(57)【要約】  本発明は、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、該製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株等を提供することにある。より詳細には、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を、より簡便、より短期間、かつ、より効率的に製造する方法や、該製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株等を提供することを目的とする。  本発明における脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法は、以下の工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を有する方法である；（Ａ）脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される１種又は２種以上の細胞を成熟脂肪細胞に分化誘導する工程；及び、（Ｂ）工程（Ａ）で得られた成熟脂肪細胞を脱分化誘導して、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を得る工程；
2017094260.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を有することを特徴とする、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
（Ａ）脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される１種又は２種以上の細胞を成熟脂肪細胞に分化誘導する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた成熟脂肪細胞を脱分化誘導して、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を得る工程；
【請求項２】
１種又は２種以上の細胞が、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去することにより得られる細胞であることを特徴とする請求項１に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項３】
脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去することにより得られる細胞が、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団を含む懸濁液を遠心分離した際に沈殿する細胞であることを特徴とする請求項２に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項４】
工程（Ａ）における１種又は２種以上の細胞を成熟脂肪細胞へ分化誘導する工程が、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インスリン及び血清からなる群から選択される１種又は２種以上の脂肪細胞分化誘導物質を含む間葉系細胞培養用基本培養液中で、前記１種又は２種以上の細胞を培養する工程であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項５】
工程（Ｂ）における成熟脂肪細胞を脱分化誘導することが、成熟脂肪細胞を天井培養することであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項６】
脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素が、コラゲナーゼ、トリプシン、カゼイナーゼ、クロストリパイン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ディスパーゼ、サーモリシン、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、パンクレアチン、エラスターゼ及びパパインからなる群から選択される１種又は２種以上の酵素であることを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項７】
脊椎動物が哺乳動物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項８】
脂肪組織が皮下脂肪組織であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株。
【請求項１０】
巨核球・血小板、骨芽細胞、軟骨及び脂肪細胞からなる群から選択される１種又は２種以上への分化能を有していることを特徴とする請求項９に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株。
【請求項１１】
以下の間葉系細胞の表面マーカー群から選択される１種又は２種以上の表面マーカーを発現しており、かつ、以下の血液細胞の表面マーカー群から選択される１種又は２種以上の表面マーカーを発現していないことを特徴とする請求項９又は１０に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株。
間葉系細胞の表面マーカー群：ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＡＢＣ；
血液細胞の表面マーカー群：ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ；
【請求項１２】
脊椎動物の脂肪組織から採取した成熟脂肪細胞を脱分化誘導して得られた脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株と比較して、中胚葉系細胞への分化誘導効率が、１．５倍以上であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を、中胚葉系細胞に分化誘導して、中胚葉系細胞を得る工程を有することを特徴とする中胚葉系細胞の製造方法。
【請求項１４】
中胚葉系細胞が、巨核球・血小板、骨芽細胞、軟骨又は脂肪細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の中胚葉系細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、該製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板輸血は、事故に伴う出血や抗がん剤使用時などで起こる血小板減少の唯一の治療法であり、その際に用いられる血小板製剤は現在のところ善意の献血に１００％依存している。血小板は非常に脆く、これまでに治療を目的とした血小板の長期保存を可能にする方法は存在しない。実際には、血小板の保管寿命は、最新の医療機関において４日間とされるが、検査ならびに出荷に要する時間を考慮すると、診療所を含む臨床現場での実質的な保管寿命は約３日とされる。このように、多くの血液バンクは常に、血小板を新鮮に維持し貯蔵する難点を抱えており、さらに、献血に依存する血小板製剤の供給量は、献血者の減少や、ウイルス感染症を患った献血者の増加による影響を受けやすい状況にある。【０００３】
そこで、近年、このような問題を抱えた献血に代わる、新たな血小板供給源の開発が注目されている（非特許文献１）。例えば、体性幹細胞である造血幹細胞（臍帯血幹細胞）を利用して血小板を体外で大量に生産する技術開発がある。しかしながら、造血幹細胞自体を体外で増幅する方法が未だ確立されていないことから実用化には至っていない。一方、多能性幹細胞である胚性幹（ＥＳ）細胞は、体外で無限に増殖させることができるという利点があり、血小板を含む血液細胞を産生する供給源として注目されてきた。この点については、ヒトＥＳ細胞から成熟巨核球及び血小板を産生する技術が既に報告されている（非特許文献２）。しかし、この方法では血小板の産生効率が悪く、１回の輸血製剤をつくるのに、シャーレが何万枚も必要となるなど、実用性は不十分であった。【０００４】
血小板の輸血においては、血小板輸血不応が問題点としてあげられる。輸血初回時は、患者のものと異なるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を有する血小板を使用できるが、輸血を繰り返すことで患者体内にこのＨＬＡに対する特異的抗体が産生され、その結果、輸血した血小板が迅速に拒絶される。あるいは、血小板は独自の血液型であるヒト同種抗原（ＨＰＡ）も有しており、この適合型の相違による輸血不応も認められる。この点の問題を解消し得る技術として、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から巨核球及び血小板を産生する技術が報告されている（非特許文献３）。例えば、患者由来のｉＰＳ細胞を用いて血小板を誘導すれば、理論上、拒絶を受けることのないオーダーメイドの血小板製剤を調製することが可能となる。しかし、ｉＰＳ細胞からの血小板産生は線維芽細胞から血小板産生に至るまでに約５０日も要するため（非特許文献３）、実用性は不十分であった。一方、線維芽細胞からダイレクトリプログラミングと呼ばれる手法により血小板を産生させる方法が知られている（非特許文献４）。この手法によれば、ｉＰＳ細胞を経由させる方法よりも、血小板産生に至るまでの期間を大幅に短縮することができ、約１４日で血小板産生に至るという利点を持つ。しかしながら、線維芽細胞を用いたダイレクトリプログラミングには遺伝子導入が必要であり、遺伝子導入用ベクターの混在による安全性への影響が懸念される。【０００５】
ところで、造血幹細胞を巨核球、血小板へと分化誘導し得る培養液として、ＭＫＬＩ培地（megakaryocyte lineage induction medium）が知られている。該ＭＫＬＩ培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）に、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、０．５％ウシ血清アルブミン、４μｇ／ｍＬ ＬＤＬコレステロール、２００μｇ／ｍＬ 鉄飽和トランスフェリン（鉄結合型トランスフェリン）、１０μｇ／ｍＬ インスリン、５０μＭ ２−β−メルカプトエタノール、ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ及びＣＴＰを各２０μＭ）、及び５０ｎｇ／ｍＬ トロンボポエチン（thrombopoietin：ＴＰＯ）を添加した培地である（非特許文献５）。本発明者らはこれまでに、造血幹細胞以外の細胞から巨核球、血小板へと分化誘導する技術について研究を進めており、上記ＭＫＬＩ培地にて、ヒトの皮下脂肪組織由来の脂肪前駆細胞（非特許文献５、６）や、マウス由来の脂肪前駆細胞（非特許文献５、７）を培養すると巨核球、血小板へと分化し得ることを見いだしている。本発明者らはさらに研究を進め、巨核球及び／又は血小板を製造し得るより優れた方法を見いだしている（特許文献１）。この特許文献１の製造方法は、間葉系細胞を、鉄イオン及び鉄輸送体を含む間葉系細胞培養用基本培地で培養し、培養物から巨核球及び／又は血小板を採取することを特徴とする製造方法である。特許文献１の製造方法は、ＴＰＯ等を培地に添加しなくとも、脂肪前駆細胞等の間葉系細胞から、血小板産生能を有する巨核球及び／又は血栓形成能を有する血小板を、比較的短期間で簡便かつ多量に、しかもより低コスト或いはより効率的に生体外で製造することが可能である。【０００６】
このように特許文献１の製造方法は、造血幹細胞、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞を用いた血小板の従来の製造方法の欠点を解消した優れた製造方法である。特許文献１には、巨核球や血小板へ分化誘導する前の間葉系細胞の１種として、脂肪前駆細胞株を用いることが開示されている。脂肪前駆細胞株は市販されており、また、脂肪組織から樹立することもできる。脂肪組織から脂肪前駆細胞株を樹立する方法としては、脂肪組織をコラゲナーゼ処理して脂肪細胞を分離し、脂肪細胞を含む細胞懸濁液を遠心分離して、上清の成熟脂肪細胞を回収し、かかる成熟脂肪細胞を、血清を含む培養液で天井培養して株化する方法が知られている（特許文献２）。しかしこの株化方法は、株化に約２ヶ月強もの期間を必要とする上、技術的にも熟練した操作が必要となるなど、実用上の課題が残されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１４／２０８１００号パンフレット
【特許文献２】日本特許第５０５５６１１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Reems JA, Pineault N, Sun S. In vitro megakaryocyte production and platelet biogenesis: state of the art. Transfus Med Rev. 2010; 24 (1): 33-43.
【非特許文献２】Takayama N, Nishikii H, Usui J, et al. Generation of functional platelets from human embryonic stem cells in vitro via ES-sacs, VEGF-promoted structures that concentrate hematopoietic progenitors. Blood. 2008; 111 (11): 5298-5306.
【非特許文献３】Nakamura S, Takayama N, Hirata S, et al. Expandable Megakaryocyte Cell Lines Enable Clinically Applicable Generation of Platelets from HumanInduced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 2014 Feb 12.pii: S1934-5909(14)00012-5. doi: 10.1016/j.stem.2014.01.011.
【非特許文献４】Ono Y, Wang Y, Suzuki H, et al. Induction of functional platelets from mouse and human fibroblasts by p45NF-E2/Maf. Blood. 2012; 120: 3812-3821.
【非特許文献５】Matsubara Y, Murata M, Ikeda Y.Culture of megakaryocytes andplatelets from subcutaneous adipose tissue and a preadipocyte cell line. MethodsMol Biol. 2012; 788: 249-258.
【非特許文献６】Matsubara Y, Saito E, Suzuki H, Watanabe N, Murata M, et al.Generation of megakaryocytes and platelets from human subcutaneous adipose tissues. Biochem Biophys Res Commun. 2009; 378: 716-720.
【非特許文献７】Matsubara Y, Suzuki H, Ikeda Y, Murata M. Generation of megakaryocytes and platelets from preadipocyte cell line 3T3-L1, but not the parent cell line 3T3, in vitro. Biochem Biophys Res Commun. 2010; 402: 796-800.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、該製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株等を提供することにある。より詳細には、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を、より簡便、より短期間、かつ、より効率的に製造する方法や、該製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団を含む懸濁液を遠心分離した際の上清の細胞集団（成熟脂肪細胞）ではなく、沈殿した細胞集団を成熟脂肪細胞に分化誘導して得られた成熟脂肪細胞について脱分化誘導を行うと、高い効率で脱分化が生じ、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株をより簡便、より短期間、かつ、より効率的に製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。なお、本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法は、特許文献２における脂肪組織からの脂肪前駆細胞株の製造方法と比較して、細胞株の樹立に要する期間は半分以下であり、同一量の脂肪組織から樹立できる細胞株の量は１０〜１５倍程度であった。【００１１】
また、本発明者らは、このようにして得られた脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株が、長期継代培養が可能であり、かつ、長期継代培養後も増殖能及び中胚葉系細胞への分化能を維持していることを見いだし、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を有することを特徴とする、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法；
（Ａ）脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される１種又は２種以上の細胞を成熟脂肪細胞に分化誘導する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた成熟脂肪細胞を脱分化誘導して、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を得る工程；や、
（２）１種又は２種以上の細胞が、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去することにより得られる細胞であることを特徴とする上記（１）に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、
（３）脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去することにより得られる細胞が、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団を含む懸濁液を遠心分離した際に沈殿する細胞であることを特徴とする上記（２）に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、
（４）工程（Ａ）における１種又は２種以上の細胞を成熟脂肪細胞へ分化誘導する工程が、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インスリン及び血清からなる群から選択される１種又は２種以上の脂肪細胞分化誘導物質を含む間葉系細胞培養用基本培養液中で、前記１種又は２種以上の細胞を培養する工程であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、
（５）工程（Ｂ）における成熟脂肪細胞を脱分化誘導することが、成熟脂肪細胞を天井培養することであることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、
（６）脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素が、コラゲナーゼ、トリプシン、カゼイナーゼ、クロストリパイン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ディスパーゼ、サーモリシン、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、パンクレアチン、エラスターゼ及びパパインからなる群から選択される１種又は２種以上の酵素であることを特徴とする上記（２）〜（５）のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、
（７）脊椎動物が哺乳動物であることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、
（８）脂肪組織が皮下脂肪組織であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法に関する。【００１３】
また、本発明は、
（９）上記（１）〜（８）のいずれかに記載の製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株や、
（１０）巨核球・血小板、骨芽細胞、軟骨及び脂肪細胞からなる群から選択される１種又は２種以上への分化能を有していることを特徴とする上記（９）に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株や、
（１１）以下の間葉系細胞の表面マーカー群から選択される１種又は２種以上の表面マーカーを発現しており、かつ、以下の血液細胞の表面マーカー群から選択される１種又は２種以上の表面マーカーを発現していないことを特徴とする上記（９）又は（１０）に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株；
間葉系細胞の表面マーカー群：ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＡＢＣ；
血液細胞の表面マーカー群：ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ；や、
（１２）脊椎動物の脂肪組織から採取した成熟脂肪細胞を脱分化誘導して得られた脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株と比較して、中胚葉系細胞への分化誘導効率が、１．５倍以上であることを特徴とする上記（９）〜（１１）のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株に関する。【００１４】
さらに、本発明は、
（１３）上記（９）〜（１２）のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を、中胚葉系細胞に分化誘導して、中胚葉系細胞を得る工程を有することを特徴とする中胚葉系細胞の製造方法や、
（１４）中胚葉系細胞が、巨核球・血小板、骨芽細胞、軟骨又は脂肪細胞であることを特徴とする上記（１３）に記載の中胚葉系細胞の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、該製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株等を提供することができる。より詳細には、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を、より簡便、より短期間、かつ、より効率的に製造する方法や、該製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株等を提供することができる。【００１６】
かかる間葉系細胞株は分化能及び増殖能が半永久的に維持されるため、「中胚葉系細胞の材料をより多量に得ることができるというメリット」や、「間葉系細胞株を冷凍保存などしておけば、巨核球、血小板、骨芽細胞、軟骨、脂肪細胞等の中胚葉系細胞が必要なときに、すぐに中胚葉系細胞の製造に着手することができるというメリット」がある。そのため、本発明による脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を用いれば、中胚葉系細胞をより短期間、かつ、より多量に得ることができるため、中胚葉系細胞を用いた細胞医療の分野への本発明の意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１で製造したヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を、位相差顕微鏡像で観察した結果を表す図である。図１中のバーは１００μｍを表す。
【図２】実施例１で製造したヒト脂肪組織由来間葉系細胞株が、骨芽細胞への分化能や、脂肪細胞への分化能や、軟骨細胞への分化能を有しているかを調べた結果を表す図である。図２上から１段目の両パネル：ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を２１日間、骨芽細胞へ分化誘導培養した細胞（Day 21）、又は、分化誘導前のヒト脂肪組織由来間葉系細胞株（Day 0）が、骨芽細胞の特徴の１つであるアルカリフォスファターゼ活性を有しているかを、該活性の基質（ブロモクロロインドリルリン酸・ニトロブルーテトラゾリウム）を添加して確認した結果を表す図である。Day 0（左パネル）では、アルカリフォスファターゼ活性を表す発色（実際は青紫色であるが、図面では黒っぽい色として表れる）は、ほとんど認められないが、Day 21（右パネル）では、その発色がDay 0よりも強く認められる。図２上から２段目の両パネル：ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を２１日間、骨芽細胞へ分化誘導培養した細胞（Day 21）、又は、分化誘導前のヒト脂肪組織由来間葉系細胞株（Day 0）に、骨芽細胞の特徴の１つである細胞の石灰化が認められるかを、アリザリンレッドで染色して確認した結果を表す図である。Day 0（左パネル）では、細胞の石灰化を表す発色（実際は赤色であるが、図面では黒っぽい色として表れる）は、ほとんど認められないが、Day 21（右パネル）では、その発色がDay 0よりも強く認められる。図２上から３段目の両パネル：ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を２１日間、脂肪細胞へ分化誘導培養した細胞（Day 21）、又は、分化誘導前のヒト脂肪組織由来間葉系細胞株（Day 0）に、脂肪細胞の特徴の１つである脂肪球の存在が認められるかを、オイルレッドＯで染色して確認した結果を表す図である。Day 0（左パネル）では、脂肪球を表す発色（実際は赤色であるが、図面では黒っぽい色として表れる）は、あまり認められないが、Day 21（右パネル）では、その発色がDay 0よりも強く認められる。図２最下段の両パネル：ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を２１日間、軟骨細胞へ分化誘導培養した細胞（Day 21）、又は、分化誘導前のヒト脂肪組織由来間葉系細胞株（Day 0）に、軟骨細胞に特徴的な細胞外マトリクスの存在が認められるかを、アリシアンブルーで染色して確認した結果を表す図である。Day 0（左パネル）では、軟骨細胞に特徴的な細胞外マトリクスの存在を表す発色（実際は青色であるが、図面では黒っぽい色として表れる）は、あまり認められないが、Day 21（右パネル）では、その発色がDay 0よりも強く認められる。
【図３】実施例１で製造したヒト脂肪組織由来間葉系細胞株における間葉系細胞や血液細胞の表面マーカーの発現をフローサイトメトリー法で解析した結果を表す図である。上段の９つのパネルは、間葉系細胞の表面マーカー（ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＡＢＣ）についての結果を表し、下段の９つのパネルは、血液細胞の表面マーカー（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ）の結果を表す。なお、上段の９つの各パネルには、それぞれ主に２つずつシグナルピークがあるが、それぞれ左側のピークはネガティブコントロール抗体を用いた結果を表し、それぞれ右側のピークは抗表面マーカー抗体を用いた結果を表す。
【図４】ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株をＭＫＬＩ培養液にて７日間培養して得られた細胞集団を、蛍光標識ＣＤ４１抗体及び蛍光標識抗ＣＤ４２ｂ抗体でラベルし、フローサイトメトリー法を用いて蛍光を測定した結果を示す図である。横軸は、蛍光標識ＣＤ４１抗体の蛍光強度を表し、縦軸は、蛍光標識抗ＣＤ４２ｂ抗体の蛍光強度を表す。
【図５】ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株をＭＫＬＩ培養液にて７日間培養して得られた細胞集団の核をプロピジウムイオダイド（ＰＩ）で染色した後、フローサイトメトリーで各細胞のＰＩの蛍光強度を測定した結果を示す図である。横軸はＰＩの蛍光強度を表し、縦軸は細胞数を表す。
【図６】ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株をＭＫＬＩ培養液にて７日間培養して得られた細胞集団を、蛍光標識抗フィブリノーゲン抗体でラベルし、フローサイトメトリー法を用いて蛍光を測定した結果を示す図である（図の右のピーク）。また、この図には、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を蛍光標識抗フィブリノーゲン抗体でラベルし、フローサイトメトリー法を用いて蛍光を測定した結果も示す（図の左のピーク）。横軸は蛍光強度を表し、縦軸は細胞数を表す。
【図７】ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株をＭＫＬＩ培養液にて７日間培養して得られた細胞集団を、蛍光標識抗ＰＡＣ−１抗体でラベルし、フローサイトメトリー法を用いて蛍光を測定した結果を示す図である（図の右のピーク）。また、この図には、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を蛍光標識抗ＰＡＣ−１抗体でラベルし、フローサイトメトリー法を用いて蛍光を測定した結果も示す（図の左のピーク）。横軸は蛍光強度を表し、縦軸は細胞数を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法＞
本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法（以下、単に「本発明の細胞株の製造方法」と表示する。）としては、
（Ａ）脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される１種又は２種以上の細胞を成熟脂肪細胞に分化誘導する工程；及び
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた成熟脂肪細胞を脱分化誘導して、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を得る工程；
を有する方法である限り特に制限されない。
工程（Ａ）の分化誘導により得られる成熟脂肪細胞は、脊椎動物の脂肪組織に存在していた成熟脂肪細胞よりも、脱分化を生じ易い成熟脂肪細胞（以下、本明細書において「易脱分化成熟脂肪細胞」とも表示する。）であるため、工程（Ｂ）における脱分化誘導によって、より簡便、より短期間、かつ、より効率的に脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を製造（樹立）することができると考えられる。なお、かかる製造方法は、生体外（ex vivo）又はin vitroでの製造方法とすることができる。
【００１９】
（工程Ａ）
上記工程（Ａ）としては、脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される１種又は２種以上の細胞（以下、本明細書において「間葉系幹細胞等」とも表示する。）を成熟脂肪細胞に分化誘導する工程である限り特に制限されない。かかる分化誘導の工程は、生体外（ex vivo）又はin vitroでの分化誘導の工程である。
【００２０】
脂肪組織の由来となる生物種としては、脊椎動物である限り特に制限されず、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等を挙げることができ、中でも、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、サル、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物を好ましく挙げることができ、中でもヒトを特に好ましく挙げることができる。また、本発明の細胞株の製造方法により製造した脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株又は該細胞株から分化誘導した中胚葉系細胞を対象脊椎動物に投与又は移植等する場合は、拒絶反応等を回避する観点から、その対象脊椎動物の脂肪組織を本発明の細胞株の製造方法に用いることが好ましい。
【００２１】
本明細書における「脂肪組織」とは、脂肪を含む組織である限り特に制限されず、皮下脂肪組織、骨髄中の脂肪組織、内臓脂肪組織等が挙げられるが、脂肪組織を供給する脊椎動物に対する侵襲性が比較的低く、採取も比較的容易である点で、皮下脂肪組織が好ましく挙げられる。
【００２２】
本明細書における「間質血管細胞群」とは、脊椎動物の脂肪組織の細胞のうち、成熟脂肪細胞以外の細胞を意味する。間質血管細胞群には、通常、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、間質細胞、血管内皮細胞、血液に関する細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞などの細胞が含まれる。かかる「間質血管細胞群」は、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去することによって得ることができる。
【００２３】
上記の「脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される１種又は２種以上の細胞」としては、脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞（mesenchymal stem cell）、脂肪前駆細胞（preadipocytesあるいはadipose progenitor cells）及び間質細胞（stromal cell）を含む間質血管細胞群（stromal vascular fraction）から選択される１種又は２種以上の細胞である限り特に制限されないが、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株をより効率的に製造する観点から、脂肪前駆細胞のみである細胞集団よりも、脂肪前駆細胞と、間葉系幹細胞及び／又は間質細胞とを少なくとも含む細胞集団であることが好ましく、脂肪前駆細胞、間葉系幹細胞及び間質細胞を少なくとも含む細胞集団であることがより好ましく、さらに調製が簡便であることから、間質血管細胞群の細胞集団であることがさらに好ましい。
【００２４】
また、上記の「脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される１種又は２種以上の細胞」の好適な態様として、脊椎動物の脂肪組織の細胞を分散して得られる間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される１種又は２種以上の細胞が挙げられ、中でも、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去することにより得られる細胞集団（細胞集団Ａ）が好ましく挙げられる。かかる細胞集団Ａから、血管内皮細胞、及び／又は、血液に関する細胞をさらに除去することにより得られる細胞集団を用いてもよい。前述の脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から成熟脂肪細胞等を除去することにより得られる細胞（細胞集団Ａ）は、間質血管細胞群の細胞集団であり、間質血管細胞群には、通常、脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、間質細胞、血管内皮細胞、血液に関する細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞などの細胞が含まれている。
【００２５】
上記の「脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で脊椎動物の脂肪組織を処理する」方法としては、例えば、該酵素を含む溶液に脊椎動物の脂肪組織を浸漬して、例えば３０分間〜３時間程度インキュベートする方法が挙げられる。
【００２６】
上記の「脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素」としては、脊椎動物の脂肪組織に作用させることによって、脊椎動物の脂肪組織の細胞を分散できる酵素である限り特に制限されず、例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、カゼイナーゼ、クロストリパイン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ディスパーゼ、サーモリシン、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、パンクレアチン、エラスターゼ及びパパインからなる群から選択される１種又は２種以上の酵素が挙げられ、中でも、コラゲナーゼ、トリプシン、カゼイナーゼ及びクロストリパインからなる群から選択される１種又は２種以上の酵素が好ましく挙げられ、市販されているコラゲナーゼ（タイプＩ）や、コラゲナーゼ（タイプII）がより好ましく挙げられ、コラゲナーゼ（タイプII）がさらに好ましく挙げられる。また、上記の「脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素」には、少なくともコラゲナーゼが含まれていることが好ましい。
【００２７】
上記の「脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去する」方法としては、かかる細胞集団から成熟脂肪細胞を除去することができる方法である限り特に制限されないが、前述の細胞集団を含む懸濁液を遠心分離した際に沈殿する細胞集団（細胞ペレット）を回収する方法が好ましく挙げられる。成熟脂肪細胞は脂肪を多く含んでいるため比重が軽く、遠心分離した際に上清の上部に浮遊するので、かかる遠心分離で沈殿した細胞ペレットを回収すれば、成熟脂肪細胞を除去することができる。また、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、血管内皮細胞や、平滑筋細胞や、線維芽細胞を除去する方法としては、かかる細胞集団からそれらの細胞を除去することができる方法である限り特に制限されないが、例えば血管内皮細胞の表面マーカーとして知られているＣＤ３１が陰性の細胞を選択すること（又は、ＣＤ３１が陽性の細胞を除去すること）により、細胞集団から血管内皮細胞を除去する方法が挙げられ、細胞集団から血液に関連する細胞を除去する方法としては、ＣＤ４５（赤血球及び血小板以外の造血細胞の表面マーカー）陰性及びＴｅｒ１１９（赤血球やその前駆細胞の表面マーカー）陰性の細胞を選択すること（又は、ＣＤ４５陽性及びＴｅｒ１１９陽性の細胞を除去すること）により、細胞集団から血液に関連する細胞を除去する方法が挙げられる。また、細胞表面マーカーではないが、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）が陰性であることを指標にすると、脊椎動物の脂肪組織に含まれていた死細胞を排除できるため好ましい。７−ＡＡＤは、死細胞のＤＮＡ鎖にインターカレートし、４８８ｎｍの励起光により赤色蛍光を発する。
【００２８】
上記の沈殿した細胞ペレット（細胞集団Ａ）は間質血管細胞群の細胞であり、間質血管細胞群には、通常、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、間質細胞（ストローマ細胞）、血管内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞などが含まれているが、成熟脂肪細胞に分化し得るのは、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、間質細胞である。したがって、成熟脂肪細胞への分化誘導を行う前などに、上記の沈殿した細胞ペレットから、これら３種以外の細胞のいずれか１種又は２種以上又はすべての種類を除去する工程をさらに有していてもよいが、有していなくてもよく、操作の簡便性の観点から、かかる工程を有していないことが好ましい。血管内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞は、間葉系幹細胞等と共に、成熟脂肪細胞への分化誘導に供したとしても、成熟脂肪細胞に分化することはなく、また、間葉系幹細胞等の成熟脂肪細胞への分化を妨げることもない。
【００２９】
上記工程（Ａ）において、脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される１種又は２種以上の細胞を成熟脂肪細胞に分化誘導する方法としては、脊椎動物の脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を含む間質血管細胞群から選択される１種又は２種以上の細胞を、脂肪細胞分化誘導物質を含む間葉系細胞培養用基本培養液中で培養する方法が好ましく挙げられる。間葉系幹細胞等を、脂肪細胞分化誘導物質を含む間葉系細胞培養用基本培養液中で培養する方法としては、かかる培養により、間葉系細胞を成熟脂肪細胞へ分化誘導し得る限り特に制限されず、例えば脂肪前駆細胞を成熟脂肪細胞へ分化誘導する通常の方法等と同様の方法、すなわち、脂肪細胞分化誘導物質を含む間葉系細胞培養用基本培養液中で出発細胞を培養する方法を用いることができる。
【００３０】
上記工程（Ａ）において、間葉系幹細胞等を、脂肪細胞分化誘導物質を含む間葉系細胞培養用基本培養液中で培養する条件等としては、例えば細胞外マトリックスでコーティングされた培養容器内で接着培養する方法を挙げることができ、培養温度として通常１２〜４５℃の範囲内、好ましくは１５〜３７℃の範囲内を挙げることができ、培養期間として、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株をより効率的に製造することと、より短期間で製造することとのバランスの観点から、５〜１６日間の範囲内、好ましくは７〜１４日間の範囲内、より好ましくは８〜１２日間の範囲内、さらに好ましくは９〜１１日間の範囲内、より好ましくは１０日間を挙げることができる。なお、かかる培養において、間葉系幹細胞等は継代しなくてもよいが、継代してもよい。また、上記の細胞外マトリックスとしては、コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ラミニンから選択される１種又は２種以上の成分が挙げられ、かかる成分を含むBD Matrigel（登録商標）（BD Biosciences社製）などを用いることもできる。
【００３１】
上記の脂肪細胞分化誘導物質としては、成熟脂肪細胞に分化誘導し得る細胞を、成熟脂肪細胞に分化させる作用又はその作用を補助する作用を有している限り特に制限されず、例えば、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インスリン及び血清からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられ、成熟脂肪細胞へのより優れた分化誘導効率を得る観点から、中でも、「血清とデキサメタゾンの組合せ」、「血清とデキサメタゾンを少なくとも含む脂肪細胞分化誘導物質の組合せ」、「血清とイソブチルメチルキサンチンの組合せ」、「血清とイソブチルメチルキサンチンを少なくとも含む脂肪細胞分化誘導物質の組合せ」が好ましく挙げられ、中でも、「血清とデキサメタゾンとインスリンの組合せ」、「血清とデキサメタゾンとインスリンを少なくとも含む脂肪細胞分化誘導物質の組合せ」、「血清とイソブチルメチルキサンチンとインスリンの組合せ」、「血清とイソブチルメチルキサンチンとインスリンを少なくとも含む脂肪細胞分化誘導物質の組合せ」、「血清とデキサメタゾンとイソブチルメチルキサンチンの組合せ」、「血清とデキサメタゾンとイソブチルメチルキサンチンを少なくとも含む脂肪細胞分化誘導物質の組合せ」がより好ましく挙げられ、中でも、「血清とデキサメタゾンとイソブチルメチルキサンチンとインスリンの組合せ」、「血清とデキサメタゾンとイソブチルメチルキサンチンとインスリンを少なくとも含む脂肪細胞分化誘導物質の組合せ」がさらに好ましく挙げられる。脂肪細胞分化誘導物質や、該物質を含む間葉系細胞培養用基本培養液は、市販されているものを用いてもよいし、かかる培養液は、間葉系細胞培養用基本培養液に脂肪細胞分化誘導物質を添加して調製した培養液を用いてもよい。脂肪細胞分化誘導物質を含む市販の培養液としては、Adipocyte Differentiation Medium培養液（Cell Applications社製）が好ましく挙げられる。なお、上に列挙した脂肪細胞分化誘導物質以外の物質であって、成熟脂肪細胞に分化させる作用を補助する作用を有する物質として、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、インドメタシン等が挙げられる。
【００３２】
上記の脂肪細胞分化誘導物質の培養液中の濃度としては、間葉系幹細胞等を成熟脂肪細胞に分化誘導し得る限り特に制限されないが、通常、デキサメタゾン濃度として、０．１〜１０μＭの範囲内、好ましくは０．５〜２．５μＭの範囲内が挙げられ、イソブチルメチルキサンチン濃度として、１０〜１０００μＭの範囲内、好ましくは２５０〜７５０μＭの範囲内が挙げられ、インスリン濃度として、０．１〜１０μＭの範囲内、好ましくは０．５〜２．５μＭの範囲内が挙げられ、血清濃度として、１〜２０重量％の範囲内、好ましくは５〜１５重量％の範囲内、より好ましくは７〜１３重量％の範囲内が挙げられる。
【００３３】
本明細書における「間葉系細胞培養用基本培養液」としては、その培養液で少なくとも１種の間葉系細胞を培養することにより、その間葉系細胞を増殖し得る培養液であれば特に制限されないが、調製が容易であり、ロットごとのばらつきを防ぐ点から化学合成培養液が好ましく、１又は２種類以上の糖（類）、１又は２種類以上の無機塩（類）、１又は２種類以上のアミノ酸（類）、及び１又は２種類以上のビタミン（類）、及び、任意で１又は２種類以上のその他成分を含むことが好ましい。
【００３４】
上記糖類としては、具体的には、グルコース、マンノース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類や、スクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類を挙げることができるが、中でもグルコースが特に好ましく、これら糖類は、１又は２以上組み合わせて添加することもできる。
【００３５】
上記無機塩類としては、具体的には、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸銅五水和物、硝酸鉄(III)九水和物、硫酸鉄(II)七水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、亜セレン酸ナトリウム五水和物、硫酸亜鉛七水和物から選ばれる１種又は２種以上の無機塩（類）を挙げることができる。
【００３６】
上記アミノ酸類としては、具体的には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等から選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸（類）、好ましくはＬ−体のアミノ酸とそれらの誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができる。例えば、上記アルギニンとしては、Ｌ−塩酸アルギニン、Ｌ−アルギニン一塩酸塩等のアルギニンの派生物を挙げることができ、上記アスパラギン酸としては、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ−アスパラギン酸一水和物、Ｌ−アスパラギン酸カリウム、Ｌ−アスパラギン酸マグネシウム等のアスパラギン酸の派生物を挙げることができ、上記システインとしては、Ｌ−システイン二塩酸塩、Ｌ-システイン塩酸塩一水和物等のシステインの派生物や、Ｌ−リジン塩酸塩等のリジンの派生物を挙げることができ、上記グルタミン酸としては、Ｌ−グルタミン酸一ナトリウム塩等のグルタミンの派生物を挙げることができ、上記アスパラギンとしては、Ｌ−アスパラギン一水和物等のアスパラギンの派生物を挙げることができ、上記チロシンとしては、Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物等のチロシンの派生物を挙げることができ、上記ヒスチジンとしては、ヒスチジン塩酸塩、ヒスチジン塩酸塩一水和物等のヒスチジンの派生物を挙げることができ、上記リジンとしては、Ｌ−リジン塩酸塩等のリジンの派生物を挙げることができる。
【００３７】
上記ビタミン類としては、具体的には、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、アスコルビン酸から選択される１種又は２種以上のビタミン（類）と、これらの成分各々の誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物を挙げることができる。例えば、上記コリンとしては、塩化コリン等のコリンの派生物を挙げることができ、ナイアシンとしては、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ニコチニックアルコール等のナイアシンの派生物を挙げることができ、パントテン酸としては、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウム、パンテノール等のパントテン酸の派生物を挙げることができ、ピリドキシンとしては、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、リン酸ピリドキサール、ピリドキサミン等のピリドキシンの派生物を挙げることができ、チアミンとしては、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミン、ベンフォチアミン等のチアミンの派生物等を挙げることができ、アスコルビン酸としては、アスコルビン酸２−リン酸エステル（Ascorbic acid 2-phosphate）、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、リン酸アスコルビルアミノプロピル、アスコルビン酸リン酸ナトリウム等のアスコルビン酸の派生物を挙げることができる。
【００３８】
上記その他成分としては、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質、ピルビン酸、及びその誘導体及びそれらの塩並びにそれらの水和物などの派生物、フェノールレッドなどを挙げることができ、上記抗生物質の派生物としては、ペニシリンＧナトリウムや硫酸ストレプトマイシン、あるいは、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液を好ましく挙げることができ、ピルビン酸の派生物としてはピルビン酸ナトリウムを好ましく挙げることができる。
【００３９】
上記間葉系細胞培養用基本培養液の具体例としては、市販のダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培養液（ＩＭＤＭ）、ＲＰＭＩ １６４０培養液、最小必須培養液（ＭＥＭ）、イーグル基礎培養液（ＢＭＥ）、Ｆ１２培養液等の公知の化学合成培養液や、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液（ＤＭＥＭとＦ１２培養液を１：１で混合した培養液）等のこれらの培養液のいずれか２以上を適当な割合で混合した培養液や、これらのいずれかの培養液に、ペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質；及び、追加のアミノ酸（好ましくは非必須アミノ酸）；からなる群から選択される１種又は２種以上の物質をさらに添加した培養液を好ましく挙げることができ、特にＤＭＥＭやＩＭＤＭやＲＰＭＩ １６４０培養液に抗生物質（好ましくはペニシリンＧナトリウム、硫酸ストレプトマイシン、あるいは、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液）をさらに添加した培養液をより好ましく挙げることができ、中でも、ＤＭＥＭに抗生物質（好ましくはペニシリンＧナトリウム、硫酸ストレプトマイシン、あるいは、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液）をさらに添加した培養液を特に好ましく挙げることができる。
【００４０】
本発明において特に好適な間葉系細胞培養用基本培養液としては、後述の組成のＤＭＥＭに対して、１００Ｕ／ｍＬ（最終濃度）のペニシリン−ストレプトマイシン溶液を添加した培養液（以下、「本発明における特に好適な基本培養液」と表示する。）や、本発明における特に好適な基本培養液における各成分の濃度に対して、各成分ごとに独立に７０％〜１３０％の範囲内の割合の濃度の各成分を含む培養液を挙げることができる。
【００４１】
（ＤＭＥＭの組成）
２００ｍｇ／Ｌ 無水塩化カルシウム、０．１ｍｇ／Ｌ Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ、２００ｍｇ／Ｌ 塩化カリウム、９７．６７ｍｇ／Ｌ 無水硫酸マグネシウム、６４００ｍｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、３７００ｍｇ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム、１２５ｍｇ／Ｌ リン酸二水素ナトリウム一水和物、４５００ｍｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、１５ｍｇ／Ｌ フェノールレッド、１１０ｍｇ／Ｌ ピルビン酸ナトリウム、８４ｍｇ／Ｌ Ｌ−塩酸アルギニン、６３ｍｇ／Ｌ Ｌ−シスチン二塩酸塩、５８４ｍｇ／Ｌ Ｌ−グルタミン、３０ｍｇ／Ｌグリシン、４２ｍｇ／Ｌ Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、１０５ｍｇ／Ｌ Ｌ−イソロイシン、１０５ｍｇ／Ｌ Ｌ−ロイシン、１４６ｍｇ／Ｌ Ｌ−リジン塩酸塩、３０ｍｇ／ＬＬ−メチオニン、６６ｍｇ／Ｌ Ｌ−フェニルアラニン、４２ｍｇ／Ｌ Ｌ−セリン、９５ｍｇ／Ｌ Ｌ−スレオニン、１６ｍｇ／Ｌ Ｌ−トリプトファン、１０４ｍｇ／Ｌ Ｌ−チロシン二ナトリウム二水和物、９４ｍｇ／Ｌ Ｌ−バリン、４ｍｇ／Ｌ Ｄ−パントテン酸カルシウム、４ｍｇ／Ｌ 塩化コリン、４ｍｇ／Ｌ 葉酸、７．２ｍｇ／Ｌ ｉ−イノシトール、４ｍｇ／Ｌ ニコチン酸アミド、４ｍｇ／Ｌ ピリドキシン塩酸塩、０．４ｍｇ／Ｌ リボフラビン、４ｍｇ／Ｌ 塩酸チアミン。
【００４２】
上記工程（Ａ）により得られる成熟脂肪細胞（すなわち、成熟脂肪細胞を含む成熟脂肪細胞集団）は、脱分化誘導した場合に脱分化が比較的生じ易い易脱分化成熟脂肪細胞（すなわち、易脱分化成熟脂肪細胞を含む易脱分化成熟脂肪細胞集団）である。本明細書における「易脱分化成熟脂肪細胞集団」とは、従来法（特許文献２；日本特許第５０５５６１１号公報）のように、脊椎動物の脂肪組織から採取した成熟脂肪細胞集団と比較して、細胞株が得られる割合が１．５倍以上である成熟脂肪細胞集団を意味し、好ましくは２倍以上、より好ましくは４倍以上、さらに好ましくは６倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１５倍以上である成熟脂肪細胞集団を含む。なお、上記の「細胞株が得られる割合」とは、特定量の成熟脂肪細胞集団から得られる細胞株の割合を表し、かかる割合には、例えば、「脱分化誘導に用いる成熟脂肪細胞の重量」に対する「得られる細胞株の重量」の割合（比率）が好ましく含まれる。
【００４３】
（工程Ｂ）
上記工程（Ｂ）としては、工程（Ａ）で得られた成熟脂肪細胞（易脱分化成熟脂肪細胞）を脱分化誘導して、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を得る工程である限り特に制限されない。かかる工程は、生体外（ex vivo）又はin vitroでの工程である。
【００４４】
工程（Ｂ）で用いる成熟脂肪細胞は、工程（Ａ）での分化誘導により得られた成熟脂肪細胞である。かかる成熟脂肪細胞は、例えば、工程（Ａ）の培養懸濁液を遠心分離して、上清の上部に浮遊する細胞を回収することにより得ることができる。成熟脂肪細胞は脂肪を多く含んでいるため比重が軽く、遠心分離した際に上清の上部に浮遊するからである。
【００４５】
上記工程（Ｂ）において、工程（Ａ）で得られた成熟脂肪細胞（易脱分化成熟脂肪細胞）を脱分化誘導して、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を得る方法としては、かかる成熟脂肪細胞を脱分化誘導して、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を得る方法である限り特に制限されないが、かかる成熟脂肪細胞をいわゆる天井培養する方法が好ましく挙げられる。天井培養とは、培養液が充満した培養容器（好ましくは培養フラスコ）の内側上面（天井面）に細胞を接着又は浮遊させて（好ましくは接着させて）培養する方法であり、脂肪を多く含んでいるため比重が軽く、培養液中で浮遊するという成熟脂肪細胞の性質を利用して、該細胞を培養する方法である。
【００４６】
成熟脂肪細胞を脱分化誘導培養する際の培養液としては、細胞外マトリックスを含む間葉系細胞培養用基本培養液が挙げられ、かかる細胞外マトリックスとしては、コラーゲン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、ラミニン、血清（ＦＢＳ等）から選択される１種又は２種以上の成分が挙げられ、かかる成分を含むBD Matrigel（登録商標）（BD Biosciences社製）などを用いることもできる。成熟脂肪細胞を脱分化誘導培養する際の培養液におけるＦＢＳ等の血清は、成熟脂肪細胞を培養容器の天井面に接着させるための接着因子としてのみ用いてもよいし、そのための接着因子としてのみ用いなくてもよい。成熟脂肪細胞を脱分化誘導培養する際の培養液は、ＦＢＳ等の血清を含んでいなくてもよいが、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株をより効率的に製造する観点から、血清以外の細胞外マトリックスと共に、又は、血清以外の細胞外マトリックスを伴わずに、ＦＢＳ等の血清を含んでいることが好ましい。かかる培養液がＦＢＳ等の血清を含んでいる場合の血清濃度としては、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株が得られる限り特に制限されないが、３〜３０重量％の範囲内が挙げられ、７〜２５重量％の範囲内が好ましく挙げられ、７〜１３重量％の範囲内がより好ましく挙げられる。
【００４７】
上記工程（Ｂ）において、成熟脂肪細胞を、細胞外マトリックスを含む間葉系細胞培養用基本培養液中で培養する条件等のうち、天井培養以外の条件等について述べると、培養温度として通常１２〜４５℃の範囲内、好ましくは１５〜３７℃の範囲内を挙げることができ、培養期間として、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株をより効率的に製造することと、より短期間で製造することとのバランスの観点から、２〜２８日間の範囲内、好ましくは４〜２１日間の範囲内、より好ましくは５〜１４日間の範囲内、さらに好ましくは６〜１０日間の範囲内、より好ましくは７日間を挙げることができる。なお、かかる培養において、成熟脂肪細胞等は継代しなくてもよいが、継代してもよい。
【００４８】
上記工程（Ｂ）において天井培養を行った培養液から、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を単離してもよいし、単離しなくてもよいが、単離することが好ましい。かかる天井培養を継続すると、株化した脂肪組織由来間葉系細胞株は活発に増殖する一方で、成熟脂肪細胞は次第に減少するので、脂肪組織由来間葉系細胞株を多く含む細胞集団を得ることができるし、例えば、天井培養を１４日間くらい継続すると、脂肪組織由来間葉系細胞株をきわめて多く含む細胞集団を得ることができる。
【００４９】
なお、上記工程（Ｂ）において天井培養を行うことには、工程（Ａ）で得られた成熟脂肪細胞（易脱分化成熟脂肪細胞）が培養容器の天井面に接着した後、その接着面が培養容器の下側となるように培養容器を配置して培養を継続することも便宜上含まれるが、工程（Ａ）で得られた成熟脂肪細胞（易脱分化成熟脂肪細胞）が培養容器の天井面に接着した状態で培養を継続し、その接着面が培養液の下側となるように培養容器を配置した培養を行わずに脂肪組織由来間葉系細胞株を得てもよい。
【００５０】
＜脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株＞
本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株としては、本発明の細胞株の製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株である限り特に制限されない。本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株は、分化誘導作用を持たない通常の間葉系細胞培養用基本培養液で培養したときに自発的な分化を起こさず、長期継代培養が可能であり、かつ、長期継代培養後も増殖能及び中胚葉系細胞（巨核球・血小板、骨芽細胞、軟骨及び脂肪細胞からなる群から選択される１種又は２種以上）への分化能を維持している。例えば、ヒトの皮下脂肪組織から製造した本発明の脂肪組織由来間葉系細胞株は、２０代目においても増殖能を維持しており、また、ダブリングタイムは２３時間であることが観察されている。
【００５１】
本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株は、従来法（特許文献２；日本特許第５０５５６１１号公報）で作製した脂肪組織由来間葉系細胞株よりも、中胚葉系細胞（好ましくは巨核球・血小板）への分化誘導効率が顕著に高い。よって、本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株は、中胚葉系細胞へ分化誘導し易い脂肪組織由来間葉系細胞株（易分化誘導脂肪組織由来間葉系細胞株）とも言える。本明細書における「易分化誘導脂肪組織由来間葉系細胞株」とは、従来法（特許文献２；日本特許第５０５５６１１号公報）で作製した脂肪組織由来間葉系細胞株よりも、いずれか１種の中胚葉系細胞（好ましくは巨核球・血小板）への分化誘導効率が１．５倍以上である脂肪組織由来間葉系細胞株を意味し、好ましくは２倍以上、より好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは３倍以上である脂肪組織由来間葉系細胞株が含まれる。
【００５２】
本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株は、以下の間葉系細胞の表面マーカー群から選択される１種又は２種以上（好ましくは３種以上、より好ましくは５種以上、さらに好ましくは７種以上、より好ましくは８種又は９種、最も好ましくは９種）の表面マーカーを発現しており、かつ、以下の血液細胞の表面マーカー群から選択される１種又は２種以上（好ましくは３種以上、より好ましくは５種以上、さらに好ましくは７種以上、より好ましくは８種又は９種、最も好ましくは９種）の表面マーカーを発現していないことが好ましい。
葉系細胞の表面マーカー群：ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＡＢＣ；
血液細胞の表面マーカー群：ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ；
【００５３】
国際細胞治療学会では間葉系幹細胞の定義として、（Ａ）付着細胞であること、（Ｂ）骨、軟骨、脂肪に分化することができること、（Ｃ）間葉系細胞の表面マーカーを発現し、血液細胞の表面マーカーを発現しないこと、の条件を挙げている。本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株のうち、好ましい態様の細胞株は、これら（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）の条件を充たしている。
【００５４】
＜中胚葉系細胞の製造方法＞
本発明の中胚葉系細胞の製造方法としては、本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を中胚葉系細胞に分化誘導して、中胚葉系細胞を得る工程を有している限り特に制限されない。かかる中胚葉系細胞としては、巨核球及び／又は血小板（巨核球・血小板）、骨芽細胞、軟骨、脂肪細胞などが挙げられる。
【００５５】
本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を中胚葉系細胞に分化誘導する方法としては、間葉系細胞を中胚葉系細胞に分化誘導する公知の方法を用いることができ、中胚葉系細胞のそれぞれの種類の細胞に分化誘導する作用が知られている物質を含む間葉系細胞培養用基本培養液において、本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を培養する方法を挙げることができる。
【００５６】
巨核球・血小板に分化誘導する作用を有する培養液としては、ＭＫＬＩ培養液（megakaryocyte lineage induction medium）（非特許文献５）や、鉄イオン及び鉄輸送体を含む間葉系細胞培養用基本培養液（特許文献１）（好ましくは、鉄結合型トランスフェリンを含む間葉系細胞培養用基本培養液；特許文献１）が挙げられる。また、骨芽細胞に分化誘導する作用を有する培養液としては、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン及び血清を含む間葉系細胞培養用基本培養液（国際公開２０１２／０２９８６３号）が挙げられ、市販の骨芽細胞分化誘導培養液として、cell applications社製のOsteoblast Differentiation Mediumが挙げられる。また、軟骨に分化誘導する作用を有する培養液としては、トランスフォーミング増殖因子β３（ＴＧＦ−β３）、デキサメタゾン及び血清を含む間葉系細胞培養用基本培養液が挙げられ、市販の軟骨分化誘導培養液として、lonza社製のhMSC Mesenchymal Stem Cell Chondrocyte Differentiation Mediumが挙げられる。また、脂肪細胞に分化誘導する作用を有する培養液としては、前述したように、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インスリン及び血清からなる群から選択される１種又は２種以上の脂肪細胞分化誘導物質を含む間葉系細胞培養用基本培養液が挙げられ、市販の脂肪細胞分化誘導培養液として、cell applications社製のAdipocyte Differentiation Mediumが挙げられる。
【００５７】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例の記載における培地成分の濃度はいずれも、培地における最終濃度を表す。
【実施例１】
【００５８】
［脂肪組織由来間葉系細胞株の作製］
ヒトから皮下脂肪組織片を単離後、コラゲナーゼ（collagenase type II； sigma社製
）を加え３７℃１時間インキュベーションし、細胞懸濁液を得た。かかる細胞懸濁液を遠心分離したところ、比重の軽い成熟脂肪細胞は上清に浮遊し、それ以外の種類の細胞は細胞ペレットとして沈殿した。細胞ペレットには、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、間質細胞（ストローマ細胞）、血管内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞などが含まれている。この後の実験には細胞ペレットの細胞を用いた。培養ディッシュに入れたAdipocyte Differentiation Medium培養液（Cell Applications社製）にて、前述の細胞ペレットの細胞を３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で１０日間培養した。培養後の細胞には、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、間質細胞を含む間質血管細胞群から分化誘導された成熟脂肪細胞（易脱分化成熟脂肪細胞）が多く含まれている。培養後の細胞を、トリプシンを用いて培養ディッシュからはがし、その細胞にトリプシン及びＤＭＥＭ培養液（Dulbecco's Modified Eagle's Medium、ライフテクノロジー社製）を加えて遠心分離器にかけ、その上清に浮いてくる成熟脂肪細胞（易脱分化成熟脂肪細胞）を回収した。２０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液を十分量入れた培養フラスコに、前述の易脱分化成熟脂肪細胞を加え、その細胞を、培養液が充満した培養フラスコの内側の上面に浮遊、付着させて培養した（いわゆる「天井培養」）。かかる天井培養は、３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で７日間行った。このように培養することにより、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株が得られた。このヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を位相差顕微鏡像で観察した結果を図１に示す。図１から分かるように、かかる細胞株は、繊維芽細胞様の形態を有しており、培養ディッシュ上に付着増殖することが示された。国際細胞治療学会では間葉系幹細胞の定義として、（Ａ）付着細胞であること、（Ｂ）骨、軟骨、脂肪に分化することができること、（Ｃ）間葉系細胞の表面マーカーを発現し、血液細胞の表面マーカーを発現しないこと、の条件を挙げている。図１の結果から、本発明におけるヒト脂肪組織由来間葉系細胞株は、間葉系幹細胞の上記定義の条件のうち、（Ａ）を充たしていることが示された。【００５９】
なお、従来法（特許文献２）では、脂肪組織の採取から脂肪前駆細胞株を作製するのに２ヶ月強の期間を要していたが、本発明のこの方法では、脂肪組織を採取してから１ヶ月弱で多くの量の脂肪組織由来間葉系細胞株を作製することができた。なお、得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液（脂肪前駆細胞培養用基本培養液）で継代培養を行った。【００６０】
なお、同じ大きさの皮下脂肪組織片（１ｃｍ平方）から脂肪前駆細胞株を作製した場合に、同じ作製期間（例えば２ヶ月間）当たりに得られる細胞株の量（細胞数）を、本発明の方法（易脱分化成熟脂肪細胞を作製してから、該細胞を天井培養して株化する方法）と、従来法（脂肪組織から採取した成熟脂肪細胞を天井培養して株化する方法（特許文献２；日本特許第５０５５６１１号公報））とで比較したところ、本発明の方法では従来法と比較して約１５倍もの細胞株が得られた。このことは、本発明の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法（樹立方法）が、脊椎動物の脂肪組織から間葉系細胞株を顕著に効率的に製造できることを示している。また、得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株は、２０代目においても増殖能を維持しており、また、ダブリングタイムは２３時間であることが観察されている。【００６１】
なお、実施例１では、ヒトの皮下脂肪組織を用いているが、本発明者らは、マウスの皮下脂肪組織を用いた場合にも、同様の方法で脂肪組織由来間葉系細胞株が得られることを確認した。
【実施例２】
【００６２】
［脂肪組織由来間葉系細胞株の骨芽細胞への分化誘導］
上記の実施例１で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を、培養ディッシュに入れた骨芽細胞分化誘導培養液（Cell Applications社製）にて、３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で２１日間培養した。得られた細胞のアルカリフォスファターゼ活性を、その基質であるブロモクロロインドリルリン酸・ニトロブルーテトラゾリウムを添加して確認したところ、青紫色の発色（ただし、図面では黒っぽい色として表される）が認められた（図２の上から１段目の右パネル）。このことから、骨芽細胞への分化が確認された。【００６３】
また、前述の培養後の細胞をアリザリンレッドで染色して、細胞の石灰化を確認したところ、赤色の発色（ただし、図面では黒っぽい色として表される）が認められた（図２の上から２段目の右パネル）。このことから、骨芽細胞における石灰化が確認された。【００６４】
以上のことから、本発明の製造方法により製造された脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株は、骨芽細胞への分化能を有していることが確認された。【００６５】
なお、実施例２では、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を用いているが、本発明者らは、マウス脂肪組織由来間葉系細胞株を用いた場合にも、骨芽細胞への分化能を有していることを確認した。
【実施例３】
【００６６】
［脂肪組織由来間葉系細胞株の脂肪細胞への分化誘導］
上記の実施例１で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を、培養ディッシュに入れたAdipocyte Differentiation Medium培養液（Cell Applications社製）にて、３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で７日間培養した。得られた細胞をオイルレッドＯで染色して、脂肪球の有無を確認したところ、赤色の発色（ただし、図面では黒っぽい色として表される）が認められた（図２の上から３段目の右パネル）。このことから、成熟脂肪細胞への分化が確認された。このことから、本発明の製造方法により製造された脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株は、脂肪細胞への分化能を有していることが確認された。【００６７】
なお、実施例３では、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を用いているが、本発明者らは、マウス脂肪組織由来間葉系細胞株を用いた場合にも、脂肪細胞への分化能を有していることを確認した。
【実施例４】
【００６８】
［脂肪組織由来間葉系細胞株の軟骨細胞への分化誘導］
上記の実施例１で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を、培養ディッシュに入れたChondrogenic Differentiation medium培養液（PromoCell社製）にて、３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で７日間培養した。得られた細胞をアリシアンブルーで染色して、軟骨細胞に特徴的な細胞外マトリクスの有無を確認したところ、青色の発色（ただし、図面では黒っぽい色として表される）が認められた（図２の上から３段目の右パネル）。このことから、軟骨細胞への分化が確認された。このことから、本発明の製造方法により製造された脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株は、軟骨細胞への分化能を有していることが確認された。【００６９】
上記実施例３及び４の結果から、上記の実施例１で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株は、国際細胞治療学会における間葉系幹細胞の定義の「（Ｂ）骨、軟骨、脂肪に分化することができること」という条件を充たしていることが分かった。
【実施例５】
【００７０】
［脂肪組織由来間葉系細胞株における間葉系細胞や血液細胞の表面マーカーの発現］
上記の実施例１で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株が、国際細胞治療学会における間葉系幹細胞の定義の「（Ｃ）間葉系細胞の表面マーカーを発現し、血液細胞の表面マーカーを発現しないこと」という条件を充たしているかどうかを調べるために、間葉系細胞の表面マーカー（ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＡＢＣ）や、血液細胞の表面マーカー（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ）を特異的に認識する抗体を用いて、前述の細胞における各表面マーカーの発現をフローサイトメトリー法にて解析した。また、ネガティブコントロールとして、アイソタイプコントロール抗体を用いて、同様のフローサイトメトリー法を行った。なお、表面マーカーを特異的に認識する抗体のうち、抗ＣＤ２９抗体、抗ＣＤ４２ｂ抗体、抗ＣＤ７１抗体については、ＢＤファーミンジェン社製のものを用い、抗ＣＤ１０５抗体については、ベックマンコールター社製のものを用い、他の抗表面マーカー抗体についてはバイオレジェンド社製のものを用いた。前述のフローサイトメトリーの結果を、図３に示す。【００７１】
図３の下段の各パネルに示されるように、血液細胞の表面マーカーについては、表面マーカー抗体を用いた場合とアイソタイプコントロール抗体を用いた場合でシグナルの差は見られなかった。一方、図３の上段の各パネルに示されるように、間葉系細胞の表面マーカーについては、表面マーカー抗体を用いた場合は、アイソタイプコントロール抗体を用いた場合と比較して、強い蛍光シグナルが確認された。これらの結果から、上記の実施例１で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株は、国際細胞治療学会における間葉系幹細胞の定義の「（Ｃ）間葉系細胞の表面マーカーを発現し、血液細胞の表面マーカーを発現しないこと」という条件を充たしていることが分かった。【００７２】
上記実施例１〜５の結果から、上記の実施例１で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株は、国際細胞治療学会における間葉系幹細胞の定義である、（Ａ）付着細胞であること、（Ｂ）骨、軟骨、脂肪に分化することができること、（Ｃ）間葉系細胞の表面マーカーを発現し、血液細胞の表面マーカーを発現しないこと、の３条件をすべて充たしていることが示された。
【実施例６】
【００７３】
［脂肪組織由来間葉系細胞株の巨核球及び／又は血小板への分化誘導］
培養ディッシュにコラーゲンをコーティングし、そこに培養培地を添加した。培養培地としては、造血幹細胞を巨核球、血小板へと分化誘導し得る培地として知られているＭＫＬＩ培養液（megakaryocyte lineage induction medium）を用いた。該ＭＫＬＩ培地は、ＩＭＤＭ培養液（Iscove's Modified Dulbecco's Medium、ライフテクノロジー社製）に、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ライフテクノロジー社製）、１００Ｕ／ｍＬ  ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（ライフテクノロジー社製）、０．５％  ＢＳＡ（シグマ社製）、４μｇ／ｍＬ  ＬＤＬコレステロール（シグマ社製）、２００μｇ／ｍＬ  鉄飽和トランスフェリン（シグマ社製）、１０μｇ／ｍＬ  インスリン（シグマ社製）、５０μＭ  ２−β−メルカプトエタノール（ライフテクノロジー社製）、２０μＭ  各ヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、及びＣＴＰ）（ライフテクノロジー社製）、及び５０ｎｇ／ｍＬ  ヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ、Stem Cell Technologies製）を添加し作製した。【００７４】
（特異的マーカーＣＤ４１及びＣＤ４２ｂの確認）
上記の実施例１で得られたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を、上記のＭＫＬＩ培養液にて、３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で７日間培養した。培養後の細胞集団を分取した後、該細胞集団におけるＣＤ４１及びＣＤ４２ｂ（巨核球や血小板の特異的マーカー）の陽性細胞の割合（％）を測定した。その結果を図４に示す。かかる測定は、ＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソチオシアネート）標識抗ＣＤ４１抗体又は、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）標識抗ＣＤ４２ｂ抗体で直接ラベルし、フローサイトメトリー法を用いて行った。かかる細胞集団におけるＣＤ４１陽性細胞の割合は７０．４±３．９％であり、ＣＤ４１陽性かつＣＤ４２ｂ陽性の細胞の割合は２３．６±２．４％であった。【００７５】
（核の倍数性の確認）
巨核球は分化が進んでくると、核の倍数性が増加することが知られている。そこで、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株をＭＫＬＩ培養液にて、３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で７日間培養して得られた細胞集団の核の倍数性（DNA Ploidy）を、萩原らの方法（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ.，２６，２２８〜２３５，１９９８）により測定した。すなわち、前述の細胞集団の細胞の核をプロピジウムイオダイド（ＰＩ）で染色した後、フローサイトメトリーで各細胞のＰＩの蛍光強度を測定し、各細胞におけるDNA Ploidyを算出した。その結果を図５に示す。図５から分かるように、４Ｎや８Ｎなどの多倍体化した細胞が認められた。【００７６】
（刺激による血小板機能の確認）
血小板においてフィブリノーゲンは、血液凝固等の作用に寄与しており、また、ＰＡＣ−１は、血小板活性化マーカーである。ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株をＭＫＬＩ培養液にて、３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で７日間培養して得られた細胞集団が、血小板の機能を有しているかを確認するために、フィブリノーゲン及びＰＡＣ−１の発現を測定した。かかる測定は、ＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソチオシアネート）標識抗フィブリノーゲン抗体又はＦＩＴＣ標識抗ＰＡＣ−１抗体で直接ラベルし、フローサイトメトリー法を用いて行った。また、コントロールとして、ＭＫＬＩ培養液で培養を開始する前のヒト脂肪組織由来間葉系細胞株についても同様のフローサイトメトリー法を行った。ＦＩＴＣ標識抗フィブリノーゲン抗体を用いたフローサイトメトリー法の結果を図６に示し、ＦＩＴＣ標識抗ＰＡＣ−１抗体を用いたフローサイトメトリー法の結果を図７に示す。図６及び図７から分かるように、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株をＭＫＬＩ培養液で培養して得られた細胞集団では、フィブリノーゲン及びＰＡＣ−１の発現の亢進が確認された。【００７７】
以上のことから、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株から巨核球・血小板への分化が確認された。このことから、本発明の製造方法により製造されたヒト脂肪組織由来間葉系細胞株は、巨核球・血小板への分化能を有していることが確認された。【００７８】
なお、実施例６では、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株を用いているが、本発明者らは、マウス脂肪組織由来間葉系細胞株を用いた場合にも、巨核球・血小板への分化能を有していることを確認した。
【実施例７】
【００７９】
［従来法（特許文献２）との収量等の比較］
特許文献２記載の方法にしたがって、ヒト脂肪組織由来間葉系細胞株（以下、「従来法による脂肪組織由来間葉系細胞株」と表示する。）を作製した。一方、実施例１で作製したヒト脂肪組織由来間葉系細胞株（以下、「本発明による脂肪組織由来間葉系細胞株」と表示する。）を用意した。これら２種の脂肪組織由来間葉系細胞株を同量ずつ分取し、それぞれ、ＭＫＬＩ培養液（培地）にて３７℃、ＣＯ２濃度５％条件下で７日間培養して、巨核球・血小板への分化誘導を行った。培養後の細胞集団を分取した後、該細胞集団におけるＣＤ４１及びＣＤ４２ｂ（巨核球や血小板の特異的マーカー）の陽性細胞の割合（％）を測定した。その結果、本発明による脂肪組織由来間葉系細胞株を用いると、従来法による脂肪組織由来間葉系細胞株を同量用いた場合と比較して、ＣＤ４１及びＣＤ４２ｂ（巨核球や血小板の特異的マーカー）の陽性細胞が３倍量得られた。この結果から、本発明による脂肪組織由来間葉系細胞株は、従来法による脂肪組織由来間葉系細胞株と比較して、巨核球・血小板への誘導効率が３倍高い細胞株であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明によれば、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法や、該製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株等を提供することができる。より詳細には、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を、より簡便、より短期間、かつ、より効率的に製造する方法や、該製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株等を提供することができる。
【図１】
2017094260.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月28日(2017.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を有することを特徴とする、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
（Ａ）脊椎動物の間質血管細胞群のうち、脂肪組織の間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞及び間質細胞を少なくとも含む細胞集団を成熟脂肪細胞に分化誘導する工程；
（Ｂ）工程（Ａ）で得られた成熟脂肪細胞を脱分化誘導して、脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を得る工程；
【請求項２】
細胞集団が、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去することにより得られる細胞集団であることを特徴とする請求項１に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項３】
脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団から、成熟脂肪細胞を除去することにより得られる細胞集団が、脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素で、脊椎動物の脂肪組織を処理して得られる細胞集団を含む懸濁液を遠心分離した際に沈殿する細胞集団であることを特徴とする請求項２に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項４】
工程（Ａ）における細胞集団を成熟脂肪細胞へ分化誘導する工程が、デキサメタゾン、イソブチルメチルキサンチン、インスリン及び血清からなる群から選択される１種又は２種以上の脂肪細胞分化誘導物質を含む間葉系細胞培養用基本培養液中で、前記細胞集団を培養する工程であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項５】
工程（Ｂ）における成熟脂肪細胞を脱分化誘導することが、成熟脂肪細胞を天井培養することであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項６】
脊椎動物の脂肪組織細胞を分散し得る酵素が、コラゲナーゼ、トリプシン、カゼイナーゼ、クロストリパイン、トリプシン−ＥＤＴＡ、ディスパーゼ、サーモリシン、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、パンクレアチン、エラスターゼ及びパパインからなる群から選択される１種又は２種以上の酵素であることを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項７】
脊椎動物が哺乳動物であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項８】
脂肪組織が皮下脂肪組織であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法により製造される脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株。
【請求項１０】
巨核球・血小板、骨芽細胞、軟骨及び脂肪細胞からなる群から選択される１種又は２種以上への分化能を有していることを特徴とする請求項９に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株。
【請求項１１】
以下の間葉系細胞の表面マーカー群から選択される１種又は２種以上の表面マーカーを発現しており、かつ、以下の血液細胞の表面マーカー群から選択される１種又は２種以上の表面マーカーを発現していないことを特徴とする請求項９又は１０に記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株。
間葉系細胞の表面マーカー群：ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＨＬＡ−ＡＢＣ；
血液細胞の表面マーカー群：ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４１、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＨＬＡ−ＤＲ；
【請求項１２】
脊椎動物の脂肪組織から採取した成熟脂肪細胞を脱分化誘導して得られた脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株と比較して、中胚葉系細胞への分化誘導効率が、１．５倍以上であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれかに記載の脊椎動物の脂肪組織由来間葉系細胞株を、中胚葉系細胞に分化誘導して、中胚葉系細胞を得る工程を有することを特徴とする中胚葉系細胞の製造方法。
【請求項１４】
中胚葉系細胞が、巨核球・血小板、骨芽細胞、軟骨又は脂肪細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の中胚葉系細胞の製造方法。
【国際調査報告】
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