(57)【要約】  非侵襲性であって、より精度が高い非アルコール性脂肪肝疾患等の肝疾患の病態を判別する方法を提供すること。非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）とを判別する方法であって、（１）被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程と、（２）同一の群の上記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアから指標値を求める工程と、（３）上記指標値が、基準値よりも大きい場合に、上記被験者がＮＡＳＨを罹患している可能性があると判定する工程と、を含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）とを判別する方法であって、
（１）被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する前記マーカー分子が、
（Ａ）ＰＲＯＳ１、ＣＬＵ、ＡＮＧ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＤ、ＣＦＨＲ１、コルチゾール、ＥＧＦＲ、ＨＰＮ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＥＴ、ＭＭＰ１０、テトラネクチン、ＴＴＲ、ＶＤＢＰ及びＶＥＧＦＲ−２からなる群１から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
ＶＣＡＭ１、ＨＡ、ＣＴＳＤ、ＣＯＬ４、ＣＯＬ４−７Ｓ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＣＣＬ１９、ＣＧＢ、ＣＳＦ１、ＦＡＳ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＣＡ１９−９、ＮＲＣＡＭ、ＯＰＧ、ＶＷＦ及びＹＫＬ−４０からなる群２から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
ＡＳＴ、ＰＳＡＴ、ＬＥＰ、ＩＣＡＭ１、ＣＫ−１８、ＧＳＴＡ１、ＡＬＴ、ＩＮＳＩＶＤ、ＩＮＳＭＡＰ、６Ｃｋｉｎｅ、ＡＧＴ、ＣＲＰ、ＣＸＣＬ１０、ＦＡＢＰ４、Ｇ６ＰＩ、ＨＳＰ−６０、Ｐ３ＮＰ及びテストステロンからなる群３から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、若しくは、
ＡＲＥＧ、ＢＤＮＦ、ＣＤ４０−Ｌ、ＥＲＥＧ、ＦＧＦ２、ＨＢＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＭＰ９、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦＢ、ＰＬＧＦ、ＳＡＰ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１及びＶＴＮからなる群４から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
又は、
（Ｂ）前記群１、前記群２、前記群３及び前記群４から選ばれる２つの群のうちの、一方から選択される少なくとも２つのマーカー分子及び他方から選択される少なくとも２つのマーカー分子、
である、工程と、
（２）前記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアから指標値を求める工程であって、同一の群の前記マーカー分子の量に基づく前記規格化スコアが下記式１から算出され、
【数１】
2016163539.tif 000072
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）、
前記マーカー分子が（Ａ）である場合、前記指標値が前記規格化スコアであり、
前記マーカー分子が（Ｂ）である場合、前記指標値が２つの群の規格化スコアから算出される、工程と、
（３）前記指標値が、基準値よりも大きい場合に、前記被験者がＮＡＳＨを罹患している、又はその可能性があると判定する工程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記（Ｂ）の場合であって、前記指標値が２つの群の規格化スコアから線形式又は非線形式を用いて算出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）とを判別する方法であって、
（１）被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する前記マーカー分子が、
（Ａ）ＰＲＯＳ１、ＣＬＵ、ＡＮＧ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＤ、ＣＦＨＲ１、コルチゾール、ＥＧＦＲ、ＨＰＮ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＥＴ、ＭＭＰ１０、テトラネクチン、ＴＴＲ、ＶＤＢＰ及びＶＥＧＦＲ−２からなる群１から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
ＶＣＡＭ１、ＨＡ、ＣＴＳＤ、ＣＯＬ４、ＣＯＬ４−７Ｓ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＣＣＬ１９、ＣＧＢ、ＣＳＦ１、ＦＡＳ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＣＡ１９−９、ＮＲＣＡＭ、ＯＰＧ、ＶＷＦ及びＹＫＬ−４０からなる群２から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
ＡＳＴ、ＰＳＡＴ、ＬＥＰ、ＩＣＡＭ１、ＣＫ−１８、ＧＳＴＡ１、ＡＬＴ、ＩＮＳＩＶＤ、ＩＮＳＭＡＰ、６Ｃｋｉｎｅ、ＡＧＴ、ＣＲＰ、ＣＸＣＬ１０、ＦＡＢＰ４、Ｇ６ＰＩ、ＨＳＰ−６０、Ｐ３ＮＰ及びテストステロンからなる群３から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、若しくは、
ＡＲＥＧ、ＢＤＮＦ、ＣＤ４０−Ｌ、ＥＲＥＧ、ＦＧＦ２、ＨＢＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＭＰ９、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦＢ、ＰＬＧＦ、ＳＡＰ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１及びＶＴＮからなる群４から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
又は、
（Ｂ）前記群１、前記群２、前記群３及び前記群４から選ばれる２つの群のうちの、一方から選択される少なくとも２つのマーカー分子及び他方から選択される少なくとも２つのマーカー分子、
である、工程と、
（２）前記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアから指標値を求める工程であって、同一の群の前記マーカー分子の量に基づく前記規格化スコアが下記式１から算出され、
【数２】
2016163539.tif 000073
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）、
前記マーカー分子が（Ａ）である場合、前記指標値が前記規格化スコアであり、
前記マーカー分子が（Ｂ）である場合、前記指標値が２つの群の規格化スコアから平均算出式を用いる方法、線形回帰式を用いる方法、線形判別式を用いる方法、ロジスティック回帰式を用いる方法、非線形平均算出式を用いる方法、非線形回帰式を用いる方法、非線形判別式を用いる方法、又は、非線形ロジスティック回帰式を用いる方法により算出される、工程と、
（３）前記指標値が、基準値よりも大きい場合に、前記被験者がＮＡＳＨを罹患している、又はその可能性があると判定する工程と、
を含む方法。
【請求項４】
前記（Ｂ）の場合であり、ロジスティック回帰式を用いる方法として、前記指標値が２つの群の規格化スコアから下記式２により算出される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
Ｉ＝ａ１×Ｍａ１＋ａ２×Ｍａ２                        （式２）
（式２において、Ｉは指標値を示し、Ｍａ１及びＭａ２はそれぞれ、前記２つの群のうちの一方の規格化スコア及び他方の規格化スコアを示し、ａ１及びａ２は、ロジスティック回帰分析によって定められる定数を示す。）
【請求項５】
前記（Ｂ）の場合であり、非線形判別式を用いる方法として、前記指標値が２つの群の規格化スコアから下記決定木１〜６のいずれかにより算出される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記マーカー分子が、前記群１及び群２より選ばれる場合は、
Ｍ１ａ≧０．４７６ならばＩ＝２、Ｍ１ａ＜０．４７６かつＭ２ａ≧０．４６６ならばＩ＝１  、Ｍ１ａ＜０．４７６かつＭ２ａ＜０．４６６ならばＩ＝０      （決定木１）
前記マーカー分子が、前記群１及び群３より選ばれる場合は、
Ｍ３ａ≧０．４０９かつ  Ｍ１ａ≧０．４５ならばＩ＝２、Ｍ３ａ≧０．４０９かつＭ１ａ＜０．４５ならばＩ＝１、Ｍ３ａ＜０．４０９ならばＩ＝０      （決定木２）
前記マーカー分子が、前記群１及び群４より選ばれる場合は、
Ｍ４ａ≧０．５４７ならばＩ＝２、Ｍ４ａ＜０．５４７かつＭ１ａ≧０．４６８ならばＩ＝１、Ｍ４ａ＜０．５４７かつ  Ｍ１ａ＜０．４６８ならばＩ＝０      （決定木３）
前記マーカー分子が、前記群２及び群３より選ばれる場合は、
Ｍ３ａ≧０．４０９かつＭ２ａ≧０．４１２ならばＩ＝２、Ｍ３ａ≧０．４０９かつＭ２ａ＜０．４１２ならばＩ＝１、Ｍ３ａ＜０．４０９ならばＩ＝０      （決定木４）
前記マーカー分子が、前記群２及び群４より選ばれる場合は、
Ｍ４ａ≧０．５４７ならばＩ＝２、Ｍ４ａ＜０．５４７かつＭ２ａ≧０．４１３ならばＩ＝１、Ｍ４ａ＜０．５４７かつ  Ｍ２ａ＜０．４１３ならばＩ＝０      （決定木５）
前記マーカー分子が、前記群３及び群４より選ばれる場合は、
Ｍ３ａ≧０．４０９ならばＩ＝２、Ｍ３ａ＜０．４０９かつＭ４ａ≧０．５８８ならばＩ＝１、Ｍ３ａ＜０．４０９かつＭ４ａ＜０．５８８ならばＩ＝０      （決定木６）
（決定木１〜６において、Ｉは指標値を示し、Ｍ１ａ、Ｍ２ａ、Ｍ３ａ及びＭ４ａはそれぞれ、前記群１、群２、群３、及び群４の規格化スコアを示す。）。
【請求項６】
前記（Ａ）の場合であって、前記マーカー分子が前記群１のＰＲＯＳ１及びＣＬＵである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記（Ａ）の場合であって、前記マーカー分子が前記群２のＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤである、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、ＨＡ及びＣＴＳＤである、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４である、又は、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記（Ａ）の場合であって、前記マーカー分子が前記群３のＡＳＴ及びＰＳＡＴである、ＡＳＴ及びＬＥＰである、ＡＳＴ及びＩＣＡＭ１である、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＬＥＰである、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＩＣＡＭ１である、ＡＳＴ、ＬＥＰ及びＣＫ−１８である、ＡＳＴ、ＩＣＡＭ１及びＧＳＴＡ１である、又は、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及び６Ｃｋｉｎｅである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記（Ｂ）の群１と群３の組合せの場合であって、群１より選択されるマーカー分子がＰＲＯＳ１及びＣＬＵであり、群３より選択されるマーカー分子がＡＳＴ及びＰＳＡＴである、ＡＳＴ及びＬＥＰである、ＡＳＴ及びＩＣＡＭ１である、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＬＥＰである、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＩＣＡＭ１である、ＡＳＴ、ＬＥＰ及びＣＫ−１８である、ＡＳＴ、ＩＣＡＭ１及びＧＳＴＡ１である、又は、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及び６Ｃｋｉｎｅである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
肝線維化を判別する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する前記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１、ＨＡ、ＣＴＳＤ、ＣＯＬ４、ＣＯＬ４−７Ｓ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＣＣＬ１９、ＣＧＢ、ＣＳＦ１、ＦＡＳ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＣＡ１９−９、ＮＲＣＡＭ、ＯＰＧ、ＶＷＦ及びＹＫＬ−４０からなる群２から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子である、又は、ＶＣＡＭ１である、工程と、
前記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアが、基準値よりも大きい場合に、前記被験者が肝線維化の病態である、又はその可能性があると判定する工程であって、前記規格化スコアが下記式１から算出される工程、を含む方法。
【数３】
2016163539.tif 000074
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）
【請求項１１】
肝線維化を判別する方法であって、
前記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１、ＨＡ、ＣＴＳＤ、ＣＯＬ４、ＣＯＬ４−７Ｓ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＣＣＬ１９、ＣＧＢ、ＣＳＦ１、ＦＡＳ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＣＡ１９−９、ＮＲＣＡＭ、ＯＰＧ、ＶＷＦ及びＹＫＬ−４０である、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤである、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、ＨＡ及びＣＴＳＤである、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、又は、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
肝線維化の判別が、マテオーニ分類におけるＴｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態とＴｙｐｅ−４の病態との判別、又は、線維化Stageにおける、Stage0、Stage1又はStage2の病態と、Stage3又はStage4の病態との判別である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
肝疾患の病態の進展度を判定する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する前記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、又は、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、工程と、
前記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアが大きい程、前記被験者における、肝臓の線維化の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度、もしくは、肝臓の炎症の進展度が高い、又はそれらの可能性があると判定する工程であって、前記規格化スコアが下記式１から算出される工程、を含む方法。
【数４】
2016163539.tif 000075
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを発症している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを発症している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）
【請求項１４】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の病態の進展度を判定する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する前記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、又は、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、工程と、
前記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアが大きい程、前記被験者における、肝臓の線維化の進展度、非アルコール性脂肪肝疾患の活動性の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度、もしくは、肝臓の炎症の進展度が高い、又はそれらの可能性があると判定する工程であって、前記規格化スコアが下記式１から算出される工程、を含む方法。
【数５】
2016163539.tif 000076
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを発症している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを発症している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
前記マーカー分子を検出するための試薬と、
前記方法を実施するための説明書と、を含むキット。
【請求項１６】
非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）とを判別する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、ＶＣＡＭ１の量を測定する工程と、
前記ＶＣＡＭ１の量が、基準値よりも大きい場合に、前記被験者がＮＡＳＨを罹患している、又はその可能性があると判定する工程、を含む方法。
【請求項１７】
肝線維化を判別する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、ＶＣＡＭ１の量を測定する工程と、
前記ＶＣＡＭ１の量が、基準値よりも大きい場合に、前記被験者が肝線維化の病態である、又はその可能性があると判定する工程、を含む方法。
【請求項１８】
肝疾患の病態の進展度を判定する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、ＶＣＡＭ１の量を測定する工程と、
前記ＶＣＡＭ１の量が大きい程、前記被験者における、肝臓の線維化の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度、もしくは、肝臓の炎症の進展度が高い、又はそれらの可能性があると判定する方法。
【請求項１９】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の病態の進展度を判定する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、ＶＣＡＭ１の量を測定する工程と、
前記ＶＣＡＭ１の量が大きい程、前記被験者における、肝臓の線維化の進展度、非アルコール性脂肪肝疾患の活動性の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度、もしくは、肝臓の炎症の進展度が高い、又はそれらの可能性があると判定する方法。
【請求項２０】
請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法に使用するためのキットであって、
ＶＣＡＭ１を検出するための試薬を含む、キット。
【請求項２１】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に使用するためのプログラムであって、
コンピュータに、
被験者から採取された血液に含まれる前記マーカー分子の量の測定データから前記式１に基づいて規格化スコアを算出し、算出された規格化スコアから指標値を求める、規格化ステップと、
求められた指標値を、基準値と比較する、比較ステップと、
比較した結果に基づき、肝疾患の病態を有するか否かを判定する、判定ステップと、
を実行させるためのプログラム。
【請求項２２】
請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法に使用するためのプログラムであって、
コンピュータに、
被験者から採取された血液に含まれるＶＣＡＭ１の量を、基準値と比較する、比較ステップと、
比較した結果に基づき、肝疾患の病態を有するか否かを判定する、判定ステップと、
を実行させるためのプログラム。
【請求項２３】
コンピュータに、被験者から採取された血液に含まれる前記マーカー分子の量又は前記ＶＣＡＭ１の量の測定データを取得する、取得ステップを更に実行させる、請求項２１又は２２に記載のプログラム。
【請求項２４】
請求項１〜１４、及び１６〜１９のいずれか一項に記載の方法に使用するための測定装置であって、
試料を設置するための試料設置部と、前記試料に光を照射するための光源部と、前記試料を透過した光を検出する検出部と、を備える測定装置。
【請求項２５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法に使用するための肝疾患判定システムであって、
被験者から採取された血液に含まれる前記マーカー分子の量を測定する測定装置と、測定した前記マーカー分子の量に基づいて肝疾患の病態を判定する肝疾患判定装置とを備え、
前記測定装置が試料を設置するための試料設置部と、前記試料に光を照射するための光源部と、前記試料を透過した光を検出する検出部と、を備え、
前記肝疾患判定装置が、前記測定装置からの測定データを取得する取得手段と、前記測定データから前記式１に基づいて規格化スコアを算出し、算出された規格化スコアから指標値を求める規格化手段と、求められた指標値を基準値と比較する比較手段と、比較した結果に基づき、肝疾患の病態を有するか否かを判定する判定手段と、を備える、肝疾患判定システム。
【請求項２６】
請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法に使用するための肝疾患判定システムであって、
被験者から採取された血液に含まれるＶＣＡＭ１の量を測定する測定装置と、測定した前記ＶＣＡＭ１の量に基づいて肝疾患の病態を判定する肝疾患判定装置とを備え、
前記測定装置が試料を設置するための試料設置部と、前記試料に光を照射するための光源部と、前記試料を透過した光を検出する検出部と、を備え、
前記肝疾患判定装置が、前記測定装置からの測定データを取得する取得手段と、前記ＶＣＡＭ１の量を基準値と比較する比較手段と、比較した結果に基づき、肝疾患の病態を有するか否かを判定する判定手段と、を備える、肝疾患判定システム。
【請求項２７】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を罹患している、肝臓の線維化の病態である、肝臓の線維化の進展度が高い、肝細胞の風船様変性の病態の進展度が高い、肝臓の炎症の進展度が高い、肝肥大の病態である、肝細胞の壊死の病態である、肝細胞のアポトーシスの病態である、肝細胞の変性の病態である、肝臓の脂肪化の病態である、又はそれらの可能性があるかを判定するための診断薬であって、ＶＣＡＭ１を検出するための試薬を含有する診断薬。
【請求項２８】
前記ＶＣＡＭ１を検出するための試薬が、抗体である、請求項２７に記載の診断薬。
【請求項２９】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、肝臓の線維化、肝細胞の風船様変性、肝臓の炎症、肝肥大、肝細胞の壊死、肝細胞のアポトーシス、肝細胞の変性、又は、肝臓の脂肪化のインビトロ検出のための、ＶＣＡＭ１を検出するための試薬の使用。
【請求項３０】
他の診断薬と併用する、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
他の診断薬がＨＡ、ＣＯＬ４、又は、ＣＯＬ４−７Ｓを検出するため診断薬である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
コンピュータに、
被験者から採取された血液に含まれるマーカー分子の量の測定データから求められた指標値を、基準値と比較する、比較ステップであって、前記マーカー分子がＶＣＡＭ１を含む、ステップと、
比較した結果に基づき、肝疾患の病態を有するか否かを判定する、判定ステップと、
を実行させるためのプログラム。
【請求項３３】
コンピュータに、被験者から採取された血液に含まれるマーカー分子の量の測定データを取得する、取得ステップを更に実行させる、請求項３２に記載のプログラム。
【請求項３４】
コンピュータに、前記測定データから規格化スコアを算出し、算出された規格化スコアから指標値を求める、規格化ステップをさらに実行させる、請求項３２又は３３に記載のプログラム。
【請求項３５】
前記マーカー分子がＨＡ、ＣＯＬ４、又は、ＣＯＬ４−７Ｓを更に含む、請求項３２〜３３のいずれか一項に記載のプログラム。
【請求項３６】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療薬の効果を判定する方法であって、
ＮＡＳＨ患者に対して前記治療薬の適用前と適用後とにおいてそれぞれ、前記患者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する前記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、又は、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、工程と、
前記マーカー分子の量に基づいて前記治療薬の適用前と適用後のそれぞれ規格化スコアを算出し、適用後の規格化スコアが、適用前の規格化スコアよりも減少している場合、前記治療薬を適用した効果があった可能性があると判定する工程であって、前記規格化スコアが下記式１から算出される工程、を含む方法。
【数６】
2016163539.tif 000077
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを発症している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを発症している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）
【請求項３７】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療薬の効果を判定する方法であって、
ＮＡＳＨ患者に対して前記治療薬の適用前と適用後とにおいてそれぞれ、前記患者から採取された血液に含まれる、ＶＣＡＭ１の量を測定する工程と、
適用後のＶＣＡＭ１の量が適用前のＶＣＡＭ１の量よりも減少している場合、前記治療薬を適用した効果があった可能性があると判定する方法。
【請求項３８】
非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）又は非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療薬の効果を判定する方法であって、
ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨ患者に対して前記治療薬の適用前と適用後とにおいてそれぞれ、
（１）被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する前記マーカー分子が、
（Ａ）ＰＲＯＳ１、ＣＬＵ、ＡＮＧ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＤ、ＣＦＨＲ１、コルチゾール、ＥＧＦＲ、ＨＰＮ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＥＴ、ＭＭＰ１０、テトラネクチン、ＴＴＲ、ＶＤＢＰ及びＶＥＧＦＲ−２からなる群１から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
ＶＣＡＭ１、ＨＡ、ＣＴＳＤ、ＣＯＬ４、ＣＯＬ４−７Ｓ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＣＣＬ１９、ＣＧＢ、ＣＳＦ１、ＦＡＳ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＣＡ１９−９、ＮＲＣＡＭ、ＯＰＧ、ＶＷＦ及びＹＫＬ−４０からなる群２から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
ＡＳＴ、ＰＳＡＴ、ＬＥＰ、ＩＣＡＭ１、ＣＫ−１８、ＧＳＴＡ１、ＡＬＴ、ＩＮＳＩＶＤ、ＩＮＳＭＡＰ、６Ｃｋｉｎｅ、ＡＧＴ、ＣＲＰ、ＣＸＣＬ１０、ＦＡＢＰ４、Ｇ６ＰＩ、ＨＳＰ−６０、Ｐ３ＮＰ及びテストステロンからなる群３から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、若しくは、
ＡＲＥＧ、ＢＤＮＦ、ＣＤ４０−Ｌ、ＥＲＥＧ、ＦＧＦ２、ＨＢＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＭＰ９、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦＢ、ＰＬＧＦ、ＳＡＰ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１及びＶＴＮからなる群４から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
又は、
（Ｂ）前記群１、前記群２、前記群３及び前記群４から選ばれる２つの群のうちの、一方から選択される少なくとも２つのマーカー分子及び他方から選択される少なくとも２つのマーカー分子、
である、工程と、
（２）前記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアから指標値を求める工程であって、同一の群の前記マーカー分子の量に基づく前記規格化スコアが下記式１から算出され、
【数７】
2016163539.tif 000078
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）、
前記マーカー分子が（Ａ）である場合、前記指標値が前記規格化スコアであり、
前記マーカー分子が（Ｂ）である場合、前記指標値が２つの群の規格化スコアから算出される、工程と、
（３）適用後の規格化スコアが、適用前の規格化スコアよりも減少している場合、前記治療薬を適用した効果があった可能性があると判定する工程と、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝疾患の病態を判別する方法に関する。また、本発明は非アルコール性脂肪肝（Nonalcoholic  fatty  liver;ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪肝炎（Nonalcoholic  steatohepatitis;ＮＡＳＨ）とを判別する方法、及び、肝線維化を判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（Nonalcoholic  fatty  liver  disease;ＮＡＦＬＤ）は、糖尿病及び肥満等の生活習慣病と密接に関連する肝疾患である。近年、生活習慣病を罹患している人の増加に伴い、世界的にＮＡＦＬＤの患者数が増加している。ＮＡＦＬＤは、予後良好な非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）から、予後不良な非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）までを含む。また、ＮＡＳＨは炎症、肝細胞の変性若しくは壊死、又は線維化を伴うことが知られている。ＮＡＳＨは進行すると肝硬変又は肝癌となり得る。さらに、ＮＡＳＨ患者の数も近年増加している。したがって、ＮＡＳＨを診断し、適切な治療を行うことが強く求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Poynard,  T.  et  al.  Diagnostic  value  of  biochemical  markers  (NashTest)  for  the  prediction  of  non  alcoholo  steato  hepatitis  in  patients  with  non-alcoholic  fatty  liver  disease.  BMC  Gastroenterol.  6,  34  (2006).
【非特許文献２】Younossi,  Z.  M.  et  al.  A  novel  diagnostic  biomarker  panel  for  obesity-related  nonalcoholic  steatohepatitis  (NASH).  Obes.  Surg.  18,  1430-7  (2008).
【非特許文献３】Sumida,  Y.  et  al.  A  simple  clinical  scoring  system  using  ferritin,  fasting  insulin,  and  type  IV  collagen  7S  for  predicting  steatohepatitis  in  nonalcoholic  fatty  liver  disease.  J.  Gastroenterol.  46,  257-68  (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、ＮＡＳＨを確定診断するための方法として、診療ガイドライン（NAFLD/NASH診療ガイドライン2014、日本消化器病学会編、南江堂、2014）で認められているのは肝生検による病理組織診断のみである。肝生検は穿刺で肝臓の組織を採取するという侵襲性の高い手法である。また肝生検は、通常入院が必要であること、費用が高額であること等から、ＮＡＳＨを罹患していると疑われる場合であっても適用されないことが多い。したがって、肝生検は、数多くの患者に対しての診断を行うには十分な方法とはいえない。このような事情から、肝生検を必要としない、非侵襲性のＮＡＳＨ診断マーカー（ＮＡＳＨを診断するためのマーカー）による、診断方法（判別方法）の開発が待たれている。
また、ＮＡＳＨの病徴の一つである肝線維化は、ＮＡＳＨの予後に大きな影響を及ぼす（J  Hepatol.  2005  Jan;42(1):132-8）ことから、ＮＡＳＨの診断及び治療において肝線維化を判別することが重要である。現在、肝線維化の有無の判別又はその進展度の評価においても、確定診断には肝生検が必要とされている。このような事情から、肝生検に拠らずに、肝線維化が生じているＮＡＳＨを判別する方法及びその進展度を評価する手法もまた開発が待たれている。【０００５】
これまでに、数多くの非侵襲性のＮＡＳＨ診断マーカーが報告されている。現在の診療ガイドラインでは、ＮＡＳＨの特徴として「脂肪変性、炎症、肝細胞障害（風船様変性）」が示されている。またＮＡＳＨには肝線維化を伴う症例も含まれる。ＮＡＦＬ−ＮＡＳＨの診断には、こうした肝生検の病理所見に基づくマテオーニ分類（Matteoni,  C.,  Younossi,  Z.  &  Gramlich,  T.  Nonalcoholic  fatty  liver  disease:  a  spectrum  of  clinical  and  pathological  severity.  Gastroenterology  1413-1419  (1999).）が広く用いられている。そして、既存のＮＡＳＨ診断法の大半は、こうしたＮＡＳＨの特徴的な病態に基づき、炎症のマーカー、肝細胞障害のマーカー、線維化のマーカー等を組み合わせたものである。既存のマーカーのうち、独立した患者群に基づく検証によって真の診断精度が確認されているのは、NASH  Test（非特許文献１）、NASH  Diagnostics（非特許文献２）、NAFIC  score（非特許文献３）の３つに留まる。一般的にＮＡＳＨの診断精度は、ＮＡＦＬＤ患者を対象にＮＡＳＨ患者をどの程度正しく診断できるかについての、感度及び特異度の受信者操作特性（Receiver  Operating  Characteristic;ＲＯＣ）曲線下の面積（Aria  Under  of  Receiver  Operating  Characteristic  curve;ＡＵＲＯＣ）によって示される。上述した３種類の既知診断法の学習／検証データに対するＮＡＦＬ−ＮＡＳＨ診断（病理所見に基づく診断）のＡＵＲＯＣ値は、それぞれ０．６９／０．８０、０．９１／０．７０、０．８５／０．７８である。これらの診断法はいずれも現在の診療ガイドラインにおいては、ＮＡＳＨの確定診断に適用できるものとは認められておらず、肝生検による確定診断の代替には一層の精度向上が必要とされる。【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、非侵襲性であって、より精度が高い非アルコール性脂肪肝疾患等の肝疾患の病型又は病態を判別する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究を行った結果、相互に生物学的な制御関係にある一群のマーカー分子を用いることで、非侵襲性の方法によって非アルコール性脂肪肝疾患等の肝疾患の病態を、従来の方法より精度よく判別できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、
（１）被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する上記マーカー分子が、
（Ａ）下記群１、下記群２、下記群３又は下記群４のいずれか１つの群中の少なくとも１種のマーカー分子であるか、
ＰＲＯＳ１、ＣＬＵ、ＡＮＧ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＤ、ＣＦＨＲ１、コルチゾール、ＥＧＦＲ、ＨＰＮ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＥＴ、ＭＭＰ１０、テトラネクチン、ＴＴＲ、ＶＤＢＰ及びＶＥＧＦＲ−２からなる群１、
ＶＣＡＭ１、ＨＡ、ＣＴＳＤ、ＣＯＬ４、ＣＯＬ４−７Ｓ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＣＣＬ１９、ＣＧＢ、ＣＳＦ１、ＦＡＳ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＣＡ１９−９、ＮＲＣＡＭ、ＯＰＧ、ＶＷＦ及びＹＫＬ−４０からなる群２、
ＡＳＴ、ＰＳＡＴ、ＬＥＰ、ＩＣＡＭ１、ＣＫ−１８、ＧＳＴＡ１、ＡＬＴ、ＩＮＳＩＶＤ、ＩＮＳＭＡＰ、６Ｃｋｉｎｅ、ＡＧＴ、ＣＲＰ、ＣＸＣＬ１０、ＦＡＢＰ４、Ｇ６ＰＩ、ＨＳＰ−６０、Ｐ３ＮＰ及びテストステロンからなる群３、
ＡＲＥＧ、ＢＤＮＦ、ＣＤ４０−Ｌ、ＥＲＥＧ、ＦＧＦ２、ＨＢＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＭＰ９、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦＢ、ＰＬＧＦ、ＳＡＰ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１及びＶＴＮからなる群４、
又は、
（Ｂ）上記群１、上記群２、上記群３及び上記群４から選ばれる２つの群のうちの、一方から選択される少なくとも１つのマーカー分子及び他方から選択される少なくとも１つのマーカー分子、
である、工程と、
（２）同一の群の上記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアから指標値を求める工程、及び
（３）上記指標値を、基準値と比較することにより、被験者が非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を罹患している可能性がある、又は、被験者が肝線維化の病態である可能性がある、と判定する工程を含む方法を提供するものである。
具体的には、本発明は以下に関する。
［１］非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）とを判別する方法であって、
（１）被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する上記マーカー分子が、
（Ａ）ＰＲＯＳ１、ＣＬＵ、ＡＮＧ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＤ、ＣＦＨＲ１、コルチゾール、ＥＧＦＲ、ＨＰＮ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＥＴ、ＭＭＰ１０、テトラネクチン、ＴＴＲ、ＶＤＢＰ及びＶＥＧＦＲ−２からなる群１から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
ＶＣＡＭ１、ＨＡ、ＣＴＳＤ、ＣＯＬ４、ＣＯＬ４−７Ｓ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＣＣＬ１９、ＣＧＢ、ＣＳＦ１、ＦＡＳ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＣＡ１９−９、ＮＲＣＡＭ、ＯＰＧ、ＶＷＦ及びＹＫＬ−４０からなる群２から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
ＡＳＴ、ＰＳＡＴ、ＬＥＰ、ＩＣＡＭ１、ＣＫ−１８、ＧＳＴＡ１、ＡＬＴ、ＩＮＳＩＶＤ、ＩＮＳＭＡＰ、６Ｃｋｉｎｅ、ＡＧＴ、ＣＲＰ、ＣＸＣＬ１０、ＦＡＢＰ４、Ｇ６ＰＩ、ＨＳＰ−６０、Ｐ３ＮＰ及びテストステロンからなる群３から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、若しくは、
ＡＲＥＧ、ＢＤＮＦ、ＣＤ４０−Ｌ、ＥＲＥＧ、ＦＧＦ２、ＨＢＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＭＰ９、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦＢ、ＰＬＧＦ、ＳＡＰ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１及びＶＴＮからなる群４から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
又は、
（Ｂ）上記群１、上記群２、上記群３及び上記群４から選ばれる２つの群のうちの、一方から選択される少なくとも２つのマーカー分子及び他方から選択される少なくとも２つのマーカー分子、
である、工程と、
（２）上記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアから指標値を求める工程であって、同一の群の上記マーカー分子の量に基づく上記規格化スコアが下記式１から算出され、
【数１】
2016163539.tif 000002
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）、
上記マーカー分子が（Ａ）である場合、上記指標値が上記規格化スコアであり、
上記マーカー分子が（Ｂ）である場合、上記指標値が２つの群の規格化スコアから算出される、工程と、
（３）上記指標値が、基準値よりも大きい場合に、上記被験者がＮＡＳＨを罹患している、又はその可能性があると判定する工程と、
を含む方法。
［２］上記（Ｂ）の場合であって、上記指標値が２つの群の規格化スコアから線形式又は非線形式を用いて算出される、上記［１］に記載の方法。
［３］非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）とを判別する方法であって、
（１）被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する上記マーカー分子が、
（Ａ）ＰＲＯＳ１、ＣＬＵ、ＡＮＧ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＤ、ＣＦＨＲ１、コルチゾール、ＥＧＦＲ、ＨＰＮ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＥＴ、ＭＭＰ１０、テトラネクチン、ＴＴＲ、ＶＤＢＰ及びＶＥＧＦＲ−２からなる群１から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
ＶＣＡＭ１、ＨＡ、ＣＴＳＤ、ＣＯＬ４、ＣＯＬ４−７Ｓ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＣＣＬ１９、ＣＧＢ、ＣＳＦ１、ＦＡＳ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＣＡ１９−９、ＮＲＣＡＭ、ＯＰＧ、ＶＷＦ及びＹＫＬ−４０からなる群２から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
ＡＳＴ、ＰＳＡＴ、ＬＥＰ、ＩＣＡＭ１、ＣＫ−１８、ＧＳＴＡ１、ＡＬＴ、ＩＮＳＩＶＤ、ＩＮＳＭＡＰ、６Ｃｋｉｎｅ、ＡＧＴ、ＣＲＰ、ＣＸＣＬ１０、ＦＡＢＰ４、Ｇ６ＰＩ、ＨＳＰ−６０、Ｐ３ＮＰ及びテストステロンからなる群３から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、若しくは、
ＡＲＥＧ、ＢＤＮＦ、ＣＤ４０−Ｌ、ＥＲＥＧ、ＦＧＦ２、ＨＢＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＭＰ９、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦＢ、ＰＬＧＦ、ＳＡＰ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１及びＶＴＮからなる群４から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
又は、
（Ｂ）上記群１、上記群２、上記群３及び上記群４から選ばれる２つの群のうちの、一方から選択される少なくとも２つのマーカー分子及び他方から選択される少なくとも２つのマーカー分子、
である、工程と、
（２）上記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアから指標値を求める工程であって、同一の群の上記マーカー分子の量に基づく上記規格化スコアが下記式１から算出され、
【数２】
2016163539.tif 000003
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）、
上記マーカー分子が（Ａ）である場合、上記指標値が上記規格化スコアであり、
上記マーカー分子が（Ｂ）である場合、上記指標値が２つの群の規格化スコアから平均算出式を用いる方法、線形回帰式を用いる方法、線形判別式を用いる方法、ロジスティック回帰式を用いる方法、非線形平均算出式を用いる方法、非線形回帰式を用いる方法、非線形判別式を用いる方法、又は、非線形ロジスティック回帰式を用いる方法により算出される、工程と、
（３）上記指標値が、基準値よりも大きい場合に、上記被験者がＮＡＳＨを罹患している、又はその可能性があると判定する工程と、
を含む方法。
［４］上記（Ｂ）の場合であり、ロジスティック回帰式を用いる方法として、上記指標値が２つの群の規格化スコアから下記式２により算出される、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
Ｉ＝ａ１×Ｍａ１＋ａ２×Ｍａ２                        （式２）
（式２において、Ｉは指標値を示し、Ｍａ１及びＭａ２はそれぞれ、上記２つの群のうちの一方の規格化スコア及び他方の規格化スコアを示し、ａ１及びａ２は、ロジスティック回帰分析によって定められる定数を示す。）
［５］上記（Ｂ）の場合であり、非線形判別式を用いる方法として、上記指標値が２つの群の規格化スコアから下記決定木１〜６のいずれかにより算出される、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
上記マーカー分子が、上記群１及び群２より選ばれる場合は、
Ｍ１ａ≧０．４７６ならばＩ＝２、Ｍ１ａ＜０．４７６かつＭ２ａ≧０．４６６ならばＩ＝１  、Ｍ１ａ＜０．４７６かつＭ２ａ＜０．４６６ならばＩ＝０      （決定木１）
上記マーカー分子が、上記群１及び群３より選ばれる場合は、
Ｍ３ａ≧０．４０９かつ  Ｍ１ａ≧０．４５ならばＩ＝２、Ｍ３ａ≧０．４０９かつＭ１ａ＜０．４５ならばＩ＝１、Ｍ３ａ＜０．４０９ならばＩ＝０      （決定木２）
上記マーカー分子が、上記群１及び群４より選ばれる場合は、
Ｍ４ａ≧０．５４７ならばＩ＝２、Ｍ４ａ＜０．５４７かつＭ１ａ≧０．４６８ならばＩ＝１、Ｍ４ａ＜０．５４７かつ  Ｍ１ａ＜０．４６８ならばＩ＝０      （決定木３）
上記マーカー分子が、上記群２及び群３より選ばれる場合は、
Ｍ３ａ≧０．４０９かつＭ２ａ≧０．４１２ならばＩ＝２、Ｍ３ａ≧０．４０９かつＭ２ａ＜０．４１２ならばＩ＝１、Ｍ３ａ＜０．４０９ならばＩ＝０      （決定木４）
上記マーカー分子が、上記群２及び群４より選ばれる場合は、
Ｍ４ａ≧０．５４７ならばＩ＝２、Ｍ４ａ＜０．５４７かつＭ２ａ≧０．４１３ならばＩ＝１、Ｍ４ａ＜０．５４７かつ  Ｍ２ａ＜０．４１３ならばＩ＝０      （決定木５）
上記マーカー分子が、上記群３及び群４より選ばれる場合は、
Ｍ３ａ≧０．４０９ならばＩ＝２、Ｍ３ａ＜０．４０９かつＭ４ａ≧０．５８８ならばＩ＝１、Ｍ３ａ＜０．４０９かつＭ４ａ＜０．５８８ならばＩ＝０      （決定木６）
（決定木１〜６において、Ｉは指標値を示し、Ｍ１ａ、Ｍ２ａ、Ｍ３ａ及びＭ４ａはそれぞれ、上記群１、群２、群３、及び群４の規格化スコアを示す。）。
［６］上記（Ａ）の場合であって、上記マーカー分子が上記群１のＰＲＯＳ１及びＣＬＵである、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［７］上記（Ａ）の場合であって、上記マーカー分子が上記群２のＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤである、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、ＨＡ及びＣＴＳＤである、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４である、又は、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓである、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［８］上記（Ａ）の場合であって、上記マーカー分子が上記群３のＡＳＴ及びＰＳＡＴである、ＡＳＴ及びＬＥＰである、ＡＳＴ及びＩＣＡＭ１である、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＬＥＰである、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＩＣＡＭ１である、ＡＳＴ、ＬＥＰ及びＣＫ−１８である、ＡＳＴ、ＩＣＡＭ１及びＧＳＴＡ１である、又は、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及び６Ｃｋｉｎｅである、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［９］上記（Ｂ）の群１と群３の組合せの場合であって、群１より選択されるマーカー分子が上記群１のＰＲＯＳ１及びＣＬＵであり、群３より選択されるマーカー分子がＡＳＴ及びＰＳＡＴである、ＡＳＴ及びＬＥＰである、ＡＳＴ及びＩＣＡＭ１である、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＬＥＰである、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＩＣＡＭ１である、ＡＳＴ、ＬＥＰ及びＣＫ−１８である、ＡＳＴ、ＩＣＡＭ１及びＧＳＴＡ１である、又は、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及び６Ｃｋｉｎｅである、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［１０］肝線維化を判別する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する上記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１、ＨＡ、ＣＴＳＤ、ＣＯＬ４、ＣＯＬ４−７Ｓ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＣＣＬ１９、ＣＧＢ、ＣＳＦ１、ＦＡＳ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＣＡ１９−９、ＮＲＣＡＭ、ＯＰＧ、ＶＷＦ及びＹＫＬ−４０からなる群２から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子である、又は、ＶＣＡＭ１である、工程と、
上記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアが、基準値よりも大きい場合に、上記被験者が肝線維化の病態である、又はその可能性があると判定する工程であって、上記規格化スコアが下記式１から算出される工程、を含む方法。
【数３】
2016163539.tif 000004
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）
［１１］肝線維化を判別する方法であって、
上記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１、ＨＡ、ＣＴＳＤ、ＣＯＬ４、ＣＯＬ４−７Ｓ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＣＣＬ１９、ＣＧＢ、ＣＳＦ１、ＦＡＳ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＣＡ１９−９、ＮＲＣＡＭ、ＯＰＧ、ＶＷＦ及びＹＫＬ−４０である、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤである、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、ＨＡ及びＣＴＳＤである、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、又は、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓである、上記［１０］に記載の方法。
［１２］肝線維化の判別が、マテオーニ分類におけるＴｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態とＴｙｐｅ−４の病態との判別、又は、線維化Stageにおける、Stage0、Stage1又はStage2の病態と、Stage3又はStage4の病態との判別である、上記［１０］又は［１１］に記載の方法。
［１３］肝疾患の病態の進展度を判定する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する上記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、又は、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、工程と、
上記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアが大きい程、上記被験者における、肝臓の線維化の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度、もしくは、肝臓の炎症の進展度が高い、又はそれらの可能性があると判定する工程であって、上記規格化スコアが下記式１から算出される工程、を含む方法。
【数４】
2016163539.tif 000005
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを発症している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを発症している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）
［１４］測定する上記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、又は、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである［１３］に記載の方法。
［１５］非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の病態の進展度を判定する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する上記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、又は、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、工程と、
上記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアが大きい程、上記被験者における、肝臓の線維化の進展度、非アルコール性脂肪肝疾患の活動性の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度、もしくは、肝臓の炎症の進展度が高い、又はそれらの可能性があると判定する工程であって、上記規格化スコアが下記式１から算出される工程、を含む方法。
【数５】
2016163539.tif 000006
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを発症している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを発症している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）
［１６］測定する上記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、又は、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである［１５］に記載の方法。
［１７］上記［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法に使用するためのキットであって、
上記マーカー分子を検出するための試薬と、
上記方法を実施するための説明書と、を含むキット。
［１８］非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）とを判別する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、ＶＣＡＭ１の量を測定する工程と、
上記ＶＣＡＭ１の量が、基準値よりも大きい場合に、上記被験者がＮＡＳＨを罹患している、又はその可能性があると判定する工程、を含む方法。
［１９］肝線維化を判別する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、ＶＣＡＭ１の量を測定する工程と、
上記ＶＣＡＭ１の量が、基準値よりも大きい場合に、上記被験者が肝線維化の病態である、又はその可能性があると判定する工程、を含む方法。
［２０］肝疾患の病態の進展度を判定する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、ＶＣＡＭ１の量を測定する工程と、
上記ＶＣＡＭ１の量が大きい程、上記被験者における、肝臓の線維化の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度、もしくは、肝臓の炎症の進展度が高い、又はそれらの可能性があると判定する方法。
［２１］非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の病態の進展度を判定する方法であって、
被験者から採取された血液に含まれる、ＶＣＡＭ１の量を測定する工程と、
上記ＶＣＡＭ１の量が大きい程、上記被験者における、肝臓の線維化の進展度、非アルコール性脂肪肝疾患の活動性の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度、もしくは、肝臓の炎症の進展度が高い、又はそれらの可能性があると判定する方法。
［２２］上記［１８］〜［２１］のいずれかに記載の方法に使用するためのキットであって、
ＶＣＡＭ１を検出するための試薬を含む、キット。
［２３］上記［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法に使用するためのプログラムであって、
コンピュータに、
被験者から採取された血液に含まれる上記マーカー分子の量の測定データから上記式１に基づいて規格化スコアを算出し、算出された規格化スコアから指標値を求める、規格化ステップと、
求められた指標値を、基準値と比較する、比較ステップと、
比較した結果に基づき、肝疾患の病態を有するか否かを判定する、判定ステップと、
を実行させるためのプログラム。
［２４］上記［１８］〜［２１］のいずれかに記載の方法に使用するためのプログラムであって、
コンピュータに、
被験者から採取された血液に含まれるＶＣＡＭ１の量を、基準値と比較する、比較ステップと、
比較した結果に基づき、肝疾患の病態を有するか否かを判定する、判定ステップと、
を実行させるためのプログラム。
［２５］コンピュータに、被験者から採取された血液に含まれる上記マーカー分子の量又は上記ＶＣＡＭ１の量の測定データを取得する、取得ステップを更に実行させる、上記［２３］又は［２４］に記載のプログラム。
［２６］上記［１］〜［１６］、及び［１８］〜［２１］のいずれかに記載の方法に使用するための測定装置であって、
試料を設置するための試料設置部と、上記試料に光を照射するための光源部と、上記試料を透過した光を検出する検出部と、を備える測定装置。
［２７］上記［１］〜［１６］のいずれかに記載の方法に使用するための肝疾患判定システムであって、
被験者から採取された血液に含まれる上記マーカー分子の量を測定する測定装置と、測定した上記マーカー分子の量に基づいて肝疾患の病態を判定する肝疾患判定装置とを備え、
上記測定装置が試料を設置するための試料設置部と、上記試料に光を照射するための光源部と、上記試料を透過した光を検出する検出部と、を備え、
上記肝疾患判定装置が、上記測定装置からの測定データを取得する取得手段と、上記測定データから上記式１に基づいて規格化スコアを算出し、算出された規格化スコアから指標値を求める規格化手段と、求められた指標値を基準値と比較する比較手段と、比較した結果に基づき、肝疾患の病態を有するか否かを判定する判定手段と、を備える、肝疾患判定システム。
［２８］上記［１８］〜［２１］のいずれかに記載の方法に使用するための肝疾患判定システムであって、
被験者から採取された血液に含まれるＶＣＡＭ１の量を測定する測定装置と、測定した上記ＶＣＡＭ１の量に基づいて肝疾患の病態を判定する肝疾患判定装置とを備え、
上記測定装置が試料を設置するための試料設置部と、上記試料に光を照射するための光源部と、上記試料を透過した光を検出する検出部と、を備え、
上記肝疾患判定装置が、上記測定装置からの測定データを取得する取得手段と、上記ＶＣＡＭ１の量を基準値と比較する比較手段と、比較した結果に基づき、肝疾患の病態を有するか否かを判定する判定手段と、を備える、肝疾患判定システム。
［２９］非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を罹患している、肝臓の線維化の病態である、肝臓の線維化の進展度が高い、肝細胞の風船様変性の病態の進展度が高い、肝臓の炎症の進展度が高い、肝肥大の病態である、肝細胞の壊死の病態である、肝細胞のアポトーシスの病態である、肝細胞の変性の病態である、肝臓の脂肪化の病態である、又はそれらの可能性があるかを判定するための診断薬であって、ＶＣＡＭ１を検出するための試薬を含有する診断薬。
［３０］上記ＶＣＡＭ１を検出するための試薬が、抗体である、上記［２９］に記載の診断薬。
［３１］非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、肝臓の線維化、肝細胞の風船様変性、肝臓の炎症、肝肥大、肝細胞の壊死、肝細胞のアポトーシス、肝細胞の変性、又は、肝臓の脂肪化のインビトロ検出のための、ＶＣＡＭ１を検出するための試薬の使用。
［３２］他の診断薬と併用する、上記［３１］に記載の使用。
［３３］他の診断薬がＨＡ、ＣＯＬ４、又は、ＣＯＬ４−７Ｓを検出するため診断薬である、上記［３２］に記載の使用。
［３４］コンピュータに、
被験者から採取された血液に含まれるマーカー分子の量の測定データから求められた指標値を、基準値と比較する、比較ステップであって、上記マーカー分子がＶＣＡＭ１を含む、ステップと、
比較した結果に基づき、肝疾患の病態を有するか否かを判定する、判定ステップと、
を実行させるためのプログラム又はその記録媒体。
［３５］コンピュータに、被験者から採取された血液に含まれるマーカー分子の量の測定データを取得する、取得ステップを更に実行させる、上記［３４］に記載のプログラム又はその記録媒体。
［３６］コンピュータに、上記測定データから規格化スコアを算出し、算出された規格化スコアから指標値を求める、規格化ステップをさらに実行させる、上記［３４］又は［３５］に記載のプログラム又はその記録媒体。
［３７］上記マーカー分子がＨＡ、ＣＯＬ４、又は、ＣＯＬ４−７Ｓを更に含む、上記［３４］〜［３６］のいずれかに記載のプログラム又はその記録媒体。【０００９】
さらに本発明は以下に関する。
［３８］非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）とを判別する方法、又は、ＮＡＦＬ及びＮＡＳＨの診断のためのデータを収集する方法であって、
（１）被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、上記マーカー分子が、
（Ａ）ＰＲＯＳ１、ＣＬＵ、ＡＮＧ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＤ、ＣＦＨＲ１、コルチゾール、ＥＧＦＲ、ＨＰＮ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＥＴ、ＭＭＰ１０、テトラネクチン、ＴＴＲ、ＶＤＢＰ及びＶＥＧＦＲ−２からなる群１の全てのマーカー分子、
ＶＣＡＭ１、ＨＡ、ＣＴＳＤ、ＣＯＬ４、ＣＯＬ４−７Ｓ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＣＣＬ１９、ＣＧＢ、ＣＳＦ１、ＦＡＳ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＣＡ１９−９、ＮＲＣＡＭ、ＯＰＧ、ＶＷＦ及びＹＫＬ−４０からなる群２の全てのマーカー分子、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ、ＬＥＰ、ＩＣＡＭ１、ＣＫ−１８、ＧＳＴＡ１、ＡＬＴ、ＩＮＳＩＶＤ、ＩＮＳＭＡＰ、６Ｃｋｉｎｅ、ＡＧＴ、ＣＲＰ、ＣＸＣＬ１０、ＦＡＢＰ４、Ｇ６ＰＩ、ＨＳＰ−６０、Ｐ３ＮＰ及びテストステロンからなる群３の全てのマーカー分子、若しくは、
ＡＲＥＧ、ＢＤＮＦ、ＣＤ４０−Ｌ、ＥＲＥＧ、ＦＧＦ２、ＨＢＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＭＰ９、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦＢ、ＰＬＧＦ、ＳＡＰ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１及びＶＴＮからなる群４の全てのマーカー分子、
又は、
（Ｂ）上記群１、上記群２、上記群３及び上記群４から選ばれる２つの群の全てのマーカー分子、
である、工程と、
（２）同一の群の上記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアから指標値を求める工程であって、上記規格化スコアが下記式１から算出され、
【数６】
2016163539.tif 000007
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）、
上記マーカー分子が（Ａ）である場合、上記指標値が上記規格化スコアであり、
上記マーカー分子が（Ｂ）である場合、上記指標値が下記式２から算出される、工程と、
Ｉ＝ａ１×Ｍａ１＋ａ２×Ｍａ２                        （式２）
（式２において、Ｉは指標値を示し、Ｍａ１及びＭａ２はそれぞれ、上記２つの群のうちの一方の規格化スコア及び他方の規格化スコアを示し、ａ１及びａ２は、ロジスティック回帰分析によって定められる定数を示す。）、
（３）上記指標値が、基準値よりも大きい場合に、上記被験者がＮＡＳＨを罹患している、又はその可能性があると判定する工程、又は、上記指標値が、基準値よりも大きい場合に、上記被験者がＮＡＳＨを罹患している可能性があるという基準に基づいて、上記被験者がＮＡＳＨを罹患しているか否かを判定するためのデータを収集する工程と、
を含む方法。
［３９］上記（Ａ）の場合であって、上記マーカー分子が上記群１の全ての分子である、上記［３８］に記載の方法。
［４０］上記（Ａ）の場合であって、上記マーカー分子が上記群２の全ての分子である、上記［３８］に記載の方法。
［４１］上記（Ａ）の場合であって、上記マーカー分子が上記群３の全ての分子である、上記［３８］に記載の方法。
［４２］上記（Ａ）の場合であって、上記マーカー分子が上記群４の全ての分子である、上記［３８］に記載の方法。
［４３］上記（Ｂ）の場合であって、上記群１、上記群２、上記群３及び上記群４から選ばれる２つの群から選択される全てのマーカー分子である、上記［３８］に記載の方法。
［４４］上記（Ｂ）の場合であって、線形式が平均算出式、線形回帰式、線形判別式、又は、ロジスティック回帰式である、上記［２］に記載の方法。
［４５］上記（Ｂ）の場合であって、平均算出式が相加平均である、上記［４４］に記載の方法。
［４６］上記（Ｂ）の場合であって、線形判別式が線形判別分析である、上記［４４］に記載の方法。
［４７］上記（Ｂ）の場合であって、非線形式が非線形平均算出式、非線形回帰式、非線形判別式、又は非線形ロジスティック回帰式である、上記［２］に記載の方法。
［４８］上記（Ｂ）の場合であって、非線形平均算出式が相乗平均である、上記［４７］に記載の方法。
［４９］上記（Ｂ）の場合であって、非線形回帰式が線形式の掛算、又は、ニューラルネットワークである、上記［４７］に記載の方法。
［５０］上記（Ｂ）の場合であって、非線形判別式が決定木、又は、サポートベクターマシンである、上記［４７］に記載の方法。
［５１］非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療薬の効果を判定する方法であって、
ＮＡＳＨ患者に対して上記治療薬の適用前と適用後とにおいてそれぞれ、上記患者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する上記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、又は、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、工程と、
上記マーカー分子の量に基づいて上記治療薬の適用前と適用後のそれぞれ規格化スコアを算出し、適用後の規格化スコアが、適用前の規格化スコアよりも減少している場合、上記治療薬を適用した効果があった可能性があると判定する工程であって、上記規格化スコアが下記式１から算出される工程、を含む方法。
【数７】
2016163539.tif 000008
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを発症している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを発症している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）
［５２］測定する上記マーカー分子が、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、又は、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである［５１］に記載の方法。
［５３］非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療薬の効果を判定する方法であって、
ＮＡＳＨ患者に対して上記治療薬の適用前と適用後とにおいてそれぞれ、上記患者から採取された血液に含まれる、ＶＣＡＭ１の量を測定する工程と、
適用後のＶＣＡＭ１の量が適用前のＶＣＡＭ１の量よりも減少している場合、上記治療薬を適用した効果があった可能性があると判定する方法。
［５４］非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）又は非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療薬の効果を判定する方法であって、
ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨ患者に対して上記治療薬の適用前と適用後とにおいてそれぞれ、
（１）被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程であって、測定する上記マーカー分子が、
（Ａ）ＰＲＯＳ１、ＣＬＵ、ＡＮＧ、ＡＰＯＣ３、ＡＰＯＤ、ＣＦＨＲ１、コルチゾール、ＥＧＦＲ、ＨＰＮ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２３Ａ、ＭＥＴ、ＭＭＰ１０、テトラネクチン、ＴＴＲ、ＶＤＢＰ及びＶＥＧＦＲ−２からなる群１から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
ＶＣＡＭ１、ＨＡ、ＣＴＳＤ、ＣＯＬ４、ＣＯＬ４−７Ｓ、ＡＬＢ、ＡＦＰ、ＡＸＬ、ＣＣＬ１９、ＣＧＢ、ＣＳＦ１、ＦＡＳ、Ｍａｃ−２ｂｐ、ＣＡ１９−９、ＮＲＣＡＭ、ＯＰＧ、ＶＷＦ及びＹＫＬ−４０からなる群２から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
ＡＳＴ、ＰＳＡＴ、ＬＥＰ、ＩＣＡＭ１、ＣＫ−１８、ＧＳＴＡ１、ＡＬＴ、ＩＮＳＩＶＤ、ＩＮＳＭＡＰ、６Ｃｋｉｎｅ、ＡＧＴ、ＣＲＰ、ＣＸＣＬ１０、ＦＡＢＰ４、Ｇ６ＰＩ、ＨＳＰ−６０、Ｐ３ＮＰ及びテストステロンからなる群３から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、若しくは、
ＡＲＥＧ、ＢＤＮＦ、ＣＤ４０−Ｌ、ＥＲＥＧ、ＦＧＦ２、ＨＢＥＧＦ、ＩＧＦＢＰ２、ＭＭＰ９、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦＢ、ＰＬＧＦ、ＳＡＰ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＨＢＳ１及びＶＴＮからなる群４から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、
又は、
（Ｂ）上記群１、上記群２、上記群３及び上記群４から選ばれる２つの群のうちの、一方から選択される少なくとも２つのマーカー分子及び他方から選択される少なくとも２つのマーカー分子、
である、工程と、
（２）上記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアから指標値を求める工程であって、同一の群の上記マーカー分子の量に基づく上記規格化スコアが下記式１から算出され、
【数８】
2016163539.tif 000009
（式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。）、
上記マーカー分子が（Ａ）である場合、上記指標値が上記規格化スコアであり、
上記マーカー分子が（Ｂ）である場合、上記指標値が２つの群の規格化スコアから算出される、工程と、
（３）適用後の規格化スコアが、適用前の規格化スコアよりも減少している場合、上記治療薬を適用した効果があった可能性があると判定する工程と、
を含む方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、非侵襲性であって、より精度が高い非アルコール性脂肪肝疾患等の肝疾患の病態を判別する方法を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】各マーカー分子を用いたときの、ＮＡＦＬの患者及びＮＡＳＨの患者における、規格化スコア又は指標値を示すグラフである。
【図２−１】各マーカー分子（測定法１）を用いたときの、ＮＡＦＬの患者及びＮＡＳＨの患者における、規格化スコアを示すグラフである。
【図２−２】各マーカー分子（測定法２）を用いたときの、ＮＡＦＬの患者及びＮＡＳＨの患者における、規格化スコア又はＶＣＡＭ１測定値を示すグラフである。
【図３】各マーカー分子を用いたときの、ＮＡＦＬの患者及びＮＡＳＨの患者における、規格化スコアを示すグラフである。
【図４】各マーカー分子を用いたときの、ＮＡＦＬの患者及びＮＡＳＨの患者における、指標値を示すグラフである。
【図５−１】各マーカー分子（測定法１）を用いたときの、マテオーニ分類のＴｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の患者及びＴｙｐｅ−４の病態の患者における、規格化スコアを示すグラフである。
【図５−２】各マーカー分子（測定法２）を用いたときの、マテオーニ分類のＴｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の患者及びＴｙｐｅ−４の病態の患者における、規格化スコア又はＶＣＡＭ１測定値を示すグラフである。
【図６−１】各マーカー分子（測定法１）を用いたときの、肝線維化の進展度の指標である「Stage」における、Stage0、Stage1又はStage2の病態の患者（Ｆ０−２）及びStage3又はStage4の病態の患者（Ｆ３−４）における、規格化スコアを示すグラフである。
【図６−２】各マーカー分子（測定法２）を用いたときの、肝線維化の進展度の指標である「Stage」における、Stage0、Stage1又はStage2の病態の患者（Ｆ０−２）及びStage3又はStage4の病態の患者（Ｆ３−４）における、規格化スコア又はＶＣＡＭ１測定値を示すグラフである。
【図７】各マーカー分子を用いたときの、肝線維化の進展度の指標である「Stage」と規格化スコアとの相関を示すグラフである。
【図８】各マーカー分子を用いたときの、炎症の進展度の指標である肝生検に基づく小葉内炎症の病理診断スコアと規格化スコアとの相関を示すグラフである。
【図９】各マーカー分子を用いたときの、肝細胞の風船状変性の進展度の指標である肝生検に基づく風船様変性の病理診断スコアと規格化スコアとの相関を示すグラフである。
【図１０】各マーカー分子を用いたときの、ＮＡＦＬＤの活動性の指標であるNAFLD  Activity  Score（NAS）と規格化スコアとの相関を示すグラフである。
【図１１】肝疾患判定システムの一実施形態を示す模式図である。
【図１２】肝疾患判定装置の機能的構成を示す概要図である。
【図１３】肝疾患の判定方法のフローチャートである。
【図１４】「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアを用いたときの、肝線維化の進展度の指標である「Stage」と規格化スコアとの相関を示すグラフである。
【図１５】「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアを用いたときの、炎症の進展度の指標である肝生検に基づく小葉内炎症の病理診断スコアと規格化スコアとの相関を示すグラフである。
【図１６】「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアを用いたときの、肝細胞の風船状変性の進展度の指標である肝生検に基づく風船様変性の病理診断スコアと規格化スコアとの相関を示すグラフである。
【図１７】「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアを用いたときの、ＮＡＦＬＤの活動性の指標であるNAFLD  Activity  Score（NAS）と規格化スコアとの相関を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
本実施形態に係る非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）とを判別する方法（以下、「判別方法」という場合がある。）は、
（１）被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程と、
（２）同一の群の上記マーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアに基づいて指標値を求める工程と、
（３）上記指標値が、基準値よりも大きい場合に、上記被験者がＮＡＳＨを発症している、又はその可能性があると判定する工程と、を含む。
【００１４】
非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）は、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）とともに、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に分類される疾患である。ＮＡＦＬＤは、ウイルス性の肝疾患及び自己免疫性の肝疾患を除外した肝疾患のうち、アルコールの過剰摂取を伴わない脂肪肝疾患として定義される。ＮＡＳＨは病理学的診断によって「肝細胞の大滴性脂肪化に加えて、炎症を伴う肝細胞の風船様変性を認めるもの」として定義される。ＮＡＳＨはマテオーニ分類において、Ｔｙｐｅ−３又はＴｙｐｅ−４に分類される症例と一致する。ＮＡＳＨはその病態が進行すると、肝硬変又は肝癌を発症し得ることが知られている。ＮＡＳＨの特徴としては、肝臓の線維化、肝細胞の風船様変性、肝臓の炎症、肝肥大、肝細胞の壊死、肝細胞のアポトーシス、肝細胞の変性、肝臓の脂肪化等が認められる。一方、ＮＡＦＬは、ＮＡＦＬＤのうち、ＮＡＳＨに該当しない、肝細胞の大滴性脂肪化を基盤とする疾患である。ＮＡＦＬは、マテオーニ分類において、Ｔｙｐｅ−１又はＴｙｐｅ−２に分類される症例と一致する。ＮＡＦＬは、ＮＡＳＨと比較して予後が良好であることが知られている。以下、各工程について説明する。
【００１５】
（１）被験者から採取された血液に含まれる、マーカー分子の量を測定する工程
被験者から採取された血液としては、全血、血清、血漿等が挙げられ、血清又は血漿が好ましく用いられる。
【００１６】
次にマーカー分子について説明する。本発明者らは、ＮＡＦＬの患者及びＮＡＳＨの患者から得られた血清試料において、約２６０種類の生体分子の量と、ＮＡＦＬ及びＮＡＳＨの病態の相違との関連性を鋭意検討したところ、血中の存在量に連動性があり、相互の生物学的関係性が強い複数の生体分子の集団（「群」、「因子モジュール」又は「モジュール」という場合がある。）を４つ見出した。以下、各群について説明する。
【００１７】
群１（「モジュール１」という場合がある。）のマーカー分子は、脂肪肝に対する防御反応と関連があるマーカー分子であり、ＰＲＯＳ１（ビタミンＫ依存性プロテインＳ）、ＣＬＵ（クラステリン）、ＡＮＧ（アンギオゲニン）、ＡＰＯＣ３（アポリポプロテインＣ−ＩＩＩ）、ＡＰＯＤ（アポリポプロテインＤ）、ＣＦＨＲ１（Complement  factor  H-related  protein  1）、コルチゾール、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＨＰＮ（Hepsin）、ＩＧＦＢＰ３（インスリン様成長因子結合蛋白３型）、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１β）、ＩＬ２３Ａ（インターロイキン２３）、ＭＥＴ（肝細胞増殖因子レセプター）、ＭＭＰ１０（マトリックスメタロプロテアーゼ１０）、テトラネクチン、ＴＴＲ（トランスチレチン）、ＶＤＢＰ（ビタミンＤ結合タンパク質）及びＶＥＧＦＲ−２（血管内皮細胞増殖因子受容体２）の１８種類である。
【００１８】
群２（「モジュール２」という場合がある。）のマーカー分子は、肝細胞障害に対する免疫系の防御反応と関連があるマーカー分子であり、ＶＣＡＭ１（血管細胞接着分子１）、ＨＡ（ヒアルロン酸）、ＣＴＳＤ（カテプシンＤ）、ＣＯＬ４（コラーゲン４）、ＣＯＬ４−７Ｓ（タイプ４コラーゲン  ７Ｓ）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）、ＡＸＬ（ＡＸＬ受容体チロシンキナーゼ）、ＣＣＬ１９（Chemokine  (C-C  motif)  ligand  19）、ＣＧＢ（ヒト絨毛性ゴナドトロピンβ）、ＣＳＦ１（マクロファージ  コロニー刺激因子１）、ＦＡＳ（FASLG  Receptor）、Ｍａｃ−２ｂｐ（Ｍａｃ−２結合タンパク質）、ＣＡ１９−９（腫瘍抗原１９−９）、ＮＲＣＡＭ（神経細胞接着分子）、ＯＰＧ（オステオプロテゲリン）、ＶＷＦ（ヴォン・ヴィレブランド因子）及びＹＫＬ−４０の１８種類である。
【００１９】
群３（「モジュール３」という場合がある。）のマーカー分子は、肝炎に起因する自然免疫反応と関連があるマーカー分子であり、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＰＳＡＴ（Phosphoserine  Aminotransferase）、ＬＥＰ（レプチン）、ＩＣＡＭ１（細胞間接着分子１）、ＣＫ−１８（CK18  M30  フラグメント）、ＧＳＴＡ１（Glutathione  S-Transferase  alpha）、ＡＬＴ（アラニン）、ＩＮＳＩＶＤ（インスリン、CLIA法によって測定されるもの）、ＩＮＳＭＡＰ（インスリン、HumanMAP法（Myriad  RBM社の提供する多重免疫測定サービスHuman  MAPによる測定、以下同じ）によって測定されるもの）、６Ｃｋｉｎｅ、ＡＧＴ（アンジオテンシノーゲン）、ＣＲＰ（C反応性タンパク質）、ＣＸＣＬ１０（C-X-C  モチーフケモカイン１０、Interferon  gamma  Induced  Protein  10）、ＦＡＢＰ４（Fatty  Acid-Binding  Protein４,  adipocyte）、Ｇ６ＰＩ（Glucose-6-phosphate  Isomerase）、ＨＳＰ−６０（熱ショックタンパク質６０）、Ｐ３ＮＰ（Procollagen  3  N-terminal  peptide）及びテストステロンの１８種類である。
【００２０】
群４（「モジュール４」という場合がある。）のマーカー分子は、肝細胞障害及び肝線維化に関わる細胞増殖と関連があるマーカー分子であり、ＡＲＥＧ（アンフィレグリン）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＣＤ４０−Ｌ（CD40  リガンド）、ＥＲＥＧ（エピレグリン）、ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合EGF様増殖因子）、ＩＧＦＢＰ２（インスリン様増殖因子  結合タンパク質2）、ＭＭＰ９（マトリックスメタロプロテアーゼ９）、ＰＡＩ−１（プラスミノーゲン活性化抑制因子１）、ＰＤＧＦＢ（血小板由来成長因子ＢＢ）、ＰＬＧＦ（胎盤増殖因子）、ＳＡＰ（血清アミロイドP成分）、ＴＧＦＡ（トランスフォーミング増殖因子α）、ＴＧＦＢ１（Latency-Associated  Peptide  of  Transforming  Growth  Factor  beta  1）、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン１）及びＶＴＮ（ビトロネクチン）の１６種類である。
【００２１】
測定されるマーカー分子としては、
（Ａ１）群１から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、群２から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、群３から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、若しくは、群４から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、又は、
（Ｂ１）上記群１、上記群２、上記群３及び上記群４から選ばれる２つの群のうちの、一方から選択される少なくとも２つのマーカー分子及び他方から選択れる少なくとも２つのマーカー分子、が挙げられる。
【００２２】
上記（Ｂ１）である場合、測定されるマーカー分子は、例えば、群１から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子及び群２から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、群１から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子及び群３から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、群１から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子及び群４から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、群２から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子及び群３から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、群２から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子及び群４から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、群３から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子及び群４から選ばれる少なくとも２つのマーカー分子、が挙げられる。
【００２３】
本実施形態の他の側面において、測定されるマーカー分子としては、
（Ａ２）群１の全てのマーカー分子、群２の全てのマーカー分子、群３の全てのマーカー分子、若しくは、群４の全てのマーカー分子、又は、
（Ｂ２）上記群１、上記群２、上記群３及び上記群４から選ばれる２つの群の全てのマーカー分子、が挙げられる。
【００２４】
上記（Ｂ２）である場合、測定されるマーカー分子は、例えば、群１及び群２の全てのマーカー分子、群１及び群３の全てのマーカー分子、群１及び群４の全てのマーカー分子、群２及び群３の全てのマーカー分子、群２及び群４の全てのマーカー分子、群３及び群４の全てのマーカー分子が挙げられ、好ましくは、群１及び群３の全てのマーカー分子である。
【００２５】
上述のマーカー分子の量を測定する方法としては、血液中の量を測定できれば特に制限はなく公知の方法を用いることが可能である。マーカー分子の量を測定する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、免疫化学発光法（CLIA法）、ラテックス凝集法、ラジオイムノアッセイ法、免疫比濁法、酵素活性測定法、色素結合法、ルミネックス法、ウエスタンブロッティング、HumanMAP法、質量分析法等が挙げられ、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法、CLIA法、ラテックス凝集法、ラジオイムノアッセイ法、免疫比濁法、酵素活性測定法、色素結合法、ルミネックス法、HumanMAP法が挙げられる。
【００２６】
（２）同一の群のマーカー分子の量に基づいて算出される規格化スコアから指標値を求める工程
同一の群のマーカー分子の量に基づいて規格化スコアを算出する工程には、測定したマーカー分子の量に由来するデータを規格化する工程、規格化されたデータの分布を変換する工程、変換した分布から求められる代表値を規格化スコアとして選択する工程が含まれる。
【００２７】
測定したマーカー分子の量に由来するデータを規格化する工程では、特に制限なく公知の方法を用いることが可能である。上記データを規格化する方法としては、例えば、二乗平均平方根が１になるように比例変換する方法、平均と分散が同等になるように線形変換する方法、最大値を１として最小値を０とする方法等が挙げられ、好ましくは平均と分散が同等になるように線形変換する方法が挙げられる。
【００２８】
規格化されたデータの分布を変換する工程では、特に制限なく公知の方法を用いることが可能である。規格化されたデータの分布を変換する方法としては、例えば対数関数による変換、シグモイド関数による変換等が挙げられ、好ましくは標準シグモイド関数による変換が挙げられる。また、この工程は省略することも可能である。
【００２９】
変換した分布から求められる代表値を規格化スコアとして選択する工程では、特に制限なく公知の方法を用いることが可能である。上記代表値としては、例えば一般的な統計値すなわち、平均値、中央値、最頻値、最大値、最小値、任意のパーセンタイル値等が挙げられ、好ましくは、平均値、中央値が挙げられる。
【００３０】
これらの工程を組み合わせる規格化スコアの算出方法として、好ましくは、平均と分散が同等になるように線形変換する方法によって上記データを規格化する工程と、標準シグモイド関数によってデータの分布を変換する工程と、変換した分布から求められる平均値を代表値として選択する工程とを含む方法が挙げられる。この方法において、規格化スコアは、同一の群のマーカー分子の量に基づいて、下記式１から算出される。
【００３１】
【数９】
2016163539.tif 000010
【００３２】
式１において、Ｍは規格化スコアを示し、Ｎはマーカー分子の数を示し、ｍｉは、測定された各マーカー分子の量を示し、ｍｅａｎ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｓｄ（ｍｉ）は、予め決められた各マーカー分子の標準偏差を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）は、ＮＡＳＨを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示し、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、ＮＡＦＬを罹患している患者における予め決められた各マーカー分子の量の平均値を示す。
【００３３】
ここで、ｍｅａｎ（ｍｉ）には、各マーカー分子の量の平均値であって、ＮＡＦＬＤ罹患者の検体を測定して得られる平均値、公知の測定データに基づくＮＡＦＬＤ罹患者の平均値、公知の測定データに基づく判別又は評価しようとする人が含まれる地域住民の平均値、公知の測定データに基づく判別又は評価しようとする人種の平均値等を用いることができる。ＮＡＦＬＤ罹患者の平均値を用いる場合には、罹患者集団全体の単純平均値、罹患者集団のうちのＮＡＦＬ罹患者の平均値とＮＡＳＨ患者の平均値との単純平均値、ＮＡＦＬ罹患者の平均値とＮＡＳＨ患者の平均値とのそれぞれに任意の加重をかけたうえで平均することで得られる加重平均値等を用いることができる。公知の測定データに基づくＮＡＦＬＤ罹患者の平均値を用いる場合には、公知の測定データに基づくＮＡＦＬＤ罹患者の単純平均値、公知の測定データに基づくＮＡＦＬ罹患者の平均値とＮＡＳＨ患者の平均値との単純平均値、公知の測定データに基づくＮＡＦＬ罹患者の平均値とＮＡＳＨ罹患患者の平均値とのそれぞれに任意の加重をかけたうえで平均することで得られる加重平均値等を用いることができる。公知の測定データとしては、論文で公表されている生体分子の測定値、体外診断薬の添付文書に記載されている値、診療ガイドラインに記載されている値等を用いることができる。複数のデータを合算して用いることもできる。好ましくは、ＮＡＦＬＤ罹患者の検体を測定して得られる、罹患者集団全体の単純平均値、又は罹患者集団のうちのＮＡＦＬ罹患者の平均値とＮＡＳＨ患者の平均値との単純平均値が挙げられる。より好ましくはＮＡＦＬＤ罹患者の検体を測定して得られる、罹患者集団のうちのＮＡＦＬ罹患者の平均値とＮＡＳＨ患者の平均値との単純平均値が挙げられる。
ｓｄ（ｍｉ）には、各マーカー分子の量の標準偏差であって、ＮＡＦＬＤ罹患者の検体を測定して得られる標準偏差、公知の測定データに基づくＮＡＦＬＤ罹患者の標準偏差、公知の測定データに基づく判別又は評価しようとする人が含まれる地域住民の標準偏差、公知の測定データに基づく判別又は評価しようとする人種の標準偏差等を用いることができる。ＮＡＦＬＤ罹患者の標準偏差を用いる場合には、罹患者集団全体の標準偏差、罹患者集団のうちのＮＡＦＬ罹患者の標準偏差とＮＡＳＨ患者の標準偏差との単純平均値、ＮＡＦＬ罹患者の標準偏差とＮＡＳＨ患者の標準偏差とのそれぞれに任意の加重をかけたうえで平均することで得られる加重平均値等を用いることができる。公知の測定データに基づくＮＡＦＬＤ罹患者の標準偏差を用いる場合には、公知の測定データに基づくＮＡＦＬＤ罹患者の標準偏差、公知の測定データに基づくＮＡＦＬ罹患者の標準偏差とＮＡＳＨ患者の標準偏差との単純平均値、公知の測定データに基づくＮＡＦＬ罹患者の標準偏差とＮＡＳＨ罹患患者の標準偏差とのそれぞれに任意の加重をかけたうえで平均することで得られる加重平均値等を用いることができる。公知の測定データとしては、論文で公表されている生体分子の測定値、体外診断薬の添付文書に記載されている値、診療ガイドラインに記載されている値等を用いることができる。複数のデータを合算して用いることもできる。好ましくは、ＮＡＦＬＤ罹患者の検体を測定して得られる、罹患者集団全体の標準偏差、又は罹患者集団のうちのＮＡＦＬ罹患者の標準偏差とＮＡＳＨ患者の標準偏差との単純平均値が挙げられる。より好ましくはＮＡＦＬＤ罹患者の検体を測定して得られる、罹患者集団のうちのＮＡＦＬ罹患者の標準偏差とＮＡＳＨ患者の標準偏差との単純平均値が挙げられる。
【００３４】
ｍｅａｎ（ｍｉ）、ｓｄ（ｍｉ）、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）及びｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、同一のマーカー分子であっても、マーカー分子の量の測定方法が異なる場合には、それぞれの測定方法に対応する異なる値をそれぞれ設定してもよい。異なる測定法の測定値の間に関係性が認められる場合には、一方の測定方法で設定したｍｅａｎ（ｍｉ）、ｓｄ（ｍｉ）、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）及びｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）の値を、それぞれ所定の関係式に代入し、他方の測定方法のそれぞれの値に変換してもよい。
【００３５】
ｍｅａｎ（ｍｉ）、ｓｄ（ｍｉ）、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）及びｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、測定対象とする人種又は地域に応じて適宜設定してもよい。ｍｅａｎ（ｍｉ）、ｓｄ（ｍｉ）、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）及びｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）の具体例としては、後述する表５〜表８及び表４１に記載の値が挙げられる。
【００３６】
算出される規格化スコアが１つである場合（マーカー分子が上記（Ａ）である場合）、規格化スコアの値がそのまま指標値として用いられる。
【００３７】
算出される規格化スコアが２つ以上である場合（マーカー分子が上記（Ｂ）である場合）、複数の規格化スコアを用いて、指標値を求めることが可能である。複数の規格化スコアから指標値を求める工程には、特に制限なく公知の方法を用いることが可能である。複数の規格化スコアから指標値を求める方法としては、例えば、線形式を用いる方法、及び非線形式を用いる方法が挙げられる。線形式を用いる方法としては、例えば、平均算出式を用いる方法、線形回帰式を用いる方法、線形判別式を用いる方法、及びロジスティック回帰式を用いる方法が挙げられる。平均算出式を用いる方法としては、例えば、相加平均を用いる方法が挙げられる。線形判別式を用いる方法としては、例えば、線形判別分析を用いる方法が挙げられる。非線形式を用いる方法としては、例えば、非線形平均算出式を用いる方法、非線形回帰式を用いる方法、非線形判別式を用いる方法、及び非線形ロジスティック回帰式を用いる方法が挙げられる。非線形平均算出式を用いる方法としては、相乗平均を用いる方法が挙げられる。非線形回帰式を用いる方法としては、線形式の掛算を用いる方法、及びニューラルネットワークを用いる方法が挙げられる。非線形判別式を用いる方法としては、決定木を用いる方法、及びサポートベクターマシンを用いる方法が挙げられる。好ましい方法としては、決定木を用いる方法、又はロジスティック回帰式を用いる方法が挙げられる。
【００３８】
より好ましい方法としては、ロジスティック回帰式を用いる方法が挙げられ、好ましい指標値は下記式２から算出される値が用いられる。式２において、Ｉは指標値を示し、Ｍａ１及びＭａ２はそれぞれ、上記２つの群のうちの一方の規格化スコア及び他方の規格化スコア（「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」）を示し、ａ１及びａ２は、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別誤差が最小となるように定められる定数を示す。
Ｉ＝ａ１×Ｍａ１＋ａ２×Ｍａ２                        （式２）
【００３９】
ａ１及びａ２は、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別誤差が最小となるように定められれば、どの様な方法によって求めてもよいが、例えば、線形判別分析、又はロジスティック回帰分析等の方法によって求められる。ａ１及びａ２の具体例として、後述する表９に記載の値が挙げられる。
【００４０】
複数の規格化スコアから決定木により指標値を求める場合、例えば、以下の決定木１〜６が用いられる。決定木により指標値を求めた場合、基準値は例えば、後述する実施例の表１１に記載の値が用いられる。
上記マーカー分子が、上記群１及び群２より選ばれる場合は、
Ｍ１ａ≧０．４７６ならばＩ＝２、Ｍ１ａ＜０．４７６かつＭ２ａ≧０．４６６ならばＩ＝１  、Ｍ１ａ＜０．４７６かつＭ２ａ＜０．４６６ならばＩ＝０      （決定木１）
上記マーカー分子が、上記群１及び群３より選ばれる場合は、
Ｍ３ａ≧０．４０９かつ  Ｍ１ａ≧０．４５ならばＩ＝２、Ｍ３ａ≧０．４０９かつＭ１ａ＜０．４５ならばＩ＝１、Ｍ３ａ＜０．４０９ならばＩ＝０      （決定木２）
上記マーカー分子が、上記群１及び群４より選ばれる場合は、
Ｍ４ａ≧０．５４７ならばＩ＝２、Ｍ４ａ＜０．５４７かつＭ１ａ≧０．４６８ならばＩ＝１、Ｍ４ａ＜０．５４７かつ  Ｍ１ａ＜０．４６８ならばＩ＝０      （決定木３）
上記マーカー分子が、上記群２及び群３より選ばれる場合は、
Ｍ３ａ≧０．４０９かつＭ２ａ≧０．４１２ならばＩ＝２、Ｍ３ａ≧０．４０９かつＭ２ａ＜０．４１２ならばＩ＝１、Ｍ３ａ＜０．４０９ならばＩ＝０      （決定木４）
上記マーカー分子が、上記群２及び群４より選ばれる場合は、
Ｍ４ａ≧０．５４７ならばＩ＝２、Ｍ４ａ＜０．５４７かつＭ２ａ≧０．４１３ならばＩ＝１、Ｍ４ａ＜０．５４７かつ  Ｍ２ａ＜０．４１３ならばＩ＝０      （決定木５）
上記マーカー分子が、上記群３及び群４より選ばれる場合は、
Ｍ３ａ≧０．４０９ならばＩ＝２、Ｍ３ａ＜０．４０９かつＭ４ａ≧０．５８８ならばＩ＝１、Ｍ３ａ＜０．４０９かつＭ４ａ＜０．５８８ならばＩ＝０      （決定木６）
（決定木１〜６において、Ｉは指標値を示し、Ｍ１ａ、Ｍ２ａ、Ｍ３ａ及びＭ４ａはそれぞれ、上記群１、群２、群３、及び群４の規格化スコアを示す。）。
【００４１】
（３）指標値が、基準値よりも大きい場合に、被験者がＮＡＳＨを罹患している可能性があると判定する工程
本明細書における「基準値」とは、２つの状態を判別するための基準となる値（カットオフ値）であり、任意に設定することができる。基準値は、ＮＡＦＬ罹患者における指標値であってもよいし、あらかじめ設定された値であってもよい。あらかじめ設定された値としては、保有するＮＡＦＬ罹患者及びＮＡＳＨ罹患者の指標値によって導かれるROC曲線から推定される、基準値と感度（ＮＡＳＨ罹患者の正診率）及び特異度（ＮＡＦＬ罹患者の正診率）の関係に基づき、使用者が必要とする感度と特異度となるような指標値を、上記基準値として設定できる。
【００４２】
被験者がＮＡＳＨを罹患している可能性があるかどうかを判定するために用いられる基準値としては、例えば以下の値が挙げられる。なお、以下に示す基準値は、規格化スコアの値がそのまま指標値として用いられた場合、及び複数の規格化スコアから上記（式２）を用いて求められた指標値を用いた場合に対応する基準値が例示されている。
マーカー分子が群１の少なくとも２つのマーカー分子である場合、基準値は例えば、０．１４９〜０．９０７の間で設定される値である。
マーカー分子が群２の少なくとも２つのマーカー分子である場合、基準値は例えば、０．０８７〜０．８４８の間で設定される値である。
マーカー分子が群３の少なくとも２つのマーカー分子である場合、基準値は例えば、０．１６４〜０．９０９の間で設定される値である。
マーカー分子が群４の少なくとも２つのマーカー分子である場合、基準値は例えば、０．０７３〜０．８５４の間で設定される値である。
マーカー分子が群１の全てのマーカー分子である場合、基準値は例えば、０．３５９〜０．５８６の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３５９〜０．４８６の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４８６〜０．５８６の間で設定される値である。
マーカー分子が群２の全てのマーカー分子である場合、基準値は例えば、０．３５７〜０．５０９の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３５７〜０．４１９の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４１９〜０．５０９の間で設定される値である。
マーカー分子が群３の全てのマーカー分子である場合、基準値は例えば、０．３７８〜０．５４５の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３７８〜０．４５の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４５〜０．５４５の間で設定される値である。
マーカー分子が群４の全てのマーカー分子である場合、基準値は例えば、０．２７２〜０．５８３の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．２７２〜０．４８９の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４８９〜０．５８３の間で設定される値である。
【００４３】
マーカー分子が群１の少なくとも２つのマーカー分子及び群２の少なくとも２つのマーカー分子である場合、基準値は例えば、３．４３８〜２５．７３５の間で設定される値である。
マーカー分子が群１の少なくとも２つのマーカー分子及び群３の少なくとも２つのマーカー分子である場合、基準値は例えば、５．９８７〜３４．７０２の間で設定される値である。
マーカー分子が群１の少なくとも２つのマーカー分子及び群４の少なくとも２つのマーカー分子である場合、基準値は例えば、１．９３２〜１４．２３９の間で設定される値である。
マーカー分子が群２の少なくとも２つのマーカー分子及び群３の少なくとも２つのマーカー分子である場合、基準値は例えば、２．８３６〜１９．６６４の間で設定される値である。
マーカー分子が群２の少なくとも２つのマーカー分子及び群４の少なくとも２つのマーカー分子である場合、基準値は例えば、１．３８７〜１４．３３４の間で設定される値である。
マーカー分子が群３の少なくとも２つのマーカー分子及び群４の少なくとも２つのマーカー分子である場合、基準値は例えば、３．０４４〜２０．５５４の間で設定される値である。
マーカー分子が群１及び群２の全てのマーカー分子である場合、基準値は例えば、１２．０２５〜１５．３９６の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１２．０２５〜１３．７９５の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１３．７９５〜１５．３９６の間で設定される値である。
マーカー分子が群１及び群３の全てのマーカー分子である場合、基準値は例えば、１５．９１５〜２０．７１２の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１５．９１５〜１８．２９７の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１８．２９７〜２０．７１２の間で設定される値である。
マーカー分子が群１及び群４の全てのマーカー分子である場合、基準値は例えば、６．２１９〜８．９６７の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは６．２１９〜７．５３３の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは７．５３３〜８．９６７の間で設定される値である。
マーカー分子が群２及び群３の全てのマーカー分子である場合、基準値は例えば、８．４９７〜１１．４６６の間で設定される値であり、好ましくは８．４９７〜１０．１２９の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１０．１２９〜１１．４６６の間で設定される値である。
マーカー分子が群２及び群４の全てのマーカー分子である場合、基準値は例えば、５．８８９〜８．９３４の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは５．８８９〜７．４４５の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは７．４４５〜８．９３４の間で設定される値である。
マーカー分子が群３及び群４の全てのマーカー分子である場合、基準値は例えば、９．０２３〜１２．５４８の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは９．０２３〜１０．６６５の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１０．６６５〜１２．５４８の間で設定される値である。
【００４４】
このように本実施形態に係る判別方法の一側面は、血中の存在量に連動性があり、相互の生物学的関係性が強い複数の生体分子（１６〜１８種類）から構成される群（モジュール）を用いること、及び個々のマーカー分子の量ではなく、所定の群（モジュール）の全てのマーカー分子の測定に基づく規格化スコアを用いることが大きな特長である。これまでにも複数のマーカー分子の測定に基づいたＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別法が報告されている。しかしながら、いずれの方法も少数のマーカー分子の測定に基づく方法であった。少数のマーカー分子の測定に基づく方法は、各マーカー分子の量の測定毎のばらつき又は偏りの影響を受けやすい傾向がある。本実施形態に係る判別方法は、より多くのマーカー分子の測定に基づき、マーカー分子の相互の生物学的関係性が強く、かつ血中の存在量に連動性があるマーカー分子から構成されるモジュールの代表値（規格化スコア）を使用するという点で、個々のマーカー分子の測定上の誤差、及びばらつきの影響を受けにくく、より精度が高い判別を行うことが可能である。
【００４５】
また、従来の複数のマーカー分子を用いるＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別法では、複数のマーカー分子の測定値のそれぞれに重みを付けたうえで足し合わせる方法、又は複数のマーカー分子の測定値を乗除する方法が用いられている。しかしながら、これらの方法は、判別法の構築すなわち学習に使用した検体群に対して、過剰に適合する傾向が比較的大きい。本実施形態に係る判別方法は、指標値として、規格化されたマーカー分子の測定値の平均値又は中央値といった統計値を用いることで、この工程での学習が行われないため、学習に使用した検体群への過剰な適合を回避できるという利点を有する。これら２点から、このように本実施形態に係る判別方法は、従来技術に比して優れた特長を有するＮＡＦＬとＮＡＳＨの判別法である。
【００４６】
本実施形態の他の側面において、測定されるマーカー分子は、所定の群（モジュール）の１又は複数のマーカー分子であってもよい。各モジュールを代表するマーカー分子を選択することで、高い精度を維持しつつ簡便に判別を行うことができる。各モジュールを代表するマーカー分子は、特に制限なく、適宜選択できる。選択される上記マーカー分子の種類は、例えば、２〜３種類であってもよいし、４〜全種類であってもよい。
【００４７】
例えば、群１の場合、マーカー分子は、ＰＲＯＳ１及びＣＬＵを含んでいてもよいし、ＰＲＯＳ１及びＣＬＵであってもよい。
群２の場合、マーカー分子は、ＶＣＡＭ１を含んでいてもよいし、ＶＣＡＭ１であってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＨＡであってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＨＡを含んでいてもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤであってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤを含んでいてもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４であってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４を含んでいてもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓであってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓを含んでいてもよいし、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓであってもよいし、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓを含んでいてもよいし、ＨＡ及びＣＴＳＤであってもよいし、ＨＡ及びＣＴＳＤを含んでいてもよいし、ＨＡ及びＣＯＬ４であってもよいし、ＨＡ及びＣＯＬ４を含んでいてもよいし、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４であってもよいし、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４を含んでいてもよいし、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓであってもよいし、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓを含んでいてもよい。
群３の場合、マーカー分子は、ＡＳＴ及びＰＳＡＴであってもよいし、ＡＳＴ及びＰＳＡＴを含んでいてもよいし、ＡＳＴ及びＬＥＰであってもよいし、ＡＳＴ及びＬＥＰを含んでいてもよいし、ＡＳＴ及びＩＣＡＭ１であってもよいし、ＡＳＴ及びＩＣＡＭ１を含んでいてもよいし、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＬＥＰであってもよいし、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＬＥＰを含んでいてもよいし、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＩＣＡＭ１であってもよいし、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＩＣＡＭ１を含んでいてもよいし、ＡＳＴ、ＬＥＰ及びＣＫ−１８であってもよいし、ＡＳＴ、ＬＥＰ及びＣＫ−１８を含んでいてもよいし、ＡＳＴ、ＩＣＡＭ１及びＧＳＴＡ１であってもよいし、ＡＳＴ、ＩＣＡＭ１及びＧＳＴＡ１を含んでいてもよいし、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及び６Ｃｋｉｎｅであってもよいし、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及び６Ｃｋｉｎｅを含んでいてもよい。
【００４８】
規格化スコアは、上記マーカー分子の量に基づいて、上記式１から算出される。被験者がＮＡＳＨに罹患している可能性があるかどうかを判定するために用いられる基準値としては、例えば以下の値が挙げられる。
【００４９】
ＰＲＯＳ１及びＣＬＵの測定にHumanMAP法が用いられる場合においては、基準値は次の通り設定することができる。
マーカー分子がＰＲＯＳ１及びＣＬＵである場合、基準値は例えば、０．２５６〜０．６３４の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．２５６〜０．４２の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４２〜０．６３４の間で設定される値である。
【００５０】
各マーカー分子の量の測定は、いずれの方法でも構わないが、例えば市販のものを利用することができる。ＨＡの測定にELISA法「Hyaluronan  Quantikine  ELISA  Kit」が用いられ、ＶＣＡＭ１、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４の測定にHumanMAP法が用いられ、かつＣＯＬ４−７Ｓの測定にラジオイムノアッセイ法「IV型コラーゲン7Sキット」が用いられる場合においては、基準値は次の通り設定することができる。
マーカー分子が、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤである、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、ＨＡ及びＣＴＳＤである、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４である、又は、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．２５６〜０．６４４の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．２５６〜０．４２の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３８９〜０．６４４の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１である場合、基準値は例えば、０．２８〜０．６４４の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．２８〜０．３８９の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３８９〜０．６４４の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＨＡである場合、基準値は例えば、０．３２６〜０．６１７の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３２６〜０．３９８の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３９８〜０．６１７の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤである場合、基準値は例えば、０．２７７〜０．６０４の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．２７７〜０．４０８の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４０８〜０．６０４の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である場合、基準値は例えば、０．３１９〜０．６１７の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３１９〜０．４０７の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４０７〜０．６１７の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３０３〜０．５４３の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３０３〜０．４１６の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４１６〜０．５４３の間で設定される値である。
マーカー分子がＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３２６〜０．５０９の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３２６〜０．３９８の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３９８〜０．５０９の間で設定される値である。
マーカー分子がＨＡ及びＣＯＬ４である場合、基準値は例えば、０．３４３〜０．４８７の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３４３〜０．３９５の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３９５〜０．４８７の間で設定される値である。
マーカー分子がＨＡ及びＣＴＳＤである場合、基準値は例えば、０．３０５〜０．５４５の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３０５〜０．４１１の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４１１〜０．５４５の間で設定される値である。
マーカー分子がＣＴＳＤ及びＣＯＬ４である場合、基準値は例えば、０．３０７〜０．５３６の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３０７〜０．４１５の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４１５〜０．５３６の間で設定される値である。
マーカー分子がＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．２７１〜０．５７５の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．２７１〜０．４１９の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４１９〜０．５７５の間で設定される値である。
【００５１】
ＨＡの測定にラテックス凝集法又はCLIA法に拠る体外診断薬「ケミルミヒアルロン酸」が用いられ、ＶＣＡＭ１の測定にELISA法「Human  sVCAM-1/CD106  Quantikine  ELISA  Kit」が用いられ、かつＣＯＬ４−７Ｓの測定にラジオイムノアッセイ法「IV型コラーゲン7Sキット」が用いられる場合においては、基準値は次の通り設定することができる。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＨＡである場合、基準値は例えば、０．３２６〜０．６８４の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３２６〜０．３９の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３９〜０．６８４の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．２９３〜０．５４８の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．２９３〜０．３９４の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３９４〜０．５４８の間で設定される値である。
マーカー分子がＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３０８〜０．６６２の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３０８〜０．３９４の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３９４〜０．６６２の間で設定される値である。
【００５２】
マーカー分子がＶＣＡＭ１である場合、上記式１から算出される規格化スコアに代えて、ＶＣＡＭ１の測定値（ＶＣＡＭ１の量）をそのまま指標値としてもよい。ＶＣＡＭ１の量の測定にELISA法「Human  sVCAM-1/CD106  Quantikine  ELISA  Kit」が用いられる場合においては、基準値（血清中の濃度（ｎｇ／ｍｌ））は例えば、５５１．１〜１２８０．１の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは５５１．１〜８０６．２の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは８０６．２〜１２８０．１の間で設定される値である。
【００５３】
ＡＳＴの測定に酵素活性測定法が用いられ、ＰＳＡＴ、ＬＥＰ、ＩＣＡＭ１、ＧＳＴＡ１、及び６Ｃｋｉｎｅの測定にHumanMAP法が用いられ、かつＣＫ−１８の測定にELISA法「M30  Apoptosense  ELISA」が用いられる場合においては、基準値は次の通り設定することができる。
マーカー分子が、ＡＳＴ及びＰＳＡＴである、ＡＳＴ及びＬＥＰである、ＡＳＴ及びＩＣＡＭ１である、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＬＥＰである、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＩＣＡＭ１である、ＡＳＴ、ＬＥＰ及びＣＫ−１８である、ＡＳＴ、ＩＣＡＭ１及びＧＳＴＡ１である、又は、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及び６Ｃｋｉｎｅである場合、基準値は例えば、０．２８４〜０．６２９の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．２８４〜０．４３９の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３９３〜０．６２９の間で設定される値である。
マーカー分子がＡＳＴ及びＰＳＡＴである場合、基準値は例えば、０．２８４〜０．５４４の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．２８４〜０．３９７の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３９７〜０．５４４の間で設定される値である。
マーカー分子がＡＳＴ及びＬＥＰである場合、基準値は例えば、０．３０９〜０．６２９の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３０９〜０．４１２の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４１２〜０．６２９の間で設定される値である。
マーカー分子がＡＳＴ及びＩＣＡＭ１である場合、基準値は例えば、０．３０２〜０．５４６の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３０２〜０．４０６の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４０６〜０．５４６の間で設定される値である。
マーカー分子がＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＬＥＰである場合、基準値は例えば、０．３０３〜０．６１９の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３０３〜０．４１８の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４１８〜０．６１９の間で設定される値である。
マーカー分子がＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＩＣＡＭ１である場合、基準値は例えば、０．３０１〜０．５５１の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３０１〜０．４０６の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４０６〜０．５５１の間で設定される値である。
マーカー分子がＡＳＴ、ＬＥＰ及びＣＫ−１８である場合、基準値は例えば、０．２９７〜０．６２５の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．２９７〜０．４３９の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４３９〜０．６２５の間で設定される値である。
マーカー分子がＡＳＴ、ＩＣＡＭ１及びＧＳＴＡ１である場合、基準値は例えば、０．３０２〜０．５７３の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３０２〜０．３９３の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．３９３〜０．５７３の間で設定される値である。
マーカー分子がＡＳＴ、ＰＳＡＴ及び６Ｃｋｉｎｅである場合、基準値は例えば、０．２９１〜０．５３５の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．２９１〜０．４１６の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは０．４１６〜０．５３５の間で設定される値である。
【００５４】
本実施形態の他の側面において、１種類のマーカー分子を所定の群（モジュール）を代表するマーカー分子として選択してもよい。この場合、上記式１から算出される規格化スコアに代えて、上記マーカー分子の測定値（測定された上記マーカー分子の量）をそのまま指標値としてもよい。
例えば、群２を代表するマーカー分子がＶＣＡＭ１であり、ＶＣＡＭ１の測定値（例えば、血清中の濃度）を指標値としてもよい。ＶＣＡＭ１の量の測定にELISA法「Human  sVCAM-1/CD106  Quantikine  ELISA  Kit」が用いられる場合においては、基準値（血清中の濃度（ｎｇ／ｍｌ））は例えば、５５１．１〜１２８０．１の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは６９３．５〜９２５．３の間で設定される値である。
【００５５】
また、第１の規格化スコアとして、ＰＲＯＳ１及びＣＬＵの量に基づいて算出される規格化スコアを、第２の規格化スコアとして、群３から選ばれる少なくとも１つのマーカー分子の量、ＡＳＴ及びＰＳＡＴの量、ＡＳＴ及びＬＥＰの量、ＡＳＴ及びＩＣＡＭ１の量、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＬＥＰの量、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＩＣＡＭ１の量、ＡＳＴ、ＬＥＰ及びＣＫ−１８の量、ＡＳＴ、ＩＣＡＭ１及びＧＳＴＡ１の量、又は、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及び６Ｃｋｉｎｅの量に基づいて算出される規格化スコアを用いて、上記式２から指標値を算出してもよい。このとき式２におけるａ１及びａ２の値としては、例えば下記表９における「Ｍ１＋Ｍ３」に対応する値が上げられる。被験者がＮＡＳＨを罹患している可能性があるかどうかを判定するために用いられる基準値としては、例えば以下の値が挙げられる。
【００５６】
ＰＲＯＳ１、ＣＬＵ、ＰＳＡＴ、ＬＥＰ、ＩＣＡＭ１、ＧＳＴＡ１及び６Ｃｋｉｎｅの測定にHumanMAP法が用いられ、ＡＳＴの測定に酵素活性測定法が用いられ、かつＣＫ−１８の測定にELISA法「M30  Apoptosense  ELISA」が用いられる場合においては、基準値は次の通り設定することができる。
マーカー分子が、ＰＲＯＳ１及びＣＬＵである、並びに、ＡＳＴ及びＰＳＡＴである、ＡＳＴ及びＬＥＰである、ＡＳＴ及びＩＣＡＭ１である、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＬＥＰである、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＩＣＡＭ１である、ＡＳＴ、ＬＥＰ及びＣＫ−１８である、ＡＳＴ、ＩＣＡＭ１及びＧＳＴＡ１である、又は、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及び６Ｃｋｉｎｅである場合、基準値は例えば、１３．４９３〜２１．２０５の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１３．４９３〜１８．３３１の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１６．７８９〜２１．２０５の間で設定される値である。
マーカー分子が、ＰＲＯＳ１及びＣＬＵである、並びに、ＡＳＴ及びＰＳＡＴである場合、基準値は例えば、１３．４９３〜２１．０２の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１３．４９３〜１７．１４１の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１７．１４１〜２１．０２の間で設定される値である。
マーカー分子が、ＰＲＯＳ１及びＣＬＵである、並びに、ＡＳＴ及びＬＥＰである場合、基準値は例えば、１４．２２８〜２０．７５５の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１４．２２８〜１８．１４５の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１８．１４５〜２０．７５５の間で設定される値である。
マーカー分子が、ＰＲＯＳ１及びＣＬＵである、並びに、ＡＳＴ及びＩＣＡＭ１である場合、基準値は例えば、１３．６６３〜２０．８３１の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１３．６６３〜１７．４０６の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１７．４０６〜２０．８３１の間で設定される値である。
マーカー分子が、ＰＲＯＳ１及びＣＬＵである、並びに、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＬＥＰである場合、基準値は例えば、１４．２２９〜２０．８４３の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１４．２２９〜１８．３３１の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１８．３３１〜２０．８４３の間で設定される値である。
マーカー分子が、ＰＲＯＳ１及びＣＬＵである、並びに、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及びＩＣＡＭ１である場合、基準値は例えば、１３．９２９〜２１．０５３の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１３．９２９〜１７．７４９の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１７．７４９〜２１．０５３の間で設定される値である。
マーカー分子が、ＰＲＯＳ１及びＣＬＵである、並びに、ＡＳＴ、ＬＥＰ及びＣＫ−１８である場合、基準値は例えば、１３．５４４〜２１．１６８の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１３．５４４〜１８．３１９の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１８．３１９〜２１．１６８の間で設定される値である。
マーカー分子が、ＰＲＯＳ１及びＣＬＵである、並びに、ＡＳＴ、ＩＣＡＭ１及びＧＳＴＡ１である場合、基準値は例えば、１３．７８８〜２０．８８２の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１３．７８８〜１７．６４３の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１７．６４３〜２０．８８２の間で設定される値である。
マーカー分子が、ＰＲＯＳ１及びＣＬＵである、並びに、ＡＳＴ、ＰＳＡＴ及び６Ｃｋｉｎｅである場合、基準値は例えば、１３．８４４〜２１．２０５の間で設定される値であり、ＮＡＳＨ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１３．８４４〜１６．７８９の間で設定される値であり、ＮＡＦＬ罹患者の正診率の向上という観点では好ましくは１６．７８９〜２１．２０５の間で設定される値である。
【００５７】
本実施形態に係る判別方法は、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨの病態の進展度を判定する方法として用いることもできる。指標値が大きい程、被験者における、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨの病態の進展度が高い可能性があると判定する。又は、治療薬の適用後の指標値が、適応前の指標値よりも減少している場合、上記治療薬を適用した効果があった可能性があると判定してもよい。
【００５８】
本実施形態に係る判別方法は、マテオーニ分類におけるＴｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態とＴｙｐｅ−４の病態とを判別する方法、及び線維化StageにおけるStage0、Stage1又はStage2の病態と、Stage3又はStage4の病態とを判別する方法等の、肝線維化を判別する方法として用いることもできる。上記肝線維化を判別する方法では、規格化スコアが、基準値よりも大きい場合に、被験者が肝線維化の病態である可能性があると判定する。これまで肝生検による病理所見に基づいてこれらの病態を判定していたが、上記判別方法によれば非侵襲性の方法で精度よく判定することができる。
【００５９】
マテオーニ分類は、肝生検の病理所見に基づくＮＡＦＬ、ＮＡＳＨの診断方法であり、一般的に用いられている方法である（Matteoni,  C.,  Younossi,  Z.  &  Gramlich,  T.  Nonalcoholic  fatty  liver  disease:  a  spectrum  of  clinical  and  pathological  severity.  Gastroenterology  1413-1419  (1999).）。マテオーニ分類と病理所見（組織所見）との関係を表１に示す。近年、ＮＡＳＨの病態の中において、肝線維化が予後の悪化因子であることが明らかとなっている。したがって、ＮＡＳＨの病態において、肝線維化を有するＮＡＳＨ罹患者が含まれる、マテオーニ分類のＴｙｐｅ−４に分類される病態を判別することの重要性が増している。
【００６０】
【表１】
2016163539.tif 000011
【００６１】
線維化の進展度は、下記表２に示す「Stage」（Kleiner  et.  al.,  Design  and  validation  of  a  histological  scoring  system  for  nonalcoholic  fatty  liver  disease,  Hepatology  41:1313-21  (2005)）を指標として一般的に評価されている。
【００６２】
【表２】
2016163539.tif 000012
【００６３】
測定されるマーカー分子は、上記群２の全てのマーカー分子であってもよいし、ＶＣＡＭ１を含んでいてもよいし、ＶＣＡＭ１であってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＨＡであってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＨＡを含んでいてもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤであってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤを含んでいてもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４であってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４を含んでいてもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓであってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓを含んでいてもよいし、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓであってもよいし、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓを含んでいてもよいし、ＨＡ及びＣＴＳＤであってもよいし、ＨＡ及びＣＴＳＤを含んでいてもよいし、ＨＡ及びＣＯＬ４であってもよいし、ＨＡ及びＣＯＬ４を含んでいてもよいし、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４であってもよいし、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４を含んでいてもよいし、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓであってもよいし、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓを含んでいてもよい。規格化スコアは、上記マーカー分子の量に基づいて、上記式１から算出される。
【００６４】
マテオーニ分類におけるＴｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態とＴｙｐｅ−４の病態とを判別する方法の場合、規格化スコアが、基準値よりも大きい場合に、被験者がマテオーニ分類におけるＴｙｐｅ−４の病態である可能性があると判定する。例えば、ＨＡの測定にELISA法「Hyaluronan  Quantikine  ELISA  Kit」が用いられ、ＶＣＡＭ１、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４の測定にHumanMAP法が用いられ、かつＣＯＬ４−７Ｓの測定にラジオイムノアッセイ法「IV型コラーゲン7Sキット」が用いられる場合においては、次の通り設定することができる。
マーカー分子が群２の少なくとも２つのマーカー分子である場合、基準値は例えば、０．０８７〜０．８４８の間で設定される値である。
マーカー分子が、上記群２の全てのマーカー分子である、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤである、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、ＨＡ及びＣＴＳＤである、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４である、又は、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３０３〜０．６１７の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３０３〜０．４７５の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４０８〜０．５３６の間で設定される値である。
マーカー分子が上記群２の全てのマーカー分子である場合、基準値は例えば、０．４０１〜０．５３６の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４０１〜０．４５の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４５〜０．５３６の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１である場合、基準値は例えば、０．３０３〜０．５３８の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３０３〜０．４２１の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４２１〜０．５３８の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＨＡである場合、基準値は例えば、０．３２８〜０．６１７の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３２８〜０．４１８の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４１８〜０．６１７の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤである場合、基準値は例えば、０．３１３〜０．５８１の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３１３〜０．４３２の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４３２〜０．５８１の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である場合、基準値は例えば、０．３４３〜０．５５８の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３４３〜０．４５７の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４５７〜０．５５８の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３５８〜０．６０２の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３５８〜０．４３８の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４３８〜０．６０２の間で設定される値である。
マーカー分子がＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３５４〜０．５６２の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３５４〜０．４５１の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４５１〜０．５６２の間で設定される値である。
マーカー分子がＨＡ及びＣＯＬ４である場合、基準値は例えば、０．３６〜０．５２２の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では０．３６〜０．４０８の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４０８〜０．５２２の間で設定される値である。
マーカー分子がＨＡ及びＣＴＳＤである場合、基準値は例えば、０．３１１〜０．５４５の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３１１〜０．４３２の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４３２〜０．５４５の間で設定される値である。
マーカー分子がＣＴＳＤ及びＣＯＬ４である場合、基準値は例えば、０．３１７〜０．５４４の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３１７〜０．４３６の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４３６〜０．５４４の間で設定される値である。
マーカー分子がＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３６４〜０．６０４の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３６４〜０．４７５の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４７５〜０．６０４の間で設定される値である。
【００６５】
ＨＡの測定にラテックス凝集法又はCLIA法に拠る体外診断薬「ケミルミヒアルロン酸」が用いられ、ＶＣＡＭ１の測定にELISA法「Human  sVCAM-1/CD106  Quantikine  ELISA  Kit」が用いられ、かつＣＯＬ４−７Ｓの測定にラジオイムノアッセイ法「IV型コラーゲン7Sキット」が用いられる場合においては、基準値は次の通り設定することができる。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＨＡである場合、基準値は例えば、０．３５７〜０．５７２の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３５７〜０．４０３の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４０３〜０．５７２の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３５６〜０．６０３の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３５６〜０．４２６の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４２６〜０．６０３の間で設定される値である。
マーカー分子がＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３３１〜０．５６３の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３３１〜０．４２の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４２〜０．５６３の間で設定される値である。
【００６６】
マーカー分子がＶＣＡＭ１である場合、上記式１から算出される規格化スコアに代えて、ＶＣＡＭ１の測定値（ＶＣＡＭ１の量）をそのまま指標値としてもよい。
ＶＣＡＭ１の量の測定にELISA法「Human  sVCAM-1/CD106  Quantikine  ELISA  Kit」が用いられる場合においては、基準値（血清中の濃度（ｎｇ／ｍｌ））は例えば、６１８．１〜１２３９．５の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−４の病態の正診率の向上という観点では好ましくは６１８．１〜８４０．０の間で設定される値であり、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態の正診率の向上という観点では好ましくは８４０．０〜１２３９．５の間で設定される値である。
【００６７】
線維化Stageにおける、Stage0、Stage1又はStage2の病態と、Stage3又はStage4の病態とを判別する方法の場合、規格化スコアが、基準値よりも大きい場合に、被験者が線維化のStageにおけるStage3又はStage4の病態である可能性があると判定する。このときに用いられる基準値としては、ＨＡの測定にELISA法「Hyaluronan  Quantikine  ELISA  Kit」が用いられ、かつＶＣＡＭ１の測定にHumanMAP法が用いられる場合においては、次の通り設定することができる。
例えば以下の値が挙げられる。
マーカー分子が群２の少なくとも２つのマーカー分子である場合、基準値は例えば、０．０８７〜０．８４８の間で設定される値である。
マーカー分子が、上記群２の全てのマーカー分子である、ＶＣＡＭ１である、ＶＣＡＭ１及びＨＡである、ＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤである、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである、ＨＡ及びＣＴＳＤである、ＨＡ及びＣＯＬ４である、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４である、又は、ＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３５３〜０．７６６の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３５３〜０．５７４の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４５３〜０．７６６の間で設定される値である。
マーカー分子が上記群２の全てのマーカー分子である場合、基準値は例えば、０．４２１〜０．６３２の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４２１〜０．５４４の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．５４４〜０．６３２の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１である場合、基準値は例えば、０．３７１〜０．５８７の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３７１〜０．４５３の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４５３〜０．５８７の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＨＡである場合、基準値は例えば、０．３８９〜０．７６６の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３８９〜０．５１９の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．５１９〜０．７６６の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＣＴＳＤである場合、基準値は例えば、０．４０６〜０．７１８の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４０６〜０．５２４の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．５２４〜０．７１８の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４である場合、基準値は例えば、０．４０７〜０．６７８の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４０７〜０．５３４の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．５３４〜０．６７８の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．４１３〜０．６８５の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４１３〜０．５７４の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．５７４〜０．６８５の間で設定される値である。
マーカー分子がＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３９８〜０．７の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３９８〜０．５３９の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．５３９〜０．７の間で設定される値である。
マーカー分子がＨＡ及びＣＯＬ４である場合、基準値は例えば、０．３９２〜０．６８３の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３９２〜０．４６３の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４６３〜０．６８３の間で設定される値である。
マーカー分子がＨＡ及びＣＴＳＤである場合、基準値は例えば、０．３７３〜０．６９の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３７３〜０．４６５の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４６５〜０．６９の間で設定される値である。
マーカー分子がＣＴＳＤ及びＣＯＬ４である場合、基準値は例えば、０．３５３〜０．６３５の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３５３〜０．４６９の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４６９〜０．６３５の間で設定される値である。
マーカー分子がＣＴＳＤ及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．４０３〜０．６７６の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．４０３〜０．５５９の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．５５９〜０．６７６の間で設定される値である。
【００６８】
ＨＡの測定にラテックス凝集法又はCLIA法に拠る体外診断薬「ケミルミヒアルロン酸」が用いられ、ＶＣＡＭ１の測定にELISA法「Human  sVCAM-1/CD106  Quantikine  ELISA  Kit」が用いられ、かつＣＯＬ４−７Ｓの測定にラジオイムノアッセイ法「IV型コラーゲン7Sキット」が用いられる場合においては、基準値は次の通り設定することができる。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＨＡである場合、基準値は例えば、０．３８１〜０．７５９の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３８１〜０．５２６の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．５２６〜０．７５９の間で設定される値である。
マーカー分子がＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３９４〜０．７１の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３９４〜０．５６５の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．５６５〜０．７１の間で設定される値である。
マーカー分子がＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓである場合、基準値は例えば、０．３７３〜０．６９８の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．３７３〜０．５６３の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは０．５６３〜０．６９８の間で設定される値である。
【００６９】
マーカー分子がＶＣＡＭ１である場合、上記式１から算出される規格化スコアに代えて、ＶＣＡＭ１の測定値（ＶＣＡＭ１の量）をそのまま指標値としてもよい。
ＶＣＡＭ１の量の測定にELISA法「Human  sVCAM-1/CD106  Quantikine  ELISA  Kit」が用いられる場合においては、基準値（血清中の濃度（ｎｇ／ｍｌ））は例えば、７８９．８〜１３４４．２の間で設定される値であり、Stage3又はStage4の病態の正診率の向上という観点では好ましくは７８９．８〜１０２９．３の間で設定される値であり、Stage0、Stage1又はStage2の病態の正診率の向上という観点では好ましくは１０２９．３〜１３４４．２の間で設定される値である。
【００７０】
本実施形態に係る判別方法は、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨの病態の進展度を判定する方法として用いることもできる。指標値が大きい程、被験者における、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＦＬ又はＮＡＳＨの病態の進展度が高い可能性があると判定する。または、治療薬の適用後の指標値が、適応前の指標値よりも減少している場合、上記治療薬を適用した効果があった可能性があると判定してもよい。
【００７１】
本実施形態に係る判別方法は、肝疾患の病態の進展度を判定する方法として用いることもできる。これまで肝生検による病理所見に基づいて判定していた肝疾患の病態の進展度を、非侵襲性の方法で判定することができる。肝疾患としては、ＮＡＦＬＤ、アルコール性肝障害、慢性肝炎、薬物性肝障害等が挙げられる。肝疾患の病態の進展度としては、肝臓の線維化の進展度、肝臓の炎症の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度、ＮＡＦＬＤの活動性の進展度、肝細胞の壊死が挙げられる。肝臓の線維化は、例えば、ＮＡＦＬＤ、アルコール性肝障害、慢性肝炎、薬物性肝障害で見られる病態である。肝臓の炎症、特に肝臓の小葉内炎症は、例えば、ＮＡＦＬＤ、アルコール性肝障害、慢性肝炎、薬物性肝障害で見られる病態である。肝細胞の風船様変性は例えば、ＮＡＦＬＤ、アルコール性肝障害、慢性肝炎で見られる病態である。肝細胞の壊死は、例えば、ＮＡＦＬＤ、アルコール性肝障害、慢性肝炎、薬物性肝障害で見られる病態である。
【００７２】
ここで、ＮＡＦＬＤの活動性を評価するスコアであるNAFLD  Activity  Score（NAS）について説明する。NAFLD  Activity  Scoreは、肝細胞の脂肪化率、肝細胞の風船様変性及び小葉内炎症の病理所見から下記表３に基づいてそれぞれ点数がつけられ、その合計値として求められる。このスコアが高い程、ＮＡＦＬＤの病態の重症度が高いと判断される。
【００７３】
【表３】
2016163539.tif 000013
【００７４】
工程（１）において測定されるマーカー分子は、ＶＣＡＭ１を含んでいてもよいし、ＶＣＡＭ１であってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＨＡであってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＨＡを含んでいてもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４であってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４を含んでいてもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓであってもよいし、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓを含んでいてもよいし、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓであってもよいし、ＨＡ及びＣＯＬ４−７Ｓを含んでいてもよい、ＨＡ及びＣＯＬ４であってもよいし、ＨＡ及びＣＯＬ４を含んでいてもよい。規格化スコアは、上記マーカー分子の量に基づいて、上記式１から算出される。規格化スコアは肝疾患の病態の進展度の指標値として用いることができる。
【００７５】
マーカー分子がＶＣＡＭ１である場合、上記式１から算出される規格化スコアに代えて、ＶＣＡＭ１の測定値（ＶＣＡＭ１の量）をそのまま指標値としてもよい。
【００７６】
指標値が大きい程、被験者における、肝臓の線維化の進展度、肝臓の炎症の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度、ＮＡＦＬＤの活動性の進展度、又は肝細胞の壊死の進展度が高い可能性があると判定する。または、指標値が、前回求めた指標値よりも増大している場合、被験者における、肝臓の線維化の進展度、肝臓の炎症の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度、ＮＡＦＬＤの活動性の進展度、又は肝細胞の壊死の進展度が進んでいる可能性があると判定してもよい。または、治療薬の適用後の指標値が、適用前の指標値よりも減少している場合、上記治療薬を適用した効果があった可能性があると判定してもよい。
【００７７】
治療薬としては、ＮＡＦＬＤの治療薬、特にＮＡＳＨの治療薬が挙げられる。ＮＡＳＨの治療薬として、当業者にとって自明なものであり、たとえば、チアゾリジン誘導体（ロシグリタゾン、ピオグリタゾン）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬（アトルバスタチン）、コレステロールトランスポーター阻害薬（エゼチミブ）、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン）、ビタミンＥが挙げられるが、それらに限定されない。また、治療薬の適用期間は、必要に応じて適宜に設定できるが、たとえば、適用１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６週後の効果を確認してもよい。
【００７８】
本実施形態の別の他の側面では、本実施形態に係る上記方法に使用するためのキットであって、上記マーカー分子を検出するための試薬と、上記方法を実施するための説明書と、を含むキットを提供する。
また、本実施形態の別の他の側面では、本実施形態に係る上記方法に使用するためのキットであって、ＶＣＡＭ１を検出するための試薬を含むキットを提供する。上記キットは、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を罹患している、肝臓の線維化の病態である、肝臓の線維化の進展度が高い、肝細胞の風船様変性の病態の進展度が高い、肝臓の炎症の進展度が高い、肝肥大の病態である、肝細胞の壊死の病態である、肝細胞のアポトーシスの病態である、肝細胞の変性の病態である、肝臓の脂肪化の病態である、又はそれらの可能性があるかを判定するための診断薬として把握することもできる。
【００７９】
上記マーカー分子を検出するための試薬としては、例えば、上記マーカー分子を特異的に認識する抗体、上記マーカー分子に特異的に結合する蛋白質又は核酸、質量分析の標準とするための合成ＶＣＡＭ１等が挙げられる。上記マーカー分子を検出するための試薬は、市販されているものを入手してもよいし、公知の方法によって製造してもよい。
【００８０】
上記方法を実施するための説明書は、本実施形態に係る方法が実施できるように記載されていれば特に制限はないが、例えば、上記規格化スコア又は上記指標値の算出方法、上記方法に用いられる基準値等が記載された説明書が挙げられる。
【００８１】
上記キットは、上記試薬及び上記説明書の他に、例えば、滅菌水、生理食塩水、界面活性剤、緩衝剤、タンパク質安定剤、保存剤、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブコントロール及びネガティブコントロール用生体分子）、標識用試薬、固相支持体を、必要に応じて含んでいてもよい。
【００８２】
本実施形態の別の他の側面では、本実施形態に係る方法に使用するための肝疾患判定システムを提供する。図１１は、肝疾患判定システムの一実施形態を示す模式図である。上記肝疾患判定システム１００は、例えば、被験者から採取された血液に含まれる上記マーカー分子の量を測定する測定装置１と、測定した上記マーカー分子の量に基づいて肝疾患の病態を判定する肝疾患判定装置１１とを備える。以下、詳細に説明する。
【００８３】
上記測定装置は、試料を設置するための試料設置部３と、上記試料に光を照射するための光源部２と、上記試料を透過した光を検出する検出部４と、検出部４によって得られた測定データ（上記マーカー分子の量の測定データ）を上記肝疾患判定装置１１に電気的に送信する通信部５とを、備える。上記試料は、例えば被験者から採取された血液等から調製される。
【００８４】
光源部２は、例えば、複数の波長が照射可能な単一又は複数の光源から構成されている。すなわち、ハロゲンランプのように多波長の光源やそれに波長選択フィルターを組み合わせたもの、また異なるピーク波長のＬＥＤの集合体などである。
【００８５】
光源部２は、試料設置部３に設置された試料に所定の波長の光を照射するものであって、その波長は、検出する試薬（蛍光色素等）に応じて適宜設定できるが、例えば、４００ｎｍ〜１０００ｎｍである。ここで、光源部２は、単色光源であっても、複数の光源を組み合せた光源であってもよい。また、検出する対象が、発光色素の光量、放射性同位体から発する放射線等の場合、光源部２は備えていなくてもよい。
【００８６】
検出部４は、上記試料を透過した光を検出するものである。検出部４は、蛍光色素、発光色素等の光量を検出するものであってもよいし、放射性同位体から発する放射線を検出するものであってもよい。
【００８７】
通信部５は、検出部４によって得られた測定データを上記肝疾患判定装置１１に電気的に送信するものである。
【００８８】
また、光源部２、検出部４、通信部５は、上記肝疾患判定装置１１と電気的に接続されており、上記肝疾患判定装置１１内にある制御部１２によってその機能が制御されていてもよい。
【００８９】
図１１の一部は、上記肝疾患判定装置１１のハードウェア的構成を示す概要図としても把握できる。上記肝疾患判定装置１１は、制御部１２と、上記通信部５から伝達されてきた測定データや解析に必要な情報を記録するための記録部１３と、計測結果の演算解析を行う演算部１４と、解析結果の表示を行う表示部１５と、制御に必要な情報を入力するため入力部１６と、を備えている。後述する肝疾患判定装置１１の各機能は、記録部１３、演算部１４等のハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、演算部１４の制御の下で入力部１６、表示部１５を動作させるとともに、記録部１３、演算部１４におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。
【００９０】
制御部１２は、肝疾患判定システム１００の作動状況を所定の手順に従って制御可能な制御装置である。
【００９１】
肝疾患判定装置１１と制御部１２は双方の機能を備えた１つのコンピュータを使用してもよいし、制御部１２、記録部１３、演算部１４、表示部１５、入力部１６に相当する機能を備えたコンピュータ等を用いてもよい。
【００９２】
図１２は、肝疾患判定装置１１の機能的構成を示す概要図である。肝疾患判定装置１１は、機能的構成要素として、取得手段Ｄ１、規格化手段Ｄ２、比較手段Ｄ３、判定手段Ｄ４及び表示手段Ｄ５を備える。
【００９３】
取得手段Ｄ１は、測定装置１からの測定データ（上記マーカー分子の量の測定データ）を取得するものである。規格化手段Ｄ２は、取得した測定データを上記式１に基づいて規格化スコアを算出し、算出された規格化スコアから指標値を求めるものである。比較手段Ｄ３は、規格化手段Ｄ２によって求められた指標値を、基準値と比較するものである。判定手段Ｄ４は、比較した結果に基づき、肝疾患の病態を有するか否かを判定するものである。表示手段Ｄ５は、判定した結果を表示するものである。
【００９４】
（肝疾患の判定プログラム）
本実施形態に係る方法に使用するためのプログラムは、コンピュータを、上述した取得手段Ｄ１、規格化手段Ｄ２、比較手段Ｄ３、判定手段Ｄ４、及び表示手段Ｄ５として機能させるものである。別の側面では、上記プログラムは、コンピュータに後述する取得ステップＳ１、規格化ステップＳ２、比較ステップＳ３、判定ステップＳ４及び表示ステップＳ５を実行させる。コンピュータに上記プログラムを読み込ませることにより、コンピュータは肝疾患判定装置１１として動作する。上記プログラムは、例えば、記録媒体に格納されて提供される。なお、記録媒体としては、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等の記録媒体、ＲＯＭ等の記録媒体、又は半導体メモリ等が例示される。
【００９５】
（肝疾患の判定方法）
次に、肝疾患判定装置１１により行われる肝疾患の判定方法について説明する。図１３は、肝疾患の判定方法のフローチャートである。肝疾患判定装置１１により行われる上記判定方法により、肝疾患の病態を有するか否かの判定を定量的且つ自動的に精度高く行うことができる。
【００９６】
［取得ステップＳ１］
最初に、取得手段Ｄ１が測定装置１からの測定データ（被験者から採取された血液に含まれる上記マーカー分子の量の測定データ）を取得する。
【００９７】
［規格化ステップＳ２］
次に、規格化手段Ｄ２が、取得手段Ｄ１によって取得した上記測定データから上記式１に基づいて規格化スコアを算出し、算出された規格化スコアから指標値を求める。上記測定データは、取得手段Ｄ１によって取得する代わりに、予め得られた測定データを肝疾患判定装置１１に入力してもよい。また、上記規格化スコアをそのまま指標値としてもよい。
【００９８】
［比較ステップＳ３］
次に、比較手段Ｄ３が、規格化手段Ｄ２によって求められた指標値を、基準値と比較する。測定するマーカー分子が１種類である場合、規格化ステップＳ２を行うことなく、取得手段Ｄ１によって取得した上記測定データを指標値として用いて比較ステップＳ３を行ってもよい。
【００９９】
［判定ステップＳ４］
次に、判定手段Ｄ４が、比較した結果に基づき、肝疾患の病態を有するか否かを判定する。例えば、指標値が、基準値よりも大きい場合に、被験者が、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を罹患している、肝臓の線維化の病態である、肝臓の線維化の進展度、肝細胞の風船様変性の病態の進展度、もしくは、肝臓の炎症の進展度が高い、肝肥大の病態である、肝細胞の壊死の病態である、肝細胞のアポトーシスの病態である、肝細胞の変性の病態である、肝臓の脂肪化の病態である、又はそれらの可能性があると判定する。
【０１００】
［表示ステップＳ５］
次に、表示手段Ｄ５が、判定ステップＳ４にて判定した結果を表示する。例えば、対象が肝疾患の病態を有するか否か等が表示手段Ｄ５によって表示される。
【０１０１】
以上説明したように本実施形態に係る判別方法は、非侵襲性であって、従来法よりも高い精度で非アルコール性脂肪肝疾患等の肝疾患の病態を判別することが可能になる。また、上記判別方法は、非アルコール性脂肪肝疾患等の肝疾患の診断のためのデータを収集する方法としても使用できる。
【０１０２】
上記判別方法では、式１から算出される規格化スコアを用いて指標値を求めたが、規格化スコア以外の統計値を用いて指標値を求めてもよい。上記統計値としては、例えば、最大値、最小値、最頻値、平均値、中央値、パーセンタイル値等が挙げられる。指標値を求めるときに用いる統計値は、１種類を単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。複数を組み合わせて用いた場合、各マーカー分子における測定値の単位、尺度、濃度、量等の違いを補正するために、測定値を標準化してもよい。また、シグモイド関数を用いて測定値の分布を判別に適した分布に変換してもよい。
【実施例】
【０１０３】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。【０１０４】
試験例１：ＮＡＦＬとＮＡＳＨとを判別する方法（１）
予めマテオーニ分類によってＮＡＳＨの患者及びＮＡＦＬの患者に分類された１３２名の患者について、下記表４に示した生体分子（マーカー分子）の血液中の量を測定した。上記生体分子のうち、ＡＬＢ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＣＯＬ４−７Ｓ及びＩＮＳＩＶＤは、日本において薬事承認されている体外診断用医薬品を用いて測定した。具体的には、ＡＬＢは色素結合法の１種であるBCP改良法によって測定した。ＡＬＴ及びＡＳＴは酵素活性測定法によって測定した。ＣＯＬ４−７ＳはRIA法によって測定した。ＩＮＳＩＶＤはCLIA法によって測定した。ＣＫ−１８は市販の評価キット（M30  Apoptosense（登録商標）  ELISA）によって測定した。ＨＡは市販の評価キット（Hyaluronan  Quantikine  ELISA  Kit）によって測定した。Ｍａｃ−２ｂｐは市販の評価キット（Human  Mac-2  binding  protein  (Mac-2bp)  Assay  Kit  −  IBL）によって測定した。市販の評価キットを用いた際に、マルチモードマイクロプレートリーダー「Spectramax  M5」（Molecular  Devices社製）を用いた。Ｐ３ＮＰは市販の評価キット（ELISA  Kit  for  Procollagen  III  N-Terminal  Propeptide  (PIIINP)）によって測定した。その他の生体分子は、Myriad  RBM社の提供する多重免疫測定サービスHuman  DiscoveryMAP（登録商標）  250+（v.  2.0）を利用して測定した。【０１０５】
【表４】
2016163539.tif 000014
【０１０６】
次に同一のモジュールの生体分子の量から、上記式１に基づいて、Ｍ１〜Ｍ４に対応するそれぞれの規格化スコアを求めた。ここで、式１におけるｍｅａｎ（ｍｉ）、ｓｄ（ｍｉ）、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）、及びｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は以下の表５〜表８に示す値を用いた。【０１０７】
【表５】
2016163539.tif 000015
【０１０８】
【表６】
2016163539.tif 000016
【０１０９】
【表７】
2016163539.tif 000017
【０１１０】
【表８】
2016163539.tif 000018
【０１１１】
また、上記モジュールに対応する規格化スコアを２つ用いた場合、上記式２に基づいて指標値を求めた。ここで、式２におけるＭａ１（第１の規格化スコア）、Ｍａ２（第２の規格化スコア）、ａ１及びａ２は、以下の値を用いた。【０１１２】
【表９】
2016163539.tif 000019
【０１１３】
求められた規格化スコア又は指標値をＮＡＦＬの患者群、ＮＡＳＨの患者群に分類してプロットしたグラフを図１に示す。図１中、実線は表１０における「基準値の範囲Ａ」の両端を示し、破線は表１０における「基準値の範囲Ｂ」の両端を示す。いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表１０に示される範囲に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。【０１１４】
【表１０】
2016163539.tif 000020
【０１１５】
また、上記モジュールに対応する規格化スコアを２つ用いた場合、上述した決定木（決定木１〜決定木６）に基づく指標値も求めたところ以下のようになった。
上記マーカー分子が、上記群１及び群２より選ばれる場合は、
Ｍ１ａ≧０．４７６ならばＩ＝２、Ｍ１ａ＜０．４７６かつＭ２ａ≧０．４６６ならばＩ＝１  、Ｍ１ａ＜０．４７６かつＭ２ａ＜０．４６６ならばＩ＝０      （決定木１）
上記マーカー分子が、上記群１及び群３より選ばれる場合は、
Ｍ３ａ≧０．４０９かつ  Ｍ１ａ≧０．４５ならばＩ＝２、Ｍ３ａ≧０．４０９かつＭ１ａ＜０．４５ならばＩ＝１、Ｍ３ａ＜０．４０９ならばＩ＝０      （決定木２）
上記マーカー分子が、上記群１及び群４より選ばれる場合は、
Ｍ４ａ≧０．５４７ならばＩ＝２、Ｍ４ａ＜０．５４７かつＭ１ａ≧０．４６８ならばＩ＝１、Ｍ４ａ＜０．５４７かつ  Ｍ１ａ＜０．４６８ならばＩ＝０      （決定木３）
上記マーカー分子が、上記群２及び群３より選ばれる場合は、
Ｍ３ａ≧０．４０９かつＭ２ａ≧０．４１２ならばＩ＝２、Ｍ３ａ≧０．４０９かつＭ２ａ＜０．４１２ならばＩ＝１、Ｍ３ａ＜０．４０９ならばＩ＝０      （決定木４）
上記マーカー分子が、上記群２及び群４より選ばれる場合は、
Ｍ４ａ≧０．５４７ならばＩ＝２、Ｍ４ａ＜０．５４７かつＭ２ａ≧０．４１３ならばＩ＝１、Ｍ４ａ＜０．５４７かつ  Ｍ２ａ＜０．４１３ならばＩ＝０      （決定木５）
上記マーカー分子が、上記群３及び群４より選ばれる場合は、
Ｍ３ａ≧０．４０９ならばＩ＝２、Ｍ３ａ＜０．４０９かつＭ４ａ≧０．５８８ならばＩ＝１、Ｍ３ａ＜０．４０９かつＭ４ａ＜０．５８８ならばＩ＝０      （決定木６）
（決定木１〜６において、Ｉは指標値を示し、Ｍ１ａ、Ｍ２ａ、Ｍ３ａ及びＭ４ａはそれぞれ、上記群１、群２、群３、及び群４の規格化スコアを示す。）。
いずれの指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また基準値として、下記表１１に示される値が有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。【０１１６】
【表１１】
2016163539.tif 000021
【０１１７】
また、上記モジュールに対応する規格化スコアを２つ用いた場合、上述した相加平均に基づく指標値も求めたところ以下のようになった。
好ましい指標値は下記式３から算出される値が用いられる。式３において、Ｉは指標値を示し、Ｍａ１及びＭａ２はそれぞれ、上記２つの群のうちの一方の規格化スコア及び他方の規格化スコア（「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」）を示す。
Ｉ＝（Ｍａ１＋Ｍａ２）／２                    （式３）
ここで、式３におけるＭａ１（第１の規格化スコア）、Ｍａ２（第２の規格化スコア）は、下記表１２に示される値を用いた。
【表１２】
2016163539.tif 000022
いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表１３に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表１３】
2016163539.tif 000023
【０１１８】
また、上記モジュールに対応する規格化スコアを２つ用いた場合、上述した線形回帰式に基づく指標値も求めたところ以下のようになった。
好ましい指標値は下記式４から算出される値が用いられる。式４において、Ｉは指標値を示し、Ｍａ１及びＭａ２はそれぞれ、上記２つの群のうちの一方の規格化スコア及び他方の規格化スコア（「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」）を示し、ｂ１及びｂ２は、線形回帰分析によって定められる定数を示す。
Ｉ＝ｂ１×Ｍａ１＋ｂ２×Ｍａ２                    （式４）
ここで、式４におけるＭａ１（第１の規格化スコア）、Ｍａ２（第２の規格化スコア）、ｂ１及びｂ２は、下記表１４に示される値を用いた。
【表１４】
2016163539.tif 000024
いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表１５に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表１５】
2016163539.tif 000025
【０１１９】
また、上記モジュールに対応する規格化スコアを２つ用いた場合、上述した線形判別分析に基づく指標値も求めたところ以下のようになった。
好ましい指標値は下記式５から算出される値が用いられる。式５において、Ｉは指標値を示し、Ｍａ１及びＭａ２はそれぞれ、上記２つの群のうちの一方の規格化スコア及び他方の規格化スコア（「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」）を示し、Ｃ１及びＣ２は、線形判別分析によって定められる定数を示す。
Ｉ＝ｃ１×Ｍａ１＋ｃ２×Ｍａ２                    （式５）
ここで、式５におけるＭａ１（第１の規格化スコア）、Ｍａ２（第２の規格化スコア）、ｃ１及びｃ２は、下記表１６に示される値を用いた。
【表１６】
2016163539.tif 000026
いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表１７に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表１７】
2016163539.tif 000027
【０１２０】
また、上記モジュールに対応する規格化スコアを２つ用いた場合、上述した相乗平均に基づく指標値も求めたところ以下のようになった。
好ましい指標値は下記式６から算出される値が用いられる。式６において、Ｉは指標値を示し、Ｍａ１及びＭａ２はそれぞれ、上記２つの群のうちの一方の規格化スコア及び他方の規格化スコア（「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」）を示す。
【数１０】
2016163539.tif 000028
ここで、式６におけるＭａ１（第１の規格化スコア）、Ｍａ２（第２の規格化スコア）は、下記表１８に示される値を用いた。
【表１８】
2016163539.tif 000029
いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表１９に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表１９】
2016163539.tif 000030
【０１２１】
また、上記モジュールに対応する規格化スコアを２つ用いた場合、上述した線形式の掛算に基づく指標値も求めたところ以下のようになった。
好ましい指標値は下記式７から算出される値が用いられる。式７において、Ｉは指標値を示し、Ｍａ１及びＭａ２はそれぞれ、上記２つの群のうちの一方の規格化スコア及び他方の規格化スコア（「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」）を示し、ｄ１、ｄ２及びｄ３は、非線形回帰分析によって定められる定数を示す。
Ｉ＝ｄ１×Ｍａ１＋ｄ２×Ｍａ２+ｄ３×Ｍａ１×Ｍａ２          （式７）
ここで、式７におけるＭａ１（第１の規格化スコア）、Ｍａ２（第２の規格化スコア）、ｄ１、ｄ２及びｄ３は、下記表２０に示される値を用いた。
【表２０】
2016163539.tif 000031
いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表２１に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表２１】
2016163539.tif 000032
【０１２２】
また、上記モジュールに対応する規格化スコアを２つ用いた場合、上述したニューラルネットワークに基づく指標値も求めたところ以下のようになった。
好ましい指標値は下記式８及び式９から算出される値が用いられる。式８において、Ａ１、Ｂ１、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ、ニューラルネットワークによって定められる定数を示す。式９において、Ｉは指標値を示し、Ａ２、Ｂ２及びＸ２は、ニューラルネットワークによって定められる定数を示す。
Ｘ２＝f（Ａ１・Ｘ１＋Ｂ１）                    （式８）
Ｉ＝f（Ａ２・Ｘ２＋Ｂ２）                      （式９）
ここで、
【数１１】
2016163539.tif 000033
「・」は行列の内積を表し、Ｘ１は２×１の行列であり、Ａ１は２×２の行列であり、Ｂ１は２×１の行列であり、Ｘ２は２×１の行列であり、Ａ２は１×２の行列であり、Ｂ２は実数である。
Ａ１、Ｂ１、Ｘ１、Ａ２及びＢ２には、下記表２２に示される値を用いた。
【表２２】
2016163539.tif 000034
上記表２２におけるＭａ１及びＭａ２はそれぞれ、上記２つの群のうちの一方の規格化スコア及び他方の規格化スコア（「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」）を示す。Ｍａ１及びＭａ２には、下記表２３に示される値を用いた。
【表２３】
2016163539.tif 000035
いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表２４に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表２４】
2016163539.tif 000036
【０１２３】
また、上記モジュールに対応する規格化スコアを２つ用いた場合、上述したサポートベクターマシンに基づく指標値も求めたところ以下のようになった。
好ましい指標値は下記式１０から算出される値が用いられる。式１０において、Ｉは指標値を示し、Ｎ、α、χ 及びν は、サポートベクターマシンによって定められる定数を示す。
【数１２】
2016163539.tif 000037
ここで、
【数１３】
2016163539.tif 000038
「・」は行列の内積を表し、χは２×１の行列であり、χTはχの転置行列であり、αは１×Ｎの行列であり、αｉはαのｉ列番目の実数であり、νは２×Ｎの行列であり、νｉはνのｉ列番目の２×１の行列であり、Ｎ、α、χ 及びνには、下記表２５に示される値を用いた。
【表２５】
2016163539.tif 000039
【表２５−２】
2016163539.tif 000040
【表２５−３】
2016163539.tif 000041
上記表２５におけるＭａ１及びＭａ２はそれぞれ、上記２つの群のうちの一方の規格化スコア及び他方の規格化スコア（「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」）を示す。Ｍａ１及びＭａ２には、下記表２６に示される値を用いた。
【表２６】
2016163539.tif 000042
いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表２７に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表２７】
2016163539.tif 000043
【０１２４】
また、上記モジュールに対応する規格化スコアを２つ用いた場合、上述した非線形ロジスティック回帰式に基づく指標値も求めたところ以下のようになった。
好ましい指標値は下記式１１から算出される値が用いられる。式１１において、Ｉは指標値を示し、Ｍａ１及びＭａ２はそれぞれ、上記２つの群のうちの一方の規格化スコア及び他方の規格化スコア（「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」）を示し、ｅ１、ｅ２及びｅ３は、非線形回帰分析によって定められる定数を示す。
Ｉ＝ｅ１×Ｍａ１＋ｅ２×Ｍａ２+ｅ３×Ｍａ１×Ｍａ２          （式１１）
ここで、式１１におけるＭａ１（第１の規格化スコア）、Ｍａ２（第２の規格化スコア）、ｅ１、ｅ２及びｅ３は、下記表２８に示される値を用いた。
【表２８】
2016163539.tif 000044
いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表２９に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表２９】
2016163539.tif 000045
【０１２５】
試験例２：ＮＡＦＬとＮＡＳＨとを判別する方法（２）
測定法１
規格化スコアを求める際に用いた生体分子を、下記表３０に示す１〜３種類の生体分子を用いたこと以外は、上記試験例１と同様の方法で規格化スコアを求めた。【０１２６】
【表３０】
2016163539.tif 000046
【０１２７】
上記モジュール１（Ｍ１）の規格化スコア及びモジュール３（Ｍ３）の規格化スコアをそれぞれ「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」とし、上記表３０に示したＭ１とＭ３の全ての組み合わせについて、上記式２に基づいて指標値を求めたところ、いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表３１に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表３１】
2016163539.tif 000047
【０１２８】
上記モジュール１（Ｍ１）の規格化スコア及びモジュール３（Ｍ３）の規格化スコアをそれぞれ「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」とし、上記表１２に示したＭ１とＭ３の全ての組み合わせについて、上記決定木２に基づく指標値も求めたところ、いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表３２に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表３２】
2016163539.tif 000048
【０１２９】
上記モジュール１（Ｍ１）の規格化スコア及びモジュール３（Ｍ３）の規格化スコアをそれぞれ「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」とし、上記表１２に示したＭ１とＭ３の全ての組み合わせについて、上記式３に基づく指標値も求めたところ、いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表３３に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表３３】
2016163539.tif 000049
【０１３０】
上記モジュール１（Ｍ１）の規格化スコア及びモジュール３（Ｍ３）の規格化スコアをそれぞれ「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」とし、上記表１２に示したＭ１とＭ３の全ての組み合わせについて、上記式４に基づく指標値も求めたところ、いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表３４に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表３４】
2016163539.tif 000050
【０１３１】
上記モジュール１（Ｍ１）の規格化スコア及びモジュール３（Ｍ３）の規格化スコアをそれぞれ「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」とし、上記表１２に示したＭ１とＭ３の全ての組み合わせについて、上記式５に基づく指標値も求めたところ、いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表３５に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表３５】
2016163539.tif 000051
【０１３２】
上記モジュール１（Ｍ１）の規格化スコア及びモジュール３（Ｍ３）の規格化スコアをそれぞれ「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」とし、上記表１２に示したＭ１とＭ３の全ての組み合わせについて、上記式６に基づく指標値も求めたところ、いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表３６に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表３６】
2016163539.tif 000052
【０１３３】
上記モジュール１（Ｍ１）の規格化スコア及びモジュール３（Ｍ３）の規格化スコアをそれぞれ「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」とし、上記表１２に示したＭ１とＭ３の全ての組み合わせについて、上記式７に基づく指標値も求めたところ、いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表３７に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表３７】
2016163539.tif 000053
【０１３４】
上記モジュール１（Ｍ１）の規格化スコア及びモジュール３（Ｍ３）の規格化スコアをそれぞれ「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」とし、上記表１２に示したＭ１とＭ３の全ての組み合わせについて、上記式８及び式９に基づく指標値も求めたところ、いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表３８に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表３８】
2016163539.tif 000054
【０１３５】
上記モジュール１（Ｍ１）の規格化スコア及びモジュール３（Ｍ３）の規格化スコアをそれぞれ「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」とし、上記表１２に示したＭ１とＭ３の全ての組み合わせについて、上記式１０に基づく指標値も求めたところ、いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表３９に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表３９】
2016163539.tif 000055
【０１３６】
上記モジュール１（Ｍ１）の規格化スコア及びモジュール３（Ｍ３）の規格化スコアをそれぞれ「第１の規格化スコア」及び「第２の規格化スコア」とし、上記表１２に示したＭ１とＭ３の全ての組み合わせについて、上記式１１に基づく指標値も求めたところ、いずれの規格化スコア、指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表４０に示される値に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。
【表４０】
2016163539.tif 000056
【０１３７】
測定法２
ＨＡ、ＶＣＡＭ１及びＣＯＬ４−７Ｓそれぞれの量を以下に示す方法で測定し、規格化スコアを求めた。ＨＡの量は、体外診断薬「エルピアエースHA」（LSIメディエンス社製）を用いたラテックス凝集法によって測定した。ＶＣＡＭ１の量は、「Human  sVCAM-1/CD106  Quantikine  ELISA  Kit」（R&D  Systems社製）を用いたELISA法によって測定した。さらに、ＣＯＬ４−７Ｓの量は、体外診断薬「ＩＶ型コラーゲン・７Ｓキット」（LSIメディエンス社製）を用いたラジオイムノアッセイ法によって測定した。測定された各生体分子の量から、上記式１に基づいて、それぞれの規格化スコアを求めた。ここで、式１におけるｍｅａｎ（ｍｉ）、ｓｄ（ｍｉ）、ｍｅａｎ（ｍｉＮＡＳＨ）、及びｍｅａｎ（ｍｉＮＡＦＬ）は、以下示す表４１の値を用いた。なお、表４１に記載の値は、上記診断薬又は試薬を用いた方法と同等の性能を有する測定法が用いられる場合においても用いられる値である。ＨＡにおいてはＮＡＦＬ罹患者４４人及びＮＡＳＨ罹患者９５人から得られた血清試料を測定した。ＶＣＡＭ１においてはＮＡＦＬ罹患者６８人及びＮＡＳＨ罹患者１２７人から得られた血清試料を測定した。ＣＯＬ４−７Ｓについては、ＮＡＦＬ罹患者６２人及びＮＡＳＨ罹患者１３０人から得られた血清試料を測定した。それぞれの分子について、ＮＡＦＬ罹患者の平均値及びＮＡＳＨ罹患者の平均値の単純平均をｍｅａｎ（ｍｉ）とし、ＮＡＦＬ罹患者の標準偏差及びＮＡＳＨ罹患者の標準偏差の単純平均をｓｄ（ｍｉ）とした。また、ＨＡの測定に体外診断薬「ケミルミヒアルロン酸」（シーメンスヘルスケア・ダイアグノスティクス社製）を用いたCLIA法によって測定する場合のｍｅａｎ（ｍｉ）、ｓｄ（ｍｉ）には、ラテックス凝集法において用いるｍｅａｎ（ｍｉ）、ｓｄ（ｍｉ）の値を、添付文書に記載される相関式（ｙ＝１．３６ｘ−１０．３）に代入して得られた値を用いて設定した。ここで、ｙは「ケミルミヒアルロン酸」を用いる場合のｍｅａｎ（ｍｉ）又はｓｄ（ｍｉ）の値を示し、ｘは「エルピアエースHA」を用いる場合のｍｅａｎ（ｍｉ）又はｓｄ（ｍｉ）の値を示す。【０１３８】
【表４１】
2016163539.tif 000057
【０１３９】
求められた規格化スコアをＮＡＦＬの患者群、ＮＡＳＨの患者群に分類してプロットしたグラフを図２−１、図２−２及び図３に示す。図中、実線は表４２及び４３における「基準値の範囲Ａ」の両端を示し、破線は表４２及び４３における「基準値の範囲Ｂ」の両端を示す。いずれの規格化スコアにおいても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表４２及び４３に示される範囲に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。【０１４０】
【表４２】
2016163539.tif 000058
【０１４１】
【表４３】
2016163539.tif 000059
【０１４２】
試験例３：ＮＡＦＬとＮＡＳＨとを判別する方法（３）
第１の規格化スコアとして、試験例２のＭ１（ＰＲＯＳ１、ＣＬＵ）に対応する規格化スコアを、第２の規格化スコアとして、試験例２のＭ３（ＡＳＴ、ＰＳＡＴ）、Ｍ３（ＡＳＴ、ＬＥＰ）、Ｍ３（ＡＳＴ、ＩＣＡＭ１）、Ｍ３（ＡＳＴ、ＰＳＡＴ、ＬＥＰ）、Ｍ３（ＡＳＴ、ＰＳＡＴ、ＩＣＡＭ１）、Ｍ３（ＡＳＴ、ＬＥＰ、ＣＫ−１８）、Ｍ３（ＡＳＴ、ＩＣＡＭ１、ＧＳＴＡ１）又はＭ３（ＡＳＴ、ＰＳＡＴ、６Ｃｋｉｎｅ）に対応する規格化スコアを用いたこと以外は、試験例１の「Ｍ１＋Ｍ３」同様の計算方法で指標値を求めた。【０１４３】
求められた指標値をＮＡＦＬの患者群、ＮＡＳＨの患者群に分類してプロットしたグラフを図４に示す。図４中、実線は表４３における「基準値の範囲Ａ」の両端を示し、破線は表４４における「基準値の範囲Ｂ」の両端を示す。いずれの指標値においても、ＮＡＦＬの患者群とＮＡＳＨの患者群との間に有意な差がみられ、ＮＡＦＬとＮＡＳＨとの判別に有効であることがわかった。また、ＮＡＳＨであるかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表に示される範囲に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣ（０．８３４）と比較したところ、従来技術よりも優れた診断精度であることが示唆された。なお、ＮＡＦＩＣスコアのＡＵＲＯＣは、本実施例の検体群を用いて算出した値である。【０１４４】
【表４４】
2016163539.tif 000060
【０１４５】
試験例４：マテオーニ分類におけるＴｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態とＴｙｐｅ−４の病態とを判別する方法
規格化スコアを求める際に用いた生体分子を、下記表４５に示す生体分子を用いたこと以外は、上記試験例２の測定法１又は測定法２と同様の方法で規格化スコアを求めた。【０１４６】
【表４５】
2016163539.tif 000061
【０１４７】
求められた規格化スコアを、マテオーニ分類におけるＴｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態に該当する患者群（Ｔｙｐｅ１−３）とＴｙｐｅ−４の病態に該当する患者群に分類してプロットしたグラフを図５−１及び図５−２に示す。図中、実線は表４６における「基準値の範囲Ａ」の両端を示し、破線は表４６における「基準値の範囲Ｂ」の両端を示す。いずれの規格化スコアにおいても、Ｔｙｐｅ１−３の患者群とＴｙｐｅ−４の患者群との間に有意な差がみられ、Ｔｙｐｅ−１〜Ｔｙｐｅ−３の病態とＴｙｐｅ−４の病態との判別に有効であることがわかった。また、Ｔｙｐｅ−４の病態に該当するかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表４６に示される範囲に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＦＩＢ４  ｉｎｄｅｘのＡＵＲＯＣ（０．７９０）と比較したところ、従来技術と同等又はそれ以上の診断精度であることが示唆された。【０１４８】
【表４６】
2016163539.tif 000062
【０１４９】
試験例５：線維化のStageにおける、Stage0〜Stage2の病態と、Stage3又はStage4の病態とを判別する方法
試験例４と同様の生体分子及び方法で規格化スコアを求めた。求められた規格化スコアを、線維化のStageにおけるStage0〜Stage2の病態に該当する患者群（Ｆ０−２）とStage3又はStage4の病態に該当する患者群（Ｆ３−４）に分類してプロットしたグラフを図６−１及び図６−２に示す。図中、実線は表４７における「基準値の範囲Ａ」の両端を示し、破線は表４７における「基準値の範囲Ｂ」の両端を示す。ここで、Stage0の病態とは、マテオーニ分類におけるＴｙｐｅ−１又はＴｙｐｅ−２の病態を意味する。いずれの規格化スコアにおいても、Ｆ０−２の患者群とＦ３−４の患者群との間に有意な差がみられ、Stage0〜Stage2の病態と、Stage3又はStage4の病態との判別に有効であることがわかった。また、Ｆ３−４の病態に該当するかどうかを判別するための基準値（カットオフ値）は、下記表４７に示される範囲に設定することが有効であることが分かった。また、これらの結果から求められたＡＵＲＯＣを、従来技術であるＦＩＢ４  ｉｎｄｅｘのＡＵＲＯＣ（０．８５８）と比較したところ、従来技術よりも優れた診断精度であることが示唆された。【０１５０】
【表４７】
2016163539.tif 000063
【０１５１】
試験例６：肝線維化の進展度を判定する方法
群２の生体分子である「ＶＣＡＭ１」、「ＶＣＡＭ１、ＨＡ」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４−７Ｓ」及び「ＨＡ、ＣＯＬ４−７Ｓ」のそれぞれの規格化スコア、並びに、ＶＣＡＭ１の測定値（血中濃度）に基づいて、肝線維化の進展度を判定することが可能かどうかを検討した。肝臓の病理の指標として、肝生検に基づく肝線維化の病理診断スコア、Fibrosis  stage（0〜4点）を用いた（Kleiner  et.  al.,  Design  and  validation  of  a  histological  scoring  system  for  nonalcoholic  fatty  liver  disease,  Hepatology  41:1313-21  (2005)）。規格化スコアは試験例１と同様の方法を用いて求めた。ＶＣＡＭ１の測定値は、ELISA法に拠る試薬「Human  sVCAM-1/CD106  Quantikine  ELISA  Kit」によって定量した。また、肝線維化を評価する指標として知られるFIB4  index（Hepatology.  2006  Jun;43(6):1317-25.）を、被験者の年齢、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び血小板数から求めた。病理診断スコアが記録された人から採取された血清１３２検体について、Fibrosis  stageと、上記規格化スコア、ＶＣＡＭ１の測定値、及びFIB4  indexとの関連を調べた。ＶＣＡＭ１の測定値については、別途測定した健常者の値も併せて検討した。結果を図７に示す。図７中、横軸はFibrosis  Stageを示し、縦軸は規格化スコア、ＶＣＡＭ１の測定値又はFIB4  indexを示し、横線は各群の中央値を示す。上記規格化スコア及びＶＣＡＭ１の測定値は、Fibrosis  stageのスコアが大きくなるに従い、大きくなることが認められた。またＶＣＡＭ１は、健常者ではＮＡＦＬＤ患者よりも小さい値を示す傾向が認められた。【０１５２】
Fibrosis  stageが０点の検体と１点以上の検体との判別を行ったときのAUROC（Stage  0  vs  Stage  1-4）、Fibrosis  stageが１点以下の検体と２点以上の検体との判別を行ったときのAUROC（Stage  0-1  vs  Stage  2-4）、及び、Fibrosis  stageが２点以下の検体と３点以上の検体との判別を行ったときのAUROC（Stage  0-2  vs  Stage  3-4）を調べ、それぞれの指標値の精度を比較した。結果を表４８に示す。「ＶＣＡＭ１」、「ＶＣＡＭ１、ＨＡ」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４−７Ｓ」、及び「ＨＡ、ＣＯＬ４−７Ｓ」のそれぞれの規格化スコア、並びに、ＶＣＡＭ１の測定値について、上記すべての判別でのAUROCが、同じ条件でのFIB4  indexのAUROCを上回っていた。以上のことから、上記規格化スコア及びＶＣＡＭ１の測定値は、肝線維化の進展度を判定するのに有用であることが示唆された。【０１５３】
【表４８】
2016163539.tif 000064
【０１５４】
試験例７：肝臓の炎症の進展度を判定する方法
群２の生体分子である「ＶＣＡＭ１」、「ＶＣＡＭ１、ＨＡ」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４−７Ｓ」、及び「ＨＡ、ＣＯＬ４−７Ｓ」のそれぞれの規格化スコア、並びに、ＶＣＡＭ１の測定値（血中濃度）に基づいて、肝臓の炎症の進展度を評価することが可能かどうかを調べた。肝臓の炎症の指標として、肝生検に基づく小葉内炎症の病理診断スコア（0〜3点）を用いた（Kleiner  et.  al.,  Design  and  validation  of  a  histological  scoring  system  for  nonalcoholic  fatty  liver  disease,  Hepatology  41:1313-21  (2005)）。規格化スコアは試験例１と同様の方法を用いて求めた。ＶＣＡＭ１の測定値は、ELISA法に拠る試薬「Human  sVCAM-1/CD106  Quantikine  ELISA  Kit」によって定量した。また、肝臓の炎症を評価する指標として知られる高感度CRP（Hepatogastroenterology.  2014  Mar-Apr;61(130):422-5）は、ラテックス凝集法によって求めた。病理診断スコアが記録された人から採取された血清１３２検体について、肝臓の小葉内炎症のスコアと、上記規格化スコア、ＶＣＡＭ１の測定値、及び高感度CRPとの関連を調べた。ＶＣＡＭ１の測定値については、別途測定した健常者の値も併せて検討した。結果を図８に示す。図８中、横軸は肝臓の小葉内炎症のスコアを示し、縦軸は規格化スコア、ＶＣＡＭ１の測定値又は高感度CRPの測定値を示し、横線は各群の中央値を示す。上記規格化スコア及びＶＣＡＭ１の測定値は、肝臓の小葉内炎症のスコアが大きくなるに従い、大きくなることが認められた。またＶＣＡＭ１は、健常者ではＮＡＦＬＤ患者よりも小さい値を示す傾向が認められた。【０１５５】
小葉内炎症のスコアが０点の検体と１点以上の検体との判別を行ったときのAUROC（炎症  0  vs  炎症  1-3）及び、小葉内炎症のスコアが１点以下の検体と２点以上の検体との判別を行ったときのAUROC（炎症  0-1  vs  炎症  2-3）を調べ、それぞれの指標値の精度を比較した。結果を表４９に示す。「ＶＣＡＭ１、ＨＡ」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４−７Ｓ」及び「ＨＡ、ＣＯＬ４−７Ｓ」のそれぞれの規格化スコアについては、スコアが０点の検体と１点以上の検体との判別、及び、スコアが１点以下の検体と２点以上の検体との判別の両方において、AUROCが高感度CRPを上回っていた。「ＶＣＡＭ１」及び「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４」のそれぞれの規格化スコア、並びに、ＶＣＡＭ１の測定値については、スコアが１点以下の検体と２点以上の検体との判別においてAUROCが高感度CRPを上回った。以上のことから、上記規格化スコア及びＶＣＡＭ１の測定値は、肝臓の炎症の進展度を判定するのに有用であることが示唆された。【０１５６】
【表４９】
2016163539.tif 000065
【０１５７】
試験例８：肝細胞の風船様変性の進展度を判定する方法
群２の生体分子である「ＶＣＡＭ１」、「ＶＣＡＭ１、ＨＡ」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４−７Ｓ」、及び「ＨＡ、ＣＯＬ４−７Ｓ」のそれぞれの規格化スコア、並びに、ＶＣＡＭ１の測定値（血中濃度）に基づいて、肝細胞の風船様変性の進展度を判定することが可能かどうかを調べた。肝細胞の風船様変性の指標として、肝生検に基づく風船様変性の病理診断スコア（0〜2点）を用いた（Kleiner  et.  al.,  Design  and  validation  of  a  histological  scoring  system  for  nonalcoholic  fatty  liver  disease,  Hepatology  41:1313-21  (2005)）。規格化スコアは試験例１と同様の方法を用いて求めた。ＶＣＡＭ１の測定値は、ELISA法に拠る試薬「Human  sVCAM-1/CD106  Quantikine  ELISA  Kit」によって定量した。また、肝細胞の風船様変性を評価する指標として知られるCK18  M30  fragment（J  Clin  Gastroenterol.  2010  Jul;44(6):440-7）は、ELISA法「M30  Apoptosense  ELISA」によって求めた。病理診断スコアが記録された人から採取された血清１３２検体について、肝細胞の風船様変性のスコアと、上記規格化スコア、ＶＣＡＭ１の測定値、及びCK18  M30  fragmentとの関連を調べた。ＶＣＡＭ１の測定値およびCK18  M30  fragmentについては、別途測定した健常者の値も併せて検討した。結果を図９に示す。図９中、横軸は肝細胞の風船様変性のスコアを示し、縦軸は規格化スコア、ＶＣＡＭ１の測定値又はCK18  M30  fragmentの測定値を示し、横線は各群の中央値を示す。上記規格化スコア及びＶＣＡＭ１の測定値は、肝細胞の風船様変性のスコアが大きくなるに従い、大きくなることが認められた。またＶＣＡＭ１は、健常者ではＮＡＦＬＤ患者よりも小さい値を示す傾向が認められた。【０１５８】
肝細胞の風船様変性のスコアが０点の検体と１点以上の検体との判別を行ったときのAUROC（風船様変性  0  vs  風船様変性1-2）及び、風船様変性のスコアが１点以下の検体と２点の検体との判別を行ったときのAUROC（風船様変性  0-1  vs  風船様変性2）を調べ、それぞれの指標値の精度を比較した。結果を表５０に示す。「ＶＣＡＭ１」、「ＶＣＡＭ１、ＨＡ」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４−７Ｓ」、及び「ＨＡ、ＣＯＬ４−７Ｓ」のそれぞれの規格化スコア、並びに、ＶＣＡＭ１の測定値について、上記の両方の判別で、AUROCがCK18  M30  fragmentを上回った。以上のことから、上記規格化スコア及びＶＣＡＭ１の測定値は、肝細胞の風船様変性の進展度を判定するのに有用であることが示唆された。【０１５９】
【表５０】
2016163539.tif 000066
【０１６０】
試験例９：非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）活動性を判定する方法
群２の生体分子である「ＶＣＡＭ１」、「ＶＣＡＭ１、ＨＡ」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４−７Ｓ」、及び「ＨＡ、ＣＯＬ４−７Ｓ」のそれぞれの規格化スコア、並びに、ＶＣＡＭ１の測定値（血中濃度）に基づいて、ＮＡＦＬＤの活動性を評価することが可能かどうかを調べた。ＮＡＦＬＤの活動性の指標として、肝生検に基づくＮＡＦＬＤの活動性の病理診断スコア（0〜8点）を用いた（Kleiner  et.  al.,  Design  and  validation  of  a  histological  scoring  system  for  nonalcoholic  fatty  liver  disease,  Hepatology  41:1313-21  (2005)）。規格化スコアは試験例１と同様の方法を用いて求めた。ＶＣＡＭ１の測定値は、ELISA法に拠る試薬「Human  sVCAM-1/CD106  Quantikine  ELISA  Kit」によって定量した。また、ＮＡＦＬＤの活動性を評価する指標として知られるCK18  M30  fragment（J  Clin  Gastroenterol.  2010  Jul;44(6):440-7）は、ELISA法「M30  Apoptosense  ELISA」によって求めた。病理診断スコアが記録された人から採取された血清１３２検体について、ＮＡＦＬＤの活動性のスコアと、上記規格化スコア、ＶＣＡＭ１の測定値、及びCK18  M30  fragmentとの関連を調べた。ＶＣＡＭ１の測定値及びCK18  M30  fragmentについては、別途測定した健常者の値も併せて検討した。結果を図１０に示す。図１０中、横軸はＮＡＦＬＤの活動性のスコアを示し、縦軸は規格化スコア、ＶＣＡＭ１の測定値又はCK18  M30  fragmentの測定値を示し、横線は各群の中央値を示す。ＶＣＡＭ１を含む群２の規格化スコア及びＶＣＡＭ１の測定値は、ＮＡＦＬＤの活動性のスコアが大きくなるに従い、大きくなることが認められた。またＶＣＡＭ１は、健常者ではＮＡＦＬＤ患者よりも小さい値を示す傾向が認められた。【０１６１】
ＮＡＦＬＤの活動性のスコアが１点の検体と２点以上の検体との判別を行ったときのAUROC（NAS1  vs  NAS  2-8）、ＮＡＦＬＤの活動性のスコアが２点以下の検体と３点以上の検体との判別を行ったときのAUROC（NAS1-2  vs  NAS  3-8）、ＮＡＦＬＤの活動性のスコアが３点以下の検体と４点以上の検体との判別を行ったときのAUROC（NAS1-3  vs  NAS  4-8）、ＮＡＦＬＤの活動性のスコアが４点以下の検体と５点以上の検体との判別を行ったときのAUROC（NAS1-4  vs  NAS  5-8）、及びＮＡＦＬＤの活動性のスコアが５点以下の検体と６点以上の検体との判別を行ったときのAUROC（NAS1-5  vs  NAS  6-8）を調べ、それぞれの指標値の精度を比較した。結果を表５１に示す。「ＶＣＡＭ１、ＨＡ」の規格化スコアについては、ＮＡＦＬＤの活動性のスコアが５点以下の検体と６点以上の検体の判別を行ったときにおいて、AUROCがCK18  M30  fragmentを上回った。「ＶＣＡＭ１」、「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４」及び「ＶＣＡＭ１、ＣＯＬ４−７Ｓ」のそれぞれの規格化スコア、並びにＶＣＡＭ１の測定値については、ＮＡＦＬＤの活動性のスコアが４点以下の検体と５点以上の検体との判別を行ったとき、及びＮＡＦＬＤの活動性のスコアが５点以下の検体と６点以上の検体との判別を行ったときにおいて、AUROCがCK18  M30  fragmentを上回った。【０１６２】
一方、「ＨＡ、ＣＯＬ４−７Ｓ」の規格化スコアについては、ＮＡＦＬＤの活動性のスコアが２点以下の検体と３点以上の検体の判別を行ったときのAUROC、ＮＡＦＬＤの活動性のスコアが３点以下の検体と４点以上の検体の判別を行ったときのAUROC、ＮＡＦＬＤの活動性のスコアが４点以下の検体と５点以上の検体の判別を行ったときのAUROC、およびＮＡＦＬＤの活動性のスコアが５点以下の検体と６点以上の検体の判別を行ったときにおいて、AUROCがCK18  M30  fragmentを上回った。以上のことから、上記規格化スコア及びＶＣＡＭ１の測定値は、ＮＡＦＬＤの活動性を判定するのに有用であることが示唆された。【０１６３】
【表５１】
2016163539.tif 000067
【０１６４】
試験例１０：「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアに基づいて、肝線維化の進展度、肝臓の炎症の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度およびＮＡＦＬＤ活動性を判定する方法
群２の生体分子である「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアに基づいて、肝線維化の進展度、肝臓の炎症の進展度、肝細胞の風船様変性の進展度およびＮＡＦＬＤ活動性を判定することが可能かどうかを調べた。方法は、それぞれ上記試験例６、試験例７、試験例８および試験例９と同じ方法を用いた。【０１６５】
「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアと肝線維化の進展度との関係を図１４に示す。図１４中、横軸はFibrosis  Stageを示し、縦軸は規格化スコアを示し、横線は各群の中央値を示す。上記規格化スコアは、Fibrosis  stageのスコアが大きくなるに従い、大きくなることが認められた。
肝線維化の進展度の判定についての結果を、表５２に示す。すべての判別においてAUROCが、同じ条件でのFIB4  indexのAUROCを上回っていた。以上のことから、「ＨＡ、ＣＯＬ４−７Ｓ」の規格化スコアは、肝線維化の進展度を判定するのに有用であることが示唆された。【０１６６】
【表５２】
2016163539.tif 000068
【０１６７】
「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアと肝臓の炎症の進展度との関係を図１５に示す。図１５中、横軸は肝臓の小葉内炎症のスコアを示し、縦軸は規格化スコアを示し、横線は各群の中央値を示す。上記規格化スコアは、肝臓の小葉内炎症のスコアが大きくなるに従い、大きくなることが認められた。
肝臓の炎症の進展度の判定についての結果を表５３に示す。肝臓の小葉内炎症のスコアが１点以下の検体と２点以上の検体との判別において、上記規格化スコアのAUROCが同じ条件での高感度CRPのAUROCを上回った。以上のことから、「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアは、肝臓の炎症の進展度を判定するのに有用であることが示唆された。【０１６８】
【表５３】
2016163539.tif 000069
【０１６９】
「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアと肝細胞の風船様変性との関係を図１６に示す。図１６中、横軸は肝細胞の風船様変性のスコアを示し、縦軸は規格化スコアを示し、横線は各群の中央値を示す。上記規格化スコアは、肝細胞の風船様変性のスコアが大きくなるに従い、大きくなることが認められた。
肝細胞の風船様変性の進展度の判定についての結果を表５４に示す。全ての判別において、上記規格化スコアのAUROCが同じ条件でのCK18  M30  fragmentのAUROCを上回った。以上のことから、「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアは、肝細胞の風船様変性の進展度を判定するのに有用であることが示唆された。【０１７０】
【表５４】
2016163539.tif 000070
【０１７１】
「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアとＮＡＦＬＤの活動性の関係を図１７に示す。図１７中、横軸はＮＡＦＬＤの活動性のスコアを示し、縦軸は規格化スコアを示し、横線は各群の中央値を示す。上記規格化スコア及びは、ＮＡＦＬＤの活動性のスコアが大きくなるに従い、大きくなることが認められた。
ＮＡＦＬＤ活動性の判定についての結果を表５５に示す。ＮＡＦＬＤの活動性のスコアが４点以下の検体と５点以上の検体との判別を行ったとき、及びＮＡＦＬＤの活動性のスコアが５点以下の検体と６点以上の検体との判別を行ったときにおいて、上記規格化スコアのAUROCが同じ条件でのCK18  M30  fragmentのAUROCを上回った。以上のことから、「ＨＡ、ＣＯＬ４」の規格化スコアは、ＮＡＦＬＤの活動性を判定するのに有用であることが示唆された。【０１７２】
【表５５】
2016163539.tif 000071
【符号の説明】
【０１７３】
１…測定装置、２…光源部、３…試料設置部、４…検出部、５…通信部、１１…肝疾患判定装置、１２…制御部、１３…記録部、１４…演算部、１５…表示部、１６…入力部、１００…肝疾患判定システム、Ｄ１…取得手段、Ｄ２…規格化手段、Ｄ３…比較手段、Ｄ４…判定手段、Ｄ５…表示手段、Ｓ１…取得ステップ、Ｓ２…規格化ステップ、Ｓ３…比較ステップ、Ｓ４…判定ステップ、Ｓ５…表示ステップ。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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