(57)【要約】  本発明は、YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を検出することを特徴とする、ESBL産生大腸菌B2-ST131クローンを識別するための検査方法に関する。また本発明は、当該第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を検出するためのポリヌクレオチド又は抗体、当該ポリヌクレオチド又は抗体のいずれかを含む試薬組成物、当該試薬組成物を含む試薬キットに関する。さらに、本発明は大腸菌B2-ST131クローンを識別するためのバイオマーカーに関する。
2016148231.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を検出することを特徴とする、大腸菌B2-ST131クローンを識別するための検査方法。
【請求項２】
前記第34番目のアラニンへの変異の検出が、以下のｉ）〜iii）より選択されるいずれかにより行われる、請求項１に記載の検査方法：
ｉ）被検試料について、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を解析すること；
ii）被検試料について、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドのアミノ酸配列を解析すること；
iii）被検試料について、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドの分子量を測定すること。
【請求項３】
前記第34番目のアラニンへの変異の検出が、以下のｉ）〜iii）より選択されるいずれかにより行われる、請求項２に記載の検査方法：
i）被検試料について、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を、核酸増幅反応により解析すること；
ii）被検試料について、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドのアミノ酸配列を、免疫学的手法により解析すること；
iii）被検試料について、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドの分子量を、質量分析計を用いて測定すること。
【請求項４】
YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を示す塩基を検出するための、少なくとも15ヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドをコードする塩基配列の部分配列又は当該部分配列に相補的な配列とハイブリダイズし得る、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、前記第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を示す塩基を含む部分配列又は当該部分配列に相補的な配列を特異的に増幅し得るプライマーである、請求項４又は５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３に示す5'-GAATTTGAAAARGTYGC-3'の塩基配列を含むものである、請求項５〜６のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか１に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして含む、プライマーセット。
【請求項９】
YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を検出するための、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを特異的に認識する、抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、前記第34番目のアミノ酸としてアラニンを含むポリペプチド又は前記第34番目のアミノ酸としてグルタミ酸を含むポリペプチドのいずれかを特異的に認識する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項４〜７のいずれか１に記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載のプライマーセット、又は請求項９〜１０のいずれか１に記載の抗体を含む、大腸菌B2-ST131クローン識別用試薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の大腸菌B2-ST131クローン識別用試薬組成物を含む、大腸菌B2-ST131クローン識別用試薬キット。
【請求項１３】
請求項４〜７のいずれか１に記載のポリヌクレオチド、請求項８に記載のプライマーセット、請求項９〜１０のいずれか１に記載の抗体、請求項１１に記載の大腸菌B2-ST131クローン識別用試薬組成物、又は請求項１２に記載の大腸菌B2-ST131クローン識別用試薬キットを用いて、YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を検出することを特徴とする、大腸菌B2-ST131クローンを識別するための検査方法。
【請求項１４】
大腸菌B2-ST131クローンが、基質特異性拡張型βラクタマーゼ（ESBL）産生大腸菌又はカルバペネマーゼ産生大腸菌を含む、請求項１〜３及び請求項１３のいずれか１に記載の検査方法。
【請求項１５】
以下のａ）またはｂ）から選択される大腸菌B2-ST131クローンを識別するためのバイオマーカー：
ａ）YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸がアラニンに変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドからなるバイオマーカー；
ｂ）ａ）に記載の前記第34番目のアミノ酸がアラニンに変異したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるバイオマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌B2-ST131クローンを識別するための検査方法、大腸菌B2-ST131クローンを識別するためのポリヌクレオチド又は抗体、当該ポリヌクレオチド又は抗体を含む試薬組成物、当該試薬組成物を含む試薬キット、および大腸菌B2-ST131クローンを識別するためのバイオマーカーに関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願2015-053351号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
近年、さまざまな薬剤耐性菌が次々と出現する事態が生じており、薬剤耐性菌の対策に対する注目度が国際的に増している。特に腸内細菌科は経口感染によりヒト腸管内に定着しやすく、医療環境や食品環境等での感染拡大が懸念される。腸内細菌科による感染症治療には、βラクタム系であるカルバペネムまたはセフタジジム、フルオロキノン系およびアミノグリコシド系の薬剤が最も汎用性の高い抗菌薬として使用されている。しかしながら、これらの抗菌薬に対する耐性を示す株について多数報告がされており、薬剤耐性菌の伝播の制御が極めて困難な状況となりつつある。【０００４】
薬剤耐性菌として、基質特異性拡張型βラクタマーゼ（Extended-spectrum-β-lactamase）（以下単に「ESBL」と称する。）を産生する大腸菌（Escherichia coli）の増加が著しいことが報告されている。病院内のみならず、市中においても蔓延が確認されている。ESBL産生大腸菌の増加の主たる原因は、ESBL産生大腸菌のB2-ST131クローンのパンデミックである。ESBL産生大腸菌B2-ST131クローンは尿路感染症の起因菌として知られており、症状が悪化した場合は敗血症などの重篤な症状を呈し、死亡に至ることもある。ESBL産生大腸菌B2-ST131クローンは、フルオロキノロン系薬剤に対してほぼ100%耐性を示し、アミノグリコシド系抗生物質に対しても耐性を示すため、高耐性かつ高病原性の株とされ、疫学上問題視されている（Benjamin A. Rogers, Hanna E. Sidjabat and David L. Paterson, 2011. J. Antimicrob. Chemother. 66: 1-14）。【０００５】
またカルバペネマーゼを産生する大腸菌についても報告がある。日本においては、まだ1%未満の分離頻度でしか報告されていないが、欧州等の一部の地域・施設においてはアウトブレイクも多く報告されている。カルバペネマーゼを産生する大腸菌は、2013年以降急増し、世界レベルでは蔓延しつつある薬剤耐性菌として知られている。カルバペネマーゼ産生菌は、ESBL産生株には効果を示すカルバペネム系抗菌薬にも耐性を示し、肺炎や尿路感染症などを引き起す。その症状の重篤化、致死率の高さから、カルバペネマーゼ産生菌は世界中で脅威となっている。またカルバペネマーゼを産生する大腸菌のおよそ半分を、大腸菌B2-ST131クローンが占めているとの報告がされている（中村彰宏ら．当院における過去4年間のカルバペネマーゼ産生腸内細菌科の検出状況と分子疫学的特徴．第26回日本臨床微生物学会総会．2015年1月31日．東京．）。【０００６】
大腸菌B2-ST131クローンの同定には、multilocus sequence typing（以下単に「MLST」と称する）解析が用いられている。しかしながら、MLST解析は操作が煩雑かつ高価な検査法であり、加えて検査結果が得られるまで長時間を要する。よってMLST解析による大腸菌B2-ST131クローンの同定は、感染症初期治療決定ツールとしては実用性が乏しいものである。医療関連感染などでは迅速な対応が必須であり、臨床上、大腸菌B2-ST131クローンを迅速に識別する検査方法が切望されているものの、未だ開発はなされていない。大腸菌B2-ST131クローンを迅速に識別する検査方法が開発されれば、感染症治療の方針決定のための革新的ツールになると考えられ、世界的なパンデミックを制御できる可能性も秘めている。【０００７】
非特許文献１（Matsumura Y, Yamamoto M, Nagao M, Tanaka M, Machida K, Ito Y, Takakura S, Ichiyama S. 2014. J. Clin. Microbiol. 52: 1034-1040.）には、ESBL産生大腸菌B2-ST131クローンをMALDI-TOF MSを用いて検出する方法が開示されているが、7,650m/zのピークについての開示はない。特許文献１および２（国際公開第WO2010/22400号および米国特許第8160819号）には、大腸菌のペリプラズムタンパク質として、34番目のアミノ酸がグルタミン酸であるYahOタンパク質を検出したことが開示されている。具体的には、大腸菌（E.coli O157、K-12株）由来のYahOタンパク質のアミノ酸配列とそのMSフラグメント（7,707m/z）が開示されている。また、34番目のアミノ酸がアラニンであるYahOタンパク質（GenBank  Accession  No.  WP_000691950）が大腸菌から単離されたことが報告されている（非特許文献２（ＵＲＬ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/?term=WP_000691950））。しかしながら、YahOタンパク質における34番目のアミノ酸のアラニンへの置換と、大腸菌B2-ST131クローンとの関連性については、開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第WO2010/22400号
【特許文献２】米国特許第8160819号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Matsumura Y, Yamamoto M, Nagao M, Tanaka M, Machida K, Ito Y, Takakura S, Ichiyama S. 2014. J. Clin. Microbiol. 52: 1034-1040.
【非特許文献２】ＵＲＬ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/?term=WP_000691950
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、大腸菌B2-ST131クローンを迅速かつ簡便に識別する検査方法や検査のためのポリヌクレオチドや抗体といった検出手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１の34番目のグルタミン酸のアラニンへの変異が、大腸菌B2-ST131クローンに特異的であることに着目し、当該アミノ酸の変異を検出することにより、大腸菌B2-ST131クローンを迅速かつ効率的に検出可能であること見出し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を検出することを特徴とする、大腸菌B2-ST131クローンを識別するための検査方法。
２．前記第34番目のアラニンへの変異の検出が、以下のｉ）〜iii）より選択されるいずれかにより行われる、前項１に記載の検査方法：
ｉ）被検試料について、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を解析すること；
ii）被検試料について、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドのアミノ酸配列を解析すること；
iii）被検試料について、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドの分子量を測定すること。
３．前記第34番目のアラニンへの変異の検出が、以下のｉ）〜iii）より選択されるいずれかにより行われる、前項２に記載の検査方法。
i）被検試料について、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を、核酸増幅反応により解析すること；
ii）被検試料について、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドのアミノ酸配列を、免疫学的手法により解析すること；
iii）被検試料について、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドの分子量を、質量分析計を用いて測定すること。
４．YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を示す塩基を検出するための、少なくとも15ヌクレオチドの長さを有するポリヌクレオチド。
５．前記ポリヌクレオチドが、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドをコードする塩基配列の部分配列又は当該部分配列に相補的な配列とハイブリダイズし得る、前項４に記載のポリヌクレオチド。
６．前記ポリヌクレオチドが、前記第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を示す塩基を含む部分配列又は当該部分配列に相補的な配列を特異的に増幅し得るプライマーである、前項４又は５に記載のポリヌクレオチド。
７．前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３に示す5'-GAATTTGAAAARGTYGC-3'の塩基配列を含むものである、前項５〜６のいずれか１に記載のポリヌクレオチド。
８．前項４〜７のいずれか１に記載のポリヌクレオチドをプライマーとして含む、プライマーセット。
９．YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を検出するための、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを特異的に認識する、抗体。
１０．前記抗体が、前記第34番目のアミノ酸としてアラニンを含むポリペプチド又は前記第34番目のアミノ酸としてグルタミ酸を含むポリペプチドのいずれかを特異的に認識する、前項９に記載の抗体。
１１．前項４〜７のいずれか１に記載のポリヌクレオチド、前項８に記載のプライマーセット、又は前項９〜１０のいずれか１に記載の抗体を含む、大腸菌B2-ST131クローン識別用試薬組成物。
１２．前項１１に記載の大腸菌B2-ST131クローン識別用試薬組成物を含む、大腸菌B2-ST131クローン識別用試薬キット。
１３．前項４〜７のいずれか１に記載のポリヌクレオチド、前項８に記載のプライマーセット、前項９〜１０のいずれか１に記載の抗体、前項１１に記載の大腸菌B2-ST131クローン識別用試薬組成物、又は前項１２に記載の大腸菌B2-ST131クローン識別用試薬キットを用いて、YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を検出することを特徴とする、大腸菌B2-ST131クローンを識別するための検査方法。
１４．大腸菌B2-ST131クローンが、基質特異性拡張型βラクタマーゼ（ESBL）産生大腸菌又はカルバペネマーゼ産生大腸菌を含む、前項１〜３及び前項１３のいずれか１に記載の検査方法。
１５．以下のａ）またはｂ）から選択される大腸菌B2-ST131クローンを識別するためのバイオマーカー：
ａ）YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸がアラニンに変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドからなるバイオマーカー；
ｂ）ａ）に記載の前記第34番目のアミノ酸がアラニンに変異したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるバイオマーカー。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、大腸菌B2-ST131クローンを迅速かつ簡便に識別することが可能となる。また本発明によるESBL産生大腸菌B2-ST131クローンに対する感度および特異度は、各々100%および89.7%と極めて高い。さらに本発明によるカルバペネマーゼ産生大腸菌B2-ST131クローンに対する感度および特異度も、各々95%および88%と極めて高い。本発明により、大腸菌B2-ST131クローンを正確に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】臨床検体由来のESBL産生大腸菌B2-ST131クローン群と他のSTクローン群の各々の培養液から抽出したタンパク質について、MALDI-TOF MS解析を行った結果を示す図である。なお、質量分析器は（Ａ）Burker社製MALDI Biotyperおよび（Ｂ）Applied Biosystems社製Voyager-DE-1000の2種を使用した。（実施例１）
【図２】プロテオミクス解析により、7,650Daまたは7,707Daのタンパク質として同定されたYahOタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。（実施例２）
【図３】ESBL産生大腸菌B2-ST131クローン群と他のSTクローン群由来の（Ａ）YahO遺伝子の塩基配列および（Ｂ）YahOタンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。矢印は置換部位を示す。（実施例３）
【図４】配列番号１３のプライマーを用いたリアルタイムPCRにより、ESBL産生大腸菌B2-ST131クローン群を検出した結果を示す図である。（実施例４（１））
【図５】配列番号１３のプライマーを用いたPCRおよび電気泳動により、ESBL産生大腸菌B2-ST131クローン群を検出した結果を示す図である。（実施例４（２））
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、大腸菌B2-ST131クローンを識別するための検査方法に関するものであり、YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を検出することを特徴とする。
【００１６】
大腸菌は、血清型（O抗原及びH抗原への免疫学的反応による分類）や、系統発生群解析（phylogenetic groups）により分類される。本発明の検査方法において識別される大腸菌B2-ST131クローンはO25:H4血清型、B2群に分類される。従来、大腸菌B2-ST131クローンの最終的な同定は、MLST解析により、Sequence  type（ST）を決定することにより行われていた。MLST解析は、細菌の5〜7領域のハウスキーピング遺伝子についてそれぞれ400〜600塩基を解読し、これらの配列を比較することでタイピングを行うものである（木村凡 モダンメディア 52 巻 7 号 2006［分子疫学］ 209、http://www.eiken.co.jp/modern_media/backnumber/pdf/MM0607-01.pdf）。大腸菌B2-ST131クローンは、上記分類方法により分類される一群の菌株であり、同一株のみならず、複数種の株を含む。大腸菌B2-ST131クローンは、大腸菌B2-ST131クローン群と称することもできる。なお以下「大腸菌B2-ST131クローン」を「B2-ST131クローン」もしくは「B2-ST131クローン群」と称することもある。
【００１７】
本発明の検査方法において識別される大腸菌B2-ST131クローンは、薬剤耐性を示す大腸菌B2-ST131クローンである。薬剤耐性を示す大腸菌B2-ST131クローンは、薬剤に対して高耐性かつ高病原性の株であり、多剤耐性大腸菌として特に警戒されている。薬剤耐性を示す大腸菌B2-ST131クローンには、βラクタマーゼを産生する大腸菌が含まれる。βラクタマーゼを産生する大腸菌には、ESBLを産生する大腸菌や、カルバペネマーゼを産生する大腸菌が含まれる。ESBLは、ペニシリンなどのβラクタム環を持つ抗生物質を分解する。ESBL産生菌は、βラクタマーゼ産生遺伝子（TEM型、SHV型、CTX-M型）の突然変異により、分解可能な薬剤の種類が拡大したβラクタマーゼを産生するようになったものであり、多剤耐性を示す。ESBLを産生する遺伝子は、薬剤プラスミド（Rプラスミド）上にコードされているため、同菌種間はもとより、腸内細菌科の異なる菌種間に伝達されることから、大腸菌のみならず、多菌種に広がってきている。またカルバペネマーゼ産生菌は、カルバペネム系抗菌薬を含むほぼすべてのβラクタム系抗菌薬を分解する。カルバペネマーゼ産生菌は、主にIMP型、VIM型、NDM型、KPC型、GES型およびOXA-48型の6種類が知られており、いずれも高度な多剤耐性を示す。カルバペネマーゼはカルバペネム系抗菌薬を分解することができ、ESBLと同様に伝達性のプラスミド上に位置することから、今後様々な菌種に急速に拡散する危険性がある。
【００１８】
本発明においては、大腸菌B2-ST131クローンと、大腸菌B2-ST131以外の他のSTクローン（本明細書において単に「他のSTクローン」と称することもある）から、タンパク質を抽出し、質量分析計を用いて網羅的に解析を行った結果、大腸菌B2-ST131クローンに特異的なピーク7,650m/zが検出されることが見出された。さらにプロテオミクス解析と遺伝子解析とを併せて研究を進めた結果、ピーク7,650m/zを示すタンパク質は、機能が未決定であるYahOタンパク質と同定された。一方、他のSTクローンにおいては、7,650m/zが検出されず、7,707m/zのピークが検出された。両者のピークのm/z差の57m/zは分子量の差であり、YahOタンパク質のアミノ酸配列の34番目のグルタミン酸のアラニンへの置換（E34A）に起因することを明らかにした。すなわち、YahOタンパク質のアミノ酸配列の34番目のグルタミン酸のアラニンへの置換（E34A）は、大腸菌B2-ST131クローンに特異的であることを明らかにした。
【００１９】
本発明は、YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１の34番目のグルタミン酸（E）のアラニンへ（A）の置換（以下「E34A」と示す）を検出することにより、大腸菌 B2-ST131クローンを識別するものである。大腸菌（E.coli O157、K-12株）由来のYahOタンパク質の全長アミノ酸配列を以下の配列番号１に示す。配列番号１のアミノ酸配列では、34番目のアミノ酸はグルタミン酸であるが、大腸菌B2-ST131クローンにおいては、かかる34番目のグルタミン酸がアラニンに置換している。
配列番号１：MKIISKMLVGALALAVTNVYAAELMTKAEFEKVESQYEKIGDISTSNEMSTADAKEDLIKKADEKGADVLVLTSGQTDNKIHGTANIYKKK（UniProtKB Accession No. P75694）
【００２０】
また、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を、以下の配列番号２に示す。大腸菌B2-ST131クローンにおいては、配列番号２のグルタミン酸をコードする100〜102番目のコドンが、アラニンをコードするコドンに置換している。
配列番号２：ATGAAAATAA TCTCTAAAAT GTTAGTCGGT GCGTTAGCGT TAGCCGTTAC CAATGTCTAT GCCGCTGAAT TGATGACCAA AGCGGAATTT GAAAAAGTTG AATCGCAGTA TGAAAAAATA GGTGATATTT CAACCAGCAA TGAAATGTCG ACTGCAGATG CAAAAGAAGA TTTGATCAAA AAAGCGGATG AAAAAGGGGC TGATGTGTTG GTACTGACCT CCGGTCAAAC TGACAATAAG ATCCACGGCA CGGCAAATAT TTATAAGAAG AAGTAA（GenBank Accession No. U00096）
【００２１】
配列番号１におけるE34A変異の検出は、YahOタンパク質およびYahO遺伝子の全長を解析してもよいが、部分断片を解析することにより行うのが簡便であり好ましい。E34A変異の検出は、いかなる手法により行ってもよいが、例えば以下のｉ）〜iii）より選択されるいずれかにより行うことができる。
ｉ）被検試料について、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を解析すること。
ii）被検試料について、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドのアミノ酸配列を解析すること。
iii）被検試料について、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドの分子量を測定すること。
【００２２】
なお本発明において「ポリペプチド」とは、２以上のアミノ酸が結合してなるペプチドおよびタンパク質を指す。また本発明における「ポリヌクレオチド」とはオリゴヌクレオチドを含む概念であり、塩基・糖・リン酸からなるヌクレオチドが２以上リン酸エステル結合した生体高分子を指し、DNAおよびRNA等の核酸を含む。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの長さは、検査に用いる解析手法により検出可能な程度であればよい。例えば、抗体の結合特異性を利用してアミノ酸配列を解析する場合、ポリペプチドの長さは抗体がアミノ酸配列を特異的に認識し得る程度の長さであればよく、少なくとも３〜１５アミノ酸程度の長さであればよい。質量分析計により分子量を測定する場合、ポリペプチドの大きさは質量分析計が測定可能な程度であればよく、例えば質量分析計としてMALDI-TOF MSを用いる場合は、2000Da〜20000Daのポリペプチドであればよい。PCR法やLAMP法等の核酸増幅反応を用いて塩基配列を解析する場合は、ポリヌクレオチドの長さは増幅反応の鋳型となり得る程度の長さであればよく、100〜1000塩基程度の長さである。
【００２３】
上記ｉ）の塩基配列の解析は、34番目のアミノ酸をコードする塩基配列を検出し得る遺伝子変異解析方法であればいかなる手法により行ってもよいが、例えば、シークエンス解析、PCR法やLAMP法等の核酸増幅反応、ハイブリダイゼーション法などが挙げられる。
【００２４】
塩基配列の解析には、YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸置換を示す塩基を検出するための、ポリヌクレオチドを用いることができる。当該ポリヌクレオチドは、少なくとも15ヌクレオチド（塩基）、好ましくは17ヌクレオチド（塩基）の長さを有するものである。当該ポリヌクレオチドはプライマー又はプローブとして機能するものである。当該ポリヌクレオチドは、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドをコードする塩基配列の部分配列又は当該部分配列に相補的な配列と特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであることが好ましく、さらに、前記第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を示す塩基を含む部分配列又は当該部分配列に相補的な配列と特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであることが好ましい。当該ポリヌクレオチドの塩基配列は、前記第34番目のアミノ酸のアラニンへの変異を示す塩基を含む部分配列又は当該部分配列に相補的な配列に100%相補的な配列である必要はなく、１塩基〜５塩基ほど（好ましくは１〜４塩基ほど、より好ましくは１〜２塩基ほど）欠失していてもよいし、相補的でない塩基が置換、挿入又は付加されていてもよい。また、ポリヌクレオチドがプライマーである場合は17〜25ヌクレオチド程度とすることが好ましく、プローブである場合は10〜30ヌクレオチド程度とすることが好ましい。
【００２５】
プライマー及びプローブは、公知のプライマー又はプローブ設計ソフトウェアを用いて設計することができる。公知のソフトウェアとしては例えば、OLIGO  Primer  Analysis  Software（Molecular  Biology  Insights社）、Beacon  Designer（PREMIER  Biosoft社）、Primer  Expressソフトウェア（ライフテクノロジーズ社）等を利用することができる。
【００２６】
またポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられるDNA自動合成装置を利用して合成することができる。
【００２７】
シークエンス解析は、自体公知の手法により行うことができる。例えば、アミノ酸置換を示す塩基の5'側数十塩基の位置に設計したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス解析を行う場合には、予めアミノ酸置換を示す塩基を含む断片をPCR法などの核酸増幅反応によって増幅しておくことが好ましい。核酸増幅反応に用いるプライマーは、目的を達成し得るものであればいかなるものであってもよいが、例えば以下のプライマーが例示される。
forward primer：5'-TAGTCGGTGCGTTAGCGTT-3'（配列番号１１）
reverse primer：5'-TGCCGTGGATCTTATTGTCA-3'（配列番号１２）
【００２８】
アミノ酸置換を示す塩基を含むポリヌクレオチドを増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによって当該塩基の種類を確認することもできる。例えば、PCR-SSCP（single-strand  conformation  polymorphs法）（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）を用いることができる。アミノ酸置換を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（RFLP法）。さらにハイブリダイゼーション法では、アミノ酸置換を示す塩基に対応するプローブを用いて、当該プローブにハイブリダイズするか否かを調べることによって、塩基の種類を解析することも可能である。
【００２９】
また、PCR法、LANP法（特許第3313358号）、NASBA法（Nucleic  Acid  Sequence-Based  Amplification；特許2843586号）、ICAN法（特開2002-233379号公報）などの核酸増幅反応を行い、増幅の有無を調べることにより解析することもできる。核酸増幅反応を用いた解析は以下の工程により行うことができる。
（１）被検試料から、ポリヌクレオチドを抽出する工程。
（２）抽出したポリヌクレオチドを鋳型として、34番目のアミノ酸置換を示す塩基を含む塩基配列を増幅し得るプライマーにより、核酸増幅反応を行う工程。
（３）増幅産物を検出する工程。
【００３０】
例えばPCR法では、前記第34番目のアミノ酸置換（好ましくはアラニンへの変異）を示す塩基を含む部分配列又は当該部分配列に相補的な配列と特異的にアニーリングし得るポリヌクレオチドであることが好ましい。一般的にアミノ酸は、３つの塩基からなるトリプレットコドンにより指定されるが、本明細書における「アミノ酸置換を示す塩基」とはトリプレットコドンのうち、少なくとも１塩基以上、好ましくは２塩基以上である。PCR法では、アミノ酸置換を示す塩基を含む領域に特異的にアニーリングし得るプライマーと、当該プライマーと対になって核酸断片を増幅し得るプライマーとをセットで用意する。かかるプライマーセットを用いてPCRを行い、増幅産物の有無によってアミノ酸置換を示す塩基の有無を検出することができる。また、アミノ酸置換を示す塩基を含む断片を増幅可能なプライマーセットを用いてPCRを行い、増幅産物を解析することにより、アミノ酸置換を示す塩基の有無を検出することができる。アミノ酸置換を示す塩基を含む領域である部分配列に特異的にハイブリダイズし得るプライマーはforwardプライマーであっても、reverseプライマーであってもよいが、例えば以下に示すオリゴヌクレオチドからなるforwardプライマーを用いることができる。
forward primer：5'-GAATTTGAAAARGTYGC-3'（配列番号１３）
配列番号１３のforwardプライマーを含むプライマーセットを用いてPCRを行った場合、増幅産物の有無はシークエンス解析による解析結果と100%一致する。配列番号１３のプライマーによる変異に対する特異度は極めて高く、正確な検出を行うことができる。
【００３１】
PCR法による増幅産物の有無の検出は、増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド、SYBR  Green  Iなどのインターカレーターにより染色することにより行うことができる。配列番号１３のforwardプライマーを用いた検出では、PCR増幅産物のバンドが観察された場合に、被検試料中に大腸菌B2-ST131クローンが存在することを意味し、PCR増幅産物のバンドが観察されない場合に、被検試料中に大腸菌B2-ST131クローンが存在しないことを意味する。
リアルタイムPCR法を用いて、E34Aの検出を行うことも可能である。公知のリアルタイムPCR装置を用いることにより自動的に短時間で増幅産物の有無を確認することができる。リアルタイムPCR法では、SYBR  Green  Iを用いて、SYBR  Green  Iが二本鎖DNAに結合したときに発する蛍光値から増幅産物量をサイクル毎にモニターすることが可能である。さらに、PCR後に融解曲線分析を行うことにより増幅産物が目的の増幅産物であるかどうかを確認できる。配列番号１３のforwardプライマーは、リアルタイムPCRにも適用可能であり、約30分程度でE34Aの有無を検出することができる。
【００３２】
本発明は、前記第34番目のアミノ酸置換を示す塩基の検出を可能にするポリヌクレオチド、プライマー、プローブ、又はプライマーセットも包含する。また、本発明は当該ポリヌクレオチド、プライマー、プローブ又はプライマーセットを含む試薬組成物をも包含する。さらに本発明は当該試薬組成物を含む試薬キットも包含する。本発明の試薬組成物又は試薬キットは、大腸菌B2-ST131クローンの識別のためのものであり、本発明の検査方法に用いられるものである。
【００３３】
上記ポリヌクレオチド、プライマー、プローブ又はプライマーセットは、乾燥した状態もしくはアルコール沈澱の状態で、固体として試薬組成物として提供することもできるし、水、生理食塩水、もしくは適当な緩衝液（例：TE緩衝液等）中に溶解した状態で、試薬組成物として提供することができる。試薬組成物には、添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤等が含有されていてもよい。安定化剤としては、グルコース等の単糖類、サッカロース、マルトース等の二糖類、マンニトール、ソルビトール等の糖アルコール、塩化ナトリウム等の中性塩、グリシン等のアミノ酸、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（プルロニック）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トゥイーン）等の非イオン系界面活性剤、ヒトアルブミン等が例示され、1〜10w/v%程度が添加されていることが好ましい。
【００３４】
また上記試薬キットは、上記ポリヌクレオチド、プライマー、プローブ又はプライマーセットを含む試薬キット等が例示される。プライマーセットは塩基配列解析を行うことができるものであればいかなるものであってもよいが、少なくとも２種以上のプライマーを含み、核酸増幅反応に用いられるものが好ましい。プライマーセットは前記第34番目のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする変異部位を示す塩基を含む領域に特異的にハイブリダイズし得るプライマーを含むセットがより好ましい。当該試薬キットには、核酸増幅反応に必要な試薬、例えば、DNA合成酵素、緩衝液、dNTPミックスや、インターカレーター、塩化マグネシウム、使用説明書より選択される１つ以上を含めることができる。またリアルタイムPCRによる増幅産物の検出を行うために、蛍光物質等で標識されたプローブを含んでもよい。あるいは、当該ポリヌクレオチドは、適当な固相に固定化された状態で提供することもできる。固相としては、例えば、ガラス、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフロリド等が挙げられるが、これらに限定されない。また、固定化手段としては、予め核酸にアミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチンなどの官能基を導入しておき、一方、固相上にも該核酸と反応し得る官能基（例：アルデヒド基、アミノ基、SH基、ストレプトアビジンなど）を導入し、両官能基間の共有結合で固相と核酸を架橋したり、ポリアニオン性の核酸に対して、固相をポリカチオンコーティングして静電結合を利用してポリヌクレオチドを固定化するなどの方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
上記ii）のアミノ酸配列の解析は、34番目のアミノ酸を検出し得るものであればいかなる手法により行ってもよいが、ウェスタンブロッティング法、ELISA法、及びラテックス凝集免疫法等の抗原抗体反応検出法や、アミノ酸配列決定法により行うことができる。
【００３６】
アミノ酸配列の解析には、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチド、好ましくは前記第34番目のアミノ酸がアラニンであるポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いることができる。当該抗体は、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドや当該ポリペプチドの抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。
【００３７】
抗体作製のための免疫原は、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを菌から分離精製して調製することができる。また、前記以外に遺伝子工学的手法により作製した組換えポリペプチドを免疫原として用いることもできる。さらに、前記で得られた免疫原をトリプシンなどのプロテアーゼで処理して得られるペプチドフラグメントや合成ペプチドを免疫原として用いることもできる。
【００３８】
本発明の前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、以下の方法により作製することができる。ウサギ、マウス、ラットなどの哺乳動物を、上記のようにして作製して精製した前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを、抗原（免疫原）として用いて免疫する。投与手段としては、腹腔内注射、静脈注射、皮下注射などが採用され、場合により皮内注射も採用される。追加免疫を数回繰り返し、最終免疫後３〜10日目に哺乳動物の採血を行い、抗血清（ポリクローナル抗体）を得る。上記工程により前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを用いて抗血清を得た後、それら抗血清と前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドの類縁タンパクとを混合して、類縁タンパクと反応する抗体を除去し、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドに対して特異的なポリクローナル抗体を作製することができる。前記第34番目のアミノ酸がアラニンであるポリペプチドに対して特異的なポリクローナル抗体を作製する場合は、類縁タンパクとして前記第34番目のアミノ酸がグルタミン酸であるポリペプチドを用いることができる。
【００３９】
本発明の前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを特異的に認識し結合するモノクローナル抗体は、ケーラーとミルステインの方法（Kohler,G.and Milstein,C.,Nature,256,495-497,1975）等の公知の方法により作製し得る。ポリクローナル抗体の作製と同様にして、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを免疫原として用いることができる。免疫原は、市販のフロイント完全アジュバント又はフロイント不完全アジュバント等の適当なアジュバントと共に投与するのが望ましい。また、被免疫動物としては、マウス、ラット、モルモット等が利用可能であるが、通常はマウスが汎用される。調製した免疫原は、動物の皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内等いずれのルートを通しても投与することができる。免疫の間隔は特に限定されないが、例えば１〜２週間隔で、２〜５回免疫するのが望ましい。また、１回当たりの投与量も限定されないが、例えば上述のように調製した免疫原を適当なアジュバントと混合し、数十μｌ〜数百μｌの量を投与すればよい。
【００４０】
最終免疫後、３〜10日後に、被免疫動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞を用いるのが一般的である。調製した抗体産生細胞を骨髄腫細胞と細胞融合させる。骨髄腫細胞としては、当業者が入手可能な株化細胞を用いることができ、Sp2/O-Ag14[ATCC CRL-1581;Nature,276,271(1978)]、P3X63Ag8[ATCC TIB-9;Nature、265、495-497(1978)]、P3X63 Ag8U.1(P3U1)[ATCC CRL-1580;Current Topics in Microbiology and Immunology、81、1-7(1978)]、P3X63Ag8.653[ATCC TIB-18;European J.Immunology、6,511-519(1976)]、P2/NSI/1-Ag4-1[ATCC CRL-1581;Nature、276、269-270(1978)]等のマウス骨髄腫細胞株が挙げられる。細胞融合は、動物細胞培養用培地中で107〜108細胞/mlの骨髄腫細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：10で、融合促進剤や融合ウイルス等を用いて、30〜37℃で１〜３分間細胞同士を接触させることにより効率的に行うことができる。
【００４１】
細胞融合処理後に選択培地を用いて細胞培養を行い、ハイブリドーマを選別する。選別されたハイブリドーマについて、限界希釈法、軟寒天法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法等によりクローニングを行う。細胞の培養上清について、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドに対する抗体の産生があるか否かを検定し、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。モノクローナル抗体について１次スクリーニングとして、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドと反応し結合するモノクローナル抗体を含む培養上清を選別し、さらに２次スクリーニングとして類縁タンパクと反応しないモノクローナル抗体を含む培養上清を選別し、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。前記第34番目のアミノ酸がアラニンであるポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体を作製する場合は、類縁タンパクとして前記第34番目のアミノ酸がグルタミン酸であるポリペプチドを用いることができる。
【００４２】
前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから通常の細胞培養法により、モノクローナル抗体を採取することができる。細胞培養法においては、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを動物細胞培養用培地中で、通常の培養条件（例えば、37℃、５％CO2濃度）で２〜14日間培養し、その培養上清から抗体を取得することができる。また腹水形成法においては、骨髄腫細胞由来の動物と同種の動物の腹腔内にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させ、１〜４週間後に腹水または血液を採集して抗体を取得することができる。 また、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマから単離し、遺伝子工学的手法により組換えタンパク質として作製することもできる。抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、DEAEセルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、分子量や構造によってふるいわける分子ふるいクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４３】
前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを特異的に反応する抗体を用いて、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを検出することが可能である。抗体を検出試薬に用いるために標識を行う場合、標識物質は限定されない。具体的には、酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン、染料ゾルおよび金コロイドやラテックス粒子等の不溶性担体を用いることができる。また、標識は公知の方法で行うことができるが、標識物質を抗体に結合させていてもよい。
【００４４】
本発明は、前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドの検出を可能にする前記第34番目のアミノ酸を含むポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体、又はポリクローナル抗体、これらの抗体のいずれか１つを含む試薬組成物、当該試薬組成物を含む試薬キットも包含する。本発明の試薬組成物又は試薬キットは、大腸菌B2-ST131クローンの識別のためのものであり、本発明の検査方法に用いられるものである。
【００４５】
上記抗体は生理食塩水、緩衝液等で希釈した状態で試薬組成物として提供してもよいし、凍結乾燥形態等の長期間保存可能な試薬組成物として提供してもよい。上記抗体は、添加剤（例えば担体、賦形剤、希釈剤等）、安定化剤等を含有する溶液に溶解した後、凍結乾燥されてもよい。安定化剤の具体例は上述した通りである。また上記抗体を含む試薬キットは、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【００４６】
上記iii）のポリペプチドの分子量の測定は、いかなる手法により行ってもよいが、例えば自体公知の質量分析計や電気泳動法を用いることにより行うことができる。質量分析計としては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（MALDI-TOF MS）、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（SELDI-TOF-MS）、液体クロマトグラフィー質量分析装置、タンデム質量分析装置（MS-MS）、エレクトロスプレーイオン化質量分析装置（ESI-MS）、脱離エレクトロスプレーイオン化質量分析装置（DESI）を用いることができるが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（MALDI-TOF MS）を用いることが好ましい。使用可能なMALDI-TOF MSは特に限定されないが、Burker社製MALDI Biotyperや、Applied Biosystems社製Voyager-DE-1000等が例示される。
【００４７】
質量分析計を用いた測定手法により、7650Daのポリペプチドが検出された場合（実施例１の手法により7,650m/zのピークが検出された場合）は、大腸菌B2-ST131クローンが被検試料または検体に含まれていることを示す。一方、7650Daのポリペプチドが検出されない場合は、大腸菌B2-ST131クローンが被検試料または検体に含まれていないことを示す。なお、7707Daのポリペプチド（実施例１の手法により検出される7,707m/zのピーク）が検出された場合は、大腸菌B2-ST131クローン以外の他のSTクローンが被検試料または検体に含まれていることを示す。
【００４８】
本発明において、検査の対象となる被検試料は、検体そのものであってもよいが、検体から調製されたものであることが好ましい。検体は、大腸菌B2-ST131クローンの含有可能性のあるものであれば特に限定されない。検体は、患者を含む被検者等の生体から採取した検体であってもよいし、医療関連感染を媒介し得る医療器具、医療機器、食物等から採取した検体であってもよい。生体から採取した検体としては、例えば尿、糞便、膿などの滲出物、喀痰、リンパ節、扁桃、皮膚、リンパ液、血液、粘膜、膀胱や大腸等の臓器や組織などが例示される。本発明において被検試料は、好ましくは、検体からヒト由来細胞や、菌株由来のタンパク質以外のタンパク質を除去して調製されたものである。被検試料の調製はいかなる方法により行ってもよいが、例えば検体から菌株を単離して培地で培養したものを被検試料とすることができる。培地は、LB培地、ブロス、平板培地など自体公知のものを用いることができる。本発明の検査方法においては、被検試料からさらに、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを抽出して調製して解析に用いてもよい。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの抽出方法は自体公知の核酸抽出方法、タンパク質抽出方法により行えばよい。
【００４９】
本発明は、以下のａ）またはｂ）から選択される大腸菌B2-ST131クローンを識別するためのバイオマーカーをも包含する。
ａ）YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸がアラニンに変異したアミノ酸配列を含むポリペプチドからなるバイオマーカー。
ｂ）ａ）に記載の前記第34番目のアミノ酸がアラニンに変異したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドからなるバイオマーカー。
ａ）のポリペプチドは、YahOタンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、配列番号１に示すアミノ酸配列における第34番目のアミノ酸がアラニンに変異したアミノ酸配列を含むものであればよく、YahOタンパク質の部分断片であっても、全長であってもよい。同様に、ｂ）のポリヌクレオチドは、YahOタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列のうち、34番目のアミノ酸置換を示す塩基を含むものであればよく、部分断片であっても、全長であってもよい。
【実施例】
【００５０】
本発明の理解を助けるために、以下に参考例および実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものでないことはいうまでもない。なお以下の参考例および実施例は、天理よろづ相談所病院の倫理委員会の承認を得て行なったものである。【００５１】
（参考例１）臨床検体由来の菌株の解析
2011年に天理よろづ相談所病院にて、臨床検体より分離されたESBL産生大腸菌（E. coli）74株（B2-ST131クローン16株、他のSTクローン58株）を使用した。これらの株についてまず、系統学的グループの解析を行い、MLSTとパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を行った。
系統学的グループの解析として、chuA、yjaA、およびTSPE4.C2の３つの遺伝子について、トリプレックスPCR（triplex PCR）を行った。MLSTとしては、7つのハウスキーピング遺伝子（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、およびrecA）をPCRダイレクトシークエンス（PCR-direct sequencing）を行った。また、制限酵素XbaI（Roche Diagnostics, Inc., Tokyo, Japan）を用いたPFGEを、CHEF-Dr II system（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）にて行った。 
得られた結果に基づき、Fingerprinting Plus Version 1.12,により系統樹を作成し、80%以上の類似性（UPGMA algorithm on Dice similarity coefficients）を示す場合に、同一PFGEクラスタであると判断した。【００５２】
これらの解析から得られた結果を表１に示す。
【表１】
2016148231.tif 000003
【００５３】
（実施例１）MALDI-TOF MSによる解析
（MALDI-TOF MSによる測定）
上記参考例１と同様の臨床検体由来の菌株を、5% [v/v]ヒツジ血液含有コロンビア血液寒天にて、37℃で16〜24時間培養した。培養後の菌株から、エタノール‐ギ酸抽出法により、タンパク質を抽出した。300μLのミリQ水に菌株を懸濁後、900μLのエタノールを加え、13,000gで2分間遠心し、上清を捨ててペレットを乾燥させた。乾燥したペレットに20μLの70%ギ酸を加え、ボルテックス後、20μLのアセトニトリルを加え、再度ボルテックス後、13,000gで2分間遠心した。上清1μLをターゲットプレートにアプライし、MALDI-TOF MS解析を行った。MALDI-TOF MS解析は、MALDI Biotyper（Bruker Daltonik, GmbH）およびMALDI Biotyper v3.1 softwareを用いて行った。マトリックスはα-cyano-4-hydroxy-cinnnamic  acid（CHCA）を使用した。 菌株同定に推奨されている設定（linear positive mode, 20-Hz laser frequency, 20-kV acceleration voltage, 18.5-kV IS2 voltage, 250 ns extraction delay, and 2000 to 20,000-m/z range）により、解析を行った。キャリブリーターとして、Bruker Bacterial Test Standard (Bruker)を用いた。また上述と同様のタンパク質抽出方法により抽出したサンプルについて、同様のマトリックスを使用し、MALDI Biotyperの代わりに他の質量分析器Voyager-DE-1000（Applied Biosystems社製）を用いて、Linear modeにより測定を行った。【００５４】
（MALDI-TOF MSにより得られたデータの解析）
MALDI-TOF MSにより得られたスペクトルを、B2-ST131クローン群と他のSTクローン群に分け、ClinProTools v2.2とFlexAnalysis v3.4 software (Bruker)を用いて多変量解析を行い、B2-ST131クローン群のバイオマーカーを探索した。 【００５５】
MALDI-TOF MSの解析結果を以下の表２に示す。
【表２】
2016148231.tif 000004
【００５６】
解析の結果、B2-ST131クローン群に特異的なピーク7,650m/zを検出した（図１（Ａ））。他のSTクローン群には、ピーク7,650m/zは検出されず、7,707m/zが検出された。またMALDI Biotyperの代わりに、Voyager-DE-1000を用いた場合も、同様のピークが確認された（図１（Ｂ））。7,650m/zをバイオマーカーとした場合、表３に示す通り、感度は100%、特異度は89.7%と高い値が得られた。
【表３】
2016148231.tif 000005
【００５７】
（実施例２）バイオマーカーとなるタンパク質の同定と解析
実施例１において特定された7650Daのタンパク質を、bottom-up proteomicsおよびエドマン分解によるN末端アミノ酸配列解析を行うことにより同定した。まず、参考例１と同様の臨床検体由来のB2-ST131クローン群の菌株から、以下のようにしてタンパク質を精製した。まず、菌株をLB培地で増殖させた後、回収して超音波破砕し、80%硫安沈殿、オープンカラムDEAEセルロース、オープンカラムCMセルロールにより段階的に精製し、その後HPLC（TSKgel Protein C4-300 (Tosoh Corporation, Tokyo, Japan)）により分取した。分取後、各画分を乾燥させて濃縮し、MALDI-TOF MSにより確認を行い、7650Daのタンパク質が溶出した画分を特定した。特定した画分に溶出したタンパク質について、Tricine SDS-PAGEを行い、silver染色後、ゲルを切り出した。切り出したゲルは、トリプシンにより消化後、LCMS-IT-TOF (Shimazu Corporation, Kyoto, Japan)を用いて、解析した。得られたスペクトルを、Mascot MS/MS Ion Search (Matrix Science K.K., Tokyo, Japan)により解析し、SwissProt databaseによりペプチドを同定した。同時に、N末端アミノ酸配列解析を行い、bottom-up proteomicsによるペプチドの同定結果と併せて、タンパク質を同定した。【００５８】
LCMS-IT-TOFの結果を以下の表４に示す。
【表４】
2016148231.tif 000006
表４の結果と、N末端アミノ酸配列解析の結果により、7650Daのタンパク質が、機能不明のYahOタンパク質であることがわかった（図２）。図２中の下線部は、LCMS-IT-TOFにより得られたアミノ酸配列であり、四角で囲った部分はN末端アミノ酸配列解析により得られたアミノ酸配列である。【００５９】
（実施例３）  バイオマーカーとなる遺伝子についての解析
実施例２において同定されたアミノ酸配列から、forward primer：5'-TAGTCGGTGCGTTAGCGTT-3'（配列番号１１）とreverse primer：5'-TGCCGTGGATCTTATTGTCA-3'（配列番号１２）を設計し、 B2-ST131クローン群と他のSTクローン群について、PCRダイレクトシークエンスによって塩基配列とアミノ酸配列の比較を行った。
まず実施例１と同様にして、臨床検体由来のB2-ST131クローン群の菌株を培地で増殖させた後、回収した。菌株を回収後、定法に従ってDNAを抽出した。抽出したDNAについて、上記配列番号１１と配列番号１２のプライマーを用いて、PCRを行った。PCRにはApplied Biosystems Veriti 96 Thermal Cycler (Life Technologies)を用い、DNA配列決定にはApplied Biosystems 3730xl DNA Analyzer (Thermo Fisher Scientific)を用いた。また理論上の分子量(Mw)をCompute pI/Mw tool (http://web.expasy.org/compute_pi/)を用いて算出した。【００６０】
その結果、B2-ST131クローン群に特異的なピーク7,650m/zと、他のSTクローン群に確認されるピーク7,707m/zとの分子量の差は、E34Aのアミノ酸変異が原因であることが明らかとなった（図３）。また、E34A検出によるESBL産生大腸菌B2-ST131クローン検出の感度および特異度は下記の表５に示すとおりであった。
【表５】
2016148231.tif 000007
【００６１】
（実施例４）  PCR法を用いたESBL産生大腸菌B2-ST131の検出
（１）まず、上記参考例１と同様の臨床検体由来の菌株を培地で増殖させた後、回収した。菌株を回収後、定法に従ってDNAを抽出した。抽出したDNAについて、以下のプライマーセットを用いて、リアルタイムPCRを行った。
forward primer：5'-GAATTTGAAAARGTYGC-3'（配列番号１３）
reverse primer：5'-TGCCGTGGATCTTATTGTCA-3'（配列番号１２）
forward primerは配列番号２がE34Aをコードするよう変異した塩基配列の85〜101番目、reverse primerは配列番号２の231〜250番目にアニーリングするよう設計されたものである。
PCR機器はLightCycler 2.0 system（Roche Diagnostics, Inc., Tokyo, Japan）、試薬はLightCycler FastStart DNA Master SYBR GreenI（Roche）を用いて、次のように行った。すなわち、初期変性を95℃で7分間行った後、95℃で1秒間、63〜53℃（step size 0.5℃/cycle）で5秒間、及び72℃で8秒間、蛍光測定（PCRによる増幅産物の測定）を1サイクルとし、これを40サイクル行い、続いて増幅産物の融解曲線分析のために、95℃で1秒、75℃で15秒後、0.15℃/秒の速度で95℃まで昇温させると同時に連続的な蛍光測定により各温度に対する増幅産物の二本鎖DNA量を測定し、最後に40℃まで降温させた。PCR終了後、融解曲線解析を同PCR装置のソフトウェアで行ない、増幅産物のTm値を求めることで特異的な増幅産物の有無を判定した。【００６２】
結果を図４に示す。増幅産物がある場合は、Tm値として82.5℃付近ピークを示すことがわかった。また、以下の表６にリアルタイムPCRによるYahO遺伝子の変異検出の特異度を示す。表６において、「This  PCR＋」はTm値のピークが認められたもの、「This  PCR−」は、Tm値のピークが認められなかったものである。
【表６】
2016148231.tif 000008
【００６３】
（２）また上記配列番号１３のforward primerと、配列番号１２のreverse primerを用いてPCRを行い、増幅産物の有無について電気泳動による確認を行った。PCRのサイクルは上述の（１）と同様であり、Mupidミニゲル泳動槽（ADVANCE社）を用いてアガロースゲルにより電気泳動を行い、エチジウムブロマイド溶液でゲルを染色して、目的の増幅バンドの有無を確認した。【００６４】
結果を、図５に示す。図５中、NCはネガティブコントロールである。上記プライマーを用いてPCRを行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動により確認することにより、B2-ST131クローン群を検出可能であることがわかった。【００６５】
（実施例５）MALDI-TOF MSを用いたカルバペネマーゼ産生大腸菌B2-ST131の検出
天理よろづ相談所病院にて保有している、臨床検体より分離されたカルバペネマーゼ産生大腸菌（E. coli）28株（B2-ST131クローン20株、他のSTクローン8株）を使用した。これらの株は、系統学的グループの解析として、chuA、yjaA、およびTSPE4.C2の３つの遺伝子についてのトリプレックスPCR（triplex PCR）、MLSTとして、7つのハウスキーピング遺伝子（adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA、およびrecA）をPCRダイレクトシークエンス（PCR-direct sequencing）、制限酵素XbaI（Roche Diagnostics, Inc., Tokyo, Japan）を用いたPFGEを、CHEF-Dr II system（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）にて行い、得られた結果に基づき、Fingerprinting Plus Version 1.12,により系統樹を作成し、80%以上の類似性（UPGMA algorithm on Dice similarity coefficients）を示す場合に、同一PFGEクラスタであると判断し、分類を行ったものである。【００６６】
上記臨床検体由来の菌株28株について、実施例１と同様にして、菌株を培養し、タンパク質を抽出し、MALDI-TOF MSによりスペクトルを得た。その結果を、以下の表７に示す。
カルバペネマーゼ産生B2-ST131クローン群には、特異的なピーク7,650m/zが検出され、他のSTクローン群には、ピーク7,650m/zは検出されず、7,707m/zが検出された。感度は95%、特異度は88%と高い値であった。
【表７】
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【００６７】
（実施例６）  PCR法を用いたカルバペネマーゼ産生大腸菌B2-ST131の検出
参考例５と同様の菌株について、実施例４と同様にして、菌株を培地にて増殖させて回収し、定法に従ってDNAを抽出し、抽出したDNAについてリアルタイムPCRを行った。【００６８】
結果として、表８にリアルタイムPCRによるYahO遺伝子の変異検出の感度と特異度を示す。上記リアルタイムPCRにより、カルバペネマーゼ産生B2-ST131クローン群を感度95%、特異度88%と高い値で検出可能であることがわかった。
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明は、迅速かつ簡便に大腸菌B2-ST131クローンを識別することを可能とするものである。本発明の検査方法は、感度および特異度も優れており、迅速かつ効率的にB2-ST131クローンを識別することができる。臨床において、本発明によりB2-ST131クローンを迅速かつ正確に識別することができることから、医療関連感染等の原因を速やかに特定することができ、感染症初期治療決定ツールとして非常に有用である。さらに本発明の検査方法は、世界的なパンデミックの制御に寄与する可能性もあり、感染症治療を飛躍的に前進させることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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