(57)【要約】  蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡が結合され、蛍光像と位相像を同時に３次元計測できるディジタルホログラフィック顕微鏡を提供する。第１のレーザ光５を用いて試料ステージ４を通過する物体光と通過しない参照光とを重ね合せた干渉光による位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系と、第２のレーザ光６を用いて蛍光励起光による蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系と、撮像手段３と、偏光依存性を有する２焦点フルネルレンズ（ＳＰＦＬ）２を備える。物体光と蛍光信号光とが同軸に重畳するように各々の光学系が配置され、重畳した光軸上に２重焦点レンズ２が配置される。撮像手段３が位相３次元像と蛍光３次元像をホログラムとして同時に取得する。位相３次元像と蛍光３次元像を分離してそれぞれの干渉強度分布から物体光と蛍光信号光を再構成する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のレーザ光を用いて観察対象試料を通過する物体光と通過しない参照光とを重ね合せた干渉光による位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系と、
第２のレーザ光を用いて前記観察対象試料の蛍光励起光による蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系と、
撮像手段と、
偏光依存性を有する２つの焦点距離を持つ２重焦点レンズと、
を備え、
前記物体光と前記蛍光信号光とが同軸に重畳するように各々の光学系が配置され、重畳した光軸上に前記２重焦点レンズが配置され、
前記撮像手段が前記位相３次元像と前記蛍光３次元像をホログラムとして同時に取得し、前記位相３次元像と前記蛍光３次元像を分離してそれぞれの干渉強度分布から前記物体光と前記蛍光信号光を再構成することを特徴とするディジタルホログラフィック顕微鏡。
【請求項２】
前記２重焦点レンズは、サブ波長周期構造の２焦点フレネルレンズであることを特徴とする請求項１に記載のディジタルホログラフィック顕微鏡。
【請求項３】
前記２重焦点レンズは、液晶空間光変調素子から成ることを特徴とする請求項１に記載のディジタルホログラフィック顕微鏡。
【請求項４】
前記２重焦点レンズは、第２のホログラフィック光学系にのみ作用し、第１のホログラフィック光学系には作用しないものであることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載のディジタルホログラフィック顕微鏡。
【請求項５】
第２のホログラフィック光学系は、前記２重焦点レンズによって自己干渉することを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載のディジタルホログラフィック顕微鏡。
【請求項６】
前記蛍光３次元像は同心円状ホログラムであり、前記位相３次元像は等傾角ホログラムであり、空間周波数面において前記蛍光３次元像と前記位相３次元像とを分離することを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載のディジタルホログラフィック顕微鏡。
【請求項７】
第２のホログラフィック光学系は、励起用レーザ光源が切替可能であることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載のディジタルホログラフィック顕微鏡。
【請求項８】
第１のホログラフィック光学系が透過型であり、第２のホログラフィック光学系が反射型であることを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載のディジタルホログラフィック顕微鏡。
【請求項９】
前記蛍光３次元像により細胞核の時空間情報を、前記位相３次元像により細胞核および細胞壁の時空間構造を同時に取得することを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載のディジタルホログラフィック顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１〜８の何れかに記載のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、
蛍光３次元像により細胞核の時空間情報と、位相３次元像により細胞核および細胞壁の時空間構造とを同時に取得する細胞観察方法。
【請求項１１】
請求項７に記載のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、
一の励起用レーザ光源を用いて取得した蛍光３次元像と、他の励起用レーザ光源を用いて取得した蛍光３次元像と、同時に取得した位相３次元像とから、細胞の挙動を観察する細胞観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光と位相を同時に３次元計測できるディジタルホログラフィック顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生きた細胞の動的３次元イメージングは、バイオ応用分野において重要な計測技術である。例えば、蛍光顕微鏡を使って細胞核中の特定ＤＮＡに蛍光分子を導入し、有糸分裂する細胞の変化を計測する蛍光標識技術が知られている。蛍光分子で染色された細胞内の核やタンパク質の相互作用を可視化することで様々な観測が可能になる。蛍光３次元像を高分解能かつ高コントラストで計測できるものとして、共焦点レーザ走査型顕微鏡が知られている。しかし、共焦点レーザ走査型顕微鏡では計測物体の一点ごとに集光点の走査が必要なため、蛍光３次元像を得るためには時間がかかり、動的物体の変化が速い現象の計測や奥行き位置が異なる複数の細胞の同時計測は不向きであるという本質的な限界がある。
また、蛍光像でだけでなく細胞核や細胞壁などの構造を同時に観察する技術も求められている。構造観察の手段として、位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡などがある。位相差像は透明物体の形状測定に有効である。【０００３】
蛍光像および位相像を同時観察することができれば、異なる情報を同時に取得することができるため、バイオ反応においてより詳細な情報を提供することが可能になる。
最近では、蛍光像および位相差像を同時観察可能な光学顕微鏡が市販されているが、フィルタの入れ替えが必要な上、一度の計測範囲は１点もしくは２次元に限られるといった制約がある。【０００４】
一方、瞬時的な３次元計測を可能とするツールとして、ディジタルホログラフィック顕微鏡（Digital Holographic Microscope；ＤＨＭ）が知られている。ディジタルホログラフィック顕微鏡では、３次元情報をホログラム情報として取得し、計算機内で光波の逆伝搬計算を行うことで奥行き位置に対する物体の光波情報を再構成する。ディジタルホログラフィック顕微鏡の特徴としては、特殊な蛍光染色が必要なく生体細胞の３次元観察が可能であること（ラベルフリー）、計算機再構成により焦点位置を任意に変更できるオートフォーカシング機能を有すること、定量的位相計測が可能であることが挙げられる。このため、３次元的に細胞が動くような状況においても、再構成計算により自動的にピントの合った再構成画像を得ることができる。【０００５】
ディジタルホログラフィック顕微鏡を細胞観察に応用する場合、蛍光情報のホログラム取得が必要となるが、蛍光を用いてホログラフィー技術を実現するためには、蛍光が非常に干渉しにくいインコヒーレント光であるという問題がある。近年、インコヒーレント光からホログラムを作る方法が次々に提案されており、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡（Fluorescence Digital Holographic Microscope；ＦＤＨＭ)に向けた研究が世界中で活性化しているが、空間光変調素子や光学素子を多く有するものが大半である（例えば、特許文献１を参照）。【０００６】
特許文献１に開示されたホログラム記録装置は、干渉性の低い光（例えば自然光または蛍光等）を観察することができないといった問題を解決するものであり、空間光変調器（波面変調素子）を用いて、互いに偏光方向が異なる第１成分光および第２成分光を含む物体光を、第１成分光の波面形状と第２成分光の波面形状を異なる形状にし、第１成分光に対する第２成分光の位相シフト量に、空間的に周期的に変化する分布を生じさせて、第１成分光と第２成分光とを干渉させてホログラムを形成するものである。これにより、単一の光路を通る干渉性の低い光を用いて、１回の撮像で記録されるホログラムから、被写体の再生像を得ることができるものである。しかしながら、この方法では、干渉性の低い蛍光３次元像の観察に限定されるといった問題がある。【０００７】
また、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡（ＦＤＨＭ）は、ターゲッティング計測には適しているが、蛍光を発生しない物質に対しては無力であるという問題がある。また、蛍光観察を行う場合に、有害な蛍光分子を使うために計測対象が制限される問題も生じる。そのため、ディジタルホログラフィック顕微鏡（ＤＨＭ）の応用拡大といった視点で見ると、位相像や蛍光像さらには偏光などの多様な情報が観測可能なマルチモーダル（multimodal）ディジタルホログラフィック顕微鏡の登場が望まれている。【０００８】
本発明者らは、マルチモーダルディジタルホログラフィック顕微鏡の実現を目指し、蛍光２次元像と位相イメージングが可能なディジタルホログラフィック顕微鏡を既に試作して実験にホログラム画像から再構成している（非特許文献１を参照）。試作した顕微鏡は、蛍光像と位相像を逐次的に取得するものであり、蛍光像と位相像を同時に計測するものではない。
以下、本明細書において、特に断らない限り、蛍光像と蛍光３次元像、位相像と位相３次元像は、それぞれ同じ意味で用いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１５−１７２６号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】的場修ら，“蛍光と位相イメージングが可能なハイブリッドディジタルホログラフィック顕微鏡の試作”，Optics & Photonics Japan 2014，No.6, P15.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述の試作のディジタルホログラフィック顕微鏡では、蛍光顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡の機能を併せ持つが、シャッターを切替えてそれぞれの像を逐次的に取得するものであり、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡が結合されたものではなく、蛍光像と位相像を同時に３次元計測できるというものではない。
かかる状況に鑑みて、本発明は、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡が結合され、蛍光像と位相像を同時に３次元計測できるディジタルホログラフィック顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を達成すべく、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡は、下記１）〜４）を備える。
１）第１のレーザ光を用いて観察対象試料を通過する物体光と通過しない参照光とを重ね合せた干渉光による位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系
２）第２のレーザ光を用いて観察対象試料の蛍光励起光による蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系
３）撮像手段
４）偏光依存性を有する２重焦点レンズ【００１３】
そして、物体光と蛍光信号光とが同軸に重畳するように各々の光学系が配置され、重畳した光軸上に上記４）の２重焦点レンズが配置される。撮像手段が位相３次元像と蛍光３次元像をホログラムとして同時に取得する。撮像手段により取得されたホログラム像から、位相３次元像と蛍光３次元像を分離してそれぞれの干渉強度分布から物体光と蛍光信号光を再構成する。【００１４】
上記構成によれば、観察対象試料から位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系と、蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系との２つの光学系を共通光路として、物体光と蛍光信号光を同軸に重畳させて、１つの撮像手段で２つのホログラム像を取得できる。
ここで、偏光依存性を有する２重焦点レンズとは、光電場の偏光方向に強い異方性を持ち、かつ、２つの焦点距離を持つレンズである。【００１５】
偏光依存性を有する２重焦点レンズとして、サブ波長周期構造の２焦点フレネルレンズ（Sub-wavelength Periodic structured Fresnel Lens；ＳＰＦＬ）が好適に用いられる。ＳＰＦＬの場合、光の波長よりも短い周期の回折格子構造であるサブ波長周期構造によって、光波の偏光状態によって回折を受けることになる。また、フレネルレンズは、通常のレンズを光の波長で折り返し厚みを減らしたレンズであり、断面は鋸状でありプリズムを並べたような形になる。２焦点フレネルレンズは、１つのビーム光を２つに分けて回折させ、異なる場所で焦点を合わせる機能を持つ。【００１６】
また、偏光依存性を有する２重焦点レンズとして、液晶空間光変調素子を用いても良い。液晶空間光素子では、液晶分子の配向により入射光電場の偏光状態に対して異なる働きを生じさせることができる。例えば、ある方向の直線偏光に対して常光線として作用するときに、それに垂直な直線偏光に対して異常光線として作用する。そのため、特定の直線偏光方向に対してのみ作用する偏光依存性のある２重焦点レンズを実現できる。
なお、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡における蛍光信号光は、液晶空間光変調素子で実現される２重レンズによって、２つの回折光が生じることになる。この２つの回折光は、共に同じ偏光であり、自己干渉が生じる。この点で、偏光方向が異なる第１成分光と第２成分光とを干渉させてホログラムを形成する上述の特許文献１における空間光変調素子とは機能が異なる（本発明の場合、蛍光ホログラム用の蛍光信号光、位相ホログラム用の物体光が、特許文献１の第１成分光と第２成分光に相当するものである。）。【００１７】
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡において、偏光依存性を有する２重焦点レンズは、第２のホログラフィック光学系にのみ作用し、第１のホログラフィック光学系には作用しないように設計される。
位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系の物体光の偏光には感度がなく、レンズ作用を起こすことがないように２重焦点レンズを設計すると共に、蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系の蛍光の偏光には強い感度を持たせるように設計する。第２のホログラフィック光学系の蛍光の偏光は、２つの焦点距離をもつ２重焦点レンズによって、自己干渉が生じることになる。【００１８】
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡では、蛍光３次元像は同心円状ホログラムであり、位相３次元像は等傾角ホログラムであり、空間周波数面において蛍光３次元像と位相３次元像とを分離する。
蛍光３次元像は、第２のホログラフィック光学系の蛍光の偏光が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。一方、位相３次元像は、等傾角干渉を用いることによってキャリア周波数をもつ干渉パターンにすることができる。同心円状干渉パターンと等傾角干渉パターンは、空間周波数面で分離することが可能であり、撮像手段により撮像した像から、蛍光３次元像と位相３次元像を空間周波数面で分離することができる。２つのホログラムパターンをフーリエ変換することで、空間周波数面で、等傾角干渉パターンの成分をバンドパスフィルタによって抽出することができる。予め、等傾角干渉パターンに用いた参照光強度分布を取得しておくことで、同心円状干渉パターンのみを抽出することが可能になる。【００１９】
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡において、第２のホログラフィック光学系は、励起用レーザ光源が切替可能であることでもよい。観察対象試料の蛍光特性に応じて、励起用レーザ光源の波長を切り替えるようにする。これにより、蛍光染色試薬の種類に応じて、励起用レーザ光源を切替えて使用することにより、ターゲットとなる細胞を選択して分裂や形状変化などの細胞の状態変化を計測できる。
すなわち、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、一の励起用レーザ光源を用いて取得した蛍光３次元像と、他の励起用レーザ光源を用いて取得した蛍光３次元像と、同時に取得した位相３次元像とから、細胞の挙動を観察する細胞観察方法を実現できる。【００２０】
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡では、第１のホログラフィック光学系が透過型であり、第２のホログラフィック光学系が反射型（落射型）にすることが好ましい。また、第１及び第２のホログラフィック光学系は、共に試料の設置状態により上下を反転させても構わない。
観察対象試料の蛍光励起光による蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系において、蛍光信号は微弱であるので、透過型にした場合に、強い蛍光励起光だけをカットするのは非常に困難になるからである。
第２のホログラフィック光学系を反射型（落射型）でなく透過型にする場合は、蛍光信号を励起する蛍光励起光を十分にカットし、蛍光信号のみを通過させるダイクロイックミラーや蛍光波長の特定の波長および位相計測のためのレーザ波長を通過させるバンドパスフィルタを用いる必要がある。【００２１】
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡において、細胞観察の際は、蛍光３次元像により細胞核の時空間情報を、位相３次元像により細胞核や細胞壁の時空間構造を同時に取得することが好ましい。
複数の物理量から得られる多次元情報は、従来のバイオイメージング分野における計測では得られておらず、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡によって、従来不可能であった観察を可能にする。本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡は、バイオイメージング分野における強力な計測ルールとして、蛍光３次元像と位相３次元像を同時かつ高速撮影することを可能にする。
すなわち、本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、蛍光３次元像により細胞核の時空間情報と、位相３次元像により細胞核や細胞壁の時空間構造とを同時に取得する細胞観察方法を実現できる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡によれば、蛍光ディジタルホログラフィック顕微鏡と位相像検出ディジタルホログラフィック顕微鏡が結合され、蛍光３次元像と位相３次元像を同時に計測できるといった効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１のディジタルホログラフィック顕微鏡の光学系の構成図
【図２】位相３次元像を取得する第１のホログラフィック光学系の構成図
【図３】蛍光３次元像を取得する第２のホログラフィック光学系の構成図
【図４】蛍光ホログラムと位相ホログラムの分離再生原理の説明図
【図５】取得したホログラム像の一例
【図６】ホログラム像から分離した蛍光像と位相像
【図７】２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）の説明図
【図８】実施例２のディジタルホログラフィック顕微鏡の光学系の構成図
【図９】オオカナダモの測定画像例（１）
【図１０】オオカナダモの測定画像例（２）
【図１１】実施例４のディジタルホログラフィック顕微鏡の光学系の構成図
【図１２】２色蛍光ビーズの位相像と蛍光像
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の実施形態の一例を、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。
【実施例１】
【００２５】
図1は、ディジタルホログラフィック顕微鏡の一実施形態の光学系の構成を示す。図１に示すディジタルホログラフィック顕微鏡は、図２に示す透過型ディジタルホログラフィック顕微鏡と、図３で示す反射型蛍光顕微鏡との２つの光学系を共通光路として、物体光と蛍光信号光を同軸に重畳させて、１つの撮像手段で位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得できるようにしたものである。【００２６】
先ず、波長３５５ｎｍから５５０ｎｍの帯域の励起用レーザ光源６を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起する。励起された蛍光分子は、波長３５５ｎｍから５５０ｎｍの帯域の励起用レーザ光源より長波長の蛍光信号を発し、試料ステージ４のガラス基板表面で反射された励起用レーザ光とともに対物レンズ１５に入射する。なお、ダイクロイックミラー１６を設置し、励起用レーザ光を十分に減衰させ、蛍光信号光を強調して蛍光３次元像を取得する。
蛍光３次元像は、２重焦点レンズである２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）２によって蛍光の偏光成分が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。ＳＰＦＬ２は、図７に示すように、２つの焦点距離（ｆ１，ｆ２）を持つサブ波長周期構造のフレネルレンズである。光の波長よりも短い周期の回折格子構造（サブ波長周期構造）によって、光波はその偏光状態によって回折を受けることになる。１つのビーム光は、２つの焦点距離をもつフレネルレンズにより、２つの回折波が生成される。そして、２つの回折波は異なる場所で焦点が合うことになる。【００２７】
また同時に、波長６３３（ｎｍ）のＨｅ−Ｎｅレーザ光源５を用いて試料ステージ４上の観察対象試料の計測物体を照明する。Ｈｅ−Ｎｅレーザ光はビームスプリッター１２により、それぞれ計測物体を透過する物体光経路と、何もない参照光経路に分けられ、マッハ・ツェンダー干渉計を構成している。計測物体を透過するＨｅ−Ｎｅレーザ光の波長が波長３５５ｎｍから５５０ｎｍの帯域の励起用レーザ光の波長より長いため、ダイクロイックミラー１６に影響されずに伝搬され、再びビームスプリッター１８により参照光と干渉することができる。この際、物体光と参照光の間にわずかに角度をつけることによって、オフアクシス（off-axis）ホログラム、すなわち等傾角干渉パターンのホログラムを取得する。取得した等傾角干渉パターンのホログラムから、フーリエ変換法を用いて物体光の振幅分布と位相分布を抽出する。オフアクシス法では元の物体位置まで逆伝搬させることにより、観察対象試料の物体光の波面が再生されることになる。【００２８】
そして、撮像手段として用いるイメージセンサ３で、位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得する。
上述の如く、蛍光３次元像は、２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）２によって蛍光の偏光成分が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。一方、位相３次元像は、等傾角干渉パターンとなる。同心円状干渉パターンと等傾角干渉パターンは、空間周波数面で分離することが可能であり、イメージセンサ３により撮像した像から、位相３次元像の位相ホログラムと蛍光３次元像の蛍光ホログラムとを空間周波数面で分離することができる。
ＳＰＦＬ２を設けることにより、位相ホログラム用の光が影響を受けないように、１／２波長板２０を設け、位相ホログラム用の光の偏光をＳＰＦＬ２によって影響しない偏光状態に合わせている。また、１／２波長板２１を設けて、蛍光励起用光源の偏光方向をＳＰＦＬ２が働く偏光方向に合せている。【００２９】
ここで、位相ホログラムと蛍光ホログラムが重畳した信号は、下記数式１のように示すことができる。【００３０】
【数１】
2016163560.tif 000003
【００３１】
上記数式１において、ｏpは位相ホログラム用の物体光波の複素振幅分布を表し、ｒpは参照光波の複素振幅分布を表す。また、ｏＦは２重焦点レンズに入射する蛍光ホログラム用物体光波の複素振幅分布である。ここで、ｆ１，ｆ２は２重焦点レンズの２つの焦点距離を示す。また、ｇはレンズの位相関数および撮像面までのフレネル回折伝搬を表す関数である。
ｒpが下記数２で表される平面波であるとすると、位相ホログラムはオフアクシス型ホログラムとなる。そこで、位相ホログラムの抽出は、上記数式１をフーリエ変換して、空間周波数面で行うことができる。【００３２】
【数２】
2016163560.tif 000004
【００３３】
上記数式１をフーリエ変換したものを下記数式３に示す。ここで、Ａは位相ホログラム用の参照光の振幅である。図４（１）は、位相ホログラムと蛍光ホログラムの２つのホログラムが重畳した干渉画像であり、下記数式３を図示化したものである。下記数式３の右辺の第１，２，５，６，７，８項は自己干渉の同心円状ホログラムによる項であり、空間周波数面で原点付近に現れる信号となる（図４（２）を参照）。また、右辺の第３，４項はオフアクシスホログラムによる項であり、空間周波数面で原点からずれた位置に存在する信号となる（図４（２）を参照）。このため、ウィンドウ関数を掛けることにより、図４（２）に示す空間周波数面で、原点付近に現れる蛍光ホログラムと、原点からずれた位置に存在する位相ホログラムの２つのホログラムを分離する（図４（３）を参照）。したがって、オフアクシスホログラムによる項である右辺の第３，４項を、それぞれ、下記数式４と数式５のように取り出すことができる。【００３４】
【数３】
2016163560.tif 000005
【００３５】
【数４】
2016163560.tif 000006
【００３６】
【数５】
2016163560.tif 000007
【００３７】
ここで、位相ホログラム用の参照光の振幅Ａは、予め測定することが可能であるため、上記数式４と数式５から位相ホログラムの物体光ｏpとその複素共役分布を求めることができる。上記数式３に上記数式４と数式５を代入して、蛍光ホログラムとして下記数式６を得る。
ここで、上記数式３における、Ｇ１とＧ２は、それぞれ、ｇ（ＯＦ（ｘ，ｙ），ｆ１）とｇ（ＯＦ（ｘ，ｙ），ｆ２）のフーリエ変換を表している。【００３８】
【数６】
2016163560.tif 000008
【００３９】
上述の如く、位相ホログラムと蛍光ホログラムの２つのパターンをフーリエ変換することにより、空間周波数面で原点からずれた位置に存在する信号の等傾角干渉パターンの成分を、バンドパスフィルタによって抽出することができる。また、予め等傾角干渉パターンに用いた参照光の強度分布を取得しておくことで、同心円状の干渉パターンのみを抽出することが可能になる。【００４０】
（撮像したホログラムの一例）
ここで、撮像したホログラムの一例を示す。イメージセンサ３は、Photometrics社のCoolSNAPKINO-SPK(4.54μm ピッチ、14bit) を使用した。また、対物レンズ１５は、オリンパス社製ＭＤＰｌａｎ４０（ＮＡ＝０．６５）の４０倍の対物レンズを使用した。観察対象としては、Invitrogen 社のTetraSpeck（登録商標）の 直径４μｍの蛍光ビーズを使用した。【００４１】
蛍光励起中心波長５３２（ｎｍ）、蛍光の中心波長５５０（ｎｍ）で、蛍光像と位相ホログラムを個別にイメージセンサで取得したホログラムのイメージの一例を図５に示す。
図５（１）が蛍光ビーズのホログラム画像であり（蛍光ビーズの部分を拡大した図も付記）、それをフーリエ変換して、図５（２）の空間周波数面を得る。空間周波数面の原点からずれた位置に存在するホログラムを抽出し、図５（３）の位相分布を取得する（拡大位相像も付記）。
図５（４）は、再構成された位相分布の３次元表示を示している。図５（４）から、蛍光ビーズの位相変化量が分かる。【００４２】
蛍光ビーズの蛍光像と、図５のプロセスで得られた位相像を、それぞれ図６（１）、（２）に示す。また位相３Ｄプロットを図６（３）に示す。図６（１）と（２）から蛍光ビーズ像と蛍光ビーズの位相像を確認できる。図６（３）から蛍光ビーズの形状が凸状の球形に近い形状が得られていることがわかる。構築した実験系を用いて、４μｍサイズの蛍光像や１０μｍサイズの細胞形状の位相像などの計測が可能であることを確認した。
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡では、リアルタイムで細胞の形状変化と核の動きを計測可能である。奥行き位置方向に結像位置を探索するオートフォーカス機能を更に実装することにより、リアルタイムに蛍光３次元像と位相３次元像の観察が実現できるであろう。
【実施例２】
【００４３】
上述の実施例２のディジタルホログラフィック顕微鏡は、位相ホログラムを取得する第１のホログラフィック光学系が透過型であり、蛍光ホログラムを取得する第２のホログラフィック光学系が反射型であるが、以下に説明するように、蛍光ホログラムを取得する第２のホログラフィック光学系が透過型であっても構わない。
図８は、実施例２のディジタルホログラフィック顕微鏡の光学系の構成図を示している。【００４４】
実施例１のディジタルホログラフィック顕微鏡の光学系と同様に、波長６３３（ｎｍ）のＨｅ−Ｎｅレーザ光源５を用いて試料ステージ４上の観察対象試料の計測物体を照明する。Ｈｅ−Ｎｅレーザ光はビームスプリッター１２により、それぞれ計測物体を透過する物体光経路と、何もない参照光経路に分けられ、マッハ・ツェンダー干渉計を構成する。計測物体を透過するＨｅ−Ｎｅレーザ光の波長が後述する波長５３２ｎｍの帯域の励起用レーザ光源より長いため、ダイクロイックミラー３３に影響されずに伝搬され、再びビームスプリッター１８により参照光と干渉することができる。この際、物体光と参照光の間にわずかに角度をつけることによって、オフアクシスホログラム（等傾角干渉パターンのホログラム）を取得する。【００４５】
また、波長５３２ｎｍの帯域の励起用レーザ光源６を用いて、試料ステージ４のガラス基板の裏面から試料ステージ４の表面に置かれた観察対象試料を透過して蛍光分子を励起する。励起された蛍光分子は、５３２（ｎｍ）より長波長の蛍光信号を発し、試料ステージ４を透過した励起用レーザ光とともに対物レンズ１５に入射する。観察対象試料の蛍光励起光による蛍光信号は微弱であるので、本実施例のような透過型にした場合に、蛍光励起光を十分にカットし、蛍光信号のみを通過させるダイクロイックミラー３３を設置し、励起用レーザ光を十分に減衰させ、蛍光信号光を強調して蛍光３次元像を取得する。蛍光３次元像は、サブ波長周期構造の２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）２によって蛍光の偏光成分が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。【００４６】
そして、イメージセンサ３で、位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得する。蛍光ホログラムの干渉パターンは同心円状となり、位相ホログラムの干渉パターンは等傾角干渉パターンとなる。実施例１と同様に、同心円状干渉パターンと等傾角干渉パターンは、空間周波数面で分離することが可能であり、イメージセンサ３により撮像した像から、位相３次元像の位相ホログラムと蛍光３次元像の蛍光ホログラムとを空間周波数面で分離することができる。また、ＳＰＦＬ２を設けることにより、位相ホログラム用の光が影響を受けないように、１／２波長板２０を設け、位相ホログラム用の光の偏光をＳＰＦＬ２によって影響しない偏光状態に合わせている。また、１／２波長板２１を設けて、蛍光励起用光源の偏光方向をＳＰＦＬ２が働く偏光方向に合せている。
【実施例３】
【００４７】
従来、バイオイメージング分野の顕微鏡観察では、焦点面近傍での細胞の動きのみしか観察できないという限界がある。一方、ディジタルホログラフィーでは、２０倍の対物レンズを用いた場合に、１０００倍の奥行き範囲を観察できることが知られている。実施例１又は２のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、３次元的な細胞の塊や奥行きに異なる細胞における反応を計測し、多数の細胞について３次元位置をマルチトラックキングすることが可能である。【００４８】
時間的に異なる再構成像の各々の点において合焦または非合焦の判別を行って、３次元的にフォーカスの合った再構成像を３０フレーム毎秒のリアルタイムで再生する。位相分布情報に対して奥行きに合焦となる位置を追跡するオートフォーカスを機能を設ける。時間分解能として１０−５秒から１０５秒の１０桁の時間スケールに対応可能なディジタルホログラフィック顕微鏡を構築することも可能である。また、奥行きの異なるがん細胞に対する薬の効果を同時観察することも可能であり、全ての面で焦点のあった再構成像を提供できる。【００４９】
図９、１０は、オオカナダモにおける葉緑体の原形質流動を、実施例１のディジタルホログラフィック顕微鏡で観察した画像のイメージを示している。図９（１）はオオカナダモの撮影画像（２層構造を示す断面図も付記）、図９（２）はホログラム、図９（３）の空間周波数面、図９（４）は再現された位相イメージを示している。
葉緑体は染色することなく自家蛍光を発する（図１０（１）を参照）。そのため、蛍光ホログラムと位相ホログラムを同時に取得し、位相測定により細胞壁の構造と葉緑体を同時に計測する（図１０（２）を参照）。葉緑体は３次元的に移動しているため、時系列に並ぶホログラム像をリアルタイムで再構成する。【００５０】
また、図９（１）に示すように、オオカナダモは表面と裏面の２層構造をしている。実施例１のディジタルホログラフィック顕微鏡によるディジタルホログラフィー計測では、奥行きに構造が存在する場合にコヒーレンス長が長いため、クロストークノイズが大きい。ディジタルホログラフィーでは奥行き位置の異なる情報をフィルタにより除去あるいは低減させることが可能であるため、信号処理により奥行き分解能を向上させることが可能である。
【実施例４】
【００５１】
図１１は、ディジタルホログラフィック顕微鏡の他の実施形態の光学系の構成を示す。図１に示すディジタルホログラフィック顕微鏡と同様、透過型ディジタルホログラフィック顕微鏡と反射型蛍光顕微鏡との２つの光学系を共通光路として、物体光と蛍光信号光を同軸に重畳させて、１つの撮像手段で位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得できるようにしたものである。【００５２】
図１に示すディジタルホログラフィック顕微鏡と異なる点は、２つの励起用レーザ光源（４１，４２）を備えている点である。具体的には、４７３ｎｍの波長の青色レーザと、５３２ｎｍの波長の緑色レーザを備える。青色レーザは、主に５００〜５３０ｎｍの蛍光を励起することを目的とする。一方、緑色レーザは、主に５４０〜６００ｎｍの蛍光を励起することを目的とする。観察対象の細胞によって、蛍光マーカーが異なることが想定される。そのため、蛍光マーカーが励起する波長のレーザを観察対象試料に照射できるようにする。
例えば、図１１に示す構成の場合、２つのシャッター（４３，４４）とビームスプリッター４６によって、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起する励起用レーザ光源（４１，４２）が切替えられる。シャッター（４３，４４）の切り替えは、シャッター制御装置５０から出力されるシャッター制御信号（５１，５２）によって行われる。ビームスプリッター４６の先になるＮＤ（Neutral Density）フィルタ４７は、色彩に影響を与えることなくレーザ光量を低下させるためのものである。【００５３】
２つの励起用レーザ光源（４１，４２）の内、一方の励起用レーザ光源を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起する。励起された蛍光分子は、励起用レーザ光源より長波長の蛍光信号を発し、試料ステージ４のガラス基板表面で反射された励起用レーザ光とともに対物レンズ１５に入射する。また、シャッター制御装置５０により、２つのシャッター（４３，４４）を切り替え、もう一方の励起用レーザ光源を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起する。
２つの励起用レーザ光源（４１，４２）の各々の蛍光３次元像は、２重焦点レンズである２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）２によって蛍光の偏光成分が自己干渉するため、干渉パターンは同心円状となる。【００５４】
蛍光３次元像の取得と同時に、波長６３３（ｎｍ）のＨｅ−Ｎｅレーザ光源５を用いて試料ステージ４上の観察対象試料の計測物体を照明し、オフアクシス（off-axis）ホログラムを作成し、イメージセンサ３で、位相３次元像と蛍光３次元像の２つのホログラムを同時に取得する。【００５５】
観察対象試料として、径が２．５〜４．５μｍで、黄色とナイルレッドの２色蛍光ビーズを混ぜたものを用いた。図１１の光学系の構成のディジタルホログラフィック顕微鏡を用いて、２色蛍光ビーズの位相像と蛍光像を取得した結果を図１２に示す。ただし、本実施例では、蛍光は２次元像の撮影となっている。図１２（１）は、２色蛍光ビーズの位相像を示している。図１２（２）（３）は、それぞれ黄色の蛍光ビーズの蛍光像、ナイルレッドの蛍光ビーズの蛍光像を示している。図１２（２）の黄色の蛍光ビーズの蛍光像は、青色レーザ光源を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起した場合の蛍光像である。また図１２（３）のナイルレッドの蛍光ビーズの蛍光像は、緑色レーザ光源を用いて、試料ステージ４上の観察対象試料の蛍光分子を励起した場合の蛍光像である。図１２（１）の位相像から６つの蛍光ビーズが確認できる。また、図１２（２）の蛍光像では４つの蛍光ビーズが確認でき、図１２（３）の蛍光像では２つの蛍光ビーズが確認できる。これらのことから、構築した実験系を用いて、μオーダサイズの蛍光粒子を、その色毎に識別して確認できることがわかった。
また、図１２（４）は、これらの蛍光ビーズの１つの位相プロファイルを示している。この図から蛍光ビーズの大きさ(約５μｍ）と位相差(２．６ rad程度）を知ることができる。【００５６】
本発明のディジタルホログラフィック顕微鏡では、リアルタイムで細胞の形状変化と細胞核の動きを計測可能であり、蛍光染色試薬の種類に応じて、励起用レーザ光源を切替えて使用することにより、ターゲットとなる細胞を選択して形状変化と動きを計測できる。
なお、本実施例では、２つの励起用レーザ光源を用いているが、３つ以上であってもよい。また、シャッター制御装置から出力されるシャッター制御信号を高速に切り替えて、蛍光像を取得してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明は、バイオイメージング分野の顕微鏡に有用である。
【符号の説明】
【００５８】
１，３０    ディジタルホログラフィック顕微鏡
２    ２焦点フレネルレンズ（ＳＰＦＬ）
３    イメージセンサ
４    試料ステージ
５    Ｈｅ−Ｎｅレーザ光源
６，４１，４２    励起用レーザ光源
１０，１１，１９，３２，３４，３５，３６  レンズ
１２，１８，４６  ビームスプリッター
１３，１４，３１，４５  反射鏡
１５  対物レンズ
１６，３３  ダイクロイックミラー
１７  チューブレンズ
２０，２１    １／２波長板
４３，４４    シャッター
４７    ＮＤフィルタ
５０    シャッター制御装置
５１，５２    シャッター制御信号
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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