(57)【要約】  本発明は、コロイド粒子を含む検体から高効率で核酸を精製する方法及びそのための薬剤を提供することを課題とする。  本発明は、（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、の一方又は両方、並びに（iii）カオトロピック剤、を含む可溶化剤、並びに該可溶化試剤を用いる核酸の精製方法等により上記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コロイド粒子を含む検体から核酸を精製する方法であって、
（a）（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、の一方又は両方、並びに（iii）カオトロピック剤、を含む可溶化剤で検体を処理して、検体中のコロイド粒子を可溶化する工程、
（b）可溶化剤で処理した検体を、核酸吸着担体と接触させる工程、並びに
（c）核酸吸着担体から核酸を溶出させる工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
コロイド粒子を含む検体から核酸を精製する方法であって、
（a）（i）アミド型界面活性剤、（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、並びに（iii）カオトロピック剤を含む可溶化剤で検体を処理して、検体中のコロイド粒子を可溶化する工程、
（b）可溶化剤で処理した検体を、核酸吸着担体と接触させる工程、並びに
（c）核酸吸着担体から核酸を溶出させる工程、
を含む、前記方法。
【請求項３】
アミド型界面活性剤が脂肪酸アルカノールアミドである請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
両親媒性有機溶媒がDMSO、エチレンジアミン、及びピリジンからなる群から選択される1種又は2種以上の組み合わせである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
カオトロピック剤がグアニジン塩である請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
検体が、コロイド液、エマルジョン、動物性乳汁、乳状体液、全血、血清、リンパ液、尿、汗、鼻腔液、脊髄液、組織液、精液、膣液、羊水、涙、唾液、糞便、膿、喀痰、乾酪化組織、細胞懸濁液、細胞含有液、組織液、乳状樹液、乳状果汁、植物性乳汁、乳製品、並びにコロイド粒子を含む化粧品、医薬品、及び洗剤からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
コロイド粒子が、ミセル、リポソーム、脂肪球、固体微粒子、泡、動物細胞、植物細胞、寄生虫、真菌、カビ、酵母、細菌、アーキア、ウイルス、胞子、芽胞、及びシストからなる群より選択される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
コロイド粒子を含む検体から核酸を精製するために、コロイド粒子を可溶化するための可溶化剤組成物であって、（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、の一方又は両方、並びに（iii）カオトロピック剤、を含む可溶化剤組成物。
【請求項９】
コロイド粒子を含む検体から核酸を精製するために、コロイド粒子を可溶化するための可溶化剤組成物であって、（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、並びに（iii）カオトロピック剤を含む可溶化剤組成物。
【請求項１０】
アミド型界面活性剤が脂肪酸アルカノールアミドである請求項8又は9に記載の可溶化剤組成物。
【請求項１１】
両親媒性有機溶媒がDMSO、エチレンジアミン、及びピリジンからなる群から選択される1種又は2種以上の組み合わせである、請求項8〜10のいずれか一項に記載の可溶化剤組成物。
【請求項１２】
カオトロピック剤がグアニジン塩である請求項8〜11のいずれか一項に記載の可溶化剤組成物。
【請求項１３】
請求項8〜12のいずれか一項に記載の可溶化剤組成物を含む、核酸精製キット。
【請求項１４】
（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、の一方又は両方、並びに（iii）カオトロピック剤、を含む、コロイド粒子を可溶化するための可溶化剤キット。
【請求項１５】
（i）アミド型界面活性剤、（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、並びに（iii）カオトロピック剤を含む、コロイド粒子を可溶化するための可溶化剤キット。
【請求項１６】
（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、の一方又は両方、並びに（iii）カオトロピック剤、を含む核酸精製キット。
【請求項１７】
（i）アミド型界面活性剤、（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、並びに（iii）カオトロピック剤を含む核酸精製キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コロイド粒子を含む検体から核酸を精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子検査は、核酸の定性的又は定量的分析に基づいて検体を検査する方法である。遺伝子検査は、高感度かつ短時間での結果判定が可能であるため、医療、農畜水産、及び品質検査等の多様な領域において応用される産業上重要な検査法である。本検査のためには、検体から核酸を精製する必要があり、核酸精製法としては、カオトロピック剤の存在下において核酸が核酸吸着担体と結合する性質を応用したバインド・エリュート法が最も汎用されている（特許文献１）。この精製法は一般に、（a）検体の溶解及び核酸の溶出を行う溶解工程、（b）核酸と核酸吸着担体の結合を行う吸着工程、（c）核酸吸着担体に結合した核酸の洗浄を行う洗浄工程、（d）核酸吸着担体に結合した核酸の溶出を行う溶出工程、から構成される。特に、スピンカラムを用いる方法は、簡便に高純度の核酸を精製することができる優れた方法である。しかしながら、血液等のコロイド粒子を多量に含む検体から核酸を精製する場合には、核酸回収効率が大きく低下することが知られていた。この原因は、検体に含まれるコロイド粒子又はその凝集体が、核酸と核酸吸着担体との結合を物理的に遮断するためである。特に、スピンカラムを利用した手法においては、コロイド粒子の凝集体がカラムの目詰まりの原因となり、核酸回収効率が著しく低下する。【０００３】
この問題を解決する手法として、検体に含まれるコロイド粒子を高速遠心により分離除去し、核酸回収効率の低下を抑制する手法が存在するが、高速遠心操作が煩雑であり、効率性の点に課題がある。また、検体にアルコール系有機溶媒、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、及びカオトロピック剤を添加し、高速遠心操作を必要とせずに、核酸回収効率の低下を抑制する手法が知られているが（特許文献２）、検体量が多い場合に適さず、また血液及び乳汁等の高濃度のコロイド粒子を含有する検体からの核酸精製においては核酸回収効率が不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2001-78790公報
【特許文献２】特表2014-526255公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、コロイド粒子を含む検体から高効率で核酸を精製する方法及び該方法に用いるための薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、（i）アミド型界面活性剤、及び／又は（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、並びに（iii）カオトロピック剤を含む可溶化剤を用いて、検体に含まれるコロイド粒子を可溶化することで、検体中の核酸を高効率で精製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００７】
したがって、本発明は、以下の態様を包含する。
（１）コロイド粒子を含む検体から核酸を精製する方法であって、
（a）（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、の一方又は両方、並びに（iii）カオトロピック剤、を含む可溶化剤で検体を処理して、検体中のコロイド粒子を可溶化する工程、
（b）可溶化剤で処理した検体を、核酸吸着担体と接触させる工程、並びに
（c）核酸吸着担体から核酸を溶出させる工程、
を含む、前記方法。
（２）コロイド粒子を含む検体から核酸を精製する方法であって、
（a）（i）アミド型界面活性剤、（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、並びに（iii）カオトロピック剤を含む可溶化剤で検体を処理して、検体中のコロイド粒子を可溶化する工程、
（b）可溶化剤で処理した検体を、核酸吸着担体と接触させる工程、並びに
（c）核酸吸着担体から核酸を溶出させる工程、
を含む、前記方法。
（３）アミド型界面活性剤が脂肪酸アルカノールアミドである（１）又は（２）に記載の方法。
（４）両親媒性有機溶媒がDMSO、エチレンジアミン、及びピリジンからなる群から選択される1種又は2種以上の組み合わせである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）カオトロピック剤がグアニジン塩である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）検体が、コロイド液、エマルジョン、動物性乳汁、乳状体液、全血、血清、リンパ液、尿、汗、鼻腔液、脊髄液、組織液、精液、膣液、羊水、涙、唾液、糞便、膿、喀痰、乾酪化組織、細胞懸濁液、細胞含有液、組織液、乳状樹液、乳状果汁、植物性乳汁、乳製品、並びにコロイド粒子を含む化粧品、医薬品、及び洗剤からなる群から選択される、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）コロイド粒子が、ミセル、リポソーム、脂肪球、固体微粒子、泡、動物細胞、植物細胞、寄生虫、真菌、カビ、酵母、細菌、アーキア、ウイルス、胞子、芽胞、及びシストからなる群より選択される、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）コロイド粒子を含む検体から核酸を精製するために、コロイド粒子を可溶化するための可溶化剤組成物であって、（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、の一方又は両方、並びに（iii）カオトロピック剤、を含む可溶化剤組成物。
（９）コロイド粒子を含む検体から核酸を精製するために、コロイド粒子を可溶化するための可溶化剤組成物であって、（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、並びに（iii）カオトロピック剤を含む可溶化剤組成物。
（１０）アミド型界面活性剤が脂肪酸アルカノールアミドである（８）又は（９）に記載の可溶化剤組成物。
（１１）両親媒性有機溶媒がDMSO、エチレンジアミン、及びピリジンからなる群から選択される1種又は2種以上の組み合わせである、（８）〜（１０）のいずれかに記載の可溶化剤組成物。
（１２）カオトロピック剤がグアニジン塩である（８）〜（１１）のいずれかに記載の可溶化剤組成物。
（１３）（８）〜（１２）のいずれかに記載の可溶化剤組成物を含む、核酸精製キット。
（１４）（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、の一方又は両方、並びに（iii）カオトロピック剤、を含む、コロイド粒子を可溶化するための可溶化剤キット。
（１５）（i）アミド型界面活性剤、（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、並びに（iii）カオトロピック剤を含む、コロイド粒子を可溶化するための可溶化剤キット。
（１６）（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、の一方又は両方、並びに（iii）カオトロピック剤、を含む核酸精製キット。
（１７）（i）アミド型界面活性剤、（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、並びに（iii）カオトロピック剤を含む核酸精製キット。
（１８）（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、の一方又は両方、並びに（iii）カオトロピック剤の、コロイド粒子を可溶化するための使用。
（１９）（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、並びに（iii）カオトロピック剤の、コロイド粒子を可溶化するための使用。
（２０）コロイド粒子を可溶化する方法であって、
コロイド粒子を、（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、の一方又は両方、並びに（iii）カオトロピック剤により処理する工程を含む方法。
（２１）コロイド粒子を可溶化する方法であって、
コロイド粒子を、（i）アミド型界面活性剤、及び（ii）スルホキシド系及びアミン系両親媒性有機溶媒からなる群から選択される1種又は2種以上の両親媒性有機溶媒、並びに（iii）カオトロピック剤により処理する工程を含む方法。
（２２）上記（１８）〜（２１）のいずれか１つにおいて、前記コロイド粒子は、検体中に含まれるコロイド粒子である。該検体は好ましくは上記（６）に記載の検体である。
（２３）上記（１８）〜（２１）のいずれか１つにおいて、コロイド粒子は上記（７）に記載のコロイド粒子である。
（２４）上記（１８）〜（２１）のいずれか１つにおいて、アミド型界面活性剤は上記（３）に記載の化合物である。
（２５）上記（１８）〜（２１）のいずれか１つにおいて、両親媒性有機溶媒は上記（４）に記載の化合物である。
（２６）上記（１８）〜（２１）のいずれか１つにおいて、カオトロピック剤は上記（５）に記載の化合物である。【０００８】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-090596号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、コロイド粒子を含む検体から、高効率かつ高純度で核酸を精製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１に記載の界面活性剤（5重量%〜20重量%）及び両親媒性有機溶媒（5容量%〜50容量%）の添加による乳汁の濁度の変化を測定した結果を示す図である。
【図２】実施例２に記載の可溶化剤組成物A〜L及び滅菌蒸留水Mを用いて乳汁検体から精製した核酸を、リアルタイムPCRにより解析した結果を示す図である。
【図３】可溶化剤組成物（15重量%アミゾールCDE-G、1.7Mチオシアン酸グアニジン、及び40容量%DMSO）を用いて乳汁検体から精製した核酸を、PCRにより増幅し、電気泳動を行った結果を示す図である。
【図４】可溶化剤組成物（15重量%アミゾールCDE-G、1.7Mチオシアン酸グアニジン、及び40容量%DMSO）を用いて血液検体から精製した核酸を、リアルタイムPCRにより解析した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一態様において、本発明は、コロイド粒子を含む検体から核酸を精製する方法に関する。
【００１２】
本明細書において、「コロイド粒子」とは、物質の形を球と仮定した場合に、その半径が一般に約10-10m（0.1nm）〜10-5m（10μm）、例えば約10-9m（1nm）〜10-6m（1μm）である粒子をいい、「コロイド」とは、コロイド粒子が気体、液体、又は固体のいずれかの分散媒中に分散した系をいう。本明細書において、コロイド粒子は、粒子のみならず、上記粒子径を有する液滴及び油滴、膜に包まれた液滴及び油滴、泡、並びにそれらの混合物を包含する。コロイド粒子としては、限定するものではないが、例えば、ミセル、リポソーム、脂肪球、固体微粒子、及び泡、並びに細胞（オレオサイエンス、第8巻第2号、pp.33-38、(2008)）、例えば、動物細胞、植物細胞、寄生虫、真菌、カビ、酵母、細菌、アーキア、ウイルス、胞子、芽胞、及びシスト等が挙げられる。
【００１３】
コロイド粒子を含む検体としては、限定するものではないが、例えば、コロイド液；エマルジョン；ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の哺乳動物由来の動物性乳汁、好ましくは牛乳；乳状体液、全血、血清、リンパ液、尿、汗、鼻腔液、脊髄液、組織液、精液、膣液、羊水、涙、唾液、糞便、膿、喀痰、及び乾酪化組織等の動物由来試料；細胞懸濁液；細胞含有液；組織液；乳状樹液；乳状果汁；豆乳、ココナッツミルク、及びアーモンドミルク等の植物性乳汁；ヨーグルト、チーズ、バター、及びクリーム等の乳製品；並びにコロイド粒子を含む化粧品、医薬品、及び洗剤等の加工品が挙げられる。
【００１４】
本明細書において、核酸は、大きく天然型核酸と非天然型核酸に分けられ、「天然型核酸」とは、ヌクレオチドを基本単位とし、各ヌクレオチド間が糖の3'位と5'位炭素のリン酸ジエステル結合で結ばれたポリヌクレオチドをいう。天然型核酸としては、DNAやRNAといったデオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチドの重合体が挙げられる。「非天然型核酸」とは、上記天然のヌクレオチドにかえて、又は加えて、非天然のヌクレオチドを含む核酸をいい、非天然のヌクレオチドとは、ヌクレオチドの塩基部分等に人工的な改変がなされたヌクレオチド、又は人工的に作られたヌクレオチドに類似する性質を有するヌクレオチド類似体を指し、例えば、キサントシン類及びジアミノピリミジン類等が挙げられる。本発明の核酸は、例えば、真核生物、細菌、アーキア、ウイルス、ウイロイド、及び人工合成物等に由来する。
【００１５】
本明細書において、核酸の「精製」とは、検体に含まれる核酸を核酸以外の夾雑物から部分的に又は完全に分離精製することを意味する。部分的に核酸を精製する場合の精製度の目安としては、例えば、精製した核酸を用いて、PCR及び等温核酸増幅法等の核酸増幅法、制限酵素処理、クローニング、塩基配列解析、サザンブロット、ノーザンブロット、ハイブリットキャプチャー解析、ラインプローブアッセイ、マイクロアレイ解析、電気泳動、質量分析、蛍光染色、色素染色、及び天然型又は非天然型核酸鎖同士の相補的結合を利用した解析等の分子生物学的解析を問題無く実施可能な程度であることが好ましい。
【００１６】
本発明のコロイド粒子を含む検体から核酸を精製する方法は、可溶化工程、核酸吸着担体との接触工程、及び核酸吸着担体からの溶出工程を含む。本発明の方法は、これらの工程に加えて、可溶化工程の前に、任意に前処理工程を含んでもよい。本発明を構成する各工程について、以下詳細に説明する。
【００１７】
＜前処理工程＞
本発明の方法において「前処理工程」とは、検体を前処理することにより、次に行われる可溶化工程の可溶化効率を高めるための工程である。前処理工程としては、例えば、攪拌機による撹拌処理、シリンジ等の細孔又はフィルターを通過させることによる濾過処理、破砕ビーズ等による破砕処理、超音波処理、遠心分離処理、凍結融解処理、熱処理、還元処理、アルカリ処理、並びにプロテアーゼ、リパーゼ、及びリゾチーム等による酵素処理が挙げられる。
【００１８】
＜可溶化工程＞
本発明の方法において、可溶化工程とは、可溶化剤で検体を処理して、検体中のコロイド粒子を可溶化する工程である。
【００１９】
本明細書において、「可溶化剤で検体を処理する」とは、検体に可溶化剤を作用させる工程、例えば可溶化剤と検体を混合する工程を意味する。本工程は、例えば可溶化剤を検体に加え、任意に混合物を撹拌することにより行うことができる。混合物を撹拌する場合、撹拌は混合時にのみ行ってもよいし、本工程を通して継続的に又は断続的に行ってもよい。本工程は、例えば1秒から30分、好ましくは5秒から20分、さらに好ましくは10秒から15分行うことができる。
【００２０】
本工程においては、可溶化剤で検体を処理する際に、例えば熱処理等の他の処理を加えることによって、さらに可溶化を促すこともできる。熱処理温度は、好ましくは40℃以上、より好ましくは60℃以上、さらに好ましくは70℃以上である。熱処理時間は好ましくは1秒から30分、より好ましくは5秒から20分、さらに好ましくは10秒から15分である。通常、高濃度のコロイド粒子を含有する血液や乳汁といった検体を熱処理すると、タンパク質等が変性し凝集体が形成され核酸精製効率が低下するが、下記の可溶化剤により可溶化した検体は、熱処理しても凝集体が形成されないため、高効率で核酸を可溶化し、精製することができる。
【００２１】
本明細書において、「可溶化」とは、コロイド粒子を凝析又は凝集させることなく、低粒子径化及び／又は低分子化することを指す。
【００２２】
本発明において「可溶化剤」とは、コロイド粒子を可溶化するために用いられる物質を指し、２種以上の成分の組合せであってもよい。本発明で用いる可溶化剤は、少なくとも、界面活性剤及び／又は両親媒性有機溶媒、並びにカオトロピック剤を含む。本発明で用いる可溶化剤に含まれる各成分は、そのうちの２つ以上が混合された混合物の形態で使用されてもよいし、個々の独立した成分を併用する形態で使用されてもよく、本発明の方法における「可溶化剤で検体を処理する」とは、どちらの形態の可溶化剤により検体を処理することも包含する。本発明で用いる可溶化剤は、コロイド粒子だけでなく、コロイド粒子の凝析体及び凝集体をも可溶化し得る。さらに、本発明で用いる可溶化剤は、コロイド粒子が生物学的試料、例えば寄生虫、真菌、カビ、酵母、細菌、アーキア、胞子、芽胞、シスト、又はウイルスである場合、それらの構造を破壊して可溶化し、それらが内包する核酸を溶液中に分散させ得る。
【００２３】
本発明で可溶化剤として用いることができる界面活性剤は、コロイド粒子を可溶化するものであれば特に限定するものではないが、例えば、陰イオン性、陽イオン性、両性イオン性、及び非イオン性界面活性剤が挙げられる。好ましくはSodium Dodecyl Sulfate（SDS）等の陰イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤が例示され、より好ましくは、エステル型、エーテル型、エステルエーテル型、アルキルエーテル型、フェニルエーテル型、ソルビタン誘導体型、アルカノールアミン型、アミド型、エチレングリコール型、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル型非イオン性界面活性剤が挙げられる。本発明で可溶化剤として用いることができる非イオン性界面活性剤の具体例として、例えば、Tween 20（商標）（ポリソルベート20、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、Tween 80（商標）（ポリソルベート80、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Triton X-100（商標）（ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル）、Nonidet P-40（商標）（（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール）、ポリオキシエチレン（20）セチルエーテル、アミゾールCDE-G（商標）（ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド）、及びアミゾールLDE-G（商標）（ラウリン酸ジエタノールアミド）が挙げられる。
【００２４】
本発明で可溶化剤として用いることができる好ましい界面活性剤として、例えば、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、及び脂肪酸アミドプロピルベタイン等のアミド型界面活性剤が挙げられる。本発明で可溶化剤として用いることができる界面活性剤としては、脂肪酸アルカノールアミド及びポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のアミド型非イオン界面活性剤が好ましく、特に脂肪酸アルカノールアミドが好ましい。本明細書において、脂肪酸アルカノールアミドは、好ましくは、以下の一般式で表される。
【００２５】
【化１】
2016175239.tif 000002
［式中、R1は、炭素数5〜21の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基若しくはアルケニル基、好ましくは炭素数7以上、9以上又は11以上であり、好ましくは炭素数19以下又は17以下であり、より好ましくは炭素数7〜19、炭素数9〜17、又は炭素数11〜17の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基若しくはアルケニル基であり、
R2は、水素、又は炭素数1〜3のヒドロキシアルキル基、好ましくは、水素又は炭素数2のヒドロキシアルキル基であり、
R3は、炭素数1〜3のヒドロキシアルキル基、好ましくは、炭素数2のヒドロキシアルキル基である]
【００２６】
本発明で可溶化剤として用いることができる脂肪酸アルカノールアミドの例として、例えば、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド、パーム核油脂肪酸モノエタノールアミド、ラウリン酸モノエタノールアミド、ラウリン酸モノイソプロパノールアミド、ミリスチン酸モノエタノールアミド、パルミチン酸モノエタノールアミド、ステアリン酸モノエタノールアミド、及びオレイン酸モノエタノールアミド等の脂肪酸モノエタノールアミド、並びに、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、パーム核油脂肪酸ジエタノールアミド、ラウリン酸ジエタノールアミド、ミリスチン酸ジエタノールアミド、パルミチン酸ジエタノールアミド、ステアリン酸ジエタノールアミド、及びオレイン酸ジエタノールアミド等の脂肪酸ジエタノールアミドが挙げられる。本発明で可溶化剤として用いることができる界面活性剤は、好ましくは脂肪酸ジエタノールアミド、特に好ましくはヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド又はラウリン酸脂肪酸ジエタノールアミドである。
【００２７】
本発明で用いる可溶化剤において、界面活性剤は単独で使用しても、組み合わせて使用してもよい。
【００２８】
本発明で用いる可溶化剤における界面活性剤の濃度は、コロイド粒子を可溶化するのに十分な濃度であれば特に限定するものではなく、当業者であれば容易に最適値を決定することができる。界面活性剤の濃度が低すぎると、コロイド粒子の可溶化が不十分となり、高すぎると、溶液の粘性が上がり扱い難くなるため好ましくない。界面活性剤の濃度は、検体と混合した時の終濃度で、例えば、0.05重量%以上、0.1重量%以上、0.5重量%以上、1重量%以上、2重量%以上、3重量%以上、4重量%以上又は5重量%以上であってよく、例えば、90重量%以下、80重量%以下、70重量%以下、60重量%以下、50重量%以下、40重量%以下、30重量%以下又は20重量%以下であってよく、例えば0.05重量%〜90重量%、0.1重量%〜80重量%、0.5重量%〜70重量%、1重量%〜60重量%、2重量%〜50重量%、3重量%〜40重量%、4重量%〜30重量%、又は5重量%〜20重量%であってよい。
【００２９】
本発明で可溶化剤として用いることができる両親媒性有機溶媒は、コロイド粒子を可溶化するものであれば特に限定するものではないが、例えば、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、ケトン、エステル、エーテル、チオール、スルホキシド、アルカン、アルケン、アルキン、アミン、イミン、アミド、及びニトリル系両親媒性有機溶媒が例示され、好ましくはアルコール系、スルホキシド系、及びアミン系両親媒性有機溶媒が挙げられる。アルコール系両親媒性有機溶媒の具体例として、メタノール、エタノール、1-プロパノール、及びイソプロパノール等が挙げられ、スルホキシド系両親媒性有機溶媒の具体例として、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ジエチルスルホキシド、及びエチルメチルスルホキシド等が挙げられ、アミン系両親媒性有機溶媒の具体例として、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミン等のアミノアルコール；メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、シクロヘキシルアミン、及びN-メチルピロリドン等の脂肪族アミン；並びにピリジン等の芳香族アミンが挙げられる。本発明で可溶化剤として用いることができる両親媒性有機溶媒は、好ましくは、ジメチルスルホキシド（DMSO）、エチレンジアミン、及びピリジンである。これらの両親媒性有機溶媒は単独で使用しても、組み合わせて使用しても良い。
【００３０】
可溶化剤として用いることができる両親媒性有機溶媒の濃度は、コロイド粒子を可溶化するのに十分な濃度であれば特に限定するものではなく、当業者であれば容易に最適値を決定することができる。両親媒性有機溶媒の濃度は、検体と混合した時の終濃度で、例えば、1重量%以上、5重量%以上、10重量%以上、20重量%以上、又は30重量%以上であってよく、例えば、95重量%以下、90重量%以下、80重量%以下、70重量%以下、又は60重量%以下であってよく、例えば、1重量%〜95重量%、5重量%〜90重量%、10重量%〜80重量%、20重量%〜70重量%、又は30重量%〜60重量%であってよい。
【００３１】
本発明で用いる可溶化剤は、界面活性剤及び／又は両親媒性有機溶媒に加えて、カオトロピック剤を含む。本発明で用いる可溶化剤に含まれるカオトロピック剤は、核酸と核酸吸着担体の結合を促進する作用を有するものであれば特に限定するものではないが、例えば、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、硫酸グアニジン、及び塩酸グアニジン等のグアニジン塩、尿素、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム、過塩素酸ナトリウム、シアン酸ナトリウム、シアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、並びにトリフルオロ酢酸ナトリウム等が挙げられ、好ましくはグアニジン塩が挙げられる。これらのカオトロピック剤は単独で使用しても、組み合わせて使用しても良い。また、カオトロピック剤は、核酸と核酸吸着担体を結合させるだけでなく、タンパク質変性剤としても作用し、コロイド粒子の可溶化にも寄与し得る。可溶化剤に含まれるカオトロピック剤の濃度は、核酸と核酸吸着担体を結合させるために十分な量であればよく、当業者であれば容易に最適値を決定することができる。カオトロピック剤の濃度は、検体と混合した時の終濃度で、例えば、0.1重量%以上、0.5重量%以上、1重量%以上、2重量%以上、5重量%以上、又は10重量%以上であってよく、例えば、90重量%以下、80重量%以下、70重量%以下、60重量%以下、50重量%以下又は40重量%以下であってよく、例えば、0.1重量%〜90重量%、0.5重量%〜80重量%、1重量%〜70重量%、2重量%〜60重量%、5重量%〜50重量%、又は10重量%〜40重量%であってよい。
【００３２】
コロイド粒子の可溶化能を有する界面活性剤と両親媒性有機溶媒を組み合わせることで、相加的又は相乗的な可溶化効果が期待されるため、本発明で用いる可溶化剤は、好ましくは、界面活性剤と両親媒性有機溶媒の両方を含む。好ましくは、本発明で用いる可溶化剤は、アミド型界面活性剤及び両親媒性有機溶媒を含むか、又は界面活性剤及びスルホキシド系若しくはアミン系有機溶媒を含む。本発明で用いる可溶化剤の例示的な組み合わせとしては、（アミド型界面活性剤、両親媒性有機溶媒、カオトロピック剤）、（アミド型界面活性剤、アルコール系有機溶媒、カオトロピック剤）、（アミド型界面活性剤、スルホキシド系有機溶媒、カオトロピック剤）、（アミド型界面活性剤、アミン系有機溶媒、カオトロピック剤）、（界面活性剤、スルホキシド系有機溶媒、カオトロピック剤）、（界面活性剤、アミン系有機溶媒、カオトロピック剤）、（非イオン性界面活性剤、スルホキシド系有機溶媒、カオトロピック剤）、及び（非イオン性界面活性剤、アミン系有機溶媒、カオトロピック剤）が挙げられ、より好ましくは、コロイド粒子の可溶化能が高い、（アミド型界面活性剤、スルホキシド系有機溶媒、カオトロピック剤）、及び（アミド型界面活性剤、アミン系有機溶媒、カオトロピック剤）が挙げられる。本発明の可溶化剤に含まれる組み合わせのさらに好ましい例として、（ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド又はラウリン酸脂肪酸ジエタノールアミド、DMSO、チオシアン酸グアニジン等のグアニジウム塩）が挙げられる。
【００３３】
本発明の可溶化工程は、緩衝剤の存在下で行うことができる。緩衝剤としては、リン酸緩衝液やグッド緩衝液等の緩衝剤が好適に用いられる。これらの緩衝剤の中でも、MES、Bis‐Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPS、CHES、CAPSO、及びCAPS等のグッド緩衝液が特に好ましい。これらの緩衝剤は単独で使用しても、組み合わせて使用しても良い。
【００３４】
本発明の可溶化工程におけるpHは、可溶化剤と試料を混合した時に試料中のコロイド粒子等が凝析しないpHであれば良く、検体と混合した時点でのpHが、好ましくはpH 2以上、より好ましくはpH 3以上、さらに好ましくはpH 4以上である。
【００３５】
本発明の可溶化工程は、可溶化の促進等のため、例えば、ジチオトレイトール（DTT）等の還元剤、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）等のキレート剤、アルカリ化剤、並びにプロテアーゼ、リパーゼ、及びリゾチーム等の分解酵素の存在下で行うことができる。さらに、本発明の可溶化工程は、DNAを選択的に精製するために、例えば、DNA保護剤、DNase阻害剤、及び／又はRNaseの存在下で行うことができ、また、RNAを選択的に精製するために、例えば、RNA保護剤、RNase阻害剤、及び／又はDNaseの存在下で行うこともできる。
【００３６】
本発明の可溶化工程において、可溶化剤を構成する各成分は、検体と混合する際に、別々に加えてもよいし、一緒に加えてもよい。すなわち、本発明の可溶化工程は、例えば、上記の界面活性剤及び／又は両親媒性有機溶媒、並びにカオトロピック剤を、別々に加えることにより行ってもよいし、各成分を含む混合物を加えることにより行ってもよい。より好ましくは、本発明の可溶化工程において、可溶化剤は下記の可溶化剤組成物として加える。
【００３７】
＜核酸吸着担体との接触工程＞
本明細書において、「核酸吸着担体との接触工程」とは、上記「可溶化工程」によって可溶化剤で処理した検体を、核酸吸着担体と接触させ、検体中の核酸を核酸吸着担体に結合させる工程を意味する。
【００３８】
本工程は、検体中に含まれる核酸が核酸吸着担体に吸着できる限り限定しない。例えば、核酸吸着担体がカラム状である場合には、このカラムに検体を通過させることにより行うことができるし、核酸吸着担体がビーズ等の固体状である場合には、核酸吸着担体と検体を混合することにより行うことができる。
【００３９】
本明細書において、核酸吸着担体は、カオトロピック剤及び／又は有機溶媒存在下において、核酸を吸着する担体であれば特に限定するものではなく、例えば、シリカ等の無機物質、樹脂、及び不溶性多糖等によって構成される核酸吸着担体を用いることができる。これら核酸吸着担体は、核酸の吸着が可能である限り、カラム状、粉末状、繊維状、ビーズ状、メンブレン状、及び多孔質状等の任意の形状であってもよい。核酸吸着担体は、磁性を帯びていてもよく、また修飾をされていてもよい。
【００４０】
＜核酸吸着担体からの溶出工程＞
本発明における核酸吸着担体からの溶出工程とは、上記「核酸吸着担体との接触工程」によって核酸吸着担体に吸着した核酸を、溶出液により溶出させる工程を意味する。本工程は、溶出前に、任意に洗浄液による洗浄工程を含む。
【００４１】
本工程における洗浄液は、核酸が吸着した核酸吸着担体に残存する可溶化剤や検体由来の夾雑物を洗浄できるものであれば限定するものではなく、例えば、核酸が溶解しない有機溶媒、水溶性高分子溶液、及び糖水溶液が挙げられる。洗浄液に含まれる溶媒としては、エタノール、イソプロパノール、及びアセトン等が例示され、これらの濃度は、当業者であれば容易に最適値を決定することができる。洗浄液における溶媒の濃度は、例えば、20重量%以上、30重量%以上、又は40重量%以上であってよく、例えば、100重量%以下、90重量%以下、又は80重量%以下であってよく、例えば、20〜100重量%、好ましくは30〜90重量%、より好ましくは40〜80重量%である。
【００４２】
洗浄液による洗浄後の核酸吸着担体は、洗浄液を除くため、遠心分離処理、並びに熱処理及び風乾による乾燥処理を行ってもよい。
【００４３】
洗浄後、核酸吸着担体から核酸を溶出させるために用いる溶出液は核酸を核酸吸着担体から溶出させるものであれば特に限定するものではなく、例えば、水及び緩衝液等が挙げられる。
【００４４】
＜可溶化剤組成物＞
一態様において、本発明は、本発明の方法において使用することができる可溶化剤組成物に関する。本発明の可溶化剤組成物は、少なくとも上記の界面活性剤及び／又は両親媒性有機溶媒、並びにカオトロピック剤を含み、好ましくは、界面活性剤、両親媒性有機溶媒、及びカオトロピック剤を含む。本発明の可溶化剤組成物に含まれ得る界面活性剤、両親媒性有機溶媒、及びカオトロピック剤の構成については、上記＜可溶化工程＞で記載した通りであるから、ここでは記載を省略する。
【００４５】
本発明の可溶化剤組成物が界面活性剤を含む場合、界面活性剤の濃度は、例えば、0.05重量%以上、0.1重量%以上、0.5重量%以上、1重量%以上、2重量%以上、3重量%以上、4重量%以上又は5重量%以上であってよく、例えば、90重量%以下、80重量%以下、70重量%以下、60重量%以下、50重量%以下、40重量%以下、30重量%以下又は20重量%以下であってよく、例えば0.05重量%〜90重量%、0.1重量%〜80重量%、0.5重量%〜70重量%、1重量%〜60重量%、2重量%〜50重量%、3重量%〜40重量%、4重量%〜30重量%、又は5重量%〜20重量%であってよい。また、本発明の可溶化剤組成物が両親媒性有機溶媒を含む場合、両親媒性有機溶媒の濃度は、例えば、1重量%以上、5重量%以上、10重量%以上、20重量%以上、又は30重量%以上であってよく、例えば、95重量%以下、90重量%以下、80重量%以下、70重量%以下、又は60重量%以下であってよく、例えば、1重量%〜95重量%、5重量%〜90重量%、10重量%〜80重量%、20重量%〜70重量%、又は30重量%〜60重量%であってよい。また、本発明の可溶化剤組成物において、カオトロピック剤の濃度は、例えば、0.1重量%以上、0.5重量%以上、1重量%以上、2重量%以上、5重量%以上、又は10重量%以上であってよく、例えば、90重量%以下、80重量%以下、70重量%以下、60重量%以下、50重量%以下又は40重量%以下であってよく、例えば、0.1重量%〜90重量%、0.5重量%〜80重量%、1重量%〜70重量%、2重量%〜60重量%、5重量%〜50重量%、又は10重量%〜40重量%であってよい。本発明の可溶化剤組成物を検体と混合した時の各成分の終濃度は、上記＜可溶化工程＞で記載した通りであるから、ここでは記載を省略する。
【００４６】
本発明の可溶化剤組成物は、上記成分以外の溶媒として水を含んでもよいが、可溶化剤組成物のpHを安定させるために上記の緩衝剤を1種以上含んでいてもよい。
【００４７】
本発明の可溶化剤組成物のpHは、試料と混合した時に試料中のコロイド粒子等が凝析しないpHであれば良く、検体と混合した時点でのpHが、好ましくはpH 2以上、より好ましくはpH 3以上、さらに好ましくはpH 4以上である。
【００４８】
本発明の可溶化剤組成物は、可溶化の促進等のため、例えば、ジチオトレイトール（DTT）等の還元剤、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）等のキレート剤、アルカリ化剤、並びにプロテアーゼ、リパーゼ、及びリゾチーム等の分解酵素を含んでいてもよい。さらに、本発明の可溶化剤組成物は、DNAを選択的に精製するために、例えば、DNA保護剤、DNase阻害剤、及び／又はRNaseを含んでいてもよく、また、RNAを選択的に精製するために、例えば、RNA保護剤、RNase阻害剤、及び／又はDNaseを含んでいてもよい。
【００４９】
本発明の可溶化剤組成物は、コロイド粒子を含む検体から核酸を精製するために、コロイド粒子を可溶化するために用いることができる。
【００５０】
本発明の可溶化剤組成物は、例えば、核酸調製装置、核酸増幅装置、又は核酸自動解析装置等に組み込まれてもよい。
【００５１】
＜キット＞
一態様において、本発明は、本発明の可溶化剤組成物を含む核酸精製キットに関する。本キットは、上記可溶化剤組成物に加えて、例えば、核酸吸着担体、吸着液、溶出液、PCRプライマー、バッファー、酵素、及び／又は使用説明書等を含んでもよい。
【００５２】
一態様において、本発明は、本発明で用いる可溶化剤に含まれる各成分、すなわち、界面活性剤及び／又は両親媒性有機溶媒、並びにカオトロピック剤を別々に含む（例えば、別々の容器に含む）、コロイド粒子を可溶化するための可溶化剤キット又は核酸精製キットに関する。本キットは、上記可溶化剤に加えて、例えば、核酸吸着担体、吸着液、溶出液、PCRプライマー、バッファー、酵素、及び／又は使用説明書等を含んでもよい。本発明で用いる可溶化剤に含まれる界面活性剤、両親媒性有機溶媒、及びカオトロピック剤の構成については、上記＜可溶化工程＞で記載した通りであるから、ここでは記載を省略する。
【００５３】
本発明のキットが、各成分を別々に含む場合の各成分の重量比は、当業者であれば適宜決定することができる。本発明のキットが、界面活性剤及びカオトロピック剤を別々に含む場合には、本発明のキットにおける界面活性剤の重量比は、例えば、カオトロピック剤100重量部に対して、例えば0.1重量部以上、1重量部以上、5重量部以上、10重量部以上、又は20重量部以上、例えば10000重量部以下、1000重量部以下、500重量部以下、100重量部以下、又は60重量部以下であってよく、より具体的には0.1重量部〜10000重量部、1重量部〜1000重量部、5重量部〜500重量部、10重量部〜100重量部、又は20重量部〜60重量部であってよい。また、本発明のキットが、両親媒性有機溶媒及びカオトロピック剤を別々に含む場合には、本発明のキットにおける両親媒性有機溶媒の重量比は、例えば、カオトロピック剤100重量部に対して、例えば0.3重量部以上、3重量部以上、6重量部以上、30重量部以上、又は60重量部以上、例えば30000重量部以下、3000重量部以下、1500重量部以下、300重量部以下、又は200重量部以下であってよく、より具体的には0.3重量部〜30000重量部、3重量部〜3000重量部、6重量部〜1500重量部、30重量部〜300重量部、又は60重量部〜200重量部であってよい。本発明のキットが、界面活性剤、両親媒性有機溶媒、及びカオトロピック剤を別々に含む場合には、本発明のキットは、カオトロピック剤100重量部に対して、例えば、上記重量比の界面活性剤及び上記重量比の両親媒性有機溶媒を含んでよい。本発明のキットに含まれる界面活性剤及び／又は両親媒性有機溶媒、並びにカオトロピック剤を検体と混合した時の各成分の終濃度は、上記＜可溶化工程＞で記載した通りであるから、ここでは記載を省略する。
【００５４】
本発明のキットは、例えば、核酸調製装置、核酸増幅装置、核酸自動解析装置等に組み込まれてもよい。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１：コロイド粒子可溶化能の評価１＞
１）概要
界面活性剤及び両親媒性有機溶媒のコロイド粒子可溶化能を評価するため、各界面活性剤又は両親媒性有機溶媒と乳汁を混合し、濁度（OD660）の変化を測定することでコロイド粒子の可溶化程度を評価した。コロイド粒子が凝析することなく可溶化すると、コロイド粒子径が小さくなるため、光の透過率が上がり、濁度の低下として観察できる。【００５６】
２）方法
市販牛乳（雪印メグミルク）10 μlと界面活性剤又は両親媒性有機溶媒190 μlを混合し、10分間静置した後、混合液から100 μlを採取してASSAY PLATE 96WELL（IWAKI）に移し、Microplate Spectrophotometer Benchmark Plus（Bio-RAD）によりOD660を測定した。界面活性剤としては、Tween 20、Tween 80、Triton X-100、Nonidet P-40、ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル（和光純薬）、アミゾールCDE-G（川研ファインケミカル）、アミゾールLDE-G（川研ファインケミカル）、及びSDSを、両親媒性有機溶媒としては、DMSO、エタノール、イソプロパノール、エチレンジアミン、及びピリジンを用いた。界面活性剤については5重量%〜20重量%に、両親媒性有機溶媒については5容量%〜50容量%に滅菌蒸留水で希釈して試験に用いた。【００５７】
３）結果
各界面活性剤又は両親媒性有機溶媒を添加した全てのサンプルにおいて、濁度の低下が確認され、乳汁成分の凝析は確認されなかった。特にアミド型界面活性剤であるアミゾールCDE-G若しくはアミゾールLDE-G、スルホキシド系有機溶媒であるDMSO、又はアミン系有機溶媒であるエチレンジアミン若しくはピリジンを添加したサンプルにおいて大きく濁度が低下しており、これらが特に強いコロイド粒子可溶化能を有することが確認された（図１）。【００５８】
＜実施例２：コロイド粒子可溶化能の評価２＞
１）方法
界面活性剤及び／又は両親媒性有機溶媒、並びにカオトロピック剤を、以下の濃度で滅菌蒸留水中に含む可溶化剤組成物A〜Lを調製した（A：10重量% アミゾールCDE-G及び3M（約35重量%） チオシアン酸グアニジン、B：20重量% アミゾールCDE-G及び3M チオシアン酸グアニジン、C：30容量%（約32重量%） DMSO及び3M チオシアン酸グアニジン、D：60容量%（約62重量%） DMSO及び3M チオシアン酸グアニジン、E：10重量% アミゾールCDE-G、30容量% DMSO、及び3M チオシアン酸グアニジン、F：10重量% アミゾールCDE-G、30容量%（約25重量%） エタノール、及び3M チオシアン酸グアニジン、G：10重量% Tween 20、30容量% DMSO、及び3M チオシアン酸グアニジン、H：10重量% Triton X-100、30容量% DMSO、3M チオシアン酸グアニジン、I：10重量% Nonidet P-40、30容量% DMSO、及び3M チオシアン酸グアニジン、J：10重量% ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル、30容量% DMSO、3M チオシアン酸グアニジン、K：10重量% ポリオキシエチレン(20)セチルエーテル、30容量% エタノール、及び3M チオシアン酸グアニジン、L：3M チオシアン酸グアニジン）。コントロールとして、M：滅菌蒸留水を用いた。各可溶化剤組成物によるコロイド粒子可溶化能を評価するため、各可溶化剤組成物と乳汁を混合し、濁度の低下を測定することでコロイド粒子の可溶化程度を評価した。すなわち、市販牛乳（雪印メグミルク）100 μlと各可溶化剤組成物500 μlを混合し、10分間静置した後、混合液から100 μlを採取してASSAY PLATE 96WELL（IWAKI）に移し、Microplate Spectrophotometer Benchmark Plus（Bio-RAD）によりOD660を測定した。また、混合液が凝析を生じているかどうかを目視により評価した。さらに、混合液を80℃にて10分間熱処理し、凝析を生じるかどうかを同様に評価した。【００５９】
２）結果
評価の結果、可溶化剤組成物A〜Jを添加したサンプルにおいて、濁度の低下が確認された。特に、可溶化剤組成物B、D、又はEを添加したサンプルにおいて大きく濁度が低下しており、これが特に強いコロイド粒子可溶化能を有することが確認された。また、各可溶化剤組成物の添加による乳汁成分の凝析は、熱処理前後において共に確認されなかった（表１）。これに対し、可溶化剤組成物K及びLにおいては、コントロールである溶液Mに比べ、若干の濁度低下が認められたが、可溶化剤組成物A〜Jに比べ濁度低下は微弱であった。また、可溶化剤組成物K〜L及び滅菌蒸留水Mでは、乳汁混合後の溶液の熱処理により、乳汁成分の凝析が確認された（表１）。
【表１】
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【００６０】
＜実施例３＞
１）概要
実施例２において作製した可溶化剤組成物A〜L又は滅菌蒸留水Mとシリカカラムを用いて、微生物を含む乳汁から核酸を精製した。続いて、精製した核酸を用いて微生物由来核酸を標的としたリアルタイムPCRを行い、核酸が適切に精製されていること、及び核酸回収効率を評価した。【００６１】
２）方法
市販牛乳（雪印メグミルク）に104cfu/mlのグラム陽性細菌Streptococcus thermophilusを添加し懸濁し、これを乳汁検体として用いた。【００６２】
可溶化剤として実施例２に記載の可溶化剤組成物A〜L及び滅菌蒸留水Mを用いた。1.5mlチューブに添加した乳汁検体100μlに各可溶化剤組成物又は滅菌蒸留水を500μl添加した。さらに、80℃にて10分間熱処理した後、可溶化した乳汁をシリカカラム（FAVORGEN）に供し、10000 g、1分間遠心した後、70% エタノールをカラムに500μl添加し、10000 g、1分間遠心し洗浄した。70% エタノールによる洗浄を再度繰り返した後、カラムを10000 g、3分間遠心し、乾燥させた。30μlの滅菌蒸留水をカラムに添加し、10000 g、1分間遠心した後、溶出液を精製核酸として回収した。核酸精製に要する時間は約20分であった。【００６３】
精製核酸を用いて、S. thermophilusを標的としたリアルタイムPCRを行った。PCR反応液の組成は、10 μMフォワードプライマーSTf（5’-GCTCCACTACAAGATGGACCTGC-3’（配列番号1）） 1.5μl、10μMリバースプライマーSTr（5’- TAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAG-3’（配列番号2）） 1.5μl、カネカ高速増幅用DNA Polymerase（カネカ） 0.5 μl、10xカネカ高速増幅用DNA Polymeraseバッファー 5.0 μl、2 mM dNTPs 5.0 μl、1000倍希釈SYBR Green I (Lonza) 2.5μl、精製DNA 2.5 μl、及び滅菌蒸留水31.5 μlである。反応はLightCycler 96システム（Roche）を用い、98℃1分の後、98℃5秒→60℃5秒→72℃15秒のPCRサイクルを45サイクル行い核酸増幅反応をモニタリングした。【００６４】
３）結果
可溶化剤組成物A〜Jを用いて精製したサンプルから核酸増幅が確認され、核酸が適切に精製されたことが認められた。可溶化剤組成物B、D、E、及びGを用いて精製したサンプルからは、特に低いCq値が確認され、これらを使用した核酸精製法における核酸回収効率が高いことが確認された（図２）。可溶化剤組成物K及びLを用いて精製したサンプルにおいては、核酸増幅が確認されたが、可溶化剤組成物A〜Jに比べ、Cq値が高く、核酸回収効率が低いことが確認された（図２）。【００６５】
＜実施例４＞
１）概要
可溶化剤組成物とシリカコートされた磁性粒子を用いて、微生物を含む乳汁から核酸を精製した。精製した核酸を用いて微生物由来核酸を標的としたPCRを行い、核酸が適切に精製されていること、及び検出下限を評価した。【００６６】
２）方法
市販牛乳（雪印メグミルク）に各cfu/ml（3.5×103 cfu/ml、3.5×102 cfu/ml、3.5×101cfu/ml、又は3.5×100 cfu/ml）のグラム陽性細菌Streptococcus thermophilusを添加して懸濁し、これを乳汁検体として用いた。【００６７】
可溶化剤組成物として、15重量%アミゾールCDE-G、1.7M（約20重量%）チオシアン酸グアニジン、及び40容量%（約42重量%）DMSOを滅菌蒸留水中に含む混合液を用いた。1.5mlチューブに添加した乳汁検体100μlに可溶化剤組成物を500μl添加し、80℃にて10分間インキュベートし、コロイド粒子を可溶化した。可溶化した乳汁検体に、シリカコートされた磁性粒子MagPrep（登録商標） Silica Particles（Merck Millipore）を20μl添加し、よく混合した後、チューブを磁性スタンドにセットし、磁性粒子を分離し上清を除去した。チューブを磁性スタンドから外した後、70%エタノールを500μl添加し、よく混合し洗浄した後、チューブを磁性スタンドにセットし、磁性粒子を分離し上清を除去した。70%エタノールによる洗浄を再度繰り返した後、チューブ内の磁性粒子を乾燥させた。乾燥後、30μlの滅菌蒸留水を添加し、チューブを磁性スタンドにセットし、上清を精製核酸として回収した。本実施例においては、高速遠心機や特別な装置を使用することなく、約10分で核酸精製が可能であった。【００６８】
PCR反応液の組成は、10 μMフォワードプライマーSTf（5’-GCTCCACTACAAGATGGACCTGC-3’（配列番号1）） 1.5μl、10μMリバースプライマーSTr（5’- TAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAG-3’（配列番号2）） 1.5μl、カネカ高速増幅用DNA Polymerase（カネカ） 0.5 μl、10xカネカ高速増幅用DNA Polymeraseバッファー 5.0 μl、2 mM dNTPs 5.0 μl、精製DNA 2.5 μl、及び滅菌蒸留水 34.0 μlである。反応は、98℃、1分の後、98℃、5秒→60℃、5秒→72℃、15秒のPCRサイクルを40サイクル行った。次に、PCR産物を常法に基づき電気泳動に供し、130 bpの増幅断片を可視化した。
３）結果
電気泳動により130 bpの増幅断片が確認され、3.5 x103 cfu/m又は3.5 x102cfu/mlの濃度でS. thermophilusを含むモデル乳汁から、核酸を適切に精製できたことが確認された（図３）。【００６９】
＜実施例５＞
１）概要
可溶化剤組成物とシリカカラムを用いて、微生物を含む血液から核酸を精製した。精製した核酸を用いて微生物由来核酸を標的としたリアルタイムPCRを行い、核酸が適切に精製されていることを評価した。【００７０】
２）方法
ヘパリン添加したマウス血液に105cfu/mlのグラム陽性細菌Streptococcus thermophilusを添加して懸濁し、これをモデル血液として用いた。【００７１】
可溶化剤組成物として、15重量%アミゾールCDE-G、1.7M（約20重量%）チオシアン酸グアニジン、及び40容量%（約42重量%）DMSOを滅菌蒸留水中に含む混合液を用いた。1.5mlチューブに添加したモデル血液100μlに可溶化剤組成物を500μl添加し、80℃にて10分間インキュベートし、コロイド粒子を可溶化した。熱処理後のサンプルは完全に可溶化しており、タンパク質等による凝集物は確認されなかった。以降は実施例３と同様の手法により精製核酸を回収した。続いて、精製核酸を用いて、S. thermophilusを標的としたリアルタイムPCRを行った。反応や試薬の調製は実施例３と同様の条件にて行った。【００７２】
３）結果
リアルタイムPCRの結果、核酸増幅が確認され、S. thermophilusを含む血液検体から核酸が適切に精製されたことが認められた（図４）。【００７３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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