(57)【要約】【解決課題】  優れた光退色耐性や速いＣａ２＋検出キネティックスを有し、なおかつ、任意の細胞内部位への局在化を可能とするカルシウムイオン検出蛍光プローブを提供すること。【解決手段】  以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。2017122799.tif 000012【選択図】なし
2017122799.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
2017122799.tif 000010
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ６は、アセトキシ基、アセトキシメトキシ基、水酸基を示し；
Ｘは、ベンゼン環とＵとの連結基ａを示し；
Ｕは、加水分解した後にカルシウムイオンを補足できる基を示し；
Ｙは、ベンゼン環とＳとの連結基ｂを示し；
Ｔは、存在する場合は、架橋基を示し；
Ｓは、ラベル部位を示し；
ｍは、１〜３の整数であり、ｎは、１〜３の整数であり、但し、ｍ＋ｎ＝４である。）
【請求項２】
前記ラベル部位がＨａｌｏタグリガンドである、請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
前記加水分解した後にカルシウムイオンを補足できる基が、アミノフェノールトリ酢酸誘導体又は１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシド）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸誘導体のエステル化合物から選択される、請求項１又は２に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
Ｘがアミド基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項５】
Ｙがアミノ基、もしくは、１つまたは２つの置換基を有するアミノ基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
【請求項６】
以下の式で表される化合物又はその塩。
2017122799.tif 000011
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
【請求項８】
細胞内のカルシウムイオンを検出する方法であって、
（ａ）請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内で発する蛍光を測定する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内でのタグ標識可能なカルシウムイオン検出蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内局所のＣａ２＋動態は、神経細胞の伝達物質放出や肥満細胞の脱顆粒など、多くの細胞機能の制御に関わることが知られている。１９８２年にＲｏｇｅｒ  Ｙ．  Ｔｓｉｅｎらがｑｕｉｎ２を開発して以来（非特許文献１）、ｆｌｕｏ−３やＣａｌｃｉｕｍＧｒｅｅｎ−１など多様のＣａ２＋蛍光プローブが開発され、細胞内のＣａ２＋動態の可視化に広く利用されている（非特許文献２）。【０００３】
しかしながら、これらの小分子蛍光プローブは、優れた光退色耐性や速いＣａ２＋検出キネティックスなど種々の特長を有しているものの、任意の細胞内部位への局在化を実現することが難しく、細胞内局所のＣａ２＋動態を特異的に可視化することは極めて困難である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Tsien, R.Y. et al. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator. J. Cell Biol. 94, 325-334 (1982)
【非特許文献２】Takahashi, A. et al. Measurement of intracellular calcium. Physiol. Rev. 79, 1089-1125 (1999)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来技術で達成されていない、優れた光退色耐性や速いＣａ２＋検出キネティックスを有し、なおかつ、任意の細胞内部位への局在化を可能とするカルシウムイオン検出蛍光プローブを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、光安定性に優れるキサンテン色素を母核としたＣａ２＋蛍光プローブの分子内にＨａｌｏＴａｇ結合部位等のラベル部位又は標的集積部位を導入し、ＨａｌｏＴａｇタンパク質等に標識可能なプローブを開発することを目的として鋭意検討したところ、キサンテンに直結したアミノ基等の連結基よりＨａｌｏＴａｇ結合部位等を導入することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。【０００７】
即ち、本発明は、
［１］以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
2017122799.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、水素原子を示すか、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示し；
Ｒ６は、アセトキシ基、アセトキシメトキシ基、水酸基を示し； 
Ｘは、ベンゼン環とＵとの連結基ａを示し；
Ｕは、加水分解した後にカルシウムイオンを補足できる基を示し； 
Ｙは、ベンゼン環とＳとの連結基ｂを示し；
Ｔは、存在する場合は、架橋基を示し；
Ｓは、ラベル部位を示し； 
ｍは、１〜３の整数であり、ｎは、１〜３の整数であり、但し、ｍ＋ｎ＝４である。）
［２］前記ラベル部位がＨａｌｏタグリガンドである、［１］に記載の化合物又はその塩。
［３］前記加水分解した後にカルシウムイオンを補足できる基が、アミノフェノールトリ酢酸誘導体又は１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシド）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸誘導体のエステル化合物から選択される、［１］又は［２］に記載の化合物又はその塩。
［４］Ｘがアミド基である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［５］Ｙがアミノ基、もしくは、１つまたは２つの置換基を有するアミノ基である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩。
［６］以下の式で表される化合物又はその塩。
2017122799.tif 000004
［７］［１］〜［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を含む蛍光プローブ。
［８］細胞内のカルシウムイオンを検出する方法であって、
（ａ）［１］〜［６］のいずれか１項に記載の化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び
（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内で発する蛍光を測定する工程
を含む方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明においては、細胞におけるＨａｌｏＴａｇタンパク質の発現部位を制御することにより、本発明の蛍光プローブを細胞内の任意の部位に局在化でき、局所的なＣａ２＋濃度変化を特異的に検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】化合物１４のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図２】ｈＣＧａｐｔ３  のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎを示す。
【図３】化合物１４によるＨＥＫ２９３Ｔ／Ｈａｌｏ−ＲｉｍＺＦ−ＣＡＡＸ選択的な標識を示す。
【図４】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞膜に局在化させたｈＣｇａｐｔ３の特性評価の結果を示す。
【図５】イオノフォア刺激によるｈＣＧａｐｔ３の蛍光強度変化を示す。
【図６】神経細胞に発現したｖｇｌｕｔ１−ｃｈａｌｏを標識するｈＣＧａｐｔ３の電気刺激に対する蛍光強度変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において、「アルキル基」又はアルキル部分を含む置換基（例えばアルコキシ基など）のアルキル部分は、特に言及しない場合には例えば炭素数１〜６個、好ましくは炭素数１〜４個、更に好ましくは炭素数１〜３個程度の直鎖、分枝鎖、環状、又はそれらの組み合わせからなるアルキル基を意味している。より具体的には、アルキル基として、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、シクロプロピルメチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基などを挙げることができる。
【００１１】
本明細書において「ハロゲン原子」という場合には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよく、好ましくはフッ素原子、塩素原子、又は臭素原子である。
【００１２】
本発明の１つの態様は、以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩である。
2017122799.tif 000005
【００１３】
本発明においては、キサンテン色素を母核としたＣａ２＋蛍光プローブの分子内にＨａｌｏＴａｇ結合部位等のラベル部位を導入するものである。ここで、分子設計が適切でないとプローブのＣａ２＋検出特性やＨａｌｏＴａｇタンパク質への結合特性が大幅に変化し所望の機能が実現しない。本発明においては、キサンテン色素の母核の特定の位置にＨａｌｏＴａｇ結合部位等のラベル部位を導入することが重要であり、これにより、優れた光退色耐性や速いＣａ２＋検出キネティックスを有し、なおかつ、任意の細胞内部位への局在化を可能とするカルシウムイオン検出蛍光プローブを提供することができる。
【００１４】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子を示すか、又はベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示す。一価の置換基としては、ハロゲン、置換されていてもよいアルキル基等が挙げられる。
【００１５】
ｍは、１〜３の整数であり、ｍと後述するｎの和は４である。
ｍが２以上の場合は、各Ｒ１は、夫々、水素原子、及び同一又は異なる一価の置換基であってもよい。本発明の１つの好ましい態様においては、ｍが２以上の場合、Ｒ１は何れも水素である。
【００１６】
一般式（Ｉ）において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基又はハロゲン原子を示す。
Ｒ２及びＲ３がアルキル基を示す場合には、該アルキル基にはハロゲン原子、カルボキシ基、スルホニル基、水酸基、アミノ基、アルコキシ基などが１個又は２個以上存在していてもよく、例えばＲ２又はＲ３が示すアルキル基はハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、カルボキシアルキル基などであってもよい。Ｒ２及びＲ３がそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子であることが好ましく、Ｒ２及びＲ３がともにフッ素原子であるか、塩素原子である場合がより好ましい。
【００１７】
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数１〜６個のアルキル基、又はハロゲン原子を示し、Ｒ２及びＲ３について説明したものと同様である。Ｒ４及びＲ５が共に水素原子であることが好ましい。
【００１８】
Ｒ６は、アセトキシ基、アセトキシメトキシ基、水酸基を示し、好ましくは、アセトキシ基、アセトキシメトキシ基、である。
【００１９】
Ｘは、後述するＵをベンゼン環に導入する連結基ａを示す。連結基ａとしては、カルボニル基、アルキルカルボニル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基などが挙げられ、特にカルボニル基、アミド基、アルキルカルボニル基が好ましい。
【００２０】
Ｕは、加水分解された後にカルシウムイオンを補足できる基を示す。加水分解された後にカルシウムイオンを補足できる基としては、アミノフェノールトリ酢酸誘導体や１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシド）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸誘導体のエステル化合物が挙げられ、特にアセトキシメチルエステル化合物が好ましい。
理論に拘束されることを意図するものではないが、Ｃａ２＋と結合する上では加水分解が必要となるところ、加水分解体は水溶性が高く細胞内に入り難いため、細胞への応用を達成する上で細胞内導入が可能なエステル体を用いるのが好ましい。そして、細胞内に入ったエステル体は、細胞内のエステラーゼで加水分解され、Ｃａ２＋と結合できるようになると考えられる。
【００２１】
式（Ｉ）において、Ｕ−Ｘ−が導入されるベンゼン環上の位置は、任意の位置でもよいが、キサンテン置換位置に対して４位に導入されることが好ましい。
【００２２】
ｎは、１〜３の整数である。ｎが２以上の場合は、Ｕ−Ｘ−は同一でも異なる種類であってもよい。
本発明においては、ｎは好ましくは１又は２であり、より好ましくは１である。
【００２３】
Ｙは、後述するＳをキサンテンのベンゼン環に導入する連結基ｂを示す。連結基ｂとしては、カルボニル基、アルキルカルボニル基、エステル基、アルキルエステル基、アミノ基、アルキルアミノ基、アゼチジン、アミド基、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基などが挙げられ、特にカルボニル基、アルキルカルボニル基、アミノ基、アゼチジンが好ましい。
【００２４】
Ｔは、存在する場合は、架橋基を示し、ＹとＳを連結させるスペーサーとして働くものであればいずれの架橋基であってもよい。例えば、置換又は無置換の炭化水素基（アルカン、アルケン、アルキン、シクロアルカン、芳香族炭化水素など）、エチレングリコール基、ジエチレングリコール基、トリエチレングリコール基、ポリエチレングリコール基、アミド基、カルボニルなど、及び複素環基（例えば、ピペリジニル基など）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、上記架橋基は、その片方または両方の端部に、Ｙ、Ｓと結合することができる官能基を有してもよく、このような官能基として、例えば、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミド基などが挙げられる。
【００２５】
Ｓは、ラベル部位を示し、その例として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｈａｌｏタグリガンド（例えば、２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタンアミノ基）、弱塩基性アミン、マレイミド、イソチオシアネート基、塩化スルホニル基、ハロアルキル基、ハロアセトアミド基、アジド基、アルキニル基、ベンジルグアニン誘導体又はベンジルシトシン誘導体などが挙げられる。また、Ｓのラベル部位には、片末端又は両末端に修飾基を有してもよいポリエチレングリコール基も含まれ、修飾基としてはアミノ基、カルボニル基、カルボキシル基などが挙げられる。修飾基を有するポリエチレングリコール基の非限定的例として、３−（２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エトキシ）プロパン酸が挙げられる。
【００２６】
本発明の１つの好ましい態様においては、ＳはＨａｌｏタグリガンドである。
本発明においては、Ｈａｌｏタグリガンド等のラベル部位をキサンテンのベンゼン環の特定の部位に導入することにより、細胞におけるＨａｌｏタグタンパク質等の発現部位の制御が可能となり、本発明の蛍光プローブを細胞内の目的の部位に局在化できることから、局所的なＣａ２＋濃度変化を特異的に可視化することが可能である。
【００２７】
本発明の１つの好ましい態様は、以下の一般式（Ｉａ）で表される化合物又はその塩である。
2017122799.tif 000006
式（Ｉａ）において、Ｒ1〜Ｒ６、Ｘ、Ｙ及びＴは、一般式（Ｉ）で定義した通りである。
また、本発明の１つの好ましい側面は、以下の一般式（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩である。
2017122799.tif 000007
式（Ｉｂ）において、Ｒ1〜Ｒ６、Ｘ及びＹは、一般式（Ｉ）で定義した通りである。
【００２８】
本発明の１つの好ましい側面は、以下の式で表される化合物又はその塩である。
2017122799.tif 000008
【００２９】
式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される本発明の化合物は、酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲内である。
【００３０】
本発明の式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される化合物は、置換基の種類により、１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があるが、１個又は２個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や２個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。
【００３１】
本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に具体的に示した。従って、当業者は、これらの説明をもとにして、反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択して、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることにより、一般式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される本発明の化合物を製造することができる。
【００３２】
本発明の式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される本発明の化合物は、カルシウムイオンを検出する蛍光プローブとして有用である。
即ち、本発明のもう１つの態様は、式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩を含む蛍光プローブである。
また、本発明のもう１つの態様は、細胞内のカルシウムイオンを検出する方法であって、（ａ）式（Ｉ）、（Ｉａ）又は（Ｉｂ）で表される化合物又はその塩を細胞内に導入する工程、及び（ｂ）当該化合物又はその塩が細胞内で発する蛍光を測定する工程を含む方法、である。
式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される本発明の化合物又はその塩は、カルシウムイオンのない環境において実質的に無蛍光であるか、弱い蛍光のみを有するが、カルシウムイオンのある環境において強い蛍光を発する特徴を有する。従って、式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される本発明の化合物又はその塩は、細胞膜やシナプスでのＣａ２＋シグナルを生理条件下で検出するためのカルシウムイオン検出蛍光プローブとして極めて有用である。
【００３３】
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記式（Ｉ）、（Ｉａ）及び（Ｉｂ）で表される化合物又はそれらの塩を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、蛍光スペクトルを測定すればよい。本発明の蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤、ｐＨ調節剤などの添加物と組み合わせることができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００３５】
［実施例１］
ビス（アセトキシメチル）２，２’−（（４−（３’−アセトキシ−２’，７’−ジクロロ−６’−（３−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）アゼチジン−１−イル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボン酸アミド）−２−（２−（アセトキシメトキシ）−２−オキソエトキシ）フェニル）アザンジイル）ジアセテート（化合物１４）の合成
以下の反応スキームの手順に従って、本発明の化合物の１つである化合物１４を合成した。
2017122799.tif 000009
【００３６】
（１）ビス（アセトキシメチル）２，２’−（（２−（２−（アセトキシメトキシ）−２−オキソエトキシ）−４−アミノフェニル）アザンジイル）ジアセテート（化合物３）の合成
２−（２−（ビス（２−メトキシ−２−オキソエチル）アミノ）−５−ニトロフェノキシ）酢酸（化合物１）（７６７．８ｍｇ、２．１５５ｍｍｏｌ）をフラスコに入れ、ＴＨＦ（１５ｍＬ）で溶解した。溶液を撹拌しながら１Ｎ  ＮａＯＨ（６．７ｍＬ）を加えた後、室温にて遮光条件下で４０分間撹拌した。その後、１Ｎ  ＮａＯＨ（２．１ｍＬ）を追加し、さらに３０分間撹拌した後溶液に酢酸エチルを加え、水で抽出した。得られた溶液に１Ｎ  ＨＣｌ（１５ｍＬ）を添加し、酢酸エチルで抽出した（２回）。こうして得られた粗生成物を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で乾燥した後、アセトニトリル（３０ｍＬ）で溶解させた。溶液を撹拌しながらＤＩＰＥＡ（４．８ｍＬ）及びブロモ酢酸メチル（１．２５ｍＬ）を添加し、遮光し、室温にてオーバーナイトで撹拌した。反応混合物に水を加え、ＤＣＭで抽出した。
得られた粗生成物を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘａｎｅ＝１／１）で精製し、ビス(アセトキシメチル)２，２’−（（２−（２−（アセトキシメトキシ）−２−オキソエトキシ）−４−ニトロフェニル）アザンジイル)ジアセテート（化合物２）を７０２．０ｍｇ得た。この化合物２を乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）で溶解し、１０％パラジウム炭素（スパーテル２杯）を添加した後遮光し、水素雰囲気下で室温にてオーバーナイトで撹拌した。反応混合物に水素を追加し、遮光して室温にて４時間撹拌し、１０％パラジウム炭素（スパーテル２杯）を追加した後さらにオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をろ過し、パラジウム炭素を除去した後溶液を濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘａｎｅ＝３／１）で精製し、化合物３を４１．９ｍｇ得た（３ステップの収率：１８％）。【００３７】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ，６．８６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．２６−６．２８（ｍ，１Ｈ），６．２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），５．８１（ｓ，２Ｈ），５．７４（ｓ，４Ｈ），４．７０（ｓ，２Ｈ），４．１３（ｓ，４Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．０９（ｓ，６Ｈ）
１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ，１７０．２２，１６９．６９，１６９．６３，１６８．０６，１５１．７３，１４３．５１，１３０．７１，１２３．４４，１０９．２７，１０３．４１，７９．４１，７９．２９，７７．４８，７６．８４，６６．０５，５４．０４，２０．７９，２０．７３
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値５１５．１５１３１；測定値５１５．１５１９９；Δ＝０．０００６８【００３８】
（２）１−（ｔｅｒｔ−ブチル）３−（メトキシメチル）４−（２，７−ジクロロ−６−（メトキシメトキシ）−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）イソフタル酸（化合物６）の合成
３’，６’−ジアセトキシ−２’，７’−ジクロロ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボン酸（化合物４）（１．００３４ｇ，１．８９５８ｍｍｏｌ）をフラスコに入れ、乾燥トルエン（６ｍＬ）で溶解し、撹拌しながら８０℃まで加温した。同じ温度のまま１０分経過したところでＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジ−ｔｅｒｔ−ブチルアセタール（２．７ｍＬ）を滴下し、さらに１０分間撹拌した後、室温にまで温度を下げた。反応混合物にＮａＨＣＯ３を加え、ＤＣＭで抽出した（２回）。こうして得られた粗生成物を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で乾燥した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘａｎｅ＝１／２）で精製し、５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２’，７’−ジクロロ−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−３’，６’−ジイルジアセテート（化合物５）を橙色の固体として７７４ｍｇ得た。
得られた化合物５（７７４ｍｇ，１．３２ｍｍｏｌ）をフラスコに入れ、ＴＨＦ：ＭｅＯＨ＝１：１の混合溶液（２０ｍＬ）を加えた。その反応混合物を撹拌しながら１Ｍ  ＮａＯＨ（３ｍＬ）を添加し、室温にて遮光条件下で２時間撹拌した。反応混合物に１Ｎ  ＨＣｌ（３ｍＬ）と水を加え、酢酸エチルで抽出した。得られた粗生成物の酢酸エチル溶液を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で乾燥した。残渣を乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）で溶解し、炭酸カリウム（４５７ｍｇ，３．３１ｍｍｏｌ）を加えた後、この溶液を０℃まで冷却した。同じ温度で撹拌しながらクロロメチルメチルエーテル（３０１μＬ，３．９７ｍｍｏｌ）をゆっくり（約１０分）滴下し、それからこの溶液を室温まで加温し、オーバーナイトで撹拌した。反応混合物に酢酸エチル（１０ｍＬ）及びＮＨ４Ｃｌ（１０ｍＬ）を添加し、水を加え、酢酸エチルで抽出した（２回）。こうして得られた粗生成物をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で乾燥した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘａｎｅ＝１／２）で精製し、橙色の固体として化合物６を５５２ｍｇ得た（３ステップの収率：４９％）。【００３９】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ，８．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ），８．４４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０，１．６Ｈｚ），７．５４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ），７．３７（ｓ，１Ｈ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ），６．４９（ｓ，１Ｈ），５．４２（ｓ，２Ｈ），５．２５−５．３１（ｍ，２Ｈ），３．５５（ｓ，３Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），１．７０（ｓ，９Ｈ）
１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ，１７７．２４，１６３．６９，１６３．５８，１５７．４５，１５６．８６，１５１．８８，１４８．１８，１３７．２３，１３５．３１，１３４．０１，１３３．７８，１３２．２６，１３０．８２，１３０．０５，１２７．５５，１２６．７７，１２０．６７，１１７．５７，１１５．１３，１０５．４７，１０３．３８，９５．１３，９１．６０，８２．３９，５７．６３，５６．６４，２７．９３
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋に対する計算値５８９．１０３２１；測定値５８９．１０２６６；Δ＝０．０００５５【００４０】
（３）（ｔｅｒｔ−ブチル２’，７’−ジクロロ−３’−（メトキシメトキシ）−３−オキソ−６’−（（（トリフルオロメチル）スルホニル）オキシ）−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボン酸塩）（化合物８）の合成
化合物６（２５４．５ｍｇ，０．４３１７８ｍｍｏｌ）をフラスコに入れ、乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）で溶解した。その溶液を撹拌しながら水（２ｍＬ）及び１Ｎ  ＮａＯＨ（１．５５ｍＬ）を添加し、室温にて８０分間撹拌した。反応混合物に１Ｎ  ＨＣｌ（２ｍＬ）及び水を加え、ＤＣＭで抽出した。得られた粗生成物を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空で乾燥した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘａｎｅ＝１／１）で精製し、オレンジ色の固体２１９ｍｇを得た。そのようにして得られた化合物（２１９ｍｇ）をフラスコに入れ、乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）で溶解した。その溶液を０℃まで冷却し、拡販しながらピリジン（３２４．１μＬ、４．０１５７ｍｍｏｌ）をゆっくり（約１０分）滴下し、同じ温度で、続けてトリフルオロメタンスルホン酸無水物（２０２．３μＬ、１．２０４７ｍｍｏｌ）をゆっくり（約１０分）滴下した。その後この溶液を室温まで加温し、遮光条件下で室温にてオーバーナイトで撹拌した。反応混合物に水を加え、ＤＣＭで抽出した後、抽出した溶液に１Ｎ  ＨＣｌを加え洗浄した。そうして得られた粗生成物を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘａｎｅ＝１／２）で精製し、膜状の白色固体として化合物８を２４３ｍｇ得た（２ステップの収率：８３．１％）。【００４１】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ，８．６８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．２，０．８Ｈｚ），８．３８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０，１．２Ｈｚ），７．３６（ｓ，１Ｈ），７．２５−７．２８（１Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），６．９４（ｓ，１Ｈ），６．７８（ｓ，１Ｈ），５．３０−５．３４（ｍ，２Ｈ），３．５３（ｓ，３Ｈ），１．５９−１．７０（９Ｈ）
１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ，１６７．７１，１６３．７３，１５５．００，１５４．９３，１５０．０７，１４９．９４，１４６．３９，１３６．９１，１３５．２７，１２８．６４，１２７．２１，１２６．２１，１２３．９６，１２２．３６，１２０．３１，１２０．２７，１１９．９２，１１２．５３，１０４．３３，９５．２６，８２．８３，８０．５５，７７．４８，７６．８４，５６．７３，２８．１３
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋ に対する計算値６７７．０２６２８；測定値６７７．０２６５５；Δ＝０．０００２７【００４２】
（４）ｔｅｒｔ−ブチル２’，７’−ジクロロ−３’−（３−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）アゼチジン−１−イル）−６’−（メトキシメトキシ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボン酸（化合物１１）の合成
化合物８（３００．８ｍｇ，０．４４４０ｍｍｏｌ）をフラスコに加えジオキサン（１８ｍＬ）に溶かし、メチルアゼチジン−３−エステル塩酸塩（１０１．０ｍｇ、０．６６６１ｍｍｏｌ）、２−ジシクロヘキシルフォスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニル−１，１’−ビフェニル（Ｘｐｈｏｓ；１０６．０ｍｇ、０．２２２０ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（Ｐｄ２（ｄｂａ）３；８１．３ｍｇ、０．０８８８ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（７２３．４ｍｇ、２．２２０ｍｍｏｌ）を加えた後、反応溶液をアルゴン雰囲気下で１００℃に加熱し、６時間撹拌した。溶液中の不溶固体をセライトでろ過し、溶液を濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘａｎｅ＝１／２）で精製し、メチル１−（５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２’，７’−ジクロロ−３’−（メトキシメトキシ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６’−イル）アゼチジン−３−カルボン酸（化合物９）を無色透明の液体として７６．８ｍｇ得た。【００４３】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋ に対する計算値６４２．１２９７６；測定値６４２．１２９７６；Δ＝０.０【００４４】
こうして得られた化合物９（７６．８ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解し、水（５ｍＬ）を加え、撹拌しながら１Ｎ  ＮａＯＨを１４３μＬ添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌し、１Ｎ  ＨＣｌを１６０μＬ加えた後水を加え、酢酸エチルで抽出した。その後無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝９４／６）で精製し、赤色固体として１−（５−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−２’，７’−ジクロロ−３’−（メトキシメトキシ）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−６’−イル）アゼチジン−３−カルボン酸（化合物１０）を６７．５ｍｇ得た。【００４５】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋ に対する計算値６２８．１１４１１；測定値６２８．１１４１０；Δ＝０．００００１【００４６】
得られた化合物１０（６７．５ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）をフラスコに加え、アセトニトリル（７ｍＬ）に溶かした。その溶液を撹拌しながらアセトニトリルに溶かした１Ｍ  ２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エタン−１−アミンを１２９μＬ添加し、さらにＯ−（ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）（４９ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（ＤＩＰＥＡ）（９３．５μＬ、０．５３７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間撹拌した。溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：ＡｃＯＥｔ／Ｈｅｘａｎｅ＝２／１）で精製し、無色透明の液体として化合物１１を５２．２ｍｇ得た（３ステップの収率：１４％）【００４７】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ，８．６２７−８．６３２（ｍ，１Ｈ），８．３４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０，１．６Ｈｚ），７．２１−７．２４（ｍ，１Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ），６．７０（ｓ，１Ｈ），６．５３（ｓ，１Ｈ），６．３３（ｓ，１Ｈ），５．３０（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝１０．８，６．８Ｈｚ），４．２１−４．３３（ｍ，４Ｈ），３．４５−３．６３（ｍ，１６Ｈ），１．３５−１．８１（ｍ，１７Ｈ）
１３ＣＮＭＲ（１００ＭＨｚ，）：δ／ｐｐｍ，１７１．５０，１６８．３７，１６４．０３，１５５．６４，１５４．４８，１５０．７２，１５０．５９，１４９．２６，１３６．４３，１３４．６１，１２９．４１，１２８．７２，１２６．８４，１２６．７７，１２４．０７，１１８．９９，１１５．９６，１１２．３３，１０８．８１，１０４．２７，１０１．４７，９５．１７，８２．５３，８２．５１，７１．３４，７０．３３，７０．０９，６９．６６，５６．６４，５６．００，４５．１１，３９．４９，３４．９７，３２．５７，２９．５２，２８．２５，２６．７３，２５．４７
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋ に対する計算値８３３．２３７４５；測定値８３３．２３５２１；Δ＝０．００２３４【００４８】
（５）化合物１４の合成
化合物１１（３０．５ｍｇ、０．０３６６ｍｍｏｌ）をフラスコに加え、乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解した。その溶液を撹拌しながらトリエチルシラン（１７．５μＬ、０．１１０ｍｍｏｌ）及びＴＦＡ（１ｍＬ）を添加し、室温にてオーバーナイトで撹拌した。その後トルエンを反応混合物に加え、留去し、メタノールで共沸した。残渣をＤＭＦ（１．５ｍＬ）に再溶解させ、ＨＰＬＣ（ＯＤＳ，Ａ（水と０．１％ＴＦＡ）：Ｂ（アセトニトリルと０．１％ＴＦＡ）＝９９：１から１：９９，２０分間）で精製した。精製後の溶液を３０ｍＬバイアルに移し、真空にて乾燥させ赤色固体として、４−（２，７−ジクロロ−６−（３−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）アゼチジン−１−イル）−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）イソフタル酸（化合物１２）２１．４ｍｇを得た。【００４９】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋ に対する計算値７３３．１４８６４；測定値７３３．１４９２２；Δ＝０．０００５８【００５０】
こうして得られた化合物１２（２１．４ｍｇ、０．０２９２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（１ｍＬ）で溶解させ、溶液を撹拌しながら無水酢酸（０．５ｍＬ）を添加し、４０℃に加温し、２時間半撹拌した。その後。反応混合物を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで２回精製し（溶出溶媒：１回目、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝９５／５、２回目、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝９７／３）、薄い桃色の透明液体として３’−アセトキシ−２’，７’−ジクロロ−６’−（３−（（２−（２−（（６−クロロヘキシル）オキシ）エトキシ）エチル）カルバモイル）アゼチジン−１−イル）−３−オキソ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９’−キサンテン］−５−カルボン酸（化合物１３）を６．５ｍｇ得た。【００５１】
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋ に対する計算値７７５．１５９２０；測定値７７５．１５９６４；Δ＝０．０００４４【００５２】
得られた化合物１３（６．５ｍｇ、０．０８４ｍｍｏｌ）を３０ｍＬバイアルに加え、アセトニトリル（１ｍＬ）に溶解させた。溶液を撹拌しながら、化合物１３をアセトニトリルに溶解させた１Ｍ  アセトニトリル溶液（８３．８μＬ，０．００８３８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物にＨＡＴＵ（３．８ｍｇ，０．０１０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（７．３μＬ，０．０４２ｍｍｏｌ）を加え、３時間撹拌した。反応混合物を留去した後、ＰＬＣ（展開溶媒；ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝９３：７）で精製し、薄い桃色の液体として化合物１４を９．９ｍｇ得た（３ステップの収率：１４％）。【００５３】
１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ／ｐｐｍ，８．５１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．８Ｈｚ），８．３１５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０，１．２Ｈｚ），８．２２（ｓ，１Ｈ），７．３１−７．３４（ｍ，２Ｈ），７．１２（ｓ，１Ｈ），６．９５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．８０（ｓ，１Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ），６．３５（ｓ，１Ｈ），６．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．２Ｈｚ），５．８４（ｓ，２Ｈ），５．７９（ｓ，４Ｈ），４．７４（ｓ，２Ｈ），４．２５（ｓ，４Ｈ），３．３３−３．８０（ｍ，２１Ｈ），２．１２−２．３７（ｍ，１２Ｈ），１．３５−１．８１（ｍ，８Ｈ）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：［Ｍ＋Ｈ］＋ に対する計算値１２７１．２９２１３；測定値１２７１．２８８９５；Δ＝０．００３１８【００５４】
ＨＰＬＣクロマトグラム（２５４ｎｍの吸光度）を図１に示す。分析条件は、ＯＤＳ−Ｃ１８カラムを用いて、Ａ液（０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ）：Ｂ液（０．１％ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）を１，２００秒掛けて９５：５から５：９５に線形に変化させ、１，２００秒以降は５：９５とした。【００５５】
［測定用試料の調製及び測定方法］
（１）エステラーゼ処理による加水分解体の取得
化合物１４（終濃度８０μＭ）、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７（０．２％）、Ｅｓｔｅｒａｓｅ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（０．４２ｕｎｉｔｓ／μＬ）（ＳＩＧＭＡ）を含む１００μＬのＰＢＳ溶液を調整し、３７℃で加水分解反応を行った。反応の時間経過を追うために、途中でサンプルの一部を採取し、分光蛍光光度計（ＪＡＳＣＯ、ＦＰ−６５００）により１０ｍＭＣａ２＋バッファー中における蛍光強度を計測した。蛍光強度がほとんど変化しなくなったところで反応を停止し、化合物１４の加水分解物を得た。【００５６】
（２）Ｃａ２＋バッファーの調製
１００ｍＭＫＣｌ、３０ｍＭ３−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）を含むバッファー中の遊離Ｃａ２＋濃度はＣａ−  Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＥＧＴＡ）系（０−１μＭ）、Ｃａ−  Ｎｉｔｒｉｌｏ  ｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＮＴＡ）系（３．２μＭ−７９４．３μＭ）、アンバッファード系（ＣａＣｌ２）（３．２ｍＭ−１０ｍＭ）を用いて調整した。Ｃａ−ＥＧＴＡ系、Ｃａ−ＮＴＡ系における遊離Ｃａ２＋濃度の調整は以下の式（１）を用いた。【００５７】
式（１）  ［Ｃａ２＋］０＝（［Ｃａ２＋］＋（［Ｌ］０＋Ｋｄ）［Ｃａ２＋］）／（Ｋｄ＋［Ｃａ２＋］）
（［Ｃａ２＋］０：カルシウム初期濃度、［Ｃａ２＋］：遊離カルシウム濃度、［Ｌ］０：キレーター初期濃度、Ｋｄ：キレーターの解離定数）【００５８】
（３）細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）は１０％ＦＢＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｗａｋｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｗａｋｏ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｗａｋｏ）中で３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。神経細胞については妊娠２１日目のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから麻酔下で胎児を取り出し、直ちに胎児の脳から抽出した海馬をトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）で消化し、神経細胞を分離した。神経細胞は単層のグリア細胞上で２％Ｂ−２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ｗａｋｏ）、１％ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。【００５９】
（４）ｐｃＤＮＡ  Ｈａｌｏ−ＲｉｍＺＦ−ＣＡＡＸベクターの作製
ｐＦＣ１４Ａ（ＨａｌｏＴａｇ  ７）ＣＭＶ  Ｆｌｅｘｉベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）をテンプレートとしたＰＣＲによりＨａｌｏＴａｇをコードするＤＮＡ断片を増幅した。また、京都大学の森泰生教授より提供を受けたプラスミドｐＣＩ−ｎｅｏ  ＲＩＭ１αをテンプレートとしたＰＣＲにより、マウスＲＩＭ１α遺伝子のＺｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒドメイン（５６−２２８ａａ）（以下「ＲｉｍＺＦ」とする）をコードする遺伝子領域を増幅した。
次に、ＨａｌｏＴａｇをコードするＤＮＡ断片とＲｉｍＺＦをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって融合させた。この時、プライマーにＫＲａｓ遺伝子のＣＡＡＸモチーフ（ＫＭＳＫＤＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣ−ＶＩＭ）をコードするＤＮＡ配列を付加することにより、ＨａｌｏＴａｇ、ＲｉｍＺＦ、ＣＡＡＸモチーフの融合タンパク質を発現させるＤＮＡ断片を得た。この断片にＨｉｎｄＩＩＩサイトとＮｏｔＩサイトを付加し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩサイトにサブクローニングすることで目的のベクターｐｃＤＮＡ  Ｈａｌｏ−ＲｉｍＺＦ−ＣＡＡＸを得た。【００６０】
（５）レンチウイルスの作製
小胞膜グルタミントランスポーター（ＶＧＬＵＴ１）をコードするＤＮＡ配列のＣ末端側にＨａｌｏＴａｇ  ｐｒｏｔｅｉｎをコードする配列を直列に融合したＤＮＡ断片をレンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６ＰＷ）にサブクローニングし、ｐＬｅｎｔｉ  ｖｇｌｕｔ１−ｃｈａｌｏを作製した。得られたｐＬｅｎｔｉ  ｖｇｌｕｔ１−ｃｈａｌｏをヘルパープラスミド（ｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し、二酸化炭素濃度５％、３７℃中で１８時間培養後、培地交換を行い、再び二酸化炭素濃度５％、３７℃中で２４時間半培養した後ウイルスを回収した。【００６１】
（６）遺伝子導入
０．０１％コラーゲン及び２５μｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジン（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）でコート処理した１２ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１ウェル当り３５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種し、５時間後にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐｃＤＮＡ  Ｈａｌｏ−ＲｉｍＺＦ−  ＣＡＡＸを１μｇ導入した。神経細胞に対しては培養１７日目に感染させ、ｖｇｌｕｔ１−ｃｈａｌｏを導入した。【００６２】
（７）細胞の標識
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は遺伝子導入した１６時間後、０．０１％コラーゲン及び２５μｇ／ｍｌポリ−Ｌ−リジン（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）でコート処理したカバーガラス上の金属リング内に１リング当りの細胞数が４０，０００個になるように播種し、二酸化炭素濃度５％、３７℃中で培養した。３時間半後、細胞外液をＣａ２＋プローブ（化合物１４又はＣａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））又は蛍光リガンド（ｈａｌｏＴＭＲ、ｈａｌｏＯｒｅｇｏｎ）（終濃度５μＭ）、０．０２％ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７を含むリンガー液（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％グルコース、ｐＨ７．２）に交換し、遮光して室温にて３０分間静置した。化合物１４と蛍光リガンドで標識した細胞はその後無血清ＤＭＥＭに交換し、二酸化炭素濃度５％、３７℃中で遊離したプローブの除去を３０分間行い、外液を再びリンガー液に交換した。Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、ＡＭで染色した細胞はリンガー液で洗浄した後すぐに蛍光観察を行った。神経細胞はウイルス感染後９日目に化合物１４（終濃度５μＭ）を含むリンガー液で１５分標識した。【００６３】
（８）ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ
標識したＨＥＫ２９３Ｔ／Ｈａｌｏ−ＲｉｍＺＦ−ＣＡＡＸを４％ＰＦＡ／ＰＢＳで１０分間固定し、２０μＭジギトニンにより膜透過処理を行った後、外液のＣａ２＋濃度を変化させたときの蛍光変化を測定した。【００６４】
（９）Ｃａ２＋イメージング
蛍光画像の取得は倒立顕微鏡（ＩＸ−７１、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、ＥＭ−ＣＣＤカメラ（Ａｎｄｏｒ、ｉＸｏｎ）、対物レンズ（対物レンズｉＸｏｎｐｕｓ化を測定、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、ＲＦＰ用フィルターセットを用いた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はｉｏｎｏｍｙｃｉｎ（１０μＭ）による刺激を行い、５秒間隔で経時的に画像を取得した。神経細胞は電気刺激（７Ｖ、１００ｍｓ間隔、１０回）を５回行い、５０Ｈｚで画像を取得した。【００６５】
［実施例２］
化合物１４の化学的性質の評価
合成した化合物１４の化学的性質を評価するために、前記の方法によりエステラーゼ処理により加水分解体を取得し、Ｃａ２＋濃度を調整したバッファー中における蛍光強度を分光蛍光光度計で測定した。
その結果、Ｃａ２＋  と結合したプローブの蛍光強度は未結合のものと比べて約１１倍大きくなり（Ｆｍａｘ／Ｆｍｉｎ＝１０．８）、解離定数（Ｋｄ）は１１．１μＭであった（図２）。図２中、●は各データポイントを示し、曲線でフィットカーブを示した。【００６６】
［実施例３］
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内における局在とＣａ２＋応答特性の評価
ｐｃＤＮＡ  Ｈａｌｏ−ＲｉｍＺＦ  ＣＡＡＸ遺伝子導入によって細胞膜上にＨａｌｏＴａｇタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（以下ＨＥＫ２９３Ｔ／Ｈａｌｏ−ＲｉｍＺＦ−ＣＡＡＸとする）を用いて、蛍光プローブによる染色を行った。Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、ＡＭでは、ＨａｌｏＴａｇタンパク質の発現の有無に関わらず視野内のすべての細胞の細胞質が染色された（図３のＡ）。一方、化合物１４では、従来プローブとは異なり、ＨａｌｏＴａｇタンパク質の発現する細胞膜上に局在する蛍光が観察された（図３のＢ）。ＨａｌｏＴａｇタンパク質の発現部位は、ＨａｌｏＴａｇリガンドを用いた染色より同定した。【００６７】
次にｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎにより標識プローブのＣａ２＋応答特性の評価を行った結果、Ｆｍａｘ／Ｆｍｉｎ＝４．７、Ｋｄ＝６．４μＭであった（図４）。図４のＢにおいて、●は各データポイントを示し、曲線でフィットカーブを示した。【００６８】
さらに、イオノフォアによって惹起されるＣａ２＋シグナルに対する応答特性をみるため、プローブで標識したＨＥＫ２９３Ｔ／Ｈａｌｏ−ＲｉｍＺＦ−ＣＡＡＸにイオノマイシンを添加し、その後の蛍光強度の経時的変化を測定した（図５）。図５のＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ／Ｈａｌｏ−ＲｉｍＺＦ−ＣＡＡＸの標識を表し、図５のＢは、イオノマイシン刺激による蛍光強度変化を表す。図５のＢでは、刺激した時点を黒矢印で示した。
図５のＢで示されるように、イオノマイシンの添加によって蛍光強度が上昇し、細胞膜上の局所的なＣａ２＋シグナルを検出した。【００６９】
［実施例４］
神経細胞を用いた電気刺激によるＣａ２＋シグナルに対する応答特性の評価
シナプスに局在性を示すｄｙｎｅｉｎ軽鎖タンパク質とＨａｌｏＴａｇとの融合タンパク質（ｄｙｎｅｉｎ−Ｈａｌｏ）を発現させたラット海馬由来神経細胞をプローブで染色し、１００Ｈｚで１０回の電気刺激を加えて連続する活動電位を惹起したところ、刺激に応じたＣａ２＋シグナル変化を観測した（図６）。
ここで、図６のＡは、ラット海馬由来神経細胞／ｖｇｌｕｔ１−ｃｈａｌｏを示し、図６のＢは、電気刺激したときの蛍光強度変化  （１００Ｈｚ、１０回）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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