(57)【要約】【課題】  試料中に含まれる、第１検出対象物と第２検出対象物との関係性を測定する測定方法および測定装置を提供する。【解決手段】  第１検出対象物よりも第２検出対象物に高い反応性を有する第１反応物質と試料との反応に基づく第１信号値と、第２検出対象物よりも第１検出対象物に高い反応性を有する第２反応物質と試料との反応に基づく第２信号値とを測定する測定工程を備える測定方法とする。また、第１検出対象物よりも第２検出対象物に高い反応性を有する第１反応物質と試料との反応に基づく第１信号値と、第２検出対象物よりも第１検出対象物に高い反応性を有する第２反応物質と試料との反応に基づく第２信号値とを測定する測定部を備える測定装置とする。
2017018049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出部材の表面に位置しており、第１検出対象物よりも第２検出対象物に高い反応性を有する第１反応物質と、第２検出対象物よりも第１検出対象物に高い反応性を有する第２反応物質とを準備する準備工程と、
前記第１検出対象物と前記第２検出対象物とを含む試料を前記検出部材の表面に供給する供給工程と、
供給工程の後、前記第１反応物質と前記試料との反応に基づく第１信号値と、前記第２反応物質と前記試料との反応に基づく第２信号値とを測定する測定工程と、
前記第１信号値および前記第２信号値に基づいて、前記試料における前記第１検出対象物と前記第２検出対象物との関係性を算出する算出工程と、を備える測定方法。
【請求項２】
前記算出工程は、予め作成された検量線と、前記第１信号値および前記第２信号値とに基づいて、前記第１検出対象物と前記第２検出対象物との前記関係性を算出する、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記検量線は、前記総検出対象物の濃度と、前記第１検出対象物と前記第２検出対象物との関係性とが予め定められた複数の標準試料を用いて測定された、前記第１反応物質と前記標準試料との反応に基づく第１標準信号値と、前記第２反応物質と前記標準試料との反応に基づく第２標準信号値とを用いて作成される、請求項２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記第１反応物質および前記第２反応物質は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、およびボロン酸化合物からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
前記第１反応物質および前記第２反応物質は、抗体あるいはアプタマーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項６】
前記第１反応物質および前記第２反応物質はいずれも、ＲＮＡアプタマーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項７】
前記検出部材は、表面弾性波素子を有し、
前記第１信号値および前記第２信号値は、前記表面弾性波素子の位相特性の値である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項８】
前記第１信号値および前記第２信号値は、ＱＣＭ、ＳＰＲおよびＦＥＴから選択された方法によって測定された値である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項９】
前記試料は、血液試料である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１０】
前記第１検出対象物および前記第２検出対象物は、タンパク性物質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１１】
前記タンパク性物質は、疾患関連タンパク性物質である、請求項１０に記載の測定方法。
【請求項１２】
第１検出対象物と第２検出対象物とを含む試料を、検出部材の表面に位置しており、前記第１検出対象物よりも前記第２検出対象物に高い反応性を有する第１反応物質と、前記第２検出対象物よりも前記第１検出対象物に高い反応性を有する第２反応物質とに供給する供給部と、
前記第１反応物質と前記試料との反応に基づく第１信号値と、前記第２反応物質と前記試料との反応に基づく第２信号値とを測定する測定部と、
前記第１信号値および前記第２信号値に基づいて、前記試料における前記第１検出対象物と前記第２検出対象物との関係性を算出する算出部と、を備える装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる、第１検出対象物と第２検出対象物との関係性を測定する方法および装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
試料中に含まれる物質には、試料のおかれた条件に応じてその濃度が変化するものが存在する。例えば、血液中の糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１）、特に、ＨｂＡ１ｃは、糖尿病患者においてその血中濃度が増加する物質として知られており、ＨｂＡ１ｃの血中濃度は糖尿病の診断基準の１つとして用いられている。【０００３】
これまでに、抗体を用いるＥＬＩＳＡ法によって試料中の物質濃度を測定する方法が知られている。例えば、ＨｂＡ１ｃ含有率を測定する方法（例えば、特許文献１および２）や、アプタマーを表面に結合させた検出素子を備えるバイオセンサを用いて、血液中のＨｂＡ１ｃ濃度を測定する方法が知られている（例えば、特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０６７６１１号パンフレット
【特許文献２】特公平０７−０２０４３７号公報
【特許文献３】特表２０１５−５０７１９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上述のような従来技術では、試料中の物質を感度良く検出するには操作時間や費用がかかるとの問題があった。また、上述のような従来技術では、全血などの精製されていない試料中の物質の濃度を測定することができないので、物質の濃度を測定する前に試料の精製操作が必要であるとの問題があった。【０００６】
そのため、費用を抑え、簡便な操作で試料中の検出対象物を高い精度で測定することができる測定方法および測定装置が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の実施形態に係る測定方法は、検出部材の表面に位置しており、第１検出対象物よりも第２検出対象物に高い反応性を有する第１反応物質と第２検出対象物よりも第１検出対象物に高い反応性を有する第２反応物質とを準備する準備工程と、第１検出対象物および第２検出対象物を含む試料を検出部材の表面に供給する供給工程と、供給工程の後、第１反応物質と前記試料との反応に基づく第１信号値と、第２反応物質と試料との反応に基づく第２信号値とを測定する測定工程と、第１信号値および第２信号値に基づいて、試料における第１検出対象物と第２検出対象物との関係性を算出する算出工程と、を備える測定方法である。【０００８】
本発明の実施形態に係る測定装置は、第１検出対象物および第２検出対象物を含む試料を、検出部材の表面に位置しており、第１検出対象物よりも第２検出対象物に高い反応性を有する第１反応物質と第２検出対象物よりも第１検出対象物に高い反応性を有する第２反応物質とに供給する供給部と、第１反応物質と試料との反応に基づく第１信号値と、第２反応物質と試料との反応に基づく第２信号値とを測定する測定部と、第１信号値および第２信号値に基づいて、試料における第１検出対象物と第２検出対象物との関係性を算出する算出部と、を備える測定装置である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の実施形態に係る測定方法および測定装置によれば、上述のような構成を有することによって、従来法に比べて、簡便な操作で、費用を抑え、試料に含まれる第１検出対象物と第２検出対象物との関係性を高い精度で測定することが可能となる。例えば、糖尿病の診断基準となる総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率、血糖コントロールの指標となるアルブミンに対するグリコアルブミンの比率、および遺伝性異常ヘモグロビン（Ｈｂ）症のスクリーニングに用いられるヘモグロビンに対するヘモグロビンＦの比率を、従来法に比べて、簡便な操作で、費用を抑え、高い精度で測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施形態に係る測定装置１００の構成を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係るバイオセンサ装置２００の斜視図である。
【図３】本発明の実施形態に係るバイオセンサ装置２００の分解斜視図である。
【図４】本発明の実施形態に係る検出素子３の平面図である。
【図５】本発明の実施形態に係る測定方法に関する実験データを示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る測定方法に関する実験データを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜測定方法＞
（第１実施形態）
本発明の第１実施形態に係る測定方法は、検出部材の表面に位置しており、第１検出対象物よりも第２検出対象物に高い反応性を有する第１反応物質と第２検出対象物よりも第１検出対象物に高い反応性を有する第２反応物質とを準備する準備工程と、第１検出対象物および第２検出対象物を含む試料を検出部材の表面に供給する供給工程と、供給工程の後、第１反応物質と試料との反応に基づく第１信号値と、第２反応物質と試料との反応に基づく第２信号値とを測定する測定工程と、第１信号値および第２信号値に基づいて、試料における第１検出対象物と第２検出対象物との関係性を算出する算出工程と、を備える。
【００１２】
以下、本実施形態の測定方法について順に説明を行なう。
本実施形態の準備工程は、検出部材の表面に位置しており、第１検出対象物よりも第２検出対象物に高い反応性を有する第１反応物質と、第２検出対象物よりも第１検出対象物に高い反応性を有する第２反応物質とを準備するものである。
【００１３】
本明細書において、「検出部材」とは、例えば、その表面に、表面弾性波素子、ＱＣＭ（Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、およびＦＥＴ（Ｆｉｅｌｄ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ）などの信号値を出力する検出素子を含むものであり、これらに限定されない。
【００１４】
本明細書において、「第１検出対象物」は、試料中に含まれる物質であれば特に限定されるものではないが、タンパク性物質であってもよく、好ましくは、疾患関連タンパク性物質である。タンパク性物質とは、アミノ酸を有する有機化合物であれば特に限定されるものではなく、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチド、ならびにそれらの糖化体などの修飾体であってもよい。疾患関連タンパク性物質とは、疾患に関連し得るタンパク性物質であれば特に限定されるものではないが、例えば、ヘモグロビンＦ（ＨｂＦ）、ＨｂＡ１ｃ、およびグリコアルブミンなどが挙げられる。
【００１５】
本明細書において、「第２検出対象物」は、試料中に含まれる物質であれば特に限定されるものではないが、タンパク性物質であってもよく、好ましくは、疾患関連タンパク性物質である。タンパク性物質とは、アミノ酸を有する有機化合物であれば特に限定されるものではなく、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチド、ならびにそれらの糖化体などの修飾体であってもよい。疾患関連タンパク性物質としては、疾患に関連し得るタンパク性物質であれば特に限定されるものではないが、例えば、ヘモグロビン（Ｈｂ）、ＨｂＡ０、およびアルブミンなどが挙げられる。また、第２検出対象物に変異体が存在する場合、第２検出対象物は、第２検出対象物の全変異体の合計であってもよい。
【００１６】
第１検出対象物および第２検出対象物は、目的に応じて選択されればよく、例えば、糖尿病の診断を目的とする場合、第１検出対象物は、ＨｂＡ１ｃであり、第２検出対象物は、ＨｂＡ０である。例えば、血糖コントロールの指標を取得することを目的とする場合、第１検出対象物は、グリコアルブミンであり、第２検出対象物は、アルブミンである。例えば、遺伝性異常Ｈｂ症のスクリーニングを目的とする場合、第１検出対象物は、ヘモグロビンＦであり、第２検出対象物は、ヘモグロビンである。
【００１７】
本明細書において、「関係性」は、第１検出対象物と第２検出対象物との間の相関関係であればよく、特に限定されるものではないが、例えば、比率、糖化率、および変異率などであってもよい。
【００１８】
本明細書において、「反応」は、第１反応物質または第２反応物質が、第１検出対象物および第２検出対象物を含む試料に影響を与えた結果、検出部材の表面状態を変化させる反応であればよく、特に限定されるものではないが、例えば、結合反応、酵素反応、および還元反応などであってもよい。
【００１９】
本明細書において、「反応性」は、第１検出対象物または第２検出対象物に対して第１反応物質または第２反応物質が影響を与える度合であり、例えば、親和性、活性、および結合性などであってもよい。
【００２０】
以下、第１検出対象物がＨｂＡ１ｃであり、第２検出対象物がＨｂＡ０である場合を例として本発明の一実施形態を説明する。ただし、以下の例は、本発明の一実施形態に過ぎず、本発明の範囲は、以下の実施形態に限定されない。
【００２１】
ＨｂＡ０よりもＨｂＡ１ｃに高い親和性を有する第１反応物質に由来する第１信号値は、試料中に含まれる総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃ比率が一定の場合、横軸を総Ｈｂ濃度の対数で表した場合には、総Ｈｂ濃度が低い時点では信号値の上昇は緩やかであるが、総Ｈｂ濃度が所定の濃度を超えて上昇すれば、急激に上昇する。なお、横軸を線形で表すと、総Ｈｂ濃度が低い時点ほど信号が急激に上昇し緩やかに収束していく傾向になる。これに対して、ＨｂＡ１ｃよりもＨｂＡ０に高い親和性を有する第２反応物質に由来する第２信号値は、試料中に含まれる総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃ比率が一定の場合、横軸を総Ｈｂ濃度の対数とした場合には、第１信号値に比べて総Ｈｂ濃度が低い時点から信号値が上昇するが、第１信号値よりも低い総Ｈｂ濃度で信号値が飽和しプラトーに達する。
【００２２】
このように、試料中に含まれる総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃ比率が一定の場合において、第１信号値と第２信号値とは試料中の総Ｈｂ濃度が上昇すると共に異なる変化を示す。総Ｈｂ濃度と総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃ比率とに基づいて第１信号値および第２信号値の関係をグラフ化すれば、総Ｈｂ濃度に対するＨｂＡ１ｃ比率と第１信号値と第２信号値とは一定の関係を示すので、この関係に基づいて検量線を作成することが可能である。
【００２３】
また、第１反応物質に由来する第１信号値と第２反応物質に由来する第２信号値とを同時に測定し、予め作成された検量線に基づいて、試料中の総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃ比率を算出することが可能となる。つまり、本実施形態における測定方法によれば、試料中の総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃ比率を簡便な操作で算出することができる。
【００２４】
一実施形態において、第１反応物質は、ＨｂＡ０よりもＨｂＡ１ｃに対して５〜３０倍程度高い親和性を有し、第２反応物質は、ＨｂＡ１ｃよりもＨｂＡ０に対して１００倍以上高い親和性を有する。なお、第１反応物質と第２反応物質とは、いずれか一方が、ＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃの両方に親和性を有すればよい。例えば、第１反応物質が、ＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃの両方に上記のように異なる親和性を有しており、第２反応物質は、ＨｂＡ０のみに親和性を有していてもよい。なお、第１反応物質が、ＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃの一方とのみ親和性を有し、第２反応物質が他方とのみ親和性を有していてもよい。
【００２５】
本明細書において「第１反応物質」および「第２反応物質」はそれぞれ、たとえば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、およびボロン酸などの化合物からなる群から選択されてもよい。第１反応物質および第２反応物質は、例えば、抗体、アプタマーおよびペプチドなどを含むリガンドであってもよい。また、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体などであってもよく、アプタマーは、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡアプタマーなどであってもよい。第１反応物質と第２反応物質とは、同じものであっても違っていてもよく、例えば、両物質ともアプタマーであってもよく、一方が抗体で他方がアプタマーであってもよい。また、第１検出対象物および第２検出対象物が、ＨｂＡ１ｃなどの糖化されている物質である場合には、第１反応物質および第２反応物質は、ボロン酸化合物などであってもよい。
【００２６】
本実施形態の供給工程は、ＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃを含む試料を検出部材の表面に供給するものである。これによって、検出部材の表面に固定された第１反応物質とＨｂＡ０および／またはＨｂＡ１ｃとの反応、ならびに検出部材の表面に固定された第２反応物質とＨｂＡ０および／またはＨｂＡ１ｃとの反応が生じる。ここで、固定とは、検出部材の表面に化学結合あるいは共有結合を行なうことによって固定化されている場合、および、単なる物理的な力によって付着している場合を含む。
【００２７】
本実施形態の測定工程は、供給工程の後、第１反応物質と試料との反応に基づく第１信号値と、第２反応物質と試料との反応に基づく第２信号値とを測定するものである。
【００２８】
本実施形態において、検出部材は表面弾性波素子を有し、第１反応物質と試料との反応に基づく第１信号値、および第２反応物質と試料との反応に基づく第２信号値として、表面弾性波素子の位相特性の値を用いてもよい。
【００２９】
本実施形態の算出工程は、第１信号値および第２信号値に基づいて、試料における総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率を算出するものである。
【００３０】
本実施形態の算出工程は、予め作成された検量線と第１信号値および第２信号値とに基づいて、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率を算出するものであってもよい。
【００３１】
本明細書において「検量線」とは、上述のような所望の関係性を算出するために必要なものであればよい。例えば、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率を算出する場合には、総Ｈｂ濃度と総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率とが予め定められた複数の標準試料を用いて測定された、第１反応物質と標準試料との反応に基づく第１標準信号値と、第２反応物質と標準試料との反応に基づく第２標準信号値とを用いて作成されるものであってもよい。
【００３２】
本明細書において、「試料」とは、例えば、全血などの血液試料であってもよく、血液試料を緩衝液などによって希釈したものであってもよい。なお、血液試料以外の試料であってもよい。
【００３３】
また、変形例として、供給工程と測定工程との間に、洗浄液を検出部材の表面に供給する洗浄工程を実施することも可能である。洗浄工程を実施することによって、試料中に含まれる総Ｈｂに含まれない物質からなる夾雑物を検出部材の表面から除くことができるので、夾雑物の影響を洗浄工程以降の工程から除くことができ、測定工程で測定される第１信号値および第２信号値の正確性を向上することができる。
【００３４】
本明細書において、「洗浄液」とは、例えば、緩衝液などであってもよい。緩衝液は、例えば、リン酸緩衝液などを含み、これらに限定されず緩衝液として公知のものを適宜用いればよい。
【００３５】
第１実施形態の一実施例として、検出部材として表面弾性波素子を有し、第１反応物質としてＨｂＡ０よりもＨｂＡ１ｃに高い親和性を有する第１ＲＮＡアプタマーを用い、第２反応物質としてＨｂＡ１ｃよりもＨｂＡ０に高い親和性を有する第２ＲＮＡアプタマーを用い、試料として血液試料を用いた例を以下に示す。
【００３６】
すなわち、第１実施形態の一実施例は、以下のような各工程を有する測定方法であってもよい。検出部材の表面に固定されており、ＨｂＡ０よりもＨｂＡ１ｃに高い親和性を有する第１ＲＮＡアプタマーと、ＨｂＡ１ｃよりもＨｂＡ０に高い親和性を有する第２ＲＮＡアプタマーとを準備する準備工程と、ＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃを含む血液試料を前記検出部材の表面に供給する供給工程と、供給工程の後、第１ＲＮＡアプタマーとＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃとの結合に基づく第１信号値と、第２ＲＮＡアプタマーとＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃとの結合に基づく第２信号値とを測定する測定工程と、前記第１信号値および前記第２信号値に基づいて、前記血液試料における総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率を算出する算出工程と、を備える測定方法であってもよい。
【００３７】
＜測定装置＞
（第２実施形態）
図１は、本発明の第２実施形態である測定装置１００の機能的構成を示すブロック図である。本発明の第１実施形態に係る測定方法は、測定装置１００で実行される。
【００３８】
以下、第１検出対象物がＨｂＡ１ｃであり、第２検出対象物がＨｂＡ０である場合を例として本発明の一実施形態を説明する。ただし、以下の例は、本発明の一実施形態に過ぎず、本発明の範囲は、以下の例に限定されない。
【００３９】
測定装置１００は、ＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃを含む試料を、検出部材の表面に固定されており、ＨｂＡ０よりもＨｂＡ１ｃに高い親和性を有する第１反応物質と、ＨｂＡ１ｃよりもＨｂＡ０に高い親和性を有する第２反応物質とに供給する供給部と、第１反応物質と試料との反応に基づく第１信号値と、第２反応物質と試料との反応に基づく第２信号値とを測定する測定部と、第１信号値および第２信号値に基づいて、試料における総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率を算出する算出部と、を備える。
【００４０】
供給部１０は、第１反応物質および第２反応物質が固定された検出部材と、この検出部材に試料を供給するための供給路、試料を供給路内に流すポンプを含むが、構成は限定されない。
【００４１】
測定部２０は、検出部材に信号を入力し、検出部材から出力される信号に基づいて予め定める信号値を取得する素子を含む装置などであってもよいが、構成は限定されない。
【００４２】
算出部３０は、測定部２０で測定された第１信号値と第２信号値とから総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率を得る演算素子を含む演算装置などであってもよいが、構成は限定されない。
【００４３】
次に測定装置１００に用いられるバイオセンサ装置の一例を示す。バイオセンサ装置は、供給部、測定部、算出部を構成する。
【００４４】
図２は、バイオセンサ装置２００の斜視図であり、図３は、バイオセンサ装置２００の分解斜視図であり、図４は、検出素子３の平面図である。
【００４５】
バイオセンサ装置２００は、基板１、流路構成体２および検出素子３からなる。流路構成体２は、図２に示すように検出素子３および支持部材４を介して基板１の上に配置されている。流路構成体２は、長手方向の一方の端部側に液体状の試料の入口である流入口１４を有し、流入口１４と連通する流路が内部に形成されている。基板１は平板状であり、例えば、樹脂基板、セラミックス基板などであり、表層または内層に配線導体などを設けている。
【００４６】
基板１の上面の一方の端部側には検出素子３が実装されている。検出素子３の両側には、検出素子３に電気的に接続された端子６が設けられている。端子６には、装置、演算装置などが接続される。
【００４７】
検出素子３は、表面弾性波素子であり、圧電基板７、第１ＩＤＴ（Inter Digital Transducer）電極８、第２ＩＤＴ電極９および検出部１３からなる。圧電基板７は、タンタル酸リチウムなどの圧電性を有する単結晶の基板からなる。第１ＩＤＴ電極８は、一対の櫛歯電極を有する。各櫛歯電極は互いに対向する２本のバスバーおよび各バスバーから他のバスバー側へ延びる複数の電極指を有する。一対の櫛歯電極は、複数の電極指が互いに噛み合うように配置されている。第２ＩＤＴ電極９も第１ＩＤＴ電極８と同様に構成されている。第１ＩＤＴ電極８および第２ＩＤＴ電極９は、トランスバーサル型のＩＤＴ電極を構成している。
【００４８】
第１ＩＤＴ電極８は、所定の弾性表面波を発生させるためのものであり、第２ＩＤＴ電極９は、第１ＩＤＴ電極８で発生した弾性表面波を受信するためのものである。第１ＩＤＴ電極８および第２ＩＤＴ電極９は、例えばアルミニウム、アルミニウムと銅との合金などからなる。
【００４９】
検出部１３は、第１ＩＤＴ電極８と第２ＩＤＴ電極９との間に設けられている。検出部１３は、例えばクロムおよびクロム上に成膜された金の２層構造となっている。検出部１３の金属膜の表面には、ＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃと反応する第１反応物質または第２反応物質が固定されている。試料が検出部に供給されると、試料中のＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃが第１反応物質または第２反応物質と反応する。
【００５０】
第１ＩＤＴ電極８と第２ＩＤＴ電極９と検出部１３を１組とすると、検出素子３には、２組設けられている。例えば、一方の検出部１３では、試料を測定し、他方の検出部１３では、リファレンス値を測定することができる。例えば、他方の検出部１３は、第１反応物質および第２反応物質が反応しない。
【００５１】
このような弾性表面波を利用した検出素子３では、まず、第１ＩＤＴ電極８に外部から所定電圧の信号を印加する。第１ＩＤＴ電極８において、圧電基板７の表面が励振され、所定の周波数の弾性表面波が発生する。発生した弾性表面波の一部が検出部１３に向かって伝搬し、検出部１３を通過して第２ＩＤＴ電極９によって受信される。検出部１３では、ＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃの量に応じて第１反応物質または第２反応物質が反応し、反応の分だけ検出部１３の質量が増加する。質量の増加に伴い検出部１３を通過する弾性表面波の位相が変化すると、変化に応じた電圧が第２ＩＤＴ電極９に生じる。第１ＩＤＴ電極８に印加された信号の位相と、第２ＩＤＴ電極９から出力される信号の位相との違いを位相変化として測定する。
【００５２】
基板１の上面には、さらに支持部材４が搭載され、支持部材４は、流路構成体２を支持している。流路構成体２は、検出素子３の少なくとも一部を覆うようにして配置される。流路構成体２は、例えば、第１接着層１９、第１親水性シート２２、第２接着層２３および第２親水性シート２４から構成される。
【００５３】
第１接着層１９は、貫通孔１９ｈを有する枠体であり、検出素子３の一部が貫通孔１９ｈによって露出している。第１接着層１９の上には第１親水性シート２２が積層される。第１親水性シート２２は、貫通孔１９ｈと同様の貫通孔２２ｈを有しており、貫通孔同士が連通するように第１接着層１９と第１親水性シート２２とが積層される。第１親水性シート２２の上には第２接着層２３が積層される。第２接着層２３には、流路を構成する長手方向に延びる貫通孔２３ｈを有する。貫通孔２３ｈの一方端部は、貫通孔２２ｈと重なる位置にまで延びている。第２接着層２３の上には第２親水性シート２４が積層される。第２親水性シート２４の両端部寄りには、貫通孔からなる流入口１４および排気口１８が設けられている。流入口１４および排気口１８は、貫通孔２３ｈと重なる位置に形成されている。
【実施例】
【００５４】
以下、上述した実施形態に係る測定方法の実施例について説明する。【００５５】
（実施例１  検量線の作成）
分子間相互作用解析装置であるＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ ヘルスケア製）を用いた。この装置は、４つのフローセル（Ｆｃ１〜４）を有している。【００５６】
基板（基体）として、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ（ＧＥ ヘルスケア製）を用いた。【００５７】
以下において、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ上に、第１反応物質であるＲＮＡアプタマーＡ（配列番号１）と第２反応物質であるＲＮＡアプタマーＢ（配列番号２）とを固定化し、それぞれのＲＮＡアプタマーとＨｂＡ０およびＨｂＡ１ｃとの結合に基づく位相特性の値（以下、信号値とも称する）を測定する手順を示す。【００５８】
ここで、ＲＮＡアプタマーＡおよびＲＮＡアプタマーＢは、アデニンおよびウラシルの２’位がフッ素基に置換されており、予めアニール処理（８５℃  ３分間、−０．１℃／秒、２５℃）したものを用いた。ＲＮＡアプタマーＡおよびＲＮＡアプタマーＢは、社外にて合成したものである。【００５９】
ＲＮＡアプタマーＡのＨｂＡ０に対する解離定数ＫＤは１６０ｎＭであった。また、ＲＮＡアプタマーＡは、ＨｂＡ１ｃに対して全く結合しないか、または非常にわずかしか結合しなかった。つまり、ＲＮＡアプタマーＡは、ＨｂＡ１ｃよりもＨｂＡ０に高い親和性を有する。【００６０】
ＲＮＡアプタマーＢのＨｂＡ０に対する解離定数ＫＤは１０００ｎＭであり、ＨｂＡ１ｃに対する解離定数ＫＤは５０ｎＭであった。つまり、ＲＮＡアプタマーＢは、ＨｂＡ０よりもＨｂＡ１ｃに高い親和性を有する。【００６１】
ランニング緩衝液として、ＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ ヘルスケア製）にＭｇＣｌ２が１ｍＭ含有されるようにＭｇＣｌ２を追加したもの（0.01M HEPES(pH7.4), 0.15M NaCl, 0.005% Surfactant P20, 1mM MgCl2）を用いた（以下、ＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）と記す。）。【００６２】
また、検量線を作成するために、ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質(JCCRM 423-9b/検査医学標準物質機構/凍結乾燥品)を変性させ、変性を停止後、カラムにより界面活性剤を除去し、脱塩カラムによって溶媒をＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）に置換して得た溶液を標準試料として用いた。【００６３】
（１）  全てのフローセルＦｃ１〜４を、１０ｍＭのＮａＯＨを用いて流速２０μｌ／ｍｉｎで１分間洗浄をした。【００６４】
（２）  上記（１）を４回繰り返した。【００６５】
（３）  フローセルＦｃ１〜４に、５’末端にビオチンを有する５μＭのＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号３）を、流速５μｌ／ｍｉｎで６分間流して固定化した。この際、希釈は、ＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）溶液を用いて行なった。【００６６】
（４）  フローセルＦｃ１〜４を、１０ｍＭのＮａＯＨを用いて流速２０μｌ／ｍｉｎで１分間洗浄をした。【００６７】
（５）  上記（４）を４回繰り返した。【００６８】
（６）  フローセルＦｃ２に、それぞれ０．５μＭのＲＮＡアプタマーＡを流速５μｌ／ｍｉｎで２分間流して固定化し、その後１分間の解離状態をモニターした。【００６９】
（７）  上記のフローセルＦｃ１およびＦｃ２に、Ｆｃ１、Ｆｃ２の順番に、総Ｈｂ濃度が０．０１μＭであり、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が５．５６％の標準試料を流速２０μｌ／ｍｉｎで５分間流し、その後２分間の解離状態をモニターした。フローセルＦｃ１は、フローセルＦｃ２に対するリファレンス値を得るために用いた。【００７０】
（８）  フローセルＦｃ１およびＦｃ２を、１０ｍＭのＮａＯＨを用いて流速２０μｌ／ｍｉｎで１分間洗浄をした。この作業により、ＲＮＡアプタマーＡが外れて、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡは上記（５）が完了した状態に戻る。【００７１】
（９）  その後、上記（６）〜（８）の操作を、総Ｈｂ濃度が０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭの標準試料について実施した。これらの標準試料における、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率は５．５６％とした。【００７２】
（１０）その後、上記（６）〜（９）の操作を、フローセルＦｃ３およびＦｃ４について、ＲＮＡアプタマーＢを用いて実施した。なお、フローセルＦｃ４にＲＮＡアプタマーＢを固定化し、フローセルＦｃ３はフローセルＦｃ４に対するリファレンス値を得るために用いた。それ以外の操作については上述と同様である。結果を図５（ａ）に示す。【００７３】
また、上記（１）〜（１０）の操作を、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が７．７４％であり、総Ｈｂ濃度が０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭの標準試料について実施した。その結果を図５（ｂ）に示す。【００７４】
また、上記（１）〜（１０）の操作を、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が１０．４８％であり、総Ｈｂ濃度が０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭの標準試料について実施した。その結果を図５（ｃ）に示す。【００７５】
図６（ａ）は、上述の図５（ａ）〜図５（ｃ）で用いた各標準試料について、総Ｈｂ濃度と、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率との関係をプロットした図である。そして、図６（ｂ）において、縦軸は図６（ａ）の各プロットにおけるＲＮＡアプタマーＢの信号値であり、横軸は図６（ａ）の各プロットにおけるＲＮＡアプタマーＡの信号値である。具体的には、点線は総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が５．５６％の標準試料について得られた結果を結んだものであり、破線は総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が７．７４％の標準試料について得られた結果を結んだものであり、実線は総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が１０．４８％の標準試料について得られた結果を結んだものである。
なお、図６（ａ）に示される白丸、白三角、白菱形、および白四角は、それぞれ図６（ｂ）に示される白丸、白三角、白菱形、および白四角に対応する。【００７６】
以上のようにして、図６（ｂ）に示すように、検量線は、標準試料中における、総Ｈｂ濃度が１〜１０μＭであり、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が５．５６〜１０．４８％である範囲で作成された。【００７７】
（実施例２  血液試料の測定）
実施例１における（１）〜（７）の操作を、標準試料に代えて血液試料について実施し、アプタマーＡおよびアプタマーＢについての信号値を得た。得られた信号値と実施例１で作成された検量線とに基づいて、血液試料に含まれる総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率を算出した。【００７８】
具体的には、アプタマーＡおよびアプタマーＢについての信号値を、図６（ｂ）に示すような検量線に示し、それを図６（ａ）に示す平面に射影することによって、血液試料に含まれる総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率を算出した。さらに、図６（ａ）におけるプロットを用いて、血液試料に含まれる総Ｈｂ濃度を算出することができた。【００７９】
（実施例３  ＲＮＡアプタマーＣおよびＤを用いた実施例）
第１反応物質として、ＲＮＡアプタマーＡに換えてＲＮＡアプタマーＣ（配列番号４）を用い、第２反応物質として、ＲＮＡアプタマーＢに換えてＲＮＡアプタマーＤ（配列番号５）を用いた他は、特に言及しなければ、実施例１および２と同様に、検量線の作成、血液試料の測定を行った。【００８０】
（１）  全てのフローセルＦｃ１〜４を、１０ｍＭのＮａＯＨを用いて流速２０μｌ／ｍｉｎで１分間洗浄をした。【００８１】
（２）  上記（１）を合計４回繰り返した。【００８２】
（３）  フローセルＦｃ２に５’末端にビオチンを有する１μＭのＲＮＡアプタマーＣを、フローセルＦｃ４に５’末端にビオチンを有する１μＭのＲＮＡアプタマーＤを、それぞれ流速５μｌ／ｍｉｎで８分間流して固定化した。この際、アプタマーの希釈は、ＨＢＳ−Ｐ（＋ＭｇＣｌ２）溶液を用いて行った。【００８３】
（４）  フローセルＦｃ１〜４を、１０ｍＭのＮａＯＨを用いて流速２０μｌ／ｍｉｎで１分間洗浄をした。【００８４】
（５）  上記（４）を合計４回繰り返した。【００８５】
（６）  上記のフローセルＦｃ１およびＦｃ２に、Ｆｃ１、Ｆｃ２の順番に、総Ｈｂ濃度が０．０１μＭであり、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が５．６１％の標準試料を流速２０μｌ／ｍｉｎで５分間流し、その後２分間の解離状態をモニターした。フローセルＦｃ１は、フローセルＦｃ２に対するリファレンス値を得るために用いた。【００８６】
（７）  フローセルＦｃ１およびＦｃ２を、１０ｍＭのＮａＯＨを用いて流速２０μｌ／ｍｉｎで１分間洗浄をした。この作業により、標準試料が外れて、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡは上記（５）が完了した状態に戻る。【００８７】
（８）  その後、上記（６）〜（７）の操作を、総Ｈｂ濃度が０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭの標準試料について実施した。これらの標準物質における、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率は５．６１％とした。【００８８】
（９）  上記のフローセルＦｃ３およびＦｃ４に、Ｆｃ３、Ｆｃ４の順番に、総Ｈｂ濃度が０．０１μＭであり、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が５．６１％の標準試料を流速２０μｌ／ｍｉｎで５分間流し、その後２分間の解離状態をモニターした。フローセルＦｃ３は、フローセルＦｃ４に対するリファレンス値を得るために用いた。【００８９】
（１０）  フローセルＦｃ３およびＦｃ４を、１０ｍＭのＮａＯＨを用いて流速２０μｌ／ｍｉｎで１分間洗浄をした。この作業により、標準試料が外れて、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡは上記（５）が完了した状態に戻る。【００９０】
（１１）  その後、上記（９）〜（１０）の操作を、総Ｈｂ濃度が０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭの標準試料について実施した。これらの標準物質における、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率は５．６１％とした。【００９１】
上記（６）〜（１１）の操作を、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が７．７１％であり、総Ｈｂ濃度が０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭの標準物質について実施した。【００９２】
また、上記（６）〜（１１）の操作を、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が１０．５５％であり、総Ｈｂ濃度が０．０１μＭ、０．０５μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０μＭの標準物質について実施した。【００９３】
検量線は、標準試料中における、総Ｈｂ濃度が１〜１０μＭであり、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が５．６１〜１０．５５％である範囲で作成された。【００９４】
実施例３における（１）〜（７）の操作を、標準試料に代えて血液試料について実施し、ＲＮＡアプタマーＣおよびＲＮＡアプタマーＤについての信号値を得た。得られた信号値と実施例３で作成された検量線とに基づいて、血液試料に含まれる総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率を算出した。その結果、血液試料に含まれる総Ｈｂ濃度を良好に算出することができた。【００９５】
（実施例４：末端にアミノ基を有する例）
以下において、実装基板上に、５’末端に６量体のオリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）を介してアミノ基を有するＲＮＡアプタマーＣおよびＤを固定化し、ＨｂＡ１ｃを検出する手順を示す。【００９６】
（１）  検出素子３を準備した。なお、固定化膜１３ａとしてＡｕ（金）を用いる。【００９７】
（２）  検出部１３を含む領域をＳＨ―３０３（関東化学製）で洗浄した。【００９８】
続く手順である下記（３）〜（７）において、固定化膜Ａｕ上にＲＮＡアプタマーＣおよびＤを固定化した。なお、検出素子３は複数の検出部１３を有しており、ＲＮＡアプタマーＣとＲＮＡアプタマーＤとを異なる検出部１３に固定化した。【００９９】
（３）  Ｃａｒｂｏｘｙ−ＥＧ６−Ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ（同仁化学研究所製）を２５０ｕＭ、Ｈｙｄｒｏｘｙ−ＥＧ３−Ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ（同仁化学研究所製）を７５０ｕＭの濃度で溶解させたエタノールに検出素子３を１６時間浸漬した。【０１００】
（４）  検出素子３をエタノールおよび超純水にてリンスし、窒素にて乾燥させた。【０１０１】
（５）  検出素子３を０．５％ＳＤＳを含む１０ｍＭ ＮａＯＨ溶液に３分間浸漬させた。同様の操作を合計３回行った後、超純水にてリンスし、窒素にて乾燥させた。【０１０２】
（６）１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド水溶液、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド水溶液、および塩酸との混合液を検出部１３を含む領域に滴下し、１０分間放置した。【０１０３】
（７）上記混合液を除去し、上記と同じ組成の混合液を検出部１３を含む領域に滴下し、１０分間放置した。【０１０４】
（８）上記（７）を４回繰り返した。【０１０５】
（９）１０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）で洗浄することにより、Ｃａｒｂｏｘｙ−ＥＧ６−Ｕｎｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌの末端に位置するカルボキシル基を活性エステル化した。【０１０６】
（１０）ＮａＣｌを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．４）液に、５’末端にアミノ基を有するＲＮＡアプタマーＣおよびＤを個別に溶解させ、別個の検出部１３を含む領域にそれぞれ滴下し、３０分間放置した。【０１０７】
（１１）上記の溶液を除去し、上記と同じＲＮＡアプタマーの溶液を検出部１３を含む領域に滴下し、３０分間放置した。【０１０８】
（１２）上記（１１）を繰り返した後、検出部１３を含む領域を１０ｍＭ酢酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）と、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）にて洗浄することにより、エステル化したカルボキシル基とＲＮＡアプタマーＣおよびＤの５’末端にＯＥＧを介して存在するアミノ基をアミド結合させた。参照電極を形成する際には、上記（１０）、（１１）の操作は行わなかった。【０１０９】
（１３）検量線を作成するために、ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質（検査医学標準物質機構製 ＪＣＣＲＭ４１１−３）を変性させた。その後カラムにより界面活性剤を除去後、変性を停止させ、脱塩カラムによって溶媒を１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＢＳ−Ｐに置換して得た溶液を標準試料として用いた。【０１１０】
（１４）５ｎＭとなるように、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＢＳ−Ｐで希釈した標準試料（検体全量に占めるＨｂＡ１ｃ比率は５．１０％）を、流路１５を用いて検出素子３に導入し、３０分間反応させた際に生じる位相変化量を測定した。【０１１１】
（１５）流路１５を用いて１０ｍＭのＮａＯＨを検出素子３に導入して１分間静置することにより、検出素子３を洗浄した。この作業により、ＲＮＡアプタマーＣおよびＤから標準試料が外れ、（１２）が完了した状態に戻る。【０１１２】
（１６）５ｎＭとなるように、１ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＨＢＳ−Ｐで希釈した標準試料（検体全量に占めるＨｂＡ１ｃ比率は１１．９８％）を、流路１５を用いて検出素子３に導入し、３０分間反応させた際に生じる位相変化量を測定した。【０１１３】
（１７）流路１５を用いて１０ｍＭのＮａＯＨを検出素子３に導入して１分間静置することにより、検出素子３を洗浄した。この作業により、ＲＮＡアプタマーＣおよびＤから標準試料が外れ、（１２）が完了した状態に戻る。【０１１４】
（１８）（１４）から（１７）の操作を、５０ｎＭ、５００ｎＭ、５μＭ、５０μＭの標準試料を用いて実施した。【０１１５】
これによれば、高い安定性を有するアミド結合を用いることで、ＲＮＡアプタマーＣおよびＤを高い安定性にて固定化することができた。【０１１６】
検量線は、標準試料中における、総Ｈｂ濃度が１〜１０μＭであり、総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率が５．１０〜１１．９８％である範囲で作成された。【０１１７】
（１４）から（１７）の操作を、標準試料に代えて血液試料について実施し、ＲＮＡアプタマーＣおよびＤについての信号値を得た。得られた信号値と実施例４で作成された検量線とに基づいて、血液試料に含まれる総Ｈｂに対するＨｂＡ１ｃの比率を算出した。その結果、血液試料に含まれる総Ｈｂ濃度を良好に算出することができた。【０１１８】
以上、本発明は、上述の各実施形態および変形例などに示した構成だけに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で改良や変更ができることは言うまでもない。
【符号の説明】
【０１１９】
１  基板
２  流路構成体
３  検出素子
４  支持部材
６  端子
７  圧電基板
８  第１ＩＤＴ電極
９  第２ＩＤＴ電極
１０  供給部
１３  検出部
１４  流入口
２０  測定部
３０  算出部
１００  測定装置
２００  バイオセンサ装置
【図１】
2017018049.tif 000003
【図２】
2017018049.tif 000004
【図３】
2017018049.tif 000005
【図４】
2017018049.tif 000006
【図５】
2017018049.tif 000007
【図６】
2017018049.tif 000008
【配列表】
2017018049000001.app
【国際調査報告】
2017018049.tif 000009
2017018049.tif 000010
2017018049.tif 000011
2017018049.tif 000012