(57)【要約】本発明は、哺乳動物の毛包組織と類似し、規則的且つ高密度の再生毛包原基の集合体を簡便に製造する方法を提供する。本発明の再生毛包原基の集合体の製造方法は、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる工程を備える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる工程を備えることを特徴とする再生毛包原基の集合体の製造方法。
【請求項２】
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる、請求項１に記載の再生毛包原基の集合体の製造方法。
【請求項３】
間葉系細胞及び上皮系細胞を含む毛包原基と、
生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、
前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されていることを特徴とする毛包組織含有シート。
【請求項４】
さらに、前記毛包原基が分化し、毛包を形成している、請求項３に記載の毛包組織含有シート。
【請求項５】
前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である、請求項３又は４に記載の毛包組織含有シート。
【請求項６】
前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、請求項５に記載の毛包組織含有シート。
【請求項７】
前記毛包原基の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の毛包組織含有シート。
【請求項８】
規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、混合培養することにより毛包原基を形成させる工程と、
前記微小凹部内に形成された毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程と、を備えることを特徴とする毛包組織含有シートの製造方法。
【請求項９】
前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、請求項８に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生毛包原基の集合体の製造方法、毛包組織含有シート、及び毛包組織含有シートの製造方法に関する。
本願は、２０１５年１０月３０日に、日本に出願された特願２０１５−２１４５４７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
臨床応用に足る毛包再生医療の確立には、再生毛包が正常な組織構造を有し、移植部位に適した毛幹を有する毛が、形成、伸長することが必要である。毛等の皮膚付属器を含む外胚葉性付属器官は、通常、胎児期において、上皮系細胞及び間葉系細胞の相互作用により発生する。外胚葉性付属器官の一つである毛包は、個体の生涯にわたって成長及び退行（毛周期）を繰り返し、成長期における毛球部の再生は、毛包器官発生期と同様な分子機構により誘導されることが知られている。また、このような毛周期における毛球部の再生は、間葉系細胞である毛乳頭細胞により誘導されると考えられている。すなわち、成長期において、毛包上皮幹細胞が間葉系細胞である毛乳頭細胞により分化誘導され毛球部が再生される。【０００３】
これまでに毛包再生に向けて間葉系細胞（毛乳頭細胞及び真皮毛根鞘細胞）を置換することによる毛包可変領域の再生、毛包誘導能を有する間葉系細胞による毛包新生、又は上皮系細胞及び間葉系細胞による毛包の再構築等が試みられてきた。具体的には、上皮系細胞及び間葉系細胞の２種類の細胞集合体をゲル内で区画化して配置することで毛包原基を構築し、化学繊維等のガイドを挿入した後、それを移植することで毛包器官を再生する方法（例えば、特許文献１参照）、体性に由来する複数種の細胞にＷｎｔシグナル活性剤を添加した培養液を用いて混合培養することで、原始的な毛包器官を形成する方法（例えば、特許文献２参照）、毛包間葉系細胞の細胞集塊（スフェロイド）の外側に上皮細胞が接着している人工毛球体を作製する方法（例えば、特許文献３参照）等が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１０８０６９号
【特許文献２】特開２０１３−７８３４４号公報
【特許文献３】特開２００３−７０４６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１〜３では、上皮系細胞及び間葉系細胞の２種類の細胞集合体を作製し、これらを融合させることで毛包原基を一つ一つ作製しており、数万本の毛髪を再生するには、作製効率及び移植効率に問題があった。【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、哺乳動物の毛包組織と類似し、規則的且つ高密度の再生毛包原基の集合体を簡便に製造する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる工程を備えることを特徴とする再生毛包原基の集合体の製造方法。
［２］前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる、［１］に記載の再生毛包原基の集合体の製造方法。
［３］間葉系細胞及び上皮系細胞を含む毛包原基と、生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されていることを特徴とする毛包組織含有シート。
［４］さらに、前記毛包原基が毛包を形成している、［３］に記載の毛包組織含有シート。
［５］前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である、［３］又は［４］に記載の毛包組織含有シート。
［６］前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、［５］に記載の毛包組織含有シート。
［７］前記毛包原基の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、［３］〜［６］のいずれか一つに記載の毛包組織含有シート。
［８］規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、混合培養することにより毛包原基を形成させる工程と、前記微小凹部内に形成された毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程と、を備えることを特徴とする毛包組織含有シートの製造方法。
［９］前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、［８］に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、簡便に、規則的且つ高密度の再生毛包原基の集合体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本実施形態における毛包組織含有シートの製造方法の一例を示す概略図である。
【図２Ａ】実施例１におけるマイクロ凹版の作製方法を示す概略図である。
【図２Ｂ】実施例１におけるマイクロ凹版の全体、底面、底面の断面を示す画像である。
【図３】実施例１におけるマイクロ凹版にて形成された毛包原基のコラーゲンゲルへの転写方法を示す概略図、及び実施例１における位相差顕微鏡を用いて工程［ａ］〜［ｃ］におけるコラーゲンゲルを撮影した結果を示す画像である。
【図４】試験例１におけるマウス毛包組織含有シートを移植したヌードマウスの再生毛髪の様子を示す画像である。
【図５Ａ】実施例２における培養開始から１日目の混合スフェロイドを、位相差蛍光顕微鏡を用いて明視野で観察した結果を示す画像である。
【図５Ｂ】実施例２における培養開始から１日目及び３日目の混合スフェロイドを、位相差蛍光顕微鏡を用いて暗視野で観察した結果を示す画像である。
【図５Ｃ】「Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」は、実施例２における培養開始から３日目の混合スフェロイド中の核を、ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色液で染色し、位相差蛍光顕微鏡を用いて暗視野で観察した結果を示す画像である。「ＡＬＰ」は、実施例２における培養開始から３日目の混合スフェロイド中のアルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰ）を染色し、位相差蛍光顕微鏡を用いて明視野で観察した結果を示す画像である。「ＳＥＭ」は、実施例２における培養開始から３日目の混合スフェロイドを、４％パラホルムアルデヒド固定液で固定化し、凍結乾燥させた後に、走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ）で観察した結果を示す画像である。
【図６Ａ】実施例２における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１４日目のヌードマウスの様子を示す画像である。
【図６Ｂ】実施例２における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から２１日目のヌードマウスの様子を示す画像である。
【図７Ａ】実施例２における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの移植部あたりの毛髪の再生本数と移植した混合スフェロイドの細胞数の関係を示すグラフである。
【図７Ｂ】実施例２における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの毛包組織の再生効率と移植した混合スフェロイドの細胞数の関係を示すグラフである。
【図８】実施例２における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目、３０日目、４２日目、５７日目のヌードマウスの移植部の様子を示す画像である。
【図９】試験例２における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの移植部の組織切片を作製し、ＨＥ染色したものを、位相差蛍光顕微鏡を用いて明視野で観察した結果を示す画像、試験例２における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの移植部の組織切片を作製し、マウスＶｅｒｓｉｃａｎ抗体で免疫染色したものを、位相差蛍光顕微鏡を用いて暗視野で観察した結果を示す画像、及び試験例２における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの移植部の組織切片を作製し、マウスＣＤ３４抗体で免疫染色したものを、位相差蛍光顕微鏡を用いて暗視野で観察した結果を示す画像である。
【図１０】試験例３における培養開始から３日目のＯｘｙｃｈｉｐ又はＮｏｎ−ｏｘｙｃｈｉｐで培養した混合スフェロイドを明視野及び暗視野で観察した結果を示す画像である。
【図１１】試験例３における培養開始から３日目の混合スフェロイドの切片を作製し、ＨＥ染色したものを、位相差蛍光顕微鏡を用いて明視野で観察した結果を示す画像である。
【図１２】試験例３における培養開始から３日目のＯｘｙｃｈｉｐ又はＮｏｎ−ｏｘｙｃｈｉｐで培養した混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの移植部の様子を示す画像である。
【図１３Ａ】実施例３における培養開始から１日目及び３日目の暗視野での９６ウェルプレートにて培養した各細胞数の混合スフェロイドを観察した結果を示す画像である。
【図１３Ｂ】実施例３における培養開始から３日目の明視野でのマイクロ凹版にて培養した４．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルの混合スフェロイドを観察した結果を示す画像である。
【図１３Ｃ】実施例３における培養開始から３日目の暗視野でのマイクロ凹版にて培養した４．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルの混合スフェロイドを観察した結果を示す画像である。
【図１４Ａ】実施例３における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの移植部における再生毛髪を肉眼で観察した結果を示す画像である。
【図１４Ｂ】実施例３における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの毛包組織の再生効率と移植した混合スフェロイドの細胞数の関係を示すグラフである。
【図１４Ｃ】実施例３における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの移植部あたりの毛髪の再生本数と移植した混合スフェロイドの細胞数の関係を示すグラフである。
【図１５Ａ】試験例４における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの移植部の組織切片を作製し、ＨＥ染色したものを、位相差蛍光顕微鏡を用いて明視野で観察した結果を示す画像である。
【図１５Ｂ】試験例４における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの移植部の組織切片を作製し、抗Ｎｕｃｌｅｉ抗体及びヒストファインマウスステインキットで免疫染色したものを、位相差蛍光顕微鏡を用いて明視野で観察した結果を示す画像である。
【図１５Ｃ】試験例４における培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に移植し、移植から１８日目のヌードマウスの移植部の再生毛髪をデジタルマイクロスコープで観察した結果を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００１１】
＜再生毛包原基の集合体の製造方法＞
一実施形態において、本発明は、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる工程を備える、再生毛包原基の集合体の製造方法を提供する。
【００１２】
本実施形態の製造方法によれば、間葉系細胞及び上皮系細胞の混合細胞集塊（以下、「混合スフェロイド」とも呼ぶ。）の構造を高密度に保つことで効率的に毛包原基を形成させることができ、簡便に、規則的且つ高密度の再生毛包原基の集合体を得ることができる。
【００１３】
本明細書において、「間葉系細胞」とは、間葉組織由来の細胞又はその細胞を培養して得られる細胞を意味する。例えば、毛乳頭細胞、真皮毛根鞘細胞、発生期の皮膚間葉系細胞、万能細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等）から誘導された毛包間葉系細胞等が挙げられる。
本明細書において、「上皮系細胞」とは、上皮組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味する。例えば、バルジ領域の外毛根鞘最外層細胞、毛母基部の上皮系細胞、万能細胞万能細胞（例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、人工多能性（ｉＰＳ）幹細胞等）から誘導された毛包上皮系細胞等が挙げられる。
細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
【００１４】
本明細書において、「毛包原基」とは、毛包のもととなる組織を意味し、上述の間葉系細胞及び上述の上皮系細胞から構成されている。毛包原基が形成される流れとしては、まず、上皮系細胞が肥厚し、間葉系細胞側に陥入することで、間葉性細胞の細胞集塊（スフェロイド）を包み込む。続いて、間葉性細胞のスフェロイドを包み込んだ上皮性細胞は毛母原基を形成し、間葉性細胞のスフェロイドは毛誘導能を持つ毛乳頭を形成することで、毛母原基及び毛乳頭等からなる毛包原基を形成する。この毛包原基では、毛乳頭細胞が毛母細胞に増殖因子を提供しており、毛母細胞の分化を誘導し、分化した細胞が毛を形成することができる。
本明細書において、「毛包」とは、表皮が内側に筒状に入り込んだ部分であって、毛を産生する皮膚の付属器官を意味する。
本明細書において、「再生毛包原基」とは、例えば、本実施形態の製造方法等により作製された毛包原基を意味する。
本明細書において、「再生毛包原基の集合体」とは、上述の再生毛包原基が複数集まった状態のものを意味する。本実施形態の製造方法では、簡便に、複数の上述の毛包原基が哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で規則的に整列した再生毛包原基の集合体を得ることができる。また、再生毛包原基の集合体は毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
【００１５】
従来では、間葉系細胞のスフェロイドを高密度で規則的な配列で培養した後に、上皮系細胞を後から播種し、間葉系細胞のスフェロイドの周囲を覆わせる方法によって、高密度で規則的な配列の再生毛包原基の集合体を得ていた。
これに対し、本発明者らは、間葉系細胞及び上皮系細胞の懸濁液を一緒に播種し、本実施形態の製造方法を用いて共培養することにより、簡便に、複数の毛包原基が哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で規則的に整列した再生毛包原基の集合体を得ることに初めて成功した。
【００１６】
本明細書において、規則的とは、等間隔で毛包原基が配置されている状態を表しており、哺乳動物の皮膚における毛穴と毛穴の間隔と同程度であればよい。また、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度とは、具体的には、２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下であることが好ましく、５０個／ｃｍ２以上２５０個／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１００個／ｃｍ２以上２００個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。
【００１７】
［マイクロ凹版］
毛包原基を形成させる際に使用するマイクロ凹版は、複数の微小凹部が規則的に配置されているものが好ましい。マイクロ凹版は、市販のものを用いてもよいし、後述の実施例１の方法等で作製してもよい。また、マイクロ凹版における微小凹部の密度は、２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下であることが好ましく、５０個／ｃｍ２以上２５０個／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１００個／ｃｍ２以上２００個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で毛包原基が配置された状態で培養することができる。後述するとおり、この規則的な配置且つ高密度の毛包原基をそのままの配置を保ちながら、被験動物の毛包欠損部に移植することで、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。
【００１８】
また、微小凹部の開口形状について、特別な限定はない。例えば、円形状、四角状、六角状、ライン状等であってもよく、中でも、毛穴に近い形状であるという観点から、円形状であることが好ましい。
微小凹部の開口部の直径及び深さについて、混合スフェロイドを収容し培養できる大きさであれば特別な限定はないが、直径については、哺乳動物の毛穴と同程度の大きさであってよく、例えば、２０μｍ以上１ｍｍ以下であってよい。また、深さについては、毛包組織含有シートの移植後の被験動物の皮膚への定着の観点から、１ｍｍ以下であってよい。
得られる毛包原基の配置及び大きさは、マイクロ凹版の微小凹部の開口形状、直径及び深さ等に依存するため、被験動物の種類、移植する部位等に合わせて、適宜マイクロ凹版の微小凹部を調製すればよい。
【００１９】
マイクロ凹版の材質は、細胞培養に適したものであればよく、特別な限定はない。例えば、透明なガラス、ポリマー材等が挙げられる。中でも、酸素透過性を有するポリマー材が好ましく、より具体的には、フッ素樹脂、シリコンゴム（例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）等）等が挙げられる。これらの材質を単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
【００２０】
本明細書において、「酸素透過性」とは、分子状の酸素を透過し、マイクロ凹版の微小凹部内まで到達させる性質を表している。具体的な酸素透過率としては、約１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であってよく、約１１００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上３０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であってよく、約１２５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以上２７５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であってよい。なお、「２４ｈｒ」は２４時間を意味し、「ａｔｍ」とは、気圧を意味しており、上記単位は、１気圧の環境下において、２４時間で透過する酸素の１ｍ２あたりの容量を表している。酸素透過率が上記範囲である材質からなるマイクロ凹版を使用することにより、十分な量の酸素を混合スフェロイドに供給でき、毛包原基を形成することができる。
【００２１】
［毛包原基形成工程］
まず、間葉系細胞及び上皮系細胞を上述のマイクロ凹版に播種する。続いて、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる。このとき、播種する細胞が多いほど、毛包原基の形成効率が高く、毛包原基の大きさも大きくなるが、播種する細胞数はマイクロ凹版の微小凹部の大きさに応じて適宜調整すればよい。培養時間は、１日以上５日以下（好ましくは、３日）であってよく、培養温度は２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）であってよい。
【００２２】
酸素を供給しながら培養する方法としては、マイクロ凹版に酸素を直接吹きかける等して供給しながら培養する方法や、酸素透過性を有する材質からなるマイクロ凹版を用いて培養する方法等が挙げられる。
【００２３】
混合スフェロイドにおいて、毛包原基が形成される流れとしては、まず、上皮系細胞が肥厚し、間葉系細胞側に陥入することで、間葉性細胞のスフェロイドを包み込む。続いて、間葉性細胞のスフェロイドを包み込んだ上皮性細胞は毛母原基を形成し、間葉性細胞のスフェロイドは毛誘導能を持つ毛乳頭を形成することで、毛母原基及び毛乳頭等からなる毛包原基を形成する。この毛包原基では、毛乳頭細胞が毛母細胞に増殖因子を提供しており、毛母細胞の分化を誘導し、分化した細胞が毛を形成することができる。さらに、本実施形態の製造方法において、毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
【００２４】
混合スフェロイドを共培養する際に使用する培地は、特別な限定はなく、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよい。例えば、ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等が挙げられる。
【００２５】
＜毛包組織含有シート＞
一実施形態において、本発明は、間葉系細胞及び上皮系細胞を含む毛包原基と、生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されている、毛包組織含有シートを提供する。
【００２６】
本実施形態の毛包組織含有シートによれば、簡便に、規則的且つ高密度の毛包組織を再生することができる。
【００２７】
本実施形態において、間葉系細胞及び上皮系細胞は上述のものと同様のものが挙げられる。また、本実施形態において、毛包組織含有シートは上述の毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
【００２８】
本明細書において、「生体適合性ハイドロゲル」とは、生体への適合性を有するゲルであって、高分子が化学結合によって網目構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を意味する。より具体的には、天然物由来の高分子や合成高分子の人工素材に架橋を導入してゲル化させたものをいう。
【００２９】
天然物由来の高分子としては、ゲル化する細胞外マトリックス成分等が挙げられる。ゲル化する細胞外マトリックス成分としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン等を例示することができる。その他天然物由来の高分子として、ゼラチン、寒天、アガロース等を使用することもできる。それぞれのゲル化に至適な塩等の成分、その濃度、ｐＨ等を選択しハイドロゲルを作製することが可能である。また、これらの原料を組み合わせてもよい。
【００３０】
また、合成高分子としては、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（ＩＩ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ等が挙げられる。また、これらの高分子を２種以上用いてハイドロゲルを作製することも可能である。
【００３１】
中でも、生体適合性ハイドロゲルは、天然物由来の高分子であることが好ましく、ゲル化する細胞外マトリックス成分であることがより好ましく、コラーゲン（特に、Ｉ型コラーゲン）であることがさらに好ましい。コラーゲンを含有することにより、より皮膚に近しい組成となり、高い毛包再生効率を実現できる。
【００３２】
本実施形態において、上述の毛包原基が、上述の生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されていることが好ましい。規則的とは、等間隔で毛包原基が配置されている状態を表しており、哺乳動物の皮膚における毛穴と毛穴の間隔と同程度であればよい。また、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度とは、具体的には、２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下であることが好ましく、５０個／ｃｍ２２５０個／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１００個／ｃｍ２２００個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。
【００３３】
＜毛包組織含有シートの製造方法＞
一実施形態において、本発明は、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、混合培養することにより毛包原基を形成させる工程と、前記微小凹部内に形成された毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程と、を備える、毛包組織含有シートの製造方法を提供する。
【００３４】
本実施形態の製造方法によれば、簡便に、規則的且つ高密度の毛包組織含有シートを得ることができる。
【００３５】
図１は、本実施形態における毛包組織含有シートの製造方法の一例を示す概略図である。図１を参照しながら、本実施形態における毛包組織含有シートの製造方法について、以下に詳細を説明する。
【００３６】
［マイクロ凹版］
毛包組織含有シートを製造する際に使用するマイクロ凹版３は、上述のとおり、複数の微小凹部４が規則的に配置されているものが好ましい。マイクロ凹版３は、市販のものを用いてもよいし、後述の実施例１の方法等で作製してもよい。また、マイクロ凹版３における微小凹部４の密度は、２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下であることが好ましく、５０個／ｃｍ２２５０個／ｃｍ２以下であることがより好ましく、１００個／ｃｍ２２００個／ｃｍ２以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で毛包原基が配置された毛包組織含有シートを得ることができる。
【００３７】
また、微小凹部の開口形状について、特別な限定はない。例えば、上述したものと同様の形状が挙げられ、中でも、毛穴に近い形状であるという観点から、円形状であることが好ましい。
微小凹部の開口部の直径及び深さについて、間葉系細胞１及び上皮系細胞２の混合スフェロイドを収容し培養できる大きさであれば特別な限定はないが、直径については、哺乳動物の毛穴と同程度の大きさであってよく、例えば、２０μｍ以上１ｍｍ以下であってよい。また、深さについては、毛包組織含有シートの移植後の被験動物の皮膚への定着の観点から、１ｍｍ以下であってよい。
得られる毛包組織含有シートにおける毛包原基の配置及び大きさは、マイクロ凹版３の微小凹部４の開口形状、直径及び深さ等に依存するため、被験動物の種類、移植する部位等に合わせて、適宜マイクロ凹版３の微小凹部４を調製すればよい。
【００３８】
マイクロ凹版の材質は、細胞培養に適したものであればよく、特別な限定はない。例えば、透明なガラス、ポリマー材等が挙げられる。中でも、酸素透過性が高いポリマー材が好ましく、より具体的には、フッ素樹脂、シリコンゴム（例えば、ポリジメチルシロキサン（ｐｏｌｙ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：ＰＤＭＳ）等）等が挙げられる。
これらの材質を単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
【００３９】
［毛包原基形成工程］
上述の＜再生毛包原基の集合体の製造方法＞と同様に、まず、間葉系細胞１及び上皮系細胞２の混合スフェロイドを、マイクロ凹版３に播種し、混合培養することにより毛包原基を形成させる。このとき、播種する細胞が多いほど、毛包原基の形成効率が高く、毛包原基の大きさも大きくなるが、播種する細胞数はマイクロ凹版３の微小凹部４の大きさに応じて適宜調整すればよい。培養時間は、１日以上５日以下（好ましくは、３日）であってよく、培養温度は２５℃以上４０℃未満（好ましくは、３７℃）であってよい。
【００４０】
間葉系細胞１及び上皮系細胞２の混合スフェロイドにおいて、毛包原基が形成される流れは、上述のとおりである。さらに、本実施形態の製造方法において、毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
【００４１】
本実施形態の製造方法において、間葉系細胞１は、上述したものと同様のものが挙げられる。また、上皮系細胞は、上述したものと同様のものが挙げられる。
細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
【００４２】
間葉系細胞１及び上皮系細胞２の混合スフェロイドを共培養する際に使用する培地は、特別な限定はなく、上述したものと同様のもの等が挙げられる。
【００４３】
［転写工程］
続いて、培地を除去して、生体適合性ハイドロゲルを含む溶液を添加して、生体適合性ハイドロゲルをゲル化させる。溶液中の生体適合性ハイドロゲルの濃度は、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。また、ゲル化させるための時間についても、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。ゲル化させる温度等の条件については、特別な限定はなく、例えば３７℃のＣ０２インキュベーター内で培養する方法等が挙げられる。
続いて、マイクロ凹版から毛包原基を含むゲル化した生体適合性ハイドロゲルを取り外すことで、毛包組織含有シートが得られる。
【００４４】
本実施形態の製造方法において、生体適合性ハイドロゲルとは、上述したものと同様のものが挙げられる。中でも、生体適合性ハイドロゲルは、天然物由来の高分子であることが好ましく、ゲル化する細胞外マトリックス成分であることがより好ましく、コラーゲン（特にＩ型コラーゲン）であることがさらに好ましい。コラーゲンを使用することにより、より皮膚に近しい組成となり、高い毛包再生効率を実現できる。
【００４５】
生体適合性ハイドロゲルを含む溶液は、Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｆ−１０又はＨａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅｓ  Ｆ−１２等の無血清培地や、生体適合性ハイドロゲル再構成用の緩衝液（例えば、水酸化ナトリウム、炭酸水水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ−Ｂｕｆｆｅｒからなる緩衝液等）等を含んでいてもよい。
【００４６】
本実施形態の製造方法において、生体適合性ハイドロゲルをゲル化させる際に、ゲルの強度を補強するために、支持体を内包させてもよい。
支持体の材質としては、移植後に、毛包原基の上皮系細胞側の部分と被験動物側の上皮系細胞との連結を促進させることができるものであれば、特別な限定はない。例えば、ナイロン等のポリマーや合成又は天然の生体吸収可能なポリマーより作られた繊維、ステンレス等の金属繊維、炭素繊維、及びガラス繊維等の化学繊維、並びに天然の動物繊維（生体由来の毛髪等）や植物繊維等を挙げることができ、より具体的には、ナイロン糸やステンレス線等を挙げることができる。支持体の直径及び長さは、再生対象となる部分により適宜設計することができる。直径は、例えば、５μｍ以上１００μｍ以下であってよく、２０μｍ以上５０μｍ以下であってよい。また、長さは、例えば、１ｍｍ以上１０ｍｍ以下であってよく、４ｍｍ以上６ｍｍ以下であってよい。
【００４７】
＜再生毛包原基の集合体の移植方法＞
一実施形態において、本発明は、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、混合培養することにより毛包原基を形成させる工程と、前記毛包原基を前記微小凹部の規則的な配置を保ちながら、被験動物の毛包欠損部に移植する工程と、を備える再生毛包原基の集合体の移植方法を提供する。
【００４８】
本実施形態の移植方法によれば、簡便に、規則的且つ高密度の毛包組織を再生することができる。
【００４９】
［毛包原基形成工程］
上述の＜再生毛包原基の集合体の製造方法＞と同様に、間葉系細胞及び上皮系細胞の混合スフェロイドを、マイクロ凹版に播種し、混合培養することにより毛包原基を形成させる。
【００５０】
［移植工程］
規則的な配置の微小凹部内において形成された毛包原基を、例えば、上述の微小凹部と同様の規則的な配置である複数のチップ、ニードル又はノズルを有するマルチピペットを用いて吸引する。続いて、被験動物の毛包欠損部に規則的な配置のまま毛包原基を移植する。規則的な配置を保つことにより、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。マルチピペットは手動のものでも、全自動のものでもよい。
【００５１】
本明細書において、「マルチピペット」とは、複数のチップ、ニードル又はノズルを先端に有し、上述の微小凹部と同様の規則的な配置でチップ、ニードル又はノズルが備えられており、間葉系細胞及び上皮系細胞からなる毛髪原基を吸引及び排出できるものであれば、特別な限定はない。材質は、細胞に有害なものでなければ特別な限定はなく、また、マルチピペットに装着するチップ、ニードル又はノズルの先端の口径は、マイクロ凹版の微小凹部に差し込むことができる程度の大きさであれば、特別な限定はない。
【００５２】
＜毛包組織含有シートの移植方法＞
本実施形態の毛包組織含有シートは、当業者に公知の方法で対象となる部位に移植することができる。例えば、シャピロ式植毛術やチョイ式植毛器を用いた植毛、空気圧を利用したインプランター等を使用し、移植することができる。シャピロ式植毛術とは、移植部位をマイクロメス等で移植創を作った後に、ピンセットを用いて移植する方法である。
本実施形態の毛包組織含有シートの大きさは、被検動物（ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物、好ましくはヒト）の年齢、性別、症状、治療部位、治療時間等を勘案して適宜調節される。
【００５３】
また、移植深度としては、再生対象となる部位により適宜変更することができる。例えば、０．０５ｍｍ以上５ｍｍ以下であってよく、０．１ｍｍ以上１ｍｍ以下であってよく、０．３ｍｍ以上０．５ｍｍ以下であってよい。また、移植する部位としては、被験動物の真皮層内に移植することが好ましく、さらに好ましくは、毛包形成及びその後の発毛効率の優れた真皮及び皮下組織の境界面より上方とすることが好ましい。また、移植創上端部に毛包原基の上皮系細胞成分の上端部が露出するよう移植深度を調節すると、さらに被験動物の上皮系細胞との連続性を高めることができるため、好ましい。
本実施形態の毛包組織含有シートにおいて、皮膚接合用のテープやバンド、縫合等により、毛包組織含有シートと移植対象部位とを固定してもよい。
【００５４】
本実施形態の毛包組織含有シートにおいて、上述の支持体を内包している場合は、再生器官原基を移植後しばらくして被験動物の上皮系細胞と、毛包原基の上皮系細胞由来の側との連続性が確保された後、移植部位より抜くことができる。移植後の状態により適宜設定することができるが、例えば、移植後３日から７日までに移植部位から抜くことが好ましい。
又は、支持体が、自然と移植部位より抜けるまで放置することもできる。生体吸収性の材料の支持体は、自然と移植部位より抜けるか、分解又は吸収されるまで放置することができる。
【００５５】
また、本実施形態の毛包組織含有シートにおいて、上述の支持体を内包している場合は、毛包原基の上皮系細胞由来の細胞が、支持体に沿って伸長する。これにより、移植後の被験動物側の上皮系細胞と毛包原基の上皮系細胞側との連続性を向上させることができる。特に、支持体が移植部位の表皮より外に維持される場合には、被験動物側の上皮系細胞が、異物を排除するように、支持体に沿って移植部位の内側へ伸長するため、連続性をさらに向上させることができる。さらに、意図した方向へ毛包形成を促すことができる。その結果、毛包原基からの発毛率を向上させることができるとともに、発毛方向の制御も可能となる。
【００５６】
＜毛包組織の再生治療方法＞
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための再生毛包原基の集合体を提供する。
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための毛包組織含有シートを提供する。
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための再生毛包原基の集合体の製造方法を提供する。
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための毛包組織含有シートの製造方法を提供する。
【００５７】
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の再生毛包原基の集合体を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の毛包組織含有シートを含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、毛包再生治療剤を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、毛包再生治療剤を製造するための上記再生毛包原基の集合体の使用を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、毛包再生治療剤を製造するための上記毛包組織含有シートの使用を提供する。
【００５８】
また、本発明の一側面は、上記再生毛包原基の集合体の有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療方法を提供する。
また、本発明の一側面は、上記毛包組織含有シートの有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療方法を提供する。
【００５９】
本明細書において、再生可能な毛包組織を含む組織としては、毛包を再生し、さらに毛髪を再生したい体表皮であれば、特別な限定はなく、例えば、頭皮等が挙げられる。
また、適用可能な疾患としては、脱毛を伴う任意の疾患であって、例えば男性型脱毛症（Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＡＧＡ）、女子男性型脱毛症（Ｆｅｍａｌｅ  Ａｎｄｒｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｌｏｐｅｃｉａ：ＦＡＧＡ）分娩後脱毛症、びまん性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、牽引性脱毛症、代謝異常性脱毛症、圧迫性脱毛症、円形脱毛症、神経性脱毛症、抜毛症、全身性脱毛症、症候性脱毛症等が挙げられ、これらに限定されない。
【００６０】
治療対象としては、特別な限定はなく、ヒト又は非ヒト動物を含む哺乳動物が挙げられ、ヒトが好ましい。
【実施例】
【００６１】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００６２】
［実施例１］マウス毛包組織含有シートの作製
（１）マイクロ凹版の作製
マイクロ凹版の作製方法の概略図を図２Ａに示す。具体的には、ＣＡＤソフト（Ｖ  Ｃａｒｖｅ  Ｐｒｏ  ６．５）を用いて、作製するマイクロ凹版のパターンをコンピューターで設計した。続いて、切削機を用いて、設計したパターン通りにオレフィン系基板を切削することで、パターンをもつ凹鋳型を作製した（工程（Ｉ））。この凹鋳型にエポキシ樹脂（クリスタルリジン：日新レジン社製）を流しこみ（工程（ＩＩ））、１日硬化させた後（工程（ＩＩＩ））、離型することで、パターンをもつ凸鋳型を形成した（工程（ＩＶ））。続いて、形成した凸鋳型を６ｃｍディッシュ底面に固定し、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を流し込み（工程（Ｖ））、固化した（工程（ＶＩ））。続いて、離型することで、ＰＤＭＳに規則的なパターンが形成されたマイクロ凹版を作製した（工程（ＶＩＩ））。なお、マイクロ凹版のパターンデザインは、日本人の頭髪の平均毛包密度に合わせて作製した。作製したマイクロ凹版を図２Ｂに示す。高さ１ｃｍ、２×２ｃｍ四方の容器の底面に直径約１ｍｍ、高さ５００μｍのウェルが約１００ウェル／ｃｍ２の密度で配置された容器を形成した。【００６３】
（２）毛包原基の形成
胎齢１８日のＣ５７ＢＬ／６マウスから上皮系細胞及び間葉系細胞を採取した。続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を１ｍＬ（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）加え、３日間培養した。培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）（１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）含有）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（倉敷紡績社製）を１：１で混合した培地（以下、「ＤＭＥＭ−ＫＧ２混合培地」とも呼ぶ。）を用いた。培地交換は毎日行った。【００６４】
（３）コラーゲンゲルへの転写
マイクロ凹版にて形成された毛包原基のコラーゲンゲルへの転写方法の概略図を図３の（Ａ）に示す。毛包原基が形成されたマイクロ凹版（工程［ａ］）から培地を除き、４℃で３０分冷却したコラーゲンゲル溶液（新田ゼラチン社製）を１ｍＬ加え、滅菌ガーゼを支持体としてゲル内に包埋した（工程［ｂ］）。続いて、シーソー型攪拌機で撹拌しながら、４℃で５０分間、ゲルをならした。続いて、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で４０分間静置した。さらに、ＤＭＥＭ−ＫＧ２混合培地を加え、ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で１時間培養した。続いて、容器の端をつつくようにしてゲルをはがすことで、毛包原基の規則的な配置を保ったままコラーゲンゲルに転写して、マウス毛包組織含有シートを作製した（工程［ｃ］）。工程［ａ］〜［ｃ］でのコラーゲンゲルを位相差顕微鏡で観察した結果を図３の（Ｂ）に示す。図３の（Ｂ）において、黒矢頭は毛包原基を示している。【００６５】
［試験例１］移植により再生した毛包組織の評価試験
（１）マウス毛包組織含有シートの移植
ヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮膚に移植創を作製した。続いて、実施例１において作製したマウス毛包組織含有シートを移植部に合わせてトリミングし、ヌードマウスの皮膚に挿入した。移植から１４日後の再生毛髪の様子を図４に示す。【００６６】
（２）結果と考察
移植部から発毛が確認され、毛髪は規則的に１〜３ｍｍピッチで発毛した。さらに、移植した毛包原基は組織内に定着し、毛周期（発毛→脱毛→発毛）を繰り返した。
以上のことから、移植したマウス毛包組織含有シートは、正常な毛包を形成していることが確認された。【００６７】
［実施例２］マウス再生毛包原基の作製と移植
（１）マイクロ凹版の作製
実施例１（１）と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。【００６８】
（２）再生毛包原基の作製
妊娠マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌ、妊娠２週間目）から間葉系細胞を１．５×１０７ｃｅｌｌｓ、上皮系細胞を１．５×１０６ｃｅｌｌｓ採取した。続いて、間葉系細胞を含む懸濁液１ｍＬにＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）  Ｃｅｌｌ−ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社製）を５μＬ加え、２０分間培養して、細胞を染色した。続いて、遠心分離を行い、上清を除去後、ＤＭＥＭ−ＫＧ２混合培地を加え、間葉系細胞及び上皮系細胞を表１に示す細胞密度でマイクロ凹版に播種した。【００６９】
【表１】
2017073625.tif 000002
【００７０】
（顕微鏡観察）
培養中の間葉系細胞及び上皮系細胞の混合細胞集塊（以下、「混合スフェロイド」とも呼ぶ。）について、培養開始から１、２、３日目に位相差蛍光顕微鏡を用いて観察した。
培養開始から１日目の細胞の明視野での観察結果を図５Ａに、培養開始から１日目及び３日目の暗視野での観察結果を図５Ｂに示す。【００７１】
（ＤＡＰＩ染色）
培養開始から１、２、３日目の混合スフェロイドを４％パラホルムアルデヒド固定液に１時間漬けて固定した。続いて、ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、１０分間インキュベーションして、核を染色した。染色された混合スフェロイドを、位相差蛍光顕微鏡を用いて観察した。培養開始から３日目の暗視野での観察結果を図５Ｃに示す（「Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ」と記載されている画像である）。図５Ｃにおいて、ＮｕｃｌｅｉとはＤＡＰＩにより青色に染色された核を示し、ＤｅｒｍａｌとはＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）  Ｃｅｌｌ−ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓにより赤色に染色された間葉系細胞を示す。【００７２】
（ＡＬＰ染色）
培養開始から１、２、３日目の混合スフェロイドをクエン酸アセトン固定液に３０秒漬けて固定した。続いて、Ｆａｓｔ  ｂｌｕｅ  ＲＲ  ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ社製）とナフトールＡＳ−ＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製）の混合液を添加し、３０分間インキュベーションして、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＡＬＰ）を染色した。染色された混合スフェロイドを、位相差蛍光顕微鏡を用いて観察した。培養開始から３日目の明視野での観察結果を図５Ｃに示す（「ＡＬＰ」と記載されている画像である）。【００７３】
（ＳＥＭ観察）
培養開始から１、２、３日目の混合スフェロイドを４％パラホルムアルデヒド固定液に１時間漬けて固定した。続いて、エタノールを添加し、脱水させた後に、ｔ−ブタノールに置換した。続いて、凍結乾燥させた後に、走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ）で観察した。培養開始から３日目の観察結果を図５Ｃに示す（「ＳＥＭ」と記載されている画像である）。【００７４】
（３）マウス皮下移植
培養開始から３日目の混合スフェロイドをヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に直接注入し、移植した。移植から１４日目のヌードマウスの様子を図６Ａに、２１日目のヌードマウスの様子を図６Ｂに示す。また、移植から１８日目のヌードマウスの移植部あたりの毛髪の再生本数（図７Ａ参照）と再生効率（＝発毛部／移植部×１００（％））（図７Ｂ参照）を示したグラフを図７Ａ及び図７Ｂに示す。さらに、移植から１８日目、３０日目、４２日目、５７日目のヌードマウスの移植部の様子を図８に示す。図８において、Ｄ１８は移植から１８日目、Ｄ３０は移植から３０日目、Ｄ４２は移植から４２日目、Ｄ５７は移植から５７日目を示す。【００７５】
（４）結果と考察
図５Ａ及び図５Ｂから、培養開始から１日目において、赤い蛍光で示された間葉系細胞は上皮系細胞を覆うように局在化し、培養開始から３日目において、上皮系細胞と間葉系細胞はそれぞれ分離し、それぞれが重なりあった毛包原基構造を形成したことが確かめられた。
図５Ｃから、培養開始から１日目において、混合スフェロイドはそれぞれ上皮−間葉の２極化した構造を形成し、細胞数が小さくなるほど、２つの球が密着したような構造を形成することが確かめられた。また、ＡＬＰ染色の結果から、細胞数に関わらず、間葉系細胞が紫色に染色された。
以上のことから、混合スフェロイドを構成する間葉系細胞は毛乳頭細胞に分化し、毛包形成及び毛幹新生を開始し始めていることが示唆された。また、今回作製した混合スフェロイドは毛幹新生能を持つ、「再生能力の高い毛乳頭」を形成していることが示された。【００７６】
図６Ａから、全ての混合スフェロイドでホクロ様の黒ずんだ部分が形成されたが、細胞数の大きいものほど、この形成効率が高く、その大きさも大きい傾向が見られることが明らかとなった。
図６Ｂから、移植後２１日目において、黒ずんだ部分から発毛が観察されることが確かめられた。
図７Ａ及び図７Ｂから、細胞数が大きい移植体ほど移植部から生える本数が多く、再生効率が高い傾向にあることが確認された。
図８から、移植した混合スフェロイドから発毛した毛は毛周期を繰り返すことが示された。また、毛周期は生体とほぼ同様の３週間程度で繰り返されることが確かめられた。【００７７】
［試験例２］マウス再生毛包の評価試験
（１）再生毛包の染色
作製した混合スフェロイドが生体と同様の構造を持つ毛包を形成しているかを確認するために、毛包上皮幹細胞に特異的に発現するＣＤ３４と毛乳頭細胞が産生するＶｅｒｓｉｃａｎを凍結切片の免疫組織化学染色により染色した。具体的な染色方法について、以下に説明する。【００７８】
（切片の作製）
実施例２（２）と同様の方法を用いて作製された混合スフェロイドを、実施例２（３）と同様の方法を用いてヌードマウスに移植した。移植後１８日目のヌードマウスの移植部の皮膚を切り出した。続いて、２０％ホルマリン（Ｗａｋｏ社製）に１日浸漬することで、組織の固定を行った。続いて、１０％、２０％、３０％スクロース溶液（Ｗａｋｏ社製のスクロースを希釈して調製した溶液）にそれぞれ１時間ずつ浸した。スクロース置換した切片を凍結組織切片作製用包埋剤（Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ：Ｏ．Ｃ．Ｔ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（サクラファインテック社製）を静かに流し込み、混合スフェロイドを封入した。続いて、クライオミクロトームを用いて微小の厚さにカットした。カットされた切片をスライドガラスに垂直に押し当て、転写した。【００７９】
（ヘマトキシリン・エオジン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ：ＨＥ）染色）
得られたスライドガラスにキシレンを１ｍＬ滴下し３０分間静置した後、溶液を除去した。続いて、キシレンを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。続いて、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。続いて、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。続いて、９０％エタノール溶液を１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。続いて、７０％エタノール溶液を１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。続いて、蒸留水を１ｍＬ滴下し３分間静置した後、蒸留水を除去した。続いて、マイヤー・ヘマトキシリン染色液を１ｍＬ滴下し３分間静置した後、溶液を除去した。続いて、流水に１３分間浸し、洗い流した。続いて、エマシンＹを１ｍＬ滴下し４分間静置した後、溶液を除去した。続いて、９０％エタノール溶液を１ｍＬ滴下し１分間静置した後、溶液を除去した。続いて、１００％エタノール溶液を１ｍＬ滴下し１分間静置した後、溶液を除去した。続いて、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。続いて、１００％エタノールを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。続いて、キシレンを１ｍＬ滴下し５分間静置した後、溶液を除去した。最後に、キシレンを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。スライドガラスが乾いたら、マウントクイック（封入剤）を少量垂らし、気泡が入らないようにマイクロカバーガラスをゆっくりかぶせ、封入した。位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）で観察した結果を図９の（Ａ）に示す。【００８０】
（免疫抗体染色）
得られたスライドガラスにＰＢＳを１ｍＬ滴下し５分静置した後、溶液を除去した（洗浄）。続いて、ＰＢＳを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度行い、洗浄した。続いて、５％スキムミルク含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：Ｄ−ＰＢＳ）を２００μＬ滴下し、３０分間静置し、ブロッキングを行った。続いて、Ｄ−ＰＢＳで２０μｇ／ｍＬとなるように希釈した、ラットに免疫したマウスＣＤ３４抗体（Ａｂｃａｍ社製）又はウサギに免疫したマウスＶｅｒｓｉｃａｎ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を一次抗体としてスライドガラスに１ｍＬ滴下し、４℃で一晩インキュベートした。続いて、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）を１ｍＬ滴下し１０分間静置した後、溶液を除去した（洗浄）。同じ操作を２回繰り返して、洗浄を行った。Ｄ−ＰＢＳで２０μｇ／ｍＬに希釈したウサギ抗ラットＩｇＧ抗体（ライフテクノロジー社製）又はヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として、スライドガラスに２００μＬ滴下し、アルミホイルで覆い、１時間常温でインキュベートした。続いて、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ−Ｔを１ｍＬ滴下し１０分間静置した後、溶液を除去した（洗浄）。同じ操作を２回繰り返し、洗浄を行った。続いて、ＰＢＳで１０ｎｇ／ｍＬに希釈したＤＡＰＩ（４’，６−Ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）溶液をスライドガラスに２００μＬ滴下し、９分間インキュベーションすることで、核染色を行った。続いて、ＰＢＳを１ｍＬ滴下し５分静置した後、溶液を除去した（洗浄）。続いて、ＰＢＳを１ｍＬ滴下し、同じ操作をもう一度行い、洗浄した。スライドガラスが乾いたら、マウントクイック（封入剤）を少量垂らし、気泡が入らないようにマイクロカバーガラスをゆっくりかぶせ、封入した。位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）で観察した結果を図９の（Ｂ）（マウスＶｅｒｓｉｃａｎ抗体）及び図９の（Ｃ）（マウスＣＤ３４抗体）に示す。図９の（Ｃ）において、バルジ領域とは、毛を作る「毛包幹細胞」と、色素を作る「色素幹細胞」が存在する部分であり、毛乳頭への発毛指令を司る部分である。【００８１】
（２）結果と考察
図９の（Ａ）から、毛包のないヌードマウスの皮下に毛組織が新たに形成されたことが確認できた。
図９の（Ｂ）及び図９の（Ｃ）から、Ｖｅｒｓｉｃａｎは毛球部、ＣＤ３４はバルジ領域に発現しており、実際の毛包と同様の位置に毛の幹細胞群が存在することが確認できた。
以上のことから、混合スフェロイドは生体と同等の毛包を再生できることが示唆された。【００８２】
［試験例３］酸素透過性及び酸素不透過性マイクロ凹版を用いた毛包形成確認試験
実施例１（１）で作製した酸素透過性の高いマイクロ凹版（以下、「Ｏｘｙｃｈｉｐ」とも呼ぶ。）と、実施例１（１）で作製したマイクロ凹版をアクリルで周りを覆った酸素不透過性のマイクロ凹版（以下、「Ｎｏｎ−ｏｘｙｃｈｉｐ」とも呼ぶ）で形成させた混合スフェロイドを比較することで、培養中の酸素供給が毛包形成に与える影響を解析した。具体的な試験方法を以下に示す。【００８３】
（１）マイクロ凹版の作製
実施例１（１）と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。作製したマイクロ凹版の内、周りをアクリルで覆い酸素を不透過としたもの（Ｎｏｎ−ｏｘｙｃｈｉｐ）も準備した。【００８４】
（２）毛包原基の作製
実施例１（２）と同様の方法を用いて、Ｏｘｙｃｈｉｐに上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を１ｍＬ（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェル）加え、３日間培養した。Ｎｏｎ−ｏｘｙｃｈｉｐについても、同様に細胞混合液を播種し、３日間培養した。【００８５】
（顕微鏡観察）
実施例２（２）と同様の方法を用いて、培養中の混合スフェロイドについて、培養開始から１、２、３日目に位相差蛍光顕微鏡を用いて観察した。培養開始から３日目の明視野及び暗視野での観察結果を図１０に示す。【００８６】
（切片の作製）
試験例２（１）（切片の作製）と同様の方法を用いて、混合スフェロイドの切片を作製した。【００８７】
（ＨＥ染色）
試験例２（１）（ＨＥ染色）と同様の方法を用いて、切片を染色した。位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）で観察した結果を図１１に示す。【００８８】
（３）マウス皮下移植
培養開始から３日目の混合スフェロイドを、実施例２（３）と同様の方法を用いて、ヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）の皮下に直接注入し、移植した。移植から１８日目のヌードマウスの様子を図１２に示す。【００８９】
（４）結果と考察
図１０から、Ｏｘｙｃｈｉｐで培養した混合スフェロイドは、上皮−間葉構造を再構成することで毛包原基構造を形成することが確かめられた。一方、Ｎｏｎ−ｏｘｙｃｈｉｐで培養したものは上皮−間葉構造の再構成が観察されず、凝集体が崩壊していることが確かめられた。
図１１から、Ｏｘｙｃｈｉｐを用いた場合では、顕微鏡観察と同様に正常な毛包原基が形成していることが確認できた。また、Ｎｏｎ−ｏｘｙｃｈｉｐを用いた場合では、混合スフェロイドは崩壊しており、多くの細胞の核において染色されないことが明らかとなった。このことから、酸素枯渇によってネクローシスを起きたと推察できる。
図１２から、Ｏｘｙｃｈｉｐで作製した毛包原基は移植から１８日目で毛髪を形成したのに対し、Ｎｏｎ−ｏｘｙｃｈｉｐで作製した毛包原基は毛髪を再生することができないことが確かめられた。【００９０】
［実施例３］ヒト毛乳頭細胞とマウス上皮系細胞とを用いた再生毛包原基の作製と移植
（１）マイクロ凹版の作製
実施例１（１）と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。【００９１】
（２）再生毛包原基の作製
妊娠マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｊｊｃｌ、妊娠２週間目）から上皮系細胞を１．５×１０６ｃｅｌｌｓ採取した。続いて、ヒト毛乳頭細胞（Ｐｒｏｍｏ  ｃｅｌｌ社製）を含む懸濁液１ｍＬにＶｙｂｒａｎｔ（登録商標）  Ｃｅｌｌ−ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ社製）を５μＬ加え、２０分間培養して、細胞を染色した。続いて、遠心分離を行い、上清を除去後、ヒト毛乳頭細胞増殖培地（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｐａｐｉｌｌａ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＰＣＧＭ）（Ｐｒｏｍｏ  ｃｅｌｌ社製）とＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２との１：１混合培地を加え、ヒト毛乳頭細胞及びマウス上皮系細胞を表１に示す細胞密度でマイクロ凹版及び９６ウェルプレートに播種した。【００９２】
【表２】
2017073625.tif 000003
【００９３】
（顕微鏡観察）
培養中のヒト毛乳頭細胞及びマウス上皮系細胞の混合細胞集塊（以下、「混合スフェロイド」とも呼ぶ。）について、培養開始から１、３日目に位相差蛍光顕微鏡を用いて観察した。
培養開始から培養開始から１日目及び３日目の暗視野での９６ウェルプレートにて培養した各細胞数の混合スフェロイドの観察結果を図１３Ａに、３日目の明視野でのマイクロ凹版にて培養した４．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルの混合スフェロイドの観察結果を図１３Ｂに、３日目の明視野でのマイクロ凹版にて培養した４．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルの混合スフェロイドの観察結果を図１３Ｃに示す。【００９４】
（３）マウス皮下移植
ヌードマウス（ＩＣＲ  ｎｕ／ｎｕマウス、５週齢）（オリエンタル酵母社から購入）の皮下にオフサルミックランス ２０Ｇ（日本アルコン社製）で移植穴をあけて、マイクロピペットを用いて、培養開始から３日目の９６ウェルプレートにて培養した各細胞数の混合スフェロイドをそれぞれ移植した。各細胞数の混合スフェロイドの移植から１８日目のヌードマウスの移植部を肉眼で観察した結果を図１４Ａに示す。また、各細胞数の混合スフェロイドの移植から１８日目のヌードマウスの移植部あたりの毛髪の再生効率（＝発毛部／移植部×１００（％））及び再生本数を示したグラフをそれぞれ図１４Ｂ及び図１４Ｃに示す。【００９５】
（４）結果と考察
図１３Ａから、培養開始から１日目において、赤い蛍光で示されたヒト毛乳頭細胞は上皮系細胞を覆うように局在化し、１つの混合スフェロイドを形成した後、培養開始から３日目において、スフェロイド内で同種細胞どうしが集合する傾向が見られた。
また、１．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル以上８．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル以下では、マウス上皮系細胞とヒト毛乳頭細胞とはそれぞれ分離し、それぞれが重なりあった毛包原基構造を形成したことが確かめられた。
一方、１６×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル以上では、マウス上皮系細胞塊の周囲で複数個のヒト毛乳頭細胞塊が融合した１つの混合スフェロイドを形成した。
また、図１３Ｂ及び図１３Ｃから、マイクロ凹版にて培養した混合スフェロイドについても、９６ウェルプレートにて培養した混合スフェロイドと同様に、自発的な毛包原基構造の形成が観察された。
図１４Ａから、移植後１８日目において、４．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル以上の細胞数の混合スフェロイドを移植した移植部では、発毛が観察されることが確かめられた。
また、図１４Ｂ及び図１４Ｃから、４．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェル以上の細胞数の混合スフェロイドの移植体において、平均再生効率及び平均再生本数は、毛包原基を構成する細胞数に依存せず、平均再生効率が約４０％程度であり、また、平均再生本数が約１〜２本となることが確認された。【００９６】
［試験例４］ヒト毛乳頭細胞を用いた再生毛包の評価試験
（１）再生毛包の染色
ヒト毛乳頭細胞を用いて作製した混合スフェロイドが生体と同様の構造を持つ毛包を形成しているかを確認するために、抗Ｎｕｃｌｅｉ抗体（ｃｌｏｎｅ２３５−１）及びヒストファインマウスステインキットを用いて、凍結切片の免疫組織化学染色により染色した。具体的な染色方法について、以下に説明する。【００９７】
（ＨＥ染色用切片の作製）
実施例３（２）と同様の方法を用いて作製された混合スフェロイドを、実施例３（３）と同様の方法を用いてヌードマウスに移植した。移植後１８日目のヌードマウスの移植部の皮膚を切り出した。続いて、ブアン固定液（ピクリン酸飽和水溶液１５ｍＬ、２０ｖ／ｖ％ホルマリン５ｍＬ、及び氷酢酸１ｍＬの混合溶液）に１日浸漬することで、組織の固定を行った。続いて、７０、９０、１００  ｖ／ｖ％エタノール、１００ｖ／ｖ％エタノール及び２−ブタノールの１：１混合溶液、２−ブタノール、２−ブタノール及びパラフィンの１：１混合溶液、並びにパラフィンに、それぞれ１時間ずつ浸した後、パラフィンブロックを作製した。続いて、回転式ミクロトームを微小の厚さにカットし、パラフィン切片を作製した。カットされた切片をスライドガラスに垂直に押し当て、転写した。【００９８】
（ＨＥ染色）
試験例２（１）（ＨＥ染色）と同様の方法を用いて、切片を染色した。位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）で観察した結果を図１３Ａに示す。【００９９】
（免疫抗体染色用切片の作製）
実施例３（２）と同様の方法を用いて作製された混合スフェロイドを、実施例３（３）と同様の方法を用いてヌードマウスに移植した。移植後１８日目のヌードマウスの移植部の皮膚を切り出した。続いて、１０％ホルマリン（Ｗａｋｏ社製）に１日浸漬することで、組織の固定を行った。続いて、７０、９０、１００  ｖ／ｖ％エタノール、１００ｖ／ｖ％エタノール及び２−ブタノールの１：１混合溶液、２−ブタノール、２−ブタノール及びパラフィンの１：１混合溶液、並びにパラフィンに、それぞれ１時間ずつ浸した後、パラフィンブロックを作製した。続いて、回転式ミクロトームを微小の厚さにカットし、パラフィン切片を作製した。カットされた切片をスライドガラスに垂直に押し当て、転写した。【０１００】
（免疫抗体染色）
得られたスライドガラスについて、抗Ｎｕｃｌｅｉ抗体（ｃｌｏｎｅ２３５−１）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）及びヒストファインマウスステインキット（ニチレイバイオサイエンス社製）を用いて、ヒト由来細胞の免疫染色を行った。位相差蛍光顕微鏡（オリンパス社製、ＩＸ−７１）で観察した結果を図１５Ｂに示す。【０１０１】
（毛のキューティクル構造の観察）
毛のキューティグル構造を確認するために、４．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルの細胞数の混合スフェロイドの移植後１８日目のヌードマウスの移植部を、走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ）を用いて観察した結果を図１５Ｃに示す。【０１０２】
（２）結果と考察
図１５Ａ及び図１５Ｂから、移植部において毛包が形成されたこと、また、形成した毛乳頭がヒト由来細胞からなることが確認できた。
図１５Ｃから、キューティクル構造を有する毛の再生が確認できた。
以上のことから、ヒト毛乳頭細胞を用いた毛包原基を免疫不全マウスに移植することでマウス皮下から毛髪を再生できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０３】
本発明によれば、簡便に、規則的且つ高密度の再生毛包原基の集合体を得ることができる。
【符号の説明】
【０１０４】
１…間葉系細胞、２…上皮系細胞、３…マイクロ凹版、４…微小凹部、５…毛包原基、６…培地、７…生体適合性ハイドロゲル、８…毛包組織含有シート。
【図１】
2017073625.tif 000004
【図２Ａ】
2017073625.tif 000005
【図２Ｂ】
2017073625.tif 000006
【図３】
2017073625.tif 000007
【図４】
2017073625.tif 000008
【図５Ａ】
2017073625.tif 000009
【図５Ｂ】
2017073625.tif 000010
【図５Ｃ】
2017073625.tif 000011
【図６Ａ】
2017073625.tif 000012
【図６Ｂ】
2017073625.tif 000013
【図７Ａ】
2017073625.tif 000014
【図７Ｂ】
2017073625.tif 000015
【図８】
2017073625.tif 000016
【図９】
2017073625.tif 000017
【図１０】
2017073625.tif 000018
【図１１】
2017073625.tif 000019
【図１２】
2017073625.tif 000020
【図１３Ａ】
2017073625.tif 000021
【図１３Ｂ】
2017073625.tif 000022
【図１３Ｃ】
2017073625.tif 000023
【図１４Ａ】
2017073625.tif 000024
【図１４Ｂ】
2017073625.tif 000025
【図１４Ｃ】
2017073625.tif 000026
【図１５Ａ】
2017073625.tif 000027
【図１５Ｂ】
2017073625.tif 000028
【図１５Ｃ】
2017073625.tif 000029
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月19日(2017.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる工程を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなることを特徴とする再生毛包原基の集合体の製造方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
間葉系細胞及び上皮系細胞を含む毛包原基と、
生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、
前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されていることを特徴とする毛包組織含有シート。
【請求項４】
さらに、前記毛包原基が分化し、毛包を形成している、請求項３に記載の毛包組織含有シート。
【請求項５】
前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である、請求項３又は４に記載の毛包組織含有シート。
【請求項６】
前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、請求項５に記載の毛包組織含有シート。
【請求項７】
前記毛包原基の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の毛包組織含有シート。
【請求項８】
規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより毛包原基を形成させる工程と、
前記微小凹部内に形成された毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程と、を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなることを特徴とする毛包組織含有シートの製造方法。
【請求項９】
前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、請求項８に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
剤を添加した培養液を用いて混合培養することで、原始的な毛包器官を形成する方法（例えば、特許文献２参照）、毛包間葉系細胞の細胞集塊（スフェロイド）の外側に上皮細胞が接着している人工毛球体を作製する方法（例えば、特許文献３参照）等が挙げられる。
先行技術文献
特許文献
［０００４］
特許文献１：国際公開第２０１２／１０８０６９号
特許文献２：特開２０１３−７８３４４号公報
特許文献３：特開２００３−７０４６６号公報
発明の概要
発明が解決しようとする課題
［０００５］
特許文献１〜３では、上皮系細胞及び間葉系細胞の２種類の細胞集合体を作製し、これらを融合させることで毛包原基を一つ一つ作製しており、数万本の毛髪を再生するには、作製効率及び移植効率に問題があった。
［０００６］
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、哺乳動物の毛包組織と類似し、規則的且つ高密度の再生毛包原基の集合体を簡便に製造する方法を提供する。
課題を解決するための手段
［０００７］
本発明は、以下の態様を含む。
［１］規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる工程を備え、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなることを特徴とする再生毛包原基の集合体の製造方法。
［３］間葉系細胞及び上皮系細胞を含む毛包原基と、生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されていることを特徴とする毛包組織含有シート。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
［４］さらに、前記毛包原基が毛包を形成している、［３］に記載の毛包組織含有シート。
［５］前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である、［３］又は［４］に記載の毛包組織含有シート。
［６］前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、［５］に記載の毛包組織含有シート。
［７］前記毛包原基の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、［３］〜［６］のいずれか一つに記載の毛包組織含有シート。
［８］規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより毛包原基を形成させる工程と、前記微小凹部内に形成された毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程と、を備え、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなることを特徴とする毛包組織含有シートの製造方法。
［９］前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、［８］に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
発明の効果
［０００８］
本発明によれば、簡便に、規則的且つ高密度の再生毛包原基の集合体を得ることができる。
図面の簡単な説明
［０００９］
［図１］本実施形態における毛包組織含有シートの製造方法の一例を示す概略図である。
［図２Ａ］実施例１におけるマイクロ凹版の作製方法を示す概略図である。
［図２Ｂ］実施例１におけるマイクロ凹版の全体、底面、底面の断面を示す画像である。
［図３］実施例１におけるマイクロ凹版にて形成された毛包原基のコラーゲンゲルへの転写方法を示す概略図、及び実施例１における位相差顕微鏡を用いて工程［ａ］〜［ｃ］におけるコラーゲンゲルを撮影した結果を示す画像であ
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月9日(2018.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
規則的な配置の微小凹部を有するマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を全面から供給しながら混合培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる工程を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなることを特徴とする再生毛包原基の集合体の製造方法。
【請求項２】
Ｗｎｔシグナル活性化剤を用いない、請求項１に記載の再生毛包原基の集合体の製造方法。
【請求項３】
前記微小凹部１つあたりに播種される間葉系細胞及び上皮系細胞の合計細胞数が４．０×１０３ｃｅｌｌｓ以上１．６×１０４ｃｅｌｌｓ未満である、請求項１又は２に記載の再生毛包原基の集合体の製造方法。
【請求項４】
間葉系細胞及び上皮系細胞を含む毛包原基と、
生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、
前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されていることを特徴とする毛包組織含有シート。
【請求項５】
さらに、前記毛包原基が分化し、毛包を形成している、請求項４に記載の毛包組織含有シート。
【請求項６】
前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である、請求項４又は５に記載の毛包組織含有シート。
【請求項７】
前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、請求項６に記載の毛包組織含有シート。
【請求項８】
前記毛包原基の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の毛包組織含有シート。
【請求項９】
規則的な配置の微小凹部を有するマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を全面から供給しながら混合培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる工程と、
前記微小凹部内に形成された毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程と、を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなることを特徴とする毛包組織含有シートの製造方法。
【請求項１０】
Ｗｎｔシグナル活性化剤を用いない、請求項９に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
【請求項１１】
前記微小凹部１つあたりに播種される間葉系細胞及び上皮系細胞の合計細胞数が４．０×１０３ｃｅｌｌｓ以上１．６×１０４ｃｅｌｌｓ未満である請求項９又は１０に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
【請求項１２】
前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
【請求項１３】
規則的な配置の微小凹部を有するマイクロ凹版を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなることを特徴とする再生毛包原基の集合体の製造用基板。
【請求項１４】
前記酸素透過性を有する材質がポリジメチルシロキサンである、請求項１３に記載の再生毛包原基の集合体の製造用基板。
【請求項１５】
前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、請求項１３又は１４に記載の再生毛包原基の集合体の製造用基板。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］規則的な配置の微小凹部を有するマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を全面から供給しながら混合培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる工程を備え、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなることを特徴とする再生毛包原基の集合体の製造方法。
［２］Ｗｎｔシグナル活性化剤を用いない、［１］に記載の再生毛包原基の集合体の製造方法。
［３］前記微小凹部１つあたりに播種される間葉系細胞及び上皮系細胞の合計細胞数が４．０×１０３ｃｅｌｌｓ以上１．６×１０４ｃｅｌｌｓ未満である、［１］又は［２］に記載の再生毛包原基の集合体の製造方法。
［４］間葉系細胞及び上皮系細胞を含む毛包原基と、生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されていることを特徴とする毛包組織含有シート。
［５］さらに、前記毛包原基が毛包を形成している、［４］に記載の毛包組織含有シート。
［６］前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である、［４］又は［５］に記載の毛包組織含有シート。
［７］前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、［６］に記載の毛包組織含有シート。
［８］前記毛包原基の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、［４］〜［７］のいずれか一つに記載の毛包組織含有シート。
［９］規則的な配置の微小凹部を有するマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を全面から供給しながら混合培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる工程と、前記微小凹部内に形成された毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程と、を備え、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなることを特徴とする毛包組織含有シートの製造方法。
［１０］Ｗｎｔシグナル活性化剤を用いない、［９］に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
［１１］前記微小凹部１つあたりに播種される間葉系細胞及び上皮系細胞の合計細胞数が４．０×１０３ｃｅｌｌｓ以上１．６×１０４ｃｅｌｌｓ未満である、［９］又は［１０］に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
［１２］前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、［９］〜［１１］のいずれか一つに記載の毛包組織含有シートの製造方法。
［１３］規則的な配置の微小凹部を有するマイクロ凹版を備え、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなることを特徴とする再生毛包原基の集合体の製造用基板。
［１４］前記酸素透過性を有する材質がポリジメチルシロキサンである、［１３］に記載の再生毛包原基の集合体の製造用基板。
［１５］前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が２０個／ｃｍ２以上５００個／ｃｍ２以下である、［１３］又は［１４］に記載の再生毛包原基の集合体の製造用基板。
【国際調査報告】
2017073625.tif 000030
2017073625.tif 000031
2017073625.tif 000032
2017073625.tif 000033