(57)【要約】本発明の目的は、グルコースに対して、グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼを作用させて、グルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料組成物を製造する方法において、該甘味料組成物におけるアルロースの含有比率を高める技術を提供することである。グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼを固定化し、固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．４９：１〜５．６１：１になるようにカラムに充填し、該カラムにグルコース溶液を通液することによって、グルコース、フラクトース及びアルロースを含み、且つアルロースの含有比率が高い甘味料組成物を連続的で効率的に製造できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料組成物の製造方法であって、
１）固定化グルコースイソメラーゼ及び固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．４９：１〜５．６１：１となるように充填したカラムを用意する工程Ａ、
２）グルコース溶液を前記カラムに通液して酵素反応を行う工程Ｂ、並びに
３）前記カラムの流出液を採取する工程Ｃ、
を含むことを特徴とする、甘味料組成物の製造方法。
【請求項２】
前記工程Ｂにおいて、空間速度を０．２〜１．０に設定してグルコース溶液の通液を行う、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記固定化グルコースイソメラーゼの比活性が１００Ｕ／ｍｌ以上である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記固定化アルロースエピメラーゼの比活性が２０Ｕ/ｍｌ以上である、請求項１〜３
のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記固定化アルロ−スエピメラーゼの固定化担体が、ポリスチレン系の弱塩基性陰イオン交換樹脂である、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記グルコース溶液が、更に水溶性マグネシウム塩を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記工程Ｃで得られた流出液を、更にグルコースとフラクトースの混合物を含む画分と、アルロースを含む画分とに別ける分離処理を行う分離工程、及び
前記分離工程で得られたアルロースを含む画分と前記工程Ｃで得られた流出液を混合する混合工程、
を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
異性化糖製品とアルロース製品を同時に製造する方法であって、
請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法を実施する第１工程、並びに
前記第１工程で得られた甘味料組成物を、更にグルコースとフラクトースの混合物を含む画分と、アルロースを含む画分に別ける分離処理を行う第２工程、
を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコースを原料として、酵素学的にグルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料組成物を製造する方法に関する。より具体的には、本発明は、グルコースを原料とし、グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼを使用して、グルコース、フラクトース及びアルロースを含み、且つアルロースの比率が高い甘味料組成物を効率的に製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
異性化糖は、糊化澱粉を酵素で加水分解してグルコース溶液とし、これにグルコースイソメラーゼを作用（異性化反応）させて製造される、グルコースとフラクトースを主成分とする甘味料である。グルコースイソメラーゼによる異性化反応は平衡反応であり、異性化糖に含まれるフラクトースの割合は通常４６％〜４２％である。更に、異性化糖の甘味不足を解消するために、精製フラクトース（前述した異性化糖に含まれるフラクトースをクロマト分離して純度を９５％程度にまで上げたもの）を添加する場合があるが、添加後の異性化糖に含まれるフラクトースは、通常５５％程度である。【０００３】
異性化糖は、その生産コストの安さからソフトドリンクや他の飲料に甘味料として幅広く大量に使用され、例えば日本では年間およそ１００万トン、アメリカでは年間およそ８００万トン消費されている。しかし一方で、異性化糖は、日本、アメリカ等をはじめとする先進国において、高血糖や過体重（肥満）、メタボリックシンドロームなどの原因として疑われている（非特許文献１）。フラクトースの肝臓での代謝はグルコースと比較して脂質生成を促進しやすく、高脂血症や肥満を誘発し易いからである。【０００４】
一方、フラクトースにＤ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼ（特許文献１）を作用させて生成されるアルロースは、別名をプシコースと称する希少糖の一種であり、エネルギー値がゼロ（非特許文献２）、食後血糖上昇抑制効果（非特許文献３）、抗肥満効果（非特許文献４）等の有用性が報告されており、生活習慣病予防素材として注目されている。そこで、アルロースと異性化糖を併用した甘味料組成物は、前述した異性化糖のリスクを低減できると期待されている。【０００５】
しかしながら、従来のアルロースの製造方法では、予め異性化糖からクロマト分離して精製したフラクトースを出発原料として使用するため、製造工程が複雑であり、原料コスト、反応コスト、プラント運転コストが高く、アルロースの効率的な工業生産は困難であった。【０００６】
そこで、アルロースと異性化糖を併用した甘味料組成物を簡易に製造する方法として、グルコースに対して、グルコースイソメラーゼとＤ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼを作用させる方法が提案されている。例えば、非特許文献５及び特許文献２には、グルコース溶液に対して、非固定化グルコースイソメラーゼ、固定化グルコースイソメラーゼ又は固定化グルコースイソメラーゼ菌体と、固定化Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼ又は非固定化Ｄ−ケトヘキソース・３−エピメラーゼとを、同時に又は連続的に作用させることにより、グルコース、フラクトース及びアルロースを含有する甘味料を製造できることが開示されている。しかしながら、非特許文献５及び特許文献２に開示されているバッチ式の製造ではアルロースの含有比率を高めることができても、連続的な製造ではアルロースの含有比率が低くなるという欠点がある。【０００７】
また、特許文献３には、アグロバクテリウム・トウメファシエンス由来のプシコースエピメラーゼ活性を有する組換え微生物をアルギン酸に固定化した固定化酵素と、固定化グルコースイソメラーゼとを用いて、グルコースからプシコースを製造する方法が開示されている。しかしながら、特許文献３では、プシコースの含有比率を高める制御ファクターとして、グルコース濃度及び反応温度が検討されているに止まり、その他の制御ファクターについては検討されていない。また、特許文献３では、固定化グルコースイソメラーゼとアルギン酸塩に固定化したプシコースエピメラーゼ活性を有する組換え微生物をそれぞれ別のカラムに充填して使用しているが、これは、固定化した両酵素の物性が相互に異なるために、両酵素を同じカラムに均質に充填して使用することが困難であること、及び同じカラムに充填した場合の酵素反応制御が困難であることを反映している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，７９，７７４−７７９，２００４．
【非特許文献２】Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，４８，７７−８０，２００２．
【非特許文献３】Ｊ．Ｎｕｔｒｉ．Ｓｃｉ．Ｖｉｔａｍｉｎｏｌ．，５４，５１１−５１４，２００８．
【非特許文献４】Ｉｎｔ．Ｊ．ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｎｕｔｒｉ．，６５，２４５−２５０，２０１４．
【非特許文献５】Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８０，１０１−１０３，１９９５．
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平６−１２５７７６号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／１４２８６０号
【特許文献３】特表２０１３−５０１５１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、アルロースが、グルコースイソメラーゼによるグルコースのフラクトースへの異性化反応を阻害することを見出しており、グルコースに対して、グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼを作用させてアルロースの含有比率が高い甘味料組成物を得るには、該阻害の影響を最小限に止めることが肝要になる。【００１１】
このような背景の下、本発明は、グルコースに対して、グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼを作用させて、グルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料組成物を製造する方法において、該甘味料組成物におけるアルロースの含有比率を高める技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼを固定化し、固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．４９：１〜５．６１：１になるようにカラムに充填し、当該カラムにグルコース溶液を通液することによって、グルコース、フラクトース及びアルロースを含み、且つアルロースの含有比率が高い甘味料組成物を連続的で効率的に製造できることを見出した。更に、かかる条件での製造において、グルコース溶液のカラム通液時の空間速度を０．２〜１．０に設定することにより、より一層効率的に甘味料組成物におけるアルロースの含有比率を向上させ得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。【００１３】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  グルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料組成物の製造方法であって、
１）固定化グルコースイソメラーゼ及び固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．４９：１〜５．６１：１となるように充填したカラムを用意する工程Ａ、
２）グルコース溶液を前記カラムに通液して酵素反応を行う工程Ｂ、並びに
３）前記カラムの流出液を採取する工程Ｃ、
を含むことを特徴とする、甘味料組成物の製造方法。
項２．  前記工程Ｂにおいて、空間速度を０．２〜１．０に設定してグルコース溶液の通液を行う、項１に記載の製造方法。
項３．  前記固定化グルコースイソメラーゼの比活性が１００Ｕ／ｍｌ以上である、項１又は２に記載の製造方法。
項４．  前記固定化アルロースエピメラーゼの比活性が２０Ｕ/ｍｌ以上である、項１〜
３のいずれかに記載の製造方法。
項５．  前記固定化アルロ−スエピメラーゼの固定化担体が、ポリスチレン系の弱塩基性陰イオン交換樹脂である、項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
項６．  前記グルコース溶液が、更に水溶性マグネシウム塩を含む、項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
項７．  前記工程Ｃで得られた流出液を、更にグルコースとフラクトースの混合物を含む画分と、アルロースを含む画分とに別ける分離処理を行う分離工程、及び
前記分離工程で得られたアルロースを含む画分と前記工程Ｃで得られた流出液を混合する混合工程、
を含む、項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
項８．  異性化糖製品とアルロース製品を同時に製造する方法であって、
項１〜６のいずれかに記載の製造方法を実施する第１工程、並びに
前記第１工程で得られた甘味料組成物を、更にグルコースとフラクトースの混合物を含む画分と、アルロースを含む画分に別ける分離処理を行う第２工程、
を含む、製造方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、グルコース溶液を所定のカラムに通液するという簡易な手法によって、グルコース、フラクトース及びアルロースを含み、且つアルロースの含有比率が高い甘味料組成物を連続的に製造することが可能になる。また、本発明の一態様では、アルロースの含有比率が１３％程度以上の甘味料組成物を効率的に製造できるため、カロリーゼロ、食後血糖上昇抑制、抗肥満等の効果を訴求する生活習慣病予防素材となり得る甘味料組成物を安価に提供することも可能になる。更に、本発明の一態様では、グルコース、フラクトース及びアルロースの含有比率が５０：３７：１３〜４３：４２：１５の甘味料組成物を得ることができるので、該甘味料組成物を分離処理に供してグルコース及びフラクトース含有画分とアルロース含有画分に分画するという簡易な手法で、既存の異性化糖製品と高純度アルロース製品を同時に得ることも可能になる。【００１５】
また、本発明の製造方法は、固定化酵素を充填したカラムにグルコース溶液を通液するという簡易な手法で行うことができ、既存の異性化糖設備をそのまま転用できるので、設備投資の負担は極めて少ないという利点もある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１の試験Ｎｏ.６で得られた流出液をクロマト分画し、各フラクションに含まれるグルコース、フラクトース及びアルロースの量を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の製造方法は、グルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料組成物の製造方法であって、１）固定化グルコースイソメラーゼ及び固定化アルロースエピメラーゼを酵素活性比率が１．４９：１〜５．６１：１となるように充填したカラムを用意する工程Ａ、２）グルコース溶液を前記カラムに通液して酵素反応を行う工程Ｂ、並びに３）前記カラムの流出液から、グルコース、フラクトース及びアルロースを含む画分を採取する工程Ｃを含むことを特徴とする。以下、本発明の製造方法について詳述する。
【００１８】
定義
本発明において、「グルコースイソメラーゼの酵素活性（Ｕ）」は、グルコースを基質として、反応温度５５℃で反応させ、１分間に１μｍｏｌのフラクトースを生成する酵素力を１単位としたものである。具体的には、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解した０．２Ｍのグルコース溶液２５００μｌ、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２１６７μｌ及びグルコースイソメラーゼ３３３μｌをスクリューキャップ付きの試験管に投入し、温水浴に浸して５５℃で１５分間反応させる。５質量％の塩酸水溶液を添加してｐＨ３．０〜２．５に調整して酵素を失活させ、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過した後、ＨＰＬＣ分析する。生成したフラクトースのピーク面積比を用いて酵素活性を算出する。
【００１９】
本発明において、「アルロースエピメラーゼの酵素活性（Ｕ）」は、アルロースを基質として、反応温度５５℃で反応させ、１分間に１μｍｏｌのフラクトースを生成する酵素力を１単位としたものである。具体的な測定手順は、基質がアルロースであること以外、上記のグルコースイソメラーゼの酵素活性の場合と同様である。
【００２０】
本発明において、「固定化グルコースイソメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ）」は、「日本工業規格  工業用グルコースイソメラーゼ  Ｋ７００２−１９８８」に記載された最大活性の測定方法に準じて測定される値である。具体的には、２ｍＭの硫酸マグネシウムと炭酸ナトリウムとを添加して、ｐＨ７．８〜８．０に調整した４５質量％のグルコース溶液を準備する。４℃で一昼夜膨潤させた固定化グルコースイソメラーゼを３０ｍｌ量り取り、これに前記グルコース溶液１００ｍｌを加えて、温水浴に浸して５０℃に保ちながら減圧し３０分以上脱気する。これをジャケット付きの内径２０ｍｍ、長さ４００ｍｍのガラス製カラムに充填した後に、ジャケット温度５５℃で前記グルコース溶液を送液ポンプを用いて下向流で通液する。流出液を採取し、その一部をイオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ分析し、生成したフラクトースのピーク面積比から異性化率を求める。この時、異性化率が０．３９〜０．４４の範囲に入るように流速を設定する。そして、次の式によって固定化グルコースイソメラーゼの比活性を求める。
Ｅ＝（ＦＳ／Ｗ）０．５０ｌｎ（０．５０／０．５０−Ｘ）
Ｅ：比活性（Ｕ／ｍｌ）
Ｆ：流速（ｍｌ／ｍｉｎ）
Ｓ：グルコース溶液におけるグルコース濃度（μｍｏｌ／ｍｌ）
Ｗ：固定化グルコースイソメラーゼの容量（ｍｌ）
Ｘ：異性化率
【００２１】
本発明において、「固定化アルロースエピメラーゼの比活性（Ｕ／ｍｌ）」は、グルコースの代わりにフラクトースを使用すること以外は、前記の固定化グルコースイソメラーゼの酵素活性の測定方法準じて測定される値である。具体的には、２ｍＭの硫酸マグネシウムと炭酸ナトリウムとを添加して、ｐＨ７．８〜８．０に調整した４５質量％のフラクトース溶液を準備する。４℃で一昼夜膨潤させた固定化アルロースエピメラーゼを３０ｍｌ量り取り、これに前記フラクトース溶液１００ｍｌを加えて、温水浴に浸して５０℃に保ちながら減圧し３０分以上脱気する。これをジャケット付きの内径２０ｍｍ、長さ４００ｍｍのガラス製カラムに充填した後に、ジャケット温度５５℃で前記フラクトース溶液を送液ポンプを用いて下向流で通液する。流出液を採取し、その一部をイオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ分析し、生成したアルロースのピーク面積比から異性化率を求める。この時、異性化率が０．２１〜０．２４の範囲に入るように流速を設定する。そして、次の式によって固定化アルロースエピメラーゼの比活性を求める。
Ｅ＝（ＦＳ／Ｗ）０．２７ｌｎ（０．２７／０．２７−Ｘ）
Ｅ：比活性（Ｕ／ｍｌ）
Ｆ：流速（ｍｌ／ｍｉｎ）
Ｓ：フラクトース溶液におけるフラクトース濃度（μｍｏｌ／ｍｌ）
Ｗ：固定化アルロースエピメラーゼの容量（ｍｌ）
Ｘ：異性化率
【００２２】
本発明において、甘味料組成物における各糖質（グルコース、フラクトース、アルロース）の含有比率とは、グルコース、フラクトース、及びアルロースの総質量（１００％）当たり、各糖質が占める質量の比率（％）である。
【００２３】
本発明において、「空間速度（ＳＶ）」とは、溶液をカラムに通液する速度の単位であり、「空間速度（ＳＶ）＝通液量（ｍｌ）／カラム体積（ｍｌ）／時間（ｈ）」にて算出される。
【００２４】
工程Ａ
工程Ａでは、固定化グルコースイソメラーゼ及び固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．４９：１〜５．６１：１となるように充填したカラムを用意する。
【００２５】
（固定化グルコースイソメラーゼ）
グルコースイソメラーゼとは、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースとの相互変換を触媒し得る酵素である。本発明で使用されるグルコースイソメラーゼの由来については、特に制限されず、微生物、動物及び植物等のいずれの由来であってもよい。グルコースイソメラーゼの由来微生物としては、例えば、Bacillus coagulans、Streptomyces griseofuscus、Streptomyces rubinosus、Streptomyces murinus等が例示される。また、本発明で使用されるグルコースイソメラーゼは、前記生物から単離したものであってもよく、また遺伝子工学的手法によって製造された組み換え体であってもよい。固定化されていないグルコースイソメラーゼは、例えば、ダウ・ケミカル社等から市販されており、本発明では市販品のグルコースイソメラーゼを固定化して使用してもよい。
【００２６】
また、本発明において固定化グルコースイソメラーゼとして、精製品又は粗精製品のグルコースイソメラーゼを固定化したものを使用してもよく、またグルコースイソメラーゼを産生する微生物を固定化したものを使用してもよい。
【００２７】
グルコースイソメラーゼの固定化に使用される固定化用担体については、当該酵素の固定化が可能であることを限度として、特に制限されないが、例えば、イオン交換樹脂、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、アクリル、キトサン、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子担体；セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、セラミックス等の無機担体等が挙げられる。また、微生物を固定化酵素として使用する場合は、４級化ピリジン化合物（例えば電気化学工業株式会社製の商品名ＤＡＣ）やアルギン酸塩を固定化用担体として使用することができる。これらの固定化用担体は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの固定化用担体の中でも、固定化によるグルコースイソメラーゼの活性維持、安価で圧損失が少なく取り扱いが容易等の観点から、好ましくはイオン交換樹脂、より好ましくは弱塩基性陰イオン交換樹脂、更に好ましくはポリスチレン系の弱塩基性陰イオン交換樹脂が挙げられる。
【００２８】
固定化グルコースイソメラーゼは、グルコースイソメラーゼ又はそれを産生する微生物を公知の手法で固定化用担体に固定化することにより得ることができる。例えば、固定化用担体としてイオン交換樹脂を使用してグルコースイソメラーゼを固定化するには、以下の手順に従って行うことができる。イオン交換樹脂をカラムに充填し、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で所定濃度に希釈したグルコースイソメラーゼ溶液を、１〜１６時間程度、循環しながら吸着させる。次いで、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、固定化グルコースイソメラーゼを得る。また、このようにグルコースイソメラーゼを固定化した後に、必要に応じて、グルタルアルデヒドやポリエチレンイミン等で架橋させて、グルコースイソメラーゼの固定化を強固にしてもよい。
【００２９】
固定化グルコースイソメラーゼの比活性については、後述する固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼとの酵素活性の比率を充足する範囲で適宜設定すればよいが、製造される甘味料組成物においてアルロースの含有比率をより一層向上させるという観点から、１００Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは１００〜１５０Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは１００〜２００Ｕ／ｍｌが挙げられる。特に、固定化グルコースイソメラーゼの比活性が前述する範囲を充足し、更に工程Ｂにおけるグルコース溶液を通液する際の空間速度を後述する範囲に設定することにより、製造される甘味料組成物におけるアルロースの含有比率が１３％以上になり、グルコース、フラクトース及びアルロースの含有比率が５０：３７：１３〜４３：４２：１５の甘味料組成物を効率的に製造することが可能になる。
【００３０】
（固定化アルロースエピメラーゼ）
アルロースエピメラーゼとは、Ｄ−フルクトースとアルロースとの相互変換を触媒し得る酵素である。本発明で使用されるアルロースエピメラーゼの由来については、特に制限されず、微生物、動物及び植物等のいずれの由来であってもよい。例えば、アルロースエピメラーゼは、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ  Ｍ３０株（寄託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−１１１１）によって産生されることが知られており、本発明では、該微生物由来のアルロースエピメラーゼを使用することができる。アルロースエピメラーゼの由来微生物としては、例えば、Pseudomonus cichorii、Agrobacterium tumefaciens、Clostridium sp、Clostridium scindens、Clostridium bolteae、Ruminococcus sp、Clostridium cellulolyticum等が挙げられる。また、本発明で使用されるアルロースエピメラーゼは、前記生物から単離したものであってもよく、また遺伝子工学的手法によって製造された組み換え体であってもよい。
【００３１】
また、本発明において固定化アルロースエピメラーゼとして、精製品又は粗精製品のアルロースエピメラーゼを固定化したものを使用してもよく、またアルロースエピメラーゼを産生する微生物を固定化したものを使用してもよい。
【００３２】
アルロースエピメラーゼの固定化に使用される固定化用担体については、当該酵素の固定化が可能であることを限度として、特に制限されないが、例えば、イオン交換樹脂、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、アクリル、キトサン、疎水吸着樹脂、キレート樹脂、合成吸着樹脂等の有機高分子担体；セライト、ケイソウ土、カオリナイト、シリカゲル、モレキュラーシーブス、多孔質ガラス、活性炭、セラミックス等の無機担体等が挙げられる。また、微生物を固定化酵素として使用する場合は、４級化ピリジン化合物（例えば電気化学工業株式会社製の商品名ＤＡＣ）やアルギン酸塩を固定化担体として使用することができる。これらの固定化用担体は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの固定化用担体の中でも、固定化によるアルロースエピメラーゼの活性維持、安価で圧損失が少なく取り扱いが容易等の観点から、好ましくはイオン交換樹脂、より好ましくは弱塩基性陰イオン交換樹脂、更に好ましくはポリスチレンジビニルベンゼン系の弱塩基性陰イオン交換樹脂が挙げられる。弱塩基性陰イオン交換樹脂のイオン交換基としては、例えば３級アミンが挙げられる。
【００３３】
固定化アルロースエピメラーゼは、アルロースエピメラーゼ又はそれを産生する微生物を公知の手法で固定化用担体に固定化することにより得ることができる。例えば、固定化用担体としてイオン交換樹脂を使用して、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ由来のアルロースエピメラーゼを固定化するには、以下の手順に従って行うことができる。先ず、０．５％Ｄ−アルロースを含む最少塩培地（ＭＳＭ培地）にＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓを植菌し、培養を行う。得られた培養液から遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄する。次いで、洗浄した菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、そこへ湿潤菌体重量当たり１０重量％程度のリゾチーム及び湿潤菌体重量当たり５重量％程度の塩化ナトリウムを加え、３７℃で１２０分間程度加熱して酵素の抽出反応を行う。その後、更に５５℃で１５分間程度の加熱を行い、非耐熱性の酵素を失活させ、遠心分離上清を回収し、粗酵素液とする。別途、イオン交換樹脂をカラムに充填し、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で希釈した前記粗酵素溶液を、１時間〜１６時間程度、循環しながらイオン交換樹脂に通液して酵素を吸着させる。次いで、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、固定化アルロースエピメラーゼを得る。また、このようにアルロースエピメラーゼを固定化した後に、必要に応じて、グルタルアルデヒドやポリエチレンイミン等で架橋させて、アルロースエピメラーゼの固定化を強固にしてもよい。
【００３４】
固定化アルロースエピメラーゼの比活性については、後述する固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼとの酵素活性の比率を充足する範囲で適宜設定すればよいが、製造される甘味料組成物においてアルロースの含有比率をより一層向上させるという観点から、２０Ｕ／ｍｌ以上、好ましくは２０〜１５０Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは２５〜８０Ｕ／ｍｌが挙げられる。特に、固定化アルロースエピメラーゼの比活性が前述する範囲を充足し、更に工程Ｂにおけるグルコース溶液を通液する際の空間速度を後述する範囲に設定することにより、製造される甘味料組成物におけるアルロースの含有比率が１３％以上になり、グルコース、フラクトース及びアルロースの含有比率が５０：３７：１３〜４３：４２：１５の甘味料組成物を効率的に製造することが可能になる。
【００３５】
（固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼのカラムへの充填）
本発明において、グルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼは、それぞれ異なる固定化用担体に固定化され、固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼが混合されて同一のカラムに充填されていてもよく、また、同一の固定化用担体にグルコースイソメラーゼ及びアルロースエピメラーゼの双方を固定化し、これがカラムに充填されていてもよい。
【００３６】
本発明では、固定化グルコースイソメラーゼ：固定化アルロースエピメラーゼの活性比率（固定化グルコースイソメラーゼの比活性：固定化アルロースエピメラーゼの比活性）が１．４９：１〜５．６１：１となるように、両固定化酵素を同一のカラムに充填する。このような比率で固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼを併用することによって、アルロースの含有比率が高い甘味料組成物を効率的に製造することが可能になる。固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が前記範囲から外れる場合には、製造される甘味料組成物におけるアルロースの含有比率が低下し、該アルロースの含有比率を高めるには通液時の空間速度を極端に下げる必要があり、アルロースの含有比率が高い甘味料組成物を効率的に製造できなくなる。
【００３７】
より一層効率的にアルロースの含有比率が高い甘味料組成物を製造するという観点から、固定化グルコースイソメラーゼ：固定化アルロースエピメラーゼの活性比率として、好ましくは２．９４：１〜３．７４：１が挙げられる。
【００３８】
工程Ｂ
工程Ｂでは、グルコース溶液を前記カラムに通液して酵素反応を行う。グルコース溶液を前記カラムに通液することにより、グルコースの一部がグルコースイソメラーゼの作用を受けてフラクトースに可逆的に変換され、更に生成したフラクトースの一部がアルロースエピメラーゼの作用を受けてアルロースに可逆的に変換される。本発明の製造方法では、グルコースイソメラーゼとアルロースエピメラーゼによる酵素反応が一本のカラム内で可逆的・連続的に進行するため、グルコース、フラクトース及びアルロースを含む甘味料を効率的に製造することができる。
【００３９】
（グルコース溶液）
グルコース溶液は、基質となるグルコースを水に溶解させた溶液である。グルコース溶液に使用されるグルコースの由来については、特に制限されないが、例えば、澱粉を酵素で加水分解・精製して得られたグルコースが挙げられる。
【００４０】
グルコース溶液のグルコース濃度については、製造される甘味料組成物に備えさせるべき糖質濃度等に応じて適宜設定すればよいが、アルロースの含有比率が高い甘味料組成物を効率的に製造するという観点からは、Ｂｒｉｘ濃度として、通常３０〜５０％、好ましくは３５〜４５％が挙げられる。
【００４１】
また、グルコース溶液には、水溶性のマグネシウム塩が含まれていてもよい。このように水溶性マグネシウム塩が含まれていることによって、アルロースエピメラーゼの安定化が可能になる。グルコース溶液に添加される水溶性のマグネシウム塩としては、食品製造上許容されるものであることを限度として特制限されないが、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。これらの水溶性のマグネシウム塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００４２】
グルコース溶液における水溶性のマグネシウム塩の含有量については、特に制限されないが、例えば１〜５ｍＭ、好ましくは１．５〜２．５ｍＭが挙げられる。
【００４３】
グルコース溶液のｐＨについては、固定化グルコースイソメラーゼ及び固定化アルロースエピメラーゼが作用可能な範囲に適宜設定すればよいが、通常７．０〜８．５、好ましくは７．８〜８．０が挙げられる。グルコース溶液のｐＨの調整は、公知のｐＨ調整剤を使用して行うことができる。
【００４４】
（グルコース溶液の通液条件）
前記カラムへのグルコース溶液の通液条件については、カラムに充填されている固定化酵素の比活性、製造される甘味料組成物に備えさせるべきアルロースの含有比率等に応じて適宜調整すればよいが、製造される甘味料組成物におけるフラクトースとアルロースの含有比率をより一層効果的に高めるという観点から、通液するグルコース溶液の空間速度（ＳＶ）として、０．２〜１．０、好ましくは０．３〜０．５が挙げられる。
【００４５】
特に、固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの各比活性が前述する範囲を充足し、且つ通液するグルコース溶液の空間速度（ＳＶ）が前記範囲を満たすことによって、製造される甘味料組成物におけるフラクトースの含有比率が３７％以上且つアルロースの含有比率が１３％以上になり、グルコース、フラクトース及びアルロースの含有比率が５０：３７：１３〜４３：４２：１５の甘味料組成物を効率的に製造することが可能になる。製造される甘味料組成物のフラクトースの含有比率が３７％を下回ると、既存の異性化糖製品の組成比と異なり、そのままでは異性化糖製品として利用できなくなり、更になる分離処理等が必要になることがある。また、製造される甘味料組成物のアルロースの含有比率が１３％を下回ると、グルコースとフラクトースの組成比が製造される甘味料組成物の付加価値が低くなってしまい、別途、アルロースの添加等が必要になることがある。
【００４６】
また、空間速度を前述する範囲よりも高く設定すると、単位時間当たりの生産量が増加するが、空間速度が高すぎると、フラクトース及びアルロース含量比率が低くなる傾向が現れる。また、逆に、空間速度を前述する範囲よりも低く設定すると、単位時間当たりの生産量が減少し、製造効率が低下する傾向が現れる。即ち、本発明の製造方法において、前記カラムへ通液するグルコース溶液の空間速度を前記範囲に制御することにより、製造される甘味料組成物をそのまま異性化糖製品として利用可能になり、しかも付加価値の高いアルロースを効率的に高含有量で含有させることができ、更にその単位時間当たりの生産量を高めることができる。
【００４７】
また、前記カラムにグルコース溶液を通液する際の温度条件については、カラムに充填されている固定化酵素が作用可能な範囲で適宜設定すればよいが、例えば、カラム内の温度として、４５〜６５℃、好ましくは５５〜６０℃が挙げられる。カラム内の温度の調節は、例えば、保温ジャケットを用いてカラムを加温する方法等が挙げられる。
【００４８】
工程Ｃ、及びその後の工程
工程Ｃでは、前記カラムの流出液を採取する。斯して回収される流出液には、グルコース、フラクトース及びアルロースが含まれており、そのまま甘味料組成物として使用することができる。また、流出液のアルロースの含有比率が１３〜１５％である場合には、該流出液は、高血糖や過体重（肥満）、メタボリックシンドロームなどを誘発するリスクが低い低カロリー甘味料組成物としてそのまま使用することができる。
【００４９】
また、工程Ｃにおいて回収した流出液を、必要に応じて濃縮等を行い、含有する糖質濃度を高めてもよい。
【００５０】
更に、工程Ｃで回収された流出液を、疑似移動床クロマトグラフィー等の分離処理に供することにより、グルコースとフラクトースの混合物を含む画分と、アルロースを含む画分を分取することもできる。このようにして得られるアルロースを含む画分は、アルロースの純度が９０％以上であり、カロリーゼロ、食後血糖上昇抑制、抗肥満等の生活習慣予防素材として利用することができる。また、グルコースとフラクトースの混合物を含む画分は、そのまま既存の異性化糖製品（グルコース：フラクトース＝５８：４２〜５０：５０、重量比）として利用することができる。
【００５１】
また、前記のアルロースを含む画分を、工程Ｃで回収された流出液に添加することによって、アルロース含有比率を更に高めた甘味料組成物を得ることもできる。アルロース含有比率を高めた甘味料組成物は、低カロリーでアルロースの機能が増強された甘味料として利用することができる。
【実施例】
【００５２】
以下に実施例を示して本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以下、「比活性の比率（Ｉ：Ｅ）」との表記は、「固定化グルコースイソメラーゼの比活性：固定化アルロースエピメラーゼの比活性」を意味する。また、「活性比率」、「酵素活性比率」及び「酵素活性の比率」についても、同義である。【００５３】
製造例１
固定化酵素の調製と固定化酵素活性の測定
市販の固定化グルコースイソメラーゼをナガセケムテックス社（製品名：スイターゼ  ＧＮ）より入手した。この製品は、グルコースイソメラーゼ活性を有する微生物を担体に固定化した顆粒状の製剤であり、膨潤後の比活性は１１０．４３Ｕ／ｍｌであった。【００５４】
固定化グルコースイソメラーゼを独自に調製する場合は、以下の手順で行った。先ず、５０ｍｌのイオン交換樹脂（ピュロライト社製、商品名：ＰＵＲＯＬＩＴＥ  Ａ１０３Ｓ）をカラムに充填し、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、４５００Ｕの液状グルコースイソメラーゼ（ダウ・ケミカル社製、製品名：Ｓｐｅｚｙｍｅ  Ｇｉｆｐ）を含む５００ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、４℃で１６時間、循環しながらイオン交換樹脂に通液してグルコースイソメラーゼを吸着させた。次いで、２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄し、固定化グルコースイソメラーゼを得た。斯して得られた固定化グルコースイソメラーゼの比活性は１０７．６５Ｕ／ｍｌであった。【００５５】
固定化アルロースエピメラーゼは、次の（１）〜（３）に示す方法で調製した。（１）菌体培養と菌体回収：０．５％のアルロースを含む最少塩培地（ＭＳＭ培地）４ＬにＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ  Ｍ３０を植菌し、ジャーファメンターを用いて３０℃で２４時間、撹拌速度４００ｒｐｍ、通気量毎分０．１０Ｌ／培地Ｌで培養した。この培養液から遠心分離により菌体１００ｇ（湿重量）を回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。（２）粗酵素の抽出工程：得られた菌体１００ｇ（湿重量）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０００ｍｌに懸濁し、そこへ１０ｇ卵白リゾチーム（食品添加物、キューピー社製）及び５ｇ塩化ナトリウムを加え、３７℃で１２０分間加熱することにより、酵素の抽出反応を行った。その後、更に５５℃で１５分間の加熱を行い、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、３０分）により得られる上清を粗酵素液とした。（３）粗酵素の固定化：湿潤状態のイオン交換樹脂（ピュロライト社製、商品名：ＰＵＲＯＬＩＴＥ  Ａ１０３Ｓ）５０ｍｌをカラムに充填し、２ｍＭ硫酸マグネシウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、４５００単位のＤ−アルロース−３−エピメラーゼを含む５００ｍｌの２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を、４℃で１６時間、循環しながらイオン交換樹脂に通液して酵素を吸着させ、２ｍＭ硫酸マグネシウム含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄して固定化アルロースエピメラーゼを得た。固定化アルロースエピメラーゼの比活性は２９．５５Ｕ／ｍｌであった。【００５６】
実施例１
固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼを充填したカラムにグルコース溶液を通液して得られる甘味料組成物の確認（空間速度ＳＶ＝０．２条件下）
製造例１で準備した市販の固定化グルコースイソメラーゼ又は独自に調製した固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼとを、表１に示す量及び活性比率になるように均一混合し、ジャケット付きの内径３２ｍｍ、長さ３００ｍｍのガラス製カラムに充填した。【００５７】
【表１】
2016152819.tif 000002
【００５８】
２ｍＭの硫酸マグネシウム及び炭酸ナトリウムを添加してｐＨ７．８〜８．０に調整した３５質量％のグルコース溶液を準備した。前記カラムにグルコース溶液をジャケット温度５０℃、空間速度（ＳＶ）が０．２となるように制御しながら、上向流で連続的に通液した。流出液を２４時間間隔で３回採取し、採取毎に液量と採取時間から空間速度ＳＶを求めた。次に、採取した各流出液の一部を、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ  ＣＫ０８ＥＣ  三菱化学社製）分析に供し、グルコース、フラクトース及びアルロースのピーク面積比を求め、反応生成物の組成比を算出した。【００５９】
得られた結果を表２に示す。表２に示す通り、流出液は、採取時間が違っても、ほぼ均一であり、グルコース、フラクトース及びアルロースの組成比（重量比）は４３．６：４１．３：１５．１〜４３．４：４１．５：１５．１になっていた。【００６０】
【表２】
2016152819.tif 000003
【００６１】
実施例２
固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの混合比率が、グルコース、フラクトース及びアルロースの組成比に及ぼす影響（空間速度ＳＶ＝０．３〜０．４条件下）
製造例１で準備した市販の固定化グルコースイソメラーゼ又は独自に調製した固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼとを、表３に示す量及び活性比率になるように均一混合し、ジャケット付きの内径３２ｍｍ、長さ３００ｍｍのガラス製カラムに充填した。【００６２】
【表３】
2016152819.tif 000004
【００６３】
２ｍＭの硫酸マグネシウム及び炭酸ナトリウムを添加してｐＨ７．８〜８．０に調整した３５質量％のグルコース溶液を準備した。前記カラムにグルコース溶液をジャケット温度５０℃、空間速度（ＳＶ）が０．３〜０．４となるように制御しながら、上向流で連続的に通液した。流出液を２４時間間隔で３〜４回採取し、採取毎に液量と採取時間から空間速度ＳＶを求めた。次に、採取した各流出液の一部を、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ  ＣＫ０８ＥＣ  三菱化学社製）分析に供し、グルコース、フラクトース及びアルロースのピーク面積比を求め、反応生成物の組成比を算出した。【００６４】
得られた結果を表４に示す。この結果から、カラムに充填した固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．２５：１〜５．６１：１の範囲の場合には、流出液におけるアルロースの含有比率が１３％を超えており、アルロースの含有比率が高くなっていた。一方、カラムに充填した固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が１．２５未満：１、又は５．６１超：１の場合には、流出液におけるアルロースの含有比率は１３％に達していなかった。この結果から、流出液中のアルロースの含有比率を高めるには、カラムに充填する固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率を１．２５：１〜５．６１：１に設定する必要があることが確認された。【００６５】
【表４】
2016152819.tif 000005
【００６６】
実施例３
固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの混合比率が、グルコース、フラクトース及びアルロースの比率に及ぼす影響（空間速度ＳＶ＝０．５条件下）
空間速度ＳＶが高い条件下であってもアルロースの比率が１３％以上となる固定化酵素の活性比率を明らかにするために、以下の試験を行った。即ち、本試験では、単位時間当たりの生産量が高い効率的な製造方法の条件を検証した。
製造例１で準備した固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼとを、表５に示す量及び活性比率になるように均一混合し、ジャケット付きの内径２０ｍｍ、長さ４００ｍｍのガラス製カラムに充填した。【００６７】
【表５】
2016152819.tif 000006
【００６８】
２ｍＭの硫酸マグネシウム及び炭酸ナトリウムを添加してｐＨ７．８〜８．０に調整した３５質量％のグルコース溶液を準備した。前記カラムにグルコース溶液をジャケット温度５０℃、空間速度（ＳＶ）が０．５となるように制御しながら、上向流で連続的に通液した。流出液を２４時間間隔で３〜４回採取し、採取毎に液量と採取時間から空間速度ＳＶを求めた。次に、採取した各流出液の一部を、イオン交換樹脂による脱塩、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ  ＣＫ０８ＥＣ  三菱化学社製）分析に供しし、グルコース、フラクトース及びアルロースのピーク面積比を求め、反応生成物の組成比を算出した。【００６９】
得られた結果を表６に示す。この結果から、カラムに充填した固定化グルコースイソメラーゼと固定化アルロースエピメラーゼの活性比率が２．９４：１〜３．７４：１の範囲内にある場合には、空間速度が０．５と高い場合であっても、アルロースの含有比率が１３％以上の流出液が安定に得られることが明らかとなった。【００７０】
【表６】
2016152819.tif 000007
【００７１】
実施例４
異性化糖製品とアルロース製品の同時製造
クロマトグラフ分離向け陽イオン交換樹脂（商品名：ＣＲ１３１０、オルガノ社製）４００ｍｌをジャケット付きの内径４２ｍｍ、長さ５００ｍｍのガラス製カラムに圧密充填して６０℃に保持したカラムに、実施例２の試験Ｎｏ.７で得られた流出液（グルコース
：フラクトース：アルロースの組成比＝４５．２：４０．３：１４．５）２１．８６ｇを注入し、溶離液としての純水をＳＶ＝１．５で通液した。溶離液通液開始から１５分後以降の溶出液を、フラクションコレクターを用いて、３０秒毎に８８フラクションに分離・採取した。各フラクションの溶液重量（ｇ）、Ｂｒｉｘ（％）を測定した後、その一部を、フィルターろ過後、ＨＰＬＣ（分析カラム：ＭＣＩＧＥＬ  ＣＫ０８ＥＣ  三菱化学社製）分析し、グルコース、フラクトース及びアルロースのピーク面積比を求め、各フラクションの組成比とした。【００７２】
これらの測定結果から、各フラクションに溶出したグルコース、フラクトース及びアルロースの固形分量（ｇ）をそれぞれ算出した。その結果を図１に示す。図１から明らかなように、フラクション１〜４５とフラクション４６〜８８の前後半で分離・採取すると、前半のフラクション１〜４５側に、異性化糖（グルコース：フラクトース：アルロース＝５３．２：４５．６：１．２）を得ることができ、後半のフラクション４６〜８８側に、純度９１．５％のアルロース（グルコース：フラクトース：アルロース＝１．５：７．０：９１．５）を得ることができることが分かった。即ち、本結果から、前記実施例１〜３で得られた流出液を、イオン交換樹脂を用いて分画することにより、異性化糖製品とアルロース製品を同時に製造できることが明らかとなった。
【図１】
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【国際調査報告】
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