(57)【要約】要約  キシランとセルロースを含むバイオマスからキシロオリゴ糖を製造する方法であって、簡便で、かつ、キシロオリゴ糖がキシロースまで分解されることが抑制されることによりキシロオリゴ糖の収量が多い、キシロオリゴ糖の製造方法が開示されている。キシロオリゴ糖の製造方法は、加水分解時に少なくとも、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの活性を有し、かつβ−キシロシダーゼの活性を実質的に有さないセルラーゼ組成物で、キシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシランとセルロースを含むバイオマスをセルラーゼ組成物で加水分解することによるキシロオリゴ糖の製造方法であって、該セルラーゼ組成物がバイオマスに対して加水分解時に少なくとも、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ及びβ−グルコシダーゼの活性を有し、かつβ−キシロシダーゼの活性を実質的に有さないセルラーゼ組成物である、キシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
前記セルラーゼ組成物が、前記バイオマスに対して少なくともキシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β‐グルコシダーゼ活性およびβ−キシロシダーゼ活性を有するトリコデルマ属真菌由来セルラーゼ混合物を保温処理することによって、前記バイオマスに対するβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロシダーゼの活性を実質的に失活させて得られた酵素活性成分を含む、請求項１に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
前記保温処理が、ｐＨ５．５〜８．０に調整した前記トリコデルマ属真菌由来セルラーゼ混合物を、３５℃〜６０℃で保温する処理である、請求項２に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
前記セルラーゼ組成物のβ−グルコシダーゼ活性成分が、アスペルギルス属真菌のβ−グルコシダーゼ活性成分を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼの活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として、該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５０〜５００Ｕ／ｇである請求項１から４のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項６】
前記セルラーゼ組成物のβ―グルコシダーゼの活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する活性として、該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり１４，０００Ｕ／ｇ以上である請求項１から５のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項７】
前記加水分解を時のｐＨ条件がｐＨ６．０〜８．０である、請求項１から６のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項８】
キシランとセルロースを含むバイオマスをアルカリ処理することによって得られる前処理物を前記セルラーゼ組成物で加水分解する、請求項１から７のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項９】
前記加水分解反応で得られた加水分解物を、固液分離し、得られた液成分を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過側からセルラーゼ組成物を回収し、透過側からキシロオリゴ糖を得る工程をさらに含む、請求項１から８のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｄ）の酵素活性を有するセルラーゼ組成物。
（ａ）キシラナーゼ活性が、キシランを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり１４，０００Ｕ／ｇ以上
（ｂ）セロビオハイドラーゼ活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５０Ｕ／ｇ以上
（ｃ）β−グルコシダーゼ活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たりの１４，０００Ｕ／ｇ以上
（ｄ）β−キシロシダーゼ活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５０〜５００Ｕ／ｇ
【請求項１１】
前記（ｃ）のβ−グルコシダーゼ活性成分が、アスペルギルス属真菌のβ−グルコシダーゼ活性成分を含む、請求項１０に記載のセルラーゼ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キシランとセルロースを含むバイオマスからキシロオリゴ糖を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キシロオリゴ糖は、キシロース単位がβ−グリコシド結合により複数個結合したオリゴ糖の総称である。キシロオリゴ糖は、優れた整腸作用を示すことなどから機能性食品用の素材としても用いられている（非特許文献１）。【０００３】
キシロオリゴ糖は、キシランとセルロースを含むバイオマスに含まれるキシランを加水分解することで得ることができる。加水分解の方法としては、水熱処理する方法（非特許文献２）、酸加水分解する方法（非特許文献３）、キシラナーゼを用いて酵素処理する方法（特許文献１）が知られている。【０００４】
このうち、キシラナーゼでキシランを加水分解すると、キシロオリゴ糖を選択的に製造することができるため、キシロオリゴ糖を効率的に製造することができる。しかしながら、キシラナーゼの基質となるキシランは、ヘミセルロースの主成分であり、植物細胞の中でヘミセルロースは、セルロースやリグニンと共に高次構造を形成している。そのため、キシラナーゼで効率的にキシランを分解するためには、これらの高次構造を加水分解する別の工程が必要になる。【０００５】
また、キシラナーゼは、微生物が生産するセルラーゼ組成物の一酵素成分として生産されるため、キシラナーゼを用いた酵素の製造方法では、キシラナーゼを主成分とする酵素の製造コストが課題となる。【０００６】
非特許文献４には、セルラーゼ組成物からキシラナーゼを分離精製せずにキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解して、キシロオリゴ糖を製造する方法が記載されている。セルラーゼ組成物には各種分解酵素が含まれているため、キシランをキシロオリゴ糖へ加水分解する反応と、キシランとセルロースを含むバイオマスに含まれる高次構造の分解や、ヘミセルロースからキシランへの加水分解を同時に行うことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００６―２９６２２４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｙｙａｐｐａｎ  ＡＡら，Ｃｏｍｐｒｅ．Ｒｅｖ．Ｆｏｏｄ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ｓａｆ．１０，２−１６（２０１１）
【非特許文献２】Ｐａｔｒｉｃｉａ  Ｍら，Ｉｎｄ．Ｃｒｏｐｓ．Ｐｒｏｄ．６２，４６０−４６５（２０１４）
【非特許文献３】Ｏｚｌｅｍ  Ａら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４４，６６０−６６６（２００９）
【非特許文献４】Ｋｕｍａｒ  Ｒら，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５，３７７−３９１（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述のように、キシラナーゼを用いた酵素処理によってキシロオリゴ糖を製造する方法では、工程の煩雑さや、キシラナーゼのコストに課題があった。また、非特許文献４に記載の方法は、工程が単純であり、酵素の精製コストも低く抑えることができるが、製造されたキシロオリゴ糖が、セルラーゼ組成物に含まれる加水分解酵素によって、キシロースにまで分解されてしまい、キシロオリゴ糖の収量が低いという課題があった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らが、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、本発明では、キシランとセルロースを含むバイオマスに対して加水分解時に少なくともキシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β−グルコシダーゼの活性を有し、かつβ−キシロシダーゼの活性を実質的に有さないセルラーゼ組成物で、キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物を加水分解することにより、ヘミセルロースからキシランへの加水分解反応と、キシランからキシロオリゴ糖の加水分解反応を同時に行うことが可能となると同時に、キシロオリゴ糖からキシロースへの加水分解反応を抑制することも可能となり、キシロオリゴ糖を効率的に生産できることを見出し、本発明を達成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は以下の［１］から［１１］の構成を有する。
（１）キシランとセルロースを含むバイオマスをセルラーゼ組成物で加水分解することによるキシロオリゴ糖の製造方法であって、該セルラーゼ組成物がキシランとセルロースを含むバイオマスに対して加水分解時に少なくとも、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの活性を有し、かつβ−キシロシダーゼの活性を実質的に有さないセルラーゼ組成物である、キシロオリゴ糖の製造方法。
（２）前記セルラーゼ組成物が、前記キシランとセルロースを含むバイオマスに対して少なくともキシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β‐グルコシダーゼ活性およびβ−キシロシダーゼ活性を有するトリコデルマ属真菌由来セルラーゼ混合物を保温処理することによって、前記バイオマスに対するβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロシダーゼの活性を実質的に失活させて得られた酵素活性成分を含む、（１）に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（３）前記保温処理が、ｐＨ５．５〜８．０に調整した前記トリコデルマ属真菌由来セルラーゼ混合物を、３５℃〜６０℃で保温する処理である、（２）に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（４）前記セルラーゼ組成物のβ−グルコシダーゼ活性成分が、アスペルギルス属真菌のβ−グルコシダーゼ活性成分を含む、（１）から（３）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（５）前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼの活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として、該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５０〜５００Ｕ／ｇである（１）から（４）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（６）前記セルラーゼ組成物のβ―グルコシダーゼの活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する活性として、該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり１４，０００Ｕ／ｇ以上である（１）から（５）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（７）前記加水分解時のｐＨ条件がｐＨ６．０〜８．０である、（１）から（６）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（８）キシランとセルロースを含むバイオマスをアルカリ処理することによって得られる前処理物を前記セルラーゼ組成物で加水分解する、（１）から（７）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（９）前記加水分解反応で得られた加水分解物を、固液分離し、得られた液成分を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過側からセルラーゼ組成物を回収し、透過側からキシロオリゴ糖を得る工程をさらに含む、（１）から（８）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（１０）以下の（ａ）〜（ｄ）の酵素活性を有するセルラーゼ組成物。
（ａ）キシラナーゼ活性が、キシランを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり１４，０００Ｕ／ｇ以上
（ｂ）セロビオハイドラーゼ活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５０Ｕ／ｇ以上
（ｃ）β−グルコシダーゼ活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たりの１４，０００Ｕ／ｇ以上
（ｄ）β−キシロシダーゼ活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５０〜５００Ｕ／ｇ
（１１）前記（ｃ）のβ−グルコシダーゼ活性成分が、アスペルギルス属真菌のβ−グルコシダーゼ活性成分を含む、（１０）に記載のセルラーゼ組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物から、簡便な方法で効率的にキシロオリゴ糖を生産することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明で用いられるキシランとセルロースを含むバイオマスは、少なくともキシロオリゴ糖の原料となるキシランとセルロースを含む植物由来のバイオマスである。
【００１４】
キシランは、植物の細胞壁に存在するヘミセルロースの構成成分であり、β−グリコシド結合したキシロースの主鎖に様々な糖が結合したヘテロ糖である。セルロースとヘミセルロースは水素結合や化学結合を介して高次構造によって植物の細胞壁を構成している。セルロースは、グルコースがβ−グリコシド結合により直鎖上に結合した構造を有する細胞壁の主成分である。
【００１５】
キシランおよびセルロースを含有するバイオマスはキシランおよびセルロースを含有する植物由来の資源であれば特に限定されず、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類、水草などの植物の他、廃建材なども用いることができる。種子植物は、裸子植物と被子植物に分類されるが、どちらも好ましく用いることができる。被子植物はさらに単子葉植物と双子葉植物に分類されるが、単子葉植物の具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらなどが挙げられ、双子葉植物の具体例としては、ビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバなどが好ましく用いられる。本発明においては、キシランおよびセルロースの分解性に優れるバガス、コーンコブ、コーンストーバー、稲わら、麦わらが好ましく、最も好ましくはバガスである。これらのバイオマスは単独で用いることも複数種類を組み合わせて用いることもできる。
【００１６】
キシランとセルロースを含むバイオマスに含まれるキシラン含有量は、キシランとセルロースを含むバイオマス固形分重量に対して５重量％以上が好ましく、より好ましくは１０重量％以上、さらに好ましくは２０％重量以上である。キシランとセルロースを含むバイオマスに含まれるキシラン含有量は、通常、５０重量％以下である。
【００１７】
本発明で用いられる前処理方法は、特に限定されないが、具体的には、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理など公知の手法を用いることができる。好ましくは、前処理におけるキシランの分解が少ないアルカリ処理または水熱処理であることが好ましく、最も好ましくはアルカリ処理である。
【００１８】
アルカリ処理には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニアを用いることができる。安価で扱いやすいという観点で、水酸化ナトリウムが好ましい。アルカリ処理条件としては、キシランとセルロースを含むバイオマス固形分濃度がアルカリ水溶液と混合した状態で０．１〜５０重量％、好ましくは１〜２０重量％、さらに好ましくは５〜１０重量％の範囲に設定することが好ましい。キシランとセルロースを含むバイオマス固形分濃度が１重量％未満であると、水の使用量が極端に多くなり、経済的に不利になる。一方、キシランとセルロースを含むバイオマス固形分濃度が２０重量％を超えると、キシランとセルロースを含むバイオマスがアルカリ溶液に浸らなくなり、前処理の効果が十分に得られない。使用するアルカリ添加量としては、例えば水酸化ナトリウム水溶液を用いる場合、水酸化ナトリウムの添加量がキシランとセルロースを含むバイオマスの固形分に対して０．１〜１００重量％、好ましくは１〜５０重量％、さらに好ましくは５〜１０重量％の範囲で添加することが好ましい。
【００１９】
キシランとセルロースを含むバイオマスの固形分濃度は、固形分重量を元に調整することができる。固形分重量は、以下の方法で算出することができる。
【００２０】
キシランとセルロースを含むバイオマス固形分重量は以下の方法で算出できる。キシランとセルロースを含むバイオマスをＡｇ量りとり、１０５℃で恒量Ｂｇになるまで加熱する。このとき、Ｂ／Ａがキシランとセルロースを含むバイオマスの固形分率となり、含水状態のキシランとセルロースを含むバイオマス重量にＢ／Ａを乗じたものを固形分重量とする。キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物の固形分重量の測定も同様の方法で行える。
【００２１】
添加するアルカリ量が１重量％未満であると、セルラーゼ組成物による、加水分解が進行しにくくなり、十分なキシロオリゴ糖収量が得られない。一方、添加量が５０重量％を超えると、アルカリ量が増大することに加え、セルラーゼ組成物で加水分解反応を行う際のｐＨ調整に使用する酸量が増大し、経済的に不利になる。アルカリ処理を行う温度は１０〜２００℃が好ましく、加水分解における糖収率の観点から、２５〜１２０℃がさらに好ましく、特に好ましくは、７５〜１００℃である。アルカリ処理の時間は、アルカリ量等に応じて適宜設定でき、通常、０．５時間〜２４時間程度である。
【００２２】
前処理後のキシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物は、そのまま本願のセルラーゼ組成物による加水分解反応に用いることができるが、加水分解反応の前に固液分離してもよい。固液分離により得られた固体分をキシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物として用いることができる。固液分離の手法としては、スクリューデカンタなどの遠心分離法、加圧・吸引濾過などの濾過法、または精密濾過などの膜濾過法など公知の手法を用いることができる。また、キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物の固体分を固液分離の前後で純水により洗浄してもよい。洗浄することにより、リグニン分解物などの酵素反応阻害物質をさらに低減でき、加水分解反応の際のｐＨ調整に必要な酸の量も低減できるため好ましい。
【００２３】
本発明において、キシロオリゴ糖は、キシロースが２個以上〜６個以下で共有結合した構造を有し、キシロース同士はβ−グリコシド結合で連結したオリゴ糖のことを指す。これらは、キシロース数に応じて、キシロビオース（２糖）、キシロトリオース（３糖）、キシロテトラオース（４糖）、キシロペンタオース（５糖）、キシロヘキサオース（６糖）と呼ばれる。
【００２４】
セルラーゼ組成物は、β−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する種々の加水分解酵素の混合物である。セルラーゼ組成物に含まれる加水分解酵素とは例えば、セロビオハイドラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ、β―グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、キシランエステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、α‐グルクロニダーゼ、キトサナーゼ、キチナーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、α‐ガラクトシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼなどが挙げられる。
【００２５】
本発明で用いるセルラーゼ組成物（以下、「本発明のセルラーゼ組成物」という。）にはこのうち、キシランとセルロースを含むバイオマスに対して加水分解時において少なくともキシラナーゼ、セオビロハイドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの活性を有しており、かつβ−キシロシダーゼの活性を実質的に有していなければよく、これらの酵素活性の由来は、特に限定されない。精製された酵素や、市販されているセルラーゼ製品、または市販製品を混合して本発明のセルラーゼ組成物を調製してもよい。また、微生物を培養して得られた培養液をセルラーゼ組成物としてそのまま用いてもよいし、培養液から精製された酵素、他の市販の酵素製品、を混合して本発明に用いることもできる。
【００２６】
微生物に由来するセルラーゼ組成物を本発明のセルラーゼ組成物として用いる場合、微生物としては、真菌を好ましく用いることができる。真菌の具体例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）などの微生物を例示することができる。これら真菌の中でもトリコデルマ属、アスペルギルス属真菌が好ましい。
【００２７】
トリコデルマ属真菌の具体例としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＲｕｔＣ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ  ＱＭ９１２３）を例示することができる。これらトリコデルマ属真菌の中でも、トリコデルマ・リーセイが好ましい。また、上記のセルラーゼ組成物を生産する真菌に変異剤または紫外線照射などで変異処理を施すことによりセルラーゼ組成物の生産性が向上した変異株や、β−キシロシダーゼの活性が低下した変異株も好ましく用いることができる。
【００２８】
また、アスペルギルス属真菌の具体例としては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・アクレアータス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）を例示することができる。
【００２９】
本発明のセルラーゼ組成物として、上記の真菌のうち１種類の真菌由来のセルラーゼ組成物を用いてもよいし、複数の真菌由来のセルラーゼ組成物を混合して用いてよい。複数の真菌由来のセルラーゼ組成物を用いる場合、組み合わせは特に限定されないが、例えばトリコデルマ属真菌由来のセルラーゼ組成物と、アスペルギルス属真菌由来のセルラーゼ組成物を混合して用いても良い。具体的には、アスペルギルス属真菌由来のβ−グルコシダーゼとして、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８（ノボザイムズ社）、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社）、スミチームＢＧＡ（新日本化学工業社）などを例示することができる。なお、β−グルコシダーゼ活性成分は、上記したアスペルギルス属真菌のβ−グルコシダーゼ活性成分を含むことが好ましい。
【００３０】
本発明のセルラーゼ組成物は、酵素以外に塩類や糖などの夾雑物、または酵素保存性を高める薬品、ｐＨ調製剤、活性増強剤を含んでいてもよい。また、セルラーゼ組成物を生産する真菌の菌体破砕液および培養液並びにこれらから塩類や糖などを除いた粗酵素なども用いることができる。
【００３１】
本発明のセルラーゼ組成物で、キシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解すると、キシロオリゴ糖とグルコースを主成分とする加水分解物を得ることができる。この場合の主成分とは、加水分解物にキシロオリゴ糖、グルコース、およびキシロースが含まれている場合には、キシロオリゴ糖の濃度％（ｗ／ｖ）が、キシロースの濃度％（ｗ／ｖ）よりも高いことを指す。一方で、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β−グルコシダーゼおよびβ−キシロシダーゼの活性を有するセルラーゼ組成物で、キシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解すると、キシロースとグルコースを主成分とする加水分解物が得られる。
【００３２】
β−キシロシダーゼの活性は、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として測定する。１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕとして定義する。酵素活性は後述の参考例５に記載の手順に準じた方法で測定する。
【００３３】
本発明のセルラーゼ組成物は、キシランとセルロースを含むバイオマスの加水分解時においてβ−キシロシダーゼの活性を実質的に有さず、セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たりのβ−キシロシダーゼの活性は５００Ｕ／ｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは４００Ｕ／ｇ以下、最も好ましくは３００Ｕ／ｇ以下であることが好ましい。ここで、本発明におけるセルラーゼ組成物中のタンパク質量はＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて測定したものとする。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質量の測定方法は、セルラーゼ組成物の希釈溶液と、ブリリアントブルーＧを含む溶液を混合後、一定時間保温し、５９５ｎｍにおける吸光度を測定して求めることができる。別途牛血清アルブミンの標準液を用いて作成した検量線をもとに、セルラーゼ組成物の希釈溶液中のタンパク質濃度を算出し、セルラーゼ組成物中のタンパク質含量を求めることができる。
【００３４】
キシラナーゼの酵素活性は、試薬であるキシランを分解するキシラン分解活性として測定する。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素量を１Ｕと定義する。酵素活性は後述の参考例５に記載の手順に準じた方法で測定する。
【００３５】
具体的には、セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たりのキシラン分解活性が、好ましくは１４，０００Ｕ／ｇ以上、より好ましくは１６，０００Ｕ／ｇ以上、さらに好ましくは１８，０００Ｕ／ｇ以上含まれることが好ましい。セルラーゼ組成物のキシラン分解活性は、通常、セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５０，０００Ｕ／ｇ以下である。
【００３６】
セロビオハイドラーゼの活性は、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として測定する。１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義する。酵素活性は後述の参考例５に記載の手順に準じた方法で測定する。
【００３７】
具体的には、セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たりのセロビオハイドラーゼの活性が、好ましくは５０Ｕ／ｇ以上、より好ましくは６５Ｕ／ｇ以上、さらに好ましくは８０Ｕ／ｇ以上含まれることが好ましい。セルラーゼ組成物のセロビオハイドラーゼ活性は、通常、セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり３００Ｕ／ｇ以下である。
【００３８】
β−グルコシダーゼの酵素活性は、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として測定される。１分間に１μｍｏｌの４―ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義する。酵素活性は後述の参考例５に記載の手順に準じた方法で測定する。
【００３９】
具体的には、セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たりのβ―グルコシダーゼの活性が、１０００Ｕ／ｇ以上であればよく、好ましくは１０，０００Ｕ／ｇ以上、より好ましくは１４，０００Ｕ／ｇ以上、さらに好ましくは１６，０００Ｕ／ｇ以上、最も好ましくは１８，０００Ｕ／ｇ以上含まれることが好ましい。セルラーゼ組成物のβ―グルコシダーゼ活性は、通常、セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５０，０００Ｕ／ｇ以下である。
【００４０】
セルラーゼ組成物中の酵素成分は、前記酵素活性を測定する方法以外に、ゲル濾過、イオン交換、二次元電気泳動などの公知手法により分離し、分離した成分のアミノ酸配列の分析（Ｎ末端分析、Ｃ末端分析、質量分析）を行い、データベースとの比較により酵素成分を同定することができる。
【００４１】
本発明では、キシランとセルロースを含むバイオマスに対して加水分解時に少なくとも、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの活性を有し、かつβ−キシロシダーゼの活性を実質的に有さないセルラーゼ組成物を用いて、キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物を加水分解すると、キシロオリゴ糖を含む加水分解物を得ることができる。
【００４２】
本発明の加水分解の反応条件は、本発明のセルラーゼ組成物が、バイオマスの前処理物を加水分解してキシロオリゴ糖を得ることができる反応条件であれば特に限定されないが、加水分解の反応温度は５０℃以下が好ましく、より好ましくは、３０℃〜４５℃の範囲になるように、維持されることが好ましい。反応温度を３０℃〜４５℃に維持すると、セルラーゼ組成物に含まれる種々の加水分解酵素の活性が低下しないため、加水分解反応後にセルラーゼ組成物を再利用することができる。
【００４３】
加水分解反応の好ましいｐＨ条件は特に限定されないが、ｐＨ４．５〜８．０が好ましく、より好ましくはｐＨ６．０〜８．０、さらに好ましくはｐＨ６．５〜７．５である。ｐＨを６．５〜７．５の範囲とすることで、キシロオリゴ糖の生成量を高める効果があり、また、加水分解後も、セルラーゼ組成物中のキシラナーゼ、セロビオハイドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの活性を高く保つことができる。
【００４４】
加水分解を行う際のｐＨの調整は、キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物にセルラーゼ組成物を添加する前に、キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物とセルラーゼ組成物のそれぞれのｐＨを調整しておいてもよいし、キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物にセルラーゼ組成物を添加した後、ｐＨの調整を行ってもよい。好ましくは、キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物にセルラーゼ組成物を添加する前に、それぞれｐＨの調整を行うことが好ましい。
【００４５】
ｐＨの調整には酸、アルカリ、またはｐＨ緩衝液を用いることができる。酸、アルカリまたはｐＨ緩衝液の種類については、所定のｐＨに調整できるものであれば特に限定されないが、酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、ギ酸、酢酸などが例示される。中でも、安価でかつ少量で所望のｐＨに調整できるという観点から、塩酸、硫酸が好ましい。アルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、アンモニア、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸三ナトリウムなどが例示される。中でも、安価でかつ少量で所望のｐＨに調整できるという観点から、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。また、ｐＨ緩衝液を用いる場合、使用するｐＨ緩衝液として酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス―塩酸緩衝液などが例示されるが、調整するｐＨがｐＨ６．０〜８．０であるという観点から、リン酸緩衝液、トリス―塩酸緩衝液が好ましい。
【００４６】
加水分解反応では、キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物と本発明のセルラーゼ組成物との接触を促進させるため、また加水分解物の糖濃度を均一にするため撹拌混合を行うことが好ましい。加水分解におけるキシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物の固形分濃度は、１〜３０重量％、好ましくは３〜２０重量％、さらに好ましくは５〜１０重量％の範囲であることが好ましい。
【００４７】
加水分解の反応時間は、１〜１４４時間、好ましくは３〜７２時間、さらに好ましくは６〜２４時間、最も好ましくは、６〜１０時間の範囲であることが好ましい。
【００４８】
本発明の加水分解反応では、セルラーゼ組成物に含まれる加水分解酵素によってキシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物に含まれるセルロースが、セロビオハイドラーゼにセロオリゴ糖に分解され、セロオリゴ糖は、β−グルコシダーゼによってグルコースに加水分解される。また、キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物に含まれるキシランは、キシラナーゼによってキシロオリゴ糖に加水分解される。
【００４９】
ここで、キシランは、植物の細胞壁に存在するヘミセルロースの構成成分であり、ヘミセルロースは、セルロースと水素結合や化学結合を介した高次構造によって植物の細胞壁を構成している。本発明では、キシラナーゼだけでなく、セロビオハイドラーゼと、β−グルコシダーゼの活性を有するセルラーゼ組成物を加水分解反応に用いることでキシロオリゴ糖を効率的に生産できることを見出した。
【００５０】
加水分解物には、キシロオリゴ糖のほかに、セルラーゼ組成物に含まれる加水分解酵素によって生じたグルコース、キシロース、マンノース、アラビノース、ガラクトースなどの単糖や、セロビオース、セロテトラオース、マンノビオース、ガラクトビオースなどのオリゴ糖などが含まれていてもよい。
【００５１】
セルラーゼ組成物が、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β−グルコシダーゼ、およびβ−キシロシダーゼの活性を有している場合、以下のような処理をすることで、本発明のセルラーゼ組成物を調製することができる。
【００５２】
セルラーゼ組成物を水系媒体に懸濁または溶解させる。得られたセルラーゼ組成物の懸濁液または水溶液のｐＨを５．５〜８．０に調整して３５℃〜６０℃に保温処理する。セルラーゼ組成物を懸濁する際には、基質を添加しない状態が好ましい。より好ましいｐＨの範囲は、ｐＨ６．０〜８．０であり、さらに好ましくは、ｐＨ６．５〜８．０である。保温時間は、特に限定されないが、２４時間以内が好ましく、さらに好ましくは、１２時間以内である。さらに好ましくは０．１〜８時間の範囲、最も好ましくは２〜６時間の範囲である。また、セルラーゼ組成物を懸濁する際の、セルラーゼ組成物の濃度は、特に限定されないが、タンパク質濃度で０．１ｇ／Ｌ〜１００ｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは１〜５０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２〜１０ｇ／Ｌとなるようにセルラーゼ組成物の濃度を調整することが好ましい。ここでのタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により測定したタンパク質濃度とする。セルラーゼ組成物の懸濁液または水溶液のｐＨ調整には、前述のキシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物のｐＨ調整に用いた酸、アルカリ、またはｐＨ緩衝液を用いることができる。
【００５３】
下記実施例に具体的に記載されるように、上記処理により、β−キシロシダーゼの活性が大幅に低減され、一方、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの活性の低減は比較的小さい。このため、セルラーゼ組成物中のβ−キシロシダーゼ活性をかなり選択的に低減させることができる。したがって、例えば、前記保温処理前のセルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼの活性がセルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５００Ｕ／ｇ超である場合であっても、前記保温処理により、β−キシロシダーゼ活性をセルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５００Ｕ／ｇ以下、好ましくは、４００Ｕ／ｇ以下、さらに好ましくは、３００Ｕ／ｇ以下にまで低減させることができ、一方で、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの活性は、上記したそれぞれ好ましい範囲に維持することができる。真菌に由来するセルラーゼ組成物では、β−キシロシダーゼ活性がセルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５００Ｕ／ｇ超である場合も少なくないが、このようなセルラーゼ組成物であっても、上記した単純な保温処理により、本発明の方法に使用可能な、β−キシロシダーゼの活性を実質的に有さないセルラーゼ組成物にすることができる。なお、ここで、「真菌に由来するセルラーゼ組成物」は、真菌により生産されたセルラーゼ組成物を含んでいれば、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの１種または２種以上を別途、追加的に添加したものも包含される。なお、β−キシロシダーゼ活性をセルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たりのβ−キシロシダーゼ活性は、通常、５０Ｕ／ｇ以上であるので、β−キシロシダーゼ活性は、５０〜５００Ｕ／ｇであることが好ましい。
【００５４】
加水分解反応後の加水分解物からセルラーゼ組成物を回収する方法は、特に限定されないが、例えば、加水分解物を限外濾過膜で濾過し非透過側よりセルラーゼ組成物を回収する方法、加水分解物を固液分離して、固形分からセルラーゼ組成物を溶出する方法が挙げられる。
【００５５】
この中でも、限外濾過膜によるセルラーゼ組成物の回収が好ましい。限外濾過膜による回収方法では、非透過側にセルラーゼ組成物が透過側にキシロオリゴ糖を含む糖液を得ることができるため好ましい。なお、非透過液に加水して、再度限外濾過膜での濾過を繰り返すことにより、セルラーゼ組成物の純度をさらに向上させることができる。
【００５６】
限外濾過膜を用いてセルラーゼ組成物を回収する場合、その分画分子量の好ましい範囲は１，０００〜５０，０００の範囲であればよく、より好ましくは分画分子量５，０００〜５０，０００の範囲であり、さらに好ましくは分画分子量１０，０００〜３０，０００の範囲である。
【００５７】
限外濾過膜の素材としては、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セルロース、セルロースエステル、スルホン化ポリスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ４フッ化エチレンなどを使用することができるが、再生セルロース、セルロース、セルロースエステルはセルラーゼ組成物による分解を受けるため、ＰＥＳ、ＰＶＤＦなどの合成高分子を素材とした限外濾過膜を使用することが好ましい。
【００５８】
限外濾過膜の濾過方式として、デッドエンド濾過、クロスフロー濾過があるが、膜ファウリング抑制の観点から、クロスフロー濾過であることが好ましい。また使用する限外濾過膜の膜形態としては、平膜型、スパイラル型、チューブラー型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。具体的には、ＤＥＳＡＬ社のＧ−５タイプ、Ｇ−１０タイプ、Ｇ−２０タイプ、Ｇ−５０タイプ、ＰＷタイプ、ＨＷＳＵＦタイプ、ＫＯＣＨ社のＨＦＭ−１８０，ＨＦＭ−１８３、ＨＦＭ−２５１、ＨＦＭ−３００、ＨＦＫ−１３１、ＨＦＫ−３２８、ＭＰＴ−Ｕ２０、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｐ、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｓ、Ｓｙｎｄｅｒ社のＳＰＥ１、ＳＰＥ３、ＳＰＥ５、ＳＰＥ１０、ＳＰＥ３０、ＳＰＶ５、ＳＰＶ５０、ＳＯＷ３０、旭化成株式会社製のマイクローザ（登録商標）ＵＦシリーズの分画分子量３，０００から１０，０００に相当するもの、日東電工株式会社製のＮＴＲ７４１０、ＮＴＲ７４５０などが挙げられる。
【００５９】
その他、本発明により得られたキシロオリゴ糖を含む糖液を、さらに糖濃度を高めるために濃縮を行ってもよい。濃縮処理は、蒸発濃縮、減圧濃縮、膜濃縮などを例示することができるが、エネルギー使用量が少なく、糖液に含まれる発酵阻害物質を分離することが可能なＷＯ２０１０／０６７７８５号に記載される、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過する方法により、糖成分が濃縮された糖濃縮液を得ることが好ましい。
【００６０】
また、本発明によって得られたキシロオリゴ糖は、そのまま食品や飼料などの素材の原料として用いてもよい。あるいは、公知の方法により精製度を高めたキシロオリゴ糖を食品や飼料などの素材の原料として用いることもできる。
【００６１】
また、上述した方法により分離したグルコースおよびキシロースを含む糖液を発酵原料として、化学品を生産する能力を有する微生物を生育させることで、各種化学品を製造することができる。ここでいう発酵原料として微生物を生育させるとは、糖液に含まれる糖成分またはアミノ源を微生物の栄養素として利用し、微生物の増殖、生育維持を行うことを意味している。化学品の具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。こうした化学品は、糖液中の糖成分を炭素源として、その代謝の過程において生体内外に化学品として蓄積生産する。微生物によって生産可能な化学品の具体例として、エタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸などの有機酸、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、カダベリンなどのアミン化合物を挙げることができる。さらに、本発明の糖液は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質などの生産に適用することも可能である。こうした化学品の製造に使用する微生物に関しては、目的の化学品を効率的に生産可能な微生物であればよく、大腸菌、酵母、真菌（糸状菌、担子菌）などの微生物を使用することができる。
【実施例】
【００６２】
以下に、実施例と比較例を挙げて本発明を具体的に説明する。【００６３】
参考例１
キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理
キシランとセルロースを含むバイオマスとしてバガスを用いて前処理を行った。バガス５ｇを量りとり、１０５℃になるまで加熱した。このときの重量変化をもとにバガスの固形分率を算出した。含水状態のバガスに含水率を乗じたものを固形分重量とした。バガス１００ｇを固形分重量が水酸化ナトリウム溶液と混合した状態で５重量％、バガス固形分に対する水酸化ナトリウム添加量が１０重量％になるように、水酸化ナトリウム水溶液に浸し、８０℃にて３時間前処理した。遠心分離（３，０００Ｇ、１０分）にて固液分離し、溶液成分と固体分に分離した。固体分を純水で洗浄したものをキシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物として以下の実験に使用した。【００６４】
参考例２
セルラーゼ組成物の調製
［前培養］
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加して、１００ｍＬを５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）添加し、前培養培地とした。この前培養培地１００ｍＬにトリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９（ＡＴＣＣより分譲）を１×１０５個／ｍＬになるように植菌し、２８℃、７２時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、前培養とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ社製  ＢＩＯ−ＳＨＡＫＥＲ  ＢＲ−４０ＬＦ）。【００６５】
［本培養］
コーンスティップリカー５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、セルロース（アビセル）１０％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄(ＩＩＩ)六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅(ＩＩ)五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるよう蒸留水に添加して、２．５Ｌを５Ｌ容撹拌ジャー（ＡＢＬＥ社製  ＤＰＣ−２Ａ）容器に張り込み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別にそれぞれ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ−ＭとＴｗｅｅｎ８０をそれぞれ０．１％添加し、本培養培地とした。この本培養培地２．５Ｌにあらかじめ前記の前培養培地で前培養したトリコデルマ・リーセイＰＣ３−７を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃、８７時間、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍにて培養を行い、遠心分離後、上清を膜濾過（ミリポア社製  ステリカップ−ＧＶ  材質：ＰＶＤＦ）した。この調製した培養液に対し、β―グルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８）をタンパク質重量比として、１／１００量添加し、セルラーゼ組成物を得た。
なお、ＬＡ  Ｇｒａｎｇｅ  ＤＣら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２，１０３６−１０４４，１９９６）、Ｂｏｅｒ  Ｈら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６９，４８６−４９４，２０００）、Ｗｉｌｌｉａｍ  ＪＣら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５，３３３−３４１，１９８７）には、糸状菌由来のセルラーゼ組成物中のキシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β−グルコシダーゼの最適ｐＨはそれぞれｐＨ５．０〜６．０、ｐＨ５．０、ｐＨ５．０であると記載されていることから、本参考例で得られたセルラーゼ組成物の酵素反応の最適ｐＨはｐＨ５であると判断した。【００６６】
参考例３
タンパク質濃度の測定
セルラーゼ組成物のタンパク質濃度の測定には、市販のタンパク質濃度測定試薬（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬２５０μＬに希釈した本発明のセルラーゼ組成物溶液を５μＬ添加し、室温で５分間静置後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ  ＨＴ、大日本住友製薬株式会社製）で測定した。牛血清アルブミン水溶液を標準液とし、検量線に照らし合わせてセルラーゼ組成物溶液のタンパク質濃度を算出した。 【００６７】
参考例４
糖濃度の測定
キシロオリゴ糖、グルコース、キシロースは、日立高速液体クロマトグラフ  ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｉｔｅ（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて、以下の条件で定量分析した。【００６８】
キシロオリゴ糖であるキシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、キシロヘキサオース、およびグルコース、キシロースの標品で作製した検量線をもとに、定量分析した。なお、本実施例で記すキシロオリゴ糖とは、キシロース単位がβグリコシド結合により２〜６個結合したキシロオリゴ糖を指す。【００６９】
カラム：ＫＳ８０２、ＫＳ８０３（Ｓｈｏｄｅｘ）
移動相：水
検出方法：ＲＩ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：７５℃。【００７０】
参考例５
酵素活性測定方法
酵素活性は、１）β−キシロシダーゼの活性、２）キシラン分解活性、３）セロビオハイドラーゼの活性、４）β−グルコシダーゼの活性の４種について、参考例２のセルラーゼ組成物の酵素反応の最適ｐＨであるｐＨ５において以下の手順で測定評価した。【００７１】
１）β−キシロシダーゼの活性
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に、１ｍＭとなるように４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶解したものを基質溶液とした。９０μＬの基質溶液に酵素液１０μＬを添加し、３０℃で静置反応させた。１０分後に炭酸ナトリウム溶液１０μＬを添加して反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定することで４−ニトロフェノールを定量した。上記反応系にて、１分間に１μｍｏｌの４―ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義し、活性値（Ｕ／ｍＬ）を下記式に従って算出した。
β−キシロシダーゼの活性（Ｕ／ｍＬ）＝４−ニトロフェノール（μｍｏｌ／ｍｌ）×反応液量（μｌ）／（（反応時間（ｍｉｎ）×酵素液量（μＬ））×希釈倍率（倍）。【００７２】
２）キシラン分解活性
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に、１重量％になるようキシラン（Ｘｙｌａｎ  ｆｒｏｍ  Ｂｉｒｃｈ  ｗｏｏｄ、Ｆｌｕｋａ社製）を懸濁したものを基質溶液とした。分注した５００μＬの基質溶液に酵素液５μＬを添加し、５０℃で回転混和しながら反応させた。反応時間は３０分間を基本とし、酵素活性の高さに応じて１０〜６０分間まで適宜変更した。反応後、チューブを遠心分離し、その上清成分の還元糖濃度をＤＮＳ法により測定した。上記反応系にて１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素量を１Ｕと定義し、活性値（Ｕ／ｍＬ）を下記式に従って算出した。
キシラン分解活性（Ｕ／ｍＬ）＝還元糖濃度（ｇ／Ｌ）×１０００×５０５（μＬ）／（１５０．１３×反応時間（分）×５（μＬ））。【００７３】
３）セロビオハイドラーゼの活性
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に、１ｍＭとなるように４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶解したものを基質溶液とした。９０μＬの基質溶液に酵素液１０μＬを添加し、３０℃で静置反応させた。１０分後に炭酸ナトリウム溶液１０μＬを添加して反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定することで４−ニトロフェノールを定量した。上記反応系にて、１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義し、活性値（Ｕ／ｍＬ）を下記式に従って算出した。
セロビオハイドラーゼの活性（Ｕ／ｍＬ）＝４−ニトロフェノール（μｍｏｌ／ｍｌ）×反応液量（μｌ）／（反応時間（ｍｉｎ）×酵素液量（μＬ））×希釈倍率（倍）。
本測定方法において、活性値が５Ｕ／ｇ未満になると検出感度が低下するため５Ｕ／ｇ未満を検出限界としている。【００７４】
４）β−グルコシダーゼの活性（ＢＧＬ活性）。
５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）に、１ｍＭとなるように４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶解したものを基質溶液とした。９０μＬの基質溶液に酵素液１０μＬを添加し、３０℃で静置反応させた。１０分後に炭酸ナトリウム溶液１０μＬを添加して反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定することで４−ニトロフェノールを定量した。上記反応系にて、１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義し、活性値（Ｕ／ｍＬ）を下記式に従って算出した。
β−グルコシダーゼの活性（Ｕ／ｍＬ）＝４−ニトロフェノール（μｍｏｌ／ｍｌ）×反応液量（μｌ）／（反応時間（ｍｉｎ）×酵素液量（μＬ））×希釈倍率（倍）。
本測定方法において、活性値が５０Ｕ／ｇ未満になると検出感度が低下するため５０Ｕ／ｇを検出限界としている。【００７５】
比較例１
キシラナーゼを用いた加水分解反応
参考例１に従って調製したキシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物の固形分率を参考例１に記載のバガスの固形分率と同様の方法で測定し、固形分で１ｇずつ５０ｍＬチューブに秤量した。キシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物の固形分濃度が反応開始時に１０重量％となるように純水を加えつつ、希塩酸を用いてｐＨ５．０に調整した。ｐＨを調製したキシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物に工業用キシラナーゼとしてセルロシンＴＰ２５（エイチビィアイ社製）を、参考例５に記載の方法でキシラン分解活性を測定し、キシラン分解活性がキシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物の固形分１ｇ当たり２５０Ｕになるようにキシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物添加した。続いて、ハイブリダイゼーションローテータ（日伸理化社製  ＳＮ−０６ＢＮ）を用いてセルロシンＴＰ２５の推奨ｐＨ、温度条件であるｐＨ５．０、４０℃の反応条件で８時間回転混和した。参考例４に記載の方法で加水分解物の上清に含まれる糖成分を測定した。【００７６】
実施例１
特定のｐＨ・温度条件で保温した本発明のセルラーゼ組成物を用いた加水分解反応
参考例２で得られたセルラーゼ組成物のｐＨを１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ５．５〜８．０に調整し、水によりタンパク質濃度４ｇ／Ｌまで希釈後、３５〜６０℃の温度範囲で保温した。詳細な保温処理条件は表1に記載した。それぞれの条件で保温処理したセルラーゼ組成物について、参考例５に記載の方法でセロビオハイドラーゼの活性、β−グルコシダーゼの活性、キシラン分解活性、β−キシロシダーゼの活性を測定した結果と、保温処理前の活性と比較した結果をそれぞれ表１に示す。これらの結果より、いずれの条件の保温処理によっても、酵素活性の最適ｐＨにおけるβ−キシロシダーゼの活性は、バイオマスに対する加水分解時に実質的に活性を有さない値にまで低減され、セロビオハイドラーゼの活性、β−グルコシダーゼの活性、キシラン分解活性は６０％以上残存していることから、いずれの保温処理条件によっても、β−キシロシダーゼ活性が選択的に失活することがわかった。【００７７】
続いて、各条件で保温処理を行うことでβ−キシロシダーゼ活性が選択的に失活したセルラーゼ組成物を本発明のセルラーゼ組成物として用い、キシランとセルロースを含むバイオマスの加水分解反応を行った。保温処理前に参考例５に準じて測定したキシラン分解活性をもとに、本発明のセルラーゼ組成物をキシラン分解活性がキシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物の固形分１ｇ当たり２５０ＵになるようにｐＨ７．０に調整したキシランとセルロースを含むバイオマスの前処理物に添加して、ハイブリダイゼーションローテータを用いてｐＨ７．０、４０℃で８時間回転混和した。参考例４に記載の方法で加水分解物の上清に含まれる糖成分を測定した結果を表２に示す。比較例１のキシラナーゼ及び比較例２の保温処理を施していないセルラーゼ組成物を用いた加水分解反応と比べてより多くのキシロオリゴ糖を得られることが明らかになった。【００７８】
【表１】
2017170919.tif 000002
【００７９】
【表２】
2017170919.tif 000003
【００８０】
実施例２
実施例１の加水分解反応において、ｐＨ７．５、温度４０℃、保温時間２時間の条件で保温処理したセルラーゼ組成物を用いて、ｐＨ６．０〜８．０、温度４０℃の条件で加水分解反応を行った。それ以外の操作は実施例１の加水分解反応と同じである。加水分解物の上清に含まれる糖成分を測定した結果を表３に示す。これらの結果より、いずれのｐＨ条件で加水分解反応を行っても、比較例１のキシラナーゼを用いた加水分解反応と比べてより多くのキシロオリゴ糖を得られることがわかった。【００８１】
【表３】
2017170919.tif 000004
【００８２】
実施例３
参考例２におけるセルラーゼ組成物において、β−グルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８）の添加前にｐH７．５、温度４０℃、保温時間２時間の条件で保温処理後を行った。保温処理後のβ−グルコシダーゼの活性は１２４Ｕ／ｇであった。次に、保温処理後のセルラーゼ組成物にβグルコシダーゼ活性がそれぞれ１，０００Ｕ／ｇ、５，０００Ｕ／ｇ、１０，０００Ｕ／ｇ、１４，０００Ｕ／ｇ、１８，０００Ｕ／ｇ、２５，０００Ｕ／ｇとなるようにβ−グルコシダーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ１８８）を添加したものを本実施例で用いるセルラーゼ組成物とした。実施例２の加水分解反応において、このセルラーゼ組成物を用いてｐH７．０、温度４０℃の条件で加水分解反応を行った。参考例４に記載の方法で加水分解物の上清に含まれる糖成分を測定した結果を表４に示す。これらの結果より、β−グルコシダーゼ添加量が多いセルラーゼ組成物においてキシロオリゴ糖収量が向上することがわかった。【００８３】
【表４】
2017170919.tif 000005
【００８４】
実施例３
実施例１の加水分解反応において、ｐＨ７．５、温度４０℃、保温時間２時間の条件で保温処理したセルラーゼ組成物を用いて、ｐＨ７．０、温度３５〜４５℃の条件で加水分解反応を行った。８時間回転混和して得られた加水分解物を８，０００ｇ、５分間遠心分離することにより、液成分と固形分に分離した。液成分は細孔径０．２２μｍの精密濾過膜（Ｍｉｌｌｅｘ―ＧＶ、ミリポア社製）に通じて濾過することで、濾過液を得た。さらに、得られた濾過液を分画分子量１０，０００の限外濾過膜（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０‐１０Ｋ、ザルトポア社製）に通じて濾過することで、透過液と非透過液を得た。透過液に含まれる糖成分を測定した結果を表４に、非透過液中に含まれる酵素活性を参考例５に準じた方法により測定した結果を表５に示す。ここで、酵素活性は、セルラーゼ組成物を保温処理する前の各酵素活性を１００とした場合の非透過液中の酵素活性を相対的に表している。これらの結果より、キシロオリゴ糖を生成した加水分解物より、加水分解後もキシラナーゼ、セロビオハイドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの活性が高く維持されたセルラーゼ組成物を回収できることがわかった。【００８５】
【表５】
2017170919.tif 000006
【００８６】
【表６】
2017170919.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明で得られるキシロオリゴ糖は、キシロオリゴ糖を含む食品や飼料などの素材の原料として使用することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月18日(2017.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシランとセルロースを含むバイオマスをセルラーゼ組成物で加水分解することによるキシロオリゴ糖の製造方法であって、該セルラーゼ組成物がバイオマスに対して加水分解時に少なくとも、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ及びβ−グルコシダーゼの活性を有し、かつβ−キシロシダーゼの活性を実質的に有さないセルラーゼ組成物であり、前記セルラーゼ組成物が、前記バイオマスに対して少なくともキシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β‐グルコシダーゼ活性およびβ−キシロシダーゼ活性を有するトリコデルマ属真菌由来セルラーゼ混合物を保温処理することによって、前記バイオマスに対するβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロシダーゼの活性を実質的に失活させて得られた酵素活性成分を含む、キシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
前記保温処理が、ｐＨ５．５〜８．０に調整した前記トリコデルマ属真菌由来セルラーゼ混合物を、３５℃〜６０℃で保温する処理である、請求項１に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
前記セルラーゼ組成物のβ−グルコシダーゼ活性成分が、アスペルギルス属真菌のβ−グルコシダーゼ活性成分を含む、請求項１又は２記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼの活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として、該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５０〜５００Ｕ／ｇである請求項１から３のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
前記セルラーゼ組成物のβ―グルコシダーゼの活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する活性として、該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり１４，０００Ｕ／ｇ以上である請求項１から４のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項６】
前記加水分解時のｐＨ条件がｐＨ６．０〜８．０である、請求項１から５のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項７】
キシランとセルロースを含むバイオマスをアルカリ処理することによって得られる前処理物を前記セルラーゼ組成物で加水分解する、請求項１から６のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項８】
前記加水分解反応で得られた加水分解物を、固液分離し、得られた液成分を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過側からセルラーゼ組成物を回収し、透過側からキシロオリゴ糖を得る工程をさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）から（８）の構成を有する。
（１）キシランとセルロースを含むバイオマスをセルラーゼ組成物で加水分解することによるキシロオリゴ糖の製造方法であって、該セルラーゼ組成物がキシランとセルロースを含むバイオマスに対して加水分解時に少なくとも、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼおよびβ−グルコシダーゼの活性を有し、かつβ−キシロシダーゼの活性を実質的に有さないセルラーゼ組成物であり、前記セルラーゼ組成物が、前記バイオマスに対して少なくともキシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β‐グルコシダーゼ活性およびβ−キシロシダーゼ活性を有するトリコデルマ属真菌由来セルラーゼ混合物を保温処理することによって、前記バイオマスに対するβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロシダーゼの活性を実質的に失活させて得られた酵素活性成分を含む、キシロオリゴ糖の製造方法。
（２）前記保温処理が、ｐＨ５．５〜８．０に調整した前記トリコデルマ属真菌由来セルラーゼ混合物を、３５℃〜６０℃で保温する処理である、（１）に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（３）前記セルラーゼ組成物のβ−グルコシダーゼ活性成分が、アスペルギルス属真菌のβ−グルコシダーゼ活性成分を含む、（１）又は（２）に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（４）前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼの活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として、該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５０〜５００Ｕ／ｇである（１）から（３）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（５）前記セルラーゼ組成物のβ―グルコシダーゼの活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する活性として、該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり１４，０００Ｕ／ｇ以上である（１）から（４）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（６）前記加水分解時のｐＨ条件がｐＨ６．０〜８．０である、（１）から（５）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（７）キシランとセルロースを含むバイオマスをアルカリ処理することによって得られる前処理物を前記セルラーゼ組成物で加水分解する、（１）から（６）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（８）前記加水分解反応で得られた加水分解物を、固液分離し、得られた液成分を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過側からセルラーゼ組成物を回収し、透過側からキシロオリゴ糖を得る工程をさらに含む、（１）から（７）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月25日(2018.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシランとセルロースを含むバイオマスをセルラーゼ組成物で加水分解することによるキシロオリゴ糖の製造方法であって、該セルラーゼ組成物がバイオマスに対して加水分解時に少なくとも、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ及びβ−グルコシダーゼの活性を有し、かつβ−キシロシダーゼの活性を実質的に有さないセルラーゼ組成物であり、前記セルラーゼ組成物のキシラナーゼ活性成分およびセロビオハイドラーゼ活性成分が、前記バイオマスに対して少なくともキシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β‐グルコシダーゼおよびβ−キシロシダーゼの活性を有するトリコデルマ属真菌由来セルラーゼ混合物を３５℃〜６０℃で保温処理することによって、前記バイオマスに対するβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロシダーゼの活性を実質的に失活させて得られた酵素活性成分を含む、キシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項２】
前記保温処理が、ｐＨ５．５〜８．０に調整した前記トリコデルマ属真菌由来セルラーゼ混合物を、３５℃〜６０℃で保温する処理である、請求項１に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項３】
前記セルラーゼ組成物のβ−グルコシダーゼ活性成分が、アスペルギルス属真菌のβ−グルコシダーゼ活性成分を含む、請求項１又は２記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項４】
前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼの活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として、該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５０〜５００Ｕ／ｇである請求項１から３のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項５】
前記セルラーゼ組成物のβ―グルコシダーゼの活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する活性として、該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり１４，０００Ｕ／ｇ以上である請求項１から４のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項６】
前記加水分解時のｐＨ条件がｐＨ６．０〜８．０である、請求項１から５のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項７】
キシランとセルロースを含むバイオマスをアルカリ処理することによって得られる前処理物を前記セルラーゼ組成物で加水分解する、請求項１から６のいずれか１項に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項８】
前記加水分解反応で得られた加水分解物を、固液分離し、得られた液成分を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過側からセルラーゼ組成物を回収し、透過側からキシロオリゴ糖を得る工程をさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）から（８）の構成を有する。
（１）キシランとセルロースを含むバイオマスをセルラーゼ組成物で加水分解することによるキシロオリゴ糖の製造方法であって、該セルラーゼ組成物がバイオマスに対して加水分解時に少なくとも、キシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ及びβ−グルコシダーゼの活性を有し、かつβ−キシロシダーゼの活性を実質的に有さないセルラーゼ組成物であり、前記セルラーゼ組成物のキシラナーゼ活性成分およびセロビオハイドラーゼ活性成分が、前記バイオマスに対して少なくともキシラナーゼ、セロビオハイドラーゼ、β‐グルコシダーゼおよびβ−キシロシダーゼの活性を有するトリコデルマ属真菌由来セルラーゼ混合物を３５℃〜６０℃で保温処理することによって、前記バイオマスに対するβ−グルコシダーゼおよびβ−キシロシダーゼの活性を実質的に失活させて得られた酵素活性成分を含む、キシロオリゴ糖の製造方法。
（２）前記保温処理が、ｐＨ５．５〜８．０に調整した前記トリコデルマ属真菌由来セルラーゼ混合物を、３５℃〜６０℃で保温する処理である、（１）に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（３）前記セルラーゼ組成物のβ−グルコシダーゼ活性成分が、アスペルギルス属真菌のβ−グルコシダーゼ活性成分を含む、（１）又は（２）に記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（４）前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼの活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として、該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり５０〜５００Ｕ／ｇである（１）から（３）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（５）前記セルラーゼ組成物のβ―グルコシダーゼの活性が、４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する活性として、該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｇ当たり１４，０００Ｕ／ｇ以上である（１）から（４）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（６）前記加水分解時のｐＨ条件がｐＨ６．０〜８．０である、（１）から（５）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（７）キシランとセルロースを含むバイオマスをアルカリ処理することによって得られる前処理物を前記セルラーゼ組成物で加水分解する、（１）から（６）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
（８）前記加水分解反応で得られた加水分解物を、固液分離し、得られた液成分を限外濾過膜に通じて濾過し、非透過側からセルラーゼ組成物を回収し、透過側からキシロオリゴ糖を得る工程をさらに含む、（１）から（７）のいずれかに記載のキシロオリゴ糖の製造方法。
【国際調査報告】
2017170919.tif 000008
2017170919.tif 000009
2017170919.tif 000010
2017170919.tif 000011