(57)【要約】タンパク質と該タンパク質が分散している極性溶媒とを含有する分散液に圧力を印加して、タンパク質とタンパク質が溶解している極性溶媒とを含有するタンパク質溶液を得ることを含む、タンパク質溶液を製造する方法。
2017094722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質と該タンパク質が分散している極性溶媒とを含有する分散液に圧力を印加して、前記タンパク質と該タンパク質が溶解している前記極性溶媒とを含有するタンパク質溶液を得ることを含む、
タンパク質溶液を製造する方法。
【請求項２】
前記圧力が、０．０５ＭＰａ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記構造タンパク質が、フィブロイン、及びケラチンからなる群より選択される１種以上の構造タンパク質である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記構造タンパク質が、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン、及びホーネットシルクフィブロインからなる群より選択される１種以上のフィブロインである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記分散液を加熱しながら前記分散液に前記圧力が印加される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記極性溶媒が、水、アルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、及びヘキサフルオロアセトンからなる群より選択される１種以上の溶媒を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
クモ糸フィブロインと、該クモ糸フィブロインが溶解している極性溶媒と、を含有するタンパク質溶液であって、
前記極性溶媒に溶解している前記クモ糸フィブロインの濃度が、当該タンパク質溶液の質量を基準として１〜７０質量％である、タンパク質溶液。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法により、タンパク質と該タンパク質が溶解している極性溶媒とを含有するタンパク質溶液を得ることと、
前記タンパク質溶液から前記極性溶媒を除去して、前記タンパク質を含有する成形体を得ることと、
を含む、成形体を製造する方法。
【請求項１０】
タンパク質を含有する成形体に接触している極性溶媒に圧力を印加して、前記タンパク質と該タンパク質が溶解している前記極性溶媒とを含有するタンパク質溶液を得ることと、
前記タンパク質溶液から前記タンパク質を回収することと、
を含む、
成形体からタンパク質を再生する方法。
【請求項１１】
前記圧力が、０．０５ＭＰａ以上である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質が構造タンパク質である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記構造タンパク質が、フィブロイン、及びケラチンからなる群より選択される１種以上の構造タンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記構造タンパク質が、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン、及びホーネットシルクフィブロインからなる群より選択される１種以上のフィブロインである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記極性溶媒を加熱しながら前記極性溶媒に前記圧力が印加される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記極性溶媒が、水、アルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、及びヘキサフルオロアセトンからなる群より選択される１種以上の溶媒を含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質溶液を製造する方法に関する。本発明はまた、タンパク質溶液を用いて成形体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境保全意識の高まりから、石油由来の材料の代替物質の検討が進められており、強度などの点で優れる構造タンパク質がその候補として挙げられる。例えば、構造タンパク質からなるキャストフィルム、ファイバー等の成形体が提案されている。【０００３】
しかし、構造タンパク質は一般に疎水性の高分子であり、水などの極性溶媒に対する溶解性に乏しい。構造タンパク質の希薄溶液から溶媒を加熱溜去することで、濃縮されたタンパク質溶液を得ることも考えられるが、この操作は、タンパク質の変性、ゲル化、分解等が発生し、歩留まりの低下を招きうる。【０００４】
上記のような問題を解決するための方法として、特許文献１では、タンパク質水溶液を透析膜を介してポリエーテル系高分子又はポリオール系高分子水溶液に接触させることを特徴とするタンパク質水溶液の濃縮方法が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−０３６６７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載の濃縮方法の場合、タンパク質溶液を調製した後に、別途、透析工程等の独立した工程を設ける必要があり、製造工程が煩雑になる。より簡易な方法で、高濃度のタンパク質溶液を得ることが望ましい。【０００７】
そこで本発明は、透析等を要せず、高濃度のタンパク質溶液を容易に得ることが可能な方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、圧力下で溶液の調製を行うことで、タンパク質の変質等を抑制しつつ、より温和な条件でタンパク質溶液を得ることが可能であることを見出し、この知見に基づいて、本発明を完成するに至った。【０００９】
本発明の一側面は、タンパク質と該タンパク質が分散している極性溶媒とを含有する分散液に圧力を印加して、タンパク質と該タンパク質が溶解している極性溶媒とを含有するタンパク質溶液を得ることを含む、タンパク質溶液を製造する方法を提供する。【００１０】
この方法によれば、透析等の工程を経ずとも、高濃度のタンパク質溶液を容易に得ることができる。例えば、クモ糸フィブロインと、該クモ糸フィブロインが溶解している極性溶媒と、を含有するタンパク質溶液であって、極性溶媒に溶解しているクモ糸フィブロインの濃度が、当該タンパク質溶液の質量を基準として１５〜７０質量％である、タンパク質溶液を得ることができる。【００１１】
本発明の別の側面は、上記方法により、タンパク質と該タンパク質が溶解している極性溶媒とを含有するタンパク質溶液を得ることと、タンパク質溶液から極性溶媒を除去して、タンパク質を含有する成形体を得ることと、を含む、成形体を製造する方法を提供する。【００１２】
この方法によれば、高濃度のタンパク質溶液を用いて容易にタンパク質の成形体を製造することができる。【００１３】
本発明の更に別の側面は、タンパク質を含有する成形体に接触している極性溶媒に圧力を印加して、タンパク質と該タンパク質が溶解している極性溶媒とを含有するタンパク質溶液を得ることと、タンパク質溶液からタンパク質を回収することと、を含む、成形体からタンパク質を再生する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の一側面によれば、透析等を要せず、高濃度の構造タンパク質溶液を容易に得ることが可能な方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例４で得られたタンパク質溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。
【図２】実施例５で得られたタンパク質溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。
【図３】実施例１４〜１９で得られたタンパク質溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明のいくつかの実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１７】
タンパク質溶液を製造する方法の一実施形態は、タンパク質と該タンパク質が分散している極性溶媒とを含有する分散液を調製することと、分散液に圧力を印加して、タンパク質と該タンパク質が溶解している極性溶媒とを含有するタンパク質溶液を得ることとを含む。
【００１８】
タンパク質を含有する分散液に圧力を印加することにより、タンパク質の溶媒への溶解性を向上させることが可能である。その結果、透析等の工程を経ずとも、高濃度のタンパク質溶液を調製することができる。本発明者らは、タンパク質を含む溶液に圧力を加えることで、溶解性に劣るタンパク質のβシート若しくはαヘリックス等からなる結晶部分、又は水素結合により高密度に凝集した部分に溶媒が含浸し、これらの部分がほぐれ、結果としてタンパク質が溶解しやすくなるため、上記のような効果が得られたものと推察している。
【００１９】
タンパク質を含有する分散液は、粉末状又はその他の任意の形態のタンパク質を極性溶媒と混合して、調製することができる。分散液中に含まれるタンパク質の全量が極性溶媒中に分散している必要は必ずしもなく、タンパク質の一部が極性溶媒に溶解していてもよい。
【００２０】
分散液を調製するために用いられる極性溶媒は、例えば、水、アルコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡ）からなる群より選択される１種以上の溶媒を含んでいてもよい。より高濃度の溶液を得る観点からは、極性溶媒はジメチルスルホキシド単独、又はジメチルスルホキシドと水との混合溶媒であることができる。環境に対する悪影響を低減する観点からは、極性溶媒は水であることができる。より温和な条件でタンパク質溶液を得る観点からは、極性溶媒がアルコールを含んでいてもよい。例えば、極性溶媒が水とアルコールとの混合溶媒、ジメチルスルホキシドとアルコールとの混合溶媒、又は、水、アルコール及びジメチルスルホキシドの混合溶媒であってもよい。極性溶媒（又は混合溶媒）の全量に対するアルコールの割合は、５〜１００質量％、又は１０〜５０質量％であってもよい。アルコールを含む極性溶媒を用いると、より低圧でタンパク質を極性溶媒に溶解させることができる傾向がある。
【００２１】
本明細書において「アルコール」は、置換基を有していてもよい脂肪族基及び該脂肪族基に結合した水酸基からなる化合物を意味する。脂肪族基は、例えばフッ素原子等のハロゲン原子で置換されていてもよいし、無置換であってもよい。フッ素原子で置換された脂肪族基を有するフルオロアルコールの例としては、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）がある。
【００２２】
低い沸点を有するアルコールは、アルコール溶液の調製及びその濃縮、成形体の形成等の条件を温和なものとできる点で、特に有利である。係る観点から、アルコールの沸点は、例えば１気圧下で９９℃以下、５０℃以上であってもよい。アルコールの沸点は、１気圧下で６０℃以上であってもよい。また、一般に、１個の水酸基を有するアルコールは、２個以上の水酸基を有するアルコールよりも低い沸点を有する傾向がある。
【００２３】
アルコールの炭素数（脂肪族基の炭素数）は、特に制限されないが、１〜１０であってもよい。特に温和な条件でタンパク質溶液を得る観点からは、アルコールの炭素数は２〜８又は２〜５であってもよい。極性溶媒に含まれるアルコールは、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、及びこれらのアルコールの異性体からなる群より選択される１種以上の炭素数１〜１０のアルコールであってもよく、エタノール、プロパノール、ブタノール、及びこれらのアルコールの異性体からなる群より選択される１種以上の炭素数２〜５のアルコールであってもよく、エタノール、１−プロパノール、及び２−プロパノールからなる群より選択される１種以上のアルコールであってもよい。
【００２４】
タンパク質は、構造タンパク質であってもよい。構造タンパク質とは、生体内で構造、形態等を形成又は保持するタンパク質を意味する。構造タンパク質には、疎水性タンパク質、及び、極性溶媒中で自己凝集を起こしやすい傾向にあるポリペプチドが含まれる。これらの構造タンパク質は、一般に極性溶媒への溶解性が低いため、これらの構造タンパク質の溶液を製造するために、本実施形態の方法が特に有用である。
【００２５】
構造タンパク質は、フィブロイン、及びケラチンからなる群より選択される１種以上を含んでもよい。フィブロインは、例えば、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン、及びホーネットシルクフィブロインからなる群より選択される１種以上であってもよい。構造タンパク質は、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン又はこれらの組み合わせであってもよい。絹フィブロインとクモ糸フィブロインとを併用する場合、絹フィブロインの割合は、例えば、クモ糸フィブロイン１００質量部に対して、４０質量部以下、３０質量部以下、又は１０質量部以下であってもよい。
【００２６】
絹は、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の幼虫である蚕の作る繭から得られる繊維である。一般に、１本の繭糸は、２本の絹フィブロインと、これらを外側から覆うニカワ質（セリシン）とから構成される。絹フィブロインは多数のフィブリルで構成される。絹フィブロインは４層のセリシンで覆われる。実用的には、精錬により外側のセリシンを溶解して取り除いて得られる絹フィラメントが、衣料用途に使用されている。一般的な絹は、１．３３の比重、平均３．３ｄｅｃｉｔｅｘの繊度、及び１３００〜１５００ｍ程度の繊維長を有する。絹フィブロインは、天然若しくは家蚕の繭、又は中古若しくは廃棄のシルク生地を原料として得られる。
【００２７】
絹フィブロインは、セリシン除去絹フィブロイン、セリシン未除去絹フィブロイン、又はこれらの組み合わせであってもよい。セリシン除去絹フィブロインは、絹フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分などを除去して精製した絹フィブロインを、凍結乾燥して得られる粉末である。セリシン未除去絹フィブロインは、セリシンなどが除去されていない未精製のフィブロインである。
【００２８】
クモ糸フィブロインは、天然クモ糸タンパク質、及び、天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドからなる群より選ばれるクモ糸ポリペプチドを含有していてもよい。
【００２９】
天然クモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。大吐糸管しおり糸は、結晶領域と無定形領域からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つと推測される。クモ糸の横糸は結晶領域を持たず、無定形領域からなる繰り返し領域を持つことが大きな特徴である。一方、横糸は、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。これは横糸の大部分が無定形領域によって構成されているためだと考えられている。
【００３０】
大吐糸管しおり糸タンパク質はクモの大瓶状腺で産生され、強靭性に優れるという特徴を有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２、並びに二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３及びＡＤＦ４が挙げられる。ＡＤＦ３は、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、これらのしおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであってもよい。ＡＤＦ３に由来するポリペプチドは、比較的合成し易く、また、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。
【００３１】
横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｇｌａｎｄ）で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。
【００３２】
天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、組換えクモ糸タンパク質であってもよい。組換えクモ糸タンパク質としては、天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体等が挙げられる。このようなポリペプチドの好適な一例は、大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えクモ糸タンパク質（「大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチド」ともいう）である。
【００３３】
大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位（モチーフともいう。）を２以上、５以上、又は１０以上含んでいてもよい。式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位の数の上限は特に限定されないが、例えば３００以下、又は２００以下であってもよい。あるいは、大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドにおいて、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００３４】
式１において、ＲＥＰ１モチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は、通常８３％以上であり、８６％以上、９０％以上又は９５％以上であってもよい。ＲＥＰ１は、アラニン残基数の比率が１００％であるポリアラニンであってもよい。ＲＥＰ１において連続して並んでいるアラニン（Ａｌａ）は、２残基以上、３残基以上、４残基以上、又は５残基以上であってもよい。ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２０残基以下、１６残基以下、１２残基以下、又は１０残基以下であってもよい。ＲＥＰ１モチーフは、アラニン（Ａｌａ）の他、セリン（Ｓｅｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ）等から選ばれる他のアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【００３５】
式１において、ＲＥＰ２は、１０〜２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、アミノ酸配列中に含まれるグリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン（Ｇｌｎ）及びアラニン（Ａｌａ）の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、６０％以上、又は７０％以上であってもよい。
【００３６】
大吐糸管しおり糸において、ＲＥＰ１は、繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、ＲＥＰ２は、繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。［ＲＥＰ１−ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域とからなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。
【００３７】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一である。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
【００３８】
式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドは、例えば、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることができる。配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）において、翻訳が第５４３番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。
【００３９】
式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドは、配列番号７に示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域とからなる繰り返し領域を有するタンパク質であることができる。本明細書において、「１又は複数個」とは、例えば、１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、及び、１又は数個から選ばれる範囲を意味する。本明細書において、「１又は数個」は、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個を意味する。
【００４０】
式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドは、配列番号８に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ４由来の組換えタンパク質であってもよい。配列番号８に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ４の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１１、ＧＩ：１２６３２８９）のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したものである。
【００４１】
式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドは、配列番号８に示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域とからなる繰り返し領域を有するポリペプチドであることができる。
【００４２】
式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドは、配列番号９に示されているアミノ酸配列を有するＭａＳｐ２由来の組換えタンパク質であってもよい。配列番号９に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＭａＳｐ２の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＴ７５３１３、ＧＩ：５０３６３１４７）のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したものである。
【００４３】
式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドは、配列番号９に示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域とからなる繰り返し領域を有するポリペプチドであることができる。
【００４４】
横糸タンパク質に由来するポリペプチドは、式２：ＲＥＰ３（２）で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上、２０以上、又は３０以上含んでいてもよい。式２：ＲＥＰ３（２）で示されるアミノ酸配列の単位の数の上限は特に限定されないが、例えば３００以下、又は２００以下であってもよい。
【００４５】
式２において、ＲＥＰ３はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘから構成されるアミノ酸配列を意味し、Ｘはアラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）からなる群から選ばれる一つのアミノ酸を意味する。
【００４６】
式２：ＲＥＰ３（２）で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上含むポリペプチドは、例えば、配列番号１０に示されているアミノ酸配列を有する鞭毛状絹タンパク質に由来の組換えタンパク質であることができる。配列番号１０に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したアミノ酸配列である。
【００４７】
式２：ＲＥＰ３（２）で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上含むポリペプチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、無定形領域からなる繰り返し領域を有するポリペプチドであることができる。
【００４８】
タンパク質又はポリペプチドの分子量は、大腸菌等の微生物を宿主とした組み換えタンパク質生産を行う場合の生産性の観点から、５００ｋＤａ以下、３００ｋＤａ以下、２００ｋＤａ以下又は１００ｋＤａ以下であってもよく、１０ｋＤa以上であってもよい。
【００４９】
ホーネットシルクフィブロインは、蜂の幼虫が産生するタンパク質であり、天然ホーネットシルクタンパク質、及び、天然ホーネットシルクタンパク質に由来するポリペプチドからなる群より選ばれるポリペプチドを含有していてもよい。
【００５０】
ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。
【００５１】
ポリペプチドをコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然型クモ糸タンパク質の場合、タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質、をコードする遺伝子を合成してもよい。
【００５２】
発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつそれ自体が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば、宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることができる。宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。
【００５３】
絹糸フィブロイン、及びクモ糸フィブロイン等の上述の構造タンパク質と、その他のタンパク質との組み合わせを、分散液及びこれから得られるタンパク質溶液が含んでいてもよい。その他のタンパク質としては、例えば、コラーゲン、大豆タンパク質、カゼイン、ケラチン、及び乳清タンパク質が挙げられる。その他のタンパク質を構造タンパク質と併用することにより、タンパク質に由来する物性を調製することができる。その他のタンパク質の割合は、例えば、構造タンパク質１００質量部に対して、４０質量部以下、３０質量部以下、又は１０質量部以下であってもよい。
【００５４】
分散液におけるタンパク質の濃度は、分散液の質量を基準として、１質量％以上、１５質量％以上、３０質量％以上、４０質量％以上、又は５０質量%以上であることができる。タンパク質溶液の製造効率の観点から、タンパク質の濃度は、分散液又はタンパク質溶液の質量を基準として、７０質量％以下、６５質量％以下、又は６０質量％以下であることができる。
【００５５】
分散液は、１種又は２種以上の無機塩を更に含有してもよい。分散液に無機塩を加えることにより、加圧による溶解性向上の効果がより一層顕著なものとなり得る。無機塩は、例えば、以下に示すルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩が挙げられる。ルイス塩基は、例えば、オキソ酸イオン(硝酸イオン、過塩素酸イオン等)、金属オキソ酸イオン(過マンガン酸イオン等)、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオンなどであってもよい。ルイス酸は、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオンなどであってもよい。無機塩の具体例としては、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウムのようなリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウムのようなカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄のような鉄塩、並びに、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウムのようなカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウムのようなナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛のような亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウムのようなマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウムのようなバリウム塩、塩化ストリンチウム、臭化ストリンチウム、ヨウ化ストリンチウム、硝酸ストリンチウム、過塩素酸ストリンチウム、及びチオシアン酸ストリンチウムのようなストリンチウム塩などが挙げられる。無機塩の濃度は、タンパク質の全量を基準として、１．０質量％以上、５．０質量％以上、９．０質量％以上、１５質量％以上又は２０．０質量％以上であることができる。無機塩の濃度はまた、タンパク質の全量を基準として、４０質量％以下、３５質量％以下又は３０質量％以下であってもよい。
【００５６】
分散液及びタンパク質溶液は、必要に応じて、各種の添加剤を含有することができる。添加剤としては、例えば、可塑剤、結晶核剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、着色剤、フィラー、及び合成樹脂が挙げられる。添加剤の濃度は、タンパク質の全量を基準として、５０質量％以下であってもよい。
【００５７】
タンパク質と極性溶媒とを含有する分散液に対して所定の圧力を印加して、極性溶媒にタンパク質を溶解させることで、タンパク質溶液が生成する。分散液に圧力を印加することにより、比較的低温であっても、タンパク質を極性溶媒に溶解させることが可能である。そのため、タンパク質の変質、ゲル化、分解の誘発をさせることを抑制しつつ、高濃度の溶液を製造することができる。さらに、透析等を用いた濃縮工程を必ずしも必要としないことから、タンパク質溶液の生産性を高めることも可能である。
【００５８】
分散液に印加される圧力は、タンパク質及び極性溶媒の種類、所望の濃度等に応じて、タンパク質が極性溶媒に適切に溶解するように調整される。分散液に印加される圧力が高いと、より高濃度の溶液が得られ易い。この観点から、分散液に印加される圧力は０．０５ＭＰａ以上、０．０６ＭＰａ以上、０．０７ＭＰａ以上、０．０８ＭＰａ以上、０．１ＭＰａ以上、１．０ＭＰａ以上、５．０ＭＰａ以上、又は１０ＭＰａ以上であることができる。分散液に印加される圧力は、３００ＭＰａ以下、１５０ＭＰａ以下、５０ＭＰａ以下、又は３０ＭＰａ以下であることができる。
【００５９】
分散液に圧力を印加する方法は、特に制限されない。例えば、分散液を収容した耐圧容器内に、窒素、アルゴン等の不活性ガス、又は空気を封入して耐圧容器内の圧力を加熱等によって調整することにより、分散液に圧力を印加することができる。
【００６０】
分散液を加熱しながら分散液に圧力を印加してもよい。加熱は、圧力を印加している間に限られず、例えば、分散液を所定の温度に加熱してから分散液に圧力を印加してもよい。タンパク質の分解をより抑制する観点から、加熱温度は、１５０℃以下、１４０℃以下、１３５℃以下、又は１３０℃以下であってもよい。極性溶媒が水の場合、水が介在するタンパク質の分解をより抑制する観点から、加熱温度が１４０℃以下であることが望ましい。より高濃度の溶液を得る観点から、加熱温度は、７０℃以上、９０℃以上、又は１００℃以上であってもよい。これら上限及び下限を任意に組み合わせることができる。例えば、加熱温度が７０℃以上１５０℃以下、９０℃以上１４０℃以下、又は１００℃以上１３０℃以下であってもよい。加熱温度は、一定の温度であってもよいし、変動してもよい。
【００６１】
分散液を攪拌しながら分散液に圧力を印加してもよい。攪拌は、圧力を印加している間に限られず、圧力を印加する前後に分散液を攪拌してもよい。攪拌の方法は特に制限されるものではない。例えば、傾斜翼、タービン翼等により分散液を攪拌することができる。
【００６２】
加圧後に得られたタンパク質溶液は、加圧用のガスを含んでいることがある。そのため、一実施形態に係るタンパク質溶液の製造方法は、タンパク質溶液からガスを除去することを更に含んでいてもよい。ガスを除去する方法は特に制限されないが、例えば、遠心分離器によす方法が挙げられる。タンパク質溶液を遠心分離器にかけることにより、ガスが比較的多量に含まれる層を除去することが可能である。
【００６３】
一実施形態の方法により得られるタンパク質は、極性溶媒に高濃度で溶解しているタンパク質を含むことができる。タンパク質溶液中で極性溶媒に溶解しているタンパク質の濃度は、分散液における濃度と同様であることができる。具体的には、極性溶媒に溶解しているタンパク質の濃度は、タンパク質溶液の質量を基準として、１質量％以上、１５質量％以上、３０質量％以上、４０質量％以上又は５０質量％以上であることができ、７０質量％以下、６５質量％以下、又は６０質量％以下であることができる。
【００６４】
タンパク質を高濃度で含むタンパク質溶液は、例えば、各種の方法でタンパク質の成形体を製造するために用いることができる。一実施形態に係る成形体を製造する方法は、タンパク質溶液から極性溶媒を除去して、タンパク質を含有する成形体を得ることを含むことができる。この方法によれば、成形体を製造する過程で除去する溶媒の量を削減できることから、生産コストを低減することが可能である。特に、クモ糸フィブロインを高濃度で含有するタンパク質溶液は、クモ糸フィブロインの特性を生かした優れた物性を有する成形体を製造するために用いることができる。
【００６５】
例えばタンパク質溶液をドープ溶液として用いて、ゲル、フィルム、ファイバー等の成形体を製造することができる。フィルムは、例えば、タンパク質溶液（ドープ溶液）の膜を形成し、形成された膜から極性溶媒を除去する方法により製造できる。ファイバーは、例えば、タンパク質溶液を紡糸し、紡糸されたタンパク質溶液から極性溶媒を除去する方法により製造できる。
【００６６】
上述のタンパク質溶液を製造する方法を利用して、成形体を形成しているタンパク質を再生することもできる。成形体からタンパク質を再生する方法の一実施形態は、タンパク質を含有する成形体に接触している極性溶媒に圧力を印加して、タンパク質と該タンパク質が溶解している極性溶媒とを含有するタンパク質溶液を得ることと、タンパク質溶液からタンパク質を回収することとを含むことができる。
【００６７】
タンパク質を再生する方法で用いる極性溶媒及びそこに添加され得る材料は、タンパク質溶液を製造する上述の方法と同様に選択することができる。成形体を極性溶媒に浸漬し、極性溶媒に圧力を印加してもよい。あるいは、粉砕等により微粒子化した成形体を極性溶媒に分散させて分散液を調製し、その分散液に圧力を印加してもよい。圧力及び加熱等の条件は、タンパク質溶液を製造する上述の方法と同様に設定することができる。
【００６８】
タンパク質溶液からタンパク質を回収する方法は、特に限定されず、タンパク質溶液から極性溶媒を除去する方法、再沈殿等の通常の方法を適用することができる。成形体から溶出させたタンパク質を含むタンパク質溶液から、粉末状等の任意の形態のタンパク質を回収してもよいし、上述の方法により成形体を直接製造してもよい。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。【００７０】
＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなる（配列番号４）を付加したアミノ酸配列（配列番号５）、をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成委託した。その結果、配列番号６で示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。【００７１】
（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲの遺伝子の合成
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉのアミノ酸配列（配列番号５）における第５４３番目のアミノ酸残基バリン（Ｖａｌ）に対応するコドンＧＴＧを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号１１に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲの遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲのアミノ酸配列は配列番号７で示すとおりである。【００７２】
＜タンパク質の発現＞
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲの遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍＬを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬと共に加え、ＯＤ６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトビラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズのバンドが観察され、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲのタンパク質を発現している大腸菌を冷凍庫（−２０℃）で保存した。【００７３】
＜クモ糸ポリペプチドの調製例＞
（Ｉ）遠沈管（５０ｍＬ）に、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲのタンパク質を発現している大腸菌の菌体約４．５ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３０ｍＬを添加し、ミキサー（ＧＥ社製「ＳＩ−０２８６」、レベル１０）で菌体を分散させた後、遠心分離機（トミー精工製の「ＭＸ−３０５」）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（ＩＩ）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３０ｍＬと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を０．３ｍＬ添加し、上記ＧＥ社製のミキサー（レベル１０）で３分間分散させた。その後、超音波破砕機（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳＩＮＣ製「ＶＣＸ５００」）を用いて菌体を破砕し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）した。
（ＩＩＩ）遠心分離で得られた沈殿物に緩衝液ＡＩを３０ｍＬ加え、ミキサー（ＩＫＡ社製「Ｔ１８ベーシック  ウルトラタラックス」、レベル２）で３分間分散させた後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を除去した。
（ＩＶ）上清を捨てた遠沈管に７．５Ｍの尿素緩衝液Ｉ（７．５Ｍ尿素、１０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）を加え、上記ＳＭＴ社製の超音波破砕機（レベル７）で沈殿を良く分散させた。その後、上記タイテック社製のシェイカー（２００ｒｐｍ、６０℃）で１２０分間溶解させた。溶解後のタンパク質溶液を上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００×ｇ、１０分、室温）し、上清を透析チューブ（三光純薬株式会社セルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分をのぞき、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲの精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＣＢＢ染色）の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＡＤＦ３Ｋａｉ−ｎｏＮＲの精製度は約８５％であった。【００７４】
（実施例１〜７、比較例１〜３）
＜クモ糸ポリペプチドの溶解試験＞
上記「クモ糸ポリペプチドの調製例」で得られた、クモ糸ポリペプチド（クモ糸フィブロイン）の凍結乾燥粉末（分子量：６０ｋＤａ）と、水又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とを表１に示す割合（質量部）で混合して、クモ糸ポリペプチドが水中に分散している分散液を調製した。表１に示すように、一部の分散液には塩化リチウムを加えた。得られた分散液を耐圧容器に入れ、耐圧容器を、密閉してから容器内温度が９０℃になるように加熱した。さらに耐圧容器内に窒素を導入して、容器内の圧力が１．０〜１０ＭＰａの所定の圧力となるように調整し、分散液に圧力を印加した。２時間経過したところで加圧を中止し、耐圧容器を２５℃まで冷却した。その後、ポリペプチドの溶解の状態を目視で観察し、下記基準に従って溶解性を評価した。結果を表１に示す。
Ａ：ポリペプチドがすべて溶解した。
Ｂ：ポリペプチドの溶け残りがわずかに観察された。
Ｃ：ポリペプチドが溶けなかった。【００７５】
＜ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析＞
クモ糸ポリペプチドの溶解が確認された溶液について、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行った。電気泳動の結果を下記条件で画像解析することにより、溶解したポリペプチドの分解の状態を確認した。結果を表１に示す。表１中、「Ａ」は溶液中の大部分の構造タンパク質が分解していなかったことを示し、「Ｃ」は溶液中の大部分の構造タンパク質が分解していたことを示す。【００７６】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析条件］
電源装置：ＰｏｗｅｒＰａｃｔｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）
画像解析システム：Ｇｅｌ  Ｄｏｃｔｍ  ＥＺ  Ｉｍａｇｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）
泳動用ゲル：Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（Ｒ）  ＴＧＸＴＭ  Ｇｅｌｓ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）
分子量マーカー：ＸＬ−Ｌａｄｄｅｒ（ＡＰＲＯ  ＳＣＯＥＭＣＥ製）
固定液：ＮｏｖｅｘＴＭ  ＩｎＶｉｓｉｏｎＴＭ  Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ｉｎ−Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）
染色剤：ＯｒｉｏｌｅＴＭ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（ＢＩＯ−ＲＡＤ製）【００７７】
図１及び図２は、それぞれ、実施例４及び実施例５で得られたタンパク質溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果である。図中の「Ｒ」は、クモ糸ポリペプチドの凍結乾燥粉末を水に浸漬した後、乾燥して準備したサンプルによる参照試験を示す。発色の強さの比較から求められるクモ糸ポリペプチドの残存度合いは、実施例４の場合に８３％程度、実施例５の場合  に１００％程度であった。【００７８】
（実施例８〜１３、比較例４）
＜絹フィブロインの溶解試験＞
Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ由来の絹フィブロイン（ｆｉｂｒｏｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  Ｆｉｂ−Ｈ［Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ］、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＦ７６９８３。以下、単に「絹フィブロイン」ともいう。理論分子量：３９１．５ｋＤａ）と、水とを表２に示す割合（質量部）で混合して、絹フィブロインが水中に分散している分散液を調製した。表２に示すように、一部の分散液には塩化リチウムを加えた。得られた分散液を耐圧容器に入れ、耐圧容器を、密閉してから容器内温度が９０℃になるように加熱した。さらに耐圧容器内に窒素を導入して、容器内の圧力が１．０〜１０ＭＰａの所定の圧力となるように調整し、分散液を加圧した。４８時間経過したところで加圧を中止し、耐圧容器を２５℃まで冷却した。その後、絹フィブロインの溶解の状態を目視で観察し、クモ糸フィブロインと同様の基準にて溶解性を評価した。結果を表２に示す。絹フィブロインは分子量が大きいため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析が困難であった。【００７９】
【表１】
2017094722.tif 000003
【００８０】
【表２】
2017094722.tif 000004
【００８１】
表１及び表２に示されるように、構造タンパク質が分散している分散液に圧力を印加することで、構造タンパク質が高濃度で溶解しているタンパク質溶液が得られることが確認された。【００８２】
（実施例１４〜１９）
＜クモ糸ポリペプチドの溶解試験２＞
（１）改変フィブロインをコードする核酸の合成、及び発現ベクターの構築
天然由来のクモ糸フィブロインであるＮｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号１２及び１３でそれぞれ示されるアミノ酸配列を有する改変フィブロインを設計した。
配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、上記天然由来のフィブロインから出発して、その（Ａ）ｎモチーフ中のアラニン残基が連続するアミノ酸配列をアラニン残基が連続する数が５つになるよう欠失させ、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）ｎモチーフ（（Ａ）５）を欠失させ、Ｃ末端配列の手前に［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］を１つ挿入し、ＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号１３で示されるアミノ酸配列はこの配列番号１２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１４で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）を付加したものである。【００８３】
配列番号１２で示されるアミノ酸配列のＮ末端にＨｉｓタグ配列及びヒンジ配列（配列番号１４）を付加した配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト、終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。【００８４】
（２）タンパク質の発現
配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。同培養液をアンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表３）にＯＤ６００が０．００５となるように添加して、形質転換大腸菌を植菌した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。【００８５】
【表３】
2017094722.tif 000005
【００８６】
当該シード培養液を５００ｍｌの生産培地（表４）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加して形質転換大腸菌を植菌した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。【００８７】
【表４】
2017094722.tif 000006
【００８８】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍｌ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするタンパク質の発現を確認した。【００８９】
（３）タンパク質の精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ  グアニジン緩衝液（８Ｍグアニジン塩酸塩、１０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。【００９０】
得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、タンパク質の精製度は約８５％であった。【００９１】
（４）溶解試験
上記で得られた、クモ糸ポリペプチド（クモ糸フィブロイン）の凍結乾燥粉末（分子量：５０ｋＤａ）と、水、エタノール、プロパノール、ブタノール又はクリンソルブＰ−７（エタノール８５．５±１．０％、イソプロパノール５．０％未満、ノルマルプロパノール９．６±０．５％、及び水分０．２％以下を含有する混合溶媒、「クリンソルブ」は日本アルコール販売株式会社の登録商標である。）とを、表５に示す割合（質量部）で混合して、クモ糸ポリペプチドが液中に分散している分散液を調製した。得られた分散液を耐圧容器に入れ、密閉してから容器内温度が９０〜１００℃の所定の温度に保持されるように断続的に加熱した。容器内温度を９０〜１００℃まで上げることで分散液中の溶媒が蒸発し、容器内の圧力が上昇して分散液に０．０８〜０．１ＭＰａの圧力（計算値）が印加される。加熱を開始してから２５分間容器内温度を９０〜１００℃に保持したのち、ポリペプチドの溶解の状態を目視で観察し、下記基準に従って溶解性を評価した。結果を表５に示す。
Ａ：ポリペプチドがすべて溶解した。
Ｂ：ポリペプチドの溶け残りがわずかに観察された。
Ｃ：ポリペプチドが溶けなかった。【００９２】
（５）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析
クモ糸ポリペプチドの溶解が確認された溶液について、実施例１〜７と同様の条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行い、溶解したポリペプチドの分解の状態を確認した。図３は、実施例１４〜１９で得られたタンパク質溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果である。結果を表５に示す。表５中、「Ａ」は溶液中の大部分の構造タンパク質が分解していなかったことを示す。いずれの実施例においても、タンパク質の分解を抑制しながらタンパク質溶液が得られた。【００９３】
【表５】
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【００９４】
表５に示されるように、構造タンパク質が分散している分散液に圧力を印加することで、構造タンパク質が高濃度で溶解しているタンパク質溶液が得られることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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