(57)【要約】  分離された細胞を、そのまま接着させて得た細胞集塊が、心臓への移植後にアディポネクチンを分泌し、心疾患に対し優れた治療効果を有することを見出した。
2017126549.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分離された細胞を接着剤により接着させることにより得られる細胞集塊を含む、心疾患の治療のための移植材料。
【請求項２】
分離された細胞が脂肪組織由来再生細胞、骨髄由来再生細胞、臍帯由来再生細胞、平滑筋由来再生細胞、多能性幹細胞およびそれに由来する再生細胞、血管内皮細胞、ならびに単球からなる群より選択される、請求項１に記載の移植材料。
【請求項３】
分離された細胞が、PPARγアゴニストを作用させた脂肪組織由来再生細胞である、請求項１に記載の移植材料。
【請求項４】
分離された細胞が培養されていないものである、請求項１から３のいずれかに記載の移植材料。
【請求項５】
接着剤がフィブリノーゲンを含む、請求項１から４のいずれかに記載の移植材料。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の移植材料で、心疾患を罹患している対象の心表面を被覆することを特徴とする、心疾患の治療方法。
【請求項７】
心疾患を罹患している対象が、移植材料が由来する細胞を採取した対象である、請求項６に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本発明は、分離された細胞を接着剤により接着させることにより得られる細胞集塊を含む心疾患の治療のための移植材料、および当該移植材料を用いた心疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞は、心筋細胞の不可逆的損傷である（非特許文献1）。虚血性心疾患は、すべての心血管系の死亡原因の50%を占め、鬱血性心不全の主要な原因となっている。鬱血性心不全と診断された患者において、治療により寛解しない場合には、予後は非常に悪く1年死亡率は20%近くになる（非特許文献2）。現在、臨床医が利用可能な治療法の多くは、この急性心筋梗塞の原因を除去し得るが、閉塞発症から再灌流までの時間が不可逆的心筋損傷の程度を決定する（非特許文献3）。心筋形成術が、鬱血性心不全に罹患した患者における左心室（LV）機能を改善するための外科的方法として提唱されているが、心機能や患者予後に対する効果は、満足するものではない（非特許文献4〜7）。臨床的に使用されるどの薬剤や処置も、機能性収縮組織で心筋瘢痕を置換することにおいて効力がなく、正常な心筋細胞を再生するための新規な治療についての需要が存在する。【０００３】
置換治療としての臓器（例えば、心臓、血管など）移植において、同種異系移植片（または同種移植片；allograft）と異種移植片（xenograft）等の外来性組織を使用した場合、免疫拒絶反応が起こることが報告されている（非特許文献8〜11）。例えば、生分解性足場を使用する生体操作した心臓移植片の移植は、心筋層にほとんど付着しないことが原因で、心機能の改善において最小限の利点しか示していない（非特許文献12、13）。一方、全心臓移植はドナー不足の為に心不全に対する第一選択となる治療法とはならない。【０００４】
最近、iPS細胞や骨髄幹細胞（MSC）などの生体物質を利用した治療法として細胞移植が注目されている。これら細胞移植においても、損傷を受けた心筋組織を置換し、心機能を改善する可能性が報告されている。例えば、脂肪組織由来細胞群の調製・移植方法の研究が行われており、そこでは脂肪組織由来細胞が直接心筋内注射や冠動脈注射により投与されている。しかし、十分な治療効果が得られず、これら投与方法では移植後に重大な副作用（不整脈など）を惹起することが報告されている（特許文献1、非特許文献14、15）。【０００５】
そこで、注射以外の投与方法の研究が行われ、温度反応性培養皿上で幹細胞群を培養し、シート状に加工した上で心表面に移植する方法が開発された。この方法では重大な副作用なく細胞を移植することができ、移植細胞から分泌される心筋保護作用・血管新生作用のあるサイトカインのパラクラインによる治療効果が注目された（特許文献2）。また、脂肪細胞から分泌されるサイトカインとして知られるアディポネクチンが、抗アポトーシス、抗炎症、血管新生、抗線維化、抗心筋肥大作用によって傷害後の心筋を保護し、心機能の増悪を抑制する可能性があることも報告された（非特許文献16、17）。さらに、長期にわたり目的の心組織にアディポネクチンを投与するための手段として、ドラッグデリバリーシステム（DDS）としての脂肪細胞移植の研究もなされてきた。その結果、培養により分化させた成熟脂肪細胞から細胞シートを作製し、これを心表面に移植してアディポネクチンを分泌させることにより、心機能を長期にわたり改善させられることが分かってきた（特許文献3）。【０００６】
しかしながら、これら移植細胞シートは作製に多くの時間と労力を要し臨床現場での利用には問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第5210155号
【特許文献２】特許第5103626号
【特許文献３】特許第5661048号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ho  KK  et  al.,  Circulation  1993;88:107-115
【非特許文献２】American  Heart  Association.,  Dallas,  Tex:  American  Heart  Association;  2001
【非特許文献３】Ryan  TJ  et  al.,  J  Am  Coll  Cardiol  1999;34:890-911
【非特許文献４】Corin  WJ  et  al.,  J  Thorac  Cardiovasc  Surg  1992;104:1662-71
【非特許文献５】Kratz  JM  et  al.,  J  Thorac  Cardiovasc  Surg  1994;107:868-78
【非特許文献６】Carpentier  A,  Chachques  JC.,  Lancet.1985;8840:1267
【非特許文献７】Hagege  AA  et  al.,  Lancet  1990;335:1122-4
【非特許文献８】Carrel  A,  J  Exp  Med  1907;9:226-8
【非特許文献９】Carrel  A,  J  Exp  Med  1912;9:389-92
【非特許文献１０】Calne  RY,  Transplant  Proc  1970;2:550
【非特許文献１１】Auchincloss,  Transplantation  1988;46:1
【非特許文献１２】Leor  J  et  al.,  Circulation  2000;102[suppl  III]III-56-III-61
【非特許文献１３】Li  RK  et  al.,  Circulation  1999;100[suppl  II]:II-63-II-69
【非特許文献１４】Yamada  Y  et  al.,  Biochem  Biophys  Res  Commun  2006;342(2):662-670
【非特許文献１５】Sanz-Ruiz  R  et  al.,  J  Cardiovasc  Transl  Res  2008;1(1):55-63
【非特許文献１６】Shibata  R  et  al.,  Circ  J  2009;73(4):608-614
【非特許文献１７】Eren  P  et  al.,  Stem  Cells  2009;27(11):2712-2721
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、心疾患の治療に優れた効果を有する移植材料であって、簡便かつ短時間で調製することが可能な移植材料を提供することにある。さらなる本発明の目的は、当該移植材料を利用した心疾患の治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、生体脂肪組織から分離した再生細胞を、培養を経ずに、そのまま接着させて得た細胞集塊が、心臓への移植後にアディポネクチンを分泌し、心疾患に対し優れた治療効果を有することを見出した。この細胞集塊の作製においては、フィブリノーゲンを細胞の接着材料として利用することにより、簡便に細胞集塊が作成できた。また、細胞集塊の作製において、PPARγアゴニストを接触させた脂肪組織由来間葉系前駆細胞を用いることにより、治療効果をより高めることができた。【００１１】
従来、脂肪細胞や脂肪組織由来の幹細胞から作製した細胞シートを心疾患の治療に応用する場合には、細胞シートを作製する前に、長時間の細胞の培養が必要とされていた。例えば、特許文献3においては、成熟脂肪細胞へと分化させるために、一般的に、播種後分化誘導までに5〜10日間、分化誘導時に36〜60時間、分化誘導後に5〜14日間、所定の培地で培養するとされている。これより短いと得られた細胞のアディポネクチン分泌量が少ないなどの理由で、実施に際して好ましくないとしている（段落0025）。【００１２】
一方、特許文献2の方法においては、成熟脂肪細胞ではなく、脂肪組織に由来する間葉系幹細胞を含む細胞シートを利用することで、心疾患の治療効果を得ている。この方法においても、採取した幹細胞を所定の培地で、一般的に数日間培養し、それを数代継代培養した上で、細胞シートを作製するとしている（段落0013〜0014）。しかしながら、この細胞シート中の間葉系幹細胞は、心臓への移植後に、心筋、血管内皮、および血管平滑筋細胞に分化しており、成熟脂肪細胞への分化やそれに伴うアディポネクチンの分泌については何ら示されていない（段落0017〜0018）。【００１３】
このような状況の下、生体脂肪組織から分離した細胞をそのまま接着させて得た細胞集塊が、心臓への移植後にアディポネクチンを分泌し、優れた心疾患の治療効果を示したことは、極めて驚くべきことである。【００１４】
上記の通り、本発明は、簡便かつ短時間で調製可能であり、かつ、心疾患に対して優れた治療効果を有する移植材料、および当該移植材料を用いた心疾患の治療方法を提供するものであり、より詳しくは以下の発明を提供するものである。【００１５】
[１]  分離された細胞を接着剤により接着させることにより得られる細胞集塊を含む、心疾患の治療のための移植材料。【００１６】
[２]  分離された細胞が脂肪組織由来再生細胞、骨髄由来再生細胞、臍帯由来再生細胞、平滑筋由来再生細胞、多能性幹細胞およびそれに由来する再生細胞、血管内皮細胞、ならびに単球からなる群より選択される、[１]に記載の移植材料。【００１７】
[３]  分離された細胞が、PPARγアゴニストを作用させた脂肪組織由来再生細胞である、[１]に記載の移植材料。【００１８】
[４]  分離された細胞が培養されていないものである、[１]から[３]のいずれかに記載の移植材料。【００１９】
[５]  接着剤がフィブリノーゲンを含む、[１]から[４]のいずれかに記載の移植材料。【００２０】
[６]  [１]から[５]のいずれかに記載の移植材料で、心疾患を罹患している対象の心表面を被覆することを特徴とする、心疾患の治療方法。【００２１】
[７]  心疾患を罹患している対象が、移植材料が由来する細胞を採取した対象である、[６]に記載の治療方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、分離された細胞を、そのまま細胞集塊に加工して移植することができる。しかも、細胞集塊への加工は、フィブリノーゲンなどを利用して簡便に行うことができる。従って、細胞シートを利用する従来の移植治療法と比較して、時間、労力、および費用を大幅に削減することができる。【００２３】
また、本発明の方法は、脂肪組織由来間葉系前駆細胞を冠動脈内や心筋内に注入する従来の移植治療法と比較して、安全性が高く、アディポネクチンの分泌も相まって、心機能改善効果においても優れている。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】図1は、脂肪組織由来再生細胞（ADRCs）の細胞集塊（以下、単に「ADRCs細胞集塊」と称することがある）につき、組織学的検討を行った結果を示す図である。図１Aは、培養後のADRCs細胞集塊の顕微鏡写真（in  vitro評価）である。
【図１Ｂ】図1Bは、ADRCs細胞集塊の培養上澄液中のアディポネクチン（APN）、VEGF、HGF、IL-6を酵素免疫抗体法（ELISA法）により測定した結果を示すグラフ（in  vitro評価）である。
【図１Ｃ】図1Cは、培養後のADRCs細胞集塊の顕微鏡写真（in  vitro評価）である。図中の球形状のものが油滴である。
【図２Ａ】図2Aは、心筋梗塞モデルラットに対するADRCs細胞集塊移植後5日目の摘出心組織の顕微鏡写真（in  vivo評価）である。
【図２Ｂ】図2Bは、心外膜側および心筋梗塞部と細胞集塊間における新生血管の発現を示す顕微鏡写真（in  vivo評価）である。
【図３Ａ】図3は、心筋梗塞モデルラットに対するADRCs細胞集塊移植処置の心機能に及ぼす影響を心臓超音波検査で検討した結果を示す図である。図3Aは、左室駆出率（EF）のグラフである。
【図３Ｂ】図3Bは、左室収縮末期径（LVESd）のグラフである。
【図３Ｃ】図3Cは、左室拡張末期径（LVEDd）のグラフである。
【図３Ｄ】図3Dは、生命予後のグラフである。
【図４Ａ】図4は、慢性心筋梗塞モデルラットに対するADRCs細胞集塊移植、ADRCs心筋内注射、またはADRCs冠動脈内投与の心機能に及ぼす影響を心臓超音波で検討した結果を示す図である。図4Aは、左室駆出率（EF）のグラフである。
【図４Ｂ】図4Bは、左室収縮末期径（LVESd）のグラフである。
【図４Ｃ】図4Cは、左室拡張末期径（LVEDd）のグラフである。
【図５Ａ】図5は、心筋梗塞モデルラットに対するADRCs細胞集塊移植処置の心筋組織に及ぼす影響を検討した結果を示す図である。図5Aは、S群のPicro-Sirius  red染色マクロ像を示す顕微鏡写真である。
【図５Ｂ】図5Bは、A群のPicro-Sirius  red染色マクロ像を示す顕微鏡写真である。
【図５Ｃ】図5Cは、AP群のPicro-Sirius  red染色マクロ像を示す顕微鏡写真である。
【図５Ｄ】図5Dは、S群、A群およびAP群の拡張末期左室壁厚（LVAWD）を測定した結果を示すグラフである。
【図５Ｅ】図5Eは、S群、A群、AP群、ic群およびim群の左室断面積における線維化率を測定した結果を示すグラフである。
【図５Ｆ】図5Fは、S群の梗塞-正常部境界領域におけるvon  Willebrand  factor染色像を示す顕微鏡写真である。
【図５Ｇ】図5Gは、A群の梗塞-正常部境界領域におけるvon  Willebrand  factor染色像を示す顕微鏡写真である。
【図５Ｈ】図5Hは、AP群の梗塞-正常部境界領域におけるvon  Willebrand  factor染色像を示す顕微鏡写真である。
【図５Ｉ】図5Iは、S群、A群、AP群、ic群およびim群の梗塞-正常部境界領域における毛細血管密度を測定した結果を示すグラフである。
【図６Ａ】図6は、慢性心筋梗塞モデルラットに対するADRCs細胞集塊移植処置後8週における心筋組織に及ぼす影響を検討した結果を示す図である。図6Aは、S群のヘマトキシリン・エオジン染色マクロ像を示す顕微鏡写真である。
【図６Ｂ】図6Bは、A群のヘマトキシリン・エオジン染色マクロ像を示す顕微鏡写真である。
【図６Ｃ】図6Cは、AP群のヘマトキシリン・エオジン染色マクロ像を示す顕微鏡写真である。
【図６Ｄ】図6Dは、S群の梗塞-正常部境界領域をPeriodic  acid-Shiff（PAS）染色した結果を示す代表的な組織写真である。
【図６Ｅ】図6Eは、A群の梗塞-正常部境界領域をPeriodic  acid-Shiff（PAS）染色した結果を示す代表的な組織組織写真である。
【図６Ｆ】図6Fは、AP群の梗塞-正常部境界領域をPeriodic  acid-Shiff（PAS）染色した結果を示す代表的な組織写真である。
【図６Ｇ】図6Gは、各実験群の心筋梗塞-正常部境界領域における心筋細胞径を定量した結果を示すグラフである。
【図７Ａ】図7は、ADRCs細胞集塊移植による抗炎症効果を検討した結果を示す図である。図7Aは、梗塞領域および梗塞-正常部境界領域におけるAdiponectin（APN）の転写量を定量化した結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】図7Bは、梗塞領域および梗塞-正常部境界領域におけるAdiponectin  receptor  1（Adipo-R1）の転写量を定量化した結果を示すグラフである。
【図７Ｃ】図7Cは、梗塞領域および梗塞-正常部境界領域におけるAdiponectin  receptor  2（Adipo-R2）の転写量を定量化した結果を示すグラフである。
【図７Ｄ】図7Dは、梗塞領域および梗塞-正常部境界領域におけるT-cadherinの転写量を定量化した結果を示すグラフである。
【図７Ｅ】図7Eは、梗塞領域および梗塞-正常部境界領域におけるvascular  endothelial  growth  factor（VEGF）の転写量を定量化した結果を示すグラフである。
【図７Ｆ】図7Fは、梗塞領域および梗塞-正常部境界領域におけるTumor  necrosis  factor  alpha（TNF-α）の転写量を定量化した結果を示すグラフである。
【図８Ａ】図8は、ADRCsのアディポネクチンの持続的産生能および心筋内生着を示す図である。図8Aは、GFPトランスジェニックLEW/Seaラット由来ADRCs細胞集塊を、LEW/Seaラット左室に移植して1週間後の組織写真で、図中上方の領域がADRCs細胞集塊であり、下方が心臓である
【図８Ｂ】図8Bは、GFPトランスジェニックLEW/Seaラット由来ADRCs細胞集塊を、LEW/Seaラット左室に移植して3週間後の組織をアディポネクチンで免疫染色した結果を示す顕微鏡写真である。色の薄い領域がアディポネクチンである。
【図８Ｃ】図8Cは、GFPトランスジェニックLEW/Seaラット由来ADRCsを左室心筋内注射した結果を示す顕微鏡写真である。
【図８Ｄ】図8Dは、GFPトランスジェニックLEW/Seaラット由来ADRCsを冠動脈内投与した結果を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明は、分離された細胞を接着剤により接着させることにより得られる細胞集塊を含む、心疾患の治療のための移植材料を提供する。
【００２６】
分離された細胞としては、心疾患の治療効果がある限り特に制限はないが、例えば、脂肪組織（例えば、皮下脂肪組織、大網、心外膜下脂肪）由来再生細胞、骨髄由来再生細胞、臍帯由来再生細胞、平滑筋（例えば、血管周囲平滑筋）由来再生細胞、多能性幹細胞（例えば、iPS細胞、ES細胞、Muse細胞）およびそれに由来する再生細胞が挙げられる。また、血管内皮細胞や単球などの分化した細胞を用いることも可能である。
【００２７】
本発明における「再生細胞」は、適用した器官や組織において、それらの構造や機能を回復させる能力を有する細胞を意味する。好ましい態様において、再生細胞は、間葉系幹細胞および間葉系前駆細胞を含む細胞群である。ここで「間葉系幹細胞」は、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞など、間葉系に属する細胞への分化能をもつ幹細胞を意味し、「間葉系前駆細胞」は、間葉系幹細胞から間葉系に属する細胞への分化過程にある細胞を意味する。また、「幹細胞」とは、自己複製能と多分化能を有する細胞を意味する。分離された再生細胞が、間葉系幹細胞や間葉系前駆細胞であるか否かは、所定の細胞表面マーカーにより評価することができる（Lin  K  et  al.,  Cytotherapy  2008;10(4):417-426）。
【００２８】
本発明においては、特に「脂肪組織由来再生細胞」が好適に用いられる。「脂肪組織」は、主として脂肪細胞から構成される結合組織であるが、再生細胞を分離するための脂肪組織としては、特に制限はなく、皮下脂肪組織、大網、心外膜下脂肪などが挙げられる。生体からの脂肪組織の採取は、例えば、小切開創からの吸引や、手術による切除により行うことができる。
【００２９】
細胞を接着させて得た細胞集塊の好ましい態様は、間葉系前駆細胞および間葉系幹細胞を合わせて、少なくとも1％以上、好ましくは5％以上（例えば、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上）含むものである。細胞集塊においては、これら細胞以外に、例えば、分離に際して混入した細胞等が含まれ得る。
【００３０】
組織からの細胞の分離は、例えば、組織を細分化した後、コラゲナーゼ処理し、フィルターによるろ過後、遠心を行うことにより実施することができる。再生細胞を分離するための遠心は、例えば、500〜800Gで、5〜10分の条件で行うことができる。
【００３１】
本発明においては、分離された細胞を接着させて細胞集塊を形成させる。細胞同士を接着させる方法としては、特に制限はないが、フィブリノーゲンを好適に用いることができる。フィブリノーゲンは、トロンビンと混合することにより糊状のフィブリンポリマーとなり、これにより細胞同士を接着させる能力を獲得する。従って、例えば、本実施例に示すように、フィブリノーゲンを添加した細胞の懸濁液とトロンビンを含む溶液とを混合することにより、簡便に細胞同士を接着させることができる。上記混合後に保温を行えば、接着をより早めることもできる。
【００３２】
このように、細胞集塊を形成させるための細胞は、培養する必要がなく、分離した再生細胞を即座に細胞集塊へと加工し、心臓への移植に用いることができる。従って、採取から細胞集塊の作製に至るまでの工程を極めて短時間で行うことができる。例えば、従来の細胞シートを用いる方法では、本発明と異なり、培養によって細胞同士を接着させるため（接着剤は、細胞シートを補強する目的などで使用されている）、生体組織の採取から細胞シートの作製までには、一般に、数日〜数週間程度の期間を要していたが、本発明においては、生体組織の採取から細胞集塊の作製までがわずか数時間であり、大幅に時間を短縮することができる。
【００３３】
細胞集塊の形成においては、PPARγアゴニストを作用させた脂肪組織由来再生細胞を用いることが好ましい。これにより心臓への移植後に、細胞集塊からのアディポネクチンの分泌をさらに増強することができる。PPARγアゴニストとしては、例えば、ピオグリタゾンなどのチアゾリジン系薬剤が挙げられるが、これらに制限されない。脂肪組織由来細胞に作用させる物質としては、上記以外に、例えば、インスリンやステロイドなどの脂肪細胞への分化誘導を促進する物質、アンジオテンシン受容体拮抗剤（ARB）やアンジオテンシン変換酵素阻害剤（ACEi）、VEGFやHGFなどのサイトカインなどが挙げられる。
【００３４】
心疾患の移植治療に用いる場合、細胞集塊は、移植する部位などに応じて、適宜、その大きさや厚さを調整することができるが、通常、直径が5mm〜5cmの円盤状か一辺が5mm〜5cmの四角形であり、十分な強度になるよう、0.5〜2mmの厚さを有することが好ましい。このような細胞集塊とするために、例えば、2x105〜2x107細胞/mlの細胞濃度の懸濁液を用いることができる。
【００３５】
本発明の移植材料においては、上記細胞集塊を含む限り、心疾患に治療に有用なその他の要素がさらに含まれていても良い。その他の要素としては、例えば、異種細胞からなる細胞集塊や細胞シート、細胞外マトリックス、接着因子蛋白質が考えられるが、これらに制限されない。
【００３６】
本発明の移植材料により治療を行う対象となる「心疾患」としては、例えば、心不全、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張相肥大型心筋症、および拡張型心筋症からなる群より選択される疾患または障害を伴う各疾患が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３７】
本発明は、また、上記記載の移植材料で、心疾患を罹患している対象の心表面を被覆することを特徴とする、心疾患の治療方法を提供する。
【００３８】
本発明における治療は、ヒトおよびヒト以外の対象に対して適用することができる。適用対象となる生物は、治療標的としての心臓を有する限り、特に制限はなく、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類が挙げられる。ヒト以外の哺乳類としては、チンパンジーやサルなどの霊長類の他、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの家畜や愛玩動物が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３９】
本発明の移植材料が由来する細胞としては、これら治療の対象となる生物に適合した由来の細胞を用いればよいが、拒絶反応の抑制などの観点から、好ましくは同種由来、特に好ましくは自己由来の細胞が用いられる。従って、特に好ましくは、本発明の移植材料は、細胞を採取した対象に対して移植される。
【００４０】
なお、本来拒絶反応が見込まれる場合でも、免疫抑制剤などの公知の手段を利用することにより、拒絶反応を抑制することも可能である。これにより特定の生物に対して、適用できる細胞の範囲を拡大することが可能である。
【００４１】
本発明の移植材料が移植される部位は、好ましくは心表面である。この場合、本発明の移植材料で心表面を被覆することにより、心疾患の治療を行うことができる。移植材料の心表面への移植においては、例えば、移植材料を病巣（例えば、心筋梗塞巣）に貼付し、プロリン針で外科的に心外膜に固定するか、フィブリン噴霧により心表面に固定すればよい。移植材料は、病変部位（例えば、心筋梗塞部位）とその周囲の正常部位との境界を十分に被覆するように、心表面に配置されることが好ましい。
【００４２】
移植に際しては、必要に応じて、予め、移植対象となる心臓に対して処理を施す。例えば、初回手術であれば、心表面の血液や水分を十分に拭き取ってから移植することが好ましく、再手術の場合は、心表面の瘢痕組織を可及的速やかに除去してから移植することが好ましい。
【００４３】
本発明の治療法においては、本発明の移植材料による治療を他の治療と組み合わせても良い。例えば、慢性心筋梗塞においては、冠動脈バイパス手術、経皮的冠動脈形成術、あるいは左室形成術と併用しても良い。また、急性心筋梗塞においては、冠動脈バイパス手術あるいは経皮的冠動脈形成術と併用しても良い。その他、弁置換術や小児心臓手術と併用することもできる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４５】
[実施例１]
[材料と方法]
(1)脂肪組織由来再生細胞（ADRCs=Adipose  derived  regenerative  cells）の調製
9週齢雌性LEW/Seaラットの両鼡径部から脂肪組織を採取した。脂肪組織を鋏で細かく刻み、0.1%のタイプIIコラゲナーゼ溶液中に懸濁し、37℃温浴槽で１時間震盪した。100μmおよび70μmのメッシュフィルターで濾過し、毎分1800回転10分間遠心分離した。沈査を培養培地（10%ウシ胎児血清、および抗生物質含有D-MEM）に懸濁したものを脂肪組織由来再生（間葉系前駆）細胞群（Adipose-derived  Regenerative  Cells:  ADRCs）とした。これらは脂肪組織由来間葉系幹細胞および前駆細胞群を含んでいる。【００４６】
(2)ADRCs細胞集塊の作製
脂肪組織からのADRCs抽出に引き続き、即座に、1片あたり5x106個のADRCsを含む細胞集塊を作製した。ADRCs細胞懸濁液140μlに対し、フィブリノーゲン60μlを添加してA液とし、また、培養液（10%ウシ胎児血清、抗生物質含有D-MEM）170μLに対し、トロンビン30mlを添加し充分に混和してB液とした。まず培養皿上にA液を滴下し、そこにB液を加え、移植に好適な形状に成形した後に、5%二酸化炭素雰囲気下、37℃の湿潤環境で5〜10分程保温して細胞同士を接着させることでADRCs細胞集塊を作製した。ADRCs細胞集塊の作製後、速やかに梗塞部位に移植した。【００４７】
(3)ADRCs細胞集塊におけるアディポネクチン等のサイトカイン分泌量の測定
ADRCs細胞集塊を24、48、72、96、120、144時間培養した上澄液を採取し、酵素免疫抗体法（ELISA法）により上澄液中のアディポネクチン、VEGF、HGF、IL-6の分泌量をそれぞれ測定した。【００４８】
(4)ADRCs細胞集塊の組織学的検討
ADRCs細胞集塊の凍結切片を作成し、4%パラホルムアルデヒドで固定後、オイルレッドO染色およびアディポネクチン免疫染色を施行した。【００４９】
(5)心不全モデルの作製およびADRCs細胞集塊の移植
心筋梗塞モデルは、7週齢雌性LEW/Seaラットを用い、左冠動脈前下行枝結紮術により作製した。イソフルランの吸入麻酔人工呼吸下（1.5%イソフルラン、換気量4ml、110サイクル/分）に全身麻酔をした後、左開胸を行い、心臓を露出した。左冠動脈起始部から2〜3mmの部位を7-0プロリン糸で結紮した。冠動脈結紮術2週間後、ADRCs細胞集塊を先曲ピンセット上に載せて左室前壁の梗塞部位に滑らせ、静置した。無治療群に対しては、ADRCsを含まない安定化フィブリンを同様な処置で移植した。【００５０】
(6)動物実験プロトコル
冠動脈結紮術2週間後、ラットを5群に分けて以下の処置を行った。すなわちADRCs細胞集塊を左室前壁に移植した群（A群；n=26）、ピオグリタゾン（PGZ,  50mM）含有ADRCs細胞集塊を移植した群（AP群；n=26）、細胞集塊移植を行わない未治療群（S群；n=26）、ADRCsの左室前壁梗塞周囲への直接心筋内移植群（im群；n=6）および経左室冠動脈内移植群（ic群；n=6）である。手術後12日および56日後に組織学的評価、分子学的評価を行った。手術後1週間毎に心臓超音波検査にて心機能評価を行った。【００５１】
(7)心臓超音波検査
イソフルランの吸入麻酔により抑制状態を得た後、14MHzトランスジューサーを備えた心臓超音波システムを用いて、乳頭筋レベルの左室短軸像を得た。左室の拡張末期径（LVEDd）および収縮末期径（LVESd）を測定した。測定は3回以上繰り返し、平均値を求めた。左室駆出率（EF%）は以下の式から算出した。
左室駆出率（EF）={(LVEDV-LVESV)/LVEDV}x100=(SV/LVEDV)x100
左室拡張末期容積(LVEDV)={7.0/(2.4+LVEDd)}xLVEDd3
左室収縮終末期容積(LVESV)={7.0/(2.4+LVEDs)}xLVEDs3
(8)組織学的評価
手術後14日目および56日目において、イソフルランの吸入深麻酔により抑制状態を得た後、拍動下に心臓を摘出した。左室を短軸方向にスライスしてコンパウンドに包理後、液体窒素中で凍結し、組織切片を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色、Picro-Sirius  red染色、マッソン・トリクロム染色、オイルレッドO染色、アディポネクチン免疫染色、SMA免疫染色、von  Willebrand  factor免疫染色を施行した。線維化率をPicro-Sirius  red染色の画像解析により求めた。梗塞周囲境界部位の生細胞サイズはヘマトキシリン・エオジン染色の1視野（400倍）の細胞短径を計測し、検体あたり10視野の平均値を算出した。また、von  Willebrand  factor免疫染色の1視野（400倍）あたりの毛細血管数を計測し、検体あたり5視野の平均値を算出した。【００５２】
(9)分子生物学的検討
移植後14日目および56日目において、摘出した心臓サンプルを梗塞部（scar）、梗塞と正常部位の境界部（border）、非梗塞部（remote）に分けて、それぞれmRNA抽出をした。mRNAから逆転写反応によりcDNAを合成した。定量PCR法により血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、アディポネクチン（APN）、アディポネクチン受容体-1（Adipo-R1）、アディポネクチン受容体-2（Adipo-R2）、T-カドヘリン（CDH-13）、および腫瘍壊死因子（TNF-α）の転写量を定量し、内在性コントロールであるグリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素（GAPDH）の転写量で除算した値を、各検体の正常値との比で表した。【００５３】
(10)統計学的分析
データは平均値±標準誤差で表した。群間の比較はt検定にて行い、P値が0.05未満を有意差ありとした。生存率解析は、カプラン・マイヤー法により生存率を算出し、各実験群について、ログランク検定で有意差を求めた。【００５４】
[結果]
(1)ADRCs細胞集塊のサイトカイン分泌能および脂肪細胞への分化能
ADRCs細胞集塊（図1A）およびピオグリタゾン（PGZ）含有ADRCs細胞集塊を作製し、5%二酸化炭素雰囲気下、37℃の湿潤環境でそれぞれ144時間培養し、サイトカイン分泌能を検討した。ADRCs細胞集塊およびPGZ含有細胞集塊のアディポネクチン（APN）、VEGF、HGF、IL-6の分泌量は培養液においてそれぞれ経時的に増加した。特に144時間培養後のアディポネクチン濃度は、それぞれ21.7±0.9ng/5x106cells/dayおよび51±3.9ng/5x106cells/dayとなり、PGZ含有のADRCs細胞集塊培養液は、ADRCsのみの細胞集塊と比較して有意に高濃度であった（図1B）。【００５５】
またADRCs細胞集塊に対して10〜15%の自己血清または牛胎児血清（FBS）、0.5〜2.0μMのインスリン、0.1〜1.0μMのデキサメタゾン、0.2〜2mMのイソブチルメルキサンチンを作用させ脂肪細胞へ分化誘導したところ、分化誘導後7日でオイルレッドＯ陽性の脂肪細胞が出現した（図1C）。1片の細胞集塊を構成する細胞数は5x106個程度であり、1000μm程度の厚さでオイルレッドO陽性細胞を含んでいたことから、細胞集塊が分化能を維持していることを確認した。【００５６】
(2)心筋表面におけるADRCs細胞集塊の生着
ADRCs細胞集塊の心筋への生着を検討するため、細胞集塊の作製後速やかにラット心筋への移植を行ったところ、数日から1週間後の細胞集塊は心表面に密着していた（図2A）。毛細血管で心筋との連絡が認められた（図2B）ことから、移植した細胞集塊は心筋へ生着することが確認できた。【００５７】
(3)ADRCs細胞集塊の移植が心機能に及ぼす影響
慢性心筋梗塞モデルラットに対するADRCs細胞集塊移植後28日の心機能評価結果を図2に示した。心臓超音波検査における左室駆出率（EF）、左室収縮末期径（LVESd）、左室拡張期径（LVEDd）、拡張末期左室壁厚（LVAWD）を心機能の評価指標とした。モデルラットは冠動脈結紮術2週間後、5群に分けて以下の処置後に、試験を行った。すなわちADRCs細胞集塊を左室前壁に移植した群（A群）、ピオグリタゾン（PGZ）含有ADRCs細胞集塊を左室前壁に移植した群（AP群）、細胞集塊移植を行わない未治療群（S群）、ADRCs細胞の左室前壁梗塞周囲への直接心筋内移植群（im群）、および経左室冠動脈内移植群（ic群）である。【００５８】
心臓超音波検査より、A群およびAP群のEFの値はS群と比して有意に大きく、左室収縮能の改善を認めた。さらにAP群は、移植後8週においてA群より優位にEFの改善を示した（図3A）。またA群およびAP群におけるLVEDdの値はS群と比して有意な差は認めず（図3C）、LVESdの値は小さかった（図3B）ことから、移植により左室収縮能の改善を認めた。また、各群の生存率について評価したところ、A群およびAP群はS群と比して有意（p=0.0424）に生存率が高かった（図3D）。以上の結果から、ADRCs細胞集塊の移植は心筋梗塞において優れた治療効果を有することが認められた。【００５９】
さらに、ADRCs細胞集塊の移植とは異なる投与方法である、ADRCs細胞の左室前壁梗塞周囲への直接心筋内移植群（im群）および経左室冠動脈内移植群（ic群）との比較試験により、A群およびAP群のEFの値はS群、im群、ic群と比して有意に大きく（図4A）、LVESdの値はS群、im群、ip群と比して小さく（図4B）、LVEDdに有意差は認めなかった（図4C）。以上の結果から、ADRCs細胞集塊の移植が心筋梗塞の治療においてADRCs細胞を心筋内あるいは冠動脈内に直接投与する方法より優れた治療効果を有することが認められた。【００６０】
(4)ADRCs細胞集塊の移植が心筋組織に及ぼす影響
心筋梗塞モデルラットに対するADRCs細胞集塊移植後、14日目および56日目に、組織学的解析を施行した。未治療であるS群は強度の左室前壁菲薄化を認めた（図5A）が、A群（図5B）およびAP群（図5C）はS群、im群、ic群とに比して左室前壁が厚く、左室前壁組織が維持されていることを認めた（図5D）。梗塞サイズを定量したところ、統計学的有意差はないもののA群およびAP群における梗塞サイズはS群、im群、ic群と比して小さい傾向を示した（図5E）。さらに、梗塞部周縁の毛細血管密度を測定したところA群（図5G）およびAP群（図5H）ではS群（図5F）、im群、ic群と比して有意に高い毛細血管密度を示した（図5I）。【００６１】
(5)ADRCs細胞集塊の心保護効果
心筋梗塞モデルラットに対するADRCs細胞集塊移植14日および56日後、組織学的解析を施行した。各群の心筋梗塞部周縁における細胞径をヘマトキシリン・エオジン染色（図6A〜C）およびPAS染色（図6D〜F）により検出したところ、A群およびAP群における細胞短径はS群、im群、ic群と比して有意に低値であった（図6G）。以上の結果より、ADRCs細胞集塊移植は、残存心筋細胞に対し抗アポトーシスなどの保護作用を有する可能性が示唆された。【００６２】
(6)ADRCs細胞集塊の抗アポトーシス・抗炎症効果
ADRCs細胞集塊移植後56日の心筋組織における心筋保護・抗炎症効果に関する検討結果を図7に示す。各群の梗塞部周縁の血管再生および心筋保護サイトカイン転写程度を評価したところ、AP群では他群と比して梗塞部周縁におけるアディポネクチン（APN）の転写量は有意に高かった（図7A）。またA群においても、S群よりも、APNの転写量は有意に高かった（図7A）。その他のAdipo-R1、Adipo-R2、CDH-13、VEGF、およびTNF-αの転写量には有意差を認められなかった（図7B〜F）。以上より、ADRCs細胞集塊にPGZを添加することにより、心筋梗塞後の心機能改善効果がさらに増強されている可能性が示唆された。【００６３】
(7)心筋梗塞部におけるADRCs細胞集塊の生着およびAPNの産生
心筋梗塞モデルラットの左室前壁に移植されたADRCs細胞集塊は、移植後28日の左室前壁瘢痕領域に良好に生着しており（図8A）、移植部位でもアディポネクチン陽性であった（図8B）。生着した細胞集塊は持続的にアディポネクチンを分泌していたことが示唆された。また、比較対象とした、ADRCsの心筋内（図8C）および冠動脈内（図8D）移植を行った群においても移植後3日で心筋内に生着を認めた。【００６４】
[実施例２]
ADRCsの構成細胞を分析するためにフローサイトメトリー(FACS)を用いて細胞表面抗原を解析した。実施例１に示す方法によって、脂肪組織から抽出した新鮮なADRCsをFACS用染色液(5%ウシ胎児血清で補完したリン酸緩衝整理食塩水)に懸濁した。表面抗原マーカーとしてのCD11b、CD31、CD45、CD73、CD90に対するマウス抗体およびそれに対応するマウスIgG1アイソタイプを陰性マーカーとして用いた。細胞を室温にて30分間染色し、洗浄した後にフローサイトメトリー（BD  FACS  cant  II  instrument(BD  Biosciences,  San  Jose,  CA)）を用いて解析した。【００６５】
その結果、ADRCの構成細胞は主に間葉系幹細胞／間葉系前駆細胞(CD90+,  CD31-,  CD45-,  CD73+)、内皮細胞(CD90+,  CD31+,  CD45-)、血管平滑筋(CD90-,  CD31-,  CD45-)、血球系細胞(CD90+/-,  CD31-,  CD45+)から構成されていた。そのおおよその構成率は表１に示す通りであり、特に脂肪組織由来間葉系幹細胞は6.5%含まれていた。【００６６】
【表１】
2017126549.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００６７】
上記の通り、本発明の移植材料は、分離された細胞を接着させた細胞集塊を含むものであり、簡便かつ短時間で作製することができる。しかも、アディポネクチンを分泌させ、優れた心疾患の治療効果を有する。従って、本発明は、心疾患を中心とした移植医療の発展に大きく貢献しうるものである。
【図１Ａ】
2017126549.tif 000004
【図１Ｂ】
2017126549.tif 000005
【図１Ｃ】
2017126549.tif 000006
【図２Ａ】
2017126549.tif 000007
【図２Ｂ】
2017126549.tif 000008
【図３Ａ】
2017126549.tif 000009
【図３Ｂ】
2017126549.tif 000010
【図３Ｃ】
2017126549.tif 000011
【図３Ｄ】
2017126549.tif 000012
【図４Ａ】
2017126549.tif 000013
【図４Ｂ】
2017126549.tif 000014
【図４Ｃ】
2017126549.tif 000015
【図５Ａ】
2017126549.tif 000016
【図５Ｂ】
2017126549.tif 000017
【図５Ｃ】
2017126549.tif 000018
【図５Ｄ】
2017126549.tif 000019
【図５Ｅ】
2017126549.tif 000020
【図５Ｆ】
2017126549.tif 000021
【図５Ｇ】
2017126549.tif 000022
【図５Ｈ】
2017126549.tif 000023
【図５Ｉ】
2017126549.tif 000024
【図６Ａ】
2017126549.tif 000025
【図６Ｂ】
2017126549.tif 000026
【図６Ｃ】
2017126549.tif 000027
【図６Ｄ】
2017126549.tif 000028
【図６Ｅ】
2017126549.tif 000029
【図６Ｆ】
2017126549.tif 000030
【図６Ｇ】
2017126549.tif 000031
【図７Ａ】
2017126549.tif 000032
【図７Ｂ】
2017126549.tif 000033
【図７Ｃ】
2017126549.tif 000034
【図７Ｄ】
2017126549.tif 000035
【図７Ｅ】
2017126549.tif 000036
【図７Ｆ】
2017126549.tif 000037
【図８Ａ】
2017126549.tif 000038
【図８Ｂ】
2017126549.tif 000039
【図８Ｃ】
2017126549.tif 000040
【図８Ｄ】
2017126549.tif 000041
【国際調査報告】
2017126549.tif 000042
2017126549.tif 000043
2017126549.tif 000044
2017126549.tif 000045