(57)【要約】  本発明は、下記工程：（ａ）固相担体上に固定した標的分子を、核酸アプタマー候補と接触させること、（ｂ）キャピラリー電気泳動によって、標的分子と結合した核酸アプタマー候補を分取すること、（ｃ）ＰＣＲによって、核酸アプタマー候補を増幅すること、を含む、核酸アプタマーをスクリーニングするための方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
（ａ）固相担体上に固定した標的分子を、核酸アプタマー候補と接触させること、
（ｂ）キャピラリー電気泳動によって、標的分子と結合した核酸アプタマー候補を分取すること、
（ｃ）ＰＣＲによって、核酸アプタマー候補を増幅すること、
を含む、核酸アプタマーをスクリーニングするための方法。
【請求項２】
さらに、（ｄ）増幅されたＰＣＲ産物を一本鎖化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固相担体が、粒子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
粒子の粒径の最小値が０．０５μｍである、請求項１〜３のいずれか１項記載のに記載の方法。
【請求項５】
標的分子が、タンパク質又は低分子量化合物である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
核酸アプタマー候補が、一本鎖ＤＮＡライブラリーである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）〜（ｄ）を最大３回反復する、請求項２〜６のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸アプタマーをスクリーニングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸アプタマーとは分子認識能をもつ一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡのことであり、１９９０年にＥｌｌｉｎｇｔｏｎらと、Ｔｕｅｒｋらによって始めて報告された。核酸アプタマーはＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  （ＳＥＬＥＸ）と呼ばれる進化工学的な手法によって獲得することが可能であり、抗体に匹敵する結合能や特異性を有するものも多数報告されている。さらに、タンパク質や細胞をはじめ、抗体の取得が困難な低分子化合物といった様々な標的に対してアプタマーを取得することができ、治療薬や診断薬への応用が期待されている。しかしながら、抗体の獲得確率は９０％以上といわれているのに対し、現在の核酸アプタマーの獲得確率は３０％以下といわれている。つまり、核酸アプタマーの獲得確率技術の向上は、今後核酸アプタマーが広く産業的に利用をされるための主要な課題であるといえる。【０００３】
核酸アプタマーは、抗体に替わる新たな分子認識素子として注目されているが、核酸アプタマーの獲得率は３０％以下とされており、高効率なアプタマー獲得法の開発が望まれている。ＣＥ−ＳＥＬＥＸは、キャピラリー電気泳動の優れた分離能を利用する迅速な核酸アプタマーのスクリーニング法である。しかしながら、実験条件設定（分取領域の設定）の難しさや、標的となる分子はｓｓＤＮＡライブラリーとの結合時に大きな電気泳動移動度が変化するような一定以上の大きさでなければならないといった制約から、汎用性の乏しさは否めない。【０００４】
ＣＥ−ＳＥＬＥＸにおいて、分取領域の設定は、アプタマー獲得率を左右する重要な要素である。標的に対して結合能をもたないｓｓＤＮＡライブラリーの混入がなく、標的と複合体を形成しているｓｓＤＮＡライブラリーを確実に含む領域を分取する必要がある。理想的な分取領域は、ｓｓＤＮＡライブラリーと標的の複合体由来のピーク範囲である。しかし、標的分子がＭｕｔＳタンパク質のようにｓｓＤＮＡと相互作用しやすいものであり、かつ、高感度な蛍光検出器を用いない限り、ｓｓＤＮＡライブラリーと標的の複合体を検出することは困難である。これまでに、標的タンパク質を蛍光修飾によって可視化したり、リアルタイムＰＣＲによって標的・アプタマー複合体の検出位置を予測したりするなど、分取領域の最適化のために様々な工夫がなされてきた。しかし、未だに複合体の検出は難しく、標的分子の検出位置からｓｓＤＮＡライブラリーが検出される直前までを分取領域とするのが一般的であった。この分取領域の設定法には、途中で解離した結合能が低い配列も分取領域に含まれやすいという問題点がある（図１Ａ）。【０００５】
また、低分子化合物などの小さな分子を標的とする場合、ｓｓＤＮＡライブラリーとの結合時の電気泳動移動度変化はほとんど期待できないため、ＣＥ−ＳＥＬＥＸの適用は困難であるとされている。ＣＥ−ＳＥＬＥＸによって低分子化合物に対するアプタマーを獲得した例は、現在までにたった一つしかないことからも、その難しさが伺える（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yang, J. & Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis-SELEX Selection of Catalytic DNA Aptamers for a Small-Molecule Porphyrin Target. Anal. Chem. 85, 1525-1530 (2013).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＣＥ−ＳＥＬＥＸの長所を生かしながらも、実験条件設定の難しさや適用可能な標的分子種の少なさといった欠点の解決した新規のＣＥ−ＳＥＬＥＸを提供する。具体的には、粒子とＣＥ−ＳＥＬＥＸを組み合わせた核酸アプタマーをスクリーニングするための方法に関する。これまでに粒子とキャピラリー電気泳動を組み合わせたＲＮＡや抗原の定量解析法は報告されているが、粒子とＣＥ−ＳＥＬＥＸを組み合わせた方法は、まだ報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、粒子とＣＥ−ＳＥＬＥＸを組み合わせることによって、従来の課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させた。
本発明は、以下に関する。
［１］下記工程：
（ａ）固相担体上に固定した標的分子を、核酸アプタマー候補と接触させること、
（ｂ）キャピラリー電気泳動によって、標的分子と結合した核酸アプタマー候補を分取すること、
（ｃ）ＰＣＲによって、核酸アプタマー候補を増幅すること、
を含む、核酸アプタマーをスクリーニングするための方法；
［２］さらに、（ｄ）増幅されたＰＣＲ産物を一本鎖化することを含む、［１］に記載の方法；
［３］固相担体が、粒子である、［１］又は［２］に記載の方法；
［４］粒子の粒径の最小値が０．０５μｍである、［１］〜［３］のいずれか記載の方法；
［５］標的分子が、タンパク質又は低分子量化合物である、［１］〜［４］のいずれか記載の方法；
［６］核酸アプタマー候補が、一本鎖ＤＮＡライブラリーである、［１］〜［５］のいずれか１項記載の方法；
［７］工程（ａ）〜（ｄ）を最大３回反復する、［２］〜［６］のいずれか記載の方法。【０００９】
固相担体は、その表面上に標的分子を固定することができる任意のものをもちいることができる。たとえば、層状のグラフェン、カーボンナノチューブ、フラーレン及び粒子を挙げることができる。粒子は、従来公知の任意の粒子を用いることができる。たとえば、シリカビーズ、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、金属コロイドを挙げることができる。本発明の粒子は、磁性粒子であることができる。粒子の平均粒径の最大値は、キャピラリーの内径に応じて決定することができる。好ましくは、１００μｍ、より好ましくは、１０μｍ、さらにより好ましくは、１μｍである。粒子の平均粒径の最小値は、好ましくは、１００ｎｍ、より好ましくは、１０ｎｍ、さらにより好ましくは、１ｎｍである。粒子の平均粒径は、公知の任意の方法を用いて決定することができる。たとえば、ふるい分け法、顕微鏡法、沈降法、レーザー回折散乱法、電気検知法をあげることができる。好ましくは、顕微鏡法である。【００１０】
高価な蛍光検出器を用いず、可視部の吸光度検出器を用いるためには、粒子は、可視光の散乱によって検出されるために十分な粒径である必要がある。この場合の粒子の平均粒径の最小値は、好ましくは、０．０５μｍ、より好ましくは、０．５μｍ、さらにより好ましくは、５μｍである。【００１１】
本発明において標的分子とは、核酸アプタマーを利用した検出方法などにおいて、検出の標的となる分子のことをいう。標的分子の化学種は特に制限されず、低分子化合物、高分子化合物、および生体由来物質など様々な化学種を含むことができる。また、標的分子は、固相担体の表面に固定することができる。より具体的には、たとえば、糖類、脂質類、オリゴペプチド、タンパク質、及び核酸を挙げることができる。標的分子機能としては、たとえば、抗原、抗体、リガンド、レセプター、相互作用タンパク質などを挙げることができる。【００１２】
本発明において核酸アプタマーとは、核酸分子であって、所定の標的分子に対する親和性が高く、特異的に結合し得る分子のことをいう。このような性質を有する核酸分子を核酸アプタマーといい、特に断らない限り、塩基配列、分子の大きさ、分子の立体構造などによって限定されるものではない。好ましくは、核酸アプタマーは、一本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡである。【００１３】
本発明において固相担体上に固定した標的分子とは、標的分子が、疎水性相互作用や静電相互作用、共有結合、配位結合、非共有結合性の分子間相互作用（ビオチン-ストレプトアビジンなど）などで固相担体表面に固定されていることをいう。【００１４】
本発明において核酸アプタマー候補とは、複数のＲＮＡ及び/又はＤＮＡで構成されるプールをいう。好ましくは、一本鎖の核酸からなる一本鎖核酸ライブラリー、より好ましくは、一本鎖のＤＮＡからなる一本鎖ＤＮＡライブラリーである。なお、一本鎖核酸の全部又は一部の塩基が互いに対合することによって形成される二本鎖核酸がその一部に含まれていてもよい。【００１５】
本発明においてキャピラリー電気泳動とは、キャピラリー内に水溶液を満たし、目的物を含む水溶液を導入して電場中に置くことにより、電荷の移動と親和性や電気浸透流などの作用が働き、分離精製が可能になるというものである。キャピラリーの内径は、任意のものを用いることができる。【００１６】
本発明においては、キャピラリー電気泳動によって、標的分子と結合した核酸アプタマー候補を分取する。キャピラリー電気泳動システムに、予め前処理を行ったキャピラリー管を設置する。その後、ｓｓＤＮＡライブラリーと標的物質を固定化した粒子を混合したサンプルをインジェクトした後、ランニングバッファー中で電気泳動を行う。泳動中は、たとえば、ダイオードアレイ検出器によって１９５、２６０、２８０、５５０ｎｍなどの波長における吸光度を経時的に測定し、得られたピークを指標として磁性粒子部分の回収を行うことができる（（ａ）工程及び（ｂ）工程）。【００１７】
本発明においては、分取された核酸アプタマー候補をＰＣＲによって増幅する。ＰＣＲとは、ポリメラーゼ連鎖反応のことで、ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡ合成反応の試験管内での繰り返しにより、その特定のＤＮＡ領域を数１０万倍に増幅することができる。このとき使用するプライマーは、使用するＤＮＡライブラリーの固定配列（プライマー配列と相補的な配列）によって異なるが、たとえばＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧ（順方向プライマー）、ＴＴＣＡＣＧＧＴＡＧＣＡＣＧＣＡＴＡＧＧ（逆方向プライマー）などがあげられる。ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、およびｄＮＴＰｓをプライマーと分取された核酸アプタマー候補を混合し、サーマルサイクラーにて加熱温度、時間を調整し、そのサイクルを繰り返すことにより、ＤＮＡ領域を増幅することができる（（ｃ）工程）。【００１８】
本発明においては、場合により、増幅されたＰＣＲ産物を一本鎖化する。たとえば、ビオチン化プライマーを用いて増幅したＰＣＲ産物にストレプトアビジン固定化磁性粒子（例えばｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など）を混合し、上清の除去、洗浄、の工程を適宜繰り返す。その後、適切な濃度のＮａＯＨを加えて目的のｓｓＤＮＡを磁性粒子表面から溶出させ、回収する（（ｄ）工程）。【００１９】
本発明においては、上記工程（ａ）〜（ｄ）を任意に反復することができる。好ましくは、上記工程（ａ）〜（ｄ）を最大３回反復する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明は、標的分子を粒子表面に固定化するだけの非常にシンプルな手法であるが、理論上はこれまでＣＥ−ＳＥＬＥＸが抱えてきた問題をほとんど解決することができる可能性がある。まず、本発明の磁性粒子を用いるＣＥ−ＳＥＬＥＸ（以下、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸという。）における分取領域の設定は、従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸと比較してはるかに容易である。粒子を光の散乱によって吸光検出器高感度に検出することができるため、高価な蛍光検出器が不要である。どのような標的分子でも磁性粒子由来のピークを分取領域とすることができる（図２）。標的・アプタマー候補複合体ピークをピンポイントで分取領域とすることで、途中で解離した結合能が低いｓｓＤＮＡライブラリーの排除が可能であり、アプタマー獲得率の向上が期待できる。【００２１】
また、本発明では、従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸに比べて、優れた獲得率を有する。したがって、より少ないラウンド数で、所望のアプタマーを選択することができる。
以下に、従来のＳＥＬＥＸと本発明の相違点を示す。【００２２】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸと本発明の相違点を示す。
【図２】図２は、ＳＰＲセンサーによるトロンビンアプタマー候補の結合能評価（従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸ）を示す。各figure  A〜J（計10個）は、表３上段に示した10個のアプタマー候補配列の検討結果を示す。
【図３】図３は、ＳＰＲセンサーによるトロンビンアプタマー候補の結合能評価（本発明のＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ）を示す。各figure  A〜J（計10個）は、表３中段に示した10個のアプタマー候補配列の検討結果を示す。
【図４】図４は、ＳＰＲセンサーによるトロンビンアプタマー候補の結合能評価（本発明のＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ  改良版）を示す。各figure  A〜J（計10個）は、表３下段に示した10個のアプタマー候補配列の検討結果を示す。
【図５】図５は、Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．１、Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．５の独特な解離相を示す。（Ａ）２００ｎＭ  Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．１のレスポンスカーブと拡大図である。（Ｂ）２００ｎＭ  Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．５のレスポンスカーブと拡大図である。
【図６】図６は、各選抜法におけるトロンビンアプタマーの獲得率（上位１０配列のみから算出した）を示す。従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸ：２３％、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ：８３％、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ（改良版）：９１％
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
磁性粒子への標的分子の固定化
表面にカルボキシ基を有する磁性粒子Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ（商標）  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を担体として、製品に付属のプロトコールにしたがい分子の固定化を行った。２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２バッファー（ｐＨ７．４）を１００μｌ添加し、１０ｍｇ／ｍｌの磁性粒子ストック溶液として４℃で保存した。【００２６】
ＣＥ−ＳＥＬＥＸ条件最適化
キャピラリー電気泳動条件
キャピラリー電気泳動システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ７１００：大塚電子）を用いた。キャピラリーは長さ８０．６ｃｍ、有効長（検出窓までの長さ）７２．２ｃｍの７５μｍ内径バブルセルフューズドシリカキャピラリー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。インレット側（注入口、陽電極側）とアウトレット側（溶出口、陰極側）の電極の間から、等しい長さのキャピラリーが出るようにキャピラリーをカセットにセットした。前処理として約１ｂａｒの圧力適用により０．１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液を１０〜２０分間流した。さらに、ランニングバッファー（１００ｍＭ  ホウ酸バッファー、ｐＨ８．５）を１０〜２０分間流すことでキャピラリー内を平衡化させた。【００２７】
標的に結合するｓｓＤＮＡの分離と分取
サンプルの調整
標的タンパク質のトロンビンやｓｓＤＮＡライブラリーは、サンプルバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２バッファー、ｐＨ７．４）で溶解または希釈した。ｓｓＤＮＡライブラリーには、３０ｍｅｒのランダム配列の両端（５’側と３’側）を２０ｍｅｒの固定配列ではさんだ計７０ｍｅｒの合成オリゴＤＮＡを用いた。サンプルバッファーと１００μＭ  ｓｓＤＮＡライブラリーをＰＣＲチューブに入れ、ピペッティングにより混合した。サーマルサイクラー（タカラバイオ）によってｓｓＤＮＡライブラリー溶液を９５℃で２分間加熱した後、０．１℃毎秒の速さで２５℃まで冷却することで、アニーリングをおこなった。【００２８】
サンプルの注入
アニーリング後、２μＭのトロンビン、あるいは５〜１０ｍｇ／ｍｌトロンビン固定化磁性粒子溶液を１μｌ加え、３０分以上室温（２５℃）でインキュベートした。ターゲット・ｓｓＤＮＡライブラリー混合溶液は、１００ｍｂａｒの圧力を６〜９秒間かけることでキャピラリーのインレット側から注入した。Ｈａｇｅｎ−ｐｏｉｓｅｕｉｌｌｅの法則に基づいて以下の式からおおよその注入量を予測することができる。Ｖは注入量（ｎｌ）、ΔＰは圧力変化（ｂａｒ）、ｄはキャピラリー内径（ｍ）、πは円周率、Ｔは注入時間（ｓ）、ηは溶液粘度、Ｌはキャピラリー全長（ｍ）を表す。
Ｖ＝ΔＰｄ４πＴ／１２８ηＬ×１０１２［ｎＬ］【００２９】
サンプルの電気泳動
５０μｌのランニングバッファーが入ったバイアルをインレット側（注入口、＋電極側）とアウトレット側（溶出口、−電極側）それぞれにセットし、３０ｋＶの定電圧を引加して電気泳動をおこなった。電気泳動中は、ダイオードアレイ検出器によって１９５、２６０、２８０、５５０ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。泳動速度は常に一定であると仮定し、以下の式から溶出時間を算出することで、分取時間を設定した。Ｔ溶出は溶出時間、Ｔ検出は検出時間、Ｌ全長はキャピラリー全長、Ｌ有効長はキャピラリー有効長を表す。
Ｔ溶出＝Ｔ検出×Ｌ全長／Ｌ有効長【００３０】
サンプルの回収
トロンビン固定化磁性粒子を用いた分取サンプルは、サーマルサイクラーを用いて９５  ℃で１０分間加熱することで磁性粒子表面のタンパク質を変性させ、ｓｓＤＮＡを遊離させた。マグネットスタンドに１分間静置した後、上静を回収した。【００３１】
ＰＣＲによる分取サンプルの増幅
キャピラリー電気泳動によって分取したｓｓＤＮＡサンプルをＰＣＲによって増幅した。１．５ｍｌチューブに２×ｐｒｅｍｉｘを４００μｌ、ＤＥＰＣ処理水を１９２μｌ、４μＭのフォワードプライマーを８０μｌ、４μＭの５’−ビオチン化リバースプライマーを８０μｌを入れて混合し、８つの２００μｌのＰＣＲチューブに９４μｌずつ分注した。６つのチューブに分取サンプルを６μｌずつ添加し、残りの二つのチューブにはポジティブ・ネガティブコントロールとして１〜１０ｐＭ  ｓｓＤＮＡライブラリーとＤＥＰＣ処理水をそれぞれ６μｌずつ添加した。サーマルサイクラー（タカラバイオ）を用いて９４℃で１分間加熱した後、「９４℃で１５秒、５５℃で５秒、７２℃で２０秒」という操作を２３〜２８回繰り返した。ＰＣＲ終了後は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって目的のサイズのＤＮＡが増幅されているかどうかを調べた。電気泳動後のゲルを染色液に浸し、１０分間振盪した。ＵＶ照射器によって、染色後のＤＮＡのバンドを検出した。【００３２】
ＰＣＲ産物の精製と一本鎖化
ＰＣＲ産物を一本鎖化し、次のラウンドで用いるｓｓＤＮＡライブラリーとした。ストレプトアビジン固定化磁性粒子であるｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＭＳ３００／Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、添付の説明書通りに固定化、洗浄操作を行った。調製しておいた０．１Ｍ  ＮａＯＨを５０μｌ添加し、１０〜１５回ゆっくりとピペッティングして懸濁した後、４分間常温で静置することでアプタマー候補を遊離・抽出した。【００３３】
次世代シークエンサーによる塩基配列解析
サンプルの調製とエマルジョンＰＣＲ
エマルジョンＰＣＲ用のサンプルは付属のプロトコルに従って調製し、ＰＡＧＥによって、目的のサイズのＤＮＡが増幅されているかを確認した。その後、Ｆａｓｔ  Ｇｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）によって、ＰＣＲ産物のカラム精製をおこなった。最終的に、Ｉｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈＴＭ  ２  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とＩｏｎ  ＰＧＭ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＯＴ２  ２００  Ｋｉｔ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてエマルジョンＰＣＲとビーズ精製をおこなった。参照した付属のプロトコールはＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＭＡＮ０００７２２０，  Ｒｅｖ．５．０である。【００３４】
次世代シーケンサーによる大規模配列解析
エマルジョンＰＣＲ後の精製ビーズを用いて、Ｉｏｎ  ＰＧＭ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と半導体チップＩｏｎ  ３１４  ｃｈｉｐとＩｏｎ  ３１８  ｃｈｉｐ  （Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｉｏｎ  ＰＧＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ２００  Ｋｉｔ  ｖ２  （Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による大規模配列解析をおこなった。操作は付属のプロトコール（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＭＡＮ０００７２７３，  Ｒｅｖ．３．０）にしたがった。シーケンスデータはＦＡＳＴＡＱファイルとして出力し、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  （ＣＬＣ  ｂｉｏ）でＤＮＡ  ライブラリーのｐｒｉｍｅｒ領域の配列（固定配列）を除き、２８〜３２  ｍｅｒのランダム配列のみを抽出した。さらに重複配列のカウント数も調べ、配列情報をｅｘｃｅｌ  ファイルとして出力した。Ｅｘｃｅｌ  （ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）上で配列をＦＡＳＴＡ形式に変換し、テキストファイルとして出力した。Ｍａｆｆｔによってアライメントをおこない、類似した配列（ファミリー配列）を抽出した。さらにＭＥＭＥ  ｓｕｉｔｅ  ４．１１．０を用いてファミリー配列を調べた。【００３５】
選抜されたアプタマーの結合能評価
標的タンパク質のセンサーチップへの固定化
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００  （ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、添付のマニュアルに従い、標的タンパク質のセンサー表面への固定化、ならびにアプタマーとの相互作用解析をおこなった。
ランニングバッファーにはＨＢＳ−ＥＰ（ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）を用いた。カルボキシメチルデキストラン修飾されたＣＭ５  ｓｅｎｓｏｒ  ｃｈｉｐ  （ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を流路にセットし、１０μｌ／ｍｉｎの流速でＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を７分間流し、センサーチップ上のカルボキシ基を活性化した。１０ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．０で希釈した１０〜２０μｇ／ｍｌ  トロンビン溶液を７分間流した。最後にエタノールアミンを７分間流してブロッキングをしてカップリング反応を完了させた。【００３６】
相互作用解析による解離定数の算出
アプタマー候補サンプルを、ランニングバッファーによって２〜４μＭに希釈した。サーマルサイクラーを用いて９５℃で２分間加熱した後、０．１℃毎秒の速さで２５℃まで冷却することで、アニーリングをおこなった。アニーリング後、ランニングバッファーでさらに５０〜２００ｎＭに希釈した。トロンビン固定化チップを流路にセットし、３０μｌ／ｍｉｎの流速で希釈したアプタマー候補を流した際に、特異的なレスポンスを示すかどうかを調べた。再生溶液として、１Ｍ  ＮａＣｌ溶液を用いた。特異的なレスポンスが得られたアプタマー候補については、６．２５〜４００ｎＭの範囲で複数の希釈サンプルを調整し、マルチカイネティクス解析をおこなった。ただし、１Ｍ  ＮａＣｌ溶液で再生できなかったアプタマー候補については、シングルカイネティクス解析（途中に再生の工程をはさまない）をおこなった。Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、解離定数を算出した。【００３７】
次世代シークエンサーによるトロンビンアプタマー候補配列の同定
次世代シークエンサーを用いてトロンビンアプタマー候補配列を決定した手順・結果を以下に示す。【００３８】
大規模配列解析
従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸ、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ（１回目）、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ（改良版）の各ラウンド（１〜３ラウンド）で得られたアプタマー候補配列を、次世代シークエンサー（Ｉｏｎ  ＰＧＭ  ｓｙｓｔｅｍ）によって解析した。ラウンド毎の総リード配列数は、９００００〜８０００００であった（表２）。各選抜法で得られた３ラウンド目の配列のうち、主にカウント数が多かった１０個の配列について解析を進めることにした。配列名を、Ｔ＿ａｐｔ．１〜１０（従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸ）、Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ａｐｔ．１〜１０（ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ）、Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．１〜１０（ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ  改良版）とした。【００３９】
表２  各ラウンドで選抜されたアプタマー候補配列の総リード数
【表２】
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【００４０】
上位塩基配列の濃縮効率の算出
まず、上位配列の存在率「（各配列のカウント数／総リード配列数）×１００（％）」を調べたところ、各選抜法で最も濃縮されていた配列の存在率は、従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸでは０．１６％、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸでは１２％、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ（改良版）では５．１％であった（表３）。Ｂｏｗｓｅｒらによって報告されたＣＥ−ＳＥＬＥＸを用いたＶＥＧＦアプタマーの取得に関する論文よれば、ＣＥ−ＳＥＬＥＸで獲得されるアプタマーは多様性に富み、特定の配列の濃縮はかかり難いという仮定がなされており、実際に４ラウンド目終了時点で最も濃縮がかかった配列の存在率０．８％程度であった。本研究の結果と比較すると、従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸで得られた上位配列の存在率に関しては、先行研究と同様の傾向がみられた。一方、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸによる選抜で得られた上位配列の存在率に関しては、従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸで得られたものと比べて５０〜１００倍ほど高い存在率を示しており、先行研究と比較してかなり高い濃縮効果を示していることが明らかとなった。ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸでは特定の結合能をもつｓｓＤＮＡが濃縮されやすい条件であると考えられる。【００４１】
表３  各選抜法の３ラウンド目における上位配列のラウンド毎のカウント数・存在率
【表３】
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【００４２】
アプタマー候補配列の結合能
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサー用いて算出された各候補配列のトロンビンに対する結合能を表４に示す。【００４３】
従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸとＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸのアプタマー獲得率の比較
上位配列のうち、トロンビンに対して高い結合能を有する配列の割合を比較することによって、新規のＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸの性能を評価した。  まず、従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸで得られた上位配列（計１０配列）の結合能の有無を調べた（図２）。予備実験から、ｓｓＤＮＡライブラリーでは特異的なレスポンスの上昇が観測されなかったことから、トロンビンはｓｓＤＮＡと非特異的に相互作用しないということが明らかになった（図２Ａ）。Ｔ＿ａｐｔ．１〜１０のうち、Ｔ＿ａｐｔ．３、Ｔ＿ａｐｔ．４、Ｔ＿ａｐｔ．６の３つのアプタマー候補において特異的なレスポンスが得られた（図２Ｂ〜Ｋ）。Ｔ＿ａｐｔ．１、Ｔ＿ａｐｔ．１０に関しては、わずかにレスポンスの上昇が観測されたものの、ピークの形状が箱型、すなわち解離が非常に早いことから、結合能は低いと考えられた（図２Ｂ、Ｋ）。コントロールとして、ＴＢＡ  １５と全く同じ配列を有するＴＢＡ＿ｌｉｋｅ＿ａｐｔ．１についても結合実験をおこなったところ、特異的なレスポンスが得られた（図２Ｌ）。【００４４】
同様にして、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸで得られた上位配列（計１０配列）の結合能の有無を調べた結果、Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ａｐｔ．１、Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ａｐｔ．３、Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ａｐｔ．７、Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ａｐｔ．８の４つのアプタマー候補において特異的なレスポンスが得られた（図３）【００４５】
最後に、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ（改良版）で得られた上位配列（計１０配列）の結合能の有無を調べた結果、Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．６、Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ａｐｔ．９以外の８つのアプタマー候補において、特異的なレスポンスが得られた（図４）。特に、Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．１とＴ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．５に関しては、他のアプタマーでは見られない独特のレスポンスカーブが得られた。これら２つのアプタマーは、比較的速い解離曲線を描いた後に一定の高さのレスポンスを保っていた（図５）。つまり、一定数のアプタマーが強固にトロンビンと結合して離れない状態にあると考えられた。【００４６】
各選抜法の上位配列のうち、高い結合能を示したものの割合は、従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸが３／１０、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸが４／１０、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ（改良版）が８／１０であった。１０個の各上位配列のカウント数（存在率）からアプタマー獲得確率（高い結合能を有する配列のカウント数の和／結合能を調べた配列のカウント数の和）を算出すると、従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸが２３％、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸが８３％、ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ（改良版）が９１％であった（図６）。ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸでは、従来のＣＥ−ＳＥＬＥＸよりも高確率でトロンビンアプタマーを取得可能であるということが明らかになった。【００４７】
トロンビンアプタマーの解離定数の算出
特異的なレスポンスカーブが得られた配列に関して、マルチカイネティクス解析あるいはシングルカイネティクス解析によって結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、解離定数ＫＤを算出した（図７  、表４）。Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．１０に関しては、解離が非常に遅いうえに高濃度のＮａＣｌでもトロンビンから解離しなかったため、シングルカイネティクス解析によって解離定数を算出した（図７Ｊ）。Ｔ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．１とＴ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．５は高い結合能を有している可能性が高いが、解離曲線の傾きがないために解離速度（ｋｄ）の算出が困難であり（図ＡとＥ）、ＳＰＲセンサーで解離定数（ＫＤ）の算出することは出来なかった。【００４８】
各選抜法の3ラウンド目における上位配列と結合速度定数、解離速度定数、解離定数
【表４】
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【００４９】
ＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ（改良版）では、アプタマー獲得確率（高い結合能を有する配列のカウント数の和／結合能を調べた配列のカウント数の和）が高くなると主に、解離速度定数が小さな（解離しにくい）核酸アプタマーが取れた。例えば、解離曲線の傾きが得られないほどの結合能を有していたＴ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．１とＴ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．５や、唯一シングルカイネティクス解析によって解離定数の算出が可能であったＴ＿ｂｅａｄｓ＿ｒｅ＿ａｐｔ．１０が得られた。分取ウインドウを意図的に広げた一回目のＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸと、分取ウインドウを狭めたＭＢ−ＣＥ−ＳＥＬＥＸ（改良版）における分取領域のたった１８秒ほどの差が、アプタマー獲得率や解離速度定数に寄与するということが明らかになった。分取ウインドウの最適化や磁性粒子由来のピークがよりシャープになるような工夫をすることで、本系がさらに改善される可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、核酸アプタマーをスクリーニングするために有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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