(57)【要約】  本発明は、同一分子内に複数のアミノ基を有するポリアミン又は同一分子内にアミノ基とフェノール性水酸基を有するモノアミンを、ピレン基を有する蛍光誘導体試薬で誘導体化することにより発せられるエキシマー蛍光の強度の測定結果に基づき前記ポリアミン又はモノアミンを分析する方法であって、  前記蛍光誘導体化試薬が、式（２）  【化２】2016139786.tif 000019  で表される、２−クロロ−４−メトキシ−６−（４−（ピレン−１−イル）ブトキシ）−１，３，５−トリアジンを含むことを特徴とする。
2016139786.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
2016139786.tif 000013
で表される化合物を含む、同一分子内に複数のアミノ基を有するポリアミン又は同一分子内にアミノ基とフェノール性水酸基を有するモノアミンを蛍光誘導体化するための蛍光誘導体化試薬。
ここで、Ｘはハロゲン元素を、Ｒ１はアルキル基を、Ｒ２はアルキル鎖を表す。
【請求項２】
前記化合物が、式（２）
【化２】
2016139786.tif 000014
で表される、２−クロロ−４−メトキシ−６−（４−（ピレン−１−イル）ブトキシ）−１，３，５−トリアジンであることを特徴とする請求項１に記載の蛍光誘導体化試薬。
【請求項３】
同一分子内に複数のアミノ基を有するポリアミン又は同一分子内にアミノ基とフェノール性水酸基を有するモノアミンを、ピレン基を有する蛍光誘導体化試薬で誘導体化することにより発せられるエキシマー蛍光の強度の測定結果に基づき前記ポリアミン又はモノアミンを分析する方法であって、
前記蛍光誘導体化試薬が、一般式（１）
【化１】
2016139786.tif 000015
で表される化合物を含むことを特徴とするアミン分析方法。
ここで、Ｘはハロゲン元素を、Ｒ１はアルキル基を、Ｒ２はアルキル鎖を表す。
【請求項４】
前記蛍光誘導体化試薬が、式（２）
【化２】
2016139786.tif 000016
で表される、２−クロロ−４−メトキシ−６−（４−（ピレン−１−イル）ブトキシ）−１，３，５−トリアジンを含むことを特徴とする請求項３に記載のアミン分析方法。
【請求項５】
下記の一般式（１）
【化１】
2016139786.tif 000017
で表される化合物。
ここで、Ｘはハロゲン元素を、Ｒ１はアルキル基を、Ｒ２はアルキル鎖を表す。
【請求項６】
式（２）
【化２】
2016139786.tif 000018
で表されることを特徴とする請求項５に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高速液体クロマトグラフィ（HPLC）を利用したヒスタミンやチラミン等の不揮発性アミン類の分析に用いられる蛍光誘導体化試薬及び該蛍光誘導体化試薬を用いたアミン分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒスタミン（Him）やチラミン（Tym）などの不揮発性アミン類は、タンパク質やアミノ酸が微生物によって分解されることにより産生される生理活性物質であり、これらアミン類の過剰摂取はアレルギー様食中毒の原因となることが知られている。そのため、世界の多くの国において食品中に含まれる不揮発性アミン類の量が規制されている。【０００３】
上記不揮発性アミン類を含む食品の一つに日本の伝統的な発酵食品（調味料）である醤油がある。醤油は、大豆及び小麦を乳酸菌、酵母等の微生物により発酵させて製造されるため、その製造過程において大豆タンパク質由来のヒスタミンやチラミンが産生される。従って、醤油に含まれるヒスタミンやチラミンの量を把握しておくことは品質管理の点で重要である。醤油の製造工程において不揮発性アミンの量を簡便に且つ高感度に測定する方法が求められている。【０００４】
食品中の不揮発性アミン類の分析法としては、食品衛生検査指針に示されているダンシル蛍光誘導体化−HPLC分析法や、HPLC−タンデム質量分析法（LC-MS/MS）が一般的である。しかし、ダンシル蛍光誘導体化−HPLC分析法は煩雑な前処理操作が必要であり、しかも感度や選択性に劣るといった問題がある。一方、LC-MS/MSは、感度や選択性は優れるものの、高額且つ大掛かりな装置を使用するため、中小規模の食品工場等で実施することが難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平10-142228号公報
【特許文献２】特開2001-242174号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hideyuki Yoshida, et al., "Simultaneous Determination of Histamine and Histidine by Liquid Chromatography Following Intramolecular Excimer-forming Fluorescence Derivatization with Pyrene-labeling Reagent" , Analytical Sciences, March 2004, Vol.20, pp.557-559
【非特許文献２】Heidi S. Marks (Rupp), and Collin R. Anderson, "Determination of putrescine and cadaverine in seafood (finfish and shellfish) be liquid chromatography using pyrene excimer fluorescence" , Journal of Chromatography A, 1094(2005), pp.60-69
【非特許文献３】Hideyuki Yoshida, et al., "A simple liquid chromatography method based on intramolecular excimer-forming derivatization and fluorescence detection for the determination of tyrosine and tyramine in urine" , Journal of Chromatography B, 821(2005), pp.88-93
【非特許文献４】Kenichiro Todoroki, et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62, pp.6206-6211
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年、ピレン基を有する化合物を含む試薬（ピレン試薬）を用いたエキシマー蛍光誘導体化−HPLC法が開発されている（特許文献１、２）。この分析法では、１分子内に２個以上のアミノ基を有するポリアミンをピレン試薬で蛍光誘導体化することにより該ポリアミン１分子中に複数のピレン基を導入し、その結果形成される励起二量体（excited-state dimer、以下「エキシマー」という。）を有するポリアミン（つまり、ラベル化されたポリアミン）をHPLCを用いて分離し、その蛍光（エキシマー蛍光）の強度を測定する。エキシマー蛍光の波長とピレン単体（モノマー）から発せられる蛍光波長とは異なるため、分取した試料中にモノアミンやピレン試薬が含まれている場合でも、ポリアミンを選択的に且つ高感度で分析することができる。【０００８】
ピレン試薬として4-(1-ピレン)酪酸クロリドや活性エステル型の 4-(1-ピレン)酪酸N-ヒドロキシコハク酸イミド等が用いられているが、これらはいずれも吸湿性が高く、容易に加水分解するため、長期保存に適さない。また、ポリアミンを蛍光誘導体化する際は粉末状のピレン試薬を溶媒に溶かした溶液が用いられるが、従来のピレン試薬は、溶媒に溶かした状態では数日間しか保存できない（非特許文献１〜３）。このため、ポリアミンを蛍光誘導体化する都度、ピレン試薬を調製しなければならず、作業性が悪かった。さらに、従来のピレン試薬は反応性のロット間差が大きく、分析再現性の点で問題があった。
なお、ここではピレン試薬を用いてポリアミンを分析する場合について説明したが、最近では、１分子中にアミノ基とフェノール性水酸基を有するチラミン等のモノアミンもピレン試薬で蛍光誘導体化されることによりエキシマーを形成することが分かっている。従って、上述したピレン試薬を用いてモノアミンを分析する場合にも同様の問題が生じる。【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、高感度で且つ選択的なアミンの分析方法を提供することであり、該分析方法に用いられる蛍光誘導体化試薬の保存安定性、分析再現性を高めることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
アミンの蛍光誘導体化試薬として用いられる化合物は、ピレンを基本とし、これにアミノ基又はフェノール性水酸基との反応性官能基が結合したものである。本願発明者は、蛍光誘導体化試薬の保存安定性を高めるために加水分解しにくい反応性官能基の構造を探索した結果、２−クロロ−４−メトキシ−６−置換−１，３，５−トリアジン等を反応性官能基とするピレン誘導体が有効であることを見い出した。
具体的には、本発明に係る蛍光誘導体化試薬は、以下の一般式（１）
【化１】
2016139786.tif 000003
で表される新規化合物を含むことを特徴とする。【００１１】
ここで、Ｘはハロゲン元素を、Ｒ１はアルキル基を、Ｒ２はアルキル鎖を表しており、特にＸは、アミノ基やフェノール性水酸基との反応性が優れるＣｌ（塩素）が好ましい。また、アルキル基及びアルキル鎖の炭素数が多いと、蛍光誘導体化試薬で誘導体化したモノアミンやポリアミンがＨＰＬＣのカラムから溶出され難くなるため、Ｒ１は炭素数１〜４のアルキル基、Ｒ２は炭素数１〜４のアルキル鎖であることが好ましい。なお、ピレンアルコールは一般式（１）で表される化合物の原料化合物の一つであるが、アルキル鎖の炭素数が１〜４のピレンアルキルアルコールは市販されており入手しやすい。従って、この点からも、アルキル鎖の炭素数は１〜４であることが好ましい。さらに、本発明に係る蛍光誘導体化試薬は、ＸがＣｌ（塩素）、Ｒ１がメチル基、Ｒ２がブチル鎖である下記式（２）で表される化合物（２−クロロ−４−メトキシ−６−（４−（ピレン−１−イル）ブトキシ）−１，３，５−トリアジン）を含むことが好ましい。
【化２】
2016139786.tif 000004
【００１２】
一般式（１）で表される化合物のハロゲン基は、アミノ基又はフェノール性水酸基に選択的に結合する。従って、目的物質が同一分子内に複数のアミノ基を有する物質（ポリアミン）又は同一分子内にアミノ基とフェノール性水酸基を有する物質（モノアミン）の場合、該目的物質と前記化合物が反応することによりピレンのエキシマーが形成され、エキシマー蛍光を発する。従って、このエキシマー蛍光の強度を測定することにより、目的物質を検出することができる。【００１３】
なお、同一分子内に１個のアミノ基のみを有する物質や同一分子内に１個のフェノール性水酸基のみを有する物質も、前記化合物と反応して蛍光を発する物質となる。従って、本発明に係る蛍光誘導体化試薬は、このような物質の蛍光誘導体化（ラベル化）にも用いることができる。この場合、エキシマー蛍光の波長（475nm）とピレン単体から発せられる蛍光の波長（375nm）が異なるため、それぞれの波長の蛍光強度を測定することにより、両者を区別して検出することができる。【００１４】
また、本発明に係るアミン分析方法は、
同一分子内に複数のアミノ基を有するポリアミン及び／又は同一分子内にアミノ基とフェノール性水酸基を有するモノアミンを、ピレン基を有する蛍光誘導体化試薬で誘導体化することにより発せられるエキシマー蛍光の強度の測定結果に基づき前記ポリアミン及び／又はモノアミンを分析する方法であって、
前記蛍光誘導体化試薬が、下記の式（２）
【化２】
2016139786.tif 000005
で表される、２−クロロ−４−メトキシ−６−（４−（ピレン−１−イル）ブトキシ）−１，３，５−トリアジンを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る蛍光誘導体化試薬はアミノ基やフェノール性水酸基に選択的に結合し、しかも、同一分子内に複数のアミノ基又は同一分子内にアミノ基とフェノール性水酸基を有する物質に結合したときにエキシマー蛍光を発するため、該エキシマー蛍光の強度を測定することにより、前記物質の量を選択的に且つ高感度に測定することができる。また、本発明に係る蛍光誘導体化試薬は吸湿性が低いため保存安定性に優れ、また、溶媒に溶かした状態でも、従来の蛍光誘導体化試薬に比べると長期間、反応性を維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施例であるＣＭＰＴの合成例を示す、２，４−ジクロロ−６−メトキシ−１，３，５−トリアジンと１−ピレンブタノールの反応式。
【図２】ヒスタミンのＡＣＮ溶液をピリジンとＣＭＰＴを含むＤＭＦ溶液に溶解してヒスタミンの蛍光誘導体化した後、エキシマー蛍光強度を検出したときの、反応時間と蛍光強度との関係を示すグラフ。
【図３】ヒスタミンのＡＣＮ溶液をピリジンとＣＭＰＴを含むＤＭＦ溶液に溶解してヒスタミンの蛍光誘導体化した後、エキシマー蛍光強度を検出したときの、ＣＭＰＴの濃度と蛍光強度の関係を示すグラフ。
【図４】ＣＭＰＴの濃度を２０ｍＭ、反応時間を２０分に設定してヒスタミンをＣＭＰＴで蛍光誘導体化したときのＨＰＬＣ分析結果度（ａ）及びＨＰＬＣの条件（ｃ）並びにＭＳの結果（ｂ）を示す。
【図５】エキシマー蛍光強度と保存時間の関係を示すグラフ。
【図６】醤油を水層とアセトニトリル層に分離した状態を示す画像（ａ）、水酸化ナトリウムの濃度と回収率の関係を示すグラフ（ｂ）、加熱ＡＣＮと非加熱ＡＣＮを用いたときの回収率の違いを示すグラフ（ｃ）。
【図７】本実施例に係るヒスタミン分析法の前処理条件。
【図８】本実施例に係るヒスタミン分析法を用いてヒスタミンを検出した結果を示すクロマトグラム。
【図９】ヒスタミンとＣＭＰＴの反応を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明に係る化合物は以下の一般式（１）で表される、エキシマー蛍光誘導体化試薬として有用な化合物である。
【化１】
2016139786.tif 000006
【００１８】
一般式（１）において、Ｘはハロゲン元素を、Ｒ１はアルキル基を、Ｒ２はアルキル鎖を表しており、特にＸがＣｌ（塩素）、Ｒ１がメチル基、Ｒ２がブチル鎖である下記の式（２）で表される２−クロロ−４−メトキシ−６−（４−（ピレン−１−イル）ブトキシ）−１，３，５−トリアジン（2-chloro-4-methoxy-6-(4-(pyren-1-yl)butoxy)-1,3,5-triazine（ＣＭＰＴ））は、ポリアミン類との反応性、保存安定性の点で優れている。
【化２】
2016139786.tif 000007
以下、ＣＭＰＴを用いたポリアミン分析方法の実施例について説明する。なお、以下では、ヒスタミンを分析対象とする場合を中心に説明するが、ヒスタミン以外のポリアミン、或るいはチラミン等の同一分子内にアミノ基とフェノール性水酸基を有するモノアミンでも同様である。
【実施例】
【００１９】
（１）ＣＭＰＴの製造方法
図１に示すように、２，４−ジクロロ−６−メトキシ−１，３，５−トリアジン（2,4-dichloro-6-methoxy-1,3,5-triazine）１当量と１−ピレンブタノール（1-pyrenebutanol）１当量に、コリジン（Collidine）１．２当量を加え、室温で24時間放置した。この溶液を高速液体クロマトグラフ（HPLC装置）で分離した後、再結晶化して精製した。得られた生成物をＮＭＲ分析及び質量分析（ＭＳ）で確認したところ、以下の式で表される化合物（ＣＭＰＴ）であると同定された。
【化２】
2016139786.tif 000008
ＣＭＰＴは、ピレン基が蛍光部位であり、Ｃｌ基が反応部位である。【００２０】
（２）ＣＭＰＴの溶媒の検討
ＣＭＰＴを用いたヒスタミンのエキシマー蛍光誘導体化反応に適した塩基及び溶媒を探索するために3種類の塩基（炭酸カリウム、コリジン（Collidine）、ピリジン(Pyridine））と、7種類の溶媒（ＤＭＦ（N,N-dimethylformamide）、ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）、ＴＨＦ（tetrahydrofuran）、ＡＣＮ（acetonitrile）、酢酸エチル、クロロホルム、アセトン）にＣＭＰＴを溶かしたときの溶液の状態を観察した。その結果を表１に示す。表１中「×」は、ＣＭＰＴが完全に溶解しなかった塩基と溶媒の組み合わせを示す。
【表１】
2016139786.tif 000009
【００２１】
表１から、ＣＭＰＴの溶媒としてはＤＭＦが優れていることが分かる。また、炭酸カリウム、コリジン、及びピリジンのいずれの塩基もＣＭＰＴの溶解性に違いはなかったが、炭酸カリウムを用いた溶液では水を加えたときにＣＭＰＴの析出が見られた。後述するように、醤油中のヒスタミンを分離するための前処理で水が添加されることを考慮すると、炭酸カリウムを用いることは好ましくない。また、塩基としてピリジンを用いた溶液及びコリジンを用いた溶液でヒスタミンを蛍光誘導体化したときのエキシマー蛍光強度を測定したところ、ピリジンの方がコリジンよりもエキシマー蛍光の強度が大きかった。そこで、本実施例では、ヒスタミン分析に用いる塩基としてピリジンを採用した。【００２２】
（３）エキシマー蛍光誘導体化の反応時間及びＣＭＰＴの濃度の検討
図２及び図３は、ヒスタミンのＡＣＮ溶液１０μＬをピリジン３μＬ、ＣＭＰＴのＤＭＦ溶液２０μＬに溶解し、ヒスタミンを蛍光誘導体化した後、ＨＰＬＣで蛍光誘導体化ヒスタミンを分離してそのエキシマー蛍光強度を検出した結果を示す。図２は、ＣＭＰＴの濃度を２０ｍＭに、反応温度を５０℃に設定したときの、反応時間と蛍光強度（面積）との関係を示す。また、図３は反応温度を５０℃に、反応時間を２０分に設定したときの、ＣＭＰＴの濃度と蛍光強度の関係を示す。図２から分かるように、反応時間が２０分までは蛍光強度が徐々に増加したが、２０分以降は蛍光強度はほとんど変化しなかった。また、図３から分かるように、２０ｍＭまでの濃度範囲では蛍光強度が徐々に増加したが、２０ｍＭよりも大きい濃度範囲では蛍光強度はほとんど変化しなかった。ヒスタミン分析に要する時間の短縮、ヒスタミン分析に使用するＣＭＰＴ量の低減の観点から、本実施例に係るヒスタミン分析におけるエキシマー蛍光誘導体化の反応時間を２０分に、ＣＭＰＴ濃度を２０ｍＭに設定した。【００２３】
この条件で行ったヒスタミン（50ppmの標準品）のＨＰＬＣ分析結果を図４（ａ）に、このときのＨＰＬＣの条件を図４（ｂ）に示す。また、ＨＰＬＣ分析によりエキシマー蛍光が検出された物質のＭＳ分析を行った結果を示す図４（ｃ）から、ヒスタミン１分子にＣＭＰＴ２分子が結合した物質が生成されていることが確認された。【００２４】
（４）ＣＭＰＴの溶液状態での保存安定性の確認
ＣＭＰＴをＤＭＦに溶解して溶液を作製し、この溶液を室温で保存した後、この溶液を用いてヒスタミンを蛍光誘導体化した。得られた蛍光誘導体化ヒスタミンをＨＰＬＣを用いて分離し、そのエキシマー蛍光の強度を求めた。その結果、エキシマー蛍光強度と保存時間の関係は図５に示すようになった。図５から分かるように、ＣＭＰＴはＤＭＦ溶液の状態でも４０日以上、ヒスタミンとの反応性が低下せず、蛍光誘導体化することができた。このことから、ＣＭＰＴは従来のエキシマー蛍光誘導体化試薬に比べると、溶液状態での保存安定性に優れることが分かる。【００２５】
（５）前処理条件の検討
醤油に含まれるアミン類をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析する場合、アミン類とその他の成分（塩分、有機酸、タンパク質、メラノイジン、アミノ酸等）を分離する前処理が必要である。この前処理法として、非特許文献４に記載された方法が知られている。この方法では、醤油（20μL）に0.1Mの硫酸マグネシウム（20μL）、1M の水酸化ナトリウム（20μL、pH10）、及びアセトニトリル320μLを添加し、遠心処理によりアミン類を含むアセトニトリル層とそれ以外の成分を含む水層に分離する（図６（ａ）参照）。硫酸マグネシウムはタンパク質等の塩析のために、水酸化ナトリウムはｐＨを調整して分子型のヒスタミン量を増やすために添加される。本発明者は、この前処理法を参考に、ヒスタミンをＣＭＰＴで蛍光誘導体化する場合に適した前処理条件を検討した。
具体的には、濃度が既知のヒスタミンを含む試料をアセトニトリル層と水層に分離したときに該アセトニトリル層に回収されたヒスタミンの割合（回収率（％））を、水酸化ナトリウムの濃度を１〜４Ｍに変化させたとき（図６（ｂ）、非加熱のアセトニトリルと加熱したアセトニトリルを用いたとき（図６（ｃ））の両方について調べた。【００２６】
図６（ｂ）から分かるように、水酸化ナトリウムの濃度が１Ｍではヒスタミンの回収率は２５％であったが、２Ｍ〜４Ｍの範囲ではヒスタミンの回収率は４５％であった。以上より、醤油の前処理に用いる水酸化ナトリウムは、２Ｍ〜４Ｍの濃度範囲が適切であると思われる。【００２７】
また、図６（ｃ）から分かるように、加熱ＡＣＮを用いると、蛍光誘導体化ヒスタミンのピーク形状が左右対称な形状であったが、非加熱ＡＣＮを用いると、蛍光誘導体化ヒスタミンは左右非対称な形状であった。これは、非加熱ＡＣＮを用いたときに試料中のタンパク質を十分に除くことができず、タンパク質由来の物質の蛍光ピークがヒスタミン由来の蛍光ピークと重複したためだと思われる。従って、醤油の前処理には非加熱ＡＣＮよりも加熱ＡＣＮを用いる方が好ましいと思われる。【００２８】
上記（１）〜（６）の結果に基づき、本実施例に係るヒスタミン分析における醤油の前処理条件を図７に示す内容に決定した。ここでは、内部標準物質（Internal standard（ I.S.））としてオクタンジアミンを用いた。また、この前処理により水層と分離されたアセトニトリル層に、ＣＭＰＴのＤＭＦ溶液（20mM）を添加してアミン類（ヒスタミン）を蛍光誘導体化した後、ＨＰＬＣ分析によりエキシマー蛍光強度を検出した結果を図８に示す。この結果から、図９に示す反応によりヒスタミンが蛍光誘導体化され、ピレンエキシマーが形成されたことが確認された。さらに、このときのヒスタミン分析の検出限界（Limit of detection、ＬＯＤ）、定量下限（Limit of quantitation、ＬＯＱ）、直線性、検量線範囲を表２に示す。表２より、本実施例に係るヒスタミン分析は、醤油中のヒスタミンを分析するのに十分な直線性と感度が得られることが分かった。
【表２】
2016139786.tif 000010
【００２９】
次に、ヒスタミン濃度が異なる複数の試料について、上記のヒスタミン分析の日内変動、日間変動を調べた。この結果を表３に示す。
【表３】
2016139786.tif 000011
表３から分かるように、日内変動は2.05〜5.61％であり日間変動は3.07％であった。また、確度（真度）は92.6〜123.5％であった。以上より、上述の前処理条件によるヒスタミン分析は再現性、正確性共に優れていることが分かった。【００３０】
次に、非特許文献４に記載されている醤油と同じ種類の醤油を試料として、本実施例に係るヒスタミン分析法によりヒスタミンの定量分析を行った。その結果を表４に示す。表４の右端の欄は非特許文献４に掲載されている、ＭＳ分析装置で求められたヒスタミン定量値を示す。
【表４】
2016139786.tif 000012
【００３１】
表４から分かるように、本実施例に係るヒスタミン分析法でも、ＭＳ分析法と同程度の定量値が得られた。このことから、本実施例に係るヒスタミン分析法は醤油中のヒスタミン量の測定に有効な方法であることが分かった。【００３２】
なお、上記した実施例は、本発明の一例に過ぎず、本発明の趣旨の範囲内で適宜変更、追加を行っても、本願の請求の範囲に包含される。
【図１】
2016139786.tif 000020
【図２】
2016139786.tif 000021
【図３】
2016139786.tif 000022
【図４】
2016139786.tif 000023
【図５】
2016139786.tif 000024
【図６】
2016139786.tif 000025
【図７】
2016139786.tif 000026
【図８】
2016139786.tif 000027
【図９】
2016139786.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月1日(2017.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
（５）前処理条件の検討
醤油に含まれるアミン類をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析する場合、アミン類とその他の成分（塩分、有機酸、タンパク質、メラノイジン、アミノ酸等）を分離する前処理が必要である。この前処理法として、非特許文献４に記載された方法が知られている。この方法では、醤油（20μL）に0.1Mの硫酸マグネシウム（20μL）、1M の水酸化ナトリウム（20μL、pH10）、及びアセトニトリル320μLを添加し、遠心処理によりアミン類を含むアセトニトリル層とそれ以外の成分を含む水層に分離する（図６（ａ）参照）。硫酸マグネシウムはタンパク質等の塩析のために、水酸化ナトリウムはｐＨを調整して分子型のヒスタミン量を増やすために添加される。本発明者は、この前処理法を参考に、ヒスタミンをＣＭＰＴで蛍光誘導体化する場合に適した前処理条件を検討した。
具体的には、濃度が既知のヒスタミンを含む試料をアセトニトリル層と水層に分離したときに該アセトニトリル層に回収されたヒスタミンの割合（回収率（％））を、水酸化ナトリウムの濃度を１〜４Ｍに変化させたとき（図６（ｂ））、非加熱のアセトニトリルと加熱したアセトニトリルを用いたとき（図６（ｃ））の両方について調べた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
上記（１）〜（５）の結果に基づき、本実施例に係るヒスタミン分析における醤油の前処理条件を図７に示す内容に決定した。ここでは、内部標準物質（Internal standard（ I.S.））としてオクタンジアミンを用いた。また、この前処理により水層と分離されたアセトニトリル層に、ＣＭＰＴのＤＭＦ溶液（20mM）を添加してアミン類（ヒスタミン）を蛍光誘導体化した後、ＨＰＬＣ分析によりエキシマー蛍光強度を検出した結果を図８に示す。この結果から、図９に示す反応によりヒスタミンが蛍光誘導体化され、ピレンエキシマーが形成されたことが確認された。さらに、このときのヒスタミン分析の検出限界（Limit of detection、ＬＯＤ）、定量下限（Limit of quantitation、ＬＯＱ）、直線性、検量線範囲を表２に示す。表２より、本実施例に係るヒスタミン分析は、醤油中のヒスタミンを分析するのに十分な直線性と感度が得られることが分かった。
【表２】
2016139786.tif 000029
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
次に、ヒスタミン濃度が異なる複数の試料について、上記のヒスタミン分析の日内変動、日間変動を調べた。この結果を表３に示す。
【表３】
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表３から分かるように、日内変動は2.05〜5.61％であり日間変動は3.07％〜6.01％であった。また、確度（真度）は92.6〜123.5％であった。以上より、上述の前処理条件によるヒスタミン分析は再現性、正確性共に優れていることが分かった。
【国際調査報告】
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