(57)【要約】  本発明は、医薬品等の原料として有用なタンパク質モノマーを、工業的かつ経済的に、高収率かつ高純度で得ることを目的とする。本発明のタンパク質の精製方法は、タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体を含むタンパク質溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液し、タンパク質モノマーをフロースルーで回収することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体を含むタンパク質溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液し、タンパク質モノマーをフロースルーで回収することを特徴とするタンパク質の精製方法。
【請求項２】
タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体を含む溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、前記タンパク質モノマーおよび前記タンパク質凝集体を負荷する工程と、
前記タンパク質モノマーおよび前記タンパク質凝集体を負荷したカラムに、移動相を通すことにより前記凝集体を吸着させ、前記タンパク質モノマーをフロースルー様式で回収する工程と、
を有することを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項３】
タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体を含む溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、前記タンパク質凝集体を前記カラムに吸着させ、前記タンパク質モノマーをフロースルーで回収することを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項４】
タンパク質溶液が、さらに宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
【請求項５】
タンパク質モノマー、タンパク質凝集体及びＨＣＰを含む溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、前記タンパク質モノマー、前記タンパク質凝集体及び前記ＨＣＰを負荷する工程と、
前記タンパク質モノマー、前記タンパク質凝集体及び前記ＨＣＰを負荷したカラムに、移動相を通すことにより前記タンパク質凝集体及び前記ＨＣＰを吸着させ、前記タンパク質モノマーをフロースルー様式で回収する工程と、
を有することを特徴とする請求項４に記載の精製方法。
【請求項６】
タンパク質モノマー、タンパク質凝集体及びＨＣＰを含む溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、前記タンパク質凝集体と前記ＨＣＰを前記カラムに吸着させ、前記タンパク質モノマーをフロースルーで回収することを特徴とする請求項４に記載の精製方法。
【請求項７】
前記硬質多孔高分子自己支持構造物を構成するためのモノマーが、メタクリレート類またはアクリレート類である請求項１〜６のいずれか1項に記載の精製方法。
【請求項８】
前記硬質多孔性高分子自己支持構造物の通液方向の厚さが、１〜１００ｍｍである請求項１〜７のいずれか1項に記載の精製方法。
【請求項９】
前記移動相の流速が２ＣＶ／分以上である請求項１〜８のいずれか1項に記載の精製方法。
【請求項１０】
前記タンパク質溶液に含まれるタンパク質の濃度は０．００１〜２０ｍｇ／ｍＬである請求項１〜９のいずれか1項に記載の精製方法。
【請求項１１】
前記カラムのカラム体積１ｍＬあたりのタンパク質負荷量は、０．００１〜５０ｍｇである請求項１〜１０のいずれか1項に記載の精製方法。
【請求項１２】
イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによる予備精製工程を更に含み、前記予備精製工程の後に実施する請求項１〜１１のいずれか1項に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体及び／又はバイオ医薬品製造工程での宿主細胞由来タンパク質を含む溶液からタンパク質凝集体及び／又は宿主細胞由来タンパク質を除去するタンパク質の精製方法に関する。
本願は、２０１５年４月３０日に、日本に出願された特願２０１５−０９３２４１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ医薬品の製造工程の中で、タンパク質が二量体、三量体等の凝集体を形成し、形成されたタンパク質凝集体が目的物質由来の不純物となることがある。タンパク質は製造過程（濃縮、酸性ｐＨ暴露、加温操作）や保存過程（溶液、凍結溶液、凍結乾燥）において分子間で会合し、凝集体を形成することが知られており、これが薬効の低下や免疫原性の発現等、医薬品にとって有害な影響をもたらすことが懸念されている。そのため、不純物である凝集体を人体に有害な影響がなくなる程度まで除去することが望まれている。
これをふまえ、医薬用タンパク質、特に抗体タンパク質などを精製することを目的として、クロマトグラフィーによって凝集体を除去する方法が多数開発された。【０００３】
報告された方法としては、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等を単独で用いるものや、複数用いるもの、これらを混合した混合モードクロマトグラフィーがある。これらは、いずれもビーズ状の多孔質高分子担体を用いたクロマトグラフィーによるものである。タンパク質凝集体とタンパク質モノマーのわずかな相互作用の違いにより両者を分離するためには、分離条件を精密に制御し、優れた分離能を発揮することが要求される。しかし、ビーズ状の多孔質高分子担体を用いたクロマトグラフィーでは、高流速になると分離性能が低下することが知られている。【０００４】
また、会合凝集体を含む抗体の溶液にアルギニンやアルギニン誘導体を含有させ、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分離する方法も報告されている。タンパク質はカラム充填剤の固定相空隙に拡散することにより、その分子量に応じて溶出する。この溶出順序の違いからタンパク質凝集体とタンパク質モノマーを分離することが可能となるが、その溶出順序は拡散に依存するため時間がかかる。またアルギニンを溶液へ添加する工程を精製プロセスに組み込む必要性や、将来的にアルギニンを除去することを義務付けられる可能性を含んでいる。これらの方法では、高流速な通液による迅速な分離を行い、精製工程の時間短縮を実現することは困難であった。【０００５】
タンパク質凝集体を高流速で除去する方法として、アニオン交換基が固定された多孔膜を用いた抗体の精製方法が開示されている。（特許文献１）しかしながら、開示されている方法は、内容量２ｍＬの中空多孔膜モジュールに対して、２ｍＬ／ｍｉｎで通液している。これは、市販のビーズ充填型アニオン交換クロマトグラフィー（カラム溶液１ｍＬ）に用いる流速１ｍＬ／ｍｉｎと容積あたりの流速は変わらない。よって高流速な通液による迅速な分離は実現しておらず、新たな方法が求められていた。【０００６】
フロースルー様式での、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いたタンパク質混合物からの抗体の精製も知られている。（特許文献２）しかしながら、開示されている方法は、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）とＨＩＣを連続的に用い、ＡＥＸを用いた工程で主にＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、プロテインＡ、ウイルス、タンパク質の培地成分などの不純物を除去し、ＨＩＣを用いた工程では主にタンパク質凝集体を除去しており、ＨＩＣを単独で用いることが可能かについては詳細に述べられていない。よってＨＩＣを使用可能な工程が限られており、任意にＨＩＣを用いる新たな方法が求められていた。【０００７】
イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液でのクロマトグラフィー材料からのポリペプチドの溶出による、ヒスチジンタグを含むポリペプチドの精製のためのアフィニティークロマトグラフィー法も知られている。（特許文献３）しかしながら、開示されている方法は、ヒスチジンタグを含むポリペプチドに限定されており、バイオ医薬品に用いられる様々なタンパク質凝集体の精製方法が求められていた。【０００８】
タンパク質凝集体を含む抗体、疎水性タンパク質または疎水性ペプチドの少なくとも一種を含む溶液をゲルろ過クロマトグラフィーで精製する方法において展開溶媒にアルギニンまたはアルギニン誘導体を含有させることにより、抗体、疎水性タンパク質、または疎水性ぺプチドの回収率を高める方法も知られている。（特許文献４）しかしながら、開示されている方法は、アルギニンを含有させる必要があり、より単純な操作による、タンパク質凝集体を含む抗体、疎水性タンパク質または疎水性ペプチドの処理が求められていた。【０００９】
温度応答性カチオン性イオン交換樹脂を用いた抗体タンパク質の凝集体精製も報告されている。（特許文献５）しかしながら、開示されている方法は、０．４ｍｌ／ｍｉｎであり精製工程に時間がかかってしまう。より速い流速での精製が求められている。【００１０】
ポリアミドからできたディスポーザブル材料の膜を用いた抗体タンパク質の凝集体精製も報告されている。（特許文献６）しかしながら、開示されている方法は、２ｍｇ／ｍｌに溶解したヒト免疫グロブリンＧ１ｍｌの精製であり、工業的なスケールからは離れている。より工業的にタンパク質凝集体の除去を実現させる方法が求められている。【００１１】
陰イオン交換クロマトグラフィー物質を用いて免疫グロブリン凝集体及び免疫グロブリンフラグメントを除去する方法も報告されている。（特許文献７）しかしながら、開示されている方法は、陰イオン交換クロマトグラフィー工程をｐＨ７．８〜ｐＨ８．８の狭いｐＨ値範囲で行わなければならない。幅広いｐＨ値でタンパク質凝集体の除去が可能である方法が求められている。【００１２】
また、バイオ医薬品の不純物として特徴的であるのは、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ：Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）である。異種細胞のタンパク質がヒトに対して抗原性を示すのはもちろん、哺乳動物細胞からのＨＣＰには造腫瘍性リスクが存在する。
バイオ医薬品は、通常は哺乳動物細胞、または昆虫細胞や大腸菌などを用いて製造されるが、製造時にその宿主細胞由来のタンパク質／ペプチドの不純物、いわゆるＨＣＰが混入することで、その薬物を投与した患者においてＨＣＰに対する重篤な免疫反応や主剤の免疫原生の亢進（ＨＣＰのアジュバンド作用）が引き起こされることが知られている。したがって、バイオ医薬品におけるＨＣＰの混入を最小限にするため、適切な分析技術を用いて各精製工程におけるＨＣＰのクリアランス能を評価することは非常に重要である。
これをふまえ、医薬用タンパク質、特に抗体タンパク質などを精製することを目的として、クロマトグラフィーによってＨＣＰやタンパク質凝集体を除去する方法が多数開発された。【００１３】
報告された方法としては、ＨＣＰの除去には疎水性相互作用クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィーなどがある。これらは、いずれもビーズ状の多孔質高分子担体を用いたクロマトグラフィーによるものである。ＨＣＰを精製するためには、分離条件を精密に制御し、優れた分離能を発揮することが要求される。しかし、ビーズ状の多孔質高分子担体を用いたクロマトグラフィーでは、高流速になると分離性能が低下することが知られている。【００１４】
フロースルー様式での、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いたタンパク質混合物からの抗体の精製も知られている。（特許文献２）しかしながら、開示されている方法は、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）とＨＩＣを連続的に用い、ＡＥＸを用いた工程で主にＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、プロテインＡ、ウイルス、タンパク質の培地成分などの不純物を除去し、ＨＩＣを用いた工程では主にタンパク質凝集体を除去しており、ＨＣＰとタンパク質凝集体が同時に除去可能かについては言及されていない。よって、ＨＣＰとタンパク質凝集体が同時に除去できる新たなタンパク質の精製方法が求められていた。【００１５】
プロテインＡクロマトグラフィーなどによってＨＣＰの除去が行われることは知られている。（特許文献８）しかしながら、開示されている方法は、ＨＣＰのみを分離しており、タンパク質凝集体の分離を同時に行うことが可能かについては述べられていない。よって、ＨＣＰとタンパク質凝集体が同時に除去できる新たなタンパク質の精製方法が求められていた。【００１６】
セラミックスヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって、酸性タンパク質が精製されることは知られている。（特許文献９）しかしながら、開示されている方法は、タンパク質凝集体やＨＣＰを同時に除去することが可能であるものの、その分離にはカラムの再生を含めると８００分かかっている。よって、ＨＣＰとタンパク質凝集体が同時に高速に除去できる新たなタンパク質の精製方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開２０１０−２４１７６１号公報
【特許文献２】特表２０１３−５１９６５２号公報
【特許文献３】特表２０１３−５２７８５１号公報
【特許文献４】特開２００６−２４２９５７号公報
【特許文献５】特開２０１４−１２９３１９号公報
【特許文献６】特開２００５−１４５８５２号公報
【特許文献７】特表２０１２−５１３４２５号公報
【特許文献８】特表２０１３−５１７３１８号公報
【特許文献９】特表２０１２−５０７５５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、医薬品等の原料として有用なタンパク質モノマーを、工業的かつ経済的に、高収率かつ高純度で得ることを目的とする。より具体的にはタンパク質モノマー及びタンパク質凝集体、及び／又はＨＣＰを含む混合物からタンパク質凝集体及び／又はＨＣＰを高速で除去し、タンパク質モノマーを高収率で得るための方法と、タンパク質モノマーを選択的に回収するための条件検討を短時間化するタンパク質の精製方法とを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明らは、タンパク質凝集体及び／又はＨＣＰの除去するタンパク質の精製方法について鋭意検討を行った。その結果、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムを用いてクロマトグラフィーを行うと、タンパク質モノマーを高流速条件で回収できることを見出した。また、この知見を用いてタンパク質モノマーを選択的に回収するための条件検討を行えば、条件検討を短時間化できることも見出し、本発明を完成した。【００２０】
本発明は以下の通りである。
［１］  タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体を含むタンパク質溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液し、タンパク質モノマーをフロースルーで回収することを特徴とするタンパク質の精製方法。
［２］  タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体を含む溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、前記タンパク質モノマーおよび前記タンパク質凝集体を負荷する工程と、
前記タンパク質モノマーおよび前記タンパク質凝集体を負荷したカラムに、移動相を通すことにより前記凝集体を吸着させ、前記タンパク質モノマーをフロースルー様式で回収する工程と、
を有することを特徴とする［１］に記載の精製方法。
［３］  タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体を含む溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、前記タンパク質凝集体を前記カラムに吸着させ、前記タンパク質モノマーをフロースルーで回収することを特徴とする［１］に記載の精製方法。
［４］  タンパク質溶液が、さらに宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）を含むことを特徴とする［１］に記載の精製方法。
［５］  タンパク質モノマー、タンパク質凝集体及びＨＣＰを含む溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、前記タンパク質モノマー、前記タンパク質凝集体及び前記ＨＣＰを負荷する工程と、
前記タンパク質モノマー、前記タンパク質凝集体及び前記ＨＣＰを負荷したカラムに、移動相を通すことにより前記タンパク質凝集体及び前記ＨＣＰを吸着させ、前記タンパク質モノマーをフロースルー様式で回収する工程と、
を有することを特徴とする［４］に記載の精製方法。
［６］  タンパク質モノマー、タンパク質凝集体及びＨＣＰを含む溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、前記タンパク質凝集体と前記ＨＣＰを前記カラムに吸着させ、前記タンパク質モノマーをフロースルーで回収することを特徴とする［４］に記載の精製方法。
［７］  前記硬質多孔高分子自己支持構造物を構成するためのモノマーが、メタクリレート類またはアクリレート類である［１］〜［６］のいずれかに記載の精製方法。
［８］  前記硬質多孔性高分子自己支持構造物の通液方向の厚さが、１〜１００ｍｍである［１］〜［７］のいずれかに記載の精製方法。
［９］  前記移動相の流速が２ＣＶ／分以上である［１］〜［８］のいずれかに記載の精製方法。
［１０］  前記タンパク質溶液に含まれるタンパク質の濃度は０．００１〜２０ｍｇ／ｍＬである［１］〜［９］のいずれかに記載の精製方法。
［１１］  前記カラムのカラム体積１ｍＬあたりのタンパク質負荷量は、０．００１〜５０ｍｇである［１］〜［１０］のいずれかに記載の精製方法。
［１２］  イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによる予備精製工程を更に含み、前記予備精製工程の後に実施する［１］〜［１１］のいずれかに記載の精製方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のタンパク質凝集体及び／又はＨＣＰを除去するタンパク質の精製方法によれば、医薬品等の原料として有用なタンパク質モノマーを、工業的かつ経済的に、高収率かつ高純度で得ることができる。より具体的にはタンパク質モノマー及びタンパク質凝集体及び／又はＨＣＰを含む混合物からタンパク質凝集体及び／又はＨＣＰを高速で除去し、タンパク質モノマーを高収率で得ることができる。また、この知見を用いてタンパク質モノマーを選択的に回収するための条件検討を行えば、条件検討を短時間化することができる。  
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】クロマトグラムにおけるフロースルー部分を示す。
【図２】実施例の回収率計算のために用いた装置の流路図である。
【図３】実施例の純度計算のために用いた装置の流路図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、本発明はそれらに限定されるものではなく、それらにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００２４】
（第１実施態様：二工程精製）
［タンパク質凝集体の除去方法］
本発明の第１実施態様のタンパク凝集体の除去方法は、タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体を含む溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、前記タンパク質モノマー及び前記タンパク質凝集体を負荷する工程と、前記タンパク質モノマー及び前記タンパク質凝集体を負荷したカラムに、移動相を通すことにより前記タンパク質凝集体を吸着させ、前記タンパク質モノマーをフロースルー様式で回収する工程と、を有することを特徴とする。
【００２５】
［タンパク質凝集体及びＨＣＰの除去方法］
本発明の第１実施態様のタンパク質凝集体及びＨＣＰの除去方法は、タンパク質モノマー、タンパク質凝集体及びＨＣＰを含む溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、前記タンパク質モノマー、タンパク質凝集体及び前記ＨＣＰを負荷する工程と、前記タンパク質モノマー、前記タンパク質凝集体及び前記タンパク質凝集体を負荷したカラムに、移動相を通すことにより前記タンパク質凝集体及び前記ＨＣＰを吸着させ、前記タンパク質モノマーをフロースルー様式で回収する工程と、を有することを特徴とする。
また、本発明の第１実施態様のタンパク質の精製方法は、上記精製方法の前に、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによる予備精製工程を更に含むことができる。
【００２６】
＜疎水性基＞
疎水性基としては、ノルマル−脂肪族基、イソ−脂肪族基、ネオ−脂肪族基、オリゴ（アルキレングリコール）基が挙げられる。具体的には、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、オクタデシル基、ドコシル基、オクタコシル基、ポリ（エチレングリコール）基、またはポリ（プロピレングリコール）基、フェニル基などを用いることができる。これらは共有結合で他の官能基に連結されていてもよい。
疎水性基は、好ましくはブチル基、オクチル基、フェニル基、オクタデシル基、ドコシル基、オクタコシル基、より好ましくはブチル基、オクチル基、フェニル基、さらに好ましくはブチル基である。
【００２７】
＜硬質多孔性高分子自己支持構造物＞
硬質多孔性高分子自己支持構造物とは、少なくとも２つ以上の重合可能な部分を有するモノマー類、または少なくとも２種類のモノマー類（第一の種類のモノマーは重合可能な部分を有するものであり、もう一つの種類のモノマーは前記第一のモノマーの重合により得られる高分子鎖を架橋できるものである）の重合により得られる高分子の構造体である。また、多孔質であり、その孔は全体にわたって均一な孔径分布を有する。形状は、板状、管状、円筒状等、一体構造に形成されている。
【００２８】
硬質多孔性高分子自己支持構造物の通液方向の厚さは１〜１００ｍｍであることが好ましい。好ましくは２〜７０ｍｍ、より好ましくは３〜６０ｍｍ、さらに好ましくは３〜５０ｍｍである。
硬質多孔性高分子自己支持構造物の厚さを１ｍｍ以上とすることにより、十分な機械的強度を持つ。
硬質多孔性高分子自己支持構造物の厚さを１００ｍｍ以下とすることにより、硬質多孔性高分子自己支持構造物の破壊を生じない圧力を保ち、ポンプ圧の上昇を防ぐことができる。
【００２９】
硬質多孔性高分子自己支持構造物を構成するためのモノマーとしては、疎水性基を有するモノマーが用いられ、例えば、ポリビニルモノマー及びモノビニルモノマーを使用することができる。
【００３０】
ポリビニルモノマーとしては、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、ジビニルピリジン、メタクリレート類、アクリレート類、ビニルエステル類、ジビニルエーテルなどのビニルエーテル類、エチレンビスアクリルアミドやプロピレンビスアクリルアミドなどのアルキレンビスアクリルアミド類またはメタクリルアミド類及びそれらの混合物を使用することができる。
メタクリレート類としては、グリシジルメタクリレート、エチレングリコールジメタクリレートやプロピレングリコールジメタクリレートなどのアルキレンジメタクリレート類、ヒドロキシエチルメタクリレートやヒドロキシプロピルメタクリレートなどのヒドロキシアルキルメタクリレート類、ペンタエリトリトールジ−、トリ−若しくはテトラメタクリレートトリメチロールプロパントリメタクリレートまたはアクリレートを使用することができる。
アクリレート類としては、エチレングリコールジアクリレート類、ペンタエリトリトールジ−、トリ−若しくはテトラアクリレートを使用することができる。
【００３１】
モノビニルモノマーとしては、スチレン、置換スチレン（ただし、置換基はクロロメチル基、１８までの炭素原子を有するアルキル基、水酸基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、ハロゲン基、ニトロ基、アミノ基、保護水酸基またはアミノ基を包含する）、ビニルナフタレン、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、酢酸ビニル及びピロリドン、並びにそれらの混合物を使用することができる。
【００３２】
硬質多孔性高分子自己支持構造物を構成するモノマーとしては、好ましくはメタクリレート類、アクリレート類、より好ましくはグリシジルメタクリレート、アルキレンジメタクリレート類、さらに好ましくはグリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体を、ブチル基を有する化合物で変性したものである。
【００３３】
この構造体は、静置したとき、その形状を自己支持できる機械的強度を保持する。すなわち、ビーズ状の多孔質高分子担体や、多孔膜を用いるものとは物理的構造が異なる。
【００３４】
硬質多孔性高分子自己支持構造物としては、具体的には、ＣＩＭ（登録商標）  Ｃ４Ａ  ＤＩＳＫ、ＣＩＭ  Ｃ４Ａ−１  Ｔｕｂｅ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭ  Ｃ４Ａ−８  Ｔｕｂｅ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭ  Ｃ４Ａ−８０  Ｔｕｂｅ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭ  Ｃ４Ａ−８００  Ｔｕｂｅ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭ  Ｃ４Ａ−８０００  Ｔｕｂｅ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｃｏｌｕｍｎが挙げられる。
なお、これらは全てグリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体の変性物である。
＜硬質多孔性高分子自己支持構造物の製造方法＞
硬質多孔性高分子自己支持構造物は、上述のモノマーの共重合体からなる。この共重合体は、ポロゲンと重合開始剤の存在下で、グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの混合物から製造される。
ポロゲンとは、多孔を形成するための添加物質であり、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、エステル類、アルコール類、ケトン類、エーテル類、可溶性高分子溶液、及びそれらの混合物のような異なる種類の材料などが使用できる。好ましくはノルマルヘキサンである。
重合開始剤としては、フリーラジカル発生開始剤が使用できる。具体的にはアゾビスイソブチロニトリルや２，２’−アゾビス（イソブチルアミド）ジヒドレートなどのアゾ化合物、過酸化ベンゾイルや過酸化ジプロピル二カルボン酸エステルなどの過酸化物が使用できる。種類の異なる重合開始剤を用いると、形の異なる孔構造を形成することができる。重合開始剤の量は、モノマー重量に対して好ましくは０．５〜４質量％である。
共重合体を製造するとき、ポロゲンとして可溶性高分子が添加されていてもよい。可溶性高分子が添加されていると、孔構造がより多く形成される。可溶性高分子の量は、共重合体全体の質量に対して、好ましくは１０〜４０質量％の量である。
ポロゲンや重合開始剤を含むグリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの混合物は、成形型の中に入れる前に、窒素又はアルゴンのような不活性ガスを用いて脱気することが好ましい。成形型は、空気汚染を防ぐために密封することが好ましい。
重合は、例えば、４０〜５０時間、５０℃〜９０℃の温度で加熱して行うことができる。
重合後、管を洗浄し、かつポロゲンとして用いた溶媒や可溶性高分子を除去する。洗浄のための溶媒としては、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、アセトン、テトラヒドロフランなどが使用できる。洗浄工程は複数回繰り返してもよい。
共重合体が修飾されている場合、ナトリウムエタノラート、ナトリウムブタノラート、又はナトリウムオクタノラートのようなアルコラートを使用して疎水性基を導入することができる。
【００３５】
＜カラム＞
カラムは、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を含んでいる。すなわち、カラムは、板状、管状、円筒状等の形状をなす硬質多孔性高分子自己支持構造物のみから構成されていてもよく、所定量の硬質多孔性高分子自己支持構造物を、筒状に容器に収容（保持）してなるものであってもよい。収納容器は構造物の外側から内側に通液できるような構造を有するものであればよく、金属製、樹脂製など素材は問わない。
カラムの大きさ（カラムボリューム）は特に制限されず、吸着させるタンパク質凝集体及び／又はＨＣＰの量に応じて適宜調整される。
【００３６】
＜タンパク質＞
本発明の第１実施態様の方法によってタンパク質凝集体を除去できるタンパク質としては、特に制限されない。例えば、イムノグロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と示す。）、イムノグロブリンＡ（以下、「ＩｇＡ」と示す。）、イムノグロブリンＭ（以下、「ＩｇＭ」と示す。）等のイムノグロブリン、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）、エリスロポエチン、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＴＧＦ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＢＤＮＦ（Ｂｒａｉｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＥＰＯ（Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＴＰＯ（Ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ｂＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ）、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｌｐｈａ）、ＴＧＦ−β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｂｅｔａ）、ＰＡＩ−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１）、ＨＢ−ＥＧＦ（Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＥＧＦ−Ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、レプチン、アディポネプチン、ＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）等のサイトカイン、ヒト成長ホルモン、インスリン、グルカゴン等のタンパク質ホルモン、血液凝固因子、アルブミン、リゾチーム、ＲＮａｓｅ  Ａ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ）、シトクロムｃなどが挙げられる。
【００３７】
＜タンパク質モノマー＞
タンパク質モノマーとは、タンパク質１分子のことを示す。
【００３８】
＜タンパク質凝集体＞
タンパク質凝集体とは、タンパク質モノマーが疎水性相互作用、静電的相互作用、その他の相互作用により可逆的または不可逆的に吸着、凝集したタンパク質複合体のことである。
【００３９】
＜ＨＣＰ＞
宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ：Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）とは、バイオ医薬品の製造に使用される、大腸菌、酵母、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞やマウスミエローマ細胞等の細胞に由来するタンパク質のことである。ＨＣＰの中には免疫原性やアジュバンド様活性をもつタンパク質が含まれている可能性があること、またプロテアーゼ等の残存により、製剤の安全性や安定性が低下することなどが報告されており、除去することが望ましい。
【００４０】
＜緩衝液＞
緩衝液としては特に制限されないが、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が使用できる。これらの中でも、緩衝能を有する使用ｐＨ範囲の点から、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液が好ましい。
緩衝液の濃度は特に制限されないが、好ましくは１〜１００ｍＭ、より好ましくは２〜５０ｍＭ、さらに好ましくは５〜３０ｍＭである。
緩衝液のｐＨは特に制限されないが、好ましくはｐＨ２〜９、より好ましくはｐＨ３〜８、さらに好ましくはｐＨ４〜７．５である。
【００４１】
＜無機塩＞
塩含有緩衝液に用いる無機塩としては、カオトロピック塩、コスモトロピック塩を用いることができ、コスモトロピック塩を用いることが好ましい。コスモトロピック塩とは、具体的には、アニオンとして、リン酸イオン、硫酸イオン、酢酸イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ化物イオン及びチオシアン酸イオンを用いることができる。カチオンとして、アンモニウムイオン、ルビジウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオンを用いることができる。
コスモトロピック塩は、好ましくは硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム及び塩化ナトリウム、より好ましくは硫酸アンモニウム、塩化ナトリウムである。
【００４２】
コスモトロピック塩は、カラムへの関連不純物の大部分が吸着するのに十分な量であることが好ましい。かつ、タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体の結合または沈殿を引き起こさないほど十分に少ない量であることが好ましい。
具体的には、塩として硫酸アンモニウムを用いる場合、緩衝液に対する濃度は、好ましくは５００〜９５０ｍＭ、より好ましくは６００〜９００ｍＭ、さらに好ましくは７００〜８００ｍＭである。塩として塩化ナトリウムを用いる場合、緩衝液に対する濃度は、好ましくは０．５〜４．０Ｍ、より好ましくは１．０〜３．０Ｍ、さらに好ましくは１．５〜２．５Ｍである。
それぞれの精製プロセスについて、予備実験等により塩の最適な量及び好ましい種類を選択することが好ましい。
【００４３】
＜カラムの平衡化＞
タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体、及び／又はＨＣＰを含む溶液をカラムに負荷する前に、カラムに緩衝液を通して平衡化しておくことが好ましい。
平衡化に用いる緩衝液の種類、濃度、ｐＨは、タンパク質を溶解する緩衝液と同様のものを用いることができる。なお、後述する無機塩と緩衝液の混合溶液により平衡化を行ってもよい。
平衡化に要する緩衝液の量は特に制限されないが、好ましくは１ＣＶ（カラム容積倍数）以上、より好ましくは２ＣＶ以上、さらに好ましくは４ＣＶ以上である。
【００４４】
＜タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体、及び／又はＨＣＰのカラムへの負荷＞
タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体、及び／又はＨＣＰを、緩衝液に溶解させて溶液を調整し（以下、この溶液を「タンパク質溶液」と言う。）、この溶液をカラムに通液することにより、タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体、及び／又はＨＣＰをカラムに負荷することができる。
【００４５】
タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体、及び／又はＨＣＰを含むタンパク質溶液を緩衝液に溶解させるとき、濃度は、好ましくは０．００１〜２０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｍＬである。
カラム体積１ｍＬあたりのタンパク質負荷量は、好ましくは０．００１〜５０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜４０ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜３０ｍｇである。
【００４６】
カラムにタンパク質を負荷する際、カラム及びタンパク質溶液の温度は、特に制限されないが、好ましくは２〜５０℃、より好ましくは４〜４０℃、さらに好ましくは８〜３０℃である。当該範囲にすることにより、タンパク質溶液の凍結、タンパク質の破壊を防ぐことができる。
【００４７】
＜タンパク質モノマーのフロースルー＞
タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体、及び／又はＨＣＰを負荷したカラムに、移動相を通すことにより、タンパク質凝集体及び／又はＨＣＰをカラムに吸着させ、タンパク質モノマーをフロースルー様式で回収することができる。移動相の溶液としては、無機塩を溶解させた塩含有緩衝液と緩衝液とを適当な比率で混合した混合液を用いることができる。
なお、タンパク質モノマーのフロースルー様式とは、回収したい目的物がクロマトグラフィーデバイスに吸着されず、通過することを意味する。
移動相の溶液としての緩衝液の種類、濃度、ｐＨは、タンパク質を溶解する緩衝液と同様のものを用いることができるし、異なっていてもよいが、同じであることが望ましい。
【００４８】
移動相及びタンパク質溶液の流速は目的を達成できる範囲であれば制限されないが、２〜１６ＣＶ／分に設定でき、好ましくは２〜１２．５ＣＶ／分、より好ましくは２．５〜５ＣＶ／分、さらに好ましくは４〜５ＣＶ／分である。
【００４９】
カラムに移動相を通す際、カラム及び移動相の温度は、特に限定されないが、好ましくは２〜５０℃、より好ましくは４〜４０℃、さらに好ましくは８〜３０℃である。当該範囲にすることにより、タンパク質溶液の凍結、タンパク質の破壊を防ぐことができる。
【００５０】
本発明の第１実施態様においては、緩衝液及びタンパク質溶液のｐＨ範囲は限定されない。また、本発明の第１実施態様は単独で行ってもよく、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによる精製工程の後に行ってもよい。さらに、本発明の第１実施態様は、精製工程の前にアルギニンなどの添加剤を加えずに実施することができる。
したがって、本発明の第１実施態様はより自由な条件のもとで、タンパク質モノマーを高収率かつ高純度で得ることができる。
【００５１】
以上の知見を用いてタンパク質モノマーを選択的に回収するための条件検討を行えば、条件検討を短時間化することができる。特に、本発明の第１実施態様においては、カラムの通液方向の厚さまたはカラムの直径を変更しても、カラムの疎水性基・構成モノマー・温度・圧力、緩衝液、塩含有緩衝液、移動相の流速（ＣＶ／分）等の条件を変更せずに精製することができるので、条件検討を短時間化することができる。
【００５２】
＜タンパク質凝集体及び／又はＨＣＰの溶出とカラムの再生＞
なお、上述の方法でタンパク質モノマーを溶出させた後に、例えば、水をカラムに通すことにより、タンパク質凝集体及び／又はＨＣＰを溶出させることができる。タンパク質凝集体及び／又はＨＣＰを溶出させた後、平衡化に用いる前述の緩衝液と同様のものを再び通すことにより、カラムを再生することもできる。
（第２実施態様：一工程精製）
［タンパク質凝集体の除去方法］
本発明の第２実施態様のタンパク質凝集体の除去方法は、タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体を含む溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、前記タンパク質凝集体を吸着させ、前記タンパク質モノマーをフロースルー様式で回収する工程を含む。
［タンパク質凝集体とＨＣＰの除去方法］
本発明の第２実施態様のタンパク質凝集体及びＨＣＰの除去方法は、タンパク質モノマー、タンパク質凝集体及びＨＣＰを含む溶液を、疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、前記タンパク質凝集体と前記ＨＣＰを吸着させ、前記タンパク質モノマーをフロースルー様式で回収する工程を含む。
【００５３】
本発明の第２実施態様の疎水性基、硬質多孔性高分子自己支持構造物、カラム、タンパク質、タンパク質モノマー、タンパク質凝集体、ＨＣＰ、緩衝液、及びカラムの平衡化については、本発明の第１実施態様と同様である。また、本発明の第１実施態様と同様に、本発明の第２実施態様のタンパク質凝集体及びＨＣＰの除去方法は、上記除去方法の前に、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによる予備精製工程を更に含むことができる。
【００５４】
＜タンパク質凝集体及びＨＣＰの吸着とタンパク質モノマーのフロースルー＞
本発明の第２実施態様においては、カラムの平衡化の後、本発明の第１実施態様の「タンパク質モノマー及びタンパク質凝集体、及び／又はＨＣＰのカラムへの負荷」工程と「タンパク質モノマーのフロースルー」工程とを１工程に併合する。
例えば、タンパク質モノマー、タンパク質凝集体及び／又はＨＣＰを、緩衝液に溶解させて溶液を調整し（以下、この溶液を「タンパク質溶液」と言う。）、この溶液を疎水性基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を保持するカラムに通液することにより、タンパク質凝集体とＨＣＰをカラムに吸着させ、タンパク質モノマーをフロースルーで回収することができる。
移動相の溶液としては、無機塩を溶解させた塩含有緩衝液と緩衝液とを適当な比率で混合した混合液を用いることができる。
【００５５】
本発明の第２実施態様において、タンパク質凝集体及びＨＣＰの吸着とタンパク質モノマーのフロースルー工程に用いる緩衝液と無機塩は、上述第１実施態様のカラム負荷工程に用いる緩衝液と無機塩を使用することができる。
【００５６】
カラムに移動相を通す際、カラム及びタンパク質溶液の温度は、特に制限されないが、好ましくは２〜５０℃、より好ましくは４〜４０℃、さらに好ましくは８〜３０℃である。当該範囲にすることにより、タンパク質溶液の凍結、タンパク質の破壊を防ぐことができる。
移動相の溶液としての緩衝液の種類、濃度、ｐＨは、カラムを平行化する際に用いる緩衝液と同様のものを用いることができるし、異なっていてもよいが、同じであることが望ましい。
＜タンパク質凝集体及び／又はＨＣＰの溶出とカラムの再生＞
本発明の第２実施態様において、本発明の第１実施態様と同様に、タンパク質凝集体及び／又はＨＣＰの溶出とカラムの再生をすることができる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例により本発明の効果をより明らかなものとする。なお本発明は、以下の実施例に限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施することができる。【００５８】
実施例において、例えば、タンパク質としてＩｇＧを用いた場合、ＩｇＧモノマーの回収率、ＩｇＧの純度、ＩｇＧ凝集体含量を次のように定義する。
＜回収率＞
ＩｇＧモノマーの回収率は、フロースルー様式でカラムから出たＩｇＧ全量とカラムに吸着させたＩｇＧの全量の合計に対して、フロースルー様式で回収されたＩｇＧモノマーの割合である。ＩｇＧの全量は、ＩｇＧモノマー及びＩｇＧ凝集体の合計である。
具体的には、クロマトグラム上でのフロースルー部分の面積を、フロースルー部分の面積と純水による溶出部分の面積との和で割った値を回収率とする。なお、フロースルー部分は、図１に示すｓｔｅｐ１の点線で囲んだピーク部分であり、カラムに吸着されずに通り抜ける部分が意味される。クロマトグラム作成には、島津製作所製のＨＰＬＣ装置（ＳＣＬ−１０  ＡＶＰ）を用いた。本装置では、送液ポンプを介して緩衝液と塩含有緩衝液がオートサンプラーに接続されており、カラムに流れる溶液の濃度を制御することができる。流路図は図２に示す。単位は％である。
＜純度＞
回収されたＩｇＧモノマーの純度は、回収されたサンプル中のＩｇＧの全量対して、それに含まれているＩｇＧモノマーの割合である。ＩｇＧの全量は、ＩｇＧモノマー及びＩｇＧ凝集体の合計である。
具体的には、フロースルーでの回収分を昭和電工株式会社製のｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＫＷ４０３−４Ｆによるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて測定することにより求める。クロマトグラム上でのタンパク質モノマーのピーク面積をＩｇＧ全量の面積で割った値を純度とする。なお、ＩｇＧ全量の面積はタンパク質凝集体のピーク面積とタンパク質モノマーのピーク面積との和とする。クロマトグラム作成には、島津製作所製のＨＰＬＣ装置（ＬＣ２０−ＡＴ）を用いた。流路図は図３に示す。単位は％である。
＜タンパク質凝集体含量＞
タンパク質凝集体が全く含まれない状態を１００としたとき、１００−純度（％）と定義する。なお、純度（％）はクロマトグラムにおける面積比として計算される。
具体的には、フロースルーでの回収分を昭和電工株式会社製のｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＫＷ４０３−４Ｆによるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて測定することにより求める。クロマトグラム上でのタンパク質凝集体のピーク面積をＩｇＧ全量の面積で割った値をタンパク質凝集体含量とする。なお、ＩｇＧ全量の面積はタンパク質凝集体のピーク面積とタンパク質モノマーのピーク面積との和とする。クロマトグラム作成には、島津製作所製のＨＰＬＣ装置（ＬＣ２０−ＡＴ）を用いた。流路図は図３に示す。単位は％である。【００５９】
＜実施例１＞
（１）カラムの平衡化
ＢＩＡ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社製のＣＩＭ（登録商標）Ｃ４Ａ−１  Ｔｕｂｅ（厚さ：６ｍｍ、外径：１８．６ｍｍ、内径：６．７ｍｍ、空隙率：６０ｖ／ｖ％、ベッドボリューム（ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）：１．０ｍＬ）に、７００ｍＭの硫酸アンモニウムを含んだ１５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）を５ＣＶ以上通して平衡化した。なお、ＣＩＭ  Ｃ４Ａ−１  Ｔｕｂｅは、グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体の変性物であり、一部のグリシジルメタクリレートにブチル基が保持されている硬質多孔性高分子自己支持構造物である。また、装置の構造によりカラムの中心の孔が塞がれるので、インジェクトされた液がカラムの中心の孔をそのまま通り抜けることはない。
（２）ＩｇＧモノマー及びＩｇＧ凝集体の負荷
７００ｍＭの硫酸アンモニウムを含んだ１５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）に、ＩｇＧ（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｇｒａｄｅ、≧９５％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶解し、濃度を３ｍｇ／ｍＬとした。この溶液のタンパク質凝集体含量は、ＩｇＧ全量に対して、およそ５％であった。
この溶液を、（１）で平衡化したカラムに２５０μＬ注入し精製した。すなわちカラム体積１ｍＬあたりのタンパク質負荷量は７５０μｇである。溶液の流速は５ＣＶ／分とした。
（３）ＩｇＧモノマーのフロースルー
１５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）に対して、硫酸アンモニウム濃度が７００ｍＭになるように混合した溶液を２５０μｌ通液してＩｇＧモノマーをフロースルー様式にて回収した。溶液の流速は５ＣＶ／分とした。
（４）ＩｇＧ凝集体の溶出
その後、純水を７．５ｍｌカラムに通し、ＩｇＧ凝集体を溶出させた。溶液の流速は５ＣＶ／分とした。
なお、実施例１において、カラム、タンパク質溶液、移動相の温度は２５℃とし、カラムの圧力は０．３〜１．８ＭＰａとした。【００６０】
＜実施例２＞
実施例１（３）の硫酸アンモニウム濃度を７５０ｍＭとした以外は実施例１と同様に実施した。
＜実施例３＞
実施例１（３）の硫酸アンモニウム濃度を８００ｍＭとした以外は実施例１と同様に実施した。【００６１】
＜実施例４＞
実施例１の１５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）を１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とした以外は実施例１と同様に実施した。【００６２】
＜実施例５＞
実施例４（３）の硫酸アンモニウム濃度を７５０ｍＭとした以外は実施例４と同様に実施した。
＜実施例６＞
実施例４（３）の硫酸アンモニウム濃度を８００ｍＭとした以外は実施例４と同様に実施した。【００６３】
＜実施例７＞
（１）カラムの平衡化
７００ｍＭの硫酸アンモニウムを２．４Ｍの塩化ナトリウムとし、クエン酸緩衝液のｐＨを５．３とした以外は実施例１（１）と同様に実施した。
（２）ＩｇＧモノマー及びＩｇＧ凝集体の負荷
７００ｍＭの硫酸アンモニウムを２．２Ｍの塩化ナトリウムとし、クエン酸緩衝液のｐＨを５．３とした以外は実施例１（２）と同様に実施した。
（３）ＩｇＧモノマーのフロースルー
クエン酸緩衝液のｐＨを５．３とし、緩衝液に対して塩化ナトリウム濃度が２．４Ｍになるように混合した溶液を通液したこと以外は実施例１（３）と同様に実施した。
（４）ＩｇＧ凝集体の溶出
実施例１（４）と同様に実施した。【００６４】
＜実施例８＞
実施例７（３）の塩化ナトリウム濃度を２．２Ｍとした以外は実施例７と同様に実施した。
＜実施例９＞
実施例７（３）の塩化ナトリウム濃度を２．０Ｍとした以外は実施例８と同様に実施した。【００６５】
＜実施例１０＞
実施例１（２）のカラム体積１ｍＬあたりのタンパク質負荷量を３８ｍｇに変更したこと以外は、実施例１と同様に行った。
なお、実施例１０において、カラムの圧力は０．３〜１．８ＭＰａとした。【００６６】
＜実施例１１＞
（１）カラムの平衡化
カラムとしてＣＩＭ（登録商標）Ｃ４Ａ  ＤＩＳＫ（厚さ：３ｍｍ、直径：１２ｍｍ、空隙率：６０ｖ／ｖ％）を用い、緩衝液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とした以外は実施例１（１）と同様に実施した。なお、ＣＩＭ  Ｃ４Ａ  ＤＩＳＫは、グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体の変性物であり、一部のグリシジルメタクリレートにブチル基が保持されている硬質多孔性高分子自己支持構造物である。
（２）ＩｇＧモノマー及びＩｇＧ凝集体の負荷
緩衝液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とし、ＩｇＧの濃度を１ｍｇ／ｍＬとし、カラム体積１ｍＬ当たりのタンパク質負荷量は２９４μｇとし、溶液の流速を４ＣＶとした以外は実施例（２）と同様に実施した。
（３）ＩｇＧモノマーのフロースルー
緩衝液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とした以外は実施例１（３）と同様に実施した。
（４）ＩｇＧ凝集体の溶出
実施例１（４）と同様に実施した。
なお、実施例１１において、カラムの圧力は０．３〜１．８ＭＰａとした。【００６７】
＜比較例１＞
（１）カラムの平衡化
カラムとしてＣＩＭｍｌｕｔｕｓ（登録商標）ＳＯ３−１ｍＬ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｃｏｌｕｍｎ（厚さ：６ｍｍ、外径：１８．６ｍｍ、内径：６．７ｍｍ、空隙率：６０ｖ／ｖ％）を用い、７００ｍＭの硫酸アンモニウムを１５０ｍＭの塩化ナトリウムとし、緩衝液の濃度を２０ｍＭ、ｐＨを５．３とした以外は実施例１（１）と同様に実施した。なお、ＣＩＭｍｌｕｔｕｓ  ＳＯ３−１ｍＬ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｃｏｌｕｍｎは、グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体の変性物であり、一部のグリシジルメタクリレートにスルホ基が保持されている硬質多孔性高分子自己支持構造物である。
（２）ＩｇＧモノマー及びＩｇＧ凝集体の負荷
７００ｍＭの硫酸アンモニウムを１５０ｍＭの塩化ナトリウムとし、緩衝液の濃度を２０ｍＭ、ｐＨを５．３とし、ＩｇＧの濃度を３ｍｇ／ｍＬとし、カラム体積１ｍＬ当たりのタンパク質負荷量は４５０μｇとし、溶液の流速を５ＣＶとした以外は実施例（２）と同様に実施した。
（３）ＩｇＧモノマーのフロースルー
緩衝液の濃度を２０ｍＭ、ｐＨを５．３とし、緩衝液に対して塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭになるように混合した溶液を通液したこと以外は実施例１（３）と同様に実施した。
（４）ＩｇＧ凝集体の溶出
実施例１（４）と同様に実施した。【００６８】
実施例、比較例の各条件、結果を表１にまとめて示す。
本発明の第１実施態様である実施例１〜１１では、カラムの種類や厚さ、ＩｇＧ負荷量、流速、ｐＨ、塩の種類を変化させても、回収率、ＩｇＧモノマー純度を向上することができた。
一方、アニオン交換基を有するカラムを用いた比較例１では、回収率、ＩｇＧモノマー純度が共に低下した。
以上より、本発明の第１実施態様の優位性を確認することができた。【００６９】
また、実施例１〜１１では、ビーズ状の多孔質高分子担体や、多孔膜を用いた場合では到達できない５ＣＶ／分という高流速の場合でも、高い回収率、純度でタンパク質モノマーを得ることができた。比較例１で用いたカラムでは、流速を遅くすれば回収率、純度を向上できる可能性はあるものの、実施例と同等である５ＣＶ／分とした場合、回収率、純度が低下した。
このことから、本発明の第１実施態様の高流速における優位性を確認することができた。【００７０】
【表１】
2016175306.tif 000002
＜実施例１２＞
（１）カラムの平衡化
ＢＩＡ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社製のＣＩＭ（登録商標）Ｃ４Ａ―１  Ｔｕｂｅに、７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含んだ１５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）を５ＣＶ以上通して平衡化した。
（２）ＩｇＧ凝集体及びＨＣＰの吸着とＩｇＧモノマーのフロースルー
プロテインＡカラム、陰イオン交換カラムによりクロマトグラフィーを行った後のモノクローナル抗体溶液（２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））を、７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含有し１Ｍクエン酸溶液でｐＨ４．３に調整した。この溶液のタンパク質モノマーとタンパク質凝集体の合計量に占めるタンパク質凝集体含量はおよそ５％であった。この溶液においてＩｇＧモノマー、ＩｇＧ凝集体及びＨＣＰを含むタンパク質の濃度はおよそ１ｍｇ／ｍＬであった。
この溶液を（１）で平衡化したカラムに５０ｍＬ注入し、ＩｇＧ凝集体とＨＣＰを吸着させＩｇＧモノマーはフロースルーさせた。すなわちカラム体積１ｍＬあたりのモノクローナル抗体負荷量はおよそ５０ｍｇである。溶液の流速は５ＣＶ／分とした。
（３）ＩｇＧ凝集体とＨＣＰの溶出
その後、純水を７．５ｍＬカラムに通し、ＩｇＧ凝集体とＨＣＰを溶出させた。溶液の流速は５ＣＶ／分とした。
ＨＣＰ定量評価は、ＣＨＯ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３ｒｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  （ＣＹＧＮＵＳ社製）キットを用いて行った。カラム通液前のＨＣＰ量は約０．００８μｇ／ｍＬであったが、カラム通液後は約０．０００２μｇ／ｍＬとなり、約９８％の除去率であった。
＜比較例２＞
カラムを構成する多孔性高分子ビーズとして、ＧＥヘルスケア社製のＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＦＦ（平均粒子径９０μｍ）を用い、カラム内におけるタンパク質溶液の流速を１ＣＶ／分とした以外は、実施例１２と同様に実施して、ＩｇＧモノマーを選択的に溶出させた。
実施例１２、比較例２の各条件、結果を表１にまとめて示す。【００７１】
また、実施例１２では、ビーズ状の多孔質高分子担体や、多孔膜を用いた場合では到達できない５ＣＶ／分という高流速の場合でも、高い回収率、純度でタンパク質モノマーを得ることができた。一方多孔性高分子ビーズを用いた比較例２では、流速を抑えてＩｇＧモノマーを回収することができたが、回収率、純度とも実施例１２に及ばなかった。また、許容圧力の観点から、流速を２ＣＶ／分以上に速くすることができず、本発明の第２実施態様の高流速における優位性を確認することができた。
【符号の説明】
【００７２】
１：緩衝液
２：塩含有緩衝液
３：送液ポンプ
４：オートサンプラー
５：分取カラム
６：ＰＤＡ検出器
７：フラクションコレクター
８：分析カラム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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