(57)【要約】  インターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法、及びインターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤を提供すること。  ＭＥＸ３Ｂ遺伝子又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の変化、及びＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを指標として、インターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法。
2018008750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の変化、及びＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを指標として、インターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項２】
前記指標が、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子を発現する細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、前記被験物質の有無に応じたＭＥＸ３Ｂ遺伝子又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の変化、及びＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能の変化よりなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病がインターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する重症喘息である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子若しくはＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の低下物質、又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の阻害物質を含む、インターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤。
【請求項５】
前記低下物質がＭＥＸ３Ｂ遺伝子中又は前記遺伝子の発現制御領域中に含まれる連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の剤。
【請求項６】
前記ＭＥＸ３Ｂ遺伝子中に含まれるオリゴヌクレオチドが、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソン中のコーディング領域若しくは非翻訳領域に含まれるオリゴヌクレオチド、又はＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン中に含まれるオリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の剤。
【請求項７】
前記低下物質がＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のコーディング領域又は非翻訳領域の連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ又は前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡである、請求項４に記載の剤。
【請求項８】
リポフェクション用担体を更に含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の剤。
【請求項９】
前記阻害物質がＭＥＸ３Ｂタンパク質に選択的に結合するアプタマー又は抗体である、請求項４に記載の剤。
【請求項１０】
前記疾病がインターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する重症喘息である、請求項４〜８のいずれか１項に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子：Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子：Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ又はｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ３  （ＣＳＦ  ３））、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法、及びＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性気道炎症は種々のアレルゲンに対するアレルギー性の疾患であると考えられてきた（例えば、非特許文献１）。
しかし、喘息が悪化して死に至るのはほとんどが高齢の患者であり、これらの重症喘息患者の気道炎症部位にはアレルギー反応により集積する好酸球ではなくむしろ感染防御に関わる好中球が多く見受けられるのが特徴である。近年の免疫学の進歩から、これら重症喘息患者におけるＴｈ１７型の免疫細抱（ＩＬ−１７を主に分泌して感染防御に対応する免疫反応を担う）が病態の根幹を担うことが明らかとなってきた（例えば、非特許文献２）。
重症患者ほど、サイトカインの一種である血清中のＩＬ−１７（インターロイキン１７）が高レベルであることも報告されている。ＩＬ−１７は肺組織からのケモカイン類（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５など）分泌を亢進させ、これらのケモカインは好中球を炎症部位に呼び寄せる。好中球浸潤は慢性炎症を繰り返し誘導し、平滑筋肥厚、気道粘膜線維化や粘膜下腺過形成などが進むと結果的には不可逆的な気道リモデリングが引き起こされる。このような状態になれば容易に呼吸困難に陥りやすくなり、治療が非常に困難になる。【０００３】
一方、ＩＬ−６は、炎症、造血、骨代謝、腫瘍増悪などに関与する重要なサイトカインであり、その活性は主に急性炎症から獲得免疫反応への移行や慢性炎症性疾患の発症に寄与することが知られている（例えば、非特許文献３）。
ＩＬ−６が、標的細胞表面に発現しているＩＬ−６受容体サブユニットとｇｐ１３０（シグナル伝達サブユニット）との複合体に結合することによりＩＬ−６細胞内シグナルが伝達され、そのシグナルによりＩＬ−６が誘導する様々な生命現象に深く関与する標的遺伝子を活性化することが知られている。
獲得免疫系の活性化においてはＩＬ−６シグナルはＴＧＦ−βシグナルと協調してＴｈ１７細胞を誘導する。重症喘息はステロイド耐性の病態を示し、その炎症部位には好中球の顕著な浸潤が見られるが、これらステロイド耐性重症喘息患者の血清中にはＩＬ−１７が顕著に高値で検出されることからＴｈ１７細胞の過剰な反応により重症喘息が引き起こされるということが近年判明している。
また、ＩＬ−１３、ＴＮＦ（中でも、ＴＮＦ−α）、Ｇ−ＣＳＦも、喘息の重症化に関与することが知られている（例えば、非特許文献４）。
ＩＬ−１３は、炎症性サイトカインとして末梢組織でのアレルギー性炎症をより増強する役割を担うことが知られており、アレルギー性喘息の主な要因であるアレルギー反応を促進するという側面のみならず、ステロイド剤が効かなくなるという喘息の難治化に関与することが知られている。またＩＬ−１３は、喘息のみならず、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎においてもその病態形成に関与している（例えば、非特許文献５、６）。【０００４】
ＴＮＦ（中でも、ＴＮＦ−α）は、炎症反応を誘発するシグナル因子であり、感染防御の観点では重要な因子であるが、一方で炎症が亢進することによる障害にも同時に関与することが知られている。すなわち様々な疾患でＴＮＦは病態の悪化に関与しており、主に関節疾患（関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎）、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、がん（卵巣がん、乳がん）、精神疾患（うつ、双極性障害、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症）、心血管疾患（心不全、動脈硬化）、呼吸器疾患（気管支喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害）、二型糖尿病、腎疾患（虚血性腎障害、移植後拒絶反応、糸球体腎炎）などに関与することが知られている（例えば、非特許文献７、８）。
また、Ｇ−ＣＳＦは顆粒球産出の促進、好中球の機能を高める作用があることが知られている。【０００５】
また、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５は炎症性ケモカインＣＸＣサブファミリーに属する。炎症性シグナルは各種血液細胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、肺胞上皮細胞などからのＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５分泌を活性化する（例えば、非特許文献９、１０）。
気道粘膜における過剰な炎症の亢進により肺組織からＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５が分泌された場合には、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５の受容体であるＣＸＣＲ２を高発現する好中球の浸潤が促される。結果的にはステロイド耐性の好中球浸潤が重症喘息を引き起こすことにより気道の不可逆的なリモデリングを誘導する慢性炎症を誘発する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３２６（１９９２），ｐｐ．２９８−３０４
【非特許文献２】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ２０１３（２０１３），ＡｒｔｉｃｌｅＩＤ６０９３９５，９ｐａｇｅｓ
【非特許文献３】Ｊ  Ａｓｔｈｍａ．２００８；４５  Ｓｕｐｐｌ  １：４１−４．
【非特許文献４】Ｔｈｏｒａｘ．  １９９９  Ｓｅｐ；５４（９）：８２５−５７．
【非特許文献５】Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  （Ｃａｉｒｏ）．２０１２；２０１２：３１６０４９
【非特許文献６】Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１１；３６５：１０８８−１０９８
【非特許文献７】Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８  Ｊａｎ；１２１（１）：５−１０
【非特許文献８】Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２００８  Ｊａｎ；２１４（２）：１４９−６０．
【非特許文献９】Ｔｈｏｒａｘ．２００７  Ｊｕｎ；６２（６）：４７５−８２．
【非特許文献１０】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１  Ｏｃｔ；３２（１０）：４５２−６０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように、近年、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５が重篤な疾病に関与することが明らかになってきた。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法、及びＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の機能が多岐にわたる生命現象を支配しており、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子がＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の発症に関わることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、本発明は以下の通りである。【０００９】
本発明の第１の態様は、
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の変化、及びＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを指標として、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法である。【００１０】
本発明の第２の態様は、
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子若しくはＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の低下物質、又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の阻害物質を含む、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の第１の態様に係るＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法は、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングすることができる。
本発明によれば、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスの胎児繊維芽細胞におけるＭＥＸ３Ｂ  ｍＲＮＡの発現レベルの検証結果を示す図である。
【図２】野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスの胎児繊維芽細胞におけるＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現レベルの検証結果を示す図である。
【図３】野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスの胎児繊維芽細胞におけるＣＸＣＬ５  ｍＲＮＡの発現レベルの検証結果を示す図である。
【図４】喘息誘発試験における野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスの各種免疫細胞の増加の検証結果を示す図である。
【図５】重症喘息誘発モデルを用いたギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチド投与試験における各種免疫細胞の増加の検証結果を示す図である。
【図６】各マウス群における各サイトカイン及びケモカインのｍＲＮＡの発現レベルのＲＴ定量的ＰＣＲ試験結果を示す図である。
【図７】各マウス群における肺組織の病理組織画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
【００１４】
＜ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法＞
本発明の第１の態様に係るスクリーニング方法において、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の変化、及びＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを指標とすることにより、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングすることができる。
ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングすることが好ましく、ＩＬ−６又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングすることがより好ましい。
【００１５】
ＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能としては、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及び／若しくはＣＸＣＬ５等種々のｍＲＮＡに結合してそれらｍＲＮＡの機能（つまりタンパク質への翻訳）を制御する機能、又はＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及び／若しくはＣＸＣＬ５等の発現を誘導する機能等が挙げられる。
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の低下、及びＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能の低下よりなる群から選択される少なくとも１つを指標とすることにより、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５発現増加に起因する疾病（例えば、重症喘息、関節リウマチ、大腸炎、クローン病、アトピー皮膚炎、全身性エリテマトーデス、がん等の中でもＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する重症喘息、関節疾患（関節リウマチ、乾癬性関節炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎）、糖尿病、炎症性腸疾患（大腸炎、クローン病）、アトピー皮膚炎、全身性エリテマトーデス、がん（卵巣がん、乳がん）、精神疾患（うつ、双極性障害、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症）、心血管疾患（心不全、動脈硬化）、呼吸器疾患（気管支喘息、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、急性肺障害）、二型糖尿病、腎疾患（虚血性腎障害、移植後拒絶反応、糸球体腎炎）等（例えば、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５  Ｊａｎ；２７（１）：２１−９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１６  Ｊａｎ；６（１）：８０−９５．等））の予防又は治療剤をスクリーニングすることができる。
また、上記低下の程度としては統計的に有意な低下であれば特に制限はないが、被験物質の非存在下（例えば、被験物質の投与前の系（例えば、野生型）、又は陰性対照（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子若しくはＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現又は機能に影響しない物質を投与した対照）の系）におけるＭＥＸ３Ｂ遺伝子若しくはＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現又は機能に対して、１／２以下であることが好ましく、１／４以下であることがより好ましく、１／１０以下であることがさらに好ましく、発現又は機能がなくなることが特に好ましい。
【００１６】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の増加、及びＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能の増加よりなる群から選択される少なくとも１つを指標とすることにより、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５発現低下に起因する疾病（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症等（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１０  Ｊｕｌ  ２３；３３（１）：１０６−１７．））の予防又は治療剤をスクリーニングすることができる。
また、上記増加の程度としては統計的に有意な増加であれば特に制限はないが、被験物質の非存在下（例えば、被験物質の投与前又は陰性対照の系）におけるＭＥＸ３Ｂ遺伝子若しくはＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現又は機能に対して、１．５倍以上であることが好ましく、２倍以上であることがより好ましい。
【００１７】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の低下、及びＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能の低下よりなる群から選択される少なくとも１つを指標とすることが好ましく、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子発現の低下を指標とすることがより好ましい。
スクリーニング方法としては、上記を指標とする限り、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、インシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）等の任意のスクリーニング方法であってもよい。スクリーニング方法の好ましい一例としては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子を発現する細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、上記被験物質の有無に応じたＭＥＸ３Ｂ遺伝子又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の変化、及びＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能の変化を指標として、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングすることが挙げられる。
【００１８】
第１の態様に係るスクリーニング方法において用いる細胞としては、マウス胚由来繊維芽細胞（マウス胎児繊維芽細胞；ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ（ＭＥＦ））であることが好ましい。
マウス胚由来繊維芽細胞は単純継代することで細胞老化（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）を誘導することができる。
ＭＥＦ系は細胞老化に伴う様々な生命現象の変化を検証するうえで用いられる手法の一つである。継代初期（例えば、ｐａｓｓａｇｅ３）では顕著に産生されない炎症性サイトカインやケモカインは継代後期（例えば、ｐａｓｓａｇｅ１３〜１５）では著しく誘導されることが知られている。気道粘膜の細胞老化の再構成系実験としてＭＥＦ細胞におけるＭＥＸ３Ｂ遺伝子の欠損とサイトカインないしケモカイン産生の変化との関係について解析することができる。
本発明者らは、ＭＥＸ３Ｂの発現が低下した細胞では、分泌因子（ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５等）が有意に低下し得ることを見出した。
ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ５は、上述のように重症喘息の病態に深く関与し得る。
【００１９】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列情報を基にすれば、インシリコでも各種のヒト組織におけるＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を検出することができる。また、インビボ、インビトロでも、例えば該遺伝子の一部又は全部の塩基配列を有するプローブまたはプライマーを利用することにより、各種のヒト組織におけるＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を検出することができる。ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現の検出は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット、サザンブロット等の常法により行うことができる。
また、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のｍＲＮＡレベルでの発現量の測定も、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロット、サザンブロット等の常法により行うことができる。
【００２０】
ＰＣＲを行なう場合、プライマーは、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のみを特異的に増幅できるものであれば特に限定されず、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の配列情報に基づき適宜設定することができる。例えば、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子又は上記遺伝子の発現制御領域の塩基配列中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして使用することができる。より具体的には、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子又は上記遺伝子の発現制御領域の塩基配列中の連続した１０〜６０残基、好ましくは１０〜４０残基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００２１】
上記したオリゴヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成機を用いて常法により製造することができる。該オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、例えば、検出したいｍＲＮＡの一部の塩基配列において、５’末端側の塩基配列に相当するセンスプライマー、３’末端側の塩基配列に相当するアンチセンスプライマー等を挙げることができる。センスプライマー及びアンチセンスプライマーとしては、それぞれの融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのないオリゴヌクレオチドであって、１０〜６０塩基程度のものが挙げられる、１０〜４０塩基程度のものが好ましい。また、本発明においては、上記したオリゴヌクレオチドの誘導体を用いることも可能であり、例えば、該オリゴヌクレオチドのメチル体やホスホロチオエート体等を用いることもできる。
【００２２】
またＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現量の測定は、後述の抗体を用いたウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡ等の通常の免疫分析により行なうことができる。具体的には、モレキュラークローニング第２版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。
また、ＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能の変化の分析は、ＭＥＸ３Ｂタンパク質のｍＲＮＡへの結合能の有無または程度の測定、ＭＥＸ３Ｂタンパク質が結合するｍＲＮＡの機能発現の有無または程度の測定、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及び／又はＣＸＣＬ５発現の有無または程度を測定することにより分析することができる。
ＭＥＸ３Ｂタンパク質のｍＲＮＡへの結合能の有無または程度の測定は、競争的阻害試験等任意の分析でおこなうことができる。
ＭＥＸ３Ｂタンパク質が結合するｍＲＮＡの機能発現の有無または程度についてのタンパク質レベルでの発現量の測定は、ウェスタンブロット又はＥＬＩＳＡ等の通常の免疫分析により行なうことができる。ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及び／又はＣＸＣＬ５発現のｍＲＮＡレベルでの発現量の測定は、ノザンブロット、サザンブロット又はＲＴ−ＰＣＲ等の常法により行うことができる。具体的には、モレキュラークローニング第２版又はカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された当業者に公知の常法により行うことができる。
【００２３】
本発明の第１の態様に係るスクリーニング方法に供される被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、核酸分子でもよいし、抗体でもよく、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。後述するゲノム編集用の人工ヌクレアーゼであってもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
被験物質は、好ましくは低分子化合物（例えば、化合物ライブラリー）、核酸分子、ゲノム編集用の人工ヌクレアーゼ又は抗体であり、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子又はタンパク質に対して特異性が高い観点から、核酸分子又は抗体がより好ましく、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子（エクソン中のコーディング領域（ＣＤＳ）若しくは非翻訳領域（ＵＴＲ）又はイントロン）中又は上記遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸分子又はＭＥＸ３Ｂタンパク質に選択的に結合するアプタマー又は抗体であることが更に好ましい。
【００２４】
（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子）
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子はエクソン１、イントロン及びエクソン２を含み、この構成はヒト、マウス、その他の哺乳類において高度に保存されている。また、エクソン１及びエクソン２にはＣＤＳ及びＵＴＲが含まれる。
エクソン中のアミノ酸をコードしない非翻訳領域（ＵＴＲ）としては、開始コドンより上流に５’ＵＴＲが存在し、終始コドンより下流に３’ＵＴＲが存在する。
ヒトＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡをコードするヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子は後記の配列番号１で表される配列を有する。
配列番号１において、４３７〜２１４６番目の塩基配列がＣＤＳであり、１〜４３６番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２１４７〜３５３２番目の塩基配列が３’ＵＴＲである。
後記の配列番号２はヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子の転写開始点から上流約３６キロ塩基の発現制御領域を含む配列を示す。後記の配列番号３はヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域の８３６塩基を示す。ヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子において、上記イントロン領域は、配列番号１で表される配列における６９４番目の塩基と６９５番目の塩基との間に存在する。
配列番号１５は、スプライシング前のヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡをコードする塩基配列を示す。配列番号１５で表されるヒトＭＥＸ３ＢのプレｍＲＮＡをコードする配列における４３７〜６９２番目及び１５２９〜２９８２番目の塩基配列がＣＤＳであり、１〜４３６番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２９８３〜４３６８番目の塩基配列が３’ＵＴＲであり、６９３〜１５２８番目の領域が、配列番号３で表されるヒトＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン領域に相当する。
【００２５】
マウスＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡをコードするマウスＭＥＸ３Ｂ遺伝子は後記の配列番号４で表される配列を有する。
配列番号４において、３１９〜２０４９番目の塩基配列がＣＤＳであり、１〜３１８番目の塩基配列が５’ＵＴＲであり、２０５０〜３４１６番目の塩基配列が３’ＵＴＲである。
また、ＭＥＸ３Ｂタンパク質（例えば、後記の配列番号５又は６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質）をコードする遺伝子は全てＭＥＸ３Ｂ遺伝子に属する。
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子は元来ＴＧＦ−βにより活性化される遺伝子として同定され、その後の解析から、ＭＥＸ３Ｂタンパク質は種々のｍＲＮＡに結合してそれらｍＲＮＡの機能（つまりタンパク質への翻訳）を制御する分子であることが知られている（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００７；３５（４）：１２８９−３００．）。
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の具体例としては、以下の（ａ）又は（ｂ）の何れかに記載の遺伝子が挙げられ、ヒトの疾病に対する予防又は治療剤をスクリーニングする観点、及びヒト由来の遺伝子をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、下記（ａ）の遺伝子であることが好ましい。
（ａ）配列表の配列番号１又は４に記載の塩基配列からなる遺伝子、
（ｂ）配列表の配列番号１又は４に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、かつＴＧＦ−βにより活性化される遺伝子、又はＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及び／若しくはＣＸＣＬ５の発現を誘導する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【００２６】
本明細書で言う「塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列」における「１もしくは数個」の範囲は特には限定されないが、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、更に好ましくは１から５個程度を意味する。
上記のＤＮＡ変異の程度としては、例えば、配列表の配列番号１又は４に記載したＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有するものが挙げられ、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００２７】
（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の取得）
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書の配列表の配列番号１、４又は１５及び５又は６に記載した塩基配列およびアミノ酸配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、ヒトｃＤＮＡライブラリー（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子が発現される適当な細胞より常法に従い調製したもの）から所望クローンを選択することにより、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子を単離することができる。
ＰＣＲ法によりＭＥＸ３Ｂ遺伝子を取得することもできる。例えば、ヒト培養細胞由来の染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１又は４に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行う。
ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
上記したブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。
【００２８】
本明細書中上記した、配列表の配列番号１又は４に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加された塩基配列からなり、ＴＧＦ−βにより活性化される遺伝子、又はＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及び／若しくはＣＸＣＬ５の発現を誘導および制御する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子（変異遺伝子）は、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することもできる。例えば、配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡを利用し、これらＤＮＡに変異を導入することにより変異ＤＮＡを取得することができる。具体的には、配列番号１又は４に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２９】
上述の通り、配列表の配列番号１又は４に記載したＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列において、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が、ＴＧＦ−βにより活性化されるタンパク質又はＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及び／若しくはＣＸＣＬ５の発現を誘導する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、配列番号１又は４に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の範囲内のものである。
【００３０】
（ＭＥＸ３Ｂタンパク質）
ＭＥＸ３Ｂタンパク質は、以下の何れかのタンパク質である。
（ａ）配列表の配列番号５又は６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列表の配列番号５又は６に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ特定のｍＲＮＡに対する結合活性を有するタンパク質、又はＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及び／若しくはＣＸＣＬ５の発現を誘導又は制御する活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）配列表の配列番号５又は６に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつＴＧＦ−βにより活性化されるタンパク質、又はＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及び／若しくはＣＸＣＬ５の発現を誘導又は制御する活性を有するタンパク質
ヒトの疾病に対する予防又は治療剤をスクリーニングする観点、及びヒト由来のタンパク質をそのまま用いることができ余計な形質転換等が要求されない観点から、上記（ａ）のタンパク質であることが好ましい。
配列番号５は、ヒトＭＥＸ３Ｂタンパク質のアミノ酸配列を表す。配列番号６は、マウスＭＥＸ３Ｂタンパク質のアミノ酸配列を表す。
【００３１】
本明細書で言う「アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から５個、さらに好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、アミノ酸の相同性が９５％以上であることを意味し、相同性は好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上である。
上述の通り、配列表の配列番号１又は４に記載の塩基配列を有する遺伝子と相同性の高い変異体遺伝子にコードされるタンパク質であって、特定のｍＲＮＡに対する結合活性を有する生理活性タンパク質、又はＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及び／若しくはＣＸＣＬ５の発現を誘導又は制御する活性を有する生理活性タンパク質は全て本発明の範囲内のものである。
タンパク質の構成要素となるアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるものであるが、実質的にタンパク質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。
【００３２】
従って、配列表の配列番号５又は６に記載したＭＥＸ３Ｂのアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異タンパク質であっても、その変異がＭＥＸ３Ｂの３次元構造において保存性が高い変異であって、その変異タンパク質がＭＥＸ３Ｂと同様に、特定のｍＲＮＡに対する結合活性を有する生理活性タンパク質、又はＩＬ−６及び／若しくはＣＸＣＬ５の発現を誘導又は制御する活性を有する生理活性タンパク質であれば、これらは全てＭＥＸ３Ｂの範囲内に属する。
ＭＥＸ３Ｂタンパク質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、生体試料又は培養細胞などから単離した天然由来のタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換えタンパク質でもよい。
【００３３】
＜ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤＞
第２の態様に係るＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤（以下、単に「第２の態様に係る予防又は治療剤」ともいう。）は、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子若しくはＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の低下物質、又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の阻害物質を含む。
第２の態様に係る予防又は治療剤は、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤であることが好ましく、ＩＬ−６又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤であることがより好ましい。
【００３４】
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子若しくはＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の低下物質としては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子（エクソン中のＣＤＳ若しくはＵＴＲ又はイントロン）中又は上記遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
上述のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入することによりＭＥＸ３Ｂ遺伝子の転写や翻訳を抑制することによりＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病を予防又は治療することができる。
例えば、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子（エクソン中のＣＤＳ若しくはＵＴＲ又はイントロン）中又は上記遺伝子の発現制御領域中に含まれるオリゴヌクレオチドと、それと相補的な上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとが、細胞に導入した後にハイブリッド形成することにより、生じたハイブリッド二本鎖に特異的なヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ）によりＭＥＸ３ＢのｍＲＮＡが分解されＭＥＸ３Ｂ遺伝子の転写や翻訳を抑制することができる。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列（エクソン中のＣＤＳ若しくはＵＴＲ又はイントロン）中又は上記遺伝子の発現制御領域中の連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、少なくとも１１ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、少なくとも１２ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましく、少なくとも１３ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが特に好ましく、少なくとも１４ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが最も好ましい。
また、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基長の上限値としては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列（エクソン中のＣＤＳ若しくはＵＴＲ又はイントロン）中又は上記遺伝子の発現制御領域中の連続する４０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましく、連続する３０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることがより好ましく、連続する２５ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが更に好ましく、連続する２０ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが特に好ましく、連続する１７ヌクレオチド以下のオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが最も好ましい。
【００３５】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、ホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有するヌクレオチドを少なくとも１つ含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。
例えば、ヌクレオチド同士をつなぐリン酸ジエステル結合部がホスホロチオエート構造を有することにより、ヌクレアーゼ耐性を獲得することができ、また、疎水性が向上することから細胞内又は核内への取り込みも向上することができる。
また、ヌクレオチドの糖部が、２’，４’−ＢＮＡ（２’，４’−Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ；別名ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ））、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等の架橋構造、２’−Ｏ−メチル化、２’−Ｏ−メトキシエチル化（２’−ＭＯＥ）等のアルコキシ構造を有することにより、ヌクレアーゼ耐性獲得及びｍＲＮＡの結合能を向上することができる。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオチド同士をつなぐ少なくとも１つのリン酸ジエステル結合部がホスホロチオエート構造を有することが好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のうちの５０％以上がホスホロチオエート構造を有することがより好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のうちの７０％以上がホスホロチオエート構造を有することが更に好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合のうちの９０％以上がホスホロチオエート構造を有することが特に好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチド中の全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート構造を有することが最も好ましい。
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、少なくともいずれか一方の末端のヌクレオチドが架橋構造又はアルコキシ構造を有することが好ましく、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端のヌクレオチドが架橋構造又はアルコキシ構造を有することがより好ましく（いわゆるギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）型アンチセンスオリゴヌクレオチド）、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端において、独立して、末端から４塩基までが架橋構造又はアルコキシ構造を有することが更に好ましく、末端から２又は３塩基が架橋構造又はアルコキシ構造を有することが特に好ましい。
【００３６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞への導入方法の１つの実施態様としては、適当なベクター中に挿入し、更に適当な宿主細胞に導入する実施態様が挙げられる。
上記適当なベクターの種類は特に限定されず、例えば、自律的に複製するベクター（例えば、プラスミド等）でもよいが、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであることが好ましい。
上記適当なベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリオファージやレトロウイルスやワクシニアウイルス等の動物ウイルス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを付加することも可能である。
【００３７】
また、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネーター又は真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネーター若しくはＡＤＨ３ターミネーターのような適切なターミネーターに機能的に結合されていてもよい。組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）及び翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウイルスＶＡＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
【００３８】
上記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそれを含むベクターを導入される宿主細胞は、高等真核細胞、細菌、酵母、真菌等が挙げられるが、哺乳類細胞であることが好ましい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞など）、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞、ＢＡＬＢ／ｃマウス細胞（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス胎児繊維芽細胞）等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入された遺伝子を発現させる方法も公知であり、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。
【００３９】
第２の態様に係る予防又は治療剤は、細胞内への取り込みを向上させる観点から、リポフェクション用担体を更に含んでいてもよいが含んでいなくてもよい。
リポフェクション用担体としては、細胞膜との親和性の高い担体（例えばリポソームやコレステロール等）が挙げられ、リポフェクトアミン又はリポフェクチンが好ましく、リポフェクトアミンがより好ましい。
例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リポフェクション用担体と一緒に患者の患部又は全身に注射などにより投与し、患者の細胞に取り込ませてＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を抑制することにより、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病を予防又は治療することができる。
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドがホスホロチオエート構造、架橋構造及びアルコキシ構造よりなる群から選択される少なくとも１つの構造を有することと、上記リポフェクション用担体とを組み合わせて用いることにより患者の細胞内又は核内への取り込みを向上させることができる。
有効成分であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ程度の範囲である。
【００４０】
（ｓｉＲＮＡ）
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子若しくはＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の低下物質としては、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ））又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡも挙げられる。
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する少なくとも２１ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましい。
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する３０ヌクレオチド以下を含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることが好ましく、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のＣＤＳ又はＵＴＲの連続する２５ヌクレオチド以下を含む二本鎖ＲＮＡ又は上記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡであることがより好ましい。
【００４１】
ＲＮＡｉ（ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、ある標的遺伝子の一部をコードするｍＲＮＡの一部を二本鎖にしたＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡ：ｄｓＲＮＡ）を細胞へ導入すると、標的遺伝子の発現が抑制される現象を言う。
二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡとしては、例えば、ＭＥＸ３Ｂまたはその部分配列の逆向き反復配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
このような逆向き反復配列を有するＤＮＡを哺乳動物の細胞に導入することにより、細胞内で標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができ、これによりＲＮＡｉ効果により標的遺伝子（ＭＥＸ３Ｂ）の発現を抑制することが可能になる。
逆向き反復配列とは、標的遺伝子並びにその逆向きの配列が適当な配列を介して並列している配列を言う。具体的には、標的遺伝子が、以下に示すｎ個の塩基配列から成る２本鎖を有する場合、
５’−Ｘ１Ｘ２．．．．．．Ｘｎ−１Ｘｎ−３’
３’−Ｙ１Ｙ２．．．．．．Ｙｎ−１Ｙｎ−５’
その逆向き配列は以下の配列を有する。
５’−ＹｎＹｎ−１．．．．．．Ｙ２Ｙ１−３’
３’−ＸｎＸｎ−１．．．．．．Ｘ２Ｘ１−５’
（ここで、Ｘで表される塩基とＹで表される塩基において、添え字の数字が同じものは互いに相補的な塩基である）
【００４２】
逆向き反復配列は上記２種の配列が適当な配列を介した配列である。逆向き反復配列としては、標的遺伝子の配列が逆向き配列の上流にある場合と、逆向き配列が標的遺伝子の配列の上流にある場合の２つの場合が考えられる。本発明で用いる逆向き反復配列は上記の何れでもよいが、好ましくは、逆向き配列が標的遺伝子の配列の上流に存在する。
標的遺伝子の配列とその逆向き配列の間に存在する配列は、ＲＮＡに転写された際にヘアピンループを形成する領域である（ｓｈＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）。この領域の長さは、ヘアピンループを形成できる限り特には限定されないが、好ましくは０〜３００ｂｐ程度、より好ましくは０〜１００ｂｐ程度である。この配列の中には制限酵素部位が存在していてもよい。
【００４３】
本発明では、哺乳動物で作動可能なプロモーター配列の下流に標的遺伝子の逆向き反復配列を組み込むことにより、哺乳動物の細胞内において標的遺伝子の逆向き反復配列を発現させることができる。本発明で用いるプロモーター配列は、哺乳動物で作動可能であれば特に限定されない。
【００４４】
例えば、上記した二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡは、細胞への取り込みを助けるために使用される、上記リポフェクション用担体と一緒に患者の患部又は全身に注射などにより投与し、患者の細胞に取り込ませて重症喘息を抑制することができる。有効成分である二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡの投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１０ｍｇ程度の範囲である。
【００４５】
（人工ヌクレアーゼ）
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子若しくはＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の低下物質としては、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓヌクレアーゼ等のゲノム編集用の人工ヌクレアーゼも挙げられ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いた人工制限酵素（人工ヌクレアーゼ）であってもよい。
ＴＡＬＥＮは４種類の塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ及びＣ）のいずれかを認識して結合する４種類のユニットを重合させてなるドメインであるＴＡＬＥｓ及びＤＮＡ切断ドメインを含む人工ヌクレアーゼであり、ＴＡＬＥｓがＭＥＸ３Ｂ遺伝子中の少なくとも部分配列を認識し結合する。
ＺＦＮはジンクフィンガードメイン及びＤＮＡ切断ドメインを含むキメラタンパク質の形態の人工ヌクレアーゼである。ジンクフィンガードメインは、特異的な３塩基配列を認識するジンクフィンガーユニットを、複数重合した構造を有し、３の倍数のＤＮＡ配列を認識し結合するドメインであり、ジンクフィンガードメインがＭＥＸ３Ｂ遺伝子中の少なくとも部分配列を認識し結合する。
【００４６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼ（好ましくはＣａｓ９）を含む。
ガイドＲＮＡとは、ＤＮＡ切断酵素であるＣａｓヌクレアーゼと結合して、Ｃａｓヌクレアーゼを標的ＤＮＡ（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子中の少なくとも部分配列）に導く機能を有するＲＮＡを意味する。ガイドＲＮＡは、その５’末端に標的ＤＮＡ（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子中の少なくとも部分配列）に相補的な配列を有し、該相補的な配列を介して標的ＤＮＡに結合することにより、Ｃａｓヌクレアーゼを標的ＤＮＡに導く。Ｃａｓヌクレアーゼは、ＤＮＡエンドヌクレアーゼとして機能し、標的ＤＮＡが存在する部位でＤＮＡを切断し、例えば、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を特異的に低下させることができる。
標的となるＭＥＸ３Ｂ遺伝子中の少なくとも部分配列は、１５〜２５塩基であることが好ましく、１７〜２２塩基がより好ましく、１８〜２１塩基がさらに好ましく、２０塩基であることが特に好ましい。
【００４７】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子に特異的なガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸もしくはＣａｓヌクレアーゼを含有する組成物を、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子を含む真核細胞又は真核生物にトランスフェクトすることによりＭＥＸ３Ｂ遺伝子の発現を低下させることができる。
Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸又はＣａｓヌクレアーゼ、及びガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、当技術分野において公知の様々な方法、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、ナノ粒子媒介性トランスフェクション、タンパク質形質導入ドメイン媒介性形質導入、ウイルス媒介性遺伝子送達、およびプロトプラストへのＰＥＧ媒介性トランスフェクションなどによって、細胞内に移入されうるが、これらに限定されない。また、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸又はＣａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは、注入などの遺伝子もしくはタンパク質を投与するための、当技術分野において公知の様々な方法によって、生物内に移入されうる。Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸又はＣａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡとの複合体の形態で、もしくは別々に、細胞内に移入されうる。Ｔａｔなどのタンパク質形質導入ドメインと融合されたＣａｓヌクレアーゼもまた、細胞内に効率的に送達され得る。
好ましくは、真核細胞又は真核生物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトされる。
連続トランスフェクションは、最初にＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸によるトランスフェクション、続いて裸のガイドＲＮＡによる第二のトランスフェクションによって行われうる。好ましくは、第二のトランスフェクションは、３、６、１２、１８、２４時間後であるが、それらに限定されない。
ガイドＲＮＡの発現は、ガイドＲＮＡ発現ユニットを用いてもよい。ガイドＲＮＡ発現ユニットとしては、標的配列（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の部分配列）とガイドＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の転写ユニットとすることが好ましく、ガイドＲＮＡを発現するためのプロモーター領域（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーターから選択されるプロモーター））、標的配列（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子）及びガイドＲＮＡを有することが好ましく、プロモーター、標的配列（ＭＥＸ３Ｂ遺伝子の少なくとも部分配列）に相補的な配列及びガイドＲＮＡがシームレスに連結していることがより好ましい。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、オフターゲットを防ぐために、ニッカーゼとして二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを切断するＣａｓ９変異体を用いることもできる。一本鎖切断型Ｃａｓ９変異体としては、例えば、Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）が挙げられる。一本鎖切断型Ｃａｓ９変異体は例えば、標的ＤＮＡの一方の鎖に相補的な標的配列を有するガイドＲＮＡと、そのごく近傍の他方の鎖に相補的な標的配列を有するガイドＲＮＡとを組み合わせて用いると、一方の鎖を２０塩基の特異性で切断し、他方の鎖をさらに２０塩基の特異性で切断するため、併せて４０塩基の特異性でＤＮＡを切断することになり、標的の特異性を大幅に向上させることが可能となる。
【００４８】
有効成分である上記人工ヌクレアーゼ又は上記人工ヌクレアーゼをコードする核酸の投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１０ｍｇ程度の範囲である。
【００４９】
第２の態様に係るＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤は、経口または非経口的に全身又は局所的に投与することができる。非経口的な投与方法としては、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などを挙げることができる。患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。その投与量は、年齢、投与経路、投与回数により異なり、当業者であれば適宜選択できる。
非経口投与に適した製剤形態として、例えば安定剤、緩衝剤、保存剤、等張化剤等の添加剤を含有したものは挙げられ、さらに薬学的に許容される担体や添加物を含むものでもよい。このような担体及び添加物の例として、水、有機溶剤、高分子化合物（コラーゲン、ポリビニルアルコールなど）、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ツルビトール、ラクトース、界面活性剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
（ＭＥＸ３Ｂタンパク質に選択的に結合するアプタマー又は抗体）
ＭＥＸ３Ｂタンパク質の阻害物質としては、ＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能を阻害する限り、高分子化合物（核酸等）、抗体、低分子化合物等任意の物質であってもよい。
ＭＥＸ３Ｂタンパク質の阻害物質の好ましい態様の１つとして、ＭＥＸ３Ｂタンパク質に選択的に結合するアプタマーを用いたＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤が挙げられる。
アプタマーとは、一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡで構成され、その立体構造により標的タンパク質と結合して機能を阻害する核酸医薬品をいう。
アプタマーは標的タンパク質に対する結合性及び特異性が高く、免疫原性が低く、化学合成により製造することができ、保存安定性も高い。
ＭＥＸ３Ｂタンパク質に選択的に結合するアプタマーの塩基長としては、ＭＥＸ３Ｂタンパク質に特異的に結合する限り特に制限はないが、１５〜６０塩基であることが好ましく、２０〜５０塩基であることがより好ましく、２５〜４７塩基であることが更に好ましく、２６〜４５塩基であることが特に好ましい。
ＭＥＸ３Ｂタンパク質に選択的に結合するアプタマーはＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法により取得することができる。
【００５１】
ＭＥＸ３Ｂタンパク質の阻害物質のもう１つの好ましい態様として、ＭＥＸ３Ｂタンパク質に選択的に結合する抗体を用いたＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤が挙げられる。上記ＭＥＸ３Ｂタンパク質に特異的に結合できるものであれば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでもよい。
ポリクローナル抗体は、抗原を免疫した動物から得られる血清を分離、精製することにより調製することができる。モノクローナル抗体は、抗原を免疫した動物から得られる抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、上記の培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。
抗原は、各種ヒト培養細胞からＭＥＸ３Ｂタンパク質を精製するか、ＭＥＸ３Ｂタンパク質のアミノ酸配列またはその変異配列またはそれらの一部を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを大腸菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などの宿主に導入して、該ＤＮＡを発現させて得られるタンパク質を分離、精製することにより調製できる。また、抗原は、ＭＥＸ３Ｂタンパク質のアミノ酸配列の部分配列を有するペプチドをアミノ酸合成機を用いて合成することによって調製することもできる。
免疫方法としては、抗原をウサギ、ヤギ、ラット、マウスまたはハムスター等などの非ヒト哺乳動物の皮下、静脈内または腹腔内にそのまま投与してもよいが、抗原をスカシガイヘモシアニン、キーホールリンペットヘモシアニン、牛血清アルブミン、牛チログロブリン等の抗原性の高いキャリアタンパク質と結合して投与したり、完全フロイントアジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔ）、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等の適当なアジュバントとともに投与することも好ましい。
【００５２】
抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行うことができる。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、該血清が免疫に用いた抗原と反応するか否かを酵素免疫測定法等に従い、抗体価を測定することにより調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示す非ヒト哺乳動物を、血清または抗体産生細胞の供給源として使用することができる。ポリクローナル抗体は、上記の血清を分離、精製することにより調製することができる。
モノクローナル抗体は、該抗体産生細胞と非ヒト哺乳動物由来の骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、該ハイブリドーマを培養するか、動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより調製することができる。抗体産生細胞としては、脾細胞、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を使用することができ、特に好ましくは脾細胞を使用することができる。
【００５３】
骨髄腫細胞としては、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株であるＰ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）株［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１−７（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）株［Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１−５１９（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）株［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）株［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８−１５５０（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）株［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）］等のマウス由来の株化細胞を用いることができる。
ハイブリドーマ細胞は、以下の方法により作製できる。先ず、抗体産生細胞と骨髄腫細胞を混合し、ＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン、チミジンおよびアミノプテリンを加えた培地］に懸濁したのち、７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり酵素免疫測定法などにより、抗原に反応し、抗原を含まないタンパク質には反応しないものを選択する。次いで、限界希釈法によりクローニングを行い、酵素免疫測定法により安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞として選択する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養して得られる培養液、またはハイブリドーマ細胞を動物の腹腔内に投与して該動物を腹水癌化させて得られる腹水から分離、精製することにより調製できる。
【００５４】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を分離、精製する方法としては、遠心分離、硫安沈殿、カプリル酸沈殿、またはＤＥＡＥ−セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインＡ若しくはＧ−カラム、若しくはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等による方法を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。
本明細書で抗体と言う場合、全長の抗体だけではなく抗体の断片も包含するものとする。抗体の断片とは、機能性の断片であることが好ましく、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’などが挙げられる。Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’とは、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）で処理することにより製造されるもので、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体断片である。
【００５５】
抗体をヒトに投与する目的で使用する場合は、免疫原性を低下させるために、ヒト型化抗体あるいはヒト化抗体を用いることが好ましい。これらのヒト型化抗体やヒト化抗体は、トランスジェニックマウスなどの哺乳動物を用いて作製することができる。ヒト型化抗体については、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）〕、野口浩〔医学のあゆみ  １６７：４５７−４６２（１９９３）〕に記載されている。ヒト化キメラ抗体は、マウス抗体のＶ領域とヒト抗体のＣ領域を遺伝子組換えにより結合し、作製することができる。ヒト化抗体は、マウスのモノクローナル抗体から相補性決定部位（ＣＤＲ）以外の領域をヒト抗体由来の配列に置換することによって作製できる。
また、抗体は、固相担体などの不溶性担体上に固定された固定化抗体として使用したり、標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。このような固定化抗体や標識抗体も全て本発明の範囲内である。
【００５６】
上記した抗体のうち、ＭＥＸ３Ｂタンパク質に特異的に結合してその機能を阻害できる抗体については、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤として使用することができる。
【００５７】
抗体をＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤として医薬組成物の形態で使用する場合には、上記抗体を有効成分として使用し、さらに薬学的に許容可能な担体、希釈剤（例えば、免疫原性アジュバントなど）、安定化剤または賦形剤などを用いて医薬組成物を調製することができる。抗体を含むＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤は、濾過滅菌および凍結乾燥し、投薬バイアルまたは安定化水性調製物中に投薬形態に製剤化することができる。
患者への投与は、たとえば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などの当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。有効成分である抗体の投与量としては、一般的には一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｍｇ程度の範囲である。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を示して本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に限定されるものではない。【００５９】
≪実施例１≫
（ＭＥＸ３Ｂ欠損（ノックアウト）ＢＡＬＢ／ｃマウスの作製）
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のゲノムＤＮＡはＢＡＣクローン（ＲＰ２３−２７２Ｆ２）に導入されたものを利用した。ターゲッティングベクターは、このＢＡＣクローンにネオマイシン耐性遺伝子カセットをＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソン１とエクソン２のＤＮＡ領域に入れ替える様式にて導入して構築した。コンストラクトはエレクトロポレーションでＢＡＬＢ／ｃ由来のＥＳ細胞（大阪大学安居博士から供与）に導入し、抗生物質（Ｇ４１８）で選択した。相同組換えの有無をＰＣＲ法、ＦＩＳＨ法およびサザンブロットで解析し、４つのＥＳクローンを同定した。選択した上記ＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞に注入し、キメラマウスを得るために仮親に移植した。得られた雄のキメラマウスはＢＡＬＢ／ｃのメスと交配し、ＭＥＸ３Ｂ突然変異をヘテロ接合で有するＦ１マウスをＰＣＲで同定し、相互交配しホモ接合のＦ２を得た。Ｆ２マウスの遺伝子型はＰＣＲによって確認した。【００６０】
（胎児繊維芽細胞の単離及び継代培養）
トリプシン粉末（ＧＩＢＣＯ社製）を０．２５％（Ｗ／Ｖ）となるようにＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶かし、０．４５マイクロメーターフィルター（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）に通して濾過滅菌した（要時調製）。マウス交配を開始した日から１３．５日後、Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスの全身を７０％エタノールでアルコール消毒し、開腹後に胎児の入った子宮を取り出した。臍帯の付け根をはさみで切断後、子宮から胎児を一匹ずつ取り出してＰＢＳに浸した。胎児から頭、内臓、手足、尻尾を除いた後、氷冷したトリプシン溶液１ｍＬに移し、鋭利なはさみを用いて２〜３ミリメートルにミンスした。１５ｍＬチューブに移し、トリプシン溶液で液量を胎児1匹あたり５ｍＬに合わせ、３７℃で６０〜１００サイクル／分で消化具合を見ながら１０分間振盪した。トリプシンの反応を止めるため、牛血清（ＦＢＳ）を１ｍＬ加えてよく懸濁し、さらに細胞塊を除くためこれを１００ｍｍセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ社製）のメッシュを用いて濾した。濾過された細胞懸濁液を遠心（２８０×ｇ、５分間、４℃）後、上清を除き、得られた沈殿を基本培地（ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ：日水社製）、１０％ＦＢＳ、ペニシリンストレプトマイシン溶液）で懸濁して１００ｍｍ培養皿に胎児１匹当たり１ウェルの割合で播いた。翌日、培地交換を行い、トリプシン処理により播き直して実験に用いた。【００６１】
野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスの胎児繊維芽細胞と、ＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスの胎児繊維芽細胞とを、それぞれ、２．５μｇ／ｍＬのＦｕｎｇｉｚｏｎｅを含む５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ：日水社製）を３５ｍｍ細胞培養ディッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｏｏｎ：３５３００１）において炭酸ガスインキュベーター内（３７℃、空気中５％ＣＯ２）で培養し、細胞がコンフレント状態になった後、継代培養を行なった。【００６２】
（ＲＴ定量的ＰＣＲ試験）
野生型マウス、ＭＥＸ３Ｂ欠損マウスそれぞれについて、継代初期（ｐａｓｓａｇｅ３）の細胞と、継代後期（ｐａｓｓａｇｅ１３〜１５）の細胞とを溶解バッファーＴＲＩｓｕｒｅ（ＢＩＯＬＩＮＥ社製）を用いて全ＲＮＡを回収した。Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）により逆転写反応を行いｃＤＮＡを得た。
その後、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０（ＲＯＣＨＥ社製）を用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。定量統計解析は３回を上回る独立した実験にて行った。【００６３】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ試験に用いたプライマー配列は以下である。
ＭＥＸ３ＢプライマーＦｗ１：５’−ＣＧＴＣＧＴＣＣＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＧＴＧ−３’（配列番号７）
ＭＥＸ３ＢプライマーＲｖ１：５’−ＴＣＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＣＧＧＡＴＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣ−３’（配列番号８）
マウスＧＡＰＤＨプライマーＦｗ１：５’−ＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴ−３’（配列番号９）
マウスＧＡＰＤＨプライマーＲｖ１：５’−ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＴＣＧＧ−３’（配列番号１０）【００６４】
マウスＩＬ−６プライマーＦｗ１：５’−ＧＣＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＴＡＴＡＡＴＣＡＧＧＡ−３’（配列番号１１）
マウスＩＬ−６プライマーＲｖ１：５’−ＣＣＡＧＧＴＡＧＣＴＡＴＧＧＴＡＣＴＣＣＡＧＡＡ−３’（配列番号１２）
マウスＣＸＣＬ５プライマーＦｗ１：５’−ＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＴＣＴＧＴＣＴＧＧＡ−３’（配列番号１３）
マウスＣＸＣＬ５プライマーＲｖ１：５’−ＴＧＣＡＴＴＣＣＧＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＴ−３’（配列番号１４）【００６５】
図１は、野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスの胎児繊維芽細胞におけるＭＥＸ３Ｂ  ｍＲＮＡの発現レベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる検証結果を示す図である。図１は、野生型マウス６匹の平均値、ＭＥＸ３Ｂ欠損マウス７匹の平均値であり、有意水準のｐ値（＜０．０５）の値である。Ｙ軸はそれぞれの野生型マウスの継代初期ｐａｓｓａｇｅ３の実際のデータについて、定量対象遺伝子量をＧＡＰＤＨ量で割った数値を「１」とした場合の相対的数値である。後記の図２及び３においても同様である。
図１から明らかなように、野生型マウス、ＭＥＸ３Ｂ欠損マウスの胎児繊維芽細胞の継代初期（ｐａｓｓａｇｅ３）と後期（ｐａｓｓａｇｅ１３〜１５）の細胞を解析した結果、継代初期と後期の細胞ともにＭＥＸ３Ｂ欠損マウス由来細胞では、Ｍｅｘ３Ｂの発現は見られなかった。【００６６】
また、図２は、野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスの胎児繊維芽細胞におけるＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現レベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる検証結果を示す図である。
図３は、野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスの胎児繊維芽細胞におけるＣＸＣＬ５  ｍＲＮＡの発現レベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる検証結果を示す図である。
図２及び３から明らかなように、野生型マウス、ＭＥＸ３Ｂ欠損マウスの胎児繊維芽細胞の継代初期と後期の細胞を解析した結果、ＭＥＸ３Ｂ欠損マウス由来細胞において、ＩＬ−６及びＣＸＣＬ５の発現は継代後期細胞では著しく低下していた。【００６７】
以上の図２及び３に示した、Ｍｅｘ３Ｂ遺伝子を欠損する細胞では継代後期の老化傾向にある繊維芽細胞でのＩＬ−６及びＣＸＣＬ５の発現が低下していた結果から、Ｍｅｘ３ＢはＩＬ−６及びＣＸＣＬ５を正に制御することを示唆しており、裏を返せばＭＥＸ３Ｂ遺伝子産物の機能を阻害することによりＩＬ−６又はＣＸＣＬ５に起因する疾患（例えば、重症喘息）の発症や重症化を抑制することが示唆された。【００６８】
（重症喘息誘発試験）
８週齢の野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスの雌を、それぞれ、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）５０μｌ及びＰＢＳ５０μｌ中に乳化した卵白アルブミン（ＯＶＡ：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）２０μｇで０日目に皮下感作した。
２１日目及び２２日目に、全てのマウス（６マウス以上／群）をＰＢＳ中０．１％ＯＶＡからなるエアロゾルを吸入させた。また、対照として、ＰＢＳからなるエアロゾルを吸入させた。２３日目に気管支肺胞洗浄液内の各種免疫細胞数を測定した。【００６９】
図４は、重症喘息誘発試験における野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスの気管支肺胞洗浄液内の各種免疫細胞（マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球）の増加の検証結果を示す図である。
図４中、ＰＢＳ＋／＋は対照としてＰＢＳを吸入させた野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける細胞数を示し、ＰＢＳ−／−は対照としてＰＢＳを吸入させたＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける細胞数を示し、ＯＶＡ＋／＋はＯＶＡを吸入させた野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける細胞数を示し、ＯＶＡ−／−はＯＶＡを吸入させたＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける細胞数を示す。
図４に示した結果から明らかなように、ＯＶＡを吸入させた野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス及びＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスはいずれも総細胞数及びマクロファージ数が対照に対して増加しており、ＯＶＡに対して感作されている。また、ＯＶＡを吸入させた野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスでは好中球数及びリンパ球数が増加していて重症喘息が誘発されていることが示唆される。
これに対し、ＯＶＡを吸入させたＭＥＸ３Ｂ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスでは好中球数及びリンパ球数が有意に低下しており、重症喘息の症状を緩和することが示唆される。
以上示した結果から、ＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能を阻害する物質（低分子化合物、たんぱく質、核酸など）を模索することが、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする手法として有用であることが分かる。【００７０】
≪実施例２≫
（重症喘息誘発モデルにおけるギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチド投与試験）
８週齢の野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスの雌をＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０μｌ及びＰＢＳ５０μｌ中に乳化したＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）２０μｇで０日目に皮下感作した。
１６日目から５日間連続してギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチドを吸入投与（１０μＭ溶液５ｍｌをネブライザーでエアロゾル化させて容器内に満たして、２０分間マウスに暴露）した。
ギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、コントロールＧａｐｍｅｒ又はマウスＭＥＸ３Ｂ特異的Ｇａｐｍｅｒを吸入投与した。以下、それぞれ、「ＯＶＡ吸入−Ｇａｐｍｅｒ（コントロール）吸入群」、「ＯＶＡ吸入−ＭＥＸ３Ｂ特異的Ｇａｐｍｅｒ吸入群」ともいう。
マウスＭＥＸ３Ｂ特異的Ｇａｐｍｅｒとして、マウスＭｅｘ３Ｂ遺伝子を表す配列番号４中の３’ＵＴＲに含まれる３１３５〜３１４９番目の塩基配列に相補的なギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチド（５’−ＡＣＡＴＡＡＡＣＧＡＧＴＧＧＴ−３’：配列番号１６；全長１５塩基）を用いた。
なお、各ギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチドの両末端には２塩基のＬＮＡ（２’，４’−ＢＮＡ）を配置し、それ以外の間を埋める塩基は通常のＤＮＡとし、各ヌクレオチドを結ぶリン酸ジエステル結合はホスホロチオエート化した。【００７１】
２１日目、２２日目及び２３日目に、全てのマウス（７マウス／群）をＰＢＳ中０．１％ＯＶＡからなるエアロゾルを吸入させた。また、コントロール群（対照群）として、ＰＢＳからなるエアロゾルを吸入させた（４マウス／群）。
２４日目にサンプル回収を行い、気管支肺胞洗浄液内の各種免疫細胞数を測定した。
結果を図５に示す。【００７２】
図５中、コントロール群は対照としてＰＢＳを吸入させたマウスにおける細胞数を示し、ＯＶＡ吸入群はＯＶＡを吸入させたマウスにおける細胞数を示し、ＯＶＡ吸入−Ｇａｐｍｅｒ（コントロール）吸入群はＧａｐｍｅｒ（コントロール）をあらかじめ吸入させた後にＯＶＡを吸入させたマウスにおける細胞数を示し、ＯＶＡ吸入−ＭＥＸ３Ｂ特異的Ｇａｐｍｅｒ吸入群はＭＥＸ３Ｂ特異的Ｇａｐｍｅｒをあらかじめ吸入させた後にＯＶＡを吸入させたマウスにおける細胞数を示す。
図５に示した結果から明らかなように、重症喘息モデルにおいて、ＯＶＡを吸入させたマウス群はいずれも総細胞数及びマクロファージ数がコントロール群に対して増加しており、ＯＶＡに対して感作されている。
また、Ｇａｐｍｅｒ（コントロール）をあらかじめ吸入させたマウス群では好中球数が増加していて重症喘息が誘発されていることが示唆される。
これに対し、ＭＥＸ３Ｂ特異的Ｇａｐｍｅｒを吸入させたマウス群では好中球数が有意に低下しており、重症喘息の症状を緩和することが示唆される。
したがって、ＭＥＸ３Ｂ特異的Ｇａｐｍｅｒは、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤として機能することが示唆される。【００７３】
（ＲＴ定量的ＰＣＲ試験）
各群のマウスから肺組織を摘出し、上記肺組織をＴＲＩｓｕｒｅ（Ｂｉｏｌｉｎｅ社製）溶液中でポリトロンホモジナイザーにより粉砕し、製品プロトコールに従ってｔｏｔａｌＲＮＡを採取し、下記表１に示すＰＣＲプライマーを用いて増幅反応を行い、各サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ及びＧ−ＣＳＦ）及び各ケモカイン（ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、及びＣＸＣＬ５）のｍＲＮＡの発現レベルを測定した。
結果を図６に示す。
【表１】
2018008750.tif 000003
【００７４】
図６に示した結果から明らかなように、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２はいずれもＰＢＳ吸入群に比較してＯＶＡ吸入群で顕著に発現が増しており、重症喘息モデルは期待通りに惹起されていることが確認された。
また、Ｇａｐｍｅｒ（コントロール）投与群と比較すると、ＭＥＸ３Ｂ特異的Ｇａｐｍｅｒ投与群ではＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ１及びＣＸＣＬ２の発現レベルは有意に減少傾向にあり、ＭＥＸ３Ｂの発現を阻害することによりこれらの炎症性因子を抑制することが示された。【００７５】
（肺組織の病理組織解析）
採取したマウス肺組織は１０％ホルマリン溶液にて固定後にパラフィンに包埋した（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）。ミクロトーム（ＬＥＩＣＡ社製）にて薄切を行い、切片はＡＰＳ（アミノシラン）コート付きスライドガラス（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ社製）に貼り付け、標準のプロトコルに従ってＨ＆Ｅ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）を行った（参考文献：Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１６  Ａｕｇ  ３０；１６（９）：２４５６−７１．）。
病理組織画像はオリンパス顕微鏡システムで撮影した。結果を図７に示す。【００７６】
図７は各マウス群における肺組織の病理組織画像を示す図であり、肺組織における炎症反応の度合いの結果を示す。
図７に示した結果から明らかなように、コントロール吸入群（ＰＢＳエアロゾル吸入）では見かけ上は何も処理を施していないマウスと同様に炎症反応は起きておらず、免疫細胞の顕著な浸潤は見られない。ＯＶＡ吸入−ＰＢＳ投与群及びＯＶＡ吸入−コントロールＧａｐｍｅｒ投与群では気道上皮細胞の肥厚及び免疫細胞の著しい浸潤が観察されており、炎症が引き起こされていることが明らかである。
一方、Ｍｅｘ３ｂ抑制効果を示すＧａｐｍｅｒ投与群であるＯＶＡ吸入−ＭＥＸ３Ｂ特異的Ｇａｐｍｅｒ投与群ではコントロール吸入群とほぼ同等であり炎症は起きていない。
この結果はＭＥＸ３Ｂ特異的Ｇａｐｍｅｒ投与によりステロイド耐性喘息の発症が劇的に抑制されたことを示唆している。
したがって、ＭＥＸ３Ｂ特異的Ｇａｐｍｅｒは、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤として機能することが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月11日(2018.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の変化、及びＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能の変化よりなる群から選択される少なくとも１つを指標として、インターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤をスクリーニングする方法であって、前記疾病が、インターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する、重症喘息、関節疾患、糖尿病、炎症性腸疾患、アトピー皮膚炎、全身性エリテマトーデス、がん、精神疾患、心血管疾患、呼吸器疾患、二型糖尿病及び腎疾患よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患である、方法。
【請求項２】
前記指標が、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子を発現する細胞を被験物質の存在下及び非存在下において培養し、前記被験物質の有無に応じたＭＥＸ３Ｂ遺伝子又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の変化、及びＭＥＸ３Ｂタンパク質の機能の変化よりなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記インターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病がインターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する重症喘息である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＥＸ３Ｂ遺伝子若しくはＭＥＸ３Ｂタンパク質の発現の低下物質であって、かつインターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５の発現の低下物質、又はＭＥＸ３Ｂタンパク質の阻害物質を含む、インターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する疾病の予防又は治療剤であって、前記疾病が、インターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する、重症喘息、関節疾患、糖尿病、炎症性腸疾患、アトピー皮膚炎、全身性エリテマトーデス、がん、精神疾患、心血管疾患、呼吸器疾患、二型糖尿病及び腎疾患よりなる群から選択される少なくとも１つの疾患であり、
前記阻害物質が、ＭＥＸ３Ｂタンパク質に選択的に結合して、インターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５の発現を低下させる物質である、剤。
【請求項５】
前記低下物質がＭＥＸ３Ｂ遺伝子中又は前記遺伝子の発現制御領域中に含まれる連続する少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項４に記載の剤。
【請求項６】
前記ＭＥＸ３Ｂ遺伝子中に含まれるオリゴヌクレオチドが、ＭＥＸ３Ｂ遺伝子のエクソン中のコーディング領域若しくは非翻訳領域に含まれるオリゴヌクレオチド、又はＭＥＸ３Ｂ遺伝子のイントロン中に含まれるオリゴヌクレオチドである、請求項５に記載の剤。
【請求項７】
前記低下物質がＭＥＸ３Ｂ遺伝子の塩基配列から転写されるＲＮＡの塩基配列中のコーディング領域又は非翻訳領域の連続する少なくとも２０ヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡ又は前記二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡである、請求項４に記載の剤。
【請求項８】
リポフェクション用担体を更に含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の剤。
【請求項９】
前記阻害物質がＭＥＸ３Ｂタンパク質に選択的に結合するアプタマー又は抗体である、請求項４に記載の剤。
【請求項１０】
前記疾病がインターロイキン６、インターロイキン１３、ＴＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、又はＣＸＣＬ５に起因する重症喘息である、請求項４〜８のいずれか１項に記載の剤。
【国際調査報告】
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