(57)【要約】  本発明は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の未分化性及び複分化能を維持したまま細胞増殖を促進する、キレート化鉄を含む神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞用培地、及び当該培地を用いた神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養方法等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キレート化鉄を含む神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞用培地。
【請求項２】
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進用である、請求項１に記載の培地。
【請求項３】
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の未分化維持用である、請求項１又は２に記載の培地。
【請求項４】
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が多能性幹細胞由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の培地。
【請求項５】
キレート化鉄を含む神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞誘導用培地。
【請求項６】
多能性幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を誘導するための培地である、請求項５に記載の培地。
【請求項７】
キレート化鉄の含有量が３〜７ｐｐｂである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の培地。
【請求項８】
キレート化鉄が、鉄結合性タンパク質と結合した鉄である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項９】
キレート化鉄が、鉄キレート剤と結合した鉄である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１０】
キレート化鉄が、トランスフェリン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、フェリチン、デフェロキサミン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、フィチン酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｌ−グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）からなる群より選択される少なくとも一種と結合した鉄である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１１】
キレート化鉄の少なくとも一種が、トランスフェリンと結合した鉄である、請求項１０に記載の培地。
【請求項１２】
トランスフェリンの培地中の含有量が０．５μｇ／ｍｌ以上６．５μｇ／ｍｌ以下である、請求項１１に記載の培地。
【請求項１３】
トランスフェリンの培地中の含有量が０．１μｇ／ｍｌ以上１．８μｇ／ｍｌ以下である、請求項１１に記載の培地。
【請求項１４】
キレート化鉄の少なくとも一種が、デフェロキサミン、クエン酸又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と結合した鉄である、請求項１０に記載の培地。
【請求項１５】
無血清培地である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１６】
塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の培地。
【請求項１７】
培地中のｂＦＧＦ量が１０ｎｇ／ｍｌ以上２００ｎｇ／ｍｌ以下である、請求項１６に記載の培地。
【請求項１８】
培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法。
【請求項１９】
培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を増殖させる方法。
【請求項２０】
培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の未分化維持方法。
【請求項２１】
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が多能性幹細胞由来である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を誘導する方法。
【請求項２３】
多能性幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞へ誘導する方法である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
キレート化鉄の含有量が３〜７ｐｐｂである、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
キレート化鉄が、鉄結合性タンパク質と結合した鉄である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
キレート化鉄が、鉄キレート剤と結合した鉄である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
キレート化鉄が、トランスフェリン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、フェリチン、デフェロキサミン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、フィチン酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｌ−グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）からなる群より選択される少なくとも一種と結合した鉄である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
キレート化鉄の少なくとも一種が、トランスフェリンと結合した鉄である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
トランスフェリンの培地中の含有量が０．５μｇ／ｍｌ以上６．５μｇ／ｍｌ以下である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
トランスフェリンの培地中の含有量が０．１μｇ／ｍｌ以上１．８μｇ／ｍｌ以下である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
キレート化鉄の少なくとも一種が、デフェロキサミン、クエン酸又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と結合した鉄である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜１７のいずれかに記載の培地並びに神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を含んでなる培養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、キレート化鉄を含む、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞用培地、及び当該培地を用いた神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経幹細胞は、自己複製能を有し、複分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する未分化な細胞であり、神経系の多様な細胞（神経細胞及び神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）、並びにグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト等）及びグリア前駆細胞等）を生み出す能力を有する細胞である。神経幹細胞及び神経前駆細胞は、神経細胞等の通常成体で増殖し難い細胞を供給することができるため、再生医療における生体材料の提供源として注目を集めており、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病などの難治性神経疾患や神経損傷に対する治療応用への期待が寄せられている。このような神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を用いた難治性神経疾患や神経損傷に対する治療、並びにこれらの治療法の開発研究などには、多量の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を必要とするため、インビトロでの神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法の開発及び改良は重要な課題の一つである。【０００３】
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法としては、これまでにいくつかの方法が報告されている。
非特許文献１には、神経幹細胞のインビトロでの培養方法として、ニューロスフィア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）培養が記載されている。該文献では、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む無血清培地中で神経幹細胞を浮遊培養することにより、神経幹細胞の未分化状態を維持し複分化能を保持したまま増殖させることが可能であることが示されている。【０００４】
また、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を接着単層培養する方法としては、ラミニン、ポリＬオルニチン、フィブロネクチン等の基質でコートされた培養器上で、ＥＧＦ及び／又はｂＦＧＦを含む培地を用いて神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する方法等が挙げられる（非特許文献２）。
上記の接着単層培養においては、神経幹細胞は対称分裂を行い、自己複製することが報告されており、ニューロスフィア培養と比較して均一な細胞集団を提供可能であるという利点を有する。【０００５】
これらの培養方法は神経幹細胞及び神経前駆細胞をインビトロで培養できるという大きな利点を有するが、細胞の増殖が遅く培養に時間がかかるという欠点がある。従って、神経幹細胞や神経前駆細胞の未分化性及び複分化能を維持したまま増殖を促進させるための、改良された培地及び培養条件の開発が望まれる。【０００６】
ところで、鉄結合性タンパク質を含む培地について、これまでいくつかの記載がなされている。非特許文献３には、ラットの新生児脳の一部位ＳＶＺ内のオリゴデンドロサイト前駆細胞の増殖にアポ・トランスフェリン（鉄と結合していないトランスフェリン）が重要であることを報告している。非特許文献４には、アポ・トランスフェリン、ＥＧＦ及びＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）が胚性ラット大脳皮質からのニューロスフィア形成に重要であることが報告されている。さらに、インスリンとアポ・トランスフェリンを混ぜるとニューロスフィアのサイズが大きくなることが報告されている。また、特許文献１には、動物細胞培養用の培地にトランスフェリンの代替物として、ヘモグロビンのリコンビナントやフラグメントを使用する方法を開示している。【０００７】
しかしながら、神経幹細胞の未分化性及び複分化能の維持や増殖促進にキレート化鉄が及ぼす影響については全く明らかになっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平６−２６９２８３号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２，２５５（５０５２），１７０７−１０．
【非特許文献２】ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，３（９），ｅ２８３
【非特許文献３】ＡＳＮ  Ｎｅｕｒｏ，２０１３，５（１），ｅ００１０７
【非特許文献４】Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ，２００８，８６（８），１８８４−９４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の、未分化性及び複分化能を維持したまま細胞増殖を促進する培地を提供することであり、また、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の未分化性及び複分化能を維持したまま細胞増殖を促進させる方法を提供することである。さらに、本発明は、多能性幹細胞等から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を誘導する培地の提供、並びに多能性幹細胞等から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を誘導する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、キレート化鉄が、神経幹細胞の未分化性及び複分化能の維持並びに増殖促進に働くこと、多能性幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］  キレート化鉄を含む神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞用培地。
［２］  神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進用である、上記［１］に記載の培地。
［３］  神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の未分化維持用である、上記［１］又は［２］に記載の培地。
［４］  神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が多能性幹細胞由来である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の培地。
［５］  キレート化鉄を含む神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞誘導用培地。
［６］  多能性幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を誘導するための培地である、上記［５］に記載の培地。
［７］  キレート化鉄の含有量が３〜７ｐｐｂである、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の培地。
［８］  キレート化鉄が、鉄結合性タンパク質と結合した鉄である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の培地。
［９］  キレート化鉄が、鉄キレート剤と結合した鉄である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の培地。
［１０］  キレート化鉄が、トランスフェリン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、フェリチン、デフェロキサミン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、フィチン酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｌ−グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）からなる群より選択される少なくとも一種と結合した鉄である、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の培地。
［１１］  キレート化鉄の少なくとも一種が、トランスフェリンと結合した鉄である、上記［１０］に記載の培地。
［１２］  トランスフェリンの培地中の含有量が０．５μｇ／ｍｌ以上６．５μｇ／ｍｌ以下である、上記［１１］に記載の培地。
［１３］  トランスフェリンの培地中の含有量が０．１μｇ／ｍｌ以上１．８μｇ／ｍｌ以下である、上記［１１］に記載の培地。
［１４］  キレート化鉄の少なくとも一種が、デフェロキサミン、クエン酸又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と結合した鉄である、上記［１０］に記載の培地。
［１５］  無血清培地である、上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の培地。
［１６］  塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む、上記［１］〜［１５］のいずれかに記載の培地。
［１７］  培地中のｂＦＧＦ量が１０ｎｇ／ｍｌ以上２００ｎｇ／ｍｌ以下である、上記［１６］に記載の培地。
［１８］  培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法。
［１９］  培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を増殖させる方法。
［２０］  培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の未分化維持方法。
［２１］  神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が多能性幹細胞由来である、上記［１８］〜［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］  培地にキレート化鉄を添加することを特徴とする、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を誘導する方法。
［２３］  多能性幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞へ誘導する方法である、上記［２２］に記載の方法。
［２４］  キレート化鉄の含有量が３〜７ｐｐｂである、上記［１８］〜［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］  キレート化鉄が、鉄結合性タンパク質と結合した鉄である、上記［１８］〜［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］  キレート化鉄が、鉄キレート剤と結合した鉄である、上記［１８］〜［２４］のいずれかに記載の方法。
［２７］  キレート化鉄が、トランスフェリン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、フェリチン、デフェロキサミン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、フィチン酸、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、Ｌ−グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）からなる群より選択される少なくとも一種と結合した鉄である、上記［１８］〜［２４］のいずれかに記載の方法。
［２８］  キレート化鉄の少なくとも一種が、トランスフェリンと結合した鉄である、上記［２７］に記載の方法。
［２９］  トランスフェリンの培地中の含有量が０．５μｇ／ｍｌ以上６．５μｇ／ｍｌ以下である、上記［２８］に記載の方法。
［３０］  トランスフェリンの培地中の含有量が０．１μｇ／ｍｌ以上１．８μｇ／ｍｌ以下である、上記［２８］に記載の方法。
［３１］  キレート化鉄の少なくとも一種が、デフェロキサミン、クエン酸又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と結合した鉄である、上記［２７］に記載の方法。
［３２］  上記［１］〜［１７］のいずれかに記載の培地並びに神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を含んでなる培養組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、未分化性、複分化能を維持したまま長期に効率よく神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養を行うことが可能となる。さらに、本発明によれば、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を効率よく誘導することが可能となる。その結果、培養により多量の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を得ることが可能となる。また、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養にかかるコストを削減することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ホロトランスフェリンを添加した培地中での神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖を示す。縦軸は細胞数、横軸は培地中に含まれるホロトランスフェリンの最終濃度（μｇ／ｍｌ）である。培地中のホロトランスフェリン濃度が１．０〜５．０μｇ／ｍｌの時に、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は良好な増殖を示した。
【図２】ホロトランスフェリン含有量が２．５μｇ／ｍｌである培地中にて培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞における、免疫染色の結果を示す。ネスチン（緑）陽性及びＳＯＸ２（赤）陽性の神経幹細胞、及びネスチン陽性ＳＯＸ２陰性の神経前駆細胞が多数観察された。
【図３】ホロトランスフェリン含有量が２．５μｇ／ｍｌである培地中にて培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の分化誘導を行い、分化誘導後の細胞に対する免疫染色の結果を示す。分化誘導後の培養皿には、神経細胞マーカーβＩＩＩチューブリン（緑）陽性細胞が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の未分化性及び複分化能を維持したまま細胞増殖を促進する培地、並びに多能性幹細胞等から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導を効率化させる培地（以下、これらを総称して本発明の培地ともいう）を提供する。さらに本発明は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を未分化性、複分化能を維持し、分化を抑制させたまま長期に効率よく培養する方法、並びに多能性幹細胞等から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を効率的に誘導する方法（以下、これらを総称して本発明の方法ともいう）を提供する。
【００１６】
（１）キレート化鉄
本明細書中、キレート化鉄とは、鉄キレート剤と結合した鉄、又は鉄結合性タンパク質と結合した鉄を指す。
キレート（ｃｈｅｌａｔｅ）とは、複数の配位座を持つ配位子（多座配位子）による金属イオンへの結合（配位）をいう。キレート化とは、配位子の有する２個以上の配位原子が、共に１つのイオン又は原子に配位して環状化合物を形成することを指す。配位とは、電子対供与体から電子対受容体への電子の供与のことをいい、配位によってできた結合を配位結合という。配位子（ｌｉｇａｎｄ）とは金属に配位する化合物を指す。配位子は孤立電子対を持つ基を有しており、この基が金属と配位結合する。配位子のうち、複数の配位基を持つ配位子を多座配位子という。配位原子とは、配位子を構成する元素の中で金属と直接結合する原子を指す。
キレート錯体とは、多座配位子と金属とが結合し形成された環状の化合物を指す。キレート錯体は配位子が複数の配位基を持っており、配位している物質から分離しにくい。
また、鉄と錯体を形成し得る物質であって、タンパク質以外の物質を鉄キレート剤と呼び、鉄と錯体を形成し得るタンパク質を鉄結合性タンパク質と呼ぶ。
本明細書中、鉄キレート剤と結合した鉄、又は鉄結合性タンパク質と結合した鉄は、それぞれ、鉄キレート剤と鉄キレート錯体を形成している鉄、又は鉄結合性タンパク質と鉄キレート錯体を形成している鉄を意味する。
【００１７】
本発明に使用するキレート化鉄は、鉄キレート剤と結合した鉄であってもよく、鉄結合性タンパク質と結合した鉄であってもよく、鉄キレート剤と結合した鉄と鉄結合性タンパク質と結合した鉄の組み合わせであってもよい。本発明に使用するキレート化鉄は、１種類のキレート化鉄からなってもよく、複数種類のキレート化鉄からなってもよい。
【００１８】
本発明の一実施形態として、キレート化鉄は、鉄キレート錯体を培地に添加することにより培地中に提供される。また別の実施形態としては、キレート化鉄は、鉄と錯体を形成していない鉄キレート剤又は鉄結合性タンパク質と、鉄供給源とをそれぞれ培地に添加することにより、培地中に提供される。本明細書中、鉄供給源とは、錯体を形成していない鉄であって、鉄キレート剤又は鉄結合性タンパク質と錯体を形成し得る鉄を指す。鉄供給源は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、第一鉄（ｆｅｒｒｏｕｓ、Ｆｅ２＋）であってもよく、第二鉄（ｆｅｒｒｉｃ、Ｆｅ３＋）であってもよい。鉄キレート剤又は鉄結合性タンパク質と鉄供給源とを別々に培地に添加する場合、鉄供給源は、水溶性であることが好ましい。鉄供給源の例としては、硫酸鉄、塩化鉄、ヘキサシアノ鉄カリウムが挙げられるがこれらに限定されない。鉄キレート剤又は鉄結合性タンパク質と鉄供給源とは、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り、同時に添加してもよく、それぞれ別に添加してもよい。また、キレート化鉄は、培地に元々含まれる鉄供給源と、添加した鉄キレート剤又は鉄結合性タンパク質により提供され得る。好ましい実施形態としては、キレート化鉄は、あらかじめ鉄キレート剤又は鉄結合性タンパク質と鉄供給源とから錯体を形成させ、該錯体を培地中に添加することにより、培地中に提供される。
【００１９】
鉄キレート剤又は鉄結合性タンパク質と鉄供給源とを別々に培地に添加する場合、本発明の培地に添加される鉄キレート剤又は鉄結合性タンパク質の量、及び鉄供給源の量は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、培地中のキレート化鉄量が３〜７ｐｐｂ、好ましくは４〜６ｐｐｂとなるように調節できる。
鉄キレート剤又は鉄結合性タンパク質と鉄供給源とからあらかじめ錯体を形成させ、該錯体培地に添加する場合、本発明の培地に含まれるキレート化鉄の量は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、３〜７ｐｐｂ、好ましくは４〜６ｐｐｂである。培地中のキレート化鉄の量は、例えば質量分析等の自体公知の方法によって測定できる。培地中のキレート化鉄の量は、例えば、実施例に記載の方法に準じて、誘導結合プラズマ質量分析装置を用いて高分子体の鉄量を測定することにより測定することができる。
【００２０】
培地中のキレート化鉄の量が少なすぎると、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖が促進されない。また、培地中のキレート化鉄の量が多すぎても、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖が促進されない。
【００２１】
鉄キレート剤の例としては、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ；ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、フィチン酸（ｐｈｙｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ；Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ；Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｔｒｉａｍｉｎｅ  Ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ）、Ｌ−グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ；ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ；Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｄｉａｍｉｎｅ  Ｔｒｉａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ；Ｇｌｙｃｏｌ  Ｅｔｈｅｒ  Ｄｉａｍｉｎｅ  Ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ；Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−ｈｅｘａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ；Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  Ｉｍｉｎｏ  Ｄｉａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ；Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  Ｇｌｙｃｉｎｅ）等が挙げられる。
【００２２】
鉄キレート剤として、デフェロキサミン（Ｎ−（５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ）−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ’−［５−（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−｛［５−（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｐｅｎｔｙｌ］ｃａｒｂａｍｏｙｌ｝ｐｒｏｐａｎａｍｉｄｏ）ｐｅｎｔｙｌ］ｂｕｔａｎｅｄｉａｍｉｄｅ）を用いる場合、デフェロキサミンはデフェロキサミン及びその塩、並びにデフェロキサミン誘導体及びそれらの塩を含む。
デフェロキサミンの入手法の例としては、ストレプトマイセス属に属するデフェロキサミンＢ生産菌株、例えば、ストレプトマイセス  ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｉｌｏｓｕｓ；ＪＣＭ４４０３、ＡＴＣＣ１９７９７など）を培養することにより得ることができる他、Ｐｒｏｌｅｇらの方法（Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ、４５，３１，１９６２）により合成することも可能である。
【００２３】
デフェロキサミンの誘導体の例としては、ホルムアルデヒドデフェロキサミン、アセトアミドデフェロキサミン、プロピルアミドデフェロキサミン、ブチルアミドデフェロキサミン、ベンゾイルアミドデフェロキサミン、スクシンアミドデフェロキサミン、メチルスルホアミドデフェロキサミン（Ｉｈｎａｔら，Ｊ．  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９１：１７３３−１７４１（２００２））、ヒドロキシエチルデンプンデフェロキサミン（Ｐｅｄｃｈｅｎｋｏら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．８４：１８８−１９７（１９９８））、アミノオキシアセチルフェリオキサミン（Ｐｏｃｈｏｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．４３：１１８８−１１９４（１９８９））等が挙げられる。
【００２４】
デフェロキサミンの塩の例としては、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、例えばデフェロキサミンメシル酸塩（ＣＡＳ  Ｎｏ．１３８−１４−７）、デフェロキサミン塩酸塩（ＣＡＳ  Ｎｏ．１９５０−３９−６）が挙げられる。デフェロキサミンメシル酸塩は、ノバルティスファーマ等から市販されているものを入手することもできる。
【００２５】
鉄キレート剤として、デフェロキサミンを用いる場合、培地に含まれるデフェロキサミンの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、多すぎると神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の細胞周期を阻害し分化を促進させるため、通常約２５μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約１０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１μｇ／ｍｌ以上である。培地中のデフェロキサミン濃度範囲は約０．１〜２５μｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌである。本明細書中、「約」とは±10%を許容する意味で用いる。
【００２６】
鉄キレート剤としてクエン酸を用いる場合、クエン酸はクエン酸及びその塩を含む。クエン酸は周知の化合物であり、自体公知の方法により入手することができる。鉄キレート剤としてクエン酸を用いる場合、鉄キレート錯体としては、例えば、クエン酸鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅｒｒｉｃ  ｃｉｔｒａｔｅ）、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｆｅｒｒｉｃ  ｃｉｔｒａｔｅ）、クエン酸第一鉄ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  Ｆｅｒｒｏｕｓ  Ｃｉｔｒａｔｅ）等が挙げられる。クエン酸鉄アンモニウムは、公知の化合物であり、例えば、水酸化鉄（ＩＩＩ）をクエン酸とアンモニアの水溶液に加えることによって製造することができる。また、クエン酸鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム、クエン酸第一鉄ナトリウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．ＬＬＣ等から市販されているものを入手することもできる。
鉄キレート剤としてクエン酸を用いる場合、培地に含まれるクエン酸の濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約３０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約３μｇ／ｍｌ以下であり、より好ましくは３μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．０３μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．３μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．３μｇ／ｍｌ以上である。培地中のクエン酸の濃度範囲は約０．０３〜３０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．３〜３μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３〜３μｇ／ｍｌである。
【００２７】
鉄キレート剤として、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いる場合、ＥＤＴＡはＥＤＴＡ及びその塩を含む。ＥＤＴＡは周知の化合物であり、自体公知の方法により入手することができる。
ＥＤＴＡの塩としては、ＥＤＴＡ  ２Ｎａ、ＥＤＴＡ  ３Ｎａ、ＥＤＴＡ  ４Ｎａ等のナトリウム塩、ＥＤＴＡ  ２Ｋ、ＥＤＴＡ３Ｋなどのカリウム塩、マグネシウム塩、クロム酸塩、ナトリウムカルシウム塩などが挙げられる。本発明に使用するＥＤＴＡの塩は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくはナトリウム塩又はカリウム塩である。
鉄キレート剤としてＥＤＴＡを用いる場合、培地に含まれるＥＤＴＡの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約５μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは５μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．０５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．５μｇ／ｍｌ以上である。培地中のＥＤＴＡの濃度範囲は約０．０５〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜５μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜５μｇ／ｍｌである。
【００２８】
鉄キレート剤としてフィチン酸（ｐｈｙｔｉｃ  ａｃｉｄ；ｍｙｏ−イノシトール−１，２，３，４，５，６−六リン酸）（ＣＡＳ  Ｎｏ．８３−８６−３）を用いる場合、フィチン酸及びその塩を含む。フィチン酸は周知の化合物であり、自体公知の方法により入手することができる。
鉄キレート剤としてフィチン酸を用いる場合、培地に含まれるフィチン酸の濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約１２０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約１２μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１２μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．１２μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約１．２μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１．２μｇ／ｍｌ以上である。培地中のフィチン酸の濃度範囲は、約０．１２〜１２０μｇ／ｍｌ、好ましくは約１．２〜１２μｇ／ｍｌ、好ましくは１．２〜１２μｇ／ｍｌである。
【００２９】
鉄キレート剤としてニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を用いる場合、例えば、ニトリロ三酢酸及びその塩を含む。ニトリロ三酢酸は公知の化合物であり、自体公知の方法により入手することができる。また、キレスト株式会社から販売されているＮＴＡ・３Ｈ（ＣＡＳ  Ｎｏ．１３９−１３−９）などの市販のニトリロ三酢酸を使用することもできる。
ニトリロ三酢酸の塩としては、例えば、ＮＴＡ・Ｈ・２Ｎａ（ＣＡＳ  Ｎｏ．１５４６７−２０−６）、ＮＴＡ・３Ｎａ・Ｈ２Ｏ（ＣＡＳ  Ｎｏ．５０６４−３１−３）、ＮＴＡ・Ｈ・２（ＮＨ４）が挙げられるが、これらに限定されない。キレスト株式会社から販売されている、キレスト３ＮＴＢ（ＮＴＡ・Ｈ・２Ｎａ）、キレストＮＴＡ（ＮＴＡ・３Ｎａ・Ｈ２Ｏ）、キレスト２ＮＴＡ（ＮＴＡ・３Ｎａ・Ｈ２Ｏ）、キレスト２ＮＸ−４０（ＮＴＡ・Ｈ・２（ＮＨ４））などを使用することもできる。
鉄キレート剤としてＮＴＡを用いる場合、培地に含まれるＮＴＡの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約３０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約３μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは３μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．０３μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．３μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．３μｇ／ｍｌ以上である。培地中のＮＴＡの濃度範囲は約０．０３〜３０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．３〜３μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３〜３μｇ／ｍｌである。
【００３０】
鉄キレート剤として、ＤＴＰＡを用いる場合、ＤＴＰＡはＤＴＰＡ及びその塩、並びにＤＴＰＡ誘導体及びそれらの塩を含む。ＤＴＰＡは公知の化合物であり、自体公知の方法により入手することができる。
ＤＴＰＡの誘導体の例としては、非エステル結合性ＤＴＰＡ誘導体（特開平９−０３１０３７）、テトラ−アルキル基−ＤＴＰＡ（特開２００６−３４２１０５）などが挙げられる。
ＤＴＰＡの塩の例としてはナトリウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に使用するＤＴＰＡの塩は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくはナトリウム塩である。
鉄キレート剤としてＤＴＰＡを用いる場合、培地に含まれるＤＴＰＡの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約４０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約４μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは４μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．０４μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．４μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．４μｇ／ｍｌ以上である。培地中のＤＴＰＡの濃度範囲は約０．０４〜４０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．４〜４μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．４〜４μｇ／ｍｌである。
【００３１】
鉄キレート剤として、ＧＬＤＡを用いる場合、ＧＬＤＡはＧＬＤＡ及びその塩、並びにＧＬＤＡ誘導体及びそれらの塩を含む。ＧＬＤＡは周知の化合物であり、自体公知の方法により入手することができる。例えば、ＧＬＤＡは、特開平６−５９４２２号公報、米国特許第２５０００１９号などに記載の方法により合成することができる。
ＧＬＤＡの塩としては、ナトリウム塩などのアルカリ金属塩、アンモニウム塩、アミン塩などが挙げられる。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくは、ＧＬＤＡの塩はナトリウム塩である。
鉄キレート剤としてＧＬＤＡを用いる場合、培地に含まれるＧＬＤＡの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約５μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは５μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．０５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．５μｇ／ｍｌ以上である。培地中のＧＬＤＡの濃度範囲は約０．０５〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜５μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜５μｇ／ｍｌである。
【００３２】
鉄キレート剤として、ＨＥＤＴＡを用いる場合、ＨＥＤＴＡはＨＥＤＴＡ及びその塩、並びにＨＥＤＴＡ誘導体及びそれらの塩を含む。ＨＥＤＴＡは周知の化合物であり、自体公知の方法により入手することができる。
ＨＥＤＴＡの塩としては、ナトリウム塩などが挙げられる。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくは、ＨＥＤＴＡの塩は三ナトリウム塩（ＣＡＳ  Ｎｏ．１３９−８９−９）である。
鉄キレート剤としてＨＥＤＴＡを用いる場合、培地に含まれるＨＥＤＴＡの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約５μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは５μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．０５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．５μｇ／ｍｌ以上である。培地中のＨＥＤＴＡの濃度範囲は約０．０５〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜５μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜５μｇ／ｍｌである。
【００３３】
鉄キレート剤として、ＧＥＤＴＡを用いる場合、ＧＥＤＴＡはＧＥＤＴＡ及びその塩、並びにＧＥＤＴＡ誘導体及びそれらの塩を含む。ＧＥＤＴＡは周知の化合物であり、自体公知の方法により入手することができる。
ＧＥＤＴＡの塩としては、カリウム塩、ナトリウム塩などが挙げられる。ＧＥＤＴＡの誘導体の例としては、８−アミノ−２−［（２−アミノ−５−メチルフェノキシ）メチル］−６−メトキシキノリン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００８  Ｊｕｌ  ７；６（１３）：２３６１−８．）が挙げられる。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくは、ＧＥＤＴＡの塩はナトリウム塩である。
鉄キレート剤としてＧＥＤＴＡを用いる場合、培地に含まれるＧＥＤＴＡの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約５μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは５μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．０５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．５μｇ／ｍｌ以上である。培地中のＧＥＤＴＡの濃度範囲は約０．０５〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜５μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５〜５μｇ／ｍｌである。
【００３４】
鉄キレート剤として、ＴＴＨＡを用いる場合、ＴＴＨＡはＴＴＨＡ及びその塩、並びにＴＴＨＡ誘導体及びそれらの塩を含む。ＴＴＨＡは周知の化合物であり、自体公知の方法により入手することができる。
ＴＴＨＡの塩としては、ナトリウム塩などが挙げられる。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくは、ＴＴＨＡの塩はナトリウム塩である。
鉄キレート剤としてＴＴＨＡを用いる場合、培地に含まれるＴＴＨＡの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約１１０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約１１μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１１μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．１１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約１．１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１．１μｇ／ｍｌ以上である。培地中のＴＴＨＡの濃度範囲は約０．１１〜１１０μｇ／ｍｌ、好ましくは約１．１〜１１μｇ／ｍｌ、より好ましくは１．１〜１１μｇ／ｍｌである。
【００３５】
鉄キレート剤として、ＨＩＤＡを用いる場合、ＨＩＤＡはＨＩＤＡ及びその塩、並びにＨＩＤＡ誘導体及びそれらの塩を含む。ＨＩＤＡは周知の化合物であり、自体公知の方法により入手することができる。
ＨＩＤＡの塩としては、ナトリウム塩などが挙げられる。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくは、ＨＩＤＡの塩は二ナトリウム塩である。
鉄キレート剤としてＨＩＤＡを用いる場合、培地に含まれるＨＩＤＡの濃度は神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約３０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約３μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは３μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．０３μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．３μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．３μｇ／ｍｌ以上である。培地中のＨＩＤＡの濃度範囲は約０．０３〜３０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．３〜３μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３〜３μｇ／ｍｌである。
【００３６】
鉄キレート剤として、ＤＨＥＧを用いる場合、ＤＨＥＧはＤＨＥＧ及びその塩、並びにＤＨＥＧ誘導体及びそれらの塩を含む。ＤＨＥＧは周知の化合物であり、自体公知の方法により入手することができる。
ＤＨＥＧの塩としては、ナトリウム塩などが挙げられる。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、入手の容易さなどの観点から好ましくは、ＤＨＥＧの塩はナトリウム塩である。
鉄キレート剤としてＤＨＥＧを用いる場合、培地に含まれるＤＨＥＧの濃度は神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約３０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約３μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは３μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．０３μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約０．３μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．３μｇ／ｍｌ以上である。培地中のＤＨＥＧの濃度範囲は約０．０３〜３０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．３〜３μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３〜３μｇ／ｍｌである。
【００３７】
鉄結合性タンパク質の例としては、トランスフェリン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、フェリチンなどが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、鉄結合性タンパク質は、トランスフェリン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、フェリチンである。鉄結合性タンパク質は、鉄結合部位を含む断片であってもよい。鉄結合性タンパク質は、自体公知の方法により入手することができる。
【００３８】
本発明に使用する鉄結合性タンパク質は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の鉄結合性タンパク質であり、好ましくは、培養する神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞と同種の動物由来の鉄結合性タンパク質である
【００３９】
本発明に用いる鉄結合性タンパク質は、天然の鉄結合性タンパク質であってもよく、非天然であってもよい。鉄結合性タンパク質は、生体、生細胞などが天然で有する遺伝子から発現した鉄結合性タンパク質を単離精製した鉄結合性タンパク質であってもよく、遺伝子組み換え技術により微生物、細胞又は動植物などにより産生させたものから単離精製したリコンビナントの鉄結合性タンパク質であってもよい。
【００４０】
鉄結合性タンパク質として、トランスフェリンを用いる場合、キレート化鉄は、好ましくは、トランスフェリンと鉄が結合した鉄キレート錯体であるホロトランスフェリンとして培地中に提供される。鉄と結合したトランスフェリンはホロトランスフェリン、鉄と結合していないトランスフェリンはアポトランスフェリンと呼ばれる。
本明細書中、ホロトランスフェリンは、アポトランスフェリン１分子と鉄イオン１つが結合した分子、及びアポトランスフェリン１分子と鉄イオン２つが結合した分子を含む。
【００４１】
本明細書中、アポトランスフェリン１分子と鉄イオン１つが結合した分子、及びアポトランスフェリン１分子と鉄イオン２つが結合した分子を総称して、鉄積載型トランスフェリン（ｉｒｏｎ−ｌａｄｅｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）と称する。培地等の溶液中で鉄搭載型トランスフェリンと、鉄と結合していないアポトランスフェリンとを厳密に区別することは困難であるため、当該技術分野の慣例にならい、本明細書中でも、上記の鉄積載型トランスフェリン及び鉄イオンが結合していないアポトランスフェリンの混合物についても、ホロトランスフェリンと称する。
【００４２】
本発明において、ホロトランスフェリンの鉄含有量は２００μｇ／ｇ〜１４００μｇ／ｇである。ホロトランスフェリンの鉄含有量は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常、入手の容易さなどの観点から、２００μｇ／ｇ〜５００μｇ／ｇであるものが好ましい。血清中のトランスフェリンと鉄含有量が近いという観点から、鉄含有量が２００μｇ／ｇ〜５００μｇ／ｇであるものがより好ましい。
【００４３】
ヒトトランスフェリンをコードする核酸配列としてはＮＭ＿００１０６３（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．）が、ヒトトランスフェリンのアミノ酸配列としてはＮＰ＿００１０５４が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
鉄キレート錯体として、ホロトランスフェリンを用いる場合、培地に含まれるホロトランスフェリンの濃度は、所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、培地中のキレート化鉄量が３〜７ｐｐｂ、好ましくは４〜６ｐｐｂとなるようなホロトランスフェリンの濃度であることが好ましい。具体的には、培地中のホロトランスフェリンの濃度は下記の通りである。
【００４５】
鉄キレート錯体として、ホロトランスフェリンを用いる場合、培地に含まれるトランスフェリンの濃度は、使用するホロトランスフェリンの鉄含有量によっても適宜増減することができ、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常、０．１〜６．５μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．３〜６．５μｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜６．５μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１〜５μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは２．５〜５μｇ／ｍｌである。尚、「培地に含まれるトランスフェリンの濃度」（あるいは「トランスフェリンの培地中の含有量」）とは、培地中の鉄積載型トランスフェリンの濃度と鉄イオンが結合していないアポトランスフェリンの濃度の合計を指す。
【００４６】
より詳細には、鉄含有量の高いホロトランスフェリン（例えば鉄含有量が１１００〜１４００μｇ／ｇ）を用いる場合、上記の値よりさらに低濃度のトランスフェリンを用いても神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成することができ、通常、２．０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１．８μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは１．４μｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは１．３μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常０．１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．２μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．３μｇ／ｍｌ以上である。鉄含有量の高いトランスフェリン（例えば鉄含有量が１１００〜１６００μｇ／ｇ）を用いる場合、培地中のトランスフェリンの濃度範囲は０．１〜２．０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１．８μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．２〜１．４μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは０．３〜１．３μｇ／ｍｌである。
【００４７】
一方、血清から単離されたホロトランスフェリン等の、鉄含有量の低いホロトランスフェリン（例えば鉄含有量が２００〜５００μｇ／ｇ）を用いる場合、培地中のトランスフェリン量は、通常約６．５μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約５μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは５μｇ／ｍｌ以下、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは約２．５μｇ／ｍｌ以上、さらにより好ましくは２．５μｇ／ｍｌ以上である。例えば鉄含有量の低いホロトランスフェリン（例えば鉄含有量が２００〜５００μｇ／ｇ）を用いる場合、培地中のトランスフェリンの濃度範囲は０．５〜６．５μｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約２．５〜５μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは２．５〜５μｇ／ｍｌである。
上記条件を達成することにより、所望の培地中のキレート化鉄量がもたらされるがこれらに限定されない。
【００４８】
ホロトランスフェリンの鉄含有量は、例えばホロトランスフェリンを適当な溶媒に懸濁し、ＳＥＣ−ＩＣＰ−ＭＳにより溶媒中の高分子体の鉄量を測定し、トランスフェリンタンパク質１ｇ当りの鉄量を計算することにより測定することができる。
【００４９】
例えば、上記鉄キレート錯体として、ホロトランスフェリンを用いる場合、市販の試薬（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いることができる。
【００５０】
鉄結合性タンパク質として、ラクトフェリンを用いる場合、ヒトラクトフェリンをコードする核酸配列としてはＭ８３２０２、Ｍ９３１５０、Ｕ０７６４３が、ヒトラクトフェリンのアミノ酸配列としてはＡＡＡ５９５１１が挙げられるが、これらに限定されない。
鉄結合性タンパク質として、ラクトフェリンを用いる場合、培地に含まれるラクトフェリンの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約１０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約５μｇ／ｍｌ以下であり、より好ましくは５μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約２．５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２．５μｇ／ｍｌ以上である。培地中のラクトフェリンの濃度範囲は約１〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは約２．５〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは２．５〜５μｇ／ｍｌである。
【００５１】
鉄結合性タンパク質として、ヘモグロビンを用いる場合、ヘモグロビンは、αサブユニット、βサブユニット、εサブユニット、γサブユニット（γ−Ｇサブユニット又はγ−Ａサブユニット）、又はδサブユニットの単量体であってもよく、２つのαサブユニットと２つのβサブユニットから構成される４量体、２つのαサブユニットと２つのδサブユニットから構成される４量体等であってもよい。また、ヘモグロビンは酸素と結合したオキシヘモグロビン（酸素化ヘモグロビン）（ｏｘｙｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）であってもよく、酸素と結合していないデオキシヘモグロビン（還元ヘモグロビン）（ｄｅｏｘｙｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）であってもよい。
ヘモグロビンαサブユニットをコードする核酸配列としてはＮＭ＿０００５５８、ＮＭ＿０００５１７が、ヒトヘモグロビンαサブユニットのアミノ酸配列としてはＮＰ＿０００５４９、ＮＰ＿０００５０８が挙げられるが、これらに限定されない。
ヘモグロビンβサブユニットをコードする核酸配列としてはＮＭ＿０００５１８が、ヒトヘモグロビンβサブユニットのアミノ酸配列としてはＮＰ＿０００５０９が挙げられるが、これらに限定されない。
ヘモグロビンδサブユニットをコードする核酸配列としてはＮＭ＿０００５１９が、ヒトヘモグロビンδサブユニットのアミノ酸配列としてはＮＰ＿０００５１０が挙げられるが、これらに限定されない。
ヘモグロビンγサブユニットをコードする核酸配列としてはＮＭ＿０００１８４が、ヒトヘモグロビンγサブユニットのアミノ酸配列としてはＮＰ＿０００１７５が挙げられるが、これらに限定されない。
鉄結合性タンパク質として、ヘモグロビンを用いる場合、培地に含まれるヘモグロビンの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約８μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約４．８μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは４．８μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約０．８μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約３．２μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは３．２μｇ／ｍｌ以上である。培地中のヘモグロビンの濃度範囲は約０．８〜８μｇ／ｍｌ、好ましくは約３．２〜４．８μｇ／ｍｌ、好ましくは３．２〜４．８μｇ／ｍｌである。
【００５２】
鉄結合性タンパク質として、フェリチンを用いる場合、ヒトフェリチンをコードする核酸配列としてはＮＭ＿０００１４６（軽鎖）、ＮＭ＿００２０３２（重鎖）、ＮＭ＿１７７４７８（ミトコンドリア）が、ヒトフェリチンのアミノ酸配列としてはＮＰ＿０００１３７（軽鎖）、ＮＰ＿００２０２３（重鎖）、ＮＰ＿８０３４３１（ミトコンドリア）が挙げられるが、これらに限定されない。
鉄結合性タンパク質として、フェリチンを用いる場合、培地に含まれるフェリチンの濃度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されないが、通常約５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは約３０μｇ／ｍｌ以下、より好ましくは３０μｇ／ｍｌ以下であり、少なすぎると所望の効果を得られないため通常約５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは約２０μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２０μｇ／ｍｌ以上である。培地中のフェリチンの濃度範囲は約５〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは約２０〜３０μｇ／ｍｌ、より好ましくは２０〜３０μｇ／ｍｌである。
【００５３】
（２）神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞
本明細書中、神経幹細胞とは、神経系細胞（神経細胞及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）、並びにそれらの前駆細胞）への複分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を維持し、自己複製能を有する未分化な細胞を意味する。具体的には、神経幹細胞とは、神経細胞及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）を最終的に生み出す能力を有し、かつ、初期化などの特別な操作を加えない限りにおいて、表皮系細胞、血球系細胞、筋肉細胞等の神経系以外の細胞を実質的に生み出さない細胞である。実質的に生み出さないとは、神経幹細胞の生み出す細胞のうち、９０％以上が、神経細胞及びグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイトなど）、並びにそれらの前駆細胞のいずれかである状態を指す。
【００５４】
本明細書中、神経前駆細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）とは、分裂能を有する未分化な細胞であって、１種以上の神経細胞に最終的に分化する能力を有する細胞を指す。神経前駆細胞は、神経細胞を最終的に生み出すよう運命決定され、かつ神経細胞及びその前駆細胞以外を実質的に生み出さない細胞を指す。グリア前駆細胞（ｇｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）とは、神経幹細胞に由来し、分裂能を有する未分化な細胞であって、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、上衣細胞、シュワン細胞のいずれか又はそれらの前駆細胞に分化する能力を有し、かつ神経細胞に実質的に分化しない細胞を指す。
【００５５】
神経幹細胞及び神経前駆細胞は、厳密に区別することが困難なため、本明細書中「神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞」として区別なく使用される場合がある。
【００５６】
本発明においては、通常、哺乳動物由来の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が用いられる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において用いられる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、好ましくはマウス等のげっ歯類又はヒト等の霊長類の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞であり、より好ましくは、ヒト神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞である。
【００５７】
本発明に用いられる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、多能性幹細胞由来のもの、生体組織から分離したもの、線維芽細胞などから多能性幹細胞を経由せずに直接分化誘導したもの（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２０１２  Ｊｕｎ；３０（６）：１１０９−１９）などが挙げられ、上記に記載の未分化性を維持し複分化能を維持する細胞であって神経細胞を生み出す能力を維持する限り、特に制限されない。本明細書中、多能性幹細胞とは、自己複製能及び分化／増殖能を有する未熟な細胞であって、胎盤を除く生体を構成する全ての組織や細胞へ分化し得る能力を有する細胞を意味する。多能性幹細胞の例としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋら，Ｃｅｌｌ．２００７  Ｎｏｖ  ３０；１３１（５）：８６１−７２）、精子幹細胞（Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｍら，Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐｒｏｄ．２００７  Ｊａｎ；７６（１）：５５−６２）、胚性生殖細胞（Ｍａｔｓｕｉ  Ｙら，Ｃｅｌｌ．１９９２  Ｓｅｐ  ４；７０（５）：８４１−７）、核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞（Ｗａｋａｙａｍａ  Ｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００１  Ａｐｒ  ２７；２９２（５５１７）：７４０−３）などが挙げられる。
多能性幹細胞由来の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は自体公知の方法により、入手できる。多能性幹細胞由来の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を作製する方法としては、多能性幹細胞の浮遊培養を行い胚葉体形成を経由して神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を形成させる方法（Ｂａｉｎ  Ｇら，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１９９５  Ａｐｒ；１６８（２）：３４２−５７など）、ストローマ細胞等をフィーダー細胞として使い多能性幹細胞を培養する方法、ｂＦＧＦを含む無血清培地中で多能性幹細胞の浮遊培養を行う方法（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｋら，Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００５  Ｍａｒ；８（３）：２８８−９６など）、ＳＭＡＤシグナル阻害剤Ｎｏｇｇｉｎ及びＳＢ４３１５４２の存在下で多能性幹細胞（ＥＳ細胞等）を接着培養する方法（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ＳＭら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９  Ｍａｒ；２７（３）：２７５−８０）、単層培養した多能性幹細胞（ＥＳ細胞等）を、ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３（ＧＳＫ３）阻害剤、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β（ＴＧＦ−β）阻害剤、Ｎｏｔｃｈシグナル阻害剤存在下で培養する方法（Ｌｉ  Ｗら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１  Ｍａｙ  １７；１０８（２０）：８２９９−３０４）などが挙げられる。
好ましくは、本発明に用いられる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、ＥＳ細胞又は人工多能性幹細胞由来であり、より好ましくは人工多能性幹細胞由来である。
【００５８】
細胞が神経幹細胞であることは、例えば、細胞をＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む無血清培地中で浮遊培養し、培養した細胞塊を分散処理後に、接着培養を行うことにより、神経細胞及びグリア細胞に分化誘導させることによって確認することができる。
また、神経幹細胞は、神経幹細胞で発現することが知られている遺伝子、その転写産物、タンパク質など（神経幹細胞マーカー）により確認することもできる。
神経幹細胞マーカーとしては、細胞骨格タンパク質であるネスチン（Ｎｅｓｔｉｎ；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，６６（１９９７））、ＳＯＸ１（ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ１）、ＳＯＸ２（ＳＲＹ（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ）−ｂｏｘ２）、Ｐａｘ６（ｐａｉｒｅｄ  ｂｏｘ  ６）、Ｋｉ６７、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、脂肪酸結合タンパク質７（Ｆａｂｐ７、ＢＬＢＰともいう）などが知られており、当業者は、これらのマーカーを適宜組み合わせて所望の神経幹細胞であることを確認することができる。本発明に適した神経幹細胞としては、例えば、ＳＯＸ２陽性かつネスチン陽性である細胞が挙げられるが、これに限定されない。
【００５９】
細胞が神経前駆細胞であることは、例えば、細胞を培養し、神経細胞に分化誘導させることによって確認することができる。
神経前駆細胞で発現する遺伝子としては、Ｔｂｒ２（Ｔ−ｂｏｘ  ｂｒａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）、ＭＡＳＨ１（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １）、ネスチン等が挙げられる。本発明に適した神経前駆細胞としては、ＳＯＸ２陰性かつネスチン陽性である細胞が挙げられるが、これに限定されない。
分化した神経細胞のマーカーの例としては、βＩＩＩチューブリン、ＭＡＰ２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）等が挙げられる。
【００６０】
本明細書中、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が未分化維持するとは、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が分裂後に形成する細胞のうち１以上の細胞が神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞としての性質を維持し続けること、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の分化が抑制されていること、あるいは神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が分裂せず神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞としての性質を維持し続けることを言う。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が分裂後に形成する細胞が、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞としての性質を維持しているか否かは、例えば、上述のマーカーにより確認することができる。本明細書中、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の分化が抑制されるとは、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が生み出す全細胞のうち、分化した細胞（例えば神経細胞）の占める割合が減少することを言う。分化の抑制は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞から神経細胞などへの分化抑制であってもよい。分化抑制されているか否かは、例えば、上述の分化マーカー（例えばβＩＩＩチューブリン等の神経細胞マーカー）により確認することができる。
【００６１】
一態様において、本発明において用いられる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。「単離された神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞」の純度（全細胞数に占める神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の数の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。
【００６２】
（３）本発明の培地
本発明の一実施形態として、本発明は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養用の培地を提供する。本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の未分化性及び多分化能を維持させ、増殖を促進させる効果を有する。別の実施形態として、本発明の培地は、多能性幹細胞からの神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導を効率化する作用を有する。本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の未分化性及び多分化能を維持させ増殖を促進させるため、誘導された少数の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を効果的に増殖させることができ、その結果、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導を効率化することができる。本発明の一実施形態として、本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の未分化維持用であり、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進用である。別の実施形態として、本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導用であり、多能性幹細胞から神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導用である。
【００６３】
本発明の培地は、キレート化鉄を含む。添加するキレート化鉄については前述のとおりである。本発明の培地に含まれるキレート化鉄以外の成分については、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されず、通常の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養に使用される組成を適宜採用し得る。
【００６４】
本発明の培地は、未分化性及び多分化能を有する神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖を促進する効果を有する。例えば、本発明の培地は、ＳＯＸ２陽性ネスチン陽性及び／又はＳＯＸ２陰性ネスチン陽性である、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の、増殖を促進する効果を有する。
【００６５】
本明細書中、「本発明の培地が神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖を促進する」とは、該培地中で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を一定期間（好ましくは４日以上（例、４日間））培養した時に、キレート化鉄を含有しないこと以外は組成が同一な対照培地中で培養した時と比較して、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の数が多いことを意味する。
【００６６】
本発明の培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製してもよい。基礎培地としては、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ−１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。本発明の培地は、幹細胞培養用として通常用いられる培地を基礎培地として調製してもよい。市販の幹細胞培養用の基礎培地としては、ＲＨＢ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，Ｉｎｃ．）、ｈＥＳＦ−ＧＲＯ培地（ニプロ株式会社）、ＨＥＳＦ−ＤＩＦ培地（ニプロ株式会社）、ＣＳＴＩ−７（株式会社細胞科学研究所）等が挙げられる。
【００６７】
本発明に用いる培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、含有成分が化学的に決定された培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ；ＣＤＭ）である。
【００６８】
血清中には神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の分化を促進する成分が含まれることから、本発明の培地は、無血清培地であることが好ましい。本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、ＥＧＦ、ｂＦＧＦなどの増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
【００６９】
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、血清アルブミン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製：以下、ＫＳＲと記すこともある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明の培地は、さらに培地添加物を含有してもよい。培地添加物としては、ビタミン類、グルタミンなどの非必須アミノ酸、サイトカイン及び成長因子などのタンパク質、Ｌ−アスコルビン酸、リン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウム、ピルビン酸ナトリウム、２−アミノエタノール、グルコース、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、インスリン、プロゲステロン、セレン酸ナトリウム、プトレシン等が挙げられるが、これらに限定されない。添加物は自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
本発明の培地は、必須アミノ酸（Ｌ−リジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−トリプトファン）を含む。本発明の培地は、好ましくは、Ｌ−セリン、Ｌ−シスチン、グリシン、Ｌ−システイン、Ｌ−プロリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸及びＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−アスパラギンを含む。
本発明の培地は、イノシトール、塩化コリン、葉酸、Ｄ−パントテン酸カルシウム、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、ナイアシンアミド、ビタミンＢ１２、リボフラビン（ビタミンＢ２）、Ｄ−ビオチン、Ｄ−グルコース、ピルビン酸ナトリウム、ヒポキサンチン、チミジン、リポ酸、プトレシン塩酸塩から成る群より選択される培地添加物を１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上含む。
【００７１】
本発明の培地を神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養に用いる場合、本発明の培地は、好ましくは、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）及び／又は塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含み、より好ましくはｂＦＧＦを含む。
本発明において培地中のｂＦＧＦの量の上限値は、所望の効果を達成し得る限り制限されないが、好ましくは１０００ｎｇ／ｍｌ以下、より好ましくは５００ｎｇ／ｍｌ以下、さらに好ましくは２００ｎｇ／ｍｌ以下である。
本発明において培地中のｂＦＧＦの量の下限値は、所望の効果を達成し得る限り制限されないが、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ以上である。
本発明において培地中のｂＦＧＦの量は、所望の効果を達成し得る限り制限されないが、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌである。
一態様として、本発明の培地は、ｂＦＧＦ（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ）を含む。また、本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の分化を促進させる効果を有する物質（本明細書中、神経分化促進物質ともいう）を実質的に含まないことが好ましい。
神経分化促進物質の例としては、ＢＤＮＦ（Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、ＧＤＮＦ（Ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）、ｃＡＭＰ（Ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｄｂｃＡＭＰ（ｄｉｂｕｔｙｒｙｌ  ｃＡＭＰ）、ＤＡＰＴ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ  （２Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−［［２−（３，５−ｄｉｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）ａｃｅｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐａｎｏｙｌ］ａｍｉｎｏ］−２−ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔａｔｅ）、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｅ（Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（３Ｓ）−２，３−Ｄｉｈｙｄｒｏ−１−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏ−５−ｐｈｅｎｙｌ−１Ｈ−１，４−ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎ−３−ｙｌ］ａｍｉｎｏ］−１−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｏｘｏｅｔｈｙｌ］−３，５−ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＳＵ５４０２（２−［（１，２−Ｄｉｈｙｄｒｏ−２−ｏｘｏ−３Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］−４−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌｅ−３−ｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ＳＵ６６６８（３−［２，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−［（Ｅ）−（２−ｏｘｏ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌ−３−ｙｌ］ｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ；  Ｏｒａｎｔｉｎｉｂ；  ３−［２，  ４−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−５−［（Ｅ）−（２−ｏｘｏ−１Ｈ−ｉｎｄｏｌ−３−ｙｌｉｄｅｎｅ）ｍｅｔｈｙｌ］−１Ｈ−ｐｙｒｒｏｌ−３−ｙｌ］  ｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）が挙げられる。
神経分化促進物質を実質的に含まないとは、神経分化促進物質が含まれていても神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の分化を促進し得ない量であり、用いる神経分化促進物質の種類によって適宜設定される。より好ましくは、本発明の培地に含まれる神経分化促進物質の濃度は、０μＭである。
【００７２】
本発明の培地を神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導に用いる場合、本発明の培地は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導を促進する物質を含むことが好ましい。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導を促進する物質は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞誘導方法に準じて適宜選択される。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞誘導方法は、前記多能性幹細胞由来の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導方法、線維芽細胞などから直接分化誘導する方法（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２０１２  Ｊｕｎ；３０（６）：１１０９−１９）等が挙げられる。
【００７３】
本発明の培地は、脂肪酸を含んでもよい。本発明の培地に含まれる脂肪酸としては、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、酪酸、酢酸、パルミトレイン酸、吉草酸（バレリアン酸）、カプロン酸、エナント酸（ヘプチル酸）、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、クセン酸、エレオステアリン酸、アラキジン酸、８，１１−エイコサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の培地に含まれる脂肪酸は飽和脂肪酸であってもよく、不飽和脂肪酸であってもよい。
【００７４】
本発明の培地は、接着培養、浮遊培養、包埋培養、組織培養等のいずれの培養方法にも用いることができる。
【００７５】
本発明の培地は、いずれの動物由来の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養にも好適に使用することができる。本発明の培地を使用して培養され得る神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等由来の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞であり、好ましくは、ヒト由来の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞である。
【００７６】
本発明の培地は、好ましくは、キレート化鉄の他、インスリン、ＮａＨＣＯ３、セレン、エタノールアミン、ｂＦＧＦを含む。より好ましくは、本発明の培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を基礎培地とし、キレート化鉄の他、インスリン、ＮａＨＣＯ３、セレン、エタノールアミン、ｂＦＧＦを含む。
【００７７】
一態様として、本発明の培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を基礎培地とし、キレート化鉄の他、アルブミン（０．５ｍｇ〜５ｍｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ）、ＮａＨＣＯ３（１００μｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ）、セレン酸ナトリウム（２ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ）、エタノールアミン（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ）を含む。
【００７８】
一態様として、本発明の培地は、ホロトランスフェリン（０．５〜６．５μｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ）を含む培地であって、培地中の鉄高分子体量が３ｐｐｂ〜７ｐｐｂである。好ましくは、本発明の培地は、鉄含有量２００μｇ／ｇ〜５００μｇ／ｇのホロトランスフェリン（０．５〜６．５μｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ）を含む。さらに好ましくは、本発明の培地は、鉄含有量３８０μｇ／ｇのホロトランスフェリン（０．５〜６．５μｇ／ｍｌ）及びｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌ）を含む。
【００７９】
（４）本発明の方法
本発明の一実施形態として、本発明は、キレート化鉄を培地に添加することを特徴とする神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養方法を提供する。当該方法は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を増殖させ、未分化を維持する方法でもある。別の実施形態として、多能性幹細胞等からの神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導を効率化する方法を提供する。本発明の方法は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の未分化性及び多分化能を維持させ増殖を促進させるため、誘導された少数の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を効果的に増殖させることができ、その結果、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導を効率化することができる。
【００８０】
本発明の一実施形態として、本発明の方法は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を本発明の培地で培養する工程を含む。また本発明の一実施形態として、本発明の方法は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を誘導し得る細胞を本発明の培地で培養する工程を含む。また別の本発明の実施形態としては、本発明の方法は、キレート化鉄を含まない培地にキレート化鉄を添加し、キレート化鉄存在下で一定期間培養する工程を含む。
【００８１】
本発明の方法に用いる神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞としては、ＳＯＸ２陽性ネスチン陽性及び／又はＳＯＸ２陰性ネスチン陽性である、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞が好ましい。
【００８２】
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に制限されるものではないが、本発明の培養方法における神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する期間は、通常２日間以上、好ましくは４日間以上、さらに好ましくは８日以上である。
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を４日以上続けて培養する場合、３日に一回、好ましくは２日に一回培地を交換することが好ましい。
【００８３】
本発明の培地中で培養した神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を回収し、その一部又は全部を新鮮な本発明の培地中に継代し、引き続き培養を続けることにより、神経前駆細胞は未分化性を維持し、増殖が促進されたまま、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を継代培養することができる。
【００８４】
本発明の方法において培地にキレート化鉄を添加する時間は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得るような長さの時間である限り特に限定されないが、好ましくは培養期間中の全期間においてキレート化鉄を含む培地で培養することが好ましい。培地の組成は前述のとおりである。
【００８５】
本発明の方法において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導を効率化させる場合、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導は、用いる培地にキレート化鉄が含まれていることを除いては、公知の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞誘導方法（例えば、前記多能性幹細胞由来の神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の誘導方法、線維芽細胞から直接分化誘導する方法等が挙げられるがこれらに限定されない）に準じて行われる。
【００８６】
本発明の方法において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する場合、用いる培地にキレート化鉄が含まれていることを除いては、接着培養、浮遊培養、組織培養などの自体公知の方法により培養可能である。培養方法は目的に応じて適宜選択可能である。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の接着培養方法の例としては、Ｆｌａｎａｇａｎ  ＬＡら，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．２００６  Ａｐｒ；８３（５）：８４５−５６、Ｃｏｎｔｉ  Ｌら，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．，２００５  Ｓｅｐ；３（９）：ｅ２８３などに記載の方法が挙げられる。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の浮遊培養とは、培地中において、培養器又はフィーダー細胞（用いられる場合）に対して非接着性の条件下で神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養することをいう。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の浮遊培養方法の例としては、ニューロスフィア法（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＢＡ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ  Ｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，１９９２  Ｍａｒ  ２７；２５５（５０５２）：１７０７−１０）、無血清凝集浮遊培養法（ＳＦＥＢ法、ＳＦＥＢｑ法；Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８，２８８−２９６（２００５））などが挙げられる。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の組織培養とは、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を含む組織を、スライスなどの組織片又は組織全体として培養する方法である。神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の組織培養としては、Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ  ＮＡら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２  Ｏｃｔ  ９；２５８（５０８０）：２９９−３０２．、Ｋｏｍｕｒｏ  Ｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２  Ａｕｇ  ７；２５７（５０７１）：８０６−９に記載のスライス培養法などが挙げられる。
【００８７】
本発明において神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖の有無、程度はトリパンブルー等の細胞染色試薬を用いて生細胞数を計測することによって評価することができる。また、浮遊培養を行いニューロスフィアを形成させる場合には、形成されるニューロスフィアの大きさ、あるいはニューロスフィアを構成する細胞の数を測定することによって評価することができる。
【００８８】
本発明の方法において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養に用いられる培養器は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられる。
【００８９】
神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の培養に用いられる培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。浮遊培養により神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する場合、培養器は細胞非接着性であることが好ましい。
接着培養により神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を培養する場合、培養器は細胞接着性であることが好ましい。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質又はそれらの機能をミミックする人工物でコーティングされたものであり得る。細胞支持用基質は、幹細胞又はフィーダー細胞（用いられる場合）の接着を目的とする任意の物質であり得る。
【００９０】
その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進及び未分化性の維持等の所望の効果を達成し得る限り特に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。酸素濃度は、通常１〜４０％であるが、培養条件などにより適宜選択される。
（５）キレート化鉄を含む培地並びに神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を含む培養組成物
本発明はさらに上記本発明の培地並びに神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞を含んでなる、培養組成物（本明細書中、本発明の培養組成物ともいう）を提供する。該培養組成物は、細胞を培養することにより得られる結果物を含む。本発明の培養組成物に関連する各用語の定義及び態様は、上記に記載したものと同一である。
【００９１】
本発明の培養組成物における神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、生存し、増殖している細胞である。
【００９２】
本発明の培養組成物における神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の純度（全細胞数に占める神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の数の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。
【００９３】
本発明の培養組成物において、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞は、本発明の培地中に存在する。一態様において、本発明の培養組成物は、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の、本発明の培地中の懸濁液である。本発明の培養組成物は、適切な容器中に封入されていてもよい。
【００９４】
一実施態様として、本発明の培養組成物は凍結保存させた状態で提供され得る。本発明の培養組成物は、凍結保存することが可能であり、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。凍結保存は、自体公知の細胞凍結保存方法を使用することができる。凍結保存の例としては、本発明の培養組成物にジメチルスルホキシドを加え、−８０〜−２００℃、好ましくは−１９６℃（液体窒素中）の条件で本発明の培養組成物を保存する。
【００９５】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００９６】
実施例１：ホロトランスフェリン機能評価
（１）Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗｉｎｇ  ｎｅｕｒｏ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｌｉｋｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ（以下ＬｔＮＥＳ細胞）誘導法
ｉＰＳ細胞よりＥＢを形成し、４日間、Ｅ６培地（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からアスコルビン酸及びトランスフェリンを除いた組成に相当する培地にホロトランスフェリン（終濃度０．５〜１０μｇ／ｍｌ）、エタノールアミン（終濃度５〜５０μＭ）、ｂＦＧＦ（終濃度５〜１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地中にて、４日間で培養した。ポリＬオルニチン（ＰＯ）コートしたｄｉｓｈにＥＢを播種し、上記培地中で１０日程度培養し、Ｒｏｓｅｔｔｅ様の構造が形成されることを確認した。Ｒｏｓｅｔｔｅ部分をくり抜き、ニューロスフィアとして上記培地中で浮遊培養を７日程度行った。ニューロスフィアをトリプシン／ＥＤＴＡにて分散し、ＰＯ／ラミニンコートしたｄｉｓｈ上でＲＨＢ−Ａ培地中にて培養し、ＬｔＮＥＳ細胞を作成した。ＬｔＮＥＳ細胞は、神経幹細胞及び神経前駆細胞が混在したものである。
なお、上記Ｅ６培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６培地）については、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社ホームページ＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ａ１５１６４０１＞において、Ｅ８培地をベースとした製法で作られ、ｂＦＧＦとＴＧＦβを含まないことが記載されている。なお、Ｅ８培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地）については、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１  Ｍａｙ；８（５）：４２４−４２９）に記載されている。
また、上記Ｅ６培地の成分は、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  ２０１４  Ａｐｒ；３２（４），１０３２−４２の要約中にも記載されている。【００９７】
（２）ＬｔＮＥＳ細胞の培養法
ヒト多能性幹細胞より誘導したＬｔＮＥＳ細胞は、ＲＨＢ−Ａ培地、２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ中にて、３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養を行った。ＬｔＮＥＳ細胞の継代には、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ内で、３７℃、１分間インキュベートを行い、培地で希釈し、その後ピペッティングを行い、単一の細胞とした。１．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）で上記培地中に分散させた細胞を播種し３７℃、５％ＣＯ２環境下で培養を行った。細胞数測定は、トリパンブルー（ライフテクノロジーズ社）による死細胞染色を行った上で、血球計算盤で行った。【００９８】
（３）ホロトランスフェリン機能評価
Ｅ６培地（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からアスコルビン酸及びトランスフェリンを除いた組成に相当する培地に、アルブミン（終濃度０．５〜５ｍｇ／ｍｌ）、エタノールアミン（終濃度５〜５０μＭ）、ｂＦＧＦ（終濃度５〜１００ｎｇ／ｍｌ）を添加して、被検基礎培地を作成した。
被検基礎培地に、ホロトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を終濃度０、１．０、２．５、５、７．５μｇ／ｍｌとなるように添加した被検培地を作成した。
各被検培地を用い、ヒト多能性幹細胞より誘導したＬｔＮＥＳ細胞を培養した。細胞の培養は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベーター内で行った。２日に一度培地交換を行い、４〜５日間培養した。培養後、被検培地の代わりにＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃、１分間インキュベートして細胞分散処理を行った。ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを培地で希釈後、ピペッティングを行い、単一の細胞とし、細胞数をカウントし、評価した。細胞数測定は、トリパンブルー（ライフテクノロジーズ社）による死細胞染色を行った上で、血球計算盤で行った。
結果を図１に示す。２．５μｇ／ｍｌホロトランスフェリン添加培地、５μｇ／ｍｌホロトランスフェリン添加培地において細胞数が最も増加し、１μｇ／ｍｌホロトランスフェリン添加培地においても細胞は良好な増殖を示した。
尚、本実施例で用いたホロトランスフェリンの鉄含有量を測定したところ、トランスフェリンサンプル（１ｍｇ／ｍｌトランスフェリン）中の高分子体の鉄量は３８０ｐｐｂであった。トランスフェリン  １ｍｇ／ｍｌに対して結合できる鉄量（飽和）は、計算値では１４００ｐｐｂである。従って、本実施例で用いたホロトランスフェリンは、トランスフェリンに対する鉄結合率が約２７％であることがわかった。【００９９】
（４）培地中総鉄量分析
ホロトランスフェリン（Ｔｆ）の添加による神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の増殖促進が、鉄量の増加に依存するのか検討するため、各被検培地に含まれる鉄量の測定を行った。また、鉄以外のＭｎ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｓｅの量についても測定した。
各被検培地を希釈し、誘導結合プラズマ質量分析装置（以下、ＩＣＰ−ＭＳ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）に導入して、各元素を検出し、外部検量線法にて定量を実施した。
結果を表１に示す。【０１００】
【表１】
2016159177.tif 000002
【０１０１】
培地中に添加したホロトランスフェリンの量に依らず、培地中の鉄量はほぼ一定であった。鉄以外の金属についても、培地中に添加したホロトランスフェリンの量に寄らず、培地中の金属量はほぼ一定であった。【０１０２】
（５）形態別鉄量分析
次に培地に含有される鉄量を鉄の形態別に測定した。
培地中の形態別鉄量分析を行うため、ＳＥＣ−ＩＣＰ−ＭＳ（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を接続したＩＣＰ−ＭＳ、アジレントテクノロジー社）を行った。培地をサイズ排除クロマトグラフィーに導入し、溶離液をオンラインで結合したＩＣＰ−ＭＳにて分析した。ＩＣＰ−ＭＳにて各元素を検出し、外部検量線法にて定量を実施した。
結果を表２に示す。【０１０３】
【表２】
2016159177.tif 000003
【０１０４】
その結果、ホロトランスフェリン添加量に応じて高分子体の鉄が増加することが判明した。【０１０５】
実施例２：神経幹細胞及び神経前駆細胞の免疫組織化学染色
ホロトランスフェリン添加培地にて良好な増殖を示した細胞が神経幹細胞であることを免疫組織化学染色を行い実証した。
実施例１と同様に、終濃度２．５μｇ／ｍｌとなるようにホロトランスフェリンを添加した培地を作成し、実施例１と同様の条件で培養を行った。培養後、細胞を固定し、神経幹／前駆細胞マーカーであるネスチンに対する抗体及び神経幹細胞マーカーであるＳＯＸ２に対する抗体を用いて免疫染色を行った。結果を図３に示す。
培養皿上の細胞は、ほぼ全て細胞が神経幹細胞及び神経前駆細胞マーカーであるネスチン陽性であった。そのうちの大部分の細胞が神経幹細胞マーカーであるＳＯＸ２陽性であった。従って、実施例２において良好な増殖を示した細胞は、ネスチン陽性ＳＯＸ２陽性である神経幹細胞であることが示唆された。【０１０６】
実施例３：神経系細胞誘導【０１０７】
ホロトランスフェリン添加培地で培養した細胞が実際に分化し得ることを実証するため、分化誘導実験を行った。
実施例１と同様に、終濃度２．５μｇ／ｍｌとなるようにホロトランスフェリンを添加した培地を作成し、実施例１と同様の条件で培養を行った。培養後、培地の代わりにＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃、１分間インキュベートして細胞分散処理を行った。ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔを培地で希釈後、ピペッティングを行い、ポリＬオルニチン／フィブロネクチンでコートした４８ウェルプレートに１．５ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。Ｍｅｄｉａ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｍｉｘ培地に１ｘＢ２７サプリメントを添加した培地中で２０日間培養した。細胞の培養は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下のインキュベーター内で行った。培地交換は２日に一度行った。
培養後、細胞を固定し、神経細胞マーカーであるβＩＩＩチューブリンに対する抗体を用いた蛍光抗体法により免疫染色を行った。
分化誘導後の細胞には、βＩＩＩチューブリン陽性である分化した神経細胞が含まれていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明によれば、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞の未分化性及び複分化能を維持したまま細胞増殖を促進させることが可能となり、神経幹細胞及び／又は神経前駆細胞培養にかかる人的コスト及び金銭的コストを削減することができる。【０１０９】
ここで述べられた特許、特許出願明細書、科学文献を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。【０１１０】
本出願は、日本で出願された特願2015-069978（出願日：2015年3月30日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2016159177.tif 000004
【図２】
2016159177.tif 000005
【図３】
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【国際調査報告】
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2016159177.tif 000008
2016159177.tif 000009
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