(57)【要約】  本発明は、5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’（配列番号1）で表されるヌクレオチド配列（該配列中、Pは、明細書中（I）で表されるプロリン誘導体リンカーを示す。）からなる一本鎖核酸分子、及び緩衝液を含有する組成物であって、以下の特徴：（a）常温で溶液の形態である；および（b）25℃、相対湿度60％で4週間保存後の該核酸分子の含量が、保存開始時の含量に対して80％以上である；を有する組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’（配列番号1）で表されるヌクレオチド配列
（該配列中、Pは、下記式（I）で表されるプロリン誘導体リンカーを示す。）
【化１】
2017073767.tif 000024
からなる一本鎖核酸分子、及び緩衝液を含有する組成物であって、以下の特徴：
（a）常温で溶液の形態である；および
（b）25℃、相対湿度60％で4週間保存後の該核酸分子の含量が、保存開始時の含量に対して80％以上である；
を有する組成物。
【請求項２】
40℃、相対湿度75％で4週間保存後の該核酸分子の含量が、保存開始時の含量に対して80％以上である、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
60℃で4週間保存後の該核酸分子の含量が、保存開始時の含量に対して60％以上である、請求項1または2記載の組成物。
【請求項４】
総曝光量120万Lux・hrに曝光された該核酸分子の含量が、保存開始時の含量に対して80％以上である、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
緩衝液が、組成物のpHを4.0以上9.0以下とする緩衝液である、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
緩衝液が、組成物のpHを4.4以上7.4以下とする緩衝液である、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
緩衝液が、組成物のpHを4.6以上7.0以下とする緩衝液である、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
緩衝液が、組成物のpHを5.5以上6.5以下とする緩衝液である、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
緩衝液が、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩酸アルギニン、クエン酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和物、L-グルタミン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、乳酸ナトリウム、リン酸一カリウム、水酸化ナトリウム、メグルミン、グリシン、クエン酸、及び酢酸から選択される1又は2以上の緩衝剤を含有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
緩衝液が、クエン酸及び／又はリン酸を含有する緩衝液である、請求項1から9のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
さらに等張化剤を含有する、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
等張化剤が、D-ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール、塩化カリウム、ラクチトール及びスクロースから選択される1以上である、請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
肺線維症もしくは急性肺傷害の予防又は治療用である、請求項1から12のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項1から13のいずれか一項に記載の組成物の製造方法であって、前記核酸分子を、該組成物のpHを5.5以上6.5以下とする緩衝液に溶解し、常温で保存することを含む、方法。
【請求項１５】
緩衝液が、クエン酸及び／又はリン酸を含有する緩衝液である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
組成物が、肺線維症もしくは急性肺傷害の予防又は治療用組成物である、請求項14又は15記載の方法。
【請求項１７】
組成物中の核酸分子の安定化方法であって、該核酸分子を、該組成物のpHを5.5以上6.5以下とする緩衝液に溶解し、常温で保存することを含む、方法。
【請求項１８】
緩衝液が、クエン酸及び／又はリン酸を含有する緩衝液である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
該溶液が、肺線維症もしくは急性肺傷害の予防又は治療用組成物である、請求項17又は18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、TGF-β1遺伝子の発現を抑制する一本鎖核酸分子を含有する組成物であって、該核酸分子の安定性が改善された新規な組成物、特に医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺線維症は、肺胞の障害と虚脱をきっかけとして、肺の間質に線維化が起こる疾患であるが、多くの場合原因は不明である。原因不明の肺線維症は、特に特発性肺線維症（Idiopathic Pulmonary Fibrosis：IPF）と呼ばれ、線維化が進行すると、肺が硬化し、酸素交換能が低下する。現在のところ、決定的な治療法も無く、その治療法はほぼ対症療法に留まっている。【０００３】
TGF-βは、細胞増殖・分化を制御するサイトカインとして知られているが、肝臓や肺の線維化にも重要な役割を果たしていると考えられていることから、肺線維症の治療ターゲットとして注目されている。【０００４】
核酸医薬は、低分子医薬品の容易な製造性と、抗体医薬の有効性と安全性とを併せ持つことから、次世代の創薬技術として期待されている。しかし、核酸分子の生体内での不安定性、自然免疫応答の亢進による副作用、効率的な薬物送達技術（DDS）が開発されていないこと等が障壁となって、医薬品開発は思うように進んでいない。【０００５】
呼吸器疾患の場合、肺への薬剤の局所投与が可能であることから、肺線維症は核酸医薬の効果的な標的疾患である。一方、核酸分子の生体内安定性や自然免疫応答惹起の問題に対しては、siRNAやmiRNAの二本鎖核酸の末端を各種のリンカーで連結した一本鎖核酸分子が開発されている（例えば、特許文献1-5参照）。Hamasakiらは、TGF-β1の発現抑制配列を搭載した下記構造の一本鎖核酸分子（以下、「PK-0051」ともいう）を肺線維症及び急性肺傷害のモデルマウスに気管内投与すると、症状が顕著に改善されたことを報告している（非特許文献1）。
5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’（配列番号1）
（下線はTGF-β1発現抑制配列を示す。Pは、下記式（I）で表されるプロリン誘導体リンカーを示す）。【０００６】
【化１】
2017073767.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2012/017919号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2013/103146号パンフレット
【特許文献３】国際公開第2012/005368号パンフレット
【特許文献４】国際公開第2012/077446号パンフレット
【特許文献５】国際公開第2013/133393号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】PLoS One, 2012, 7(8):e42655.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一般に、核酸は溶液中で分解されやすく不安定であることから、常温での取扱いは非常に困難である。そのため、通常は、凍結乾燥保存や、トリスエデト酸緩衝液（TE）に50%のエタノールを加えて、-20℃で凍らさないで保存する方法が用いられている。このような状況で、有効成分である核酸を常温で安定に存在させ得る、取扱いに優れた安定な核酸製剤の開発が望まれている。
従って、本発明は、肺線維症や急性肺傷害に対する治療効果が確認されている一本鎖核酸分子（PK-0051）を、常温で溶液として安定に含有する組成物、特に医薬組成物、及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、PK-0051を緩衝液に溶解して、PK-0051溶液のpHを特定の範囲に制御することにより、意外にもPK-0051分子を長期間安定に保存可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、次の通りである。
[1] 5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’（配列番号1）で表されるヌクレオチド配列
（該配列中、Pは、下記式（I）で表されるプロリン誘導体リンカーを示す。）【００１２】
【化２】
2017073767.tif 000003
【００１３】
からなる一本鎖核酸分子、及び緩衝液を含有する組成物であって、以下の特徴：
（a）常温で溶液の形態である；および
（b）25℃、相対湿度60％で4週間保存後の該核酸分子の含量が、保存開始時の含量に対して80％以上である；
を有する組成物。
[2] 40℃、相対湿度75％で4週間保存後の該核酸分子の含量が、保存開始時の含量に対して80％以上である、[1]記載の組成物。
[3] 60℃で4週間保存後の該核酸分子の含量が、保存開始時の含量に対して60％以上である、[1]または[2]記載の組成物。
[4] 総曝光量120万Lux・hrに曝光された該核酸分子の含量が、保存開始時の含量に対して80％以上である、[1]記載の組成物。
[5] 緩衝液が、組成物のpHを4.0以上9.0以下とする緩衝液である、[1]から[4]のいずれかに記載の組成物。
[6] 緩衝液が、組成物のpHを4.4以上7.4以下とする緩衝液である、[1]から[4]のいずれかに記載の組成物。
[7] 緩衝液が、組成物のpHを4.6以上7.0以下とする緩衝液である、[1]から[4]のいずれかに記載の組成物。
[8] 緩衝液が、組成物のpHを5.5以上6.5以下とする緩衝液である、[1]から[4]のいずれかに記載の組成物。
[9] 緩衝液が、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩酸アルギニン、クエン酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和物、L-グルタミン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、乳酸ナトリウム、リン酸一カリウム、水酸化ナトリウム、メグルミン、グリシン、クエン酸、及び酢酸から選択される1又は2以上の緩衝剤を含有する、[1]から[8]のいずれかに記載の組成物。
[10] 緩衝液が、クエン酸及び／又はリン酸を含有する緩衝液である、[1]から[9]のいずれかに記載の組成物。
[11] さらに等張化剤を含有する、[1]から[10]のいずれかに記載の組成物。 
[12] 等張化剤が、D-ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール、塩化カリウム、ラクチトール及びスクロースから選択される1以上である、[11]に記載の組成物。
[13] 肺線維症もしくは急性肺傷害の予防又は治療用である、[1]から[12]のいずれかに記載の組成物。
[14] [1]から[13]のいずれかに記載の組成物の製造方法であって、前記核酸分子を、該組成物のpHを4.6以上7.0以下とする緩衝液に溶解し、常温で保存することを含む、方法。
[15] [1]から[13]のいずれかに記載の組成物の製造方法であって、前記核酸分子を、該組成物のpHを5.5以上6.5以下とする緩衝液に溶解し、常温で保存することを含む、方法。
[16] 緩衝液が、クエン酸及び／又はリン酸を含有する緩衝液である、[14]または[15]に記載の方法。
[17] 組成物が、肺線維症もしくは急性肺傷害の予防又は治療用組成物である、[14]から[16]のいずれかに記載の方法。
[18] 組成物中の核酸分子の安定化方法であって、該核酸分子を、該組成物のpHを4.6以上7.0以下とする緩衝液に溶解し、常温で保存することを含む、方法。
[19] 組成物中の核酸分子の安定化方法であって、該核酸分子を、該組成物のpHを5.5以上6.5以下とする緩衝液に溶解し、常温で保存することを含む、方法。
[20] 緩衝液が、クエン酸及び／又はリン酸を含有する緩衝液である、[18]または[19]に記載の方法。
[21] 該溶液が、肺線維症もしくは急性肺傷害の予防又は治療用組成物である、[18]から[20]のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、有効成分である一本鎖核酸分子の安定性が改善された、用時再溶解の必要のない新規かつ取扱い容易な医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】各pHの緩衝液を用いて調製したPK-0051溶液について、25℃の安定性試験を行った結果を示す図である。
【図２】各pHの緩衝液を用いて調製したPK-0051溶液について、40℃の安定性試験を行った結果を示す図である。
【図３】各pHの緩衝液を用いて調製したPK-0051溶液について、60℃の安定性試験を行った結果を示す図である。
【図４】0.05 M クエン酸緩衝液（pH4.0〜7.5）を用いて調製したPK-0051溶液について、60℃の安定性試験を行った結果を示す図である。
【図５】0.1 M クエン酸緩衝液（pH4.0〜7.8）を用いて調製したPK-0051溶液について、60℃の安定性試験を行った結果を示す図である。
【図６】0.05 M リン酸緩衝液（pH4.0〜7.9）を用いて調製したPK-0051溶液について、60℃の安定性試験を行った結果を示す図である。
【図７】0.05Mクエン酸緩衝液：0.05 M リン酸緩衝液（8：2）（pH4.0〜7.8）を用いて調製したPK-0051溶液について、60℃の安定性試験を行った結果を示す図である。
【図８】0.05Mクエン酸緩衝液：0.05 M リン酸緩衝液（5：5）（pH4.0〜7.8）を用いて調製したPK-0051溶液について、60℃の安定性試験を行った結果を示す図である。
【図９】0.05Mクエン酸緩衝液：0.05 M リン酸緩衝液（2：8）（pH4.0〜7.8）を用いて調製したPK-0051溶液について、60℃の安定性試験を行った結果を示す図である。
【図１０】各濃度のクエン酸緩衝液を用いて調製したPK-0051溶液について、40℃の安定性試験を行った結果を示す図である。
【図１１】各濃度のクエン酸緩衝液を用いて調製したPK-0051溶液について、60℃の安定性試験を行った結果を示す図である。
【図１２】1mg/mLのPK-0051溶液（pH6.5）について、安定性試験を行った結果を示す図である。
【図１３】10mg／mLのPK-0051溶液（pH6.5）について、安定性試験を行った結果を示す図である。
【図１４】1mg/mLのPK-0051溶液（pH6.0）について、安定性試験を行った結果を示す図である。
【図１５】PK-0051の各投与群における、肺組織中のhTGF-β1の相対量を示す図である。
【図１６】PK-0051の各投与群における、肺組織中のハイドロキシプロリン量を示す図である。
【図１７】10、20、40及び80 mg/mLのPK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0））について、60℃の安定性試験を行った結果を示す図である。
【図１８】1mg/mLのPK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 5.5））について、光安定性試験を行った結果を示す図である。測定にはイオン交換HPLCを用いた。
【図１９】1mg/mLのPK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0））について、光安定性試験を行った結果を示す図である。測定にはイオン交換HPLCを用いた。
【図２０】1mg/mLのPK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.5））について、光安定性試験を行った結果を示す図である。測定にはイオン交換HPLCを用いた。
【図２１】1mg/mLのPK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 5.5））について、光安定性試験を行った結果を示す図である。測定には逆相HPLCを用いた。
【図２２】1mg/mLのPK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0））について、光安定性試験を行った結果を示す図である。測定には逆相HPLCを用いた。
【図２３】1mg/mLのPK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.5））について、光安定性試験を行った結果を示す図である。測定には逆相HPLCを用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、TGF-β1遺伝子の発現を抑制するヌクレオチド配列を含む一本鎖核酸分子PK-0051を、常温で溶液の形態で安定に保存し得る、該核酸分子含有組成物（以下、「本発明の組成物」ともいう）を提供する。ここで「常温」とは15〜30℃の温度範囲を意味し、「安定に保存」とは、保存開始時（組成物の調製時）の核酸分子の80％以上が、（1）4週間以上、好ましくは（2）24週（約6ヶ月）以上、より好ましくは（3）200週（約3.7年）以上、分解されずに保存されることを意味する。かかる保存安定性は、それぞれ以下の安定性試験の結果により確認又は予測することができる。
（1）25℃、相対湿度60％の条件下で4週間保存後の組成物中の核酸分子の含量が、保存開始時の含量に対して80％以上である。
（2）40℃、相対湿度75％の条件下で4週間保存後の組成物中の核酸分子の含量が、保存開始時の含量に対して80％以上である。
（3）60℃で4週間保存後の組成物中の核酸分子の含量が保存開始時の含量に対して60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上である。または、105℃で15分間もしくは121℃で15分間保存後の組成物中の核酸分子の含量が保存開始時の含量に対して60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上である。
【００１７】
本発明の組成物は、高温条件下で安定に保存し得る。また、凍結融解条件下でも安定に保存し得る。
【００１８】
また、「安定に保存」とは、好ましくは、「光に安定に保存」であることを含む。「光に安定に保存」とは、保存開始時（組成物の調製時）の核酸分子の80％以上が、総曝光量120万Lux・hrに曝光された後も分解されずに保存されることを意味する。かかる保存安定性は、D65ランプを光源とする昼光色蛍光灯（照度1580Lux）下で4週間保存した後の組成物中の核酸分子の含量が、保存開始時の含量に対して80％以上であることにより確認又は予測することができる。
【００１９】
ここで、組成物中の核酸分子の含量は、被検試料と同量の核酸分子を注射用水に溶解した溶液（100%）、該溶液と注射用水とをそれぞれ9:1、8:2、7:3及び6:4の割合で混合した溶液（それぞれ90%、80%、70%及び60%）を検量線試料とし、各検量線試料10 μLをHPLCにかけてピーク面積を測定し、横軸（X）に理論含量（%）、縦軸（Y）にピーク面積をとり、各検量線試料の測定値をプロットして、最小二乗法により回帰直線（Y＝aX＋b）（検量線）を求め、同一条件下でのHPLCにて測定された被検試料のピーク面積を該検量線に当てはめて、理論含量（%）を求めることにより決定される。上記HPLCの測定条件は以下のとおりである。
逆相ＨＰＬＣ
測定機器：LC-10A SHIMAZU HPLCシステム（RP-HPLC）、島津製作所製
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：254 nm）（島津製作所社製）
カラム：X-Bridge OST C18（2.5μm，4.6×50mm）（日本ウォーターズ(株)社製）
カラム温度：40℃
移動相A：50mM TEAA（pH7.0）、 0.5% Acetonitrile
移動相B：100% Acetonitrile
移動相の送液：移動相A及び移動相Bの混合比を次のように変えて濃度勾配制御する。
【００２０】
【表１】
2017073767.tif 000004
【００２１】
イオン交換HPLC
測定機器：LC-20A SHIMAZU HPLCシステム（AEX-HPLC）、島津製作所製
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：260 nm）
カラム：DNAPac PA-100（4×250 mm）
カラム温度：80℃
移動相A：25 mM Tris-HCL（pH8.0）、8M尿素、10% Acetonitrile
移動相B：移動相A、700 mM過塩素酸ナトリウム一水和物
移動相の送液：移動相A及び移動相Bの混合比を次のように変えて濃度勾配制御する。
【００２２】
【表２】
2017073767.tif 000005
【００２３】
1．核酸分子
本発明の組成物に含有される有効成分である核酸分子は、下記のヌクレオチド配列で表される。
5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’（配列番号1）
（該配列中は、Pは下記式（I）で表されるプロリン誘導体リンカーを示す）。
【００２４】
【化３】
2017073767.tif 000006
【００２５】
上記ヌクレオチド配列中、下線を付した配列が、ヒトTGF-β1 mRNAと相補的なヌクレオチド配列であり、該mRNAと結合してRNA干渉作用を発揮するTGF-β1発現抑制配列である。
【００２６】
本発明の組成物に含有される核酸分子は、自体公知の方法により製造することができる。例えば、国際公開第2013/133393号パンフレット、PLoS One, 2012, 7(8):e42655に記載の方法に従って製造することができる。
【００２７】
本発明の組成物における核酸分子の含有量は特に制限はないが、該組成物が医薬組成物である場合、医薬組成物全体に対して、通常0.0001〜60重量%、好ましくは0.001〜15重量%、さらに好ましくは0.01〜1重量%である。
【００２８】
2．緩衝液
本発明の組成物は、緩衝液を含有する。本発明において、緩衝液とは緩衝作用をもつ溶液（特に水溶液）をいい、緩衝剤を含有することにより構成される。本発明で緩衝剤とは、水溶液のpHの安定剤を意味し、医薬製造の分野で一般的に使用されているものを選択することができる。
本発明においては、緩衝液を使用することで、組成物中における核酸分子の分解を防ぐことができる。
本発明に用いられる緩衝液としては、組成物のpHを4.0以上9.0以下とする緩衝液が挙げられ、組成物のpHを4.4以上7.4以下とする緩衝液が好ましく、組成物のpHを4.6以上7.0以下とする緩衝液がより好ましく、組成物のpHを5.5以上6.5以下とする緩衝液がさらに好ましい。
【００２９】
本発明に用いられる緩衝剤としては、具体的には、アスコルビン酸、L-アスパラギン酸マグネシウム、亜硫酸ナトリウム、L-アルギニン、L-アルギニン塩酸塩、安息香酸、安息香酸ナトリウム、イプシロン-アミノカプロン酸、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化グルコサミン、塩酸トリエタノールアミン、希塩酸、クエン酸、無水クエン酸、無水クエン酸ナトリウム、クエン酸水和物、クエン酸ナトリウム水和物、クエン酸二水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三ナトリウム二水和物、クエン酸カリウム、グリシルグリシン、グリシン、グルコノ-σ-ラクトン、グルコン酸、グルコン酸カルシウム水和物、L-グルタミン酸、L-グルタミン酸ナトリウム、クレアチニン、クロロブタノール、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、コハク酸、コハク酸二ナトリウム六水和物、酢酸、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム水和物、ジイソプロパノールアミン、ジエタノールアミン、酒石酸、L-酒石酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、タウリン、炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム水和物、炭酸水素ナトリウム、トリイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタモール、二酸化炭素、乳酸、乳酸カルシウム水和物、乳酸ナトリウム液、L-ヒスチジン、4-（2-ヒドロキシエチル）、氷酢酸、ブドウ糖、フマル酸一ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ベンザルコニウム塩化物、芳香族炭化水素混合溶剤、ホウ酸アンモニウム、マレイン酸、無水酢酸ナトリウム、無水炭酸ナトリウム、無水リン酸一水素ナトリウム、無水リン酸三ナトリウム、無水リン酸二水素ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、メタンスルホン酸、硫酸、硫酸アルミニウムカリウム水和物、リン酸、リン酸一水素ナトリウム七水和物、リン酸三ナトリウム、リン酸水素ナトリウム水和物、リン酸水素二ナトリウム水和物、リン酸二水素ナトリウム水和物、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム一水和物から選択される1又は2以上の緩衝剤が挙げられる。中でも、クエン酸もしくはその塩又はその水和物、あるいは、リン酸もしくはその塩又はその水和物を緩衝剤として含む緩衝液を用いることが好ましい。
従って、本発明の組成物に用いられる緩衝液として、好ましくはクエン酸及び／又はリン酸を含有する緩衝液が挙げられる。
また、本発明において、緩衝液は、上記緩衝剤として例示した酸とその塩、あるいは上記緩衝剤として例示した酸の2種以上の塩を含有することが好ましい。より好ましくは、クエン酸とその塩（例えば、クエン酸とクエン酸ナトリウム、クエン酸とクエン酸三ナトリウムなど）を含有する緩衝液、リン酸とその塩（例えば、リン酸とリン酸二水素ナトリウムなど）を含有する緩衝液、2種のリン酸塩（例えば、リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウム）を含有する緩衝液が挙げられる。特に好ましくは、クエン酸とその塩とを含有する緩衝液及び／又は2種のリン酸塩を含有する緩衝液である。
【００３０】
本発明の組成物における緩衝液の使用量は、所望のpHの範囲に調整できる量であればよいが、例えば、該組成物中の緩衝剤の含有量が下記の範囲となるように適宜決定すればよい。すなわち、本発明の組成物における緩衝剤の含有量は、組成物全体に対して、通常0.0001〜40重量%、好ましくは0.0005〜20重量%、さらに好ましくは0.001〜10重量%である。
【００３１】
3．その他の添加剤
本発明の組成物は、さらに溶剤を含有していてもよい。溶剤としては、例えば、薬学的に許容される有機溶剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン等）、水、注射用水、生理食塩水、ブドウ糖液等が挙げられる。溶剤は1種または2種以上を組合せて用いてもよい。
本発明においては、核酸分子を予め溶剤に溶解した後に、緩衝液と混合することが、核酸分子を短時間で溶解できるという点で好ましい。溶剤としては、水が好ましい。尚、本明細書において、特にことわらない限り、「核酸分子を緩衝液に溶解させる」という語は、固体である核酸分子を直接緩衝液に溶解させる場合だけでなく、前述のように、核酸分子を一旦水等の溶剤に溶解して得られた溶液と、緩衝液とを混合する場合をも包含する意味で用いるものとする。
本発明において、溶剤の含有量は、総量として、組成物全体に対して、通常0.0001重量%以上100重量%未満、好ましくは0.001重量%以上100重量%未満、さらに好ましくは0.005重量%以上100重量%未満である。
【００３２】
本発明の組成物は、さらに等張化剤を含有していてもよい。等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、D-ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール、塩化カリウム、ラクチトール、スクロース、グルコース等が挙げられる。好ましい等張化剤は、D-ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール、塩化カリウム、ラクチトール、スクロースであり、より好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウム、スクロースである。等張化剤は1種または2種以上を組合せて用いてもよい。
等張化剤を用いる場合、本発明の組成物の浸透圧比（生理食塩液の与えるオスモル濃度に対する本発明の組成物のオスモル濃度の比）は、好ましくは0.6〜1.4、より好ましくは0.8〜1.2、さらに好ましくは1.0である。
【００３３】
本発明の組成物が医薬組成物である場合、該組成物は、公知の方法で、例えば、吸入液剤、注射剤、液剤等に製剤化して、非経口投与（例えば、経鼻投与、静脈投与、点滴投与、筋肉内投与、皮下投与等）により投与することができる。また、適当な剤形(例えばカプセル剤等)により経口的に投与することができる。好ましい投与方法は、ネブライザーを用いた液滴粒子の吸入である。
また、本発明の医薬組成物が注射剤である場合、核酸分子を緩衝液に溶解して得られた溶液と、脂質膜構成分子とを接触させて、核酸分子が封入されたリポソーム製剤として製造することもできる。該リポソーム製剤は、静脈内注射や筋肉内注射等の全身投与のための注射剤として、好ましく用いることができる。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、上記の成分の他にも、必要に応じて、薬学的に許容される添加剤を含有していてもよく、本発明の医薬組成物が注射剤である場合、添加剤としては、例えば、等張化剤（例、ブドウ糖、D-ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール、塩化カリウム、ラクチトール、スクロース、グルコース等）、無痛化剤（例、ベンジルアルコール等）、防腐剤（例、安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール等）等が挙げられる。好ましい添加剤は、安息香酸メチル、D-ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、D-マンニトール、塩化カリウム、ラクチトール、スクロースである。より好ましい添加剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、スクロースである。
【００３５】
本発明の医薬組成物を吸入剤に製剤化する場合は、例えば、核酸分子を水等の溶剤に溶解して得られた溶液に、緩衝剤（例、クエン酸およびその塩、リン酸およびその塩）を加えた水溶液を混合し、混合液を除菌ろ過し、得られた薬液をバイアル、アンプル等の密封容器に充填して吸入剤を製造することができる。また、例えば、核酸分子を、水と緩衝剤（例、クエン酸およびその塩、リン酸およびその塩）を含む水溶液と混合し、超音波処理等により溶解し、除菌ろ過し、得られた薬液をバイアル、アンプル等の密封容器に充填して吸入剤を製造することもできる。通常、使用する密封容器としては、無色透明の硼珪酸ガラス製容器であるが、ガラス内面の接液部分が石英のような表面特性を有する容器を使用することもできる。
【００３６】
本発明の医薬組成物は、TGF-β1の発現を抑制し得る核酸分子を有効成分とするので、TGF-β1発現の異常亢進が関与する疾患、特に肺線維症及び急性肺傷害の治療及び予防に有用である。本発明において、「治療」は、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、また「予防」は、発症の阻止、発症遅延の意味を含む。
【００３７】
本発明の医薬組成物の投与量は、投与対象の薬物受容性、投与ルート、疾患の重篤度等によっても異なるが、例えば、肺線維症の治療剤として、成人に対し、吸入液剤として投与する場合、有効成分である核酸分子の投与量が、約0.001ないし約20mg/kg体重、好ましくは約0.005ないし約5mg/kg体重、更に好ましくは約0.01ないし約1mg/kg体重であって、1日1ないし数回に分けて投与することができる。
【００３８】
本発明はまた、核酸分子に緩衝液を添加することを特徴とする、組成物中の該核酸分子の安定化方法、あるいは安定な核酸分子含有組成物の製造方法に関する。当該方法に用いられる緩衝液としては、前記の本発明の組成物について例示したものと同様のものが挙げられ、同様のものが好ましい。
本発明の安定化／製造方法における緩衝液の添加量は、所望のpHの範囲に調整できる量であればよいが、例えば、緩衝剤の添加量が下記の範囲となるように適宜決定すればよい。すなわち、本発明の安定化／製造方法における、緩衝剤の添加量は、当該方法により得られる組成物全体に対して、通常0.0001〜40重量%、好ましくは0.0005〜20重量%、さらに好ましくは0.001〜10重量%である。
【００３９】
以下に、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
製造例1（一本鎖核酸分子の合成）
TGF-β1の発現抑制配列を搭載した一本鎖核酸分子PK-0051を、ホスホロアミダイト法に基づき、核酸合成機（商品名ABI  Expedite（登録商標）  8909  Nucleic  Acid  Synthesis  System、アプライドバイオシステムス）により合成した。前記合成には、RNAアミダイトとして、RNA  Phosphoramidites（2’-O-TBDMSi、商品名、三千里製薬）を用いた（以下、同様）。前記アミダイトの脱保護は、定法に従った。合成したRNAは、HPLCにより精製した。精製後のRNAは、それぞれ凍結乾燥した。
リンカー領域は、L-プロリンジアミドアミダイトを用いた。下線部は、ヒトTGF-β1遺伝子の発現抑制配列である。
5’-AGCAGAGUACACACAGCAUAUACC-P-GGUAUAUGCUGUGUGUACUCUGCUUC-P-G-3’（配列番号1）
（Pは、下記式（I）で表されるプロリン誘導体リンカーを示す）。【００４１】
【化４】
2017073767.tif 000007
【００４２】
実施例1（pHが及ぼす保存温度の影響評価）
核酸吸入プロトタイプのPK-0051含有組成物の熱による安定性を評価した。
1.被験組成物の調製
被験組成物1の調製は以下のように行った。
97.0mLの0.04M塩酸、50mLの0.04M塩化カリウム及び53mLの注射用水を混合し、0.04M塩酸-塩化カリウム緩衝液（pH1.0）を調製した。当該緩衝液を用いて、0.1mg/mLのPK-0051を調製した。
被験組成物2の調製は以下のように行った。
10mLの0.04Mリン酸、10mLの0.04Mホウ酸及び10mLの0.04M酢酸を混合し、2N NaOHでpH2.0に調整し、0.04M Britton-Robinson緩衝液を調製した。当該緩衝液を用いて、0.1mg/mLのPK-0051を調製した。
被験組成物3〜12は、2N NaOHで各pHに調整した点を除いて、被験組成物2と同様の方法で調製した。
被験組成物1:PK-0051（0.04 M 塩酸-塩化カリウム緩衝液（pH 1.5））、（0.1 mg/mL）
被験組成物2:PK-0051（0.04 M Britton-Robinson緩衝液（pH 2.0））、（0.1 mg/mL）
被験組成物3:PK-0051（0.04 M Britton-Robinson緩衝液（pH 3.0））、（0.1 mg/mL）
被験組成物4:PK-0051（0.04 M Britton-Robinson緩衝液（pH 4.0））、（0.1 mg/mL）
被験組成物5:PK-0051（0.04 M Britton-Robinson緩衝液（pH 5.0））、（0.1 mg/mL）
被験組成物6:PK-0051（0.04 M Britton-Robinson緩衝液（pH 6.0））、（0.1 mg/mL）
被験組成物7:PK-0051（0.04 M Britton-Robinson緩衝液（pH 7.0））、（0.1 mg/mL）
被験組成物8:PK-0051（0.04 M Britton-Robinson緩衝液（pH 8.0））、（0.1 mg/mL）
被験組成物9:PK-0051（0.04 M Britton-Robinson緩衝液（pH 9.0））、（0.1 mg/mL）
被験組成物10:PK-0051（0.04 M Britton-Robinson緩衝液（pH 10.0））、（0.1 mg/mL）
被験組成物11:PK-0051（0.04 M Britton-Robinson緩衝液（pH 11.0））、（0.1 mg/mL）
被験組成物12:PK-0051（0.04 M Britton-Robinson緩衝液（pH 12.0））、（0.1 mg/mL）【００４３】
2.評価方法
被験組成物1〜12をそれぞれ1mLずつ4本の5mLガラスバイアルに入れ、4℃、25℃/60%RH、40℃/75%RH及び60℃の安定性試験器（エスペック（株）社製）に各1本を保存した。被験組成物を1週間ごとに4週間、50μLずつサンプリングしてHPLCで測定した。PK-0051の含量を算出し、保存開始時の含量に対する含量割合（%）の減少による安定性の評価を行った。含量の算出方法及び測定方法を以下に示す。
被験組成物中のPK-0051の含量は、被験組成物と同量のPK-0051を注射用水に溶解した溶液（100%）、該溶液と注射用水とをそれぞれ9:1、8:2、7:3及び6:4の割合で混合した溶液（それぞれ90%、80%、70%及び60%）を検量線試料とし、各検量線試料10 μLをHPLCにかけてピーク面積を測定し、横軸（X）に理論含量（%）、縦軸（Y）にピーク面積をとり、各検量線試料の測定値をプロットして、最小二乗法により回帰直線（Y＝aX＋b）（検量線）を求め、同一条件下でのHPLCにて測定された被験組成物のピーク面積を該検量線に当てはめて、理論含量（%）を求めた。【００４４】
測定方法
下記測定条件にて検量線試料（60%〜100%）及び被験組成物を測定した。
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：254 nm）
カラム：X-Bridge OST C18（2.5μm，4.6×50mm）
カラム温度：40℃
移動相A：50mM TEAA（pH7.0）、0.5% Acetonitrile
移動相B：100% Acetonitrile
移動相の送液：移動相A及び移動相Bの混合比を次のように変えて濃度勾配制御した（表3）。【００４５】
【表３】
2017073767.tif 000008
【００４６】
3.結果
結果を図1〜図3に示す。最も苛酷な条件である60℃、4週間保存においてpH5〜7の範囲において明確な含量低下が見られなかった。
また、一般的に核酸は温度の影響を受けやすく常温以上で長時間保存が不可能といわれているが、本結果から一本鎖核酸は溶液のpHをコントロールすることで常温以上であっても長期間保存可能であることが示された。【００４７】
実施例2（クエン酸緩衝液及び／またはリン酸緩衝液を用いた異なるpHにおける安定性評価）
核酸吸入プロトタイプのPK-0051含有組成物の各種緩衝液及び各pHにおける安定性を評価した。【００４８】
1.被験組成物
被験組成物13〜48の調製は以下のように行った。
0.1Mクエン酸ナトリウム水溶液と0.1Mクエン酸水溶液を混合しpH4.0〜7.5に調製した各pHの0.1Mクエン酸緩衝液を調製した。注射用水で調製した2.35mg/mLのPK-0051（2.13mL）、注射用水（0.37mL）、及び各pHの0.1Mクエン酸緩衝液（2.5mL）を混合し、1mg/mLの被験組成物13〜48を各5mL調製した。
被験組成物49〜68の調製は以下のように行った。
0.1Mクエン酸ナトリウム水溶液と0.1Mクエン酸水溶液を混合しpH4.0〜7.8に調製した各pHの0.1Mクエン酸緩衝液を調製した。注射用水で調製した5.8mg/mLのPK-0051（0.086mL）、及び各pHの0.1Mクエン酸緩衝液（4.914mL）を混合し、0.1mg/mLの被験組成物49〜68を各5mL調製した。
被験組成物69〜108の調製は以下のように行った。
0.1Mリン酸二水素ナトリウム水溶液と0.1Mリン酸水素二ナトリウム溶液を混合しpH4.0〜7.9に調製した各pHの0.1Mリン酸緩衝液を調製した。注射用水で調製した1.2mg/mLのPK-0051（0.495mL）、注射用水（2.505mL）、及び各pHの0.1Mリン酸緩衝液（3.000mL）を混合し、0.1mg/mLの被験組成物69〜108を各6mL調製した。
被験組成物109〜168の調製は以下のように行った。
0.1Mクエン酸ナトリウム水溶液と0.1Mクエン酸水溶液を混合しpH4.0〜7.8に調製した各pHの0.1Mクエン酸緩衝液を調製した。同様に0.1Mリン酸二水素ナトリウム水溶液と0.1Mリン酸水素二ナトリウム溶液を混合しpH4.0〜7.8に調製した各pHの0.1Mリン酸緩衝液を調製した。それぞれ同一pHの0.1Mクエン酸緩衝液対0.1Mリン酸緩衝液を8:2(4mL:1mL)、5:5(3mL:3mL)、2:8(1mL:4mL)の割合で混合し、pH4.0〜7.8の0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（8:2）、0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（5:5）、0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（2:8）を調製した。
注射用水で調製した5.8mg/mLのPK-0051（0.1mL）、注射用水（2.9mL）、及び各pHの0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（8:2）（3.0mL）を混合し、0.1mg/mLの被験組成物109〜128を各6mL調製した。被験組成物129〜148は、各pHの0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（8:2）（3.0mL）の代わりに0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（5:5）（3.0mL）を用いた点を除いて、被験組成物109〜128と同様の方法で調製した。被験組成物149〜168は、各pHの0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（8:2）（3.0mL）の代わりに0.1Mクエン酸リン酸緩衝液（2:8）（3.0mL）を用いた点を除いて、被験組成物109〜128と同様の方法で調製した。【００４９】
1-1. 0.05M クエン酸緩衝液（pH 4.0〜7.5）
被験組成物13：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 4.0））,（1 mg/mL）
被験組成物14：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 4.1））,（1 mg/mL）
被験組成物15：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 4.2））,（1 mg/mL）
被験組成物16：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 4.3））,（1 mg/mL）
被験組成物17：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 4.4））,（1 mg/mL）
被験組成物18：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 4.5））,（1 mg/mL）
被験組成物19：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 4.6））,（1 mg/mL）
被験組成物20：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 4.7））,（1 mg/mL）
被験組成物21：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 4.8））,（1 mg/mL）
被験組成物22：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 4.9））,（1 mg/mL）
被験組成物23：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 5.0））,（1 mg/mL）
被験組成物24：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 5.1））,（1 mg/mL）
被験組成物25：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 5.2））,（1 mg/mL）
被験組成物26：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 5.3））,（1 mg/mL）
被験組成物27：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 5.4））,（1 mg/mL）
被験組成物28：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 5.5））,（1 mg/mL）
被験組成物29：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 5.6））,（1 mg/mL）
被験組成物30：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 5.7））,（1 mg/mL）
被験組成物31：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 5.8））,（1 mg/mL）
被験組成物32：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 5.9））,（1 mg/mL）
被験組成物33：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 6.0））,（1 mg/mL）
被験組成物34：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 6.1））,（1 mg/mL）
被験組成物35：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 6.2））,（1 mg/mL）
被験組成物36：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 6.3））,（1 mg/mL）
被験組成物37：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 6.4））,（1 mg/mL）
被験組成物38：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 6.5））,（1 mg/mL）
被験組成物39：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 6.6））,（1 mg/mL）
被験組成物40：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 6.7））,（1 mg/mL）
被験組成物41：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 6.8））,（1 mg/mL）
被験組成物42：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 6.9））,（1 mg/mL）
被験組成物43：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 7.0））,（1 mg/mL）
被験組成物44：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 7.1））,（1 mg/mL）
被験組成物45：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 7.2））,（1 mg/mL）
被験組成物46：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 7.3））,（1 mg/mL）
被験組成物47：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 7.4））,（1 mg/mL）
被験組成物48：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 7.5））,（1 mg/mL）【００５０】
1-2. 0.1M クエン酸緩衝液（pH 4.0〜7.8）
被験組成物49：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 4.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物50：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 4.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物51：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 4.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物52：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 4.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物53：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 4.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物54：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 5.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物55：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 5.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物56：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 5.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物57：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 5.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物58：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 5.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物59：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 6.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物60：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 6.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物61：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 6.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物62：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 6.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物63：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 6.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物64：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 7.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物65：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 7.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物66：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 7.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物67：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 7.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物68：PK-0051（0.1 M クエン酸緩衝液（pH 7.8））,（0.1 mg/mL）【００５１】
1-3. 0.05M リン酸緩衝液（pH 4.0〜7.9）
被験組成物69：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 4.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物70：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 4.1））,（0.1 mg/mL）
被験組成物71：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 4.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物72：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 4.3））,（0.1 mg/mL）
被験組成物73：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 4.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物74：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 4.5））,（0.1 mg/mL）
被験組成物75：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 4.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物76：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 4.7））,（0.1 mg/mL）
被験組成物77：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 4.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物78：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 4.9））,（0.1 mg/mL）
被験組成物79：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 5.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物80：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 5.1））,（0.1 mg/mL）
被験組成物81：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 5.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物82：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 5.3））,（0.1 mg/mL）
被験組成物83：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 5.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物84：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 5.5））,（0.1 mg/mL）
被験組成物85：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 5.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物86：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 5.7））,（0.1 mg/mL）
被験組成物87：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 5.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物88：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 5.9））,（0.1 mg/mL）
被験組成物89：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 6.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物90：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 6.1））,（0.1 mg/mL）
被験組成物91：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 6.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物92：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 6.3））,（0.1 mg/mL）
被験組成物93：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 6.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物94：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 6.5））,（0.1 mg/mL）
被験組成物95：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 6.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物96：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 6.7））,（0.1 mg/mL）
被験組成物97：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 6.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物98：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 6.9））,（0.1 mg/mL）
被験組成物99：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 7.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物100：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 7.1））,（0.1 mg/mL）
被験組成物101：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 7.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物102：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 7.3））,（0.1 mg/mL）
被験組成物103：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 7.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物104：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 7.5））,（0.1 mg/mL）
被験組成物105：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 7.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物106：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 7.7））,（0.1 mg/mL）
被験組成物107：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 7.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物108：PK-0051（0.05 M  リン酸緩衝液（pH 7.9））,（0.1 mg/mL）【００５２】
1-4. 0.05Mクエン酸緩衝液：0.05 M リン酸緩衝液（8：2）（pH 4.0〜7.8）
被験組成物109：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH4.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物110：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH4.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物111：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH4.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物112：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH4.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物113：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH4.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物114：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH5.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物115：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH5.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物116：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH5.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物117：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH5.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物118：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH5.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物119：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH6.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物120：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH6.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物121：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH6.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物122：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH6.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物123：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH6.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物124：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH7.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物125：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH7.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物126：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH7.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物127：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH7.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物128：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（8：2）（pH7.8））,（0.1 mg/mL）【００５３】
1-5. 0.05Mクエン酸緩衝液：0.05 M リン酸緩衝液（5：5）（pH 4.0〜7.8）
被験組成物129：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH4.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物130：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH4.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物131：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH4.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物132：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH4.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物133：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH4.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物134：PK-005（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH5.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物135：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH5.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物136：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH5.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物137：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH5.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物138：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH5.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物139：PK-005（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH6.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物140：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH6.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物141：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH6.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物142：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH6.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物143：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH6.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物144：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH7.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物145：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH7.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物146：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH7.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物147：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH7.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物148：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（5：5）（pH7.8））,（0.1 mg/mL）【００５４】
1-6. 0.05Mクエン酸緩衝液：0.05 M リン酸緩衝液（2：8）（pH 4.0〜7.8）
被験組成物149：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH4.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物150：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH4.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物151：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH4.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物152：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH4.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物153：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH4.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物154：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH5.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物155：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH5.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物156：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH5.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物157：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH5.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物158：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH5.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物159：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH6.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物160：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH6.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物161：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH6.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物162：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH6.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物163：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH6.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物164：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH7.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物165：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH7.2））,（0.1 mg/mL）
被験組成物166：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH7.4））,（0.1 mg/mL）
被験組成物167：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH7.6））,（0.1 mg/mL）
被験組成物168：PK-0051（0.05Mクエン酸緩衝液：0.05Mリン酸緩衝液（2：8）（pH7.8））,（0.1 mg/mL）【００５５】
2. 評価方法
被験組成物13〜168をそれぞれ1mLずつ5本の5mLガラスバイアルに入れ、60℃の安定性試験器に保存した。4週間目にHPLCで測定した。PK-0051の含量を算出し、保存開始時の含量に対する含量割合（%）の減少による安定性の評価を行った。測定方法及び含量の算出方法は、実施例1と同様の方法を用いた。【００５６】
3. 結果
結果を図4〜図9に示す。いずれの緩衝液を用いた場合も、60℃、4週間保存においてpH4.6前後〜pH7.4前後の範囲において、含量は80%以上であった。【００５７】
実施例3（クエン酸緩衝液とその濃度における安定性評価）
核酸吸入プロトタイプのPK-0051含有組成物の熱による安定性を評価した。
1. 被験組成物
被験組成物169の調製は以下のように行った。
0.1Mクエン酸ナトリウム水溶液と0.1Mクエン酸水溶液を混合しpH6.8の0.1Mクエン酸緩衝液を調製した。注射用水で調製した20mg/mLのPK-0051（0.1mL）、注射用水（9.9mL）、及びpH6.8の0.1Mクエン酸緩衝液（10mL）を混合し、0.1mg/mLの被験組成物169を20mL調製した。
被験組成物170の調製は以下のように行った。
0.1Mクエン酸ナトリウム水溶液と0.1Mクエン酸水溶液を混合しpH6.8の0.1Mクエン酸緩衝液を調製した。これを10倍希釈してpH6.8の0.01Mクエン酸緩衝液とした。注射用水で調製した14.2mg/mLのPK-0051（0.0704mL）、注射用水（4.9296mL）、及びpH6.8の0.01Mクエン酸緩衝液（5mL）を混合し、0.1mg/mLの被験組成物170を10mL調製した。
被験組成物169：PK-0051 （0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.8））,（0.1 mg/mL）
被験組成物170：PK-0051 （0.005 Mクエン酸緩衝液（pH 6.8））,（0.1 mg/mL）【００５８】
2. 評価方法
被験組成物169及び170をそれぞれ1mLずつ9本の5mLガラスバイアルに入れ、40℃/75%RH及び60℃の安定性試験器に各4本及び4℃に1本保存した。被験組成物を1週間ごとに4週間、HPLCで測定した。PK-0051の含量を算出し、保存開始時の含量に対する含量割合（%）の減少による安定性の評価を行った。測定方法及び含量の算出方法は、実施例1と同様の方法を用いた。【００５９】
3. 結果
結果を図10及び図11に示す。本結果より、クエン酸緩衝液の濃度が0.005M及び0.05Mにおいて、60℃、4週間でも明確な含量の変化がないことが示された。これにより一本鎖核酸の濃度が増えてもクエン酸緩衝液の濃度をコントロールする事で核酸安定性の効果を持続させる事が可能であることが示唆された。【００６０】
実施例4（PK-0051含有組成物（pH6.5）の安定性評価）
10mg/mL及び1mg/mLのPK-0051含有組成物（pH6.5）を調製し、安定性を評価した。
1. 被験組成物
10 mg/mLのPK-0051含有組成物（pH6.5）は、以下のように調製した。
クエン酸水和物21.0gを1 L注射用水に溶解し0.1 Mクエン酸溶液とした。同様にクエン酸三ナトリウム二水和物29.4 gを1 L注射用水に溶解し0.1 Mクエン酸ナトリウム溶液とした。0.1 Mクエン酸ナトリウム溶液に0.1 Mクエン酸溶液を加えてpH6.5に調整し、0.1Mクエン酸緩衝液（pH6.5）を得た。製造例1で合成したPK-0051 10gを注射用水500 mLに溶解して、0.1Mクエン酸緩衝液（pH6.5）500 mLを加えて混合した。ポリフッ化ビニリデン（PVDF）製の0.22 μmフィルターでろ過して、10mg/mLのPK-0051含有組成物（pH6.5）を得た。
1mg/mLのPK-0051含有組成物（pH6.5）は、PK-0051を1.0gに変更した点を除いて上記と同様の方法で調製した。【００６１】
10mg/mL及び1mg/mLのPK-0051の含有組成物（pH6.5）を被験組成物171及び172として、安定性を評価した。 
被験組成物171：PK-0051 （0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.5））,（1 mg/mL）
被験組成物172：PK-0051 （0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.5））,（10 mg/mL）【００６２】
2. 評価方法
被験組成物171及び172をそれぞれ1mLずつ9本の5mLガラスバイアルに入れ、25℃/60%RH、40℃/75%RH及び60℃の安定性試験器に各4本、4℃に1本を保存した。被験組成物を1週間ごとに4週間、HPLCで測定した。PK-0051の含量を算出し、保存開始時の含量に対する含量割合（%）の減少による安定性の評価を行った。測定方法は、実施例1と同様の方法を用いた。
被験組成物中のPK-0051の含量は、PK-0051を注射用水に溶解して1mg/mLに調製した溶液（100%）、該溶液と注射用水とをそれぞれ9:1、8:2、7:3及び6:4の割合で混合した溶液（それぞれ90%、80%、70%及び60%）を検量線試料とし、各検量線試料10 μLをHPLCにかけてピーク面積を測定し、横軸（X）に理論含量（%）、縦軸（Y）にピーク面積をとり、各検量線試料の測定値をプロットして、最小二乗法により回帰直線（Y＝aX＋b）（検量線）を求め、同一条件下でのHPLCにて測定された被験組成物のピーク面積を該検量線に当てはめて、理論含量（%）を求めた。被験組成物172中のPK-0051の含量は、1μLをHPLCにかけた点を除いて、上記と同様の方法で求めた。【００６３】
3. 結果
結果を図12及び図13に示す。本結果より、いずれも、60℃、4週間でも明確な含量の変化がないことが示された。これにより1 mg/mL及び10 mg/mLのPK-0051の含有組成物（pH6.5）は高い安定性を有することが示された。【００６４】
実施例5（PK-0051含有組成物（pH6.0）の安定性評価）
1mg/mLのPK-0051含有組成物（pH6.0）を調製し、安定性を評価した。
1. 被験組成物
クエン酸水和物21.014gを1L注射用水に溶解し0.1 Mクエン酸溶液とした。同様にクエン酸三ナトリウム二水和物29.41gを1L注射用水に溶解し0.1 Mクエン酸ナトリウム溶液とした。0.1 Mクエン酸ナトリウム溶液に0.1 Mクエン酸溶液を加えてpH6.0に調整し、0.1Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を得た。製造例1で合成したPK-0051 347 mgを注射用水5mLに溶解した。この液0.144mLに4.856mL注射用水及び0.1Mクエン酸緩衝液（pH6.0）5mLを加えて混合した。ポリフッ化ビニリデン（PVDF）製の0.22 μmフィルターでろ過して、1mg/mLのPK-0051含有組成物（pH6.0）を得た。【００６５】
1mg/mLのPK-0051含有組成物（pH6.0）を被験組成物173として、安定性を評価した。
被験組成物173：PK-0051（0.05 M  クエン酸緩衝液（pH 6.0））,（1 mg/mL）【００６６】
2. 評価方法
被験組成物173を1mLずつ5本の5mLガラスバイアルに入れ、4℃に1本、60℃の安定性試験器に4本保存した。被験組成物を1週間ごとに4週間、HPLCで測定した。PK-0051の含量を算出し、保存開始時の含量に対する含量割合（%）の減少による安定性の評価を行った。測定方法及び含量の算出方法は実施例1と同様の方法を用いた。【００６７】
3. 結果
結果を図14に示す。本結果より、60℃、4週間でも明確な含量の変化がないことが示された。これにより1 mg/mLのPK-0051含有組成物（pH6.0）は高い安定性を有することが示された。【００６８】
実施例6（肺線維症自然発症モデルマウスにおける肺線維化抑制効果）
肺線維症自然発症モデルマウス（Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2012, 46(3), 397-406及びPLoS One, 2012, 7(8):e42655記載のヒトTGF-β1トランスジェニックマウス、以下TGマウスと呼ぶ）を用いて、本発明の組成物の肺線維化抑制効果を確認した。前記効果の確認は、肺組織中のハイドロキシプロリン量を指標として、PLoS One, 2012 (上述)記載の方法に従って行った。【００６９】
1. 被験組成物
実施例4で調製した10mg/mLのPK-0051含有組成物（pH6.5）を0.05Mクエン酸緩衝液（pH 6.5）で希釈したものを被験組成物とした。希釈は、TGマウスに被験組成物を投与する日の体重に基づいて行った。【００７０】
2. 群分け及び被験組成物の投与
マイクロCT装置（R_mCT2，リガク社製）を用いてTGマウスの肺の線維化を評価し、肺線維化程度と群分け時の体重とが各群で均等になるように振り分けた。
以下に、各投与群を示す。各投与群において、11匹の雄マウスを使用した。イソフルラン麻酔下にてマイクロスプレイヤー（MSA-250-M：PENNCENTURY社製）を用いて、被験組成物をTGマウスの気管内に合計4回投与した。
・投与群1
TGマウスに、0.05Mクエン酸緩衝液（pH 6.5）を1回/1週で投与した。
・投与群2
TGマウスに、被験組成物5mg／kg体重を1回/2週で投与した。
・投与群3
TGマウスに、被験組成物5mg／kg体重を1回/1週で投与した。【００７１】
3. 肺組織のサンプリング
ペントバルビタールをTGマウスの腹腔内に投与（1.22 mg/150 μL/匹〜1.62 mg/200 μL/匹）して麻酔し、採血後、全肺葉を摘出しホモジネートサンプル用に凍結した。【００７２】
4.肺組織中のhTGF-β1の定量
全肺葉をビーズ式細胞破砕装置（MS-100，トミー精工社製）でホモジネートし、遠心分離により上清の一部を回収した。上清のhTGF-β1の量は、Human TGF-β1ELISA Set（BD社製）を用いて求めた。【００７３】
5.肺組織中のハイドロキシプロリンの定量
ホモジネート後の全肺葉を、110℃で一晩インキュベートして乾燥させた後、再度ビーズ式細胞破砕装置を用いて粉砕した。粉砕した全肺葉に6N  HClを1mL加え、110℃で一晩、ドラフト内でインキュベートした。その後、110℃で一晩、ドラフト内でインキュベートして乾燥させた。そこに2mLのPBSを加え60℃で1時間インキュベートし、フィルター濾過したものを、ハイドロキシプロリン量測定用サンプルとした。ハイドロキシプロリン量は、PLoS One. 2012;7(8):e42655.の方法より求めた。【００７４】
6.結果
結果を、図15及び図16に示す。図15は、各投与群におけるTGF-β1量を示すグラフであり、縦軸は、肺組織中のTGF-β1量を示す。図16は、各投与群におけるハイドロキシプロリン量を示すグラフであり、縦軸は、肺組織中のハイドロキシプロリン量を示す。TGマウス／核酸分子溶液（0.1mg/kg）の投与群3は、TGマウス/0.05Mクエン酸緩衝液（pH 6.5）の投与群1と比較して、肺組織中のTGF-β1量及びハイドロキシプロリン量が有意に抑制された。
このことから、本発明の核酸分子であるPK-0051は、in  vivoにおいてもターゲットであるTGF-β1の発現を抑制し、かつ肺線維化を抑制することが示された。【００７５】
実施例7（10、20、40及び80 mg/mLのPK-0051含有組成物（pH6.0）の安定性評価）
10、20、40及び80 mg/mLのPK-0051含有組成物（pH6.0）を調製し、安定性を評価した。
1. 被験組成物
被験組成物174の調製は以下のように行った。105.07gのクエン酸水和物を1Lの注射用水に溶解し0.5 Mクエン酸溶液とした。同様に147.05gのクエン酸三ナトリウム二水和物を1Lの注射用水に溶解し0.5 Mクエン酸ナトリウム溶液とした。0.5 Mクエン酸ナトリウム溶液に0.5 Mクエン酸溶液を加えてpH6.0に調整し、0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を得た。840 mgのPK-0051を8mLの注射用水に溶解し、原液とした。0.48mLの原液に4.02mLの注射用水及び0.5mLの0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）製の0.22 μmフィルターでろ過した。
被験組成物175の調製は、0.95mLの原液に3.55mLの注射用水及び0.5mLの0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合した点を除き、被験組成物174の調製と同様の方法で行った。
被験組成物176の調製は、1.9mLの原液に2.6mLの注射用水及び0.5mLの0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合した点を除き、被験組成物174の調製と同様の方法で行った。
被験組成物177の調製は、3.81mLの原液に0.69mLの注射用水及び0.5mLの0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合した点を除き、被験組成物174の調製と同様の方法で行った。
被験組成物174：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0））、（10 mg/mL）
被験組成物175：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0））、（20 mg/mL）
被験組成物176：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0））、（40 mg/mL）
被験組成物177：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0））、（80 mg/mL）【００７６】
2. 評価方法
被験組成物174〜177をそれぞれ1mLずつ4本の5mL ガラスバイアルに入れ、60℃の安定性試験器に保存した。被験組成物を1週間ごとに取り出して10倍希釈し、被験組成物174については10 μL、被験組成物175については5 μL、被験組成物176については3 μL、被験組成物177については2 μLをHPLCで測定した。測定は4週間目まで行った。PK-0051の含量を算出し、保存開始時の含量に対する含量割合（%）の減少による安定性の評価を行った。含量の算出方法及び測定方法を以下に示す。
別途4℃で保存した被験組成物174を10倍希釈した溶液（100%）、該溶液と注射用水とをそれぞれ9:1、8:2、7:3及び6:4の割合で混合した溶液（それぞれ90%、80%、70%及び60%）を検量線試料とし、各検量線試料10 μLをHPLCにかけてピーク面積を測定し、横軸（X）に理論含量（%）、縦軸（Y）にピーク面積をとり、各検量線試料の測定値をプロットして、最小二乗法により回帰直線（Y＝aX＋b）（検量線）を求め、同一条件下でのHPLCにて測定された被験組成物174のピーク面積を該検量線に当てはめて、理論含量（%）を求めた。被験組成物175の含量は、被験組成物175を用いて作製した各検量線試料5μLをHPLCにかけた点を除いて上記と同様の方法で求めた。被験組成物176の含量は、被験組成物176を用いて作製した各検量線試料3μLをHPLCにかけた点を除いて上記と同様の方法で求めた。被験組成物177の含量は、被験組成物177を用いて作製した各検量線試料2μLをHPLCにかけた点を除いて上記と同様の方法で求めた。【００７７】
測定方法
下記測定条件にて検量線試料（60%〜100%）及び各被験組成物を測定した。
イオン交換HPLC
測定機器：LC-20A SHIMAZU HPLCシステム（AEX-HPLC）、島津製作所製
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：260 nm）
カラム：DNAPac PA-100（4×250 mm）
カラム温度：80℃
移動相A：25 mM Tris-HCL（pH8.0）、8M尿素、10% Acetonitrile
移動相B：移動相A、700 mM過塩素酸ナトリウム一水和物
移動相の送液：移動相A及び移動相Bの混合比を次のように変えて濃度勾配制御した（表4）。【００７８】
【表４】
2017073767.tif 000009
【００７９】
3.結果
結果を表5及び図17に示す。60℃、4週間保存におけるPK-0051の含量は、PK-0051の濃度が10 mg/mLの場合は約97%、20 mg/mLの場合は約95%、40 mg/mLの場合は約91%、80 mg/mLの場合は約85%であり、濃度が上がるに従って、保存開始時と比較した含量の低下が大きくなることが示された。一方で、PK-0051の濃度が10 mg/mL及び20 mg/mLの場合、保存開始時と比較した含量の低下が10%未満であること、最も含量が低下したPK-0051の濃度が80 mg/mLの場合でも、含量の低下が約15%であることから、60℃、4週間の過酷な保存条件下においてもPK-0051は高い安定性を有する事が示された。【００８０】
【表５】
2017073767.tif 000010
【００８１】
実施例8（1 mg/mLのPK-0051含有組成物（pH 5.5、6.0及び6.5）の安定性評価（光安定性））
PK-0051含有組成物を充填した透明ガラスバイアル、褐色ガラスバイアル、及びさらにそれらを紙箱で包装したものを用いて、光に対するPK-0051の安定性を評価した。
1. 被験組成物
被験組成物178の調製は以下のように行った。21.014gのクエン酸水和物を1Lの注射用水に溶解し0.1 Mクエン酸溶液とした。同様に29.41gのクエン酸三ナトリウム二水和物を1Lの注射用水に溶解し0.1 Mクエン酸ナトリウム溶液とした。0.1 Mクエン酸ナトリウム溶液に0.1 Mクエン酸溶液を加えてpH5.5に調整し、0.1Mクエン酸緩衝液（pH5.5）を得た。210mgのPK-0051を10mLの注射用水に溶解し、原液とした。1mLの原液に9.5mLの注射用水及び10.5mLの0.1Mクエン酸緩衝液（pH5.5）を加えて混合し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）製の0.22 μmフィルターでろ過した。
被験組成物179の調製は、0.1 Mクエン酸ナトリウム溶液に0.1 Mクエン酸溶液を加えてpH6.0に調整して0.1Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を得た点、1mLの原液に9.5mLの注射用水及び10.5mLの0.1Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合した点を除き、被験組成物178の調製と同様の方法で行った。
被験組成物180の調製は、0.1 Mクエン酸ナトリウム溶液に0.1 Mクエン酸溶液を加えてpH6.5に調整して0.1Mクエン酸緩衝液（pH6.5）を得た点、1mLの原液に9.5mLの注射用水及び10.5mLの0.1Mクエン酸緩衝液（pH6.5）を加えて混合した点を除き、被験組成物178の調製と同様の方法で行った。
被験組成物178：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 5.5））、（1 mg/mL）
被験組成物179：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0））、（1 mg/mL）
被験組成物180：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.5））、（1 mg/mL）【００８２】
2. 評価方法
被験組成物178〜180をそれぞれ1mLずつ、10本の5mL透明ガラスバイアル、及び10本の5mL褐色ガラスバイアルに充填した（透明瓶及び遮光瓶）。また、被験組成物178〜180を同様に充填した透明瓶及び遮光瓶をそれぞれ紙箱で包装した（透明瓶 二次包装及び遮光瓶 二次包装）。これらを25℃/60%RHの安定性試験器内にて、D65ランプを光源とする昼光色蛍光灯（照度1580Lux）下で総曝光量が120万Lux・hrに達するまで保存した（保存期間32日、総曝光量1,213,743Lux・hr）。総曝光量が30万Lux・hr、60万Lux・hr、90万Lux・hr及び120万Lux・hrに達したら被験組成物を取り出し、10 μLを逆相HPLC及びイオン交換HPLCで測定した。PK-0051の含量を算出し、保存開始時の含量に対する含量割合（%）の減少による安定性の評価を行った。含量の算出方法及び測定方法を以下に示す。
上記と同様に調製し（透明瓶、遮光瓶、透明瓶 二次包装及び遮光瓶 二次包装）、4℃暗所で保存した被験組成物178（100%）と注射用水とをそれぞれ9:1、8:2、7:3及び6:4の割合で混合した溶液（それぞれ90%、80%、70%及び60%）を検量線試料とし、各検量線試料10 μLずつを逆相HPLC及びイオン交換HPLCにかけてピーク面積を測定し、横軸（X）に理論含量（%）、縦軸（Y）にピーク面積をとり、各検量線試料の測定値をプロットして、最小二乗法により回帰直線（Y＝aX＋b）（検量線）を求め、同一条件下での逆相HPLC及びイオン交換HPLCにて測定された被験組成物178のピーク面積を該検量線に当てはめて、理論含量（%）を求めた。被験組成物179及び180の含量は、上記と同様の方法で求めた。【００８３】
測定方法
下記測定条件にて検量線試料（60%〜100%）及び各被験組成物を測定した。イオン交換HPLCによる測定は、実施例7と同様の測定方法で行った。
逆相HPLC
測定機器：LC-10A SHIMAZU HPLCシステム（RP-HPLC）、島津製作所製
検出器：紫外吸光光度計（測定波長：260 nm）
カラム：X-Bridge OST C18（2.5 μm、4.6×50 mm）
カラム温度：40℃
移動相A：50 mM TEAA（pH7.0）、 0.5% Acetonitrile
移動相B：100% Acetonitrile
移動相の送液：移動相A及び移動相Bの混合比を次のように変えて濃度勾配制御した（表6）。【００８４】
【表６】
2017073767.tif 000011
【００８５】
3. 結果
結果を表7〜9及び図18〜23に示す。全ての被験組成物において、逆相HPLC及びイオン交換HPLCのいずれによる測定の場合も明確な含量の変化は無く、光に対し安定であることが明らかとなった。また、本結果より、本発明の組成物は、製造から使用にいたるまでの間に120万Lux・hrの光量に曝光されたとしても、光による製剤の品質の低下は無く、非曝光品と同様に取り扱うことが可能であると考えられる。さらに、褐色ガラスバイアルの代わりに、よりコストが低い透明ガラスバイアルの使用が可能であると考えられる。【００８６】
【表７】
2017073767.tif 000012
【００８７】
【表８】
2017073767.tif 000013
【００８８】
【表９】
2017073767.tif 000014
【００８９】
実施例9（等張化剤により浸透圧比を調整したPK-0051含有組成物の安定性評価）
各種の等張化剤（NaCl、KCl、グリセリン、D-マンニトール、ラクチトール、D-ソルビトール、およびスクロース）を用いてPK-0051含有組成物の浸透圧比を1±0.1に調整し、安定性を評価した。
1. 被験組成物
被験組成物181の調製は以下のように行った。105.07gのクエン酸水和物を1Lの注射用水に溶解し0.5Mクエン酸溶液とした。同様に147.05gのクエン酸三ナトリウム二水和物を1Lの注射用水に溶解し0.5 Mクエン酸ナトリウム溶液とした。0.5Mクエン酸ナトリウム溶液に0.5Mクエン酸溶液を加えてpH6.0に調整し、0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を得た。1gのNaClを10mLの注射用水に溶解し、10%溶液を得た。210mgのPK-0051を140mLの注射用水に溶解し、原液とした。1mLの原液に0.68mLのNaCl 10%溶液、11.82mLの注射用水及び1.5mLの0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）製の0.22μmフィルターでろ過した。
被験組成物182の調製は、NaClの代わりにKClを用いた点、1mLの原液に0.85mLのKCl 10%溶液、11.65mLの注射用水及び1.5mLの0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合した点を除き、被験組成物181の調製と同様の方法で行った。
被験組成物183の調製は、NaClの代わりにグリセリンを用いた点、1mLの原液に1.8mLのグリセリン10%溶液、10.7mLの注射用水及び1.5mLの0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合した点を除き、被験組成物181の調製と同様の方法で行った。
被験組成物184の調製は、NaClの代わりにD-マンニトールを用いた点、1mLの原液に3.75mLのD-マンニトール 10%溶液、8.75mLの注射用水及び1.5mLの0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合した点を除き、被験組成物181の調製と同様の方法で行った。
被験組成物185の調製は、NaClの代わりにラクチトールを用いた点、1mLの原液に7.05mLのラクチトール10%溶液、5.45mLの注射用水及び1.5mLの0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合した点を除き、被験組成物181の調製と同様の方法で行った。
被験組成物186の調製は、NaClの代わりにD-ソルビトールを用いた点、1mLの原液に3.75mLのD-ソルビトール 10%溶液、8.75mLの注射用水及び1.5mLの0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合した点を除き、被験組成物181の調製と同様の方法で行った。
被験組成物187の調製は、NaClの代わりにスクロースを用いた点、1mLの原液に7mLのスクロース 10%溶液、5.5mLの注射用水及び1.5mLの0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合した点を除き、被験組成物181の調製と同様の方法で行った。
被験組成物188の調製は、1mLの原液に12.5mLの注射用水及び1.5mLの0.5Mクエン酸緩衝液（pH6.0）を加えて混合した点を除き、被験組成物181の調製と同様の方法で行った。
被験組成物189の調製は、1mLの原液に12.65mLの注射用水及び1.35mLのNaCl 10%溶液を加えて混合した点を除き、被験組成物181の調製と同様の方法で行った。
被験組成物181：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0）/NaCl（浸透圧比1））,（0.1 mg/mL）
被験組成物182：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0）/KCl（浸透圧比1））,（0.1 mg/mL）
被験組成物183：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0）/グリセリン（浸透圧比1））,（0.1 mg/mL）
被験組成物184：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0）/D-マンニトール（浸透圧比1））,（0.1 mg/mL）
被験組成物185：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0）/ラクチトール（浸透圧比1））,（0.1 mg/mL）
被験組成物186：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0）/D-ソルビトール（浸透圧比1））,（0.1 mg/mL）
被験組成物187：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0）/スクロース（浸透圧比1））,（0.1 mg/mL）
被験組成物188：PK-0051（0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0））,（0.1 mg/mL）
被験組成物189：PK-0051（NaCl（浸透圧比1））,（0.1 mg/mL）【００９０】
2. 評価方法
被験組成物181〜189をそれぞれ1mLずつ14本の5mLガラスバイアルに入れ、25℃/60%RH、40℃/75%RH及び60℃の安定性試験器に保存した。1及び2週間後に、各被験組成物30 μLを逆相HPLC及びイオン交換HPLCで測定した。
また、被験組成物181〜189について、60℃で4週間保存に相当する条件(105℃及び121℃で5分及び15分間)で加速試験を行った。被験組成物181〜189をそれぞれ、105℃で5分間、105℃で15分間、121℃で5分間、および121℃で15分間の4つの条件下でオートクレーブ処理した後、30 μLを逆相HPLC及びイオン交換HPLCで測定した。
HPLCで測定後、PK-0051の含量を算出し、保存開始時の含量に対する含量割合（%）の減少による安定性の評価を行った。含量の算出方法及び測定方法を以下に示す。
被験組成物188（100%）と注射用水とをそれぞれ9:1、8:2、7:3及び6:4の割合で混合した溶液（それぞれ90%、80%、70%及び60%）を検量線試料とし、各検量線試料30 μLをHPLCにかけてピーク面積を測定し、横軸（X）に理論含量（%）、縦軸（Y）にピーク面積をとり、各検量線試料の測定値をプロットして、最小二乗法により回帰直線（Y＝aX＋b）（検量線）を求め、同一条件下でのHPLCにて測定された被験組成物のピーク面積を該検量線に当てはめて、理論含量（%）を求めた。【００９１】
測定方法
下記測定条件にて検量線試料（60%〜100%）及び被験組成物を測定した。イオン交換HPLCによる測定は、実施例7と同様の測定方法で行った。逆相HPLCによる測定は、移動相Aとして50 mM TEAA（pH 7.3）を用いた点、および測定波長が254 nmである点を除いて、実施例8と同様の測定方法で行った。【００９２】
3. 結果
結果を表10〜18に示す。被験組成物181〜188では25℃、40℃及び60℃の2週間保存においてPK-0051の明確な含量低下は見られなかった。また、被験組成物181〜188では、オートクレーブ処理（105℃及び121℃の5分及び15分）においてもPK-0051の含量低下は約15%以内であり、高い安定性が示された。一方、被験組成物189では25℃、40℃及び60℃の2週間保存においてPK-0051の明確な含量低下は見られなかったものの、オートクレーブ処理（121℃の5分及び15分）においてPK-0051の含量低下が顕著に見られた（121℃の5分で約24%、121℃の15分で約41%の低下）。また、0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0）が含まれない状況下ではNaClによる影響により安定性が低下する事が明らかとなった。以上の結果より、等張化剤が、0.05 Mクエン酸緩衝液（pH 6.0）中のPK-0051の安定性を低下させることは無いことが明らかになった。【００９３】
【表１０】
2017073767.tif 000015
【００９４】
【表１１】
2017073767.tif 000016
【００９５】
【表１２】
2017073767.tif 000017
【００９６】
【表１３】
2017073767.tif 000018
【００９７】
【表１４】
2017073767.tif 000019
【００９８】
【表１５】
2017073767.tif 000020
【００９９】
【表１６】
2017073767.tif 000021
【０１００】
【表１７】
2017073767.tif 000022
【０１０１】
【表１８】
2017073767.tif 000023
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明によれば、TGF-β1の発現を抑制し得る一本鎖核酸分子PK-0051を、常温で溶液の状態で長期安定に保存することができる。従って、保存や輸送が簡便であり、また、用時に再溶解して調製する必要もなく、取扱いに優れた核酸医薬品を提供できる点で極めて有用である。
本出願は、日本で出願された特願2015-215207（2015年10月30日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
2017073767.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2017073767.tif 000031
【図８】
2017073767.tif 000032
【図９】
2017073767.tif 000033
【図１０】
2017073767.tif 000034
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
2017073767000001.app
【国際調査報告】
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2017073767.tif 000049
2017073767.tif 000050
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