基部位の修飾の例は、前述の通りである。Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なっていてもよく、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５（ここで、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルキルチオ基、炭素数１〜６のシアノアルコキシ基又は炭素数１〜５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す）を示す］。
【００６４】
なお、前記化学式において示されている化合物はヌクレオシドであるが、ある実施形態における「ＬＮＡ」及び通常ＢＮＡには、当該ヌクレオシドにリン酸基が結合した形態（ヌクレオチド）も含まれる。すなわち、ＬＮＡといったＢＮＡは、ポリヌクレオチド中に、ヌクレオチドとして組み込まれる。
【００６５】
本発明の１つの実施態様において、「１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含むウィング領域」は、前記少なくとも４つ以上の連続したデオキシリボヌクレオチドを含む領域（以下「ＤＮＡギャップ領域」とも称する）の５’末側及び／又は３’末側に配置されるものである。
【００６６】
本発明の１つの実施態様において、該ＤＮＡギャップ領域の５’末端に配置された修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む領域（以下「５’ウィング領域」とも称する）、及び該ＤＮＡギャップ領域の３’末端に配置された修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む領域（以下「３’ウィング領域」とも称する）は、それぞれ独立したものであり、前記アンチセンス法に関する文献に挙げられている修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを少なくとも１種含んでいればよく、さらに、かかる修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ以外に天然型のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）も含まれていてもよい。また、５’ウィング領域及び３’ウィング領域の鎖長は独立的に、通常１〜１０塩基であることができ、好ましくは１〜７塩基、又は２〜５塩基、例えば２〜４塩基である。
【００６７】
さらに、５’ウィング領域及び３’ウィング領域における修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ及び天然型のヌクレオチドの種類や数や位置については、ある実施形態における核酸複合体が奏するアンチセンス効果等に影響を与える場合もあるため、好ましい態様は、配列等によっても変わり得る。一概には言えないが、当業者であれば、前記アンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、好ましい態様を決定することができる。また、前記「少なくとも４つ以上の連続したデオキシリボヌクレオチド」を含む領域同様に、修飾後の核酸、好ましくは二本鎖核酸が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、修飾前の核酸、好ましくは二本鎖核酸のそれよりも有意に低下していなければ、当該修飾は好ましい態様であると評価することができる。
【００６８】
なお、特許文献１に記載されているように、従前から試みられているＲＮＡやＬＮＡのみからなるアンチセンス法は、標的となるｍＲＮＡと結合することで翻訳を抑制したが、その効果は概して不十分であった。一方ＤＮＡのみからなるアンチセンス法では、標的遺伝子と結合するとＤＮＡとＲＮＡからなる二本鎖構造となるため、ＲＮａｓｅＨの標的となることでｍＲＮＡが切断されることにより強い標的遺伝子発現抑制効果が期待できたが、標的遺伝子との結合自体が弱いため実際の効果はやはり不十分だった。従って、活性部分におけるポリヌクレオチドにおいて、中央に少なくとも４塩基以上の鎖長のＤＮＡが配置され、さらにＲＮＡ（すなわち、標的転写産物）と強い結合能力を持つＬＮＡ（又は他のＢＮＡ）が両端に配置されることによって、このような複合鎖は、ＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡの切断を促進することとなる。
【００６９】
よって、上記５’ウィング領域および３’ウィング領域はそれぞれ、修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含んでいることが望ましい。本発明の１つの実施態様において、上記５’ウィング領域および３’ウィング領域はそれぞれ、修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログからなる。上記５’ウィング領域および３’ウィング領域はそれぞれ、ＢＮＡを含んでいてもよく、例えばＬＮＡを含んでいてもよい。
【００７０】
本発明の１つの実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドからなる。
【００７１】
本発明の他の実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドならびに修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログからなる。
【００７２】
本発明のさらなる実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドとその５’側に位置する５’ウィング領域および３’側に位置する３’ウィング領域とからなる。この態様において、上記デオキシリボヌクレオチドはその一部または全部が修飾されていてもよい。
【００７３】
本発明の１つの実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含まない。
【００７４】
上述のように、本発明は、
（ｉ）デオキシリボヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドを含む活性部分、および
（ｉｉ）ヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含む核酸複合体であって、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含む、核酸複合体に関する。
【００７５】
本発明の１つの実施態様において、上記（ｉ）活性部分のポリヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチドの一部または全部が修飾されている。
【００７６】
また、本発明のさらなる実施態様において、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドは１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む。
【００７７】
本発明の１つの実施態様において、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドは１つまたは複数のヌクレオチドアナログを含み、該ヌクレオチドアナログの少なくとも１つは修飾されていてもよい。
【００７８】
本発明のさらなる実施態様において、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドは、少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドを含み、そして
当該ポリヌクレオチドは、
（ａ）上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む５’ウィング領域、および／または、
（ｂ）上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む３’ウィング領域、
を含む。ここで、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドは、上記（ａ）５’ウィング領域および（ｂ）３’ウィング領域を含むことができる。
【００７９】
本発明の１つの実施態様において、上記５’ウィング領域は２〜５個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み、上記３’ウィング領域は２〜５個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む。また、本発明の別の実施態様において、上記５’ウィング領域は１個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み、上記３’ウィング領域は１個の修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含む。ここで、上記５’ウィング領域および３’ウィング領域は、糖修飾ヌクレオチド（すなわち、糖サブユニットが修飾されているヌクレオチド）および／またはヌクレオチドアナログとして架橋化ヌクレオチドを含むことができる。また、上記架橋化ヌクレオチドは、ＬＮＡ、ｃＥｔ−ＢＮＡ、アミドＢＮＡ（ＡｍＮＡ）及びｃＭＯＥ−ＢＮＡからなる群から選択されてもよい。さらに、上記架橋化ヌクレオチドはホスホロチオエート化されていてもよい。また、上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート化されていてもよい。
【００８０】
例えば、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる５’ウィング領域、ホスホロチオエート化されている少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドおよびホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる３’ウィング領域からなる。両ウィング領域が２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる場合、上記ポリヌクレオチドは、以下の式（Ｉ）で表すことができる：
【００８１】
【化３】
2017068791.tif 000004
【００８２】
［式中、Ｂは独立に架橋化ヌクレオシドを表し、Ｄは独立にデオキシリボヌクレオシドを表し、ｅは１〜４の整数、ｆは１〜４の整数、ｎは３以上の整数、好ましくは３〜１９の整数、より好ましくは４〜１５の整数、さらに好ましくは５〜１３の整数、例えば６〜１２の整数を表す］。
【００８３】
上記式（Ｉ）において、下記の部分（Ｉ−１）：
【００８４】
【化４】
2017068791.tif 000005
【００８５】
が５’ウィング領域に相当し、
下記の部分（Ｉ−２）：
【００８６】
【化５】
2017068791.tif 000006
【００８７】
がホスホロチオエート化されている少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドに相当し、そして、
下記の部分（Ｉ−３）：
【００８８】
【化６】
2017068791.tif 000007
【００８９】
が３’ウィング領域に相当する。なお、下記の式（ＩＩ）においても同様に、それぞれ対応する部分が、５’ウィング領域、少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドおよび３’ウィング領域である。
【００９０】
本発明のさらなる実施態様において、上記５’ウィング領域は１〜５個の糖修飾リボヌクレオチドからなり、上記３’ウィング領域は１〜５個の糖修飾リボヌクレオチドからなり、そして、糖修飾リボヌクレオチドはさらにホスホロチオエート化されていてもよい。例えば、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート化された糖修飾リボヌクレオチドからなる５’ウィング領域、ホスホロチオエート化されている少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドおよびホスホロチオエート化された糖修飾リボヌクレオチドからなる３’ウィング領域からなり、以下の式（ＩＩ）で表すことができる：
【００９１】
【化７】
2017068791.tif 000008
【００９２】
［式中、Ｒ’は独立に糖修飾リボヌクレオシドを表し、Ｄは独立にデオキシリボヌクレオシドを表し、ｅは０〜４の整数、ｆは０〜４の整数、ｎは３以上の整数、好ましくは３〜１９の整数、より好ましくは４〜１５の整数、さらに好ましくは５〜１３の整数、例えば６〜１２の整数を表す］。
ここで、上記糖修飾は、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’−Ｏ−アミノプロピル（ＡＰ）化および２’−フルオロ化からなる群から選択されてもよい。
【００９３】
なお、５’ウィング領域を構成するヌクレオチドの数と３’ウィング領域を構成するヌクレオチドの数は同一であっても、または異なっていてもよい。従って、例えば上記式（Ｉ）および（ＩＩ）では、ｅとｆは同一であっても、異なっていてもよい。例えば、上記式（Ｉ）および／または（ＩＩ）において、ｅ＝０かつｆ＝０（式（ＩＩ）の場合）、ｅ＝１かつｆ＝１、ｅ＝２かつｆ＝２、またはｅ＝３かつｆ＝３であることができ、あるいは、ｅ＝１かつｆ＝２、またはｅ＝２かつｆ＝１であることができる。
【００９４】
本発明の他の実施態様において、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート化された少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドからなる。すなわち、当該態様において、上記ポリヌクレオチドは、以下の式（ＩＩＩ）で表すことができる：
【００９５】
【化８】
2017068791.tif 000009
【００９６】
［式中、Ｄは独立にデオキシリボヌクレオシドを表し、ｎは２以上の整数、好ましくは２〜１８の整数、より好ましくは３〜１４の整数、さらに好ましくは４〜１２の整数、例えば５〜１１の整数を表す］。
【００９７】
本発明のさらなる実施態様において、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドは、修飾されていない少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドからなる。すなわち、当該態様において、上記ポリヌクレオチドは、以下の式（ＩＶ）で表すことができる：
【００９８】
【化９】
2017068791.tif 000010
【００９９】
［式中、Ｄは独立にデオキシリボヌクレオシドを表し、ｎは２以上の整数、好ましくは２〜１８の整数、より好ましくは３〜１４の整数、さらに好ましくは４〜１２の整数、例えば５〜１１の整数を表す］。
【０１００】
本発明の１つの好ましい実施態様において、上記活性部分において、上記５’ウィング領域はポリヌクレオチドの５’末端に位置し、すなわち、ポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位を含む。本発明のさらなる好ましい実施態様において、上記活性部分において、上記３’ウィング領域はポリヌクレオチドの３’末端に位置し、すなわち、ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位を含む。
【０１０１】
上述のように、本発明において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、前述の活性部分におけるポリヌクレオチドと少なくとも一部が相補的なポリヌクレオチドである。キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの塩基配列と活性部分におけるポリヌクレオチドの塩基配列とは、両者が少なくとも部分的に二本鎖を形成することが可能であれば、完全に相補的である必要はなく、例えば、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有していればよい。なお、当該相補性は、上述のように二本鎖形成領域全体における相補性として算出されるが、キャリアー部分のポリヌクレオチドはバルジ構造部分を含むため、上記相補性は、バルジ構造部分を二本鎖形成領域から除いた後に算出する。すなわち、上記相補性の算出の際、バルジ構造部分は二本鎖形成領域に含めない。
【０１０２】
本発明の１つの好ましい実施態様において、両ポリヌクレオチドは１００％の相補性を有する。ここで、相補性は上記のようにバルジ構造部分を除いた二本鎖形成領域（二本鎖形成領域全体）における相補性として算出する。この態様では、例えば、キャリアー部分のポリヌクレオチド（バルジ形成部分を除く）の長さが、活性部分のポリヌクレオチドの長さより長い場合には、活性部分のポリヌクレオチド全体がキャリアー部分のポリヌクレオチドの一部分と完全に相補的であり（バルジ形成部分を除く）、その完全に相補的な部分が二本鎖形成領域となる。また、キャリアー部分のポリヌクレオチド（バルジ形成部分を除く）の長さが、活性部分のポリヌクレオチドより短い場合には、キャリアー部分のポリヌクレオチド全体（バルジ形成部分を除く）が活性部分のポリヌクレオチドの一部分と完全に相補的であり、その完全に相補的な部分が二本鎖形成領域となる。そして、活性部分のポリヌクレオチドとキャリアー部分のポリヌクレオチド（バルジ形成部分を除く）が同じ長さを有する場合には、バルジ構造部分を除いて両ポリヌクレオチドは全体にわたって完全に相補的である。
【０１０３】
キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、上述のように、ヌクレオチドと、任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとを含み、そしてさらに、少なくとも１つのバルジを含む。ここで、当該ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドとして、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の１つの実施態様において、当該ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドとして、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含むことができる。
【０１０４】
ＲＮＡ分解酵素等の核酸分解酵素に対する耐性が高いという観点から、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドにおいても、上記ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチド）は、活性部分におけるポリヌクレオチドに関して述べたような修飾を受けていてもよい。
【０１０５】
また、キャリアー部分のポリヌクレオチドが特定の細胞の核内に送達されるまで、ＲＮａｓｅＡ等のＲＮＡ分解酵素による分解を抑制しつつも、特定の細胞内においてはＲＮａｓｅＨにより該ポリヌクレオチドが分解されることにより、アンチセンス効果を発揮し易いという観点から、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに関して述べたような修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含んでいてもよい。
【０１０６】
なお、活性部分におけるポリヌクレオチドの場合と同様に、ヌクレオチドアナログを含む場合には当該ヌクレオチドアナログは修飾を受けていてもよい。
【０１０７】
修飾の数や位置は、ある実施形態における核酸複合体が奏するアンチセンス効果等に影響を与える場合もあるため、キャリアー部分のポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドアナログの数及び修飾の位置には好ましい態様が存在する。この好ましい態様は、修飾対象となる核酸の種類、配列等によっても異なるため、一概には言えないが、前述の活性部分におけるポリヌクレオチド同様に、修飾後の核酸複合体が有するアンチセンス効果を測定することにより特定することができる。
【０１０８】
本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分のポリヌクレオチドの５’ウィング領域及び／又は３’ウィング領域に対して相補的な領域に、修飾デオキシリボヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを有する。この場合、これらの修飾および／またはアナログがＲＮＡ分解酵素等の酵素による分解を抑制する効果を有すると期待される。本発明のさらなる１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分のポリヌクレオチドのヌクレオチドアナログを含む領域に相補的な領域の全てが修飾されており、活性部分のポリヌクレオチドの修飾核酸を含む領域に相補的な領域の一部が修飾されている。この場合に、キャリアー部分のポリヌクレオチドにおいて修飾されている領域は、該一部を含む限り、活性部分のポリヌクレオチドにおける修飾核酸を含む領域よりも長くなっていてもよく、短くなっていてもよく、または同じ長さを有していてもよい。
【０１０９】
キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さは特に制限されないが、少なくとも８塩基であり、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、少なくとも１３塩基であり、少なくとも１４塩基であり、少なくとも１５塩基、または少なくとも１６塩基である。前記長さは、好ましくは１００塩基以下、４５塩基以下、３５塩基以下、３０塩基以下、２５塩基以下、２４塩基以下、２３塩基以下、２２塩基以下、２１塩基以下または２０塩基以下であることができる。前記長さの範囲は、好ましくは１０〜３５塩基であり、より好ましくは１２〜２５塩基であり、さらに好ましくは１３〜２２塩基である。通常、標的部位への送達に及ぼす効果や、バルジの大きさや数、費用、合成収率等の他の要素に応じて、長さは選択される。
【０１１０】
本発明の１つの実施形態において、キャリアー部分のポリヌクレオチドからバルジ部分を除いて比較した場合に、活性部分におけるポリヌクレオチドの長さとキャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さは同一であってもよく、異なっていてもよい。
【０１１１】
本発明の１つの実施形態において、キャリアー部分のポリヌクレオチドからバルジ部分を除いて比較した場合に、活性部分におけるポリヌクレオチドの長さは、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さよりも大きい。
【０１１２】
本発明の他の実施形態において、キャリアー部分のポリヌクレオチドからバルジ部分を除いて比較した場合に、活性部分におけるポリヌクレオチドの長さは、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さよりも小さい。
【０１１３】
上述のように、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、少なくとも１つのバルジを含む。ここで、「バルジ」とは、活性部分のポリヌクレオチドとキャリアー部分のポリヌクレオチドとの間のアニーリングによって形成された二本鎖領域（以下、単に「二本鎖領域」とも呼ぶ）内で、後者に対応する１個の塩基または連続する２個以上の塩基が前者に不足していることにより生じる、塩基対を形成せずに二本鎖核酸から外部に飛び出した後者ポリヌクレオチド内のヌクレオチド（および／または修飾ヌクレオチド／ヌクレオチドアナログ）から形成されるふくらみ構造を意味する。
【０１１４】
バルジの数は、二本鎖の形成が可能な範囲内であれば特に制限はされない。本発明の１つの実施態様では、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは１〜４つのバルジ、例えば、１〜３つまたは２〜３つのバルジを含むことができる。本発明のさらなる１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、１、２、３または４つのバルジを含む。
【０１１５】
バルジの位置は、バルジ構造を形成できる位置であれば特に制限はされない。例えば、活性部分のポリヌクレオチドおよびキャリアー部分のポリヌクレオチドがそれぞれ１０〜３５塩基の長さを有する場合には、例えば、二本鎖形成領域の５’末端（活性部分のポリヌクレオチドの上記領域の５’末端）から数えて、２〜１５番目の位置に、例えば６〜１１番目（例えば６、７、８、９、１０または１１番目）の位置になるように、キャリアー部分のポリヌクレオチドの対応の位置にバルジを導入することができる。また、キャリアー部分のポリヌクレオチドが複数のバルジを有する場合には、例えば、二本鎖形成領域の５’末端（活性部分のポリヌクレオチドの上記領域の５’末端）から数えて２〜１５番目の位置、例えば６〜１１番目の位置になるように、キャリアー部分のポリヌクレオチドの対応の位置に第１のバルジを導入し、第１のバルジの位置から１〜数個置き、例えば、１〜３個置きまたは１〜２個置きに、他のバルジを導入することができる。
【０１１６】
バルジを構成するヌクレオチド等の数（活性部分のポリヌクレオチドと塩基対を形成していないヌクレオチドの数）は、バルジ構造を形成できる数であれば特に制限はされない。本発明の１つの実施態様において、上記バルジは、１つのバルジあたり１〜７つ、例えば、１〜５つまたは２〜４つ（例えば３つ）のヌクレオチド等で構成されることができる。
【０１１７】
複数のバルジを有する場合、各バルジは、同一の数のヌクレオチド等で構成されていても、あるいは、各バルジはそれぞれ独立に異なる数のヌクレオチド等で構成されていてもよい。
【０１１８】
本発明の１つの実施態様において、上記バルジは、ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログから構成される。
【０１１９】
本発明のさらなる１つの実施態様において、上記バルジを構成するヌクレオチドとしては、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチド（いずれも修飾されていても、修飾されていなくてもよい）が使用される。
【０１２０】
当業者であれば、活性部分におけるポリヌクレオチドの種類や塩基配列に応じて、バルジが形成されるように、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの構成単位を適宜選択することが可能である。
【０１２１】
本発明の１つの好ましい実施態様において、上記バルジを構成するヌクレオチドは、その一部または全部がリボヌクレオチド、好ましくはウラシル（Ｕ）である。
【０１２２】
キャリアー部分におけるポリヌクレオチドがバルジを含む本発明の核酸複合体（好ましくは二本鎖核酸複合体）は、バルジ構造の部分（すなわち、二本鎖が形成されていない部分）において、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅの攻撃を適度に受けるため、細胞内または生体内において、標的ｍＲＮＡに送達される頃までの間に、当該キャリアー部分のみが適度に切断されて（キャリアー部分のポリヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはこれらの組み合わせのいずれの場合であっても）、活性部分のポリヌクレオチドのみとなり、当該活性部分のポリヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと良好に二本鎖を形成するのを促進すると考えられる。この場合、活性部分のポリヌクレオチドと標的ｍＲＮＡとの二本鎖がＲＮａｓｅＨによって認識され、効率的に標的ｍＲＮＡが切断されるので、より強力な発現抑制効果が達成されると考えられる。
【０１２３】
本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む。
【０１２４】
「ミスマッチ」とは、活性部分におけるポリヌクレオチドとキャリアー部分におけるポリヌクレオチドとの間のアニーリングによって形成された二本鎖形成領域（以下、単に「二本鎖形成領域」とも呼ぶ）内のある位置において、両ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド間でワトソン−クリック型塩基対が形成されないことをいう。
【０１２５】
ただし、ここでいうミスマッチは、活性部分のポリヌクレオチドとキャリアー部分のポリヌクレオチドが二本鎖形成領域内で同一の数のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ（以下、まとめて「ヌクレオチド等」とも呼ぶ）を有し、上記位置を除く全ての位置において塩基対を形成しているにもかかわらずに、当該位置でのみ塩基対が形成されないことを意味する。従って、これは、オーバーハングや、二本鎖形成領域内の両ポリヌクレオチドの長さの相違に起因して生じるバルジのような構造は含まない。なおこれは、ミスマッチとオーバーハングやバルジとを区別することを意図するものであり、本発明の核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体において、ミスマッチとバルジ（および／またはオーバーハング）が同時に存在することを妨げるものではない。
【０１２６】
従って、「キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む」とは、活性部分のポリヌクレオチドとキャリアー部分のポリヌクレオチドがバルジ構造部分を除く二本鎖形成領域内において同一の長さを有し、かつ、後者が、両ポリヌクレオチド間でワトソン−クリック型塩基対を形成しないようなヌクレオチド等を当該二本鎖形成領域内において少なくとも１つ含むことを意味する。ミスマッチの例としては、Ａ対Ｇ、Ｃ対Ａ、Ｕ対Ｃ、Ａ対Ａ、Ｇ対Ｇ、Ｃ対Ｃ等や、リボヌクレオチドを用いたＵ対Ｇ、Ｕ対Ｃ、Ｕ対Ｔ等が挙げられるが、同様に、例えば、Ｉ対Ｇや、非塩基残基対ヌクレオチド等、非環状残基対ヌクレオチド等も含まれる。広い意味において、ここで用いられるミスマッチには、特定の位置における二本鎖の熱力学的安定性がその位置におけるワトソン−クリック型塩基対の熱力学的安定性よりも低くなるように、その位置またはその近傍での熱力学的安定性を減少させる、その位置での任意の変換も含まれる。
【０１２７】
本発明において、核酸複合体は、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含んでいてもよい。同様に、活性部分におけるポリヌクレオチドも、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対しておよび／または標的転写産物（具体的には、活性部分のポリヌクレオチドと二本鎖を形成する領域）に対して、少なくとも１つのミスマッチを含むことができる。特に、活性部分におけるポリヌクレオチドは、標的転写産物に対して、少なくとも１つのミスマッチを含むことができる。ミスマッチの数は、二本鎖核酸の形成が妨げられない範囲内であれば特に制限はされず、ミスマッチを複数個含む場合には、各ミスマッチは互いに離れて存在していてもよく、または連続して存在していても、両者が組み合わされて存在していてもよい。本発明の１つの実施態様では、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して１〜７つのミスマッチ、例えば、１〜５つ、１〜４つまたは２〜３つのミスマッチを含むことができる。本発明のさらなる１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して１、２、３、４、５、６または７つのミスマッチを含む。また、活性部分におけるポリヌクレオチドは、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対しておよび／または標的転写産物（具体的には、活性部分のポリヌクレオチドと二本鎖を形成する領域）に対して１〜７つのミスマッチ、例えば、１〜５つ、１〜４つまたは２〜３つのミスマッチを含むことができる。本発明のさらなる１つの実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対しておよび／または標的転写産物（具体的には、活性部分のポリヌクレオチドと二本鎖を形成する領域）に対して１、２、３、４、５、６または７つのミスマッチを含む。キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含み、それと同時に、活性部分におけるポリヌクレオチドも、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対しておよび／または標的転写産物（具体的には、活性部分のポリヌクレオチドと二本鎖を形成する領域）に対して少なくとも１つのミスマッチを含むことも可能である。
【０１２８】
本発明の１つの実施態様において、上記キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、上記活性部分におけるポリヌクレオチドに対するミスマッチを含まない。本発明のさらなる実施態様において、上記活性部分におけるポリヌクレオチドは、上記キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対するおよび／または標的転写産物に対するミスマッチを含まず、特に標的転写産物に対するミスマッチを含まない。
【０１２９】
ミスマッチの位置は、バルジの形成を妨げずにミスマッチ構造を形成できる位置であれば特に制限はされない。
【０１３０】
例えば、活性部分のポリヌクレオチドおよびキャリアー部分のポリヌクレオチドがそれぞれ１０〜３５塩基の長さを有する場合には、例えば、二本鎖形成領域の５’末端（活性部分のポリヌクレオチドの上記領域内の５’末端）から数えて、２〜１５番目の位置に、例えば６〜１１番目（例えば６、７、８、９、１０または１１番目）の位置にミスマッチを導入することができる。また、キャリアー部分のポリヌクレオチドおよび／または活性部分におけるポリヌクレオチドがそれぞれ独立にまたは合計で複数のミスマッチを有する場合には、例えば、二本鎖形成領域の５’末端（活性部分のポリヌクレオチドの上記領域内の５’末端）から数えて２〜１５番目の位置、例えば６〜１１番目（例えば６、７、８、９、１０または１１番目）の位置に第１のミスマッチを導入し、第１のミスマッチの位置から１〜２個置きにまたは連続的に、またはこれらを組み合わせて、他のミスマッチを導入することができる。
【０１３１】
例えば、本発明の核酸複合体が少なくとも１つのミスマッチを有する場合、ミスマッチの部分、すなわち、二本鎖が形成されていない部分において、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅの攻撃を適度に受けるため、細胞内または生体内において、標的ｍＲＮＡに送達される頃までの間に、当該キャリアー部分のみが適度に切断されて（キャリアー部分のポリヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせのいずれの場合であっても）、活性部分のポリヌクレオチドのみとなり、当該活性部分のポリヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと良好に二本鎖を形成するのを促進すると考えられる。この場合、活性部分のポリヌクレオチドと標的ｍＲＮＡとの二本鎖がＲＮａｓｅＨによって認識され、効率的に標的ｍＲＮＡが切断されるので、より強力な発現抑制効果が達成されると考えられる。
【０１３２】
上記のようなミスマッチを有する場合、活性部分におけるポリヌクレオチドとキャリアー部分におけるポリヌクレオチド（バルジ部分は除く）は完全に相補的ではなくなるが、上記のように、本発明ではこのように両者が完全に相補的でなくてもよい。本発明の１つの好ましい態様では、キャリアー部分のポリヌクレオチドがミスマッチを含む場合、両ポリヌクレオチドは、ミスマッチ部分とバルジ部分を除く二本鎖形成領域において、１００％の相補性を有する。このことは、活性部分のポリヌクレオチドが標的転写産物に対して少なくとも１つのミスマッチを有する場合にも当てはまる。
【０１３３】
また、本発明の１つの態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、少なくとも１つのバルジと少なくとも１つのミスマッチを含む。
【０１３４】
本発明の別の実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、ミスマッチを含まない。
【０１３５】
また、例えばキャリアー部分におけるポリヌクレオチドを適度に切断するという観点から、上記のようなミスマッチを形成させる代わりに、または、ミスマッチ形成に加えて、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに上述のように、少なくとも１つのリボヌクレオチドを含ませることも可能である。リボヌクレオチドは概して、デオキシリボヌクレオチド（修飾デオキシリボヌクレオチドを含む）やヌクレオチドアナログよりも核酸分解酵素に対する耐性が弱いため、キャリアー部分においてリボヌクレオチド導入部位を起点としたポリヌクレオチドの切断が適度に促進されると考えられる。
【０１３６】
従って、本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、構成単位としてリボヌクレオチドを含む。
【０１３７】
本発明のさらなる実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含み、かつ、構成単位としてリボヌクレオチドを含む。
【０１３８】
本発明のさらに１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含み、かつ、リボヌクレオチドを構成単位として含み、かつ、当該リボヌクレオチドの少なくとも１つ、例えば、１、２、３または４つが、当該ミスマッチを形成する。
【０１３９】
キャリアー部分のポリヌクレオチドに含まれるリボヌクレオチドの数は、特に制限はされない。キャリアー部分のポリヌクレオチドは、例えば、当該ポリヌクレオチドの総ヌクレオチド数に対して、１〜９０％、好ましくは５〜７０％、１０〜５０％の数のリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分のポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの総ヌクレオチド数に対して、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０％の数のリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の別の実施態様において、キャリアー部分のポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドのみからなる。
【０１４０】
また、本発明のさらなる実施態様では、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、１〜１２個のリボヌクレオチド、例えば、２〜１０個、３〜８個または４〜７個のリボヌクレオチドを含むことができる。本発明のさらなる１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のリボヌクレオチドを含む。
【０１４１】
リボヌクレオチドを複数個含む場合には、各リボヌクレオチドは互いに離れて存在していてもよく、または連続して存在していても、両者が組み合わされて存在していてもよい。本発明の１つの態様において、キャリアー部分のポリヌクレオチドはリボヌクレオチドを複数個含み、リボヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドと交互にまたはほぼ交互に存在する。この場合に、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドは、１個ずつ、２個ずつ、３個ずつ、４個ずつ、５個ずつまたは６個ずつ、交互に（またはほぼ交互に）存在していてもよい。
【０１４２】
キャリアー部分のポリヌクレオチドにおけるリボヌクレオチドの位置は、特に制限はされない。上記ポリヌクレオチドが１０〜３５塩基の長さを有する場合には、５’末端から数えて、１〜３５番目、例えば２〜３０番目、３〜２５番目、４〜２０番目、５〜１５番目、６〜１１番目（例えば、６、７、８、９、１０または１１番目）の位置にリボヌクレオチドを含むことができる。また、キャリアー部分のポリヌクレオチドが複数のリボヌクレオチドを含む場合には、例えば、５’末端から数えて１〜１５番目の位置、例えば６〜１１番目（例えば、６、７、８、９、１０または１１番目）の位置に第１のリボヌクレオチドを導入し、第１のリボヌクレオチドの位置から１〜２個置きにまたは連続的に、またはこれらを組み合わせて、他のリボヌクレオチドを含ませることができる。例えば、複数のリボヌクレオチドを連続的に含む場合に、上記ポリヌクレオチドは以下の式（Ｖ）により表すことができる：
【０１４３】
【化１０】
2017068791.tif 000011
【０１４４】
［式中、Ｄは独立にデオキシリボヌクレオシドを表し、Ｒは独立にリボヌクレオシドを表し、Ｑは独立にＳまたはＯを表し、ｎ’は０以上の整数、ｎ’’は１以上の整数、ｍは２以上の整数を表す。ここで、ｎ’＋ｎ’’＋ｍの合計は、好ましくは８〜３３、より好ましくは１０〜２３、さらに好ましくは１１〜１８の整数である］。
ここで、ｎ’＝４〜９の場合が、上記で挙げた６〜１１番目の位置に第１のリボヌクレオチドを導入する態様に該当する。ｍは例えば２〜６の整数であることができる。また、ｎ’は例えば、３〜１５、４〜１０または５〜８の整数であることができる。ｎ’’は例えば、３〜１５、４〜１０または５〜８の整数であることができる。なお、ｍ＝１の場合、すなわち、上記ポリヌクレオチドが１つのリボヌクレオチドを含む場合も、上記のように、本発明の１つの態様である。
【０１４５】
例えば、例１の配列番号２で表されるポリヌクレオチドは、１７塩基の長さを有し、１個のリボヌクレオチドを含み、５’末端から数えて９番目の位置にリボヌクレオチドを含むものであり、上記式（Ｖ）（式中、Ｑ＝Ｏ、ｎ’＝７、ｍ＝１、ｎ’’＝７）に相当する。また、配列番号３〜５で表されるポリヌクレオチドは、それぞれ、１８〜２０塩基の長さを有し、２〜４個のリボヌクレオチドを含み、いずれも５’末端から数えて９番目の位置に第１のリボヌクレオチドを有し、そこから連続的に他のリボヌクレオチドを含むものである。これらはそれぞれ、
配列番号３：上記式（Ｖ）（式中、Ｑ＝Ｏ、ｎ’＝７、ｍ＝２、ｎ’’＝７）；
配列番号４：上記式（Ｖ）（式中、Ｑ＝Ｏ、ｎ’＝７、ｍ＝３、ｎ’’＝７）；
配列番号５：上記式（Ｖ）（式中、Ｑ＝Ｏ、ｎ’＝７、ｍ＝４、ｎ’’＝７）；
で表される。
【０１４６】
また、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドがリボヌクレオチドを含み、かつ当該リボヌクレオチドの少なくとも１つが上記のミスマッチを生じさせる場合にも、上記ポリヌクレオチドは、同様の位置にリボヌクレオチドを含むことができる。
【０１４７】
さらに、本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、上記のようにバルジ部分にリボヌクレオチドを含むこともできる。
【０１４８】
リボヌクレオチドの数が多い場合（特に連続したリボヌクレオチドの数が多い場合）、活性部分のポリヌクレオチドとキャリアー部分のポリヌクレオチドとの間である程度の長さを有するＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖が形成され、ＲＮａｓｅＨによって認識によって認識されやすくなるため、細胞内または生体内において、標的ｍＲＮＡに送達される頃までの間に適切に切断されるという効果も期待できる。
【０１４９】
なお、切断の程度を調節するために、上記リボヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドに関して記載したような修飾が施されていてもよい。
【０１５０】
また、本発明の１つの実施態様において、上記核酸複合体はオーバーハングを有することができる。
【０１５１】
ここで、「オーバーハング」とは、一方の鎖が二本鎖を形成する相補性の他鎖の末端を超えて伸びる１本鎖領域から生じる、末端塩基対非形成型ヌクレオチド（修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ）のことをいう。各オーバーハングは、少なくとも１つのヌクレオチド（修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ）を含む。好ましくは、各オーバーハングは、２ヌクレオチドオーバーハングである。オーバーハングを構成するヌクレオチドは任意に選択することができる。オーバーハングのヌクレオチドは、標的転写産物と塩基対を形成してもしなくてもよい。上記２ヌクレオチドオーバーハングの例としては、ＵＵ、ＴＴ、ＡＡ、ＧＧ、ＣＣ、ＡＣ、ＣＡ、ＡＧ、ＧＡ、ＧＣおよびＣＧが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１５２】
オーバーハングの位置としては、活性部分におけるポリヌクレオチドの５’末端、活性部分におけるポリヌクレオチドの３’末端、活性部分におけるポリヌクレオチドの５’末端および３’末端、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの５’末端、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの３’末端、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの５’末端および３’末端、活性部分のポリヌクレオチドの５’末端およびキャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端、または活性部分のポリヌクレオチドの３’末端およびキャリアー部分のポリヌクレオチドの３’末端が可能である。
【０１５３】
本発明の他の実施態様において、上記核酸複合体はオーバーハングを含まない。
【０１５４】
また、本発明の別の実施態様において、キャリアー部分のポリヌクレオチドは、活性部分のポリヌクレオチドに関して記載したように、少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドを含み、その５’側に位置する５’ウィング領域、および／またはその３’側に位置する３’ウィング領域を含むことができる。
【０１５５】
本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドのみからなるか、あるいは、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドのバルジを除く部分は、デオキシリボヌクレオチドのみからなる。この態様の場合でも、上記核酸複合体は標的転写産物のレベルを良好に抑制できるが、これは以下の機構によるものと考えられる：活性部分におけるポリヌクレオチドとキャリアー部分におけるポリヌクレオチドにより形成されたＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖が標的転写産物に送達されるまでの間にＤＮａｓｅに認識され、当該ＤＮａｓｅによってキャリアー部分におけるポリヌクレオチドが分解される。その後、残った活性部分におけるポリヌクレオチドが標的転写産物とＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を形成し、ＲＮａｓｅＨによってこの部分が認識され、分解される。
【０１５６】
本発明の他の実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのみからなる。本発明の別の実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドならびに修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログのみからなるか、リボヌクレオチドならびに修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログのみからなるか、あるいは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド並びに修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログのみからなる。
【０１５７】
本発明のさらなる実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドとその５’側に位置する５’ウィング領域および３’側に位置する３’ウィング領域とからなる。
【０１５８】
本発明のさらなる実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドとその５’側に位置する５’ウィング領域および３’側に位置する３’ウィング領域とリボヌクレオチドからなり、該リボヌクレオチドは、５’ウィング領域および／または３’ウィング領域に存在してもよく、ここで、上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドのいくつかはリボヌクレオチドに置き換えられていてもよい。
【０１５９】
本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含まない。
【０１６０】
本発明の別の実施態様において、キャリアー部分のポリヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチドは修飾されていない。
【０１６１】
本発明のさらに別の実施態様において、キャリアー部分のポリヌクレオチドにおけるリボヌクレオチドは修飾されていない。
【０１６２】
上述のように、本発明の核酸複合体は、
（ｉｉ）ヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログとを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含み、かつ上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含むが、本発明の１つの実施態様において、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、構成単位としてデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。ここで、上記ポリヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドからなることもできる。また、上記ポリヌクレオチドは構成単位としてリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の１つの実施態様において、上記ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドからなる。これらの態様において、上記リボヌクレオチドの一部または全部が修飾されていてもよく、またはリボヌクレオチドは修飾されていなくてもよい。同様に、上記デオキシリボヌクレオチドの一部または全部が修飾されていてもよく、または上記デオキシリボヌクレオチドは修飾されていなくてもよい。例えば、修飾デオキシリボヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチド（すなわち、塩基サブユニットが修飾されているヌクレオチド）であることができ、好ましくは脱塩基ヌクレオチド（これは上述の「非塩基残基」に相当し得る）であることができる。ここで、１つの態様では、上記修飾デオキシリボヌクレオチドは、塩基修飾以外の修飾を受けていない。
【０１６３】
本発明の１つの実施態様において、上記バルジは、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドから形成される。
【０１６４】
例えば、上記バルジはデオキシリボヌクレオチドから形成される。この場合、デオキシリボヌクレオチドの一部または全部が修飾されていてもよいし、または上記デオキシリボヌクレオチドは修飾されていなくてもよい。本発明の１つの好ましい実施態様において、上記バルジは修飾デオキシリボヌクレオチド、好ましくは塩基修飾デオキシリボヌクレオチド、特に脱塩基デオキシリボヌクレオチドから構成される。例えば、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが修飾されていないデオキシリボヌクレオチドと修飾されたデオキシリボヌクレオチドからなり、当該修飾デオキシリボヌクレオチド（好ましくは、少なくとも２つの、例えば３、４、５または６つの連続した修飾デオキシリボヌクレオチド）がバルジを構成する。ここで上記修飾デオキシリボヌクレオチドは、好ましくは、塩基修飾デオキシリボヌクレオチド、より好ましくは脱塩基デオキシリボヌクレオチドであり、特に好ましくは、上記修飾デオキシリボヌクレオチドは塩基修飾以外の修飾を受けていない。
【０１６５】
本発明の別の好ましい実施態様において、上記バルジは修飾されていないデオキシリボヌクレオチド（例えば、デオキシイノシンまたはチミジン）から、好ましくは、同一の塩基配列（例えば、デオキシイノシンまたはチミジン）を有する少なくとも２つの、例えば３、４、５または６つの連続した非修飾デオキシリボヌクレオチドから構成される。
【０１６６】
また、上記バルジはリボヌクレオチドから形成されていてもよい。この場合、リボヌクレオチドの一部または全部が修飾されていてもよいし、または上記リボヌクレオチドは修飾されていなくてもよい。本発明の１つの好ましい実施態様において、上記バルジは修飾されていないリボヌクレオチドから構成される。例えば、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが修飾されていないデオキシリボヌクレオチドと修飾されていないリボヌクレオチドからなり、当該非修飾リボヌクレオチド（例えば、イノシンまたはウラシル）が、好ましくは同一の塩基配列（例えば、デオキシイノシンまたはチミジン）を有する少なくとも２つの、例えば３、４、５または６つの連続した非修飾リボヌクレオチドがバルジを構成する。
【０１６７】
本発明の１つの好ましい態様において、本発明は、
（ｉ）ホスホロチオエート化されている少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチド、上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる５’ウィング領域および上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる３’ウィング領域を構成単位として含むポリヌクレオチドを含む活性部分、ならびに
（ｉｉ）構成単位としての修飾されていないデオキシリボヌクレオチドからなるか、または構成単位としての修飾されていないリボヌクレオチドおよび修飾されていないデオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含む、二本鎖核酸複合体であって、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含む二本鎖核酸複合体に関する。
【０１６８】
本発明の他の好ましい態様において、本発明は、
（ｉ）ホスホロチオエート化されている少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチド、上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる５’ウィング領域および上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる３’ウィング領域を構成単位として含むポリヌクレオチドを含む活性部分、ならびに
（ｉｉ）構成単位としての修飾されていないリボヌクレオチドおよび修飾されていないデオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含む、二本鎖核酸複合体であって、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含み、当該バルジは修飾されていないリボヌクレオチドから形成される二本鎖核酸複合体に関する。
【０１６９】
さらに、本発明はまた、
（ｉ）ホスホロチオエート化されている少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチド、上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる５’ウィング領域および上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる３’ウィング領域を構成単位として含むポリヌクレオチドを含む活性部分、ならびに
（ｉｉ）構成単位としての修飾されていないリボヌクレオチドおよび修飾されていないデオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含む、二本鎖核酸複合体であって、
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含み、当該バルジは修飾されていないリボヌクレオチドから形成され、かつ
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対するおよび／または標的転写産物に対するミスマッチを含まない二本鎖核酸複合体に関する。
【０１７０】
本発明の１つの好ましい実施態様において、上記キャリアー部分のポリペプチドにおいて、上記５’ウィング領域はポリヌクレオチドの５’末端に位置し、すなわち、ポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位を含む。本発明のさらなる好ましい実施態様において、上記キャリアー部分において、上記３’ウィング領域はポリヌクレオチドの３’末端に位置し、すなわち、ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位を含む。
【０１７１】
本発明においては、活性部分のポリヌクレオチドに関する上述の態様と、キャリアー部分のポリヌクレオチドに関する上述の態様を、適宜組み合わせることにより、種々の態様の核酸複合体、好ましくは二本鎖複合体を作製することができる。
【０１７２】
本発明の１つの実施態様において、上記核酸複合体は、細胞または哺乳動物において標的転写産物、例えば標的遺伝子の発現を減少させるための核酸複合体である。
【０１７３】
本発明のさらなる１つの実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である。本発明の１つの実施態様において、上記標的遺伝子は、ヒトｂｃｌ−２またはヒトＳＴＡＴ３である。本発明の別の実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、標的としてのタンパク質をコードしない転写産物、例えば標的ノンコーディングＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である。本発明の１つの実施態様において、標的ノンコーディングＲＮＡは、ヒトまたはマウスの転位関連肺腺癌転写産物（ＭＡＬＡＴ１）である。
【０１７４】
本発明の１つの実施態様において、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号１、６〜１２または２１のいずれか１つで示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｂ）上記（ａ）のポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ａ）のポリヌクレオチドのうちの少数のヌクレオチドが置換し、欠失し、付加し及び／又は挿入されたポリヌクレオチド、
（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチド。
【０１７５】
上記（ｂ）のポリヌクレオチドは、上記（ａ）のポリヌクレオチドの塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有する。好ましくは、上記（ｂ）のポリヌクレオチドは、標的転写産物の発現抑制活性を有する。
【０１７６】
上記（ｃ）のポリヌクレオチドは、上記（ａ）のポリヌクレオチドのうちの少数の、好ましくは、１個〜数個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドが置換し、欠失し、付加し及び／又は挿入されたポリヌクレオチドであることができる。好ましくは、上記（ｃ）のポリヌクレオチドは、標的転写産物の発現抑制活性を有する。
【０１７７】
上記（ｄ）のポリヌクレオチドは、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチドであり、好ましくは標的転写産物の発現抑制活性を有する。本発明の１つの実施態様において、上記（ｄ）のポリヌクレオチドの長さは８〜１００塩基である。好ましくは、前記長さは、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、又は少なくとも１３塩基である。前記長さは、好ましくは１００塩基以下、３５塩基以下、２５塩基以下または２０塩基以下であることができる。
【０１７８】
本明細書において、塩基配列に関する「配列同一性」とは、比較すべき２つ塩基配列の塩基ができるだけ多く一致するように両塩基配列を整列させ、一致した塩基数を全塩基数で除したものを百分率（％）で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる（Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：２２６４−２２６８，  １９９３；  Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２，  １９９７）。ギャップが挿入される場合、上記全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数となる。このようにして数えた全塩基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全塩基数で、一致した塩基数を除して算出される。
【０１７９】
通常、上述の修飾やヌクレオチドアナログの存在は、上記の配列同一性に影響を及ぼさない。
【０１８０】
本発明の１つの実施態様において、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、以下の（ａ’）〜（ｄ’）から選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ’）配列番号２〜５、１３〜２０または２２のいずれか１つで示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、（ｂ’）上記（ａ’）のポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ’）上記（ａ’）のポリヌクレオチドのうちの少数のヌクレオチドが置換し、欠失し、付加し及び／又は挿入されたポリヌクレオチド、
（ｄ’）上記（ａ’）〜（ｃ’）のいずれか１つのポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチド。
【０１８１】
上記（ｂ’）のポリヌクレオチドは、上記（ａ’）のポリヌクレオチドの塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有する。好ましくは、上記（ｂ’）のポリヌクレオチドは、活性部分のキャリアーとしての機能を有する。
【０１８２】
上記（ｃ’）のポリヌクレオチドは、上記（ａ’）のポリヌクレオチドのうちの少数の、好ましくは、１個〜数個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドが置換し、欠失し、付加し及び／又は挿入されたポリヌクレオチドであることができる。好ましくは、上記（ｃ’）のポリヌクレオチドは、活性部分のキャリアーとしての機能を有する。
【０１８３】
上記（ｄ’）のポリヌクレオチドは、上記（ａ’）〜（ｃ’）のいずれかのポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチドであり、好ましくは活性部分のキャリアーとしての機能を有する。本発明の１つの実施態様において、上記（ｄ’）のポリヌクレオチドの長さは８〜１００塩基である。好ましくは、前記長さは、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、少なくとも１３塩基であり、少なくとも１４塩基であり、少なくとも１５塩基、または少なくとも１６塩基である。前記長さは、好ましくは１００塩基以下、４５塩基以下、３５塩基以下、３０塩基以下、２５塩基以下、２４塩基以下、２３塩基以下、２２塩基以下、２１塩基以下または２０塩基以下であることができる。
【０１８４】
本発明の１つの実施態様において、核酸複合体は、好ましくはキャリアー部分に、機能性部分を含む。本発明の１つの実施態様において、機能性部分は、キャリアー部分に、好ましくは、キャリアー部分のポリヌクレオチドに結合していてもよい。本発明の１つの実施態様において、機能性部分は、バルジに結合していてもよい。当該ポリヌクレオチドと機能性部分との結合は、直接的な結合であってもよく、他の物質を介した間接的な結合であってもよいが、ある実施形態において、共有結合、イオン結合、水素結合等でキャリアー部分におけるポリヌクレオチドと機能性部分とが直接的に結合していることが好ましく、より安定した結合が得られるという観点から、共有結合がより好ましい。
【０１８５】
ある実施形態において、「機能性部分」の構造上、特に制限はなく、それを含むまたはそれと結合する核酸複合体、キャリアー部分及び／又はキャリアー部分のポリヌクレオチドに所望の機能を付与する。所望の機能としては、標識機能、精製機能及び標的への送達機能が挙げられる。標識機能を付与する部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物が挙げられる。精製機能を付与する部分の例としては、ビオチン、アビジン、Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物が挙げられる。
【０１８６】
また、本発明の１つの実施態様において、活性部分を特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ当該活性部分によって標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制するという観点から、上記核酸複合体は、当該複合体を標的部位に送達させる活性を有する分子を機能性部分として含むことができる。好ましくは、キャリアー部分が当該分子を含み、好ましくは、当該分子はキャリアー部分のポリヌクレオチド、好ましいバルジ構造に結合している。
【０１８７】
「標的への送達機能」を有する部分として、例えば、肝臓等に特異性高く効率的にある実施形態における核酸複合体を送達できるという観点から、脂質が挙げられる。このような脂質としては、コレステロール、脂肪酸等の脂質（例えば、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）、ビタミンＡ，ビタミンＤ）、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン（例えば、アシルカルニチン）、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質、グリセリド、並びにそれらの誘導体等を例示することができるが、これらの中では、より安全性が高いという観点から、ある実施形態において、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）を利用することが好ましい。また、脳に特異性高く効率的に本発明の核酸を送達できるという観点から、ある実施形態における「機能性部分」としては、糖（例えば、グルコース、スクロース）が挙げられる。さらに、低分子および生体分子／生体活性分子（以下、「低分子リガンド」とも呼ぶ。例えばアニスアミド、チロフィバン、および２−ピロリジン−１−イル−Ｎ−［４−［４−（２−ピロリジン−１−イル−アセチルアミノ）−ベンジル］−フェニル］−アセトアミド）を挙げることもできる。また、各臓器の細胞表面にある各種タンパク質に結合することにより、当該臓器に特異性高く効率的にある実施形態における核酸複合体を送達できるという観点から、受容体のリガンドや抗体、及び／又はそれらの断片等のペプチド又はタンパク質、葉酸が、ある実施形態における「機能性部分」として挙げられる。「ペプチド」とは、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した物質であり、本明細書においては、１００残基未満のアミノ酸が連結した物質を指す。本発明においては、好ましくは、６０残基以下のアミノ酸、例えば５０残基以下、４０残基以下、３０残基以下、２０残基以下、または１０残基以下のアミノ酸、例えば９残基以下、８残基以下、７残基以下、６残基以下、５残基以下のアミノ酸が連結したペプチドが標的への送達機能を有する部分（送達機能部分）として使用される。送達機能部分として使用されるペプチド（以下、「ペプチドリガンド」とも呼ぶ）は、特に限定されないが、その例としては、環状ＲＧＤ配列含有ペプチド、インスリン、グルカゴン様ペプチド−１、バソプレシン、オキシトシンが挙げられる。
【０１８８】
ここで、「環状ＲＧＤ配列含有ペプチド」（以後、「ｃＲＧＤ」、「ｃＲＧＤペプチド」とも呼ぶ）は、少なくとも１つのアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を有し、環状構造を形成するペプチドである。ＲＧＤ配列は、細胞表面上の細胞接着分子であるインテグリン分子（特にαＶβ３やαＶβ５等）に結合してこれを活性化することや、細胞側のエンドサイトーシスを誘導することが知られており、ＲＧＤぺプチドの腫瘍標的リガンドとしての使用も知られている。本発明では、斯かるＲＧＤ配列を有し、環状構造を形成するペプチドであれば、任意のｃＲＧＤペプチドを使用することが可能である。ｃＲＧＤペプチドの配列長は特に制限されないが、環構造を形成する観点から、アミノ酸数が通常３以上、例えば、４〜１５または５〜１０であることが好ましい。
【０１８９】
本発明においては、「ペプチドリガンド」と同様に、送達性機能を有する上記の脂質、タンパク質、糖鎖、低分子および生体分子／生体活性分子についてもそれぞれ、「脂質リガンド」「タンパク質リガンド」「糖鎖リガンド」「低分子リガンド」「生体分子／生体活性分子リガンド」と呼ぶことがあり、これらをまとめて単に「リガンド」とも呼ぶこともある。
【０１９０】
本発明の１つの実施態様において、上記（ｉｉ）キャリアー部分は、標的への送達機能を有する機能性部分（送達機能部分）を含み、当該送達機能部分は、好ましくは、脂質、ペプチド、タンパク質、糖鎖、低分子および生体分子／生体活性分子からなる群から選択される分子であり、例えば、環状アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール）、ステアリン酸、ドコサン酸、アニスアミド、葉酸、アナンダミドまたはスペルミンである。
【０１９１】
本発明の１つの実施態様において、上記（ｉｉ）キャリアー部分は、ポリヌクレオチドと機能性部分、特に送達機能部分とからなる。
【０１９２】
本発明の１つのさらなる実施態様において、上記（ｉｉ）キャリアー部分は機能性部分を含まず、特に送達機能部分を含まない。
【０１９３】
本発明の他の態様において、本発明は、
（ｉ）ホスホロチオエート化されている少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチド、上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる５’ウィング領域および上記少なくとも４つの連続したデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、２〜５個のホスホロチオエート化された架橋化ヌクレオチドからなる３’ウィング領域を構成単位として含むポリヌクレオチドを含む活性部分、ならびに
（ｉｉ）構成単位としての修飾されていないリボヌクレオチドおよび修飾されていないデオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含む、二本鎖核酸複合体であって、
上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが少なくとも１つのバルジを含み、当該バルジは修飾されていないリボヌクレオチドから形成され、
上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに対するおよび／または標的転写産物に対するミスマッチを含まず、かつ
上記（ｉｉ）キャリアー部分が標的への送達機能を有する機能性部分を含まない、二本鎖核酸複合体に関する。
【０１９４】
例えば、上記のようなリガンドを有する本発明の核酸複合体は、上記リガンドが特異的に結合可能なレセプターを有する細胞や組織（例えばそれらの表面に有する）を標的細胞または標的組織とすることができる。標的細胞や標的組織の種類は特に限定されず、目的などに応じて適宜の細胞や組織を標的とすることができる。例えば、標的細胞は組織や臓器を形成する細胞であってもよい。あるいは、標的細胞は、白血病細胞のように単独で存在する細胞であってもよく、固形がん細胞のように組織に腫瘍を形成している細胞やリンパ組織や他の組織に浸潤している細胞などであってもよい（以下、これらの細胞をまとめて単に「癌細胞」とも呼ぶ）。
【０１９５】
本発明の１つの実施態様において、上記リガンドは、上記核酸複合体に、好ましくは上記キャリアー部分に、より好ましくは上記キャリアー部分のポリヌクレオチドに、直接結合していても、リンカーを介して間接的に結合していてもよい。例えば、上記リガンドは、上記ポリヌクレオチドの５’末端または３’末端に、好ましくは５’末端に、直接またはリンカーを介して結合させることができる。上記のようなリガンドを、任意選択的にリンカーを介して、ポリヌクレオチドに結合させる方法は当業者によく知られている。当業者は、使用するリガンドやリンカーの種類に応じて適宜適切な公知の方法を選択することにより、上記結合を達成することが可能である。
【０１９６】
１つの実施態様において、上記送達機能部分は、リガンドのみからなる。本発明のさらなる実施態様において、上記送達機能部分は、リガンドおよびリンカーのみからなる。
【０１９７】
一般的に、化合物を経腸投与（経口投与等）した場合には、その化合物は血管ではなく、リンパ管を通して生体内に拡散されていく。しかしながら、リンパ管に達するためには、化合物の分子量は１１０００〜１７０００ダルトン以上であることが必要となる。さらに、経腸投与した化合物は、腸管内のＲＮａｓｅＡに曝露されることになるため、リボヌクレオチドを含有する核酸医薬は、当該リボヌクレオチドの部分を全て２’−Ｏ−メチル化等にて修飾しておくことも好ましい。従って、本発明の１つの実施態様において、上記核酸複合体がリボヌクレオチドや構造化学的にＲＮＡ構造を有する修飾ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ、例えばＬＮＡを含む場合、これらは全て２’−Ｏ−メチル化されている。
【０１９８】
以上、いくつかの実施態様において、核酸複合体の好適な典型例について説明したが、いくつかの実施態様における核酸複合体は上記典型例に限定されるものではない。また、いくつかの実施形態において、活性部分のポリヌクレオチドおよびキャリアー部分のポリヌクレオチドは、当業者であれば公知の方法を適宜選択することにより調製することができる。例えば、標的転写産物の塩基配列（又は、いくつかの場合においては標的遺伝子の塩基配列）の情報に基づいて、核酸の塩基配列を設計し、市販の核酸自動合成機（アプライドバイオシステムズ社製、べックマン社製等）を用いて合成し、次いで、得られるポリヌクレオチドを逆相カラム等を用いて精製することにより、核酸を調製することができる。そして、このようにして調製した核酸を適当な緩衝液中にて混合し、約９０〜９８℃にて数分間（例えば、５分間）かけて変性させた後、約３０〜７０℃にて約１〜８時間かけてアニーリングさせることにより、いくつかの実施形態における核酸複合体を調製することができる。また、機能性部分が結合している核酸複合体は、予め機能性部分を結合させた核酸種を用いて、前記の通り、合成、精製及びアニーリングすることにより、調製することができる。機能性部分と核酸とを結合させるための多くの方法は、当該分野においてよく知られている。
【０１９９】
なお、上述のように、本発明の核酸複合体は、主にＲＮａｓｅＨ依存的な経路により、そのアンチセンス効果を発揮するものと考えられる。しかしながら、本発明のさらなる実施態様において、本発明の核酸複合体は、ＲＮａｓｅＨ非依存的アンチセンス効果を有し得る。「ＲＮａｓｅＨ非依存的アンチセンス効果」とは、標的遺伝子の転写産物（ＲＮＡセンス鎖）と、その部分配列に相補的な核酸鎖とがハイブリダイズすることによる翻訳の阻害やエキソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果によって生じる標的遺伝子の発現を抑制する活性のことを意味する。
【０２００】
＜標的遺伝子の発現又は標的転写産物を抑制するための組成物＞
いくつかの実施形態における核酸複合体は、特異性高く効率良く標的部位に送達され、かつ、後述の実施例において示す通り、標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルを非常に効果的に抑制することができる。従って、いくつかの実施形態における核酸複合体を有効成分として含有する、例えば、標的遺伝子の発現をアンチセンス効果によって抑制するための組成物を、本発明は提供することができる。特に、いくつかの実施形態における核酸複合体は、低濃度の投与により高い薬効を得ることができ、かつアンチセンス核酸の送達標的領域以外の臓器における分布を抑制することにより、副作用も低減できるため、代謝性疾患、腫瘍、感染症といった標的遺伝子の発現亢進に伴う疾患を治療、予防するための医薬組成物も、いくつかの実施形態において提供することができる。
【０２０１】
従って、本発明の１つの実施態様において、本発明は、上記核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物に関する。
【０２０２】
また、本発明の別の実施態様において、本発明は、医薬組成物を製造するための、上記核酸複合体の使用に関する。
【０２０３】
さらに別の実施態様において、本発明は、上記核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において癌を治療する方法に関する。
【０２０４】
上記医薬組成物は、癌細胞の増殖を抑制するための医薬組成物であることができ、または、癌治療用および／または予防用医薬組成物であることができる。
【０２０５】
上記癌は、例えば、脳腫瘍；頭、首、肺、子宮又は食道の扁平上皮癌；メラノーマ；肺又は子宮の腺癌；腎癌；悪性混合腫瘍；肝細胞癌；基底細胞癌；勅細胞腫様歯肉腫；口腔内腫瘤；肛門周囲腺癌；肛門嚢腫瘤；肛門嚢アポクリン腺癌；セルトリ細胞腫；膣前庭癌；皮脂腺癌；皮脂腺上皮腫；脂腺腺腫；汗腺癌；鼻腔内腺癌；鼻腺癌；甲状腺癌；大腸癌；気管支腺癌；腺癌；腺管癌；乳腺癌；複合型乳腺癌；乳腺悪性混合腫瘍；乳管内乳頭状腺癌；線維肉腫；血管周皮腫；肉腫；骨肉腫；軟骨肉腫；軟部組織肉腫；組織球肉腫；粘液肉腫；未分化肉腫；肺癌；肥満細胞腫；皮膚平滑筋腫；腹腔内平滑筋腫；平滑筋腫；慢性型リンパ球性白血病；リンパ腫；消化管型リンパ腫；消化器型リンパ腫；小〜中細胞型リンパ腫；副腎髄質腫瘍；顆粒膜細胞腫；褐色細胞腫；頭頸部癌；乳癌；肺癌；結腸癌；卵巣癌；前立腺癌；神経膠腫；神経膠芽腫；星状細胞腫；多形神経膠芽腫；炎症性乳癌；ウィルムス腫瘍；ユーイング肉腫；横紋筋肉腫；上衣腫；髄芽腫；腎癌；肝癌；黒色腫；膵臓癌；骨巨細胞腫；甲状腺癌；リンパ芽球性Ｔ細胞白血病；慢性骨髄性白血病；慢性リンパ球性白血病；ヘアリー細胞白血病；急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；ＡＭＬ；慢性好中球性白血病；急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病；形質細胞腫；免疫芽球性大細胞型白血病；マントル細胞白血病；多発性骨髄腫；巨核芽球性白血病；急性巨核球性白血病；前骨髄球性白血病；赤白血病；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；リンパ芽球性Ｔ細胞リンパ腫；バーキットリンパ腫；濾胞性リンパ腫；神経芽細胞腫；膀胱癌；尿路上皮癌；外陰癌；子宮頸癌；子宮内膜癌；中皮腫；食道癌；唾液腺癌；肝細胞癌；胃癌；上咽頭癌；頬癌；口腔癌ＧＩＳＴ（消化管間葉性腫瘍）；上皮様細胞癌；肺胞基底上皮腺癌および精巣癌からなる群から選択される。
【０２０６】
本発明のさらなる実施態様において、本発明は、上記核酸複合体を細胞と接触させる工程を含む、細胞内の転写産物レベルを低減する方法に関する。
【０２０７】
本発明の別の実施態様において、本発明は、上記核酸複合体を細胞、好ましくは癌細胞と接触させる工程を含む、当該細胞の増殖を抑制する方法に関する。
【０２０８】
本発明の別の実施態様において、本発明は、哺乳動物において標的遺伝子またはタンパク質をコードしない転写産物、例えばノンコーディングＲＮＡの発現を低減させるための、上記核酸複合体の使用に関する。
【０２０９】
本発明の別の実施態様において、本発明は、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的細胞、好ましくは癌細胞の増殖を抑制するための、上記核酸複合体の使用に関する。
【０２１０】
本発明はさらに、哺乳動物において標的遺伝子またはタンパク質をコードしない転写産物（例えばノンコーディングＲＮＡ）の発現を低減させるための薬剤を製造するための、上記核酸複合体の使用に関する。本発明はまた、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的細胞、好ましくは癌細胞の増殖を抑制するための薬剤を製造するための、上記核酸複合体の使用に関する。
【０２１１】
さらなる実施態様において、本発明は、上記核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において標的遺伝子またはタンパク質をコードしない転写産物（例えばノンコーディングＲＮＡ）の発現レベルを低減する方法に関する。本発明の別の実施態様において、本発明は、上記核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的細胞、好ましくは癌細胞の増殖を抑制する方法に関する。上記の態様では、好ましくは、活性部分のポリヌクレオチドは、転写産物、例えば標的遺伝子ｍＲＮＡやタンパク質をコードしない転写産物（例えばノンコーディングＲＮＡ）のいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である。
【０２１２】
１つの実施態様において、上記転写産物は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物である。好ましくは、上記タンパク質はヒトＢＣＬ２またはヒトＳＴＡＴ３である。他の実施態様において、上記転写産物は、タンパク質をコードしない転写産物、例えばマウスの転位関連肺腺癌転写産物（ＭＡＬＡＴ１）ノンコーディングＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＮＲ＿００２８４７）である。
【０２１３】
また、本発明の１つの実施態様において、上記標的遺伝子は、ヒトｂｃｌ−２またはヒトＳＴＡＴ３である。
【０２１４】
１つの好ましい実施態様において、上記哺乳動物はヒトである。
【０２１５】
核酸複合体を含む上記組成物や薬剤は、公知の製剤学的方法により製剤化することができ、例えば所望の投与形態や剤形に製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的に使用することができる。
【０２１６】
これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容可能な担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、ｐＨ調節剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
【０２１７】
製剤化等に際し、「Ｋａｚｕｔａｋａ  Ｎｉｓｈｉｎａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００８年、１６巻、７３４〜７４０ページ」に示されるように、機能性部分として脂質が結合している、いくつかの実施形態における二本鎖核酸複合体においては、カイロミクロンやカイロミクロンレムナント等のリポタンパク質との複合体を形成させてもよい。さらに、経腸投与の効率を高めるという観点から、前記リポタンパク質に加え、大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する物質（例えば、中鎖脂肪酸、長鎖不飽和脂肪酸又はそれらの誘導体（塩、エステル体又はエーテル体））及び界面活性剤（非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤）との複合体（混合ミセル、エマルジョン）であってもよい。
【０２１８】
上記組成物または薬剤の好ましい投与形態としては特に制限はなく、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。
【０２１９】
各実施形態において核酸複合体や組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができ、すなわち、ヒトおよびヒト以外の動物を対象とすることができる。ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。
【０２２０】
いくつかの実施形態における組成物を投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）等に応じて、適宜選択されるが、ある実施形態にかかる組成物の有効摂取量は、ヌクレオチド換算で０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日であることが好ましい。
【０２２１】
本発明の二本鎖核酸は、特異性高く効率的に標的部位に送達され、かつ後述の実施例において示す通り標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルを非常に効果的に抑制することができ、さらに抗腫瘍効果を発揮することができる。従って、本発明の１つの実施態様では、対象に対して、上記核酸複合体を投与し、標的遺伝子の発現又は標的転写産物をアンチセンス効果によって抑制する方法を提供することができる。また、本発明の組成物を対象に投与することによって、標的遺伝子の発現亢進等を伴う各種疾患を治療、予防するための方法をも提供することができる。
【実施例】
【０２２２】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、実施形態は以下の実施例に限定されるものではない。【０２２３】
例１
［２本鎖核酸の合成］
ヒトＢＣＬ２遺伝子の配列に基づいて、該遺伝子を標的とするＤＮＡ−バルジ型ＤＮＡを基本骨格とする２本鎖核酸を設計した。ＢＣＬ２遺伝子に対する２本鎖核酸の具体例としては、アンチセンス鎖ヌクレオチドの配列（１６ｍｅｒ）を配列番号１に、相補鎖ヌクレオチド配列を配列番号２〜５に示す。各々の遺伝子配列においてアンチセンス鎖とそれぞれの相補鎖をアニーリングさせることで２本鎖核酸を形成する。配列番号１と２から形成される２本鎖核酸をＢＲＤＢ−１、配列番号１と３から形成される２本鎖核酸をＢＲＤＢ−２、配列番号１と４から形成される２本鎖核酸をＢＲＤＢ−３、配列番号１と５から形成される２本鎖核酸をＢＲＤＢ−４とする。これらの２本鎖核酸は株式会社ジーンデザイン社に合成を委託した。配列表記として下線で示すヌクレオチドはＲＮＡ、【０２２４】
【化１１】
2017068791.tif 000012
【０２２５】
はＬＮＡ、それ以外はＤＮＡを表す。また、ヌクレオチドの結合様式としてｐｓはチオリン酸結合、ｐｏはホスホジエステル結合を示す。【０２２６】
【表１】
2017068791.tif 000013
【０２２７】
例２
［細胞培養］
後述の実験に用いるヒト癌由来細胞株は、以下の方法で維持した細胞株を用いた。【０２２８】
ヒト上皮様細胞癌由来細胞株（Ａ４３１細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ０００４）は、１０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＤＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社製）を用い、ヒト膵臓癌由来細胞株（ＡｓＰＣ−１細胞株：ＡＴＣＣ細胞バンクより購入、細胞番号：ＣＲＬ−１６８２）は、１０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＲＰＭＩ１６４０：ＧＩＢＣＯ社製）を用いて、３７℃、５質量％ＣＯ２条件下にて維持した。
また、ヒト肺胞基底上皮腺癌由来細胞株（Ａ５４９細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ００７６）及びヒト大腸癌由来細胞株（ＨＣＴ１１６細胞株：ＡＴＣＣ細胞バンクより購入、細胞番号：ＣＣＬ−２４７）は、１０質量％のウシ胎児血清、ＭＥＭ用非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社）を用い、３７℃、５質量％ＣＯ２条件下にて維持した。【０２２９】
例３
［細胞増殖アッセイ］
後述の実験で行った細胞増殖アッセイは、特に断りのない限り、以下の方法で行った。９６穴マイクロプレートを用い、加湿条件下（３７℃、５％  ＣＯ２）、１００μｌ／ウェルの培地で細胞を培養した。細胞増殖アッセイには細胞増殖試薬  ＷＳＴ−１（ロッシュ社製）を１ウェルに対し１０μｌ添加し、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を用いて吸光度を測定した。【０２３０】
例４
［定量ＲＴ−ＰＣＲ］
後述の実験で行った定量ＲＴ−ＰＣＲは、特に断りのない限り、以下の方法で行った。Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、培養細胞からトータルＲＮＡを抽出した。上記トータルＲＮＡを用いた定量ＲＴ−ＰＣＲはＱｕａｎｔ−Ｆａｓｔ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し、推奨される条件で行った。プライマーはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製  ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  Ｐｒｏｂｅを使用した。内因性コントロールプライマーには同社製β−Ａｃｔｉｎを用いた。上記定量ＲＴ−ＰＣＲの増幅は、ＲＯＴＯＲ−Ｇｅｎｅ  Ｑ  （ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。ｍＲＮＡ発現量はＤｅｌｔａ
Ｄｅｌｔａ  ＣＴ法により算出した。【０２３１】
例５
［ヒトｂｃｌ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験］
上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおける細胞増殖抑制活性を調べるために、以下の実験を行った。まず、配列番号１と配列番号２〜５をアニーリングさせた２本鎖核酸（計４本）を用意した。次いで、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、Ａ４３１、ＡｓＰＣ−１、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６細胞株に１０ｎＭの上記２本鎖核酸をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞株を、トランスフェクトから７２時間培養し、上述の例３に記載の細胞増殖アッセイ法により２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性を測定した。【０２３２】
また、上記の２本鎖核酸に代えて、非標的遺伝子（ＧＬ３）に対する２本鎖核酸を用いて、同様の細胞増殖アッセイを行った。【０２３３】
その結果をＡ４３１細胞株は図１、ＡｓＰＣ−１細胞株は図２、Ａ５４９細胞株は図３、ＨＣＴ１１６細胞株は図４に示す。図１〜４から分かるように、ＤＮＡ−バルジ型を基本骨格とする２本鎖核酸はヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とすることで各種癌細胞株に対する増殖抑制活性を示した。【０２３４】
例６
［ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、以下の実験を行った。まず、配列番号１と配列番号５をアニーリングさせた２本鎖核酸を用意した。次いで、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、Ａ４３１、ＡｓＰＣ−１、Ａ５４９、ＨＣＴ１１６細胞株に１０ｎＭの上記２本鎖核酸をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞株を、トランスフェクトから２４時間培養し、上述の例４に記載の定量ＲＴ−ＰＣＲ法により２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０２３５】
また、上記の２本鎖核酸に代えて、非標的遺伝子（ＧＬ３）に対する２本鎖核酸を用いて、同様のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０２３６】
その結果をＡ４３１細胞株は図５、ＡｓＰＣ−１細胞株は図６、Ａ５４９細胞株は図７、ＨＣＴ１１６細胞株は図８に示す。図５〜８より分かる通り、ＤＮＡ−バルジ型を基本骨格とする２本鎖核酸はヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とすることで各種癌細胞株に対するｍＲＮＡ発現抑制活性を示した。【０２３７】
例７
［２本鎖核酸の合成］
ヒトＢＣＬ２及びＭＡＬＡＴ１遺伝子の配列に基づいて、該遺伝子を標的とするＤＮＡ−バルジ型を基本骨格とする２本鎖核酸を設計した。具体例としては、ＢＣＬ２遺伝子に対するアンチセンス鎖ヌクレオチドの配列を配列番号６〜１２、ＭＡＬＡＴ１遺伝子に対するアンチセンス鎖ヌクレオチドの配列を２１に、相補鎖ヌクレオチドのＢＣＬ２遺伝子に対する配列を配列番号１３〜２０、ＭＡＬＡＴ１遺伝子に対する配列を２２に示す（表２）。各々の遺伝子配列においてアンチセンス鎖とそれぞれの相補鎖をアニーリングさせることで２本鎖核酸を形成する。配列番号１と１３から形成される２本鎖核酸をＢＲＤＢ−５、配列番号１と１４から形成される２本鎖核酸をＢＲＤＢ−６、配列番号１と１５から形成される２本鎖核酸をＢＲＤＢ−７、配列番号１と１６から形成される２本鎖核酸をＢＲＤＢ−８、配列番号１と１７から形成される２本鎖核酸をＢＲＤＢ−９、配列番号１と１８から形成される２本鎖核酸をＢＲＤＢ−１０、配列番号１と１９から形成される２本鎖核酸をＢＲＤＢ−１１とする。配列番号６と２〜５及び１３、１４から形成される２本鎖核酸をＢＲＤ−１２〜１７、配列番号７と２〜５及び１３、１４から形成される２本鎖核酸をＢＲＤ−１８〜２３、配列番号８〜１２と５から形成される２本鎖核酸をＢＲＤ−２４〜２８、配列番号１と２０から形成される２本鎖核酸をＢＲＤ−２９、配列番号２１と２２から形成される２本鎖核酸をＢＲＤ−３０とする。【０２３８】
尚、配列番号２０，２２の５’末端には、【０２３９】
【化１２】
2017068791.tif 000014
【０２４０】
で表示している５’−Ｏｃｔｙｌ−ｔｏｃｈｏｐｈｅｒｏｌ（Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を結合させた。これらの２本鎖核酸は株式会社ジーンデザイン社に合成を委託した。【０２４１】
配列表記としてＩはｉｎｏｓｉｎｅまたはｄｅｏｘｙ  ｉｎｏｓｉｎｅ、下線で示すヌクレオチドはＲＮＡ、【０２４２】
【化１３】
2017068791.tif 000015
【０２４３】
はＬＮＡ、それ以外はＤＮＡを表す。また、ヌクレオチドの結合様式としてｐｓはチオリン酸結合、ｐｏはホスホジエステル結合を示し、Ｎ（ｆ）は２’−Ｆ修飾ヌクレオチド、Ｘは１，２−Ｄｉｄｅｏｘｙ−Ｂ−Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ−３−ＣＥＰ（Ｃｈｅｍｇｅｎｅ社製  Ｃａｔ  Ｎｏ．ＡＮＰ−７０５８）を示す。【０２４４】
【表２】
2017068791.tif 000016
【０２４５】
例８
［細胞培養］
後述の実験に用いるヒト癌由来細胞株は、以下の方法で維持した細胞株を用いた。【０２４６】
ヒト肝癌由来細胞株（ＨｅｐＧ２細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ１８８６）及びヒト膵臓癌由来細胞株（ＨＰＡＣ細胞株：ＡＴＣＣ細胞バンクより購入、細胞番号：ＣＲＬ−２１１９）は、１０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＤＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社製）を用い、ヒト胃癌由来細胞株（ＭＫＮ４５細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ０２５４）、ヒト膵臓癌由来細胞株（ＰＡＮＣ−１細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２０９５）、ヒト前立腺癌由来細胞株（ＤＵ１４５細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２１４３）、ヒト前立腺癌由来細胞株（ＬＮＣａｐ細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２１４４）、ヒト前立腺癌由来細胞株（ＰＣ−３細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２１４５）、及びヒト卵巣癌由来細胞株（ＯＶＣＡＲ−３細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２１３５）は、１０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＲＰＭＩ１６４０：ＧＩＢＣＯ社製）を用い、ヒト腎癌由来細胞株（Ｃａｋｉ−１細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ０８０１）、ヒト胃癌由来細胞株（ＨＧＣ−２７細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ０５００）、及びヒト膀胱癌由来細胞株（Ｔ２４細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ−ＲＣＢ２５３６）、ヒト大腸癌由来細胞株（ＬＳ１７４Ｔ細胞株：ＡＴＣＣ細胞バンクより購入、細胞番号：ＣＲＬ−１８８）は、１０質量％のウシ胎児血清、ＭＥＭ用非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社）を用い、ヒト乳腺癌由来細胞株（ＭＣＦ−７細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ０１３４）は、１０質量％のウシ胎児血清、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌ  インスリン、ＭＥＭ用非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社）を用い、ヒト膵臓癌由来細胞株（Ｃａｐａｎ−１細胞株：ＡＴＣＣ細胞バンクより購入、細胞番号：ＨＴＢ−７９）は、２０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＩＭＤＭ：ＧＩＢＣＯ社製）を用い、３７℃、５質量％ＣＯ２条件下にて維持した。【０２４７】
例９
［ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験］
上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおける細胞増殖抑制活性を調べるために、以下の実験を行った。まず、２本鎖核酸ＢＲＤＢ−１〜２８（計２８本）を用意した。次いで、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、上述の例２及び８に示したヒト癌由来細胞株に１０ｎＭの２本鎖核酸をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞株を、トランスフェクトから７２時間培養し、上述の例３に記載の細胞増殖アッセイ法により２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性を測定した。【０２４８】
また、上記の２本鎖核酸に代えて、非標的遺伝子（ＧＬ３）に対する２本鎖核酸を用いて、同様の細胞増殖アッセイを行った。【０２４９】
ＢＲＤＢ−１〜４の様々な細胞株に対する増殖抑制活性作用の結果をＰＡＮＣ−１細胞株は図９、Ｃａｐａｎ−１細胞株は図１０、Ｌｓ１７４Ｔ細胞株は図１１、ＨＰＡＣ細胞株は図１２に示す。【０２５０】
ＢＲＤＢ−５〜２３の様々な細胞株に対する増殖抑制活性作用の結果をＡｓＰＣ−１細胞株は図１３、ＨＣＴ１１６細胞株は図１４、Ａ５４９細胞株は図１５、Ａ４３１細胞株は図１６に、ＰＡＮＣ−１細胞株は図１７示す。【０２５１】
ＢＲＤＢ−２４〜２８の様々な細胞株に対する増殖抑制活性作用の結果をＡ５４９細胞株は図１８、Ａ４３１細胞株は図１９、ＡｓＰＣ−１細胞株は図２０、ＨＣＴ１１６細胞株は図２１示す。【０２５２】
ＢＲＤＢ−４、１５、２１の様々な細胞株に対する増殖抑制活性作用の結果をＣａｋｉ−１細胞株は図２２、ＭＣＦ−７細胞株は図２３、ＤＵ１４５細胞株は図２４、ＬＮＣａＰ細胞株は図２５、ＰＣ−３細胞株は図２６、ＨＧＣ２７細胞株は図２７、ＭＫＮ−４５細胞は図２８、ＯＶＣＡＲ−３細胞は図２９、ＨｅｐＧ２細胞は図３０、Ｔ２４細胞は図３１に示す。【０２５３】
図９〜３１より分かる通り、ＤＮＡ−バルジ型を基本骨格とする様々な構造の２本鎖核酸はヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とすることで各種癌細胞株に対する増殖抑制活性を示した。【０２５４】
例１０
［ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、以下の実験を行った。まず、２本鎖核酸ＢＲＤＢ−４、１５、２１を用意した。次いで、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社）を用いて、上述の例２に示したＡ５４９細胞株に１０ｎＭの２本鎖核酸をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞株を、トランスフェクトから２４時間培養し、上述の例４に記載の定量ＲＴ−ＰＣＲ法により２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０２５５】
また、上記の２本鎖核酸に代えて、非標的遺伝子（ＧＬ３）に対する２本鎖核酸を用いて、同様のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０２５６】
ＢＲＤＢ−４、１５、２１のＡ５４９細胞株に対するｍＲＮＡ発現抑制活性の結果を図３２に示す。【０２５７】
図３２より分かる通り、ＤＮＡ−バルジ型を基本骨格とする構造の２本鎖核酸はヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とすることでＡ５４９細胞株に対するｍＲＮＡ発現抑制活性を示した。【０２５８】
例１１
［ＤＮＡ−バルジを基本骨格とする２本鎖核酸の膵癌細胞株肝臓転移マウスモデルにおける薬効評価］
上記のＤＮＡ−バルジ構造を基本骨格とするＢＣＬ２遺伝子を標的とした２本鎖核酸の膵癌細胞株肝臓転移マウスモデルにおける抗腫瘍効果を検証するため、以下の実験を行った。【０２５９】
飼育環境下で数日間馴化したＢＡＬＢ／ｃＡ  Ｊｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウス（６週令：雄、日本クレア株式会社より購入）に三種混合麻酔薬（ドミトール０．３ｍｇ／ｋｇ  ＋  ドルミカム４ｍｇ／ｋｇ  ＋  ベトルファール５ｍｇ／ｋｇ）をマウス体重１０ｇあたり８０μｌ、腹腔内投与して全身麻酔を施した後、１匹あたり１×１０６個のヒト膵臓癌細胞株（ＡｓＰＣ−１）を脾臓に注入し、脾注肝転移モデルマウスを作製した（ＳｈａｍとしてＰＢＳを注入するマウスも作製した）。尚、移植翌日から毎日（午後）体重を測定し、人道的エンドポイントから急激な体重減少（数日間で２０％以上）、自力歩行不能かつ摂食・摂水不能な重篤状態に陥ったマウスには安楽死処置を施すこととした。癌細胞移植４日後（ｄａｙ４）、体重を指標に群分けを行い、Ｓａｌｉｎｅ、非標的遺伝子（ＧＬ３）に対する２本鎖核酸及びＢＲＤＢ−２９を１、３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈より投与した。投与期間及び回数は１日１回（ｄａｙ４，６，８，１２，１５，１８，２０，２２，２５）の合計９回実施した。体重測定等で経過を観察し、癌細胞移植から２６日後、頸椎脱臼にて安楽死させた後、肝臓を摘出した。抗腫瘍効果を評価するため、摘出した肝臓重量を測定し、マウス体重で補正することで肝重量比を算出した。その結果を図３３に示す。図３３から分かる通り、ＤＮＡ−バルジを基本骨格とするＢＣＬ２遺伝子を標的とした２本鎖核酸は、膵癌細胞株肝臓転移マウスモデルにおいて統計学的に有意な抗腫瘍効果を示した。【０２６０】
例１２
［ＤＮＡ−バルジ構造を基本骨格とする２本鎖核酸のマウス肝臓におけるＭＡＬＡＴ１遺伝子ノックダウン効果の検証］
転位関連肺腺癌転写産物（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  １、ＭＡＬＡＴ１）ノンコーディングＲＮＡを標的とした一実施形態による二本鎖核酸剤の有用性を検証するｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った。対照（ＡＳＯ）は、１６ｍｅｒの１本鎖ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマーとした（配列番号２１）。このＡＳＯは、５‘末端の３個および３’末端の３個のＬＮＡヌクレオシド、ならびにそれらの間の１０個のＤＮＡヌクレオシドを含む。このＡＳＯギャップマーは、マウスの転位関連肺腺癌転写産物（ＭＡＬＡＴ１）ノンコーディングＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＲ＿００２８４７）の１３１６〜１３３１位に相補的である。【０２６１】
体重２０〜２５ｇの７週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６  マウスを使用した。ＰＢＳ、１本鎖アンチセンス核酸（ＡＳＯ：配列番号２１）及びＲＢＤＢ−３０を、マウスにそれぞれ尾静脈を通じて６９．２ｎｍｏｌ／ｋｇの量（ｎ＝５）で静脈内投与した。投与７２時間後、ＰＢＳをマウスに灌流させ、その後マウスを解剖して肝臓を摘出した。摘出した肝臓からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、上述の例４に記載の定量ＲＴ−ＰＣＲ法により２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。【０２６２】
その結果は、図３４のグラフに示される。１本鎖ＡＳＯ、ＲＢＤＢ−３０の２つの核酸試薬は全て、陰性対照（ＰＢＳのみ）と比較して、ＭＡＬＡＴ１  ＲＮＡの発現の阻害を示した。しかし、ＲＢＤＢ−３０によって得られた阻害度は、１本鎖ＡＳＯによって得られた阻害度よりも大きく、その差は統計的に有意であった。
【産業上の利用可能性】
【０２６３】
以上説明したように、本発明の少なくとも１つのバルジ構造を有する核酸複合体を用いることによって、アンチセンス核酸を特異性高く効率的に特定の臓器（細胞）に送達し、当該核酸によって標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルを非常に効果的に抑制することが可能となる。また、上記核酸複合体には、特定の臓器に送達させるための機能性分子として、脂質（例えば、トコフェロール、コレステロール）、糖（例えば、グルコース、スクロース）、タンパク質、ペプチド、抗体等の多種多様な分子を適用できるため、上記核酸複合体は、様々な臓器、組織、細胞を標的とすることができる。さらには、本発明の核酸複合体における二本鎖核酸に、ＲＮａｓｅ等に対する耐性を付与するための修飾を施しても、そのアンチセンス効果は低減することはないため、上記核酸複合体は、経腸投与の態様でも利用できる。【０２６４】
そして、本発明では、ＤＮＡをベースとする核酸と、それに相補的な核酸とを含む二本鎖核酸複合体に少なくとも１つのバルジ構造を導入することにより、より優れたアンチセンス効果を達成できること、例えば、実施例でも実証されているように、動物組織内において一本鎖構造を有するＡＳＯよりも非常に優れた標的ＲＮＡ発現阻害効果を示すことが見出された。【０２６５】
従って、本発明の少なくとも１つのバルジ構造を有する核酸複合体は、低濃度の投与により高い薬効を得ることができ、かつアンチセンス核酸の標的以外の臓器における分布を抑制することにより、副作用も低減できるという点に優れているため、代謝性疾患、腫瘍、感染症等の、標的遺伝子の発現亢進及び／又は転写産物レベル亢進に伴う疾患を治療、予防するための医薬組成物等として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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