(57)【要約】  本発明は、血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）との結合を阻害するVEGFに対する抗体の提供を目的とする。  本発明は、VEGFとNRP1との結合を阻害する、VEGFに対する抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
【請求項２】
血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）及び血管内皮増殖因子受容体−２（VEGFR2）との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
【請求項３】
血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）及び血管内皮増殖因子受容体−１（VEGFR1）との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
【請求項４】
血管内皮増殖因子（VEGF）と、ニューロピリン−１（NRP1）、血管内皮増殖因子受容体−２（VEGFR2）及び血管内皮増殖因子受容体−１（VEGFR1）との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
【請求項５】
抗体がモノクローナル抗体である請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体が結合する部位に結合する抗体。
【請求項７】
抗体がキメラ抗体、ヒト型化抗体又はイヌ型化抗体である、請求項５又は６に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号１４のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号１６のアミノ酸配列を含むCDR-H2及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR-L1、アミノ酸配列Glu−Gly−Asnを含むCDR-L2及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号１４のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号１６のアミノ酸配列を含むCDR-H2及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、かつ、
配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR-L1、アミノ酸配列Glu−Gly−Asnを含むCDR-L2及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
さらにヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列及びヒトＩｇＧ１軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号３６のアミノ酸配列を含むものであり、かつ、ヒトＩｇＧ１軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号３８のアミノ酸配列を含むものである、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号２４のアミノ酸配列及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖並びに
配列番号２６のアミノ酸配列及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
さらにイヌＩｇＧＢ重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列及びイヌＩｇ軽鎖（κ鎖）定常領域に由来するアミノ酸配列を含む請求項１０に記載の抗体。
【請求項１５】
イヌＩｇＧＢ重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号４０のアミノ酸配列を含むものであり、かつ、イヌＩｇ軽鎖（κ鎖）定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号４２のアミノ酸配列を含むものである、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
配列番号２４のアミノ酸配列及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖並びに
配列番号２６のアミノ酸配列及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体の断片。
【請求項１８】
断片が抗原結合断片である請求項１７に記載の断片。
【請求項１９】
抗原結合断片が単鎖抗体又は二本鎖抗体である、請求項１８に記載の断片。
【請求項２０】
請求項５に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を含む医薬組成物。
【請求項２２】
癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防に使用するための、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防が、血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）との結合の阻害によるものである、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防が血管新生又は血管透過性亢進の阻害によるものである、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
血管新生が病的な血管新生である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
癌が固形癌又は血液腫瘍である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
癌が、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸の癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
VEGF媒介性眼疾患が、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的近視に伴う脈絡膜血管新生、翼状片、ルベオーシス、パンヌス、粘膜皮膚眼症候群及び眼における移植組織の免疫拒絶からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を含む、血管新生阻害剤。
【請求項３０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を含む、試薬。
【請求項３１】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を含む、キット。
【請求項３２】
治療上有効量の請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又はその断片を被験者に投与する工程を含む、癌又はVEGF媒介性眼科疾患の治療又は予防方法。
【請求項３３】
癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法において使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又はその断片。
【請求項３４】
癌又はVEGF媒介性眼疾患を治療又は予防するための医薬の製造において使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）との結合を阻害する抗体及び該抗体を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
新たな血管が形成されること（血管新生）は、生命を維持するうえで必要不可欠なプロセスである。その一方で、病的な血管新生は、多くの疾病に関与することが知られている。【０００３】
血管新生に関わる因子としては、血管内皮増殖因子（VEGF）が知られている（非特許文献１：Ferrara N, et al, Endocr Rev., 1997,18(1):4-25）。VEGFはその受容体と結合することで、細胞内にシグナルを伝達させ、細胞分裂や遊走、分化誘導、血管透過性の亢進、単球やマクロファージの活性化等に関与していることが知られている。【０００４】
VEGFの受容体としては、血管内皮増殖因子受容体−１（VEGFR1（別名Flt-1））、血管内皮増殖因子受容体−２（VEGFR2（別名KDR））、ニューロピリン−１（NRP1）の３種類が報告されている。
NRP1は、およそ130kDaのI型膜貫通型糖タンパク質であり、当初は軸索ガイダンスのメディエータとして報告されたが、脈管発生においても重要な役割を果たすことが報告されている（非特許文献２：Nature,436:193-200, 2005）。また、ノックアウトマウスを用いた研究では、NRP1の機能が喪失することにより、血管リモデリング及び分枝に欠陥がもたらされることが報告されている（非特許文献３：Development, 135, 2479-88, 2008）。さらに、上皮細胞においては、NRP1はVEGFとVEGFR2とが結合することによって生じるシグナルを増強する働きを持っており、細胞の移動や血管形成を亢進されることが報告されている（非特許文献４：Cell, 92, 735-745, 1998）。【０００５】
VEGFは、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PIGF-1、PIGF-2からなるVEGFファミリーを形成している。ヒトVEGF-Aには、VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189、VEGF206等の亜型が知られているが、VEGF165が最も多く存在する。また、VEGF165は、VEGFR1、VEGFR2及びNRP1の全てに結合することが知られている。【０００６】
他方、VEGF165の亜型として、VEGF165のＣ末端の６残基がエクソン8aではなくエクソン8bから翻訳されたVEGF165ｂが報告されている。VEGF165bは、VEGF165とは異なり、血管新生を抑制する、腎臓癌の増殖を抑制するといった、VEGFとは反対の機能を有することが報告されている。VEGF165ｂではVEGF165の160番目のシステイン（Cys）がセリン（Ser）に置換されているため、NRP１に結合する立体構造が形成されず、血管新生の作用が起こらないと考えられている（非特許文献５：Nature Reviews Cancer, 8, 880-887, 2008）。【０００７】
また、VEGFは、正常な血管新生だけではなく、病的な血管新生や血管透過性亢進も誘導することが知られている。病的な血管新生が関与する疾患としては、腫瘍の悪性化、転移や滲出型加齢黄斑変性などが知られている。異常な血管透過性亢進が関与する疾患としては、網膜静脈閉塞症や糖尿病黄斑浮腫などが知られている。これらの疾患の治療には、VEGFの活性を中和する抗体が用いられている。【０００８】
抗VEGF中和抗体は、ヌードマウスにおいて種々のヒト腫瘍細胞株の成長を抑制し、また、虚血性網膜障害のモデルにおいて、眼内の新脈管形成を阻害する（特許文献１：特表２０１１−５２５３５９号公報、特許文献２：特表２００７−５２６７５６号公報）。抗VEGF抗体としては、ベバシズマブ（bevacizumab、アバスチン（登録商標））が知られており、転移性直腸結腸癌（CRC）及び非小細胞肺癌（NSCLC）を処置するために化学療法レジメンとの併用がFDAによって承認されている。【０００９】
また、ベバシズマブのFab（antigen-binding fragment）抗体として、ラニビズマブ（Ranibizumab  ルセンティス（登録商標））が開発されている。ラニビズマブは、2006年にFDAにより加齢黄斑変性治療薬として承認されている。【００１０】
ベバシズマブ及びそのFab抗体は、VEGFと結合することにより、VEGFとVEGFR1及びVEGFR2との結合を阻害することで、血管新生を阻害し、増殖速度の速い癌細胞への栄養供給を低下させる機構で薬効を発揮すると考えられている。しかしながら、ベバシズマブはVEGFとNRP1との結合を阻害しないことが知られている。【００１１】
他方、NRP1に対する抗体の中には、VEGFとNRP1との結合を阻害するモノクローナル抗体が報告されている（特許文献３：特表２０１０−５３０３５９号公報）。これらの抗体は、NRP1に結合することにより、VEGFがNRP1に結合することを阻害し、VEGFの機能を抑制する。【００１２】
VEGFは血管新生及び血管透過性に関わる作用を持つ一方で、癌幹細胞にも影響していることが報告されている。皮膚の扁平上皮癌においては、VEGFがNRP1と結合することで、癌幹細胞の幹細胞性の制御に関与していると報告されている（非特許文献５：Nature, 478, 399-403, 2011）。【００１３】
上記のように、ベバシズマブはVEGFとVEGFR1及びVEGFR2との結合を阻害する抗体であり、VEGFとNRP1との結合を抑制することはできない。また、VEGFに対する抗体の中で、VEGFとNRP1との結合を抑制するような抗体は報告されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特表２０１１−５２５３５９号公報
【特許文献２】特表２００７−５２６７５６号公報
【特許文献３】特表２０１０−５３０３５９号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Endocrine Reviews, 18, 4-25, 1997
【非特許文献２】Nature,436:193-200, 2005
【非特許文献３】Development, 135, 2479-88, 2008
【非特許文献４】Cell, 92, 735-745, 1998
【非特許文献５】Nature Reviews Cancer, 8, 880-887, 2008
【非特許文献６】Nature, 478, 399-403, 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）との結合を阻害する、VEGFに対する新規抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、VEGFとNRP1との結合を阻害する抗体を作製し、当該抗体がVEGFの生理作用を阻害することを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１８】
（１）血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
（２）血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）及び血管内皮増殖因子受容体−２（VEGFR2）との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
（３）血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）及び血管内皮増殖因子受容体−１（VEGFR1）との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
（４）血管内皮増殖因子（VEGF）と、ニューロピリン−１（NRP1）、血管内皮増殖因子受容体−２（VEGFR2）及び血管内皮増殖因子受容体−１（VEGFR1）との結合を阻害する、VEGFに対する抗体。
（５）抗体がモノクローナル抗体である上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体が結合する部位に結合する抗体。
（７）抗体がキメラ抗体又はヒト型化抗体である、上記（５）又は（６）に記載の抗体。
（８）配列番号１４のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号１６のアミノ酸配列を含むCDR-H2及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含む、上記（１）〜(７)のいずれかに記載の抗体。
（９）配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR-L1、アミノ酸配列Glu−Gly−Asnを含むCDR-L2及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、上記（１）〜(７)のいずれかに記載の抗体。
（１０）配列番号１４のアミノ酸配列を含むCDR-H1、配列番号１６のアミノ酸配列を含むCDR-H2及び配列番号１８のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み、かつ、配列番号２０のアミノ酸配列を含むCDR-L1、アミノ酸配列Glu−Gly−Asnを含むCDR-L2及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むCDR-L3を含む、上記（１）〜(７)のいずれかに記載の抗体。
（１１）さらにヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列及びヒトＩｇＧ１軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を含む、上記（１０）に記載の抗体。
（１２）ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号３６のアミノ酸配列を含むものであり、かつ、ヒトＩｇＧ１軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号３８のアミノ酸配列を含むものである、上記（１１）に記載の抗体。
（１３）配列番号２４のアミノ酸配列及び配列番号３６のアミノ酸配列を含む重鎖並びに配列番号２６のアミノ酸配列及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、上記（１２）に記載の抗体。
（１４）さらにイヌＩｇＧＢ重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列及びイヌＩｇ軽鎖（κ鎖）定常領域に由来するアミノ酸配列を含む上記（１０）に記載の抗体。
（１５）イヌＩｇＧＢ重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号４０のアミノ酸配列を含むものであり、かつ、イヌＩｇ軽鎖（κ鎖）定常領域に由来するアミノ酸配列が配列番号４２のアミノ酸配列を含むものである、上記（１４）に記載の抗体。
（１６）配列番号２４のアミノ酸配列及び配列番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖並びに配列番号２６のアミノ酸配列及び配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、上記（１５）に記載の抗体。
（１７）上記（１）〜（１６）のいずれかに記載の抗体の断片。
（１８）断片が抗原結合断片である上記（１７）に記載の断片。
（１９）抗原結合断片が単鎖抗体又は二本鎖抗体である、上記（１８）に記載の断片。
（２０）上記（５）に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（２１）上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の抗体又はその断片を含む医薬組成物。
（２２）癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防に使用するための、上記（２１）に記載の医薬組成物。
（２３）癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防が、血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）との結合の阻害によるものである、上記（２２）に記載の医薬組成物。
（２４）癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防が血管新生又は血管透過性亢進の阻害によるものである、上記（２２）に記載の医薬組成物。
（２５）血管新生が病的な血管新生である、上記（２４）に記載の医薬組成物。
（２６）癌が固形癌又は血液腫瘍である、上記（２２）に記載の医薬組成物。
（２７）癌が、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸の癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（２２）に記載の医薬組成物。
（２８）VEGF媒介性眼疾患が、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的近視に伴う脈絡膜血管新生、翼状片、ルベオーシス、パンヌス、粘膜皮膚眼症候群及び眼における移植組織の免疫拒絶からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（２２）に記載の医薬組成物。
（２９）上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の抗体又はその断片を含む、血管新生阻害剤。
（３０）上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の抗体又はその断片を含む、試薬。
（３１）上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の抗体又はその断片を含む、キット。
（３２）治療上有効量の上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の抗体又はその断片を被験者に投与する工程を含む、癌又はVEGF媒介性眼科疾患の治療又は予防方法。
（３３）癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法において使用するための、上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の抗体又はその断片。
（３４）癌又はVEGF媒介性眼疾患を治療又は予防するための医薬の製造において使用するための、上記（１）〜（１９）のいずれかに記載の抗体又はその断片。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）との結合を阻害する、VEGFに対する新規抗体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】VEGF165とVEGF121について受容体結合ドメインを表した図である。
【図２】本発明の抗体について、VEGFとNRP1との結合阻害能を解析した結果を示す図である。
【図３】本発明の抗体について、VEGFとVEGFR2との結合阻害能を解析した結果を示す図である。
【図４】本発明の抗体について、VEGFとVEGFR1との結合阻害能を解析した結果を示す図である。
【図５】本発明の抗体であるKLHc161の細胞増殖阻害効果を検討した結果を示す図である。
【図６】本発明の抗体であるKLHc161の細胞増殖阻害効果を検討した結果を示す図である。
【図７】本発明の抗体であるKLHc161のin vivoにおける腫瘍増殖阻害効果を検討した結果を示す図である。
【図８】マウス・レーザー誘発脈絡膜血管新生(CNV)モデルを用いた試験のスケジュールを示す図である。
【図９】本発明の抗体であるKLHc161のCNVモデルに対する血管新生阻害効果を検討した結果を示す図である。
【図１０】本発明のヒト型キメラ抗体であるKLHc161HCのin vivoにおける腫瘍増殖阻害効果を検討した結果を示す図である。
【図１１】本発明のイヌ型キメラ抗体であるKLHc161CCのヒト及びイヌVEGFへの交差性を検討した結果を示す図である。
【図１２】本発明のイヌ型キメラ抗体であるKLHc161CCのin vivoにおけるヒト細胞株に対する腫瘍増殖阻害効果を検討した結果を示す図である。
【図１３】本発明のイヌ型キメラ抗体であるKLHc161CCのin vivoにおけるイヌ細胞株に対する腫瘍増殖阻害効果を検討した結果を示す図である。
【図１４】本発明のヒト型キメラ抗体であるKLHc161HCの、VEGF165、VEGF121及びVEGF165bに対する結合能を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる2016年1月6日に出願された日本国特許出願（特願2016-001275号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００２２】
１．概要
本発明は、血管内皮増殖因子（VEGF）とニューロピリン−１（NRP1）との結合を阻害する、VEGFに対する抗体に関する。
抗VEGF中和抗体として知られるベバシズマブは、VEGFとVEGFR1及びVEGFR2との結合を阻害する抗体であり、VEGFとNRP1との結合は阻害しない。また、VEGFとNRP1との結合を阻害する抗体には、NRP1に対する抗体は知られているが、VEGFに対する抗体は知られていない。
これに対し、本発明者はVEGFとNRP1との結合を阻害するVEGFに対する抗体を開発した。また、本発明者は、この抗体がVEGFとNRP1との結合を阻害することに加えて、VEGFと血管内皮増殖因子受容体−２（VEGFR2）との結合及びVEGFと血管内皮増殖因子受容体−１（VEGFR1）との結合を阻害することを見出した。さらに、本発明者は、NRP1がVEGFによる血管新生や癌幹細胞の制御に重要な役割を果たしていることに着目し、VEGFとNRP1との結合を阻害するVEGFに対する抗体が、癌、VEGF媒介性眼疾患、その他病的な血管新生又は血管透過性亢進に起因する疾患の治療又は予防に有効であることを見出した。本発明はこのような知見に基づき完成されたものである。
【００２３】
２．血管内皮増殖因子（VEGF）
VEGFは、血管新生において重要な役割を果たしているタンパク質である。VEGFは、その受容体と結合することで、細胞内にシグナルを伝達し、細胞分裂や遊走、分化誘導、血管透過性の亢進、単球やマクロファージの活性化等に関与している。
【００２４】
本発明において、VEGFとしては、例えば、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PIGF-1、PIGF-2などが挙げられるが、好ましくはVEGF-Aである。
【００２５】
本発明におけるVEGFは、任意の哺乳動物に由来するものであってもよく、そのような哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、イヌ、サル、ヒトが挙げられ、好ましくは、マウス、ラット、イヌ、ヒトである。
【００２６】
また、ヒトVEGF-Aとしては、例えば、165アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF165）、その亜型である121アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF121）、145アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF145）、183アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF183）、189アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF189）、206アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF206）、前記VEGF165とはC末端領域のアミノ酸配列が異なるVEGF（VEGF165b）、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型が挙げられる。本発明において、ヒトVEGF-Aとしては、VEGF121、VEGF165が好ましい。VEGFは染色体６p12にコードされ、mRNAは16,272bpの長さである。VEGFは、エクソン1〜5と、6a、6b、7a、7b、8a及び8bからなる。VEGF165は、NRP1、VEGFR1及びVEGFR2の全てに結合する。
さらに、イヌVEGFとしては、例えば、164アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF164）、120アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF120）、144アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF144）、147アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF147）、162アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF162）、182アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF182）、188アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF188）、205アミノ酸残基からなるVEGF（VEGF205）、前記VEGF164とはC末端領域のアミノ酸配列が異なるVEGF（VEGF164b）、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明において、マウス、ラット、イヌ及びヒトのVEGF、並びにVEGF121及びVEGF165のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２、４、６、８、１０及び１２で表される。また、マウス、ラット、イヌ及びヒトのVEGF、並びにVEGF121及びVEGF165をコードするDNAの塩基（ヌクレオチド）配列は、それぞれ、配列番号１、３、５、７、９及び１１で表される。各アミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれGenBankデータベースにおいて、所定のアクセッション番号（Accession No.）により登録されている。
【００２８】
マウスVEGFのアミノ酸配列：NP_001020421.2（配列番号２）
ラットVEGFのアミノ酸配列：NP_114024.2（配列番号４）
イヌVEGFのアミノ酸配列：NP_001003175 (配列番号６)
ヒトVEGF-Aのアミノ酸配列：NP_001020537.2（配列番号８）
VEGF121のアミノ酸配列：ABO26344.1（配列番号１０）
VEGF165のアミノ酸配列：AAM03108.1（配列番号１２）
マウスVEGFをコードするDNAの塩基配列：NM_001025250.3（配列番号１）
ラットVEGFをコードするDNAの塩基配列：NM_031836.2（配列番号３）
イヌVEGFをコードするDNAの塩基配列：NM_001003175.2  (配列番号５)
ヒトVEGF-AをコードするDNAの塩基配列：NM_001025366.2（配列番号７）
VEGF121をコードするDNAの塩基配列：EF424789.1（配列番号９）
VEGF165をコードするDNAの塩基配列：AF486837.1（配列番号１１）
【００２９】
本発明で用いられるVEGFには、以下の（a）〜（c）のタンパク質が含まれる。
(a) 配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質、
(b) 配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつVEGF受容体と結合する活性を有するタンパク質、
(c) 配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列に対して80％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列を含み、かつVEGF受容体と結合する活性を有するタンパク質。
【００３０】
本発明において、「配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質」には、配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。
また、「配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、
(i) 配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２で表されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜 (iii)の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００３１】
本発明において「VEGF受容体」とは、ニューロピリン−１（NRP1）、血管内皮増殖因子受容体−１（VEGFR1（別名Flt-1））又は血管内皮増殖因子受容体−２（VEGFR2（別名KDR））である。また、「VEGF受容体と結合する活性」とは、VEGF受容体と特異的に結合する活性を意味する。当該結合活性の有無については、公知の方法、例えば免疫沈降法、ウェスタンブロッティング、EIA（enzyme immunoassay）、ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)などの免疫学的手法やプルダウンアッセイ等の方法を用いることにより測定することができる。また、「VEGF受容体と結合する活性」とは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を100としたときと比較して、少なくとも10%以上、20％以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、好ましくは90%以上の活性を有することを意味する。
【００３２】
また、本発明におけるVEGFには、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列のほか、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列と80％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列を有し、かつVEGF受容体と結合する活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列に対して、約80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつVEGF受容体と結合する活性を有するもの（配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列と実質的に同等のアミノ酸配列）も含まれる。相同性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば、日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST等の相同性検索を利用できる。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いた検索を行うこともできる。
【００３３】
上記の変異を有するタンパク質を調製するために、該タンパク質をコードするDNAに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual(4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
【００３４】
３．VEGFに対する抗体
本発明において、VEGFに対する抗体（以下「抗VEGF抗体」とも称する。）とは、上記VEGFと特異的に結合する抗体を意味する。本発明の抗VEGF抗体は、VEGFとNRP1との結合を阻害する。また、本発明の抗VEGF抗体は、VEGFとNRP1及びVEGFR2との結合、VEGFとNRP1及びVEGFR1との結合を阻害する。さらに、本発明の抗VEGF抗体は、VEGFとNRP1、VEGFR2及びVEGFR1との結合を阻害する。
なお、抗VEGF抗体として広く知られているベバシズマブ（アバスチン（登録商標））は、VEGFとVEGFR1及びVEGFR2との結合を阻害するが、VEGFとNRP1との結合は阻害しない。
【００３５】
本発明において、「VEGFとNRP1及びVEGFR2との結合を阻害する」とは、本発明の抗体が、VEGFに結合することにより、VEGFとNRP1との結合及びVEGFとVEGFR2との結合を阻害することを意味する。「VEGFとNRP1及びVEGFR1との結合を阻害する」及び「VEGFとNRP1、VEGFR2及びVEGFR1との結合を阻害する」についても同様である。
本発明において「結合を阻害する」とは、必ずしもVEGFとVEGF受容体（NRP1、VEGFR2又はVEGFR1）との結合を100％阻害することを意味するものではない。本発明の抗体は、VEGFとVEGF受容体との結合を、例えば50％以上、好ましくは60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上阻害する。
結合阻害効果は、結合阻害試験に関する公知の方法、例えば本明細書の実施例２で用いた方法を用いて評価することができる。
【００３６】
本発明の抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００３７】
本発明の抗体は、VEGFに特異的に結合し、VEGFの活性を中和する中和抗体である。本発明において、「特異的に結合する」とは、標的分子には結合する（反応する）が、標的分子以外には実質的に結合しない（反応しない）ことを意味する。また、本発明において、「中和する」とは、少なくとも、VEGFのNRP1、VEGFR2及び／又はVEGFR1に結合する活性を阻害（抑制）することを意味する。結合が特異的か否かであることの確認は、免疫学的手法、例えばELISA法、ウエスタンブロット法又は免疫組織学的染色等によって確認することができる。
【００３８】
以下、抗VEGF抗体の調製方法について説明する。
（１）抗原の調製
VEGFは、本発明の抗体を作製するための免疫原として使用される。
免疫原としてVEGFを用いる場合、VEGFの全長配列のうち一部のアミノ酸配列を含むペプチドを使用することもできる。抗原又は免疫原として用いられるVEGF及び変異の導入方法等の説明については、上記「２．VEGF」に記載した通りである。
【００３９】
VEGFは、マウス、ラット、イヌ、ヒト等の組織や細胞から精製された天然型のVEGFでもよいし、遺伝子工学的に生産されたVEGFでもよい。例えば、VEGFが認められる生体試料を各種界面活性剤、例えばTriton-X、Sarkosylなどを用い、可溶性画分と不溶性画分に分画する。さらに不溶性画分を尿素やグアニジン塩酸などに溶解し、各種カラム、例えばヘパリンカラムあるいは結合樹脂に結合させることによりVEGFを得ることができる。また、抗原として用いるVEGFは、そのアミノ酸配列を指定することにより、固相法などの公知のタンパク質合成法又は市販のタンパク質合成装置を用いて合成することもできる。合成したペプチドは、Keyhole Limpet Hemocyanin（KLH）又はThyroglobulinなどの担体タンパク質と結合させ、免疫原として用いることができる。
【００４０】
（２）ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして作製したVEGF又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体、希釈剤と共に非ヒト哺乳動物、例えばウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヤギ等に投与することにより免疫する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いるときは0.1〜10 mgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（FCA）、フロイント不完全アジュバント（FIA）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは1〜2週間間隔で、2〜10回、好ましくは3〜5回免疫を行う。免疫の間隔は、当業者であれば得られる抗体価を勘案して設定することができる。3〜4回皮下免疫を行った時点で試採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。血清中の抗体価の測定は、ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）、EIA（enzyme immunoassay）、放射性免疫測定法（RIA; radioimmuno assay）等によって行うことができる。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。分離精製は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより、精製することができる。具体的には、目的の抗体を含有する血清を、VEGF以外のタンパク質を結合したカラムに通し、素通り画分を採取することにより、VEGFに対する特異性を向上させたポリクローナル抗体を得ることができる。
【００４１】
（３）モノクローナル抗体の作製
(i) 抗体産生細胞の採取
ポリクローナル抗体の作製と同様に、VEGF又は部分ペプチドをそれ自体で、あるいは担体及び希釈剤と共に非ヒト哺乳動物に投与することにより免疫する。動物１匹当たりの抗原の投与量、用いられるアジュバントの種類、免疫方法、免疫の間隔はポリクローナル抗体の作製と同様である。最終の免疫日から1〜30日後、好ましくは2〜5日後に、抗体価の認められた個体を選択し抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましい。
【００４２】
(ii) 細胞融合
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。融合操作は既知の方法、例えばKohlerらの方法に従い実施できる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばP3-x63-Ag8U．1、SP2/O-Ag14、PAI、P3U1、NSI/1-Ag4-1、NSO/1などのマウスミエローマ細胞株、YB2/0などのラットミエローマ細胞株などが挙げられる。
【００４３】
上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合は、血清を含まないDMEM、RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、1×108〜5×108個の抗体産生細胞と2×107〜10×107個のミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比10：1〜1：1）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量1000〜6000ダルトンのポリエチレングリコール又はセンダイウイルス等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
【００４４】
(iii) ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を、例えば10〜20%のウシ胎児血清含有RPMI-1640培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に限界希釈法で計算上0.3 個／well程度まき、各ウェルにHAT培地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、10日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００４５】
次に、生育してきたハイブリドーマをさらにスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマを培養したウェルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、スクリーニングすることができる。具体的には、96ウェルプレートに抗原を吸着させた後、仔牛血清でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の培養上清を固相化した抗原に37℃で1時間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスIgGを37℃で1時間反応させ、オルトフェニレンジアミンを基質として用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、490nmの波長における吸光度を測定することにより、スクリーニングすることができる。上記測定法により陽性を示したモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法等によりクローニングする。そして、最終的に、VEGFに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリドーマを樹立する。
【００４６】
(iv) モノクローナル抗体の採取
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを10％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば37℃、5% CO2濃度）で7〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物、例えばマウス（BALB/c）の腹腔内にハイブリドーマを約5×106 〜2×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1〜2週間後に腹水を採取する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４７】
本発明の抗体としては、例えば、重鎖可変領域（VH）が、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる重鎖相補性決定領域（CDR）1（CDR-H1）、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる重鎖CDR2（CDR-H2）及び／又は配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる重鎖CDR3（CDR-H3）を含み、かつ／又は軽鎖可変領域（VL）が、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる軽鎖CDR1（CDR-L1）、グルタミン酸（E）-グリシン（G）-アスパラギン（N）からなるアミノ酸配列（「アミノ酸配列EGN」又は「アミノ酸配列Glu−Gly−Asn」とも称する）を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる軽鎖CDR2（CDR-L2）及び／又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる軽鎖CDR3（CDR-L3）を含む抗体が挙げられるが、これらに限定されない。また別の態様において、本発明の抗体としては、例えば、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなり、かつ／又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
（４）遺伝子組換え抗体の作製
本発明の抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗体が挙げられる。遺伝子組換え抗体としては、限定はされないが、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体、イヌ型化抗体等が挙げられる。
【００４９】
キメラ抗体は、異種の動物の免疫グロブリン遺伝子断片を連結して作製された抗体をいう。本発明において、キメラ抗体としては、例えば、ヒト型キメラ抗体、イヌ型キメラ抗体等が挙げられるが、キメラ抗体の可変領域及び定常領域が由来する動物の種類は限定されるものではない。ヒト型キメラ抗体は、例えば、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結（接合）した抗体であり（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851-6855, (1984) 等を参照）、イヌ型キメラ抗体は、例えば、マウス由来抗体の可変領域をイヌ由来の定常領域に連結した抗体である。キメラを作製する場合は、そのように連結した抗体が得られるよう、遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
ここで、マウス由来抗体の可変領域としては、重鎖可変領域が、例えば配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが挙げられ、軽鎖可変領域が、例えば配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるCDRグラフティング（CDR移植）と呼ばれる手法を採用することができる。CDRグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（CDR）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（FR）はヒト由来のものでCDRはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（Nature, 321, 522-525 (1986)；J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)；Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)；特許第2828340号公報等を参照）。ここで、本発明のヒト型化抗体に用いることができるマウス由来のCDRのアミノ酸配列としては、例えば、重鎖可変領域のCDR1〜3（CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3）として、それぞれ配列番号１４、１６及び１８で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが挙げられ、軽鎖可変領域のCDR1〜3（CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3）として、それぞれ配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるもの、グルタミン酸（E）-グリシン（G）-アスパラギン（N）からなるアミノ酸配列（アミノ酸配列Glu−Gly−Asn）を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるもの及び配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるものが挙げられるが、これらに限定されない。
イヌ型化抗体についても、上記のヒト型化抗体の作製方法と同様の手法により作製することができる。
【００５１】
本発明において、キメラ抗体及びヒト型化抗体に用いることができるヒト重鎖定常領域としては、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を含むもの、例えば、配列番号３６で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるヒト重鎖定常領域が挙げられるが、これらに限定されない。また、キメラ抗体及びヒト型化抗体に用いることができるヒト軽鎖定常領域としては、ヒトＩｇＧ１軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を含むもの、例えば、配列番号３８で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるヒト軽鎖定常領域が挙げられるが、これらに限定されない。また、ヒト重鎖定常領域をコードするDNAとしては、例えば、配列番号３５で示される塩基配列を含むか若しくは該塩基配列からなるDNAが挙げられ、ヒト軽鎖定常領域をコードするDNAとしては、例えば、配列番号３７で示される塩基配列を含むか若しくは該塩基配列からなるDNAが挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明において、キメラ抗体及びイヌ型化抗体に用いることができるイヌ重鎖定常領域としては、イヌＩｇＧＢ重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を含むもの、例えば、配列番号４０で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるイヌ重鎖定常領域が挙げられるが、これらに限定されない。また、キメラ抗体及びイヌ型化抗体に用いることができるイヌ軽鎖定常領域としては、イヌＩｇ軽鎖（κ鎖）定常領域に由来するアミノ酸配列を含むもの、例えば、配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなるイヌ軽鎖定常領域が挙げられるが、これらに限定されない。また、イヌ重鎖定常領域をコードするDNAとしては、例えば、配列番号３９で示される塩基配列を含むか若しくは該塩基配列からなるDNAが挙げられ、イヌ軽鎖定常領域をコードするDNAとしては、例えば、配列番号４１で示される塩基配列を含むか若しくは該塩基配列からなるDNAが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明においては、ハイブリドーマ又は当該ハイブリドーマから抽出したDNA若しくはRNAなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、イヌ型化抗体を作製することができる。
さらに、本発明の抗体が融合したタンパク質は、抗体の可変領域とその他のタンパク質を公知の遺伝子組換え方法を用いることにより作製することができる。また、当該融合タンパク質は、モノクローナル抗体と他のタンパク質とをクロスリンカーを用いて架橋することにより作製することができる。
【００５２】
（５）抗体断片の作製
本発明で使用されるVEGFに対する抗体の断片は、VEGFに特異的に結合する。
抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を含むポリペプチドを意味する。抗体の断片としては、抗原結合断片が好ましい。抗原結合断片としては、例えば、単鎖抗体（scFv（single chain Fv）、sc(Fv)2）、二本鎖抗体（Fab、Fab'、ダイアボディ（diabody（dibodies）、dsFv）、F(ab')2などが挙げられるが、これらに限定されない。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Fabは、抗体分子をパパインで処理することにより、F(ab')2は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
scFvの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、scFvを製造することができる。
diabodyの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにscFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、diabodyを製造することができる。
dsFvの場合は、抗体のH鎖V領域及びL鎖V領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、dsFvを製造することができる。
【００５３】
本発明において、重鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列としては、例えば配列番号２３で示される塩基配列を含むか又は該塩基配列からなるものが挙げられ、軽鎖可変領域をコードするDNAの塩基配列としては、例えば配列番号２５で示される塩基配列を含むか又は該塩基配列からなるものが挙げられるが、これらに限定されない。
また、本発明の抗体断片の具体例としては、例えば、重鎖可変領域（VH）が、配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる重鎖CDR1（CDR-H1）、配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる重鎖CDR2（CDR-H2）及び／又は配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる重鎖CDR3（CDR-H3）を含み、かつ／又は軽鎖可変領域（VL）が、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる軽鎖CDR1（CDR-L1）、グルタミン酸（E）-グリシン（G）-アスパラギン（N）からなるアミノ酸配列（アミノ酸配列Glu−Gly−Asn）を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる軽鎖CDR2（CDR-L2）及び／又は配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むか若しくは該アミノ酸配列からなる軽鎖CDR3（CDR-L3）を含む抗体断片が挙げられる。さらに、VHが配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むか該アミノ酸配列からなり、かつ／又はVLが配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含むか該アミノ酸配列からなる抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
CDRを含む抗体断片（ペプチド）は、VH又はVLのCDR（CDR1〜3）の少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のCDRを含む抗体断片は、直接又は適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含む抗体断片は、抗体のVH及びVLのCDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクター又は真核生物用発現ベクターに挿入して、該発現ベクターを原核生物又は真核生物へ導入することにより発現させて、製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）及びtBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
VHのCDR1〜3をコードするDNAとしては、例えば、それぞれ配列番号１３、１５及び１７で示される塩基配列を含むか該塩基配列からなるDNAが挙げられ、VLのCDR1〜3をコードするDNAとしては、例えば、それぞれ配列番号１９で示される塩基配列を含むか該塩基配列からなるDNA、グアニン（G）-アデニン（A）-アデニン（A）-グアニン（G）-グアニン（G）-シトシン（C）-アデニン（A）-アデニン（A）-チミン（T）からなる塩基配列（「塩基配列GAAGGCAAT」とも称する）を含むか該塩基配列からなるDNA及び配列番号２１で示される塩基配列を含むか該塩基配列からなるDNAが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
（６）結合親和性
結合親和性は、結合定数(KA)及び解離定数(KD)により決定することができる。親和性平衡定数(K)はKA/KDの比で表される。その結合親和性は、以下のようにして検出することができる。
結合定数(KA)及び解離定数(KD)は、表面プラスモン共鳴(SPR)を用いて測定することができ、結合率をリアルタイムで検出し、さらにモニタリングする公知の機器及び方法を採用することができる（例えばBiacore（登録商標）-3000 (GE Healthcare社）、ProteON XPR36 (Bio-Rad社)など）。
【００５６】
本発明は、本発明のVEGFに対する抗体が結合する部位に結合する抗体を提供する。具体的には、本発明のVEGFに対する抗体には、(i) VEGFとNRP1との結合を阻害するVEGFに対する抗体、(ii) VEGFとNRP1及びVEGFR2との結合を阻害するVEGFに対する抗体、並びに(iii)VEGFと、NRP1、VEGFR2及びVEGFR1との結合を阻害するVEGFに対する抗体、のいずれかの抗体が結合する部位に結合する抗体が含まれる。
本発明の抗VEGF抗体が結合する部位は、抗原であるVEGFの少なくとも一部の領域であればよく、限定されない。本発明の抗VEGF抗体が結合する部位としては、エクソン１、２、３、４、５、６ａ、６ｂ、７ａ、７ｂ、８ａからなる群から選択される少なくとも１つの領域が挙げられるが、エクソン１〜５の領域が好ましい。当業者であれば、Genbank等の公知の情報に基づいて各種VEGFのエクソン１〜５の領域を特定することができる。例えば、マウス、ラット、イヌ、ヒトのVEGFのエクソン１〜５のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号４３、４４、４５及び４６で示される。
本発明の抗VEGF抗体が結合する部位（領域、エピトープ等）又はこれを含むポリペプチドは、当業者であれば、本明細書の記載及びエピトープマッピングやX線構造解析などの公知の手法に基づいて特定することができる。
また、上記(i)〜(iii)のいずれかの抗体が結合する部位に結合する抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体である場合は、遺伝子組換え抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化抗体、イヌ型化抗体であってもよい。
【００５７】
本発明のVEGFに対する抗体が結合する部位に結合する抗体は、VEGFとの結合について本発明のVEGFに対する抗体と競合する抗体である。当業者であれば、VEGFとの結合について本発明のVEGFに対する抗体と競合する抗体は、本発明の抗体（すなわち上記(i)〜(iii)の抗体）と同等の特異性及び／又は活性を有するものと理解できる。
抗体を用いた競合試験は、一組の抗体が同じ（又は重複する）部位に結合するかどうかを調べるための手法として抗体の技術分野において確立された手法である（Ju-Won Kwak et al., Journal of Immunological Methods 191 (1996) 49-54等を参照）。そして、競合試験において、本発明のVEGFに対する抗体が、試験対象の抗VEGF抗体により結合が競合阻害される場合には、当該試験対象の抗VEGF抗体は、本発明のVEGFに対する抗体が結合する部位に結合する抗体であると同定することができる。また、この試験方法においては、一組の抗体が同じ（又は重複する）部位に結合するかどうかを調べる上で、その部位がどのような構造であるかという情報を必要としない。
すなわち、本発明のVEGFに対する抗体が結合する部位に結合する抗体は、当業者であれば、本発明のVEGFに対する抗体を用いて競合試験を行うことにより、過度の実験を伴うことなく得ることができる。
【００５８】
４．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、上記「３．VEGFに対する抗体」に記載した抗体又はその断片を有効成分として含有し、対象疾患に対する医薬組成物である。本発明の医薬組成物は、対象疾患の予防又は治療に使用され、当該予防又は治療に有効である。
本発明の医薬組成物の対象となる疾患は、VEGFが関与する疾患（症状を含む）であれば限定されるものではなく、このような疾患としては、固形腫瘍、特に問題となる転移性腫瘍を含む癌、VEGF媒介性眼疾患が挙げられ、その他免疫性の疾患も対象となる。
【００５９】
腫瘍の血管構造は、血液を供給することが知られているが、癌幹細胞を支える血管ニッチ環境としても機能し、例えば、NRP1の遺伝子であるNrp1を欠失させるとVEGFの腫瘍形成促進能が阻害されることが示されている(Nature,478,p.399-403,2011)。血管ニッチ環境とは、血液や血管の元となる造血幹細胞の維持や増殖、分化に関わる環境を示しており、癌幹細胞の増殖においても重要な環境であると考えられている。
【００６０】
癌細胞は、正常細胞に比べ、高い増殖力や細胞分裂の回数に制限がない、周辺組織への浸潤や転移を起こすという特徴を持っている。近年、癌組織の中の癌細胞全てがこのような性質を持つのではなく、一部の限られた細胞がこのような性質を持つと考えられるようになった。すなわち、これらの一部の癌細胞は、自らと全く同じ細胞を作り出す自己複製能と、多種類の細胞に分化しうる多分化能という、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞に共通して見られる特徴を持つ細胞であり、癌組織中で自己複製により自分と同じ細胞を維持しながら、分化によって周辺の大多数の癌細胞を生み出すもとになっている癌幹細胞であると考えられている。
【００６１】
癌幹細胞は、癌の再発や転移の主要な原因と考えられており、癌治療において癌幹細胞を標的にすることの重要性が指摘されている。腫瘍組織内における癌幹細胞の増殖を優位に阻害することが可能になれば、効果的に癌細胞全体を殺傷することができる新たな治療法の開発が可能になると考えられる。VEGFとNRP1との結合が、皮膚の扁平上皮癌における癌幹細胞の幹細胞性を制御している可能性が示されていることから、VEGFと結合する抗体の中でNRP1の結合を阻害するような抗体は、ベバシズマブに代表される従来の抗VEGF抗体を凌ぐ治療効果を発揮する可能性がある。
【００６２】
本発明において「癌幹細胞性」とは、癌幹細胞の性質を示す細胞の集団の性質を意味する。すなわち、癌幹細胞性とは、幹細胞に特有の自己複製と多分化能を有し、癌の元になる細胞の性質を持つ性質を意味する。
【００６３】
本発明において、癌としては、脳腫瘍、頚癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸の癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫、メラノーマ、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられる。
【００６４】
本発明において、VEGF媒介性眼疾患とは、眼における病的な血管新生あるいは血管透過性亢進に起因する疾患であり、VEGFが関与する疾患である。すなわち、VEGF媒介性眼疾患は、抗VEGF抗体を用いてVEGFとVEGF受容体との結合を阻害することにより、治療又は予防が可能である。このような疾患としては、例えば、加齢黄斑変性（ポリープ状脈絡膜血管症、網膜血管腫状増殖などの特殊型を含む）、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、血管新生緑内障、網膜静脈閉塞症、未熟児網膜症、病的近視に伴う脈絡膜血管新生、翼状片、ルベオーシス、パンヌス、粘膜皮膚眼症候群、眼における移植組織（例えば角膜組織等）の免疫拒絶などが挙げられる。
【００６５】
本発明において、「病的な血管新生」とは、病的状態又は病的状態を引き起こす状態において、正常な生理的血管新生（血管形成）と比較して、新しい血管が過剰に、不十分に又は不適切に（例えば、血管形成の医学的見地から見て望ましくない位置、時期又は発生において）成長するときに生じる血管新生をいう。
【００６６】
本発明において、「治療」とは、疾患の発症後に本発明の抗体若しくはその断片又はそれを含む医薬組成物（以下「本発明の医薬組成物等」とも称する）を被験者に接触させる（例えば、投与する）ことにより、接触させない場合に比べて、当該疾患の症状を軽減することを意味し、必ずしも疾患の症状を完全に抑制することを意味するものではない。疾患の発症とは、疾患の症状が身体に現れることを意味する。
本発明において、「予防」とは、疾患の発症前に本発明の医薬組成物等を被験者に接触させる（例えば、投与する）ことにより、接触させない場合に比べて、疾患の発症後の症状を軽減することを意味し、必ずしも発症を完全に抑制することを意味するものではない。
【００６７】
本発明の医薬組成物は、本発明のVEGFに対する抗体のほか、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」とは、免疫疾患に対する医薬組成物に適する任意の担体（リポソーム、脂質小胞体、ミセル等）、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、着香料又は甘味料を指す。
【００６８】
本発明の医薬組成物等は、注射剤、凍結乾燥品、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、シロップ剤、坐剤、バップ剤、軟膏剤、クリーム剤、点眼剤等の剤型をとることができる。注射剤などの液体製剤は、使用前に生理食塩水等で溶解する用時調製用粉末（例えば凍結乾燥粉末）の形態であってもよい。
【００６９】
本発明の医薬組成物等は、当業者に既知である任意の手段によって局所的又は全身に投与することができる。本発明の医薬組成物の投与経路としては、経口投与及び非経口投与のいずれも可能であり、非経口投与の場合は、組織内投与（皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、皮内投与、局所投与（経皮投与など）又は経直腸的に投与することができる。本発明の医薬組成物は、これらの投与経路に適した投与形態で投与することができる。
【００７０】
本発明の医薬組成物等の投与量は、被験者の年齢、体重、健康状態、性別、症状、動物種、投与経路、投与回数、剤型などの要因に応じて変化し、具体的な投与手順は当業者により設定することができる。癌の治療のための本発明の抗体の投与量としては、被験者の体重1 kgあたり、例えば0.1mg〜100mg/日、好ましくは1mg〜15mg/日、より好ましくは2-12mg/日であるが、これに限定されない。投与回数としては、一日に１〜５回投与することができる。VEGF媒介性眼疾患の治療のための本発明の抗体の投与量としては、例えば0.01mg〜100mg/眼であり、より好ましくは、0.1mg〜10mg/眼である。投与回数としては、1日〜2ヶ月に1回投与することができるが、これに限定されない。
【００７１】
投与時期は、症状に応じて適宜定めることができ、複数回分を同時に又は時間を置いて別々に投与することができる。また、本発明の医薬組成物は、疾患の発症前に被験者に投与してもよいし、疾患の発症後に投与してもよい。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、哺乳動物を被験者として投与することができる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、ヒトなどが挙げられる。
【００７３】
５．癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法
本発明においては、VEGFに対する抗体若しくはその断片又はこれを含む医薬組成物を被験者に投与することにより、癌又はVEGF媒介性眼疾患を治療又は予防することができる。すなわち、本発明は、治療上有効量の本発明の抗体若しくはその断片又はそれを含む医薬組成物を被験者に投与する工程を含む、癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法を提供する。本発明の抗体若しくはその断片又はそれを含む医薬組成物の治療上の有効量は、被験者の年齢、体重、健康状態、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型などの要因に応じて変化する。当業者であれば、癌又はVEGF媒介性眼疾患を治療、又は予防に必要な治療上の有効量を容易に決定することができる。本発明において、「被験者」には、癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防を必要とする被験者が含まれる。また、「被験者」として治療又は予防の対象となる哺乳動物は、上記の通りである。
本発明の癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法において、「癌」、「VEGF媒介性眼疾患」、「治療」及び「予防」についての説明は上記の通りである。また、本発明の抗体若しくはその断片又はそれを含む医薬組成物の剤形、投与経路、投与量、投与時期などの説明についても上記の通りである。
【００７４】
６．血管新生阻害剤
本発明の抗体は、VEGFとVEGF受容体との結合を阻害するため、当該結合によって生じる血管新生を阻害することができる。すなわち、本発明は、上記「３．VEGFに対する抗体」に記載された抗体又はその断片を有効成分として含む血管新生阻害剤を提供する。
本発明の血管新生阻害剤は、試薬として、あるいは哺乳動物の治療に用いることができ、その投与形態、添加物、投与経路、投与対象、投与量などは、上記「４．医薬組成物」の記載に準じて適宜選択することができる。ただし、本発明の血管新生阻害剤は、本発明の抗体又はその断片のみを含有するものであってもよい。
【００７５】
７．抗体の使用
本発明の抗体又はその断片は、癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法において、あるいは癌又はVEGF媒介性眼疾患を治療又は予防するための医薬の製造において、使用することができる。すなわち、本発明は、癌又はVEGF媒介性眼疾患の治療又は予防方法において使用するための、本発明の抗VEGF抗体又はその断片を提供する。また、本発明は、癌又はVEGF媒介性眼疾患を治療又は予防するための医薬の製造において使用するための、本発明の抗VEGF抗体又はその断片を提供する。さらに、本発明は、血管新生阻害剤の製造において使用するための、抗VEGF抗体又はその断片を提供する。
これらの態様における、「癌」、「VEGF媒介性眼疾患」、「治療」及び「予防」についての説明は上記の通りである。
【００７６】
８．併用療法
本発明の医薬組成物は、他の抗癌剤の少なくとも１種と併用投与するために用いることができる。本発明に使用される抗癌剤としては、例えば、ソラフェニブ（ネクサバール（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、シスプラチン（cDDP）、カルボプラチン（パラプラチン（登録商標））、パクリタキセル（タキソール（登録商標））、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、塩酸ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、エルロチニブ（タルセバ（登録商標））、塩酸イリノテカン（CPT-11）、5-フルオロウラシル（5-FU）などが挙げられる。
【００７７】
本発明の医薬組成物と抗癌剤の少なくとも1種とを併用投与することにより、それぞれ単独で用いるよりもさらに優れた効果が期待される。優れた効果には、治療効果を維持しつつ従来よりも副作用を軽減するという効果が含まれる。
本発明において「併用」とは、本発明の医薬組成物と前記抗癌剤の少なくとも1種とを、同時又は別々に投与することを意味する。「同時」とは、一つの投与スケジュールにおいて同一のタイミングで投与されることを意味し、投与の時分が完全に同一である必要はない。「別々」とは、一つの投与スケジュールにおいて異なるタイミングで投与されることを意味する。
本発明の併用療法に用いる医薬組成物等及び抗癌剤の投与形態、投与経路、投与対象は特に限定されず、上記「４．医薬組成物」の記載に準じて適宜選択することができる。また、併用する薬剤の投与形態又は投与量が互いに異なっていてもよく、その併用する組み合わせにより、適宜調整することができる。
本発明の医薬組成物を他の抗癌剤と併用する場合は、投与量を適宜減らすことも可能である。従って、本発明の医薬組成物と他の抗癌剤との組合せにおいては、
(i) 本発明の医薬組成物の有効量と、他の抗癌剤の有効量、
(ii) 本発明の医薬組成物の有効量と、他の抗癌剤の非有効量、
(iii) 本発明の医薬組成物の非有効量と、他の抗癌剤の有効量、及び
(iv) 本発明の医薬組成物の非有効量と、他の抗癌剤の非有効量
の組合せを採用することができる。
医薬組成物及び抗癌剤の一方又は両者が非有効量の使用態様であっても、併用により薬理効果を発揮することができる場合は、そのような態様により併用投与することができる。
【００７８】
９．試薬、キット
本発明の抗体又はその断片は、VEGFの検出試薬又はキットに含めることができる。すなわち、本発明は、本発明の抗体又はその断片を含む試薬及びキットを提供する。本発明の試薬及びキットは、例えば、VEGFの検出用試薬又はキットとして使用することができる。
本発明の試薬及びキットにおいて、本発明の抗体又はその断片は、例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、そのまま若しくは賦形剤、増量剤、結合剤、滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、公知の添加剤（緩衝剤、等張化剤、キレート剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等が含まれる）などと混合してもよい。
本発明のキットには、本発明の抗体又はその断片のほか、緩衝液、酵素液、二次抗体、希釈用溶液、使用説明書などを含めることもできる。
【００７９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８０】
モノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
CHO細胞で発現させたヒト組換え体VEGF165（以下「VEGF」、「rhVEGF165」又は「rhVEGF」とも称する）（PROSPEC社）を抗原として用いた。VEGFによるマウスへの影響を抑制する目的で、KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）に結合させた抗原を準備した。この場合、VEGFとKLHとが、モル比で4:1となるようPBS(-)(0.01M sodium-phosphate buffer、0.138M NaCl、0.0027M KCl、pH 7.4）に混合した後、1%のグルタルアルデヒドを添加し、1時間、室温で反応させることにより、KLHとrhVEGF165とを架橋した。このように調製したタンパク質を、以下「KLH-VEGF」とも称する。【００８１】
（２）免疫
rhVEGF又はKLH-VEGFをフロイント完全アジュバントと等量混合し、BALB/cマウスの腹腔内に100μl(約40μg/マウス）投与した。約3週間後、同じくrhVEGFをフロイント不完全アジュバントと等量混合し、腹腔内に投与した。この作業を7回〜12回繰り返した後、抗体価の上昇を確認した。力価の上昇したマウスに対しては、最終免疫としてrhVEGFあるいはKLH-VEGFを約40μg静脈内に投与し、その3日後に脾臓を摘出した。【００８２】
（３）細胞融合
単離した脾細胞とマウス骨髄腫細胞株であるP3-x63-Ag8U．1（DSファーマバイオメディカル社）とを5:1の細胞数で混合し、50%ポリエチレングリコール3350（Sigma社）を用いて細胞融合を行った。細胞はHAT培地(1/2×HT(MP社)、1/2×HAT(MP社)、10%FBS、50ng/L mouseI L-6、500mg/mL D-Glucoseを添加したRPMI1640培地）に懸濁し、96穴のマイクロカルチャープレートに分注して培養した。【００８３】
（４）ELISA
ハイブリドーマが増殖してきたウェルの培養上清を回収し、rhVEGF165に反応するモノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマを選択した。rhVEGF165をPBS(-)で希釈し、96ウェルのELISAプレート（Nunc社）に1ウェル当たり1μgとなるよう分注して、4℃で一晩放置することでプレート表面に結合させた。次に、0.05%Tween 20を含むPBS(-)（以下、「PBS-T」と記載する）350μLで3回洗浄した後、1%スキムミルクを含むPBS-Tを300μＬずつ各ウェルに分注し、１時間、室温でブロッキングした。PBS-Tで洗浄後、ハイブリドーマの培養上清をrhVEGF165を固相化したELISAプレートに分注し、1時間、室温で反応させた。PBS-Tで洗浄後、ペルオキシダーゼ（以下、「POD」と記載する）標識抗マウス免疫グロブリン抗体（BETHYL社製）を10000倍希釈したものを各ウェル100μL分注し、1時間、室温で反応させた。同様の洗浄を行った後、1 mg/mL PODとなるよう調製したPOD基質を加え、室温、5分間発色させた。1.5Nの硫酸で反応を停止した後、490nmの吸収をプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて測定した。【００８４】
（５）抗VEGFモノクローナル抗体の樹立
rhVEGF165を固相化していないプレートにおける吸光度を基準として、吸光度が3倍以上であったウェルを陽性として、限界希釈法にてクローニングした。単一コロニーを含むウェルの細胞上清の抗体活性を上記（４）の方法で調べ、選択した後に、培養し、rhVEGF165に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株を樹立した。
【実施例２】
【００８５】
モノクローナル抗体の評価
（１）rhVEGF121と反応するモノクローナル抗体の選別
ヒト293細胞で発現させたrhVEGF（以下「rhVEGF121」とも称する）（HUMANZYME社）を用いて、実施例１の（４）記載の方法で、得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体の評価を行った。VEGF165とNRP1の結合ドメインは、エクソン7に相当するHeparin結合ドメインとエクソン8aに相当するC末端領域であることが知られている。VEGF121は、NRP1結合ドメインの1つである、Heparin結合ドメインを欠いている。一次配列を元に作製した模式図を図１に示した。VEGF121は、VEGFR1、VEGFR2結合ドメインを持ちつつ、NRP1結合ドメインの1つであるHeparin結合ドメインを持たないため、VEGF121に結合する抗体は、VEGF165のエクソン1、2、3、4、5もしくは8aに結合する。NRP1結合ドメインではない領域に結合するにもかかわらず、NRP1とVEGFとの結合を阻害する抗体を取得する目的で、得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体の中で、rhVEGF121に強く反応するクローンを選別した。【００８６】
（２）モノクローナル抗体の精製
上記で選別されたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体に関して、VEGFとVEGFR1、VEGFR2及びNRP1との結合を阻害するか解析するために、当該ハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体の精製を行った。ハイブリドーマ細胞を、10cm dish 1枚に90%コンフルエントとなるよう培養し、HT培地（Invitrogen社製）とEX CELL Sp2/0（ニチレイバイオサイエンス社製）とを1:1で混合した培地でさらに10日間培養を行った。培養上清を回収し、ProteinGカラムを用いて精製した。培養上清20mLに対し、0.1 mLのProtein Gカラム（GEヘルスケア社）を用いた。PBSで平衡化したProtein Gカラムに対し、培養液を1〜3 ml/minの流速で通過させた後、2 mLの洗浄バッファー（25mM Tris-HCl（pH7.4）、140 mM NaCl、10 mM KCl）で洗浄した。次に0.5 mLの溶出バッファー（0.1M Glycine （pH2.5））で抗体タンパク質を溶出させ、3M Tris-HCl（pH7.4）を用いてpH7.0〜7.4の間になるよう中和した。Amicon Ultra 30（Millipore社）を用いて抗体を濃縮するとともにバッファーをPBSに置換した。【００８７】
（３）抗マウスポリクローナル抗体のHRP標識
上記実施例１の（２）で免疫したマウスから抗血清を回収し、抗VEGFポリクローナル抗体を含む分画の調製を行った。ジエチルエーテルを用いて免疫マウスに麻酔を行い、心臓から血液を回収した。回収された血液を12000 rpm、10分間、4℃で遠心分離を行い、血球を含まない上清を抗血清として回収した。この抗血清から、上記（２）と同様の方法でマウスIgG抗体を精製し、HRP Labeling Kit（DOJINDO社）を用いてHRP標識を行った（以下、HRP標識されたポリクローナル抗体を、「抗VEGFポリクローナル抗体−HRP標識」とも称する）。【００８８】
（４）VEGFとNRP1との結合阻害試験
実施例１で得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体に関して、VEGFとNRP1との結合を阻害するか解析を実施した。Recombinant Human Neuropilin-1(R&D Systems社)(以下「NRP1」とも称する)を、PBS(-)で希釈したのち、96ウェルのELISAプレートに1ウェルあたり0.5μgずつ添加し、室温で2時間静置することで、プレート表面上に固相化させた。次に、0.1% Tween 20を含むTBS(50 mM Tris-HCl, pH7.4, 500 mM NaCl)(以下「TBS-T」とも称する)を用いて洗浄した後、2% Bovine Serum Albumin(以下「BSA」とも称する)含有TBS-Tを1ウェルあたり300 μLずつ添加し、室温で1時間静置することにより、ブロッキングした。これとは別に、10 μg/mLとなるようPBS(-)に希釈したRecombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO(Prospec社)(以下「rhVEGF」とも称する)及び34.1 μg/mLとなるようPBS(-)に希釈したモノクローナル抗体（実施例１で得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体）を、各々100 μLずつ混合し、37℃で1時間反応させた。この溶液をNRP1-Fcが固相化されたプレートに添加し、室温で1時間反応させた後、TBS-Tで洗浄した。別のモノクローナル抗体(クローン番号KLHa1527)を、1%BSA含有TBS-Tを用いて、5 μg/mLの濃度に希釈し、1ウェルあたり100 μLずつ添加し、室温で1時間反応させた。TBS-Tで洗浄後、1%BSA含有TBS-Tを用いて5000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体(Bethyl社)を、1ウェルあたり100μLずつ添加し、室温で30分間反応させた。TBS-Tで洗浄後、TMB ELISA Substrates(Invitrogen社)を用いてシグナルを検出した。マウスIgGアイソタイプコントロール(BD社)を用いた吸光度を100%として、モノクローナル抗体の添加による阻害効果を評価した。なお、上記クローン番号KLHa1527は、VEGFと受容体との結合を阻害しないと考えられるため、受容体に結合したVEGFを定量するために用いた。
その結果、VEGFとNRP1との結合を阻害する複数の抗VEGF抗体を得ることができた（図２）。その中でも特にクローン番号KLHc161のモノクローナル抗体は、VEGFとNRP1との結合を著しく阻害した。
すなわち、本実施例において、VEGFとNRP1との結合を阻害する抗VEGF抗体を得ることができた。
また、VEGFとNRP1との結合は癌幹細胞の幹細胞性を制御していると考えられており（Nature, 478, 399-403, 2011）、またNRP1は癌細胞の増殖にも関与していると考えられていることから、VEGFとNRP1との結合を阻害する本発明の抗体は癌の治療又は予防に有用である。【００８９】
（５）VEGFとVEGFR2との結合阻害試験
実施例１で得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体に関して、VEGFとVEGFR2との結合を阻害するか解析を実施した。Recombinant Human VEGF R2/KDR/Flk-1 Fc Chimera (R&D Systems社)(以下「VEGFR2-Fc」とも称する)を、PBS(-)で希釈したのち、96ウェルのELISAプレートに、1ウェルあたり0.5μgずつ添加し、室温で2時間静置することで、プレート表面上に固相化させた。次に、0.1% Tween 20を含むTBS(50 mM Tris-HCl, pH7.4, 500 mM NaCl)(以下「TBS-T」とも称する)を用いて洗浄した後、1%Bovine Serum Albumin(以下「BSA」とも称する)含有TBS-Tを1ウェルあたり300μLずつ添加し、室温で1時間静置することにより、ブロッキングした。これとは別に、5μg/mLとなるようPBS(-)に希釈したRecombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO(Prospec社)(以下「rhVEGF」とも称する)、及び80 μg/mLとなるようPBS(-)に希釈したモノクローナル抗体（実施例１で得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体）を、各々100 μLずつ混合し、37℃で1時間反応させた。この溶液をVEGFR2-Fcが固相化されたプレートに添加し、室温で1時間反応させた後、TBS-Tで洗浄した。Anti-VEGF antibody(HRP)(abcam社)を、1%BSA含有TBS-Tを用いて200倍に希釈し、1ウェルあたり100 μLずつ添加し、室温で1時間反応させた。TBS-Tで洗浄後、TMB ELISA Substrates(Invitrogen社)を用いてシグナルを検出した。マウスIgGアイソタイプコントロール(BD社)を用いた吸光度を100%として、モノクローナル抗体の添加による阻害効果を評価した。
その結果、VEGFとVEGFR2との結合を阻害する複数の抗VEGF抗体を得ることができた（図３）。また、これらの抗VEGF抗体にはVEGFとNRP1との結合を阻害する抗体（例えばクローン番号KLHc161）も含まれることから、この結果は、VEGFとNRP1との結合を阻害し、かつVEGFとVEGFR2との結合も阻害する抗体が得られたことを示す。
すなわち、本実施例において、VEGFとNRP1及びVEGFR2との結合を阻害する抗VEGF抗体を得ることができた。【００９０】
（６）VEGFとVEGFR1との結合阻害試験
実施例１で得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体に関して、VEGFとVEGFR1との結合を阻害するか解析を実施した。Recombinant Human VEGF R1/Flt-1 Fc Chimera (R&D Systems社)(以下「VEGFR1-Fc」とも称する)を、PBS(-)で希釈したのち、96ウェルのELISAプレートに、1ウェルあたり0.3 μgずつ添加し、室温で3時間静置することで、プレート表面上に固相化させた。次に、0.1%Tween 20を含むTBS(50 mM Tris-HCl, pH7.4, 500 mM NaCl)(以下「TBS-T」とも称する)を用いて洗浄した後、1%Bovine SerumAlbumin(以下「BSA」とも称する)含有TBS-Tを1ウェルあたり300 μLずつ添加し、室温で1時間静置することにより、ブロッキングした。これとは別に、1 μg/mLとなるようPBS(-)に希釈したRecombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO(Prospec社)(以下「rhVEGF」とも称する)及び5 μg/mLとなるようPBS(-)に希釈したモノクローナル抗体（実施例１で得られたハイブリドーマ細胞が産生するモノクローナル抗体）を、各々100 μLずつ混合し、37℃で1時間反応させた。この溶液をVEGFR1-Fcが固相化されたプレートに添加し、室温で1時間反応させた後、TBS-Tで洗浄した。Anti-VEGF antibody(HRP)(abcam社)を、1%BSA含有TBS-Tを用いて200倍に希釈し、1ウェルあたり100 μLずつ添加し、室温で1時間反応させた。TBS-Tで洗浄後、TMB ELISA Substrates(Invitrogen社)を用いてシグナルを検出した。マウスIgGアイソタイプコントロール(BD社)を用いた吸光度を100%として、モノクローナル抗体の添加による阻害効果を評価した。
その結果、VEGFとVEGFR1との結合を阻害する複数の抗VEGF抗体を得ることができた（図４）。また、これらの抗VEGF抗体には、VEGFとNRP1及びVEGFR2との結合を阻害する抗体（例えばクローン番号KLHc161）も含まれることから、この結果は、VEGFとNRP1との結合、VEGFとVEGFR2との結合及びVEGFとVEGFR1との結合を阻害する抗体が得られたことを示す。
すなわち、本実施例において、VEGFとNRP1及びVEGFR1との結合を阻害する抗VEGF抗体、並びにVEGFとNRP1、VEGFR2及びVEGFR1との結合を阻害する抗VEGF抗体を得ることができた。
【実施例３】
【００９１】
モノクローナル抗体の細胞増殖阻害効果
取得した抗VEGF抗体からクローン番号KLHc161のモノクローナル抗体を選択し、この抗体が、正常ヒト臍帯静脈由来内皮細胞(以下「HUVEC」とも称する)に対するVEGFの作用を阻害するか解析を行った。HUVEC(BD社)を付属の増殖培地を用いて解凍、培養することで、対数増殖期のHUVECを準備した。試験に用いたHUVECは、継代回数が8回を超えない範囲で使用した。1％Fetal Bovine Serum及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen社)を含むMedium 200(Invitrogen社)を用いて、12ウェルプレートに5000個ずつ細胞を播種し、Recombinant Human Vascular Endothelial Growth Factor, CHO(Prospec社)(以下「rhVEGF」とも称する)を、50 ng/mLの濃度で添加し、培養を継続した。評価に際しては、培養開始と同時に、rhVEGFを50 ng/mLの濃度で添加した細胞群、又は、50 ng/mLの濃度でrhVEGFを含むと同時に2500 ng/mLの濃度で該抗体を添加した細胞群において、rhVEGFを添加後、２、４、６、８日目の細胞数を、血球計算盤を用いて測定した。
結果を図５に示す。該抗体を2500 ng/mLの濃度で添加した細胞群では、rhVEGF及びマウスIgGアイソタイプコントロール(BD社)を添加した陽性対照と比較して、細胞数が少ないことから、該抗体による細胞増殖阻害（抑制）効果が認められた。【００９２】
さらに、上記と同様の方法で対数増殖期のHUVECを準備し、1％Fetal Bovine Serum及び1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Invitrogen社)を含むMedium 200(Invitrogen社)を用いて、96ウェルプレートに10000個ずつ細胞を播種した。Recombinant Human Vascular EndothelialGrowth Factor, CHO(Prospec社)(以下「rhVEGF」とも称する)を、50 ng/mLの濃度で添加し、培養を継続した。rhVEGF添加24時間後の細胞数を、血球計算盤を用いて測定した。
結果を図６に示す。本発明の抗体を2500 ng/mLの濃度で添加した細胞群では、rhVEGF及びマウスIgGアイソタイプコントロール(BD社)を添加した陽性対照と比較して、細胞数が少ないことから、該抗体による細胞増殖阻害効果が認められた。
これらの結果から、本発明の抗体は、細胞増殖阻害効果を有することが示された。
【実施例４】
【００９３】
in vivoにおけるモノクローナル抗体の腫瘍増殖阻害効果
ヒト大腸癌細胞株LS174T細胞を、20匹の免疫不全マウスに、マウスあたり2X106細胞の割合で、右側腹部に皮下注射した。注射翌日に、0.9%NaCl(対照群A)又は抗VEGF抗体(クローン番号KLHc161；対照群B)のいずれかを腹腔内に投与した。対照群Bのマウスには、抗VEGF抗体を、0.5 mg/Kg、2.5 mg/Kg、あるいは5 mg/Kgにて、週2回投与した。また、抗体と同様に、対照群Aのマウスには、0.9%NaClを週に2回投与した。細胞接種後、1、5、9、16及び20日目に、腫瘍を測定し、腫瘍量（Tumor Volume）を、式：V(mm3) = d2X D/2を用いて算出した。
結果を図７に示す。図７においては、A群(0.9%NaCl対照)を(◇)で示し、B群(抗VEGF抗体を接種したマウス)を、(□：0.5 mg/Kg）、(△：2.5 mg/Kg)、(○：5.0 mg/Kg)のいずれかで示した。図７に示されるように、腫瘍量の減少が、抗VEGF抗体を接種したマウスで観察された。
これらの結果から、本発明の抗VEGF抗体は、in vivoにおいても腫瘍の増殖を阻害（抑制）することが示された。また、このことから、本発明の抗体を含む医薬組成物は癌の治療又は予防に非常に有効であることが示された。
【実施例５】
【００９４】
マウス・レーザー誘発脈絡膜血管新生モデルに対する効果の検討
本実施例では、本発明の抗体のVEGF媒介性眼疾患に対する効果をin vivoで検討するため、滲出型加齢黄斑変性(wAMD)モデルであるマウス・レーザー誘発脈絡膜血管新生(CNV)モデルを用いて試験を行った。マウス・レーザー誘発脈絡膜血管新生(CNV)モデルは、脈絡膜にレーザー光凝固を行うことにより炎症を惹起し、脈絡膜から血管新生を誘導することにより作製することができる。【００９５】
１．材料及び方法
（１）抗体
本実施例では、実施例１において作製された抗VEGF抗体を用いた。具体的には、VEGFとNRP1及びVEGFR2との結合を阻害する抗体としてKLHc161を用いた。
（２）滲出型加齢黄斑変性(wAMD)モデルの作製
滲出型加齢黄斑変性(wAMD)モデルであるマウス・レーザー誘発脈絡膜血管新生(CNV)モデルは、8週齢雄C57BL/6Jマウスの眼底後極部において、散在性に太い網膜血管を避けて、4スポット(スポットサイズ50 μm、出力60 mW、凝固時間0.l秒)の光凝固を行うことにより作製した。
（３）群構成
群構成を下記の表に示す。下記表においてPBSは陰性対照である。
【表１】
2017119434.tif 000002
（４）薬物投与（硝子体内投与）
硝子体内投与における抗体を含む組成物の投与量は5μl/eyeであり、投与回数は１回である。
（５）試験スケジュール
試験スケジュールを図８に示す。
（６）評価方法
光凝固14日後に両眼の蛍光眼底造影を行い、光凝固部位の蛍光色素漏出面積を測定することにより、脈絡膜新生血管（CNV）面積を求めた。【００９６】
２．結果
上記CNVモデルにKLHc161を投与した結果、0.3μg/eye投与群において、CNV面積が有意に抑制された（図９）。図９において、#: PBS投与群に対しp<0.05 (Dunnett's multiple comparison test)。
この結果から、本発明の抗体は、in vivoにおいても、血管新生阻害剤として有効であり、また、加齢黄斑変性等のVEGF媒介性眼疾患にも有効であることが示された。
【実施例６】
【００９７】
モノクローナル抗体の可変領域に関する検討
本発明の抗体の可変領域のアミノ酸配列及びこれをコードするヌクレオチド配列について解析を行った。
具体的には、抗VEGF抗体(クローン番号KLHc161)を産生するハイブリドーマの重鎖の可変領域のゲノム配列を、以下のプライマーをそれぞれ用いて配列決定により解析した。
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(センスプライマー)  （配列番号２７） 
5’-CCAGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTTG-3’(アンチセンスプライマー）  (配列番号２８) 
及び 
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(センスプライマー)  （配列番号２９） 
5’-CCAGGGGCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTTG-3’(アンチセンスプライマー）  (配列番号３０)
また、該抗体を産生するハイブリドーマの軽鎖の可変領域のゲノム配列を、以下のプライマーをそれぞれ用いて配列決定により解析した。 
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(センスプライマー)  （配列番号３１）
5’-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTCACT-3’(アンチセンスプライマー）  (配列番号３２) 
及び 
5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(センスプライマー)  （配列番号３３）
5’-GCACCTCCAGATGTTAACTGCTCACT-3’(アンチセンスプライマー）  (配列番号３４) 【００９８】
さらに、該抗体の可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3のアミノ酸配列を、IMGT/V-QUESTソフトウェア、バージョン3.3.0を用いて、「the international ImMunoGeneTics information system (登録商標)」（IMGT/GENE-DB)の免疫グロブリンデータベース上で決定した。
その結果を下記の表に示す。
【表２】
2017119434.tif 000003
【実施例７】
【００９９】
ヒト-IgG1キメラKLHc161抗体(KLHc161HC)の作製
KLHc161抗体を産生するハイブリドーマから、KLHc161抗体の重鎖可変領域遺伝子(塩基配列: 配列番号２３、アミノ酸配列: 配列番号２４) 及び軽鎖可変領域遺伝子(塩基配列: 配列番号２５、アミノ酸配列: 配列番号２６)をクローニングした。次に、これらの遺伝子をそれぞれヒトIgG1の重鎖定常領域遺伝子、あるいは軽鎖(κ鎖)定常領域遺伝子の塩基配列にインフレームで連結した。重鎖可変領域の5’末端塩基配列と制限酵素MluI配列を有するプライマー及び3’末端塩基配列の相補配列と制限酵素NheI配列を有するアンチセンスプライマーを用いてPCRを実施した。次に、軽鎖可変領域遺伝子の5’末端塩基配列とコザック配列と制限酵素BamHI配列とを有するプライマー及び3’末端塩基配列の相補配列と制限酵素BsiWI配列とを有するアンチセンスプライマーを用いてPCRを実施した。得られた増幅産物を制限酵素MluI及びNheI又はBamHI及びBsiWIで処理し、ヒトIgG1重鎖定常領域発現プラスミド(pEF6/G1)のMluI-NheIサイト、あるいはヒトIgG1軽鎖定常領域発現プラスミド(pEF1/G1k)のBamHI-BsiWIサイトに組み込んだ。pEF6/G1は、プラスミドpEF6/myc-His(インビトロジェン社)にヒトIgG1の重鎖定常領域遺伝子(塩基配列: 配列番号３５、アミノ酸配列: 配列番号３６)が、またpEF1/G1-kには、プラスミドpEF1/myc-His(インビトロジェン社)にヒトIgG1の軽鎖定常領域遺伝子(塩基配列: 配列番号３７、アミノ酸配列: 配列番号３８）がクローニングされている。制限酵素NheIによりマウス重鎖可変領域とヒト重鎖定常領域が連結され、制限酵素BsiWI配列によりマウス軽鎖可変領域とヒト軽鎖定常領域が連結された。【０１００】
FreeStyleTM 293 Expression System(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて、プラスミドpEF6/G1-KLHc161及びpEF1/G1-K-KLHc161を293F細胞へ導入し、一過性にヒトIgG1キメラKLHc161抗体(以下「KLHc161HC抗体」とも称する)を発現させた。次に、このキメラ遺伝子を導入した293F細胞の培養上清からProtein G Sepharose 4 Fast Flow(GEヘルスケア・ジャパン社)を用いてKLHc161HC抗体を精製した。アミコンウルトラ-15遠心式フィルターユニット(メルクミリポア社)を用いて溶媒をD-PBS(-)に置換した。精製したKLHc161HC抗体の濃度はNano drop 1000(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を用いて定量した。KLHc161HC抗体のVEGFに対する結合を、上記「モノクローナル抗体の精製(4)ELISA」記載の方法により評価した結果、KLHc161HC抗体がVEGFに特異的に結合することが確認された。
すなわち、本実施例において、本発明の抗VEGF抗体のキメラ抗体を得ることができた。
【実施例８】
【０１０１】
in vivoにおけるヒトIgG1キメラKLHc161抗体（KLHc161HC抗体）の腫瘍増殖阻害効果
ヒト大腸癌細胞株LS174T細胞を、20匹の免疫不全マウスに、マウスあたり2x106細胞の割合で、右側腹部に皮下注射した。注射翌日に、0.9%NaCl(対照群A)又はKLHc161HC抗体(対照群B)のいずれかを腹腔内に投与した。対照群Bのマウスには、KLHc161HC抗体を、0.5 mg/Kg、2.5 mg/Kg、あるいは5 mg/Kgにて、週2回投与した。また、抗体と同様に、対照群Aのマウスには、0.9%NaClを週に2回投与した。細胞接種後、1、5、8、12、15、19及び22日目に、腫瘍径を測定し、腫瘍量(Tumor Volume)を、式：V(mm3) = (d: 短径)2 x (D: 長径)/2を用いて算出した。結果を図１０に示す。図１０においては、A群(0.9%NaCl対照)を(◇)で示し、B群KLHc161HC抗体を接種したマウス)を、(□：0.5 mg/Kg）、(△：2.5 mg/Kg)、(○：5.0 mg/Kg)のいずれかで示した。図１０に示されるように、腫瘍量の著しい減少が、KLHc161HC抗体を接種したマウスで観察された。これらの結果から、本発明のキメラ抗体であるKLHc161HC抗体は、in vivoにおいても腫瘍の増殖を阻害（抑制）することが示された。
このことから、本発明のヒトIgG1キメラ抗VEGF抗体を含む医薬組成物は癌の治療又は予防に非常に有効であることが示された。
【実施例９】
【０１０２】
イヌ-IgGBキメラKLHc161抗体(KLHc161CC抗体)の作製
KLHc161抗体を産生するハイブリドーマから、KLHc161抗体の重鎖可変領域遺伝子(塩基配列: 配列番号２３、アミノ酸配列: 配列番号２４)及び軽鎖可変領域遺伝子(塩基配列: 配列番号２５、アミノ酸配列: 配列番号２６)をクローニングした。次に、これらの遺伝子をそれぞれイヌIgGBの重鎖定常領域遺伝子、あるいは軽鎖(κ鎖)定常領域遺伝子の塩基配列にインフレームで連結した。重鎖可変領域の5’末端塩基配列とコザック配列と制限酵素EcoRV配列を有するプライマー、及び3’末端塩基配列の相補配列と制限酵素NheI配列を有するアンチセンスプライマーを用いてPCRを実施した。次に、軽鎖可変領域遺伝子の5’末端塩基配列と制限酵素EcoRI配列を有するプライマー、及び3’末端塩基配列の相補配列と制限酵素XhoI配列を有するアンチセンスプライマーを用いてPCRを実施した。得られた増幅産物を制限酵素EcoVびNheI、又はEcoRI及びXhoIで処理し、イヌIgGB重鎖定常領域発現プラスミド(pFUSE2ss-CHIg-dGB)のEcoRV-NheIサイト、あるいはイヌＩｇ軽鎖定常領域発現プラスミド(pFUSE2ss-CHIg-dK)のEcoRI-XhoIサイトに組み込んだ。pFUSE2ss-CHIg-dGBは、プラスミドpFUSE2ss-CLIg-hl2(インビボジェン社)にイヌIgGBの重鎖定常領域遺伝子(塩基配列: 配列番号３９、アミノ酸配列: 配列番号４０)が、またpFUSE2ss-CHIg-dKには、プラスミドpFUSE2ss-CLIg-hl2にイヌIgの軽鎖(κ鎖)定常領域遺伝子(塩基配列: 配列番号４１、アミノ酸配列: 配列番号４２)がクローニングされている。制限酵素NheIによりマウス重鎖可変領域とイヌ重鎖定常領域が連結され、制限酵素XhoI配列によりマウス軽鎖可変領域とイヌ軽鎖定常領域が連結された。
【実施例１０】
【０１０３】
イヌ-IgGBキメラKLHc161抗体(KLHc161CC抗体)とヒトVEGF165及びイヌVEGFAへの交差性
作製したイヌ-IgGBキメラ抗体が、ヒトVEGF165及びイヌVEGFA（VEGF164）への結合能を有しているか、ELISAで確認した。ヒトVEGF165もしくはイヌVEGFAをTBSで希釈し、96ウェルのELISAプレート（Nunc社）に1ウェル当たり20 ngとなるよう分注して、37℃で1時間インキュベートすることでプレート表面に結合させた。次に、0.02%Tween 20を含むPBS(-)（以下、「PBS-T」と記載する）300μLで3回洗浄した後、3%スキムミルクを含むPBS(-)を300μLずつ各ウェルに分注し、37℃で1時間、ブロッキングした。PBS-Tで洗浄後、1μg/mlの濃度から段階希釈したイヌ-IgGBキメラKLHc161抗体(KLHc161CC抗体)をVEGFが固相化されたELISAプレートに分注し、37℃で1時間反応させた。PBS-Tで洗浄後、100 ng/mlに調製したペルオキシダーゼ標識抗イヌ免疫グロブリン抗体（BETHYL社製）を各ウェル100μL分注し、37℃で1時間反応させた。同様の洗浄を行った後、TMB Single Solutionを加え、室温で発色させた。1Nの硫酸で反応を停止した後、450nmの吸収をプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて測定した。結果を図１１に示す。KLHc161CC抗体は、イヌVEGFAに対してヒトVEGF165と同程度の親和性で結合することが示された。
このことから、本発明のイヌIgGBキメラ抗VEGF抗体を含む医薬組成物は、イヌにおける疾患の治療又は予防に用いることができることが示された。
【実施例１１】
【０１０４】
in vivoにおけるイヌIgGBキメラKLHc161抗体（KLHc161CC抗体）のヒト癌細胞株に対する腫瘍増殖阻害効果
ヒト大腸癌細胞株LS174T細胞を、20匹の免疫不全マウスに、マウスあたり2 x 106細胞の割合で、右側腹部に皮下注射した。注射翌日に、0.9% NaCl(対照群A)又はKLHc161CC抗体(対照群B)のいずれかを腹腔内に投与した。対照群Bのマウスには、KLHc161CC抗体を、0.5 mg/Kg、2.5 mg/Kg、あるいは5 mg/Kgにて、週2回投与した。また、抗体と同様に、対照群Aのマウスには、0.9%NaClを週に2回投与した。細胞接種後、5、8、12、15、19及び22日目に、腫瘍径を測定し、腫瘍量(Tumor Volume)を、式：V(mm3) = (d: 短径)2 x (D: 長径)/2を用いて算出した。結果を図１２に示す。図１２においては、A群(0.9%NaCl対照)を(■)で示し、B群(抗VEGF抗体を接種したマウス)を、(●：0.5 mg/Kg）、(▲：2.5 mg/Kg)、(△：5.0 mg/Kg)のいずれかで示した。図１２に示されるように、腫瘍量の著しい減少が、KLHc161CC抗体を接種したマウスで観察された。
これらの結果から、本発明のKLHc161CC抗体は、in vivoにおいてもヒトの腫瘍の増殖を阻害（抑制）することが示された。また、このことから、本発明のイヌIgGBキメラ抗VEGF抗体を含む医薬組成物は、癌の治療又は予防に非常に有効であることが示された。
【実施例１２】
【０１０５】
in vivoにおけるイヌIgGBキメラKLHc161抗体（KLHc161CC抗体）のイヌ癌細胞株に対する腫瘍増殖阻害効果
イヌ骨肉腫細胞株D-17細胞を、20匹の免疫不全マウスに、マウスあたり1 x 107細胞の割合で、右側腹部に皮下注射した。平均腫瘍量が150 mm3に達してから、0.9%NaCl(対照群A)又はKLHc161CC抗体(対照群B)のいずれかを腹腔内に投与した。対照群Bのマウスには、KLHc161CC抗体を、0.5 mg/Kg、2.5 mg/Kg、あるいは5 mg/Kgにて、週2回投与した。また、抗体と同様に、対照群Aのマウスには、0.9% NaClを週に2回投与した。細胞接種後、50、54、57、61、64、67、70、74、77及び81日目に、腫瘍径を測定し、腫瘍量(Tumor Volume)を、式：V(mm3) = (d: 短径)2 x (D: 長径)/2を用いて算出した。結果を図１３に示す。図１３においては、A群(0.9% NaCl対照)を(■)で示し、B群(抗VEGF抗体を接種したマウス)を、(●：0.5 mg/Kg）、(▲：2.5 mg/Kg)、(△：5.0 mg/Kg)のいずれかで示した。図１３に示されるように、腫瘍量の著しい減少が、KLHc161CC抗体を接種したマウスで観察された。これらの結果から、本発明のKLHc161CC抗体は、in vivoにおいてもイヌの腫瘍の増殖を阻害（抑制）することが示された。また、このことから、本発明のイヌIgGBキメラ抗VEGF抗体を含む医薬組成物は、イヌの癌の治療又は予防に非常に有効であることが示された。
【実施例１３】
【０１０６】
本発明の抗体の抗原結合部位に関する検討
VEGFにおける本発明の抗体との結合部位を調べるため、下記の通り、ELISA法に基づく結合実験を行った。
本実施例において、抗VEGF抗体としては、実施例7で得られたヒト-IgG1キメラ抗体のうち、VEGFとNRP1との結合を阻害する抗VEGF抗体であるKLHc161HCを含む３つの抗VEGF抗体を選択して用いた。
また、VEGFとしては、(i) NRP1との２つの結合領域のうちの一つ（VEGFのC末端領域であるエクソン8a）を含むVEGF165、(ii) NRP1との２つの結合領域のうちの一つ（ヘパリン結合領域）を欠いたVEGF121、(iii) VEGF165におけるNRP1との結合領域とは異なるアミノ酸配列（エクソン8b）を有するVEGF165b、の３つタイプのVEGFを用いた。
結合実験は、具体的には下記のように実施した。
ヒトVEGF165 (エクソン1、2、3、4、5、7と8aからなる)ヒトVEGF165b (エクソン1、2、3、4、5、7と8bからなる)もしくはヒトVEGF121(エクソン1、2、3、4、5と8aからなる)をTBSで希釈し、96ウェルのELISAプレート（Nunc社）に1ウェル当たり20 ngとなるよう分注して、37℃で1時間インキュベートすることでプレート表面に結合させた。次に、0.02%Tween 20を含むPBS(-)（以下、「PBS-T」と記載する）300μLで3回洗浄した後、3%スキムミルクを含むPBS(-)を300μLずつ各ウェルに分注し、37℃で1時間、ブロッキングした。PBS-Tで洗浄後、1 ug/mlの濃度から段階希釈したKLHc161HC抗体をVEGFが固相化されたELISAプレートに分注し、37℃で1時間反応させた。PBS-Tで洗浄後、100 ng/mlに調製したペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン抗体（BETHYL社製）を各ウェル100μL分注し、37℃で1時間反応させた。同様の洗浄を行った後、TMB Single Solutionを加え、室温で発色させた。1Nの硫酸で反応を停止した後、450nmの吸収をプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）を用いて測定した。
その結果、本発明のVEGFとNRP1との結合を阻害する抗VEGF抗体であるKLHc161HCを含む３つの抗VEGF抗体のいずれもが、上記VEGF165、VEGF121及びVEGF165bの全てに結合した（図１４）。
この結果は、本発明の抗体が、NRP1との結合領域として知られているVEGFのC末端側の２つの領域とは全く異なる、VEGFのN末端側であるエクソン１〜５の領域に結合することを示す。
また、この結果は、驚くべきことに、本発明の抗体が、VEGFのNRP1の結合領域として知られていないエクソン１〜５の領域に結合するにもかかわらず、VEGFとNRP1との結合を阻害することを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明により、VEGFとNRP1との結合を阻害する抗VEGF抗体が提供される。本発明の抗体は、VEGFによる異常な血管新生、血管透過性亢進や細胞増殖を抑制することで、癌、VEGF媒介性眼疾患、その他異常な血管新生あるいは血管透過性亢進が関与する疾患等の治療又は予防に利用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
配列番号１３：合成DNA
配列番号１４：合成ペプチド
配列番号１５：合成DNA
配列番号１６：合成ペプチド
配列番号１７：合成DNA
配列番号１８：合成ペプチド
配列番号１９：合成DNA
配列番号２０：合成ペプチド
配列番号２１：合成DNA
配列番号２２：合成ペプチド
配列番号２３：合成DNA
配列番号２４：合成ペプチド
配列番号２５：合成DNA
配列番号２６：合成ペプチド
配列番号２７〜３４：合成DNA
配列番号３５：合成DNA
配列番号３６：合成ペプチド
配列番号３７：合成DNA
配列番号３８：合成ペプチド
配列番号３９：合成DNA
配列番号４０：合成ペプチド
配列番号４１：合成DNA
配列番号４２：合成ペプチド
配列番号４３〜４６：合成ペプチド
【図１】
2017119434.tif 000004
【図２】
2017119434.tif 000005
【図３】
2017119434.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2017119434.tif 000010
【図８】
2017119434.tif 000011
【図９】
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【図１０】
2017119434.tif 000013
【図１１】
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【図１２】
2017119434.tif 000015
【図１３】
2017119434.tif 000016
【図１４】
2017119434.tif 000017
【配列表】
2017119434000001.app
【国際調査報告】
2017119434.tif 000018
2017119434.tif 000019
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