(57)【要約】  油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％以上の濃度でドコサヘキサエン酸を含有し、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークの温度が１５℃以下である、ドコサヘキサエン酸含有油、及びこれを含むバイオマス；このドコサヘキサエン酸含有油を生成し得るアウランティオキトリウム属微生物を培養してバイオマスを得ること、培養後のバイオマスを回収すること、回収後のバイオマスから油を抽出することを含む、ドコサヘキサエン酸含有油の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％以上の濃度でドコサヘキサエン酸を含有し、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークの温度が１５℃以下である、ドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項２】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークの温度が、１０℃以下である請求項１記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項３】
ドコサヘキサエン酸の濃度が油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％〜９８重量％である請求項１又は請求項２記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項４】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークの温度が−５０℃〜１０℃である請求項１〜請求項３のいずれか１項記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項５】
微生物油である請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項６】
微生物油が、オピストコンタ（Ｏｐｉｓｔｈｏｋｏｎｔａ）、アーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）、エクスカバータ（Ｅｘｃａｖａｔａ）、ＳＡＲ、並びにこれらに分類されないハプト藻類（Ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）及びクリプト藻類（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）に属する微生物、並びに細菌（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群より選択される少なくとも１種の微生物の微生物油である請求項５記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項７】
微生物油が、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）に属する微生物の微生物油である請求項５記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項８】
微生物油が、ラビリンチュラ綱（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）に属する微生物の微生物油である請求項５記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項９】
微生物油が、ヤブレツボカビ類（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）に属する微生物の微生物油である請求項５記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項１０】
微生物油が、アウランティオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微生物の微生物油である請求項５記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項１１】
微生物油が、アウランティオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）のドコサヘキサエン酸生成変異株の微生物油である請求項５記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項１２】
微生物油が、アウランティオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＮｉＤ２株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９６）、ＮｉＤ３株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９７）又は、当該株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株の微生物油である請求項５記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項１３】
微生物油の粗油である請求項１〜請求項１２のいずれか１項記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項１４】
微生物油の精製油である請求項１〜請求項１２のいずれか１項記載のドコサヘキサエン酸含有油。
【請求項１５】
請求項１〜請求項１３のいずれか１項記載のドコサヘキサエン酸含有油を含む微生物のバイオマス。
【請求項１６】
ドコサヘキサエン酸の蓄積量が、培養物１リットルあたりの乾燥バイオマス重量の１８重量％以上である請求項１５記載のバイオマス。
【請求項１７】
乾燥バイオマスである請求項１５又は請求項１６記載のバイオマス。
【請求項１８】
請求項１〜請求項１４のいずれか１項記載のドコサヘキサエン酸含有油を生成し得るアウランティオキトリウム属微生物。
【請求項１９】
アウランティオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＮｉＤ２株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９６）、又はＮｉＤ３株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９７）である請求項１８記載のアウランティオキトリウム属微生物。
【請求項２０】
ＮｉＤ２株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９６）、又はＮｉＤ３株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９７）と実質的に同一の菌学的性質を有する請求項１９記載のアウランティオキトリウム属微生物。
【請求項２１】
請求項１８〜請求項２０のいずれか１項記載のアウランティオキトリウム属微生物を培養して、バイオマスを得ること、
培養後のバイオマスを回収すること、
を含む、請求項１５〜請求項１７のいずれか１項記載のバイオマスの製造方法。
【請求項２２】
培養後に得られたバイオマスを乾燥することを更に含む請求項２１記載のバイオマスの製造方法。
【請求項２３】
請求項１８〜請求項２０のいずれか１項記載のアウランティオキトリウム属菌株を培養して、バイオマスを得ること、
培養後のバイオマスを回収すること、
回収後のバイオマスから油を抽出すること、
を含み、抽出された油から、油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％以上の濃度でドコサヘキサエン酸を含有し、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークの温度が１５℃以下であるドコサヘキサエン酸含有油が得られる、ドコサヘキサエン酸含有油の製造方法。
【請求項２４】
得られたドコサヘキサエン酸含有油が粗油である請求項２３記載の製造方法。
【請求項２５】
抽出された油を精製することを更に含む請求項２３記載の製造方法。
【請求項２６】
微生物の培養を１０℃〜４０℃で行う請求項２１〜請求項２５のいずれか１項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ドコサヘキサエン酸含有油及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｎ−３系不飽和脂肪酸（以下、ｎ−３系ＰＵＦＡ）であるエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡと略すことがある）、ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡと略すことがある）等は、様々な生理作用を持ち、医薬品、健康食品、食品素材などとして利用されている。ＤＨＡを含む魚油を添加した飲料は特定保健用食品としても認可されている。ｎ−３系ＰＵＦＡは、国内外においてサプリメントとしての需要も非常に高い。これに伴い、高純度で大量に多価不飽和脂肪酸を生産することが求められている。このようなｎ−３系ＰＵＦＡのひとつであるＤＨＡを工業的に効率よく得るには、蒸留技術等を用いてＤＨＡ含有油中のＤＨＡを高濃度に濃縮する手法が用いられているが、その一方で、このような濃縮手法を適用する前の原料油としても、ＤＨＡを高濃度に含有する油を得ることが提案されている。【０００３】
例えば、特開２０１５−５０９７３３号公報は、所定の照明条件を組み合わせた培養条件でシゾキトリウム属に属する菌株を培養することにより、脂肪酸組成で４０％超のＤＨＡを含有する脂質を産生する微生物を開示している。
特開平１０−７２５９０号公報は、海洋性微生物として単離された特定のスラウストキトリウム属微生物から、ＤＨＡ含量４０％超のＤＨＡ含有油が得られることを開示している。【０００４】
一方、食品用油脂においては、結晶化の挙動に関する指標として示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークを測定することがある（例えば、特開平６−１４７１０号公報及び特開２００５−５０７０２８号公報）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＤＨＡを高濃度で含有する油であっても、ＤＨＡ以外の他の飽和又は不飽和脂肪酸の存在に起因して、異なる性状を示すことがある。例えば、同様の高濃度でＤＨＡを含有する油であっても、室温から温度が降下していくと、他の飽和又は不飽和脂肪酸の種類及び濃度によって、より低温時でＤＨＡ含有油の性状が変化し又は結晶化が生じて、固化し、その結果、配管目詰まりなどの取り扱い性が低下することがある。
ＤＨＡを高濃度で含有するバイオマスも、ＤＨＡ以外の他の飽和又は不飽和脂肪酸の存在に起因して、異なる性状を示すことがある。例えば、同様の高濃度でＤＨＡを含有する油を含有するバイオマスであっても、他の飽和又は不飽和脂肪酸の種類及び濃度によってバイオマス全体の性状が変化し、粘度が上昇し、その結果、高圧下での混練時にエクストルーダー等の装置の目詰まりを起こしやすいなどの取り扱い性が低下することがある。【０００６】
本開示は、高濃度にドコサヘキサエン酸を含有し、低温での安定性に優れたドコサヘキサエン酸含有油及びバイオマス、並びにこれらの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は以下の各態様を含む。
［１］  油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％以上の濃度でドコサヘキサエン酸を含有し、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークの温度が１５℃以下である、ドコサヘキサエン酸含有油。
［２］  示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークの温度が、１０℃以下である［１］に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［３］  ドコサヘキサエン酸の濃度が油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％〜９８重量％である［１］又は［２］に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［４］  示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークの温度が−５０℃〜１０℃である［１］〜［３］のいずれか１に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［５］  微生物油である［１］〜［４］のいずれか１に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［６］  微生物油が、オピストコンタ（Ｏｐｉｓｔｈｏｋｏｎｔａ）、アーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）、エクスカバータ（Ｅｘｃａｖａｔａ）、ＳＡＲ、並びにこれらに分類されないハプト藻類（Ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）及びクリプト藻類（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）に属する微生物、並びに細菌（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群より選択される少なくとも１種の微生物の微生物油である［５］に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［７］  微生物油が、ストラメノパイル（Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ）に属する微生物の微生物油である［５］に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［８］  微生物油が、ラビリンチュラ綱（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）に属する微生物の微生物油である［５］に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［９］  微生物油が、ヤブレツボカビ類（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄ）に属する微生物の微生物油である［５］に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［１０］  微生物油が、アウランティオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属微生物の微生物油である［５］に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［１１］  微生物油が、アウランティオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）のドコサヘキサエン酸生成変異株の微生物油である［５］に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［１２］  微生物油が、アウランティオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＮｉＤ２株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９６）、ＮｉＤ３株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９７）又は、当該株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株の微生物油である［５］に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［１３］  微生物油の粗油である［１］〜［１２］のいずれか１に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［１４］  微生物油の精製油である［１］〜［１２］のいずれか１に記載のドコサヘキサエン酸含有油。
［１５］  ［１］〜［１３］のいずれか１に記載のドコサヘキサエン酸含有油を含む微生物のバイオマス。
［１６］  ドコサヘキサエン酸の蓄積量が、培養物１リットルあたりの乾燥バイオマス重量の１８重量％以上である［１５］に記載のバイオマス。
［１７］  乾燥バイオマスである［１５］又は［１６］に記載のバイオマス。
［１８］  ［１］〜［１４］のいずれか１に記載のドコサヘキサエン酸含有油を生成し得るアウランティオキトリウム属微生物。
［１９］  アウランティオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＮｉＤ２株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９６）、又はＮｉＤ３株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９７）である［１８］に記載のアウランティオキトリウム属微生物。
［２０］  ＮｉＤ２株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９６）、又はＮｉＤ３株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９７）と実質的に同一の菌学的性質を有する［１９］に記載のアウランティオキトリウム属微生物。
［２１］  ［１８］〜［２０］のいずれか１に記載のアウランティオキトリウム属微生物を培養して、バイオマスを得ること、培養後のバイオマスを回収すること、を含む、［１５］〜［１７］のいずれか１に記載のバイオマスの製造方法。
［２２］  培養後に得られたバイオマスを乾燥することを更に含む［２１］に記載のバイオマスの製造方法。
［２３］  ［１８］〜［２０］のいずれか１に記載のアウランティオキトリウム属微生物を培養して、バイオマスを得ること、培養後のバイオマスを回収すること、回収後のバイオマスから油を抽出すること、を含み、抽出された油から、油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％以上の濃度でドコサヘキサエン酸を含有し、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークの温度が１５℃以下であるドコサヘキサエン酸含有油が得られる、ドコサヘキサエン酸含有油の製造方法。
［２４］  得られたドコサヘキサエン酸含有油が粗油である［２３］に記載の製造方法。
［２５］  抽出された油を精製することを更に含む［２３］に記載の製造方法。
［２６］  微生物の培養を１０℃〜４０℃で行う［２１］〜［２５］のいずれか１に記載の製造方法。
［２７］  ［１］〜［１４］のいずれか１に記載のドコサヘキサエン酸含有油、又は［１５］〜［１７］のいずれか１に記載のバイオマスを含有する、食品、サプリメント、医薬品、化粧品、又は飼料。
［２８］  ［１］〜［１４］のいずれか１に記載のドコサヘキサエン酸含有油、又は［１５］〜［１７］のいずれか１に記載のバイオマスの、食品、サプリメント、医薬品、化粧品、又は飼料の製造方法における使用。
【発明の効果】
【０００８】
本開示によれば、高濃度にドコサヘキサエン酸を含有し、低温での安定性に優れたドコサヘキサエン酸含有油及びバイオマス、並びにこれらの製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
一実施形態におけるドコサヘキサエン酸含有油は、油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％以上の濃度でドコサヘキサエン酸を含有し、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークの温度が１５℃以下のドコサヘキサエン酸含有油である。一実施形態における微生物のバイオマスは、当該ドコサヘキサエン酸含有油を含むバイオマスであり、一実施形態における微生物は、当該ドコサヘキサエン酸含有油を生成しうる微生物である。
【００１０】
本実施形態におけるドコサヘキサエン酸含有油は、高濃度にドコサヘキサエン酸を含むと共に、油中のドコサヘキサエン酸以外の他の成分、例えば、他の飽和又は不飽和脂肪酸が含まれていたとしても、性状が変化しにくく、また結晶化の速度及び挙動が適度に調整されて、低温で固化しにくい。このため、本実施形態におけるドコサヘキサエン酸含有油は、低温での安定性に優れ、適切な粘度を有し、広い温度範囲で滑らかな性状を示すことができる。この結果、ドコサヘキサエン酸含有油それ自体で、良好な取り扱い性を示すことができ、別途、粘度調整剤等の添加剤を併用する必要性を排除することができる。本実施形態に係るバイオマス及び乾燥バイオマスは、本実施形態に係るドコサヘキサエン酸を含有する油をバイオマス内に保持しているので、ＤＨＡを高濃度に含有し、低温での安定性に優れたドコサヘキサエン酸含有油を効率よく得るために好適である。本明細書における低温とは、室温、即ち２５℃よりも低い温度を意味し、例えば、１５℃以下、１０℃以下、又は５℃以下を指し、場合によって０℃以下であってもよい。
【００１１】
本明細書において、一実施形態にかかる特定の濃度でＤＨＡを含有し、特定のＤＳＣにより求められる吸熱ピークの温度を有するドコサヘキサエン酸含有油を、単に、「高濃度ＤＨＡ含有油（ｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ＤＨＡ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｏｉｌ）」と称する場合がある。
【００１２】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけではなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示すものとする。本明細書において、パーセントに関して「以下」又は「未満」との用語は、下限値を特に記載しない限り、０％又は、現状の手段では検出不可の値を含む範囲を意味する。
【００１３】
本明細書において、組成物中の各成分の量は、混合物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、混合物中に存在する当該複数の物質の合計の量を意味する。本明細書において、混合物中の各成分の濃度又は含有量（％）は、混合物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、混合物中に存在する当該複数の物質の合計の濃度又は含有量を意味する。
【００１４】
本明細書において、同一の対象について、１若しくは複数の上限値のみを規定する数値範囲と１若しくは複数の下限値のみを規定する数値範囲とが記載されている場合、特に断らない限り、１又は複数の上限値から任意に選択された上限値と、１又は複数の下限値から任意に選択された下限値とを組み合わせて成立する数値範囲も、本発明の一実施形態に含まれる。
【００１５】
本明細書において、「油」又は「油脂」とは、常温常圧、即ち２５℃１気圧下で水に不溶の有機物の混合物であり、トリグリセリドのみを含む油と、トリグリセリドを主成分とし、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、コレステロール、遊離脂肪酸等の他の脂質が含まれている粗油も含む。「油」又は「油脂」は、これらの脂質を含む組成物を意味する。本明細書において「粗油」とは、上述した脂質の混合物であって、生物から抽出された状態の油を意味する。本明細書において「精製油」とは、粗油に対して、脱ガム工程、脱酸工程、脱色工程、及び脱臭工程からなる群より選択される少なくとも１つの油脂の精製工程を行い、リン脂質及びステロールなどの目的物以外の物質を除去する精製処理を行った油を意味する。
【００１６】
本明細書において「微生物油」とは、微生物バイオマスを起源として得られる油を意味し、微生物油には、飽和又は不飽和脂肪酸、リン脂質、ステロール、グリセロール、セラミド、スフィンゴ脂質、テルペノイド、フラボノイド、トコフェロール等の油性成分が含まれる。飽和又は不飽和脂肪酸は、他の油性成分における構成脂肪酸として存在する場合もある。
【００１７】
本明細書において、用語「脂肪酸」には、遊離の飽和脂肪酸及び遊離の不飽和脂肪酸それら自体だけでなく、遊離の飽和若しくは不飽和脂肪酸、飽和若しくは不飽和脂肪酸アルキルエステル、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、ステリルエステル等中に含まれる構成単位としての脂肪酸も含まれ、構成脂肪酸とも言い換えられ得る。
【００１８】
本明細書において、特に断らない限り、又は特に示さない限り、存在する若しくは使用する脂肪酸に関して言及する場合、如何なる形態の脂肪酸含有化合物の存在又は使用も含まれる。脂肪酸を含む化合物の形態としては、遊離脂肪酸形態、脂肪酸アルキルエステル形態、グリセリルエステル形態、リン脂質の形態、ステリルエステル形態等を挙げることができる。ある脂肪酸が特定された場合、ひとつの形態で存在してもよく、２つ以上の形態の混合物として存在してもよい。
【００１９】
脂肪酸を表記する際に、炭素数、二重結合の数及び二重結合の場所を、それぞれ数字とアルファベットを用いて簡略的に表した数値表現を用いることがある。例えば、炭素数２０の飽和脂肪酸は「Ｃ２０：０」と表記され、炭素数１８の一価不飽和脂肪酸は「Ｃ１８：１」等と表記され、ジホモ−γ−リノレン酸は「Ｃ２０：３，ｎ−６」等と表記され、アラキドン酸は「Ｃ２０：４，ｎ−６」等と表記され得る。ここで、「ｎ−６」はω−６としても表記されるが、これは、最後の炭素（ω）からカルボキシに向かって数えたときの最初の二重結合の結合位置が６番目であることを示す。この方法は当業者には周知であり、この方法に従って表記された脂肪酸については、当業者であれば容易に特定することができる。
【００２０】
本明細書における脂肪酸の濃度は、特に断らない限り、脂肪酸組成に基づいて決定する。脂肪酸組成は、常法に従って求めることができる。具体的には、測定対象となる油を、低級アルコールと触媒を用いてエステル化して得た脂肪酸低級アルキルエステルを用いる。次いで、得られた脂肪酸低級アルキルエステルを、試料として、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）付きのガスクロマトグラフを用いて分析する。得られたガスクロマトグラフィーのチャートにおいて各脂肪酸に相当するピークを同定し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ積分アルゴリズム（リビジョンＣ．０１．０３［３７］、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、各脂肪酸のピーク面積を求める。脂肪酸のピーク面積の総和に対する各ピーク面積の百分率（面積％）をもって、脂肪酸組成とする。上述の測定方法により得られた面積％による値は、試料中の各脂肪酸の重量％による値と同一として互換可能に使用でき、本発明における脂肪酸組成は、上述の測定方法により得られた面積％を「重量％」との表記で定義する。日本油化学会（ＪＯＣＳ）制定  基準油脂分析試験法  ２０１３年版  ２．４．２．１−２０１３  脂肪酸組成（ＦＩＤ恒温ガスクロマトグラフ法)及び、同２．４．２．２−２０１３  脂肪酸組成（ＦＩＤ昇温ガスクロマトグラフ法）を参照のこと。
【００２１】
本明細書において、「バイオマス」という用語は、所定の領域又は生態系で成長した所定の時点の細胞の集合物又は塊を指す。この領域又は生態系は、天然に存在する環境、例えば、水域でもよいし、合成環境、例えば、開放型若しくは密閉型の発酵槽又はバイオリアクタでもよい。本明細書において、乾燥工程後に得られるバイオマスを、特に「乾燥バイオマス」と称することがある。
【００２２】
（１）高濃度ＤＨＡ含有油
高濃度ＤＨＡ含有油は、油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％以上の濃度でＤＨＡを含有し、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークの温度が１５℃以下である。
高濃度ＤＨＡ含有油中のＤＨＡの濃度は、油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％以上、４３重量％以上、５０重量％以上、５５重量％以上、６０重量％以上、６５重量％以上、又は７０重量％以上とすることができる。高濃度ＤＨＡ含有油中のＤＨＡの濃度は、油中の脂肪酸の合計重量の９８重量％以下、９０重量％以下、又は８０重量％以下であってもよい。高濃度ＤＨＡ含有油中のＤＨＡ濃度の上限値及び下限値は、いずれを組み合わせてもよい。例えば、高濃度ＤＨＡ含有油のＤＨＡ濃度は、油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％〜９８重量％、４３重量％〜９８重量％、５０重量％〜９８重量％、６０重量％〜９８重量％、６５重量％〜９８重量％、又は７０重量％〜９８重量％であってもよい。高濃度ＤＨＡ含有油中のＤＨＡの濃度が高いほど、高濃度ＤＨＡ含有油におけるＤＨＡの機能がより強く発揮されると期待できる。
【００２３】
高濃度ＤＨＡ含有油は、ＤＨＡ以外の脂肪酸を含有することができる。高濃度ＤＨＡ含有油に含まれるＤＨＡ以外の脂肪酸を、以下、「低濃度脂肪酸」と称することがある。低濃度脂肪酸は、飽和脂肪酸又は不飽和脂肪酸であってもよく、油中に一種又は複数種組み合わせて含まれていてもよい。低濃度脂肪酸は、油中の脂肪酸の合計重量の６０重量％未満とすることができ、２重量％超且つ６０重量％未満とすることができ、５重量％〜５０重量％、又は５重量％〜３０重量％とすることができる。低濃度脂肪酸の濃度は、複数種を組み合わせた場合に合計の濃度としてはＤＨＡよりも高い濃度で存在することができ、この場合、低濃度脂肪酸それぞれの濃度は、ＤＨＡの濃度を超えないことが好ましい。高濃度ＤＨＡ含有油の低温での安定性の観点から、高濃度ＤＨＡ含有油は、油中に存在する低濃度脂肪酸の合計濃度がＤＨＡの濃度を超えないことが好ましい。低濃度脂肪酸がこの範囲内であれば、ＤＨＡ含有油の低温における粘度が適切であり、取り扱い性が大きく損なわれない傾向がある。
【００２４】
低濃度脂肪酸として存在し得る不飽和脂肪酸としては、例えば、炭素数２０以上の二価以上、好ましくは三価以上の不飽和脂肪酸を挙げることができる。炭素数２０以上の三価以上の不飽和脂肪酸としては、炭素数２０以上２２以下の多価不飽和脂肪酸を挙げることができ、具体的には、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２，ｎ−９、ＥＤＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２０：３，ｎ−６、ＤＧＬＡ）、ミード酸（Ｃ２０：３，ｎ−９、ＭＡ）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４，ｎ−３、ＥＴＡ）、アラキドン酸（Ｃ２０：４，ｎ−６、ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，ｎ−３、ＥＰＡ）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４，ｎ−６、ＤＴＡ）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−３、ｎ−３ＤＰＡ）及びドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−６、ｎ−６ＤＰＡ）等を挙げることができる。
【００２５】
例えば、高濃度ＤＨＡ含有油は、ｎ−６ＤＰＡを、例えば油中の脂肪酸の合計重量の５重量％以上、又は８重量％以上で含むことができ、２０重量％以下、又は１２重量％以下とすることができる。高濃度ＤＨＡ含有油中のｎ−６ＤＰＡの含有量がこの範囲内であれば、ＤＨＡ含有油の低温における粘度が適切であり、取り扱い性が大きく損なわれない傾向がある。
【００２６】
これらの低濃度脂肪酸として存在し得る不飽和脂肪酸の合計の濃度は、油中の脂肪酸の合計重量の５重量％以上、又は８重量％以上で含むことができ、３０重量％以下、２０重量％以下、又は１２重量％以下とすることができる。低濃度脂肪酸として存在しうる不飽和脂肪酸の合計の濃度が３０重量％以下の高濃度ＤＨＡ含有油は、ＤＨＡを効率よく得ることが望まれる用途に好ましく用いられることができ、また、低温での安定性がより向上し得る。
【００２７】
低濃度脂肪酸として存在しうる飽和脂肪酸としては、例えば、炭素数１２以上の飽和脂肪酸を挙げることができる。炭素数１２以上の飽和脂肪酸としては、ラウリン酸（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、アラキジン酸（Ｃ２０：０）、ベヘン酸（Ｃ２２：０）、リグノセリン酸（Ｃ２４：０）等を挙げることができる。これらの飽和脂肪酸の濃度が所定の範囲に制限される場合、高濃度ＤＨＡ含有油は、低温での安定性がより良好であり、取り扱い性により優れる。
【００２８】
高濃度ＤＨＡ含有油におけるラウリン酸（Ｃ１２：０）の濃度は、１．０重量％以下、０．５重量％以下、０．３重量％以下、又は０．１重量％とすることができる。高濃度ＤＨＡ含有油におけるラウリン酸とＤＨＡとの濃度比は、ラウリン酸／ＤＨＡの比として、０．３以下、０．２５以下、又は０．２以下とすることができる。高濃度ＤＨＡ含有油におけるラウリン酸の含有量の下限値は、例えば０．０５重量％であってもよい。
【００２９】
高濃度ＤＨＡ含有油におけるミリスチン酸（Ｃ１４：０）の濃度は、１０．０重量％以下、８．０重量％以下、５．０重量％以下、又は３．０重量％以下、又は２．５重量％以下とすることができる。高濃度ＤＨＡ含有油におけるミリスチン酸とＤＨＡとの濃度比は、ミリスチン酸／ＤＨＡの比として、０．３以下、０．２以下、又は０．１以下とすることができる。高濃度ＤＨＡ含有油におけるミリスチン酸の含有量の下限値は、例えば０．１重量％であってもよい。
【００３０】
高濃度ＤＨＡ含有油におけるパルミチン酸（Ｃ１６：０）の濃度は、４０．０重量％以下、３５．０重量％以下、又は３０．０重量％以下とすることができる。高濃度ＤＨＡ含有油におけるパルミチン酸とＤＨＡとの濃度比は、パルミチン酸／ＤＨＡの比として、０．８以下、又は０．６以下とすることができる。高濃度ＤＨＡ含有油におけるパルミチン酸の含有量の下限値は、例えば５．０重量％であってもよい。
【００３１】
高濃度ＤＨＡ含有油におけるステアリン酸（Ｃ１８：０）の濃度は、１８．０重量％以下、１５．０重量％以下、１０．０重量％以下、５．０重量％以下、２．０重量％以下、又は１．５重量％とすることができる。高濃度ＤＨＡ含有油におけるステアリン酸とＤＨＡとの濃度比は、ステアリン酸／ＤＨＡの比として、０．５以下、０．３以下、又は０．１以下とすることができ。高濃度ＤＨＡ含有油におけるステアリン酸の含有量の下限値は、例えば０．３重量％であってもよい。
【００３２】
高濃度ＤＨＡ含有油では、ＤＳＣにより求められる吸熱ピークの温度が１５℃以下である。ＤＳＣにより求められる吸熱ピークの温度が１５℃以下の場合に、高濃度ＤＨＡ含有油は適切な粘性を示すことができ、取り扱い性が良好となる。例えば、高濃度ＤＨＡ含有油を他の組成物に配合を行う場合に粘度の観点から配合しやすいという利点を有する。高濃度ＤＨＡ含有油のＤＳＣにより求められる吸熱ピークの温度を、本明細書では、「ＤＳＣ流動点」と称する場合がある。
ＤＳＣ流動点は、以下のようにして測定される。
示差走査熱量測定装置  ＤＳＣ  ３５００  Ｓｉｒｉｕｓ、ＮＥＴＺＳＣＨ社製を用い、サンプルパンに測定試料を１０ｍｇ秤量し、５０℃で５分間加温した後、５０℃から−６０℃まで３℃／分の冷却速度で冷却し、その後、−６０℃から５０℃まで１０℃／分の昇温速度で昇温して測定する。得られたＤＳＣ曲線における吸熱ピークのうちの極大値における温度を、ＤＳＣ流動点（℃）とする。
【００３３】
高濃度ＤＨＡ含有油のＤＳＣ流動点は、１０℃以下、５℃以下、０℃以下、−５℃以下、又は−１０℃以下であってもよい。高濃度ＤＨＡ含有油のＤＳＣ流動点の下限値としては、特に制限はないが、例えば、−６５℃、又は−５０℃とすることができる。ＤＳＣ流動点の上限値がより低い場合には、低温での安定性により優れ、取り扱い性がより高まる傾向がある。特定理論に限定されないが、ＤＳＣ流動点の上限値がより低い場合には、炭素数１２〜炭素数２０の飽和脂肪酸の濃度が低い傾向があり、この結果、低温での取り扱い性が向上すると推測される。高濃度ＤＨＡ含有油のＤＳＣ流動点の上限値及び下限値は、いずれを組み合わせてもよい。例えば、−６５℃〜１５℃、−５０℃〜１０℃、−５０℃〜５℃、−５０〜０℃、又は−５０℃〜−５℃とすることができる。
【００３４】
高濃度ＤＨＡ含有油では、油に対して不溶性成分の含有量が１０重量％以下、５重量％以下、又は３重量％以下のものであることができる。油に対して不溶性成分が１０重量％又はそれよりの少ない場合、高濃度ＤＨＡ含有油は、澄明性が高く、取り扱い性に優れる。高濃度ＤＨＡ含有油中の不溶性成分とは、高濃度ＤＨＡ含有油を２５℃において１時間静置させたときに生じる沈殿物を意味する。高濃度ＤＨＡ含有油中の不溶性成分の量は、以下のようにして測定する。
高濃度ＤＨＡ含有油１０００ｍｇを、秤量した容量２ｍｌのエッペンドルフ製のマイクロテストチューブに採取し、２５℃で１時間静置した後、微量高速冷却遠心機により沈殿物を回収し、精密天秤により沈殿物重量を測定し、微生物油１０００ｍｇ中の重量％として算出する。微量高速冷却遠心機としては、ＭＸ−３００、株式会社トミー精工、を使用する。
【００３５】
高濃度ＤＨＡ含有油は、上述した所定のＤＳＣ流動点及びＤＨＡ濃度を有するものであれば由来には特に限定されない。高濃度ＤＨＡ含有油は、植物、魚類、微生物等の生物に由来する生物油であることができ、例えば、微生物油であることができる。生物油とは、生物のバイオマスを起源として得られたもの意味し、微生物油とは、既述のとおり、微生物のバイオマスを起源として得られた油を意味する。また、生物油を提供する生物は、遺伝子組換え体であってもよい。
【００３６】
高濃度ＤＨＡ含有油は、微生物油の粗油又は精製油とすることができる。本明細書において「微生物油の粗油」とは、微生物のバイオマスから抽出され、後述する精製工程を経ていない状態の組成物を指す。本明細書において「微生物の精製油」とは、微生物の粗油に対して脱ガム工程、脱酸工程、活性白土又は活性炭を用いた脱色工程、水洗工程、水蒸気蒸留等による脱臭工程などを行って、リン脂質及びステロールなどの目的物以外の物質を除去する粗油精製工程を経て得た組成物を指す。
【００３７】
微生物としては、高濃度ＤＨＡ含有油を生成し得る微生物であればよく、Ａｄｌらの提唱する分類体系（Ａｄｌ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．５９（５）：４２９−４９３（２０１２））におけるオピストコンタ（Ｏｐｉｓｔｈｏｋｏｎｔａ）、アーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）、エクスカバータ（Ｅｘｃａｖａｔａ）、ＳＡＲ、並びにこれらに分類されないハプト藻類（Ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）及びクリプト藻類（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）に属する微生物、並びに細菌（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を挙げることができ、これらを単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。即ち、微生物油としては、これらの微生物のうち、１種の微生物から得られた微生物油としてもよく、２種以上の微生物から得られた微生物油の混合物であってもよい。
【００３８】
オピストコンタとしては、菌類（ｆｕｎｇｉ）に属する微生物を挙げることができる。菌類としては、酵母（Ｙｅａｓｔ）、糸状菌（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ）を挙げることができる。酵母としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属微生物、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属微生物、及びトリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｎ）属微生物からなる群より選択される少なくとも１種の微生物を挙げることができる。糸状菌としては、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属微生物、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属微生物及びフィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属微生物からなる群より選択される少なくとも１種の微生物を挙げることができる。なかでも、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に属する微生物が更に好ましい。モルティエレラ属に属する微生物としては、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ) 、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）を挙げることができる。
【００３９】
アーケプラスチダとしては、例えば、緑藻類（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａ）の微生物を挙げることができる。緑藻類の微生物としては、例えばボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードコリシスティス（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）、イカダモ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ及びＤｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）に属する微生物を挙げることができる。
【００４０】
エクスカバータとしては、例えば、ユーグレナ藻類（Ｅｕｇｌｅｎｉｄａ）の微生物を挙げることができる。ユーグレナ藻綱の微生物としては、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａｃｅａｅ）科に属する微生物を挙げることができる。ミドリムシ科に属する微生物としては、例えば、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属に属する微生物を挙げることができる。
【００４１】
ＳＡＲとしては、ストラメノパイル、アルベオラータ及びリザリア（Ｒｈｉｚａｒｉａ）の微生物が該当する。ストラメノパイルとしては、ビコソエカ類（Ｂｉｃｏｓｏｅｃｉｄａ）、ラビリンチュラ類（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）、ブラストシスチス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ）、無殻太陽虫（Ａｃｔｉｎｏｐｈｙｉｄａ）、オパリナ類（Ｏｐａｌｉｎａｔａ）、プラシディア類（Ｐｌａｃｉｄｉｄａ）、卵菌類（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）、サカゲツボカビ類（Ｈｙｐｈｏｃｈｙｔｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）、ヴェロパイエラ（Ｄｅｖｅｌｏｐａｙｅｌｌａ）、黄金色藻（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ）、真正眼点藻（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）、ファエオタムニオン藻（Ｐｈａｅｏｔｈａｍｎｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、ピングイオ藻（Ｐｉｎｇｕｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、ラフィド藻（Ｒａｐｈｉｄｏｐｈｙｃｅａｅ）、シヌラ藻（Ｓｙｎｕｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、黄緑藻（Ｘａｎｔｅｘｙｏｐｈｙｃｅａｅ）、褐藻（Ｐｈａｅｏｐｈｙｃｅａｅ）、シゾクラディア藻（Ｓｃｈｉｚｏｃｌａｄｉｏｐｈｙｃｅａｅ）、クリソメリス藻（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｒｏｐｈｙｃｅａｅ）、ディクチオカ藻（Ｄｉｃｔｙｏｃｈｏｐｈｙｃｅａｅ）、ボリド藻（Ｂｏｌｉｄｏｐｈｉｃｅａｅ）、ペラゴ藻（Ｐｅｌａｇｏｐｈｙｃｅａｅ）及び珪藻（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ）微生物からなる群より選択される少なくとも１種の微生物を挙げることができる。アルベオラータとしては、繊毛虫（Ｃｉｌｉｏｐｈｏｒａ）、アピコンプレクサ（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）、渦鞭毛藻類（Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ）に属する微生物を挙げることができる。渦鞭毛藻類としては、例えばクリプテコデニィウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属に属する微生物を挙げることができる。クリプテコデニィウム属に属する微生物としては、例えば、クリプテコディニウム・コーニイ（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ）を挙げることができる。
【００４２】
なかでも微生物としては、ラビリンチュラ綱に属する微生物が好ましく、その中でも、ヤブレツボカビ類（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｔｒｉｄ）に属する微生物が特に好ましい。ヤブレツボカビ類に属する微生物としては、例えば、アプラノキトリウム属（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、イァポノキトリウム属（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ラビリンチュロイデス属（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｏｉｄｅｓ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｙｔｒｉｕｍ）、ヤブレツボカビ属（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ウルケニア属（Ｕｌｋｅｎｉａ）、アウランティオキトリウム属（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、オブロンギキトリウム属（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ボトリオキトリウム属（Ｂｏｔｒｙｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、パリエティキトリウム属（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シクヨイドキトリウム属（Ｓｉｃｙｏｉｄｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に属する微生物が好ましく、その中でも特に好ましくは、アウランティオキトリウム属微生物からなる群より選択された少なくとも１種の微生物を選択することができる。
【００４３】
アウランティオキトリウム属微生物としては、アウランティオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）、及びアウランティオキトリウム・マングローベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）からなる群より選択される少なくとも１つを選択することができ、特に微生物の増殖性の点で、アウランティオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）を選択することができる。
【００４４】
ハプト藻及びクリプト藻に属する微生物としては、オピストコンタ（Ｏｐｉｓｔｈｏｋｏｎｔａ）、アーケプラスチダ（Ａｒｃｈａｅｐｌａｓｔｉｄａ）、エクスカバータ（Ｅｘｃａｖａｔａ）、ＳＡＲのいずれにも属さないハプト藻類（Ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）及びクリプト藻類（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）に属する微生物が該当する。具体的には、ハプト藻綱（Ｈａｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）、及びクリプト藻綱（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）が挙げられる。
【００４５】
細菌（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）としては、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フィルミクテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）の微生物を挙げることができる。プロテオバクテリアに属する微生物としては、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が挙げられる。フィルミクテスに属する微生物としては、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。
【００４６】
上述した微生物のうち、ストラメノパイルをＤＨＡ生産のための微生物として選択した場合には、ＤＨＡの生産効率がより向上する傾向がある。また、ストラメノパイルのうち、海洋又は汽水域に存在する海洋性微生物が、ＤＨＡの生産効率が比較的高い。海洋性微生物の中でも、ヤブレツボカビ属の微生物、アウランティオキトリウム属の微生物、シゾキトリウム属の微生物、及びウルケニア属の微生物と、アルベオラータのうちのクリプテコディニウム属の微生物と、これらの変異株とは、特にＤＨＡを、他の微生物と比較して、より生産性よく生成する傾向がある。本明細書では、これらの微生物を特に「ＤＨＡ高生産性微生物」と称する場合がある。高濃度ＤＨＡ含有油としては、ＤＨＡ高生産性微生物を起源として得られるＤＨＡ高生産性微生物油、細菌バイオマスを起源として得られる細菌油、真菌バイオマスを起源として得られる真菌油、糸状菌バイオマスを起源として得られる糸状菌油等が挙げられる。なかでも、ＤＨＡ高生産性微生物油は、特にＤＨＡ濃度が高い傾向が強い。
【００４７】
一般に、微生物の分類については未確定の部分があるため、上述した分類学上の位置以外の基準に基づいて、高濃度ＤＨＡ含有油を生成し得る微生物を選択することができる。このような分類学上の位置以外の基準としては、形態、及び脂肪酸組成を挙げることができる。微生物を形態に基づいて選択する場合には、少なくとも１つのべん毛基部（basal body）を持つこと、細胞内に油球に代表される脂質を蓄積する構造物を含むこと等が挙げられる。脂肪酸組成に基づいて選択する場合には、炭素数２０以上の三価以上の不飽和脂肪酸、具体的には、エイコサジエン酸（Ｃ２０：２，ｎ−９、ＥＤＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸（Ｃ２０：３，ｎ−６、ＤＧＬＡ）、ミード酸（Ｃ２０：３，ｎ−９、ＭＡ）、エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４，ｎ−３、ＥＴＡ）、アラキドン酸（Ｃ２０：４，ｎ−６、ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（Ｃ２０：５，ｎ−３、ＥＰＡ）、ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４，ｎ−６、ＤＴＡ）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−３、ｎ−３ＤＰＡ）及びドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５，ｎ−６、ｎ−６ＤＰＡ）からなる群より選択される少なくとも１つを含むことが挙げられる。微生物の選択は、形態及び脂肪酸組成の双方に基づいて行ってもよく、いずれか一方のみに基づいて行ってもよい。
【００４８】
上述した微生物は、高濃度ＤＨＡ含有油生成能を有する限り、天然の環境下から採取される天然株であってもよく、天然株に対して人為的又は偶発的に突然変異が誘導されて得られる高濃度ＤＨＡ含有油生成変異株であってもよい。
【００４９】
変異株の作出方法としては、従来公知の突然変異誘導方法であれば、特に制限することなく用いることができる。変異株の作出方法としては、放射線照射、突然変異誘導物質等による処理を挙げることができる。放射線照射及び突然変異誘導物質の少なくとも一方を用いて突然変異誘導処理を行う場合には、微生物の死滅率が９８％、９９％、又は９９．９％となるように処理を行うことができる。このような死滅率による突然変異誘導処理によって、高濃度ＤＨＡ含有油を得るために有用な微生物を高頻度に取得できる。
【００５０】
突然変異誘導物質を用いた処理による突然変異誘導方法では、選択された突然変異誘導物質を、対象となる微生物に添加して、突然変異を誘導する。突然変異誘導物質の適用量としては、突然変異を誘導可能な適用量であればよく、微生物の種、微生物の状態、微生物に対する負荷の程度、突然変異誘導物質の種類等に応じて適宜選択される。
【００５１】
選択可能な突然変異誘導物質としては、限定されないが、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、メタンスルホン酸メチル（ＭＭＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、トリエチルメラミン（ＴＥＭ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＭＮＵ）、プロカルバジン、クロラムブシル、シクロホスファミド、硫酸ジエチル、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、２−アミノプリン、７，１２ジメチル−ベンズ（ａ）アントラセン（ＤＭＢＡ）、エチレンオキシド、ヘキサメチルホスホラミド、ブスルファン、ジエポキシアルカン類（ジエポキシオクタン（ＤＥＯ）、ジエポキシブタン（ＢＥＢ）等）、２−メトキシ−６−クロロ−９［３−（エチル−２−クロロエチル）アミノプロピルアミノ］アクリジン・２塩酸塩（ＩＣＲ−１７０）、ホルムアルデヒドなどが挙げられ、これらの突然変異誘導物質からなる群より選択される少なくとも１つを選択することができる。
【００５２】
突然変異誘導物質による処理の対象となる微生物の状態、即ち、密度、成育ステージ等については、微生物の種類及び成育状態等に応じて適宜選択できる。突然変異誘導物質による処理の対象となる微生物の形態は、生育菌体（栄養細胞や菌糸など）でもよく、遊走細胞や胞子でもよい。高濃度ＤＨＡ含有油を生産する変異株を効率よく得る点で、処理の対象となる微生物は、遊走細胞を形成している微生物とすることができる。
【００５３】
高濃度ＤＨＡ含有油を得るために有用な突然変異誘導処理対象となる微生物は、取得効率の点で、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ヤブレツボカビ属(Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ)、アウランティオキトリウム属(Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ)、アプラノキトリウム属の微生物（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に属する微生物が好ましく、その中でも特に好ましくは、アウランティオキトリウム属微生物からなる群より選択される少なくとも１種の微生物に、突然変異誘導物質により処理を行うことによって得られた変異株とすることができる。
【００５４】
高濃度ＤＨＡ含有油を得るために有用な微生物は、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ヤブレツボカビ属(Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ)、アウランティオキトリウム属(Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ)、アプラノキトリウム属の微生物（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）に属する微生物、その中でも特に好ましくは、アウランティオキトリウム属微生物からなる群より選択される少なくとも１種の微生物であって、遊走細胞を形成する成育ステージの微生物に対して、微生物の死滅率が９８％、９９％、又は９９．９％となるように、突然変異誘導物質、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、及びＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）からなる群より選択される少なくとも１種の薬剤により処理を行うことによって得られた変異株とすることができる。これらの変異株は、いっそう効率よく、高濃度ＤＨＡ含有油を生成し得る。
【００５５】
あるいは、高濃度ＤＨＡ含有油を得るために有用な微生物は、アウランティオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）、アウランティオキトリウム・マングローベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）等からなる群より選択される少なくとも１種の微生物であって、遊走細胞を形成する成育ステージの微生物に対して、微生物の死滅率が９８％、９９％、又は９９．９％となるように、突然変異誘導物質、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ＥＮＵ）、及びＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）からなる群より選択される少なくとも１種の薬剤により処理を行うことによって得られた変異株とすることができる。これらの変異株は、いっそう効率よく、高濃度ＤＨＡ含有油を生成し得る。
【００５６】
高濃度ＤＨＡ含有油を得るために有用な変異株としては、例えば、アウランティオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＮｉＤ２株及びＮｉＤ３株、並びに当該菌株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株を挙げることができる。アウランティオキトリウム・リマシナムＮｉＤ２株及びＮｉＤ３株、並びに当該菌株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株は、本明細書で規定する高濃度ＤＨＡ含有油を、安定して生産することができる。アウランティオキトリウム・リマシナムＮｉＤ２株及びＮｉＤ３株、並びにそれらの親株であるＮＢＬ−８株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２０号室）に平成２７年１０月７日付でそれぞれ寄託されている（ＮＢＬ−８株：受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９５、ＮｉＤ２株：受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９６、ＮｉＤ３株：受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９７）。
【００５７】
高濃度ＤＨＡ含有油が微生物油である場合、高濃度ＤＨＡ含有油は、微生物油に特有の他の成分を含むことができ、微生物に特有な脂肪酸組成を示すことができ、又は微生物に特有な他の成分を含み且つ特有な脂肪酸組成を示すことができる。微生物油に特有な他の成分として、リン脂質、遊離脂肪酸、脂肪酸エステル、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロール、ステロール及びステロールエステル、カロテノイド、キサントフィル、ユビキノン、炭化水素、イソプレノイド誘導化合物及びこれらいずれかが代謝された化合物等を挙げることができる。
【００５８】
微生物油である高濃度ＤＨＡ含有油は、化学合成の工程を経ずに得ることができるため、有機溶媒の含有量が低いものであることができる。本明細書における有機溶媒は、脂肪酸以外のものであって、少なくとも１つの炭素原子を有する疎水性又は親水性の溶媒を意味し、極性溶媒、非極性溶媒、水混和性溶媒、水不混和性溶媒、及びそれらの２以上の組み合わせが挙げられる。有機溶媒としては、置換又は未置換の、飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、アルコール、エーテル、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、ニトリル、アミド等を挙げることができ、これらは単独で又は２つ以上の組み合わせであってもよい。
【００５９】
高濃度ＤＨＡ含有油における残留有機溶媒の総含有量は、５０００ｐｐｍ以下、３０００ｐｐｍ以下、２０００ｐｐｍ以下、又は１０００ｐｐｍ以下とすることができる。
高濃度ＤＨＡ含有油は、有機溶媒のなかでも、メタノール、エタノール、アセトン及びヘキサンからなる群より選択される少なくとも１つの含有量が低いものであってもよい。これらの有機溶媒は、それぞれ独立に、５００ｐｐｍ以下、３００ｐｐｍ以下、又は２００ｐｐｍ以下とすることができる。例えば、高濃度ＤＨＡ含有油におけるメタノール、エタノール、アセトン及びヘキサンの含有量のいずれもが、５００ｐｐｍ以下、３００ｐｐｍ以下、又は２００ｐｐｍ以下とすることができる。
【００６０】
高濃度ＤＨＡ含有油が微生物油の粗油である場合、ＤＨＡの濃度は、油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％以上、４３重量％以上、５０重量％以上、５５重量％以上、６０重量％以上、６５重量％以上、又は７０重量％以上とすることができる。高濃度ＤＨＡ含有油が微生物の粗油である場合、ＤＨＡの濃度は、油中の脂肪酸の合計重量の９５重量％以下、９０重量％以下、８５重量％、又は８０重量％以下であってもよい。高濃度ＤＨＡ含有油中のＤＨＡ濃度の上限値及び下限値は、いずれを組み合わせてもよい。例えば、高濃度ＤＨＡ含有油のＤＨＡ濃度は、油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％〜９５重量％、４０重量％〜８５重量％、４０重量％〜８０重量％、６０重量％〜８０重量％、７０重量％〜８５重量％、又は７０重量％〜９５重量％とすることができる。
【００６１】
低温での安定性の観点から、高濃度ＤＨＡ含有油は、以下のいずれかであってもよい：
油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％〜９５重量％のＤＨＡを含有し、ＤＳＣ流動点が１０℃以下であるアウランティオキトリウム・リナシナムの微生物油；
油中の脂肪酸の合計重量の６５重量％〜８０重量％のＤＨＡを含有し、ＤＳＣ流動点が５℃以下であるアウランティオキトリウム属微生物の微生物油；
油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％〜９５重量％のＤＨＡを含有し、ＤＳＣ流動点が１０℃以下であるアウランティオキトリウム・リナシナムの微生物油の粗油；
油中の脂肪酸の合計重量の６５重量％〜８０重量％のＤＨＡを含有し、ＤＳＣ流動点が５℃以下であるアウランティオキトリウム属微生物の微生物油の粗油；
油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％〜９５重量％のＤＨＡを含有し、ＤＳＣ流動点が−５０℃〜１０℃以下であるアウランティオキトリウム属微生物の微生物油；
油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％〜８０重量％のＤＨＡを含有し、ＤＳＣ流動点が−５０℃〜５℃以下であるアウランティオキトリウム・リナシナムの微生物油の粗油。
【００６２】
高濃度ＤＨＡ含有油は、後述するようにバイオマスに含まれていてもよい。高濃度ＤＨＡ含有油は、特定の微生物バイオマス、例えば、アウランティオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＮｉＤ２株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９６）、ＮｉＤ３株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２２９７）及びこれら株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株のバイオマスに含まれていてもよい。
【００６３】
（２）ＤＨＡ含有バイオマス
本開示の一実施形態におけるＤＨＡ含有バイオマスは、上述した高濃度ＤＨＡ含有油、すなわち、油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％以上の濃度でＤＨＡを含有し、ＤＳＣにより求められる吸熱ピークの温度が１５℃以下である油を含む。本明細書では、本開示の一実施形態における高濃度ＤＨＡ含有油を含有するバイオマスを、単に、「高濃度ＤＨＡ含有バイオマス」と称する場合がある。
【００６４】
高濃度ＤＨＡ含有バイオマスは、上述した高濃度ＤＨＡ含有油を生成し得る微生物の集合体又は塊のものであれば、如何なる形態のものを包含することができる。例えば、高濃度ＤＨＡ含有バイオマスは、培養液中の微生物の集合体又は塊であってもよく、培養液から回収された後の微生物の集合体又は塊であってもよく、培養液から回収された後に乾燥処理等を経た微生物の集合体又は塊であってもよい。乾燥処理を経た高濃度ＤＨＡ含有バイオマスを特に示す場合、本明細書では「高濃度ＤＨＡ含有乾燥バイオマス」と称する場合がある。高濃度ＤＨＡ含有乾燥バイオマスは、乾燥形態であるので、取り扱いがより容易となる傾向がある。
【００６５】
高濃度ＤＨＡ含有バイオマス又は高濃度ＤＨＡ含有乾燥バイオマスにおいて、高濃度ＤＨＡ含有油は、バイオマスを構成する個々の菌の細胞内に存在していてもよく、培養されたバイオマスから、バイオマスの一部として回収可能であれば、細胞外に放出されたものであってもよい。
【００６６】
高濃度ＤＨＡ含有バイオマスを構成する微生物については、以下に特記する事項以外は、高濃度ＤＨＡ含有油における微生物として記述した事項を、バイオマスにおける微生物に置き換えた事項としてそのまま適用する。
高濃度ＤＨＡ含有バイオマスにおける微生物は、微生物の増殖性及び脂質蓄積性の点で、ストラメノパイル、好ましくはヤブレツボカビ類に属する微生物、及び、アルベオラータ、好ましくはクリプテコディニウム属に属する微生物を挙げることができ、更に好ましくはシゾキトリウム属の微生物、クリプテコディニウム属の微生物、及びアウランティオキトリウム属の微生物からなる群より選択された少なくとも１種の微生物を選択することができ、特に、アウランティオキトリウム属微生物からなる群より選択される少なくとも１種を選択することができる。これらの微生物は、ＤＨＡ含有油生成能を有する限り、天然の環境下から採取される天然株であってもよく、天然株に対して人為的又は偶発的に突然変異が誘導されて得られる変異株であってもよい。高濃度ＤＨＡ含有バイオマスを構成し得る変異株については、高濃度ＤＨＡ含有油における変異株について記述した事項を、バイオマスにおける変異株に置き換えてそのまま適用する。高濃度ＤＨＡ含有バイオマスにおける微生物の変異株としては、例えば、アウランティオキトリウム・リナシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）ＮｉＤ２、ＮｉＤ３株及びこれらの菌株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株を挙げることができる。
【００６７】
ＮｉＤ２株及びＮｉＤ３株、並びにこれらの菌株と実施的に同一の菌学的性質を有する菌株は、これらの菌株を含むバイオマス又は細胞内に、脂肪酸の合計重量の４０重量％以上の濃度でＤＨＡ含み、ＤＳＣ流動点が１５℃以下である高濃度ＤＨＡ含有油を生成することができる。これらの菌株が生成する高濃度ＤＨＡ含有油では、油中のｎ−６ＤＰＡの含有量が、これらの菌株の親株が生成する油中での含有量よりも高い傾向を示す場合、パルミチン酸の含有量が、これらの菌株の親株が生成する油中での含有量よりも低い傾向を示す場合、又はこれらの組み合わせた傾向を示す場合がある。
【００６８】
高濃度ＤＨＡ含有バイオマスは、ＤＨＡを効率よく生成しうる。高濃度ＤＨＡ含有バイオマスのＤＨＡの蓄積量は、培養物１リットル中のバイオマスが生成するＤＨＡの量を意味し、培養液１リットルあたりの乾燥バイオマス重量に対するＤＨＡ量の比（重量比）として求められる。高濃度ＤＨＡ含有バイオマスのＤＨＡ蓄積量は、例えば、乾燥バイオマス重量の１８重量％以上、２０重量％以上、２３重量％以上、２８重量％以上、３０重量％以上、３３重量％以上、３８重量％以上、４０重量％以上、４８重量％以上、５０重量％以上、又は５３重量％以上とすることができる。高濃度ＤＨＡ含有バイオマスは、このようなＤＨＡ濃度となる高濃度ＤＨＡ含有油を含むので、例えば、通常用いられる抽出方法によって、高濃度ＤＨＡ含有油をバイオマスから効率よく得ることができる。また、高濃度ＤＨＡ含有バイオマス又は高濃度ＤＨＡ含有乾燥バイオマスをそのまま摂取することにより、高濃度ＤＨＡ含有油を効率よく摂取可能にすることができる。
【００６９】
（３）製造方法
高濃度ＤＨＡ含有油の製造方法は、油中の脂肪酸の合計重量の４０重量％以上の濃度でＤＨＡを含有し、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により求められる吸熱ピークの温度が１５℃以下である油、即ち、高濃度ＤＨＡ含有油を生成し得る生物、例えばアウランティオキトリウム属菌株を培養して、バイオマスを得ること（以下、培養工程と称する場合がある）、培養後のバイオマスを回収すること（以下、回収工程と称する場合がある）、回収後のバイオマスから油を抽出すること（以下、抽出工程と称する場合がある）、含み、必要に応じて更に他の工程を含むことができる。
本開示の一態様に係るバイオマスの製造方法は、上記培養工程及び回収工程を含み、必要に応じて更に他の工程を含むことができる。
本開示の一態様に係る乾燥バイオマスの製造方法は、上記培養工程及び回収工程と、回収により得られたバイオマスを乾燥すること（以下、乾燥工程と称する場合がある）を含み、必要に応じて更に他の工程を含むことができる。
【００７０】
培養工程では、高濃度ＤＨＡ含有油を生成し得る既述の生物を培養する。培養工程で用いられる生物については、高濃度ＤＨＡ含有油を生成し得る生物であれば制限はなく、高濃度ＤＨＡ含有油を生成し得る生物に通常適用される培養条件、培養液、培養装置等をそのまま適用することができる。
【００７１】
高濃度ＤＨＡ含有油を生成し得る生物が微生物の場合には、菌株の胞子、菌糸、又は予め微生物を培養して得た前培養液を、液体培地又は固形培地に接種し、培養する。培地としては、例えば炭素源としてグルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、デンプン、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール等；窒素源として酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー、ペプトン、ポリペプトン、大豆粉、脱脂大豆粉、カザミノ酸、尿素、グルタミン酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等；無機塩として塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等；ビタミンその他、必要な成分を適宜組み合わせた培地を挙げることができる。塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等を含む培地とすることで、海洋性微生物の培養にも適用可能となる。培地としては、広く多くの高濃度ＤＨＡ含有油を生成し得る微生物の増殖可能性の点で、例えば、酵母エキス・グルコース寒天培地（ＧＹ培地）が用いることができる。液体培地の基材となる水性媒体は、基本的に水であり、蒸留水や精製水を用いることができる。培地は調製後、ｐＨを３．０〜９．０の範囲内に調整した後、オートクレーブ等により殺菌して用いる。培養は、１０℃〜４０℃の培養温度にて、１日間〜１４日間の期間、通気撹拌培養、振とう培養又は静置培養により行うことができる。
【００７２】
例えば、菌株の胞子、菌糸、又は予め微生物を培養して得た前培養液を、液体培地又は固形培地に接種し、培養することができる。培地としては、炭素源としてはグルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、デンプン、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール等；窒素源としては酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー、ペプトン、ポリペプトン、大豆粉、脱脂大豆粉、カザミノ酸等の天然窒素源、並びに、尿素等の有機窒素源、及び、グルタミン酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム等の無機窒素源；リン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等の微量栄養源、その他、必要な成分を適宜組み合わせた培地を挙げることができる。このような培地とすることにより、土壌由来微生物に適用可能となる。液体培地の基材となる水性媒体は、基本的に水であり、蒸留水や精製水を用いる。
【００７３】
培地における窒素源は、微生物の増殖維持又は促進の点で、０．０１重量％〜１０重量％、好ましくは０．１重量％〜４重量％とすることができる。窒素源は、微生物の増殖に伴って、回数に制限なく適当量で培養液中に追加することができる。窒素源を追加する場合、一回に添加する窒素源の量は、微生物の増殖維持又は促進の観点から適宜設定することができる。
【００７４】
培地における炭素源は、微生物の増殖維持又は促進の点で、０．１重量％〜３０重量％、好ましくは１重量％〜１５重量％とすることができる。炭素源は、微生物の増殖に伴って、回数に制限なく適当量で培養液中に追加することができる。炭素源を追加する場合、一回に添加する窒素源の量は、微生物の増殖維持又は促進の観点から適宜設定することができる。
【００７５】
以下の（ｉ）〜（iv）の微生物が選択されるとき、ナトリウム塩の添加量、ビタミン類の添加量を、特定範囲に選択することができる。ナトリウム塩の添加量及びビタミン類の添加量を特定範囲に選択した場合には、これらの海洋性微生物によるＤＨＡ生産効率が向上する傾向がある：
（ｉ）海洋性微生物；
（ii）ＤＨＡ高生産性微生物として、ヤブレツボカビ属の微生物、アウランティオキトリウム属の微生物、シゾキトリウム属の微生物、ウルケニア属の微生物、クリプテコディニウム属、並びにこれらの変異株からなる群より選択される少なくとも１種の微生物；
（iii）アウランティオキトリウム・リナシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）、アウランティオキトリウム・マングローベイ（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍａｎｇｒｏｖｅｉ）等のアウランティオキトリウム属微生物、これらの変異株からなる群より選択される少なくとも１種の微生物；又は、
（iv）アウランティオキトリウム・リナシナムＮｉＤ２、ＮｉＤ３、及び当該菌株と実質的に同一の菌学的性質を有する菌株からなる群より選択される少なくとも１種の微生物。
【００７６】
即ち、これらの海洋性微生物、例えばＤＨＡ高生産性微生物を選択する場合、培地におけるナトリウム塩の添加量は微生物の増殖、脂肪酸の合成、ＤＨＡ合成等の維持又は促進の観点から選択することができ、０．００１重量％〜１０重量％、好ましくは０．１重量％〜５重量％、より好ましくは１．０重量％〜３．０重量％とすることができる。窒素源又は炭素源の追加に伴って、培地中のナトリウム塩の濃度が低下することが想定される場合、培地のナトリウム塩濃度を微生物の増殖を阻害しない濃度範囲においてあらかじめ高くすることもできる。ナトリウム塩は、回数に制限なく適当量で培養液中に追加することができる。ナトリウム塩を添加する場合、一回に添加するナトリウム塩の量は、微生物の増殖維持又は促進の観点から適宜設定することができる。
【００７７】
海洋性微生物、例えばＤＨＡ高生産性微生物を選択する場合、培地におけるビタミン類の添加量は、微生物の増殖維持又は促進、奇数鎖の脂肪酸の生産抑制の観点から選択することができ、ビタミン類の合計量として、０．０１ｐｐｍ〜５０ｐｐｍ、好ましくは０．１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍとすることができる。ビタミン類は、予め調製された濃縮溶液の形態で培地へ添加してもよい。窒素源若しくは炭素源又はその他の培地成分の追加に伴って、培地中のビタミン濃度が低下することが想定される場合、培地のビタミン類の量を、微生物の増殖を阻害しない濃度範囲においてあらかじめ高くすることができる。ビタミン類は、回数に制限なく適当量で培養液中に追加することができる。ビタミン類を添加する場合、一回に添加するビタミン類の量は、微生物の増殖維持又は促進の観点から適宜設定することができる。
【００７８】
海洋性微生物、例えばＤＨＡ高生産性微生物を選択する場合、培地における金属塩類の添加量は、微生物の増殖、脂肪酸の合成、ＤＨＡの合成等の維持又は促進の観点から選択することができ、金属塩類の合計量として、０．０００１重量％〜５重量％、好ましくは０．００１重量％〜２重量％とすることができる。金属塩は、予め調製された濃縮溶液の形態で培地へ添加してもよい。窒素源若しくは炭素源又はその他の培地成分の追加に伴って、培地中の金属塩の濃度が低下することが想定される場合、培地の金属塩量を、微生物の増殖を阻害しない濃度範囲においてあらかじめ高くすることができる。金属塩は、回数に制限なく適当量で培養液中に追加することができる。金属塩を添加する場合、一回に添加する金属塩の量は、微生物の増殖維持又は促進の観点から適宜設定することができる。
【００７９】
海洋性微生物、例えばＤＨＡ高生産性微生物を選択する場合、培地のｐＨは、微生物の増殖、脂肪酸の合成、ＤＨＡの合成等の維持又は促進の観点から選択することができ、３．０〜９．５、好ましくは３．５〜９．５、より好ましくは４．５〜９．０とすることができる。培養液のｐＨは培地中の成分が微生物によって代謝されることにより上下する場合、水酸化ナトリウム、硫酸等のｐＨ調整剤によって適宜制御することができる。
【００８０】
培養温度については、ＤＨＡの生産効率の観点から、例えば、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２８℃以下、又は２５℃以下とすることができ、一方、微生物の成育の観点から、８℃以上、１０℃以上、又は１５℃以上とすることができる。培養温度の上限値又は下限値はいずれの組み合わせでもよく、例えば、８℃〜４０℃、８℃〜２８℃、１０℃〜４０℃、１０℃〜２５℃、１５℃〜２５℃とすることができる。このような温度範囲での培養を行う場合、高濃度ＤＨＡ含有油中のＤＨＡの濃度をより高くすることができる。
【００８１】
培養器については特に制限はなく、通常、微生物の培養に用いられる装置であればいずれも適用可能であり、培養のスケールに応じて適宜選択可能である。例えば、１Ｌ〜５０Ｌスケールの液体培養が可能な培養器を挙げることができる。培養器は、撹拌又は浸透機能を備えることができる。１Ｌ〜５０Ｌスケールで液体培養する場合、より高い濃度で高濃度ＤＨＡ含有油を得るには、培養器としては、撹拌型培養器が好ましい。撹拌型培養器としては、ディスクタービン型の撹拌翼を少なくとも１段有している撹拌型培養器が好ましく、ディスクタービン型の撹拌翼を２段有する撹拌型培養器がより好ましい。
【００８２】
培養工程における培養期間は、微生物の種類、成育状態、脂肪酸の蓄積効率等により異なり、特に制限はないが、培養液１リットルあたりの乾燥バイオマス量が２０ｇ〜２００ｇとなった場合に終了することができる。培養工程における培養期間は、通常、１日間〜１４日間、又は３日間〜１０日間とすることができる。通気培養における通気量としては、一般に０．２ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍ、好ましくは０．５ｖｖｍ〜１．０ｖｖｍとすることができる。また、庫内ゲージ圧力としては、一般に０．０１ＭＰａ〜０．２ＭＰａ、好ましくは０．０２ＭＰａ〜０．１ＭＰａとすることができる。
【００８３】
回収工程では、培養後のバイオマスを回収する。培養後のバイオマスは、生物の種類及び培地の種類に応じて、当業界で既知の方法により培地から回収することができる。回収工程により、高濃度ＤＨＡ含有油を含むバイオマスが得られる。回収の処理は、例えば、液体培養を用いて培養した場合には、一般に、培養終了後、培養液より、遠心分離及び濾過等の固液分離手段を用いて行うことができる。固体培地で培養した場合には、バイオマスと培地とを分離することなく、固体培地とバイオマスとをホモジナイザー等で破砕し、得られた破砕物を、後段の抽出工程に供することができる。
【００８４】
乾燥バイオマスを得るために、抽出工程の前に、回収工程で得られたバイオマスを乾燥する乾燥工程が含まれていてもよい。乾燥処理は、凍結乾燥、風乾、加熱乾燥等の、当業界で既知の方法により行うことができる。乾燥処理を経たバイオマスか否かについては、水分量を測定することにより確認することができる。例えば、乾燥菌体バイオマスの水分量は１０％以下とすることができる。水分量は、日本食品工業学会食品分析法編集委員会編、「新・食品分析法」（１９９７年１月）に記載の「常圧加熱乾燥法」に準拠して測定することができる。
【００８５】
抽出工程では、回収工程後のバイオマスから油を抽出して抽出油を得る。抽出処理には、通常、有機溶媒を用いる常法による抽出方法を適用することができる。回収後のバイオマスが乾燥バイオマスの場合には、抽出処理は、超臨界二酸化炭素による抽出であってもよく、窒素気流下での有機溶媒による抽出処理であってもよい。抽出処理の用いられる有機溶媒としては、ジメチルエーテル、ジエチルーテル等のエーテル；石油エーテル、ヘキサン、ヘプタン等の炭素数１０以下の炭化水素；メタノール、エタノール等のアルコール；クロロホルム；ジクロロメタン；オクタン酸等の脂肪酸又はそのアルキルエステル；植物油等の油脂などを用いることができる。抽出処理としては、メタノールと石油エーテルの交互抽出又はクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いた抽出を適用することができる。この場合には、より良好な抽出処理の結果を得ることができる。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、抽出油を得ることができる。トリアシルグリセロールを採取する場合又は微生物から抽出油を抽出する場合には、有機溶媒としては、一般にヘキサンが用いられる。粗油は、上述のとおり、抽出処理直後に得られる抽出油を指す。
【００８６】
抽出された油から高濃度ＤＨＡ含有油を得ることができる。高濃度ＤＨＡ含有油が粗油である場合には、抽出工程によって高濃度ＤＨＡ含有油を得ることができる。抽出工程で得られる抽出油、即ち、粗油は、４０重量％以上のＤＨＡを含有し、且つＤＳＣ流動点が１５℃以下であるので、温度変化に対して比較的安定であり、低温時での安定性に優れ、また取り扱い性に優れる。例えば、粗油を抽出工程又はそれ以降の処理に的起用する場合、配管内部での詰まりの発生を抑制することができ、粗油を配合する組成物を調製する場合、粗油を配合する組成物の粘度上昇を抑制し、調製しやすくすることができる。
【００８７】
抽出処理に湿菌体を用いる場合には、湿菌体を圧搾してもよく、溶媒を使用してもよい。使用可能な溶媒としては、メタノール、エタノール等の水に対して相溶性の溶媒、又は、水に対して相溶性の溶媒と水及び／又は他の溶媒との混合溶媒を挙げることができる。その他の手順は上記と同様である。
【００８８】
高濃度ＤＨＡ含有油が粗油である場合、高濃度ＤＨＡ含有油は、以下の特性のうち、少なくともひとつ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又はすべてを有することができる。２つ以上の特性を有する場合、下記（１）〜（６）のうちの任意の組み合わせとすることができる。
（１）酸価（ＡＶ）は、０．５ｍｇ ＫＯＨ／ｇを超えてもよく、１．０ｍｇ ＫＯＨ／ｇを超えてもよく、１．５ｍｇ ＫＯＨ／ｇを超えてもよい。
（２）リン脂質の濃度は、３重量％以上、５重量％以上、又は１０重量％以上であってもよい。
（３）糖脂質の濃度は、３重量％以上、５重量％以上、又は１０重量％以上であってもよい。
（４）トリグリセリドの濃度は、９０重量％以上、９２重量％以上、又は９４重量％以上であってもよい。
（５）トリグリセリド中のＤＨＡ濃度は、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上であってもよい。
（６）不ケン化物の濃度は、４．５重量％を超えてもよい。
【００８９】
酸価（ＡＶ）は、基準油脂分析試験法（２０１３年版）２．３．１−２０１３  酸価  （社団法人日本油化学会編）に準じて測定した。
リン脂質の濃度は、基準油脂分析試験法（２０１３年版）２．４．１１−２０１３  リン脂質  （公益社団法人日本油化学会編）に準じて測定した。
【００９０】
糖脂質の濃度は、次のようにして求めた。即ち、Lipid analysis: isolation, separation, identification, and structural analysis of lipids、Christie, W. W. Oily Press: Bridgwater, England, 2003; pp 69: Chapter 4 "Analysis of simple lipid classes、A. Preliminary fractionation of lipid extracts" に記載の方法に準じて糖脂質のフラクションを得た。シリカゲルは、５５μｍ〜１０５μｍの粒子径、６９０ｍｇの容量（Sorbent weight）の、Sep-Pak（登録商標） Plus Silica Cartridges（Waters Corporation）を用いた。得られたフラクション中のアセトンと、存在する場合には他の溶媒とを除去した後の脂質量を測定し、得られた脂質量の全脂質量に対する重量百分率を糖脂質の濃度とした。
【００９１】
不ケン化物の濃度とは、日本油化学協会の基準油脂分析試験法の不ケン化物の定量に記載された規定の方法に基づき、油脂をケン化したのち、定量に使用する溶剤にて抽出される物質より混入脂肪酸量を削除し試料に対する百分率として表したものをいう。但し、精製後に添加した例えばトコフェロールのような不ケン化物量は差し引くものとする。上記規定の方法の概略は以下の通りである（油化学、１３、４８９（１９９６）参照）。
【００９２】
フラスコに試料約５ｇを取り、１Ｎ−エタノールカリ５０ｍｌを加え、穏やかに１時間沸騰しケン化させる。ケン化が終われば加熱をやめ、温水１００ｍｌでケン化用フラスコを洗いながら、ケン化後の液を分液漏斗に移し、これに水５０ｍｌを加えて室温になるまで冷却する。次にエチルエーテル１００ｍｌを、ケン化用フラスコを洗いながら分液漏斗に加え、分液漏斗に密栓して１分間激しく振り混ぜた後、明らかに２層に分かれるまで静置する。分かれた下層を第２の分液漏斗に移し、これにエチルエーテル５０ｍｌを加え、第１の分液漏斗と同様に振り混ぜた後、静置する。２層に分かれたならば、下層を第３の分液漏斗に移し、同様にエチルエーテル５０ｍｌで抽出を繰り返す。
第２、第３の分液漏斗中のエチルエーテル層は、各分液漏斗を少量のエチルエーテルで洗浄しつつ第１の分液漏斗に移し、これに水３０ｍｌを加えて振り混ぜ、次いで、静置して２層に分け、下層を除く。さらに毎回水３０ｍｌを添加して振り混ぜては静置分別を繰り返して、分別した水がフェノールフタレイン指示薬で着色しなくなるまで洗浄する。洗浄したエチルエーテル抽出液は必要に応じて硫酸ナトリウム（無水）で脱水処理した後、乾燥した濾紙で濾過して蒸留フラスコに移す。抽出に用いた諸容器、濾紙などは、すべて少量のエチルエーテルで洗浄して、洗浄液も蒸留フラスコに加える。蒸留フラスコ中のエチルエーテルを蒸留除去し、その液量が５０ｍｌ程度となったならば冷却し、少量のエチルエーテルでフラスコを洗いながら濃縮されたエチルエーテル抽出物を、あらかじめ正しく重量が計られた１００ｍｌ丸底フラスコに移す。
【００９３】
丸底フラスコ中のエチルエーテルをほとんど蒸留除去し、次にアセトン３ｍｌを加えて前同様にその大部分を蒸留除去した後、例えば２００ｍｍＨｇ程度の軽い減圧下、７０〜８０℃に３０分、抽出物を加熱してから、丸底フラスコを真空デシケーター中に移し、３０分放置冷却する。丸底フラスコの重量を正しくはかり抽出物の重量を求めておく。丸底フラスコにエチルエーテル２ｍｌと中性エタノール１０ｍｌとを加えてよく振り混ぜて抽出物を溶解した後、フェノールフタレイン指示薬を用いＮ／１０−エタノールカリ標準液で、混入する脂肪酸の量を決定する。ここで、滴定指示薬の微紅色が３０秒続いたとき終点とする。
不ケン化物濃度（％）＝Ａ−（Ｂ×Ｆ×０．０２８２）／Ｃ×１００
混入する脂肪酸（オレイン酸として、ｇ）＝Ｂ×Ｆ×０．０２８２
ただし、
Ａ＝抽出物の重量（ｇ）
Ｂ＝Ｎ／１０−エタノールカリ標準液の使用量（ｍｌ）
Ｃ＝試料採取量（ｇ）
Ｆ＝Ｎ／１０−エタノールカリ標準液の力価
【００９４】
トリグリセリドの濃度は、AOCS Recommended Practice Cd 11c-93 (1997), SAMPLING AND ANALYSIS OF COMMERCIAL FATS AND OILS, (American Oil Chemists’ Society）に準じて測定した。
【００９５】
高濃度ＤＨＡ含有油が精製油である場合、高濃度ＤＨＡ含有油の製造方法は、抽出工程の後に、得られた抽出油、即ち粗油に対して、脱ガム工程、脱酸工程、脱色工程及び脱臭工程を含む精製処理を含むことができる。精製処理によって、精製油である高濃度ＤＨＡ含有油を得ることができる。微生物バイオマス由来の抽出油に対して精製処理を行うことによって、主として、トリアシルグリセロールの濃度が粗油よりも高いトリアシルグリセロール濃縮物が得られる。
【００９６】
精製工程では、粗油に対して、植物油、魚油等の精製に用いられる方法で、脱ガム、脱酸、脱色及び脱臭を当業者に既知の方法によって行う。脱ガム処理は、例えば水洗処理等により行われる。脱酸処理は、例えば蒸留処理等により行われる。脱色処理は、例えば、活性白土、活性炭、シリカゲル等を用いた脱色処理により行われる。脱臭処理は、例えば水蒸気蒸留等により行われる。精製工程で得られる精製油は、４０重量％以上のＤＨＡを含有し、且つＤＳＣ流動点が１５℃以下であるので、温度変化に対して比較的安定であり、低温時での安定性に優れる。このため、粗油と同様に、精製工程又はそれ以降の処理において、配管内部での詰まりの発生を抑制することができ、取り扱いに優れる。
【００９７】
精製工程後に得られる精製油では、トリグリセリドの濃度が９５重量％以上であって、以下の（Ｐ１）〜（Ｐ４）からなる群より選択される少なくとも１つの条件を満たすものであってもよく、又は、以下の（Ｐ１）〜（Ｐ４）からなる群より選択される少なくとも１つの条件を満たし、かつ、トリグリセリド中のＤＨＡ濃度が、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上であってもよい。
（Ｐ１）酸価（ＡＶ）は、０．５ｍｇ ＫＯＨ／ｇ以下、
（Ｐ２）リン脂質の濃度は、３重量％未満、
（Ｐ３）糖脂質の濃度は、３重量％未満、及び、
（Ｐ４）不ケン化物の濃度は、４．５重量％以下。
【００９８】
高濃度ＤＨＡ含有油の製造方法は、抽出工程、場合により抽出工程及び精製工程の後に、粗油又は精製油に対して加水分解、アルキルエステル化等の加工を行う加工工程を含むことができる。加工工程により、遊離脂肪酸を含有する組成物、脂肪酸低級アルキルエステルを含有する組成物等を得ることができる。特に、高濃度ＤＨＡ含有油の製造方法が、抽出工程後に、精製工程及び加工工程をこの順で含む場合、精製工程で得られたトリアシルグリセロール濃縮物に由来する遊離脂肪酸、脂肪酸低級アルキルエステル等を得ることができる。加工工程におけるアルキルエステル化処理及び加水分解処理は、当業者に既知の条件によって行うことができる。
【００９９】
アルキルエステル化処理には低級アルコールが用いられる。低級アルコールとしては、炭素数１〜３のアルコールを挙げることができ、メタノール、エタノール、プロパノール等が挙げられる。例えば、脂肪酸メチルエステルを得るには、抽出油を、無水メタノール−塩酸５％〜１０％、ＢＦ３−メタノール１０％〜５０％等により、室温にて１時間〜２４時間処理することにより得られる。脂肪酸のエチルエステルを得るには、抽出油を、１％〜２０％硫酸エタノール等により、２５℃〜１００℃にて１５分〜６０分処理することにより得られる。その反応液からヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチル等の有機溶媒でメチルエステル、又はエチルエステルを抽出することができる。この抽出液を無水硫酸ナトリウム等により乾燥し、有機溶媒を留去することにより脂肪酸アルキルエステルを主成分とする組成物が得られる。
【０１００】
加水分解処理は、当業者には公知の条件で行えばよく、例えば、抽出油を、５％水酸化ナトリウムにより室温にて２時間〜３時間でアルカリ分解処理を行った後、得られた分解液から、脂肪酸の抽出又は精製に常用されている方法を用いて、遊離脂肪酸を含有する組成物を得ることができる。
【０１０１】
遊離脂肪酸を得るには、アルキルエステル化処理と加水分解処理との双方を行ってもよい。アルキルエステル化処理及び加水分解処理を連続して行うことにより、より純度の高い遊離脂肪酸を得ることができる。脂肪酸アルキルエステルから遊離脂肪酸を得るには、例えば、アルカリ触媒で加水分解した後、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒を用いた抽出処理を実施すればよい。
【０１０２】
高濃度ＤＨＡ含有油製造方法は、精製工程後、又は加工処理後に、ＤＨＡ以外の脂肪酸を構成脂肪酸とする脂肪酸の濃度を低下させ、且つ、ＤＨＡの濃度を高めるために、濃縮処理を含むことができる。濃縮処理には、蒸留、精留、カラムクロマトグラフィー、低温結晶化法、尿素包接法、液々向流分配クロマトグラフィー等を、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて適用することができる。蒸留又は精留とカラムクロマトグラフィー又は液々向流分配クロマトグラフィーの組み合わせが好ましい。カラムクロマトグラフィーとしては逆相分配系のカラムクロマトグラフィーが好ましい。ＤＨＡを濃縮又は単離する工程を経た場合には、高濃度ＤＨＡ含有油中に最終的に含まれ得るＤＨＡの脂肪酸中の含有量を高め、かつ、ＤＨＡ以外の他の脂肪酸の脂肪酸中の含有量を低減させることができる。
【０１０３】
例えば、精留を用いる場合、精留工程としては、蒸留塔の塔上部の圧力を１０ｍｍＨｇ（１３３３Ｐａ）以下の減圧とし、塔底温度を１６５℃〜２１０℃、好ましくは１７０℃〜１９５℃とする条件で蒸留することが、熱による脂肪酸の変性を抑え、精留効率を高める点で好ましい。蒸留塔の塔上部の圧力は、低いほどよく、０．１ｍｍＨｇ（１３．３３Ｐａ）以下であることがより好ましい。塔上部の温度については特に制限はなく、例えば、１６０℃以下とすることができる。精留工程によって、より高い含有量のＤＨＡを含む組成物を得ることができる。
逆相カラムクロマトグラフィーとしては、当業界で公知の逆相カラムクロマトグラフィーを挙げることができ、特にオクタデシルシリル基（ＯＤＳ）で修飾された基材を固定相とした高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が好ましく挙げられる。
このような濃縮処理を行うことによって、ＤＨＡ濃度が、例えば、油中の脂肪酸の合計重量の９０重量％〜９８重量％、９５重量％〜９８重量％、９６重量％〜９８重量％又は９７重量％〜９８重量のＤＨＡ濃縮油を得ることができる。
【０１０４】
（４）用途
高濃度ＤＨＡ含有油及び高濃度ＤＨＡ含有バイオマスは、ＤＨＡの各種機能を効率よく摂取することが求められる用途に適用することができる。高濃度ＤＨＡ含有油及び高濃度ＤＨＡ含有バイオマスを含有する製品としては、例えば、食品、サプリメント、医薬品、化粧品、飼料等を挙げることができる。高濃度ＤＨＡ含有油及び高濃度ＤＨＡ含有バイオマスは、これらの製品の製造方法において使用することができる。高濃度ＤＨＡ含有油及び高濃度ＤＨＡ含有バイオマスの用途としては、特に、ＤＨＡを有効成分として含む、動脈硬化、脳梗塞、心筋梗塞、血栓症、高脂血症等の生活習慣病予防、メタボリックシンドローム改善、抗アレルギー、抗炎症、抗がん、脳機能改善、ストレス改善等の作用が期待できる食品、サプリメント、医薬品、化粧品、飼料等が挙げられる。医薬品としては、皮膚外用剤、経口剤等が挙げられる。
【０１０５】
高濃度ＤＨＡ含有油、高濃度ＤＨＡ含有バイオマス及び高濃度ＤＨＡ含有乾燥バイオマスの使用の形態については、特に制限はなく、液体成分として、又は固体成分として、使用することができる。例えば、高濃度ＤＨＡ含有油、高濃度ＤＨＡ含有バイオマス又は高濃度ＤＨＡ含有乾燥バイオマスを、食品、サプリメント、医薬品、化粧品、飼料等の製品に適用する場合には、高濃度ＤＨＡ含有油、高濃度ＤＨＡ含有バイオマス又は高濃度ＤＨＡ含有乾燥バイオマスそのものを、他の任意成分と組み合わせて製品化してもよく、他の成分と組み合わせる前又は後に、任意の追加的な処理を行い、製品化することができる。このような追加的な処理としては、粉末化、ペレット化、カプセル化、錠剤化等を挙げることができる。
【０１０６】
高濃度ＤＨＡ含有油、高濃度ＤＨＡ含有バイオマス及び高濃度ＤＨＡ含有乾燥バイオマスを医薬品として用いる場合、医薬品は、高濃度ＤＨＡ含有油、高濃度ＤＨＡ含有バイオマス及び高濃度ＤＨＡ含有乾燥バイオマスと、医薬的に許容可能な担体と、必要に応じて他の成分とを含む。投与形態は、経口投与又は非経口投与が都合よく行われるものであればどのような形態であってもよい。投与形態としては、例えば注射液、輸液、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸溶剤、トローチ、内用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤、湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤等を挙げることができ、これらを症状に応じてそれぞれ単独で、または組み合わせて使用することができる。
【０１０７】
これら各種製剤は、常法に従って目的に応じて主薬に賦刑剤、結合剤、防腐剤、安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。またその投与量は、投与の目的、投与対象者の状況、例えば性別、年齢、体重等によって異なるが、通常、成人に対して経口投与の場合、構造脂質としてのＤＨＡの総量として、１日あたり０．０１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜２ｇ、さらに好ましくは１ｍｇ〜２００ｍｇの範囲で、また非経口投与の場合、構造脂質としてのＤＨＡの総量として、１日あたり０．００１ｍｇ〜１ｇ、好ましくは０．０１ｍｇ〜２００ｍｇ、さらに好ましくは０．１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲で適宜調節して投与することができる。
【０１０８】
本明細書において、本開示の各態様（aspect）に関して一実施形態（embodiment）中で説明された各発明特定事項（feature）は、任意に組み合わせて新たな実施形態としてもよく、このような新たな実施形態も、本開示の各態様に包含され得るものとして理解されるべきである。
【実施例】
【０１０９】
以下、本開示を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本開示はそれらに何ら限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「部」又は「％」は質量基準である。
以下の実施例の項において「細胞」又は「菌体」とは、特に断りのない限り、細胞又は菌体の集合物を意味し、本明細書におけるバイオマスに相当する。【０１１０】
［実施例１］
（ＮＢＬ−８株の単離と同定）
石垣島の汽水域から泥を採取した。得られた泥を、人工海水で適宜希釈してから、１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むヤブレツボカビ用寒天培地に塗布し、２６℃で培養した。培養３日目に、培地においてコロニーを形成する菌株を複数採取し、そのうちのひとつをＮＢＬ−８株と命名した。【０１１１】
ＮＢＬ−８株は、ヤブレツボカビ用液体培地において、栄養細胞と遊走細胞の生活史を有し、ＮＢＬ−８株の栄養細胞は運動性を示さず、主に連続する２分裂によって増殖する。また、ＮＢＬ−８株は、遊走子嚢を形成し、遊走子嚢内において複数の遊走細胞を形成する。遊走細胞はその後、遊走子嚢外に放出され、遊走細胞となる。遊走細胞は一定期間遊泳後、着定し栄養細胞となる。このような生活史はクロミスタ界（Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｃｈｒｏｍｉｓｔａ）ラビリンチュラ綱（Ｃｌａｓｓ  Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌｅａ）ヤブレツボカビ科（Ｆａｍｉｌｙ  Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｃｅａｅ）アウランティオキトリウム属（Ｇｅｎｕｓ  Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）リマシナム種（Ｓｐｅｃｉｅｓ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）に特徴的である（Ｈｏｎｄａ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１０２（４）：４３９−４４８（１９９８）；  Ｙｏｋｏｙａｍａ  ａｎｄ  Ｈｏｎｄａ，Ｍｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ．４８（４）：１９９−２１１（２００７）、参照）。ＮＢＬ−８株は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の解析結果からも、ＮＢＬ−８株はアウランティオキトリウム・リマシナムであると認められた。
なお、アウランティオキトリウム・リマシナムの分離報告時の名称はシゾキトリウム・リマシナムである。２００７年に本多らによってヤブレツボカビ科の分類が見直され、アウランティオキトリウムに改名された（上記文献参照）。【０１１２】
ＮＢＬ−８株を単離するために用いた人工海水、ヤブレツボカビ用寒天培地及びヤブレツボカビ用液体培地の組成をそれぞれ表１〜表３に示す。ビタミン溶液は、各組成物を溶解後、フィルター滅菌し、−２０℃で保存したものを用いた。金属塩溶液は、各組成物を溶解後、滅菌し、４℃で保存したものを用いた。以下の実施例の項においても同じものを用いた。
表２及び表３中のビタミン溶液（＊）及び金属塩溶液（＊＊）の組成は、それぞれ表４及び表５に示す。【０１１３】
【表１】
2017094804.tif 000002
【０１１４】
【表２】
2017094804.tif 000003
【０１１５】
【表３】
2017094804.tif 000004
【０１１６】
【表４】
2017094804.tif 000005
【０１１７】
【表５】
2017094804.tif 000006
【０１１８】
［実施例２］
（ＮＢＬ−８株の凍結保存）
ヤブレツボカビ用寒天培地プレート上に形成されたＮＢＬ−８株のコロニーを、無菌の接種ループで採取し、ヤブレツボカビ用液体培地１００ｍｌを含有する無菌の５００ｍｌひだ付き振盪フラスコ中に接種した。このフラスコを２〜５日間、２８℃、１２０ｒｐｍで振とうした。培養には、高崎科学器械株式会社（現：株式会社プリス）製ＴＸＹ−２５Ｒ−２Ｆを用いた。
その後、２〜５日間、振盪フラスコ中で培養して得られた培養細胞懸濁液２０ｍｌを、無菌の５０ｍｌ試験管に採取し、遠心分離し、細胞を回収した。回収した細胞を人工海水で２度洗浄した。その後、終濃度１０重量％グリセロール、５重量％トレハロースを含む人工海水２０ｍｌに、回収した細胞、即ち、ＮＢＬ−８株を再懸濁した。これをＮＢＬ−８株の凍結培養細胞液とし、各実験に用いるまで−８０℃で凍結保存した。【０１１９】
［実施例３］
（変異株の取得）
ＮＢＬ−８株の凍結培養細胞液０．１ｍｌを、ヤブレツボカビ用液体培地１００ｍｌを含有する無菌の５００ｍｌひだ付き振盪フラスコ中に接種した。このフラスコを２日間、２８℃、１２０ｒｐｍで振とうした。培養後に得られた培養細胞懸濁液２０ｍｌを、５０ｍｌの無菌の試験管中に移した。次いで、遠心分離によって、培養細胞懸濁液中の細胞を回収した。回収した細胞を滅菌人工海水で２度洗った。【０１２０】
次に、遊走細胞の放出をうながすために、回収した細胞を人工海水中で振とうした。具体的には、無菌の試験管中に回収した細胞と人工海水２０ｍｌを入れ、得られた細胞懸濁液を、３０分２００ｒｐｍで振とうした。次に、変異誘導試薬として、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を、死滅率９９％以上となるように、細胞懸濁液に適宜添加し、１分〜３０分２００ｒｐｍで振とうし、変異を誘発させた。変異誘発処理した細胞を、人工海水で適宜希釈し、ヤブレツボカビ用寒天培地プレート上に塗布し、２〜５日間２８℃で培養した。【０１２１】
寒天培地プレート上に形成されたコロニーを無菌の接種ループで選び取り、それぞれ新たなヤブレツボカビ用寒天培地プレート上に再度画線し、培養を行った。この作業を２度繰り返し、変異株を単離した。単離したコロニーから、実施例２と同様に行って培養細胞懸濁液を得た。この培養細胞懸濁液１ｍｌ〜１０ｍｌを採取し、実施例２と同様に、遠心分離し、−８０℃で凍結した後に凍結乾燥機（ＴＡＩＴＥＣ社製ＶＡ−１４０Ｓ）に供し、変異体の凍結乾燥菌体を得た。【０１２２】
得られた凍結乾燥菌体から総脂質、即ち微生物油を得た後、脂肪酸メチルエステルへと変換した。
具体的には、Ｆｏｌｃｈらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ．２２６：４９７−５０９（１９５７））に従って、クロロホルム：メタノール（２：１、v/v）で凍結乾燥菌体から総脂質を抽出した。得られた総脂質に対し、メチル
エステル化して、脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を得た。得られたＦＡＭＥに対して、ガスクロマトグラフィーによりＦＡＭＥ分析を行った。ガスクロマトグラフの条件は以下のとおりに設定した。
・カラム    ＤＢ−ＷＡＸ  ０．５３０ｍｍ×３０ｍ、フィルム厚１．００μｍ（アジレント・テクノロジー株式会社）
・キャリアーガス条件    ヘリウム  １．０ｍｌ／分、分離比１００：１
・カラム温度条件    １４０℃で５分、２４０℃まで４℃／分で昇温、２４０℃で１０分
・検出    ＦＩＤ
・検出器温度    ２６０℃
・注入口温度    ２５０℃
・注入量    １μＬ【０１２３】
ＦＡＭＥ分析の結果、脂肪酸中のＤＨＡ濃度が増加した変異体は２００株中６株得られた。これらは親株のコロニー形状が不定型な円形で、縁が波状である中から、コロニー形状がより円形で、縁がより全縁であり、サイズがより小さいコロニーを採取したところ、いずれも共通した性質を示した。このうちの２つをＮｉＤ２株、ＮｉＤ３株とした。得られたＤＨＡ濃度増加株について、実施例２で記載した方法に従って、培養し、凍結保存した。【０１２４】
［実施例４］
（ＤＨＡ微生物油の生産）
ＮＢＬ−８又はＮｉＤ２凍結細胞液０．１ｍｌを、ヤブレツボカビ用液体培地１００ｍｌを含有する無菌の５００ｍｌひだ付き振盪フラスコ中に接種した。このフラスコを２〜３日間、２８℃、１２０ｒｐｍで振とうした。得られた細胞懸濁液を、ジャーファメンターに植菌する前培養液とした。【０１２５】
１Ｌ容量の発酵槽に、６０ｇのグルコース、１０ｇの酵母エキス、１５ｇのＮａＣｌ、０．３５ｇのＫＣｌ、５．４ｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２．７ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．０ｍＬのビタミン溶液、２．０ｍＬの金属塩溶液を含む培地０．５Ｌを入れ、そこに１％量（ｖ／ｖ）の前培養液を植菌した。【０１２６】
培養温度２０℃、２６℃又は３２℃、撹拌速度６００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、庫内ゲージ圧０ＭＰａ、ｐＨ７．０±０．５の条件で、１〜３日間培養を行った。その後、６日間、表６に示すフィード液を、培地中のグルコース濃度が６重量％以下になるように繰り返し添加し、培養を続けた。培養中、多量の発泡が生じた場合は、適宜、発泡抑制剤を添加した。発砲抑制剤としては、大豆油、ＫＭ−７２Ｆ等が使用できる。【０１２７】
【表６】
2017094804.tif 000007
【０１２８】
その後、培養細胞懸濁液２ｍｌを、秤量した２ｍｌ遠心チューブに採取し、微量高速冷却遠心機を用いて遠心分離して菌体を回収する洗浄の操作を数回行ってから、１０５℃で加熱乾燥させた。その後、秤量し、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を算出した。ＤＣＷは３回測定し、その平均値とした。微量高速冷却遠心機としては、ＭＸ−３００、株式会社トミー精工、を使用した。【０１２９】
また、培養細胞懸濁液１０ｍｌを１５ｍｌ遠心チューブに採取し、実施例２と同様にして凍結乾燥菌体を得た後、実施例３と同様にして凍結乾燥菌体から総脂質を得た後、総脂質をメチルエステル化して、脂肪酸メチルエステルを得て、ガスクロマトグラフィーによりＦＡＭＥの分析を行い、更に、乾燥菌体当たりの脂肪酸量及びＤＨＡ蓄積量を算出した。
ＮＢＬ−８又はＮｉＤ２株の凍結細胞液０．１ｍｌを、ヤブレツボカビ用液体培地１００ｍｌを含有する無菌の５００ｍｌひだ付き振盪フラスコ中に接種した。このフラスコを３〜４日間、２２℃及び２０℃、１２０ｒｐｍで振とうした。
その後、秤量し、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）を算出した。ＤＣＷは３回測定し、その平均値とした。【０１３０】
ＮＢＬ−８又はＮｉＤ２株から得られた脂肪酸の脂肪酸組成（重量％）、培養液１リットルあたりの乾燥バイオマス量、培養液１リットルあたりの全脂肪酸量、培養液１リットルあたりのＤＨＡ量、及びＤＨＡ生産効率を表７に示す。
以下、表中を含め、培養液１リットルあたりの乾燥バイオマス量を「ＤＣＷ（ｇ／Ｌ）」と表し、培養液１リットルあたりの全脂肪酸量を「ＴＦＡ（ｇ／Ｌ）」と表し、培養液１リットルあたりのＤＨＡ量を「ＤＨＡ（ｇ／Ｌ）」と表し、ＤＨＡ生産効率を「ＤＨＡ（ｖｓＤＣＷ）」と、それぞれ表す。また表中「others」は、その他の脂肪酸の濃度を示す。
２０℃で培養したＮｉＤ２株によって生産される脂肪酸中の各種脂肪酸の濃度は、ＤＨＡは５０重量％以上であり、Ｃ１６：０は３０重量％未満であった。一方、２０℃で培養したＮＢＬ−８株によって生産される全脂肪酸中の各種脂肪酸の濃度は、ＤＨＡは４０重量％未満であり、Ｃ１６：０は３０重量％以上であった。
同様に、２６℃又は３２℃で培養したＮｉＤ２株によって生産される脂肪酸中のＤＨＡ濃度は、同温度で培養したＮＢＬ−８株によって生産される脂肪酸中のＤＨＡ濃度よりも高かった。【０１３１】
ＮｉＤ２株のＤＨＡ生産効率は、いずれも培養温度においても２０重量％以上であり、それぞれ、同じ培養温度で培養したＮＢＬ−８株よりも高くなっていた。
また、全ての条件において、ＮｉＤ２株の微生物油では、Ｃ１２：０の濃度は０．１％重量以下であった。
ＮＢＬ−８株及びＮｉＤ２株から得られた微生物油中の酸価（ＡＶ）と、リン脂質、糖脂質及び不ケン化物の各濃度とを本明細書記載の方法に従って求める場合、酸価（ＡＶ）は０．５ｍｇ ＫＯＨ／ｇ超、リン脂質の濃度は３重量％以上、糖脂質の濃度は３重量％以上、及び不ケン化物の濃度は４．５重量％超となる。
また、ＮｉＤ２株の微生物油と同様にして得られた他の菌株の微生物油では、トリグリセリド濃度は９０重量％以上、トリグリセリド中のＤＨＡ濃度は、５０重量％以上、リン脂質の濃度は５重量％以上、糖脂質の濃度は３重量％以上であった。【０１３２】
【表７】
2017094804.tif 000008
【０１３３】
［実施例５］
（低温培養による高濃度ＤＨＡの生産）
ＮｉＤ２株の凍結細胞液０．１ｍｌを、ヤブレツボカビ用液体培地１００ｍｌを含有する無菌の５００ｍｌひだ付き振盪フラスコ中に接種した。このフラスコを１ヶ月間、１０℃、１２０ｒｐｍで振とうした。その後、実施例４と同一の方法でＤＣＷの測定及びＦＡＭＥ分析を行い、更に、乾燥菌体当たりの脂肪酸量及びＤＨＡ蓄積量を算出した。
１０℃で培養したＮｉＤ２株によって生産される脂肪酸の組成（重量％）、及びＤＨＡ濃度（重量％）を、表８に示す。
１０℃で生産される脂肪酸中のＤＨＡ濃度は７０．５重量％であった。また、Ｃ１２：０の濃度は０．１％重量以下であった。【０１３４】
【表８】
2017094804.tif 000009
【０１３５】
［実施例６］
（微生物油の性状）
実施例４で得たＮＢＬ−８又はＮｉＤ２株の一部、及び実施例２と同一の条件で培養したＮｉＤ３株から、以下のようにして、微生物油をそれぞれ抽出した。
培養菌体を、加熱殺菌し、採取し、遠心分離し、洗浄し、加熱乾燥することで、乾燥細胞を得た。乾燥細胞に５倍量（ｗ／ｖ）のヘキサンを加え、ホモジナイザーを用いて細胞を破砕した。この細胞破砕物を含む懸濁液を、遠心分離し、微生物油を含むヘキサン層を回収した。この作業を３回行った。その後、ヘキサンをエバポレーターによって留去し、微生物油を得た。
得られた微生物油をサンプル瓶に移し、サンプル瓶上部の空気を窒素置換し、密閉した。この微生物油を分析に使用するまで−８０℃で保管した。【０１３６】
抽出した微生物油を対象に、文献（Ｇｏｖｉｎｄａｐｉｌｌａｉ  ｅｔ．  ａｌ．，（２００９），  Ｌｕｂｉｒｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２１：１３−２６．）に記載の方法に準じ、ＤＳＣ流動点を、以下のようにして測定した。
示差走査熱量測定装置  ＤＳＣ  ３５００  Ｓｉｒｉｕｓ（ＮＥＴＺＳＣＨ社製）を用い、サンプルパンに測定試料を１０ｍｇ秤量し、５０℃で５分間加温した後、５０℃から−６０℃まで３℃／分の冷却速度で冷却し、その後、−６０℃から５０℃まで１０℃／分の昇温速度で昇温して測定を行い、ＤＳＣ曲線を得た。得られたＤＳＣ曲線における吸熱ピークのうちの極大値における温度を、ＤＳＣ流動点（℃）とした。【０１３７】
流動点は、日本工業規格原油及び石油製品の流動点並びに石油製品曇り点試験方法（ＪＩＳ  Ｋ  ２２６９−１９８７）に記載の方法を用いて測定した。【０１３８】
沈殿物量として、微生物油１０００ｍｇを、秤量した容量２ｍｌのエッペンドルフ製のマイクロテストチューブに採取し、２５℃で１時間静置した後、微量高速冷却遠心機により沈殿物を回収し、精密天秤により沈殿物重量を測定し、微生物油１０００ｍｇ中の重量％として算出した。微量高速冷却遠心機としては、ＭＸ−３００、株式会社トミー精工、を用いた。【０１３９】
実験に使用した微生物油の脂肪酸組成（重量％）及びＤＳＣ流動点、流動点及び沈殿物量を、表９に示す。表９に示すように、ＮｉＤ２及びＮｉＤ３株から得られた微生物油は、培養温度に関わらずＤＳＣ流動点が０℃以下と低く、更に、流動点も０℃以下と低く、沈殿物量もＮＢＬ−８株と比較して少なかった。また、ＮｉＤ２株及びＮｉＤ３株は、親株であるＮＢＬ−８株に対して、ＤＳＣ流動点が大幅に低く、ＮＢＬ−８株よりも低温での取り扱い性に優れることがわかる。このようにＮｉＤ２株及びＮｉＤ３株から得られた微生物油は、常温から温度が低下しても、流動性が変化しにくく、澄明性に優れ、低温での取扱い性に優れるものであった。【０１４０】
ＤＳＣ流動点による測定については、測定時に外的測定環境要因を受けにくいため測定値が安定するという利点があり、更に、ＤＳＣ流動点を用いることによって、ＪＩＳ  Ｋ  ２２６９−１９８７による流動点と比較して、脂肪酸組成に基づく微生物油の特性を、微生物油全体として、かつ、より的確に、把握できることがわかった。【０１４１】
【表９】
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【０１４２】
次に、ＮｉＤ２株又はＮＢＬ−８株を２０℃で培養することによってそれぞれ得られた微生物油の性状を、滑らかさに基づいて官能評価したところ、ＮｉＤ２株由来の微生物油では、滑らかで、食品として好ましい感触が得られた。これに対して、ＮＢＬ−８株由来の微生物油では、ざらつきが感じられ、食品としては好ましくない感触であった。ＮＢＬ−８株による微生物油のざらつきは、微生物油中に発生した結晶によるものと推測され、ＮｉＤ２株由来の微生物油では、結晶化速度が適切に調節されて、その結果、食品としての良好な感触が得られることがわかった。【０１４３】
得られたＮｉＤ２株及びＮｉＤ３株由来の微生物油に対して、脱ガム工程、脱酸工程、脱色工程及び脱臭工程を含む精製処理を行うことにより、精製油を得ることができる。
また、得られたＮｉＤ２株及びＮｉＤ３株由来の微生物油又はその精製油に対して、低級アルコールを用いて常法によるアルキルエステル化処理を行うことにより、ＤＨＡアルキルエステルを含有する組成物を得ることができる。得られたＮｉＤ２株及びＮｉＤ３株由来の微生物油又はその精製油に対して、例えば５％水酸化ナトリウムにより室温にて２時間〜３時間でアルカリ分解処理を行った後、得られた分解液から、脂肪酸の抽出又は精製に常用されている方法を用いて、遊離ＤＨＡを含有する組成物を得ることができる。【０１４４】
更に、上述のようにして得られるＤＨＡアルキルエステル含有組成物又は遊離ＤＨＡ含有組成物を、蒸留、精留、カラムクロマトグラフィー、低温結晶化法、尿素包接法、液々向流分配クロマトグラフィー等の濃縮処理に供することにより、ＤＨＡ含有量がより高い濃縮ＤＨＡ含有組成物を得ることができる。【０１４５】
従って、本開示によれば、高濃度にＤＨＡを含有すると共に低温での安定性に優れ、取り扱い性が良好なＤＨＡ含有油、微生物油、及びバイオマスを得ることができる。このようなＤＨＡ含有油、微生物油、及びバイオマスは、医薬、サプリメント等の用途に好ましく適用できる。【０１４６】
２０１５年１２月１日に出願された日本国特許出願第２０１５−２３４９８５号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【国際調査報告】
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