(57)【要約】本発明は、スクロースを資化することのできるＰＨＡ生産微生物、およびスクロースを炭素源として該微生物を培養することによるＰＨＡの製造方法を提供することを課題とする。ＰＨＡ合成酵素遺伝子と、下記（１）及び（２）の異種生物由来遺伝子とを有するＰＨＡ生産微生物。（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするスクロース加水分解酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、スクロース加水分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするスクロース透過酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、スクロース透過酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。また、該微生物を、スクロースを炭素源として含む培地で培養する工程を含む、ＰＨＡの製造方法。
2017104722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＨＡ合成酵素遺伝子と、下記（１）及び（２）の異種生物由来遺伝子とを有するＰＨＡ生産微生物。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするスクロース加水分解酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、スクロース加水分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするスクロース透過酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、スクロース透過酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
【請求項２】
前記微生物が、カプリアビダス属に属する微生物を宿主とする形質転換体である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記カプリアビダス属に属する微生物が、カプリアビダス・ネカトールである、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
グルコース資化性が付与又は強化されている、請求項１〜３いずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
前記ＰＨＡ合成酵素遺伝子が、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子である、請求項１〜４いずれか１項に記載の微生物。
【請求項６】
さらにクロトニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子およびエチルマロニル−ＣｏＡ脱炭酸酵素遺伝子を有する、請求項３〜５いずれか１項に記載の微生物。
【請求項７】
アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子が欠失した、またはその発現量が抑制されている、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか１項に記載の微生物を、スクロースを炭素源として含む培地で培養する工程を含む、ＰＨＡの製造方法。
【請求項９】
ＰＨＡがＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である請求項８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スクロース資化性を有するＰＨＡ生産微生物と、該微生物を用いたＰＨＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡと記すこともある）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機ポリマーである。ＰＨＡは生分解性を有する熱可塑性高分子であり、再生可能資源を原料として産生することができる。これらのことから、ＰＨＡを環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。【０００３】
このＰＨＡを構成するモノマー単位の一般名は、ヒドロキシアルカン酸である。ヒドロキシアルカン酸には、具体的には３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと記すこともある）、３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと記すこともある）、３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと記すこともある）、３−ヒドロキシオクタン酸、よりアルキル鎖の長い３−ヒドロキシアルカン酸や、４−ヒドロキシ酪酸などが例示され、これらが単独重合または共重合することにより、ポリマー分子であるＰＨＡが形成される。【０００４】
ＰＨＡの具体例として、３ＨＢのホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と記すこともある）が挙げられる。また、３ＨＢと３ＨＶの共重合体であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）、３ＨＢと３ＨＨの共重合体であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）（以下、ＰＨＢＨと記すこともある）や、３ＨＢと４ＨＢの共重合体であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）なども挙げられる。この中でも特にＰＨＢＨは、３ＨＨ組成比を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を持たせることができる。そのため、ＰＨＢＨは、低３ＨＨ組成比のＰＨＢＨを用いたテレビの筐体等のように硬さを要求されるものから、高３ＨＨ組成比のＰＨＢＨを用いたフィルム等のように柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。【０００５】
ＰＨＡのようなバルクケミカルの発酵生産において、生産コストにおける炭素源コストの占める割合は大きい。したがって、安価な炭素源を効率よく発酵に用いることが重要となる。【０００６】
微生物発酵による化学物質生産では、グルコースを主炭素源として行われる場合が多くみられるが、グルコースは比較的高価格の炭素源である。従って、グルコースを主炭素源とすると、原油を主原料物質とした化学合成法による生産価格よりも高価となる場合があり、価格競争力の面で商業化には困難がある。【０００７】
一方で、グルコースよりも安価な糖原料としてスクロースが知られている。スクロースは、グルコースとフルクトースで形成された二糖類の一つであり、光合成能を有する全ての植物から生産され、自然界に非常に豊富に存在する炭素源である。さらにスクロースは廃糖蜜の主成分であり、廃糖蜜は食料と競合しない再生可能資源という点でも魅力的な炭素源である。【０００８】
特許文献１によれば、微生物がスクロースを資化するメカニズムは、スクロースＰＴＳ（Phosphoenolpyruvate: Carbohydrate Phosphotransferase System）とスクロース非ＰＴＳの２つに大別される。スクロース非ＰＴＳを経由する場合、微生物はスクロースをそのままの形で取り込み、その後にグルコースとフルクトースに分解する。一方、スクロースＰＴＳを経由する場合では、微生物はスクロースを取り込む際にスクロースをリン酸化し、スクロース−６−リン酸へと変換する。そして微生物細胞内部でグルコース−６−リン酸とフルクトースに分解する。あるいは、微生物細胞外でスクロースが分解され、生じたグルコースとフルクトースが資化される場合もある。【０００９】
しかしながら、すべての微生物がスクロースを資化できるわけではない。例えば、ＰＨＡ生産微生物として知られるカプリアビダス・ネカトールＨ１６株は、フルクトースは資化できるがグルコースとスクロースは資化することができない。【００１０】
これまでにスクロース非資化性の微生物に対して、遺伝子工学的手法によりスクロース資化性を付加するいくつかの研究が行われている。例えば、非特許文献１では、元来スクロース非資化性であるエシェリキア・コリＫ−１２株に対して、エシェリキア・コリＷ株に由来するスクロース資化関連遺伝子（スクロース透過酵素遺伝子およびスクロース加水分解酵素遺伝子）を導入することによって、スクロース資化が可能となったことが示されている。この場合、遺伝子の由来生物と導入する宿主が同種の生物であるため、遺伝子組み換えによって導入された遺伝子がうまく機能する蓋然性は高いと考えられる。また、特許文献２では、スクロースＰＴＳ遺伝子群を導入することでスクロース非資化性のエシェリキア属細菌にスクロース資化性を付与した例が開示されている。さらに、特許文献１では、スクロースホスホトランスフェラーゼ遺伝子およびスクロース加水分解酵素遺伝子を導入することでスクロース資化性を付与した例が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２０１１−５０５８６９号公報
【特許文献２】特開２００１−３４６５７８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ，ｖｏｌ．７９，４７８（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、スクロースを資化することができるＰＨＡ生産微生物、及び、スクロースを炭素源として該微生物を培養することによるＰＨＡの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＰＨＡを産生する能力を有する微生物に、スクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする異種生物由来遺伝子とスクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする異種生物由来遺伝子の両方を導入することによって、当該微生物にスクロース分解能力及び細胞内へのスクロース取り込み能力が付加され、スクロースを炭素源としたＰＨＡ生産が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１５】
すなわち、本発明は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子と、下記（１）及び（２）の異種生物由来遺伝子とを有するＰＨＡ生産微生物に関する。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするスクロース加水分解酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、スクロース加水分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするスクロース透過酵素遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して90%以上の配列同一性を有し、スクロース透過酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
好ましくは、前記微生物が、カプリアビダス属に属する微生物を宿主とする形質転換体であり、より好ましくは、前記カプリアビダス属に属する微生物が、カプリアビダス・ネカトールである。好ましくは、前記微生物はグルコース資化性が付与又は強化されている。好ましくは、前記ＰＨＡ合成酵素遺伝子が、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子である。好ましくは、前記微生物は、さらにクロトニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子およびエチルマロニル−ＣｏＡ脱炭酸酵素遺伝子を有する。好ましくは、前記微生物は、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子が欠失した、またはその発現量が抑制されている。【００１６】
また、本発明は、前記微生物を、スクロースを炭素源として含む培地で培養する工程を含む、ＰＨＡの製造方法に関し、好ましくはＰＨＡがＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である前記製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、スクロースを資化することができるＰＨＡ生産微生物を提供することができる。また、炭素源としてスクロースを用いて該微生物を培養することでＰＨＡを発酵生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】比較例１に関し、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株のスクロース含有培地における増殖および培地中の糖濃度変化を示すグラフである（●を含む実線：ＯＤ６００；△を含む実線：スクロース濃度；■を含む実線：グルコース濃度；×を含む実線：フルクトース濃度）
【図２】比較例２に関し、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株のスクロース含有培地における増殖および培地中の糖濃度変化を示すグラフである（●を含む実線：ＯＤ６００；△を含む実線：スクロース濃度；■を含む実線：グルコース濃度；×を含む実線：フルクトース濃度）
【図３】比較例３に関し、ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株のスクロース含有培地における増殖および培地中の糖濃度変化を示すグラフである（●を含む実線：ＯＤ６００；△を含む実線：スクロース濃度；■を含む実線：グルコース濃度；×を含む実線：フルクトース濃度）
【図４】比較例４に関し、ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株のスクロース含有培地における増殖および培地中の糖濃度変化を示すグラフである（●を含む実線：ＯＤ６００；△を含む実線：スクロース濃度；■を含む実線：グルコース濃度；×を含む実線：フルクトース濃度）
【図５】実施例１に関し、ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株のスクロース含有培地における増殖および培地中の糖濃度変化を示すグラフである（●を含む実線：ＯＤ６００；△を含む実線：スクロース濃度；■を含む実線：グルコース濃度；×を含む実線：フルクトース濃度）
【図６】実施例２に関し、ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ，ｄＲ株のスクロース含有培地における増殖および培地中の糖濃度変化を示すグラフである（●を含む実線：ＯＤ６００；△を含む実線：スクロース濃度；■を含む実線：グルコース濃度；×を含む実線：フルクトース濃度）
【図７】実施例２に関し、ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株のスクロース含有培地、グルコース含有培地、又はフルクトース含有培地における増殖および乾燥菌体重量、ＰＨＡ生産量の変化を示すグラフである。（△を含む実線：スクロース含有培地における変化；■を含む実線：グルコース含有培地における変化；×を含む実線：フルクトース含有培地における変化）
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。
【００２０】
（１）スクロース資化性が付与または強化されたＰＨＡ生産微生物
本発明では、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物に対し、異種生物由来のスクロース加水分解酵素遺伝子と異種生物由来のスクロース透過酵素遺伝子の両方を導入することによって、スクロース資化性が付与または強化され、スクロースを炭素源としてＰＨＡを生産する微生物を提供する。
【００２１】
本明細書で使用する「スクロース加水分解酵素遺伝子」は、スクロースを加水分解し、グルコースとフルクトースを生じさせる酵素であるスクロース加水分解酵素（ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子である。また、本明細書で使用する「スクロース透過酵素遺伝子」は、スクロースを細胞内に取り込む働きを持つスクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする遺伝子である。
【００２２】
本発明において、スクロース加水分解酵素遺伝子とスクロース透過酵素遺伝子が導入される元株（宿主）となる微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有し、ＰＨＡを生産できる微生物である限り特に限定されないが、本来はスクロース資化性を持たない、又はスクロース資化性の低いＰＨＡ生産微生物が好ましい。このようなＰＨＡ生産微生物としては、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有する野生株だけではなく、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株や、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を本来的に有しない微生物に対して遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された組み換え菌株であってもよい。
【００２３】
そのような微生物として、具体的には、細菌、酵母、糸状菌などが例示され、好ましくは、細菌である。当該細菌としては、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する細菌類が好ましい例として挙げられる。安全性及び生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス属、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属又はアエロモナス属に属する細菌であり、さらにより好ましくはカプリアビダス属に属する微生物であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）である。
【００２４】
ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物が、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された組み換え菌株である場合、前記外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子としては、例えば、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株（Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株）が保有する配列番号３に記載するアミノ酸配列をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子、又は、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ＰＨＡ合成活性を有するポリペプチドをコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子や、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）が保有するＰＨＡ合成酵素遺伝子、又は、該アミノ酸配列に対して８５％以上の配列同一性を有し、且つ、ＰＨＡ合成活性を有するポリペプチドをコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子などが挙げられるがこれらに限定されず、その他のＰＨＡ合成酵素遺伝子も好適に利用出来る。なお、上記配列同一性は好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。これらの中でも、ＰＨＡとしてＰＨＢＨを合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子が好ましく、例えば配列番号４に記載するアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードするＰＨＡ合成酵素遺伝子がより好ましい。
【００２５】
本発明においてスクロース加水分解酵素遺伝子とスクロース透過酵素遺伝子を導入される元株となる微生物としては、ＰＨＢＨを合成可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する微生物が好ましく、その具体例としては、カプリアビダス・ネカトールに、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入された形質転換体が最も好適である。
【００２６】
本発明では、上記微生物に、当該微生物とは異種の生物に由来するスクロース加水分解酵素遺伝子とスクロース透過酵素遺伝子を導入する。ここで、スクロース加水分解酵素遺伝子としては、エシェリキア・コリ由来の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、且つスクロース加水分解酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であれば特に限定されないが、一例として、配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。スクロース透過酵素遺伝子については、エシェリキア・コリ由来の配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、且つスクロース透過酵素活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子であれば特に限定されないが、一例として、配列番号６に記載の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。なお、上記配列相同性としては好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。
【００２７】
本発明のＰＨＡ生産微生物において、ＰＨＡ合成酵素遺伝子や、スクロース加水分解酵素遺伝子及びスクロース透過酵素遺伝子は、宿主となる微生物が保有する染色体、プラスミド、メガプラスミドなどのＤＮＡ上に存在しても良いし、プラスミドベクター上や人工染色体上など人為的に微生物内に組み込まれたＤＮＡ上に存在しても良い。しかし、導入されたＤＮＡの保持という観点から、微生物が保有する染色体あるいはメガプラスミド上に存在するのが好ましく、微生物が保有する染色体上に存在するのがより好ましい。
【００２８】
微生物が保有するＤＮＡ上に任意のＤＮＡを部位特異的に置換又は挿入する方法は当業者に周知であり、本発明の微生物を製造する際に使用できる。特に限定されないが、代表的な方法としては、トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  ｖｏｌ．１６２：ｐ１０６８（１９８５））、相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ｖｏｌ．１５４，  ｐ１９７（１９８７））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，  Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ｖｏｌ．６，  ｐ１１９５  （１９９２）、  Ｌｅｎｚ等，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  ｖｏｌ．１７６，  ｐ４３８５（１９９４））等が挙げられる。また、細胞へのベクターの導入方法としても特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
【００２９】
なお、遺伝子クローニングや遺伝子組み換え技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９又は２００１）などに記載される技術を利用することができる。
【００３０】
上記スクロース加水分解酵素遺伝子、及びスクロース透過酵素遺伝子を発現させるためのプロモーターは特に限定されない。例えば、カプリアビダス・ネカトールのｐｈａＣ１遺伝子のプロモーター、ｐｈａＰ１遺伝子のプロモーター、大腸菌に由来するｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｉｃプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが使用可能である。また、各遺伝子に対し同じプロモーターを使用してもよく、異なるプロモーターを使用してもよい。特に、配列番号７に示されるｌａｃＵＶ５プロモーターを両遺伝子に対し使用するのが好ましい。
【００３１】
上記によりスクロース資化性が付与または強化された微生物のグルコース資化性が低い、または資化性を持たない場合、遺伝子変異や破壊、遺伝子発現の強化、外来遺伝子の導入などの方法によって、前記微生物にグルコース資化性を付与または強化することが好ましい。これによって、前記微生物のスクロース資化性をさらに強化し、スクロースを炭素源として用いた場合にＰＨＡ生産量を向上させることができる。例えば、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株はグルコース取り込み系の遺伝子を持たないため、グルコースを資化することができない。Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株にグルコース資化性を付与する方法は特に限定されないが、一例として、Ｎ−アセチルグルコサミンの取り込み遺伝子であるｎａｇＥの７９３番目の塩基であるＧをＣに置換し、さらに転写制御因子をコードする遺伝子であるｎａｇＲを破壊することで、グルコース資化性を付与する方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ.１１３，６３（２０１２））が挙げられる。また、グルコーストランスポーターをコードする外来遺伝子を導入することで、グルコース資化性を付与する方法（特開２００９−２２５６６２号公報）も挙げられる。さらに、グルコースリン酸化酵素遺伝子を導入する方法が有効な場合もある。
【００３２】
従来の研究から、３ＨＨモノマーを取り込み可能なＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入したカプリアビダス・ネカトールに、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｃｃｒ）およびエチルマロニル−ＣｏＡ脱炭酸酵素遺伝子（ｅｍｄ）を導入することで、あるいは（Ｒ）−特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子（ｐｈａＪ）をさらに導入することで、フルクトースを炭素源としてＰＨＢＨを生産できることが知られている（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．２７，３８（２０１５））。本発明のＰＨＡ生産微生物において、前記スクロース加水分解酵素遺伝子及びスクロース透過酵素遺伝子に加えて、ｃｃｒ及び／又はｅｍｄが導入されていても良い。ｃｃｒ及び／又はｅｍｄの導入により、糖質を炭素源とする場合において、炭素数６の（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡの合成経路が強化又は効率化され、生産されるＰＨＢＨにおける３ＨＨ組成比率を向上させることができる。
【００３３】
本発明において使用されるクロトニル−ＣｏＡ還元酵素とは、脂肪酸β−酸化経路の中間体である炭素数４のクロトニル−ＣｏＡを還元し、ブチリル−ＣｏＡを生成する酵素である。ブチリル−ＣｏＡがβ−ケトチオラーゼ（ＢｋｔＢ）の作用によりもう１分子のアセチル−ＣｏＡと縮合し、さらに変換されることにより、炭素数６の（Ｒ）−３ＨＨｘ−ＣｏＡが供給され、これが、広基質特異性を示すポリエステル重合酵素により（Ｒ）−３ＨＢ−ＣｏＡと共重合される。本発明において使用され得るｃｃｒは、翻訳後の該還元酵素が上記のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素活性を有する限り特に限定されないが、例えば、放線菌Ｓ．ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ由来のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ１７８６７３）や、メタノール資化性菌Ｍ．ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ由来のクロトニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：７９９０２０８）等が挙げられる。好ましくは配列番号４０に記載のアミノ酸配列を有するクロトニル−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子、又は該アミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し、且つクロトニル−ＣｏＡ還元酵素活性を示すポリペプチドをコードする遺伝子である。
【００３４】
本発明に使用されるエチルマロニル−ＣｏＡ脱炭酸酵素とは、クロトニル−ＣｏＡ還元酵素やプロピオニル−ＣｏＡカルボキシラーゼなどによる副反応で生じたエチルマロニル−ＣｏＡのブチリル−ＣｏＡへの脱炭酸反応を触媒する酵素を意味する。この活性を有する限りにおいては、エチルマロニル−ＣｏＡ脱炭酸酵素の由来は特に限定されないが、例えば配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有するマウス由来のエチルマロニル−ＣｏＡ脱炭酸酵素が挙げられる。該アミノ酸配列をコードし、カプリアビダス・ネカトールにおいて使用可能な遺伝子塩基配列としては、例えば、配列番号４２に記載の塩基配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３５】
本発明によるＰＨＢＨ生産微生物においては、上記ｃｃｒおよびｅｍｄの導入に加えて、上記（Ｒ）−特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼをコードする遺伝子（ｐｈａＪ）をさらに導入してもよい。これにより、（Ｒ）−３ＨＨｘ−ＣｏＡの生合成能力を強化することができる。ここで、本発明に使用される（Ｒ）−特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼとは、脂肪酸β−酸化系中間体である２−エノイル−ＣｏＡを、ＰＨＡモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する酵素を意味する。この活性を有する限りにおいては、ｐｈａＪの由来は特に限定されないが、好ましくは、カプリアビダス・ネカトール又はアエロモナス・キャビエ由来である。本発明に使用されるｐｈａＪとして、例えば、カプリアビダス・ネカトール由来のｐｈａＪ４ａ（Ｈ１６  Ａ１０７０,ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：４２４８６８９）やｐｈａＪ４ｂ（Ｈ１６  Ｂ０３９７,ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：４４５４９８６）、アエロモナス・キャビエ由来のｐｈａＪ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡＡ２１８１６）等が挙げられる。
【００３６】
本発明のＰＨＢＨ生産微生物においては、上記ｃｃｒおよびｅｍｄの導入に加えて、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子を欠失させるか、その発現を抑制することで、より高い３ＨＨ組成比率のＰＨＢＨを生産することが可能となる。欠失させるかまたは発現を抑制するアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子としては、アセトアセチル−ＣｏＡを基質として（Ｒ）−３ＨＢ−ＣｏＡを生成する触媒機能を有する酵素をコードする遺伝子であればよい。特に限定されないが、例えば、ｐｈａＢ１やｐｈａＢ３（ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：４２４９７８４、ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：４２５０１５５）が挙げられる。
【００３７】
本明細書において欠失とは、遺伝子操作や突然変異によって、対象とする遺伝子の一部又は全部が存在しなくなった、あるいは塩基配列の追加や置換によって終止コドンが出現したりコードするアミノ配列が変化したなどの結果として、該遺伝子によってコードされたタンパク質の活性の一部又は全部が失われることを意図する。遺伝子発現を抑制する方法としては、遺伝子上流のプロモーター領域やリボソーム結合配列における塩基配列の改変などが挙げられるが、これに限定されない。
【００３８】
本発明のＰＨＡ生産微生物において、ｃｃｒ、ｅｍｄ、及びｐｈａＪは、宿主となる微生物が保有する染色体、プラスミド、メガプラスミドなどのＤＮＡ上に存在しても良いし、プラスミドベクター上や人工染色体上など人為的に微生物内に組み込まれたＤＮＡ上に存在しても良い。しかし、導入されたＤＮＡの保持という観点から、微生物が保有する染色体あるいはメガプラスミド上に存在するのが好ましく、微生物が保有する染色体上に存在するのがより好ましい。また、宿主となる微生物がこれらの遺伝子を元々保有している場合には、元々保有する遺伝子の上流の塩基配列を置換、欠失または付加することなどにより、遺伝子の発現量を増加させてもよい。
【００３９】
上記ｃｃｒ、ｅｍｄ、及びｐｈａＪを発現させるためのプロモーターは特に限定されない。例えば、カプリアビダス・ネカトールのｐｈａＣ１遺伝子のプロモーター、ｐｈａＰ１遺伝子のプロモーター、大腸菌に由来するｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｉｃプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが使用可能である。また、各遺伝子に対し同じプロモーターを使用してもよく、異なるプロモーターを使用してもよい。特に、ｔｒｃプロモーターを各遺伝子に対し使用するのが好ましい。
【００４０】
（２）ＰＨＡの製造方法
本発明の微生物を、炭素源としてスクロースを含む培地で培養することで、ＰＨＡを生産させ、得られたＰＨＡを回収することでＰＨＡを製造することができる。
【００４１】
本発明によるＰＨＡの生産においては、炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地において、前記微生物を培養することが好ましい。
【００４２】
炭素源としてはスクロースを含有していれば良く、スクロースを含有する炭素源として、スクロースを豊富に含む糖蜜、または廃糖蜜が挙げられる。また、スクロースを含有していれば他の炭素源が含まれていてもよく、スクロースと他の炭素源を併用してもよい。他の炭素源としては、本発明の微生物が資化可能であればどんな炭素源でも使用可能であるが、好ましくは、グルコース、フルクトースなどの糖類、パーム油、パーム核油、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体等が挙げられる。
【００４３】
窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
【００４４】
本発明の微生物を培養する際の、培養温度、培養時間、培養時ｐＨ、培地等の条件は、使用する微生物、例えばラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属、アエロモナス属、エシェリキア属、アルカリゲネス属、シュードモナス属等の細菌類の培養で通常使用されるような条件でよい。
【００４５】
本発明において生産されるＰＨＡの種類としては、微生物が生産することのできるＰＨＡであれば特に限定されないが、好ましくは、炭素数４〜１６のヒドロキシアルカン酸から選択される１種以上のモノマーを重合して得られるＰＨＡが好ましい。例えば、３ＨＢのホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３ＨＶの共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）、３ＨＢと３ＨＨの共重合体ＰＨＢＨ、３ＨＢと４ＨＢの共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、ＰＨＢＨが好ましい。なお、生産されるＰＨＡの種類は、その目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
【００４６】
本発明において、微生物を培養した後、菌体からのＰＨＡの回収は、特に限定されないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰＨＡを抽出する。このＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰＨＡを回収する。
【００４７】
得られたＰＨＡの重量平均分子量（Ｍｗ）や３ＨＨ等のモノマー組成（ｍｏｌ％）の分析は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィーやガスクロマトグラフ法、核磁気共鳴法等により行うことができる。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。【００４９】
また、以下の製造例、実施例、及び比較例で使用されるＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ１，２，６遺伝子が欠失し、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入された形質転換体であり、国際公開第２０１４／０６５２５３号の方法に準じて作製することが出来る。【００５０】
（製造例１）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株の作製
まず、染色体置換用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。【００５１】
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号８及び配列番号９で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは初めに９８℃で２分の処理を行った後、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２分の一連の反応を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用いた。また同様に、配列番号１０及び配列番号１１で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号８及び１１で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢと、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基より上流および下流の塩基配列を有し、且つｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基がＧからＣに置換された塩基配列を含む染色体置換用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｎａｇＥＧ７９３Ｃを作製した。【００５２】
次に、染色体置換用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｎａｇＥＧ７９３Ｃを用いて、以下のようにして染色体置換株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株の作製を行った。【００５３】
染色体置換用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｎａｇＥＧ７９３Ｃで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。【００５４】
得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、当該寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、前記プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＤＮＡシーケンサーによる解析により、染色体上のｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換された菌株１株を単離した。この変異導入株をＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株と命名した。得られたＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株はＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、さらにｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換された株である。【００５５】
さらに、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。【００５６】
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号１２及び配列番号１３で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは上記と同様の反応条件で行い、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用いた。また同様に、配列番号１４及び配列番号１５で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号１２及び１５で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢと、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｎａｇＲ構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｎａｇＲＵＤを作製した。【００５７】
次に、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｎａｇＲＵＤを用いて、以下のようにして遺伝子破壊株ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株の作製を行った。【００５８】
遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｎａｇＲＵＤで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、上記で得られたＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。【００５９】
得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、当該寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、前記プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＤＮＡシーケンサーによる解析により、染色体上のｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。この遺伝子破壊株をＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株と命名した。ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、さらにｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した株である。【００６０】
（製造例２）ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の作製
まず、ｃｓｃＡおよびｃｓｃＢ遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。【００６１】
人工遺伝子合成により、ｃｓｃＡおよびｃｓｃＢ遺伝子を含む、配列番号１６で示される塩基配列が導入されたプラスミドを得た。このプラスミドを制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたｃｓｃＡおよびｃｓｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、国際公開第２００７／０４９７１６号に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｃｓｃＡＢを得た。【００６２】
さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１７および配列番号１８で示されるプライマーを用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたｌａｃＵＶ５プロモーター配列を含むＤＮＡ断片をＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片を、上記のプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｃｓｃＡＢをＭｕｎＩで切断したものと連結した。得られたプラスミドの中から、ｌａｃＵＶ５プロモーターの下流にｃｓｃＡおよびｃｓｃＢが位置する向きに、ｌａｃＵＶ５プロモーター配列を含むＤＮＡ断片が挿入されたものをＰＣＲによって選別し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢを得た。【００６３】
次に、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢをＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１，２，６株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株を得た。【００６４】
プラスミドベクターの細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた形質転換体ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株を取得した。【００６５】
（製造例３）ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株の作製
製造例２で作製したプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢを、製造例２と同様の方法で、製造例１で作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株を得た。【００６６】
（製造例４）ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の作製
まず、ｃｓｃＡ遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。【００６７】
製造例２に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢをテンプレートとして配列番号１９及び配列番号２０で示されるプライマーを用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたｃｓｃＡ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、国際公開第２００７／０４９７１６号に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｃｓｃＡを得た。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１７および配列番号１８で示されるプライマーを用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたｌａｃＵＶ５プロモーター配列を含むＤＮＡ断片をＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片を、上記のプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｃｓｃＡをＭｕｎＩで切断したものと連結した。得られたプラスミドの中から、ｌａｃＵＶ５プロモーターの下流にｃｓｃＡが位置する向きに、ｌａｃＵＶ５プロモーター配列を含むＤＮＡ断片が挿入されたものをＰＣＲによって選別し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡを得た。【００６８】
次に、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡを、製造例２と同様の方法でＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株を得た。【００６９】
（製造例５）ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の作製
まず、ｃｓｃＢ遺伝子発現用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。【００７０】
製造例２に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢをテンプレートとして配列番号２１及び配列番号２２で示されるプライマーを用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたｃｓｃＢ遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、国際公開第２００７／０４９７１６号に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２をＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｃｓｃＢを得た。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１７および配列番号１８で示されるプライマーを用いて製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたｌａｃＵＶ５プロモーター配列を含むＤＮＡ断片をＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片を、上記のプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｃｓｃＢをＭｕｎＩで切断したものと連結した。得られたプラスミドの中から、ｌａｃＵＶ５プロモーターの下流にｃｓｃＢが位置する向きに、ｌａｃＵＶ５プロモーター配列を含むＤＮＡ断片が挿入されたものをＰＣＲによって選別し、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＢを得た。【００７１】
次に、プラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＢを、製造例２と同様の方法でＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株を得た。【００７２】
（製造例６）ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４４Ｓ株の作製
まず、特開２０１３−９６２７号公報に記載のプラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いて、以下のようにしてプロモーターおよびリボソーム結合配列挿入株ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株の作製を行った。【００７３】
プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、製造例１で得られたＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ，ｄＲ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。【００７４】
得られた培養液を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、当該寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、前記プラスミドがＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ，ｄＲ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＤＮＡシーケンサーによる解析により、染色体上のｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株１株を単離した。この遺伝子挿入株をＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株と命名した。ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｂｋｔＢ（βケトチオラーゼ）遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株である。【００７５】
さらに、以下のようにしてプロモーターおよびリボソーム結合配列挿入株ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ株の作製を行った。【００７６】
まず、プロモーターおよびリボソーム結合配列挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。【００７７】
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号２３及び配列番号２４で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号２５及び配列番号２６で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。さらに、プラスミドｐＫＫ３８８−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートとして配列番号２７および配列番号２８で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた３種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号２３及び配列番号２６で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢと、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子より上流の塩基配列、ｔｒｃプロモーター、リボソーム結合配列、及びｐｈａＪ４ｂ構造遺伝子配列を有するプロモーターおよびリボソーム結合配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂを作製した。【００７８】
次に、プロモーターおよびリボソーム結合配列挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＪ４ｂＵ−ｔｒｃ−ｐｈａＪ４ｂを用いて、ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株を親株として、上記のプロモーターおよびリボソーム結合配列挿入株の作製方法と同様に、接合伝達、シモンズ寒天培地での選択、及び、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地での選択を行い、ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ株を作製した。ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、さらにｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株である。【００７９】
さらに、以下のようにして染色体置換株ＫＮＫ１４４Ｓ株の作製を行った。【００８０】
特開２００８−２９２１８号公報に記載の染色体置換用ベクターｐＢｌｕｅＡＳＲＵを用いて、ＡＣＰ−ｂｋｔＢ／ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ／ｔｒｃ−Ｊ４ｂ株を親株として、製造例１に記載の染色体置換株の作製と同様に、接合伝達、シモンズ寒天培地での選択、及び、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地での選択を行い、ＫＮＫ１４４Ｓ株を作製した。ＫＮＫ１４４Ｓ株はＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、さらにｐｈａＡ構造遺伝子配列中に終止コドンと制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が生成した株である。【００８１】
次に、製造例２に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢを、製造例２と同様の方法でＫＮＫ１４４Ｓ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４４Ｓ株を得た。【００８２】
（製造例７）ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４３Ｓ株の作製
まず、プロモーター、リボソーム結合配列及び遺伝子挿入用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。【００８３】
Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号２９及び配列番号３０で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは上記と同様の反応条件で行い、ポリメラーゼはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用いた。また同様に、配列番号３１及び配列番号３２で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。さらに、上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号２９及び３２で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢと、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＺ２構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するプラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＺ２ＭｕｎＩＳｐｅＩを作製した。【００８４】
次に、人工遺伝子合成により、リボソーム結合配列、ｃｃｒおよびｅｍｄを含む、配列番号３３で示される塩基配列が導入されたプラスミドを得た。このプラスミドを制限酵素ＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで消化し、得られたリボソーム結合配列、ｃｃｒおよびｅｍｄ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２ＵＤＭｕｎＩＳｐｅＩをＭｕｎＩおよびＳｐｅＩで切断したものと連結し、プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２Ｕ−ｃｃｒ−ｅｍｄ−Ｚ２Ｄを得た。【００８５】
次に、プラスミドｐＫＫ３８８−１（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）をテンプレートとして配列番号３４および配列番号３５で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲで得られたｔｒｃプロモーター配列を含むＤＮＡ断片をＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片を、上記のプラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２Ｕ−ｃｃｒ−ｅｍｄ−Ｚ２ＤをＭｕｎＩで切断したものと連結した。得られたプラスミドの中から、ｔｒｃプロモーターの下流にｃｃｒおよびｅｍｄが位置する向きに、ｔｒｃプロモーター配列を含むＤＮＡ断片が挿入されたものをＰＣＲによって選別し、プロモーター、リボソーム結合配列及び遺伝子挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２Ｕ−ｔｒｃ−ｃｃｒ−ｅｍｄ−Ｚ２Ｄを得た。【００８６】
次に、プロモーター、リボソーム結合配列及び遺伝子挿入用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋Ｚ２Ｕ−ｔｒｃ−ｃｃｒ−ｅｍｄ−Ｚ２Ｄを用いて、ＫＮＫ１４４Ｓ株を親株として、製造例６に記載のプロモーターおよびリボソーム結合配列挿入株の作製方法と同様に、接合伝達、シモンズ寒天培地での選択、及び、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地での選択を行い、ＫＮＫ１４３Ｓ株を作製した。ＫＮＫ１４３Ｓ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＡ構造遺伝子配列中に終止コドンと制限酵素ＮｈｅＩ切断部位が生成し、さらに元々はｐｈａＺ２遺伝子があった位置にｔｒｃプロモーター、リボソーム結合配列、ｃｃｒ遺伝子及びｅｍｄ遺伝子が挿入された株である。【００８７】
次に、製造例２に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢを、製造例２に記載の方法でＫＮＫ１４３Ｓ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４３Ｓ株を得た。【００８８】
（製造例８）ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４０Ｓ株の作製
まず、遺伝子破壊用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。【００８９】
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の染色体ＤＮＡをテンプレートとして配列番号３６及び配列番号３７で示されるプライマーを用いて、製造例１と同様の条件でＰＣＲを行った。また同様に、配列番号３８及び配列番号３９で示されるプライマーを用いて、同様の条件でＰＣＲを行った。上記ＰＣＲで得られた２種類のＤＮＡ断片をテンプレートとして、配列番号３６及び配列番号３９で示されるプライマーを用いて同様の条件でＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化した。このＤＮＡ断片を、ＳｗａＩ消化した特開２００７−２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢと、ＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｐｈａＡ構造遺伝子より上流の塩基配列、及びｐｈａＢ１（アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ）構造遺伝子より下流の塩基配列を有する遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢ１ＵＤを作製した。【００９０】
次に、遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢ１ＵＤを用いて、ＫＮＫ−１４４Ｓ株を親株として、製造例１に記載の染色体置換株の作製と同様に、接合伝達、シモンズ寒天培地での選択、及び、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地での選択を行い、ＫＮＫ１４０Ｓ株を作製した。ＫＮＫ１４０Ｓ株は、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、さらにｐｈａＡ遺伝子の開始コドンからｐｈａＢ１遺伝子の終止コドンまでを欠失した株である。【００９１】
次に、製造例２に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢを、製造例２に記載の方法でＫＮＫ１４０Ｓ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４０Ｓ株を得た。【００９２】
（製造例９）ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４２Ｓ株の作製
製造例８に記載の遺伝子破壊用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ−ｓａｃＢ＋ｐｈａＡＢ１ＵＤを用いて、製造例７に記載のＫＮＫ−１４３Ｓ株を親株として、製造例１に記載の染色体置換株の作製と同様に、接合伝達、シモンズ寒天培地での選択、及び、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ  Ａｇａｒ培地での選択を行い、ＫＮＫ１４２Ｓ株を作製した。ＫＮＫ１４２Ｓ株はＣ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株の染色体上のｐｈａＺ６遺伝子及びｐｈａＺ１遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、さらにｐｈａＺ２遺伝子の１６番目のコドンから終止コドンまでを欠失し、染色体上に配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子が導入され、ｎａｇＥ構造遺伝子の７９３番目の塩基であるＧがＣに置換され、ｎａｇＲ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にＡ. ｃａｖｉａｅのｐｈａＣ遺伝子のプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、ｐｈａＪ４ｂ遺伝子の開始コドン直前にｔｒｃプロモーターおよびリボソーム結合配列を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入され、元々はｐｈａＺ２遺伝子があった位置にｔｒｃプロモーター、リボソーム結合配列、ｃｃｒ遺伝子及びｅｍｄ遺伝子が挿入され、さらにｐｈａＡ遺伝子の開始コドンからｐｈａＢ１遺伝子の終止コドンまでを欠失した株である。【００９３】
次に、製造例２に記載のプラスミドベクターｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢを、製造例２に記載の方法でＫＮＫ１４２Ｓ株へ導入し、形質転換体ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４２Ｓ株を得た。【００９４】
（比較例１〜４）ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株、ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株およびｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株におけるスクロースの資化性、ＰＨＡ生産性およびその３ＨＨ組成比率
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％  Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４とした。種母培地でプラスミドベクター導入株を培養する場合には、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように種母培地に添加した。【００９５】
スクロース資化性試験およびＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成は１．１ｗ／ｖ％  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％  ＫＨ２ＰＯ４、０．１３ｗ／ｖ％  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源は４０ｗ／ｖ％スクロース水溶液を単一炭素源として用い、１．５ｗ／ｖ％となるように培地に添加した。【００９６】
ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株（国際公開第２０１４／０６５２５３号参照）、製造例１において作製したＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株、製造例４において作製したｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株および製造例５において作製したｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株の各グリセロールストック（５０μＬ）をそれぞれ種母培地（５ｍＬ）に接種して培養温度３０℃で２４時間振とう培養し、得られた培養液を種母とした。【００９７】
スクロース資化性試験およびＰＨＡ生産培養では、２００ｍＬの生産培地を入れた坂口フラスコに前記種母を１．０ｖ／ｖ％接種し、培養温度３０℃で振とう培養を行った。経時的に培養液をサンプリングし、菌体の増殖（ＯＤ６００）および培地中の各種糖濃度（スクロース、グルコース、フルクトース）を測定した。糖濃度の測定はＦ−キット ショ糖／D−グルコース／果糖（株式会社 J.K.インターナショナル）を用いて行った。結果を図１〜４に示した。【００９８】
７２時間培養後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。【００９９】
ＰＨＡ生産量は以下のように算出した。得られた乾燥菌体１ｇあたり１００ｍＬのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が１／３になるまで濃縮後、濃縮液量の３倍量のヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、ＰＨＡ生産量を算出した。結果を表１に示した。【０１００】
生産されたＰＨＡの３ＨＨ組成比率は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ＰＨＡの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでＰＨＡ分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のＰＨＡ分解物のモノマー単位組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌを注入した。温度条件は、初発温度１００〜２００℃まで８℃／分の速度で昇温し、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、得られたＰＨＡの３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１０１】
比較例１、２および４のＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株、ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株およびｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株は、スクロースを炭素源として増殖することができなかった。比較例３のｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株は、スクロースを炭素源としてわずかに増殖したが、その増殖速度は非常に遅かった。また、比較例３のｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株によって生産されたＰＨＡは３ＨＨモノマー単位を含有せず、３ＨＢのホモポリマーであるＰＨＢであった。【０１０２】
（実施例１）ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株におけるスクロース資化性、ＰＨＡ生産性およびその３ＨＨ組成比率
種母培地の組成は比較例１〜４に記載のものと同様とした。種母培地でプラスミドベクター導入株を培養する場合には、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように種母培地に添加した。【０１０３】
スクロース資化性試験およびＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成および炭素源は比較例１〜４に記載のものと同様とした。【０１０４】
製造例２において作製したｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株を比較例１〜４と同様の方法で培養し、経時的に培養液をサンプリングし、菌体の増殖（ＯＤ６００）および培地中の各種糖濃度（スクロース、グルコース、フルクトース）を測定した。糖濃度の測定は比較例１〜４と同様の方法で行った。結果を図５に示した。【０１０５】
７２時間培養後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。【０１０６】
ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１〜４と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１０７】
ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６株は、スクロースを炭素源として良好に増殖し、ＰＨＡを生産した。生産されたＰＨＡはホモポリマーであるＰＨＢであった。【０１０８】
（実施例２）ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株におけるスクロース、グルコース、フルクトース資化性、ＰＨＡ生産性およびその３ＨＨ組成比率
種母培地の組成は比較例１〜４に記載のものと同様とした。種母培地でプラスミドベクター導入株を培養する場合には、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように種母培地に添加した。【０１０９】
スクロース資化性試験およびＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成は比較例１〜４に記載のものと同様とした。炭素源は４０ｗ／ｖ％スクロース水溶液を単一炭素源として用い、１．５ｗ／ｖ％となるように培地に添加した。【０１１０】
製造例３において作製したｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株を比較例１〜４と同様の方法で培養し、経時的に培養液をサンプリングし、菌体の増殖（ＯＤ６００）および培地中の各種糖濃度（スクロース、グルコース、フルクトース）を測定した。糖濃度の測定は比較例１〜４と同様の方法で行った。結果を図６に示した。【０１１１】
７２時間培養後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。【０１１２】
ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１〜４と同様の方法で算出した。結果を表１に示した。【０１１３】
また、上記と同様の条件で炭素源をスクロース水溶液から同濃度のグルコース水溶液またはフルクトース水溶液に変更した生産培地において培養を行い、経時的に培養液をサンプリングし、菌体の増殖（ＯＤ６００）、乾燥菌体重量、及び、ＰＨＡ生産量を測定した。結果を図７に示した。【０１１４】
生産されたＰＨＡの３ＨＨ組成比率を比較例１〜４と同様の方法で算出した。得られたＰＨＡの３ＨＨ組成比率を表１に示した。【０１１５】
ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株は、スクロースを炭素源として、特に優れた増殖力およびＰＨＡ生産性を示した。スクロースを炭素源とした場合の増殖速度はグルコースを炭素源とした場合を上回り、Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ  Ｈ１６株が元来資化可能なフルクトースを炭素源とした場合と同等であった。【０１１６】
ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ００５ΔｐｈａＺ１,２,６／ｎａｇＥＧ７９３Ｃ,ｄＲ株によって生産されたＰＨＡは、３ＨＢのホモポリマーであるＰＨＢであった。【０１１７】
（実施例３〜６）ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４４Ｓ株、ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４３Ｓ株、ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４０Ｓ株およびｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４２Ｓ株におけるＰＨＡ生産性およびその３ＨＨ組成比率
種母培地の組成は比較例１〜４に記載のものと同様とした。種母培地でプラスミドベクター導入株を培養する場合には、カナマイシンを最終濃度１００μｇ／ｍｌとなるように種母培地に添加した。【０１１８】
ＰＨＡ生産に使用した生産培地の組成および炭素源は比較例１〜４に記載のものと同様とした。製造例６〜９において作製したｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４４Ｓ株、ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４３Ｓ株、ｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４０Ｓ株およびｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４２Ｓ株をそれぞれ比較例１〜４と同様の方法で培養し、７２時間培養後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。【０１１９】
ＰＨＡ生産量および３ＨＨ組成比率を比較例１〜４と同様の方法で算出した。結果を表１に示した。【０１２０】
いずれの株も、スクロースを炭素源として良好に増殖し、ＰＨＡを生産した。実施例３のｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４４Ｓ株および実施例５のｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４０Ｓ株によって生産されたＰＨＡは３ＨＨモノマーを僅かに含有するＰＨＢＨであり、実施例４のｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４３Ｓ株によって生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が２．３％のＰＨＢＨであった。実施例６のｐＣＵＰ２−ｌａｃＵＶ５−ｃｓｃＡＢ  ｉｎ  ＫＮＫ１４２Ｓ株によって生産されたＰＨＡは、３ＨＨ組成比率が２６．７％と非常に高いＰＨＢＨであった。【０１２１】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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