(57)【要約】  細胞捕捉デバイスに用いられるフィルター１０５は、ニッケル又は銅が主成分であり、厚み方向に複数の貫通孔が形成されたシート状の本体部分（卑金属めっき層５）と、パラジウムが主成分であり、前記本体部分の表面を覆うパラジウム層７と、金が主成分であり、前記パラジウム層の表面を覆う金層８と、を有する。
2017135153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニッケル又は銅が主成分であり、厚み方向に複数の貫通孔が形成されたシート状の本体部分と、
パラジウムが主成分であり、前記本体部分の表面を覆うパラジウム層と、
金が主成分であり、前記パラジウム層の表面を覆う金層と、
を有する細胞捕捉フィルター。
【請求項２】
前記パラジウム層の膜厚が０．１μｍ〜１μｍである請求項１に記載の細胞捕捉フィルター。
【請求項３】
リン脂質を骨格の一部にもつ表面処理剤によって前記金層の表面に形成された疎水化層をさらに有する請求項１又は２に記載の細胞捕捉フィルター。
【請求項４】
試料液を内部へ導入するための導入流路と、前記試料液を外部へ排出するための排出流路と、を有する筐体と、
前記導入流路と前記排出流路との間の前記筐体の内部の流路上に、前記試料が前記貫通孔を通過するように設けられた請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞捕捉フィルターと、
を有する細胞捕捉デバイス。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞捕捉フィルターでフィルトレーションすることにより、試料液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉する細胞捕捉方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞捕捉フィルターでフィルトレーションすることにより、試料液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉し、前記細胞捕捉フィルター上において捕捉された前記特定の細胞を、固定液を用いて固定した後、電子顕微鏡で観察する、細胞観察方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞捕捉フィルターでフィルトレーションすることにより、試料液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉し、前記細胞捕捉フィルター上において捕捉された前記特定の細胞を、培養液により培養する細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中循環癌細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ：ＣＴＣ）を始めとする血中の希少細胞を効率良く捕獲できる細胞捕捉フィルター、細胞捕捉デバイス、細胞捕捉方法、細胞観察方法、及び、細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は世界各国で死因の上位を占め、わが国においては年間３０万人以上が癌によって死亡しており、その早期発見および治療が望まれている。癌による人の死亡は、癌の転移再発によるものがほとんどである。癌の転移再発は、癌細胞が原発巣から血管またはリンパ管を経由して、別臓器組織の血管壁に定着、浸潤して微小転移巣を形成することで起こる。このような血管又はリンパ管を通じての人の体内を循環する癌細胞は、血中循環癌細胞と呼ばれている。【０００３】
血液には赤血球、白血球および血小板等の血球成分が多く含まれ、その個数は血液１ｍＬ中に３．５×１０９〜９×１０９個ともいわれている。その中でＣＴＣは僅か数個程度しか存在しない。血球成分の中からＣＴＣを効率的に検出するためには血球成分を分離する必要がある。これに対して、機械的濾過法を適用してこれらの血球成分を除去し、癌細胞を濃縮することが検討されている。このような機械的濾過法を行うためのフィルターとして、金属フィルターを使用することが考えられる。金属フィルターの製造方法としては、例えば、フォトリソグラフィーを用いた電気鋳造（電鋳）めっきの方法が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１１−１６３８３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
金属フィルターを用いてＣＴＣ等の希少細胞を捕捉する場合、血液等の試料液に由来して金属フィルターが溶出する場合がある。金属フィルターの材料が細胞毒性を有する成分である場合、フィルターにより捕捉した細胞に対しても影響を与える可能性が考えられる。これを防ぐ方法として、フィルターの表面を金めっきにより覆うことが考えられるが、十分ではない場合も考えられる。【０００６】
本発明は上記を鑑みてなされたものであり、捕捉した細胞の損傷を抑制しながら希少細胞の捕捉を好適に行うことが可能な細胞捕捉フィルターと、当該細胞捕捉フィルターを使用した細胞捕捉デバイス、細胞捕捉方法、細胞観察方法、及び、細胞培養方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る細胞捕捉フィルターは、ニッケル又は銅が主成分であり、厚み方向に複数の貫通孔が形成されたシート状の本体部分と、パラジウムが主成分であり、前記本体部分の表面を覆うパラジウム層と、金が主成分であり、前記パラジウム層の表面を覆う金層と、を有する。【０００８】
上記のように、本体部分の表面にパラジウム層と金層とが積層されていることで、細胞捕捉フィルターの本体部分が外部に露出することを防ぐことができる。本体部分が外部に露出すると、本体部分の金属イオンが流出（溶出）するため、捕捉した細胞が損傷する可能性がある。これに対して、金層の内側にパラジウム層が設けられていることで、パラジウム層の内側の本体部分が外部に露出することを防ぐことができるため、希少細胞の捕捉を好適に行うことが可能であると共に、細胞捕捉フィルターにおいて捕捉した細胞が本体部分の金属イオンの流出により損傷することを防ぐことができる。【０００９】
ここで、前記パラジウム層の膜厚が０．１μｍ〜１μｍである態様とすることができる。【００１０】
上記のように、パラジウム層の厚さを０．１μｍ〜１μｍとすることで、細胞捕捉フィルターの本体部分の金属イオンの流出（溶出）をより防ぐことができる。【００１１】
また、リン脂質を骨格の一部にもつ表面処理剤によって前記金層の表面に形成された疎水化層をさらに有する態様とすることができる。【００１２】
上記のように、細胞捕捉フィルターの金層の表面に主な骨格にリン脂質を含む表面処理剤により形成された疎水化層を有する場合、細胞捕捉フィルターの表面に希少細胞及び他の細胞が付着することを防ぐことができ、希少細胞の捕捉効率を高めることができる。【００１３】
また、本発明の一形態に係る細胞捕捉デバイスは、試料液を内部へ導入するための導入流路と、前記試料液を外部へ排出するための排出流路と、を有する筐体と、前記導入流路と前記排出流路との間の前記筐体の内部の流路上に、前記試料が前記貫通孔を通過するように設けられた上記の細胞捕捉フィルターと、を有する。【００１４】
上記の細胞捕捉デバイスでは、細胞捕捉フィルターの本体部分の表面にパラジウム層と金層とが積層されていることで、細胞捕捉フィルターの本体部分が外部に露出することを防ぐことができる。したがって、希少細胞の捕捉を好適に行うことが可能であると共に、細胞捕捉フィルターにおいて捕捉した細胞が本体部分の金属イオンの流出により損傷することを防ぐことができる。【００１５】
また、本発明の一形態に係る細胞捕捉方法は、上記の細胞捕捉フィルターでフィルトレーションすることにより、試料液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉する。【００１６】
上記の細胞捕捉フィルターでフィルトレーションすることで、本体部分の金属イオンの流出による細胞の損傷等を防ぎながら、特定の細胞を選択的に捕捉することができる。【００１７】
また、本発明の一形態に係る細胞観察方法は、上記の細胞捕捉フィルターでフィルトレーションすることにより、試料液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉し、前記細胞捕捉フィルター上において前記捕捉された特定の細胞を、固定液を用いて固定した後、電子顕微鏡で観察する。【００１８】
上記の細胞観察方法では、細胞捕捉フィルターの本体部分からの金属イオンの流出による細胞の損傷等を防ぎながら、特定の細胞の観察を好適に行うことができる。【００１９】
また、本発明の一形態に係る細胞培養方法は、上記の細胞捕捉フィルターでフィルトレーションすることにより、試料液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉し、前記細胞捕捉フィルター上において前記捕捉された特定の細胞を、培養液により細胞培養する。【００２０】
上記の細胞培養方法では、細胞捕捉フィルターの本体部分からの金属イオンの流出による細胞の損傷等を防ぎながら、フィルター上で特定の細胞を培養することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、捕捉した細胞の損傷を抑制しながら希少細胞の捕捉を好適に行うことが可能な細胞捕捉フィルターと、当該細胞捕捉フィルターを使用した細胞捕捉デバイス、細胞捕捉方法、細胞観察方法、及び、細胞培養方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施形態に係る細胞捕捉デバイスの概略構成を示す図である。
【図２】実施形態に係るフィルターを模式的に示す図である。
【図３】実施形態に係るフィルターの製造方法の例を説明する工程図である。
【図４】実施形態に係るフィルターの製造方法の他の例を説明する工程図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。
【００２４】
本発明の一実施形態に係る細胞捕捉フィルターを適用した細胞捕捉デバイスについて、図１を参照しながら説明する。細胞捕捉デバイス１００は、図１に示すように、捕捉対象の希少細胞が含まれる試料液が流入する流入管１２５（導入流路）が接続された流入口１３０と、試料液が流出する流出管１３５（排出流路）が接続された流出口１４０とを有する筐体１２０と、筐体１２０内に配置され、試料液に含まれる希少細胞を捕捉する捕捉領域を有するフィルター１０５（細胞捕捉フィルター）とを備える。
【００２５】
細胞捕捉デバイス１００におけるフィルター１０５による捕捉の対象である「希少細胞」とは、生体試料に含まれる特定種類の細胞を指す。このような希少細胞としては、例えば、血液に含まれる血中循環癌細胞（ＣＴＣ：Circulating  Tumor  Cell）、及び、循環血管内皮細胞（ＣＥＣ：Circulating  Endothelial  Cell）が挙げられる。ＣＴＣは、血液中のがん（癌）細胞である。また、ＣＥＣは、血管の内皮細胞であり、代謝によって血管壁から剥がれ落ちた成熟細胞となるものである。ＣＴＣは、循環器系の疾患（心筋梗塞等）などの病態で増加すると言われている。細胞捕捉デバイス１００では、ＣＴＣ及びＣＥＣ等のように試料液に含まれる特定種類の希少細胞を選択的に捕獲する機能を有する。なお、ＣＴＣ又はＣＥＣが捕捉対象である場合、試料液としては、血液又は血液に対して緩衝液等の添加剤を添加した液体を用いることができるが、これに限定されない。例えば、播種及び微転移した癌細胞の検出を目的とする場合には、リンパ液等の体液及びこれらを含む液体を試料液として用いることもできる。また、細胞捕捉デバイス１００による希少細胞の捕捉の前に、試料液に含まれる捕捉対象の希少細胞に対して標識化等の修飾を施してもよい。
【００２６】
筐体１２０は、希少細胞を捕捉するためのフィルター１０５を保持するための部材であり、上部部材１１０及び下部部材１１５から構成される。筐体１２０の形状は直方体又は円筒等であってよく、特に制約はない。
【００２７】
流入管１２５の上流には、例えば、試料液又は洗浄液等の処理液に係る容器又は配管が接続される。また、流出管１３５の下流に、ポンプＰを接続することで、ポンプＰの駆動により、流入管１２５から筐体１２０の内部に試料液等が供給される。また、ポンプＰの駆動により、試料液等は流出管１３５から外部に排出される。
【００２８】
フィルター１０５には複数の貫通孔１０６が形成されている。試料液として血液を細胞捕捉デバイス１００内に導入した場合、血液の赤血球等は貫通孔１０６を通過するが、捕捉対象の希少細胞は貫通孔１０６を通過できず、フィルター１０５表面に滞留する。これにより、血中の希少細胞を回収することができる。なお、フィルター１０５により捕捉された細胞については、染色等の追加処理を行うこともできる。この場合には、細胞が捕捉されたフィルター１０５に対して、緩衝液、染色液、培養液等の追加の液体を通過させることにより種々の処理を行うことができる。
【００２９】
なお、細胞捕捉デバイス１００の形状は上記に限定されない。フィルター１０５に設けられた複数の貫通孔１０６に対して捕捉対象の希少細胞が含まれる試料液を通過させることが可能であれば、細胞捕捉デバイス１００の具体的な構成は特に限定されない。
【００３０】
フィルター１０５についてさらに説明する。図２は、フィルター１０５の上面を模式的に示した図である。細胞捕捉デバイス１００に用いられるフィルター１０５は、ニッケル又は銅が主成分であり、厚み方向に複数の貫通孔が形成されたシート状の本体部分の外側に、パラジウムを主成分とするパラジウムめっき層が形成され、さらにパラジウムめっき層の外側に、金を主成分とする金めっき層が形成されていることを特徴とする。すなわち、フィルター１０５では、本体部分の表面がパラジウムめっき層で覆われていると共に、パラジウムめっき層の表面が金めっき層で覆われている。なお、本実施形態において特定の材料が「主成分」であるとは、当該材料の含有量が５０質量％以上であることを示す。
【００３１】
フィルター１０５は、本体部分の主成分がニッケル又は銅であることにより、次のような利点がある。まず、ニッケル又は銅は加工性に優れているため、フィルターの加工精度を高めることができる。これにより、捕獲対象とする成分の捕獲率を更に向上させることができる。また、金属はプラスチックなどの他の材料と比べて剛直であるため、外部から力が加わってもそのサイズ又は形状が維持される。このため、貫通孔よりも若干大きな血液成分（特に白血球）を変形させて通過させ、高精度の分離・濃縮が可能となる。
【００３２】
フィルター１０５の厚さは３μｍ〜５０μｍであることが好ましく、５μｍ〜４０μｍであることがより好ましく、５μｍ〜３０μｍであることが特に好ましい。フィルター１０５の膜厚が３μｍ未満の場合はフィルター１０５の強度が低下し、取り扱い性が困難になる場合がある。逆に、５０μｍを超えると加工時間が長くなることによる生産性低下、必要以上の材料消費によるコスト的な不利又は微細加工そのものが困難になることが懸念される。
【００３３】
なお、フィルター１０５のうち、パラジウムめっき層（図３及び図４ではパラジウムめっき層７として示している）の厚さは０．１μｍ〜１μｍであることが好ましい。また、パラジウムめっき層の外側に形成される金めっき層（図３及び図４では金めっき層８として示している）の厚さは、０．５μｍ〜０．８μｍであることが好ましい。パラジウムめっき層を上記の範囲とすることで、パラジウムめっき層によって覆われるフィルター１０５の本体部分の金属イオンの流出（溶出）をより防ぐことができる。また、金めっき層の厚さを上記の範囲とすることで、フィルター本体部分の金属による細胞への影響をより低減することができる。
【００３４】
フィルター１０５に設けられる複数の貫通孔１０６の開口形状としては、円、楕円、角丸長方形、長方形、正方形、波形等が例示できる。図２では、貫通孔１０６の開口形状が角丸長方形である例を示している。図２では、角丸長方形の貫通孔１０６が一方向に沿って並んでいる例を示しているが、配列等については特に限定されない。効率良く癌細胞を捕獲できる観点からは、円、角丸長方形、長方形又は波形が好ましい。また、フィルター１０５の目詰まり防止の観点からは、角丸長方形又は長方形が特に好ましい。
【００３５】
フィルター１０５の貫通孔１０６の孔径等は、捕捉対象とする希少細胞のサイズに応じて設定する。なお、開口形状が楕円、長方形、波形等の円以外の形状の貫通孔１０６において、孔径とは、それぞれの貫通孔１０６を通過できる変形しない球の直径の最大値を意味する。すなわち、貫通孔１０６の孔径は、例えば開口形状が長方形又は角丸長方形の場合、その長方形又は角丸長方形の短辺の長さとなる。図２に示すフィルター１０５の貫通孔１０６の場合、辺Ｌ１が短辺に相当し、辺Ｌ２が長辺に相当する。
【００３６】
捕捉対象の細胞が血中循環癌細胞（ＣＴＣ）である場合、フィルター１０５の貫通孔１０６の孔径は、フィルター１０５の入口側において、５〜１００μｍであることが好ましく、５〜５０μｍがより好ましく、５〜３０μｍが特に好ましい。ここで、貫通孔１０６の入口側とは、血液等の試料がフィルター１０５を通過する際の流入側のことである。また、捕捉対象の細胞が循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）である場合、フィルター１０５の貫通孔１０６の孔径は、フィルター１０５の入口側において、５〜１００μｍであることが好ましく、５〜５０μｍがより好ましく、５〜３０μｍが特に好ましい。
【００３７】
また、貫通孔１０６の断面形状において、出口側最狭部の孔径が入口側最狭部の孔径以上の大きさであれば、貫通孔中央部の孔径が出口側最狭部の孔径を超える形状（中央部が膨らんだ形状）であってもよい。
【００３８】
フィルター１０５の貫通孔１０６の平均開口率は、５〜５０％が好ましく、１０〜４０％がより好ましく、１０〜３０％が特に好ましい。フィルター１０５における貫通孔１０６の開口率とは、図２に示すように、フィルター１０５のうち実際に試料液が通過する領域の全体の面積Ａ１における、貫通孔１０６が占める面積の割合をいう。図１に示すように、フィルター１０５の周縁部分は、上部部材１１０及び下部部材１１５によって保持させるため、実際には周縁部分のフィルター１０５の貫通孔１０６を試料液が通過しない場合がある。したがって、開口率の算出の際には、試料液が実際に通過する領域を特定し、その領域Ａ１における貫通孔１０６が占める割合を算出する。なお、目詰まり防止の観点から平均開口率は大きいほど好ましいが、５０％を超えるとフィルター１０５の強度が低下したり、加工が困難になる場合がある。また、５％より小さいと目詰まりを発生しやすくなるため、フィルター１０５による希少細胞の濃縮性能が低下する場合がある。
【００３９】
本実施形態では、細胞捕捉デバイス１００を使用し、フィルター１０５に対して試料液を通過させることをフィルトレーションという。フィルトレーションにより、貫通孔１０６を通過することができない希少細胞等の細胞がフィルター１０５上に残存する。これにより、フィルター１０５を用いて特定の細胞を選択的に捕捉することができる。
【００４０】
次に、フィルター１０５の製造方法について説明する。
【００４１】
本実施形態に係るフィルター１０５（細胞捕捉フィルター）の製造方法は、銅基板上に感光性樹脂組成物を積層して感光性樹脂組成物層を形成する積層工程と、感光性樹脂組成物層の所定部分を活性光線で露光し、感光性樹脂組成物の硬化物を形成する露光工程と、感光性樹脂組成物層のうち感光性樹脂組成物の硬化物以外の部分を現像により除去し、銅基板上に感光性樹脂組成物の硬化物からなるレジストパターンを形成する現像工程と、レジストパターンが形成された銅基板に対して卑金属めっきを行う卑金属めっき工程と、銅基板を化学的溶解によって除去して、レジストパターン及び卑金属めっき層からなる構造物を得る溶解工程と、構造物からレジストパターンを除去して、前記卑金属めっき層を得る剥離工程と、剥離工程後の卑金属めっき層に対して貴金属めっきを行う貴金属めっき工程と、を有する。
【００４２】
図３（Ａ）〜（Ｉ）は、フィルター１０５の製造方法の一実施形態を説明する工程図である。本実施形態では、銅基板としてピーラブル銅箔を使用すると共に、フィルター１０５の本体部分がニッケルを主成分としている場合について説明する。
【００４３】
図３（Ａ）は、キャリア層１及び銅箔層２からなるピーラブル銅箔を示す。図３（Ｂ）に示す積層工程において、銅箔層２に感光性樹脂組成物を積層し、感光性樹脂組成物層３を形成する。続いて、図３（Ｃ）に示す露光工程において、フォトマスク４を通して感光性樹脂組成物層３に活性光線（ＵＶ光等）を照射し、露光された部分を光硬化させて感光性樹脂組成物の硬化物３ａを形成する。続いて、図３（Ｄ）に示す現像工程において、感光性樹脂組成物層３のうち感光性樹脂組成物の硬化物３ａ以外の部分３ｂを除去し、感光性樹脂組成物の硬化物３ａからなるレジストパターンを形成する。続いて、図３（Ｅ）に示す卑金属めっき工程において、感光性樹脂組成物の硬化物３ａからなるレジストパターンが形成された銅箔層２上に卑金属めっき層５を形成する。続いて、図３（Ｆ）に示すように、ピーラブル銅箔の銅箔層２とキャリア層１とを剥離する。続いて、図３（Ｇ）に示す溶解工程において、銅箔層２を化学的溶解により除去する。この結果、感光性樹脂組成物の硬化物３ａ及び卑金属めっき層５が残る。続いて、図３（Ｈ）に示す剥離工程において、感光性樹脂組成物の硬化物３ａからなるレジストパターンを除去し、卑金属めっき層５からなるフィルターの本体部分を得る。フィルターの本体部分には貫通孔６が形成されている。続いて、図３（Ｇ）に示す貴金属めっき工程において、卑金属めっき層５の外側に、パラジウムめっき層７及び金めっき層８を形成する。これにより、フィルター１０５が得られる。
【００４４】
図４（Ａ）〜（Ｈ）は、本実施形態に係るフィルター１０５の製造方法の他の例を説明する工程図である。図４で示す製造方法は、図３で示した製造方法で用いたピーラブル銅箔の代わりに銅基板２’を使用する点以外は図４で示したフィルター１０５の製造方法と同じである。図４で示すフィルター１０５の製造方法は、図３（Ｆ）に示す、ピーラブル銅箔の銅箔層２とキャリア層１とを剥離する工程が存在しない点以外は上記実施形態と同様である。なお、銅基板２’は図３で示したピーラブル銅箔における銅箔層２よりも厚いため、溶解工程において銅基板２’を化学的溶解により除去する工程において、上記実施形態よりも多くの化学的溶解剤と時間が必要になる。
【００４５】
次に、上記のフィルター１０５の製造方法の各工程をより詳細に説明する。
【００４６】
（積層工程）
まず、積層工程について説明する。フィルターの本体部分の主成分がニッケルである場合、基板には銅基板を用いる。これにより、化学的溶解によって基板を除去することが可能となる。このため、後述する溶解工程において、基板を除去する際に、フィルターの本体部分にダメージを与えることがなく、フィルターの貫通孔の変形を抑制することができる。このため、貫通孔の高い加工精度を実現することができる。また、銅は、感光性樹脂組成物との密着力に優れるため、小さい密着面積でもレジストパターンを形成することができる。このため、微細な貫通孔を形成することができる。なお、フィルターの本体部分の主成分が銅である場合、基板にはニッケル基板を用いることが好ましい。
【００４７】
銅基板としては、銅又は表面に銅を有するものであれば特に制限はないが、例えば、厚さ１〜１００μｍの銅箔、銅箔テープ、ピーラブル銅箔等が挙げられる。作業性の観点からは、ピーラブル銅箔が好ましい。ピーラブル銅箔を使用することによって、後述する溶解工程において、化学的溶解で銅基板を除去する時間を短縮することができる。
【００４８】
感光性樹脂組成物としては、ネガ型及びポジ型のいずれも使用可能であるが、ネガ型感光性樹脂組成物が好ましい。ネガ型感光性樹脂組成物は、少なくとも、バインダー樹脂、不飽和結合を有する光重合性化合物、光重合開始剤を含むものであることが好ましい。なお、ポジ型の感光性樹脂組成物を使用する場合には、感光性樹脂組成物層のうち、活性光線の照射により露光された部分の現像液に対する溶解性が増大するため、現像工程において、露光された部分が除去されることになる。以下、ネガ型感光性樹脂組成物を使用した場合について説明する。
【００４９】
製造されるフィルターの本体部分の厚さは、感光性樹脂組成物層よりも小さくなる。このため、目的とするフィルターの本体部分の厚さに適した膜厚の感光性樹脂組成物層を形成する必要がある。例えば、本体部分の厚さを１５μｍ以下とする場合には、感光性樹脂組成物の厚さは１５μｍ以上とする必要がある。
【００５０】
感光性樹脂組成物の銅基板上への積層は、例えば、支持フィルム、感光性樹脂組成物及び保護フィルムからなるシート状の感光性エレメントの保護フィルムを除去した後、感光性エレメントの感光性樹脂組成物層を加熱しながら銅基板に圧着することにより行う。これにより、銅基板と感光性樹脂組成物層と支持フィルムとからなり、これらが順に積層された積層体が得られる。
【００５１】
この積層作業は、密着性及び追従性の見地から、減圧下で行うことが好ましい。圧着の際の感光性樹脂組成物層及び／又は銅基板に対する加熱温度、圧力等の条件に特に制限はないが、７０℃〜１３０℃の温度で行うことが好ましく、１００ｋＰａ〜１０００ｋＰａ程度の圧力で圧着することが好ましい。なお、感光性樹脂組成物層の圧着において、積層性を向上させるために、銅基板を予熱処理してもよい。
【００５２】
（露光工程）
次に、露光工程について説明する。銅基板上の感光性樹脂組成物層の所定部分に活性光線を照射し、露光された部分を光硬化させて感光性樹脂組成物の硬化物を形成する。この際、感光性樹脂組成物層上に存在する支持フィルムが活性光線に対して透過性を有する場合には、支持フィルムを通して活性光線を照射することができる。一方、支持フィルムが活性光線に対して遮光性を有する場合には、支持フィルムを除去した後に感光性樹脂組成物層に活性光線を照射する。
【００５３】
露光方法としては、アートワークと呼ばれるネガ又はポジマスクパターンを通して活性光線を画像上に照射する方法（マスク露光法）が挙げられる。また、ＬＤＩ（Ｌａｓｅｒ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ）露光法又はＤＬＰ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｌｉｇｈｔ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）露光法等の直接描画露光法により活性光線を画像状に照射する方法を採用してもよい。
【００５４】
活性光線の光源としては、一般的な光源を用いることができ、例えば、カーボンアーク灯、水銀蒸気アーク灯、高圧水銀灯、キセノンランプ、アルゴンレーザ等のガスレーザ、ＹＡＧレーザ等の固体レーザ、半導体レーザ等の、紫外線、可視光等を有効に放射するものが挙げられる。
【００５５】
活性光線の波長（露光波長）としては、３５０ｎｍ〜４１０ｎｍの範囲内とすることが好ましく、３９０〜４１０ｎｍの範囲内とすることがより好ましい。
【００５６】
（現像工程）
次に、現像工程について説明する。現像工程では、感光性樹脂組成物層のうち、感光性樹脂組成物の硬化物以外の部分を銅基板上から除去することにより、銅基板上に、感光性樹脂組成物の硬化物からなるレジストパターンを形成する。感光性樹脂組成物層上に支持フィルムが存在している場合には、支持フィルムを除去してから、上記感光性樹脂組成物の硬化物以外の部分の除去（現像）を行う。現像方法には、ウェット現像とドライ現像とがあるが、ウェット現像が広く用いられている。
【００５７】
ウェット現像による場合、感光性樹脂組成物に対応した現像液を用いて、一般的な現像方法により現像する。現像方法としては、ディップ方式、パドル方式、スプレー方式、ブラッシング、スラッピング、スクラッピング、揺動浸漬等を用いた方法が挙げられ、解像性向上の観点からは、高圧スプレー方式が最も適している。２種以上の方法を組み合わせて現像を行ってもよい。
【００５８】
現像液としては、アルカリ性水溶液、水系現像液、有機溶剤系現像液等が挙げられる。アルカリ性水溶液は、現像液として用いられる場合、安全且つ安定であり、操作性が良好である。アルカリ性水溶液の塩基としては、リチウム、ナトリウム又はカリウムの水酸化物等のアルカリ金属水酸化物；リチウム、ナトリウム、カリウム若しくはアンモニウムの炭酸塩又は重炭酸塩；リン酸カリウム、リン酸ナトリウム等のアルカリ金属リン酸塩；ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム等のアルカリ金属ピロリン酸塩等が用いられる。
【００５９】
アルカリ性水溶液としては、０．１質量％〜５質量％炭酸ナトリウムの希薄溶液、０．１質量％〜５質量％炭酸カリウムの希薄溶液、０．１質量％〜５質量％水酸化ナトリウムの希薄溶液、０．１質量％〜５質量％四ホウ酸ナトリウムの希薄溶液等が好ましい。アルカリ性水溶液のｐＨは９〜１１の範囲とすることが好ましく、その温度は、感光性樹脂組成物層のアルカリ現像性に合わせて調節される。アルカリ性水溶液中には、表面活性剤、消泡剤、現像を促進させるための少量の有機溶剤等を混入させてもよい。
【００６０】
感光性樹脂組成物の硬化物以外の部分を現像により除去し、銅基板上に感光性樹脂組成物の硬化物からなるレジストパターンを形成した後、必要に応じて６０℃〜２５０℃程度の加熱又は０．２Ｊ／ｃｍ２〜１０Ｊ／ｃｍ２程度の露光を行うことにより、レジストパターンを更に硬化してもよい。
【００６１】
上記の積層工程、露光工程、現像工程の条件によっては、製造された本体部分の貫通孔の断面がテーパー状になる。このため、積層工程、露光工程、現像工程の条件の最適化が必要な場合がある。また、逆にいえば、上記の製造方法により、断面がテーパー状の貫通孔を有する本体部分を製造することも可能である。
【００６２】
（卑金属めっき工程）
卑金属めっき工程について説明する。現像工程の後、銅基板上に卑金属めっきを行い、卑金属めっき層を形成する。銅基板上に卑金属めっきを行う場合には、ニッケルめっきが行われる。卑金属めっき工程で形成される卑金属めっき層が最終的にフィルターの本体部分となる。
【００６３】
上述のように、フィルターの本体部分の材質はニッケル又は銅を主成分とする金属から選ばれる。
【００６４】
めっきの形態であるが、電気めっき又は無電解めっきのどちらでもよい。例えば、電解ニッケルめっきとしてはワット浴（硫酸ニッケル、塩化ニッケル、ホウ酸が主成分）、スルファミン酸浴（スルファミン酸ニッケル、ホウ酸が主成分）、ストライク浴（塩化ニッケル、塩化水素が主成分）などが挙げられる。
【００６５】
電解めっきの場合では、銅基板が給電層となり、銅の表面にめっきが析出する。
【００６６】
無電解めっきにより形成する場合、表面を酸又はアルカリ等で脱脂することが好ましい。その後、表面に触媒を付与し、表面を活性化させることが好ましい。触媒としては、Ｐｄ、Ａｕ及びＰｔ等の貴金属が主に用いられる。
【００６７】
無電解めっきに用いるめっき液は、金属イオン（めっき成分）のほかに、錯化剤及び還元剤を含んでよい。ニッケル（Ｎｉ）の合金を主成分とするめっき層を無電解めっきにより形成する場合、Ｎｉの合金としては、たとえば、Ｎｉ−Ｐ、Ｎｉ−Ｂ、Ｎｉ−Ｗ、Ｎｉ−Ｐｄ及びＮｉ−Ｃｕ等が挙げられる。Ｎｉイオンの還元剤としては、次亜リン酸若しくはその塩類、亜リン酸若しくはその塩類、ヒドラジン、水素化ホウ素、及びジメチルアミンンボラン等が用いられる。これらの中でも、次亜リン酸塩を用いた無電解Ｎｉめっきが好ましい。還元剤として次亜リン酸塩を用いることにより、Ｎｉの結晶度を結晶質から非晶質まで制御可能である。
【００６８】
めっき液のｐＨ範囲は、電気めっきの場合、４．０〜６．０が好ましく、無電解めっきの場合、４．０〜９．０が好ましい。また、めっき液の温度は、電気めっきの場合、４０℃〜６０℃が好ましく、無電解めっきの場合、６０〜９５℃が好ましい。
【００６９】
電気及び無電解めっきともクリーニング及びコンディショニングを行うことが好ましい。めっきを行う面は必ず清浄な面でなければいけない。汚染された面にめっきを行うと、剥離、変色又は未析出などの問題が発生する。
【００７０】
（溶解工程）
次に、溶解工程について説明する。卑金属めっき層（ここでは、ニッケルめっき層）を形成した後、銅基板を化学的に溶解して除去する。これにより、人手作業（手剥がし）によらずにフィルターの本体部分となる卑金属めっき層及び感光性樹脂組成物の硬化物からなる構造物を回収することができる。このため、シワ・折れ・キズ・カール等のダメージ及び微細な貫通孔の変形を生じることなく、フィルターの本体部分を製造することができる。銅基板を溶解する化学的溶解剤としては、メックブライトＳＦ−５４２０Ｂ（メック株式会社製）、銅選択エッチング液−ＣＳＳ（日本化学産業株式会社製）等を使用することができる。
【００７１】
なお、溶解対象の基板の材質がニッケルである場合には、化学的溶解剤として、ニッケル選択エッチング液ＮＣ（日本化学産業株式会社製）、メックリムーバーＮＨ−１８６０（メック株式会社製）等を使用することができる。
【００７２】
（剥離工程）
次に、剥離工程について説明する。溶解工程の後、レジストパターン（感光性樹脂組成物の硬化物）を、例えば、現像に用いたアルカリ性水溶液より更に強アルカリ性の水溶液により剥離する。この強アルカリ性の水溶液としては、例えば、１質量％〜１０質量％水酸化ナトリウム水溶液又は水酸化カリウム水溶液を用いることが好ましく、１質量％〜５質量％水酸化ナトリウム水溶液又は水酸化カリウム水溶液を用いることがより好ましい。レジストパターンを剥離することにより、卑金属めっき層のみフィルターの本体部分として回収することができる。
【００７３】
レジストパターンの剥離方式としては、浸漬方式、スプレー方式、超音波を用いる方式等が挙げられ、これらは単独で用いても併用してもよい。
【００７４】
（貴金属めっき工程−パラジウムめっき）
次に、貴金属めっき工程について説明する。剥離工程により得られた本体部分に対して、貴金属めっきにより、パラジウムめっき層及び金めっき層を形成する。
【００７５】
まず、本体部分に対してパラジウムめっきを行う。パラジウムめっきの具体的な方法は特に限定されず、無電解パラジウムめっき又は電解めっきで行うことができる。無電解パラジウムめっきにより形成されるパラジウムめっき層は、無電解パラジウムめっき用のめっき液中のパラジウムイオンが、還元剤の働きにより、ニッケルを主成分とする本体部分の表面にパラジウムとして析出したものである。
【００７６】
無電解パラジウムめっきにより形成されるパラジウムめっき層７には、パラジウムのほか、リン、ホウ素等が含まれる場合がある。ただし、純度が９９質量％以上であるパラジウムめっき層７は、好ましくは、還元剤としてギ酸化合物を用いた無電解パラジウムめっきによって形成される。ギ酸化合物を用いることにより、高純度のめっき被膜を特に容易により均一に析出させることが可能である。純度が１００質量％に近いほど、パラジウムの析出形態は均一性に優れる。
【００７７】
パラジウムの純度が９０質量％以上９９質量％未満であるパラジウムめっき層７は、一般に、還元剤として次亜リン酸、亜リン酸等のリン含有化合物、又はホウ素含有化合物を含有するめっき液を用いて形成することができる。これらめっき液を用いてパラジウム−リンめっき合金被膜又はパラジウム−ホウ素合金被膜がそれぞれ形成される。めっき液における還元剤の濃度、ｐＨ、浴温等はパラジウムの純度が９０質量％以上〜９９質量％未満になるように調節される。具体的には、例えば、還元剤として次亜リン酸を用いた場合、０．００５ｍｏｌ／Ｌ〜０．３ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５〜１１．５、温度４０℃〜８０℃の範囲において、パラジウムの純度が９０質量％以上９９質量％未満のパラジウムめっき層７を形成することができる。
【００７８】
なお、電気パラジウムめっきによりパラジウムめっき層７を形成してもよい。電気パラジウムめっきは、めっき液中のパラジウムイオンを電気により金属パラジウムに還元し、ニッケル表面にパラジウムを析出させるものであれば良く、特に限定しない。
【００７９】
（貴金属めっき工程−金めっき）
次に、パラジウムめっき層７の表面に金めっきにより、金めっき層を形成する。金めっきは無電解で行うことも出きるし、電解で行うこともできる。電解で行う場合は厚みばらつきが大きくなり、フィルターの孔径精度に影響出やすいことから、無電解で行うことが望ましい。
【００８０】
金めっき前の本体部分は表面が酸化していることがある。そこで、酸化皮膜の除去を行う前処理工程を加えてもよい。酸化皮膜の除去は、金属イオンと錯体を形成する化合物の入った水溶液で洗浄すると良い。具体的にはシアン類、ＥＤＴＡ類、又はクエン酸類の入った水溶液がよい。
【００８１】
中でもクエン酸類は金めっきの前処理として最適である。具体的にはクエン酸の無水物、クエン酸の水和物、クエン酸塩あるいはクエン酸塩の水和物であればよく、具体的には、クエン酸無水物、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム等を使用することができる。その濃度は０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜３ｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、０．０３ｍｏｌ／Ｌ〜２ｍｏｌ／Ｌであることがより好ましく、０．０５ｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの範囲であることが特に好ましい。クエン酸類の濃度を０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上とすることで、金めっき層とパラジウムめっき層との密着性が向上する。なお、クエン酸類の濃度が３ｍｏｌ／Ｌを超えた場合、効果が向上しない上、経済的に好ましくない。クエン酸を含む溶液への浸漬は、７０℃〜９５℃で、１〜２０分間行うと良い。
【００８２】
クエン酸を含む溶液は、発明の効果が得られる範囲でめっき液などに含まれる還元剤、ｐＨ調整剤等の緩衝剤を加えることも可能であるが、還元剤、ｐＨ調整剤などは少量が望ましく、クエン酸のみの水溶液が最も好ましい。クエン酸を含む溶液のｐＨは、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜９である。
【００８３】
ｐＨ調整剤としては、酸又はアルカリであれば特に限定されず、酸としては、塩酸、硫酸、硝酸などが使用でき、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、等のアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物溶液が挙げられる。前述したように、クエン酸の効果を阻害しない範囲で使用することができる。また、クエン酸を含む溶液に、硝酸を１００ｍｌ／Ｌといった高濃度で含有させると、クエン酸のみを含む溶液で処理した場合と比較して、接着性を改善する効果が低下する。
【００８４】
還元剤としては、還元性のあるものであれば特に限定されず、次亜リン酸、ホルムアルデヒド、ジメチルアミンボラン、水素化ホウ素ナトリウムなどが挙げられる。
【００８５】
上記の前処理を行った後に、置換金めっきを行う。置換金めっきにはシアン浴と非シアン浴とがあるが、環境負荷又は残存時の細胞毒性を考えると非シアン浴が望ましい。非シアン浴に含まれる金塩としては、塩化金酸塩、亜硫酸金塩、チオ硫酸金塩、チオリンゴ酸金塩が例示可能である。金塩は一種類のみ用いてもよく、二種以上を組み合わせて用いても良い。
【００８６】
金の供給源としては亜硫酸金が特に好ましい。亜硫酸金としては、亜硫酸金ナトリウム、亜硫酸金カリウム、亜硫酸金アンモニウム、などがよい。
【００８７】
金濃度は０．１ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌの範囲が好ましい。０．１ｇ／Ｌ未満では金が析出しにくく、５ｇ／Ｌを超えると液が分解しやすくなる。
【００８８】
置換金めっき浴には金の錯化剤としてアンモニウム塩又はエチレンジアミンテトラ酢酸塩が入っているとよい。アンモニウム塩としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムが挙げられ、エチレンジアミンテトラ酢酸塩としては、エチレンジアミンテトラ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸カリウム、エチレンジアミンテトラ酢酸アンモニウムを使用する。アンモニウム塩の濃度は、７×１０−３ｍｏｌ／Ｌ〜０．４ｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することが好ましく、アンモニウム塩の濃度がこの範囲外だと液が不安定になる傾向がある。エチレンジアミンテトラ酢酸塩の濃度は、２×１０−３ｍｏｌ／Ｌ〜０．２ｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することが好ましく、アンモニウム塩の濃度がこの範囲外だと液が不安定になる傾向がある。
【００８９】
めっき液を安定に保つために０．１ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌの亜硫酸塩が入っているとよい。亜硫酸塩としては亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、又は亜硫酸アンモニウムなどが挙げられる。
【００９０】
ｐＨ調整剤としてｐＨを下げる場合には、塩酸或いは硫酸を使用するのが好ましい。また、ｐＨを上げる場合には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水を使用することが好ましい。ｐＨは６〜７に調整するとよい。この範囲外では液の安定性又はめっきの外観に悪影響を与える。
【００９１】
置換めっきは液温３０℃〜８０℃で使用することが好ましく、この範囲外では液の安定性又はめっきの外観に悪影響を与える。
【００９２】
以上のようにして置換めっきを行うわけであるが、置換めっきでは完全に金属を覆うのが難しい。そこで、次に還元剤の入った還元型の無電解金めっきを行うことが好ましい。置換めっきの厚みは０．０２μｍ〜０．１μｍの範囲が好ましい。還元剤の入った還元型の無電解金めっきとしては、公知の方法を用いることができる。また、還元型の無電解金めっきを行う際の条件は、適宜変更することができる。
【００９３】
このようにして形成される最外層の金めっき層８は、９９質量％以上の純度の金からなることが好ましい。金めっき層７の金の純度が９９質量％未満であると、接触部の細胞毒性が高くなる。信頼性を高める観点からは、金めっき層８の金の純度は、９９．５質量％以上であることがより好ましい。
【００９４】
（後処理工程）
上記の工程により製造されたフィルター１０５に対して、表面処理を行う後処理工程を加えてもよい。具体的には、主な骨格にリン脂質を含む表面処理剤を用いることも好ましい。これはフィルター表面を疎水化することで希少細胞及び他の細胞（白血球、赤血球、血小板等）がフィルター１０５の表面に付着することを防ぐ効果がある。後処理工程を経ると、フィルター１０５の金めっき層８の表面に疎水化層が形成される。
【００９５】
フィルター１０５の表面処理に用いる表面処理剤としては、例えば、生体適合性ポリマーを用いることができる。生体適合性ポリマーを含む溶液に対してフィルター１０５を浸漬することで、フィルター１０５の表面に疎水処理を行うことができる。
【００９６】
生体適合性ポリマーを含む溶媒としては、脊椎動物のアルブミンが挙げられる。中でも血清アルブミンが望ましい。血清アルブミンは血清中に多く存在するたんぱく質の一つであり、分子量は約６万６千である。血清中には多くのタンパク質が存在するが、血清アルブミンは約５０〜６５％を占める。
【００９７】
アルブミンはアミノ酸が多数連結しているのでアミノ基を多数有している。アミノ基は貴金属（金、白金、パラジウム）に対して強固な配位結合をする。特に金は酸化皮膜が殆ど存在しないので、特別な前処理をしなくてもアルブミンと強固な結合を形成する。
【００９８】
なお、表面処理剤として、脊椎動物の血清アルブミンが好適に用いられるが、アルブミンの中でもウシ血清アルブミンは安価で好ましい。また、血清アルブミンの中でも脂肪酸フリーのタイプは白血球、赤血球、血小板の吸着抑制効果が大きい。
【００９９】
また、近年、生体由来の生体適合性ポリマーを模倣した人工合成ポリマーが多数合成されている。しかしながら、生きた細胞は生体由来の生体適合性ポリマーと人工合成ポリマーとの差を感知することができる。したがって、厳密には、人工合成ポリマーと比較して生体由来の生体適合性ポリマーの方が細胞の付着を抑制する効果が優れている。
【０１００】
人工合成ポリマーとしてはシリコーン、各種ポリウレタン、ポリフォスファゼン等が挙げられるが、特に優れているのが２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（略称：ＭＰＣ）のホモポリマー、もしくはＭＰＣを含む共重合体である。以下にその構造式を示す。
【０１０１】
【化１】
2017135153.tif 000003
【０１０２】
なお、上記化学式はＭＰＣポリマーを示すものであるが、Ｒには、アルキル基、水素、アミノ基、ヒドロキシアルキル基等を適用することができる。
【０１０３】
また、市販のＭＰＣポリマーを用いることもできる。市販のＭＰＣポリマーとしては、Lipidure-BL103、Lipidure-BL203、Lipidure-BL206、Lipidure-BL405、Lipidure-BL502、Lipidure-BL702、Lipidure-BL802、Lipidure-BL1002、Lipidure-BL1201、Lipidure-BL1301、Lipidure-CM5206（Lipidureは登録商標、いずれも日油株式会社製）等が挙げられる。
【０１０４】
こうした生体適合性ポリマーを希釈した溶液に対してフィルター１０５を浸漬する。生体適合性ポリマーを含む溶液の濃度は０．１％〜５．０％の範囲が好ましい。
【０１０５】
希釈に用いる溶液は水系が好ましく、リン酸等の緩衝液が入っていてもよい。或いはＥＤＴＡ又はヘパリンのような血液の凝固抑制剤が入っていてもよい。
【０１０６】
処理時間（浸漬時間）は１分以上６０分以下が好ましく、１分以上１０分以下が更に好ましい。１分以上処理を行うことで、生体適合高分子とフィルター１０５の金めっき層の表面との配位結合を促進することができる。また、処理時間を６０分以下とすることで、作業時間の長期化を防ぐことができる。
【０１０７】
上記の後処理工程を経たフィルター１０５を用いることで、フィルター１０５表面に希少細胞及び他の細胞が付着することを防ぐことができ、希少細胞の捕捉効率を高めることができる。
【０１０８】
上記のように、本実施形態に係る細胞捕捉用のフィルター１０５及びこのフィルター１０５を利用した細胞捕捉デバイス１００においては、ニッケル又は銅を主成分としているフィルター１０５の本体部分（卑金属めっき層５）の表面がパラジウムめっき層７及び金めっき層８により覆われていることを特徴とする。これにより、本体部分の金属が試料液中等へ流出することを抑制することができる。
【０１０９】
従来から、細胞捕捉用のフィルター１０５として金属フィルターを用いることは検討されている。また、フィルター１０５の材料としては、金属の中でも安価な卑金属が主成分として用いられることが多い。しかしながら、卑金属のフィルターを用いた場合には、フィルターを構成する金属成分が試料液中に溶出する可能性があり、特に試料液等に対して鎖化剤が添加されている場合に顕著となる。例えば、血液中の希少細胞が捕捉対象である場合には、血液の凝固を防ぐためにＥＤＴＡを血液と混合した試料液を用いることがある。この場合、ＥＤＴＡが鎖化剤として働くため、イオン化傾向の低い卑金属が金属イオンとして溶出する可能性がある。
【０１１０】
金属フィルターの主成分として、コスト及び加工性の観点から、卑金属の中でもニッケル又は銅を選択することが多い。しかしながら、ニッケル及び銅の金属イオンは細胞毒性が強い。したがって、フィルターから溶出した金属イオンが、フィルターに捕捉した後の希少細胞に対してダメージを与えてしまうことが考えらえる。
【０１１１】
卑金属の金属イオンが試料液中に溶出することを防ぐために、例えば貴金属を用いてフィルターを製造することが考えられる。しかしながら、貴金属のみでフィルターを製造することはコスト的に現実的ではない。そこで、従来は、卑金属から製造したフィルターに対して金めっきを施すことが行われていた。
【０１１２】
ところが、卑金属から製造したフィルターの本体部分の表面に金めっきを施した場合でも、試料液中に対して卑金属の金属イオンが大量に流出（溶出）する場合があることが確認された。具体的には、フィルターの本体部分の金めっきにピンホールが形成されている場合であって、試料液と卑金属とが接触する箇所が一部分でもあると、内部のフィルターの本体部分の金属イオンが大量に溶出することが分かった。金めっきにごく小さなピンホールが設けられているだけでも本体部分の金属イオンが外部に流出（溶出）してしまうことが分かった。また、ピンホールは、フィルターの本体部分の表面を均一にした場合でも発生してしまうことが確認された。したがって、フィルターの本体部分に対して金めっきを施す工程において、ピンホールの発生を防ぐことが非常に困難であることが分かった。金めっきにおけるピンホールの形成を防ぐ他の方法としては、金めっきの膜厚を大きくする等の対応も考えられるが、金めっき層の形成に係るコストが上昇する。
【０１１３】
そこで、本実施形態に係る細胞捕捉用のフィルター１０５では、ニッケル又は銅を主成分としているフィルター１０５の本体部分（卑金属めっき層５）の表面に対してまずパラジウムめっき層７を形成し、パラジウムめっき層７の外側に金めっき層８が形成されている。このように２層の貴金属層が本体部分の表面に積層されていることで、本体部分が外部に露出することを防ぐことができる。仮に最外面の金めっき８層の形成時にピンホールが残ったとしても、金めっき層８の内側にパラジウムめっき層７が設けられていることで、パラジウムめっき層７の内側の本体部分が外部に露出し試料液等と接触することを防ぐことができる。したがって、本実施形態に係る細胞捕捉用のフィルター１０５及びこのフィルター１０５を利用した細胞捕捉デバイス１００では、希少細胞の捕捉を好適に行うことが可能であると共に、フィルター１０５において捕捉した細胞が本体部分の金属イオンの流出により損傷が発生することを防ぐことができる。
【０１１４】
また、本実施形態に係る細胞捕捉用のフィルター１０５では、パラジウムめっき層７の厚さを０．１μｍ〜１μｍとすることで、フィルター１０５の本体部分の金属イオンが外部に流出（溶出）することを防ぐことができる。
【０１１５】
また、フィルター１０５の金めっき層８の表面に主な骨格にリン脂質を含む表面処理剤により形成された疎水化層を有する場合、フィルター１０５表面に希少細胞及び他の細胞が付着することを防ぐことができ、希少細胞の捕捉効率を高めることができる。
【０１１６】
さらに、本実施形態に係る細胞捕捉用のフィルター１０５を用いた細胞捕捉方法では、フィルター１０５によりフィルトレーションすることにより、試料液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉する。上記実施形態で説明したフィルター１０５を用いてフィルトレーションすることで、フィルター１０５の本体部分の金属イオンの流出による細胞の損傷等を防ぎながら、特定の細胞を選択的に捕捉することができる。
【０１１７】
本実施形態に係る細胞捕捉用のフィルター１０５を用いた細胞観察方法として、フィルター１０５によりフィルトレーションすることにより、試料液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉した後、捕捉した細胞について固定液を用いて固定し、電子顕微鏡で観察する方法が挙げられる。固定液を用いた細胞の固定方法としては、公知の手法を利用することができる。上記実施形態で説明したフィルター１０５を用いてフィルトレーションした後に、固定液を用いて固定し、観察することにより、フィルター１０５の本体部分の金属イオンの流出による細胞の損傷等を防ぎながら、特定の細胞の観察を好適に行うことができる。上記固定液としては特には制限されないが、グルタルアルデヒドやホルムアルデヒドなどのアルデヒド、四酸化オスミウム等を用いることができる。
【０１１８】
本実施形態に係る細胞捕捉用のフィルター１０５を用いた細胞培養方法として、フィルター１０５によりフィルトレーションすることにより、試料液に含まれる特定の細胞を選択的に捕捉した後、フィルター１０５上に捕捉された細胞を培養液により培養する方法が挙げられる。具体的には、細胞が捕捉された状態のフィルター１０５を培養液に浸漬することで、培養を行うことができる。上記実施形態で説明したフィルター１０５を用いてフィルトレーションした後に、フィルター１０５上で培養液による細胞の培養を行う場合、フィルター１０５の本体部分の金属イオンの流出による細胞の損傷等を防ぎながら、特定の細胞の培養を好適に行うことができる。
【０１１９】
以上、本発明をその実施形態に基づいて詳細に説明した。しかし、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明は、その要旨を逸脱しない範囲で以下のような様々な変形が可能である。
【０１２０】
例えば、上記実施形態では、フィルター１０５の本体部分（卑金属めっき層５）の外側表面に形成されるパラジウムめっき層７及び金めっき層８がそれぞれめっきにより形成されている例について説明した。しかしながら、本発明の一形態に係るフィルター１０５においては、ニッケル又は銅を主成分とする本体部分の外側表面がパラジウム層及び金層により覆われていればよく、パラジウム層及び金層の形成方法については特に限定されない。したがって、めっき法とは異なる手法（例えば、スパッタ、蒸着、化学気相成長法（ＣＶＤ）等）を用いて、フィルター１０５の本体部分の外側にパラジウム層及び金層を積層することでフィルター１０５を製造してもよい。
【実施例】
【０１２１】
＜フィルターの作成＞
（実施例１）
感光性樹脂組成物（ＰＨＯＴＥＣ（登録商標）  ＲＤ−１２２５：厚さ２５μｍ、日立化成株式会社製）を２５０ｍｍ角の基板（ＭＣＬ（登録商標）−Ｅ６７９Ｆ：キャリア層上に銅箔層を有するピーラブル銅箔、日立化成株式会社製）の銅箔層上にラミネートした。ラミネートは、ロール温度９０℃、圧力０．３ＭＰａ、コンベア速度２．０ｍ／分の条件で行った。【０１２２】
次に、ガラスマスクを、上記基板の感光性樹脂組成物層上に静置した。上記のガラスマスクは、同一の方向を向いた長方形が長軸及び短軸方向に一定のピッチで整列した光透過部を有しており、上記の長方形のサイズは８×３０μｍであり、ピッチは長軸及び短軸方向のいずれも６０μｍであった。次に、６００ｍｍＨｇ以下の真空下において、上記のガラスマスクを載置した基板の上部から、平行光を照射する紫外線照射装置によって、露光量４０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を照射した。【０１２３】
次に、１．０％炭酸ナトリウム水溶液を使用し、温度３０℃、スプレー圧０．１ＭＰａ、現像時間約３０秒で現像を行い、露光部以外の感光性樹脂組成物層を除去し、基板上に長方形の感光性樹脂組成物の硬化物が垂直に立ったレジストパターンを形成した。【０１２４】
次に、ｐＨが４．５になるように調製したニッケルめっき液中、温度５５℃で約２０分間めっきを行い、ニッケルめっき層を形成した。ニッケルめっき液の組成を表１に示す。建浴後、電解ニッケルめっき用添加剤Ａ（製品名：ＮＳＦ−Ｈ２、日本化学産業株式会社製）を添加した。【０１２５】
【表１】
2017135153.tif 000004
【０１２６】
得られたニッケルめっき層を基板のピーラブル銅箔とともに剥離した。続いて、銅基板（ピーラブル銅箔）と銅を温度４０℃で約１２０分間、化学的溶解剤（メックブライトＳＦ−５４２０Ｂ、メック株式会社製）中で攪拌処理することによって除去した。これにより、卑金属めっき層及び感光性樹脂組成物の硬化物からなる構造物を回収した。【０１２７】
次に、温度５５℃で約６０分間、レジスト剥離液（Ｐ３  Ｐｏｌｅｖｅ、Ｈｅｎｋｅｌ社製）中で超音波処理することによって、上記の構造物中の感光性樹脂組成物の硬化物（レジストパターン）を除去し、これにより、フィルターの本体部分に相当する卑金属フィルターを作製した。【０１２８】
その後、卑金属フィルターの表面に貴金属めっき処理を行い、パラジウムめっき層及び金めっき層を形成した。貴金属めっき処理に係る諸条件は以下の通りである。
・脱脂・・・・Ｚ−２００（株式会社ワールドメタル社製、商品名）６０℃、１分
・水洗・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・室温、２分
・無電解パラジウムめっき：パラジウムめっき膜厚さ０．５μｍ  ＨＰＳ−３０００（日立化成株式会社製、商品名）・・・・・・・・７０℃、５分
・水洗・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・室温、２分
・置換金めっき：金めっき膜厚；０．０２μｍ  ＨＧＳ−１００（日立化成株式会社製、商品名）・・・・・８５℃、１０分
・水洗・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・室温、２分
・乾燥・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・８５℃、３０分【０１２９】
その後、フィルターの表面について疎水化処理を行い、表面に疎水化層を形成した。具体的には、表面処理剤として９８ｗｔ％エタノールにより生体適合性ポリマー（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ（登録商標）−ＣＭ５２０６、日油株式会社製）を０．５ｗｔ％に希釈した溶液を用い、貴金属めっき後のフィルターを表面処理剤内に浸漬することで表面の疎水化処理を行った。以上により、実施例１に係るフィルターが得られた。【０１３０】
（実施例２）
上記実施例１と比較して、貴金属めっき処理における表面の疎水化処理を行わなかったほかは、実施例１と同様の方法を用いて、実施例２に係るフィルターを作製した。【０１３１】
（実施例３）
上記実施例１と比較して、電解ニッケルめっき用の添加剤を添加剤Ａから添加剤Ｂ（製品名：ＮＳＦ−Ｈ２、日本化学産業株式会社製）へ変更し、表面の疎水化処理を行わなかったほかは、実施例１と同様の方法を用いて、実施例３に係るフィルターを作製した。【０１３２】
（比較例１）
上記実施例１と比較して、貴金属めっき処理における無電解パラジウムめっき工程及び表面の疎水化処理を行わなかったほかは、実施例１と同様の方法を用いて、比較例１に係るフィルターを作製した。【０１３３】
（比較例２）
上記実施例１と比較して、電解ニッケルめっき用の添加剤を添加剤Ａから添加剤Ｂ（製品名：ＮＳＦ−Ｈ２、日本化学産業株式会社製）へ変更し、貴金属めっき処理における無電解パラジウムめっき工程及び表面の疎水化処理を行わなかったほかは、実施例１と同様の方法を用いて、比較例２に係るフィルターを作製した。【０１３４】
（比較例３）
上記実施例１と比較して、電解ニッケルめっき用の添加剤を添加剤Ａから添加剤Ｂ（製品名：ＮＳＦ−Ｈ２、日本化学産業株式会社製）へ変更し、貴金属めっき処理における無電解パラジウムめっき工程を行わなかったほかは、実施例１と同様の方法を用いて、比較例３に係るフィルターを作製した。【０１３５】
＜評価１：溶出状況の評価＞
原子吸光測定方法により、フィルター周辺への卑金属の溶出状況を測定した。具体的には、６ウェルプレートに上記の実施例１〜４及び比較例１〜３に係るフィルターを入れ、それぞれウォッシュバッファ（ＥＤＴＡが０．３７ｇ／Ｌ含まれるリン酸緩衝液、ｐ７．４）を１ｍＬずつ添加し、３時間浸漬した。その後、ウォッシュバッファを純水で１０ｍＬに希釈した。その後、偏光ゼーマン式原子吸光分光光度計（型番：Ｚ−５３１０、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を用いて希釈液中のニッケル濃度を測定した。測定結果を表２に示す。【０１３６】
【表２】
2017135153.tif 000005
【０１３７】
添加剤の種類を添加剤Ａから添加剤Ｂに変えることで、フィルターの本体部分となるニッケルめっき層の表面状態が変わることが確認された。添加剤Ａの場合、表面が平坦なめっき層が形成され、添加剤Ｂの場合は、半光沢のあるめっき表面となった。ただし、表面状態が異なっても、同等の結果が得られることが上記の表２の結果から確認することができた。【０１３８】
また、表２の結果によれば、金層の表面に生体適合性ポリマーを含む疎水化層を形成した場合であっても、希釈液中のニッケル濃度の上昇が防がれていることが確認された。したがって、金層の外側に機能向上を目的とした層を重ねて設けた場合であっても、フィルターの本体部分の金属イオンが流出（溶出）することを防ぐことができることが確認された。【０１３９】
なお、フィルター材質の主成分を銅（Ｃｕ）に変更し、上記の実施例１〜３及び比較例１〜３と同様の条件での評価を行ったところ、パラジウム層を設けていることによりＣｕの溶出が抑制されていることが確認された。【０１４０】
原子吸光光度計測定結果を表３に記す。表３に示すように、パラジウム層があるとニッケルの溶出量が少ないことが確認された。なお、表３では、参考として、ウォッシュバッファのみ（参考１）の原子吸光光度計測定結果も併記している。参考１は、フィルターを用いていない条件である。【０１４１】
【表３】
2017135153.tif 000006
【０１４２】
＜評価２：細胞属性＞
実施例１〜３及び比較例１〜３と同様の工程で作製したフィルターをそれぞれウォッシュバッファに浸漬し金属を溶出させ、その溶出液の細胞毒性を調べた。参照として、フィルターを浸漬させないウォッシュバッファ（参考１）をネガティブコントロールとし、Ｎｉ（１ｐｐｍ）を添加したウォッシュバッファ（参考２）をポジティブコントロールとして用意した。【０１４３】
（試験方法）
１．まず、６穴ディッシュに各々フィルターとウォッシュバッファを１ｍＬずつ入れ、３時間浸漬後、フィルターのみ取り出した。なお、参考１及び参考２については、フィルターを入れずに同じ操作を行った。
２．培養したヒト細気管支肺胞上皮癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ３５８）を１ウエルあたりおよそ１０万個程度添加した。
３．５％ＣＯ２インキュベータ（３７℃）３０分間インキュベートした。
４．０．２５％トリプシンＥＤＴＡ（和光純薬社製）を１００μＬ添加しウエル底面に付着した細胞を剥離した。
５．３分後、細胞培養液（ＲＰＭＩ−１６４０、和光純薬社製）を１００μＬずつ添加し、トリプシンの反応を止めた。
６．上記トリパンブルーで染めた後、細胞計算盤を用いて生細胞と死細胞をカウントした。【０１４４】
（結果）
生存率を表３に示した。生存率が５０％以上である場合を「○」とし、生存率が５０％未満であったものを「×」としている。表３に示すように、Ｎｉの溶出量と細胞の生存率とに相関があることが確認されて、Ｎｉの溶出量が多いものほど生存率が低いことがわかった。一方、パラジウム層が含まれるフィルターを用いた場合には、細胞の生存率が高いことが確認された。【０１４５】
＜評価３：培養可能性＞
フィルター上に濃縮した細胞を培養できると、将来的にさまざまな方面に展開が期待できるため、培養の可能性を調べた。【０１４６】
実施例１〜３及び比較例１〜３と同様の工程で作成したフィルターをそれぞれ培養液に浸漬させながら、細胞を培養した。【０１４７】
（試験方法）
１．培養したヒト肺胞基底上皮腺癌細胞Ａ５４９を、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎで染色し、細胞数が５×１０４  個／ｍＬになるよう細胞培養液（ＲＰＭＩ−１６４０、和光純薬社製）を用いて希釈調節した。
２．６穴ディッシュに各々、上記実施例１〜３及び比較例１〜３と同様の工程で作成したフィルターと上記細胞溶液を各々２ｍＬずつ入れ、５％ＣＯ２インキュベータで３７℃２日間培養した。
３．ディッシュに残存した細胞を倒立顕微鏡及び蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  ２、Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて観察した。観察視野の画像を取得し、フィルターに捕捉された癌細胞の数を計測した。【０１４８】
（結果）
培養の可否を表３に示す。表３に示すように、パラジウム層を有するフィルター上では、細胞の培養が可能であることが確認された。
【符号の説明】
【０１４９】
１…ＭＣＬ、２…銅箔層、２’…銅基板、３…感光性樹脂組成物層、３ａ…感光性樹脂組成物の硬化物、４…フォトマスク、５…卑金属めっき層（本体部分）、６…貫通孔、７…パラジウムめっき層、８…金めっき層、１００…細胞捕捉デバイス、１０５…フィルター、１１０…上部部材、１１５…下部部材、１２０…筐体。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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