(57)【要約】要約  粒子浮遊液から連続的に媒体を回収することができる、液状の媒体中に粒子が分散された粒子浮遊液から媒体を回収する方法及び装置が開示されている。液状の媒体中に粒子が分散された粒子浮遊液から媒体を回収する方法は、第１の流路と、第１の流路に接続され、第１の流路よりもサイズが大きい第２の流路と、第２の流路から分岐し、第２の流路よりもサイズが小さい第３の流路を具備する流路デバイスを準備する工程と、前記第１の流路側から前記粒子浮遊液を前記第２の流路側に流通させる工程と、前記第３の流路から、媒体を回収する工程とを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液状の媒体中に粒子が浮遊した粒子浮遊液から媒体を回収する方法であって、
第１の流路と、該第１の流路に接続され、第１の流路よりもサイズが大きい第２の流路と、該第２の流路から分岐し、該第２の流路よりもサイズが小さい第３の流路を具備する流路デバイスを準備する工程と、
前記第１の流路側から前記粒子浮遊液を前記第２の流路側に流通させる工程と、
前記第３の流路から、媒体を回収する工程とを含む、粒子浮遊液の媒体の回収方法。
【請求項２】
前記第１の流路の上流側に、該第１の流路よりもサイズが大きい第４の流路が接続されており、前記粒子浮遊液を、該第４の流路から前記第１の流路に流通させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記流路デバイスがマイクロ流路チップの形態にある請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記粒子が細胞であり、前記媒体が液体培地である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が微生物細胞である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が細菌又は酵母である請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記第１の流路、又は該第１の流路よりもサイズが大きい第４の流路が接続されている場合には、該第４の流路に、粒子の軸集中により得られた、粒子濃度が低減された粒子浮遊液を供給する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第１の流路と、該第１の流路に接続され、第１の流路よりもサイズが大きい第２の流路と、該第２の流路から分岐し、該第２の流路よりもサイズが小さい第３の流路を具備する、粒子浮遊液から媒体を回収する媒体回収装置。
【請求項９】
前記第１の流路の上流側に、該第１の流路よりもサイズが大きい第４の流路が接続されている請求項８記載の装置。
【請求項１０】
前記流路デバイスがマイクロ流路チップの形態にある請求項８又は９記載の装置。
【請求項１１】
前記装置は、粒子の軸集中を行う第５の流路と、該第５の流路から分岐した、軸集中により生じる、粒子濃度が低減された粒子浮遊液を回収する第６の流路をさらに具備し、該第６の流路が、前記第１の流路の上流側、又は該第１の流路よりもサイズが大きい第４の流路が接続されている場合には、該第４の流路の上流側に接続されている請求項８〜１０のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液状の媒体中に粒子が浮遊した粒子浮遊液から媒体を分離する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、細菌や酵母のような微生物を液体培養して微生物に有用物質を生産、分泌させ、液体培地中に分泌された有用物質を回収することにより有用物質を生産する方法が工業的に広く行われている。このような方法を実施するためには、有用物質の回収時に培養液と微生物細胞とを分離することが必要である。この分離は、従来より、通常、遠心分離又はろ過により行われている。【０００３】
しかしながら、遠心分離やろ過は、バッチ式であり、微生物細胞を含む培養物から連続的に微生物細胞を含まない液体培地を回収することはできない。【０００４】
一方、非特許文献１には、種々のサイズの粒子を含む粒子浮遊液中の粒子を、粒子のサイズに基づいて分離する方法が記載されている。この方法では、狭い流路と広い流路が接続された流路デバイスを用い、狭い流路から広い流路に粒子浮遊液を流通させ、広い流路中では大きな粒子が流路の中央付近を流通し、小さな粒子がその外側の部分を流れる現象を利用して粒子を粒子サイズに基づき分離している。さらに、粒子を、狭い流路の一方の壁面上に並べるために粒子を含まない液を狭い流路の入口付近で合流させている。【０００５】
しかしながら、非特許文献１記載の方法では、粒子を含まない媒体を分離することは記載も示唆もされておらず、非特許文献１記載の装置によっては、粒子を含まない媒体を分離することはできない。また、粒子の軸集中現象を利用して全血から血漿を分離する方法も知られている（特許文献１、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2010-237050号公報
【特許文献２】米国特許公報8,889,071 B2
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Masumi Yamada et al., Anal. Chem. 2004, 76, 5465-5471
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、粒子浮遊液から連続的に粒子を含まない媒体を分離することができる、液状の媒体中に粒子が分散された粒子浮遊液から粒子を含まない媒体を分離する方法及び装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、狭い流路から広い流路に粒子浮遊液を流通させると、広い流路内では、流路の周縁部には粒子が流れない現象を見出し、粒子が流れない流路周縁部から媒体を回収するための流路を分岐させ、この分岐から媒体を回収することによって、実質的に粒子を含まない媒体の分離が可能であることに想到し、かつ、実験的に確認して本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、液状の媒体中に粒子が分散された粒子浮遊液から媒体を回収する方法であって、
第１の流路と、該第１の流路に接続され、第１の流路よりもサイズが大きい第２の流路と、該第２の流路から分岐し、該第２の流路よりもサイズが小さい第３の流路を具備する流路デバイスを準備する工程と、
前記第１の流路側から前記粒子浮遊液を前記第２の流路側に流通させる工程と、
前記第３の流路から、媒体を回収する工程とを含む、方法を提供する。【００１１】
また、本発明は、第１の流路と、該第１の流路に接続され、第１の流路よりもサイズが大きい第２の流路と、該第２の流路から分岐し、該第２の流路よりもサイズが小さい第３の流路を具備する、粒子浮遊液から媒体を回収する媒体回収装置を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、粒子浮遊液を循環させたまま、実質的に粒子を含まない媒体を連続的に回収することが可能な、媒体の分離方法及びそのための装置が初めて提供された。本発明の方法を、例えば、有用物質を生産する微生物の培養物からの培地の回収方法に適用すれば、新鮮な液体培地を補充しながら培養物を循環させ、分泌された有用物質を含む培地を連続的に回収することが可能となるので、有用物質の生産効率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１の上図は、本発明の好ましい一実施形態になる分離装置の模式平面図であり、下図は、上図の要部拡大図である。
【図２】図２は、本発明の方法に利用可能な軸集中現象を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の方法は、液状の媒体中に粒子が分散された粒子浮遊液から媒体を分離して回収する方法である。ここで、「粒子」は、粒径（直径、ただし、球形ではなく、長径と短径が存在する場合には、長径）が通常、０．５μm〜５０μm程度、好ましくは１μm〜１０μm程度の粒子である。粒子の例としては、大腸菌等の細菌や酵母のような微生物；哺乳動物のような多細胞生物の細胞等を挙げることができるが、これらに限定されるものではなく、工業的に生産されるラテックス粒子やプラスチック粒子等であってもよい。「液状の媒体」は、上記した粒子を浮遊（懸濁）させている媒体であり、粒子を浮遊できる液体であれば何ら限定されるものではない。細胞の培養物の場合には液体培地等であり、工業的な粒子の場合には、その粒子の製造に利用される溶媒や分散媒等である。媒体は、任意の成分を溶解した溶液であってもよい。「粒子浮遊液」は、上記媒体中に上記粒子が浮遊されている液であり、代表的な例としては、微生物や多細胞生物の細胞の培養物や、工業的に製造された粒子を分散した分散液等を挙げることができる。
【００１５】
本発明の方法に用いられる流路デバイスは、第１の流路と、該第１の流路に接続され、第１の流路よりもサイズが大きい第２の流路と、該第２の流路から分岐し、該第２の流路よりもサイズが小さい第３の流路を具備する。ここで、「サイズが大きい」とは、流路の断面積が大きいことを意味する。各流路は、基板内に同じ深さで形成することもできる。この場合には、「サイズが大きい」は、「幅が広い」ことを意味し、「サイズが小さい」は「幅が狭い」ことを意味する。各流路の深さが同じ場合、第１の流路と第２の流路との幅の比率は、第２の流路の周縁部に粒子が含まれない領域が形成されるのであれば特に限定されないが、通常、5:100〜30:100程度である。また、第２の流路と第３の流路の幅の比率は、第３の流路から実質的に粒子を含まない媒体を回収できるのであれば特に限定されないが、通常、100:10〜100:30程度である。ここで実質的に粒子を含まない媒体とは、目的とする機能に支障がない程度にまで粒子濃度が減少している媒体を意味する。
【００１６】
前記第１の流路の上流側に、該第１の流路よりもサイズが大きい第４の流路が接続されていることが好ましい。第４の流路は設けなくてもよいが、第４の流路が存在すると、比較的小さな圧力で第４の流路に粒子浮遊液を流した場合でも、サイズが小さい第１の流路では大きな圧力が得られるので好ましい。第４の流路と第１の流路が同じ深さの場合、幅の比率は、特に限定されないが、通常、100:5〜100:30程度である。なお、プラスチック、ガラス、紙等の成形等により流路を形成すれば、流路の深さを容易に変えることができるので、流路の深さは同じである必要はなく、この場合には、上記した第１の流路と第２の流路との好ましい幅の比率、上記した第２の流路と第３の流路の幅の好ましい比率、及び上記した第４の流路と第１の流路の好ましい幅の比率は、各流路の好ましい断面積の比率である。
【００１７】
上記した流路デバイスにおける流路の幅や深さは特に限定されないが、流路デバイスは、マイクロ流路チップの形態にあることが好ましい。マイクロ流路チップは、基板（チップ）内にマイクロ流路（すなわち、通常、幅が５μm〜２mm程度、特には１０μm〜２mm程度、深さが５μm〜２mm程度、特には５μm〜５００μm程度の流路）を形成したものである。マイクロ流路チップは、流路が小さいので流路を流通する液の量は少ないが、液量が少ないが故に混合や分離の効率が良く、液の加熱や冷却も速やかに行うことができるという有利な利点を有している。個々の流路を流れる液体の流量は少ないが、多数のマイクロ流路チップを同時併用すれば、全体としての処理量を大きくすることができる。このため、近年様々な工業的な化学プロセスにおいても盛んに実用化されつつあるものである。本発明においても、流路デバイスをマイクロ流路チップとすることにより、媒体の回収効率を高めることができるので好ましい。
【００１８】
マイクロ流路チップは、例えば、各流路の底面を構成する平板（下部基板）上に、各流路を貫通させたシート（上部基板）を積層して固定することにより容易に作製することができる。この場合、シートの厚さは一定であるので、各流路の深さは同じとなる。したがって、流路のサイズは、流路の幅により規定される。もっとも、上記のとおり、マイクロ流路チップであっても、型を用いたプラスチック、ガラス、紙などの成形により、各流路の深さを容易に変えることが可能であるので、深さが同じということは必須的ではない。
【００１９】
マイクロ流路チップの場合、いずれの流路とも、幅が通常、５μｍ〜２mm程度、特に１０μｍ〜２mm程度、深さも通常、５μｍ〜２mm程度、特に５μｍ〜５００μｍでよいが、上記した第１の流路の幅は、例えば１０μｍ〜２００μｍであり、前記第２の流路の幅は、例えば２００μｍ〜２ｍｍである。また、第３の流路及び第４の流路の幅は、通常、これらの幅の第１の流路及び第２の流路に対して上記した範囲の比率となる幅である。また、第１の流路１２の長さは任意でよく、例えば、1mm〜5mm程度である。他の流路の長さも全くの任意でよい。
【００２０】
流路デバイスがマイクロ流路チップであり、第４の流路も形成した好ましい一実施形態の模式平面図を図１に示す。図１に示す流路デバイス１０は、第１の流路１２と、該第１の流路１２に接続され、第１の流路１２よりも幅が大きい第２の流路と、該第２の流路から分岐し、該第２の流路よりも幅が小さい第３の流路を具備する。さらに、第１の流路１２の上流側に、該第１の流路１２よりも幅が大きい第４の流路１８が接続されている。
【００２１】
次に、図１に示すマイクロ流路チップを用いて本発明の方法を実施する操作方法と動作原理を説明する。図１中の３つの白抜き矢印は、それぞれ液の流れる方向を示している。先ず、第４の流路１８の上流側（第１の流路１２が接続されている側とは反対側）から、粒子浮遊液２０を流す。これは図示しないポンプを用いて容易に行うことができる。図１中、参照番号２２で示される多数の小さな円は、粒子浮遊液中２０に浮遊する粒子を模式的に示す。この際の流速は、特に限定されないが、通常、１０μＬ／分〜２００μＬ／分程度である。また、圧力は、特に限定されないが、通常、５０ヘクトパスカル〜５００ヘクトパスカル程度である。
【００２２】
そうすると、粒子浮遊液２０は、第１の流路１２に進む。なお、第４の流路１８から、粒子２２がスムースに第１の流路１２内に侵入するように、第４の流路１８の下流端部（第１の流路１２に近い側）には、テーパー部１８ａを設けることが好ましい。
【００２３】
次いで、粒子浮遊液２０は、第２の流路１４に進む。この際、粒子浮遊液２０は、第４の流路１８内での圧力よりも大きな圧力（概ね、第４の流路内の圧力に、第４の流路１８と第１の流路１２の断面積の比を乗じた圧力になる）で第２の流路１４に押し出される。
【００２４】
本願発明者らは、第２の流路１４に押し出された粒子浮遊液２０中の粒子２２は、第２の流路１４の中央部分を進み、周縁部には進まないことを見出した。この様子を図１の下図に模式的に示す。図１の下図は、第１の流路１２の近傍を拡大した模式平面図である。図１の下図に模式的に示されるように、粒子２２は、「粒子の流出領域」と図中に記載されている領域にしか進まず、その周縁部には、粒子２２が存在しない領域が生じる。そこで、この領域に第３の流路１６を分岐として設けることにより、粒子２２を実質的に含まない媒体のみが第３の流路１６に進入する。したがって、粒子２２を実質的に含まない媒体のみを第３の流路１６から回収することができる。なお、第３の流路１６は、図示のように、第２の流路の最上流側に設けることが好ましい。粒子２２は、図１下図に示す粒子の流出領域を進むが、下流側に進むにつれて再び拡散して第２の流路１４の周縁部にも入ってくるので、まだ拡散が起きていない部位で第３の流路１６を分岐させることが好ましい。なお、粒子２２を含む粒子浮遊液２０は、第２の流路１４内をそのまま進む。
【００２５】
上記した好ましい一実施形態では、各流路の深さは同じであり、粒子の流出領域は、流路の平面方向に規定されているが、各流路の深さを変えて、粒子の流出領域を例えば鉛直方向等、任意の方向に規定することも可能である。深さの異なる流路は、型を用いたプラスチック、ガラス、紙等の成形や、マイクロドリルを用いた掘削等により作製可能である。
【００２６】
上記した好ましい一実施形態では、第１の流路１２の下流端は、第２の流路１４の上流端のほぼ中央に接続しているが、中央からずれた位置（周縁部でも可）に接続することも可能である。この場合には、第３の流路１６は、第１の流路１２から遠い側の周縁部に設けることが、粒子２２の混入を避ける上で好ましい。
【００２７】
なお、非特許文献１に記載された装置では、第４の流路１８と第１の流路１２の接続部分にさらなる流路を接続し、粒子を含まない媒体を流して粒子を第１の流路内の一方の壁面に接触させているが、本発明においては、このようなさらなる流路を設けなくても、粒子を含まない媒体を回収することが可能であるので、このようなさらなる流路は不要である。
【００２８】
上記したマイクロ流路チップ１０を、粒子浮遊液の供給源タンク（例えば微生物の培養物に適用する場合には培養タンク）に接続される閉じた回路に組み入れ、ポンプにより回路に粒子浮遊液を連続的に循環させることにより、第３の流路１６から連続的に粒子２２を含まない媒体を回収することができる。この場合、回収される媒体と同量の新鮮な媒体を補充しながら行うことにより、長期間に亘って連続的に粒子２２を含まない媒体を回収することができる。したがって、本発明の方法を微生物等の細胞の培養物に適用した場合には、細胞の培養を全く中断することなく、細胞により生産された有用物質を含む液体培地を長期間に亘って連続的に回収することができるので、従来法のように培養を少なくとも部分的に中断して遠心分離やろ過を行う必要がなく、有用物質の回収効率を大幅に向上させることができる。
【００２９】
本発明の方法を工業的に実施する場合、マイクロ流路チップが１つだけでは処理量が少ないので、上記したようなマイクロ流路チップを多数同時併用することが好ましい。この場合、複数のマイクロ流路チップを直列に接続する（すなわち、マイクロ流路の第２の流路１４の下流端を、次のマイクロ流路チップの第４の流路１８の上流端に接続する）こともできるし、並列に接続（例えば、粒子浮遊液の供給源タンクに多数の出入り口を設けてそれぞれ閉じた回路を形成し、各回路内に上記マイクロ流路チップを組み込む等）こともできるし、直列接続と並列接続の両者を併用することもできる。これらにより、工業的に実用化が可能な程度の処理量を達成することができる。これは様々な他の化学プロセスにおいても確認されている。また、第３の流路１６から回収された媒体を、さらに他のマイクロ流路チップの第４の流路１８の上流側から供給し、そのマイクロ流路チップの第３の流路１６から培地を回収することにより、１個目のマイクロ流路チップから回収された媒体に混入する恐れがある粒子２２を確実に排除することもできる。
【００３０】
上記した本発明の装置に供給する粒子浮遊液として、粒子の軸集中により得られた、粒子濃度が低減された粒子浮遊液を用いることにより、粒子を含まない媒体をより確実に回収することが可能になるので好ましい。「粒子の軸集中」現象は、直線状のマイクロ流路中に粒子浮遊液を流すと、粒子が流路の中心付近に集中し、その結果、流路の中心付近では粒子濃度が高く、流路の周縁部では粒子濃度が低くなる現象である。この現象自体は公知であり、例えば、特開2010-237050号公報や、米国特許公報8,889,071 B2に記載されている。すなわち、幅が３０μm〜５００μm、好ましくは１００μm〜４００μmであり、深さが１０μm〜５００μmの範囲、好ましくは５０μm〜４００μmの範囲であるマイクロ流路に粒子浮遊液を流通させると、例えば、図２の顕微鏡写真に示されるように、粒子の大部分が流路の中心から直径の約８０％の範囲内を流れ、直径の約１０％ずつの流路周縁部に流れる粒子は少なくなっている。軸集中現象を起こすためには、粒子浮遊液を所定の流速に達するまで加速する（以下、便宜的に「軸集中加速」と呼ぶことがある）必要があり、所定の流速は、流路の幅と深さに応じて適宜設定することができる。すなわち、軸集中が起きているかどうかは、顕微鏡観察により容易にわかるので、ルーチンな実験により、軸集中現象が起きる流速を容易に設定することができる。図２の顕微鏡写真は、幅１００μm、深さ４０μmの流路に３０μL／分の流速で粒子浮遊液を流した際の様子を示すものである。軸集中加速を行うための流路（第５の流路）の長さは、１０mm以上であり、上限は特にないが、長すぎても無駄であるので、通常、１０mm〜５０mm、好ましくは２０mm〜３０mm程度である。
【００３１】
粒子が軸集中した粒子浮遊液から、粒子濃度が低減した浮遊液を回収することは、単に軸集中加速した浮遊液が流れる流路に分岐路（第６の流路）を設ければよい。この分岐路には、軸集中現象により粒子の濃度が低下した粒子浮遊液が流れるので、これを、前記第１の流路、又は第４の流路が接続されている場合には、第４の流路に供給することにより、粒子を含まない媒体をより確実に回収することが可能になる。この場合、分岐路の幅は、軸集中加速を行う軸集中加速流路の幅の５％〜３０％程度が好ましい。また、分岐路は、流路を上から見て左右に１本ずつ設け、それぞれの分岐路に本発明の装置をそれぞれ接続することも可能である。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例に基づき、本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００３３】
実施例１
図１に示すマイクロ流路チップを作製した。第２の流路１４及び第４の流路１８の幅は２mm、第１の流路の幅は１００μｍ、第３の流路の幅は５００μｍ、各流路の深さは全て１００μｍであった。また、第１の流路１２の長さは、５mmであった。このマイクロ流路チップの上流にポンプ、流量計及び圧力計を直列に接続した。【００３４】
直径１０μｍ又は５０μｍのプラスチックビーズの浮遊液（媒体は水、粒子濃度２重量％）を調製した。このビーズ浮遊液を、ポンプによりマイクロ流路チップの第４の流路１８の上流から流した。この際の圧力は１２５ヘクトパスカル又は１５０ヘクトパスカルであり、流速は３０μＬ／分〜５０μＬ／分であった。【００３５】
その結果、第３の流路１６から、粒子を全く含まない媒体を連続的に回収することができた。回収速度は、1.75μL/分(１２５ヘクトパスカル又は3.5μL/分（２５０ヘクトパスカル）であった。【００３６】
実施例２
図１に示すマイクロ流路チップを作製した。第２の流路１４及び第４の流路１８の幅は３００μｍ、第１の流路の幅は１００μｍ、第３の流路の幅は１００μｍ、各流路の深さは全て１００μｍであった。また、第１の流路１２の長さは、５mmであった。このマイクロ流路チップの上流にポンプ、流量計及び圧力計を直列に接続した。【００３７】
直径約５μｍの酵母培養液を、ポンプによりマイクロ流路チップの第４の流路１８の上流から流した。この際の圧力は１００ヘクトパスカル又は３００ヘクトパスカルであり、流速は３０μＬ／分〜９０μＬ／分であった。【００３８】
酵母培養液は以下に示す手法に従って調製した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＦＯ  １０２１７株をＹＰＤ寒天培地（１０  ｇ／ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，  ２０  ｇ／ｌ  Ｐｅｐｔｏｎｅ，  ２０  ｇ／ｌ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ，  ２％  Ａｇａｒ）上で３０℃、一晩、恒温層にて静置培養した。この培養物を、あらかじめ１２１℃、20分間オートクレーブ滅菌したＹＰＤ液体培地（１０  ｇ／ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ，  ２０  ｇ／ｌ  Ｐｅｐｔｏｎｅ，  ２０  ｇ／ｌ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）５０  ｍｌに一白金耳量接種し、３０℃にて24時間、しんとう培養した。得られた培養液を以降の実験に使用した。なお、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＩＦＯ  １０２１７株は、独立行政法人産業技術総合研究所に寄託されているものを使用した。【００３９】
その結果、第３の流路１６から、酵母を全く含まない液体培地を連続的に回収することができた。回収速度は、0.7μL/分(１００ヘクトパスカル）又は4.0μL/分（３００ヘクトパスカル）であった。
【符号の説明】
【００４０】
１０  マイクロ流路チップ
１２  第１の流路
１４  第２の流路
１６  第３の流路
１８  第４の流路
１８ａ  第４の流路のテーパー部
２０  粒子浮遊液
２２  粒子
【図１】
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【図２】
2017104812.tif 000004
【国際調査報告】
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