(57)【要約】  核酸架橋体は、第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、一般式2016204107.tif 000024で表される化合物と、からなり、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基がＲ１及びＲ２に共有結合することで、前記二本鎖核酸が前記化合物に結合している。（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１〜３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
2016204107.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、
一般式１
【化１】
2016204107.tif 000021
で表される化合物と、
からなり、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基がＲ１及びＲ２に共有結合することで、前記二本鎖核酸が前記化合物に結合している核酸架橋体。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１〜３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
【請求項２】
前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている、
ことを特徴とする請求項１に記載の核酸架橋体。
【請求項３】
前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である、
ことを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸架橋体。
【請求項４】
前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である、
ことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の核酸架橋体。
【請求項５】
前記一般式１において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである、
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の核酸架橋体。
【請求項６】
前記一般式１において、Ａｒは、ベンゼンである、
ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の核酸架橋体。
【請求項７】
前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
ことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の核酸架橋体。
【請求項８】
前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である、
ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の核酸架橋体。
【請求項９】
前記一般式１において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０〜１５のアルキルアミド基である、
ことを特徴とする請求項８に記載の核酸架橋体。
【請求項１０】
前記一般式１において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である、
ことを特徴とする請求項９に記載の核酸架橋体。
【請求項１１】
前記一般式１において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
ことを特徴とする請求項６に記載の核酸架橋体。
【請求項１２】
第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなる二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物であって、
一般式２
【化２】
2016204107.tif 000022
で表され、
前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させ、標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、前記二本鎖核酸に前記標的分子を結合させる、
ことを特徴とする二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１〜３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
【請求項１３】
前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている、
ことを特徴とする請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である、
ことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である、
ことを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか１つに記載の化合物体。
【請求項１６】
前記一般式２において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである、
ことを特徴とする請求項１２乃至１５のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１７】
前記一般式２において、Ａｒは、ベンゼンである、
ことを特徴とする請求項１２乃至１６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１８】
前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
ことを特徴とする請求項１２乃至１７のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１９】
前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である、
ことを特徴とする請求項１２乃至１８のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項２０】
前記一般式２において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０〜１５のアルキルアミド基である、
ことを特徴とする請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
前記一般式２において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である、
ことを特徴とする請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
前記一般式２において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
ことを特徴とする請求項１７に記載の化合物。
【請求項２３】
（ａ）第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、
一般式３
【化３】
2016204107.tif 000023
で表される化合物と、
を混合して、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させることで、前記二本鎖核酸に前記化合物を結合させて、核酸架橋体を得る工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸架橋体と、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基を有する標的分子と、を混合して、前記標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、前記核酸架橋体に前記標的分子を結合させる工程と、
を含む二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１〜３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸架橋体、二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成核酸（オリゴヌクレオチド）に蛍光色素等の機能性化合物を有機化学的に連結させた複合分子は、分子生物学の分野では、遺伝子検出等、広く利用されている。特に、医薬開発の分野においては、核酸の血中滞留性の向上、生分解性の抑制、特定細胞への到達を向上させる観点から、合成核酸に、タンパク質（酵素、抗体等）、ペプチド、糖鎖等の生体関連分子を連結させた複合分子の研究開発が活発に進められている。【０００３】
一方で、相補的な塩基対の配列により二本鎖を形成した二本鎖核酸は、生体内においてタンパク質と相互作用することで、遺伝子の発現、転写抑制等の様々な機能を制御していることが知られている。そのため、二本鎖核酸を医薬分子として開発する研究も盛んに報告されており、上述した血中滞留性の向上、生分解性の抑制、特定細胞への到達を向上させる技術として、機能成分子や生体関連分子との複合体の合成研究が数多く報告されている。【０００４】
通常、このような二本鎖核酸と異分子との複合体の調製は、機能性分子を化学的に連結させた一本鎖の核酸と、相補的配列を有する未修飾の核酸と、の間で二本鎖を形成させることにより調整されている（非特許文献１）。しかしながら、相補的な塩基対形成により会合している二本鎖核酸は、加熱や水素結合阻害剤等の添加により容易に一本鎖へと解離してしまう。そのため、二本鎖核酸としての機能を正確に解析するためには、二本鎖の解離を抑制した状態で異分子と連結させる必要がある（非特許文献２）。【０００５】
非特許文献３には、ヘアピン構造により二本鎖を形成している核酸に、異分子（シグナルペプチド）を連結させる手法が報告されている。非特許文献４でも同様に、ヘアピン構造により二本鎖を形成している核酸と第３の分子との複合体を合成したことが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３２，２００４，１７３，Ｃｚａｕｄｅｒｎａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，２００３，２７０５
【非特許文献２】Ｄｅｆｒａｎｃｑ，Ｅ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１９，２００９，６５３４
【非特許文献３】Ｚａｎｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，１９９９，９１
【非特許文献４】Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｓ．，Ｕｅｎｏ，Ｈ．，Ｓｕｎａｄｏｍｅ，Ｔ．，Ｓａｔｏ，Ｋ．ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｄａ，Ａ．Ｔｒｉｓ（ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ；ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｄｕｍｂｂｅｌｌ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔ．２０１３，  １５，６９４−６９７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、非特許文献３、４の方法は、複合体の作製にあたってヘアピン構造を有する長鎖のオリゴヌクレオチドを要するため、コストが高くなる傾向にあり、その利用が限定的なものとならざるを得ない点で課題を残していた。【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、二本鎖核酸の解離の可能性を低減して、二本鎖核酸を標的分子に安定的に結合させることができる核酸架橋体、標的分子を結合させるための化合物、及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するため、本発明の第１の観点に係る核酸架橋体は、
第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、
一般式１
【化１】
2016204107.tif 000003
で表される化合物と、
からなり、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基がＲ１及びＲ２に共有結合することで、前記二本鎖核酸が前記化合物に結合している。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１〜３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）【００１０】
例えば、前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている。【００１１】
例えば、前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である。【００１２】
例えば、前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である。【００１３】
例えば、前記一般式１において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである。【００１４】
例えば、前記一般式１において、Ａｒは、ベンゼンである。【００１５】
例えば、前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である。【００１６】
例えば、前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である。【００１７】
例えば、前記一般式１において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０〜１５のアルキルアミド基である。【００１８】
例えば、前記一般式１において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である。【００１９】
例えば、前記一般式１において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である。【００２０】
本発明の第２の観点に係る二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物は、
第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなる二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物であって、
一般式２
【化２】
2016204107.tif 000004
で表され、
前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させ、標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、前記二本鎖核酸に前記標的分子を結合させる、
ことを特徴とする。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１〜３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）【００２１】
例えば、前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている。【００２２】
例えば、前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である。【００２３】
例えば、前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である。【００２４】
例えば、前記一般式２において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである。【００２５】
例えば、前記一般式２において、Ａｒは、ベンゼンである。【００２６】
例えば、前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である。【００２７】
例えば、前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である。【００２８】
例えば、前記一般式２において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０〜１５のアルキルアミド基である。【００２９】
例えば、前記一般式２において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である。【００３０】
例えば、前記一般式２において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である。【００３１】
本発明の第３の観点に係る二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法は、
（ａ）第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、
一般式３
【化３】
2016204107.tif 000005
で表される化合物と、
を混合して、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させることで、前記二本鎖核酸に前記化合物を結合させて、核酸架橋体を得る工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸架橋体と、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基を有する標的分子と、を混合して、前記標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、前記核酸架橋体に前記標的分子を結合させる工程と、
を含む。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１〜３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、二本鎖核酸の解離の可能性を低減して、二本鎖核酸を標的分子に安定的に結合させることができる核酸架橋体、標的分子を結合させるための化合物、及び二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】二本鎖核酸に、本発明による化合物（架橋化試薬）を介して、標的分子を結合させる過程を模式的に説明する図である。（ａ）は第一の核酸鎖の３’末端及び第二の核酸鎖の５’末端にアミノ基が導入された形態の二本鎖核酸、（ｂ）は第二の核酸鎖が２本の核酸鎖からなり、第二の核酸鎖の一方の核酸鎖の５’末端及び他方の核酸鎖の３’末端にアミノ基が導入され、第一の核酸鎖には、アミノ基が導入されていない形態の二本鎖核酸、（ｃ）は、第一の核酸鎖の３’末端及び第二の核酸鎖の５’末端にアミノ基が導入され、かつ、第一の核酸鎖の５’末端及び第二の核酸鎖の３’末端にアミノ基が導入された形態の二本鎖核酸を説明する図である。
【図２】二本鎖核酸（２本鎖ＤＮＡ）を、架橋化試薬としてｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩを用いて架橋化する過程を模式的に説明する図である。
【図３】（ａ）は、２本鎖ＤＮＡのｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩによる核酸架橋体のグラフを示す図であり、（ｂ）は、２本鎖ＤＮＡのｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩによる架橋化反応の２０％変性ＰＡＧＥによる分析結果を示す図である。
【図４】（ａ）は、２本鎖ＲＮＡのｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩによる核酸架橋体のグラフを示す図であり、（ｂ）は、２本鎖ＲＮＡのｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩによる架橋化反応の２０％変性ＰＡＧＥによる分析結果を示す図である。
【図５】ｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩによって架橋化された２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体に、６−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｈｅｘａｎｏｌ（標的分子）を結合させて逆相カラムＨＰＬＣによって分析した結果を示す図である。（ａ）は、反応前の分析結果、（ｂ）は、反応後の分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
まず、本発明による化合物について詳細に説明する。
【００３５】
本発明による化合物は、二本鎖核酸に標的分子（下述）を結合させるために用いられる。より具体的には、本発明による化合物は、二本鎖核酸を架橋化させて核酸架橋体とし、さらに該核酸架橋体に標的分子を結合させることができる。本発明による化合物を用いることで、二本鎖核酸の解離の可能性を低減して、二本鎖核酸に標的分子を安定的に結合させることができる。本発明による化合物によって、二本鎖核酸を架橋化させて核酸架橋体とし、さらに該核酸架橋体に標的分子を結合させたもの（後述する「核酸−標的分子複合体」）は、分子生物学の分野では、遺伝子検出等に用いられ、医薬の分野においては、核酸−標的分子複合体を用いることで、二本鎖核酸の血中滞留性の向上、生分解性の抑制、特定細胞への到達能向上等の効果を得ることができる。なお、本願明細書において、本発明による化合物を「架橋化試薬」という場合がある。また、本願明細書において、本発明による化合物（架橋化試薬）によって二本鎖核酸を架橋化させる反応を「架橋化反応」という場合がある。
【００３６】
本願明細書において、「標的分子」とは、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基を有するタンパク質、核酸（二本鎖状を含む）、有機分子等を表す。標的分子は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基を有するが、標的分子がこれらの基を元々有していてもよく、標的分子にこれらの基が有機化学的に導入されてもよい。
【００３７】
本発明による化合物は、下記の一般式で表される。
【００３８】
【化４】
2016204107.tif 000006
【００３９】
上記式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン、トリフェニレン等が挙げられる。Ａｒは、好ましくはベンゼンである。
【００４０】
上記式中、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１〜３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３の炭素数は、好ましくは１〜２０である。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。例えば、Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３が炭素数０〜１５のアルキルアミド基であってもよく；Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３がペンチルアミド基であってもよく；Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が単結合であってもよい。
【００４１】
上記式中、Ｒ１は、二本鎖核酸に導入されたアミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、二本鎖核酸に導入されたアミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。このように、Ｒ１（第一の反応性官能基）及びＲ２（第二の反応性官能基）が二本鎖核酸に結合し、Ｒ３（第三の反応性官能基）が標的分子に結合することで、本発明による化合物（架橋化試薬）を介して、二本鎖核酸に標的分子を連結させることができる。なお、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。
【００４２】
Ｒ１（第一の反応性官能基）及びＲ２（第二の反応性官能基）は、それぞれ独立に、例えば、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基又はその誘導体、活性エステル基、エポキシ基、ハロアルキル基等であってもよい。活性エステル基として、例えば、イソチオシアナート基、ペンタフルオロフェニルエステル基、ペンタクロロフェニルエステル基、パラニトロフェニル基等を挙げることができる。ハロアルキル基は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素からなる群より少なくとも１つ選択されたハロゲン原子を有する、分岐していてもよい炭素数１〜５のアルキル基を表す。
【００４３】
Ｒ３（第三の反応性官能基）は、例えば、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基、イソシアナート基等であってもよい。
【００４４】
Ｒ１（第一の反応性官能基）及びＲ２（第二の反応性官能基）は、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である。Ｒ３（第三の反応性官能基）は、好ましくは、マレイミド基又はチオール基である。Ｒ１（第一の反応性官能基）、Ｒ２（第二の反応性官能基）及びＲ３（第三の反応性官能基）のすべてがＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基であってもよい。
【００４５】
本発明による化合物（架橋化試薬）として、上記式中、Ａｒがベンゼンであり、Ｌ１及びＬ２が単結合であり、Ｌ３がペンチルアミド基であり、Ｒ１（第一の反応性官能基）及びＲ２（第二の反応性官能基）がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基であり、Ｒ３（第三の反応性官能基）がマレイミド基である、下記化合物（ｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩ）を例示することができる。
【００４６】
【化５】
2016204107.tif 000007
【００４７】
また、本発明による化合物（架橋化試薬）として、上記式中、Ａｒがベンゼンであり、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が単結合であり、Ｒ１（第一の反応性官能基）、Ｒ２（第二の反応性官能基）及びＲ３（第三の反応性官能基）がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、下記化合物を例示することができる。
【００４８】
【化６】
2016204107.tif 000008
【００４９】
次に、本発明による核酸架橋体について詳細に説明する。
【００５０】
本発明による核酸架橋体は、二本鎖核酸と、上記同様の本発明による化合物（架橋化試薬、下記一般式）と、からなり、二本鎖核酸に導入されたアミノ基がＲ１及びＲ２に共有結合することで、二本鎖核酸が化合物（架橋化試薬）に結合しているものである。なお、下記一般式のＲ３が、標的分子の有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成することで、核酸架橋体に標的分子を結合させることができる。本願明細書において、核酸架橋体に標的分子を結合させたものを「核酸−標的分子複合体」と称する場合がある。核酸−標的分子複合体は、分子生物学の分野では、遺伝子検出等に用いられ、医薬の分野においては、核酸−標的分子複合体を用いることで、二本鎖核酸の血中滞留性の向上、生分解性の抑制、特定細胞への到達能向上等の効果を得ることができる。
【００５１】
【化７】
2016204107.tif 000009
【００５２】
上記式中、Ａｒ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３、並びにＲ１（第一の反応性官能基）、Ｒ２（第二の反応性官能基）及びＲ３（第三の反応性官能基）の詳細については、前述同様である。
【００５３】
本発明による核酸架橋体を構成する二本鎖核酸は、第一の核酸鎖と、第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖と、からなり、アミノ基が導入されたものである。
【００５４】
二本鎖核酸における２本の核酸鎖（すなわち第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖）は、ＤＮＡ；ＲＮＡ；２’−Ｏ−メチル化ＲＮＡ（以下、２’−ＯＭｅ  ＲＮＡという）、Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（以下、ＬＮＡという）等の核酸の糖部を誘導体化した修飾核酸；リン酸ジエステル結合を誘導体化した修飾核酸（例えば、酸素原子を硫黄原子に変換したリン酸チオエステル結合）；その他の修飾核酸；又はそれらの混合物であってもよい。なお、これらの修飾核酸については、例えば、Ｄｅｌｅａｖｅｙ，Ｇ．Ｆ．ａｎｄ  Ｄａｍｈａ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９，９３７−９５４，２０１２に開示される。  
【００５５】
本明細書において、“第一の核酸鎖に完全に相補的な塩基配列”とは、第一の核酸鎖の塩基配列のすべての塩基と対合し得る塩基配列をいう。
【００５６】
本明細書において、“第一の核酸鎖に十分に相補的な塩基配列”とは、第一の核酸鎖の塩基配列の５０％以上１００％未満、好ましくは６０％以上１００％未満、より好ましくは７０％以上１００％未満、さらに好ましくは８０％以上１００％未満、さらにより好ましくは９０％以上１００％未満の塩基と対合し得る塩基配列をいう。より具体的には、第一の核酸鎖の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列において、例えば、１又は２〜４の塩基を他の塩基に置換した結果、その置換した位置におけるヌクレオチド残基が対合できなくなった場合（この場合、他の塩基に置換した位置を“ミスマッチ部位”という）；第一の核酸鎖の塩基配列に対して完全に相補的な塩基配列において、例えば、１又は２〜４の塩基を欠失した結果、その欠失した位置におけるヌクレオチド残基が対合できなくなった場合等を挙げることができる。
【００５７】
本発明による核酸架橋体を構成する二本鎖核酸には、アミノ基が導入されている。二本鎖核酸へのアミノ基の導入箇所について、図１に３つの例を挙げて説明する。
【００５８】
図１（ａ）は、第一の核酸鎖の３’末端及び第二の核酸鎖の５’末端にアミノ基が導入された形態である。なお、第一の核酸鎖の５’末端及び第二の核酸鎖の３’末端にアミノ基が導入されていてもよい。また、この場合、二本鎖核酸は、アミノ基が導入された末端とは反対側の末端において、ヘアピンループ構造を形成していてもよい。第一核酸鎖及び第二核酸鎖の長さは、特に限定されるものではなく、例えば、数十ｍｅｒ、数百ｍｅｒ、数千ｍｅｒの範囲であれば適宜設定され得る（例えば、アミノ基が結合した合成核酸を、酵素など（ＰＣＲ法を含む）を用いて数千ｍｅｒ程度の長鎖とし、それを第一核酸鎖及び第二核酸鎖として用いることができる）。また、第一核酸鎖と第二核酸鎖とは、長さが同じでもよく、長さが異なっていてもよい。第一核酸鎖と第二核酸鎖との長さが異なっている場合とは、例えば、図１（ａ）において、第一の核酸鎖の５’末端側に、第一の核酸鎖の鎖長の０．１〜１０％程度の鎖長を有する（第二の核酸鎖とは相補的ではない）塩基配列が付加的に結合している形態が挙げられる。
【００５９】
図１（ｂ）は、第二の核酸鎖が２本の核酸鎖からなり、第二の核酸鎖の一方の核酸鎖の５’末端及び他方の核酸鎖の３’末端にアミノ基が導入され、第一の核酸鎖には、アミノ基が導入されていない形態である。なお、第一の核酸鎖が２本の核酸鎖からなり、第一の核酸鎖の一方の核酸鎖の３’末端及び他方の核酸鎖の５’末端にアミノ基が導入され、第二の核酸鎖には、アミノ基が導入されていない形態であってもよい。また、第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖の双方が２本の核酸鎖からなり、第一の核酸鎖の一方の核酸鎖の３’末端及び他方の核酸鎖の５’末端にアミノ基が導入され、第二の核酸鎖の一方の核酸鎖の５’末端及び他方の核酸鎖の３’末端にアミノ基が導入された形態であってもよい。また、この場合、二本鎖核酸は、少なくとも一方の末端において、ヘアピンループ構造を形成していてもよい。第一核酸鎖及び第二核酸鎖の長さは、特に限定されるものではなく、例えば、数十ｍｅｒ、数百ｍｅｒ、数千ｍｅｒの範囲であれば適宜設定され得る（例えば、アミノ基が結合した合成核酸を、酵素など（ＰＣＲ法を含む）を用いて数千ｍｅｒ程度の長鎖とし、それを第一核酸鎖及び第二核酸鎖として用いることができる）。なお、例えば図１（ｂ）の場合、“一方の第二の核酸鎖の長さ”と“他方の第二の核酸鎖の長さ”との和は、“第一の核酸鎖の長さ”と略同じとなり、“一方の第二の核酸鎖”と“他方の第二の核酸鎖”とは、長さが同じでもよく、長さが異なっていてもよい。また、例えば図１（ｂ）において、第一の核酸鎖の５’末端側及び３’末端側の少なくとも一方に、第一の核酸鎖の鎖長の０．１〜１０％程度の鎖長を有する（第二の核酸鎖とは相補的ではない）塩基配列が付加的に結合していてもよい。
【００６０】
図１（ｃ）は、第一の核酸鎖の５’末端及び第二の核酸鎖の３’末端にアミノ基が導入され、かつ、第一の核酸鎖の３’末端及び第二の核酸鎖の５’末端にアミノ基が導入された形態である。第一核酸鎖及び第二核酸鎖の長さは、特に限定されるものではなく、例えば、数十ｍｅｒ、数百ｍｅｒ、数千ｍｅｒの範囲であれば適宜設定され得る（例えば、アミノ基が結合した合成核酸を、酵素など（ＰＣＲ法を含む）を用いて数千ｍｅｒ程度の長鎖とし、それを第一核酸鎖及び第二核酸鎖として用いることができる）。
【００６１】
二本鎖核酸へのアミノ基の導入方法については、第一の核酸鎖及び第二の核酸鎖の所定の位置にアミノ基が導入される方法であれば特に限定されることなく用いられ、例えば、下記に示すカルバメート構造を有するＳＳＨ−ｌｉｎｋｅｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、下図において「ＳＳＨ」）、３’−ＣＡ−ａｍｉｎｏ−ｌｉｎｋｅｒ（ｒｅｖＨ−ｌｉｎｋｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ社、下図において「ｒｅｖＨ」）、６つの炭素原子により構成されるＣ６−ｌｉｎｋｅｒ（下図において「Ｃ６」）を導入する方法等が挙げられる。
【００６２】
【化８】
2016204107.tif 000010
【００６３】
次に、本発明による二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物について説明する。
【００６４】
本発明による二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物は、前述した本発明による化合物の、二本鎖核酸に標的分子を結合させる用途に関するものである。なお、二本鎖核酸及び標的分子の詳細については、前述同様である。
【００６５】
本発明による二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物は、
下記一般式
【化９】
2016204107.tif 000011
で表され、二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させ、標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、二本鎖核酸に標的分子を結合させる。
【００６６】
上記式中、Ａｒ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３、並びにＲ１（第一の反応性官能基）、Ｒ２（第二の反応性官能基）及びＲ３（第三の反応性官能基）の詳細については、前述同様である。
【００６７】
次に、本発明による二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法について説明する。なお、該方法は、前述の核酸−標的分子複合体を製造するための方法でもある。
【００６８】
本発明による二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法は、
（ａ）二本鎖核酸と、
下記一般式
【化１０】
2016204107.tif 000012
で表される化合物と、
を混合して、二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させることで、二本鎖核酸に該化合物を結合させて、核酸架橋体を得る工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られた核酸架橋体と、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基を有する標的分子と、を混合して、標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、核酸架橋体に標的分子を結合させる工程と、
を含む。
【００６９】
なお、二本鎖核酸及び標的分子の詳細については、前述同様である。また、上記式中、Ａｒ、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３、並びにＲ１（第一の反応性官能基）、Ｒ２（第二の反応性官能基）及びＲ３（第三の反応性官能基）の詳細については、前述同様である。
【００７０】
上記工程（ａ）において、例えば、第一の核酸鎖と第二の核酸鎖を混合したものに、例えばリン酸バッファー及び／又水を加えて、高温（例えば９０℃）で加熱し、冷却後、架橋化試薬の溶液（例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させたもの）を加えて、例えば２７℃で反応させることで、核酸架橋体を得ることができる。
【００７１】
上記工程（ｂ）において、例えば、核酸架橋体と標的分子とを混合し、例えばリン酸バッファー存在下で、例えば２７℃で反応させることで、核酸架橋体に標的分子を結合させることができる。
【００７２】
以上説明したように、本発明によれば、二本鎖核酸の解離の可能性を低減して、二本鎖核酸に標的分子を安定的に結合させることができる。本発明によって得られた核酸−標的分子複合体は、分子生物学の分野では、遺伝子検出等に用いられ、医薬の分野においては、核酸−標的分子複合体を用いることで、二本鎖核酸の血中滞留性の向上、生分解性の抑制、特定細胞への到達能向上等の効果を得ることができる。
【００７３】
また、本発明によれば、核酸−標的分子複合体の作製過程において二本鎖が解離する可能性が低減されるため、核酸−標的分子複合体を容易に合成することが可能となる。また、核酸−標的分子複合体の精製過程において二本鎖が解離する可能性が低減されるため、核酸−標的分子複合体の取り扱いを著しく簡便化することが可能となる。このため、「二本鎖核酸−タンパク質複合体」（標的分子：タンパク質）として医薬品やバイオセンサー等に、また、「二本鎖核酸−核酸複合体」（標的分子：核酸）又は「二本鎖核酸−二本鎖核酸複合体」（標的分子：二本鎖核酸）としてバイオセンサー等への適用が期待される。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００７５】
（実施例１）
架橋化試薬の合成【００７６】
以下のスキームに従い、架橋化試薬（ｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩ）を合成した。【００７７】
【化１１】
2016204107.tif 000013
【００７８】
（５−アミノイソフタル酸ジ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（化合物２）の合成）
アルゴン雰囲気下、５−アミノイソフタル酸（化合物１）３６２ｍｇ（２.００ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド３０ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド９２０ｍｇ（４当量）および１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＷＳＣ）１.５３ｇ（４当量）を加えて室温で２０時間撹拌した。反応液に酢酸エチル（２００ｍＬ）を加え、水（５０ｍＬ）で４回、飽和食塩水（５０ｍＬ）で１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣を酢酸エチルとヘキサンの混合溶液（１：１、３０ｍＬ）にサスペンドした。得られた白色沈殿をろ取して標記化合物（化合物２）６９２ｍｇ（収率９２％）を白色固体状物質として得た。【００７９】
ＥＳＩ−ＭＳ：ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ１６Ｈ１３Ｎ３Ｏ８Ｎａ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）３９８．０５９５，ｆｏｕｎｄ  ３９８．０６０３．
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７．７５（ｔ，１Ｈ，Ｐｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．６３（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ，Ｊ＝１，６Ｈｚ），６．２２（ｂｒ  ｓ，２  Ｈ，ＮＨ２），２．８９（ｂｒ  ｓ，８Ｈ，ＮＨＳ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１７２．５５（Ｃ），１６１．６４  （Ｃ），１５１．１０（Ｃ），１２６．６４（Ｃ），１２０．１７（ＣＨ），１１７．００（ＣＨ），２５．６４（ＣＨ２）．【００８０】
（５−（６’−マレイミドヘキサノイル）アミノイソフタル酸ジ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩ、化合物３）の合成）
アルゴン雰囲気下、６−マレイミドヘキサン酸４２２ｍｇ（１．８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１５ｍＬに溶解し、塩化オキサリル０.１８ｍＬ（２．２ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１時間撹拌した。この溶液を５−アミノイソフタル酸ジ−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（化合物２）４５０ｍｇ（１.２ｍｍｏｌ）のピリジン（１５ｍＬ）溶液に滴下し、室温でさらに１時間撹拌した。エタノール３ｍＬを加えた後、減圧下溶媒を留去した。残渣を酢酸エチル７０ｍＬに溶解し、水３０ｍＬで２回、飽和食塩水３０ｍＬで１回洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮し、残渣をピリジンで２回共沸した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：酢酸エチル−ヘキサン）により精製して標記化合物３１６ｍｇを淡赤色泡状物質として得た。得られた化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（中性シリカゲル、溶出溶媒：エタノール−クロロホルム）により再精製して標記化合物（ｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩ、化合物３）２６８ｍｇ（３９％）を白色泡状物質として得た。【００８１】
ＥＳＩ−ＭＳ：ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ  Ｃ２６Ｈ２４Ｎ４Ｏ１１Ｎａ（［Ｍ＋Ｎａ］＋）５９１．１３３４，ｆｏｕｎｄ  ５９１．１３４８．
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１０．６１（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．７６（ｄ，２Ｈ，Ｐｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），８．２８（ｔ，１Ｈ，Ｐｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），６．９９（ｓ，２Ｈ，ｍａｌｅｉｍｉｄｏ）．３．４０（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２，Ｊ＝７．１Ｈｚ），２．９１（ｂｒ  ｓ，８Ｈ，ＮＨＳ），２．３６（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．６２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．５２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２），１．２７  （ｍ，２Ｈ，ＣＨ２）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１７２．６１（Ｃ），１７１．４５（Ｃ），１７０．４６（Ｃ），１６１．０７（Ｃ），１４１．７３（Ｃ），１３４．８１  （ＣＨ），１２６．６８（Ｃ），１２５．７２（ＣＨ），１２４．８１（ＣＨ），３７．３１（ＣＨ２），３６．５９（ＣＨ２），２８．０９（ＣＨ２），２６．０４（ＣＨ２），２５．９７（ＣＨ２），２４．６２（ＣＨ２）．【００８２】
（実施例２）
一級アミノ基を有する２本鎖ＤＮＡの架橋化反応【００８３】
対向する５’末端及び３’末端にアミノ基を有する相補的な配列の２５ｍｅｒの２本鎖ＤＮＡ（Ｓｐ２５：配列番号１、ａｓ２５：配列番号２）に対し、架橋化試薬（ｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩ）を作用させることで、架橋化反応を行い、２本鎖ＤＮＡの末端部位を連結させた（図２）。オリゴヌクレオチドへのアミノ基導入には、直鎖の炭素原子（Ｃ６）よりなるＣ６−ｌｉｎｋｅｒ、カルバメート構造を有するｓｓＨ−ｌｉｎｋｅｒ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び３’−ＣＡ−ａｍｉｎｏ−ｌｉｎｋｅｒ（以下、ｒｅｖＨ−ｌｉｎｋｅｒ；Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ）を用いた。【００８４】
【化１２】
2016204107.tif 000014
【００８５】
本実施例で調製した２本鎖ＤＮＡ（２種）について説明する。
（ｉ）Ｓｐ２５−ｒｅｖＨ／ｓｓＨ−ａｓ２５：
Ｓｐ２５（配列番号１）の３’末端にｒｅｖＨ−ｌｉｎｋｅｒを連結させたものと、ａｓ２５（配列番号２）の５’末端にｓｓＨ−ｌｉｎｋｅｒを連結させたもの、とからなる２本鎖ＤＮＡである。
（ｉｉ）Ｓｐ２５−Ｃ６／Ｃ６−ａｓ２５：
Ｓｐ２５（配列番号１）の３’末端にＣ６−ｌｉｎｋｅｒを連結させたものと、ａｓ２５（配列番号２）の５’末端にＣ６−ｌｉｎｋｅｒを連結させたもの、とからなる２本鎖ＤＮＡである。【００８６】
（２本鎖ＤＮＡの架橋化反応）
上記に示す相補的な配列の２種の２本鎖ＤＮＡ（Ｓｐ２５−ｒｅｖＨ／ｓｓＨ−ａｓ２５、Ｓｐ２５−Ｃ６／Ｃ６−ａｓ２５）をそれぞれ同モル（２０ｐｍｏｌ）混合し、１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８）（６．２５μＬ）及び滅菌水を加えて全量４０μＬとした。反応溶液を９０℃、１分間加熱後、氷水中で５分間放置した。続いて、架橋化試薬のＤＭＦ溶液（２ｍＭ  ｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩ／ＤＭＦ、１０μＬ）を加え（全量５０μＬ）、反応を開始した。２７℃で反応を行い、一定時間ごとに反応液の一部をサンプリングし、２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって生成物（核酸架橋体）を分析した。Ｓｐ２５−ｒｅｖＨ／ｓｓＨ−ａｓ２５の２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体を下記に示す。【００８７】
【化１３】
2016204107.tif 000015
【００８８】
２本鎖ＤＮＡのｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩによる架橋化反応について、核酸架橋体のグラフを図３（ａ）に、２０％変性ＰＡＧＥによる分析結果を図３（ｂ）に示す。図３（ａ）において、「Ｓｐ２５−ｒｅｖＨ／ｓｓＨ−ａｓ２５  ｂｉｓ  ＣＬ」は、Ｓｐ２５−ｒｅｖＨ／ｓｓＨ−ａｓ２５（２本鎖ＤＮＡ）とｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩとによる核酸架橋体を表し、「Ｓｐ２５−Ｃ６／Ｃ６−ａｓ２５  ｂｉｓ  ＣＬ」は、Ｓｐ２５−Ｃ６／Ｃ６−ａｓ２５（２本鎖ＤＮＡ）とｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩとによる核酸架橋体を表す。【００８９】
反応の結果、２本鎖ＤＮＡの対向する末端にアミノ基を有する場合、ｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩは２本鎖間を高効率で架橋化することが確認された。また、反応１０分後において、「Ｓｐ２５−Ｃ６／Ｃ６−ａｓ２５  ｂｉｓ  ＣＬ」では７７％の生成率であったのに対し、「Ｓｐ２５−ｒｅｖＨ／ｓｓＨ−ａｓ２５  ｂｉｓ  ＣＬ」では、９０％が架橋化されていた。このことから、ｓｓＨ−ｌｉｎｋｅｒ／ｒｅｖＨ−ｌｉｎｋｅｒの組み合わせによってアミノ基を導入した２本鎖ＤＮＡにおいて、架橋化効率が高いことが明らかとなった。【００９０】
得られた２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体については、下記のＨＰＬＣ条件で精製後に分子量測定を行い、目的物であることを確認した。
ＥＳＩ  ｍａｓｓ：ｃａｌｃ．１６１８９．９４，ｆｏｕｎｄ  １６１９１．６８【００９１】
ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
Ｂ％：３０−１００％／２０ｍｉｎ（Ａ  ｂｕｆｆｅｒ：５％ＣＨ３ＣＮ，０．１Ｍ  ＴＥＡＡ；Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ：２５％ＣＨ３ＣＮ，０．１Ｍ  ＴＥＡＡ）
カラム温度  ５０℃【００９２】
（実施例３）
２本鎖ＲＮＡの架橋化反応【００９３】
対向する５’末端及び３’末端にアミノ基を有する相補的な配列の２１ｍｅｒの２本鎖ＲＮＡ（ＬＨ２１−ｒｅｖＨ：配列番号３、ＬＨ２１ｂ：配列番号４）（ルシフェラーゼのｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ）に対し、架橋化試薬（ｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩ）を作用させることで、架橋化反応を行い、２本鎖ＲＮＡの末端部位を連結させた。アミノ基導入には、実施例２と同様のｓｓＨ−ｌｉｎｋｅｒ及びｒｅｖＨ−ｌｉｎｋｅｒを用いた。架橋化試薬（ｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩ）による架橋化反応及び変性ＰＡＧＥによる分析については、実施例２と同様に行った。この２本鎖ＲＮＡによる核酸架橋体を下記に示す。【００９４】
【化１４】
2016204107.tif 000016
【００９５】
本実施例で使用した２本鎖ＲＮＡについて説明する。
ＬＨ２１−ｒｅｖＨ／ＬＨ２１ｂ：
配列番号３のＲＮＡ鎖の３’末端にｒｅｖＨ−ｌｉｎｋｅｒを連結させたものと、配列番号４のＲＮＡ鎖の５’末端にｓｓＨ−ｌｉｎｋｅｒを連結させたもの、とからなる２本鎖ＲＮＡである。【００９６】
２本鎖ＲＮＡのｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩによる架橋化反応について、核酸架橋体のグラフを図４（ａ）に、２０％変性ＰＡＧＥによる分析結果を図４（ｂ）に示す。反応の結果、２本鎖ＤＮＡと同様に２本鎖ＲＮＡにおいても高効率で架橋化されることが明らかとなった。１０分後の反応収率は、９９％であり、２本鎖ＤＮＡよりも高い値となった。【００９７】
上記同様の反応を、３ｎｍｏｌの２本鎖ＲＮＡ鎖に対して３００ｎｍｏｌの架橋化試薬（ｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩ）を作用させて行い、３時間反応後に逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって２本鎖ＲＮＡによる核酸架橋体を精製した。【００９８】
得られた２本鎖ＲＮＡによる核酸架橋体については、分子量測定を行い、目的物であることを確認した。
分子量ＥＳＩ  ｍａｓｓ．ｃａｌｃ．１４１５２．１４１，ｆｏｕｎｄ．１４１５３．５０【００９９】
ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
Ｂ％：０−１００％／２０ｍｉｎ（Ａ  ｂｕｆｆｅｒ：５％ＣＨ３ＣＮ，０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ：２５％ＣＨ３ＣＮ，０．１Ｍ  ＴＥＡＡ）
カラム温度：室温【０１００】
（実施例４）
２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体の化学修飾【０１０１】
２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体に対して、チオール基を有する物質（標的分子）が結合可能かどうかを調べた。【０１０２】
実施例２で得られた、対向する末端がｂｉｓ−ＮＨＳ−ＭＩによって架橋化された２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体（ｓｓＨ−ａｓ２５／Ｓｐ２５−ｒｅｖＨ  ｂｉｓ−ＣＬ）（１００ｐｍｏｌ）と、６−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｈｅｘａｎｏｌ（１００ｎｍｏｌ）（標的分子）と、を混合し、１２５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）存在下、２７℃で反応を行った（反応溶液量１００μＬ）。反応溶液を逆相カラムＨＰＬＣによって分析した。【０１０３】
ＨＰＬＣ条件を以下に示す。
Ｂ％：３０−１００％／２０ｍｉｎ（Ａ  ｂｕｆｆｅｒ：５％ＣＨ３ＣＮ，０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、Ｂ  ｂｕｆｆｅｒ：２５％  ＣＨ３ＣＮ，０．１Ｍ  ＴＥＡＡ）
カラム温度：室温【０１０４】
反応前の分析結果を図５（ａ）に、反応後の分析結果を図５（ｂ）に示す。反応後、原料の２本鎖ＤＮＡによる核酸架橋体のピークが消失して、６−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｈｅｘａｎｏｌが結合した物質（核酸−標的分子複合体）のピークを確認した。【０１０５】
以上より、本実施例による核酸架橋体に標的分子を安定的に結合させ得ることが示された。【０１０６】
なお、本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。つまり、本発明の範囲は、実施形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。【０１０７】
本出願は、２０１５年６月１７日に出願された日本国特許出願２０１５−１２２４６７号に基づくものであり、その明細書、特許請求の範囲、図面および要約書を含むものである。上記日本国特許出願における開示は、その全体が本明細書中に参照として含まれる。【０１０８】
（付記１）
第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、
一般式１
【化１５】
2016204107.tif 000017
で表される化合物と、
からなり、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基がＲ１及びＲ２に共有結合することで、前記二本鎖核酸が前記化合物に結合している核酸架橋体。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１〜３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）【０１０９】
（付記２）
前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている、
ことを特徴とする付記１に記載の核酸架橋体。【０１１０】
（付記３）
前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である、
ことを特徴とする付記１又は２に記載の核酸架橋体。【０１１１】
（付記４）
前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である、
ことを特徴とする付記１乃至３のいずれか１つに記載の核酸架橋体。【０１１２】
（付記５）
前記一般式１において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである、
ことを特徴とする付記１乃至４のいずれか１つに記載の核酸架橋体。【０１１３】
（付記６）
前記一般式１において、Ａｒは、ベンゼンである、
ことを特徴とする付記１乃至５のいずれか１つに記載の核酸架橋体。【０１１４】
（付記７）
前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
ことを特徴とする付記１乃至６のいずれか１つに記載の核酸架橋体。【０１１５】
（付記８）
前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である、
ことを特徴とする付記１乃至７のいずれか１つに記載の核酸架橋体。【０１１６】
（付記９）
前記一般式１において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０〜１５のアルキルアミド基である、
ことを特徴とする付記８に記載の核酸架橋体。【０１１７】
（付記１０）
前記一般式１において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である、
ことを特徴とする付記９に記載の核酸架橋体。【０１１８】
（付記１１）
前記一般式１において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
ことを特徴とする付記６に記載の核酸架橋体。【０１１９】
（付記１２）
第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなる二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物であって、
一般式２
【化１６】
2016204107.tif 000018
で表され、
前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させ、標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、前記二本鎖核酸に前記標的分子を結合させる、
ことを特徴とする二本鎖核酸に標的分子を結合させるための化合物。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１〜３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）【０１２０】
（付記１３）
前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている、
ことを特徴とする付記１２に記載の化合物。【０１２１】
（付記１４）
前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である、
ことを特徴とする付記１２又は１３に記載の化合物。【０１２２】
（付記１５）
前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である、
ことを特徴とする付記１２乃至１４のいずれか１つに記載の化合物体。【０１２３】
（付記１６）
前記一般式２において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである、
ことを特徴とする付記１２乃至１５のいずれか１つに記載の化合物。【０１２４】
（付記１７）
前記一般式２において、Ａｒは、ベンゼンである、
ことを特徴とする付記１２乃至１６のいずれか１つに記載の化合物。【０１２５】
（付記１８）
前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
ことを特徴とする付記１２乃至１７のいずれか１つに記載の化合物。【０１２６】
（付記１９）
前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である、
ことを特徴とする付記１２乃至１８のいずれか１つに記載の化合物。【０１２７】
（付記２０）
前記一般式２において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０〜１５のアルキルアミド基である、
ことを特徴とする付記１９に記載の化合物。【０１２８】
（付記２１）
前記一般式２において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である、
ことを特徴とする付記２０に記載の化合物。【０１２９】
（付記２２）
前記一般式２において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
ことを特徴とする付記１７に記載の化合物。【０１３０】
（付記２３）
（ａ）第一の核酸鎖及び前記第一の核酸鎖に完全に又は十分に相補的な塩基配列を含む第二の核酸鎖からなり、アミノ基が導入された二本鎖核酸と、
一般式３
【化１７】
2016204107.tif 000019
で表される化合物と、
を混合して、前記二本鎖核酸に導入されたアミノ基にＲ１及びＲ２を共有結合させることで、前記二本鎖核酸に前記化合物を結合させて、核酸架橋体を得る工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸架橋体と、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基を有する標的分子と、を混合して、前記標的分子が有するアミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基にＲ３を共有結合させることで、前記核酸架橋体に前記標的分子を結合させる工程と、
を含む二本鎖核酸に標的分子を結合させるための方法。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１〜３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１は、アミノ基と共有結合を形成する第一の反応性官能基を表し、Ｒ２は、アミノ基と共有結合を形成する第二の反応性官能基を表し、Ｒ３は、アミノ基、チオール基、アジド基又はエチニル基と共有結合を形成する第三の反応性官能基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）【０１３１】
（付記２４）
前記第一の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入されている、又は前記第一の核酸鎖の５’末端に１つのアミノ基が導入され前記第二の核酸鎖の３’末端に１つのアミノ基が導入されている、
ことを特徴とする付記２３に記載の方法。【０１３２】
（付記２５）
前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基である、
ことを特徴とする付記２３又は２４に記載の方法。【０１３３】
（付記２６）
前記第三の反応性官能基は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基である、
ことを特徴とする付記２３乃至２５のいずれか１つに記載の方法。【０１３４】
（付記２７）
前記一般式３において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである、
ことを特徴とする付記２３乃至２６のいずれか１つに記載の方法。【０１３５】
（付記２８）
前記一般式３において、Ａｒは、ベンゼンである、
ことを特徴とする付記２３乃至２７のいずれか１つに記載の方法。【０１３６】
（付記２９）
前記第一の反応性官能基及び前記第二の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
ことを特徴とする付記２３乃至２８のいずれか１つに記載の方法。【０１３７】
（付記３０）
前記第三の反応性官能基は、マレイミド基又はチオール基である、
ことを特徴とする付記２３乃至２９のいずれか１つに記載の方法。【０１３８】
（付記３１）
前記一般式３において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０〜１５のアルキルアミド基である、
ことを特徴とする付記３０に記載の方法。【０１３９】
（付記３２）
前記一般式３において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である、
ことを特徴とする付記３１に記載の方法。【０１４０】
（付記３３）
前記一般式３において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、前記第一の反応性官能基、前記第二の反応性官能基及び前記第三の反応性官能基は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル基である、
ことを特徴とする付記２８に記載の方法。【０１４１】
（付記３４）
一般式４
【化１８】
2016204107.tif 000020
で表される化合物。
（式中、Ａｒは、３価の芳香族基を表し、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、単結合又は炭素数１〜３０の分岐していてもよく、脂環式基を含んでいてもよく、１若しくは２以上の複素原子を含んでいてもよい置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素からなる２価の連結基を表し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基若しくはその誘導体、活性エステル基、エポキシ基又はハロアルキル基を表し、Ｒ３は、マレイミド基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、イソチオシアナート基、エチニル基、アジド基、ビニル基、ヒドラジン基、エポキシ基又はイソシアナート基を表す。Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、同一であっても、異なっていてもよい。）【０１４２】
（付記３５）
前記一般式４において、Ａｒは、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、クリセン、アズレン、アセナフテン、フルオレン、フルオランテン、テトラセン又はトリフェニレンである、
ことを特徴とする付記３４に記載の化合物。【０１４３】
（付記３６）
前記一般式４において、Ａｒは、ベンゼンである、
ことを特徴とする付記３４又は３５に記載の化合物。【０１４４】
（付記３７）
前記一般式４において、Ｒ１及びＲ２は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
ことを特徴とする付記３４乃至３６のいずれか１つに記載の化合物。【０１４５】
（付記３８）
前記一般式４において、Ｒ３は、マレイミド基又はチオール基である、
ことを特徴とする付記３４乃至３７のいずれか１つに記載の化合物。【０１４６】
（付記３９）
前記一般式４において、Ｌ１及びＬ２は、単結合であり、Ｌ３は、炭素数０〜１５のアルキルアミド基である、
ことを特徴とする付記３８に記載の化合物。【０１４７】
（付記４０）
前記一般式４において、Ｌ３は、ペンチルアミド基である、
ことを特徴とする付記３９に記載の化合物。【０１４８】
（付記４１）
前記一般式４において、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、単結合であり、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である、
ことを特徴とする付記３６に記載の化合物。
【図１】
2016204107.tif 000025
【図２】
2016204107.tif 000026
【図３】
2016204107.tif 000027
【図４】
2016204107.tif 000028
【図５】
2016204107.tif 000029
【配列表】
2016204107000001.app
【国際調査報告】
2016204107.tif 000030
2016204107.tif 000031
2016204107.tif 000032
2016204107.tif 000033