(57)【要約】【課題】食経験のある安全な酵母からβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチド（β-ＮＭＮ）を含有した酵母エキスを得ること、酵母由来のβ-ＮＭＮ組成物を得ることを課題とする。【解決手段】酵母から特定温度、ｐＨ、で酵母エキスを抽出することで、β-ＮＭＮを含有した酵母エキスを得られることを見出した。また、β-ＮＭＮ含有酵母エキス又は酵母抽出液からβ-ＮＭＮを精製することで、酵母由来のβ-ＮＭＮ含有組成物を得ることができる。【選択図】図５【特許請求の範囲】
【請求項１】
β‐ニコチンアミドモノヌクレオチド含有酵母エキス。
【請求項２】
β‐ニコチンアミドモノヌクレオチドを０．１％重量以上含有する酵母エキス。
【請求項３】
酵母由来のβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチドを含む組成物。
【請求項４】
培養した酵母菌体からｐＨ７．５〜１１．０、抽出温度５０〜７０℃で抽出するβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチド含有酵母エキスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャンディダ・ウチリスを用いて、培養、抽出工程より得られた食品規格のβ−Nicotinamide Mononucleotide （β-ＮＭＮ）含有酵母エキス、及びその製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
β‐ニコチンアミドモノヌクレオチド（β-ＮＭＮ）は生体内のサルベージ経路の中核物質であるNicotinamide Adenine Dinucleotide （ＮＡＤ）の中間代謝物である。β-ＮＭＮ投与によるＮＡＤ増加に伴う、Ｓｉｒｔ １に代表される「サーチュイン遺伝子 (長寿遺伝子) 」の活性化による抗老化 (アンチエイジング)を示す。近年、β-ＮＭＮが関わる機能として、「サーカディアンクロックへの関与 (非特許文献１）」、「脂質や糖代謝異常の改善  （非特許文献２）」、「老化によるミトコンドリア機能の改善  （非特許文献３）」、「虚血再灌流からの心臓の保護  （非特許文献４）」、「老化による神経幹細胞の減少抑制 (非特許文献５)」、「エピジェネティク抑制による糖尿病性アルブミン尿の抑制 (非特許文献６)」などが報告されている。このように、糖代謝、糖尿病や神経変性疾患、心疾患など老化現象に関わるさまざまな生体現象は、β-ＮＭＮがサーチュイン活性のトリガーになることで抑制することができ、最終的には生命の延命に繋がるとされている。【０００３】
また、酵母は、各種食品等に使用されており、トルラ酵母（Candida utilis）は、アメリカ食品医薬品局 （ＦＡＤ）より高い栄養機能性と食経験からの安全性が評価されている食用酵母である。このことより、長年にわたって医薬品やサプリメント、調味料をなどに有効活用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１４／１４６０４４
【特許文献２】中国特許公報第１０１６０１６７９ Ｂ
【特許文献３】米国特許公開第２０１１‐０１２３５１０ Ａ１
【特許文献４】米国特許第７７３７１５８号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ramsey, KM . et al. Circadian clock feedback cycle through NAMPT-mediated NAD+ biosynthesis . Science. 2009, 324(5927), P. 651-654.
【非特許文献２】J, Yoshino . et al. Nicotinamide Mononucleotide, a Key NAD+ Intermediate, Treats the Pathophysiology of Diet- and Age-Induced Diabetes in Mice . Cell Metab. 2011, 14(4), P. 528-536.
【非特許文献３】Ana, P. Gomes . et al. Declining NAD+ Induces a Pseudohypoxic State Disrupting Nuclear-Mitochondrial Communication during Aging . Cell. 2013, 155(7), P. 1624-1638.
【非特許文献４】T, Yamamoto . et al. Nicotinamide mononucleotide, an intermediate of NAD+ synthesis, protects the heart from ischemia and reperfusion . PLoS One. 2014, 9(6), e98972.
【非特許文献５】Liana, R Stein . et al. Specific ablation of Nampt in adult neural stem cells recapitulates their functional defects during aging . EMBO J. 2014, 33(12), P. 1321-1340
【非特許文献６】K, Hasegawa . et al. Renal tubular Sirt1 attenuates diabetic albuminuria by epigenetically suppressing Claudin-1 overexpression in podocytes . Nat Med. 2013, 19(11), P. 1496-1504
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在、β-ＮＭＮは食品規格ではなく、研究用途で合成品しか販売されていない。よって、食経験のある酵母からβ-ＮＭＮを含有した酵母エキスを得ること、酵母由来のβ-ＮＭＮ組成物を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、酵母から特定の方法で酵母エキスを抽出することで、β-ＮＭＮを含有した酵母エキスを得られることを見出し、本発明を完成させた。
具体的には、
（１）β‐ニコチンアミドモノヌクレオチド含有酵母エキス、
（２）β‐ニコチンアミドモノヌクレオチドを０．１重量％以上含有する酵母エキス、
（３）酵母由来のβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチドを含有する組成物、
（４）培養した酵母菌体からｐＨ７．５〜１１．０、抽出温度５０〜７０℃で抽出するβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチド含有酵母エキスの製造方法、
である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、β‐ニコチンアミドモノヌクレオチドを食経験のある酵母エキスから簡便に取得できる。特にトルラ酵母は古くから食経験のある酵母であり、これから取得した酵母エキスは安全性が高い。このような、β‐ニコチンアミドモノヌクレオチドを含有する酵母エキスは、医薬品、サプリメント、機能性食品等として摂取できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＨＰＬＣにおける、β‐ＮＭＮの検量線である。
【図２】実施例１の結果。抽出ｐHと酵母エキス中のβ−ＮＭＮ含量との関係を示すグラフである。
【図３】実施例２の結果。抽出温度と酵母エキス中のβ−ＮＭＮ含量との関係を示すグラフである。
【図４】実施例３の結果。抽出時間と酵母エキス中のβ−ＮＭＮ含量との関係を示すグラフである。
【図５】実施例５の結果。Candida utilis IAM 4264 から得られた酵母エキス中のβ−ＮＭＮ含量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明では、酵母として食用酵母が使用できる。例えばサッカロマイセス属に属する酵母、クリベロマイセス属酵母、キャンディダ属酵母、ピヒヤ属酵母などが挙げられ，中でもキャンディダ属酵母、キャンディダ・ウチリスが好ましい。より具体的には、Candida utilis ATCC 9950、Candida utilis ATCC 9550、Candida utilis IAM 4233、Candida utilis IAM 4264、Candida utilis AHU 3259などである。さらに好ましくは、グルタチオンを含有する酵母を使用すると、β‐ニコチンアミドモノヌクレオチドの含量が高まる。
【００１１】
酵母を培養する際の培地には、炭素源として、ブドウ糖、酢酸、エタノール、グリセロール、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液等が用いられ、窒素源としては、尿素、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸塩などが使用される。リン酸、カリウム、マグネシウム源も過リン酸石灰、リン酸アンモニウム、塩化カリウム、水酸化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の通常の工業用原料でよく、その他亜鉛、銅、マンガン、鉄イオン等の無機塩を添加する。その他は、ビタミン、アミノ酸、核酸関連物質等を使用しないでも培養可能であるが、これらを添加しても良い。コーンスチーブリカー、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、ペプトン等の有機物を添加しても良い。
【００１２】
培養温度やｐH等の培養条件は、特に制限なく適用でき、使用する酵母菌株に合わせて設定すれば良い。一般的には、培養温度は２１〜３７℃、好ましくは２５〜３４℃が良く、ｐＨは３．０〜８．０、特に３．５〜７．０が好ましい。
【００１３】
本発明の培養形式としては、バッチ培養、あるいは連続培養のいずれでも良いが、工業的には後者が望ましい。培養時の撹拌、通気等の条件は特に制限なく、一般的な方法でよい。
【００１４】
菌体培養後に本発明のエキス抽出を行う。菌体培養後の湿潤酵母菌体を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄した後に、酵母エキスの抽出を行う。
抽出法は、使用する酵母菌体の種類に応じて適宜調整すればよいが、β‐ＮＭＮの含量を高めるには、自己消化法、アルカリ抽出法、温水抽出法、又はこれらの組み合わせにより行う。
キャンディダ・ウチリスを用いた場合の方法は、菌体濃度が乾燥重量換算で、７〜１０％、好ましくは８〜９％になるように蒸留水に再懸濁する。この菌体懸濁液においてエキス抽出を行うのに際し、ｐＨ調整を行う。β−ＮＭＮを含有する酵母エキスを取得するには、抽出時のｐＨを７．５〜１１．０、好ましくは、８．０〜１０．０、さらに好ましくは９．０〜１０．０に調整する。ｐＨ調整法は、公知の方法でよい。
【００１５】
抽出温度は、５０〜７０℃、好ましくは、５５〜６５℃とする。温度の調整法は、抽出液が前記の温度になれば特に制限なく公知の方法が利用できる。
【００１６】
抽出時間は、５分以上行えばよい。抽出中は、撹拌することが望ましい。撹拌速度等は、適宜調整すればよく、特に制限はない。また、抽出時間を４０〜５０分とすると、β‐ＮＭＮの含量が高まるので、さらに好ましい。
【００１７】
酵母エキス抽出後、遠心分離で酵母残渣を分離することで、酵母抽出液を得ることが出来る。この酵母抽出液を濃縮後、凍結乾燥又は熱風乾燥することで、β‐ＮＭＮ含有酵母エキスを得ることができる。培養した酵母から前述の方法で酵母エキスを抽出することで、酵母エキスの固形分に対して０．０１重量％以上、０．１重量％以上、又は０．５重量％以上のβ‐ＮＭＮを含有する酵母エキスを得ることができる。なお、本願でβ‐ＮＭＮの含量の定量は、実施例中に記載したＨＰＬＣの測定条件による。
【００１８】
さらに、β‐ＮＭＮ含有酵母エキスから、β‐ＮＭＮを精製することで、酵母由来のβ‐ＮＭＮを含有する組成物を得ることができる。また、前段の酵母抽出液からβ‐ＮＭＮを精製することでも、酵母由来のβ‐ＮＭＮを含有する組成物を得ることができる。
精製法は、イオン交換樹脂等を用いた、一般的に採用できる精製法が利用できる。
【００１９】
本発明の酵母エキス又は酵母由来のβ‐ＮＭＮ含有組成物の摂取方法は、特に限定されず、経口投与、静脈内、腹膜内もしくは皮下投与等の非経口投与をあげることができる。具体的には、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、クリーム剤、坐剤等の非経口剤のいずれでもよい。
【００２０】
酵母エキスは、医薬品だけでなく、食品として摂取可能であり、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント等としても摂取できる。
【００２１】
また、本発明は、β‐ＮＭＮのサーチュイン活性を低下させない又はβ‐ＮＭＮのサーチュイン活性を増加させる他の組成物と併用することも可能である。例えば、賦形剤、希釈剤となるマルチトール、ソルビトール、澱粉などである。
【００２２】
本発明の摂取量は、β‐ＮＭＮの活性が発現される量を投与すればよい。一般的に、β‐ＮＭＮの活性に必要な投与量を決定するには、摂取者の状態、投与される組成物の選択、摂取者の年齢、体重、および応答、摂取者の状態などによって決定される。
【実施例】
【００２３】
以下に、本願発明を具体的に示すが、本願発明は、これに限定されるものではない。
（β‐ニコチンアミドモノヌクレオチドの測定法）
ＨＰＬＣにより測定
ポンプ： Chromaster 5110 (HITACHI)      
デガッサー：  なし      
オートサンプラー： Chromaster 5210 (HITACHI)    
UV-VIS 検出器： Chromaster 5420 (HITACHI)     
カラムオーブン： Chromaster 5310 (HITACHI)     
移動相： 75 mM リン酸二水素アンモニウム NH4H2PO4 (pH 2.3) (wako)。アスピレーターで60 分間の脱気処理を行った。     
カラム： Wakosil-II 5C18 RS (φ4.6 mm X W 30 mm) ⇒ Wakosil-II 5C18 RS (φ4.6 mm X W 150 mm) ⇒ Wakosil-II 5C18 RS (φ4.6 mm X W 250 mm)の順でカラムをタンデムに３連結した。     
カラムオーブン温度： 26℃      
流速： 1.0 mL/min (0.0 分) ⇒ 1.0 mL/min (7.0 分) ⇒ 0.2 mL/min (8.0 分) ⇒ 0.2 mL/min (20.0 分) ⇒ 1.5 mL/min (21.0 分) ⇒ 1.5 mL/min (55.0 分) ⇒ 1.0 mL/min (56.0 分) ⇒ 1.0 mL/min (60.0 分)
溶出法： アイソクラテック      
検出波長： abs 260 nm       
分析時間： 60 min      
サンプル注入量： 5 uL      
オートサンプラー温度： 2℃      
分析検体の調製法： 検体溶液を移動相
75 mM NH4H2PO4 (pH 2.3)で10倍希釈を行った。その後、希釈溶液は、シリンジに装着したDISMIC 13CP020AS 0.45 umフィルター (ADVANTEC)によって不溶性物質をろ過し、HPLCに供した。
標準β‐ニコチンアミドモノヌクレオチド（Sigma-Aldrich社から入手）
図１に示す検量線から、各実施例のβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチドの濃度を測定した。定量値は以下の式で求めた。
定量値 (ppm)=(LC intensity-504.87)/15684.59
【００２４】
＜実施例１＞
（酵母の培養）
キャンディダ・ウチリスＣｓ７５２９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１６５６株）を予めＹＰＤ培地（酵母エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）を含む三角フラスコで種母培養し、これを３０Ｌ容発酵槽に１８Ｌ培地に１〜２％植菌した。培地組成は、グルコース４％、燐酸一アンモニウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１６１％、塩化カリウム０．１３７％、硫酸マグネシウム０．０８％、硫酸銅１．６ｐｐｍ、硫酸鉄１４ｐｐｍ、硫酸マンガン１６ｐｐｍ、硫酸亜鉛１４ｐｐｍを用いた。培養条件は、ｐＨ４．０、培養温度３０℃、通気量１ｖｖｍ、撹拌６００ｒｐｍで行い、アンモニアを添加しｐＨのコントロールを行った。１６時間菌体培養した後、培養液を回収し、遠心分離により集菌し、１８０ｇの湿潤酵母菌体を得た。
得られた酵母菌体を蒸留水に懸濁して遠心分離を繰り返すことで洗浄した。乾燥固形分濃度８２．８８ｇ／Ｌとなるよう蒸留水に再懸濁した。この時ｐＨ ５．８であった。【００２５】
（酵母エキスの抽出）
（抽出ｐＨの検討）
上記菌体懸濁液に酢酸を終濃度０．５ ％ （ｖ／ｖ）になるように添加し、１０Ｎ  ＨＣｌまたは１０ Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１．０／ｐＨ２．０／ｐＨ３．０／ｐＨ４．０／ｐＨ５．０／ｐＨ６．０／ｐＨ７．０／ｐＨ８．０に調整を行った。 
ｐＨ調整した各菌体懸濁液２５ ｍＬを９５℃のウォーターバス下で90℃まで達温し、撹拌しながら、５分間熱水抽出した。 抽出処理後、サンプリングした菌体懸濁液２５ ｍＬを氷中下で冷却し、１００００ ｒｐｍで１０分、４℃下で遠心分離し、上清を取得した。沈殿物に２５ ｍＬの超純水を添加、懸濁、再び度遠心分離し、上清を取得した。最初の遠心分離で取得した上清と２回目に遠心分離して取得した上清をプールし、超純水で５０ ｍＬにメスアップしたものを抽出液とした。この抽出液について、前記の方法によりβ−ＮＭＮの濃度を測定した。また、乾燥固形分中のβ−ＮＭＮ含量を算出するため、１８０℃で６０分乾熱乾燥を行った。各ｐＨでの抽出における、酵母エキス中のβ‐ＮＭＮの濃度を、図２に示す。抽出のｐＨが１〜８では、アルカリ側になるほど、β‐ＮＭＮ含量の高い酵母エキスとなった。【００２６】
＜実施例２＞
（抽出温度検討）
実施例１と同様に酵母を培養し、酵母エキス抽出ｐＨ８．０、熱水抽出の温度を６０℃、７０℃、８０℃、９０℃とした他は、実施例１と同様に酵母エキスを製造した。各温度での抽出における、酵母エキス中のβ‐ＮＭＮの濃度を、図３に示す。抽出温度が６０〜９０℃では、６０℃、７０℃でβ‐ＮＭＮ含量の高い酵母エキスとなった。【００２７】
＜実施例３＞
（抽出ｐＨ、抽出時間の検討）
実施例１において、ｐＨ調整を１０ Ｎ ＮａＯＨでｐＨ８．０／ｐＨ９．０／ｐＨ１０．０とし、熱水抽出の温度を６０℃とし、抽出時間を、１０分／２０分／３０分／４０分／５０分／６０分とした他は、実施例１と同様にして、酵母エキスを製造した。各ｐＨ、各抽出時間における酵母エキス中のβ‐ＮＭＮの濃度を図４に示す。抽出温度６０℃においては、抽出ｐＨ９．０、抽出時間３０以上において、最もβ−ＮＭＮ含量の高い酵母エキスが得られた。【００２８】
＜実施例４＞
酵母菌株にキャンディダ・ウチリス３６Ｄ６１（受託番号  ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５４６）を用いた以外は、実施例１同様に培養し、ｐＨ９．０、抽出温度６０℃、抽出時間４０分でβ‐ＮＭＮ含有酵母エキスを得た。
ＨＰＬＣでβ‐ＮＭＮ濃度を測定すると、対固形分あたり、０．６５％含有していた。【００２９】
＜実施例５＞
Candida utilis IAM 4264を用いて、４ロットに分けて（サンプル１〜４）、実施例１と同様に培養し、ｐＨ９．０、抽出温度６０℃、抽出時間４０分、その他は実施例１同様にβ‐ＮＭＮ含有酵母エキスを得た。β‐ＮＭＮの含量は、図５のようになった。β-ＮＭＮ濃度は固形分あたり、０．５０％〜０．７８％であった。【００３０】
＜比較例＞
市販されている酵母エキス中のβ‐ＮＭＮの含量を測定した。
使用した酵母エキスは、アロマイルド（興人ライフサイエンス社製）、ハイパーミーストＧＴ（アサヒフードアンドヘルスケア社製）、バーテックスＩＧ２０（富士食品工業社製）、酵母エキスＢ２（オリエンタル酵母社製）であり、測定の結果、いずれの酵母エキスも、ＨＰＬＣでは、β‐ＮＭＮを検出できなかった。
このように、通常の酵母エキス抽出法では、β‐ＮＭＮを含有する酵母エキスを得ることはできない。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
食用として安全な酵母からβ‐ニコチンアミドモノヌクレオチドを得ることができ、医薬品だけでなく、機能性食品、栄養補助食品としても摂取可能であり、本発明品の摂取により、β‐ニコチンアミドモノヌクレオチドの有する機能性を得ることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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