(57)【要約】  ８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン（Ｌ-０１２）またはその塩に共存させることで、測定時において悪影響を及ぼさず、なおかつ、露光による測定感度の低下を抑制できるＬ-０１２またはその塩の安定化剤等を提供することを課題とする。  本発明は、一般式［１］で示される、Ｌ-０１２またはその塩の安定化剤、およびＬ-０１２またはその塩に該安定化剤を共存させるＬ-０１２またはその塩の安定化方法等に関する。一般式［１］：2017069192.tif 000083（式中、ｐ個のＭ１はそれぞれ独立して、水素原子またはアルカリ金属原子を表し、ｑ個のＲ１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基またはスルホン酸基を表し、ｍは、０または１を表し、ｐは、１〜３の整数を表し、ｑは、０〜４の整数を表し、Ｙは、窒素原子またはＣＨ基（メチン基）を表し、Ｚは、特定構造のアリール基または特定構造のピラゾリル基を表す。）
2017069192.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［１］で示される、８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオンまたはその塩の安定化剤。
一般式［１］：
2017069192.tif 000039
（式中、ｐ個のＭ１はそれぞれ独立して、水素原子またはアルカリ金属原子を表し、ｑ個のＲ１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｍは、０または１を表し、ｐは、１〜３の整数を表し、ｑは、０〜４の整数を表し、Ｙは、窒素原子またはＣＨ基（メチン基）を表し、Ｚは、一般式［Ｚ-１］で示される基、一般式［Ｚ-２］で示される基または一般式［Ｚ-３］で示される基を表す。）
一般式［Ａ］：
2017069192.tif 000040
（式中、Ｍ２は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）
一般式［Ｚ-１］：
2017069192.tif 000041
（式中、ｒ個のＲ２はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ３は、水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｒ４は、水素原子または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ５は、水素原子、式［Ｂ］で示されるフェニルアミノ基または一般式［Ｃ］で示されるナフチルアゾ基を表し、ｎは、０または１を表し、ｒは、０〜４の整数を表す。）
式［Ｂ］：
2017069192.tif 000042
一般式［Ｃ］：
2017069192.tif 000043
（式中、Ｒ１２〜Ｒ１４はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-２］：
2017069192.tif 000044
（式中、Ｒ６〜Ｒ９はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-３］：
2017069192.tif 000045
（式中、Ｒ１０は、水素原子または一般式［Ｄ］で示されるカルボン酸基を表し、ｓ個のＲ１１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｓは、０〜５の整数を表す。）
一般式［Ｄ］：
2017069192.tif 000046
（式中、Ｍ３は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）
【請求項２】
前記一般式［１］で示される安定化剤が、一般式［２］で示されるものである、請求項１に記載の安定化剤。
一般式［２］：
2017069192.tif 000047
（式中、ｐ個のＭ１、ｑ個のＲ１、ｒ個のＲ２、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびＹは、前記に同じ。）
【請求項３】
前記一般式［１］で示される安定化剤が、一般式［２'］で示されるものである、請求項１に記載の安定化剤。
一般式［２'］：
2017069192.tif 000048
（式中、Ｒ１５およびＲ１６はそれぞれ独立して、水素原子または一般式［Ｅ］で示されるスルホン酸基を表し、ｑ個のＲ１、ｒ個のＲ２、ｎ、ｑ、ｒおよびＹは、前記に同じ。ただし、Ｒ１５およびＲ１６のうち、少なくとも１つは一般式［Ｅ］で示されるスルホン酸基である。）
一般式［Ｅ］：
2017069192.tif 000049
（式中、Ｍ１は、前記に同じ。）
【請求項４】
前記一般式［１］で示される安定化剤が、４-ヒドロキシ-５-（サリチリデンアミノ）-２，７-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、７-ヒドロキシ-８-（４-スルホ-１-ナフチルアゾ）-１，３-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、２-（４-スルホフェニルアゾ）-１，８-ジヒドロキシ-３，６-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、３-［４-（フェニルアミノ）フェニルアゾ］ベンゼンスルホン酸またはその塩、３-ヒドロキシ-４-［４-（４-スルホフェニルアゾ）-２-スルホフェニルアゾ］-２，７-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、および４，５-ジヒドロ-５-オキソ-１-（４-スルホフェニル）-４-［（４-スルホフェニル）アゾ］-１Ｈ-ピラゾール-３-カルボン酸またはその塩から選ばれるものである、請求項１に記載の安定化剤。
【請求項５】
前記一般式［１］で示される安定化剤が、４-ヒドロキシ-５-（サリチリデンアミノ）-２，７-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、および７-ヒドロキシ-８-（４-スルホ-１-ナフチルアゾ）-１，３-ナフタレンジスルホン酸またはその塩から選ばれるものである、請求項１に記載の安定化剤。
【請求項６】
８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオンまたはその塩に、一般式［１］で示される化合物を共存させる、８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオンまたはその塩の安定化方法。
一般式［１］：
2017069192.tif 000050
（式中、ｐ個のＭ１はそれぞれ独立して、水素原子またはアルカリ金属原子を表し、ｑ個のＲ１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｍは、０または１を表し、ｐは、１〜３の整数を表し、ｑは、０〜４の整数を表し、Ｙは、窒素原子またはＣＨ基（メチン基）を表し、Ｚは、一般式［Ｚ-１］で示される基、一般式［Ｚ-２］で示される基または一般式［Ｚ-３］で示される基を表す。）
一般式［Ａ］：
2017069192.tif 000051
（式中、Ｍ２は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）
一般式［Ｚ-１］：
2017069192.tif 000052
（式中、ｒ個のＲ２はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ３は、水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｒ４は、水素原子または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ５は、水素原子、式［Ｂ］で示されるフェニルアミノ基または一般式［Ｃ］で示されるナフチルアゾ基を表し、ｎは、０または１を表し、ｒは、０〜４の整数を表す。）
式［Ｂ］：
2017069192.tif 000053
一般式［Ｃ］：
2017069192.tif 000054
（式中、Ｒ１２〜Ｒ１４はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-２］：
2017069192.tif 000055
（式中、Ｒ６〜Ｒ９はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-３］：
2017069192.tif 000056
（式中、Ｒ１０は、水素原子または一般式［Ｄ］で示されるカルボン酸基を表し、ｓ個のＲ１１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｓは、０〜５の整数を表す。）
一般式［Ｄ］：
2017069192.tif 000057
（式中、Ｍ３は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）
【請求項７】
前記一般式［１］で示される化合物が、一般式［２］で示されるものである、請求項６に記載の安定化方法。
一般式［２］：
2017069192.tif 000058
（式中、ｐ個のＭ１、ｑ個のＲ１、ｒ個のＲ２、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびＹは、前記に同じ。）
【請求項８】
前記一般式［１］で示される化合物が、一般式［２'］で示されるものである、請求項６に記載の安定化方法。
一般式［２'］：
2017069192.tif 000059
（式中、Ｒ１５およびＲ１６はそれぞれ独立して、水素原子または一般式［Ｅ］で示されるスルホン酸基を表し、ｑ個のＲ１、ｒ個のＲ２、ｎ、ｑ、ｒおよびＹは、前記に同じ。ただし、Ｒ１５およびＲ１６のうち、少なくとも１つは一般式［Ｅ］で示されるスルホン酸基である。）
一般式［Ｅ］：
2017069192.tif 000060
（式中、Ｍ１は、前記に同じ。）
【請求項９】
前記一般式［１］で示される化合物が、４-ヒドロキシ-５-（サリチリデンアミノ）-２，７-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、７-ヒドロキシ-８-（４-スルホ-１-ナフチルアゾ）-１，３-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、２-（４-スルホフェニルアゾ）-１，８-ジヒドロキシ-３，６-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、３-［４-（フェニルアミノ）フェニルアゾ］ベンゼンスルホン酸またはその塩、３-ヒドロキシ-４-［４-（４-スルホフェニルアゾ）-２-スルホフェニルアゾ］-２，７-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、および４，５-ジヒドロ-５-オキソ-１-（４-スルホフェニル）-４-［（４-スルホフェニル）アゾ］-１Ｈ-ピラゾール-３-カルボン酸またはその塩から選ばれるものである、請求項６に記載の安定化方法。
【請求項１０】
前記一般式［１］で示される化合物が、４-ヒドロキシ-５-（サリチリデンアミノ）-２，７-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、および７-ヒドロキシ-８-（４-スルホ-１-ナフチルアゾ）-１，３-ナフタレンジスルホン酸またはその塩から選ばれるものである、請求項６に記載の安定化方法。
【請求項１１】
８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオンまたはその塩と、一般式［１］で示される化合物を含む、組成物。
一般式［１］：
2017069192.tif 000061
（式中、ｐ個のＭ１はそれぞれ独立して、水素原子またはアルカリ金属原子を表し、ｑ個のＲ１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｍは、０または１を表し、ｐは、１〜３の整数を表し、ｑは、０〜４の整数を表し、Ｙは、窒素原子またはＣＨ基（メチン基）を表し、Ｚは、一般式［Ｚ-１］で示される基、一般式［Ｚ-２］で示される基または一般式［Ｚ-３］で示される基を表す。）
一般式［Ａ］：
2017069192.tif 000062
（式中、Ｍ２は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）
一般式［Ｚ-１］：
2017069192.tif 000063
（式中、ｒ個のＲ２はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ３は、水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｒ４は、水素原子または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ５は、水素原子、式［Ｂ］で示されるフェニルアミノ基または一般式［Ｃ］で示されるナフチルアゾ基を表し、ｎは、０または１を表し、ｒは、０〜４の整数を表す。）
式［Ｂ］：
2017069192.tif 000064
一般式［Ｃ］：
2017069192.tif 000065
（式中、Ｒ１２〜Ｒ１４はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-２］：
2017069192.tif 000066
（式中、Ｒ６〜Ｒ９はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-３］：
2017069192.tif 000067
（式中、Ｒ１０は、水素原子または一般式［Ｄ］で示されるカルボン酸基を表し、ｓ個のＲ１１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｓは、０〜５の整数を表す。）
一般式［Ｄ］：
2017069192.tif 000068
（式中、Ｍ３は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）
【請求項１２】
前記一般式［１］で示される化合物が、一般式［２］で示されるものである、請求項１１に記載の組成物。
一般式［２］：
2017069192.tif 000069
（式中、ｐ個のＭ１、ｑ個のＲ１、ｒ個のＲ２、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびＹは、前記に同じ。）
【請求項１３】
前記一般式［１］で示される化合物が、一般式［２'］で示されるものである、請求項１１に記載の組成物。
一般式［２'］：
2017069192.tif 000070
（式中、Ｒ１５およびＲ１６はそれぞれ独立して、水素原子または一般式［Ｅ］で示されるスルホン酸基を表し、ｑ個のＲ１、ｒ個のＲ２、ｎ、ｑ、ｒおよびＹは、前記に同じ。ただし、Ｒ１５およびＲ１６のうち、少なくとも１つは一般式［Ｅ］で示されるスルホン酸基である。）
一般式［Ｅ］：
2017069192.tif 000071
（式中、Ｍ１は、前記に同じ。）
【請求項１４】
前記一般式［１］で示される化合物が、４-ヒドロキシ-５-（サリチリデンアミノ）-２，７-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、７-ヒドロキシ-８-（４-スルホ-１-ナフチルアゾ）-１，３-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、２-（４-スルホフェニルアゾ）-１，８-ジヒドロキシ-３，６-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、３-［４-（フェニルアミノ）フェニルアゾ］ベンゼンスルホン酸またはその塩、３-ヒドロキシ-４-［４-（４-スルホフェニルアゾ）-２-スルホフェニルアゾ］-２，７-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、および４，５-ジヒドロ-５-オキソ-１-（４-スルホフェニル）-４-［（４-スルホフェニル）アゾ］-１Ｈ-ピラゾール-３-カルボン酸またはその塩から選ばれるものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記一般式［１］で示される化合物が、４-ヒドロキシ-５-（サリチリデンアミノ）-２，７-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、および７-ヒドロキシ-８-（４-スルホ-１-ナフチルアゾ）-１，３-ナフタレンジスルホン酸またはその塩から選ばれるものである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオンまたはその塩と、一般式［１］で示される化合物を含む、発光測定用キット。
一般式［１］：
2017069192.tif 000072
（式中、ｐ個のＭ１はそれぞれ独立して、水素原子またはアルカリ金属原子を表し、ｑ個のＲ１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｍは、０または１を表し、ｐは、１〜３の整数を表し、ｑは、０〜４の整数を表し、Ｙは、窒素原子またはＣＨ基（メチン基）を表し、Ｚは、一般式［Ｚ-１］で示される基、一般式［Ｚ-２］で示される基または一般式［Ｚ-３］で示される基を表す。）
一般式［Ａ］：
2017069192.tif 000073
（式中、Ｍ２は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）
一般式［Ｚ-１］：
2017069192.tif 000074
（式中、ｒ個のＲ２はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ３は、水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｒ４は、水素原子または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ５は、水素原子、式［Ｂ］で示されるフェニルアミノ基または一般式［Ｃ］で示されるナフチルアゾ基を表し、ｎは、０または１を表し、ｒは、０〜４の整数を表す。）
式［Ｂ］：
2017069192.tif 000075
一般式［Ｃ］：
2017069192.tif 000076
（式中、Ｒ１２〜Ｒ１４はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-２］：
2017069192.tif 000077
（式中、Ｒ６〜Ｒ９はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-３］：
2017069192.tif 000078
（式中、Ｒ１０は、水素原子または一般式［Ｄ］で示されるカルボン酸基を表し、ｓ個のＲ１１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または前記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｓは、０〜５の整数を表す。）
一般式［Ｄ］：
2017069192.tif 000079
（式中、Ｍ３は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）
【請求項１７】
前記一般式［１］で示される化合物が、一般式［２］で示されるものである、請求項１６に記載の発光測定用キット。
一般式［２］：
2017069192.tif 000080
（式中、ｐ個のＭ１、ｑ個のＲ１、ｒ個のＲ２、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびＹは、前記に同じ。）
【請求項１８】
前記一般式［１］で示される化合物が、一般式［２'］で示されるものである、請求項１６に記載の発光測定用キット。
一般式［２'］：
2017069192.tif 000081
（式中、Ｒ１５およびＲ１６はそれぞれ独立して、水素原子または一般式［Ｅ］で示されるスルホン酸基を表し、ｑ個のＲ１、ｒ個のＲ２、ｎ、ｑ、ｒおよびＹは、前記に同じ。ただし、Ｒ１５およびＲ１６のうち、少なくとも１つは一般式［Ｅ］で示されるスルホン酸基である。）
一般式［Ｅ］：
2017069192.tif 000082
（式中、Ｍ１は、前記に同じ。）
【請求項１９】
前記一般式［１］で示される化合物が、４-ヒドロキシ-５-（サリチリデンアミノ）-２，７-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、７-ヒドロキシ-８-（４-スルホ-１-ナフチルアゾ）-１，３-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、２-（４-スルホフェニルアゾ）-１，８-ジヒドロキシ-３，６-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、３-［４-（フェニルアミノ）フェニルアゾ］ベンゼンスルホン酸またはその塩、３-ヒドロキシ-４-［４-（４-スルホフェニルアゾ）-２-スルホフェニルアゾ］-２，７-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、および４，５-ジヒドロ-５-オキソ-１-（４-スルホフェニル）-４-［（４-スルホフェニル）アゾ］-１Ｈ-ピラゾール-３-カルボン酸またはその塩から選ばれるものである、請求項１６に記載の発光測定用キット。
【請求項２０】
前記一般式［１］で示される化合物が、４-ヒドロキシ-５-（サリチリデンアミノ）-２，７-ナフタレンジスルホン酸またはその塩、および７-ヒドロキシ-８-（４-スルホ-１-ナフチルアゾ）-１，３-ナフタレンジスルホン酸またはその塩から選ばれるものである、請求項１６に記載の発光測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン（以下、Ｌ-０１２と略記する場合がある。）またはその塩の安定化剤、安定化方法、組成物および発光測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
化学発光反応による分析方法は高感度測定が可能であることから、免疫学的分野の測定系として盛んに研究が進められている。抗原や抗体等を酵素で標識した酵素免疫測定法において酵素活性の測定に化学発光反応が利用され、化学発光物質としてルミノールやイソルミノール等のルミノール誘導体が用いられている。生体内において微量にしか存在しない物質の定量には目的物を高感度に検出する必要があるため、ルミノールやルミノール誘導体は化学発光量子収率の優れた化合物として広く用いられている。【０００３】
その一方で、Ｌ-０１２（またはその塩）は、その発光強度がルミノールに比べて１０倍以上も大きいことが知られており（例えば非特許文献１）、塩基性線維芽細胞増殖因子の定量（例えば非特許文献２）やスーパーオキシドラジカルの検出・定量（例えば非特許文献３）等の報告例がある。そのため、Ｌ-０１２（またはその塩）は、ルミノールに代わる優れた化学発光物質として注目されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】今田ら 生化学 第69巻 第7号 3423 (1997)
【非特許文献２】Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 193, 540-545 (1993)
【非特許文献３】Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 193, 554-559 (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、Ｌ-０１２またはその塩は、自然光（例えば太陽光）や人工光（例えば蛍光灯由来の光）に晒されると測定感度が低下するという問題点がある。このため、Ｌ-０１２またはその塩を用いた測定系では、Ｌ-０１２またはその塩を含む測定試薬の製造過程や該測定試薬の使用時において、これらの自然光や人工光に晒されること（露光）により、測定感度が低下して測定値に誤差を生じる可能性がある。このようなことから、測定時において悪影響を及ぼさず、なおかつ、露光による測定感度の低下を抑制できるＬ-０１２またはその塩の安定化剤の開発が望まれている。【０００６】
本発明は、上述した状況に鑑み成されたものであり、測定時において悪影響を及ぼさず、なおかつ、露光によってＬ-０１２またはその塩を含む測定溶液（発光基質液）の測定感度が低下するという現象を抑制できる安定化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の構成よりなる。
（１）一般式［１］で示される、８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン（Ｌ-０１２）またはその塩の安定化剤（以下、本発明の安定化剤と略記する場合がある。）。
一般式［１］：
2017069192.tif 000003
（式中、ｐ個のＭ１はそれぞれ独立して、水素原子またはアルカリ金属原子を表し、ｑ個のＲ１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｍは、０または１を表し、ｐは、１〜３の整数を表し、ｑは、０〜４の整数を表し、Ｙは、窒素原子またはＣＨ基（メチン基）を表し、Ｚは、一般式［Ｚ-１］で示される基、一般式［Ｚ-２］で示される基または一般式［Ｚ-３］で示される基を表す。）
一般式［Ａ］：
2017069192.tif 000004
（式中、Ｍ２は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）
一般式［Ｚ-１］：
2017069192.tif 000005
（式中、ｒ個のＲ２はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ３は、水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｒ４は、水素原子または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ５は、水素原子、式［Ｂ］で示されるフェニルアミノ基または一般式［Ｃ］で示されるナフチルアゾ基を表し、ｎは、０または１を表し、ｒは、０〜４の整数を表す。）
式［Ｂ］：
2017069192.tif 000006
一般式［Ｃ］：
2017069192.tif 000007
（式中、Ｒ１２〜Ｒ１４はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-２］：
2017069192.tif 000008
（式中、Ｒ６〜Ｒ９はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-３］：
2017069192.tif 000009
（式中、Ｒ１０は、水素原子または一般式［Ｄ］で示されるカルボン酸基を表し、ｓ個のＲ１１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｓは、０〜５の整数を表す。）
一般式［Ｄ］：
2017069192.tif 000010
（式中、Ｍ３は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）【０００８】
（２）８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン（Ｌ-０１２）またはその塩に、一般式［１］で示される化合物を共存させる、８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン（Ｌ-０１２）またはその塩の安定化方法（以下、本発明の安定化方法と略記する場合がある。）。
一般式［１］：
2017069192.tif 000011
（式中、ｐ個のＭ１はそれぞれ独立して、水素原子またはアルカリ金属原子を表し、ｑ個のＲ１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｍは、０または１を表し、ｐは、１〜３の整数を表し、ｑは、０〜４の整数を表し、Ｙは、窒素原子またはＣＨ基（メチン基）を表し、Ｚは、一般式［Ｚ-１］で示される基、一般式［Ｚ-２］で示される基または一般式［Ｚ-３］で示される基を表す。）
一般式［Ａ］：
2017069192.tif 000012
（式中、Ｍ２は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）
一般式［Ｚ-１］：
2017069192.tif 000013
（式中、ｒ個のＲ２はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ３は、水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｒ４は、水素原子または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ５は、水素原子、式［Ｂ］で示されるフェニルアミノ基または一般式［Ｃ］で示されるナフチルアゾ基を表し、ｎは、０または１を表し、ｒは、０〜４の整数を表す。）
式［Ｂ］：
2017069192.tif 000014
一般式［Ｃ］：
2017069192.tif 000015
（式中、Ｒ１２〜Ｒ１４はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-２］：
2017069192.tif 000016
（式中、Ｒ６〜Ｒ９はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-３］：
2017069192.tif 000017
（式中、Ｒ１０は、水素原子または一般式［Ｄ］で示されるカルボン酸基を表し、ｓ個のＲ１１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｓは、０〜５の整数を表す。）
一般式［Ｄ］：
2017069192.tif 000018
（式中、Ｍ３は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）【０００９】
（３）８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン（Ｌ-０１２）またはその塩と、上記一般式［１］で示される化合物を含む、組成物（以下、本発明の組成物と略記する場合がある。）。【００１０】
（４）８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン（Ｌ-０１２）またはその塩と、上記一般式［１］で示される化合物を含む、発光測定用キット（以下、本発明の発光測定用キットと略記する場合がある。）。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の安定化剤は、アゾ基またはイミノ基とベンゼンスルホン酸基を有する特定構造の化合物であり、Ｌ-０１２またはその塩に本発明の安定化剤を共存させることで、Ｌ-０１２またはその塩そのものが持つ発光量を保ちつつ、光によって分解（劣化）すること等に起因するＬ-０１２またはその塩の発光強度の減少（測定感度の低下）を抑制することができる。【００１２】
また、本発明の組成物および本発明の発光測定用キットは、Ｌ-０１２またはその塩と上記一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を含むものであり、該組成物または該キットの製造過程やその使用時（測定時）において、露光によるＬ-０１２またはその塩の発光強度の減少（測定感度の低下）が抑制されており、これを用いれば高感度で精度よく目的物質を測定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン（Ｌ-０１２）またはその塩とは、式［Ｘ-１］で示される化合物またはその塩である。
式［Ｘ-１］：
2017069192.tif 000019
【００１４】
上記式［Ｘ-１］で示される化合物の塩とは、該化合物中のピリドピリダジン環のカルボニル基がエノール化して、一価または二価のカチオンと塩を形成する化合物を意味する。かかる一価のカチオンとしては、例えばナトリウムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン等のアルカリ金属イオン、例えばアンモニウムイオン、例えばメチルアンモニウムイオン、エチルアンモニウムイオン、プロピルアンモニウムイオン、ブチルアンモニウムイオン等の炭素数１〜４のモノアルキルアンモニウムイオン、例えばジメチルアンモニウムイオン、ジエチルアンモニウムイオン、ジプロピルアンモニウムイオン、ジブチルアンモニウムイオン等の炭素数２〜８のジアルキルアンモニウムイオン、例えばトリメチルアンモニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、トリプロピルアンモニウムイオン、トリブチルアンモニウムイオン等の炭素数３〜１２のトリアルキルアンモニウムイオン、例えばテトラメチルアンモニウムイオン、テトラエチルアンモニウムイオン、テトラプロピルアンモニウムイオン、テトラブチルアンモニウムイオン等の炭素数４〜１６のテトラアルキルアンモニウムイオン、ピリジニウムイオン、ヒドラジニウムイオン等のアンモニウムイオン等が挙げられる。かかる二価のカチオンとしては、例えばマグネシウムイオン、カルシウムイオン等のアルカリ土類金属イオン等が挙げられる。これらの一価または二価のカチオンのなかでも、ナトリウムイオンが好ましい。
【００１５】
上述の上記式［Ｘ-１］で示される化合物の塩の具体例としては、例えば式［Ｘ-２］で示される、８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン，ナトリウム塩が挙げられる。
式［Ｘ-２］：
2017069192.tif 000020
【００１６】
上述の８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン（Ｌ-０１２）またはその塩（上記式［Ｘ-１］で示される化合物またはその塩）のなかでも、８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン（Ｌ-０１２：上記式［Ｘ-１］で示される化合物）および８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン，ナトリウム塩（上記式［Ｘ-２］で示される化合物）が好ましく、そのなかでも、８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン，ナトリウム塩（上記式［Ｘ-２］で示される化合物）がより好ましい。なお、これらのＬ-０１２またはその塩は、市販のものを用いてもよいし、公知の方法によって適宜合成したものを用いてもよい。
【００１７】
−本発明の安定化剤−
本発明の安定化剤は、一般式［１］で示されるものである。
一般式［１］：
2017069192.tif 000021
（式中、ｐ個のＭ１はそれぞれ独立して、水素原子またはアルカリ金属原子を表し、ｑ個のＲ１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｍは、０または１を表し、ｐは、１〜３の整数を表し、ｑは、０〜４の整数を表し、Ｙは、窒素原子またはＣＨ基（メチン基）を表し、Ｚは、一般式［Ｚ-１］で示される基、一般式［Ｚ-２］で示される基または一般式［Ｚ-３］で示される基を表す。）
一般式［Ａ］：
2017069192.tif 000022
（式中、Ｍ２は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）
一般式［Ｚ-１］：
2017069192.tif 000023
（式中、ｒ個のＲ２はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ３は、水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｒ４は、水素原子または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、Ｒ５は、水素原子、式［Ｂ］で示されるフェニルアミノ基または一般式［Ｃ］で示されるナフチルアゾ基を表し、ｎは、０または１を表し、ｒは、０〜４の整数を表す。）
式［Ｂ］：
2017069192.tif 000024
一般式［Ｃ］：
2017069192.tif 000025
（式中、Ｒ１２〜Ｒ１４はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-２］：
2017069192.tif 000026
（式中、Ｒ６〜Ｒ９はそれぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表す。）
一般式［Ｚ-３］：
2017069192.tif 000027
（式中、Ｒ１０は、水素原子または一般式［Ｄ］で示されるカルボン酸基を表し、ｓ個のＲ１１はそれぞれ独立して、ヒドロキシル基または上記一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基を表し、ｓは、０〜５の整数を表す。）
一般式［Ｄ］：
2017069192.tif 000028
（式中、Ｍ３は、水素原子またはアルカリ金属原子を表す。）
【００１８】
一般式［１］におけるｐ個のＭ１、一般式［Ａ］におけるＭ２および一般式［Ｄ］におけるＭ３で示されるアルカリ金属原子としては、リチウム原子、ナトリウム原子、カリウム原子が好ましく、なかでも、ナトリウム原子が好ましい。
【００１９】
一般式［１］におけるＺとしては、一般式［Ｚ-１］で示される基が好ましい。
【００２０】
一般式［Ｚ-１］におけるｒ個のＲ２としては、すべてのＲ２が一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基であることが好ましい。
【００２１】
一般式［Ｚ-１］におけるＲ３としては、ヒドロキシル基が好ましい。
【００２２】
一般式［Ｚ-１］におけるＲ４としては、水素原子が好ましい。
【００２３】
一般式［Ｚ-１］におけるＲ５としては、水素原子が好ましい。
【００２４】
一般式［Ｚ-２］におけるＲ６およびＲ７としては、一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基が好ましい。
【００２５】
一般式［Ｚ-２］におけるＲ８およびＲ９としては、ヒドロキシル基が好ましい。
【００２６】
一般式［Ｚ-３］におけるＲ１０としては、一般式［Ｄ］で示されるカルボン酸基が好ましい。
【００２７】
一般式［Ｚ-３］におけるｓ個のＲ１１としては、すべてのＲ１１が一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基であることが好ましい。
【００２８】
一般式［Ｃ］におけるＲ１２としては、ヒドロキシル基が好ましい。
【００２９】
一般式［Ｃ］におけるＲ１３およびＲ１４としては、一般式［Ａ］で示されるスルホン酸基が好ましい。
【００３０】
一般式［１］におけるｍとしては、１が好ましい。
【００３１】
一般式［１］におけるｍが０の場合は、ベンゼン環を表し、ｍが１の場合は、ナフタレン環を表す。なお、ｍが０の場合は、ｑ個のＲ１で示される基は存在しないことを意味する。
【００３２】
一般式［Ｚ-１］におけるｎが０の場合は、ベンゼン環を表し、ｎが１の場合は、ナフタレン環を表す。なお、ｎが０の場合は、ｒ個のＲ２で示される基は存在しないことを意味する。
【００３３】
一般式［１］におけるｐとしては、１〜２の整数が好ましく、なかでも、１がより好ましい。
【００３４】
一般式［１］におけるｐ個の−ＳＯ３Ｍ１で示されるスルホン酸基は、−Ｎ＝Ｙ−Ｚで示される基が結合する炭素原子を、ベンゼン環またはナフタレン環の１位の炭素原子とした場合に、ベンゼン環またはナフタレン環の３位または４位の炭素原子に結合していることが好ましい。
【００３５】
一般式［１］におけるｑとしては、０〜２の整数が好ましく、なかでも、０または２がより好ましい。なお、ｑが０の場合は、Ｒ１で示される基は存在しないことを意味する。
【００３６】
一般式［１］におけるｑ個のＲ１で示される基は、−Ｎ＝Ｙ−Ｚで示される基が結合する炭素原子を、ナフタレン環の１位の炭素原子とした場合に、ナフタレン環の６位または８位の炭素原子に結合していることが好ましい。
【００３７】
一般式［Ｚ-１］におけるｒとしては、２が好ましい。なお、ｒが０の場合は、Ｒ２で示される基は存在しないことを意味する。
【００３８】
一般式［Ｚ-１］におけるｒ個のＲ２で示される基は、一般式［１］におけるＹで示される基が結合する炭素原子を、ナフタレン環の１位の炭素原子とした場合に、ナフタレン環の６位または８位の炭素原子に結合していることが好ましい。
【００３９】
一般式［Ｚ-３］におけるｓとしては、０〜３の整数が好ましく、なかでも、１が好ましい。なお、ｓが０の場合は、Ｒ１１で示される基は存在しないことを意味する。
【００４０】
一般式［Ｚ-３］におけるｓ個のＲ１１で示される基は、ピラゾリン環が結合する炭素原子を、ベンゼン環の１位の炭素原子とした場合に、ベンゼン環の４位の炭素原子に結合していることが好ましい。
【００４１】
一般式［Ｚ-３］で示される基（一般式［Ｚ-３］で示される構造）は、一般式［Ｚ-４］で示される基（一般式［Ｚ-４］で示される構造）に異性化する場合がある。本発明においては、一般式［１］で示される安定化剤が、一般式［Ｚ-４］で示される構造（エノール型）のものであっても、本発明の（一般式［１］で示される）安定化剤に含まれる。
一般式［Ｚ-４］：
2017069192.tif 000029
【００４２】
上述の一般式［１］で示される本発明の安定化剤の具体例としては、例えば式［１-１］〜［１-６］で示されるものが挙げられる。なお、本発明の安定化剤は、式［１-１］〜［１-６］で示されるものに限定されない。
式［１-１］〜［１-６］：
2017069192.tif 000030
【００４３】
上述の式［１-１］〜［１-６］の名称は以下のとおりである。
式［１-１］：４-ヒドロキシ-５-（サリチリデンアミノ）-２，７-ナフタレンジスルホン酸：アゾメチンＨ
式［１-２］：７-ヒドロキシ-８-（４-スルホ-１-ナフチルアゾ）-１，３-ナフタレンジスルホン酸
式［１-３］：２-（４-スルホフェニルアゾ）-１，８-ジヒドロキシ-３，６-ナフタレンジスルホン酸
式［１-４］：３-［４-（フェニルアミノ）フェニルアゾ］ベンゼンスルホン酸
式［１-５］：３-ヒドロキシ-４-［４-（４-スルホフェニルアゾ）-２-スルホフェニルアゾ］-２，７-ナフタレンジスルホン酸
式［１-６］：４，５-ジヒドロ-５-オキソ-１-（４-スルホフェニル）-４-［（４-スルホフェニル）アゾ］-１Ｈ-ピラゾール-３-カルボン酸
【００４４】
また、上述の式［１-１］〜［１-６］で示される安定化剤は、アルカリ金属とで塩を形成していてもよく、例えば式［１-７］〜［１-１２］で示されるものが挙げられる。なお、アルカリ金属塩である本発明の安定化剤は、下記式［１-７］〜［１-１２］で示されるものに限定されない。
式［１-７］〜［１-１２］：
2017069192.tif 000031
【００４５】
上述の式［１-７］〜［１-１２］の名称は以下のとおりである。
式［１-７］：４-ヒドロキシ-５-（サリチリデンアミノ）-２，７-ナフタレンジスルホン酸，ナトリウム塩または４-ヒドロキシ-５-（サリチリデンアミノ）-２，７-ナフタレンジスルホン酸，２ナトリウム塩：アゾメチンＨ，ナトリウム塩またはアゾメチンＨ，２ナトリウム塩
式［１-８］：７-ヒドロキシ-８-（４-スルホ-１-ナフチルアゾ）-１，３-ナフタレンジスルホン酸，３ナトリウム塩：ニューコクシン
式［１-９］：２-（４-スルホフェニルアゾ）-１，８-ジヒドロキシ-３，６-ナフタレンジスルホン酸，３ナトリウム塩：スルファニル酸アゾクロムトロップ
式［１-１０］：３-［４-（フェニルアミノ）フェニルアゾ］ベンゼンスルホン酸，ナトリウム塩：メタニルイエロー
式［１-１１］：３-ヒドロキシ-４-［４-（４-スルホフェニルアゾ）-２-スルホフェニルアゾ］-２，７-ナフタレンジスルホン酸，４ナトリウム塩：ポンソーＳ
式［１-１２］：４，５-ジヒドロ-５-オキソ-１-（４-スルホフェニル）-４-［（４-スルホフェニル）アゾ］-１Ｈ-ピラゾール-３-カルボン酸，３ナトリウム塩：タートラジン
【００４６】
本発明の安定化剤は、上述の一般式［１］で示される特定の構造を有するが故に、Ｌ-０１２またはその塩に共存させることで、測定時において悪影響を及ぼさず、なおかつ、露光による測定感度の低下を抑制できるのである。本発明の安定化剤は、一般的な水溶性色素として知られているものではある。しかしながら、水溶性色素であればどのようなものでもＬ-０１２またはその塩の安定化効果を有するわけではなく、また、Ｌ-０１２またはその塩の安定化効果は、色素の極大吸収波長とも相関しない。すなわち、本発明の安定化剤は、アゾ基またはイミノ基を有し、共鳴構造を有する一般式［１］で示される特定の構造に特徴がある。そのため、本発明の安定化剤のみが、Ｌ-０１２またはその塩の安定化効果と測定に悪影響を与えないという効果の両方を有するのである。
【００４７】
上述の一般式［１］で示される安定化剤のなかでも、一般式［２］で示される安定化剤が好ましい。
一般式［２］：
2017069192.tif 000032
（式中、ｐ個のＭ１、ｑ個のＲ１、ｒ個のＲ２、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒおよびＹは、上記に同じ。）
【００４８】
上述の一般式［２］で示される安定化剤の具体例としては、例えば上記式［１-１］、［１-２］、［１-７］および［１-８］で示されるものが挙げられる。
【００４９】
本発明の安定化剤のなかでも、上述の一般式［２］で示される安定化剤は、測定時において悪影響を及ぼさず、なおかつ、露光による測定感度の低下をより効果的に抑制できるという効果を奏する。
【００５０】
さらに、上述の一般式［２］で示される安定化剤のなかでも、一般式［２'］で示される安定化剤が好ましい。
一般式［２'］：
2017069192.tif 000033
（式中、Ｒ１５およびＲ１６はそれぞれ独立して、水素原子または一般式［Ｅ］で示されるスルホン酸基を表し、ｑ個のＲ１、ｒ個のＲ２、ｎ、ｑ、ｒおよびＹは、上記に同じ。ただし、Ｒ１５およびＲ１６のうち、少なくとも１つは一般式［Ｅ］で示されるスルホン酸基である。）
一般式［Ｅ］：
2017069192.tif 000034
（式中、Ｍ１は、上記に同じ。）
【００５１】
上述の一般式［２'］で示される安定化剤の具体例としては、例えば上記式［１-１］、［１-２］、［１-７］および［１-８］で示されるものが挙げられる。
【００５２】
本発明の安定化剤は、市販のものを用いてもよいし、公知の方法によって適宜合成したものを用いてもよい。
【００５３】
−本発明の安定化方法−
本発明の安定化方法は、Ｌ-０１２またはその塩に、上述の一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を共存させる方法である。
【００５４】
本発明の安定化方法の具体的手法としては、最終的に、Ｌ-０１２またはその塩に上述の一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を共存させることができる方法であれば特に制限されず、例えば（１）Ｌ-０１２またはその塩を含有する溶液に、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を添加して、Ｌ-０１２またはその塩に一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を共存させる方法、（２）一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を含有する溶液に、Ｌ-０１２またはその塩を添加して、Ｌ-０１２またはその塩に一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を共存させる方法、あるいは（３）Ｌ-０１２またはその塩と一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）とを、水や適当な緩衝液等の溶解液に添加して、Ｌ-０１２またはその塩に一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を共存させる方法等が挙げられる。
【００５５】
本発明の安定化方法において、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）は、１種類の化合物（安定化剤）を単独で用いてもよいし、２種類以上の化合物（安定化剤）を組み合わせて用いてもよい。
【００５６】
本発明の安定化方法において、Ｌ-０１２またはその塩、あるいは／および一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）に含有させる溶解液としては、この分野において使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば水、緩衝液等が挙げられる。
【００５７】
本発明の安定化方法にかかる水としては、この分野において使用される水であれば特に制限はなく、具体的には、例えば蒸留水、脱イオン水等の精製水等が挙げられる。
【００５８】
本発明の安定化方法にかかる緩衝液としては、この分野において使用される緩衝液であれば特に制限はなく、具体的には、例えばＮ-（２-アセトアミド）-２-アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ-（２-アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ-ビス（２-ヒドロキシエチル）-２-アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ，Ｎ-ビス（２-ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、ビス（２-ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシエチル）メタン（Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓ）、Ｎ-シクロヘキシル-３-アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ-シクロヘキシル-２-ヒドロキシ-３-アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ-シクロヘキシル-２-アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、３-［Ｎ，Ｎ-ビス（２-ヒドロキシエチル）アミノ］-２-ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２-ヒドロキシ-３-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３-（Ｎ-モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２-ヒドロキシ-３-（Ｎ-モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン-１，４-ビス（２-エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン-１，４-ビス（２-ヒドロキシ-３-プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-３-アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、２-ヒドロキシ-Ｎ-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-３-アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-２-アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ-［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）等の緩衝剤を溶解させた（グッド）緩衝液、例えばリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等の緩衝剤を溶解させた緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。また、これらの緩衝液は、１種類の緩衝液を単独で用いてもよいし、２種類以上の緩衝液を組み合わせて用いてもよく、これらの緩衝液と水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物とを組み合わせて緩衝液としてもよい。緩衝液の組み合わせの具体例としては、３-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）／水酸化ナトリウム緩衝液、２-ヒドロキシ-３-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）／水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液等が挙げられる。
【００５９】
本発明の安定化方法における一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）の濃度としては、Ｌ-０１２またはその塩を含む試薬や測定溶液（発光基質液）等の溶液中に存在するＬ-０１２またはその塩を安定化し得る濃度であれば特に制限されない。使用濃度の一例としては、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）の種類、共存させるＬ-０１２またはその塩の濃度、溶解液の純度等により変動するが、Ｌ-０１２またはその塩が存在する溶液中での一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）の濃度として、下限が、通常０．００１μＭ以上、好ましくは０．０１μＭ以上、より好ましくは０．０５μＭ以上であり、上限が、通常１０００μＭ以下、好ましくは８００μＭ以下、より好ましくは５００μＭ以下である。
【００６０】
本発明の安定化方法におけるＬ-０１２またはその塩の濃度としては、化学発光測定の分野において使用される濃度範囲から適宜選択すればよく、具体的には、溶液中でのＬ-０１２またはその塩の濃度として、下限が、通常０．０１ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上、より好ましくは０．３ｍＭ以上であり、上限が、通常５ｍＭ以下、好ましくは２ｍＭ以下、より好ましくは１ｍＭ以下である。
【００６１】
本発明の安定化方法における、Ｌ-０１２またはその塩の濃度に対する一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）の濃度｛Ｌ-０１２またはその塩に対する一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）の濃度比｝としては、Ｌ-０１２またはその塩を安定化し得る濃度比であれば特に制限されず、濃度比の一例としては、溶液中でのＬ-０１２またはその塩の濃度１ｍＭに対して、溶液中での一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）の濃度として、下限が、通常０．００２μＭ以上、好ましくは０．０２μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上であり、上限が、通常２０００μＭ以下、好ましくは１６００μＭ以下、より好ましくは１０００μＭ以下である。
【００６２】
本発明の安定化方法における緩衝液中の緩衝剤の濃度としては、通常１０〜５００ｍＭ、好ましくは１０〜３００ｍＭの範囲から適宜選択すればよい。
【００６３】
本発明の安定化方法における緩衝液のｐＨとしては、通常ｐＨ３〜１２、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６．５〜９の範囲から適宜選択すればよい。
【００６４】
本発明の安定化方法においては、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）、Ｌ-０１２またはその塩、ならびに水または／および緩衝液のほかに、例えばアジ化ナトリウム等の保存剤、例えばマルトース、スクロース、トレハロース等の糖類、例えば蛋白質等の安定化剤、例えば塩化ナトリウム、塩化マグネシウム等の塩類、例えば５-クロロ-２-メチル-４-イソチアゾリン-３-オン、２-メチル-４-イソチアゾリン-３-オン、５-ブロモ-５-ニトロ-１，３-ジオキサン、（＋）-１０-カンファースルホン酸等の防腐剤、界面活性剤等の、この分野において使用される添加剤を共存させてもよい。
【００６５】
これらの添加剤の添加量としては、この分野において使用される範囲内から適宜設定すればよい。
【００６６】
上述した具体的手法に基づいて行われる本発明の安定化方法は、露光によるＬ-０１２またはその塩の分解（劣化）を抑制してＬ-０１２またはその塩を長期間安定化し、ひいてはＬ-０１２またはその塩の発光強度の減少（測定感度の低下）を抑制できる方法である。また、本発明の安定化方法によってＬ-０１２またはその塩を安定化させれば、Ｌ-０１２またはその塩を含む試薬や測定溶液（発光基質液）の使用時において、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）は測定に悪影響を及ぼさないため、高感度で精度よく目的物質を測定することができる。
【００６７】
−本発明の組成物−
本発明の組成物は、Ｌ-０１２またはその塩と、上述の一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を含むものであり、該組成物の製造過程やその使用時（測定時）において、露光によるＬ-０１２またはその塩の発光強度の減少（測定感度の低下）が抑制されている。例えば化学発光測定において、本発明の組成物を用いれば、生体中の目的物質を高感度で精度よく測定することができる。
【００６８】
本発明の組成物は、一般的には溶液状態であるが、凍結状態または凍結乾燥状態であってもよい。
【００６９】
本発明の組成物は、上述した濃度範囲のＬ-０１２またはその塩と、上述した濃度範囲の一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）とを上述した濃度比で含有するものである。
【００７０】
例えば、本発明の組成物が溶液状態の場合には、適当な溶解液に、Ｌ-０１２またはその塩と一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を、それぞれ上述した濃度範囲および濃度比となるように含有させればよい。また、本発明の組成物が凍結状態または凍結乾燥状態の場合には、凍結原液あるいは凍結乾燥原液に、Ｌ-０１２またはその塩と一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を、溶解液により調製した際の濃度がそれぞれ上述した濃度範囲および濃度比となるように含有させればよい。なお、当該組成物を溶解液により調製した場合に、上述した濃度範囲のＬ-０１２またはその塩と、上述した濃度範囲の一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）とを、上述した濃度比となるようにすれば、調製後の組成物におけるＬ-０１２またはその塩も安定化し得ることは言うまでもない。
【００７１】
本発明の組成物において使用される溶解液としては、上述の本発明の安定化方法で用いられる水、緩衝液の具体例と同様のものが挙げられ、その使用濃度やｐＨも上述の範囲と同様である。
【００７２】
本発明の組成物には、Ｌ-０１２またはその塩、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）および溶解液のほかに、この分野において使用される添加剤を共存させてもよく、このような添加剤としては、本発明の安定化方法における添加剤の具体例と同様のものが挙げられ、その添加量としては、この分野において使用される範囲内から適宜設定すればよい。
【００７３】
−Ｌ-０１２またはその塩と一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を含む測定溶液（発光基質液）を用いる発光測定法−
一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）は、Ｌ-０１２またはその塩を反応系に存在させる任意の発光測定法に使用することができる。
【００７４】
このような発光測定法の具体例としては、例えば過酸化水素等の酸化剤とＬ-０１２またはその塩との反応により生じた化学発光を検出・測定する方法等が挙げられ、その原理としては、サンドイッチ法、競合法、二抗体法等の自体公知の種々の方法が挙げられる。
【００７５】
酸化剤とＬ-０１２またはその塩との反応を利用した化学発光測定の具体例としては、試料中の触媒と、酸化剤およびＬ-０１２またはその塩を反応させて化学発光を生じさせる方法、試料中の酸化剤と、触媒およびＬ-０１２またはその塩を反応させて化学発光を生じさせる方法等が挙げられる。これらの反応は、通常溶液中で行われ、測定対象により、（１）Ｌ-０１２またはその塩と一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を含む測定溶液（発光基質液）、酸化剤を含む溶液および試料中の触媒を含む溶液を適宜の順序で混合して反応させる方法、（２）Ｌ-０１２またはその塩と一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を含む測定溶液（発光基質液）、試料中の酸化剤を含む溶液および触媒を含む溶液を適宜の順序で混合して反応させる方法、（３）Ｌ-０１２またはその塩と一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を含む測定溶液（発光基質液）、酸化剤を含む溶液、触媒を含む溶液および試料を含む溶液を適宜の順序で混合して反応させる方法等がある。なお、上述した化学発光測定において、目的物質は、主反応に直接的に関与するものであっても、主反応に間接的に関与するものであってもよい。
【００７６】
上述の触媒としては、例えばフェリシアン化カリウム等の鉄イオン、銅イオン、コバルトイオン等を含有する遷移金属錯体、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、カタラーゼ等の酵素、ヘモグロビン等の生体成分等が挙げられ、なかでも、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、カタラーゼ等の酵素が好ましく、そのなかでも、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）がより好ましい。
【００７７】
上述のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）としては、過酸化水素等の酸化剤の存在下に、Ｌ-０１２またはその塩を化学発光させることができるものであれば特に制限はない。具体的には、例えば西洋ワサビ、パイナップル、イチジク等の植物に由来するもの、例えばカビ、酵母等の微生物に由来するもの、例えば動物の白血球、甲状腺等に由来するもの等が挙げられ、なかでも、西洋ワサビに由来するものが好ましい。なお、かかるペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）には、遺伝子工学により製造されたもの、あるいは天然由来のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を、蛋白質分解酵素等により、その構造の一部を加水分解等して得られたものであって、ＰＯＤ活性を有するものも含まれる。また、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）は、それ自体（未修飾のもの）であっても、例えば抗原、抗体等により化学修飾されたものであってもよい。
【００７８】
上述の酸化剤としては、例えば過酸化水素、過酸化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、過マンガン酸ナトリウム、過マンガン酸カリウム、ヨウ素等が挙げられ、なかでも、過酸化水素が好ましい。なお、これらの酸化剤は、市販のものを用いればよい。
【００７９】
上述の化学発光測定においては、Ｌ-０１２またはその塩、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）、触媒および酸化剤のほかに、増感剤（エンハンサー）を使用してもよい。
【００８０】
上述の増感剤（エンハンサー）としては、この分野において使用される増感剤（エンハンサー）であれば特に制限はなく、具体的には、例えば４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール等のチアゾ−ル誘導体、例えば４-（イミダゾール-１-イル）フェノール等のイミダゾ−ル誘導体、例えば４-（４-ヒドロキシフェニル）オキサゾール等のオキサゾ−ル誘導体、例えばｐ-ヨードフェノール、４-ヒドロキシケイ皮酸、４-（４'-チアゾリル）フェノール等のフェノ−ル誘導体、例えば１-ブロモナフトール等のナフト−ル誘導体等が挙げられ、なかでも、例えば４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール等のチアゾ−ル誘導体が好ましい。なお、これらの増感剤（エンハンサー）は、１種類の増感剤（エンハンサー）を単独で用いてもよいし、２種類以上の増感剤（エンハンサー）を組み合わせて用いてもよい。なお、これらの増感剤（エンハンサー）は市販のものを用いればよい。
【００８１】
上述の化学発光測定において使用するＬ-０１２またはその塩の量としては、測定の様式によって異なる場合があるため一概には言えないが、例えば総発光量を測定する場合では、試料２５μＬに対して、通常濃度０．０１〜５ｍＭのもので５μＬ〜１ｍＬであり、好ましくは濃度０．１〜２ｍＭのもので１０〜５００μＬであり、より好ましくは濃度０．３〜１ｍＭのもので２０〜３００μＬである。一方、単位時間あたりの発光量を測定する場合では、使用するＬ-０１２またはその塩の量は、試料２５μＬに対して、通常濃度０．０１〜５ｍＭのもので５μＬ〜１ｍＬであり、好ましくは濃度０．１〜２ｍＭのもので１０〜５００μＬであり、より好ましくは濃度０．３〜１ｍＭのもので２０〜３００μＬである。
【００８２】
上述の化学発光測定において使用する一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）の量としては、測定の様式によって異なる場合があるため一概には言えないが、例えば総発光量を測定する場合では、試料２５μＬに対して、通常濃度０．００１〜１０００μＭのもので５μＬ〜１ｍＬであり、好ましくは濃度０．０１〜８００μＭのもので１０〜５００μＬであり、より好ましくは濃度０．０５〜５００μＭのもので２０〜３００μＬである。一方、単位時間あたりの発光量を測定する場合では、使用する一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）の量は、試料２５μＬに対して、通常濃度０．００１〜１０００μＭのもので５μＬ〜１ｍＬであり、好ましくは濃度０．０１〜８００μＭのもので１０〜５００μＬであり、より好ましくは濃度０．０５〜５００μＭのもので２０〜３００μＬである。
【００８３】
Ｌ-０１２またはその塩と一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を含む測定溶液（発光基質液）中における、Ｌ-０１２またはその塩の濃度に対する一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）の濃度｛Ｌ-０１２またはその塩に対する一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）の濃度比｝としては、溶液中でのＬ-０１２またはその塩の濃度１ｍＭに対して、溶液中での一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）の濃度として、下限が、通常０．００２μＭ以上、好ましくは０．０２μＭ以上、より好ましくは０．１μＭ以上であり、上限が、通常２０００μＭ以下、好ましくは１６００μＭ以下、より好ましくは１０００μＭ以下である。
【００８４】
上述の化学発光測定において使用する触媒の量としては、使用する触媒の種類や測定の様式によって異なる場合があるため一概には言えないが、例えば触媒がペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）であって、総発光量を測定する場合では、試料２５μＬに対して、通常濃度０．１〜２００Ｕ／ｍＬのもので５μＬ〜１ｍＬであり、好ましくは濃度０．２〜１００Ｕ／ｍＬのもので１０〜５００μＬであり、より好ましくは濃度０．５〜５０Ｕ／ｍＬのもので２０〜３００μＬである。一方、単位時間あたりの発光量を測定する場合では、使用するペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の量は、試料２５μＬに対して、通常濃度０．１〜２００Ｕ／ｍＬのもので５μＬ〜１ｍＬであり、好ましくは濃度０．２〜１００Ｕ／ｍＬのもので１０〜５００μＬであり、より好ましくは濃度０．５〜５０Ｕ／ｍＬのもので２０〜３００μＬである。
【００８５】
上述の化学発光測定において使用する酸化剤の量としては、使用する酸化剤の種類や測定の様式によって異なる場合があるため一概には言えないが、例えば酸化剤が過酸化水素であって、総発光量を測定する場合では、試料２５μＬに対して、通常濃度０.３μＭ〜０．１ｍＭのもので５μＬ〜１ｍＬであり、好ましくは濃度０．５〜５００μＭのもので１０〜５００μＬであり、より好ましくは濃度０．７〜２００μＭのもので２０〜３００μＬである。一方、単位時間あたりの発光量を測定する場合では、使用する過酸化水素の量は、試料２５μＬに対して、通常濃度０.３μＭ〜０．１ｍＭのもので２．５〜５００μＬであり、好ましくは濃度０．５〜５００μＭのもので５〜２５０μＬであり、より好ましくは濃度０．７〜２００μＭのもので１０〜１５０μＬである。
【００８６】
上述の化学発光測定において使用する増感剤（エンハンサー）の量としては、使用する増感剤（エンハンサー）の種類や測定の様式によって異なる場合があるため一概には言えないが、例えば増感剤（エンハンサー）がチアゾール誘導体であって、総発光量を測定する場合では、試料２５μＬに対して、通常濃度０.１μＭ〜１０ｍＭのもので５μＬ〜１ｍＬであり、好ましくは濃度１μＭ〜２ｍＭのもので１０〜５００μＬであり、より好ましくは濃度１００μＭ〜１ｍＭのもので２０〜３００μＬである。一方、単位時間あたりの発光量を測定する場合では、使用するチアゾール誘導体の量は、試料２５μＬに対して、通常濃度０.１μＭ〜１０ｍＭのもので５μＬ〜１ｍＬであり、好ましくは濃度１μＭ〜２ｍＭのもので１０〜５００μＬであり、より好ましくは濃度１００μＭ〜１ｍＭのもので２０〜３００μＬである。
【００８７】
上述の化学発光測定においては、試料中に含まれる目的物質以外の成分の影響を回避する、あるいは目的物質の検出感度を高くする等の目的のために、測定系に界面活性剤、賦活化剤等の、この分野において使用される添加剤を添加してもよい。また、これらの添加剤の添加量としては、この分野において使用される範囲内から適宜設定すればよい。
【００８８】
上述の化学発光測定におけるＬ-０１２またはその塩の発光反応は、通常ｐＨ３〜１２、好ましくはｐＨ５〜１０、より好ましくはｐＨ６．５〜９の条件下で行えばよい。
【００８９】
このようなｐＨに調整するには、測定溶液（発光基質液）等の溶液のｐＨを調整することで行えばよく、例えばＬ-０１２またはその塩、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）、触媒あるいは酸化剤を含有させる緩衝液を用いることでｐＨを調整すればよい。このような緩衝液としては、上述の本発明の安定化方法で挙げた緩衝液の具体例と同様のものが挙げられ、その使用濃度も上述の範囲と同様である。
【００９０】
上述の化学発光測定におけるＬ-０１２またはその塩の発光反応およびそれに続く発光測定は、通常１０〜６０℃、好ましくは１５〜５０℃、より好ましくは２０〜４５℃の温度条件下で行えばよい。
【００９１】
上述の化学発光測定におけるＬ-０１２またはその塩の発光反応およびそれに続く発光測定の時間は、通常１０秒〜３０分、好ましくは３０秒〜２０分、より好ましくは３０秒〜１０分である。
【００９２】
触媒として、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）等の酵素で標識した標識抗原または標識抗体を使用し、抗原抗体反応を行って酵素標識免疫複合体を形成させ、該複合体を上述の化学発光測定に用いる場合において、抗原抗体反応は、上述の化学発光測定におけるＬ-０１２またはその塩の発光反応と同様のｐＨ、温度条件下で行えばよい。
【００９３】
上述の抗原抗体反応の反応時間は、通常１０秒〜１２０分、好ましくは３０秒〜６０分、より好ましくは１〜３０分である。
【００９４】
上述した化学発光測定のなかでも、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識した特定成分に対する抗体（標識抗体）と特定成分とを反応させて特定成分と標識抗体の免疫複合体を生じさせ、次いで、（ＰＯＤが結合している）当該免疫複合体と過酸化水素およびＬ-０１２またはその塩とを反応させて化学発光を生じさせる方法において、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）は、好適に使用される。
【００９５】
一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を用いて、試料中のＢ型肝炎ウイルス表面抗体（以下、ＨＢｓ抗体と略記する場合がある。）を測定する方法を例にとって説明すると、例えば以下のとおりである。
【００９６】
反応容器または／および測光室の反応容器周辺の雰囲気を一定にする機構を備えた適当な自動分析装置に、試料、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（以下、ＨＢｓ抗原と略記する場合がある。）結合磁性粒子を含有する溶液、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識ＨＢｓ抗原含有溶液、Ｌ-０１２またはその塩、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）および増感剤（エンハンサー）として４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾールを含有する溶液（発光基質液）、過酸化水素含有溶液をそれぞれ装填する。次いで機械を始動させて、ＨＢｓ抗体を含有する試料とＨＢｓ抗原結合磁性粒子を含有する溶液とを反応させて、「ＨＢｓ抗原結合磁性粒子−ＨＢｓ抗体」複合体を形成させ、Ｂ／Ｆ分離する。次いで、「ＨＢｓ抗原結合磁性粒子−ＨＢｓ抗体」複合体を含有する溶液に、ＰＯＤ標識ＨＢｓ抗原含有溶液を加えて反応させて、「ＨＢｓ抗原結合磁性粒子−ＨＢｓ抗体−ＰＯＤ標識ＨＢｓ抗原」複合体を形成させ、Ｂ／Ｆ分離する。続いて、Ｂ／Ｆ分離を行った磁性粒子に、発光基質液と過酸化水素含有溶液を添加し、混合後、試料の発光を測定すればよい。
【００９７】
上述した化学発光測定における磁性粒子としては、この分野において使用される磁性粒子であれば特に制限はなく、市販のものを用いてもよいし、公知の方法によって適宜合成したものを用いてもよい。また、該磁性粒子を用いたＨＢｓ抗原結合磁性粒子等の抗原または抗体が結合した磁性粒子の作製は、自体公知の方法に準じて行えばよい。
【００９８】
自動分析装置の代わりに一般の分光測定装置を用いて化学発光測定を行う場合には、用手法で試料と各種試薬等を反応させ、発光反応を生じさせた後、反応容器を、反応容器または／および測光室の反応容器周辺の雰囲気を一定にする機構を備えた分光測定装置にセットして、試料の発光を測定すればよい。
【００９９】
上述した化学発光測定においては、ＨＢｓ抗体の測定系を例に挙げたが、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）とＬ-０１２またはその塩を用いれば、種々の目的物質（測定対象物質）を測定することができる。このような目的物質（測定対象物質）としては、何らかの方法によりそれに対する抗体または抗原を得ることができるものであれば特に制限なく挙げられ、例えば生物学的および臨床的重要性を有する薬剤、代謝物質、ビタミン、殺虫剤、ステロイド、ペプチド、ホルモン、肝炎マーカー、癌マーカー、抗体および血清タンパク等、通常補体免疫測定法で測定可能と考えられる測定対象物質は全て挙げることができる。具体例として、内分泌機能関連物質としては、例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副甲状腺ホルモン（ｉＰＴＨ）、成長ホルモン（ＧＨ）、ソマトメジンＣ（ＩＧＦ-１）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、バソプレッシン、オキシトシン、ソマトスタチン、エンケファリン、β-エンドルフィン、サイロキシン、トリヨードサイロニン、サイログロブリン、抗サイログロブリン抗体、抗Ｔ３抗体、抗Ｔ４抗体、抗ＴＳＨ抗体、カルシトニン、カテコールアミン、ドーパミン、セロトニン、アルドステロン、レニン、アンギオテンシン、コルチゾール、デオキシコルチゾール、コルチゾン、コルチコステロン、デオキシコルチコステロン、アンドロステロン、プロゲステロン、プレグネノロン、エストロゲン、エストロン、エストリオール、エストラジオール、テストステロン、ゴナドトロピン、インシュリン、抗インシュリン抗体、Ｃ-ペプタイド、グルカゴン、ガストリン、セクレチン、サイクリックＡＭＰ、サイクリックＧＭＰ、プロスタグランジン類、トロンボキサン、エリスロポエチン、ヒスタミン等が挙げられ、腫瘍関連物質としては、例えばＣＥＡ、フェリチン、β２-マイクログロブリン、エラスターゼ、α-フェトプロテイン、神経特異エノラーゼ、前立腺特異抗原、ＣＡ１９-９等が挙げられ、薬物、ビタミン関連物質としては、例えばフェノバルビタール、フェニトイン、カルバマゼピン、プリミドン、エトスクシミド、バルプロ酸、アセタゾールアミド、スルチアム、グルテチミド、クロナゼパム、ニトラゼパム、ジアゼパム、ペントバルビタール、セコバルビタール、ブピバカイン、メピバカイン、リドカイン、プロカインアミド、キニジン、ジゴキシン、ジキトキシン、テオフィリン、アミトリプチリン、イミプラミン、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、セファレキシン、スルファメトキサゾール、メトトレキサート、シクロスポリン、メチルプレドニゾロン、サリチル酸、アセトアミノフェン、インドメタシン、アロプリノール、ビタミンＡ、カロチン、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ等が挙げられ、血清または血漿タンパク関連物質としては、例えばアルブミン、α１-マイクログロブリン、α１-アンチトリプシン、α２-マクログロブリン、ハプトグロブリン、ヘモペキシン、トランスフェリン、ミオグロビン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、フィブリノーゲン、ア��チトロンビン、プラスミノーゲン、アンチプラスミン、プロテインＣ、リウマチ因子、抗ＤＮＡ抗体、Ｃ反応性蛋白等が挙げられ、ウイルス、感染症関連物質としては、例えばＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体、ＨＴＬＶ-Ｉ抗体、ＨＴＬＶ-ＩＩＩ抗体、ＴＰＨＡ、各種ウイルス抗原、各種ウイルス抗体等が挙げられる。これらの目的物質（測定対象物質）のなかでも、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副甲状腺ホルモン（ｉＰＴＨ）、アルドステロン、レニン、コルチゾール、ＨＢｓ抗体、ＨＢｃ抗体が好ましい。
【０１００】
化学発光測定におけるこれらの目的物質（測定対象物質）の濃度としては、目的物質（測定対象物質）の種類に応じて、この分野における濃度範囲から適宜選択すればよい。
【０１０１】
以上のように、Ｌ-０１２またはその塩を用いる化学発光測定において、Ｌ-０１２またはその塩に一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を共存させることで、Ｌ-０１２またはその塩を含む測定溶液（発光基質液）を露光させたとしても、Ｌ-０１２またはその塩の発光強度の減少（測定感度の低下）を抑制することができ、なおかつ、Ｌ-０１２またはその塩そのものの発光量には悪影響を及ぼしにくいため、測定時において悪影響を及ぼすことなく、高感度で精度よく目的物質（測定対象物質）を測定できるという効果を奏する。さらに、Ｌ-０１２またはその塩に本発明の安定化剤を共存させれば、Ｌ-０１２またはその塩を含む測定溶液（発光基質液）を遮光する必要がなくなることから、より簡便に測定できるという効果を奏する。
【０１０２】
−本発明の発光測定用キット−
本発明の発光測定用キットは、Ｌ-０１２またはその塩の化学発光を利用する方法に用いられるものであり、上述の発光測定法の具体例から明らかなように、Ｌ-０１２またはその塩の化学発光測定法において用いられる触媒、酸化剤等の自体公知の試薬類と、Ｌ-０１２またはその塩と上述の一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を含むものである。
【０１０３】
本発明の発光測定用キットの具体例としては、例えばＬ-０１２またはその塩、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）および酸化剤を含むキット、例えばＬ-０１２またはその塩、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）および触媒を含むキット、例えばＬ-０１２またはその塩、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）、酸化剤および触媒を含むキット等が挙げられる。
【０１０４】
このような本発明の発光測定用キットの一例を以下に挙げる。
Ａ）Ｌ-０１２またはその塩、Ｂ）一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）およびＣ）過酸化水素を含有する発光測定用キット。
Ａ）Ｌ-０１２またはその塩、Ｂ）一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）およびＤ）ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を含有する発光測定用キット。
Ａ）Ｌ-０１２またはその塩、Ｂ）一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）、Ｃ）過酸化水素およびＤ）ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を含有する発光測定用キット。
【０１０５】
本発明の発光測定用キットに含まれるＬ-０１２またはその塩、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）および試薬類の含有量としては、化学発光測定の際に、Ｌ-０１２またはその塩、一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）および試薬類等の各成分の終濃度および濃度比が、上述した範囲となるように含有させればよい。
【０１０６】
本発明の発光測定用キットには、上述した試薬類のほかに、増感剤（エンハンサー）、賦活化剤、保存剤、安定化剤、防腐剤、界面活性剤等の、この分野において使用される添加剤を含有させてもよい。また、これらの添加剤の含有量としては、この分野において使用される範囲内から適宜設定すればよい。
【０１０７】
このような添加剤等を含む本発明の発光測定用キットとしては、例えば以下のものが挙げられる。
Ａ）Ｌ-０１２またはその塩、Ｂ）一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）、Ｃ）過酸化水素およびＥ）増感剤（エンハンサー）を含有する発光測定用キット。
Ａ）Ｌ-０１２またはその塩、Ｂ）一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）、Ｃ）過酸化水素およびＦ）磁性粒子を含有する発光測定用キット。
Ａ）Ｌ-０１２またはその塩、Ｂ）一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）、Ｃ）過酸化水素、Ｅ）増感剤（エンハンサー）およびＦ）磁性粒子を含有する発光測定用キット。
【０１０８】
上述の本発明の発光測定用キットにおけるキット中の形態としては、溶液状態、凍結状態または凍結乾燥状態のいずれであってもよい。
【実施例】
【０１０９】
以下、実施例および比較例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら限定されない。【０１１０】
−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いた化学発光測定系における試薬の調製および化学発光の測定−
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いた化学発光測定の一般的手法において、試薬の調製、ならびに各種安定化剤または水溶性色素を用いた化学発光の測定方法および評価方法を以下に示す。【０１１１】
−実施例１〜１４および比較例１〜１４−
（１）発光測定用試薬第１液の調製
（ａ）発光測定用試薬第１-Ａ液の調製（実施例１〜１４および比較例１〜１２）
８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン，ナトリウム塩（和光純薬工業（株）製）１５．６ｍｇおよび４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール（和光純薬工業（株）製）３．５ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、表１に示す各種安定化剤または水溶性色素を、化学発光測定時の終濃度が表１に示す所定濃度となるような量を添加し、さらに、２-ヒドロキシ-３-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）／水酸化ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ８．５５）２０ｍＬを添加した後、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第１-Ａ液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。なお、表１に示す安定化剤および水溶性色素は、以下に示す市販のものを用いた。
アゾメチンＨ：和光純薬工業（株）製
ニューコクシン：和光純薬工業（株）製
スルファニル酸アゾクロムトロップ：和光純薬工業（株）製
メタニルイエロー：和光純薬工業（株）製
ポンソーＳ：和光純薬工業（株）製
タートラジン：和光純薬工業（株）製
Ｎ-ベンゾイルＨ酸，１カリウム，１ナトリウム塩：和光純薬工業（株）製
アリザリンイエローＧＧ：東京化成工業（株）製
クレゾールレッド：和光純薬工業（株）製
（ｂ）発光測定用試薬第１-Ｂ液の調製（比較例１３）
８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン，ナトリウム塩（和光純薬工業（株）製）１５．６ｍｇおよび４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール（和光純薬工業（株）製）３．５ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、２-ヒドロキシ-３-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）／水酸化ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ８．５５）２０ｍＬを添加した後、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第１-Ｂ液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
（ｃ）発光測定用試薬第１-Ｃ液の調製（比較例１４）
ルミノール，ナトリウム塩（和光純薬工業（株）製）４０ｍｇおよび４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール（和光純薬工業（株）製）３．５ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、ホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ８．５５）２０ｍＬを添加した後、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第１-Ｃ液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１１２】
（２）ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）緩衝液の調製
西洋ワサビ由来ＰＯＤ（ロシュ・ダイアグノスティックス（株）製）を０．０２μｇ／ｍＬとなるように５０ｍＭの２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて希釈調製し、ＰＯＤ緩衝液を得た。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１１３】
（３）発光測定用試薬第２液の調製
過酸化水素水（和光純薬工業（株）製、試薬特級、濃度３０重量％）６７μＬを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第２液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１１４】
（４）化学発光の測定
得られた各試薬を用いて、以下に示す測定方法により、実施例１〜１４および比較例１〜１４にかかる発光測定用試薬第１液に基づいて発光量（平均値）を測定し、各種安定化剤または水溶性色素の光安定化効果およびＬ-０１２（のナトリウム塩）の発光強度に対する影響の有無を評価した。
先ず、（１）で得られた発光測定用試薬第１液（１-Ａ液、１-Ｂ液、１-Ｃ液）を１ｍＬずつ５ｍＬの試験管２つにそれぞれ移し、一方については４３０〜４５０Ｌｘの蛍光灯の光に３０分間晒し（露光発光測定用試薬第１液）、他方については試験管をアルミホイルで覆うことにより遮光した（遮光発光測定用試薬第１液）。
次いで、ＰＯＤ緩衝液５０μＬに、露光発光測定用試薬第１液（１-Ａ液、１-Ｂ液、１-Ｃ液）または遮光発光測定用試薬第１液（１-Ａ液、１-Ｂ液、１-Ｃ液）をそれぞれ１００μＬと、発光測定用試薬第２液１００μＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、発光測定用試薬第１液および第２液を同時に添加してから、４３〜４５秒間での平均発光量を発光検出器（Lumat LB9507：ベルトールドジャパン製）で測定した。【０１１５】
（５）結果
得られた結果から、以下に示すように「安定化剤または水溶性色素の光安定化効果」および「ルミノールに対する相対感度」を算出し、各種安定化剤または水溶性色素の評価を行った。結果を表１にそれぞれ示す。
〈安定化剤または水溶性色素の光安定化効果〉
それぞれの発光測定用試薬第１液について、遮光発光測定用試薬第１液での平均発光量（遮光発光量）に対する露光発光測定用試薬第１液での平均発光量（露光発光量）の割合〔露光発光量／遮光発光量×１００％＝発光量比〕を算出した。この発光量比に基づいて、各種安定化剤または水溶性色素の光安定化効果を評価した。
すなわち、発光量比が１００％に近いほど、各種安定化剤または水溶性色素のＬ-０１２（のナトリウム塩）に対する光安定化効果が高いことを意味し、安定化剤または水溶性色素を添加していない発光測定用試薬第１-Ｂ液を用いた場合における発光量比が６４％であったことから、７０％以上の発光量比を示した発光測定用試薬第１-Ａ液に含まれる安定化剤または水溶性色素を、光安定化効果が高く、露光時における測定感度の低下を抑制できる安定化剤または水溶性色素と評価した。
〈ルミノールに対する相対感度〉
それぞれの発光測定用試薬第１-Ａ液および１-Ｂ液について、各発光測定用試薬第１-Ａ液または１-Ｂ液での遮光発光量（Ｌ-０１２発光量）に対する発光測定用試薬第１-Ｃ液での遮光発光量（ルミノール発光量）の割合〔Ｌ-０１２発光量／ルミノール発光量×１００％＝相対感度〕を算出した。この相対感度に基づいて、各種安定化剤または水溶性色素の測定感度を評価した。
すなわち、ルミノール発光量（１２７，４００ｃｐｓ）よりも高いＬ-０１２発光量を示した発光測定用試薬第１-Ａ液は、測定感度が高く、ルミノール発光を利用した発光測定よりも、高感度での測定を可能にする試薬（Ｌ-０１２発光試薬）と評価した。換言すれば、１００％以上の相対感度を示した発光測定用試薬第１-Ａ液に含まれる安定化剤または水溶性色素は、Ｌ-０１２の発光強度に対して悪影響を及ぼすことなく、高感度測定が可能な安定化剤または水溶性色素であると評価した。【０１１６】
【表１】
2017069192.tif 000035
【０１１７】
表１の結果から、本発明の安定化剤である、アゾメチンＨ、ニューコクシン、スルファニル酸アゾクロムトロップ、メタニルイエロー、ポンソーＳおよびタートラジンのみが、露光による測定感度の低下を抑制できる効果（光安定化効果）と、Ｌ-０１２（のナトリウム塩）の発光強度に対する影響が少なく、高感度測定が可能であるという効果の両方を有していることがわかった。【０１１８】
−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いた活性型レニン測定系における試薬の調製および活性型レニンの測定−
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いた活性型レニンの測定系において、試薬の調製、ならびに各種安定化剤または水溶性色素を用いた活性型レニンの測定方法および評価方法を以下に示す。【０１１９】
−実施例１５〜２７および比較例１５〜２８−
（１）発光測定用試薬第１液の調製
（ａ）発光測定用試薬第１-Ａ液の調製（実施例１５〜２７および比較例１５〜２６）
８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン，ナトリウム塩（和光純薬工業（株）製）１５．６ｍｇおよび４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール（和光純薬工業（株）製）３．５ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、表２に示す各種安定化剤または水溶性色素を、化学発光測定時の終濃度が表２に示す所定濃度となるような量を添加し、さらに、２-ヒドロキシ-３-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）／水酸化ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ８．５５）２０ｍＬを添加した後、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第１-Ａ液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
（ｂ）発光測定用試薬第１-Ｂ液の調製（比較例２７）
８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン，ナトリウム塩（和光純薬工業（株）製）１５．６ｍｇおよび４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール（和光純薬工業（株）製）３．５ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、２-ヒドロキシ-３-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）／水酸化ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ８．５５）２０ｍＬを添加した後、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第１-Ｂ液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
（ｃ）発光測定用試薬第１-Ｃ液の調製（比較例２８）
ルミノール，ナトリウム塩（和光純薬工業（株）製）４０ｍｇおよび４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール（和光純薬工業（株）製）３．５ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、ホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ８．５５）２０ｍＬを添加した後、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第１-Ｃ液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１２０】
（２）磁性粒子を含有する試薬（抗レニンモノクローナル抗体（マウス）結合磁性粒子試薬）の調製
９７重量％３-アミノプロピルトリエトキシシラン含有エタノール溶液５０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に磁性粒子（ＷＯ２０１２／１７３００２号公報に記載の製造例１に準じて作製）１２．５ｍＬを加え、２５℃で１時間反応させた後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去した。次いで、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．１）５０ｍＬを加えて蓋をし、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去して磁性粒子を洗浄した。この洗浄操作を４回行った。
この洗浄後の磁性粒子を、０．５重量％無水コハク酸エタノール溶液５０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で２時間反応させた。反応後、１００ｍＭの２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍＬを加えて蓋をし、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去して磁性粒子を洗浄した。この洗浄操作を４回行った。
さらに、この洗浄後の磁性粒子を、抗レニンモノクローナル抗体（マウス）（（株）ＩＴＭ製）を２００μｇ／ｍＬの濃度で含む１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、１１℃で１５〜２５時間反応させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、ＭＥＳ緩衝液で洗浄した後、ブロッキング液｛０．５％ブロックエース（雪印乳業（株）製）を含む５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）｝を加え、１１℃で１５時間反応させることにより、抗レニンモノクローナル抗体（マウス）結合磁性粒子を作製した。これを、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で、抗レニンモノクローナル抗体結合磁性粒子濃度として０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように希釈し、抗体結合磁性粒子を含有する試薬（抗レニンモノクローナル抗体（マウス）結合磁性粒子試薬）を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１２１】
（３）免疫反応用緩衝液の調製
５０ｍＭの３-（Ｎ-モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）を調製し、免疫反応用緩衝液を得た。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１２２】
（４）酵素標識試薬（ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗レニンモノクローナル抗体（マウス）試薬）の調製
抗レニンモノクローナル抗体（マウス）（（株）ＩＴＭ製）、西洋ワサビ由来ＰＯＤ（ロシュ・ダイアグノスティックス（株）製）を用い、文献（S. YOSHITAKE, M. IMAGAWA, E. ISHIKAWA, H. OGAWA; J Biochem (1982) Vol. 92, (5): 1413-1424）に記載の方法でＰＯＤ標識抗レニンモノクローナル抗体（マウス）を調製した。これを、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）で、ＰＯＤ標識抗レニンモノクローナル抗体濃度として１．０ｍＬ／Ｌの濃度となるように希釈し、酵素標識試薬（ＰＯＤ標識抗レニンモノクローナル抗体（マウス）試薬）を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１２３】
（５）発光測定用試薬第２液の調製
過酸化水素水（和光純薬工業（株）製、試薬特級、濃度３０重量％）６７μＬを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第２液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１２４】
（６）化学発光の測定
得られた各試薬を用いて、以下に示す測定方法により、実施例１５〜２７および比較例１５〜２８にかかる発光測定用試薬第１液に基づいて発光量（平均値）を測定し、各種安定化剤または水溶性色素の光安定化効果およびＬ-０１２（のナトリウム塩）の発光強度に対する影響の有無を評価した。
先ず、（１）で得られた発光測定用試薬第１液のうち、第１-Ａ液および第１-Ｂ液については、それぞれ１ｍＬずつ５ｍＬの試験管２つにそれぞれ移し、一方については４３０〜４５０Ｌｘの蛍光灯の光に３０分間晒し（露光発光測定用試薬第１液）、他方については試験管をアルミホイルで覆うことにより遮光した（遮光発光測定用試薬第１液）。第１-Ｃ液については、その１ｍＬを５ｍＬの試験管１つに移し、試験管をアルミホイルで覆うことにより遮光した（遮光発光測定用試薬第１液）。
次いで、抗体結合磁性粒子を含有する試薬（抗レニンモノクローナル抗体（マウス）結合磁性粒子試薬）１０〜５０μｇ、１％の牛血清アルブミン含有の１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で調製したレニン濃度が２５ｐｇ／ｍＬの標準レニン溶液２５μＬ、および免疫反応用緩衝液５０μＬを試験管に加えて混合し、３７℃で３分間反応させて、「抗レニンモノクローナル抗体（マウス）結合磁性粒子−レニン」複合体を形成させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去した後、生理食塩水１００μＬを加え、磁性粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液体を吸引除去する洗浄操作を３回行った。
続いて、酵素標識試薬（ＰＯＤ標識抗レニンモノクローナル抗体（マウス）試薬）５０μＬを試験管に加え、３７℃で３分間反応させて、「抗レニンモノクローナル抗体（マウス）結合磁性粒子−レニン−ＰＯＤ標識抗レニンモノクローナル抗体（マウス）」複合体を形成させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去した後、生理食塩水１００μＬを加え、磁性粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液体を吸引除去する洗浄操作を２回行った。
最後に、露光発光測定用試薬第１液（１-Ａ液、１-Ｂ液）または遮光発光測定用試薬第１液（１-Ａ液、１-Ｂ液、１-Ｃ液）をそれぞれ１００μＬと、発光測定用試薬第２液１００μＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、発光測定用試薬第１液および第２液を同時に添加してから、４３〜４５秒間での平均発光量を発光検出器（Lumat LB9507：ベルトールドジャパン製）で測定した。【０１２５】
（７）結果
得られた結果から、以下に示すように「安定化剤または水溶性色素の光安定化効果」および「ルミノールに対する相対感度」を算出し、各種安定化剤または水溶性色素の評価を行った。結果を表２にそれぞれ示す。
〈安定化剤または水溶性色素の光安定化効果〉
それぞれの発光測定用試薬第１液について、遮光発光測定用試薬第１液での平均発光量（遮光発光量）に対する露光発光測定用試薬第１液での平均発光量（露光発光量）の割合〔露光発光量／遮光発光量×１００％＝発光量比〕を算出した。この発光量比に基づいて、各種安定化剤または水溶性色素の光安定化効果を評価した。
すなわち、発光量比が１００％に近いほど、各種安定化剤または水溶性色素のＬ-０１２（のナトリウム塩）に対する光安定化効果が高いことを意味し、安定化剤または水溶性色素を添加していない発光測定用試薬第１-Ｂ液を用いた場合における発光量比が７５％であったことから、８０％以上の発光量比を示した発光測定用試薬第１-Ａ液に含まれる安定化剤または水溶性色素を、光安定化効果が高く、露光時における測定感度の低下を抑制できる安定化剤または水溶性色素と評価した。
〈ルミノールに対する相対感度〉
それぞれの発光測定用試薬第１-Ａ液および１-Ｂ液について、各発光測定用試薬第１-Ａ液または１-Ｂ液での遮光発光量（Ｌ-０１２発光量）に対する発光測定用試薬第１-Ｃ液での遮光発光量（ルミノール発光量）の割合〔Ｌ-０１２発光量／ルミノール発光量×１００％＝相対感度〕を算出した。この相対感度に基づいて、各種安定化剤または水溶性色素の測定感度を評価した。
すなわち、ルミノール発光量（６４５，９３８ｃｐｓ）よりも高いＬ-０１２発光量を示した発光測定用試薬第１-Ａ液は、測定感度が高く、ルミノール発光を利用した発光測定よりも、高感度での測定を可能にする試薬（Ｌ-０１２発光試薬）と評価した。換言すれば、１００％以上の相対感度を示した発光測定用試薬第１-Ａ液に含まれる安定化剤または水溶性色素は、Ｌ-０１２の発光強度に対して悪影響を及ぼすことなく、高感度測定が可能な安定化剤または水溶性色素であると評価した。【０１２６】
【表２】
2017069192.tif 000036
【０１２７】
表２の結果から、本発明の安定化剤である、アゾメチンＨ、ニューコクシンおよびタートラジンは、露光による測定感度の低下を抑制できる効果（光安定化効果）と、Ｌ-０１２（のナトリウム塩）の発光強度に対する影響が少なく、高感度測定が可能であるという効果の両方を有していることがわかった。【０１２８】
−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いたＨＢｓ抗体測定系における試薬の調製およびＨＢｓ抗体の測定−
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いたＨＢｓ抗体の測定系において、試薬の調製、ならびに各種安定化剤または水溶性色素を用いたＨＢｓ抗体の測定方法および評価方法を以下に示す。【０１２９】
−実施例２８〜４３および比較例２９〜３０−
（１）発光測定用試薬第１液の調製
（ａ）発光測定用試薬第１-Ａ液の調製（実施例２８〜４３）
８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン，ナトリウム塩（和光純薬工業（株）製）１５．６ｍｇおよび４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール（和光純薬工業（株）製）３．５ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、表３に示す各種安定化剤または水溶性色素を、化学発光測定時の終濃度が表３に示す所定濃度となるような量を添加し、さらに、２-ヒドロキシ-３-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）／水酸化ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ８．５５）２０ｍＬを添加した後、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第１-Ａ液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
（ｂ）発光測定用試薬第１-Ｂ液の調製（比較例２９）
８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン，ナトリウム塩（和光純薬工業（株）製）１５．６ｍｇおよび４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール（和光純薬工業（株）製）３．５ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、２-ヒドロキシ-３-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）／水酸化ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ８．５５）２０ｍＬを添加した後、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第１-Ｂ液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
（ｃ）発光測定用試薬第１-Ｃ液の調製（比較例３０）
ルミノール，ナトリウム塩（和光純薬工業（株）製）４０ｍｇおよび４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール（和光純薬工業（株）製）３．５ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、ホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ８．５５）２０ｍＬを添加した後、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第１-Ｃ液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１３０】
（２）磁性粒子を含有する試薬（ＨＢｓ抗原結合磁性粒子試薬）の調製
９７重量％３-アミノプロピルトリエトキシシラン含有エタノール溶液５０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に磁性粒子（ＷＯ２０１２／１７３００２号公報に記載の製造例１に準じて作製）１２．５ｍＬを加え、２５℃で１時間反応させた後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去した。次いで、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．１）５０ｍＬを加えて蓋をし、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去して磁性粒子を洗浄した。この洗浄操作を４回行った。
この洗浄後の磁性粒子を、２５重量％グルタルアルデヒド１ｍＬ／炭酸水素ナトリウム緩衝液９ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、蒸留水を加えて蓋をし、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去して磁性粒子を洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
さらに、この洗浄後の磁性粒子を、ＨＢｓ抗原（TRINA BIOREACTIVES AG製）を２．２４ｍｇ／ｍＬの濃度で含む１５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）８ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で２時間反応させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、生理食塩水で洗浄した後、ブロッキング液｛０．５％ブロックエースを含む５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）｝を加え、３７℃で１５〜２５時間反応させることにより、ＨＢｓ抗原結合磁性粒子を作製した。これを、ブロックエース（雪印乳業（株）製）０．５％を含む５０ｍＭの３-（Ｎ-モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液（ｐＨ７．５）で、ＨＢｓ抗原結合磁性粒子濃度として０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように希釈し、抗原結合磁性粒子を含有する試薬（ＨＢｓ抗原結合磁性粒子試薬）を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１３１】
（３）酵素標識試薬（ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識ＨＢｓ抗原試薬）の調製
ＨＢｓ抗原（TRINA BIOREACTIVES AG製）、西洋ワサビ由来ＰＯＤ（ロシュ・ダイアグノスティックス（株）製）を用い、文献（S. YOSHITAKE, M. IMAGAWA, E. ISHIKAWA, H. OGAWA; J Biochem (1982) Vol. 92, (5): 1413-1424）に記載の方法でＰＯＤ標識ＨＢｓ抗原を調製した。これを、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）で、ＰＯＤ標識ＨＢｓ抗原濃度として１．０ｍＬ／Ｌの濃度となるように希釈し、酵素標識試薬（ＰＯＤ標識ＨＢｓ抗原試薬）を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１３２】
（４）発光測定用試薬第２液の調製
過酸化水素水（和光純薬工業（株）製、試薬特級、濃度３０重量％）６７μＬを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第２液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１３３】
（５）化学発光の測定
得られた各試薬を用いて、以下に示す測定方法により、実施例２８〜４３および比較例２９〜３０にかかる発光測定用試薬第１液に基づいて発光量（平均値）を測定し、各種安定化剤または水溶性色素の光安定化効果およびＬ-０１２（のナトリウム塩）の発光強度に対する影響の有無を評価した。
先ず、（１）で得られた発光測定用試薬第１液（１-Ａ液、１-Ｂ液、１-Ｃ液）を１ｍＬずつ５ｍＬの試験管２つにそれぞれ移し、一方については４３０〜４５０Ｌｘの蛍光灯の光に３０分間晒し（露光発光測定用試薬第１液）、他方については試験管をアルミホイルで覆うことにより遮光した（遮光発光測定用試薬第１液）。
次いで、抗原結合磁性粒子を含有する試薬（ＨＢｓ抗原結合磁性粒子試薬）１０〜５０μｇ、および２％の牛血清アルブミン含有の５０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で調製したＨＢｓ抗体濃度が２５０ｍＩＵ／ｍＬの標準ＨＢｓ抗体溶液２５μＬを試験管に加えて混合し、３７℃で３分間反応させて、「ＨＢｓ抗原結合磁性粒子−ＨＢｓ抗体」複合体を形成させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去した後、生理食塩水１００μＬを加え、磁性粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液体を吸引除去する洗浄操作を３回行った。
続いて、酵素標識試薬（ＰＯＤ標識ＨＢｓ抗原試薬）５０μＬを試験管に加え、３７℃で３分間反応させて、「ＨＢｓ抗原結合磁性粒子−ＨＢｓ抗体−ＰＯＤ標識ＨＢｓ抗原」複合体を形成させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去した後、生理食塩水１００μＬを加え、磁性粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液体を吸引除去する洗浄操作を２回行った。
最後に、露光発光測定用試薬第１液（１-Ａ液、１-Ｂ液、１-Ｃ液）または遮光発光測定用試薬第１液（１-Ａ液、１-Ｂ液、１-Ｃ液）をそれぞれ１００μＬと、発光測定用試薬第２液１００μＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、発光測定用試薬第１液および第２液を同時に添加してから、４３〜４５秒間での平均発光量を発光検出器（Lumat LB9507：ベルトールドジャパン製）で測定した。【０１３４】
（６）結果
得られた結果から、以下に示すように「安定化剤または水溶性色素の光安定化効果」および「ルミノールに対する相対感度」を算出し、各種安定化剤または水溶性色素の評価を行った。結果を表３にそれぞれ示す。
〈安定化剤または水溶性色素の光安定化効果〉
それぞれの発光測定用試薬第１液について、遮光発光測定用試薬第１液での平均発光量（遮光発光量）に対する露光発光測定用試薬第１液での平均発光量（露光発光量）の割合〔露光発光量／遮光発光量×１００％＝発光量比〕を算出した。この発光量比に基づいて、各種安定化剤または水溶性色素の光安定化効果を評価した。
すなわち、発光量比が１００％に近いほど、各種安定化剤または水溶性色素のＬ-０１２（のナトリウム塩）に対する光安定化効果が高いことを意味し、安定化剤または水溶性色素を添加していない発光測定用試薬第１-Ｂ液を用いた場合における発光量比が６７％であったことから、７２％以上の発光量比を示した発光測定用試薬第１-Ａ液に含まれる安定化剤または水溶性色素を、光安定化効果が高く、露光時における測定感度の低下を抑制できる安定化剤または水溶性色素と評価した。
〈ルミノールに対する相対感度〉
それぞれの発光測定用試薬第１-Ａ液および１-Ｂ液について、各発光測定用試薬第１-Ａ液または１-Ｂ液での遮光発光量（Ｌ-０１２発光量）に対する発光測定用試薬第１-Ｃ液での遮光発光量（ルミノール発光量）の割合〔Ｌ-０１２発光量／ルミノール発光量×１００％＝相対感度〕を算出した。この相対感度に基づいて、各種安定化剤または水溶性色素の測定感度を評価した。
すなわち、ルミノール発光量（３２１，４８２ｃｐｓ）よりも高いＬ-０１２発光量を示した発光測定用試薬第１-Ａ液は、測定感度が高く、ルミノール発光を利用した発光測定よりも、高感度での測定を可能にする試薬（Ｌ-０１２発光試薬）と評価した。換言すれば、１００％以上の相対感度を示した発光測定用試薬第１-Ａ液に含まれる安定化剤または水溶性色素は、Ｌ-０１２の発光強度に対して悪影響を及ぼすことなく、高感度測定が可能な安定化剤または水溶性色素であると評価した。【０１３５】
【表３】
2017069192.tif 000037
【０１３６】
表３の結果から、本発明の安定化剤である、アゾメチンＨ、ニューコクシン、スルファニル酸アゾクロムトロップ、メタニルイエロー、ポンソーＳおよびタートラジンのいずれにおいても、露光による測定感度の低下を抑制できる効果（光安定化効果）と、Ｌ-０１２（のナトリウム塩）の発光強度に対する影響が少なく、高感度測定が可能であるという効果の両方を有していることがわかった。【０１３７】
−ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いたアルドステロン測定系における試薬の調製およびアルドステロンの測定−
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を用いたアルドステロンの測定系において、試薬の調製、ならびに各種安定化剤または水溶性色素を用いたアルドステロンの測定方法および評価方法を以下に示す。【０１３８】
−実施例４４〜４７および比較例３１〜３６−
（１）発光測定用試薬第１液の調製
（ａ）発光測定用試薬第１-Ａ液の調製（実施例４４〜４７）
８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン，ナトリウム塩（和光純薬工業（株）製）１５．６ｍｇおよび４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール（和光純薬工業（株）製）３．５ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、アゾメチンＨを、化学発光測定時の終濃度が表４に示す所定濃度となるような量を添加し、さらに、３-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）／水酸化ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ８．０）２０ｍＬを添加した後、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第１-Ａ液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
（ｂ）発光測定用試薬第１-Ｂ液の調製（比較例３１〜３３）
８-アミノ-５-クロロ-７-フェニルピリド［３，４-ｄ］ピリダジン-１，４（２Ｈ，３Ｈ）-ジオン，ナトリウム塩（和光純薬工業（株）製）１５．６ｍｇおよび４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール（和光純薬工業（株）製）３．５ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、３-［４-（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジニル］プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）／水酸化ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ８．０）２０ｍＬを添加した後、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第１-Ｂ液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
（ｃ）発光測定用試薬第１-Ｃ液の調製（比較例３４〜３６）
ルミノール，ナトリウム塩（和光純薬工業（株）製）４０ｍｇおよび４-（４-ヒドロキシフェニル）チアゾール（和光純薬工業（株）製）３．５ｍｇを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、ホウ酸／水酸化ナトリウム緩衝液（２５０ｍＭ、ｐＨ８．５５）２０ｍＬを添加した後、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第１-Ｃ液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１３９】
（２）磁性粒子を含有する試薬（抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ヤギ）結合磁性粒子試薬）の調製
９７重量％３-アミノプロピルトリエトキシシラン含有エタノール溶液８０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に磁性粒子（ＷＯ２０１２／１７３００２号公報に記載の製造例１に準じて作製）２０ｍＬを加え、２５℃で１時間反応させた後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去した。次いで、１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．１）８０ｍＬを加えて蓋をし、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去して磁性粒子を洗浄した。この洗浄操作を４回行った。
この洗浄後の磁性粒子を、０．５重量％無水コハク酸エタノール溶液８０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で２時間反応させた。反応後、１００ｍＭの２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ５．０）８０ｍＬを加えて蓋をし、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去して磁性粒子を洗浄した。この洗浄操作を４回行った。
さらに、この洗浄後の磁性粒子を、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ヤギ）（Jackson ImmunoResearch製）を１００μｇ／ｍＬの濃度で含む１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．０）８０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１５〜２５時間反応させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、ＭＥＳ緩衝液で洗浄した後、０．０３％グルタルアルデヒド水溶液８ｍＬを加えて、２５℃で２時間反応させた。次いで、水素化ホウ素ナトリウム１９．２ｍｇを加えて、２５℃で３０分反応させた後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、ＭＥＳ緩衝液で洗浄した後、ブロッキング液｛０．５％ブロックエース（雪印乳業（株）製）を含む５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）｝を加え、２５℃で１５〜２５時間反応させることにより、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ヤギ）結合磁性粒子を作製した。さらに、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、ブロッキング液をアスピレーターで吸引除去した後、これを、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で、抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体結合磁性粒子濃度として０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように希釈し、抗体結合磁性粒子を含有する試薬（抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ヤギ）結合磁性粒子試薬）を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１４０】
（３）免疫反応用緩衝液（抗アルドステロンモノクローナル抗体（マウス）含有緩衝液）の調製
２００ｍＭのＮ-［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ８．２）１００ｍＬに、抗アルドステロンモノクローナル抗体（マウス）（（株）ＩＴＭ製）０．１ｍＬを添加した後、２５℃で５分間攪拌することにより、抗アルドステロンモノクローナル抗体（マウス）を１ｍＬ／Ｌの濃度で含む２００ｍＭのＮ-［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン緩衝液（ｐＨ８．２）を調製し、免疫反応用緩衝液を得た。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１４１】
（４）酵素標識試薬（ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識アルドステロン抗原試薬）の調製
アルドステロン抗原（SIGMA ALDRICH製）、西洋ワサビ由来ＰＯＤ（ロシュ・ダイアグノスティックス（株）製）を用い、文献（S. YOSHITAKE, M. IMAGAWA, E. ISHIKAWA, H. OGAWA; J Biochem (1982) Vol. 92, (5): 1413-1424）に記載の方法でＰＯＤ標識アルドステロン抗原を調製した。これを、５０ｍＭのＮ-（２-アセトアミド）-２-アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．２）で、ＰＯＤ標識アルドステロン抗原濃度として１．０ｍＬ／Ｌの濃度となるように希釈し、酵素標識試薬（ＰＯＤ標識アルドステロン抗原試薬）を調製し、測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１４２】
（５）発光測定用試薬第２液の調製
過酸化水素水（和光純薬工業（株）製、試薬特級、濃度３０重量％）６７μＬを１００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。次いで、蒸留水を用いて溶液の容量を１００ｍＬにメスアップし、２５℃で均一に混合して発光測定用試薬第２液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）で保存した。【０１４３】
（６）化学発光の測定
得られた各試薬を用いて、以下に示す測定方法により、実施例４４〜４７および比較例３１〜３６にかかる発光測定用試薬第１液に基づいて発光量（平均値）を測定し、アゾメチンＨの光安定化効果およびＬ-０１２（のナトリウム塩）の発光強度に対する影響の有無を評価した。
先ず、（１）で得られた発光測定用試薬第１液のうち、第１-Ａ液および第１-Ｂ液については、それぞれ１ｍＬずつ５ｍＬの試験管２つにそれぞれ移し、一方については４３０〜４５０Ｌｘの蛍光灯の光に３０分間晒し（露光発光測定用試薬第１液）、他方については試験管をアルミホイルで覆うことにより遮光した（遮光発光測定用試薬第１液）。第１-Ｃ液については、その１ｍＬを５ｍＬの試験管１つに移し、試験管をアルミホイルで覆うことにより遮光した（遮光発光測定用試薬第１液）。
次いで、抗体結合磁性粒子を含有する試薬（抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ヤギ）結合磁性粒子試薬）１０〜５０μｇ、１％の牛血清アルブミン含有の１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で調製したアルドステロン濃度が０〜８００ｐｇ／ｍＬの標準アルドステロン溶液２５μＬ、および免疫反応用緩衝液５０μＬを試験管に加えて混合し、３７℃で３分間反応させた後、さらに、酵素標識試薬（ＰＯＤ標識アルドステロン抗原試薬）５０μＬを試験管に加え、３７℃で３分間反応させて、「抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ヤギ）結合磁性粒子−抗アルドステロンモノクローナル抗体（マウス）−ＰＯＤ標識アルドステロン抗原」複合体を形成させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性粒子を集磁し、液体をアスピレーターで吸引除去した後、生理食塩水１００μＬを加え、磁性粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液体を吸引除去する洗浄操作を２回行った。
最後に、露光発光測定用試薬第１液（１-Ａ液、１-Ｂ液）または遮光発光測定用試薬第１液（１-Ａ液、１-Ｂ液、１-Ｃ液）をそれぞれ１００μＬと、発光測定用試薬第２液１００μＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、発光測定用試薬第１液および第２液を同時に添加してから、４３〜４５秒間での平均発光量を発光検出器（Lumat LB9507：ベルトールドジャパン製）で測定した。【０１４４】
（７）結果
得られた結果から、以下に示すように「アゾメチンＨ（安定化剤）の光安定化効果」および「ルミノールに対する相対感度」を算出し、アゾメチンＨ（安定化剤）の評価を行った。結果を表４にそれぞれ示す。
〈アゾメチンＨ（安定化剤）の光安定化効果〉
それぞれの発光測定用試薬第１液について、遮光発光測定用試薬第１液での平均発光量（遮光発光量）に対する露光発光測定用試薬第１液での平均発光量（露光発光量）の割合〔露光発光量／遮光発光量×１００％＝発光量比〕を算出した。この発光量比に基づいて、アゾメチンＨ（安定化剤）の光安定化効果を評価した。
すなわち、発光量比が１００％に近いほど、アゾメチンＨ（安定化剤）のＬ-０１２（のナトリウム塩）に対する光安定化効果が高いことを意味し、表４に示す各アルドステロン濃度において、アゾメチンＨ（安定化剤）を添加していない発光測定用試薬第１-Ｂ液を用いた場合における発光量比よりも高い発光量比を示すか否かを判定し、アルドステロンの濃度範囲と光安定化効果との関係を評価した。
〈ルミノールに対する相対感度〉
それぞれの発光測定用試薬第１-Ａ液および１-Ｂ液について、各発光測定用試薬第１-Ａ液または１-Ｂ液での遮光発光量（Ｌ-０１２発光量）に対する発光測定用試薬第１-Ｃ液での遮光発光量（ルミノール発光量）の割合〔Ｌ-０１２発光量／ルミノール発光量×１００％＝相対感度〕を算出した。この相対感度に基づいて、アゾメチンＨ（安定化剤）の測定感度を評価した。
すなわち、表４に示す各アルドステロン濃度において、ルミノール発光量よりも高いＬ-０１２発光量を示すか否かを判定し、アルドステロンの濃度範囲と測定感度との関係を評価した。【０１４５】
【表４】
2017069192.tif 000038
【０１４６】
表４の結果から、本発明の安定化剤であるアゾメチンＨは、アルドステロンの濃度が０〜８００ｐｇ／ｍＬと、幅広い濃度範囲において、露光による測定感度の低下を抑制できる効果（光安定化効果）と、Ｌ-０１２（のナトリウム塩）の発光強度に対する影響が少なく、高感度測定が可能であるという効果の両方を有していることから、本発明の安定化剤は、目的物質（測定対象物質）の濃度によらず、光安定化効果と高感度測定が可能であるという効果の両方を有していることがわかった。【０１４７】
表１〜表４の結果から、本発明の安定化剤である、アゾメチンＨ、ニューコクシン、スルファニル酸アゾクロムトロップ、メタニルイエロー、ポンソーＳおよびタートラジンのいずれをＬ-０１２またはその塩の安定化剤として用いた場合でも、安定化剤を用いない場合と比べて、高い発光量比を示すことから、本発明の安定化剤は、露光によるＬ-０１２またはその塩の劣化（分解）を抑制している（光安定化効果を有する）ことがわかった。故に、化学発光測定において、Ｌ-０１２またはその塩を含む測定溶液（発光基質液）に本発明の安定化剤を共存させれば、露光による測定感度の低下を抑制できるため、Ｌ-０１２またはその塩を含む測定溶液（発光基質液）を遮光する必要がなくなり、より簡便に測定に供することができるのである。さらに、本発明の安定化剤は、Ｌ-０１２またはその塩そのものの発光量には、悪影響を及ぼしにくく、ルミノール発光を利用した発光測定に比べて、高感度での測定が可能であることがわかった。故に、化学発光測定において、Ｌ-０１２またはその塩を含む測定溶液（発光基質液）に本発明の安定化剤を共存させれば、測定に悪影響を及ぼすことなく、高感度で精度よく目的物質（測定対象物質）を測定できるのである。また、これらの安定化剤のなかでも、アゾメチンＨおよびニューコクシンは、概して光安定化効果が高く、測定系によらず高感度で精度よく目的物質（測定対象物質）を測定できることがわかった。その一方で、Ｎ-ベンゾイルＨ酸，１カリウム，１ナトリウム塩、アリザリンイエローＧＧおよびクレゾールレッド等の水溶性色素は、光安定化効果が得られないか、あるいは測定に悪影響を及ぼしてしまい、目的物質（測定対象物質）を精度よく測定できないことがわかった。上述したような効果は、安定化剤の極大吸収波長と相関しないことを考慮すると、安定化剤の構造と関係があるものと示唆される。【０１４８】
以上のことから、本発明の安定化剤のみが、Ｌ-０１２またはその塩の安定化効果と測定に悪影響を及ぼさないという効果の両方を有していることがわかった。故に、化学発光測定において、Ｌ-０１２またはその塩を含む測定溶液（発光基質液）に本発明の安定化剤を共存させれば、生体中の種々の目的物質（測定対象物質）を高感度で精度よく、なおかつ、簡便に測定できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明の一般式［１］で示される安定化剤は、化学発光物質であるＬ-０１２またはその塩の露光による分解（劣化）を抑制できる化合物であり、化学発光測定において、Ｌ-０１２またはその塩に本発明の安定化剤を共存させることで、露光によるＬ-０１２またはその塩の分解（劣化）を抑制してＬ-０１２またはその塩を長期間安定化し、ひいてはＬ-０１２またはその塩の発光強度の減少（測定感度の低下）を抑制できるものである。【０１５０】
また、本発明の組成物および本発明の発光測定用キットは、Ｌ-０１２またはその塩と、上述の一般式［１］で示される化合物（本発明の安定化剤）を含むものであり、該組成物または該キットの製造過程やその使用時（測定時）において、露光によるＬ-０１２またはその塩の発光強度の減少（測定感度の低下）が抑制されており、なおかつ、Ｌ-０１２またはその塩そのものの発光量には悪影響を及ぼしにくいため、例えば化学発光測定においてこれを用いれば、生体中の目的物質（測定対象物質）を高感度で精度よく、かつ簡便に測定することができるものである。
【国際調査報告】
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