(57)【要約】本発明は、弱酸性条件での溶出工程を含む、抗体様タンパク質の精製方法を提供する。本発明は、下記（ａ）〜（ｂ）の工程；（ａ）抗体様タンパク質を、担体に固定化されたリガンドを含むアフィニティー分離マトリックスと接触させ、アフィニティー分離マトリックスに吸着させる工程、および（ｂ）ｐＨ３．５以上の溶出液をアフィニティー分離マトリックスと接触させ、抗体様タンパク質を溶出させる工程、を含み、前記リガンドが、配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｆｃ結合部位のＧｌｎおよび／またはＬｙｓをＡｌａ、Ｓｅｒ、および／またはＴｈｒに置換して得られるアミノ酸配列を含み、前記置換前のリガンドと比較して、酸性ｐＨ領域での抗体結合能が低下しているリガンドである、抗体様タンパク質の精製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｂ）の工程；
（ａ）抗体様タンパク質を、担体に固定化されたリガンドを含むアフィニティー分離マトリックスと接触させ、アフィニティー分離マトリックスに吸着させる工程、および
（ｂ）ｐＨ３．５以上の溶出液をアフィニティー分離マトリックスと接触させ、抗体様タンパク質を溶出させる工程
を含み、前記リガンドが、
配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｆｃ結合部位のＧｌｎおよび／またはＬｙｓをＡｌａ、Ｓｅｒ、および／またはＴｈｒに置換して得られるアミノ酸配列を含み、
前記置換前のリガンドと比較して、酸性ｐＨ領域での抗体結合能が低下しているリガンドである、
抗体様タンパク質の精製方法。
【請求項２】
前記アフィニティー分離マトリックスが水不溶性基材にリガンドを固定化した担体である、請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
水不溶性基材が合成高分子又は多糖類からなる、請求項１または２に記載の精製方法。
【請求項４】
多糖類がセルロースまたはアガロースである、請求項３に記載の精製方法。
【請求項５】
溶出液が酢酸イオン、クエン酸イオン、グリシン、コハク酸イオン、リン酸イオンおよびギ酸イオンからなる群から選択される少なくとも１種類のアニオン種を含む酸性緩衝液である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項６】
溶出液中の宿主由来タンパク質および／または免疫グロブリンの抗体様タンパク質の凝集体の含量が低減される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項７】
抗体様タンパク質の溶出がｐＨグラジエント溶出により行われる、請求項６に記載の精製方法。
【請求項８】
ｐＨグラジエント溶出がｐＨ４〜６の溶出液により行われる、請求項７に記載の精製方法。
【請求項９】
精製前の抗体様タンパク質が宿主細胞由来タンパク質との混合物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１０】
精製前の抗体様タンパク質が抗体様タンパク質の凝集体との混合物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱酸性条件での溶出工程を含む抗体様タンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬として開発されているのは、モノクローナル抗体が中心であり、これらのモノクローナル抗体は組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。培養細胞によって生産されたモノクローナル抗体は各種クロマトグラフィーによって精製されて、医薬品となる。クロマトグラフィーの中でも特にプロテインＡを固定化したアフィニティー分離クロマトグラフィーによる精製は、抗体を、動物細胞培養物から一段階で高純度に精製できるため、抗体医薬品の製造に必要不可欠な工程である。【０００３】
プロテインＡは、グラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、シグナル配列Ｓ、５つの免疫グロブリン結合性ドメイン（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）、および、細胞壁結合ドメインであるＸＭ領域から構成されている（非特許文献１）。【０００４】
プロテインＡに、タンパク質工学的に改変を加えて高機能化する技術が多数開発されている。例えば、プロテインＡのアルカリ耐性向上、抗体酸解離特性の向上、固定化点への変異導入による抗体結合容量の向上などの例が知られている（特許文献１〜４）。【０００５】
近年、細胞培養における抗体の生産力価が向上しており、下流の精製プロセスへの負荷が増している。プロテインＡを固定化したアフィニティー分離クロマトグラフィーを使用する工程では、一般的に中性のｐＨで抗体を担体に結合させた後、酸性のｐＨで抗体溶出させることにより、抗体を精製できる。しかし、一部の抗体は低ｐＨにおいて凝集したり、抗体活性が低下したりすることが知られている。これらの現象は、抗体の製造において精製工程の負荷（工数の増加や収率の低減）になるだけでなく、医薬品として重大な副作用をもたらす場合もある。そのため、より高いｐＨで溶出可能な、アフィニティー分離クロマトグラフィー担体が必要とされている。抗体酸解離特性を向上させるために、３３位のＳｅｒの置換、１８位のＨｉｓの置換や、各種アミノ酸残基のＨｉｓへの置換などが知られている（特許文献３、５、６）。【０００６】
プロテインＡのＦｃ結合部位のうち、Ｃドメインの９位に対応するＧｌｎの、ＡｌａやＴｈｒへの置換変異が知られているが、それらの変異体の抗体酸解離特性は開示されていない（特許文献７、非特許文献２）。また、プロテインＡのＦｃ結合部位のうちＣドメインの３５位に対応するＬｙｓの置換変異体も各種知られているが、それらの変異体の抗体酸解離特性は開示されていない（特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０３／０８０６５５号
【特許文献２】欧州特許第１１２３３８９号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１１／１１８６９９号
【特許文献４】国際公開第２０１２／１３３３４９号
【特許文献５】国際公開第２０１２／０８７２３１号
【特許文献６】国際公開第２０１２／１６５５４４号
【特許文献７】国際公開第２０１５／００５８５９号
【特許文献８】特開２００７−２５２３６８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｏｂｅｒ  Ｓ．他著、「Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ」２００７年、８４８巻、４０−４７頁
【非特許文献２】Ｏ’Ｓｅａｇｈｄｈａ Ｍ．他著、「ＦＥＢＳ Ｊ」、２００６年、２７３巻、４８３１−４８４１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
弱酸性条件での溶出工程を含む、抗体様タンパク質の精製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、アミノ酸置換変異を有する数多くの組み換えプロテインＡ変異体の活性を比較検討した結果、配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｆｃ結合部位のＧｌｎおよび／またはＬｙｓをＡｌａ、Ｓｅｒ、および／またはＴｈｒに置換して得られるアミノ酸配列を含むリガンドの酸性ｐＨ領域での抗体結合能が、前記置換前のリガンドと比較して低下していることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
すなわち、本発明は、下記（ａ）〜（ｂ）の工程；（ａ）抗体様タンパク質を、担体に固定化されたリガンドを含むアフィニティー分離マトリックスと接触させ、アフィニティー分離マトリックスに吸着させる工程、および（ｂ）ｐＨ３．５以上の溶出液をアフィニティー分離マトリックスと接触させ、抗体様タンパク質を溶出させる工程を含み、前記リガンドが、配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｆｃ結合部位のＧｌｎおよび／またはＬｙｓをＡｌａ、Ｓｅｒ、および／またはＴｈｒに置換して得られるアミノ酸配列を含み、前記置換前のリガンドと比較して酸性ｐＨ領域での抗体結合能が低下しているリガンドである、抗体様タンパク質の精製方法に関する。【００１２】
前記アフィニティー分離マトリックスが水不溶性基材にリガンドを固定化した担体であることが好ましい。【００１３】
水不溶性基材が合成高分子又は多糖類からなることが好ましい。【００１４】
多糖類がセルロースまたはアガロースであることが好ましい。【００１５】
溶出液が酢酸イオン、クエン酸イオン、グリシン、コハク酸イオン、リン酸イオンおよびギ酸イオンからなる群から選択される少なくとも１種類のアニオン種を含む酸性緩衝液であることが好ましい。【００１６】
溶出液中の宿主由来タンパク質および／または免疫グロブリンの抗体様タンパク質の凝集体の含量が低減されることが好ましい。【００１７】
抗体様タンパク質の溶出がｐＨグラジエント溶出により行われることが好ましい。【００１８】
ｐＨグラジエント溶出がｐＨ４〜６の溶出液により行われることが好ましい。【００１９】
精製前の抗体様タンパク質が宿主細胞由来タンパク質との混合物であってもよい。【００２０】
精製前の抗体様タンパク質が抗体様タンパク質の凝集体との混合物であってもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の抗体様タンパク質の精製方法では、従来より高いｐＨで抗体様タンパク質を溶出できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインの配列比較表である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、下記（ａ）〜（ｂ）の工程；（ａ）抗体様タンパク質を、担体に固定化されたリガンドを含むアフィニティー分離マトリックスと接触させ、アフィニティー分離マトリックスに吸着させる工程、および（ｂ）ｐＨ３．５以上の溶出液をアフィニティー分離マトリックスと接触させ、抗体様タンパク質を溶出させる工程を含み、前記リガンドが、配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｆｃ結合部位のＧｌｎおよび／またはＬｙｓをＡｌａ、Ｓｅｒ、および／またはＴｈｒに置換して得られるアミノ酸配列を含み、前記置換前のリガンドと比較して、酸性ｐＨ領域での抗体結合能が低下しているリガンドである、抗体様タンパク質の精製方法である。
【００２４】
プロテインＡは、免疫グロブリン結合性ドメインであるＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインからなるタンパク質である。Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、およびＣドメインは、免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができる免疫グロブリン結合性ドメインであり、いずれのドメインも、免疫グロブリンのＦｃ領域、Ｆａｂ領域、および、Ｆａｂ領域中の特にＦｖ領域に結合する活性を有する。なお、本発明においてプロテインＡの由来は特に限定されないが、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するプロテインＡであることが好ましい。
【００２５】
「タンパク質」という用語は、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、断片化された、または、ペプチド結合によって連結されたポリペプチド鎖も、「タンパク質」という用語に包含される。また、「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。
【００２６】
ドメインに由来するアミノ酸配列は、アミノ酸を置換する前のアミノ酸配列を指す。ドメインに由来するアミノ酸配列は、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインの野生型アミノ酸配列のみに限定されず、アミノ酸の置換、挿入、欠失、および、化学修飾により部分的に改変されたアミノ酸配列であっても、Ｆｃ領域への結合能を有しているタンパク質である限りこれに含まれる。ドメインに由来するアミノ酸配列として、例えば、配列番号１〜５に記載のスタフィロコッカスのプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインを構成するアミノ酸配列が挙げられ、また、プロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、および、Ｃドメインに対して、Ｃドメインの２９位に対応するＧｌｙをＡｌａに置換する変異を導入したアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、ＢドメインにＡ１ＶとＧ２９Ａという変異を導入したＺドメインもＦｃ領域への結合能を有しているので、ドメインに由来するアミノ酸配列に該当する。ドメインに由来するアミノ酸配列は、化学安定性が高いドメイン、または、その変異体であることが好ましい。
【００２７】
ドメインに由来するアミノ酸配列は、Ｆｃ領域への結合能を有する。ドメインに由来するアミノ酸配列と、配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインとの配列同一性は８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
【００２８】
本発明で用いるリガンドは、配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｆｃ結合部位のＧｌｎおよび／またはＬｙｓをＡｌａ、Ｓｅｒ、および／またはＴｈｒに置換して得られるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｆｃ結合部位はプロテインＡのＣドメインの５位、９位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、２８位、３１位、３２位、３５位に対応するアミノ酸残基を意味する（Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. Ｕｓａ、２０００年、９７巻、５３９９−５４０４頁）。
【００３０】
Ｆｃ結合部位のＧｌｎとしてはＣドメインの９位、１０位、３２位に対応するアミノ酸残基が挙げられる。この中でもＣドメインの９位、３２位に対応するアミノ酸残基が好ましい。
【００３１】
Ｆｃ結合部位のＬｙｓとしてはＣドメインの３５位に対応するアミノ酸残基が挙げられる。
【００３２】
アミノ酸の置換は、元のアミノ酸を削除し、その位置に、種類の異なる別のアミノ酸を追加する変異のことを意味する。なお、アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型、または、非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。
【００３３】
Ｆｃ結合部位のＧｌｎおよび／またはＬｙｓにおいて置換するアミノ酸としては、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒが挙げられる。
【００３４】
より具体的な置換態様としては、Ｃドメインの９位に対応するＧｌｎのＡｌａへの置換、９位に対応するＧｌｎのＳｅｒへの置換、９位に対応するＧｌｎのＴｈｒへの置換、３２位に対応するＧｌｎのＡｌａまたはＴｈｒへの置換、３５位に対応するＬｙｓのＳｅｒへの置換が挙げられる。この中でも、ＣドメインにおけるＱ９Ａ、Ｑ９Ｓ、Ｑ９Ｔ、Ｑ３２Ａ、Ｑ３２Ｔ、Ｋ３５Ｓが好ましい。
【００３５】
アミノ酸置換の数は、置換前と比較して酸性ｐＨ領域での抗体結合能が低下していれば特に限定されないが、変異導入前のタンパク質の立体構造の維持という観点からは、４個以下であることが好ましく、２個以下であることがより好ましい。
【００３６】
置換前と比較して酸性ｐＨ領域での抗体結合能が低下している限り、Ｆｃ結合部位のＧｌｎおよび／またはＬｙｓの、Ａｌａ、Ｓｅｒ、および／またはＴｈｒへの置換以外に、任意のアミノ酸置換を含んでいてもよい。このようなアミノ酸置換としては、ＣドメインにおけるＧ２９Ａ、Ｆ５Ａ、Ｆ５Ｙ、Ａ１２Ｒ、Ｆ１３Ｙ、Ｌ１７Ｉ、Ｌ１７Ｔ、Ｌ１７Ｖ、Ｌ１９Ｒ、Ｌ２２Ｒ、Ｑ２６Ｒ、Ｉ３１Ｌ、Ｉ３１Ｓ、Ｉ３１Ｔ、Ｉ３１Ｖ、Ｑ３２Ｒ、Ｓ３３Ｈ、Ｖ４０Ｑ、Ｖ４０Ｔ、Ｖ４０Ｈの置換が挙げられる。また、Ｅ、Ｄ、Ａ、またはＢドメインにおいて、Ｃドメインの前述の位置に対応するアミノ酸の、同様の置換が挙げられる。また、Ａｓｎを他のアミノ酸に置換するアミノ酸置換は、アルカリ耐性向上が期待できるため好ましい。
【００３７】
配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインに由来するアミノ酸配列において、Ｆｃ結合部位のＧｌｎおよび／またはＬｙｓを、Ａｌａ、Ｓｅｒ、および／またはＴｈｒに置換して得られるアミノ酸配列と、配列番号１〜５に記載のプロテインＡのＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、またはＣドメインとの配列同一性が８５％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましい。
【００３８】
本発明で用いるリガンドにおいて、次に示すアミノ酸残基が、９０％以上保持されていることが好ましく、９５％以上保持されていることがより好ましい；Ｇｌｎ−９、Ｇｌｎ−１０、Ｐｈｅ−１３、Ｔｙｒ−１４、Ｌｅｕ−１７、Ｐｒｏ−２０、Ａｓｎ−２１、Ｌｅｕ−２２、Ｇｌｎ−２６、Ａｒｇ−２７、Ｐｈｅ−３０、Ｉｌｅ−３１、Ｌｅｕ−３４、Ｐｒｏ−３８、Ｓｅｒ−３９、Ｌｅｕ−４５、Ｌｅｕ−５１、Ａｓｎ−５２、Ｇｌｎ−５５、およびＰｒｏ−５７（残基番号はＣドメインに対応する）。
【００３９】
本発明で用いるリガンドは、置換前と比較して酸性ｐＨ領域での抗体結合能が低下していることを特徴とする。酸性ｐＨ領域としては、弱酸性領域、具体的にはｐＨ３〜６の範囲が挙げられる。
【００４０】
酸性領域での抗体結合能はＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたｐＨグラジエント溶出試験（実施例１）や酸性ｐＨ領域で分子間相互作用解析装置により抗体結合能を測定することにより評価できる。例えば、ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いたｐＨグラジエント溶出試験の場合、変異導入前（例えば、Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄ）のタンパク質に比べて、酸性領域での抗体結合能が低下した変異体はより高いｐＨで溶出する。変異導入前のタンパク質の溶出ピークのピークトップから算出される溶出ｐＨを基準とした場合に、変異体の溶出ｐＨが０．０５以上高いことが好ましく、０．１以上高いことがより好ましい。
【００４１】
本発明で用いるリガンドは、前記アミノ酸置換が導入された単一のドメインのみからなるリガンドであってもよく、前記アミノ酸置換が導入されたドメインを２個以上連結して得られる複数ドメインからなるリガンドであってもよい。
【００４２】
複数ドメインからなるリガンドである場合、リガンドは、同種のドメインからなるリガンド（ホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマー）であってもよいし、種類の異なるドメインからなるリガンド（ヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマー）であってもよい。連結するドメインの数は、２個以上であることが好ましく、２〜１０個であることがより好ましく、２〜６個であることがさらに好ましい。
【００４３】
複数ドメインからなるリガンドにおいて、単量体ドメイン同士の連結のされ方としては、リンカーとなるアミノ酸残基を介さずに連結する方法、または、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法が挙げられるが、これらに限定されない。連結に用いられるアミノ酸残基の数は特に限定されず、連結様式および連結数も、単量体ドメインの３次元立体構造を不安定化しないものであれば特に限定されない。
【００４４】
また、前記リガンドを１つの構成成分として、機能の異なる他のタンパク質と融合されている融合タンパク質も、本発明で用いられ得る。融合タンパク質の例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）が融合したタンパク質を例として挙げることができるが、これに限定されない。ＧＳＴ、ＭＢＰとの融合タンパク質として発現することにより、リガンドの精製を容易にすることができる。また、リガンドには、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されていてもよい。
【００４５】
上述のリガンドをコードするＤＮＡは、それを構成する塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、リガンドを構成するものであればよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、ＰＣＲと略す）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。
【００４６】
本発明のＤＮＡは、野生型または変異型のプロテインＡのドメインをコードする従来公知のＤＮＡに対して、部位特異的に変異を導入することにより得られる。部位特異的な変異の導入は、以下のように、組み換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
【００４７】
組み換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、リガンドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
【００４８】
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、リガンドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により、行うことができる。
【００４９】
また、複数ドメインからなるリガンドをコードするＤＮＡは、本発明の単量体リガンド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより作製することができる。例えば、複数ドメインからなるリガンドをコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。或いは、複数ドメインからなるリガンドをコードするＤＮＡは、プロテインＡをコードするＤＮＡ（例えば、国際公開第０６／００４０６７号）に上記の変異導入法を適用することで作製することも可能である。ここで、複数ドメインからなるリガンドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体リガンドをコードする塩基配列が同一の場合には宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体リガンドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、より好ましくは８５％以下である。
【００５０】
本発明のベクターは、前述したリガンドまたは複数ドメインからなるリガンドをコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、前述したリガンドをコードするＤＮＡを、ベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができる。
【００５１】
遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。遺伝子を挿入するためのベクターは、例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社製）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社製）、および、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）のベクターなどが挙げられる。ブレビバチルス属細菌を宿主として用いる場合には、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、または、ｐＨＹ５００（特開平２−３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４−２７８０９１号公報）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７−１７０９８４号公報）、ｐＨＴ２１０（特開平６−１３３７８２号公報）、または、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＭＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）などを使用することができる。
【００５２】
ベクターで宿主を形質転換することにより、形質転換体を得ることができる。宿主としては、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。より好ましくは、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のグラム陽性菌がよい。さらに好ましくは、プロテインＡの大量生産への適応例（国際公開第０６／００４０６７号）が公知である、ブレビバチルス属細菌がよい。
【００５３】
ブレビバチルス属細菌としては、特に限定されないが、例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｇｒｉ、Ｂ．ｂｏｒｓｔｅｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｃｅｎｔｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｆｏｒｍｏｓｕｓ、Ｂ．ｉｎｖｏｃａｔｕｓ、Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｂ．ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｒｅｕｓｚｅｒｉ、Ｂ．ｔｈｅｒｍｏｒｕｂｅｒが挙げられる。好ましくは、ブレビバチルス・ブレビス４７株（ＪＣＭ６２８５）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７−５Ｑ株（ＪＣＭ８９７０）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８７）およびブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４５７３）が挙げられる。生産量の向上などの目的に応じて、上記ブレビバチルス属細菌のプロテアーゼ欠損株、高発現株、または、芽胞形成能欠失株のような変異株（または、誘導株）を使用してもよい。具体的に挙げれば、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１由来のプロテアーゼ変異株であるブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＯＫ（特開平６−２９６４８５号公報）や、芽胞形成能を有しないブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１−ＳＰ３（国際公開第０５／０４５００５号）が使用できる。
【００５４】
宿主細胞へのベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、または、ポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。  
【００５５】
上記の形質転換体、またはＤＮＡを用いた無細胞タンパク質合成系により、リガンドを製造することができる。
【００５６】
形質転換体を用いてリガンドを製造する場合、形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）にリガンドを生成蓄積させることにより製造することができ、該培養物から所望のリガンドを採取することができる。
【００５７】
形質転換細胞を用いてリガンドを製造する場合には、形質転換体の細胞内および／またはペリプラズム領域内にリガンドを蓄積することも可能である。この場合、細胞内に蓄積すると、発現タンパク質の酸化を防ぐことができ、培地成分との副反応もない点で有利であり、ペリプラズム領域内に蓄積すると、細胞内プロテアーゼによる分解を抑えることができる点で有利である。一方、リガンドを製造する場合に、形質転換体の細胞外にリガンドを分泌することも可能である。この場合、菌体破砕や抽出の工程が不要となるため、製造コストが抑えられる点で有利である。
【００５８】
本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、該リガンドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
【００５９】
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによるリガンドの分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｔｅｔｒａ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）、および／または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
【００６０】
さらに、リガンドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。この場合、例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、リガンドと共存させることができる。なお、リガンドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン  １％、酵母エキス  ０．５％、ＮａＣｌ  １％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン  １．６％、酵母エキス  １．０％、ＮａＣｌ  ０．５％）等が挙げられる。
【００６２】
ブレビバチルス属細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、ＴＭ培地（ペプトン  １％、肉エキス  ０．５％、酵母エキス  ０．２％、グルコース  １％、ｐＨ７．０）、または、２ＳＬ培地（ペプトン  ４％、酵母エキス  ０．５％、グルコース  ２％、ｐＨ７．２）等が挙げられる。
【００６３】
また、培養温度は、１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することによりリガンドを、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。
【００６４】
組み換えタンパク質が分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたタンパク質を含む上清を分離することにより生産された組み換えタンパク質を回収することができる。
【００６５】
また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたリガンドを回収することができる。
【００６６】
リガンドを無細胞タンパク質合成系により製造する場合、無細胞タンパク質合成系としては、特に限定されず、例えば、原核細胞由来、植物細胞由来、高等動物細胞由来の合成系などを使用することができる。
【００６７】
リガンドの精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。
【００６８】
得られた精製物質が目的のリガンドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
【００６９】
本発明で用いるリガンドを、水不溶性基材からなる担体にアフィニティーリガンドとして固定化して、アフィニティー分離マトリックスを製造することができる。ここで、「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質（官能基）を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するタンパク質を指す。本明細書においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同意である。
【００７０】
水不溶性基材からなる担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、セルロース、アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。セルロースとしては結晶性セルロース、架橋セルロースが挙げられる。アガロースとしては架橋アガロースが挙げられる。
【００７１】
市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００、メタクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
【００７２】
また、水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【００７３】
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基、または、チオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、および、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化し（あるいは担体表面に反応性官能基を導入し）、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
【００７４】
また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。したがって、固定化のために、リガンドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。リガンドに付与される効果が、リガンドを水不溶性担体に固定化したマトリックスにおいても同様に付与されている限り、固定化のための修飾・改変方法は限定されない。
【００７５】
本発明において精製される抗体様タンパク質としては、免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。  
【００７６】
免疫グロブリンＧとしては、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、ＩｇＧ３、ラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２Ｃ、ヤギＩｇＧ１、ＩｇＧ２、モルモットＩｇＧ、ウシＩｇＧ２、ウサギＩｇＧが挙げられる。免疫グロブリンＧ誘導体としては、例えば、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧや、ヒト免疫グロブリンＧのＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ）部分を他生物種抗体のＣＤＲ部分に置き換えて融合させたヒト型化免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、ヒト免疫グロブリンＧのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工免疫グロブリンＧなどが挙げられる。
【００７７】
また、リガンドが結合する領域をＦａｂ領域（特にＦｖ領域）、および、Ｆｃ領域、というように広く定義したが、抗体の立体構造はすでに既知であるので、リガンドおよびアフィニティー分離マトリックスが結合する対象となるタンパク質は、タンパク質工学的にプロテインＡが結合する領域の立体構造を保持した上で、Ｆａｂ領域やＦｃ領域にさらなる改変（断片化など）が施されたものであってもよい。
【００７８】
抗体様タンパク質を、担体に固定化されたリガンドを含むアフィニティー分離マトリックスと接触させ、アフィニティー分離マトリックスに吸着させる工程、およびｐＨ３．５以上の溶出液をアフィニティー分離マトリックスと接触させ、抗体様タンパク質を溶出させる工程により、抗体様タンパク質を精製することができる。
【００７９】
抗体様タンパク質の精製方法の第一工程では、抗体様タンパク質を、担体に固定化されたリガンドを含むアフィニティー分離マトリックスと接触させることにより、抗体様タンパク質をアフィニティー分離マトリックスに吸着させる。具体的には、抗体様タンパク質を含有する緩衝液を中性となるように調整した後、該溶液をアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、抗体様タンパク質を吸着させる。緩衝液としては、例えばクエン酸、２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＥＳ）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＤＡ）、Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＣＥＳ）、３−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）、Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＥＳ）、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、Ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、３−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＰＰＳ）、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＡＰＳ）、もしくはダルベッコリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液が挙げられる。抗体様タンパク質をアフィニティー分離マトリックスに吸着させる際のｐＨは６．５〜８．５であることが好ましく、ｐＨ７〜８であることがより好ましい。抗体様タンパク質をアフィニティー分離マトリックスに吸着させる際の温度は、１〜４０℃であることが好ましく、４〜３０℃であることがより好ましい。
【００８０】
第一工程に次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄してもよい。この時点では所望の抗体様タンパク質はカラム内のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。洗浄のために使用する緩衝液は、第一工程で使用する緩衝液と同じものを使用できる。
【００８１】
抗体様タンパク質の精製方法の第二工程では、ｐＨ３．５以上の溶出液をアフィニティー分離マトリックスと接触させ、抗体様タンパク質を溶出させる。溶出液としては、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオン、グリシン、コハク酸イオン、リン酸イオン、ギ酸イオン、プロピオン酸イオン、γ―アミノ酪酸、乳酸などのアニオン種を含む溶出液が挙げられる。
【００８２】
溶出液のｐＨは、ｐＨ３．５以上であることが好ましく、ｐＨ３．６以上であることがより好ましく、ｐＨ３．７５以上であることがさらに好ましく、ｐＨ３．８以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．９以上であることが特に好ましく、ｐＨ４．０以上であることが最も好ましい。溶出液のｐＨの上限はｐＨ６．０であることが好ましい。
【００８３】
アフィニティー分離マトリックスからの抗体様タンパク質の溶出において、複数のｐＨの溶出液を用いて抗体様タンパク質を段階的に溶出することも可能である。また、ｐＨの異なる２種類以上の溶出液（例えばｐＨ６とｐＨ３）を用いたグラジエント溶出でｐＨに勾配をつけて溶出すれば、より高度に精製できるため、好適である。本発明のアフィニティー分離マトリックスは特に高ｐＨで抗体を溶出することが可能であるため、グラジエント溶出ではその一部にｐＨ４〜６の溶出液を含むことが好ましい。吸着時、洗浄時、溶出時の緩衝液には界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０やＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）やカオトロープ剤（例えば、尿素やグアニジン）、アミノ酸（例えば、アルギニン）を添加することも可能である。
【００８４】
同様に、抗体様タンパク質を溶出させる際の、アフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラム内のｐＨは、ｐＨ３．５以上であることが好ましく、ｐＨ３．６以上であることがより好ましく、ｐＨ３．７５以上であることがさらに好ましく、ｐＨ３．８以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．９以上であることが特に好ましく、ｐＨ４．０以上であることが最も好ましい。ｐＨ３．５以上の条件で溶出すると、抗体へのダメージを低減できる（Ｇｈｏｓｅ  Ｓ．他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、２００５年、９２巻、６号）。また、抗体様タンパク質を溶出させる際の、アフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラム内のｐＨの上限はｐＨ６．０であることが好ましい。本発明の精製方法では、抗体様タンパク質をより中性側の酸性溶出条件で解離でき、抗体様タンパク質を酸性条件下で溶出させたときの溶出ピーク・プロファイルがよりシャープである。クロマトグラフィーの溶出ピーク・プロファイルがシャープになることで、少ない容量の溶出液で高濃度の抗体含有溶出液を回収できる。
【００８５】
抗体様タンパク質を溶出する際の温度は１〜４０℃であることが好ましく、４〜３０℃であることがより好ましい。
【００８６】
本発明の精製方法により回収される抗体様タンパク質の回収率は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。回収率は、下記式により算出される。
回収率（％）＝（溶出した抗体様タンパク質の濃度（ｍｇ／ｍＬ）×溶出した液量（ｍｌ））÷（負荷した抗体様タンパク質の濃度（ｍｇ／ｍＬ）×負荷した液量（ｍｌ））×１００
【００８７】
本発明の精製方法では、抗体様タンパク質を発現させるための宿主に由来するタンパク質の混入を低減できる。また、抗体様タンパク質の凝集体の混入も低減できる。これらのタンパク質の混入は、抗体様タンパク質の製造における精製工程の負荷増大（工数の増加や収率の低減）や不純物タンパク質が医薬品として重大な副作用をもたらす可能性があるが、高いｐＨの溶出液を用いた本発明の精製方法ではこの問題を回避できる。
【００８８】
本発明のアフィニティー分離マトリックスでは精製前の抗体様タンパク質が宿主細胞由来タンパク質との混合物である場合にも、抗体様タンパク質と宿主由来タンパク質を分離するのに効果的である。宿主細胞タンパク質の由来となる宿主細胞は抗体様タンパク質を発現できる細胞であり、特に遺伝子組換え技術が確立されているＣＨＯ細胞や大腸菌が例として挙げられる。これらの宿主由来タンパク質は、市販のイムノアッセイキットによって定量することが可能である。例えば、ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｙｇｎｕｓ社製）を用いれば、ＣＨＯ細胞由来のタンパク質を定量できる。
【００８９】
本発明のアフィニティー分離マトリックスでは、精製前の抗体様タンパク質が抗体様タンパク質の凝集体との混合物である場合にも、抗体様タンパク質の凝集体、例えば、溶出液中の抗体様タンパク質の総量に対して、少なくとも、１％、もしくは５％、１０％の凝集体を含む溶液から、凝集していない抗体様タンパク質を精製し、凝集体を除去するのに効果的である。凝集体の含有量は、例えばゲルろ過クロマトグラフィーにより分析、定量することができる。
【００９０】
アフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液（適当な変性剤、または、有機溶剤を含む溶液の場合もある）を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。
【００９１】
リガンドおよびアフィニティー分離マトリックスの、抗体様タンパク質抗体様タンパク質に対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）などのバイオセンサーによって試験することができる。リガンドが有する免疫グロブリンに対する親和性は、ヒト免疫グロブリンＧ製剤に対する親和性を後述のＢｉａｃｏｒｅシステムにより測定した時に、結合定数（ＫＡ）が１０６（Ｍ−１）以上であることが好ましく、１０７（Ｍ−１）以上であることがより好ましい。
【００９２】
測定条件としては、リガンドが免疫グロブリンのＦｃ領域に結合した時の結合シグナルが検出できる条件であればよく、温度２０〜４０℃（一定温度）にて、ｐＨ６〜８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
【００９３】
結合相手の免疫グロブリン分子としては、例えば、ポリクローナル抗体であるガンマグロブリン・ニチヤク（ヒト免疫グロブリンＧ）（日本製薬社製）や市販医薬品のモノクローナル抗体が挙げられる。
【００９４】
親和性の違いは、同じ測定条件にて、同じ免疫グロブリン分子に対する結合反応曲線を得て、解析した時に得られる結合パラメータにて、比較対象のリガンドと比較することで当業者が容易に検証することができる。
【００９５】
結合パラメータとしては、例えば、結合定数（ＫＡ）や解離定数（ＫＤ）を用いることができる（永田他  著、「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」、シュプリンガー・フェアラーク東京、１９９８年、４１頁）。リガンドとＦａｂの親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにＶＨ３サブファミリーに属する免疫グロブリンのＦａｂフラグメントを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、リガンドを流路添加する実験系で求めることができる。なお、文献によっては結合定数は親和定数と表記されることもあるが、基本的に両者の定義は同じである。  
【実施例】
【００９６】
以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。本実施例では、組換えＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。（１）Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、「モレキュラー・クローニング／ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）。（２）村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（１９９６）、丸善株式会社刊。また、本実施例で用いる試薬、制限酵素等については特に明記しない限り、市販品を用いた。【００９７】
実施例で取得した各種タンパク質を「ドメインを示すアルファベット−導入した変異（野生型ではＷｉｌｄ）」の形で表記する。例えば、プロテインＡの野生型Ｃドメインは「Ｃ−ｗｉｌｄ」、変異Ｇ２９Ｅを導入したＣドメイン変異体は「Ｃ−Ｇ２９Ｅ」と表記する。２種類の変異を同時に導入した変異体の表記は、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｇ２９Ｅ、および、変異Ｓ１３Ｌを導入したＣドメイン変異体は、「Ｃ−Ｇ２９Ｅ／Ｓ１３Ｌ」と表記する。また、単ドメインを複数連結したタンパク質は、ピリオドの後に、連結した数に「ｄ」をつけて表記する。例えば、変異Ｇ２９Ｅ、および変異Ｓ１３Ｌを導入したＣドメイン変異体を５連結したタンパク質は「Ｃ−Ｇ２９Ｅ／Ｓ１３Ｌ．５ｄ」と表記する。【００９８】
（実施例１）ＩｇＧ固定化担体を用いたＣドメイン変異体の抗体結合能の評価
プロテインＡのＣドメイン体にＧ２９Ａ変異を導入したＣ−Ｇ２９Ａ．２ｄ（配列番号６）をコードするＤＮＡの５’末端に、ＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号７）に、表１に記載のアミノ酸置換変異を導入した改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄの人工合成遺伝子を外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社製）。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社製）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社製）へライゲーションし、改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。なお、プラスミドの調製にはエシェリヒア・コリＪＭ１０９株を用いた。【００９９】
ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（タカラバイオ社製）を得られたプラスミドで形質転換し、改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄを分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む３０ｍＬのＡ培地（ポリペプトン  ３．０％、酵母エキス  ０．５％、グルコース  ３％、硫酸マグネシウム  ０．０１％、硫酸鉄  ０．００１％、塩化マンガン  ０．００１％、塩化亜鉛  ０．０００１％）にて、３０℃で３日間の振盪培養を行った。【０１００】
上記の手順で発現される、Ｃ−Ｑ９Ａ／Ｇ２９Ａ．２ｄ、Ｃ−Ｑ９Ｓ／Ｇ２９Ａ．２ｄ、Ｃ−Ｑ９Ｔ／Ｇ２９Ａ．２ｄ、Ｃ−Ｇ２９Ａ／Ｑ３２Ａ．２ｄ、Ｃ−Ｇ２９Ａ／Ｋ３５Ｓ．２ｄ、Ｃ−Ｇ２９Ａ／Ｑ３２Ｔ．２ｄのアミノ酸配列を、それぞれ、配列表の配列番号１０〜１５に記載する。【０１０１】
培養後、培養液から遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２５℃、５分間）により菌体を除去した後、高速液体クロマトグラフィーで培養上清中の改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄの濃度を測定した。ＩｇＧ固定化担体を用いて、培養上清中の改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄ及びＣ−Ｇ２９Ａ．２ｄの溶出試験を下記の条件で実施した。【０１０２】
＜ＩｇＧ固定化担体を用いた溶出試験の条件＞
担体：ＩｇＧ  Ｓｅｈｐａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）
カラム：オムニフィットカラム（ディバ・インダストリーズ社製）、カラム径０．６６ｃｍ、ベッド高６．４ｃｍ、カラムボリューム：２．１９ｍＬ
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、接触時間２．７ｍｉｎ
負荷量：４７０μＬ（リガンド濃度１．３ｍｇ／ｍＬ）
平衡化ｂｕｆｆｅｒ：５０ｍＭ  トリス塩酸  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５
溶出条件：５０ｍＭ  クエン酸ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ６．０→５０ｍＭ  クエン酸ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ３．０（２０ＣＶ）【０１０３】
Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄの溶出ｐＨを基準としたときの、改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄの溶出ｐＨの差を算出した。結果を表１に示す。いずれの改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄもＣ−Ｇ２９Ａ．２ｄと比較して、ＩｇＧ固定化担体からの溶出ｐＨが高かった。この結果は、改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄを固定化した担体はＣ−Ｇ２９Ａ．２ｄを固定化した担体より高いｐＨで抗体を溶出できることを示している。【０１０４】
【表１】
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【０１０５】
（実施例２）分子間相互作用解析装置を用いたＣドメイン変異体の抗体結合能の評価
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ  ３０００（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、実施例１で取得した各種タンパク質の免疫グロブリンとの親和性を解析した。本実施例では、ヒト血漿から分画したヒト免疫グロブリンＧ製剤（以後は、ヒトＩｇＧと記する）を利用した。【０１０６】
ヒトＩｇＧをセンサーチップに固定化し、各種タンパク質をチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ヒトＩｇＧのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）、および、Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｒｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケア社製）。ヒトＩｇＧ溶液は、ガンマグロブリン「ニチヤク」（日本製薬社製）を標準緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１．０ｍｇ／ｍＬになるよう溶解して調製した。ヒトＩｇＧ溶液を、固定化用緩衝液（１０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＨ−ＣＨ３ＣＯＯＮａ、ｐＨ５．０）で１００倍に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００付属のプロトコルに従い、ヒトＩｇＧをセンサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にＥｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。【０１０７】
各種タンパク質は、ランニング緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％  Ｐ−２０、ｐＨ７．４）を用いて、１０〜１０００ｎＭの範囲で適宜調製し（各々について、異なるタンパク質濃度の溶液を３種類調製）、各々のタンパク質溶液を、流速２０μＬ／ｍｉｎで３０秒間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相、３０秒間）、および、添加終了後（解離相、６０秒間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  １０ｍＭ  ｐＨ３．０（ＧＥヘルスケア社製）を添加してセンサーチップを再生（３０秒間）した（センサーチップ上に残った添加タンパク質の除去が目的であり、固定化したヒトＩｇＧの結合活性がほぼ完全に戻ることを確認した）。【０１０８】
得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、結合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）、および、結合定数（ＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）を算出した。結果を表２に示す。【０１０９】
表２に示すように、改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄのヒトＩｇＧに対する結合パラメータは、Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄ（対照）と同程度であった。具体的には、ヒトＩｇＧに対する結合定数は、いずれのリガンドも１０８Ｍ−１以上を示した。いずれの改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄも中性ｐＨ領域では変異導入前のＣ−Ｇ２９Ａ．２ｄと同程度の抗体結合能を有していた。【０１１０】
【表２】
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【０１１１】
（実施例３）ＩｇＧ固定化担体を用いたＢドメイン変異体の抗体結合能の評価
プロテインＡのＢドメイン体にＧ２９Ａ変異を導入したＢ−Ｇ２９Ａ．２ｄ（配列番号８）をコードするＤＮＡの５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号９）に９位のＧｌｎをＡｌａに置換した改変型Ｂ−Ｑ９Ａ／Ｇ２９Ａ．２ｄの人工合成遺伝子を外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社製）。実施例１と同様にして、組換え発現し、得られた培養上清についてＩｇＧ固定化担体を用いて溶出試験を実施した。その結果、Ｂ−Ｑ９Ａ／Ｇ２９Ａ．２ｄはＢ−Ｇ２９Ａ．２ｄと比較して、ＩｇＧ固定化担体からの溶出ｐＨが０．２２高かった。この結果は、実施例１の変異はＣドメインに限らず、Ｂドメインにも同様の効果をもたらすことを示している。【０１１２】
（実施例４）
実施例１で調製した改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄ及び対照であるＣ−Ｇ２９Ａ．２ｄの培養上清について、ＩｇＧ固定化担体を用いて下記条件で溶出試験を実施した。【０１１３】
＜ＩｇＧ固定化担体を用いた溶出試験の条件＞
担体：ＩｇＧ  Ｓｅｈｐａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）、
カラム：オムニフィットカラム（ディバ・インダストリーズ社製）、カラム径０．６６ｃｍ、ベッド高６．４ｃｍ
カラムボリューム：２．１９ｍＬ、
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、接触時間２．７ｍｉｎ
負荷量：４７０μＬ（リガンド濃度１．３ｍｇ／ｍＬ）
平衡化ｂｕｆｆｅｒ：５０ｍＭ  トリス塩酸  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５
溶出条件：溶出（１）５０ｍＭ  クエン酸ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ４．０（２ＣＶ）、溶出（２）５０ｍＭ  クエン酸ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ３．０（４ＣＶ）【０１１４】
各溶出液のリガンド濃度を測定し、回収率を算出した。結果を表３に示す。いずれの改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄも、ｐＨ４．０での溶出液の回収率がＣ−Ｇ２９Ａ．２ｄと比較して高かった。この結果から、Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄを固定化した担体と比較して、改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄを固定化した担体はより高いｐＨで溶出した時の抗体回収率が高くなると予測された。【０１１５】
【表３】
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【０１１６】
（実施例５）改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄアフィニティー分離マトリックスの抗体溶出試験
実施例１と同様に培養した改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄ及び対照のＣ−Ｇ２９Ａ．２ｄの培養物を遠心分離して菌体を分離し、得られた培養上清に酢酸を添加してｐＨを４．５に調整後、一時間静置し、目的のタンパク質を沈殿させた。遠心分離により沈殿を回収し、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）に溶解した。【０１１７】
次に、ＨｉＴｒａｐ  Ｑカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を利用した陰イオン交換クロマトグラフィーで目的タンパク質を精製した。具体的には、目的タンパク質溶液を、陰イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｑカラムに添加し、陰イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陰イオン交換緩衝液Ａと陰イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を利用した塩濃度勾配により、途中に溶出される目的タンパク質を分取した。分取した目的タンパク質溶液を超純水に透析し、透析後の水溶液を最終精製サンプルとした。なお、カラムを用いたクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、全てＡＫＴＡ  ａｖａｎｔシステム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を利用して実施した。【０１１８】
水不溶性基材として、市販の活性化型プレパックカラム「Ｈｉｔｒａｐ  ＮＨＳ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ」１ｍＬ（ＧＥヘルスケア社製）を使用した。このカラムは、架橋アガロースをベースとし、タンパク性リガンド固定化用のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基が導入されている。製品マニュアルに従い、最終精製サンプルをリガンドとして固定化し、アフィニティー分離マトリックスをそれぞれ調製した。【０１１９】
具体的には、最終精製サンプルをカップリング緩衝液（０．２Ｍ  炭酸ナトリウム、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で終濃度約１３ｍｇ／ｍＬに希釈した溶液を１ｍＬ調製した。氷浴で冷やした１ｍＭ  ＨＣｌを、流速１ｍＬ／ｍｉｎで２ｍＬ分流する操作を３回行い、カラム中のイソプロパノールを除去した。その後すぐに、先に調製したサンプル希釈溶液を同じ流速で１ｍＬ添加し、カラムの上下に栓をして２５℃で３０分間静置することで、取得したタンパク質をカラムに固定化した。その後開栓し、カップリング緩衝液を同じ流速で３ｍＬ流して、未反応タンパク質を回収した。その後、ブロッキング用緩衝液（０．５Ｍ  エタノールアミン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）を２ｍＬ流す操作を３回実施し、洗浄用緩衝液（０．１Ｍ  酢酸、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）を２ｍＬ流す操作を３回実施し、最後に標準緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４−Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を２ｍＬ流してアフィニティー分離カラムの作製を完了した。得られたアフィニティー分離マトリックスを用いて、下記条件で抗体溶出試験を実施した。対照として同様に調製したＣ−Ｇ２９Ａ．２ｄアフィニティー分離マトリックスについても試験した。抗体回収率は溶出液の吸光度を測定して、算出した。【０１２０】
＜改変型Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄアフィニティー分離マトリックスを用いた抗体溶出試験の条件＞
カラム：プレパックカラムＨｉｔｒａｐ  ＮＨＳ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ」１ｍＬ（ＧＥヘルスケア社製）（各リガンドを固定化した担体を含むカラム）
流速：０．３３ｍＬ／ｍｉｎ、接触時間３．０ｍｉｎ、
負荷液：ガンマグロブリン「ニチヤク」（日本製薬社製）５ｍＬ（リガンド濃度１ｍｇ／ｍＬ）
平衡化ｂｕｆｆｅｒ：ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（シグマ・アルドリッチ社製）
溶出条件：溶出（１）：５０ｍＭ  クエン酸ｂｕｆｆｅｒ（４ＣＶ）、試験Ａ：ｐＨ４．０、試験Ｂ：ｐＨ３．７５、試験Ｃ：ｐＨ３．５、溶出（２）：５０ｍＭ  クエン酸ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ３．０（４ＣＶ）【０１２１】
測定結果を表４に示す。Ｃ−Ｇ２９Ａ．２ｄのアフィニティー分離マトリックスと比較するとＣ−Ｑ９Ｔ／Ｇ２９Ａ．２ｄを用いて調製したアフィニティー分離マトリックスは高いｐＨ（ｐＨ４．０〜３．５）での溶出液中の抗体回収率が高かった。この結果は、実施例４のＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた試験でｐＨ４．０での回収率が高かったリガンドは、水不溶性担体に固定化してアフィニティー分離マトリックスとした場合に、高いｐＨの溶出条件における抗体回収率を向上できることを示している。【０１２２】
【表４】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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