(57)【要約】  反応時に系中に成分を補完する必要がなく、室温で安定に保存可能な乾燥形態のアンモニウム塩含有酵素反応試薬を提供する。  アンモニウム塩に由来する乾燥時の緩衝剤のｐＨ変化を、グッド緩衝剤を用いることにより抑制する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも緩衝剤、アンモニウム塩、及び酵素から成る生化学的反応試薬における、乾燥時の酵素活性低下を抑えるためのグッド緩衝剤の使用。
【請求項２】
乾燥試薬組成物の製造方法であって、
a) ２．５ｍＭを超える濃度のグッド緩衝剤、アンモニウム塩、乾燥保護剤、及び核酸増幅酵素を含む試薬溶液の調製工程、
b) a)で調製した試薬溶液の乾燥工程
を含む、乾燥試薬組成物の製造方法。
【請求項３】
前記グッド緩衝剤の濃度が５ｍＭ以上であることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記グッド緩衝剤が、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、およびＴｒｉｃｉｎｅからなる群のうち少なくとも１つである、請求項２または３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記グッド緩衝剤が、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、およびＴｒｉｃｉｎｅからなる群のうち少なくとも１つである、請求項２〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記グッド緩衝剤が、ＢｉｃｉｎｅまたはＴｒｉｃｉｎｅである、請求項２〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
前記アンモニウム塩が硫酸アンモニウムである、請求項２〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
前記乾燥保護剤が、糖類、界面活性剤、水溶性ポリマー、タンパク質からなる群のうち少なくとも１つである、請求項２〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
請求項２〜８のいずれかに記載の製造方法で得られる核酸増幅反応用乾燥試薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質の保存方法およびそのための試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、酵素反応の高い特異性を活かした様々な検査方法や診断方法が開発され、その一部は製品として世の中に普及している。一般的に、酵素反応は緩衝液や金属塩、基質、補酵素などから成る複雑な組成をしているため、検査や診断の際に反応溶液を用時調製するのは煩雑な作業である。そこで反応溶液の調製を簡便化するために、反応に必要な試薬類を予め混合しておくという方法がある。液状形態のプレミックス試薬は検体を添加するだけで使用でき、簡便性が高い。しかし酵素は希釈溶液の状態で長期間保存すると失活してしまう場合が多く、低温で１年程度の品質保証期限となっている。一方、乾燥形態のプレミックス試薬は使用時に溶解する必要があるものの、溶解液の種類や分量を任意に選択することができるため、用途展開の幅が広い。また軽量で輸送しやすく、常温で長期間安定に保存することが可能である。【０００３】
酵素反応の中でもよく知られたものの一つに、ポリメラーゼによる配列特異的な核酸合成反応がある。ＰＣＲに代表される核酸増幅法はこの反応を利用しており、学術研究の場のみならず、遺伝子検査などにも活用されている。遺伝子検査試薬の中には、検体を添加するだけで反応が開始できるものもあり、乾燥試薬の場合には室温で長期間安定に保存できるものも存在する。【０００４】
核酸増幅反応の中には反応を最適化するためにアンモニウム塩を含むものが少なくない。例えば、等温増幅法であるＬＡＭＰ法やＳｍａｒｔＡｍｐ法に使用されるＢｓｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼやＡａｃ  ＤＮＡ  ポリメラーゼなどは一般的に反応溶液中に硫酸アンモニウムを含んでいる（非特許文献１、２）。【０００５】
しかし、このようなアンモニウム塩を含む試薬を凍結乾燥すると、乾燥直後であっても再溶解した反応溶液の酵素活性が著しく低下することが以前から知られている。この問題に対し、酵素と緩衝剤またはその成分とアンモニウム塩とを接触させない、ないしは高濃度で接触させない状態で凍結乾燥し、反応時に混合するという手法が提案されている（特許文献１）。しかし製品形態に制約を課す可能性があるため、反応前に分離しておく必要の無い乾燥形態のアンモニウム塩含有酵素反応試薬は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−１２９７２７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎｏｔｏｍｉ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２８，  ２０００，  ｅ６３
【非特許文献２】Ｍｉｔａｎｉ  ｅｔ．ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ４，  ２００７，  ２５７−２６２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、上記従来技術の問題を解消し、反応時に系中に成分を補完する必要がなく、室温で安定に保存可能な乾燥形態のアンモニウム塩含有酵素反応試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、アンモニウム塩を含む試薬を乾燥して再溶解する際に生じる酵素活性の低下を、グッド緩衝剤を用いることで抑制できることを見出し、本方法及び本試薬を発明した。【００１０】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
（１）少なくとも緩衝剤、アンモニウム塩、及び酵素から成る生化学的反応試薬における、乾燥時の酵素活性低下を抑えるためのグッド緩衝剤の使用。
（２）乾燥試薬組成物の製造方法であって、
a) ２．５ｍＭを超える濃度のグッド緩衝剤、アンモニウム塩、乾燥保護剤、及び核酸増幅酵素を含む試薬溶液の調製工程、
b) a)で調製した試薬溶液の乾燥工程
を含む、乾燥試薬組成物の製造方法。
（３）前記グッド緩衝剤の濃度が５ｍＭ以上であることを特徴とする、（２）に記載の製造方法。
（４）前記グッド緩衝剤が、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＣＨＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、およびＴｒｉｃｉｎｅからなる群のうち少なくとも１つである、（２）または（３）に記載の製造方法。
（５）前記グッド緩衝剤が、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、およびＴｒｉｃｉｎｅからなる群のうち少なくとも１つである、（２）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）前記グッド緩衝剤が、ＢｉｃｉｎｅまたはＴｒｉｃｉｎｅである、（２）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）前記アンモニウム塩が硫酸アンモニウムである、（２）〜（６）のいずれかに記載の製造方法。
（８）前記乾燥保護剤が、糖類、界面活性剤、水溶性ポリマー、タンパク質からなる群のうち少なくとも１つである、（２）〜（７）のいずれかに記載の製造方法。
（９）（２）〜（８）のいずれかに記載の製造方法で得られる核酸増幅反応用乾燥試薬組成物。【００１１】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-095535号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、反応時に系中に成分を補完する必要がなく、室温で安定に保存可能な乾燥形態のアンモニウム塩含有酵素反応試薬を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明におけるグッド緩衝剤とは、緩衝剤のなかでも特に、両性イオン構造を分子内に有する化合物を含む緩衝剤を指し、その特徴的性質としては、化学的に安定であり、酸解離平衡がイオン組成の影響を受けにくい、あるいはまた、金属イオンとの錯形成能が小さいこと等が挙げられるが、これらと同様の性質を示すものであれば限定されない。
【００１４】
本発明におけるグッド緩衝剤は、好ましくは、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｂｉｃｉｎｅ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ）、ＣＨＥＳ（Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＤＩＰＳＯ（３−［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＥＰＰＳ（３−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＨＥＰＰＳＯ（２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＭＯＰＳ（３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＯＰＳＯ（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＴＡＰＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＴＡＰＳＯ（２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｎ−ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ），およびＴｒｉｃｉｎｅ（Ｎ−［Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎｅ）からなる群のうち少なくとも１つ、より好ましくは、ＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、およびＴｒｉｃｉｎｅからなる群のうち少なくとも１つであり、さらに好ましくは、Ｂｉｃｉｎｅ、およびＴｒｉｃｉｎｅである。本発明においてグッド緩衝剤は水和物、塩等の種々の形態のものを使用することができる。例えば、ＨＥＰＰＳＯとして２−Ｈｙｄｒｏｘｙ−３−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，  ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅを使用することができ、ＰＯＰＳＯとしてＰｉｐｅｒａｚｉｎｅ−１，４−ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，  ｄｉｈｙｄｒａｔｅを使用することができる。
【００１５】
本発明で用いられるグッド緩衝剤の濃度は、２．５ｍＭを超える値となるように設定することが好ましい。より好ましくは、５ｍＭ以上に設定すると良い。そうすることで、酵素活性維持の十分な緩衝効果を得ることができる。一方、この値が２．５ｍＭを下回ると酵素活性維持の十分な緩衝効果が得られない可能性がある。その場合、酵素活性を回復させるために反応前に試薬を追加する必要が生じうるが、例えば核酸増幅反応において、このような試薬追加の工程はコンタミネーションのリスクを増大させる危険性が高い。加えて、工程追加は製造コストの増加につながる。
【００１６】
また本発明で用いられるグッド緩衝剤の濃度は、１２５ｍＭ以下に設定するのが好ましい。１２５ｍＭを超えると、酵素反応が阻害を受ける可能性がある。
【００１７】
本発明で用いられるグッド緩衝剤のｐＨは、用いられる酵素の種類により様々であり、上記の個々の緩衝剤における緩衝域の範囲内であれば特に限定されないが、好ましくはｐＨ７．０以上、より好ましくはｐＨ７．５以上、より好ましくはｐＨ８．０以上であり、好ましくはｐＨ１０．０以下、より好ましくはｐＨ９．５以下、より好ましくはｐＨ９．０以下であり、具体的には、好ましくはｐＨ７．０〜１０．０、より好ましくはｐＨ７．５〜９．５、最も好ましくはｐＨ８．０〜９．０である。
【００１８】
本発明で用いられるアンモニウム塩は、安息香酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ギ酸アンモニウム、クエン酸三アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、クエン酸二水素アンモニウム、酢酸アンモニウム、臭化アンモニウム、酒石酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、シュウ酸アンモニウム、チオシアン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸二水素アンモニウムなどが好ましく、より好ましくは硫酸アンモニウムである。
【００１９】
本発明で用いられるアンモニウム塩の濃度は特に限定されないが、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましく２ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上であり、好ましくは５０ｍＭ以下、より好ましくは４０ｍＭ以下、より好ましくは２５ｍＭ以下であり、具体的には、好ましくは１〜５０ｍＭ、より好ましくは２〜４０ｍＭ、最も好ましくは５〜２５ｍＭである。この数値範囲外になると、酵素活性を向上させる効果が十分に得られなくなる可能性がある。
【００２０】
本発明で用いられる酵素は、アンモニウム塩の存在によって乾燥時に酵素活性低下が懸念される酵素であれば特に限定されない。例えば、ＰＣＲや等温増幅法といった核酸増幅反応に用いられる核酸増幅酵素もその一種である。具体的には、Ａａｃ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Ｔｆ１  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡ  ポリメラーゼなどのＤＮＡ  ポリメラーゼがその一例である。なお、これらの核酸増幅酵素は逆転写能を有していても良い。
【００２１】
本発明に用いられる酵素の濃度は目的とする反応が進む限りにおいて特に限定されないが、例えば核酸増幅反応においては、０．０１Ｕ以上または１００Ｕ以下が好ましく、０．１Ｕ以上または５０Ｕ以下がさらに好ましく、１Ｕ以上または１０Ｕ以下が最も好ましい。
【００２２】
本発明における生化学的反応試薬の乾燥していない状態でのグッド緩衝剤の濃度、グッド緩衝剤のｐＨ、アンモニウム塩の濃度、酵素の濃度は、それぞれ、上記の範囲から選択することが好ましい。同様に、本発明における試薬溶液の調製工程により調製される試薬溶液でのグッド緩衝剤の濃度、グッド緩衝剤のｐＨ、アンモニウム塩の濃度、酵素の濃度は、それぞれ、上記の範囲から選択することが好ましい。
【００２３】
本発明における生化学的反応試薬とは、ポリメラーゼによる核酸増幅反応、リガーゼによるライゲーション反応、抗体抗原反応、キナーゼによるリン酸化反応、アルキル基転移酵素によるアルキル化反応、ヌクレアーゼによる核酸分解反応、DNA相同組換え反応、プロテアーゼによるタンパク質分解反応を行う試薬が好ましく、より好ましくはポリメラーゼによる核酸増幅反応を行う試薬である。
【００２４】
本発明における試薬溶液の調製工程は、グッド緩衝剤、アンモニウム塩、乾燥保護剤、及び核酸増幅酵素などを溶媒に溶解させる工程を意味する。溶媒としては水が好ましく、水としては蒸留水または脱イオン水が好ましく、滅菌蒸留水、滅菌脱イオン水がさらに好ましい。なお、本工程は低温で行うのが一般的であるが、工程の温度を調整してもよいし、工程を行う室内などの空間を低温に調整してもよい。
【００２５】
本発明における乾燥工程は、真空乾燥、凍結乾燥、熱風乾燥、または噴霧乾燥などの手段で行うのが好ましく、より好ましい手段は凍結乾燥である。凍結乾燥は一般的な凍結乾燥装置を用いればよく、その条件は一般的な範囲で適宜決定できる。また、必要に応じて予備凍結を行ってもよい。
【００２６】
本発明における酵素活性低下とは、乾燥後に溶解した溶液中における酵素の活性が、乾燥前の溶液中における酵素の活性より低下していることを示す。その一因としては、一般的な緩衝剤であるＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤とアンモニウム塩を含む試薬を乾燥を経て再溶解すると、反応溶液のｐＨが酵素の至適ｐＨから大きく変化することが考えられるが、原因は特に限定されない。
【００２７】
また酵素の活性の測定方法は、それぞれの酵素によってさまざまであり、適宜その酵素に見合った測定方法を選択する必要がある。
【００２８】
例えば核酸増幅反応においては、ＰＣＲの増幅産物がある量に達したときのサイクル数であるＣｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）値や、等温増幅反応の増幅産物がある量に達したときの時間であるＴｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｔｉｍｅ）値を用いることができる。
【００２９】
これらの値は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなどの蛍光性核酸インターカレーターや、Ｔａｑｍａｎプローブなどの蛍光性核酸プローブを用いて増幅産物をリアルタイムにモニターすることにより得ることができる。
【００３０】
本発明における乾燥組成物は、生化学反応試薬から前記乾燥方法にて水分を除去し、目的の反応を行う際に水分の添加を必要とするものである。このときの水分とは、純水、緩衝液、塩溶液、タンパク質溶液、有機溶媒を含む。
【００３１】
本発明の乾燥組成物は、酵素活性をより強く保持する目的で、乾燥保護剤を含むことが好ましい。ここで用いられる乾燥保護剤としては、糖類や界面活性剤、水溶性ポリマー、タンパク質が挙げられる。
【００３２】
糖類としては、単糖類や二糖類、三糖類、低級オリゴ糖類、多糖類、ならびにこれらの誘導体を使用することができる。具体的には、単糖類であるアラビノース、グルコース、単糖類誘導体であるソルビトール、マンニトール、還元二糖類であるセロビオース、マルトース、ラクトース、非還元二糖類であるスクロース、トレハロース、三糖類であるラフィノース、マルトトリオース、低級オリゴ糖類であるマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、多糖類であるデキストランが挙げられる。より好ましくは、アラビノース、スクロース、セロビオース、デキストラン、トレハロース、マルトース、マルトトリオース、ラクトース、ラフィノースなどが挙げられる。
【００３３】
界面活性剤としては、ＮＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル）、水溶性ポリマーとしてはフィコール、ポリエチレングリコール、タンパク質としては牛血清アルブミンなどが好ましい。乾燥保護剤は任意の種類のものを任意の割合で混合することができ、実施例の範囲に限定されることはない。
【００３４】
乾燥保護剤の添加量は、乾燥組成物中において、好ましくは１（ｗ／ｖ）％以上、より好ましくは２．５（ｗ／ｖ）％以上であり、好ましくは３０（ｗ／ｖ）％以下、より好ましくは２０（ｗ／ｖ）％以下であり、具体的には、１〜３０（ｗ／ｖ）％が好ましく、より好ましくは２．５〜２０（ｗ／ｖ）％である。この数値範囲以下になると、十分な酵素活性維持の効果が得られない可能性があり、逆にこの数値範囲以上になると、酵素活性が阻害される可能性がある。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。なお、特に注釈しない場合、試薬は和光純薬株式会社から購入したものを用いた。
（実施例１）
１ｍＬの脱イオン水に、２０ｍＭ  グッド緩衝剤、１０ｍＭ  塩化カリウム、１０ｍＭ  硫酸アンモニウム（ナカライテスク株式会社製）、８ｍＭ  硫酸マグネシウム（関東化学株式会社製）、１．４ｍＭ  デオキシヌクレオチド三リン酸（株式会社ニッポンジーン製）、５％  トレハロース（ナカライテスク株式会社製）を含む溶液を調製した。グッド緩衝剤としてはＮａＯＨでｐＨ８．０に調整したＢＥＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＤＩＰＳＯ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、ＨＥＰＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）、ＴＥＳ（ナカライテスク株式会社製）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（ナカライテスク株式会社製）およびｐＨ８．８に調整したＣＨＥＳを用いた。この溶液を−４０℃で１時間予備凍結した後、１０Ｐａ以下に減圧して−４０℃で７時間、−１０℃で１２時間、１０℃で３時間、２５℃で１時間かけて凍結乾燥機（ＦＤＵ−２１１０型およびＤＲＣ−１０００型、東京理科器械株式会社製）にて凍結乾燥した。乾燥後、それぞれの乾燥試薬を脱イオン水で溶解し、ｐＨメーターでｐＨを測定した後、乾燥前の値と比較した。再溶解時の脱イオン水の量は１ｍＬであった。結果を表１に示す。ｐＨ変化値は、乾燥後のｐＨ値から、乾燥前のｐＨを引いた差を示す。【００３６】
【表１】
2016181897.tif 000002
【００３７】
（比較例１）
グッド緩衝剤の代わりにＨＣｌでｐＨ８．０あるいはｐＨ８．８に調整したＴｒｉｓ緩衝剤（ナカライテスク株式会社製）を用いて、実施例１と同じ条件で凍結乾燥試薬を作製した。これらの乾燥試薬を脱イオン水で溶解し、ｐＨメーターでｐＨを測定した後、乾燥前の値と比較した。結果を表１に示す。【００３８】
表１より、グッド緩衝剤を用いた場合、Ｔｒｉｓ緩衝剤を用いた場合と比較して、明らかなｐＨ変化の抑制が見られた。
（実施例２）
２５μＬの脱イオン水に、２０ｍＭ  グッド緩衝剤、１０ｍＭ  塩化カリウム、１０ｍＭ  硫酸アンモニウム（ナカライテスク株式会社製）、８ｍＭ  硫酸マグネシウム（関東化学株式会社製）、１．４ｍＭ  デオキシヌクレオチド三リン酸（株式会社ニッポンジーン製）、１．６μＭ  プライマー１（配列番号１）、１．６μＭ  プライマー２（配列番号２）、０．８μＭ  プライマー３（配列番号３）、０．２μＭ  プライマー４（配列番号４）、０．２μＭ  プライマー５（配列番号５）、４Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（株式会社ニッポンジーン製）、５％  トレハロース（ナカライテスク株式会社製）を含む溶液を調製した。グッド緩衝剤としてはＮａＯＨでｐＨ８．０に調整したＢｉｃｉｎｅ、ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）、ＨＥＰＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ製）、ＴＥＳ（ナカライテスク株式会社製）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（ナカライテスク株式会社製）およびｐＨ８．８に調整したＣＨＥＳを用いた。この溶液を−４０℃で１時間予備凍結した後、１０Ｐａ以下に減圧して−４０℃で７時間、−１０℃で１２時間、１０℃で３時間、２５℃で１時間かけて凍結乾燥機（ＦＤＵ−２１１０型およびＤＲＣ−１０００型、東京理科器械株式会社製）にて凍結乾燥した。乾燥後、それぞれの乾燥試薬を脱イオン水で溶解して鋳型（１ｎｇ）を添加し、６３℃で６０分間インキュベートした。再溶解時の脱イオン水の量は２５μＬであった。反応の追跡をリアルタイム蛍光測定（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６、ＲＯＣＨＥ製）にて行い、反応速度の尺度となるＴｔ値をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにて算出した。このＴｔ値を乾燥前の値と比較した。結果を表２に示す。Ｔｔ変化値は、それぞれのグッド緩衝材について、乾燥後のＴｔ値から、乾燥前のＴｔ値を引いた差を示す。【００３９】
【表２】
2016181897.tif 000003
【００４０】
（比較例２）
グッド緩衝剤の代わりにＨＣｌでｐＨ８．０あるいはｐＨ８．８に調整したＴｒｉｓ緩衝剤（ナカライテスク株式会社製）を用いて、実施例２と同じ条件で凍結乾燥試薬を作製した。これらの乾燥試薬を脱イオン水で溶解して鋳型（１ｎｇ）を添加し、６３℃で６０分間インキュベートした。反応の追跡をリアルタイム蛍光測定（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６、ＲＯＣＨＥ製）にて行い、反応速度の尺度となるＴｔ値をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにて算出した。このＴｔ値を乾燥前の値と比較した。結果を表２に示す。【００４１】
表２より、グッド緩衝剤を用いた場合、Ｔｒｉｓ緩衝剤を用いた場合と比較して、明らかにＴｔ値の変化が抑制された。
（実施例３）
２５μＬの脱イオン水に、５〜４０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ（ｐＨ８．０、濃度は表中に記載)、１０ｍＭ  塩化カリウム、１０ｍＭ  硫酸アンモニウム（ナカライテスク株式会社製）、８ｍＭ  硫酸マグネシウム（関東化学株式会社製）、１．４ｍＭ  デオキシヌクレオチド三リン酸（株式会社ニッポンジーン製）、１．６μＭ  プライマー１（配列番号１）、１．６μＭ  プライマー２（配列番号２）、０．８μＭ  プライマー３（配列番号３）、０．２μＭ  プライマー４（配列番号４）、０．２μＭ  プライマー５（配列番号５）、４Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（株式会社ニッポンジーン製）、５％  トレハロース（ナカライテスク株式会社製）を含む溶液を調製した。この溶液を−４０℃で１時間予備凍結した後、１０Ｐａ以下に減圧して−４０℃で７時間、−１０℃で１２時間、１０℃で３時間、２５℃で１時間かけて凍結乾燥機（ＦＤＵ−２１１０型およびＤＲＣ−１０００型、東京理科器械株式会社製）にて凍結乾燥した。乾燥後、それぞれの乾燥試薬を脱イオン水で溶解して鋳型（１ｎｇ）を添加し、６３℃で６０分間インキュベートした。再溶解時の脱イオン水の量は２５μＬであった。反応の追跡をリアルタイム蛍光測定（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６、ＲＯＣＨＥ製）にて行い、反応速度の尺度となるＴｔ値をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにて算出した。このＴｔ値を乾燥前の値と比較した。結果を表３に示す。Ｔｔ変化値は、実施例２と同様に算出した。【００４２】
【表３】
2016181897.tif 000004
【００４３】
（比較例３）
２．５ｍＭあるいは１ｍＭのＴｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨを用いて、実施例３と同じ条件で凍結乾燥試薬を作製した。これらの乾燥試薬を脱イオン水で溶解して鋳型（１ｎｇ）を添加し、６３℃で６０分間インキュベートした。反応の追跡をリアルタイム蛍光測定（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ９６、ＲＯＣＨＥ製）にて行い、反応速度の尺度となるＴｔ値をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにて算出した。このＴｔ値を乾燥前の値と比較した。結果を表３に示す。【００４４】
表３より、２．５ｍＭを超える濃度の場合に、本発明は酵素活性を維持することが可能であった。【００４５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【配列表】
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【国際調査報告】
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