(57)【要約】  海産魚類の卵巣の維持方法、及び受精卵取得方法の提供。海産魚類より卵巣を摘出し、卵巣又は断片化された卵巣を培養液中で培養する卵巣の維持方法。また、摘出後維持した卵巣を排卵させ人工授精させることを特徴とする、海産魚類の受精卵取得方法。さらに、前記培養液を用いた海産魚類の排卵卵の受精能維持方法に関する。本発明により、海産魚類の受精卵取得が容易となり、効率的に種苗を生産することができる。
2016152215.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
海産魚類から卵巣を摘出し、前記摘出した卵巣又は断片化された卵巣を培養液中で培養する、海産魚類の卵巣の維持方法。
【請求項２】
卵巣に含まれる卵を受精可能な状態に維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
卵巣が、卵母細胞を含む卵巣である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
培養液のｐＨが、卵巣を摘出した魚種の卵巣腔液のｐＨと比べて＋０．５から−０．５の範囲となるように調整したものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
培養液の浸透圧が、１００ｍＯｓｍ/ｋｇ以上６０００ｍＯｓｍ/ｋｇ以下である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。 
【請求項６】
培養液が、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、及びマグネシウムイオンから選択される１種以上を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
培養液のナトリウムイオン濃度が１２０ｍＭ以上２５０ｍＭ以下である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
培養液のカリウムイオン濃度が５ｍＭ以上１０ｍＭ以下である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
培養液のカルシウムイオン濃度が１．５ｍＭ以上５．０ｍＭ以下である、請求項６〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
培養液のマグネシウムイオン濃度が１．０ｍＭ以上２．０ｍＭ以下である、請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
培養液が、塩素イオン及び/又は硫酸イオンを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
培養液が、グルコース、ガラクトース、果糖、及びショ糖から選択される１種以上の糖を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
培養液が、抗生物質を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
卵巣の摘出対象の海産魚類が養殖魚である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
卵巣の摘出対象の海産魚類が釣り上げられた魚である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
海産魚類がサバ科魚類である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法で培養した卵巣を排卵させて卵を得る、海産魚類の卵の生産方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法により得た卵と、精子とを掛け合わせて受精卵を得る、海産魚類の受精卵の生産方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法で得られる、海産魚類の卵。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法で得られる、海産魚類の受精卵。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法で得られる、受精卵から孵化した仔魚を、稚魚、未成魚又は成魚まで成育させる成育する工程を含む、海産魚類の成育方法。
【請求項２２】
請求項１８に記載の方法で得られる、受精卵から孵化した仔魚を、稚魚、未成魚又は成魚まで成育させる工程を含む養殖海産魚類の生産方法。
【請求項２３】
海産魚類から卵巣を摘出した卵巣又は断片化された卵巣を維持するために用いられる培養液の調整方法であって、
卵巣の摘出対象である魚種の卵巣腔液のｐＨを測定する工程と、
ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、及びマグネシウムイオンから選択される１種以上の濃度を調整することで、測定された卵巣腔液のｐＨに対し、＋０．５から−０．５の範囲となるように、培養液のｐＨ調整する工程と、を含む方法。
【請求項２４】
培養液のナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンのモル濃度が、卵巣の摘出に用いる海産魚類の血清のナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンのそれぞれ１/４から４倍のモル濃度に調整する、請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権情報）
本国際出願は，２０１５年３月２６日に日本国特許庁に出願された特許出願である特願２０１５−６５１２４号に基づく優先権を主張するものであり、特願２０１５−６５１２４号の全内容を参照により本国際出願に援用する。【０００２】
本発明は、海産魚類の卵巣の維持方法及びこれに用いる培養液の調整方法、並びに海産魚類の卵又は受精卵の生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
現在、海産魚類からの卵の生産方法として、天然又は養殖した魚が自然産卵した卵を回収する方法が執られている。一部の養殖魚では、生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンを水中で遊泳中の魚に投与して、成熟及び採卵を誘導する方法が執られている（非特許文献１）。しかし、前記方法で得られる卵を無傷で回収することは難しく、人工授精を行っても成功率が低いことが多い。
また、釣り上げられた魚から成熟した受精可能な卵及び精子を採取し、人工授精することもある（非特許文献２）。人工授精を成功させるためには、受精に適した時期の卵、例えば排卵している卵を持つ個体から卵を得る必要がある。しかし、海産魚の生活史において、受精に適した時期の卵を持つ時期は短い。また、海産魚類においては受精に適した時期の卵を持つ個体を外観で区別することが難しい。魚を釣り上げた後に卵の状態を調べても、釣り上げて卵の状態を調べることにより衰弱又は斃死してしまうことが多いため、魚を釣り上げて、前記魚の卵の状態を調べた後に、再び水中に戻して受精に適した時期の卵を持つまで待つということも難しい。このことから、前記方法で得られる卵では、人工受精を行っても成功率が低い。また、釣り上げられた魚から卵巣を摘出すると、速やかに卵が不活性化するため、摘出した卵巣から受精できる卵を得ることは難しかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】C.C.Mylonas et al., Reviews in Fisheries Science, Volume 15, Issue 3, pp183-210(2007)
【非特許文献２】遠藤ら、日本水産学会大会講演要旨集、2012：130．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、海産魚類において、摘出した卵巣に含まれる卵の受精能を維持し、前記卵巣から卵を得ること、特に受精し、孵化できる能力がある卵を得ることに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞  海産魚類から卵巣を摘出し、前記摘出した卵巣又は断片化された卵巣を培養液中で培養する、海産魚類の卵巣の維持方法。
＜２＞  卵巣に含まれる卵を受精可能な状態に維持する、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  卵巣が、卵母細胞を含む卵巣である、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
＜４＞  培養液のｐＨが、卵巣を摘出した魚種の卵巣腔液のｐＨと比べて＋０．５から−０．５の範囲となるように調整したものである、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の方法。
＜５＞  培養液の浸透圧が、１００ｍＯｓｍ/ｋｇ以上６０００ｍＯｓｍ/ｋｇ以下である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法。 
＜６＞  培養液が、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、及びマグネシウムイオンから選択される１種以上を含む、＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の方法。
＜７＞  培養液のナトリウムイオン濃度が１２０ｍＭ以上２５０ｍＭ以下である、＜６＞に記載の方法。
＜８＞  培養液のカリウムイオン濃度が５ｍＭ以上１０ｍＭ以下である、＜６＞又は＜７＞に記載の方法。
＜９＞  培養液のカルシウムイオン濃度が１．５ｍＭ以上５．０ｍＭ以下である、＜６＞〜＜８＞のいずれかに記載の方法。
＜１０＞  培養液のマグネシウムイオン濃度が１．０ｍＭ以上２．０ｍＭ以下である、＜６＞〜＜９＞のいずれかに記載の方法。【０００７】
＜１１＞  培養液が、塩素イオン及び/又は硫酸イオンを含む、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の方法。
＜１２＞  培養液が、グルコース、ガラクトース、果糖、ショ糖から選択される１種以上の糖を含む、＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の方法。
＜１３＞  培養液が、抗生物質を含む、＜１＞〜＜１２＞のいずれかに記載の方法。
＜１４＞  卵巣の摘出対象の海産魚類が養殖魚である、＜１＞〜＜１３＞のいずれかに記載の方法。
＜１５＞  卵巣の摘出対象の海産魚類が釣り上げられた魚である、＜１＞〜＜１３＞のいずれかに記載の方法。
＜１６＞  海産魚類がサバ科魚類である、＜１＞〜＜１５＞のいずれかに記載の方法。【０００８】
＜１７＞  ＜１＞〜＜１６＞のいずれかに記載の方法で培養した卵巣を排卵させて卵を得る、海産魚類の卵の生産方法。
＜１８＞  ＜１７＞に記載の方法により得た卵と、精子とを掛け合わせて受精卵を得る、海産魚類の受精卵の生産方法。
＜１９＞  ＜１７＞に記載の方法で得られる、海産魚類の卵。
＜２０＞  ＜１８＞に記載の方法で得られる、海産魚類の受精卵。
＜２１＞  ＜１８＞に記載の方法で得られる、受精卵から孵化した仔魚を、稚魚、未成魚又は成魚まで成育させる成育する工程を含む、海産魚類の成育方法。
＜２２＞  ＜１８＞に記載の方法で得られる、受精卵から孵化した仔魚を、稚魚、未成魚又は成魚まで成育させる工程を含む養殖海産魚類の生産方法。
＜２３＞  海産魚類から卵巣を摘出した卵巣又は断片化された卵巣を維持するために用いられる培養液の調整方法であって、
卵巣の摘出対象である魚種の卵巣腔液のｐＨを測定する工程と、
ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、及びマグネシウムイオンから選択される１種以上の濃度を調整することで、測定された卵巣腔液のｐＨに対し、＋０．５から−０．５の範囲となるように、培養液のｐＨ調整する工程とを含む方法。
＜２４＞  培養液のナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンのモル濃度が、卵巣の摘出に用いる海産魚類の血清のナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンのそれぞれ１/４から４倍のモル濃度に調整する、＜２３＞記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、海産魚類において、摘出した卵巣又は断片化された卵巣を受精可能な状態に維持することができる。また、前記卵巣から卵を得ること、特に受精し、孵化できる能力がある卵を得ることができる。そのため、海産魚類の受精卵取得が容易となり、効率的に種苗を生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】生体内で排卵した卵を無処理の対照区、および培養液中に漬ける培養液区における各受精時間の浮上率を表すグラフである。アスタリスクは０時間に対する有意差を示し、*：P<0.05、**：P<0.01、***：P<0.001を意味する。
【図２】生体内で排卵した卵を無処理の対照区、および培養液中に漬ける培養液区における各受精時間の受精率を表すグラフである。グラフ中のアスタリスクは０時間に対する有意差を示し、*：P<0.05、**：P<0.01、***：P<0.001を意味する。
【００１１】
【図３】生体内で排卵した卵を無処理の対照区、および培養液中に漬ける培養液区における各受精時間の孵化率を表すグラフである。グラフ中のアスタリスクは０時間に対する有意差を示し、*：P<0.05、**：P<0.01、***：P<0.001を意味する。
【図４】卵巣摘出０、１、２、または３時間後実験区、および対照区における排卵率の経時変化を表すグラフである。グラフ中の異なるアルファベットは同じ実験区群内での有意差を示し、アルファベット上の文字は群を示す。
【図５】各実験区における断片化及びマイクロプレートへの分配処理の2時間後において排卵した卵の形態を表す写真であり、(A)卵巣摘出０時間後に断片化及びマイクロプレートへの分配処理をした実験区、(B)卵巣摘出１時間後に断片化及びマイクロプレートへの分配処理をした実験区、(C)卵巣摘出２時間後に断片化及びマイクロプレートへの分配処理をした実験区、(D)卵巣摘出３時間後に断片化及びマイクロプレートへの分配処理をした実験区、(E)対照区、(F)別個体で得られた生体内で排卵した卵の形態である。
【図６】実験区、および対照区における正常または異常な形態を示す排卵した卵の出現頻度を表すグラフである。
【図７】生体外での排卵から得られた受精卵および孵化仔魚を表す写真であり、(A)は受精卵、(B)は孵化仔魚である。
【図８】１個体目の卵巣を用いた試験における実施例１に記載した培養液を使用する標準培養液区、又はマグロ血清の金属イオンの組成に合わせた培養液を使用するマグロ培養液区の各培養時間での排卵率を表すグラフである。グラフ中のアスタリスクは標準培養液区に対する有意差を示し、*：P<0.05、**：P<0.01、***：P<0.001を意味する。
【図９】１個体目の卵巣を用いた試験における実施例１に記載した培養液を使用する標準培養液区、又はマグロ血清の金属イオンの組成に合わせた培養液を使用するマグロ培養液区の各培養時間での浮上率を表すグラフである。グラフ中のアスタリスクは標準培養液区に対する有意差を示し、*：P<0.05、**：P<0.01、***：P<0.001を意味する。
【図１０】１個体目の卵巣を用いた試験における実施例1に記載した培養液を使用する標準培養液区、又はマグロ血清の金属イオンの組成に合わせた培養液を使用するマグロ培養液区の各培養時間での受精率を表すグラフである。グラフ中のアスタリスクは標準培養液区に対する有意差を示し、*：P<0.05、**：P<0.01、***：P<0.001を意味する。
【図１１】１個体目の卵巣を用いた試験における実施例1に記載した培養液を使用する標準培養液区、又はマグロ血清の金属イオンの組成に合わせた培養液を使用するマグロ培養液区の各培養時間での孵化率を表すグラフである。グラフ中のアスタリスクは標準培養液区に対する有意差を示し、*：P<0.05、**：P<0.01、***：P<0.001を意味する。
【図１２】２個体目の卵巣を用いた試験における実施例1に記載した培養液を使用する標準培養液区、又はマグロ血清の金属イオンの組成に合わせた培養液を使用するマグロ培養液区の各培養時間での排卵率を表すグラフである。グラフ中のえアスタリスクは標準培養液区に対する有意差を示し、*：P<0.05、**：P<0.01、***：P<0.001を意味する。
【図１３】２個体目の卵巣を用いた試験における実施例１に記載した培養液を使用する標準培養液区、又はマグロ血清の金属イオンの組成に合わせた培養液を使用するマグロ培養液区の各培養時間での浮上率を表すグラフである。グラフ中のアスタリスクは標準培養液区に対する有意差を示し、*：P<0.05、**：P<0.01、***：P<0.001を意味する。
【図１４】２個体目の卵巣を用いた試験における実施例１に記載した培養液を使用する標準培養液区、又はマグロ血清の金属イオンの組成に合わせた培養液を使用するマグロ培養液区の各培養時間での受精率を表すグラフである。グラフ中のアスタリスクは標準培養液区に対する有意差を示し、*：P<0.05、**：P<0.01、***：P<0.001を意味する。
【図１５】２個体目の卵巣を用いた試験における実施例１に記載した培養液を使用する標準培養液区、又はマグロ血清の金属イオンの組成に合わせた培養液を使用するマグロ培養液区の各培養時間での孵化率を表すグラフである。グラフ中のアスタリスクは標準培養液区に対する有意差を示し、*：P<0.05、**：P<0.01、***：P<0.001を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について例示物等を示して詳細に説明するが、本発明は以下の例示物等に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において任意に変更して実施できる。なお、本明細書において、「ＡからＢ」又は「Ａ〜Ｂ」とはその前後の数値又は物理量を含む表現として用いるものとする。また、本明細書において、「Ａおよび／またはＢ」という表現は、「ＡおよびＢのいずれか一方または双方」を意味する。すなわち、「Ａおよび／またはＢ」には、「Ａのみ」、「Ｂのみ」、「ＡおよびＢの双方」が含まれる。
【００１３】
本発明は、海産魚類から卵巣を摘出し、前記摘出した卵巣又は断片化された卵巣を培養液中で培養し、前記卵巣に含まれる卵を受精可能な状態に維持する海産魚類の卵巣の維持方法（以下、「本発明の卵巣維持方法」と称す場合がある。）に関する。
また、本発明の他の態様は、本発明の卵巣維持方法で培養した卵巣を排卵させて卵を得る海産魚類の卵の生産方法（本発明の卵の生産方法）である。
また、本発明の他の態様は、本発明の海産魚類の卵の生産方法によって得られた卵と、精子を掛け合わせて受精卵を得る海産魚類の受精卵の生産方法（本発明の受精卵の生産方法）である。
また、本発明の他の態様は、本発明の卵生産方法に関連する、海産魚類の成育方法（本発明の海産魚類の成育方法）、養殖海産魚類の生産方法（本発明の海産魚類の成育方法）である。
なお、以下、本発明の全ての態様を総称して、「本発明」と記載する場合がある。
【００１４】
本明細書において、「海産魚類」とは、自然環境下において海に生息する魚を意味し、海において成魚となる魚、卵を成熟させる魚、海において排卵をする魚及び／又は海において受精をする魚のいずれもが含まれる。
魚には、硬骨魚類が含まれる。硬骨魚類には、ニシン目、ヒメ目、ハダカイワシ目、アカマンボウ目、ギンメダイ目、タラ目、アンコウ目、ボラ目、トウゴロウイワシ目、ダツ目、キンメダイ目、マトウダイ目、カサゴ目、スズキ目、カレイ目、フグ目の魚類が含まれる。スズキ目の魚には、スズキ亜目、ゲンゲ亜目、ワニギス亜目、ハゼ亜目、ニザダイ亜目、サバ亜目、イボダイ亜目の魚が含まれる。
サバ亜目の魚には、カマス科、クロタチカマス科、タチウオ科、サバ科、メカジキ科、マカジキ科の魚が含まれる。魚には養殖魚が含まれる。魚には人工飼育されたものが含まれる。魚には、特定の種の魚の他、雑種が含まれる。魚には人工的に作出した２倍体、３倍体、４倍体、異数倍数体を含む倍数体の魚が含まれる。魚には人工的に作出したキメラ、遺伝子導入個体、遺伝子改変個体、遺伝子組み換え個体、形質転換体が含まれる。
【００１５】
本明細書において、「養殖魚」とは、生簀等において人工的に飼育されている魚をいう。養殖魚には特に魚の増養殖を目的として飼育されている魚が含まれる。
【００１６】
本明細書において、「卵巣」とは、雌性生殖器で卵を作り出す器官をいう。卵巣には自然環境下で作り出されるものの他、人工的な環境で作り出されるものも含まれる。卵巣には生体内で作り出されるものが含まれる。卵巣には生殖腺刺激ホルモン放出ホルモンに例示される性ホルモンを魚に投与することで成熟されるものが含まれる。
【００１７】
本明細書において、「卵」とは、卵巣において作り出される雌性配偶子をいう。卵には卵母細胞が成熟した卵が含まれる。卵には受精前の未受精卵及び自然環境下又は人工環境下で受精した受精卵が含まれる。
【００１８】
本明細書において、「卵母細胞」とは減数分裂により生じる雌性生殖細胞をいう。卵母細胞には卵巣内の減数分裂により生じる卵母細胞が含まれる。卵母細胞には、第一減数分裂を行う前の一次卵母細胞及び第一減数分裂を終えた二次卵母細胞が含まれる。
【００１９】
本明細書において、「卵巣腔液」とは、卵巣を摘出した魚種の卵巣付近の膣液のことをいう。卵巣腔液には、排卵期にある魚の卵巣腔液が含まれる。
【００２０】
以下、本発明を具体的に説明する。なお、以下の説明において、特段の説明をしている場合を除き、「魚」は「海産魚類」を意味する
【００２１】
１．海産魚類の卵巣の維持方法
本発明の卵巣維持方法は、海産魚類から卵巣を摘出し、前記摘出した卵巣又は断片化された卵巣を培養液中で培養する方法である。
ここで、摘出とは、器官（特には卵巣）を個体から取り出すことをいい、器官を取り出される個体には生体が含まれる。取り出される器官は他の器官と混合、接合、結合又は癒着した器官であっても構わない。
摘出対象となる卵巣は、卵巣としての機能を維持しているものが含まれ、特に卵母細胞を含む卵巣が含まれる。
また、本発明の卵巣維持方法で使用される培養液の詳細については後述する。
【００２２】
卵巣の摘出対象となる海産魚類は、卵巣に含まれる卵の受精能が維持されるのであれば、どのような方法で採取してもよく、自然環境下で採取された魚を用いてもよいし、人工的に飼育されている養殖魚であってもよい。なお、自然環境下で採取された魚としては、釣り上げられた魚が含まれる。釣り上げられた魚は損傷が少なく、卵巣に含まれる卵の受精能が維持されやすいからである。
【００２３】
本発明の卵巣の摘出に用いる魚は、特に制限されないが、ブリ、ハマチに例示されるブリ類、カンパチ、ヒラマサに例示されるカンパチ類、シマアジ類、マダイ、チダイ、ヘダイに例示されるタイ類、クロマグロ、タイセイヨウクロマグロ、ミナミマグロ、キハダ、メバチ、ビンナガ、コシナガ、タイセイヨウマグロ、カツオ、スマ、ヒラソウダ、マルソウダに例示されるマグロ類、マサバ、ゴマサバに例示されるサバ類、ハガツオ、イソマグロに例示されるハガツオ類、サワラ、カマスサワラに例示されるサワラ類、サケ、マスに例示されるサケマス類、ヒラメ、カレイ、ウシノシタに例示されるカレイ類等が挙げられる。これらは自然環境下で採取された魚であっても、養殖魚であってもよい。
【００２４】
本発明の卵巣維持方法対象には、サバ科魚類が含まれる。サバ科魚類とは、スズキ目サバ亜科サバ科に分類される魚をいう。サバ科魚類にはハガツオ族、サワラ族、サバ族、マグロ族が含まれる。ハガツオ族にはイソマグロ属、ハガツオ属が含まれ、サワラ族にはカマスサワラ属、ニジョウサバ属、サワラ属が含まれ、サバ族にはグルクマ属、サバ属が含まれ、マグロ族にはソウダガツオ属、スマ属、カツオ属、マグロ属が含まれる。イソマグロ属にはイソマグロが、ハガツオ属にはハガツオが、カマスサワラ属にはカマスサワラが、サワラ属にはサワラが、サバ属にはマサバ、ゴマサバが、ソウダガツオ属にはヒラソウダ、マルソウダが、スマ属にはスマが、カツオ属にはカツオが、マグロ属にはクロマグロ、タイセイヨウクロマグロ、ミナミマグロ、キハダ、メバチ、ビンナガ、コシナガ、タイセイヨウマグロが含まれる。サバ科魚類の中でもマグロ属は本発明の卵巣維持方法における対象のひとつである。
【００２５】
卵巣の摘出に用いる魚は、その種の最低成熟年数に達し、成熟した卵巣を有する魚を用いる場合がある。成熟した卵巣を有する魚には、卵巣に含まれる卵が受精能を有することが多いからである。
卵巣の摘出に用いる魚として、成熟した卵巣を有する魚のうち、産卵期の魚を用いる場合がある。産卵期の魚には、卵巣に含まれる卵が受精能を有することが多いからである。
卵巣の摘出に用いる魚として、透明化卵を有する卵巣を有する魚を用いる場合がある。透明化卵を有する卵巣を有する魚の卵巣には、卵巣に含まれる卵が受精能を有することが多いからである。
【００２６】
卵巣に含まれる卵が受精能の有するのであれば、卵巣を摘出する魚は生体でもよいし、心停止に至った直後の魚でもよいし、冷凍保存した魚でもよい。
【００２７】
卵巣の摘出は、卵巣に含まれる卵が受精能を失わないようにできるだけ素早く行う。摘出に時間をかけてしまうと、卵巣に含まれる卵が受精能を低下させてしまうことがあるからである。
【００２８】
本発明の卵巣維持方法における「卵巣の維持」とは、卵巣に含まれる卵を受精可能な状態に維持することをいう。卵巣の維持には、摘出した卵巣を維持することが含まれる。また、卵巣の維持には摘出した卵巣の一部を維持することが含まれ、摘出した卵巣を切断、裁断、破砕又は分解して維持すること及び切断、裁断、破砕又は分解した卵巣と他の細胞、組織若しくは器官とを混合、接合、結合又は癒着した状態で維持することが含まれる。
【００２９】
本明細書において、「培養」とは細胞、組織又は器官の活性を維持しながら一定期間保持することを意味し、「培養液中で培養する」とは、所望の活性が維持されるために、細胞、組織又は器官を培養液中に保持することをいう。
本発明の卵巣維持方法における培養には、卵巣の維持のために、摘出した卵巣又は断片化された卵巣を一定期間保持することが含まれる。保持される期間は、所望の活性が維持されている期間であれば長短を問わない。培養には、所望の活性が維持される範囲において静置すること、振とうすること、回転すること、及び撹拌することが含まれる。
【００３０】
本発明の卵巣維持方法において、培養液中で培養することには、摘出した卵巣の維持のために、摘出した卵巣又は断片化された卵巣を培養液中で培養することが含まれる。
本発明の卵巣維持方法において、摘出した卵巣又は断片化された卵巣を培養液中で培養することには、摘出した卵巣又は断片化された卵巣を培養開始前から培養液中に保持すること、培養後に培養液中に保持すること、培養中に培養液を除去すること、培養中に培養液を交換すること、培養中に培養液を変換すること及びこれらの組み合わせが含まれる。
【００３１】
卵巣の培養は、卵巣に含まれる卵が受精能を維持するのであれば、卵巣全体を培養してもよいし、卵巣の断片化を行って、卵巣の一部を培養してもよい。
卵巣の断片化を行う際には、1mm角、2mm角、5mm角、1cm角から10cm角、5cm角、2cm角、1cm角の大きさで断片化を行う場合がある。1mm角より小さい断片を得ようとすると、卵巣に含まれる卵が破壊される可能性が高くなり、受精能を低下させてしまうことがあるからである。10cm角より大きい断片を得ようとすると、培養液を多く必要となってしまう他、培養液が卵巣又は断片化された卵巣に行きわたらずに、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を低下させてしまうことがあるからである。
【００３２】
卵巣又は断片化された卵巣の培養は、透明化卵が含まれる卵巣又は断片化された卵巣を用いて行う場合がある。透明化卵が含まれる卵巣又は断片化された卵巣には、受精能を有する卵が多く含まれるからである。
卵巣の培養は、卵巣又は断片化された卵巣に、透明化卵が10個以上、50個以上又は100個以上、かつ、10000個以下、1000個以下又は200個以下で含まれるような卵巣又は断片化された卵巣を用いて行う場合がある。透明化卵が10個以上含まれる卵巣又は断片化された卵巣には、受精能を有する卵が多く含まれるからである。透明化卵が1000個以上含まれる卵巣又は断片化された卵巣では、卵巣又は断片化された卵巣の大きさが大きくなり過ぎてしまい、培養液を多く必要となってしまう他、培養液が卵巣又は断片化された卵巣に行き渡らずに、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を低下させてしまうことがあるからである。
【００３３】
卵巣又は断片化された卵巣の培養は、卵巣又は断片化された卵巣が培養液全体に覆われるように培養する場合がある。このようにすることにより、培養液が卵巣又は断片化された卵巣に行きわたり、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を低下させてしまうことを回避できる。
【００３４】
卵巣又は断片化された卵巣の培養は、卵巣の摘出対象である魚の産卵温度付近の温度で培養する場合がある。産卵温度付近であれば、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持し、また、培養後に排卵しやすくなるからである。産卵温度はクロマグロでは24℃以上、25℃以上又は26℃以上であり、28℃以下、27℃以下又は26℃以下である。
【００３５】
卵巣又は断片化された卵巣の培養は、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持する期間行う。
例えば、クロマグロの場合、卵巣又は断片化された卵巣の培養は、培養開始後1分以上、10分以上又は30分以上培養する場合がある。培養期間が短すぎると培養の効果が十分に得られないからである。クロマグロでは、卵巣又は断片化された卵巣の培養は、培養開始後24時間以内、16時間以内、8時間以内又は5時間以内で終了する場合がある。培養期間が長すぎると、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持することが難しくなるからである。
【００３６】
本発明の卵巣維持方法により、卵巣に含まれる卵が受精能を維持することが可能となり、受精能を有する卵を排卵させることが可能となる。また、卵巣を維持することにより、受精能を有する卵が得られる機会を増やし、効率的に卵を得ることができ、人工授精をしやすくなる。
【００３７】
以下、本発明の卵巣維持方法で使用される培養液について説明する。
「培養液」は、細胞、組織又は器官の活性を維持するために用いられる溶液であり、本発明の卵巣維持方法における培養液（以下、「本発明の培養液」、又は単に「培養液」と称す。）においては、卵巣の維持に用いられる溶液を意味する。
【００３８】
培養液の組成とは、培養において所望の活性を維持するために寄与している成分の組成をいう。培養液の組成は、培養期間中のあらゆる時点において求めることができる。培養液の満たすべき組成は、培養において所望の活性を維持するためであれば、培養期間中のどの時点で満たしてもよい。培養液の満たすべき組成は、培養において所望の活性を維持できる範囲において、培養期間中に連続して満たしてもよいし、培養期間中に断続して満たしてもよいし、培養期間中の一部の期間のみ満たしてもよい。
【００３９】
本発明の培養液は、培養において卵巣に含まれる卵の受精能を維持するための成分であれば、含有成分は限定されない。本発明の培養液における含有成分としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン並びにマグネシウムイオンに例示される正の電荷の金属イオン、塩素イオン並びに硫酸イオンに例示される負の電荷のイオン、緩衝剤、糖及び／又は抗生物質を含む溶液が含まれる。本発明の培養液には市販されているもの、調合されたもの、凍結保存されたもの及び／又は希釈若しくは濃縮されたものが含まれる。
【００４０】
培養液の含有成分の濃度測定方法は、対象となる成分濃度が測定できる公知の方法により行えばよい。
正の電荷の金属イオンの場合には、原子吸光法が挙げられる。また、ナトリウムイオン及びカリウムイオン等の場合には、イオン選択電極法によって測定してもよい。
【００４１】
ナトリウムイオンとは溶液中で電離しているナトリウムをいう。溶液中で電離しているナトリウムには電離しているナトリウム原子が含まれる。本発明のナトリウムイオンには培養液中で電離しているナトリウムイオンが含まれる。ナトリウムイオンは通常は培養液中では一価の正の電荷を持つ。
培養液中で電離しているナトリウムイオンとは、培養において所望の活性を維持するために寄与しているナトリウムイオンのことをいう。培養液中で電離しているナトリウムイオンには、所望の活性を維持するために寄与するべくキレート剤でキレートされているナトリウムイオンが含まれる。培養液中で電離しているナトリウムイオンには、所望の活性を維持することに寄与しない析出化、結晶化、固形化及び錯体化しているナトリウムイオンは含まれない。
【００４２】
カリウムイオンとは溶液中で電離しているカリウムをいう。溶液中で電離しているカリウムには電離しているカリウム原子が含まれる。カリウムイオンには培養液中で電離しているカリウムイオンが含まれる。カリウムイオンは通常は培養液中では一価の正の電荷を持つ。
培養液中で電離しているカリウムイオンとは、培養において所望の活性を維持するために寄与しているカリウムイオンのことをいう。培養液中で電離しているカリウムイオンには、所望の活性を維持するために寄与するべくキレート剤でキレートされているカリウムイオンが含まれる。培養液中で電離しているカリウムイオンには、所望の活性を維持することに寄与しない析出化、結晶化、固形化及び錯体化しているカリウムイオンは含まれない。
【００４３】
カルシウムイオンとは、溶液中で電離しているカルシウムをいう。溶液中で電離しているカルシウムには電離しているカルシウム原子が含まれる。えカルシウムイオンには培養液中で電離しているカルシウムイオンが含まれる。カルシウムイオンは通常は培養液中では二価の正の電荷を持つ。
培養液中で電離しているカルシウムイオンとは、培養において所望の活性を維持するために寄与しているカルシウムイオンのことをいう。培養液中で電離しているカルシウムイオンには、所望の活性を維持するために寄与するべくキレート剤でキレートされているカルシウムイオンが含まれる。培養液中で電離しているカルシウムイオンには、所望の活性を維持することに寄与しない析出化、結晶化、固形化及び錯体化しているカルシウムイオンは含まれない。
【００４４】
マグネシウムイオンとは、溶液中で電離しているマグネシウムをいう。溶液中で電離しているマグネシウムには電離しているマグネシウム原子が含まれる。マグネシウムイオンには培養液中で電離しているマグネシウムイオンが含まれる。マグネシウムイオンは通常は培養液中では二価の正の電荷を持つ。
培養液中で電離しているマグネシウムイオンとは、培養において所望の活性を維持するために寄与しているマグネシウムイオンのことをいう。培養液中で電離しているマグネシウムイオンには、所望の活性を維持するために寄与するべくキレート剤でキレートされているマグネシウムイオンが含まれる。培養液中で電離しているマグネシウムイオンには、所望の活性を維持することに寄与しない析出化、結晶化、固形化及び錯体化しているマグネシウムイオンは含まれない。
【００４５】
塩素イオンとは、溶液中で電離している塩素をいう。溶液中で電離している塩素には電離している塩素原子が含まれる。塩素イオンには培養液中で電離している塩素イオンが含まれる。塩素イオンは通常は培養液中では一価の負の電荷を持つ。
培養液中で電離している塩素イオンとは、培養において所望の活性を維持するために寄与している塩素イオンのことをいう。培養液中で電離している塩素イオンには、所望の活性を維持することに寄与しない析出化、結晶化、固形化及び錯体化している塩素イオンは含まれない。
【００４６】
硫酸イオンとは、溶液中で電離している硫酸をいう。溶液中で電離している硫酸にはイオウ原子１個と酸素原子を４個からなる硫酸イオン分子が含まれる。硫酸イオンには培養液中で電離している硫酸イオンが含まれる。硫酸イオンは通常は培養液中では二価の負の電荷を持つ。
培養液中で電離している硫酸イオンとは、培養において所望の活性を維持するために寄与している硫酸イオンのことをいう。培養液中で電離している硫酸イオンには、所望の活性を維持することに寄与しない析出化、結晶化、固形化及び錯体化している硫酸イオンは含まれない。
【００４７】
培養液の調整は、あらかじめ定めた組成となるよう個々の成分を混合して調整する。卵巣又は断片化された卵巣の培養に用いる培養液のｐＨは、卵巣を摘出した魚種の卵巣腔液のｐＨと比べて＋0.5から-0.5の範囲、＋0.3から-0.3の範囲又は＋0.1から-0.1の範囲となるよう調整する場合が含まれる。卵巣又は断片化された卵巣の培養に用いる培養液のpHが、卵巣を摘出した魚種の卵巣腔液のｐＨと比べて＋0.5から-0.5の範囲、＋0.3から-0.3の範囲又は＋0.1から-0.1の範囲となるよう調整したほうが、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵に負担が少なく、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持しやすいからである。前記培養液のｐＨの調整には、緩衝剤として EPPS、MES、HEPES、PIPES、TES、ADA、BES、ACESに例示されるグッドバッファーを用いる場合がある。グッドバッファーを用いると、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵に負担が少なく、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持しやすいからである。
【００４８】
培養液に含まれる正の電荷の金属イオンは制限されないが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンが例示される。前記正の電荷の金属イオンは培養液中に存在することにより浸透圧を高めるとともに、正の電荷の金属イオンの生理的な作用により、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵に負担を減らし、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持しやすくする、及び／又は、培養している卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が排卵されること促すからである。
【００４９】
ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンに例示される正の電荷の金属イオンは単独で含まれる場合もあるし、２以上の任意の数を組み合わせて含まれる場合もある。卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵の受精能を維持するためには、前記培養液に、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン又はマグネシウムイオンのうち、少なくとも２種以上、３種以上又は４種すべてを含む場合がある。多くの種類の正の電荷の金属イオンを含むほうが、バランスがよく、含まれる全ての正の電荷の金属イオンに基づく相乗効果が期待できるからである。
【００５０】
ナトリウムイオンは、ナトリウムイオンチャンネル及び／又はナトリウム結合タンパクに作用し、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵の受精能の維持に貢献する。前記ナトリウム結合タンパクには、アネキシンに例示されるカルシウム結合タンパクとして知られるものも含まれる。
ナトリウムイオンは、培養液に10mM以上、50mM以上、100mM以上、120mM以上又は150mM以上のモル濃度で含まれ、500mM以下、300mM以下、250mM以下、200mM以下又は150mM以下のモル濃度で含まれる。例えば120mM以上250mM以下の範囲で含まれる場合がある。ナトリウムイオンが少なすぎると培養液にナトリウムイオンを添加した効果が薄れてしまい、ナトリウムイオンが多すぎると、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持することが難しくなるからである。
【００５１】
カリウムイオンは、カリウムイオンチャンネル及び／又はカリウム結合タンパクに作用し、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵の受精能の維持に貢献する。カリウム結合タンパクには、Emp46p、Emp47pに例示される糖鎖認識部位を含むタンパクが含まれる。
カリウムイオンは、培養液に1.0mM以上、2.0mM以上、3.0mM以上、5.0mM以上又は7.0mM以上のモル濃度で含まれ、20mM以下、15mM以下、10mM以下、8.0mM以下又は7.0mM以下のモル濃度で含まれる。例えば5mM以上10mM以下の範囲で含まれる場合がある。カリウムイオンが少なすぎると培養液にカリウムイオンを添加した効果が薄れてしまい、カリウムイオンが多すぎると、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持することが難しくなるからである。
【００５２】
カルシウムイオンは、カルシウムイオンチャンネル及び／又はカルシウム結合タンパクに作用し、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵の受精能の維持に貢献する。前記カルシウム結合タンパクには、プロテアーゼ、ホスホリパーゼA2、アミラーゼを含む分解酵素、ホスホリラーゼbキナーゼ、カルシウム輸送ATPアーゼ、カルセクエストリン、カレクシチン、トロポニンが例示される。
カルシウムイオンは、培養液に0.1mM以上、0.5mM以上、0.8mM以上、1.0mM以上又は1.5mM以上のモル濃度で含まれ、5.0mM以下、4.0mM以下、3.5mM以下、3.0mM以下又は2.0mM以下のモル濃度で含まれる。例えば1.5mM以上5.0mM以下の範囲で含まれる場合がある。カルシウムイオンが少なすぎると培養液にカルシウムイオンを添加した効果が薄れてしまい、カルシウムイオンが多すぎると、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持することが難しくなるからである。
【００５３】
マグネシウムイオンは、マグネシウムイオンチャンネル及び／又はマグネシウム結合タンパクに作用し、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵の受精能の維持に貢献するからである。前記マグネシウム結合タンパクにはRNAポリメラーゼ、パラセリンに例示される RNA 結合タンパク又はマグネシウム輸送体タンパクが含まれる。
マグネシウムイオンは、培養液に0.1mM以上、0.3mM以上、0.5mM以上、1.0mM以上又は1.5mM以上のモル濃度で含まれ、5.0mM以下、3.0mM以下、2.0mM以下、1.8mM以下又は1.5mM以下のモル濃度で含まれる。例えば1.0mM以上2.0mM以下の範囲で含まれる場合がある。マグネシウムイオンが少なすぎると培養液にマグネシウムイオンを添加した効果が薄れてしまい、マグネシウムイオンが多すぎると、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持することが難しくなるからである。
【００５４】
卵巣又は断片化された卵巣の培養に用いる培養液のナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンの組成は、卵巣の摘出に用いる海産魚類又は卵巣の摘出に用いる海産魚類と同一の種の魚であって産卵期にある魚の血清のナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンに近いものとすることができる。
培養液のナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンのモル濃度は、卵巣の摘出に用いる海産魚の血清のナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンのそれぞれ1/4から4倍のモル濃度、それぞれ1/2から2倍のモル濃度、それぞれ2/3から1.5倍のモル濃度で用いることができる。培養液のナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンのモル濃度が卵巣の摘出に用いる海産魚類の血清又は卵巣の摘出に用いる海産魚と同一の種の魚であって産卵期にある魚のナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンに近いほど、摘出のストレスを和らげることができ、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵の受精能の維持に貢献するからである。
ここで、卵巣の摘出に用いる海産魚類と同一の種の魚であって産卵期にある魚として、マグロの場合は体重が20kgから100kgである魚、特には40kgから80kgである魚から選ぶことができる。体重が少なすぎると産卵期にあっても卵としての性質が十分でないことがあり、体重が大きすぎると釣り上げて血清を得ることに例示されるサンプリングが困難となりやすいからである。
【００５５】
培養液のナトリウムイオンとカリウムイオンのモル濃度比は、ナトリウムイオンを１としたとき、カリウムイオンを1/100以上、1/50以上、1/25以上とすることができる。同時に、培養液のナトリウムイオンとカリウムイオンの比は、ナトリウムイオンを１としたとき、カリウムイオンを1/20以下、1/10以下、1/5以下とすることができる。ナトリウムイオン：カリウムイオンの比が大きすぎると、ナトリウムイオンの阻害効果が強くなり、相対的にカリウムイオンの不足効果が強くなる。逆にナトリウムイオン：カリウムイオンの比が小さすぎると、ナトリウムイオンの不足効果が強くなり、カリウムイオンの阻害効果が強くなる。
【００５６】
培養液のナトリウムイオンとカルシウムイオンのモル濃度比は、ナトリウムイオンを１としたとき、カルシウムイオンを1/200以上、1/100以上、又は1/50以上とすることができる。同時に、培養液のナトリウムイオンとカルシウムイオンの比は、ナトリウムイオンを１としたとき、カルシウムイオンを1/40以下、1/20以下、又は1/10以下とすることができる。ナトリウムイオン：カルシウムイオンの比が大きすぎると、ナトリウムイオンの阻害効果が強くなり、相対的にカルシウムイオンの不足効果が強くなる。逆にナトリウムイオン：カルシウムイオンの比が小さすぎると、ナトリウムイオンの不足効果が強くなり、カルシウムイオンの阻害効果が強くなる。
【００５７】
培養液のナトリウムイオンとマグネシウムイオンのモル濃度比は、ナトリウムイオンを１としたとき、マグネシウムイオンを1/1000以上、1/500以上、又は1/250以上とすることができる。同時に、培養液のナトリウムイオンとマグネシウムイオンの比は、ナトリウムイオンを１としたとき、マグネシウムイオンを1/200以下、1/100以下、又は1/50以下とすることができる。ナトリウムイオン：マグネシウムイオンの比が大きすぎると、ナトリウムイオンの阻害効果が強くなり、相対的にマグネシウムイオンの不足効果が強くなる。逆にナトリウムイオン：マグネシウムイオンの比が小さすぎると、ナトリウムイオンの不足効果が強くなり、マグネシウムイオンの阻害効果が強くなる。
【００５８】
培養液のカリウムイオンとカルシウムイオンのモル濃度比は、カリウムイオンを１としたとき、カルシウムイオンを1/10以上、1/5以上、又は1/3以上とすることができる。同時に、培養液のカリウムイオンとカルシウムイオンの比は、カリウムイオンを１としたとき、カルシウムイオンを1/2以下、1以下、又は2以下とすることができる。カリウムイオン：カルシウムイオンの比が大きすぎると、カリウムイオンの阻害効果が強くなり、相対的にカルシウムイオンの不足効果が強くなる。逆にカリウムイオン：カルシウムイオンの比が小さすぎると、カリウムイオンの不足効果が強くなり、カルシウムイオンの阻害効果が強くなる。
【００５９】
培養液のカリウムイオンとマグネシウムイオンのモル濃度比は、カリウムイオンを１としたとき、マグネシウムイオンを1/50以上、1/25以上、又は1/10以上とすることができる。同時に、培養液のカリウムイオンとマグネシウムイオンの比は、カリウムイオンを１としたとき、マグネシウムイオンを1/8以下、1/4以下、1/2以下とすることができる。カリウムイオン：マグネシウムイオンの比が大きすぎると、カリウムイオンの阻害効果が強くなり、相対的にマグネシウムイオンの不足効果が強くなる。逆にカリウムイオン：マグネシウムイオンの比が小さすぎると、カリウムイオンの不足効果が強くなり、マグネシウムイオンの阻害効果が強くなる。
【００６０】
培養液のカルシウムイオンとマグネシウムイオンのモル濃度比は、カルシウムイオンを１としたとき、マグネシウムイオンを1/25以上、1/10以上、1/5以上とすることができる。同時に、培養液のカルシウムイオンとマグネシウムイオンの比は、カルシウムイオンを１としたとき、マグネシウムイオンを1/4以下、1/2以下、又は1以下とすることができる。カルシウムイオン：マグネシウムイオンの比が大きすぎると、カルシウムイオンの阻害効果が強くなり、相対的にマグネシウムイオンの不足効果が強くなる。逆にカルシウムイオン：マグネシウムイオンの比が小さすぎると、カルシウムイオンの不足効果が強くなり、マグネシウムイオンの阻害効果が強くなる。
【００６１】
培養液のナトリウムイオンとカリウムイオンとカルシウムイオンのモル濃度比は、以下の（１）から（３）のいずれかの範囲で設定することができる。
（１）ナトリウムイオンを１としたとき、カリウムイオンが1/40から1/10、かつカルシウムイオンが1/100から1/25
（２）カリウムイオンを１としたとき、ナトリウムイオンが10から40、かつカルシウムイオンが1/4から1
（３）カルシウムイオンを１としたとき、ナトリウムイオンが25から100、かつカリウムイオンが１から4
各イオンの適切なモル濃度比は、生体内の活動状態を反映し、ストレスの少ない状態で所望の効果を達成しやすくできる。
【００６２】
培養液のナトリウムイオンとカリウムイオンとマグネシウムイオンのモル濃度比は、以下の（１）から（３）のいずれかの範囲で設定することができる。
（１）ナトリウムイオンを１としたとき、カリウムイオンが1/40から1/10、かつマグネシウムイオンが1/400から1/100
（２）カリウムイオンを１としたとき、ナトリウムイオンが10から40、かつマグネシウムイオンが1/16から1/4
（３）マグネシウムイオンを１としたとき、ナトリウムイオンが100から400、かつカリウムイオンが4から16
各イオンの適切なモル濃度比は、生体内の活動状態を反映し、ストレスの少ない状態で所望の効果を達成しやすくできる。
【００６３】
培養液のナトリウムイオンとカルシウムイオンとマグネシウムイオンのモル濃度比は、以下の（１）から（３）のいずれかの範囲で設定することができる。
（１）ナトリウムイオンを１としたとき、カルシウムイオンが1/100から1/25、かつマグネシウムイオンが1/400から1/100
（２）カルシウムイオンを１としたとき、ナトリウムイオンが25から100、かつマグネシウムイオンが1/8から1/2
（３）マグネシウムイオンを１としたとき、ナトリウムイオンが100から400、かつカルシウムイオンが2から8
各イオンの適切なモル濃度比は、生体内の活動状態を反映し、ストレスの少ない状態で所望の効果を達成しやすくできる。
【００６４】
培養液のカリウムイオンとカルシウムイオンとマグネシウムイオンのモル濃度比は、以下の（１）から（３）のいずれかの範囲で設定することができる。
（１）カリウムイオンを１としたとき、カルシウムイオンが1/4から1、かつマグネシウムイオンが1/16から1/4
（２）カルシウムイオンを１としたとき、カリウムイオンが1から4、かつマグネシウムイオンが1/8から1/2
（３）マグネシウムイオンを１としたとき、カリウムイオンが4から16、かつカルシウムイオンが2から8
各イオンの適切なモル濃度比は、生体内の活動状態を反映し、ストレスの少ない状態で所望の効果を達成しやすくできる。
【００６５】
培養液のナトリウムイオンとカリウムイオンとカルシウムイオンとマグネシウムイオンのモル濃度比は、以下の（１）から（４）のいずれかの範囲で設定することができる。
（１）ナトリウムイオンを１としたとき、カリウムイオンが1/40から1/10、カルシウムイオンが1/100から1/25、かつマグネシウムイオンが1/400から1/100
（２）カリウムイオンを１としたとき、ナトリウムイオンが10から40、カルシウムイオンが1/4から1、かつマグネシウムイオンが1/16から1/4
（３）カルシウムイオンを１としたとき、ナトリウムイオンが25から100、カリウムイオンが1から4、かつマグネシウムイオンが1/8から1/2
（４）マグネシウムイオンを１としたとき、ナトリウムイオンが100から400、カリウムイオンが4から16、かつカルシウムイオンが2から8
各イオンの適切なモル濃度比は、生体内の活動状態を反映し、ストレスの少ない状態で所望の効果を達成しやすくできる。
【００６６】
培養液に含まれる負の電荷のイオンは制限されないが、塩素イオン及び硫酸イオンが例示される。負の電荷のイオンは培養液中に存在することにより浸透圧を高めるとともに、負の電荷のイオンの生理的な作用により、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵に負担を減らし、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持しやすくする、及び／又は、培養している卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が排卵されること促すからである。
【００６７】
塩素イオン及び硫酸イオンに例示される前記負の電荷のイオンは単独で含まれる場合もあるし、２以上の任意の数を組み合わせて含まれる場合もある。卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵の受精能を維持するためには、前記培養液に、塩素イオン又は硫酸イオンの両方を含む場合がある。多くの種類を含むほうが、バランスがよく、含まれる全ての負の電荷のイオンに基づく相乗効果が期待できるからである。
【００６８】
塩素イオンは、塩素イオンチャンネル及び／又は塩素イオン結合タンパクに作用し、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵の受精能の維持に貢献する。塩素イオン結合タンパクには、塩素イオンチャネルに例示される塩素イオン結合タンパクとして知られるものも含まれる。
塩素イオンは、培養液に50mM、100mM、150mM又は200mM以上の濃度で含まれ、500mM、300mM、250mM又は200mM以下で含まれる。例えば150mM以上250mM以下の範囲で含まれる場合がある。塩素イオンが少なすぎると培養液に塩素イオンを添加した効果が薄れてしまい、塩素イオンが多すぎると、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持が難しくなるからである。
【００６９】
硫酸イオンは、硫酸イオンチャンネル及び／又は硫酸イオン結合タンパクに作用し、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵の受精能の維持に貢献する。硫酸イオン結合タンパクには、硫酸イオン輸送体に例示される硫酸イオンに結合するタンパクが含まれる。
硫酸イオンは、培養液に1mM、10mM、50mM、100mM又は200mM以上の濃度で含まれ、500mM、300mM、250mM又は200mM以下で含まれる。例えば100mM以上250mM以下の範囲で含まれる場合がある。硫酸イオンが少なすぎると培養液に硫酸イオンを添加した効果が薄れてしまい、硫酸イオンが多すぎると、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持が難しくなるからである。
【００７０】
卵巣又は断片化された卵巣の培養に用いる培養液の塩素イオンと硫酸イオンのモル濃度比は、塩素イオンを１としたとき、硫酸イオンを10以上、25以上、又は50以上とすることができる。同時に、卵巣又は断片化された卵巣の培養に用いる培養液の塩素イオンと硫酸イオンの比は、塩素イオンを１としたとき、硫酸イオンを400以下、200以下、又は100以下とすることができる。塩素イオン：硫酸イオンの比が大きすぎると、塩素イオンの阻害効果が強くなり、相対的に硫酸イオンの不足効果が強くなる。逆に塩素イオン：硫酸イオンの比が小さすぎると、塩素イオンの不足効果が強くなり、硫酸イオンの阻害効果が強くなる。
【００７１】
培養液の正の電荷の金属イオンと負の電荷のイオンのモル濃度比は、正の電荷の金属イオンを１としたとき、負の電荷のイオンを0.5以上、0.7以上、又は0.9以上とすることができる。同時に、培養液の正の電荷の金属イオンと負の電荷のイオンの比は、正の電荷の金属イオンを１としたとき、負の電荷のイオンを1.5以下、1.3以下、又は1.1以下とすることができる。正の電荷の金属イオン：負の電荷のイオンの比が大きすぎると、正の電荷の金属イオンの阻害効果が強くなり、相対的に負の電荷のイオンの不足効果が強くなる。逆に正の電荷の金属イオン：負の電荷のイオンの比が小さすぎると、正の電荷の金属イオンの不足効果が強くなり、負の電荷のイオンの阻害効果が強くなる。
【００７２】
培養液に、糖を含む場合がある。前記糖は培養液中に存在することにより浸透圧を高め、エネルギー源として作用し、又は、シグナル分子として作用することで、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵に負担を減らし、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持しやすくする、及び／又は、培養している卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が排卵されること促すからである。
培養液に含まれる糖の種類は本発明の目的を損なわない限り制限されないが、グルコース、ガラクトース、果糖、ショ糖が例示される。グルコース、ガラクトース、果糖、ショ糖は細胞内でエネルギーとしての利用効率が高く、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持しやすくする、及び／又は、培養している卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が排卵されること促すことにおいて、高い効果が期待できるからである。糖は、１種又は２種以上を組み合わせて用いる場合がある。
前記糖は、培養液中に、0.1mM以上、1.0mM以上、3.0mM以上、又は5mM以上のモル濃度で含まれ、100mM以下、50mM以下、20mM以下、10mM以下又は5.0mM以下のモル濃度で含まれる。糖が少なすぎると、培養液中に糖を添加した効果が薄れてしまい、糖が多すぎると、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持することが難しくなるからである。
【００７３】
培養液に、抗生物質を含む場合がある。前記抗生物質は培養液中に存在することで、雑菌の繁殖を弱めることで、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持しやすくするからである。
培養液に含まれる抗生物質の種類は本発明の目的を損なわない限り制限されないが、抗生物質としては、ベンジルペニシリンカリウム、アンピシリンに例示されるペニシリン系、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ネオマイシンに例示されるアミノグリコシド系の抗生物質が含まれる。前記抗生物質は、抗生物質としての効果が得られ、かつ、副作用が出ない範囲において、1種又は2種以上を組み合わせて用いる。ペニシリン系及びアミノグリコシド系の抗生物質は、水産系の抗生物質として効果が得られやすいからである。
【００７４】
前記抗生物質は、各抗生物質の適正な容量において培養液中に含まれる。前記ペニシリン系抗生物質としてベンジルペニシリンカリウムを用いる場合は、10mg/L以上、30mg/L以上、50mg/L以上又は70mg/L以上、かつ、500mg/L以下、300mg/L以下、150mg/L以下又は70mg/L以下で用いる。ベンジルペニシリンカリウムが少なすぎると、ベンジルペニシリンカリウムを添加した効果が得られにくく、ベンジルペニシリンカリウムが多すぎると、副作用により、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持が難しくなるからである。
【００７５】
前記アミノグリコシド系の抗生物質としてカナマイシン硫酸塩を用いる場合は、10mg/L以上、20mg/L以上、30mg/L以上又は50mg/L以上、かつ、500mg/L以下、300mg/L以下、100mg/L以下又は50mg/L以下で用いる。カナマイシンが少なすぎると、カナマイシンを添加した効果が得られにくく、カナマイシンが多すぎると、副作用により、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持が難しくなるからである。
【００７６】
前記アミノグリコシド系の抗生物質としてストレプトマイシン硫酸塩を用いる場合は、10mg/L以上、30mg/L以上、60mg/L以上又は100mg/L以上、かつ、500mg/L以下、300mg/L以下、150mg/L以下又は100mg/L以下で用いる。ストレプトマイシンが少なすぎると、ストレプトマイシンを添加した効果が得られにくく、ストレプトマイシンが多すぎると、副作用により、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵が受精能を維持することが難しくなるからである。
【００７７】
培養液の浸透圧は、100 mOsm/kg以上、200 mOsm/kg以上又は350 mOsm/kg以上とすることができ、6000 mOsm/kg以下、5000 mOsm/kg以下又は4500 mOsm/kg 以下とすることができる。浸透圧が低すぎると細胞に低浸透圧ストレスがかかり、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵の受精能が低下する場合がある。浸透圧が高すぎると細胞に高浸透圧ストレスがかかり、卵巣又は断片化された卵巣に含まれる卵の受精能が低下する場合がある。
【００７８】
培養液の浸透圧を担う成分として、正の電荷の金属イオン、負の電荷のイオン及び糖で浸透圧全体の90%以上、95%以上又は99%以上を構成する場合がある。糖はグルコース、ガラクトース、果糖、ショ糖のうち、1種又は2種以上を組み合わせて用いる場合がある。
【００７９】
正の電荷の金属イオン、負の電荷のイオン及び糖は生体内で細胞内液及び細胞外液において浸透圧調節に用いられることがあり、細胞にとって負担が少ない。
培養液の浸透圧を担う成分として、正の電荷の金属イオンは浸透圧全体の1/3以上、2/5以上又は3/7以上を構成し、2/3以下、3/5以下又は4/7以下を構成するとよい。
培養液の浸透圧を担う成分として、負の電荷のイオンは浸透圧全体の1/3以上、2/5以上又は3/7以上を構成し、2/3以下、3/5以下又は4/7以下を構成するとよい。正の電荷の金属イオンが多すぎる場合には負の電荷のイオンが相対的に少なくなり、正の電荷の金属イオンが少なすぎる場合には負の電荷のイオンが相対的に多くなり、いずれの場合も細胞に過度のストレスを与える場合がある。
【００８０】
培養液の浸透圧を担う成分として、糖は浸透圧全体の1/3以上、2/5以上又は3/7以上を構成し、2/3以下、3/5以下又は4/7以下を構成するとよい。
糖が少なすぎると細胞の代謝に負担がかかり、糖が多すぎると培養液の流動性に不都合が生じる場合がある。
【００８１】
２．海産魚類の卵の生産方法
本発明の海産魚類の卵生産方法は、本発明の卵巣維持方法により培養した卵巣を排卵させて卵を得る方法である。
【００８２】
本発明の卵の生産方法において、排卵は、通常、卵巣又は断片化された卵巣を培養液中で培養することにより自動的に行われる。また、得られる卵を損なわない限り、任意の方法で排卵を促してもよく、培養液から取り出して、強制的に排卵させてもよい。
「排卵」とは、卵巣内で卵胞が避けて卵が排出されることをいい、卵の排出には個体内で卵が排出されることの他、取り出された卵巣において卵巣外に卵が排出されることが含まれる。
【００８３】
「排卵数」は、実態顕微鏡により、断片化された卵巣から隔離した卵を排卵数として観察すること、又は、培養後に卵巣又は断片化された卵巣を固定液で固定して、卵巣又は断片化された卵巣内の排卵後濾胞を排卵数として計測することで決定することができる。「排卵しなかった透明化卵の数」は、培養後に卵巣又は断片化された卵巣を固定液で固定して、卵巣又は断片化された卵巣内に排卵せずに残された透明化卵の数を計測することで決定することができる。「排卵率」は、排卵数を排卵数と排卵せずに残された透明化卵の数の和で割ることで求めることができる。
【００８４】
本発明の受精卵の生産方法は、本発明の卵の生産方法により得られた卵と精子を掛け合わせて受精卵を得る方法である。上記の本発明の卵生産方法により得られた卵は、受精能を有するため、受精させることが可能となり、人工授精を計画的に行うことができるようになる。
【００８５】
「精子」とは、精巣において作り出される雄性配偶子である。本発明の受精卵の生産方法における精子は、受精作用を有していればよく、自然環境下で放精された精子及び人工環境下で誘導して放精された精子、生体から精巣を取り出して採取した精子、凍結保存された精子が含まれる。
【００８６】
「卵と精子を掛け合わせる」とは、卵と精子を接触させる環境におき受精を促すことをいう。本発明の受精卵の生産方法において、本発明の掛け合わせは自然環境下で行うもの及び人工的に調整した溶液中で行うものが含まれる。
本発明の受精卵の生産方法において、卵と精子の掛け合わせを自然環境下で行ってもよいし、人工的に調整した溶液中で行ってもよい。卵と精子の掛け合わせを一つの卵と一つ若しくは複数の精子、複数の卵と一つ若しくは複数の精子で行ってもよい。
【００８７】
「受精」とは、精子と卵が接合し、精子が卵の中に入り込むことをいう。本発明の受精卵の生産方法における受精には自然環境下で行うもの及び人工的に調整した溶液中で行うものが含まれる。受精は、卵から培養液を除去した後に精子をかけてもよい。
「受精卵」とは受精した卵をいう。本発明の受精卵の生産方法における受精卵には、精子と卵の接合後に細胞分裂を開始するもの、細胞分裂の後に浮上して浮上卵となるもの、浮上後に透明化して透明化卵となるものが含まれる。
【００８８】
「受精能がある卵」とは、卵と精子を掛け合わせたとき、受精する能力を有する卵のことをいう。本発明の受精卵の生産方法において、卵が、受精能がある卵であるか否かは、その種において受精を阻害しない環境下において、精子と接触させて受精するか否かにおいて判断する。
【００８９】
３．本発明の海産魚類の成育方法、及び本発明の養殖海産魚類の生産方法
本発明の海産魚類の成育方法は、上記本発明の受精卵の生産方法で得られる、受精卵から孵化した仔魚を、稚魚、未成魚又は成魚まで成育させる成育する工程を含む方法である。また、本発明の養殖海産魚類の生産方法は、上記本発明の受精卵の生産方法で得られる、受精卵から孵化した仔魚を、稚魚、未成魚又は成魚まで成育させる工程を含む方法である。
すなわち、本発明の受精卵の生産方法により得られた受精卵は、孵化して、孵化仔魚とすることができ、その後、未成魚及び成魚へと成長することができる。また、受精卵を計画的に得られることで、孵化仔魚を計画的に得ることができ、種苗生産及び養殖を計画的及び／又は効率的に行うことができる。
【００９０】
「仔魚」とは、卵から孵化して稚魚になるまでの段階の魚をいう。仔魚には、自然環境下及び人工環境下で付加した仔魚が含まれる。
「稚魚」とは、仔魚が成長し、未成魚になるまでの段階をいう。稚魚には、鰭条数や脊椎骨数が定数に達し、種の特徴を示す段階に至った魚が含まれる。
「未成魚」とは、稚魚が成長し、成魚になるまでの段階をいう。未成魚には、ウロコが形成されてから成熟に至るまでの魚が含まれる。
「成魚」とは未成魚魚が成長し、成熟した魚をいう。成魚には、成熟後に生殖能力を有するようになった魚及び生殖能力を有した後に生殖能力を失った魚が含まれる。
【００９１】
受精卵を孵化させるには、受精卵を海水中又は適切な溶液中で一定期間保持することで行うことができ、対象となる海産魚類の種類に応じて適宜決定される。
【００９２】
孵化仔魚から未成魚及び成魚を得るには、孵化仔魚を海水中又は適切な環境下で一定期間飼育することで行うことができ、その飼育条件は対象となる海産魚類の種類に応じて適宜決定される。
【００９３】
本発明の海産魚類の成育方法（養殖海産魚類の生産方法）により得られた仔魚、稚魚、未成魚及び成魚は、種苗あるいは食用として販売することができる。
【００９４】
本明細書において、発明の各態様に関する一実施形態中で説明された各発明特定事項は、任意に組み合わせて新たな実施形態としてもよく、このような新たな実施形態も、本発明の各態様に包含され得るものとして、理解されるべきである。
【実施例】
【００９５】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００９６】
＜材料と方法＞
(1)供試魚
実験には、養殖クロマグロ（平均魚体重：86.4 kg）を用いた。これらの魚は日本海で巻き網により採捕され、養成3年である。養殖期間中は、これらの魚に対し、冷凍のイカナゴ、イワシ、アジ、およびサバを給餌した。
(2)精子の採取
実験に用いる精子は、出荷のために釣り上げられた雄魚において、生殖孔から放出する精子、または摘出された精巣内の精子を採取し、1〜3尾分混合して使用した。実験には、当日に採取した精子のみを使用した。
(3)培養液
培養液は、124.1 mM塩化ナトリウム、5.1 mM 塩化カリウム、1.0 mM硫酸マグネシウム、1.6 mM塩化カルシウム、5.6 mMグルコースからなる組成のものを用いた。培養液の作製は、和光純薬工業社製で販売されている試薬を混合することで行った。この培養液に対し、抗生物質として100 mg/Lストレプマイシン硫酸塩、50 mg/Lカナマイシン硫酸塩、および70 mg/Lベンジルペニシリンカリウムを添加して用いた。抗生物質は全て和光純薬工業社製の試薬を用いた。さらに、クロマグロの卵巣腔液は、平均pH 8.0（n=5、最大値pH8.1最小値pH7.9）であったため、培養液はpH 8.0とし、緩衝剤として同仁化学研究所製のEPPSを10 mMで用いた。
【実施例２】
【００９７】
＜培養液の検討＞
今回使用する培養液がクロマグロの排卵した卵の受精能を維持できるかを検討した。実験には、生体内で既に排卵していた卵を使用し、出荷のために釣り上げられた雌魚1尾の摘出された卵巣内から採取した。採取後、これらの卵は、AGCテクノグラス社製の12穴培養用マイクロプレートにそれぞれ約100粒ずつ分配した。そして、採取した卵を無処理の対照区、および培養液で洗浄後に2mlの培養液に漬ける培養液区を設け、さらに、これらの試験区の中に、実験開始0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、または8.0時間後に人工授精を実施する区を設けた。なお、実験開始0時間とは開始直後に行ったことを意味する。
卵採取後は、速やかに試験区を設定して実験を開始し、人工授精するまでは温度26℃、湿度100％で管理した。人工授精時は精子を卵にかけて十分にいきわたらせた後、海水を加えて受精させた。培養液区の場合は、培養液を極力除去した後に精子をかけた。
人工授精後は、オリンパス社製の実体顕微鏡SZ61を用いた観察により、桑実胚期における浮上率（100×浮上卵数/実験に用いた全排卵卵数）、受精率（浮上率×受精卵数/浮上卵数）、を算出した。さらに、浮上卵からランダムに約20粒を10mLの海水が入った6穴培養用マイクロプレートに移し、孵化まで管理し、孵化率（浮上率×孵化仔魚数/移した浮上卵数）を求めた。管理中は適宜死卵を除去し、水質を維持した。【００９８】
図１〜３に示されるように、対照区の浮上率、受精率、孵化率は、2時間以上経過してから人工授精を行った区から有意に低下した。培養液区の浮上率は8時間後まで維持され、受精率および孵化率は、4時間後から低下する傾向が見られ、6時間以上経過した区では有意に低下した。従って、排卵した卵は培養液中で4時間までは受精能を維持可能であり、培養液は今後の培養実験に使用可能なことが確認された。
【実施例３】
【００９９】
＜生体外で排卵させるための卵巣の処理方法の検討＞
生体外で排卵させるための卵を採取するために、適切な卵巣の処理方法を検討した。実験には透明化した卵母細胞である透明化卵が含まれる卵巣を用い、出荷のために釣り上げられた雌魚1尾から摘出された卵巣を摘出した。
摘出した卵巣を培養液中で卵巣を約1cm角に断片化し、これらの断片化された卵巣を2mlの培養液を満たした12穴培養用マイクロプレートにそれぞれ約100粒の透明化卵が含まれるように分配した。前記断片化及びマイクロプレートへの分配処理は卵巣摘出直後を0時間とし、以後1、2、及び3時間後に実施する実験区、および断片化及びマイクロプレートへの分配処理を行わず卵巣をそのままの実験区と同じ条件で保持する対照区を設定した。  実験区においては、前記断片化及びマイクロプレートへの分配処理後0.5時間毎に2時間まで、対照区においては、卵巣摘出直後を0時間とし、以後0.5時間毎に5時間までサンプリングを行った。実験中は温度26℃で管理した。
サンプリングした試料から、排卵率を算出した。排卵率の算出は、実体顕微鏡を用いて、実験区では、培養プレートのウェル内に断片化された卵巣から剥離した卵を排卵した卵として計数し、対照区では、10％ホルマリン（和光純薬工業社製）で固定された試料卵巣内の排卵後濾胞の数を排卵として計数した。
また、両区共に、10％ホルマリンで固定された断片化された卵巣内又は試料卵巣内に排卵せずに残された透明化卵を計数した。実験区では排卵した卵の数と排卵せずに残された透明化卵の数を足して分母とし、対照区では排卵後濾胞の数と排卵せずに残された透明化卵の数を足して分母とし、それぞれ排卵した卵の数を割ることにより、排卵率を計算した。さらに、実体顕微鏡を用いて前記断片化及びマイクロプレートへの分配処理2時間後におけて排卵した卵の形態観察を行った。卵の形態は、別個体で得られた生体内で排卵した卵の形態を正常な形態とし、球状ではない卵及び卵内に不均一な褐色成分が見られる卵を異常な形態の卵と判断した。【０１００】
この結果、図４に示されるように、卵巣摘出０、１、２、３時間後に断片化及びマイクロプレートへの分配処理をした実験区においては、断片化及びマイクロプレートへの分配処理0.5時間後から排卵率が有意に上昇していった。しかし、対照区では排卵率に変化は見られなかった。
図５に各実験区における断片化及びマイクロプレートへの分配処理の２時間後において排卵した卵の形態観察の結果を示す。排卵した卵の形態観察の結果、生体内での排卵に見られるような正常な形態の卵は卵巣摘出直後に断片化及びマイクロプレートへの分配処理を施した区のみで確認された。図６に実験区、および対照区における正常または異常な形態を示す排卵した卵の出現頻度を示す。
従って、卵巣を断片化処理することにより排卵は起きるが、受精能を有すると考えられる正常な形態の排卵した卵を生体外で得るためには、卵巣摘出直後に断片化及びマイクロプレート処理を実施する必要があることが確認された。
【実施例４】
【０１０１】
＜受精能の確認＞
合計７尾の卵巣を用いて、卵巣摘出直後に断片化及びマイクロプレートへの分配処理をしたものを0時間とし、培養液中で１時間培養し生体外で排卵した卵に対し、人工授精を行った。図７に生体外での排卵から得られた受精卵および孵化仔魚の写真を示す。また、表１に各個体における排卵率、浮上率、受精率、孵化率をまとめて示す。
この結果、卵質に個体差が見られたものの、５尾から仔魚を得ることができた。【０１０２】
【表１】
2016152215.tif 000003
【実施例５】
【０１０３】
＜培養液の組成検討＞
表２に示す範囲の濃度（組成）の培養液を用い、卵巣摘出直後に断片化及びマイクロプレートへの分配処理をし、1時間培養後に得られた排卵された卵の人工授精を行った。先ず、50、100、150、または200％の濃度で試験した結果、全ての濃度で受精卵および仔魚を得ることができた。
また、別個体を用い、同様の試験を100〜175％の濃度で行った結果、良好な培養成績は100〜150％の濃度で得られた（表３）。【０１０４】
【表２】
2016152215.tif 000004
【０１０５】
【表３】
2016152215.tif 000005
【実施例６】
【０１０６】
＜マグロ血清の金属イオン組成に合わせた培養液の調整＞
雌魚５尾から血清を採取し、ナトリウムイオン及びカリウムイオンの濃度をイオン選択電極法により測定した。さらに、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンの濃度は、原子吸光法により測定した。
その結果、採取された血清は、表４のような組成であった。この金属イオンの組成に合わせて、193.6 mM塩化ナトリウム、7.8 mM 塩化カリウム、3.8 mM塩化カルシウム、1.1 mM硫酸マグネシウムの組成の培養液とし、さらに、この培養液に対して、5.6 mMグルコース、抗生物質（100 mg/Lストレプマイシン硫酸塩、50 mg/Lカナマイシン硫酸塩、及び70 mg/Lベンジルペニシリンカリウム）、及び10mM Eppsを加え、pHを8.0に調整した。【０１０７】
【表４】
2016152215.tif 000006
【０１０８】
＜マグロ血清の金属イオン組成に合わせた培養液の効果＞
実施例１に記載した培養液を使用する標準培養液区、又は前記マグロ血清の金属イオンの組成に合わせた培養液を使用するマグロ培養液区を設定し、それぞれ卵巣摘出直後に断片化及びマイクロプレートへの分配処理をし、1、2、3、及び4時間培養した後に、受精を行い、排卵率、浮上率、受精率、及び孵化率を算出した。試験は、2個体からの卵巣を用いて2回実施した。【０１０９】
１固体目の結果を図８〜１１に示す。
図８に示されるように1個体目における標準培養液区の排卵率は、培養1時間からほぼ100％に達した。これに対し、培養1時間でのマグロ培養液区の排卵率は低く、その後、培養時間の経過に伴い上昇していった。また、浮上率は、両区間に差はみられなかった（図９）。また、受精率は、マグロ培養液区において、標準培養液区に対し、培養2時間以降で高くなった（図１０）。また、孵化率に関しては、全ての培養時間で、標準培養液区に対し、マグロ培養液区で高い値を示した（図１１）。【０１１０】
２固体目の結果を図１２〜１５に示す。
2個体目においても、ほぼ同様の結果がみられたが、標準培養液区において、受精率が著しく低く、孵化率に関しては、全ての培養時間で0％であった。【０１１１】
以上の結果より、マグロ血清の金属イオンの組成に合わせた培養液を用いると、標準培養液に対し、受精および孵化の成績が向上することが示された。さらに、全く孵化しないような場合でも、孵化仔魚を得られることが明らかになった。一方、排卵の進行はこれまでよりも遅くなったが、培養時間を延ばすことで一定数の排卵した卵を得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明は海産魚類の卵巣の維持方法、及び受精卵取得方法に関する。本発明により、海産魚類の摘出した卵巣の維持、並びに受精卵の取得が容易となり、効率的に種苗を生産することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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