(57)【要約】  大動物においてもノックアウト個体の安定的な量産を可能にする新規な手段が開示されている。本発明の方法は、異個体由来の配偶子を生産する非ヒト大型哺乳動物又は魚類（非ヒト動物）の作出方法であって、第１の非ヒト動物に由来する、nanos3遺伝子の機能が阻害されたゲノムを有する卵割期の胚に、第２の非ヒト動物に由来する少なくとも１個の多能性細胞を移植してキメラ胚を調製し、該キメラ胚を発生させて個体を得ることを含む。第２の非ヒト動物由来の多能性細胞として、所望の遺伝子がノックアウトされたゲノムを有する多能性細胞を用いた場合には、第１の非ヒト動物に所望の遺伝子がノックアウトされた生殖細胞を作らせることができるので、そのような非ヒト動物の交配により容易にノックアウト非ヒト動物を量産できる。
2016163386.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異個体由来の配偶子を生産する非ヒト大型哺乳動物又は魚類の作出方法であって、第１の非ヒト大型哺乳動物又は魚類に由来する、nanos3遺伝子の機能が阻害されたゲノムを有する卵割期の胚に、第２の非ヒト大型哺乳動物又は魚類に由来する少なくとも１個の多能性細胞を移植してキメラ胚を調製し、該キメラ胚を発生させて個体を得ることを含む、方法。
【請求項２】
nanos3遺伝子の機能の阻害が、相同組換えによるnanos3遺伝子のノックアウトにより行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記卵割期が2細胞期〜胚盤胞期である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記多能性細胞は、所望の遺伝的特性を有する第２の非ヒト大型哺乳動物又は魚類に由来する細胞であり、所望の遺伝的特性を有する異個体由来の配偶子を生産する非ヒト大型哺乳動物又は魚類を作出する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
所望の遺伝的特性は、人為的な遺伝的改変である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
人為的な遺伝的改変は、所望の遺伝子のノックアウトである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記多能性細胞は割球である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、異個体由来の配偶子を生産する非ヒト大型哺乳動物の作出方法であり、前記キメラ胚を非ヒト代理母に移植して産仔を得ることをさらに含む、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の非ヒト大型哺乳動物及び前記第２の非ヒト大型哺乳動物の少なくとも一方がウシである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法により作出された非ヒト大型哺乳動物又は魚類の雌個体から卵子を回収することを含む、非ヒト大型哺乳動物又は魚類の卵子の生産方法。
【請求項１１】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法により作出された非ヒト大型哺乳動物又は魚類の雄個体から精子を回収することを含む、非ヒト大型哺乳動物又は魚類の精子の生産方法。
【請求項１２】
請求項１０記載の方法により生産された卵子と、請求項１１記載の方法により生産された精子を受精して受精卵を得ることを含む、非ヒト大型哺乳動物又は魚類の受精卵の生産方法。
【請求項１３】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法により作出された雌雄の非ヒト大型動物又は魚類の後代を自然交配、人工授精又は体外授精により得ることを含む、非ヒト大型哺乳動物又は魚類の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異個体由来の配偶子を生産する非ヒト大型哺乳動物又は魚類の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の遺伝子機能を正確に解析するためには、目的とする遺伝子をノックアウト（KO）した生物の量産が不可欠である。遺伝子KOマウスは重要なモデル生物である。一般的にKOマウスは相同組換えを起こした胚性幹細胞（以下、ES細胞）を胚盤胞に注入することによって比較的容易に作り出される。【０００３】
しかしながら、ES細胞が樹立されていない牛や豚などを用いてKO動物を製造する場合、体細胞核移植（SCNT）技術が必要となる。これまでに羊、マウス、牛、山羊、豚および馬など、多くの種類のSCNT動物作出に関する研究が行われてきたが（非特許文献１〜５）、低受胎、流産、死産および生後直死などが高頻度で発生するため、安定的なKO大動物の量産は極めて困難な状況にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５６８６３５７号公報
【特許文献２】特許第５６８８８００号公報
【特許文献３】特開２０１４−１２１３２９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wilmut, I. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385, 810-813 (1997).
【非特許文献２】Wakayama, T. et al. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394, 369-374 (1999).
【非特許文献３】Kato, Y. et al. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science 282, 2095-2098 (1998).
【非特許文献４】Baguisi, A. et al. Y. Production of goats by somatic cell nuclear transfer. Nature Biotechnol 17, 456-461 (1999).
【非特許文献５】Onishi, A. et al. Pig cloned by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 289, 1188-1190 (2000).
【非特許文献６】Galli, C. et al. A cloned horse born to its dam twin. Nature 424, 635 (2003).
【非特許文献７】Kobayashi, T. et al. Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells. Cell 142, 787-799 (2010).
【非特許文献８】Usui, J. et al. Generation of kidney from pluripotent stem cells via blastocyst complementation. Am. J. Pathol 180, 2417-2426 (2012).
【非特許文献９】Matsunari, H. et al. Blastocyst complementation generates exogenic pancreas in vivo in apancreatic cloned pigs. Proc Natl Acad. Sci. USA 110, 4557-4562 (2013).
【非特許文献１０】Tsuda, M. et al. Conserved role of nanos proteins in germ cell development. Science 301, 1239-1241 (2003).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、大動物においてもノックアウト個体の安定的な量産を可能にする新規な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特定遺伝子をKOした初期胚と正常初期胚を混合し、混合胚（キメラ胚）を作製し発生させると、混合胚において、KO胚に由来する細胞の欠損部分を正常胚に由来する細胞が補完することが示されている（非特許文献６〜９、特許文献１〜３）。この技術は胚盤胞補完技術として知られている。一方、nanos3遺伝子は、始原生殖細胞で特異的に発現している生殖細胞分化関連遺伝子であるが、マウスにおいてnanos3をノックアウトすると生殖細胞（精子・卵子）が形成されなくなることが報告されている（非特許文献１０）。【０００８】
本願発明者らは、これらの技術に着目し、nonos3-KO/SCNT胚をホスト胚、特定遺伝子KO/SCNT胚由来細胞をドナー細胞としてキメラ胚を作出した場合、生まれた個体の精子や卵子はすべて特定遺伝子がKO状態となり得ること、このようにして作出された雌雄を交配（人工授精や体外受精）させることで安定的に特定遺伝子KO大動物を得られる可能性があることを見出し、大動物の代表例としてウシを用いて鋭意に研究した結果、黒毛和牛においてnanos3遺伝子KOにより生殖細胞が欠損することを確認し、さらに、黒毛和牛のnanos3-KO/SCNT胚にホルスタイン種の受精卵割球を注入することでホルスタイン種の生殖細胞を補完することに成功し、本願発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、異個体由来の配偶子を生産する非ヒト大型哺乳動物又は魚類の作出方法であって、第１の非ヒト大型哺乳動物又は魚類に由来する、nanos3遺伝子の機能が阻害されたゲノムを有する卵割期の胚に、第２の非ヒト大型哺乳動物又は魚類に由来する少なくとも１個の多能性細胞を移植してキメラ胚を調製し、該キメラ胚を発生させて個体を得ることを含む、方法を提供する。また、本発明は、上記本発明の作出方法により作出された非ヒト大型哺乳動物又は魚類の雌個体から卵子を回収することを含む、非ヒト大型哺乳動物又は魚類の卵子の生産方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の作出方法により作出された非ヒト大型哺乳動物又は魚類の雄個体から精子を回収することを含む、非ヒト大型哺乳動物又は魚類の精子の生産方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の生産方法により生産された卵子と精子を受精して受精卵を得ることを含む、非ヒト大型哺乳動物又は魚類の受精卵の生産方法を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の作出方法により作出された雌雄の非ヒト大型動物又は魚類の後代を自然交配、人工授精又は体外授精により得ることを含む、非ヒト大型哺乳動物又は魚類の生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来ノックアウト個体の安定的な量産が極めて困難であった大動物においても、所望の特定遺伝子がノックアウトされた個体を安定供給することができる。ノックアウト個体の安定的量産は本発明の態様のひとつであり、本発明によれば、ノックアウト以外の所望の遺伝的特性を有する非ヒト動物の低コストでの安定供給も可能になる。本発明の具体的応用例としては以下のようなものが挙げられる。【００１１】
(1)  KO大動物ラインの確立
nanos3-KO細胞核移植胚に所望の遺伝子（A遺伝子）がKOされた個体由来の多能性細胞（ES様細胞、割球など）を注入して生殖細胞を補完し、個体を発生させる。雄からはA遺伝子KO精子が、雌からはA遺伝子KO卵子が安定的に得られる。両者の交配（自然交配、人工授精、又は体外受精）により、A遺伝子KO個体を安定的に大量生産できる。【００１２】
(2)  望ましい特性を有する個体の卵子をクローン技術によらずに大量生産する
nanos3-KO細胞核移植胚に望ましい遺伝的特性を有する個体由来の多能性細胞（ES様細胞、割球など）を注入して生殖細胞を補完し、個体を発生させる。該個体は、望ましい遺伝的特性を有する精子又は卵子を作る。排卵数が多い系統で該個体を作れば（つまり、nanos3-KO細胞株及び核移植レシピエントとしてそのような系統を用いればよい）、望ましい遺伝的特性を有する精子、卵子及び受精卵を安価に大量生産することができる。【００１３】
(3)  管理コストが安価な動物に異種の精子・卵子を作らせ、受精卵を安価に製造する
ヤギやヒツジのnanos3-KO/核移植胚に優れた増体能を有する黒毛和牛由来の多能性細胞を注入して生殖細胞を補完し、個体（ヤギ、ヒツジ）を発生させる。該個体（ヤギ、ヒツジ）は、優れた増体能を有する黒毛和牛の精子又は卵子を作る。管理コストが安価なヤギやヒツジから黒毛和牛の受精卵を大量に製造できる。哺乳動物のみならず、海洋生物でも可能である。例えば、アジやサバでnanos3-KO/核移植胚を作ってマグロの生殖細胞を補完し、マグロの精子・卵子を作るアジやサバを得ることができる。このアジ・サバを飼育すればマグロが得られる。【００１４】
(4)  Y精子不活化ウシ（雌しか生まれないウシ系統）の確立
SRY遺伝子は生殖腺原基を精巣に分化させる働きをするY染色体上の遺伝子である。SRY遺伝子を不活化すると、Y精子が受精しても雌が生まれるようになる。従来技術で雌の誕生を希望する場合、フローサイトメーターによる精子の選別が必要になるが、この選別操作により精子の活力は低下してしまう。本発明の方法により、SRYをノックアウトした核移植胚をドナーとしてnanos3-KO胚の生殖細胞を補完することで、Y精子が不活化した雌しか生まれない大型動物系統を作出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の技術の概略を示した図である。
【図２】nanos3ヘテロKO細胞株樹立用ターゲティングベクターの構成と、当該ベクターによりnanos3がノックアウトされたアレルの構造を示した図である。
【図３】nanos3ホモKO細胞株樹立用ターゲティングベクターの構成と、当該ベクターによりnanos3がノックアウトされたアレルの構造を示した図である。
【図４】nanos3ヘテロKO判定のためのPCR解析の説明及び解析結果を示した図である。
【図５】nanos3ホモKO判定のためのPCR解析の説明及び解析結果を示した図である。
【図６】nanos3ホモKO胎仔及び非KO胎仔（約200日齢）の卵巣の組織像である。a: nanos3ホモKO胎仔の卵巣（低倍率）、b及びc: aの高倍率画像、d: コントロールの非KO胎仔の卵巣。dでは一次卵胞が認められるが、a〜cでは認められない。
【図７】nanos3ホモKO核移植胚（桑実期胚）にホルスタイン種体外受精胚の割球を注入して作製したキメラ胚由来の胎仔（141日齢）２個体の卵巣の組織像である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において対象となる動物は、非ヒト大型哺乳動物又は魚類である。以下、本明細書において、非ヒト大型哺乳動物及び魚類の両者をまとめて「非ヒト動物」ということがある。
【００１７】
本発明において対象となる非ヒト大型哺乳動物は、典型的には家畜動物であり得る。「大型」とは、小型の哺乳動物を除外することを意図しており、詳細に分類した場合に中型動物に分類され得る哺乳動物も本発明にいう非ヒト大型哺乳動物に包含される。非ヒト大型哺乳動物の具体例として、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イノシシ、シカ、ラクダ、カバなどの偶蹄類、及びウマ、サイ、バクなどの奇蹄類を含む各種の有蹄動物、並びに実験動物としての分類では一般に大型動物に分類されるサル、イヌなどのウサギを除く非げっ歯類が挙げられ、特に好ましい例としてウシを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明において対象となる魚類は、典型的には養殖魚であり得る。近年様々な食用魚で養殖技術が開発されている。本発明で対象となる魚類の具体例として、マグロ、ブリ、サバ、カツオ、アジ等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明では、nanos3遺伝子の機能が阻害されたゲノムを有する胚であって、非ヒト動物に由来する卵割期の胚に、別の非ヒト動物個体に由来する多能性細胞を移植（注入）する。nanos3遺伝子の機能がノックアウト等により阻害された動物個体では、生殖細胞（配偶子、すなわち精子・卵子）が形成されない。従って、nanos3遺伝子の機能が阻害された非ヒト動物に由来する胚に、nanos3遺伝子が正常に機能している別の非ヒト動物個体に由来する多能性細胞を移植することで、移植した多能性細胞により生殖細胞が補完され、当該別個体に由来する生殖細胞を生産する動物個体を得ることができる。
【００２０】
本発明においては、便宜上、nanos3遺伝子の機能を阻害する側の非ヒト動物（非ヒト大型哺乳動物又は魚類）を「第１の非ヒト動物」といい、生殖細胞を補完するための多能性細胞が由来する非ヒト動物をこれと区別して「第２の非ヒト動物」という。第１の非ヒト動物と第２の非ヒト動物は、同種ないしは同品種に属する動物個体であってもよいし（例えばウシ同士、黒毛和種同士など）、異種ないしは異品種の動物であってもよい（例えばヒツジとウシ、黒毛和種とホルスタインなど）。
【００２１】
本発明において、「遺伝子の機能を阻害する」とは、ゲノム上の当該遺伝子領域の少なくとも一部を改変すること等により、本来コードしているmRNA又はタンパク質の生成又は蓄積を低下又は欠失させることをいい、遺伝子の機能の低下から機能の完全な欠損まで包含される。特定の遺伝子の機能を阻害するための遺伝子改変方法はこの分野で広く知られており、当業者であれば適宜選択して実行できる。大別すると、遺伝子の機能を欠損させる遺伝子破壊法（ノックアウト法）と、遺伝子の機能を低下させる遺伝子ノックダウン法があり、ノックダウン法の具体例としてアンチセンス法、RNAi等を挙げることができる。
【００２２】
本発明におけるnanos3遺伝子の機能の阻害は、nanos3遺伝子の破壊（ノックアウト）による機能欠損が好ましい。例えば、ゲノムの両アリルにおいて、nanos3遺伝子のコード領域やプロモーター領域を欠失させたり、あるいは正常なnanos3タンパク質を産生できないように置換や挿入等の変異を導入することで、nanos3遺伝子をノックアウトすることができる。ノックアウト細胞株のスクリーニングの便宜のため、nanos3遺伝子コード領域の全部又は一部を薬剤耐性や蛍光タンパク質等のマーカー遺伝子配列に置き換えてもよい。
【００２３】
遺伝子ノックアウトの具体的手法の一つとして、下記実施例に記載されているターゲティングベクターを用いた相同組換えによるノックアウト法を挙げることができる。その他の遺伝子ノックアウト法として、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）法（Porteus, M.H. et al. Gene targeting using zinc finger nucleases. Nat. Biotechnol. 23, 967-973 (2005).）、TALEN法（Christian, M. et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics 186, 757-761 (2010).）、及びCRISPR/Cas9法（Sander, J.D. et al. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol 32, 347-355 (2014).）などを挙げることもできる。遺伝子ノックアウトに用いる非ヒト動物の種類に応じて、適当なノックアウト法を選択すればよい。例えば、ターゲティングベクターを用いた方法では、後述する通り、体細胞核移植により胚を再構築するステップが必要になるが、ブタなどの体細胞核移植効率が低い動物や、体細胞核移植による胚の再構築技術が確立していない動物種において遺伝子をノックアウトしたい場合には、体細胞核移植工程が不要なZFN法、TALEN法及びCRISPR/Cas9法を好ましく用いることができる。
【００２４】
ターゲティングベクターを用いたノックアウト法では、欠失させたい領域の上流側及び下流側のゲノム配列を対象生物のゲノムDNAからPCRにより増幅して上流側相同領域及び下流側相同領域を調製し、これらの相同領域及びマーカー遺伝子を順次適当なプラスミドベクターに挿入して、上流側相同領域−マーカー遺伝子−下流側相同領域の順に並んだ遺伝子破壊用DNAコンストラクトを含むターゲティングベクターを構築し、これをエレクトロポレーション等の常法により対象生物由来の体細胞（線維芽細胞など）に導入すればよい。このようなターゲティングベクターを細胞に導入すると、相同組換えにより遺伝子破壊用コンストラクトがゲノム上の所期の位置に導入され、nanos3遺伝子の一部又は全部がマーカー遺伝子に置き換えられた変異アレルが生じる。
【００２５】
上流側相同領域及び下流側相同領域のサイズは相同組換えの効率に影響し、効率の低い生物種ではサイズの大きな相同領域が用いられる。哺乳動物の遺伝子破壊においては、一般に用いられる相同領域は数kb程度のサイズである。一方の相同領域を1〜3kb程度（短腕）、他方の相同領域を5kb程度以上（長腕）とするのが一般的であるが、両者を5kb程度のサイズとしてもよい。配列番号３及び４に示す塩基配列は、ウシのnanos3遺伝子の上流側及び下流側のゲノム領域であり、ウシのnanos3遺伝子をノックアウトする場合にはこれらの領域ないしは適当なサイズのその部分領域を相同領域として利用可能である。
【００２６】
nanos3遺伝子はこれまでに無脊椎動物及び脊椎動物を含む様々な動物においてクローニングされている。nanos3遺伝子の機能を阻害する側の第１の非ヒト動物として、nanos3遺伝子が未クローニングの動物を用いる場合には、ヒトやマウス等の同定済みのnanos3遺伝子の配列情報を用いて、当該動物の全ゲノム配列情報（ショットガンシークエンス等）を対象に検索を行ない、推定されるnanos3遺伝子領域を同定することで、ターゲティングベクターに組み込む相同領域などのnanos3遺伝子の機能阻害のために必要なゲノム配列情報を得ることができる。
【００２７】
哺乳動物細胞においては、相同組換えによる遺伝子破壊用コンストラクトのゲノムへの導入頻度は、相同組換えによらないランダムな導入の頻度に比べて非常に低い。そのため、本発明におけるnanos3遺伝子のノックアウトでは、薬剤耐性を与えるポジティブ選択マーカーと薬剤感受性を与えるネガティブ選択マーカーを併用することが好ましい。上記の遺伝子破壊用コンストラクトにおいて、２つの相同領域の間に連結するマーカー遺伝子をポジティブ選択マーカー遺伝子とし、２つの相同領域の外側（上流側相同領域の5'側又は下流側相同領域の3'側）にネガティブ選択マーカー遺伝子を連結しておけばよい。該コンストラクトが相同組換えによりゲノムに導入されていれば、コンストラクトのうち相同領域の外側の領域はゲノムに導入されないので、ネガティブ選択マーカー遺伝子により薬剤感受性が付与されることはない。一方、該コンストラクトが相同組換えによらずにゲノムに導入された場合、ネガティブ選択マーカー遺伝子もゲノムに導入されるため、そのような形質転換細胞には薬剤感受性が付与されることになる。よって、遺伝子破壊用コンストラクトを第１の非ヒト動物由来の体細胞に導入後、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーによるスクリーニングを行えば、相同組換えにより適切な位置にコンストラクトが導入されnanos3遺伝子が破壊された細胞を効率よく選抜することができる。
【００２８】
一般に使用されるマーカー遺伝子の具体例を挙げると、ポジティブ選択マーカーとしてはネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられ、ネガティブ選択マーカーとしてはチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Aフラグメント（DT-A)等が挙げられるが、これらに限定されない。それぞれ適当なプロモーターとの組み合わせで用いられるが、当業者であればマーカー遺伝子の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
マーカーによるスクリーニングの後、PCRやサザンブロッティングによる遺伝子破壊の確認を行ない、nanos3遺伝子が破壊されたアレルを有する細胞を取得する。PCRに使用するプライマーやサザンブロッティングに使用するプローブは、当業者であれば、遺伝子破壊用DNAコンストラクトの構造に応じて適宜設計することができる。
【００３０】
上述した通り、哺乳動物細胞における相同組換えの頻度は非常に低いため、両アレルで同時に相同組換えが生じる可能性は極めて低く、通常はヘテロのノックアウトとなる。ホモでノックアウトされた細胞を得るためには、ヘテロノックアウトであることを確認した細胞株を用いて、上述した遺伝子破壊用コンストラクトの導入とスクリーニングを再度繰り返せばよい。ヘテロノックアウト細胞の調製に使用する遺伝子破壊用DNAコンストラクトと、ホモノックアウト細胞の調製に使用する遺伝子破壊用DNAコンストラクトとで、異なる薬剤耐性ポジティブ選択マーカーを用いれば、ホモノックアウト細胞を適切に選抜することができる。
【００３１】
なお、相同組換えの効率を上げるため、nanos3遺伝子ノックアウト処理に加えてBML遺伝子のノックダウン処理を行なってもよい。ヒト細胞を用いた研究で、BML遺伝子のノックダウン処理が相同組換え効率を上げるとの報告があり（So S et al. Genes to Cells 2006; 11(4):363-371.）、本発明で対象とする非ヒト動物においても同様にBML遺伝子のノックダウンが相同組換え効率の向上に有効である。BML遺伝子も配列情報等が公知であり、各種動物種のBML遺伝子をノックダウンするための核酸試薬が市販されているので、当業者であれば適宜そのような市販品を用いてBML遺伝子のノックダウン処理を実施できる。
【００３２】
次いで、上記のようにしてnanos3遺伝子の機能が阻害された細胞から、体細胞核移植技術により胚を再構築する。大型哺乳動物においても体細胞核移植技術は確立した技術となっている（Nature, 385, p.810-813, 1997; Science, 282(5396), p.2095-2098, 1998; Science, 298, p.1188-1190, 2000; Nature, 407, p.86-90, 2000; Nat Biotechnol., 18, P.1055-1059, 2000; Cloning Stem Cells 9, 571-580 (2007)等参照）。具体的には、大型哺乳動物の体内成熟卵子又は体外成熟卵子を調製し、該卵子を除核し、除核卵子にnanos3阻害細胞を移植して電気刺激等により細胞を融合することで、nanos3遺伝子の機能が阻害されたゲノムを有する、第１の非ヒト大型哺乳動物に由来する再構築胚（核移植胚）を得ることができる。
【００３３】
この再構築胚を活性化処理して卵割期まで培養し、nanos3遺伝子が正常な（機能が阻害されていない）第２の非ヒト大型哺乳動物に由来する少なくとも１個の多能性細胞を注入してキメラ胚を調製する。注入する多能性細胞の数は少なくとも１個であればよいが、通常は複数個、例えば数個〜十数個程度の細胞を注入する。
【００３４】
第２の非ヒト動物に由来する多能性細胞は、分化多能性を有する細胞であれば特に限定されない。ES細胞やiPS細胞株が樹立されている動物種であればES細胞やiPS細胞株を用いることができるし、未樹立の動物種の場合には、例えば受精卵の割球を用いることができる。
【００３５】
多能性細胞を注入する時の第１の非ヒト動物由来の胚の発生ステージは、卵割期であれば特に限定されず、２細胞期〜胚盤胞期のいずれの時期でもよい。例えば、４細胞期、８細胞期、１６細胞期、桑実胚期、又は胚盤胞期であり得る。一般的には、桑実胚期〜胚盤胞期に注入を行なうことが好ましい。
【００３６】
上記のキメラ胚を発生させて得られた個体では、異個体である第２の非ヒト大型哺乳動物由来の生殖細胞（配偶子、すなわち卵子又は精子）が生産される。このキメラ胚を代理母（仮腹親）に移植して産仔を得れば、そのような異個体由来の配偶子を生産する非ヒト大型哺乳動物を得ることができる。キメラ胚を移植する代理母は、通常、第１の非ヒト大型哺乳動物と同種の雌個体である。例えば、第１の非ヒト大型哺乳動物がヒツジであり、第２の非ヒト大型哺乳動物がウシである場合、キメラ胚を移植する代理母は通常ヒツジの雌個体である。
【００３７】
ターゲティングベクターによる方法以外に使用可能な遺伝子ノックアウト法であるZFN法、TALEN法、およびCRISPR/Cas9法は、いずれも、所望の塩基配列を特異的に認識するように設計したDNA認識部位（ZFN法ではジンクフィンガードメイン、TALEN法では植物病原菌Xanthomonas由来のTAL effectorのDNA結合ドメイン、CRISPR/Cas9法では切断したいDNA配列に対する相補的な配列を含むguide RNA）をヌクレアーゼに融合させた人工のヌクレアーゼを用いる手法である。これらの人工ヌクレアーゼの一対（プラス鎖とマイナス鎖それぞれに対して設計する）を細胞内に導入すると、目的の部位でDNA二本鎖が切断され、非相同末端結合（Non-Homologous End Joining; NHEJ）による修復過程での修復エラーによって塩基の置換や欠損、挿入が生じ、これにより目的遺伝子が破壊される。人工ヌクレアーゼとともに上記したような２つの相同領域を含む遺伝子破壊用DNAコンストラクトを細胞内に導入すれば、相同組換え修復（homology-directed repair; HDR）による修復過程で標的部位へ遺伝子破壊用コンストラクトが挿入されるので、マーカー遺伝子配列等の所望の配列を標的部位に挿入することができる。
【００３８】
これらの手法によれば、nanos3遺伝子を標的とするように設計した人工ヌクレアーゼを第１の非ヒト動物由来の受精卵に導入してnanos3遺伝子を破壊し、ホモで破壊された受精卵を作出することで、nanos3遺伝子がノックアウトされたゲノムを有する受精卵（胚）を得ることができるので、体細胞核移植操作を行なわなくてよい。従って、体細胞核移植の効率が低い動物種の場合には、ターゲティングベクターを用いた遺伝子ノックアウト法よりもこれらの手法の方が好ましく使用し得る。魚類のnanos3遺伝子ノックアウト体の作出においても、これらの手法を好ましく使用することができる。
【００３９】
これ以後の工程はターゲティングベクターによる手法において先に説明した工程と同様であり、上記のようにして得られたゲノム上のnanos3遺伝子がホモで破壊された受精卵（胚）に、第２の非ヒト動物由来の多能性細胞を移植して、キメラ胚を調製すればよい。このキメラ胚を発生させれば、異個体由来の配偶子を生産する非ヒト動物個体を得ることができる。哺乳動物の場合には、キメラ胚を代理母（仮腹親）に移植して産仔を得ればよい。魚類の場合は当然ながらこの胚移植のステップは不要である。
【００４０】
キメラ胚を発生させて得られた、異個体由来の配偶子を生産する非ヒト動物の後代は、そのような非ヒト動物の雌雄の自然交配により、又は人工授精若しくは体外受精により得ることができる。体外受精の場合、通常は、本発明の方法により作出した当該異個体由来の配偶子を生産する非ヒト動物の雌個体に体外受精した受精卵を移植するが、これとは異なる非ヒト動物（例えば、第２の非ヒト動物と同種の個体）に当該受精卵を移植してもよい。
【００４１】
本発明によれば、例えば、飼育コストが高い家畜の精子又は卵子を、飼育コストが低い家畜に生産させることができる。具体的な例を挙げると、ヒツジやヤギはウシに比べると強健で粗食に耐えるので管理コストが安価であり、また早熟であるため繁殖効率がよい。従って、第１の非ヒト動物としてヒツジやヤギを使用し、第２の非ヒト動物としてウシを使用すると、ヒツジやヤギにウシの配偶子を作らせることができるので、低コスト管理でウシの人工授精用精子や受精卵を提供することが可能になる。同様に、第１の非ヒト動物としてアジやサバを使用し、第２の非ヒト動物としてマグロを使用すると、アジやサバにマグロの配偶子を作らせることができるので、養殖用のマグロの稚魚を低コストで大量生産することができる。
【００４２】
また、本発明の方法によれば、ある非ヒト動物において、これとは別の第２の非ヒト動物が有している所望の遺伝的特性を有する配偶子を生産することができる。一旦そのような配偶子を生産する非ヒト動物系統を確立すれば、雌雄の交配（自然交配、人工授精、又は体外受精）により、体細胞クローン技術によらずに所望の遺伝的特性を有する非ヒト動物個体を大量生産することができる。
【００４３】
「所望の遺伝的特性」には、第２の非ヒト動物において天然に生じた遺伝的特性と、人為的な遺伝的改変の両者が包含される。前者の例としては、育種価が極めて高い（例えば増体能力が極めて高い）という特性を挙げることができる。人為的な遺伝的改変は、例えば、所望の遺伝子の機能の阻害、典型的には所望の遺伝子のノックアウトであり得る。
【００４４】
所望の遺伝子をノックアウトした非ヒト動物の配偶子を別の非ヒト動物に生産させる場合には、キメラ胚作製に用いる第２の非ヒト動物由来の多能性細胞において、所望の遺伝子がノックアウトされていればよい。そのような、所望の遺伝子がノックアウトされたゲノムを有する第２の非ヒト動物由来多能性細胞は、第２の非ヒト動物由来の適当な細胞を用いて、基本的にはnanos3遺伝子のノックアウトと同様の手順で得ることができる。ターゲティングベクターによるノックアウト法を用いる場合には、所望の遺伝子がホモでノックアウトされた再構築胚の割球を当該多能性細胞として用いることができる。人工ヌクレアーゼによるノックアウト法を用いる場合には、所望の遺伝子がホモでノックアウトされた受精卵の割球を当該多能性細胞として用いることができる。
【００４５】
本発明の方法を用いれば、所望の遺伝子がノックアウトされた卵子と精子を、当該遺伝子がノックアウトされていない非ヒト動物個体に安定的に生産させることができる。本発明の方法により作出された、所望の遺伝子がノックアウトされた配偶子を生産する非ヒト動物の雌雄を自然交配、ないしは人工授精や体外受精させることで、特定遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物を安定的に得ることができる。本発明によれば、大動物においても、特定遺伝子ノックアウト個体の安定供給が可能になる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００４７】
１．目的
体細胞核移植クローン技術と遺伝子組換え技術を活用することにより、中大型家畜においても遺伝子ノックアウト(KO)個体の作出が可能となった。これらの技術は、家畜の遺伝子育種に必要とされる特定遺伝子の機能解析において最も有効な技術である。しかしながら、体細胞核移植クローン技術を用いた個体作出効率は非常に低い状況にあり、安定的に多数のKO個体を作出することは現状では不可能である。最近、マウスにおいて、遺伝子KO初期胚と正常胚を混合し混合胚を作製すると混合胚はKO胚由来の細胞によって生じる欠損(細胞分化障害および臓器欠損等)を補完し正常に発生・誕生することが報告された（Kobayashi et al., Cell 142, 787-799 (2010)）。また、マウスにおいて生殖細胞分化関連遺伝子nanos3をKOすると卵子および精子が形成されないことが報告されている（Tsuda et al., SCIENCE 301, 1239-1241 (2003)）。本試験においては、先に示した胚盤胞補完法を利用し、nanos3遺伝子をKOした胚と特定遺伝子をKOした胚を混合し補完胚を作製した時、遺伝子KO卵子(または精子）のみを形成する個体が作出できるかを検討する。当該技術が実証された場合、交配や人工授精により安定的にKO個体のみを作出することが可能となる（図１：技術の概略）。【００４８】
２．試験方法および材料
ア．ウシnanos3遺伝子ゲノムDNA KOベクター構築
生殖細胞分化関連遺伝子nanos3遺伝子KOベクターの構築は、NCBIデーターベースに公開されているウシnanos3遺伝子ゲノム構造情報をもとに実施した。【００４９】
ヘテロKO操作に使用するKOベクター(pNOS3-KOn)を構築するため、nanos3遺伝子の周辺ゲノム領域（1.5kbおよび6.5kb断片:図２）をPCRクローニング法によりクローニングした。鋳型DNAとして、黒毛和牛の胎仔由来線維芽細胞から抽出したゲノムDNAを用いた。ベクターの短腕として使用する1.5kb断片（1.5kS）（配列番号３の333nt〜1879ntの領域）のPCR増幅には、センスプライマー：CTCTCCGTTGCATCCATGCC（配列番号６）およびアンチセンスプライマー：AGCCACTGACCTTCCAGCTGAC（配列番号７）を使用した。また、長腕として使用する6.5kb断片（6.5kbL）（配列番号４の283nt〜6809ntの領域）の増幅にはセンスプライマー：GGACAAGGTATCGTGAACTGC（配列番号８）およびアンチセンスプライマー：AACACGAGGAGCACCTTCTTGC（配列番号９）を使用した。pNOS3-KOnベクターは、nanos3遺伝子全体（エクソン1および２）を欠失するように選択マーカーであるPGK-neoユニット(PGKプロモータを持つネオマイシン耐性遺伝子)を挿入し構築した。pNOS3-KOnベクターはPGK-neoユニットの5’側に短腕1.5kS、そして3’側に長腕6.5kLが位置し、さらに1.5kSの5’側にネガティブ選択用遺伝子マーカーのMC1-TK(MC1プロモータを持つヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子)が位置するかたちに構築した（図２）。【００５０】
ホモKO操作に使用するベクターとして、nanos3遺伝子のタンパク質をコードする領域の一部を蛍光タンパク質であるクサビラオレンジ(huKO)をコードするcDNAに置き換えた構成のKO-ノックイン(KI)ベクター（pNOS3-huKO-KIb）を構築した（図２）。クサビラオレンジのcDNA断片は、ユーロフィンジェノミクス社に委託して合成しベクター構築に使用した。huKOのcDNAを含む短腕の配列（2.0k ウシゲノム配列＋0.66k huKO＋0.35k ウシゲノム配列からなる3.0kbの配列）を配列番号５に示す。配列番号５中、2049nt〜2709ntがhuKOのcDNA配列である。選択マーカーはCAG-bsrユニット(CAGプロモータを持つブラストサイジンS耐性遺伝子)を使用した（図２）。【００５１】
イ. ウシ胎仔由来線維芽細胞へのKOベクターの導入・選別培養およびKO細胞株樹立
ウシ（黒毛和牛）胎仔由来線維芽細胞(#906♀株)へのpNOS3-KOnベクターの導入・選別培養およびKO細胞株樹立は、既報（千代、飼中研報告、1501-622（2009）、及びSendai, Y. et al., Transplantation 81, 706-766 (2006)）の方法に従い行った。また、ヒト細胞を用いた研究でBLM遺伝子のノックダウン処理が相同組換え効率を上げるという報告があることから（So S et al. Genes to Cells 2006; 11(4):363-371.）、nanos3ノックダウンにおける相同組換えの効率を上げる目的で、ウシBML遺伝子のノックダウン処理も行なった。ウシBML遺伝子のノックダウン処理は、既報（千代、飼中研報告、1501-604（2009））の方法に従い、インビトロジェン社に委託して作製したウシBML用stealth RNA（合成位置2656）を用いて行なった。ホモKO細胞株樹立においては、nanos3ヘテロKO胎仔由来細胞株（＃3933株）にpNOS3-huKO-KIbベクターを導入し、２種の選別薬剤（ネオマイシン：G418およびブラストサイジンS）を含む培地で培養し樹立操作を行った。【００５２】
KO判定のためのPCR解析は定法に従い行った。解析に用いたプライマーの塩基配列を下記に示す。
P1: AACACGGTGAAGCTCACTTAGG（配列番号１０）
P2: CATGCTCCAGACTGCCTTGG（配列番号１１）
P3: CTCTCCGTTGCATCCATGCC（配列番号１２）
P4: CTTCATCTCGGGCTTGATCGTCG（配列番号１３）
P5: GCTTCATCCTTGAGCACGTGG（配列番号１４）
P6: CCACGTGCTCAAGGATGAAGC（配列番号１５）
P7: CTGATACGTAAGCCTAGCTACTCG（配列番号１６）【００５３】
各プライマーの設定領域は図４及び図５に示した通りである。ヘテロKO判定には、P3-P2（ヘテロKO用ベクター内のコンストラクトの一部を増幅）、及びP1-P2（ヘテロKO用コンストラクトが正しい位置に挿入されているアレルを検出）を用いた（図４）。ホモKO判定には、P3-P2及びP1-P2に加え、P3-P4（ホモKO用ベクター内のコンストラクトの一部を増幅）、P1-P4（ホモKO用コンストラクトが正しい位置に挿入されているアレルを検出）、P1-P5（wtアレルを検出）及びP6-P7（wtアレルを検出）を用いた。【００５４】
ウ. 体細胞核移植および胎仔回収
PCR解析によりnanos3遺伝子のヘテロKO又はホモKOが確認された細胞株を核ドナーとして使用し、既報（Ideta, A. et al. Cloning Stem Cells 9, 571-580 (2007)）に従い体細胞核移植操作を行ない、核移植胚（再構築胚）を調製した。手順を簡単に記載すると以下の通りである。【００５５】
食肉処理場由来ウシ卵巣から卵胞卵子を吸引採取し、約20時間の成熟培養を行った。ヒアルロニダーゼ（シグマ社）で卵丘細胞を剥離後、第１極体の放出を確認した卵子を選抜した。除核したレシピエント卵子の囲卵腔に核ドナーを挿入して電気刺激により細胞を融合させ、再構築胚の発生を促進するためにカルシウムイオノフォア（シグマ社）などで人為的活性化処理を施した。その後、発生培地中で体外培養し発生を観察した。【００５６】
核移植胚をレシピエント牛に移植し、約200日齢胎仔を帝王切開により取り出し、胎仔の卵巣を観察した。卵巣組織を10%中性緩衝ホルマリン液で固定後、パラフィン包埋法により組織切片を作成した。ヘマトキシリン-エオジン(HE)染色を施し、光学顕微鏡を用いた組織観察を行った。【００５７】
エ. nanos3-KOウシにおける生殖細胞の補完
nanos3-KO核移植胚（桑実期胚）にホルスタイン種体外受精胚の割球（7〜10個）を注入し、2日間体外培養した。成長したキメラ胚をレシピエント牛に移植後、約140日齢胎仔を帝王切開により取り出し、胎仔の卵巣を観察した。また、キメラ胎仔の各臓器のキメラ率（ホルスタイン細胞含有率）をリアルタイムPCR法で調査した。【００５８】
３．結果および考察
（１）ウシnanos3遺伝子ゲノムのクローニングと遺伝子KOベクターの構築
マウスを用いたKO個体作出実験において、生殖細胞分化関連遺伝子nanos3をKOすると発生の初期段階に存在する始原生殖細胞の分裂能が低下し且つ生殖隆起への移動が起こらず、生まれたKO個体の卵巣および精巣内に卵子や精子が形成されないことが報告されている（Tsuda et al., SCIENCE 301, 1239-1241 (2003)）。また、最近の研究において、特定遺伝子をKOして臓器等が形成できない状態にした初期胚に正常初期胚に由来する未分化細胞を混合すると、発生中の混合胚において正常胚に由来する細胞がKO欠損細胞を補完し(胚盤胞補完)正常な臓器が形成されることがマウスおよびブタにおいて示された（Kobayashi et al., Cell 142, 787-799 (2010)、及びMatsunari et al., PNAS 110(12),4557-4562 (2013)）。これらの結果は、nanos3遺伝子をKOした胚と特定遺伝子をKOした胚を混合し混合補完胚を作製した場合、特定遺伝子KO卵子(または精子）のみを形成する個体が作出できる可能性を示しており、特定遺伝子KO個体の安定的生産系が実現する可能性も示唆している(図１)。本試験においては、この仮説を確認するため、ウシnanos3遺伝子KO個体作出に向けKO細胞株の樹立を試みた。【００５９】
ウシnanos3遺伝子はゲノム情報より推定（XM_002688743、配列番号１）されていたが、XM_002688743に示された配列情報とヒトnanos3遺伝子のエクソン情報を比較してウシのエクソンを推定したところ、２つのエクソンが推定された。これらの推定されたエクソン（１および２）の配列をNCBIのBLASTにて分析した結果、ウシnanos3のそれぞれのエクソンが位置する染色体（７番）と周辺の遺伝子配列（NC007305.5, region 10061880）が得られた。以上の結果から、ウシにおいてnanos3遺伝子の存在が確認でき、遺伝子構造がマウスと同様に２つのエクソンで構成されていることが判明した(図２)。nanos3遺伝子KOベクター構築のためのnanos3遺伝子周辺ゲノム領域（1.5kbおよび6.5kb断片:図２）のクローニングはPCRクローニング法により行った。【００６０】
nanos3遺伝子は線維芽細胞で発現していないことから、KOベクターは、ポジティブ-ネガティブ選別タイプを採用し、nanos3遺伝子全体を欠失させる様に構築した（図２）。ポジティブ選別用薬剤耐性遺伝子としてはPGK-neoを使用した。また、ネガティブ選別用薬剤感受性遺伝子としてはMC1-TKを使用した（図２：pNOS-KOn）。ホモKO細胞株樹立には、nanos3遺伝子のタンパク質をコードする領域の一部を蛍光タンパク質クサビラオレンジ(huKO)をコードするcDNAに置き換えたタイプのKO-huKO-KIベクターを構築した。選別用薬剤耐性遺伝子はCAG-bsrを使用した（図２:pNOS-huKO-KIb）。このベクターを使用し樹立したNOS3-KO-KI細胞株をドナーとして核移植個体を作出した場合、nanos3遺伝子を発現している生殖系細胞（始原生殖細胞等）の存在位置をhuKO蛍光により可視化する事が出来る（図２:pNOS-huKO-KIb）。【００６１】
（２）ウシnanos3遺伝子KO細胞株樹立
構築したKOベクター（pNOS3-KOn）を使用し、雌黒毛和牛胎仔由来線維芽細胞（#906株(♀)）を用いてKO操作を実施し、まずヘテロKO細胞株を樹立した。KO株樹立試験を４回実施した結果、調査した411 well中、9 wellがKOと判定された（表１）。このKOと判定された9 wellのうち4 wellにおいては、単一のコロニーに由来し、正しい位置で相同組換え反応が起きている細胞が増殖していることが、詳細なPCR解析により示唆された（#2-4株、#4-24株、#4-25株、#4-68株）（図４）。これら４株のうち、細胞増殖性が良かった#4-68株を用いて核移植クローン胎仔の作出および回収・細胞株樹立を行った。その結果、１胎仔の作出・回収に成功し胎仔由来細胞株の樹立（＃3933株）にも成功し、ゲノムPCR解析においてもヘテロKOであることが確認できた（図４）。【００６２】
【表１】
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【００６３】
次に、樹立したヘテロKO細胞（＃3933株）に対しKO-huKO-KIベクター（pNOS3-huKO-KIb）を導入しホモKO細胞株の樹立を試みた。樹立試験を２回実施した結果、調査した221 well中、15 wellがホモKO-huKO-KIと判定された（表2）。このホモKO-huKO-KIと判定された15 well のうち1 wellにおいて、単一のコロニーに由来し増殖性も良く、正しい位置で相同組換え反応が起きている細胞であることが、詳細なPCR解析により示唆された（#2-36株）（図５）。この細胞を用いて核移植胎仔の作出および回収・細胞株樹立を行った結果、１胎仔の作出・回収に成功し胎仔由来細胞株が樹立（＃Y6158株）出来た。ゲノムDNAのPCR解析においてもホモKOであることが確認できた（図５）。【００６４】
【表２】
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【００６５】
（３）nanos3ホモKO胎仔における生殖細胞の欠損
nanos3ホモKO胎仔の卵巣の組織像を図６に示す。非KOのほぼ同齢の胎仔では、卵巣皮質内に多数の一次卵胞が認められ、生殖細胞が正常に形成されるが（図6d）、nanos3ホモKO胎仔の卵巣内には卵胞細胞が確認できなかった（図6a-c）。このことから、nanos3ノックアウトウシの始原生殖細胞は胎生初期でアポトーシスにより死滅し、生体（194日齢胎仔）は完全に生殖細胞を欠損することが明らかとなった。【００６６】
（４）nanos3ホモKOウシにおける生殖細胞の補完
nanos3-KO核移植胚（桑実期胚）にホルスタイン種体外受精胚の割球（7〜10個）を注入して作製したキメラ胚由来の胎仔（141日齢）の卵巣の組織像を図７に示す。2頭のキメラ胎仔のうちの１頭において、卵巣内に一次卵胞が確認できた。このことから、胚盤胞補完法によってnanos3-KOウシの卵巣内にドナー細胞由来の生殖細胞が補完されることが明らかとなった。【００６７】
キメラ胎仔の各臓器のキメラ率（ホルスタイン細胞含有率）をリアルタイムPCRで調べた結果、脳：12.1%、心臓：20.2%、肝臓：1.8%、子宮：22.4%および卵巣：15.8%であった。ここで作出したウシ胎仔は黒毛和種とホルスタイン種のキメラ個体であり、卵巣内にはホルスタイン種の生殖細胞が形成されたことになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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