(57)【要約】  アトピー性皮膚炎等の皮膚炎を治療又は予防できる新規な手段が開示されている。本発明による皮膚炎の治療又は予防剤は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子（アミノ酸系分子含有ナノ粒子）を有効成分として含有する。アミノ酸系分子含有ナノ粒子は、I型とIV型のアレルギー反応を抑制する作用を有するので、例えばI型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与する皮膚炎等のアレルギー症状の治療又は予防剤としても有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分として含有する、皮膚炎の治療又は予防剤。
【請求項２】
前記粒子は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、及びそれらのオリゴマーからなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１記載の治療又は予防剤。
【請求項３】
前記粒子は、少なくとも１種のアミノ酸を含む、請求項２記載の治療又は予防剤。
【請求項４】
前記アミノ酸誘導体が、クレアチン、オルニチン、サイロキシン、デスモシン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、ホスホセリン、テアニン、カイニン酸、トリコロミン酸、及びサルコシンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２記載の治療又は予防剤。
【請求項５】
前記アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、シスチン又はシステイン、グルタミン、アスパラギン、プロリン、メチオニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、カルニチン、γ−アミノレブリン酸、及びγ−アミノ吉草酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項６】
前記アミノ酸が、グリシン及びアスパラギン酸からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項５記載の治療又は予防剤。
【請求項７】
前記粒子は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種が共存する条件下において、シアノアクリレートモノマーをアニオン重合させることにより製造された粒子である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項８】
前記粒子は、糖及びポリソルベートからなる群より選択される少なくとも１種をさらに含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項９】
前記粒子は、少なくとも１種の糖をさらに含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項１０】
前記糖が、水酸基を有する単糖類、水酸基を有する二糖類及び水酸基を有する多糖類からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項８又は９記載の治療又は予防剤。
【請求項１１】
前記粒子は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種と、糖及びポリソルベートからなる群より選択される少なくとも１種とが共存する条件下において、シアノアクリレートモノマーをアニオン重合させることにより製造された粒子である、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項１２】
前記シアノアクリレートがｎ−ブチルシアノアクリレートである請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項１３】
前記皮膚炎がアトピー性皮膚炎である請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項１４】
前記皮膚炎が、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与する皮膚炎である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の治療又は予防剤。
【請求項１５】
アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分として含有する、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応の抑制剤。
【請求項１６】
アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分として含有する、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与するアレルギー症状の治療又は予防剤。
【請求項１７】
治療すべき皮膚病変部、又は皮膚炎の発生の予防が望まれる皮膚領域に、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子の有効量を投与することを含む、皮膚炎の治療又は予防方法。
【請求項１８】
それを必要とする対象に対し、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子の有効量を投与することを含む、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応の抑制方法。
【請求項１９】
それを必要とする対象に対し、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子の有効量を投与することを含む、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与するアレルギー症状の治療又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノサイズのシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分とする皮膚炎の治療又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
主としてヒトの医薬に応用すべく、薬物のデリバリーシステム（ＤＤＳ）や徐放化による薬物の効果向上を目的に、薬剤の微粒子化の研究が進んでおり、例えばシアノアクリレートポリマー粒子に薬剤を抱合させたＤＤＳが公知である（特許文献１、２及び非特許文献１）。本願発明者も、現在までに、粒径のばらつきが少ないシアノアクリレートポリマー粒子の製造方法、抗菌剤抱合粒子、及びプラスミド抱合粒子を開示している（特許文献３〜５）。従来のポリマー粒子合成法では、シアノアクリレートのアニオン重合反応の開始及び安定化の目的で、重合反応系内に糖類やポリソルベートを共存させる。これらの過去の研究は、薬物のDDSと徐放化が目的であった。【０００３】
その後、本願発明者は、シアノアクリレートポリマー粒子そのものにグラム陽性細菌に対する抗菌活性があることを見出した（特許文献６）。さらに、アミノ酸を抱合したシアノアクリレートポリマー粒子が抗がん活性を有するほか（特許文献７）、グラム染色性を問わず各種の細菌に対し抗菌力を発揮できることを見出した（特許文献８、９）。ナノサイズのポリマー粒子は、細菌表面（細胞壁）に特異的に接着し、細菌を溶菌に導く。シアノアクリレートナノ粒子は、抗生物質とは全く異なる作用機序で抗菌活性を発揮し、MRSA（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus）やVRE（Vancomycin resistant enterococcus）等の多剤耐性菌に対しても有効である。【０００４】
しかしながら、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎に対するシアノアクリレートポリマー粒子の効果は知られていない。【０００５】
アトピー性皮膚炎は、日本国内でも有病率が高い皮膚疾患である。近年増加傾向にあり、患者は多くの精神的・身体的苦痛を強いられる。【０００６】
アトピー性皮膚炎の薬物療法の基本は、重症度に合わせた強度のステロイド外用薬、カルシニューリン阻害外用薬、必要に応じて抗ヒスタミン・抗アレルギー内服薬が併用され、最重症の場合にはさらに必要に応じてステロイド内服薬、カルシニューリン阻害内服薬が用いられる（非特許文献２）。しかしながら、ステロイド剤の大量連用による副作用を恐れてステロイド剤を忌避する患者が多く、また免疫抑制による易感染性の問題もあるため、新たな治療手段が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表平１１−５０３１４８号公報
【特許文献２】特表２００２−５０４５２６号公報
【特許文献３】特開２００８−１２７５３８号公報
【特許文献４】国際公開第２００８／１２６８４６号公報
【特許文献５】特開２００８−２０８０７０号公報
【特許文献６】国際公開第２００９／０８４４９４号公報
【特許文献７】国際公開第２０１０／１０１１７８号公報
【特許文献８】国際公開第２０１２／１３３６４８号公報
【特許文献９】国際公開第２０１３／１０８８７１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Christine Vauthier et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 55, 519-548 (2003)
【非特許文献２】日本皮膚科学会ガイドライン「アトピー性皮膚炎診療ガイドライン」、日本皮膚科学会アトピー性皮膚炎診療ガイドライン作成委員会、日皮会誌: 119(8), 1515-1534, 2009(平21)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、アトピー性皮膚炎等の皮膚炎を治療又は予防できる新規な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは、皮膚炎モデルマウスを用いて鋭意研究した結果、抗菌活性が知られているナノサイズのシアノアクリレートポリマー粒子が皮膚炎に対しても有効であることを見出し、本願発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分として含有する、皮膚炎の治療又は予防剤を提供する。また、本発明は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分として含有する、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応の抑制剤を提供する。さらに、本発明は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子を有効成分として含有する、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与するアレルギー症状の治療又は予防剤を提供する。さらに、本発明は、治療すべき皮膚病変部、又は皮膚炎の発生の予防が望まれる皮膚領域に、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子の有効量を投与することを含む、皮膚炎の治療又は予防方法を提供する。さらに、本発明は、それを必要とする対象に対し、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子の有効量を投与することを含む、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応の抑制方法を提供する。さらに、本発明は、それを必要とする対象に対し、アミノ酸、アミノ酸誘導体、並びにそれらのオリゴマー及びポリマーからなる群より選択される少なくとも１種を含み、平均粒径が1000nm未満であるシアノアクリレートポリマー粒子の有効量を投与することを含む、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与するアレルギー症状の治療又は予防方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ステロイド系薬剤とは異なる新規な皮膚炎の治療又は予防手段が提供される。本発明の治療又は予防剤の有効成分であるシアノアクリレートナノ粒子は、薬剤のDDSとして用いられるのではなく、粒子それ自体が皮膚炎の治療及び予防効果を現す。ステロイド系薬剤に不安を抱く患者や、副作用のためステロイド系薬剤を使用できない患者、さらには易感染性を示す免疫能低下を認める患者に対しても、本発明の治療又は予防剤を好ましく使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】NC/NgaSlcマウスに対する処置スケジュールを示す（検討１）。
【図２】図１に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたNC/NgaSlcマウスの皮膚病変部の写真である。Aは、初回テープストリッピングから３週間後の病変部。Bは、ナノ粒子水又は滅菌水の噴霧処置開始から２日目の病変部。Cは、ナノ粒子水又は滅菌水の噴霧処置開始から８日目の病変部。Dは、DNFB塗布開始から３日目の病変部。
【図３】皮膚炎誘導部における皮膚表面の細菌数を測定した結果である。
【図４】図２に示した病変部の皮膚炎症状をスコア化したグラフである。
【図５】図１に示すスケジュールで、テープストリッピング誘発性皮膚炎を観察した後に、DNFBを塗布して８日目のNC/NgaSlcマウスの背部皮膚組織のHE染色像である。
【図６】図１に示したスケジュールで皮膚炎を誘発させたNC/NgaSlcマウスの血中IgE濃度を測定した結果である。実験開始時（採血１）及び終了時（採血２）の比較を示す。
【図７】皮膚炎予防モデルにおけるナノ粒子水の効果を検討した、BALB/cマウスに対する処置スケジュールを示す（検討２）。
【図８】図７に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの皮膚病変部の写真である。
【図９】図８に示した病変部の皮膚炎症状をスコア化したグラフである。
【図１０】図７に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの血中IgE濃度を測定した結果である（day0, day22, day24）。
【図１１】図７に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの背部皮膚組織のHE染色像である。DNFB塗布後３日目の背部皮膚を、塗布した頭側と塗布していない尾側で比較した。
【図１２】図７に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させた皮膚炎予防モデル群のBALB/cマウスの背部頭側（DNFB塗布あり）及び尾側（DNFB塗布なし）の皮膚における各種サイトカインの発現量を調べた結果である。
【図１３】皮膚炎治療モデルおよび予防モデルとして検討したBALB/cマウスに対する処置スケジュールを示す（検討３）。
【図１４】図１３に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの皮膚病変部の写真である。
【図１５】図１４に示した病変部の皮膚炎の程度をスコア化したグラフである。
【図１６】図１３に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの血中IgE濃度を測定した結果である（day0, day22, day24）。
【図１７】図１３に示すスケジュールで、予防モデルとして、ナノ粒子水あるいは水を噴霧後、皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの背部皮膚組織のHE染色像である。予防モデルへの皮膚炎を誘発するため、背部尾側にDNFBを塗布して３日目の組織である。比較のため、治療モデルとして、実験開始時にDNFBに塗布した背部頭側の皮膚も染色した。
【図１８】図１３に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの背部頭側（治療モデルとして実験開始時にのみDNFBを塗布し、以後ナノ粒子水あるいは水を噴霧したもの）及び尾側（予防モデルとして、ナノ粒子水あるいは水を噴霧し、実験終了前にDNFBを塗布し、３日目）における各種サイトカインの発現量を調べた結果である。
【図１９】テープストリッピング誘発性皮膚炎モデルとしたBALB/cマウスに対する処置スケジュールを示す（検討４）。
【図２０】図１９に示すスケジュールに従い、テープストリッピングを繰り返して皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの皮膚炎の程度をスコア化したグラフである。
【図２１】図１９に示すスケジュールに従い、繰り返しテープストリッピングにより皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの皮膚炎誘導部における水分蒸散量を測定した結果である。
【図２２】図１９に示すスケジュールに従い、繰り返しテープストリッピングにより皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの背部皮膚組織のHE染色像である（day14）。ナノ粒子水あるいは水噴霧群それぞれから、無作為に選んだ2匹の組織を示す。
【図２３】図１９に示すスケジュールで繰り返しテープストリッピングにより皮膚炎を誘発させたBALB/cマウスの背部皮膚における各種サイトカインの発現量を調べた結果である。同じ処置をした頭側および尾側の皮膚について、それぞれ測定した。
【図２４】繰り返しDNFB塗布によるハプテン誘発性慢性皮膚炎モデルとして検討した、ヘアレスマウスに対する処置スケジュールを示す（検討５）。
【図２５】図２４に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、皮膚炎症状をスコア化し、スコアの変化を調べた結果である。
【図２６】図２４に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウスの皮膚病変部の写真である（day33）。
【図２７】図２４に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、耳介の厚さの変化を調べた結果である。
【図２８】図２４に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、頭側背部皮膚の水分蒸散量の変化を調べた結果である。
【図２９】図２４に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、頭側背部皮膚の保水度の変化を調べた結果である。
【図３０】図２４に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウスの、day33における代表的な炎症状態及び炎症誘発部位のHE染色像である。A〜DがそれぞれA群〜D群を示す。中央のA-1〜D-1が右耳介皮膚組織、右のA-2〜D-2が頭側背部皮膚組織である。組織像中のバーは100μmを示す。
【図３１】図２４に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウスの、炎症誘発部位における各種サイトカインの、HPRTに対する相対的発現量である（day34）。
【図３２】図２４に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、血清中の抗DNP IgG抗体をELISAにより測定した結果である（day34）。
【図３３】図２４に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、背部頭側の皮膚表在細菌数の変化を調べた結果である。
【図３４】図２４に示すスケジュールで皮膚炎を誘発させたヘアレスマウス各群の個体について、還元血清中の抗S.aureus抗体（主としてIgG）の凝集価を調べた結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明で用いる粒子は、シアノアクリレートモノマーをアニオン重合して得られるナノサイズ（平均粒径1000 nm未満）のポリマー粒子であり、アミノ酸、アミノ酸誘導体、それらのオリゴマー及びポリマー（以下、これらを総称して「アミノ酸系分子」ということがある）から選択される少なくとも１種を含む。さらに、糖及びポリソルベートからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよい。
【００１５】
アミノ酸系分子、糖及びポリソルベートは、シアノアクリレートモノマーのアニオン重合の重合開始・安定剤として使用できることが知られている。例えば、糖及び／又はポリソルベートを重合開始・安定剤として用いるナノ粒子製造法は、特許文献３、特許文献４（抗菌剤抱合粒子）、特許文献５（プラスミド抱合粒子）等に記載され公知である。アミノ酸系分子を重合開始・安定剤として用いるナノ粒子製造法は、特許文献８、９（アミノ酸系分子の単独使用）等に記載され公知である。また、特許文献７には、アミノ酸と糖類・ポリソルベートを併用する製造法が記載されている。これらの重合開始・安定剤は、いずれか１種のみを使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００１６】
本発明において、「アミノ酸」とは、分子内にアミノ基とカルボキシ基とを持つ化合物をいい、一般的なアミノ酸の定義の通り、アミノ基の水素が分子内の他の部分と置換して二級アミンとなった環状化合物であるイミノ酸も包含する。本発明で使用できるアミノ酸の代表的な例としては、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、シスチン又はシステイン、グルタミン、アスパラギン、プロリン、メチオニン）が挙げられるが、これらに限定されず、β−、γ−及びδ−アミノ酸系分子も包含される。具体例を挙げると、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、シスチン又はシステイン、グルタミン、アスパラギン、プロリン、メチオニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ；神経伝達物質）、カルニチン、γ−アミノレブリン酸、γ−アミノ吉草酸などが挙げられる。好ましいアミノ酸の例として、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、シスチン又はシステイン、グルタミン、アスパラギン、プロリン、及びメチオニンから選択される少なくとも１種、中でも特に、グリシン及びアスパラギン酸からなる群より選択される少なくとも１種を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１７】
「アミノ酸誘導体」とは、上記定義によるアミノ酸においていずれかの基が修飾又は置換された構造を有する化合物をいう。生物体成分として天然に存在するアミノ酸誘導体は、通常、本発明で好ましく使用することができる。使用可能なアミノ酸誘導体の具体例を挙げると、クレアチン（アルギニン誘導体で1-メチルグアニジノ酢酸）、オルニチン（アルギニン誘導体で尿素サイクル産物）、サイロキシン（芳香族アミノ酸類であるトリヨウドサイロニン；Ｔ４）、デスモシン（角質エラスチンやコラーゲンの構成成分；3分子のアリシンの側鎖と1分子のリシンの側鎖が結合した構造）、ヒドロキシプロリン及びヒドロキシリジン（ゼラチンやコラーゲン構成成分）、ホスホセリン（セリンとリン酸のエステル；カゼイン構成成分）、テアニン（茶成分、グルタミン酸誘導体）、カイニン酸（海人草の虫下し成分）、トリコロミン酸（シメジの成分）やサルコシン（卵黄・ハム・豆類成分；Nメチルグリシン）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
アミノ酸の「オリゴマー」とは、１０個以下のアミノ酸残基がペプチド結合により結合したオリゴペプチドをいい、アミノ酸の「ポリマー」とは、１１個以上のアミノ酸残基がペプチド結合により結合したポリペプチドをいう。いずれも、アミノ酸だけではなくアミノ酸誘導体を残基として含んでいてよい。ポリペプチドの残基数の上限は特に限定されないが、例えば５００残基以下であり得る。ポリペプチドとしては、１１〜１００残基、１１〜５０残基、１１〜３０残基、１１〜２０残基、あるいは１１〜１５残基のものが好ましく用いられ得る。
【００１９】
オリゴペプチドはポリペプチドよりも好ましく用いられ得る。中でも、２〜７残基、２〜５残基、あるいは２又は３残基のオリゴペプチドがより好ましく用いられ得る。
【００２０】
上記した特許文献８〜９に記載されている通り、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸のいずれでも、糖類やポリソルベートを使用しない条件でナノサイズ（1000nm未満）のシアノアクリレートポリマー粒子を合成できる。中性・酸性・塩基性アミノ酸のいずれでも、そして直鎖・芳香族・イミノ・含硫黄構造のいずれでも、糖類もポリソルベートも使用せずにナノ粒子を製造できることが示されている。従って、２０種のα−アミノ酸のみならず、上記したその他のアミノ酸及びアミノ酸誘導体もナノ粒子合成に使用することができるし、また、オリゴペプチドやポリペプチドも分子内にアミノ酸構造を有するので、やはりナノ粒子合成に使用することができる。
【００２１】
「糖」には、水酸基を有する単糖類（例えばグルコース、マンノース、リボース及びフルクトース等）、水酸基を有する二糖類（例えばマルトース、トレハロース、ラクトース及びスクロース等）及び水酸基を有する多糖類（例えばデキストランやマンナン等）が包含される。これらの糖は、環状、鎖状のいずれの形態であってもよく、また、環状の場合、ピラノース型やフラノース型等のいずれであってもよい。また、糖には種々の異性体が存在するがそれらのいずれでもよい。
【００２２】
「ポリソルベート」には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名 Tween 20）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（商品名 Tween 80）等の各種のTween系界面活性剤が包含される。
【００２３】
単糖類、二糖類及び多糖類並びにポリソルベートは、単独で用いることもできるし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。上記した糖及びポリソルベートのうち、グルコース、デキストラン、Tween 20（商品名）が安価に入手できコスト面で有利である。デキストランとしては、平均分子量５万程度以上の重合度であるデキストランが好ましい。デキストランの分子量の上限は特にないが、通常、分子量50万程度以下である。
【００２４】
本発明で用いるナノ粒子としては、重合開始・安定剤としてアミノ酸系分子を使用し、糖及びポリソルベートのいずれも使用せずに合成した粒子（すなわち、アミノ酸系分子を含み、糖及びポリソルベートのいずれも含まない粒子）、並びに、重合開始・安定剤としてアミノ酸系分子及び糖を併用し、ポリソルベートを使用せずに合成した粒子（すなわち、アミノ酸系分子及び糖を含み、ポリソルベートを含まず、SDS等のその他の界面活性剤も含まない粒子）が好ましい。
【００２５】
シアノアクリレートモノマーとしては、アルキルシアノアクリレートモノマーが好ましい。アルキル基の炭素数は好ましくは１〜８、より好ましくは２〜６、さらに好ましくは３〜５であり、直鎖でも分岐でもよい。またアルキル基を構成する炭素原子の少なくとも１つがハロゲン原子（塩素、臭素、ヨウ素）で置き換わっていてもよい。好ましいシアノアクリレートモノマーの具体例としては、メチル−２−シアノアクリレート、エチル−２−シアノアクリレート、ｎ−プロピル−２−シアノアクリレート、ｉ−プロピル−２−シアノアクリレート、ｎ−ブチル−２−シアノアクリレート、i-ブチル-2-シアノアクリレート、n-ペンチル-2-シアノアクリレート、ｎ−ヘキシル-2-シアノアクリレート、ｎ−ヘプチル-2-シアノアクリレート、n-オクチル-2-シアノアクリレート等を挙げることができる。これらの中でも特に、外科領域において傷口の縫合のための接着剤として従来用いられている、下記式で表されるn-ブチル-2-シアノアクリレート(nBCA)を好ましく用いることができる。
【００２６】
【化１】
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【００２７】
ナノ粒子の製造工程では、適当な溶媒中に少なくとも１種の重合開始・安定剤を溶解させた後、撹拌下にて少なくとも１種のシアノアクリレートモノマーを加え、適宜撹拌を続けて重合反応を進行させればよい。本発明で用いるナノ粒子の製造においては、少なくとも１種のアミノ酸系分子を重合開始・安定剤として使用する。さらに糖及びポリソルベートからなる群より選択される少なくとも１種の重合開始・安定剤を組み合わせて用いてもよい。シアノアクリレートモノマーは、１種類のみ用いてもよいし、２種類以上を用いてもよい。
【００２８】
重合開始・安定剤として糖及び／又はポリソルベートを使用する場合、反応開始時の重合反応液中の糖及び／又はポリソルベートの濃度（複数種類用いる場合はその合計濃度）は、特に限定されないが、通常、0.5％〜10％程度、好ましくは0.75％〜7.5％程度である。なお、糖の濃度はw/v％、ポリソルベートの濃度はv/v％を意味し、例えば糖を単独で用いる場合には、上記した濃度範囲はそれぞれ「0.5w/v％〜10w/v％」、「0.75w/v％〜7.5w/v％」を意味する。また、糖を5w/v％、ポリソルベートを1v/v％で併せて用いる場合には、これらの合計濃度を6％というものとする。ただし、単糖類（例えばグルコース）のみを用いる場合には、2.5w/v％〜10w/v％程度で用いることが好ましい。
【００２９】
重合開始・安定剤としてアミノ酸系分子を使用する場合、反応開始時の重合反応液中のアミノ酸系分子の濃度（複数種類用いる場合はその合計濃度）は、特に限定されないが、通常0.1w/v％〜3w/v％程度である。糖及び／又はポリソルベートと併用する場合、アミノ酸系分子の使用濃度はこれより低い濃度であっても差し支えない。
【００３０】
重合反応の溶媒としては、水を主体とする水性溶媒（例えば水、低級アルコール水溶液など）を使用することができ、アミノ酸系分子含有粒子の製造の場合は、通常、水が好ましく用いられる。アニオン重合は水酸イオンにより開始されるので、反応液のpHは重合速度に影響する。反応液のpHが高い場合には、水酸イオンの濃度が高くなるので重合が速く、pHが低い場合には重合が遅くなる。アミノ酸系分子含有粒子を製造する場合には、通常、pHが1.5〜3.0程度の酸性下で適度な重合速度が得られる。反応液を酸性にするために添加する酸は特に限定されず、無機酸及び有機酸のいずれでも使用することができる。例えば、塩酸は、反応に悪影響を与えず、反応後に揮散することから、アミノ酸系分子含有粒子の製造において好ましく用いることができるが、使用可能な酸はこれに限定されない。塩酸等の酸の濃度は、特に限定されないが、0.0005N〜0.5N程度の範囲で適宜選択可能である。
【００３１】
アミノ酸を重合開始剤としてシアノクリレートモノマーを重合し、ナノサイズのポリマー粒子を合成する方法として、ミニエマルジョン法と呼ばれる手法が知られているが（Weiss, C.K. et al., Preparatio, Macromolecules, 2007, Vol. 40, p. 928-938; WO 2008/003706 A1）、この手法では、ヘキサデカン等の親油性溶媒を含むO相と塩酸等を含むW相の２相で構成されるミニエマルジョン中でアニオン重合が行われ、SDS等の界面活性剤の使用も必須である。本願発明者が開発した上記の方法によれば、O相を含まない単相の水性溶媒中での重合反応によりナノポリマー粒子を合成できるので、溶媒として有機溶媒や界面活性剤を使用する必要が無い。また、本願発明者の方法では、重合開始・安定剤としてポリソルベート以外のものを使用してナノポリマー粒子を製造することもできるので、Tween系の界面活性剤を含め、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、及び非イオン界面活性剤のいずれの界面活性剤も含有しないナノ粒子を調製することができる。もっとも、ミニエマルジョン法により合成されたナノポリマー粒子の皮膚炎に対する効果は不明である。
【００３２】
反応開始時の重合反応液中のシアノアクリレートモノマーの濃度は、特に限定されないが、通常、0.5v/v％〜2.0v/v％程度、好ましくは0.8v/v％〜1.2v/v％程度である。
【００３３】
反応温度は、特に限定されないが、室温で行なうことが簡便で好ましい。反応時間は、反応液のpH、溶媒の種類等に応じて反応速度が異なるため、これらの要素に応じて適宜選択される。特に限定されないが、通常、反応時間は１０分〜５時間程度、好ましくは３０分〜４時間程度である。得られたアミノ酸系分子含有粒子は、通常、中性の粒子として用いられるので、反応終了後、水酸化ナトリウム水溶液等の塩基を反応液に添加して中和することが好ましい。反応終了後の反応液をフィルター濾過し、適宜滅菌水で洗浄して粒子を回収すればよい。
【００３４】
上記の方法によれば、平均粒径が1000nm未満であるナノサイズのシアノアクリレートポリマー粒子を容易に製造することができる。粒子サイズの下限は特に限定されないが、上記の重合反応で製造される粒子の粒径は通常7nm程度以上となる。好ましくは、粒子の平均粒径は20nm〜600nm、より好ましくは50nm〜550nmである。粒子のサイズは、反応液中のシアノアクリレートモノマーの濃度やpH、反応時間を調節することによって調節することができる。また、重合開始・安定剤として糖及びポリソルベートから選択される少なくとも１種を用いる場合には、該重合開始・安定剤の濃度や種類を変えることによっても、粒子サイズを調節することができる（特許文献３、４等参照）。一般に、反応液のpHを高めた場合、反応時間を長くした場合、及び反応液の糖濃度を低くした場合には粒子サイズが大きくなり、重合開始・安定剤としてポリソルベートを用いた場合には粒子サイズが小さくなる。これらの反応条件を適宜組み合わせることで、所望のサイズの粒子を製造することができる。
【００３５】
ナノ粒子の電荷（ゼータ電位）は、特に限定されないが、通常-50mV〜0mV程度である。ゼータ電位とは、粒子表面の電荷を示すもので、粒子の分散性の指標となる。粒子サイズとゼータ電位は、例えばHe・Neレーザーを用いた市販の装置（例えばMalvern Inst.UK社製のゼータサイザー等）を用いて容易に測定することができる。
【００３６】
アミノ酸系分子を重合開始・安定剤として用いて製造されたナノ粒子では、アミノ酸系分子が単に粒子に付着して含有されるのみならず、アミノ酸構造中の-COO基がシアノアクリレートのエチレン末端の炭素に結合し、共有結合により粒子に含有されていると考えられる。なお、上記方法で得られる粒子のアミノ酸系分子の含有率は、通常約２０％〜約６５％程度である。アミノ酸系分子の含有率は、重合後にフィルター洗浄したときのフィルター通過液の吸光度を適当な波長で測定し、フィルター通過液中のアミノ酸系分子の量（すなわち粒子に結合しなかったアミノ酸系分子の量）を吸光度法により求めた後、下記の式によって算出することができる。
アミノ酸系分子含有量＝(アミノ酸系分子添加量)−(フィルター通過液中のアミノ酸系分子の量)
アミノ酸系分子含有率（％）＝アミノ酸系分子含有量÷アミノ酸系分子添加量×100
【００３７】
本発明で用いるアミノ酸系分子含有ナノ粒子は、細菌類に対する抗菌活性成分を含まない。アミノ酸を含有するシアノアクリレートポリマーナノ粒子がグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌の両者に対して抗菌活性を発揮できることは、特許文献８、９に記載される通り公知であり、細菌表面（細胞壁）への特異的接着性により細菌を溶菌に導くことで抗菌作用を発揮する。ナノ粒子が有する細胞障害活性は、正常な哺乳動物細胞に対しては発揮されず、ナノ粒子にはin vivo毒性もないことが確認されている。また、本発明で用いるアミノ酸系分子含有ナノ粒子は、真菌に対する抗菌活性成分も含まない。
【００３８】
ここでいう「抗菌活性成分」とは、細菌又は真菌の代謝経路ないしは生理機能に生化学的に作用して該細菌の発育を阻止することができる化学物質成分をいい、具体的には、細菌又は真菌の抗菌に利用可能な抗生物質その他の化学物質成分を言う。「抗菌活性成分を含まない」とは、抗菌活性成分を全く含まないか、含んでいたとしてもごく微量であって、その抗菌活性成分に対し感受性である細菌又は真菌を抗菌することができない程度の微量にしか該抗菌活性成分を含んでいないことをいう。本発明で用いるナノ粒子は、細菌類及び真菌類に対する抗菌活性成分を「実質的に含まない」ということもできる。「抗菌することができない程度の微量」とは、粒子単位体積当たりに含まれる粒子中の抗菌活性成分量を粒子中の含有濃度と定義し、この含有濃度と同濃度の抗菌活性成分を粒子に含有させず単独で感受性細菌又は真菌に作用させた場合に、該感受性細菌又は真菌の発育を阻止できない量のことを意味する。本発明で用いるナノ粒子は、抗生物質等の抗菌活性成分を全く含まない粒子であり得る。
【００３９】
また、アミノ酸系分子含有ナノ粒子は、従来用いられている皮膚炎の治療薬のような、皮膚炎に対する治療又は予防活性を有する化学物質成分を含まない。ここでいう「含まない」も上記と同様であり、そのような化学物質成分を全く含まないか、含んでいたとしてもごく微量であって、皮膚病変部の治療及び予防効果を発揮することができない程度の微量にしか該化学物質成分を含んでいないことを意味する。本発明で用いるナノ粒子は、皮膚炎治療薬のDDSではなく、ナノ粒子それ自体が皮膚バリア機能の向上と表在細菌数制御の関与する免疫応答とを介して皮膚炎症反応を制御し、皮膚炎の治療及び予防効果を奏する。
【００４０】
本発明において対象となる皮膚炎は、特に限定されないが、第一には掻痒を伴う皮膚炎（掻痒性皮膚炎）であり得る。掻痒性皮膚炎の具体例としては、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、感染性皮膚炎、乾癬や自己免疫機序による皮膚炎、薬疹等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４１】
また、対象となる皮膚炎は、第二には皮膚傷害に関連した皮膚炎であり得る。そのような皮膚炎の具体例としては、放射線性皮膚炎、熱傷、じょく瘡等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４２】
下記実施例において確認されている通り、アミノ酸系分子含有ナノ粒子はI型とIV型のアレルギー反応を抑制する作用を有する。従って、アミノ酸系分子含有ナノ粒子を有効成分とする本発明の剤は、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応の抑制剤として、例えばI型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与する皮膚炎等のアレルギー症状の治療又は予防剤として有用である。上記した掻痒性皮膚炎は、I型アレルギー反応又はIV型アレルギー反応が関与し得ることが知られている。
【００４３】
上述した通り、本発明で用いるナノサイズのシアノアクリレートポリマー粒子には細菌に対する抗菌活性があることが知られている（特許文献８、９）。感染性皮膚炎等の感染を主因とする皮膚炎に対しては、粒子の抗菌活性が感染した細菌に対しても効果を発揮すると期待されるため、感染を主因とする皮膚炎に対しても本発明の剤を使用することができるが、本発明で対象とする皮膚炎は、細菌感染を主因とする皮膚炎以外の皮膚炎であり得る。
【００４４】
本発明の剤は、治療すべき皮膚病変部、又は皮膚炎の発生の予防が望まれる皮膚領域に局部投与して用いられる。局部投与方法としては、注射剤・点滴剤等による皮内投与、軟膏剤・クリーム剤・貼付剤等による局所適用等が挙げられる。投与量は、症状、年齢、体重、投与方法等に応じて適宜選択され、特に限定されないが、通常、対象動物に対し有効成分であるアミノ酸系分子含有粒子の量として１日0.01μg〜10000mg程度、例えば1μg〜100mg程度であり、１回ないし数回に分けて投与される。症状の改善の程度に応じ、数日ないし数ヶ月間にわたり、毎日１回若しくは数回、ないしは数日おきに１日若しくは数回、定期的に投与してもよいし、あるいは、症状が発生した時に投与してもよい。
【００４５】
本発明の剤の投与対象は哺乳動物であり、例えばヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター等が挙げられる。
【００４６】
本発明の剤は、単独で用いてもよいし、他の掻痒性皮膚疾患の治療又は予防剤等と併せて用いることもできる。掻痒性皮膚疾患に従来用いられている標準的治療薬はステロイド剤、カルシニューリン阻害薬や抗ヒスタミン薬であるが、本発明の剤はこれらの標準的治療薬とは作用機序が異なると考えられるので、本発明の剤とステロイド剤等とを組み合わせて用いることも可能である。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００４８】
１．アミノ酸含有ナノ粒子の製造
国際公開第２０１２／１３３６４８号公報および国際公開第２０１３／１０８８７１号公報に記載されている方法に準じて、アミノ酸及びデキストランを含有するナノサイズのポリマー粒子を製造した。具体的な手順は以下の通りである。【００４９】
10 mLの0.01N HClに、100mgのデキストラン60K及び100mgのアミノ酸を溶解し、その液性pHを要時1N塩酸を用いてpH=3に調整した。アミノ酸としては、グリシン及びアスパラギン酸を使用した。【００５０】
デキストラン及びアミノ酸を溶解させた上記の溶液を撹拌下、100μLのnBCAを加え、3時間撹拌し重合反応を実施した。1N NaOHを滴下して反応溶液を中和後(pH7.8)、さらに30分撹拌することで、アミノ酸及びデキストランを含有するナノサイズのポリマー粒子を得た。得られた粒子は、ミリポア社限外濾過器及びポール社製ワクチン製造向け透析限外濃縮装置にて2段階の限外濾過処理に付し、粒子精製品（粒子濃度2mg/mlのコロイド水溶液）を得た。【００５１】
市販のゼータサイザー（Malvern Inst.UK社製）を用いてナノ粒子の平均粒径及びゼータ電位を測定した。また、フィルター洗浄時のフィルター通過液中のアミノ酸分子の量を吸光度法により求め、粒子のアミノ酸含有率を算出した。結果を表１に示す。【００５２】
【表１】
2016121829.tif 000004
【００５３】
２．マウス皮膚炎モデルにおけるナノ粒子の治療及び予防効果の検討１
上記で製造したアスパラギン酸含有ナノ粒子を用いて実験を行なった。ナノ粒子は、滅菌水に懸濁してナノ粒子水（0.3％（w/v）に希釈、粒子濃度6μg/ml）を調製し、実験に用いた。以下に用いたマウスはすべて、高知大学動物実験委員会で承認された実験計画に沿って実施し、SPFの環境下で飼育、実験を行った。【００５４】
[方法]
NC/NgaSlcマウス（日本SLC、静岡）は、背部の剃毛および除毛後、テープストリッピングにより皮膚炎を自然発症することが知られており、アトピー性皮膚炎のモデルとして使われている（Matsuda, M., et.al. Int. Immunol. 9:461, 1997）。本実験では、5週齢のNC/NgaSlcマウス雄5匹を使用し、図１に示すスケジュールで処置を行なった。NC/NgaSlcマウスの背部をシェーバーで剃毛した後、除毛クリーム（Epilat、クラシエホームプロダクツ株式会社、東京）にて除毛した。除毛クリームをふき取り、翌日に粘着テープによりテープストリッピング（Scotchメンディングテープ、cat.no.810-3-24、スリーエムジャパン株式会社、東京）を8回行い、皮膚炎を誘発した。途中毛が生えたら同様の操作を繰り返し行った。３週間後、いずれのマウスにおいても背部の広範囲にわたり皮膚炎の発症が確認された（図2A）。【００５５】
皮膚炎を発症したマウス５匹のうち、３匹をナノ粒子水噴霧群、２匹を水噴霧群とした。病変部を含む背部皮膚に、２日毎にナノ粒子水又は滅菌水を噴霧した。マウス１匹の背中8〜10cm2に対して総液量0.3〜0.4mL（ナノ粒子の量として1.8〜2.4μg）を噴霧した。２日目、６日目および８日目に背部中央部の細菌数を測定した。具体的には、マウスの背部中央部に生菌数測定用標準寒天培地（ぺたんチェック、栄研化学）を5秒間押し当てた後、37℃フラン器で24時間培養し、6cm2の区画あたりのコロニー数をカウントした。寒天培地に触れた皮膚を水で湿らせたティシューペーパーで拭いた後、ナノ粒子水又は蒸留水を噴霧して１時間放置し、乾かした。皮膚病変については、２日目（図2B）及び８日目（図2C）に写真撮影を行なった。【００５６】
図１の３０日目より２週間放置後、さらにハプテン誘発性IV型アレルギー反応を惹起させる目的で、全てのマウスについて再度背部の剃毛と除毛を行なった。翌日（1日目）と２日目に、マウスの背部頭側に0.5%ジニトロフルオロベンゼン（1-fluoro-2,4-dinitrobenzene、DNFB）（ナカライテスク株式会社、京都）を溶かしたオリーブ油−アセトン溶液（油：アセトン＝１：４）を20μL塗布した。ナノ粒子水噴霧および水噴霧は、除毛をした４４日目より毎日行った。DNFB塗布した場合はDNFBが乾燥した後に行った。DNFB塗布後２日目に写真撮影を行なった（図2D）。DNFB塗布後６日目に血清サンプルを採取後、安楽死させ、DNFBを塗布した頭側背部の皮膚とDNFBを塗布していない尾基部付近の皮膚を採取し、ヘマトキシリン−エオジン（HE）染色を行った（図5A-5D）。【００５７】
また、下記表2に示した基準で図2に示したA〜Dのマウスの皮膚炎の程度をスコア化した。スコア化はFanらの報告した文献（Fan et al., Exp Biol Med, 226, 1045-1050, 2001）に基づき、３つの皮膚病変について、程度を0〜3のスコアで評価した。【００５８】
【表２】
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【００５９】
[結果]
皮膚炎発症マウスの背部中央部の細菌数をカウントした結果を表３及び図３に示す。ナノ粒子水噴霧群では表在細菌数がおよそ半分程度に減少した。【００６０】
寒天培地のコロニー数は、ナノ粒子水噴霧群は5個、7個、8個であったのに対して蒸留水噴霧群は48個、85個であった。ナノ粒子水の抗菌能力は噴霧後の早い時間から発揮されることが確認された。【００６１】
【表３】
2016121829.tif 000006
【００６２】
NC/NgaSlcマウスにテープストリッピングで惹起した皮膚炎の治癒の速度や程度には両群の間で大きな差は見られなかったが（図2A〜2C、図4）、繰り返し除毛とテープストリッピングを行い、0.5%DNFB溶液を20μL塗布して惹起したハプテン誘導性皮膚炎においては、水噴霧群における皮膚炎の程度はナノ粒子水噴霧群皮膚炎よりも重症であった（図2D、図4）。【００６３】
HE染色皮膚切片を観察すると（図5）、ナノ粒子水噴霧群および水噴霧群いずれにおいても、DNFB塗布部位(図５A, C)では非塗布部位(図５B, D)に比べて、表皮肥厚と真皮内細胞浸潤、線維化が認められた。しかし、水噴霧群の方がナノ粒子水噴霧群よりもDNFB塗布による表皮肥厚、真皮の病変の程度が著明であった（図5Aと5C）。さらに、水噴霧群でみられたDNFB非塗布部位の軽度の表皮肥厚は、ナノ粒子水噴霧群では完全に抑制されていた（図5Bと5D）。【００６４】
また、I型アレルギー反応にナノ粒子が及ぼす影響を調べる目的で、DNFB塗布開始前（図１、４４日目）及びDNFB初回塗布から８日目（５２日目の実験終了時）のマウス血中のIgE濃度を固相化抗体（rat anti-mouse IgE, Southern Biotech, AL, USA）と酵素標識抗体（HRP-conjugated goat anti-mouse IgE antibody, BETHYL, TX, USA）で構成されたサンドイッチELISA法にて測定した。その結果、水噴霧群では、実験開始時のIgE量と比較して、実験終了時には5倍近くIgE量の上昇を示したのに対し、ナノ粒子水噴霧群ではIgE量の上昇は2-3倍程度にとどまっていた（表４、図６）。ナノ粒子水噴霧はIV型アレルギー反応にのみならずI型アレルギー反応の制御にも有効であることが確認された。【００６５】
【表４】
2016121829.tif 000007
【００６６】
[結論]
ナノ粒子水の有する殺菌作用は、テープストリッピングにより誘導したNC/NgaSlcマウスの皮膚炎に対する治療促進効果とDNFB塗布による皮膚炎誘導に対する予防効果を有することが示された。その効果は、殺菌作用によるバリア機能回復の促進と炎症反応の制御に基づくことが示唆された。【００６７】
３．マウス皮膚炎モデルにおけるナノ粒子の治療及び予防効果の検討２
ナノ粒子の効果をさらに検証するため、MHC遺伝子型が知られているBALB/cマウスを用いて実験を行なった。まずは、ナノ粒子水による皮膚炎の予防効果をみる実験を行った。図７に示すスケジュールでテープストリッピングにより炎症を誘導し、一定期間後DNFB塗布により皮膚炎を再誘導した。この皮膚炎に対するナノ粒子水の治療効果について、皮膚炎症状態の経過観察、血中IgE濃度測定、およびHE組織染色標本観察を行い評価した。【００６８】
[方法]
BALB/cマウス（雌、8週齢）６匹の尾から採血した後、背部をシェーバーとクリームにより剃毛および除毛した。水でクリームをふき取り皮膚を乾燥した後、スコッチテープで８回ストリッピングし写真撮影をした（図８、day0）。【００６９】
６匹のマウスはナノ粒子水噴霧群（3匹）と水噴霧群（3匹）の2群に分けて実験を行った。１日目に噴霧処理（ナノ粒子水噴霧は、マウス１匹の背中8〜10cm2に対して総液量0.3〜0.4mL、ナノ粒子量として1.8〜2.4μgを噴霧）をした後、２日目以降は２０日目まで１日おきに噴霧処理を行なった。２２日目と２３日目にDNFB処理（マウス背部頭側に0.5%DNFBのオリーブ油−アセトン溶液（油：アセトン＝１：４）を20μL塗布）を行なった。【００７０】
写真撮影は０、３、７、１１、１３、１５、２２、２３、２４日目に行ない、上記表２に示した基準で皮膚炎をスコア化した。背部頭側と尾側を分けてスコア化し、その合計値によって評価した。【００７１】
採血は、テープストリッピングする前（図７、採血1）、テープストリッピング誘導後22日目（図７、採血2）、DNFB塗布で再誘導開始後2日目（図７、採血3）に行ない、その血清分画のIgE量をサンドイッチELISAにより測定した。【００７２】
２４日目の実験終了時、マウスの背部頭側及び尾側の皮膚組織を採取した。皮膚組織の一部は、HE組織染色評価に用いた。また残りの一部は、mRNAを抽出し、定量的RT-PCRにより各種サイトカイン発現量（IL-1α、TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-4、IFN-γ）を調べた。発現量は、HPRT遺伝子に対してノーマライズし、相対発現量で評価した。表５に各マウスサイトカインに対するプライマー配列を示す。【００７３】
【表５】
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【００７４】
[結果]
1. 皮膚炎症状の判定結果
テープストリッピング後、すべてのマウス背部に多数の糜爛を伴う紅斑を認めた（図８、day0）。テープストリッピングのみにより誘導された皮膚炎は、ナノ粒子水噴霧群では水噴霧群と比べて紅斑の消失が早く、糜爛も認められなかった（図８、day3）。両群の皮膚に明瞭な浮腫は認められなかった。一週間目以降はナノ粒子水噴霧群、水噴霧群ともに（番号8のマウス以外は）も炎症症状はほぼ同程度に回復した（図８、day7〜day15）。経過日数に対する皮膚炎スコアの変化を図９に示す。ナノ粒子水噴霧群の方が水噴霧群のマウスと比べて、より早期から炎症程度が改善されることがスコアにおいて認められた。【００７５】
DNFB塗布により再刺激した場合に誘導される皮膚炎の程度はナノ粒子水噴霧群の方が水噴霧群よりも軽度であり、予防効果が示唆された。特に、DNFB塗布前のシェーバーおよび除毛クリームによる剃毛による皮膚のダメージは、皮膚病変スコア（図９）に示したように、ナノ粒子水噴霧群の方が低かった。【００７６】
2. 血中IgE濃度
実験開始時（0日目）、DNFBを塗布し皮膚炎を再誘導開始時（22日目）、および実験終了時（24日目）に採血した血中のIgE濃度を測定した結果を図１０に示す。ナノ粒子水噴霧群と水噴霧群との間で有意な差は認められなかった。【００７７】
3. HE皮膚病理組織像
炎症再誘導後の皮膚組織のHE染色像を図１１に示す。DNFB塗布した背部頭側の表皮肥厚および真皮の炎症は、ナノ粒子水噴霧群では水噴霧群と比較して軽度であった。DNFB非塗布の背部尾側においても、表皮肥厚はナノ粒子水噴霧群では著明に抑制され、炎症細胞浸潤も認めなかった。【００７８】
4. サイトカイン発現量
背中の皮膚炎誘導部を背部頭側（DNFB塗布あり）及び尾側（DNFB塗布なし）に分けて各種サイトカイン発現量を調べた結果を図１２に示す。DNFB塗布により再刺激した場合、IL-1α, TNF-α, IL-6などのバリア機能破壊と関連したサイトカインは、ナノ粒子水噴霧の有無を問わず、DNFB塗布された背部頭側およびDNFB非塗部の尾側共に発現が認められた。DNFB塗布により再刺激した場合、T細胞の産生するサイトカインであるIL-17A, IL-4, IFN-γは、ナノ粒子水噴霧の有無を問わず、頭側、尾側皮膚ともに発現が低かった。【００７９】
[結論]
NC/NgaSlcマウスの場合と同様に、BALB/cマウスにおいても、マクロ的な評価ばかりでなく、ミクロ的な評価でもナノ粒子水噴霧群の方が蒸留水噴霧群よりも治療の効果は優れていると結論付けられる。さらに、ナノ粒子水噴霧群は蒸留水噴霧群と比較して表皮肥厚、真皮炎症は軽度であり、さらに、再度のDNFB塗布による皮膚炎誘導後においても病変は軽度であることから、ナノ粒子水噴霧が繰り返しの炎症誘導に対してこれを制御し皮膚を保護する役割を果たすと考えられる。【００８０】
実験終了時における血中のIgE量は実験開始時や再度の炎症誘導前の血中IgE量に比べて有意に上昇したが、NC/NgaSlcマウスの場合と異なり、BALB/cマウスにおいてはナノ粒子水噴霧群と水噴霧群との間には有意な差がみられなかった。【００８１】
４．マウス皮膚炎モデルにおけるナノ粒子の治療及び予防効果の検討３
テープストリッピングやDNFB塗布による皮膚炎誘導後の表皮肥厚軽減および皮膚炎を再誘導した場合の炎症制御にナノ粒子水噴霧が有効であることが、先の皮膚炎の予防効果をみる実験で示された。この効果が、すでに皮膚炎が起こっているマウスに対しても見られるかどうか、また、それが皮膚バリア機能に関係するかどうかを明らかにする目的で、MHC遺伝子型が知られている純系のBALB/cマウスを用いて検証した。【００８２】
BALB/cマウスにテープストリッピングとDNFB塗布で誘導した皮膚炎に対する治療効果とDNFB塗布による再誘導に対する予防効果を検討するため以下の項目を調べた。
(1)  皮膚炎の程度の記録とスコア化
(2)  DNFB塗布による皮膚炎再誘導後の血中IgE量測定
(3)  DNFB塗布による皮膚炎再誘導後の皮膚HE染色組織観察
(4)  DNFB塗布による皮膚炎再誘導後の皮膚炎関連炎症性サイトカイン発現量測定【００８３】
[方法]
図１３に示すスケジュールでBALB/cマウス（雌、8週齢）を処置した。まず、マウスの背部をシェーバーとクリームにより剃毛および除毛し、8回のテープストリッピングを行い、皮膚のバリア破壊を行った。先にハプテン誘発性皮膚炎を誘発し、ナノ粒子水あるいは水噴霧による治療効果を検討する実験では、テープストリッピングの後、マウス背部頭側へDNFBを塗布（1日目及び2日目）して皮膚炎を誘導した。ナノ粒子水又は蒸留水の噴霧は、1日目及び2日目のDNFB塗布後と、それ以降は20日目まで1日おきに実施した。ナノ粒子水あるいは水噴霧の皮膚炎に対する予防効果を検討する目的で、２１日目に再度除毛処理をし、２２日目と２３日目にマウス背部尾側に0.5%DNFBのオリーブ油−アセトン溶液（油：アセトン＝１：４）を20μL塗布することで皮膚炎の誘導を行なった。【００８４】
写真撮影は０、３、７、１１、１３、１５、２２、２３、２４日目に行ない、皮膚炎症に対する治療効果を観察し、上記表２に示した基準で皮膚炎の程度をスコア化した。背部頭側（治療モデル）と尾側（予防モデル）とに分けてスコア化し、評価した。【００８５】
血液サンプルの採取は０日目（採血１）、２２日目（採血２）及び２４日目（採血３）に行ない、血清分画のIgE量をサンドイッチELISAにより測定した。【００８６】
２４日目の実験終了時、マウスの背部頭側（治療モデル）及び尾側（予防モデル）の皮膚組織を採取し、HE組織染色観察及びサイトカイン発現量測定を行なった。【００８７】
[結果]
1. 皮膚炎症状の判定結果
マウス背部の写真を図１４に、炎症状態のスコア評価結果を図１５に示す。テープストリッピングとDNFB塗布により誘導した皮膚炎に対する治療効果は、ナノ粒子水噴霧は水噴霧よりも優れていた。DNFB塗布により再刺激した場合に誘導される皮膚炎の程度はナノ粒子水噴霧群の方が水噴霧群よりも低く、予防効果に優れていた。特に、DNFB塗布前にシェーバーおよび除毛クリームによる剃毛を行なった際の皮膚のダメージは、皮膚炎スコア（図１５）に示したように、ナノ粒子水噴霧群の方が低かった。【００８８】
2. 血中IgE濃度
実験開始時（0日目）、背中後半部へのDNFB塗布による炎症再誘導開始時（22日目）、および実験終了時（24日目）に採血した血中のIgE濃度を測定した結果を図１６に示す。DNFB塗布により再刺激した場合の血中IgE濃度程度は、ナノ粒子水噴霧群の方が水噴霧群よりも低い傾向が認められた。【００８９】
3. HE組織染色像
炎症誘導後の皮膚病理組織のHE染色像を図１７に示す。皮膚炎の予防モデルとして、先にナノ粒子水又は水の噴霧を行い、実験終了前に皮膚炎の誘導を行なった背部尾側の表皮肥厚は、ナノ粒子噴霧群の方が水噴霧群よりも軽度であった。皮膚炎の治療モデルとして、先にDNFB塗布を行い、追ってナノ粒子水又は水の噴霧を続けた背部頭側の皮膚についても、表皮肥厚はナノ粒子噴霧群の方が水噴霧群よりも軽度であった。【００９０】
4. サイトカイン発現量
背部皮膚を頭側（先にDNFB塗布、続いてナノ粒子水又は水を噴霧する治療モデル）及び尾側（先にナノ粒子水又は水を噴霧、最後にDNFB塗布をする予防モデル）に分けて各種サイトカイン発現量を調べた結果を図１８に示す。【００９１】
IL-1α, TNF-α, IL-6などのバリア機能破壊と関連したサイトカインは、ナノ粒子噴霧の有無を問わず、皮膚炎の予防モデルとして、実験終了前にDNFBを塗布して誘導した背部尾側部、および先に存在する皮膚炎に対する治療モデルとして最初にDNFB塗布を行い、実験終了直前にはDNFB塗布をしていない背部頭側部のいずれにおいても発現が認められた。さらに、皮膚採取前にDNFB塗布をした背部尾側において、発現が高い傾向が認められた。【００９２】
皮膚炎の予防モデルとして、最初にナノ粒子水又は水の噴霧を繰り返し、実験終了前にDNFBを塗布して皮膚炎を惹起した場合、T細胞の産生するサイトカインIL-17A, IL-4, IFN-γは、ナノ粒子噴霧の有無を問わず、DNFBを実験終了前に塗布した背部尾側は、実験終了前にはDNFB塗布をしていない頭側に比べて発現が上昇した。加えて、IFN-γの発現は、ナノ粒子水噴霧群の方が水噴霧群の方と比べて発現量が上昇する傾向が認められた。【００９３】
[結論]
NC/Ngaマウスの場合と同様にBALB/cにおいてもナノ粒子水の有する殺菌作用はテープストリッピング＋DNFB塗布により誘導した皮膚炎に対する治療効果とDNFB塗布による皮膚炎誘導に対する予防効果があることが示された。【００９４】
NC/Ngaマウスの場合と同様にBALB/cにおいてもその効果は殺菌作用によるバリア機能回復の促進とそれに関連する炎症反応の制御に基づくことを示唆する結果が得られた。【００９５】
５．マウス皮膚炎モデルにおけるナノ粒子水の治療及び予防効果の検討４
ナノ粒子水噴霧がバリア機能の保持と炎症性応答制御に関与しているかどうかをさらに詳細に調べるために、12週齢BALB/cマウスに繰り返しテープストリッピングを行い、次の項目について調べた。
(1)  繰り返しテープストリッピングをする過程の皮膚炎症状態のスコア変化
(2)  繰り返しテープストリッピングをする過程の水分蒸散量変化
(3)  繰り返しテープストリッピング後の皮膚HE染色組織観察
(4)  繰り返しテープストリッピング後の皮膚炎関連炎症性サイトカイン発現量測定【００９６】
図１９に示すスケジュールで繰り返しテープストリッピングを行った。12週齢BALB/cマウスの背部を剃毛および除毛した後、水分蒸散量（皮膚バリア機能の指標）を測定しながらその値が30から50g/hm2の範囲になるようにテープストリッピング（3〜5回）をした。水分蒸散量の測定には、Courage + Khazaka electronic GmbH社（独国ケルン）のThe Multi Probe Adapter System（略称MPA5)（ソフトウェア：CK-MPA-multi-probe version 1.5.1.4）に蒸散量測定用のプローブTewameter(登録商標) probe(TM300MP)を接続したものを用いた。測定に際してはプローブを左足付け根部分にずれないように押し当てて行った。麻酔後に写真撮影と、その写真に基づいた皮膚炎症状態のスコア化、及び皮膚蒸散量の測定を行い、その後にナノ粒子水または蒸留水を噴霧した（各群4匹ずつ）。皮膚炎症の状態のスコア化は、上述の検討２、３と同様に、背部頭側部と尾側部とに分けてスコア化し、それぞれ、合計値によって評価した。ナノ粒子水噴霧群の水分蒸散量が10g/hm2前後の値を示した4日目、8日目および11日目に再び除毛とテープストリッピングを行った。14日目に写真撮影と水分蒸散量測定を行い、その後に採血と皮膚組織のサンプリング（凍結切片、固定標本およびRT-PCR用のRNA調製）を行った。【００９７】
皮膚炎状態をスコア評価した結果を図２０に示す。ナノ粒子噴霧群および水噴霧群共に、テープストリッピング毎にスコアは12程度まで上昇し、その翌日には2〜3程度まで低下するという、バリア破壊と組織修飾の繰り返しが観察された。14日目の皮膚炎症状態は、ナノ粒子水噴霧群と水噴霧群との間に大きな差はなかった。【００９８】
一方、皮膚の水分蒸散量を測定したところ（結果を図２１に示す）、テープストリッピングを繰り返していると、テープストリッピング毎に水噴霧群は60〜70 g/hm2まで上昇するが、ナノ粒子水噴霧群のほうは最大50 g/hm2程度までしか上昇しなかった。テープストリッピング後、翌日には、ナノ粒子水噴霧群は10 g/hm2程度まで蒸散量が低下しているのに対し、テープストリッピングを繰り返していると、水噴霧群では、次第に蒸散量の回復が不十分となり、その値が徐々に上昇し、14日目には20 g/hm2以上を示した。このことは、繰り返しテープストリッピング後、皮膚バリア破壊後の修復機能は水噴霧群のほうがナノ粒子水噴霧群よりも劣っていることを示している。【００９９】
またこのことは、図２２に示すように、14日目に採取した皮膚のHE染色標本において、表皮の肥厚化程度がナノ粒子水噴霧群に比べて水噴霧群のほうが大きいことからも支持される。【０１００】
さらに、繰り返しテープストリッピング後のIL-1α, TNF-α, IL-6などの表皮バリア機能破壊と関連したサイトカインの発現量をRT-PCR法で調べてみると（結果を図２３に示す）、ナノ粒子水噴霧の有無を問わず、背部尾側および頭側のいずれにおいても同程度の発現が認められた。一方、T細胞の産生するサイトカイン発現量はIL-4, IFN-γはその発現量は低く両者の群の間には大きな差がみられなかったが、表皮の破壊と関連性の高いIL-17Aは水噴霧群のほうがナノ粒子水噴霧群に比べて発現量が高く、皮膚バリア機能は水噴霧群のほうがナノ粒子水噴霧群よりも障害されていることを示唆していた。【０１０１】
ナノ粒子水の有する殺菌・保水作用は、繰り返しテープストリッピングによる皮膚損傷に対する治療と、該処理により誘導されうる皮膚炎症に対する予防に効果があることが示された。【０１０２】
６．マウス皮膚炎モデルにおけるナノ粒子水の治療及び予防効果の検討５（ヘアレスマウスを用いた、ハプテン誘導性慢性皮膚炎モデルでの検討）
剃毛、除毛に伴う物理的な皮膚バリア機能破壊の影響を避けるため、ヘアレスマウス（Hos:HR-1、日本SLC）を用い、また、アトピー性皮膚炎をはじめとする人の慢性皮膚炎に近い動物モデルを使ってナノ粒子水の抗菌、保水効果の検討を行うため、ハプテンを繰り返し塗布するマウス慢性皮膚炎モデルを作製し（Nakajima, S. et al., J. Invest. Dermatol, 134, 2122-2130, 2014らの方法をDNFBの抗原系に改変）、下記の８項目について調べた。背部皮膚にDNFBを塗布する実験群では、四肢による掻把の影響が少ないと思われる肩甲骨の位置の皮膚に塗布した。【０１０３】
＜評価項目＞
(1)  皮膚炎症状態のスコア化：肉眼的な皮膚炎症程度の評価
(2)  両耳介の厚さ測定：耳介の炎症反応程度の評価
(3)  皮膚の水分蒸散量と保水度の測定：上背部皮膚表皮のバリア機能の破壊・回復程度の評価
(4)  HE組織染色標本観察：顕微鏡観察による皮膚炎症程度の評価
(5)  皮膚内に発現するサイトカインの種類と量の測定：背部頭側の皮膚と右耳介に発現するサイトカインの種類と発現量の評価
(6)  血清中の抗Hapten抗体量の測定：血清中の抗DNP IgG抗体量の評価
(7)  頭側背部皮膚の表在細菌数の測定：頭側背部皮膚の表在細菌数の評価
(8)  血清中の黄色ブドウ球菌に対するIgG抗体量の測定：ヘアレスマウスの背部皮膚から分離した黄色ブドウ球菌に対する血清IgG抗体量の評価【０１０４】
＜マウス慢性皮膚炎モデルの作製方法＞
ヘアレスマウス（Hos:HR-1）雌を一群５匹として、表６の通りに４つの実験群を作った。処置スケジュールを図２４に示す。【０１０５】
【表６】
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【０１０６】
皮膚の写真撮影、常在細菌数、耳の厚さ、皮膚水分蒸散量、皮膚保水度、および皮膚炎スコアの測定は、マウスを麻酔してから行ない、これらの測定後にDNFB塗布を行なった。この間、DNFB塗布の翌日から１日おきにナノ粒子水の噴霧を行った（図２４）。day33に0.3%DNFBを塗布し、その１日後（day34）に両耳と背部の皮膚の採取と採血をおこなった。右耳介と頭側背部皮膚からはHE染色標本を作成し、また、RT-PCRによる各種サイトカインの測定を行った。血液からは血清中の抗DNP抗体及び抗S.aureus抗体の凝集価の測定を行った。【０１０７】
(1)  皮膚炎症のスコア化
皮膚炎スコアは下記表７のように定義し、皮膚炎の程度をスコア化した。スコアは、マウス１匹について、紅斑、鱗屑、糜爛、隆起、痂皮、左耳介の肥厚・変形、右耳介の肥厚・変形の７項目について０〜３の４段階のスコアを付け、合計した。１匹当たりの最大スコアは２１ポイントである。各実験群のマウスについて、day5, day12, day19, day26, day33に皮膚炎スコアを測定した。【０１０８】
【表７】
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【０１０９】
DNFB塗布後の頭側背部及び両耳介の皮膚炎スコアの変化を追った結果を図２５に示す。またday33における各実験群の頭側背部皮膚および両耳介の画像を図２６に示す。DNFB塗布とともにナノ粒子水噴霧したA群では、ナノ粒子水噴霧をしなかったC群（陽性対照群）や水噴霧B群よりも明らかに皮膚炎スコアが低かった（図２５）。D群はDNFB塗布、噴霧いずれも施行しなかった陰性対照を示す。図２６に示す通り、B群とC群では皮膚炎、耳介変形が明らかに認められた一方、ナノ粒子水噴霧群（A群）は、陰性対照（D群）同等、著明に症状が抑制された。【０１１０】
(2)  両耳介の厚さ測定
各実験群のマウスについて、day5, day12, day19, day26, day33に左右耳介の厚さをそれぞれ厚みゲージで測定した。左右耳介の測定値の平均値をその個体の測定値としてグラフ化した。【０１１１】
結果を図２７に示す。水噴霧群（B群）及び陽性対照群（C群）では、DNFB塗布後のday12頃より耳介が肥厚し始めた一方、ナノ粒子水噴霧群（A群）は肥厚することなくday33には抑制効果が明らかであり、陰性対照群（D群）とほとんど変わらない結果を示した。【０１１２】
(3)  皮膚の水分蒸散量と保水度測定
各実験群のマウスについて、day5, day12, day19, day26, day33に上背部皮膚の水分蒸散量及び保水度を測定した。測定にはCourage + Khazaka electronic GmbH社（独国ケルン）のThe Multi Probe Adapter System（略称MPA5)（ソフトウェア：CK-MPA-multi-probe version 1.5.1.4）を使用した。蒸散量の測定では、MPA5に蒸散量測定用のプローブTewameter(登録商標) probe(TM300MP)を接続し、プローブを頭側背部皮膚に押し付けて測定を行なった。保水度の測定では、MPA5に保水度測定用プローブCorneometer (CM825MP)を接続し、頭側背部皮膚3か所にプローブを押し付けて保水度を測定し、3か所の測定値の平均値をその個体の測定値とした。【０１１３】
皮膚水分蒸散量の測定結果を図２８に示す。B群及びC群では、DNFB塗布後day12には蒸散量が明らかに上昇し、その後も高い蒸散量を示した。ナノ粒子水噴霧群（A群）では、一時的にわずかな蒸散量の上昇が認められたものの低い値を維持していた。day33には、A群はB群およびC群に比べ有意に低値を示した。【０１１４】
保水度の測定結果を図２９に示す。B群及びC群ではDNFB塗布後、経時的に保水度が低下した一方、ナノ粒子水噴霧群（A群）では保水度の低下は全く見られず、無処置群（D群）と同様、保水能が維持された。day33には、ナノ粒子水噴霧群（A群）はB群、C群に比べて有意差を示した。【０１１５】
(4)  HE組織染色標本観察
各実験群のマウスより、day34（33日目にDNFB 0.3%の塗布後１日目）に右耳介と頭側背部皮膚を採取し、HE染色を行なった。【０１１６】
図３０A〜Dは、A群〜D群の代表的な耳介および頭側背部皮膚の症状とHE染色像である。A-1、B-1、C-1、D-1は右耳介皮膚のHE組織染色写真であり、A-2、B-2、C-2、D-2は頭側背部皮膚のHE組織染色写真である。黒のバーは100μmを示す。【０１１７】
水噴霧群（B群）では、肉眼的に炎症が強く、病理組織では耳介の表皮肥厚、および真皮の炎症、線維化も著明であった。一方、ナノ粒子水噴霧群（A群）は臨床症状、病理組織ともに明らかに抑制されていた。背部皮膚の病理組織では、差異は明かではないが、ナノ粒子水噴霧群（A群）では毛包周囲（ヘアレスマウスでは嚢胞状構造が形成される）の炎症細胞浸潤が軽度であった。【０１１８】
陽性対照群（C群）でもB群同様、強く皮膚炎症が認められ、A群に比べて耳介、背部皮膚の変化が強く認められた。【０１１９】
(5)  皮膚内に発現するサイトカインの種類と量の測定
各実験群のマウスよりday34に採取した右耳介組織及び上背部皮膚組織におけるサイトカインの発現を定量的RT-PCRにより測定した。プライマーは上記表５に記載のものを用いた。発現量は、HPRT遺伝子に対してノーマライズし、相対発現量で評価した。【０１２０】
結果を図３１に示す。耳介（図３１右）では、B群、C群の炎症性サイトカイン（IL-6,、IFN-γ）の発現がA群やD群よりも上昇し、B群、C群の耳介の炎症程度と関連性を示していた。背部皮膚（図３１左）では、A群以外にD群にもTNF-αやIL-17などのサイトカインの発現が認められた。このことは、ヘアレスマウスの場合はTh17細胞を介した皮膚恒常性の維持機構の存在を示唆していた。【０１２１】
(6)  血清中の抗hapten抗体量の測定
各実験群のマウスよりday34に血液を採取し、血清中の抗DNP抗体量をDNP-BSAを抗原としたELISAにて測定した。5μg/mLのDNP-BSAでコートしたELISAプレートを使用し、マウス血清の希釈系列をサンプルとしてELISAを行なった。検出にはHRPO結合ヤギ抗マウスIgGを用いた。【０１２２】
結果を図３２に示す。抗DNP抗体量は、ナノ粒子水噴霧群（A）、水噴霧群（B）、噴霧なし群（C）の3群間ではあまり変わらず、DNPに対する免疫応答（B細胞とTｈ細胞の反応）は遜色なく起こっていることが確認された。このことから、皮膚に会合したナノ粒子の存在によってDNFBの皮膚への反応性が低下するなどの理由により、ハプテン誘導性免疫応答自体が低下した、という可能性は低いことが示唆された。【０１２３】
(7)  頭側背部皮膚の表在細菌数の測定
各実験群のマウスについて、day5, day12, day19, day26, day33に上背部皮膚の表在細菌数を測定した。頭側背部皮膚に生菌数測定用標準寒天培地（ペタンチェック、栄研化学）を5秒間押し当てた後、37℃フラン器で24時間培養し、4cm2の区画あたりのコロニー数をカウントした。【０１２４】
結果を図３３に示す。ナノ粒子水噴霧群（A群）では、水噴霧群（B群）、噴霧なし群（C群）、前処理もDNFB塗布も行わない無処理群（D群）と比べて細菌数の変動が少なく、かつ低い値を示した。【０１２５】
(8)  血清中の黄色ブドウ球菌に対するIgG抗体量の測定
各実験群のマウスより、day34に採血し、血清を分離した。血清を非動化した後、血清と当量の0.2M 2-MEを加え37℃で１時間加温した。この処理により、腸管系で多くが産生されるIgM自然抗体がモノマー化し、凝集価への寄与が乏しくなる。その後、この血清を256倍まで倍々希釈し、これらヘアレスマウスの皮膚から分離したS.aureusを用いて作製した不活化S.aureus菌体液と混合して4℃で一晩反応させた。凝集が起こらなかった最大希釈倍率を凝集価とし、凝集価をグラフ化した。【０１２６】
結果を図３４に示す。ナノ粒子水噴霧群（A群）の凝集価は水噴霧群（B群）及び噴霧なし群（C群）よりも有意に低く、ナノ粒子水噴霧による血清中の抗S.aureus IgG抗体の減少が認められた。このことから、ナノ粒子水噴霧による皮膚バリア機能の速やかな修復の結果、IgG抗体産生を誘導するような皮膚表在細菌の真皮あるいはそれより深部への侵入が抑えられたことが示唆される。【０１２７】
＜検討５まとめ＞
ナノ粒子水を噴霧した群では、皮膚炎症スコア値は水噴霧群・非噴霧群のそれよりも低値であった。皮膚炎症スコア値は、免疫応答性の指標である両耳介の肥厚化のみならず、皮膚バリア機能の指標である背部皮膚水分蒸散量と保水度にも関連性が認められた。
ナノ粒子水噴霧群の場合は、表皮増殖関連のサイトカインはTh17細胞系とともに発現し、一方、水噴霧群・噴霧なし群の場合は、皮膚ダメージ関連シグナルを介して発現することが示唆された。
ナノ粒子水噴霧群の表在細菌数は他の3群と比べて一定の低値に制御されていた。ナノ粒子水噴霧による表在細菌数制御は、皮膚バリア性の向上との相乗効果により、血清中の抗S.aureus IgG抗体の減少をもたらした。
以上の結果より、ナノ粒子水噴霧は皮膚バリア機能の向上と表在細菌数制御の関与する免疫応答とを介して皮膚炎症反応を制御することが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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