(57)【要約】本発明は、半月板の再生治療において、膝関節の半月板の欠損部分に充填することで、半月板の再生を促進することができる半月板再生基材を提供することを目的とする。本発明は、半月板の再生治療において、膝関節の半月板の欠損部分に充填することで、半月板の再生を促進することができる半月板再生基材であって、生体吸収性材料からなるフィルム層、生体吸収性材料からなる平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層、及び、生体吸収性材料からなる平均孔径が２２〜５０μｍである不織布からなる層が複合一体化し、少なくとも一方の表面が前記生体吸収性材料からなるフィルム層である積層体からなる半月板再生基材である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
半月板の再生治療において、膝関節の半月板の欠損部分に充填することで、半月板の再生を促進することができる半月板再生基材であって、
生体吸収性材料からなるフィルム層、生体吸収性材料からなる平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層、及び、生体吸収性材料からなる平均孔径が２２〜５０μｍである不織布からなる層が複合一体化し、少なくとも一方の表面が前記生体吸収性材料からなるフィルム層である積層体からなる
ことを特徴とする半月板再生基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、半月板の再生治療において、膝関節の半月板の欠損部分に充填することで、半月板の再生を促進することができる半月板再生基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
半月板は、膝関節内にある軟骨様組織である。以下に図１及び２を用いて膝関節の構造について説明する。図１は、右膝関節の矢状面での断面模式図であり、図２は右膝関節の横断面での断面模式図である。図１に示すように、膝関節は大腿骨４と脛骨５との間に半月板１を有し、大腿骨４と脛骨５とが対向する側にはそれぞれ軟骨３が形成されている。膝の前面には膝蓋骨６があり、その下部には膝蓋下脂肪体（ＩＰＦＰ：Ｉｎｆｒａｐａｔｅｌｌａｒ  Ｆａｔ  Ｐａｄ）２がある。膝関節は関節包７で包まれており、関節内部は関節液８で満たされている。図２に示すように、半月板１は膝関節の内側と外側で対抗するように一対形成されており、膝関節の前面側と後面側が厚くなっている。【０００３】
半月板の変性や損傷は、変形性膝関節症（ＯＡ：ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）における軟骨変性とともによく見られる病態の一つである。また、半月板を切除することで、軟骨組織が減少し、変形性膝関節症が進行するという報告もある。半月板は、無血管領域を多く含む組織であるため、自己再生能力が乏しく自己修復は困難である。そのため、手術では半月板の治癒を促進する目的で、半月縫合術に加えて、成長因子、滑膜移植、骨髄刺激等の追加処置がなされてきたが、半月板の再生は不充分であった。【０００４】
一方、近年の細胞工学技術の進展によって、ヒト細胞を含む数々の動物細胞の培養が可能となり、また、それらの細胞を用いてヒトの組織や器官を再構築しようとする、いわゆる再生医療の研究が急速に進んでいる。再生医療においては、細胞が増殖分化して三次元的な生体組織様の構造物を構築できるかがポイントであり、例えば、基材を患者の体内に移植し、周りの組織又は器官から細胞を基材中に侵入させ増殖分化させて組織又は器官を再生する方法が行われている。【０００５】
このような再生医療用の基材として、例えば、特許文献１に開示されるような生体吸収性材料からなる不織布を用いることが提案されている。生体吸収性材料からなる不織布は、再生医療用の基材や縫合補強材として用いた場合には、その空隙部分に細胞が侵入して増殖し、早期に組織が再生される。半月板の再生治療においても、このような組織再生基材を用いることが試みられるようになってきた。
しかしながら、実際には、従来の組織再生基材を用いても、期待したほどには半月板の再生が促進されないという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平０５−０７６５８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、半月板の再生治療において、膝関節の半月板の欠損部分に充填することで、半月板の再生を促進することができる半月板再生基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、半月板の再生治療において、膝関節の半月板の欠損部分に充填することで、半月板の再生を促進することができる半月板再生基材であって、生体吸収性材料からなるフィルム層、生体吸収性材料からなる平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層、及び、生体吸収性材料からなる平均孔径が２２〜５０μｍである不織布からなる層が複合一体化し、少なくとも一方の表面が前記生体吸収性材料からなるフィルム層である積層体からなる半月板再生基材である。
以下に本発明を詳述する。【０００９】
本発明者らは、従来の組織再生基材を用いて半月板の再生を行ったときに、充分に再生が促進されない原因について検討した。従来の組織再生基材を構成する不織布は、細胞の侵入性を確保するために５〜３０μｍ程度の平均孔径であることが好適であることが知られている。本発明者は、鋭意検討の結果、このような従来の組織再生基材は、細胞の侵入性の点では優れているものの、侵入した細胞の一部が組織再生基材を通過して、組織再生基材の外に漏出してしまうことがあることを見出した。侵入した細胞が組織再生基材の外に漏出してしまうことにより、実際に患部に留まる細胞成分の濃度が不足するため、期待したほどには組織の再生が促進されないものと考えられた。また、正常な半月板の組織の再生には、細胞同士が緻密な組織を形成して、細胞間の相互作用によって増殖、分化していくことも重要であるが、従来の組織再生基材では細胞同士の距離が離れてしまい、緻密な組織を形成し難いという問題もあった。一方、細胞の漏出を防止したり、細胞同士の距離を近くしたりするために不織布の平均孔径を小さくした場合には、細胞の侵入性が損なわれてしまうことから、組織が再生されるのは基材表面のごく一部に限られ、充分な厚みをもった組織を再生することができない。更に、半月板再生においては、移植した基材と軟骨とが膝関節の動きにより接触し、その摩擦によって基材の表面が磨耗してしまうという、半月板の再生に独特の問題もあった。【００１０】
本発明者らは、更に鋭意検討の結果、生体吸収性材料からなる平均孔径が２２〜５０μｍである不織布からなる層（以下、「細胞侵入層」ともいう。）に対して、生体吸収性材料からなる平均孔径が５〜２０μｍである不織布からなる層（以下、「細胞漏出防止層」ともいう。）を組み合わせ、更に少なくとも一方の表面に生体吸収性材料からなるフィルム層（以下、単に「フィルム層」ともいう。）を配置した積層体とすることにより、優れた細胞侵入性を維持したまま、細胞が半月板再生基材の外に漏出してしまうことを防止しして、充分な厚みの半月板を再生することができ、かつ、軟骨との摩擦による磨耗をも防止できることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
本発明の半月板再生基材は、フィルム層、細胞侵入層、及び、細胞漏出防止層が複合一体化した積層体からなる。
上記細胞侵入層は、移植後に周囲組織から侵入する細胞増殖の足場となり、半月板の再生を促進する役割を有する。上記積層体は、上記細胞侵入層を１層のみ有してもよく、２層以上を有してもよい。【００１２】
上記細胞侵入層は、生体吸収性材料からなる不織布からなる。
上記細胞侵入層を構成する生体吸収性材料としては、例えば、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリ−ε−カプロラクトン、ラクチド−グリコリド共重合体、グリコリド−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体、ポリジオキサノン、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ−α−シアノアクリレート、ポリ−β−ヒドロキシ酸、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレート、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、ポリエチレンカーボネート、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタメート、ポリ−Ｌ−アラニン等の合成高分子や、デンプン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ペクチン酸及びその誘導体等の多糖類や、ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、フィブリン等のタンパク質等の天然高分子等が挙げられる。これらの生体吸収性材料は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。【００１３】
上記生体吸収性材料のなかでも、ポリグリコリドが好適である。ポリグリコリドを用いた場合には、特に細胞の侵入性に優れ、正常な組織の再生を行うことができる。ポリグリコリドは、例えば繊維状にして３７℃の生理食塩水中に浸漬した場合に、引張強度が浸漬前の１／２になるまでの期間が約１４日である。このような分解性を有することにより、細胞が増殖して組織が再生する時期に基材が徐々に分解吸収されることとなり、基材内部まで再生した組織が構築され、その結果として良質な再生組織が構築されるものと考えられる。更に、生体内に埋入後数日間で炎症系の細胞が消失することから、組織の癒着を引き起こしにくいという優れた効果をも発揮できる。【００１４】
なお、本明細書においてポリグリコリドは、ポリグリコール酸等のグリコリドの重合体を意味するが、本発明の効果を阻害しない範囲で、ラクチド、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン等の他の生体吸収性の成分との共重合体としてもよい。また、本発明の効果を阻害しない範囲で、ポリラクチド等の他の生体吸収性材料との混合物としてもよい。
上記ポリグリコリドがラクチド、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン等の他の生体吸収性の成分との共重合体である場合、該共重合体におけるグリコリド成分の配合量の好ましい下限は６０モル％である。グリコリド成分の配合量を６０モル％以上とすることにより、細胞の侵入性に優れ、かつ、正常な組織の再生を行うという本発明の優れた効果を特に発揮することができる。
上記ポリグリコリドとポリラクチド等の他の生体吸収性材料との混合物を用いる場合、該混合物におけるポリグリコリドの配合量の好ましい下限は５０モル％である。ポリグリコリドの配合量を５０モル％以上とすることにより、細胞の侵入性に優れ、かつ、正常な組織の再生を行うという本発明の優れた効果を特に発揮することができる。【００１５】
上記生体吸収性材料がポリグリコリドである場合、該ポリグリコリドの重量平均分子量の好ましい下限は３００００、好ましい上限は４０００００である。上記ポリグリコリドの重量平均分子量が３００００未満であると、強度が不足して充分な組織補強効果が得られないことがあり、４０００００を超えると、生体内における分解速度が遅くなり、異物反応を起こすことがある。上記ポリグリコリドの重量平均分子量のより好ましい下限は５００００、より好ましい上限は３０００００である。【００１６】
上記生体吸収性材料がポリグリコリドである場合、当該ポリグリコリドの分子量の代替指標としてメルトフローレートを用いてもよい。該ポリグリコリドのメルトフローレートの好ましい下限は０．１ｇ／１０分、好ましい上限は１００ｇ／１０分である。この範囲内であると、ポリグリコリドからなる不織布を作製することが容易となる。ポリグリコリドのメルトフローレートのより好ましい下限は１ｇ／１０分、より好ましい上限は５０ｇ／１０分である。
なお、メルトフローレートの測定条件は、ポリグリコリドを２４０℃、１０分間、シリンダー内で保持して溶融した後、荷重４ｋｇｆの条件で測定した値を意味する。【００１７】
上記細胞侵入層を構成する不織布は、平均孔径の下限が２２μｍ、上限が５０μｍである。上記細胞侵入層がこのような平均孔径を満たす場合に、細胞の侵入性に優れ、かつ、正常な半月板の再生に好適な半月板再生基材を提供できる。不織布中の孔径が２２〜５０μｍの孔には、細胞が容易に侵入することができ、細胞侵入層中で増殖、分化して半月板の組織を形成することができる。これに対して、平均孔径が２２μｍ未満であると、細胞が効率よく侵入することができず、平均孔径が５０μｍを超えると、細胞の侵入は可能であるものの、細胞間の距離が離れすぎるため、細胞侵入層に接着した細胞や、周囲組織から侵入してくる細胞が充分に増殖、分化することができない。上記細胞侵入層を構成する不織布の平均孔径の好ましい下限は２４μｍ、好ましい上限は４０μｍであり、より好ましい下限は２５μｍ、より好ましい上限は３０μｍである。
なお、本明細書において不織布の平均孔径は、バブルポイント法により測定された平均孔径を意味する。【００１８】
上記バブルポイント法による不織布の孔径分布の測定について説明する。
バブルポイント法とは、測定対象となる膜をよく濡らす液体を予め膜の細孔内に吸収させておき、図３に示したような器具に設置し、膜の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定し、液体の表面張力とバブルポイントとの関係式から孔径分布を推算する（図４）方法である。
具体的には、測定対象となる不織布に湿潤液（例えば、フッ素系溶媒、商品名Ｐｏｒｏｆｉｌ（商標））を吸収させた後、図３に示したような器具（例えば、日本ベル社製、Ｐｏｒｏｍｅｔｅｒ  ３Ｇ）に試験片寸法が直径２５ｍｍの円状になるように設置した後、不織布の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定する。
なお、図４に記載された細孔径を算出する式において、γは浸潤液の表面張力を表し、θは不織布素材上の浸潤液の接触角を表し、ΔＰはバブルポイント圧を表す。【００１９】
上記細胞侵入層を構成する不織布の平均繊維径は特に限定されないが、好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は５０μｍである。上記不織布の平均繊維径がこの範囲にある場合には、平均孔径を上記規定の範囲に調整することが容易となる。上記不織布の平均繊維径のより好ましい下限は１５μｍ、より好ましい上限は４０μｍである。【００２０】
上記細胞侵入層の厚さは特に限定されないが、好ましい下限は１００μｍ、好ましい上限は３ｍｍである。上記細胞侵入層の厚さが１００μｍ未満であると、充分な厚みを有する半月板を再生できないことがあり、３ｍｍを超えると、取り扱い性に劣ることがある。上記細胞侵入層の厚さのより好ましい下限は１５０μｍ、より好ましい上限は２．５ｍｍである。【００２１】
上記細胞漏出防止層は、侵入した細胞が半月板再生基材の外に漏出してしまうことを防止する役割を有する。また、細胞侵入層で増殖した細胞が細胞漏出防止層内部へも侵入して、細胞同士が緻密な組織を形成することにより、増殖、分化を促し、より正常な半月板の組織の再生を促進する役割も有する。上記積層体は、上記細胞漏出防止層を１層のみ有してもよく、２層以上を有してもよい。【００２２】
上記細胞漏出防止層は、生体吸収性材料からなる不織布からなる。
上記細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料としては、上記細胞侵入層に用いるものと同様の生体吸収性材料を用いることができる。上記細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料は、上記細胞侵入層を構成する生体吸収性材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。【００２３】
上記細胞漏出防止層を構成する不織布は、平均孔径の下限が５μｍ、上限が２０μｍである。上記細胞漏出防止層がこのような平均孔径を満たす場合に、細胞の漏出を防止することができるとともに、細胞侵入層で増殖した細胞が細胞漏出防止層内部へも侵入することができ、細胞同士が緻密な組織を形成することができる。上記細胞漏出防止層を構成する不織布の平均孔径が２０μｍを超えると、半月板再生基材からの細胞の漏出を充分に防止することができない。上記細胞漏出防止層を構成する不織布の平均孔径が５μｍ未満であると、上記細胞漏出防止層への細胞の侵入性が低下して、充分に半月板の組織の再生を促進できないことがある。上記細胞漏出防止層を構成する不織布の平均孔径の好ましい下限は６μｍ、好ましい上限は１８μｍであり、より好ましい下限は７μｍ、より好ましい上限は１６μｍである。【００２４】
上記細胞漏出防止層を構成する不織布の平均繊維径は特に限定されないが、好ましい下限は０．７μｍ、好ましい上限は７．０μｍである。上記不織布の平均繊維径がこの範囲にある場合には、平均孔径を上記規定の範囲に調整することが容易となる。上記不織布の平均繊維径のより好ましい下限は０．９μｍ、より好ましい上限は５．０μｍである。【００２５】
上記細胞漏出防止層の厚さは特に限定されないが、好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は１５０μｍである。上記細胞漏出防止層の厚さが１０μｍ未満であると、半月板再生基材からの細胞の漏出を充分に防止できないことがあり、１５０μｍを超えると、細胞が侵入できない領域が大きくなり、正常な半月板の組織を再生できないことがある。上記細胞漏出防止層の厚さのより好ましい下限は３０μｍ、より好ましい上限は１００μｍである。【００２６】
上記フィルム層は、上記積層体の少なくとも一方の表面に配置されるものであり、本発明の半月板再生基材中に侵入した細胞が漏出してしまうのを更に防止するとともに、滑り性を向上させて、移植後に軟骨との接触による摩擦によって基材の表面が磨耗してしまうのを防止する役割を有する。
上記フィルム層は、上記積層体の少なくとも一方の表面に配置されていればよいが、両方の表面に配置されていることが好ましい。
なお、本明細書においてフィルムとは、少なくとも光学顕微鏡により観察可能なμｍオーダーの孔を有しない、薄い膜状体を意味する。【００２７】
上記フィルム層を構成する生体吸収性材料としては、上記細胞侵入層や上記細胞漏出防止層に用いるものと同様の生体吸収性材料を用いることができる。上記フィルム層を構成する生体吸収性材料は、上記細胞侵入層や上記細胞漏出防止層を構成する生体吸収性材料と同じであってもよく、異なっていてもよい。なかでも、高い耐磨耗性を発揮できることから、ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体が好適である。【００２８】
上記フィルム層は、医療用の用途を損なわない範囲で、滑り性を更に向上させる目的で滑剤を含有してもよい。  【００２９】
上記フィルム層の厚さは特に限定されないが、好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は５００μｍである。上記フィルム層の厚さが１０μｍ未満であると、移植後に軟骨との接触による摩擦によって基材の表面が磨耗してしまうのを充分には防止できないことがあり、５００μｍを超えると、取り扱い性に劣ることがある。上記フィルム層の厚さのより好ましい下限は２５μｍ、より好ましい上限は２５０μｍである。【００３０】
上記積層体においては、上記フィルム層、上記細胞漏出防止層及び上記細胞侵入層は、複合一体化している。
上記各層が複合一体化していないと、本発明の半月板再生基材を移植する際に、上記各層間の一部又は全部が剥離してしまうことがある。上記各層間が一部でも剥離すると、該剥離部に形成された空間に細胞溜まりが生じて、正常な組織又は器官が再生されないことがある。
なお、本明細書において上記各層が複合一体化しているとは、本発明の半月板再生基材を移植する際に、折り畳んで移植しても上記各層間が剥離しないことを意味する。より定量的には、ＪＩＳ  Ｌ  １０２１−９に規定される剥離強さ試験方法に準じて測定された剥離強さが０．１Ｎ以上であることが好ましく、０．３Ｎ以上であることがより好ましい。【００３１】
上記積層体は、上記フィルム層、上記細胞漏出防止層及び上記細胞侵入層が複合一体化し、少なくとも一方の表面が上記フィルム層であれば、各層が複数層あってもよい。具体的には例えば、フィルム層／細胞侵入層／細胞漏出防止層／細胞侵入層／フィルム層の５層構造や、フィルム層／細胞侵入層／フィルム層／細胞漏出防止層／フィルム層／細胞侵入層／フィルム層／細胞漏出防止層／フィルム層／細胞侵入層の１０層構造であってもよい。【００３２】
図５に本発明の半月板再生基材の一例を示す模式図を示した。
図５（１）の半月板再生基材１０では、フィルム層１１、細胞漏出防止層１２、細胞侵入層１３及びフィルム層１１がこの順に積層一体化されている。
図５（２）の半月板再生基材２０では、フィルム層２１、細胞侵入層２３、細胞漏出防止層２２、細胞侵入層２３及びフィルム層２１がこの順に積層一体化されている。【００３３】
本発明の半月板再生基材を製造する方法は特に限定されず、例えば、上記フィルム層、上記細胞漏出防止層及び上記細胞侵入層を別々に調製した後、医療用接着剤を用いて貼り合わせたり、各層の表面の一部を溶剤で溶解してから貼り合わせたりする方法等が挙げられる。
また、例えば、予め上記細胞侵入層を調製した後、該細胞侵入層上にメルトブロー法により生体吸収性材料からなる糸を吐出して上記細胞漏出防止層を形成し、更に、該積層体の上記細胞漏出防止層側からニードルが進入するようにニードルパンチを行って上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とを複合一体化させた後、一方又は両方の表面にフィルム層を積層する方法も好適である。このような方法によれば、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層との接合面において塞孔することなく、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とを複合一体化することができる。【００３４】
本発明の半月板再生基材の製造方法の一例について、更に詳しく説明する。
上記製造方法では、まず、上記細胞侵入層を調製する。
上記細胞侵入層を調製する方法は特に限定されず、例えば、エレクトロスピニングデポジション法、メルトブロー法、ニードルパンチ法、スパンボンド法、フラッシュ紡糸法、水流交絡法、エアレイド法、サーマルボンド法、レジンボンド法、湿式法等の従来公知の方法を用いることができる。なかでも、上記細胞侵入層の調製にはニードルパンチ法が好適である。【００３５】
上記細胞侵入層の上記細胞漏出防止層を積層する側の表面には、羽毛立ち処理を施してもよい。予め上記細胞侵入層の表面に羽毛立ち処理を施すことにより、上記細胞漏出防止層との密着性がより向上する。
上記羽毛立ち処理は、具体的には例えば、起毛機を用いて上記細胞侵入層の上記細胞漏出防止層を積層する側の表面を起毛処理する方法等が挙げられる。なお、上記細胞侵入層の製造方法としてニードルパンチ法を用いた場合には、得られた細胞侵入層の表面は既に起毛していることから、羽毛立ち処理を施したのと同様の効果が得られる。【００３６】
上記製造方法では、次いで、上記細胞侵入層上に、メルトブロー法により生体吸収性材料からなる糸を吐出して上記細胞漏出防止層を形成する。
メルトブロー法は、原料となる生体吸収性材料を１段階で不織布にする溶融紡糸法である。具体的には、押出機で溶融した生体吸収性材料を、幅方向に多数の口金を有するダイから繊維捕集点に向かって高温、高速の空気流で糸状に吹き出し、繊維状に延伸された樹脂をコンベア上で集積する。吐出から集積の間に繊維同士の絡み合い及び融着が起こることから不織布が形成される。具体的には例えば、上記細胞侵入層をコンベア上、メルトブロー法による繊維捕集点よりも手前となるように配置し、該細胞侵入層をコンベアで移動させながら、細胞侵入層上に繊維を吐出して細胞漏出防止層を形成させる。
この際、メルトブロー法のポリマー吐出量、吐出出口付近のエア風速、コンベアの速度等を調節することにより、形成される細胞漏出防止層の繊維径、密度、厚み等を制御することができる。【００３７】
上記製造方法では、次いで、得られた上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層との積層体の上記細胞漏出防止層側からニードルが進入するようにニードルパンチを行い、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とを複合一体化させる。
ニードルパンチにより、接合面において各層の孔を塞ぐことなく、上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層とを確実に複合一体化させることができる。【００３８】
上記製造方法では、次いで、得られた上記細胞侵入層と上記細胞漏出防止層との積層体の一方又は両方の面に、上記フィルム層を積層する。上記フィルム層を積層する方法としては、例えば、上記フィルム層の表面に、上記フィルム層を溶解可能な溶剤を塗布して一部を溶解した後、積層体の一方又は両方の面に貼り合わせる方法等が挙げられる。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、半月板の再生治療において、膝関節の半月板の欠損部分に充填することで、半月板の再生を促進することができる半月板再生基材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】右膝関節の矢状面での断面模式図である。
【図２】右膝関節の横断面での断面模式図である。
【図３】バブルポイント法による不織布の孔径分布の測定方法を説明する模式図である。
【図４】バブルポイント法によって得られたデータから不織布の孔径分布を推算する方法を説明する模式図である。
【図５】本発明の半月板再生基材の一例を示す模式図である。
【図６】実施例２の半月板再生基材を移植して１２週目の移植部分をサフラニンＯ染色した顕微鏡写真像である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００４２】
（実施例１）
（１）細胞侵入層用不織布の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約２０μｍ、厚さが約３００μｍの細胞侵入層用の不織布を得た。
【００４３】
なお、得られた不織布に、湿潤液としてフッ素系溶媒（商品名Ｐｏｒｏｆｉｌ（商標））を吸収させた後、日本ベル社製のＰｏｒｏｍｅｔｅｒ  ３Ｇに試験片寸法が直径２５ｍｍの円状になるように設置し、不織布の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定した。得られたバブルポイントをもとに不織布の孔径分布を示すグラフを得て、該グラフより平均孔径を算出したところ、２８μｍであった。
【００４４】
（２）細胞漏出防止層の積層
得られた細胞侵入層用の不織布を、メルトブロー法による繊維捕集点よりも手前となるようにコンベア上に設置した。コンベアを移動させながら、細胞侵入層用の不織布上にメルトブロー法によりポリグリコリドからなる糸を吐出して、平均繊維径が約１μｍ、厚さが約８０μｍの細胞漏出防止層を積層した。
メルトブロー法は、原料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、ポリマー吐出量０．２ｋｇ／ｈ、吐出出口付近のエア風速１１ｍ／秒の条件として行った。また、コンベアの移動速度は、上記メルトブロー法により得られる不織布の密度が１０ｇ／ｍ２となる速度に設定した。
なお、別に同様の条件で細胞漏出防止層のみからなる不織布を製造し、バブルポイント法により不織布の平均孔径を算出したところ、１２μｍであった。
【００４５】
（３）細胞侵入層と細胞漏出防止層との複合一体化
得られた積層体の細胞漏出防止層側からニードルが進入するようにニードルパンチを行い、細胞侵入層と細胞漏出防止層とを複合一体化させた。
【００４６】
（４）フィルム層の積層
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０、重量平均分子量２０万）をジオキサンに溶解して４重量％ジオキサン溶液を調製した。得られた溶液をガラスシャーレに流し入れ、風乾及び熱処理することにより厚さ約１００μｍのフィルムを得た。
得られたフィルムの一方の面の表面にジオキサンを少量塗布することにより一部溶解させ、その上に得られた細胞侵入層と細胞漏出防止層との積層体を、細胞漏出防止層側がフィルムに接するように積層し、乾燥させてフィルムと積層体とを複合一体化させて、半月板再生基材を得た。
【００４７】
（比較例１）
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約２０μｍ、厚さが約３８０μｍの細胞侵入層用の不織布を得た。
得られた細胞侵入層用の不織布について、バブルポイント法により不織布の平均孔径を算出したところ、２８μｍであった。
【００４８】
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０、重量平均分子量２０万）をジオキサンに溶解して４重量％ジオキサン溶液を調製した。得られた溶液をガラスシャーレに流し入れ、風乾及び熱処理することにより厚さ約１００μｍのフィルムを得た。
得られたフィルムの一方の面の表面にジオキサンを少量塗布することにより一部溶解させ、その上に得られた細胞侵入層用の不織布を積層し、乾燥させてフィルムと不織布とを複合一体化させて、半月板再生基材を得た。
【００４９】
（比較例２）
テフロン（登録商標）シートを、メルトブロー法による繊維捕集点よりも手前となるようにコンベア上に設置した。コンベアを移動させながら、テフロン（登録商標）シート上にメルトブロー法によりポリグリコリドからなる糸を吐出して、平均繊維径が約１μｍ、厚さが約３８０μｍの細胞漏出防止層を得た。
メルトブロー法は、原料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、ポリマー吐出量０．２ｋｇ／ｈ、吐出出口付近のエア風速１１ｍ／秒の条件として行った。また、コンベアの移動速度は、上記メルトブロー法により得られる不織布の密度が１０ｇ／ｍ２となる速度に設定した。
得られた細胞漏出防止層用の不織布について、バブルポイント法により不織布の平均孔径を算出したところ、１２μｍであった。
【００５０】
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０、重量平均分子量２０万）をジオキサンに溶解して４重量％ジオキサン溶液を調製した。得られた溶液をガラスシャーレに流し入れ、風乾及び熱処理することにより厚さ約１００μｍのフィルムを得た。
得られたフィルムの一方の面の表面にジオキサンを少量塗布することにより一部溶解させ、その上に得られた細胞漏出防止層の不織布を積層し、乾燥させてフィルムと不織布とを複合一体化させて、半月板再生基材を得た。
【００５１】
（比較例３）
フィルム層を積層しなかった以外は実施例１と同様にして半月板再生基材を得た。
【００５２】
＜動物実験による評価＞
実験動物としてウサギを準備し、右膝関節の内側半月板の前節〜中節（図２の点線で囲んだ部分）を切除した。半月板除去部に、実施例及び比較例にて得られた半月板再生基材を移植して縫合した。
術後８週目に犠牲死させ、右膝関節を観察したところ、実施例１においては除去部分を完全に埋める程度に半月板様組織が再生しているのを確認できた。一方、比較例１〜３では、半月板様組織の再生は認められなかった。
【００５３】
（実施例２）
（１）細胞侵入層用不織布の調製
生体吸収性材料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、これを紡糸して得た糸からなる布をニードルパンチ法により不織布化する方法により、平均繊維径が約２０μｍ、厚さが約３００μｍの細胞侵入層用の不織布を得た。
【００５４】
なお、得られた不織布に、湿潤液としてフッ素系溶媒（商品名Ｐｏｒｏｆｉｌ（商標））を吸収させた後、日本ベル社製のＰｏｒｏｍｅｔｅｒ  ３Ｇに試験片寸法が直径２５ｍｍの円状になるように設置し、不織布の裏側から空気圧をかけて、膜表面に気泡の発生が観察できる最小圧力（バブルポイント）を測定した。得られたバブルポイントをもとに不織布の孔径分布を示すグラフを得て、該グラフより平均孔径を算出したところ、２８μｍであった。
【００５５】
（２）フィルム層用フィルムの調製
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０、重量平均分子量２０万）をジオキサンに溶解して４重量％ジオキサン溶液を調製した。得られた溶液をガラスシャーレに流し入れ、風乾及び熱処理することにより厚さ約１００μｍのフィルム層用のフィルムを得た。
【００５６】
（３）細胞漏出防止層用不織布の調製
生体吸収性材料としてポリグリコリドを用い、スクリュー径２０ｍｍの汎用小型押出機にてメルトブロー法により不織布を作製した。ホッパー内を窒素ガスパージし、熱風下にて紡糸を行い、吐出量とベルトコンベアの速度を調整することにより平均繊維径が約１μｍ、厚さが約８０μｍの細胞漏出防止層用の不織布を得た。
メルトブロー法は、原料として重量平均分子量が２５００００のポリグリコリドを用い、ポリマー吐出量０．２ｋｇ／ｈ、吐出出口付近のエア風速１１ｍ／秒の条件として行った。また、コンベアの移動速度は、上記メルトブロー法により得られる不織布の密度が１０ｇ／ｍ２となる速度に設定した。
なお、別に同様の条件で細胞漏出防止層のみからなる不織布を製造し、バブルポイント法により不織布の平均孔径を算出したところ、１２μｍであった。
【００５７】
（４）１０層構造積層体からなる半月板再生基材の製造
フィルム層用フィルムの一方の面の表面にジオキサンを少量塗布することにより一部溶解させ、その上に得られた細胞侵入層用不織布を積層した。次いで、細胞侵入層用不織布を積層したフィルム層用フィルムの他方の面の表面にジオキサンを少量塗布することにより一部溶解させ、その上に得られた細胞漏出防止層用不織布を積層し乾燥させて積層体を得た。前記と略同様の工程を繰り返すことにより、フィルム層／細胞侵入層／フィルム層／細胞漏出防止層／フィルム層／細胞侵入層／フィルム層／細胞漏出防止層／フィルム層／細胞侵入層の１０層構造の積層体からなる半月板再生基材を得た。
【００５８】
＜動物実験による評価＞
実験動物としてウサギを準備し、右膝関節の内側半月板の前節〜中節（図２の点線で囲んだ部分）の一部を切除した。半月板除去部に、実施例２で得られた半月板再生基材を移植して縫合した。
また、比較対象として、半月板除去部に、半月板再生基材を移植せず縫合した実験、及び、ｓｈａｍ対照として、メスを入れ、半月板除去を行わずにそのまま閉創した実験も行った。
【００５９】
術後１２週目に犠牲死させ、内側半月板を取り出し、移植部分（比較対照においては内側半月板の前節〜中節の部分）を摘出した。得られた標本をサフラニンＯ染色した顕微鏡写真像を図６に示した。
図６より、術後１２週後には、半月板再生基材を移植した部分において、ｓｈａｍ対照と同程度の軟骨組織の再生（染色像において赤く染色された部分）が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、半月板の再生治療において、膝関節の半月板の欠損部分に充填することで、半月板の再生を促進することができる半月板再生基材を提供することができる。
【符号の説明】
【００６１】
１  半月板
２  膝蓋下脂肪体
３  軟骨
４  大腿骨
５  脛骨
６  膝蓋骨
７  関節包
８  関節液
１０  半月板再生基材
１１  フィルム層
１２  細胞漏出防止層
１３  細胞侵入層
２０  半月板再生基材
２１  フィルム層
２２  細胞漏出防止層
２３  細胞侵入層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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