(57)【要約】  ＰＣＲを行うことなく、マイクロＲＮＡをはじめとするターゲットを直接的に検出するための新たなターゲットの分析方法及びターゲット分析チップを提供する。  本発明のターゲットの分析方法は、試料中のターゲットと、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び担体に結合する担体結合用プローブとを接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程、前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、第２の結合体を形成する工程、前記担体を濃縮する工程、及び前記濃縮された担体に結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程を含むことを特徴とする。
2017126479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のターゲットと、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブとを液体溶媒中で接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程である第１反応工程、
前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、比重が前記液体溶媒より大きい第２の結合体を形成する工程である第２反応工程、
前記第２の結合体を含む前記液体溶媒を遠心し、前記第２の結合体を濃縮する工程である濃縮工程、並びに
前記濃縮された状態で、前記第２の結合体中に含まれる前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程である分析工程を含むことを特徴とする、ターゲットの分析方法。
【請求項２】
前記担体結合用プローブが、第１結合物質を含み、
前記担体が、前記第１結合物質と結合する第２結合物質を含み、
前記担体結合用プローブが、前記第１結合物質と前記第２結合物質との結合を介して前記担体と結合する、請求項１記載のターゲットの分析方法。
【請求項３】
前記ターゲットが、ターゲット核酸である、請求項１又は２記載のターゲットの分析方法。
【請求項４】
前記ターゲット核酸が、マイクロＲＮＡである、請求項３記載のターゲットの分析方法。
【請求項５】
前記標識プローブが、蛍光標識プローブである、請求項３又は４記載のターゲットの分析方法。
【請求項６】
前記蛍光標識プローブが、前記担体結合用プローブと比較して、前記ターゲット核酸の５’端側に結合する、請求項５記載のターゲットの分析方法。
【請求項７】
前記蛍光標識プローブが、前記ターゲット核酸の５’端から連続する塩基に結合し、
前記担体結合用プローブが、前記ターゲット核酸の３’端から連続する塩基に結合する、請求項６記載のターゲットの分析方法。
【請求項８】
前記蛍光標識プローブの蛍光標識が、前記蛍光標識プローブが前記ターゲット核酸に結合することにより、シグナル変化する物質である、請求項５から７までのいずれか一項に記載のターゲットの分析方法。
【請求項９】
前記蛍光標識が、ピレンを含む物質である、請求項８記載のターゲットの分析方法。
【請求項１０】
前記標識プローブが、さらにソラレンで修飾され、
紫外線を照射することにより、前記ソラレンと前記ターゲット核酸とを結合させる工程を含む、請求項３から９までのいずれか一項に記載のターゲットの分析方法。
【請求項１１】
反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有するターゲット分析チップを使用し、
前記反応部は、前記ターゲット、前記標識プローブ、前記担体結合用プローブ及び前記担体が結合反応する部位であり、
前記検出部は、前記第２の結合体が濃縮される部位であり、
前記流路は、前記第２の結合体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記第２の結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動でき、
前記反応部に前記ターゲットを含む試料が導入された後、前記反応部にて前記第１反応工程が行われ、
さらに前記反応部にて前記第２反応工程が行われ、
前記反応部から前記流路を介して前記検出部までに至る間で前記濃縮工程が行われ、
前記検出部において、前記分析工程が行われる、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のターゲットの分析方法。
【請求項１２】
前記検出部の高さが、１〜５００μｍである、請求項１１記載のターゲットの分析方法。
【請求項１３】
前記担体が、ビーズである、請求項１から１２までのいずれか一項に記載のターゲットの分析方法。
【請求項１４】
前記ビーズの直径が、１００ｎｍ〜４μｍである、請求項１３記載のターゲットの分析方法。
【請求項１５】
反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有し、
前記反応部は、試料中のターゲット、前記ターゲットに結合する標識プローブ、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブ並びに前記担体が結合反応する部位であり、
前記検出部は、前記ターゲット、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが結合した第１の結合体と、前記担体結合用プローブを介して前記担体と、が結合することにより形成された第２の結合体が濃縮される部位であり、
前記流路は、前記第２の結合体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、液体溶媒中において、比重が前記液体溶媒より大きい前記第２の結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする、ターゲットの分析チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲットの分析方法及びターゲット分析チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血中マイクロＲＮＡ等のＲＮＡと疾患との関連性が注目されており、前記ＲＮＡの検出を、疾患の早期発見等のため医療に利用することが試みられている。【０００３】
マイクロＲＮＡの定量方法としては、例えば、ターゲットのマイクロＲＮＡをポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）により特異的に増幅して検出する方法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、ＰＣＲが必須であるため、温度コントロールを行う装置、ＤＮＡへの逆転写等が必要であり、操作が煩雑となる。また、前記方法では、少量の試料に含まれるＲＮＡから、逆転写によりＤＮＡを得て、さらにＰＣＲを行うことで増幅させている。しかし、このような逆転写ＰＣＲは、前記試料中のＲＮＡの間接的な検出であって、直接的な検出ではないため、定量分析の場合、精度が十分ではないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許５１９２２２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、ＰＣＲを必須とすることなく、マイクロＲＮＡをはじめとするターゲットを直接的に検出するための新たなターゲットの分析方法及びターゲット分析チップの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記本発明の課題を解決するために、本発明のターゲットの分析方法は、試料中のターゲットと、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブとを液体溶媒中で接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程である第１反応工程、
前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、比重が前記液体溶媒より大きい第２の結合体を形成する工程である第２反応工程、
前記第２の結合体を含む前記液体溶媒を遠心し、前記第２の結合体を濃縮する工程である濃縮工程、並びに
前記濃縮された状態で、前記第２の結合体中に含まれる前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程である分析工程を含むことを特徴とする。【０００７】
本発明のターゲット分析チップは、反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有し、
前記反応部は、試料中のターゲット、前記ターゲットに結合する標識プローブ、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブ並びに前記担体が結合反応する部位であり、
前記検出部は、前記ターゲット、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが結合した第１の結合体と、前記担体結合用プローブを介して前記担体と、が結合することにより形成された第２の結合体が濃縮される部位であり、
前記流路は、前記第２の結合体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、液体溶媒中において、比重が前記液体溶媒より大きい前記第２の結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＰＣＲを使用することなく、試料中のターゲットを直接的に分析できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明のターゲット分析チップの一例を示す概略図であり、（Ａ）は、斜視図、（Ｂ）は、平面図、（Ｃ）は、（Ａ）のＩ−Ｉ方向の断面図である。
【図２】遠心装置の一例を示す断面図である。
【図３】遠心装置にターゲット分析チップを配置した状態の一例を示す概略図である。
【図４】本発明の実施例１におけるガラスボトムディッシュ上のアビジン修飾ビーズを測定した写真である。
【図５】本発明の実施例１における蛍光シグナルのスペクトルを示すグラフである。
【図６】（Ａ）は、実施例２における平均蛍光強度を示すグラフであり、（Ｂ）は、実施例２における吸光度を示すグラフである。
【図７】実施例３において使用した分析チップの内部の平面図である。
【図８】実施例３における総蛍光量の相対値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のターゲットの分析方法は、先述の通り、試料中のターゲットと、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブとを液体溶媒中で接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程である第１反応工程、
前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、比重が前記液体溶媒より大きい第２の結合体を形成する工程である第２反応工程、
前記第２の結合体を含む前記液体溶媒を遠心し、前記第２の結合体を濃縮する工程である濃縮工程、並びに
前記濃縮された状態で、前記第２の結合体中に含まれる前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程である分析工程を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明のターゲットの分析方法では、例えば、前記担体結合用プローブが、第１結合物質を含み、
前記担体が、前記第１結合物質と結合する第２結合物質を含み、
前記担体結合用プローブが、前記第１結合物質と前記第２結合物質との結合を介して前記担体と結合する。
【００１２】
本発明のターゲットの分析方法は、前記ターゲットが、ターゲット核酸である。
【００１３】
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記ターゲット核酸が、ターゲットＲＮＡである。前記ターゲットＲＮＡは、例えば、マイクロＲＮＡである。
【００１４】
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記標識プローブが、蛍光標識プローブである。
【００１５】
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記蛍光標識プローブが、前記担体結合用プローブと比較して、前記ターゲット核酸の５’端側に結合する。
【００１６】
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記蛍光標識プローブが、前記ターゲット核酸の５’端から連続する塩基に結合し、
前記担体結合用プローブが、前記ターゲット核酸の３’端から連続する塩基に結合する。
【００１７】
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記蛍光標識プローブの蛍光標識が、前記蛍光標識プローブが前記ターゲット核酸に結合することにより、シグナル変化する物質である。
【００１８】
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記蛍光標識が、ピレンを含む物質である。
【００１９】
本発明のターゲットの分析方法は、前記標識プローブが、さらにソラレンで修飾され、
紫外線を照射することにより、前記ソラレンと前記ターゲット核酸とを結合させる工程を含む。
【００２０】
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、波長４５０〜５１０ｎｍの蛍光シグナルを検出することにより、前記蛍光を検出する。
【００２１】
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記担体の直径が、１００μｍ未満、より望ましくは、１００ｎｍ〜４μｍである。
【００２２】
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有するターゲット分析チップを使用し、
前記反応部は、前記ターゲット、前記標識プローブ、前記担体結合用プローブ及び前記担体が結合反応する部位であり、
前記検出部は、前記第２の結合体が濃縮される部位であり、
前記流路は、前記第２の結合体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記第２の結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動でき、
前記反応部に前記ターゲットを含む試料が導入された後、前記反応部にて前記第１反応工程が行われ、
さらに前記反応部にて前記第２反応工程が行われ、
前記反応部から前記流路を介して前記検出部までに至る間で前記濃縮工程が行われ、
前記検出部において、前記分析工程が行われる。
【００２３】
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記検出部の高さが、１〜５００μｍである。
【００２４】
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記担体が、ビーズである。また、前記担体が、例えば、シリカ製である。
【００２５】
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記ビーズの直径が、１００ｎｍ〜４μｍである。
【００２６】
＜ターゲット分析方法＞
本発明のターゲット分析方法（以下、「分析方法」ともいう。）は、前述のように、試料中のターゲットと、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブとを液体溶媒中で接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程（第１反応工程）、前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、比重が前記液体溶媒より大きい第２の結合体を形成する工程（第２反応工程）、前記第２の結合体を含む前記液体溶媒を遠心し、前記第２の結合体を濃縮する工程（濃縮工程）、並びに前記濃縮された状態で、前記第２の結合体中に含まれる前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程（分析工程）を含むことを特徴とする。本発明の分析方法は、前記第１反応工程、前記第２反応工程、前記濃縮工程及び前記分析工程を含むことが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の分析方法は、前記第１反応工程及び前記第２反応工程において、前記ターゲット、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブの第１の結合体を、前記担体結合用プローブを介して前記担体に濃縮でき、かつ前記濃縮工程において、前記担体を濃縮できる。このため、本発明の分析方法は、例えば、前記分析工程において、前記ターゲットを含む第１の結合体が濃縮して結合された担体（第２の結合体）を高濃度の状態で分析できる。したがって、本発明の分析方法によれば、例えば、優れた感度及び精度を実現でき、例えば、供する試料が微量であっても、分析可能である。また、本発明の分析方法は、例えば、前記担体を高濃度の状態で分析できるため、前記ターゲットに結合していない前記標識プローブによる分析への影響を避けることができる。このため、本発明の分析方法は、例えば、バックグラウンドが低減されている。さらに、本発明の分析方法は、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとが、分散された状態で結合反応を行うことができ、さらに、得られた第１の結合体中の前記担体結合用プローブを介して、前記第１の結合体と前記担体とを結合させることができる。このため、本発明の分析方法は、例えば、第１反応工程において、反応液中に分散された前記標識プローブと前記ターゲットとの結合反応が起こる確率が高くなるため、前記標識プローブを固定化した前記担体を使用して前記ターゲットを分析する方法、又は前記担体結合用プローブと前記担体とが先に結合した結合体を使用して前記ターゲットを分析する方法と比較して、結合反応の時間をより短縮でき、また、感度をより向上できる。
【００２７】
本発明の分析方法は、例えば、前記試料中のターゲットの有無を分析する定性分析であってもよいし、前記試料中のターゲットの程度を分析する定量分析であってもよい。本発明のターゲットの分析方法は、ＰＣＲ工程を含まない。
【００２８】
本発明の分析試料において、前記試料は、液体試料である。前記液体試料は、例えば、生体由来の検体が挙げられ、また、前記検体の希釈液、懸濁液等でもよい。前記検体は、例えば、血液、尿、胃液、喀痰、羊水、腹膜液等の体液、大腸、肺等の組織、口腔内細胞、生殖細胞、爪、毛等の細胞等が挙げられる。前記血液は、例えば、全血、血漿、血清、溶血液等が挙げられる。前記液体試料は、例えば、前処理したものを使用してもよい。前記前処理は、特に制限されず、例えば、前記検体に含まれる細胞からターゲット（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡの核酸等）を放出させる処理等が挙げられる。本発明の分析方法において、前記試料は、例えば、ターゲットを含む試料でもよいし、ターゲットを含まない試料でもよいし、ターゲットを含むか不明の試料であってもよい。
【００２９】
本発明の分析方法において、前記ターゲットの種類は、特に制限されず、例えば、ターゲット核酸等が挙げられる。前記ターゲット核酸は、例えば、ターゲットＲＮＡ、ターゲットＤＮＡ等が挙げられる。前記ターゲットＲＮＡは、特に制限されず、例えば、マイクロＲＮＡ、ウィルス由来ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ等が挙げられる。前記ターゲットＤＮＡは、特に制限されず、例えば、ゲノムＤＮＡ又はその断片、ｃＤＮＡ、血中遊離ＤＮＡ、血中循環腫瘍細胞に含まれるＤＮＡ等が挙げられる。
【００３０】
前記標識プローブは、標識物質により修飾（以下、「標識」ともいう。）されたプローブである。前記プローブは、例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡが挙げられ、好ましくは、ＲＮＡである。前記ＲＮＡは、例えば、非修飾ＲＮＡでもよいし、修飾ＲＮＡでもよいし、両者を含んでもよい。前記修飾ＲＮＡは、例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ等が挙げられる。また、前記ＤＮＡは、例えば、修飾ＤＮＡでもよいし、非修飾ＤＮＡでもよいし、両者を含んでもよい。前記プローブは、例えば、人工核酸モノマーを含んでもよい。前記人工核酸モノマーは、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等が挙げられる。前記標識物質による前記プローブの修飾方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記標識プローブの配列は、例えば、分析対象のターゲットに基づいて、適宜設計できる。前記ターゲットが前記ターゲット核酸の場合、前記標識プローブの配列は、例えば、前記ターゲット核酸に部分的又は完全に相補的な配列が挙げられる。前記標識プローブの標識位置は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブの３’末端の塩基でもよいし、５’末端の塩基でもよいし、それ以外の塩基でもよい。
【００３１】
前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光標識物質、放射性標識物質等が挙げられる。前記蛍光標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光団等の蛍光物質等が挙げられる。前記蛍光標識物質は、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等が挙げられ、市販の蛍光標識物質は、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（登録商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３及びＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラー・プローブ社製）等が挙げられる。
【００３２】
前記標識プローブが前記蛍光標識物質で標識された蛍光標識プローブの場合、前記蛍光標識プローブの蛍光標識物質は、例えば、前記蛍光標識プローブが前記ターゲット（例えば、ターゲット核酸）に結合することにより、シグナル変化する物質であることが好ましい。前記シグナルは、例えば、蛍光シグナルである。このような蛍光標識物質であれば、例えば、前記ターゲットが結合した前記蛍光標識プローブと、前記ターゲットが未結合の前記蛍光標識プローブとを分離する必要がなく、分析精度をさらに向上でき、また、さらに簡便である。
【００３３】
前記蛍光標識物質の具体例としては、例えば、ピレンを含む物質（以下、「ピレン含有物質」ともいう）が挙げられる。前記蛍光標識物質は、例えば、ピレンを含むものでもよいし、ピレンそのものでもよい。前記蛍光標識物質がピレン含有物質の場合、前記蛍光標識プローブの設計は、例えば、日本国特許第４２３８３８１号の記載を援用できる。前記ピレン含有物質は、例えば、ウリジン残基及び／又はシチジン残基を修飾することが好ましく、具体的には、ウリジン残基の２’位の水酸基及び／又はシチジン残基の２’位の水酸基に共有結合していることが好ましい。前記蛍光標識プローブは、例えば、前記ピレン含有物質が共有結合したウリジンを含むＲＮＡ、又は前記ピレン含有物質が共有結合したウリジン及び／又はシチジンを含むＤＮＡであることが好ましい。前記ピレン含有物質で修飾した前記蛍光標識プローブは、例えば、前記ターゲット核酸（例えば、ターゲットＲＮＡ）と結合し、二重鎖構造を形成することで蛍光を発する。このため、前記蛍光のシグナルを検出することで、前記ターゲット核酸の分析が可能である。前記蛍光は、例えば、紫外光照射で励起することで、発光させることができる。前記照射光（励起光）の波長は、例えば、３２５〜３５０ｎｍ（望ましくは、３４０ｎｍ）であり、蛍光の検出波長は、例えば、４５０〜５１０ｎｍ（望ましくは、４８０ｎｍ）である。
【００３４】
前記蛍光標識プローブは、例えば、さらにソラレンで修飾されていることが好ましい。前記蛍光標識プローブがソラレンを有する場合、例えば、前記蛍光標識プローブと前記ターゲット核酸との二重鎖に紫外光を照射すると、前記二重鎖において、前記蛍光標識プローブのソラレンが、前記ターゲット核酸におけるウラシル残基と共有結合する。このため、前記ターゲット核酸と前記蛍光標識プローブとの二重鎖結合を、より安定化でき、例えば、前記分析チップに対して、後述するような様々な処理を施している間においても、前記蛍光標識プローブから前記ターゲット核酸が解離することを十分に防止でき、また、感度もより向上できる。
【００３５】
前記標識プローブの長さは、特に制限されず、例えば、前記ターゲットの種類に応じて、適宜決定できる。前記ターゲットが前記ターゲット核酸の場合、前記標識プローブの長さは、例えば、前記ターゲット核酸の長さに応じて適宜設定できる。前記ターゲット核酸がマイクロＲＮＡの場合、前記標識プローブの長さは、例えば、７〜１５塩基長である。
【００３６】
本発明の分析方法において、前記担体結合用プローブは、前記担体に結合可能な標識（結合用標識）により修飾されたプローブである。前記プローブは、例えばＲＮＡ又はＤＮＡが挙げられる。前記ＲＮＡは、例えば、非修飾ＲＮＡでもよいし、修飾ＲＮＡでもよいし、両者を含んでもよい。前記修飾ＲＮＡは、例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ等が挙げられる。また、前記ＤＮＡは、例えば、修飾ＤＮＡでもよいし、非修飾ＤＮＡでもよいし、両者を含んでもよい。前記担体結合用プローブは、例えば、前記人工核酸モノマーを含んでもよい。前記結合用標識による前記担体結合用プローブの修飾方法は、特に制限されず、前記結合用標識の種類に応じて、公知の方法が採用できる。前記担体結合用プローブの配列は、例えば、分析対象のターゲットに基づいて、適宜設計できる。前記ターゲットが前記ターゲット核酸の場合、前記担体結合用プローブの配列は、例えば、前記ターゲット核酸に部分的又は完全に相補的な配列が挙げられる。前記担体結合用プローブにおける前記結合用標識の数は、特に制限されず、前記結合用標識の種類に応じて、適宜設定できる。
【００３７】
前記結合用標識は、例えば、前記担体に特異的に結合する標識である。このような標識であれば、例えば、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとが、分散された状態で結合反応を行うことができ、さらに、得られた第１の結合体中の前記担体結合用プローブを介して、前記第１の結合体と前記担体とを結合させることができる。このため、本発明の分析方法は、例えば、前記標識プローブが固定化された前記担体を使用して前記ターゲットを分析する方法、又は前記担体結合用プローブと前記担体とを先に結合反応させた第１の結合体を使用して前記ターゲットを分析する方法と比較して、結合反応時に、反応系（例えば、反応液）に分散された前記標識プローブと前記ターゲットとの結合反応が起こる確率が高くなるため、結合反応の時間をより短縮でき、また、感度をより向上できる。また、前記標識プローブを固定化した前記担体を使用して前記ターゲットを分析する方法は、例えば、前記ターゲットが存在しない場合においても標識が検出されるため、バックグラウンドが高い。しかしながら、本発明の分析方法は、例えば、前記第１の結合体と結合した前記担体において、前記標識の検出が可能である。このため、本発明の分析方法は、例えば、前記標識プローブが固定化された前記担体を使用して前記ターゲットを分析する方法と比較して、バックグラウンドが低い。
【００３８】
前記結合用標識の具体例としては、例えば、前記担体に結合可能な官能基、前記担体又は前記担体の標識に特異的に結合する物質等が挙げられる。前記担体結合用プローブにおける標識位置は、特に制限されず、例えば、前記プローブの５’末端の塩基、前記プローブの３’末端の塩基、それ以外の塩基等が挙げられ、好ましくは、前記プローブの５’末端の塩基である。前記担体結合用プローブにおける前記結合用標識の数は、特に制限されず、前記結合用標識の種類に応じて設定できる。
【００３９】
前記担体結合用プローブの長さは、特に制限されず、例えば、前記ターゲットの種類に応じて、適宜決定できる。前記ターゲットが前記ターゲット核酸の場合、前記担体結合用プローブの長さは、例えば、前記ターゲット核酸の長さに応じて適宜設定できる。前記ターゲット核酸がマイクロＲＮＡの場合、前記担体結合用プローブの長さは、例えば、７〜２５塩基長、望ましくは７〜１５塩基長である。
【００４０】
前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブにおける前記ターゲットと結合する結合塩基数は、特に制限されず、例えば、前記ターゲットに応じて、適宜設定できる。前記ターゲットが前記ターゲット核酸の場合、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブの結合塩基数は、例えば、前記ターゲット核酸の長さに応じて、適宜設定できる。前記標識プローブの結合塩基数は、例えば、７〜１５塩基である。前記担体結合用プローブの結合塩基数は、例えば、７〜２５塩基、望ましくは７〜１５塩基である。
【００４１】
前記標識プローブの結合塩基数は、例えば、前記担体結合用プローブの結合塩基数より少なくてもよいし、多くてもよいし、同じでもよい。
【００４２】
本発明の分析方法において、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブの前記ターゲットにおける結合位置は、特に制限されず、例えば、異なる位置である。前記ターゲットが前記ターゲット核酸の場合、前記標識プローブは、例えば、前記担体結合用プローブと比較して、前記ターゲット核酸の５’端側に結合してもよいし、前記ターゲット核酸の３’端側に結合してもよいが、好ましくは、５’端側である。具体例として、前記標識プローブが、前記ターゲット核酸の５’端から連続する塩基に結合し、前記担体結合用プローブが、前記ターゲット核酸の３’端から連続する塩基に結合することが好ましい。
【００４３】
前記ターゲットが前記ターゲット核酸の場合、前記標識プローブは、例えば、前記ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列からなるプローブでもよいし、前記ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むプローブでもよい。後者の場合、前記標識プローブは、例えば、付加配列及び／又はリンカーを含む。前記標識プローブが付加配列を含む場合、例えば、前記標識プローブの付加配列が、前記標識物質により標識されてもよい。
【００４４】
前記ターゲットが前記ターゲット核酸の場合、前記担体結合用プローブは、例えば、前記ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列からなるプローブでもよいし、前記ターゲット核酸に対して相補的な塩基配列を含むプローブでもよい。後者の場合、前記担体結合用プローブは、例えば、付加配列及び／又はリンカーを含んでもよい。前記担体結合用プローブが付加配列を含む場合、例えば、前記担体結合用プローブの付加配列が前記結合用標識により標識されてもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、炭素数６〜１６の直鎖又は分枝アルキル鎖、アミド結合を含むリンカー、ポリエチレンオキシ構造を含むリンカー等が挙げられ、具体例として、アミド結合を含む炭素数６のアルキル鎖からなるリンカーが挙げられる。前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが付加配列及び／又はリンカーを有する場合、両者の付加配列及び／又はリンカーは、例えば、同じでもよいし、異なってもよく、また、その長さは、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。
【００４５】
前記付加配列の塩基配列は、特に制限されない。前記付加配列を含む場合、前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１〜１０塩基長である。前記付加配列は、例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡが挙げられる。
【００４６】
本発明の分析方法において、前記担体は、例えば、前記担体結合用プローブに結合可能な標識（担体用標識）により修飾された担体である。前記担体は、特に制限されず、例えば、比重が１より大きく、かつ光透過性を有する素材で形成された担体が挙げられる。具体例として、前記担体は、例えば、シリカ製担体、シリカゲル製担体、アガロース製担体、ガラス（例えば、ホウケイ酸ガラス、ライムガラス）製担体、ポリスチレン製担体、アクリル樹脂担体、ポリビニルアルコール樹脂製担体、ポリカーボネート製担体等が挙げられる。前記担体の大きさは、特に制限されない。前記担体の形状は、特に制限されず、例えば、楕円、真円等の球状が挙げられ、具体例として、球状のビーズが挙げられる。前記担体が前記ビーズの場合、その直径は、下限が、例えば、０．１μｍ（１００ｎｍ）、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、又は３００ｎｍであり、上限が、例えば、１００μｍ未満であって、より望ましくは１０μｍ、５μｍ、４μｍ、１μｍ、８００ｎｍ、又は４００ｎｍであり、その範囲は、例えば、１００ｎｍ〜４μｍ、１００〜８００ｎｍ、２００ｎｍ〜８００ｎｍ、又は２５０〜４００ｎｍである。ここで、光透過性を有する素材とは前記検出部で濃縮された際にターゲットを分析する際に、十分な光透過性を有する素材をいう。
【００４７】
前記担体用標識による前記担体の修飾方法は、特に制限されず、前記担体用標識の種類に応じて、公知の方法が採用できる。前記担体用標識は、例えば、前記担体結合用プローブに特異的に結合する標識である。前記担体用標識の具体例としては、前記担体結合用プローブに結合可能な官能基、前記担体結合用プローブ又は前記結合用標識に特異的に結合する物質等が挙げられる。前記担体における前記担体用標識の数は、特に制限されず、前記担体用標識の種類に応じて、適宜設定できる。前記担体用標識と前記担体との結合は、直接的な結合でもよいし、間接的な結合でもよい。後者の場合、前記担体用標識は、例えば、前記リンカーを介して前記担体と結合する。
【００４８】
前記担体結合用プローブと前記担体との結合は、例えば、直接的な結合でもよいし、間接的な結合でもよい。前者の場合、前記結合は、例えば、前記担体結合用プローブの官能基と前記担体の官能基との反応による結合等が挙げられる。後者の場合、前記結合は、例えば、前記担体結合用プローブの前記結合用標識を介した前記担体との結合、前記担体の前記担体用標識を介した前記担体結合用プローブとの結合、前記担体結合用プローブの前記結合用標識と前記担体の担体用標識との結合等が挙げられる。
【００４９】
本発明の分析方法において、前記担体結合用プローブが、第１結合物質を含み、前記担体が、前記第１結合物質と結合する第２結合物質を含み、前記担体結合用プローブが、前記第１結合物質と前記第２結合物質との結合を介して前記担体と結合することが好ましい。前記第１結合物質と前記第２結合物質とは、少なくとも一方が他方に結合する物質の組合せであればよく、例えば、前記第１結合物質が、前記第２結合物質に結合してもよいし、前記第２結合物質が前記第１結合物質に結合してもよい。前記第１結合物質と前記第２結合物質との組合せは、特に制限されず、例えば、ビオチンとアビジンとの組合せ、抗原と前記抗原特異的な抗体との組合せ等が挙げられる。また、前記第１結合物質と前記第２結合物質とは、例えば、前記組合せの例示において、逆の組合せとしてもよい。
【００５０】
本発明の分析方法において、以下の各工程は、例えば、反応系で行なってもよい。前記反応系は、液体系であり、前記反応系が含む試薬に応じて、例えば、前記試料、前記標識プローブ、及び前記担体結合用プローブを含む第１反応系、前記試料、前記標識プローブ、前記担体結合用プローブ及び前記担体を含む第２反応系等ということもできる。
【００５１】
前記第１反応工程は、前述のように、前記試料中のターゲットと、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び担体に結合する担体結合用プローブとを液体溶媒中で接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程である。前記接触の順序は、特に制限されず、例えば、前記試料に、前記標識プローブ、及び前記担体結合用プローブを添加し、接触させる。そして、前記接触後の混合物（第１反応系）を、例えば、混合、撹拌することにより、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合させる。前記混合は、例えば、転倒混和、振動等の公知の方法が挙げられる。前記撹拌は、例えば、撹拌素子を用いた方法が挙げられる。前記第１反応工程において、前記試料と、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとの接触条件（例えば、温度、時間等）は、特に制限されない。前記接触温度は、例えば、室温（２５℃前後）が挙げられる。
【００５２】
前記第１反応工程において、前記標識プローブの数は、特に制限されず、例えば、前記試料中のターゲットの数に応じて、適宜決定できる。前記標識プローブの数は、例えば、前記ターゲットの数以上である。前記第１反応系における標識プローブの濃度は、特に制限されず、例えば、０．０１〜１ｎｍｏｌ／Ｌである。前記標識プローブの濃度は、例えば、１種類の標識プローブの濃度でもよいし、２種類以上の標識プローブの濃度の合計の濃度でもよい（以下、同様）。
【００５３】
前記第１反応工程において、前記担体結合用プローブの数は、特に制限されず、例えば、前記担体用標識の数に応じて適宜決定できる。前記担体結合用プローブの数は、例えば、前記担体用標識の数以下である。前記第１反応系における前記担体結合用プローブの濃度は、例えば、０．１〜１００ｐｍｏｌ／Ｌである。前記担体結合用プローブの濃度は、例えば、１種類の担体結合用プローブの濃度でもよいし、２種類以上の担体結合用プローブの濃度の合計の濃度でもよい（以下、同様）。
【００５４】
次に、前記第２反応工程は、前述のように、前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、比重が前記液体溶媒より大きい第２の結合体を形成する工程である。前記接触の順序は、特に制限されず、例えば、前記第１の結合体を含む前記第１反応系に、前記担体を添加し、接触させる。そして、前記接触後の混合物（第２反応系）を、例えば、前記第１反応工程と同様に、混合、撹拌することにより、前記第１の結合体中の前記担体結合用プローブを介して、前記第１の結合体と前記担体とを結合させる。前記第２反応工程における混合、撹拌、及び接触条件（例えば、温度、時間等）は、例えば、前記第１反応工程の説明を援用できる。
【００５５】
前記第２反応工程において、前記担体の数は、特に制限されない。前記第２反応系において、前記担体の体積（Ｃ）と、前記第２反応系の体積（Ｒ）との体積比の値（Ｃ／Ｒ）は、例えば、１／１０２〜１／１０５、望ましくは１／１０３前後である。前記担体の体積は、例えば、１種類の担体の体積でもよいし、２種類以上の担体の体積の合計の体積でもよい（以下、同様）。
【００５６】
前記濃縮工程は、前述のように、前記第２の結合体を含む前記液体溶媒を遠心し、前記第２の結合体を濃縮する工程である。前記濃縮工程において、濃縮される担体は、例えば、前記第２の結合体を形成している担体でもよいし、前記第２の結合体を形成している担体及び前記第２の結合体を形成していない担体の混合物でもよい。
【００５７】
次に、前記分析工程は、前記濃縮された状態で、前記第２の結合体中に含まれる前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程である。前記標識の検出は、特に制限されず、例えば、前記標識の種類に応じて、適宜決定できる。具体例として、前記標識が蛍光標識物質の場合、前記標識の検出は、例えば、前記蛍光標識物質に起因する蛍光シグナルの検出である。前記蛍光シグナルの検出条件は、例えば、前記蛍光標識物質の種類に応じて、適宜設定できる。前記標識プローブが前記蛍光標識プローブの場合、前記蛍光標識プローブの前記蛍光標識は、例えば、前述のように、前記蛍光標識プローブが前記ターゲット核酸に結合することにより、シグナル変化する物質であることが好ましい。この場合、前記分析工程では、例えば、前記蛍光標識のシグナル変化を検出する。具体例として、前記蛍光標識が、前記ピレン含有物質の場合、前記検出部に紫外光を照射して、ピレンに起因する蛍光シグナルを検出する。前記ピレンに起因する蛍光シグナルの検出条件は、例えば、前述の通りである。
【００５８】
本発明の分析方法は、例えば、ターゲット分析チップ（以下、「分析チップ」ともいう。）を使用して実施してもよい。前記分析チップは、例えば、前記第１反応工程、前記第２反応工程、前記濃縮工程及び前記分析工程を実施できる分析チップであればよく、その構成は、特に制限されない。前記分析チップは、例えば、反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有し、前記反応部は、試料中のターゲット、前記ターゲットに結合する標識プローブ、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブ並びに前記担体が結合反応する部位であり、前記検出部は、前記ターゲット、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが結合した第１の結合体と、前記担体結合用プローブを介して前記担体と、が結合することにより形成された第２の結合体が濃縮される部位であり、前記流路は、前記第２の結合体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、前記移動制御手段により、液体溶媒中において、比重が前記液体溶媒より大きい前記第２の結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できる、分析チップが挙げられる。本発明の分析方法は、例えば、前記分析チップを使用し、実施することにより、簡便に実施することができる。また、前記分析チップは、例えば、前記反応工程における結合反応、及び前記濃縮工程における濃縮を効果的に実施可能である。このため、本発明の分析方法は、前記分析チップを使用し、実施することにより、より優れた感度及び精度を実現できる。前記分析チップの説明は、例えば、後述する本発明のターゲット分析チップの説明を援用できる。
【００５９】
前記分析チップを使用する場合、前記分析方法は、例えば、前記反応部に前記試料を導入する工程（試料導入工程）、前記試料中のターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程（第１反応工程）、前記反応部に前記担体を導入する工程（担体導入工程）、前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、第２の結合体を形成する工程（第２反応工程）、前記反応部における第２の結合体を、前記疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）によって、前記検出部に移動させ、前記担体を濃縮する工程（濃縮工程）、及び、前記検出部において、前記濃縮された担体に結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程（分析工程）を含む。
【００６０】
前記試料導入工程は、例えば、前述のように、前記反応部に、前記試料を導入する工程である。前記試料の導入方法は、特に制限されない。前記試料は、例えば、前記反応部の開口から導入する。前記反応部において、後述するように、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが固定化されている場合、前記試料が導入されることによって、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブの固定化が解除され遊離する。また、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが固定化されていない場合、前記試料導入工程と同時に、あるいはその前後に、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブを前記反応部に導入する工程を設けることとしてもよい。
【００６１】
前記第１反応工程は、例えば、前記試料中のターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程である。この際、前記反応部において、前記試料と、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとの混合物を、撹拌することが好ましい。前記撹拌の方法は、特に制限されない。
【００６２】
前記撹拌方法としては、例えば、前記撹拌素子を用いた方法が挙げられる。この場合、前記分析チップの前記反応部が、さらに、前記撹拌素子を有し、前記撹拌素子によって、前記反応部において前記混合物を撹拌することが好ましい。前記撹拌素子を用いた撹拌は、例えば、前記分析チップの外部に磁石を配置し、前記磁石により前記撹拌素子を動かすことで行える。前記撹拌素子は、例えば、自転させてもよいし、公転させてもよいし、ランダムに動かしてもよい。
【００６３】
また、前記撹拌方法としては、例えば、遠心装置を利用する方法が挙げられる。前記分析チップは、後述するように、前記反応部から前記検出部への前記担体の移動に遠心力を利用することから、例えば、遠心装置にセットして使用できる。このため、前記反応工程において、前記分析チップを遠心することで撹拌することもできる。前記遠心は、例えば、同一方向の遠心でもよいし、交互に逆回転させる遠心でもよい。
【００６４】
前記担体導入工程は、例えば、前記反応部に前記担体を導入する工程である。前記担体の導入方法は、特に制限されない。前記担体は、例えば、前記反応部の開口から導入する。
【００６５】
なお、前記担体をあらかじめ前記反応部に固定化しておくことも可能である。その場合、この担体導入工程は省略できる。
【００６６】
前記第２反応工程は、例えば、前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、第２の結合体を形成する工程である。この際、前記反応部において、前記第１の結合体と前記担体との混合物を、撹拌することが好ましい。前記撹拌の方法は、例えば、前述の撹拌方法が挙げられる。
【００６７】
次に、前記濃縮工程は、例えば、前記反応部における前記第２の結合体を、前記疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）によって、前記検出部に移動させ、前記担体を濃縮する工程である。前記濃縮工程において、濃縮される担体は、前述のように、例えば、前記第２の結合体を形成している担体でもよいし、前記第２の結合体を形成している担体及び前記第２の結合体を形成していない担体の混合物でもよい。
【００６８】
前記抵抗力（Ｒ）は、例えば、前記流路の内壁の疎水性の程度に応じて、適宜算出できる。具体例として、前記抵抗力（Ｒ）は、例えば、前記試料、前記試薬及び前記担体の混合物の表面張力、前記流路の内壁と、前記試料、前記試薬及び前記担体の混合物との接触角、前記分析チップの流路の幅及び高さ等から算出することができ、具体的には、下記式（１）で表される。前記流路の内壁と、前記試料、前記試薬及び前記担体の混合物との接触角（θ）が９０°以上の場合、前記抵抗力（Ｒ）は、例えば、下記式（１）により好適に算出できる。
【００６９】
Ｒ＝−２ｗｈγｃｏｓθ（１／ｗ＋１／ｈ）    ・・・（１）
Ｒ：抵抗力（Ｎ）
γ：試料、試薬及び担体の混合物の表面張力（Ｎ／ｍ）
θ：流路の内壁と、試料、試薬及び担体の混合物との接触角
ｗ：流路の幅（ｍ）
ｈ：流路の高さ（ｍ）
【００７０】
前記遠心力（Ｃ）は、特に制限されず、例えば、前記第２の結合体を前記検出部に移動できればよい。本発明の分析方法において、前記試料、前記試薬及び前記担体の混合物は、例えば、前記遠心力（Ｃ）によって、前記流路に導入される。さらに、前記遠心力（Ｃ）によって、前記混合物における前記担体（例えば、第２の結合体）が、例えば、前記分析チップの検出部における前記流路の反対端側に集積する。このとき、前記担体（第２の結合体）が前記検出部に集積するのに要する時間（Δｔ）は、例えば、前記混合物の粘度及び密度、前記担体の密度、前記担体の半径、遠心時の回転速度、回転半径の始点及び終点等から算出することができ、具体的には、下記式（２）で表される。下記式（２）によれば、例えば、所望の遠心時間内に前記担体を前記検出部に集積をする場合の担体の密度及び半径、遠心力（Ｃ）、すなわち、回転半径及び回転速度（回転の角速度）を算出（推定）することができる。
【００７１】
Δｔ＝［１８μ／(４ω２Ｒ２（ρｓ−ρｌ））］ｌｎ（ｒ２／ｒ１）  ・・・（２）
Δｔ：回転半径の始点ｒ１から回転半径の終点ｒ２に担体が移動するのに要する時間（ｓｅｃ）
μ：試料、試薬及び担体の混合物の粘度（Ｐａ・ｓｅｃ）
ρｌ：試料、試薬及び担体の混合物の密度（ｋｇ／ｍ３）
ρｓ：担体の密度（ｋｇ／ｍ３）
Ｒ：担体の半径（ｍ）
ω：回転の角速度（ｒａｄ／ｓｅｃ）
ｒ１：回転半径の始点（遠心時の軸から反応部までの最短距離）（ｍ）
ｒ２：回転半径の終点（軸から検出部までの最長距離）（ｍ）
【００７２】
本発明の分析方法において、前記分析チップへの遠心力は、例えば、遠心装置を使用することにより付与できる。この場合、前記分析チップは、例えば、さらに、前記遠心装置への配置部位を有することが好ましい。そして、例えば、前記配置部位において、前記分析チップを前記遠心装置に配置し、前記遠心装置により、前記分析チップに遠心力をかけることができる。
【００７３】
そして、前記分析工程は、前述のように、例えば、前記検出部において、前記濃縮された担体に結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程である。前記標識の検出は、例えば、前述のように実施できる。
【００７４】
＜ターゲット分析チップ＞
本発明のターゲット分析チップ（以下、「分析チップ」ともいう。）は、前述のように、反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有し、前記反応部は、試料中のターゲット、前記ターゲットに結合する標識プローブ、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブ並びに前記担体が結合反応する部位であり、前記検出部は、前記ターゲット、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが結合した第１の結合体と、前記担体結合用プローブを介して前記担体と、が結合することにより形成された第２の結合体が濃縮される部位であり、前記流路は、前記第２の結合体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、前記移動制御手段により、液体溶媒中において、比重が前記液体溶媒より大きい前記第２の結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする。
【００７５】
本発明の分析チップは、前記流路が、前記移動制御手段として前記疎水性の内壁を有することで、前記反応部から前記検出部への前記担体の移動を制御できることにより、例えば、前記反応部から前記検出部への自発的な毛管現象が発生せず、所定の遠心力によって、毛管現象が発生する。このため、本発明の分析チップは、例えば、前記反応部から前記検出部方向への自発的な毛管現象が発生せず、所定の遠心力によって、毛管現象が発生するチップということもできる。本発明の分析チップにおいて、前記反応部から前記検出部への移動を制御される担体は、例えば、前記第２の結合体を形成している担体及び前記第２の結合体を形成していない担体の一方であってもよいし、混合物であってもよく、好ましくは、混合物である。本発明の分析チップは、前記本発明の分析方法に使用するチップであり、前述の本発明の分析方法の説明を援用できる。
【００７６】
本発明のターゲット分析チップにおいて、前記担体は、前記基板の前記反応部にあらかじめ固定化されていてもよいし、また、別個に包装され前記基板と同梱されていてもよい。後者の場合、本発明のターゲット分析チップは、例えば、ターゲット分析キットということもできる。
【００７７】
本発明の分析チップにおいて、前記反応部及び前記検出部は、例えば、一方向に向いて順に配置されている。本発明の分析チップにおいて、この分析チップを水平面上に載置した状態において、同水平面に平行で、かつ、前記反応部から前記検出部に向かう方向を、「長手方向」、又は前記試料及び前記担体の「移動方向」ともいい、同水平面に平行で、かつ、前記長手方向に対する垂直方向を、「幅方向」ともいい、また、同水平面に対して垂直方向（前記長手方向及び前記幅方向に対して垂直方向）を、「厚み方向」又は「深さ方向」ともいう。本発明の分析チップにおいて、前記担体を、以下、「分析用担体」ともいう。
【００７８】
本発明の分析チップにおいて、前記基板は、例えば、下基板と上基板とを含んでもよい。この場合、例えば、前記下基板と前記上基板とを積層することで、前記反応部、前記流路及び前記検出部が形成されることが好ましい。
【００７９】
第１の具体例として、例えば、前記下基板の上表面（前記上基板との積層表面）が、平らであり、前記上基板が、前記反応部へ試料を導入する開口となる貫通孔を有し、前記上基板の下表面（前記下基板との積層表面）が、前記反応部、前記流路及び前記検出部となる凹部を有し、前記貫通孔と前記凹部とがつながっている形態が挙げられる。この場合、前記下基板と前記上基板とを積層することで、前記上基板の貫通孔と前記下基板の上表面とにより、前記開口が形成され、前記上基板の凹部と前記下基板の上表面とにより、前記反応部、前記流路及び前記検出部が連通して形成される。
【００８０】
第２の具体例として、例えば、前記上基板の下表面（前記下基板との積層表面）が、平らであり、前記上基板が、前記反応部へ試料を導入する開口となる貫通孔を有し、前記下基板の上表面（前記上基板との積層表面）が、前記反応部、前記流路及び前記検出部となる凹部を有し、前記貫通孔と前記凹部のうち前記反応部に当たる部分とが同一の平面位置となっている形態が挙げられる。この場合、前記下基板と前記上基板とを積層することで、前記上基板の貫通孔により前記開口が形成され、前記下基板の凹部と、前記上基板の貫通孔及び下表面とにより、前記反応部、前記流路及び前記検出部が連通して形成される。
【００８１】
本発明の分析チップにおいて、前記反応部の大きさ及び形状は、特に制限されない。
【００８２】
前記反応部は、例えば、その底面が、前記下基板の上表面によって形成され、その上面が、前記上基板の下表面により形成された形態である。前記反応部は、例えば、中空の柱状（筒状ともいう）であり、具体的には、前記分析チップの厚み方向を軸方向とする柱状が好ましい。前記柱状は、例えば、円柱状、角柱状等である。前記反応部は、例えば、空気孔を有してもよく、前記空気孔は、例えば、前記反応部の上面側において、前記上基板に貫通孔として形成できる。
【００８３】
本発明の分析チップにおいて、前記流路は、例えば、その底面が、前記下基板の上表面によって形成され、その上面が、前記上基板の下表面により形成された形態である。前記流路は、中空であり、具体的には、前記分析チップの長手方向を軸方向とする中空である。前記流路は、前記軸方向に垂直な断面（中空の断面）が、例えば、真円、楕円等の円形又は正方形、長方形等の多角形である。
【００８４】
前記流路は、例えば、前記反応部側から前記検出部側に向かう前記分析用担体の移動を促進する移動促進手段を有することが好ましい。前記移動促進手段を有することで、例えば、効率良く前記分析用担体を移動させ、前記検出部において前記分析用担体を回収することができる。前記流路における前記移動促進手段は、特に制限されず、例えば、後述するように、前記反応部側から前記検出部側に向かって、断面積が小さくなる構造でもよい。
【００８５】
前記流路は、例えば、前記反応部側から前記検出部側に向かって、断面積が小さくなる構造が挙げられる。前記構造は、例えば、前記反応部側から前記検出部側に向かって、狭窄する構造ということもできる。前記流路の断面積は、例えば、前記分析チップの長手方向に垂直な断面の面積であり、前記流路における中空の断面の面積である。
【００８６】
前記断面積は、前記反応部側から前記検出部側に向かって、例えば、連続的に断面積が小さくなってもよいし、非連続的に（段階的に）断面積が小さくなってもよい。具体例として、前記流路は、例えば、軸方向に平行な断面の形状が、前記反応部側から前記検出部側に向かって、テーパー状に狭まっている形状でもよい。具体的には、前記流路は、例えば、前記分析チップの側面から見た断面の形状が、反応部側から前記検出部側に向かって、テーパー状に狭まっている形状でもよいし、前記分析チップの上表面（又は下表面）から見た断面の形状が、反応部側から前記検出部側に向かって、テーパー状に狭まっている形状でもよいし、両方であってもよい。
【００８７】
前記流路の側面が、例えば、前記反応部から前記検出部側に向かってテーパー状に狭まる曲面であることが好ましい。前記流路の側面をこのような形状とすることで、効率良く前記分析用担体を移動させ、前記検出部において前記分析用担体を回収することができる。前記曲面の曲率半径Ｒは、より効率良く前記分析用担体を前記検出部に回収できることから、例えば、１〜５ｍｍ、１．５〜４．５ｍｍ又は３ｍｍ前後（例えば、２．５〜３．５ｍｍ）である。前記曲面の曲率半径Ｒは、例えば、前記テーパー状に狭まる曲面の曲率半径である。
【００８８】
前記流路は、前述のように、前記分析用担体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段を有する。前記移動制御手段により、前記反応部における第２の結合体は、比重が前記液体溶媒より大きく、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できる。具体的には、前記流路が、前記移動制御手段として、疎水性の内壁を有することで、前記第２の結合体に、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）が負荷されない場合、例えば、前記反応部から前記検出部への自発的な毛管現象が発生しないため、前記第２の結合体を前記反応部に維持でき、前記第２の結合体に、前記抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）が負荷された場合、前記反応部から前記検出部への毛管現象が発生するため、前記第２の結合体を前記反応部から前記検出部に移動させることができる。このため、本発明の分析チップにおいて、疎水性とは、例えば、自発的な毛管現象による前記反応部から前記検出部への液体画分の移動が発生しない程度の疎水性を意味する。本発明において、前記第２の結合体に加え、前記第２の結合体を形成していない分析用担体が、例えば、前記遠心力（Ｃ）が負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できてもよい。前記流路の疎水性の内壁は、例えば、後述する疎水性部材により形成できる。前記流路において、例えば、上下面及び側面の全ての内壁が、疎水性でもよいし、一部の内壁が、疎水性でもよい。具体例として、前記分析チップが上基板と下基板とによって形成される場合、例えば、前記上基板により形成される流路の内壁が、疎水性であってもよいし、前記下基板により形成される流路の内壁が、疎水性であってもよいし、前記上基板及び前記下基板により形成される流路の内壁が、疎水性であってもよい。本発明の分析チップにおいて、さらに、前記検出部の内壁を疎水性とし、前記移動制御手段が、前記検出部の疎水性の内壁を含んでもよい。前記抵抗力（Ｒ）及び遠心力（Ｃ）については、前述の説明を援用できる。
【００８９】
前記流路の内部空間の大きさは、特に制限されない。前記流路の高さ（深さ）は、例えば、１〜３，０００μｍ、望ましくは１００〜５００μｍである。前記流路の幅は、例えば、１〜３，０００μｍ、望ましくは１００〜５００μｍである。前記流路の高さ及び幅は、例えば、それぞれ、前記流路の内部空間における高さ及び幅である。
【００９０】
本発明の分析チップにおいて、前記検出部の形状は、特に制限されない。前記検出部は、例えば、中空であり、前記流路の延長であってもよい。すなわち、本発明の分析チップにおいて、前記検出部は、例えば、前記反応部に連通する前記流路において、前記反応部と反対側の末端領域であってもよい。前記検出部の形状は、特に制限されず、前記軸方向に垂直な断面（例えば、中空の断面）が、例えば、真円若しくは楕円等の円形又は正方形若しくは長方形等の多角形である。
【００９１】
前記検出部の内部空間の容積は、例えば、前記試料の体積よりも小さいことが好ましい。このように、前記検出部の容積を、例えば、前記試料と比較して相対的に小さく設計することで、前記検出部における前記分析用担体の濃度を相対的に高く設定することができる。前記検出部の内部空間の容積は、前記試料の体積に対して、例えば、１０−２倍〜１０−６倍である（例えば、１０−４倍）。また、前記検出部の容積は、下限が、例えば、前記反応部に配置されている前記分析用担体全量の体積を超えることが好ましい。前記検出部の内部空間の容積は、例えば、前記反応部の内部空間の容積よりも小さいことが好ましい。このように、前記検出部の容積を、例えば、前記反応部の内部空間の容積と比較して相対的に小さく設計することで、前記検出部における前記分析用担体の濃度を相対的に高く設定することができる。前記検出部の内部空間の容積は、前記反応部の内部空間の容積に対して、例えば、１０−１倍〜１０−６倍、望ましくは１０−２倍〜１０−５倍である（より望ましくは、１０−４倍）。前記検出部の高さ（深さ）は、特に制限されず、例えば、１〜３，０００μｍ、１０〜３００μｍ、又は１００μｍ前後（望ましくは、５０〜１５０μｍ）等が挙げられる。前記検出部をこのような高さにすることで、例えば、前記検出部に移動した担体において、検出できる標識の割合がより増加する。前記検出部の幅は、特に制限されず、例えば、１〜３，０００μｍ、望ましくは１０〜３００μｍである。前記検出部の高さ及び幅は、例えば、それぞれ、前記検出部の内部空間における高さ及び幅である。前記検出部の高さが１〜５００μｍの場合、前記検出部に移動する前記担体の割合が向上し、かつ検出できる標識の割合がより増加することから、前記担体の直径は、例えば、１００ｎｍ〜４μｍ、１００〜８００ｎｍ、又は２５０〜４００ｎｍであることが好ましい。このように検出部の高さ（深さ）を設定すれば、シリカ製ビーズのような担体であっても、前記検出部で光透過性を有することができる。
【００９２】
本発明の分析チップにおいて、前記反応部は、前述のように、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び担体に結合する担体結合用プローブとを有する。前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブの説明は、例えば、前述の説明を援用できる。
【００９３】
本発明の分析チップにおいて、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブは、例えば、前記反応部において遊離状態でもよい。また、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブは、例えば、前記反応部（前記反応部の内壁）において、遊離可能なように固定化された状態でもよい。後者の場合、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブは、例えば、水溶性材料によって、前記反応部に固定化されていることが好ましい。この場合、例えば、前記反応部の開口から導入された試料により、前記反応部（前記反応部の内壁）から、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが遊離される。前記水溶性材料は、例えば、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体、ポリアクリル酸系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、デンプン、ゼラチン等の水溶性ポリマー、スクロース、トレハロース、マンニトール、ラクトース等の少糖類等が挙げられる。なお、前記分析用担体も、上記と同様に、前記反応部（前記反応部の内壁）において、遊離可能なように固定化された状態としてもよい。
【００９４】
本発明の分析チップは、例えば、前記反応部に、試薬として、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブの他に、さらにその他の物質を含んでいてもよい。前記その他の物質は、特に制限されず、例えば、界面活性剤、緩衝剤、塩類、水溶性高分子、糖類等が挙げられる。前記界面活性剤は、例えば、非イオン系界面活性剤、イオン系界面活性剤等が挙げられ、前記ターゲットと前記標識プローブとの反応を促進することから、好ましくは、非イオン系界面活性剤である。前記非イオン系界面活性剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、蔗糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。前記その他の物質は、例えば、前記分析用担体とともに含んでもよい。
【００９５】
本発明の分析チップにおいて、前記反応部は、さらに、撹拌素子を有してもよい。この場合、前記撹拌素子によって、前記反応部において、前記試料と前記反応部に配置された前記試薬との混合液、又は、前記第１の結合体と前記分析用担体との混合液を撹拌し、前記試料中のターゲット及び前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブ、又は前記第１の結合体及び前記分析用担体を、効率よく接触させることができる。前記撹拌素子は、例えば、磁性撹拌素子が使用でき、具体例として、例えば、磁性ビーズ等のスターラー等が挙げられる。前記撹拌素子の材料は、特に制限されず、例えば、ＳＵＳ等の磁性体が好ましい。前記撹拌素子の形状は、例えば、球形であり、その大きさは、例えば、直径０．１〜５ｍｍ（例えば、１ｍｍ）である。
【００９６】
本発明の分析チップにおいて、前記基板の材質は、特に制限されず、例えば、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス又はＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ポリスチレン、アクリル樹脂、シクロオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート等の樹脂等が使用でき、後述する疎水性部材を使用することが好ましい。また、前記基板が、前述のように、前記下基板と前記上基板とを有する場合、前記両基板は、例えば、同じ部材でもよいし、異なる部材でもよい。
【００９７】
本発明の分析チップにおいて、前記検出部は、例えば、光透過性部材で形成されており、好ましくは、紫外光透過性部材である。前記光透過性部材は、例えば、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス、ＰＤＭＳ等の樹脂等が挙げられる。
【００９８】
本発明の分析チップにおいて、前記流路の内壁は、前述のように、疎水性である。前記疎水性の内壁は、例えば、前記基板として疎水性部材を使用することにより構成してもよいし、前記基板の表面に、疎水性部材を積層することにより構成してもよいし、前記基板の表面を疎水性に改変することにより構成してもよい。前記疎水性部材としては、例えば、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ポリスチレン、アクリル樹脂、シクロオレフィン系樹脂等の疎水性樹脂等が挙げられる。また、疎水性への改変方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。
【００９９】
本発明の分析チップは、前述のように、例えば、遠心装置にセットして、遠心力をかけることから、さらに、前記遠心装置への配置部位を有することが好ましい。
【０１００】
本発明の分析チップに導入する試料は、ターゲットを含む試料であるが、本発明はこれに限定されず、前記試料は、例えば、ターゲットを含まない試料、ターゲットを含むか不明の試料等であってもよい。前記試料の形態は、特に制限されず、例えば、前述の説明を援用できる。
【０１０１】
本発明の分析チップに導入する試料の量は、特に制限されず、前記分析チップ１個あたり、例えば、１〜１００μＬ（例えば、５０μＬ）である。
【０１０２】
以下に、本発明の実施形態として、本発明のターゲット分析チップ及びこれを用いた本発明のターゲット分析方法の前記標識プローブとして、前記蛍光標識プローブを用い、前記ターゲットとしてターゲットＲＮＡを分析する場合の具体例について、図面を用いて説明する。なお、本発明は、これらの例示には限定されない。
【０１０３】
図１は、本発明の分析チップの一例を示す概略図であり、（Ａ）は、斜視図、（Ｂ）は、平面図、（Ｃ）は、前記（Ａ）のＩ−Ｉ方向断面図である。
【０１０４】
図１に示すように、分析チップ１は、下基板１０ａと上基板１０ｂとからなる基板１０を有する。上基板１０ｂは、貫通孔１２と、下表面における凹部１３、１４、１５とを有している。上基板１０ｂと下基板１０ａとの積層により、前記貫通孔１２は反応部の開口１２を構成し、前記凹部１３は反応部１３を構成し、前記凹部１４は流路１４を構成し、及び前記凹部１５は検出部１５を構成している。反応部１３と検出部１５は、流路１４で連通する。図１（Ｃ）において、矢印Ｘは、分析チップ１における試料の移動方向（分析チップ１の長手方向）を示す。
【０１０５】
分析チップ１の大きさは、特に制限されず、以下の条件が例示できる。
反応部１３
直径１〜３０ｍｍ（例えば、８ｍｍ）
導入する試料の体積１〜１，０００μＬ（例えば、５０μＬ）
流路１４
長さ１０〜５，０００μｍ（例えば、２，５００μｍ）
反応部１３端の幅  １００〜５，０００μｍ（例えば、１，０００μｍ）
反応部１３端の深さ１００〜５，０００μｍ（例えば、２，０００μｍ）
検出部１５端の幅  １０〜１，０００μｍ（例えば、１５０μｍ）
検出部１５端の深さ１０〜１，０００μｍ（例えば、１５０μｍ）
検出部１５
長さ１０〜１，０００μｍ（例えば、２２０μｍ）
幅  １０〜１，０００μｍ（例えば、１５０μｍ）
深さ１０〜１，０００μｍ（例えば、１５０μｍ）
容積０．００１〜１，０００ｎＬ（例えば、５ｎＬ）
【０１０６】
流路１４は、図１に示すように、反応部１３側から検出部１５側に向かって、狭まっていく狭窄形状である。具体的には、分析チップ１の上表面から見た場合、図１（Ｂ）に示すように、反応部１３側から検出部１５側に向かって、両側からテーパー状に狭まっており、また、分析チップ１の側面から見た場合、図１（Ｃ）に示すように、反応部１３側から検出部１５側に向かって、上面がテーパー状に狭まっていく形状である。
【０１０７】
分析チップ１の反応部１３には、前記分析用担体が配置されている（図示せず）。前記分析用担体は、前述のように、前記水溶性材料により固定化されていることが好ましい。
【０１０８】
分析チップ１を用いた試料中のＲＮＡの分析は、例えば、以下のようにして行うことができる。以下の実施形態では、前記蛍光標識プローブの蛍光標識がピレン含有物質であり、反応部１３に前記磁性撹拌素子として直径１ｍｍのＳＵＳ製ビーズのスターラーが同様に前記水溶性材料により固定化されている場合の一例とする。
【０１０９】
まず、分析チップ１の反応部１３に、前記開口１２から試料を導入する。この試料の液体溶媒によって、水溶性材料により反応部１３に固定化されていた前記分析用担体及び前記磁性撹拌素子が遊離する。そして、分析チップ１の外部に配置された磁石により、反応部１３における前記磁性撹拌素子を自転させることにより、反応部１３において、試料と前記分析用担体とを接触させる。これによって、前記試料中のターゲットＲＮＡと前記分析用担体における前記蛍光標識プローブとが結合する。
【０１１０】
次に、分析チップ１を遠心し、遠心力（Ｃ）により、反応部１３から、流路１４を介して検出部１５に、前記分析用担体を移動させる。そして、検出部１５に、分析チップ１の上方向から紫外光（例えば、３４０ｎｍ）を照射し、ターゲットＲＮＡと前記蛍光標識プローブとの結合により発するピレン由来の蛍光を、所定の波長（例えば、４８０ｎｍ）で光検出器により検出する。ピレンで修飾された前記蛍光標識プローブは、ターゲットＲＮＡと結合した状態でのみ蛍光を発するため、ピレンに由来する蛍光の有無及び量は、ターゲットＲＮＡの有無及び量と相関関係を示す。このため、前記蛍光の検出により、ターゲットＲＮＡを定性分析又は定量分析できる。
【０１１１】
本発明において、前記分析チップに対する遠心力は、前述のように、例えば、遠心装置を使用することができる。図２及び図３に、遠心装置の一例の概略図を示す。
【０１１２】
図２は、遠心装置の断面図であり、遠心装置２は、基板２０と、モーター２１と、軸２２と、ステージ２３とを有する。ステージ２３には、配置した前記分析チップを固定化するための固定部２４ａ、２４ｂを有する。図３は、遠心装置２のステージ２３の上面の平面図である。
【０１１３】
遠心装置２への前記分析チップの配置は、例えば、以下のように行える。まず、ステージ２３上に分析チップ１を配置する。この際、分析チップ１の反応部１３側（図１参照）が、軸２２側となるように配置する。そして、分析チップ１を固定部２４ａ、２４ｂでステージ２３に固定する。次に、モーター２１を駆動させ、軸２２を中心として、ステージ２３を回転させる。これによって、分析チップ１の反応部１３側から検出部１５側に向かって矢印Ｙ方向の遠心力がかかり、分析チップ１において矢印Ｘ方向に前記試料の移動又は前記分析用担体の移動を行うことができる。
【実施例】
【０１１４】
次に、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例により制限されない。【０１１５】
（実施例１）
本発明の分析方法により、ターゲットＲＮＡを分析できることを確認した。【０１１６】
（１）アビジン修飾ビーズの調製及び評価
ＮＨＳ−活性化セファロースビーズ（NHS-activated  Sepharose  4  Fast  Flow、GE-ヘルスケア社製）の原液２０μＬに、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌ水溶液を２００μＬ添加後、撹拌した。前記撹拌後、混合液を２，８４０ｇで遠心分離し、上清２００μＬを除去した。さらに、得られた沈殿にＨＣｌ水溶液の添加及び遠心分離を２回行ない、前記ビーズを洗浄した。【０１１７】
前記洗浄後のビーズに、アビジン結合反応液１８０μＬを添加した。前記アビジン結合反応液は、０．８μｍｏｌアビジン、０．２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、及び０．５ｍｏｌ／Ｌを含む水溶液とした。前記添加後、４℃の条件下で１４時間、得られた反応液を撹拌した。次に、前記反応液を２，８４０ｇで遠心分離し、上清１８０μＬを除去した。さらに、得られた沈殿に、ブロッキング溶液１８０μＬを添加した。前記ブロッキング溶液は、０．２ｍｏｌ／Ｌ  ２−アミノエタノール（エタノールアミン）、０．２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、及び０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む水溶液とした。そして、前記添加後、２０℃の条件下で３０分間、得られた反応液を撹拌した。前記撹拌後、２，８４０ｇで遠心分離し、上清１８０μＬを除去した。【０１１８】
得られた沈殿に、０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）３８０μＬを添加した。次に、２，８４０ｇで遠心分離し、上清３８０μＬを除去した。前記リン酸緩衝液の添加及び遠心分離を２回行ない、前記ビーズを洗浄した。前記洗浄後のビーズに、前記リン酸緩衝液３８０μＬを添加し、４００μＬのアビジン修飾ビーズ分散液を調製した。前記ビーズ分散液において、前記アビジン修飾ビーズの濃度は、約２５粒／μＬであった。【０１１９】
次に、前記ビーズ分散液５０μＬに、０．６７ｍｏｌ／Ｌ  ビオチン修飾ＤＮＡを含む水溶液１５０μＬを添加した。前記添加後、２０℃の条件下で、３０分間、得られた混合液を撹拌した。さらに、２，８４０ｇで遠心分離し、上清を回収した。そして、前記上清について、吸光光度計（ＵＶ１８００、島津製作所社製）を用いて、スペクトルを測定した。また、前記ビオチン修飾ＤＮＡ溶液についても、同様にしてスペクトルを測定した。そして、前記上清及び前記ビオチン修飾ＤＮＡ溶液のスペクトルに基づき、常法により、アビジン修飾ビーズ１粒に対して結合可能なビオチンのモル数を算出した。その結果、前記アビジン修飾ビーズ１粒に対し結合可能なビオチンのモル数は、約４０ｆｍｏｌであった。このようなアビジン修飾ビーズを、後述する分析に使用した。【０１２０】
（２）核酸試薬
ターゲットＲＮＡとして、下記配列番号１の塩基配列からなるターゲットＲＮＡ分子を合成した。また、蛍光標識プローブとして、下記配列番号２の塩基配列からなるピレン標識プローブを合成した。前記ピレン標識プローブは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡを用い合成し、下記配列番号２の塩基配列において、下線を引いたｎは、２’の水酸基をピレン標識したシチジンを用いた。さらに、前記担体結合用プローブとして、５’末端がビオチン化された下記配列番号３の塩基配列からなるビオチン化プローブを合成した。なお、前記ビオチン化プローブにおいて、５’末端側の４塩基は、付加配列である。前記ピレン標識プローブは、前記ターゲットＲＮＡ分子の５’端側から連続する１４塩基に結合し、前記ビオチン化プローブは、前記ターゲットＲＮＡ分子の前記ピレン標識プローブが結合しない塩基に結合する。【０１２１】
ターゲットＲＮＡモデル  （配列番号１）5’-agucaauagggugugugagagacuuaacug-3’
ピレン標識プローブ      （配列番号２）5’-acacnnuauugacu-3’
ビオチン化プローブ      （配列番号３）5’-cagccagttaagtctctcac-3’【０１２２】
（３）分析
１．２５μｍｏｌ／Ｌ  ターゲットＲＮＡ分子、１．２５ｍｏｌ／Ｌ  ピレン標識プローブ、及び１．２５ｍｏｌ／Ｌ  ビオチン化プローブを含む１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．００）１２０μＬを調製した。前記調製後、１５℃の条件下で４時間、得られた反応液をインキュベートし、前記ターゲットＲＮＡ分子、前記ピレン標識プローブ、及び前記ビオチン化プローブを結合させた。次に、前記ビーズ分散液４０μＬを前記反応液に添加し、１５℃の条件下で１時間、得られた混合液を撹拌し、前記ターゲットＲＮＡ分子、前記ピレン標識プローブ、及び前記ビオチン化プローブの第１の結合体と、前記アビジン修飾ビーズとを結合させた。【０１２３】
前記結合後、前記混合液を、２，８４０ｇで遠心分離し、上清を回収した。そして、前記上清の一部で前記遠心分離後の沈殿を分散した。そして、得られた分散液１００μＬについて、ガラスボトムディッシュ（松浪ガラス工業社製）に滴下した。そして、前記ガラスボトムディッシュ上のアビジン修飾ビーズの蛍光シグナルについて、位相差／蛍光顕微鏡（ECLIPSE  TE300、Nicon社製）を用いて測定した。なお、励起光は、３４０±１０ｎｍとし、４００ｎｍ以上の蛍光シグナルについて測定した。写真の測定時の露光時間は、２秒とした。また、比較例１Ａ〜Ｃは、それぞれ、前記ビオチン化プローブ、前記ターゲットＲＮＡ分子、及び前記ピレン標識プローブを添加しなかった以外は同様にして測定した。さらに、比較例１Ｄは、前記ビオチン化プローブ、前記ターゲットＲＮＡ分子、及び前記ピレン標識プローブを添加しなかった以外は同様にして、蛍光シグナルを測定した。【０１２４】
この結果を図４に示す。図４は、ガラスボトムディッシュ上のアビジン修飾ビーズを測定した写真である。図４において、（Ａ）は、位相差画像を示し、（Ｂ）は、蛍光画像を示す。図４において、各写真は、左から、実施例１及び比較例１Ａ〜Ｄの結果を示し、図中の矢印は、蛍光シグナルを発するビーズを示す。図４（Ａ）に示すように、いずれのサンプルにおいてもアビジン修飾ビーズが観察された。また、図４Ａ（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、比較例１Ａ〜Ｄでは、前記位相差画像において前記アビジン修飾ビーズが観察された領域において、蛍光シグナルが観察されなかった。これに対し、実施例１では、前記位相差画像において前記アビジン修飾ビーズが観察された領域において、矢印で示すように、蛍光シグナルが観察された。【０１２５】
次に、実施例１の分散液及び比較例１Ｂの分散液について、顕微分光器（ECLIPSE  TE300、Nicon社製）を用いて、励起光を３４０±１０ｎｍとした際の４００ｎｍ以上の蛍光シグナルのスペクトルを測定した。また、コントロールとして、前記ＰＢＳを用いた以外は同様にしてスペクトルを測定した。【０１２６】
この結果を図５に示す。図５は、蛍光シグナルのスペクトルを示すグラフである。図５において、横軸は、波長を示し、縦軸は、蛍光強度を示す。図５に示すように、比較例１Ｂでは、ピレンの蛍光シグナルである４５０〜５１０ｎｍにおいて、蛍光シグナルはコントロールと同程度であった。これに対し、実施例１では、５００ｎｍ弱に明確な蛍光シグナルのピークが観察された。【０１２７】
（実施例２）
異なる深さの検出部を有する分析チップを作製し、異なる直径を有するビーズを前記検出部に回収できることを確認した。【０１２８】
（１）流路構造体の製造
以下に示す方法により、図１の分析チップ１の上基板１０ｂを作製した。なお、前記分析チップについて、各部位の大きさ及び材質は、以下の通りとした。
反応部１３：深さ２ｍｍ、直径８ｍｍ、円形、直径６ｍｍの円形貫通孔
検出部１５：幅０．１５ｍｍ、深さ０．１５ｍｍ、長さ０．３ｍｍ、直方体形状
流路１４：長さ３．３ｍｍ、幅０．５ｍｍ、上流側から下流側に向かって、深さが１ｍｍから０．１５ｍｍにスロープ状に変化
材質：ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製【０１２９】
まず、前記構造の流路構造体を製造するために、鋳型となるアルミ製の流路金型を切削加工により作製した。そして、ＰＤＭＳプレポリマー溶液を、前記流路金型に流し入れ、７０℃のオーブンに１時間入れて熱硬化させた。熱硬化後、硬化したＰＤＭＳ成型体を、静かに前記流路金型から引き剥がし、前記流路構造体を得た。前記ＰＤＭＳプレポリマー混合液は、ＰＤＭＳのプレポリマーと硬化剤（商品名シルポット（東レダウコーニング製）の主剤と硬化剤）を、重量比１０：１で均一になるまで混合した後、その混合液をデシケータに入れて減圧処理し、混合時に発生した気泡を除去して調製した。【０１３０】
（２）反応試薬液の調製
ローダミン標識シリカ製ビーズ（micromod  Partikeltechnologie  GmbH社製）、マンニトール、ウシ血清アルブミンを、それぞれ、蒸留水に、０．０５ｗ／ｖ％、２ｗ／ｖ％、及び１ｗ／ｖ％となるように混合して、反応試薬液を調製した。なお、使用したビーズの平均直径は、３００ｎｍ、８００ｎｍ、５μｍ及び１０μｍの４通りとした。【０１３１】
（３）前記反応試薬の固定化
厚み０．１７ｍｍのホウケイ酸ガラス板の表面に、前記反応試薬液５μＬを滴下し、さらに、滴下した前記反応試薬液の上に、直径０．５ｍｍのステンレス球を載せた後、前記ガラス板を、温度２５℃、湿度０％の恒温恒湿器内で２４時間インキュベートし、前記反応試薬液を乾燥させるとともに、前記ステンレス球を前記ガラス板上に固定した。【０１３２】
（４）分析チップ
前記（１）の前記流路構造体について、流路の形成面（前記ガラス板との貼り合わせ面）を酸素プラズマ処理した。そして、処理後の前記流路構造体と前記ガラス板とを貼り合せ、分析チップを作製した。前記両者の貼り合わせは、前記流路構造体の反応部と前記ガラス基板上の前記反応試薬との位置が対向するようにして、行った。また、検出部１５の深さを４０、７０、又は１５０μｍとした以外は、同様にして異なる深さの検出部１５を有する分析チップを作製した。【０１３３】
（５）分析
リン酸緩衝液５０μＬを、前記分析チップの反応部１３に滴下した後、前記分析チップを図２に示す遠心装置２のステージ２３に固定化した。【０１３４】
前記分析チップの反応部１３内の前記ステンレス球を、磁力で回転（２００ｒｐｍ）させ、前記サンプルにより前記反応試薬を溶解した。この操作を、１０分間行った。次に、前記分析チップを、４，０００ｒｐｍ(回転半径５０ｍｍ)で６０秒間回転させ、反応部１３内の前記ビーズを検出部１５に移動させた。【０１３５】
そして、蛍光顕微鏡を用い、前記分析チップの検出部１５の先端に集積した前記ビーズに、波長５１０〜５６０ｎｍの励起光を照射し、波長４９０ｎｍ以上の平均蛍光強度及び吸光度を測定した。【０１３６】
これらの結果を図６に示す。図６は、平均蛍光強度又は吸光度を示すグラフである。図６において、（Ａ）は、平均蛍光強度の結果を示し、（Ｂ）は吸光度の結果を示し、図中の三角（△）は、３００ｎｍビーズの結果を示し、菱形（◇）は、８００ｎｍのビーズの結果を示し、丸（○）は、５μｍのビーズの結果を示し、バツ（×）は、１０μｍのビーズの結果を示す。また、図６（Ａ）において、横軸は、検出部１５の深さを示し、縦軸は、平均蛍光強度を示し、（Ｂ）において、横軸は、検出部１５の深さを示し、縦軸は、吸光度を示す。図６（Ａ）に示すように、いずれの直径のビーズにおいても、検出部１５の深さが増加するについて、平均蛍光強度が増加した。また、各ビーズの中でも、３００ｎｍのビーズは、検出部１５の深さが増加する際の平均蛍光強度の増加割合が高く、かつ増加割合が一定であり、前記担体として特に好適に使用できることが分かった。また、図６（Ｂ）に示すように、いずれの直径のビーズにおいても、検出部１５の深さが増加するにつれて、吸光度が増加した。また、３００ｎｍ、５μｍ、及び１０μｍのビーズは、検出部１５の深さがいずれの深さの場合においても、吸光度が低減されており、例えば、光学的な方法により標識を検出する際に、検出漏れが低減できることが分かった。【０１３７】
（実施例３）
流路１４の側面が、反応部１３から検出部１５側に向かってテーパー状に狭まる曲面であり、前記曲面の曲率半径が異なる分析チップと異なる濃度の界面活性剤を使用し、前記ビーズを前記検出部に回収できることを確認した。【０１３８】
（１）分析チップ
図７（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、流路１４の側面を、反応部１３から検出部１５側に向かってテーパー状に狭まる曲面とし、検出部１５の深さを１００μｍとし、平均直径３００μｍ及び５μｍの２通りのローダミン標識シリカ製ビーズを用いた以外は、前記実施例２（１）〜（４）と同様に、分析チップを作製した。なお、図７（Ａ）〜（Ｃ）の分析チップにおいて、テーパー状に狭まる曲面における各曲面の曲率半径Ｒは、それぞれ、１．５、３、及び４．５ｍｍとした。【０１３９】
（２）分析
０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）又はＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０μＬを前記分析チップの反応部１３に滴下後、前記実施例２（５）と同様にして、検出部１５に前記ビーズを集積させた。そして、蛍光顕微鏡を用い、前記分析チップの検出部１５の先端に集積した前記ビーズに、波長５１０−５６０ｎｍの励起光を照射し、前記ビーズの集積部分の波長４９０ｎｍ以上の蛍光強度の総和（総蛍光量）を算出した。また、前記ビーズ添加前に、同様にして、総蛍光量を算出し、前記ビーズ添加後に算出された総蛍光量から前記ビーズ添加前に算出された総蛍光量を除くことで、総蛍光量を補正した（補正後の総蛍光量）。【０１４０】
この結果を図８に示す。図８は、補正後の総蛍光量を示すグラフであり、（Ａ）は、５μｍのビーズを用いた場合の結果であり、（Ｂ）は、３００ｎｍのビーズを用いた場合の結果である。図８において、横軸は、界面活性剤の種類を示し、縦軸は、補正後の総蛍光量を示す。図８に示すように、流路１４の側面がいずれの曲率半径を有する曲面であっても、補正後の総蛍光量が高く、効率良く前記ビーズが回収できることが分かった。また、図８に示すように、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ２０又はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を含む場合は、界面活性剤を含まない場合（ＰＢＳ）に対して、補正後の総蛍光量が有意に増加した。すなわち、前記試薬として界面活性剤を用いることで、効率良く前記ビーズが回収できることが分かった。【０１４１】
（実施例４）
ターゲット核酸としてのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１２４６）を含む異なる血清試料Ａ、Ｂ及びＣそれぞれ３００μＬを、汎用の遺伝子抽出キットを使用して各々３０μＬに濃縮してＲＮＡを抽出した。その抽出液３０μＬのうち３μＬを測定試料とし、これに、適宜調整したピレン標識プローブ及びビオチン化プローブその他適宜の緩衝液等を含む試薬２７μＬを加えた合計３０μＬを、前記実施例１に記載するようなターゲット分析方法によって定量的に分析した。当該定量分析は、各血清試料３サンプルについて、観察された蛍光シグナルの強度（図５参照）を、あらかじめ既知のターゲット核酸を用いて作成した検量線へ当てはめることによって得た値の平均値を求めることで実施した。【０１４２】
その結果、抽出液中のターゲット核酸濃度は、前記血清試料Ａ、Ｂ及びＣについてそれぞれ２．２ｐｍｏｌ／Ｌ、２．５ｐｍｏｌ／Ｌ及び１．３ｐｍｏｌ／Ｌであった。【０１４３】
以上の実施例４の結果の通り、本発明のターゲット分析方法によって微量の試料中からもターゲット核酸を高感度で検出できることがわかった。【０１４４】
これらの結果から、本発明の分析方法によれば、ＰＣＲを使用することなく、試料中のターゲットを直接的に分析できることがわかった。【０１４５】
以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明によれば、ＰＣＲを使用することなく、試料中のターゲットを直接的に分析できる。また、本発明の分析方法は、前記第１反応工程及び前記第２反応工程において、前記ターゲット、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブの第１の結合体を、前記担体結合用プローブを介して前記担体に濃縮でき、かつ前記濃縮工程において、前記担体を濃縮できる。このため、本発明の分析方法は、例えば、前記分析工程において、前記ターゲットを含む第１の結合体が濃縮して結合された担体（第２の結合体）を高濃度の状態で分析できる。したがって、本発明の分析方法によれば、例えば、優れた感度及び精度を実現でき、例えば、供する試料が微量であっても、分析可能である。また、本発明の分析方法は、例えば、前記担体を高濃度の状態で分析できるため、前記ターゲットに結合していない前記標識プローブによる分析への影響を避けることができる。このため、本発明の分析方法は、例えば、バックグラウンドが低減されている。さらに、本発明の分析方法は、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとが、分散された状態で結合反応を行うことができ、さらに、得られた第１の結合体中の前記担体結合用プローブを介して、前記第１の結合体と前記担体とを結合させることができる。このため、本発明の分析方法は、例えば、第１反応工程において、反応液中に分散された前記標識プローブと前記ターゲットとの結合反応が起こる確率が高くなるため、前記標識プローブを固定化した前記担体を使用して前記ターゲットを分析する方法、又は前記担体結合用プローブと前記担体とが先に結合した結合体を使用して前記ターゲットを分析する方法と比較して、結合反応の時間をより短縮でき、また、感度をより向上できる。したがって、本発明は、例えば、マイクロＲＮＡをはじめとするターゲットの分析が行われる医療分野等において有用といえる。
【図１】
2017126479.tif 000003
【図２】
2017126479.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
2017126479000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月6日(2017.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のターゲットと、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブとを液体溶媒中で接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程である第１反応工程、
前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、比重が前記液体溶媒より大きい第２の結合体を形成する工程である第２反応工程、
前記第２の結合体を含む前記液体溶媒を遠心し、前記第２の結合体を前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに濃縮する工程である濃縮工程、並びに
前記濃縮された状態で、前記第２の結合体中に含まれる前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程である分析工程を含むことを特徴とする、ターゲットの分析方法。
【請求項２】
前記担体結合用プローブが、第１結合物質を含み、
前記担体が、前記第１結合物質と結合する第２結合物質を含み、
前記担体結合用プローブが、前記第１結合物質と前記第２結合物質との結合を介して前記担体と結合する、請求項１記載のターゲットの分析方法。
【請求項３】
前記ターゲットが、ターゲット核酸である、請求項１又は２記載のターゲットの分析方法。
【請求項４】
前記ターゲット核酸が、マイクロＲＮＡである、請求項３記載のターゲットの分析方法。
【請求項５】
前記標識プローブが、蛍光標識プローブである、請求項３又は４記載のターゲットの分析方法。
【請求項６】
前記蛍光標識プローブが、前記担体結合用プローブと比較して、前記ターゲット核酸の５’端側に結合する、請求項５記載のターゲットの分析方法。
【請求項７】
前記蛍光標識プローブが、前記ターゲット核酸の５’端から連続する塩基に結合し、
前記担体結合用プローブが、前記ターゲット核酸の３’端から連続する塩基に結合する、請求項６記載のターゲットの分析方法。
【請求項８】
前記蛍光標識プローブの蛍光標識が、前記蛍光標識プローブが前記ターゲット核酸に結合することにより、シグナル変化する物質である、請求項５から７までのいずれか一項に記載のターゲットの分析方法。
【請求項９】
前記蛍光標識が、ピレンを含む物質である、請求項８記載のターゲットの分析方法。
【請求項１０】
前記標識プローブが、さらにソラレンで修飾され、
紫外線を照射することにより、前記ソラレンと前記ターゲット核酸とを結合させる工程を含む、請求項３から９までのいずれか一項に記載のターゲットの分析方法。
【請求項１１】
反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有するターゲット分析チップを使用し、
前記反応部は、前記ターゲット、前記標識プローブ、前記担体結合用プローブ及び前記担体が結合反応する部位であり、
前記検出部は、前記第２の結合体が前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに濃縮される部位であり、
前記流路は、前記第２の結合体と前記第１の結合体が結合していない前記担体との前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記第２の結合体は前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動でき、
前記反応部に前記ターゲットを含む試料が導入された後、前記反応部にて前記第１反応工程が行われ、
さらに前記反応部にて前記第２反応工程が行われ、
前記反応部から前記流路を介して前記検出部までに至る間で前記濃縮工程が行われ、
前記検出部において、前記分析工程が行われる、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のターゲットの分析方法。
【請求項１２】
前記検出部の高さが、１〜５００μｍである、請求項１１記載のターゲットの分析方法。
【請求項１３】
前記担体が、ビーズである、請求項１から１２までのいずれか一項に記載のターゲットの分析方法。
【請求項１４】
前記ビーズの直径が、１００ｎｍ〜４μｍである、請求項１３記載のターゲットの分析方法。
【請求項１５】
反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有し、
前記反応部は、試料中のターゲット、前記ターゲットに結合する標識プローブ、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブ並びに前記担体が結合反応する部位であり、
前記検出部は、前記ターゲット、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが結合した第１の結合体と、前記担体結合用プローブを介して前記担体と、が結合することにより形成された第２の結合体と前記第１の結合体が結合していない前記担体とが濃縮される部位であり、
前記流路は、前記第２の結合体と前記第１の結合体が結合していない前記担体との前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、液体溶媒中において、比重が前記液体溶媒より大きい前記第２の結合体は前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする、ターゲットの分析チップ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
試料中のターゲットと、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブとを液体溶媒中で接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程である第１反応工程、
前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、比重が前記液体溶媒より大きい第２の結合体を形成する工程である第２反応工程、
前記第２の結合体を含む前記液体溶媒を遠心し、前記第２の結合体を前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに濃縮する工程である濃縮工程、並びに
前記濃縮された状態で、前記第２の結合体中に含まれる前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程である分析工程を含むことを特徴とする。
［０００７］
本発明のターゲット分析チップは、反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有し、
前記反応部は、試料中のターゲット、前記ターゲットに結合する標識プローブ、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブ並びに前記担体が結合反応する部位であり、
前記検出部は、前記ターゲット、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが結合した第１の結合体と、前記担体結合用プローブを介して前記担体と、が結合することにより形成された第２の結合体が前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに濃縮される部位であり、
前記流路は、前記第２の結合体と前記第１の結合体が結合していない前記担体との前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、液体溶媒中において、比重が前記液体溶媒より大きい前記第２の結合体は前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
発明の効果
［０００８］
本発明によれば、ＰＣＲを使用することなく、試料中のターゲットを直接的に分析できる。
図面の簡単な説明
［０００９］
［図１］本発明のターゲット分析チップの一例を示す概略図であり、（Ａ）は、斜視図、（Ｂ）は、平面図、（Ｃ）は、（Ａ）のＩ−Ｉ方向の断面図である。
［図２］遠心装置の一例を示す断面図である。
［図３］遠心装置にターゲット分析チップを配置した状態の一例を示す概略図である。
［図４］本発明の実施例１におけるガラスボトムディッシュ上のアビジン修飾ビーズを測定した写真である。
［図５］本発明の実施例１における蛍光シグナルのスペクトルを示すグラフである。
［図６］（Ａ）は、実施例２における平均蛍光強度を示すグラフであり、（Ｂ）は、実施例２における吸光度を示すグラフである。
［図７］実施例３において使用した分析チップの内部の平面図である。
［図８］実施例３における総蛍光量の相対値を示すグラフである。
発明を実施するための形態
［００１０］
本発明のターゲットの分析方法は、先述の通り、試料中のターゲットと、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブとを液体溶媒中で接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程である第１反応工程、前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、比重が前記液体溶媒より大きい第２の結合体を形成する工程である第２反応工程、
前記第２の結合体を含む前記液体溶媒を遠心し、前記第２の結合体を前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに濃縮す
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
［００１９］
本発明のターゲットの分析方法は、前記標識プローブが、さらにソラレンで修飾され、
紫外線を照射することにより、前記ソラレンと前記ターゲット核酸とを結合させる工程を含む。
［００２０］
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、波長４５０〜５１０ｎｍの蛍光シグナルを検出することにより、前記蛍光を検出する。
［００２１］
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記担体の直径が、１００μｍ未満、より望ましくは、１００ｎｍ〜４μｍである。
［００２２］
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有するターゲット分析チップを使用し、
前記反応部は、前記ターゲット、前記標識プローブ、前記担体結合用プローブ及び前記担体が結合反応する部位であり、
前記検出部は、前記第２の結合体が前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに濃縮される部位であり、
前記流路は、前記第２の結合体と前記第１の結合体が結合していない前記担体との前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記第２の結合体は前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動でき、
前記反応部に前記ターゲットを含む試料が導入された後、前記反応部にて前記第１反応工程が行われ、
さらに前記反応部にて前記第２反応工程が行われ、
前記反応部から前記流路を介して前記検出部までに至る間で前記濃縮工程が行われ、
前記検出部において、前記分析工程が行われる。
［００２３］
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記検出部の高さが、１〜５００μｍである。
［００２４］
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記担体が、ビーズである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
また、前記担体が、例えば、シリカ製である。
［００２５］
本発明のターゲットの分析方法は、例えば、前記ビーズの直径が、１００ｎｍ〜４μｍである。
［００２６］
＜ターゲット分析方法＞
本発明のターゲット分析方法（以下、「分析方法」ともいう。）は、前述のように、試料中のターゲットと、前記ターゲットに結合する標識プローブと、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブとを液体溶媒中で接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程（第１反応工程）、前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、比重が前記液体溶媒より大きい第２の結合体を形成する工程（第２反応工程）、前記第２の結合体を含む前記液体溶媒を遠心し、前記第２の結合体を前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに濃縮する工程（濃縮工程）、並びに前記濃縮された状態で、前記第２の結合体中に含まれる前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程（分析工程）を含むことを特徴とする。本発明の分析方法は、前記第１反応工程、前記第２反応工程、前記濃縮工程及び前記分析工程を含むことが特徴であり、その他の工程及び条件は、特に制限されない。本発明の分析方法は、前記第１反応工程及び前記第２反応工程において、前記ターゲット、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブの第１の結合体を、前記担体結合用プローブを介して前記担体に濃縮でき、かつ前記濃縮工程において、前記担体を濃縮できる。このため、本発明の分析方法は、例えば、前記分析工程において、前記ターゲットを含む第１の結合体が濃縮して結合された担体（第２の結合体）を高濃度の状態で分析できる。したがって、本発明の分析方法によれば、例えば、優れた感度及び精度を実現でき、例えば、供する試料が微量であっても、分析可能である。また、本発明の分析方法は、例えば、前記担体を高濃度の状態で分析できるため、前記ターゲットに結合していない前記標識プローブによる分析への影響を避けることができる。このため
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
における標識プローブの濃度は、特に制限されず、例えば、０．０１〜１ｎｍｏｌ／Ｌである。前記標識プローブの濃度は、例えば、１種類の標識プローブの濃度でもよいし、２種類以上の標識プローブの濃度の合計の濃度でもよい（以下、同様）。
［００５３］
前記第１反応工程において、前記担体結合用プローブの数は、特に制限されず、例えば、前記担体用標識の数に応じて適宜決定できる。前記担体結合用プローブの数は、例えば、前記担体用標識の数以下である。前記第１反応系における前記担体結合用プローブの濃度は、例えば、０．１〜１００ｐｍｏｌ／Ｌである。前記担体結合用プローブの濃度は、例えば、１種類の担体結合用プローブの濃度でもよいし、２種類以上の担体結合用プローブの濃度の合計の濃度でもよい（以下、同様）。
［００５４］
次に、前記第２反応工程は、前述のように、前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、比重が前記液体溶媒より大きい第２の結合体を形成する工程である。前記接触の順序は、特に制限されず、例えば、前記第１の結合体を含む前記第１反応系に、前記担体を添加し、接触させる。そして、前記接触後の混合物（第２反応系）を、例えば、前記第１反応工程と同様に、混合、撹拌することにより、前記第１の結合体中の前記担体結合用プローブを介して、前記第１の結合体と前記担体とを結合させる。前記第２反応工程における混合、撹拌、及び接触条件（例えば、温度、時間等）は、例えば、前記第１反応工程の説明を援用できる。
［００５５］
前記第２反応工程において、前記担体の数は、特に制限されない。前記第２反応系において、前記担体の体積（Ｃ）と、前記第２反応系の体積（Ｒ）との体積比の値（Ｃ／Ｒ）は、例えば、１／１０２〜１／１０５、望ましくは１／１０３前後である。前記担体の体積は、例えば、１種類の担体の体積でもよいし、２種類以上の担体の体積の合計の体積でもよい（以下、同様）。
［００５６］
前記濃縮工程は、前述のように、前記第２の結合体を含む前記液体溶媒を遠心し、前記第２の結合体を前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに濃縮する工程である。前記濃縮工程において、
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
濃縮される担体は、前記第２の結合体を形成している担体及び前記第２の結合体を形成していない担体の混合物である。
［００５７］
次に、前記分析工程は、前記濃縮された状態で、前記第２の結合体中に含まれる前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程である。前記標識の検出は、特に制限されず、例えば、前記標識の種類に応じて、適宜決定できる。具体例として、前記標識が蛍光標識物質の場合、前記標識の検出は、例えば、前記蛍光標識物質に起因する蛍光シグナルの検出である。前記蛍光シグナルの検出条件は、例えば、前記蛍光標識物質の種類に応じて、適宜設定できる。前記標識プローブが前記蛍光標識プローブの場合、前記蛍光標識プローブの前記蛍光標識は、例えば、前述のように、前記蛍光標識プローブが前記ターゲット核酸に結合することにより、シグナル変化する物質であることが好ましい。この場合、前記分析工程では、例えば、前記蛍光標識のシグナル変化を検出する。具体例として、前記蛍光標識が、前記ピレン含有物質の場合、前記検出部に紫外光を照射して、ピレンに起因する蛍光シグナルを検出する。前記ピレンに起因する蛍光シグナルの検出条件は、例えば、前述の通りである。
［００５８］
本発明の分析方法は、例えば、ターゲット分析チップ（以下、「分析チップ」ともいう。）を使用して実施してもよい。前記分析チップは、例えば、前記第１反応工程、前記第２反応工程、前記濃縮工程及び前記分析工程を実施できる分析チップであればよく、その構成は、特に制限されない。前記分析チップは、例えば、反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有し、前記反応部は、試料中のターゲット、前記ターゲットに結合する標識プローブ、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブ並びに前記担体が結合反応する部位であり、前記検出部は、前記ターゲット、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが結合した第１の結合体と、前記担体結合用プローブを介して前記担体と、が結合することにより形成された第２の結合体が
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに濃縮される部位であり、前記流路は、前記第２の結合体と前記第１の結合体が結合していない前記担体との前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、前記移動制御手段により、液体溶媒中において、比重が前記液体溶媒より大きい前記第２の結合体は前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できる、分析チップが挙げられる。本発明の分析方法は、例えば、前記分析チップを使用し、実施することにより、簡便に実施することができる。また、前記分析チップは、例えば、前記反応工程における結合反応、及び前記濃縮工程における濃縮を効果的に実施可能である。このため、本発明の分析方法は、前記分析チップを使用し、実施することにより、より優れた感度及び精度を実現できる。前記分析チップの説明は、例えば、後述する本発明のターゲット分析チップの説明を援用できる。
［００５９］
前記分析チップを使用する場合、前記分析方法は、例えば、前記反応部に前記試料を導入する工程（試料導入工程）、前記試料中のターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを接触させ、前記ターゲットと、前記標識プローブと、前記担体結合用プローブとを結合反応させ、第１の結合体を形成する工程（第１反応工程）、前記反応部に前記担体を導入する工程（担体導入工程）、前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、第２の結合体を形成する工程（第２反応工程）、前記反応部における第２の結合体を、前記疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）によって、前記検出部に移動させ、前記担体を濃縮する工程（濃縮工程）、及び、前記検出部において、前記濃縮された担体に結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程（分析工程）を含む。
［００６０］
前記試料導入工程は、例えば、前述のように、前記反応部に、前記試料を導入する工程である。前記試料の導入方法は、特に制限されない。前記試料は、例えば、前記反応部の開口から導入する。前記反応部において、後述するように、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが固定化されてい
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
る。その場合、この担体導入工程は省略できる。
［００６６］
前記第２反応工程は、例えば、前記第１の結合体と前記担体とを接触させ、前記第１の結合体と前記担体とを結合反応させ、第２の結合体を形成する工程である。この際、前記反応部において、前記第１の結合体と前記担体との混合物を、撹拌することが好ましい。前記撹拌の方法は、例えば、前述の撹拌方法が挙げられる。
［００６７］
次に、前記濃縮工程は、例えば、前記反応部における前記第２の結合体を前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに、前記疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）によって、前記検出部に移動させ、前記担体を濃縮する工程である。前記濃縮工程において、濃縮される担体は、前述のように、前記第２の結合体を形成している担体及び前記第２の結合体を形成していない担体の混合物である。
［００６８］
前記抵抗力（Ｒ）は、例えば、前記流路の内壁の疎水性の程度に応じて、適宜算出できる。具体例として、前記抵抗力（Ｒ）は、例えば、前記試料、前記試薬及び前記担体の混合物の表面張力、前記流路の内壁と、前記試料、前記試薬及び前記担体の混合物との接触角、前記分析チップの流路の幅及び高さ等から算出することができ、具体的には、下記式（１）で表される。前記流路の内壁と、前記試料、前記試薬及び前記担体の混合物との接触角（θ）が９０°以上の場合、前記抵抗力（Ｒ）は、例えば、下記式（１）により好適に算出できる。
［００６９］
Ｒ＝−２ｗｈγｃｏｓθ（１／ｗ＋１／ｈ）        ・・・（１）
Ｒ：抵抗力（Ｎ）
γ：試料、試薬及び担体の混合物の表面張力（Ｎ／ｍ）
θ：流路の内壁と、試料、試薬及び担体の混合物との接触角
ｗ：流路の幅（ｍ）
ｈ：流路の高さ（ｍ）
［００７０］
前記遠心力（Ｃ）は、特に制限されず、例えば、前記第２の結合体を前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに前記検出部に移動できればよい。本発明の分析方法において、前記試料、前記試
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
前記濃縮された担体に結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程である。前記標識の検出は、例えば、前述のように実施できる。
［００７４］
＜ターゲット分析チップ＞
本発明のターゲット分析チップ（以下、「分析チップ」ともいう。）は、前述のように、反応部、検出部、及び前記反応部と前記検出部とを連通する流路を備えた基板を有し、前記反応部は、試料中のターゲット、前記ターゲットに結合する標識プローブ、前記ターゲット及び光透過性を有する素材で形成された担体に結合する担体結合用プローブ並びに前記担体が結合反応する部位であり、前記検出部は、前記ターゲット、前記標識プローブ及び前記担体結合用プローブが結合した第１の結合体と、前記担体結合用プローブを介して前記担体と、が結合することにより形成された第２の結合体が前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに濃縮される部位であり、前記流路は、前記第２の結合体と前記第１の結合体が結合していない前記担体との前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段としての疎水性の内壁を有し、前記移動制御手段により、液体溶媒中において、比重が前記液体溶媒より大きい前記第２の結合体は前記第１の結合体が結合していない前記担体とともに、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする。
［００７５］
本発明の分析チップは、前記流路が、前記移動制御手段として前記疎水性の内壁を有することで、前記反応部から前記検出部への前記担体の移動を制御できることにより、例えば、前記反応部から前記検出部への自発的な毛管現象が発生せず、所定の遠心力によって、毛管現象が発生する。このため、本発明の分析チップは、例えば、前記反応部から前記検出部方向への自発的な毛管現象が発生せず、所定の遠心力によって、毛管現象が発生するチップということもできる。本発明の分析チップにおいて、前記反応部から前記検出部への移動を制御される担体は、前記第２の結合体を形成している担体及び前記第２の結合体を形成していない担体の混合物である。本発明の分析チップ
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月25日(2018.5.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
本発明の分析チップにおいて、前記基板の材質は、特に制限されず、例えば、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス又はＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ポリスチレン、アクリル樹脂、シクロオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート等の樹脂等が使用でき、後述する疎水性部材を使用することが好ましい。また、前記基板が、前述のように、前記下基板と前記上基板とを有する場合、前記両基板は、例えば、同じ材質でもよいし、異なる材質でもよい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
前記洗浄後のビーズに、アビジン結合反応液１８０μＬを添加した。前記アビジン結合反応液は、０．８μｍｏｌアビジン、０．２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、及び０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む水溶液とした。前記添加後、４℃の条件下で１４時間、得られた反応液を撹拌した。次に、前記反応液を２，８４０ｇで遠心分離し、上清１８０μＬを除去した。さらに、得られた沈殿に、ブロッキング溶液１８０μＬを添加した。前記ブロッキング溶液は、０．２ｍｏｌ／Ｌ  ２−アミノエタノール（エタノールアミン）、０．２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、及び０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む水溶液とした。そして、前記添加後、２０℃の条件下で３０分間、得られた反応液を撹拌した。前記撹拌後、２，８４０ｇで遠心分離し、上清１８０μＬを除去した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
次に、前記ビーズ分散液５０μＬに、０．６７μｍｏｌ／Ｌ  ビオチン修飾ＤＮＡを含む水溶液１５０μＬを添加した。前記添加後、２０℃の条件下で、３０分間、得られた混合液を撹拌した。さらに、２，８４０ｇで遠心分離し、上清を回収した。そして、前記上清について、吸光光度計（ＵＶ１８００、島津製作所社製）を用いて、スペクトルを測定した。また、前記ビオチン修飾ＤＮＡ溶液についても、同様にしてスペクトルを測定した。そして、前記上清及び前記ビオチン修飾ＤＮＡ溶液のスペクトルに基づき、常法により、アビジン修飾ビーズ１粒に対して結合可能なビオチンのモル数を算出した。その結果、前記アビジン修飾ビーズ１粒に対し結合可能なビオチンのモル数は、約４０ｆｍｏｌであった。このようなアビジン修飾ビーズを、後述する分析に使用した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
（３）分析
１．２５μｍｏｌ／Ｌ  ターゲットＲＮＡ分子、１．２５μｍｏｌ／Ｌ  ピレン標識プローブ、及び１．２５μｍｏｌ／Ｌ  ビオチン化プローブを含む１２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＰＢＳ（ｐＨ７．００）１２０μＬを調製した。前記調製後、１５℃の条件下で４時間、得られた反応液をインキュベートし、前記ターゲットＲＮＡ分子、前記ピレン標識プローブ、及び前記ビオチン化プローブを結合させた。次に、前記ビーズ分散液４０μＬを前記反応液に添加し、１５℃の条件下で１時間、得られた混合液を撹拌し、前記ターゲットＲＮＡ分子、前記ピレン標識プローブ、及び前記ビオチン化プローブの第１の結合体と、前記アビジン修飾ビーズとを結合させた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
前記分析チップの反応部１３内の前記ステンレス球を、磁力で回転（２００ｒｐｍ）させ、前記反応試薬を溶解した。この操作を、１０分間行った。次に、前記分析チップを、４，０００ｒｐｍ(回転半径５０ｍｍ)で６０秒間回転させ、反応部１３内の前記ビーズを検出部１５に移動させた。
【国際調査報告】
2017126479.tif 000011
2017126479.tif 000012
2017126479.tif 000013
2017126479.tif 000014