(57)【要約】  電子移動特性が改変されたグルコースデヒドロゲナーゼ、及びそれを用いたグルコース測定方法および測定用キットを提供する。  配列番号１と相同性を有するグルコースデヒドロゲナーゼの、配列番号１における４５７〜４７７位に対応する領域に少なくとも１つ、２つ又は３つのアミノ酸置換、例えば極性アミノ酸又はアラニンでのアミノ酸置換を有するグルコースデヒドロゲナーゼ並びにこれを用いたグルコース測定方法、測定試薬キット及びセンサー。  本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、電子移動特性が改変されており、より低濃度のメディエーター存在下で、またはメディエーター不在下で、グルコース測定を行うことができ、例えば連続グルコース測定に用いることができる。
2017073786.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、酵素から電極へ直接電子移動が可能な、シトクロムドメインを有しないグルコースデヒドロゲナーゼ変異体、又は
配列番号１の４５７位〜４７７位からなる領域若しくはこれに対応する領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ、電子移動特性が改変された、シトクロムドメインを有しないグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
【請求項２】
酵素から電極へ直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ変異体が、配列番号１の４５７位〜４７７位からなる領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項３】
配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置の１以上にアミノ酸置換を有する、請求項１又は２に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
【請求項４】
前記のグルコースデヒドロゲナーゼにおいて、当該グルコースデヒドロゲナーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１の３２〜３４位、５８〜６２位、１０６〜１０９位、１１１〜１１６位、１１９〜１２６位、１３２〜１３４位、１３６〜１４４位、１５０〜１５３位、１６７〜１７１位、２２２〜２２５位、２５３〜２６２位、２７７〜２８１位、３０１〜３０３位、３０５〜３１２位、３１４〜３１９位、３２４〜３２６位、３３２〜３３７位、３３９〜３４６位、３８８〜３９０位、４１５〜４１７位、４５４〜４５６位、４８６〜４９１位、５０８〜５１１位、５６４〜５６７位、５７０〜５７４位、５８４〜５８６位、５９２〜５９４位、５９７〜５９９位、６０１〜６０４位、６０７〜６０９位、６１１〜６１７位、及び６２５〜６３０位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該グルコースデヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
【請求項５】
配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位に対応する位置のアミノ酸が極性アミノ酸又はアラニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における４７０位に対応する位置のアミノ酸が極性アミノ酸又はアラニンに置換されている、及び／又は
配列番号１に示すアミノ酸配列における４７２位に対応する位置のアミノ酸が極性アミノ酸又はアラニンに置換されている、請求項３または４に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
【請求項６】
配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位に対応する位置のアミノ酸がシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリン、アラニン、トレオニンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における４７０位に対応する位置のアミノ酸がシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリン、アラニン、トレオニン、アルギニンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、及び／又は
配列番号１に示すアミノ酸配列における４７２位に対応する位置のアミノ酸がシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、請求項３〜５のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
【請求項７】
配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位又は４７２位に対応する位置の２つまたは３つのアミノ酸がシステインに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位又は４７２位に対応する位置の２つまたは３つのアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位又は４７２位に対応する位置の２つまたは３つのアミノ酸がヒスチジンに置換されている、
請求項５又は６に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。
【請求項８】
（ｉ）  グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１の４５７位〜４７７位若しくは４６１〜４７７位からなる領域若しくはこれに対応する領域中に少なくとも１、２又は３つの極性アミノ酸若しくはアラニン置換を有するか又はシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリン、アラニン、トレオニン及びアルギニンからなる群より選択されるアミノ酸置換を有するか、配列番号１の４６１位〜４７６位の領域若しくはこれに対応する領域中にＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓからなるモチーフ配列を有するか、又は配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置の少なくとも１、２又は３つに極性アミノ酸若しくはアラニン置換を有するか又はシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリン、アラニン、トレオニン及びアルギニンからなる群より選択されるアミノ酸置換を有し、かつ、酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼ、
（ｉｉ）  前記（ｉ）のグルコースデヒドロゲナーゼにおいて、前記のアミノ酸置換が導入された位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼ、
（ｉｉｉ）  前記（ｉ）のグルコースデヒドロゲナーゼにおいて、当該グルコースデヒドロゲナーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１の３２〜３４位、５８〜６２位、１０６〜１０９位、１１１〜１１６位、１１９〜１２６位、１３２〜１３４位、１３６〜１４４位、１５０〜１５３位、１６７〜１７１位、２２２〜２２５位、２５３〜２６２位、２７７〜２８１位、３０１〜３０３位、３０５〜３１２位、３１４〜３１９位、３２４〜３２６位、３３２〜３３７位、３３９〜３４６位、３８８〜３９０位、４１５〜４１７位、４５４〜４５６位、４８６〜４９１位、５０８〜５１１位、５６４〜５６７位、５７０〜５７４位、５８４〜５８６位、５９２〜５９４位、５９７〜５９９位、６０１〜６０４位、６０７〜６０９位、６１１〜６１７位、及び６２５〜６３０位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該グルコースデヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、
（ｉｖ）  配列番号１のアミノ酸配列の４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置のアミノ酸残基がシステインである、
（ｖ）  配列番号１のアミノ酸配列の４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸である、或いは
（ｖｉ）  配列番号１のアミノ酸配列の４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置のアミノ酸残基がヒスチジンである、
請求項１〜４のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項９】
前記グルコースデヒドロゲナーゼが、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、カラクサケカビ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属、ムコール・プライニ（Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ）、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ムコール・サブチリスマス（Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ）、ムコール・ギリエルモンディ（Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ムコール・ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコール・ダイモルフォスポラス（Ｍｕｃｏｒ  ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ）、アブシジア・シリンドロスポラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ）、アブシジア・ヒアロスポラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａ）、アクチノムコール・エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）、シルシネラ・シンプレックス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、シルシネラ属種（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、シルシネラ・アンガレンシス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ａｎｇａｒｅｎｓｉｓ）、シルシネラ・シネンシス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、シルシネラ・ラクリミスポラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｌａｃｒｙｍｉｓｐｏｒａ）、シルシネラ・マイナー（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｉｎｏｒ）、シルシネラ・ムコロイデス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ）、シルシネラ・リジダ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｒｉｇｉｄａ）、シルシネラ・アンベラータ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ）又はシルシネラ・ムスカエ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｓｃａｅ）由来である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項１０】
酵素から電極へ直接電子移動が可能な、請求項１〜９のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項１１】
以下の特性、
作用：グルコース脱水素酵素活性を示し、メディエーターの不在下で酵素から電極への直接的な電子移動が可能である、
分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の一次配列に基づく推定分子量が約７０ｋＤａであるか又はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定したときの分子量が約８０ｋＤａである、
基質特異性：Ｄ−グルコースに対する反応性と比較して、マルトース及びＤ−キシロースに対する反応性が低い、
補因子特性：フラビン結合型であり、かつ、分子内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、
を備える、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
【請求項１２】
（ａ）  請求項１〜１１のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｃ）  配列番号１３に示す塩基配列を有するＤＮＡ、或いは
（ｄ）  配列番号１３に示す塩基配列と６５％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、メディエーターの不在下で直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
からなる電子移動特性が改変されたグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の遺伝子を含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項１３記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
以下の工程：
請求項１４に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを回収する工程
を含む、グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とする、グルコース測定方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定キット。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコース測定法に関する。より詳細には、本発明は電子移動特性が改変されたグルコースデヒドロゲナーゼ及びこれを用いたグルコース測定法に関する。また本発明は、糖尿病の診断用酵素として、グルコースセンサーとして、また、グルコース測定キットに有利に利用され得る電子移動特性が改変されたグルコースデヒドロゲナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコース測定は、糖尿病患者の血糖値モニタリングなどに用いられる。グルコースの定量には通常、グルコースオキシダーゼ（以下、ＧＯＤともいう）やグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨともいう）が用いられる。これらは家庭で使用できる血中グルコースの自己測定（ＳＭＢＧ）装置や、体内に埋め込み型の連続グルコース測定（以下、ＣＧＭともいう）装置、読み取り部をセンサーにかざした瞬間の血中グルコース濃度を測定可能な装置  （以下、ＦＧＭ装置ともいう）に用いられている。【０００３】
グルコースオキシダーゼはβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−１，５−ラクトン（グルコノラクトン）へ酸化する反応を触媒する酸化還元酵素である。グルコースオキシダーゼは酸素を電子受容体とし、また補因子としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を用いる。【０００４】
グルコースデヒドロゲナーゼは酸化還元酵素に分類され、グルコース及び電子アクセプターを基質とし、グルコノラクトン及び還元型アクセプターを生成する反応を触媒する。グルコースデヒドロゲナーゼとしてはニコチンアミドジヌクレオチド依存性ＧＤＨ、ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸依存性ＧＤＨ、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）依存性ＧＤＨ、ＦＡＤ依存性ＧＤＨ（フラビン結合型ＧＤＨ）等が挙げられる。【０００５】
グルコース測定にＧＯＤを用いる際、過酸化水素電極を使用することができる。この方法では、過酸化水素電極に＋０．６Ｖ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）〜＋０．９Ｖ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を印加して、グルコースからグルコノラクトンが生じる際に生成する過酸化水素を測定する。この方法は主としてＳＭＢＧやＣＧＭに用いられている。しかしながらこの方法は比較的高い電圧を印加するため、測定溶液に含まれるアスコルビン酸などの夾雑物質の影響を受けるという問題があった。【０００６】
そこで過酸化水素に代えて人工電子メディエーター（以下、単にメディエーターともいう）を用いる方法が開発された。この方法では、酵素的にグルコースがグルコノラクトンへと変換される際に、酸化型メディエーターが還元型となる。そして還元型メディエーターが電極に電子を受け渡し、酸化型に戻る。メディエーターを用いる方法の利点として印加電圧を過酸化水素電極の場合と比較して低くすることができる。メディエーターは典型的にはフェリシアン化カリウム等の金属錯体であるが、これはヒトの体内に入ると有害の恐れがある。【０００７】
ＧＯＤやＧＤＨは、補因子ＦＡＤが酵素分子の内部に埋没していることが多いため、これらをグルコース測定に用いる場合には通常、メディエーターが存在しないと電極へと電子を受け渡すことができない。ところがメディエーターは高価であり、また、電極表面に固定化するのが困難である。例えば糖尿病患者のグルコース測定において、メディエーターを電極に固定化せずに体内埋め込み型の連続グルコース測定用（ＣＧＭ）機器やＦＧＭ機器に用いようとすると測定溶液中に存在するメディエーターが体内へ流入する可能性があるが、メディエーターは多くの場合、生体適合性を有しない又は毒性であり、これが体内へ流入することは望ましくない。そのため、メディエーターを用いるグルコース測定法はＣＧＭやＦＧＭの機器には向いていない。またＧＯＤとＧＤＨとを比較すると、ＧＯＤは系に存在する溶存酸素の影響を受ける可能性があるため、ＧＯＤよりはＧＤＨが望まれている。そこで低い印加電位でも測定可能な化合物に用いることのできるＧＤＨが望まれている。またメディエーターを必要とすることなく、電極へと電子を直接受け渡すことができるＧＤＨが望まれている。【０００８】
非特許文献１では、メディエーターを電極に固定化するアプローチとは別に、メディエーターをＧＯＤに修飾する手法も報告されている。しかしながら化学修飾による酵素活性の低下や、メディエーターの体内への流入の可能性がないとは言えない点から、実用化には至っていない。【０００９】
一方で酸化還元反応に関与する物質として鉄硫黄クラスターが知られている。鉄硫黄クラスター（ＦｅＳクラスターとも記載する）は鉄原子および硫黄原子により構成される。鉄硫黄クラスターを有するタンパク質は種々知られており、主としてポリペプチド中のシステイン残基が鉄硫黄クラスターの鉄原子に配位する。タンパク質に含まれる鉄硫黄クラスターとしては代表的には［２Ｆｅ−２Ｓ］型、［３Ｆｅ−４Ｓ］型、［４Ｆｅ−４Ｓ］型等が存在する。アミノ酸配列としては、鉄硫黄クラスター配位に特徴的なモチーフが知られている。例えば非特許文献２にはＣ−Ｘ２−５−Ｃ−ＸＸ−Ｃというモチーフが記載されている（Ｘは他の任意のアミノ酸）。また非特許文献３は光化学系Ｉ反応中心に存在する鉄硫黄クラスターを記載しており、クラスターに配位するアミノ酸配列がＣ−ＸＸ−Ｃ−ＸＸ−Ｃ−ＸＸＸ−ＣＰというクラスター配位に特徴的なモチーフである、と記載している。【００１０】
特許文献１はバークホルデリア  セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）由来のＧＤＨを記載している。記載されているＧＤＨはαサブユニットとβサブユニットとからなる複合体タンパク質であり、αサブユニットにはＦＡＤとＦｅＳクラスターが含有されている。βサブユニットはシトクロムｃであり、ＦＡＤから電極への電子伝達の役割を担う。特許文献２はバークホルデリア  セパシア由来のＧＤＨを用いたグルコース測定及びグルコースセンサーを記載している。また電子伝達に与るβサブユニットが存在しない場合、ＧＤＨから電極への直接電子移動活性が著しく低下することが記載されている。【００１１】
既知の直接電子移動型ＧＤＨは、グルコース以外の糖にも作用する可能性があり、グルコースセンサーに用いるには基質特異性が必ずしも十分とはいえなかった。また既知の直接電子移動型ＧＤＨは、メディエーターに類似する役割を果たす電子伝達ドメインを必要とし、それ故酵素の分子量が大きく酵素の安定性や生産性等の問題があった。さらに、該酵素はバークホルデリア  セパシア由来の膜結合性酵素のため、該酵素のサブユニット又は該酵素を得るためには、可溶化の処理等、煩雑な処理が必要とされる。その上、可溶化処理をした物は不安定であり、乾燥させる等の取扱いを行うと該酵素又はそのサブユニット構造を維持することは難しい。【００１２】
タンパク質に鉄硫黄クラスターを導入した例としては非特許文献４が挙げられる。非特許文献４では、ストレプトコッカス由来プロテインＧの免疫グロブリン結合Ｂ１ドメイン中の４つのアミノ酸残基をそれぞれシステイン残基に置換することで鉄硫黄クラスターを導入したことを記載している。非特許文献４によると設計された鉄硫黄クラスター含有タンパク質は不安定であると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特許第４１０７３８６号明細書（国際公開第２００２／０３６７７９号）
【特許文献２】特許第４３５９５９５号明細書（国際公開第２００５／０２３１１１号）
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ９１（６），  １２８５−９  ，  １９８７
【非特許文献２】日本結晶学会誌，５２，１７４−１８３，２０１０
【非特許文献３】低温科学，６７，  ２４５−２４７，  ２００９
【非特許文献４】Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ７，  １９３９−１９４６，  １９９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、上記の問題を解消しうる、電子移動特性が改変されたグルコースデヒドロゲナーゼを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意努力した結果、電極表面にメディエーターを固定化するのではなく、グルコースデヒドロゲナーゼにアミノ酸置換を導入しようと考えた。シトクロムドメインを有しない種類のグルコースデヒドロゲナーゼにアミノ酸置換を行ったところ、驚くべきことに、電子移動特性が改変されたグルコースデヒドロゲナーゼを取得し、本発明を完成させた。【００１７】
すなわち本発明は以下の実施形態を包含する。
［１］  少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、酵素から電極へ直接電子移動が可能な、シトクロムドメインを有しないグルコースデヒドロゲナーゼ変異体、又は
配列番号１の４５７位〜４７７位若しくは４６１〜４７７位からなる領域若しくはこれに対応する領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、かつ、電子移動特性が改変された、シトクロムドメインを有しないグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。    
［２］  酵素から電極へ直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ変異体が、配列番号１の４５７位〜４７７位若しくは４６１〜４７７位からなる領域に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、１に記載の変異体。
［３］  配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置の１以上にアミノ酸置換を有する、１又は２に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。    
［４］  前記のグルコースデヒドロゲナーゼにおいて、当該グルコースデヒドロゲナーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１の３２〜３４位、５８〜６２位、１０６〜１０９位、１１１〜１１６位、１１９〜１２６位、１３２〜１３４位、１３６〜１４４位、１５０〜１５３位、１６７〜１７１位、２２２〜２２５位、２５３〜２６２位、２７７〜２８１位、３０１〜３０３位、３０５〜３１２位、３１４〜３１９位、３２４〜３２６位、３３２〜３３７位、３３９〜３４６位、３８８〜３９０位、４１５〜４１７位、４５４〜４５６位、４８６〜４９１位、５０８〜５１１位、５６４〜５６７位、５７０〜５７４位、５８４〜５８６位、５９２〜５９４位、５９７〜５９９位、６０１〜６０４位、６０７〜６０９位、６１１〜６１７位、及び６２５〜６３０位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該グルコースデヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、１〜３のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。    
［５］  配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位に対応する位置のアミノ酸が極性アミノ酸又はアラニンに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における４７０位に対応する位置のアミノ酸が極性アミノ酸又はアラニンに置換されている、及び／又は
配列番号１に示すアミノ酸配列における４７２位に対応する位置のアミノ酸が極性アミノ酸又はアラニンに置換されている、３または４に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。    
［６］  配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位に対応する位置のアミノ酸がシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリン、アラニン、トレオニンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における４７０位に対応する位置のアミノ酸がシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリン、アラニン、トレオニン、アルギニンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、及び／又は
配列番号１に示すアミノ酸配列における４７２位に対応する位置のアミノ酸がシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、３〜５のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。    
［７］  配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位又は４７２位に対応する位置の２つまたは３つのアミノ酸がシステインに置換されている、
配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位又は４７２位に対応する位置の２つまたは３つのアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、或いは
配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位又は４７２位に対応する位置の２つまたは３つのアミノ酸がヒスチジンに置換されている、
５又は６に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体。    
［８］  （ｉ）  グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１の４５７位〜４７７位若しくは４６１〜４７７位からなる領域若しくはこれに対応する領域中に少なくとも１、２又は３つの極性アミノ酸若しくはアラニン置換を有するか又はシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリン、アラニン、トレオニン及びアルギニンからなる群より選択されるアミノ酸置換を有するか、配列番号１の４６１位〜４７６位の領域若しくはこれに対応する領域中にＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓからなるモチーフ配列を有するか、又は配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置の少なくとも１、２又は３つに極性アミノ酸若しくはアラニン置換を有するか又はシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリン、アラニン、トレオニン及びアルギニンからなる群より選択されるアミノ酸置換を有し、かつ、酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼ、
（ｉｉ）  前記（ｉ）のグルコースデヒドロゲナーゼにおいて、前記のアミノ酸置換が導入された位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するグルコースデヒドロゲナーゼ、
（ｉｉｉ）  前記（ｉ）のグルコースデヒドロゲナーゼにおいて、当該グルコースデヒドロゲナーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、配列番号１の３２〜３４位、５８〜６２位、１０６〜１０９位、１１１〜１１６位、１１９〜１２６位、１３２〜１３４位、１３６〜１４４位、１５０〜１５３位、１６７〜１７１位、２２２〜２２５位、２５３〜２６２位、２７７〜２８１位、３０１〜３０３位、３０５〜３１２位、３１４〜３１９位、３２４〜３２６位、３３２〜３３７位、３３９〜３４６位、３８８〜３９０位、４１５〜４１７位、４５４〜４５６位、４８６〜４９１位、５０８〜５１１位、５６４〜５６７位、５７０〜５７４位、５８４〜５８６位、５９２〜５９４位、５９７〜５９９位、６０１〜６０４位、６０７〜６０９位、６１１〜６１７位、及び６２５〜６３０位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該グルコースデヒドロゲナーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ酵素から電極への直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する、
（ｉｖ）  配列番号１のアミノ酸配列の４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置のアミノ酸残基がシステインである、
（ｖ）  配列番号１のアミノ酸配列の４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置のアミノ酸残基がアスパラギン酸である、或いは
（ｖｉ）  配列番号１のアミノ酸配列の４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置のアミノ酸残基がヒスチジンである、
１〜４のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。    
［９］  前記グルコースデヒドロゲナーゼが、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、カラクサケカビ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属、ムコール・プライニ（Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ）、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ムコール・サブチリスマス（Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ）、ムコール・ギリエルモンディ（Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ムコール・ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコール・ダイモルフォスポラス（Ｍｕｃｏｒ  ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ）、アブシジア・シリンドロスポラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ）、アブシジア・ヒアロスポラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａ）、アクチノムコール・エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）、シルシネラ・シンプレックス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、シルシネラ属種（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、シルシネラ・アンガレンシス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ａｎｇａｒｅｎｓｉｓ）、シルシネラ・シネンシス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、シルシネラ・ラクリミスポラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｌａｃｒｙｍｉｓｐｏｒａ）、シルシネラ・マイナー（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｉｎｏｒ）、シルシネラ・ムコロイデス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ）、シルシネラ・リジダ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｒｉｇｉｄａ）、シルシネラ・アンベラータ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ）又はシルシネラ・ムスカエ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｓｃａｅ）由来である、１〜８のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。    【００１８】
［１０］  酵素から電極へ直接電子移動が可能な、１〜９のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。    
［１１］  以下の特性、
作用：グルコース脱水素酵素活性を示し、メディエーターの不在下で酵素から電極への直接的な電子移動が可能である、
分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の一次配列に基づく推定分子量が約７０ｋＤａであるか又はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定したときの分子量が約８０ｋＤａである、
基質特異性：Ｄ−グルコースに対する反応性と比較して、マルトース及びＤ−キシロースに対する反応性が低い、
補因子特性：フラビン結合型であり、かつ、分子内に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、
を備える、１〜１０のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
［１２］  （ａ）１〜１１のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、
（ｂ）  配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（ｃ）  配列番号１３に示す塩基配列を有するＤＮＡ、或いは
（ｄ）  配列番号１３に示す塩基配列と６５％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、メディエーターの不在下で直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
からなる電子移動特性が改変されたグルコースデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子。
［１３］  １２に記載の遺伝子を含む、ベクター。    
［１４］  １３記載のベクターを含む、宿主細胞。    
［１５］  以下の工程：
１４に記載の宿主細胞を培養する工程、
前記宿主細胞中に含まれるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現させる工程、及び
前記培養物からグルコースデヒドロゲナーゼを回収する工程
を含む、グルコースデヒドロゲナーゼを製造する方法。    
［１６］  １〜１１のいずれかに記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いることを特徴とする、グルコース測定方法。    
［１７］  １〜１１のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定キット。    
［１８］  １〜１１のいずれか１項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサー。【００１９】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１５−２１４４００号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の効果として、より低濃度のメディエーター存在下で、又はメディエーターを用いることなく、グルコース測定が可能となる。メディエーターは糖尿病患者等に毒性でありうるが、グルコース測定にメディエーターが不要となることから本発明に係るグルコースデヒドロゲナーゼは、体内埋め込み型の連続グルコース測定に用いることができる。また本発明に係るグルコース測定方法は、高価なメディエーター分子を必要としないかその使用量を軽減できるため、低コストである。また本発明に係るグルコースデヒドロゲナーゼは、従来のものよりも使用できる電子受容化合物の種類が広がり、より多くの選択肢を提供することができる。また本発明に係るグルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースオキシダーゼと比較して溶存酸素の影響を受けにくいため、より正確にグルコース測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１−１】各種由来のＧＤＨのマルチプルアライメントを示す。ＭｐＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ由来ＧＤＨ（配列番号１）であり、ＭｈＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ由来ＧＤＨ（配列番号３）であり、ＭｄｒＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ＤＲ０５６８６０由来ＧＤＨ（配列番号４）であり、ＭｓＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ由来ＧＤＨ（配列番号５）であり、ＭｇＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ由来ＧＤＨ（配列番号６）であり、ＣｓＧＤＨはＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来ＧＤＨ（配列番号７）であり、ＣｒＧＤＨはＣｉｒｃｉｎｅｌｌａ属由来ＧＤＨ（配列番号８）であり、ＭｃＧＤＨはＭｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ由来ＧＤＨ（配列番号９）である。
【図１−２】図１−１のつづきである。
【図１−３】図１−１のつづきである。
【図１−４】図１−１のつづきである。
【図２】ＭｐＧＤＨ−Ｍ１のクロノアンペロメトリーの測定結果である。
【図３】ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ三重変異体のクロノアンペロメトリーの測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（本発明に係るグルコースデヒドロゲナーゼ）
第一の実施形態において本発明はグルコースデヒドロゲナーゼ変異体を提供する。ある実施形態において本発明は、アミノ酸置換を有し電子移動特性が改変されたグルコースデヒドロゲナーゼを提供する。ある実施形態において、前記アミノ酸置換は、配列番号１の４５７位〜４７７位若しくは４６１〜４７７位又はこれに対応する領域への置換であり得る。本明細書において、「電子移動特性が改変された」とは、酵素から電極への電子移動が、未改変の酵素と比較して、促進されていることをいう。電子移動の促進の程度は、未改変酵素と改変酵素とについて、電圧を印加したとき（例えば＋３００ｍＶ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）又は＋５００ｍＶ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ））の応答電流（ｎＡ）の比により評価することができる。したがって、あるＧＤＨ変異体について「電子移動特性が改変された」とは、未改変の酵素と比較して、電圧を印加したときの応答電流が、例えば２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、又は１５００％以上増大していることをいう。また、あるＧＤＨ変異体について「電子移動特性が改変された」とは、未改変の酵素と比較して、電圧を印加したときの応答電流が、例えば１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、又は３０倍以上増大していることをいう。
【００２３】
さらなる実施形態において本発明は、アミノ酸置換を有し、酵素から電極への直接的な電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼを提供する。このようなグルコースデヒドロゲナーゼを本明細書において、直接電子移動型グルコースデヒドロゲナーゼということがある。ある実施形態において、前記アミノ酸置換は、配列番号１の４５７〜４７７位又はこれに対応する領域への置換であり得る。
【００２４】
直接電子移動型グルコースデヒドロゲナーゼは、フェリシアン化カリウムのようなメディエーターを必要とせず、電子を酵素から直接固相電極へと受け渡し得る。すなわち「直接的な電子移動が可能」とは、電圧を印加したときにメディエーターが存在せずとも、酵素から電極へ電子が受け渡され応答電流が観察されることをいう。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、このとき電子は酵素に含まれるＦＡＤのような補因子から、または酵素に含まれる置換アミノ酸から、固相電極へと受け渡されると考えられる。このような化学種と固相電極との間の電子移動を異種電子移動（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）という。電子移動は電子の移動が起こる素反応の一種であり、内圏型（ｉｎｎｅｒ  ｓｐｈｅｒｅ）、外圏型（ｏｕｔｅｒ  ｓｐｈｅｒｅ）、異種電子移動があるが、本発明における直接電子移動は、酵素から固相電極へと電子が移動すれば、その種類は問わない。なお、ここでいう酵素とは、ＧＤＨが人工的な遺伝子操作により別のタンパク質と融合体を形成している場合や、人工的な遺伝子操作を受けたＧＤＨが金属（イオン）若しくは低分子化合物と複合体を形成している場合には、当該融合体又は複合体全体を指す。ある実施形態において本発明のグルコースデヒドロゲナーゼはフラビン結合型ＧＤＨである。
【００２５】
ある実施形態において、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは、配列番号１、配列番号１０又は配列番号１２に示すアミノ酸配列を有するＭｕｃｏｒ属由来のグルコースデヒドロゲナーゼに基づき作製された、グルコースデヒドロゲナーゼの変異体である。このような変異体の例としては、配列番号１と高い配列同一性（例えば、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上）を有するアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼおよび配列番号１のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変もしくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するグルコースデヒドロゲナーゼを挙げることができる。
【００２６】
グルコースデヒドロゲナーゼは天然に広く存在し、微生物や動植物起源の酵素を探索することにより得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼは例えば、ケカビ亜門、ケカビ綱、ケカビ目、ケカビ科に分類される微生物、例えばムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、アブシジア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、アクチノムコール（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ）属、カラクサケカビ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属などの生物種に由来するＧＤＨに基づき作製されたものでもよい。
【００２７】
ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物としては、ムコール・プライニ（Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ）、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ムコール・サブチリスマス（Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ）、ムコール・ギリエルモンディ（Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）、ムコール・ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、ムコール・ダイモルフォスポラス（Ｍｕｃｏｒ  ｄｉｍｏｒｐｈｏｓｐｏｒｕｓ）が挙げられる。Ａｂｓｉｄｉａ属の微生物としては、アブシジア・シリンドロスポラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｏｒａ）、アブシジア・ヒアロスポラ（Ａｂｓｉｄｉａ  ｈｙａｌｏｓｐｏｒａ）を挙げることができる。Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ属微生物としては、アクチノムコール・エレガンス（Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ  ｅｌｅｇａｎｓ）を挙げることができる。カラクサケカビ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属の微生物としては、シルシネラ・シンプレックス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、シルシネラ属種（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、シルシネラ・アンガレンシス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ａｎｇａｒｅｎｓｉｓ）、シルシネラ・シネンシス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、シルシネラ・ラクリミスポラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｌａｃｒｙｍｉｓｐｏｒａ）、シルシネラ・マイナー（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｉｎｏｒ）、シルシネラ・ムコロイデス（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｃｏｒｏｉｄｅｓ）、シルシネラ・リジダ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｒｉｇｉｄａ）、シルシネラ・アンベラータ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ）及びシルシネラ・ムスカエ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｍｕｓｃａｅ）を挙げることができる。
【００２８】
本発明のＧＤＨ変異体が由来するＧＤＨは、天然においてシトクロムドメインを有しない種類のものである。したがって天然においてシトクロムドメインを有するＧＤＨは、本発明から除かれる。また、本発明のＧＤＨは水溶性であり、膜結合性ＧＤＨは除かれる。
【００２９】
（アミノ酸置換を導入する領域）
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体は、グルコースデヒドロゲナーゼの特定領域にアミノ酸置換を導入することにより得ることができる。ある実施形態において前記特定領域は、配列番号１の４５７〜４７７位、４６１〜４７６位若しくは４６１〜４７７位の領域、又はこれに対応する領域である。
【００３０】
ある実施形態では、グルコースデヒドロゲナーゼの特定領域のアミノ酸配列に関し、少なくとも１、２又は３つのアミノ酸残基を極性アミノ酸又はアラニン、例えばシステイン、アスパラギン酸、ヒスチジン、セリン、トレオニン、又はアラニンに置換することができる。ある実施形態において、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１に示すアミノ酸配列における４５７〜４７７位若しくは４６１位〜４７７位の領域又はこれらに対応する領域中に少なくとも１、２、又は３つのアミノ酸置換、例えばシステイン、セリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン、アルギニン又はヒスチジンへのアミノ酸置換を有するものであり得る。別の実施形態において、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１に示すアミノ酸配列における４６１位〜４７６位の領域中にＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓからなるモチーフ配列（配列番号１４、配列中、Ｘａａは任意のアミノ酸残基を表す）を有するか、又は配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置のアミノ酸がいずれもシステインであるか、いずれもアスパラギン酸であるか、いずれもヒスチジンである。
【００３１】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体は、配列番号１に示すアミノ酸配列において、上記の特定領域へのアミノ酸置換を有し得る。さらに、本発明のグルコースデヒドロゲナーゼ変異体は、それらの置換アミノ酸以外の位置で、さらに１または数個（例えば１〜１５個、１〜１０個、１〜５個、例えば１〜３個）のアミノ酸が欠失、挿入、付加および／または置換されていてもよい。さらに本発明は、上記の特定領域へのアミノ酸置換のほかに、基質特異性や熱安定性等の性質を向上するアミノ酸の置換変異を有してもよく、配列番号１に示すアミノ酸配列における前記置換したアミノ酸以外のアミノ酸を除いた部分のアミノ酸配列に対して、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上のアミノ酸配列同一性を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、電子移動特性が改変されたＧＤＨを包含する。該電子移動特性が改変されたＧＤＨは直接電子移動型ＧＤＨを包含する。
【００３２】
ある実施形態において本発明の電子移動特性が改変されたＧＤＨは、配列番号１で示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列と例えば７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列、または該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有し、かつ、配列番号１のアミノ酸配列における４５７〜４７７位若しくは４６１位〜４７７位又はこれに対応する領域中に少なくとも１、２、又は３つのアミノ酸置換、例えば極性アミノ酸若しくはアラニンへの置換、又は、システイン、セリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン若しくはヒスチジンへのアミノ酸置換を有するか、配列番号１のアミノ酸配列における４６１位〜４７６位若しくはこれに対応する領域中にＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓからなるモチーフ配列を有するか、又は配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置にシステイン、アスパラギン酸若しくはヒスチジン残基を有する。
【００３３】
（対応する領域）
配列番号１に示すアミノ酸配列における４６１位〜４７７位の領域に対応する領域とは、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントさせたときに配列番号１のアミノ酸配列の４６１位〜４７７位の領域に対応する他の生物種由来のＧＤＨのアミノ酸配列における領域をいう。配列番号１のアミノ酸配列における４５７位〜４７７位の領域に対応する領域とは、配列番号１のアミノ酸配列とアライメントさせたときに配列番号１のアミノ酸配列の４５７位〜４７７位の領域に対応する他の生物種由来のＧＤＨのアミノ酸配列における領域をいう。
【００３４】
「対応する領域」を特定する方法としては、例えば、まずリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各ＧＤＨのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えるマルチプルアライメントを行う。ＧＤＨのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各ＧＤＨ配列における配列中の位置を決めることができる。ついで場合により、公知の二次構造予測アルゴルズム等を用いてαヘリックスやβシート、コイルなどの二次構造を予測することができる。
【００３５】
例えば配列番号１に示すアミノ酸配列または適当なＧＤＨのアミノ酸配列について、二次構造予測アルゴリズムを用いることにより、その二次構造を予測することができる。二次構造予測ツールとしては、ＪＮｅｔアルゴリズムを実装したＪｐｒｅｄ  ３（Ｃｏｌｅ  ＣらＴｈｅ  Ｊｐｒｅｄ  ３  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｒｖｅｒ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００８，：Ｗ１９７−２０１）やＪｐｒｅｄ４（Ｄｒｏｚｄｅｔｓｋｉｙ  Ａら（２０１５）  ＪＰｒｅｄ４：  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｒｖｅｒ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ３３２）が挙げられる。Ｊｐｒｅｄ  ３を用いてＭｐＧＤＨ（配列番号１）について二次構造予測を行うと、配列番号１に示すアミノ酸配列における４５６位〜４６０位及び４７７位〜４８３位はβストランド構造と予測されるが（Ｓａｔａｋｅら、Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  （２０１５），  Ｖｏｌ．  １２０，  Ｉｓｓｕｅ  ５，  Ｎｏｖ  ２０１５，  ４９８−５０３）、４６１位〜４７６位の領域はβストランド構造やαヘリックス構造が存在するとは予測されない。同様にＪｐｒｅｄ  ４では配列番号１の４６１位〜４７７位の領域はβストランド構造やαヘリックス構造が存在するとは予測されない。Ｊｐｒｅｄ  ３とＪｐｒｅｄ  ４とで予測が異なる場合はＪｐｒｅｄ  ４の予測を優先するものとする。
【００３６】
配列番号１に示すアミノ酸配列における４６１位〜４７７位の領域に対応する領域としては、
配列番号３に示すアミノ酸配列における４５８位〜４７４位、
配列番号４に示すアミノ酸配列における４５８位〜４７４位、
配列番号５に示すアミノ酸配列における４６１位〜４７７位、
配列番号６に示すアミノ酸配列における４５６位〜４７２位、
配列番号７に示すアミノ酸配列における４６０位〜４７６位、
配列番号８に示すアミノ酸配列における４６０位〜４７６位、及び
配列番号９に示すアミノ酸配列における４６２位〜４７８位、が挙げられるが、これに限定されない。その他のＧＤＨについても、例えば、Ｓａｔａｋｅら（Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  （２０１５），  Ｖｏｌ．  １２０，  Ｉｓｓｕｅ  ５，  Ｎｏｖ  ２０１５，  ４９８−５０３）に記載のアライメントを行うことにより、配列番号１に示すアミノ酸配列における４６１位〜４７７位の領域に対応する領域を明らかにすることができる。
【００３７】
対応する領域は、三次元構造中で同一または類似する領域を占めると考えられ、対象となるＧＤＨにおいて同様の領域を形成しうると合理的に推定される。
【００３８】
配列番号１に示すアミノ酸配列における４５７位〜４７７位の領域に対応する領域としては、
配列番号３に示すアミノ酸配列における４５４位〜４７４位、
配列番号４に示すアミノ酸配列における４５４位〜４７４位、
配列番号５に示すアミノ酸配列における４５７位〜４７７位、
配列番号６に示すアミノ酸配列における４５２位〜４７２位、
配列番号７に示すアミノ酸配列における４５６位〜４７６位、
配列番号８に示すアミノ酸配列における４５６位〜４７６位、及び
配列番号９に示すアミノ酸配列における４５８位〜４７８位、が挙げられるが、これに限定されない。その他のＧＤＨについても、例えば、Ｓａｔａｋｅら（Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  （２０１５），  Ｖｏｌ．  １２０，  Ｉｓｓｕｅ  ５，  Ｎｏｖ  ２０１５，  ４９８−５０３）に記載のアライメントを行うことにより、配列番号１に示すアミノ酸配列における４６１位〜４７７位若しくは４５７位〜４７７位の領域に対応する領域を明らかにすることができる。
【００３９】
図１に種々の公知の生物種由来のＧＤＨのアミノ酸配列とそのアライメントを示す。最上段は配列番号１のアミノ酸配列である。これを公知のアルゴリズムを用いて各種由来のＧＤＨと整列させた。配列番号１のアミノ酸配列を有するＭｕｃｏｒ属由来のＧＤＨの４５７〜４７７位若しくは４６１位〜４７７位に対応する領域、並びに４６４位、４７０位及び４７２位にそれぞれ対応する位置を特定することができる。
【００４０】
ある実施形態において本発明の電子移動特性が改変されたＧＤＨは、配列番号１のアミノ酸配列における４６１位〜４７６位、４６１位〜４７７位、若しくは４５７位〜４７７位に対応する領域に少なくとも３つのシステイン残基を有する。このとき、配列番号１のアミノ酸配列における４６１位〜４７６位の領域に対応する領域はＣｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓからなるモチーフ配列（配列番号１４）を有しうる。配列中、Ｘａａは任意のアミノ酸でありうる。
【００４１】
（対応する位置）
ある実施形態において本発明の電子移動特性が改変されたＧＤＨは、配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置に１、２、または３つのアミノ酸置換、例えばシステイン、セリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン又はヒスチジンへのアミノ酸置換を有する。配列番号１に示すアミノ酸配列におけるこれらの位置に対応する位置は、上記の対応する領域を特定する方法と同様に特定することができる。
【００４２】
配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位、及び４７２位に対応する位置は、対象のＧＤＨのアミノ酸配列を配列番号１のＧＤＨのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１の４６４位、４７０位、及び４７２位にそれぞれ対応する位置を意味する。ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属やカラクサケカビ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属の所定のＧＤＨであれば図１などからこれらを特定することができる。配列番号１のＧＤＨと相同性を有するＧＤＨであれば同様の手法によりそれぞれの対応する位置を特定することができる。
【００４３】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列における４６４位に対応する位置は、
Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ由来ＧＤＨ（ＭｈＧＤＨ、配列番号３）では４６１位、
Ｍｕｃｏｒ  ＤＲ０５６８６０由来ＧＤＨ（ＭｄｒＧＤＨ、配列番号４）では４６１位、
Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ由来ＧＤＨ（ＭｓＧＤＨ、配列番号５）では４６４位、
Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ由来ＧＤＨ（ＭｇＧＤＨ、配列番号６）では４５９位、
Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来ＧＤＨ（ＣｓＧＤＨ、配列番号７）では４６３位、
Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ属由来ＧＤＨ（ＣｒＧＤＨ、配列番号８）では４６３位、
Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ由来ＧＤＨ（ＭｃＧＤＨ、配列番号９）では４６５位である。
【００４４】
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列における４７０位に対応する位置は、
Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ由来ＧＤＨ（ＭｈＧＤＨ、配列番号３）では４６７位、
Ｍｕｃｏｒ  ＤＲ０５６８６０由来ＧＤＨ（ＭｄｒＧＤＨ、配列番号４）では４６７位、
Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ由来ＧＤＨ（ＭｓＧＤＨ、配列番号５）では４７０位、
Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ由来ＧＤＨ（ＭｇＧＤＨ、配列番号６）では４６５位、
Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来ＧＤＨ（ＣｓＧＤＨ、配列番号７）では４６９位、
Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ属由来ＧＤＨ（ＣｒＧＤＨ、配列番号８）では４６９位、
Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ由来ＧＤＨ（ＭｃＧＤＨ、配列番号９）では４７１位である。
【００４５】
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列における４７２位に対応する位置は、
Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ由来ＧＤＨ（ＭｈＧＤＨ、配列番号３）では４６９位、
Ｍｕｃｏｒ  ＤＲ０５６８６０由来ＧＤＨ（ＭｄｒＧＤＨ、配列番号４）では４６９位、
Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ由来ＧＤＨ（ＭｓＧＤＨ、配列番号５）では４７２位、
Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ由来ＧＤＨ（ＭｇＧＤＨ、配列番号６）では４６７位、
Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来ＧＤＨ（ＣｓＧＤＨ、配列番号７）では４７１位、
Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ属由来ＧＤＨ（ＣｒＧＤＨ、配列番号８）では４７１位、
Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ由来ＧＤＨ（ＭｃＧＤＨ、配列番号９）では４７３位である。
【００４６】
（ａ）場合により配列番号１のアミノ酸配列における４６４位に対応する位置のアミノ酸は、極性アミノ酸又はアラニンへと置換されてもよい。本明細書において極性アミノ酸とはシステイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、リシン、グリシン及びチロシンをいう。
【００４７】
（ｂ）場合により配列番号１のアミノ酸配列における４７０位に対応する位置のアミノ酸は、極性アミノ酸又はアラニンへと置換されてもよい。
【００４８】
（ｃ）場合により配列番号１のアミノ酸配列における４７２位に対応する位置は、極性アミノ酸又はアラニンへと置換されてもよい。
【００４９】
（ａ−１）場合により配列番号１のアミノ酸配列における４６４位に対応する位置のアミノ酸は、システイン、セリン、アラニン、アスパラギン酸、トレオニン、又はヒスチジンへと置換されてもよい。
【００５０】
（ｂ−１）場合により配列番号１のアミノ酸配列における４７０位に対応する位置のアミノ酸は、システイン、アラニン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、アルギニン、又はヒスチジンへと置換されてもよい。
【００５１】
（ｃ−１）場合により配列番号１のアミノ酸配列における４７２位に対応する位置は、システイン、セリン、アスパラギン酸、又はヒスチジンへと置換されてもよい。
【００５２】
上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ａ−１）、（ｂ−１）、及び（ｃ−１）は任意に組み合わせてもよい。例えば変異体は（ａ）及び（ｂ）の置換を有してもよく、（ｂ）及び（ｃ）の置換を有してもよく、（ｃ）及び（ａ）の置換を有してもよく、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）置換を有してもよい。便宜上、位置ｘｘｘのアミノ酸Ａ１をアミノ酸Ａ２へと置換する変異をＡ１ｘｘｘＡ２と記載する。例えば４６４位のチロシンをシステインへと置換する変異をＹ４６４Ｃと記載する。また二重変異体については、第１の変異と第２の変異を「／」記号で示す。例えば本発明のＧＤＨは、配列番号１のアミノ酸配列について、Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ、Ｙ４６４Ｃ／Ｌ４７２Ｃ、又はＶ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ変異を有し得る。同様に本発明は以下の変異体を提供するが、変異体はこれに限らない：
Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ、Ｙ４６４Ｃ／Ｌ４７２Ｃ、Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ、Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｓ、Ｙ４６４Ｓ／Ｌ４７２Ｓ、Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｓ、Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｈ、Ｙ４６４Ｈ／Ｌ４７２Ｈ、Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ａ／Ｖ４７０Ａ、Ｙ４６４Ａ／Ｌ４７２Ａ、Ｖ４７０Ａ／Ｌ４７２Ａ、Ｙ４６４Ｔ／Ｖ４７０Ｔ、Ｙ４６４Ｔ／Ｌ４７２Ｔ、Ｖ４７０Ｔ／Ｌ４７２Ｔ、Ｙ４６４Ｒ／Ｖ４７０Ｒ、Ｙ４６４Ｒ／Ｌ４７２Ｒ、Ｖ４７０Ｒ／Ｌ４７２Ｒ、Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｄ、Ｙ４６４Ｄ／Ｌ４７２Ｄ、Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｄ、Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ、Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｓ、Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｃ、Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ、Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｓ、Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｓ、Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｃ、Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｓ、
Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｄ、Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｃ、Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ、Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｄ、Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｄ、Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｃ、Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｄ、Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｓ、Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｄ、Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｄ、Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｓ、Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｓ、Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｄ、
Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｃ、Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ、Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｃ、Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｓ、Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｓ、Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｓ、
Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｄ、Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｄ、Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｄ、
Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｒ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｈ、Ｙ４６４Ｔ／Ｖ４７０Ｔ／Ｌ４７２Ｔ、Ｙ４６４Ａ／Ｖ４７０Ａ／Ｌ４７２Ａ。
【００５３】
本明細書において、グルコースデヒドロゲナーゼ中の、配列番号１に示すアミノ酸配列における４６４位、４７０位及び４７２位に対応する位置に関し、「アミノ酸が置換されている」とは、当該グルコースデヒドロゲナーゼのその位置における野生型アミノ酸は除かれ、野生型アミノ酸以外のアミノ酸に置換されていることをいう。例えば一部のＧＤＨにおいて、配列番号１の４７０位に対応する位置のアミノ酸はアラニンである（例えばＭｄｒＧＤＨ、配列番号４）。このようなＧＤＨについては、配列番号１のアミノ酸配列における４７０位に対応する位置のアミノ酸置換からアラニンは除かれ、当該位置のアミノ酸はアラニン以外のアミノ酸、例えば極性アミノ酸へと置換されてもよい。例えば一部のＧＤＨにおいて、配列番号１の４７２位に対応する位置のアミノ酸はリシンである（例えばＭｇＧＤＨ、配列番号６）。このようなＧＤＨについては、配列番号１のアミノ酸配列における４７２位に対応する位置のアミノ酸置換からリシンは除かれ、当該位置のアミノ酸はリシン以外の極性アミノ酸又はアラニンへと置換されてもよい。例えば一部のＧＤＨにおいて、配列番号１の４６４位に対応する位置のアミノ酸はチロシンである（例えば図１−３参照）。このようなＧＤＨについては、配列番号１のアミノ酸配列における４６４位に対応する位置のアミノ酸置換からチロシンは除かれ、当該位置のアミノ酸はチロシン以外の極性アミノ酸又はアラニンへと置換されてもよい。配列番号１の４６４位に対応する位置のアミノ酸がチロシンではないGDH（例えばSatakeら、J. Biosci. Bioeng., (2015), Vol. 120, Issue 5, Nov 2015, 498-503参照）については、当該位置のアミノ酸は、チロシンへと置換されてもよい。
【００５４】
（相同性領域について）
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のＧＤＨをアライメントしたときに、該２以上のＧＤＨにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
【００５５】
また、２以上のＧＤＨにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてＢｌｏｓｕｍ６２を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
【００５６】
本明細書において「相同性領域」とは、２以上のＧＤＨをアライメントしたときに、ある基準となるＧＤＨと比較対象のＧＤＨの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が７０％以上であるＧＤＨをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるＭｕｃｏｒ属ＧＤＨを基準として第３１位〜４１位は同一又アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるＭｕｃｏｒ属ＧＤＨを基準として５８〜６２位、７１〜８５位、１０６〜１１６位、１１９〜１２７位、１３２〜１３４位、１３６〜１４４位、１５０〜１５７位、１６７〜１７１位、２１９〜２２５位、２５３〜２６２位、２７７〜２８１位、３０１〜３０３位、３０５〜３１２位、３１４〜３１９位、３２４〜３２６位、３３２〜３３７位、３３９〜３４６位、３４８〜３５４位、３８８〜３９４位、４１５〜４１７位、４５４〜４５６位、４７８〜４８４位、４８６〜４９１位、５０８〜５１１位、５６４〜５７９位、５８４〜５８６位、５９２〜６０５位、６０７〜６１７位、及び６２５〜６３０位は相同性領域に該当しうる。
【００５７】
ある実施形態において、ＧＤＨの相同性領域は、配列番号１で示されるＭｕｃｏｒ属ＧＤＨを基準として、３２〜３８位、５８〜６２位、７６〜８２位、１０６〜１０９位、１１１〜１１６位、１１９〜１２６位、１３２〜１３４位、１３６〜１４４位、１５０〜１５３位、１６７〜１７１位、２２２〜２２５位、２５３〜２６２位、２７７〜２８１位、３０１〜３０３位、３０５〜３１２位、３１４〜３１９位、３２４〜３２６位、３３２〜３３７位、３３９〜３４６位、３４８〜３５４位、３８８〜３９０位、４１５〜４１７位、４５４〜４５６位、４７８〜４８２位、４８６〜４９１位、５０８〜５１１位、５６４〜〜５６７位、５７０〜５７９位、５８４〜５８６位、５９２〜５９５位、５９７〜５９９位、６０１〜６０４位、６０７〜６０９位、６１１〜６１７位、及び６２５〜６３０位のアミノ酸配列からなる領域である。
【００５８】
ある実施形態において、ＧＤＨの相同性領域は、配列番号１で示されるＭｕｃｏｒ属ＧＤＨを基準として、３２〜３４位、５８〜６２位、１０６〜１０９位、１１１〜１１６位、１１９〜１２６位、１３２〜１３４位、１３６〜１４４位、１５０〜１５３位、１６７〜１７１位、２２２〜２２５位、２５３〜２６２位、２７７〜２８１位、３０１〜３０３位、３０５〜３１２位、３１４〜３１９位、３２４〜３２６位、３３２〜３３７位、３３９〜３４６位、３８８〜３９０位、４１５〜４１７位、４５４〜４５６位、４８６〜４９１位、５０８〜５１１位、５６４〜５６７位、５７０〜５７４位、５８４〜５８６位、５９２〜５９４位、５９７〜５９９位、６０１〜６０４位、６０７〜６０９位、６１１〜６１７位、及び６２５〜６３０位のアミノ酸配列からなる領域である。
【００５９】
本発明のＧＤＨは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＧＤＨとアライメントしたときに５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を有する。さらに、本発明のＧＤＨ変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１における相同性領域のアミノ酸配列と８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有する。
【００６０】
（さらなる置換）
（ＧＤＨの熱安定性を向上させるアミノ酸置換について）
本発明者らは、ＧＤＨのアミノ酸残基を置換することによりその熱安定性を向上させることができることを以前に報告した（例えば国際公開２０１２／１６９５１２号を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。本発明のＧＤＨは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
【００６１】
ＧＤＨの基質特異性を変化させる又は熱安定性を向上させるアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置に対応する位置へのアミノ酸の置換が挙げられる。  
（ａ）２３２位
（ｂ）３８７位
（ｃ）５４５位
場合により（ａ）２３２位に対応する位置のアミノ酸は、アラニン、メチオニン、システイン、グルタミン又はグルタミン酸へと置換されてもよい。  
場合により（ｂ）３８７位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸はアラニン、バリン、グリシン、セリン又はシステインへと置換されてもよい。  
場合により（ｃ）５４５位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はバリン、トレオニン、セリン、プロリン、アラニン、チロシン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン又はグルタミン酸へと置換されてもよい。
【００６２】
また、ＧＤＨのアミノ酸残基を置換することによりその熱安定性が向上することができることを以前に報告した（例えば国際公開２０１５／０９９１１２号を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。本発明のＧＤＨは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
【００６３】
ＧＤＨの熱安定性を向上させるアミノ酸置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置に対応する位置へのアミノ酸の置換が挙げられる。  
（ｄ）６６位
（ｅ）６８位
（ｆ）８８位
（ｇ）１５８位
（ｈ）２３３位
（ｉ）３８５位
（ｊ）３９１位
（ｋ）５５７位
（ｌ）５５９位
場合により（ｄ）６６位に対応する位置のアミノ酸は、チロシンへと置換されてもよい。場合により（ｅ）６８位に対応する位置のアミノ酸は、グリシンへと置換されてもよい。場合により（ｆ）８８位に対応する位置のアミノ酸は、アラニンへと置換されてもよい。場合により（ｇ）１５８位に対応する位置のアミノ酸は、ヒスチジンへと置換されてもよい。  
場合により（ｈ）２３３位に対応する位置のアミノ酸は、アルギニンへと置換されてもよい。  
場合により（ｉ）３８５位に対応する位置のアミノ酸は、トレオニンへと置換されてもよい。  
場合により（ｊ）３９１位に対応する位置のアミノ酸は、イソロイシンへと置換されてもよい。  
場合により（ｋ）５５７位に対応する位置のアミノ酸は、バリンへと置換されてもよい。場合により（ｌ）５５９位に対応する位置のアミノ酸は、リシンへと置換されてもよい。
【００６４】
（ＧＤＨの比活性を向上させるアミノ酸置換について）
本発明者らは、ＧＤＨのアミノ酸残基を置換することによりその熱安定性を向上させることができることを以前に報告した（例えば国際公開２０１５／１２９４７５号を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。本発明のＧＤＨは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
【００６５】
ＧＤＨの比活性を向上させるアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置に対応する位置へのアミノ酸の置換が挙げられる。  
（ｍ）８８位
（ｎ）５５４位
場合により（ｍ）８８位に対応する位置のアミノ酸は、アラニンへと置換されてもよい。場合により（ｎ）５５４位に対応する位置のアミノ酸は、アスパラギン酸へと置換されてもよい。
【００６６】
（本発明のフラビン結合型ＧＤＨの酵素化学的特徴）
ある実施形態において、本発明のＧＤＨは以下の性質を有する。    
作用：グルコース脱水素酵素活性を示し、メディエーターの不在下で酵素から電極への直接電子移動が可能である、
分子量：タンパク質のポリペプチド鎖部分の一次配列に基づく推定分子量が約７０ｋＤａであるか又はＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定したときの分子量が約８０ｋＤａである、
基質特異性：Ｄ−グルコースに対する反応性と比較して、マルトース、及びＤ−キシロースに対する反応性が低い、
補因子特性：フラビン結合型であり、かつ、分子内に、例えば分子内の特定領域に、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。
【００６７】
ある実施形態では、本発明のＧＤＨはさらに、Ｄ−グルコースに対する反応性と比較して、Ｄ−ガラクトースに対する反応性が低い。本明細書においてＤ−グルコースに対する反応性と比較して、ある糖に対する反応性が低いとは、Ｄ−グルコースに対する活性を１００％とした場合に、当該糖に対する活性が５％未満、例えば４％未満、３％未満、２％未満、例えば１．５％未満であることをいう。
【００６８】
分子量は、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１１（ゼネティックス社製）やＥｘＰＡＳｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｏｍｐｕｔｅ＿ｐｉ／）等のプログラムを用いて、一次配列情報から算出する、あるいはＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定することができる。例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．１１を用いて算出する場合、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨの一次配列に基づく推定分子量は、７０ｋＤａである。また、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で測定する場合、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するフラビン結合型ＧＤＨの分子量は、約８０ｋＤａである。
【００６９】
ある実施形態において本発明は、グルコースデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを提供する。ある実施形態において本発明は配列番号１２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、又は配列番号１３に示す塩基配列を有するＤＮＡを提供する。ある実施形態において本発明は、配列番号１３に示す塩基配列と６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有し、かつ、メディエーターの不在下で直接電子移動が可能なグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。
【００７０】
（ＧＤＨ遺伝子）
ＧＤＨをコードする遺伝子を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、ＧＤＨ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００７１】
次いで、上記ＧＤＨのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成し、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからＧＤＨ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、ＧＤＨをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のＧＤＨ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
【００７２】
このようにして得られたＧＤＨをコードする遺伝子の例として、Ｍｕｃｏｒ属由来のＧＤＨ遺伝子（特許第４６４８９９３号に記載のもの）が挙げられる。この遺伝子を改変したものを用いてもよく、例えば国際公開第２０１２／１６９５１２号及び国際公開第２０１５／０９９１１２号に記載の改変遺伝子などが挙げられる。
【００７３】
これらのＧＤＨ遺伝子は、各種ベクターに連結または挿入してもよく、染色体やゲノムに組み入れてもよい。ベクターを用いる場合、ベクターへのクローニングには、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）やＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）などの市販のキット；ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（ストラタジーン社）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌  ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）や大腸菌  ＤＨ５α株（タカラバイオ社）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）などを用いて精製する。
【００７４】
（ＧＤＨ遺伝子の変異処理）
公知のＧＤＨから出発し、本発明のＧＤＨを取得する方法として、出発ＧＤＨ遺伝子に変異を導入し、各種の変異遺伝子から発現されるＧＤＨについて、酵素科学的性質を指標に選択又はスクリーニングを行うことができる。
【００７５】
出発ＧＤＨ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ＧＤＨ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；タンパク質工学的手法；またはこれらの組み合わせ等を広く用いることができる。
【００７６】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
【００７７】
上記接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件をとることが可能であり、現実に所望の変異をＧＤＨ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、ｐ２４〜３０、１９８９年６月号）。
【００７８】
タンパク質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，９４４１（１９８４）：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）：  Ｇｅｎｅ，３７，７３（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，８７４９（１９８５）：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３，８７６５（１９８５）：  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１４，９６７９（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２，４８８（１９８５）：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））等が挙げられる。ＤＮＡ中の塩基配列を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；  Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社，ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製，  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ；  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製など）の利用が挙げられる。
【００７９】
また、一般的なＰＣＲ法（ポリメラーゼチェインリアクション、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１，１１（１９８９））。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変ＧＤＨ遺伝子を合成することもできる。
【００８０】
上記方法により得られるＧＤＨ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定もしくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行うことができる。
【００８１】
（本発明のＧＤＨ遺伝子が挿入されたベクターおよび宿主細胞）
上述のように得られた本発明のＧＤＨ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、又は原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主細胞を常法により、形質転換又は形質導入をすることができる。
【００８２】
原核宿主細胞の一例としては、エッシェリシア属に属する微生物、例えば大腸菌Ｋ−１２株、エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５α、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００等（いずれもタカラバイオ社製）が利用でき、それらを形質転換し、または、それらに形質導入して、ＤＮＡが導入された宿主細胞（形質転換体）を得る。宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばＥＣＯＳ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  エシェリヒア・コリーＢＬ２１（ＤＥ３）；ニッポンジーン製）を用いても良い。
【００８３】
なお本発明者らは、天然ＧＤＨのＮ末端シグナルペプチドを欠失させることにより、大腸菌等の微生物を宿主とした際に、その生産性を向上させうることを確認している（例えば国際公開２０１２／１６９５１２号を参照）。大腸菌等の微生物を宿主とする場合には、本発明のＧＤＨは場合によりさらにＮ末端シグナルペプチドを欠失させることができる。
【００８４】
配列番号１で示されるＭｕｃｏｒ属ＧＤＨのＮ末端シグナルペプチドは、配列番号１における１〜２０位のペプチドである。２０位のアラニンと２１位のグルタミンの間で切断が生じる。このポリペプチドからＮ末端シグナルペプチドを欠失させるには、２０位のアラニンをコードするコドンまたは２１位のグルタミンをコードするコドンを開始コドンに置換してもよい。配列番号１と配列同一性を有する他のＧＤＨの、配列番号１の２０位または２１位に対応する位置についても同様である。
【００８５】
また、例えば、真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、分泌シグナル配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５，  ２５５−２６９（１９９５））やエレクトロポレーション（Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５５  （２００３）４８１−４８４）等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えば良い。
【００８６】
また、例えば、真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属やトリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属のような糸状菌が挙げられる。糸状菌の形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、ＧＤＨをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法が挙げられる。具体的には、ＧＤＨをコードする遺伝子を発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いでＧＤＨをコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主糸状菌を形質転換することにより、ＧＤＨをコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主糸状菌を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター−ＧＤＨをコードする遺伝子−ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
【００８７】
ＧＤＨをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主糸状菌内に導入する手法などが挙げられる。
【００８８】
相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主糸状菌のゲノム中に挿入することができる。自身の高発現プロモーター制御下で宿主糸状菌内で過剰発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域などが挙げられる。
【００８９】
ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、糸状菌の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主糸状菌を常法により形質転換することができる。
【００９０】
そのような、好適なベクター−宿主系としては、宿主糸状菌中でＧＤＨを生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２１８，  ９９−１０４，  １９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
【００９１】
ＤＮＡコンストラクトは宿主糸状菌の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９，  １１３３  （１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
【００９２】
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢ、オリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞中でＧＤＨをコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
【００９３】
ＤＮＡコンストラクトにおいて、ＧＤＨをコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入するＧＤＨをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
【００９４】
ＤＮＡコンストラクトの一実施態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、ＧＤＨをコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
【００９５】
糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主糸状菌のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２１８，  ９９−１０４，  １９８９、特開２００７−２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換糸状菌を再生させるための培地は、用いる宿主糸状菌と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主糸状菌としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換糸状菌の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社）で行うことができる。
【００９６】
また、例えば、本発明の形質転換糸状菌を得るために、相同組換えを利用して、宿主糸状菌が本来染色体上に有するＧＤＨをコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開２０１１−２３９６８１に記載の実施例１や図１を参照して、ＧＤＨをコードする遺伝子の上流領域−形質転換マーカー遺伝子−高発現プロモーター−ＧＤＨをコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、ＧＤＨをコードする遺伝子の上流領域及びＧＤＨをコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。ＧＤＨをコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好ましい。
【００９７】
本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、ＧＤＨの酵素活性が認められる条件下で本発明の形質転換糸状菌を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるＧＤＨの活性を確認することにより行うことができる。
【００９８】
また、本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、形質転換糸状菌から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。
【００９９】
例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【０１００】
（本発明のＧＤＨを生産する宿主細胞の選抜）
本発明のＧＤＨを生産する形質転換糸状菌を効率よく選抜するためには、例えば、次のような方法を用いてもよい。得られた宿主細胞（形質転換体）がコロニーを形成した０．５％寒天を含む最少培地からコロニーをＤＰＹ液体培地（１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０）に植菌し、３日間で振とう培養を行う。得られた培養上清液を、ＧＤＨが作用すれば発色または変色する組成とした反応液（グルコース、ＤＣＩＰまたはシトクロムｃを含む１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０））と混合し、ＤＣＩＰ由来紫色またはシトクロムｃ由来赤褐色の変色の度合を観察する。電子移動にＰＭＳ等のメディエーターを必要とするＧＤＨの場合、メディエーターの存在しない反応液では変色する度合が少ないが、電子移動特性が改変された本発明のＧＤＨ、例えば直接電子移動が可能なＧＤＨの場合は、反応液の変色する度合が多くなる。これを利用し、野生型ＧＤＨ生産株が混合された反応液の変色度合との比較により、電子移動特性が改変されたＧＤＨ、例えば直接電子移動が可能なＧＤＨを生産する形質転換体を選抜しうる。
【０１０１】
また、本発明のＧＤＨを生産する形質転換大腸菌を効率よく選抜するためには、例えば、次のような方法を用いてもよい。得られた宿主細胞（形質転換体）がコロニーを形成したＬＢ寒天培地から、滅菌したビロード生地等で新しい寒天培地にレプリカを数枚とり、培養する。レプリカをとった寒天培地のコロニーが十分な大きさになったら、リゾチーム等の溶菌剤に浸した膜を培地に重ねて、室温で１時間ほど静置し、溶菌させる。このとき、溶菌した粗酵素液が膜に吸着する。
【０１０２】
次いで、粗酵素液を吸着させた前記の膜を、３５℃、１分〜１時間静置した後、ＧＤＨが作用すれば変色する組成とした反応液（グルコース、ＤＣＩＰまたはシトクロムｃを含む１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に浸した膜と重ね合わせ、ＤＣＩＰ由来紫色またはシトクロムｃ由来赤褐色の変色の度合を観察する。電子移動にＰＭＳ等のメディエーターを必要とするＧＤＨの場合、メディエーターの存在しない反応液ではコロニーが変色する度合が少ないが、電子移動特性が改変された本発明のＧＤＨ、例えば直接電子移動が可能なＧＤＨの場合は、コロニーが変色する度合が多くなる。これを利用し、野生型ＧＤＨ生産株のコロニーの変色度合との比較により、電子移動特性が改変されたＧＤＨ、例えば直接電子移動が可能なＧＤＨを生産する形質転換体を選抜しうる。
【０１０３】
必要に応じ、このように見出した電子移動特性が改変されたＧＤＨをコードする遺伝子に対して、さらに変異導入を繰り返し行うことにより、一層優れた改変ＧＤＨ及びその生産能を有する形質転換体を得ることもできる。
【０１０４】
（ハイスループットスクリーニング）
ＧＤＨはさらに、機能性ＧＤＨ変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したＧＤＨ遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、または液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ（例えばＣｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０５  （１１）：  ４０５６−７２，  ２００５）、イーストディスプレイ（例えばＣｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．  ２００８；１１（２）：  １２７−３４）、バクテリアルディスプレイ（例えばＣｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １７：  ４７４−８０，  ２００７）等を用いて、変異ＧＤＨの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またＡｇｒｅｓｔｉ  ｅｔ  ａｌ，  “Ｕｌｔｒａｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｄｒｏｐ−ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０７  （９）：  ４００４−４００９  （Ｍａｒ，  ２０１０）を参照のこと。ＧＤＨバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンＰＣＲ法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の領域や位置又はそれらに対応する領域や位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントＥＢＹ−１００細胞等の適当な細胞を形質転換し、約１０の７乗の変異体を取得しうる。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン（ＰＤＭＳ）マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際にはＧＤＨ活性の有無を利用しうる。これには例えば上記のＧＤＨが作用すれば発色または変色する組成とした反応液を用いてもよい。例えばシトクロムｃを用いる場合は、９６ウェルプレート、１９２ウェルプレート、３８４ウェルプレート、９６００ウェルプレート等及びプレートリーダーを用いて５５０ｎｍの吸光度を測定してもよい。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
【０１０５】
（本発明のＧＤＨの製造）
本発明のＧＤＨは、上述のように取得した本発明のＧＤＨを生産する宿主細胞を培養し、前記宿主細胞中に含まれるＧＤＨ遺伝子を発現させ、次いで、前記培養物からＧＤＨタンパク質を単離することにより製造すればよい。
【０１０６】
微生物宿主細胞を培養する際は、１０〜４２℃の培養温度、好ましくは２５℃前後の培養温度で数時間〜数日間、さらに好ましくは２５℃前後の培養温度で好ましくは１〜７日間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施すればよい。糸状菌を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。また、上記微生物宿主細胞を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【０１０７】
培養条件は、当業者により通常知られる糸状菌の培養条件を採用すればよく、例えば、培地の初発ｐＨは５〜１０に調整し、培養温度は２０〜４０℃、培養時間は数時間〜数日間、好ましくは１〜７日間、より好ましくは２〜５日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるＤＰＹ培地を用いた、３０℃、１６０ｒｐｍでの３〜５日間の振盪培養が挙げられる。
【０１０８】
培養終了後、該培養物より本発明のＧＤＨを採取する。これには、通常の公知の酵素採取手段を用いればよい。例えば、培地上清画分を回収するか、または、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、又はリゾチームやヤタラーゼ等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、又はトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、本発明のＧＤＨの粗酵素を得る。
【０１０９】
本発明のＧＤＨの粗酵素を、公知の任意の手段を用いてさらに精製することもできる。精製された酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、ウルトロゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲルろ過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、又はこれらを組み合わせて実施することにより、精製された本発明のＧＤＨ酵素標品を得ることができる。
【０１１０】
（本発明のＧＤＨの活性測定）
本発明のＧＤＨは、グルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。
【０１１１】
本発明のＧＤＨの活性は、この作用原理を利用し、例えば、電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及び２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を用いた以下の測定系を用いて測定することができる。
（反応１）  Ｄ−グルコ−ス  ＋  ＰＭＳ（酸化型）
→  Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン  ＋  ＰＭＳ（還元型）
（反応２）  ＰＭＳ（還元型）  ＋  ＤＣＩＰ（酸化型）
→  ＰＭＳ（酸化型）  ＋  ＤＣＩＰ（還元型）
【０１１２】
具体的には、まず、（反応１）において、Ｄ−グルコースの酸化に伴い、ＰＭＳ（還元型）が生成する。続いて進行する（反応２）により、ＰＭＳ（還元型）が酸化されるのに伴ってＤＣＩＰが還元される。この「ＤＣＩＰ（酸化型）」の消失度合を波長６００ｎｍにおける吸光度の変化量として検知し、この変化量に基づいて酵素活性を求めることができる。
【０１１３】
具体的には、ＧＤＨの活性は、以下の手順に従って測定することができる。１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）  ２．０５ｍＬ、１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液  ０．６ｍＬおよび２ｍＭ  ＤＣＩＰ溶液  ０．１５ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、１５ｍＭ  ＰＭＳ溶液  ０．１ｍＬ及び酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いＧＤＨ活性を算出する。この際、ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度２００ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
【数１】
2017073786.tif 000003
【０１１４】
なお、式中の３．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは１００ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍数を表す。
【０１１５】
（本発明のＧＤＨを用いたグルコース測定方法）
ある実施形態において本発明は、本発明のＧＤＨを含むグルコースアッセイキットを提供する。このキットを用いることにより、本発明のＧＤＨを用いて血中のグルコース（血糖値）を測定することができる。測定は連続的に行ってもよい。
【０１１６】
本発明のグルコースアッセイキットは、少なくとも１回のアッセイに十分な量の本発明のＧＤＨを含む。典型的には、本発明のグルコースアッセイキットは、本発明のＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに指針を含む。ある実施形態において、本発明のグルコースアッセイキット、例えばＳＭＢＧ用、ＣＧＭ用、またはＦＧＭ用のグルコースアッセイキットはメディエーターを含む。ある実施形態において、本発明のグルコースアッセイキット、例えばＳＭＢＧ用、ＣＧＭ用、またはＦＧＭ用のグルコースアッセイキットはメディエーターを含まなくともよい。本発明のＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、ビーズや電極表面に固定化された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【０１１７】
グルコース濃度の測定は、比色式グルコースアッセイキットの場合は、例えば、以下のよう行うことができる。グルコースアッセイキットの反応層にはＧＤＨ、そして反応促進剤としてＮ−（２−アセトアミド）イミド２酢酸（ＡＤＡ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、炭酸ナトリウムおよびイミダゾールからなる群より選ばれる１以上の物質を含む液状もしくは固体状の組成物を保持させておく。ここで、必要に応じてｐＨ緩衝剤、発色試薬（変色試薬）を添加する。ここにグルコースを含む試料を加え、一定時間反応させる。この間、ＧＤＨより電子を直接受け取ることによって重合し生成する色素もしくは還元された色素の最大吸収波長に相当する吸光度をモニタリングする。レート法であれば、吸光度の時間あたりの変化率から、エンドポイント法であれば、試料中のグルコースがすべて酸化された時点までの吸光度変化から、予め標準濃度のグルコース溶液を用いて作製したキャリブレーションカーブを元にして、試料中のグルコース濃度を算出することができる。
【０１１８】
この方法において使用できる発色試薬（変色試薬）としては、たとえば２，６−ジクロロインドフェノール（ＤＣＩＰ）を電子受容体として添加し、６００ｎｍにおける吸光度の減少をモニタリングすることでグルコースの定量が可能である。また、発色試薬としてニトロテトラゾリウムブルー（ＮＴＢ）を加え、５７０ｎｍ吸光度を測定することにより生成するジホルマザンの量を決定し、グルコース濃度を算出することが可能である。なお、いうまでもなく、使用する発色試薬（変色試薬）はこれらに限定されない。
【０１１９】
（本発明のＧＤＨを含むグルコースセンサー）
ある実施形態において本発明は、本発明のＧＤＨを用いるグルコースセンサーを提供する。電極としては、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明のＧＤＨ酵素を塗布または固定化することができる。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、ポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングする。
【０１２０】
本発明のＧＤＨは、ポテンショスタットやガルバノスタットなどを用いることにより、種々の電気化学的な測定手法に適用することができる。電気化学的測定法としては、アンペロメトリー、ボルタンメトリー、ポテンショメトリー、クーロメトリーなどの様々な手法が挙げられる。例えばアンペロメトリー法により、グルコースが還元される際の電流を測定することで、試料中のグルコース濃度を算出することができる。印加電圧は条件や装置の設定にもよるが、例えば―１０００ｍＶ〜＋１０００ｍＶ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）などとすることができる。
【０１２１】
グルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。作用電極として本発明のＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【０１２２】
具体的な例としては、グラッシーカーボン（ＧＣ）電極に本発明の０．２Ｕ〜１５０Ｕより好ましくは、０．５Ｕ〜１００ＵのＧＤＨを固定化し、グルコース濃度に対する応答電流値を測定する。電解セル中に、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１０．０ｍｌを添加する。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して＋５００ｍＶを印加する。これらの系に１Ｍ  Ｄ−グルコース溶液を終濃度が５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭになるよう添加し、添加ごとに定常状態の電流値を測定する。この電流値を既知のグルコース濃度（５、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ）に対してプロットし、検量線が作成する。これより本発明のグルコース脱水素酵素を使用した酵素固定化電極でグルコースの定量が可能となる。
【０１２３】
さらに電気化学測定のために印刷電極を用いることもできる。これにより測定に必要な溶液量を低減することができる。この場合、電極は絶縁基板上に形成されてなることが好ましい。具体的には、フォトリゾグラフィ技術や、スクリーン印刷、グラビア印刷、フレキソ印刷などの印刷技術により、電極を基板上に形成させることが望ましい。また、絶縁基板の素材としては、シリコン、ガラス、セラミック、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステルなどが挙げられるが、各種の溶媒や薬品に対する耐性の強いものを用いるのがより好ましい。
【０１２４】
メディエーターについて
本発明の測定方法、キット、装置及びセンサーには、メディエーター（人工電子メディエーター、人工電子アクセプター、電子メディエーターともいう）を用いることもできる。メディエーターは、本発明のＧＤＨから電子を受け取ることができるものであれば特に限定されない。メディエーターとしてはキノン類、フェナジン類、ビオロゲン類、シトクロム類（例えば、シトクロムｂ、シトクロムｃ）、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェリシアン化物、例えばフェリシアン化カリウム、フェレドキシン類、フェロセン、オスミウム錯体、およびその誘導体等などが挙げられ、フェナジン化合物としては例えばＰＭＳ、メトキシＰＭＳが挙げられるがこれに限定されない。
【０１２５】
ある実施形態において、本発明のＧＤＨは、アミノ酸置換を有し、電子移動特性が改変されている。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ある実施形態では、本発明のＧＤＨは導入された置換アミノ酸を介して、ＧＤＨ酵素から別の電子受容物質への電子移動が容易となっていると考えられる。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ある実施形態では、本発明のＧＤＨに導入されたヒスチジンは金属イオンと相互作用し、ＧＤＨ酵素から別の電子受容物質又は電極への電子移動を促進している可能性があると考えられる。また、カーボン電極の表面電荷は中性〜塩基性において、負電荷を帯びていることが知られている（特開平８−５６００号参照）。したがって、特定の理論に拘束されることを望むものではないが、酵素の活性部位付近に正電荷であるアルギニンやリジン、ヒスチジンが存在すると、静電的相互作用により電極とこれらのアミノ酸の距離が近づきうる。その結果、電極と酵素の活性部位の距離も短くなり、酵素から電極への電子移動が促進される可能性が考えられる。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ある実施形態では、本発明のＧＤＨに導入されたアスパラギン酸は当該アスパラギン酸付近の領域の電子密度を高め、ＧＤＨ酵素から別の電子受容物質又は電極への電子移動を促進している可能性があると考えられる。同様の効果はグルタミン酸についても期待される。ある実施形態において、本発明のＧＤＨ酵素から別の電子受容物質への電子移動は、改変前の酵素の場合と比較して、より低濃度のメディエーターの存在下でも可能である。ある実施形態において、本発明のＧＤＨ酵素から別の電子受容物質への電子移動は、メディエーターの不在下でも可能である。ある実施形態において、本発明のＧＤＨ酵素は酵素から電極への直接電子移動が可能である。
【０１２６】
ある実施形態において、本発明のＧＤＨ酵素から別の電子受容物質への電子移動は、改変前の酵素の場合に困難であった種類のメディエーターでも可能である。例えばルテニウム化合物は、ｍＰＭＳ等の第２のメディエーターとの共存下でなければ従来のグルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコース測定においてグルコース濃度依存的な応答電流が生じない（特開２０１３−０８３６３４参照）。本発明の電子移動特性が改変されたＧＤＨは、ｍＰＭＳ等の第２のメディエーターを用いることなく、ルテニウム化合物と組み合わせてグルコース測定に使用することができる。別の例としては、本発明の電子移動特性が改変されたＧＤＨは、ｍＰＭＳ等の第２のメディエーターを用いることなく、シトクロムｃと組み合わせてグルコース測定に使用することができる。
【０１２７】
本発明の電子移動特性が改変されたＧＤＨは、従来のＧＤＨと同じ用途に使用することができる。また、本発明のＧＤＨは、試料中のグルコース濃度測定に使用することができ、これは例えば糖尿病の診断や血糖値の自己モニタリングに役立てることができる。また、本発明のＧＤＨは酵素電極として使用することができ、これは種々の電気化学的測定に用いることができる。また、本発明のＧＤＨは酵素センサーとして使用することができる。また、本発明のＧＤＨはグルコース測定キットやグルコースセンサーに利用することができる。これは例示であり、本発明の改変ＧＤＨの用途はこれに限られない。
【０１２８】
以下の実施例により、本発明をさらに例証する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０１２９】
［実施例１］
１．Ｍｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ遺伝子の宿主への導入とＧＤＨ活性の確認
大まかに説明すると、まずＭｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ、配列番号１）にＮ６６Ｙ／Ｎ６８Ｇ／Ｃ８８Ａ／Ｑ２３３Ｒ／Ｔ３８７Ｃ／Ｅ５５４Ｄ／Ｌ５５７Ｖ／Ｓ５５９Ｋの各変異を導入した改変ＧＤＨ（以下、本明細書においてＭｐＧＤＨ−Ｍ１ということがある）をコードする遺伝子を取得した。ＭｐＧＤＨ−Ｍ１のアミノ酸配列は配列番号１０に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号１１に示す。プラスミドｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトに対象遺伝子であるＭｐＧＤＨ−Ｍ１遺伝子を常法により挿入させたＤＮＡコンストラクトを作製した。具体的には、ｐＵＣ１９は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）に付属されているｐＵＣ１９  ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒを用いた。ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅにて、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１遺伝子を、上記したＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用して、キットに添付されたプロトコールに従って連結して、コンストラクト用プラスミド（ｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１）を得た。【０１３０】
得られた組換え体プラスミドｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１を鋳型として、配列番号１５、１６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。【０１３１】
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるＭｐＧＤＨ−Ｍ１遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、８分」のサイクルを３０回繰り返した。【０１３２】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約８，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地［１％（Ｗ／Ｖ）  バクトトリプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ペプトン、０．５％（Ｗ／Ｖ）  ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ］２．５ｍｌに接種して、３７℃で２０時間振とう培養し、培養物を得た。この培養物を７，０００ｒｐｍで、５分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。次いで、この菌体よりＱＩＡＧＥＮ  ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドを抽出して精製し、ＤＮＡ２．５μｇを得た。該プラスミド中のＭｐＧＤＨ−Ｍ１をコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌジェネティックアナライザ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の４６４位のチロシン、４７０位のバリン、及び４７２位のロイシンを全てシステインに置換した三重変異体であるＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ（配列番号１２）をコードするＤＮＡコンストラクトを得た（配列番号１３）。【０１３３】
この遺伝子をコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ；  アスペルギルス・ソーヤ）で発現させ、そのＧＤＨ活性を評価した。【０１３４】
具体的には、Ｍｕｃｏｒ属由来ＧＤＨ遺伝子を出発物質とし、これを改変して本発明のＧＤＨを取得することを目的として、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ；  アスペルギルス・ソーヤ）での組換え発現に適したＧＤＨ遺伝子を設計した。具体的には、配列番号１のＧＤＨの遺伝子配列を元に、そのコドン使用頻度を宿主に適合させた遺伝子配列を設計し、該遺伝子を全合成した。この全合成したＤＮＡの配列を配列番号２に示す。【０１３５】
Ｄｏｕｂｌｅ−ｊｏｉｎｔ  ＰＣＲ（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００４年，第４１巻，ｐ９７３−９８１）を行い、５’アーム領域〜ＰｙｒＧ遺伝子（ウラシル栄養要求性マーカー）〜ＴＥＦ１プロモーター遺伝子〜フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子〜３’アーム領域から成るカセットを構築し、下記の手順でアスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）の形質転換に用いた。５００ｍｌ容三角フラスコ中の２０ｍＭウリジンを含むポリペプトンデキストリン液体培地１００ｍｌに、アスペルギルス・ソーヤＮＢＲＣ４２３９株由来ｐｙｒＧ破壊株の分生子を接種し、３０℃で約２０時間振とう培養を行った後、菌体を回収した。回収した菌体からプロトプラストを調製した。得られたプロトプラスト及び２０μｇの対象遺伝子挿入ＤＮＡコンストラクトを用いて、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、次いで０．５％（ｗ／ｖ）寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社；ｐＨ６）を用いて、３０℃、５日間以上インキュベートし、コロニー形成能があるものとして形質転換アスペルギルス・ソーヤを得た。【０１３６】
得られた形質転換アスペルギルス・ソーヤは、ウリジン要求性を相補する遺伝子であるｐｙｒＧが導入されることにより、ウリジン無添加培地に生育できるようになることで、目的の遺伝子が導入された株として選択できた。得られた菌株の中から目的の形質転換体を、ＰＣＲで確認して選抜した。【０１３７】
ＭｐＧＤＨ−Ｍ１もしくはＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃの遺伝子により形質転換した形質転換アスペルギルス・ソーヤを用いて、それぞれのＧＤＨ生産を行った。【０１３８】
２００ｍｌ容三角フラスコ中のＤＰＹ液体培地（１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、２％（ｗ／ｖ）デキストリン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０；ｐＨ未調整）４０ｍｌに、各菌株の分生子を接種し、３０℃で４日間、１６０ｒｐｍで振とう培養を行った。次いで、培養後の培養物から菌体をろ過し、得られた培地上清画分をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５，  ３０Ｋ  ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で１０ｍＬまで濃縮し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、ＧＤＨ活性を示す画分を回収し、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１もしくはＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃの精製標品を得た。【０１３９】
クロノアンペロメトリー
ＭｐＧＤＨ−Ｍ１もしくはＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃの精製酵素を用いて、印刷電極測定によるクロノアンペロメトリーを行った。具体的には、グラッシーカーボンの作用電極、銀塩化銀の参照電極が印刷されてなる、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極（丸形・カーボン・ダムリング付き；バイオデバイステクノロジー社製）上に、終濃度約１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び１３５Ｕの精製酵素ＭｐＧＤＨ−Ｍ１液または１２８Ｕの精製酵素ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ液を１５μＬに溶解した液を載せた。その後、ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ専用コネクターを用いて、ＡＬＳ  電気化学アナライザー  ８１４Ｄ（ＢＡＳ社製）に接続した。そして、＋３００ｍＶもしくは＋５００ｍＶ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を印加して、１００ｍＭグルコース溶液５μＬを電極上に載せて反応を行い、１２０秒間の電流値を測定した。【０１４０】
結果を図２及び３に示す。図２はシステイン残基を導入していないＭｐＧＤＨ−Ｍ１酵素のクロノアンペロメトリー測定結果である。３００ｍＶ及び５００ｍＶのいずれの場合についてもグルコースの有無により応答電流に有意の差は見られなかった。図３はシステイン残基を導入した三重変異体ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ酵素のクロノアンペロメトリー測定結果である。＋３００ｍＶ及び＋５００ｍＶ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）のいずれの場合についてもグルコースを添加した場合に有意に高い応答電流が見られた。＋３００ｍＶ（ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）の印加電圧でも測定開始から１２０秒後において応答電流が３１ｎＡと高い値が示された。【０１４１】
基質特異性が維持されていることの確認試験
ＭｐＧＤＨ−Ｍ１酵素は基質特異性が高く、Ｄ−グルコースに対する反応性と比較して、マルトース及びＤ−キシロースに対する反応性が低い。ＭｐＧＤＨ−Ｍ１酵素に三重変異Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃを導入しても、このような高い基質特異性が維持されているか確認した。ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃは、Ｄ−グルコースに対する活性を１００％とした場合に、マルトース、Ｄ−キシロースに対する活性は、それぞれ１．１％、１．０％であった。したがって、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１に三重変異Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃを導入した本発明のＧＤＨは高い基質特異性を示し、Ｄ−グルコースに対する高い反応性を示す一方で、マルトース及びＤ−キシロースに対してほとんど反応性を示さないといえる。【０１４２】
以上より、メディエーターの不在下でも応答電流が観察されたことから、本発明のＧＤＨはグルコースをグルコノラクトンへ酸化するときに、酵素から電極へと直接電子を受け渡していると考えられる。このようにシトクロムドメインを有しないＧＤＨにアミノ酸置換を導入することのみで、酵素から電極への直接電子移動を可能としたＧＤＨやＧＯＤはこれまで報告されていない。【０１４３】
［実施例２］
Ｍｕｃｏｒ属由来ＧＤＨに各種の変異を導入した場合の応答電流測定
実施例１と同様に、組換え体プラスミドｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１を鋳型として、配列番号１７、１８の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応を行い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  ＳＭＫ−１０１、東洋紡社製）に記載の方法により、配列番号１記載のアミノ酸配列の４６４位のチロシンをシステインに置換した変異体であるＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４ＣをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。続いて、実施例１と同様に、この遺伝子をＡ．  ｓｏｊａｅで発現させ、精製標品を得た。【０１４４】
ＭｐＧＤＨ−Ｍ１もしくはＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃの精製酵素を用いて、印刷電極測定によるクロノアンペロメトリーを行った。ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極の作用極上に、８０μｇの精製酵素ＭｐＧＤＨ−Ｍ１を含む溶液または８０μｇの精製酵素ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃを含む溶液を添加した後に、室温で風乾させた。続いて、終濃度２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）／１．５Ｍの塩化カリウム／２０ｍＭグルコース溶液１０μＬを電極上に載せて反応を行い、＋３００ｍＶ  （ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を印加して、６０秒間の電流値を測定した。対照として、グルコースを含まない溶液でも同様に測定を行い、グルコースを含んだ溶液で測定により得られた応答電流からグルコースを含まない溶液で測定により得られた応答電流を差し引いた値で比較した。【０１４５】
その結果、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１酵素の場合、グルコースを含んだ溶液で測定により得られた応答電流からグルコースを含まない溶液で測定により得られた応答電流を差し引いた値は２ｎＡであり、ほとんど差異がみられなかった。一方で、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ酵素の測定結果は、１４ｎＡと高い値が示された。【０１４６】
続いて、上記と同様に、組換え体プラスミドｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１を鋳型として、以下の表中の配列番号の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応を行い、以下の変異体をコードするＤＮＡコンストラクトを得た。
配列番号２１、２２：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｌ４７２Ｃ
配列番号２３、２４：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ｃ
配列番号２５、２６：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｌ４７２Ｃ
配列番号２７、２８：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ
配列番号２９、３０：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｓ
配列番号３１、３２：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ａ
配列番号３３、３４：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄ
配列番号３５、３６：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｔ
配列番号３７、３８：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ａ
配列番号３９、４０：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ｓ
配列番号４１、４２：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ｔ
配列番号４３、４４：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｓ
配列番号４５、４６：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｄ
配列番号５１、５２：ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｈ。【０１４７】
続いて、配列番号４７、４８の合成オリゴヌクレオチドを用いて、ｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄを鋳型にＰＣＲ反応を行い、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｒ／Ｌ４７２ＨをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。また配列番号４９、５０の合成オリゴヌクレオチドを用いて、ｐＵＣ１９−ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄを鋳型にＰＣＲ反応を行い、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２ＨをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。続いて、実施例１と同様に、この遺伝子をＡ．  ｓｏｊａｅで発現させ、精製標品を得た。【０１４８】
上記と同様に、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｌ４７２Ｃ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ｃ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｌ４７２Ｃ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｄ、もしくはＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｈの精製酵素を用いて、印刷電極測定によるクロノアンペロメトリーを行った。ＤＥＰ  Ｃｈｉｐ電極の作用極上に、８０μｇの各精製酵素を含む溶液を添加した後に、室温で風乾させた。続いて、終濃度２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）／１．５Ｍの塩化カリウム／２０ｍＭグルコース溶液１０μＬを電極上に載せて反応を行い、＋３００ｍＶ  （ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）の電圧を印加して、６０秒間の電流値を測定した。対照として、グルコースを含まない溶液でも同様に測定を行い、グルコースを含んだ溶液で測定により得られた応答電流からグルコースを含まない溶液で測定により得られた応答電流を差し引いた値で比較した。ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｌ４７２Ｃ酵素の測定結果は１０ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ｃ酵素の測定結果は１２ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｌ４７２Ｃ酵素の測定結果は１０ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ酵素の測定結果は２０ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｄ／Ｌ４７２Ｄ酵素の測定結果は６３ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｈ／Ｖ４７０Ｈ／Ｌ４７２Ｈ酵素の測定結果は３１ｎＡと高い値が示された。【０１４９】
また上記と同様に、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｌ４７２Ｃ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ａ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｓ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｔ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ａ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ｓ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ｔ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｓ  、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｒ／Ｌ４７２Ｈ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｈの精製酵素を用いて、印刷電極測定によるクロノアンペロメトリーを行った。ただし、印加電圧を＋５００ｍＶ  （ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）とした。【０１５０】
ＭｐＧＤＨ−Ｍ１酵素の測定結果は５ｎＡであったが、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｌ４７２Ｃ酵素の測定結果は２７ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ａ酵素の測定結果は１３ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｓ酵素の測定結果は１６ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄ酵素の測定結果は１２ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｔ酵素の測定結果は２２ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ａ酵素の測定結果は２８ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ｓ酵素の測定結果は１５ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｖ４７０Ｔ酵素の測定結果は９ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｓ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｓ酵素の測定結果は２２ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｒ／Ｌ４７２Ｈ酵素の測定結果は１９ｎＡ、ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｄ／Ｖ４７０Ｓ／Ｌ４７２Ｈ酵素の測定結果は１４４ｎＡと高い値であった。【０１５１】
［実施例３］
ＭｄｒＧＤＨへの変異導入と応答電流測定
Ｍｕｃｏｒ  ＤＲ０５６８６０由来ＧＤＨ（ＭｄｒＧＤＨ）をコードする遺伝子を取得した（国際公開第２０１３／１１８７９８号参照）。ＭｄｒＧＤＨのアミノ酸配列は配列番号４に示し、その遺伝子の塩基配列は配列番号５３に示す。実施例２と同様に、配列番号５４、５５の合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲ反応を行い、配列番号４記載のアミノ酸配列の４６１位のチロシンをシステインに、４６７位のアラニンをシステインに、４６９位のロイシンをシステインに置換した変異体であるＭｄｒＧＤＨ／Ｙ４６１Ｃ／Ａ４６７Ｃ／Ｌ４６９ＣをコードするＤＮＡコンストラクトを得た。続いて、実施例１と同様に、ＭｄｒＧＤＨ及びＭｄｒＧＤＨ／Ｙ４６１Ｃ／Ａ４６７Ｃ／Ｌ４６９Ｃをコードする遺伝子をＡ．  ｓｏｊａｅで発現させ、精製標品を得、応答電流測定を行った。【０１５２】
実施例１と同様に精製酵素ＭｄｒＧＤＨ及びＭｄｒＧＤＨ／Ｙ４６１Ｃ／Ａ４６７Ｃ／Ｌ４６９Ｃを用いて、印刷電極測定によるクロノアンペロメトリーを行った。ただし、１３０μｇの精製酵素を作用極上に風乾させ、印加電圧は＋５００ｍＶ  （ｖｓ．  Ａｇ／ＡｇＣｌ）とし、測定時間は４０秒間とした。【０１５３】
ＭｄｒＧＤＨ酵素の測定結果は１６ｎＡであったが、ＭｄｒＧＤＨ／Ｙ４６１Ｃ／Ａ４６７Ｃ／Ｌ４６９Ｃ酵素の測定結果は２４ｎＡと高い応答電流が観察された。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明のグルコースデヒドロゲナーゼを用いることにより、メディエーターを従来よりも低濃度で使用して、またはメディエーターを使用することなく、グルコース測定を行うことができる。また本発明のグルコースデヒドロゲナーゼはグルコースセンサーに用いることができ、連続グルコース測定に用いることができる。【０１５５】
配列の簡単な説明
配列番号１  Ｍｕｃｏｒ  ｐｒａｉｎｉｉ由来ＧＤＨ（ＭｐＧＤＨ）のアミノ酸配列
配列番号２  ＭｐＧＤＨ遺伝子の塩基配列
配列番号３  Ｍｕｃｏｒ  ｈｉｅｍａｌｉｓ由来ＧＤＨ（ＭｈＧＤＨ）のアミノ酸配列
配列番号４  Ｍｕｃｏｒ  ＤＲ０５６８６０由来ＧＤＨ（ＭｄｒＧＤＨ）のアミノ酸配列
配列番号５  Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ由来ＧＤＨ（ＭｓＧＤＨ）のアミノ酸配列
配列番号６  Ｍｕｃｏｒ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ由来ＧＤＨ（ＭｇＧＤＨ）のアミノ酸配列
配列番号７  Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ  ｓｉｍｐｌｅｘ由来ＧＤＨ（ＣｓＧＤＨ）のアミノ酸配列
配列番号８  Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ属由来ＧＤＨ（ＣｒＧＤＨ）のアミノ酸配列
配列番号９  Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ由来ＧＤＨ（ＭｃＧＤＨ）のアミノ酸配列
配列番号１０  ＭｐＧＤＨ−Ｍ１グルコースデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列
配列番号１１  ＭｐＧＤＨ−Ｍ１遺伝子の塩基配列
配列番号１２  ＭｐＧＤＨ−Ｍ１／Ｙ４６４Ｃ／Ｖ４７０Ｃ／Ｌ４７２Ｃ三重変異体のアミノ酸配列
配列番号１３  配列番号１２のポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列
配列番号１４  Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓモチーフ配列
配列番号１５〜５２  プライマー
配列番号５３  Ｍｕｃｏｒ  ＤＲ０５６８６０由来ＧＤＨ（ＭｄｒＧＤＨ）
配列番号５４〜５５  プライマー【０１５６】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１−１】
2017073786.tif 000004
【図１−２】
2017073786.tif 000005
【図１−３】
2017073786.tif 000006
【図１−４】
2017073786.tif 000007
【図２】
2017073786.tif 000008
【図３】
2017073786.tif 000009
【配列表】
2017073786000001.app
【国際調査報告】
2017073786.tif 000010
2017073786.tif 000011
2017073786.tif 000012
2017073786.tif 000013