(57)【要約】  抗血小板療法におけるモニタリングに用いることができる、血小板凝集能の新たな測定装置、方法を提供する。  血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、  該血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部とを含む血小板凝集能解析装置。
2017141508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、
該血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と
を含む血小板凝集能解析装置。
【請求項２】
前記血小板含有試料と前記血小板惹起物質とを保持する生体試料保持部を更に含む、請求項１に記載の血小板凝集能解析装置。
【請求項３】
前記血小板含有試料の凝固過程を測定する測定部を更に含む、請求項１に記載の血小板凝集能解析装置。
【請求項４】
前記血小板含有試料を供給する生体試料供給部を更に含む、請求項１に記載の血小板凝集能解析装置。
【請求項５】
前記血小板惹起物質を供給する薬剤供給部を更に含む、請求項１に記載の血小板凝集能解析装置。
【請求項６】
前記血液凝固系解析部は、前記血小板惹起物質が添加されていない血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データを解析する、請求項１に記載の血小板凝集能解析装置。
【請求項７】
前記血小板含有試料の凝固過程を測定した測定情報は、電気的特性及び／又は粘弾性の測定データである、請求項１に記載の血小板凝集能解析装置。
【請求項８】
前記電気的特性の測定データは血小板含有試料の誘電率である、請求項７に記載の血小板凝集能解析装置。
【請求項９】
前記粘弾性の測定データは血小板含有試料のレオメーターによる測定データである、請求項７に記載の血小板凝集能解析装置。
【請求項１０】
前記血小板含有試料は血液又は血漿である、請求項１に記載の血小板凝集能解析装置。
【請求項１１】
前記血液又は血漿は、抗血小板凝集薬又は抗凝固薬を投与された被験者から採取されたものである、請求項１０に記載の血小板凝集能解析装置。
【請求項１２】
前記血小板含有試料と前記血小板惹起物質は１分以上２０分以下の時間で反応が行われる、請求項１に記載の血小板凝集能解析装置。
【請求項１３】
前記血小板含有試料と血小板惹起物質との反応後、血小板凝集塊の回収を行う、請求項１２に記載の血小板凝集能解析装置。
【請求項１４】
血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、
該血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と
を含む血小板凝集能解析装置、及び
前記解析結果を表示する表示装置
を備える、血小板凝集能解析システム。
【請求項１５】
血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する工程と、
該解析結果の出力を制御する工程と
をコンピュータに実行させる血小板凝集能解析用プログラム。
【請求項１６】
血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する工程と、
該解析結果の出力を制御する工程と
を含む血小板凝集能解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板凝集能解析装置、血小板凝集能解析システム、血小板凝集能解析用プログラム及び血小板凝集能の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から行われている抗凝固療法や抗血小板療法は、血栓症予防に欠くことのできない治療法であり、その有用性は大規模な臨床試験により示されている。しかし、抗血小板療法が動脈血栓症を低減する効果は、抗凝固療法の脳梗塞低減効果よりも低い。これは、抗凝固療法においては、プロトロンビン時間国際標準比（PT-INR）やトロンボテストにより患者ごとに薬効が適切にモニタリングされている一方で、抗血小板薬の感受性や効果の持続にはかなりの個体差があることが報告されているにも関わらず、抗血小板療法におけるモニタリング方法が確立していないことが原因の一つとして考えられる。従って、抗血小板療法においても、分かりやすい方法で薬効が適切にモニタリングできれば、各症例における薬品の適正な使用方法を探る手段となり、治療効果の向上が期待できる。【０００３】
血小板の最も基本的な機能は、粘着と凝集である。血小板同士の付着状態を判定する血小板凝集能は、この基本的な現象を定量的に測定する方法として最も普及しており、その検査法には、(1)透過度法、(2)インピーダンス法、(3)粒子算定法等がある。これらの検査法に用いる凝集惹起物質の種類・濃度によって、血小検機能低下および亢進の詳細を知ることが可能である。特に、日常検査として一般的なのは透過度法である。【０００４】
前記(1)の透過度法は、血小板刺激物質を加え、多血小板血漿(PRP)中の血小板凝集に伴い、多血小板血漿の透明度が上昇すること利用して経時的に血小板凝集を定量化する方法である。
問題点としては、以下の(i)〜(iv)：
(i) 血漿の分離が必須のため、測定までの検体処理が複雑で、遠沈条件によって得られるPRPの量はそれぞれ異なり、血小板の回収率も一定でない。また、PRP分離操作の際に、密度の高い血小板は赤血球と共に沈殿し、それらの凝集態度は観察できない、
(ii) 血小板凝集の強さ(凝集率)は、PRP中の血小板数にある程度依存するので、血小板数が10万/μl以下の場合には、凝集前後の吸光度の差が小さく、僅かな変化は検出できない、
(iii) 全血および乳糜血漿など混濁した血漿を用いての検査は不可能である、
(iv) 血小板凝集塊の形成と光透過性の相関が悪い、
等が挙げられる。【０００５】
前記(2)のインピーダンス法は、血小板の凝集を電極間の電気抵抗の変化として検出する方法であり、全血中の血小板の凝集能を観察でき、遠沈操作が無いため全ての血小板の凝集態度を観察出来る。
問題点としては、以下の(v)及び(vi)：
(v) 電気抵抗の初期の減少は電極間の赤血球の存在に由来し、血小板凝集の初期状態の判定が困難、
(vi) 透過度法と比較して、凝集パターンは安定でない、
等が挙げられる。【０００６】
前記(3)の粒子算定法は、血小板凝集塊、または凝集塊の形成に関与しない単一血小板の数をコールターカウンターで算定し、凝集の程度を知る方法である。
問題点としては、以下の(vii)〜(ix)：
(vii) 手技が煩雑である、
(viii) 継時的変化を記録できない、
(ix) 凝集惹起物質による血小板溶解を単一血小板の減少と誤って算定される、
等が挙げられる。【０００７】
ところで、血液凝固系解析においては、近年、血液凝固測定を簡便且つ正確に評価することができる手法として、血液凝固過程の誘電率の測定を行う方法が考案された（特許文献１）。
この手法は、一対の電極からなるコンデンサー状の試料部に血液を充填し、それに交番電圧を印加して血液の凝固過程に伴う誘電率の変化を測定する方法である。ここで、血液検体は、クエン酸を抗凝固剤として用いて静脈から採血されたものであり、測定開始直前に塩化カルシウム水溶液を添加することでクエン酸の抗凝固作用を解除して血液凝固反応を進行させる。こうして得られたデータを所定のアルゴリズムに従って解析することで、血液凝固時間等、血液凝固に係るパラメータを得ることができる。【０００８】
前記誘電率測定による血液凝固系解析系装置は、血小板が凝固に与える影響に関する情報を取得することもできる。
例えば、血小板を活性化あるいは不活化する物質を血液に添加することにより該血液の凝固過程で測定される複素誘電率スペクトルに生じる変化に基づいて、前記血液の凝固能に関する情報を取得する血液凝固系解析を行うことができる（特許文献２）。この血液凝固系解析方法では、前記物質に血小板活性化物質を用いた場合には、該物質による血小板活性化に伴って前記複素誘電率スペクトルに生じる変化に基づき、血液中に不活性な状態で含まれる血小板の凝固能に関する情報を取得することができる。また、前記物質に血小板不活化物質を用いた場合には、該物質による血小板不活化に伴って前記複素誘電率スペクトルに生じる変化に基づき、血液中に活性な状態で含まれる血小板の凝固に関する情報を取得することができる。【０００９】
一方、プロトロンビン時間国際標準比（PT-INR）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）等の従来の血液凝固能検査では、実質的には抗凝固薬の過剰投与による血液凝固能の低下に伴う出血リスクしか評価できず、血液凝固能の亢進に伴う血栓リスクの評価はできない。また、多血小板血漿（PRP）を用いた既存の血小板凝集能検査は、遠心分離手順が必須となり、該手順中に血小板が活性化してしまうことにより正確な検査結果が得られず、操作も煩雑である。【００１０】
また、従来の血液凝固能検査では、以下の(x)及び(xi)：
(x) 正常な凝固能を有するサンプル（全血）を用いて、予め基準となる血液凝固時間の短縮幅Δts（基準値）を設定する必要がある、
(xi) 凝固反応を進行させる際、加速試薬を添加していないため測定時間が長い（加速試薬を添加すると、血小板機能による差が見えなくなる）、
という問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１０−１８１４００号公報
【特許文献２】特開２０１２−１９４０８７号公報
【特許文献３】国際公開第２０１５／１５９６２３号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本願発明者らは、例えば抗血小板療法におけるモニタリングに用いることができる、血小板凝集能の新たな測定方法、装置を提供するべく鋭意研究を行い、本技術を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
すなわち、本技術は、
血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、
該血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と
を含む血小板凝集能解析装置を提供する。
前記装置は、前記血小板含有試料と前記血小板惹起物質とを保持する生体試料保持部を含むことができる。
また、前記装置は、前記血小板含有試料の凝固過程を測定する測定部を含むことができる。
更に、前記装置は、血小板含有試料を供給する生体試料供給部を含むことができる。
更にまた、前記装置は、前記血小板惹起物質を供給する薬剤供給部を含むことができる。
前記血液凝固系解析部は、前記血小板惹起物質が添加されていない血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データを解析することができる。
前記血小板含有試料の凝固過程を測定した測定情報は、電気的特性及び／又は粘弾性の測定データでよい。
前記電気的特性の測定データは血小板含有試料の誘電率であり、前記粘弾性の測定データは血小板含有試料のレオメーターによる測定データとすることができる。
また、前記血小板含有試料は血液又は血漿である。
更に、前記血液又は血漿は、抗血小板凝集薬又は抗凝固薬を投与された被験者から採取されたものとすることができる。
前記血小板含有試料と前記血小板惹起物質は１分以上２０分以下の時間で反応が行われる。
また、前記血小板含有試料と血小板惹起物質との反応後、血小板凝集塊の回収を行うことができる。【００１４】
本技術は、血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、
該血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と
を含む血小板凝集能解析装置、及び
前記解析結果を表示する表示装置
を備える、血小板凝集能解析システムを提供する。【００１５】
本技術は、血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する工程と、
該解析結果の出力を制御する工程と
をコンピュータに実行させる血小板凝集能解析用プログラムを提供する。【００１６】
本技術は、血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する工程と、
該解析結果の出力を制御する工程と
を含む血小板凝集能解析方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】血小板凝集能解析システムの構成を示す図である。
【図２】血小板凝集能解析装置の構成を示す図である。
【図３】血小板凝集能の解析の工程を示す図である。
【図４】血液への血小板惹起物質添加による血小板数の変化を示すグラフである。
【図５−１】誘電率を用いた血小板凝集能解析装置による全血の測定結果を示すグラフである。
【図５−２】誘電率を用いた血小板凝集能解析装置による全血の測定結果を示すグラフである。
【図６−１】ROTEMのEXTEMによる全血の測定結果を示すグラフである。
【図６−２】ROTEMのINTEMによる全血の測定結果を示すグラフである。
【図７−１】ROTEMのEXTEMによる血漿の測定結果を示すグラフである。
【図７−２】ROTEMのINTEMによる血漿の測定結果を示すグラフである。
【図８】全血への血小板惹起物質添加後の反応時間による血小板数の変化を示すグラフである。
【図９−１】誘電率を用いた血小板凝集能解析装置による全血の測定結果を示すグラフである。
【図９−２】ROTEMのEXTEMによる全血の測定結果を示すグラフである。
【図１０−１】誘電率を用いた血小板凝集能解析装置による全血の測定結果を示すグラフである。
【図１０−２】ROTEMのEXTEMによる全血の測定結果を示すグラフである。
【図１１】フィルターの効果を示すグラフである。
【図１２−１】誘電率を用いた血小板凝集能解析装置による最大値を１とした全血の測定結果を示すグラフである。
【図１２−２】誘電率を用いた血小板凝集能解析装置による全血の測定結果の差分の逆数を算出したものを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．血小板凝集能解析システム
２．血小板凝集能解析装置
２−１．装置の構成
２−２．装置の動作
３．実施例
３−１．本実施例の概要
３−２．血小板凝集が起きていることの確認
３−３．検体が全血の場合
３−４．検体が血漿の場合
３−５．血小板と惹起物質を反応させる時間の効果
３−６．血小板の刺激を長時間行った場合
３−７．フィルター等による凝集した血小板の回収
３−８．血小板凝集能の解析方法
３−９．まとめ
【００１９】
１．血小板凝集能解析システム
本技術に係る血小板凝集能解析システムは、
血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、
該血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と
を含む血小板凝集能解析装置、及び
前記解析結果を表示する表示装置
を備える。
【００２０】
図１に血小板凝集能解析システムの構成を示す。
血小板凝集能解析システム2000は、血小板凝集能解析装置1000と表示装置1010を備える。
血小板凝集能解析システム2000は、血小板含有試料の血小板凝集能を測定し、測定データから血小板凝集能を解析する。
表示装置1010は、血小板凝集能の解析結果を表示する。
【００２１】
血小板凝集能解析装置1000は、測定データから血小板凝集能を行うプログラムを備えたコンピュータ等を含む構成であってもよく、表示装置1010はコンピュータに備え付けられたディスプレイ等であってもよい。
【００２２】
また、血小板凝集能解析装置1000は、血小板含有試料の血小板凝集能だけでなく、他の血液凝固系測定項目も解析できるようにしてもよい。前記他の血液凝固系測定項目としては、例えば、血液の凝固（凝血）、フィブリン形成、フィブリン塊形成、血餅形成、赤血球の連銭形成、血液の凝集、赤血球の沈降（赤沈）、血餅収縮（退縮）、溶血、フィブリノリジス等が挙げられる。これらの項目の解析の際には、コンピュータに備えられた血小板凝集能を行うプログラムに代えて、これらの項目解析用プログラムを用いる。
【００２３】
表示装置1010は、警告部を含んでもよい。警告部は、各血液の状態変化における正常値の範囲を予め設定しておき、試料の分析結果が正常値の範囲外であったときに警告を発する。
警告の方法は特に限定されず、例えば、ディスプレイ表示や音声により警告することができる。
【００２４】
２．血小板凝集能解析装置
２−１．装置の構成
図２に、前記図１に記載された血小板凝集能解析装置1000の一例の詳細な構成を示す。血小板凝集能解析装置1000は、血液凝固系解析部12と出力制御部14とを含み、更に詳細には、主要部として、生体試料供給部2と、薬剤供給部3aと、試薬供給部3bと、生体試料保持部1a、1bと、測定部10も含む。
【００２５】
生体試料供給部2は、ヒトや哺乳動物から採血した血液を血小板凝集能解析装置1000に供給する。
血液の供給方法は特に限定されず、シリンジから供給したり、サンプルカートリッジに血液を入れて血小板凝集能解析装置1000にセットしたり、被験者からチューブを介して直接血小板凝集能解析装置1000に供給することができる。被験者は、抗血小板凝集薬又は抗凝固薬を投与されていてもよい。
【００２６】
生体試料待機部4は、前記生体試料供給部2から送られた血液を一定の温度、状態に維持できるようにする。生体試料待機部4は、血液の温度を維持する温度制御部5、血液の待機時間を制御する時間制御部6を備え、更に好ましくは撹拌機構7aを備える。
【００２７】
第１の生体試料保持部1aは、血液に前述の血小板惹起物質を供給し、反応を行う。第１の生体試料保持部1aには薬剤供給部3aが連結されている。
薬剤供給部3aは、血液に血小板惹起物質を供給する。
また、第１の生体試料保持部1aは、温度制御部5、時間制御部6、撹拌機構7bを備える。第１の生体試料保持部1aでは、生体試料待機部4から送られた血液の温度を維持しつつ撹拌して、一定時間、血液中の血小板と、薬剤供給部3aからの血小板惹起物質とを反応させる。
【００２８】
生体試料分取部8は、第１の生体試料保持部で血小板惹起物質と反応させた血液を分取する。分取された血液は、生体試料分取部8から第２の生体試料保持部1bに送られる。
【００２９】
第２の生体試料保持部1bは、血液に凝固促進物質を供給し、反応を行う。第２の生体試料保持部1bには試薬供給部3bが連結されている。
試薬供給部3bは、血液に凝固促進物質を供給する。
凝固促進物質は、例えば、カルシウム、外因系凝固促進試薬、内因系凝固促進物質等が挙げられる。これらから1種類、又は２種類以上を組み合わせて凝固促進を行ってもよい。具体的な外因系凝固促進試薬としては、例えば組織トロンボプラスチン、組織因子等があり、内因系凝固促進試薬としては、例えばエラグ酸、カオリン等がある。
【００３０】
また、第２の生体試料保持部1bは、温度制御部5と撹拌機構7cを備え、更に駆動機構9を備えていてもよい。駆動機構9は、温度制御部5や撹拌機構7cの駆動、血液を送る等の、第２の生体試料保持部1bに関わる動作を行う。
第２の生体試料保持部1bでは、血液を一定の温度に保ちつつ、血液と試薬供給部3bからの凝固促進物質とを反応させる。
【００３１】
測定部10は、血液に凝固促進物質を添加した後又は添加と同時に誘電率を測定する。測定部10にはレオメーターを用いてもよい。レオメーターとして、例えば、ローテーショントロンボエラストメトリー、トロンボエラストグラフィー、レオロックス（ReoRox(商標)）が挙げられる。
【００３２】
測定条件制御部13は、温度や測定時間等、各々の測定方法に適した条件に調節する。測定部10での誘電率測定の際には、測定条件制御部13は、例えば測定に用いる周波数や測定の間隔等をコントロールする。
【００３３】
また、精度管理部11は、測定間差、バックグラウンドの変動等が生じないようにデータを管理すること、装置の各部の状態を監視すること等を行い、これを測定部10に備えることができる。
なお、測定部10の前に、凝集した血小板を回収するフィルター等を備えた血小板回収部が備えられていてもよい。
【００３４】
血液凝固系解析部12は、誘電率による測定データに基づいて血液の状態変化を検出して解析する。血液凝固系解析部12は、出力制御部14に対し、解析結果を出力する。出力制御部14は、解析結果を表示装置1010に出力し表示させる。また、血液凝固系解析部12は記憶部15と連絡し、記憶部15は、血小板含有試料の連続測定におけるデータや解析結果の経時的変化、あるいは以前に測定したデータや解析結果等を記憶する。
【００３５】
以上の血液凝集能解析装置1000は、プロセッサがメモリ又は他の記録媒体に記憶されるプログラムを実行することにより、血小板凝集能解析装置1000の様々な論理的機能を動作させる。
【００３６】
２−２．装置の動作
まず、ヒト又は哺乳動物から採血する。全血をそのまま試料としてもよいし、血液を例えば1000rpm、10分間延伸して、血小板血漿を回収して、試料としてもよい。
【００３７】
図３に、血小板凝集能解析の工程を示す。
試料は、まず生体試料供給部2に供される。試料は、生体試料供給部2から生体試料待機部4に送られ、37℃に加温し、例えば3分間撹拌して維持される（S1101）。次に、試料は生体試料保持部10に送られ、対照には生理食塩水、測定対象の試料には血小板惹起物質を添加する（S1102）。添加する血小板惹起物質は特に限定されないが、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン、カルシウムイオン、トロンビン、トロンボキサンA2、トロンビン受容体活性化タンパク質（TRAP）、アデノシン二リン酸（ADP）、アラキドン酸（AA）、セロトニン、アドレナリン、ノルアドレナリン等が用いられる。
【００３８】
血小板惹起物質の濃度としては、トロンビン受容体活性化タンパク質（TRAP）であれば、好ましくは1μM以上100μM以下、より好ましくは3μM以上80μM以下、更に好ましくは5.4μM以上62μM以下である。アデノシン二リン酸（ADP）であれば、好ましくは0.1μM以上100μM以下、より好ましくは0.5μM以上30μM以下、更に好ましくは1.0μM以上12.5μM以下である。アラキドン酸（AA）であれば、好ましくは0.01mM以上10mM以下、より好ましくは0.05mM以上5.0mM以下、更に好ましくは0.08mM以上1.0mM以下である。
【００３９】
第１の生体試料保持部1aで試料に前記生理食塩水又は血小板惹起物質を添加後、第１の生体試料保持部1a内で37℃に加温し続け、例えば、好ましくは1分以上20分以下、より好ましくは3分以上6分以下で撹拌し（S1103）、血小板を消費する。1分以上撹拌すると、血小板と血小板惹起物質との反応が進み、20分以下で撹拌すると、血小板凝集塊の崩壊まで至らないことがある。
【００４０】
次に、消費（凝集）した血小板を回収するかの判断を行う（S1104）。回収は、例えばフィルトレーションにより行うことができる（S1105）。
凝集した血小板を回収すると判断され、凝集した血小板が除去された試料は、第２の生体試料保持部1bに備えられた測定部10で外因系・内因系凝固測定に供される（S1106）。
【００４１】
次に、血液凝固系解析部12は、外・内因系凝固測定のデータから、以下の手順で解析を行う。
まず、血液凝固系解析部12は、測定結果に基づいて、特徴点の抽出を行う（S1107）。
特徴点は、例えば、コントロールと試料の測定結果が安定し始めた点、血小板の凝固時間の決まる点等である。
次に、血液凝固系解析部12は、抽出された特徴点において、コントロールと試料との差分を算出し（S1108）、その結果を出力する。
血液凝固系解析部12は、コントロールと試料との特徴点の差分の大きさが大きい程、血小板が活性化していると判定する（S1109）。
次いで、血液凝固系解析部12は解析結果を表示制御部14へ出力し、表示制御部は表示装置1010に解析結果を出力して表示させる(S1112)。
【００４２】
あるいは、凝集した血小板を回収しないと判断された場合は、凝集した血小板を回収せずに、第２の生体試料保持部に備えられた測定部で外因系・内因系凝固測定を行う（S1110）。
次に、血小板の凝固への寄与の解析を行う（S1111）。解析は、前記生理食塩水を添加した対照の測定結果と血小板惹起物質を添加した試料の測定結果とを比較することにより行うことができる。
例えば、経時的に得られた測定データをグラフ化し、特定の時間での測定数値の差分又は比率、グラフ面積の差分又は比率等をみることで、血小板の凝固への寄与を解析することができる。測定した試料と対照との差分が小さくなった場合、血小板凝集機能の低下や血小板阻害薬を服用していることが推測される。
次いで、血液凝固系解析部12は解析結果を表示制御部14へ出力し、表示制御部は表示装置1010に解析結果を出力して表示させる(S1113)。
【００４３】
なお、図３に記載されたフローチャートに示された手順は、記載された順序に沿って時系列的に行われる処理はもちろん、必ずしも時系列的に処理されなくとも、並列的に又は個別的に実行される処理をも含む。また、時系列的に処理される手順でも、場合によっては適宜順序を変更することが可能であることは言うまでもない。
【００４４】
また、前記手順を行うため、本技術の血小板凝集能解析装置1000に内蔵されるハードウェアに組み込まれるコンピュータプログラムを作成することも可能である。該コンピュータプログラムが記憶された記憶媒体も本技術によって提供される。
【００４５】
以上の説明は、主に、電気的特性（誘電率）を利用した凝固過程の測定方法を利用した技術（特許第5691168号明細書、特許第5768422号明細書参照）についてのものであるが、その他の方法によっても凝固過程の測定を行うことができる。
その他の方法として、例えば、粘弾性による凝固過程の測定が挙げられ、この方法を本技術に適用することもできる。
【００４６】
粘弾性の測定には、前述のトロンボエラストグラフィー（TEG（登録商標））血液凝固分析装置（ヘモネティクス社）、ローテーショントロンボエラストメトリー（ROTEM（登録商標））血液凝固分析装置（日本フィンガルリンク社）等を用いることができる。
【００４７】
トロンボエラストグラフィーでは、測定容器であるカップに全血検体を注入し、検査目的に応じた惹起物質を添加したうえで、容器の上部よりワイヤーで吊るされた棒状のピンを浸漬し、容器に対して定常的な往復角運動（典型的には10秒間で4.45°の範囲を往復する運動）を与える。凝固反応の進行に伴い検体の粘弾性が増加し、カップとピンの相対運動は小さくなり、したがってピンの回転変位は増加する。この回転変位を装置内の光学系を用いて経時的に記録することで、トロンボエラストグラムと呼ばれる波形が得られる。
【００４８】
カップではなくピンに対して往復角運動が与えられるという違いはあるものの、ローテーショントロンボエラストメトリーも基本的に同一の原理に基づいている。上記のプロトロンビン時間や活性化部分トロンボプラスチン時間が凝固の終点検出法であるのに対して、トロンボエラストグラフィーやトロンボエラストメトリーは、凝固開始から血栓形成、更にはその後の線溶までの一連のプロセスをひとつの装置で経時的にモニタリングできるという利点がある。
【００４９】
前記ローテーショントロンボエラストメトリーで凝固過程を測定する場合は、全血、血漿共に血小板含有試料として使用することができる。前記血小板凝集能解析装置1000を用いた場合、全血の使用が好適である。
【００５０】
３．実施例
以下、実施例の一例を説明するが、本技術はこれに限定されるものではない。
３−１．本実施例の概要
まず、全血若しくは多血小板血漿（PRP）に血小板惹起物質を添加した。一定時間撹拌すると血小板は凝集反応を示し、その反応の度合いを血小板数の減少によって確認した。血小板数は、細胞の大きさによって種類を分類するDC検出法を測定原理としている多項目自動血球系計数装置pocH-100i（Sysmex社）によって測定した。
【００５１】
３−２．血小板凝集が起きていることの確認
＜実験方法＞
健常者の静脈血採血は、クエン酸を抗凝固剤として内包した市販の真空採血管（採血量1.8mL、5本）を用いて通常の方法で行った。最初の1本目は使用せずに廃棄し、残りの4本を以下に示す実験に用いた。また、採血後、約30分室温静置した後に使用した。
まず、全血300ulを3分間37℃で撹拌した。その後、血小板惹起物質を添加し、6分間反応させた。この際、コントロールとして、生理食塩水を加えた系も作製し、反応後の血液中の血小板数を多項目自動血球系計数装置pocH-100i（Sysmex）によって測定した。
また、再現性を確認するため複数回の実験を行い、さらに、上記とは別の健常者による同様の実験も行った。
【００５２】
＜結果＞
図４に、コントロールである血液の血小板数と、血小板惹起物質を血液に加えた際の血小板数を示す。図４中、添加試薬として記載されるNaClは生理食塩水を示し、コントロールとした。また、TRAPはトロンビン受容体活性化タンパク質、AAはアラキドン酸、AA+ASAはアラキドン酸及びアスピリン、ADPはアデノシン二リン酸、ADP+PGE1はアデノシン二リン酸及びプロスタグランジンE1を示す。
【００５３】
図４に示されるように、血小板の数は、血小板惹起物質を添加することによって減少することが分かった。結果から、血小板惹起物質の添加によって、血中に血小板凝集塊が増加し、単一血小板が減少したことが分かった。
【００５４】
血小板を活性化する物質には、トロンビン受容体活性化タンパク質（TRAP）、アデノシン二リン酸（ADP）、アラキドン酸（AA）、コラーゲン、エピネフリン、リストセチン、トロンボキサンA2（TAX2）、アドレナリンなどを用いることができるが、本実施例においてはTRAP、AA、ADPを使用した。
また、それぞれの活性化経路を不活化する物質を加えた場合も、血小板数を測定した。
これにより、不活化物質が添加されている場合は、活性化剤を添加しても血小板凝集塊が増加せず、単一血小板のままで存在することが分かった。
【００５５】
３−３．検体が全血の場合
＜実験方法＞
前記３−２．の実験で反応させた血液を用いて、血液凝固能の測定を行った。この測定は、前述した試料の誘電率測定を行う血液凝固系解析装置（誘電コアグロメータープロトタイプ2号機）と、包括的止血能測定システムROTEM（登録商標）を用いて、測定温度は37℃で行った。
血液凝固系解析装置の場合は、測定開始直前に混合するカルシウム水溶液（0.2M Ca）と市販の外因系刺激試薬（100倍希釈＋PBS（v/v=1/5））を添加するDiCA-Exの測定と、カルシウム水溶液（0.2MCa）と市販の内因系刺激試薬（＋PBS（v/v=1/5））を添加するDiCA-Inの測定を行った。量は血液180uLあたり各12uLと統一した。
【００５６】
ROTEMにおいては、組織トロンボプラスチンあるいは組織因子を凝固剤として添加する原理を用いたEXTEM、エラジン酸を活性化剤として加え、部分トロンボプラスチンを添加する原理を用いたINTEMを測定した。
また、再現性を確認するため複数回の実験を行い、さらに、前記とは別の健常者による同様の実験も行った。
【００５７】
＜結果＞
図５−１、図５−２に示すように、100kHzにおける誘電率（規格化）の時間変化を、生理食塩水添加後（コントロール、＋NaCl）と血小板惹起物質添加後(+TRAP)で比較すると、血小板惹起物質を添加した場合に振幅が高くなることが分かった。
ROTEMにおいても、図６−１（EXTEM）、図６−２（INTEM）に示すように、血餅硬度を示すCFに変化が現れた。
この変化は血小板消費によるものであり、ROTEMにおいても同様の方法で血小板凝集能を測定できることが分かった（図６−１、図６−２）。
【００５８】
３−４．検体が血漿の場合
＜実験方法＞
健常者の静脈血採血は、クエン酸を抗凝固剤として内包した市販の真空採血管（採血量1.8mL、3本）を用いて通常の方法で行った。最初の1本目は使用せずに廃棄し、残りの2本を以下に示す実験に用いた。また、採血後、約30分室温静置した後に、2本を1000rpm、10分間遠心し、多血小板血漿（PRP）を回収した。
【００５９】
まず、血漿300ulを3分間37℃で撹拌した。その後、血小板惹起物質を20ul添加し、6分間反応させた。この際、コントロールとして、生理食塩水を加えた系も作製し、反応後の血液中の血小板数を多項目自動血球系計数装置pocH-100i（Sysmex社）によって測定した。ROTEMでEXTEM及びINTEMの測定を実施した。なお、ROTEMでは血漿も検体として測定することが可能である。
【００６０】
＜結果＞
図７−１、図７−２に示すように、全血の場合と同様に、血餅硬度を示すCFに変化が現れた結果が得られたため、測定検体には血小板を含む血漿及び全血を使用できることが示された。
【００６１】
３−５．血小板と惹起物質を反応させる時間の効果
＜実験方法＞
全血（採血方法は前記３−２．の実験と同様）を用いて、血小板惹起物質添加後の反応時間（加温・撹拌時間）に関する実験を行った。血液に血小板惹起物質を添加後、各反応時間後（1分〜45分）の血小板数の変化を、pocH-100i（Sysmex）によって測定した。
【００６２】
＜実験結果＞
図８に示すように、血小板数は3分〜6分の間に最小になり、その後は時間とともに数が回復していることが分かった。よって、血小板惹起物質添加後3〜6分後が最も血小板機能が活性化していることが推測され、この反応時間後が血小板凝集による凝固反応への影響が一番見易いと判断できる。
【００６３】
なお、図８には示していないが、今回検体として使用した血液の惹起物質を添加しない場合の血小板数は34万/ulであった。
また、正常血小板数の下限が5万/ulであることから、血小板惹起物質添加後45分以降は、血小板凝集の変化による凝固能の変化をみることが難しくなると想定され、次の３−６．の実験にて確認を行った。
【００６４】
３−６．血小板の刺激を長時間行った場合
＜実験方法＞
健常者の静脈血採血は、クエン酸を抗凝固剤として内包した市販の真空採血管（採血量1.8mL、5本）を用いて通常の方法で行った。最初の1本目は使用せずに廃棄し、残りの4本を以後に示す実験に用いた。また、採血後、約30分室温静置した後に使用した。
【００６５】
まず、全血300ulを3分間37℃で撹拌した。その後、血小板惹起物質を20ul添加し、6分間または30分間反応させた。反応させた血液を用いて、凝固能の測定を行った。測定に用いた装置や試薬濃度は前記４−３．の実験と同様とした。
この時、対照として血小板惹起物質と同量の生理食塩水を添加した系も測定した。
【００６６】
＜結果＞
図９−１、図９−２に示すように血小板惹起物質添加後、30分加温・撹拌を行うと血小板惹起物質を添加していない系に近づくことが分かった。すなわち、前記４−５．の実験結果が確認された。
【００６７】
３−７．フィルター等による凝集した血小板の回収
＜実験方法＞
前述の実験方法と同様に、全血に血小板惹起物質を添加することによって血小板を活性化した後、フィルター（PluriStrainer）に反応後の全血を通し、血液凝固系解析装置でDiCa-EX を、ROTEMにてEXTEMの測定を行った。
フィルターのサイズは血小板の小凝集塊のサイズである15〜25umを使用した。本実験では15umを使用した際の結果を示す。
【００６８】
＜結果＞
DiCa-Exの場合は、図１０−１に示すように、フィルターを通した系と通してない系で大きな差は見られなかった。即ち、血小板が凝集塊として存在している系と、フィルターによって除去した系はほぼ同様の比を示しているので、凝集塊の存在は対照との差を見るうえで影響を与えないことが推測された。
【００６９】
一方、ROTEM-EXTEMの場合は、図１０−２に示すように、フィルターを用いた血小板凝集塊の除去の有無で惹起物質添加の効果が変化している。ROTEMを使用する場合には、凝固測定前に物理的に血小板凝集塊を除去する方が、対照との差が良く見えることが分かった。
なお、その他の血小板凝集塊を除去する方法としては、測定開始前に活性化血小板特異的表面抗体がコーティングされたマイクロビーズを用いる方法が挙げられる。
【００７０】
前記図１０−１（DiCa-Ex）、図１０−２（ROTEM-EXTEM）において、凝固時間の決まる15分を検討時間とし、15分の値（DiCaは最大値1と15分値の差分）における、NaCl−TRAP（フィルターなし）、NaCl＋Filter−TRAP＋Filter（フィルターあり）の比を算出した。
結果を図１１に示す。
DiCa-Exの場合は、フィルターありなしで、比に大きな差は生じないが、ROTEMの場合では、フィルターありの方が比の差が大きかった。
【００７１】
３−８．血小板凝集能の解析方法
前記３−３．の誘電率による血小板凝固解析装置の測定結果をもとに、解析方法の例を示す。
凝固時間の決まる10分を検討時間（図１２−１）とし、最大値を１とし、そこからの差分の逆数を算出したもの（算出CF）を、図１２−２に示した。NaClを加えた場合（コントロール）の平均値は17.7、血小板惹起物質を加えた場合の平均値は12.7であった（n=4）。
【００７２】
図１２−２上の矢印で示す範囲が、血小板機能によって反映され（血小板寄与部）、血小板凝集機能が低下している場合や血小板阻害薬を服用している場合はこの差が小さくなることが想定される。このことは、実際に、ADPとプロスタグランジンE1阻害薬（ADP経路阻害薬）の組み合わせ等で確認された。
【００７３】
また、ｔ検定において、p=0.001（p＜0.01）であったので、NaClを加えた場合と血小板惹起物質を加えた場合の２つの平均値に有意差があると判断できた。
（ここで、ｔ分布において、外側5％の範囲にあれば同一母集団からの標本ではなく、有意差があると考えられ、95％信頼区間の外側に来る確率をpとする。）
【００７４】
前記解析方法の他にも、得られた凝固過程の測定データをグラフ化したときの面積や、比で、対照との差分を算出する方法などが考えられる。血液凝固系解析装置は測定周波数によっても見方が変わるので、ROTEMと比較して自由度が高く、血小板機能以外のパラメータの算出も同時にできる可能性がある。
【００７５】
また、本技術において、以下の工程：
（１）血小板惹起物質等を添加しない血小板含有試料の凝固過程の測定データをとる（血小板とフィブリンの凝集効果が表れたデータが得られる）、
（２）一方で、血小板機能阻害薬を添加した血小板含有試料の凝固過程の測定データをとる（血小板を除いた（フィブリンの）データが得られる）、及び
（３）更に、血小板凝固惹起物質を添加した血小板含有試料の凝固過程の測定データをとる、
ことを含む解析方法を行うことができる。被験者が抗血小板薬を服薬している場合、その効果の度合いによって、測定結果が（１）と（２）のデータの間に出現する。
【００７６】
３−９．まとめ
本技術によれば、血液凝固系解析装置を血小板凝集能解析装置として、凝固因子に関する測定だけでなく血小板機能の測定にも用いることができ、抗血小板薬の種類別にモニタリング治療につなげることができる。
また、本技術によれば、血栓症を視野に入れた臨床検査として、より優れた試料である全血で測定を行うことができる。
【００７７】
なお、本技術は、以下の構成をとることもできる；
〔１〕血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、
該血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と
を含む血小板凝集能解析装置。
〔２〕前記血小板含有試料と前記血小板惹起物質とを保持する生体試料保持部を更に含む、〔１〕に記載の血小板凝集能解析装置。
〔３〕前記血小板含有試料の凝固過程を測定する測定部を更に含む、〔１〕又は〔２〕に記載の血小板凝集能解析装置。
〔４〕前記血小板含有試料を供給する生体試料供給部を更に含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
〔５〕前記血小板惹起物質を供給する薬剤供給部を更に含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
〔６〕前記血液凝固系解析部は、前記血小板惹起物質が添加されていない血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて、前記血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データを解析する、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
〔７〕前記血小板含有試料の凝固過程を測定した測定情報は、電気的特性及び／又は粘弾性の測定データである、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
〔８〕前記電気的特性の測定データは血小板含有試料の誘電率である、〔７〕に記載の血小板凝集能解析装置。
〔９〕前記粘弾性の測定データは血小板含有試料のレオメーターによる測定データである、〔７〕に記載の血小板凝集能解析装置。
〔１０〕前記血小板含有試料は血液又は血漿である、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
〔１１〕前記血液又は血漿は、抗血小板凝集薬又は抗凝固薬を投与された被験者から採取されたものである、〔１０〕に記載の血小板凝集能解析装置。
〔１２〕前記血小板含有試料と前記血小板惹起物質は１分以上２０分以下の時間で反応が行われる、〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の血小板凝集能解析装置。
〔１３〕前記血小板含有試料と血小板惹起物質との反応後、血小板凝集塊の回収を行う、〔１２〕に記載の血小板凝集能解析装置。
〔１４〕血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する血液凝固系解析部と、
該血液凝固系解析部による解析結果の出力を制御する出力制御部と
を含む血小板凝集能解析装置、及び
前記解析結果を表示する表示装置
を備える、血小板凝集能解析システム。
〔１５〕血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する解析機能と、
該解析結果の出力を制御する出力制御機能と
をコンピュータに実行させる血小板凝集能解析用プログラム。
〔１６〕血小板惹起物質が添加された血小板含有試料の凝固過程の測定データに基づいて血小板凝集能を解析する工程と、
該解析結果の出力を制御する工程と
を含む血小板凝集能解析方法。
【符号の説明】
【００７８】
１ａ              第１の生体試料保持部
１ｂ              第２の生体試料保持部
２                生体試料供給部
３ａ              薬剤供給部
３ｂ              試薬供給部
４                生体試料待機部
５                温度制御部
６                時間制御部
７ａ、７ｂ        撹拌機構
８                生体試料分取部
９                駆動機構
１０              測定部
１１              精度管理部
１２              血液凝固系解析部
１３              測定条件制御部
１４              出力制御部
１５              記憶部
１０００          血小板凝集能解析装置
１０１０          表示装置
２０００          血小板凝集能解析システム
【図１】
2017141508.tif 000003
【図２】
2017141508.tif 000004
【図３】
2017141508.tif 000005
【図４】
2017141508.tif 000006
【図５−１】
2017141508.tif 000007
【図５−２】
2017141508.tif 000008
【図６−１】
2017141508.tif 000009
【図６−２】
2017141508.tif 000010
【図７−１】
2017141508.tif 000011
【図７−２】
2017141508.tif 000012
【図８】
2017141508.tif 000013
【図９−１】
2017141508.tif 000014
【図９−２】
2017141508.tif 000015
【図１０−１】
2017141508.tif 000016
【図１０−２】
2017141508.tif 000017
【図１１】
2017141508.tif 000018
【図１２−１】
2017141508.tif 000019
【図１２−２】
2017141508.tif 000020
【国際調査報告】
2017141508.tif 000021
2017141508.tif 000022
2017141508.tif 000023
2017141508.tif 000024