(57)【要約】（i）標的RNAの第１の部位に相補的な１０〜３０塩基の配列と、該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基のプライマー結合配列と、グアニン四重鎖形成配列などの検出用試薬結合配列に相補的な配列と、を含む一本鎖環状DNA鋳型と、（ii）標的RNAの、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８〜１５塩基の配列と、該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNA鋳型のプライマー結合配列に相補的な７〜８塩基の配列と、を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、（iii）グアニン四重鎖結合試薬などの検出用試薬と、を含むRNA検出用キット。
2016152936.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）標的RNAの第１の部位に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基のプライマー結合配列と、
検出用試薬結合配列と相補的な配列と、
を含む一本鎖環状DNA鋳型と、
（ii）標的RNAの、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８〜１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNA鋳型のプライマー結合配列に相補的な７〜８塩基の配列と、
を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）検出用試薬と、
を含むRNA検出用キット。
【請求項２】
（i）標的RNAの第１の部位に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基の第１プライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列と、
を含む第１一本鎖環状DNA鋳型と、
（ii）標的RNAの、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８〜１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第１一本鎖環状DNA鋳型の第１プライマー結合部位に相補的な７〜８塩基の配列と、
を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２プライマー結合配列と、
検出用試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む、第２一本鎖環状DNAと、
（iv）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の５’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列に相補的な配列と、
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（v）検出用試薬、と
を含む、RNA検出用キット。
【請求項３】
前記検出用試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列であり、前記検出用試薬がグアニン四重鎖結合試薬である、請求項１または２に記載のRNA検出用キット。
【請求項４】
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列がＣ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3配列を含む、請求項３に記載のRNA検出用キット。
【請求項５】
グアニン四重鎖結合試薬が下記一般式（I）で表される化合物を含む、請求項３または４に記載のRNA検出用キット。
【化１】
2016152936.tif 000014
Ｒ1は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭化水素基を示し、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して炭素数１〜５の炭化水素基を示し、
nは０〜５の整数を示し、
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示す。
【請求項６】
一般式（I）で表される化合物が下記式（II）または（III）で表される、請求項５に記載のRNA検出用キット。
【化２】
2016152936.tif 000015
【化３】
2016152936.tif 000016
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のキットを使用した標的RNAの検出方法であって、
標的RNAに前記一本鎖環状DNA鋳型および前記プライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的RNAに基づく核酸増幅反応を行う工程、および増幅された検出用試薬結合配列含有配列を検出用試薬によって検出する工程、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的RNAを簡便に効率よく検出するための試薬およびそれを用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、mRNAやmiRNAなどのRNA分子を標的とした疾患やストレスなどの検出法の開発が注目されている。RNAの定量検出法としてリアルタイムPCRを用いる方法が知られているが、クリニックでの簡易検査やセルフメディケーションに用いるには装置の価格や使用コストが高く、操作も煩雑である。【０００３】
一方、特許文献１ではローリングサークル増幅法によってRNAを検出する方法が開示されているが、アナライトのRNAをプライマーに使用しているため、検出対象にできる配列が３'末端に制約される。また、増幅効率や検出効率の面でも十分ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2012-080871号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、標的RNAを簡便な手法で効率よく検出するためのキットおよび方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、標的RNAと一本鎖環状DNAおよびプライマーとをハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させ、プライマーからローリングサークル増幅（RCA）法により増幅を行い、増幅産物に含まれる検出試薬結合配列（グアニン四重鎖含有配列など）をチオフラビンT（ThT）誘導体などの検出試薬を用いて検出することで、標的RNAの検出が簡便かつ効率的に行うことができることを見出し、本発明を完成させた。【０００７】
すなわち、本発明の第一の態様によれば、
（i）標的RNAの第１の部位に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基のプライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む一本鎖環状DNA鋳型と、
（ii）標的RNAの、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８〜１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNA鋳型のプライマー結合配列に相補的な７〜８塩基の配列と、
を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬と、
を含むRNA検出用キットが提供される。【０００８】
本発明の第二の態様によれば、
（i）標的RNAの第１の部位に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基の第１プライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列と、
を含む第１一本鎖環状DNA鋳型と、
（ii）標的RNAの、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８〜１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第１一本鎖環状DNA鋳型の第１プライマー結合部位に相補的な７〜８塩基の配列と、
を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２プライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む、第２一本鎖環状DNAと、
（iv）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の５’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列に相補的な配列と、
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（v）グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬、と
を含む、RNA検出用キットが提供される。【０００９】
また、本発明によれば、前記のキットを使用した標的RNAの検出方法であって、
標的RNAに前記一本鎖環状DNA鋳型および前記プライマーをハイブリダイズさせる工程、ローリングサークル増幅によって標的RNAに基づく核酸増幅反応を行う工程、および
増幅されたグアニン四重鎖含有配列などの検出試薬結合配列をグアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬によって検出する工程、
を含む方法、が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、標的RNA配列が存在すると、一本鎖環状DNAとプライマーがハイブリダイズして、そこから、幾つものグアニン四重鎖含有配列などの検出試薬結合配列が直列に繋がったDNA鎖が生成し、これをThT（誘導体）などの検出試薬で染色することにより、RNA配列を特異的に検出できる。昇温・降温などの温度サイクルを必要するPCR法ではなく、一定温度で反応が進行するRCA法を用いるため、簡易検出法への応用が可能である。また、通常の一本鎖核酸(DNA, RNA)や二重鎖核酸(DNA/DNA, DNA/RNA, RNA/RNA)に対しては殆ど発光を示さないThT（誘導体）などの検出試薬で染色することで、生成したグアニン四重鎖含有配列などの検出試薬結合配列を蛍光等により特異的に検出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の第一の態様にかかるRNA検出方法の模式図。
【図２】２７Ｍｙｃ（Ａ、Ｃ及びＥ）とｄｓＤＮＡ（Ｂ、Ｄ及びＦ）の濃度を上昇させたとき（０、１、３、６、９、１２及び１５μＭ）のＰＢＳ１５３ＮＭ中のＴｈＴ（Ａ及びＢ）、ＴｈＴ−ＤＢ（Ｃ及びＤ）、ＴｈＴ−ＨＥ（Ｅ及びＦ）（３μＭ）の蛍光スペクトルを示す図（中間調画像）。オリゴヌクレオチドの濃度：０μＭ（紫）、１μＭ（黒）、３μＭ（青）、６μＭ（水色）、９μＭ（緑）、１２μＭ（黄色）、および１５μＭ（赤）。
【図３−１】ＴＲＳ５０Ｋ（Ａ）、ＰＢＳ１５０Ｋ（Ｂ）、ＰＢＳ１４０ＫＭ（Ｃ）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（Ｄ）中で各種オリゴヌクレオチドと混合したときのＴｈＴの蛍光スペクトルを示す図（中間調画像）。
【図３−２】ＴＲＳ５０Ｋ（Ａ）、ＰＢＳ１５０Ｋ（Ｂ）、ＰＢＳ１４０ＫＭ（Ｃ）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（Ｄ）中で各種オリゴヌクレオチドと混合したときのＴｈＴ−ＤＢの蛍光スペクトルを示す図（中間調画像）。
【図３−３】ＴＲＳ５０Ｋ（Ａ）、ＰＢＳ１５０Ｋ（Ｂ）、ＰＢＳ１４０ＫＭ（Ｃ）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（Ｄ）中で各種オリゴヌクレオチドと混合したときのＴｈＴ−ＨＥの蛍光スペクトルを示す図（中間調画像）。
【図３−４】ＰＢＳ１５０Ｋ（Ａ）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（Ｂ）中で各種オリゴヌクレオチドと混合したときのｄｓＤＮＡに対するＴｈＴの相対蛍光強度を示す図（中間調画像）。
【図３−５】ＰＢＳ１５０Ｋ（Ａ）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（Ｂ）中で各種オリゴヌクレオチドと混合したときのｄｓＤＮＡに対するＴｈＴ−ＤＢの相対蛍光強度を示す図（中間調画像）。
【図３−６】ＰＢＳ１５０Ｋ（Ａ）及びＰＢＳ１５３ＮＭ（Ｂ）中で各種オリゴヌクレオチドと混合したときのｄｓＤＮＡに対するＴｈＴ−ＨＥの相対蛍光強度を示す図（中間調画像）。
【図４】実施例１の標的RNA、一本鎖環状DNA鋳型、および各種プライマーの配列を示す図。
【図５】実施例における標的RNA検出結果を示す図（写真）。(A)色素にSYBR Gold（商標）を用いた場合、(B) 色素にThT誘導体を用いた場合。各反応液の組成は表２に対応している。
【図６】実施例２の標的RNA、一本鎖環状DNA鋳型、および各種プライマーの配列を示す図。
【図７】実施例２の実験結果を示す図（写真）。
【図８】実施例３（サンプル＜５＞）の一本鎖環状DNA鋳型、およびプライマーの配列を示す図。
【図９】実施例３（サンプル＜６＞）の標的RNA、一本鎖環状DNA鋳型、および各種プライマーの配列を示す図。
【図１０】実施例３（サンプル＜７＞）の一本鎖環状DNA鋳型、および各種プライマーの配列を示す図。
【図１１】実施例３（サンプル＜８＞）の一本鎖環状DNA鋳型、および各種プライマーの配列を示す図。
【図１２】実施例３（サンプル＜９＞）の標的RNA、一本鎖環状DNA鋳型、および各種プライマーの配列を示す図。
【図１３】実施例３の実験結果を示す図（写真）。
【図１４】本発明の第二の態様にかかるRNA検出方法の模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜検出キット〜第１の態様＞
本発明の第１の態様にかかる標的RNA検出キットは、
（i）標的RNAの第１の部位に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基のプライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む一本鎖環状DNA鋳型と、
（ii）標的RNAの、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８〜１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、一本鎖環状DNA鋳型のプライマー結合配列に相補的な７〜８塩基の配列と、
を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬と、
を含む。
【００１３】
＜標的RNA＞
標的RNAは、特に限定されず、mRNA、リボソームRNA（rRNA）、トランスファーRNA（tRNA）を含むあらゆる種類のRNAを標的として検出することが可能である。検出対象のmRNAは、ポリＡ配列を有していても、有していなくてもよい。RNAは、siRNA、miRNA、piRNA、rasiRNA、rRNA、tRNAを含むノンコーディングRNAであってもよく、さらに、ウイルスなどのゲノムRNAであってもよい。また、検出対象のRNAの形状は、直鎖状または環状のどちらでも可能である。疾患特異的に発現するRNAや疾患で発現量が変化するRNA、感染症などの疾患や中毒症などを引き起こすウイルスや病原菌由来のRNAなどが例示される。
【００１４】
標的RNAは生物種由来の試料から調製または単離されたものでもよい。そのようなRNAを含む試料には、ウイルス、原核生物または真核生物の個体そのもの、あるいはその一部が使用できる。例えば、脊椎動物（ヒトを含む）では、糞便、尿、または汗のような排泄物、血液、精液、唾液、胃液、または胆汁のような体液等が挙げられる。また、外科的に生体から取り出した組織、または体毛のように生体から脱落した組織であってもよい。さらに、食品等の加工物から調製したRNA含有調製物であってもよい。また、前記試料をさらに分画して、その一部を取り出したものから調製したRNA含有調製物であってもよい。試料は、標的となるRNAを含有していれば、RNAが精製されていても、精製されていなくても用いることができる。目的RNAの分解を避けるため、リボヌクレアーゼ活性の低減した試料であってもよい。例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤で処理し、リボヌクレアーゼ活性を抑制させた試料であってもよい。
【００１５】
標的RNAは一本鎖環状DNA鋳型およびプライマーがハイブリダイズできるものであれば、長さも特に限定されない。ステムループ構造のループ部分に一本鎖環状DNA鋳型がハイブリダイズしやすいので、ステムループ構造を取るRNAが好ましい。
【００１６】
＜一本鎖環状DNA鋳型＞
一本鎖環状DNA鋳型は、標的RNAの第１の部位に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基のプライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、を含む。
【００１７】
図１を参照して説明する。なお、一本鎖環状DNA鋳型では、時計回りに５’→３’である。一本鎖環状DNA鋳型１０は標的RNA１１の第1の部位１１１に相補的な配列１０１と、その５’側に連結したプライマー結合配列１０２と、グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列１０３を含む。配列１０１の長さは、通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。配列１０２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。
【００１８】
グアニン四重鎖形成配列としては、Nat Rev Drug Discov. 2011 Apr; 10(4): 261-275.に記載されたような配列が挙げられ、Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3Ｎ1-10Ｇ3で表されるが、具体的には、配列番号１〜６に記載の配列などが例示される。よって、グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列としては、Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3Ｎ1-10Ｃ3が例示される。すなわち、連続する３つのＣが、１〜１０個（好ましくは１〜５個）の任意の塩基（Ｎ＝Ａ，Ｔ，ＧまたはＣ）からなる配列をスペーサーとして、４回繰り返される配列である。
【００１９】
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列はその前後、すなわち、プライマー結合配列１０２との間および標的RNAの第1の部位に相補的な配列１０１との間に任意の配列を含んでもよい。一本鎖環状DNA鋳型１０全体の長さは、好ましくは３５〜１００塩基である。
【００２０】
なお、図１では、検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列である場合について説明したが、検出試薬結合配列をアプタマー配列もしくは分子ビーコン（FRETを生じさせる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチド）結合配列とし、検出試薬として、アプタマー結合性発色分子もしくは分子ビーコンを用いて検出することも可能である。
【００２１】
一本鎖環状DNA鋳型１０は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。一本鎖ＤＮＡの環状化は、任意の手段によって行うことができるが、例えば、CircLigase（登録商標）、CircLigase II（登録商標）、ssDNA Ligase（Epicentre社）、ThermoPhage ligase（登録商標） single-stranded DNA（Prokzyme社）を用いて行うことができる。
【００２２】
＜オリゴヌクレオチドプライマー＞
プライマー１２は、標的RNA１１の、第１の部位１１１の３’側に隣接した第２の部位１１２に相補的な８〜１５塩基の配列１２１と、その３’側に連結された、一本鎖環状DNA鋳型１０のプライマー結合部位１０２に相補的な７〜８塩基の配列１２２と、を含む。なお、プライマーは担体に固定化するなどして固層化されてもよい。これにより固層での検出も可能となる。固層化法としては、ビオチンなどでプライマーを標識し、アビジン等との相互作用により固層化する方法などが挙げられる。
【００２３】
＜増幅方法＞
標的RNA１１に一本鎖環状DNA鋳型１０およびプライマー１２をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅（RCA）法によって標的RNAに基づく核酸増幅反応を行う。
【００２４】
ハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば、一本鎖環状DNA鋳型と標的RNAとプライマーの組み合わせを検討し、適宜設定できる。
【００２５】
RCA法はLizardi et al., Nature Genet. 19: 225-232 (1998);米国特許第５，８５４，０３３号及び同第６，１４３，４９５号；ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１９１９３などに記載されている。RCA法は、例えば、phi29 polymerase、Klenow DNA Polymerase (5'-3', 3'-5' exo minus) 、Sequenase（登録商標）Version 2.0 T7 DNA Polymerase (USB社)、Bsu DNA Polymerase, Large Fragment (NEB社)などの中温性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素や、Bst DNA Polymerase (Large Fragment) 、Bsm DNA Polymerase, Large Fragment (Fermentas社)、BcaBEST DNA polymerase (TakaraBio社)、Vent DNA polymerase (NEB社)、Deep Vent DNA polymerase (NEB社)、DisplaceAce (登録商標) DNA Polymerase (Epicentre社)等の耐熱性の鎖置換型ＤＮＡ合成酵素を用いることで行うことができる。
【００２６】
RCAによるＤＮＡの伸長反応は、サーマルサイクラーを用いる必要はなく、例えば、２５℃〜６５℃の範囲の一定の温度において実施される。反応温度は、酵素の至適温度とプライマー鎖長に基づく変性温度（プライマーが鋳型ＤＮＡに結合（アニール）／解離する温度帯）に基づいて通常の手順により適宜設定される。さらに、一定の比較的低温においても実施される。例えば、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素としてphi29ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、好ましくは２５℃〜４２℃、より好ましくは約３０〜３７℃で反応する。RCAによって、標的RNA１１依存的に、プライマー１２から一本鎖環状DNA鋳型１０に沿ってグアニン四重鎖形成配列（配列１０３に対応）を含む核酸（増幅産物１３）が増幅される。増幅産物１３はグアニン四重鎖を含む配列１０４を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬１０５によって検出される。
【００２７】
＜検出キット〜第２の態様＞
本発明の第２の態様にかかる標的RNA検出キットは、
（i）標的RNAの第１の部位に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基の第１プライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列と、
を含む第１一本鎖環状DNA鋳型と、
（ii）標的RNAの、第１の部位の３’側に隣接した第２の部位に相補的な８〜１５塩基の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第１一本鎖環状DNA鋳型の第１プライマー結合部位に相補的な７〜８塩基の配列と、
を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（iii）第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２プライマー結合配列と、
グアニン四重鎖形成配列などの検出試薬結合配列に相補的な配列と、
を含む、第２一本鎖環状DNAと、
（iv））第１一本鎖環状DNAの第２一本鎖環状DNA結合配列の５’側に隣接した部位と同一の配列と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列に相補的な配列と、
を含む、第２のオリゴヌクレオチドプライマーと、
（v）グアニン四重鎖結合試薬などの検出試薬、とを含む。
【００２８】
＜標的RNA＞
標的RNAについては、第一の態様で説明したとおりである。
【００２９】
＜第１一本鎖環状DNA鋳型＞
第１一本鎖環状DNA鋳型は、標的RNAの第１の部位に相補的な１０〜３０塩基の配列と、
該配列の５’側に隣接した、７〜８塩基のプライマー結合配列と、
第２一本鎖環状DNA結合配列と、
を含む。
【００３０】
図１４を参照して説明する。
第１一本鎖環状DNA鋳型２０は標的RNA２１の第1の部位２１１に相補的な配列２０１と、
その５’側に連結したプライマー結合配列２０２と、第２一本鎖環状DNA結合配列２０３を含む。
配列２０１の長さは、通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。配列２０２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。第１一本鎖環状DNA鋳型２０全体の長さは、好ましくは３５〜１００塩基である。第１一本鎖環状DNA鋳型２０は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
【００３１】
＜第１オリゴヌクレオチドプライマー＞
第１オリゴヌクレオチドプライマー２２は、標的RNA２１の、第１の部位２１１の３’側に隣接した第２の部位２１２に相補的な８〜１５塩基の配列２２１と、その３’側に連結された、第１一本鎖環状DNA鋳型２０のプライマー結合部位２０２に相補的な７〜８塩基の配列２２２と、を含む。
【００３２】
＜第２一本鎖環状DNA鋳型＞
第２一本鎖環状DNA鋳型２４は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一本鎖環状DNA結合配列２０３と同一の配列２４１と、
該配列の３’側に隣接した、第２プライマー結合配列２４２と、
グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３と、
を含む。
配列２０３の長さは、通常、１０〜３０塩基であり、好ましくは１５〜２５塩基であり、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。配列２４２の長さは７塩基または８塩基であり、配列は特に制限されないが、GC含量は好ましくは３０〜７０％である。グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列２４３については、第一の態様で説明したのと同様である。第２一本鎖環状DNA鋳型２４全体の長さは、好ましくは３５〜１００塩基である。第２一本鎖環状DNA鋳型２４は上述した方法で、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を環状化することによって得ることができる。
【００３３】
なお、図１４では、検出試薬結合配列がグアニン四重鎖形成配列である場合について説明したが、検出試薬結合配列をアプタマー配列もしくは分子ビーコン（FRETを生じさせる蛍光基（ドナー）と消光基（アクセプター）を有するヘアピン状のオリゴヌクレオチド）結合配列とし、検出試薬として、アプタマー結合性発色分子もしくは分子ビーコンを用いて検出することも可能である（ChemBioChem 2007, 8, 1795-1803；J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 7430-7433）。
【００３４】
＜第２オリゴヌクレオチドプライマー＞
第２オリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一本鎖環状DNA結合配列２０３の５’側に隣接した部位２０４と同一の配列２５１（好ましくは８〜１５塩基の配列）と、
該配列の３’側に隣接した、第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列２４２に相補的な配列２５２（好ましくは７〜８塩基の配列）と、
を含む。
【００３５】
＜増幅方法＞
図１４に示されるように、まず、標的RNA２１に第１一本鎖環状DNA鋳型２０およびプライマー２２をハイブリダイズさせて三者の複合体を形成させた後、ローリングサークル増幅（RCA）法によって標的RNAに基づく核酸増幅反応を行う。反応条件等は第一の態様と同様である。
RCAによって、標的RNA２１依存的に、プライマー２２から第１一本鎖環状DNA鋳型２０に沿って第１増幅産物２３が増幅される。
【００３６】
増幅産物２３は、第１一本鎖環状DNA鋳型２０の第２一本鎖環状DNA結合配列２０３に相補的な配列２３３を含むため、この配列２０３と同一の配列２４１を含む第２一本鎖環状DNA２４は、第１増幅産物２３の配列２３３に、配列２４１を介してハイブリダイズする。
このようにしてできた、第１増幅産物２３と、第２一本鎖環状DNAの複合体に、第２オリゴヌクレオチドプライマー２５がハイブリダイズして三者の複合体ができる。
【００３７】
すなわち、第２オリゴヌクレオチドプライマー２５は、第１一本鎖環状DNA２０の第２一本鎖環状DNA結合配列２０３の５’側に隣接した部位２０４と同一の配列２５１を有するので、第１増幅産物２３の、第１一本鎖環状DNA２０の部位２０４に相補的な領域２３２に、配列２５１を介してハイブリダイズする。
また、第２オリゴヌクレオチドプライマー２５は、配列２５１の３’側に、第２一本鎖環状DNA２４の第２プライマー結合配列２４２に相補的な配列２５２を有するので、第２一本鎖環状DNA２４にも配列２５２を介してハイブリダイズする。
【００３８】
この第１増幅産物２３と、第２一本鎖環状DNA２４と、第２オリゴヌクレオチドプライマー２５との三者複合体から、RCAにより、第２増幅産物２６が増幅される。第２増幅産物２６はグアニン四重鎖を含む配列２６１を含んでおり、グアニン四重鎖検出試薬２６２によって検出される。第二の態様では、第１増幅産物２３に含まれる領域２３１のそれぞれに第２一本鎖環状DNA２４がハイブリダイズしてRCA反応が起こるので、検出感度の著しい工場が達せられる。
【００３９】
＜検出方法＞
上記第一および第二の態様のいずれにおいても、RCAによって得られる増幅産物にはグアニン四重鎖が含まれるので、グアニン四重鎖結合試薬を用いて検出することができる。グアニン四重鎖結合試薬としては、以下のような試薬が挙げられる。
［１］チオフラビンT（ThT）またはその誘導体
【化１】
2016152936.tif 000003
［２］H-aggregate 『 Yan, J. W.; Ye, W. J.; Chen, S. B.; Wu, W. B.; Hou, J. Q.; Ou, T. M.; Tan, J. H.; Li, D.; Gu, L. Q.; Huang, Z. S. Anal. Chem. 2012, 84, 6288-6292.』
【化２】
2016152936.tif 000004
［３］TMPyP4 『Yaku, H.; Fujimoto, T.; Murashima, T.; Miyoshi, D.; Sugimoto, N. Chem. Commun. 2012, 48, 6203-6216.』
【化３】
2016152936.tif 000005
［４］ PPIX 『Li, T.; Wang, E.; Dong, S. Anal. Chem. 2010, 82, 7576-7580.』
【化４】
2016152936.tif 000006
［５］BPBC『Jin, B.; Zhang, X.; Zheng, W.; Liu, X.; Qi, C.; Wang, F.; Shangguan, D. Anal. Chem. 2014, 86, 943-952.』
［６］APD『Nikan, M.; Di Antonio, M.; Abecassis, K.; McLuckie, K.; Balasubramanian, S. Angew. Chem., Int. Ed. 2013, 52, 1428-1431.』
【化５】
2016152936.tif 000007
［７］チアゾールオレンジ（TO）
『Nakayama S.;Kelsey I.; Wang J.; Roelofs K.; Stefane B.; Luo Y.;Lee V  .T.;Sintim H.O. J.Am.Chem.Soc. 2011,133,4856-4864.』
【００４０】
好ましくは、以下の一般式（I）で示されるＴｈＴ誘導体が使用できる（Anal. Chem. 2014, 86, 12078-12084）。
【化６】
2016152936.tif 000008
ここで、Ｒ1は水素、またはＯ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでもよい炭素数１〜１０（好ましくは１〜５）の炭化水素基を示す。炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよく、アルキル基などの脂肪族炭化水素基でもよいし、アリール基やアリールアルキル基などの芳香族炭化水素基でもよい。「Ｏ、ＳおよびＮから選ばれる１種類以上を含んでいてもよい」とは、炭化水素基が、アミノ基（−ＮＲ2）（Ｒは独立して水素または炭素数１〜５のアルキル基）、ニトロ基（−ＮＯ2）、シアノ基（−ＣＮ）、イソシアネート基（−ＮＣＯ）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、アルデヒド基（−ＣＨＯ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、メルカプト基（−ＳＨ）、スルホン酸基（−ＳＯ3Ｈ）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む官能基を含んでいてもよいことを意味するほか、エーテル基（−Ｏ−）、イミノ基（−ＮＨ−）、チオエーテル基（−Ｓ−）、カルボニル基（−Ｃ（＝Ｏ）−）、アミド基（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、エステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、チオエステル基（−Ｃ（＝Ｏ）−Ｓ−）等の窒素原子、酸素原子、硫黄原子等を含む連結基が炭化水素基の炭素骨格の内部又は末端に含まれていてもよいことを意味する。
【００４１】
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4はそれぞれ独立して炭素数１〜５の（脂肪族）炭化水素基を示し、より好ましくは炭素数１〜３の炭化水素基を示し、メチル基が特に好ましい。炭素数１〜５の炭化水素基は直鎖でも分岐鎖でもよいし、飽和でも不飽和でもよい。
【００４２】
ｎは０〜５の整数を示し、より好ましくは０〜３の整数を示し、特に好ましくは１である。
ＸはＯ、ＳまたはＮＨを示し、より好ましくはＯである。
【００４３】
具体的には以下のような化合物が例示される。
【化７】
2016152936.tif 000009
【化８】
2016152936.tif 000010
【００４４】
検出は、例えば、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩と、RCA産物を含む試料を接触させ、グアニン四重鎖構造に結合した化合物を、化合物が発する蛍光に基づいて検出することにより、被検ＤＮＡ中のグアニン四重鎖構造を検出することができる。検出操作自体は、一般式（Ｉ）で示される化合物又はその塩を用いる点を除けば、公知の方法と同様であり、化合物を緩衝液中に溶解した溶液を、被検ＤＮＡを含む試料と接触させ、インキュベーション後、洗浄し、洗浄後に被検ＤＮＡと結合している蛍光色素の蛍光を検出することにより行うことができる。
【００４５】
［参考例］
以下、本発明の方法に使用し得る、グアニン四重鎖検出試薬の一例として、ThT誘導体の合成例と、ThT誘導体を用いたグアニン四重鎖検出の実験例を示す。
【００４６】
１．機器等
ＮＭＲスペクトルはＪＮＭ−ＥＣＳ４００およびＪＮＭ−ＥＣＡ６００（日本電子株式会社、東京、日本）を使用して測定された。ＥＳＩマススペクトルはＡＰＩ２０００質量分析計（アプライドバイオシステムズ株式会社、東京、日本）を使用して測定された。蛍光スペクトルはＬＳ−５５蛍光分光光度計（株式会社パーキンエルマージャパン、神奈川、日本）を使用して測定された。
【００４７】
２．材料
２−アミノ−６−メチルベンゾチアゾール、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（ＤＨＰ）、ブロモ酢酸メチル、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ）、および水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4）は東京化成工業株式会社（東京、日本）から購入したものである。シリカゲル６０、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）は関東化学株式会社（東京、日本）から購入したものである。アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、塩化アンモニウム、ジクロロメタン（ＣＨ2Ｃｌ2）、ジエチルエーテル、リン酸水素二カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）、エタノール（ＥｔＯＨ）、エチレングリコール、塩酸（ＨＣｌ水溶液）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ）、硫酸マグネシウム七水和物、メタノール（ＭｅＯＨ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2ＰＯ4）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸二水素ナトリウム二水和物（ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ）、硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4）およびチオフラビンＴ（ＴｈＴ）は和光純薬工業株式会社（大阪、日本）から購入したものである。ウシ胸腺ＤＮＡ（ウシの胸腺由来のデオキシリボ核酸、ＸＶ型）、４−（ジメチルアミノ）ベンゾイルクロリドおよびＴｒｉｚｍａ（登録商標）塩基はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．（ミズーリ州、米国）から購入したものである。オリゴヌクレオチドは株式会社日本バイオサービス（埼玉、日本）および株式会社ジーンデザイン（大阪、日本）から購入したものである。
【００４８】
３．チオフラビンＴ誘導体の合成
我々はＴｈＴ中の候補置換部位として４つのメチル基に焦点を当てた。分子動態（ＭＤ）シミュレーションに基づいて、ベンゾチアゾール環上のＮ３位のメチル基のみがＧカルテット平面と有意に重なり合うことが示唆された。したがって、我々はこの位置に置換基を導入することが異なるＧ４タイプを区別するための特異性を改善させることになるかもしれないと考えた。
そこで、最初に７ステップ反応により２−アミノ−６−メチルベンゾチアゾールからＴｈＴ−ＤＢとＴｈＴ−ＨＥを合成した。
【化９】
2016152936.tif 000011
【００４９】
化合物Ｔ１の合成：乾燥ＭｅＣＮ中の２−アミノ−６−メチルベンゾチアゾール（５３０ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）の溶液にブロモ酢酸メチル（３５０μＬ、３．７ｍｍｏｌ）を添加し、４時間還流した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させた。残留物をＭｅＣＮと懸濁し、そして、濾過した。得られた沈殿物を真空下で乾燥させてＴ１（８３７ｍｇ、定量的収量）を得た； 1H NMR (400 MHz, メタノール-d4) 6 7.63 (1H, s) 7.40-7.33 (2H, q) 5.12 (2H, s) 3.80 (3H, s) 2.41 (3H, s); ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 237.1, [M+]の計算値 = 237.07。
【００５０】
化合物Ｔ２の合成：乾燥ＭｅＯＨ（６．８ｍＬ）中の化合物Ｔ１（５０２ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ）の溶液にＮａＢＨ4（９６０ｍｇ、２５ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、残留物を酢酸エチルと懸濁した。懸濁液を冷水に注ぎ、有機層を水で洗浄し、次に硫酸ナトリウム上で乾燥させた。濾過とその後の溶媒の蒸発により黄色の粉末として化合物Ｔ２を得た（７２７ｍｇ、７５％）； 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 6 7.09 (1H, s) 7.04-7.02 (1H, d) 6.79-6.77 (1H, d) 4.15-4.13 (2H, t) 3.99-3.96 (2H, t) 2.33 (3H, s); ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 209.2, [M+]の計算値 = 209.07。
【００５１】
化合物Ｔ３の合成：５０％ＫＯＨ（重量／体積）水溶液（４７ｍＬ）とエチレングリコール（５０ｍＬ）の混合液に化合物Ｔ２（７１１ｍｇ、３．４ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下で２４時間還流し、そして、通気しながら２４時間さらに撹拌した。反応混合物を室温まで冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液で希釈し、そして、ジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして、濾過した。濾過物を乾燥するまで蒸発させ、結果生じた残留物をジクロロメタン中のメタノールの０％〜５％の濃度勾配によるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して黄色の油として化合物Ｔ３を得た（２５０ｍｇ、４０％）； 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 6 7.11-7.10 (2H, d) 7.07-7.04 (2H, q) 6.60-6.57 (2H, d) 3.72-3.61 (4H, m) 3.28-3.22 (4H, d) 2.17 (6H, s); ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 365.2, [(M+H)+] の計算値 = 365.53。
【００５２】
化合物Ｔ４の合成：乾燥ジクロロメタン（３．６ｍＬ）中の化合物Ｔ３（１９０ｍｇ，０．５２ｍｍｏｌ）の溶液にｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（７８ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）と３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン（４００μＬ、４．７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で５時間撹拌した。反応混合物をジエチルエーテルで希釈した。有機層を半飽和食塩水で洗浄して触媒を取り除き、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして、乾燥するまで蒸発させて黄色の油として化合物Ｔ４を得た（２７６ｍｇ、粗生成物）；ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 533.3, [(M+H)+] の計算値 = 533.24。
【００５３】
化合物Ｔ５の合成：乾燥エタノール（４．７ｍＬ）中の粗化合物Ｔ４（１５８ｍｇ）の溶液にＮａＢＨ4（２２４ｍｇ、５．９ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、混合物を室温で８時間撹拌した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、残留物を酢酸エチルと懸濁し、そして、冷水に注いだ。有機層を水で洗浄し、次に硫酸ナトリウム上で乾燥させた。濾過とその後の溶媒の蒸発により黄色の油として化合物Ｔ５を得た（１４９ｍｇ、粗生成物）； ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 268.0, [(M+H)+]の計算値 = 268.12。
【００５４】
ＴｈＴ−ＤＢおよびＴｈＴ−ＨＥの合成：乾燥ＭｅＣＮ（２．６ｍＬ）中の粗化合物Ｔ５（８６ｍｇ）の溶液に４−（ジメチルアミノ）ベンゾイルクロリド（８９ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１８時間撹拌した。反応混合物を水で希釈し、生成物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、そして、濾過した。濾過物を乾燥するまで蒸発させ、残留物をジクロロメタン中のメタノールの０％〜２０％の濃度勾配によるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して中間体Ｔ６と黄色の油としてＴｈＴ−ＤＢ（５７ｍｇ、粗精製品）を得た； T6: ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 397.2, [M+]の計算値 =397.19; ThT-DB: ESI-MS (陽イオンモード) m/z, found=460.1, [M+]の計算値 =460.21。次に、Ｔ６とＴｈＴ−ＤＢ（５４ｍｇ）の混合物を２５０μＬのＴＦＡ／水／ＭｅＯＨ（２／１／２、体積／体積／体積）中に溶解し、混合物を室温で８時間撹拌した。反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、結果生じた残留物を、オクタデシルシリカ（ＯＤＳ）ゲルカラムを装着したＨＰＬＣシステムにより精製してそれぞれ黄色の粉末としてＴｈＴ−ＨＥ（２ｍｇ、Ｔ４より１．７％）およびＴｈＴ−ＤＢ（６．８ｍｇ、Ｔ４より５．７％）を得た；
ThT-HE: 1H NMR (600 MHz, CDCl3) 6 8.13-8.12 (1H, d) 7.90-7.89 (2H, d) 7.73 (1H, s) 7.62-7.61 (1H, d) 6.86-6.85 (2H, d) 4.94 (2H, s) 4.37 (2H, s) 3.16 (6H, s) 2.57 (3H, s); ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値 = 313.1, [M+]の計算値= 313.14; 
ThT-DB: 1H NMR (600 MHz, CDCl3) 6 8.20-8.19 (1H, d) 7.79 (1H, s) 7.70-7.69 (2H, d) 7.61-7.60 (1H, d) 7.55-7.54 (2H, d) 6.75-6.74 (2H, d) 6.53-6.52 (2H, d) 5.49 (2H, s) 4.74 (2H, s) 3.12 (6H, s) 3.04 (6H, s) 2.55 (3H, s); ESI-MS (陽イオンモード) m/z, 実測値=460.1, [M+]の計算値=460.21。
【００５５】
４．ＴＨＴ誘導体の評価
次に、様々なＧ４形成オリゴヌクレオチドが存在する状態でのＴｈＴとＴｈＴ誘導体の蛍光特性とＧ４における化合物誘導性のトポロジー変化を調べた。
【００５６】
Ｇ４を形成する次の６種類のヒト由来オリゴヌクレオチドを使用した：
22mer DNA（２２ＡＧ：5'-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3' （配列番号１）および２２Ｋｉｔ：5'-AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3'（配列番号２））、
26mer DNA（２６Ｔｅｌ：5'-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTT-3'（配列番号３））、
27mer DNA（２７Ｍｙｃ：5'-TGGGGAGGGTGGGGAGGGTGGGGA AGG-3'（配列番号４））、
20mer DNA（２０Ｓｒｃ：5'-GGGCGGCGGGCTGGGCGGGG-3'（配列番号５））、および
18mer RNA（１８Ｒａｓ：5'-GGGAGGGGCGGGUCUGGG-3'（配列番号６））。
【００５７】
これらはヒト遺伝子から得られた：
テロメア領域（２２ＡＧおよび２６Ｔｅｌ）、
ｃ−ＭｙｃＰ１プロモーターのヌクレアーゼ高感受性エレメント領域（２７Ｍｙｃ）、
チロシンキナーゼをコードするプロトオンコジーンの転写開始部位の８７ヌクレオチド上流域（２２Ｋｉｔ）、
非受容体型チロシンキナーゼをコードするプロトオンコジーン（２０Ｓｒｃ）、および
ヒトＮＲＡＳプロトオンコジーン転写物の５’非翻訳領域（１８Ｒａｓ）。
【００５８】
これらの配列の他に、次の２種類のオリゴヌクレオチドを基準として使用した：
17mer DNA（ssDNA：5’-GGGTTACTACGAACTGG-3’（配列番号７））、及び
ssDNA の相補配列（cDNA：5’-CCAGTTCGTAGTAACCC-3’（配列番号８））。
ssDNAは一本鎖ＤＮＡとして使用し、cDNAはssDNAと１：１の比率で混合し、二本鎖DNA（dsDNA）として使用した。
【００５９】
緩衝条件のＧ４の立体構造への効果とそれによる蛍光放射への効果を分析するために４種類の緩衝液溶液を使用した：
ＴＲＳ５０Ｋ（５０ｍＭトリス塩酸、５０ｍＭ  ＫＣｌ；ｐＨ７．２）；
ＰＢＳ１５０Ｋ（９２ｍＭ  ＨＰＯ42-、１５０ｍＭ  Ｋ+、１５ｍＭ  Ｎａ+；ｐＨ７．０）；
ＰＢＳ１４０ＫＭ（８０ｍＭ  ＨＰＯ42-、２．５ｍＭ  ＳＯ４2-、１４０ｍＭ  Ｋ+、１０ｍＭ  Ｎａ+、２．５ｍＭ  Ｍｇ2+；ｐＨ７．４）、および
ＰＢＳ１５３ＮＭ（１０ｍＭ  ＨＰＯ42-、１４６ｍＭ  Ｃｌ-、１５３ｍＭ  Ｎａ+、２．７ｍＭ  Ｋ+、２．５ｍＭ  Ｍｇ2+；ｐＨ７．４）。
ＰＢＳ１５０ＫとＰＢＳ１４０ＫＭは細胞内イオン成分と似ており、ＰＢＳ１５３ＮＭは典型的なリン酸生理食塩水である。
【００６０】
４−１．蛍光スペクトル分析
８種類のオリゴヌクレオチド（２２ＡＧ、２６Ｔｅｌ、２７Ｍｙｃ、２２Ｋｉｔ、２０Ｓｒｃ、１８Ｒａｓ、ｓｓＤＮＡ、およびｄｓＤＮＡ）を２１μＭの濃度でそれぞれ緩衝液ＴＲＳ５０Ｋ、ＰＢＳ１５０Ｋ、ＰＢＳ１４０ＫＭ、およびＰＢＳ１５３ＮＭに溶解し、サーマルサイクラーを使用して９５℃で０．５分間加熱して変性し（１８Ｒａｓについては４０℃で）、０．５℃／分の割合で２５℃まで冷却することによってリフォールディングさせた。これらの溶液を適切なオリゴヌクレオチド濃度まで希釈し、アリコット（５０μＬずつ）を２５℃で３０分間保温し、次にそれぞれ緩衝液ＴＲＳ５０Ｋ、ＰＢＳ１５０Ｋ、ＰＢＳ１４０ＫＭ、およびＰＢＳ１５３ＮＭの中の色素（ＴｈＴ、ＴｈＴ−ＤＢ、およびＴｈＴ−ＨＥ；１０．５μＭ）の２０μＬの溶液と混合した。さらに、これらの混合物を２５℃で３０分間保温した。色素の放射スペクトルは、４１５ｎｍで励起し、４５０ｎｍと６００ｎｍの間で蛍光をモニターすることにより得た。
図２にＴｈＴ、ＴｈＴ−ＤＢ、およびＴｈＴ−ＨＥを２７ＭｙｃまたはｄｓＤＮＡと混合したときの結果を示し、図３−１〜３−３にＴｈＴ、ＴｈＴ−ＤＢ、およびＴｈＴ−ＨＥを各種緩衝液中で、各種オリゴヌクレオチドと混合したときの結果を示す。
図２より、ＴｈＴはｄｓＤＮＡ存在下でもかなりの蛍光を発しバックグラウンドが高いのに対し、ＴｈＴ−ＤＢ、およびＴｈＴ−ＨＥはｄｓＤＮＡ存在下ではほとんど蛍光を発しないのでグアニン四重鎖特異性が高いことがわかった。
【００６１】
図３−４〜３−６では、ｄｓＤＮＡと相互作用した色素の強度を１と設定し、４８５ｎｍ（ＴｈＴおよびＴｈＴ−ＨＥ）または５００ｎｍ（ＴｈＴ−ＤＢ）での放射光のピークとしての相対蛍光強度を表した。Ｘ軸はオリゴヌクレオチド濃度を表す。
Ｋｄ値を図３−４〜３−６中の滴定曲線から決定し、表１に記載した。
表１の結果から、ＴｈＴ−ＨＥの標的Ｇ４への親和性は概してＴｈＴの標的Ｇ４への親和性と比べて低かったが、ＴｈＴ−ＤＢの標的Ｇ４への親和性はほぼ同等であった。
【００６２】
【表１】
2016152936.tif 000012
n.d.:正確な値は測定不能であったが、Ｋｄ＞４０ｎＭと推定される。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例の態様には限定されない。【００６４】
＜実施例１＞
1.環状DNAテンプレートの作製
（１）5μMの1本鎖DNA(55mer)を20μL(最終濃度0.5μM)、10×添付Bufferを20μL、50mM MnCl2を10μL(最終濃度2.5mM)、5M Betaine 40μL(最終濃度1M)、100U/μLのCircLigaseを10μL(最終濃度5U/μL)、水100μLを混合した(計200μL)。
（２）60℃で16時間インキュベートさせた。
（３）PAGE精製を行い、一本鎖環状DNAの生成を確認した。
1本鎖DNA(55mer)
phosphate-CCCCAAAAAGGAGCTTGAGGTTCTCCTTTAAAACCTTCCCCACCCTCCCCACCCT（配列番号９）
用いた試薬
CircLigase II ssDNA Ligase(Epicentre Technologies, WI, USA)【００６５】
2.RCA
（１）溶液の調製
Positive Control(POS_SYBR GoldおよびPOS_ThT誘導体)
200nMの環状DNAテンプレート 2μL(最終濃度20nM)、1.6μMのDNAプライマー＜１＞ 2μL(最終濃度160nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水8μLを混合した(計20μL)。
テンプレートとプライマーのみ(Sa1〜6およびTa1〜6)
200nMの環状DNA 2μL(最終濃度20nM)、1.6μMのDNAプライマー(表２参照) 2μL(最終濃度160nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液 2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水8μLを混合した(計20μL)。
テンプレートとプライマーとターゲットRNA(Sb1〜6およびTb1〜6)
200nMの環状DNA 2μL(最終濃度20nM)、1.6μMのDNAプライマー(表２参照) 2μL(最終濃度160nM)、800nMのターゲットRNA 2μL(80nM)、10×添付バッファー2μL、10×添付BSA溶液
2μL、10mMのdNTPs 2μL(最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 2μL(最終濃度0.1U/μL)、水6μLを混合した(計20μL)。【００６６】
【表２】
2016152936.tif 000013
【００６７】
各プライマーと、標的RNAと、環状DNAの位置関係を図４に示す。
DNAプライマー＜１＞(20mer) GGA AGG TTT TAA AGG AGA AC（配列番号１０）
DNAプライマー＜２＞(16mer) GGA TCA GGC CAT TTT T（配列番号１１）
DNAプライマー＜３＞(18mer) GGA TCA GGC CAT TTT TGG（配列番号１２）
DNAプライマー＜４＞(19mer) GGA TCA GGC CAT TTT TGG G（配列番号１３）
DNAプライマー＜５＞(20mer) GGA TCA GGC CAT TTT TGG GG（配列番号１４）
DNAプライマー＜６＞(21mer) GGA TCA GGC CAT TTT TGG GGA（配列番号１５）
ターゲットRNA(40mer)
GGG UUG GCC AAA GGA GAA CCU CAA GCU CCU GGC CUG AUC C（配列番号１６）
用いた試薬
phi29 DNA Polymerase(New England Biolabs Japan,東京,日本)【００６８】
（２）ポリメラーゼ反応
（１）で調製した溶液を37℃で2時間インキュベートさせた。【００６９】
（３）視覚的検出
（２）の反応溶液 16μLに5×PBS153NMバッファーを4μL加えた。これを94℃から25℃まで0.5℃ずつ温度を降下させアニーリングを行った。
アニーリングを行った溶液 10μLと蛍光色素(SaとSbには1×PBS153NMバッファーで800倍に希釈したSYBR Gold溶液、最終濃度4800倍、TaとTbには1×リン酸バッファーに溶けた30μM ThT誘導体溶液、最終濃度5μM)2μLを混合させて25℃で30分インキュベートさせた。調製した溶液に256nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。【００７０】
用いた試薬
ThT(チオフラビンT)誘導体 （ThT-HE）
SYBR Goldライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社,東京,日本
5×PBS153NM
50 mM HPO42-, 730 mM Cl-, 765 mM Na+, 13.5 mM K+, 12.5 mM Mg2+pH 7.4
1×PBS153NM
10 mM HPO42-, 146 mM Cl-, 153 mM Na+, 2.7 mM K+, 2.5 mM Mg2+pH 7.4【００７１】
SYBR Goldは核酸濃度に依存して蛍光強度が変化する。一方、ThT誘導体溶液はグアニン四重鎖の濃度に依存して蛍光強度が変化する。そのため、SYBR Goldを添加したサンプルは高バックグランドとなる。一方でThT誘導体は核酸の濃度に依存されずに反応の進行を高感度に検出することが期待できる。
ポリメラーゼ反応では、設計上ターゲットであるRNA存在下で反応が進行することが望ましい。よってSaおよびTaは蛍光を発しないはずである。
一方、プライマーの長さはテンプレートとプライマーのみで反応が進行しない長さが望ましい。今回は16,18,19,20,21merの長さで検討を行った。【００７２】
結果を図５に示す。
はじめにPOS_SYBRおよびPOS_ThT誘導体であるが、両者とも反応が進行して蛍光を発していることがわかる。【００７３】
Sa1およびTa1はネガティブコントロール（プライマーなし、RNAなし）で両方とも蛍光は検出されなかった。【００７４】
Sb1およびTb1はテンプレートとRNAを混合した溶液で、プライマーがないので反応は進行しない。しかし、Sb1はRNAの濃度があるためSYBR Goldによる蛍光を発している。一方でTb1は反応が進行しないためグアニン四重鎖は生成されず蛍光は確認できない。【００７５】
Sa2〜Sa6およびTa2〜Ta6はRNAがないので本来反応が進行しないはずが、Ta5,6ではDNAプライマー単体でテンプレートとハイブリダイズしていまい反応が進行してしまったと考えられる。蛍光を見てみるとSa2〜Sa6はプライマーの存在が原因で蛍光強度のバックグランドが高めに出ている。一方で、反応していないTa2〜Ta4は蛍光はほとんど見られなかった。【００７６】
次に、一本鎖RNAを加えたときの反応の変化を比べるとTa2では反応は進まなかったがTb3,4では反応が進行したことが確認できた。一方でSa3,4とSb3,4を比べてもバックグランドが高いため判別は困難となっている。【００７７】
以上より、SYBR Goldは核酸そのものを染色するため、SYBR Goldを添加した場合は、RNAが存在しないときも蛍光を発し、RNAの有無を検出できなかった。
一方、ThT誘導体は、グアニン四重鎖を染色するため、RNAがないときは蛍光を発さず、RNAがあるときは蛍光を発するという、RNAの有無の検出に用いることができることが分かった。ただし、プライマーの一本鎖環状DNAにハイブリダイズする部分が長すぎるとRNAがなくとも増幅反応が起こってしまうので、プライマーの一本鎖環状DNAにハイブリダイズする部分の長さを７〜８塩基にするのがよいことがわかった。【００７８】
＜実施例２＞
検出方法2 (ストレプトアビジンビーズを使用したRCA)（図６）
[1] 環状DNAテンプレートの作製
(1) 5μMの1本鎖DNA(55mer)を20μL(最終濃度0.5μM)、10×添付Bufferを20μL、50mM MnCl2を10μL(最終濃度2.5mM)、5M Betaine 40μL(最終濃度1M)、100U/μLのCircLigaseを10μL(最終濃度5U/μL)、水100μLを混合した(計200μL)。
(2) 60℃で16時間インキュベートさせた。
(3) PAGE精製を行った。
1本鎖DNA(55mer)
phosphate-CCCCAAAAAGGAGCTTGAGGTTCTCCTTTAAAACCTTCCCCACCCTCCCCACCCT（配列番号１７）
用いた試薬
CircLigase II ssDNA Ligase(Epicentre Technologies, WI, USA)【００７９】
[2] プライマー結合ストレプトアビジンビーズの作製
(1) ストレプトアビジン担持磁気ビーズ(理論上4.5 pmolのビオチンと結合可能)に1×Phi29 polymerase bufferを50μL加えた。磁石によりビーズを引き寄せて1×Phi29 polymerase bufferを除去した。これを2回繰り返した。
(2) (1)に1.6μM 5′ビオチン化DNAプライマーA及びB(1×Phi29 polymerase buffer に調製済み)を1μL加えて37℃、30分間インキュベートさせた。
(3) (2)に1×Phi29 polymerase bufferを50μL加えた。磁石によりビーズを引き寄せて1×Phi29 polymerase bufferを除去した。これを2回繰り返した。【００８０】
用いたオリゴマー
5′-ビオチン化DNAプライマーA (18mer) 
5′-Biotin-GGA TCA GGC CAT TTT TGG-3′（配列番号１８）
5′-ビオチン化DNAプライマーB (19mer) 
5′-Biotin-GGA TCA GGC CAT TTT TGG G-3′（配列番号１９）
使用した試薬
Streptavidin Mag Sepharose (GEヘルスケア・ジャパン株式会社, 東京, 日本)【００８１】
[3] 各サンプルの調製
(1) Reaction
5′-ビオチン化DNAプライマーA使用＝サンプル＜２＞
5′-ビオチン化DNAプライマーB使用＝サンプル＜４＞
調製したプライマー結合ストレプトアビジンビーズに200nMの環状DNAテンプレート 1μL(最終濃度20nM)、Target RNA 1μL (最終濃度80nM)、10×添付バッファー1μL、10×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 1μL (最終濃度1mM)、1U/μLのPhi29 Polymerase 1μL (最終濃度0.1U/μL)、水4μLを混合した(計10μL)。【００８２】
(1)Negative control (Target RNAなし)
5′-ビオチン化DNAプライマーA使用＝サンプル＜１＞
5′-ビオチン化DNAプライマーB使用＝サンプル＜３＞
調製したプライマー結合ストレプトアビジンビーズに200nMの環状DNAテンプレート 1μL(最終濃度20nM)、10×添付バッファー1μL、10×添付BSA溶液 1μL、10mMのdNTPs 1μL (最終濃度1mM)、1U/μL のPhi29 Polymerase 1μL (最終濃度0.1U/μL)、水5μLを混合した(計10μL)。【００８３】
(2)使用した試薬等
phi29 DNA Polymerase(New England Biolabs Japan,東京,日本)
1×PBS153NM: 10 mM HPO42-, 146 mM Cl-, 153 mM Na+, 2.7 mM K+, 2.5 mM Mg2+pH 7.4【００８４】
[4] ポリメラーゼ反応
上記[3]で調製した溶液を37℃で2時間インキュベートさせた。【００８５】
[5] 色素液の添加
(1) 1×PBS153NM bufferを50μL加えた。磁石によりビーズを引き寄せて1×PBS153NM bufferを除去した。これを2回繰り返した。
(2) (1)に30μLのThT-HE溶液(ThT-HE：15μM、PBS153NM Buffer：1×)を反応液に加えた。ThT-HEの最終濃度は5μMでPBS153NMBufferは1×の濃度になる。【００８６】
[6] 視覚的検出
色素液添加後に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。【００８７】
[7] 結果
プライマー結合ビーズ用いて反応を行ったところ、いずれのプライマーを用いた場合でもビーズを用いない方法（方法1）よりも蛍光の視認性が良くなった（図７）。【００８８】
＜実施例３＞
検出方法3 (2種類のテンプレート使用したRCA)
[1] テンプレートの作製
(1) 5μMの1本鎖DNA(Cid_Pre_T：67mer, Cid_Mai_T：62mer)を20μL(最終濃度0.5μM)、10×添付Bufferを20μL、50mM MnCl2を10μL(最終濃度2.5mM)、5M Beatine 40μL(最終濃度1M)、100U/μLのCircLigaseを10μL(最終濃度5U/μL)、水100μLを混合した(計200μL)。
(2) 60℃で24時間インキュベートさせた。
(3) PAGE精製を行った。【００８９】
用いたオリゴマー
Cid_Pre_T (67mer)
Phosphate-CCCCAAAAAGGAGCTTGAGGTTCTCCTTTAAAAAGAAGCTGTTGTATTGTTGTCGAAGAAGAAAAGT（配列番号２０）
Cid_Mai_T (62mer)
Phosphate-CCCAACCCTACCCACCCTCAAGAAAAAAAAGTGATAATTGTTGTCGAAGAAGAAAAAAAATT（配列番号２１）
用いた試薬
CircLigase II ssDNA Ligase(Epicentre Technologies, WI, USA)【００９０】
[2] 各オリゴ核酸(DNA)の配列
環状Cid_Pre_T：(67mer)
CCC CAA AAA GGA GCT TGA GGT TCT CCT TTA AAA AGA AGC TGT TGT ATT GTT GTC GAA GAA GAA AAG T（配列番号２０）
両端で結合して環状化している。
環状Cid_Mai_T：(62mer)
CCC AAC CCT ACC CAC CCT CAA GAA AAA AAA GTG ATA ATT GTT GTC GAA GAA GAA AAA AAA TT（配列番号２１）
両端で結合して環状化している。
Cid_Pre_PP：(20mer)
AAC CTC AAG CTC CTT TTT GG（配列番号２２）
Cid_P18：(18mer)
GGA TCA GGC CAT TTT TGG（配列番号２３）
Cid_Mai_PP：(22mer)
TCT TCG ACA ACA ATT ATC ACT T（配列番号２４）
Cid_Mai_P18：(18mer)
GAA GCT GTT GTT ATC ACT（配列番号２５）【００９１】
[3] 各試薬の最終濃度
Pre-amplifier template (環状Cid_Pre_T) 4nM
Pre-amplifier primer (Cid_P18 or Cid_Pre_PP) 40nM
Target RNA 2nM
Main-amplifier template (環状Cid_Mai_T) 40nM
Main-amplifier primer (Cid_Mai_P18 or Cid Mai_PP) 200nM
Phi29 polymerase buffer 1×
BSA (Bovine serum albumin) 0.1mg/μL
dNTPs (dATP, TTP, dGTP, dCTP) 1mM
Phi29 polymerase 0.05U/μL【００９２】
[4] 各サンプルの調製
＜１＞ Negative control
5μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度：1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度：0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度：40nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。
＜２＞Negative control (Cid_Mai_P18のみで反応しないことの確認)4μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度：1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度：0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度：40nM)、2μM Cid_Mai_P18 (最終濃度：200nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。
＜３＞Negative control (Cid_P18添加で反応しないことの確認)
4μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度：1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度：0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度 1mM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度：40nM)、400nM Cid_P18 (最終濃度：40nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。
＜４＞Negative control (RNA添加で反応しないことの確認)
4μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度：1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度：0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度：40nM)、20nM Target RNA (最終濃度：2nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。
＜５＞Negative control (pre側の反応進行によってMain側が反応しないことの確認)
3μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度：1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度：0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、40nM Pre-amplifier template(最終濃度：4nM)、400nM Cid_Pre_PP (最終濃度：40nM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度：40nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。（図８）
＜６＞Negative control (pre側の反応進行によってMain側が反応しないことの確認)
2μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度：1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度：0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、40nM Pre-amplifier template (最終濃度：4nM)、400nM Cid_P18 (最終濃度：40nM)、20nM Target RNA (最終濃度：2nM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度：40nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。（図９）
＜７＞Positive control
4μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度：1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度：0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度：40nM)、2μM Cid_Mai_PP (最終濃度：200nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。（図１０）
＜８＞Positive control (pre側の反応進行によってMain側が反応することの確認)
2μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度：1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度：0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、40nM Pre-amplifier template(最終濃度：4nM)、400nM Cid_Pre_PP (最終濃度：40nM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度：40nM)、2μM Cid_Mai_P18 (最終濃度：200nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。（図１１）
＜９＞Reaction
1μLの水に、10×Phi29 polymerase buffer(最終濃度：1×)、1mg/1μLのBSA溶液(最終濃度：0.1mg/μL)、10mM dNTPs (最終濃度1mM)、40nM Pre-amplifier template(最終濃度：4nM)、400nM Cid_P18 (最終濃度：40nM)、20nM Target RNA (最終濃度：2nM)、400nM Main-amplifier template(最終濃度：40nM)、2μM Cid_Mai_P18 (最終濃度：200nM)、0.5U/μL Phi29 polymerase (最終濃度 0.05U/μL)をそれぞれ1μLずつ加えてよく混合した(最終容量10μL)。（図１２）【００９３】
[5] 反応
反応液の調製は96wellプレートを使って行った。37℃で1時間反応させた。【００９４】
[6] 色素液の添加
20μLのThT-HE溶液(ThT-HE：15μM、PBS153NM Buffer：1.5×)を反応液に加えた。ThT-HEの最終濃度は5μMでPBS153NMBufferは1×の濃度になる。
1×PBS153NM
10 mM HPO42-, 146 mM Cl-, 153 mM Na+, 2.7 mM K+, 2.5 mM Mg2+pH 7.4【００９５】
[7] 視覚的検出
色素液添加後に410nmのUVランプを照射してカットフィルター(460nmより短波長をカットする)を装着したカメラで撮影した。【００９６】
[8] 結果
グアニン四重鎖を生成する反応は＜７＞、＜８＞、＜９＞である（図１３）。他のNegative controlにおいては蛍光がほとんど確認できなかった。このことから、Main側の反応の制御能が高いといえる。また、環状テンプレートが1つの場合よりもTarget RNAの濃度は低くできることから高い検出能も達成できた。
【符号の説明】
【００９７】
１０・・・一本鎖環状DNA鋳型、１１・・・標的RNA、１２・・・オリゴヌクレオチドプライマー、１３・・・増幅産物、１０１・・・第１の部位に相補的な配列、１０２・・・プライマー結合配列、１０３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、１０４・・・グアニン四重鎖を含む配列、１０５・・・グアニン四重鎖検出試薬、１１１・・・第１の部位、１１２・・・第２の部位、１２１・・・第２の部位に相補的な配列、１２２・・・プライマー結合部位に相補的な配列【００９８】
２０・・・一本鎖環状DNA鋳型、２１・・・標的RNA、２２・・・第１オリゴヌクレオチドプライマー、２３・・・第１増幅産物、２４・・・第２一本鎖環状DNA鋳型、２５・・・第２オリゴヌクレオチドプライマー、２６・・・第２増幅産物、２０１・・・第１の部位に相補的な配列、２０２・・・第１プライマー結合配列、２０３・・・第２一本鎖環状DNA結合配列、２０４・・・２０３の５’側に隣接した部位、２４３・・・グアニン四重鎖形成配列に相補的な配列、２６１・・・グアニン四重鎖を含む配列、２６２・・・グアニン四重鎖検出試薬、２１１・・・第１の部位、２１２・・・第２の部位、２２１・・・第２の部位に相補的な配列、２２２・・・第１プライマー結合部位に相補的な配列、２３１・・・、２０３の相補領域、２３２・・・部位２０４に相補的な領域、２３３・・・配列２０３に相補的な配列、２４１・・・第２一本鎖環状DNA結合配列２０３と同一の配列、２４２・・・第２プライマー結合配列、２５１・・・部位２０４と同一の配列、２５２・・・第２一本鎖環状DNAの第２プライマー結合配列２４２に相補的な配列
【図１】
2016152936.tif 000017
【図２】
2016152936.tif 000018
【図３−１】
2016152936.tif 000019
【図３−２】
2016152936.tif 000020
【図３−３】
2016152936.tif 000021
【図３−４】
2016152936.tif 000022
【図３−５】
2016152936.tif 000023
【図３−６】
2016152936.tif 000024
【図４】
2016152936.tif 000025
【図５】
2016152936.tif 000026
【図６】
2016152936.tif 000027
【図７】
2016152936.tif 000028
【図８】
2016152936.tif 000029
【図９】
2016152936.tif 000030
【図１０】
2016152936.tif 000031
【図１１】
2016152936.tif 000032
【図１２】
2016152936.tif 000033
【図１３】
2016152936.tif 000034
【図１４】
2016152936.tif 000035
【配列表】
2016152936000001.app
【国際調査報告】
2016152936.tif 000036
2016152936.tif 000037
2016152936.tif 000038
2016152936.tif 000039