(57)【要約】本発明は、新規な特性を有するセルロース構造体を提供することを目的とし、具体的には、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）を用いたセルロースの合成において、多様な高分子を用いることで、新規な特性を有するセルロース三次元構造体を合成することに関する。
2016140369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
2016140369.tif 000008
（式中、ｎは、４〜１０である）
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体。
【請求項２】
高分子を含有する、請求項１記載のセルロース三次元構造体。
【請求項３】
高分子がセルロースナノ結晶又は水溶性高分子である、請求項２記載のセルロース三次元構造体。
【請求項４】
水溶性高分子がポリエチレングリコール、デキストラン及びポリビニルピロリドンから成る群より選択される、請求項３記載のセルロース三次元構造体。
【請求項５】
含有される水溶性高分子が除去された、請求項３又は４記載のセルロース三次元構造体。
【請求項６】
セルロース三次元構造体が三次元網目構造を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載のセルロース三次元構造体。
【請求項７】
三次元網目構造がスポンジ状である、請求項６記載のセルロース三次元構造体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載のセルロース三次元構造体を含む足場材。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項記載のセルロース三次元構造体を含むフィルム。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項記載のセルロース三次元構造体又は請求項９記載のフィルムを含むセパレータ。
【請求項１１】
α−Ｄ−グルコース一リン酸と、プライマーとしてＤ−（＋）−グルコースとを、高分子存在下でセロデキストリンホスホリラーゼと反応させる工程を含む、次式（Ｉ）：
【化２】
2016140369.tif 000009
（式中、ｎは、４〜１０である）
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体の製造方法。
【請求項１２】
高分子がセルロースナノ結晶又は水溶性高分子である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
水溶性高分子がポリエチレングリコール、デキストラン及びポリビニルピロリドンから成る群より選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
セルロース三次元構造体から水溶性高分子を除去する工程をさらに含む、請求項１２又は１３記載の方法。
【請求項１５】
セルロース三次元構造体が三次元網目構造を有する、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
三次元網目構造がスポンジ状である、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば人工的に合成したセルロース三次元構造体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、地球上で最も豊富に存在する有機高分子である。セルロースは、その資源性に加え、高いサステイナビリティをもつことから、注目されているマテリアル素材である。機械的処理や化学的処理によって天然物から得られるセルロースは、繊維状の形態であることが知られており、その構造や物性に応じた利用が展開されている。また、天然資源を酸処理することによって得られるセルロースナノ結晶（ＣＮＣ）は、新たなセルロース素材としての利用が期待されている。ＣＮＣは、セルロース鎖が平行に配列したＩ型結晶構造を有し、高いアスペクト比や優れた機械的強度、熱的安定性等から複合材料のフィラーとして注目されている。
一方、結晶性のセルロースが人工的にも合成できることが知られている（人工合成で得られるセルロースは一般にオリゴマーであることから、このようなセルロースはセロデキストリンと呼ばれる。ここでは、区別せずにすべてセルロースと呼ぶ）。下記の反応は、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）の逆反応を利用したセルロースの酵素合成を示す。
【化１】
2016140369.tif 000003
上記反応に示すように、加リン酸分解酵素であるＣＤＰの逆反応を利用した酵素合成により、長さ数μｍ、幅数百ｎｍ、厚さ４．５ｎｍのナノシート構造を有するセルロース結晶（セルロースナノシート；ＣＮＳ）が得られる（非特許文献１）。当該合成においては、プライマーとして働くＤ−（＋）−グルコースに対して、α−Ｄ−グルコース一リン酸（αＧ１Ｐ）がモノマーとして逐次的に重合される。ＣＤＰが本来加水分解する基質に対する認識能と比較し、セルロース合成に用いられるＤ−（＋）−グルコースは認識されにくいものの、結果として首尾良く重合反応が進む。また、ＣＮＳは、天然由来のＩ型結晶とは異なり、より安定な逆平行鎖のＩＩ型結晶構造を有する。そのため、ＣＮＳ内でセルロース鎖は厚さ方向に逆平行に配列しており、結果としてセルロースの還元末端及び非還元末端がシート表面に規則的に露出している。また、ＣＮＳは純水に安定に分散するが、ＮａＯＨ水溶液に溶解する性質を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｈｉｒａｉｓｈｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００９年，Ｖｏｌ．３４４，ｐｐ．２４６８−２４７３
【発明の概要】
【０００４】
上述のセロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）を用いたセルロースの合成において、多様な高分子を添加することで、セルロース分子間の相互作用が変化し、新規な特性を有するセルロース構造体を合成できると考えられる。
そこで、本発明は、これらの実情に鑑み、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）を用いたセルロースの合成において、多様な高分子を利用し、新規な特性を有するセルロース構造体を合成することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）を用いたセルロースの合成において、セルロースナノ結晶や水溶性高分子等の様々な高分子を添加することで、新規な特性を有するセルロース三次元構造体を合成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）次式（Ｉ）：
【化２】
2016140369.tif 000004
（式中、ｎは、４〜１０である）
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体。
（２）高分子を含有する、（１）記載のセルロース三次元構造体。
（３）高分子がセルロースナノ結晶又は水溶性高分子である、（２）記載のセルロース三次元構造体。
（４）水溶性高分子がポリエチレングリコール、デキストラン及びポリビニルピロリドンから成る群より選択される、（３）記載のセルロース三次元構造体。
（５）含有される水溶性高分子が除去された、（３）又は（４）記載のセルロース三次元構造体。
（６）セルロース三次元構造体が三次元網目構造を有する、（１）〜（５）のいずれか１記載のセルロース三次元構造体。
（７）三次元網目構造がスポンジ状である、（６）記載のセルロース三次元構造体。
（８）（１）〜（７）のいずれか１記載のセルロース三次元構造体を含む足場材。
（９）（１）〜（７）のいずれか１記載のセルロース三次元構造体を含むフィルム。
（１０）（１）〜（７）のいずれか１記載のセルロース三次元構造体又は（９）記載のフィルムを含むセパレータ。
（１１）α−Ｄ−グルコース一リン酸と、プライマーとしてＤ−（＋）−グルコースとを、高分子存在下でセロデキストリンホスホリラーゼと反応させる工程を含む、次式（Ｉ）：
【化３】
2016140369.tif 000005
（式中、ｎは、４〜１０である）
で示される化合物を構成成分として含有するセルロース三次元構造体の製造方法。
（１２）高分子がセルロースナノ結晶又は水溶性高分子である、（１１）記載の方法。
（１３）水溶性高分子がポリエチレングリコール、デキストラン及びポリビニルピロリドンから成る群より選択される、（１２）記載の方法。
（１４）セルロース三次元構造体から水溶性高分子を除去する工程をさらに含む、（１２）又は（１３）記載の方法。
（１５）セルロース三次元構造体が三次元網目構造を有する、（１１）〜（１４）のいずれか１記載の方法。
（１６）三次元網目構造がスポンジ状である、（１５）記載の方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１５−０４０７３５号の開示内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】実施例１のセルロースの合成方法１におけるマボヤ由来セルロースナノ結晶（ＣＮＣ）濃度を変化させたとき（セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）が０．２０Ｕ／ｍＬの条件）のサンプル管転倒試験の写真を示す。
【図２】実施例１のセルロースの合成方法１におけるＣＤＰ濃度を変化させたとき（マボヤ由来ＣＮＣが０．１０ｗ／ｖ％の条件）のサンプル管転倒試験の写真を示す。
【図３】実施例１のセルロースの合成方法１における均一にスポンジ化した試料（マボヤ由来ＣＮＣが０．１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）の走査型電子顕微鏡（２０，０００倍の倍率）の観察結果を示す。
【図４】実施例１のセルロースの合成方法１における均一にスポンジ化した試料（マボヤ由来ＣＮＣが０．１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）のＡＦＭ（原子間力顕微鏡）の観察結果を示す。
【図５】実施例１のセルロースの合成方法１における均一にスポンジ化した試料の全反射赤外分光光度計による解析結果を示す。
【図６】実施例１のセルロースの合成方法１における均一にスポンジ化したセルロースの核磁気共鳴分光装置による解析結果を示す。
【図７】実施例１のセルロースの合成方法１における均一にスポンジ化した試料（マボヤ由来ＣＮＣが０．１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計）による解析結果を示す。数字はセルロースの重合度を示す。
【図８】実施例１のセルロースの合成方法１における均一にスポンジ化した試料の押し込み破断の測定結果を示す。
【図９Ａ】実施例１のセルロースの合成方法１における木由来ＣＮＣ濃度を変化させたとき（ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）のサンプル管転倒試験の写真を示す。
【図９Ｂ】実施例１のセルロースの合成方法１における均一にスポンジ化した試料（木由来ＣＮＣが０．５０ｗ／ｖ％の条件）の全反射赤外分光光度計による解析結果を示す。
【図１０】実施例１のセルロースの合成方法１における均一にスポンジ化した試料（マボヤ由来ＣＮＣが０．１０ｗ／ｖ％、木由来ＣＮＣが０．５０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）に、試験棒の押込みによりスポンジが破断した後の写真を示す。
【図１１】実施例１のセルロースの合成方法２におけるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）濃度を変化させたとき（ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）のサンプル管転倒試験の写真を示す。
【図１２】実施例１のセルロースの合成方法２におけるＣＤＰ濃度を変化させたとき（ＰＥＧが１０ｗ／ｖ％の条件）のサンプル管転倒試験の写真を示す。
【図１３】実施例１のセルロースの合成方法２における均一にスポンジ化した試料（ＰＥＧが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）の走査型電子顕微鏡の観察結果（左の写真：倍率５０００倍；右の写真：倍率１００００倍）を示す。
【図１４】実施例１のセルロースの合成方法２における均一にスポンジ化した試料（デキストラン（Ｄｅｘ）、ＰＥＧ又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）のサンプル管転倒試験の写真及び均一にスポンジ化した試料（ＰＥＧが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）の走査型電子顕微鏡の観察結果（左の写真）とαＧ１Ｐの転化率（右のグラフ）を示す。
【図１５】実施例１のセルロースの合成方法２における均一にスポンジ化した試料（Ｄｅｘが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）の走査型電子顕微鏡の観察結果を示す。
【図１６】実施例１のセルロースの合成方法２における均一にスポンジ化した試料（ＰＶＰが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）の走査型電子顕微鏡の観察結果を示す。
【図１７】実施例１のセルロースの合成方法２における均一にスポンジ化した試料（ＰＥＧが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０又は０．４０Ｕ／ｍＬの条件）の全反射赤外分光光度計による解析結果を示す。
【図１８】実施例１のセルロースの合成方法２における均一にスポンジ化したセルロース（ＰＥＧが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０又は０．４０Ｕ／ｍＬの条件）の核磁気共鳴分光装置による解析結果を示す。
【図１９】実施例１のセルロースの合成方法２における均一にスポンジ化したセルロース（Ｄｅｘ、ＰＥＧ又はＰＶＰが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）の化学構造・結晶構造解析結果を示す。
【図２０】実施例１のセルロースの合成方法２におけるＤｅｘの共存により調製したスポンジ状セルロース構造体（Ｄｅｘが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）のサンプル管転倒試験の写真を示す。
【図２１】実施例１のセルロースの合成方法２におけるＤｅｘの共存により調製したスポンジ状セルロース構造体のサンプル管転倒試験の写真を示す。
【図２２】実施例１のセルロースの合成方法２における均一にスポンジ化した試料の押し込み破断の測定結果を示す。
【図２３】実施例１のセルロースの合成方法２における均一にスポンジ化した試料（Ｄｅｘが１０ｗ／ｖ％、ＰＥＧが１０ｗ／ｖ％、ＰＶＰが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）の押し込み破断の測定結果を示す。
【図２４】実施例１のセルロースの合成方法２における均一にスポンジ化した試料（ＰＥＧが１０ｗ／ｖ％、Ｄｅｘが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）に、試験棒の押込みによりスポンジが破断した後の写真を示す。
【図２５】実施例１のセルロースの合成方法２におけるＤｅｘもしくはＰＥＧの共存により、均一にスポンジ化した試料の全反射赤外分光光度計による解析結果を示す。
【図２６】実施例１のセルロースの合成方法２におけるＤｅｘの共存により調製した試料（ＣＤＰ濃度０．２０又は０．４０Ｕ／ｍＬに対してＤｅｘ濃度が１０ｗ／ｖ％であるか、又はＤｅｘ濃度２〜２０ｗ／ｖ％に対してＣＤＰ濃度が０．２０Ｕ／ｍＬである条件）のＮＭＲ測定、及び試料（ＣＤＰ濃度０．０５〜０．４０Ｕ／ｍＬに対してＤｅｘ濃度が１０ｗ／ｖ％であるか、又はＤｅｘ濃度２〜２０ｗ／ｖ％に対してＣＤＰ濃度が０．２０Ｕ／ｍＬである条件）のＩＲ測定による解析結果を示す。
【図２７】実施例１のセルロースの合成方法２におけるＤｅｘの共存により、均一にスポンジ化した試料（ＣＤＰ濃度０．２０又は０．４０Ｕ／ｍＬに対してＤｅｘ濃度が１０ｗ／ｖ％であるか、又はＤｅｘ濃度２〜２０ｗ／ｖ％に対してＣＤＰ濃度が０．２０Ｕ／ｍＬである条件）のＮＭＲ測定による解析結果を示す。
【図２８】実施例１のセルロースの合成方法２における均一にスポンジ化した試料（Ｄｅｘが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）のＡＦＭ（原子間力顕微鏡）の観察結果を示す。
【図２９】実施例１におけるスポンジ状セルロース構造体を酵素水溶液に浸漬したときの観察結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
１．本発明に係るセルロース三次元構造体
本発明に係るセルロース三次元構造体は、次式（Ｉ）：
【化４】
2016140369.tif 000006
（式中、ｎは、４〜１０である）
で示される化合物を構成成分として含有するものである。天然由来のセルロース鎖が平行に配列したＩ型セルロース構造とは異なり、本発明に係るセルロース三次元構造体は、より安定な逆平行鎖のＩＩ型セルロース構造を有する。
式（Ｉ）の化合物の重合度は、例えば６以上、７以上、好ましくは８以上（すなわち、式（Ｉ）の化合物において、ｎが４以上、５以上、好ましくは６以上）であり、且つ１２以下、好ましくは１１以下（すなわち、式（Ｉ）の化合物において、ｎが１０以下、好ましくは９以下）である。
本発明に係るセルロース三次元構造体は、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）を用いたセルロースの合成の際の高分子の共存により、スポンジ状の構造（リボン状セルロースのネットワーク）等の三次元網目構造を有する三次元構造体となる。当該三次元構造体においては、網目構造中の空隙が外面につながっている（よって、溶媒（水分）が外に出る）状態である。従って、当該三次元構造体は、押す（圧力をかける）と、圧力に応じた構造の崩壊を伴いながら、溶媒（水分）が外面に出る構造を有する。
合成の際の高分子の共存により、本発明に係るセルロース三次元構造体は、高分子を含有する。高分子としては、例えばセルロースナノ結晶、水溶性高分子等が挙げられる。セルロースナノ結晶は、例えばマボヤ又は木等の天然由来のものである。マボヤ又は木由来のセルロースナノ結晶は、Ｊ．Ａｒａｋｉら，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ．Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ，１９９８年，１４２，７５−８２に記載の方法に準じて製造することができる。水溶性高分子としては、例えばポリエチレングリコール（例えば分子量：１５０００〜２５０００）、デキストラン（例えば分子量：９００００〜２１００００）、及びポリビニルピロリドン（例えば重量平均分子量：ｃａ．２９０００）等が挙げられる。
また、本発明に係るセルロース三次元構造体の製造後、水溶性高分子を除去し、式（Ｉ）の化合物単独から構成されるセルロース三次元構造体とすることができる。
２．本発明に係るセルロース三次元構造体の製造方法
以上に説明した本発明に係るセルロース三次元構造体は、以下に示される反応に準じて製造することができる。
【化５】
2016140369.tif 000007
具体的には、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）の逆反応を利用した酵素合成により、α−Ｄ−グルコース一リン酸（αＧ１Ｐ）とプライマーとしてＤ−（＋）−グルコースとを、高分子存在下でＣＤＰと反応させることにより、本発明に係るセルロース三次元構造体を製造することができる。プライマーとして働くＤ−（＋）−グルコースに対して、αＧ１Ｐがモノマーとして逐次的に重合される。
αＧ１Ｐ及びＤ−（＋）−グルコースは、市販品として入手できるものであってよい。
一方、ＣＤＰは、例えばＭ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１−８に記載の方法に準じて調製することができる。具体的には、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１−８によれば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍＹＭ４株由来のＣＤＰを調製することができる。
また、ＣＤＰの酵素量は、例えばα−Ｄ−グルコース一リン酸とＤ−（＋）−セロビオース及びＣＤＰをインキュベーションし、ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間当たり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕとして求めることができる。
例えば、１０〜１０００ｍＭ（好ましくは１００〜３００ｍＭ）のαＧ１Ｐ、１０〜２００ｍＭ（好ましくは５０〜６０ｍＭ）のＤ−（＋）−グルコース、高分子（例えば、セルロースナノ結晶の場合、０．００１〜１ｗ／ｖ％、好ましくは０．０２〜０．５０ｗ／ｖ％；水溶性高分子の場合、２〜２０ｗ／ｖ％、５〜２０ｗ／ｖ％、好ましくは１０ｗ／ｖ％）、及び０．０１〜１．５Ｕ／ｍＬ（好ましくは０．０５〜０．５０Ｕ／ｍＬ）のＣＤＰを、１００〜１０００ｍＭ（好ましくは２５０〜７５０ｍＭ）の２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０（好ましくはｐＨ７．５））中で混合し、１０〜８０℃（好ましくは、２０〜６０℃）で０．５〜３０日間（好ましくは、１〜１４日間）インキュベートし、反応させる。このようにして、本発明に係るセルロース三次元構造体を製造することができる。
また、製造されたセルロース三次元構造体から製造時に使用した水溶性高分子を除去することができる。水溶性高分子の除去は、例えばセルロース三次元構造体を水に浸漬させることにより行うことができる。
３．本発明に係るセルロース三次元構造体の用途
３−１．医療分野
３−１−１．細胞培養足場材
本発明に係るセルロース三次元構造体は、例えばその表面に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。
生育させる細胞としては、動物由来であれば良く、例えば哺乳類、爬虫類、又は昆虫由来の細胞が挙げられる。また、心臓、肝臓、脾臓、表皮等の臓器や組織から分離した初代培養細胞でも、継代培養した株化細胞、腫瘍細胞でも良い。さらに、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）等の体性幹細胞、人工多能性幹細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｖｅｒｏ細胞等の細胞株（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ）等でも良い。
細胞培養に用いる培地としては、平衡塩類溶液にアミノ酸やビタミン等の低分子化合物を加えた基礎培地が挙げられる。さらに、血清或いは血清・組織抽出物、加水分解物、成長因子、ホルモン、搬送体タンパク質、脂質、ポリアミン酸、微量元素、ビタミン、増粘剤、界面活性剤、細胞接着因子等を添加した培地を使用することもできる。
当該セルロース三次元構造体を、薄膜状に成形して、薄膜の表面で細胞を培養できる。栄養成分を薄膜底面からも供給することで培養効率を高めることができる。
当該セルロース三次元構造体上に単層状に生育した細胞は、細胞剥離剤にて剥離し回収することができる。細胞剥離剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の２価カチオン除去のためのキレート剤、細胞・基質間、細胞・細胞間接着タンパク質のためのトリプシン等のプロテアーゼを用いることもできるし、セルラーゼにより当該セルロース三次元構造体の一部又は全部を分解し、可溶化することで細胞を剥離することもできる。プロテアーゼを用いない後者の方法では、細胞・細胞間の接着は剥離することなく、また細胞への影響も無いことから、活性の高い懸濁細胞又は細胞シートを得ることができる。
得られた細胞シートは、同様に得られた細胞シートと積層するか、或いは細胞シートの表面を細胞間接着タンパク質等でコートし、さらに細胞を培養することで、三次元的に厚みを持った細胞塊を得ることができる。
３−１−２．高濃度細胞培養用足場材
本発明に係るセルロース三次元構造体は、その内部に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。当該セルロース三次元構造体を、細胞が入ることができる大きさ程度又はそれ以上の空隙を持つ構造体に成形し、構造体の中で細胞を培養することができる。
生育させる細胞は、上記の第３−１−１節に記載するように、動物由来であればどのような細胞でも良い。また、培養に用いる培地は、上記の第３−１−１節に記載するように、基礎培地、血清添加培地又はその他成分を添加した培地でも良い。
当該セルロース三次元構造体中で細胞を培養することで、浮遊懸濁培養の際に起こる撹拌のせん断応力による細胞の傷害が起こらず、培養液当たりの細胞の高濃度化が可能となる。
また、抗体やタンパク質等のバイオ医薬品の生成能を付与したｒＣＨＯ細胞等を当該セルロース三次元構造体で高濃度に培養すれば、バッチ当たりの抗体やタンパク質等の生産量が増大し、バイオ医薬品の製造コスト低減が可能である。さらに、目的生産物を回収後、新しい培地を添加し、再度培養を行うか、或いは連続的に目的生産物を含む培地を回収し、新しい培地を追加添加することで、バッチ連続式又は連続式に生産物を得ることができる。
さらに、高濃度培養した細胞は、足場材として利用したセルロース三次元構造体をセルラーゼ処理に供することで、プロテアーゼ処理の際に起こるような細胞への傷害を起こさずに細胞を遊離させ、回収することができる。ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の全能性幹細胞を当該手法で大量に培養し、再生医療や創薬産業のために必要な細胞を供給することができる。
３−１−３．三次元構造体足場材
本発明に係るセルロース三次元構造体は、その内部に動物細胞を生育させる足場材として使用することができる。当該セルロース三次元構造体を、細胞が入ることができる大きさ程度又はそれ以上の空隙を持つ構造体に成形し、構造体の中で細胞を培養することができる。
生育させる細胞は、上記の第３−１−１節に記載するように、動物由来であればどのような細胞でも良い。培養に用いる培地は、上記の第３−１−１節に記載するように、基礎培地、血清添加培地又はその他成分を添加した培地でも良い。
当該セルロース三次元構造体を、細胞培養の前、途中又は後に、目的組織に合わせた形状に成形し、生体組織又は臓器の再生のために用いることができる。細胞培養の前に成形する場合、当該セルロース三次元構造体の重合反応時に目的の形状の型枠で反応させることもできるし、成形後に切断、積層、編み込み等で目的の形状にすることができる。
当該セルロース三次元構造体は、セルラーゼ処理により、細胞へ影響することなく分解可溶化することができる。臓器への移植する前に、セルラーゼ処理に供し、部分的に、又は全部を分解可溶化しても良いし、セルラーゼ処理に供することなく足場材と共に移植しても良い。
さらに、細胞を生育させた三次元構造体は、組織又は臓器の形状や機能を生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で再現したものとして、癌転移の機構解明、制癌剤の薬効評価等の基礎医学研究用、或いは、近年動物試験が禁止された化粧品の皮膚等の生体組織への影響を検討するための素材として利用することができる。
３−１−４．骨欠損部位への移植材料
本発明に係るセルロース三次元構造体は、動物の骨欠損部位への移植材料、歯周組織の再生誘導材料としても使用することができる。当該セルロース三次元構造体は、容易に望む形に成形加工することができ、高圧蒸気による滅菌も可能である。当該セルロース三次元構造体は、移植する前に細胞を生着させても良いし、そのまま移植しても良い。
３−２．環境・エネルギー分野
下記に説明するように、本発明に係るセルロース三次元構造体は、フィルム（例えば、微多孔性のフィルム（用途例：セパレータ、吸着材、バイオセンサー等）、緻密なフィルム（用途例：バリアフィルム等））として環境・エネルギー分野において使用することができる。
３−２−１．電池セパレータ用途
本発明に係るセルロース三次元構造体は、例えばリチウムイオン電池等の二次電池向けのセパレータとしても用いることができる。セパレータとして用いることにより、従来のポリオレフィン製のセパレータに比べ、高い耐熱性を有するため、例えば、過充電等により、電池が異常発熱した場合に、セパレータが融解し、内部短絡することを防ぐことができ、安全性を向上させることができる。
３−２−２．吸着材、濃縮（生分解性）
本発明に係るセルロース三次元構造体は、シリカ、アルミナ、ゼオライト、プルシアンブルー等の吸着材微粒子を分散、担持させることにより、アンモニア、アルデヒド等の有毒ガス、放射性廃棄物等の有害物質、海水中の有価金属等を吸着回収することが可能である。
また、該セルロース三次元構造体は、分解酵素を用いて簡単に分解可能であることから、吸着回収した物質を必要に応じて簡単に濃縮することができるといった特長も有する。
３−２−３．バイオセンサー
本発明に係るセルロース三次元構造体は、酵素や抗体を担持することによってバイオセンサーとして使用することができる。例えば、グルコースオキシダーゼ等の酵素を担持すればグルコースセンサーとして使用することが可能である。
３−２−４．ガスバリアシート（構造体も含む）
本発明に係るセルロース三次元構造体に無機ナノ材料を緻密に担持させることにより、例えば水蒸気等のガスを遮断するガスバリアシートとすることができる。無機ナノ材料としては、シリカ等のナノ粒子、又はモンモリロナイト等のクレイが挙げられる。
３−２−５．放熱シート
本発明に係るセルロース三次元構造体に高熱伝導率を持つ材料を緻密に担持させることにより、放熱材料として使用することが可能である。高熱伝導率を持つ材料としては、ダイヤモンド、グラフェン、カーボンナノチューブ等の炭素系材料、銀、銅、金、アルミニウム等の金属材料、アルミナ、マグネシア、六方晶窒化ホウ素等の無機材料等が挙げられる。
３−２−６．蓄熱シート
本発明に係るセルロース三次元構造体に蓄熱性を有する材料を分散、担持させることにより、蓄熱材として使用することが可能である。蓄熱材としては、エリスリトール、酢酸ナトリウム３水塩、硫酸ナトリウム１０水塩、パラフィン、Ｆｅ−Ｃｏ合金等の潜熱蓄熱材、その他、顕熱蓄熱材、化学蓄熱材等が挙げられる。潜熱蓄熱材は物質の相転移を利用するものであり、固液相転移を利用する蓄熱材の場合は、液状となった場合に漏洩が生じないように工夫する必要があり、例えば石油樹脂等のカプセル内に包含させる方法がある。
３−２−７．分離精製の基材（カラムの充填剤、電気泳動）
本発明に係るセルロース三次元構造体は、ナノサイズの空間を有しているため、該空間を利用して分離精製カラムや電気泳動の充填剤として用いることが可能である。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、略語は、以下の用語を示す；ＣＤＰ：セロデキストリンホスホリラーゼ、ＣＮＣ：セルロースナノ結晶、ＰＥＧ：ポリエチレングリコール、Ｄｅｘ：デキストラン、ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン。
【実施例１】
【０００７】
スポンジ状セルロース構造体の合成
１．実験方法
１−１．材料
α−Ｄ−グルコース一リン酸二ナトリウムｎ水和物（生化学用）は和光純薬工業株式会社より購入した。Ｄ−（＋）−グルコース（特級、バイオテクノロジーグレード）及びＤ−（＋）−セロビオース（特級）はナカライテスクから購入した。
ＣＤＰは、Ｍ．Ｋｒｉｓｈｎａｒｅｄｄｙら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００２年，４９，１−８に記載の方法と同様の方法により調製した。
Ａｖｉｃｅｌは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。マボヤ由来及び木（Ａｖｉｃｅｌ）由来ＣＮＣは、Ｊ．Ａｒａｋｉら，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ．Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ，１９９８年，１４２，７５−８２に記載の方法と同様の方法により調製した。
ＰＥＧ（分子量１５０００〜２５０００）はナカライテスクから、Ｄｅｘ（分子量９００００〜２１００００）は和光純薬工業株式会社から購入した。ＰＶＰは、重量平均分子量がｃａ．２９，０００のものをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（グッドバッファー）及び３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（バイオテクノロジーグレード）はナカライテスクから購入した。
４ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液はナカライテスクから購入した。
酢酸（スペクトル用特製試薬）及び酢酸ナトリウム（特級）はナカライテスクより購入した。
セルラーゼはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ由来のものをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより購入した。
超純水は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ａ１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製した水を用いた。
４０％重水酸化ナトリウム／重水溶液、グリセロール（特級）、カナマイシン硫酸塩（生化学用）、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（生化学用）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（特級）は和光純薬から購入した。
アクリルアミド（ｆｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ｆｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、ドデシル硫酸ナトリウム（Ａ．Ｃ．Ｓ．ｒｅａｇｅｎｔ）、過硫酸アンモニウム（ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ、ｆｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ｍａｔｒｉｘ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｆｏｒ  ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、重水、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定のキャリブレーションに用いるペプチドスタンダード及び１％トリフルオロ酢酸水溶液及びアセトニトリル（ＰｒｏｔｅｏＭａｓｓＴＭ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＡＬＤＩ−ＭＳ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
カーボンテープ、ドータイトは日新ＥＭから購入した。
ジチオスレイトール（分子生物学研究用特製試薬）、Ｌ（＋）−アスコルビン酸（バイオテクノロジーグレード）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物（特級）、酢酸亜鉛二水和物（特級）、リン酸二水素ナトリウム二水和物（特級）、亜塩素酸ナトリウム（化学用）、水酸化ナトリウム（特級）、水酸化カリウム（特級）、イミダゾール（分子生物学研究用特製試薬）、塩化ナトリウム（分子生物学研究用特製試薬）、アジ化ナトリウム（特級）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（分子生物学研究用特製試薬）、６Ｍ塩酸、１−ブタノール（特級）、グリシン（分子生物学研究用特製試薬）、エタノール（バイオテクノロジーグレード）、エタノール（スペクトル用特製試薬）、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（特級）はナカライテスクから購入した。
ＬＢ−ＢＲＯＴＨ  ＬＥＮＮＯＸ及びＬＢ−ＡＧＡＲ  ＬＥＮＮＯＸはフナコシから購入した。
Ｎｉ−ＮＴＡアガロースゲルはＱＩＡＧＥＮから購入した。
１−２．酵素の活性測定
ＣＤＰの活性は以下のように測定した。１０ｍＭのα−Ｄ−グルコース一リン酸と１０ｍＭのＤ−（＋）−セロビオース、及び所定倍率希釈されたＣＤＰを含む５０ｍＭの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を３７℃でインキュベーションした。ＣＤＰにより生成されるリン酸を定量し、１分間当たり１μｍｏｌのリン酸を遊離する酵素量を１Ｕと定義した際のＵ／ｍＬを求め、酵素活性とした。ＣＤＰの希釈率は、反応時間が１００分の際におけるα−Ｄ−グルコース一リン酸の転化率が１０％以下になるように決定した。
１−３．セルロースの合成方法１：ＣＮＣの共存
モノマーであるα−Ｄ−グルコース一リン酸が２００ｍＭ、プライマーであるＤ−（＋）−グルコースが５０ｍＭ、ＣＤＰが０．０１〜０．４０Ｕ／ｍＬ、ＣＮＣが０．００１〜０．５０ｗ／ｖ％になるように、これらを５００ｍＭの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で混合し、６０℃で３日間反応させた。生成したスポンジ状セルロース構造体を超純水に１週間浸漬させ、精製した。
１−４．セルロースの合成方法２：水溶性高分子の共存
モノマーであるα−Ｄ−グルコース一リン酸が２００ｍＭ、プライマーであるＤ−（＋）−グルコースが５０ｍＭ、ＣＤＰが０．０５〜０．４０Ｕ／ｍＬ、ＰＥＧ、Ｄｅｘ又はＰＶＰが２〜２０ｗ／ｖ％又は５〜２０ｗ／ｖ％になるように、これらを５００ｍＭの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で混合し、６０℃で３日間反応させた。生成したスポンジ状セルロース構造体を超純水に１週間浸漬させ、精製した。
１−５．セルロースの評価方法
スポンジ化の有無をサンプル管転倒試験（サンプル管を上下逆さま置いたときに流れてこないときにスポンジ化したと判断）により評価した。
スポンジ状セルロース構造体の構造は、スポンジ状セルロース構造体を凍結乾燥後に、走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−７５００Ｆ、日本電子）及び全反射赤外分光光度計（ＦＴ／ＩＲ−４１００、日本分光）により評価した。
セルロースの構造及び平均重合度は、スポンジ状セルロース構造体を凍結乾燥した後に、４％重水酸化ナトリウム／重水溶液を加え、核磁気共鳴分光装置（ＤＰＸ−３００、Ｂｒｕｋｅｒ）により評価した。なお、第１−３節で得たセルロースの場合、４％重水酸化ナトリウム／重水溶液を加えた後に、遠心分離により共存するＣＮＣを取り除いた。
スポンジ状セルロースに対し、万能小型試験機（ＡＧＳ−Ｘ，島津製作所）により直径３ｍｍの試験棒を１ｍｍ／ｍｉｎの速度で押込み、スポンジを破断させた。この際、破断した後の様子からセルロースの状態を評価した。
また、スポンジ状セルロース構造体の構造は、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡；ＳＰＭ−９６００、島津製作所）及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計；ＡＸＩＭＡ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、島津製作所）により評価した。
１−６．スポンジ状セルロース構造体の酵素分解
スポンジ状セルロースの酵素分解は、３ｍｇ／ｍＬのセルラーゼを含む５０ｍＭの酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８）に厚さ０．７５ｍｍ、直径８．５ｍｍの円柱状のスポンジ状セルロースを浸漬させて５０℃で反応させ、大きさの経時変化を観察することで評価した。
２．結果
２−１．セルロースの合成方法１：ＣＮＣの共存
図１に、マボヤ由来ＣＮＣ濃度を変化させたときのサンプル管転倒試験の写真を示す。同ＣＮＣの共存により、反応後に溶液の全部若しくは一部は流れなくなった。同ＣＮＣが０．０１ｗ／ｖ％以下では、溶液の一部がスポンジ化したものの不均一であった。一方、同ＣＮＣが０．０２ｗ／ｖ％以上の濃度では、均一にスポンジ化した。
図２に、ＣＤＰ濃度を変化させたときのサンプル管転倒試験の写真を示す。ＣＤＰが０．０２５Ｕ／ｍＬ以上の濃度で、反応後に溶液は流れなくなった。ＣＤＰが０．０２５Ｕ／ｍＬの濃度では、溶液の一部がスポンジ化したものの不均一であった。一方、ＣＤＰが０．０５Ｕ／ｍＬ以上の濃度では、均一にスポンジ化した。
図３に、均一にスポンジ化した試料の走査型電子顕微鏡（２０，０００倍の倍率）の観察結果を示す。スポンジ状セルロース構造体に特長的な網目状の構造（リボン状セルロースのネットワーク）が観察された。
図４に、均一にスポンジ化した試料（マボヤ由来ＣＮＣが０．１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）のＡＦＭ（原子間力顕微鏡）の観察結果を示す。スポンジ状セルロース構造体に特長的なリボンの厚さは、およそ５．７ｎｍであることが分かった。
図５に、均一にスポンジ化した試料の全反射赤外分光光度計による解析結果を示す。ＩＩ型セルロース由来のピークが３４８８ｃｍ−１と３４４５ｃｍ−１付近に観察され、ＩＩ型セルロースを含むスポンジ状セルロース構造体であることが分かった。
図６に、均一にスポンジ化したセルロースの核磁気共鳴分光装置による解析結果を示す。セルロース由来のピークが３〜５ｐｐｍ付近に観察され、還元末端のグルコース単位の１位ＣＨ基とそれ以外のグルコース単位の１位ＣＨ基のプロトン比から求めた平均重合度は９〜１０であった。
図７に、均一にスポンジ化した試料（マボヤ由来ＣＮＣが０．１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計）による解析結果を示す。重合度は６〜１２であった。
図８に、均一にスポンジ化した試料の押し込み破断の測定結果を示す。ＣＤＰ濃度及びマボヤ由来ＣＮＣの濃度が高くなるにつれて、強度が上昇した。
図９Ａ及びＢに、木由来ＣＮＣ濃度を変化させた時のサンプル管転倒試験の写真（図９Ａ）と全反射赤外分光光度計による解析結果（図９Ｂ）を示す。同ＣＮＣの共存により、反応後に溶液の全部若しくは一部は流れなくなった。同ＣＮＣが０．１０ｗ／ｖ％以下では、溶液の一部がスポンジ化したものの不均一であった。一方、同ＣＮＣが０．５０ｗ／ｖ％の濃度では、均一にスポンジ化した。また、全反射赤外分光光度計による解析の結果、ＩＩ型セルロース由来のピークが３４８８ｃｍ−１と３４４５ｃｍ−１付近に観察され、ＩＩ型セルロースを含むスポンジ状セルロース構造体であることが分かった。
図１０に、均一にスポンジ化した試料に、試験棒の押込みによりスポンジが破断した後の写真を示す。試験棒を試料に押込むことにより、絞り出された水（矢印部）が観察されたことから、試料がスポンジ状であることが確認できた。
２−２．セルロースの合成方法２：水溶性高分子の共存
図１１に、ＰＥＧ濃度を変化させたときのサンプル管転倒試験の写真を示す。ＰＥＧが５ｗ／ｖ％の濃度では、溶液がゆっくりと流れた。一方、ＰＥＧが１０ｗ／ｖ％の濃度では、均一にスポンジ化した。ＰＥＧが２０ｗ／ｖ％の濃度では溶液が二相に分離し、下の相のみがスポンジ化した。
図１２に、ＣＤＰ濃度を変化させたときのサンプル管転倒試験の写真を示す。ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬ以上の濃度で、反応後に溶液は流れなくなり、均一にスポンジ化した。
図１３に、均一にスポンジ化した試料の走査型電子顕微鏡の観察結果（左の写真：倍率５０００倍；右の写真：倍率１００００倍）を示す。スポンジ状セルロース構造体に特長的な網目状の構造（ネットワーク）が観察された。
図１４に、均一にスポンジ化した試料のサンプル管転倒試験の写真及び均一にスポンジ化した試料（ＰＥＧが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）の走査型電子顕微鏡の観察結果（左の写真）とαＧ１Ｐの転化率（右のグラフ）を示す。ＰＥＧを用いて調製したスポンジ化した試料においてリボン状の構造体が見られた。また、何も添加物を加えなかった場合のαＧ１Ｐの転化率が３５％程度なのに対して、水溶性高分子を添加した場合は、それよりも低かった。
図１５及び１６に、均一にスポンジ化した試料の走査型電子顕微鏡の観察結果を示す。Ｄｅｘ又はＰＶＰを用いて調製したスポンジ化した試料において網目構造（リボン）が見られた。
図１７に、均一にスポンジ化した試料の全反射赤外分光光度計による解析結果を示す。ＩＩ型セルロース由来のピークが３４８８ｃｍ−１と３４４５ｃｍ−１付近に観察され、ＩＩ型セルロースを含むスポンジ状セルロース構造体であることが分かった。
図１８に、均一にスポンジ化したセルロースの核磁気共鳴分光装置による解析結果を示す。セルロース由来のピークが３〜５ｐｐｍ付近に観察され、還元末端のグルコース単位の１位ＣＨ基とそれ以外のグルコース単位の１位ＣＨ基のプロトン比から求めた平均重合度は９〜１１であった。
図１９に、均一にスポンジ化したセルロースの化学構造・結晶構造解析結果を示す。スポンジ化したセルロースは、結晶性のセルロースオリゴマーで構成されていることが分かった。
図２０に、Ｄｅｘの共存により調製したスポンジ状セルロース構造体のサンプル管転倒試験の写真を示す。Ｄｅｘの共存により、反応後に溶液は流れなくなり、同様にスポンジ化した。
図２１に、Ｄｅｘの共存により調製したスポンジ状セルロース構造体のサンプル管転倒試験の写真を示す。ＣＤＰ濃度が０．２０Ｕ／ｍＬ以上、Ｄｅｘ濃度が５ｗ／ｖ％以上で、均一にスポンジ化した。
図２２及び２３に、均一にスポンジ化した試料の押し込み破断の測定結果を示す。ＣＤＰの濃度が高くなるにつれて、強度が上昇した。またＰＥＧ又はＰＶＰの共存により調製したスポンジ状セルロースと比較して、Ｄｅｘの共存により調製したスポンジ状セルロースの方が、強度が高かった。
図２４に、均一にスポンジ化した試料に、試験棒の押込みによりスポンジが破断した後の写真を示す。試験棒を試料に押込むことにより、絞り出された水が観察されたことから、試料がスポンジ状であることが確認できた。
図２５に、ＤｅｘもしくはＰＥＧの共存により、均一にスポンジ化した試料の全反射赤外分光光度計による解析結果を示す。ＩＩ型セルロース由来のピークが３４８８ｃｍ−１と３４４５ｃｍ−１付近に観察され、ＩＩ型セルロースを含むスポンジ状セルロース構造体であることが分かった。
図２６に、Ｄｅｘの共存により調製した試料（ＣＤＰ濃度０．２０又は０．４０Ｕ／ｍＬに対してＤｅｘ濃度が１０ｗ／ｖ％であるか、又はＤｅｘ濃度２〜２０ｗ／ｖ％に対してＣＤＰ濃度が０．２０Ｕ／ｍＬである条件）のＮＭＲ測定、及び試料（ＣＤＰ濃度０．０５〜０．４０Ｕ／ｍＬに対してＤｅｘ濃度が１０ｗ／ｖ％であるか、又はＤｅｘ濃度２〜２０ｗ／ｖ％に対してＣＤＰ濃度が０．２０Ｕ／ｍＬである条件）のＩＲ測定による解析結果を示す。
図２７に、Ｄｅｘの共存により調製した試料（ＣＤＰ濃度０．２０又は０．４０Ｕ／ｍＬに対してＤｅｘ濃度が１０ｗ／ｖ％であるか、又はＤｅｘ濃度２〜２０ｗ／ｖ％に対してＣＤＰ濃度が０．２０Ｕ／ｍＬである条件）のＮＭＲ測定による解析結果を示す。セルロース由来のピークが３−５ｐｐｍ付近に観察され、還元末端のグルコース単位の１位ＣＨ基とそれ以外のグルコース単位の１位ＣＨ基のプロトン比から求めた平均重合度は８−１０であることが分かった。なお、図２６において、ＣＤＰ濃度が０．０５Ｕ／ｍＬのサンプル、及びＤｅｘ濃度が２ｗ／ｖ％のサンプルはスポンジ化しなかった。また、図２７において、Ｄｅｘ濃度が２ｗ／ｖ％のサンプルはスポンジ化しなかった。
図２８に、均一にスポンジ化した試料（Ｄｅｘが１０ｗ／ｖ％、ＣＤＰが０．２０Ｕ／ｍＬの条件）のＡＦＭ（原子間力顕微鏡）の観察結果を示す。ナノリボンの厚さはおよそ５．４ｎｍであり、重合度９の分子鎖の長さ４．７ｎｍとよく一致した。
２−３．スポンジ状セルロース構造体の酵素分解
図２９に、スポンジ状セルロース構造体を酵素水溶液に浸漬したときの観察結果を示す。時間の経過とともにスポンジの大きさが小さくなり、酵素により分解されることが確認できた。酵素処理後、マボヤ由来ＣＮＣ添加スポンジ状セルロース構造体は４８時間で、ＰＥＧ添加スポンジ状セルロース構造体は３時間でほとんど分解された。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明によれば、足場材などの医療分野、および蓄電池用セパレータなどの環境・エネルギー分野において有用なセルロース三次元構造体を提供することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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