(57)【要約】【課題】濃度の異なる複数の分析対象成分を、幅広い測定レンジで、同時に測定できる蛍光検出器が提供される。【解決手段】  蛍光検出装置１００は、試料中の分析対象成分が導入されるセル１１０と、前記セルの前記分析対象成分に対して励起光を照射する光源１３０と、励起光が分析対象成分に照射されると前記成分から発生する蛍光を測定する第１の検出器５２と、励起光が前記分析対象成分に照射された後に、前記分析対象成分から発生する蛍光を、前記第１の検出器と異なる測定レンジで検出する第２の検出器５３と、を備え、前記第１の検出器及び第２の検出器が、同時に前記蛍光を検出する、ことを特徴とする。
2017078153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析対象成分が導入されるセルと、
前記セルの前記分析対象成分に対して励起光を照射する光源と、
励起光が前記分析対象成分に照射されると前記分析対象成分から発生する蛍光を測定する第１の検出器と、
励起光が前記分析対象成分に照射された後に、前記分析対象成分から発生する蛍光を、前記第１の検出器と異なる測定レンジで検出する第２の検出器と、を備え、
前記第１の検出器及び第２の検出器が、同時に前記蛍光を検出することを特徴とする、
蛍光検出装置。
【請求項２】
前記光源はＬＥＤであることを特徴とする、
請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記第１の検出器及び第２の検出器は、前記セルの表面に設けられていることを特徴とする、
請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記セルの前記表面に、前記分析対象成分から発生する所定の蛍光波長を透過させる第１の蛍光フィルタが接して設けられ、前記第１の蛍光フィルタに接して前記第１の検出器、及び前記所定の蛍光波長を透過させる第２の蛍光フィルタが接して設けられ、前記第２の蛍光フィルタに接して前記第２の検出器が設けられていることを特徴とする、
請求項３項に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記セルの、光が前記分析対象成分に照射される入射面に励起光フィルタが接して設けられ、前記励起光フィルタに接して、前記光源として前記ＬＥＤが設けられており、
前記１の検出器及び前記第２の検出器が設けられる前記セルの前記表面は、前記入射面とは異なる面であり、
前記ＬＥＤ、前記励起光フィルタ、前記セル、前記第１の蛍光フィルタ、前記第１の検出器、前記第２の蛍光フィルタ、及び前記第２の検出器は、夫々、連接して一体化していることを特徴とする、
請求項４に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記セルは、透明石英ブロック及び黒色石英ブロックから成り、
前記光源からの励起光が入射する位置及び前記第１の検出器及び前記第２の検出器に対して蛍光が出射する位置に前記透明石英ブロックを配置し、
前記セルの中心部には、前記分析対象成分を含む前記試料が通過する試料通過部が形成されており、
前記励起光が照射される入射面は、励起光入射用の透明石英ブロックの両端に黒色石英ブロックが結合され、
前記入射面と対向する面に、反射ミラーが蒸着されていることを特徴とする、
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
前記第１の検出器は、前記励起光が照射される入射面に対して側方である第１の表面に設けられ、
前記第２の検出器は、前記入射面とは異なり、前記第１の表面と対向する第２の表面に設けられることを特徴とする、
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の蛍光検出装置。
【請求項８】
前記試料は第１の成分と該第１の成分より含有量の少ない第２の成分と、を含み、
前記第１の検出器は前記試料の第１の成分を検出するための第１の測定レンジで測定し、
前記第２の検出器は前記試料の前記第２の成分を検出するために、前記第１の測定レンジよりも高い第２の測定レンジで測定することを特徴とする、
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の蛍光検出装置。
【請求項９】
所定の励起波長で試料中の分析対象成分が導入されたセルに励起光を照射するステップと、
励起光が照射されることで、前記セルに含まれる前記分析対象成分が励起し、基底状態に戻る際に発生する蛍光を、第１の検出器及び第２の検出器で、第１の感度と該第１の感度と異なる第２の感度とで同時に測定するステップと、を有することを特徴とする、
分析方法。
【請求項１０】
前記試料は光学異性体を含むアミノ酸又はアミノ酸誘導体であることを特徴とする、
請求項９に記載の分析方法。
【請求項１１】
前記試料は、フルオレセインを含むことを特徴とする、
請求項９に記載の分析方法。
【請求項１２】
試料を投入する試料投入部と、
試料から特定の分析対象成分へ分離する分離部と、
請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の蛍光検出装置と、を備えることを特徴とする、
蛍光検出システム。
【請求項１３】
前記試料中の分析対象成分は光学異性体を含むアミノ酸又はアミノ酸誘導体であり、
前記分離部は、前記蛍光検出装置で、前記光学異性体を検出することで、前記アミノ酸又は前記アミノ酸誘導体の光学分割を行うことを特徴とする、
請求項１２に記載の蛍光検出システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光検出装置、該蛍光検出装置を用いた分析方法、及び該蛍光検出装置を備える蛍光検出システムに関する。【０００２】
本出願は、２０１５年１１月６日に出願されたＰＣＴ出願であるＰＣＴ／ＪＰ２０１５／０８１３８９に基づく優先権を主張するものであり、前記ＰＣＴ出願に記載された全ての内容を本出願に援用する。
【背景技術】
【０００３】
紫外・可視分光検出器や蛍光検出器のような濃度感応性の検出器は一般に検量線の直線性が得られる範囲（測定レンジ）においてのみ精度の高い定量性を示す。試料中の分析対象成分が検出器の測定レンジを超えて存在する場合において、従来はそれぞれの成分の濃度を含む測定レンジを有する複数回の分析を実施するか、一度の分析においてそれぞれの成分の濃度を含む測定レンジを有する複数の検出手段を段階的に用いる必要があった。【０００４】
そこで濃度の異なる複数の成分を検出するため、２つのセルを直列的に接続し、それぞれ別の検出器で検出をすることで、測定レンジを拡大させる技術（特許文献１）や、１つのセルに対して、感度の異なる２種類の検出器から１つを選択して、成分を検出する技術（特許文献２）が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２１２２３５号公報
【特許文献２】特開２０１５−０２２０２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記特許文献１では、２種類の感度の異なる検出器を用いることによって測定レンジは拡大する。しかし、セルを２段階に配置することで、分析対象成分が拡散する機会が増加することで分離能が低下したり、光学的な検出においてはセル内で分析対象成分の不可逆的な分解が生じることで定量精度が低下したりするおそれがあった。また、直列に接続された２つの異なる検出手段それぞれに最適化した条件を設定することは困難であった。【０００７】
また、上記特許文献２では、２つの検出器の切替手段を設けることにより、分析対象成分に対し所望の測定レンジを選択することを可能としているが、一分画に対しては一検出器の測定レンジしか適用できないため、レンジオーバーした場合は複数回の分析を余儀なくされる可能性があり、これは分析回数が限られる希少な生体試料を対象とするような分析においては致命的な問題であった。また、これを回避するためには複雑なアルゴリズムからなる制御機構を備える必要があった。【０００８】
そこで、本発明は上記事情に鑑み、上記課題を解決した、濃度の異なる複数の分析対象成分を、幅広い測定レンジで同時に測定できる、蛍光検出装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため、本発明の一態様の蛍光検出装置は、試料中の分析対象成分が導入されるセルと、前記セルの前記分析対象成分に対して励起光を照射する光源と、励起光が前記分析対象成分に照射された後に前記分析対象成分から発生する蛍光を検出する第１の検出器と、励起光が前記分析対象成分に照射された後に前記分析対象成分から発生する蛍光を、前記第１の検出器と異なる測定レンジで検出する第２の検出器と、を備え、前記第１の検出器及び前記第２の検出器が、同時に前記蛍光を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の一態様によれば、蛍光検出装置は、濃度の異なる複数の分析対象成分を、幅広い測定レンジで、同時に測定できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の第１実施形態に係る二次元ＨＰＬＣシステムの概要図。
【図２】本発明の二次元目の蛍光検出のフローチャート。
【図３】従来の一般的な、蛍光検出のフローチャート。
【図４】比較例１の模式的なフローチャート。
【図５】比較例２の模試的なフローチャート。
【図６Ａ】本発明の二次元目の蛍光検出装置の上方斜視図。
【図６Ｂ】本発明の二次元目の蛍光検出装置の上面模式図。
【図７Ａ】図６Ａの蛍光検出装置に備えられるセルの上面図、左側面を斜視した図、右側面を斜視した図、及び下面図。
【図７Ｂ】図７Ａのセルの斜視図。
【図８】本発明の蛍光検出装置の第１の検出器、第２の検出器を取り外した分解図。
【図９】比較例３の蛍光検出器のブロック図。
【図１０】本発明の蛍光検出器のブロック図。
【図１１Ａ】図１のシステムに含まれる一次元目の蛍光検出装置の上方斜視図。
【図１１Ｂ】図１のシステムに含まれる一次元目の蛍光検出装置の上面模式図。
【図１２Ａ】図１１Ａの蛍光検出装置に備えられるセルの上面図、左側面を斜視した図、右側面を斜視した図、及び下面図。
【図１２Ｂ】図１２Ａのセルの斜視図。
【図１３】一次元目の蛍光検出装置と二次元目蛍光検出装置が一体となった一体化検出装置の構成例。
【図１４】本発明の第２実施形態に係る、二次元ＨＰＬＣシステムにＭＳ装置とＰＣが接続されたシステム概略図。
【図１５】本発明の第３実施形態に係る、図６Ｂに示す蛍光検出装置を備えるＨＰＬＣシステムの概略図。
【図１６】本発明の第４実施形態に係る、図６Ｂに示す蛍光検出装置を２つ備えるＨＰＬＣシステムの概略図。
【図１７Ａ】セリン（Ｓｅｒ）のＬ体、Ｄ体の低濃度側レンジの検出測定結果。
【図１７Ｂ】ＳｅｒのＬ体、Ｄ体の高濃度側レンジの検出測定結果。
【図１８Ａ】本発明におけるＬＥＤを用いた蛍光検出装置のＳｅｒの検出結果の直線性試験の測定結果。
【図１８Ｂ】比較例におけるキセノンランプを用いた蛍光検出装置のＳｅｒの検出結果の直線性試験の測定結果。
【図１９Ａ】本発明におけるＬＥＤを用いた蛍光検出装置と、比較例におけるキセノンランプを用いた蛍光検出装置との、黒酢中のＬ−Ｓｅｒの検出結果の低濃度側レンジの感度比較結果。
【図１９Ｂ】本発明におけるＬＥＤを用いた蛍光検出装置と、比較例におけるキセノンランプを用いた蛍光検出装置との、黒酢中のＤ−Ｓｅｒの検出結果の高濃度側レンジの感度比較結果。
【図２０】アラニン（Ａｌａ）の質量分析結果（ＱＤａデータ）と蛍光検出結果。
【図２１】ロイシン（Ｌｅｕ）の質量分析結果と蛍光検出結果。
【図２２】アスパラギン酸（Ａｓｐ）の質量分析結果と蛍光検出結果。
【図２３】グルタミン酸（Ｇｌｕ）の質量分析結果と蛍光検出結果。
【図２４Ａ】図１６のシステムを用いた際のフルオレセインの検出結果の高濃度側レンジの直線性試験の測定結果。
【図２４Ｂ】図１６のシステムを用いた際のフルオレセインの検出結果の低濃度側レンジの直線性試験の測定結果。
【図２５Ａ】比較例におけるキセノンランプを用いた蛍光検出装置のフルオレセインの検出結果の高濃度側レンジの直線性試験の測定結果。
【図２５Ｂ】比較例におけるキセノンランプを用いた蛍光検出装置のフルオレセインの検出結果レンジの高感度の直線性試験の測定結果。
【図２６Ａ】本発明の図１６のシステムを用いてサンプリングレート5Hz,タイムコンスタント2Secの条件における1,000ng/mLフルオレセインの検出結果。
【図２６Ｂ】本発明の図１６のシステムを用いてサンプリングレート2Hz,タイムコンスタント5Secの条件における1,000ng/mLフルオレセインの検出結果。
【図２７Ａ】本発明の図１６のシステムを用いてサンプリングレート5Hz,タイムコンスタント2Secの条件における1,0000ng/mLフルオレセインの検出結果。
【図２７Ｂ】本発明の図１６のシステムを用いてサンプリングレート2Hz,タイムコンスタント5Secの条件における1,0000ng/mLフルオレセインの検出結果。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の実施の形態について図面と共に説明する。
まず、本発明による二次元ＨＰＬＣシステムである、液体クロマトグラフィー装置に係るシステムの一態様を、図１を用いて説明する。
【００１３】
下記、液体クロマトグラフィー装置では、二次元（二段階の）の分離（アミノ酸の種類による分離、光学異性体の分離）、一次元目の検出、二次元目の検出を備えるものを説明する。しかし、本発明の主要部である、蛍光検出装置１００に係る部分を有していれば、クロマトグラフィー装置はどのような形態を取ってもよく一段階であっても多次元であってもよい。一段階の例は、第３実施形態及び第４実施形態とともに説明する。
【００１４】
また、下記、蛍光検出装置１００は、アミノ酸の光学異性体の検出について、説明している。しかし、本発明に係る蛍光検出装置１００は、上記アミノ酸の光学異性体の検出に限られず、試料内に幅広い量で存在する複数の成分が対象となる、特に、試料中における存在量の比率が５桁オーダー以上に及ぶ複数の対象成分を検出することに適用できる。
【００１５】
［二次元ＨＰＬＣシステム（液体クロマトグラフィー装置）］
図１に示す本発明の一実施形態による液体クロマトグラフィー装置１は、第一の移動相供給部１１、第一のポンプ２１、試料注入部３０、逆相カラム４１、逆相カラム恒温槽４５、一次元目検出器５１、一次元目データ処理部９１、流路切替バルブ６０、マルチループユニット７０、第二の移動相供給部１２、脱気装置８０、第二のポンプ２２、キラルカラム４２、キラルカラム恒温槽４６、二次元目検出器として第１の検出器５２と第２の検出器５３、及び二次元目データ処理部として第１のデータ処理部９２と第２のデータ処理部９３を含む。
【００１６】
第一の移動相供給部（貯槽、容器）１１には、移動相としての第一の液体が貯蔵されている。第一のポンプ２１によって第一の液体が送られ、流路上にある試料注入部（オートサンプラー）より、一例として複数種のアミノ酸又はアミノ酸の誘導体等のような光学異性体を有する成分を含む試料が注入される。試料は、第一の液体と共に、カラム恒温槽４５で一定の温度に維持された逆相カラム４１に送られる。
【００１７】
アミノ酸又はアミノ酸の誘導体のような試料に含まれる複数の成分は、逆相カラム４１によって互いに分離され、互いに異なる時間に溶出し一次元目検出器（Ｄ１）５１によって検出される。
【００１８】
一次元目検出器５１で検出された試料の成分の信号は、一次元目データ処理部９１においてデータ処理され、分離された成分の溶出時間と量に応じた信号強度の情報からクロマトグラムを描くことができる。
【００１９】
また、第二の移動相供給部１２に、移動相としての第二の液体が貯蔵されている。第二の移動相供給部１２の後段に、脱気のための脱気装置（デガッサー）８０を設けてもよい。
【００２０】
また、流路切替バルブ６０は、図１に示すように、（実線で示す）Ａ１、Ａ２及びＡ３の組み合わせ並びに（点線で示す）Ｂ１、Ｂ２及びＢ３の組み合わせの間で、第一の液体及び第二の液体の流路を切替える。
【００２１】
一次元目検出器５１でアミノ酸又はアミノ酸誘導体等の試料の成分が検出されたとき、成分が含まれる分画が、流路切替バルブ６０を通過するタイミングにおいてのみ流路をＡ１、Ａ２、及びＡ３の組み合わせからＢ１、Ｂ２及びＢ３の組み合わせに切替えると、第一の液体と共に一次元目検出器５１で検出されたアミノ酸又はアミノ酸誘導体等の試料の成分が含まれる分画のみ、マルチループユニット７０に送ることができる。
【００２２】
マルチループユニット７０は、複数のループ７１、並びに複数のループ７１のうち選択されたループを流路Ｂ１及びＢ３と接続する切り替え手段７２を有する。このようなマルチループユニット７０を用いることで、逆相カラム４１で分離された試料の成分の各々の分画を、それぞれ、個別にループ７１に保持することができる。すなわち、一次元目検出器５１における試料の成分の検出に合わせて、流路Ｂ１及びＢ３と接続するループを切替えれば、各々のループごとに、試料の成分の各々を保持することができる。
【００２３】
複数のループ７１の一つに保持された所望の試料の成分は、切り替え手段７２を切り替えることにより第二の液体と共に、カラム恒温槽４６によって一定の温度に維持されたキラルカラム４２に送られる。キラルカラム４２において、送られた試料の光学異性体（アミノ酸又はアミノ酸誘導体のエナンチオマー（Ｄ体及びＬ体）等）が互いに分離される。
【００２４】
分離された試料の成分の光学異性体は、互いに異なる時間で溶出し第１の検出器５２、第２の検出器５３によって検出される。本発明の主要部としての蛍光検出装置１００に係る、二次元目検出器として、第１の検出器（Ｄ２）５２、第２の検出器（Ｄ３）５３の構成及び検出の方法については、図６Ａ〜図８、図１０とともに後述する。第１の検出器５２と第２の検出器５３とは、同一のセルに対して設けられ、異なる感度で同時に測定する。
【００２５】
ループを切り替え手段７２によって切替えることにより、ループに保持されたそれぞれの成分について順次キラルカラム４２において光学異性体の分離及び二次元目検出器５２，５３による検出を行う。このようにして、マルチループユニット７０に保持された全ての成分について光学異性体の分離及び検出を行うことができる。
【００２６】
試料に含有される成分がアミノ酸である場合には、多種類のアミノ酸の光学異性体について、逆相カラム４１でＤ体及びＬ体の混合物として分離した後、複数のループ７１を通じ、それぞれをキラルカラム４２に順次導入し分離・定量するという一度のプロセスにおいて一斉に全アミノ酸の分析を行うことができる。
【００２７】
なお、移動相に含まれる気体の影響を低減させる目的でポンプ２１の上流に脱気装置を設けてもよい。また、対象の成分の分析条件に応じて複数の移動相・カラムやそれを切り替える手段を適宜追加することもできる。
【００２８】
本システムにおいて、上記のような光学異性体の分離に用いられる、二次元目の検出システムを、本発明の蛍光検出システムと呼ぶ。蛍光検出システムは、分離部として、カラムと、カラム恒温槽を備え、蛍光検出装置として、蛍光検出器と、データ処理部等を備えている。
【００２９】
さらに、試料注入部、マルチループユニットやそれぞれに具備される流路切替バルブが蛍光検出システムにおける試料投入部として機能する。
【００３０】
この、蛍光検出システムに係る、一例として光学異性体を検出するための流れを示すフローチャートを図２に示す。
【００３１】
図２のステップＳ１で、移動相へ、試料投入部より、分析用の試料（例えば特定のアミノ酸を含む試料）を投入する。
【００３２】
Ｓ２で、カラム試料中の成分が互いに分離される。
【００３３】
その後、Ｓ３で、蛍光検出器のフローセル（図６Ｂ参照）を通過する分析対象成分を、第１の検出器５２で検出する。このとき、Ｓ４で、第１の検出器５２が検出を行うＳ３と同一のタイミングで、同じフローセルを通過する分析対象成分を第２の検出器５３でも検出する。
【００３４】
そして、Ｓ５においてデータ処理部により、測定レンジの異なる第１の検出器と、第２の検出器による検出情報を並行して、データ処理する（定量等）。
【００３５】
ここで、図３に、従来の、一般的な蛍光検出システムのフローチャートを示す。
【００３６】
従来の一般的なフローでは、図３のＳ１０１において、試料を注入した後、Ｓ１０２において、カラムを用いて成分を分離する。その後、Ｓ１０３において、例えば一般的なキセノンランプ型の蛍光検出器を用いて、セル内の濃度の異なる複数の対象成分を測定する。そのため、試料中の複数の分析対象成分の存在比（含まれる成分の濃度の差）が測定レンジを超えた場合は、分析精度が著しく低下することが免れない。
【００３７】
そこで、比較例１の図４のフローでは、直列に配置された２種類の検出器で検出をしている（Ｓ２０３，Ｓ２０５）。これにより、測定レンジを拡大させることができるが、セルを２段階に配置することで、分析対象成分の拡散や光照射による分解にともなう分析精度の低下が引き起こされる。
【００３８】
また、図５に示す比較例２のフローでは、検出のステップにおいて、１つのセルに対して、感度（測定レンジ）の異なる２種類の検出器から１つを選択して（Ｓ３０３，Ｓ３０４，Ｓ３０５）、試料を検出している。しかし、このフローでは、所望な感度で検出しているが、一度に検出できるのは、どちらか一方の検出器であり、検出結果も１つ検出器による出力であった（Ｓ３０６）。また、２種類の検出器は択一的に切り替えて利用されるため、切り替えのための制御機構が必要となった。
【００３９】
上記図３〜図５と比較して、本発明のフローでは、図２に示すように、Ｓ３，Ｓ４で、濃度の異なる２つの対象物を、２つの検出器で、幅広い測定レンジで同時に測定できる。また、１つのセルを用いて２つの検出器で同時に検出できるため、図５に示す従来例のように、測定レンジを広げるためにセルを２段階にすることで分析対象成分の拡散・分解による分析精度の低下を解消できる。
【００４０】
［蛍光検出装置］
ここで、蛍光検出装置１００に係る構造を図６Ａ及び図６Ｂに示す。図６Ａは、蛍光検出装置１００の外観図であり、図６Ｂは、図６Ａに示す蛍光検出装置１００における、セル１１０、検出器５２，５３のケースを外した場合の上面図である。
【００４１】
図６Ａ及び図６Ｂに示すように、蛍光検出装置１００は、セル１１０と、光源１３０と、第１の検出器５２と、第２の検出器５３と、を備えている。
【００４２】
図６Ａに示すように、蛍光検出装置１００では、セル１１０は筐体１１９に囲われ、光源１３０は筐体１３９で囲われ、第１の検出器５２はケース５６で覆われ、第２の検出器５３はケース５７で覆われている。
【００４３】
セル１１０には、試料中の分析対象成分（例えば、アミノ酸）が導入される。ここで適用されるセル１１０は、配管３１０から試料が流れてくるフローセルである。セル１１０は、光の透過性が良好で、溶液耐性の高い、石英で作製されると好適である。一例として、セル１１０の溶液通過部（試料通過部）１１５の容量は、７．２μＬである。
【００４４】
光源１３０は、セル１１０にある分析対象成分に対して励起光を照射する。本発明において、光源１３０はＬＥＤ（Light Emitting Diode）で構成されると好適である。NBD-Fで蛍光誘導体化されたアミノ酸に適用されるＬＥＤは、４７０ｎｍの波長で発光する青色ＬＥＤである。
【００４５】
第１の検出器５２は、励起光が分析対象成分に照射された後に発生する蛍光を測定する。第２の検出器５３は、同時に、第１の検出器５２と異なる感度（第２の測定レンジ）で測定する。第１の検出器５２及び第２の検出器５３は、光電子倍増菅（ＰＭＴ、フォトマルとも言う）から成る光センサである。
【００４６】
図６Ｂに示すように、第１の検出器５２及び第２の検出器５３は、セル１１０の表面に設けられている（近接配置されている）。
【００４７】
さらに、図６Ｂに示すように、蛍光検出装置１００では、光源１３０と接触する励起光フィルタ１４１、第１の検出器５２と接触する第１の蛍光フィルタ１４２、第２の検出器５３と接触する第２の蛍光フィルタ１４３が、セル１１０に接して設けられている。図６Ｂの例では、詳しくは、セル１１０はセル筐体１１９の内部に設けられ、第１の蛍光フィルタ１４２、第２の蛍光フィルタ１４３は、セル筐体１１９と接触し、セル１１０とは近接配置されている。ただし、フィルタ１４１，１４２，１４３及び検出器５２，５３、光源１３０等がセル１１０（表面）に直接接触して設けられていてもよい。
【００４８】
ここで、「セルに接して設けられている」あるいは「表面に設けられている」として、フィルタ１４１，１４２，１４３及び検出器５２，５３、光源１３０等がセル１１０（表面）に直接接触して設けられていること、及び図６Ｂのように、セル１１０（表面）と近接配置されていること、の双方を含むものを意味する。
【００４９】
光源１３０は、例えば、所定の波長の光（例えば、４７０ｎｍ）を発光する。製造時の公差等を考慮して、４７０ｎｍをピンポイントに通して、光が試料に照射させるように、励起光フィルタ１４１は、セル１１０の入射面に設けられている（図６Ｂ下側）。
【００５０】
セル１１０内の試料は、所定の励起波長が照射されると、励起し、基底状態に戻る際に蛍光が発生する。第１の蛍光フィルタ１４２は、試料から発生する所定の蛍光波長（例えば、ＮＢＤ−アミノ酸に対応する５１２ｎｍ）を透過させる。
【００５１】
第２の蛍光フィルタ１４３は、第１の蛍光フィルタ１４２を透過させる波長と同じ波長を透過させる。
【００５２】
第１の検出器５２及び第２の検出器５３が設けられるセル１１０の表面は、入射面とは異なる面（方向）である。図６Ｂの例では、第１の検出器５２は、励起光が照射される入射面１１０ａ（図７Ａ参照）に対して側方である、セル１１０の第１の表面１１０ｂに設けられている。第２の検出器５３は、入射面１１０ａとは異なり、第１の表面１１０ｂと対称となる、セル１１０の第２の表面１１０ｄに設けられている。
【００５３】
図６Ａ及び図６Ｂの構成により、光源（ＬＥＤ）１３０、励起光フィルタ１４１、セル１１０、第１の蛍光フィルタ１４２、第１の検出器５２、第２の蛍光フィルタ１４３、及び第２の検出器５３は、夫々、連接して一体化している。
【００５４】
このような構成により、セル１１０の内部にある試料に光が照射されると、第１の検出器５２及び第２の検出器５３に、同時に、試料からの蛍光が導入される。
【００５５】
この構成により、１つのセル１１０に対して、感度の異なる２つの検出器（ＰＭＴセンサ）５２，５３を取り付けることで、全くの同条件で２つの測定レンジにおいて同時検出が可能となる。したがって、測定レンジを拡大（ワイドレンジ化）することが可能になる。例えば、ＮＢＤ−アミノ酸においては検出下限５００［ａｍｏｌ］から検出上限５００［ｐｍｏｌ］の範囲での広い範囲での定量が可能となる。
【００５６】
詳しくは、この蛍光検出装置１００を用いて、後述する実施例２のように、ＮＢＤ−Ｓｅｒ標準品を分析すると、６桁に及ぶ良好な直線性を示した（図１８Ａ，図１８Ｂ）。これにより、生体・食品試料中のタンパク質構成アミノ酸のＤ体とＬ体（４３種）の濃度範囲において１台の上記蛍光検出装置１００で測定レンジ（定量範囲）をカバーすることができる。
【００５７】
例えば、黒酢に含まれるセリン（Ｓｅｒ）のうちＤ−Ｓｅｒは数パーセントである。後述する実施例３に示すように、黒酢において、Ｌ−ＳｅｒとＤ−Ｓｅｒの存在比が３桁を超える場合でも、測定レンジが異なる検出器を２つ設置することで、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒの両方とも同時に検出できる（図１９Ａ，図１９Ｂ）。このような測定のワイドレンジ化の対象はアミノ酸に限られるものではない。
【００５８】
次に、図７Ａ及び図７Ｂを参照して、蛍光検出装置１００に適用されるセル１１０の構造を説明する。図７Ａは、蛍光検出装置１００に備えられるセル１１０の上面図（中央）、左側面を斜視した図、右側面を斜視した図、及び下面図を示し、図７Ｂは、セル１１０の斜視図を示す。
【００５９】
セル１１０の中心部に試料を保持する溶液通過部１１５を形成されている。セル１１０は、透明石英ブロック１１１，１１４及び黒色石英ブロック１１２，１１３によって構成されている。
【００６０】
詳しくは、図７Ａ及び図７Ｂからわかるように、光源１３０側の励起光が入射する位置に透明石英ブロック１１１が設けられている。励起光が照射される入射面１１０ａにおいて、励起光入射用の透明石英ブロック１１１の両端に黒色石英ブロック１１２，１１３が結合されている。
【００６１】
また、第１の検出器５２側及び第２の検出器５３側の蛍光が出射する位置に透明石英ブロック１１４を配置されている。
【００６２】
入射面１１０ａと対向する面に、反射用ミラーが蒸着されている。詳しくは、図７に示すように、反射ミラーとして、入射面１１０ａと対向する入射対向面１１０ｃにミラー部１２１が、第１の表面１１０ｂにおいて、蛍光が透過する部分を除いた部分にミラー部１２２，１２３が、第２の表面１１０ｄにおいて、蛍光が透過する部分を除いた部分にミラー部１２４，１２５が設けられている。
【００６３】
さらに、試料からのより多く集光するために、セル１１０の上面、及び下面において、少なくとも光を反射させる部分に、ミラー部１２６，１２７を設けてもよい。
【００６４】
このようにセルを構成することにより、レンズを設置することによる集光が不要となり、光源１３０とセル１１０、及びセル１１０と二次元目検出器５２，５３を直接接して（近接して）配置させることが可能となる。
【００６５】
なお、本構成例では、四角形のセル１１０に対して、２つの二次元目検出器５２，５３を設けていた。しかし、セル１１０の形状は四角形状に限定されず、２つの検出器５２，５３に対して、同じ条件で、セルに含まれる試料からの蛍光が進入可能であれば、セルの形状は三角形や、五角形、六角形、他の多角形等であってもよい。
【００６６】
さらに、反射等により、同じ条件でセルに含まれる試料からの蛍光が進入可能であれば、１つのセルに対する検出器の数は２つよりも大きくてもよい。例えば、六角形にする場合は４つの検出器を備えてもよく、必要な測定レンジと感度に応じ用途により適宜調整しうる。
【００６７】
図８は、図７Ａに示す蛍光検出装置１００において、二次元目検出器５２，５３を取り外した、セル１１０の筐体１１９と光源１３０を示す。
【００６８】
図９は、比較例３の蛍光検出装置の構造の制御ブロック図を示す。図１０は、本発明の蛍光検出装置１００の構造の制御ブロック図を示す。
【００６９】
従来は、蛍光検出装置において、波長選択範囲が広いという利点を活かし、蛍光検出に限られず、様々な分野の光源として利用されて得る、キセノンランプが用いられていた。
【００７０】
しかし、キセノンランプは、寿命が５００時間（２０日）と短く、さらに交換後は不安定であるため多くのロスタイムを生じ連続多検体分析の障害となっていた。また、キセノンランプは、光量が環境（周辺温度）により不安定になるため、空調等の環境整備も含めた維持コストも高い。さらに、消費電力が大きい、オゾンが発生してしまう等の問題があった。
【００７１】
図９の比較例に示すように、キセノンランプを用いて、検出を行う場合、分光のために、光源９０１とフローセル９０７の間に、スリット９０３ａ，９０３ｂ、格子９０３ｃ、レンズ９０５、等が配置されているとともに、光源９０１とフローセル９０７との間に所定の距離を設けるように設定されていた。また、検出器９１７とフローセル９０７の間にも、スリット９１５ａ，９１５ｂ、格子９１５ｃ、レンズ９１３等が配置され、検出器９１７とフローセル９０７との間にも所定の距離を設けることが必要であったため、１つのフローセルに対して、複数の検出器を設けることは困難であった。
【００７２】
また、上記環境による光量の不安定さを解消するために、光量を検知して、検出を補正する構造等も考えられた。具体的には、図９の比較例に示すように、試料から発せられる蛍光を検出するための光検出器に加えて、試料セルを挟んで反対側に試料セルの試料の蛍光測定部位と同じ部位からの散乱光を測定するための光検出器９１１が設けられている。
【００７３】
しかし、このようにキセノンランプの不安定さを解消しようとすると、必要な構成要素が多くなってしまい、装置が大型化してしまっていた。
【００７４】
そこで、本発明では、図６Ａ〜図８、図１０に示すように、蛍光検出装置の光源１３０にＬＥＤを用いているので、長寿命（例えば、２５０００時間）であって、キセノン型の蛍光検出装置と比べると、約５０倍の連続稼働が可能になる。さらに、光源にＬＥＤを用いることで、消費電力が小さく（数ワット程度）、キセノン型と比較して、約９６％の電力削減を達成することができ自然環境にやさしい。また、ＬＥＤは、オゾンを発生させないため衛生環境も良好に保つことができる。
【００７５】
さらに、本発明では、上記装置の大型化の問題に対応するため、励起波長がＮＢＤ用の４７０ｎｍに固定された光源としてＬＥＤを用いている。そのため、特定の波長の帯域に対して狭く発光するＬＥＤを適用することができる。ＬＥＤを適用すると、ＬＥＤの特性により、キセノンランプを用いたときと比較して波長が特定な値に対して鋭利なピークを持つため、分光するための回折格子、レンズが不要になる。その分、装置が小型化できる。
【００７６】
そのため、光源であるＬＥＤは、分光することなく、検出対象であるフローセルと近接配置することができる。
【００７７】
なお、ＬＥＤの製造時のバラツキ等を考慮して、接触して配置できるフィルタを挟むことで再現性を向上することができる。ここで、フィルタは、バンドパスフィルタ等、波長の帯域幅を規定するものである。
【００７８】
また、ＬＥＤは、外部環境に対して光量特性が安定なため、光源からの光量を参照・補正しなくてもよいため、本実施形態におけるシステムは、図９の比較例３に示すランプ型装置と比較して制御機構が簡素化できる。
【００７９】
例えば、図１０に示すように、本発明では外部機器接続部（制御部）９０において、光量を参照、補正することなく、検出器５２，５３は相互に独立して、インターフェース９７を介して、ＣＰＵ９４により制御される。後述の実施例のように、検出器５２、５３の感度は、感度調整部９５，９６により、所定の異なる測定レンジ（感度）を設定可能であり、表示部・操作部２８０は、第２実施形態において接続されるコンピュータ４００に設けてもよい。
【００８０】
また、本発明の一実施形態では、ＮＢＤ−アミノ酸等に特化した測定を行うため、波長４７０ｎｍの光を発するＬＥＤを用いている。
【００８１】
従って、本発明の、特定の波長で発光するＬＥＤを備える蛍光検出装置１００で検出される試料は、試料は光学異性体を含むアミノ酸又はアミノ酸誘導体であると好適である。
例えば、試料には、下記立体配置に示すような、アミノ酸又はアミノ酸誘導体のＬ体と、Ｄ体とが含まれている。
【００８２】
【化１】
2017078153.tif 000003
第１の検出器５２は、アミノ酸又はアミノ酸誘導体のＬ体を、第１の成分（第１対象成分）として、第１の感度（低感度）で、即ち、第１の測定レンジで検出している。第２の検出器５３は、アミノ酸又はアミノ酸誘導体のＤ体を、第２の成分として、第１の感度よりも高い第２の感度（高感度）で、即ち、第２の測定レンジで検出している。
【００８３】
上記、本発明のＬＥＤを用いた蛍光検出装置を、二次元側の蛍光検出装置に適用させて説明したが、上記ＬＥＤを用いた蛍光検出装置は一次元側にも適用することができる。
【００８４】
［一次元側の蛍光検出装置］
図１１Ａは、一次元側の蛍光検出装置２００の外観図であり、図１１Ｂは、図１１Ａに示す蛍光検出装置２００のケースを外した場合の上面図である。
【００８５】
図１１Ａ及び図１１Ｂに示すように、蛍光検出装置２００は、セル２１０と、光源２３０と、一次元目検出器５１とを備えている。図１１Ａに示すように、蛍光検出装置２００では、セル２１０は筐体２１９に囲われ、光源２３０は筐体２３９で囲われ、一次元目検出器５１はケース５５で覆われている。
【００８６】
上記の蛍光検出装置１００と同様に、セル２１０の試料に対して励起光を照射する光源２３０は、ＬＥＤで構成されると好適である。
【００８７】
一次元目検出器５１は、励起光が試料に照射されると試料から発生する蛍光を測定する。一次元目の検出では、検出対象は特定の物質（アミノ酸等）であり、ワイドレンジ化が不要である場合において、セル２１０に対して設けられる検出器が１つで有る点が、二次元目の蛍光検出とは異なる。
【００８８】
また、図１１Ｂに示すように、蛍光検出装置２００では、光源２３０と接触する励起光フィルタ２４１、一次元目検出器５１と接触する蛍光フィルタ２４２が、セル２１０に接して（近接して）設けられている。
【００８９】
次に、一次元目の蛍光検出装置２００に適用されるフローセル２１０の構造を説明する。図１２Ａは、セル２１０の上面図、左側面を斜視した図、右側面を斜視した図、下面図を示し、図１２Ｂは、セル２１０の斜視図を示す。
【００９０】
図１２Ａ及び図１２Ｂにおいて、セル２１０の本体における、試料を保持する溶液通過部２１５、透明石英ブロック２１１，２１４、及び黒色石英２１２，２１３の配置は、図７Ａ、図７Ｂに示すセル１１０と同様である。
【００９１】
蛍光検出装置２００では、検出器は１つであるため、反射ミラーが蒸着される範囲が広くなる。詳しくは図１２Ａ、図１２Ｂに示すように、反射ミラーとして、入射面２１０ａと対向する入射対向面２１０ｃに設けられているミラー部２２１が設けられ、第２の表面２１０ｄでは、蛍光が透過する部分を除いた部分にミラー部２２３，２２４が設けられている構造は略同一であるが、第１の表面２１０ｂにおいては、全面にミラー部２２２が設けられている点が異なる。
【００９２】
さらに、試料からのより多く集光するために、セル２１０の上面、及び下面において、少なくことも光を反射させる部分にミラー部２２５，２２６を設けてもよい。
【００９３】
このようにセルを加工することにより、レンズを設置することによる集光が不要となり、光源２３０とセル２１０、及びセル２１０と一次元目検出器５１を直接接して配置させることが可能となる。
【００９４】
図１のシステムにおいて、一次元目検出器５１の測定、及び二次元目蛍光検出器５２，５３の測定のための光源をＬＥＤにすることで、システム全体を、小型化することができる。
【００９５】
例えば、図１３に示すように、一次元目の蛍光検出装置２００と一次元目データ処理部９１、及び二次元目の蛍光検出装置１００と二次元目データ処理部９２，９３をまとめて１つの装置として構成してもよい。まとめて１つに構成する場合の構成例を図１３に示す。
【００９６】
［一体化検出装置］
図１３に示すように、一体化検出装置３００は、ケース３３０で覆われている。ケース３３０で覆われることで、セル１１０，２１０が配置される部分は、所望の環境（温度、湿度、照度）が維持されている。また、検出器５１，５２，５３で検出された検出結果は処理部９１，９２，９３においてデータ処理され、分離された溶出時間と量に応じた信号強度に従いクロマトグラムを描く。
【００９７】
図１３に示すように、この一体化検出装置３００は、２つの青色ＬＥＤモジュールである光源１３０，２３０が設けられ、３つの検出器５１，５２，５３が設けられている（３チャンネル）。一例として、図１０の制御ブロック図で示す構成を用いて、検出器５１，５２，５３の感度（測定レンジ）を切り替えることができる。
【００９８】
例えば、図１３と図１０を参照して、操作部２６０の検知器設定感度入力部２９０により操作することで、検出器（ＰＭＴ）５１，５２，５３、データ処理部９１，９２，９３に関する感度、サンプリングレート、タイムコンスタントは多段階に切り替えられるようにしてもよい。
【００９９】
このとき、３つの検出器は夫々独立に、２０ｂｉｔ１Ｖフルスケールで出力されるようにした。
【０１００】
ここで、サンプリングレート・タイムコンスタント（平滑化時間）は、分析に要求される分解能やシグナル・ノイズ比のバランスを調整し、用途に合わせて任意に設定する。
【０１０１】
このように構成される一体化検出装置３００は全体の外形として、１９インチラック規格に準拠しうる。図９の比較例３では、１つのセルに対して、レンズを設ける必要があったため１セルに１ケースが必要であったが、本発明の蛍光検出装置１００，２００は、レンズが不要であり、装置内で一次元目のセル２１０と検出器５１、及び二次元目のセル１１０と検出器５２と５３が夫々一体化しているため、蛍光検出装置１００，２００を１つのケース３３０にまとめることができる。その分、ケースの大きさが小さく、少なくとも１／２以下にすることが可能になる。
【０１０２】
また、この一体化検出装置３００は、電源はＡＣ１００Ｖ〜２４０Ｖに対応し、光源１３０，２３０にＬＥＤを用いるため、消費電力が少なく、５０Ｗ以下である。この一体化検出装置３００は、ＵＳＢシリアル通信を可能にすることも出来、後述するＰＣ２、質量分析装置５００と通信可能としてもよい。
【０１０３】
＜第２実施形態＞
上記の本発明の第１実施形態に係る二次元ＨＰＬＣシステムの検出結果をさらに補完するために、図１４に示すように、二次元ＨＰＬＣシステムである液体クロマトグラフィー装置１にコンピュータ４００と、質量分析装置（ＭＳ装置）５００とを接続してもよい。
【０１０４】
質量分析装置５００を接続することで、蛍光検出装置１００により検出した、例えばアミノ酸のＬ体とＤ体の検出結果（蛍光検出結果）と質量分析結果とを比較することが可能になるため、測定の精度を向上させることが可能となる。
【０１０５】
上述の実施形態により、本発明では、濃度の異なる２つの対象物を、幅広い測定範囲（レンジ）で同時に測定できる、蛍光検出装置を提供することができる。また、上記蛍光検出装置で実現する分析方法は、第１の感度（第１の測定レンジ）と該第１の感度と異なる第２の感度（第２の測定レンジ）とで、濃度の異なる２つの対象物を同時に測定することができる。
【０１０６】
さらに、このような蛍光検出装置が搭載される蛍光検出システムでは、分離部に送られた試料中の対象成分（例えば、光学異性体（アミノ酸又はアミノ酸誘導体のエナンチオマー（Ｄ体及びＬ体）等）が互いに分離され、分離された試料の成分の光学異性体は、それぞれ蛍光検出装置では２つの検出器（２つの測定レンジ）によって、一連の分析で検出することができる。
【０１０７】
上述のように、本発明の蛍光検出装置も用いて、アミノ酸のＤ体、Ｌ体を夫々検出し、Ｄ／Ｌ組成をプロファイルすることで、例えばＤ体の独自の機能の働きを調べることができる。例えば、Ｄ―Ｓｅｒは、神経物質の調整、保湿、Ｄ―アラニン（Ａｌａ）は血糖調整、皮膚バリア調整、Ｄ―アスコルビン酸（Ａｓｐ）は、ホルモン分泌の制御、抗酸化作用等の機能がある。したがって、医療分野に利用することができる。
【０１０８】
また、本発明の蛍光検出装置を用いて、食品中のキラルアミノ酸の含量解析（メタボリックプロファイリング）を行うことにより、味覚等の品質管理やトレーサビリティに加え、価値を付したブランディングの手段になり得るものと期待され得る。
【０１０９】
＜第３実施形態＞
上述の実施形態では、液体クロマトグラフィーシステムにおいて、二次元目に本発明に係る２つの検出器を用いる蛍光検出装置１００を配置する例を説明したが、分画する構成を含まないシステムに、本発明に係る蛍光検出装置を配置してもよい。
【０１１０】
図１５に、本発明の第３実施形態に係る、図６Ｂに示す蛍光検出装置を備えるＨＰＬＣシステム２の概略図を示す。図１５の構成では、カラム分離後の検出装置が、２つの異なる測定レンジの検出器５２Ａ（Ｄ２），５３Ａ（Ｄ３）を有する蛍光検出装置１００Ａである。
【０１１１】
分析対象成分の濃度が不明な場合においても、２つの検出器による幅広い測定レンジで検出することで、測定の対象としている物質（第１の成分）の測定と同時に、未知の成分を副次的に検出することも可能となる。例えば、生体試料等複雑なマトリクスでは、測定レンジの拡大により、含量の著しく異なるより多くの成分を検出できると好適である。
【０１１２】
詳しくは、後述する実施例６で示すように、検出感度が異なる検出器を２つ設置して同時に検出することで、試料中の含有量の不明な測定対象物質（フルオレセインを検出する際の副次的な混合物）において、低濃度側の測定レンジで、不純物を検出することが可能であった（図２６，図２７参照）。
【０１１３】
なお、本実施形態においても、データ処理部９２Ａ，９３Ａには、図１０に示すように操作部２６０や検知器設定感度入力部２９０が操作可能に接続されており、検出器（ＰＭＴ）５２Ａ，５３Ａの感度や各種設定を、段階的に切り替えられるものとする。
【０１１４】
例えば、検出器（ＰＭＴ）５２Ａ（Ｄ２），５３Ａ（Ｄ３）の感度、サンプリングレート、タイムコンスタント（平滑化時間）は目的に応じて任意に設定できる。
【０１１５】
＜第４実施形態＞
また、ＨＰＬＣシステムにおいて、蛍光検出装置を連続して接続するように設けて検出装置間の再現性を確認することができる。図１６に、本発明の第４実施形態に係る、図６Ｂに示す蛍光検出装置を２つ備えるＨＰＬＣシステム３の概略図を示す。
【０１１６】
ＨＰＬＣシステム３に含まれる構成は、図１５のＨＰＬＣシステム２の蛍光検出装置１００Ａの後段に蛍光検出装置１００Ｂが追加して設けられており、この蛍光検出装置１００Ａ，１００Ｂを含むＨＰＬＣシステム３を用いて、後述する実施例５のように、蛍光色素であるフルオレセインの標準品を分析すると、６桁に及ぶ良好な直線性と装置間再現性を示した（図２４Ａ，図２４Ｂ）。
【０１１７】
この２つの検出装置のうち、一方を標準装置と定めることにより他方の性能検査を行うことができる。上述した通り、シンプルな光学系により２つの蛍光検出装置が近接したコンパクトな設計が可能となり、蛍光検出器間をより短い配管で接続することができるため、試料が配管を通過する時間、通過中の拡散・化学変化（分解等）を最小限に抑えることにより、２つの蛍光検出装置の再現性を向上させている。
【０１１８】
なお、第３実施形態や第４実施形態のＨＰＬＣシステム２，３に対して、図１４で示したＭＳ装置５００や、コンピュータ４００を接続してもよい。
【０１１９】
以上、本発明の好ましい実施形態について詳述したが、本発明は上記した特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能なものである。
【実施例】
【０１２０】
以下に、液体クロマトグラフィー装置を用いて２次元液体クロマトグラフィー分析を行った実施例１〜実施例４を説明する。【０１２１】
なお、液体クロマトグラフィー装置として、実施例１〜実施例４では、図１の流路図に示すような二次元ＨＰＬＣシステム１を用いて測定し、システムは以下の仕様のものを用いて構成し、以下の操作条件とした。【０１２２】
＜機器＞
第一のポンプ２１及び第二のポンプ２２には、試料注入部（オートサンプラー）３０、脱気装置８０、蛍光検出器５１，５２，５３、流路切替バルブ６０等は、株式会社資生堂で製作した。【０１２３】
マルチループユニット７０として、１５００ｍｍｘ０．５ｍｍ  ｉ．ｄ．（容量３００μＬ）のループ７１を９本接続して使用した。【０１２４】
また、カラムとして、一次元目の逆相カラム４１は（０．５３ｍｍ  ｉ．ｄ．  ｘ  １０００ｍｍ）の大きさのものを用いた。二次元目の光学分割カラム４２ａ，４２ｂ，４２ｃは、いずれも（１．５ｍｍ  ｉ．ｄ．ｘ２５０ｍｍ）の大きさであって、種類や性質が異なる。【０１２５】
＜キラルアミノ酸分析＞
（１）標準品アミノ酸のＮＢＤ誘導体化反応
各アミノ酸についてＤ体２．５μＭ、Ｌ体１０μＭ（ただし、グリシン（Ｇｌｙ）は１０μＭ、Ｍｅｔ、リジン（Ｌｙｓ）及びシステイン（Ｃｙｓ）はＤ体１２．５μＭ、Ｌ体５０μＭ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＤ体２５μＭ、Ｌ体１００μＭ、チロシン（Ｔｙｒ）はＤ体１２５μＭ、Ｌ体５００μＭ）を含む水溶液１０μＬに、４００ｍＭホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）１０μＬと４０ｍＭ  ＮＢＤ−Ｆアセトニトリル溶液５μＬを加えて６０℃で２分間加熱した。【０１２６】
これに０．１％ＴＦＡ  ３０％  アセトニトリル溶液７５μＬを加えた後、０．５％ＴＦＡ水溶液で１０倍に希釈し２０μＬを、下記（２）に記載したＨＰＬＣ条件で分析した。【０１２７】
（２）ＨＰＬＣ条件
＜一次元目＞
カラムは  ４５℃に保たれている。
励起波長：４７０ｎｍ、蛍光波長：５３０ｎｍとした。
移動相Ａ：5%MeCN 0.045%TFA in water
移動相Ｂ：85%MeCN in water
移動相Ｃ：25%MeCN 0.05%TFA in water
移動相Ｄ：25%THF 0.05%TFA in water
ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓは下記表１に示す通りである。【０１２８】
【表１】
2017078153.tif 000004
＜二次元目＞
カラム：必要に応じて４２ａ，４２ｂ，４２ｃを使い分け，いずれも２５℃に保たれていた。
励起波長：４７０ｎｍ、蛍光波長：５３０ｎｍとした。
適切な移動相はアミノ酸ごとに夫々異なる。下記のものを用いた。
Ｈｉｓ（ヒスチジン）：0.07% formate in MeOH/MeCN(30/70, v/v), 300μL/min
Ａｒｇ（アルギニン）：MeOH/MeCN(60/40, v/v), 150μL/min
Ｓｅｒ（セリン），  Ａｓｎ（アスパラギン），  Ｇｌｎ（グルタミン），  Ｇｌｙ（グリシン），  Ｔｈｒ（トレオニン）：0.75% formate in MeOH/MeCN(12.5/87.5, v/v), 200μL/min
Ｐｒｏ（プロリン），  Ｍｅｔ（メチオミン）：1% formate in MeOH/MeCN(12.5/87.5, v/v), 200μL/min
Ａｌａ（アラニン）：0.5% formate in MeOH/MeCN(19/81, v/v), 200μL/min
Ｖａｌ（バリン），  ａｌｌｏ−Ｉｌｅ（アロイソロイシン），  Ｉｌｅ（イソロイシン），  Ｌｅｕ（ロイシン）：0.15% formate in MeOH/MeCN(85/15, v/v), 200μL/min
Ａｓｐ（アスパラギン酸）．  Ｇｌｕ（グルタミン酸）：0.6% formate in MeOH/MeCN(85/15, v/v), 150μL/min
ａｌｌｏ−Ｔｈｒ（アロトレオニン）：0.4% formate in MeOH/MeCN(5/95, v/v), 200μL/min
Ｔｒｐ（トリプトファン）：0.2%formate in MeOH/MeCN(5/95, v/v), 175μL/min
Ｐｈｅ（フェニルアラニン），  Ｌｙｓ（リジン），  Ｔｙｒ（チロシン）：0.4% formate in MeOH/MeCN(60/40, v/v), 200μL/min
Ｃｙｓ（システイン）：3% formate in MeOH/MeCN(25/75, v/v), 250μL/min
なお、アミノ酸に関して、下記、適宜略号で表す。【０１２９】
＜蛍光検出装置の構成＞
光源１３０，２３０として、ＣＣＳ社の青色ＬＥＤは「ＨＬＶ−１４ＢＬ−２Ｗ−ＮＲ−ＳＰ」を用いた。検出器５１，５２，５３は、浜松ホトニクス社のＰＭＴモジュール「Ｈ９３０６−０１」を用いた。励起光フィルタ１４１，２４１は、４７０ｎｍをターゲットとするバンド幅２２ｎｍのＳｅｍｒｏｃｋ社の光学バンドパスフィルタ「ＦＦ０１−４７０／２７−２５」を用いた。蛍光フィルタ１４２，１４３，２４２は、５４２ｎｍをターゲットとするバンド幅２７ｎｍのＳｅｍｒｏｃｋ社の光学バンドパスフィルタ「ＦＦ０１−５４２／２７−２５」を用いた。【０１３０】
（３）試料のＮＢＤ誘導体化反応
試料に水及びＭｅＯＨ１を加えて撹拌した後、遠心分離し上清を得た。この上清を減圧乾固しホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）  ＮＢＤ−Ｆ  アセトニトリル溶液を加えて６０℃２分間加熱した。これをＴＦＡ  水溶液で希釈し（２）のＨＰＬＣ条件で分析した。
【実施例１】
【０１３１】
上記のような設定により、ＮＢＤ−Ｓｅｒ（セリン）標準品であって、ＮＢＤ−Ｄ／Ｌ−Ｓｅｒ  （Ｌ：Ｄ＝１：１），  ５００［ｆｍｏｌ］を用いて、二次元目での第１の検出器５２は６００Ｖ（高濃度用レンジ）、第２の検出器５３は１２００Ｖ（低濃度用レンジ）の検出結果を図１７Ａ，図１７Ｂに示す。
【実施例２】
【０１３２】
検出信号の電気的特性を把握するため、ＮＢＤ−Ｓｅｒ標準品を用いて時定数と各検出器の電圧（フォトマル電圧）について条件を検討したところ、時定数は１０秒、フォトマル電圧は一次元目検出器５１を８００Ｖ、二次元目での第１の検出器５２は６００Ｖ（高濃度用レンジ）、第２の検出器５３は１２００Ｖ（低濃度用レンジ）において最良のシグナル・ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が得られた。これをアミノ酸検出の最適値として定めた。【０１３３】
図１８ＡにＳｅｒ（セリン）の、本発明の実施形態に係る蛍光検出装置１００を用いた直線性試験の結果を示す。【０１３４】
図１８Ａに示すように、この条件下で９点の濃度（１０ｆｍｏｌ，５０ｆｍｏｌ，１００ｆｍｏｌ，５００ｆｍｏｌ，１  ｐｍｏｌ，  ５ｐｍｏｌ，  １０ｐｍｏｌ，５０ｐｍｏｌ，１００ｐｍｏｌ）のＮＢＤ−Ｓｅｒ標準品を分析したところ６桁に及ぶ良好な直線性を示した。【０１３５】
同様の実験を行うことで、食品試料中のタンパク質構成アミノ酸のＤ体とＬ体（４３種）の濃度範囲において１台の上記蛍光検出装置１００で定量レンジをカバーすることができた。上記の直線性の調査により、検出下限５００ａｍｏｌから検出上限５００ｐｍｏｌの範囲という６桁以上の測定レンジにおいて精度の高い定量が可能となる。【０１３６】
例えば、１０ｆｍｏｌ注入した場合のＳ／Ｎは３４（シグナル（Ｓ）：１５．５ｍＶ、ノイズ（Ｎ）：０．４５６ｍＶ）であり、検出限界（Ｓ／Ｎ＝３）は０．８８ｆｍｏｌと算出された。【０１３７】
比較として、図１８Ｂにキセノン（Ｘｅ）ランプ型の蛍光検出器の測定結果を示す。同条件でのキセノンランプ型蛍光検出器のダイナミックレンジは３桁未満、Ｓ／Ｎは６．４（１．３６ｍＶ、ノイズ：０．２１３ｍＶ）、検出限界は、４．６９ｆｍｏｌであった。【０１３８】
上記比較により、本発明の蛍光検出装置では、良好な直線性で、測定範囲を幅広くカバーできる。したがって、例えば、本発明の蛍光検出装置は、試料中で、２種類の対象物において一方の存在量に対して、他方の存在量が極端に少ない場合であっても、多い方だけではなく、少ない方の対象物も一度の測定で正しく検出・定量できるようになる。
【実施例３】
【０１３９】
本発明におけるＬＥＤを用いた蛍光検出装置と、比較例におけるキセノンランプを用いた蛍光検出装置との検出結果の感度を比較した。図１９Ａは第１の検出器５２を６００Ｖ（高濃度用レンジ）とした検出結果を示し、図１９Ｂは、第２の検出器５３を１２００Ｖ（低濃度用レンジ）とした検出結果を示す。【０１４０】
本仕様の試作機において、図１９Ａ，図１９Ｂに示すように、定量レンジ６桁以上、感度１ｆｍｏｌ以上を達成したことから食品実試料（黒酢）に適用したところ、標準品での試験通りＤ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｓｅｒを検出し、キセノンランプ型蛍光検出器を上回る性能（感度・ダイナミックレンジ）を示すことができたことがわかる。【０１４１】
この測定結果により、黒酢において、Ｌ−ＳｅｒとＤ−Ｓｅｒの存在比が３桁を超えても、検出感度が異なる検出器を２つ設置することで、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒの両方とも検出・定量できる。
【実施例４】
【０１４２】
本実施例では、本発明の蛍光検出装置の測定の精度を検証するため、図１４に示すように、質量分析装置５００、及びコンピュータ４００を二次元ＨＰＬＣシステムである液体クロマトグラフィー装置１に接続して測定して比較した。【０１４３】
本実施例において、質量分析装置５００として、日本ウォーターズ株式会社のＡＣＱＵＩＴＹ  ＱＤａ装置（下記ＭＳ装置と呼ぶ）を用いた。【０１４４】
本実施例においてＭＳ装置５００は、ＮＢＤ−アミノ酸標準品を用いたチューニングにより、サンプリングレート：１Ｈｚ、キャピラリー電圧：０．８ｋｖ、コーン電圧：１５ｖと定め、フルスキャンモード（１００．００−４００．００  Ｄａ）で測定した。その結果、いずれのＮＢＤ−アミノ酸もネガティブモードでのみ検出が可能であった。【０１４５】
そこで、ＳＩＲ（選択的イオン検出）モードにおいてＮＢＤ−Ａｌａ（２５１．００）、ＮＢＤ−Ｌｅｕ（２９３．１０）、ＮＢＤ−Ａｓｐ（２９５．００）、ＮＢＤ−Ｇｌｕ（３０９．００）について、ＭＳ装置５００で測定した結果（ＭＳデータ）と、蛍光検出装置１００で測定した蛍光検出データと比較した。【０１４６】
図２０は、ＡｌａのＭＳデータと、Ａｌａの蛍光検出データとを示す。図２１は、ＬｅｕのＭＳデータと、Ｌｅｕの蛍光検出データとを示す。図２２は、ＡｓｐのＭＳデータと、Ａｓｐの蛍光検出データとを示す。図２３は、ＧｌｕのＭＳデータと、Ｇｌｕの蛍光検出データとを示す。【０１４７】
図２０〜図２３からわかるように、分析対象成分のピークに関するＭＳデータと、蛍光検出データのピークは同等であるため、本発明の実施形態に係る蛍光検出装置１００を用いることで、再現的にＤ−アミノ酸・Ｌ−アミノ酸比（Ｄ／Ｌ）を得られることがわかる。即ち、蛍光検出装置１００と、ＭＳ装置５００を組み合わせることで、相補的により精度の高い検出を行うことができる。
【実施例５】
【０１４８】
以下に、液体クロマトグラフィー装置を用いて液体クロマトグラフィー分析を行った実施例５、実施例６を説明する。液体クロマトグラフィー装置として、実施例５、実施例６では、図１６の流路図に示すようなＨＰＬＣシステム３を用いて測定し、システムは以下の仕様のものを用いて構成し、以下の装置条件、操作条件とした。
カラム４１：2mm x 150mm S-3 MG
接続する配管：（[カラム]−(φ0.13mm-L=600mm配管)−[Ｄ２，Ｄ３検出用のセル１１０Ａ] − (φ0.13mm-L=600mm配管×2)−[Ｄ４，Ｄ５検出用のセル１１０Ｂ] 
移動相：MeOH:0.05%ギ酸水＝50:50  
移動相の流速：200uL/min
標品：６種類の濃度のフルオレセイン(1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL，10000ng/mL，100000ng/mL)
注入量：1uL
本蛍光検出器は、検出感度の高い方からＨ３、Ｈ２、Ｈ１、ＭＩＤ、Ｌ２、Ｌ１の６段階に設定可能な仕様に設計した。ここで上流の蛍光検出装置１００Ａにおいて、検出器Ｄ２（５２Ａ）を高濃度側の測定レンジ用として低感度（最も低いＬ１）、検出器Ｄ３（５３Ａ）を低濃度側の測定レンジ用として高感度（最も高いＨ３）と設定した。下流の蛍光検出装置１００Ｂにおいて、検出器Ｄ４（５２Ｂ）を高濃度側測定レンジ用として低感度Ｌ１、検出器Ｄ５（５３Ｂ）を低濃度側の測定レンジ用として高感度（Ｈ３）と設定した。【０１４９】
サンプリングレートは、5Hz、2Hzで、タイムコンスタント（平滑化時間）：2sec(5Hzの場合)、5sec(2Hzの場合)とした。（5Hz、2sec）、（2Hz、5sec）の夫々の場合について（Ｄ２、Ｄ３）の検出から（Ｄ４、Ｄ５）の検出は、図１６に示すＨＰＬＣシステム３の流れで行った。この際、Ｄ２とＤ３の検出は同時に行い、その直後にＤ４とＤ５の検出を同時に行った。【０１５０】
このように設定した、本発明のＨＰＬＣシステム３で、フルオレセインの直線性を検証した。【０１５１】
さらに、比較例として、従来より汎用されているキセノン（Ｘｅ）ランプ型の蛍光検出装置で、フルオレセインを測定した。キセノンランプ型の蛍光検出装置については測定レンジ（感度幅）が最大になるように適宜設定した。【０１５２】
また、ＬＥＤ型の蛍光検出装置１００Ａ，１００Ｂと同様に、サンプリングレート5Hz、タイムコンスタント（平滑化時間）：2secと設定した。移動相、標品も、上記ＨＰＬＣシステム３での検出の場合と、同様のものを用いる。【０１５３】
なお、キセノンランプ型の蛍光検出装置は１台につき１つの検出器を備えていることから、最高感度側・最低感度側について同時ではなく個別に分析した。【０１５４】
図２４Ａ、図２４Ｂは、図１６のシステムを用いた際のフルオレセインの検出結果の直線性試験の測定結果を示す。図２５Ａ，２５Ｂは比較例におけるキセノンランプを用いた蛍光検出装置のフルオレセインの検出結果の直線性試験の測定結果を示す。表２に、比較例のキセノンランプ型蛍光検出装置、及び本発明の蛍光検出装置のおけるフルオレセインの検出結果の直線性試験の測定結果をまとめて示す。【０１５５】
【表２】
2017078153.tif 000005
1ng/mL〜1,000ng/mLのフルオレセインは、図２５Ｂの比較例のキセノンランプ型蛍光検出装置の最高感度設定で、図２４Ｂの本発明のＬＥＤ型蛍光検出装置の最高感度設定（Ｈ３）で検出される。いずれの場合も、図２４Ｂ及び図２５Ｂのグラフで良好な直線性を示しており、十分に定量可能な測定レンジが確保されていた。【０１５６】
また、1,000ng/mL〜100,000ng/mLフルオレセインは図２５Ａのキセノンランプ型蛍光検出装置の最低感度設定で、図２４Ａの本発明のＬＥＤ型蛍光検出装置１００Ａの最低感度設定（Ｌ１）で検出される。いずれの場合も、図２４Ａ及び図２５Ａのグラフで良好な直線性を示しており、十分に定量可能な測定レンジが確保されていた。【０１５７】
このように６桁オーダー以上に及ぶ定量測定レンジを確保するに当たり、従来より汎用されているキセノンランプ型蛍光検出装置は２回の分析が必要であることに対し、本発明のＬＥＤ型蛍光検出器は１回の分析で十分であることが示された。
【実施例６】
【０１５８】
1,000ng/mL、10,000ng/mLの濃度で、（１）サンプリングレート5Hz、タイムコンスタント（平滑化時間）：2sec、（２）サンプリングレート2Hz、タイムコンスタント（平滑化  時間）：5secの２つの設定条件で分析した。【０１５９】
図２６Ａに、本発明の図１６のシステムを用いてサンプリングレート5Hz,タイムコンスタント2Secの条件における1,000ng/mLフルオレセインの検出結果を示し、図２６Ｂに本発明の図１６のシステムを用いてサンプリングレート2Hz,タイムコンスタント5Secの条件における1,000ng/mLフルオレセインの検出結果を示す。【０１６０】
また、図２７Ａに本発明の図１６のシステムを用いてサンプリングレート5Hz,タイムコンスタント2Secの条件における1,0000ng/mLフルオレセインの検出結果を示し、図２７Ｂに本発明の図１６のシステムを用いてサンプリングレート2Hz,タイムコンスタント5Secの条件における1,0000ng/mLフルオレセインの検出結果を示す。【０１６１】
図２６Ａ、図２６Ｂ、図２７Ａ、図２７Ｂでは、Ｄ２とＤ３は同時に検出し、その直後に、Ｄ４とＤ５は同時に検出している。このデータから別個体の蛍光検出装置においても同等オーダーレベルの感度とダイナミックレンジが再現的に確保され、量産可能な仕様を有していることが確認された。【０１６２】
また、図２６Ａと図２６Ｂとの比較、及び図２７Ａと図２７Ｂとの比較により、サンプリングレート、タイムコンスタントの設定条件の違いは、検出感度に大きな影響を与えることなく、分析に要求される分解能やシグナル・ノイズ比を考慮して詳細に設定可能なことが示された。【０１６３】
ここで、本実施例では、フルオレセインの検出を目的としているが、図２７Ａ、図２７Ｂに示すように10,000ng/mLの際の、高感度側では、副次的に目的外の物質（不純物、アーティファクト）も検出できた。【０１６４】
これは本発明の蛍光検出装置が従来にない広いダイナミックレンジを有しているからこそ観察できた現象であり、生体試料における極微量成分や化学製品における不純物の検出・定量に有用であることが示唆されている。
【符号の説明】
【０１６５】
１      二次元ＨＰＬＣシステム（液体クロマトグラフィー装置）
２，３  ＨＰＬＣシステム（液体クロマトグラフィー装置）
３      質量分析装置（ＭＳ装置）
１１    第一の移動相供給部
１２    第二の移動相供給部
２１    第一のポンプ
２２    第二のポンプ
３０    試料注入部
４１    逆相カラム
４２（４２ａ，４２ｂ，４２ｃ）    キラルカラム
４５    逆相カラム恒温槽
４６（４６ａ，４６ｂ）    キラルカラム恒温槽
４７ａ，４７ｂ，４７ｃ    調整用流路切替バルブ
５１    一次元目検出器
５２，５２Ａ，５２Ｂ    第１の検出器（二次元目検出器）
５３，５３Ａ，５３Ｂ    第２の検出器（二次元目検出器）
５５    ケース（一次元目検出器用）
５６    ケース（第１の検出器用）
５７    ケース（第２の検出器用）
６０    流路切替バルブ
７０    マルチループユニット
７１    ループ
７２    切り替え手段
８０    脱気装置
９１    一次元目データ処理部
９２    （第１の記録計）二次元目データ処理部
９３    （第２の記録計）二次元目データ処理部
９２Ａ  （第１の記録計）データ処理部
９３Ａ  （第２の記録計）データ処理部
９８    （第１の記録計）下流側データ処理部
９９    （第２の記録計）下流側データ処理部
１００  蛍光検出装置（二次元目蛍光検出装置）
１００Ａ  蛍光検出装置
１００Ｂ  蛍光検出装置（下流側蛍光検出装置）
１１０，１１０Ａ，１１０Ｂ  セル（フローセル）
１１０ａ  励起面（入射面）
１１０ｂ  第１の検出面
１１０ｃ  入射対向面
１１０ｄ  第２の検出面
１１１，１１４  透明石英
１１２，１１４  黒色石英
１１５  溶液通過部（試料通過部）
１１９  筐体（セル用）
１２１，１２２，１２３，１２４，１２５，１２６  ミラー部（反射用ミラー）
１３０  光源
１３９  筐体（光源用）
１４１  励起光フィルタ
１４２  第１の蛍光フィルタ
１４３  第２の蛍光フィルタ
２００  蛍光検出装置（一次元目蛍光検出装置）
２１０  セル
３００  一体化検出装置
４００  ＰＣ（コンピュータ）
５００  質量分析装置（ＭＳ装置）
【図１】
2017078153.tif 000006
【図２】
2017078153.tif 000007
【図３】
2017078153.tif 000008
【図４】
2017078153.tif 000009
【図５】
2017078153.tif 000010
【図６Ａ】
2017078153.tif 000011
【図６Ｂ】
2017078153.tif 000012
【図７Ａ】
2017078153.tif 000013
【図７Ｂ】
2017078153.tif 000014
【図８】
2017078153.tif 000015
【図９】
2017078153.tif 000016
【図１０】
2017078153.tif 000017
【図１１Ａ】
2017078153.tif 000018
【図１１Ｂ】
2017078153.tif 000019
【図１２Ａ】
2017078153.tif 000020
【図１２Ｂ】
2017078153.tif 000021
【図１３】
2017078153.tif 000022
【図１４】
2017078153.tif 000023
【図１５】
2017078153.tif 000024
【図１６】
2017078153.tif 000025
【図１７Ａ】
2017078153.tif 000026
【図１７Ｂ】
2017078153.tif 000027
【図１８Ａ】
2017078153.tif 000028
【図１８Ｂ】
2017078153.tif 000029
【図１９Ａ】
2017078153.tif 000030
【図１９Ｂ】
2017078153.tif 000031
【図２０】
2017078153.tif 000032
【図２１】
2017078153.tif 000033
【図２２】
2017078153.tif 000034
【図２３】
2017078153.tif 000035
【図２４Ａ】
2017078153.tif 000036
【図２４Ｂ】
2017078153.tif 000037
【図２５Ａ】
2017078153.tif 000038
【図２５Ｂ】
2017078153.tif 000039
【図２６Ａ】
2017078153.tif 000040
【図２６Ｂ】
2017078153.tif 000041
【図２７Ａ】
2017078153.tif 000042
【図２７Ｂ】
2017078153.tif 000043
【国際調査報告】
2017078153.tif 000044
2017078153.tif 000045
2017078153.tif 000046
2017078153.tif 000047