(57)【要約】  この発明は、多孔質体の細孔内表面に固定化した標的モノクローナル抗体と、前記多孔質体の平均細孔径よりも大きい平均粒径を有するナノ粒子の表面に固定化したプロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の１００ｒｐｍ未満の低速で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させて前記標的モノクローナル抗体の消化を行う工程を含む、ただし、前記多孔質体の平均細孔径が１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であり、前記ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることを特徴とする、前記標的モノクローナル抗体から該抗体のＦａｂ領域若しくは可変領域又はその一部を含むペプチド断片の収量を増加する方法、並びに、該方法で使用するためのキットを提供する。
2016143226.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質体の細孔内表面に固定化した標的モノクローナル抗体と、前記多孔質体の平均細孔径よりも大きい平均粒径を有するナノ粒子の表面に固定化したプロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の速度で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させて前記標的モノクローナル抗体を前記プロテアーゼにより消化させる工程を含む、前記標的モノクローナル抗体から該抗体のＦａｂ領域若しくは可変領域又はその一部を含むペプチド断片を得る方法。
【請求項２】
多孔質体の細孔内表面に固定化した標的モノクローナル抗体と、前記多孔質体の平均細孔径よりも大きい平均粒径を有するナノ粒子の表面に固定化したプロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の１００ｒｐｍ未満の低速で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させて前記標的モノクローナル抗体を前記プロテアーゼにより消化させる工程を含む、ただし、前記多孔質体の平均細孔径が１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であり、前記ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることを特徴とする、前記標的モノクローナル抗体から該抗体のＦａｂ領域若しくは可変領域又はその一部を含むペプチド断片の収量を増加する方法。
【請求項３】
前記ナノ粒子の平均粒径が多孔質体の平均細孔径の１．５倍〜４倍大きいことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記攪拌又はタッピングローテーション攪拌を、５０ｒｐｍ以下の低速で行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記プロテアーゼが、トリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、及びそれらの２以上の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的モノクローナル抗体が、前記多孔質体の細孔内表面にリンカー分子を介して結合されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチド断片が、相補性決定領域（ＣＤＲ）領域又はその一部を含むペプチド断片であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
生物学的サンプルから標的モノクローナル抗体又は該標的モノクローナル抗体を含む抗体集団を分離する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが、血液、血清、血漿、組織又は細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的モノクローナル抗体を含む抗体集団を前記多孔質体の細孔内表面に結合する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記液体が、塩を含まない緩衝液であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的モノクローナル抗体が、抗体治療薬であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法で使用するためのキットであって、（ｉ）標的モノクローナル抗体を固定化可能な細孔を有する多孔質体、（ｉｉ）プロテアーゼを表面に固定化したナノ粒子、及び（ｉｉｉ）前記標的モノクローナル抗体と前記プロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の１００ｒｐｍ未満の低速で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させることを指示する使用説明書を含み、ただし前記ナノ粒子の平均粒径が前記多孔質体の細孔径よりも大きいことを特徴とするキット。
【請求項１４】
抗体を分離精製するためのアフィニティー手段をさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記多孔質体が、粒子表面及び細孔内表面に結合されたリンカー分子を有することを特徴とする、請求項１３又は１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記リンカー分子が、抗体結合ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析を用いたモノクローナル抗体の検出のための、反応場を制限したプロテアーゼ分解反応により標的モノクローナル抗体から特異的配列を含むペプチド断片を得る、好ましくは増加収量で得る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療現場でのトラスツズマブ（商品名：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）などの抗体医薬による治療の拡大に伴って患者血液中の抗体濃度が患者の生存率と有意の相関関係があることが知られるようになり、血中の抗体濃度を精度よく定量することが求められている。また、薬物動態確認等の品質管理や、後発医薬品の臨床試験等における先発医薬品との同一性確認等においても、抗体医薬の同定や、その血中濃度の定量へのニーズが益々増大している。【０００３】
タンパク質の定量法には、酵素抗体測定法、蛍光抗体測定法、放射免疫測定法などの他に、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析（ＬＣＭＳ）装置を使用する方法なども知られている（例えば特許文献１、特許文献２、等）。ＬＣＭＳ法では、標的タンパク質をプロテアーゼで消化後に生じるペプチド断片をＬＣ法とＭＳ法を組み合わせて定量する。特許文献１では、生物学的サンプル中の抗体量を決定する方法において、サンプル中の非免疫グロブリンタンパク質のプロテアーゼ消化の後でペプシン様プロテアーゼ処理によって少なくともＣＤＲ領域を含む抗体断片を生成しＬＣＭＳ法で定量することが記載されている。【０００４】
プロテアーゼ消化は、消化対象となる基質タンパク質の種類により、その消化効率が異なるため、質量分析に供するためのペプチド断片サンプルの調製を簡便化するためには、消化効率の向上が重要となる。近年、プロテアーゼ消化の高効率化手法として、ナノ粒子等の微小環境（マイクロリアクター）内で、プロテアーゼ消化を行う方法が注目されており、例えば、非特許文献１では、ナイロンの多孔質膜の細孔内にトリプシンを固定化し、この多孔質膜にアルブミン溶液を通過させることにより、アルブミンのトリプシン消化を高効率化した例が報告されている。また、非特許文献２では、細孔内にトリプシンを固定したメソ多孔シリカを用いることで、分子量の小さいタンパク質を選択的にトリプシン消化できることが報告されている。これらの方法はいずれも、多孔質体の細孔内にプロテアーゼを固定化し、当該固定化プロテアーゼと液相内の基質タンパク質とを反応させるものである。このような方法は、よく知られており、固液分離、すなわちタンパク質分解産物と固定化プロテアーゼの分離を容易に行うことができるという利点がある。【０００５】
さらにまた、固定化プロテアーゼと固定化タンパク質とを反応させる方法も提供されており、例えば非特許文献３では、約１９０ｎｍ±２０ｎｍ粒径のナノ粒子に固定化されたプロテアーゼにより、細孔径５０〜１００ｎｍの微細孔内の表面に結合されたプロテインＧにＦｃを介して非共有結合的に結合された抗体を消化することによってＣＤＲペプチド若しくはその一部を含む抗体分解産物の生成法が開示されている。この方法は本発明者らによって開発され提案された斬新な方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５１５０２０号公報
【特許文献２】特開２０１２−１９７２５８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｅｉ  Ｘｕ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２０１０，  ８２：１００４５−１００５１
【非特許文献２】Ｑｉａｎｈａｏ  Ｍｉｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ２０１０，  ４６：６１４４−６１４６
【非特許文献３】ＮｏｒｉｋｏＩｗａｍｏｔｏ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｓｔ，  ２０１４，  １３９：５７６−５８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の非特許文献３に記載のように固相基質と固相酵素を反応させる場合、液体中での反応ではあるがそれぞれの固相は重力のために沈降する特性を有するため、攪拌などで分散性を保つ必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、今回、固相基質（抗体タンパク質）−固相酵素（プロテアーゼ）反応において特定の固相−固相間の接触を最適化するとき目的の分解産物の収量が有意に増加することを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
本発明は、要約すると以下の特徴を含む。【００１１】
（１）多孔質体の細孔内表面に固定化した標的モノクローナル抗体と、前記多孔質体の平均細孔径よりも大きい平均粒径を有するナノ粒子の表面に固定化したプロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の速度で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させて前記標的モノクローナル抗体を前記プロテアーゼにより消化させる工程を含む、前記標的モノクローナル抗体から該抗体のＦａｂ領域若しくは可変領域又はその一部を含むペプチド断片を得る方法。【００１２】
（２）多孔質体の細孔内表面に固定化した標的モノクローナル抗体と、前記多孔質体の平均細孔径よりも大きい平均粒径を有するナノ粒子の表面に固定化したプロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の１００ｒｐｍ未満の低速で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させて前記標的モノクローナル抗体を前記プロテアーゼにより消化させる工程を含む、ただし、前記多孔質体の平均細孔径が１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であり、前記ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることを特徴とする、前記標的モノクローナル抗体から該抗体のＦａｂ領域若しくは可変領域又はその一部を含むペプチド断片の収量を増加する方法。【００１３】
（３）前記ナノ粒子の平均粒径が多孔質体の平均細孔径の１．５倍〜４倍大きいことを特徴とする、（１）又は（２）に記載の方法。【００１４】
（４）前記攪拌又はタッピングローテーション攪拌を、５０ｒｐｍ以下の低速で行うことを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。【００１５】
（５）前記プロテアーゼが、トリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、及びそれらの２以上の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。【００１６】
（６）前記標的モノクローナル抗体が、前記多孔質体の細孔内表面にリンカー分子を介して結合されていることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。【００１７】
（７）前記ペプチド断片が、相補性決定領域（ＣＤＲ）領域又はその一部を含むペプチド断片であることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。【００１８】
（８）生物学的サンプルから標的モノクローナル抗体又は該標的モノクローナル抗体を含む抗体集団を分離する工程をさらに含むことを特徴とする、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。【００１９】
（９）前記生物学的サンプルが、血液、血清、血漿、組織又は細胞であることを特徴とする、（８）に記載の方法。【００２０】
（１０）前記標的モノクローナル抗体を含む抗体集団を前記多孔質体の細孔内表面に結合する工程をさらに含むことを特徴とする（８）又は（９）に記載の方法。【００２１】
（１１）前記液体が、塩を含まない緩衝液であることを特徴とする、（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。【００２２】
（１２）前記標的モノクローナル抗体が、抗体治療薬であることを特徴とする、（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。【００２３】
（１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法で使用するためのキットであって、（ｉ）標的モノクローナル抗体を固定化可能な細孔を有する多孔質体、（ｉｉ）プロテアーゼを表面に固定化したナノ粒子、及び（ｉｉｉ）前記標的モノクローナル抗体と前記プロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の１００ｒｐｍ未満の低速で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させることを指示する使用説明書を含み、ただし前記ナノ粒子の平均粒径が前記多孔質体の細孔径よりも大きいことを特徴とするキット。【００２４】
（１４）抗体を分離精製するためのアフィニティー手段をさらに含むことを特徴とする、（１３）に記載のキット。【００２５】
（１５）前記多孔質体が、粒子表面及び細孔内表面に結合されたリンカー分子を有することを特徴とする、（１３）又は（１４）に記載のキット。【００２６】
（１６）前記リンカー分子が、抗体結合ポリペプチドであることを特徴とする、（１５）に記載のキット。【００２７】
本発明の方法は、ＬＣＭＳ法により血液等の生物学的サンプル中の抗体医薬の濃度を正確に測定するための前処理として標的モノクローナル抗体のプロテアーゼ消化産物の収量を増加する方法を提供するものであり、したがって抗体医薬用分析キットの製品でのプロトコール最適化につながり、かつ分析再現性を保つことを可能にする利点を有する。【００２８】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-047740号の開示内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】この図は、本発明における反応場を制限したプロテアーゼ消化の原理を説明するための概念図である。
【図２】この図は、基質：プロテアーゼの最適量比を決定するための試験におけるプロテアーゼ消化の電気泳動図である。
【図３】この図は、消化時間検討実験の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）スペクトルである。
【図４】この図は、タッピングローテーション攪拌（回転数１〜５ｒｐｍ；タッピング回数２回／分）又はボルテックス（渦流）攪拌（回転数１００ｒｐｍ）下でのプロテアーゼ反応におけるトラスツズマブ抗体のトリプシン消化によるペプチド収量の比較である。図中、黒いバーがタッピングローテーション攪拌（Ｒｏｔａｔｅ）の結果を示し、白いバーがボルテックス攪拌（Ｖｏｌｔｅｘ）の結果を示す。（Ａ）及び（Ｂ）はそれぞれ、固定化抗体について１０μｇ／ｍｌ、３．３μｇ／ｍｌの抗体濃度（１反応あたりの抗体量はそれぞれ１μｇ、０．３３μｇである。）、固定化トリプシンについてトリプシン３μｇを用いて反応したときの結果を示す。横軸は標的ペプチド及びＭＲＭトランジションを示し、縦軸はボルテックス攪拌下でのペプチド収量を１としたときのタッピングローテーション攪拌下でのペプチド収量の相対値（変化倍率）を表す。ＭＲＭは、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（多重反応モニタリング）の略であり、イオン化プローブでイオン化した種々のイオンに対し、Ｑ１（１段目のＭＳ）において特定のイオン（プリカーサーイオン）を選択し、コリジョンセル（ｑ２，衝突室）でそのイオンを壊し（衝突誘起解離）、Ｑ３（２段目のＭＳ）において壊したイオン（プロダクトイオン）の中から特定のイオンを検出する方法である。ＭＲＭトランジションの数字は、Ｑ１の値（前駆体）＞Ｑ３の値（産物）を示す。測定されたペプチド断片は、ＩＹＰＴＮＧＹＴＲ（配列番号１）、ＦＴＩＳＡＤＴＳＫ（配列番号２）、ＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫ（配列番号３）、ＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲ（配列番号４）、ＧＬＥＷＶＡＲ（配列番号５）、ＤＴＹＩＨＷＶＲ（配列番号６）である。＊＊は、ｐ＞０．０１であることを示す。
【図５】この図は、タッピングローテーション攪拌（回転数１〜５ｒｐｍ；タッピング回数２回／分）とボルテックス（渦流）攪拌（回転数１００ｒｐｍ）下でのベバシズマブ抗体のトリプシン消化によるペプチド断片収量の比較である。図中、黒いバーがタッピングローテーション攪拌（Ｒｏｔａｔｅ）の結果を示し、白いバーがボルテックス攪拌（Ｖｏｌｔｅｘ）の結果を示す。（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）はそれぞれ、固定化抗体について１０μｇ／ｍｌ、３．３μｇ／ｍｌ、１．１μｇ／ｍｌの抗体濃度（１反応あたりの抗体量はそれぞれ１μｇ、０．３３μｇ、０．１１μｇである。）、固定化トリプシンについてトリプシン３μｇを用いて反応したときの結果を示す。横軸は標的ペプチド及びＭＲＭトランジションを示し、縦軸はボルテックス攪拌下でのペプチド収量を１としたときのタッピングローテーション攪拌下でのペプチド収量の相対値（変化倍率）を表す。ＭＲＭトランジションの数字は、Ｑ１の値（前駆体）＞Ｑ３の値（産物）を示す。測定されたペプチドは、ＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲ（配列番号７）、ＦＴＦＳＬＤＴＳＫ（配列番号８）である。＊＊は、ｐ＞０．０１であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明について、さらに具体的に説明する。
【００３１】
１．抗体のプロテアーゼ消化産物（ペプチド断片）の取得法及び収量増加法
本発明は、第１の態様により、多孔質体の細孔内表面に固定化した標的モノクローナル抗体と、前記多孔質体の平均細孔径よりも大きい平均粒径を有するナノ粒子の表面に固定化したプロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の速度で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させて前記標的モノクローナル抗体を前記プロテアーゼにより消化させる工程を含む、前記標的モノクローナル抗体から該抗体のＦａｂ領域若しくは可変領域又はその一部を含むペプチド断片を得る方法を提供する。
【００３２】
本発明はまた、上記方法と関連する第２の態様により、多孔質体の細孔内表面に固定化した標的モノクローナル抗体と、前記多孔質体の平均細孔径よりも大きい平均粒径を有するナノ粒子の表面に固定化したプロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の１００ｒｐｍ未満の低速で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させて前記標的モノクローナル抗体を前記プロテアーゼにより消化させる工程を含む、ただし、前記多孔質体の平均細孔径が１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であり、前記ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることを特徴とする、前記標的モノクローナル抗体から該抗体のＦａｂ領域若しくは可変領域又はその一部を含むペプチド断片の収量を増加する方法を提供する。
【００３３】
＜標的抗体＞
本発明の方法における測定対象はモノクローナル抗体、好ましくは抗体治療薬（「抗体医薬」とも称する。）である。
【００３４】
本明細書中で使用する「モノクローナル抗体」なる用語は、以下に定義するモノクローナル抗体の他に、該抗体の特異性を維持しつつ更なる機能を付加した複合体、例えば抗体融合タンパク質（例えば、エタネルセプト等）、抗体−薬物複合体（例えば、トラスツズマブ-エムタンシン等）などを含むものとする。
【００３５】
モノクローナル抗体は、免疫グロブリンＩｇＧであり、２本の重鎖（分子量約５０ｋＤａ）と２本の軽鎖（分子量約２５ｋＤａ）が複数のジスルフィド結合でつながった構造を有する生体高分子である。ＦａｂドメインとＦｃドメインがヒンジを介してつながっており、また重鎖及び軽鎖はそれぞれ定常領域と可変領域から成る。定常領域は、抗体の特徴的なＹ字型の形を保つ構造を有し、同一種由来の抗体のほとんどで共通するアミノ酸配列を有している。一方、可変領域には、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ，  ＣＤＲ）と呼ばれる特異的な配列を持つ部位が各３つずつ存在する。このＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）領域が規定する立体構造が抗原との特異的結合に関わっており、それによって抗体−抗原複合体が形成される。重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲ１の前、ＣＤＲ１とＣＤＲ２の間、ＣＤＲ２とＣＤＲ３の間、ＣＤＲ３の後にはそれぞれフレームワーク１（ＦＲ１）、フレームワーク２（ＦＲ２）、フレームワーク３（ＦＲ３）、フレームワーク４（ＦＲ４）が存在する。
【００３６】
抗体の高次構造でさらに特徴的なものは、リジッドな構造を持つ定常領域に対し、非常にフレキシブルなヒンジ領域である。重鎖のＣ末端側（特に、Ｆｃ領域のＣＨ２からＣＨ３にかけての領域）にはＰｒｏｔｅｉｎ  ＡやＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇと呼ばれる特定のタンパク質が結合する部位が存在することが知られている。
【００３７】
近年では、種々の疾患に対して特異的に作用し得る抗体医薬として、数多くのモノクローナル抗体が開発されており、そのいくつかは臨床の場で使用されている。本発明は、ＬＣＭＳ分析を利用した生物学的サンプル中の標的モノクローナル抗体の正確な検出や定量のために有用な方法を提供するものであり、当該方法において測定対象となり得るモノクローナル抗体としては、限定するものではないが、例えばパニツムマブ、オファツムマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ等のヒト抗体；トシリズマブ、トラスツズマブ、トラスツズマブ−ＤＭ１、ベバシズマブ、オマリズマブ、メポリズマブ、ゲムツズマブ、パリビズマブ、ラニビズマブ、セルトリズマブ、オクレリズマブ、モガムリズマブ、エクリズマブ等のヒト化抗体；リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ等のキメラ抗体等が挙げられる。なお、モノクローナル抗体の分子径は約１４．５ｎｍである。
【００３８】
本発明の方法によれば、標的モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域若しくはその一部、並びに／或いは、Ｆａｂ領域若しくはその一部、場合により定常領域の一部（例えばＦｃ領域）、好ましくは、少なくともＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３）領域又はその一部を含む領域を位置選択的にプロテアーゼ消化により切り出してペプチド断片の収量を増加することが可能であり、それによって得られた該抗体に特徴的かつ特異的なペプチド断片を質量分析に掛けることにより標的抗体の正確な同定や定量を行い得る。本発明方法は、抗体の種類に関わらず適用可能であるため、上記例示の抗体に限定されず、新規に開発されたモノクローナル抗体等にも適用できる。
【００３９】
抗体のＣＤＲ領域を決定するときには、目的の抗体のアミノ酸置換頻度分布、目的の抗体と他の抗体とのアミノ酸配列のマルチプルアラインメント、目的の抗体と内在性抗体との交差反応性等を確認することにより３つのＣＤＲ領域を決定することができる。本明細書における「ＣＤＲ（領域）」とは、ＣＤＲ１（領域）、ＣＤＲ２（領域）、ＣＤＲ３（領域）、或いはそれらの２つ以上のＣＤＲ領域の組み合わせをいう。
【００４０】
臨床現場で患者に抗体医薬（通常、モノクローナル抗体）を投与したときには、血中の該抗体量を正確に測定することが求められており、それによって治療計画に活かすことが可能になる。血中には、標的抗体の他に多量の免疫グロブリンが含まれているため、該標的抗体を含有する血液から慣用の遠心分離等により血清若しくは血漿を回収し、得られた血清若しくは血漿を、標的抗体の血中濃度を決定するためのサンプルとする。また必要であれば、標的抗体を有する組織や、標的抗体が膜レセプターを介して結合した細胞を分離し、慣用手法、例えば破砕、遠心分離、親和性クロマトグラフィー（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ結合又はＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ結合）等により抗体画分を分離しサンプルとすることができる。
【００４１】
本発明の実施形態により、生物学的サンプル（例えば血液）から標的抗体又は該標的抗体を含む抗体集団を分離する工程をさらに含むことができる。
【００４２】
本発明では、ＬＣＭＳを利用することによって、血液、血漿、血清、組織、細胞などの生物学的サンプルであっても標的のモノクローナル抗体の定性及び定量測定が可能である。この場合、該モノクローナル抗体は、分析に先立って該ＣＤＲ配列が決定されている必要がある。
【００４３】
＜多孔質体＞
本発明の方法に使用する多孔質体（例えば「抗体Ｆｃ固定化樹脂」）は、多数の細孔を有するものであれば、その材料は特に限定されず、活性炭、多孔質膜、多孔質樹脂ビーズ、金属粒子等を用いることができる。これらの中でも、抗体を部位特異的に結合可能なものが特に好ましい。
【００４４】
図１では、半球形状の細孔が図示されているが、細孔の形状は特に限定されない。また、多孔質膜のように、多孔質体を貫通する細孔が形成されたものを用いることもできる。多孔質体の細孔の大きさは特に限定されず、抗体を固定化した際に、細孔の表層付近に選択的に消化されるべき部位が位置するように、抗体の分子径等を考慮して決定することが好ましい。多孔質体の平均細孔径Ｄ２は、例えば、１０ｎｍ〜２００ｎｍ程度の範囲で、かつナノ粒子の平均粒径Ｄ１よりも小さい範囲で適宜に設定される。多孔質体の平均細孔径Ｄ２は、例えば、２０ｎｍ〜２００ｎｍ程度が好ましく、３０ｎｍ〜１５０ｎｍ程度がより好ましい。抗体のＦｃ領域を細孔内に固定化し、Ｆａｂ領域を位置選択的にプロテアーゼ消化するためには、多孔質体の細孔径は、３０ｎｍ〜１５０ｎｍが好ましく、４０ｎｍ〜１２０ｎｍがより好ましく、５０ｎｍ〜１００ｎｍ、特に約１００ｎｍがさらに好ましい。
【００４５】
本発明の方法は、測定対象のモノクローナル抗体を多孔質体の細孔内に固定化する。細孔内に抗体を固定化し、固相と液相の界面という微細な環境に存在させることで、抗体は変性を起こしやすく、分子の揺らぎが摂動を受け、プロテアーゼのアタックを受ける確率が向上する。また、本発明では、後述するようにプロテアーゼがナノ粒子に固定化されることで、立体的に安定で、自己消化が生じ難い環境となるため、プロテアーゼの安定性が増すと考えられる。そのため、本発明の方法によれば、位置選択的なプロテアーゼ消化が可能となることに加えて、プロテアーゼの高活性を維持できる。
【００４６】
本発明においては、多孔質体の細孔内に、抗体と部位特異的に相互作用するリンカー分子が固定化されたものが好ましく用いられる。抗体とリンカー分子との相互作用としては、化学結合、水素結合、イオン結合、錯体形成、疎水的相互作用、ファンデルワールス相互作用、静電的相互作用、立体選択的相互作用等が挙げられる。
【００４７】
リンカー分子としては、抗体結合ポリペプチド、例えば、抗体の特定部位と特異的に結合するＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、ＩｇＧ結合ペプチド、等が好ましく用いられる。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇは、抗体（特にＩｇＧ）のＦｃ領域と部位特異的に結合することが知られている。
【００４８】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）の細胞壁に存在する４６．７ｋＤａのタンパク質であり、免疫グロブリン（特にＩｇＧ）のＦｃ領域に特異的に結合する。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａとヒト免疫グロブリンとの結合性について、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４には強く結合するのに対し、ヒトＩｇＧ３とはほとんど結合しないことが知られている。
【００４９】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇは、ｇｒｏｕｐ  Ｇ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（Ｇ群溶血性レンサ球菌）の細胞壁に存在するタンパク質であり、免疫グロブリン（特にＩｇＧ）のＦｃ領域に特異的に結合し、Ｆａｂフラグメントとも弱く結合することが知られている。
【００５０】
ＩｇＧ結合ペプチドは、例えば国際公開ＷＯ２０１３／０２７７９６Ａ１に記載される、ＩｇＧに特異的に結合する、かつ、約１３〜１７アミノ酸からなる公知のポリペプチドである。
【００５１】
表面及び細孔内にこれらのリンカー分子が固定化された多孔質体を用いることにより、細孔内のリンカー分子を介して抗体がそのＦｃ領域で固定化され、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域又はＦａｂ領域が細孔の表層付近に位置するようにすることができる。このように、細孔内での抗体の配向が制御されることで、プロテアーゼによる抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域又はＦａｂ領域、好ましくは可変領域内のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３）又はその一部を含む領域の位置選択的消化が可能となる。ここで、「その一部」とは、例えば「ＣＤＲ１の一部」と称する場合、ＣＤＲ１領域のアミノ酸配列において連続するアミノ酸残基が少なくとも１個以上、好ましくは複数個含む部分を意図する。
【００５２】
リンカー分子の大きさは、抗体の選択的切断部位が細孔の表層付近に位置するように選択される。リンカー分子と抗体とが結合した状態の分子サイズは、多孔質体の細孔径の０．２倍〜１．５倍程度が好ましく、０．６倍〜１．２倍程度がより好ましく、０．７倍〜１．１倍程度がさらに好ましく、０．８倍〜１倍程度が特に好ましい。なお、多孔質体にリンカー分子が固定されておらず、細孔内に抗体を直接結合させる場合は、抗体の分子径と多孔質体の細孔径が上記関係を満たすことが好ましい。
【００５３】
本発明において好適に使用可能な多孔質体として、特に限定するものではないが、例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ社製）、トヨパール、ＴＳＫｇｅｌ（ＴＯＳＯＨ社製）等が挙げられる。例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ樹脂では、樹脂に結合したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇの９５％は細孔内にあることがわかっている。
【００５４】
＜多孔質体への抗体の固定化＞
抗体を多孔質体の細孔内に固定化する方法は特に限定されず、抗体と多孔質体或いはリンカー分子の特性等に応じて適宜の方法を採用できる。例えば、細孔内にｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、ＩｇＧ結合ペプチドなどの抗体結合ポリペプチドが予め固定化されている多孔質体に抗体を固定化する場合は、多孔質体の懸濁液と抗体を含む溶液とを混合することにより、細孔内に抗体を容易に固定化できる。
【００５５】
生物学的サンプルが血液、血漿又は血清である場合、前記標的抗体を含む抗体集団を前記多孔質体の細孔内表面に結合することができる。このような場合であっても、例えば液体クロマトグラフィー（ＬＣ）による精密分離が可能であるため質量分析と組み合わせることによって標的抗体に特徴的なペプチド断片をＬＣＭＳ分析により定性及び定量することができる。
【００５６】
多孔質体と抗体の量比は、目的に応じて適宜に設定できる。例えば、抗体の定量分析を行う場合、サンプル中の抗体のほぼ全量が多孔質体に固定化されることが望まれる。そのため、サンプル中の抗体の推定含有量に対して、多孔質体の量が過剰となるように量比を設定することが好ましい。
【００５７】
＜ナノ粒子＞
本発明の方法において、ナノ粒子は、その表面にプロテアーゼを固定化して、多孔質体の細孔内に固定化された抗体へのプロテアーゼのアクセスを制御する目的で用いられる。そのため、ナノ粒子は、多孔質体の細孔の奥深くまで入り込まないように、その平均粒径Ｄ１が、多孔質体の平均細孔径Ｄ２よりも大きいものとする（図１）。
【００５８】
ナノ粒子の形状は特に限定されないが、多孔質体の細孔へのプロテアーゼのアクセスの均一化観点から、球状のナノ粒子が好ましい。また、ナノ粒子は、分散性が高く、直径ばらつきの少ない、平均粒径が均一であることが好ましい。
【００５９】
ナノ粒子の平均粒径Ｄ１は、５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であり、多孔質体の平均細孔径Ｄ２の１．２倍以上がより好ましく、１．５倍以上がさらに好ましく、１．８倍以上が特に好ましい。固相−固相間のプロテアーゼ消化反応の効率性を考慮すると、以下の範囲に限定するものではないが、ナノ粒子の平均粒径Ｄ１は、多孔質体の平均細孔径Ｄ２の１．５倍〜４倍が好ましく、１．８倍〜２．５倍、例えば約２倍、がさらに好ましい。例えば多孔質体の平均細孔径が３０〜１５０ｎｍ程度の場合、ナノ粒子の平均粒径Ｄ１は１００ｎｍ以上が好ましく、１５０ｎｍ以上がより好ましい。多孔質体の平均細孔径が５０ｎｍ〜１００ｎｍ程度の場合、ナノ粒子の平均粒径は、１２０ｎｍ以上が好ましく、１５０ｎｍ以上がより好ましく、１７０ｎｍ以上が特に好ましい。ナノ粒子の平均粒径Ｄ１の上限は、プロテアーゼによる消化効率を高める観点から、５００ｎｍ以下が好ましく、３００ｎｍ以下がさらに好ましい。
【００６０】
ナノ粒子は、上記のプロテアーゼを表面に固定化できるものであれば、その材質は特に限定されず、金属や樹脂等が適宜に用いられる。また、金属表面を樹脂で被覆したものや、樹脂表面を金属で被覆したもの等を用いることもできる。
【００６１】
ナノ粒子の種類としては、水性媒体に分散又は懸濁することができ、分散液又は懸濁液から磁気分離又は磁性沈殿分離により容易に回収することができる磁気ナノ粒子が好ましい。また、凝集が起こりにくいという点において、その表面が有機ポリマーで被覆された磁気ナノ粒子がより好ましい。磁気ナノ粒子の基材としては、酸化鉄（マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（γ‐Ｆｅ２Ｏ３））、フェライト（Ｆｅ／Ｍ）３Ｏ４などの強磁性合金が挙げられる。フェライト（Ｆｅ／Ｍ）３Ｏ４において、Ｍは、鉄イオンと共に用いて磁性金属酸化物を形成することのできる金属イオンを意味し、典型的にはＣｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋などが用いられる。また、磁気ナノ粒子を被覆する有機ポリマーとしては、ポリグリシジルメタクリレート（ポリＧＭＡ）、ＧＭＡとスチレンのコポリマー、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリアクリル酸メチル（ＰＭＡ）などを挙げることができる。有機ポリマーで被覆された磁性ナノビーズの具体例としては、ＦＧビーズ、ＳＧビーズ、Ａｄｅｍｂｅａｄｓ、ｎａｎｏｍａｇなどが挙げられる。市販品としては、例えば、多摩川精機株式会社（東京、日本国）製のＦＧ  ｂｅａｄｓ（フェライト粒子をポリグリシジルメタクリレート（ポリＧＭＡ）で被覆した粒径約２００ｎｍのポリマー磁性ナノ粒子）が好適に用いられる。
【００６２】
上記ナノ粒子は、非特異的なタンパク質の吸着抑制と、プロテアーゼの選択的な固定化のために、プロテアーゼと結合可能なスペーサ分子で修飾されていることが好ましい。スペーサ分子を介してプロテアーゼを固定化することにより、ナノ粒子表面からのプロテアーゼの脱離が抑制され、プロテアーゼ消化の位置選択性が高められる。また、スペーサの分子サイズを調整することにより、抗体の所望の位置にプロテアーゼを選択的にアクセスさせ、位置選択性を高めることもできる。
【００６３】
スペーサは、プロテアーゼと結合可能であり、かつプロテアーゼを失活させないものが好ましい。ナノ粒子表面に固定化されたプロテアーゼのアクセス範囲を制御する観点から、スペーサは分子径が小さいものが好ましい。スペーサの分子径は、５ｎｍ以下が好ましく、３ｎｍ以下がより好ましく、２ｎｍ以下がさらに好ましい。また、スペーサの分子量は２０００以下が好ましく、１５００以下がより好ましく、１０００以下がさらに好ましい。
【００６４】
上記分子径で、プロテアーゼを固定化できるスペーサ分子は、非タンパク質が好ましく、末端にアミノ基、カルボキシル基、エステル基、エポキシ基、トシル基、ヒドロキル基、チオール基、アルデヒド基、マレイミド基、スクシンイミド基、アジド基、ビオチン、アビジン、キレート等の官能基を有する分子が好ましい。例えば、トリプシンの固定には、活性化されたエステル基を有するスペーサ分子が好ましい。また、スペーサ分子のうち、上記官能基以外のスペーサアーム部分は、ポリエチレングリコール及びその誘導体、ポリプロピレングリコール及びその誘導体、ポリアクリルアミド及びその誘導体、ポリエチレンイミン及びその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）及びその誘導体、ポリ（エチレンテレフタル酸）及びその誘導体などの親水性分子が用いられる。
【００６５】
このようなスペーサ分子で表面修飾されたナノ粒子もまた市販されており、それらを利用すればよい。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたエステル基（活性エステル基）を有するスペーサ分子で修飾されたナノ粒子は、商品名「ＦＧ  ｂｅａｄｓ  ＮＨＳ」（多摩川精機株式会社）として市販されている。ＦＧ  ｂｅａｄｓ  ＮＨＳの粒子径は約２００ｎｍ±２０ｎｍであり、ナノ粒子として非常に均質のものである。
【００６６】
＜プロテアーゼ＞
本発明の方法は、プロテアーゼが、多孔質体の細孔内に固定化された抗体を特定のアミノ酸配列部位で切断して、好ましくは、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内のＣＤＲ領域又はその一部を含むペプチド断片を生じさせるものである。
【００６７】
本発明においてナノ粒子に固定化させるプロテアーゼの種類は、質量分析による定量又は同定の対象となるタンパク質の種類に応じて適宜選択すればよく、限定はされないが、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ−Ｃ）、Ｖ８プロテアーゼ、ＡｓｐＮプロテアーゼ（Ａｓｐ−Ｎ）、ＡｒｇＣプロテアーゼ（Ａｒｇ−Ｃ）、パパイン、ペプシン、ジペプチジルペプチダーゼなどが挙げられる。プロテアーゼは２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００６８】
上記プロテアーゼの中でも、本発明においては、トリプシンが特に好ましく用いられる。トリプシンは基質特異性が高く、また切断後のペプチドのＣ末端にＬｙｓ又はＡｒｇがあるためにペプチドの電荷量及び電荷局在を均質にすることができ、質量分析のためのサンプルの作製のために特に好適である。またトリプシンは分子径が小さく（約３．８ｎｍ）、かつ活性部位が分子の内部に存在している。そのため、活性部位が抗体にアクセスできる領域が制限され、プロテアーゼ消化の位置選択性を高めることができる。
【００６９】
プロテアーゼ消化後の抗体のペプチド断片を測定サンプルとして質量分析に供する場合は、自己消化が少なく、切断配列の選択性が高いプロテアーゼを用いることが好ましい。市販のプロテアーゼを用いる場合、質量分析グレードや配列決定（シーケンス）グレードのプロテアーゼを用いることが好ましい。例えば、生体由来のネイティブのトリプシンは、自己消化活性が残存していたり、キモトリプシン様の活性を示す疑似トリプシンが残存しているため、切断部位の特異性および活性が低いことが知られている。そのため、質量分析グレードとして、トリプシンのリジン残基を還元メチル化して自己消化に対する抵抗性を高めたものが市販されている。
【００７０】
本発明の方法において好適に使用できるプロテアーゼとして、例えばＴｒｙｐｓｉｎ  Ｇｏｌｄ（プロメガ社製）、Ｔｒｙｐｓｉｎ  ＴＰＣＫ−ｔｒｅａｔｅｄ（シグマ社製）等が挙げられる。
【００７１】
＜ナノ粒子へのトリプシンの固定化＞
プロテアーゼをナノ粒子の表面に固定化する方法は特に限定されず、プロテアーゼとナノ粒子（或いは、ナノ粒子表面を修飾するスペーサ分子）の特性等に応じて適宜の方法を採用でき、例えば、プロテアーゼをスペーサ修飾されたナノ粒子表面に固定化する場合は、ナノ粒子の懸濁液とプロテアーゼを含む溶液とを混合することにより、ナノ粒子表面にプロテアーゼを固定化できる。上記のスペーサ分子の官能基を介したナノ粒子とプロテアーゼのアミンカップリング法が好ましい。例えば、ナノ粒子に表面修飾したカルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）でエステル化して活性化エステル基とし、これに、プロテアーゼのアミノ基を結合させることができる。このカップリング反応には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ビス（２，６−ジイソプロピルフェニル）カルボジイミド（ＤＩＰＣ）等のカルボジイミドを縮合剤の存在下に行うことができる。また、ナノ粒子に表面修飾したアミノ基に、グルタルアルデヒド、２官能性スクシンイミド、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、スルホニルクロリド、マレイミド、ピリジルジスルフィド等の架橋剤を用いてプロテアーゼのアミノ基を結合させてもよい。
【００７２】
スペーサ分子の官能基を介したナノ粒子とプロテアーゼのカップリング法は、ナノ粒子の懸濁液にプロテアーゼ溶液を添加し、一定の条件下で混合撹拌するという簡便な操作で行うことができる。反応条件は特に限定されないが、例えば、プロテアーゼを添加したナノ粒子の懸濁液を温度１〜１０℃、ｐＨ７．０で、５０〜２００ｒｐｍで０．５〜１時間攪拌する。
【００７３】
ナノ粒子表面にプロテアーゼを固定化後に、ナノ粒子表面のプロテアーゼと未結合の活性部分を不活性化させることができる。例えば、ナノ粒子表面にプロテアーゼが固定化されていないスペーサ分子が存在すると、未結合のスペーサ分子が、サンプル中の夾雑物等と結合して、プロテアーゼ消化に悪影響を及ぼす場合や、プロテアーゼ消化により産生されたペプチド断片がナノ粒子に固定化される等の不具合を生じる場合などがある。プロテアーゼを固定化後に、未結合のスペーサ分子をブロックすることにより、このような不具合が抑制される。プロテアーゼと未結合の活性部分を不活性化する方法としては、化学修飾が好ましい。例えば、活性化エステル基は、一級アミンとの反応によりアミド結合を形成して不活性化させることができる。
【００７４】
＜プロテアーゼ消化＞
本発明により、標的となるモノクローナル抗体が固定化された上記多孔質体と、プロテアーゼが表面に固定化された上記ナノ粒子とを液体中で均一分散を保持する程度の１００ｒｐｍ未満の低速での攪拌又はタッピングローテーション撹拌により接触させることにより、抗体がプロテアーゼ消化され、該抗体からそのＦａｂ領域若しくは可変領域又はその一部を含むペプチド断片が増加収量で産生される。本方法による撹拌を含む条件は、ボルテックス撹拌（回転数１００ｒｐｍ）と比べて、目的ペプチド断片の収量を約２〜５倍程度増加させることができる。
【００７５】
本明細書で使用される「液体」なる用語は、基質（固相）及び酵素（固相）が液相中で接触し反応させるための媒体を意味し、プロテアーゼ消化反応に適した水性媒体を意図する。
【００７６】
本発明におけるプロテアーゼ消化のための必要な条件のひとつは、標的モノクローナル抗体が固定化された多孔質体とプロテアーゼが固定化されたナノ粒子とを液体中で均一分散を保持する程度の１００ｒｐｍ未満、より好ましくは５０ｒｐｍ以下、さらに好ましくは２０ｒｐｍ以下の低速で攪拌又はタッピングローテーション撹拌することにより接触させてプロテアーゼ消化反応を行うことである。このような範囲の速度であれば後述の実施例の効果と同等若しくはそれに近い効果を得ることができる。
【００７７】
本明細書中の「攪拌」は、上記の条件を満たす限り任意の攪拌様式で実施し得る。攪拌の例は、非限定的に、低速調整可能な、ロータリーミキサー、スターラー、ボルテックスミキサーなどによる攪拌である。
【００７８】
本明細書中で使用する「タッピングローテーション撹拌」は、上記の範囲内での緩やかな回転による撹拌とともに定期的なタッピングを伴うことを意図している。このような撹拌において、「緩やかな回転」は、例えば３〜１０ｒｐｍ程度の回転数を指し、また、「タッピング」は、弾くような、又は、ショック若しくは衝撃を与えるような瞬間的動作（頻度：例えば、１分間あたり１〜５回、好ましくは２〜４回）を指し、これによって、抗体固定化多孔質体とプロテアーゼ固定化ナノ粒子がともに均一分散状態を保持しながらナノ粒子上のプロテアーゼが多孔質体の細孔内のモノクローナル抗体のＮ末端側の重鎖及び軽鎖のＦａｂ領域若しくは可変領域を実質的に優先的に攻撃してプロテアーゼ消化反応効率を高める。
【００７９】
タッピングローテーション撹拌は、具体的には市販のタッピングロータリーミキサー、例えばショック付（タッピング）ロータリーミキサーＮＲＣ−２０Ｄ（日伸理化（東京、日本国）；回転数１〜１５ｒｐｍ、タッピング２回／分）などの撹拌装置を使用して行うことができる。
【００８０】
さらなる必要な条件は、反応の際に使用する上記液体は塩を含まない緩衝液である。塩は、緩衝剤成分以外の塩を意味し、とりわけ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）及び塩化カリウム（ＫＣｌ）である。塩が存在すると、粒子（固相）間の反発力が弱まって、粒子間の衝突が生じ易くなるため、プロテアーゼ消化が進み難くなる。
【００８１】
その他のプロテアーゼ消化の条件として、一般的には、プロテアーゼの種類に応じてその至適ｐＨ若しくはその近傍に調整された緩衝溶液中、至適温度若しくはその近傍の温度が選択される。プロテアーゼがトリプシンである場合、緩衝溶液は、通常、ｐＨ７．５〜９．０、例えばｐＨ８．０のトリスバッファーなどであり、また、温度は、通常、約３５〜４０℃、例えば３７℃程度である。本発明の方法では、反応のインキュベーション時間として、非限定的に約２時間〜２０時間程度することができるが、トータルの分析時間を短縮することも重要な要素であることから、抗体量とプロテアーゼ量の比率や、多孔質体の細孔径とナノ粒子の粒径との比率を最適化することによって反応時間を例えば１時間〜２時間又はそれ以下とすることも可能である。とりわけ、多孔質体の細孔径とナノ粒子の粒径との比率を決定する場合、多孔質体の細孔内に結合された抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又は、ＣＤＲ３）領域をプロテアーゼが選択的に攻撃できるように上記比率を設定することによって反応時間の短縮が可能になると考えられる。
【００８２】
モノクローナル抗体が固定化された多孔質体と、プロテアーゼが表面に固定化されたナノ粒子との混合量比は、特に制限されないものとし、例えば、基質：プロテアーゼ＝１００：１〜２０：１（重量比）程度である。本発明では、多孔質体とナノ粒子との組み合わせにより、モノクローナル抗体とプロテアーゼとのアクセスが物理的に制限されるため、一般的なプロテアーゼ消化に比べて、プロテアーゼ量を多くすることが好ましい。例えば、モノクローナル抗体：プロテアーゼ＝３０：１〜３：１程度が好ましく、１５：１〜４：１程度がより好ましく、１０：１〜５：１程度がさらに好ましい。
【００８３】
本発明の方法では、多孔質体にモノクローナル抗体を固定化させたままの状態で固定化プロテアーゼによる消化が行われる。プロテアーゼ消化により産生されたペプチド断片は液相内に存在するため、抗体の溶出や変性操作を行うことなく、位置選択的に目的のペプチド断片が得られる。本発明の方法によれば、従来法に比して簡便な操作で、かつ好ましくは、位置選択的に切断された、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又は、ＣＤＲ３）領域又はその一部を含むペプチド断片の収量増加を達成することができる。
【００８４】
より具体的には、例えば細孔径約９０〜１２０ｎｍのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ固定化樹脂上のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇに抗体のＣ末端側を非共有結合し、抗体の可変領域は必ず溶液側に配向するようにする。次に、粒子径約１８０〜２４０ｎｍのナノ粒子表面にプロテアーゼを固定化する。プロテアーゼの抗体への接触を制限することで、可変領域選択的に抗体のプロテアーゼ分解反応を行う反応場を形成することが可能となる。また相対表面積の非常に大きなナノ粒子表面をプロテアーゼ反応場として用いることで、抗原との接触確率を向上させることが可能となる。
【００８５】
これに関連して図１では、ナノ粒子の平均粒径Ｄ１は、多孔質体の平均細孔径Ｄ２よりも大きいため、ナノ粒子は細孔の表層付近にはアクセスできるが、細孔の奥深くにはアクセスできない。これに伴って、ナノ粒子表面に固定化されたプロテアーゼも、細孔の奥深くにはアクセスできない。図１において細孔付近の点線は、プロテアーゼがアクセスできる（すなわち、接近可能な）領域の境界を表している。このように、細孔内の抗体へのプロテアーゼのアクセスが位置特異的に制限され、抗体の液相側（特に可変領域又はＦａｂ領域）への相対的なアクセス確率が高められる。これにより、抗体を位置選択的にプロテアーゼ消化して、抗体に特徴的なペプチド断片を得ることができる。
【００８６】
後述の実施例では、抗体医薬であるトラスツズマブ及びベバシズマブを具体例として取り上げて本発明方法によるプロテアーゼ消化反応を実施した。その結果、タッピングローテーション攪拌（回転数３〜１０ｒｐｍ、タッピング回数２回／分）の場合のペプチド断片の収量は、反応スケール約２００μＬ、トリプシン３μｇ，抗体濃度１．１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ（１００μＬ使用）、温度３７℃、反応時間６時間のとき、ボルテックス攪拌（回転数１００ｒｐｍ）の場合と比べて、トラスツズマブで約３〜５倍、ベバシズマブで約１．４〜４倍それぞれ増加する傾向を示した。さらにまた、本方法によるトラスツズマブ及びベバシズマブのプロテアーゼ消化によってこれらの抗体を特徴づけるＣＤＲ領域又はその一部を含むペプチド断片が増加収量で回収することが確認された。このようなペプチド断片の例は以下のとおりである。
【００８７】
トリプシンによるトラスツズマブの消化では、例えば、ＴＮＧＹＴＲ（配列番号１；ＶＨ  ＣＤＲ２の一部）、ＦＴＩＳＡＤＴＳＫ（配列番号２；ＶＨ  ＣＤＲ３の一部）、ＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫ（配列番号３；ＶＬ  ＣＤＲ１の一部）、ＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲ（配列番号４；ＶＨ  ＣＤＲ３の一部）、ＧＬＥＷＶＡＲ（配列番号５；ＶＨ  ＣＤＲ２の一部）、ＤＴＹＩＨＷＶＲ（配列番号６；ＶＨ  ＣＤＲ１の一部）である。
【００８８】
トリプシンによるベバシズマブの消化では、例えば、ＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲ（配列番号７；ＶＨ  ＣＤＲ３の一部）、ＦＴＦＳＬＤＴＳＫ（配列番号８；ＶＨ  ＣＤＲ３の一部）、ＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号９；ＶＨ  ＣＤＲ２の一部とＣＤＲ２）、ＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲ（配列番号１０；ＶＬ  ＣＤＲ２の一部、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の一部）である。
【００８９】
プロテアーゼ消化によって得られた目的のペプチド断片を質量分析に供するためには、多孔質体及びナノ粒子を反応系から除去することが必要である。これは、プロテアーゼ消化後のサンプルに対して濾過、遠心分離、磁気分離、透析等の操作を行うことで達成できる。例えばポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）製の濾過膜（Ｌｏｗ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ＰＶＤＦ、孔径０．２μｍ、ミリポア社製）を用いてろ過することにより、多孔質体及びナノ粒子を簡便に除去することができる。
【００９０】
２．抗体ペプチド断片の定量
上記で得られたペプチド断片を含むサンプルを、クロマトグラフィーや質量分析により分析することで、抗体の同定や定量を行い得る。本発明では、基質タンパク質が位置選択的にプロテアーゼ処理されるため、サンプル中に含まれるペプチド断片の種類が低減されている。そのため、質量分析等による分析条件の設定を容易になし得る。分析に際しては、必要に応じて、脱塩、可溶化、抽出、濃縮、乾燥等の処理を行った後、サンプルを分析に用いてもよい。
【００９１】
プロテアーゼ消化により産生されたペプチド断片から、基質タンパク質の同定や定量を行うには、質量分析が適している。質量分析は、アミノ酸配列を決定可能であるため、ペプチド断片が抗体等の特定のタンパク質に由来のペプチド断片であるか否かを判別可能である。また、ピーク強度に基づいてサンプル中のペプチド断片の濃度を決定できる。
【００９２】
質量分析におけるイオン化法は特に限定されず、電子イオン化（ＥＩ）法、化学イオン化（ＣＩ）法、電界脱離（ＦＤ）法、高速原子衝突（ＦＡＢ）法、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法等を採用し得る。イオン化されたサンプルの分析方法も特に限定されず、磁場偏向型、四重極（Ｑ）型、イオントラップ（ＩＴ）型、飛行時間（ＴＯＦ）型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）型等を、イオン化法に応じて適宜に決定できる。また、三連四重極型質量分析装置等を用いて、ＭＳ／ＭＳ分析、あるいはＭＳ３以上の多段階質量分析を行うこともできる。
【００９３】
ペプチド断片の分離をより確実として、分析精度を高める等の目的で、質量分析に供する前のサンプルを、液体クロマトグラフ（ＬＣ）や、固相抽出（ＳＰＥ）等により、分離・濃縮してもよい。ＬＣによりサンプルの分離を行う場合、質量分析の前段としてＬＣを備えるＬＣ／ＭＳを用い、ＬＣからの溶出液を直接イオン化して質量分析に供しても良い。ＬＣとタンデム質量分析を組み合わせたＬＣ／ＭＳ／ＭＳやＬＣ／ＭＳｎにより分析を行うこともできる。また、ＬＣからの溶出液を一度分取してから、質量分析に供してもよい。ＬＣのカラムやＳＰＥの担体は特に限定されず、ペプチドの分析に一般的に用いられるＣ３０，Ｃ１８，Ｃ８，Ｃ４等の疎水性カラムや、親水性アフィニティークロマトグラフィー用の担体等を適宜に選択して用いることができる。ＬＣは、標的抗体に特徴的なペプチド断片を、例えば血液サンプル由来の多孔質体に結合された他の抗体由来のペプチド断片から区別し分離するために有用である。
【００９４】
質量分析結果に基づいて、抗体等のタンパク質を同定するために、既存のデータベースを用いることもできる。本発明では、抗体等の基質タンパク質が位置特異的にプロテアーゼ消化されたペプチド断片が用いられるため、データベース検索によるヒット率やデータの確度が高められる。また、多段階の質量分析等により、ペプチド断片のアミノ酸配列を特定することにより、基質タンパク質である抗体を同定することもできる。例えば、抗体に特異的なアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部のアミノ酸配列を含むペプチド断片のアミノ酸配列を決定すれば、抗体を同定できる。
【００９５】
なお、ＣＤＲ又はその一部の配列を含む特定のペプチド断片の検出結果に基づいて、抗体の検出や定量を行う場合、検出対象のペプチドは、アミノ酸残基数が５〜３０程度が好ましく、７〜２５程度がより好ましい。アミノ酸残基数が過度に小さいと、夾雑物や同一タンパク質の別の部位に由来するペプチド断片との区別がつき難く、誤検出等の原因となり得る。また、アミノ酸残基数が過度に大きいと、イオン化が困難となる等の理由により、検出が困難となる場合や定量性が低下する場合がある。
【００９６】
基質タンパク質である抗体の濃度を定量する場合、検出されたペプチド断片イオン（多段階ＭＳの場合は、ペプチド断片イオンの開裂により得られた開裂イオン）のピーク面積やピーク強度に基づいて、抗体の量を算出できる。また、定量に際して安定同位体を標識した内部標準の使用もありうる。例えば、予め求められた検量線（較正曲線）とピーク面積との関連付けや、サンプル中に添加された内部標準由来のピーク面積とサンプル由来のピーク面積との関連付け等によって、サンプル中のペプチド断片の濃度が算出され、ペプチド断片濃度に基づいて、抗体の量や濃度が算出される。
【００９７】
以下に、ＬＣＭＳの条件の一例を示すが、使用する装置に適した条件を設定することが望ましい。
（ＨＰＬＣ条件（Ｎｅｘｅｒａ  ＬＣ３０Ａ液体クロマトグラフシステム（島津製作所、京都、日本国）））
溶媒Ａ：０．１％ギ酸、溶媒Ｂ：０．１％ギ酸＋アセトニトリル
流速：０．５ｍｌ／分
グラジェント時間：１％Ｂ（１．５分）、１〜４０％Ｂグラジェント（５分）、９５％Ｂ（５分）、１％Ｂ（５分）
カラム：Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ２  ＯＤＳ，  ２×５０ｍｍ（化学物質評価研究機構、東京、日本国）
カラム温度：５０℃
（ＭＳインターフェイス条件（ＬＣＭＳ−８０５０（島津製作所））
ネブライザーガス：３  Ｌ／分
ヒーティングガス：１０  Ｌ／分
ドライイングガス：１０  Ｌ／分
インターフェイス温度：３００℃
ＤＬ温度：２５０℃
ヒートブロック温度：４００℃
【００９８】
３．ペプチド断片調製用キット
本発明はさらに、第３の態様により、上記１の方法で使用するためのキットであって、（ｉ）標的モノクローナル抗体を固定化可能な細孔を有する多孔質体、（ｉｉ）プロテアーゼを表面に固定化したナノ粒子、及び（ｉｉｉ）前記標的モノクローナル抗体と前記プロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の１００ｒｐｍ以下の低速で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させることを指示する使用説明書を含み、ただし前記ナノ粒子の平均粒径が前記多孔質体の細孔径よりも大きいことを特徴とするキットを提供する。
【００９９】
一の実施形態において、前記キットには、生物学的サンプル等から抗体を分離精製するためのアフィニティー手段をさらに含むことができる。
【０１００】
そのようなアフィニティー手段は、固相ゲル粒子に抗体結合ポリペプチドを結合させたものなど、例えばアガロースゲルにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇを共有結合して得られたアフィニティーカラムであり、通常、市販品でよい。
【０１０１】
別の実施形態において、前記多孔質体が、粒子表面及び細孔内表面に結合されたリンカー分子を有することができる。好ましいリンカー分子は、上記のとおり抗体結合ポリペプチドであり、具体的には、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、ＩｇＧ結合ペプチドなどである。
【０１０２】
本発明のキットに含まれる多孔質体及びナノ粒子は、上で説明したとおりであり、また、前記使用説明書は、本発明の方法により標的抗体由来のペプチド断片の収量増加を可能にするための手順や条件を記載したものである。
【０１０３】
ユーザーは、該使用説明書にしたがって標的抗体の位置特異的プロテアーゼ消化により目的のペプチド断片を増加収量で得ることができる。
【０１０４】
別の実施形態において、好ましいプロテアーゼはトリプシンであるが、上に記載し例示した種々のプロテアーゼを固定化するために使用できる。
【０１０５】
トリプシンは、基質特異性が高く、また切断後のペプチドのＣ末端にＬｙｓ又はＡｒｇがあるためにペプチドの電荷量及び電荷局在を均質にすることができ、質量分析のためのサンプルの作製のために特に好適であること、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のアミノ酸配列には適度に塩基性アミノ酸が存在するため適度のサイズのペプチド断片を切り出すことができることなどの利点がある。
【実施例】
【０１０６】
以下では、モノクローナル抗体としてトラスツズマブ（商品名：ハーセプチン）及びベバシズマブ（商品名：アバスチン）を具体例として選択し、タッピングローテーション攪拌（本発明）又はボルテックス攪拌（比較）を使用する条件にて各抗体をプロテアーゼ消化して得られた消化産物であるペプチド断片を質量分析に供して収量を決定した実験例を示す。なお、本発明の技術的範囲は、以下の具体例に限定されるものではない。【０１０７】
＜試薬類等＞
以下において、％の記載は、特に断りがない限り重量％を表す。本実験例で使用した試薬等は下記の通りである。
トリプシン（シーケンスグレード、ｐｒｏｍｅｇａ）
リジルエンドペプチダーゼ（質量分析グレード、和光純薬工業（大阪、日本国））
２−モルホリノエタンスルホン酸，（ＭＥＳ、同人化学（熊本、日本国））
２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ、同人化学）
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ、和光純薬工業）
上記以外の有機溶媒等、特に記載のないものは、和光純薬工業より入手した。【０１０８】
また、各バッファーは、精密ｐＨメーターを用いてｐＨを調整した以下の緩衝液を使用した。
ＭＥＳバッファー：２５ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ５．５
ＨＥＰＥＳバッファー：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ７．０
エタノールアミンバッファー：１Ｍ  エタノールアミン（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）−ＨＣｌ，ｐＨ８．０
Ｔｒｉｓバッファー：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０【０１０９】
＜抗体固定化多孔質体の作製＞
ＭＥＳバッファー２００μＬ中に、多孔質ビーズの表面にＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇを結合した樹脂ビーズの懸濁液（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＵｌｔｒａＬｉｎｋ  ｒｅｓｉｎ、平均粒径：１００μｍ、細孔径：５０〜１００ｎｍ）を５μＬ加え、そこに抗体溶液を加えた後、室温で約１時間ゆっくり撹拌し、樹脂ビーズ表面のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇに抗体を結合させ固定化した。その後、４℃で遠心（１５０００ｒｐｍ，１分）して樹脂ビーズを沈降させ、上清を取り除いた後、Ｔｒｉｓバッ２５ファーによる洗浄と遠心を２回繰り返し、Ｔｒｉｓバッファー（２００μＬ）中に多孔質ビーズを懸濁させた。なお、上記抗体溶液としては、トラスツズマブ（商品名：ハーセプチン、２０ｍｇ／ｍＬ、中外製薬）及びベバシズマブ（商品名：アバスチン、２０ｍｇ／ｍＬ、中外製薬）溶液を用いた。【０１１０】
＜プロテアーゼ固定化ナノ粒子の調製＞
平均粒径１９０ｎｍのナノ粒子の表面が、カルボキシ基がＮ−ヒロドキシスクシンイミドで活性化されたスペーサ（下記化学式（Ｌはナノ粒子表面への結合部位）参照、スペーサの長さ１ｎｍ）で修飾されたプロテアーゼ固定化用のナノ粒子（多摩川精機（東京、日本国）、ＦＧ  ｂｅａｄｓ  ＮＨＳ）を用いた。【０１１１】
【化１】
2016143226.tif 000003
【０１１２】
ＦＧ  ｂｅａｄｓのイソプロパノール懸濁液５０μＬを、４℃で遠心（１５０００ｒｐｍ，５分）してナノ粒子を沈降させ、上清を取り除いた後、メタノールで洗浄した。５０μｇのプロテアーゼを含む溶液を２００μＬのＨＥＰＥＳバッファーに溶解したものを、上記のナノ粒子に加えて、ナノ粒子を懸濁させた。なお、懸濁に際しては、懸濁液の温度が上昇しないように、数秒の超音波処理を行った。【０１１３】
このナノ粒子の懸濁液を、４℃で３０分撹拌し、４℃で遠心（１５０００ｒｐｍ，５分）してナノ粒子を沈降させ、上清を取り除いた後、エタノールアミンバッファー２００μＬを加えてビーズを懸濁させ、４℃で３０分撹拌して、ナノ粒子表面の余剰のＮ−ヒロドキシスクシンイミド基をエタノールアミンによりブロックした。その後、４℃で遠心（１５０００ｒｐｍ，５分）してナノ粒子を沈降させ、上清を取り除いた後、Ｔｒｉｓバッファーによる洗浄と遠心を２回繰り返し、Ｔｒｉｓバッファー（１００μＬ）中に懸濁させた。この懸濁液中のプロテアーゼ濃度は、０．５μｇ／μＬである。【０１１４】
［実験１：多孔質体への抗体固定化量の確認］
抗体固定化多孔質体の作製において、１００μｇのＩｇＧに対するＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ結合樹脂ビーズ懸濁液の量を０〜２０μＬの範囲で変化させ、上清液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析し、電気泳動像バンドピクセル数から、上清中に残った未結合ＩｇＧの概算量（抗体残量）を求めた。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ結合樹脂ビーズ量の増加にともなって、抗体残量が低減される傾向がみられ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ結合樹脂ビーズ量が１０μＬの場合の抗体残量は約３％であり、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ結合樹脂ビーズのカタログスペックをほぼ再現していることが確認できた。【０１１５】
［実験２：抗体とプロテアーゼの量比の検討］
ＩｇＧ固定化多孔質体懸濁液（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−ＩｇＧ）とプロテアーゼ固定化ナノ粒子（ＦＧ  ｂｅａｄｓ−Ｔｒｉｐｓｉｎ）とを混合し、３７℃で１５時間ゆっくり撹拌しながら、プロテアーゼ消化を行った。その後、４℃で遠心（１５０００ｒｐｍ，５分）して樹脂を沈降させ、液相（上清）を回収した。プロテアーゼの量が、５μｇ（水準１）、１０μｇ（水準２）、２５μｇ（水準３）となるように、プロテアーゼ固定化ナノ粒子の量を変化させて上記実験を行った。水準４〜６では、ＩｇＧ固定化多孔質体懸濁液に代えて、ＩｇＧが固定化されていない多孔質体（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＵｌｔｒａＬｉｎｋ  ｒｅｓｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））をそのまま用いて同様の実験を行った。また、水準７，８では、多孔質体を用いず、プロテアーゼ固定化ナノ粒子（ＦＧ  ｂｅａｄｓ−Ｔｒｉｐｓｉｎ）のみを３７℃で１５時間インキュベートした。【０１１６】
上記各実験の水準を表１に示す。表１における重量（μｇ）は、サンプル中のタンパク質（ＩｇＧまたはトリプシン）の量である。得られた上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動像を図２に示す。図２において、左端のレーンは分子量マーカーである。【０１１７】
【表１】
2016143226.tif 000004
【０１１８】
さらに、質量分析によりプロテアーゼ消化産物の解析を行った。【０１１９】
上記水準１〜６の上清を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ（島津製作所、ＡＸＩＭＡ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ＭＡＬＤＩ−ＱＩＴ  ＴＯＦ  ＭＳ）により分析した。まず、上清２０μＬに、終濃度が０．５％となるようにトリフルオロ酢酸を加え、疎水性樹脂充填チップ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＺｉｐＴｉｐ  ｕＣ１８）を用いて精製を行った後、１μＬで２回の溶出を行った。溶出液は直接ＭＡＬＤＩステンレスターゲット上にアプライし、クリーンベンチ内で風乾させた。風乾後、１０ｍｇ／ｍＬの２，５−ジヒドロキシ安息香酸溶液（ＤＨＢＡ、島津ＧＬＣ、水／アセトニトリル＝５０／５０）を１μＬ重層し、質量分析を行った。なお、装置のｍ／ｚは、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ｍ／ｚ＝１０４６．５４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とＡＣＴＨ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ｍ／ｚ＝２４６５．２０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて行った。【０１２０】
図２の水準４〜６のバンドは、いずれも水準７，８のバンドと同一であった。また、水準４〜６で検出されたｍ／ｚ＝８４２，１０４５，２２１１，２２８３のピークは、いずれもトリプシンの自己消化断片である。これらの結果から、プロテアーゼ固定化ナノ粒子とＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ多孔質体とを接触させても、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇは消化されないことがわかる。これは、多孔質体の細孔径が、プロテアーゼ固定化ナノ粒子の粒径よりも小さいために、ナノ粒子表面に固定化されたトリプシンが、細孔内のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇにアクセスできないことに起因すると考えられる。【０１２１】
水準１〜３では、トリプシンの自己消化断片以外に、ｍ／ｚ＝８３５、９１３、１１８７、１２８７、１５１０、１６７８、１９４６のピークが検出され、これらはいずれもＩｇＧのトリプシン消化ペプチド断片であることが確認された。この結果から、ＩｇＧを固定化した多孔質体と、トリプシンを固定化したナノ粒子とを接触させることにより、多孔質体のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇを消化することなく、ＩｇＧを選択的に消化できることが示された。【０１２２】
図２の水準１〜３を対比すると、トリプシン量の増加に伴い、高分子側のバンドが減少しており、抗体の消化反応がよく進んでいることがわかる。一方で、トリプシン量の増加に伴って自己消化も顕著になっている。これらの結果を踏まえて、水準２（基質：プロテアーゼ比率＝１０：１）を標準条件と設定し、以降の条件検討を行った。【０１２３】
なお、一般的なプロテアーゼ消化条件は、基質タンパク質：プロテアーゼ＝１００：１〜２０：１である。本方法では、多孔質体とナノ粒子との組み合わせにより、基質タンパク質とプロテアーゼとのアクセスが物理的に制限されているため、一般的なプロテアーゼ消化に比べて、プロテアーゼ量が多くなり、最適な基質：プロテアーゼ比率は１０：１〜５：１程度と推測される。【０１２４】
［実験３：消化時間に対する回収ペプチドの評価］
上記実験２の水準２の条件、すなわち、ＩｇＧ固定化多孔質体懸濁液（ＩｇＧ固相量１００μｇ）とプロテアーゼ固定化ナノ粒子（トリプシン固相量１０μｇ）とを混合し、３７℃での消化時間を、（１）１５分、（２）４５分、（３）９０分、（４）１８０分、（５）３６０分、（６）１５時間（終夜、Ｏ／Ｎ）とした。それ以外は、上記実験２と同様にして、トリプシン消化を行い、得られたサンプルの質量分析を行った。ＭＳスペクトルを図３に示す。【０１２５】
図３に示すように、消化時間の増加にともなって、ペプチド断片のピークが増大し、ペプチド断片の回収量が増加していることがわかる。（５）３６０分と（６）終夜とを比較すると、終夜の方が回収率は高く、特に、ｍ／ｚ＝１１８７，１５１０，１６７８等のプロテアーゼ消化を受け易い断片の集積がより顕著となる傾向がみられた。しかし、これらの断片は、抗体のＣ領域に由来する断片であり、ＣＤＲを含むペプチド断片の分析には寄与しないものである。そのため、プロテアーゼ消化時間を６時間に設定して、以降の検討を行った。【０１２６】
［実験４：トラスツズマブ又はベバシズマブのトリプシン消化および質量分析］
抗体としてＩｇＧに代えてトラスツズマブ又はベバシズマブを用いて抗体固定化多孔質体を作製し、上記実験２、実験３で選択した条件、すなわち、抗体固相量１００μｇに対するプロテアーゼ固定ナノ粒子量：１０μｇ、消化時間：６時間の条件でトリプシン消化を行い、質量分析を行い、質量分析結果に基づいて、データベース（Ｍａｓｃｏｔ  ｓｅｒｖｅｒ）解析を行った。その結果、トラスツズマブ、ベバシズマブはともに、極めて高いスコアで同定された。【０１２７】
本実験において、トラスツズマブ又はベバシズマブのペプチド断片が質量分析により検出されていることを確認するために、より詳細な質量分析を行った。【０１２８】
また、ＬＣ−ＭＳ（島津製作所、ＬＣＭＳ−８０８０  Ｔｒｉｐｌｅ−ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｕｌｔｒａ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ＭＳ）により、消化後の上清の分析を行った。なおＬＣ−ＭＳの測定に際しては、終濃度が０．５％となるように、上清にギ酸を加えたものをサンプルとして用い、ＬＣ条件は以下の通りとした。【０１２９】
＜ＨＰＬＣ溶液＞
溶液Ａ：０．１％ギ酸、１％アセトニトリル／水溶液
溶液Ｂ：０．１％ギ酸、アセトニトリル溶液【０１３０】
＜カラム＞
ＳｈｉｍＰａｃｋ  ＯＤＳ  ＸＲ−ＯＤＳ  ＩＩ  （内径２ｍｍ、カラム長５０ｍｍ；島津ジーエルシー（京都、日本国））
カラム温度：４０℃
流速：０．４ｍＬ／分
インジェクション量：２０μＬ【０１３１】
＜グラジェントプログラム＞
０−２分：％Ｂ＝０
２−１０分：％Ｂ＝０−４０グラジェント
１０−１１分：％Ｂ＝４０−９８グラジェント
１１−１３分：％Ｂ＝９８
１３−１３．５分：％Ｂ＝９８−０グラジェント
１３．５−１５分：％Ｂ＝０【０１３２】
トラスツズマブの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＬＨ）において、上記の質量分析で検出・同定されたペプチド配列は、トラスツズマブの場合、例えばＩＹＰＴＮＧＹＴＲ（配列番号１；ＶＨ  ＣＤＲ２の一部）、ＦＴＩＳＡＤＴＳＫ（配列番号２；ＶＨ  ＣＤＲ３の一部）、ＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫ（配列番号３；ＶＬ  ＣＤＲ１の一部）、ＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲ（配列番号４；ＶＨ  ＣＤＲ３の一部）、ＧＬＥＷＶＡＲ（配列番号５；ＶＨ  ＣＤＲ２の一部）、ＤＴＹＩＨＷＶＲ（配列番号６；ＶＨ  ＣＤＲ１の一部）などであり、ベバシズマブの場合、例えばＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲ（配列番号７；ＶＨ  ＣＤＲ３の一部）、ＦＴＦＳＬＤＴＳＫ（配列番号８；ＶＨ  ＣＤＲ３の一部）、ＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号９；ＶＨ  ＣＤＲ２の一部とＣＤＲ２）、ＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲ（配列番号１０；ＶＬ  ＣＤＲ２の一部、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の一部）などであった。トラスツズマブ及びベバシズマブの各アミノ酸配列に特徴的な配列が検出されているため、これらの抗体が実際に同定された。【０１３３】
［実験５：混合プロテアーゼ消化の検討］
以下では、本発明の系における混合プロテアーゼ消化の適用可能性を検討するため、トリプシンとリジルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ‐Ｃ）の併用系で、プロテアーゼ消化実験を行った。【０１３４】
上記各実験例と同様に、抗体（ＩｇＧまたはハーセプチン）１００μｇを多孔質体のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇに固定化した抗体固定化多孔質体と、１０μｇのプロテアーゼを固定化したナノ粒子とを、３７℃で６時間撹拌して、抗体のプロテアーゼ消化を行った。抗体としてＩｇＧを用いた場合およびハーセプチンを用いた場合のそれぞれについて、トリプシンとリジルエンドペプチダーゼの比（重量比）を、（１）１０：０、（２）９：１、（３）８：２、（４）０：１０として実験を行い、消化後の上清液および多孔質体表面の固定化成分のそれぞれを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分析した。【０１３５】
抗体としてハーセプチンを用いた場合の上記水準１〜４の消化後の上清を、上記実験２と同様にして、質量分析を行った。また、質量分析結果に基づいて、実験４と同様にＭａｓｃｏｔ  ｓｅｒｖｅｒ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ＵＳＡ）によるデータベース解析を行った。【０１３６】
トリプシンとリジルエンドペプチダーゼとを併用した水準２，３では、解析結果として、ハーセプチンの抗原結合領域に加えて、ヒト由来抗体の定常領域が示されていた。また、リジルエンドペプチダーゼのみを用いた水準４では、ハーセプチンが含まれず、抗体の定常領域のみが優位に検出されたとの解析結果が示された。【０１３７】
電気泳動により、リジルエンドペプチダーゼ比率の上昇にともなって、上清のペプチド断片の数が増え、バンド面積も増加する傾向があり、消化効率およびペプチド回収率が増大していることがわかる。また、質量分析により、リジルエンドペプチダーゼの比率の上昇にともなって、検出されるペプチド断片の種類や量が増加している。しかし、水準２〜４で新たに検出されたペプチド断片は、ハーセプチンのＦｃドメイン由来のものが多く、プロテアーゼ消化の位置選択性（Ｆａｂ領域を選択的に消化する特性）が低下していることがわかる。【０１３８】
これらの結果から、リジルエンドペプチダーゼの使用量が増大するにつれて、抗体の消化効率は向上するもの、プロテアーゼ消化の位置選択性が低下し、定常領域のペプチド断片の産生量が増大に伴って、Ｖ領域のペプチド断片の相対的な産生量が減少するために、抗体の検出・同定精度が低下する傾向がうかがえる。そのため、本発明の方法により、抗体のＦａｂ領域の位置選択的な切断を行い、ＣＤＲの特異的検出を行う観点においては、トリプシンを単独で用いることが好ましく、トリプシンとリジルエンドペプチダーゼとを併用する場合は、リジルエンドペプチダーゼの混合量を１０％以下とすることが好ましいといえる。【０１３９】
さらにまた、リジルエンドペプチダーゼのみを用いた水準４では、部位特異的な消化が行われなかったのに対して、トリプシンのみを用いた水準１（実験４）ではデータベース解析によりＣＤＲが効率的に検出されていることから、Ｆａｂ領域のＶ領域が選択的にプロテアーゼ消化されていることがわかる。以上の結果によれば、基質タンパク質が抗体である場合に、トリプシンを用いて本発明を適用すれば、抗体に対するプロテアーゼの立体的なアクセスが適切に制御され、位置選択的なプロテアーゼ消化が可能であることが示されたといえる。【０１４０】
また、本実験により、トリプシンとリジルエンドペプチダーゼを併用した場合に、各プロテアーゼがその機能を失うことなく、細孔内に固定化された基質タンパク質を切断し得ることが示された。抗体は、Ｖ領域が分子の先端に存在するために、リジルエンドペプチダーゼの使用量が増加すると位置特異性が低下する傾向があるが、基質として他のタンパク質を用いる場合には、プロテアーゼの併用系により、位置選択性や消化効率の向上が図られる可能性が示唆された。【０１４１】
以上、各実験例でより示したように、本発明によれば、抗体等のタンパク質を簡便な方法で位置選択的にプロテアーゼ消化してペプチド断片サンプルが得られ、得られたペプチド断片サンプルが質量分析によるタンパク質の同定や定量に適していることがわかる。【０１４２】
［実験６：抗体のプロテアーゼ消化におけるペプチド断片の収量増加の検討］
以下では、医薬抗体であるトラスツズマブ又はベバシズマブをトリプシン消化するときのペプチド断片の収量を増加することを可能にする条件の検討を行った。【０１４３】
＜実験手順＞
実験を以下の手順に従って行った。
（ステップ１）
抗体医薬（トラスツズマブ、ベバシズマブ）を低吸着チューブ（リッチェル  マイクロレシコチューブ  ９２０１７（Ｒｉｃｈｅｌｌ（富山、日本国）））にとり、１８０μＬのＰＢＳで希釈する。希釈溶液の濃度を、１０μｇ／ｍＬをスタートとし、３倍希釈系列で１０μｇ／ｍＬ、３．３μｇ／ｍＬ、１．１μｇ／ｍＬに調整した。各サンプルはＮ＝６にて分析を行う。【０１４４】
（ステップ２）
抗体分画ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ  ５３１２６  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＵｌｔｒａＬｉｎｋ  Ｒｅｓｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ））１０μＬをフィルターチューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＵＦＣ３０ＬＧ００  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−Ｃ３ＬＣＲ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）  ０．２μｍ）に分注する。【０１４５】
（ステップ３）
ステップ１の血清希釈サンプルを、ステップ２のフィルターチューブへ移す。【０１４６】
（ステップ４）
タッピングロータリーミキサー（ＮＲＣ−２０Ｄ型、日伸理化（東京、日本国））で軽くタッピングしながら、室温で２時間攪拌する。【０１４７】
（ステップ５）
遠心ろ過（１０，０００×ｇ、１分）し、溶液を分離する。ＰＢＳを２００μＬ加えて遠心ろ過し、ろ液を廃棄する。この操作を３回行い、抗体分画ビーズ（抗体量、それぞれ１．０μｇ、０．３３μｇ、０．１１μｇ）を回収する。【０１４８】
（ステップ６）
ステップ５の抗体分画ビーズに酵素反応緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）を２００μＬ加える。【０１４９】
（ステップ７）
抗体分解用ＦＧビーズ（トリプシン３μｇ）を氷上で手早く超音波洗浄機もしくはボルテックスミキサーで均一に分散し、ステップ６の酵素反応緩衝液へ加える。【０１５０】
（ステップ８）
フィルターチューブに溶液回収用チューブをとりつけ、ふた側にパラフィルムなどを用いシールをする。回転数１〜５ｒｐｍ及びタッピング回数２回／分に調整したタッピングロータリーミキサーでタッピングしながら、３７℃で６時間攪拌して、抗体のプロテアーゼ消化反応を行う。このとき比較群として、ボルテックスミキサーにて攪拌を行う。【０１５１】
（ステップ９）
ステップ８の反応混合液を遠心ろ過（１０，０００×ｇ、１分）し、樹脂を除去し、ろ液を回収する。【０１５２】
（ステップ１０）
ステップ９のろ液に、酵素反応停止液（１０％ギ酸）１５μＬを加える。【０１５３】
（ステップ１１）
ステップ１０の反応停止した溶液をＬＣＭＳバイアルセット（島津ＧＬＣ  ＧＬＣ４０１０−ＶＰターゲットバイアルＶＰ、Ｃ４０１０−６３０Ｐ  Ｔａｒｇｅｔ  ＰＰ  Ｐｏｌｙｓｐｒｉｎｇ）に移し、底の気泡を除去し、分析用サンプルとする。【０１５４】
（ステップ１２）
ステップ１１の分析用サンプルをＬＣＭＳのオートサンプラーにセットし、分析を行う。【０１５５】
＜結果＞
質量分析で検出・同定されたペプチド配列のなかから、トラスツズマブの場合、ＩＹＰＴＮＧＹＴＲ（配列番号１；ＶＨ  ＣＤＲ２の一部）、ＦＴＩＳＡＤＴＳＫ（配列番号２；ＶＨ  ＣＤＲ３の一部）、ＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫ（配列番号３；ＶＬ  ＣＤＲ１の一部）、ＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲ（配列番号４；ＶＨ  ＣＤＲ３の一部）、ＧＬＥＷＶＡＲ（配列番号５；ＶＨ  ＣＤＲ２の一部）、ＤＴＹＩＨＷＶＲ（配列番号６；ＶＨ  ＣＤＲ１の一部）を、一方、ベバシズマブの場合、ＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲ（配列番号７；ＶＨ  ＣＤＲ３の一部）、ＦＴＦＳＬＤＴＳＫ（配列番号８；ＶＨ  ＣＤＲ３の一部）、ＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲ（配列番号９；ＶＨ  ＣＤＲ２の一部とＣＤＲ２）、ＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲ（配列番号１０；ＶＬ  ＣＤＲ２の一部、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の一部）をそれぞれ選択し、タッピングローテーション攪拌又はボルテックス攪拌で反応したときの各ペプチド断片の収量をＬＣＭＳデータ（ＭＲＭイオン強度）から決定した。定量値の有意差はＴ検定を用いて行い、ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）とマークした。【０１５６】
結果を、配列番号１〜６のアミノ酸配列からなるペプチド断片の相対収量を図４に、及び、配列番号７〜８のアミノ酸配列からなるペプチド断片の相対収量を図５にそれぞれ示した。【０１５７】
図から、トラスツズマブとベバシズマブのプロテアーゼ消化反応の結果は、攪拌の仕方（すなわち、タッピングローテーション攪拌、ボルテックス攪拌）によって、反応産物であるペプチド断片の収量が大きく異なり、タッピングローテーション攪拌の場合のペプチド断片の収量は、ボルテックス攪拌（回転数１００ｒｐｍ）の場合と比べて、トラスツズマブで約３〜５倍、ベバシズマブで約１．４〜４倍それぞれ増加する傾向を示した。タッピングローテーション攪拌（好適回転数：３〜１０ｒｐｍ、好適タッピング回数：１〜５回）によりプロテアーゼ消化を効率よく進めることができる。【０１５８】
さらに、図から、基質：酵素の量比を変えることによって、タッピングローテーション攪拌：ボルテックス攪拌の相対収量比が変動するため、最適なペプチド断片収量を達成するように抗体濃度、例えば１．１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ（反応スケール２００μＬあたり１００μＬ使用）を含む範囲で最適の基質：酵素の量比を決定することが必要である。【０１５９】
さらにまた、ステップ８での抗体のプロテアーゼ消化反応では、塩（ＮａＣｌ）を含まない酵素反応緩衝液（好適ｐＨ：７．０〜９．０；トリプシンの場合ｐＨ約８．０）を使用することによって固相粒子同士の凝集を防止し良好な拡散が得られることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１６０】
反応場を制限したプロテアーゼ分解反応は知られているが、固相−固相間での反応効率を高めて抗体の分解産物であるペプチド断片（主に、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域若しくはＦａｂ領域又はその一部を含むペプチド断片）の収量を増加することは、これまでほとんどなされていなかったが、本発明によって非常に簡単な手法で効率よく抗体のペプチド断片の収量を増加させることができる。これによって、ＬＣＭＳを利用した血液などの生物学的サンプル中の医薬抗体の正確な定量を行うことができるため、医療現場で患者において副作用が低減され、かつ医師による効果的な治療が可能になる。
【配列表フリーテキスト】
【０１６１】
配列番号１〜１０：抗体断片【０１６２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月11日(2017.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔質体の細孔内表面に固定化した標的モノクローナル抗体と、前記多孔質体の平均細孔径よりも大きい平均粒径を有するナノ粒子の表面に固定化したプロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の速度で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させて前記標的モノクローナル抗体を前記プロテアーゼにより消化させる工程を含む、前記標的モノクローナル抗体から該抗体のＦａｂ領域若しくは可変領域又はその一部を含むペプチド断片を得る方法。
【請求項２】
多孔質体の細孔内表面に固定化した標的モノクローナル抗体と、前記多孔質体の平均細孔径よりも大きい平均粒径を有するナノ粒子の表面に固定化したプロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の１００ｒｐｍ未満の低速で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させて前記標的モノクローナル抗体を前記プロテアーゼにより消化させる工程を含む、ただし、前記多孔質体の平均細孔径が１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲であり、前記ナノ粒子の平均粒径が５０ｎｍ〜５００ｎｍの範囲であることを特徴とする、前記標的モノクローナル抗体から該抗体のＦａｂ領域若しくは可変領域又はその一部を含むペプチド断片の収量を増加する方法。
【請求項３】
前記ナノ粒子の平均粒径が多孔質体の平均細孔径の１．５倍〜４倍大きいことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記攪拌又はタッピングローテーション攪拌を、５０ｒｐｍ以下の低速で行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記プロテアーゼが、トリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ、及びそれらの２以上の組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的モノクローナル抗体が、前記多孔質体の細孔内表面にリンカー分子を介して結合されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチド断片が、相補性決定領域（ＣＤＲ）領域又はその一部を含むペプチド断片であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
生物学的サンプルから標的モノクローナル抗体又は該標的モノクローナル抗体を含む抗体集団を分離する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが、血液、血清、血漿、組織又は細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的モノクローナル抗体を含む抗体集団を前記多孔質体の細孔内表面に結合する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記液体が、塩を含まない緩衝液であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的モノクローナル抗体が、抗体治療薬であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法で使用するためのキットであって、（ｉ）標的モノクローナル抗体を固定化可能な細孔を有する多孔質体、（ｉｉ）プロテアーゼを表面に固定化したナノ粒子、及び（ｉｉｉ）前記標的モノクローナル抗体と前記プロテアーゼとを液体中で均一分散を保持する程度の１００ｒｐｍ未満の低速で攪拌又はタッピングローテーション攪拌することにより接触させることを指示する使用説明書を含み、ただし前記ナノ粒子の平均粒径が前記多孔質体の細孔径よりも大きいことを特徴とするキット。
【請求項１４】
抗体を分離精製するためのアフィニティー手段をさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記多孔質体が、粒子表面及び細孔内表面に結合されたリンカー分子を有することを特徴とする、請求項１３又は１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記リンカー分子が、抗体結合ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記低速が１０ｒｐｍ以下である、請求項４に記載の方法。
【請求項１８】
前記低速が１０ｒｐｍ以下である、請求項１３に記載のキット。
【国際調査報告】
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