(57)【要約】  （Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとを用いて細胞外小胞体由来のシグナル強度を測定する工程を含む、膀胱がんの検出方法。本発明の方法により、サンプル提供者が膀胱がんを発症している可能性が高いか否かを判定することができる。これにより、サンプル提供者は癌の進行を阻止する手段を講じることができるため、有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとを用い、被験者に由来する体液試料中のＣＤ９及び／又はＣＤ６３と、ＣＤ５５、ＣＤ８２、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１からなる群より選ばれる少なくとも１つとを発現している細胞外小胞体由来のシグナル強度を測定する工程と、
前記工程で得られた被験者におけるシグナル強度と、対照者におけるシグナル強度とを対比する工程
とを含み、前記被験者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合が、膀胱がんの存在の指標となる、膀胱がんの検出方法。
【請求項２】
体液試料中の細胞外小胞体由来のシグナル強度を測定する工程が、エクソスクリーン法又はサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
体液試料が尿である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗ＣＤ９モノクローナル抗体又はその抗体断片が、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５１９として寄託されているハイブリドーマにより産出されるモノクローナル抗体又はその抗体断片である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抗ＣＤ６３モノクローナル抗体又はその抗体断片が、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５２０として寄託されているハイブリドーマにより産出されるモノクローナル抗体、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５２１として寄託されているハイブリドーマにより産出されるモノクローナル抗体、又はそれらの抗体断片である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
（Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとを含有してなる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法に使用するためのキット。
【請求項７】
（Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとによって認識される細胞外小胞体の膀胱がんのマーカーとしての使用。
【請求項８】
（Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとによって認識される細胞外小胞体を、被験者に由来する体液試料中から検出することを特徴とする、膀胱がん又は膀胱がんの疑いの情報を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膀胱がんの検出方法に関する。さらに詳しくは、サンプル中のエクソソーム（Ｅｘｏｓｏｍｅ）を含む細胞外小胞体の表面の特定抗原（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ５５、ＣＤ８２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１）に対するモノクローナル抗体又はそれらの抗体断片を用いて、膀胱がんの存在を検出するための方法、及び該方法に用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
エクソソームは、生体内の体液中に存在する細胞外小胞体の１種である。エクソソーム表面には、一般的な細胞表面と同様に、種々の膜タンパク質が存在することが知られている。また、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種がん細胞から分泌されることが報告されており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役として機能し生理現象と関連することや、がんなどの疾患との関連性が注目されている。【０００３】
例えば、非特許文献１には、膀胱がん患者の腫瘍組織において、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９のｍＲＮＡ発現量が増加していることが開示されている。また、特許文献１においては、膀胱がん患者の膀胱に特徴的な腫瘍マーカーとして、ＣＤ５５がその一例として記載されている。【０００４】
また、非特許文献２には、ＣＤ８２(ＫＡＩ１)の変異はめったに起こらず、ＫＡＩ１のダウンレギュレーションやグリコシル化がマーカー情報としては重要であるとされており、前立腺がん、肺がん、膵臓がんの進行に関与していると開示されている。一方、正常膀胱細胞にはＫＡＩ１がタンパクレベルで発現しているが、膀胱がん細胞株の８種中３種において発現が抑制され、１種では大きく促進されていることが示されており、膀胱がんとの関連性は不明である。特許文献２においては、シスプラチンを用いた化学療法に対して抵抗性を示す膀胱がん細胞において、ＣＤ８２が遺伝子レベル(ｍＲＮＡ)で増加することが記載されている。【０００５】
特許文献３においては、正常膀胱細胞に比べて異常値を示すマーカーをターゲットにして膀胱がんを診断する方法が開示されており、発現量が増加するマーカーとしてＨＬＡ-ＤＲＢ１が例示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０９１９０４号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１４／０８５６６６号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１２／１７８０８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Int J Cancer. 2008 September 15; 123(6): 1357-1363
【非特許文献２】Oncogene (1998) 16, 3143-3149
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
エクソソームなどの細胞外小胞体に存在する膜タンパク質をバイオマーカーとして、がんを検出することは可能である。しかしながら、サンプルの種類や用いる抗体によっては、感度や特異性の変動が大きい等の理由から十分な結果を得ることが困難であり、従前からのがんの診断では、偽陽性となる場合があり、診断の精度に問題があった。よって、細胞外小胞体を検出することで精度よくがんを検出するために、さらなる技術の開発が必要である。【０００９】
本発明の課題は、細胞外小胞体、特にエクソソームを測定することで膀胱がんを検出する方法、及び該方法に用いるキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、下記〔１〕〜〔７〕に関する。
〔１〕  （Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとを用い、被験者に由来する体液試料中のＣＤ９及び／又はＣＤ６３と、ＣＤ５５、ＣＤ８２、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１からなる群より選ばれる少なくとも１つとを発現している細胞外小胞体由来のシグナル強度を測定する工程と、
前記工程で得られた被験者におけるシグナル強度と、対照者におけるシグナル強度とを対比する工程
とを含み、前記被験者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合が、膀胱がんの存在の指標となる、膀胱がんの検出方法。
〔２〕  （Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとを用い、被験者に由来する体液試料中のＣＤ９及び／又はＣＤ６３と、ＣＤ５５、ＣＤ８２、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１からなる群より選ばれる少なくとも１つとを発現しているエクソソーム由来のシグナル強度を測定する工程と、
前記工程で得られた被験者におけるシグナル強度と、対照者におけるシグナル強度とを対比する工程
とを含み、前記被験者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合が、膀胱がんの存在の指標となる、膀胱がんの検出方法。
〔３〕  （Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとを含有してなる、前記〔１〕又は〔２〕記載の方法に使用するためのキット。
〔４〕  （Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとによって認識される細胞外小胞体の膀胱がんのマーカーとしての使用。
〔５〕  （Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとによって認識されるエクソソームの膀胱がんのマーカーとしての使用。
〔６〕  （Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとによって認識される細胞外小胞体を、被験者に由来する体液試料中から検出することを特徴とする、膀胱がん又は膀胱がんの疑いの情報を提供する方法。
〔７〕  （Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとによって認識されるエクソソームを、被験者に由来する体液試料中から検出することを特徴とする、膀胱がん又は膀胱がんの疑いの情報を提供する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法により、偽陽性の心配もなく、エクソソーム等の細胞外小胞体を測定することで膀胱がんを検出することができ、これにより、膀胱がんの発症の有無や進行程度を判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、エクソスクリーン法を用いた膀胱がん患者尿由来エクソソームにおける各種マーカーの検出結果を示す図である。(a)ビオチン化抗体；ＣＤ５５、アクセプタービーズ結合抗体；ＣＤ９。(b)ビオチン化抗体；ＣＤ８２、アクセプタービーズ結合抗体；ＣＤ９。(c)ビオチン化抗体；ＨＬＡ-ＤＲＢ１、アクセプタービーズ結合抗体；ＣＤ６３。
【図２】図２は、エクソスクリーン法を用いた膀胱がん患者尿由来エクソソームにおける各種マーカー発現をクレアチニン量に基づいた相対結果を示す図である。(a)ビオチン化抗体；ＣＤ５５、アクセプタービーズ結合抗体；ＣＤ９。(b)ビオチン化抗体；ＣＤ８２、アクセプタービーズ結合抗体；ＣＤ９。(c)ビオチン化抗体；ＨＬＡ-ＤＲＢ１、アクセプタービーズ結合抗体；ＣＤ６３。
【図３】図３は、エクソソーム由来ＣＤ５５とＣＤ８２のそれぞれの検出結果(クレアチニン量基準)を対比した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、被験者における膀胱がんを検出するための方法であって、体液試料中の細胞外小胞体由来のシグナル強度を特定のモノクローナル抗体を用いて測定し、その値が健常人のそれより大きい場合に膀胱がんに罹患している可能性があると判断することを大きな特徴とする。具体的には、特定抗原に対するモノクローナル抗体又はその抗体断片を用い、被験者に由来する体液試料中の該抗原を発現している細胞外小胞体由来のシグナル強度を測定する工程（以降、工程Ａともいう）と、前記工程で得られた被験者におけるシグナル強度と、対照者におけるシグナル強度とを対比する工程（以降、工程Ｂともいう）とを含み、ここで、前記被験者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合が、膀胱がんの存在の指標となる。なお、本明細書において、膀胱がんを検出するとは、膀胱がんの発症の有無、病態の進行度を検出することを含む。
【００１４】
本発明者らは、尿中のエクソソームに存在する膜タンパクに着目し、膀胱がん患者の尿中のエクソソームには検出されるものの健常人では検出され難いものを検討することで、膀胱がん患者の尿中のエクソソームに特異的な抗原としてＣＥＡＣＡＭ７、ＤＵＯＸ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＡＢＣＢ１、ＥＬＡＮＥ、ＩＦＩＴＭ２、ＣＤ５５、ＣＤ８２を同定することに成功した。本発明者らは、先に、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体を用いてエクソソームを特異的に捕捉できることを既に見出していたが、これらと前記抗原に対する抗体を組み合わせることにより、健常人の測定値はばらつきが少なく偽陽性が検出されず、膀胱がん患者のみからシグナルが検出されるという良好な結果が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
以下に、本発明における各工程について説明する。
【００１６】
工程Ａは、特定抗原に対するモノクローナル抗体又はその抗体断片を用い、被験者に由来する体液試料中の該抗原を発現している細胞外小胞体由来のシグナルを測定する工程である。なお、本明細書において、細胞外小胞体とは、細胞外に分泌された小胞体のことであり、エクソソーム等が例示される。
【００１７】
工程Ａで用いるモノクローナル抗体又はその抗体断片としては、２種類の群からなるモノクローナル抗体又はその断片が挙げられる。具体的には、細胞外小胞体を特異的に捕捉する抗体群（Ａ）及び膀胱がん細胞から分泌される細胞外小胞体に特異的な抗原に対する抗体群（Ｂ）である。
【００１８】
抗体群（Ａ）としては、細胞外小胞体を特異的に捕捉できる抗体であればよく、具体的には、抗ＣＤ９モノクローナル抗体又はその抗体断片、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体又はその抗体断片である。これらは少なくとも１種を用いることができればよい。
【００１９】
抗体群（Ｂ）としては、膀胱がん細胞から分泌される細胞外小胞体を特異的に捕捉できる抗体であればよく、具体的には、抗ＣＥＡＣＡＭ７モノクローナル抗体又はその抗体断片、抗ＤＵＯＸ２モノクローナル抗体又はその抗体断片、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体又はその抗体断片、抗ＡＢＣＢ１モノクローナル抗体又はその抗体断片、抗ＥＬＡＮＥモノクローナル抗体又はその抗体断片、抗ＩＦＩＴＭ２モノクローナル抗体又はその抗体断片、抗ＣＤ５５モノクローナル抗体又はその抗体断片、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体又はその抗体断片である。これらは少なくとも１種を用いることができればよい。
【００２０】
本発明で用いるモノクローナル抗体又はその抗体断片は、それぞれ特定抗原を認識するものであればよく、公知の方法に従って調製することができる。即ち、抗ＣＤ９モノクローナル抗体又はその抗体断片はＣＤ９を認識し、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体又はその抗体断片はＣＤ６３を認識し、抗ＣＥＡＣＡＭ７モノクローナル抗体又はその抗体断片はＣＥＡＣＡＭ７を認識し、抗ＤＵＯＸ２モノクローナル抗体又はその抗体断片はＤＵＯＸ２を認識し、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体又はその抗体断片はＨＬＡ−ＤＲＢ１を認識し、抗ＡＢＣＢ１モノクローナル抗体又はその抗体断片はＡＢＣＢ１を認識し、抗ＥＬＡＮＥモノクローナル抗体又はその抗体断片はＥＬＡＮＥを認識し、抗ＩＦＩＴＭ２モノクローナル抗体又はその抗体断片はＩＦＩＴＭ２を認識し、抗ＣＤ５５モノクローナル抗体又はその抗体断片はＣＤ５５を認識し、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体又はその抗体断片はＣＤ８２を認識するものであり、哺乳動物の免疫応答により調製してもよく、各抗原の配列情報に基づいて調製してもよい。
【００２１】
また、本発明では、抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片としては、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター(茨城県つくば市東１−１−１  つくばセンター中央第６)に下記受託番号のもとで寄託された細胞より得られるものを使用することもできる。
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５１９(産生されるモノクローナル抗体がＣＤ９−１２Ａ１２抗体、表示ＣＤ９：１２Ａ１２、受託日２０１１年１１月８日）
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５２０（産生されるモノクローナル抗体がＣＤ６３−８Ａ１２抗体、表示ＣＤ６３：８Ａ１２、受託日２０１１年１１月８日）
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５２１（産生されるモノクローナル抗体がＣＤ６３−１３Ｃ８抗体、表示ＣＤ６３：１３Ｃ８、受託日２０１１年１１月８日）
【００２２】
本発明において「モノクローナル抗体断片」とは、前述するモノクローナル抗体の一部であって、当該モノクローナル抗体と同様にＣＤ９や、ＣＤ６３、ＣＥＡＣＡＭ７、ＤＵＯＸ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＡＢＣＢ１、ＥＬＡＮＥ、ＩＦＩＴＭ２、ＣＤ５５、ＣＤ８２に特異的な結合性を有する断片を意味する。前記抗原に対して特異的結合性を有する断片とは、具体的には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、２量化体Ｖ領域断片（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第６巻、第５号、第４４１〜４５６頁、１９９６年）。
【００２３】
これらの抗体群（Ａ）と抗体群（Ｂ）は、それぞれの群に属するモノクローナル抗体又はその抗体断片を適宜組み合わせて用いるのであれば特に限定はなく、例えば、以下の組み合わせを用いる態様が挙げられる。
態様１：抗ＣＤ９モノクローナル抗体及びその抗体断片と抗ＣＤ５５モノクローナル抗体又はその断片とを組み合わせて用いる態様
態様２：抗ＣＤ９モノクローナル抗体及びその抗体断片と抗ＣＤ８２モノクローナル抗体又はその断片とを組み合わせて用いる態様
態様３：抗ＣＤ６３モノクローナル抗体及びその抗体断片と抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体又はその断片とを組み合わせて用いる態様
【００２４】
これらの組み合わせたモノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる方法としては、いずれか一方のモノクローナル抗体又はその抗体断片により細胞外小胞体を認識し、そして、もう一方のモノクローナル抗体又はその抗体断片により対応する抗原が発現している細胞外小胞体由来のシグナルを定量することができる。具体的には、例えば、態様１では、細胞外小胞体上のＣＤ９とＣＤ５５とを、これらのモノクローナル抗体又はその断片により認識して、ＣＤ９とＣＤ５５が発現している細胞外小胞体由来のシグナルを定量することができる。他の態様についても同様である。
【００２５】
また、前記組み合わせたモノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる方法としては、いずれか一方のモノクローナル抗体又はその抗体断片を固相抗体として、もう一方のモノクローナル抗体又はその抗体断片を標識抗体として用いてもよい。固相抗体と標識抗体は抗体群（Ａ）と抗体群（Ｂ）のいずれであってもよいが、膀胱がん患者に由来する体液試料中の細胞外小胞体に特異的な抗原に由来するシグナルを検出する観点から、抗体群（Ａ）を固相抗体として、抗体群（Ｂ）を標識抗体として用いることが好ましい。固相抗体及び標識抗体の調製は、特に限定はなく、公知の方法に従って行うことができる。かかる組み合わせのモノクローナル抗体又はその抗体断片は、後述のサンドイッチＥＬＩＳＡ法、エクソスクリーン法に好適に用いられる。
【００２６】
本発明における、細胞外小胞体由来のシグナル強度の測定用に供されるサンプルとしては、体液試料であれば限定はなく、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、乳汁、鼻汁、脳脊髄液からなる群より選択されるものが例示される。なかでも、尿が好ましい。
【００２７】
細胞外小胞体由来のシグナル強度の測定は、前記モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いる方法であればよく、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、エクソスクリーン法に従って行なうことができる。
【００２８】
サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、具体的には、先ず、一種類のモノクローナル抗体又はその抗体断片を固相抗体とし、細胞外小胞体を含有するサンプルと接触させて複合体を形成させる。その後、そこに、別のモノクローナル抗体又はその抗体断片を標識後添加して、さらなる複合体を形成させて標識を検出することにより、両抗体が認識する抗原を発現している細胞外小胞体由来のシグナル強度を測定することができる。
【００２９】
エクソスクリーン法はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社が開発したＡｌｐｈａＬＩＳＡを応用したものである。本方法はエピトープの異なる２種類の抗体を用いて、片方の抗体はビオチン化を、もう片方にはＡｌｐｈａＬＩＳＡアクセプタービーズを結合させた抗体を用いてサンプルと反応させる。その後、ストレプトアビジンが結合したドナービーズを添加することで、ビオチン化抗体とドナービーズがストレプトアビジンを介して結合し、アクセプタービーズとドナービーズが隣接する。隣接した状態で(２００ｎｍ以内)、６８０ｎｍ励起により、ドナービーズから一重項酸素が発生し、アクセプタービーズに一重項酸素が到達すると６１５ｎｍの光を発してシグナルとして検出することができる。この方法を応用することで、１００ｎｍ程度の大きさであるエクソソームをサンプルとして測定することができる。
【００３０】
かくして、体液試料中の標的タンパク質を含む細胞外小胞体由来のシグナル強度を測定することができる。得られた細胞外小胞体由来のシグナル強度を用いて、次の工程Ｂを行う。
【００３１】
工程Ｂは、工程Ａで得られた被験者における細胞外小胞体由来のシグナル強度と、対照者におけるシグナル強度とを対比する工程であり、前記被験者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合が、膀胱がんの存在の指標となる。なお、本明細書において、対照者とは、膀胱がんを発症していない者であれば良く、健常人が挙げられる。
【００３２】
対照者におけるシグナル強度は、対照者に由来する体液試料中の細胞外小胞体由来のシグナル強度であり、工程Ａで被験者の細胞外小胞体由来のシグナル強度を測定する際に併せて測定しても、別途測定してもよい。また、複数の対照者の細胞外小胞体由来のシグナル強度を測定し、その統計から対照者の細胞外小胞体由来のシグナル強度を設定してもよい。
【００３３】
対照者由来の体液試料としては、被験者由来の体液試料と同種の試料であることが好ましく、例えば、被験者由来の体液試料が尿である場合、対照者由来の体液試料も尿である。
【００３４】
被験者のシグナル強度と対照者のシグナル強度とを対比するには、被験者の細胞外小胞体由来のシグナル強度と対照者の細胞外小胞体由来のシグナル強度とを対比して解析すればよく、かかる方法としては、特に限定はなく、公知の方法(Steel法、t検定、Wilcoxon検定等)を用いることができる。前記解析により対照者の細胞外小胞体由来のシグナル強度に対する被験者の細胞外小胞体由来のシグナル強度がより有意に増加していることが示された場合は、被験者に膀胱がんが存在している可能性が高いと判断される。
【００３５】
なお、前記抗体を用いて体液試料中に存在する細胞外小胞体を検出することにより、膀胱がんの存在可能性の有無を判断することができることから、本発明の一態様として、（Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとによって認識される細胞外小胞体を、被験者に由来する体液試料中から検出することを特徴とする、膀胱がん又は膀胱がんの疑いの情報を提供する方法を挙げることができる。
【００３６】
また、前記解析において、対照者の細胞外小胞体由来のシグナル強度を被験者の術前の細胞外小胞体由来のシグナル強度に設定し、術後の細胞外小胞体由来のシグナル強度を被験者の細胞外小胞体由来のシグナル強度として対比することで、術後の細胞外小胞体由来のシグナル強度が減少していることが示された場合は、膀胱がんが縮小又は減退している可能性が高いと判断することができる。
【００３７】
またさらに、前記解析において、例えば、被験者が膀胱がんと診断された場合においては、対照者の細胞外小胞体由来のシグナル強度を被験者の治療前の細胞外小胞体由来のシグナル強度に設定し、治療後の細胞外小胞体由来のシグナル強度を被験者の細胞外小胞体由来のシグナル強度として対比することで、治療後の細胞外小胞体由来のシグナル強度が減少していることが示された場合は、当該治療が膀胱がんの治療に有効である可能性が高いと判断することができる。従って、本発明はまた、膀胱がんの治療を受ける前と受けた後において、前記モノクローナル抗体又はその抗体断片を用いて細胞外小胞体由来のシグナル強度を測定し、治療後の値が治療前のそれより小さい場合に、当該治療が効果を有すると判断することを特徴とする評価方法を提供することができる。
【００３８】
また、本発明の別の態様では、膀胱がんを検出するためのキットが提供される。
【００３９】
本発明のキットには、体液試料中の細胞外小胞体を検出することができるものであれば全て含まれる。具体的には、前記細胞外小胞体表面に存在する抗原を認識できる抗体、（Ａ）抗ＣＤ９モノクローナル抗体、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つと、（Ｂ）抗ＣＤ５５モノクローナル抗体、抗ＣＤ８２モノクローナル抗体、抗ＨＬＡ−ＤＲＢ１モノクローナル抗体、及びそれらの抗体断片からなる群より選ばれる少なくとも１つとを含有するキットが挙げられる。
【００４０】
これらのキットは、体液試料中の細胞外小胞体を検出する際に抗体を用いる検出方法であれば(例えば、ＥＬＩＳＡ法、エクソスクリーン法等)、用いることができる。なお、細胞外小胞体が検出されるのであれば、細胞外小胞体以外のタンパク質も前記抗体により同時に検出されることがあってもよい。
【００４１】
本発明のキットを用いて、例えば、健常人と被験者の血液サンプル中に存在する細胞外小胞体由来のシグナルを測定して、両者のシグナル強度に有意差が生じた場合には、被験者における膀胱がんの発症の決定及び／又は診断を行うことができる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、実施例は本発明をより良く理解するために例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。【００４３】
実施例１（膀胱がんマーカータンパク質の検出）
膀胱がん患者の尿に由来するエクソソームを用いたプロテオーム解析を行った。具体的には、３人の膀胱がん患者の導尿と２人の健常人の導尿に由来するエクソソームをプロテオーム解析し、２人以上の膀胱がんの患者で検出され、健常人では検出されなかったタンパク質を選択した。選択された結果を表１に示す。【００４４】
【表１】
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【００４５】
実施例２（膀胱がんの検出）
実施例１で得られた結果より、ＣＤ５５、ＣＤ８２、又はＨＬＡ−ＤＲＢ１を指標として、膀胱がんを検出した。【００４６】
具体的には、１４例の膀胱がん患者の導尿及び７例の健常人の導尿を用いて、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社）により７．５倍に濃縮したエクソソーム溶液５μＬを調製後、ビオチン化した抗ＣＤ５５モノクローナル抗体（ＡＢＣＡＭ社製、クローン１４３?３０）、ビオチン化した抗ＣＤ８２モノクローナル抗体（ダイアクローン社製、クローンＢ-Ｌ２）、ビオチン化した抗ＨＬＡ-ＤＲＢ１モノクローナル抗体（ミリポア社製、クローンＤＪ９）とアクセプタービーズが結合した抗ＣＤ９モノクローナル抗体（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５１９として寄託されているハイブリドーマにより産出されるモノクローナル抗体）もしくはアクセプタービーズが結合した抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（受託番号 ＢＰ−１１５２０として寄託されているハイブリドーマにより産出されるモノクローナル抗体）を用いて、エクソスクリーン法により、ＣＤ９とＣＤ５５、ＣＤ９とＣＤ８２、ＣＤ６３とＨＬＡ-ＤＲＢ１が発現しているエクソソーム由来のシグナルを測定した(図１ａ、ｂ、ｃ)。【００４７】
また、尿中成分を補正するため、各種測定シグナルをエクソソーム濃縮前の尿中クレアチニン濃度にて補正した(図２ａ、ｂ、ｃ)。なお、クレアチニン濃度は改良型ヤッフェ法を用いて測定した。【００４８】
結果、いずれの抗体の組み合わせにおいても、膀胱がん患者１４例中６例程度は健常人のそれよりも高いシグナルを示すことが明らかになった。【００４９】
実施例３（ＣＤ５５及びＣＤ８２を指標にした膀胱がんの検出）
ＣＤ９とＣＤ５５陽性エクソソームの測定シグナルを横軸に、ＣＤ９とＣＤ８２陽性エクソソームの測定シグナルを縦軸に取り、７例全ての健常人が陰性になるようにカットオフ値を定めると、１４例中８例の膀胱がん患者が少なくともどちらかのエクソソームが陽性であることが示された（図３）。すなわち、ＣＤ５５とＣＤ８２を組み合わせることで、より精度の高い膀胱がんマーカーとなりうることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の方法により、サンプル提供者が膀胱がんを発症している可能性が高いか否かを判定することができる。これにより、サンプル提供者は癌の進行を阻止する手段を講じることができるため、有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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