(57)【要約】  分化多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の機能を維持したまま、未分化の多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞の造腫瘍性を低減させる凍結保存方法を提供する。  多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の凍結保存方法であって、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から細胞を解離するステップを含む方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の凍結保存方法であって、
多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から細胞を解離するステップ、
を含む方法。
【請求項２】
解離した細胞を凍結保護剤を含む凍結保存液中で凍結するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
凍結保護剤が、細胞膜透過性の凍結保護剤である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
凍結保護剤が、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール（ＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、１，２−プロパンジオール（１，２−ＰＤ）、１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）、ブチレングリコール（ＢＧ）、イソプレングリコール（ＩＰＧ）、ジプロピレングリコール（ＤＰＧ）およびグリセリンからなる群から選択される１種または２種以上である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
凍結保護剤が、ジメチルスルホキシドである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
凍結保護剤が、１，２−プロパンジオールである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
シート状細胞培養物の製造方法であって、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により得られた凍結した細胞を解凍するステップ、および
シート状細胞培養物を形成するステップ、
を含む方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法により製造されたシート状細胞培養物、前記シート状培養物を含む組成物、あるいは請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により得られた凍結した細胞、細胞培養液および培養基材を含むキットの、薬剤のスクリーニングのための使用。
【請求項１０】
キットが、医療用接着剤および細胞洗浄液をさらに含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
対象において疾患を処置する方法であって、請求項８に記載の方法により製造されたシート状細胞培養物または前記シート状細胞培養物を含む組成物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から解離した細胞における分化した多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の純度を高める方法であって、
解離した細胞を凍結保護剤を含む凍結保存液中で凍結するステップ、
を含む方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から解離した細胞における未分化の多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞の割合を低下させる方法であって、
解離した細胞を凍結保護剤を含む凍結保存液中で凍結するステップ、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞を凍結保存する技術、該心筋細胞を含むシート状細胞培養物を製造する技術、および該シート状細胞培養物の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の心臓病に対する治療の革新的進歩にかかわらず、重症心不全に対する治療体系は未だ確立されていない。このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞やｉＰＳ細胞由来心筋細胞による臨床応用・研究が開始されている。その一例として、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いることによって、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む心臓に適用可能な三次元に構成された細胞培養物と、その製造方法が提供された（特許文献１）。しかし、温度応答性培養皿で調製するシート状培養物は脆弱で破れやすいため、輸送することが困難である。【０００３】
一方、シート状細胞培養物の製造に、凍結・解凍した細胞を用いることが知られており（特許文献２）、その凍結は一般に保存液中で細胞を急速凍結または緩慢凍結して行われる（特許文献２〜１２）。凍結した細胞は、上述のようなシート状培養物に生じる輸送上の問題が生じることは考えにくいが、凍結する細胞として人工多能性幹細胞（特許文献３）や胚性幹細胞（特許文献５）などを好適に凍結・解凍することについての報告はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／１８５５１７号
【特許文献３】特開２０１０−２１３６９２号公報
【特許文献４】特表２０１２−５３３６２０号公報
【特許文献５】国際公開第２００５／０４５００７号
【特許文献６】特開２００７−１６１３０７号公報
【特許文献７】特開２００２−２０４６９０号公報
【特許文献８】特開２０１１−１１５０５８号公報
【特許文献９】特開２００３−９３０４４号公報
【特許文献１０】特表平５−５０７７１５号公報
【特許文献１１】特開２００４−２５４５９７号公報
【特許文献１２】特開平８−３０８５５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、新たな細胞ソースとして期待される多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の細胞のシート状細胞培養物の作製に取り組む中で、これらの細胞から分化誘導された細胞は、その分化誘導後の細胞が凍結解凍後に、その機能を維持することができない、生存率が低下する等、凍結障害性が高い上、分化誘導後に未分化の多能性幹細胞が残存すると移植組織が腫瘍化する原因となるといった問題に直面し、これらの問題を解決しない限り前記のシート状細胞培養物の作製は不可能であるとの認識を持つに至った。すなわち本発明の目的は、かかる問題を解決した、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の凍結保存方法を提供し、もって該心筋細胞を含む好適なシート状細胞培養物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、かかる課題を解決するために鋭意研究に取り組む中で、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から細胞を解離して凍結することで、驚くべきことに、分化多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の機能を維持することができ、さらに未分化の多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞の造腫瘍性を低減させることができる、との知見を得、さらに研究を進めた結果本発明を完成させるに至った。【０００７】
すなわち、本発明は以下に関する。
＜１＞多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の凍結保存方法であって、
多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から細胞を解離するステップ、
を含む方法。
＜２＞解離した細胞を凍結保護剤を含む凍結保存液中で凍結するステップをさらに含む、上記＜１＞に記載の方法。
＜３＞凍結保護剤が、細胞膜透過性の凍結保護剤である、上記＜２＞に記載の方法。
＜４＞凍結保護剤が、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール（ＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、１，２−プロパンジオール（１，２−ＰＤ）、１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）、ブチレングリコール（ＢＧ）、イソプレングリコール（ＩＰＧ）、ジプロピレングリコール（ＤＰＧ）およびグリセリンからなる群から選択される１種または２種以上である、上記＜２＞または＜３＞に記載の方法。
＜５＞凍結保護剤が、ジメチルスルホキシドである、上記＜４＞に記載の方法。
＜６＞  凍結保護剤が、１，２−プロパンジオールである、上記＜４＞に記載の方法。
＜７＞多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、上記＜１＞〜＜６＞のいずれか一つに記載の方法。
＜８＞シート状細胞培養物の製造方法であって、
上記＜１＞〜＜７＞のいずれか一つに記載の方法により得られた凍結した細胞を解凍するステップ、および
シート状細胞培養物を形成するステップ、
を含む方法。【０００８】
＜９＞上記＜８＞に記載の方法により製造されたシート状細胞培養物、前記シート状培養物を含む組成物、あるいは上記＜１＞〜＜７＞のいずれか一つに記載の方法により得られた凍結した細胞、細胞培養液および培養基材を含むキットの、薬剤のスクリーニングのための使用。
＜１０＞キットが、医療用接着剤および細胞洗浄液をさらに含む、上記＜９＞に記載の使用。
＜１１＞対象において疾患を処置する方法であって、上記＜８＞に記載の方法により製造されたシート状細胞培養物または前記シート状細胞培養物を含む組成物の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む方法。
＜１２＞多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から解離した細胞における分化した多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の純度を高める方法であって、
解離した細胞を凍結保護剤を含む凍結保存液中で凍結するステップ、
を含む方法。
＜１３＞多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から解離した細胞における未分化の多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞の割合を低下させる方法であって、
解離した細胞を凍結保護剤を含む凍結保存液中で凍結するステップ、
を含む方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法は、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から細胞を解離して凍結することにより、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の高い細胞生存率や自律的拍動性を維持したまま当該細胞を凍結保存することを可能とする。また、本発明の方法は、臨床応用する上で腫瘍形成の原因となる分化誘導後の残存する多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞の多能性や増殖性を同時に低減することができる。さらに、本発明の方法により得られた凍結保存された多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞から、細胞生存率や自律的拍動性を維持したままシート状細胞培養物を製造することが可能である。また、本発明における凍結・解凍操作は、従来のシート状細胞培養物の製造方法と親和性が高く、手間やコストが軽微であるため、本発明の方法はシート状細胞培養物の製造に広く利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団の凍結前後のＳＳＥＡ−４陽性率およびｃ−ＴＮＴ陽性率を示すグラフである。
【図２】図２は、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団の凍結前後のｃ−ＴＮＴ陽性率を示すグラフである。
【図３】図３は、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団の凍結前後のＴｒａ−１−６０陽性率およびｃ−ＴＮＴ陽性率を示すグラフである。
【図４】図４は、ｉＰＳ細胞の凍結前後のＳＳＥＡ−４陽性率を示すグラフである。
【図５】図５は、完成したシート状細胞培養物の外観を示した写真図である。
【図６】図６は、完成したシート状細胞培養物の一部の細胞についてヘマトキシリン・エオシン染色した光学顕微鏡写真図である。
【図７】図７は、完成したシート状細胞培養物の一部の細胞について多重標識した蛍光顕微鏡写真図である。
【図８】図８は、完成したシート状細胞培養物の自発的な同期拍動を示した図である。
【図９】図９は、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞の安定性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、凍結保存液を比較したグラフである。
【図１１】図１１は、凍結方法を比較したグラフである。
【図１２】図１２は、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞シートの有効性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物（インターネットから入手可能な情報を含む）は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【００１２】
本発明の一側面は、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から細胞を解離するステップを含む、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の凍結保存方法に関する。特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明の方法において、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から解離した細胞を凍結することにより、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞が自律的拍動性を維持したまま細胞が残存する一方、分化誘導後に残存する多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞が脱落すると考えられる。
【００１３】
多能性幹細胞は、当該技術分野で周知の用語であり、生体の様々な組織に分化する能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の非限定例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。
間葉系幹細胞は、当該技術分野で周知の用語であり、間葉系組織に存在し、間葉系組織に属する細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。本明細書では、特に別記しない限り間葉系幹細胞は脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞を指すものとする。
【００１４】
本発明において、「多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞」は、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞に由来する心筋細胞の特徴を有する細胞を意味する。心筋細胞の特徴としては、限定されずに、例えば、心筋細胞マーカーの発現、自律的拍動の存在などが挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定例としては、例えば、ｃ−ＴＮＴ（cardiac troponin T）、ＣＤ１７２ａ（別名ＳＩＲＰＡまたはＳＨＰＳ−１）、ＫＤＲ（別名ＣＤ３０９、ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２）、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。一態様において、多能性幹細胞または間葉系幹細胞由来の心筋細胞は、ｃ−ＴＮＴ陽性かつ／またはＣＤ１７２ａ陽性である。
【００１５】
本発明において、「多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団」とは、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞を培養して誘導された心筋細胞ならびに未分化の多能性幹細胞および／または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞を含む細胞塊または細胞凝集体である。当該細胞集団には、誘導された他の細胞種も含まれ得る。当該細胞集団は、胚様体形成による方法（例えば、Burridge et al., Cell Stem Cell. 2012 Jan 6;10(1):16-28）によって、多能性幹細胞または間葉系幹細胞から心筋細胞を誘導すること、すなわち、多能性幹細胞または間葉系幹細胞を心筋細胞の分化誘導処理に供することによって得ることができる。当該方法において、中胚葉誘導因子（例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦなど）、心臓特異化（cardiac specification）因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＤＫＫ１、Ｗｎｔシグナルインヒビター（例えば、ＩＷＲ−１、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−４等）、ＢＭＰシグナルインヒビター（例えば、ＮＯＧＧＩＮ等）、ＴＧＦβ／アクチビン／ＮＯＤＡＬシグナルインヒビター（例えば、SB431542等）、レチノイン酸シグナルインヒビターなど）および心臓分化因子（例えば、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＤＫＫ１など）を、順次作用させることにより誘導効率を高めることができる。一態様において、多能性幹細胞からの心筋細胞誘導処理は、浮遊培養下で形成した細胞集団に、（１）ＢＭＰ４、（２）ＢＭＰ４とｂＦＧＦとアクチビンＡとの組み合わせ、（３）ＩＷＲ−１、および、（４）ＶＥＧＦとｂＦＧＦとの組み合わせを順次作用させることを含む。
【００１６】
本発明の方法における、細胞集団から細胞を解離するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、トリプシン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、プロナーゼ、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、ＣＴＫ（株式会社リプロセル）などを細胞解離剤として用いて解離する化学的な方法、ピペッティングなどによる物理的方法などが挙げられる。細胞集団を培養基材に接着培養後に細胞を解離してもよい。
【００１７】
本発明の方法の一側面は、解離した細胞を凍結保護剤を含む凍結保存液中で凍結するステップをさらに含む。かかる凍結するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、容器内の細胞を、凍結手段、例えば、フリーザー、ディープフリーザー、低温の媒体（例えば、液体窒素等）に供することなどが挙げられる。凍結手段の温度は、容器内の細胞集団の一部、好ましくは全体を凍結させ得る温度であれば特に限定されないが、典型的には０℃以下、好ましくは−２０℃以下、より好ましくは−４０℃以下、さらに好ましくは−８０℃以下である。また、凍結操作における冷却速度は、凍結解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には４℃から冷却を始めて−８０℃に達するまで１〜５時間、好ましくは２〜４時間、特に約３時間かける程度の冷却速度である。具体的には、例えば、０．４６℃／分の速度で冷却することができる。かかる冷却速度は、所望の温度に設定した凍結手段に、細胞を含む容器を直接、または、凍結処理容器に収容して供することにより達成することができる。凍結処理容器は、容器内の温度の下降速度を所定の速度に制御する機能を有していてもよい。かかる凍結処理容器としては、既知の任意のもの、例えば、BICELL(R)（日本フリーザー）などを用いることができる。また、上記冷却速度は、プログラム設定などにより冷却速度を制御することができるフリーザーまたはディープフリーザーを用いることにより達成することができる。かかるフリーザーまたはディープフリーザーとしては、既知の任意のもの、例えば、プログラムフリーザー（例えば、PDF-2000G（ストレックス）、KRYO-560-16（朝日ライフサイエンス））などを用いることができる。
【００１８】
凍結操作は、細胞を浸漬させた培養液や生理緩衝液などを凍結保存液として用い、これに凍結保護剤を加えたり、培養液を凍結保護剤を含む凍結保存液と置換するなどの処理を施したうえで行ってもよい。したがって、本発明の方法は、培養液に凍結保護剤を添加するステップ、または、培養液を凍結保存液に置換するステップをさらに含んでもよい。培養液を凍結保存液に置換する場合、凍結時に細胞が浸漬している液に有効濃度の凍結保護剤が含まれていれば、培養液を実質的に全て除去してから凍結保存液を添加しても、培養液を一部残したまま凍結保存液を添加してもよい。ここで、「有効濃度」とは、凍結保護剤が、毒性を示すことなく、凍結保護効果、例えば、凍結保護剤を用いない場合と比べた、凍結解凍後の細胞の生存率、活力、機能などの低下抑制効果を示す濃度を意味する。かかる濃度は当業者に知られているか、ルーチンの実験などにより適宜決定することができる。
【００１９】
本発明の方法に用いる凍結保護剤は、細胞膜透過性のものであれば特に限定されず、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、１，２−プロパンジオール（１，２−ＰＤ）、１，３−プロパンジオール（１，３−ＰＤ）、ブチレングリコール（ＢＧ）、イソプレングリコール（ＩＰＧ）、ジプロピレングリコール（ＤＰＧ）およびグリセリンなどを含む。特に好ましい凍結保護剤は、ＤＭＳＯおよび１，２−ＰＤである。凍結保護剤は、単独で用いても、２種または３種以上を組み合わせて用いてもよい。
凍結保護剤は、細胞外凍結保護剤と組み合わせて用いてもよい。細胞外凍結保護剤は、例えば、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、デキストラン、アルブミンなどを含む。
【００２０】
培養液への凍結保護剤の添加濃度、または、凍結保存液中の凍結保護剤の濃度は、上記で定義した有効濃度であれば特に限定されず、典型的には、例えば、培養液または凍結保存液全体に対して２〜２０％（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは５〜１５％、最も好ましくは８〜１２％、さらに最も好ましくは１０％である。しかしながら、この濃度範囲からは外れるが、それぞれの凍結保護剤について知られているか、実験的に決定した代替的な使用濃度を採用することもでき、かかる濃度も本発明の範囲内である。例えば、ＤＭＳＯの場合、培養液または凍結保存液全体に対して２〜２０％（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは２．５〜１２．５％、最も好ましくは５〜１０％である。
【００２１】
多能性幹細胞または間葉系幹細胞由来の心筋細胞は、誘導後に精製し、純度を高めることができる。精製方法としては、心筋細胞に特異的なマーカー（例えば、細胞表面マーカーなど）を用いた種々の分離法、例えば、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）、フローサイトメトリー法、アフィニティ分離法や、特異的プロモーターにより選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子など）を発現させる方法、心筋細胞の栄養要求性を利用した方法、すなわち心筋細胞以外の細胞の生存に必要な栄養源を除いた培地で培養して心筋細胞以外の細胞を駆逐する方法（特開2013-143968）、低栄養条件で生存することができる細胞を選抜する方法（WO2007/088874）、心筋細胞と心筋細胞以外の接着タンパク質をコーティングした基材への接着性の違いを用いて心筋細胞を回収する方法（特願2014-188180）、さらにはこれらの方法の組合せなどが挙げられる（例えば、上記Burridge et al.など参照）。心筋細胞に特異的な細胞表面マーカーとしては、例えば、ＣＤ１７２ａ、ＫＤＲ、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。また、心筋細胞に特異的なプロモーターとしては、例えば、ＮＫＸ２−５、ＭＹＨ６、ＭＬＣ２Ｖ、ＩＳＬ１などが挙げられる。一態様において、心筋細胞は細胞表面マーカーであるＣＤ１７２ａに基づいて精製される。
【００２２】
多能性幹細胞または間葉系幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団から未分化の多能性幹細胞または間葉系幹細胞を除去することができる。多能性幹細胞または間葉系幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団に未分化細胞が残存していると、移植後にガン化する可能性が危惧される。未分化細胞を除去する工程には、公知の未分化細胞除去方法を好適に用いることができる。精製方法としては、未分化細胞に特異的なマーカー（例えば、細胞表面マーカーなど）を用いた種々の分離法、例えば、磁気細胞分離法（ＭＡＣＳ）、フローサイトメトリー法、アフィニティ分離法や、特異的プロモーターにより選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子など）を発現させる方法、未分化細胞の生存に必要な栄養源（メチオニン等）を除いた培地で培養して未分化細胞を駆逐する方法、未分化細胞の表面抗原をターゲットにした薬剤で処理する方法、公知の未分化細胞を除去する方法としては、WO2014/126146、WO2012/056997に記載の方法、WO2012/147992に記載の方法、WO2012/133674に記載の方法、WO2012/012803（特表2013-535194）に記載の方法、WO2012/078153（特表2014-501518）に記載の方法、特開2013-143968およびCell Stem Cell Vol.12 January 2013, Page 127-137に記載の方法、 PNAS 2013 Aug 27;110(35):E3281-90に記載の方法などが挙げられる。
【００２３】
多能性幹細胞または間葉系幹細胞由来の心筋細胞は、上記のように多能性幹細胞または間葉系幹細胞から誘導し、任意に上記のような精製処理に供した心筋細胞集団であってもよい。当該心筋細胞集団における心筋細胞の純度（例えば、心筋細胞集団の全細胞数に対する心筋細胞マーカー陽性細胞数の割合）は、例えば、約８５％超、約８６％超、約８７％超、約８８％超、約８９％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超などであってよい。一態様において、本発明における多能性幹細胞または間葉系幹細胞由来の心筋細胞は、心筋細胞の純度が９０％超の心筋細胞集団である。
【００２４】
多能性幹細胞または間葉系幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団は、多能性幹細胞または間葉系幹細胞を心筋細胞誘導処理に供して得られる心筋細胞誘導後の細胞集団をそのまま利用しても、心筋細胞誘導後の細胞集団から心筋細胞を精製して純度を高めたものを利用しても、心筋細胞誘導後の細胞集団から心筋細胞の一部を除去して純度を低下させたものを利用しても、精製した心筋細胞集団を他の細胞集団と混合したものを利用してもよい。一態様において、多能性幹細胞または間葉系幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団は、多能性幹細胞または間葉系幹細胞を心筋細胞誘導処理に供して得られる細胞集団を精製して得た心筋細胞集団と、精製後に残った非心筋細胞集団とを、所定の比率で混合して得たものである。
【００２５】
本発明の別の側面は、上記方法により得られた凍結した細胞を解凍するステップおよびシート状細胞培養物を形成するステップを含む、シート状細胞培養物の製造方法に関する。
【００２６】
本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。
【００２７】
シート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本発明におけるシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができるものであってもよい。また、シート状細胞培養物は、好ましくは、細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
【００２８】
シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。一態様において、シート状細胞培養物を構成する細胞はヒト細胞である。
【００２９】
シート状細胞培養物を形成する細胞は、異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本発明においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本発明の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本発明の一態様において、細胞は自家細胞である。本発明の別の態様において、細胞は他家細胞である。
【００３０】
自家または他家多能性幹細胞は、限定されずに、例えば、採取した自家または他家体細胞（例えば、皮膚細胞（線維芽細胞、ケラチノサイト等）や血球（末梢血単核球等）など）に、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ等の遺伝子を導入するなどして自家または他家ｉＰＳ細胞を誘導することにより得ることができる。体細胞からｉＰＳ細胞を誘導する方法は当該技術分野において周知である（例えば、Bayart and Cohen-Haguenauer, Curr Gene Ther. 2013 Apr;13(2):73-92など参照）。
【００３１】
本発明の製造方法における、凍結した細胞を解凍するステップは、既知の任意の細胞解凍手法により行うことができ、典型的には、例えば、凍結した細胞を、解凍手段、例えば、凍結温度より高い温度の固形、液状もしくはガス状の媒体（例えば、水）、ウォーターバス、インキュベーター、恒温器などに供したり、または、凍結した細胞を、凍結温度より高い温度の媒体（例えば、培養液）で浸漬することにより達成されるが、これに限定されない。解凍手段または浸漬媒体の温度は、細胞を所望の時間内に解凍できる温度であれば特に限定されないが、典型的には４〜５０℃、好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３６〜３８℃である。また、解凍時間は、解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には２分以内であり、特に２０秒以内とすることで生存率の低下を大幅に抑制することができる。解凍時間は、例えば、解凍手段または浸漬媒体の温度、凍結時の培養液または凍結保存液の容量もしくは組成などを変化させて調節することができる。
【００３２】
本発明の製造方法は、凍結した細胞を解凍するステップの後、かつ、シート状細胞培養物を形成するステップの前に、細胞を洗浄するステップを含んでいてもよい。細胞の洗浄は、既知の任意の手法により行うことができ、典型的には、例えば、細胞を細胞洗浄液（例えば、血清や血清成分（血清アルブミンなど）を含むもしくは含まない、培養液または生理緩衝液など）に懸濁し、遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿した細胞を回収することにより達成されるが、これに限定されない。細胞を洗浄するステップにおいては、かかる懸濁、遠心分離、回収のサイクルを１回または複数回（例えば、２、３、４、５回など）行ってもよい。本発明の一態様において、細胞を洗浄するステップは、凍結した細胞を解凍するステップの直後に行われる。本発明において用いることができる市販されている細胞洗浄液の例としては、セルローション（日本全薬工業株式会社）が挙げられる。
【００３３】
本発明の製造方法における、シート状細胞培養物を形成するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、特許文献１や特開2012-115254に記載されたものが挙げられる。
本発明の一態様において、シート状細胞培養物を形成するステップは、細胞を培養基材上に播種するステップ、および、播種した細胞をシート化するステップを含んでもよい。
本発明の一態様において、シート状細胞培養物を形成するステップは、細胞の表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を培養するステップを含んでもよく、前記被覆細胞を培養するステップにおいて、前記被覆細胞と前記培養細胞とは、前記接着膜を介して互いに接着している。前記被覆細胞を被覆する接着膜は、培養細胞同士を接着できる物質であれば限定されないが、分子量１千以上１千万以下のタンパク質等の天然高分子や化学的に得られる合成高分子が好ましい。また、接着膜は、第１の物質を含む膜と第１の物質とは異なる第２の物質を含む膜とが積層された膜とすることが好ましい。第１の物質および第２の物質の組合せとしては、インテグリンが結合するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を含む高分子とＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する高分子との組み合わせであることが好ましい。ＲＧＤ配列を含む高分子は、元来ＲＧＤ配列を有するタンパク質であってもよく、ＲＧＤ配列が化学的に結合されたタンパク質であってもよい。ＲＧＤ配列を含む高分子と相互作用する高分子は、例えばコラーゲン、ゼラチン、プロテオグリカン、インテグリン、酵素および抗体等の水溶性タンパク質を含む。上記ステップにより、個々の細胞に形成された接着膜同士が相互作用して組織化し、三次元構造を有するシート状細胞培養物を形成することができる。
【００３４】
培養基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックス、フィルムなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材が挙げられる。具体的には、親水性の表面を有する基材、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R) TC-Treated Culture Dish、Corning社製など）。
【００３５】
培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平2-211865、特開2003-33177など参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、セルシード社のUpCell(R)）、これらを本発明の製造方法に使用することができる。
【００３６】
上記培養基材は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、典型的には、１〜２００ｃｍ２、好ましくは２〜１００ｃｍ２、より好ましくは３〜５０ｃｍ２である。
【００３７】
培養基材への細胞の播種は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。培養基材への細胞の播種は、例えば、細胞を培養液に懸濁した細胞懸濁液を培養基材（培養容器）に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。
【００３８】
本発明の好ましい態様において、播種は、細胞が培養１〜７日間培養後にシート状細胞培養物を形成し得る密度で行われる。ある態様では、例えば、５×１０４〜５×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では、１×１０５〜２×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では、１×１０５〜１×１０６個／ｃｍ２である。
【００３９】
播種した細胞をシート化するステップも、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特許文献１などに記載されている。細胞のシート化は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、播種した細胞をシート化するステップは、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。かかる条件としては、例えば、３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の気圧（大気圧）下で行うことができる。当業者であれば、播種する細胞の種類に応じて最適な条件を選択することができる。本明細書において、播種した細胞をシート化するための培養を、「シート化培養」と呼ぶ場合もある。
【００４０】
本発明の一態様において、細胞の培養は、所定の期間内、好ましくは、７日以内、より好ましくは５日以内、さらに好ましくは３日以内に行われる。
【００４１】
培養に用いる細胞培養液（単に「培養液」もしくは「培地」と呼ぶ場合もある）は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本発明の一態様において、培養液は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。
基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本発明に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。
【００４２】
基礎培地に含まれるアミノ酸としては、限定されずに、例えば、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンなどが、ビタミン類としては、限定されずに、例えば、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ビオチン、リポ酸、ビタミンＢ１２、アデニン、チミジンなどが、そして、電解質としては、限定されずに、例えば、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＳＯ４、Ｎａ２ＳｉＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮａＶＯ３、ＮｉＣｌ２、ＺｎＳＯ４などがそれぞれ含まれる。基礎培地には、これらの成分のほか、Ｄ−グルコースなどの糖類、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬、プトレシンなどを含んでもよい。
【００４３】
本発明の一態様において、基礎培地に含まれるアミノ酸の濃度は、Ｌ−アルギニン：６３．２〜８４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン：３５〜６３ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン：４．４〜５８４ｍｇ／Ｌ、グリシン：２．３〜３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン：４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン：６６〜１０５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン：１０５〜１３１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リジン：１４６〜１８２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン：１５〜３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン：３３〜６６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−セリン：３２〜４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トレオニン：１２〜９５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン：４．１〜１６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン：１８．１〜１０４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン：９４〜１１７ｍｇ／Ｌである。
また、本発明の一態様において、基礎培地に含まれるビタミン剤の濃度は、Ｄ−パントテン酸カルシウム：４〜１２ｍｇ／Ｌ、塩化コリン：４〜１４ｍｇ／Ｌ、葉酸：０．６〜４ｍｇ／Ｌ、ｉ−イノシトール：７．２ｍｇ／Ｌ、ナイアシンアミド：４〜６．１ｍｇ／Ｌ、リボフラビン：０．００３８〜０．４ｍｇ／Ｌ、チアミン：３．４〜４ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン：２．１〜４ｍｇ／Ｌである。
【００４４】
細胞培養液は、上記のほか、血清、成長因子、ステロイド剤成分、セレン成分などの１種または２種以上の添加物を含んでもよい。しかし、これらの成分は臨床においてはレシピエントに対するアナフィラキシーショック等の副作用要因となり得ることが否定できない製造工程由来不純物であり、臨床への適用にあたっては排除することが望ましい。したがって、本発明の好ましい態様において、細胞培養液は、これらの添加物の少なくとも１種の有効量を含まない。また、本発明のより好ましい態様において、細胞培養液は、これらの添加物の少なくとも１種を実質的に含まない。さらに、本発明の特に好ましい態様において、細胞培養液は、添加物を実質的に含まない。したがって、細胞培養液は、基礎培地のみを含んでもよい。
本発明の別の態様において、細胞培養液は、ＲＯＣＫ（Rho-associated coiled-coil forming kinase）（Rho結合キナーゼ）阻害剤Y-27632を含んでもよい。
本発明において用いられる細胞培養液として、例えば２０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。
【００４５】
本発明の一態様において、シート状細胞培養物を形成するステップは、心筋細胞の精製や未分化細胞の除去を含んでもよい。心筋細胞の精製や未分化細胞の除去は、シート状細胞培養物の形成と並行して行えるものであれば特に限定はされず、例えば、特開2013-143968およびWO2012/056997に記載の、低血清条件、低糖条件、低栄養条件、低カルシウム条件、弱酸性ｐＨ条件、乳酸添加条件、アスパラギン酸・グルタミン酸添加条件および／またはピルビン酸添加条件で、ならびに／あるいはメチオニン、ロイシン、システイン、チロシンおよびアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸を含まない細胞培養液中で行ってもよい。低血清条件とは、無血清条件または分化誘導時に用いた細胞培養液に添加した血清または血清成分もしくは人工的な生理活性物質群の濃度を１００％として算出した場合に０〜１０％にする条件である。低糖条件とは、糖類を含まない条件または分化誘導時に用いた細胞培養液中の糖類の条件と比較して糖類を１％未満まで低下させた条件である。低栄養条件とは、細胞培養液に含有されるすべての栄養成分が、細胞培養液中の栄養成分と比較して１０％以下まで低下している条件である。低カルシウム条件とは、細胞培養液中のカルシウム濃度が０．３〜１．３ｍＭの条件である。弱酸性ｐＨ条件とは、細胞培養液のｐＨが６〜７である条件である。乳酸添加条件とは、細胞培養液に乳酸を０．１〜５ｍＭ添加した条件である。アスパラギン酸・グルタミン酸添加条件とは、細胞培養液にアスパラギン酸およびグルタミン酸をそれぞれ２０〜１００ｍｇ／Ｌ添加した条件である。ピルビン酸添加条件とは、細胞培養液にピルビン酸を０．５〜５ｍＭ添加した条件である。メチオニン、ロイシン、システイン、チロシンおよびアルギニンからなる群より選ばれる少なくとも１つのアミノ酸を含まないとは、細胞培養液が特定のアミノ酸を全く含まないか微量に含有する場合を含む。微量とは、例えば、２０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、さらに好ましくは１μＭ以下、最も好ましくは０．１μＭ以下をいう。これらの条件で培養することにより、分化誘導された心筋細胞に選択的に栄養を供給できると考えられ、未分化細胞が減少または除去するかあるいは分化誘導効率が上がり、心筋細胞を精製することができる。
【００４６】
本発明の製造方法は、シート状細胞培養物を形成するステップの後に、形成されたシート状細胞培養物を回収するステップをさらに含んでもよい。シート状細胞培養物の回収は、シート状細胞培養物が少なくとも部分的に、シート構造を保ったまま、足場となっている培養基材から遊離（剥離）できれば特に限定されず、例えば、タンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）による酵素処理および／またはピペッティングなどの機械的処理によって行うことができる。また、細胞を、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面を被覆した培養基材上で培養して細胞培養物を形成した場合には、所定の刺激を加えることで、非酵素的に遊離することもできる。
【００４７】
本発明の製造方法の一態様は、シート状細胞培養物を形成するステップの後に、シート状細胞培養物を回収するステップをさらに含み、細胞を解凍するステップが、シート状細胞培養物を回収するステップの４８時間以内前に行われる。細胞を解凍するステップと、シート状細胞培養物を回収するステップとの間の時間を４８時間以下、好ましくは３６時間以下、より好ましくは２４時間以下とすることにより、シート状細胞培養物の活性をさらに高めることができる。
【００４８】
本発明の製造方法は、細胞を凍結するステップの前に、細胞を増殖させるステップをさらに含んでもよい。細胞を増殖させるステップは、既知の任意の手法で行ってもよく、当業者は各種細胞の増殖に適した培養条件に精通している。本発明の製造方法において、細胞を解凍するステップの後、細胞を実質的に増殖させずに、シート状細胞培養物を形成する場合、または、細胞を解凍するステップを、シート状細胞培養物を回収するステップの４８時間以内前に行う場合、所望の細胞数を得るために、細胞を凍結するステップの前に、細胞を増殖させるステップを行うことは有用である。
【００４９】
本発明の製造方法は、細胞を凍結するステップの前および／または後に、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団を分散させて単細胞化し、心筋細胞を精製し、当該細胞を凝集して細胞塊を形成するステップをさらに含んでもよい。細胞集団を分散させて単細胞化し、心筋細胞を精製する手法は、酵素の作用により心筋細胞をバラバラに分散（単細胞化）して、個々の心筋細胞として精製することができる方法であれば、特に限定されない。例えば、心筋細胞内のミトコンドリアを指標として選択する方法（WO2006/022377）、低栄養条件で生存することができる細胞を選抜する方法（WO 2007/088874）を用いて心筋細胞のみを精製（選択）することができる。当該精製された心筋細胞を凝集して細胞塊を形成する手法は、既知の任意の手法で行ってもよく、例えば、無血清条件下の培地を用いて当該細胞を培養することにより、当該細胞を凝集させて細胞塊を形成する手法が挙げられる。好ましくは、当該培養に用いる培地にインスリン（０．１〜１０ｍｇ／Ｌ）、トランスフェリン（０．１〜１０μｇ／Ｌ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ（０．１〜１０μｇ／Ｌ））、上皮細胞増殖因子（１ｎｇ〜１０００ｎｇ／ｍＬ）、血小板由来成長因子（１ｎｇ〜１０００ｎｇ／ｍＬ）およびエンドセリン−１（ＥＴ−１）（１×１０−８〜１×１０−６Ｍ）からなる物質群から選択される少なくとも１つの物質が含まれていることが望ましい。上記成分以外の培地の組成や培養条件等は、当業者であれば、WO 2009/017254等を参考に適宜設定することができる。
【００５０】
一態様において、本発明の製造方法は、細胞に遺伝子を導入するステップを含まない。別の態様において、本発明の製造方法は、細胞に遺伝子を導入するステップを含む。導入する遺伝子は、対象とする疾患の処置に有用なものであれば特に限定されず、例えば、ＨＧＦ、ＶＥＧＦなどのサイトカインであってもよい。遺伝子の導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、電気穿孔法、パーティクルガン法、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター利用する方法、マイクロインジェクション法などの既知の任意の方法を用いて行うことができる。細胞への遺伝子の導入は、限定されずに、例えば、細胞を凍結するステップの前に行うことができる。
【００５１】
一態様において、本発明の製造方法はその全ステップがin vitroで行われる。別の態様において、本発明の製造方法は、in vivoで行われるステップ、限定されずに、例えば、対象から細胞（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚細胞、血球等）または細胞の給源となる組織（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚組織、血液等）を採取するステップを含む。一態様において、本発明の製造方法はその全ステップが無菌条件下で行われる。一態様において、本発明の製造方法は、最終的に得られるシート状細胞培養物が実質的に無菌となるように行われる。一態様において、本発明の製造方法は、最終的に得られるシート状細胞培養物が無菌となるように行われる。
【００５２】
本発明の別の側面は、本発明のシート状細胞培養物を含む組成物、移植片および医療製品など（以下、「組成物等」と総称することがある）に関する。
本発明の組成物等は、本発明のシート状細胞培養物に加えて、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体や、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。また、本発明の組成物等は、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などと併用することができる。
【００５３】
一態様において、本発明のシート状細胞培養物および組成物等は疾患（例えば、心疾患）を処置するためのものである。また、本発明のシート状細胞培養物は、疾患（例えば、心疾患）を処置するための組成物等の製造に使用することができる。疾患としては、限定されずに、例えば、心筋梗塞（心筋梗塞に伴う慢性心不全を含む）、拡張型心筋症、虚血性心筋症、収縮機能障害（例えば、左室収縮機能障害）を伴う心疾患（例えば、心不全、特に慢性心不全）などが挙げられる。疾患は、心筋細胞、および／または、シート状細胞培養物（細胞シート）が、その処置に有用なものであってもよい。
【００５４】
本発明の別の側面は、上記方法により得られた凍結した多能性幹細胞または間葉系幹細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団、細胞培養液および培養基材を含むキット（以下、「本発明のキット」と称することがある）に関する。細胞培養液および培養基材は、上記培養に用いる細胞培養液および培養基材からそれぞれ選択される。
【００５５】
本発明のキットの一側面は、医療用接着剤および細胞洗浄液をさらに含む。医療用接着剤は、外科手術等に使用される接着剤であれば、特に限定されない。医療用接着剤の例として、シアノアクリレート系、ゼラチン−アルデヒド系およびフィブリングルー系接着剤が挙げられ、ベリプラスト(R)（ＣＳＬベーリング株式会社）およびボルヒール(R)（帝人ファーマ株式会社）等のフィブリングルー系接着剤が好ましい。細胞洗浄液は、上述の細胞を洗浄するステップにおいて用いる細胞洗浄液である。
【００５６】
本発明のキットはさらに、血管内皮細胞、壁細胞および線維芽細胞から選択される１種または２種以上の細胞、上記添加物、培養皿、心筋細胞の精製に用いる試薬（例えば、抗体、洗浄液、ビーズ等）、器具類（例えば、ピペット、スポイト、ピンセット等）、シート状細胞培養物の製造方法や使用方法に関する指示（例えば、使用説明書、製造方法や使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリー等）などを含んでいてもよい。
【００５７】
本発明の別の側面は、本発明のシート状細胞培養物、本発明の組成物または本発明のキットの、薬剤のスクリーニングのための使用に関する。本発明のシート状細胞培養物を、薬剤スクリーニングに従来使用されていた動物実験モデルの代替として使用することができる。薬剤の種類およびスクリーニング方法については、当業者が適宜選択および設定することができる。
【００５８】
本発明の別の側面は、本発明のシート状細胞培養物または組成物等の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、前記対象における疾患を処置する方法に関する。処置の対象となる疾患は、本発明のシート状細胞培養物および組成物等について上記したとおりである。
【００５９】
本発明において、用語「対象」は、任意の生物個体、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体を意味する。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、組織の異常に関連する疾患の処置が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
【００６０】
また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、組織の異常に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００６１】
本発明の処置方法においては、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本発明のシート状細胞培養物または組成物等と併用することができる。
【００６２】
本発明の処置方法は、本発明の製造方法に従って、本発明のシート状細胞培養物を製造するステップをさらに含んでもよい。本発明の処置方法は、シート状細胞培養物を製造するステップの前に、対象からシート状細胞培養物を製造するための細胞（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚細胞、血球等）または細胞の給源となる組織（ｉＰＳ細胞を用いる場合は、例えば、皮膚組織、血液等）を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象とは異種の個体である。
【００６３】
本発明において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、シート状細胞培養物のサイズ、重量、枚数等）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。
【００６４】
投与方法としては、典型的には組織への直接的な適用が挙げられる。投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。組織に適用する際、本発明のシート状細胞培養物や組成物等を対象の組織に縫合糸やステープルなどの係止手段により固定してもよい。
【００６５】
本発明の別の側面は、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から解離した細胞を凍結保護剤を含む凍結保存液中で凍結するステップを含む、前記解離した細胞における分化した多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から分化誘導された心筋細胞の純度を高める方法に関する。
【００６６】
上記凍結するステップは、本発明の製造方法について上記したとおりである。また、「分化した多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞由来の心筋細胞の純度を高める」とは、凍結後の多能性幹細胞または間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から解離した全細胞数に対する分化した多能性幹細胞または間葉系幹細胞由来の心筋細胞数の割合を、凍結前と比較して約５％以上、約１０％以上、約１５％以上または約２０％以上高めることなどを意味する。
【００６７】
本発明の別の側面は、多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から解離した細胞を凍結保護剤を含む凍結保存液中で凍結するステップを含む、前記解離した細胞における未分化の多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞の割合を低下させる方法に関する。
【００６８】
上記凍結するステップは、本発明の製造方法について上記したとおりである。また、「未分化の多能性幹細胞または脂肪組織もしくは骨髄由来の間葉系幹細胞の割合を低下させる」とは、凍結後の多能性幹細胞または間葉系幹細胞から心筋細胞への分化誘導を受けた細胞集団から解離した全細胞数に対する未分化の多能性幹細胞または間葉系幹細胞数の割合が、凍結前と比較して約５％以上、約１０％以上、約１５％以上または約２０％以上低下することなどを意味する。
【実施例】
【００６９】
本発明を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これらは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。【００７０】
例１  ヒトｉＰＳ細胞からの心筋細胞の誘導
ヒトｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１を理化学研究所から購入して使用した。 Matsuura K et al., Biochem Biophys Res Commun, 2012 Aug 24;425(2):321-7に記載の方法に従いリアクターを用いて心筋分化誘導を行った。具体的には、ＰｒｉｍａｔｅＥＳ培地（リプロセル社）に５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したものを未分化維持培地として用い、マイトマイシンＣ処理を行ったＭＥＦ上で未分化２５３Ｇ１細胞を培養した。１０ｃｍ培養皿１０枚分の未分化２５３Ｇ１細胞を、剥離液（リプロセル社）を用いて回収し、１０μＭのＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）を添加したｍＴｅＳＲ培地（ステムセルテクノロジーズ）１００ｍＬに懸濁した後、ベッセルに移し、バイオリアクター（エイブル社）で撹件培養を開始した。１日後、培地からＹ２７６３２を除いた。１〜３日後に培地をＳｔｅｍＰｒｏ−３４（ライフテクノロジーズ）に置換し、３日〜４日後に０．５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４を添加し、４〜７日後に１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４と５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと３ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加し、７〜９日後に４μＭのＩＷＲ-１を添加し、９日目以降は５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦと１０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加して撹絆を続け、１６〜１８日後に細胞を回収した。
こうしてヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を含む細胞集団（細胞塊）を得た。当該細胞集団は、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで解離後、残存する細胞凝集物をストレイナー（BD Bioscience社製）で除去し、その後の実験に供した。【００７１】
例２  ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞の凍結保存・融解
例１で得た解離した細胞集団の一部を、２．５×１０６〜１．１×１０７個／１ｍＬの濃度で１０％ＤＭＳＯを含む細胞培養用血清代替品（10% DMSO in serum replacement containing culture medium）に懸濁し、液体窒素タンク内で凍結保存した。
凍結保存した細胞を、３７℃で解凍し、０．５％血清アルブミンを含む緩衝液を用いて２回洗浄した。【００７２】
例３  ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞の生存率評価１
例２に従い、別個に凍結保存・解凍した細胞の４つのサンプルを用意した。各サンプルから一部の細胞を採取し、トリパンブルー染色法により生細胞、死細胞をそれぞれカウントし、総細胞数と生細胞数から生存率を算出した。結果を、以下の表１に示す。
【表１】
2017010544.tif 000002
【００７３】
表１に示すとおり、本願発明の方法により凍結保存・解凍した多能性幹細胞由来の心筋細胞は、高い細胞生存率を維持することができた。【００７４】
例４  ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞の生存率評価２
例１で得た細胞の一部を用いて、当該細胞におけるｉＰＳ細胞と心筋細胞の割合を調べた。まず、細胞を、ｉＰＳ細胞のマーカーであるＳＳＥＡ−４またはＴｒａ−１−６０と心筋細胞のマーカーであるｃ−ＴＮＴの両方について二重標識した。【００７５】
標識した細胞を、BD FACSCantoTM II フローサイトメーターおよびBD FACSDivaTM ソフトウェア（いずれもBD社製）を用いて解析した。全細胞数に対するｉＰＳ細胞および心筋細胞それぞれの割合は、全細胞数に対するＳＳＥＡ−４またはＴｒａ−１−６０陽性細胞数およびｃ−ＴＮＴ陽性細胞数それぞれの割合として算出した。結果を、図１〜３に示す。
また、参考のために、例１の分化誘導前のｉＰＳ細胞の一部について、例１に記載の方法により解離および細胞凝集物除去し、例２に従い凍結保存・解凍し、上述と同様に標識、分析および算出した結果を、図４に示す。
ＳＳＥＡ−４およびｃ−ＴＮＴで二重標識した細胞は、図１および２に示すとおり、ｃ−ＴＮＴ陽性率は凍結前後４５％台から４４％台に低下したに止まったのに対し、ＳＳＥＡ−４陽性率は凍結前２０．６％から凍結後８．４％に減少した。ｉＰＳ細胞のみで凍結保存した際にも、図４に示すとおり、ＳＳＥＡ−４陽性率は約８７％から約７３％に減少した。Ｔｒａ−１−６０およびｃ−ＴＮＴで二重標識した細胞は、図３に示すとおり、ｃ−ＴＮＴ陽性率は凍結前６３．５％から凍結後６８．７％に上昇しているのに対し、Ｔｒａ−１−６０陽性率は凍結前０．８％から凍結後０．６％に減少し、約２５％の減少率を示した。【００７６】
例５  シート状細胞培養物の作製
UpCell(R)３．５ｃｍディッシュ（CellSeed Inc.）に、培養表面が全て覆われる程度の２０％血清含有培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の環境で３時間〜３日間処理した。処理後、添加した培地は廃棄した。例２で得られた細胞を、１０％血清含有培地に懸濁し、処理済みUpCell(R)に２〜１０×１０５個／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の環境で３〜５日間、シート化培養を行った。【００７７】
例６  シート状細胞培養物の評価
（１）外観
例５で作成したシート状細胞培養物は、移植に適した白色円形の形状を形成することができた（図５）。
（２）ヘマトキシリン・エオシン染色
例５で作成したシート状細胞培養物の一部の細胞を採取し、当該細胞に、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）を行った。染色した細胞を、光学顕微鏡で観察した。図６に示すとおり、細胞核が青紫に染色され、細胞質が赤黄色に染色され、例５で作成したシート状細胞培養物の細胞は、細胞膜や細胞核が正常であることが確認された。
（３）免疫染色
例５で作成したシート状細胞培養物の一部の細胞を採取し、当該細胞を、アクチニンのマーカーであるＡｃｔｉｎｉｎ、心筋細胞のマーカーであるｃ−ＴＮＴおよびＤＮＡのマーカーである４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）について多重染色した。標識した細胞を、励起波長を当てて蛍光発色させ、蛍光顕微鏡で観察した。図７に示すとおり、Ａｃｔｉｎｉｎ陽性部分は赤色に、ｃ−ＴＮＴ陽性部分は緑色に、ＤＡＰＩ陽性部分は青紫色に発光した。図７から、例５で作成したシート状細胞培養物の細胞は、心筋細胞であり、心筋細胞として機能することが確認された。
（４）同期拍動
例５で作成したシート状細胞培養物を、マルチチャンネル細胞外記録法(Multi Electrode Dish : MED、アルファメッドサイエンティフィック社製、MED64システム)を用いて解析した。当該シート状細胞培養物は、自発的な同期拍動を示した（図８）。【００７８】
例７  ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞の安定性データ
例１で得た解離した細胞集団の一部を、１．０×１０７個／１ｍＬの濃度で市販のSTEM-CELLBANKER(R) GMP Grade（日本全薬工業株式会社）に懸濁し、プログラムフリーザーPDF-2000G（ストレックス）を用いた緩慢凍結し、液体窒素タンク内で凍結保存した。プログラムフリーザーの緩慢凍結条件は、４℃で１０分間プレコンディショニングした後、−１℃／ｍｉｎでの緩慢凍結であった。その後、凍結保存開始日を０日目として１日目と４２日目に細胞を、３７℃で解凍し、０．５％血清アルブミンを含む緩衝液を用いて２回洗浄した。各サンプルの細胞を採取し、トリパンブルー染色法により生細胞、死細胞をそれぞれカウントし、総細胞数と生細胞数から細胞回収率を算出した。結果を図９に示す。本願発明の方法により凍結保存・解凍した多能性幹細胞由来の心筋細胞は、凍結保存開始１日目に解凍した場合も凍結保存開始４２日目に解凍した場合も７０％前後の細胞回収率を維持した。上記結果から、本願発明の方法により凍結保存・解凍した多能性幹細胞由来の心筋細胞は、１ヶ月以上保存後にも高い安定性を維持していることが分かった。【００７９】
例８  凍結保存液の比較
例１で得た解離した細胞集団の一部を、１．０×１０６個／１ｍＬの濃度でＤＭＳＯが０〜１５％濃度範囲になるよう調整した細胞培養用血清代替品（０〜１５％ DMSO in serum replacement containing culture medium）または市販のSTEM-CELLBANKER(R) GMP Grade（日本全薬工業株式会社）に懸濁し、−８０℃の超低温冷凍庫でBICELL(R)を用いた緩慢凍結し、液体窒素タンク内で凍結保存した。その後、凍結保存した細胞を、３７℃で解凍し、０．５％血清アルブミンを含む緩衝液を用いて２回洗浄した。各サンプルの細胞を採取し、トリパンブルー染色法により生細胞、死細胞をそれぞれカウントし、総細胞数と生細胞数から細胞回収率を算出した。結果を、図１０に示す。凍結保存液としては、STEM-CELLBANKER(R) GMP Gradeまたは５％〜１０％のＤＭＳＯ凍結保存液が、２５％以上のより高い心筋細胞の回収率を示した。【００８０】
例９  凍結方法の比較
例１で得た解離した細胞集団の一部を、１．０×１０６個／１ｍＬの濃度でＤＭＳＯ濃度が１０％となるように調製した細胞培養用血清代替品（10% DMSO in serum replacement containing culture medium）あるいは市販のSTEM-CELLBANKER(R) GMP GradeまたはSTEM-CELLBANKER(R) DMSO Free GMP Grade（日本全薬工業株式会社）に懸濁し、プログラムフリーザーPDF-2000G（ストレックス）または−８０℃の超低温冷凍庫でBICELL(R)を用いた緩慢凍結し、液体窒素タンク内で凍結保存した。プログラムフリーザーの緩慢凍結条件は、４℃で１０分間プレコンディショニングした後、−１℃／ｍｉｎでの緩慢凍結であった。その後、凍結保存液および凍結手段の各組合せで凍結保存した細胞を、３７℃で解凍し、０．５％血清アルブミンを含む緩衝液を用いて２回洗浄した。各サンプルの細胞を採取し、トリパンブルー染色法により生細胞、死細胞をそれぞれカウントし、総細胞数と生細胞数から細胞回収率を算出した。結果を、図１１に示す。いずれの組合せも、４２％以上の心筋細胞の回収率を達成した。中でも、STEM-CELLBANKER(R) DMSO Free GMP Gradeおよびプログラムフリーザーで凍結保存する方法が、最も高い心筋細胞の回収率（６７％）を示した。【００８１】
例１０  ヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞シートの有効性評価
凍結したｉＰＳ細胞由来心筋細胞と凍結していないｉＰＳ細胞由来心筋細胞からそれぞれ細胞シートを調製して、虚血性心筋梗塞モデルのヌードラットに移植して、心機能改善効果を確認した。凍結するｉＰＳ細胞由来心筋細胞は１．０×１０7個／１ｍＬの濃度で市販のSTEM-CELLBANKER(R) GMP Grade（日本全薬工業社）に懸濁し、プログラムフリーザーを用いた緩慢凍結し、液体窒素タンク内で凍結保存した。 融解操作は３７℃で解凍し、０．５％血清アルブミンを含む緩衝液を用いて２回洗浄した。凍結しないｉＰＳ細胞由来心筋細胞細胞は、２０％血清含有培地に懸濁した。各サンプルの細胞を採取し、トリパンブルー染色法により、総細胞数と生細胞数から細胞回収率を算出した。UpCell(R) 48 wellディッシュ（CellSeed Inc.）に、培養表面が全て覆われる程度の２０％血清含有培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の環境で３時間〜３日間処理した。処理後、添加した培地は廃棄した。凍結していないｉＰＳ細胞由来心筋細胞および凍結したｉＰＳ細胞由来心筋細胞をそれぞれ１０％血清含有培地に懸濁し、処理済みUpCell(R)に２〜１０×１０５個／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２の環境で２〜５日間、シート化培養を行った。作製した細胞シートを剥離して、虚血性心筋梗塞モデルのヌードラットの心臓表面に移植した。結果を、図１２に示す。移植後４週目の心エコーおよび心カテーテル検査で、ｉＰＳ心筋細胞シート群は細胞シートを移植しないSham ope群と比較して、心機能（ejection fraction: EF, fractional shortening: FS）の有意な改善が認められた（非凍結心筋細胞群：51±3%, n=6、凍結心筋細胞群：51±5%, n=7、Sham群：39±1%, n=6）。一方、非凍結心筋細胞群と凍結心筋細胞群では心機能に有意な差は認められなかった。また、どちらの群においても、移植した細胞シートによる腫瘍形成など、特段の異常は認められなかった。【００８２】
本明細書に記載された本発明の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、すべて本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。
【図１】
2017010544.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2017010544.tif 000009
【図８】
2017010544.tif 000010
【図９】
2017010544.tif 000011
【図１０】
2017010544.tif 000012
【図１１】
2017010544.tif 000013
【図１２】
2017010544.tif 000014
【国際調査報告】
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