(57)【要約】【課題】  従来と比較して容易に３次元細胞構造体を製造することができる方法およびこれに用いる支持体を提供する。【解決手段】  本発明の支持体１は、４辺の枠体１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄと、枠体１０の間を延在するＸ方向およびＹ方向のストリング部材２０とを含む。ストリング部材２０は、支持体１内に複数のメッシュ状の矩形状の空間を形成する。支持体１のメッシュ状の空間には、ディスペンサから細胞凝集体が分注され、そのような支持体１が複数積層される。最終的に、支持体１およびストリング部材２０が、細胞凝集体の接着、融合により形成された３次元細胞構造体から除去される。【選択図】  図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞構造体の製造方法であって、
複数の糸もしくは針状部材により網目状の空間を形成した支持体であって前記複数の糸もしくは針状部材上に細胞凝集体を供給するステップと、
前記細胞凝集体が供給された支持体を積層するステップと、
融合された細胞凝集体から前記複数の糸もしくは針状部材を除去するステップとを含む、
細胞構造体の製造方法。
【請求項２】
細胞構造体の製造方法であって、
複数の糸もしくは針状部材により網目状の空間を形成した支持体を積層するステップと、
積層された支持体上に細胞凝集体を供給するステップと、
融合された細胞凝集体から前記複数の糸もしくは針状部材を除去するステップとを含む、
細胞構造体の製造方法。
【請求項３】
細胞構造体の製造方法であって、
要求される細胞構造体の形状の境界を規定する複数の糸もしくは針状部材を含む支持体を積層するステップと、
積層された支持体上に細胞凝集体を供給するステップと、
融合された細胞凝集体から前記複数の糸もしくは針状部材を除去するステップとを含む、
細胞構造体の製造方法。
【請求項４】
前記供給するステップは、細胞凝集体をディスペンサに充填するステップと、前記ディスペンサを走査することにより前記支持体の糸もしくは針状部材上に前記細胞凝集体を分注するステップとを含む、請求項１ないし３いずれか１つに記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項５】
前記供給するステップは、細胞凝集体の形状を規定するためのガイド部材を支持体上に配置するステップを含み、前記ガイド部材内に細胞凝集体が供給される、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項６】
前記供給するステップは、細胞凝集体を含む溶液が保持された容器内において、前記支持体により細胞凝集体をすくい上げるステップを含む、請求項１ないし３いずれか１つに記載の製造方法。
【請求項７】
製造方法はさらに、細胞凝集体が供給された支持体を培養液を含む容器内に浸漬し、支持体または容器に振動または揺動を与えるステップを含む、請求項１ないし６いずれか１つに記載の製造方法。
【請求項８】
前記除去するステップは、複数の糸もしくは針状部材を前記細胞凝集体からＸ方向またはＹ方向に引き抜くことを含む、請求項１ないし７いずれか１つに記載の製造方法。
【請求項９】
１つの支持体には、細胞凝集体の大きさよりも小さい網目状の空間と、細胞凝集体の大きさよりも大きい網目状の空間とが形成され、前記小さい網目状の空間と前記大きい網目状の空間との境界が融合される細胞凝集体の形状を規定する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１０】
下層に位置する支持体の網目状の空間が上層に位置する支持体の網目状の空間よりも小さく、上層の支持体上に供給された細胞凝集体が当該上層の支持体を通り抜けて下層の支持体上に保持される、請求項２に記載の製造方法。
【請求項１１】
細胞構造体の製造に使用される支持体であって、
複数の枠体と、
複数の枠体によって囲まれた空間内に網目状の空間を形成する複数の糸もしくは針状部材とを有し、
前記網目状の空間は、細胞凝集体を保持することが可能である、支持体。
【請求項１２】
細胞構造体の製造に使用される支持体であって、
複数の枠体と、
複数の枠体によって囲まれた空間内に、要求される細胞構造体の形状の境界を規定する複数の糸もしくは針状部材とを有し、
前記複数の糸もしくは針状部材により規定される空間内に細胞凝集体を保持することが可能である、支持体。
【請求項１３】
支持体はさらに、細胞凝集体の形状を規定するためのガイド部材を前記網目状の空間上に含む、請求項１１に記載の支持体。
【請求項１４】
前記網目状の空間は、細胞凝集体の大きさよりも小さい網目状の空間と、細胞凝集体の大きさよりも大きい網目状の空間とを含み、前記小さい網目状の空間と前記大きい網目状の空間との境界が融合される細胞凝集体の形状を規定する、請求項１１に記載の支持体。
【請求項１５】
前記糸もしくは針状部材は、前記細胞凝集体に対して非接着性のある材質から構成される、請求項１１ないし１４いずれか１つに記載の支持体。
【請求項１６】
前記糸もしくは針状部材は、前記細胞凝集体に対して非接着性のコーティングをされている、請求項１１ないし１４いずれか１つに記載の支持体。
【請求項１７】
複数の枠体の少なくとも一部が残りの枠体から分離可能である、請求項１１ないし１６いずれか１つに記載の支持体。
【請求項１８】
支持体は、複数の支持体が積層されるときに各支持体を位置決めするための位置決め手段を含む、請求項１１ないし１７いずれか１つに記載の支持体。
【請求項１９】
自動ディスペンサにより細胞構造体を製造する方法であって、
複数の糸もしくは針状部材により網目状の空間が形成された支持体を用意するステップと、
自動ディスペンサのノズルから吐出された細胞凝集体を前記支持体の網目状空間で保持するステップと、
融合された細胞凝集体から複数の糸もしくは針状部材を除去するステップと、
を含む製造方法。
【請求項２０】
請求項１１ないし１８いずれか１つに記載の支持体の製造方法であって、
薄板部材上にマスク層を形成し、
前記マスク層により露出された前記薄板部材をエッチングすることにより複数の糸もしくは針状部材を形成する、支持体の製造方法。
【請求項２１】
請求項１１ないし１８いずれか１つに記載の支持体の製造方法であって、
複数の糸もしくは針状部材をボンディングワイヤにより形成する、支持体の製造方法。
【請求項２２】
請求項１１ないし１８いずれか１つに記載の支持体の製造方法であって、
複数の糸もしくは針状部材を含む支持体は３次元プリンタにより製造される、支持体の製造方法。
【請求項２３】
請求項１ないし１０いずれか１つに記載された製造方法により製造される細胞構造体は、同一種類の細胞から構成される、細胞構造体。
【請求項２４】
請求項１ないし１０いずれか１つに記載された製造方法により製造される細胞構造体は、異なる種類の細胞から構成される、細胞構造体
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞凝集体を用いた３次元細胞構造体もしくは３次元細胞構築物の製造方法に関し、特に、網目状またはメッシュ状の支持体を用いて３次元細胞構造体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界的な人口増加と長寿命化に従い医療行為への要求・要望・需要は高まるばかりであるが、近年は新たな手法として細胞を利用した再生医療が注目されている。最終的な目的は人体移植目的とした人工組織や人工臓器の作製である。人工組織はその一部分を機能が発現する形で作製されたもので、人体移植が最終目的である。ただし、人体への移植までには相応の評価認定が必要となり、長期的な取り組みが必要である。
人体移植目的以外に大きく期待される分野が、これらの３次元細胞構造体を用いた毒性検査、薬剤効果判定、病理判定、発生学などを試験片としての活用法である。ヒト細胞のみを用いて３次元細胞構造体を作成し体内の環境を再現もしくは近い環境下にて上記の試験をすることで、体内を模した実験が体外で可能となる。これにより効率的な創薬研究、パーソナライズした投薬診断、各器官発生の観察研究などが可能になる。
特にがんの投薬においてはその時期と効果予測判定が難しいが、例えば本技術を利用患者のがん組織にて作成された試験片を体外でまず投薬試験評価判定をすることで、薬効果の見極めの指標となることが期待される。【０００３】
細胞には、浮遊系細胞と足場依存の接着性細胞の２種類がある。前者には、血液系や免疫系の細胞が属し、後者には臓器や皮膚、や骨などの細胞が属する。接着性細胞は、在溶液中で浮いている状態では長期間の生存はできず、ガラスシャーレやハイドロゲルなどの足場に付着することで生存及び増殖させる必要がある。接着性の細胞を非接着の環境下に置くと、細胞は足場を求めて相互に接着し、細胞凝集体が形成され、さらに細胞凝集体同士を何らかの手法で相互に接触した環境下に置くと、それらが接着、融合しさらに大きな三次元細胞構造体を構成する。この現象は広く知られており、非特許文献１〜６はこれらの具体的実施例を示すものである。非特許文献１にあるように細胞凝集体（本文献内ではClusterとも表記される）が融合する現象は古く１９６０年代から知られている。特に非特許文献６にて示されるのは、３次元細胞構造体を「積木ブロック（Building Block）」として扱うアイデアを示しており、多様な細胞が利用可能であることを示唆している。
細胞塊（Spheroid）は細胞のみで構成されたおおむね円形の凝集体、細胞凝集体凝集体（Cell Aggregate）は細胞塊及びと細胞とそれ以外の物質で構成された凝集体を示すものとする。【０００４】
特許文献１は、担体を用いることなく細胞だけで任意の形状の組織を作成することができる組織プラグ製造方法を開示する。具体的には、底面のみに培養液が通過できる微細孔を有するチャンバー内に細胞凝集体を入れ、細胞凝集体の一部が気相に接する程度の量の培養液がチャンバー内に含まれるようにして、チャンバー内の培養液よりも過剰量の培養液中で細胞凝集体を培養させるものである。【０００５】
また、３次元細胞構造体を製造する方法として、特許文献２に示すバイオプリンターのノズルから細胞凝集体を平面上に分注していくディスペンス方式や、特許文献３に示す針状の支持体に細胞塊を貫通させる剣山方式が知られている。剣山方式は、基板に設けられた複数の針を含む支持体を用い、複数の針に細胞塊を貫通させ、細胞塊の融合後、融合した細胞塊から針を引き抜くことで３次元細胞構造体を製造するものである。さらに特許文献４は、透過性シート上で平面培養した培養細胞を他の平面培養した培養細胞上にシートごと積層し、立体的な細胞を製造する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４１２２２８０号
【特許文献２】米国特許第８８５２９３２号公報
【特許文献３】特許第４５１７１２５号公報（国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００８／０５６８２６号）
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００５／０４７４９６号公報
【非特許文献１】PLOS ONE, Journal. Pone. 0136681, “Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D printer Undergo Remolding and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae”, Manabu Itoh et al, September 1, 2015
【非特許文献２】Gordon R, Goel NS, Steinberg MS, Wiseman LL. A rheological mechanism sufficient to explain the  kinetics of cell sorting. J Theor Biol. 1972; 37:43-73. [PubMed: 4652421]
【非特許文献３】Jakab K, Damon B, Marga F, Doaga O, Mironov V, Kosztin I, Markwald R, Forgacs G. Relating cell  and tissue mechanics: implications and applications. Dev. Dyn. 2008; 237:2438-2449. [PubMed:  18729216]
【非特許文献４】Jakab K, Neagu A, Mironov V, Markwald RR, Forgacs G. Engineering biological structures of  prescribed shape using self-assembling multicellular systems. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;  101:2864-2869. [PubMed: 14981244]
【非特許文献５】Perez-Pomares JM, Foty RA. Tissue fusion and cell sorting in embryonic development and disease:biomedical implications. Bioessays. 2006; 28:809-821. [PubMed: 16927301]
【非特許文献６】Organ printing: Tissue spheroids as building blocks”  Biomaterials. Vladimir Mironov, Richard P. Visconti, Vladimir Kasynocv, Gabor Forgacs, Christopher J. Drake, and Roger R. Markwald, 2009 April ; 30(12):2164-2174. doi:10.1016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献２に示すディスペンス方式の多くは、バイオインクと呼ばれる細胞塊とハイドロゲルやコラーゲンなどの繋ぎ材を混ぜ合わせたものを平面上に吐出していく手法、もしくはハイドロゲルやコラーゲンなどの固まりやすい形状保持可能な材料にてあらかじめ作成した足場（Scaffold）の内部に細胞塊を注入して三次元細胞構造体手法であるが、繋ぎ材が酸素および栄養素の供給を遮断してしまう欠点がある。さらにこの特許文献では「細胞凝集体が接触するように規則的に配置」と規則的に配置することを要求している。また、３次元細胞構造体は、繋ぎ材の形状保持力に依存するため、３次元細胞構造体の大きさや形状（特に高さ方向）に制限が課される。さらに３次元細胞構造体内に繋ぎ材が残存するので、繋ぎ材が細胞に与える悪影響を排除しきれないという課題が残り、人体移植時、もしくは効果判定時に追加の評価確認が必要となる。【０００８】
特許文献３に示す剣山方式は、針状の支持体の相互距離が決められているため、そこに貫通させる細胞凝集体は、概ね円形であること、貫通させられる柔らかさと貫通後に所定位置に止まるだけの硬さを有すること、さらに相互に接触しあうために大きさが一定の範囲内にあることが要求される。さらに細胞凝集体を１つずつ積層しなければならないので相応の時間を必要とする。さらには複数の針を狭ピッチで精度よく形成しなければならないため、剣山の製造コストもかかるうえに専用の機器が必要となる。【０００９】
本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、従来と比較して容易に３次元細胞構造体を製造することができる方法およびこれに用いる支持体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係る細胞構造体の製造方法は、複数の糸もしくは針状部材により網目状の空間を形成した支持体であって前記複数の糸もしくは針状部材上に細胞凝集体を供給するステップと、前記細胞凝集体が供給された支持体を積層するステップと、融合された細胞凝集体から前記複数の糸もしくは針状部材を除去するステップとを含む。【００１１】
さらに本発明に係る細胞構造体の製造方法は、複数の糸もしくは針状部材により網目状の空間を形成した支持体を積層するステップと、積層された支持体上に細胞凝集体を供給するステップと、融合された細胞凝集体から前記複数の糸もしくは針状部材を除去するステップとを含む。【００１２】
本発明に係る細胞構造体の製造に使用される支持体は、複数の枠体と、複数の枠体によって囲まれた空間内に網目状の空間を形成する複数の糸もしくは針状部材とを有し、前記網目状の空間は、細胞凝集体を保持することが可能である。【００１３】
本発明に係る自動ディスペンサにより細胞構造体を製造する方法は、複数の糸もしくは針状部材により網目状の空間が形成された支持体を用意するステップと、自動ディスペンサのノズルから吐出された細胞凝集体を前記支持体の網目状空間で保持するステップと、融合された細胞凝集体から複数の糸もしくは針状部材を除去するステップとを含む。【００１４】
本発明に係る支持体の製造方法は、薄板部材上にマスク層を形成し、前記マスク層により露出された前記薄板部材をエッチングすることにより複数の糸もしくは針状部材を形成する。さらに本発明に係る支持体の製造方法は、複数の糸もしくは針状部材をボンディングワイヤにより形成する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、複数の糸もしくは針状部材およびこれによって形成される網目状の空間に細胞凝集体を供給し、細胞凝集体が融合された後に細胞凝集体から糸もしくは針状部材を除去するようにしたので、従来と比較して簡易に３次元細胞構造体を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の第１の実施例に係る３次元細胞構造体を製造するのに用いられる支持体の斜視図である。
【図２】図１に示す支持体の平面図である。
【図３】図１に示す支持体の背面図を示す図である。
【図４】本発明の第１の実施例に係る支持体を積層した状態を示す斜視図である。
【図５】本発明の第１の実施例に係る支持体の分離例を示す図である。
【図６】本発明の第１の実施例に係る３次元細胞構築物の製造工程を示すフローである。
【図７】細胞凝集体の充填を説明する図である。
【図８】ディスペンサによる細胞凝集体の分注を説明する図である。
【図９】細胞凝集体を分注された支持体の積層を示す図である。
【図１０】図１０（Ａ）は、支持体の枠体を分離したときの３次元細胞構造体の概略斜視図、図１０（Ｂ）は、ストリング部材を除去した後の３次元細胞構造体の概略斜視図である。
【図１１】本発明の変形例であり、複数の支持体を積層後に分注を行う例を示す図である。
【図１２】本発明の第２の実施例に係る支持体の構成を示す斜視図である。
【図１２Ａ】本発明の第２の実施例の変形例を示す図である。
【図１３】本発明の第２の実施例に係る支持体上への細胞凝集体の分注を示す図である。
【図１３Ａ】図１３に示す支持体を切断しストリング部材を抜去する例を示す図である。
【図１４】本発明の第２の実施例に係る支持体を用いて製造された３次元細胞構造体の概略斜視図である。
【図１５】本発明の第３の実施例に係る支持体の構成を示す図である。
【図１６】本発明の第３の実施例に係る支持体を用いて製造された３次元細胞構造体の概略斜視図である。
【図１７】本発明の第３の実施例の変形例を示す図である。
【図１８】本発明の第４の実施例による３次元細胞構造体の製造方法を説明する図である。
【図１９】本発明の第５の実施例による３次元細胞構造体の製造方法を説明する図である。
【図１９Ａ】本発明の第６の実施例による３次元細胞構造体の製造方法を説明する図である。
【図２０】本発明の実施例による支持体を半導体工程により製造したときの概略断面図である。
【図２０Ａ】本発明の実施例による支持体をボンディングワイヤにより形成しえたときの概略断面図である。
【図２１】本発明の実施例に係る３次元細胞構造体の製造装置の一例を示す図である。
【図２２】本発明の第６の実施例による３次元プリンタによる支持体の製造方法を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
次に、本発明の実施の形態に係る３次元細胞構築物の製造方法は、枠体と、枠体内にメッシュ状またはマトリックス状の空間を形成する糸状のストリング部材（糸もしくは針状部材）とを有する支持体を用い、メッシュ状の空間に細胞凝集体（スフェロイド）を含む溶液を分注し、接着、融合された細胞凝集体からストリング部材を抜くことで３次元細胞構造物を製造するものである。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明の実施例について図面を参照して説明する。図１は、本発明の第１の実施例に係る支持体の斜視図、図２は、その支持体の平面図、図３は、その支持体の背面図である。本実施例の支持体１は、１つの好ましい例として矩形状に形成される。すなわち、支持体１は、４辺を構成する枠体１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄと（以下、総称して枠体１０と呼ぶことがある）、枠体１０内にメッシュ状またはマトリックス状の空間を形成する複数のストリング部材２０と、支持体が積層されるときに各支持体の位置決めを行う位置決め手段３０とを含んで構成される。【００１９】
枠体１０は、任意の材料から構成することができるが、例えば、樹脂などから構成される。また、枠１０の大きさは任意であるが、例えば、細胞凝集体の大きさが約２００μｍ以上であれば、１辺の長さが３ｃｍ〜４ｃｍ程度、厚さが０．１ないし１ｍｍ程度であることができる。【００２０】
ストリング部材２０は、枠体１０内にＸ方向およびＹ方向に延在する。ストリング部材２０は、例えば、ステンレス、ナイロン、ポリエステルなどの材料から構成され、例えば、直径が約１０μｍである。好ましくは、ストリング部材２０は、Ｐ−ＨＥＭＡ等の日接着剤がコーティングされ、かつエタノール等によって消毒される。Ｘ方向に延在するストリング部材２０Ｘの一方の端部が枠体１０Ａに固定され（例えば、接着剤等により固定）、他方の端部が枠体１０Ａと対向する枠体１０Ｃに固定される。Ｙ方向に延在するストリング部材２０Ｙの一方の端部が枠体１０Ｂに固定され、他方の端部が枠体１０Ｂと対向する枠体１０Ｄに固定される。Ｘ方向のストリング部材２０Ｘは、一定のピッチＰｘで配列され、Ｙ方向のストリング部材２０Ｙは、一定のピッチＰｙで配列され、その結果、枠体１０の内側には、幅Ｐｘ、Ｐｘで規定される複数の矩形状の空間が形成される。ピッチＰｘ、Ｐｙは、例えば、約０．１ｍｍである。また、支持体１のアスペクト比（縦横比）に応じてピッチＰｘとＰｙの比を決定することができるが（例えば、アスペクト比が４：３であるとき、Ｐｘ：Ｐｙが４：３）、必ずしもこれに限定されるものではない。【００２１】
支持体１のストリング部材２０上には、後述するように細胞凝集体がディスペンスされ、ディスペンスされた細胞凝集体は、ストリング部材２０によって形成されたメッシュ状の空間内に保持されなければならない。従って、ストリング部材２０によって形成されるメッシュ状の空間（Ｐｘ、Ｐｙ）は、ディスペンスされる細胞凝集体の大きさよりも小さくなければならない。但し、ディスペンスされる細胞凝集体を均一にしたり、あるいは一定の範囲内に収める必要はなく、ディスペンスされる細胞凝集体の最小サイズＤｍｉｎがＰｘ、Ｐｙよりも大きければよい（Ｄｍｉｎ＞Ｐｘ、Ｄｍｉｎ＞Ｐｙ）ことに留意すべきである。【００２２】
１つの好ましい例では、３次元細胞構造体を製造するために、同一形状の支持体１が図４（Ａ）に示すように複数積層される。このとき、支持体１の位置合わせを容易にするための位置決め手段３０が支持体１に設けられる。位置決め手段３０は、特に制限されないが、例えば、アリホゾ関係にある部材の嵌合、ネジなどによる締結、あるいはその他の部材による係合により実施することができる。図の例では、支持体１の表側の各コーナーには、円柱状の突起３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄが形成され、支持体１の裏側の各コーナーには、突起３０Ａ、３０Ｂ、３０Ｃ、３０Ｄとそれぞれ係合する円柱状の凹部４０Ａ、４０Ｂ、４０Ｃ、４０Ｄが形成される。これらの突起３０と凹部４０とを利用して複数の支持体１の積層が容易に行われる。図４（Ａ）には、３つの支持体１−１、１−２、１−３が積層された例が示されている。ここで、突起３０の高さ、または凹部４０の深さを選択することで、積層される支持体の間に所望の間隙を形成することができる。図４（Ｂ）では、凹部４０の深さよりも突起３０の高さが小さく、支持体１−１と１−２との間に間隙が形成されない積層であり、図４（Ｃ）では、凹部４０の深さよりも突起３０の高さが大きく、支持体１−１と１−２との間に間隙Δｄが形成される。Δｄは、支持体１の厚さ、あるいはディスペンスされる細胞凝集体のサイズに応じて適宜選択される。【００２３】
好ましい例では、複数の枠体のうち少なくとも１つの枠体が残りの枠体から分離可能に構成される。これは、後述するように、支持体上にディスペンスされた細胞凝集体が接着、融合した後、融合した３次元細胞構造体からストリング部材２０の除去を容易にするためである。図５（Ａ）は、１つの枠体の分離方法を示している。枠体１０Ａの両端部には、それぞれ凹部５４Ａが形成され、枠体１０Ｃの両端部には、それぞれ凹部５４Ｃが形成されている。また、枠体１０Ｂの両端部には、それぞれ凸部５２Ｂが形成され、枠体１０Ｄの両端部には、それぞれ凸部５２Ｄが形成されている。凸部５２Ｂ、５２Ｄと凹部５４Ａ、５４Ｃとはそれぞれ着脱可能に係合し、すなわち、細胞凝集体をディスペンスするとき、凸部５２Ｂ、５２Ｄが凹部５４Ａ、５４Ｃに嵌り合い、４つの連結された枠体１０により矩形状の支持体１が構成され、他方、三次元細胞構造体からストリング部材を引き抜くとき、凸部５２Ｂ、５２Ｄと凹部５４Ａ、５４Ｃが離脱し、４つの枠体がそれぞれ分離可能になる。なお、４つの枠体１０が分離されるとき、ストリング部材２０と枠体１０との接続は解除される。例えば、ストリング部材２０の端部が枠体１０の固定部分から引き抜かれるか、あるいはストリング部材と枠体１０との間がカッターなどにより切断されるようにしてもよい。【００２４】
図５（Ｂ）は、他の枠体の分離方法を示している。この方法では、４つの枠体が２つに分離される。つまり、枠体１０Ａおよび１０Ｄが結合された状態を保ち、枠体１０Ｂおよび１０Ｃが結合された状態を保つ。このような分離方法でも、Ｘ方向およびＹ方向に延在するストリング部材２０を三次元細胞構造体から引き抜くことが可能になる。【００２５】
なお、枠体の分離方法は、必ずしも図５に示すような方法に限定されるものではない。例えば、枠体１０が切断容易な材料から構成されている場合には、カッター、レーザー等を用いて複数の切断位置で枠体を他の枠体から分離するようにしてもよいし、あるいは枠体とストリング部材の端部との間を直接切断するようにしてもよい。この場合、枠体１０は、再利用されず、使い捨てされる。【００２６】
次に、支持体１を用いた３次元細胞構造体の製造方法について図６のフローチャートを参照して説明する。まず、複数の細胞を凝集させ、一定の大きさにした細胞凝集体（スフェロイド）を製造する（Ｓ１００）。細胞凝集体の製造方法に関しては、特に限定されず、例えば、特許文献３に記載されている細胞凝集体の製造方法を用いることができる。【００２７】
細胞凝集体を製造した後、生理食塩水などと共に細胞凝集体をディスペンサ内に充填する（Ｓ１０２）。図７（Ａ）は、ディスペンサへの細胞凝集体の充填例を示す図である。複数の細胞凝集体を含む細胞凝集体溶液１００がディスペンサ２００内に充填される。細胞凝集体溶液１００に含まれる細胞凝集体は、種々のサイズであることができるが、細胞凝集体の最小サイズＤｍｉｎは、ストリング部材２０により形成される空間の幅Ｐｘ、Ｐｙよりも大きい。図７（Ｂ）に示すようにディスペンサ２００は、先端に吐出部２１０を含み、シリンダ２２０を駆動することで吐出部２１０から細胞凝集体溶液１００を吐出することが可能である。【００２８】
次に、支持体上に細胞凝集体が分注（ディスペンス）される（Ｓ１０４）。図８に示すように、ディスペンサ２００を、製造すべき３次元細胞構造体の形状に合わせてＸ方向およびＹ方向に走査することで、支持体１のストリング部材２０上に細胞凝集体１００が分注される。あるいは、ディスペンサ２００の位置を固定し、支持体１をステージ上に搭載し、ステージ１をＸ、Ｙ方向に移動するようにしてもよい。分注された細胞凝集体の最小サイズＤｍｉｎは、幅Ｐｘ、Ｐｙよりも大きいため、分注された細胞凝集体は、メッシュ状のストリング部材２０から落下することなくストリング部材２０上に保持される。ここで留意すべきは、細胞凝集体溶液１００に含まれる球形状、楕円状等の細胞凝集体の下部の一部は、幅Ｐｘ、Ｐｙの空間の隙間から下方に突出し得る。【００２９】
次に、決められた積層数に到達したか否かが判定される（Ｓ１０６）。積層数は、製造すべき３次元細胞構造体のＺ方向の高さにより決定される。もし、積層数に到達していない場合には、支持体がさらに積層され（Ｓ１０８）、積層された支持体上に細胞凝集体溶液が分注される（Ｓ１０４）。支持体１を積層するとき、各支持体は位置決め手段３０、４０により相互に位置決めされる。図９（Ａ）には、支持体１−１、１−２のそれぞれに細胞凝集体溶液１００を分注した様子が示され、支持体１−２への細胞凝集体溶液１００の分注が終了すると、次に、支持体１−３が積層され、そこへ細胞凝集体溶液１００の分注が行われる。こうして、製造すべき３次元細胞構造体のサイズに応じて複数の支持体が積層され、積層された支持体へ細胞凝集体溶液１００の分注が行われる。図９（Ｂ）は、３つの支持体１−１、１−２、１−３が積層された状態を示している。複数の支持体が積層されたとき、上段の支持体に分注された細胞凝集体の一部は、メッシュ空間の隙間から下方に突出し、下段の支持体に分注された細胞凝集体の一部に接触することが可能となる。【００３０】
積層数に到達すると、細胞凝集体溶液の分注は終了され、次に、これらを細胞に適した培養液中に透過することで細胞凝集体の接着、融合が行われる（Ｓ１１０）。例えば、細胞凝集体が積層された支持体１が、培養液を含む容器内に浸漬される。その際、接着、融合の促進を図るために、支持体１または容器に一定の振動または揺動が与えられるようにしてもよい。支持体上の細胞凝集体は、その水平方向において隣接する細胞凝集体と接着、融合する。また、細胞凝集体は、積層された各支持体の細胞凝集体と垂直方向において接着、融合する。１つの支持体上に分注された複数の細胞凝集体の間には、栄養や酸素を遮断するような障害物が存在しないので、細胞凝集体には、十分な栄養素や酸素が行きわたる。また、積層された支持体間の細胞凝集体の間には、ストリング部材２０が介在するだけであり、細胞凝集体は、メッシュ状の空間によって栄養素や酸素に晒される。このため、細胞凝集体の接着、融合が好適な環境下において行われる。接着、融合に要する最適な放置時間は、適宜選択される。【００３１】
細胞凝集体の接着、融合が行われた後、積層された支持体の枠体が分離される（Ｓ１１２）。枠体の分離は、例えば、図５（Ａ）、（Ｂ）に示すように一部または全部の枠体が分離され、かつ分離された枠体からストリング部材２０の一端が分離され、あるいはカッターやレーザーにより枠体とストリング部材２０とが分離される。図１０（Ａ）は、すべての枠体が分離された場合の融合された細胞凝集体、すなわち３次元細胞構造体３００の模式図である。模式的に表された３次元細胞構造体３００は、直方体状であり、３次元細胞構造体３００の内部には、Ｘ方向に延在する複数のストリング部材２０Ｘと、Ｙ方向に延在する複数のストリング部材２０Ｙとが存在し、これらストリング部材２０Ｘ、２０Ｙが３次元細胞構造体３００の側面から突出している。【００３２】
次に、３次元細胞構造体からストリング部材が除去される（Ｓ１１４）。好ましくは、図１０（Ａ）に示す３次元細胞構造体３００からＸ方向のストリング部材２０ＸをＸ方向に引き抜き、Ｙ方向のストリング部材２０ＹをＹ方向に引き抜くことで、３次元細胞構造体３００から完全に異物であるストリング部材２０が除去される。図１０（Ｂ）は、ストリング部材２０を引き抜いたときの３次元細胞構造体３００の模式図である。３次元細胞構造体３００の各側面には、ストリング部材２０を引き抜いた痕跡として微小な貫通孔３０２が形成される。微小な貫通孔３０２は、さらなる培養液中での培養をすることで細胞凝集体の接着、融合により時間経過と共に消滅する。【００３３】
このように本実施例によれば、ストリング部材によりメッシュ状の空間を形成した支持体を用い、メッシュ状の空間に細胞凝集体を分注し、細胞凝集体が分注された支持体を積層し、細胞凝集体が接着、融合された３次元細胞構造体からストリング部材を除去するようにしたので、１つの支持体上にＸ、Ｙ平面の細胞凝集体の形状形成が容易となり、かつ、支持体を積層することでＺ方向の形状形成も容易になる。また、細胞凝集体は、微小な線径のストリング部材２０によって担持されるため、細胞への栄養や酸素の供給が阻害されるのを最小限にすることができる。さらに最終的にストリング部材が３次元細胞構造体から引き抜かれるため、３次元細胞構造体は、異物を含まない、必要とされる純粋な細胞のみから構成することができる。【００３４】
なお、上記実施例では、１つの支持体に細胞凝集体を分注し、次に積層された支持体に細胞凝集体を分注したが、これに限らず、細胞凝集体が分注されていない支持体を複数積層し、その積層された支持体に細胞凝集体を分注するようにしてもよい。図１１（Ａ）に示すように、支持体１をｎ層積層し、次に、図１１（Ｂ）に示すように、支持体１の最上層の上方からディスペンサ２００により細胞凝集体を分注する。好ましくは、このような分注をする場合には、最上層から最下層に向かうに従い支持体のピッチＰｘ、Ｐｙが徐々に小さくなるようにする。最上層の支持体のピッチＰｘ_max、Ｐｙ_max、最下層の支持体のピッチＰｘ_min、Ｐｙ_minであるとき、ディスペンサ２００に充填される細胞凝集体は、Ｐｘ_min、Ｐｙ_min〜Ｐｘ_max、Ｐｙ_maxの範囲で種々のサイズを包含する。これにより、上層の支持体のストリング部材の空間を通過した細胞凝集体は、下層の支持体のストリング部材の空間に保持され得る。【００３５】
次に、本発明の第２の実施例について説明する。第１の実施例では、支持体内の全面にメッシュ状の空間を形成したが、第２の実施例では、製造すべき３次元細胞構造体の形状およびサイズに応じたメッシュ状の空間を支持体に形成し、これを用いて３次元細胞構造体を製造する。【００３６】
図１２は、第２の実施例に係る支持体を簡略に示す図である。本実施例に係る支持体１は、Ｘ方向のストリング部材２０Ｘが幅Ｌｘの範囲に形成され、Ｙ方向のストリング部材２０Ｙが幅Ｌｙの範囲に形成される。その結果、支持体１内には、幅Ｌｘ×Ｌｙ内に複数のメッシュ状の空間が形成される。メッシュ状の空間が形成されていない領域２５は、仮に、ディスペンサ２００から細胞凝集体が分注されたとしても、細胞凝集体を保持するのに十分の大きさではないため、領域２５に分注された細胞凝集体は、ストリング部材やその空間には保持されず、そこから脱落する。結果的に、幅Ｌｘ、Ｌｙのメッシュ状の空間において３次元細胞構造体が保持されることになる。【００３７】
なお、上記例では、矩形状の空間Ｌｘ、Ｌｙを形成したが、これ以外の形状であってもよい。例えば、図１２Ａに示すように、支持体内に複数の矩形状の空間Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４が形成されるようにしてもよい。この場合、空間Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ３に対応する４つの３次元細胞構造体が一度に形成される。【００３８】
第２の実施例においても第１の実施例のときと同様に、要求されるべき３次元細胞構造体の高さに応じて複数の支持体が積層される。図１３は、第２の実施例による支持体が積層され、その上に細胞凝集体が分注される様子を示している。図１３（Ａ）において、支持体１−１、１−２は、上蓋を構成し、支持体１−７、１−８は、下蓋を構成する。支持体１−３〜１−６は、要求される３次元細胞構造体の高さに応じてその数が選択される。支持体１−１、１−７は、Ｘ方向に一定の間隔で複数のストリング部材２０Ｘを含み、支持体１−２、１−８は、Ｙ方向に一定の間隔で複数のストリング部材２０Ｙを含む。支持体１−３は、３次元細胞構造体の形状のＸ方向の境界を規定するためのＸ方向の境界用の一対のストリング部材２２Ｘを含み、支持体１−４は、３次元細胞構造体の形状のＹ方向の境界を規定するためのＹ方向の境界用の一対のストリング部材２２Ｙを含む。好ましくは支持体１−３と支持体１−４とが交互に積層される。次に、図１３（Ｂ）に示すように、上蓋１−１、１０２が外された状態で、ディスペンサ２００から細胞凝集体が積層された支持体に分注される。分注が終了した後、上蓋１−１、１−２が支持体１−３の上に取り付けられる。【００３９】
図１３Ａに、図１３の支持体のストリング部材を抜去する例を示す。同図（Ａ）に示すように、３カ所の切断位置ＣＵＴにおいて積層された支持体を上下方向に切断し、枠体１０Ｂ、１０Ｃを本体から切り離す。そして、同図（Ｂ）に示すように、残された枠体１０Ａ、１０ＤをＸ方向、Ｙ方向に移動させることで、ストリング部材を３次元細胞構造体３００から抜去する。【００４０】
図１４は、第２の実施例に係る支持体を用いて製造された３次元細胞構造体を概略斜視図である。３次元細胞構造体３００は、Ｘ方向のストリング部材２０ＸとＹ方向のストリング部材２０Ｙによって規定された空間Ｌｘ、Ｌｙの大きさに製造される。【００４１】
次に、本発明の第３の実施例について説明する。第３の実施例では、分注される細胞凝集体の形状を規定するガイド部材を支持体上に備える。図１５（Ａ）は、ガイド部材４００の一例であり、ガイド部材４００は、長さＬａ、Ｌｂ、Ｌｃの三角形状を有する。ガイド部材４００の高さＨは、支持体１を積層するときの支持体間のスペーサΔｄとして同時に機能し得る。ガイド部材４００は、図１５（Ｂ）に示すように、支持体１上に位置決めして載置される。位置決め方法は、特に問わないが、例えば、支持体１上には位置合わせ用のマーキングが成され、そのマーキングに合うようにガイド部材４００が載置される。ガイド部材４００は、固定部材または接着部材によりストリング部材２０に軽く接合するようにしてもよいし、あるいはそのまま載置されてもよい。また、ガイド部材４００の表面には、細胞凝集体が剥離し易くなるように非接着剤がコーティングされることが望ましい。【００４２】
図１５（Ｂ）のようにガイド部材４００が取り付けられた状態で、ディスペンサ２００は、ガイド部材４００に包囲された領域内に細胞凝集体を分注する。次に、積層される支持体にも同様にガイド部材４００が載置され、ガイド部材４００内に細胞凝集体が分注される。その結果、図１６に示すように、ガイド部材４００の長さＬａ、Ｌｂ、Ｌｃ、高さＨに対応したサイズの３次元細胞構造体３００が製造される。【００４３】
上記例では、３各形状のガイド部材を例示したが、勿論、これと異なる形状のガイド部材（例えば、円形状、ドーナツ状、矩形状、楕円状）であっても良い。例えば、図１７（Ａ）に示すように、ドーナツ状のガイド部材４１０を用いた場合、図１７（Ｂ）に示すようにドーナツ状の３次元細胞構造体３１０を製造することができる。【００４４】
次に、本発明の第４の実施例について説明する。第１ないし第３の実施例では、ディスペンサを利用して細胞凝集体を支持体上に分注したが、第４の実施例は、容器内に保持された細胞凝集体を支持体で拾い上げることで細胞凝集体を支持体上に保持する。その一例を図１８に示す。同図に示すように、容器４２０内に細胞凝集体１００を含む溶液を溜め、支持体１によって細胞凝集体を救う。これにより、ストリング部材２０のメッシュ空間よりも大きい細胞凝集体がストリング部材上に拾い上げられる。【００４５】
ストリング部材２０のメッシュ空間のサイズが同一である支持体を複数利用して細胞凝集体を拾上げた場合、支持体上に一定サイズ以上の細胞凝集体を分注させたのと同様の効果を得ることができる。他方、ストリング部材のメッシュ空間のサイズが異なる複数種の支持体を利用すれば、容器内の種々のサイズの細胞凝集体を万遍なく拾い上げることができる。【００４６】
次に、本発明の第５の実施例について説明する。第５の実施例は、網型枠方式（メッシュモールド方式）により３次元細胞構造体を製造する。図１９に第５の実施例の方法を示す。図１９（Ａ）に示すようなメッシュ空間を形成することが可能なストリング部材を準備し、次に、図１９（Ｂ）、（Ｃ）に示すような型枠４５０を準備する。型枠４５０の形状は任意であるが、例えば、矩形状の内部空間４５２を有する型枠が形成される。型枠４５０の製造方法は任意であるが、例えば、モールド樹脂成型により型枠４５０を形成することができる。あるいは、レーザー加工、パンチング等の機械加工により型枠４５０を形成することもできる。次に、図１９（Ｄ）に示すように、型枠４５０の内部空間４５２を這うようにストリング部材２０が配置される。次に、図１９（Ｅ）、（Ｆ）に示すように、ディスペンサにより細胞凝集体１００が型枠４５０の内部空間４５２内に充填される。次に、図１９（Ｇ）に示すように、ストリング部材２０による蓋が形成される。これにより、培養液を含む容器内で揺動されたときに細胞凝集体がこぼれ落ちないようにする。次いで、細胞凝集体が接着、融合された後、ストリング部材２０を型枠４５０から持ち上げることで、細胞凝集体１００が型枠４５０から取り出される。その後、細胞凝集体１００の側面および底面からストリング部材２０を剥離することで、図１９（Ｈ）に示すような、型枠４５０のサイズを反映した３次元細胞構造体４６０が製造される。好ましくは、ストリング部材２０を非接着性の材料から構成するか、その表面に非接着性の材料をコーティングすることで、ストリング部材２０の細胞凝集体１００からの離脱が容易になる。【００４７】
次に、本発明の第６の実施例について説明する。第６の実施例は、本実施例の支持体を３次元ディスペンサに適用するものである。図１９Ａに示すように、自動ディスペンサは、ステージ４７０と、ステージ４７０上に設置されたＸ方向、Ｙ方向の基準ガイド４７２、４７４と、ステージ４７０上をＸ方向に摺動可能に取り付けられた一対の駆動橋４８０と、一対の駆動橋４８０の間にＹ方向に設けられた支持部材４８２と、支持部材４８２上をＹ方向およびＺ方向に摺動可能に取り付けられたスライド部材４８４と、スライド部材４８４に取り付けられたディスペンサ４９０と押子４９２とを含んで構成される。【００４８】
ディスペンサ４９０には、細胞凝集体１００が充填され、押子４９２がＺ方向に移動されることで、ディスペンサ４９０の先端部から細胞凝集体１００が吐出される。自動ディスペンサには、支持体１の形状および細胞凝集体の投入位置が初期設定されており、自動ディスペンサは、３次元細胞構造体の３次元データに基づき各部をＸ、Ｙ、Ｚ方向に移動制御する。ステージ４７０の基準ガイド４７２、４７４に従い支持体１が位置決めされると、ディスペンサ４９０がＸ方向およびＹ方向に走査され、その間、押子４９２がＺ方向に駆動され、ディスペンサ４９０の先端から細胞凝集体が支持体１上に分注される。１つの支持体への分注が終了すると、次の支持体が積層され、当該支持体上に３次元データに従い細胞凝集体が分注される。このように自動ディスペンサを使用することで、支持体上に高速に細胞凝集体を分注させることが可能になる。【００４９】
次に、本実施例の支持体の幾つかの製造方法について説明する。支持体１は、例えば、図１に示すように矩形状の枠体１０を含む。枠体１０の形状やサイズは任意であり、枠体１０により囲まれた空間が複数のストリング部材２０によりさらに細かい空間に分割される。ストリング部材２０は、糸状の部材または針状の部材から構成され、ストリング部材２０の端部は、接着剤やその他の方法で枠体１０に固定される。【００５０】
支持体の他の製造方法として、薄板状のプラスチック部材または金属部材を用意し、そこに半導体リソグラフィを利用して複数の空間を形成するようにしてもよい。図２０は、その製造工程を示す概略断面図である。図２０（Ａ）に示すように、紫外線硬化型のような樹脂フィルム５００上に、支持体１を構成する薄板部材５１０を配置し、薄板部材５１０上に、フォトリソ工程によりパターン加工されたマスク５２０が形成される。マスク５２０は、ピッチＰｘ、Ｐｙの開口が２次元マトリクス状に形成されるように加工される。次に、図２０（Ｂ）に示すように、マスク５２０により露出された薄板部材５１０がエッチングにより除去される。好ましくは、ピッチＰｘ、Ｐｙの精度を良くするため選択性のある異方性エッチングが用いられる。エッチングは、ウエットエッチングまたはドライエッチングのいずれでも良い。次に、図２０（Ｃ）に示すようにマスク５２０が除去され、次に、図２０（Ｄ）に示すように、樹脂フィルム５００に紫外線を照射し、樹脂フィルム５００が薄板部材５１０の裏面から剥離される。こうして、枠体１０とその間に残存するストリング部材２０とを一体で有する支持体１を得ることができる。なお、上記事例では、フォトリソ工程によりマスク５２０を形成したが、マスク５２０の形成方法は任意であり、例えば、レーザー加工であってもよい。【００５１】
さらに他の製造方法として、支持体を構成する薄板部材にレーザー光を照射し、ピッチＰｘ、Ｐｙの穴を形成するようにしてもよい。さらに他の製造方法として、支持体を構成する薄板部材に、ピッチＰｘ、Ｐｙの突起を有する型押し部材をパンチングすることで、薄板部材にピッチＰｘ、Ｐｙの開口を形成するようにしてもよい。さたに他の製造方法として、支持体およびストリング部材を樹脂等により一体成型する場合には、３次元プリンタにより形成してもよい。【００５２】
さらに他の製造方法として、支持体のストリング部材２０をボンディングワイヤにより形成するようにしてもよい。図２０Ａは、ボンディングワイヤによりストリング部材を形成したときの概略断面図である。好ましい例では、先ず、最下層５５０が用意される。最下層５５０は、例えば、ステンレスあるいはその他の金属から構成される。最下層５５０は、周縁部５５２と、周縁部５５２によって囲まれたマトリクス状の複数の開口５５２が形成された中央網部とを有する。中央網部の開口５５２は、例えば、最下層５５０をエッチングすることにより形成されている。最下層５５０の周縁部５５２上に、内周に段差が形成された矩形状の枠体５６０Ａ、５６０Ｃが形成される。枠体５６０Ａ、５６０Ｃは、それぞれ図１の枠体１０Ａ、１０Ｃに対応する。図の例では、枠体５６０Ａ、５６０Ｃは、４層の支持体に相当する段差を備えている。層１−１のレベルでボンディングワイヤＢ−１がＸ、Ｙ方向に形成され、層１−２のレベルでボンディングワイヤＢ−２がＸ方向、Ｙ方向に形成され、層１−３のレベルでボンディングワイヤＢ−３がＸ方向、Ｙ方向に形成され、層１−４のレベルでボンディングワイヤＢ−４がＸ方向、Ｙ方向に形成される。このような構成により、実質的に支持体を５層積層したのと同様の構成となり得る。【００５３】
なお、ボンディングワイヤＢ−１〜Ｂ−４のＸ方向およびＹ方向のピッチ、最下層５５０の開口５５２のＸ方向およびＹ方向のピッチは、必ずしも同一である必要はなく、図１１で説明したように、それぞれ異なるようにしてもよい。さらに、必要があれば、最上層５７０の蓋を取り付けるようにしてもよい。この場合、最上層５７０は、最下層５５０と同一構成のものを使用することができる。【００５４】
図２１は、本実施例の３次元細胞構造体を製造する製造装置の電気的な構成を示すブロック図である。製造装置６００は、ユーザーからの入力または外部装置との接続を可能にするインターフェース６１０、データやプログラム等を格納する記憶部６２０、制御部６３０、およびディスペンサ２００を駆動するアクチュエータ部６４０を含む。記憶部６２０は、３次元細胞構造体を製造するための製造シーケンスを実行するためのプログラムを搭載し、制御部６３０は、当該プログラムを実行することで３次元細胞構造体の製造を制御する。１つの好ましい例では、記憶部６２０には、製造されるべき３次元細胞構造体の３次元形状データが格納され、制御部６３０は、前記プログラムを実行するとき、３次元形状データに基づきディスペンサ２００の移動軌跡を制御する。すなわち、ディスペンサ２００は、３次元形状データに基づき、支持体上に分注する細胞凝集体の形状を決定する。この場合、積層される支持体の各段の細胞凝集体の形状は、３次元形状データに基づき決定される。例えば、３次元形状データが円錐形であれば、当該円錐形に応じて、ディスペンサ２００は、支持体の各段の細胞凝集体の分注するエリアを異ならせる。なお、ステージをＸ、Ｙ方向に移動させる場合には、アクチュエータ部６４０は、３次元形状データに基づきステージをＸ、Ｙ方向に移動させて細胞凝集体を支持体上に分注させるようにしてもよい。【００５５】
次に、本発明の第６の実施例について説明する。図２２は、３次元プリンタにより本実施例の３次元支持体を製造する例について説明する。本実施例の３次元支持体を、ここでは型枠７００と称する。型枠７００は、人体に無害な材料から構成される。好ましくは、型枠７００は、熱殺菌するために融点が一定以上の材料、例えば、ポリカーボネートが用いられる。好ましくは、型枠７００の表面には、細胞の融着等を防止するため非接触性の材料がコーティングされる。【００５６】
型枠７００は、図２２（Ａ）に示すように、上枠部分７１０と、下枠部分７２０とを含んで構成される。上枠部分７１０と下枠部分７２０とは、３次元プリンタにより一体に形成され、その内部空間内に細胞凝集体を保持する網目状部分が形成される。型枠７００は、細胞凝集体を内部に投入後に３次元構造細胞体を取り出すとき、切断位置Ｄｖで上枠部分７１０と下枠部分７２０に分割される。【００５７】
上枠部分７１０は、上部とその周囲に側部とを含み、上部には、内部空間に繋がる複数の投入孔７０２が形成される。また、上枠部分７１０の側部には、複数の培地循環穴７０４が形成される。さらに上枠部分７１０には、上部から延在する複数の保持柱７０６が形成され、複数の保持柱７０６には、２次元的な網目状空間を形成する上側網目状部分７０８が形成される。下枠部分７２０の側部には培地循環穴７１２が形成され、また下枠部分７２０の底面には複数の保持柱７１４が形成され、保持柱７１４には２次元的な網目状空間を形成する下側網目状部分７１６が形成される。【００５８】
型枠７００の投入孔７０２から細胞凝集体１００が内部に投入される。１つの好ましい例では、上側網目状部分７０８の間隔が細胞の外径よりも大きく、下側網目状部分７１６の間隔が細胞の外径よりも小さく、その結果、投入孔７０２から投入された細胞が上側網目状部分７０８を通過し、下側網目状部分７１６によって保持される。但し、これは一例であり、例えば、細胞凝集体が複数のサイズの細胞を包含するような場合には、上側網目状部分７０８と下側網目状部分７１６の間隔は同じであってもよい。【００５９】
次に、図２２（Ｂ）に示すように、細胞凝集体が投入された型枠７００が、培地７３０を含むよう容器７２０内に浸漬される。シェーカーにより容器７００に揺動または振動を与えることで、培地７３０が、投入孔７０２、および培地循環穴７０４、７１２を介して型枠７００の内部を循環し、これにより細胞が効果的に培養される。培養が終了し構造体が完成すると、図２２（Ｃ）に示すように、型枠７００が切断位置Ｄｖで上枠７１０と下枠７２０とに分割され、３次元細胞構造体３００を得ることができる。【００６０】
第１ないし第６の実施例で使用されるストリング部材２０は、細胞凝集体に対して接着性または非接着性のある材質により形成される。好ましくは、ストリング部材２０は、細胞凝集体からの離脱が容易となるように非接着性の材料から構成されるか、非接着性の機能を有する材料がコーティングされる。【００６１】
第１ないし第３の実施例で使用される細胞凝集体は、すべて同じ種類の細胞であってもよいし、種類が異なる細胞であってもよい。種類が異な細胞を使用する場合には、完成する３次元細胞構築物は、複数種類の細胞を含んだ構造体となる。【００６２】
第１ないし第５の実施例で製造される３次元細胞構造体は、医療目的または実験目的で使用されるほか、関節の再生、毒性検査、がんに関する研究、神経の再生、血管の再生など、様々な分野への応用が期待される。【００６３】
以上、本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明は、特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
【符号の説明】
【００６４】
１：支持体                              １０：枠体
２０：ストリング部材                      ３０、４０：位置決め手段
５２Ｂ、５２Ｄ：凸部                      ５４Ａ、５４Ｃ：凹部
１００：細胞凝集体溶液                      ２００：ディスペンサ
【図１】
2018051415.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２Ａ】
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【図１３】
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【図１３Ａ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2018051415.tif 000023
【図１９Ａ】
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【図２０】
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【図２０Ａ】
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【図２１】
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【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年7月11日(2017.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞構造体の製造方法であって、
複数の糸もしくは針状部材により網目状の空間を形成した支持体であって前記複数の糸もしくは針状部材上に細胞凝集体を供給するステップと、
前記細胞凝集体が供給された支持体を積層するステップと、
融合された細胞凝集体から前記複数の糸もしくは針状部材を除去するステップとを含む、
細胞構造体の製造方法。
【請求項２】
細胞構造体の製造方法であって、
複数の糸もしくは針状部材により網目状の空間を形成した支持体を積層するステップと、
積層された支持体上に細胞凝集体を供給するステップと、
融合された細胞凝集体から前記複数の糸もしくは針状部材を除去するステップとを含む、
細胞構造体の製造方法。
【請求項３】
細胞構造体の製造方法であって、
要求される細胞構造体の形状の境界を規定する複数の糸もしくは針状部材を含む支持体を積層するステップと、
積層された支持体上に細胞凝集体を供給するステップと、
融合された細胞凝集体から前記複数の糸もしくは針状部材を除去するステップとを含む、
細胞構造体の製造方法。
【請求項４】
前記供給するステップは、細胞凝集体をディスペンサに充填するステップと、前記ディスペンサを走査することにより前記支持体の糸もしくは針状部材上に前記細胞凝集体を分注するステップとを含む、請求項１ないし３いずれか１つに記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項５】
前記供給するステップは、細胞凝集体の形状を規定するためのガイド部材を支持体上に配置するステップを含み、前記ガイド部材内に細胞凝集体が供給される、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項６】
前記供給するステップは、細胞凝集体を含む溶液が保持された容器内において、前記支持体により細胞凝集体をすくい上げるステップを含む、請求項１ないし３いずれか１つに記載の製造方法。
【請求項７】
製造方法はさらに、細胞凝集体が供給された支持体を培養液を含む容器内に浸漬し、支持体または容器に振動または揺動を与えるステップを含む、請求項１ないし６いずれか１つに記載の製造方法。
【請求項８】
前記除去するステップは、複数の糸もしくは針状部材を前記細胞凝集体からＸ方向またはＹ方向に引き抜くことを含む、請求項１ないし７いずれか１つに記載の製造方法。
【請求項９】
１つの支持体には、細胞凝集体の大きさよりも小さい網目状の空間と、細胞凝集体の大きさよりも大きい網目状の空間とが形成され、前記小さい網目状の空間と前記大きい網目状の空間との境界が融合される細胞凝集体の形状を規定する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１０】
下層に位置する支持体の網目状の空間が上層に位置する支持体の網目状の空間よりも小さく、上層の支持体上に供給された細胞凝集体が当該上層の支持体を通り抜けて下層の支持体上に保持される、請求項２に記載の製造方法。
【請求項１１】
細胞構造体の製造に使用される支持体であって、
複数の枠体と、
複数の枠体によって囲まれた空間内に網目状の空間を形成する複数の糸もしくは針状部材とを有し、
前記網目状の空間は、細胞凝集体を保持することが可能である、支持体。
【請求項１２】
細胞構造体の製造に使用される支持体であって、
複数の枠体と、
複数の枠体によって囲まれた空間内に、要求される細胞構造体の形状の境界を規定する複数の糸もしくは針状部材とを有し、
前記複数の糸もしくは針状部材により規定される空間内に細胞凝集体を保持することが可能である、支持体。
【請求項１３】
支持体はさらに、細胞凝集体の形状を規定するためのガイド部材を前記網目状の空間上に含む、請求項１１に記載の支持体。
【請求項１４】
前記網目状の空間は、細胞凝集体の大きさよりも小さい網目状の空間と、細胞凝集体の大きさよりも大きい網目状の空間とを含み、前記小さい網目状の空間と前記大きい網目状の空間との境界が融合される細胞凝集体の形状を規定する、請求項１１に記載の支持体。
【請求項１５】
前記糸もしくは針状部材は、前記細胞凝集体に対して非接着性のある材質から構成される、請求項１１ないし１４いずれか１つに記載の支持体。
【請求項１６】
前記糸もしくは針状部材は、前記細胞凝集体に対して非接着性のコーティングをされている、請求項１１ないし１４いずれか１つに記載の支持体。
【請求項１７】
複数の枠体の少なくとも一部が残りの枠体から分離可能である、請求項１１ないし１６いずれか１つに記載の支持体。
【請求項１８】
支持体は、複数の支持体が積層されるときに各支持体を位置決めするための位置決め手段を含む、請求項１１ないし１７いずれか１つに記載の支持体。
【請求項１９】
自動ディスペンサにより細胞構造体を製造する方法であって、
複数の糸もしくは針状部材により網目状の空間が形成された支持体を用意するステップと、
自動ディスペンサのノズルから吐出された細胞凝集体を前記支持体の網目状空間で保持するステップと、
融合された細胞凝集体から複数の糸もしくは針状部材を除去するステップと、
を含む製造方法。
【請求項２０】
請求項１１ないし１８いずれか１つに記載の支持体の製造方法であって、
薄板部材上にマスク層を形成し、
前記マスク層により露出された前記薄板部材をエッチングすることにより複数の糸もしくは針状部材を形成する、支持体の製造方法。
【請求項２１】
請求項１１ないし１８いずれか１つに記載の支持体の製造方法であって、
複数の糸もしくは針状部材をボンディングワイヤにより形成する、支持体の製造方法。
【請求項２２】
請求項１１ないし１８いずれか１つに記載の支持体の製造方法であって、
複数の糸もしくは針状部材を含む支持体は３次元プリンタにより製造される、支持体の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月2日(2017.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞構造体の製造方法であって、
複数の糸もしくは針状部材により網目状の空間を形成した支持体において前記複数の糸もしくは針状部材上に細胞凝集体を供給するステップと、
前記細胞凝集体が供給された支持体を積層するステップと、
前記細胞凝集体を培養し、前記細胞凝集体を融合するステップと、
融合された細胞凝集体から前記複数の糸もしくは針状部材を除去するステップとを含む、
細胞構造体の製造方法。
【請求項２】
細胞構造体の製造方法であって、
複数の糸もしくは針状部材により網目状の空間を形成した支持体を積層するステップと、
積層された支持体上に細胞凝集体を供給するステップと、
前記細胞凝集体を培養し、前記細胞凝集体を融合するステップと、
融合された細胞凝集体から前記複数の糸もしくは針状部材を除去するステップとを含む、
細胞構造体の製造方法。
【請求項３】
細胞構造体の製造方法であって、
要求される細胞構造体の形状の境界を規定する複数の糸もしくは針状部材を含む支持体を積層するステップと、
積層された支持体上に細胞凝集体を供給するステップと、
前記細胞凝集体を培養し、前記細胞凝集体を融合するステップと、
融合された細胞凝集体から前記複数の糸もしくは針状部材を除去するステップとを含む、
細胞構造体の製造方法。
【請求項４】
前記供給するステップは、細胞凝集体をディスペンサに充填するステップと、前記ディスペンサを走査することにより前記支持体の糸もしくは針状部材上に前記細胞凝集体を分注するステップとを含む、請求項１ないし３いずれか１つに記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項５】
前記供給するステップは、細胞凝集体の形状を規定するためのガイド部材を支持体上に配置するステップを含み、前記ガイド部材内に細胞凝集体が供給される、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項６】
前記供給するステップは、細胞凝集体を含む溶液が保持された容器内において、前記支持体により細胞凝集体をすくい上げるステップを含む、請求項１ないし３いずれか１つに記載の製造方法。
【請求項７】
製造方法はさらに、細胞凝集体が供給された支持体を培養液を含む容器内に浸漬し、支持体または容器に振動または揺動を与えるステップを含む、請求項１ないし６いずれか１つに記載の製造方法。
【請求項８】
前記除去するステップは、複数の糸もしくは針状部材を前記細胞凝集体からＸ方向またはＹ方向に引き抜くことを含む、請求項１ないし７いずれか１つに記載の製造方法。
【請求項９】
１つの支持体には、細胞凝集体の大きさよりも小さい網目状の空間と、細胞凝集体の大きさよりも大きい網目状の空間とが形成され、前記小さい網目状の空間と前記大きい網目状の空間との境界が融合される細胞凝集体の形状を規定する、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１０】
下層に位置する支持体の網目状の空間が上層に位置する支持体の網目状の空間よりも小さく、上層の支持体上に供給された細胞凝集体が当該上層の支持体を通り抜けて下層の支持体上に保持される、請求項２に記載の製造方法。
【請求項１１】
細胞構造体の製造に使用される支持体であって、
複数の枠体と、
複数の枠体によって囲まれた空間内に網目状の空間を形成する複数の糸もしくは針状部材とを有し、
前記網目状の空間は、細胞凝集体を保持することが可能であり、複数の枠体の少なくとも一部が残りの枠体から分離可能である、支持体。
【請求項１２】
細胞構造体の製造に使用される支持体であって、
複数の枠体と、
複数の枠体によって囲まれた空間内に、要求される細胞構造体の形状の境界を規定する複数の糸もしくは針状部材とを有し、
前記複数の糸もしくは針状部材により規定される空間内に細胞凝集体を保持することが可能であり、複数の枠体の少なくとも一部が残りの枠体から分離可能である、支持体。
【請求項１３】
支持体はさらに、細胞凝集体の形状を規定するためのガイド部材を前記網目状の空間上に含む、請求項１１に記載の支持体。
【請求項１４】
前記網目状の空間は、細胞凝集体の大きさよりも小さい網目状の空間と、細胞凝集体の大きさよりも大きい網目状の空間とを含み、前記小さい網目状の空間と前記大きい網目状の空間との境界が融合される細胞凝集体の形状を規定する、請求項１１に記載の支持体。
【請求項１５】
前記糸もしくは針状部材は、前記細胞凝集体に対して非接着性のある材質から構成される、請求項１１ないし１４いずれか１つに記載の支持体。
【請求項１６】
前記糸もしくは針状部材は、前記細胞凝集体に対して非接着性のコーティングをされている、請求項１１ないし１４いずれか１つに記載の支持体。
【請求項１７】
複数の枠体の少なくとも一部が切断により残りの枠体から分離可能である、請求項１１ないし１６いずれか１つに記載の支持体。
【請求項１８】
支持体は、複数の支持体が積層されるときに各支持体を位置決めするための位置決め手段を含む、請求項１１ないし１７いずれか１つに記載の支持体。
【請求項１９】
自動ディスペンサにより細胞構造体を製造する方法であって、
複数の糸もしくは針状部材により網目状の空間が形成された支持体を用意するステップと、
自動ディスペンサのノズルから吐出された細胞凝集体を前記支持体が積層された網目状空間で保持するステップと、
前記細胞凝集体を培養し、前記細胞凝集体を融合するステップと、
融合された細胞凝集体から複数の糸もしくは針状部材を除去するステップと、
を含む製造方法。
【請求項２０】
請求項１１ないし１８いずれか１つに記載の支持体の製造方法であって、
薄板部材上にマスク層を形成し、
前記マスク層により露出された前記薄板部材をエッチングすることにより複数の糸もしくは針状部材を形成する、支持体の製造方法。
【請求項２１】
請求項１１ないし１８いずれか１つに記載の支持体の製造方法であって、
複数の糸もしくは針状部材をボンディングワイヤにより形成する、支持体の製造方法。
【請求項２２】
請求項１１ないし１８いずれか１つに記載の支持体の製造方法であって、
複数の糸もしくは針状部材を含む支持体は３次元プリンタにより製造される、支持体の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
細胞には、浮遊系細胞と足場依存の接着性細胞の２種類がある。前者には、血液系や免疫系の細胞が属し、後者には臓器や皮膚、や骨などの細胞が属する。接着性細胞は、在溶液中で浮いている状態では長期間の生存はできず、ガラスシャーレやハイドロゲルなどの足場に付着することで生存及び増殖させる必要がある。接着性の細胞を非接着の環境下に置くと、細胞は足場を求めて相互に接着し、細胞凝集体が形成され、さらに細胞凝集体同士を何らかの手法で相互に接触した環境下に置くと、それらが接着、融合しさらに大きな三次元細胞構造体を構成する。この現象は広く知られており、非特許文献１〜６はこれらの具体的実施例を示すものである。非特許文献１にあるように細胞凝集体（本文献内ではClusterとも表記される）が融合する現象は古く１９６０年代から知られている。特に非特許文献６にて示されるのは、３次元細胞構造体を「積木ブロック（Building Block）」として扱うアイデアを示しており、多様な細胞が利用可能であることを示唆している。細胞塊（Spheroid）は、細胞のみで構成されたおおむね円形の凝集体、細胞凝集体（Cell Aggregate）は、細胞塊及び細胞とそれ以外の物質で構成された凝集体を示すものとする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
ストリング部材２０は、枠体１０内にＸ方向およびＹ方向に延在する。ストリング部材２０は、例えば、ステンレス、ナイロン、ポリエステルなどの材料から構成され、例えば、直径が約１０μｍである。好ましくは、ストリング部材２０は、Ｐ−ＨＥＭＡ等の非接着剤がコーティングされ、かつエタノール等によって消毒される。Ｘ方向に延在するストリング部材２０Ｘの一方の端部が枠体１０Ａに固定され（例えば、接着剤等により固定）、他方の端部が枠体１０Ａと対向する枠体１０Ｃに固定される。Ｙ方向に延在するストリング部材２０Ｙの一方の端部が枠体１０Ｂに固定され、他方の端部が枠体１０Ｂと対向する枠体１０Ｄに固定される。Ｘ方向のストリング部材２０Ｘは、一定のピッチＰｘで配列され、Ｙ方向のストリング部材２０Ｙは、一定のピッチＰｙで配列され、その結果、枠体１０の内側には、幅Ｐｘ、Ｐｘで規定される複数の矩形状の空間が形成される。ピッチＰｘ、Ｐｙは、例えば、約０．１ｍｍである。また、支持体１のアスペクト比（縦横比）に応じてピッチＰｘとＰｙの比を決定することができるが（例えば、アスペクト比が４：３であるとき、Ｐｘ：Ｐｙが４：３）、必ずしもこれに限定されるものではない。
【国際調査報告】
2018051415.tif 000029
2018051415.tif 000030