(57)【要約】  本発明は、従来のアプタマーよりも結合能、特異性、及び／又は安定性が高い癌細胞に対するアプタマーを提供することを目的とする。  本発明は、人工塩基を含む癌細胞に結合するＤＮＡアプタマーにより上記課題を解決する。
2017073535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（i）又は（ii）の塩基配列を含む、癌細胞に結合するDNAアプタマー：
（i）（a）N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34（配列番号35）に示される塩基配列
（配列中、N1〜N5は独立にG、T、A若しくはCであり、N26は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N30はN5と、N31はN4と、N32はN3と、N33はN2と、N34はN1と塩基対を形成する）、又は
（b）（i）（a）に示される塩基配列のN26以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列；及び
（ii）（a）N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N29N30N31（配列番号28）に示される塩基配列
（配列中、N1〜N6、N14、N25は独立にG、T、A若しくはCであり、N13及びN22は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N26はN4と、N29はN3と、N30はN2と、N31はN1と塩基対を形成し、N27及びN28は独立にG、T、A、C若しくは存在しない）、又は
（b）（ii）（a）に示される塩基配列のN13及びN22以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
【請求項２】
（i）（a）又は（ii）（a）の塩基配列がさらに1〜5個のGC対を末端に含む、請求項１に記載のDNAアプタマー。
【請求項３】
前記塩基対がGC対である、請求項１又は２に記載のDNAアプタマー。
【請求項４】
（i）（b）の付加、欠失、及び／又は置換が、配列番号35の1位〜5位又は30位〜34位においてなされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。
【請求項５】
（ii）（b）の付加、欠失、及び／又は置換が、配列番号28の1位〜6位、14位又は25位〜31位においてなされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。
【請求項６】
（i）（a）の塩基配列が、配列番号36、37、又は40に示される配列である、請求項１又は２に記載のDNAアプタマー。
【請求項７】
（ii）（a）の塩基配列が、配列番号29に示される配列である、請求項１又は２に記載のDNAアプタマー。
【請求項８】
3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
前記ミニヘアピン構造が、
5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
（B）GNA又はGNNA（ここで、各nは独立にG、T、A若しくはCのいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、
かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。
【請求項９】
以下の（I）〜（IV）のいずれかの塩基配列を含む、乳癌細胞に結合するDNAアプタマー：
（I）（a）N1N2N3N4N5N6CAGCCTGGGN16TN18TCTTTN24AGTCN29AN31TTCAN36TCGN40N41N42N43N44N45（配列番号43）に示される塩基配列
（配列中、N1〜N6、N18、N24、N31、及びN36は独立に、G、T、A若しくはCであり、N16は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N29は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl、G、T、A若しくはCであり、N40はN6と、N41はN5と、N42はN4と、N43はN3と、N44はN2と、N45はN1と塩基対を形成する）、又は
（b）（I）（a）に示される塩基配列のN16以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列；及び
（II）（a）N1N2N3N4CN6N7TCGAACTGN16N17ATGAGN23GTN26N27N28N29N30N31（配列番号2）に示される塩基配列
（配列中、N1〜N4、N7、N16、N23、N26及びN31独立に、G、T、A若しくはCであり、N6は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl、G、T、A若しくはCであり、N17は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N27はN3と、N28はN2と塩基対を形成し、N29及びN30はG、T、A、C若しくは存在しない）、又は
（b）（II）（a）に示される塩基配列のN17以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列；
（III）（a）N1N2N3CCGGCTN10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20N21N22N23N24N25TCCTGGN32N33TAAGGTTTCTAAN46N47N48N49N50N51（配列番号18）に示される塩基配列
（配列中、N1〜N3、N13〜N17、N19〜N22、N33、N46〜N48、及びN50は独立に、G、T、A若しくはCであり、N10〜N12及びN23〜N25はG、T、A、C若しくは存在せず、N18は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl、G、T、A若しくはC、又は存在せず、N32は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N49はN3と、N51はN1と塩基対を形成し、N10〜N15の三つ以上がN20〜N25の三つ以上と塩基対を形成する）、又は
（b）（III）（a）に示される塩基配列のN32以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列；
（IV）（a）N1N2N3TCTTAAGTTTAN15AN17N18TN20N21N22N23TN25N26N27N28N29N30N31N32TN34GGGCGTTTTAAN46N47N48N49（配列番号50）に示される塩基配列
（配列中、N1〜N3、N15、N17、N20〜N23、N25〜N29、N31〜N32、N34及びN46は独立に、G、T、A若しくはCであり、N18及びN30は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N47はN3と、N48はN2と、N49はN1と塩基対を形成する）、又は
（b）（IV）（a）に示される塩基配列のN18及びN30以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
【請求項１０】
（I）（a）、（II）（a）、（III）（a）、又は（IV）（a）の塩基配列がさらに1〜5個のGC対を末端に含む、請求項９に記載のDNAアプタマー。
【請求項１１】
前記塩基対がGC対である、請求項９又は１０に記載のDNAアプタマー。
【請求項１２】
（I）（b）の付加、欠失、及び／又は置換が、配列番号43の1位〜6位、18位、24位、29位、31位、36位、又は40位〜45位においてなされる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。
【請求項１３】
（II）（b）の付加、欠失、及び／又は置換が、配列番号2の1位〜4位、6〜7位、16位、23位、又は26位〜31位においてなされる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。
【請求項１４】
（III）（b）の付加、欠失、及び／又は置換が、配列番号18の1位〜3位、10位〜25位、33位、又は46位〜51位においてなされる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。
【請求項１５】
（IV）（b）の付加、欠失、及び／又は置換が、配列番号50の1位〜3位、15位、17位、20位〜23位、25位〜29位、31位〜32位、34位、又は46位〜49位においてなされる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。
【請求項１６】
（I）（a）の塩基配列が、配列番号44又は46に示される配列である、請求項９又は１０に記載のDNAアプタマー。
【請求項１７】
（II）（a）の塩基配列が、配列番号3〜5、8〜9、及び14〜16のいずれかに示される配列である、請求項９又は１０に記載のDNAアプタマー。
【請求項１８】
（III）（a）の塩基配列が、配列番号20、21、及び26のいずれかに示される配列である、請求項９又は１０に記載のDNAアプタマー。
【請求項１９】
（IV）（a）の塩基配列が、配列番号51に示される配列である、請求項９又は１０に記載のDNAアプタマー。
【請求項２０】
3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
前記ミニヘアピン構造が、
5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
（B）GNA又はGNNA（ここで、各Nは、独立に、G、T、A若しくはCのいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、
かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
請求項９〜１９のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含む癌検出剤。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含む癌細胞検出用キット。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の（i）（a）又は（b）の塩基配列を含むDNAアプタマーからなる抗癌剤。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のDNAアプタマーと薬剤とを含む、薬剤を癌細胞に送達するための医薬組成物。
【請求項２６】
癌細胞を検出する方法であって、
被験体から得られた細胞を含むサンプルを、請求項１〜８のいずれか一項に記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記サンプルと前記DNAアプタマーの結合に基づいて癌細胞を検出する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２７】
乳癌細胞を検出する方法であって、
被験体から得られた細胞を含むサンプルを、請求項９〜２０のいずれか一項に記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記サンプルと前記DNAアプタマーの結合に基づいて乳癌細胞を検出する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２８】
被験体から得られた癌細胞を分類する方法であって、
被験体から得られた癌細胞を、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記癌細胞と前記DNAアプタマーの結合の有無又は強度を測定する工程、
前記結合の有無又は強度に基づいて癌細胞を分類する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２９】
被験体から得られた乳癌細胞を分類する方法であって、
被験体から得られた乳癌細胞を、請求項９〜２０のいずれか一項に記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記乳癌細胞と前記DNAアプタマーの結合の有無又は強度を測定する工程、
前記結合の有無又は強度に基づいて乳癌細胞を分類する工程、
を含む、前記方法。
【請求項３０】
接触工程が、被験体から得られた乳癌細胞を、請求項９〜２０のいずれか一項に記載の（I）〜（IV）の四つの群の少なくとも二つの群から選択される二種以上のDNAアプタマーと接触させる工程である、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工塩基を含む、癌細胞に結合するDNAアプタマー、該DNAアプタマーを含む医薬組成物、及び該DNAアプタマーを用いて癌細胞を検出する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的分子に対する結合活性を有する核酸断片は核酸アプタマーと呼ばれ、核酸医薬品として医療への幅広い応用が期待されている。近年、低分子物質やタンパク質ばかりでなく、細胞やウイルス自体も核酸アプタマーの標的となり得ることが示されている（非特許文献１〜３）。細胞全体を標的とすることで、細胞表面に発現している受容体や糖鎖など、その細胞を特徴づける表面分子を認識するアプタマーを取得できる。【０００３】
また、近年、癌の治療において、癌マーカーの発現状態を指標に治療方針を決めることが一般的になってきている。しかし、既知のマーカーの種類はまだ乏しいのが現状である。癌細胞を標的とした核酸アプタマーの獲得により、多様な癌を特徴づけることのできる新たなマーカーを発見できれば、各種癌の早期診断に役立ち得る。また、癌細胞に特異的に標的結合する核酸アプタマーを得られれば、抗癌剤やドラッグデリバリーシステム（DDS）への応用も可能となる。しかしながら、従来の核酸アプタマーは、治療及び診断をはじめとする医療分野に用いるには、結合能、特異性、及び安定性等の点で十分といえるものではなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Sefah, K. et al., Nature protocols 2010, 5, 6, pp. 1169-1185
【非特許文献２】Acquah, C. et al., Critical Reviews in Biotechnology 2015, early Online (Doi: 10.3109/07388551.2015.1083940)
【非特許文献３】Meyer, M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013, 97, pp. 7097-7109.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、従来の核酸アプタマーよりも結合能、特異性、及び／又は安定性が高い癌細胞に対するアプタマーの開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、乳癌由来の3種類の細胞株（MCF7、MDA-MB-231、T-47D）のそれぞれを標的として、本発明者が開発した人工塩基を含むライブラリーを用いたCell-SELEX法（WO2013/073602）を実施し、人工塩基を含む複数のDNAアプタマーを得た。それぞれの人工塩基含有DNAアプタマーは、標的とした細胞株に極めて強固に結合したが、非癌細胞との親和性はほとんど認められなかった。また、得られたDNAアプタマーについてさらなる研究を行った結果、ほとんどの癌細胞に結合するDNAアプタマーと、細胞株に応じて結合能が異なるDNAアプタマーが認められた。前者のDNAアプタマーは、広範な癌細胞を検出できる点で、後者のDNAアプタマーは癌細胞の分類に用い得る点で、有用性が高いと考えられる。【０００７】
本発明は、上記知見に基づくものであり、以下の態様を包含する。
（１）以下の（i）又は（ii）の塩基配列を含む、癌細胞に結合するDNAアプタマー：
（i）（a）N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34（配列番号35）に示される塩基配列
（配列中、N1〜N5は独立にG、T、A若しくはCであり、N26は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N30はN5と、N31はN4と、N32はN3と、N33はN2と、N34はN1と塩基対を形成する）、又は
（b）（i）（a）に示される塩基配列のN26以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列；及び
（ii）（a）N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N29N30N31（配列番号28）に示される塩基配列
（配列中、N1〜N6、N14、N25は独立にG、T、A若しくはCであり、N13及びN22は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N26はN4と、N29はN3と、N30はN2と、N31はN1と塩基対を形成し、N27及びN28は独立にG、T、A、C若しくは存在しない）、又は
（b）（ii）（a）に示される塩基配列のN13及びN22以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
（２）（i）（a）又は（ii）（a）の塩基配列がさらに1〜5個のGC対を末端に含む、（１）に記載のDNAアプタマー。
（３）前記塩基対がGC対である、（１）又は（２）に記載のDNAアプタマー。
（４）（i）（b）の付加、欠失、及び／又は置換が、配列番号35の1位〜5位又は30位〜34位においてなされる、（１）〜（３）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（５）（ii）（b）の付加、欠失、及び／又は置換が、配列番号28の1位〜6位、14位又は25位〜31位においてなされる、（１）〜（３）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（６）（i）（a）の塩基配列が、配列番号36、37、又は40に示される配列である、（１）又は（２）に記載のDNAアプタマー。
（７）（ii）（a）の塩基配列が、配列番号29に示される配列である、（１）又は（２）に記載のDNAアプタマー。
（８）3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
前記ミニヘアピン構造が、
5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
（B）GNA又はGNNA（ここで、各nは独立にG、T、A若しくはCのいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、
かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
（１）〜（７）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（９）以下の（I）〜（IV）のいずれかの塩基配列を含む、乳癌細胞に結合するDNAアプタマー：
（I）（a）N1N2N3N4N5N6CAGCCTGGGN16TN18TCTTTN24AGTCN29AN31TTCAN36TCGN40N41N42N43N44N45（配列番号43）に示される塩基配列
（配列中、N1〜N6、N18、N24、N31、及びN36は独立に、G、T、A若しくはCであり、N16は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N29は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl、G、T、A若しくはCであり、N40はN6と、N41はN5と、N42はN4と、N43はN3と、N44はN2と、N45はN1と塩基対を形成する）、又は
（b）（I）（a）に示される塩基配列のN16以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列；及び
（II）（a）N1N2N3N4CN6N7TCGAACTGN16N17ATGAGN23GTN26N27N28N29N30N31（配列番号2）に示される塩基配列
（配列中、N1〜N4、N7、N16、N23、N26及びN31独立に、G、T、A若しくはCであり、N6は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl、G、T、A若しくはCであり、N17は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N27はN3と、N28はN2と塩基対を形成し、N29及びN30はG、T、A、C若しくは存在しない）、又は
（b）（II）（a）に示される塩基配列のN17以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列；
（III）（a）N1N2N3CCGGCTN10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20N21N22N23N24N25TCCTGGN32N33TAAGGTTTCTAAN46N47N48N49N50N51（配列番号18）に示される塩基配列
（配列中、N1〜N3、N13〜N17、N19〜N22、N33、N46〜N48、及びN50は独立に、G、T、A若しくはCであり、N10〜N12及びN23〜N25はG、T、A、C若しくは存在せず、N18は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl、G、T、A若しくはC、又は存在せず、N32は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N49はN3と、N51はN1と塩基対を形成し、N10〜N15の三つ以上がN20〜N25の三つ以上と塩基対を形成する）、又は
（b）（III）（a）に示される塩基配列のN32以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列；
（IV）（a）N1N2N3TCTTAAGTTTAN15AN17N18TN20N21N22N23TN25N26N27N28N29N30N31N32TN34GGGCGTTTTAAN46N47N48N49（配列番号50）に示される塩基配列
（配列中、N1〜N3、N15、N17、N20〜N23、N25〜N29、N31〜N32、N34及びN46は独立に、G、T、A若しくはCであり、N18及びN30は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-ylであり、N47はN3と、N48はN2と、N49はN1と塩基対を形成する）、又は
（b）（IV）（a）に示される塩基配列のN18及びN30以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
（１０）（I）（a）、（II）（a）、（III）（a）、又は（IV）（a）の塩基配列がさらに1〜5個のGC対を末端に含む、（９）に記載のDNAアプタマー。
（１１）前記塩基対がGC対である、（９）又は（１０）に記載のDNAアプタマー。
（１２）（I）（b）の付加、欠失、及び／又は置換が、配列番号43の1位〜6位、18位、24位、29位、31位、36位、又は40位〜45位においてなされる、（９）〜（１１）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（１３）（II）（b）の付加、欠失、及び／又は置換が、配列番号2の1位〜4位、6〜7位、16位、23位、又は26位〜31位においてなされる、（９）〜（１１）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（１４）（III）（b）の付加、欠失、及び／又は置換が、配列番号18の1位〜3位、10位〜25位、33位、又は46位〜51位においてなされる、（９）〜（１１）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（１５）（IV）（b）の付加、欠失、及び／又は置換が、配列番号50の1位〜3位、15位、17位、20位〜23位、25位〜29位、31位〜32位、34位、又は46位〜49位においてなされる、（９）〜（１１）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（１６）（I）（a）の塩基配列が、配列番号44又は46に示される配列である、（９）又は（１０）に記載のDNAアプタマー。
（１７）（II）（a）の塩基配列が、配列番号3〜5、8〜9、及び14〜16のいずれかに示される配列である、（９）又は（１０）に記載のDNAアプタマー。
（１８）（III）（a）の塩基配列が、配列番号20、21、及び26のいずれかに示される配列である、（９）又は（１０）に記載のDNAアプタマー。
（１９）（IV）（a）の塩基配列が、配列番号51に示される配列である、（９）又は（１０）に記載のDNAアプタマー。
（２０）3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
前記ミニヘアピン構造が、
5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
（B）GNA又はGNNA（ここで、各Nは、独立に、G、T、A若しくはCのいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域からなり、
かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
（９）〜（１９）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（２１）（１）〜（２０）のいずれかに記載のDNAアプタマーを含む癌検出剤。
（２２）（１）〜（２０）のいずれかに記載のDNAアプタマーを含む癌細胞検出用キット。
（２３）（１）〜（２０）のいずれかに記載のDNAアプタマーを含む医薬組成物。
（２４）（１）〜（８）のいずれかに記載の（i）（a）又は（b）の塩基配列を含むDNAアプタマーからなる抗癌剤。
（２５）（１）〜（２０）のいずれかに記載のDNAアプタマーと薬剤とを含む、薬剤を癌細胞に送達するための医薬組成物。
（２６）癌細胞を検出する方法であって、
被験体から得られた細胞を含むサンプルを、（１）〜（８）のいずれかに記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記サンプルと前記DNAアプタマーの結合に基づいて癌細胞を検出する工程、
を含む、前記方法。
（２７）乳癌細胞を検出する方法であって、
被験体から得られた細胞を含むサンプルを、（９）〜（２０）のいずれかに記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記サンプルと前記DNAアプタマーの結合に基づいて乳癌細胞を検出する工程、
を含む、前記方法。
（２８）被験体から得られた癌細胞を分類する方法であって、
被験体から得られた癌細胞を、（１）〜（２０）のいずれかに記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記癌細胞と前記DNAアプタマーの結合の有無又は強度を測定する工程、
前記結合の有無又は強度に基づいて癌細胞を分類する工程、
を含む、前記方法。
（２９）被験体から得られた乳癌細胞を分類する方法であって、
被験体から得られた乳癌細胞を、（９）〜（２０）のいずれかに記載のDNAアプタマーと接触させる工程、
前記乳癌細胞と前記DNAアプタマーの結合の有無又は強度を測定する工程、
前記結合の有無又は強度に基づいて乳癌細胞を分類する工程、
を含む、前記方法。
（３０）接触工程が、被験体から得られた乳癌細胞を、（９）〜（２０）のいずれかに記載の（I）〜（IV）の四つの群の少なくとも二つの群から選択される二種以上のDNAアプタマーと接触させる工程である、（２９）に記載の方法。【０００８】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-214591号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、従来の核酸アプタマーよりも結合能、特異性、及び／又は安定性が高い癌細胞に対するDNAアプタマーが提供される。また、本発明のDNAアプタマーにより、癌罹患の有無の診断を補助する方法、癌の検出方法、並びに癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物等が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】MCF7細胞に対するCell-SELEXによって得られたDNAアプタマー（14A-MCF7）の配列（配列番号4）及び推定二次構造を示す。セカンドセレクションにおいて85%以上の保存性が認められた塩基を丸で、人工塩基であるDsを四角で示す。図中、太線はワトソンクリック塩基対を形成し得る塩基を、破線は非ワトソンクリック塩基対を形成し得る塩基を示し、通常の線は塩基がホスホジエステル結合を介して連結されていることを示す。太線、破線、通常の線の意味は以下の図2〜7、9、11、13、15、17、及び19について同様である。
【図２】MCF7細胞に対するCell-SELEXによって得られたDNAアプタマー（08B-MCF7）の配列（配列番号17）及び推定二次構造を示す。セカンドセレクションにおいて85%以上の保存性が認められた塩基を丸で、Dsを四角で示す。
【図３】T47D細胞に対するCell-SELEXによって得られたDNAアプタマー（03-T47D）の配列（配列番号27）及び推定二次構造を示す。セカンドセレクションにおいて85%以上の保存性が認められた塩基を丸で、Dsを四角で示す。
【図４】MB231細胞に対するCell-SELEXによって得られたDNAアプタマー（05-MB231）の配列（配列番号34）及び推定二次構造を示す。セカンドセレクションにおいて85%以上の保存性が認められた塩基を丸で、Dsを四角で示す。
【図５】MB231細胞に対するCell-SELEXによって得られたDNAアプタマー（07-MB231）の配列（配列番号42）及び推定二次構造を示す。セカンドセレクションにおいて85%以上の保存性が認められた塩基を丸で、Dsを四角で示す。
【図６】MB231細胞に対するCell-SELEXによって得られたDNAアプタマー（23-MB231）の配列（配列番号49）及び推定二次構造を示す。セカンドセレクションにおいて85%以上の保存性が認められた塩基を丸で、Dsを四角で示す。
【図７】実施例4で用いたDNAアプタマーの配列及び推定二次構造を示す。14A-MCF7（53DsDs）（配列番号4）を元に、17位のDsをAに置換した14A-MCF7（53ADs）（配列番号5）、28位のDsをAに置換した14A-MCF7（53DsA）（配列番号6）、17位と28位のDsをAに置換した14A-MCF7（53AA）（配列番号7）、3'末端側のバルジ部分のAGをTTに置換し、ステム部分のミスマッチ部分の一部を塩基対を形成するように置換した14A-MCF7（Opt53DsDs）（配列番号3）を設計した。Dsを四角で、DsをAに置換した部位を矢頭で示す。
【図８】図7で示したDNAアプタマー並びにAS1411及びCont26の細胞に対する結合能をフローサイトメーターによって解析した結果を示す。
【図９】実施例4で用いたDNAアプタマーの配列及び推定二次構造を示す。14A-MCF7（53DsDs）を元に、5'末端及び3'末端からそれぞれ8塩基、計16塩基を除いた14A-MCF7 (37DsDs)（配列番号8）、14A-MCF7 (37DsDs)からさらにAGからなるバルジ構造を除き、末端のステムのいくつかをGC対に置換した14A-MCF7（35DsDs）（配列番号9）、14A-MCF7（35DsDs）の3'末端にミニヘアピンを付加した14A-MCF7mh (44DsDs)（配列番号10）、ステム構造のGC対をそれぞれ1対、2対、及び3対除いた14A-MCF7mh（配列番号11）、14A-MCF7mh(40DsDs)（配列番号12）、及び14A-MCF7mh(38DsDs)（配列番号13）を設計した。Dsを四角で示す。
【図１０】図9で示したDNAアプタマー並びにAS1411及びCont26の細胞に対する結合能をフローサイトメーターによって解析した結果を示す。
【図１１】実施例5で用いたDNAアプタマーの配列及び推定二次構造を示す。08B-MCF7（51DsDs）（配列番号20）を元に、18位のDsをAに置換した08B-MCF7（51ADs）（配列番号21）、32位のDsをAに置換した08B-MCF7（51DsA）（配列番号22）、18位及び32位のDsをAに置換した08B-MCF7（51AA）（配列番号23）、08B-MCF7（51DsDs）にミニヘアピンを付加した08B-MCF7mh（配列番号24）、08B-MCF7mhの内部のステムループをミニヘアピンに置換した08B-MCF7mh2（配列番号25）を設計した。Dsを四角で、DsをAに置換した部位を矢頭で、ステムループをミニヘアピンに置換した部位を矢頭を付した四角で示す。
【図１２】図11で示したDNAアプタマー並びにAS1411及びCont26の細胞対する結合能をフローサイトメーターによって解析した結果を示す。
【図１３】実施例6で用いたDNAアプタマーの配列及び推定二次構造を示す。03-T47D（DsDs）（配列番号29）を元に、24位のDsをAに置換した03-T47D（DsA）（配列番号30）、15位のDsをAに置換した03-T47D（ADs）（配列番号31）、15位及び24位のDsをAに置換した03-T47D（AA）（配列番号32）、03-T47D（DsDs）の末端にミニヘアピンを付加した03-T47Dmh（配列番号33）を設計した。Dsを四角で、DsをAに置換した部位を矢頭で示す。
【図１４】図13で示したDNAアプタマー並びにAS1411及びCont26の細胞に対する結合能をフローサイトメーターによって解析した結果を示す。
【図１５】実施例7で用いたDNAアプタマーの配列及び推定二次構造を示す。05-MB231（DsDs）（配列番号36）を元に、44位のDsをAに置換した05-MB231（DsA）（配列番号37）、33位のDsをAに置換した05-MB231（ADs）（配列番号38）、33位及び44位のDsをAに置換した05-MB231（AA）（配列番号39）、05-MB231（DsDs）の末端の配列の一部を除去し、ステムの一部をGC対に置換した05-MB231GC（配列番号40）、及び05-MB231GCにミニヘアピンを付加した05-MB231GCmh（配列番号41）を設計した。Dsを四角で、DsをAに置換した部位を矢頭で示す。
【図１６】図15で示したDNAアプタマー並びにAS1411及びCont26の細胞に対する結合能をフローサイトメーターによって解析した結果を示す。
【図１７】実施例8で用いたDNAアプタマーの配列及び推定二次構造を示す。07-MB231（DsDs）（配列番号44）を元に、28位のDsをAに置換した07-MB231（DsA）（配列番号46）、15位のDsをAに置換した07-MB231（ADs）（配列番号47）、15位及び28位のDsをAに置換した07-MB231（AA）（配列番号48）、07-MB231の末端にミニヘアピンを付加した07-MB231mh（配列番号45）を設計した。Dsを四角で、DsをAに置換した部位を矢頭で示す。
【図１８】図17で示したDNAアプタマー並びにAS1411及びCont26の細胞に対する結合能をフローサイトメーターによって解析した結果を示す。
【図１９】実施例9で用いたDNAアプタマーの配列及び推定二次構造を示す。23-MB231b（配列番号51）を元に、末端にミニへピンを付加した23-MB231bmh（配列番号52）を設計した。Dsを四角で示す。
【図２０】実施例9で用いたDNAアプタマー並びにAS1411及びCont26の細胞に対する結合能をフローサイトメーターによって解析した結果を示す。
【図２１】14A-MCF7（37DsDs）及びその改変体の、フローサイトメーターによるKd値の測定結果を示す。横軸はDNAアプタマーの濃度、縦軸は蛍光強度を示す。Aは14A-MCF7（37DsDs）の、Bは14A-MCF7mh（44DsDs）の、Cは14A-MCF7mhの、Dは14A-MCF7mh（40DsDs）の、Eは14A-MCF7mh（38DsDs）の結果を示す。
【図２２】08B-MCF7（51DsDs）及びその改変体の、フローサイトメーターによるKd値の測定結果を示す。横軸はDNAアプタマーの濃度、縦軸は蛍光強度を示す。Aは08B-MCF7（51DsDs）の、Bは08B-MCF7mhの、Cは08B-MCF7mh2の結果を示す。
【図２３】03-T47D（DsDs）及びその改変体の、フローサイトメーターによるKd値の測定結果を示す。横軸はDNAアプタマーの濃度、縦軸は蛍光強度を示す。Aは03-T47D（DsDs）の、Bは03-T47Dmhの結果を示す。
【図２４】05-MB231GC及びその改変体の、フローサイトメーターによるKd値の測定結果を示す。横軸はDNAアプタマーの濃度、縦軸は蛍光強度を示す。Aは05-MB231GCの、Bは05-MB231GCmhの結果を示す。
【図２５】07-MB231（DsDs）及びその改変体の、フローサイトメーターによるKd値の測定結果を示す。横軸はDNAアプタマーの濃度、縦軸は蛍光強度を示す。Aは07-MB231（DsDs）の、Bは07-MB231mhの結果を示す。
【図２６】23-MB231b及びその改変体の、フローサイトメーターによるKd値の測定結果を示す。横軸はDNAアプタマーの濃度、縦軸は蛍光強度を示す。Aは23-MB231bの、Bは23-MB231bmhの結果を示す。
【図２７】14A-MCF7（37DsDs）及び14A-MCF7mh（44DsDs）、並びに08B-MCF7（51DsDs）及び08B-MCF7mhのTm値の測定結果を示す。横軸は温度を示す。Aは260nmでの吸光度の一次導関数を、Bは260nmでの吸光度を示す。
【図２８】各DNAアプタマー（08B-MCF7mh2、14A-MCF7mh、AS1411）の細胞への結合及び細胞での局在の分析結果を示す。AはAlexa488の蛍光を、BはDAPIの蛍光を、Cは透過光での観察結果を示す。
【図２９】各DNAアプタマー（05-MB231GCmh、07-MB231mh、23-MB231bmh）の細胞への結合及び細胞での局在の分析結果を示す。AはAlexa488の蛍光を、BはDAPIの蛍光を、Cは透過光での観察結果を示す。
【図３０】14A-MCF7mh（44DsDs）アプタマーの細胞への結合及び細胞での局在の分析結果を示す。
【図３１】AS1411の細胞への結合及び細胞での局在の分析結果を示す。
【図３２−１】非標識の08B-MCF7mh及び14A-MCF7mh、及び他の薬剤の、標的癌細胞（MCF7）（A、C）及び非癌細胞（MCF10A）（B、D）の細胞増殖に対する影響を示す。FUdRはフロクスウリジンを、PTXはパクリタキセルを指す。N.A.（Not available）は測定しなかったことを意味する。
【図３２−２】非標識の05-MB231GCmh及び07-MB231mh、及び他の薬剤の、標的癌細胞（MB231）（A、C）及び非癌細胞（MCF10A）（B、D）の細胞増殖に対する影響を示す。FUdRはフロクスウリジンを、PTXはパクリタキセルを指す。
【図３２−３】非標識の03-T47Dmh及び他の薬剤の、標的癌細胞（T47D）（A）及び非癌細胞（MCF10A）（B）の細胞増殖に対する影響を示す。FUdRはフロクスウリジンを、PTXはパクリタキセルを指す。
【図３３−１】非標識の05-MB231GCmmhアプタマー及び他の薬剤の、様々な癌細胞（A：MCF7、B：T47D、C：MDA-MB231、D：MDA-MB453）の増殖に対する影響を示す。FUdRはフロクスウリジンを、PTXはパクリタキセルを指す。
【図３３−２】非標識の05-MB231GCmmhアプタマー及び他の薬剤の、様々な癌細胞（A：MIAPaCa-2、B：PC-3、C：HCT116、D：A549）の増殖に対する影響を示す。FUdRはフロクスウリジンを、PTXはパクリタキセルを指す。
【図３３−３】非標識の05-MB231GCmmhアプタマー及び他の薬剤の、癌細胞（KG-1）（A）及び非癌細胞（B：MCF10A、C：HUVEC）の細胞増殖に対する影響を示す。FUdRはフロクスウリジンを、PTXはパクリタキセルを指す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．定義
本明細書で使用する一般的な用語の定義について以下で説明する。
【００１２】
本明細書において「核酸」又は「核酸分子」とは、原則としてヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した生体高分子をいう。
【００１３】
本明細書において「天然型ヌクレオチド」とは、自然界に存在するヌクレオチドであって、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの天然型塩基を有するデオキシリボヌクレオチドから構成されるDNA、及びアデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの天然塩基を有するリボヌクレオチドから構成されるRNA、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００１４】
本明細書において「非天然型ヌクレオチド」とは、その塩基が人工塩基で構成されている自然界に存在しないヌクレオチドをいう。本発明における非天然型ヌクレオチドを構成するリン酸基及び糖は、天然型ヌクレオチドのリン酸基及び糖と構造的に同一である。
【００１５】
本明細書において「人工塩基」又は「塩基類似体」とは、天然型ヌクレオチドを構成する天然型塩基に類似の性質を有する人工的に構築された化学物質であって、天然型塩基と同様に、人工塩基対を形成することのできる相手となる塩基類似体（本明細書では、以降「相補的人工塩基」とする）を有する。本明細書において「人工塩基対合」とは、天然型塩基のアデニンとチミン、アデニンとウラシル、又はグアニンとシトシンのように、一対の相補的人工塩基が互いに形成する塩基対合をいう。人工塩基対合は、天然型塩基間の塩基対合に見られる水素結合を介した化学的結合、人工塩基間の分子構造に基づく嵌合を介した物理的結合、及び疎水性相互作用を介したスタッキング効果を含む。
【００１６】
人工塩基が有する「天然型塩基に類似の性質」には、人工塩基対合による相補性によって核酸の複製又は転写（逆転写を含む）が可能な性質を含む。人工塩基は、天然型塩基と同様に、人工塩基対合において排他的選択性を有する。したがって、基質ヌクレオチドに一対の相補的人工塩基を有する非天然型ヌクレオチドが存在すれば、非天然型ヌクレオチドを含む核酸分子であっても、人工塩基間の相補性によって、天然型ヌクレオチドと同様に正確な複製や転写ができる。それ故、非天然型ヌクレオチドを含みながら、PCR等の核酸増幅法によるDNA分子の増幅等が可能となる。
【００１７】
上記人工塩基の具体例として、Ds（7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl；本明細書では「Ds」とする）、Pn(2-nitropyrrole-1-yl；本明細書では「Pn」とする）、Pa（2-formyl-1H-pyrrole-1-yl；本明細書では「Pa」とする）、P(2-amino-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one；本明細書では「P」とする）、Z(6-amino-5-nitro-2(1H)-pyridone；本明細書では「Z」とする）、5SICS（6-methylisoquinoline-1(2H)-thione；本明細書では「5SICS」とする）、NaM（3-methoxynaphthalen-2-yl；本明細書では「NaM」とする）、及びMMO2（2-methoxy-4-methylphenyl；本明細書では「MMO2」とする）が挙げられる。これらの人工塩基において、Dsの相補的人工塩基には、Pn、及びPaが挙げられる。Pの相補的人工塩基には、Zが挙げられる。5SICSの相補的人工塩基には、NaM、及びMMO2が挙げられる。
【００１８】
なお、人工塩基は、複製や転写の際、相補的人工塩基を有する非天然型ヌクレオチドが基質に含まれない場合には、相補的人工塩基と構造的に及び／又は性質的に近い天然型塩基と代替的に塩基対合することができる。この場合、鋳型となった核酸分子における非天然型ヌクレオチドは、複製又は転写後に天然型ヌクレオチドに置換されることとなる。例えば、Dsの場合、A又はTに置換されることが知られている。
【００１９】
本明細書において、「修飾塩基」とは、人工的に化学修飾された塩基を意味する。修飾塩基として、例えば、修飾化ピリミジン（例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル、5-(3-インドール-2-エチル)ウラシル、5-(4-ヒドロキシフェニル-2-エチル)ウラシル）、修飾化プリン（例えば、6-メチルアデニン、6-チオグアノシン）及び他の複素環塩基等が挙げられる。
【００２０】
本明細書において、「DNAアプタマー」とは、DNAで構成されるアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸分子の二次構造、さらに三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的分子と強固、かつ特異的に結合するリガンド分子をいう。DNAアプタマーが標的分子の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を持つ場合には、DNAアプタマーは、標的分子の機能阻害剤となり得る。本明細書において「標的分子の機能阻害」とは、標的分子が有する触媒機能又は遺伝子発現制御機能（転写、翻訳、輸送等の制御を含む）、アポトーシス制御機能のような生物学的機能を阻害又は抑制することをいう。
【００２１】
本明細書において「標的分子」とは、DNAアプタマーの結合対象となり得る物質をいう。標的分子の種類は、DNAアプタマーが結合し得る生体物質であれば、特に制限はしない。例えば、ペプチド（オリゴペプチド、又はポリペプチド）、核酸、脂質、糖（糖鎖を含む）、低分子化合物、天然由来の物質、化学合成物質、遺伝子組換え物質、細胞、ウイルス等いずれであってもよく、好ましくは癌細胞又は癌細胞に発現するタンパク質等の物質である。
【００２２】
本明細書において、「塩基対」とは、特に明記しない限り、ワトソンクリック型の塩基対、すなわちAT対又はGC対をいう。
【００２３】
本明細書において、「ミニヘアピン構造」は、以下の第１核酸領域、第2核酸領域、及び第3核酸領域の3つのDNA核酸領域がそれぞれ5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された構造を有する。ミニヘアピン型DNAは、核酸分解酵素に対する分解耐性を高め、及び／又はDNAアプタマーのTm値を上げることでDNAアプタマーの熱安定性を増加させ得る。
【００２４】
「第1核酸領域」とは、2〜5個の任意のヌクレオチドからなる核酸領域である。前記ヌクレオチドは、グアニン（G）、アデニン（A）、シトシン（C）又はチミン（T）の塩基を有するデオキシリボヌクレオチドをいう。本核酸領域の塩基は、好ましくはグアニン又はシトシンである。これは、後述する第3核酸領域との間でステム構造を形成するにあたり、GC含量が多いほどTm値も増加し、前記ステム構造を安定的に保持することができるからである。したがって、第1核酸領域の全塩基配列がG及び／又はCで構成されていることがもっとも好ましい。
【００２５】
「第2核酸領域」とは、5'‐GNA‐3'又は5'‐GNNA‐3'の塩基配列からなる核酸領域である。配列中の各Nは、独立に、天然型塩基（G、A、T、若しくはC）のいずれか、例えばTからなる。
【００２６】
「第3核酸領域」とは、第1核酸領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸領域である。したがって、第3核酸領域の塩基配列は、第1核酸領域の塩基配列によって定まり、また第1核酸領域と第3核酸領域は、分子内で塩基対を形成する。その結果、第1核酸領域と第3核酸領域は、互いに完全に塩基対合したステム部分を、また第1核酸領域と第3核酸領域の間に存在する第2核酸領域は、ループ部分をそれぞれ構成し、全体として、7〜14個のヌクレオチドからなるミニヘアピン型DNAが形成される。ミニヘアピン型DNAの例として、CGCGTAGCG（配列番号83）に示す塩基配列からなるDNAが挙げられる。
【００２７】
２．癌細胞に結合するDNAアプタマー
一態様において、本発明は、以下の（i）（a）〜（b）又は（ii）（a）〜（b）の塩基配列を含む、癌細胞に結合するDNAアプタマーに関する。
【００２８】
前記（i）（a）の塩基配列は、N1N2N3N4N5AGGGGTGTTTGTGCCGTGAGN26TGTN30N31N32N33N34（配列番号35）に示される塩基配列（配列中、N1〜N5は独立にG、T、A若しくはCであり、N26は7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl（本明細書では、以下、単に「Ds」とも表記する）であり、N30はN5と、N31はN4と、N32はN3と、N33はN2と、N34はN1と塩基対を形成する）である。前記塩基対は、GC対であってよい。一実施形態において、N30はAであり、N32はCであり、N33はGであり、及び／又はN34はTである。（i）（a）の塩基配列の例として、配列番号36、37、又は40に示される配列が挙げられる。
【００２９】
前記（i）（b）の塩基配列は、（i）（a）に示される塩基配列のN26以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列である。本明細書において、「1又は数個」とは、例えば1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、又は1〜2個を意味する。付加、欠失、及び／又は置換は、実施例3のセカンドセレクションによって保存性が低かった部位等において、例えば配列番号35の1位〜5位又は30位〜34位、好ましくは1位〜5位又は31位において行うことができる。
【００３０】
前記（ii）（a）の塩基配列は、N1N2N3N4N5N6GATCACN13N14CTAGGGGN22CCN25N26N27N28N29N30N31（配列番号28）に示される塩基配列（配列中、N1〜N6、N14、N25は独立にG、T、A若しくはCであり、N13及びN22はDsであり、N26はN4と、N29はN3と、N30はN2と、N31はN1と塩基対を形成し、N27及びN28は独立にG、T、A、C若しくは存在しない）である。前記塩基対は、GC対であってよい。一実施形態において、N3はCであり、N4はGであり、及び／又はN14はAである。（ii）（a）のヌクオチド配列として、配列番号29に示される配列が挙げられる。
【００３１】
前記（ii）（b）の塩基配列は、（ii）（a）に示される塩基配列のN13及びN22以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列である。付加、欠失、及び／又は置換は、実施例3のセカンドセレクションによって保存性が低かった部位等において、例えば配列番号28の1位〜6位、14位、又は25位〜31位、例えば1位〜6位又は25位〜31位、好ましくは1位〜2位、5位〜6位又は25〜31位において行うことができる。
【００３２】
一実施形態において、（i）（a）又は（ii）（a）の塩基配列は、その末端に塩基対、例えばGC対を1〜5個、例えば、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個含む。（i）（a）又は（ii）（a）の塩基配列は、これらの塩基対に加えて、又はこれらの塩基対に替えて、ミニヘアピン構造を形成する配列（以下、本明細書では「ミニヘアピン配列」とも称する）を含んでよい。
【００３３】
（i）（a）の配列にミニヘアピン配列を付加した配列の例として、配列番号40に示される配列にミニヘアピン配列を付加した配列番号41又は配列番号80に示される配列が挙げられる。また、（ii）（a）の配列に、ミニヘアピン配列を付加した配列の例として、配列番号29に示される配列にミニヘアピン配列を付加した配列番号33に示される配列が挙げられる。
【００３４】
本発明の癌細胞に結合するDNAアプタマーは、上記（i）（a）〜（b）又は（ii）（a）〜（b）の塩基配列、又はこれにGC対及び／又はミニヘアピン配列を付加した配列からなるものであってよい。
【００３５】
本発明のDNAアプタマーが結合する癌細胞として、限定するものではないが、乳癌細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、大腸（例えば結腸）癌細胞、胃癌細胞、子宮頸癌細胞、及び肺癌細胞等が挙げられる。本明細書において、癌細胞には、白血病細胞や悪性リンパ腫の細胞も含まれるものとする。癌細胞の由来となる生物種は問わないが、例えば哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトの癌細胞が挙げられる。
【００３６】
本発明の癌細胞に結合するDNAアプタマーは、広範な癌細胞に結合することから、様々な癌細胞及び癌の検出又は治療に用いることができる。また、（i）（a）又は（i）（b）に示される塩基配列を含むDNAアプタマーは、癌細胞に結合するだけでなく、癌細胞の増殖を抑制し得ることから、抗癌剤として用いることができる。
【００３７】
本発明の癌細胞に結合するDNAアプタマーの長さは、例えば、150mer以下、140mer以下、130mer以下、120mer以下、110mer以下、好ましくは100mer以下、90mer以下、80mer以下、70mer以下、又は60mer以下である。
【００３８】
本発明の癌細胞に結合するDNAアプタマーは、Dsに加えて、任意に塩基類似体、他の人工塩基、又は他の修飾塩基等を含んでよい。
【００３９】
本発明の癌細胞に結合するDNAアプタマーは、他の物質、例えばポリエチレングリコール（PEG）（例えば、約20〜約60kDaのPEG重合体）、アミノ酸、ペプチド、inverted dT、脂質、色素、蛍光物質、酵素、放射性物質、ビオチン等を付加することにより修飾されていてもよい。これらの物質は、必要に応じて公知のリンカーを介して連結してもよい。本明細書におけるリンカーの例として、ヌクレオチドリンカー、ペプチドリンカー、及びジスルフィド結合を含むリンカー等が挙げられる。PEGを連結することにより、一般にDNAアプタマーの半減期を伸ばすことができることが知られている。
【００４０】
本発明の癌細胞に結合するDNAアプタマーは、癌細胞に対して、フローサイトメーターによる測定に基づいて、例えば100nM以下、90nM以下、80nM以下、70nM以下、60nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下、好ましくは10nM以下、9nM以下、8nM以下、7nM以下、6nM以下、5nM以下、4nM以下、又は3nM以下のKd値を有する。
【００４１】
本発明の癌細胞に結合するDNAアプタマーの製造方法は特に限定しない。本分野で公知の方法を用いればよい。例えば、本発明のDNAアプタマーは、上記の配列に基づいて公知の固相合成法に従って化学合成することができる。核酸の化学合成法については、例えば、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Volume 1, Section 3を参照されたい。また、このような化学合成については、多くのライフサイエンス系メーカー（例えば、タカラバイオ株式会社、Sigma-Aldrich Corporation等）が受託製造サービスを行っており、それらを利用することもできる。DNAアプタマーの配列に基づいて幾つかの断片を合成した後に、分子内アニールやリガーゼによるライゲーション等によって断片を連結することによりDNAアプタマーを作製してもよい。
【００４２】
化学合成後の本発明のDNAアプタマーは、使用前に当該分野で公知の方法によって精製することが好ましい。精製方法としては、例えば、ゲル精製法、アフィニティーカラム精製法、HPLC法等が挙げられる。
【００４３】
３．乳癌細胞に結合するDNAアプタマー
一態様において、本発明は、以下の（I）（a）〜（b）、（II）（a）〜（b）、（III）（a）〜（b）、又は（IV）（a）〜（b）の塩基配列を含む、乳癌細胞に結合するDNAアプタマーに関する。
【００４４】
前記（I）（a）の塩基配列は、N1N2N3N4N5N6CAGCCTGGGN16TN18TCTTTN24AGTCN29AN31TTCAN36TCGN40N41N42N43N44N45（配列番号43）に示される塩基配列（配列中、N1〜N6、N18、N24、N31、及びN36は独立に、G、T、A若しくはCであり、N16はDs、N29はDs、G、T、A若しくはC、好ましくはDsであり、N40はN6と、N41はN5と、N42はN4と、N43はN3と、N44はN2と、N45はN1と塩基対を形成する）である。一実施形態において、N3はTであり、N18はCであり、N24はTであり、N31はGであり、及び／又はN36はAである。（I）（a）の塩基配列として、例えば配列番号44又は46に示される配列が挙げられる。
【００４５】
前記（I）（b）の塩基配列は、（I）（a）に示される塩基配列のN16以外、好ましくはN16及びN29以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列である。付加、欠失、及び／又は置換は、実施例3のセカンドセレクションによって保存性が低かった部位等において、例えば配列番号43の、1位〜6位、18位、24位、29位、31位、36位、又は40位〜45位、例えば1位〜6位、18位、24位、31位、36位、又は40位〜45位、好ましくは1位〜6位又は40位〜45位、さらに好ましくは1位〜2位、4位〜6位、又は40位〜45位において行うことができる。
【００４６】
前記（II）（a）の塩基配列は、N1N2N3N4CN6N7TCGAACTGN16N17ATGAGN23GTN26N27N28N29N30N31（配列番号2）に示される塩基配列（配列中、N1〜N4、N7、N16、N23、N26及びN31独立に、G、T、A若しくはC、好ましくはDsであり、N6はDs、G、T、A若しくはCであり、N17はDsであり、N27はN3と、N28はN2と塩基対を形成し、N29及びN30はG、T、A、C若しくは存在しない）である。N23はN7と、N31はN1と塩基対を形成してもよい。一実施形態において、N7はGであり、N16はTであり、及び／又はN23はCである。（II）（a）の塩基配列として、例えば配列番号3〜5、8〜9、及び14〜16のいずれかに示される配列が挙げられる。
【００４７】
前記（II）（b）の塩基配列は、（II）（a）に示される塩基配列のN17以外、好ましくはN6及びN17以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列を含む。付加、欠失、及び／又は置換は、実施例3のセカンドセレクションによって保存性が低かった部位等において、例えば配列番号2の、1位〜4位、6〜7位、16位、23位、又は26位〜31位、例えば1位〜4位、7位、16位、23位、又は26位〜31位、好ましくは1位〜4位、7位、23位、又は26位〜31位、好ましくは1位〜4位又は26位〜31位において行うことができる。
【００４８】
前記（III）（a）の塩基配列は、N1N2N3CCGGCTN10N11N12N13N14N15N16N17N18N19N20N21N22N23N24N25TCCTGGN32N33TAAGGTTTCTAAN46N47N48N49N50N51（配列番号18）に示される塩基配列（配列中、N1〜N3、N13〜N17、N19〜N22、N33、N46〜N48、及びN50は独立に、G、T、A若しくはCであり、N10〜N12及びN23〜N25はG、T、A、C若しくは存在せず、N18はDs、G、T、A若しくはC、又は存在せず、N32はDsであり、N49はN3と、N51はN1と塩基対を形成し、N10〜N15の三つ以上がN20〜N25の三つ以上と塩基対を形成する）である。N50はN2と塩基対合していてもよく、N10〜N15とN20〜N25は完全に塩基対合していてもよい。N10〜N25は、全体として、ミニヘアピン構造を形成していてもよい。一実施形態において、N33はCであり、N46はAであり、N47はGであり、及び／又はN48はGである。（III）（a）の塩基配列の例として、例えば、配列番号20、21、及び26のいずれかに示される配列が挙げられる。
【００４９】
前記（III）（b）の塩基配列は、（III）（a）に示される塩基配列のN32以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列である。付加、欠失、及び／又は置換は、実施例3のセカンドセレクションによって保存性が低かった部位等において、例えば配列番号18の1位〜3位、10位〜25位、33位、又は46位〜51位、例えば1位〜3位、10位〜25位、又は46位〜51位、好ましくは1位〜3位又は46位〜51位において行うことができる。
【００５０】
前記（IV）（a）の塩基配列は、N1N2N3TCTTAAGTTTAN15AN17N18TN20N21N22N23TN25N26N27N28N29N30N31N32TN34GGGCGTTTTAAN46N47N48N49（配列番号50）に示される塩基配列（配列中、N1〜N3、N15、N17、N20〜N23、N25〜N29、N31〜N32、N34及びN46は独立に、G、T、A若しくはCであり、N18及びN30はDsであり、N47はN3と、N48はN2と、N49はN1と塩基対を形成する）である。一実施形態において、N1はCであり、N2はCであり、N15はTであり、及び／又はN34はAである。（IV）（a）の塩基配列として、配列番号51に示される配列が挙げられる。
【００５１】
前記（IV）（b）の塩基配列は、（IV）（a）に示される塩基配列のN18及びN30以外の位置において、1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列である。付加、欠失、及び／又は置換は、実施例3のセカンドセレクションによって保存性が低かった部位等において、例えば配列番号50の1位〜3位、15位、17位、20位〜23位、25位〜29位、31位〜32位、34位、又は46位〜49位、例えば1位〜3位又は47位〜49位、好ましくは3位又は47〜49位に行うことができる。
【００５２】
一実施形態において、（I）（a）、（II）（a）、（III）（a）、又は（VI）（a）の塩基配列は、その末端に塩基対、例えばGC対を1〜5個、例えば、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個含む。
【００５３】
また、（I）（a）、（II）（a）、（III）（a）、又は（VI）（a）の塩基配列は、これらの塩基対に加えて、又はこれらの塩基対に替えて、ミニヘアピン構造を形成する配列を含んでよい。（I）（a）の配列にミニヘアピン配列を付加した配列の例として、配列番号44に示される配列にミニヘアピン配列を付加した配列番号45に示される配列が挙げられる。（II）（a）の配列に、ミニヘアピン配列を付加した配列の例として、配列番号9及び14〜16に示される配列にミニヘアピン配列をそれぞれ付加した配列番号10及び配列番号11〜13に示される配列が挙げられる。（III）（a）の配列に、ミニヘアピン配列を付加した配列の例として、配列番号20及び26に示される配列にミニヘアピン配列をそれぞれ付加した配列番号24及び25に示される配列が挙げられる。（IV）（a）の配列に、ミニヘアピン配列を付加した配列の例として、配列番号51に示される配列にミニヘアピン配列を付加した配列番号52に示される配列が挙げられる。
【００５４】
本発明の乳癌細胞に結合するDNAアプタマーは、Dsに加えて、任意に塩基類似体、他の人工塩基、又は修飾塩基等を含んでよい。
【００５５】
本発明の乳癌細胞に結合するDNAアプタマーは、上記（I）（a）〜（b）、（II）（a）〜（b）、（III）（a）〜（b）又は（IV）（a）〜（b）の塩基配列、又はこれにGC対及び／又はミニヘアピン配列を付加した配列からなるものであってよい。
【００５６】
本発明の乳癌細胞に結合するDNAアプタマーは、乳癌細胞以外の癌細胞とも結合し得る。そのような癌細胞として、限定するものではないが、前立腺癌細胞及び肺癌細胞が挙げられる。癌細胞の由来となる生物種は問わないが、例えば哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトの癌細胞が挙げられる。
【００５７】
本発明の乳癌細胞に結合するDNAアプタマー、特に（I）〜（III）のDNAアプタマーはそれぞれ07-MB231アプタマー、14A-MCF7アプタマー、及び08B-MCF7アプタマーに由来し、これらのDNAアプタマーは乳癌細胞の細胞株に応じて結合能が異なることが示されているため、乳癌細胞の分類を可能とし得る。例えば、07-MB231アプタマーはトリプルネガティブ細胞であるMDA-MB-231細胞にのみ結合したことから、07-MB231アプタマーに由来する（I）（a）又は（I）（b）の塩基配列を含むDNAアプタマーは、乳癌細胞がトリプルネガティブ細胞であるか否かの判断を可能とし得、トリプルネガティブ乳癌の診断に用いることができるため、特に有用である。トリプルネガティブとは、乳癌原因遺伝子であるエストロゲン受容体（Estrogen Receptor：ER）、プロゲステロン受容体（Progesterone Receptor：PR）、及び上皮細胞増殖因子受容体2型（Human Epidermal growth factor Receptor 2：HER2）の過剰発現がいずれも認められないタイプの乳癌である。それゆえ、確立した治療方針がなく予後不良であることが知られており、またその検出も困難であった。
【００５８】
本発明の乳癌細胞に結合するDNAアプタマーは、他の物質、例えばポリエチレングリコール（PEG）（例えば、約20〜約60kDaのPEG重合体）、アミノ酸、ペプチド、inverted dT、脂質、色素、蛍光物質、酵素、放射性物質、ビオチン等を付加することにより修飾されていてもよい。これらの物質は、必要に応じて公知のリンカーを介して連結してもよい。PEGを連結することにより、一般にDNAアプタマーの半減期を伸ばすことができることが知られている。
【００５９】
本発明の乳癌細胞に結合するDNAアプタマーの長さは、例えば、150mer以下、140mer以下、130mer以下、120mer以下、110mer以下、好ましくは100mer以下、90mer以下、80mer以下、70mer以下、又は60mer以下である。
【００６０】
本発明の乳癌細胞に結合するDNAアプタマーの製造方法は、上記「２．癌細胞に結合するDNAアプタマー」において記載したのと同様であるからここでは記載を省略する。
【００６１】
４．DNAアプタマーを含む医薬組成物
一態様において、本発明は、上記２又は３に記載のDNAアプタマー（本明細書では単に、これらを合わせて「本発明のDNAアプタマー」とも記載する）を含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、本発明のアプタマーが有する癌細胞への結合能を失わない範囲において、他の薬剤を一以上含有することもできる。例えば、抗癌剤を所定量含有していてもよい。
【００６２】
一実施形態において、本発明は、DNAアプタマーと他の薬剤とを含む、薬剤を癌細胞に送達するための医薬組成物に関する。他の薬剤はDNAアプタマーに結合させてもよく、それにより、DNAアプタマーの癌細胞への結合能を利用して、薬剤を癌細胞に効率的に送達することが可能となる。DNAアプタマーと薬剤の結合方法は限定されるものではない。
【００６３】
本発明の医薬組成物の予防及び／又は治療の対象となる疾患は、癌である。例えば、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、大腸癌、結腸癌、胃癌、子宮頸癌、及び肺癌並びに白血病及び悪性リンパ腫等が挙げられる。
【００６４】
癌に罹患した被験体に医薬組成物を投与することにより治療効果が、癌に罹患するリスクがある被験体に医薬組成物を投与することにより予防効果が期待される。
【００６５】
本発明の医薬組成物は、製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する医薬組成物の製剤化や生体への適用を容易にし、その作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される物質をいう。担体には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、潤滑沢剤、又は安定化剤が挙げられる。
【００６６】
「賦形剤」としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、或いはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６７】
「結合剤」としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００６８】
「崩壊剤」としては、例えば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。
【００６９】
「充填剤」としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
【００７０】
「乳化剤」としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
【００７１】
「流動添加調節剤」及び「滑沢剤」としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
【００７２】
「安定化剤」としては、例えば、アスコルビン酸や亜硫酸塩等の酸化防止剤、トレハロースやブドウ糖等の糖類が挙げられる。
【００７３】
このような担体は、必要に応じて適宜使用すればよい。本発明の医薬組成物は、上記の添加剤の他、必要に応じて矯味矯臭剤、溶解補助剤（可溶化剤）、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、吸収促進剤（例えば、第4級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等）、増量剤、付湿剤、保湿剤（例えば、グリセリン、澱粉等）、吸着剤（例えば、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等）、崩壊抑制剤（例えば、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等）、コーティング剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、溶解補助剤等を含むこともできる。
【００７４】
「界面活性剤」としては、例えば、リグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩、アルキルアリールスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、脂肪アルコールスルフェート、脂肪酸及び硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテル、さらに、スルホン化ナフタレン及びナフタレン誘導体とホルムアルデヒドの縮合物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコール及び脂肪アルコール／エチレンオキシドの縮合物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグノ亜硫酸廃液、及びメチルセルロースが該当する。
【００７５】
本実施形態の医薬組成物は、一医薬組成物中に上記担体を一以上包含することが可能である。
【００７６】
本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分を不活化させない形態であって、投与後、生体内でその薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。通常は、投与方法及び／又は処方条件によって異なる。
【００７７】
例えば、経口投与に適した剤形としては、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤等を挙げることができる。さらに固形剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。
【００７８】
非経口投与は、全身投与及び局所投与に細分され、局所投与は、組織内投与、経表皮投与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分されるが、医薬組成物も、それぞれの投与方法に適した剤形にすることができる。全身又は組織内投与に適した剤形としては、例えば、液剤である注射剤が挙げられる。経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、例えば、液剤（塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む）、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、粉剤（点鼻剤、吸引剤を含む）、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げることができる。経直腸的投与に適した剤形としては、例えば、坐剤等を挙げることができる。
【００７９】
なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
【００８０】
本発明の医薬組成物を製造するには、原則として当該分野で公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Merck Publishing Co．，Easton，Pa．）に記載の方法を参照することができる。
【００８１】
例えば、注射剤の場合には、本発明のDNAアプタマーを製薬上許容可能な溶媒に溶解し、必要に応じて製薬上許容可能な担体を加え、当該分野で慣用されている方法により製造することができる。
【００８２】
「薬学的に許容可能な溶媒」としては、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。これらは、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、目的とする癌等の疾患の治療又は予防のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、全身投与又は局所的投与のいずれであってもよい。疾患の種類、発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。発症箇所が局部的な疾患であれば、注射などにより発症箇所及びその周辺に直接投与する局所的投与が好ましい。治療すべき箇所（組織又は器官）に本発明のDNAアプタマーを十分量投与することができ、また他の組織に影響を及ぼしにくいからである。一方、治療箇所を特定できない場合や発症が全身性の疾患の場合には、限定はしないが、静脈注射等による全身投与が好ましい。血流を介して本発明のDNAアプタマーを全身に行き渡らせることで、診断で発見できない病変部にも投与が可能となるからである。
【００８５】
本発明の医薬組成物は、有効成分が失活しないあらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）又は経口のいずれであってもよい。好ましくは、注射である。
【００８６】
注射による投与の場合、注入部位は、特に限定しない。有効成分であるDNAアプタマーが標的物質に結合することができれば、いずれの部位であってもよい。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経肺、経皮、皮下、皮内、腹腔内等が挙げられる。
【００８７】
５．DNAアプタマーからなる抗癌剤
一態様において、本発明は、上記「２．癌細胞に結合するDNAアプタマー」の（i）（a）又は（i）（b）に記載の塩基配列を含むDNAアプタマーからなる抗癌剤に関する。このDNAアプタマーの由来となった05-MB231アプタマーは癌細胞に結合するだけでなく、癌細胞の増殖を抑制することができることが示されていることから、抗癌剤として用いることができる。また、一実施形態において、本発明は、上記DNAアプタマーからなる抗癌剤を有効成分として含む医薬組成物に関する。医薬組成物の構成については上記の通りであるからここでは記載を省略する。
【００８８】
６．DNAアプタマーを用いる治療方法
一態様において、本発明は上記医薬組成物又は抗癌剤を被験体に投与することを含む、癌の治療及び／又は予防方法に関する。
【００８９】
本発明の医薬組成物の予防及び／又は治療の対象となる疾患は、癌、例えば、乳癌、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、大腸癌、結腸癌、胃癌、子宮頸癌、及び肺癌、並びに白血病及び悪性リンパ腫等である。
【００９０】
本明細書において、「被験体」となり得る動物種は、例えば哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトである。
【００９１】
７．DNAアプタマーを含む検出剤
一態様において、本発明は、本発明のDNAアプタマーを含む癌検出剤に関する。本発明の癌検出剤は、DNAアプタマーの癌細胞への結合能を利用して、in vivo又はin vitroにおいて癌又は癌細胞を検出するための組成物である。例えば、DNAアプタマーをあらかじめ蛍光試薬等で標識し、これを投与することによって、生体内で癌細胞の有無を決定し、また存在する場合にはその局在を調べることができる。本発明のDNAアプタマーは、イメージング及び組織染色等において有用である。
【００９２】
一実施形態において、本発明は、本発明のDNAアプタマーを含む癌検出用組成物に関する。組成物の構成については上記医薬組成物と同様であるから、ここでは記載を省略する。
【００９３】
一態様において、本発明は、本発明のDNAアプタマーを含む癌細胞検出用キットに関する。本発明のキットは、本発明のDNAアプタマーに加えて、バッファー、標識試薬、及び／又は説明書等を含んでよい。
【００９４】
本発明の癌検出剤、癌検出用組成物、及び癌検出用キットは、癌罹患の有無の診断を補助する方法、又は下記の癌細胞の分類方法において用いることができる。
【００９５】
８．癌細胞の検出方法
一態様において、本発明は、癌細胞を検出する方法に関する。本方法は、被験体から得られたサンプルを、本発明のDNAアプタマーと接触させる工程、及びサンプルとDNAアプタマーの結合に基づいて癌細胞を検出する工程を含む。本方法によって、被験体における癌罹患の有無の診断を補助することが可能となり得る。
【００９６】
本方法において用いるサンプルとしては、組織及び細胞を含む生体試料が挙げられる。組織の例として、病変部位、例えば、乳房、肝臓、膵臓、前立腺、卵巣、大腸、結腸、胃、子宮頸部、及び肺、骨髄、リンパ節、脾臓、及び胸腺等が挙げられ、例えばこれらの組織の生検サンプルを用いることができる。細胞の例として、例えば、末梢血細胞、細胞を含むリンパ液及び組織液、毛母細胞、口腔細胞、鼻腔細胞、腸管細胞、膣内細胞、粘膜細胞、喀痰（肺胞細胞又は気肝細胞等を含み得る）が挙げられる。
【００９７】
また、本発明のDNAアプタマーが癌細胞に存在するタンパク質、脂質、糖鎖等のマーカーを認識する場合であって、これらのマーカーが分泌、切断等されて尿及び血液等の体液中に生じる場合には、本発明のDNAアプタマーは体液中のこれらのマーカーを検出するために用いることもできる。
【００９８】
本発明の検出方法の検出工程は、サンプルとDNAアプタマーの結合を利用するものであれば特に限定せず、公知の方法を用いればよい。例えば、SPR法、比濁法、比色法又は蛍光法を利用することができる。
【００９９】
SPR（表面プラズモン共鳴）は、金属薄膜にレーザー光を照射すると特定の入射角度（共鳴角）において反射光強度が著しく減衰する現象をいう。SPR法は、この現象を利用した測定方法で、センサ部である金属薄膜表面上の吸着物を高感度に測定することができる。本発明においては、例えば、予め本発明のDNAアプタマーを金属薄膜表面上に固定化しておき、その金属薄膜表面上に試料を通過させ、当該核酸分子と標的物質との結合によって生じる試料通過前後の金属表面上の吸着物の差を検出することにより試料中の標的物質を検出することができる。SPR法には、置換法、間接競合法等が知られるがいずれを用いてもよい。
【０１００】
比濁法は、溶液に光を照射し、溶液中に浮遊する物質によって散乱する散乱光の減衰又はその溶液を通過した透過光を、比色計等を用いて光学的に計測することにより溶液中の物質量を測定する方法である。本発明においては、試料中に本発明のDNAアプタマーを添加する前後の吸光度を計測することによって、試料中の標的物質を定量的に検出することができる。
【０１０１】
また、標的物質に対する抗体と併用することにより標的物質を検出することもできる。例えば、ELISA法のサンドイッチ法を応用した方法を用いてもよい。この方法では、まず、固相担体に本発明のDNAアプタマーを固定しておき、次に試料を加えて、試料中に存在する標的物質と前記DNAアプタマーとを結合させる。続いて、試料を洗い流した後、抗標的物質抗体を加えて標的物質に結合させる。洗浄後、適当な標識をした二次抗体を用いて抗標的物質抗体を検出することにより、試料中の標的物質を検出することができる。固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。
【０１０２】
一態様において、本発明は、被験体において癌罹患の有無の診断を補助する方法に関する。本方法は、被験体に本発明のDNAアプタマー又は本発明の癌検出剤又は癌検出用組成物を投与する工程、及びDNAアプタマーを検出する工程を含む。例えば、生体内で特定の部位でDNAアプタマーが高濃度で検出された場合には、その部位において癌が生じていると判断することができる。検出工程は、公知の方法を用いればよく、例えば上記蛍光法を用いることができる。
【０１０３】
９．癌細胞の分類方法
一態様において、本発明は、被験体から得られた癌細胞を分類する方法に関する。本方法は、被験体から得られた癌細胞を、本発明のDNAアプタマーと接触させる工程、前記癌細胞と前記DNAアプタマーの結合の有無又は強度を測定する工程、前記結合の有無又は強度に基づいて癌細胞を分類する工程を含む。癌細胞とDNAアプタマーの結合の有無又は強度を測定する工程については、上記癌細胞の検出方法において記載したのと同様であるからここでは記載を省略する。
【０１０４】
本方法は、本発明のDNAアプタマーの一つのみを用いて行ってもよいし、本発明のDNAアプタマーを複数用いて行ってもよい。本発明のDNAアプタマーを一つだけ用いる場合、形態観察、癌マーカーの測定、染色法、及び従来のアプタマーを用いる方法等の従来の癌の分類方法と組み合わせることで、より詳細に癌細胞を分類することができる。
【０１０５】
本発明の癌細胞の分類方法においては、癌細胞とDNAアプタマーの結合に基づいて、癌細胞の由来組織、サブタイプ、固有のサブタイプ（Intrinsic Subtype）、分化度、及び浸潤性等を分類することができる。また、癌細胞の分類に基づいて、癌細胞の由来となった被験体の臨床病期（進行度、ステージ）、予後予測、及び治療計画の作成等も可能となり得る。
【０１０６】
一実施形態において、本方法において分類される癌細胞は、乳癌細胞である。本方法では、上記「３．乳癌細胞に結合するDNAアプタマー」に記載の（Ｉ）〜（IV）の四つの群から選択される二種以上のDNAアプタマー、例えば（I）〜（III）の三つの群から選択される二種以上のDNAアプタマーを用いることが好ましい。（I）〜（III）の三つの群のDNAアプタマーはそれぞれ07-MB231アプタマー、14A-MCF7アプタマー、及び08B-MCF7アプタマーに由来し、これらのDNAアプタマーは乳癌細胞の細胞株に応じて結合能が異なることが示されているからである。例えば、07-MB231アプタマーがトリプルネガティブ細胞であるMDA-MB-231細胞にのみ結合したことから、本DNAアプタマーに由来する（I）（a）又は（b）の塩基配列を含むDNAアプタマーは、トリプルネガティブ細胞であるか否かの判断を可能とし得、トリプルネガティブ乳癌の診断に用いることができるため、特に有用である。トリプルネガティブとは、乳癌原因遺伝子であるエストロゲン受容体（Estrogen Receptor：ER）、プロゲステロン受容体（Progesterone Receptor：PR）、及び上皮細胞増殖因子受容体2型（Human Epidermal growth factor Receptor 2：HER2）の過剰発現がいずれも認められないタイプの乳癌である。それゆえ、確立した治療方針がなく予後不良であることが知られており、またその検出も困難であった。
【実施例】
【０１０７】
＜実施例1：Cell-SELEX＞
細胞株：
実施例に用いた細胞株の入手先とその培養培地は、以下の通りである：
ヒト乳癌由来細胞株MCF7（理研バイオリソースセンター（BRC）、RCB1904、MEM）、T-47D（ATCC、HTB-133TM、RPMI1640培地）、MDA-MB-231（ATCC、HTB-26TM、L15培地、CO2不要、CO2環境下ではDMEM培地）、MDA-MB-453（BRC、RCB1192、L15培地、CO2不要、CO2環境下ではDMEM培地）、ヒト乳腺線維症由来細胞株MCF 10A（ATCC、CRL-10317TM、MEGM培地）、大腸癌由来細胞株HCT-116（BRC、RCB2979、DMEM培地）、肺癌由来細胞株A549（BRC、RCB0098、F12K培地）、胃癌由来細胞株 MKN45（BRC、RCB1001、RPMI1640培地）、卵巣癌由来細胞株NIH: OVCAR-3（BRC、RCB2135、RPMI1640培地）、前立腺癌由来細胞株PC-3（ATCC、CRL-1435、RPMI1640培地）、膵臓癌由来細胞株MIAPaca2（東北大学加齢医学研究所、TKG0227、RPMI1640培地）、Panc1（東北大学加齢医学研究所、TKG0606、RPMI1640培地）、肝癌由来細胞株PLC/PRT/5（JCRB、JCRB0406、RPMI1640培地）、子宮頸癌由来細胞株HeLa（BRC、BRC0007、MEM培地）、骨髄性白血病由来細胞株KG-1（BRC、RCB1166、RPMI1640培地）、急性リンパ性白血病由来細胞株CCRF-CEM（東北大学加齢医学研究所、I-4924、RPMI1640培地）、ヒト臍帯血内皮細胞株Huvec（Lonza、CC-2519、MEG培地）。特に明記しない限り、全ての実施例において、上記の細胞株を用いた。
（Cell-SELEX）
まずWO2013/073602に記載の方法に準じてDNAライブラリーの調製を行った。DNAライブラリーは、両末端のプライマー配列（25塩基）と中間部の45塩基のランダム配列からなる計95塩基の配列を含む核酸で構成される。45塩基のランダム配列中の二か所には、人工塩基Dsを組み込んでおり、その組み入れ位置は、ランダム配列の5'末端の3塩基を構成する配列（タグ配列）から判定できる。これらタグ配列を持つ24種のサブライブラリーを化学合成し、混合することで、DNAライブラリー（N42Ds3nmix-P003）を調製した（表１）。【０１０８】
【表１】
2017073535.tif 000003
【０１０９】
乳癌細胞株MCF7に対するCell-SELEXを上記ライブラリー2000 pmolを出発として実施した。同様に乳癌細胞株T-47D、乳癌細胞株MDA-MB-231については、上記ライブラリー1000 pmolを出発材料としてCell-SELEXを実施した。Cell-SELEXの方法については、非特許文献1に記載の方法に準じて実施し、人工塩基を含むDNAライブラリーの取扱いについては、WO2013/073602に記載の方法に準じて実施した。【０１１０】
3ラウンド目からは、対照細胞として、非癌性の乳腺由来の上皮性細胞株MCF10Aを使って、非特許文献1に記載の方法に準じてカウンターセレクションを行った。それぞれの細胞におけるスクリーニング条件を表2〜4に示す。【０１１１】
【表２】
2017073535.tif 000004
【０１１２】
【表３】
2017073535.tif 000005
【０１１３】
【表４】
2017073535.tif 000006
【０１１４】
各ラウンドで得られたDNAプールの5'末端を、PCRを用いてAlexa488で蛍光標識し、フローサイトメーターを使って結合配列の濃縮を確認した。具体的には、25 pmolのAlexa488標識された各ラウンドプールDNAを、D-PBS(-)中で95℃、5分間の加熱を行った後、室温で20分間放置することによってフォールディングした。これらの標識DNAを非酵素的に懸濁したMCF7細胞（2.5 × 105 cells）と4℃で30分間のインキュベーションを行った（0.45％グルコース、0.1mg/mL tRNA、1 mg/mL BSA、5 mM MgCl2/D-PBS(-)）。洗浄バッファー（0.45%グルコース、5mM MgCl2）で細胞に結合しなかった標識DNAを洗い流した後、それぞれの細胞に結合したDNAアプタマーを、蛍光強度の変化としてフローサイトメーター（S3 Cell Sorter、BIO-Rad）で解析した。【０１１５】
その結果、MCF7 Cell-SELEXでは5ラウンド目から蛍光強度の変化が起こりはじめ、その蛍光強度は7ラウンド目まで増強していった。MDA-MB231では、6ラウンドから変化が起こり始め、7ラウンドでさらに蛍光強度は増強した。7ラウンド目の蛍光強度がシフトした集団（蛍光標識したDNAが細胞に結合した集団）をセルソーター（S3 Cell Sorter、BIO-Rad）で分取した。【０１１６】
＜実施例2：Cell-SELEXによって得られたDNAの配列決定＞
Ion PGM sequencing（Thermo Fisher Scientific）により、ソートした細胞から得られたDNAの塩基配列の特定を行った。MCF7 Cell-SELEXでは、総リード（read）数246,903配列から両末端のプライマー配列を正しく保持している配列を抽出したところ、解析対象は80,592配列であった。抽出した配列を基に、1塩基違いの配列を派生配列とみなす条件でクラスタリングし、配列の濃縮程度を確認したところ、10配列が濃縮候補として挙がった。それらの候補配列をそれぞれ化学合成して、個々に結合能スクリーニングを実施し、2配列（14A-MCF7（配列番号4）及び08B-MCF7（配列番号17））に絞った。【０１１７】
T-47D Cell-SELEX（１回目)では、総リード数638,160配列から両末端のプライマー配列を正しく保持している配列を抽出したところ、解析対象は205,801配列であった。抽出した配列を基に、1塩基違いの配列を派生配列とみなす条件でクラスタリングしたところ、全体の76％を占める配列（03-T47D（配列番号27））に濃縮していた。【０１１８】
MDA-MB-231Cell-SELEXでは、総リード数497,341配列から両末端のプライマー配列を正しく保持している配列を抽出したところ、解析対象は128,607配列であった。抽出した配列を基に、1塩基違いの配列を派生配列とみなす条件でクラスタリングし、配列の濃縮程度を確認したところ、23-MB231（配列番号49）;36.6%、05-MB231（配列番号34）;17.5%、07-MB231（配列番号42）;14.2%の3配列が高度に濃縮していた。【０１１９】
＜実施例3：Cell-SELEXによって得られたDNAアプタマーのセカンドセレクション＞
実施例2で得られた配列を含むDNAアプタマーについて、WO2013/073602の実施例3に記載の方法に準じてセカンドセレクション（Doped selection）を実施し、それぞれのDNAアプタマーの二次構造の推定を行った。セカンドセレクションでは、オリジナルの1stセレクションで得られたオリジナル配列のそれぞれの塩基組成を55％、その他ヌクレオチドをそれぞれ15％含む割合で調製されたライブラリー（Doped-14A、Doped-08B、Doped-03-T47D short、Doped-05-MB231、Doped-07-MB231、Doped-23-MB231）を使って、再びセレクションを行った。【０１２０】
セレクション条件は、標的細胞であるMCF7、T-47D、又はMDA-MB-231のみを用いて、4ラウンドを実施した。各DNAアプタマーのセカンドセレクションの条件を以下の表5〜表7に示す。【０１２１】
【表５】
2017073535.tif 000007
【０１２２】
【表６】
2017073535.tif 000008
【０１２３】
【表７】
2017073535.tif 000009
【０１２４】
Cell-SELEXによって得られたDNAアプタマーの配列を図1〜6に示す。セカンドセレクションの結果、1stセレクションで得られた配列の残存率が85％以上である塩基を丸で囲んだ。【０１２５】
＜実施例4：14A-MCF7アプタマーの改変＞
実施例3で得られた14A-MCF7（53DsDs）（配列番号4）を元に、17位のDsをAに置換した14A-MCF7（53ADs）（配列番号5）、28位のDsをAに置換した14A-MCF7（53DsA）（配列番号6）、17位と28位のDsをAに置換した14A-MCF7（53AA）（配列番号7）、3'末端側のバルジ部分のAGをTTに置換し、ステム部分のミスマッチ部分の一部を塩基対を形成するように置換した14A-MCF7（Opt53DsDs）（配列番号3）を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した（それぞれの塩基配列と、Doped selectionから予測される二次構造を図7に示す）。【０１２６】
陽性対象として、癌細胞への結合を示すと報告されているヌクレオリンを標的とするAS1411（配列番号81）（本明細書では単に「AS1411」とも表記する）、及び陰性対象として、ヌクレオリンへの結合能を欠失したAS1411の変異体であるCont26（配列番号82）（本明細書では単に「Cont26」とも表記する）も化学合成した。上記の通り調製したDNAアプタマーを用いて、それぞれのMCF-7細胞に対する結合性を、実施例1と同様に蛍光強度の変化で解析した（25 pmol Alexa488標識DNA/2.5 × 105cells/100 μLでインキュベーションを行った）。その結果、14A-MCF7（53ADs）では元のDNAアプタマー（14A-MCF7（53DsDs））と比べて活性の低下が認められ、14A-MCF7（53DsA）では活性の消失が認められたことから、配列中のDsの2か所とも結合に関与しており、特に3'末端側のDsが結合に大きく関与していることが示唆された（図8）。また、バルジ部分やステム部分を変更した配列を有するDNAアプタマー14A-MCF7（Opt53DsDs）において、元のDNAアプタマーと同程度の活性が認められたことは、これらの部分がDNAアプタマーの結合活性にほとんど関与していないことを示唆している。【０１２７】
続いて、結合に影響を与えうるステム長の検討を行った。具体的には、14A-MCF7（53DsDs）を元に、5'末端及び3'末端からそれぞれ8塩基、計16塩基を除いた14A-MCF7 (37DsDs)（配列番号8）、14A-MCF7 (37DsDs)からさらにAGからなるバルジ構造を除き、末端のステムのいくつかをGC対に置換した14A-MCF7（35DsDs）（配列番号9）、14A-MCF7（35DsDs）の3'末端にミニヘアピンを付加した14A-MCF7mh (44DsDs)（配列番号10）、ステム構造のGC対をそれぞれ1対、2対、3対除いた14A-MCF7mh（配列番号11）、14A-MCF7mh(40DsDs)（配列番号12）、14A-MCF7mh(38DsDs)（配列番号13）を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した（それぞれの塩基配列とDoped selectionから予測される二次構造を図9に示す）。それぞれ250 nM （25 pmol Alexa488標識DNA/2.5 × 105 cells/100 μL）で4℃、30分のインキュベーションを行い、実施例1と同様にフローサイトメーターで蛍光強度シフトによる細胞への結合性を確認した。【０１２８】
その結果、いずれもMCF7細胞に対して、結合性を有することが確認できた（図10）。これらの結果により、末端のステム構造を短縮化又は末端にミニヘアピンを付加しても、同等の活性が維持されることが示された。【０１２９】
＜実施例5：08B-MCF7DNAアプタマーの改変＞
08B-MCF7アプタマーでも改変を行った。具体的には、08B-MCF7（51DsDs）（配列番号20）を元に、18位のDsをAに置換した08B-MCF7（51ADs）（配列番号21）、32位のDsをAに置換した08B-MCF7（51DsA）（配列番号22）、18位及び32位のDsをAに置換した08B-MCF7（51AA）（配列番号23）、08B-MCF7（51DsDs）にミニヘアピンを付加した08B-MCF7mh（配列番号24）、08B-MCF7mhの内部のステムループをミニヘアピンに置換した08B-MCF7mh2（配列番号25）を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した（それぞれの塩基配列とDoped selectionから予測される二次構造を図11に示す）。【０１３０】
それぞれ250 nM （25 pmol Alexa488標識DNA/2.5 × 105 cells/100 μL）で4℃、30分のインキュベーションを行い、実施例1と同様にフローサイトメーターで蛍光強度シフトによる細胞への結合性を確認した。【０１３１】
結果を図12に示す。08B-MCF7（51ADs）では活性が維持され、08B-MCF7（51DsA）では活性の低下が認められたことから、5'側（18位）のDsは細胞結合には関与しておらず、3'側（32位）のDsにのみ、細胞結合性が依存していることが示唆された。5'側のDsが細胞結合に寄与していないことから、5'側のステムループをミニへピンに置換した08B-MCF7mh2を合成し試験したところ、これもMCF7細胞に結合した（図12）。【０１３２】
＜実施例6：03-T47D アプタマーの改変＞
03-T47Dアプタマーでも改変を行った。具体的には、03-T47D（配列番号27）の末端にGC対を付加した03-T47D（DsDs）（配列番号29）を元に、24位のDsをAに置換した03-T47D（DsA）（配列番号30）、15位のDsをAに置換した03-T47D（ADs）（配列番号31）、15位及び24位のDsをAに置換した03-T47D（AA）（配列番号32）、03-T47D（DsDs）の末端にミニヘアピンを付加した03-T47Dmh（配列番号33）を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した（それぞれの塩基配列とDoped selectionから予測される二次構造を図13に示す）。【０１３３】
それぞれ250 nM （25 pmol Alexa488標識DNA/2.5 × 105 cells/100 μL）で4℃、30分のインキュベーションを行い、実施例1と同様にフローサイトメーターで蛍光強度シフトによる細胞への結合性を確認した。【０１３４】
結果を図14に示す。03-T47D（DsA）及び03-T47D（ADs）の両方において結合の低下が認められたことは、配列中の2つのDsはいずれも細胞結合に関与していることを示唆している。また、末端にミニへピンを付加したDNAアプタマー（03-T47Dmh）についても細胞への結合を確認した（図14）。【０１３５】
＜実施例7：05-MB231アプタマーの改変＞
05-MB231アプタマーでも改変を行った。具体的には、05-MB231（配列番号34）の末端のステムの一部をGC対に置換した05-MB231（DsDs）（配列番号36）を元に、44位のDsをAに置換した05-MB231（DsA）（配列番号37）、33位のDsをAに置換した05-MB231（ADs）（配列番号38）、33位及び44位のDsをAに置換した05-MB231（AA）（配列番号39）、05-MB231（DsDs）の末端の配列の一部を除去し、ステムの一部をGC対に置換した05-MB231GC（配列番号40）、及び05-MB231GCにミニヘアピンを付加した05-MB231GCmh（配列番号41）を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した（それぞれの塩基配列とDoped selectionから予測される二次構造を図15に示す）。【０１３６】
それぞれ250 nM （25 pmol Alexa488標識DNA/2.5 × 105 cells/100 μL）で4℃、30分のインキュベーションを行い、実施例1と同様にフローサイトメーターで蛍光強度シフトによる細胞への結合性を確認した。【０１３７】
結果を図16に示す。05-MB231（ADs）においては結合能の低下が認められたが、05-MB231（DsA）において結合の低下が認められなかったことから、3'側のDsが結合に関与していないことが示された。この領域を除去した配列（05-MB231GC）、及びこれに末端にミニへピンを付加した配列（05-MB231GCmh）含むDNAアプタマーについても結合を確認した。【０１３８】
＜実施例8：07-MB231アプタマーの改変＞
07-MB231アプタマーでも改変を行った。具体的には、07-MB231（配列番号42）の末端のステムの一部をGC対に置換した07-MB231（DsDs）（配列番号44）を元に、28位のDsをAに置換した07-MB231（DsA）（配列番号46）、15位のDsをAに置換した07-MB231（ADs）（配列番号47）、15位及び28位のDsをAに置換した07-MB231（AA）（配列番号48）、07-MB231の末端にミニヘアピンを付加した07-MB231mh（配列番号45）を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した（それぞれの塩基配列とDoped selectionから予測される二次構造を図17に示す）。【０１３９】
それぞれ250 nM （25 pmol Alexa488標識DNA/2.5 × 105 cells/100 μL）で4℃、30分のインキュベーションを行い、実施例1と同様にフローサイトメーターで蛍光強度シフトによる細胞への結合性を確認した。【０１４０】
結果を図18に示す。07-MB231（DsA）及び07-MB231（ADs）のいずれにおいても結合能の低下が認められ、07-MB231（ADs）においてより顕著に結合能の低下が認められたことから、構造中の2つのDsのいずれもが細胞結合に関与しており、特に5'側のDsが細胞への結合に大きく関与していることが示唆された。末端にミニへピンを付加した配列を含むDNAアプタマー（07-MB231mh）についても結合を確認した。【０１４１】
＜実施例9：23-MB231 アプタマーの改変＞
23-MB231でも改変を行った。具体的には、23-MB231b（配列番号51）を元に、末端にミニへピンを付加した23-MB231bmh（配列番号52）を設計し、それぞれの塩基配列を有するDNAアプタマーを化学合成した（それぞれの塩基配列とDoped selectionから予測される二次構造を図19に示す）。【０１４２】
それぞれ250 nM （25 pmol Alexa488標識DNA/2.5 × 105 cells/100 μL）で4℃、30分のインキュベーションを行い、実施例1と同様にフローサイトメーターで蛍光強度シフトによる細胞への結合性を確認した。【０１４３】
結果を図20に示す。いずれのDNAアプタマーについて結合を確認した。【０１４４】
＜実施例10：DNAアプタマーのアフィニティ（KD）検討＞
最適化、安定化を行ったDNAアプタマーを用いて、標的細胞株に対する親和性を比較検討した。方法は、DNAアプタマーにAlexa488標識を行い、細胞結合によって生じる蛍光強度の変化をフローサイトメーターで解析した。【０１４５】
具体的には、標識DNAアプタマーを終濃度 100、50、25、10、5、2.5、1、又は0 nMに段階希釈を行い、2.5 × 105細胞の非酵素的に懸濁したMCF7と4℃で30分のインキュベーションを行い、2回の洗浄後、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した（3反復）。それぞれの濃度で得られた蛍光値を基にKaleida GraphでKd値を算出した。計算式はy=m1 ×M0/(m2 + M0)である。【０１４６】
結果を図21〜26及び表8に示す。08B-MCF7、14A-MCF7、05-MB231、及び07-MB231に由来するアプタマーについては、基本構造及び末端にミニヘアピンを付加した構造のいずれにおいても、細胞に対して数nMレベルの非常に強い結合能を有していた。03-T47D及び23-MB231に由来するアプタマーについては数10nM〜数nMレベルの結合能を有していた。【０１４７】
【表８】
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【０１４８】
＜実施例11：Tm値の算出＞
14A-MCF7アプタマーに由来するアプタマー及び08B-MCF7アプタマーに由来するアプタマーのTm値をUV-2450（島津製作所）で測定した（3回平均）。【０１４９】
具体的には、それぞれのDNAアプタマーをD-PBS(-)で希釈を行い、260 pmol/130μLを5 mｌラウンドチューブに用意した。これらを95℃で3分間加熱したのち、デシケーター中で1分間の脱気を行った。これらのサンプルをキュベットに移し、15〜100℃の温度条件で0.5℃/秒ずつ温度を上昇させ、260nmの吸光度を測定した。データはIGOR proでグラフ化を行い、3回行い値を平均して示した。【０１５０】
結果を図27及び表9に示す。【０１５１】
【表９】
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【０１５２】
14A-MCF7に由来するアプタマーの260nｍの吸光度が60℃付近から急激に変化するのに対して、08B-MCF7に由来するアプタマーではなだらかに推移した。これは、14A-MCF7に由来するアプタマーの方が、08B-MCF7に由来するアプタマーよりも構造的に熱安定性に優れていることを示唆している。【０１５３】
＜実施例12：結合競合阻害試験＞
細胞結合能が特に強い4種のDNAアプタマー（14A-MCF7mh、08B-MCF7mh、05-MB231GCmh、及び07-MB231mh）の細胞結合性について、競合実験を行い、結合標的の同一性を検討した。すなわち、DNAアプタマーにAlexa488標識を行い、細胞結合によって生じるKd値濃度付近の蛍光強度の変化が、他のDNAアプタマーの存在下で変化するかどうかをフローサイトメーターで解析した。【０１５４】
具体的には、標識DNAアプタマーを終濃度 2.5あるいは5 nMに設定し、競合させるDNAアプタマーを0, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 nMで混在させた。それぞれを2.5 × 105細胞の非酵素的に懸濁したMCF７と4℃で30分のインキュベーションを行い、洗浄バッファー（0.45%グルコース、5mM MgCl2）による2回の洗浄後、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。この時、使用する細胞株としては、蛍光標識体が14A-MCF7mh、08B-MCF7mhの場合にはMCF7細胞株を用い、05-MB231GCmh、07-MB231mhの場合には、MDA-MB-231細胞株を使用した。【０１５５】
結果を表10に示す。14A-MCF7mhは08B-MCF7mh2と結合競合を示したが、05-MB231GCmh及び07-MB231mhについては細胞結合に関して、他のDNAアプタマーの存在に干渉されることはなかった。これは、14A-MCF7mhと08B-MCF7mh2が同じ結合標的を有するのに対し、05-MB231GCmh及び07-MB231mhはそれぞれ特異的な結合標的を有することを示唆している。【０１５６】
【表１０】
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【０１５７】
＜実施例13：各DNAアプタマーの細胞結合特異性＞
取得したDNAアプタマーの結合特異性を確認するために、これらのAlexa488標識体と種々の培養癌細胞株をインキュベーションし、結合の有無を実施例1と同様にフローサイトメーターで蛍光強度のシフトにて解析した。陽性対照として、AS1411を、陰性対照としてAS1411の変異体Cont26を用いて、その蛍光強度のシフトより判断した。Cont26よりも弱い蛍光強度が認められたものを-、Cont26よりも強い蛍光強度が認められたものを+、AS1141よりも強い蛍光強度が認められたものを++と評価した。【０１５８】
結果を表11に示す。【０１５９】
【表１１】
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【０１６０】
表11に示される通り、14A-MCF7mh、08B-MCF7mh2はともに、MCF7細胞株にのみ、細胞結合を示す強い蛍光強度のシフトが観察された。また、07-MB231mhでは、MDA-MB-231細胞株に対する特異的結合が観察された。一方、03-T47Dmh及び05-MB231GCmhでは、非癌細胞以外のほとんどの癌細胞株に結合することが観察された。【０１６１】
＜実施例14：DNAアプタマーの細胞内在性の確認＞
各DNAアプタマーの結合局在を確認するために、250 nMのAlexa488標識を施したDNAアプタマーをOPTI-MEM（GibcoBRL）中で4℃又は37℃で30分インキュベーションを行った。細胞は、各DNAアプタマーの由来となる細胞を用いた。上記培地には後期エンドソーム及びリソソームを染色するLysoTracker Red DND-99（Molecular Probes）を75 nM添加しておき、細胞内オルガネラマーカーとして局在の指標に用いた。インキュベーションを行った細胞は、4%パラホルムアルデヒドで固定し、DAPI染色を施して封入しサンプルとした。これらのサンプルについて、ECLIPSE Ti (ニコン)で蛍光顕微鏡観察を、FV10iあるいはFV1200（共にオリンパス）共焦点顕微鏡観察を実施した。【０１６２】
結果を図28〜31に示す。いずれのDNAアプタマーにおいても、Alexa488の蛍光は細胞表面上にドット状に点在していることが観察され、細胞表面上に結合している様子が見られた（図28〜29）。また、これらのうち、14A-MCF7mhを使った共焦点顕微鏡観察においては、Alexa488の蛍光が細胞表面だけでなくエンドソーム（LysoTrackerと共局在している）に局在していることが観察された（図30）。これは、細胞膜表面上の何らかの標的に結合した14A-MCF7mhアプタマーが、エンドサイトーシスで細胞内に取り込まれ、徐々にエンドソーム（リソソーム）に移行していくことを示唆している。【０１６３】
一方、陽性対照として用いたAS1411では、細胞表面にドット状に局在していることが観察された（LysoTrackerの局在とは一致しない）（図31）。これは、本発明のDNAアプタマーとAS1141が、細胞への取り込みシステムを異にしている（すなわち、標的が異なる）ことを示唆している。 【０１６４】
＜実施例15：各種DNAアプタマーの培養細胞に対する影響の検討＞
種々の培養癌細胞株を用いて、取得した各DNAアプタマーの細胞増殖抑制効果を検証した。接着性の種々の癌細胞（MCF7 / MEM培地、T47D /RPMI培地、MDA-MB-231 / DMEM培地、MDA-MB-453 / DMEM培地、MIAPaca2 / RPMI培地、PC-3 / RPMI培地、HCT-116 / DMEM培地、A549/ DMEM培地）は、薬剤添加前日に1×103 から2.5×103 cells/wellとなるように、96穴プレートに播種した。骨髄性白血病由来細胞株KG-1（RPMI培地）は、薬剤添加約2時間前に4×104 cells/mLで90 μL/wellとなるように播種した。非癌細胞（MCF10A及びHUVEC）は、4×103cells/wellとなるように播種した。【０１６５】
各DNAアプタマーを、100 μMとなるようにD-PBS（-）で希釈し、その溶液を95℃で5分加熱後、室温で20分以上放置することで、フォールディングを行った。核酸の対照サンプルには、AS1411及びCont26を用い、50 μM又は100 μMとなるようにD-PBS（-）で希釈し、95℃より1℃/分で徐冷してフォールディングを行った。低分子化合物の対照サンプルには、既存抗癌剤であるパクリタキセル（シグマアルドリッチ、略称 PTX、終濃度 10 nM）、フロクスウリジン（ナカライテスク、略称 FUdR、終濃度 10 nM）を用いた。DNAアプタマーについては、それぞれ指定の培地で終濃度が1、2.5、5、又は10 μMとなるように10倍希釈して培地交換により添加（接着細胞）し、もしくは終濃度の10倍濃度にD-PBS（-）で希釈したサンプルを細胞溶液に直接10 μL添加した。PTXについては各培地で1000倍希釈、FUdRについては10倍希釈し細胞添加を行った。また、それぞれの溶媒であるD-PBS(-)、DMSO単体についても、溶媒コントロールとして処理群の設定をおこなった。薬剤添加後、4日間（接着細胞）又は3日間（浮遊細胞）の培養を行った。生細胞数測定試薬（WST-8アッセイ、ナカライテスク）を用いてアッセイを行い、Arvo multilabel counter（Perkin Elmer）にて、各ウェルの450 nm での吸光度を測定し、これらの結果を培地交換のみ行った群で標準化して、細胞増殖を評価した。【０１６６】
図32-1〜3に、非蛍光標識の各DNAアプタマー（08B-MCF7mh、14A-MCF7mh、05-MB231GCmh、07-MB231mh、03-T47Dmh）の、各DNAアプタマー取得に使用した標的癌細胞（08B-MCF7mh及び14A-MCF7mhについてはMCF7細胞、05-MB231GCmh及び07-MB231mhについてはMB231細胞、03-T47DmhについてはT47D細胞）に対する増殖抑制効果を調べた結果を示す。05-MB231GCmhは、陽性対照であるAS1411と同様に、濃度依存的に、細胞増殖抑制効果を示すことがわかり、非癌細胞であるMCF10Aへの増殖抑制はみられないことがわかった。05-MB231GCmh以外のDNAアプタマーは、陰性対照であるCont26と同様に、標的癌細胞、非癌細胞いずれにも、細胞増殖に影響を与えないことがわかった。【０１６７】
図33-1〜3に、標的癌細胞に対して細胞増殖抑制効果がみられた05-MB231GCmhの一塩基置換体である05-MB231GCmmh（配列番号80）を用いて、様々な癌細胞に対する増殖抑制効果を調べた結果を示す。05-MB231GCmmhは、05-MB231GCmhと同様に、標的に用いた癌細胞株MDA-MB231だけでなく、様々な癌細胞の増殖を濃度依存的に抑制する効果があることがわかった。また、一方で図32-1〜3と同様、非癌細胞であるMCF10AやHUVECに対しては、増殖抑制効果はほとんど認められなかった。【０１６８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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