(57)【要約】  本発明は、ゾニサミド又はそのアルカリ金属塩を有効成分とする、末梢神経障害又は脊髄損傷の治療剤及び／又は予防剤などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゾニサミド又はそのアルカリ金属塩を有効成分とする、末梢神経障害の治療剤及び／又は予防剤。
【請求項２】
末梢神経障害が、運動神経障害、感覚神経障害、及び自律神経障害から選択される少なくとも一つの神経障害を含む、請求項１に記載の治療剤及び／又は予防剤。
【請求項３】
末梢神経障害が、少なくとも運動神経障害を含む、請求項２に記載の治療剤及び／又は予防剤。
【請求項４】
運動神経障害が、麻痺、しびれ、筋力低下、脱力、筋萎縮、巧緻運動障害、手関節背屈障害、足関節背屈障害、垂れ足、反射低下、又は血管運動神経症状である、請求項２又は３に記載の治療剤及び／又は予防剤。
【請求項５】
運動神経障害が、麻痺、又はしびれである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の治療剤及び／又は予防剤。
【請求項６】
感覚神経障害が、疼痛、知覚異常、又は振動覚異常である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の治療剤及び／又は予防剤。
【請求項７】
自律神経障害が、発汗異常、下痢、便秘、立ちくらみ、震え、動悸、又は心拍変動異常である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の治療剤及び／又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゾニサミドを有効成分とする、末梢神経障害又は脊髄損傷の治療剤及び／又は予防剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
末梢神経障害とは、末梢神経の正常な伝導が障害される病態であり、ニューロパチーとも称される。末梢神経障害にて障害される神経の種類は運動神経、感覚神経、自律神経に及ぶ。末梢神経障害は、臨床学的に、単神経障害（モノニューロパシー；単一の神経の障害）、多発単神経障害（多発性モノニューロパシー；別々の領域にある２つ以上の神経の障害）、又は多発神経障害（多発ニューロパシー；左右対称に生じた広範な神経障害）に分類され、病理学的には、軸索が中心に侵された軸索障害、又は髄鞘が変性脱落した髄鞘障害に分類される。末梢神経障害は、運動神経、感覚神経、及び自律神経に対して障害をもたらす。その結果、疼痛、知覚異常、麻痺、しびれ、筋力低下、発汗異常、又は排尿障害などの症状をもたらし、時間とともに悪化することを特徴とする。末梢神経障害の主な原因としては、変形等の身体的要因による損傷、圧迫、血行障害、遺伝的要因、代謝異常、中毒、免疫応答、感染症、癌、腎不全、又は肝疾患が挙げられる。また、原因が明らかになっていない末梢神経障害として、顔面神経麻痺等が挙げられる。
末梢神経障害に対する治療薬としてメチルビタミンＢ１２（メチルコバラミン）が臨床にて用いられるが（非特許文献１）、臨床的に有効である症例は極めて稀である。また、糖尿病性の末梢神経障害に対しては、アルドース還元酵素阻害薬であるエパルレスタットが使用されている（非特許文献２）。【０００３】
神経障害に伴う運動麻痺は、日常生活に深刻な影響をもたらすものの、有効な治療方法が未だ確立されていない。ＮＧＦ及びＢＤＮＦといったニューロトロフィン、ラミニン、並びにカドヘリン―１１は、動物モデルにおいて運動神経軸索の伸長をもたらし、運動障害を改善するものの（非特許文献３〜５）、生体内での半減期が極めて短いことから、ヒトを対象とする臨床で使用することができない（非特許文献６）。近年、細胞移植が、神経障害の治療方法として注目されているものの、未だ安全性の懸念が存在する（非特許文献７、８）。この他、非ステロイド性抗炎症薬等が、運動神経の損傷を改善することが報告されているが、未だ運動神経障害治療に対して臨床で用いられている薬剤は存在しない（非特許文献９）。【０００４】
脊髄損傷とは、主に脊柱に強い外力が加えられることにより、脊椎が損壊し、脊髄が損傷を受ける病態である。脊髄損傷は、運動機能、感覚機能及び自律神経機能に対して障害をもたらす。その結果、麻痺、疼痛、知覚異常、幻肢痛（ファントムペイン）、痙攣、痙性、痙縮、発汗異常、体温調節異常、排泄不全、又は勃起不全などの症状をもたらす。また、褥瘡、尿路感染症及び／又は肺炎などの合併症がもたらされる。脊髄損傷の主な原因としては、外傷、変形等の身体的要因による損傷、圧迫、血行障害、又は感染症が挙げられる。
脊髄は一度損傷すると修復再生することはなく、未だこれを回復させる決定的な治療法は確立されていない。受傷後、４８時間〜７２時間以内であれば、ステロイドを大量に投与することにより、後遺症を抑制するとの報告があるものの、確実性に疑問があり、未だ一般化されていない。また、Ｐ２Ｘ７受容体のアンタゴニスト又はＨＧＦ（肝細胞増殖因子）を脊髄損傷したラットに投与すると回復が認められたとする報告があるものの、未だ脊髄損傷治療に対して用いられている薬剤は存在しない（非特許文献１０、１１）。【０００５】
ドラッグリポジショニングとは、既に広く使用されている既存医薬品、あるいは薬効不足等で開発を中止した化合物の新しい薬理作用を発見し、新たな疾患治療薬として開発するする戦略である。ドラッグリポジショニングによる薬剤開発は、従来の新薬開発に比べ、薬剤開発に必要なコスト及び時間を大幅に削減することができる（非特許文献１２）。【０００６】
ゾニサミド（化学名：３−スルファモイルメチル−１，２−ベンズイソオキサゾール又は１，２−ベンズイソオキサゾール−３−メタンスルホンアミド）は、１９８９年に日本において販売が開始された後、２０年以上使用され続けてきた安全性の高い薬剤である。現在、ゾニサミドは小児又は成人の癲癇発作（部分発作、全般発作、混合発作）治療薬又はパーキンソン病治療薬として用いられている。ゾニサミドは、抗てんかん薬、及び神経変性疾患治療薬（原発性或いは続発性パーキンソン病、ハンチントン病、舞踏病症候群、ジストニア症候群等の哺乳動物（ヒトを含む）の各種神経変性疾患）の予防及び治療に使用することができる（特許文献１、２）。さらに、ゾニサミドの新たな薬理作用として、遅発性ジスキネジアの軽減、抗肥満作用、及び双極性障害に対する気分安定化作用等が報告されている（非特許文献１３〜１５）。この他、ゾニサミドは、ドパミン神経保護効果、脳虚血に対する神経保護効果を有することが報告されている（非特許文献１６、１７）。
しかしながら、これらの特許文献及び非特許文献には、ゾニサミドが、末梢神経障害又は脊髄損傷に有効である記述や示唆は一切ない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公昭６０−０３３１４号
【特許文献２】特許第３３６４４８１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yamazaki et al. Neurosci Lett, 170: 195-197. (1994)
【非特許文献２】Ramirez et al. Pharmacotherapy 28: 646-55. (2008)
【非特許文献３】Coumans et al. J Neurosci 21: 9334-9344. (2001)
【非特許文献４】Powell et al. J Biochem Cell Biol 29: 401-414. (1997)
【非特許文献５】Marthiens et al. Mol Cell Neurosci 28: 715-726. (2005)
【非特許文献６】Poduslo et al. Brain Res Mol Brain Res 36: 280-286. (1996)
【非特許文献７】Nakamura et al. Cell Res 23: 70-80. (2013)
【非特許文献８】Guo et al. Histopathology 59: 763-775. (2011)
【非特許文献９】Fu et al. J Neurosci 27: 4154-4164. (2007)
【非特許文献１０】Peng et al. Proc Natl Acad Sci 106: 12489-12493 (2009)
【非特許文献１１】Peng et al. J Neurosci Res. 85: 2332-2342 (2007)
【非特許文献１２】Ashburn et. al. Nat Rev Drug Discov 3: 673-683. (2004)
【非特許文献１３】Iwata et. al. J Neurol Sci. 315: 137-40. (2012)
【非特許文献１４】Gadde et. al. JAMA. 289(14): 1820-1825. (2003)
【非特許文献１５】Hasegawa et. al. Curr Med Res Opin. 20(5): 577-80. (2004)
【非特許文献１６】Asanuma et al. Ann Neurol 67: 239-249. (2010)
【非特許文献１７】Minato et. al. Epilepsia 38: 975-980. (1997)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、ゾニサミドの新規用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ゾニサミドが神経突起の伸長を促進させるとともに、神経突起の再生を促進させることを見出した。また、ゾニサミドは、活性酸素によって誘発される酸化ストレスに対して、神経細胞保護効果を示すとともに、神経成長因子に関するｍＲＮＡの発現を向上させることが明らかとなった。さらに、坐骨神経切断モデル動物に対してゾニサミドを投与することにより、神経再生がもたらされることを見出した。加えて、重度脊髄圧挫モデル動物に対してゾニサミドを投与することにより、運動機能が回復することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下の通りである。【００１２】
［項１］ゾニサミド又はそのアルカリ金属塩を有効成分とする、末梢神経障害の治療剤及び／又は予防剤。【００１３】
［項２］末梢神経障害が、運動神経障害、感覚神経障害、及び自律神経障害から選択される少なくとも一つの神経障害を含む、項１に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００１４】
［項３］末梢神経障害が、少なくとも運動神経障害を含む、項２に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００１５】
［項４］運動神経障害が、麻痺、しびれ、筋力低下、脱力、筋萎縮、巧緻運動障害、手関節背屈障害、足関節背屈障害、垂れ足、反射低下、又は血管運動神経症状である、項２又は３に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００１６】
［項５］運動神経障害が、麻痺、又はしびれである、項２〜４のいずれか一項に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００１７】
［項６］感覚神経障害が、疼痛、知覚異常、又は振動覚異常である、項２〜５のいずれか一項に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００１８】
［項７］自律神経障害が、発汗異常、下痢、便秘、立ちくらみ、震え、動悸、又は心拍変動異常である、項２〜６のいずれか一項に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００１９】
［項８］末梢神経障害の治療剤及び／又は予防剤を製造するための、ゾニサミド又はそのアルカリ金属塩の使用。【００２０】
［項９］末梢神経障害が、運動神経障害、感覚神経障害、及び自律神経障害から選択される少なくとも一つの神経障害を含む、項８に記載の使用。【００２１】
［項１０］末梢神経障害が、少なくとも運動神経障害を含む、項９に記載の使用。【００２２】
［項１１］運動神経障害が、麻痺、しびれ、筋力低下、脱力、筋萎縮、巧緻運動障害、手関節背屈障害、足関節背屈障害、垂れ足、反射低下、又は血管運動神経症状である、項８又は９に記載の使用。【００２３】
［項１２］運動神経障害が、麻痺、又はしびれである、項９〜１１のいずれか一項に記載の使用。【００２４】
［項１３］感覚神経障害が、疼痛、知覚異常、又は振動覚異常である、項９〜１２のいずれか一項に記載の使用。【００２５】
［項１４］自律神経障害が、発汗異常、下痢、便秘、立ちくらみ、震え、動悸、又は心拍変動異常である、項９〜１３のいずれか一項に記載の使用。【００２６】
［項１５］末梢神経障害の治療及び／又は予防剤に使用するための、ゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００２７】
［項１６］末梢神経障害が、運動神経障害、感覚神経障害、及び自律神経障害から選択される少なくとも一つの神経障害を含む、項１５に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００２８】
［項１７］末梢神経障害が、少なくとも運動神経障害を含む、項１６に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００２９】
［項１８］運動神経障害が、麻痺、しびれ、筋力低下、脱力、筋萎縮、巧緻運動障害、手関節背屈障害、足関節背屈障害、垂れ足、反射低下、又は血管運動神経症状である、項１６又は１７に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００３０】
［項１９］運動神経障害が、麻痺、又はしびれである、項１６〜１８のいずれか一項に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００３１】
［項２０］感覚神経障害が、疼痛、知覚異常、又は振動覚異常である、項１６〜１９のいずれか一項に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００３２】
［項２１］自律神経障害が、発汗異常、下痢、便秘、立ちくらみ、震え、動悸、又は心拍変動異常である、項１６〜２０のいずれか一項に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００３３】
［項２２］治療及び／又は予防が必要な患者に、ゾニサミド又はそのアルカリ金属塩を投与することを特徴とする、末梢神経障害の治療及び／又は予防方法。【００３４】
［項２３］末梢神経障害が、運動神経障害、感覚神経障害、及び自律神経障害から選択される少なくとも一つの神経障害を含む、項２２に記載の治療及び／又は予防方法。【００３５】
［項２４］末梢神経障害が、少なくとも運動神経障害を含む、項２３に記載の治療及び／又は予防方法。【００３６】
［項２５］運動神経障害が、麻痺、しびれ、筋力低下、脱力、筋萎縮、巧緻運動障害、手関節背屈障害、足関節背屈障害、垂れ足、反射低下、又は血管運動神経症状である、項２３又は２４に記載の治療及び／又は予防方法。【００３７】
［項２６］運動神経障害が、麻痺、又はしびれである、項２３〜２５のいずれか一項に記載の治療及び／又は予防方法。【００３８】
［項２７］感覚神経障害が、疼痛、知覚異常、又は振動覚異常である、項２３〜２６のいずれか一項に記載の治療及び／又は予防方法。【００３９】
［項２８］自律神経障害が、発汗異常、下痢、便秘、立ちくらみ、震え、動悸、又は心拍変動異常である、項２３〜２７のいずれか一項に記載の治療及び／又は予防方法。【００４０】
［項２９］末梢神経障害が、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性圧脆弱性神経障害、遺伝性神経痛性筋萎縮症、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、Ｋｒａｂｂｅ病、Ｆａｂｒｙ病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、Ｒｅｆｓｕｍ病、タンジール病、急性ポルフィリン症、家族性アミロイド多発神経障害、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、ＡＬアミロイドーシスに伴う神経障害、糖尿病性神経障害、甲状腺機能低下症、膠原病（自己免疫疾患及び全身性エリテマトーデス等）に伴う神経障害、尿毒症性神経障害、慢性肝疾患に伴う神経障害、クロウ・フカセ症候、フィッシャー症候群、重篤疾患多発神経障害、ヒト免疫不全ウイルスに伴う神経障害、水痘帯状疱疹ウイルスに伴う神経障害、顔面神経麻痺、先天性筋無力症候群、重症筋無力症、サルコペニア、ボツリヌス中毒、イートン・ランバート症候群、薬剤性神経筋接合部障害、手根管症候群、肘部管症候群、Ｇｕｙｏｎ管症候群、撓骨神経麻痺、異常感覚性大腿神経痛、総腓骨神経麻痺、胸郭出口症候群及び足根管症候群からなる群から選択される、項１〜７のいずれか一項に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００４１】
［項３０］末梢神経障害が、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）及び手根管症候群からなる群から選択される、項２９に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００４２】
［項３１］末梢神経障害が、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性圧脆弱性神経障害、遺伝性神経痛性筋萎縮症、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、Ｋｒａｂｂｅ病、Ｆａｂｒｙ病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、Ｒｅｆｓｕｍ病、タンジール病、急性ポルフィリン症、家族性アミロイド多発神経障害、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、ＡＬアミロイドーシスに伴う神経障害、糖尿病性神経障害、甲状腺機能低下症、膠原病（自己免疫疾患及び全身性エリテマトーデス等）に伴う神経障害、尿毒症性神経障害、慢性肝疾患に伴う神経障害、クロウ・フカセ症候、フィッシャー症候群、重篤疾患多発神経障害、ヒト免疫不全ウイルスに伴う神経障害、水痘帯状疱疹ウイルスに伴う神経障害、顔面神経麻痺、先天性筋無力症候群、重症筋無力症、サルコペニア、ボツリヌス中毒、イートン・ランバート症候群、薬剤性神経筋接合部障害、手根管症候群、肘部管症候群、Ｇｕｙｏｎ管症候群、撓骨神経麻痺、異常感覚性大腿神経痛、総腓骨神経麻痺、胸郭出口症候群及び足根管症候群からなる群から選択される、項８〜１４のいずれか一項に記載の使用。【００４３】
［項３２］末梢神経障害が、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）及び手根管症候群からなる群から選択される、項３１に記載の使用。【００４４】
［項３３］末梢神経障害が、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性圧脆弱性神経障害、遺伝性神経痛性筋萎縮症、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、Ｋｒａｂｂｅ病、Ｆａｂｒｙ病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、Ｒｅｆｓｕｍ病、タンジール病、急性ポルフィリン症、家族性アミロイド多発神経障害、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、ＡＬアミロイドーシスに伴う神経障害、糖尿病性神経障害、甲状腺機能低下症、膠原病（自己免疫疾患及び全身性エリテマトーデス等）に伴う神経障害、尿毒症性神経障害、慢性肝疾患に伴う神経障害、クロウ・フカセ症候、フィッシャー症候群、重篤疾患多発神経障害、ヒト免疫不全ウイルスに伴う神経障害、水痘帯状疱疹ウイルスに伴う神経障害、顔面神経麻痺、先天性筋無力症候群、重症筋無力症、サルコペニア、ボツリヌス中毒、イートン・ランバート症候群、薬剤性神経筋接合部障害、手根管症候群、肘部管症候群、Ｇｕｙｏｎ管症候群、撓骨神経麻痺、異常感覚性大腿神経痛、総腓骨神経麻痺、胸郭出口症候群及び足根管症候群からなる群から選択される、項１５〜２１のいずれか一項に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００４５】
［項３４］末梢神経障害が、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）及び手根管症候群からなる群から選択される、項３３に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００４６】
［項３５］末梢神経障害が、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性圧脆弱性神経障害、遺伝性神経痛性筋萎縮症、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、Ｋｒａｂｂｅ病、Ｆａｂｒｙ病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、Ｒｅｆｓｕｍ病、タンジール病、急性ポルフィリン症、家族性アミロイド多発神経障害、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、ＡＬアミロイドーシスに伴う神経障害、糖尿病性神経障害、甲状腺機能低下症、膠原病（自己免疫疾患及び全身性エリテマトーデス等）に伴う神経障害、尿毒症性神経障害、慢性肝疾患に伴う神経障害、クロウ・フカセ症候、フィッシャー症候群、重篤疾患多発神経障害、ヒト免疫不全ウイルスに伴う神経障害、水痘帯状疱疹ウイルスに伴う神経障害、顔面神経麻痺、先天性筋無力症候群、重症筋無力症、サルコペニア、ボツリヌス中毒、イートン・ランバート症候群、薬剤性神経筋接合部障害、手根管症候群、肘部管症候群、Ｇｕｙｏｎ管症候群、撓骨神経麻痺、異常感覚性大腿神経痛、総腓骨神経麻痺、胸郭出口症候群及び足根管症候群からなる群から選択される、項２２〜２８のいずれか一項に記載の治療及び／又は予防方法。【００４７】
［項３６］末梢神経障害が、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）及び手根管症候群からなる群から選択される、項３５に記載の治療及び／又は予防方法。【００４８】
［項３７］ゾニサミド又はそのアルカリ金属塩を有効成分とする、脊髄損傷の治療剤及び／又は予防剤。【００４９】
［項３８］脊髄損傷が、運動機能障害、感覚機能障害、及び自律神経機能障害から選択される少なくとも一つの機能障害を伴う、項３７に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００５０】
［項３９］脊髄損傷が、少なくとも運動機能障害を伴う、項３８に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００５１】
［項４０］脊髄損傷に伴う運動機能障害、感覚機能障害、又は自律神経機能障害を治療及び／又は予防するための、項３７に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００５２】
［項４１］脊髄損傷に伴う運動機能障害を治療及び／又は予防するための、項４０に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００５３】
［項４２］運動機能障害が、麻痺、しびれ、筋力低下、脱力、巧緻運動障害、手関節背屈障害、足関節背屈障害、垂れ足、反射低下、血管運動神経症状、痙攣、痙性、又は痙縮である、項３８〜４１のいずれか一項に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００５４】
［項４３］運動機能障害が、麻痺、又はしびれである、項３８〜４２のいずれか一項に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００５５】
［項４４］感覚機能障害が、疼痛、知覚異常、又は幻肢痛である、項３８〜４３のいずれか一項に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００５６】
［項４５］自律神経機能障害が、発汗異常、下痢、便秘、立ちくらみ、震え、動悸、心拍変動異常、又は排泄不全である、項３８〜４４のいずれか一項に記載の治療剤及び／又は予防剤。【００５７】
［項４６］脊髄損傷の治療剤及び／又は予防剤を製造するための、ゾニサミド又はそのアルカリ金属塩の使用。【００５８】
［項４７］脊髄損傷が、運動機能障害、感覚機能障害、及び自律神経機能障害から選択される少なくとも一つの機能障害を伴う、項４６に記載の使用。【００５９】
［項４８］脊髄損傷が、少なくとも運動機能障害を伴う、項４５に記載の使用。【００６０】
［項４９］脊髄損傷に伴う運動機能障害、感覚機能障害、又は自律神経機能障害の治療剤及び／又は予防剤を製造するための、項４６に記載の使用。【００６１】
［項５０］脊髄損傷に伴う運動機能障害の治療剤及び／又は予防剤を製造するための、項４６に記載の使用。【００６２】
［項５１］運動機能障害が、麻痺、しびれ、筋力低下、脱力、巧緻運動障害、手関節背屈障害、足関節背屈障害、垂れ足、反射低下、血管運動神経症状、痙攣、痙性、又は痙縮である、項４７〜５０のいずれか一項に記載の使用。【００６３】
［項５２］運動機能障害が、麻痺、又はしびれである、項４７〜５１のいずれか一項に記載の使用。【００６４】
［項５３］感覚機能障害が、疼痛、知覚異常、又は幻肢痛である、項４７〜５２のいずれか一項に記載の使用。【００６５】
［項５４］自律神経機能障害が、発汗異常、下痢、便秘、立ちくらみ、震え、動悸、心拍変動異常、又は排泄不全である、項４７〜５３のいずれか一項に記載の使用。【００６６】
［項５５］脊髄損傷の治療及び／又は予防剤に使用するための、ゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００６７】
［項５６］脊髄損傷が、運動機能障害、感覚機能障害、及び自律神経機能障害から選択される少なくとも一つの機能障害を伴う、項５５に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００６８】
［項５７］脊髄損傷が、少なくとも運動機能障害を伴う、項５６に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００６９】
［項５８］脊髄損傷に伴う運動機能障害、感覚機能障害、又は自律神経機能障害の治療剤及び／又は予防剤に使用するための、項５５に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００７０】
［項５９］脊髄損傷に伴う運動機能障害の治療剤及び／又は予防剤に使用するための、項５８に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００７１】
［項６０］運動機能障害が、麻痺、しびれ、筋力低下、脱力、巧緻運動障害、手関節背屈障害、足関節背屈障害、垂れ足、反射低下、血管運動神経症状、痙攣、痙性、又は痙縮である、項５６〜５９のいずれか一項に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００７２】
［項６１］運動機能障害が、麻痺、又はしびれである、項５６〜６０のいずれか一項に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００７３】
［項６２］感覚機能障害が、疼痛、知覚異常、又は幻肢痛である、項５５６〜６１のいずれか一項に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００７４】
［項６３］自律神経機能障害が、発汗異常、下痢、便秘、立ちくらみ、震え、動悸、心拍変動異常、又は排泄不全である、項５６〜６２のいずれか一項に記載のゾニサミド又はそのアルカリ金属塩。【００７５】
［項６４］治療及び／又は予防が必要な患者に、ゾニサミド又はそのアルカリ金属塩を投与することを特徴とする、脊髄損傷の治療及び／又は予防方法。【００７６】
［項６５］脊髄損傷が、運動機能障害、感覚機能障害、及び自律神経機能障害から選択される少なくとも一つの神経障害を伴う、項６４に記載の治療及び／又は予防方法。【００７７】
［項６６］脊髄損傷が、少なくとも運動機能障害を伴う、項６５に記載の治療及び／又は予防方法。【００７８】
［項６７］脊髄損傷に伴う運動機能障害、感覚機能障害、又は自律神経機能障害を治療及び／又は予防するための、項６４に記載の治療及び／又は予防方法。【００７９】
［項６８］脊髄損傷に伴う運動機能障害を治療及び／又は予防するための、項６７に記載の治療及び／又は予防方法。【００８０】
［項６９］運動機能障害が、麻痺、しびれ、筋力低下、脱力、巧緻運動障害、手関節背屈障害、足関節背屈障害、垂れ足、反射低下、血管運動神経症状、痙攣、痙性、又は痙縮である、項６５〜６８のいずれか一項に記載の治療及び／又は予防方法。【００８１】
［項７０］運動機能障害が、麻痺、又はしびれである、項６５〜６９のいずれか一項に記載の治療及び／又は予防方法。【００８２】
［項７１］感覚機能障害が、疼痛、知覚異常、又は幻肢痛である、項６５〜７０のいずれか一項に記載の治療及び／又は予防方法。【００８３】
［項７２］自律神経障害が、発汗異常、下痢、便秘、立ちくらみ、震え、動悸、心拍変動異常、又は排泄不全である、項６５〜７１のいずれか一項に記載の治療及び／又は予防方法。
【発明の効果】
【００８４】
本発明のゾニサミド又はその製薬学的に許容される塩は、高い安全性を有するとともに、末梢神経障害又は脊髄損傷の治療及び／又は予防に有効であり、外傷を原因とする末梢神経障害又は脊髄損傷の治療及び／又は予防に特に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、ＮＳＣ３４細胞の神経突起の平均長、初代培養運動ニューロンの神経突起の平均長、初代培養運動ニューロンにおける１ニューロン当たりの分岐点数、及び初代培養運動ニューロンにおける神経突起を有する細胞の割合に対する、ゾニサミドの用量依存的効果を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、スクラッチアッセイにおける、ゾニサミド投与時及び非投与時の神経突起の比較を示す写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、スクラッチアッセイにおける、神経突起の長さの合計に対する、ゾニサミドの用量依存的効果を示す図である。
【図３】図３は、タイムラプスイメージングを用いた、マウス初代培養運動ニューロンの神経突起伸長効果に対する、ゾニサミドの用量及び時間依存的効果を示す図である。
【図４】図４は、酸化ストレスによってもたらされる初代培養運動ニューロンの細胞死に対する、ゾニサミドの神経保護効果を示す図である。
【図５】図５は、ゾニサミドを投与した初代培養運動ニューロンにおける、Ｂｄｎｆ、Ｎｇｆ、Ｎｔｆ４、Ｎｔｒｋ１、Ｎｔｒｋ２、Ｍａｐ２、Ｍａｐｔ及びＧａｐ４３のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図６】図６は、ゾニサミドを投与した初代培養運動ニューロンにおける、Ｅｒｋ１／２及びＪＮＫ１／２／３のリン酸化を測定した結果を示す図である。
【図７】図７は、マウス坐骨神経自家移植モデルにおいて、手術後１週間後、末梢側切断部位を起点に０．７ｍｍ末梢側の部分を輪切り方向に切断した断面を、トルイジンブルーを用いて染色した写真である。
【図８】図８は、マウス坐骨神経自家移植モデルにおいて、手術後１週間後、末梢側切断部位を起点に０．７ｍｍ末梢側の部分を輪切り方向に切断した断面における、１神経線維あたりの軸索の総数及び神経線維あたりの軸索の面積を示した図である。
【図９】図９は、マウス坐骨神経自家移植モデルにおける、ゾニサミドの運動機能改善効果を示す図である。
【図１０】図１０は、マウス坐骨神経自家移植モデルにおいて、手術後８週間後の前脛骨筋の断面をヘマトキシリン及びエオシン染色した写真である。
【図１１】図１１は、マウス坐骨神経自家移植モデルにおいて、手術後８週間後の前脛骨筋線維の断面積（ＣＳＡ）に対する、ゾニサミドの神経再生効果を示す図である。
【図１２】図１２は、マウス坐骨神経自家移植モデルにおいて、手術後８週間後、腓腹筋におけるＣｈｒｎｅ、Ｃｏｌｑ及びＲａｐｓｎのｍＲＮＡ発現量を示す図である。ｍＲＮＡ発現に対する、ゾニサミド投与及び神経切断の有無が与える影響を示した図である。
【図１３】図１３は、マウス坐骨神経自家移植モデルにおいて、手術後８週間後、坐骨神経におけるＢｄｎｆ、Ｎｇｆ、Ｎｔｆ４、Ｎｔｒｋ１、Ｎｔｒｋ２、Ｍａｐ２、Ｍａｐｔ及びＧａｐ４３のｍＲＮＡ発現量を示す図である。ｍＲＮＡ発現に対する、ゾニサミド投与及び神経切断の有無が与える影響を示した図である。
【図１４】図１４は、重度脊髄圧挫モデルマウスにおいて、ＢＭＳスコアによる運動機能評価に基づく、ゾニサミドの運動機能改善効果を示す図である。
【図１５】図１５は、重度脊髄圧挫モデルマウスにおいて、ロータロッド試験による運動機能評価に基づく、ゾニサミドの運動機能改善効果を示す図である。
【図１６】図１６は、重度脊髄圧挫モデルマウスの損傷部及び損傷部周辺の神経突起伸長に関連する遺伝子発現を評価するための、脊髄の単離方法を示した図である。
【図１７】図１７は、重度脊髄圧挫モデルマウスにおいて、手術後２８日後、脊髄の損傷部及び損傷尾側における、ＢｄｎｆのｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図１８】図１８は、重度脊髄圧挫モデルマウスにおいて、手術後２８日後、脊髄の損傷部及び損傷尾側における、ＮｇｆのｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図１９】図１９は、重度脊髄圧挫モデルマウスにおいて、手術後２８日後、脊髄の損傷部及び損傷尾側における、Ｎｔｆ４のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図２０】図２０は、重度脊髄圧挫モデルマウスにおいて、手術後２８日後、脊髄の損傷部及び損傷尾側における、Ｎｔｒｋ１のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図２１】図２１は、重度脊髄圧挫モデルマウスにおいて、手術後２８日後、脊髄の損傷部及び損傷尾側における、Ｎｔｒｋ２のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図２２】図２２は、重度脊髄圧挫モデルマウスにおいて、手術後２８日後、脊髄の損傷部及び損傷尾側における、Ｍａｐ２のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図２３】図２３は、重度脊髄圧挫モデルマウスにおいて、手術後２８日後、脊髄の損傷部及び損傷尾側における、ＭａｐｔのｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【図２４】図２３は、重度脊髄圧挫モデルマウスにおいて、手術後２８日後、脊髄の損傷部及び損傷尾側における、Ｇａｐ４３のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
本発明におけるゾニサミド（化学名：３−スルファモイルメチル−１，２−ベンズイソオキサゾール又は１，２−ベンズイソオキサゾール−３−メタンスルホンアミド）は、適宜そのアルカリ金属塩で用いられ得る。ゾニサミドのアルカリ金属塩として、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩が挙げられる。好ましくは、ナトリウム塩及びカリウム塩が挙げられる。より好ましくは、ナトリウム塩が挙げられる。
【００８７】
結晶として得られるゾニサミド又はそのアルカリ金属塩は、結晶多型が存在する場合があり、本発明におけるゾニサミドには、あらゆる結晶形のものが含まれる。
【００８８】
本発明のゾニサミドは、水和物及び／又は溶媒和物の形で存在することもあるので、ゾニサミド又はそのアルカリ金属塩の水和物及び／又は溶媒和物もまた本発明化合物に包含される
【００８９】
本発明で用いるゾニサミド又はそのアルカリ金属塩は、プロドラッグの形態であってもよい。かかるプロドラッグは、必要な化合物（ゾニサミド）に生体内で容易に変換され得る本発明の化合物（ゾニサミド）の機能性誘導体である。
【００９０】
本発明で用いる「治療」とは、疾患のあらゆる治療（例えば、症状の改善、症状の軽減、症状の進行の抑制など）が含まれる。本発明で用いる「予防」とは、疾患に関するあらゆる予防（例えば、症状の発現阻止など）が含まれる。
【００９１】
本発明で用いる、Ｂｄｎｆ、Ｎｇｆ、Ｎｔｆ４、Ｎｔｒｋ１、Ｎｔｒｋ２、Ｍａｐ２、Ｍａｐｔ、Ｇａｐ４３、Ｃｈｒｎｅ、Ｃｏｌｑ及びＲａｐｓｎは、各々ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−４／５、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＭＡＰ２、Ｔａｕ、ＧＡＰ４３、ＡＣｈＲε、ＣｏｌＱ、Ｒａｐｓｙｎをコードする遺伝子名を意味する。
【００９２】
本発明で用いる「末梢神経」とは、「体性神経」及び「自律神経」からなる。本発明で用いる「体性神経」とは、「感覚神経」及び「運動神経」からなる。本発明で用いる「自律神経」とは、「交感神経」及び「副交感神経」からなる。
【００９３】
本発明で用いる「末梢神経障害」とは、末梢神経の正常な伝導が障害される病態である。「末梢神経障害」としては、運動神経障害、感覚神経障害、及び自律神経障害が挙げられる。
【００９４】
本発明におけるゾニサミド又はそのアルカリ金属塩は、神経細胞を再生させることにより「末梢神経障害」そのものを治療及び／又は予防することから、「感覚神経障害」、「運動神経障害」、及び「自律神経障害」を治療及び／又は予防することができる。
「感覚神経障害」として、例えば、疼痛、知覚異常、灼熱感、又は振動覚異常が挙げられる。
「運動神経障害」として、例えば、麻痺、しびれ、筋力低下、脱力、筋萎縮、巧緻運動障害、手関節背屈障害、足関節背屈障害、垂れ足、反射低下、又は血管運動神経症状が挙げられる。
「自律神経障害」として、発汗異常、排尿障害、勃起不全、下痢、便秘、立ちくらみ、震え、動悸、耳鳴り、吐き気、頭痛、微熱、過呼吸、倦怠感、不眠症、生理不順、味覚障害、又は心拍変動異常が挙げられる。
【００９５】
「末梢神経障害」として好ましくは、運動神経障害、及び感覚神経障害が挙げられる。「末梢神経障害」としてさらに好ましくは、運動神経障害が挙げられる。
【００９６】
本発明で用いる「末梢神経障害」には、種々の原因による末梢神経障害が含まれる。末梢神経障害の原因としては、外傷、変形等の身体的要因による損傷、圧迫、血行障害、遺伝的要因、代謝異常、中毒、免疫応答、感染症、癌、腎不全、又は肝疾患が挙げられる。「末梢神経障害」の原因として好ましくは、外傷、身体的要因による損傷、又は圧迫が挙げられる。「末梢神経障害」の原因としてさらに好ましくは、外傷、又は身体的要因による損傷が挙げられる。
【００９７】
「末梢神経障害」は、脊椎が損壊し、末梢神経根が損傷を受けることによっても発症するため、本発明で用いる「末梢神経障害」には、「脊椎症に伴う末梢神経障害」が含まれる。「脊椎症に伴う末梢神経障害」は、脊椎の損傷部位により、「頸椎症に伴う末梢神経障害」、「胸椎症に伴う末梢神経障害」、「腰椎症に伴う末梢神経障害」、「仙椎症に伴う末梢神経障害」及び「尾椎症に伴う末梢神経障害」に分類される。本発明における「末梢神経障害」には、いずれの部位の損傷による障害も含まれる。
【００９８】
本発明で用いる「末梢神経障害」は、臨床学的に、「単神経障害」、「多発単神経障害」又は「多発神経障害」に分類される。
【００９９】
「単神経障害」は、主に、外傷、圧迫又は血行障害によって、単一の末梢神経が障害されることによりもたらされる。「単神経障害」としては、骨髄腫関連神経障害、膠原病（例えば、自己免疫疾患又は全身性エリテマトーデス等）に伴う単神経障害、ＡＬアミロイドーシスに伴う単神経障害、糖尿病性の単神経障害、又は外傷に伴う単神経障害が挙げられる。「単神経障害」として好ましくは、膠原病に伴う単神経障害、糖尿病性の単神経障害、又は外傷に伴う単神経障害が挙げられる。「単神経障害」としてさらに好ましくは、糖尿病性の単神経障害、又は外傷に伴う単神経障害が挙げられる。「単神経障害」としてさらに好ましくは、外傷に伴う単神経障害が挙げられる。
【０１００】
「多発単神経障害」は、主に、外傷、圧迫、又は血行障害によって単神経障害が複数生じることによりもたらされる。通常、多発単神経障害は左右不対称で、不規則に分布する。「多発単神経障害」としては、全身性血管炎に伴う多発単神経障害、全身の肉芽腫性病変（サルコイドーシス等）に伴う多発単神経障害、又は糖尿病性の多発単神経障害が挙げられる。「多発単神経障害」として好ましくは、糖尿病性の多発単神経障害が挙げられる。
【０１０１】
「多発神経障害」は、主に、遺伝的要因、代謝異常、中毒又は免疫応答によって単神経障害が広範に左右対称性に生じることによりもたらされる。原則として四肢遠位部に症状が強く表れる。「多発神経障害」としては、糖尿病性の多発神経障害、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、シャルコー・マリー・トゥース病、及びジフテリア性神経炎が挙げられる。「多発神経障害」として好ましくは、シャルコー・マリー・トゥース病、又は糖尿病性の多発神経障害が挙げられる。「多発神経障害」としてより好ましくは、シャルコー・マリー・トゥース病が挙げられる。
【０１０２】
本発明で用いる「末梢神経障害」は、病理学的に、「軸索障害」又は「髄鞘障害」に分類される。
「軸索障害」は、軸索が中心に侵された末梢神経障害であり、例えば、ワーラー変性による末梢神経障害、又は後退変性による末梢神経障害が挙げられる。
「髄鞘障害」は、髄鞘が変性・脱落した末梢神経障害であり、例えば、原発性節性脱髄による末梢神経障害、又は続発性節性脱髄による末梢神経障害が挙げられる。
【０１０３】
「末梢神経障害」の具体例としては、例えば、「遺伝性神経障害」、「後天性神経障害」、「悪性腫瘍関連神経障害」、「中毒性神経障害」、「栄養障害神経障害」、「原因不明の神経障害」、「神経筋接合部障害」又は「圧迫性神経障害」が挙げられる。
「末梢神経障害」として、好ましくは、「後天性神経障害」、「悪性腫瘍関連神経障害」、「中毒性神経障害」、「栄養障害神経障害」、「原因不明の神経障害」、「神経筋接合部障害」又は「圧迫性神経障害」が挙げられる。「末梢神経障害」として、より好ましくは、「後天性神経障害」、「悪性腫瘍関連神経障害」、「原因不明の神経障害」、「神経筋接合部障害」又は「圧迫性神経障害」が挙げられる。「末梢神経障害」として、さらに好ましくは、「後天性神経障害」、「原因不明の神経障害」、「神経筋接合部障害」又は「圧迫性神経障害」が挙げられる。「末梢神経障害」として、最も好ましくは、「圧迫性神経障害」が挙げられる。
【０１０４】
「遺伝性神経障害」としては、例えば、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性圧脆弱性神経障害、遺伝性神経痛性筋萎縮症、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、Ｋｒａｂｂｅ病、Ｆａｂｒｙ病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、Ｒｅｆｓｕｍ病、タンジール病、急性ポルフィリン症、又は家族性アミロイド多発神経障害が挙げられる。「遺伝性神経障害」として好ましくは、シャルコー・マリー・トゥース病が挙げられる。
【０１０５】
「後天性神経障害」としては、炎症性神経障害、ＡＬアミロイドーシスに伴う神経障害、糖尿病性神経障害、甲状腺機能低下症、膠原病（自己免疫疾患及び全身性エリテマトーデス等）に伴う神経障害、尿毒症性神経障害、慢性肝疾患に伴う神経障害、クロウ・フカセ症候、フィッシャー症候群、重篤疾患多発神経障害、ヒト免疫不全ウイルスに伴う神経障害、又は水痘帯状疱疹ウイルスに伴う神経障害が挙げられる。
炎症性神経障害としては、ギラン・バレー症候群、又は慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）が挙げられる。
「後天性神経障害」として好ましくは、炎症性神経障害、又は糖尿病性神経障害が挙げられる。「後天性神経障害」としてより好ましくは、炎症性神経障害が挙げられる。「後天性神経障害」として最も好ましくは、ギラン・バレー症候群、又は慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）が挙げられる。
【０１０６】
「悪性腫瘍関連神経障害」としては、傍腫瘍性神経症候群が挙げられる。
【０１０７】
「中毒性神経障害」としては、薬剤性中毒性神経障害、有機物による神経障害、又は金属による神経障害が挙げられる。
薬剤性中毒性神経障害の原因薬剤として、イソニアジド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスプラチン、ボルテゾミブ、クロラムフェニコール、メトロニダゾール、ニトロフラントイン、アミオダロン、サリドマイド、ピリドキシン、フェニトイン、ジスルフィラム、クロロキン、又はピリドキシン（ビタミンＢ６）が挙げられる。
有機物による神経障害として、ｎ−ヘキサン、アルコール又はスチレン中毒による神経障害が挙げられる。
金属による神経障害として、ヒ素、水銀、又はタリウムによる神経障害が挙げられる。
【０１０８】
「原因不明の神経障害」として、原因不明の感覚神経障害、又は原因不明の感覚運動性多発神経障害が挙げられる。具体的には、顔面神経麻痺が挙げられる。
【０１０９】
「神経筋接合部障害」としては、先天性筋無力症候群、重症筋無力症、サルコペニア、ボツリヌス中毒、イートン・ランバート症候群、又は薬剤性神経筋接合部障害が挙げられる。
薬剤性神経筋接合部障害の原因薬剤として、抗生物質、殺虫剤、クラーレ、又は神経ガスが挙げられる。
【０１１０】
「圧迫性神経障害」として、手根管症候群、肘部管症候群、Ｇｕｙｏｎ管症候群、撓骨神経麻痺、異常感覚性大腿神経痛、総腓骨神経麻痺、胸郭出口症候群又は足根管症候群が挙げられる。「圧迫性神経障害」として好ましくは、手根管症候群、胸郭出口症候群又は足根管症候群が挙げられる。
「圧迫性神経障害」としてより好ましくは、手根管症候群又は足根管症候群が挙げられる。「圧迫性神経障害」として最も好ましくは手根管症候群が挙げられる。
圧迫性神経障害の原因としては、外傷、圧迫（微小外傷を伴うこともある）及び／又は反復性のストレスが挙げられる。
【０１１１】
「末梢神経障害」の別の好ましい具体例として、シャルコー・マリー・トゥース病、遺伝性圧脆弱性神経障害、遺伝性神経痛性筋萎縮症、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、Ｋｒａｂｂｅ病、Ｆａｂｒｙ病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、Ｒｅｆｓｕｍ病、タンジール病、急性ポルフィリン症、家族性アミロイド多発神経障害、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、ＡＬアミロイドーシスに伴う神経障害、糖尿病性神経障害、甲状腺機能低下症、膠原病（自己免疫疾患及び全身性エリテマトーデス等）に伴う神経障害、尿毒症性神経障害、慢性肝疾患に伴う神経障害、クロウ・フカセ症候、フィッシャー症候群、重篤疾患多発神経障害、ヒト免疫不全ウイルスに伴う神経障害、水痘帯状疱疹ウイルスに伴う神経障害、顔面神経麻痺、先天性筋無力症候群、重症筋無力症、サルコペニア、ボツリヌス中毒、イートン・ランバート症候群、薬剤性神経筋接合部障害、手根管症候群、肘部管症候群、Ｇｕｙｏｎ管症候群、撓骨神経麻痺、異常感覚性大腿神経痛、総腓骨神経麻痺、胸郭出口症候群又は足根管症候群が挙げられる。
「末梢神経障害」として好ましくは、シャルコー・マリー・トゥース病、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、糖尿病性神経障害、顔面神経麻痺、先天性筋無力症候群、重症筋無力症、サルコペニア、イートン・ランバート症候群、薬剤性神経筋接合部障害、手根管症候群、肘部管症候群、撓骨神経麻痺、異常感覚性大腿神経痛、総腓骨神経麻痺、胸郭出口症候群又は足根管症候群が挙げられる。
「末梢神経障害」としてより好ましくは、シャルコー・マリー・トゥース病、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、糖尿病性神経障害、顔面神経麻痺、先天性筋無力症候群、重症筋無力症、サルコペニア、イートン・ランバート症候群、手根管症候群、肘部管症候群、胸郭出口症候群又は足根管症候群が挙げられる。
「末梢神経障害」としてさらに好ましくは、シャルコー・マリー・トゥース病、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、糖尿病性神経障害、顔面神経麻痺、重症筋無力症又は手根管症候群が挙げられる。
「末梢神経障害」として最も好ましくは、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）又は手根管症候群が挙げられる。
【０１１２】
本発明で用いる「脊椎」とは、「頸椎」、「胸椎」、「腰椎」、「仙椎」及び「尾椎」からなる。
【０１１３】
本発明で用いる「脊髄」とは、「頸髄」、「胸髄」、「腰髄」、「仙髄」及び「尾髄」からなる。
【０１１４】
本発明で用いる「脊髄損傷」とは、主に脊柱に強い外力が加えられることにより、脊椎が損壊し、脊髄に損傷を受ける病態である。「脊髄損傷」として、「運動機能障害」を伴う脊髄損傷、「感覚機能障害」を伴う脊髄損傷及び「自律神経機能障害」を伴う脊髄損傷が挙げられる。
【０１１５】
本発明におけるゾニサミド又はそのアルカリ金属塩は、「脊髄損傷」そのものを治療及び／又は予防することから、脊髄損傷に伴う「運動機能障害」、「感覚機能障害」及び「自律神経機能障害」を治療及び／又は予防することができる。
【０１１６】
「運動機能障害」として、麻痺、しびれ、筋力低下、脱力、巧緻運動障害、手関節背屈障害、足関節背屈障害、垂れ足、反射低下、血管運動神経症状、痙攣、痙性、又は痙縮が挙げられる。
「運動機能障害」として、好ましくは、麻痺、しびれ、筋力低下、脱力、反射低下、痙攣、痙性、又は痙縮が挙げられる。「運動機能障害」として、より好ましくは、麻痺、しびれ、筋力低下、反射低下、又は痙攣が挙げられる。「運動機能障害」として、さらに好ましくは、麻痺、しびれ、筋力低下、又は反射低下が挙げられる。
「運動機能障害」として、最も好ましくは、麻痺、又はしびれが挙げられる。
【０１１７】
「感覚神経障害」として、疼痛、知覚異常、又は幻肢痛が挙げられる。
【０１１８】
「自律神経機能障害」として、発汗異常、排泄不全、勃起不全、下痢、便秘、立ちくらみ、震え、動悸、耳鳴り、吐き気、頭痛、微熱、過呼吸、倦怠感、不眠症、生理不順、味覚障害、又は心拍変動異常が挙げられる。
【０１１９】
「脊髄損傷」として好ましくは、「運動機能障害」を伴う脊髄損傷及び「感覚機能障害」を伴う脊髄損傷が挙げられる。「脊髄損傷」としてより好ましくは、「運動機能障害」を伴う脊髄損傷が挙げられる。「脊髄損傷」に伴う機能障害として好ましくは、「運動機能障害」及び「感覚機能障害」が挙げられる。「脊髄損傷」に伴う機能障害としてより好ましくは、「運動機能障害」が挙げられる。
【０１２０】
本発明で用いる「脊髄損傷」は、損傷部位により、「頸髄損傷」、「胸髄損傷」、「腰髄損傷」、「仙髄損傷」及び「尾髄損傷」に分類される。本発明における「脊髄損傷」には、いずれの部位における損傷も含まれる。
【０１２１】
本発明で用いる「脊髄損傷」は、脊髄の損傷の度合いにより、「完全型」と「不完全型」に分類される。「完全型」は脊髄が横断的に断絶し、神経伝達機能が完全に断たれた状態であり、「不完全型」は脊髄の一部が損傷、圧迫などを受け、一部機能が残存するものを示す。本発明における「脊髄損傷」には、「完全型」と「不完全型」のいずれの損傷も含まれる。
【０１２２】
本発明で用いる「脊髄損傷」には、種々の原因による「脊髄損傷」が含まれる。「脊髄損傷」の原因としては、外傷、変形等の身体的要因による損傷、圧迫、血行障害、又は感染症、が挙げられる。「脊髄損傷」の原因として好ましくは、外傷、身体的要因による損傷、又は圧迫が挙げられる。「脊髄損傷」の原因としてさらに好ましくは、外傷、又は身体的要因による損傷が挙げられる。
【０１２３】
本発明で用いる「脊髄損傷」には、「脊椎症に伴う脊髄損傷」が含まれる。「脊椎症に伴う脊髄損傷」は、脊椎の損傷部位により、「頸椎症に伴う脊髄損傷」、「胸椎症に伴う脊髄損傷」、「腰椎症に伴う脊髄損傷」、「仙椎症に伴う脊髄損傷」及び「尾椎症に伴う脊椎損傷」に分類される。本発明における「脊髄損傷」には、いずれの部位の損傷に伴うものも含まれる。
【０１２４】
本発明の活性成分（ゾニサミド又はそのアルカリ金属塩）は、経口投与又は非経口投与により、適当な剤形を用いて製剤にし、投与できる。剤形は、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、注射剤、貼付剤、ハップ剤等が挙げられるがこれに限らない。製剤は、薬学的に許容される添加剤を用いて、公知の方法で製造される。
添加剤は、目的に応じて、賦形剤、崩壊剤、結合剤、流動化剤、滑沢剤、コーティング剤、溶解剤、溶解補助剤、増粘剤、分散剤、安定化剤、甘味剤、香料等を用いることができる。具体的には、例えば、乳糖、マンニトール、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、トウモロコシデンプン、部分α化デンプン、軽質無水ケイ酸、カルメロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、エチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、アスパルテーム、酸化チタン、タルク等が挙げられる。
【０１２５】
本発明の化合物の投与経路としては、経口投与、非経口投与又は直腸内投与のいずれでもよく、その一日投与量は、化合物の種類、投与方法、患者の症状・年齢等により異なる。例えば、経口投与の場合には、成人に対して、１日当たり、０．１ｍｇ〜３０００ｍｇ、１ｍｇ〜２０００ｍｇ、１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、又は２０ｍｇ〜６００ｍｇを１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することにより効果が期待される。
例えば、静脈内注射の場合には、成人に対して、１日当たり、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、０．１ｍｇ〜５００ｍｇ、１ｍｇ〜２００ｍｇ、又は１ｍｇ〜５０ｍｇを１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することにより効果が期待される。
【０１２６】
本発明の活性化合物であるゾニサミド又はそのアルカリ金属塩の製剤（医薬製剤又は医薬組成物）、又は他の薬剤と組み合わせて単一の製剤で調製される場合、これに限らないが、例えばその活性成分の和がその製剤の組成物全体に対して０．１〜７０重量％含まれている。好ましくは、その活性成分の和がその製剤の組成物全体に対して５〜６０重量％含まれている。より好ましくは、その活性成分の和がその製剤の組成物全体に対して１０〜５５重量％含まれている。
【実施例】
【０１２７】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。【０１２８】
実施例１
ＮＳＣ３４細胞及び初代脊髄運動ニューロンを用いたスクリーニング【０１２９】
ＮＳＣ３４細胞を用いたスクリーニング方法
ＮＳＣ３４細胞（ｍｏｕｓｅ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ−ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ａ  ｍｕｌｔｉｐｏｌａｒ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ；ドキシサイクリンによって安定的にＧＦＰが誘導される細胞株（ＮＳＣ３４−ｐＴｅｔＲ１２−ＴＯ／ＧＦＰ）、Dev Dyn 1992, 194, 209-221.）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、湿度９５％、二酸化炭素５％雰囲気下、３７℃にて培養した。９６穴プレートにおいて、１％のＦＢＳ及び２ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２分化培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、細胞を１．６×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように播種し、ＧＦＰを発現させた。１日目に分化培地を、１％ＮＥＡＡ（Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）及び２ｍｇ／ｍＬのドキシサイクリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に変更し、被検化合物（ＦＤＡ承認済みの１１８６個の薬剤）１０μｍｏｌ／Ｌ存在下、４８時間インキュベートした。その後、細胞の核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（１：１００，０００、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて染色した。ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ  ＨＣＳ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）にて１ウェルあたり１６項目の画像を取得した。各々のウェルにおける神経突起の長さの平均をＮｅｕｒｏｎａｌ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｖ４．０  ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）を用いて自動的に測定した。【０１３０】
初代脊髄運動ニューロンを用いたスクリーニング方法
マウス胚脊髄運動ニューロンの初代培養物は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの胎生１３．５日目（Ｅ１３．５）の脊髄胚から単離した。２００μｍｏｌ／Ｌから２ｍｍｏｌ／ＬまでのゾニサミドのＤＭＳＯ溶液を作成した後、培養培地にゾニサミドの最終濃度が１μｍｏｌ／Ｌから２０μｍｏｌ／Ｌになるように添加した。なお、ゾニサミドを含むか否かに関わらず、培養培地は０．５％のＤＭＳＯを含む。細胞を、ポリ−Ｌ−リシン及びラミニンでコートされた９６穴プレート（Ａｓａｈｉ  Ｔｅｃｈｎｏ  Ｇｌａｓｓ）に４．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２にて播種し、Ｓｕｍｉｌｏｎ  ｎｅｕｒｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ  Ｂａｋｅｌｉｔｅ）にて維持した。細胞を２日間インキュベートした後、常温にて、４％ホルムアミドを含むＰＢＳを用いて１５分間固定化した。細胞を、一度ＰＢＳを用いて洗浄し、２％ヤギ血清及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含むＰＢＳによりブロッキングし、その後、マウス抗タウ−１モノクローナル抗体（１：５００、ＭＡＢ３４２０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ヤギ抗マウス二次抗体（１：１０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、免疫染色した。神経突起は、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ  ＨＣＳ  Ｒｅａｄｅｒを用いて自動分析した。神経突起の長さ及び神経分岐点数の定量は、長い方から２００本の神経突起を評価することで求めた。神経突起を有する細胞の割合は、各ウェルにおいて、神経突起の長さが２５ミクロン以上の細胞数を計測することで求めた。【０１３１】
ＮＳＣ３４細胞を用いたスクリーニング結果
１１８６個の被検化合物のうち、約１００個の化合物が、ＮＳＣ３４細胞の神経突起の平均長を増加させる作用があった。１００化合物のうち２０化合物については、全身投与できないこと又は毒性を理由に排除した。残りの８０化合物について同様のアッセイを１６回繰り返し、１６個の薬剤を選び出した。【０１３２】
初代脊髄運動ニューロンを用いたスクリーニング結果
上記１６個の薬剤を、Ｅ１３．５におけるＣ５７／ＢＬ６Ｊマウスの脊髄から単離した初代培養運動ニューロンに添加した。４８時間培養後、軸索をタウで蛍光免疫染色した後、ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ  ＨＣＳ  Ｒｅａｄｅｒを用いて、神経突起の長さを自動的に測定した。その結果、ゾニサミドを、初代培養運動ニューロンの神経突起を伸長させる薬剤として同定した。【０１３３】
用量依存性評価結果
ゾニサミドの脊髄運動ニューロンの神経突起伸長作用に対する用量依存性評価を行った（図１）。ゾニサミドは用量依存的にＮＳＣ３４細胞及び初代培養運動ニューロンの軸索伸長をもたらした。さらに、ゾニサミドは用量依存的に初代培養運動ニューロンの軸索における分岐点数を増加させた。しかしながら、初代培養運動ニューロンにおける、神経突起を有する細胞の割合については、ゾニサミド投与によって増強されなかった。【０１３４】
実施例２
スクラッチアッセイを用いた神経突起再生効果の評価【０１３５】
スクラッチアッセイの方法
初代培養運動ニューロンを、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたＮｕｎ  Ｌａｂ−Ｔｅｋ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に８．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２×０．７ｃｍ２／ｗｅｌｌにて播種した後、４８時間、Ｓｕｍｉｌｏｎ  ｎｅｕｒｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍにて培養した。初代培養運動ニューロンの神経突起を、２００μＬの滅菌ピペットチップを用いて線状に傷つけた。細胞を直ちにＰＢＳでリンスし、０、１、１０、及び２０μｍｏｌ／Ｌのゾニサミドを含むＳｕｍｉｌｏｎ  ｎｅｕｒｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍにて４８時間培養した。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、神経特異的β−ＩＩＩチュブリンモノクローナル抗体（１：１０００、ＭＡＢ１１９５、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ抗マウス二次抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて免疫染色した。傷をつけた領域の画像を、顕微鏡（オリンパスＬＸ７１）を用いて取得した。傷をつけた領域における、初代培養運動ニューロンの神経突起の長さは、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）によって自動計測した。【０１３６】
スクラッチアッセイの結果
スクラッチアッセイにおいて、ゾニサミドは神経突起の長さを用量依存的に伸長させた（図２Ａ及び２Ｂ）。ゾニサミドは、初代培養運動ニューロンの神経突起再生を促すことが示された。【０１３７】
実施例３
初代培養運動ニューロン軸索伸長のタイムラプスイメージング【０１３８】
イメージングの方法
初代培養運動ニューロンを、神経突起伸長を誘導するために、Ｓｕｍｉｌｏｎ  ｎｅｕｒｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ中で９６ウェルプレートに、６．０×１０３  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌにて播種した。位相差顕微鏡画像をＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、８時間ごとに３日間に渡って撮影した。神経突起の長さを自動的にＮｅｕｒｏＴｒａｃｋソフトウェア(ＩｎｃｕＣｙｔｅ)にて解析した。【０１３９】
結果
ゾニサミド投与後４０時間後に、マウス初代培養運動ニューロンの神経突起伸長効果が認められた（図３）。観察期間を通じて、１０μｍｏｌ／Ｌのゾニサミド投与群が、１μｍｏｌ／Ｌのゾニサミド投与群に比べ、高い伸長効果を示した。ゾニサミドは、神経突起伸長の開始をもたらすというよりむしろ、ゾニサミドが神経突起の伸長の増強効果をもたらすことが示された。【０１４０】
実施例４
ＭＴＳアッセイを用いた酸化ストレスに関する評価【０１４１】
ＭＴＳアッセイ方法
細胞生存率を、ミトコンドリアレダクターゼ活性を表すＭＴＳアッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ，  Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて評価した。初代培養運動ニューロンをＳｕｍｉｌｏｎ  ｎｅｕｒｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍにて２４時間培養した後、０．５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２に培地を交換し２４時間培養した。種々の濃度のゾニサミドを１時間添加した後、１００μｍｏｌ／Ｌの過酸化水素を２４時間添加した。細胞をＭＴＳ試薬と共に２時間インキュベートした。ＭＴＳシグナルは、マイクロプレートリーダー（ＰｏｗｅｒＳｃａｎ  ＨＴ、ＤＳファーマバイオマテリアル）を用いて定量した。ＭＴＳシグナルは過酸化水素処理をしていない細胞群をコントロールとして評価した。【０１４２】
ＭＴＳアッセイ結果
ゾニサミドは用量依存的に、初代培養運動ニューロンの生細胞数を有意に増加させた（図４）。ゾニサミドは、初代培養運動ニューロンの酸化ストレスによってもたらされる細胞死に対し神経保護効果を示した。【０１４３】
実施例５
神経突起伸長関連する遺伝子発現の評価【０１４４】
全ＲＮＡ抽出及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析方法
全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、０、１及び１０μｍｏｌ／Ｌのゾニサミドと共に培養した初代培養運動ニューロンから単離した。同様に、全ＲＮＡを、坐骨神経の３ｍｍセグメント及び前脛骨筋から単離した。一本鎖ｃＤＮＡは、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて合成した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、Ｂｄｎｆ、Ｎｇｆ、Ｎｔｆ４、Ｎｔｒｋ１、Ｎｔｒｋ２、Ｍａｐ２、Ｍａｐｔ、及びＧａｐ４３のｍＲＮＡ発現量を定量した。ｍＲＮＡレベルは、Ｇａｐｄｈの発現量で標準化した。【０１４５】
結果
ゾニサミド添加後２日目と３日目に、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、及びＮＴＦ４（ニューロトロフィン）のｍＲＮＡレベルが増加することが示された（図５）。また、それらの受容体であるＮＴＲＫ１（ＮＧＦの受容体）及びＮＴＲＫ２（ＢＤＮＦとＮＴ４−４／５の受容体）のｍＲＮＡレベルが、ゾニサミド投与によって増加した。構造タンパク質であるＭＡＰ２（樹状突起に豊富に存在）、ＭＡＰＴ（軸索に豊富に存在）、及びＧＡＰ４３（成長円錐に豊富に存在）のｍＲＮＡレベルは、３日目までには増加しなかった。ゾニサミドは、ニィーロトロフィンとその受容体の発現量を上昇させた。【０１４６】
実施例６
ＥＲＫ１／２及びＪＮＫ１／２／３リン酸化度の測定【０１４７】
ウエスタンブロッドの方法
ゾニサミド（０、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ）を、培養開始後４時間後の初代培養運動ニューロンに添加した。細胞は、２日目及び３日目に、緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１％  グリセロール、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＧＴＡ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ピロリン酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍＬ  アプロチニン、１ｍｇ／ｍＬ  ロイペプチン、１ｍｇ／ｍＬ  ペプスタチンＡ，  １ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＭＳＦ、及び１ｍｍｏｌ／Ｌ  オルトバナジン（Ｖ）酸ナトリウム）にてリンスした。全タンパク質を１×レムリ緩衝液に溶解させ、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。メンブレンを０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（ＴＢＳ−Ｔ）を含むトリス緩衝生理食塩水で洗浄し、３％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ中で、室温下、１時間ブロッキングした。ａｎｔｉ−Ｅｒｋ１／２（＃４６９６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｅｒｋ１／２  （＃４３７０，  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、又はａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ＪＮＫ１／２／３  （＃４６６８，  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の抗体（希釈  １：１０００）の何れかを用いて、メンブレンを４℃で一晩インキュベートした。メンブレンをＴＢＳ−Ｔを用いて１０分間３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１：６０００）とコンジュゲートしたマウス抗マウスＩｇＧ二次抗体とともに、室温で１時間インキュベーとした。ブロットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて検出し、ＩｍａｇｅＪプログラムで定量した（http://imagej.nih.gov/ij/index.html）。【０１４８】
結果
初代培養運動ニューロンのＥｒｋ１／２及びＪＮＫ１／２／３のリン酸化を測定することにより、ゾニサミドがＥｒｋ１／２のリン酸化を抑制することが見出された（図６）。対照的に、ゾニサミドはＮＳＣ３４細胞で、ＪＮＫ１／２／３のリン酸化を僅かに増強したものの、初代培養運動ニューロンのＪＮＫ１／２／３のリン酸化には影響は認められなかった。【０１４９】
実施例７
マウス坐骨神経自家移植モデルを用いた評価【０１５０】
評価方法
成体雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢；１９．５〜２２．０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入した。マウスはイソフルランで麻酔し、無菌下で、左足の坐骨神経を殿筋切開にて露出させた。坐骨神経を以下の（１）及び（２）の２つの部位で切断した。
（１）大腿二頭筋の最初の分岐から末端方向に３ｍｍ進んだ部位（近位切断部位）
（２）近位切断部分からさらに末端方向に３ｍｍ進んだ部位（末梢側切断部位）
切除した長さ３ｍｍの神経セグメントは２か所の部分において完全に切断されたことを確認した。神経周膜を顕微鏡下で、近位切断部位及び末梢側切断部位にて、ナイロン糸（１０−０黒）を用いて縫合した。残りの糸を、マウスを屠殺した時に神経切断部位を見つけるためのマーカーとして使用した。ＤＭＳＯの毒性を軽減するために、６０ｍｇ／ｍＬのゾニサミドの１００％ＤＭＳＯ溶液を調整し、オリーブオイルで希釈することで３ｍｇ／ｍＬのゾニサミドの５％ＤＭＳＯ溶液を調整した。コントロール溶液（５％ＤＭＳＯ）又は３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのゾニサミド（３ｍｇ／ｍＬ  ｘ  〜０．２ｍＬ）を使い捨てプローブ針（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｔｙｐｅ、Ｆｕｃｈｉｇａｍｉ）を用いて、手術後から屠殺するまでの１〜８週間、１日一回、胃に投与した。各グループのマウス６匹における坐骨神経の髄鞘形成を分析した。坐骨神経自家移植の１週間後、「近位切断部位」及び「末梢側切断部位から３ｍｍ末梢側に進んだ部位」で切断することにより、６ｍｍの神経セグメントを切り出した。その後、神経線維を、０．２ｍｏｌ／Ｌのカコジル酸ナトリウム緩衝液中、ｐＨ７．３にて一晩２％パラホルムアルデヒド／２．５％グルタルアルデヒドにて固定化した後、２％四酸化オスミウムを３時間作用させ、エタノールにて脱水した。エポン包埋後、半薄断面（１μｍ）を末梢側切断部位から末梢側０．７ｍｍにて取得し、ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  ｂｌｕｅ（Ｓｉｇｍａ）で染色し、顕微鏡（ＦＳＸ１００、オリンパス）下で検査した。坐骨神経における有髄軸索の数と面積は、盲検法にてＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して手動で計数した。
運動機能は、各群の３匹のマウスにて、ウォーキングトラック分析法を用い、毎週評価した。ここにおいて、マウスがランウェイを自由に歩くことを許可した場合のマウスの両側の後肢の足跡を記録した。坐骨神経機能指数（ＳＦＩ；Bain et. al. Plast Reconstr Surg 83: 129-138. (1989)）は、盲検法にて両足の足跡の幅及び長さを測定することにより計測した。坐骨神経を切断した後肢及び切断していない後肢との間に違いが存在しない場合は、ＳＦＩを０とした。一方、坐骨神経を切断した後肢が完全に麻痺した場合、ＳＦＩを−１００とした。足跡の記録を取得する前に、マウスにランウェイを歩く練習を数回させた。なお、足跡は、６〜８枚の薄板に記録した。
坐骨神経自家移植後８週目に、全腓腹筋、及び末梢側切断部位から末梢側３ｍｍの坐骨神経セグメントを、全ＲＮＡの抽出のために単離した。同様の坐骨神経セグメントを切断していない後肢からも単離した。Ｂｄｎｆ、Ｎｇｆ、Ｎｔｆ４、Ｎｔｒｋ１、Ｎｔｒｋ２、Ｍａｐ２、Ｍａｐｔ、Ｇａｐ４３、Ｃｈｒｎe、Ｃｏｌｑ及びＲａｐｓｎのｍＲＮＡ発現量を実施例５と同様に定量した。
坐骨神経自家移植後８週目に前脛骨筋を単離し、ヘマトキシリン及びエオシン染色のために冷却した１００％メタノールで固定化した。【０１５１】
結果
Ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるゾニサミドの神経再生効果を、坐骨神経自家移植モデルを用いて評価した。３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのゾニサミドを外科手術後、毎日、胃を介して投与した。術後１週間の時点で、末梢側切断部位を起点に０．７ｍｍ末梢側の切断図を観察したところ、軸索の数に変化は認められなかったが、軸索の面積がゾニサミド非投与群に比べ、３．９倍増加することが明らかとなった（図７）。
ゾニサミドの長期投与による運動機能及び筋肉（前脛骨筋及び腓腹筋）への影響を調査した。坐骨神経自家移植後の後肢の運動機能のマーカーであるＳＦＩが、手術後６週間から８週間後、ゾニサミドが投与されたマウス群において劇的に改善されることが明らかとなった（図９）。
組織学的及び形態学的解析に前脛骨筋の断面を解析したところ、ゾニサミドが脱神経萎縮からの回復を促進させることが明らかとなった（図１０、図１１）。
ゾニサミド投与群において、Ｃｈｒｎｅ（Jones et. al. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 5985-5990.(1996)）、Ｃｏｌｑ（Trinkaus et. al. J Neurochem 105: 2535-2544.(2008)）及びＲａｐｓｎ（Brockhausen et. al. Dev Neurobiol 68: 1153-1169.(2008)）といった、神経筋接合部に特異的に発現する遺伝子の発現量が上昇していることが明らかとなった（図１２）。
末梢側切断部位から末梢側の坐骨神経セグメントにおける遺伝子発現を解析したところ、ゾニサミドを投与したマウスにおいて、手術後８週の時点において、Ｂｄｎｆの発現量に変化は認められなかったものの、Ｎｇｆ及びＮｔｆ４の遺伝子発現が向上していることが明らかとなった（図１３）。さらに、受容体であるＮｔｒｋ１及びＮｔｒｋ２のｍＲＮＡレベルについても、ゾニサミドによって上昇することが明らかとなった。また、構造タンパク質であるＭａｐ２、Ｍａｐｔ及びＧａｐ４３のｍＲＮＡレベルについても、ゾニサミド投与群において上昇が認められた。
以上より、ゾニサミドは、軸索の伸長及び坐骨神経の機能回復をもたらすことが明らかとなった。【０１５２】
実施例８
重度脊髄圧挫モデルマウスを用いた運動機能評価【０１５３】
重度脊髄圧挫モデルマウスの作成方法
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウス（８週齢；１９．５〜２２．０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスを、ペントバルビタール  ナトリウムを腹腔内投与することで麻酔し、無菌下で背部切開後、第１０胸椎の椎弓切除を行った。ＩＨ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｃｏｒｄ  Ｉｍｐａｃｔｏｒを使用して、φ１．３５ｍｍのチップを用いて１００ｋｄｙｎで脊髄を圧挫した。顕微鏡下に脊髄の血腫を確認後閉創し、後頸部の皮下に脱水予防のため１ｍｌの生理食塩水を注射した。脊髄損傷を起こしたマウスを盲検的に２群に分類した。術当日より、一方の群のマウスに、オリーブオイル（溶媒）にて３ｍｇ／ｍＬに希釈したゾニサミドを３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙにて、使い捨てプローブ針（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｔｙｐｅ、Ｆｕｃｈｉｇａｍｉ）を用いて胃内に連日投与した。他方の群のマウスには溶媒のみを同様の手法で連日投与した。術後１日目に、両群のマウスの運動機能をＢＭＳスコア（Ｂａｓｓｏ  ｍｏｕｓｅ  ｓｃａｌｅ；Li et.al. J Neurosurg Spine 4: 165-173. (2006)）を用い盲検法にて評価し、ＢＭＳスコアが１以下のマウスを選別し、重度脊髄圧挫モデルマウスとした。術後３日間は感染予防のため、トリメトプリム（１６ｍｇ）／スルファメトキサゾール（８０ｍｇ）を含有した２００ｍＬの水を給水瓶に入れ投与した。
以上より、「重度脊髄圧挫モデルマウスへゾニサミドを投与した群（ゾニサミド投与群）」及び「重度脊髄圧挫モデルマウスへ溶媒のみを投与したコントロール群（コントロール群）」を作成した。【０１５４】
ＢＭＳスコアについて
ＢＭＳスコアとは足関節の動き、体重支持、ステップ、前後肢の協同運動（協調性）、歩行時の後肢の肢位、体幹の安定性、尾の位置を点数化したものであり、０から９点の採点で、後肢の完全麻痺が０点、正常運動が９点となり、具体的には以下の通りである。
０点：足関節が動かない。
１点：わずかに足関節が動く（可動域の５０％未満）。
２点：広く足関節が動く（可動域の５０％以上）。
３点：足底が接地する  又は足背でステップを踏むことがある。
４点：しばしば足底でステップを踏み、体を持ち上げる（前進時の５０％以下）。
５点：ほぼ足底でステップを踏み（前進時の５０％以上）、四肢の協同運動がない  
又はほぼ足底でステップを踏み、四肢の協同運動はたまにあり、後肢は接地時、爪先離地時ともに外旋。
６点：四肢の協同運動はたまにあり、後肢は接地時に体と平行となるが爪先離地時には外旋、又は四肢の協同運動は多くみられるが、後肢は接地時、爪先離地時ともに外旋。
７点：四肢の協同運動は多くみられ、後肢は接地時に体と平行となる又は四肢の協同運動は多くみられ、後肢は接地時、爪先離地時ともに体と平行となるが、体幹は非常に不安定。
８点：後肢は接地時、爪先離地時ともに体と平行で、体幹はやや不安定又は後肢は接地時、爪先離地時ともに体と平行で、体幹は安定するが、尾が接地することがある
９点：体幹は安定し、尾は常時浮いている。【０１５５】
結果
ＢＭＳスコアによる運動機能評価試験
「ゾニサミド投与群１０匹」、「コントロール群１０匹」及び「脊髄圧挫はせずに椎弓切除のみ施行し溶媒のみ投与したＳｈａｍ群（Ｓｈａｍ群）３匹」を用いて運動機能を評価した。損傷日当日より、「重度脊髄圧挫モデルマウスの作成方法」に記載の手法にて、「ゾニサミド投与群」へは溶媒にて希釈したゾニサミドを、「コントロール群」及び「Ｓｈａｍ群」へは溶媒を連日投与した。術後１日目、術後３日目、術後７日目、術後１４日目、術後２１日目、及び術後２８日目のＢＭＳスコアを盲検法にて確認した（図１４）。
椎弓切除のみ施行したＳｈａｍ群でのＢＭＳスコアは、術後３日目より９点満点であった。ゾニサミド投与群とコントロール群では、術後１４日目以降から有意にゾニサミド群でＢＭＳスコアが高かった。術後１４日目においては、ゾニサミド投与群が３．２±０．３点であったのに対し、コントロール群は１．４±０．５点であった（ｐ＝０．０１４）。術後２１日目においては、ゾニサミド投与群が３．２±０．４点であったのに対し、コントロール群は１．２±０．５点であった（ｐ＝０．００８）。術後２８日目においては、ゾニサミド投与群が３．７±０．４点であったのに対し、コントロール群は１．５±０．５点であった（ｐ＝０．００５）。【０１５６】
ロータロッド試験による運動機能評価試験
「ゾニサミド投与群４匹」、「コントロール群４匹」、及び「Ｓｈａｍ群３匹」にて、「ＢＭＳスコアによる運動機能評価試験」と同様に、損傷日当日より連日薬剤投与を行い、術当日、術後１日目、術後７日目、術後１４日目、術後２１日目、術後２８日目のロータロッド（ＵＧＯ  ＢＡＳＩＬＥ社製）を用いてマウスの運動機能を評価した。初速２ｒｐｍ、加速５ｒｐｍ／ｍｉｎ、最高速度４０ｒｐｍの加速回転モードにて、マウスがロータリングロッドから落ちるまでの時間（保持時間、秒；最大３００秒）を計測した。インターバル１０分で３回計測し、３回の平均値にて評価した（図１５）。
Ｓｈａｍ群の保持時間は、術翌日から２５０秒以上であった。ゾニサミド投与群の保持時間は、術後２１日目及び２８日目において、コントロール群に対して長い傾向が認められた。術後２８日目においては、ゾニサミド投与群が１３５．３±１６．４秒であったのに対し、コントロール群は７６．６±１８．９秒であった（ｐ＝０．０８８）。【０１５７】
ＢＭＳスコア及びロータロッド試験による運動機能評価試験の結果から、重度脊髄圧挫モデルマウスにおいて、ゾニサミドを投与することにて運動機能が改善することが明らかになった。【０１５８】
実施例９
重度脊髄圧挫モデルマウスの損傷部及び損傷部周辺の神経突起伸長に関連する遺伝子発現の評価【０１５９】
方法
実施例８の「重度脊髄圧挫モデルマウスの作成方法」に従って重度脊髄圧挫モデルマウスを作成した。ゾニサミド投与群４匹、コントロール群４匹の脊髄を術後２８日目に摘出し、損傷部５ｍｍ、損傷部尾側５ｍｍをそれぞれ採取した（図１６）。それぞれの脊髄５ｍｍセグメントから、全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて単離した。一本鎖ｃＤＮＡは、ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（Ｔｏｙｏｂｏ）を用いて合成した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、神経栄養因子であるＢｄｎｆ、Ｎｇｆ、Ｎｔｆ４、Ｎｔｒｋ１、Ｎｔｒｋ２、Ｍａｐ２、Ｍａｐｔ、及びＧａｐ４３のｍＲＮＡ発現量を定量した（図１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４）。ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨの発現量で標準化した。【０１６０】
結果
ゾニサミド投与群の損傷尾側にて、ＭＡＰ２及びＴａｕ遺伝子の発現がコントロール群に対し有意に増加していた（図２２、ｐ＝０．０２９；図２３、ｐ＝０．００８）。ＭＡＰ２は神経細胞では樹状突起に、Ｔａｕは軸索に多く存在しているため、ゾニサミド投与により、損傷脊髄尾側にて軸索の延長作用のみではなく、樹状突起も増加していることが示唆された。ＮＧＦの発現も、ＭＡＰ２、Ｔａｕと同じく損傷尾側にて発現が増加している傾向が認められた（図１８、ｐ＝０．０５３）。
以上により、神経突起伸長に関連する遺伝子発現が損傷尾側にて増加していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明に係るゾニサミド又はそのアルカリ金属塩は、末梢神経障害及び脊髄損傷に対して極めて有用である。神経細胞を再生させることにより「末梢神経障害」そのものを治療し、「末梢神経障害」に伴う運動機能障害、感覚機能障害、及び／又は自律神経機能障害の治療に有用である。さらに、本発明に係るゾニサミド又はそのアルカリ金属塩は「脊髄損傷」を治療することにより、「脊髄損傷」に伴う運動機能障害、感覚機能障害及び／又は自律神経機能障害の治療に有用である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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