(57)【要約】  本発明は、ＮＡＳＨの検出の指標（特に、ＮＡＳＨとＮＡＦＬを区別する指標）となる新規のマーカー、該マーカーを用いたＮＡＳＨの検出方法、さらに該マーカーによりＮＡＳＨを検出するためのキットを提供する。具体的には、該マーカーはα１‐アンチトリプシンに結合している糖鎖Ａ３Ｆである。
2017126514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料における、α１‐アンチトリプシンに結合している式（Ｉ）：
【化１】
2017126514.tif 000012
で示される構造を含むフコシル化糖鎖の量を測定することを特徴とする、非アルコール性脂肪肝炎の検出方法。
【請求項２】
非アルコール性脂肪肝炎に罹患していない被検体由来の対照試料における量と比較して、被検試料における量が多いことを、該被検試料が非アルコール性脂肪肝炎に罹患している被検体由来の試料であることの指標とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該非アルコール性脂肪肝炎に罹患していない被検体が、非アルコール性脂肪肝に罹患している被検体である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
被検試料が、非アルコール性脂肪性肝疾患に罹患している被検体由来である、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
該被検試料が血液又は血清である、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
該測定が、免疫測定法、質量分析法又は液体クロマトグラフィーを用いて行うものである、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
該免疫測定法がＥＬＩＳＡである請求項６記載の方法。
【請求項８】
該質量分析法がＭＡＬＤＩ法、ＬＣ／ＭＳ法又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法である請求項６記載の方法。
【請求項９】
α１‐アンチトリプシンに結合している式（Ｉ）：
【化２】
2017126514.tif 000013
で示される構造を含むフコシル化糖鎖からなる、非アルコール性脂肪肝炎検出用マーカー。
【請求項１０】
式（Ｉ）：
【化３】
2017126514.tif 000014
で示される構造を含むフコシル化糖鎖及び／又は
α１‐アンチトリプシンに対する抗体若しくはその断片
を含む、非アルコール性脂肪肝炎検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の検出の指標となるマーカー、該マーカーを用いたＮＡＳＨの検出方法及び該マーカーを含むＮＡＳＨ検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス性、自己免疫性等の慢性肝疾患を除く、明らかな飲酒歴のない人に発生する疾患群は、一括して非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：以下、ＮＡＦＬＤと記す）と定義される。ＮＡＦＬＤは、さらに、非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ：以下、ＮＡＦＬと記す）と非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：以下、ＮＡＳＨと記す）とに分類される。ＮＡＦＬは病態が進行することは稀で病的意義は少ない。一方、肥満、糖尿病等の生活習慣病を背景とするＮＡＳＨは肝硬変を経て肝癌又は肝関連死のリスクをもたらす予後の悪い疾患であり、早期の診断と治療が必要である。【０００３】
ＮＡＦＬＤに罹患しているか否かは、画像検査による脂肪肝の確認、血液検査によるウイルス性でないことの確認、飲酒歴の問診による多量の飲酒が原因ではないことの確認により診断が可能であるが、ＮＡＦＬＤと診断された患者がＮＡＦＬではなく、ＮＡＳＨに罹患していることの確定診断は、現在、肝生検にて行われ、小葉内の炎症、肝細胞の風船様変性、マロリー・デンク体あるいは線維化の有無に基づくＭａｔｔｅｏｎｉ分類（非特許文献１）を用いた病理判定や脂肪蓄積、炎症、肝細胞風船様肥大の各スコアから算出されるＮＡＦＬＤ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｓｃｏｒｅ（ＮＡＳ）や肝線維化の病理判定（非特許文献２）が診断基準となる。しかし、肝生検は患者への負担が大きいうえ、サンプリングエラーや評価者間のバラつき等の課題も多いため、肝生検に代わる非侵襲診断法の開発が求められている。【０００４】
また、近年、タンパク質結合糖鎖を癌等の疾患の診断マーカーとして用いるための研究が行われている。例えば、Ｍａｃ−２結合蛋白糖鎖修飾異性体（Ｍ２ＢＰＧｉ）がＣ型肝炎患者のデータをもとに、肝臓の線維化ステージの進展を反映する糖鎖マーカーとして知られており（非特許文献３）、日本において測定キットが上市されている（ＨＩＳＣＬ（登録商標）Ｍ２ＢＰＧｉ試薬、シスメックス株式会社）。タンパク質結合糖鎖マーカーとＮＡＳＨの関連としては、例えば、非特許文献４では、Ｍ２ＢＰＧｉがＮＡＳＨ患者における線維化ステージの進展を反映することが記載されているが、ＮＡＳＨ患者とＮＡＦＬ患者の選別に関しては記載も示唆もされていない。なお、非特許文献５では、フコシル化Ｍａｃ−２結合タンパク質（Ｍａｃ２ｂｐ）はＭａｃ２ｂｐの総量と関連しているとして、糖鎖ではなく、Ｍａｃ２ｂｐの総量を測定し、非ＮＡＳＨ（ＮＡＦＬ）患者と比較してＮＡＳＨ患者でＭａｃ２ｂｐが有意に増加していることが記載されている。
非特許文献６には、血清のフコシル化ハプトグロビン（Ｆｕｃ−Ｈｐｔ）が非ＮＡＳＨ（ＮＡＦＬ）患者と比べてＮＡＳＨ患者において顕著に増加することが記載されている。また、非特許文献７には、Ｆｕｃ−ＨｐｔとＭａｃ２ｂｐの併用により、より効率的にＮＡＦＬＤ患者からＮＡＳＨ患者を選別可能であることが記載されている。【０００５】
α１‐アンチトリプシン（ＡＡＴ）は血中の最も主要なプロテアーゼインヒビターであって、種々のセリンプロテアーゼを阻害する。主に肝細胞で生成され、種々の炎症時に血中に増加する急性相反応物質の一つであり、炎症性疾患、悪性腫瘍の指標となることが知られている。また、非特許文献８には、血液中のＡＡＴに結合している糖鎖Ａ３Ｆ（３）１Ｇ３Ｓ３（アウターアームフコシル化）の量が、健常者と比較してＣ型肝炎起因の肝硬変患者、Ｃ型肝炎起因の肝癌患者において上昇することが記載されている。但し、ＡＡＴとＮＡＳＨの関係、あるいは、ＡＡＴに結合している糖鎖とＮＡＳＨの関係は知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １１６，  Ｉｓｓｕｅ  ６，  １４１３−１４１９（１９９９）
【非特許文献２】Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ４１，  Ｉｓｓｕｅ  ６，  １３１３−１３２１（２００５）
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ３，  １０６５（２０１３）
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５０，７７６−７８４  （２０１５）
【非特許文献５】Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ７，  ６４８−６５６（２０１３）
【非特許文献６】ＰＬｏｓ  ＯＮＥ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ８，  Ｉｓｓｕｅ  ６，  ｅ６６３２８  （２０１３）
【非特許文献７】Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６２，  Ｉｓｓｕｅ  ５，  １４３３−１４４３  （２０１５）
【非特許文献８】ＰＬｏｓ  ＯＮＥ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ５，  Ｉｓｓｕｅ  ８，  ｅ１２４１９  （２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＮＡＳＨの検出の指標（特に、ＮＡＳＨとＮＡＦＬを区別する指標）となる新規のマーカー、該マーカーを用いたＮＡＳＨの検出方法、さらに該マーカーによりＮＡＳＨを検出するためのキットを提供することにある。また、該マーカーを用いたＮＡＳＨの診断方法、ＮＡＳＨの進行又は軽減のモニタリング方法、ＮＡＳＨの治療効果の評価方法、ＮＡＳＨを治療するための物質の有効性の評価方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、α１―アンチトリプシン（ＡＡＴ）に結合している約２０種の糖鎖の中から、式（Ｉ）
【化１】
2017126514.tif 000003
（式中、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミン、Ｍａｎはマンノースを意味する。）
で示される構造を含むフコシル化糖鎖のみ、ＮＡＦＬ患者と比較してＮＡＳＨ患者において有意に増加することを見出し、新規のＮＡＳＨ検出用マーカーとして同定した。本明細書において式（Ｉ）の構造を含むフコシル化糖鎖を「Ａ３Ｆ」ともいう。本明細書において、上記本発明のマーカーを「ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆ」とも言う。【０００９】
すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）被検試料における、α１‐アンチトリプシンに結合している式（Ｉ）：
【化２】
2017126514.tif 000004
で示される構造を含むフコシル化糖鎖の量を測定することを特徴とする、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の検出方法。
（２）非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患していない被検体由来の対照試料における量と比較して、被検試料における量が多いことを、該被検試料が非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している被検体由来の試料であることの指標とする、（１）記載の方法。
（３）該非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患していない被検体が、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）に罹患している被検体である、（２）記載の方法。
（４）被検試料が、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に罹患している被検体由来である、（１）〜（３）いずれかに記載の方法。
（５）該被検試料が血液又は血清である、（１）〜（４）いずれかに記載の方法。
（６）該測定が、免疫測定法、質量分析法又は液体クロマトグラフィーを用いて行うものである、（１）〜（５）いずれかに記載の方法。
（７）該免疫測定法がＥＬＩＳＡである（６）記載の方法。
（８）該質量分析法がＭＡＬＤＩ法、ＬＣ／ＭＳ法又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法である（６）記載の方法。
（９）α１‐アンチトリプシンに結合している式（Ｉ）：
【化３】
2017126514.tif 000005
で示される構造を含むフコシル化糖鎖からなる、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）検出用マーカー。
（１０）式（Ｉ）：
【化４】
2017126514.tif 000006
で示される構造を含むフコシル化糖鎖及び／又は
α１‐アンチトリプシンに対する抗体若しくはその断片
を含む、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）検出用キット。
（１１）α１‐アンチトリプシンに対する抗体を用いて、被検試料における、α１‐アンチトリプシンに結合している式（Ｉ）で示される構造を含むフコシル化糖鎖の量を測定することを特徴とする、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の検出方法。
（１２）（２）〜（８）いずれかに記載の方法で非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を検出する工程、及び
薬物療法、運動療法及び食事療法からなる群より選ばれる１以上の治療により非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）が検出された被検体を治療する工程を含む、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）治療方法。
（１３）被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量が、０．８μＭ以上である場合に、該被検試料が非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している被検体由来の試料であるとする、（２）〜（８）いずれかに記載の方法。（実施例１）
（１４）被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量が、０．３μＭ以上である場合に、該被検試料が非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している被検体由来の試料であるとする、（２）〜（８）いずれかに記載の方法。（実施例１）
（１５）被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量が、９μＭ以上である場合に、該被検試料が非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患している被検体由来の試料であるとする、（２）〜（８）いずれかに記載の方法。（実施例２）【００１０】
また、本発明には、以下も含まれる。
（１−１）（Ａ）被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量を測定する工程、
（Ｂ）非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に罹患していない被検体由来の対照試料における量と比較して、工程（Ａ）で測定した被検試料における量が多いことを、該被検試料が非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者由来の試料であることの指標とする工程を含む、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）患者のスクリーニング方法。
（１−２）被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量を測定することを特徴とする、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の進行又は軽減をモニタリングする方法。
（１−３）被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量を測定することを特徴とする、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療効果を評価する方法。
（１−４）被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量を測定することを特徴とする、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を治療するための物質の有効性の評価方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のマーカーは、ＮＡＳＨとＮＡＦＬを区別してＮＡＳＨを検出することができ、ＮＡＳＨの診断方法、ＮＡＳＨの進行又は軽減のモニタリング方法、ＮＡＳＨの治療効果の評価方法、ＮＡＳＨを治療するための物質の有効性の評価に有用である。さらに、血液又は血清を用いて測定が可能であり、肝生検と比べて、患者や医療従事者の負担も軽く、より迅速かつ簡便に上記診断や評価等が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（Ａ）ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの検体ごとの血清中濃度、及び、（Ｂ）（Ａ）から作成した箱ひげ図（実施例１）
【図２】ＮＡＳＨの診断におけるＡＡＴ結合糖鎖Ａ３ＦのＲＯＣ曲線（実施例１）
【図３】（Ａ）ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの検体ごとの血清中濃度、及び、（Ｂ）（Ａ）から作成した箱ひげ図（実施例２）
【図４】ＮＡＳＨの診断におけるＡＡＴ結合糖鎖Ａ３ＦのＲＯＣ曲線（実施例２）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において使用される用語は、特に言及する場合を除いて、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。
【００１４】
「被検試料」とは、被検体から単離した生物学的材料を意味する。例えば、血液、リンパ液、髄液、尿及びその処理物等が用いられるが、好ましくは血液、さらに好ましくは該血液を分離して得られる血清、血漿が用いられる。
【００１５】
「被検体」とは任意の動物を意味する。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳類が挙げられる。好ましくは、ヒト又はマウスである。
【００１６】
以下に、本発明の具体的態様を記載するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００１７】
Ｉ．ＮＡＳＨ検出用マーカー
本明細書の実施例に示す通り、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆを新規のＮＡＳＨ検出用マーカーとして見出した。つまり、本発明は、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆからなる、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）検出用マーカーを包含する。
【００１８】
本発明のマーカーであるＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆは公知物質である。
【００１９】
α１‐アンチトリプシン（ＡＡＴ、アルファ−１−アンチトリプシン）は４１８アミノ酸からなるタンパク質であり、配列は、アクセッション番号ＡＡＢ５９３７５として、ＧｅｎＢａｎｋに登録され、公表されている。また、アクセッション番号Ｐ０１００９として、Ｕｎｉｐｒｏｔに登録されており、その中で、アイソフォームや数多くの自然変異体が公表されている。
ＡＡＴの配列上のＮ−グリコシル化位置として、７０位、１０７位又は２７１位のアスパラギンが知られている（Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ２０１４，；１３（７）：３１３１−４３）。本発明のマーカーがＮＡＳＨ検出用マーカーとして利用可能である理由としては、ＮＡＦＬ患者と比較してＮＡＳＨ患者において、該３ヶ所のグリコシル化位置に結合する糖鎖の総量における、Ａ３Ｆの割合が有意に多いことが考えらえる。
【００２０】
ＡＡＴは、上記に登録されているタンパク質や自然変異体のみならず、生体内で生じ得る変異体も含み、該タンパク質において１〜数個、１〜５個、１〜３個、１若しくは２個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質であって多形性や突然変異に基づく変異により生じるものが含まれる。ただし、Ｎ−グリコシル化位置である、７０位、１０７位又は２７１位のアスパラギンは保存されていることが好ましい。
【００２１】
本発明のＮＡＳＨマーカーは、具体的には、式（Ｉ）で示される構造を含む糖鎖であって、当該糖鎖の何れかの糖残基がフコシル化（Ｆｕｃ）されているものである。より具体的には、本発明のＮＡＳＨマーカーとしては、式（Ｉ）で示される構造を含む糖鎖であって、いずれか１つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がフコシル化されているものが挙げられる。より具体的には、式（Ｉ）で示される構造を含む糖鎖であって、非還元末端側（糖鎖頭部）に存在する３本に分岐した糖鎖中のいずれか１つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がフコシル化されているもの（アウターアームフコシル化）、又は、式（Ｉ）で示される構造を含む糖鎖であって、最もアスパラギン残基に近い還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）がフコシル化されているもの（コアフコシル化）が挙げられる。
式（Ｉ）で示される構造には、例えば、以下の式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）で示される構造等が包含される。
【化５】
2017126514.tif 000007
【化６】
2017126514.tif 000008
（式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）中のα２―３／６はα２―３グリコシド結合又はα２―６グリコシド結合を、β１−３／４はβ１−３グリコシド結合又はβ１−４グリコシド結合を意味する。）
【００２２】
ＩＩ．ＮＡＳＨの検出方法
上記「Ｉ．ＮＡＳＨ検出用マーカー」を用いて、ＮＡＳＨの検出を行うことができる。つまり、本発明は、被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量を測定することを特徴とする、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の検出方法を包含する。
【００２３】
本発明のマーカーはＮＡＳＨを検出するために利用することができる。すなわち、被検試料における、
ＡＡＴに結合している式（Ｉ）
【化７】
2017126514.tif 000009
で示される構造を含むフコシル化糖鎖（Ａ３Ｆ）の量
を測定することにより、ＮＡＳＨを検出することができる。
【００２４】
ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量の測定方法としては、例えば、免疫測定法や質量分析を用いた方法等が挙げられる。下記実施例を参照に測定することもできる。
【００２５】
免疫測定法としては、公知の免疫学的方法を利用することができる。公知の免疫学的方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロット法等が例示される。
【００２６】
質量分析法としては、具体的には、例えば、
（ａ）被検試料からＡＡＴを分離する工程、及び、
（ｂ）分離されたＡＡＴに結合しているＡ３Ｆの量を測定する工程
を含む方法等が挙げられる。
【００２７】
工程（ａ）としては、ＡＡＴを特異的に認識して、その他のタンパク質も含む被検試料からＡＡＴを分離し得る方法であればいずれのものでもよい。この際、ＡＡＴはＡ３Ｆが結合している部位が含まれていれば、野生型であっても変異型であってもよいし、全長であっても断片であってもよい。より具体的には、ＡＡＴの配列上の７０位、１０７位又は２７１位のアスパラギンを含むタンパク質又は断片であればよい。
【００２８】
具体的には、例えば、抗ＡＡＴ抗体を用いた免疫沈降法、抗体アフィニティーカラムによりＡＡＴを被検試料から分離する方法が挙げられる。
まず、アガロースビーズ又は磁気ビーズにＡＡＴに対する抗体を結合させる。ここで、結合の様式は共有結合でもよいし、ビオチン−アビジンによる結合でもよい。次に、抗体結合ビーズに対して被検試料を接触させ、ビーズ上の抗体に被検試料中のＡＡＴを結合させた後、ビーズを充分に洗浄し、さらに酸、アルカリ、又は高塩濃度の溶液を用いてビーズ上の抗体からＡＡＴを遊離させることで、ＡＡＴを分離する。
【００２９】
工程（ｂ）としては、工程（ａ）で分離されたＡＡＴに結合しているＡ３Ｆの量を測定し得る方法であればいずれのものでもよい。例えば、公知の質量分析又はクロマトグラフィーにより測定する方法等が例示される。ＭＳ法、ＭＳ／ＭＳ法、ＬＣ／ＭＳ法、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法、ＨＰＬＣ、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー等が例示される。また、工程（ａ）と同様に公知の免疫学的測定方法も利用可能である。
【００３０】
なお、本発明のマーカーであるＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量として、その絶対量を必ずしも求める必要はなく、上記測定方法等で検出された個々のＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆ固有のピークを数値化したり、基準とするピークとの比を求めたりすることによっても求めることもできる。この具体的な方法としては、検出された各ピークの高さを数値化する方法、ピーク面積を数値化する方法等があり、液体クロマトグラフィーでは定量性を有する測定方法であるのでどちらかに限定されるものではないが、ＭＳ法ではピーク面積を数値化する方法が、精度がよく、好ましい。
【００３１】
質量分析により測定する方法とは、具体的には、工程（ａ）で分離されたＡＡＴをプロテアーゼ等によりペプチド断片化し、得られたＡＡＴ断片の混合物から、本発明のマーカーであるＡ３Ｆを有するＡＡＴ断片を質量分析装置で検出する方法が挙げられる。工程（ａ）で分離されたＡＡＴは変性後、還元アルキル化し、プロテアーゼを使い、ペプチド断片化する。プロテアーゼはタンパク質をペプチド断片に分解するものであればどのようなものでもよいが、トリプシン、リシルエンドペプチターゼ等が挙げられる。ＡＡＴ断片はそのまま質量分析装置で計測しても問題ないが、抗体やレクチン等を用いて予め濃縮することが望ましい。具体的には、例えば、ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＯＬ（Ａｅｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｅｃｔｉｎ）、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ  ｌｅｃｔｉｎ）、ＵＥＡ  Ｉ（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐｅｕｓ  Ｉ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ−Ａ）等のようにフコースに結合するレクチンを使ってＡＡＴを濃縮することが望ましい。質量分析装置による計測は、質量分析装置単体でも問題ないが、液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動等のクロマトグラフィーと組み合わせることが望ましい。Ａ３Ｆの量を測定する方法としては、ピーク面積を計測する方法が挙げられる。
【００３２】
また、工程（ａ）で分離されたＡＡＴの糖鎖部分を、グリカナーゼやヒドラジンを使って分解して遊離させた後、測定の対象とする該糖鎖部分（Ａ３Ｆ）を必要に応じて誘導体化又は化学修飾して、その量を測定することができる。または、液体クロマトグラフィー等によりＡ３Ｆを分離して、その量を測定することができる。
【００３３】
ＡＡＴから糖鎖部分を分解する方法としては、ヒドラジン分解法や、酵素（Ｎ−グリカナーゼ）消化法等が挙げられる。これらのうち、定量的に糖鎖を切断するには酵素（Ｎ−グリカナーゼ）消化法が好ましい。
【００３４】
上述のようにして調製した糖鎖において、検出したいＡ３Ｆを標識、誘導体化する方法としては、特に限定されるものではないが、質量分析法装置を使う場合はイオン化効率を高める標識法、より具体的には、Ｎα‐（（ａｍｉｎｏｏｘｙ）ａｃｅｔｙｌ）ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ａｏＷＲ）を用いる標識方法が特に好ましい。蛍光検出器を使う場合は２-アミノピリジンにより糖鎖部分を標識することが好ましい。また、上述のようにして標識した糖鎖部分を誘導体化する方法として、標識にａｏＷＲを用いる場合は、例えば、Ｊ．  Ｆｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ８０（２００８）１０９４‐１１０１に記載の方法等が用いられ、標識に２−アミノピリジンを用いる場合はＹ．  Ｏｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｔｏｋｙｏ）１２９（２００１）５３７−４２に記載の方法等が用いられる。
【００３５】
上述のようにして、標識、誘導化されたＡ３Ｆを分離する方法としては、液体クロマトグラフィーの他、電気泳動等を用いることができる、好ましくは液体クロマトグラフィーを用いることができる。液体クロマトグラフィーの条件は特に限定されるものではないが、逆相又は順相カラムが望ましく、溶離液が安定的に送液できるものであればどのような仕様でもよく、特に限定されるものではない。
【００３６】
次に、Ａ３Ｆの量の測定を行なうが、この方法としては、Ａ３Ｆを選択的に検出できるものであれば、特に限定されるものではない。具体的な測定方法としては、紫外可視光吸収法、蛍光検出法、質量分析法、核磁気共鳴法、本発明の糖鎖部に特異的な抗体を用いる方法等が挙げられ、中でも、質量分析法や蛍光検出法が望ましい。
【００３７】
蛍光検出法を用いて検出する場合は、上述の２−アミノピリジン等の蛍光物質で予め糖鎖を標識化する必要がある。蛍光検出法の検出条件は、検出対象とする糖鎖（Ａ３Ｆ）を検出できるものであれば、特に限定されるものではない。２−アミノピリジンを標識化合物に使った場合は、励起光に波長２８０ｎｍ〜３３０ｎｍ、蛍光検出に波長３５０ｎｍ〜４２０ｎｍを選択することが好ましい。
【００３８】
また、質量分析法を使う場合は上述のａｏＷＲにより予め糖鎖にイオン性化合物を付加することが望ましい．質量分析法を用いて検出する場合、質量分析装置の検出範囲としては、検出対象とする糖鎖（Ａ３Ｆ）を検出できる範囲であれば、特に限定されるものではない。イオン化法はＭＡＬＤＩ、ＥＳＩ（エレクトロスプレーイオン化）の他、ＡＰＣＩ（大気圧化学イオン化）等でもよいが、ＭＡＬＤＩが最も好ましい。質量分析装置は四重極型、ＴＯＦ型、イオントラップ型、磁場型、フーリエ変換型のいずれでもよいが、定量性の高い四重極型、感度の高いＴＯＦ型、イオントラップ型が特に好ましい。また、検出するイオンは、親イオンに限定されるものではなく、フラグメントイオン、付加イオン、２量体イオン等関連イオンであってもよい。このようにして求められる本発明のＮＡＳＨマーカーの量を測定する方法としては、検出対象とする糖鎖（Ａ３Ｆ）に相当するピークのピーク面積を計測する方法等が挙げられる。なお、質量分析法を用いて検出する場合、液体クロマトグラフィーの機能も有するＬＳ／ＭＳを用いることもできる。
【００３９】
また、上述した方法の他、被検試料から、本発明のマーカーであるＡ３Ｆを有する糖タンパク質を分離する工程と、分離されたＡ３Ｆをもつ糖タンパク質に含まれるＡＡＴの量を測定する工程とを含む方法を用いることもできる。すなわち、本発明の方法におけるマーカーを測定する工程が、
（ｃ）前記体液中の全糖タンパク質からＡ３Ｆを有する糖タンパク質を分離する工程、及び
（ｄ）該分離された糖タンパク質におけるＡＡＴの量を測定する工程、
を含むＮＡＳＨ検出方法である。
【００４０】
２以上の測定値を比較する場合、１種又は複数の統計的分析（例えば、ｔ−検定、ウェルチのＴ検定、ウィルコクソンの順位和検定、ＡＮＯＶＡ、再帰的分割、ランダムフォレスト等）を使用して、比較することができる。
【００４１】
本発明のマーカーは単独で用いられてもよいが、他のＮＡＳＨの検出が可能であることが知られているマーカー（例えば、Ｆｕｃ−Ｈｐｔ、Ｍａｃ２ｂｐ等）と組み合わせて利用することもできる。
【００４２】
ＩＩＩ．ＮＡＳＨの診断方法
上記「Ｉ．ＮＡＳＨ検出用マーカー」を用いて、ＮＡＳＨの診断が可能である。本発明のマーカーは、健常人及びＮＡＦＬ患者では被検試料中の量が少なく、ＮＡＳＨ患者において被検試料中の量が有意に上昇する。よって、「ＩＩ．ＮＡＳＨの検出方法」において、ＮＡＳＨに罹患していない被検体（健常人及び／又はＮＡＦＬ患者）由来の対照試料における量と比較して、被検試料における量が多いことを、該被検試料がＮＡＳＨに罹患している被検体由来の試料であることの指標とすることにより、ＮＡＳＨを検出することができる。
つまり、本発明は、
（Ａ）被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆを測定する工程、
（Ｂ）ＮＡＳＨに罹患していない被検体由来の対照試料における量と比較して、工程（Ａ）で測定した被検試料における量が多いことを、該被検試料がＮＡＳＨ患者由来の試料であることの指標とする工程を含む、ＮＡＳＨ患者のスクリーニング方法を包含する。
【００４３】
臨床においては、現在、ＮＡＦＬＤは、診断基準が確立しており、画像検査による脂肪肝の確認、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体、各種自己抗体等を用いた公知の血液検査によるウイルス性疾患でないことの確認、飲酒歴の問診による多量の飲酒が原因ではないことの確認（例えば、飲酒量がエタノール換算で２０ｇ未満／日又は１４０ｇ未満／週）により診断可能である。よって、ＮＡＦＬＤと診断された患者が、病態が進行することが稀なＮＡＦＬではなく、予後の悪いＮＡＳＨに罹患していることの確定診断が重要となり、本発明のマーカーは、特に、公知の診断方法によりＮＡＦＬＤに罹患していると診断された被験者に関し、ＮＡＳＨに罹患しているか否かの診断を可能にする点で非常に有用である。つまり、「ＩＩ．ＮＡＳＨの検出方法」において、測定したＮＡＦＬＤ患者由来の被検試料における量を、ＮＡＳＨに罹患しておらず、かつ、ＮＡＦＬＤに罹患している被検体（つまり、ＮＡＦＬに罹患している被検体）由来の対照試料における量と比較して、被検試料における量が多いことを、被検試料がＮＡＳＨに罹患している被検体由来の試料であることの指標とすることにより、ＮＡＳＨを検出（診断）し、ＮＡＳＨ患者をスクリーニングすることができる。
【００４４】
対照試料における量とは、複数のサンプルの平均値を用いることが好ましい。対照試料における量は被検試料と同時に測定してもよいし、予め測定してカットオフ値を設定してもよい。
【００４５】
「本発明のＮＡＳＨマーカーの量」は、ＮＡＳＨに罹患していない被検体由来の被検試料では少ないが、ＮＡＳＨ患者由来の被検試料では顕著に多くなる。従って、「ＩＩ．ＮＡＳＨの検出方法」において被検試料中の「本発明のＮＡＳＨマーカーの量」又は該ＮＡＳＨマーカーの量に基づく算出値が前記「対照試料における量」より有意に大きいとき又は予め設定されたカットオフ値より大きいときに、その被検試料はＮＡＳＨ患者由来の試料である可能性が高いということができる。
【００４６】
なお、本発明における「カットオフ値」とは、「ＩＩ．ＮＡＳＨの検出方法」により得られたＮＡＳＨマーカーの量又はＮＡＳＨマーカーの量に基づく算出値と比較して、ＮＡＳＨ患者とＮＡＳＨに罹患していない被検体（健常人及び／又はＮＡＦＬ患者）を区別する値を指す。カットオフ値の決定方法は、特に限定されないが、下記実施例のように、ＲＯＣ曲線を用いてカットオフ値を決定してもよい。
カットオフ値を用いてＮＡＳＨを検出する場合、ＮＡＳＨの定義やマーカーの測定方法によって、カットオフ値が変わってくる。従って、目的とするマーカーについて、ＮＡＳＨに罹患していない被検体、ＮＡＳＨ患者の測定値を事前に確認して、カットオフ値を決めて、それに従って検出することが好ましい。本発明の実施例に従って、被験者の血清を用いてマーカーの測定を行う場合には、本発明の実施例で得られた数値を参考にＮＡＳＨを検出することができる。
【００４７】
上記のように本発明のマーカーを用いて診断し、ＮＡＳＨ患者の治療を行うことも可能である。具体的には、「ＩＩ．ＮＡＳＨの検出方法」において、ＮＡＳＨに罹患していない被検体由来の対照試料における量と比較して、被検試料における量が多いことを、該被検試料がＮＡＳＨに罹患している被検体由来の試料であることの指標とすることにより、ＮＡＳＨを検出する工程、及び
薬物療法、運動療法及び食事療法からなる群より選ばれる１以上の治療によりＮＡＳＨが検出された被検体を治療する工程を含む、ＮＡＳＨ治療方法である。
つまり、本発明は、
（Ａ）被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量を測定する工程、
（Ｂ）ＮＡＳＨに罹患していない被検体由来の対照試料における量と比較して、工程（Ａ）で測定した被検試料における量が多いことを、被検試料がＮＡＳＨ患者由来の試料であることの指標とすることにより、ＮＡＳＨを検出する工程、
（Ｃ）薬物療法、運動療法及び食事療法からなる群より選ばれる１以上の治療によりＮＡＳＨが検出された被検体を治療する工程を含む、ＮＡＳＨ治療方法を包含する。
薬物療法としては、インスリン抵抗性改善薬（例えば、ピオグリタゾン）、ビタミンＥ（例えば、αトコフェノール）等が挙げられる。
【００４８】
ＩＶ．ＮＡＳＨの進行／軽減のモニタリング方法
上記「Ｉ．ＮＡＳＨ検出用マーカー」を用いて、被検体におけるＮＡＳＨの進行／軽減のモニタリングを行うことができる。具体的には、被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量を測定することを特徴とする方法により、ＮＡＳＨの進行又は軽減をモニタリングすることができる。
つまり、本発明は、
（Ｄ）第１の被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量を測定する工程、
（Ｅ）同一の被検体由来の第２の被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆを測定する工程、
（Ｆ）第１の被検試料の測定値と第２の被検試料の測定値を比較する工程
を含む、ＮＡＳＨの進行又は軽減をモニタリングする方法を包含する。該方法の結果は、被検体におけるＮＡＳＨの経過（すなわち、変化があるならば、進行又は軽減）を示す。
【００４９】
本発明のマーカーを一定期間以上の間を空けて少なくとも２回測定し、測定値を比較する。一定期間以上の間を空けて複数回行い、測定値の経時的変化を比較してもよい。本発明のマーカーの測定値の経時的な変化がある場合、該変化は、被検体におけるＮＡＳＨの進行又は軽減を示し得る。第１の被検試料の測定値と第２の被検試料の測定値を比較することにより、本発明のマーカーの測定値が経時的に増加している場合、その結果は、該被検体におけるＮＡＳＨの進行（悪化）を意味する。第１の被検試料の測定値と第２の被検試料の測定値を比較することにより、本発明のマーカーの測定値が経時的に減少している場合、その結果は、該被検体におけるＮＡＳＨの軽減を意味する。
【００５０】
該方法は、ＮＡＳＨに罹患している被検体におけるＮＡＳＨの経過をモニタリングするために実施することができる。また、ＮＡＳＨに対する素因のレベルをモニタリングするために、ＮＡＳＨを有さない被検体（例えば、ＮＡＳＨを発症しやすいと疑われる被検体）で使用することができる。被験者のマーカー測定値がＮＡＳＨに罹患していない者（健常者又はＮＡＦＬ患者）の測定値に近づくほど、ＮＡＳＨが重篤ではないことが示唆される。逆に、被験者のマーカー測定値がＮＡＳＨに罹患していない者（健常者又はＮＡＦＬ患者）の測定値から遠くなるに従い、ＮＡＳＨが重篤である、あるいは、病態の悪化が示唆される。
【００５１】
Ｖ．ＮＡＳＨの治療効果の評価方法
上記「Ｉ．ＮＡＳＨ検出用マーカー」を用いて、被検体におけるＮＡＳＨの治療効果の評価を行うことができる。具体的には、被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量を測定することを特徴とする方法により、ＮＡＳＨの治療効果を評価することができる。
つまり、本発明は、上記工程（Ｄ）〜（Ｆ）をＮＡＳＨの治療前、治療期、治療後等、経時的に行うことにより、ＮＡＳＨの治療効果を評価する方法を包含する。該方法の結果は、被検体におけるＮＡＳＨの治療効果を示す。
【００５２】
本発明のマーカーを一定期間以上の間を空けて少なくとも２回測定し、測定値を比較する。一定期間以上の間を空けて複数回行い、測定値の経時的変化を比較してもよい。本発明のマーカーの測定値の経時的な変化がある場合、該変化は、被検体におけるＮＡＳＨの治療効果の有無を示し得る。第１の被検試料の測定値と第２の被検試料の測定値を比較することにより、本発明のマーカーの測定値が減少している場合、その結果は、該被検体におけるＮＡＳＨの治療に効果があることを意味する。第１の被検試料の測定値と第２の被検試料の測定値を比較することにより、本発明のマーカーの測定値が増加している場合あるいは変化がない場合、その結果は、該被検体におけるＮＡＳＨの治療に効果がないことを意味する。
【００５３】
ＮＡＳＨの治療とは、薬物療法、運動療法、食事療法、その他ＮＡＳＨの治療を目的として行われる外科的治療等の治療方法を含む。本発明において、ＮＡＳＨの治療が行われている期間をＮＡＳＨの治療期という。
本発明の治療効果の評価のための方法は、ＮＡＳＨの治療が一定期間以上行われ、本発明のマーカーの測定がＮＡＳＨ治療期に一定期間以上の間を空けて行われることが望ましい。本発明において一定期間とは特に限定されないが、好ましくは１週間、より好ましくは１ヶ月、３ヶ月、６カ月、１年であり、１年以上の期間であってもよい。例えば、３ヶ月毎に定期的に被験者の被検試料におけるマーカーが測定される態様も望ましい。
【００５４】
ＶＩ．ＮＡＳＨを治療するための物質の有効性の評価方法
上記「Ｉ．ＮＡＳＨ検出用マーカー」を用いて、ＮＡＳＨを治療するための物質の有効性の評価を行うことができる。具体的には、被検試料における、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの量を測定することを特徴とする方法により、ＮＡＳＨを治療するための物質の有効性の評価を行うことができる。
つまり、上記工程（Ｄ）〜（Ｆ）を、ＮＡＳＨを治療するための物質の投与前、投与期、投与後等、経時的に行うことにより、該物質の有効性を評価する方法を含有する。該方法の結果は、該物質の有効性を示す。
【００５５】
本発明のマーカーを一定期間以上の間を空けて少なくとも２回測定し、測定値を比較する。一定期間以上の間を空けて複数回行い、測定値の経時的変化を比較してもよい。本発明のマーカーの測定値の経時的な変化がある場合、該変化は、該物質の有効性の有無を示し得る。第１の被検試料の測定値と第２の被検試料の測定値を比較することにより、本発明のマーカーの測定値が減少している場合、その結果は、該物質がＮＡＳＨの治療に有効であることを意味する。第１の被検試料の測定値と第２の被検試料の測定値を比較することにより、本発明のマーカーの測定値が増加している場合あるいは変化がない場合、その結果は、該物質がＮＡＳＨの治療に効果がないことを意味する。
【００５６】
ＶＩＩ．  ＮＡＳＨ検出用キット
本発明は、上記ＩＩ〜ＶＩの方法に用いられるＮＡＳＨ検出用キットを包含する。詳しくは、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆを含む、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）検出用キットが挙げられる。
【００５７】
また、α１‐アンチトリプシン（ＡＡＴ）に対する抗体若しくはその断片を含む、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）検出用キットも挙げられる。該キットは、Ａ３Ｆが結合しているＡＡＴの被検試料からの単離やＡ３Ｆが結合しているＡＡＴの被検試料中の量の測定に利用可能である。
該抗体は、ＡＡＴに特異的結合性を有する限り、その種類や由来等は特に限定されない。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を使用できるが、好ましくはモノクローナル抗体である。また、該抗体は標識されていてもよい。
該抗体作製方法は、特に限定されず、公知の方法が利用可能である。具体的には、ＡＡＴ又はその部分配列ペプチドで動物を免疫して、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を作製することができる。
【実施例】
【００５８】
以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。【００５９】
実施例１
検体
肝生検によりＮＡＦＬと診断された患者の血清（１７検体）、肝生検によりＮＡＳＨと診断された患者の血清（２８検体）を用いて解析を行った。ＮＡＦＬ及びＮＡＳＨの診断は、病理所見に基づくＭａｔｔｅｏｎｉ分類によって行った。Ｍａｔｔｅｏｎｉ分類とは、小葉内の炎症、肝細胞の風船様変性、マロリー・デンク体あるいは線維化の有無に基づく非アルコール性脂肪性肝疾患の分類法であり、脂肪肝のみでは１型、１型に小葉内炎症を伴う場合は２型、１型に肝細胞の風船様変性を伴う場合は３型、３型にマロリー・デンク体あるいは線維化を伴う場合は４型と分類される。１型及び２型がＮＡＦＬ、３型及び４型がＮＡＳＨと診断される。【００６０】
ＡＡＴの分離
ＮＡＦＬ及びＮＡＳＨ患者の血清５０μＬを０．２２μｍのフィルター（Cellulose Acetate Spin Filters, Agilent, Santa Clara, CA）で濾過した後、１５０μＬのＢｕｆｆｅｒ  Ａ（Agilent, Santa Clara, CA）で希釈した。希釈した血清を、Ｂｕｆｆｅｒ  Ａで平衡化したＭＡＲＳ  ＨＳＡ／ＩｇＧスピンカートリッジ（Agilent, Santa Clara, CA）に供した。遠心（１００ｘｇ，２分間，４℃）し、溶出液１を回収した。ＭＡＲＳ  ＨＳＡ／ＩｇＧスピンカートリッジを２６７μＬのＢｕｆｆｅｒ  Ａで３回洗浄し、全ての溶出液を溶出液１と合わせて溶出液２とした。約１０００μＬの溶出液２のうち、２００μＬをＢｕｆｆｅｒ  Ａで平衡化したＭＡＲＳ  Ｈｕｍａｎ−１４スピンカートリッジ（Agilent, Santa Clara, CA）に供した。遠心（１００ｘｇ，２分間，４℃）し、５分間室温で静置した後、２６７μＬのＢｕｆｆｅｒ  Ａで３回洗浄し、２．５ｍＬのＢｕｆｆｅｒ  Ｂ（Agilent, Santa Clara, CA）でＡＡＴを含む画分を溶出した。このＡＡＴを含む画分の溶媒を、Ｓｐｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ，５Ｋ  ＭＷＣＯ（Agilent, Santa Clara, CA）を用いてリン酸緩衝生理食塩水に置換した。この溶液にＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（４Ｘ）（Invitrogen, Waltham, MA）を加え、７０℃で１５分間加熱しタンパク質を変性させた。変性させたタンパク質１０μｇをＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ  １．０  ｍｍ，  １０  Ｗｅｌｌ（Invitrogen, Waltham, MA）で分離し、タンパク質をＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Invitrogen, Waltham, MA）で染色した。ＡＡＴに当たるバンドを切り出し、Ｉｎ−Ｇｅｌ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Pierce Biotechnology, Waltham, MA）を用いてゲルからのタンパク質の抽出とトリプシン消化を行った。トリプシン消化後のゲルに対して２００μＬの精製水を加え、室温で３０分間振とうし、上清を新しいサンプルチューブに移した（サンプル溶液Ａ）。次に、ゲルに対して４００μＬの１２．５ｍＭ  重炭酸アンモニウム緩衝液／５０％アセトニトリルを加え、室温で３０分間振とうし、上清をサンプル溶液Ａと合わせた（サンプル溶液Ｂ）。さらに、ゲルに対して２００μＬのアセトニトリルを加え、室温で３０分間振とうし、上清をサンプル溶液Ｂと合わせた。この溶液を減圧乾固させた後、１００μＬの２５ｍＭ  重炭酸アンモニウム緩衝液で溶解し、９０℃で１０分間加熱した後に氷上で冷却した（サンプル溶液Ｃ）。【００６１】
ＡＡＴの糖鎖解析
サンプル溶液Ｃに１ＵのＰＮＧａｓｅＦ（Basel, Switzerland）を加え、３７℃で一晩静置した。この溶液のうち、５０μＬ中に含まれる糖鎖をＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Sumitomo Bakelite Co. Ltd., Tokyo, Japan）を用いたグライコブロッティング法によりａｏＷＲ標識した。この際、サンプル中のシアル酸が持つＣＯＯＨ基を１−メチル−３−ｐ−トリルトリアゼン（Tokyo Chemical Industry Co., Ltd, Tokyo, japan）によってメチルエスエル化した。上記のグライコブロッティングを行う際、Ａ３  ｇｌｙｃａｎ（Ludger, Oxfordshire, UK）を併せてａｏＷＲ標識した。Ａ３  ｇｌｙｃａｎ中のシアル酸が持つＣＯＯＨ基を１−エチル−３−ｐ−トリルトリアゼン（Tokyo Chemical Industry Co., Ltd, Tokyo, japan）によってエチルエステル化した。ａｏＷＲ標識反応後、標識糖鎖を１００μＬの精製水で溶出した。このうちの５０μＬに対し、ａｏＷＲ標識を行ったＡ３  ｇｌｙｃａｎを２．５ｐｍｏｌ添加し、ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ  ＨＩＬＩＣ  ｕＥｌｕｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ（Waters, Milford, MA）によって糖鎖を精製した。２，５−ジヒロドキシ安息香酸（１０ｍｇ／ｍＬ）をマトリクスとして、ＵｌｔｒａＦｌｅｘ  ＩＩ（Bruker Daltonics GmbsH, Bremen, Germany）によりＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（/ＴＯＦ）解析を行った。サンプル中のＡ３ＦのピークとＡ３  ｇｌｙｃａｎのピーク比から、Ａ３Ｆの定量を行った。【００６２】
糖鎖解析に供した血清量を基に、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの血清中濃度を算出し、ＮＡＦＬ患者とＮＡＳＨ患者とで比較した。ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの検体ごとの血清中濃度を図１（Ａ）に、図１（Ａ）から作成した箱ひげ図を図１（Ｂ）に示す。また、ＮＡＦＬ及びＮＡＳＨそれぞれの平均値（Ｍｅａｎ）及び標準偏差（ＳＤ）を表１に示す。有意差の検定にはｔ検定を用いた。【００６３】
【表１】
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【００６４】
ＮＡＳＨ患者血清中のＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆ濃度は、ＮＡＦＬ患者と比較して有意に上昇していた。従って、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆが、ＮＡＳＨマーカーとしてＮＡＳＨ患者をＮＡＦＬ患者と区別するという点で有用であることが示された。
ＮＡＳＨの診断におけるＡＡＴ結合糖鎖Ａ３ＦのＲＯＣ（受信者動作特性：ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）曲線を図２に示した。ＲＯＣ曲線はＲ（Ｖｅｒ３．３．２）を用いて作成した。ＲＯＣ曲線から求めたＲＯＣ曲線下面積は０．７７５であった。ＲＯＣ曲線において、特異度と感度との和が最大となる点をカットオフ値とすると、その値は０．８μＭであった。カットオフ値を０．８μＭとした場合、ＮＡＳＨの診断における感度は６４％、特異度は８２％であった。
ＮＡＳＨ患者血清中のＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆ濃度は０．３μＭ以上であったことから、カットオフ値を０．３μＭとすることで、偽陰性を排除することができる。カットオフ値を０．３μＭとした場合、ＮＡＳＨ診断における感度は１００％、特異度は２９．４％であった。【００６５】
実施例２
検体
肝生検によりＮＡＦＬと診断された患者の血清（３１検体）、肝生検によりＮＡＳＨと診断された患者の血清（３８検体）を用いて解析を行った。ＮＡＦＬ及びＮＡＳＨの診断は、実施例１と同様に病理所見に基づくＭａｔｔｅｏｎｉ分類によって行った。【００６６】
免疫沈降法によるＡＡＴの精製
０．４５μｍの遠心式フィルターユニット（Ultrafree-MC HV Centrifugal Filter, Millipore, Billerica, Massachusetts）に３００μＬのＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  Ｂｌｕｅ  Ｇｅｌ（Bio-Rad, Alfred Nobel Drive Hercules, CA）と７０μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（GE Healhcare, Chicago, Illinois）を入れ、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化し、カラムＡとした。ＮＡＦＬ及びＮＡＳＨ患者の血清５０μＬを１５０μＬの２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し、０．４５μｍの遠心式フィルターユニット（Ultrafree-MC HV Centrifugal Filter）で濾過した。濾過した血清をカラムＡに供し、室温で１０分間振とうして混和した。遠心（２５００ｘｇ，１分間，室温）し、溶出液を再度カラムＡに供し、室温で１０分間振とうして混和した。遠心（２５００ｘｇ，１分間，室温）し、溶出液を回収した（溶出液３）。カラムＡを２５０μＬの２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、洗浄液を溶出液３と合わせて溶出液４とした。新しい０．４５μｍの遠心式フィルターユニット（Ultrafree-MC HV Centrifugal Filter）に２０μＬのＡｌｐｈａ−１  Ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ  Ｓｅｌｅｃｔ（GE Healhcare）を入れ、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム／２０  ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化し、カラムＢとした。溶出液４に５Ｍ  塩化ナトリウム水溶液を加えることで溶媒を１５０ｍＭ  塩化ナトリウム／２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）とし、カラムＢに供して室温で３０分間振とうして混和した。遠心（１００ｘｇ，５分間，室温）し、溶出液を再度カラムＢに供し、室温で３０分間振とうして混和した。遠心（１００ｘｇ，５分間，室温）し、カラムＢを２００μＬの１５０ｍＭ  塩化ナトリウム／２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄した。カラムＢに２００μＬの２Ｍ  塩化マグネシウム／２０ｍＭ  トリス―塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し，室温で１分間振とうして混和した。遠心（１０００ｘｇ，１分間，室温）し、ＡＡＴを含む溶出液５を回収した。カラムＢに再度２００μＬの２Ｍ  塩化マグネシウム／２０ｍＭ  トリス―塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を添加し，室温で１分間振とうして混和した。遠心（１０００ｘｇ，１分間，室温）し、溶出液を溶出液５と合わせた。この溶液の溶媒を、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）  Ｕｌｔｒａ  ０．５  ｍＬ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ（ＭＷＣＯ＝３ｋＤａ）（Millipore）を用いて１０ｍＭ  重炭酸アンモニウム溶液に置換し、精製ＡＡＴ溶液とした。【００６７】
ＥＬＩＳＡによるＡＡＴ濃度測定
血清及び精製ＡＡＴ溶液のＡＡＴ濃度をＨｕｍａｎ  Ｓｅｒｐｉｎ  Ａ１  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（R&D Systems, Inc., McKinley Place NE, MN）で測定した。Ｎｕｎｃ（登録商標）  ＭａｘｉＳｏｒｐTM  ３８４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にリン酸緩衝生理食塩水で４００ｎｇ／ｍＬとした捕捉抗体を１５μＬ／ウェルで加え、４℃で１晩静置した。９０μＬの洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で３回洗浄し、７０μＬの５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳでブロッキングした。９０μＬの洗浄液で２回洗浄し、５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで懸濁した試料を１５μＬ／ウェルで添加し、室温で２時間静置した。９０μＬの洗浄液で４回洗浄し、５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで１５０ｎｇ／ｍＬとした検出抗体を１５μＬ／ウェルで加え、室温で２時間静置した。９０μＬの洗浄液で４回洗浄し、５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで１０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を１５μＬ／ウェルで加え、室温で３０分間静置した。９０μＬの洗浄液で４回洗浄し、ＴＭＢ溶液（Dako, Santa Clara, California）を１５μＬ／ウェルで加え、室温で３０分間静置した。１５μＬの１Ｎ硫酸で反応を停止し、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｐｌｕｓ（Bio-Rad）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＡＡＴ定量における標品としてＳｉｇｍａ社（St. Louis, Missouri）から購入したヒト血漿由来ＡＡＴを用い、試料中のＡＡＴ濃度を定量した。【００６８】
ＡＡＴの糖鎖解析
１０μｇのＡＡＴに対して還元・アルキル化処理を行い、０．１μｇのトリプシンを加えて３７℃で一晩静置した。９０℃，１０分間の加熱によってトリプシンを失活させた後、１ＵのＰＮＧａｓｅＦ（Roche, Basel, Switzerland）を加えて３７℃で一晩静置した。９０℃，１０分間の加熱によって酵素を失活させた。ＡＡＴから遊離した糖鎖を実施例１の「ＡＡＴの糖鎖解析」と同様の方法で定量した。ＡＡＴに由来するＡ３Ｆの正確な定量を目的とし、１μｇあたり１５ｐｍｏｌのＡ３Ｆを含むと報告されている（Anal Chim Acta. (2015) 25;866:59-68.）α１−ａｃｉｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎに由来する糖鎖で検量線を作成し、Ａ３Ｆの定量値を算出した。【００６９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるＡ３Ｆ定量値（ｐｍｏｌ／μｇ  ＡＡＴ）と、ＥＬＩＳＡで測定した血清中ＡＡＴ濃度（ｍｇ／ｍＬ）から、ＡＡＴ−Ａ３Ｆの血清中濃度（μＭ）を算出し、その値をＮＡＦＬ患者とＮＡＳＨ患者とで比較した。ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆの検体ごとの血清中濃度を図３（Ａ）に、図３（Ａ）から作成した箱ひげ図を図３（Ｂ）に示す。また、ＮＡＦＬ及びＮＡＳＨそれぞれの平均値（Ｍｅａｎ）及び標準偏差（ＳＤ）を表２に示す。有意差の検定にはｔ検定を用いた。【００７０】
【表２】
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【００７１】
ＮＡＳＨ患者血清中のＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆ濃度は、ＮＡＦＬ患者と比較して有意に上昇していた。従って、ＡＡＴ結合糖鎖Ａ３Ｆが、ＮＡＳＨマーカーとしてＮＡＳＨ患者をＮＡＦＬ患者と区別するという点で有用であることが示された。
ＮＡＳＨの診断におけるＡＡＴ結合糖鎖Ａ３ＦのＲＯＣ曲線を図４に示した。ＲＯＣ曲線はＲ（Ｖｅｒ３．３．２）を用いて作成した。ＲＯＣ曲線から求めたＲＯＣ曲線下面積は０．６５５であった。ＲＯＣ曲線において、特異度と感度との和が最大となる点をカットオフ値とすると、その値は９μＭであった。カットオフ値を９μＭとした場合、ＮＡＳＨの診断における感度は５８％、特異度は７４％であった。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のマーカーは、ＮＡＳＨとＮＡＦＬを区別することができ、ＮＡＳＨの診断方法、ＮＡＳＨの進行又は軽減のモニタリング方法、ＮＡＳＨの治療効果の評価方法、ＮＡＳＨを治療するための物質の有効性の評価に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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