(57)【要約】  チオール基をアミノ基近傍に有し、そのチオール基とアミノ基に特定の保護基を導入したアミノ酸残基をＮ末端に有するペプチドを、イニシエーション・サプレッション法により翻訳すると、アミノ酸翻訳反応の開始確率が向上するうえ、切断ペプチドの生成が抑制され、翻訳効率と純度が向上することが明らかとなった。また、当該ペプチドにおいて、アミド結合による環化反応を効率的に進行させることが可能であることが明らかとなった。これらの知見に基づき、非天然アミノ酸を多複数含むペプチドであってアミド結合による環化部位を有するペプチドと核酸の複合体の新たな製造方法が見出された。
2017150732.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又は当該複合体を含むライブラリーの製造方法であって、
第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）：
2017150732.tif 000200
（式中、
Ｒ１は、翻訳合成が可能なチオール基の保護基であり；
Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、またはシクロアルキル基であり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ２とＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し；あるいはＲ２またはＲ３は、Ｒ４およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しＲ２が、これが結合するＮ原子およびＳＰ−１と一緒になってアジド基（−Ｎ３）を形成する場合、上記の定義はＲ２に対して適用されず；
Ｒ４は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく； 
Ｒ１１、およびＲ１２は、それぞれ独立して、単結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく；
ＳＰ−１は、これが結合するＮ原子およびＲ２と一緒になってアジド基を形成するか、
以下の式：
2017150732.tif 000201
（式中のＰ１は、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである）で表されるか、または以下の式：
2017150732.tif 000202
（式中のＰ２は、アルキル、アリール、またはヘテロアリールである）で表される、アミノ基の保護基である）
で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成されるペプチド、または当該ペプチドと当該核酸との複合体において、第一の反応点と第二の反応点とを反応させて、アミド結合を形成させる工程を含む、方法。
【請求項２】
Ｒ１が、Ｓ−Ｒ２３（ここで、Ｒ２３はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはアラルキルであり、これらの基は置換されていてもよい）、スルホネート（−ＳＯ３−）、およびチオスルホネート（−Ｓ２Ｏ３−）からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｒ２３が、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ―ブチル、フェニル、ｐ−トリフルオロメチルフェニル、ｐ−フルオロフェニル、ベンジル、またはフェネチルであり、これらの基は置換されていてもよい、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲンで置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキル、またはＣ１−Ｃ４アルコキシである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ４が、以下：
2017150732.tif 000203
（式中、Ｒ１３〜Ｒ１８は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである）からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１３〜Ｒ１８が、それぞれ独立して、水素原子またはメチルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ１１およびＲ１２がそれぞれ独立して、単結合であるか、または以下：
2017150732.tif 000204
（ここでＲ１３'〜Ｒ１８'は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである）からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ１３'〜Ｒ１８'が、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000205
（式中、
Ｒ１〜Ｒ４およびＳＰ−１は、それぞれ請求項１に記載のＲ１〜Ｒ４およびＳＰ−１と同意義を表し、
Ｒ１３'〜Ｒ１６'は、それぞれ請求項７に記載のＲ１３'〜Ｒ１６'と同意義を表す。）
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000206
（式中、
Ｒ１、Ｒ４およびＳＰ−１は、それぞれ請求項１に記載のＲ１、Ｒ４およびＳＰ−１と同意義を表し、
Ｒ１３'〜Ｒ１８'は、それぞれ請求項７に記載のＲ１３'〜Ｒ１８'と同意義を表す。）
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000207
（式中、
Ｒ１〜Ｒ３およびＳＰ−１は、それぞれ請求項１に記載のＲ１〜Ｒ３およびＳＰ−１と同意義を表し；
Ｒ１３〜Ｒ１６は、それぞれ請求項５に記載のＲ１３〜１６と同意義を表し；
Ｒ１３'〜Ｒ１６'は、それぞれ請求項７に記載のＲ１３'〜Ｒ１６'と同意義を表し；あるいはＲ２は、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５またはＲ１６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しＲ２が、これが結合するＮ原子およびＳＰ−１と一緒になってアジド基（−Ｎ３）を形成する場合、上記の定義はＲ２に対して適用されない）
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000208
（式中、
Ｒ１およびＳＰ−１は、それぞれ請求項１に記載のＲ１およびＳＰ−１と同意義を表し；
Ｒ１３〜Ｒ１８は、それぞれ請求項５に記載のＲ１３〜Ｒ１８と同意義を表し；
Ｒ１３'〜Ｒ１８'は、それぞれ請求項７に記載のＲ１３'〜Ｒ１８'と同意義を表す。）
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＳＰ−１が、４−アジドベンジルオキシカルボニル（ｐ−Ａｃｂｚ）、２−アジドベンジルオキシカルボニル（ｏ−Ａｃｂｚ）、アジドメトキシカルボニル（Ａｚｏｃ）、フェニルジスルファニルエチルオキシカルボニル（Ｐｈｄｅｃ）、２−ピリジルジスルファニルエチルオキシカルボニル（Ｐｙｄｅｃ）、もしくは２−（ｔ−ブチルジスルファニル）エチルオキシカルボニル（Ｔｂｅｏｃ）であるか、またはＳＰ−１は、これが結合するＮ原子およびＲ２と一緒になってアジド基を形成する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000209
（式中、
Ｒ２"、Ｒ３"は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ２"とＲ３"は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し；あるいはＲ２"またはＲ３"は、Ｒ２６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し；
Ｒ２５は水酸基であるか、またはそれが結合するＣＯと共に活性エステルを形成し；
Ｒ２６は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよい）
で表される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ２６が、以下： 
2017150732.tif 000210
（式中、Ｒ１３"〜Ｒ１８"は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである）からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000211
（式中、
Ｒ２"は、請求項１２に記載のＲ２"と同意義を表し；
Ｒ３"は、水素原子、または置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基であり；
Ｒ２７は、水素原子、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいアラルキル基の中から選択される）
で表される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000212
（式中、
Ｒ２"は、請求項１２に記載のＲ２"と同意義を表し；
Ｒ３"は、水素原子、または置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基であり；
Ｒ２８およびＲ２９は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換されてもよいＣ２−Ｃ６アルケニル基、置換されてもよいＣ２−Ｃ６アルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいアラルキル基、または置換されてもよいシクロアルキル基であり；
Ｒ２７は、水素原子、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいアラルキル基の中から選択される）
で表される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
環状部に存在する−ＳＨ基を脱硫する工程をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
環状部を有するペプチドと核酸との複合体が、ペプチドと核酸との間にリンカーを有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ペプチドが、メチオニン、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素（ＭｅｔＲＳ）、メチオニン用翻訳開始ｔＲＮＡ、フォルミルドナー、メチオニルｔＲＮＡトランスフェラーゼの少なくとも１つを含まない無細胞翻訳系において翻訳して合成される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
下記一般式（ＩＡ）または下記一般式（ＩＩＡ）で表される化合物：
2017150732.tif 000213
（式中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１は、それぞれ請求項１のＲ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１と同意義を表す）。
【請求項２０】
下記一般式（ＩＢ）または下記一般式（ＩＩＢ）で表される化合物：
2017150732.tif 000214
（式中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１は、それぞれ請求項１のＲ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１と同意義を表し、Ｒ３０はＨまたは水酸基を表す）。
【請求項２１】
請求項１９記載の化合物とｔＲＮＡが結合してなるアミノアシルｔＲＮＡ。
【請求項２２】
第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）で表される、アミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチド、または当該ペプチドと核酸との複合体：
2017150732.tif 000215
（式中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１は、それぞれ請求項１のＲ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１と同意義を表す）。
【請求項２３】
非環状ペプチドが、第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）：
2017150732.tif 000216
（式中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１は、それぞれ請求項１のＲ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１と同意義を表す）で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成する工程を含む方法によって得られる、請求項２２記載のペプチド又は複合体。
【請求項２４】
請求項２２もしくは２３記載のペプチド又は複合体を用いて、２以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又はそのライブラリーを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸がＮ末端に配置された、アミノ酸類縁体を複数含むペプチド、当該ペプチドと核酸複合体の効率的な翻訳手法の構築に関する。また本発明は、複数のアミノ酸類縁体を含む環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体およびそれを含むライブラリーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の低分子化合物からではヒット化合物の取得が困難な分子を標的とする創薬を可能とする技術として、近年、分子量５００〜２０００の中分子化合物を用いた創薬が注目されている。中分子化合物のひとつであるペプチドは一般に代謝安定性や膜透過性が低いとされてきた。【０００３】
しかし、シクロスポリンＡに代表される環状ペプチドや、Ｎ−メチルアミノ酸、Ｄ−アミノ酸等のアミノ酸類縁体を含むペプチドにおいて、代謝安定性や膜透過性が向上することが明らかとなってきている（非特許文献１〜３）。さらに、中分子ペプチドのドラッグライクネス（druglikeness、代謝安定性と膜透過性が優れた性質）を満たすために必要な条件（例えば、総アミノ酸数の範囲、Ｎ−置換アミノ酸数、ペプチドの脂溶性）が明らかとなってきている（特許文献１）。【０００４】
そこで、膜透過性と代謝安定性の要件を満たす中分子環状ペプチドからなるライブラリーを構築し、ディスプレイライブラリー技術により、その中から薬効を有するペプチド（ヒット化合物）を選択し、その構造最適化を行えれば、中分子創薬を効率化できると考えられる。【０００５】
近年、多様なペプチドを有するライブラリーとしてｍＲＮＡディスプレイ法によるライブラリーの研究が進んでいる。この技術によれば１０１２の種類の多様な化合物を含むライブラリーを短期間で創出することが可能である。また最近、再構成無細胞翻訳系を利用したアミノ酸類縁体を含むペプチド調製法が報告され、アミノ酸類縁体を含む環状ペプチドのディスプレイ用ライブラリーが作製された例も報告されている（特許文献２、非特許文献４、５）。【０００６】
しかし、従来の方法により作製される、チオエーテル結合により環化されたペプチドは、一般的に酸化代謝を受けやすいことを考慮すると（非特許文献６）、代謝安定性において改善の余地が残されている。【０００７】
その一方、特許文献１にて報告されているアミド結合により環化されたペプチドライブラリーは、先述のチオエーテル環化部位を有するペプチドライブラリーと比べて膜透過性と代謝安定性に優れる。【０００８】
アミド環化部位を有するペプチドライブラリーを構築する方法の１つとして、Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体を持ち、Ｃ末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチドを翻訳してネイティブケミカルライゲーションを用いて環化させる方法がある（特許文献１）。【０００９】
その環化ペプチド前駆体であるＮ末端にシステインまたはシステイン類縁体を持つペプチドを翻訳合成するには以下の３つの方法が報告されている（特許文献１）。【００１０】
第１に、ホルミルメチオニンで開始されたペプチドのＮ末端アミノ酸もしくはＮ末端側ペプチドを、システインの直前で酵素によって切断し、システインをＮ末端に有するペプチドを合成する方法である。酵素の例としては、ペプチドデホルミラーゼ（ＰＤＦ）とメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を利用した方法が報告されている（非特許文献７）。【００１１】
第２に、再構築無細胞翻訳系を用い、予め系内からメチオニンを除き、かつＮ末端から２残基目にシステインあるいはシステイン類縁体を配置し、開始コドンであるメチオニンを読み飛ばして翻訳合成を行う方法（イニシエーションリードスルー（initiation read-through；ｉＲＴ）法と定義する)である。【００１２】
第３に、メチオニンもしくは翻訳開始メチオニンｔＲＮＡを含まない再構築無細胞翻訳系に、予め開始用のｔＲＮＡとして、アミノ基またはチオール基が保護されていてもよいシステインあるいはシステイン類縁体をアミノアシル化して調製したアミノアシルｔＲＮＡを加えて翻訳合成を行う方法（イニシエーションサプレッション（Initiation suppression）法（ｉＳＰ）法と定義する)である。【００１３】
特許文献１には、システインおよびシステイン類縁体が無保護である場合、そのアミノアシルｔＲＮＡを調製するのが困難であること、アミノ基の保護基としてペンテノイル（pentenoyl）基または６−ニトロベラトリルオキシカルボニル（NVOC）基を有するアミノアシルｔＲＮＡを用いたことが報告されている。【００１４】
一方、アミノ酸類縁体を複数含むペプチドを翻訳合成する方法として、予め人工的にアミノ酸類縁体をアミノアシル化したｔＲＮＡを調製し翻訳に使う方法と、天然型アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase、ARS）を利用して翻訳系中にてアミノ酸類縁体からアミノアシルｔＲＮＡを調製して翻訳導入する方法が知られている（非特許文献５，８，９）。これらは、翻訳導入部位に直接関与するアミノ酸類縁体のアミノアシルｔＲＮＡを利用した方法である。【００１５】
しかし、これらの方法を用いてアミノ酸類縁体を複数含むペプチドを翻訳合成しても、翻訳効率が高くない、あるいは生成物の純度が低下する課題が残されている。例えば、アミノ酸類縁体の導入点前後で切れたペプチド(これらを「切断ペプチド」と定義する)が生成する現象が知られている（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／１００１３２
【特許文献２】ＷＯ２００８／１１７８３３
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】J. Chatterjee, et al., Acc. Chem. Res. 2008, 41, 1331.
【非特許文献２】J. E. Bock, et al., ACS Chem. Biol. 2013, 8, 488.
【非特許文献３】K. Jpsephson, et al., Drug Discovery Today 2014, 19, 388-399.
【非特許文献４】H. Suga et al., Chem. Bio. 2008, 15, 32.
【非特許文献５】J. W. Szostak et al., J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 10469-10477
【非特許文献６】薬物代謝学  医療薬学・医薬品開発の基礎として  第3版  加藤隆一、鎌滝哲也、横井毅  編
【非特許文献７】Meinnel, T., et al. Biochimie (1993) 75, 1061-1075
【非特許文献８】M. C. T. Hartman et al., PLoS one, 2007, 10, e972.
【非特許文献９】T. Kawakami, ACS Chem Biol., 8, 1205-1214, 2013
【非特許文献１０】J. W. Szostak et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 6131-6136
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、上述の課題を鑑みてなされたものであり、チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸残基がＮ末端に配置された、アミノ酸類縁体を複数含むペプチドの効率的な翻訳手法を提供することを目的とする。また本発明は、複数のアミノ酸類縁体を含む環状部であってアミド結合による環化部位を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体およびそれを含むライブラリーの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、翻訳の伸長反応に直接関与しないと想定されてきた翻訳の開始方法が、翻訳の下流におけるアミノ酸類縁体の翻訳効率と生成物の純度ならびに、不純物である切断ペプチドの生成に影響を与えることを明らかにした。この事実は、通常の評価法（すなわち、Ｎ末端以外は天然型アミノ酸から構成されるペプチドでの評価）で検出することはできず、複数のアミノ酸類縁体が含まれるペプチドでの評価によって初めて可能となった。【００２０】
即ち本発明者らは、ペプチドやペプチドと核酸の複合体に様々な官能基が共存する中、チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸残基であって、チオール基とアミノ基の両方が選択的かつ定量的に脱保護可能な特定の保護基で保護されたアミノ酸残基をＮ末端に有するペプチドを、ｉＳＰ法により翻訳したところ、当該翻訳反応の開始確率が向上するうえ、切断ペプチドの生成が抑制され、翻訳効率と純度が向上することを明らかにした。さらに本発明者らは、ｉＳＰ法を用いて得られたペプチドおよび当該ペプチドと核酸の複合体のペプチド部位を効率的に環化できる、環化部位を有するペプチドおよび当該ペプチドと核酸の複合体の新たな製造方法を見出し、本発明に至った。【００２１】
すなわち、本発明は以下を含む。
〔１〕
２以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又は当該複合体を含むライブラリーの製造方法であって、
第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）：
2017150732.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、翻訳合成が可能なチオール基の保護基であり；
Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、またはシクロアルキル基であり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ２とＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し；あるいはＲ２またはＲ３は、Ｒ４およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しＲ２が、これが結合するＮ原子およびＳＰ−１と一緒になってアジド基（−Ｎ３）を形成する場合、上記の定義はＲ２に対して適用されず；
Ｒ４は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく； 
Ｒ１１、およびＲ１２は、それぞれ独立して、単結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく；
ＳＰ−１は、これが結合するＮ原子およびＲ２と一緒になってアジド基を形成するか、
以下の式：
2017150732.tif 000004
（式中のＰ１は、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである）で表されるか、または以下の式：
2017150732.tif 000005
（式中のＰ２は、アルキル、アリール、またはヘテロアリールである）で表される、アミノ基の保護基である）
で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成されるペプチド、または当該ペプチドと当該核酸との複合体において、第一の反応点と第二の反応点とを反応させて、アミド結合を形成させる工程を含む、方法。
〔２〕
Ｒ１が、Ｓ−Ｒ２３（ここで、Ｒ２３はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはアラルキルであり、これらの基は置換されていてもよい）、スルホネート（−ＳＯ３−）、およびチオスルホネート（−Ｓ２Ｏ３−）からなる群より選択される、〔１〕記載の方法。
〔３〕
Ｒ２３が、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ―ブチル、フェニル、ｐ−トリフルオロメチルフェニル、ｐ−フルオロフェニル、ベンジル、またはフェネチルであり、これらの基は置換されていてもよい、〔２〕に記載の方法。
〔４〕
Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲンで置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキル、またはＣ１−Ｃ４アルコキシである、〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５〕
Ｒ４が、以下：
2017150732.tif 000006
（式中、Ｒ１３〜Ｒ１８は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである）からなる群より選択される、〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６〕
Ｒ１３〜Ｒ１８が、それぞれ独立して、水素原子またはメチルである、〔５〕に記載の方法。
〔７〕
Ｒ１１およびＲ１２がそれぞれ独立して、単結合であるか、または以下：
2017150732.tif 000007
（ここでＲ１３'〜Ｒ１８'は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである）からなる群より選択される、〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８〕
Ｒ１３'〜Ｒ１８'が、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基である、〔７〕に記載の方法。
〔９〕
一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000008
（式中、
Ｒ１〜Ｒ４およびＳＰ−１は、それぞれ〔１〕に記載のＲ１〜Ｒ４およびＳＰ−１と同意義を表し、
Ｒ１３'〜Ｒ１６'は、それぞれ〔７〕に記載のＲ１３'〜Ｒ１６'と同意義を表す。）
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000009
（式中、
Ｒ１、Ｒ４およびＳＰ−１は、それぞれ〔１〕に記載のＲ１、Ｒ４およびＳＰ−１と同意義を表し、
Ｒ１３'〜Ｒ１８'は、それぞれ〔７〕に記載のＲ１３'〜Ｒ１８'と同意義を表す。）
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０〕
一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000010
（式中、
Ｒ１〜Ｒ３およびＳＰ−１は、それぞれ〔１〕に記載のＲ１〜Ｒ３およびＳＰ−１と同意義を表し；
Ｒ１３〜Ｒ１６は、それぞれ〔５〕に記載のＲ１３〜１６と同意義を表し；
Ｒ１３'〜Ｒ１６'は、それぞれ〔７〕に記載のＲ１３'〜Ｒ１６'と同意義を表し；あるいはＲ２は、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５またはＲ１６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しＲ２が、これが結合するＮ原子およびＳＰ−１と一緒になってアジド基（−Ｎ３）を形成する場合、上記の定義はＲ２に対して適用されない）のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000011
（式中、
Ｒ１およびＳＰ−１は、それぞれ〔１〕に記載のＲ１およびＳＰ−１と同意義を表し；
Ｒ１３〜Ｒ１８は、それぞれ〔５〕に記載のＲ１３〜Ｒ１８と同意義を表し；
Ｒ１３'〜Ｒ１８'は、それぞれ〔７〕に記載のＲ１３'〜Ｒ１８'と同意義を表す。）
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１〕
ＳＰ−１が、４−アジドベンジルオキシカルボニル（ｐ−Ａｃｂｚ）、２−アジドベンジルオキシカルボニル（ｏ−Ａｃｂｚ）、アジドメトキシカルボニル（Ａｚｏｃ）、フェニルジスルファニルエチルオキシカルボニル（Ｐｈｄｅｃ）、２−ピリジルジスルファニルエチルオキシカルボニル（Ｐｙｄｅｃ）、もしくは２−（ｔ−ブチルジスルファニル）エチルオキシカルボニル（Ｔｂｅｏｃ）であるか、またはＳＰ−１は、これが結合するＮ原子およびＲ２と一緒になってアジド基を形成する、〔１〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２〕
側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000012
（式中、
Ｒ２"、Ｒ３"は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ２"とＲ３"は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し；あるいはＲ２"またはＲ３"は、Ｒ２６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し；
Ｒ２５は水酸基であるか、またはそれが結合するＣＯと共に活性エステルを形成し；
Ｒ２６は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよい）
で表される、〔１〕〜〔１１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３〕
Ｒ２６が、以下：
2017150732.tif 000013
（式中、Ｒ１３"〜Ｒ１８"は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである）からなる群より選択される、〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４〕
側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000014
（式中、
Ｒ２"は、〔１２〕に記載のＲ２"と同意義を表し；
Ｒ３"は、水素原子、または置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基であり；
Ｒ２７は、水素原子、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいアラルキル基の中から選択される）
で表される、〔１〕〜〔１３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１５〕
側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式：
2017150732.tif 000015
（式中、
Ｒ２"は、〔１２〕に記載のＲ２"と同意義を表し；
Ｒ３"は、水素原子、または置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキル基であり；
Ｒ２８およびＲ２９は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいＣ１−Ｃ６アルキル基、置換されてもよいＣ２−Ｃ６アルケニル基、置換されてもよいＣ２−Ｃ６アルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいアラルキル基、または置換されてもよいシクロアルキル基であり；
Ｒ２７は、水素原子、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいアラルキル基の中から選択される）
で表される、〔１〕〜〔１４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１６〕
環状部に存在する−ＳＨ基を脱硫する工程をさらに含む、〔１〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１７〕
環状部を有するペプチドと核酸との複合体が、ペプチドと核酸との間にリンカーを有する、〔１〕〜〔１６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１８〕
ペプチドが、メチオニン、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素（ＭｅｔＲＳ）、メチオニン用翻訳開始ｔＲＮＡ、フォルミルドナー、メチオニルｔＲＮＡトランスフェラーゼの少なくとも１つを含まない無細胞翻訳系において翻訳して合成される、〔１〕〜〔１７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１９〕
下記一般式（ＩＡ）または下記一般式（ＩＩＡ）で表される化合物：
2017150732.tif 000016
（式中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１は、それぞれ〔１〕のＲ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１と同意義を表す）。
〔２０〕
下記一般式（ＩＢ）または下記一般式（ＩＩＢ）で表される化合物：
2017150732.tif 000017
2017150732.tif 000018
（式中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１は、それぞれ〔１〕のＲ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１と同意義を表し、Ｒ３０はＨまたは水酸基を表す）。
〔２１〕
〔１９〕記載の化合物とｔＲＮＡが結合してなるアミノアシルｔＲＮＡ。
〔２２〕
第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）で表される、アミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチド、または当該ペプチドと核酸との複合体：
2017150732.tif 000019
（式中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１は、それぞれ〔１〕のＲ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１と同意義を表す）。
〔２３〕
非環状ペプチドが、第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）：
2017150732.tif 000020
（式中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１は、それぞれ〔１〕のＲ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１と同意義を表す）で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成する工程を含む方法によって得られる、〔２２〕記載のペプチド又は複合体。
〔２４〕
〔２２〕もしくは〔２３〕記載のペプチド又は複合体を用いて、２以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又はそのライブラリーを製造する方法。
〔２５〕
一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基が、以下の式：
2017150732.tif 000021
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＳＰ−１は、それぞれ〔１〕のＲ１、Ｒ２、およびＳＰ−１と同意義を表す）。
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または
一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基が、以下の式：
2017150732.tif 000022
（式中、
Ｒ１は、−Ｓ−Ｒ２３であり、
Ｒ２３は、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよいベンジルであり、
ＳＰ−１は、ｐ−Ａｃｂｚ、ｏ−Ａｃｂｚ、またはＡｚｏｃである）
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、〔１〕〜〔１８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２６〕
一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基が、以下の式：
2017150732.tif 000023
（式中、Ｒ１、およびＳＰ−１は、それぞれ〔１〕のＲ１、およびＳＰ−１と同意義を表し、Ｒ２は水素原子、またはアルキル基であり、アルキル基は置換されていてもよい）
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基が、以下の式：
2017150732.tif 000024
（式中、
Ｒ１は、−Ｓ−Ｒ２３であり、
Ｒ２３は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、またはｓｅｃ−ブチルであり、
ＳＰ−１は、ｐ−Ａｃｂｚ、ｏ−Ａｃｂｚ、またはＡｚｏｃである）
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、〔１〕〜〔１８〕および〔２５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２７〕
２以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又は当該複合体を含むライブラリーの製造方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む方法：
（ａ）第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）：
2017150732.tif 000025
（式中、
Ｒ１は、翻訳合成が可能なチオール基の保護基であり；
Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ２とＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し；あるいはＲ２またはＲ３は、Ｒ４およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しＲ２が、これが結合するＮ原子およびＳＰ−１と一緒になってアジド基（−Ｎ３）を形成する場合、上記の定義はＲ２に対して適用されず；
Ｒ４は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく； 
Ｒ１１、およびＲ１２は、それぞれ独立して、単結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく；
ＳＰ−１は、これが結合するＮ原子およびＲ２と一緒になってアジド基を形成するか、
以下の式：
2017150732.tif 000026
（式中のＰ１は、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである）で表されるか、または以下の式：
2017150732.tif 000027
（式中のＰ２は、アルキル、アリール、またはヘテロアリールである）で表される、アミノ基の保護基である）
で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチド、または当該ペプチドと核酸との複合体を、当該ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で得られる非環状ペプチド、または当該ペプチドと核酸との複合体から一般式（Ｉ）中のＲ１およびＳＰ−１を除去し、第一の反応点と第二の反応点とを反応させてアミド結合を形成させる工程を含む、方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、アミノ酸類縁体を複数含むペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体を、切断ペプチドの生成を抑制して高い収率と純度で翻訳合成し、かつ効率的に環化することが可能となる。
その結果、アミノ酸類縁体を複数含むドラックライクな環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体、および当該複合体のディスプレイライブラリーが提供される。本発明を用いて構築したディスプレイライブラリーは、従来の手法よりもアミノ酸類縁体を多数含むペプチドを高い効率で翻訳合成できるので、より多彩なドラックライクなヒット化合物を取得する確率がさらに高まる。【００２３】
また、本発明を用いればＬ−システインのみならず、Ｄ−システインや、ＬまたはＤ−Ｎメチルシステインを含む、チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸残基を、Ｎ末端に翻訳導入することが可能となる。そのため、より多様性の高いドラッグライクなディスプレイライブラリーを提供することが可能となる。【００２４】
さらに本発明によるｍＲＮＡディスプレイライブラリーから得られたヒット化合物は、既に優れた膜透過性と代謝安定性を有しているので、医薬品としての最適化を効率良く実施することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、Ｎ末端にｐ−Ａｃｂｚ保護されたシステイン類縁体を持つ翻訳合成ペプチドの電気泳動による確認を示す図である。
【図２−１】図２−１は、ｐ−Ａｃｂｚ保護されたＮ−メチルシステインの翻訳合成ペプチドのMALDI TOF MSによる確認を示す図である。
【図２−２】図２−２は、ｐ−Ａｃｂｚ保護されたＮ−メチル−Ｄ−システインの翻訳合成ペプチドのMALDI TOF MSによる確認を示す図である。
【図２−３】図２−３は、ｏ−Ａｃｂｚまたはｐ−Ａｃｂｚ保護されたＮ−メチルシステインの翻訳合成ペプチドのMALDI TOF MSによる確認を示す図である。
【図３−１】図３−１は、Ａｃｂｚ保護されたＮ−メチルシステインの翻訳合成ペプチドの電気泳動による確認を示す図である。
【図３−２】図３−２は、ｏ−Ａｃｂｚまたはｐ−Ａｃｂｚ保護されたＮ−メチルシステインの翻訳合成ペプチドの電気泳動による確認を示す図である。
【図４】図４は、Initiation suppression法とinitiation read-through法のそれぞれの翻訳の開始方法を用いて同じペプチドを翻訳合成した際のMALDI-TOF MS分析の結果を示す図である。Initiation read-through法とInitiation suppression法を比較すると、 Initiation suppression法は目的物のＭＳ強度がより強く観測された。また切断ペプチドのＭＳ強度はより弱く観測され、それぞれのＭＳ強度は目的物と比較して１／２０以下であった。
【図５】図５は、それぞれの翻訳開始方法によってアミノ酸類縁体を複数含むペプチドを翻訳合成した際に得られた目的物と副生成物である切断ペプチドのＭＳ強度を示す図である。切断ペプチドＭＳ強度を示すグラフは、複数の切断ペプチドが観測された場合、それらのＭＳ強度の合計値を表している。Initiation read-through法とInitiation suppression法を比較すると、 Initiation suppression法は目的物のＭＳ強度がより強く観測され、切断ペプチドのＭＳ強度はより弱く観測された。
【図６−１】図６−１は、Ｎ−末端に保護基を有するＮ−メチルシステインとＣ末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチドを翻訳合成した後に、Ｎ−メチルシステインの保護基を脱保護し、ネイティブケミカルライゲーションによる環化反応によって得られた化合物と、その後の脱硫反応によって得られたアミド環化ペプチドのマススペクトルを示した図である。
【図６−２】図６−２は、図６−１の続きを示す図である。
【図６−３】図６−３は、図６−２の続きを示す図である。
【図６−４】図６−４は、図６−３の続きを示す図である。
【図６−５】図６−５は、図６−４の続きを示す図である。
【図６−６】図６−６は、図６−５の続きを示す図である。
【図７】図７は、Ａｃｂｚ脱保護反応、ネイティブケミカルライゲーションによる環化反応、脱硫反応条件下におけるＲＮＡの安定性を電気泳動により評価した結果を示す図である。
【図８】アミノ基がp-Acbz保護されたアミノ酸類縁体をN末端に翻訳導入したペプチドの電気泳動による確認を示す図である。
【図９】アミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を有するアミノ酸類縁体をN末端に翻訳導入したペプチドの電気泳動による確認を示す図である。
【図１０−１】N-末端にAcbz-Cys(StBu)を有しCys-Pro-HOGlyとC末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチドを翻訳合成した後にAcbz基、StBuをそれぞれ脱保護しネイティブケミカルライゲーションによる環化反応によって得られた環化ペプチドPep-71のマススペクトルを示した図である。
【図１０−２】翻訳ペプチドからネイティブケミカルライゲーションによって合成した環状ペプチドPep-71を分枝反応条件に付した分枝ペプチドのマススペクトルを示した図である。上図は分枝反応条件改良する前、下図は改良した分岐反応条件に付したマススペクトルをそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
＜置換基等の定義＞
本明細書において、「アルキル」とは脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和の炭素−炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。炭素鎖の長さｎは１〜２０個の範囲である。アルキルとしては、たとえば、「Ｃ１−Ｃ６アルキル」が挙げられ具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、ｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、１−メチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１，１，２，２−テトラメチルプロピル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、イソペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。
【００２７】
本明細書において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニルとしては、直鎖状または分枝鎖状のものが挙げられ、内部オレフィンを含む直鎖などを含む。好ましくはＣ２−Ｃ１０アルケニル、さらに好ましくはＣ２−Ｃ６アルケニルが挙げられる。
このようなアルケニルとして、具体的には、たとえば、ビニル、アリル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル（シス、トランスを含む）、３−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
【００２８】
本明細書において「アルキニル」は、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。直鎖状または分枝鎖状のアルキニルが挙げられ、内部アルキレンを含む。好ましくはＣ２−Ｃ１０アルキニル、さらに好ましくはＣ２−Ｃ６アルキニルが挙げられる。
アルキニルとしては具体的には、たとえば、エチニル、１−プロピニル、プロパルギル、３−ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３−フェニル−２−プロピニル、３−（２'−フルオロフェニル）−２−プロピニル、２−ヒドロキシ−２−プロピニル、３−（３−フルオロフェニル）−２−プロピニル、３−メチル−（５−フェニル）−４−ペンチニルなどが挙げられる。
【００２９】
本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。好ましくはＣ３−Ｃ１０シクロアルキルが挙げられる。シクロアルキルとしては具体的には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチルなどが挙げられる。
【００３０】
本明細書において「アリール」とは１価の芳香族炭化水素環を意味し、好ましくはＣ６−Ｃ１０アリールが挙げられる。アリールとしては具体的には、たとえば、フェニル、ナフチル（たとえば、１−ナフチル、２−ナフチル）などが挙げられる。
【００３１】
本明細書において「ヘテロアリール」とは、環を構成する原子中に好ましくは１〜５個のヘテロ原子を含有する芳香族性の環の１価の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、または２個の縮合環（たとえば、ベンゼンまたは単環へテロアリールと縮合した２環式ヘテロアリール）であってもよい。環を構成する原子の数は好ましくは５〜１０である（５員−１０員ヘテロアリール）。
ヘテロアリールとしては具体的には、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。
【００３２】
本明細書において「アリールアルキル（アラルキル）」とは、アリールとアルキルを共に含む基であり、例えば、前記アルキルの少なくとも一つの水素原子がアリールで置換された基を意味し、好ましくは、「Ｃ５−Ｃ１０アリールＣ１−Ｃ６アルキル」が挙げられる。たとえば、ベンジルなどが挙げられる。
【００３３】
本明細書において「アルキレン」は、前記「アルキル」からさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される二価の基を意味し、アルキレンとしては好ましくはＣ１−Ｃ２アルキレン、Ｃ１−Ｃ３アルキレン、Ｃ１−Ｃ４アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキレン、Ｃ１−Ｃ６アルキレンが挙げられる。アルキレンとして具体的には、たとえば、メチレン、１，２−エチレン、１，１−エチレン、１，３−プロピレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレンなどが挙げられる。
【００３４】
本明細書において「アリーレン」は、前記アリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。アリーレンは、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、好ましくは６〜１０である（Ｃ６−１０アリーレン）。アリーレンとして具体的には、たとえば、フェニレン、ナフチレンなどが挙げられる。
【００３５】
本明細書において「ヘテロアリーレン」は、前記ヘテロアリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。ヘテロアリーレンは、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、好ましくは５〜１０である（５員〜１０員ヘテロアリーレン）。ヘテロアリーレンとして具体的には、ピロールジイル、イミダゾールジイル、ピラゾールジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアゾールジイル、トリアジンジイル、イソオキサゾールジイル、オキサゾールジイル、オキサジアゾールジイル、イソチアゾールジイル、チアゾールジイル、チアジアゾールジイル、フランジイルおよびチオフェンジイルなどが挙げられる。
【００３６】
本明細書において「アルキレンアリーレン」とは、前記アルキレンと前記アリーレンとが任意の位置で結合した２価の基であって、基本骨格側にアルキレンが結合した基を意味する。アルキレンアリーレンとして具体的には、−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−Ｃ６−Ｃ１０アリーレンなどが挙げられる。
【００３７】
本明細書において「アリーレンアルキレン」とは、前記アリーレンと前記アルキレンとが任意の位置で結合した２価の基であって、基本骨格側にアリーレンが結合した基を意味する。アリーレンアルキレンとして具体的には、−Ｃ６−Ｃ１０アリーレン−Ｃ１−Ｃ６アルキレンなどが挙げられる。
【００３８】
本明細書において「アルキレンヘテロアリーレン」とは、前記アルキレンと前記ヘテロアリーレンとが任意の位置で結合した２価の基であって、基本骨格側にアルキレンが結合した基を意味する。アルキレンヘテロアリーレンとして具体的には、−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−５員−１０員ヘテロアリーレンなどが挙げられる。
【００３９】
本明細書において「ヘテロアリーレンアルキレン」とは、前記ヘテロアリーレンと前記アルキレンとが任意の位置で結合した２価の基であって、基本骨格側にヘテロアリーレンが結合した基を意味する。ヘテロアリーレンアルキレンとして具体的には、−５員−１０員ヘテロアリーレン−Ｃ１−Ｃ６アルキレンなどが挙げられる。
【００４０】
本明細書において、「活性エステル」とは、アミノ基と反応してアミド結合を生成するカルボニルを含む基であって、該カルボニルに、たとえばＯＢｔ、ＯＡｔ、ＯＳｕ、ＯＰｆｐ、ＳＲ１などが結合した基であり、アミンとの反応を促進しうる基である。
【００４１】
「反応補助基」とは、望みの位置で選択的に反応を起こさせるために、結合させる官能基の近傍に導入されて、該官能基を結合反応に対して活性化する基であり、たとえば、カルボニルとアミンを反応させるため、カルボニルとアミン側のいずれか、あるいは両方に反応補助基を導入させることができる。このような反応補助基は、結合反応とともに、あるいは結合反応後に脱離させることもできる。
【００４２】
＜ペプチド、ペプチドと核酸の複合体＞
・環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体
本発明において、環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体の環状部は、翻訳合成された後のペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体をアミド化反応に供することにより形成される。本発明において、ペプチドと核酸の複合体のペプチドの部分を、「ペプチド部位」と記載する場合がある。また、本発明において、「核酸」にはＤＮＡとｍＲＮＡが含まれる。
【００４３】
また、翻訳合成後、アミド化反応により環状部が形成されたペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体のペプチド部位をさらに化学修飾して得られるペプチド、ペプチドと核酸の複合体も、本発明のペプチド、ペプチドと核酸の複合体に含まれる。
【００４４】
スキームＡに例示されるとおり、本発明のペプチド、ペプチドと核酸の複合体は直鎖部を有していてもよい。ペプチド、ペプチド部位のアミド結合の数（アミノ酸の数・長さ）は特に限定されないが、直鎖部を有する場合、環状部と直鎖部を併せて３０残基以内が好ましい。直鎖部の数は特に限定されないが、１または２以上の直鎖部を有していてもよい。最終的に得られる環状ペプチドが高い膜透過性を獲得するためには、環状部と直鎖部を併せた総アミノ酸数は１３残基以下であることが好ましい。高い代謝安定性を獲得するためには、総アミノ酸数が９以上であることが好ましい。膜透過性と代謝安定性の両立（ドラッグライクネス）を考慮すると環状部を構成するアミノ酸の数は５〜１２であることが好ましく、５〜１１であることがより好ましく、７〜１１であることがさらに好ましく、９〜１１であることが特に好ましい。直鎖部のアミノ酸の数（ユニットの数）は０〜８であることが好ましく、０〜３であることがより好ましい。
【００４５】
2017150732.tif 000028
【００４６】
スキームＡは、本発明のペプチドと核酸の複合体のうち、（環化前後の）ペプチド部位を説明したスキームである。白丸（○）ユニット（交差ユニット）、黒丸（●）ユニット（環状部主鎖ユニット）、四角（■）ユニット（直鎖部主鎖ユニット）、三角（▲）ユニット（環化Ｎ末端ユニット）はそれぞれペプチド部位を構成するアミノ酸を意味する。それぞれのユニットは同一のアミノ酸であっても、異なるアミノ酸であってもよい。
【００４７】
ここで、ユニットとは、翻訳合成後環化前のアミノ酸、環化後のアミノ酸、環化後の化学修飾が完了した時点でのアミノ酸のいずれかを意味する。環化後の化学修飾が完了した時点でのアミノ酸には、１つのｔＲＮＡによって翻訳されたアミノ酸が、翻訳後の化学修飾により、化学変換や骨格変換されたアミノ酸が含まれる。
【００４８】
環状部とは、スキームＡにおいては、１つの三角ユニットと８つの黒丸ユニットおよび１つの白丸ユニットからなる部位であり、直鎖部とは６つの四角ユニットからなる部位である。スキームＡの曲線部分が翻訳後に環化される部位（翻訳後環化部）であり、この部分はアミド結合にて結合される。
【００４９】
本発明のペプチドまたはペプチド部位は、スキームＡに記載の三角ユニットや交差ユニットに反応性官能基を要求するため、三角ユニットや交差ユニットには必ずしもドラッグライクなアミノ酸が選択されない。また、本発明においては、環状部は、２以上のアミノ酸類縁体残基を含むことが好ましい。
【００５０】
また、本発明のペプチド、ペプチドと核酸の複合体は、スキームＡに沿って、三角ユニットと交差ユニットとを環化した後、例えば、分子内環化反応をさらに行うことにより、２つの直鎖部（直鎖部１および直鎖部２）を有する環状ペプチドを得ることができる（ＷＯ２０１３／１００１３２参照）。
2017150732.tif 000029
【００５１】
本明細書において「翻訳合成」とは、ペプチドまたはペプチド部位をコードする核酸（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）から、該ペプチドまたはペプチド部位を翻訳して合成すること意味する。翻訳とは、リボゾームの作用によってｍＲＮＡを鋳型にアミド結合反応を繰り返すことによって直鎖ペプチドを得る工程である。
【００５２】
本明細書において「翻訳後修飾」とは、翻訳後にリボゾームの作用以外で自動的にあるいは試薬を添加させて生じさせる化学反応を意味し、例えば環化反応、脱硫反応、脱保護反応を挙げることができる。
【００５３】
本発明において、環化前のペプチドまたはペプチド部位における三角ユニット（環化前Ｎ末端ユニット）には、チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸残基であって、チオール基とアミノ基の両方が保護基によって保護されたものを利用することができる。このようなアミノ酸残基として、具体的には、一般式（Ｉ）：
2017150732.tif 000030
または一般式（ＩＩ）：
2017150732.tif 000031
で表されるアミノ酸残基が挙げられる。
【００５４】
本発明において、環化前のペプチドまたはペプチド部位における交差ユニットには、三角ユニットのアミノ酸が有する官能基（第一の反応点）と、アミド結合によって環化できる官能基（第二の反応点）を側鎖に有するアミノ酸が用いられる。交差ユニットでは、主鎖のアミノ基、カルボキシル基が翻訳合成での他のアミノ酸残基との共有結合形成に使用され、かつ第三の官能基が翻訳後環化に必要であるため、合計３つ以上の官能基を有する必要がある。この中で、翻訳後の環化反応には、交差ユニットの側鎖部位の官能基が用いられる。
【００５５】
交差ユニットは、環化可能な位置であれば、環化前ペプチド部位中の任意の位置に組み込むことが可能であるが、環化、もしくは環化後の翻訳後修飾が施された後の環状部のアミノ酸数が５〜１２となるような位置に組み込むことが好ましく、５〜１１となる位置に組み込むことがより好ましい。すなわち本発明においては、交差ユニットは、三角ユニットから少なくとも４アミノ酸残基（例えば、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基）Ｃ末端側の位置に組み込むことが好ましい。
【００５６】
このような交差ユニットとして具体的には、下記一般式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ−ＯＨ）：
2017150732.tif 000032
で表されるアミノ酸残基が挙げられる。
【００５７】
黒丸ユニット、四角ユニットはアミノ酸より選択され、好ましくはドラッグライクなアミノ酸から選択される。
【００５８】
本発明において「ドラッグライクなアミノ酸」とは、ドラッグライクなペプチド部位を構成するアミノ酸をいい、「アミノ酸」と同一の骨格、すなわち、α、βおよびγ−アミノ酸と同一の骨格を有するものをいう。具体的には、ドラッグライクなアミノ酸は、Ｌ型アミノ酸およびＤ型アミノ酸、α、α―ジアルキルアミノ酸などから選択される。好ましくは、主鎖アミノ基（ＮＨ２基）の水素原子２つのうちの１つがメチルで置換されたものが挙げられ、当該メチルの水素原子のうち１つあるいは２つがさらにアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどで置換されてもよいものが挙げられる。また、主鎖メチレン（−ＣＨ２−）の水素原子のうち、１つあるいは２つがアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどで置換されたもの、あるいは「ドラッグライクネスに寄与する置換基」が直接置換したものも含む。
【００５９】
「ドラッグライクなアミノ酸」の上記の置換基は、「ドラッグライクネスに寄与する置換基」でさらに置換されていてもよい。ここで、「ドラッグライクネスに寄与する置換基」には、例えば、ヒドロキシル（−ＯＨ）、オキシ（−ＯＲ）、アミド（−ＮＲ−ＣＯ−Ｒ'もしくは−ＣＯ−ＮＲＲ'）、スルホニル（−ＳＯ２−Ｒ）、スルフィニル（−ＳＯ−Ｒ）、ハロゲン、オキシアミノ（−ＮＲ−ＯＲ'）、アミノオキシ（−Ｏ−ＮＲＲ'）、オキシカルボニル（−ＣＯ−ＯＲ）、チオカルボニル（−ＣＯ−ＳＲ）、チオール（−ＳＨ）、チオ（−ＳＲ）、１級アミノ（−ＮＨ２）、２級アミノ（−ＮＨＲ）あるいは３級アミノ（−ＮＲＲ'）、スルホニルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ）、ボリル（−ＢＲＲ'）、ジオキシボリル（−Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））、アジド（−Ｎ３）、カルボキシカルボニル（−ＣＯ−ＣＯ２Ｈ）、ホスホリルカルボニル（−ＣＯ−ＰＯ（Ｒ）（Ｒ'））、カルボニルオキシアミノ（−ＮＨ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ）などの中から選択される１つ以上の置換基が挙げられる。
【００６０】
また「ドラッグライクなアミノ酸」には、ペプチドの側鎖部分（例えばＤ−チロシンにてヒット化合物が取得された場合には、そこから化学修飾させたＤ型のアミノ酸、β―アラニンにてヒット化合物が取得された場合には、そこから化学修飾させたβ―アミノ酸）、あるいはＮメチルアミノ酸の化学変換によるＮ末端置換部分の構造を最適化した、化学的に合成し得る全てのアミノ酸も含まれる。
【００６１】
本発明において「ドラッグライクネス」あるいは「ドラッグライク」とは、ペプチド部位が、少なくとも経口剤、あるいは、細胞内蛋白、核酸、膜蛋白の細胞内領域又は膜蛋白の膜貫通ドメインを標的とした場合に、医薬品として利用できる程度の膜透過性と代謝安定性を有することを意味する。
【００６２】
本発明のペプチドまたはペプチド部位は、直鎖部がなくてもよいが、直鎖部を有することで、環状部を有するペプチドまたはペプチド部位の機能を強化することが可能である。例えば、あるレセプターとリガンドの結合を阻害するために前記ペプチドまたはペプチド部位を利用する場合、当該ペプチドまたはペプチド部位が直鎖部を有することで、直鎖部がない場合と比較して、当該ペプチドまたはペプチド部位の、レセプターあるいはリガンドに対する結合活性を高めることができる。そして、当該結合活性の増強により、レセプターとリガンドの結合阻害効果を高めることが可能である（ＷＯ２０１３／１００１３２参照）。
【００６３】
本発明において、ペプチドまたはペプチド部位を構成する「アミノ酸」は、「天然アミノ酸」でも「アミノ酸類縁体」でもよい。「アミノ酸」、「天然アミノ酸」、「アミノ酸類縁体」はそれぞれ、「アミノ酸残基」、「天然アミノ酸残基」、「アミノ酸類縁体残基」ということがある。
【００６４】
「天然アミノ酸」とは、α−アミノカルボン酸（α−アミノ酸）であり、タンパク質に含まれる２０種類のアミノ酸を指す。具体的にはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏを指す。
【００６５】
「アミノ酸類縁体」は、非天然型アミノ酸（例えば、非天然型のα−アミノ酸、βアミノ酸、γ−アミノ酸）を含む。α−アミノ酸の場合、Ｄ型アミノ酸でもよく、α，α−ジアルキルアミノ酸でもよい。βやγ−アミノ酸の場合も、α−アミノ酸と同様に、任意の立体配置が許容される。アミノ酸類縁体の側鎖（主鎖メチレン）は特に制限されないが、水素原子の他にも例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを有し得る。それぞれには１つ以上の置換基を有していてもよく、それら置換基は例えば、ハロゲン原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、Ｐ原子を含む任意の官能基の中から選択することができる。例えば、本明細書において「ハロゲンを置換基に有していてもよいＣ１−Ｃ６アルキル」とは、１つ以上のハロゲン原子で置換された「Ｃ１−Ｃ６アルキル」を意味し、具体的には、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、フルオロメチル、ペンタプルオロエチル、テトラフルオロエチル、トリフルオロエチル、ジフルオロエチル、フルオロエチル、トリクロロメチル、ジクロロメチル、クロロメチル、ペンタクロロエチル、テトラクロロエチル、トリクロロエチル、ジクロロエチル、クロロエチル等が挙げられる。また、例えば「置換基を有していてもよいＣ５−Ｃ１０アリールＣ１−Ｃ６アルキル」とは、「Ｃ５−Ｃ１０アリールＣ１−Ｃ６アルキル」のアリールおよび／またはアルキルの少なくとも一つの水素原子が、置換基により置換された基を意味する。さらに、これら「置換基を２つ以上有している場合」は、例えば、Ｓ原子を含む官能基を有し、さらにその官能基がアミノやハロゲンなどの官能基を有していることも含む。
【００６６】
アミノ酸類縁体の主鎖アミノ基は、非置換（ＮＨ２基）でもよく、置換（即ち、ＮＨＲ基：Ｒは置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示し、またプロリンのようにＮ原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。該置換基は、側鎖の置換基と同様であり、例えば、ハロゲン、オキシ、ヒドロキシなどが挙げられる。）されていてもよい。さらに、これらの置換基の定義の中における「アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキル」は、前記の当該官能基の定義を準用する。例えば、本明細書において「アルコキシ」とは、水酸基の水素原子が前記アルキルで置換された基を意味し、例えば好ましい例として「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ」が挙げられる。
【００６７】
また、「アミノ酸類縁体」には、「アミノ酸」のアミノ基が水酸基に置き換わった、ヒドロキシカルボン酸も含まれる。当該ヒドロキシカルボン酸は、他のアミノ酸類縁体と同様に、様々な置換基を有していてもよい。ヒドロキシカルボン酸の立体配置はアミノ酸のＬ型、Ｄ型のいずれに対応するものでもよい。その側鎖は特に制限されないが、例えば置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルなどの中から選択される。
【００６８】
ハロゲン由来の置換基としては、フルオロ（−Ｆ）、クロロ（−Ｃｌ）、ブロモ（−Ｂｒ）、ヨウド（−Ｉ）などが挙げられる。
【００６９】
Ｏ原子由来の置換基としては、ヒドロキシル（−ＯＨ）、オキシ（−ＯＲ）、カルボニル（−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、カルボキシル（−ＣＯ２Ｈ）、オキシカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）、カルボニルオキシ（−Ｏ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、チオカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＳＲ）、カルボニルチオ基（−Ｓ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、アミノカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）、スルホニルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ）、アミノスルホニル（−ＳＯ２−ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−ＮＨＲ）、チオカルボキシル（−Ｃ（＝Ｏ）−ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＯ２Ｈ）が挙げられる。
【００７０】
オキシ（−ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。
【００７１】
カルボニル（−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、ホルミル（−Ｃ＝Ｏ−Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。
【００７２】
オキシカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
（−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）
【００７３】
カルボニルオキシ（−Ｏ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。
【００７４】
チオカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。
【００７５】
カルボニルチオ（−Ｓ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。
【００７６】
アミノカルボニル（−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。これらに加えて、−Ｃ＝Ｏ−ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００７７】
カルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００７８】
オキシカルボニルアミノ（−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、−ＮＨ−Ｃ＝Ｏ−ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００７９】
スルホニルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００８０】
アミノスルホニル（−ＳＯ２−ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。これらに加えて、−ＳＯ２−ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
【００８１】
スルファモイルアミノ（−ＮＨ−ＳＯ２−ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、−ＮＨ−ＳＯ２−ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より独立して選択される置換基で置換されていてもよく、またこれらの２つの置換基は環を形成しても良い。
【００８２】
Ｓ原子由来の置換基として、チオール（−ＳＨ）、チオ（−Ｓ−Ｒ）、スルフィニル（−Ｓ＝Ｏ−Ｒ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ）、スルホ（−ＳＯ３Ｈ）が挙げられる。
【００８３】
チオ（−Ｓ−Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどの中から選択される。
【００８４】
スルフィニル（−Ｓ＝Ｏ−Ｒ）の例としては、アルキルスルフィニル、シクロアルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、アラルキルスルフィニルなどが挙げられる。
【００８５】
スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。
【００８６】
Ｎ原子由来の置換基として、アジド（−Ｎ３、「アジド基」ともいう）、シアノ（−ＣＮ）、１級アミノ（−ＮＨ２）、２級アミノ（−ＮＨ−Ｒ）、３級アミノ（−ＮＲ（Ｒ'））、アミジノ（−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２）、置換アミジノ（−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ'Ｒ"）、グアニジノ（−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＮＨ２）、置換グアニジノ（−ＮＲ−Ｃ（＝ＮＲ'''）−ＮＲ'Ｒ"）、アミノカルボニルアミノ（−ＮＲ−ＣＯ−ＮＲ'Ｒ"）が挙げられる。
【００８７】
２級アミノ（−ＮＨ−Ｒ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。
【００８８】
３級アミノ（−ＮＲ（Ｒ'））の例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなど、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択される、任意の２つの置換基を有するアミノ基が挙げられ、これらの任意の２つの置換基は環を形成しても良い。
【００８９】
置換アミジノ（−Ｃ（＝ＮＲ）−ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｎ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ"が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。
【００９０】
置換グアニジノ（−ＮＲ−Ｃ（＝ＮＲ'''）−ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｒ，Ｒ'、Ｒ"、およびＲ'''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらが環を形成した基などが挙げられる。
【００９１】
アミノカルボニルアミノ（−ＮＲ−ＣＯ−ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｒ、Ｒ'、およびＲ"が、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらは環を形成した基などが挙げられる。
【００９２】
Ｂ原子由来の置換基として、ボリル（−ＢＲ（Ｒ'））やジオキシボリル（−Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））などが挙げられる。これらの２つの置換基ＲおよびＲ'は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択されるか、あるいはこれらは環を形成してもよい。
【００９３】
ペプチドまたはペプチド部位を構成する「アミノ酸」を構成する少なくとも１つの原子は、原子番号（陽子数）が同じで，質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子（同位体）であってもよい。当該ペプチド部位を構成する「アミノ酸」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ等が含まれる。
【００９４】
本発明において、Ｎ末端以外に利用できる非天然型アミノ酸（アミノ酸類縁体）を以下に例示するが、それらに限定されない。これらの非天然型アミノ酸の多くは側鎖が保護あるいは無保護、アミン部位が保護あるいは無保護の状態で購入することができる。購入できないものは、既知の方法によって合成することができる。
2017150732.tif 000033
【００９５】
非天然型アミノ酸として、以下のＮ−Ｍｅアミノ酸を用いることができる。
Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルフェニルアラニン、Ｎ−メチルチロシン、Ｎ−メチル−３−クロロフェニルアラニン、Ｎ−メチル−４―クロロフェニルアラニン、Ｎ−メチル−４−メトキシフェニルアラニン、Ｎ−メチル−４−チアゾールアラニン、Ｎ−メチルヒスチジン、Ｎ−メチルセリン、Ｎ−メチルアスパラギン酸、
2017150732.tif 000034
【００９６】
非天然型アミノ酸として、以下のＮ−アルキルアミノ酸も用いることができる。
2017150732.tif 000035
【００９７】
非天然型アミノ酸として、以下のＤ型アミノ酸も用いることができる。
2017150732.tif 000036
【００９８】
非天然型アミノ酸として、以下のα，α−ジアルキルアミノ酸も用いることができる。
2017150732.tif 000037
【００９９】
非天然型アミノ酸として以下のアミノ酸も用いることができる。
2017150732.tif 000038
【０１００】
＜環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体の製造方法＞
本発明の環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体（ペプチド−核酸複合体）、またはペプチド−核酸複合体のライブラリーは、例えば以下に記載の工程を含む方法を利用して製造することが可能である。
１）アミノ酸残基により構成される非環状のペプチドまたはペプチド部位を、該ペプチドまたはペプチド部位をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、
該非環状のペプチドまたはペプチド部位は、第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）：
2017150732.tif 000039
で表されるアミノ酸残基をＮ末端に含み、側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＣ末端側に含む、工程；および
２）第一の反応点と、第二の反応点とを反応させ、アミド結合を形成させる工程
を含む、前記方法。
【０１０１】
本発明において、非環状のペプチドまたはペプチド部位の翻訳合成には、イニシエーションサプレッション（Initiation Suppression：iSP）法を利用する。通常の翻訳では、一般的に翻訳開始アミノ酸としてメチオニンがＮ末端アミノ酸として翻訳される。翻訳の開始には専用の「開始ｔＲＮＡ」があり、開始ｔＲＮＡがメチオニン（原核生物ではホルミルメチオニン）と結合しリボソームに運ばれることによって、翻訳が開始され、Ｎ末端のアミノ酸がメチオニン（原核生物ではホルミルメチオニン）となる。これに対し、翻訳系内からメチオニンがアミノアシル化された開始ｔＲＮＡを除去し（または生成されないにし）、予め調製した所望のアミノ酸がアミノアシル化された開始ｔＲＮＡを代わりに翻訳系内に加えることによって、Ｎ末端に所望のアミノ酸を持つペプチドを翻訳合成することをイニシエーションサプレッション法という。アミノ酸類縁体のＮ末端導入ではアミノ酸の許容度が伸長時よりも高く、天然型アミノ酸と大きく構造の異なるアミノ酸、アミノ酸類縁体を利用することが知られている（非特許文献：J Am Chem Soc. 2009 Apr 15;131(14):5040-1.Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides.Goto Y, Suga H.）。
【０１０２】
第一の反応点を有する上記一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基をＮ末端に含み、側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＣ末端側に含むペプチドは、それをコードする核酸を翻訳することによってｉＳＰ法により取得することができる。
【０１０３】
ペプチドまたはペプチド部位を構成するアミノ酸は、ドラッグライクなアミノ酸であることが好ましい。得られるペプチドまたはペプチド部位がドラッグライクなものとなるように、翻訳合成後にドラッグライクなアミノ酸となるように化学修飾してもよい。
【０１０４】
＜翻訳可能なアミノ酸のＮ末端への導入＞
本発明では、チオール基をアミノ基近傍に有し、チオール基とアミノ基がどちらとも保護されているアミノ酸残基（三角ユニット、例えば、保護基によって保護されたシステインやシステイン類縁体）をアミノアシル化した翻訳開始ｔＲＮＡを用いて翻訳させることによってＮ末端を所望のアミノ酸として翻訳させることもできる。すなわち本発明は、第一の反応点を有する一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基をＮ末端に含み、側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＣ末端側に含む非環状ペプチドの製造方法をも提供する。
【０１０５】
本発明においては、ｉＳＰ法を使用することができる。すなわち、アミノアシル化したｔＲＮＡをメチオニン、フォルミルドナーもしくはメチオニルトランスフェラーゼを抜いた翻訳系に添加し、翻訳開始コドン（例えばＡＵＧ）に三角ユニットをコードさせて翻訳させることによって、Ｎ末端を三角ユニットとする環化前のペプチド部位又はペプチド部位ライブラリーを構築することができる。
【０１０６】
本発明における「システイン」とはＬ−システインを意味し、そのチオール基、アミノ基は保護基を有していないものを意味する。また「システイン類縁体」とは側鎖にチオールを有する、天然アミノ酸以外のアミノ酸であって、そのチオール基、アミノ基には保護基を有していないものを意味する（式（I）のＲ１、Ｒ２、ＳＰ−１が水素原子であるものに対応）。システイン類縁体の立体配置は任意であり、チオール基を有していれば側鎖の構造は特に限定されない。このような側鎖として、具体的には、例えば置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルなどが挙げられる。置換基の数は１つに限定されず、２つ以上有していてもよい。
【０１０７】
アンチコドンがＣＡＵでない翻訳開始ｔＲＮＡと当該翻訳開始ｔＲＮＡのアンチコドンに対応するコドンの様々な組み合わせを、翻訳開始ｔＲＮＡ及び開始コドンの組み合わせとして利用すると、Ｎ末端に多様性をもたせることが可能である。つまり、アンチコドンの異なる複数種類の翻訳開始ｔＲＮＡに所望のシステインまたはシステイン類縁体をそれぞれアミノアシル化したアミノアシルｔＲＮＡを使用して、当該アミノアシルｔＲＮＡのアンチコドンに対応するコドンを開始コドンとしたｍＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーを翻訳させることによって、Ｎ末端残基が一種類に限定されない環化前のペプチド部位又はペプチド部位のライブラリーを作製することができる。具体的には例えば、Mayer C,et al. Anticodon sequence mutants of Escherichia coli initiator tRNA: effects of overproduction of aminoacyl-tRNA synthetases, methionyl-tRNA formyltransferase, and initiation factor 2 on activity in initiation.Biochemistry. 2003, 42, 4787-99.（ＣＡＵ以外のアンチコドンを持つ開始ｔＲＮＡの変異大腸菌によるｆ−Ｍｅｔ以外のアミノ酸からの翻訳開始と同コドンを途中に含む蛋白の発現。）に記載の方法を用いて環化前のペプチド部位又はペプチド部位ライブラリーを作製することができる。
【０１０８】
以下に本発明のペプチドまたはペプチド部位おいて環状部を形成させる工程について説明する。交差ユニットの反応点とアミド結合を形成する三角ユニットの反応させたい基（反応点、例えばアミノ基）と、ペプチド部位を構成するアミノ酸残基の反応させたくない塩基性官能基との反応選択性を獲得するために、三角ユニットの反応点をより活性化させる手法が用いられる。このような手法として、具体的には反応点の近傍に反応補助基（例えば、チオール基）を有するアミノ酸をＮ末端に用いる。例えばシステインは、アミノ基のβ位にチオールを有することから、このようなアミノ酸に該当する。Ｎ末端としてシステインを用いる場合、スキームＣに示されるとおり、システインのチオール基とアミノ基は、翻訳導入の過程では、どちらとも保護されているが、環化反応と同時にまたはそれに先立って脱保護反応により遊離のチオール基とアミノ基を生成させる。反応補助基を介した三角ユニットの反応点（例えば、アミノ基）と、交差ユニットの反応点（例えば、活性化されたカルボキシル基）との反応により、望みの位置でのアミド環化されたペプチドを得ることができる。得られた環状ペプチドの三角ユニットに含まれるチオール基は、ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシルエチル）ホスフィン）とＶＡ−０４４（２，２'−アゾビス−２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン二塩酸塩）などの適当な試薬を用いて、ＲＮＡが反応しない温和な反応条件で脱硫することができる。
【０１０９】
2017150732.tif 000040
【０１１０】
環化反応の好ましい反応条件として、ｐＨは、好ましくは６．０以上９．２以下であり、より好ましくは７．０以上８．５以下である。反応温度は通常化学反応が実施できる範囲であれば特に限定されないが、好ましくは４℃〜８０℃であり、より好ましくは１０℃〜５０℃である。副反応である空気による酸化反応（Ｓ−Ｓ形成反応）を抑制する目的で、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（＝ＴＣＥＰ）のような還元剤を添加することも可能である。ＴＣＥＰを用いる場合、その使用量は特に限定されないが、反応性を高めるために１ｍＭ以上が好ましく、１０ｍＭ以上１００ｍＭ以下であることがより好ましい。
【０１１１】
脱硫反応の好ましい反応条件として、ＲＮＡを安定に存在させること、および加水分解を抑制させることを考慮すると、ｐＨは、３．０以上９．２以下であることが好ましく、５．０以上８．５以下であることがより好ましい。反応温度は通常化学反応が実施できる範囲であれば特に限定されないが、４℃〜８０℃であることが好ましく、３０℃〜６０℃であることがより好ましい。ＴＣＥＰの使用量は特に限定されないが、反応性を高めるために１０ｍＭ以上が好ましく、５０ｍＭ以上２Ｍ以下であることがより好ましく、１００ｍＭ以上５００ｍＭ以下であることがさらに好ましい。またＶＡ−０４４の使用量は特に限定されないが、反応性を高めるために１０ｍＭ以上が好ましく、５０ｍＭ以上２Ｍ以下がより好ましく、１００ｍＭ以上５００ｍＭ以下がさらに好ましい。反応は、PUREsystemなどの反応翻訳液中単独で実施してもよく、これにＤＭＦやＮＭＰなどの有機溶媒を添加してもよい。また、翻訳液をカラム精製などで精製した後に溶媒を変更して実施してもよい。
【０１１２】
三角ユニットとして用いることができる環化前のＮ末端アミノ酸残基は、以下の一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）：
2017150732.tif 000041
として表すことができる。
【０１１３】
前記一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基において、Ｒ１は、翻訳合成が可能なチオール基の保護基であり、翻訳合成液中で脱保護され、環化前に水素原子となるものであれば、特に限定されない。このような保護基として、具体的にはＳ−Ｒ２３基、スルホネート（−ＳＯ３−）、チオスルホネート（−Ｓ２Ｏ３−）が挙げられる。Ｒ１が、スルホネートやチオスルホネートである場合、対カチオンは特に限定されないが、Ｎａ＋やＫ＋などが挙げられる。Ｒ２３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはアラルキルであり、これらの基は置換されていてもよい。Ｒ２３として、具体的には、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ―ブチル、フェニル、ｐ−トリフルオロメチルフェニル、ｐ−フルオロフェニル、ベンジル、フェネチルなどが挙げられる。Ｓ−Ｒ２３基のような保護基は翻訳合成液中でゆっくりと脱保護されるため、積極的に脱保護条件を別途定める必要なく脱保護することができる。これらの保護基の採用によって、脱保護とアミド環化を１工程で実施することができる。脱保護には必要に応じて本明細書記載の様々な反応条件にて脱保護剤を添加することができる。
【０１１４】
Ｒ２、Ｒ３はドラッグライクなアミノ酸の側鎖の定義と同様に定義される。たとえば、Ｒ２、Ｒ３は、好ましくは、それぞれ独立して水素原子であるか、または置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、もしくはシクロアルキルである。あるいはＲ２とＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成してもよく、またはＲ２もしくはＲ３は、Ｒ４およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成してもよい。その構造に含まれる立体配置は任意の配置を許容する。
【０１１５】
「Ｒ２とＲ３が結合する原子と一緒になって環を形成する」場合の例として、Ｒ２と、Ｒ２が結合するＮと、Ｒ３と、Ｒ３が結合するＣとを構成原子の一部として４〜７員環を形成した、以下の構造が挙げられる。
2017150732.tif 000042
【０１１６】
「Ｒ２は、Ｒ４およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成する」場合の例として、Ｒ２と、Ｒ２が結合するＮと、Ｒ４と、Ｒ４が結合するＣとを構成原子の一部として５〜７員環を形成した、以下の構造が挙げられる。
2017150732.tif 000043
【０１１７】
「Ｒ３は、Ｒ４およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成する」場合の例として、Ｒ３と、Ｒ４と、Ｒ３およびＲ４が結合するＣとを構成原子の一部として３〜７員環を形成した、以下の構造が挙げられる。
2017150732.tif 000044
【０１１８】
Ｒ２、Ｒ３としてさらに好ましくは、水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ及び／またはハロゲンなどで置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキル、またはＲ２、Ｒ３、Ｒ４から選択された２つの部位で形成されるＣ５−Ｃ６員環である。なお、その構造に含まれる立体配置は任意の配置を許容する。
【０１１９】
Ｒ４は、Ｓ（硫黄）原子とアミノ酸部位を連結するユニットであり、例えばアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、およびヘテロアリーレンアルキレンからなる群より選択され、これらの基は置換されていてもよい。
【０１２０】
Ｒ４の代表的構造であるＮ−３〜Ｎ−８を以下に示す。
2017150732.tif 000045
【０１２１】
Ｓ原子とアミノ酸部位とを、置換されていてもよいメチレン（Ｎ−３）、置換されていてもよいエチレン（Ｎ−４）、置換されていてもよいプロピレン（Ｎ−５）などの、置換されていてもよい１〜５の炭素原子で連結させることができる。置換されていてもよいメチレン、エチレン、プロピレンの例としては、たとえば、Ｒ１３がメチルでＲ１４が水素原子である基や、Ｒ１３もＲ１４もメチルのように、ジアルキル化された基などが挙げられる。
【０１２２】
Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８も、Ｒ２又はＲ３と同様に定義され、例えば、水素原子、ハロゲン原子などで置換されてもよいアルキル、ハロゲン原子などで置換されてもよいアルコキシから選択されることが好ましい。これらの間で環構造を形成してもよい。より好ましくは、Ｒ１３〜Ｒ１８は、水素原子、直鎖状もしくは分岐状のＣ１−Ｃ４アルキル、１またはそれ以上のフッ素原子で置換されていてもよいＣ１−Ｃ５アルコキシ、１またはそれ以上のフッ素原子、または１またはそれ以上のフッ素原子で置換されていてもよいＣ１−Ｃ５アルコキシで置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキルであるか、またはＲ１３〜Ｒ１８から選択された２つの部位とそれらが結合する原子で構成されるＣ３−Ｃ７員環を形成する。特に好ましくは、Ｒ１３〜Ｒ１８は、水素原子またはメチルである。
【０１２３】
Ｓ原子とアミノ酸部位とを芳香環の炭素原子と直接連結させることもできる（Ｎ−６）。Ｓ原子とアミノ酸部位とをアラルキル構造で連結させることもできる（Ｎ−７、Ｎ−８）。Ｎ−７では、２つの結合部位のうち、どちらがアミノ酸部位側であっても、Ｓ原子側であってもよい。
【０１２４】
なお、Ｎ−６〜Ｎ−８では、芳香環としてベンゼンが用いられているが、ベンゼン以外の芳香環（すなわち、芳香族複素環を含む様々な芳香環）を用いてもよく、また該芳香環はハロゲンやアルコキシやトリフルオロメチルなどの置換基により置換されていてもよい。
【０１２５】
Ｒ１１およびＲ１２もＲ４と同様の部分構造から選択される。例えばＮ−３、Ｎ−４、Ｎ−５、Ｎ−６、Ｎ−７、Ｎ−８型の構造から選択することができ、それぞれＲ１３'からＲ１８'の置換基を有する。また、Ｒ１１およびＲ１２は単結合でもよい。
【０１２６】
式（Ｉ）の好ましい構造式を、Ｎ−９、Ｎ−１０、Ｎ−１１に示す。Ｎ−９では、式（Ｉ）のＲ１２が単結合である。Ｎ−１０では、式（Ｉ）のＲ１２部位が１炭素原子（Ｎ−３型に対応）である。Ｎ−１１では、式（Ｉ）のＲ１２が２炭素原子（Ｎ−４型に対応）である。
2017150732.tif 000046
式中のＲ１〜Ｒ４は、それぞれ前記Ｒ１〜Ｒ４の定義と同一であり、Ｒ１３'〜Ｒ１６'はそれぞれ前記Ｒ１３〜Ｒ１６の定義と同様であり、式中のＳＰ−１は、後述のＳＰ−１の定義と同一である。
【０１２７】
式（ＩＩ）の好ましい構造式を、Ｎ−１８、Ｎ−１９、Ｎ−２０に示す。Ｎ−１８では、式（ＩＩ）のＲ１１部位が１炭素原子（Ｎ−３型に対応）である。Ｎ−１９では、式（ＩＩ）のＲ１１が２炭素原子（Ｎ−４型に対応）である。Ｎ−２０では、式（ＩＩ）のＲ１１が３炭素原子（Ｎ−５型に対応）である。
2017150732.tif 000047
式中のＲ１、Ｒ４は、それぞれ前記Ｒ１、Ｒ４の定義と同一であり、Ｒ１３'〜Ｒ１８'はそれぞれ前記Ｒ１３〜Ｒ１８の定義と同様であり、式中のＳＰ−１は、後述のＳＰ−１の定義と同一である。
【０１２８】
さらに、式（Ｉ）のより好ましい構造式を、Ｎ−１２、Ｎ−１３、Ｎ−１４、Ｎ−１５、Ｎ−１６、Ｎ−１７に示す。Ｎ−１２では、Ｎ−９のＲ４が１炭素原子（Ｎ−３）である。Ｎ−１３では、Ｎ―１０のＲ４が１炭素原子（Ｎ−３）である。Ｎ−１４では、Ｎ−１１のＲ４が１炭素原子（Ｎ−３）である。Ｎ−１５では、Ｎ−９のＲ４が２炭素原子（Ｎ−４）である。Ｎ−１６では、Ｎ−１０のＲ４が２炭素原子（Ｎ−４）である。Ｎ−１７では、Ｎ−１１のＲ４が２炭素原子（Ｎ−４）である。
2017150732.tif 000048
式中のＲ１〜Ｒ３、およびＲ１３〜Ｒ１６は、それぞれ前記Ｒ１〜Ｒ３、およびＲ１３〜Ｒ１６の定義と同一であり、式中のＲ１３'〜Ｒ１６'は、それぞれ前記Ｒ１３〜Ｒ１６の定義と同様であり、式中のＳＰ−１は、後述のＳＰ−１の定義と同一であり、
あるいはＲ２は、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５またはＲ１６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しＲ２が、これが結合するＮ原子およびＳＰ−１と一緒になってアジド基（−Ｎ３）を形成する場合、上記の定義はＲ２に対して適用されない
【０１２９】
さらに、式（ＩＩ）のより好ましい構造式を、Ｎ−２１〜Ｎ−２６に示す。Ｎ−２１では、Ｎ−１８のＲ４が２炭素原子（Ｎ−４）である。Ｎ−２２では、Ｎ−１９のＲ４が２炭素原子（Ｎ−４）である。Ｎ−２３では、Ｎ−２０のＲ４が２炭素原子（Ｎ−４）である。Ｎ−２４では、Ｎ−１８のＲ４が３炭素原子（Ｎ−５）である。Ｎ−２５では、Ｎ−１９のＲ４が３炭素原子（Ｎ−５）である。Ｎ−２６では、Ｎ−２０のＲ４が３炭素原子（Ｎ−５）である。
2017150732.tif 000049
式中のＲ１、およびＲ１３〜Ｒ１８は、それぞれ前記Ｒ１、およびＲ１３〜Ｒ１８の定義と同一であり、式中のＲ１３'〜Ｒ１８'は、それぞれ前記Ｒ１３〜Ｒ１８の定義と同様であり、式中のＳＰ−１は、後述のＳＰ−１の定義と同一である。
【０１３０】
環化前のペプチド部位の翻訳合成にｉＳＰ法を利用する本発明においては、環化前の三角ユニット（例えば、一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基）中のアミノ基の保護基"ＳＰ−１"）は、以下の３つ条件の全てを満たすことが好ましい。
（１）翻訳反応条件下でのアミノアシルｔＲＮＡの安定性を向上させること、
（２）翻訳効率を低下させないこと、
（３）脱保護反応時にｍＲＮＡには反応せずに望みの官能基のみが選択的に脱保護されること。
【０１３１】
このような３条件を満たす保護基として、還元的条件で脱保護される保護基が挙げられる。具体的には、例えばトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ＶＡ−０４４（２，２'−アゾビス−２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン二塩酸塩）の存在下で脱保護可能な保護基である。
【０１３２】
ある態様において、ＳＰ−１は、以下の式：
2017150732.tif 000050
で表すことができる。
この場合、Ｐ１は、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンなどから選択され、これらの基は、ハロゲンやアルコキシなどの置換基によりさらに置換されていてもよい。また、式中のカルボニル基のβ位に位置するメチレン基もまた置換されていてもよい。この態様における、ＳＰ−１の好ましい例として、４−アジドベンジルオキシカルボニル（ｐ−Ａｃｂｚ）、２−アジドベンジルオキシカルボニル（ｏ−Ａｃｂｚ）、アジドメトキシカルボニル（Ａｚｏｃ）などが挙げられる。
【０１３３】
別の態様において、ＳＰ−１は、以下の式：
2017150732.tif 000051
で表すことができる。この場合、Ｐ２は、アルキル、アリール、またはヘテロアリールなどから選択され、これらの基はさらに置換されていてもよい。また、式中のカルボニル基のβ位および／またはγ位のメチレン基もまた置換されていてもよい。この態様における、ＳＰ−１の好ましい例として、フェニルジスルファニルエチルオキシカルボニル（Ｐｈｄｅｃ）、２−ピリジルジスルファニルエチルオキシカルボニル（Ｐｙｄｅｃ）、２−（ｔ−ブチルジスルファニル）エチルオキシカルボニル基（Ｔｂｅｏｃ）などが挙げられる。
【０１３４】
さらに別の態様において、Ｎ末端のアミノ酸残基が、一般式（Ｉ）で表される場合、ＳＰ−１は、自身が結合した窒素原子およびＲ２と一緒になってアジド（−Ｎ３）を形成することができる。アジドは、アミン等価体として用いることができる。
2017150732.tif 000052
【０１３５】
ｐ−Ａｃｂｚ、ｏ−Ａｃｂｚ、Ａｚｏｃ、Ｐｈｄｅｃ、Ｐｙｄｅｃ、Ｔｂｅｏｃの具体的な構造を以下に示す。これらのうち、好ましくは、ｐ−Ａｃｂｚ、ｏ−Ａｃｂｚ、Ａｚｏｃである。
2017150732.tif 000053
【０１３６】
さらに好ましい、式（Ｉ）の構造式と置換基を以下に示す。
2017150732.tif 000054
式中、
Ｒ１は、−Ｓ−Ｒ２３であり
Ｒ２３は、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよいベンジルであり、
Ｒ２は、ドラッグライクネスに寄与する置換基で置換されていてもよいＣ１−Ｃ６アルキルであり、
ＳＰ−１は、ｐ−Ａｃｂｚ、ｏ−Ａｃｂｚ、またはＡｚｏｃである。
【０１３７】
さらに好ましい、式（ＩＩ）の構造式と置換基を以下に示す。
2017150732.tif 000055
式中、
Ｒ１は、−Ｓ−Ｒ２３であり
Ｒ２３は、Ｃ１−Ｃ２０アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよいベンジルであり、
ＳＰ−１は、ｐ−Ａｃｂｚ、ｏ−Ａｃｂｚ、またはＡｚｏｃである。
【０１３８】
よりさらに好ましい、式（Ｉ）の構造式と置換基を以下に示す。
2017150732.tif 000056
式中、
Ｒ１は、−Ｓ−Ｒ２３であり、
Ｒ２３は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、またはｓｅｃ−ブチルであり、
Ｒ２は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、またはｎ−ブチルであり、
ＳＰ−１は、ｐ−Ａｃｂｚ、またはｏ−Ａｃｂｚである。
【０１３９】
よりさらに好ましい、式（ＩＩ）の構造式と置換基を以下に示す。
2017150732.tif 000057
式中、
Ｒ１は、−Ｓ−Ｒ２３であり、
Ｒ２３は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、またはｓｅｃ−ブチルであり、
ＳＰ−１は、ｐ−Ａｃｂｚ、ｏ−Ａｃｂｚ、またはＡｚｏｃである。
【０１４０】
側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基を一般式（ＩＩＩ）：
2017150732.tif 000058
で表すことができる。式中、第二の反応点である活性エステル部位（−ＣＯＲ２５）以外の置換基（即ち、Ｒ２"、Ｒ３"、Ｒ２６）は、ドラッグライクなアミノ酸となるような基から選択することができる。本発明では活性エステルとは、三角ユニットのアミノ基部位と反応補助基であるチオールを介して反応することが可能なエステルまたはチオエステルを意味し、そのような性質を有するものであれば特に制限されない。
【０１４１】
具体的には、Ｒ２５は、水酸基であるか、あるいはそれが結合するＣＯと共に活性エステルを形成する。このようなＲ２５として、本技術分野において一般に使用されているものを用いることができ、具体的には、ハロゲン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（−ＯＳｕ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（−ＯＡｔ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（−ＯＢｔ）、ペンタフルオロフェノール（−ＯＰｆｐ）などが挙げられる。また、Ｒ２５が水酸基の場合は、例えば、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）や１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）といった縮合剤を用いてアミド化を行うことができる。Ｒ２５はそれが結合するＣＯと共に、メチルチオエステルやアリールチオエステル、アラルキルチオエステルなどのチオエステル（−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ：Ｒとして好ましくは、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ベンジル、ＣＨ２−ベンジル、フェニルが挙げられる）を形成してもよい。これらの活性エステルは、本技術分野において一般に利用されている置換基（たとえば、反応性を高める目的で使用されることが多いハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、ニトリルなどの電子吸引基や、反応をより低めて反応選択性を高める目的で使用されることが多いメトキシなどのアルコキシ、メチルなどのアルキルのような電子供与基、ｔ−ブチルやイソプロピルに代表される嵩高い置換基、親水性を考慮した、スルホ基や、ジメチルアミノのようなジ置換アミノ基、親油性を考慮した長鎖アルキルなどの高脂溶性基など）がさらに付与されたものであっても、同様の反応性を示すものであれば利用することができる。
【０１４２】
このような活性エステルを側鎖の一つに有するアミノ酸残基のペプチド部位への導入には、例えば、カルボン酸を含むアミノ酸残基をPUREsystemなどにて翻訳させた後に反応系中で活性エステル化反応により活性化エステルを発生させる手法や、予め活性エステルを有するアミノ酸残基をPUREsystemにて翻訳させる手法などを用いることができる。一般的には、活性エステルの中でも比較的反応性が低いチオエステルなどを有するアミノ酸残基は予め活性エステルとして単離した後に翻訳させるのに適している。一方、より反応性の高い１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＯＡｔ）エステルなどを有するアミノ酸残基は翻訳後に活性化エステルを発生させることが好ましい。
【０１４３】
本発明において、三角ユニットのアミノ酸残基（例えば、一般式（Ｉ）で表される残基）が有するＳ−Ｒ１基は、環化反応時に脱保護され、その結果生じるＳＨ基が反応補助基として作用することから、交差ユニットの活性エステルと三角ユニットのアミノ基とを選択的かつ効率的に反応させて、アミド結合を形成し、環化することができる。すなわち、ＳＨ基が高い求核性を有するために、最初に三角ユニットのＳＨ基と交差ユニットの活性エステルとが素早く反応し、次いで分子内転移反応によって、熱力学的により安定なアミド結合に移行する。その結果、三角ユニットと交差ユニットとを選択的にアミド化することが可能となる（Chemical ligation法）。
2017150732.tif 000059
【０１４４】
式（ＩＩＩ）のＲ２"およびＲ３"は、式（Ｉ）で定義したＲ２およびＲ３と同様に定義される。具体的には、Ｒ２"、Ｒ３"は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよい。あるいはＲ２"とＲ３"は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成してもよく、またはＲ２"もしくはＲ３"は、Ｒ２６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成してもよい。その構造に含まれる立体配置は任意の配置を許容する。
【０１４５】
「Ｒ２"とＲ３"が結合する原子と一緒になって環を形成する」場合の例として、Ｒ２"と、Ｒ２"が結合するＮと、Ｒ３"と、Ｒ３"が結合するＣとを構成原子の一部として４〜７員環を形成した、以下の構造が挙げられる。
2017150732.tif 000060
【０１４６】
「Ｒ２"は、Ｒ２６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成する」場合の例として、Ｒ２"と、Ｒ２"が結合するＮと、Ｒ２６と、Ｒ２６が結合するＣとを構成原子の一部として４〜７員環を形成した、以下の構造が挙げられる。
2017150732.tif 000061
【０１４７】
「Ｒ３"は、Ｒ２６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成する」場合の例として、Ｒ３"と、Ｒ２６と、Ｒ３"およびＲ２６が結合するＣとを構成原子の一部として３〜７員環を形成した、以下の構造が挙げられる。
2017150732.tif 000062
【０１４８】
Ｒ２"、Ｒ３"としてさらに好ましくは、水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ及び／またはハロゲンなどで置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキル、またはＲ２"、Ｒ３"、Ｒ２６から選択された２つの部位で形成されるＣ５−Ｃ６員環である。なお、その構造に含まれる立体配置は任意の配置を許容する。
【０１４９】
Ｒ２６は式（Ｉ）のＲ４の定義と同様に定義される。具体的には、Ｒ２６は例えばアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、およびヘテロアリーレンアルキレンからなる群より選択され、これらの基は置換されていてもよい。
【０１５０】
以下にＲ２６の代表的構造を示す。
2017150732.tif 000063
【０１５１】
第二の反応点（例えば、活性エステル）とアミノ酸部位とを置換されていてもよいメチレン（Ｎ−３'）、置換されていてもよいエチレン（Ｎ−４'）、置換されていてもよいプロピレン（Ｎ−５'）などの、置換されていてもよい１〜６の炭素原子で連結させることができる。
【０１５２】
Ｒ１３"、Ｒ１４"、Ｒ１５"、Ｒ１６"、Ｒ１７"、Ｒ１８"は、上述で定義したドラッグライクなアミノ酸の側鎖の定義と同様であるが、例えば、水素原子、ハロゲン原子などで置換されてもよいアルキル、ハロゲン原子などで置換されてもよいアルコキシから選択される。これらの間で環化構造となっていてもよい。より好ましくは、Ｒ１３"〜Ｒ１８"は、水素原子、直鎖状もしくは分岐状のＣ１−Ｃ４アルキル、１またはそれ以上のフッ素原子で置換されていてもよいＣ１−Ｃ５アルコキシ、１またはそれ以上のフッ素原子、または１またはそれ以上のフッ素原子で置換されていてもよいＣ１−Ｃ５アルコキシで置換されていてもよいＣ１−Ｃ４アルキルであるか、またはＲ１３"〜Ｒ１８" から選択された２つの部位とそれらが結合する原子で構成されるＣ３−Ｃ７員環を形成する。特に好ましくは、Ｒ１３"〜Ｒ１８"は、水素原子またはメチルである。
【０１５３】
Ｒ２６は、より好ましくは、１炭素原子のメチレン（Ｎ−３'）、４炭素原子、５炭素原子、または６炭素原子である。さらに好ましくは、Ｒ２６は、１炭素原子（Ｎ−３'）である。
【０１５４】
また第二の反応点（例えば、活性エステル部位）とアミノ酸部位とを芳香環の炭素原子から直接連結させることもできる（Ｎ−６'）。また活性エステル部位とアミノ酸部位とをアラルキル構造で連結させることもできる（Ｎ−７'、Ｎ−８'）。
【０１５５】
なお、Ｎ−６'〜Ｎ−８'では、連結位置をオルトに限定したが、オルトに限定されずメタ、パラなども可能である。またＮ−６'〜Ｎ−８'では、芳香環としてベンゼンが用いられているが、ベンゼン以外の芳香環（すなわち、芳香族複素環を含む様々な芳香環）を用いてもよく、また該芳香環はハロゲンやアルコキシなどの置換基により置換されていてもよい。
【０１５６】
式（ＩＩＩ）の中で、好ましい構造を式（ＩＩＩ−２）に示す。
2017150732.tif 000064
Ｒ２７は水素原子、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアルケニル、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルキルで置換されていてもよいアラルキルの中から選択される。
【０１５７】
Ｒ２７として列記された基が有し得る置換基は、その置換基を有する式（ＩＩＩ−２）が翻訳合成され得るものであれば、特に限定されない。このような置換基としては、反応性を高める目的で使用されることが多いハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、ニトリルなどの電子吸引基や、反応をより低めて反応選択性を高める目的で使用されることが多いメトキシなどのアルコキシ、メチルなどのアルキルのような電子供与基、ｔ−ブチルやイソプロピルに代表される、嵩高い置換基、親水性を考慮した、スルホ基や、ジメチルアミノのようなジ置換アミノ基、親油性を考慮した長鎖アルキルなどの高脂溶性基などが挙げられる。このような置換基として、好ましくは、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアラルキルが挙げられ、さらに好ましくは、アルキルおよび／またはアリールが置換されていてもよいアラルキルが挙げられる。
【０１５８】
式（ＩＩＩ−２）のＲ３"はドラッグライクなアミノ酸の側鎖の定義と同様に定義されるが、例えば、水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ハロゲンなどで置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキルが好ましく、水素原子が特に好ましい。なお、Ｒ３"の立体配置はＲ３"が水素原子と仮定した場合のＬ型、Ｄ型アミノ酸に対応するものの両方が許容されるが、Ｌ型アミノ酸に対応するものが好ましい。
【０１５９】
式（ＩＩＩ）の中で、さらに好ましい構造を式（ＩＩＩ−３）に示す。
2017150732.tif 000065
Ｒ２８およびＲ２９はそれぞれ、ドラッグライクなアミノ酸の側鎖の定義と同様に定義されるが、例えば水素原子、置換されてもよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されてもよいＣ２−Ｃ６アルケニル、置換されてもよいＣ２−Ｃ６アルキニル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよいＣ１−Ｃ６アルキルで置換されていてもよいアラルキル、置換されてもよいシクロアルキルの中から選択される。
【０１６０】
Ｒ２８およびＲ２９として好ましくは、モノメチル（Ｒ２８＝Ｍｅ、Ｒ２９＝Ｈ）やジメチル（Ｒ２８＝Ｒ２９＝Ｍｅ）、モノトリフルオロメチル（Ｒ２８＝ＣＦ３、Ｒ２９＝Ｈ）などが挙げられる。
【０１６１】
Ｒ３"は水素原子、ハロゲンなどで置換されてもよいＣ１−Ｃ４アルキルなどから選択されるが、特に水素原子が好ましい。なお、Ｒ３"基の立体配置はＲ３"が水素原子と仮定した場合のＬ型、Ｄ型アミノ酸に対応するもの両方が許容されるが、Ｌ型アミノ酸に対応するものが好ましい。
【０１６２】
側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基として、ＩＩＩ、ＩＩＩ−２、ＩＩＩ−３に加えて、ＩＩＩ−ＯＨ、ＩＩＩ−２−ＯＨ、ＩＩＩ−３−ＯＨを利用することもできる。
2017150732.tif 000066
（式ＩＩＩ−ＯＨ中の、Ｒ３"、Ｒ２５、Ｒ２６、式ＩＩＩ−２−ＯＨ中のＲ３"、Ｒ２６、Ｒ２７、式ＩＩＩ−３−ＯＨ中のＲ３"、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９は、それぞれ式ＩＩＩ中の、Ｒ３"、Ｒ２５、Ｒ２６、式ＩＩＩ−２中のＲ３"、Ｒ２６、Ｒ２７、式ＩＩＩ−３中のＲ３"、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９と同意義である。）
【０１６３】
本発明において、環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体の製造方法には、三角ユニットとして、Ｎ−１２、Ｎ−１５のアミノ酸残基を用い、交差ユニットとして、式（ＩＩＩ−３）のアミノ酸残基を用いることが好ましい。また、副反応を避けるべく、交差ユニットの隣のアミノ酸残基には、Ｎ−アルキル化されたアミノ酸（例えばプロリンや、Ｎ−メチルアラニンなど）を用いることが好ましい。
【０１６４】
所望の活性を有するドラッグライクなペプチドと核酸の複合体を製造する方法としては、例えば以下の工程を含む製造方法を挙げることができる（特許文献１）：
(i)アミノ酸の総数が９〜１３残基である非環状ペプチド部位を翻訳合成して、当該非環状ペプチド部位とそれをコードする核酸配列がリンカーを介して結合している複合体からなる非環状ペプチド部位−核酸複合体を形成する工程
(ii)工程(i)で翻訳合成された複合体の非環状ペプチド部位をアミド結合によって環化し、環状部のアミノ酸残基数の合計が５〜１２となる環状化合物を形成する工程
(iii)工程(ii)で得られた環状部を有するペプチド部位-核酸複合体ライブラリーと生体内分子とを接触させ、当該生体内分子に対して結合活性を有する複合体を選択する工程。
【０１６５】
ペプチドまたはペプチド部位−核酸複合体の合成工程において用いられるアミノアシルｔＲＮＡは、具体的には、以下のような方法を用いて作製することができる。
【０１６６】
所望のｔＲＮＡ配列をコードし、上流にＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６プロモーターを配置した鋳型ＤＮＡを用意し、T7 RNA polymeraseやT3, SP6 RNA polymeraseなどプロモーターに適応したＲＮＡポリメラーゼを利用して転写によってＲＮＡを合成することが出来る。細胞からｔＲＮＡを抽出精製し、ｔＲＮＡの配列の相補配列のプローブを用いて目的の生成ｔＲＮＡを抽出することも出来る。この際目的のｔＲＮＡの発現ベクターで形質転換した細胞をソースにすることも出来る。化学合成によって目的の配列のＲＮＡを合成することも出来る。例えば、このようにして得られた３'末端のＣＣＡ配列からＣＡを除いたｔＲＮＡと別途調製したアミノアシル化したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡとをＲＮＡリガーゼで結合させることでアミノアシルｔＲＮＡを得ることが出来る（ｐｄＣｐＡ法、ｐＣｐＡ法）。例えば、式（Ｉ）で表されるアミノ酸のためのｔＲＮＡは、式（Ｉ）で表されるアミノ酸と結合したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡを使用して製造することができる。当該ｔＲＮＡは、本発明のペプチド、ペプチド部位とｍＲＮＡの結合体、ペプチド部位とｍＲＮＡの結合体のライブラリーの製造において有用である。したがって本発明は、式（Ｉ）で表されるアミノ酸と結合したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡに関する。また本発明は、式（Ｉ）で表されるアミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡに関する。
あるいは、全長ｔＲＮＡを用意し、種々のアミノ酸類縁体の活性エステルをｔＲＮＡに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化も可能である。この他にも後述の方法を用いることによってアシル化ｔＲＮＡを得ることが出来る。
【０１６７】
また本発明において翻訳合成は、例えば、大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類（メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ、 EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF、IF1、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、ARS（AlaRS、ArgRS、AsnRS、AspRS、CysRS、GlnRS、GluRS、GlyRS、HisRS、IleRS、LeuRS、LysRS、MetRS、PheRS、ProRS、SerRS、ThrRS、TrpRS、TyrRS、ValRSから必要なものを選ぶ））、リボソーム、アミノ酸、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、無機ピロフォスファターゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、E. coli 由来tRNA、クレアチンリン酸、グルタミン酸カリウム、HEPES-KOH pH7.6、酢酸マグネシウム、スペルミジン、ジチオスレイトール、GTP、ATP、CTP、UTPなどを混合したPUREsystem等の公知の無細胞翻訳系にmRNAを加えることによって行うことが出来る。また、T7 RNA polymeraseを加えておけば、T7プロモーターを含む鋳型DNAからの転写、翻訳を共役して行なうこともできる。このとき所望のアシル化tRNA群やARSが許容するアミノ酸類縁体群（例えばF-Tyr）を系に添加することによってアミノ酸類縁体群を含むペプチドを翻訳合成することが出来る（Kawakami T, et al. Ribosomal synthesis of polypeptoids and peptoid-peptide hybrids. J Am Chem Soc. 2008, 130, 16861-3., Kawakami T, et al. Diverse backbone-cyclized peptides via codon reprogramming. Nat Chem Biol. 2009, 5, 888-90.）。あるいは、リボソームやEF-Tuなどの変異体を利用することによってアミノ酸類縁体の翻訳導入の効率を高めることも出来る(Dedkova LM, et al. Construction of modified ribosomes for incorporation of D-amino acids into proteins. Biochemistry. 2006, 45, 15541-51., Doi Y,et al. Elongation factor Tu mutants expand amino acid tolerance of protein biosynthesis system. J Am Chem Soc. 2007, 129, 14458-62., Park HS,et al. Expanding the genetic code of Escherichia coli with phosphoserine. Science. 2011, 333, 1151-4.)。
【０１６８】
無細胞翻訳系は、細胞より抽出したリボソームの他、翻訳に関与する蛋白因子群、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰなどのエネルギー源、その再生系を組み合わせたものでｍＲＮＡを蛋白に翻訳することが出来るものであれば限定されない。本発明の無細胞翻訳系には、これら以外にも、開始因子、伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素などを含むことができる。これらの因子は、種々の細胞の抽出液から精製することによって得ることができる。因子を精製するための細胞は、例えば原核細胞、または真核細胞を挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、または枯草菌細胞を挙げることができる。真核細胞としては、酵母細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を材料にしたものが知られている。
一方、PURE systemは大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類、エネルギー再生系酵素、リボソームのそれぞれを抽出、精製し、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰなどと混合した再構成無細胞翻訳系である。不純物の含有量が少ないだけでなく、再構成系であるため排除したい蛋白因子、アミノ酸を含まない系を容易に作製することができる。（(i)Nat Biotechnol. 2001;19:751-5. Cell-free translation reconstituted with purified components. Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y, Suzuki T, Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T.(ii)Methods Mol Biol. 2010;607:11-21.PURE technology.Shimizu Y, Ueda T.）。
【０１６９】
ｍＲＮＡディスプレイライブラリーは、例えば以下のように作製することができる。まずＴ７プロモーターなどのプロモーターの下流に所望の配列を配置したＤＮＡのライブラリーを化学合成し、これを鋳型にプライマー伸長反応にて二本鎖ＤＮＡにする。これを鋳型にT7 RNApolymeraseなどのRNAポリメラーゼを用いてｍＲＮＡに転写する。このＲＮＡの３'末端にアミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンなどがつながったリンカー（スペーサー）を結合させる。これを上記のPUREsystemなど公知の無細胞翻訳系に加え、保温することによってｍＲＮＡが翻訳され、ｍＲＮＡとこれにコードされるペプチドがピューロマイシンなどを含むリンカーを介して連結される。このようにしてｍＲＮＡとその産物が対応付けられたｍＲＮＡとその産物の複合体からなるディスプレイライブラリーを構築することが出来る。リンカーはさらに、当業者に周知のスペーサーを含むことができる。
【０１７０】
さらに、所望の固定した標的に当該ライブラリーを接触させ、標的に結合しない分子を洗い流すことで標的に結合する分子を濃縮することが出来る（パニング）。このように選択された分子についている遺伝子情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで、結合したペプチドの配列を明らかにすることが出来る。
【０１７１】
本発明では、環化ペプチド部位と核酸の複合体のディスプレイライブラリーの構築、さらには構築されたディスプレイライブラリーから、標的に結合する環化ペプチド部位もしくは環化分枝ペプチドの取得は、具体的には、例えば以下の様態に示す方法によって行なうことができる。
【０１７２】
より具体的には、本発明の環状部を有するペプチドと核酸複合体およびそのアミド環化ペプチドライブラリーの製造方法は、以下の１又は複数の工程を含む。
A)  式（Ｉ）をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
B)  3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C)  工程A)のpdCpA又はpCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、式（Ｉ）の開始アミノアシルtRNAを提供する工程、
D)  式（ＩＩＩ）をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
E)  3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F)  工程 D)のpdCpA又はpCpAと工程E)のtRNAを連結させ、式（ＩＩＩ）のアミノアシルtRNAを提供する工程、
G)  工程C)の開始アミノアシルtRNAと工程F)のアミノアシルtRNAを含み、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程、
H)  プロモーターの下流に、工程C)の開始アミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを１番目のコドンとして有し、さらにその下流に工程F)のアミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I)  工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J)  工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にリンカーを結合させる工程
K)  工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のリンカーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前（非環状）ペプチド部位-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L)  環状部を形成し、その後脱硫させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
M)  パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
N)  逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
O)  塩基配列を解析する工程
【０１７３】
このような本発明の環状部を有するペプチド−ｍＲＮＡ結合体およびそのアミド環化ペプチドライブラリーの製造方法として、以下の１又は複数の工程を含む方法が好ましい。
A)  N-9をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
B)  3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C)  工程A)のpdCpA又はpCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、N-9の開始アミノアシルtRNAを提供する工程、
D)  式（ＩＩＩ）−２または式（ＩＩＩ）−２―ＯＨをアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
E)  3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F)  工程 D)のpdCpA又はpCpAと工程E)のtRNAを連結させ、式（ＩＩＩ）−２または式（ＩＩＩ）−２―ＯＨのアミノアシルtRNAを提供する工程、
G)  工程C)の開始アミノアシルtRNAと工程F)のアミノアシルtRNAを含み、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程、
H）プロモーターの下流に、工程C)の開始アミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを１番目のコドンとしてATGを有し、さらにその下流に工程F)のアミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その３'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるＮ−メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I)  工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J)  工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にリンカーを結合させる工程
K)  工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のリンカーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前（非環状）ペプチド部位-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L)  環状部を形成し、その後脱硫させる工程
【０１７４】
このような本発明の環状部を有するペプチド−ｍＲＮＡ結合体およびそのアミド環化ペプチドライブラリーの製造方法として、以下の１又は複数の工程を含む方法がより好ましい。
A)  Ｎ−１２またはＮ−１５をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
B)  3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C)  工程A)のpdCpA又はpCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、Ｎ−１２またはＮ−１５の開始アミノアシルtRNAを提供する工程、
D)  式（ＩＩＩ）−３または（ＩＩＩ）−３−ＯＨをアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
E)  3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F)  工程 D)のpdCpA又はpCpAと工程E)のtRNAを連結させ、式（ＩＩＩ）−３または（ＩＩＩ）−３−ＯＨのアミノアシルtRNAを提供する工程、
G)  工程C)の開始アミノアシルtRNAと工程F)のアミノアシルtRNAを含み、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程、
H）プロモーターの下流に、工程C)の開始アミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを１番目のコドンとしてATGを有し、さらにその下流に工程F)のアミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その３'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるＮ−メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I)  工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J)  工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にリンカーを結合させる工程
K)  工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のリンカーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前（非環状）ペプチド部位-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L)  環状部を形成し、その後脱硫させる工程
【０１７５】
このような本発明の環状部を有するペプチド−ｍＲＮＡ結合体およびそのアミド環化ペプチドライブラリーの製造方法として以下の１又は複数の工程を含む方法がさらにより好ましい。
A)  Ｎ−１２−１、Ｎ−１２−２、Ｎ−１３−１またはＮ−１４−１をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
B)  3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C)  工程A)のpdCpA又はpCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、Ｎ−１２−１、Ｎ−１２−２、Ｎ−１３−１またはＮ−１４−１の開始アミノアシルtRNAを提供する工程、
D)  式（ＩＩＩ）−３をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
E)  3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F)  工程 D)のpdCpA又はpCpAと工程E)のtRNAを連結させ、式（ＩＩＩ）−３のアミノアシルtRNAを提供する工程、
G)  工程C)の開始アミノアシルtRNAと工程F)のアミノアシルtRNAを含み、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程、
H）プロモーターの下流に、工程C)の開始アミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを１番目のコドンとしてATGを有し、さらにその下流に工程F)のアミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その３'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるＮ−メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I)  工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J)  工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にリンカーを結合させる工程
K)  工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のリンカーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前（非環状）ペプチド部位-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L)  環状部を形成し、その後脱硫させる工程
【０１７６】
アスパルチミド形成抑制法
アスパラギン酸型のチオエステルを翻訳にて導入する場合、Ｃ末端側アミノ酸残基直後のアミド結合とチオエステルが反応してアスパルチミドを形成する。そこで、アスパラギン酸型のチオエステルを翻訳にて導入する際に直後のアミノ酸残基をＮ−アルキル基を有するアミノ酸（例えばプロリン）にすることによって望みのチオエステルを含む全長ペプチドを翻訳合成することができる。
【０１７７】
また本発明は、以下の一般式（ＩＡ）および一般式（ＩＩＡ）で表される化合物に関する。
2017150732.tif 000067
【０１７８】
また本発明は、以下の一般式（ＩＢ）および一般式（ＩＩＢ）で表される化合物に関する。
2017150732.tif 000068
上記一般式（ＩＡ）および（ＩＢ）中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ１２、およびＳＰ−１は、一般式（Ｉ）のＲ１〜Ｒ４、Ｒ１２、およびＳＰ−１と同意義であり、Ｒ３０はＨまたは水酸基を表す。Ｒ３０として特に好ましくはＯＨである。
また、上記一般式（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ１１、およびＳＰ−１は、一般式（ＩＩ）のＲ１、Ｒ４、Ｒ１１、およびＳＰ−１と同意義であり、Ｒ３０はＨまたは水酸基を表す。Ｒ３０として特に好ましくはＯＨである。
【０１７９】
さらに本発明は、上記一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＩＡ）とアミノアシルｔＲＮＡの結合体に関する。
【０１８０】
上記一般式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、および（ＩＩＢ）で表される化合物、一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＩＡ）とアミノアシルｔＲＮＡの結合体は、システインまたはシステイン類縁体がＮ末端に配置されたアミノ酸類縁体を複数含むペプチドの効率的な翻訳において有用である。また、複数のアミノ酸類縁体を含む環状部を有するペプチドと核酸の複合体およびそれを含むライブラリーの製造方法において有用である。
【０１８１】
上記一般式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、および（ＩＩＢ）で表される化合物、一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＩＡ）とアミノアシルｔＲＮＡの結合体は、当業者に周知の方法によって取得することができる。
【０１８２】
さらに本発明は、第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチドと核酸との複合体に関する。
2017150732.tif 000069
当該複合体は、第一の反応点を有する上記一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成する工程を含む方法によって取得することができる。なお、上記式（Ｉ）中、Ｒ１〜Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ−１は、本明細書に記載の定義に従う。
【０１８３】
当該複合体を構成する非環状ペプチドをコードする核酸を用いれば、２以上のアミノ酸類縁体を含み、かつ環状部を有するペプチドと核酸との複合体又はそのライブラリーを効率的に製造することができる。
【０１８４】
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１８５】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
なお、実施例中では以下の略号を使用した。
ＤＣＭ          ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ      Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ          ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ        ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ          ジチオスレイロール
ＦＡ            ギ酸
ＴＦＡ          トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ          テトラヒドロフラン
ＴＣＥＰ        トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン
ＮＭＰ          N-メチル‐２‐ピロリドン
ＤＢＵ          １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン
Ａｃｂｚ        ４−アジドベンジルオキシカルボニル基
2017150732.tif 000070
ｏ−Ａｃｂｚ    ２−アジドベンジルオキシカルボニル基
2017150732.tif 000071
Ｐｅｎ          ４−ペンテノイル基
ＣＨ２ＣＮ       シアノメチル基【０１８６】
また、ＬＣＭＳの分析条件は、下記のとおりである。【０１８７】
【表１】
2017150732.tif 000072
【０１８８】
実施例１  無細胞翻訳系に用いるｐＣｐＡ-アミノ酸の合成
１−１．Initiation suppression法によりＮ末端にシステインまたはシステイン類縁体を翻訳導入するためのｐＣｐＡ−アミノ酸の合成
Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体を有するペプチドをInitiation suppression法により翻訳合成するために、システインまたはシステイン類縁体のアミノアシル化ｐＣｐＡを合成した。すなわち、以下のスキームに従い、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｎｋ−０５、０９、１４、１９、２２）を合成した。
2017150732.tif 000073
【０１８９】
(R)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ０２、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）の合成
2017150732.tif 000074
【０１９０】
窒素雰囲気下、Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチルメルカプト−Ｌ−システイン（化合物ｎｋ０１、Ｈ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ））（１２６ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）と文献記載（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２００８，  １９，  ７１４．）の方法で合成した炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（２０７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．６ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（２５１μＬ、１．８０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で１２時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｒ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｎｋ０２、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（２２０．１ｍｇ、９５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３８３  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１９１】
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ０３、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2017150732.tif 000075
【０１９２】
窒素雰囲気下、（Ｒ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｎｋ０２、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（１．１５ｇ、３．００ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．５７６ｍＬ、３．３０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（６．０ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．６２７ｍＬ、９．００ｍｍｏｌ）を加えて室温で５時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ヘキサン＝１：９→１：１）で精製し、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ０３、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．２１ｇ、９５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４２２  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１９３】
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ０４)の合成
2017150732.tif 000076
【０１９４】
緩衝液Ａ（６０ｍｌ）に、文献記載（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）の方法で合成したリン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（１２０．４ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）を溶解させ、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ０３、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（２１２ｍｇ、０．５００ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２．５ｍｌ）溶液を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から５分後、３０分後にそれぞれ０．８３ｍＬ、合計３回投与)，、室温で７０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ０４）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（５６６ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０８７  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１９５】
なお、緩衝液Ａは以下のように調整した。
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物（６，４０ｇ、２０ｍｍｏｌ）とイミダゾール（６．８１ｇ、１００ｍｍｏｌ）の水溶液に酢酸を添加し、ｐＨ８、２０ｍＭ  Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム、１００ｍＭイミダゾールの緩衝液Ａ（１Ｌ）を得た。【０１９６】
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（ｎｋ０５、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）の合成
2017150732.tif 000077
【０１９７】
前工程にて得られた2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ０４)とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（２７０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ０５、Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）（１７．８ｍｇ、２１％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０１９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０１９８】
(S)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸(化合物ｎｋ０６、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ)の合成
2017150732.tif 000078
【０１９９】
窒素雰囲気下、Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチルメルカプト−Ｄ−システイン（Ｈ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（４００ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）と炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（６６１ｍｇ、２．１０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（１．９１ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（７９９μＬ、５．７３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で２時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(S)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ０６、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（６５８．２ｍｇ、９０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３８３  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２００】
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (S)-シアノメチル（化合物ｎｋ０７、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2017150732.tif 000079
【０２０１】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−２−（（（（４−アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｎｋ０６、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（０．６５８ｇ、１．７１ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．３２９ｍＬ、１．８８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．４２ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．３５８ｍＬ、５．１３ｍｍｏｌ）を加えて室温で５時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ヘキサン＝１：９→１：１）で精製し、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (S)-シアノメチル（化合物ｎｋ０７、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．７１５ｇ、９９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４２２  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２０２】
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ０８)の合成
2017150732.tif 000080
【０２０３】
緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（６０．２ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を溶解させ、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (S)-シアノメチル（化合物ｎｋ０７、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１０６ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．２６ｍｌ）溶液を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から５分後、３０分後にそれぞれ０．４２ｍＬ、合計３回投与)、室温で７０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ０８）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（２４２．５ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０８７  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．５９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２０４】
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（ｎｋ０９、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）の合成
2017150732.tif 000081
【０２０５】
前工程にて得られた2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ０８)とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（２４２．５ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ０９、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）（２４．７ｍｇ、２９％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０１９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２０６】
(R)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１０、Ｈ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）の合成
2017150732.tif 000082
【０２０７】
（Ｒ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（３．００ｇ、６．７３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１３．４ｍｌ）溶液に１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（１．１２ｍｌ、７．４１ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分攪拌した。反応溶液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、(R)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１０、Ｈ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（１．４６ｇ、９７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２２４  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２０８】
(R)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ１１、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）の合成
2017150732.tif 000083
【０２０９】
窒素雰囲気下、(R)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１０、Ｈ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（７００ｍｇ、３．１３ｍｍｏｌ）と炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（１．０３４ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（３．１３ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（１．３１ｍＬ、９．４０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で４日間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(R)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ１１、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（１．１５ｇ、９２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３９７  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１０】
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ１２、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2017150732.tif 000084
【０２１１】
窒素雰囲気下、(R)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ１１、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（１．１４ｇ、２．８６ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．４９ｍＬ、２．８０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５．７２ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．５９８ｍＬ、８．５８ｍｍｏｌ）を加えて室温で７時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ヘキサン＝１：９→１：１）で精製し、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ１２、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．１７ｇ、９３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４３６  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１２】
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ１３)の合成
2017150732.tif 000085
【０２１３】
緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（６０．２ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を溶解させ、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ１２、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１０９ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．２６ｍｌ）溶液を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から５分後、３０分後にそれぞれ０．４２ｍＬ、合計３回投与)、室温で１２０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ１３）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（９０ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １１０１  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１４】
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ１４、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）の合成
2017150732.tif 000086
【０２１５】
前工程にて得られた2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル (化合物ｎｋ１３)とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（９０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）を加えて室温で１５０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ１４、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）（２６．７ｍｇ、３１％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０３３  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１６】
(S)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１５、Ｈ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）の合成
2017150732.tif 000087
【０２１７】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）−３−（ｔｅｒｔ−ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（０．５ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．２４ｍｌ）溶液に１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）（０．１８６ｍｌ、１．２３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で９０分攪拌した。反応溶液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、(Ｓ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１５、Ｈ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（０．２２ｇ、８８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２２４  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２１８】
(S)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (化合物ｎｋ１６、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ)の合成
2017150732.tif 000088
【０２１９】
窒素雰囲気下、(Ｓ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１５、Ｈ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（２００ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）と炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（２９５ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．９０ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（３７４μＬ、２．６９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃で２時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(Ｓ)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ１６、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（３５０ｍｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３９７  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２２０】
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (S)-シアノメチル（化合物ｎｋ１７、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2017150732.tif 000089
【０２２１】
窒素雰囲気下、(Ｓ)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ１６、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（３５０ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１５ｍＬ、０．８６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．７５ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．１８ｍＬ、２．６３ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ１７、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．１７ｇ）を得た。得られた粗生成物2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ１７、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）をアセトニトリル（４．４ｍｌ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４３６  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２２２】
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ１８)の合成
2017150732.tif 000090
【０２２３】
緩衝液Ａ（５６．４ｍＬ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（８５．０ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）を溶解させ、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ１７、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の０．２Ｍアセトニトリル溶液（１．７７ｍｌ、０．３５３ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から１０分後、３０分後にそれぞれ０．５９ｍＬ、合計３回投与)、室温で１２０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ１８）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（１０５．２ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １１０１  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２２４】
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（ｎｋ１９、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）の合成
2017150732.tif 000091
【０２２５】
前工程にて得られた2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ１８)とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（１００ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）を加えて室温で８０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ１９、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）（３９．８ｍｇ、４３％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０３３  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２２６】
(R)-2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸(化合物ｎｋ２０、ｏ−Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ)の合成
2017150732.tif 000092
【０２２７】
窒素雰囲気下、(R)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１０、Ｈ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（１１２ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）と炭酸（４−ニトロフェニル）２−アジドベンジル（１６５ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．５ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（０．２１ｍＬ、１．５０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３０℃で４時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(R)-2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ２０、ｏ−Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（１９７ｍｇ、９９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３９７  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２２８】
2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ２１、ｏ−Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2017150732.tif 000093
【０２２９】
窒素雰囲気下、(R)-2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ２０、ｏ−Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（１９６ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０８４ｍＬ、０．４８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（９８４μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．１０３ｍＬ、１．４８ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ２１、ｏ−Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ２１、ｏ−Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）をアセトニトリル（２．４６ｍｌ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４３８  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．００分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２３０】
2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ２２、ｏ−Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ)の合成
2017150732.tif 000094
【０２３１】
緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（６０．２ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を溶解させ、2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ２１、ｏ−Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の０．２Ｍアセトニトリル溶液（１．２５ｍｌ、０．２５ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から５分後、３０分後にそれぞれ０．４２ｍＬ、合計３回投与)、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応液を０度で１０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ２２、ｏ−Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｐＣｐＡ）（２６．３ｍｇ、３１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０３３  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２３２】
１−２．翻訳伸長用のｐＣｐＡ-アミノ酸の合成
(2S)-2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)- 3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸(化合物ｎｋ２３、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＨ)の合成
2017150732.tif 000095
【０２３３】
(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸（Ｆｍｏｃ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＨ）（４．２０ｇ、１０．２８ｍｍｏｌ）に２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（１００ｍＬ）を加え室温で２時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、濃縮残渣にジエチルエーテルを加え、混合物をろ過し、ジエチルエーテルでろ紙上の固体を洗浄し、粗生成物(2S)-2-(メチルアミノ)-3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸を得た。
得られた(2S)-2-(メチルアミノ)-3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸を１，４−ジオキサン （４０ ｍｌ）／水（４０ｍｌ）に溶解させた後に、ペンタ-4-エン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イル（３．２００  ｇ，  １６．２３  ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（１．８０ｇ、２１．４３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を３０度で１２時間撹拌した。反応が完結した後、反応液に水を加えて酢酸エチルで洗浄し、水層の液性がｐＨ２になるまで１Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液を加えた。得られた混合物を酢酸エチルで抽出操作を行い有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、(2S)-2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)- 3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸(化合物ｎｋ２３、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＨ)（０．６０ｇ、２２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２６９  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．３２分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１）【０２３４】
2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸 (S)-シアノメチル（化合物ｎｋ２４、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2017150732.tif 000096
【０２３５】
窒素雰囲気下、(2S)-2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)- 3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸（化合物ｎｋ２３、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＨ）（１．５０ｇ、２．８０ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（６８０ｍｇ、５．２６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（８０ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（１．２５ｇ、１０．４２ｍｍｏｌ）を加えて室温で終夜攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸 (S)-シアノメチル(化合物ｎｋ２４、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＣＨ２ＣＮ)（０．２３ｇ、２７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３０８  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．６１分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ１）【０２３６】
2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ２５)の合成
2017150732.tif 000097
【０２３７】
緩衝液Ａ（１２０ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（３００ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）を溶解させ、2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸 (S)-シアノメチル(化合物ｎｋ２４、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ＯＣＨ２ＣＮ)（３１１ｍｇ、１．０１３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．６ｍｌ）溶液を加え、室温で４時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ２５）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（３００ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ９７１  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．５９分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）【０２３８】
2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ２６、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ｐＣｐＡ）の合成
2017150732.tif 000098
【０２３９】
前工程にて得られた2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ２５)とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物を（３００ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（６ｍＬ）を加えて室温で７時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ２６、Ｐｅｎ−ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ｐＣｐＡ）（４６ｍｇ、１７％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ９０３  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２４０】
２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）酢酸シアノメチル（化合物ｎｋ２７、Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2017150732.tif 000099
【０２４１】
Ｎ−メチルグリシン（１．５ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）とＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（７．３５ｍｌ、４２．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン （３３．７ ｍｌ）に加えた。その後混合物を０℃に冷却した後に、ペンタ-4-エン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イル (１．９５ｍｌ、 １７．７ｍｍｏｌ)を加え、反応液を２５度で３日間撹拌した。反応が完結した後、反応混合物にＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（２．９４ｍｌ、１６．８ｍｍｏｌ）と２−ブロモアセトニトリル（２．３５ｍｌ、３３．７ｍｍｏｌ）を加えて２５度で４時間攪拌した。反応液にジクロロメタンで希釈したのちに、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、有機層を飽和食塩水で洗浄した。その後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）酢酸シアノメチル（化合物ｎｋ２７、Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．１ｇ、３１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２１１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ３）【０２４２】
(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル N-メチル-N-(ペンタ-4-エノイル)グリシナート（化合物ｎｋ２８、Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｙ−ｐＣｐＡ）の合成
2017150732.tif 000100
【０２４３】
緩衝液Ａ（１００ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（２５０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を溶解させ、２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）酢酸シアノメチル（化合物ｎｋ２７、Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｙ−ＯＣＨ２ＣＮ）（２９０ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．５ｍｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。さらに８０％酢酸水溶液（１５ｍｌ）を反応液に加えて、室温で４時間撹拌した。
反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ２８、Ｐｅｎ−ＭｅＧｌｙ−ｐＣｐＡ）（３７．６ｍｇ、１３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ８０６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６０分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ２）【０２４４】
１−３．交差ユニット用のｐＣｐＡ-アミノ酸の合成
4-(メチルチオ)-4-オキソ-2-(ペンタ-4-エンアミド)ブタン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ３０、Ｐｅｎ−ＡｓｐＳＭｅ−ｐＣｐＡ）の合成
2017150732.tif 000101
【０２４５】
緩衝液Ａ（２００ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を溶解させ、文献記載（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ）の方法で合成した4-(メチルチオ)-4-オキソ-2-(ペンタ-4-エンアミド)ブタン酸 (S)-シアノメチル（６３０ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４．０ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。さらにトリフルオロ酢酸（４．６ｍｌ、６０ｍｍｏｌ）を反応液に加えて、反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ３０、Ｐｅｎ−ＡｓｐＳＭｅ−ｐＣｐＡ）（２０ｍｇ、４．２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ８８０.４  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０２４６】
実施例２  システインまたはシステイン類縁体を有する翻訳開始用のアミノアシルｔＲＮＡの合成
２−１．転写によるｔＲＮＡ（ＣＡ欠損）の合成
鋳型ＤＮＡ（配列番号Ｄ−１）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro の転写により３'端のCAを欠くtRNAfMetCAU(-CA)（配列番号Ｒ−１）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。【０２４７】
配列番号Ｄ−1（配列番号：１）:
tRNAfMetCAT(-CA) DNA配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCGGGGTGGAGCAGCCTGGTAGCTCGTCGGGCTCATAACCCGAAGATCGTCGGTTCAAATCCGGCCCCCGCAAC【０２４８】
配列番号Ｒ−１（配列番号：２）:
tRNAfMetCAU(-CA)  RNA配列：
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAAC【０２４９】
２−２．  システインまたはシステイン類縁体アミノアシル化ｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成
５０μＭ  転写tRNAfMetCAU(-CA)  （配列番号Ｒ−１）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ  ＡＴＰ  （４μｌ）、Nuclease free water  （５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、５ｍＭのアミノアシル化ｐＣｐＡ（ｎｋ−０５、０９、１４、１９、２２）のＤＭＳＯ溶液  （４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ−１、２、３、４、５）は、フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ−１、２、３、４、５）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。【０２５０】
化合物ＡＡｔＲ−１
Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
2017150732.tif 000102
【０２５１】
化合物ＡＡｔＲ−２
Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
2017150732.tif 000103
【０２５２】
化合物ＡＡｔＲ−３
Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
2017150732.tif 000104
【０２５３】
化合物ＡＡｔＲ−４
Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
2017150732.tif 000105
【０２５４】
化合物ＡＡｔＲ−５
o-Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
2017150732.tif 000106
【０２５５】
実施例３  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基のついたシステインまたはシステイン類縁体を有するペプチドの翻訳合成
以下の実験で示すとおり、アミノ基にＡｃｂｚ基、チオール基にＳｔＢｕをそれぞれ保護されたシステインまたはシステイン類縁体をＮ末端に翻訳導入することが可能であることが示された。すなわち、L-システインのみならず、D-システインや、LまたはD-Nメチルシステインを含むシステイン類縁体を、N末端に翻訳導入することが可能であることが示された。ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１において、アミノ基の保護基であるＡｃｂｚ基はＲＮＡが安定に存在できる反応条件下にて選択的に脱保護できることが示されており、アミド環化を有するペプチドライブラリーを効率的に合成するために必要な条件が満たされた。【０２５６】
３−１．  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にシステインまたはシステイン類縁体を有するペプチドの翻訳合成
Initiation suppression法を用いてN末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されているかを確かめるために、システインまたはシステイン類縁体がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔを無細胞翻訳系に加えて翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ  ＧＴＰ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  酢酸カリウム，６ｍＭ  酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ  ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM  10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ  ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ  無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ  ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ  メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ  ＥＦ−Ｇ、０．２４μＭ  ＲＦ２、０．１７μＭ  ＲＦ３、０．５μＭ  ＲＲＦ，２．７μＭ  ＩＦ１，０．４μＭ  ＩＦ２，１．５μＭ  ＩＦ３，４０μＭ  ＥＦ−Ｔｕ，４４μＭ  ＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭ  リボソーム，０．７３μＭ  ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ  ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ  ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ  ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ  ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ  ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ  ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ  ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ  ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ  ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ  ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ  ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ  ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ  ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ  ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ  ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ  ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ  ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ  ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ  ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ  鋳型ｍＲＮＡと、Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙの各アミノ酸をそれぞれ２５０μＭずつ加え、さらに２０μＭ  翻訳開始用のアミノアシルｔＲＮＡｆＭｅｔ（Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-1）、Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-２）、Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。【０２５７】
＜質量分析による検出＞
無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ  鋳型mRNA（Ｒ−４）と各アミノ酸としてＴｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、２０μＭ  翻訳開始用のアミノアシルｔＲＮＡｆＭｅｔ（Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-1）、Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-２）、Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）。
ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１において、Ａｃｂｚ保護基はＭＡＬＤＩ測定中または測定前処理の操作中において外れてしまうことが報告されている。そのため、Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-1）、Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-２）、Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）、をそれぞれ用いた翻訳実験では、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）による還元的条件によって脱保護を行った後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる質量分析を実施した。具体的には、得られた翻訳反応物に、ｐＨ  ７．０トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）溶液（最終濃度２０ｍＭ）を加えた後、３７℃で１時間静置した。マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで翻訳産物を分析した。
その結果Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体が導入されたペプチド（表２、ペプチド配列番号Ｐｅｐ−３，４，５）を示すＭＳがそれぞれ観測された。また副生成物として1文字目が読み飛ばされたペプチド（表２、ペプチド配列番号Ｐｅｐ−２）を示すＭＳが観測された。
また対照実験として翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡの代わりに２５０μＭ  Ｍｅｔを加えたものと、翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡを加えないものをそれぞれ調製し、３７℃で１時間静置した。翻訳反応物を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにおけるマトリックスはα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いた。翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡの代わりに２５０μＭ  Ｍｅｔを用いた場合は、Ｎ末端がホルミルメチオニン（以下ホルミルメチオニンをｆＭｅｔと略称する）から開始されたペプチド（表２、ペプチド配列番号Ｐｅｐ−１）を示すＭＳが観測された。また翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡを加えないものでは，ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ（特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１））により、1文字目が読み飛ばされたペプチド（表２、ペプチド配列番号Ｐｅｐ−２）を示すＭＳが観測された。【０２５８】
鋳型ｍＲＮＡ  配列番号Ｒ−４（配列番号：４）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUCGUACUAAGGCUUACUGGAGUCUUCCGGGUUAAGCUUCG【０２５９】
ペプチド配列
[Xaa]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSerLeuProGly【０２６０】
【表２】
2017150732.tif 000107
【０２６１】
＜電気泳動による検出＞
N末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ  鋳型mRNA（Ｒ−４Ｄ）と各アミノ酸としてＴｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ（各々最終濃度２５０μＭ）、１４Ｃ-アスパラギン酸(最終濃度３７μＭ、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、MC139)を加えた溶液を調製し、２０μＭ  システインまたはシステイン類縁体がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔ（Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-1）、Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-２）、Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
また対照実験として翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡの代わりに２５０μＭ  Ｍｅｔを加えたものと、翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡを加えないものをそれぞれ調製し、３７℃で１時間静置した。
得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(ＴＥＦＣＯ社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動（16% Peptide-PAGE mini、ＴＥＦＣＯ社、TB-162）を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(ＴＥＦＣＯ社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に２４時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
Ｎ末端にＡｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）、Ａｃｂｚ−Ｄ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）、Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）それぞれ翻訳導入した場合においても目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−１０、１１、１２、１５）のバンドが主生成物としてそれぞれ観測された（図1において、対照実験であるホルミルメチオニンで開始されたペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−８）の翻訳効率を１００としたときの相対的な翻訳効率を示す）。また不純物として1文字目が読み飛ばされたペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−９）を示すバンドが観測された。【０２６２】
鋳型ｍＲＮＡ  配列番号Ｒ−４Ｄ（配列番号：５）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUCGUACUAAGGCUUACUGGAGUCUUCCGGGUGACGACGACUAAGCUUCG【０２６３】
ペプチド配列
[Xaa]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSerLeuProGlyAspAspAsp【０２６４】
【表３】
2017150732.tif 000108
【０２６５】
３−２．  副生成物の生成を低減させた翻訳合成条件下における、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にＮ−メチルシステインを有するペプチドの翻訳合成
上記の通り、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法によるＮ末端にシステインまたはシステイン類縁体を翻訳合成する際に、２番目コドンにコードされるアミノ酸から開始して全長にわたって翻訳されたペプチドが副生成物として確認された。次に副生成物の生成を低減させて目的とするペプチドの翻訳効率を向上させるために、翻訳条件の最適化を行った。具体的には翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡの濃度条件（１，２，５，１０，２５μＭ）の検討を行い、目的とするペプチドと副生成物の生成比が最も良い翻訳条件を設定するに至った。【０２６６】
Initiation suppression法を用いてN末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されているかを確かめるために、保護基を有するＮ−メチルシステインがアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔを無細胞翻訳系に加えて翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ  ＧＴＰ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  酢酸カリウム，１０ｍＭ  酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM  10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ  ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ  無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ  ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ  メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ  ＥＦ−Ｇ、０．２４μＭ  ＲＦ２、０．１７μＭ  ＲＦ３、０．５μＭ  ＲＲＦ，２．７μＭ  ＩＦ１，０．４μＭ  ＩＦ２，１．５μＭ  ＩＦ３，４０μＭ  ＥＦ−Ｔｕ，４４μＭ  ＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭ  リボソーム，０．７３μＭ  ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ  ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ  ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ  ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ  ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ  ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ  ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ  ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ  ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ  ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ  ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ  ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ  ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ  ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ  ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ  ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ  ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ  ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ  ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ  ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ  鋳型ｍＲＮＡと、Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙをそれぞれ２５０μＭずつ加え、さらにＮ−メチルシステイン類縁体がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔを翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。【０２６７】
＜質量分析による検出＞
無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ  鋳型mRNA（Ｒ−４）と各アミノ酸としてＴｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、さらに２または２５μＭＮ−メチルシステイン類縁体がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔ（Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）、Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-４）、o-Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-５））を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
得られた翻訳反応物に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）（最終濃度２０ｍＭ）を加えた後、３７℃で１時間静置した。マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより翻訳産物を分析した。
その結果Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）、Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-４）をそれぞれ２５μＭ使用した場合、主生成物としてＮ末端にＮＭｅシステインまたはＮＭｅ−Ｄ−システインが導入されたペプチド（表４  ペプチド配列番号Ｐｅｐ−５、６）を示すＭＳがそれぞれ観測された（図２−１，２−２）。またAcbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）、Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-４）をそれぞれ２μＭ使用した場合、主生成物として1文字目が読み飛ばされたペプチド（表２、ペプチド配列番号Ｐｅｐ−２）を示すＭＳが観測された（図２−１，２−２）。Ｎ末端にＮＭｅシステインまたはＮＭｅ−Ｄ−システインが導入されたペプチド（表４  ペプチド配列番号Ｐｅｐ−５、６）を示すＭＳは観測されたものの、そのＭＳ強度比は1文字目が読み飛ばされたペプチド（表1、ペプチド配列番号Ｐｅｐ−２）の1/10以下であった。
またo-Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-５））を２５μＭ用いた場合、主生成物としてＮ末端にＮＭｅシステインが導入されたペプチド（表４  ペプチド配列番号Ｐｅｐ−５）を示すＭＳが観測された（図２−３）【０２６８】
【表４】
2017150732.tif 000109
【０２６９】
＜電気泳動による検出＞
N末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ  鋳型mRNA（Ｒ−４Ｄ）と各アミノ酸、Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ（各々最終濃度２５０μＭ）、１４Ｃ-アスパラギン酸(最終濃度３７μＭ、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、MC139)を加えた溶液を調製し、さらにシステインまたはシステイン類縁体がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔ（１，２，５，１０，２５μＭの５条件を実施）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。また対照実験として翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡの代わりに２５０μＭ  Ｍｅｔを加えたものと、翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡを加えないものを調製し、３７℃で１時間静置した。
得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(ＴＥＦＣＯ社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動（16% Peptide-PAGE mini、ＴＥＦＣＯ社、TB-162）を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(ＴＥＦＣＯ社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に２４時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）、Ａｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）それぞれの翻訳合成において、どちらの場合においてもアミノアシルｔＲＮＡの濃度が２５μＭのときに目的とするペプチドの翻訳効率が最も高く、さらに副生成物の翻訳効率が最も低いことが示された（図３−１）。具体的にはＡｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）の場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−１２）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−９）の生成比は９６：３３（対照実験であるホルミルメチオニンで開始されたペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−８）の翻訳効率を１００としたときの相対的な翻訳効率を示す）であった。またＡｃｂｚ−Ｄ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）の場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−１３）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−９）の生成比は５６：２２であった。さらに、ｏ−Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）の場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−１４）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−９）の生成比は１０９：１６であった（図３−２）。【０２７０】
【表５】
2017150732.tif 000110
【０２７１】
実施例４  翻訳の開始方法によって翻訳の伸長反応におけるアミノ酸類縁体の翻訳効率と生成物の純度を評価するための翻訳合成
以下の方法に従って、アミノ酸類縁体のアミノアシルｔＲＮＡの合成を行った。
４−１−１．転写によるｔＲＮＡ（ＣＡ欠損）の合成
鋳型ＤＮＡ（配列番号Ｄ−２）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro の転写により３'端のCAを欠くtRNAGluCUG(-CA)（配列番号Ｒ−２）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。【０２７２】
配列番号Ｄ−２（配列番号：６）
tRNAGluCTG(-CA) DNA配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCTGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC【０２７３】
配列番号Ｄ−３（配列番号：７）
tRNAGluAAG(-CA) DNA配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC【０２７４】
配列番号Ｒ−２（配列番号：８）
tRNAGluCUG(-CA)  RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC【０２７５】
配列番号Ｒ−３（配列番号：９）
tRNAGluAAG(-CA)  RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC【０２７６】
４−１−２．  ｔＲＮＡ（ＣＡ欠損）とｐＣｐＡ-アミノ酸との反応による、アミノアシルｔＲＮＡの合成
５０μＭ  転写tRNAGluCUG(-CA)  （配列番号Ｒ−２）またはtRNAGluAAG(-CA)  （配列番号Ｒ−３）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ  ＡＴＰ  （４μｌ）、Nuclease free water  （５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、５ｍＭのアミノアシル化ｐＣｐＡ（ｎｋ−０２６、２８、３０）のＤＭＳＯ溶液  （４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液４０μＬに、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（４μＬ）６２．５ｍＭ  ヨウ素（水：ＴＨＦ＝１：１溶液）４４μＬを加え、室温で１時間、脱保護を行った。アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ−７、８、９）は、フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ−７、８、９）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。【０２７７】
化合物ＡＡｔＲ−７（配列番号：１０）
MeAla(4-Thz)-tRNAGluCUG
2017150732.tif 000111
化合物ＡＡｔＲ−８
MeGly-tRNAGluCUG（配列番号：１０）
2017150732.tif 000112
化合物ＡＡｔＲ−９（配列番号：１１）
AspSMe-tRNAGluAAG
2017150732.tif 000113
次に翻訳の開始方法によって、翻訳の伸長反応におけるアミノ酸類縁体の翻訳効率と生成物の純度がどのように影響されるかを確認するための実験を実施した。具体的には、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法とＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ法の翻訳の開始方法をそれぞれ用いて、アミノ酸類縁体を複数含む同じペプチド化合物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−１７）を翻訳合成を実施した。生成物を含む翻訳液のＭＳ分析を行い、同じペプチド化合物である目的物のＭＳ強度を比較し翻訳効率の比較を行った。また生成物の純度を確認するために生成物に含まれる切断ペプチドのＭＳ強度を比較した。【０２７８】
４−２―１．  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ法を用いてＮ末端にシステインを有するペプチドの翻訳合成
Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ法を用いてN末端にＣｙｓを翻訳導入したペプチドを翻訳合成した後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて翻訳合成から得られたペプチドの純度を確認した。
翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ  ＧＴＰ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  酢酸カリウム，６ｍＭ  酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ  ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM  10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ  ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ  無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ  ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ  メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ  ＥＦ−Ｇ、０．２４μＭ  ＲＦ２、０．１７μＭ  ＲＦ３、０．５μＭ  ＲＲＦ，２．７μＭ  ＩＦ１，０．４μＭ  ＩＦ２，１．５μＭ  ＩＦ３，４０μＭ  ＥＦ−Ｔｕ，４４μＭ  ＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭ  リボソーム，０．７３μＭ  ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ  ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ  ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ  ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ  ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ  ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ  ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ  ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ  ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ  ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ  ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ  ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ  ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ  ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ  ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ  ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ  ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ  ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ  ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ  ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−５−２ (配列番号１７)）と、各アミノ酸Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，３-フルオローＬ−チロシン（Ｔｙｒ（３−Ｆ））をそれぞれ２５０μＭずつ加え、Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）を５ｍＭ加え、さらに２０μＭ  ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ｔＲＮＡＧｌｕＣＵＧ（化合物ＡＡｔＲ−７）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
得られた翻訳反応物を、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで翻訳産物を分析した。その結果、Ｎ末端にＣｙｓが導入された目的物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−１７）のＭＳが観測されたものの、２種類の切断ペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−１９、２１）のＭＳも観測された(図４)。またそれぞれのペプチドのＭＳ強度比は、目的物（ペプチド配列番号 Ｐｅｐ−１７）：切断ペプチド（ペプチド配列番号 Ｐｅｐ−１９）：切断ペプチド（ペプチド配列番号 Ｐｅｐ−２１）＝１：１：１であった。【０２７９】
鋳型ｍＲＮＡ  配列番号Ｒ−５−２（配列番号：１７）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGCAGUUUUCCGAGUCAGAUUGUUUACACUGGUCGUCCGUAAGCUUCG【０２８０】
【表６】
2017150732.tif 000114
【０２８１】
４−２―２．  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にシステインを有するペプチドの翻訳合成【０２８２】
Initiation suppression法を用いてN末端にＡｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）を翻訳導入したペプチドを翻訳合成した後に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）によってＡｃｂｚを脱保護を行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて、翻訳合成によって得られるペプチドの純度を確認した。
翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ  ＧＴＰ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  酢酸カリウム，６ｍＭ  酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ  ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM  10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ  ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ  無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ  ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ  メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ  ＥＦ−Ｇ、０．２４μＭ  ＲＦ２、０．１７μＭ  ＲＦ３、０．５μＭ  ＲＲＦ，２．７μＭ  ＩＦ１，０．４μＭ  ＩＦ２，１．５μＭ  ＩＦ３，４０μＭ  ＥＦ−Ｔｕ，４４μＭ  ＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭ  リボソーム，０．７３μＭ  ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ  ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ  ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ  ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ  ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ  ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ  ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ  ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ  ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ  ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ  ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ  ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ  ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ  ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ  ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ  ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ  ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ  ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ  ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ  ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−５−１ (配列番号１２)）と、各アミノ酸Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，３-フルオローＬ−チロシン（Ｔｙｒ（３−Ｆ））をそれぞれ２５０μＭずつ加え、Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）を５ｍＭ加え、さらに２０μＭ  Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物ＡＡｔＲ−１）と２０μＭ  ＭｅＡｌａ（４−Ｔｈｚ）−ｔＲＮＡＧｌｕＣＵＧ（化合物ＡＡｔＲ−７）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
得られた翻訳反応物に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）（最終濃度２０ｍＭ）を加えた後、３７℃で１時間静置した。マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで翻訳産物を分析した。
その結果、Ｎ末端にＣｙｓが導入された目的物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−１７）のＭＳがメインピークとして観測され、ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ法と比べて２８倍のＭＳ強度であった(図４)
また４種類の切断ペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−１８、１９、２０、２１）のＭＳは観測されたものの、目的物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−１７）のＭＳ強度と比べてそれぞれ１／２０以下のＭＳ強度であった。【０２８３】
鋳型ｍＲＮＡ  配列番号Ｒ−５−１（配列番号：１２）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAGUUUUCCGAGUCAGAUUGUUUACACUGGUCGUCCGUAAGCUUCG【０２８４】
【表７】
2017150732.tif 000115
【０２８５】
以上の結果からＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いれば、Ｎ末端にシステインを持ちアミノ酸類縁体を複数含むペプチドをより効率良くならびに高い純度で翻訳合成することができることが示された。【０２８６】
４−３―１．  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法とＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ法それぞれの翻訳の開始方法を用いてＮ末端にシステインまたはシステイン類縁体を有するペプチドの翻訳合成
以上の観測された現象が他のペプチドを翻訳合成する際にも観測されるかを確認するために実施した実験を次に記す。対照実験としてAcbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物ＡＡｔＲ−１）の代わりに２５０μＭ  Ｍｅｔを加えて、Ｎ末端がｆＭｅｔで開始されたペプチドの翻訳合成を実施した。翻訳合成に使用した鋳型ｍＲＮＡ配列を以下の表８に記した。【０２８７】
【表８】
2017150732.tif 000116
【０２８８】
４−３―１−１．  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ法を用いてＮ末端にシステインを有するペプチドの翻訳合成
翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ  ＧＴＰ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  酢酸カリウム，６ｍＭ  酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ  ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM  10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ  ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ  無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ  ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ  メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ  ＥＦ−Ｇ、０．２４μＭ  ＲＦ２、０．１７μＭ  ＲＦ３、０．５μＭ  ＲＲＦ，２．７μＭ  ＩＦ１，０．４μＭ  ＩＦ２，１．５μＭ  ＩＦ３，４０μＭ  ＥＦ−Ｔｕ，４４μＭ  ＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭ  リボソーム，０．７３μＭ  ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ  ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ  ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ  ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ  ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ  ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ  ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ  ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ  ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ  ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ  ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ  ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ  ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ  ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ  ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ  ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ  ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ  ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ  ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ  ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−６−２ (配列番号１８)、Ｒ−７−２ (配列番号１９)、Ｒ−８−２ (配列番号２０)、Ｒ−９−２ (配列番号２１)、Ｒ−５−２ (配列番号１７)）と、各アミノ酸Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，３-フルオローＬ−チロシン（Ｔｙｒ（３−Ｆ））をそれぞれ２５０μＭずつ加え、Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、Ｎ−メチルアラニン（ＭｅＡｌａ）をそれぞれ５ｍＭ加え、さらに２０μＭ  ＭｅＧｌｙ−ｔＲＮＡＧｌｕＣＵＧ（化合物ＡＡｔＲ−８）（配列番号：１０）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
得られた翻訳反応物を、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで翻訳産物を分析した。翻訳合成に使用した鋳型ｍＲＮＡ配列番号と翻訳合成された目的物と切断ペプチドのＭＳ理論値、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの実測値を示す表９〜１３に記した。また、翻訳合成された目的物と切断ペプチドのＭＳ強度を図５に記した。図５における切断ペプチドのＭＳ強度を示すグラフにおいて、複数の切断ペプチドが観測された場合はそれぞれの切断ペプチドのＭＳ強度の合計値を表している。【０２８９】
【表９】
2017150732.tif 000117
【０２９０】
【表１０】
2017150732.tif 000118
【０２９１】
【表１１】
2017150732.tif 000119
【０２９２】
【表１２】
2017150732.tif 000120
【０２９３】
【表１３】
2017150732.tif 000121
【０２９４】
４−３―１−２．  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にシステインを有するペプチドの翻訳合成
Initiation suppression法を用いてN末端にＡｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）を翻訳導入したペプチドを翻訳合成し、その後にトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）によってＡｃｂｚを脱保護を行った。得られた反応混合物をＭＡＬＤＩによる質量分析を実施し、翻訳合成によって得られるペプチドの純度を確認した。
翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ  ＧＴＰ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  酢酸カリウム，６ｍＭ  酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ  ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM  10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ  ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ  無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ  ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ  メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ  ＥＦ−Ｇ、０．２４μＭ  ＲＦ２、０．１７μＭ  ＲＦ３、０．５μＭ  ＲＲＦ，２．７μＭ  ＩＦ１，０．４μＭ  ＩＦ２，１．５μＭ  ＩＦ３，４０μＭ  ＥＦ−Ｔｕ，４４μＭ  ＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭ  リボソーム，０．７３μＭ  ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ  ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ  ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ  ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ  ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ  ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ  ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ  ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ  ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ  ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ  ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ  ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ  ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ  ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ  ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ  ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ  ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ  ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ  ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ  ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−６−１ (配列番号１８)、Ｒ−７−１ (配列番号１９)、Ｒ−８−１ (配列番号２０)、Ｒ−９−１ (配列番号２１)、Ｒ−５−１ (配列番号１７)）と、各アミノ酸Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，３-フルオローＬ−チロシン（Ｔｙｒ（３−Ｆ））をそれぞれ２５０μＭずつ加え、Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、Ｎ−メチルアラニン（ＭｅＡｌａ）をそれぞれ５ｍＭ加え、さらに２０μＭ  ＭｅＧｌｙ−ｔＲＮＡＧｌｕＣＵＧ（化合物ＡＡｔＲ−８）（配列番号：１０）、２０μＭ  Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物ＡＡｔＲ−１）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
得られた翻訳反応物を、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで翻訳産物を分析した。翻訳合成に使用した鋳型ｍＲＮＡ配列番号と翻訳合成された目的物と切断ペプチドのＭＳ理論値、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの実測値を示す表１４〜１８に記した。また、翻訳合成された目的物と切断ペプチドのＭＳ強度を図５に記した。図５における切断ペプチドのＭＳ強度を示すグラフにおいて、複数の切断ペプチドが観測された場合はそれぞれの切断ペプチドのＭＳ強度の合計値を表している。【０２９５】
【表１４】
2017150732.tif 000122
【０２９６】
【表１５】
2017150732.tif 000123
【０２９７】
【表１６】
2017150732.tif 000124
【０２９８】
【表１７】
2017150732.tif 000125
【０２９９】
【表１８】
2017150732.tif 000126
【０３００】
図５に示したように、今回翻訳評価したアミノ酸類縁体を複数含むペプチドすべてにおいてＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ法とＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を比較すると、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法は目的物のMS強度がより強く観測され、切断ペプチドのMS強度はより弱く観測された。すなわち、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法は効率よくＮ末端にシステインを持つアミノ酸類縁体を複数含むペプチドを翻訳合成する手法であることが証明された。また、切断ペプチドはアミノ酸類縁体の翻訳導入前後で切断されたものが観測されており、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法は複数のアミノ酸類縁体を含むペプチドを高い純度で翻訳合成できることが示された。【０３０１】
実施例５  Ｎ末端に保護基を持つＮＭｅシステインを有するペプチドを翻訳合成し、保護基を脱保護した後にネイティブケミカルライゲーションによりアミド環化ペプチドの合成
５―１．  Ｎ末端に保護基を持つＮＭｅシステインを有し、Ｃ末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチドの翻訳合成と、翻訳合成したペプチドの保護基を脱保護した後にネイティブケミカルライゲーションと脱硫反応によるアミド環化ペプチドの合成
以下の反応式に示すようにInitiation suppression法を用いてN末端にＡｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）を持つペプチドを翻訳合成し、その後にトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）によってＡｃｂｚを脱保護とネイティブケミカルライゲーションと脱硫反応によるアミド環化ペプチドの合成を実施した。具体的には、ＭｅＣｙｓを基質とするネイティブケミカルライゲーションはチオエステル交換から生成するチオラクトン体と、その後のＳ−Ｎ交換から生成するＮＣＬアミド体との間で平衡が存在し、２つの混合物が得られる。その混合物を脱硫反応に付し、ＮＣＬアミド体を脱硫させることによって平衡を偏らせて反応を進行させ目的の環状ペプチドが得られた。よって翻訳合成から得られたペプチドから連続的に変換し、目的とするアミド環化ペプチドを合成することのできる反応条件の設定に至った。
得られた反応混合物をＭＡＬＤＩによる質量分析を実施し、それぞれの反応が進行し目的のアミド環化ペプチドが得られたことを確認した。翻訳合成に使用した鋳型ｍＲＮＡ配列を以下の表１９に記した。【０３０２】
2017150732.tif 000127
【０３０３】
【表１９】
2017150732.tif 000128
【０３０４】
翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ  ＧＴＰ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  酢酸カリウム，６ｍＭ  酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ  ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM  10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ  ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ  無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ  ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ  メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ  ＥＦ−Ｇ、０．２４μＭ  ＲＦ２、０．１７μＭ  ＲＦ３、０．５μＭ  ＲＲＦ，２．７μＭ  ＩＦ１，０．４μＭ  ＩＦ２，１．５μＭ  ＩＦ３，４０μＭ  ＥＦ−Ｔｕ，４４μＭ  ＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭ  リボソーム，０．７３μＭ  ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ  ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ  ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ  ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ  ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ  ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ  ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ  ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ  ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ  ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ  ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ  ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ  ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ  ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ  ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ  ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ  ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ  ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ  ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ  ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−１０、Ｒ−１１、Ｒ−１２、Ｒ−１３，Ｒ−１４，Ｒ−１５）と、各アミノ酸Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，３-フルオローＬ−チロシン（Ｔｙｒ（３−Ｆ））をそれぞれ２５０μＭずつ加え、Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）５ｍＭ加え、さらに２０μＭ  ＡｓｐＳＭｅ−ｔＲＮＡＧｌｕＡＡＧ（化合物ＡＡｔＲ−９）、２０μＭ  Ａｃｂｚ−ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｔＲＮＡｆＭｅｔＣＡＵ（化合物ＡＡｔＲ−３）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
次に翻訳反応液（８μＬ）に、１５０ｍＭ  ＴＣＥＰ環化反応試薬溶液（２μＬ）を混合し、３７℃で１時間静置した。Ａｃｂｚの脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応が進行していることを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより確認した（図６）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの分析には反応液を１μＬサンプリングしSPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて実施した。また、１５０ｍＭ  ＴＣＥＰ環化反応試薬溶液は、ｐＨ  ７．０ＴＣＥＰ溶液（５００ｍＭ，１２μＬ）、ｐＨ８．３  Ｔｒｉｓ溶液（２Ｍ，３μＬ）、ｐＨ８．０  ＥＤＴＡ溶液（５００ｍＭ、nacalai社  製品番号14362-24、５μＬ）、水酸化カリウム水溶液（２００ｍＭ、２０μＬ）を混合し調製した。
さらに、環化反応液（７μＬ）に、ｐＨ  ７．０ＴＣＥＰ溶液（５００ｍＭ，７μＬ）、グルタチオン（ＧＳＨ）溶液（２５０ｍＭ，１μＬ）を加え、４２℃で１分間静置し、続いて2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]二塩酸塩（ＶＡ−０４４）溶液（１Ｍ、４μＬ）、水酸化カリウム水溶液（１Ｍ、１μＬ）を混合し４２℃で２時間静置した。
脱硫反応が進行していることを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより確認した（図６）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの分析には、反応液を１μＬサンプリングしSPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて実施した。【０３０５】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１０  から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物の混合物
［ＭｅＣｙｓ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］［ＭｅＰｈｅ］ＶａｌＧｌｎＳｅｒ［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］ＳｅｒＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−４３とＰｅｐ−４４の混合物）
Ｐｅｐ−４３
2017150732.tif 000129
Ｐｅｐ−４４
2017150732.tif 000130
【０３０６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝1477.5  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．1476.7【０３０７】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１０  から由来する化合物の混合物（Ｐｅｐ−４３とＰｅｐ−４４）を脱硫反応に付して得られた化合物
［ＭｅＡｌａ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］［ＭｅＰｈｅ］ＶａｌＧｌｎＳｅｒ［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］ＳｅｒＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−４５）
Ｐｅｐ−４５
2017150732.tif 000131
【０３０８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１４４５．５  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１４４４．７【０３０９】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１１  から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物の混合物
［ＭｅＣｙｓ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］ＶａｌＧｌｎＩｌｅ［ＭｅＰｈｅ］ＳｅｒＶａｌＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−４６とＰｅｐ−４７）
Ｐｅｐ−４６
2017150732.tif 000132
Ｐｅｐ−４７
2017150732.tif 000133
【０３１０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１４２１．５  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１４２０．７【０３１１】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１１  から由来する化合物の混合物（Ｐｅｐ−４６とＰｅｐ−４７）を脱硫反応に付して得られた化合物
［ＭｅＡｌａ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］ＶａｌＧｌｎＩｌｅ［ＭｅＰｈｅ］ＳｅｒＶａｌＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−４８）
Ｐｅｐ−４８
2017150732.tif 000134
【０３１２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１３８９．６  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１３８８．７【０３１３】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１２  から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物の混合物
［ＭｅＣｙｓ＊］ＴｈｒＴｈｒＰｒｏ［ＭｅＰｈｅ］ＧｌｙＧｌｎＳｅｒ［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］ＩｌｅＶａｌＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−４９とＰｅｐ−５０）
Ｐｅｐ−４９
2017150732.tif 000135
Ｐｅｐ−５０
2017150732.tif 000136
【０３１４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１６１１．４  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１６１０．８【０３１５】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１２  から由来する化合物の混合物（Ｐｅｐ−４９と化合物Ｐｅｐ−５０）を脱硫反応に付して得られた化合物
［ＭｅＡｌａ＊］ＴｈｒＴｈｒＰｒｏ［ＭｅＰｈｅ］ＧｌｙＧｌｎＳｅｒ［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］ＩｌｅＶａｌＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−５１）
Ｐｅｐ−５１
2017150732.tif 000137
【０３１６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１５７９．５  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１５７８．８【０３１７】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１３  から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物の混合物
［ＭｅＣｙｓ＊］［ＭｅＰｈｅ］ＶａｌＴｈｒＧｌｎＡｌａＴｈｒ［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］ＧｌｙＩｌｅＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−５２とＰｅｐ−５３）
Ｐｅｐ−５２
2017150732.tif 000138
Ｐｅｐ−５３
2017150732.tif 000139
【０３１８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１４９８．４  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１４９７．７【０３１９】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１３  から由来する化合物の混合物（Ｐｅｐ−５２とＰｅｐ−５３）を脱硫反応に付して得られた化合物
［ＭｅＡｌａ＊］［ＭｅＰｈｅ］ＶａｌＴｈｒＧｌｎＡｌａＴｈｒ［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］ＧｌｙＩｌｅＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−５４）
Ｐｅｐ−５４
2017150732.tif 000140
【０３２０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１４６６．５  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１４６５．７【０３２１】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１４  から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物の混合物
［ＭｅＣｙｓ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］ＰｒｏＳｅｒＧｌｎＩｌｅＶａｌ［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］ＴｈｒＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−５５とＰｅｐ−５６）
Ｐｅｐ−５５
2017150732.tif 000141
Ｐｅｐ−５６
2017150732.tif 000142
【０３２２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１５４０．４  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１５３９．７【０３２３】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１４  から由来する化合物（Ｐｅｐ−５５とＰｅｐ−５６）を脱硫反応に付して得られた化合物
［ＭｅＡｌａ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］ＰｒｏＳｅｒＧｌｎＩｌｅＶａｌ［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］ＴｈｒＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−５７）
2017150732.tif 000143
【０３２４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１５０８．４  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１５０７．７【０３２５】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１５  から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物の混合物
［ＭｅＣｙｓ＊］［ＭｅＰｈｅ］［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］Ｔｒｐ［ＭｅＰｈｅ］ＰｒｏＧｌｎ［ＭｅＰｈｅ］ＬｙｓＴｒｐＡsp＊ＰｒｏＡｒｇ［Ｔｙｒ（３−Ｆ）]（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−５８とＰｅｐ−５９）
Ｐｅｐ−５８
2017150732.tif 000144
Ｐｅｐ−５９
2017150732.tif 000145
【０３２６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝２０５６．４  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．２０５５．９【０３２７】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１５  から由来する化合物の混合物（Ｐｅｐ−５８とＰｅｐ−５９）を脱硫反応に付して得られた化合物
［ＭｅＡｌａ＊］［ＭｅＰｈｅ］［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］Ｔｒｐ［ＭｅＰｈｅ］ＰｒｏＧｌｎ［ＭｅＰｈｅ］ＬｙｓＴｒｐＡsp＊ＰｒｏＡｒｇ［Ｔｙｒ（３−Ｆ）]（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−６０）
Ｐｅｐ−６０
2017150732.tif 000146
【０３２８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝２０２４．７  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．２０２４．０【０３２９】
実施例６  翻訳後修飾条件下におけるＲＮＡの安定性評価
翻訳合成から得られたペプチドから連続的に変換し目的とするアミド環化ペプチドを合成することのできるそれぞれの反応条件下において、ＲＮＡが安定であることを確認する実験を行った。
６−１．  翻訳後修飾条件下における安定性を評価するためのｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物の調製
文献記載（特許文献  ＷＯ２０１３／１００１３２）の方法により調製したＤＮＡライブラリー(配列番号  Ｄ−１６)を鋳型に、T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System(Promega社、P1320)を用いたin vitro転写によりｍＲＮＡ（配列番号R-16)を調製し、RNeasy MinElute kit (Qiagen社)を用いて精製した。
6μＭ  ｍＲＮＡ（配列番号R-16)を、9μＭのピューロマイシンリンカー (Sigma社)(配列番号Ｃ−１)、 1X T4 RNAライゲースリアクションバッファー(New england bio lab.社)、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０％ ＤＭＳＯ、０．６２５ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４  ＲＮＡライゲース(New england bio lab.社)の条件で、37℃で30分間ライゲーション反応させた後、RNeasy MinElute kit (Qiagen社)により精製しｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)を得た。【０３３０】
ＤＮＡ  配列番号Ｄ−１６（配列番号：２８）
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGC(NNN)9TAGCCGACCGGCACCGGCACCGGCGATAGGGCGGCGGGGACAAA
配列中に（NNN）と示した箇所は、TTT, TTG, CTA, ATT, GTT, CCG, ACT, GCT, TAC, CAT, CAG, GAA, TGG, CGG, AGT, AGG, GGTがランダムに出現することを意味する。また、（NNN）9は任意のNNN が９回結合していることを意味しており（ATT）９のみを意味するのでなく、例えば17種類から選択すると179の多様性が生じることを模式的に示したものである。【０３３１】
ＲＮＡ  配列番号Ｒ−１６（配列番号：２９）
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC(PPP)9UAGCCGACCGGCACCGGCACCGGCGAUAGGGCGGCGGGGACAAA
配列中に（PPP）と示した箇所は、UUU, UUG, CUA, AUU, GUU, CCG, ACU, GCU, UAC, CAU, CAG, GAA, UGG, CGG, AGU, AGG, GGUがランダムに出現することを意味する。また、（PPP）9は任意のPPP が９回結合していることを意味しており（AUU）９のみを意味するのでなく、例えば17種類から選択すると179の多様性が生じることを模式的に示したものである。【０３３２】
ピューロマイシンリンカー 配列番号Ｃ−１（配列番号：３０）
[P]CCCGTCCCCGCCGCCCT[Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18]CC[Puromycin] ([P]:5'リン酸化)
詳細な部分構造は以下の通りである。
2017150732.tif 000147
ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)（配列番号：３１）
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC(PPP)9UAGCCGACCGGCACCGGCACCGGCGAUAGGGCGGCGGGGACAAACCCGTCCCCGCCGCCCT[Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18]CC[Puromycin]【０３３３】
６−２．  Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによるアミド環化反応とその後の脱硫反応条件でのＲＮＡの安定性を確認した例
前述したＡｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによるアミド環化反応、その後の脱硫反応という一連の反応条件においてRNAが安定に存在するかを確認した。すなわち、ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)を一連の反応条件に付した後、ゲル電気泳動による解析を行った。【０３３４】
具体的には、１μＭ  ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)を含む緩衝液（１ｍＭ  ＧＴＰ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  酢酸カリウム，９ｍＭ  酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．１ｍM  10-HCO-H4folate）（６０μL）に、１５０ｍＭ  ＴＣＥＰ環化反応試薬溶液（１５μＬ）を混合し、３７℃で１時間静置した。１５０ｍＭ  ＴＣＥＰ環化反応試薬溶液は、ｐＨ  ７．０ＴＣＥＰ溶液（５００ｍＭ，１２μＬ）、ｐＨ８．３  Ｔｒｉｓ溶液（２Ｍ，３μＬ）、ｐＨ８．０  ＥＤＴＡ溶液（５００ｍＭ、nacalai社  製品番号14362-24、５μＬ）、水酸化カリウム水溶液（２００ｍＭ、２０μＬ）を混合しＡｃｂｚ脱保護環化溶液を調製した。【０３３５】
さらに、混合溶液（７５μＬ）に、ｐＨ  ７．０ＴＣＥＰ溶液（５００ｍＭ，７５μＬ）、グルタチオン（ＧＳＨ）溶液（２５０ｍＭ，１０．７μＬ）を加え、４２℃で１分間静置し、続いて2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]二塩酸塩（ＶＡ−０４４）溶液（１Ｍ、４２．９μＬ）、水酸化カリウム水溶液（１Ｍ、１０．７μＬ）を混合し４２℃で３時間静置した。
その後RNeasy MinElute kit (Qiagen社)を用いて精製し、ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物の溶液を得た後、電気泳動による解析を行った。（図７、レーン１）。【０３３６】
一方、上述のＡｃｂｚ脱保護環化溶液（７５μＬ）に水１３９．３μLを加え、４２℃で３時間静置した。上記と同様にRNeasy MinElute kit (Qiagen社)を用いてｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物を精製し、脱硫反応条件に付していない溶液として調製し泳動比較に用いることにした（図７，レーン２）。
さらに標準溶液として、反応条件に付していない０．５μＭ  ｍＲＮＡ−ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)溶液を泳動比較に用いることにした（図７，レーン３）。またマーカーとしてTrackIt 10 bp ladder (Life Technologies社, 製品番号10488-019)を用いた（図７，レーン４）。【０３３７】
それぞれの上記反応サンプル１０μＬの溶液に対して１０μＬのNovex(登録商標) TBE−Ureaサンプルバッファー（２ｘ）（Invitrogen社）を加え、そのうち４μＬを使って１０％TBE−ウレアゲルにて電気泳動を行い、SYBR gold nucleic acid stain  (Invitrogen社)により染色を行った。その結果、いずれの反応サンプル(図７、レーン１，２)においても、標準溶液（図７，レーン３）と比較して分解物に由来するようなバンドパターンの変化は観測されなかった。 これらの事から、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによるアミド環化反応、その後の脱硫反応という一連の反応条件においてRNAは分解せず安定に存在する事が示された。【０３３８】
【表２０】
2017150732.tif 000148
【０３３９】
実施例７  無細胞翻訳系に用いるｐＣｐＡ−アミノ酸の合成
用語の定義
Ａｚｏｃ        アジドメトキシカルボニル基
2017150732.tif 000149
ＨＯＧｌｙ      グリコール酸
ＤＭＴ          ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル基
2017150732.tif 000150
【０３４０】
７−１．Initiation suppression法によりＮ末端にアミノ酸類縁体を翻訳導入するためのｐＣｐＡ−アミノ酸の合成
2-(tert-ブチルジスルファニル)エタン-1-アミン 塩酸塩（化合物ｎｋ３１）の合成
2017150732.tif 000151
【０３４１】
文献記載（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ）の方法で合成した(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)カルバミン酸 tert-ブチル（５３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）に４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（１．０ｍｌ）を加えて室温で９０分撹拌した。反応液を減圧濃縮して2-(tert-ブチルジスルファニル)エタン-1-アミン 塩酸塩（化合物ｎｋ３１）（４０ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １６６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３４２】
N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシン（化合物ｎｋ３２）の合成
2017150732.tif 000152
【０３４３】
前工程にて得られた2-(tert-ブチルジスルファニル)エタン-1-アミン 塩酸塩（化合物ｎｋ３１）（４０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１４０ｍｌ、０．８０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．０ｍｌ）に溶解した。混合物を氷浴で冷却後、２−ブロモ酢酸 tert-ブチル（０．０２９ｍｌ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５分撹拌後、室温で９０分撹拌した。さらに２−ブロモ酢酸 tert-ブチル（０．００６ｍｌ、０．０４０ｍｍｏｌ）を添加し室温で１６．５時間撹拌した後に、反応液を減圧濃縮して濃縮残渣を得た。得られた濃縮残渣をＤＣＭ（１ｍｌ）に溶かし、混合物を氷浴で冷却後にＴＦＡ（１ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温で６０分撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。
窒素雰囲気下、得られた濃縮残渣と炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（６２．９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．４０ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（８４μＬ、０．６０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で３日撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシン（化合物ｎｋ３２）（５３．９ｍｇ、６８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３９７  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３４４】
シアノメチル N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシナート(化合物ｎｋ３３)の合成
2017150732.tif 000153
【０３４５】
窒素雰囲気下、N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシン（化合物ｎｋ３２）（５３．９ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０４７ｍＬ、０．２７１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５４１μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．０１４ｍＬ、０．２０３ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間３０分攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシナート（化合物ｎｋ３３）を得た。得られた粗生成物シアノメチル N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシナート（化合物ｎｋ３３）をアセトニトリル（０．６７５ｍｌ）に溶解させ、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４３８  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３４６】
(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシナート(化合物ｎｋ３４)の合成
2017150732.tif 000154
【０３４７】
緩衝液Ａ（１６．４ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（２４．６ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシナート（化合物ｎｋ３３）の０．２Ｍアセトニトリル溶液（０．３３９ｍｌ、０．０６８ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から１０分後、３０分後にそれぞれ０．１１３ｍＬ、合計３回投与)、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（０．８２ｍＬ）を加えた。反応液を０度で１０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ３４）（１６．２ｍｇ、４６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０３３  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３４８】
3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ３５）の合成
2017150732.tif 000155
【０３４９】
2-(tert-ブチルジスルファニル)エタン-1-アミン 塩酸塩（化合物ｎｋ３１）（４０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２７９ｍｌ、１．６０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．０ｍｌ）に溶解した。混合物を氷浴で冷却後、3-ブロモプロパン酸 tert-ブチル（０．１０ｍｌ、０．６０ｍｍｏｌ）を添加し、５分撹拌した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した後に、反応液を減圧濃縮して濃縮残渣を得た。得られた濃縮残渣をＤＣＭ（１ｍｌ）に溶かし、混合物を氷浴で冷却後にＴＦＡ（１ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温で１５分撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。
窒素雰囲気下、得られた濃縮残渣と炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（６２．９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．４ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（１３９μＬ、１．００ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３５℃で１日撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ３５）（４７．５ｍｇ、５８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１１  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３５０】
3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸シアノメチル (化合物ｎｋ３６)の合成
2017150732.tif 000156
【０３５１】
窒素雰囲気下、3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ３５）（４７．５ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０４０ｍＬ、０．２３０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４６１μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．０１２ｍＬ、０．１７３ｍｍｏｌ）を加えて室温で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸シアノメチル (化合物ｎｋ３６)を得た。得られた粗生成物3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸シアノメチル (化合物ｎｋ３６)をアセトニトリル（０．５７５ｍｌ）に溶解させ、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４５２  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．００分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３５２】
3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル (化合物ｎｋ３７)の合成
2017150732.tif 000157
【０３５３】
緩衝液Ａ（２７．７ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（４１．５ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を溶解させ、3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸シアノメチル (化合物ｎｋ３６)の０．２Ｍアセトニトリル溶液（０．５７６ｍｌ、０．１１５ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から１０分後、３０分後にそれぞれ０．１９２ｍＬ、合計３回投与)、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（１．３９ｍＬ）を加えた。反応液を０度で１０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ３７）（２８．１ｍｇ、４７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０４７．５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３５４】
(R)-(1-(tert-ブチルジスルファニル)-4-ジアゾ-3-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸 tert-ブチル(化合物ｎｋ３８)の合成
2017150732.tif 000158
【０３５５】
N-(tert-ブトキシカルボニル)-S-(tert-ブチルチオ)-L-システイン（Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ＯＨ）（３０９ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１７５ｍＬ、１．００ｍｍｏｌ）を加えて、混合物を−１５度に冷却し、クロロギ酸エチル（０．１０５ｍＬ、１．１０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合液を−１５度で６時間攪拌し、さらに室温で１２時間撹拌した。反応液を氷浴で冷却後、酢酸（０．１１４ｍＬ、２．００ｍｍｏｌ）を加え、混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水で洗浄を行った。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し(R)-(1-(tert-ブチルジスルファニル)-4-ジアゾ-3-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸 tert-ブチル（化合物ｎｋ３８）（５５．１ｍｇ、１７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３３４  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３５６】
(R)-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸 (化合物ｎｋ３９)の合成
2017150732.tif 000159
【０３５７】
(R)-(1-(tert-ブチルジスルファニル)-4-ジアゾ-3-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸 tert-ブチル（化合物ｎｋ３８）（８５ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．７ｍＬ）に溶かし、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１１１ｍＬ、０．６３７ｍｍｏｌ）を加えて、混合液を氷浴で冷却後、トリフルオロ酢酸銀(I)（１１．３ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合液を遮光下、０度で２時間攪拌し、さらに室温で３日間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(R)-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸 (化合物ｎｋ３９)（３０ｍｇ、３６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３２２  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３５８】
(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸（化合物ｎｋ４０）の合成
2017150732.tif 000160
【０３５９】
(R)-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸 (化合物ｎｋ３９)（３０ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）に４Ｎ塩酸／１，４−ジオキサン溶液（１．０ｍｌ）を加えて室温で６０分撹拌し、反応液を減圧濃縮した。
窒素雰囲気下、得られた濃縮残渣と炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（２９．２ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．９３ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（３２μＬ、０．２３３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３０℃で３日撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸（化合物ｎｋ４０）（１８．８ｍｇ、５１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３９７  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３６０】
(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸シアノメチル(化合物ｎｋ４１)の合成
2017150732.tif 000161
【０３６１】
窒素雰囲気下、(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸（化合物ｎｋ４０）（１８．８ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０１２ｍＬ、０．０７１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２３６μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．００５ｍＬ、０．０７１ｍｍｏｌ）を加えて室温で６時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸シアノメチル(化合物ｎｋ４１)を得た。得られた粗生成物(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸シアノメチル(化合物ｎｋ４１)をアセトニトリル（０．２３６ｍｌ）に溶解させ、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４３６  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．９３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３６２】
(3R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル (化合物ｎｋ４２)の合成
2017150732.tif 000162
【０３６３】
緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（３４．０ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）を溶解させ、(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸シアノメチル(化合物ｎｋ４１)の０．２Ｍアセトニトリル溶液（０．２３６ｍｌ、０．０４７ｍｍｏｌ）を加えて、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応液を０度で１０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ４２）（１０．３ｍｇ、２１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０３３．６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３６４】
(2S,4R)-1-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物ｎｋ４３)の合成
2017150732.tif 000163
【０３６５】
(2S,4R)-1-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-4-(トリチルチオ)ピロリジン-2-カルボン酸（１２０ｍｇ、０．１９６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶かし、ＴＦＡ（０．１００ｍＬ、１．３０ｍｍｏｌ）とトリエチルシラン（０．０６０ｍＬ、０．３８ｍｍｏｌ）を加えて、反応混合液を室温で１時間攪拌した。さらに反応液にメタンチオスルホン酸 Ｓ-メチル（０．０９２ｍＬ、０．９８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．２４０ｍＬ、１．３７ｍｍｏｌ）を加えて反応混合液を室温で１時間攪拌した。
反応液を減圧濃縮し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(2S,4R)-1-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物ｎｋ４３)（７７．８ｍｇ、９５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４１６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３６６】
(2S,4R)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸(化合物ｎｋ４４)の合成
2017150732.tif 000164
【０３６７】
(2S,4R)-1-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物ｎｋ４３)（１００ｍｇ、０．２４１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．９６ｍｌ）溶液に4-(3-フェニルプロピル)ピペリジン（０．１０２ｍｌ、０．４８１ｍｍｏｌ）を加え、室温で６０分攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、(2S,4R)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸(化合物ｎｋ４４)（３９．５ｍｇ、８５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １９４  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．２５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３６８】
(2S,4R)-1-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物ｎｋ４５)の合成
2017150732.tif 000165
【０３６９】
窒素雰囲気下、(2S,4R)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸(化合物ｎｋ４４)（３９．５ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）と炭酸（４−ニトロフェニル）４−アジドベンジル（６４．２ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（０．４１ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（７１．２μＬ、０．５１１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３０℃で４時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(2S,4R)-1-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物ｎｋ４５)（７４．８ｍｇ、９９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３６７  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３７０】
(2S,4R)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-1,2-ジカルボン酸 2-(シアノメチル) 1-(4-アジドベンジル) (化合物ｎｋ４６)の合成
2017150732.tif 000166
【０３７１】
窒素雰囲気下、(2S,4R)-1-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物ｎｋ４５)（７４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０５２ｍＬ、０．３０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４００μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．０２０ｍＬ、０．３０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１７時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物(2S,4R)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-1,2-ジカルボン酸 2-(シアノメチル) 1-(4-アジドベンジル) (化合物ｎｋ４６)を得た。得られた粗生成物(2S,4R)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-1,2-ジカルボン酸 2-(シアノメチル) 1-(4-アジドベンジル) (化合物ｎｋ４６)をアセトニトリル（１．０ｍｌ）に溶解させ、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ４０８  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３７２】
(2S,4R)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-1,2-ジカルボン酸 1-(4-アジドベンジル) 2-((2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル) (化合物ｎｋ４７)の合成
2017150732.tif 000167
【０３７３】
緩衝液Ａ（４８ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（７２．２ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を溶解させ、(2S,4R)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-1,2-ジカルボン酸 2-(シアノメチル) 1-(4-アジドベンジル) (化合物ｎｋ４６)の０．２Ｍアセトニトリル溶液（１．００Ｌ、０．２０ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から１０分後、３０分後にそれぞれ０．３３ｍＬ、合計３回投与)、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２．４ｍＬ）を加えた。反応液を０度で１０分撹拌しさらに室温で１０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ４７）（２３．５ｍｇ、２３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １００１  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．５３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３７４】
4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸メチル（化合物ｎｋ５０）の合成
2017150732.tif 000168
【０３７５】
2-(tert-ブチルジスルファニル)エタン-1-アミン 塩酸塩（化合物ｎｋ３１）（８１ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２７９ｍＬ、１．６０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．６ｍＬ）に溶解した。混合物を氷浴で冷却後、4-ブロモ酪酸メチル（０．０７５ｍＬ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５分撹拌後、６０度で２５時間撹拌した後に反応液を減圧濃縮して濃縮残渣を得た。
得られた濃縮残渣をアセトニトリル（１．６ｍＬ）に溶かし、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１４ｍＬ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を−２０度に冷却後にクロロぎ酸クロロメチル（５１．６ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０度で３０分撹拌した後、水（７．２μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を加えて反応混合物を室温で１０分撹拌した後に反応液を減圧濃縮した。得られた濃縮残渣をアセトニトリル（１．６ｍＬ）に溶かし、テトラブチルアンモニウムアジド（５６９ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３日撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸メチル（化合物ｎｋ５０）（８９．７ｍｇ、６２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３６５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３７６】
4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸 (化合物ｎｋ５１)の合成
2017150732.tif 000169
【０３７７】
4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸メチル（化合物ｎｋ５０）（８４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をメタノール（０．８０ｍＬ）に溶かした後、０．６Ｍ水酸化リチウム溶液（メタノール：水＝１：１、０．７６８ｍＬ）を加えて反応液を室温で２時間撹拌した。反応混合物を氷浴で冷却後、１Ｍ塩酸（０．５ｍＬ）を添加した後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸 (化合物ｎｋ５１)（７５．６ｍｇ、９４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３４９  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．７８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３７８】
4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸シアノメチル (化合物ｎｋ５２)の合成
2017150732.tif 000170
【０３７９】
窒素雰囲気下、4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸 (化合物ｎｋ５１)（７５．６ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０９４ｍＬ、０．５４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５３９μｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（０．０２９ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸シアノメチル (化合物ｎｋ５２)を得た。得られた粗生成物4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸シアノメチル (化合物ｎｋ５２)をアセトニトリル（１．０８ｍＬ）に溶解させ、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３９０  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３８０】
4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸
(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ５３)の合成
2017150732.tif 000171
【０３８１】
緩衝液Ａ（４５ｍL）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（６７ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）を溶解させ、4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸シアノメチル (化合物ｎｋ５２)の０．２Ｍアセトニトリル溶液（０．９２ｍＬ、０．１８ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から１０分後、３０分後にそれぞれ０．３１ｍＬ、合計３回投与)、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加えた。反応液を０度で１０分撹拌しさらに室温で１０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ５３）（３１．０ｍｇ、３４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ９８５．５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３８２】
実施例８  アミノ基に保護基を有する翻訳開始用のアミノアシルｔＲＮＡの合成
８−１．  アミノ酸類縁体をＮ末端に導入するためのアミノアシルｔＲＮＡ合成
５０μＭ  転写tRNAfMetCAU(-CA)  （配列番号Ｒ−１）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ  ＡＴＰ  （４μｌ）、Nuclease free water  （５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、５ｍＭのアミノアシル化ｐＣｐＡ（ｎｋ−３４、３７、４２、４７、５３）のＤＭＳＯ溶液  （４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ−１０、１１、１２、１３、１４）は、フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ−１０、１１、１２、１３）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。【０３８３】
化合物ＡＡｔＲ−１０
Acbz-(tBuSSEt)Gly-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
2017150732.tif 000172
【０３８４】
化合物ＡＡｔＲ−１１
Acbz-(tBuSSEt)βAla-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
2017150732.tif 000173
【０３８５】
化合物ＡＡｔＲ−１２
Acbz-βhCys(StBu)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
2017150732.tif 000174
【０３８６】
化合物ＡＡｔＲ−１３
Acbz-Pro(SSMe)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
2017150732.tif 000175
【０３８７】
化合物ＡＡｔＲ−１４
Azoc-(tBuSSEt)GABA-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
2017150732.tif 000176
【０３８８】
実施例９
９−１．  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸を有するペプチドの翻訳合成
上記３−２と同様に、Initiation suppression法を用いて、アミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔを無細胞翻訳系に加えて翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ  ＧＴＰ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  酢酸カリウム，１０ｍＭ  酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM  10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ  ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ  無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ  ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ  メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ  ＥＦ−Ｇ、０．２４μＭ  ＲＦ２、０．１７μＭ  ＲＦ３、０．５μＭ  ＲＲＦ，２．７μＭ  ＩＦ１，０．４μＭ  ＩＦ２，１．５μＭ  ＩＦ３，４０μＭ  ＥＦ−Ｔｕ，４４μＭ  ＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭ  リボソーム，０．７３μＭ  ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ  ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ  ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ  ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ  ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ  ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ  ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ  ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ  ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ  ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ  ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ  ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ  ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ  ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ  ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ  ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ  ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ  ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ  ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ  ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ  鋳型ｍＲＮＡと、Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙをそれぞれ２５０μＭずつ加え、さらにアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔを翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。【０３８９】
＜質量分析による検出＞
無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ  鋳型mRNA（Ｒ−４）と各アミノ酸としてＴｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、さらにアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔ（Acbz-(tBuSSEt)Gly-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１０）、Acbz-(tBuSSEt)βAla-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１１）、Acbz-βhCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１２）、Acbz-Pro(SSMe)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１３）、Azoc-(tBuSSEt)GABA -tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１４））（最終濃度２５μＭ）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
得られた翻訳反応物に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）（最終濃度２０ｍＭ）を加えた後、３７℃で１時間静置した。マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより翻訳産物を分析した。
その結果Ｎ末端にチオール基を有するアミノ酸が導入されたペプチド（表２１  ペプチド配列番号Ｐｅｐ−６１、Ｐｅｐ−６２、Ｐｅｐ−６３，Ｐｅｐ−６４，Ｐｅｐ−６５）を示すＭＳが観測された。【０３９０】
【表２１】
2017150732.tif 000177
【０３９１】
＜電気泳動による検出＞
N末端にアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ  鋳型mRNA（Ｒ−４Ｄ）と各アミノ酸、Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ（各々最終濃度２５０μＭ）、１４Ｃ-アスパラギン酸(最終濃度３７μＭ、Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、MC139)を加えた溶液を調製し、さらにアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔ（Acbz-(tBuSSEt)Gly-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１０）、Acbz-(tBuSSEt)βAla-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１１）、Acbz-βhCys(StBu)-tRNAfMetCAU （化合物AAtR-１２）、Acbz-Pro(SSMe)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１３）、Azoc-(tBuSSEt)GABA-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１４）（最終濃度２５μＭ）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。また対照実験として翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡの代わりに２５０μＭ  Ｍｅｔを加えたものと、翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡを加えないものを調製し、３７℃で１時間静置した。
得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(ＴＥＦＣＯ社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動（16% Peptide-PAGE mini、ＴＥＦＣＯ社、TB-162）を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(ＴＥＦＣＯ社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に２４時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
その結果Ａｃｂｚ−（ｔＢｕＳＳＥｔ）Ｇｌｙの場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−６６）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−９）の生成比は９６：１０（対照実験であるホルミルメチオニンで開始されたペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−８）の翻訳効率を１００としたときの相対的な翻訳効率を示す）であった（図８）。また、Ａｃｂｚ−（ｔＢｕＳＳＥｔ）βＡｌａの場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−６７）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−９）の生成比は９２：１２であり、Ａｃｂｚ−βｈＣｙｓ（ＳｔＢｕ）の場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−６８）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−９）の生成比は１０４：１１であった。
また、Ａｃｂｚ−Ｐｒｏ（ＳＳＭｅ）の場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−６９）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−９）の生成比は９３：９、Ａｚｏｃ−（ｔＢｕＳＳＥｔ）ＧＡＢＡの場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−７０）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ−９）の生成比は１０８：１０であった(図９）。【０３９２】
【表２２】
2017150732.tif 000178
【０３９３】
実施例１０  翻訳産物からの分枝ペプチドの生成
１０−１．  翻訳産物から分枝ペプチドの生成を可能とするアシルｐＣｐＡの合成
2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)酢酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ４８、ＤＭＴ−ＨＯＧｌｙ−ｐＣｐＡ）の合成
2017150732.tif 000179
【０３９４】
窒素雰囲気下、文献記載（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  ２００７，  １２９，  ６１８０．）の方法で合成した2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)酢酸シアノメチル（１１５ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）とリン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（１６７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（１９３μＬ、１．３８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３５℃で３時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)酢酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ４８、ＤＭＴ−ＨＯＧｌｙ−ｐＣｐＡ）（６１．２ｍｇ、４１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０８１．６  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３９５】
2-ヒドロキシ酢酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ４９、ＨＯＧｌｙ−ｐＣｐＡ）の合成
2017150732.tif 000180
【０３９６】
前工程にて得られた（2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)酢酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ４８、ＤＭＴ−ＨＯＧｌｙ−ｐＣｐＡ）（１５．８ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）に８０％酢酸水溶液（３１６μＬ）を加えて室温で９０分撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ４９、ＨＯＧｌｙ−ｐＣｐＡ）（８．４ｍｇ、８１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ７０９  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．１３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０３９７】
１０−２．  ＨＯＧｌｙ−ｐＣｐＡを用いたアシルｔＲＮＡ合成
５０μＭ  転写tRNAGluCUG(-CA)  （配列番号Ｒ−２）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ  ＡＴＰ  （４μｌ）、Nuclease free water  （５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、５ｍＭのＨＯＧｌｙ−ｐＣｐＡ（ｎｋ−４９）のＤＭＳＯ溶液  （４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。アシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ−１５）は、フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ−１５）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。【０３９８】
化合物ＡＡｔＲ−１５
HOGly-tRNAGluCUG（配列番号：１０）
2017150732.tif 000181
【０３９９】
翻訳ペプチドから分枝ペプチドを合成するために、以下の反応式に示すようにＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にＡｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）を有しＣｙｓ−Ｐｒｏ−ＨＯＧｌｙ配列をおよび側鎖アミノ基を有するリジンを持つペプチドを翻訳合成した。さらにＡｃｂｚ脱保護後にネイティブケミカルライゲーションによる環化反応により環状ペプチドを合成した後に、続く2回目の反応により分枝ペプチドを合成した。
2017150732.tif 000182
【０４００】
１０−３．Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にシステインを有し、システニルプロリルエステル配列及び側鎖アミノ基を持つペプチドを翻訳合成した後にネイティブケミカルライゲーションによる環状ペプチドの合成
鋳型ｍＲＮＡ  配列番号Ｒ−１８  （配列番号：３７）
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAGUUUUUGCCCGCAGAUUAAAUACGUUGGUCUUCCGCGUUAAGCUUCG【０４０１】
翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ  ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ  ＧＴＰ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  酢酸カリウム，１０ｍＭ  酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ  ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），４μｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ  ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ  無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ  ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ  メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ  ＥＦ−Ｇ、０．２４μＭ  ＲＦ２、０．１７μＭ  ＲＦ３、０．５μＭ  ＲＲＦ，２．７μＭ  ＩＦ１，０．４μＭ  ＩＦ２，１．５μＭ  ＩＦ３，４０μＭ  ＥＦ−Ｔｕ，４４μＭ  ＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭ  リボソーム，０．７３μＭ  ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ  ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ  ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ  ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ  ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ  ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ  ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ  ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ  ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ  ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ  ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ  ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ  ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ  ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ  ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ  ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ  ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ  ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ  ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ  ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ  鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ−１８）と、各アミノ酸Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，３-フルオローＬ−チロシン（Ｔｙｒ（３−Ｆ））をそれぞれ２５０μＭずつ加え、Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）５ｍＭ加え、さらに２０μＭ  ＡｓｐＳＭｅ−ｔＲＮＡＧｌｕＡＡＧ（化合物ＡＡｔＲ−９）、２０μＭ  ＨＯＧｌｙ−ｔＲＮＡＧｌｕＣＵＧ（化合物ＡＡｔＲ−１５）、２０μＭ  Ａｃｂｚ−Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）−ｔＲＮＡｆＭｅｔＣＡＵ（化合物ＡＡｔＲ−１）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
次に翻訳反応液（７．８μＬ）に、ｐＨ  ７．０ＴＣＥＰ溶液（５００ｍＭ，１．２μＬ）、Ｎ−メチルー２-ピロリドン（ＮＭＰ）(１０μＬ)  、ｐＨ８．０  ＥＤＴＡ溶液（５００ｍＭ、nacalai社  製品番号14362-24、０．５μＬ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（０．５μＬ）を
をそれぞれ混合し、３７℃で３０分間静置した。Ａｃｂｚの脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応が進行していることを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳにより確認した（図１０−１）。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの分析には反応液を１μＬサンプリングしSPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて実施した。【０４０２】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１８  から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物
［Ｃｙｓ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］ＣｙｓＰｒｏＨＯＧｌｙＩｌｅＬｙｓ［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］ＶａｌＧｌｙ[Ａｓｐ＊]ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−７１）
Ｐｅｐ−７１
2017150732.tif 000183
【０４０３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１５５６．４  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１５５５．７【０４０４】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１８  から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応において生成した副生成物
ＨＯＧｌｙＩｌｅＬｙｓ［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］ＶａｌＧｌｙ[Ａｓｐ（ＳＭｅ）]ＰｒｏＡｒｇ（Ｐｅｐ−７２）
Ｐｅｐ−７２
2017150732.tif 000184
【０４０５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１０５３．３  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１０５２．５【０４０６】
１０−４．翻訳ペプチドから合成した環状ペプチドＰｅｐ−７１を用いた分子内分枝ペプチド生成反応
前述のＰｅｐ−７１を含む環化反応液（１０μＬ）に、Ｎ−メチルー２-ピロリドン（ＮＭＰ）(２０μＬ)、ｐＨ  ７．０ＴＣＥＰ溶液（５００ｍＭ，５μＬ）、ｐＨ９．２  ビシン溶液（２Ｍ、９μＬ）、水酸化カリウム水溶液（５Ｍ、６μＬ）、４−（トリフルオロメチル）ベンゼンチオール（６．８μＬ、５０μＬ）をそれぞれ混合し、３０℃で２４時間静置した。
分枝ペプチドが生成していることを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより確認した（図１０−２、上図）。その結果目的物である分枝ペプチド（Ｐｅｐ−７３）と副生成物（Ｐｅｐ−７４）と環状ペプチド（Ｐｅｐ−７１）のＭＳ強度比は２０：６：７４であった。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの分析には、反応液を２μＬサンプリングしSPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて実施した。【０４０７】
鋳型ｍＲＮＡ配列番号  Ｒ−１８  から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物（Ｐｅｐ−７３）
Ｐｅｐ−７３
2017150732.tif 000185
【０４０８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１３５６．３  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１３５５．６【０４０９】
分子内分枝ペプチド合成反応において生成した副生成物
ＨＯＧｌｙＩｌｅ[Ｌｙｓ＊]［Ｔｙｒ（３−Ｆ）］ＶａｌＧｌｙ[Ａｓｐ＊]ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ−７４）
Ｐｅｐ−７４
2017150732.tif 000186
【０４１０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ｍ／ｚ＝１００５．３  （Ｍ＋Ｈ）＋    Ｃａｌｃ．１００４．５【０４１１】
以上の結果から分枝ペプチド（Ｐｅｐ−７３）は生成しているものの、中間体である環状ペプチド（Ｐｅｐ−７１）が主なピークであり改善の余地が残されていた。分枝ペプチドをより効率よく合成するために、さらなる分枝化反応の改良を実施した。【０４１２】
１０−５．分枝化反応が良好に進行する条件下における、翻訳ペプチドから合成した環状ペプチドＰｅｐ−７１を用いた分子内分枝ペプチド生成反応
前述のＰｅｐ−７１を含む環化反応液（１０μＬ）に、Ｎ−メチル−２-ピロリドン（ＮＭＰ）(２０μＬ)、ＴＣＥＰ溶液（１Ｍ，５μＬ）、ｐＨ９．２  ビシン溶液（２Ｍ、８μＬ）、水酸化カリウム水溶液（５Ｍ、７μＬ）、４−（トリフルオロメチル）ベンゼンチオール（６．８μＬ、５０μＬ）をそれぞれ混合し、４５℃で１４時間静置した。
ＴＣＥＰ溶液（１Ｍ）は、ＴＣＥＰ塩酸塩（７３．２ｍｇ、０．２５６ｍｍｏｌ）、水酸化カリウム水溶液（８Ｍ、１２８μＬ）を混合しＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを用いて調製した。
分枝ペプチドが生成していることを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより確認した（図１０−２、下図）。その結果目的物である分枝ペプチド（Ｐｅｐ−７３）と副生成物（Ｐｅｐ−７４）と環状ペプチド（Ｐｅｐ−７１）のＭＳ強度比は８５：９：６であった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの分析には、反応液を２μＬサンプリングしSPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて実施した。
以上の結果から、分枝化反応の条件を改良することによって翻訳産物から一連の反応を経て目的とする分枝ペプチドを良好な収率で進行することが示された。
一方、文献（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ）からこれらの一連の反応条件はＲＮＡが十分安定な範囲であるため、ペプチド−ＲＮＡ複合体においてもＲＮＡを分解させることなく良好な収率で分枝反応を進行させることが可能である。【０４１３】
実施例１１  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてアミド環化にて環化されたディスプレイライブラリの構築と標的結合ペプチドのパニング実施
ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を利用して環状ペプチドのディスプレイライブラリを作製しパニングを実施してＧＴＰａｓｅ  ＫＲａｓ（ＫＲＡＳ）に対する結合ペプチドを取得するための実験を行った。【０４１４】
１１−１．  ディスプレイライブラリ構築のためのｐＣｐＡ―アミノ酸の合成
３−（４−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸  （Ｓ）−シアノメチル（化合物ｎｋ５６、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
下記のスキームにしたがって合成を行った。
2017150732.tif 000187
【０４１５】
（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸（Ｂｏｃ−Ｐｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（４．００ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１２０ｍＬ）に溶解した後、０℃にて水素化ナトリウム（１．６０ｇ、４０．０ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）、ヨウ化メチル（９．４８ｇ、６６．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応液をオイルバスを用い、３０℃にて２日間撹拌した後、反応を氷水（５０ｍＬ）で停止させた。混合溶液を酢酸エチルで３回洗浄した後、水層を硫酸水素ナトリウムを用いてｐＨ３−４に調整し、酢酸エチルで３回抽出した。有機層をまとめて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸（化合物ｎｋ５４、Ｂｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（２．２０ｇ、５３％）を得た。
窒素雰囲気下、前工程にて得られた（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸（化合物ｎｋ５４、Ｂｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．５０ｇ、４．７８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（８０ｍＬ）溶液にＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１．２４ｇ、９．５９ｍｍｏｌ）および２−ブロモアセトニトリル（２．２８ｇ、１９．０ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｎｋ５５、Ｂｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．４５ｇ、８６％）を得た。
前工程にて得られた（Ｓ）−２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）−３−（４−クロロフェニル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｎｋ５５、Ｂｏｃ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．３０ｇ、３．６８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、塩酸ガスを吹き付け２０℃にて１時間撹拌した。反応液を濃縮し、混合物として（Ｓ）−３−（４−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸シアノメチルを（１．０６ｇ）得た。
前工程にて得られた（Ｓ）−３−（４−クロロフェニル）−２−（メチルアミノ）プロパン酸シアノメチルの混合物（０．９６ｇ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、０℃にてトリエチルアミン（８４０ｍｇ、８．３０ｍｍｏｌ）を加えた後、塩化ペンタ−４−エノイル（４７２ｍｇ、３．９８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）を滴下しながら加えた。反応液を２０℃で２時間撹拌した後、濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、３−（４−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸  （Ｓ）−シアノメチル（化合物ｎｋ５６、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．９１８ｇ、８３％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３３５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．２１分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ５）【０４１６】
３−（４−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸  （２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｎｋ５７）の合成
2017150732.tif 000188
【０４１７】
緩衝液Ａ（１１５ｍｌ）に、リン酸二水素  （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（２００ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）の水溶液（６．２５ｍＬ）、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｎｋ５６、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３７１ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．１ｍｌ）溶液を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製、表題化合物（化合物ｎｋ５７）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（２７７ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  １０００  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５８分（分析条件ＳＱＤFＡ０５）【０４１８】
３−（４−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸  （２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｎｋ５８）の合成
2017150732.tif 000189
【０４１９】
前工程にて得られた３−（４−クロロフェニル）−２−（Ｎ−メチルペンタ−４−エンアミド）プロパン酸  （２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｎｋ５７）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物を（２７７ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（４．０ｍＬ）を加えて室温で４時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ５８、Ｐｅｎ−ＭｅＰｈｅ（４−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（１１９ｍｇ、４６％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ９２８  （Ｍ−Ｈ）−
保持時間：０．５２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０４２０】
（Ｓ）−４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｎｋ５９、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ）の合成
2017150732.tif 000190
【０４２１】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−４−（メチルスルホニル）ブタン酸（Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ）（５．００ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）に２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（８０．０ｍＬ）を加えた後、反応液を２５℃で３時間撹拌した。次いで、反応液にジエチルエーテル（５０ｍＬ）を加え、混合物をろ過し、得られた固体をジエチルエーテルおよびヘキサンで洗浄することで、粗生成物である（Ｓ）−２−アミノ−４−（メチルスルホニル）ブタン酸（Ｈ―Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ）（２．８８ｇ）を得た。
水（４０ｍＬ）と１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）の混合溶媒に、得られた粗生成物である（Ｓ）−２−アミノ−４−（メチルスルホニル）ブタン酸（Ｈ―Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ）（２．８８ｇ）とペンタ−４−エン酸  ２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  （３．７６ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（２．６８ｇ、３１．９ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を２５℃で４時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで２回洗浄した後、水層を１Ｍの塩酸水溶液でｐＨ２になるまで調整し、ジクロロメタンで４回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮を行った。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）−４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｎｋ５９、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ）（２．４ｇ、７４％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ２６４  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．００分（分析条件ＳＭＤ  ｍｅｔｈｏｄ４）【０４２２】
４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸  （Ｓ）−シアノメチル（化合物ｎｋ６０、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2017150732.tif 000191
【０４２３】
窒素雰囲気下、（Ｓ）−４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸（化合物ｎｋ５９、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＨ）（１．８０ｇ、６．８４ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（３．００ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（３．２８ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸  （Ｓ）−シアノメチル（化合物ｎｋ６０、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（１．５ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３０３  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）【０４２４】
４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸  （２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｎｋ６１）の合成
2017150732.tif 000192
【０４２５】
緩衝液Ａ（１２０ｍｌ）に、リン酸二水素  （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（３００ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）の水溶液（３．６ｍＬ）、４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸  （Ｓ）−シアノメチル（化合物ｎｋ６０、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ＯＣＨ２ＣＮ）（５０２ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．６ｍｌ）溶液を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ６１）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（１３６ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ９６８．５  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）【０４２６】
４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸  （２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｎｋ６２、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ｐＣｐＡ）の合成
2017150732.tif 000193
【０４２７】
前工程にて得られた４−（メチルスルホニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）ブタン酸  （２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｎｋ６１）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（７０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（１．０ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ６２、Ｐｅｎ−Ｍｅｔ（Ｏ２）−ｐＣｐＡ）（１２．７ｍｇ、７％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ８９８  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．２９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０４２８】
（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｎｋ６３、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）の合成
2017150732.tif 000194
【０４２９】
（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−３−（３−クロロフェニル）プロパン酸（ＦｍｏｃーＰｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（５．００ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）に２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（７６ｍＬ）を加えた後、反応液を２５℃で１６時間撹拌した。反応液を濃縮後、得られた残渣にジエチルエーテルを加え、混合物をろ過することで、粗生成物である（Ｓ）−２−アミノ−３−（３−クロロフェニル）プロパン酸（Ｈ―Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（２．２２ｇ）を得た。
水（２８ｍＬ）と１，４−ジオキサン（２８ｍＬ）の混合溶媒に、得られた粗生成物である（Ｓ）−２−アミノ−３−（３−クロロフェニル）プロパン酸（Ｈ―Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（２．２２ｇ）とペンタ−４−エン酸  ２，５−ジオキソピロリジン−１−イル  （２．６２ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（１．８６ｇ、２２．１ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を２５℃で１６時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで２回洗浄した後、水層を１Ｍの塩酸水溶液でｐＨ２になるまで調整し、ジクロロメタンで３回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮を行った。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．５ｇ、４５％、２工程）を得た。
窒素雰囲気下、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸（Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＨ）（１．５０ｇ、５．３２ｍｍｏｌ）およびＮ−エチル−イソプロピルプロパン−２−アミン（ＤＩＰＥＡ）（１．３７ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２４ｍｌ）に溶解し、２−ブロモアセトニトリル（２．５５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｎｋ６３、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（０．７６７ｇ、４５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ３２１  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）【０４３０】
３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸  （２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｎｋ６４）の合成
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【０４３１】
緩衝液Ａ（１２０ｍｌ）に、リン酸二水素  （（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−３−（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−３，４−ジヒドロキシテトラヒドロフラン−２−イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−２−イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（２００ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）の水溶液（３．０ｍＬ）、（Ｓ）−３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｎｋ６３、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ＯＣＨ２ＣＮ）（３５５ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．０ｍｌ）溶液を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ６４）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物（７５ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ９８６  （Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）【０４３２】
３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸  （２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−ヒドロキシ−２−（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｎｋ６５、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）の合成
2017150732.tif 000196
【０４３３】
前工程にて得られた３−（３−クロロフェニル）−２−（ペンタ−４−エンアミド）プロパン酸  （２Ｓ）−（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−２−（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−５−（４−アミノ−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−２−（（ホスホノオキシ）メチル）−４−（（テトラヒドロフラン−２−イル）オキシ）テトラヒドロフラン−３−イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）−５−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−ヒドロキシテトラヒドロフラン−３−イル（化合物ｎｋ６４）とＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルヘキサデカン−１−アミニウム  塩化物の混合物を（４０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（０．８０ｍＬ）を加えて室温で６時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製した後、再び逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）で精製することで、表題化合物（化合物ｎｋ６５、Ｐｅｎ−Ｐｈｅ（３−Ｃｌ）−ｐＣｐＡ）（７．５ｍｇ、６％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  ＝  ９１４  （Ｍ―Ｈ）―
保持時間：０．４７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）【０４３４】
１１−２．アシル化ｔＲＮＡの合成
特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１）に記載の手法でパニングに使用するアシル化ｔＲＮＡを調製した。使用したtRNA(CA欠損)の塩基配列を表２３に示した。表２４に示すＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ混合物を調製した。以降、翻訳で使用する際には、表２４示す最終濃度となるよう翻訳液を調製した。Ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡの調製は、ライゲーション反応後、脱保護を実施せずにフェノール抽出以降の作業を行った。表２５に示す三種類を個別に調整し、翻訳で使用する際にもいずれか一つを表に示す最終濃度で翻訳液に添加した。【０４３５】
【表２３】
2017150732.tif 000197
【０４３６】
【表２４】
2017150732.tif 000198
【０４３７】
【表２５】
2017150732.tif 000199
【０４３８】
１１−３．ペプチドライブラリをコードするランダム化された２本鎖ＤＮＡライブラリ
特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１）に記載の手法で、DNAライブラリを構築した。  TTT, TTG, CTA, ATT, GTT, CCG, ACT, GCT, TAC, CAT, CAG, TGG, CGG, AGT, AGG, GGTのいずれかのコドンが9回繰り返しで出現するもの用意した。【０４３９】
１１−４．ビオチン化標的タンパク質の調製
パニングに使用する標的タンパク質として、大腸菌で発現・精製したＧＴＰａｓｅ  ＫＲａｓ（ＫＲＡＳ）を用いた。非特許文献BMC biotechnology, 2008,8,41、および非特許文献Protein Science,1999,8,921-929の方法を用いてビオチン化タンパクを調製した。【０４４０】
１１−５．パニングに使用する翻訳液
パニングに使用した翻訳液は以下の組成で構成される。１ｍＭ  ＧＴＰ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．６，１００ｍＭ  酢酸カリウム，１０ｍＭ  酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ  ジチオスレイトール，０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），４μｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ  ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ  無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ  ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．２６μＭ  ＥＦ−Ｇ，２．７μＭ  ＩＦ１，０．４μＭ  ＩＦ２，１．５μＭ  ＩＦ３，４０μＭ  ＥＦ−Ｔｕ，４４μＭ  ＥＦ−Ｔｓ，１．２μＭ  リボソーム，２．７３μＭ  ＡｌａＲＳ，０．０９μＭ  ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ  ＩｌｅＲＳ，０．５μＭ  変異体ＰｈｅＲＳ０５（特許文献WO2016/148044），０．１６μＭ  ＰｒｏＲＳ，１μＭ  変異体ＳｅｒＲＳ３７（特許文献WO2016/148044），０．０９μＭ  ＴｈｒＲＳ，０．０１μＭ  ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ  ＴｙｒＲＳ，１μＭ  変異体ＶａｌＲＳ１３（特許文献WO2016/148044），０．１１μＭ  ＬｙｓＲＳ，０．３３μＭ  ＨｉｓＲＳ，３μＭ  in vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ  Ａｌａ１Ｂ，３μＭ  精製大腸菌ｔＲＮＡ  Ｈｉｓ  ＱＵＧ（非特許文献Nucleic Acids Res. 2010 Apr;38(6):e89.の手法に習い精製。），２５０μＭグリシン、２５０μＭイソロイシン、２５０μＭプロリン、２５０μＭスレオニン、２５０μＭトリプトファン、２５０μＭリジン、５ｍＭ  Ｎ−メチルバリン、５ｍＭ  Ｎ−メチルセリン、５ｍＭ  Ｎ−メチルアラニン、５ｍＭ  Ｎ−メチルフェニルアラニン、２５０μＭ  ３−フルオロチロシン、５ｍＭ  Ｎ−メチルヒスチジン、表２３に示すＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ混合物。さらにＩｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（表２４）のなかのいずれか一つを加えて調製した。【０４４１】
１１−６．パニングの実施
前述の二本鎖ＤＮＡライブラリと翻訳液を使用し、特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１）に倣ってパニングを実施した。【０４４２】
１１−７．濃縮配列の解析と標的への結合確認
パニング後のＤＮＡプールの塩基配列解析を行い、出現頻度の高かった配列について、特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１）に倣ってペプチドの固相合成を実施した。標的タンパク質に対する結合能をＢｉａｃｏｒｅで確認した。その結果複数の配列で標的に結合することが示された。
これらの標的に結合する配列は複数のアミノ酸類縁体を含む環状部を有するペプチドであった。以上の結果よりｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いて、ＧＴＰａｓｅ  ＫＲａｓ（ＫＲＡＳ）に対して結合するアミノ酸類縁体を複数含む環状ペプチドを取得できたことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０４４３】
本発明は、アミノ酸類縁体を複数含むドラックライクな環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体、および当該複合体のディスプレイライブラリーの提供において有用である。本発明を用いて構築されたディスプレイライブラリーを用いれば、従来の手法により得られるディスプレイライブラリーと比較して、高い効率でペプチドを合成することができる。また、本発明を用いて構築されたディスプレイライブラリーは、、従来の手法により得られるディスプレイライブラリーと比較して、より多彩な化合物を含むことが期待される。したがって、本発明の方法を利用することにより、より多彩なドラックライクなヒット化合物を取得する確率がさらに高まる。
【図１】
2017150732.tif 000217
【図２−１】
2017150732.tif 000218
【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
2017150732.tif 000221
【図３−２】
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【図４】
2017150732.tif 000223
【図５】
2017150732.tif 000224
【図６−１】
2017150732.tif 000225
【図６−２】
2017150732.tif 000226
【図６−３】
2017150732.tif 000227
【図６−４】
2017150732.tif 000228
【図６−５】
2017150732.tif 000229
【図６−６】
2017150732.tif 000230
【図７】
2017150732.tif 000231
【図８】
2017150732.tif 000232
【図９】
2017150732.tif 000233
【図１０−１】
2017150732.tif 000234
【図１０−２】
2017150732.tif 000235
【配列表】
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【国際調査報告】
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