(57)【要約】  大量の非標的核酸と希少な標的核酸の混在した試料について、非標的核酸の核酸増幅を抑制し、かつ標的核酸を選択的に核酸増幅できる方法、当該核酸増幅方法と標的核酸の特異的リアルタイム検出方法を組み合わせた希少な変異型遺伝子を高感度で検出する方法、当該方法のための組成物及びキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、
（ｉ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド；及び
（ｉｉ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
を試料と接触させる工程を含む方法。
【請求項２】
非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基置換を生じた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸とハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズした際に前記ミスマッチに相当するミスマッチと少なくとももう１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
非標的核酸とハイブリダイズさせた際に１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記ミスマッチに相当するミスマッチともう１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドを使用することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
標的核酸とオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた際に生じる２つのミスマッチが、隣接するか又は５塩基までの間隔で位置していることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の挿入がなされた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸の当該挿入がなされた塩基配列を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の欠失が生じた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸の当該欠失が生じた部位を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが耐熱性菌由来のポリペプチドもしくはその変異体である請求項１〜６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
酸性高分子物質存在下で行われることを特徴とする請求項１〜７いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の標的核酸を選択的に増幅する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法；
（１）請求項１〜８いずれか１項に記載の方法で試料中の非標的核酸を切断する工程；及び
（２）標的核酸を増幅する工程。
【請求項１０】
標的核酸の増幅がＰＣＲによって行われることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の標的核酸を選択的に検出する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法；
（１）請求項９又は１０記載の方法で標的核酸を選択的に増幅する工程；及び
（２）上記工程（１）と同時に又は工程（１）の後で、標的核酸を検出する工程。
【請求項１２】
標的核酸の検出がサイクリング・プローブ法又はＴａｑＭａｎ法で行われることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項９〜１２いずれか１項に記載の方法のための組成物であって、
（ａ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｃ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含有する組成物。
【請求項１４】
請求項９〜１２いずれか１項に記載の方法のためのキットであって、
（ａ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｃ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含有するキット。
【請求項１５】
さらに酸性高分子物質を含むことを特徴とする請求項１３記載の組成物又は請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
酸性高分子物質存在下で標的核酸と、標的核酸と少なくとも１塩基が相違する塩基配列を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、
（ｉ）酸性高分子物質； 
（ｉｉ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｉｉｉ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、を試料と接触させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非標的核酸の核酸増幅を選択的に抑制する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド及びミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを組み合わせた標的核酸の高感度検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝性および後天性の疾患は、塩基置換、欠失および挿入などの遺伝子変異と関連したものがあることが知られている。これらの変異の中には、疾患があることと直接関連するものもあれば、疾患の危険性および／または予後と相関するものもある。その中で、疾患の進行に伴って、野生型遺伝子が変異型遺伝子に変化していく疾患や、変異型遺伝子を有する細胞の増加がみられる疾患においては、当該変異遺伝子の存在を調べることが重要になってくる。当該遺伝子変異を伴う後天的な疾患と関連遺伝子変異の例としては、肺がんとＥＧＦＲ遺伝子変異又はＫ−ｒａｓ遺伝子変異、肺扁平上皮がんとＤＤＲ２遺伝子変異、大腸がんとＫ-ｒａｓ遺伝子変異、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子変異又はＢ-ｒａｆ遺伝子変異、胃がんとＫｉｔ遺伝子変異又はＰＤＧＦＲＡ遺伝子変異が挙げられる。【０００３】
また、上記事例の逆の場合もありうる。例えば、遺伝子変異を伴う後天的な疾患を治療している過程において、今度は変異型遺伝子が減少し、野生型遺伝子が増加してくる状況をモニターリングする場合などである。微小残存病変検出などが例示される。【０００４】
これらの遺伝子変異を解析する方法として、従来は制限酵素断片長多型法（ＲＦＬＰ法）が用いられたが、操作が煩雑で長時間を要する上、一塩基多型（ＳＮＰ）部位近辺の塩基配列によっては適用が不可能な場合が多いなど、臨床検査の現場で使用するには問題の多いことが指摘されてきた。そこで近年では、より簡便で汎用性のある手法としてＩｎｖａｄｅｒ法、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法、一塩基伸長法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ａｓｓａｙ法など種々の方法が開発されている。しかしながら通常のＰＣＲ法では、野生型遺伝子に混入する微量の変異型遺伝子が５％未満の場合、変異型遺伝子由来の標的核酸が検出できる量に達する前に増幅反応自体がプラトーに達してしまい、結局のところ標的核酸を十分検出できない。【０００５】
このように変異型遺伝子を標的核酸として検出するのにＰＣＲ法は非常に有効なツールである。しかしながらＰＣＲ法では増幅産物の濃度が高くなるに従い、増幅産物同士のアニールとプライマーのアニールとの競合が増加し、ついにはプライマーがアニールできなくなって反応がプラトーに達する。その結果、ＳＮＰや短い欠失や挿入を含む標的核酸の増幅断片は、大過剰に存在する非標的核酸の増幅断片とアニールしてしまうため、増幅反応がプラトーに達した時点では、標的核酸の増幅断片の存在比は反応前の存在比を下回っている。従って、同一領域の微量なＳＮＰや欠失、挿入を検出する場合には、野生型遺伝子由来の核酸の増幅を抑制した変異型遺伝子由来の核酸の特異的な増幅が必要となる。【０００６】
野生型遺伝子の核酸増幅を抑制し、変異型遺伝子由来の核酸を選択的に増幅する方法としては、Ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ＰＣＲ法（非特許文献１）やＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ法（非特許文献２、３および特許文献１）が報告されている。当該方法では、目的遺伝子の変異部位の塩基配列を含むプライマーの内部に制限酵素の認識・切断サイトを導入し、野生型遺伝子の増幅を抑制し、変異型遺伝子を選択的に増幅させる。しかしながら、これらの方法では、解析したい目的遺伝子の変異部位を認識・切断する制限酵素を選択する必要があり、さらに当該制限酵素が認識・切断するのは、野生型遺伝子でなければならない。また、当該制限酵素は、ＰＣＲ法のサイクルの間に失活してはならない。これらの要件を満たす制限酵素は限られており、適用可能な野生型遺伝子及び変異型遺伝子の対象が限られているという問題がある。【０００７】
別の野生型遺伝子及び変異型遺伝子の核酸を増幅する方法として、Ｍｕｔａｎｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ３’−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ（ＭＥＭＯ）法（非特許文献４及び特許文献２）が提案された。当該方法では、目的遺伝子の変異部位を含む３’末端ブロッキングプイライマーを使用する。この３’末端ブロッキングプイライマーは、野生型遺伝子に１００％マッチするが変異型遺伝子とはミスマッチする特徴を有している。当該３’末端ブロッキングプライマーにより野生型遺伝子の核酸増幅において増幅用プライマーのアニーリング及び伸長が阻害される。一方、変異型遺伝子に対しては、当該３’末端ブロッキングプイライマーとの間に生じるミスマッチに起因する不安定性により増幅用プライマーのアニーリング及び伸長は阻害されない。その結果、変異型遺伝子の核酸の増幅が優先される。当該方法での検出は、融解曲線解析やシークエンシングにて行う。しかしながら、この方法では、３’末端ブロッキングプイライマーが野生型遺伝子のプライマー伸長反応のみを阻害するようにハイブリダイズさせる必要があり、核酸増幅反応中の温度を厳格にコントロールする必要がある。また、もとの試料中に大量に存在する野生型遺伝子の初期量は保持されたままであり、当該野生型遺伝子の核酸の予期せぬ増幅を減少させることはできない。【０００８】
また最近になって、耐熱性のミスマッチエンドヌクレアーゼを用いた変異検出方法（特許文献３）が報告された。しかしながら、これらの方法でも野生型遺伝子の核酸増幅を抑制し、変異型遺伝子を選択的に増幅し、変異遺伝子の存在のみを正確に検出するにはまだまだ問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第１９９６／３２５００号パンフレット
【特許文献２】米国第２０１３／０１４９６９５号公開公報
【特許文献３】国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ロイケミア  （Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、第５巻、第２号、１６０〜１６１頁（１９９１年）
【非特許文献２】オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、第６巻、第６号、１０７９〜１０８３頁（１９９１年）
【非特許文献３】アメリカン  ジャーナル  オブ  パソロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、第１５３巻、３７３−３７９頁（１９９８年）
【非特許文献４】ザ  ジャーナル  オブ  モレキュラー  ダイアグノスティクス（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、第１３巻、６５７−６６８頁（２０１１年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、非標的核酸に対して微量な標的核酸の高感度検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ミスマッチ部位を認識・切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの特性、特にミスマッチの種類や位置と切断活性との相関を解析した。その結果、配列中の少なくとも１塩基が相違する２種の核酸について、相違する塩基の種類に制限されることなく、そのうちの任意の一方を切断できる方法を見出した。また、当該方法で大量の非標的核酸と希少な標的核酸の混在した試料を処理することで、非標的核酸を選択的に切断することが可能となり、希少な標的核酸を選択的に核酸増幅できる方法、さらに当該核酸増幅方法を用いた標的核酸の高感度検出方法を見出し、本発明を完成させた。【００１３】
すなわち、本発明の第一の発明は、標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、
（ｉ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド；及び
（ｉｉ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、
を試料と接触させる工程を含む方法に関する。【００１４】
本発明の第一の発明において、非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基置換を生じた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸とハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズした際に前記ミスマッチに相当するミスマッチと少なくとももう１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであってもよい。また、当該オリゴヌクレオチドは、非標的核酸とハイブリダイズさせた際に１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記ミスマッチに相当するミスマッチともう１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドであってもよい。さらに当該オリゴヌクレオチドにおいては、標的核酸とオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせた際に生じる２つのミスマッチが、隣接するか又は５塩基までの間隔で位置しているものが好適に使用できる。【００１５】
本発明の第一の発明の別態様としては、非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の挿入がなされた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸の当該挿入がなされた塩基配列を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドを使用する方法が挙げられる。【００１６】
さらに別態様としては、非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の欠失が生じた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸の当該欠失が生じた部位を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドを用いる方法が挙げられる。【００１７】
本発明の第一の発明においては、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとして、耐熱性菌由来のポリペプチドもしくはその変異体を使うことができる。また、本発明は、酸性高分子物質存在下で行うことができる。さらに、増殖細胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。【００１８】
本発明の第二の発明は、標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の標的核酸を選択的に増幅する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法；
（１）前記第一の発明の方法で試料中の非標的核酸を切断する工程；及び
（２）標的核酸を増幅する工程、に関する。【００１９】
また、本発明の第二の発明において、標的核酸の増幅はＰＣＲによって行うことができる。【００２０】
本発明の第三の発明は、標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の標的核酸を選択的に検出する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法；
（１）前記第二の発明の方法で標的核酸を選択的に増幅する工程；及び
（２）上記工程（１）と同時に又は工程（１）の後で、標的核酸を検出する工程、に関する。【００２１】
また、本発明の第三の発明において、標的核酸の検出はサイクリング・プローブ法又はＴａｑＭａｎ（登録商標）法で行うことができる。【００２２】
本発明の第四の発明は、本発明の第二又は第三の発明のための組成物であって、
（ａ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｃ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含有する組成物、に関する。【００２３】
本発明の第五の発明は、本発明の第二又は第三の発明のためのキットであって、
（ａ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド；
（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｃ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含有するキット、に関する。【００２４】
本発明の第四又は第五の発明において、さらに酸性高分子物質を含んでもよい。また、当該発明において、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド並びにＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、耐熱性のポリペプチドであってもよく、変異体であってよい。さらに、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を含んでいてもよい。【００２５】
本発明の第六の発明は、酸性高分子物質存在下で標的核酸と、標的核酸と少なくとも１塩基が相違する塩基配列を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、
（ｉ）酸性高分子物質；
（ｉｉ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド；及び
（ｉｉｉ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、を試料と接触させる工程を含む方法、に関する。【００２６】
本発明の第六の発明において、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、耐熱性のポリペプチドであってもよく、変異体であってもよい。また、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、大量の非標的核酸と希少な標的核酸の混在した試料について、非標的核酸の核酸増幅を抑制し、かつ標的核酸を選択的に核酸増幅できる方法が提供される。また、当該核酸増幅方法と標的核酸の特異的リアルタイム検出方法を組み合わせることで、希少な変異型遺伝子の高感度での検出を可能とする方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施例１で調製した各存在比率の非標的核酸及び標的核酸を含む試料のリアルタイム検出結果である。
【図２】実施例２で調製した各存在比率の非標的核酸及び標的核酸を含む試料のリアルタイム検出結果である。
【図３．Ａ】実施例３の本発明の切断方法における酸性高分子物質の効果（アルギン酸ナトリウム非存在下）を示したリアルタイム検出結果である。
【図３．Ｂ】実施例３の本発明の切断方法における酸性高分子物質の効果（５６μg／ｍｌのアルギン酸ナトリウム存在下）を示したリアルタイム検出結果である。
【図３．Ｃ】実施例３の本発明の切断方法における酸性高分子物質の効果（１４０μg／ｍｌのアルギン酸ナトリウム存在下）を示したリアルタイム検出結果である。
【図３．Ｄ】実施例３の本発明の切断方法における酸性高分子物質の効果（１６８μg／ｍｌのアルギン酸ナトリウム存在下）を示したリアルタイム検出結果である。
【図４】実施例５で調製した各存在比率の非標的核酸及び標的核酸を含む試料のリアルタイム検出結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明においてミスマッチとは、二本鎖核酸中に存在するワトソン−クリック塩基対とは異なる塩基の対合、すなわちＧ（グアニン塩基）−Ｃ（シトシン塩基）、Ａ（アデニン塩基）−Ｔ（チミン塩基）またはＵ（ウラシル塩基）の塩基対結合以外の組み合わせの塩基結合を示す。
【００３０】
本発明において、標的核酸とは、検出することが望まれる任意の核酸（例えば天然の遺伝子を構成する核酸、人為的に作製された核酸が挙げられる）を言う。本発明は、当該標的核酸をこれと類似した塩基配列の非標的核酸と区別することに有用である。特に本発明を限定するものではないが、本発明における標的核酸、非標的核酸にはＤＮＡが好適である。
【００３１】
特に限定はされないが、例えば標的核酸と非標的核酸としては、変異型遺伝子由来の核酸と当該変異型遺伝子に対応する野生型遺伝子由来の核酸の組み合わせ、人為的変異導入後の核酸と変異導入前の核酸の組み合わせ、バイサルファイト処理された核酸と処理前のメチル化された核酸の組み合わせ、あるいは置換、欠失、挿入が生じた後の核酸とこれら変異が生じる前の核酸の組み合わせ、薬剤投与の前及び後に生体、組織、細胞等から採取された核酸の組み合わせ等が挙げられる。なお本発明においては、標的核酸を上記例示のどちらの核酸に設定するかによって、組み合わせ中の標的核酸と非標的核酸が入れ替わることもありうる。
【００３２】
以下、さらに詳細に説明する。
【００３３】
（１）本発明の非標的核酸の選択的切断方法
本発明は、標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸とを含有する試料中において、非標的核酸のみを選択的に切断する方法を提供する。ここで、「標的核酸と相同な塩基配列の領域を有する非標的核酸」とは、非標的核酸の塩基配列中に、標的核酸の塩基配列の少なくとも一部と相同性のある塩基配列が含まれていることを意味する。例えば、標的核酸が有している塩基配列に１以上の塩基置換を生じた塩基配列を有している非標的核酸、標的核酸が有している塩基配列に１以上の塩基の挿入がなされた塩基配列を有している非標的核酸、標的核酸が有している塩基配列に１以上の塩基の欠失が生じた塩基配列を有している非標的核酸などが挙げられる。相同な配列における塩基置換、挿入、又は欠失の数は、特に限定されない。しかしながら本発明では標的核酸と非標的核酸の塩基配列で少なくとも１塩基の違いがあれば当該核酸を区別することができる。さらに相違する塩基数が増加するにつれて、標的核酸と非標的核酸の識別精度も向上させることができる。
【００３４】
本発明の第一の態様では、標的核酸と、標的核酸と相同な塩基配列の領域を有している非標的核酸の混合物中で、非標的核酸が選択的に切断される。前記の方法は、非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド（以下、抑制オリゴヌクレオチドと称することがある）とミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを用いる。抑制オリゴヌクレオチドを非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じる少なくとも１つのミスマッチの数は、非標的核酸の選択的切断が起こる範囲であれば特に限定されず、抑制オリゴヌクレオチドの鎖長にもよるが、例えば、１〜７個、１〜５個、又は１〜３個などが挙げられる。また、上記ミスマッチの数を抑制オリゴヌクレオチドの鎖長に占める％で表現すると、例えば、１〜２０％、３〜１５％、又は４〜８％の範囲である。本態様について、塩基配列中の１つの塩基のみが相違する標的核酸、非標的核酸の組合せを例として説明する。当該抑制オリゴヌクレオチドを標的核酸とハイブリダイズさせると、標的核酸、非標的核酸の間で相違する塩基との間でミスマッチ（以降、第１のミスマッチと称することがある）を生じるとともに、もう一つの別のミスマッチ（以降、第２のミスマッチと称することがある）を生じる。
【００３５】
前記第１のミスマッチの塩基は、標的核酸と非標的核酸の間で相違する塩基に関連するものであり、共存するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるか否かは問わない。
【００３６】
一方、第２のミスマッチは、共存するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるミスマッチ塩基である。特に限定はされないが例えば、グアニン塩基−グアニン塩基、グアニン塩基−チミン塩基、又はチミン塩基−チミン塩基を認識・切断するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの場合は、これらから選択されるミスマッチが形成されるように抑制オリゴヌクレオチドが設計される。
【００３７】
また当該抑制オリゴヌクレオチドは、非標的核酸とハイブリダイズさせた際には、前記の第２のミスマッチを生じるが、第１のミスマッチは生じない。
【００３８】
以上のような性質を備えた抑制オリゴヌクレオチドを設計して使用することにより、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによる非標的核酸の選択的な切断が可能となる。本発明は、前記のような１つもしくは２つのミスマッチを形成できる抑制オリゴヌクレオチドの使用に限定されるものではなく、所望の核酸の選択的切断が起こる範囲で、３以上のミスマッチを生じる抑制オリゴヌクレオチドを設計し、使用してもよい。この場合、標的核酸および非標的核酸において生じる少なくとも１つのミスマッチが前記第２のミスマッチであればよく、その他のミスマッチについて、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるか否かは問わない。好ましくは、前記３以上のミスマッチは、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるものである。
【００３９】
本発明の方法で使用する抑制オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡで構成されるが、その一部をヌクレオチドアナログやＲＮＡとしてもよい。即ち、非標的核酸とハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを有する二本鎖核酸を形成する構造を有し、さらに前記ミスマッチが共存するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによって認識・切断されるものであれば特に限定はされない。
【００４０】
例えば、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを使用して２種の核酸における１塩基の相違を識別する場合には、通常、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが本来認識しうるミスマッチが前記核酸の一方で形成されるようなオリゴヌクレオチドを作製して使用される。
【００４１】
しかしながら、識別しようとする塩基によってはミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが本来認識するミスマッチを形成させられない場合がある。このような場合は、本発明の方法のように、核酸上の識別しようとする塩基以外の領域でミスマッチを生じさせ、これを前記塩基の違いに基づいたミスマッチの形成／非形成と組み合わせることによって、一方の核酸の選択的な切断を起こすことができる。すなわち本発明では、塩基配列中の少なくとも１塩基相違する２種の核酸のうち、一方とハイブリダイズした場合にはミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが本来認識する少なくとも１つのミスマッチを形成し、他方とハイブリダイズした場合には前記のミスマッチに加えて、２種の核酸の塩基配列中の相違する塩基に由来する少なくとも１つのミスマッチが形成されるような塩基配列のオリゴヌクレオチドが利用される。このオリゴヌクレオチド（抑制オリゴヌクレオチド）とミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとを組み合わせることにより、１つのミスマッチが生じた二本鎖核酸は前記ポリペプチドにより切断されるが、２つ以上のミスマッチが生じた二本鎖核酸ではそのような切断は起こらない。
【００４２】
従って本発明の方法の別態様としては、非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基置換を生じた塩基配列を有しており、非標的核酸とハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズした際に前記ミスマッチに相当するミスマッチと少なくとももう１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドと、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとを試料と接触させることを特徴とする方法が挙げられる。当該態様では、前記オリゴヌクレオチドは、非標的核酸あるいはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に１つのミスマッチ（第２のミスマッチ）を生じ、かつ標的核酸あるいはその相補鎖とハイブリダイズさせた際に前記ミスマッチに相当するミスマッチともう１つのミスマッチ（第１のミスマッチ）を生じるものも含まれる。
【００４３】
例えば、ある変異型遺伝子の塩基変異部位（例えば、ＳＮＰ）の塩基ではミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが本来認識するミスマッチを形成させることができない場合は、標的核酸とする当該変異型遺伝子のＳＮＰ部位でのミスマッチの他に、当該ＳＮＰ部位の近傍にもう一つのミスマッチが形成されるような塩基配列を有する抑制オリゴヌクレオチドを作製することができる。前記の、もう一つのミスマッチは、ＳＮＰと無関係な塩基、すなわち変異型遺伝子と野生型遺伝子に共通する塩基で形成され、かつ、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断可能なミスマッチである。また、この抑制オリゴヌクレオチドの、当該ＳＮＰ部位の塩基に対応する塩基は野生型遺伝子の塩基に正しく対合するものとしておく。野生型遺伝子の核酸に抑制オリゴヌクレオチドがハイブリダイズして形成される二本鎖核酸にはミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで切断可能な１つのミスマッチが形成されることから、野生型遺伝子の核酸は選択的に切断される。一方、変異型遺伝子の核酸では２つのミスマッチが形成されるために抑制オリゴヌクレオチドが安定的にハイブリダイズできず、さらに前記ポリペプチドによる切断が妨害される。このように本発明の方法では、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによる野生型遺伝子の選択的切断が、共存する変異型遺伝子の塩基変異部位と異なる位置で行われることが特徴である。
【００４４】
また、本発明の方法の別態様は、非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の挿入がなされた塩基配列を有しており、オリゴヌクレオチドが非標的核酸の当該挿入がなされた塩基配列を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドとミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを試料と接触させることを特徴とする方法が挙げられる。当該態様においては、前記オリゴヌクレオチド（抑制オリゴヌクレオチド）のハイブリダイズする領域は、標的核酸には存在しないが、非標的核酸には存在する領域から選択することが好適である。あるいは前記ハイブリダイズする領域は、標的核酸には存在しない領域と存在する領域にまたがる領域であってもよい。
【００４５】
このような抑制オリゴヌクレオチドは、非標的核酸とハイブリダイズした場合に、少なくともミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによって認識・切断されるミスマッチが１つ以上形成されるように設計する。このように設計したオリゴヌクレオチドは、非標的核酸に挿入された塩基配列を有しない標的核酸との間ではさらに数多くのミスマッチを形成して二本鎖核酸が不安定化されるか、もしくは標的核酸とハイブリダイズできない。さらにミスマッチを生じさせる場合には当該ミスマッチの配置には限定はない。
【００４６】
さらに本発明の方法の別態様しては、非標的核酸が、標的核酸が有している塩基配列に塩基の欠失が生じた塩基配列を有しており、非標的核酸の当該欠失が生じた部位を含む領域にハイブリダイズした際に少なくとも１つのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチドとミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを試料と接触させることを特徴とする方法が挙げられる。当該態様においては、前記オリゴヌクレオチド（抑制オリゴヌクレオチド）のハイブリダイズする領域は、非標的核酸上の前記の欠失が生じた部位を含む領域から選択することが好適である。また、抑制オリゴヌクレオチドは、非標的核酸とハイブリダイズした場合にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによって認識・切断されるミスマッチが１つ以上形成されるように設計する。このように設計したオリゴヌクレオチドは、非標的核酸では失われている塩基配列を有する標的核酸との間ではさらに数多くのミスマッチを形成して二本鎖核酸が不安定化されるか、もしくは標的核酸とハイブリダイズできない。さらにミスマッチを生じさせる場合には当該ミスマッチの配置には限定はない。
【００４７】
本発明の方法に使用される抑制オリゴヌクレオチドの鎖長は、７塩基以上のものが好ましく、特に限定はされないが７〜４０塩基、好ましくは１０〜３０塩基、特に好ましくは１１〜２５塩基の範囲である。また、抑制オリゴヌクレオチドの塩基配列は、非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるように設計される。この際、標的核酸（例えば変異型遺伝子由来の核酸）あるいはその相補鎖とハイブリダイズした場合に、標的核酸と非標的核酸とで相違する塩基との間でミスマッチを形成するとともに、当該塩基の位置から５’側あるいは３’側に、好ましくは５塩基の範囲、特に好ましくは２塩基の範囲、あるいは隣接して、少なくとももう１つのミスマッチ塩基を有するような塩基配列が選択される。即ち、２つのミスマッチが５塩基以内に配置されるものが好適に使用できる。さらに、両ミスマッチは、当該オリゴヌクレオチドの中心塩基に近い領域に設定することが好ましい。また、この塩基配列のオリゴヌクレオチドは非標的核酸（例えば野生型遺伝子由来の核酸）とハイブリダイズした場合には、標的核酸と非標的核酸とで相違する塩基との間でミスマッチを形成しない。また、標的核酸あるいはその相補鎖とハイブリダイズした場合に標的核酸と非標的核酸とで相違する塩基との間で生じるミスマッチは、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるものであっても、されないものであってもよい。さらに、標的核酸または非標的核酸あるいはそれらの相補鎖とハイブリダイズした場合に、標的核酸と非標的核酸とで相違する塩基以外の塩基との間で生じるミスマッチのうち少なくとも１つは、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで認識・切断されるものである。このような抑制オリゴヌクレオチドのデザインにより、本発明の方法は、制限酵素等を用いる従来技術に比べ格段に変異検出のターゲットを広げることができる。さらに、本発明を特に限定するものではないが、このオリゴデオキシヌクレオチドの３’端は、このオリゴデオキシヌクレオチドからのＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応を抑制するための修飾を施されていてもよい。例えば、アミノ化などの修飾が例示される。
【００４８】
本発明の方法において、抑制オリゴヌクレオチドは、ミスマッチ塩基の認識・切断に最適なミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドと組み合わせて使用される。特に限定はされないが例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰＦ００１２ポリペプチド（国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレット）あるいは当該ペプチドの変異体（総称してＮｕｃＳタンパク質と記載することがある）が好適に使用できる。また、前記ポリペプチドの、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ由来のホモログ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ９Ｖ２Ｅ８）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｐｈｉｌｕｓ由来のホモログ（ＲｓｆＳｅｑ  ＩＤ：ＹＰ＿００４０７２０７５）やＭｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のホモログ（ＲｓｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＰ  ２４７１９４）由来のホモログ、あるいはそれらの変異体も本発明の方法で好適に使用できる。
【００４９】
本発明の好適な態様においては、並行して行われる核酸増幅や検出のために耐熱性菌由来のミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを用いることが好ましい。特に限定はされないが、例えばＰＣＲのような熱サイクル中でも安定に活性を保持するものが好ましく、５０℃以上、さらに好ましくは、７０℃以上、より好ましくは９０℃以上でも失活しないポリペプチドが使用できる。
【００５０】
本発明の方法は、酸性高分子物質存在下で実施することができる。当該酸性高分子物質は、それが共存することによって、当該ポリペプチドのミスマッチ認識・切断活性を制御する効果が確認されている。当該効果は、試料中の核酸量が少ない場合において、より効果を発揮する。当該酸性高分子物質としては、ポリアニオンであるものが好ましい。また糖骨格を有する酸性多糖あるいは直鎖炭素鎖を有する酸性多糖が好ましい。酸性高分子物質としては、フコース硫酸含有多糖、デキストラン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、ラムナン硫酸、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、アルギン酸、ペクチン、ポリグルタミン酸、ポリアクリル酸、ポリビニル硫酸、ポリスチレン硫酸、およびそれらの塩、あるいは標的核酸及び非標的核酸とは異なる核酸からなる群より選択された１種以上を使用することができる。
【００５１】
本発明の方法は、さらに、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。
【００５２】
（２）本発明の標的核酸の選択的増幅方法
本発明の核酸の選択的な増幅方法は、類似した塩基配列の領域を有する２種の核酸（標的核酸及び非標的核酸）が存在する試料において、前記核酸のうちの一方（標的核酸）を選択的に増幅する方法であって、（１）本発明の非標的核酸の選択的切断方法で試料中の非標的核酸を切断する工程、及び（２）標的核酸を増幅する工程、を含むことを特徴とする。前記の２つの工程は、それぞれを段階的に行っても良いし、両工程を同時に行ってもよい。即ち、後者では核酸増幅反応中に非標的核酸の切断が生じていればよい。
【００５３】
本発明の標的核酸の選択的増幅方法においては、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドで非標的核酸が選択的に切断され、その存在比率が低下した結果、標的核酸が選択的に増幅される。核酸増幅の工程には、公知の核酸増幅方法が利用できるが、前記抑制オリゴヌクレオチドが非標的核酸とハイブリダイズ可能な環境を経る核酸増幅方法が好ましい。特に好ましくは、ＰＣＲ法を本発明の方法に使用できるが、これに限定はされない。
【００５４】
本発明では、核酸増幅を酸性高分子物質存在下で実施することができる。前記の（１）、（２）両工程を同時に実施する態様では、当該酸性高分子物質の効果により、核酸増幅の効率向上とミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによる非標的核酸の認識・切断の効率向上を同時に達成することができる。当該効果は、試料中の核酸量が少ない場合において、より効果を発揮する。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。
【００５５】
さらに本発明の方法は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。
【００５６】
（３）本発明の標的核酸の選択的検出方法
本発明の標的核酸の選択的検出方法は、（１）本発明の標的核酸の選択的増幅方法で標的核酸を増幅する工程、及び（２）上記工程（１）と同時又は工程（１）の後で、標的核酸を検出する工程、を含むことを特徴とする。当該検出方法を多量の非標的核酸と微量の標的核酸とを含有する試料に適用した場合には、出発試料中の非標的核酸と標的核酸の存在比率と検出工程での存在比率は逆転する。言い換えれば、非標的核酸の増幅を抑制しつつ標的核酸を増幅することにより、標的核酸を感度よく検出することが可能となる。本発明の検出方法は、工程（１）の後に工程（２）を実施してもよく、両工程を同時に実施することもできる。工程（２）の検出方法は、増幅物の検出や定量を実施する方法でもよく、増幅物をその塩基配列特異的に検出する方法であってもよい。例えばエンドポイント検出では、ダイレクトシーケンス法やインターカーレーターによる高解像度融解曲線解析（ＨＲＭ：Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｃｕｒｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）法を用いることができる。またリアルタイム検出では、配列特異的プローブを使用するサイクリング・プローブ法（例えば国際公開第２００３／０７４６９６号）やＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ法（例えば国際公開第９２／０２６３８号）と組み合わせることができる。特に好ましくは、ＰＣＲ法と組み合わせることができるサイクリング・プローブ法による検出である。
【００５７】
ＰＣＲ法に使用するプライマー対は、標的核酸及び非標的核酸中の、両核酸で相違している配列を含む領域（すなわち抑制オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な領域）が増幅されるように設計すればよい。プライマーの設計および合成は公知の方法で実施することができる。
【００５８】
特に限定はされないが上記サイクリング・ブローブ法で検出する場合には、当該検出系にリボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドを共存させる。当該リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドは、耐熱性のものが好ましい。特に限定はされないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ由来、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来、又はＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ由来のリボヌクレアーゼＨが好適に使用できる。
【００５９】
サイクリング・プローブ法では標的核酸を非標的核酸と区別して検出することが可能である。このような検出に使用可能なプローブ（キメラオリゴヌクレオチドプローブ）は公知の方法、例えば国際公開第２０１２／０１４９８８号パンフレットに開示された方法により設計することができる。当該キメラオリゴヌクレオチドプローブは、ＲＮＡ部分を挟んで一方が蛍光物質で、もう一方がその蛍光物質の発する蛍光を消光する物質（クエンチャー）で標識されているものが好適である。当該物質の組合せとしては、６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＤＡＢＣＹＬ（４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ−４’−ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＲＯＸ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）とＤＡＢＣＹＬ、６−ＦＡＭとＥｃｌｉｐｓｅ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＲＯＸとＥｃｌｉｐｓｅ、ＴＥＴ（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＤＡＢＣＹＬ、ＴＥＴとＥｃｌｉｐｓｅ等が好適に使用できる。
【００６０】
本発明の標的核酸の選択的検出方法において使用する抑制オリゴヌクレオチドは、本発明の非標的核酸の選択的切断方法で説明した抑制オリゴヌクレオチドの特性を備え、さらに標的核酸の検出方法で用いるオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした場合に共存するミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによって認識・切断されないように設計することが好ましい。
【００６１】
ＰＣＲを利用する本発明の検出方法においては、さらに陽性対照核酸の増幅と検出を組み合わせてもよい。前記陽性対照核酸は、試料中に最初から存在する検出の対象となる遺伝子と異なる遺伝子の核酸（例えば、ハウスキーピング遺伝子など）が好ましい。試料中に最初から存在する遺伝子を陽性対照核酸とする場合は、当該遺伝子の任意の領域を増幅させるためのプライマー対と検出用プローブを組み合わせて使用する。また、人工核酸を調製して試料に予め添加してもよく、例えば、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域と同じ領域あるいは標的核酸及び非標的核酸の増幅領域とは異なる領域の核酸であってもよい。予め試料に既知量を添加した人工核酸を陽性対照核酸とする場合は、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域と同じプライマーで増幅可能であれば共通のプライマー対を使用し、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域とは異なる領域であれば当該領域増幅用のプライマー対を使用する。当該陽性対照核酸を検出するためのプローブは、これらの陽性対照核酸を選択的に検出できるものを使用する。本発明の標的核酸の検出と同時にこれらの陽性対照核酸の検出を行うことにより、本発明の検出系での増幅に異常かないかどうかの確認、並びに増幅曲線の比較による標的核酸の初期量の半定量的な解析が可能となる。
【００６２】
本発明の検出方法は、酸性高分子物質存在下で実施することができる。当該酸性高分子物質の効果は、サンプルの核酸量が少ない場合において、より効果を発揮する。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。本発明の方法は、さらに増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。
【００６３】
本発明の検出方法は、特定の塩基配列を有する核酸、例えば変異の存在が知られている遺伝子に対応する核酸について、野生型遺伝子と変異型遺伝子とを区別して検出することを可能にする。変異型遺伝子の塩基配列を有する核酸を標的核酸に、また野生型遺伝子の塩基配列を有する核酸を非標的核酸に設定して本発明の検出方法を実施することにより、大過剰の正常対立遺伝子（すなわち野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ）の存在下における少数の変異対立遺伝子の検出が可能となる。例えば血中循環腫瘍ＤＮＡの検出や母親の血液中に含有されている少量の胎児ＤＮＡ配列の検出に本発明の方法は有用である。当該変異としては、微小欠失及び点突然変異が例示される。
【００６４】
本発明を特に限定するものではないが、前記の特定の塩基配列を有する核酸としては、腫瘍マーカーとして利用される一塩基多型変異、癌治療用薬剤による治療効果と相関する一塩基多型変異、及び細胞の癌化との相関が知られている一塩基多型変異からなる群より選択された少なくとも１つの一塩基多型変異を含む核酸が好ましい。ＳＮＰｓには、腫瘍細胞に高頻度で認められるものや、癌治療用薬剤による治療効果や発癌との相関が知られているものがある。このような後天的遺伝子変異としては、Ｋ−ｒａｓ遺伝子、Ｂ−ｒａｆ遺伝子、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）遺伝子の変異が例示される。Ｋ−ｒａｓ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸癌、肺腺癌、甲状腺癌等において高頻度で認められる。Ｂ−ｒａｆ遺伝子の体細胞変異は、結腸直腸癌、悪性黒色腫、甲状腺乳頭癌、非小細胞肺癌、肺腺癌等において高頻度で認められる。また、ＥＧＦＲ遺伝子の体細胞変異は、様々な固形腫瘍において高頻度で認められる。ゲフィチニブやエルロチニブ等のＥＧＦＲ阻害剤による癌の治療は、癌組織のＥＧＦＲ遺伝子が特定の一塩基多型変異を有する場合に有効である可能性が高いことが知られている。一方、癌組織のＫ−ｒａｓ遺伝子が一塩基多型変異を有する場合には、ＥＧＦＲ阻害剤への抵抗性を示す可能性が高いことが知られている。
【００６５】
本発明の検出方法は、メチル化解析にも利用することができる。例えば、生物由来試料から抽出したメチル化ＤＮＡを野生型遺伝子とし、当該野生型遺伝子を含む組成物を亜硫酸水素塩処理した後に得られたＤＮＡを変異型遺伝子として実施してもよい。本発明の検出方法によれば、大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子の検出、あるいは大過剰のメチル化対立遺伝子の存在下における少数の非メチル化対立遺伝子の検出を行うことができる。
【００６６】
前記の亜硫酸水素塩による処理として、メチル化ＤＮＡの検出に用いられる公知の亜硫酸水素塩法（バイサルファイト法）が利用できる。当該処理により非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンは変化しない。さらに、このバイサルファイト処理済みの反応液をＰＣＲ法で増幅すると、ウラシルはチミンに変換され、メチル化シトシンはシトシンとなる。つまり特定の部位での大過剰の非メチル化対立遺伝子の存在下における少数のメチル化対立遺伝子の検出、あるいは大過剰のメチル化対立遺伝子の存在下における少数の非メチル化対立遺伝子の検出は、それぞれ大過剰のチミン含有核酸の中のシトシン含有核酸の存在、または大過剰のシトシン含有核酸の中のチミン含有核酸の存在を検証することに他ならない。ここで大過剰に存在するチミンあるいはシトシンを含有するＤＮＡからの増幅を抑制できれば、少数のメチル化対立遺伝子あるいは非メチル化対立遺伝子の存在はたやすく検証することができる。
【００６７】
本発明の検出方法では、反応液中にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドと野生型遺伝子との間でミスマッチを生じる抑制オリゴデオキシヌクレオチドを添加することにより、野生型遺伝子の増幅を抑制し、かつ希少な変異型遺伝子を選択的に増幅、簡便に検出することができる。また、後述の実施例で示すように本来の塩基変異部位と当該変異部位と異なる位置に少なくとももう一つミスマッチを人為的に設定することで当該塩基変異部位の塩基の種類にとらわれることなく、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが認識・切断可能な抑制オリゴヌクレオチドを幅広く設計できる。
【００６８】
（４）本発明の組成物
本発明の標的核酸の選択的増幅方法及び／又は標的核酸の選択的検出方法のための組成物としては、（ａ）標非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｃ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、及び（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、を含有する組成物が例示される。
【００６９】
当該組成物は、酸性高分子物質を含んでいてもよい。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。
【００７０】
本発明の組成物は、さらに増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を含んでいてもよい。
【００７１】
また、ＰＣＲにより標的核酸の検出を実施する本発明の標的核酸の選択的検出方法に使用される組成物は、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチド又はその変異体、キメラオリゴヌクレオチドであるサイクリング・プローブ、あるいはＴａｑＭａｎプローブを含んでいてもよい。特にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドは、野生型ポリペプチドあるいは変異型ポリペプチドのいずれから選択してもよい。特に限定はされないが、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとしてＰｆｕ由来ＮｕｃＳタンパク質の変異体が好適である。さらに陽性対照核酸検出用のプライマー対とキメラオリゴヌクレオチドプローブあるいはＴａｑＭａｎプローブを組み合わせてもよい。
【００７２】
（５）本発明のキット
本発明の標的核酸の選択的増幅方法及び／又は標的核酸の選択的検出方法のためのキットとしては、（ａ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、（ｂ）少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｃ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、及び（ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド又はその変異体、を含有するキットが例示される。
【００７３】
本発明のキットは、さらに酸性高分子物質を含んでいてもよく、適当な濃度に調製された水溶液が好適に使用できる。当該酸性高分子物質としては、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。
【００７４】
本発明のキットは、さらに増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を含んでいてもよい。
【００７５】
また、ＰＣＲにより標的核酸の検出を実施する本発明の標的核酸の選択的検出方法に使用されるキットは、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチド又はその変異体、キメラオリゴヌクレオチドであるサイクリング・プローブ、あるいはＴａｑＭａｎプローブを含んでいてもよい。特にミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドは、野生型ポリペプチドあるいは変異型ポリペプチドのいずれから選択してもよい。特に限定はされないが、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとしてＰｆｕ由来ＮｕｃＳタンパク質の変異体が好適である。さらに陽性対照核酸検出用のプライマー対とキメラオリゴヌクレオチドプローブあるいはＴａｑＭａｎプローブを組み合わせてもよい。
【００７６】
（６）本発明の酸性高分子物質存在下における非標的核酸の選択的切断方法
本発明の非標的核酸の選択的切断方法の別態様としては、酸性高分子物質存在下で標的核酸と、標的核酸と相同な領域を有する非標的核酸とを含有する試料中の非標的核酸を選択的に切断する方法であって、（ｉ）酸性高分子物質、（ｉｉ）ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及び（ｉｉｉ）非標的核酸とハイブリダイズさせた際に少なくとも１つのミスマッチを生じ、かつ標的核酸とハイブリダイズさせた際に前記非標的核酸とハイブリダイズさせた際に生じるミスマッチよりも多くのミスマッチを生じるオリゴヌクレオチド、を試料と接触させる工程を含む方法が例示される。
【００７７】
当該方法において、前記酸性高分子物質、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、及びオリゴヌクレオチドは、前述の本発明の非標的核酸の選択的切断方法の説明で例示されたものが好適に使用できる。本発明の方法は、さらに増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）を組み合わせて実施してもよい。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００７９】
実施例１  ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドによる希少混入変異型遺伝子ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍの特異的増幅
（１）検出用テンプレートの準備
ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＿０００００７で公開されているＨｕｍａｎ  ＥＧＦＲ遺伝子のＣＤＳ配列情報から、後述のプライマー  ＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ＿Ｆ及びＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ＿Ｒに対応する塩基配列、並びに両配列に挟まれた領域の塩基配列を含有するＤＮＡを人工合成した。この際、ＥＧＦＲ遺伝子における塩基番号２３６９の塩基ＣをＴに変換した。この塩基置換により、人工合成されたＤＮＡ中の、ＥＧＦＲの７９０番のアミノ酸に対応するコドンがスレオニン（Ｔ）のものからメチオニン（Ｍ）のものに置換される。得られた人工合成遺伝子は、ＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ７９０  ＤＮＡと命名し、変異型遺伝子として用いた。この変異をＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍと称す。当該事例においては、Ｔ７９０Ｍの部分でミスマッチ塩基を設定できる。また野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡとして、ヒト細胞ＨＬ６０よりゲノムＤＮＡを調製した。【００８０】
本実施例では、標的核酸はＥＧＦＲ  コドン７９０位で変異を有するＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ  ＤＮＡ、非標的核酸はＨＬ６０ゲノムＤＮＡになる。【００８１】
（２）増幅用プライマー及び抑制オリゴヌクレオチドの調製
配列表の配列番号１及び２に示した塩基配列を有する２種のプライマー  ＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ＿Ｆ及びＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ＿Ｒを常法により調製した。次に、ＥＧＦＲ遺伝子の、塩基番号２３６９の塩基を含む領域にハイブリダイズ可能な、配列表の配列番号３記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを常法により調製した。当該オリゴヌクレオチドは、その３’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、３’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド  Ｔ７９０Ｍ＿ＮｕｃＧ−１と命名した。前記オリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲの野生型遺伝子のマイナス鎖とハイブリダイズすると塩基番号２３６９（プラス鎖）のＣと相補的なＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチを生じる。一方、塩基番号２３６９がＴに置換された変異型遺伝子のマイナス鎖とハイブリダイズすると当該Ｔに相補的なＡの位置でＧ−Ａのミスマッチを生じる。【００８２】
（３）特異的変異型遺伝子検出用プローブの設計、調製
ＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ７９０  ＤＮＡを特異的に検出するためのプローブとして、ＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ７９０  ＤＮＡ上の、ＥＧＦＲ遺伝子の塩基番号２３６９に相当する塩基から３’側方向に１塩基、５’側方向に８塩基伸ばした領域のマイナス鎖の塩基配列を有し、かつ５’側末端から４塩基目のＤＮＡをＲＮＡに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、このオリゴヌクレオチドの５’末端にＥｃｌｉｐｓ  ｑｕｅｎｃｈｅｒを、３’末端にＦＡＭ色素を結合させた。こうして作製されたキメラオリゴヌクレオチドプローブをＴ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ−１と命名した。当該Ｔ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ−１の塩基配列を配列表の配列番号４に示す。【００８３】
Ｔ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ−１は、塩基番号２３６９がＴに置換された変異型ＥＧＦＲ遺伝子に完全にハイブリダイズするため、ここにリボヌクレアーゼＨが共存するとＲＮＡ部分が切断される。一方、野生型ＥＧＦＲ遺伝子にハイブリダイズするとミスマッチを生じるためリボヌクレアーゼＨによる切断を受けない。【００８４】
（４）野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出方法の検討
実施例１-（１）で調製したＨＬ６０ゲノムＤＮＡならびにＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ７９０  ＤＮＡを５０,０００コピー：５００コピー（＝１００：１）、５０，０００コピー：５０コピー（＝１０００：１）および５０，０００コピー：５コピー（＝１０，０００：１）で混合したＤＮＡサンプルを調製した。ＨＬ６０ゲノムＤＮＡ５０,０００コピーのＤＮＡ量としては、約１８５ｎｇになる。また、対照として、ＨＬ６０ゲノムＤＮＡのみのものも調製した。これらのサンプルを鋳型として使用した。【００８５】
ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドとして使用する、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のミスマッチヌクレオチド特異的二本鎖切断活性を有するポリペプチド（以下、ＮｕｃＳタンパク質と称す）は、国際公開第２０１４／１４２２６１号パンフレットの調製例１〜３及び実施例１記載の方法で調製したＷ７７Ｆが導入されたＰＦ００１２ポリペプチドの変異体である。【００８６】
野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出は、以下のようにして行った。即ち、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて、上記サンプル、１１２ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＴ７９０Ｍ＿ＮｕｃＧ−１及び０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ  プライマー対、０．２μＭのＴ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ−１を含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。リアルタイムＰＣＲ検出は、サーマルサイクラーＴＰ９００（タカラバイオ社製）で行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃  １０秒の初期変性処理の後、９５℃  ５秒、５５℃  １０秒、７２℃  ２０秒を１サイクルとする４５サイクル反応で行い、経時的に蛍光強度を観察した。この時、対照として、ＮｕｃＳタンパク質を添加しない反応液群を作製し、同様の測定を行った。その結果を図１に示す。【００８７】
即ち、図１はＥＧＦＲ遺伝子のＴ７９０Ｍ変異の高感度検出方法の結果であり、縦軸は蛍光高度を示し、横軸はＰＣＲサイクル数を示す。蛍光曲線は、変異型遺伝子のコピー数（０、５、５０及び５００コピー）を示す。ＮｕｃＳタンパク質を含まない、図１（Ｂ）の反応液ではキメラオリゴヌクレオチドプローブ  Ｔ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ−１の切断による蛍光値の上昇は見られなかった。このことは、混在するＨＬ６０ゲノムＤＮＡによってＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ７９０  ＤＮＡに由来するＤＮＡの増幅が抑制されていることを示唆している。【００８８】
一方、ＮｕｃＳタンパク質を添加してＰＣＲを実施した図１（Ａ）の反応液では、５０，０００コピーのＨＬ６０ゲノムＤＮＡに対し５コピーのＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ７９０  ＤＮＡが混在するサンプルにおいても経時的な蛍光値の上昇が確認された。すなわち、ＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ７９０  ＤＮＡを鋳型として増幅されたＤＮＡがＴ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ−１により特異的に検出された。この結果より、ＮｕｃＳと抑制オリゴヌクレオチドを組み合わせによりＨＬ６０ゲノムＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ増幅が抑制され、ＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ７９０  ＤＮＡの検出が可能となることが確認できた。【００８９】
実施例２  Ｌ８５８Ｒ変異を有するＥＧＦＲ遺伝子の特異的検出
（１）検出用テンプレートの準備
ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＿０００００７で公開されているＨｕｍａｎ  ＥＧＦＲのＣＤＳ配列情報からプライマー  ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｆ及びＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｒに対応する塩基配列、並びに両配列に挟まれた領域の塩基配列を含有するＤＮＡを人工合成した。この際、ＥＧＦＲ遺伝子における塩基番号２５７３の塩基ＴをＧに変換した。配列を人工合成した。この塩基置換により、人工合成されたＤＮＡ中の、ＥＧＦＲの８５８番目のアミノ酸に対応するコドンがロイシン（Ｌ）のものからアルギニン（Ｒ）のものに置換される。得られた人工合成遺伝子は、ＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ８５８  ＤＮＡと命名し、変異型遺伝子として用いた。この変異をＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒと称す。当該事例においては、Ｌ８５８Ｒの部分でミスマッチ塩基を設定できない。また野生型遺伝子は、実施例１で調製したヒト細胞ＨＬ６０ゲノムＤＮＡを用いた。【００９０】
本実施例では、標的核酸はＥＧＦＲ  コドン８５８位で変異を有するＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ  ＤＮＡ、非標的核酸はＨＬ６０ゲノムＤＮＡになる。【００９１】
（２）増幅用プライマー及び抑制オリゴヌクレオチドの調製
配列表の配列番号５及び６に示した塩基配列を有する２種のプライマー  ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｆ及びＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｒを常法により調製した。次に、ＥＧＦＲ遺伝子の塩基番号２５７３を含む領域にハイブリダイズ可能な、配列番号７記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。当該オリゴヌクレオチドは、その３’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、３’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド  ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿ｐ３と命名した。当該ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿ｐ３の塩基配列を配列表の配列番号７に示す。前記オリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲの野生型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズすると塩基番号２５７５のＧの位置でＧ−Ｔのミスマッチを生じる。一方、塩基番号２５７３がＧに置換された変異型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズした場合には、当該Ｇの位置でＧ−Ａのミスマッチを生じ、さらにその３’側２塩基目（塩基番号２５７５）のＧの位置でもＧ−Ｔのミスマッチを生じる。【００９２】
（３）特異的変異型遺伝子検出用プローブの設計、調製
ＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ８５８ＤＮＡを特異的に検出するためのプローブとして、当該ＤＮＡ上の、ＥＧＦＲ遺伝子の塩基番号２５７３に相当する塩基から３’側方向に１塩基、５’側方向に９塩基伸ばした領域の相補鎖の配列を有し、かつ５’側末端から３塩基目のＤＮＡをＲＮＡに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、このオリゴヌクレオチドプローブの５’末端にＥｃｌｉｐｓ  ｑｕｅｎｃｈｅｒを、３’末端にＦＡＭ色素を結合させた。このキメラオリゴヌクレオチドプローブをＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｐ２と命名した。当該ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｐ２の塩基配列を配列表の配列番号８に示す。【００９３】
ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｐ２は、塩基番号２５７３の塩基ＴがＧに置換された変異型ＥＧＦＲ遺伝子に完全にハイブリダイズするため、ここにリボヌクレアーゼＨが共存するとＲＮＡ部分が切断される。一方、野生型ＥＧＦＲ遺伝子にハイブリダイズするとミスマッチを生じるためリボヌクレアーゼＨによる切断を受けない。【００９４】
（４）野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出方法の検討
ＨＬ６０ゲノムＤＮＡならびにＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ８５８  ＤＮＡを５０，０００コピー：５００コピー（＝１００：１）、５０，０００コピー：５０コピー（＝１０００：１）および５０，０００コピー：５コピー（＝１０，０００：１）で混合したＤＮＡサンプルを調製した。また対照にはＨＬ６０ゲノムＤＮＡのみを使用した。ＨＬ６０ゲノムＤＮＡ５０,０００コピーのＤＮＡ量としては、約１８５ｎｇになる。【００９５】
野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出は、以下のようにして行った。即ち、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて、上記の各ＤＮＡサンプル、１１２ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿ｐ３及び各０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ  プライマー対、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿Ｐ２を含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。リアルタイムＰＣＲ検出は、サーマルサイクラーＴＰ９００（タカラバイオ社製）で行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃  １０秒の初期変性処理の後、９５℃  ５秒、５５℃  １０秒、７２℃  ２０秒を１サイクルとする４５サイクル反応で行い、経時的に蛍光強度を観察した。この時、対照として、ＮｕｃＳタンパク質を添加しない反応液群を作製し、同様の測定を行った。その結果を図２に示す。【００９６】
即ち、図２はＥＧＦＲ遺伝子  Ｌ８５８Ｒ変異の検出方法の結果であり、縦軸は蛍光高度を示し、横軸はＰＣＲサイクル数を示す。蛍光曲線は、変異型遺伝子のコピー数（０、５、５０及び５００コピー）を示す。ＮｕｃＳタンパク質を含まない、図２（Ｂ）の反応液では、キメラオリゴヌクレオチドプローブ  ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｐ２の切断による蛍光値の上昇は見られなかった。すなわち、ＨＬ６０ゲノムＤＮＡの混在のためにＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ８５８  ＤＮＡに由来するＤＮＡの増幅が抑制されていることが示された。【００９７】
一方、ＮｕｃＳタンパク質を添加してＰＣＲを実施した図２（Ａ）に示される反応液では、５０,０００コピーの野生型遺伝子に対し５コピーの変異型遺伝子が混在するサンプルにおいても蛍光値の上昇、すなわちキメラオリゴヌクレオチドＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿Ｐ２の切断が確認された。すなわち、大過剰の野生型遺伝子の混在化でのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ変異遺伝子の検出が可能であることが示された。【００９８】
この結果より、本発明により提供される抑制オリゴヌクレオチドとミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド（ＮｕｃＳタンパク質）とを組み合わせることにより、当該ポリペプチドが認識できるミスマッチを形成できないような塩基置換であっても、核酸中の当該塩基置換の有無を区別して、その一方を選択的に切断できる系を構築できることが確認できた。さらに前記組み合わせに核酸増幅反応を組み合わせることにより、存在比率の高い野生型遺伝子由来の核酸の増幅を抑制し、かつ変異型遺伝子由来の核酸を優先的に増幅させることにより、変異型遺伝子を高感度に検出できることが確認できた。【００９９】
実施例３  酸性高分子物質存在下における標的核酸の検出方法の検討
（１）酸性高分子物質存在下における変異検出方法の検討
実施例２（４）で調製したものと同じ一連のＤＮＡサンプルを調製した。同様にＨＬ６０ゲノムＤＮＡならびにＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ８５８  ＤＮＡを５，０００コピー：５００コピー（＝１０：１）、５，０００コピー：５０コピー（＝１００：１）および５，０００コピー：５コピー（＝１，０００：１）で混合したＤＮＡサンプルを調製した。さらに、対照として、鋳型ＤＮＡを含まないサンプルも調製した。ＨＬ６０ゲノムＤＮＡ５,０００コピーのＤＮＡ量としては、約１８.５ｎｇになる。【０１００】
ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて、上記の各ＤＮＡサンプル、１１２ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿ｐ３及び各０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ  プライマー対、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿Ｐ２、ならびに終濃度５６μｇ／ｍｌ、１４０μｇ／ｍｌまたは１６８μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウムを含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。比較のため、同じ組成でアルギン酸ナトリウムを含まない反応液も調製した。【０１０１】
リアルタイムＰＣＲ検出は、サーマルサイクラーＴＰ９００（タカラバイオ社製）で行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃  １０秒の初期変性処理の後、９５℃  ５秒、５５℃  １０秒、７２℃  ２０秒を１サイクルとする４５サイクル反応で行い、経時的に蛍光強度を観察した。【０１０２】
（２）酸性高分子物質の効果の解析
リアルタイムＰＣＲ検出の結果を図３に示す。即ち、図３は本発明の変異型遺伝子検出方法における酸性高分子物質の効果を示す図であり、縦軸は蛍光高度を示し、横軸はＰＣＲサイクル数を示す。蛍光曲線は、鋳型ＤＮＡなし（Ｎ．Ｃ．）と変異型遺伝子のコピー数（５、５０及び５００コピー）を示す。図３（Ａ−１）、（Ｂ−１）、（Ｃ−１）及び（Ｄ−１）はＨＬ６０ゲノムＤＮＡが５０，０００コピーの場合、図３（Ａ−２）、（Ｂ−２）、（Ｃ−２）及び（Ｄ−２）はＨＬ６０ゲノムＤＮＡが５，０００コピーの場合を示す。図３（Ａ）がアルギン酸ナトリウム非存在下の場合、（Ｂ）は５６μg／ｍｌのアルギン酸ナトリウム存在下の場合、（Ｃ）は１４０μg／ｍｌのアルギン酸ナトリウム存在下の場合及び（Ｄ）は１６８μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム存在下の場合での効果を示す。いずれの濃度においてもアルギン酸非存在下の場合に比べて検出効率が増大していることが確認できた。特に、鋳型ＤＮＡ量が少ない（ＨＬゲノムＤＮＡが５，０００コピー）場合に効果が大きいことが確認できた。このことから、本発明の検出方法で酸性高分子物質を組み合わせることにより、検体由来のＤＮＡ量が少なくても効率よく変異型遺伝子を検出できることが確認できた。【０１０３】
実施例４  ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの核酸切断反応における酸性高分子物質の効果
酸性高分子物質の効果について、さらに検討した。反応液は以下のようにして調製した。即ち、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を使用して５コピー（０．１６ｆｇ）のＥＧＦＲ  ｃｏｄｏｎ７９０  ＤＮＡ、１１２ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＴ７９０Ｍ＿ＮｕｃＧ−１、各０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｔ７９０Ｍ  プライマー対、０．２μＭのＴ７９０Ｍ＿ｄｅｔｅｃｔ−１並びに最終濃度１４０μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウムを含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。本反応液を反応液４とした。さらに、反応液４からＮｕｃＳタンパク質及びアルギン酸ナトリウムを除いた反応液１、反応液４からＮｕｃＳタンパク質を除いた反応液２、反応液４からアルギン酸ナトリウムを除いた反応液３を調製した。リアルタイムＰＣＲ検出は、実施例１記載の条件で行った。【０１０４】
その結果、反応液１、反応液２及び反応液４では微量コピー数でも変異型遺伝子の増幅が確認できた。一方、反応液３は、全く増幅が確認できなかった。【０１０５】
反応液３では野生型遺伝子が存在しないために、抑制オリゴヌクレオチドが変異遺伝子と予期せぬハイブリダイズを引き起こし、それをＮｕｃＳタンパク質が切断した可能性が示唆された。それとは対照的に反応液４では、酸性高分子物質がＮｕｃＳタンパク質と相互作用することにより、予期せぬ切断を抑えたことが示唆された。【０１０６】
以上の事から、酸性高分子物質はＮｕｃＳタンパク質と相互作用することによって、当該ＮｕｃＳタンパク質のミスマッチ認識・切断活性を制御する効果があることを確認できた。【０１０７】
実施例５  ＥＧＦＲ＿エキソン１９欠失変異遺伝子の特異的検出
本発明の方法を用いたＥＧＦＲ遺伝子エキソン１９の欠失変異検出について検討した。本実施例では、標的核酸はＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０  ＤＮＡ、非標的核酸はＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）になる。
（１）検出用テンプレートの準備
ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＿０００００７で公開されているＨｕｍａｎ  ＥＧＦＲのＣＤＳ配列情報からプライマー  ＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０＿Ｆ及びＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０＿Ｒに対応する塩基配列、並びに両配列に挟まれた領域で塩基番号の２２３６番目〜２２５０番目までが欠失した塩基配列を含有するＤＮＡを人工合成した。この塩基欠失により、人工合成されたＤＮＡ中の、ＥＧＦＲの７４６番目〜７５０番目までのアミノ酸が欠失していることになる。得られた人工合成遺伝子は、ＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０  ＤＮＡと命名し、変異型遺伝子として用いた。  【０１０８】
（２）増幅用プライマー及び抑制オリゴヌクレオチドの調製
配列表の配列番号９及び１０に示した塩基配列を有する２種のプライマー  ＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０＿Ｆ及びＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０＿Ｒを常法により調製した。次に、ＥＧＦＲ遺伝子の欠失領域にハイブリダイズ可能な、配列番号１１記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。当該オリゴヌクレオチドは、その３’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、３’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド  ＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０  ｏｌｉｇｏ−７と命名した。前記オリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲの野生型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズすると塩基番号２２４５番目のＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチを生じる。一方、欠失変異型遺伝子のプラス鎖には、ハイブリダイズしない。【０１０９】
（３）特異的変異型遺伝子検出用プローブの設計、調製
ＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０  ＤＮＡを特異的に検出するためのプローブとして、当該ＤＮＡ上の、ＥＧＦＲ遺伝子の塩基番号２２２８番目〜２２３５番目並びに２２５１番目〜２２５３番目の領域に対する相補鎖を有し、かつ５’側末端から３塩基目のＤＮＡをＲＮＡに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、このオリゴヌクレオチドプローブの５’末端にＥｃｌｉｐｓ  ｑｕｅｎｃｈｅｒを、３’末端にＦＡＭ色素を結合させた。このキメラオリゴヌクレオチドプローブをＥＧＦＲ＿２２３６−２２５０ｄｅｌと命名した。当該ＥＧＦＲ＿２２３６−２２５０ｄｅｌの塩基配列を配列表の配列番号１２に示す。【０１１０】
ＥＧＦＲ＿２２３６−２２５０ｄｅｌは、塩基番号２２３６番目〜２２５０番目の塩基配列が欠失した変異型ＥＧＦＲ遺伝子に完全にハイブリダイズするため、ここにリボヌクレアーゼＨが共存するとＲＮＡ部分が切断される。一方、野生型ＥＧＦＲ遺伝子にはハイブリダイズせず、リボヌクレアーゼＨによる切断を受けない。【０１１１】
（４）野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出方法の検討
Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡならびにＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０  ＤＮＡを５０，０００コピー：５００コピー（＝１００：１）、５０，０００コピー：５０コピー（＝１０００：１）および５０，０００コピー：５コピー（＝１０，０００：１）で混合したＤＮＡサンプルを調製した。また対照にはＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡのみを使用した。Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ５０,０００コピーのＤＮＡ量としては、約１８５ｎｇになる。【０１１２】
野生型遺伝子増幅抑制を伴う特異的変異検出は、以下のようにして行った。即ち、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘを用いて、上記の各ＤＮＡサンプル、６８７．５ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＥＧＦＲ＿２２３６−２２５０ｄｅｌ及び各０．２μＭのＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０  プライマー対、０．２μＭのＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０  ｏｌｉｇｏ−７、最終濃度１４０μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウムを含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。リアルタイムＰＣＲ検出は、サーマルサイクラーＴＰ９００で行った。ＰＣＲの反応条件は、９５℃  １０秒の初期変性処理の後、９５℃  ５秒、５５℃  １０秒、７２℃  ２０秒を１サイクルとする４５サイクル反応で行い、経時的に蛍光強度を観察した。この時、対照として、ＮｕｃＳタンパク質を添加しない反応液群を作製し、同様の測定を行った。その結果を図４に示す。【０１１３】
即ち、図４はＥＧＦＲ遺伝子  エキソン１９の欠失変異の検出方法の結果であり、縦軸は蛍光高度を示し、横軸はＰＣＲサイクル数を示す。蛍光曲線は、変異型遺伝子のコピー数（０、５、５０及び５００コピー）を示す。ＮｕｃＳタンパク質を添加してＰＣＲを実施した反応液では、５０,０００コピーの野生型遺伝子に対し５コピーの変異型遺伝子が混在するサンプルにおいても蛍光値の上昇、すなわちキメラオリゴヌクレオチドＥＧＦＲ＿２２３６−２２５０ｄｅｌの切断が確認された。一方、ＮｕｃＳタンパク質を含まない反応液では、キメラオリゴヌクレオチドプローブ  ＥＧＦＲ＿２２３６−２２５０ｄｅｌの切断による蛍光値の上昇は見られなかった。すなわち、Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡの混在のためにＥＧＦＲ＿１９＿ｄｅｌＥ７４６−Ａ７５０  ＤＮＡに由来するＤＮＡの増幅が抑制されていることが示された。【０１１４】
この結果より、本発明により提供される抑制オリゴヌクレオチドとミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド（ＮｕｃＳタンパク質）とを組み合わせることにより、欠失型遺伝子変異であっても問題なく大過剰の野生型遺伝子の混在化でも目的の欠失型遺伝子を高感度に検出できることが確認できた。【０１１５】
実施例６  ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２及びコドン１３の変異解析
本発明の方法を用いたｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２及びコドン１３の点突然変異検出について検討した。本実施例では、標的核酸はｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２の点突然変異体、及びｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１３の点突然変異体、非標的核酸はＨＬ６０ゲノムＤＮＡになる。
（１）検出用テンプレートの準備
ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＿００００１２．１２で公開されているＨｕｍａｎ  Ｋ−ｒａｓ遺伝子情報から配列表の配列番号１３及び１４記載の塩基配列を有するｋ−ｒａｓＧ１２＿Ｆ及びｋ−ｒａｓＧ１２＿Ｒプライマーを化学合成した。また、前記プライマーの塩基配列に挟まれた領域の塩基配列を有するＤＮＡであって、コドン１２の点突然変異により当該コドンのアミノ酸がグリシンからセリン、グリシンからシステイン、グリシンからアルギニン、グリシンからアスパラギン酸、グリシンからバリン並びにグリシンからアラニンになったものも人工合成した。これらの人工合成ＤＮＡは、それぞれＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ２０（タカラバイオ社製）のＴ−ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ部位に常法により挿入した。このようにして調製したプラスミドは、ｋ−ｒａｓＧ１２Ｓ  ＤＮＡ、ｋ−ｒａｓＧ１２Ｃ  ＤＮＡ、ｋ−ｒａｓＧ１２Ｒ  ＤＮＡ、ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄ  ＤＮＡ、ｋ−ｒａｓＧ１２Ｖ  ＤＮＡ並びにｋ−ｒａｓＧ１２Ａ  ＤＮＡと命名し、それぞれ変異型遺伝子として用いた。【０１１６】
同様に、ｋ−ｒａｓＧ１２＿Ｆ及びｋ−ｒａｓＧ１２＿Ｒプライマー対に対応する塩基配列に挟まれた領域の塩基配列を有するＤＮＡであって、コドン１３の点突然変異により当該コドンのアミノ酸がグリシンからセリン、グリシンからシステイン、グリシンからアルギニン、グリシンからアスパラギン酸並びにグリシンからアラニンになったものを人工合成した。さらに得られた人工合成ＤＮＡをそれぞれＴ−Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＭＤ２０のＴ−ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ部位に常法により挿入した。このようにして調製したプラスミドは、ｋ−ｒａｓＧ１３Ｓ  ＤＮＡ、ｋ−ｒａｓＧ１３Ｃ  ＤＮＡ、ｋ−ｒａｓＧ１３Ｒ  ＤＮＡ、ｋ−ｒａｓＧ１３Ｄ  ＤＮＡ並びにｋ−ｒａｓＧ１３Ａ  ＤＮＡと命名し、それぞれ変異型遺伝子として用いた。【０１１７】
（２）抑制オリゴヌクレオチドの調製
ｋ−ｒａｓ遺伝子コドン１２及びコドン１３を含む領域にハイブリダイズ可能な、配列番号１５記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを作製した。当該オリゴヌクレオチドは、その３’末端からポリメラーゼ伸長反応が起こらないように、３’末端のヒドロキシ基がアミノ基で修飾されている。このオリゴヌクレオチドを抑制オリゴヌクレオチド  ｋ−ｒａｓＧ１２/１３＿Ｓ１と命名した。前記オリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１６記載の塩基配列を有するｋ−ｒａｓ  コドン１２の野生型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズすると塩基番号３５番目のＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチを生じる。一方、ｋ−ｒａｓＧ１２Ｓ  ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３４番目のＡの位置でＡ−Ｃのミスマッチを生じる。ｋ−ｒａｓＧ１２Ｃ  ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３４番目のＴの位置でＴ−Ｃのミスマッチを生じる。ｋ−ｒａｓＧ１２Ｒ  ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３４番目のＣの位置でＣ−Ｃのミスマッチを生じる。ｋ−ｒａｓＧ１２Ｄ  ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＡの位置でＡ−Ｇのミスマッチが生じる。ｋ−ｒａｓＧ１２Ｖ  ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＴの位置でＴ−Ｇのミスマッチが生じる。ｋ−ｒａｓＧ１２Ａ  ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、ミスマッチが生じない。【０１１８】
また、抑制オリゴヌクレオチド  ｋ−ｒａｓＧ１２/１３＿Ｓ１は、ｋ−ｒａｓ  コドン１３の野生型遺伝子のプラス鎖とハイブリダイズすると塩基番号３５番目のＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチを生じる。一方、ｋ−ｒａｓＧ１３Ｓ  ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３７番目のＡの位置でＡ−Ｃのミスマッチを生じる。ｋ−ｒａｓＧ１３Ｃ  ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３７番目のＴの位置でＴ−Ｃのミスマッチを生じる。ｋ−ｒａｓＧ１３Ｒ  ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３７番目のＣの位置でＣ−Ｃのミスマッチを生じる。ｋ−ｒａｓＧ１３Ｄ  ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３８番目のＡの位置でＡ−Ｃのミスマッチを生じる。ｋ−ｒａｓＧ１３Ａ  ＤＮＡのプラス鎖とハイブリダイズした場合には、塩基番号３５番目のＧの位置でＧ−Ｇのミスマッチが生じ、さらに塩基番号３８番目のＣの位置でＣ−Ｃのミスマッチを生じる。【０１１９】
（３）野生型遺伝子増幅抑制の確認
Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡならびにｋ−ｒａｓＧ１２Ｃ  ＤＮＡを５０，０００コピー：５０コピー（＝１０００：１）で混合したＤＮＡサンプルを調製した。また対照にはＨｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡのみを使用した。Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ５０,０００コピーのＤＮＡ量としては、約１８５ｎｇになる。【０１２０】
同様に、Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡならびにｋ−ｒａｓＧ１３Ｃ  ＤＮＡを５０，０００コピー：５０コピー（＝１０００：１）で混合したＤＮＡサンプルも調製した。【０１２１】
上記の各ＤＮＡサンプル、１０００ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、各０．２μＭのｋ−ｒａｓＧ１２＿Ｆ及びｋ−ｒａｓＧ１２＿Ｒ  プライマー対、０．２μＭのｋ−ｒａｓＧ１２／１３＿Ｓ１、最終濃度１４０μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウムを含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＴＰ９００で行った。反応温度条件は、９５℃  １０秒の初期変性処理の後、９５℃  ５秒、５５℃  １０秒、７２℃  ２０秒を１サイクルとする４５サイクル反応し、得られた増幅断片をＴａＫａＲＡ  ＭｉｎｉＢＥＳＴ  ＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｐｕｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．４．０（タカラバイオ社製）で精製後、配列表の配列番号１３記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いてダイレクトシークエンスに供した。【０１２２】
ダイレクトシークエンスの結果から、上記ｋ−ｒａｓＧ１２Ｃ  ＤＮＡサンプルからｋ−ｒａｓＧ１２Ｃ  ＤＮＡ由来のものが主増産物として解析できた。また、ｋ−ｒａｓＧ１３Ｃ  ＤＮＡサンプルからもｋ−ｒａｓＧ１３Ｃ  ＤＮＡ由来のものが主増産物として解析できたこのことから、本発明の方法で野生型遺伝子の増幅が抑制され、かつ変異型遺伝子の増幅が優先されることが確認できた。すなわち、変異型遺伝子の選択的濃縮が可能であることが示された。【０１２３】
実施例７  酸性高分子物質を組み合わせた高感度検出方法
実施例２のＬ８５８Ｒ変異を有するＥＧＦＲ遺伝子の特異的検出方法をモデルとして、酸性高分子物質の効果についてさらに検討した。本実施例では、酸性高分子物質として、糖鎖骨格を有するコンドロイチン硫酸Ｂの塩及び糖鎖骨格を有さないポリアクリル酸について検討した。
（１）酸性高分子物質の影響-１
ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘを用いて、実施例３（１）で調製したＤＮＡサンプル、１２５ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿ｐ３及び各０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ  プライマー対、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿Ｐ２、ならびに終濃度３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ並びに６０μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸Ｂナトリウム（シグマ-アルドリッチ社製）を含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。比較のため、同じ組成でコンドロイチン硫酸Ｂナトリウムを含まない反応液も調製した。【０１２４】
リアルタイムＰＣＲ検出は、実施例３（１）と同条件で行った。その結果、コンドロイチン硫酸Ｂナトリウムを含まない場合よりも反応液に含む方が、いずれの最終濃度の場合でも明らかにＣｔ値が小さくなることが確認できた。このことから、糖鎖骨格を有する酸性高分子が本発明の方法に有効であることが確認できた。【０１２５】
（２）酸性高分子物質の影響−２
次に糖鎖骨格を有さない酸性高分子物質として、ポリアクリル酸５０００（和光純薬社製）を使用した場合について検討した。反応液は、上記（１）の組成で、コンドロイチン硫酸Ｂナトリウムの代わりに、終濃度１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、３μｇ/ｍｌ、４μｇ/ｍｌ並びに５μｇ／ｍｌのポリアクリル酸５０００を含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。比較のため、同じ組成でポリアクリル酸５０００を含まない反応液も調製した。【０１２６】
リアルタイムＰＣＲ検出の結果、ポリアクリル酸を含まない場合よりも反応液に含む方が、いずれの最終濃度の場合でも明らかにＣｔ値が小さくなることが確認できた。このことから、糖鎖骨格を有さない直鎖炭素鎖の酸性高分子物質であっても本発明の方法に有効であることが確認できた。【０１２７】
実施例８  陽性対照核酸の増幅を組み合わせた本発明の方法
本発明の方法を用いた標的核酸の定量方法について検討した。標的核酸は、ＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒとした。ＥＧＦＲ遺伝子の別の領域を陽性対照核酸とした。即ち、配列表の配列番号１７及び１８記載の塩基配列を有するＥＧＦＲＬ８５８Ｒ＿ＩＣ２＿Ｆ及びＥＧＦＲＬ８５８Ｒ＿ＩＣ２＿Ｒプライマー対を常法により合成した。また、当該陽性対照核酸を特異的に検出するためのプローブとして、配列表の配列番号１９記載の塩基配列を有し、かつ５’側末端から３塩基目のＤＮＡをＲＮＡに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブを合成した。さらに、このオリゴヌクレオチドプローブの５’末端にＥｃｌｉｐｓ  ｑｕｅｎｃｈｅｒを、３’末端にＦＡＭ色素を結合させた。このキメラオリゴヌクレオチドプローブをＥＧＦＲＬ８５８Ｒ＿ＩＣ２＿Ｐ２と命名した。【０１２８】
鋳型となるＤＮＡは、実施例２で調製したＤＮＡサンプルを用いた。また、反応液は以下のようにして調製した。即ち、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘを用いて、各ＤＮＡサンプル、１２５ｎＭのＮｕｃＳタンパク質、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿ｐ３及び各０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ  プライマー対、０．２μＭのＥＧＦＲ＿Ｌ８５８Ｒ＿ｓｕｐ＿Ｐ２、ならびに終濃度５６μｇ／ｍｌのアルギン酸ナトリウム、さらに各０．１μＭのＥＧＦＲＬ８５８Ｒ＿ＩＣ２プライマー対、０．２μＭのＥＧＦＲＬ８５８Ｒ＿ＩＣ２＿Ｐ２を含む最終容量２５μｌの反応液を調製した。また、リアルタイムＰＣＲ検出は、実施例３の条件と同じにした。【０１２９】
リアルタイムＰＣＲ検出の結果、陽性対照核酸の増幅が並行して行われているにも関わらず、実施例３と同じ結果が得られた。このことから、当該陽性対照核酸の増幅量を指標として、各反応液間の誤差を補正することが可能であることが確認できた。また、増幅対照核酸の増幅量とサンプル中の標的核酸の増幅量を比較することにより、サンプル中の標的核酸の存在を定量できることが確認できた。このことから、本発明の検出方法で検体由来のＤＮＡ量が少なくても効率よく変異型遺伝子を検出し、陽性対照核酸の増幅と比較することにより変異型遺伝子の定量もできることが確認できた。【０１３０】
実施例９  ＰＣＮＡを組み合わせた本発明の方法
本発明の方法におけるＰＣＮＡの効果について検討した。反応液組成は、陽性対照核酸検出用として配列表の配列番号２０記載の塩基配列を有し、かつ５’側末端から３塩基目のＤＮＡをＲＮＡに置き換えたキメラオリゴヌクレオチドプローブのＥＧＦＲＬ８５８Ｒ＿ＩＣ２＿Ｐ３、１００μｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸Ｂナトリウム、国際公開ＷＯ２００７／００４６５４号パンフレット  実施例記載の方法で調製した８μｇ/ｍｌのＰｕｆＰＣＮＡ  Ｄ１４３Ｒ変異体（ＰＣＮＡ１３）並びに３７５ｎＭのＮｕｃＳ蛋白質を含む以外は、実施例８記載のものと同様にした。また、リアルタイムＰＣＲ検出は、実施例３の条件と同じにした。【０１３１】
リアルタイムＰＣＲ検出の結果、陽性対照核酸の増幅が並行して行われているにも関わらず、ＰＣＮＡを反応液に含まない場合よりも含む方が、明らかにＣｔ値が小さくなることが確認できた。このことから、ＰＣＮＡが本発明の方法をさらに改善することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明の高感度変異検出方法により、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドの本来のミスマッチ認識形態にとらわれることなくミスマッチ塩基対形成を人為的に発生させることにより大量に存在する野生型遺伝子の増幅を排除し、希少な変異型遺伝子を特異的に増幅し、検出することができる。当該方法は、遺伝子工学、生物学、医学、農業等幅広い分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１３３】
SEQ ID NO: 1: EGFR_T790M_F primer
SEQ ID NO: 2: EFGR_T790M_R primer
SEQ ID NO: 3: T790M_NucG-1. 3'-end is modified by amino linker (NH2).
SEQ ID NO: 4: T790M_detect-1. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 4 is RNA.
SEQ ID NO: 5: EGFR_L858R_F primer
SEQ ID NO: 6: EGFR_L858R_R primer
SEQ ID NO: 7: EGFR_L858R_ sup_p3. 3'-end is modified by amino linker (NH2).
SEQ ID NO: 8: EGFR_L858R_P2. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 3 is RNA.
SEQ ID NO: 9: EGFR_19_delE746-A750_F primer
SEQ ID NO: 10: EGFR_19_delE746-A750_R primer
SEQ ID NO: 11: EGFR_19_delE746-A750 oligo-7.  3'-end is modified by amino linker (NH2)
SEQ ID NO: 12: EGFR_2236-2250del. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 3 is RNA.
SEQ ID NO: 13: k-rasG12_F primer
SEQ ID NO: 14: k-rasG12_R primer
SEQ ID NO: 15: k-rasG12/13_s1. 3'-end is modified by amino linker (NH2)
SEQ ID NO: 16: SEQ IDDNA fragment containing k-ras codon 12 and codon 13 regions
SEQ ID NO: 17: EGFRL858R_IC2_F primer
SEQ ID NO: 18: EGFRL858R_IC2_R primer
SEQ ID NO: 19: EGFRL858R_IC2_P2. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 3 is RNA.
SEQ ID NO: 20: EGFRL858R_IC2_P3. 5'-end is added Eclips and 3'-end is added FAM. nucleotide position 3 is RNA.
【図１】
2016152812.tif 000002
【図２】
2016152812.tif 000003
【図３．Ａ】
2016152812.tif 000004
【図３．Ｂ】
2016152812.tif 000005
【図３．Ｃ】
2016152812.tif 000006
【図３．Ｄ】
2016152812.tif 000007
【図４】
2016152812.tif 000008
【配列表】
2016152812000001.app
【国際調査報告】
2016152812.tif 000009
2016152812.tif 000010
2016152812.tif 000011
2016152812.tif 000012