(57)【要約】  電子移動特性が改変されたシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質、及びそれを用いたグルコース測定方法および測定用キットを提供する。  配列番号１又は配列番号４と相同性を有するグルコースデヒドロゲナーゼとシトクロムｂとが連結された、シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質並びにこれを用いたグルコース測定方法、測定試薬キット及びセンサー。  本発明のシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質は、電子移動特性が改変されており、より低濃度の遊離型メディエーター存在下で、または遊離型メディエーター不在下で、グルコース測定を行うことができ、例えば連続グルコース測定に用いることができる。
2017094776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)天然においてシトクロムドメインを有しないグルコースデヒドロゲナーゼに由来するグルコースデヒドロゲナーゼ部分と、(ii)シトクロムｂ部分とを融合させた、電子移動特性が改変され、酵素から電極への直接電子移動が可能な、シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質。
【請求項２】
前記シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が単独でグルコースデヒドロゲナーゼとして存在した場合の遊離型メディエーター不在下及び300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧の下での応答電流A1300と比較して、シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼの遊離型メディエーター不在下及び同じ印加電圧の下での応答電流A2300が1.5倍以上増大している、すなわちA2300／A1300が1.5以上であるか、または
前記シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が単独でグルコースデヒドロゲナーゼとして存在した場合の遊離型メディエーター不在下及び500mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧の下での応答電流A1500と比較して、シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼの遊離型メディエーター不在下及び同じ印加電圧の下での応答電流A2500が1.5倍以上増大している、すなわちA2500／A1500が1.5以上であり、
ここで、前記応答電流A1300、A2300、A1500、又はA2500は、試料添加後であって電圧印加による測定開始から４０秒後における応答電流であり、前記応答電流はシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼタンパク質８０μｇを用いた場合における応答電流であり、遊離型メディエーター不在下及びグルコース存在下でのシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼ溶液を用いた際の応答電流値から遊離型メディエーター不在下及びグルコース不在下でのシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼ溶液を用いた際の応答電流値を減算した値である、請求項１に記載のシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質。
【請求項３】
(i)  シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分の全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４のアミノ酸配列と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１の32〜34位、58〜62位、106〜109位、111〜116位、119〜126位、132〜134位、136〜144位、150〜153位、167〜171位、222〜225位、253〜262位、277〜281位、301〜303位、305〜312位、314〜319位、324〜326位、332〜337位、339〜346位、388〜390位、415〜417位、454〜459位、486〜491位、508〜511位、564〜567位、570〜574位、584〜586位、592〜594位、597〜599位、601〜604位、607〜609位、611〜617位、及び625〜630位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該グルコースデヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項１または２に記載の融合タンパク質、
(ii)  シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムｂ部分の全長アミノ酸配列が配列番号１２のアミノ酸配列と50%以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１２の35-36位、52-53位、59-61位、64-69位、73-76位、99-100位、119-120位、133-134位、143-144位、148-150位、152-154位、167-168位、174-176位、188-189位、および216-217位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該シトクロムｂの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１または２に記載の融合タンパク質、
(iii)  シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムｂ部分の全長アミノ酸配列が配列番号１４のアミノ酸配列と５０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１４の1-2位、8-10位、12-14位、23-24位、30-31位、35-37位、41-42位、50-57位、59-61位、64-74位、82-83位、85-86位、88-91位、93-97位、99-104位、110-123位、125-128位、130-134位、149-150位、152-156位、166-168位、172-175位、187-190位、194-197位、199-200位、及び202-205位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該シトクロムｂの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１または２に記載の融合タンパク質、
(iv)  シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムｂ部分の全長アミノ酸配列が配列番号１６のアミノ酸配列と45%以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１２の35-36位、52-53位、59-61位、64-69位、73-76位、99-100位、119-120位、133-134位、143-144位、148-150位、152-154位、167-168位、174-176位、188-189位、および216-217位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該シトクロムｂの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１または２に記載の融合タンパク質、
(v)  上記の(ii)、(iii)または(iv)に記載の該シトクロムｂ部分について、配列番号１２のアミノ酸配列における第９５位に対応する位置のアミノ酸がメチオニンであり、第１９７位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、配列番号１２のアミノ酸配列における９３−９５位に対応する位置の配列がGly-Xaa-Met（Xaaは任意のアミノ酸）であり、配列番号１２のアミノ酸配列における１２０−１２３位に対応する位置の配列がTyr-Xaa-Xaa-Pro（Xaaは任意のアミノ酸）であり、配列番号１２のアミノ酸配列における１５０−１５３位に対応する位置の配列がCys-Xaa-Xaa-Cys（Xaaは任意のアミノ酸）である、請求項１または２に記載の融合タンパク質、あるいは
(vi)  シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が上記の(i)に記載したものであり、かつ、シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムｂ部分が上記の(ii)、(iii)、(iv)または（v）に記載したものである、請求項１または２に記載の融合タンパク質、あるいは
(vii)  前記(vi)の融合タンパク質について、前記(v)に規定された位置以外の位置において、グルコースデヒドロゲナーゼ部分及び／又はシトクロムｂ部分の１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分とシトクロムｂ部分とがリンカーにより連結されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が、ムコール（Mucor）属、アブシジア（Absidia）属、アクチノムコール（Actinomucor）属、カラクサケカビ（Circinella）属、ムコール・プライニ（Mucor prainii）、ムコール・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、ムコール・ヒエマリス（Mucor hiemalis）、ムコール・サブチリスマス（Mucor subtilissimus）、ムコール・ギリエルモンディ（Mucor guilliermondii）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）、ムコール・ダイモルフォスポラス（Mucor dimorphosporus）、アブシジア・シリンドロスポラ（Absidia cylindrospora）、アブシジア・ヒアロスポラ（Absidia hyalospora）、アクチノムコール・エレガンス（Actinomucor elegans）、シルシネラ・シンプレックス（Circinella simplex）、シルシネラ属種（Circinella sp.）、シルシネラ・アンガレンシス（Circinella angarensis）、シルシネラ・シネンシス（Circinella chinensis）、シルシネラ・ラクリミスポラ（Circinella lacrymispora）、シルシネラ・マイナー（Circinella minor）、シルシネラ・ムコロイデス（Circinella mucoroides）、シルシネラ・リジダ（Circinella rigida）、シルシネラ・アンベラータ（Circinella umbellata）又はシルシネラ・ムスカエ（Circinella muscae）由来である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記融合タンパク質中のシトクロムｂ部分が、Myriococcum属由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ（CDH）が有するCytbドメイン、Myriococcum thermophilum由来のCDHが有するCytbドメイン、Corynascud属由来のCDHが有するCytbドメイン、Corynascud thermophiles由来のCDHが有するCytbドメイン、Apergillus属由来のCDHが有するCytbドメイン、Apergillus sojae由来のCDHが有するCytbドメイン又はAspergillus oryzae由来のCDHが有するCytbドメイン、Hypoxylon属由来のCDHが有するCytbドメイン、Hypoxylon haematostroma由来のCDHが有するCytbドメイン、Chaetomium属由来のCDHが有するCytbドメイン、Chaetomium attrobruneum由来のCDHが有するCytbドメイン、Neurospora属由来のCDHが有するCytbドメイン、Neurospora crassa由来のCDHが有するCytbドメイン、Humicola属由来のCDHが有するCytbドメイン、Humicola insolens由来のCDHが有するCytbドメイン、Thielavia属由来のCDHが有するCytbドメイン、又はThielavia terrestris由来のCDHが有するCytbドメインに由来するものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が、以下の特性、
作用：グルコース脱水素酵素活性を示す、
分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の一次配列に基づく推定分子量が約70kDaであるか又はSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で測定したときの分子量が約80kDaである、
基質特異性：Ｄ−グルコースに対する反応性と比較して、マルトース及びＤ−キシロースに対する反応性が低い、
補因子特性：フラビン結合型である、
を備える、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
(a) 請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするDNA、
(b) 配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、１１４、１１６または１１８に示すアミノ酸配列をコードするDNA、
(c) 配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、１１５、１１７または１１９に示す塩基配列を有するDNA、或いは
(d) 配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、１１５、１１７または１１９に示す塩基配列と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、遊離型メディエーターの不在下で直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する融合タンパク質をコードするDNA、
からなる電子移動特性が改変されたシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項９】
請求項８に記載の遺伝子を含む、ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１１】
以下の工程：
請求項１０に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を回収する工程
を含む、シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を製造する方法。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれかに記載のシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を用いることを特徴とする、グルコース測定方法。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を含む、グルコース測定キット。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を含む、グルコースセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法に関する。より詳細には、本発明はシトクロム融合型のグルコースデヒドロゲナーゼ及びこれを用いたグルコース測定法に関する。また本発明は、糖尿病の診断用酵素として、グルコースセンサーとして、また、グルコース測定キットに有利に利用され得るシトクロム融合型グルコースデヒドロゲナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコース測定は、糖尿病患者の血糖値モニタリングなどに用いられる。グルコースの定量には通常、グルコースオキシダーゼ（以下、GODともいう）やグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、GDHともいう）が用いられる。これらは家庭で使用できる血中グルコースの自己測定（SMBG）装置や、体内に埋め込み型の連続グルコース測定（以下、CGMともいう）装置、読み取り部をセンサーにかざした瞬間の血中グルコース濃度を測定可能な装置(以下、FGM装置ともいう)に用いられている。【０００３】
グルコースオキシダーゼはβ-D-グルコースをD-グルコノ-1,5-ラクトン(グルコノラクトン)へ酸化する反応を触媒する酸化還元酵素である。グルコースオキシダーゼは酸素を電子受容体とし、また補因子としてフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）を用いる。【０００４】
グルコースデヒドロゲナーゼは酸化還元酵素に分類され、グルコース及び電子アクセプターを基質とし、グルコノラクトン及び還元型アクセプターを生成する反応を触媒する。グルコースデヒドロゲナーゼとしてはニコチンアミドジヌクレオチド依存性GDH、ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸依存性GDH、ピロロキノリンキノン（PQQ）依存性GDH、FAD依存性GDH(フラビン結合型GDH)等が挙げられる。【０００５】
グルコース測定にGODを用いる際、過酸化水素電極を使用することができる。この方法では、過酸化水素電極に+0.6V(vs. Ag/AgCl)〜+0.9V(vs. Ag/AgCl)の電圧を印加して、グルコースからグルコノラクトンが生じる際に生成する過酸化水素を測定する。この方法は主としてSMBGやCGMに用いられている。しかしながらこの方法は比較的高い電圧を印加するため、測定溶液に含まれるアスコルビン酸などの夾雑物質の影響を受けるという問題があった。【０００６】
そこで過酸化水素に代えて人工電子メディエーター（以下、単にメディエーターともいうことがある）を用いる方法が開発された。この方法では、酵素的にグルコースがグルコノラクトンへと変換される際に、酸化型メディエーターが還元型となる。そして還元型メディエーターが電極に電子を受け渡し、酸化型に戻る。メディエーターを用いる方法の利点として印加電圧を過酸化水素電極の場合と比較して低くすることができる。フェリシアン化カリウム等の金属錯体のような人工電子メディエーターはヒトの体内に入ると有害の恐れがある。【０００７】
GODやGDHは、補因子FADが酵素分子の内部に埋没していることが多いため、これらをグルコース測定に用いる場合には通常、メディエーターが存在しないと電極へと電子を受け渡すことができない。ところがメディエーターは電極表面に固定化するのが困難である。例えば糖尿病患者のグルコース測定において、メディエーターを電極に固定化せずに体内埋め込み型の連続グルコース測定用（CGM）機器やFGM機器に用いようとすると測定溶液中に存在する人工電子メディエーターが体内へ流入する可能性があるが、生体適合性を有しない又は毒性のメディエーターが体内へ流入することは望ましくない。そのため、毒性であり得る人工電子メディエーターを用いるグルコース測定法は体内埋め込み型の連続グルコース測定用（CGM）やFGMの機器には向いていない。またGODとGDHとを比較すると、GODは系に存在する溶存酸素の影響を受ける可能性があるため、GODよりはGDHが望まれている。そこで低い印加電位でも測定可能な化合物に用いることのできるGDHが望まれている。またGDH酵素とは別の分子として遊離型メディエーターを必要とすることなく、電極へと電子を直接受け渡すことができるGDHが望まれている。【０００８】
非特許文献１では、メディエーターを電極に固定化するアプローチとは別に、メディエーターをGODに修飾する手法も報告されている。しかしながら化学修飾による酵素活性の低下や、人工電子メディエーターの体内への流入の可能性がないとは言えない点から、実用化には至っていない。【０００９】
一方でメディエーターとしてフェリシアン化カリウムのような金属錯体ではなく、タンパク質性のメディエーターを用いるアプローチがある。例えば特許文献１はシトクロムを用いた酵素電極を記載している。しかしながら、シトクロムを別途調製する必要があり、酵素よりシトクロムを多量に混合させる必要がある。【００１０】
また、例えば特許文献２において、アスペルギルス属由来シトクロムをGDHに融合させた融合酵素が記載されている。しかしながら、該融合酵素は遊離型のシトクロムcに電子を受け渡すことは示されているが、該融合酵素から電極へ直接電子移動可能かは記載されていない。【００１１】
特許文献３はバークホルデリア  セパシア（Burkholderia cepacia）由来のGDHを記載している。記載されているGDHはαサブユニットとβサブユニットとからなる複合体タンパク質であり、αサブユニットにはFADとFeSクラスターが含有されている。βサブユニットはシトクロムcであり、FADから電極への電子伝達の役割を担う。特許文献４はバークホルデリア  セパシア由来のGDHを用いたグルコース測定及びグルコースセンサーを記載している。また電子伝達に与るβサブユニットが存在しない場合、GDHから電極への直接電子移動活性が著しく低下することが記載されている。【００１２】
既知の直接電子移動型GDHは、グルコース以外の糖にも作用する可能性があり、グルコースセンサーに用いるには基質特異性が必ずしも十分とはいえなかった。また既知の直接電子移動型GDHは、メディエーターに類似する役割を果たす電子伝達ドメインを必要とし、それ故酵素の分子量が大きく酵素の安定性や生産性等の問題があった。さらに、該酵素はバークホルデリア  セパシア由来の膜結合性酵素のため、該酵素のサブユニット又は該酵素を得るためには、可溶化の処理等、煩雑な処理が必要とされる。その上、可溶化処理をした物は不安定であり、乾燥させる等の取扱いを行うと該酵素又はそのサブユニット構造を維持することは難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第2002/073181号
【特許文献２】国際公開第2010/126139号
【特許文献３】特許第4107386号明細書（国際公開第2002/036779号）
【特許文献４】特許第4359595号明細書（国際公開第2005/023111号）
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】The Journal of Physical Chemistry, 91(6), 1285-9 , 1987
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記の問題を解消しうる、電子移動特性が改変されたグルコースデヒドロゲナーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記の課題を解決するために鋭意努力した結果、電極表面にメディエーターを固定化するのではなく、グルコースデヒドロゲナーゼにシトクロムｂを連結した融合タンパク質を作製し、電子移動特性が改変されたグルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を取得し、本発明を完成させた。【００１７】
すなわち本発明は以下の実施形態を包含する。
[１]  (i)天然においてシトクロムドメインを有しないグルコースデヒドロゲナーゼに由来するグルコースデヒドロゲナーゼ部分と、(ii)シトクロムｂ部分とを融合させた、電子移動特性が改変され、酵素から電極への直接電子移動が可能な、シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質。   
[２]  前記シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が単独でグルコースデヒドロゲナーゼとして存在した場合の遊離型メディエーター不在下及び300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧の下での応答電流A1300と比較して、シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼの遊離型メディエーター不在下及び同じ印加電圧の下での応答電流A2300が1.5倍以上増大している、すなわちA2300／A1300が1.5以上であるか、または
前記シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が単独でグルコースデヒドロゲナーゼとして存在した場合の遊離型メディエーター不在下及び500mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧の下での応答電流A1500と比較して、シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼの遊離型メディエーター不在下及び同じ印加電圧の下での応答電流A2500が1.5倍以上増大している、すなわちA2500／A1500が1.5以上であり、
ここで、前記応答電流A1300、A2300、A1500、又はA2500は、試料添加後であって電圧印加による測定開始から４０秒後における応答電流であり、前記応答電流はシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼタンパク質８０μｇを用いた場合における応答電流であり、遊離型メディエーター不在下及びグルコース存在下でのシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼ溶液を用いた際の応答電流値から遊離型メディエーター不在下及びグルコース不在下でのシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼ溶液を用いた際の応答電流値を減算した値である、[１]に記載のシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質。   
[３]  (i)  シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分の全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４のアミノ酸配列と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１の32〜34位、58〜62位、106〜109位、111〜116位、119〜126位、132〜134位、136〜144位、150〜153位、167〜171位、222〜225位、253〜262位、277〜281位、301〜303位、305〜312位、314〜319位、324〜326位、332〜337位、339〜346位、388〜390位、415〜417位、454〜459位、486〜491位、508〜511位、564〜567位、570〜574位、584〜586位、592〜594位、597〜599位、601〜604位、607〜609位、611〜617位、及び625〜630位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該グルコースデヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、[１]または[２]に記載の融合タンパク質、
(ii)  シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムｂ部分の全長アミノ酸配列が配列番号１２のアミノ酸配列と50%以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１２の35-36位、52-53位、59-61位、64-69位、73-76位、99-100位、119-120位、133-134位、143-144位、148-150位、152-154位、167-168位、174-176位、188-189位、および216-217位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該シトクロムｂの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有する、[１]または[２]に記載の融合タンパク質、
(iii)  シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムｂ部分の全長アミノ酸配列が配列番号１４のアミノ酸配列と５０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１４の1-2位、8-10位、12-14位、23-24位、30-31位、35-37位、41-42位、50-57位、59-61位、64-74位、82-83位、85-86位、88-91位、93-97位、99-104位、110-123位、125-128位、130-134位、149-150位、152-156位、166-168位、172-175位、187-190位、194-197位、199-200位、及び202-205位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該シトクロムｂの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する、[１]または[２]に記載の融合タンパク質、
(iv)  シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムｂ部分の全長アミノ酸配列が配列番号１６のアミノ酸配列と45%以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１２の35-36位、52-53位、59-61位、64-69位、73-76位、99-100位、119-120位、133-134位、143-144位、148-150位、152-154位、167-168位、174-176位、188-189位、および216-217位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該シトクロムｂの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有する、[１]または[２]に記載の融合タンパク質、
(v)  上記の(ii)、(iii)または(iv)に記載の該シトクロムｂ部分について、配列番号１２のアミノ酸配列における第９５位に対応する位置のアミノ酸がメチオニンであり、第１９７位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、配列番号１２のアミノ酸配列における９３−９５位に対応する位置の配列がGly-Xaa-Met（Xaaは任意のアミノ酸）であり、配列番号１２のアミノ酸配列における１２０−１２３位に対応する位置の配列がTyr-Xaa-Xaa-Pro（Xaaは任意のアミノ酸）であり、配列番号１２のアミノ酸配列における１５０−１５３位に対応する位置の配列がCys-Xaa-Xaa-Cys（Xaaは任意のアミノ酸）である、[１]または[２]に記載の融合タンパク質、あるいは
(vi)  シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が上記の(i)に記載したものであり、かつ、シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質中のシトクロムｂ部分が上記の(ii)、(iii)、(iv)または（v）に記載したものである、[１]または[２]に記載の融合タンパク質、あるいは
(vii)  前記(vi)の融合タンパク質について、前記(v)に規定された位置以外の位置において、グルコースデヒドロゲナーゼ部分及び／又はシトクロムｂ部分の１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、[１]または[２]に記載の融合タンパク質。   
[４]  融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分とシトクロムｂ部分とがリンカーにより連結されている、[１]〜[３]のいずれかに記載の融合タンパク質。   
[５]  前記融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が、ムコール（Mucor）属、アブシジア（Absidia）属、アクチノムコール（Actinomucor）属、カラクサケカビ（Circinella）属、ムコール・プライニ（Mucor prainii）、ムコール・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、ムコール・ヒエマリス（Mucor hiemalis）、ムコール・サブチリスマス（Mucor subtilissimus）、ムコール・ギリエルモンディ（Mucor guilliermondii）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）、ムコール・ダイモルフォスポラス（Mucor dimorphosporus）、アブシジア・シリンドロスポラ（Absidia cylindrospora）、アブシジア・ヒアロスポラ（Absidia hyalospora）、アクチノムコール・エレガンス（Actinomucor elegans）、シルシネラ・シンプレックス（Circinella simplex）、シルシネラ属種（Circinella sp.）、シルシネラ・アンガレンシス（Circinella angarensis）、シルシネラ・シネンシス（Circinella chinensis）、シルシネラ・ラクリミスポラ（Circinella lacrymispora）、シルシネラ・マイナー（Circinella minor）、シルシネラ・ムコロイデス（Circinella mucoroides）、シルシネラ・リジダ（Circinella rigida）、シルシネラ・アンベラータ（Circinella umbellata）又はシルシネラ・ムスカエ（Circinella muscae）由来である、[１]〜[４]のいずれかに記載の融合タンパク質。   
[６]  前記融合タンパク質中のシトクロムｂ部分が、Myriococcum属由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ（CDH）が有するCytbドメイン、Myriococcum thermophilum由来のCDHが有するCytbドメイン、Corynascud属由来のCDHが有するCytbドメイン、Corynascud thermophiles由来のCDHが有するCytbドメイン、Apergillus属由来のCDHが有するCytbドメイン、Apergillus sojae由来のCDHが有するCytbドメイン又はAspergillus oryzae由来のCDHが有するCytbドメイン、Hypoxylon属由来のCDHが有するCytbドメイン、Hypoxylon haematostroma由来のCDHが有するCytbドメイン、Chaetomium属由来のCDHが有するCytbドメイン、Chaetomium attrobruneum由来のCDHが有するCytbドメイン、Neurospora属由来のCDHが有するCytbドメイン、Neurospora crassa由来のCDHが有するCytbドメイン、Humicola属由来のCDHが有するCytbドメイン、Humicola insolens由来のCDHが有するCytbドメイン、Thielavia属由来のCDHが有するCytbドメイン、又はThielavia terrestris由来のCDHが有するCytbドメインに由来するものである、[１]〜[５]のいずれかに記載の融合タンパク質。   
[７]  前記融合タンパク質中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が、以下の特性、
作用：グルコース脱水素酵素活性を示す、
分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の一次配列に基づく推定分子量が約７０ｋＤａであるか又はSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で測定したときの分子量が約８０ｋＤａである、
基質特異性：Ｄ−グルコースに対する反応性と比較して、マルトース及びＤ−キシロースに対する反応性が低い、
補因子特性：フラビン結合型である、
を備える、[１]〜[６]のいずれかに記載の融合タンパク質。   
[８]  (a)[１]〜[７]のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするDNA、
(b) 配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、１１４、１１６または１１８に示すアミノ酸配列をコードするDNA、
(c) 配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、１１５、１１７または１１９に示す塩基配列を有するDNA、或いは
(d) 配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、１１５、１１７または１１９に示す塩基配列と６０％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、遊離型メディエーターの不在下で直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する融合タンパク質をコードするDNA、
からなる電子移動特性が改変されたシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質をコードする遺伝子。   
[９]  [８]に記載の遺伝子を含む、ベクター。   
[１０]  [９]記載のベクターを含む、宿主細胞。   
[１１]  以下の工程：
[１０]に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を回収する工程
を含む、シトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を製造する方法。   
[１２]  [１]〜[７]のいずれかに記載のシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を用いることを特徴とする、グルコース測定方法。   
[１３]  [１]〜[７]のいずれかに記載のシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を含む、グルコース測定キット。   
[１４]  [１]〜[７]のいずれかに記載のシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を含む、グルコースセンサー。【００１８】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-233983号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の効果として、より低濃度の人工電子メディエーター存在下で、又は人工電子メディエーターを用いることなく、グルコース測定が可能となる。人工電子メディエーターは糖尿病患者等に毒性でありうるが、グルコース測定に遊離型メディエーターが不要となることから本発明に係るグルコースデヒドロゲナーゼは、体内埋め込み型の連続グルコース測定に用いることができる。また本発明に係るグルコース測定方法は、高価なメディエーター分子を必要としないかその使用量を軽減できるため、低コストである。また本発明に係るグルコースデヒドロゲナーゼは、従来のものよりも使用できる電子受容化合物の種類が広がり、より多くの選択肢を提供することができる。また本発明に係るグルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースオキシダーゼと比較して溶存酸素の影響を受けにくいため、より正確にグルコース測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】各種由来のGDHのマルチプルアライメントを示す。MpGDHはMucor prainii由来GDH（配列番号１）であり、MhGDHはMucor hiemalis由来GDH（配列番号３）であり、MdrGDHはMucor DR056860由来GDH（配列番号４）であり、MsGDHはMucor subtilissimus由来GDH（配列番号５）であり、MgGDHはMucor guilliermondii由来GDH（配列番号６）であり、CsGDHはCircinella simplex由来GDH（配列番号７）であり、CrGDHはCircinella属由来GDH（配列番号８）であり、McGDHはMucor circinelloides由来GDH（配列番号９）である。
【図１−２】図１−１のつづきである。
【図１−３】図１−１のつづきである。
【図１−４】図１−１のつづきである。
【図２】各種由来のCytbのマルチプルアライメントを示す。MtCytbはMyriococcum thermophilum由来のCDH中のcytbドメインのアミノ酸配列（配列番号１２）であり、AsCytbはApergillus sojae由来のCDH中のcytbドメインのアミノ酸配列（配列番号１６）であり、HhCytbはHypoxylon haematostroma由来のCDH中のcytbドメインのアミノ酸配列（配列番号１８）であり、CaCytbはChaetomium attrobruneum由来のCDH中のcytbドメインのアミノ酸配列（配列番号１９）であり、NcCytbはNeurospora crassa由来のCDH中のcytbドメインのアミノ酸配列（配列番号２０）である。
【図３】各種由来のCytbのマルチプルアライメントを示す。CtCytbはCorynascud thermophiles由来のCDH中のcytbドメインのアミノ酸配列（配列番号１４）であり、HiCytbはHumicola insolens由来のCDH中のcytbドメインのアミノ酸配列（配列番号２１）であり、TtCytbはThielavia terrestris由来のCDH中のcytbドメインのアミノ酸配列（配列番号２２）である。
【図４】GDHのクロノアンペロメトリーの測定結果である。500mVはグルコースを含まない場合の結果であり（コントロール）、500mV+Gluはグルコースを添加し+500mVを印加した場合の結果である（以下、グルコースをGluと記載することがある）。
【図５】MtCytb-MpGDH-M1のクロノアンペロメトリーの測定結果である。
【図６】CtCytb-MpGDH-M1のクロノアンペロメトリーの測定結果である。
【図７】AsCytb-L1-MpGDH-M1のクロノアンペロメトリーの測定結果である。
【図８】AsCytbx2-MpGDH-M1のクロノアンペロメトリーの測定結果である。
【図９】AsCytb-L2-MpGDH-M1のクロノアンペロメトリーの測定結果である。
【図１０】MpGDH-M1-CtCytbのクロノアンペロメトリー測定結果である。
【図１１】MtCytb-MpGDH-M1を用いた場合の、電流密度とグルコース濃度の関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（本発明に係るシトクロムb−グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質）
第一の実施形態において本発明はシトクロムb−グルコースデヒドロゲナーゼ融合タンパク質を提供する。この融合タンパク質を本明細書においてCytb-GDHと記載することがある。該融合タンパク質は、グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ末端（以下、N末端と記載することがある）側にシトクロムbが連結されていてもよく、またはグルコースデヒドロゲナーゼのカルボキシ末端（以下、C末端と記載することがある）側にシトクロムbが連結されていてもよい。特に断らない限り、Cytb-GDHとの記載は、この両者を包含するものとする。なお、GDH-Cytbとの記載は、特に断らない限り、グルコースデヒドロゲナーゼのC末端側にCytbが連結されている融合タンパク質を表し、グルコースデヒドロゲナーゼのN末端側にCytbが連結されている融合タンパク質は包含しないものとする。グルコースデヒドロゲナーゼには、一または複数のCytbが連結されていてもよい。便宜上、前記のCytb-GDHとの記載は、複数のCytbが連結された融合タンパク質も包含するものとする。なお、Cytbx2-GDHとの記載は、特に断らない限り、グルコースデヒドロゲナーゼにCytbが２連結されている融合タンパク質を表わす。融合タンパク質中のCytb部分とグルコースデヒドロゲナーゼ部分とは、リンカーにより連結されていてもよい。またCytbが複数連結されている場合には、Cytb同士が場合によりリンカーを介して互いに連結されていてもよい。こうした態様もCytb-GDHとの記載に包含されるものとする。
【００２２】
本発明に係るCytb-GDHは、電子移動特性が改変されている。電子移動特性が改変されている、とは、Cytb-GDH中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が単独でグルコースデヒドロゲナーゼとして存在した場合のある印加電圧の下及びグルコース存在下での応答電流と比較して、Cytb-GDHの同じ印加電圧及び同じグルコース濃度の下での応答電流が増大していることをいう。ある実施形態において、本発明に係るCytb-GDHは、当該Cytb-GDH中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が単独でグルコースデヒドロゲナーゼとして存在した場合の遊離型メディエーター不在下及び300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧の下での応答電流A1300と比較して、Cytb-GDHの遊離型メディエーター不在下及び同じ印加電圧の下での応答電流A2300が1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍又は10倍以上（A2300／A1300≧１０)、増大している。なお、特に断らない限り、印加する電圧の参照電極は銀塩化銀電極を用いる。ある実施形態において、本発明に係るCytb-GDHは、当該Cytb-GDH中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分が単独でグルコースデヒドロゲナーゼとして存在した場合の遊離型メディエーター不在下及び500mVの印加電圧の下での応答電流A1500と比較して、Cytb-GDHの遊離型メディエーター不在下及び同じ印加電圧の下での応答電流A2500が1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍又は10倍以上（A2500／A1500≧１０)、増大している。ここで、前記応答電流（A1300、A2300、A1500、A2500等）は、（グルコース含有又はブランク）試料添加後であって電圧印加による測定開始から４０秒後における応答電流であり、前記応答電流はシトクロムｂ―グルコースデヒドロゲナーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼタンパク質８０μｇを用いた場合における応答電流であり、遊離型メディエーター不在下及びグルコース存在下でのCytb-GDH又はグルコースデヒドロゲナーゼ溶液を用いた際の応答電流値（+Glu）から遊離型メディエーター不在下及びグルコース不在下でのCytb-GDH又はグルコースデヒドロゲナーゼ溶液を用いた際の応答電流値（blank）を減算した値である。また、タンパク質１３０μｇを用いて同様の測定を行った場合、グルコースを酸化する速度が単純に増すことに伴い、応答電流が高まる可能性が高い。つまりは、タンパク質８０μｇを用いて得られた前記応答電流（A1300、A2300、A1500、A2500等）と比較して、タンパク質１３０μｇを用いて得られる応答電流は高くなる蓋然性が高い。
【００２３】
本明細書において遊離型メディエーターとは、GDHに連結されていないメディエーターをいい、例えば遊離型のシトクロム（例えば遊離型のCytb）、すなわちGDHに融合されていないシトクロムや、遊離型の低分子化合物、すなわちGDHに融合されていない低分子化合物が挙げられる。
【００２４】
ある実施形態において、本発明に係るCytb-GDHは、電子移動特性が改変されているのみならず、フェリシアン化カリウムのような遊離型メディエーターが存在しない場合にも電子を融合タンパク質から直接固相電極へと受け渡し得る。このようなCytb-GDHを本明細書において、直接電子移動型Cytb-GDHということがある。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、直接電子移動が生じるときに、電子は主に、GDH部分に含まれるFADのような補因子からCytb部分へと受け渡され、さらにCytb部分から固相電極へと受け渡されると考えられる。しかしながら本発明は特定の機序に限定されず、フェリシアン化カリウムのような遊離型メディエーターが存在しない場合にも融合タンパク質から固相電極へ電流が観測されれば、それは本発明にいう直接電子移動型Cytb-GDHに該当する。このような化学種と固相電極との間の電子移動を異種電子移動（heterogeneous electron transfer）という。電子移動は電子の移動が起こる素反応の一種であり、内圏型（inner sphere）、外圏型（outer sphere）、異種電子移動があるが、本発明における直接電子移動は、酵素から固相電極へと電子が移動すれば、その種類は問わない。ある実施形態における本発明のCytb-GDHによる電子移動は、異種電子移動である。
【００２５】
（GDH部分）
ある実施形態において、本発明のCytb-GDH中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分は、配列番号１、配列番号４または配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するMucor属由来のグルコースデヒドロゲナーゼに基づき作製された、グルコースデヒドロゲナーゼの変異体である。このような変異体の例としては、配列番号１、配列番号４または配列番号１０と高い配列同一性（例えば、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上）を有するアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼおよび配列番号１、配列番号４または配列番号１０のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼを挙げることができる。
【００２６】
グルコースデヒドロゲナーゼは天然に広く存在し、微生物や動植物起源の酵素を探索することにより得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは例えば、ケカビ亜門、ケカビ綱、ケカビ目、ケカビ科に分類される微生物、例えばムコール（Mucor）属、アブシジア（Absidia）属、アクチノムコール（Actinomucor）属、カラクサケカビ（Circinella）属などの生物種に由来するGDHに基づき作製されたものでもよい。
【００２７】
ムコール（Mucor）属の微生物としては、ムコール・プライニ（Mucor prainii）、ムコール・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）、ムコール・ヒエマリス（Mucor hiemalis）、ムコール・サブチリスマス（Mucor subtilissimus）、ムコール・ギリエルモンディ（Mucor guilliermondii）、ムコール・ジャバニカス（Mucor javanicus）、ムコール・ダイモルフォスポラス（Mucor dimorphosporus）が挙げられる。Absidia属の微生物としては、アブシジア・シリンドロスポラ（Absidia cylindrospora）、アブシジア・ヒアロスポラ（Absidia hyalospora）を挙げることができる。Actinomucor属微生物としては、アクチノムコール・エレガンス（Actinomucor elegans）を挙げることができる。カラクサケカビ（Circinella）属の微生物としては、シルシネラ・シンプレックス（Circinella simplex）、シルシネラ属種（Circinella sp.）、シルシネラ・アンガレンシス（Circinella angarensis）、シルシネラ・シネンシス（Circinella chinensis）、シルシネラ・ラクリミスポラ（Circinella lacrymispora）、シルシネラ・マイナー（Circinella minor）、シルシネラ・ムコロイデス（Circinella mucoroides）、シルシネラ・リジダ（Circinella rigida）、シルシネラ・アンベラータ（Circinella umbellata）及びシルシネラ・ムスカエ（Circinella muscae）を挙げることができる。
【００２８】
本発明のCytb-GDH中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分は、天然においてCytドメインを有しない種類のGDHに由来する。したがって天然においてCytドメインを有する種類のGDHに由来するGDH部分は、本発明のCytb-GDH中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分から除かれ、例えば特許文献３に記載のBurkholderia cepacia由来GDHは除かれる。また、本発明のCytb-GDH中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分は天然において水溶性のGDHであり、膜結合性ＧＤＨは除かれる。
【００２９】
ある実施形態において本発明のCytb-GDH中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分は、一次アミノ酸配列のN末端側にてCytbと連結されている。またある実施形態において本発明のCytb-GDH中のグルコースデヒドロゲナーゼ部分は、一次アミノ酸配列のC末端側にてCytbと連結されている。さらに、本発明の融合タンパク質のグルコースデヒドロゲナーゼ部分は、１または数個（例えば１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、例えば１〜３個）のアミノ酸が欠失、挿入、付加および／または置換されていてもよい。さらに本発明の融合タンパク質のグルコースデヒドロゲナーゼ部分は、基質特異性や熱安定性等の性質を向上するアミノ酸の置換変異を有してもよく、配列番号１、配列番号４、又は配列番号１０に示すアミノ酸配列に対して、例えば70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上のアミノ酸配列同一性を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。このようなグルコースデヒドロゲナーゼ部分を有する、電子移動特性が改変されたCytb-GDHは、直接電子移動型Cytb-GDHを包含する。
【００３０】
（相同性領域について）
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、GENETYX Ver.11（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはDNASIS Pro（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のGDHをアライメントしたときに、該２以上のGDHにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。また２以上のCytbをアライメントしたときに、該２以上のCytbにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
【００３１】
２以上のGDHにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。また、２以上のCytbにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
【００３２】
相同性領域を決定するにあたり、CLUSTALWのマルチプルアライメントのパラメータを適宜設定することができる。例えばCytbは、ヘム鉄に結合するアミノ酸残基としてメチオニン及びヒスチジンを有することが知られており、配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するCytbについては９５位のメチオニンと１９７位のヒスチジンがこれに該当すると考えられる。そこで配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するCytbを他の由来のCytbとアライメントさせた場合に、これらの位置に対応するアミノ酸が保存されない場合は、保存されるようCLUSTALWのマルチプルアライメントのパラメータ、例えばギャップペナルティを設定することができる。例えばギャップ開き(Gap open)のペナルティを１と設定することができる。またギャップ伸長(Gap extend)のペナルティを１と設定することができる。
【００３３】
本明細書においてGDHの「相同性領域」とは、２以上のGDHをアライメントしたときに、ある基準となるGDHと比較対象のGDHの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が７０％以上であるGDHをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるMucor属GDHを基準として第31位〜41位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるMucor属GDHを基準として58〜62位、71〜85位、106〜116位、119〜127位、132〜134位、136〜144位、150〜157位、167〜171位、219〜225位、253〜262位、277〜281位、301〜303位、305〜312位、314〜319位、324〜326位、332〜337位、339〜346位、348〜354位、388〜394位、415〜417位、454〜459位、477〜484位、486〜491位、508〜511位、564〜579位、584〜586位、592〜605位、607〜617位、及び625〜630位は相同性領域に該当しうる。ある実施形態においてGDHの相同性領域は、これらの領域からなる。
【００３４】
ある実施形態において、GDHの相同性領域は、配列番号１で示されるMucor属GDHを基準として、32〜38位、58〜62位、76〜82位、106〜109位、111〜１１６位、119〜126位、132〜134位、136〜144位、150〜153位、167〜171位、222〜225位、253〜262位、277〜281位、301〜303位、305〜312位、314〜319位、324〜326位、332〜337位、339〜346位、348〜354位、388〜390位、415〜417位、454〜459位、477〜482位、486〜491位、508〜511位、564〜567位、570〜579位、584〜586位、592〜595位、597〜599位、601〜604位、607〜609位、611〜617位、及び625〜630位のアミノ酸配列からなる領域である。
【００３５】
ある実施形態において、GDHの相同性領域は、配列番号１で示されるMucor属GDHを基準として、32〜34位、58〜62位、106〜109位、111〜116位、119〜126位、132〜134位、136〜144位、150〜153位、167〜171位、222〜225位、253〜262位、277〜281位、301〜303位、305〜312位、314〜319位、324〜326位、332〜337位、339〜346位、388〜390位、415〜417位、454〜459位、486〜491位、508〜511位、564〜567位、570〜574位、584〜586位、592〜594位、597〜599位、601〜604位、607〜609位、611〜617位、及び625〜630位のアミノ酸配列からなる領域である。
【００３６】
本発明に係る融合タンパク質中のGDH部分は、配列番号１、配列番号４、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するGDHとアライメントしたときに例えば50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。さらに、本発明の融合タンパク質中の変異GDHの相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号４、又は配列番号１０における相同性領域のアミノ酸配列と例えば80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の配列同一性を有する。
【００３７】
（さらなる置換）
（GDHの熱安定性を向上させるアミノ酸置換について）
本発明者らは、GDHのアミノ酸残基を置換することによりその熱安定性を向上させることができることを以前に報告した（例えば国際公開2012/169512号を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。本発明の融合タンパク質中のGDH部分は、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
【００３８】
GDHの基質特異性を変化させる又は熱安定性を向上させるアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置に対応する位置へのアミノ酸の置換が挙げられる。 
（ａ）２３２位
（ｂ）３８７位
（ｃ）５４５位
場合により（ａ）２３２位に対応する位置のアミノ酸は、アラニン、メチオニン、システイン、グルタミン又はグルタミン酸へと置換されてもよい。 
場合により（ｂ）３８７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸はアラニン、バリン、グリシン、セリン又はシステインへと置換されてもよい。 
場合により（ｃ）５４５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はバリン、トレオニン、セリン、プロリン、アラニン、チロシン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン又はグルタミン酸へと置換されてもよい。
【００３９】
例えば同様のアミノ酸置換を配列番号４のアミノ酸配列における対応する位置に導入してもよい。すなわち、配列番号４の（ａ）２２８位、（ｂ）３８４位、及び／又は（ｃ）５４１位は上記置換を有しうる。
【００４０】
また、GDHのアミノ酸残基を置換することによりその熱安定性が向上することができることを以前に報告した（例えば国際公開2015/099112号を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。本発明の融合タンパク質中のGDH部分は、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
【００４１】
GDHの熱安定性を向上させるアミノ酸置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置に対応する位置へのアミノ酸の置換が挙げられる。 
（ｄ）６６位
（ｅ）６８位
（ｆ）８８位
（ｇ）１５８位
（ｈ）２３３位
（ｉ）３８５位
（ｊ）３９１位
（ｋ）５５７位
（ｌ）５５９位
場合により（ｄ）６６位に対応する位置のアミノ酸は、チロシンへと置換されてもよい。場合により（ｅ）６８位に対応する位置のアミノ酸は、グリシンへと置換されてもよい。場合により（ｆ）８８位に対応する位置のアミノ酸は、アラニンへと置換されてもよい。場合により（ｇ）１５８位に対応する位置のアミノ酸は、ヒスチジンへと置換されてもよい。 
場合により（ｈ）２３３位に対応する位置のアミノ酸は、アルギニンへと置換されてもよい。 
場合により（ｉ）３８５位に対応する位置のアミノ酸は、トレオニンへと置換されてもよい。 
場合により（ｊ）３９１位に対応する位置のアミノ酸は、イソロイシンへと置換されてもよい。 
場合により（ｋ）５５７位に対応する位置のアミノ酸は、バリンへと置換されてもよい。場合により（ｌ）５５９位に対応する位置のアミノ酸は、リシンへと置換されてもよい。
【００４２】
例えば同様のアミノ酸置換を配列番号４のアミノ酸配列における対応する位置に導入してもよい。すなわち、配列番号４の（ｄ）６２位、（ｅ）６４位、（ｆ）８４位、（ｇ）１５４位、（ｈ）２２９位、（ｉ）３８２位、（ｊ）３８８位、（ｋ）５５３位及び／又は（ｌ）５５５位は上記置換を有しうる。
【００４３】
（GDHの比活性を向上させるアミノ酸置換について）
本発明者らは、GDHのアミノ酸残基を置換することによりその熱安定性を向上させることができることを以前に報告した（例えば特願2014-037737を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。本発明の融合タンパク質中のGDH部分は、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
【００４４】
GDHの基質特異性を変化させる又は熱安定性を向上させるアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置に対応する位置へのアミノ酸の置換が挙げられる。 
（ｍ）８８位
（ｎ）５５４位
場合により（ｍ）８８位に対応する位置のアミノ酸は、アラニンへと置換されてもよい。場合により（ｎ）５５４位に対応する位置のアミノ酸は、アスパラギン酸へと置換されてもよい。
【００４５】
例えば同様のアミノ酸置換を配列番号４のアミノ酸配列における対応する位置に導入してもよい。すなわち、配列番号４の（ｍ）８４位、及び／又は（ｎ）５５０位は上記置換を有しうる。
【００４６】
本発明の融合タンパク質中のGDH部分の酵素化学的特徴
ある実施形態において本発明のCytb-GDH中のGDH部分はフラビン結合型GDHである。GDH部分がフラビン結合型GDHである場合において、本発明の融合タンパク質中のGDH部分は以下の性質を有するものでありうる。
作用：グルコース脱水素酵素活性を示す、
分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の一次配列に基づく推定分子量が約70kDaであるか又はSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で測定したときの分子量が約80kDaである、
基質特異性：Ｄ−グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、及びＤ−キシロースに対する反応性が低い、
補因子特性：フラビン結合型である。
【００４７】
ある実施形態では、本発明の融合タンパク質中のGDH部分はさらに、Ｄ−グルコースに対する反応性と比較して、Ｄ−ガラクトースに対する反応性が低い。本明細書においてＤ−グルコースに対する反応性と比較して、ある糖に対する反応性が低いとは、Ｄ−グルコースに対する活性を１００％とした場合に、当該糖に対する活性が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、例えば１．５％未満であることをいう。
【００４８】
分子量は、例えば、GENETYX Ver.11（ゼネティックス社製）やExPASy（http://web.expasy.org/compute_pi/）等のプログラムを用いて、一次配列情報から算出する、あるいはSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で測定することができる。例えば、GENETYX Ver.11を用いて算出する場合、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨの一次配列に基づく推定分子量は、約７０ｋＤａである。また、例えば、SDS-ポリアクリルアミド電気泳動で測定する場合、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨの糖鎖を除去した際の分子量は、約８０ｋＤａである（特許第4648993号参照）。GENETYX Ver.11を用いて算出する場合、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨの一次配列に基づく推定分子量は、約７０ｋＤａである。
【００４９】
（Cytb部分）
ある実施形態において、本発明のCytb-GDH中のCytb部分は、配列番号１２、１４、１６または２１に示すアミノ酸配列を有するCytbに基づき作製された、Cytbの変異体である。このような変異体の例としては、配列番号１２、１４、１６または２１と高い配列同一性（例えば、45%以上、46%以上、47%以上、48%以上、49%以上、50%以上、51%以上、52%以上、53%以上、54%以上、55%以上、56%以上、57%以上、58%以上、59%以上、60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)を有するアミノ酸配列を有するCytbおよび配列番号１２、１４、１６または２１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するCytbを挙げることができる。ある実施形態において、本発明のCytb-GDH中のCytb部分は、融合型Cytbということがある。
【００５０】
ある実施形態において、本発明のCytb-GDH中のCytb部分は、配列番号１２、１４、１６または２１の部分配列、例えば配列番号１２のアミノ酸配列における第５２位〜２２１位からなるアミノ酸配列、配列番号１４のアミノ酸配列における第５０位〜２２０位からなるアミノ酸配列、配列番号１６のアミノ酸配列における第５２位〜２２２位からなるアミノ酸配列、または配列番号２１のアミノ酸配列における４８位〜２１８位からなるアミノ酸配列と高い配列同一性（例えば、50%以上、51%以上、52%以上、53%以上、54%以上、55%以上、56%以上、57%以上、58%以上、59%以上、60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上）を有するアミノ酸配列を有するCytbおよび該配列番号１２、１４、１６または２１の部分アミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するCytbを挙げることができる。
【００５１】
Cytbは天然に広く存在し、微生物や動植物起源の酵素を探索することにより得ることができる。微生物においては、例えば、真菌、酵母または細菌等から得ることができる。Cytbとしては、Cytb5のA型（ミクロソーム性）、Cytb5のB型（ミトコンドリア外膜）、Cytbアスコルビン酸依存性3（CYBASC3）、及びミトコンドリアによりコードされるCytbが挙げられるがこれに限らない。本発明のCytbは例えば、Myriococcum属、Corynascud属、Apergillus属、Hypoxylon属、Chaetomium属、Neurospora属、Humicola属、Thielavia属などの生物種に由来するCytbに基づき作製されたものでもよい。本発明の融合タンパク質に用いるCytbは、天然において単独のポリペプチドとして存在するものである必要はなく、あるタンパク質中のCytbドメインを用いることもできる。Cytbドメインとしては、Myriococcum属由来のCDHが有するCytbドメイン、例えばMyriococcum thermophilum由来のCDHが有するCytbドメイン、Corynascud属由来のCDHが有するCytbドメイン、例えばCorynascud thermophiles由来のCDHが有するCytbドメイン、Apergillus属由来のCDHが有するCytbドメイン、例えばApergillus sojae由来のCDHが有するCytbドメインやAspergillus oryzae由来のCDHが有するCytbドメイン、Hypoxylon属由来のCDHが有するCytbドメイン、例えばHypoxylon haematostroma由来のCDHが有するCytbドメイン、Chaetomium属由来のCDHが有するCytbドメイン、例えばChaetomium attrobruneum由来のCDHが有するCytbドメイン、Neurospora属由来のCDHが有するCytbドメイン、例えばNeurospora crassa由来のCDHが有するCytbドメイン、Humicola属由来のCDHが有するCytbドメイン、例えばHumicola insolens由来のCDHが有するCytbドメイン、Thielavia属由来のCDHが有するCytbドメイン、例えばThielavia terrestris由来のCDHが有するCytbドメインが挙げられるがこれに限らない。
【００５２】
さらに、Extracellular cytochrome遺伝子であるAccession no. AB193288、XM_382527若しくはXM_369170の既知配列、CDH（セロビオースデヒドロゲナーゼ）のＮ末端に位置する電子伝達ヘム含有ドメイン用いても良い（APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 71, 4548-4555 (2005）参照）。加えて、シトクロムを構成するポリペプチドが、配列番号１２のアミノ酸配列における９３−９５位に対応する位置にヘム結合リガンドである「G-X-M」（Xは任意のアミノ酸）を有し、１２０−１２３位に対応する位置に「Y-X-X-P」（Xは任意のアミノ酸）モチーフを有し、１５０−１５３位に対応する位置にＳ−Ｓ結合モチーフである「C-X-X-C」（Xは任意のアミノ酸）を有し、１９７位に対応する位置にヘム結合リガンドであるヒスチジン残基を有するものを用いることができる。
【００５３】
本明細書においてCytbの「相同性領域」とは、２以上のCytbをアライメントしたときに、ある基準となるCytbと比較対象のCytbの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。
【００５４】
（MtCytbを基準とした相同性領域）
例えば、図２では配列番号１２で示されるMyriococcum thermophilumのCDH中のCytbドメイン(以下、MtCytb)と全長アミノ酸配列の配列同一性が５２％以上であるCytbをアライメントした。このうち、配列番号１２で示されるMtCytbを基準として第５２−５３位は同一アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１２で示されるMtCytbを基準として３５−３６位、５９−６１位、６４−６９位、７３−７６位、９９−１００位、１１９−１２０位、１３３−１３４位、１４３−１４４位、１４８−１５０位、１５２−１５４位、１６７−１６８位、１７４−１７６位、１８８−１８９位、および２１６−２１７位はMtCytbの相同性領域に該当しうる。ある実施形態ではMtCytbの相同性領域はこれらの領域からなる。
【００５５】
（CtCytbを基準とした相同性領域）
別の例として、図３では配列番号１４で示されるCorynascud thermophiles由来のCDH中のCytbドメイン(以下、CtCytb)と全長アミノ酸配列の配列同一性が５０％以上であるCytbをアライメントした。このうち、配列番号１４で示されるCtCytbを基準として第１−２位は同一アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１４で示されるCtCytbを基準として８−１０位、１２−１４位、２３−２４位、３０−３１位、３５−３７位、４１−４２位、５０−５７位、５９−６１位、６４−７４位、８２−８３位、８５−８６位、８８−９１位、９３−９７位、９９−１０４位、１１０−１２３位、１２５−１２８位、１３０−１３４位、１４９−１５０位、１５２−１５６位、１６６−１６８位、１７２−１７５位、１８７−１９０位、１９４−１９７位、１９９−２００位、及び２０２−２０５位はCtCytbの相同性領域に該当しうる。ある実施形態ではCtCytbの相同性領域はこれらの領域からなる。
【００５６】
（活性に関連する保存アミノ酸残基または保存アミノ酸モチーフ）
アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定する手法と同じ手法を用いて、アミノ酸配列中の保存アミノ酸残基または保存アミノ酸モチーフを決定することができる。マルチプルアライメントプログラム等によりアミノ酸配列をアライメントさせた後、保存されているアミノ酸残基またはアミノ酸モチーフを特定する。その後、部位特異的突然変異を導入により活性に関連することが知られてるアミノ酸残基、又は、結晶構造解析により三次元構造が明らかとなっているアミノ酸配列中の活性に関連すると考えられる特定の位置のアミノ酸残基と、アライメントから得られた保存アミノ酸残基とを比較する。これらのアミノ酸残基が一致すれば、その保存アミノ酸残基は活性に関連すると考えられる。単独のアミノ酸残基のみならず、複数のアミノ酸を有するアミノ酸モチーフについても同様である。
【００５７】
例えば配列番号１２で示されるMtCytbを基準として第９５位のメチオニン及び１９７位のヒスチジンは種々のCytbにおいて保存されている。一方でPhanerochaete chrysosporium由来CDHのCytbドメインの結晶構造は報告されており（Structure 8, 79-88 (2000)、PDB ID:1D7B）、当該配列中の65位のMet及び163位のHisはヘム結合残基であることが知られている。MtCytbとPcCytbtとをアライメントすると、配列番号１２の配列における９５位のMetはPcCytbtの65位のMetに対応し、配列番号１２の配列における１９７位のHisはPcCytbtの163位のHisに対応する。よって、配列番号１２で示されるMtCytbを基準として第９５位に対応する位置のMet及び１９７位に対応する位置のHisは、それぞれ活性に関連する保存アミノ酸残基と考えられる。実際に、Nature Communications, 6, 7542 (2015)において報告されている MtCytbの結晶構造(PDB ID : 4QI6)から、第９５位に対応する位置のMet及び１９７位に対応する位置のHisがヘムと結合することが確認された。同様に、配列番号１２のアミノ酸配列における９３−９５位に対応する位置の配列「G-X-M」（Xは任意のアミノ酸）モチーフはヘム結合リガンドと考えられる。また、配列番号１２のアミノ酸配列における１２０−１２３位に対応する位置の配列「Y-X-X-P」（Xは任意のアミノ酸）は保存アミノ酸モチーフと考えられる。また配列番号１２のアミノ酸配列における１５０−１５３位に対応する位置の配列「C-X-X-C」（Xは任意のアミノ酸）はジスルフィド結合モチーフであると考えられる。好ましくは、本発明のCytb-GDHに用いるCytb部分は、このような活性に関連すると考えられる保存アミノ酸残基または保存アミノ酸モチーフを含む。
【００５８】
（本発明の融合タンパク質中のCytb部分の酵素化学的特徴）
ある実施形態において本発明のCytb-GDH中のCytb部分は以下の性質を有するものでありうる。 
作用：グルコースデヒドロゲナーゼ部分から電子を受け取ることができ、かつ、受け取った電子を遊離型メディエーターの不在下で電極へ受け渡すことができる、
分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の一次配列に基づく推定分子量が約20−約25kDa、例えば約22.9−約23.4kDa、例えば約23kDaである、
分光特性：還元型で、Cytbに特徴的な吸収スペクトルを有する、
溶解特性：可溶性タンパク質である、
構造：アミノ末端にシグナル配列を有する。
【００５９】
ある実施形態において、該Cytb部分は分光特性として、還元型で、563nm及び533nmに特徴的な吸収スペクトルを有する。
【００６０】
大腸菌等の微生物を宿主とする場合には、本発明の融合タンパク質中のシトクロム部分は場合によりN末端シグナルペプチドを欠失させたものとすることができる。
【００６１】
配列番号１２に示されるMyriococcum thermophilum由来セロビオースデヒドロゲナーゼが含有するCytbのN末端シグナルペプチドは、配列番号１２における１〜２１位のペプチドである。２１位のアラニンと２２位のグルタミンの間で切断が生じる。このポリペプチドからN末端シグナルペプチドを欠失させるには、２１位のアラニンをコードするコドンまたは２２位のグルタミンをコードするコドンを開始コドンに置換してもよい。配列番号１２と配列同一性を有する他のCytbの、配列番号１２の２１位または２２位に対応する位置についても同様である。
【００６２】
同様に、配列番号１４に示されるCorynascud thermophilus由来セロビオースデヒドロゲナーゼが含有するCytbのN末端シグナルペプチドは、配列番号１４における１〜２３位のペプチドである。２３位のアラニンと２４位のグルタミンの間で切断が生じる。このポリペプチドからN末端シグナルペプチドを欠失させるには、２３位のアラニンをコードするコドンまたは２４位のグルタミンをコードするコドンを開始コドンに置換してもよい。配列番号１４と配列同一性を有する他のCytbの、配列番号１４の２３位または２４位に対応する位置についても同様である。
【００６３】
GDH部分のC末端にCytbを融合する場合には、Cytbのシグナル配列を除去した配列を連結しうる。また、N末端にCytbを融合する場合に、Cytbのシグナル配列を除去し、GDH由来のシグナル配列を付加しても良い。
【００６４】
（リンカー部分）
ある実施形態において本発明のCytb-GDHは、GDH部分のN末端側がCytb部分に連結されている。またある実施形態において本発明のCytb-GDHは、GDH部分のC末端側がCytb部分に連結されている。このとき、GDH部分とCytb部分とは、リンカー部分により連結されていてもよい。リンカーとしては、天然のリンカー若しくはその部分配列、それを改変した配列、遺伝子操作されたリンカー配列、同一又は異なるリンカーを反復した配列、天然リンカーの一部を欠失させた配列、およびこれらの組み合わせ等を用いることができる。天然のリンカーとは、天然のポリペプチド配列中のあるドメインと別のドメインとを連結する部分をいう。例えば天然のCDHはフラボデヒドロゲナーゼドメインとCytbドメインとを有し、このとき該フラボデヒドロゲナーゼドメインとCytbドメインとを連結している部分がリンカーである。同一リンカーを反復した配列とは、リンカーLを、L-L、L-L-L等、適当に反復した配列をいう。異なるリンカーを反復した配列とは、例えばリンカーL1とリンカーL2がある場合において、L1-L2-L1、L1-L1-L2、L1-L2-L2、L1-L2-L1-L2、L1-L1-L2-L2、L1-L1-L1-L2等、適当な順列でL1とL2とのいずれかまたは両方を反復した配列をいう。リンカーの長さは例えば１〜６０アミノ酸、２〜５０アミノ酸、３〜４０アミノ酸、４〜３５アミノ酸、５〜３１アミノ酸等でありうる。
【００６５】
天然リンカーの例としては、Myriococcum thermophilum由来のセロビオースデヒドロゲナーゼ（CDH）の推定リンカー配列（配列番号２３）、Corynascud thermophiles由来のCDHの推定リンカー配列（配列番号２５）、Apergillus sojae由来のCDHの推定リンカー配列（配列番号２７または２９）、Aspergillus terreus由来のCDHの推定リンカー配列GDCSGDGGGGSGPEPVPVPDG、HSP70由来のリンカー配列GGGGSLVPRGSGGGGS、鶏卵リゾチーム由来リンカー配列GGGGSLVPRGSGGGGS、ヘマグルチニンHAペプチド由来リンカー配列GGSGGGGG等のリンカー配列又は推定リンカー配列が挙げられるがこれに限らない。天然リンカー配列は公知のペプチド配列データベースから取得することができる。また天然リンカー配列は例えばProtein Sci. 2013; 22(2): 153-167の表１に例示されている。タンパク質中のリンカー部分は、公知の配列解析ソフトウェアやツール、例えばDomCutソフトウェアやPfamソフトウェア等により予測することができる。ドメイン推測ツールによりフラボデヒドロゲナーゼドメインと予測される部分及びCytbドメインと予測される部分の間の領域をリンカー部分と予測することができる。また、Myriococcum thermophilum由来のCDHの結晶構造情報(PDB ID :4QI6)より、リンカー部を推定することもできる。リンカー部分とタンパク質ドメイン部分との境界は必ずしも明確ではないことがあるが、本発明のCytb-GDHから電極への直接電子移動が可能であれば、リンカーの予測が実際の配列と１又は数アミノ酸残基程度異なってもよい。リンカー鎖長の最適化は例えばPNAS 1998; 95(11): 5929-5934に記載されている。
【００６６】
天然リンカーの一部を欠失させた配列は、リンカー配列のN末端側から例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30アミノ酸残基を欠失させたものでもよく、リンカー配列のC末端側から例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20アミノ酸残基を欠失させたものでもよく、リンカー配列のN末端及びC末端以外の任意のアミノ酸残基を例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30アミノ酸残基欠失させたものでもよく、これらの組み合わせでもよい。
【００６７】
天然のリンカー配列の部分配列は、天然のリンカー配列のうちのN末端側から例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34又は35アミノ酸残基からなる部分配列でありうる。また天然のリンカー配列の部分配列は、天然のリンカー配列のうちのC末端側から例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34又は35アミノ酸残基からなる部分配列でありうる。天然のリンカー配列の部分配列は、天然のリンカー配列のうちのN末端及びC末端ではない部分のうちの任意のアミノ酸残基、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34又は35アミノ酸残基からなる部分配列でありうる。
【００６８】
遺伝子操作されたリンカー配列としては、抗体における単鎖可変フラグメント（scFv）の重鎖（VH)と軽鎖（VL）とを連結するリンカー配列が挙げられるがこれに限らない。リンカーは可動性を確保するためにグリシンを1以上含んでよく、また可溶性を確保するためにセリン若しくはトレオニンを1以上含んでもよい。
【００６９】
リンカーとしては、グリシンリンカー、例えばGx（式中、xは、任意の自然数でありうる）が挙げられる。例えばGG、GGG、GGGG、GGGGG等が挙げられる。
【００７０】
リンカーとしては、グリシンアラニンリンカー、例えばGx-Ay（式中、x及びyは、それぞれ独立に0又は任意の自然数でありうる）やGx-Ay-Gz（式中、x、y及びｚは、それぞれ独立に0又は任意の自然数でありうる）が挙げられる。例えばGAリンカー、これを反復したGA-GA、GA-GA-GA、GA-GA-GA-GA等；GGGAリンカー、これを反復したGGGA-GGGA、GGGA-GGGA-GGGA、GGGA-GGGA-GGGA-GGGA等；GGAGリンカー、これを反復したGGAG-GGAG、GGAG-GGAG-GGAG、GGAG-GGAG-GGAG-GGAG等；GGGGAリンカー、これを反復したGGGGA-GGGGA、GGGGA-GGGGA-GGGGA等；GGAGGリンカー、これを反復したGGAGG-GGAGG等；或いはこれらの任意の組み合わせ、例えばGGGA-GGGGA-GGGA、GGGGA-GGGA-GGGGA等が挙げられる。
【００７１】
リンカーとしては、グリシンセリンリンカー、例えばGx-Sy（式中、x及びyは、それぞれ独立に0又は任意の自然数でありうる）やGx-Sy-Gz（式中、x、y及びｚは、それぞれ独立に0又は任意の自然数でありうる）が挙げられる。例えばGSリンカー、これを反復したGS-GS、GS-GS-GS、GS-GS-GS-GS等；GSGリンカー、これを反復したGSG-GSG、GSG-GSG-GSG、GSG-GSG-GSG-GSG等；GGGSリンカー、これを反復したGGGS-GGGS、GGGS-GGGS-GGGS、GGGS-GGGS-GGGS-GGGS等；GGSGリンカー、これを反復したGGSG-GGSG、GGSG-GGSG-GGSG、GGSG-GGSG-GGSG-GGSG等；GGGGSリンカー、これを反復したGGGGS-GGGGS、GGGGS-GGGGS-GGGGS等；GGSGGリンカー、これを反復したGGSGG-GGSGG等；或いはこれらの任意の組み合わせ、例えばGGGS-GGGGS-GGGS、GGGGS-GGGS-GGGGS等が挙げられる（配列番号７１−１１１）。
【００７２】
上記のグリシンアラニンリンカーとグリシンセリンリンカーとを組み合わせてもよい。また上記のSは任意にTに置き換えうる。
【００７３】
（本発明に係るCytb-GDH）
ある実施形態において本発明のCytb-GDHは、GDH部分のN末端がCytb部分に連結されており、又はGDH部分のC末端がCytb部分に連結されている。このとき、Ctyb部分のアミノ酸配列は、電子メディエータ機能を有するポリペプチドを構成するアミノ酸配列であれば、その一部を欠失させた部分アミノ酸配列であってもよい。例えばCytb部分は、当該Cytb部分中のN末端側若しくはC末端側のアミノ酸配列の一部、例えば１〜６０個、例えば２〜５５個、３〜５４個、４〜５３個、５〜５２個、６〜５１個、例えば７〜５０個のアミノ酸を欠失させたアミノ酸配列であり得る。またGDH部分はグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドを構成するアミノ酸配列であれば、その一部を欠失させた部分アミノ酸配列であってもよい。例えばGDH部分は、当該GDH部分中のN末端側若しくはC末端側のアミノ酸配列の一部、例えば１〜６０個、例えば２〜５５個、３〜５０個、４〜４５個、５〜４０個、６〜３５個、７〜３０個、８〜２９個、例えば１１〜２８個のアミノ酸を欠失させたアミノ酸配列であり得る。
【００７４】
アミノ酸配列の一部を欠失させる場合は、例えばシグナル配列と予測される配列の一部若しくは全部を欠失させうる。シグナル配列予測は、Neural NetworksアルゴリズムやHidden Markov Modelsアルゴリズムにより行うことができ、例えばPSORT II、SignalP、Signal-BLAST等の公知のソフトウェア又はツールを用いて行うことができる。シグナル配列を欠失させるか否かは、GDHまたはCytbの由来、及び組換え発現に用いる宿主の種類に応じて適宜決定しうる。
【００７５】
ある実施形態において本発明の電子移動特性が改変されたCytb-GDHは、GDH部分のN末端がCytb部分に連結されており又はGDH部分のC末端がCytb部分に連結されており、場合により該GDH部分と該Cytb部分とはリンカーにより連結されており、
GDH部分は全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号４又は配列番号１０で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と例えば70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、例えば99%以上の同一性を有し、配列番号１の31-41位、58-62位、71-85位、106-116位、119-127位、132-134位、136-144位、150-157位、167-171位、219-225位、253-262位、277-281位、301-303位、305-312位、314-319位、324-326位、332-337位、339-346位、348-354位、388-394位、415-417位、454-459位、477-484位、486-491位、508-511位、564-579位、584-586位、592-605位、607-617位、及び625-630位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該グルコースデヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有し、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、
Cytb部分は、その全長アミノ酸配列が、配列番号１２若しくは１６で示されるアミノ酸配列と例えば45%以上、46%以上、47%以上、48%以上、49%以上、50%以上、51%以上、52%以上、53%以上、54%以上、55%以上、56%以上、57%以上、58%以上、59%以上、60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上の同一性を有し、配列番号１２の35-36位、52-53位、59-61位、64-69位、73-76位、99-100位、119-120位、133-134位、143-144位、148-150位、152-154位、167-168位、174-176位、188-189位、および216-217位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該Cytbの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、
またはその全長アミノ酸配列が、配列番号１４若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列と例えば45%以上、46%以上、47%以上、48%以上、49%以上、50%以上、51%以上、52%以上、53%以上、54%以上、55%以上、56%以上、57%以上、58%以上、59%以上、60%以上、61%以上、62%以上、63%以上、64%以上、65%以上、66%以上、67%以上、68%以上、69%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、例えば99%以上の同一性を有し、配列番号１４の1-2位、8-10位、12-14位、23-24位、30-31位、35-37位、41-42位、50-57位、59-61位、64-74位、82-83位、85-86位、88-91位、93-97位、99-104位、110-123位、125-128位、130-134位、149-150位、152-156位、166-168位、172-175位、187-190位、194-197位、199-200位、及び202-205位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該Cytbの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上のアミノ酸配列同一性を有し、
または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、配列番号１２のアミノ酸配列における第９５位に対応する位置のアミノ酸がメチオニンであり、第１９７位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンであり、場合により配列番号１２のアミノ酸配列における９３−９５位に対応する位置の配列がGly-Xaa-Met（Xaaは任意のアミノ酸）であり、場合により配列番号１２のアミノ酸配列における１２０−１２３位に対応する位置の配列がTyr-Xaa-Xaa-Pro（Xaaは任意のアミノ酸）であり、場合により配列番号１２のアミノ酸配列における１５０−１５３位に対応する位置の配列がCys-Xaa-Xaa-Cys（Xaaは任意のアミノ酸）であり、かつ、
該Cytb部分は該GDH部分から電子を受け取ることができ、受け取った電子を遊離型メディエーターの不在下で電極へ受け渡すことができる、すなわちCytb-GDHから電極への直接電子移動が可能である。
【００７６】
ある実施形態において本発明は、Cytb-GDH融合タンパク質をコードするDNAを提供する。ある実施形態において本発明は配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、１１５、１１７または１１９の塩基配列を含む、DNA構築物を提供するある実施形態において本発明は、配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、１１５、１１７または１１９の塩基配列と60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、90%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、遊離型メディエーターの不在下で直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するCytb-GDH融合タンパク質をコードするDNAを提供する。
【００７７】
（GDH遺伝子）
GDHをコードする遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、GDH生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNAまたはmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNAまたはcDNAを用いて、染色体DNAまたはcDNAのライブラリーを作製することができる。
【００７８】
次いで、上記GDHのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブDNAを合成し、これを用いて染色体DNAまたはcDNAのライブラリーからGDH遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーDNAを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（PCR法）により、GDHをコードする目的の遺伝子断片を含むDNAを増幅させ、これらのDNA断片を連結させて、目的のGDH遺伝子の全長を含むDNAを得ることができる。
【００７９】
このようにして得られたGDHをコードする遺伝子の例として、Mucor属由来のGDH遺伝子（特許第4648993号に記載のもの）が挙げられる。この遺伝子を改変したものを用いてもよく、例えば国際公開第2012/169512号及び国際公開第2015/099112号に記載の改変遺伝子などが挙げられる。
【００８０】
（Cytb遺伝子）
本明細書においてCytb遺伝子という場合、これはCytbをコードする遺伝子のみならず、Cytbドメインをコードする遺伝子も包含するものとする。Cytbをコードする遺伝子又はCytbドメインをコードする遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、Cytb生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNAまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNAまたはcDNAを用いて、染色体DNAまたはcDNAのライブラリーを作製することができる。
【００８１】
次いで、上記Cytbのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブDNAを合成し、これを用いて染色体DNAまたはcDNAのライブラリーからCytb遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーDNAを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（PCR法）により、Cytbをコードする目的の遺伝子断片を含むDNAを増幅させ、これらのDNA断片を連結させて、目的のCytb遺伝子の全長を含むDNAを得ることができる。
【００８２】
このようにして得られたCytbをコードする遺伝子の例として、Myriococcum thermophilum由来のCDHが有するCytbドメイン、Corynascud thermophiles由来のCDHが有するCytbドメイン、Apergillus sojae由来のCDHが有するCytbドメインやAspergillus oryzae由来のCDHが有するCytbドメインが挙げられるがこれに限らない。
【００８３】
（Cytb-GDHをコードする遺伝子）
Cytb-GDHをコードする遺伝子（以下、Cytb-GDH遺伝子ということがある）は、上記のGDH遺伝子と上記のCytb遺伝子とを、慣用の遺伝子操作方法により連結して作製することができる。このとき、GDH遺伝子をCytbの5'側に配置してもく、または3'側に配置してもよい。Cytb遺伝子は複数連結してもよい。またGDH遺伝子と該一又は複数のCytb遺伝子との間にはリンカーペプチドをコードする塩基配列を配置してもよい。
【００８４】
Cytb遺伝子が、Cytbドメイン遺伝子である場合、例えばCDH遺伝子中のCytbドメイン遺伝子である場合、まず適当なプライマー対を用いてセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子中のCytbドメイン及びリンカー部分をコードする塩基配列を増幅することができる。次いで、これを、GDHをコードする塩基配列と連結することができる。あるいは、適当なプライマー対を用いてセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子中のCytbドメインを増幅し、異なるプライマー対を用いて同一又は異なる由来からのリンカーをコードする塩基配列を増幅することができる。次いで、これらを、GDHをコードする塩基配列と連結することができる。
【００８５】
これらのGDH遺伝子やCytb遺伝子、またはCytb-GDH遺伝子は、各種ベクターに連結または挿入してもよく、染色体やゲノムに組み入れてもよい。ベクターを用いる場合、ベクターへのクローニングには、TA Cloning Kit（インビトロジェン社）やIn-Fusion HD Cloning Kit（クロンテック社）などの市販のキット；pUC119（タカラバイオ社）、pUC18（タカラバイオ社）、pUC19（タカラバイオ社）、pBR322（タカラバイオ社）、pBluescript SK+（ストラタジーン社）、pYES2/CT（インビトロジェン社）などの市販のプラスミドベクターDNA；λEMBL3（ストラタジーン社）などの市販のバクテリオファージベクターDNAが使用できる。該組換え体DNAを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、好ましくは大腸菌JM109株（タカラバイオ社）や大腸菌  DH5α株（タカラバイオ社）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体DNAを、QIAGEN Plasmid Mini Kit（キアゲン社）などを用いて精製する。
【００８６】
（GDH遺伝子、Cytb遺伝子又はCytb-GDH遺伝子の変異処理）
公知のGDHから出発し、本発明に係る融合タンパク質に用いるGDHを取得する方法として、出発GDH遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるGDHについて、酵素科学的性質を指標に選択又はスクリーニングを行うことができる。
【００８７】
公知のCytbから出発し、本発明に係る融合タンパク質に用いるCytbを取得する方法として、出発Cytb遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるCytbについて、酵素科学的性質を指標に選択又はスクリーニングを行うことができる。
【００８８】
公知のGDH遺伝子若しくは改変GDH遺伝子と公知のCytb遺伝子若しくは改変Cytb遺伝子とを機能的に連結し、Cytb-GDH遺伝子を作製することができる。このような出発Cytb-GDH遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるCytb-GDH融合タンパク質について、酵素科学的性質を指標に選択又はスクリーニングを行うことができる。
【００８９】
出発GDH遺伝子、Cytb遺伝子又はCytb-GDH遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、GDH遺伝子、Cytb遺伝子、又はCytb-GDH遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；タンパク質工学的手法；またはこれらの組み合わせ等を広く用いることができる。
【００９０】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
【００９１】
上記接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件をとることが可能であり、現実に所望の変異をGDH遺伝子又はCytb遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。
【００９２】
タンパク質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Site-Specific Mutagenesisとして知られる手法を用いることができる。例えば、Kramer法（Nucleic Acids Res.,12,9441(1984): Methods Enzymol.,154,350(1987): Gene,37,73(1985))、Eckstein法(Nucleic Acids Res.,13,8749(1985): Nucleic Acids Res.,13,8765(1985): Nucleic Acids Res,14,9679(1986))、Kunkel法(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A.,82,488(1985): Methods Enzymol.,154,367(1987))等が挙げられる。DNA中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット(Transformer Mutagenesis Kit; Clonetech社，EXOIII/Mung Bean Deletion Kit; Stratagene製， Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene製など）の利用が挙げられる。
【００９３】
また、一般的なPCR法（ポリメラーゼチェインリアクション、Polymerase Chain Reaction）として知られる手法を用いることもできる(Technique,1,11(1989))。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変GDH遺伝子又はCytb遺伝子を合成することもできる。
【００９４】
上記方法により得られるGDH遺伝子、Cytb遺伝子又はCytb-GDH遺伝子のDNA塩基配列の決定もしくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行うことができる。
【００９５】
（本発明のCytb-GDH遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞）
上述のように得られた本発明のCytb-GDH遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
【００９６】
原核宿主細胞の一例としては、エッシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌K-12株、エシェリヒア・コリーBL21(DE3)、エシェリヒア・コリーJM109、エシェリヒア・コリーDH5α、エシェリヒア・コリーW3110、エシェリヒア・コリーC600等（いずれもタカラバイオ社製）が利用でき、それらを形質転換し、または、それらに形質導入して、DNAが導入された宿主細胞（形質転換体）を得る。宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えDNAの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばECOS Competent エシェリヒア・コリーBL21(DE3)；ニッポンジーン製）を用いても良い。
【００９７】
なお本発明者らは、天然GDHのN末端シグナルペプチドを欠失させることにより、大腸菌等の微生物を宿主とした際に、その生産性を向上させうることを確認している（例えば国際公開2012/169512号を参照）。大腸菌等の微生物を宿主とする場合には、本発明の融合タンパク質中のGDH部分は場合によりN末端シグナルペプチドを欠失させたものとすることができる。
【００９８】
配列番号１で示されるMucor属GDHのN末端シグナルペプチドは、配列番号１における１〜２０位のペプチドである。２０位のアラニンと２１位のグルタミンの間で切断が生じる。このポリペプチドからN末端シグナルペプチドを欠失させるには、２０位のアラニンをコードするコドンまたは２１位のグルタミンをコードするコドンを開始コドンに置換してもよい。配列番号１と配列同一性を有する他のGDHの、配列番号１の２０位または２１位に対応する位置についても同様である。Cytbのアミノ酸配列が、配列番号１で示されるMucor属GDHの第２０位又は２１位に連結されるようCytb-GDH遺伝子の塩基配列を遺伝し工学的に操作してもよい。
【００９９】
また、例えば、真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、分泌シグナル配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法(Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269(1995))やエレクトロポレーション(J Microbiol Methods 55 (2003)481-484)等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。
【０１００】
また、例えば、宿主糸状菌の他の例としては、アスペルギルス(Aspergillus)属やトリコデルマ(Tricoderma)属のようなカビ細胞が挙げられる。カビ細胞の形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、Cytb-GDH遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法が挙げられる。具体的には、Cytb-GDHをコードする遺伝子を発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したDNAコンストラクトを作製し、次いでCytb-GDHをコードする遺伝子を含むDNAコンストラクトで宿主糸状菌を形質転換することにより、GDHをコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主糸状菌を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター−Cytb-GDHをコードする遺伝子−ターミネーターからなるDNA断片及び該DNA断片を含む組換えベクターをDNAコンストラクトと総称してよぶ。
【０１０１】
Cytb-GDHをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主糸状菌内に導入する手法などが挙げられる。
【０１０２】
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、DNAコンストラクトを連結し、宿主糸状菌のゲノム中に挿入することができる。自身の高発現プロモーター制御下で宿主糸状菌内で過剰発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるTEF1遺伝子(tef1)のプロモーター領域、α−アミラーゼ遺伝子(amy)のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子(alp)プロモーター領域などが挙げられる。
【０１０３】
ベクターを利用する方法では、DNAコンストラクトを、常法により、糸状菌の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主糸状菌を常法により形質転換することができる。
【０１０４】
そのような、好適なベクター−宿主系としては、宿主糸状菌中でCytb-GDHを生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、pUC19及び糸状菌の系、pSTA14(Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989）及び糸状菌の系などが挙げられる。
【０１０５】
DNAコンストラクトは宿主糸状菌の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ozeki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1133 (1995)）にDNAコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
【０１０６】
DNAコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、pyrG、niaD、adeAのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢ、オリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、DNAコンストラクトは、宿主細胞中でGDHをコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、tef1プロモーター、alpプロモーター、amyプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、alpターミネーター、amyターミネーター、tef1ターミネーターなどが挙げられる。
【０１０７】
DNAコンストラクトにおいて、Cytb-GDHをコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入するCytb-GDHをコードする遺伝子を含むDNA断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、DNAコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
【０１０８】
DNAコンストラクトの一実施態様は、例えば、pUC19のマルチクローニングサイトにあるIn-Fusion Cloning Siteに、tef1遺伝子プロモーター、Cytbをコードする遺伝子、場合により存在してもよいリンカーペプチドをコードする遺伝子、GDHをコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びpyrGマーカー遺伝子を連結させたDNAコンストラクトである。
【０１０９】
糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主糸状菌のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストPEG法（例えば、Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989、特開2007-222055号公報などを参照）を用いることができる。形質転換糸状菌を再生させるための培地は、用いる宿主糸状菌と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主糸状菌としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質転換マーカー遺伝子としてpyrG遺伝子を用いた場合は、形質転換糸状菌の再生は、例えば、0.5%寒天及び1.2Mソルビトールを含むCzapek-Dox最少培地（ディフコ社）で行うことができる。
【０１１０】
また、例えば、本発明の形質転換糸状菌を得るために、相同組換えを利用して、宿主糸状菌が本来染色体上に有するCytb-GDHをコードする遺伝子のプロモーターをtef1などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、pyrGなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開2011-239681に記載の実施例１や図１を参照して、Cytb-GDHをコードする遺伝子の上流領域−形質転換マーカー遺伝子−高発現プロモーター−Cytb-GDHをコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、Cytb-GDHをコードする遺伝子の上流領域及びCytb-GDHをコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。Cytb-GDHをコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは0.5kb以上あることが好ましい。
【０１１１】
本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、Cytb-GDHの酵素活性が認められる条件下で本発明の形質転換糸状菌を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるCytb-GDHの活性を確認することにより行うことができる。
【０１１２】
また、本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、形質転換糸状菌から染色体DNAを抽出し、これを鋳型としてPCRを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なPCR産物が生じることを確認することにより行ってもよい。
【０１１３】
例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでPCRを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【０１１４】
（本発明のCytb-GDHを生産する宿主細胞の選抜）
本発明のCytb-GDHを生産する形質転換糸状菌を効率よく選抜するためには、例えば、次のような方法を用いてもよい。得られた宿主細胞（形質転換体）がコロニーを形成した0.5%寒天を含む最少培地からコロニーをDPY液体培地(1%(w/v)ポリペプトン、2%(w/v)デキストリン、0.5%(w/v)酵母エキス、0.5%(w/v)KH2PO4、0.05%(w/v)MgSO4・7H20)に植菌し、３日間で振とう培養を行う。得られた培養上清液を、Cytb-GDHが作用すれば発色または変色する組成とした反応液（グルコース、DCIPまたはシトクロムcを含む10mM リン酸緩衝液（pH7.0)）と混合し、DCIP由来紫色またはシトクロムc由来赤褐色の変色の度合を観察する。電子移動にPMS等の遊離型メディエーターを必要とするCytb-GDHの場合、遊離型メディエーターの存在しない反応液では変色する度合が少ないが、電子移動特性が改変された本発明のCytb-GDH、例えば直接電子移動が可能なCytb-GDHの場合は、反応液の変色する度合が多くなる。これを利用し、野生型Cytb及び野生型GDHから構成されるCytb-GDHを産生する株が混合された反応液の変色度合との比較により、電子移動特性が改変されたCytb-GDH、例えば直接電子移動が可能なCytb-GDHを生産する形質転換体を選抜しうる。
【０１１５】
また、本発明のCytb-GDHを生産する形質転換大腸菌を効率よく選抜するためには、例えば、次のような方法を用いてもよい。得られた宿主細胞（形質転換体）がコロニーを形成したＬＢ寒天培地から、滅菌したビロード生地等で新しい寒天培地にレプリカを数枚とり、培養する。レプリカをとった寒天培地のコロニーが十分な大きさになったら、リゾチーム等の溶菌剤に浸した膜を培地に重ねて、室温で１時間ほど静置し、溶菌させる。このとき、溶菌した粗酵素液が膜に吸着する。
【０１１６】
次いで、粗酵素液を吸着させた前記の膜を、35℃、１分〜１時間静置した後、GDHが作用すれば変色する組成とした反応液（グルコース、DCIPまたはシトクロムcを含む10mM リン酸緩衝液(pH7.0))に浸した膜と重ね合わせ、DCIP由来紫色またはシトクロムc由来赤褐色の変色の度合を観察する。電子移動にPMS等の遊離型メディエーターを必要とするCytb-GDHの場合、遊離型メディエーターの存在しない反応液ではコロニーが変色する度合が少ないが、電子移動特性が改変された本発明のCytb-GDH、例えば直接電子移動が可能なCytb-GDHの場合は、コロニーが変色する度合が多くなる。これを利用し、野生型Cytb及び野生型GDHから構成されるCytb-GDHを産生する株のコロニーの変色度合との比較により、電子移動特性が改変されたCytb-GDH、例えば直接電子移動が可能なCytb-GDHを生産する形質転換体を選抜しうる。
【０１１７】
必要に応じ、このように見出した電子移動特性が改変されたCytb-GDHをコードする遺伝子に対して、さらに変異導入を繰り返し行うことにより、一層優れた改変Cytb-GDH及びその生産能を有する形質転換体を得ることもできる。
【０１１８】
また、必要に応じ、Cytb-GDH中のGDH部分をコードする遺伝子のみについて変異導入と選抜とを１回または複数回行い、Cytb-GDH中のCytb部分をコードする遺伝子のみについて変異導入と選抜とを１回または複数回行い、その後、変異Cytbをコードする遺伝子及び変異GDHをコードする遺伝子を用いて改変Cytb-GDH遺伝子を取得し、これを産生する形質転換体を得ることもできる。
【０１１９】
（ハイスループットスクリーニング）
Cytb-GDHはさらに、機能性Cytb-GDH変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したCytb-GDH遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、または液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ(例えばChem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005)、イーストディスプレイ(例えばComb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34)、バクテリアルディスプレイ(例えばCurr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007)等を用いて、変異GDHの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。Cytb-GDHバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンPCR法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の領域や位置又はそれらに対応する領域や位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約１０の７乗の変異体を取得しうる。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際にはGDH活性の有無を利用しうる。これには例えば上記のCytb-GDHが作用すれば発色または変色する組成とした反応液を用いてもよい。例えば96ウェルプレート、192ウェルプレート、384ウェルプレート、9600ウェルプレート等及びプレートリーダーを用いて550nmの吸光度を測定してもよい。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
【０１２０】
（本発明のCytb-GDHの製造）
本発明のCytb-GDHは、上述のように取得した本発明のCytb-GDHを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるCytb-GDH遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からCytb-GDHタンパク質を単離することにより製造すればよい。
【０１２１】
糸状菌を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。また、上記微生物宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【０１２２】
培養条件は、当業者により通常知られる糸状菌の培養条件を採用すればよく、例えば、培地の初発pHは5〜10に調整し、培養温度は20〜40℃、培養時間は数時間〜数日間、好ましくは1〜7日間、より好ましくは2〜5日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるDPY培地を用いた、30℃、160rpmでの3〜5日間の振盪培養が挙げられる。微生物宿主細胞を培養する際は、10〜42℃の培養温度、好ましくは25℃前後の培養温度で4〜24時間、さらに好ましくは25℃前後の培養温度で4〜8時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。
【０１２３】
培養終了後、該培養物より本発明のCytb-GDHを採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、培地上清画分を回収するか、または、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、又はリゾチーム、ヤタラーゼ等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、本発明のCytb-GDHの粗酵素を得る。
【０１２４】
本発明のCytb-GDHの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲルろ過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された本発明のCytb-GDH酵素標品を得ることができる。
【０１２５】
（本発明のCytb-GDHの活性測定）
本発明のCytb-GDH中のGDH部分は、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。これを便宜上、GDH活性と呼ぶことがある。
【０１２６】
本発明のCytb-GDHのGDH活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（PMS）及び2,6-ジクロロインドフェノール(DCIP)を用いた以下の測定系を用いて測定することができる。
（反応１）  D-グルコ−ス  ＋  PMS（酸化型）
→  D-グルコノ−δ−ラクトン  ＋  PMS（還元型）
（反応２）  PMS（還元型）  ＋  DCIP（酸化型）
→  PMS（酸化型）  ＋  DCIP（還元型）
【０１２７】
具体的には、まず、（反応１）において、D-グルコースの酸化に伴い、PMS（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってDCIPが還元される。この「DCIP（酸化型）」の消失度合を波長600nmにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
【０１２８】
具体的には、GDH活性は、以下の手順に従って測定することができる。100mM リン酸緩衝液(pH7.0) 2.05mL、1M D-グルコース溶液 0.6mLおよび2mM DCIP溶液0.15mLを混合し、37℃で5分間保温する。次いで、15mM PMS溶液 0.1mL及び酵素サンプル溶液0.1mLを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う600nmにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔA600）を求め、次式に従いGDH活性を算出する。この際、GDH活性は、37℃において濃度200mMのD-グルコース存在下で1分間に1μmolのDCIPを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
【０１２９】
【数１】
2017094776.tif 000003
【０１３０】
なお、式中の3.0は反応試薬＋酵素試薬の液量(mL)、16.3は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数(cm2/μmol)、0.1は酵素溶液の液量(mL)、1.0はセルの光路長（ｃｍ）、ΔA600blankは100mM リン酸緩衝液(pH7.0)を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の600 nmにおける吸光度の１分間あたりの減少量、dfは希釈倍数を表す。
【０１３１】
（本発明のCytb-GDHを用いたグルコース測定方法）
ある実施形態において本発明は、本発明のCytb-GDHを含むグルコースアッセイキットを提供する。このキットを用いることにより、本発明のCytb-GDHを用いて血中のグルコース（血糖値）を測定することができる。測定は連続的に行ってもよい。
【０１３２】
本発明のグルコースアッセイキットは、少なくとも１回のアッセイに十分な量の本発明のCytb-GDHを含む。典型的には、本発明のグルコースアッセイキットは、本発明のCytb-GDHに加えて、アッセイに必要な緩衝液、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに指針を含む。ある実施形態において、本発明のグルコースアッセイキット、例えばSMBG用、CGM用、またはFGM用のグルコースアッセイキットは遊離型メディエーターを含む。ある実施形態において、本発明のグルコースアッセイキット、例えばSMBG用、CGM用、またはFGM用のグルコースアッセイキットは遊離型メディエーターを含まなくともよい。本発明のCytb-GDHは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、ビーズや電極表面に固定化された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【０１３３】
グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のよう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはCytb-GDH、そして反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸(ADA)、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬（変色試薬）を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、Cytb-GDHより電子を直接受け取ることによって重合し生成する色素もしくは還元された色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作製したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
【０１３４】
この方法において使用できる発色試薬（変色試薬）としては、たとえば２，６−ジクロロインドフェノール(DCIP)を電子受容体として添加し、600nmにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー(NTB)を加え、570nm吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する発色試薬（変色試薬）はこれらに限定されない。
【０１３５】
（本発明のCytb-GDHを含むグルコースセンサー）
ある実施形態において本発明は、本発明のCytb-GDHを用いるグルコースセンサーを提供する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のCytb-GDH酵素を塗布または固定化することができる。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、ポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のCytb-GDHをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【０１３６】
本発明のCytb-GDHは、ポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法に適用することができる。電気化学的測定法としては、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリーなどの様々な手法が挙げられる。例えばアンペロメトリー法により、グルコースが還元される際の電流を測定することで、試料中のグルコース濃度を算出することができる。印加電圧は条件や装置の設定にもよるが、例えば-1000mV〜+1000mV(vs. Ag/AgCl)などとすることができる。
【０１３７】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極として本発明のCytb-GDHを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばAg/AgCl電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【０１３８】
具体的な例としては、グラッシーカーボン(GC)電極に本発明の0.2U〜1000Uより好ましくは、0.5U〜700UのCytb-GDHを固定化し、グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。また、GC電極に本発明の0.5μg〜5000μgより好ましくは、1μg〜2000μgのCytb-GDHを固定化し、グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。GDH若しくはCytb-GDHの比活性を測定することにより、タンパク質量から活性値を算出することが可能である。電解セル中に、100mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)10.0mlを添加する。GC電極をポテンショスタットBAS100B/W(BAS製）に接続し、37℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して+500mVを印加する。これらの系に1M D-グルコース溶液を終濃度が0.1、0.2、0.5、1、3、5、10、20、30、40、50mMになるよう添加し、添加した各濃度ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（0.1、0.2、0.5、1、3、5、10、20、30、40、50mM）に対してプロットし、検量線が作成する。この時、作用極面積で標準化した電流密度(nA/cm2)をプロットしても良い。これより本発明のグルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能となる。
【０１３９】
さらに電気化学測定のために印刷電極を用いることもできる。これにより測定に必要な溶液量を低減することができる。この場合、電極は絶縁基板上に形成されてなることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成させることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられるが、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。
【０１４０】
ある実施形態では、印刷電極に本発明の0.2U〜1000Uより好ましくは、0.5U〜700UのCytb-GDH溶液を塗布する。塗布したCytb-GDHは、場合により風乾させてもよい。その後グルコース溶液を添加し、電圧を印加し、グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。別の実施形態では、印刷電極に本発明のCytb-GDH及びグルコースを含む溶液を添加し、電圧を印加し、応答電流を測定することもできる。これらの実施形態でも、GDH若しくはCytb-GDHの比活性を測定することにより、タンパク質量から活性値を算出することが可能である。印刷電極上で、Cytb-GDH及びグルコース溶液を接触させ、電圧を印加する（例えば銀塩化銀参照電極に対して+500mVまたは+300mV)。グルコースは、1M D-グルコース溶液を終濃度が0.1、0.2、0.5、1、3、5、10、20、30、40、50mMになるよう添加しうる。添加した各濃度ごとに例えば電圧印加による測定開始から４０秒後の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（0.1、0.2、0.5、1、3、5、10、20、30、40、50mM）に対してプロットし、検量線が作成する。この時、作用極面積で標準化した電流密度(nA/cm2)をプロットしても良い。これより本発明のグルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能となる。
【０１４１】
遊離型メディエーターについて
ある実施形態において、本発明の測定方法、キット、装置及びセンサーには、遊離型メディエーター（人工電子メディエーター、人工電子アクセプター、電子メディエーターともいう）を用いることもできる。遊離型メディエーターは、本発明のCytb-GDHから電子を受け取ることができるものであれば特に限定されない。遊離型メディエーターとしては遊離型の、キノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類(例えば、Cytb、Cytc)、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、例えばフェリシアン化カリウム、フェレドキシン類、フェロセン、オスミウム錯体、およびその誘導体等などが挙げられ、フェナジン化合物としては例えばPMS、メトキシPMSが挙げられるがこれに限定されない。なお、本明細書にいう「遊離型メディエーター」とは、Cytb-GDHに含まれる融合型Cytbと対比した便宜上の用語に過ぎない。あるメディエーターが、GDHに融合又は連結されていなければ、当該メディエーターが膜に包埋されていても、又は電極に固定化されていても、それは本明細書にいう「遊離型メディエーター」に包含されるものとする。また遊離型メディエーターを非融合型メディエーターということがある。
【０１４２】
本発明のCytb-GDHは、Cytbドメインを有し、電子移動特性が改変されている。ある実施形態では、本発明のCytb-GDHはCytbドメインを有することにより、Cytb-GDH融合タンパク質から別の電子受容物質への電子移動が容易となっている。ある実施形態において、本発明のCytb-GDH融合タンパク質から別の電子受容物質への電子移動は、単独のGDH酵素の場合と比較して、より低濃度の遊離型メディエーターの存在下でも可能である。ある実施形態において、本発明のCytb-GDH酵素から別の電子受容物質への電子移動は、遊離型メディエーターの不在下でも可能である。ある実施形態において、本発明のCytb-GDH融合タンパク質は融合タンパク質から電極への直接電子移動が可能である。
【０１４３】
ある実施形態において、本発明のCytb-GDH融合タンパク質から別の電子受容物質への電子移動は、Cytbを連結していない単独のGDH酵素の場合に困難であった種類のメディエーターでも可能である。例えばルテニウム化合物は、mPMS等の第2のメディエーターとの共存下でなければ従来のグルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定においてグルコース濃度依存的な応答電流が生じない（特開2013-083634参照）。本発明の電子移動特性が改変されたCytb-GDHは、mPMS等の第2のメディエーターを用いることなく、ルテニウム化合物と組み合わせてグルコース測定に使用することができる。別の例としては、本発明の電子移動特性が改変されたCytb-GDHは、mPMS等の第2のメディエーターを用いることなく、グルコース測定に使用することができる。
【０１４４】
本発明の電子移動特性が改変されたCytb-GDHは、従来のGDHと同じ用途に使用することができる。また、本発明のCytb-GDHは、試料中のグルコース濃度測定に使用することができ、これは例えば糖尿病の診断や血糖値の自己モニタリングに役立てることができる。また、本発明のCytb-GDHは酵素電極として使用することができ、これは種々の電気化学的測定に用いることができる。また、本発明のCytb-GDHは酵素センサーとして使用することができる。また、本発明のCytb-GDHはグルコース測定キットやグルコースセンサーに利用することができる。これは例示であり、本発明の改変Cytb-GDHの用途はこれに限られない。
【０１４５】
以下の実施例により、本発明をさらに例証する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０１４６】
[実施例１]
１．Mucor属由来GDH遺伝子の宿主への導入とGDH活性の確認
まずMucor属由来GDH（MpGDH、配列番号１）にN66Y/N68G/C88A/Q233R/T387C/E554D/L557V/S559Kの各変異を導入した改変GDH（以下、本明細書においてMpGDH-M1ということがある）をコードする遺伝子を取得した。MpGDH-M1のアミノ酸配列は配列番号１０に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号１１に示す。プラスミドpUC19のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるMpGDH-M1遺伝子を常法により挿入させたDNAコンストラクトを作製した。具体的には、pUC19は、In-Fusion HD Cloning Kit（クロンテック社）に付属されているpUC19 linearized Vectorを用いた。pUC19のマルチクローニングサイトにあるIn-Fusion Cloning Siteにて、MpGDH-M1遺伝子を、上記したIn-Fusion HD Cloning Kitを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミド（pUC19−MpGDH-M1）を得た。【０１４７】
配列番号１２はMyriococcum thermophilum由来セロビオースデヒドロゲナーゼが含有するCytb（以降MtCytbと称する）のアミノ酸配列である（国際公開第2010/097462号）。配列番号１２のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１３）および配列番号２３のリンカー配列をコードする遺伝子（配列番号２４）を定法である遺伝子断片のPCRによる全合成によりcDNAを全合成することで取得した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図１のMtCytbの配列及びリンカーの配列と一致していることを確認した。次に、In-Fusion HD Cloning Kitを使用して、配列番号４５〜４８の合成オリゴヌクレオチドを用いて、MtCytb及び配列番号２３に記載されたリンカー配列をpUC19−MpGDH-M1を鋳型にして挿入し、大腸菌JM109を形質転換し、LB-amp寒天培地に展開した。生育したコロニーをLB-amp培地［1%(W/V) バクトトリプトン、0.5%(W/V) ペプトン、0.5%(W/V) NaCl、50μg/ml Ampicilin］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。この培養物を7,000rpmで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりQIAGEN tip-100（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドを抽出して精製し、DNA2.5μgを得た。該プラスミド中のMtCytb-MpGDH-M1（配列番号３３）をコードするDNAの塩基配列（配列番号３４）を、マルチキャピラリーDNA解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、シトクロム融合体であるMtCytb-MpGDH-M1のコンストラクト用プラスミド（pUC19-MtCytb-MpGDH-M1）を得た。この際に、MpGDH-M1における１〜２０位のシグナルペプチドを欠失させた。【０１４８】
次に、配列番号１４はCorynascud thermophilus由来セロビオースデヒドロゲナーゼが含有するCytb（以降CtCytbと称する）のアミノ酸配列である（国際公開第2010/097462号）。配列番号１４のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１５）および配列番号２５のリンカー配列をコードする遺伝子（配列番号２６）を定法である遺伝子断片のPCRによる全合成によりcDNAを全合成することで取得した。上記と同様の手法により、In-Fusion HD Cloning Kitを使用して、配列番号４９〜５２の合成オリゴヌクレオチドを用いて、CtCytb及び配列番号２５に記載されたリンカー配列をpUC19−MpGDH-M1を鋳型にして挿入し、シトクロム融合体であるCtCytb-MpGDH-M1（配列番号３５）のコンストラクト用プラスミド（pUC19−CtCytb-MpGDH-M1）を得た。【０１４９】
続いて、配列番号１６はAspergillus sojae由来セロビオースデヒドロゲナーゼが含有するCytb（以降AsCytbと称する）のアミノ酸配列である。配列番号１６のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１７）および配列番号２７のリンカー配列をコードする遺伝子（配列番号２８）を定法である遺伝子断片のPCRによる全合成によりcDNAを全合成することで取得した。上記と同様の手法により、In-Fusion HD Cloning Kitを使用して、配列番号５３〜５６の合成オリゴヌクレオチドを用いて、AsCytb及び配列番号２７に記載されたリンカー配列をpUC19−MpGDH-M1を鋳型にして挿入し、シトクロム融合体であるAsCytb-L1-MpGDH-M1（配列番号３７）のコンストラクト用プラスミド（pUC19−AsCytb-L1-MpGDH-M1）を得た。【０１５０】
さらに、In-Fusion HD Cloning Kitを使用して、配列番号５７〜６０の合成オリゴヌクレオチドを用いて、AsCytb及び配列番号２７に記載されたリンカー配列をpUC19−AsCytb-MpGDH-M1に挿入し、AsCytbとリンカー配列が２連結されたAsCytbx2-MpGDH-M1（配列番号３９）のコンストラクト用プラスミド（pUC19−AsCytbx2-MpGDH-M1）を得た。【０１５１】
また、得られた組換え体プラスミドpUC19−AsCytb-L1-MpGDH-M1  DNAを鋳型として、配列番号６１、６２の合成オリゴヌクレオチド、KOD-Plus-（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でPCR反応を行った。【０１５２】
すなわち、10×KOD-Plus-緩衝液を5μl、dNTPが各2mMになるよう調製されたdNTPs混合溶液を5μl、25mMのMgSO4溶液を2μl、鋳型となるpUC19−AsCytb-L1-MpGDH-M1  DNAを50ng、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ15pmol、KOD-Plus-を1Unit加えて、滅菌水により全量を50μlとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、94℃で2分間インキュベートし、続いて、「94℃、15秒」−「50℃、30秒」−「68℃、8分」のサイクルを30回繰り返した。【０１５３】
反応液の一部を1.0%アガロースゲルで電気泳動し、約8,000bpのDNAが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたDNAを制限酵素DpnI(NEW ENGLAND BIOLABS社製）で処理し、残存している鋳型DNAを切断した。DpnI処理済みPCR産物を2μl、滅菌水を7μl、Ligation high（東洋紡績社製）を5μl、T4 Polynucleotide Kinase(5U/μl、東洋紡績社製）を1μl混合し、16℃で１時間反応させた。反応液の一部(〜10μl)を用いて大腸菌JM109を形質転換し、LB-amp寒天培地に展開した。生育したコロニーをLB-amp培地に接種して振とう培養し、上記と同様の方法でプラスミドDNAを単離した。該プラスミド中のCytb-GDHをコードするDNAの塩基配列を、マルチキャピラリーDNA解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、その結果、pUC19−Ascytb-L1-MpGDH-M1のリンカー長を9アミノ酸短縮させたAscytb-L2-MPGDH-M1（配列番号４１）のコンストラクト用プラスミド（pUC19−Ascytb-L2-MpGDH-M1）を得た。【０１５４】
次に、上記と同様の手法により、In-Fusion HD Cloning Kitを使用して、配列番号６３〜６６の合成オリゴヌクレオチドを用いて、CtCytb及び配列番号３１に記載されたリンカー配列をpUC19−MpGDH-M1を鋳型にして挿入し、MpGDHのC末端にシトクロムを融合させたMpGDH-M1-CtCytbのコンストラクト用プラスミド（pUC19−MpGDH-M1-CtCytb）を得た。この際に、CtCytbにおける１〜２３位のシグナルペプチドを欠失させた。【０１５５】
次に、上記と同様の手法により、In-Fusion HD Cloning Kitを使用して、配列番号１２６〜１２９の合成オリゴヌクレオチドを用いて、HiCytb及び配列番号３１に記載されたリンカー配列をpUC19−CtCytb-MpGDH-M1を鋳型にして挿入し、MpGDHのN末端にシトクロムを融合させたHiCytb-MpGDH-M1のコンストラクト用プラスミド（pUC19−HiCytb-MpGDH-M1）を得た。【０１５６】
これらの遺伝子をコウジカビ（Aspergillus sojae; アスペルギルス・ソーヤ）で発現させ、そのGDH活性を評価した。【０１５７】
Double-joint PCR(Fungal Genetics and Biology，2004年，第41巻，p973-981）を行い、5’アーム領域〜pyrG遺伝子（ウラシル栄養要求性マーカー）〜TEF1プロモーター遺伝子〜フラビン結合型GDH遺伝子(配列番号２)〜3’アーム領域から成るカセットを構築し、下記の手順でアスペルギルス・ソーヤNBRC4239株由来pyrG破壊株（pyrG遺伝子の上流48bp、コード領域896bp、下流240bp欠損株）の形質転換に用いた。500ml容三角フラスコ中の20mMウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地100mlに、アスペルギルス・ソーヤNBRC4239株由来pyrG破壊株の分生子を接種し、30℃で約20時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び20μgの対象遺伝子挿入DNAコンストラクトを用いて、プロトプラストPEG法により形質転換を行い、次いで0.5%(w/v)寒天及び1.2Mソルビトールを含むCzapek-Dox最少培地（ディフコ社；pH6)を用いて、30℃、5日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。同様にして、pUC19−MtCytb-MpGDH-M1、pUC19−CtCytb-MpGDH-M1、pUC19−AsCytb-L1-MpGDH-M1、pUC19−AsCytbx2-MpGDH-M1、pUC19−AsCytb-L2-MpGDH-M1、pUC19−MpGDH-M1-CtCytb、HiCytb-MpGDH-M1を用いて、5’アーム領域〜pyrG遺伝子（ウラシル栄養要求性マーカー）〜TEF1プロモーター遺伝子〜シトクロム融合フラビン結合型GDH遺伝子〜3’アーム領域から成るカセットを構築し、形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。【０１５８】
得られた形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるpyrGが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。得られた菌株の中から目的の形質転換体を、PCRで確認して選抜した。【０１５９】
MpGDH-M1もしくはMtCytb-MpGDH-M1、CtCytb-MpGDH-M1、AsCytb-L1-MpGDH-M1、AsCytbx2-MpGDH-M1、AsCytb-L2-MpGDH-M1、MpGDH-M1-CtCytb、HiCytb-MpGDH-M1の遺伝子により形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いて、それぞれのGDH生産を行った。【０１６０】
200ml容三角フラスコ中のDPY液体培地(1%(w/v)ポリペプトン、2%(w/v)デキストリン、0.5%(w/v)酵母エキス、0.5%(w/v)KH2PO4、0.05%(w/v)MgSO4・7H2O；ｐＨ未調整）40mlに、各菌株の分生子を接種し、30℃で４日間、160rpmで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養物から菌体をろ過し、得られた培地上清画分をAmicon Ultra-15， 30K NMWL（ミリポア社製）で１０ｍLまで濃縮し、150mM NaClを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.5)で平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 200pg(GEヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、GDH活性を示し、SDS-PAGE解析により目的分子量と一致した画分を回収し、MpGDH-M1もしくはMtCytb-MpGDH-M1、CtCytb-MpGDH-M1、AsCytb-L1-MpGDH-M1、AsCytbx2-MpGDH-M1、AsCytb-L2-MpGDH-M1、MpGDH-M1-CtCytb、HiCytb-MpGDH-M1の精製標品を得た。【０１６１】
クロノアンペロメトリー
MpGDH-M1もしくはMtCytb-MpGDH-M1、CtCytb-MpGDH-M1、AsCytb-L1-MpGDH-M1、AsCytbx2-MpGDH-M1、AsCytb-L2-MpGDH-M1、MpGDH-M1-CtCytbの精製酵素を用いて、印刷電極測定によるクロノアンペロメトリーを行った。具体的には、グラッシーカーボンの作用電極、銀塩化銀の参照電極が印刷されてなる、DEP Chip電極（丸形・カーボン・ダムリング付き；バイオデバイステクノロジー社製）上に、終濃度約100mMのリン酸緩衝液(pH7.0)及び130μgの精製酵素MpGDH-M1液または80μgの精製酵素MtCytb-MpGDH-M1液、80μgの精製酵素CtCytb-MpGDH-M1液、80μgの精製酵素AsCytb-L1-MpGDH-M1液、80μgの精製酵素AsCytbx2-MpGDH-M1液、80μgの精製酵素AsCytb-L2-MpGDH-M1液、80μgの精製酵素MpGDH-M1-CtCytb液を10μLに溶解した液を載せた。その後、DEP Chip専用コネクターを用いて、オートマチック ポラリゼーションシステム HSV-100(北斗電工社製）に接続した。そして、+300mVもしくは+500mV(vs. Ag/AgCl)の電圧を印加して、100mMグルコース溶液5μLを電極上に載せて反応を行い、40秒間の電流値を測定した。【０１６２】
結果を図４〜１０に示す。図４は+500mV(vs. Ag/AgCl)の電圧を印加した際のCytbドメインを有しないMpGDH-M1酵素のクロノアンペロメトリー測定結果である。グルコース存在下において測定開始から40秒間後の応答電流は19nAであり、グルコース不在下では16nAであった。したがって、これらの差し引きは3nAとなり、グルコースの有無により応答電流に有意の差は見られなかった。また、同様にして+300mV(vs. Ag/AgCl)の電圧を印加した際のCytbドメインを有しないMpGDH-M1酵素のクロノアンペロメトリー測定の結果、グルコース存在下において測定開始から40秒間後の応答電流から、グルコース不在下における応答電流の差し引きは4nAとなり、グルコースの有無により応答電流に有意の差は見られなかった。【０１６３】
図５は+500mV(vs. Ag/AgCl)の電圧を印加した際のMtCytb-MpGDH-M1のクロノアンペロメトリー測定結果である。グルコース存在下において測定開始から40秒間後の応答電流は64nAであり、グルコース不在下では18nAであった。したがって、これらの差し引きは46nAとなり、グルコースを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。また、＋300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧でもグルコースを添加した場合に測定開始から40秒後において応答電流が30nAと高い値が示された。グルコース不在下では18nAであった。したがって、これらの差し引きは12nAとなり、グルコースを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。【０１６４】
図６は+500mV(vs. Ag/AgCl)の電圧を印加した際のCtCytb-MpGDH-M1のクロノアンペロメトリー測定結果である。＋300mV及び＋500mV(vs. Ag/AgCl)のいずれの場合についてもグルコースを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。＋300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧でも測定開始から40秒後において応答電流が19nAと検出可能な値が示された。グルコース不在下では10nAであった。したがって、これらの差し引きは9nAとなり、グルコースを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。同様の手法により、以下の実施例においてもCytb-GDH融合タンパク質とCytbドメインを有しないMpGDH-M1酵素との応答電流を比較することができる。【０１６５】
図７は+500mV(vs. Ag/AgCl)の電圧を印加した際のAsCytb-L1-MpGDH-M1のクロノアンペロメトリー測定結果である。＋500mV(vs. Ag/AgCl)の場合についてグルコースを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。＋500mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧で測定開始から４０秒後において応答電流が9nAと検出可能な値が示された。【０１６６】
図８は+500mV(vs. Ag/AgCl)の電圧を印加した際のAsCytbx2-MpGDH-M1のクロノアンペロメトリー測定結果である。＋300mV及び＋500mV(vs. Ag/AgCl)のいずれの場合についてもグルコースを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。＋300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧で測定開始から40秒後において応答電流が15nAと検出可能な値が示された。【０１６７】
図９は+500mV(vs. Ag/AgCl)の電圧を印加した際のAsCytb-L2-MpGDH-M1のクロノアンペロメトリー測定結果である。＋500mV(vs. Ag/AgCl)の場合についてグルコースを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。＋500mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧で測定開始から４０秒後において応答電流が15nAと検出可能な値が示された。【０１６８】
図１０は+500mV(vs. Ag/AgCl)の電圧を印加した際のMpGDH-M1-CtCytbのクロノアンペロメトリー測定結果である。＋300mV及び＋500mV(vs. Ag/AgCl)のいずれの場合についてもグルコースを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。＋300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧でも測定開始から４０秒後において応答電流が11nAと検出可能な値が示された。【０１６９】
続いて、MpGDH-M1もしくはHiCytb-MpGDH-M1を用いて、クロノアンペロメトリー測定を行った。具体的には、グラッシーカーボンの作用電極、銀塩化銀の参照電極が印刷されてなる、DEP Chip電極（丸形・カーボン・ダムリング付き；バイオデバイステクノロジー社製）の作用極上に、80μgの精製酵素MpGDH-M1を含む溶液または80μgの精製酵素HiCytb-MpGDH-M1を含む溶液を添加した後に、室温で風乾させた。その後、DEP Chip専用コネクターを用いて、ALS 電気化学アナライザー 814D(BAS社製）に接続した。続いて、終濃度20mMのリン酸緩衝液(pH7.5)/1.5Mの塩化カリウム/20mMグルコース溶液10μLを電極上に載せて反応を行い、+300mV (vs. Ag/AgCl)の電圧を印加して、40秒間の電流値を測定した。対照として、グルコースを含まない溶液でも同様に測定を行った。【０１７０】
その結果、グルコース存在下において測定開始から40秒間後の応答電流は3nAであり、グルコース不在下では1nAであった。したがって、これらの差し引きは2nAとなり、本条件においても、Cytbドメインを有しないMpGDH-M1酵素のクロノアンペロメトリー測定では、グルコースの有無により応答電流に有意の差は見られなかった。【０１７１】
HiCytb-MpGDH-M1を用いた場合には、＋300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧で測定開始から40秒後において応答電流が16nAと検出可能な値が示された。【０１７２】
[実施例２]
Mucor DR056860由来GDH(MdrGDH)をコードする遺伝子を取得した（国際公開第2013/118798号参照）。MdrGDHのアミノ酸配列は配列番号４に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号１１２に示す。【０１７３】
実施例２と同様に、In-Fusion HD Cloning Kitを使用して、配列番号１３０〜１３３の合成オリゴヌクレオチドを用いて、MtCytb及び配列番号１２２に記載されたリンカー配列をpUC19-MdrGDHを鋳型にして挿入し、MdrGDHのN末端にシトクロムを融合させたMtCytb-MdrGDHのコンストラクト用プラスミド（pUC19−MtCytb-MdrGDH）を得た。また、同様にして配列番号１３４〜１３７の合成オリゴヌクレオチドを用いて、CtCytb及び配列番号１２４に記載されたリンカー配列をpUC19-MdrGDHを鋳型にして挿入し、MdrGDHのN末端にシトクロムを融合させたCtCytb-MdrGDHのコンストラクト用プラスミド（pUC19−CtCytb-MdrGDH）を得た。続いて、実施例２と同様に、MdrGDH、MtCytb-MdrGDH及びCtCytb-MdrGDHをコードする遺伝子をA. sojaeで発現させ、精製標品を得、応答電流測定を行った。【０１７４】
実施例１と同様にして、DEP Chip電極の作用極上に、80μgの精製酵素MdrGDHを含む溶液、80μgの精製酵素MtCytb-MdrGDHを含む溶液または80μgの精製酵素CtCytb-MdrGDHを含む溶液を添加した後に、室温で風乾させた。続いて、終濃度20mMのリン酸緩衝液(pH7.5)/1.5Mの塩化カリウム/20mMグルコース溶液10μLを電極上に載せて反応を行い、+300mV (vs. Ag/AgCl)の電圧を印加して、40秒間の電流値を測定した。【０１７５】
クロノアンペロメトリーの結果、MdrGDHを用いた場合には、＋300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧で測定開始から40秒後において応答電流が7nAであった。グルコース不在下では4nAであった。したがって、これらの差し引きは3nAとなり、グルコースの有無により応答電流に有意の差は見られなかった。一方で、MtCytb-MdrGDHを用いた場合には、＋300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧で測定開始から40秒後において応答電流が13nA、グルコース不在下では6nAであった。したがって、これらの差し引きは7nAとなり、シトクロムを有さない場合と比較して、有意に高い応答電流を示した。また、CtCytb-MdrGDHを用いた場合には、＋300mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧で測定開始から40秒後において応答電流が27nA、グルコース不在下では7nAであった。したがって、これらの差し引きは20nAとなり、シトクロムを有さない場合と比較して、有意に高い応答電流を示した。【０１７６】
[実施例３]
カーボンの作用電極、銀の参照電極が印刷されてなる、SCREEN-PRINTED ELECTRODES(Drop Sense社製、DRP-110）の作用極上に、MtCytb-MpGDH-M1を875μg塗布し、37℃で乾燥させた。その後、37℃で溶解させた3wt%のAgarose L（株式会社ニッポンジーン製）を25μL塗布し、室温で冷却することで包括固定した。続いて、酵素固定化印刷電極を、専用コネクター(Drop Sense社製、DRP-CAC）を用いて、ALS  電気化学アナライザー 814D(BAS社製）に作用極として接続した。さらに、参照極として飽和KCl銀塩化銀参照電極（BAS社製）、対極として白金電極（BAS社製）を用い、それぞれALS 電気化学アナライザー 814Dに接続した。3極を30mLの100mMリン酸カリウム溶液(pH7.0)に入れ、スターラーにより攪拌しながら、1Mグルコースを適宜添加し、+500mV(vs. Ag/AgCl)の印加電圧での応答電流を計測した。グルコース添加後、一定の応答電流値となってから、その値を記録し、グルコースを再添加するというサイクルを繰り返した。その結果、0.1mMから50mMグルコースにおいて、遊離型メディエーターを溶液中に添加することなく、応答電流の増加を示すことができた。【０１７７】
以上より、遊離型メディエーターの不在下でも応答電流が観察されたことから、本発明のCytb-GDHはグルコースをグルコノラクトンへ酸化するときに、酵素から電極へと直接電子を受け渡していると考えられる。また、GDHに連結するCytbは、MtCytbでもCtCytbでもAsCytbでも応答電流が観察されたことから、他の由来のCytbも用いることができると考えられる。また、GDHのN末端にCtCytbを連結した場合もC末端にCtCytbを連結した場合も応答電流が観察されたことから、他の由来のCytbをGDHに連結する場合にも、GDHのN末端に連結してもよくC末端に連結してもよいと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明のCytb-GDHを用いることにより、遊離型メディエーターを従来よりも低濃度で使用して、または遊離型メディエーターを使用することなく、グルコース測定を行うことができる。また本発明のCytb-GDHはグルコースセンサーに用いることができ、連続グルコース測定に用いることができる。【０１７９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。【０１８０】
配列の簡単な説明
配列番号１  Mucor prainii由来GDH（MpGDH）のアミノ酸配列
配列番号２  MpGDH遺伝子の塩基配列
配列番号３  Mucor hiemalis由来GDH（MhGDH）のアミノ酸配列
配列番号４  Mucor DR056860由来GDH（MdrGDH）のアミノ酸配列
配列番号５  Mucor subtilissimus由来GDH（MsGDH）のアミノ酸配列
配列番号６  Mucor guilliermondii由来GDH（MgGDH）のアミノ酸配列
配列番号７  Circinella simplex由来GDH（CsGDH）のアミノ酸配列
配列番号８  Circinella属由来GDH（CrGDH）のアミノ酸配列
配列番号９  Mucor circinelloides由来GDH（McGDH）のアミノ酸配列
配列番号１０  MpGDH-M1グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列
配列番号１１  MpGDH-M1遺伝子の塩基配列
配列番号１２  Mt Cytbのアミノ酸配列
配列番号１３  配列番号１２のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１４  Ct Cytbのアミノ酸配列
配列番号１５  配列番号１４のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１６  As Cytbの推定アミノ酸配列
配列番号１７  配列番号１６のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１８  Hypoxylon haematostroma由来Cytbのアミノ酸配列
配列番号１９  Chaetomium attrobruneum由来Cytbのアミノ酸配列
配列番号２０  Neurospora crassa由来Cytbのアミノ酸配列
配列番号２１  Humicola insolens由来のアミノ酸配列
配列番号２２  Thielavia terrestris由来のアミノ酸配列
配列番号２３  リンカー配列  Ｍｔ
配列番号２４  リンカー配列  Ｍｔ塩基配列
配列番号２５  リンカー配列  Ｃｔ
配列番号２６  リンカー配列  Ｃｔ塩基配列
配列番号２７  リンカー配列  ＡｓＬ１
配列番号２８  リンカー配列  ＡｓＬ１塩基配列
配列番号２９  リンカー配列  ＡｓＬ２
配列番号３０  リンカー配列  ＡｓＬ２塩基配列
配列番号３１  リンカー配列  Ｃ末端Ｃｔ
配列番号３２  リンカー配列  Ｃ末端Ｃｔ塩基配列
配列番号３３  MtCytb-MpGDH-M1のアミノ酸配列
配列番号３４  MtCytb-MpGDH-M1遺伝子の塩基配列
配列番号３５  CtCytb-MpGDH-M11のアミノ酸配列
配列番号３６  CtCytb-MpGDH-M1遺伝子の塩基配列
配列番号３７  AsCytb-L1-MpGDH-M11のアミノ酸配列
配列番号３８  AsCytb-L1-MpGDH-M1遺伝子の塩基配列
配列番号３９  AsCytbx2-MpGDH-M11のアミノ酸配列
配列番号４０  AsCytbx2-MpGDH-M1遺伝子の塩基配列
配列番号４１  AsCytb-L2-MpGDH-M11のアミノ酸配列
配列番号４２  AsCytb-L2-MpGDH-M1遺伝子の塩基配列
配列番号４３  MpGDH-M1-CtCytbのアミノ酸配列
配列番号４４  MpGDH-M1-CtCytb遺伝子の塩基配列
配列番号４５〜４８  MtCytb-MpGDH-M1作製用プライマー
配列番号４９〜５２  CtCytb-MpGDH-M1作製用プライマー
配列番号５３〜５６  AsCytb-L1-MpGDH-M1作製用プライマー
配列番号５７〜６０  AsCytbx2-MpGDH-M1作製用プライマー
配列番号６１〜６２  AsCytb-L2-MpGDH-M1作製用プライマー
配列番号６３〜６６  MpGDH-M1-CtCytb作製用プライマー
配列番号６７  Aspergillus terreus由来のCDHのリンカー配列GDCSGDGGGGSGPEPVPVPDG
配列番号６８  HSP70由来のリンカー配列GGGGSLVPRGSGGGGS
配列番号６９  鶏卵リゾチーム由来リンカー配列GGGGSLVPRGSGGGGS
配列番号７０  ヘマグルチニンHAペプチド由来リンカー配列GGSGGGGG
配列番号７１−１１１  リンカー
配列番号１１２  配列番号４のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１１３  配列番号２１のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１１４  HiCytb-MpGDH-M1のアミノ酸配列
配列番号１１５  配列番号１１４のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１１６  MtCytb-MdrGDHのアミノ酸配列
配列番号１１７  配列番号１１６のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１１８  CtCytb-MdrGDHのアミノ酸配列
配列番号１１９  配列番号１１８のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１２０  リンカー配列  Hi
配列番号１２１  リンカー配列  Hi塩基配列
配列番号１２２  リンカー配列  Mt-Mdr
配列番号１２３  リンカー配列  Mt-Mdr塩基配列
配列番号１２４  リンカー配列  Ct-Mdr
配列番号１２５  リンカー配列  Ct-Mdr塩基配列
配列番号１２６〜１２９  HiCytb-MpGDH-M1作製用プライマー
配列番号１３０〜１３３  MtCytb-MdrGDH作製用プライマー
配列番号１３４〜１３７  CtCytb-MdrGDH作製用プライマー【０１８１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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