(57)【要約】  本発明は、ネフロン前駆細胞を、未分化状態を維持しながら増幅培養する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、培養したネフロン前駆細胞がネフロン形成能力を有する増幅培養方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、優れた増幅率を達成できる、ネフロン前駆細胞の増幅培養方法を提供することを目的とする。本発明により、以下の化合物：（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤、（ｉｉｉ）Ｂｍｐ、（ｉｖ）白血球阻害因子、（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および（ｖｉ）Ｆｇｆを含む培地を用いて、単離された哺乳動物由来のネフロン前駆細胞またはｉＰＳ細胞から作成されたネフロン前駆細胞を培養して増やす方法が提供される。
2017010448.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化合物：
（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、
（ｉｉ）Ｆｇｆ、
（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、
（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、
（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および
（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
を含む培地を用いて、単離された哺乳動物由来のネフロン前駆細胞を培養して増やす方法。
【請求項２】
さらに、培地が（ｖｉｉ）Ｔｇｆ−αを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地が、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｍｐファミリー化合物を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培地が０．１μＭ〜５μＭの濃度のＷｎｔアゴニスト、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｍｐファミリー化合物、１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＦｇｆ、および、１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＩＦを含む、請求項１〜３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
前記培地が、１．０μＭ〜５０μＭの濃度のＲｏｃｋ阻害剤、および、１．０μＭ〜２０μＭの濃度のＮｏｔｃｈ阻害剤を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が、１ｎｇ／ｍｌ〜５００の濃度のＴｇｆαを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｂｍｐファミリー化合物が、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ７、およびＧＤＦ１１からなる群より選ばれる、請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ−３阻害剤から選ばれる、請求項１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ１、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９、およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＦｇｆがＦｇｆ９またはＦｇｆ２であり、前記ＢｍｐがＢｍｐ７であり、前記Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
前記ネフロン前駆細胞が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞由来のネフロン前駆細胞である、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
前記ネフロン前駆細胞が５日以上培養されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
前記ネフロン前駆細胞が、培養開始時の細胞数と比較して４倍以上の細胞数まで培養されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
前記培養が、ｉＭａｔｒｉｘまたはフィブロネクチン被覆プレート上で行われる、上記請求項１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
前記培養が、Ｕ底低細胞吸着プレートで行われる、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一つに記載の方法を用いて培養されたネフロン形成能を有するネフロン前駆細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一つに記載の方法を用いて培養されたネフロン前駆細胞を用いて、糸球体および尿細管を有する三次元腎臓構造を作成する方法。
【請求項１８】
以下の化合物：
（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、
（ｉｉ）Ｆｇｆ、
（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、
（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、
（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および
（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
を含む、ネフロン前駆細胞を増幅させるための培地。
【請求項１９】
さらに、（ｖｉｉ）Ｔｇｆαを含む請求項１８に記載の培地。
【請求項２０】
１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｍｐファミリー化合物を含む、請求項１８または１９に記載の培地。
【請求項２１】
０．１μＭ〜５μＭの濃度のＷｎｔアゴニスト、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｍｐファミリー化合物、１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＦｇｆ、および、１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＩＦを含む、請求項１８〜２０のいずれか一つに記載の培地。
【請求項２２】
前記培地が、１．０μＭ〜５０μＭの濃度のＲｏｃｋ阻害剤、および、１．０μＭ〜２０μＭの濃度のＮｏｔｃｈ阻害剤を含む、請求項２１に記載の培地。
【請求項２３】
１ｎｇ／ｍｌ〜５００の濃度のＴｇｆαを含む、請求項２２に記載の培地。
【請求項２４】
Ｂｍｐファミリー化合物が、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ７、およびＧＤＦ１１からなる群より選ばれる、請求項１８〜２３のいずれか一つに記載の培地。
【請求項２５】
前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ−３阻害剤である、請求項１８〜２４のいずれか一つに記載の培地。
【請求項２６】
前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ１、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９、およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、請求項１８〜２３のいずれかに記載の培地。
【請求項２７】
前記ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＦｇｆがＦｇｆ９またはＦｇｆ２であり、前記ＢｍｐがＢｍｐ７であり、前記Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項１８〜２６のいずれか一つに記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネフロン前駆細胞の増幅培養方法に関する。より具体的には、ネフロン前駆細胞を、分化能を失うことなく未分化状態に維持したまま増幅させることができる培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の腎臓には、約１００万のネフロンが含まれており、それは、糸球体と尿細管からなる。成体の腎臓は再生しない臓器であるが、胎児期の腎臓では、後腎間葉（ＭＭ）と呼ばれる組織に転写因子Ｓｉｘ２陽性のネフロン前駆細胞が存在し自己複製を繰り返しながら糸球体や尿細管からなる主要機能単位であるネフロンに分化する。しかし、前駆細胞は、マウスでは出生後数日以内（腎臓発生から約１０日後）に、ヒトでは妊娠３４週で、自己複製を停止し、最終分化する。したがって、成体の腎臓では新たなネフロン形成は起こらない。これが、成体の腎臓が再生しない一因であると考えられている。そして、病的な腎臓が回復不能であることの原因となっている。【０００３】
後腎間葉（ＭＭ）は、転写因子Ｓｉｘ２を発現するネフロン前駆細胞を含んでおり、これらの細胞は尿管芽由来Ｗｎｔ９によって誘発される標準的なＷｎｔシグナルに応答してネフロン上皮（組織）を生じる。Ｓｉｘ２は、Ｗｎｔが媒介する分化信号に対抗しており、それによってネフロン前駆細胞を未分化の状態に維持している。したがって、ネフロン前駆細胞の、自己複製および分化の間のバランスは、腎器官形成にとって重要である。【０００４】
よって、このネフロンへと分化可能なＳｉｘ２陽性のネフロン前駆細胞集団がどのように自己複製し、分化するのかを細胞レベルで理解することが、腎臓再生医療の基盤構築として重要である。また、そのような前駆細胞を大量に調製することが腎臓再生医療に欠かせない課題である。そこで、ネフロン前駆細胞を未分化の状態で培養や増幅をする方法が今まで試みられてきた。【０００５】
これまでにネフロン前駆細胞を未分化の状態で培養や増幅をする方法の研究は多数報告されている。例えば、マウスのネフロン前駆細胞の増幅培養を試みた報告としては以下がある。Ｂａｒａｋらは、胎生１４−１７日目のＳｉｘ２−ＧＦＰマウスの腎臓からＦＡＣＳによって単離したＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性の細胞を、Ｂｍｐ７（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｇｆ９（８．６ｎＭ，２００ｎｇ／ｍｌに相当）及びｈｅｐａｒｉｎ（１μｇ／ｍｌ）を含む培養条件で培養した（非特許文献１）。その結果、５日間のＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性の細胞の維持に成功したとしている。しかし、培養２日目以降に増殖能の低下および尿細管形成能が喪失している。一方、Ｂｒｏｗｎらは、Ｂｍｐ７陽性の細胞をマウス胎生１７日目の腎臓からＦＡＣＳによって単離し、その細胞をｎｅｐｈｒｏｇｅｎｉｃ ｚｏｎｅ ｃｅｌｌ（ＮＺＣ）とし、ネフロン前駆細胞に発現するＣｉｔｅｄ１が陽性の細胞が、Ｆｇｆ−１，−２，−９および−２０（２００ｎｇ／ｍｌ）の各々の存在下で２４時間維持されることを報告している（非特許文献２）。さらに、Ｂｒｏｗｎらは、Ｂｍｐ７（５０ｎｇ／ｍｌ）とＷｎｔ経路の活性化剤であるＢＩＯ（０．５μＭ）でＮＺＣを処理すると分化することを報告している（非特許文献３）。これらの報告は、ネフロン前駆細胞の維持にはＦｇｆ（２００ｎｇ／ｍｌ）／Ｂｍｐ７（５０ｎｇ／ｍｌ）が重要である一方、Ｗｎｔ活性化剤によって分化することを示している。
なお、これらの報告では、ネフロン前駆細胞の増幅量については述べられていない。【０００６】
また、Ｙｕｒｉらは、再凝集系（"re-aggregate" system）を用いたネフロン前駆細胞の培養・増幅方法を報告している（非特許文献４）。そこでは、Ｓｉｘ２−ＧＦＰ陽性のマウスネフロン前駆細胞が、２１日目まで培養できたこと、および２１日目にはＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性のネフロン前駆細胞の数が２０倍を超えて増幅したことが記載されている。しかし、１４日後は、細胞数はプラトーに達している。また、Ｎｏｔｃｈシグナル経路を阻害するγ−セクレターゼであり、ネフロン前駆細胞の分化を妨げるＤＡＰＴは、最初の凝集体から再構築された新たな凝集体中でのＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性のネフロン前駆細胞の維持および増幅に有効であり、６５倍にまで増幅出来たことが記載されている。Ｙｕｒｉらの再凝集系においては、最初の凝集体を用いて、単一細胞に分離された細胞を調製し、そこから再び新たな凝集体を構築している。しかし、培養後の細胞が、凝集体が上皮マーカーのＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ陽性であることは示されているが、糸球体、尿細管の三次元のネフロン構造を再構築する能力は示されていない。また、この培養系は胎生１２日目の腎臓を０．２５％トリプシンＥＤＴＡ溶液で解離し、尿管芽、ネフロン前駆細胞および間質の細胞が混在した細胞を再凝集化したものを培養している。つまり、Ｙｕｒｉらの培養条件は、尿管芽から単離したネフロン前駆細胞だけでは培養できないことを示している。よって、この培養系は、胎生期の尿管芽が必要であり、培養条件がネフロン前駆細胞の増幅に直接作用しているかどうかは明確ではない。【０００７】
上記のように、ネフロン前駆細胞を、ネフロン形成能力を保持しかつ未分化状態を維持したまま培養や増幅することは困難であり、適切な培養法はこれまでに確立されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１５−５６７５６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Barak et al., Developmental Cell, 22, 1191-1207 (2012)
【非特許文献２】Brown et al., Development, 138, 5099-5112 (2011)
【非特許文献３】Brown et al., PNAS 110, 4640-4645 (2013)
【非特許文献４】Yuri et al., PLoS ONE 10(6): e0129242 (2015)
【非特許文献５】ＩＳＮ−International Society of Nephrology, Forefronts Symposium, September (2013), Florence Italy. Poster No.45
【非特許文献６】Taguchiら, Cell Stem Cell 14, 53-67 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ネフロン前駆細胞を、未分化状態を維持しながら増幅培養する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、培養した後もネフロン前駆細胞がネフロン形成能力を有する増幅培養方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、優れた増幅率を達成できる、ネフロン前駆細胞の増幅培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らはまず、ラットの後腎間葉（ＭＭ）を用いて、Ｆｇｆ２およびＴｇｆαに加えて、１ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ（白血球阻害因子）と低分子化合物Ｙ２７６３２（１０μＭ）の共添加と細胞外マトリックス（ＬａｍｉｎｉｎまたはＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）でラットの後腎間葉が増幅することを発見し、報告した（非特許文献５）。
その後、研究を重ねた結果、上記条件で増殖した細胞はネフロン前駆細胞の主要なマーカー遺伝子を発現し、尿細管や糸球体を形成する分化能力を維持していたことを確認した。しかし、ラットのＭＭと同じ条件下で培養したマウスの全領域のＭＭは、容易に、ネフロン構造を形成する能力を失う。【００１２】
そこで本発明者らは上記課題を解決するために引き続き鋭意研究を重ねた結果、糸球体と尿細管の３次元の腎臓組織を形成する能力を持つＳｉｘ２陽性のネフロン前駆細胞を高率（例えば、全体の６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）で維持したまま、ネフロン前駆細胞を長期間（例えば、少なくとも７日以上、好ましくは１０日以上、より好ましくは１５日以上、さらに好ましくは１９日間以上）増幅する培養法を確立し、本発明を完成した。
より具体的には、本発明者らは、ネフロン前駆細胞の培養条件として、培地へのＦｇｆ９、Ｂｍｐ７、ＣＨＩＲ９９０２１の添加に加え、培地中のＷｎｔ活性化剤の濃度と培地中のＢｍｐ７の濃度の組み合わせがネフロン前駆細胞の分化、増殖に重要であることをつきとめた。さらに本発明者らは、Ｗｎｔ活性化剤とＢｍｐ７だけでは高効率のＳｉｘ２陽性の細胞の維持には不十分で、Ｌｉｆが必須であることもつきとめた。【００１３】
本発明は以下を含む。
［１］以下の化合物：
（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、
（ｉｉ）Ｆｇｆ、
（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、
（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、
（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および
（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
を含む培地を用いて、単離された哺乳動物由来のネフロン前駆細胞の増幅培養方法。
［２］さらに、培地が（ｖｉｉ）Ｔｇｆ−αを含む上記［１］に記載の方法。
［３］前記培地が、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、よりに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＢｍｐファミリー化合物を含む、上記［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記培地が、０．１μＭ〜５μＭ（好ましくは、０．５μＭ〜２．５μＭ、より好ましくは０．７５μＭ〜１．５μＭ）の濃度のＷｎｔアゴニスト、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＢｍｐファミリー化合物、１０〜５００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、３０〜３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＦｇｆ、および、１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＬＩＦを含む、上記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の方法。
［５］前記培地が、１．０μＭ〜５０μＭ（好ましくは、２．０μＭ〜３０μＭ、より好ましくは、５μＭ〜２０μＭ）の濃度のＲｏｃｋ阻害剤、および、１．０μＭ〜２０μＭ（好ましくは、１．０μＭ〜１０μＭ、より好ましくは、１．０μＭ〜５μＭ、さらに好ましくは２．５μＭ〜５μＭ）の濃度のＮｏｔｃｈ阻害剤を含む、上記［４］に記載の方法。
［６］前記培地が、１ｎｇ／ｍｌ〜５００（好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＴｇｆαを含む、上記［５］に記載の方法。
［７］前記Ｂｍｐファミリー化合物が、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ７、およびＧＤＦ１１からなる群より選ばれる、上記［１］〜［６］のいずれか一つに記載の方法。
［８］前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ−３阻害剤（好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、またはＳＢ４１５２８６、より好ましくはＣＨＩＲ９９０２１）である、上記［１］〜［７］のいずれか一つに記載の方法。
［９］前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ１、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９、およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、前記［１］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＦｇｆがＦｇｆ９またはＦｇｆ２であり、前記ＢｍｐがＢｍｐ７であり、前記Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、前記［１］〜［６］のいずれか一つに記載の方法。
［１１］前記ネフロン前駆細胞が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞由来のネフロン前駆細胞（好ましくは、マウスＥＳ細胞またはマウスｉＰＳ細胞由来のマウスネフロン前駆細胞、またはヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞由来のヒトネフロン前駆細胞）である、上記［１］〜［１０］のいずれか一つに記載の方法。
［１２］前記ネフロン前駆細胞が５日以上（好ましくは７日以上、より好ましくは１０日以上、更に好ましくは１５日以上）培養されることを特徴とする、上記［１］〜［１１］のいずれか一つに記載の方法。
［１３］前記ネフロン前駆細胞が、培養開始時の細胞数と比較して４倍以上（好ましくは、１０倍以上、より好ましくは３０倍以上、更に好ましくは５０倍以上、最も好ましくは１００倍以上）の細胞数まで培養されることを特徴とする、上記［１］〜［１２］のいずれか一つに記載の方法。
［１４］前記培養が、ｉＭａｔｒｉｘまたはフィブロネクチン被覆プレート上で行われる、上記［１］〜［１３］のいずれか一つに記載の方法。
［１５］前記培養が、Ｕ底低細胞吸着プレートで行われる、上記［１］〜［１３］のいずれか一つに記載の方法。
［１６］上記［１］〜［１５］のいずれか一つに記載の方法を用いて培養されたネフロン形成能を有するネフロン前駆細胞。
［１７］上記［１］〜［１５］のいずれか一つに記載の方法を用いて培養されたネフロン前駆細胞を用いて、糸球体および尿細管を有する三次元腎臓構造を作成する方法。【００１４】
［１８］以下の化合物：
（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、
（ｉｉ）Ｆｇｆ、
（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、
（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、
（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および
（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
を含む、ネフロン前駆細胞を増幅させるための培地。
［１９］さらに、（ｖｉｉ）Ｔｇｆαを含む上記［１８］に記載の培地。
［２０］１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、よりに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＢｍｐファミリー化合物を含む、上記［１８］または［１９］に記載の培地。
［２１］０．１μＭ〜５μＭ（好ましくは、０．５μＭ〜２．５μＭ、より好ましくは０．７５μＭ〜１．５μＭ）の濃度のＷｎｔアゴニスト、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＢｍｐファミリー化合物、１０〜５００ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、３０〜３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０〜２００ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＦｇｆ、および、１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ（好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＬＩＦを含む、上記［１８］〜［２０］のいずれか一つに記載の培地。
［２２］前記培地が、１．０μＭ〜５０μＭ（好ましくは、２．０μＭ〜３０μＭ、より好ましくは、５μＭ〜２０μＭ）の濃度のＲｏｃｋ阻害剤、および、１．０μＭ〜２０μＭ（好ましくは、２．０μＭ〜１０μＭ、より好ましくは、２．５μＭ〜５μＭ）の濃度のＮｏｔｃｈ阻害剤を含む、上記［２１］に記載の培地。
［２３］１ｎｇ／ｍｌ〜５００（好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０〜２００ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＴｇｆαを含む、上記［２２］に記載の培地。
［２４］Ｂｍｐファミリー化合物が、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ７、およびＧＤＦ１１からなる群より選ばれる、上記［１８］〜［２３］のいずれか一つに記載の培地。
［２５］前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ−３阻害剤（好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、またはＳＢ４１５２８６、より好ましくはＣＨＩＲ９９０２１）である、上記［１８］〜［２４］のいずれか一つに記載の培地。
［２６］前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ１、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９、およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、前記［１８］〜［２５］のいずれかに記載の培地。
［２７］前記ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＦｇｆがＦｇｆ９またはＦｇｆ２であり、前記ＢｍｐがＢｍｐ７であり、前記Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、前記［１８］〜［２３］のいずれか一つに記載の培地。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ネフロン前駆細胞を、未分化状態に維持したまま培養して増やすことができ、そのようにして増やしたネフロン前駆細胞は、ネフロンへの分化能を有する。すなわち、本発明により、ネフロン前駆細胞の増幅培養が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｓｉｘ２−ＧＦＰマウスの腎臓からのＭＭの採取、および培養の概略を示した図である。ＭＭは、個々の単一の細胞に分散させることなく培養される。
【図２】７日間、ｉＭａｔｒｉｘまたはフィブロネクチン（Ｆｎ）で被覆したプレート上で培養したＭＭのネフロン前駆細胞マーカーのｑＰＣＲ分析の結果である。Ｅ１１．５で新たに単離したＭＭは、ポジティブコントロール（Ｅ１１．５ＭＭ）として使用した。ＦＴ：コントロール；ＬＹ：ＬＩＦ＋Ｙ２７６３２；ＬＹＤ：ＬＹ＋ＤＡＰＴ。
【図３】Ｅ１１．５の腎臓から調製した細胞を用いて、ＣＤＬＹおよびＣＤＢＬＹの条件で培養した結果である。培養７日目での総細胞数およびＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞数を示す。図中の数値は、ＧＦＰ陽性細胞の割合（％）である。ＦＴは、基本培地（コントロール）である。
【図４】Ｅ１５．５またはＰ０の腎臓から調製した細胞を用いてＣＤＢＬＹの条件で培養した結果である。培養７日目での総細胞数およびＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞数を示す。図中の数値は、ＧＦＰ陽性細胞の割合（％）である。
【図５】Ｅ１５．５またはＰ０の腎臓から調製した細胞を用いて増殖させた細胞からの３次元ネフロン構造の再構成の結果である。左列：ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色；真ん中の列：糸球体のためのマーカーであるネフリン（赤）とＷＴ１（緑）の免疫染色；右列：それぞれ遠位端と近位尿細管のマーカーである、Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（赤）とＣａｄｈｅｒｉｎ６（緑）の免疫染色。スケールバー：２０μｍ。右側の白抜き矢印は糸球体を、左側の黒矢印は尿細管を示している。
【図６】Ｅ１１．５のＳｉｘ２−ＧＦＰマウスの腎臓からの細胞の増殖に対するＦＧＦ２およびＦＧＦ９の影響を確認した結果である。Ｅ１１．５からのＧＦＰ陽性細胞は、ＦＧＦ２（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＦＧＦ９（５０ｎｇの／ｍｌ）にて７日間培養し、その後、ＦＡＣＳにより分析した。培養開始時のＦＡＣＳ分析の結果を左上のパネルに、７日間培養後のＦＡＣＳ分析の結果を右上のパネルに示した。下の左パネルは、培養開始時（Ｅ１１．５）および培養７日目での総細胞数およびＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞の数である。下の右パネルは、各条件におけるネフロン前駆細胞マーカー（Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、およびＷｔ１）の発現を示す。
【図７】Ｅ１１．５の腎臓から調製した細胞を用いて増殖させた細胞からの３次元ネフロン構造の再構成の結果である。左列：ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色；真ん中の列：糸球体のためのマーカーであるネフリン（赤）とＷＴ１（緑）の免疫染色；右列：それぞれ遠位端と近位尿細管のマーカーである、Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（赤）とＣａｄｈｅｒｉｎ６（緑）の免疫染色。スケールバー：２０μｍ。白抜き矢印は糸球体を、黒矢印は尿細管を示している。
【図８】ネフロン前駆細胞の増殖におけるＣＨＩＲとＢｍｐ７の最適濃度の検討を示している。精製されたＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞を、示された濃度のＣＨＩＲまたはＢｍｐ７と、ＦＧＦ９を含む最適化条件（ＣＤＢＬＹ＋Ｆｇｆ９）で７日間培養した後、ＦＡＣＳ分析を行った。総細胞数およびＧＦＰ陽性細胞の数を右のパネルに示す。
【図９】ネフロン前駆細胞の増殖におけるＬＩＦとＢｍｐ７の必須性を検討した結果である。Ｅ１１．５のＧＦＰ陽性細胞を、ＦＧＦ９を添加した最適化された状態（全因子を含む）または図に示された因子の非存在下で培養した。総細胞数およびＧＦＰ陽性細胞の数は、右のパネルに示す。
【図１０】Ｅ１１．５からＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞の連続継代培養の概略図である。ソートした前駆細胞（緑）は２日間培養して凝集し、さらに、６日間（８日目）プレート上で培養した。次いで、細胞は、１：３に希釈し、１９日目まで培養した。
【図１１】最適化された条件（全ての因子を含む）、または示された因子の非存在下での、培養１９日目の総細胞数およびＧＦＰ陽性細胞の数を示す。
【図１２】培養中のＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示している。
【図１３】ネフロン前駆細胞マーカー（Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、Ｗｔ１およびＯｓｒ１）の定量ＰＣＲ解析の結果を示す。
【図１４】１９日間培養した細胞からの３次元ネフロン構造の再構成の結果である。左列：ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色；真ん中の列：糸球体のためのマーカーであるネフリン（赤）とＷＴ１（緑）の免疫染色；右列：それぞれ遠位端と近位尿細管のマーカーである、Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（赤）とＣａｄｈｅｒｉｎ６（緑）の免疫染色。スケールバー：２０μｍ。白抜き矢印は糸球体を、黒矢印は尿細管を示している。
【図１５】生体内での状態と比較して、インビトロでのネフロン前駆細胞の増幅細胞数を計算した結果である。左パネル：各発達段階における１つの腎臓の総細胞数とＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞数の計算値である（ｎ＝４）。右パネル：１つのＥ１１．５の腎臓の前駆細胞から、インビトロで８日間および１９日間増幅培養したＧＦＰ陽性細胞数の計算値である。
【図１６】培養７日目における、総細胞数およびＯＳＲ１−ＧＦＰ陽性細胞の数（左パネル）、ネフロン前駆細胞マーカー（Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、Ｗｔ１およびＯｓｒ１）の定量ＰＣＲ解析の結果（右パネル）を示している。
【図１７】ＯＳＲ１−ＧＦＰ  ＥＳ細胞由来の７日間増幅培養したネフロン前駆細胞からのネフロン構造の再構成の結果である。左列：ＨＥ染色；真ん中の列：糸球体のためのマーカーであるネフリン（赤）とＷＴ１（緑）の免疫染色；右列：それぞれ遠位端と近位尿細管のマーカーである、Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（赤）とＣａｄｈｅｒｉｎ６（緑）の免疫染色。スケールバー：２０μｍ。白抜き矢印は糸球体を、黒矢印は尿細管を示している。
【図１８】ヒトｉＰＳ細胞由来のネフロン前駆細胞の培養の概略を示した図である。ＭＭは、個々の単一細胞に分散されることなく培養される。
【図１９】培養０日目と８日目のネフロン前駆細胞の細胞数を測定した結果を左図に、ネフロン前駆細胞マーカーの発現レベルを測定した結果を右図に示す。
【図２０】ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞を用いて増殖させた細胞からの３次元ネフロン構造の再構成の結果である。左列：ＨＥ染色；真ん中の列：糸球体のためのマーカーであるネフリン（赤）とＷＴ１（緑）の免疫染色；右列：それぞれ遠位端と近位尿細管のマーカーである、Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（赤）とＣａｄｈｅｒｉｎ６（緑）の免疫染色。スケールバー：２０μｍ。右側２つの白抜き矢印は糸球体を、左側２つの黒矢印は尿細管を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明する。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
【００１８】
本発明の一つの態様は、ネフロン前駆細胞を、（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、（ｉｉ）Ｆｇｆ、（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤を含む培地で培養して増やす方法である。
本発明の別の態様は、ネフロン前駆細胞を、さらに（ｖｉｉ）Ｔｇｆαを含む培地で培養して増やす方法である。
本発明の他の態様は、ネフロン前駆細胞を未分化状態で増幅培養することができる培地である。
本発明の他の態様は、上記の方法で培養されたネフロン形成能を有するネフロン前駆細胞である。ここでネフロン形成能とは、分化して、発達した糸球体や尿細管を有する３次元のネフロン構造を形成できることを意味する。
本発明の他の態様は、本発明の方法で増幅培養されたネフロン前駆細胞を用いて糸球体および尿細管を有する三次元腎臓構造（ネフロン）を作成する方法である。
【００１９】
本発明の培養方法で用いる培地は、一般に用いられている培地を基礎培地として用いることができ、本発明の目的を達成できる限り特に制限がなく、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧｊＢ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ培地、改良ＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅｓ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ダルベッコ培地、改良ダルベッコ培地、およびこれらの混合培地等をあげることができる。例えば、好ましくは、ＤＭＥＭにＦ１２を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を用いることができるが、これに制限されない。
【００２０】
本発明の培養方法で用いられる培地は、血清含有培地、無血清培地であり得るが、異種成分の排除による細胞移植の安全性の確保という観点からは、無血清培地が好ましい。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）または、血清代替物が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。かかる無血清培地としては、例えば、市販のＫＳＲを適量（例えば、１−２０％）添加した無血清培地、インスリンおよびトランスフェリンを添加した無血清培地、細胞由来の因子を添加した培地等をあげることができるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明のネフロン前駆細胞の増幅培養方法は、後に詳細に記載するように、本発明に従って、上記の培地に各成分や因子を添加した培地を用いて行うことができる。培地に任意に添加する成分や因子としては、これに限定されないが、例えば、Ｂ２７、Ｎ２、Insulin-transferrin-serenium、β-メルカプトエタノール、アスコルビン酸、Non-essential amino acidなどをあげることができる。
【００２２】
以下、本発明において用いられる各成分または因子である化合物を説明する。
（ａ）Ｗｎｔアゴニスト
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストは、Ｗｎｔアゴニスト活性を有する限り特に制限されない。Ｗｎｔアゴニストは、細胞中でＴＣＦ／ＬＥＦ介在性の転写を活性化する薬剤として定義される。従ってＷｎｔアゴニストは、Ｗｎｔファミリータンパク質のありとあらゆるものを含むＦｒｉｚｚｌｅｄ受容体ファミリーメンバーに結合し、活性化する真のＷｎｔアゴニスト、細胞内β−カテニン分解の阻害剤およびＴＣＦ／ＬＥＦの活性化物質から選択される。本発明でいう、Ｗｎｔアゴニストは、この分子の非存在下でのＷｎｔ活性のレベルと比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、よりさらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは１００％、細胞においてＷｎｔ活性を刺激するものを言う。当業者にとって公知のように、Ｗｎｔ活性は、例えばｐＴＯＰＦＬＡＳＨおよびｐＦＯＰＦＬＡＳＨ Ｔｃｆルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって、Ｗｎｔの転写活性を測定することにより調べることができる（Korinekら, Science 275:1784-1787, 1997）。
【００２３】
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストは、Ｗｎｔ−１／Ｉｎｔ−１；Ｗｎｔ−２／Ｉｒｐ（Ｉｎｔ−１関連タンパク質）；Ｗｎｔ−２ｂ／１３、Ｗｎｔ−３／Ｉｎｔ−４；Ｗｎｔ−３ａ；Ｗｎｔ−４；Ｗｎｔ−５ａ；Ｗｎｔ−５ｂ；Ｗｎｔ−６；Ｗｎｔ−７ａ；Ｗｎｔ−７ｂ、Ｗｎｔ−８ａ／８ｄ；Ｗｎｔ−８ｂ；Ｗｎｔ−９ａ／１４；Ｗｎｔ−９ｂ／１４ｂ／１５；Ｗｎｔ−１０ａ；Ｗｎｔ−１０ｂ／１２；Ｗｎｔ−１１およびＷｎｔ−１６を含む分泌糖タンパク質を含む。さらに、Ｗｎｔアゴニストは、分泌タンパク質のＲ−スポンジンファミリーおよび、高親和性でＦｒｉｚｚｌｅｄ−４受容体に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化を誘導するという点でＷｎｔタンパク質のように機能する分泌性制御タンパク質であるノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）を含む。Ｗｎｔシグナル伝達経路の小分子アゴニスト、アミノピリミジン誘導体もまたＷｎｔアゴニストとして明確に含まれる。
【００２４】
上記定義に含まれるＷｎｔアゴニストはまた、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質、ＧＳＫ−３阻害剤、Ｄｋｋ１アンタゴニスト等も含む。ＧＳＫ−３阻害剤とは、ＧＳＫ−αまたはβ阻害剤を含み、ＧＳＫ−３αまたはβ蛋白質のキナーゼ活性、例えばβカテニンに対するリン酸化能、を阻害する物質として定義され、多くの物質が知られている。その具体例としては、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、リチウムやバルプロ酸、ベンズアゼピノン（ｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｏｎｅ）ファミリーのケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ；９−ブロモ−７，１２−ジヒドロインドロ［３，２−ｄ］［１］ベンズアセピン−６（５Ｈ）−オン）やアルスターパウロン（Ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ；９−ニトロ−７，１２−ジヒドロインドロ［３，２−ｄ］［１］ベンズアセピン−６（５Ｈ）−オン）、インジルビン誘導体である５−クロロ−インジルビン、インジルビン−３’−モノオキシムやＢＩＯ（別名、ＧＳＫ−３βインヒビターＩＸ；６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）やＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、チアジアゾリジノン（ＴＤＺＤ：ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）類似体であるＴＤＺＤ−８（別名、ＧＳＫ−３βインヒビターＩ；４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン）やＯＴＤＺＴ（別名、ＧＳＫ−３βインヒビターＩＩＩ；２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ−３βインヒビターＶＩＩ（４−ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３−ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ−３βペプチドインヒビター；Ｍｙｒ−Ｎ−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ2）などが挙げられる。
【００２５】
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストはさらに、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含み、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として公知のまたは販売されている物質を用いることができる。
本発明で用いることができるＷｎｔアゴニストは、上記の定義に含まれる限り、天然物または合成物のいずれも含まれ、また、タンパク質、高分子、低分子のいずれであってもよい。本発明において用いることができるＷｎｔアゴニストの例としては、これに限定されないが、例えば、好ましくは、ＧＳＫ−３阻害剤、より好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、またはＳＢ４１５２８６をあげることができ、特に好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１をあげることができる。各Ｗｎｔアゴニストの使用濃度は使用目的に合わせて適宜選択できるが、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１を用いた場合に得られる効果と同様の効果を発揮できる濃度を選択することができる。これらのＷｎｔアゴニストは市販されている。
例えばＣＨＩＲ９９０２１を用いた場合、培地中の濃度は、例えば、０．１〜５．０μＭ、好ましくは、０．５〜２．５μＭ、より好ましくは、０．７５〜１．５μＭをあげることができる。
【００２６】
（ｂ）Ｆｇｆ
本発明で用いることができるＦｇｆは、Ｆｇｆファミリーからなる群から選ぶことができ、好ましくはＦｇｆ２、Ｆｇｆ９およびＦｇｆ２０から選ばれ、より好ましくはＦｇｆ９である。培地中のＦｇｆの濃度は、例えば、１０〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、３０〜３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、５０〜２００ｎｇ／ｍｌである。
またこれらのＦｇｆも市販されており、特に制限なく、本発明に用いることができる。
【００２７】
（ｃ）白血球阻害剤（ＬＩＦ）
本発明で用いるＬＩＦの培地中の濃度は、例えば、１．０ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、よりに好ましくは、１．０ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度をあげることができる。
ＬＩＦの濃度が高いと（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ以上）、ネフロン前駆細胞において、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）およびｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（Ｊｎｋｓ）の活性化と分化を引き起こす。このような活性化は低濃度では軽度であり、低濃度のＬＩＦは、前駆細胞の増幅に重要なＳｉｘ２とＹａｐの核局在化を維持することができる。また、Ｒｏｃｋ阻害剤（Ｙ２７６３２）との併用処置は、ＬＩＦによって誘導されるＪＮＫ活性化を減衰させ、それによってネフロン前駆細胞の増幅を可能にする。
また、ＬＩＦは市販されているものを制限なく用いることができる。
【００２８】
（ｄ）Ｂｍｐ
本発明で用いられるＢｍｐファミリー化合物（以下、単に「Ｂｍｐ」と言う場合がある）は、Ｂｍｐ１、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ６、Ｂｍｐ７、Ｂｍｐ８a、Ｂｍｐ８ｂおよびＢｍｐ１０、ＧＤＦ１１等のＢｍｐファミリーからなる群より選ばれ、好ましくは、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４またはＢｍｐ７から選ばれ、さらに好ましくはＢｍｐ７である。これらのＢｍｐは市販されている
培地中のＢｍｐの濃度は、Ｂｍｐの種類に応じて適宜選択できるが、例えば、Ｂｍｐ７を用いた場合は、例えば、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌ、よりに好ましくは、５ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌの濃度をあげることができる。これらの濃度は、引用している従来技術（非特許文献１〜４）で用いられている濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）とは大きく異なるものである。
また、用いるＢｍｐは、いずれの起源のＢｍｐを用いることができるが、好ましくはヒトＢｍｐである。他のＢｍｐ化合物を用いる場合は、Ｂｍｐ７を用いた場合に得られる効果を同様の効果を発揮できる濃度を適宜選択することができる。
【００２９】
（ｅ）Ｒｏｃｋ阻害剤
Ｒｏｃｋ（Ｒｈｏキナーゼ）は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質Ｒｈｏの標的タンパク質として同定されたセリン・スレオニンタンパク質リン酸化酵素である。その阻害剤であるＲｏｃｋ阻害剤は、市販されており、それらのものが本発明において制限なく用いることができる。本発明で用いるＲｏｃｋ阻害剤としては、これに制限されないが、例えば、Ｙ２７６３２、ＨＡ１０７７をあげることができ、好ましくは、Ｙ２７３６２である。本発明で用いるＲｏｃｋ阻害剤の濃度は、例えば、１〜５０μＭ、好ましくは２〜３０μＭ、より好ましくは５〜２０μＭをあげることができる。
【００３０】
（ｆ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
本発明で用いられるＮｏｔｃｈ阻害剤は、Ｎｏｔｃｈシグナルを阻害する化合物であり、同様の活性を示す限りγ―セレクターゼも本発明のＮｏｔｃｈシグナル阻害剤に含まれる。好ましいＮｏｔｃｈ阻害剤としては、ＤＡＰＴをあげることができ、これらは市販されている。
培地中のＮｏｔｃｈ阻害剤の濃度は、用いるＮｏｔｃｈ阻害剤の種類に応じて適宜選択できるが、例えば、ＤＡＰＴを用いた場合は、例えば、１．０〜２０μＭ、好ましくは、１．０〜１０μＭ、よりに好ましくは、１．０〜５μＭ、さらに好ましくは２．５〜５μＭの濃度をあげることができる。
【００３１】
本発明の培養方法においては、さらに、培地にＴｇｆαをさらに添加することもできる。Ｔｇｆαは、未分化細胞、例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の培養において一般に用いられている因子であり、ネフロン前駆細胞の培養においても通常培地中に添加されている因子である。
培地中のＴｇｆαの濃度は、例えば、１〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５〜３００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０〜２００ｎｇ／ｍｌをあげることができる。
またこれらのＴｇｆαも市販されており、特に制限なく、本発明に用いることができる。
【００３２】
本発明の方法においては、細胞を、マトリックス被覆したプレート上で培養することもでき、より良好な培養結果を得ることが期待される。被覆マトリックスとしては、これに限定されないが、ｉＭａｔｒｉｘ、フィブロネクチン、ラミニン、およびコラーゲンをあげることができる、これらのマトリックスにより被覆されたプレートは市販されている。  また、本発明の方法においては、細胞をスフェロイド状でＵ底のプレート（例えば、複数のウェルをもつ、ｌｏｗ-ｃｅｌｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ−ｐｌａｔｅ）で培養することもでき、より良好な増幅培養が達成できる。細胞をスフェロイド状を保持して培養することも本発明の方法の一つの態様としてあげることができる。
【００３３】
ネフロン前駆細胞
本発明の培養方法で用いるネフロン前駆細胞は、生体から採取・回収したネフロン前駆細胞、多能性幹細胞（例えば、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞）から分化誘導したネフロン前駆細胞のいずれも制限なく用いることができる。
ヒトを除く哺乳動物のネフロン前駆細胞の生体からの採取・回収は、胎児の腎臓を摘出し、後腎間葉を単離することにより行うことができる。例えばマウスを例にした場合は、これに限定されないが、ネフロン前駆細胞が発生する胎生１０−１１日に、マウスの胎児の腎臓を摘出し、後腎間葉を単離することにより、採取・回収することができる。マウス前駆細胞マーカーがＧＦＰで標識されたマウスを用いることにより、胎生１２日〜出生後１日目のマウスのネフロン前駆細胞をＦＡＣＳにより単離・回収することができる。
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞からのネフロン前駆細胞は、例えば、本発明者の公知の報告（非特許文献６；特許文献１）に従って作成できる。
【００３４】
本発明の増幅培養方法によりネフロン前駆細胞を培養すると、前駆細胞は継続して増殖でき、少なくとも５日間、好ましくは７日間、より好ましくは１０日以上、さらに好ましくは１２日以上、よりさらに好ましくは１５日以上、最も好ましくは１９日以上培養が可能である。
本発明の増幅培養方法によりネフロン前駆細胞を培養すると、マウスネフロン前駆細胞を用いた場合は、細胞数は、培養開始時と比較して、少なくとも１０倍以上、通常は３０倍以上、好ましくは５０倍以上、より好ましくは７０倍以上、さらに好ましくは１００倍以上、よりさらに好ましくは１０００倍以上の増幅が可能である。ヒトのネフロン前駆細胞を用いた場合は、細胞数は、培養開始時と比較して、少なくとも４倍以上、好ましくは１０倍以上の増幅が可能である。
本発明の増幅培養方法により培養したネフロン前駆細胞は、未分化状態を維持しており、また、ネフロンへの分化能を持っている。
【００３５】
本発明の増幅培養方法においては、培養開始時および／またはその培養期間において、細胞塊（細胞凝集体）を単一の細胞単位に分離することを必要としない。
ただし、純化した細胞（単一の細胞単位）から増幅した多くのネフロン前駆細胞を調製することが好ましい場合は、ネフロン前駆細胞を純化した後、本発明の増幅培養方法を用いて、効率良くネフロン前駆細胞を調製することができる。これに限定されないが、例えば、ヒトｉＰＳ細胞から誘導した組織からネフロン前駆細胞を単離し、細胞を純化した後、本発明の増幅培養方法を用いてネフロン形成能を有するネフロン前駆細胞を増幅培養することができる。
【００３６】
本発明の増幅培養方法においては、好ましくは、培養の途中、例えば、約７日目において、細胞塊（細胞凝集体）を複数の小さな細胞塊に分離し分割した後、引き続き培養を継続することにより、効率良く前駆細胞を増幅させることができる。
【００３７】
また、本発明の増幅培養方法により培養したネフロン前駆細胞は、凍結保存することも可能である。例えば、既成の細胞凍結保存溶液を使用して凍結保存することが可能であり、そのようにして保存したネフロン前駆細胞を用いて三次元のネフロン構造を再構成すること（例えば、糸球体と尿細管の形成）が可能である。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００３９】
（Ａ）材料と方法
（１−１）動物
バクテリア人工染色体技術によって作成されたトランスジェニックマウス、Ｓｉｘ２ＧＦＰＣｒｅは、アンドリュー・マクマホン（南カリフォルニア大学）により提供された。すべての動物操作は、熊本大学の実験動物委員会のガイドライン（＃のA27-018）にしたがって行った。
（１−２）ｉＰＳ細胞
ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）は、理研バイオリソースセンターから入手した。【００４０】
（２）マウス胚腎臓からのネフロン前駆細胞の単離および増幅
Ｓｉｘ２プロモーター下でＧＦＰを発現する系統であるＳｉｘ２−ＧＦＰマウスを用いた。胎生１１．５日目（Ｅ１１．５）のＳｉｘ２−ＧＦＰマウスの胎児の腎臓を摘出し、後腎間葉（ＭＭ）を、コラゲナーゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ）を用いて尿管芽から単離し、次いで、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、ＣａＣｌ2、およびＮａＨＣＯ3を含むＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ＨＢＳＳ）で洗浄した。単離したＭＭは、トリプシン処理（０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ）し、緩衝液で洗浄後、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＨＢＳＳ、１％ＢＳＡ、０．０３５％ ＮaＨＣＯ3、および１μｇ／ｍｌ ヨウ化プロピジウム）中に懸濁した。Ｅ１５．５ Ｓｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞の単離は、腎臓を３７℃で１０分間、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡでンキュベートし、そして細胞を、１０％ＦＣＳを含む冷却ＤＭＥＭ中でピペッティングにより分離した。新生児腎臓を、コラゲナーゼＸＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ディスパーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、およびＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）の混合物を用いて、３７℃で１０分間、処理し、次いで、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで、３７℃にて５分間処理して、単一の細胞に分離した。【００４１】
Ｓｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞は、ＦＡＣＳＡｒｉａ ＳＯＲＰ（ＢＤ）によりソートし、Ｕ−底 ｌｏｗ−ｃｅｌｌｂｉｎｄｉｎｇ ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ）に、ウェルあたり３０００−１０，０００細胞を播種した。４８時間後、細胞凝集体をｉＭａｔｒｉｘ被覆プレート（０．５μｇ／ｃｍ2）に移し、さらに５日間培養した（ｄａｙ ７）。基礎培地は、トリヨードサイロニン、ヒドロコルチゾン、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、１０ ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、および５０ ｎｇ／ｍｌのＦｇｆ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）／Ｆｇｆ９（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した無血清 ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた（「ＦＴ」と略す）。最適条件（「ＣＤＢＬＹ」と略す）は、さらに、１μＭのＣＨＩＲ９９０２１（和光）、２．５μＭのＤＡＰＴ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｏｐｏｒｅ）、５ ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、５ ｎｇ／ｍｌのＬＩＦ（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ）、および１０μＭのＹ２７６３２（和光）を添加した。【００４２】
Ｄａｙ ８にて、培養した細胞を、解離溶液（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）を使用して小さな塊に分離し、３プレートに分けた。培地は、次の継代まで、３〜４日間、２４時間毎に交換した。培養細胞の総数は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動セルカウンター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で計数した。ネフロン前駆細胞の数は、ＦＡＣＳ分析によって同定したＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞の割合を用いて算出した。【００４３】
（３）マウスＥＳ細胞から作成したネフロン前駆細胞の単離
ＯＳＲ１−ＧＦＰマウスＥＳ細胞を、ネフロン前駆細胞の誘導に使用した。ＥＳ細胞は、フィーダーを除去するために２日間ゼラチンコートプレート上で継代した。次いで、細胞を、メーカー記載の５段階のプロトコルに従い、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により回収し、凝集させ、分化させた。誘導したスフェロイドは、ｄａｙ ８．５で回収し、０．２５％トリプシンＥＤＴＡを用いて解離させた。細胞は、正常マウス血清によってブロックし、そしてＦＡＣＳ緩衝液中で、抗ｉｎｔｅｇｒｉｎα８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および抗ＰＤＧＦＲα（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体で染色した。ＯＳＲ１−ＧＦＰ＋／ｉｎｔｅｇｒｉｎα８＋／Ｐｄｇｆｒα− フラクションをＦＡＣＳＡｒｉａ ＳＯＲＰ（ＢＤ）でソートし、ＣＤＢＬＹ添加培地で培養した。【００４４】
（４）培養マウス前駆細胞から作成したネフロン構造体の免疫染色
培養細胞は、ｌｏｗ−ｃｅｌｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｌａｔｅｓに播種し、４８時間かけて凝集体を形成させた。そして、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に浮遊させたＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で、胚の脊髄と７日間共培養した。培地は３日ごとに交換した。培養した移植片を１０％ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した。６ミクロンの切片にスライスし、脱パラフィンし、次いで、１２１℃で５分間、クエン酸（１０ｍＭ、ｐＨ６．０）により抗原回復を行った。切片は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックし、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした後、室温で１時間二次抗体とインキュベートした。共焦点画像は、ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によって撮像した。用いた一次抗体は以下の通りである：抗Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（ＢＤ）、抗Ｃａｄｈｅｒｉｎ６（グレゴリー・ドレスラー博士、Department of Pathology, University of Michigan, AnnArbor, MI 48109, USA、から供与）、抗ネフリン（Ｐｒｏｇｅｎ）、および抗ＷＴ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。用いた二次次抗体は以下の通りである：抗ウサギＡｌｅｘａ４８８、抗モルモットＡｌｅｘａ４６８、および抗マウスＡｌｅｘａ５９４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。【００４５】
（５）定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、そしてｃＤＮＡを、製造業者の指示にしたがって、ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により合成した。ＰＣＲ反応は、Ｔｈｕｎｄｅｒｂｉｒｄ ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅ（東洋紡）およびＤｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（タカラバイオ）を用いて行った。各マーカー遺伝子（β−Ａｃｔｉｎ，Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ，Ｌｅｆ１，Ｏｓｒ１，Ｐａｘ２，Ｓａｌｌ１，Ｓｉｘ２，およびＷｎｔ１）に対するｑＰＣＲ用のプライマー配列はタカラバイオから購入した。インキュベーション条件は、４５サイクルとした（９５℃で１５秒、６０℃で４５秒）。全てのサンプルはアクチン発現で正規化した。【００４６】
（６）統計分析
データは、スチューデントのt検定を用いて解析し、統計的有意性を評価した。全ての実験は、独立して、少なくとも３回実施し、そして代表的なデータを示した。結果は、平均±標準偏差として示した。【００４７】
Ｂ．実施例
実施例１：後腎間葉からネフロン前駆細胞の部分的増幅
培養時のマウスのネフロン前駆細胞の割合を正確に測定するために、Ｅ１１．５でＳｉｘ２−ＧＦＰマウスの腎臓から全ＭＭを単離し、ラットＭＭの培養に用いたようにしてＬＩＦとＹ２７６３２（合わせて「ＬＹ」と略す）の存在下で、フィブロネクチンコートしたプレート上で、個々の細胞に分散させることなく細胞塊として培養した（図１）。ＦＡＣＳ分析の結果、ＧＦＰ陽性細胞は、単離されたばかりのＭＭの２２．６％を占めていたが、７日の培養後には、割合は５．０％に低下した。ＬＩＦおよびＹ２７６３２の非存在下では、細胞のわずか０．１％がＧＦＰ陽性であった。このことは、ＬＹが、マウス前駆細胞にある種の効果を発揮しているが、ネフロン前駆細胞を維持するのに十分ではなかったことを明らかに示唆している。
７日目のＳｉｘ２とＰａｘ２の発現レベルは、新たに単離したＭＭのものと比べると低かった。発明者らは以前にＮｏｔｃｈ２の活性化が未成熟な前駆細胞の分化を引き起こしたことを報告している。そこで、発明者らは、ＬＹに加えて、Ｎｏｔｃｈ阻害剤ＤＡＰＴをテストした。また、コーティングのマトリックスとして、ラミニンのＥ８フラグメント（ｉＭａｔｒｉｘ）をフィブロネクチンと比較した結果、ｉＭａｔｒｉｘとＤＡＰＴの組み合わせが、Ｓｉｘ２の、そしてより顕著にはＰａｘ２のレベルを維持するのに有効であることが判った。結果を図２に示す。【００４８】
平行して、Ｗｎｔシグナル伝達は、ネフロン前駆細胞の維持および分化において重要な役割を果たしているので、ＷｎｔアゴニストＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）を試験した。ＬＩＦ単独（１−１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で限られた数のＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞が維持されたが、ＣＨＩＲは培養７日目でＧＦＰ陽性細胞を増加させ、ＬＩＦおよびＣＨＩＲの組み合わせは、ＧＦＰ陽性細胞の大量の増幅を示した。そこで、ｉＭａｔｒｉｘ被覆プレート上で、ＬＩＦ、Ｙ２７６３２、ＣＨＩＲ、およびＤＡＰＴ（「ＣＤＬＹ」と略す）の組み合わせを試験した結果、培養７日後で２６．３％が陽性となった。そこでさらに、ネフロン前駆細胞の重要な調節因子であるＢＭＰ７を追加した。その結果、顕著な細胞増殖が観察され、ＧＦＰ陽性細胞は４０．６％に増加した。結果を図３に示す。Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、Ｗｔ１およびＯｓｒ１を含むネフロン前駆細胞マーカーの発現レベルを確認したところ、この条件（ＣＤＬＹ＋ＢＭＰ７：「ＣＤＢＬＹ」と略す）では、他の条件よりも高く、新たに単離したＭＭのものとほぼ同等であった。それゆえ、混合細胞集団を含む全ＭＭから培養を開始しているが、この条件がネフロン前駆細胞の増幅に適していると判った。【００４９】
実施例２：マウスの胚および新生児の腎臓から精製したネフロン前駆細胞のインビトロでの増幅
上記の培養条件（ＣＤＢＬＹ）を、精製したＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性前駆細胞に適用した。細胞数の制限のために、最初は、Ｅ１１．５の代わりにＥ１５．５および新生児（Ｐ０）腎臓を用いて、ソートした結果、ＧＦＰ陽性細胞は、それぞれ、全細胞の２１．１％と８．１％であった。ソートした細胞はその後、スフェロイドを形成するために二日間培養し凝集させ、ｉＭａｔｒｉｘ被覆プレート上に播種し、上記した条件で５日間以上培養した。図４に示されるように、総細胞数は増加し（Ｅ１５．５で２．４倍、Ｐ０で１．７倍）、ＧＦＰ陽性の割合が非常に高いままであった（Ｅ１５．５で９４．３パーセント、Ｐ０で９０．９パーセント）。７日目でのネフロン前駆細胞マーカーの発現レベルを確認したところ、新たに単離したネフロン前駆細胞のものとほぼ同等であった。これらの培養細胞を、Ｗｎｔを発現する間葉上皮転換の強力な誘導因子である脊髄と組み合わせると、管形成が３日以内に観察され、誘導してから５日後に回収したときは多数の糸球体や尿細管が確認された。結果を図５に示す。糸球体は、丸形で、足細胞特異的マーカーである、Ｗｔ１とネフリンが陽性であった。誘導された尿細管は、カドヘリン６陽性近位およびカドヘリン１陽性遠位ドメインに領域化した。したがって、この培養条件は、よく発達した糸球体や尿細管で示される三次元ネフロン構造を形成する能力を維持しながら、精製したネフロン前駆細胞の増殖を可能にした。新生児からの前駆細胞が７日間維持されたことは注目すべきことである。なぜなら、マウスのネフロン前駆細胞は、出生後２〜３日以内には増殖するのをやめ、最終分化をする。したがって、この結果は、本発明の培養条件は、生体内でそれらの生理学的制限時間を超えて前駆細胞の増殖を維持していることを示している。【００５０】
実施例３：マウスネフロン前駆細胞の増殖に対するＬＩＦ、ＦＧＦ２／９、ＢＭＰ７、およびＷｎｔアゴニストの影響
上記の培養条件は、Ｅ１５．５またはＰ０から精製ネフロン前駆細胞の増殖を可能にするが、細胞数の増加は劇的ではなかった（約２倍、図４参照）。上記のように、最初は、Ｅ１１．５からの全ＭＭを用いて培養条件を最適化し、Ｅ１５．５やＰ０でも同様の結果が得られることを確認した。
次に、細胞数が制限されていたが、Ｅ１１．５でＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性前駆細胞を精製した。選別された細胞を、７日間、ｉＭａｔｒｉｘ被覆プレート上に凝集させ培養した結果、顕著な細胞数の増加（３０倍）および９５％以上のＧＦＰ陽性の残存が観察された（図６）。これらのデータは、後の発生段階のものと比較して、Ｅ１１．５でのＳｉｘ２陽性細胞は、より高い増殖能力を有していることを示唆している。【００５１】
上記の実施例では、全ての実験で使用培地（ＣＤＢＬＹ）はＦｇｆ２を含んでいた。これは、発明者らが最近報告したラットＭＭ培養の結果に基づいている。インビボにおいてＦｇｆ９がマウスネフロン前駆細胞の維持に必要であることが報告されているので、培養におけるＦｇｆ２およびＦｇｆ９の効果を比較した。Ｆｇｆ２およびＦｇｄｆ９の両方とも、非常に高い割合（９５％以上）でＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞を維持したが、より大きな細胞数の増加は、Ｆｇｆ９に基づく条件で観察された（３０倍対６０倍）（図６）。いずれの条件においても、ネフロン前駆細胞マーカー（Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、およびＷｔ１）の発現レベルは、Ｅ１１．５で新たに単離したＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞のものと同等であった（図６）。図７に示すように、脊髄と組み合わせた場合に、いずれの条件でも糸球体および尿細管が形成された。したがって、以下の実験では、Ｆｇｆ９を使用した。【００５２】
かなり最適化された条件（ＣＤＢＬＹ＋Ｆｇｆ９）にて、Ｅ１１．５からのＳｉｘ２陽性ネフロン前駆細胞を用いて、その維持および増殖のための各要素の必要性を再検討した。細胞はＦｇｆの非存在下で増殖することができなかったので、Ｆｇｆシグナリングが重要であると判った（図６参照）。カノニカルＷｎｔシグナルはネフロン前駆細胞の分化に関連しているので、次に、Ｗｎｔシグナル伝達の必要性を検討した。種々の濃度のＣＨＩＲとＢｍｐ７を試験した。結果を図８に示す。その結果、Ｓｉｘ２陽性細胞は、ＣＨＩＲに関し、１μＭまでは濃度依存的に増加したことがわかった。２．５μＭのＣＨＩＲ処理は、ＧＦＰ陰性細胞は増幅したが、前駆細胞の維持は出来なかった。これらのデータは、Ｗｎｔシグナルの最適な強度が自己複製のために必要であり、過剰な信号は増殖を伴う分化を誘導することを示唆している。また、Ｂｍｐ７については、高濃度（２５ｎｇ／ｍＬ超）はＧＦＰ＋前駆細胞を減少させたが、低濃度（５ｎｇ／ｍＬ）は至適であった。次に、培養条件におけるＬＩＦおよびＢｍｐ７の役割を検討した。結果を図９に示す。ＬＩＦを培地から除くと、全細胞数がわずかに増加したが、ＧＦＰ陽性細胞の割合が８４％に減少した。このことは、ＬＩＦが分化した細胞の増殖を阻害し得ることを示唆している。Ｂｍｐ７の非存在下では、全細胞数は減少したが、ＧＦＰ陽性の割合は高いままであった。ＬＩＦおよびＢＭＰ７を除くと、細胞数はＢＭＰ７のみが非存在下のものよりも多かったが、ＧＦＰ陽性細胞の割合は大幅に減少した。このことより、ＬＩＦは、分化を阻害するだけでなく前駆細胞および分化した細胞の両方の増殖を阻害することができ、一方、Ｂｍｐ７は、前駆細胞に対するＬＩＦの負の効果に対抗して前駆細胞の増殖を高め、それによってネフロン前駆細胞の自己複製を可能にすると推測できる。さらなるメカニズムの研究が必要であるが、これらのデータは、ＬＩＦおよびＢｍｐ７の両方が最適化された培養条件のために必要であることを示している。【００５３】
実施例４：マウスの１９日間継代胚性ネフロン前駆細胞を用いた三次元ネフロン構造の再構成
次に、一週間を超える前駆細胞の増幅を試みた。８日目での単一細胞への分散は、細胞のさらなる増殖を妨げた（データ示さず）。しかし、細胞を小さな塊（凝集体）に分離し３つのプレートに分割した場合は、細胞は成長を続け、１９日目まで３〜４日ごとに継代することができた（図１０参照）。１９日目で、細胞数が増加し、９７％がＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性のままであった（図１１）。最適条件（全ての因子を添加）では、１９日目でＧＦＰ陽性細胞の割合は９７％であった。ＬＩＦの非存在下では、ＧＦＰ陽性細胞の割合が８日目に急激に低下し、１９日で７３％であったが、逆に、ＬＩＦ存在の条件と比較した場合、全細胞数は増加した。結果を図１２に示す。このことは、図９の状況と同様である。興味深いことに、Ｂｍｐ７の非存在下では、ＧＦＰ陽性細胞の割合は、１１日目まで高いレベルに維持され、１９日目で５３％にまで急激に減少した。したがって、Ｂｍｐ７は、ＧＦＰ陽性細胞の長期維持に必須であった。培地からのＬＩＦおよびＢｍｐ７の排除はまた、全細胞数の増加にもかかわらず、Ｓｉｘ２陽性細胞を維持することができなかった（６８％）。したがって、ＬＩＦおよびＢｍｐ７の両方がネフロン前駆細胞の自己複製に必要であると判った。この最適化された状態（ＣＤＢＬＹ＋Ｆｇｆ９）では、Ｐａｘ２を除くネフロン前駆細胞マーカーのほとんどが、８日目より低いレベルであったが、１９日目で維持されていた（図１３）。さらに、図１４に示すように、培養細胞は、脊髄と組み合わせることにより、３次元ネフロン構造（糸球体と尿細管）を形成した。したがって、培養細胞は、１９日間、分化能を保持していた。【００５４】
インビボおよびインビトロでの増幅理論細胞数を計算した。結果を図１５に示す。インビボでは、Ｓｉｘ２−ＧＦＰ陽性ネフロン前駆細胞の割合は減少したが、１腎臓内の全細胞数は増加した。したがって、１腎臓における前駆細胞の絶対数は、Ｅ１１．５での２１２５７±７３４４から出生時に３８６５００±８４４０３へと増加したと推定された（１８倍の増加）。Ｅ１１．５での前駆細胞の同じ数の前駆体をインビトロに置くと、ＧＦＰ陽性細胞数が、８日目で１７０万（６０倍の増加）、１９日目で４５００万（１５００倍の増加）と推定された。よって、分化能を維持したまま、細胞数および期間の両者で、成体内での生理的限界を遥かに超えて、インビトロでのネフロン前駆細胞の増幅に成功した。【００５５】
以上の結果より、本発明の方法を用いて、マウス胎児のネフロン前駆細胞を、未分化の状態を維持したまま１９日間の培養で約１５００倍に増幅し、培養後も増幅した前駆細胞から糸球体と尿細管の３次元構造を形成できることが判った。【００５６】
実施例５：マウスＥＳ細胞から作成されたネフロン前駆細胞の増幅とネフロン形成能
発明者らは、マウスＥＳ細胞からネフロン前駆細胞の作成を最近報告している（非特許文献６；特許文献１）。そこで、上記の増幅培養方法が、ＥＳ細胞由来ネフロン前駆細胞に適用することができるかどうかを検討した。腎臓系統への分化能を持つＳｉｘ２−ＧＦＰ ＥＳ細胞は入手できなかったので、ネフロン前駆細胞およびそれに続いて三次元ネフロンに分化することが示されているＯｓｒ１−ＧＦＰ ＥＳ細胞を用いた。マウスＥＳ細胞から誘導された凝集体は、おそらくＥ１０．５−１１．５でのネフロン前駆細胞に相当する。Ｏｓｒ１は、ネフロン前駆細胞で発現されているばかりでなくこの段階での間質でも発現されているが、発達の後期段階ではその発現はネフロン前駆細胞に制限されている。したがって、ネフロン前駆細胞画分としてＯｓｒ１−ＧＦＰ＋／インテグリンα８＋／Ｐｄｇｆｒα−集団を選別し、それを７日間培養した。細胞は１５倍に増殖し、それらの９０．３パーセントはＯｓｒ１−ＧＦＰについて陽性のままであったが、インテグリンα８＋／Ｐｄｇｆｒα−画分の割合は６５．２パーセントに減少した。結果を図１６に示す。７日目のＯｓｒ１−ＧＦＰ陽性細胞におけるネフロン前駆細胞マーカー（Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、Ｗｔ１およびＯｓｒ１）の発現レベルは、Ｅ１１．５でのインビボでのＳｉｘ２陽性細胞のものと同等であった。これらの培養細胞は、脊髄により刺激されると、三次元ネフロン構造を形成した（図１７）。したがって、マウスＥＳ細胞から作成されたネフロン前駆細胞は、ネフロン形成能を維持したまま増幅でき、このことは、本発明の培養条件がしっかりしたものであることを示している。【００５７】
以上の結果より、本発明の方法により、マウスＥＳ細胞から誘導したネフロン前駆細胞は培養７日間で１５倍に増幅し、増幅した細胞が糸球体と尿細管の３次元構造を形成できることが判った。【００５８】
実施例６：ヒトｉＰＳ細胞から作成されたネフロン前駆細胞の増幅とネフロン形成
太口らの方法（非特許文献６）に沿ってヒトｉＰＳ細胞からネフロン前駆細胞を誘導する。その際に、ネフロン前駆細胞マーカーがＧＦＰで光るヒトｉＰＳ細胞を作成し、ＦＡＣＳによってネフロン前駆細胞を単離する。その後、上記の実施例と同様にし、本発明の記載の各化合物の濃度にて、ネフロン細胞の培養を行う。培養したネフロン前駆細胞を用い、上記実施例と同様にして、本発明者の公知の報告（非特許文献６；特許文献１）に従い、三次元ネフロン構造を形成する。
具体的には以下のようにして行った。概略を図１８に示す。
ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）から太口らの方法に従いヒトネフロン前駆細胞を作成した。培養１４日目の前駆体スフェロイドを、解離溶液（ＣＴＫ溶液、Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）で処理して、小さな塊に解離した。前駆体スフェロイドを約１／４に分割した塊を、ｉＭａｔｒｉｘ被覆プレートに播き、ＣＤＢＬＹを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＣＨＩＲ９９０２１：１μＭ、ＤＡＰＴ：２．５μＭ、ＢＭＰ７：５ｎｇ／ｍｌ、ＬＩＦ：５ｎｇ／ｍｌ、Ｙ２７６３２：１０μＭ）中で培養した。培地を毎日交換し、８日間培養を続けた。培養８日目のネフロン前駆体細胞数及びネフロン前駆細胞マーカーの遺伝子発現レベルを測定した結果を図１９に示す。８日間で細胞が４倍に増幅された。
培養８日目の細胞を用いて、ネフロンへの分化アッセイを行った。培養８日目のｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆体細胞を解離溶液（ＣＴＫ溶液）を用いて小さな塊に解離し、９６ウェルのＵ底ｌｏｗ−ｃｅｌｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｌａｔｅｓに播種して（ウェル当たり２００，０００細胞）２４−４８時間培養して凝集体を形成させ、次いで、胚の脊髄とともに共培養することにより、ネフロンを形成させた。その結果を図２０に示す。糸球体や尿細管が確認された。【００５９】
実施例７：ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞からのネフロン形成
実施例６と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞の増幅と増幅した細胞のネフロン形成を行った。但し、ネフロン前駆細胞の増幅は、ｉＭａｒｔｉｘ被覆プレートの代わりに９６ウェルのＵ底ｌｏｗ−ｃｅｌｌ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｌａｔｅｓを用いて培養１４日目の前駆体スフェロイドをタングステン針で４分割し、スフェロイド状で培養した。結果は、実施例６と同様に、ネフロンが形成され、多数の糸球体や尿細管が確認された（データは示さず）。【００６０】
実施例８：純化したヒトｉＰＳ細胞由来のネフロン前駆細胞の増幅培養
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７から太口らの方法に従い誘導したｓｐｈｅｒｏｉｄ様のネフロン前駆細胞を含む組織を１ｘＡｃｃｕｍａｘ細胞剥離液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に浸し、３７度、８分間処理し、解離した（２０個ｓｐｈｅｒｏｉｄ／５００μLのＡｃｃｕｍａｘ細胞剥離液）。その間、２分ごとに溶液を攪拌した。
反応後、すぐに遠心を行った（１０００ｒｐｍ，２分）。次いで、上清を取り除き、５００μＬのＦＡＣＳ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（ＨＢＳＳ，ＦＣＳ，ＤＮａｓｅ，ＣａＣｌ２, ＮａＨＣＯ3）で再懸濁した。
Ｉｎｔｅｇｒｉｎ α抗体およびＰＤＧＦＲ α抗体で細胞を処理し、ＦＡＣＳによりＩｎｔｅｇｒｉｎ α陽性／ＰＤＧＦＲ α陰性の細胞を単離した。
これをネフロン前駆細胞として、実施例６に記載の培地条件および培養条件にて培養した。具体的には、純化した１０，０００個のＩｎｔｅｇｒｉｎ α陽性のネフロン前駆細胞をｌｏｗ−ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｌａｔｅにて培養し凝集体を形成させた。その結果、８日間の培養で４０−６０倍に増幅した。さらに、増幅した細胞から尿細管、糸球体様の組織をマウス胎児の脊髄との共培養によって再構築することできた。【００６１】
上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の方法は、ネフロン前駆細胞の増幅培養法として有用である。また、本発明の方法により増幅培養されたネフロン前駆細胞は、腎臓発生学や再生の研究材料として、および再生医療の原料として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年4月20日(2017.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された哺乳動物由来のネフロン前駆細胞を培養して増やす方法であって、
以下の化合物：
（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、
（ｉｉ）Ｆｇｆ、
（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、
（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、
（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および
（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
を含む培地を用いることを特徴とする方法、
ここで、前記Ｂｍｐファミリー化合物は、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度にて培地中に含まれる。
【請求項２】
さらに、培地が（ｖｉｉ）Ｔｇｆ−αを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
前記培地が０．１μＭ〜５μＭの濃度のＷｎｔアゴニスト、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｍｐファミリー化合物、１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＦｇｆ、および、１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＩＦを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記培地が、１．０μＭ〜５０μＭの濃度のＲｏｃｋ阻害剤、および、１．０μＭ〜２０μＭの濃度のＮｏｔｃｈ阻害剤を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が、１ｎｇ／ｍｌ〜５００の濃度のＴｇｆαを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｂｍｐファミリー化合物が、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ７、およびＧＤＦ１１からなる群より選ばれる、請求項１、２、４〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ−３阻害剤から選ばれる、請求項１、２、４〜７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ１、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９、およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、請求項１、２、４〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＦｇｆがＦｇｆ９またはＦｇｆ２であり、前記ＢｍｐがＢｍｐ７であり、前記Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項１、２、４〜６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
前記ネフロン前駆細胞が、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞由来のネフロン前駆細胞である、請求項１、２、４〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
前記ネフロン前駆細胞が５日以上培養されることを特徴とする、請求項１、２、４〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
前記ネフロン前駆細胞が、培養開始時の細胞数と比較して４倍以上の細胞数まで培養されることを特徴とする、請求項１、２、４〜１２のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
前記培養が、ｉＭａｔｒｉｘまたはフィブロネクチン被覆プレート上で行われる、上記請求項１、２、４〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１５】
前記培養が、Ｕ底低細胞吸着プレートで行われる、請求項１、２、４〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
以下の化合物：
（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト、
（ｉｉ）Ｆｇｆ、
（ｉｉｉ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）、
（ｉｖ）Ｂｍｐファミリー化合物、
（ｖ）Ｒｏｃｋ阻害剤、および
（ｖｉ）Ｎｏｔｃｈ阻害剤
を含む、ネフロン前駆細胞を増幅させるための培地、
ここで、前記Ｂｍｐファミリー化合物は、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度にて培地中に含まれる。
【請求項１９】
さらに、（ｖｉｉ）Ｔｇｆαを含む請求項１８に記載の培地。
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
０．１μＭ〜５μＭの濃度のＷｎｔアゴニスト、１．０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢｍｐファミリー化合物、１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＦｇｆ、および、１ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌの濃度のＬＩＦを含む、請求項１８または１９に記載の培地。
【請求項２２】
前記培地が、１．０μＭ〜５０μＭの濃度のＲｏｃｋ阻害剤、および、１．０μＭ〜２０μＭの濃度のＮｏｔｃｈ阻害剤を含む、請求項２１に記載の培地。
【請求項２３】
１ｎｇ／ｍｌ〜５００の濃度のＴｇｆαを含む、請求項２２に記載の培地。
【請求項２４】
Ｂｍｐファミリー化合物が、Ｂｍｐ２、Ｂｍｐ４、Ｂｍｐ７、およびＧＤＦ１１からなる群より選ばれる、請求項１８、１９、２１〜２３のいずれか一つに記載の培地。
【請求項２５】
前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ−３阻害剤である、請求項１８、１９、２１〜２４のいずれか一つに記載の培地。
【請求項２６】
前記Ｆｇｆが、Ｆｇｆ１、Ｆｇｆ２、Ｆｇｆ９、およびＦｇｆ２０からなる群より選ばれる、請求項１８、１９、２１〜２３のいずれかに記載の培地。
【請求項２７】
前記ＷｎｔアゴニストがＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＦｇｆがＦｇｆ９またはＦｇｆ２であり、前記ＢｍｐがＢｍｐ７であり、前記Ｒｏｃｋ阻害剤がＹ２７６３２であり、前記Ｎｏｔｃｈ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項１８、１９、２１〜２３のいずれか一つに記載の培地。
【国際調査報告】
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2017010448.tif 000024
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