(57)【要約】梗塞性疾患に対して予防及び治療効果を有するオリゴペプチドを提供すること。RANKLタンパク質のDEループ配列を含み、細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有する、オリゴペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
RANKLタンパク質のDEループ配列を含み、細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有する、オリゴペプチド。
【請求項２】
前記DEループ配列が下記（a）又は（b）のアミノ酸配列である、請求項１に記載のオリゴペプチド：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【請求項３】
RANKLタンパク質のCDループ配列を含まない、請求項１又は２に記載のオリゴペプチド。
【請求項４】
前記DEループ配列のN末端側に隣接してRANKLタンパク質のβストランドD配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項５】
前記βストランドD配列が下記（c）又は（d）のアミノ酸配列である、請求項４に記載のオリゴペプチド：
（c）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（d）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【請求項６】
前記DEループ配列のC末端側に隣接してRANKLタンパク質のβストランドE配列を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項７】
前記βストランドE配列が下記（e）又は（f）のアミノ酸配列である、請求項６に記載のオリゴペプチド：
（e）配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（f）配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【請求項８】
下記（g）又は（h）のアミノ酸配列からなる、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴペプチド：
（g）配列番号10〜14及び22〜24のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（h）配列番号10〜14及び22〜24のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴペプチドを含有する、医薬。
【請求項１０】
梗塞性疾患、骨粗鬆症、敗血症、多発性骨髄腫による骨病変、及び固形癌転移による骨病変等からなる群より選択される少なくとも１種の疾患の予防又は治療に用いられる、請求項９に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有するオリゴペプチド、これを含有する梗塞性疾患の予防又は治療用医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳梗塞や心筋梗塞などの梗塞性疾患は、血管閉塞等により虚血部位が生じることに起因する。通常、虚血部位が生じることによりその周辺部位に酸素や栄養が行き届かなくなり、さらにこれと同時に或いはこれに伴って炎症反応やフリーラジカル生成が起こることにより、壊死部位が短期間に拡大していく。したがって、梗塞性疾患の治療には、虚血部位の発生後、比較的早期に有効な治療薬を投与することが極めて重要となる。【０００３】
脳梗塞の治療薬として、国際的に有効性が認められているものとしては、例えば血栓溶解薬（組織プラスミノーゲンアクチベーター）が知られている。しかしながら、血栓溶解薬は、虚血部位の発生後4.5時間以内に投与される必要があるので、虚血部位の発生時刻が全く不明である患者や既に虚血部位の発生後4.5時間以上経過している患者に対しては用いることができない。他の脳梗塞治療薬としてはエダラボンが知られているが、これは複数回（通常、1日2回）投与する必要がある。【０００４】
一方、本発明者等によって、RANKLタンパク質が炎症性サイトカインを抑制すること、及び梗塞性疾患に対して予防及び治療効果を有することが報告されている（特許文献1）。ただ、これはRANKLタンパク質全長を有効成分としているところ、安定性、経済性等の観点からは、より短いオリゴペプチドを有効成分とすることが望ましい。しかし、RANKLタンパク質のどの領域が細胞の（特にミクログリア細胞、マクロファージ細胞等の）炎症性サイトカインを抑制し、梗塞性疾患に対して予防及び治療効果を有するかについては、知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2014/051202号
【特許文献２】国際公開第2012／147805号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】The Journal of Clinical Investigation, No.7, Vol.108, 2001, pages 971-979.
【非特許文献２】Mol Endocrinol, January 2009, 23(1):35-46.
【非特許文献３】J Cell Mol Med. 2010 Dec; 14(12): 2827-2839.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、梗塞性疾患に対して予防及び治療効果を有するオリゴペプチド、及びこれを含有する梗塞性疾患の予防又は治療用医薬を提供することを課題とする。特に、虚血部位の発生後数時間（例えば4時間）以上経過後に投与しても、梗塞性疾患に対して治療効果を発揮できる医薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は鋭意研究を進めた結果、RANKLタンパク質のDEループ配列を含み、且つ細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有するオリゴペプチドであれば上記課題を解決できることを見出した。この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。【０００９】
項１．  RANKLタンパク質のDEループ配列を含み、細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有する、オリゴペプチド．
項２．  前記DEループ配列が下記（a）又は（b）のアミノ酸配列である、項１に記載のオリゴペプチド：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列．
項３．  RANKLタンパク質のCDループ配列を含まない、項１又は２に記載のオリゴペプチド．
項４．  前記DEループ配列のN末端側に隣接してRANKLタンパク質のβストランドD配列を含む、項１〜３のいずれかに記載のオリゴペプチド．
項５．  前記βストランドD配列が下記（c）又は（d）のアミノ酸配列である、項４に記載のオリゴペプチド：
（c）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（d）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列．
項６．  前記DEループ配列のC末端側に隣接してRANKLタンパク質のβストランドE配列を含む、項１〜５のいずれかに記載のオリゴペプチド．
項７．  前記βストランドE配列が下記（e）又は（f）のアミノ酸配列である、項６に記載のオリゴペプチド：
（e）配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（f）配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列．
項８．  下記（g）又は（h）のアミノ酸配列からなる、項１〜７のいずれかに記載のオリゴペプチド：
（g）配列番号10〜14及び22〜24のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（h）配列番号10〜14及び22〜24のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列．
項９．  項１〜８のいずれかに記載のオリゴペプチドを含有する、医薬．
項１０．  梗塞性疾患、骨粗鬆症、敗血症、多発性骨髄腫による骨病変、及び固形癌転移による骨病変等からなる群より選択される少なくとも１種の疾患の予防又は治療に用いられる、項９に記載の医薬．
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、梗塞性疾患に対して予防及び治療効果を有するオリゴペプチド、及びこれを含有する梗塞性疾患の予防又は治療用医薬を提供することができる。このオリゴペプチドは、虚血部位の発生後3時間以上経過後に投与しても、梗塞性疾患に対して治療効果を発揮できるので、より多くの患者に対して適用することができる。【００１１】
また、このオリゴペプチドを用いれば、既知の治療薬であるエダラボンや、梗塞性疾患に対する治療効果を有することが報告されているRANKL全長タンパク質を投与する場合に比べて、梗塞性疾患に対してより高い治療効果を発揮することが期待できる。【００１２】
さらに、RANKLタンパク質は破骨細胞を活性化するのに対して、このオリゴペプチドはそのような性質を有さず、寧ろRANKLによる破骨細胞の活性化を抑制することができる。このため、このオリゴペプチドを用いれば、梗塞性疾患を治療しつつ、発症後の骨密度の低下を抑制することも可能である。【００１３】
その上さらに、本発明のオリゴペプチドは脳室投与以外の投与経路（例えば静脈投与等）であっても、脳梗塞に対する治療効果を発揮できる。【００１４】
梗塞性疾患に関する国民医療費は非常に高額（例えば脳梗塞については1兆円を超える（平成21年度））であり、高齢化の進行に伴い、その額は年々増加している。また、梗塞性疾患は、重度になる程、発症後の介護の必要性及びその程度も高まる。したがって、本発明のオリゴペプチドを用いて梗塞性疾患をより軽度に留めることにより、医療費及び介護費の削減に資することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】炎症反応を惹起するリポ多糖（LPS）によってミクログリア細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-6）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例２）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6濃度を示す。横軸の数値は、LPS、MHP1、又はMHP2の培地中の濃度を示し、‐はLPS、MHP1、又はMHP2の培地中の濃度が0であることを示す。
【図２】炎症反応を惹起するリポ多糖（LPS）によってミクログリア細胞から分泌される炎症性サイトカイン（TNFα）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例２）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のTNFα濃度を示す。横軸の数値は、LPS、MHP1、又はMHP2の培地中の濃度を示し、‐はLPS、MHP1、又はMHP2の培地中の濃度が0であることを示す。
【図３】炎症反応を惹起するリポ多糖（LPS）によってマクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカイン（IL-6）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例３）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6濃度を示す。横軸の数値は、LPS又はMHP1の培地中の濃度を示し、‐はLPS又はMHP1の培地中の濃度が0であることを示す。
【図４】炎症反応を惹起するリポ多糖（LPS）によってマクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカイン（TNFα）の量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例３）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のTNFα濃度を示す。横軸の数値は、LPS又はMHP1の培地中の濃度を示し、‐はLPS又はMHP1の培地中の濃度が0であることを示す。
【図５】神経細胞−グリア細胞混合培養系において、LPSによって分泌される炎症性サイトカイン（TNFα）の量に対して、RANKLペプチド（前処理）が与える影響を調べた結果を示す（実施例４のA群）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のTNFα濃度を示す。横軸の数値は、MHP1の培地中の濃度（μg/ml）を示し、‐はLPS又はMHP1の培地中の濃度が0であることを示し、＋はLPSの培地中の濃度が10μg/mlであることを示す。＊は、LPS＋且つMHP1−の場合（左から2つ目のカラム）に対するP値が0.05未満であったことを示す。
【図６】神経細胞−グリア細胞混合培養系において、LPSによる神経細胞死に対して、RANKLペプチド（前処理）が与える影響を調べた結果を示す（実施例４のB群）。縦軸は、神経細胞マーカー（MAP2）に対する抗体で染色された領域（すなわち生存神経細胞が占める領域）の面積が、培養ディッシュ面積に対して占める割合を示す。横軸の数値は、MHP1の培地中の濃度（μg/ml）を示し、‐はLPS又はMHP1の培地中の濃度が0であることを示し、＋はLPSの培地中の濃度が10μg/mlであることを示す。
【図７】神経細胞−グリア細胞混合培養系において、LPSによって分泌される炎症性サイトカイン（TNFα）の量に対して、RANKLペプチド（同時処理）が与える影響を調べた結果を示す（実施例４のC群）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のTNFα濃度を示す。横軸の数値は、MHP1の培地中の濃度（μg/ml）を示し、‐はLPS又はMHP1の培地中の濃度が0であることを示し、＋はLPSの培地中の濃度が10μg/mlであることを示す。＊＊は、LPS＋且つMHP1−の場合（左から2つ目のカラム）に対するP値が0.01未満であったことを示す。
【図８】LPSによるM1シフトに対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例５）。縦軸は、M1状態又はM2状態のミクログリア細胞が占める割合を示す。横軸中、Controlは培地にLPS、RANKLタンパク質、及びRANKLペプチドのいずれも含めなかった場合を示し、LPSは培地にLPSのみを含めた場合を示し、LPS＋RANKLは培地にLPS及びRANKLタンパク質を含めた場合を示し、LPS＋MHP1は培地にLPS及びRANKLペプチド（MHP1）を含めた場合を示す。
【図９】RAW264.7細胞のRANKがノックダウンされたことを示す（実施例６）。矢印で示される位置がRANKのバンドの位置である。
【図１０】RANKLペプチドによる炎症性サイトカインの分泌抑制が、RANK非存在下でも起こるかどうか調べた結果を示す（実施例６）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6濃度を示す。横軸中、control siはcontrol siRNAを示し、siはRANKに対するsiRNAを示し、＋／−は左側に示される成分の有無を示す。
【図１１】RANKLペプチドによる炎症性サイトカインの分泌抑制が、RANK非存在下でも起こるかどうか調べた結果を示す（実施例６）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のTNFα濃度を示す。横軸中、control siはcontrol siRNAを示し、siはRANKに対するsiRNAを示し、＋／−は左側に示される成分の有無を示す。
【図１２】RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響を調べた結果を示す（実施例７）。図１２Ａ及びＢ中、縦軸は、測定対象のmRNA発現量をGAPDH mRNA発現量で除した値を示す。図１２Ｃ中、縦軸は、TransAM NFkB p65 kitによって測定された吸光度（NFκB結合配列を有するDNAに結合した、核タンパク中のp65量を表わす）を示す。
【図１３】RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響を調べた結果を示す（実施例８）。（ａ）は、A群、B群、及びD群のTRAP染色像を、（ｂ）は、C群のTRAP染色像（上段）及び核染色像（下段）を示す。
【図１４】RANKLペプチドによる炎症性サイトカインの分泌抑制が、ヒト細胞でも起こるかどうか調べた結果を示す（実施例９）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6濃度を示す。横軸中、左から1つ目のカラム（control）はLPS及びRANKLペプチドのいずれも培地に含めなかった場合を示し、2つ目のカラム（LPS）はLPSのみを培地に含めた場合を示し、3〜7つ目のカラムはLPSとRANKLペプチド（終濃度はそれぞれのカラムに記載の濃度（μg/ml））を培地に含めた場合を示す。
【図１５】脳虚血後の壊死部位のサイズに対する、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例１０）。縦軸は、測定された脳梗塞面積の割合を示す。横軸は、測定対象の脳断面部位を示す。各プロットは各マウスの測定結果を示し、バーは平均値を示す。ContolはaCSF投与群を示し、MHP1はMHP1溶液投与群を示し、Edaravoneはエダラボン投与群を示す。
【図１６】脳梗塞半球のF4/80陽性細胞（活性化マクロファージ・ミクログリア）の割合（／中大脳動脈領域）、及び該細胞数を測定した結果を示す（実施例１０）。各プロットは各マウスの測定結果を示し、中央のバーは平均値を、上端、下端のバーは、標準偏差を示す。＊＊は、controlに対するP値が0.01未満であったことを示す。
【図１７】RANKLペプチドの敗血症予防／治療効果を調べた結果を示す（実施例１１）。縦軸は、生存率を示し、横軸はLPS投与後の日数を示す。
【図１８】RANKLペプチドの安定性を調べた結果を示す（実施例１２）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6又はTNF−αの濃度を示す。＊＊は、controlに対するP値が0.01未満であったことを示す。
【図１９】RANKLペプチドとRANKL全長タンパク質との比較結果を示す（実施例１３）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6又はTNF−αの濃度を示す。＊＊は、controlに対するP値が0.01未満であったことを示す。
【図２０】TLR2による炎症性サイトカイン分泌に対する、RANKLペプチドの効果に関する、試験結果を示す（実施例１４）。縦軸は、ELISAで測定された、培地中のIL-6又はTNF−αの濃度を示す。＊＊は、controlに対するP値が0.01未満であったことを示す。
【図２１】RANKLペプチドの静脈投与後の動態解析結果を示す（実施例１５）。各写真中、「Intact」は脳梗塞モデルを作成していない側の組織の写真を示し、「Ischemia」は脳梗塞モデル作成側の組織の写真を示し、「5 min」及び「1 hr」は投与後の経過時間を示し、「saline」は投与液の代わりに生理食塩水を投与した場合を示す。
【図２２】脳虚血後の壊死部位のサイズに対する、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例１６）。縦軸は、測定された脳梗塞面積の割合を示す。横軸は、測定対象の脳断面部位を示す。各プロットは各マウスの測定結果を示し、バーは平均値を示す。Salineは生理食塩水投与群を示し、MHP1はMHP1投与液投与群を示す。
【図２３】脳虚血後の脳梗塞症状に対する、RANKLペプチドが与える影響を調べた結果を示す（実施例１６）。縦軸は、測定されたNeurological severity scoreを示し、横軸は、脳梗塞モデル作成後の経過時間を示す。Salineは生理食塩水投与群を示し、MHP1はMHP1投与液投与群を示す。
【図２４】RANKLペプチド投与による破骨細胞への影響を調べた結果を示す（実施例１７）。A〜Cは、TRAP染色像を示す。A：正常マウス、B：脳梗塞マウス（生食投与）、C：脳梗塞マウス（MHP1投与）。Dの縦軸は、TRAP染色像における、骨領域に占める染色領域（破骨細胞領域）の割合を示す。Dの横軸中、Normalは正常マウス群（A）を示し、Salineは脳梗塞後生理食塩水投与群（B）を示し、MHP1は脳梗塞後MHP1投与液投与群（C）を示す。
【図２５】脳梗塞6時間目のRANKLペプチド投与の効果を調べた結果を示す（実施例１８）。A中、縦軸は、測定されたNeurological severity scoreを示し、横軸は、脳梗塞モデル作成後の経過時間を示す。B中、縦軸は、測定された脳梗塞面積の割合を示し、横軸は、測定対象の脳断面部位を示す。B中、各プロットは各マウスの測定結果を示し、バーは平均値を示す。A及びB中、Salineは生理食塩水投与群を示し、MHP1 4（又は6）hrsは脳梗塞モデル作成から4（又は6）時間経過後にMHP1投与液を投与した群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．定義
本明細書において、アミノ酸配列の表記は全て一文字表記で表わす。
【００１７】
本明細書において、アミノ酸配列の『同一性』とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS， Altschul SF．“Methods for assessing the statisticalsignificance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc．Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statisticsfor multiple high−scoringsegments in molecular sequences．”NatlAcad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、NationalCenter of BiotechnologyInformation（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。
【００１８】
本明細書において、オリゴペプチドにおけるアミノ酸変異は、保存的置換であることが好ましい。保存的置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００１９】
２．オリゴペプチド
本発明は、RANKLタンパク質のDEループ配列を含み、細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有する、オリゴペプチド（本明細書において、「本発明のオリゴペプチド」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００２０】
RANKLタンパク質のDEループ配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、DEループを形成するアミノ酸配列である限り特に限定されない。該DEループ配列が由来する生物種は特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒト、サル、マウス、ラット等、より好ましくはヒト、マウス等、よりさらに好ましくはヒトが挙げられる。各生物種のDEループ配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献1、2等に記載されている。また、ある生物種由来のDEループ配列が公知でなくとも、公知の情報（例えば非特許文献1、2等）に基づいて、その配列を容易に決定することができる。RANKLタンパク質のDEループ配列として、具体的には、例えば配列番号1に示されるアミノ酸配列（ヒト及びマウス由来RANKLタンパク質のDEループ配列）等が挙げられる。
【００２１】
RANKLタンパク質のDEループ配列として、好ましくは下記（a）又は（b）のアミノ酸配列が挙げられる：
（a）配列番号1に示されるアミノ酸配列、又は
（b）配列番号1に示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸（好ましくは1個のアミノ酸）が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【００２２】
上記（b）において、複数個とは、例えば2〜5個であり、好ましくは2〜4個であり、より好ましくは2〜3個であり、さらに好ましくは2個である。
【００２３】
（b）のアミノ酸配列の一例としては、（b’）N末端−セリン（S）−イソロイシン（I）−リシン（K）−C末端で示されるアミノ酸配列が挙げられる。  細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性は、例えば次のように判定することができる。ミクログリア細胞（例えばMG6細胞等）又はマクロファージ細胞（例えばRAW264.7細胞、THP1細胞等）に対して、炎症反応を惹起する物質（例えばリポ多糖（LPS）、FSL-1等）と共に活性測定対象のオリゴペプチドを接触させた場合に、コントロール（活性測定対象のオリゴペプチドを接触させない場合）に比べて、培地中の炎症性サイトカイン量が少ない場合は、活性測定対象のオリゴペプチドが細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有すると判定することができる。具体的には、実施例２、３、９、１４等の方法に従って行うことができる。
【００２４】
本発明のオリゴペプチドは、より確実に（例えば、「より多くの細胞種において」、「より多くのToll様受容体を介した炎症反応に対して」、「より強く」等）所望の活性（細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性）を発揮できるという観点から、RANKLタンパク質のCDループ配列を含まないことが好ましい。
【００２５】
RANKLタンパク質のCDループ配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、CDループを形成するアミノ酸配列である限り特に限定されない。該CDループ配列が由来する生物種は特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒト、サル、マウス、ラット等、より好ましくはヒト、マウス等、よりさらに好ましくはヒトが挙げられる。各生物種のCDループ配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献1、2等に記載されている。また、ある生物種由来のCDループ配列が公知でなくとも、公知の情報（例えば非特許文献1、2等）に基づいて、その配列を容易に決定することができる。RANKLタンパク質のCDループ配列として、具体的には、例えば配列番号15に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のCDループ配列）、配列番号16に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のCDループ配列）等が挙げられる。
【００２６】
RANKLタンパク質のCDループ配列として、好ましくは下記（a）又は（b）のアミノ酸配列が挙げられる：
（i）配列番号15又は16に示されるアミノ酸配列、又は
（j）配列番号15又は16に示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸（好ましくは1個のアミノ酸）が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【００２７】
上記（j）において、複数個とは、例えば2〜3個であり、好ましくは2個である。
【００２８】
本発明のオリゴペプチドは、より確実に（例えば、「より多くの細胞種において」、「より多くのToll様受容体を介した炎症反応に対して」、「より強く」等）所望の活性（細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性）を発揮できるという観点から、上記DEループ配列のN末端側に隣接してRANKLタンパク質のβストランドD配列を含むことが好ましい。「N末端側に隣接して」とは、上記DEループ配列のN末端のアミノ酸と上記βストランドD配列のC末端のアミノ酸とがペプチド結合により連結していることを示す。
【００２９】
RANKLタンパク質のβストランドD配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、βストランドDを形成するアミノ酸配列である限り特に限定されない。該βストランドD配列が由来する生物種は特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒト、サル、マウス、ラット等、より好ましくはヒト、マウス等、よりさらに好ましくはヒトが挙げられる。各生物種のβストランドD配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献1、2等に記載されている。また、ある生物種由来のβストランドD配列が公知でなくとも、公知の情報（例えば非特許文献1、2等）に基づいて、その配列を容易に決定することができる。RANKLタンパク質のβストランドD配列として、具体的には、例えば配列番号2に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドD配列の一部）、配列番号3に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドD配列）、配列番号4に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドD配列の一部）、配列番号5に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドD配列）等が挙げられる。
【００３０】
なお、配列番号2〜5において、配列番号2及び4のN末端のロイシン残基、及び配列番号3及び5のN末端から4番目アミノ酸であるロイシン残基は、炎症性サイトカイン分泌抑制活性に対して重要である。このため、βストランドD配列を含む場合、このロイシン残基は変異していないことが望ましい。
【００３１】
RANKLタンパク質のβストランドD配列として、好ましくは下記（c）又は（d）のアミノ酸配列が挙げられる：
（c）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（d）配列番号2〜5のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸（好ましくは1個のアミノ酸）が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【００３２】
上記（d）において、複数個とは、例えば2〜3個であり、好ましくは2個である。
【００３３】
本発明のオリゴペプチドは、より確実に（例えば、「より多くの細胞種において」、「より多くのToll様受容体を介した炎症反応に対して」、「より強く」等）所望の活性（細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性）を発揮できるという観点から、上記DEループ配列のC末端側に隣接してRANKLタンパク質のβストランドE配列を含むことが好ましい。「C末端側に隣接して」とは、上記DEループ配列のC末端のアミノ酸と上記βストランドE配列のN末端のアミノ酸とがペプチド結合により連結していることを示す。
【００３４】
RANKLタンパク質のβストランドE配列は、RANKLタンパク質のアミノ酸配列中、βストランドEを形成するアミノ酸配列である限り特に限定されない。該βストランドE配列が由来する生物種は特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類が挙げられる。これらの中でも、好ましくはヒト、サル、マウス、ラット等、より好ましくはヒト、マウス等、よりさらに好ましくはヒトが挙げられる。各生物種のβストランドE配列は公知であり、例えばマウス、ラットの場合は非特許文献1、2等に記載されている。また、ある生物種由来のβストランドE配列が公知でなくとも、公知の情報（例えば非特許文献1、2等）に基づいて、その配列を容易に決定することができる。RANKLタンパク質のβストランドE配列として、具体的には、例えば配列番号6に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドE配列）、配列番号7に示されるアミノ酸配列（マウス由来RANKLタンパク質のβストランドE配列の一部）、配列番号8に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドE配列）、配列番号9に示されるアミノ酸配列（ヒト由来RANKLタンパク質のβストランドE配列の一部）等が挙げられる。
【００３５】
RANKLタンパク質のβストランドE配列として、好ましくは下記（e）又は（f）のアミノ酸配列が挙げられる：
（e）配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（f）配列番号6〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1又は数個のアミノ酸（好ましくは1このアミノ酸）が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【００３６】
上記（f）において、複数個とは、例えば2〜3個であり、好ましくは2個である。
【００３７】
本発明のオリゴペプチドの長さとしては、オリゴペプチドとして一般的な長さである限り特に限定されない。該長さは、例えば5〜50アミノ酸残基、好ましくは5〜40アミノ酸残基、より好ましくは6〜35アミノ酸残基であることができる。
【００３８】
本発明のオリゴペプチドには、細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有する限りにおいて、上記した配列以外の他の配列を含んでいてもよい。他の配列は特に限定されないが、オリゴペプチド全体の親水性となるという観点や、細胞内半減期がより長いという観点等から決定することが望ましい。なお、親水性か否か、及び細胞内半減期については、各種ウェブサイト（例えばエクスパシー（http://web.expasy.org/protparam/））上で行うことができる。エクスパシーを利用する場合、親水性については、「Grand average of hydropathicity」がマイナスの値を示すように配列を設計することが好ましい。
【００３９】
また、本発明のオリゴペプチドを梗塞性疾患の予防又は治療用医薬の有効成分として用いる場合であれば、他の配列として血液脳関門通過を促進することが知られている配列を付加又は挿入したり、血液脳関門通過を促進することが知られている低分子を連結させてもよい（例えば特許文献２、非特許文献３等）。
【００４０】
本発明のオリゴペプチドとして、より確実に（例えば、「より多くの細胞種において」、「より多くのToll様受容体を介した炎症反応に対して」、「より強く」等）所望の活性（細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性）を発揮できるという観点から、好ましくは下記（g）又は（h）のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドが挙げられる：
（g）配列番号10〜14及び22〜24のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（h）配列番号10〜14及び22〜24のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【００４１】
上記（h）において、複数個とは、例えば2〜5個であり、好ましくは2〜3個であり、より好ましくは2個である。
【００４２】
本発明のオリゴペプチドは、細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有する限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
【００４３】
本発明のオリゴペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
【００４４】
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００４５】
さらに、本発明のオリゴペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、なども包含される。
【００４６】
本発明のオリゴペプチドには、直鎖状、分枝状、環状等の種々の形態のものが包含されるが、直鎖状であることが好ましい。また、本発明のオリゴペプチドは、細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有する限りにおいて、公知の手段に従って又は準じて架橋されていてもよい。
【００４７】
本発明のオリゴペプチドは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；  酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；  アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；  カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
【００４８】
本発明のオリゴペプチドは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
【００４９】
本発明のオリゴペプチドは、そのアミノ酸配列に応じて、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。
【００５０】
３．医薬
本発明は、本発明のオリゴペプチドを含有する医薬（本明細書において、「本発明の医薬」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。
【００５１】
本発明の医薬は、例えば梗塞性疾患、骨粗鬆症、敗血症、多発性骨髄腫による骨病変、固形癌転移による骨病変等の予防又は治療に有用である。
【００５２】
本発明において、梗塞性疾患とは、虚血部位が生じることに起因して、該虚血部位周辺の組織の壊死部位が拡大している状態又は拡大した状態を意味する。虚血部位が生じる原因としては、例えば、血栓や塞栓等が血管に詰まることにより生じる血管閉塞が挙げられる。血管閉塞の原因としては、例えば血栓や塞栓が血管に詰まることや、血管が狭窄することが挙げられる。
【００５３】
具体的な梗塞性疾患としては、例えば、脳梗塞、心筋梗塞、肺梗塞、腎梗塞、下肢急性動脈閉塞症、クモ膜下出血後の血管攣縮による脳梗塞、脾臓における梗塞、肝臓における梗塞、腸管における梗塞、睾丸における梗塞、及び卵巣における梗塞等が挙げられ、好ましくは脳梗塞、心筋梗塞、肺梗塞、腎梗塞、下肢急性動脈閉塞症、クモ膜下出血後の血管攣縮による脳梗塞、脾臓における梗塞が挙げられ、より好ましくは脳梗塞及び心筋梗塞が挙げられ、よりさらに好ましくは脳梗塞が挙げられる。
【００５４】
本発明において、梗塞性疾患の予防または治療とは、虚血部位発生の前後に本発明の医薬を投与することにより、虚血部位周辺に生じる壊死部位の拡大が抑制されることを意味する。
【００５５】
本発明において、骨粗鬆症とは、骨密度が低下した状態を意味する。本発明の医薬が予防又は治療対象とする骨粗鬆症としては、梗塞性疾患発症に伴って発症する骨粗鬆症が好ましい。
【００５６】
本発明の医薬は、本発明のオリゴペプチドそのものであることもできるし、本発明のオリゴペプチド以外の成分（以下、単に「添加剤」と表記することもある）を含む組成物であることができる。添加剤としては、薬学的に許容される成分であれば特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、及びキレート剤等が挙げられる。本発明の医薬が添加剤を含む場合は、剤形に応じた慣用の方法に従って添加剤を用いることにより、本発明の医薬を製造することができる。
【００５７】
本発明の医薬は、任意の剤形、例えば錠剤、丸剤、散剤、液剤、注射剤、懸濁剤、乳剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等であることができるが、好ましくは注射剤である。
【００５８】
本発明の医薬の投与対象は、梗塞性疾患、骨粗鬆症、若しくは敗血症の患者、又は梗塞性疾患、骨粗鬆症、若しくは敗血症を発症する可能性がある被検体である。梗塞性疾患、骨粗鬆症、若しくは敗血症の患者とは、前述の梗塞性疾患、骨粗鬆症、若しくは敗血症を発症した患者である。梗塞性疾患、骨粗鬆症、若しくは敗血症を発症する可能性がある被検体とは、前述の梗塞性疾患、骨粗鬆症、若しくは敗血症の前兆症状が認められ、梗塞性疾患、骨粗鬆症、若しくは敗血症を発症する可能性があると診断された被検体である。
【００５９】
本発明の医薬の投与経路としては、例えば経口投与、非経口投与等が挙げられる。より具体的な投与経路としては、皮下投与、経静脈投与、経動脈投与、皮内投与、筋肉内投与、骨内投与、心臓内投与、脳室内投与、クモ膜下投与、及び腹腔内投与が挙げられる。予防又は治療対象が梗塞性疾患である場合は、梗塞性疾患を発症している臓器への投与であってもよい。
【００６０】
本発明の医薬中の、本発明のオリゴペプチドの含有量としては、梗塞性疾患、骨粗鬆症、若しくは敗血症に対する治療効果を発揮できる限りにおいて特に限定されない。例えば0.01〜80重量％、好ましくは1〜50重量％であることができる。
【００６１】
本発明の医薬の投与形態及び有効な投与量は、投与対象、投与経路、剤形、患者の状態、及び医師の判断などに左右されるものであり、限定はされないが、例えば、体重60 kgの成人に対して、1回当たり、1 ng〜100 mgを投与することができる。
【００６２】
なお、梗塞性疾患の治療に用いる場合の投与形態としては、虚血部位の発生後、複数回、例えば1〜数十時間毎に投与することが好ましい。本発明の医薬は、虚血部位の発生後3時間以上経過した後に第1回目の投与を行っても梗塞性疾患治療効果を発揮できる点で優れている。したがって、梗塞性疾患の治療に用いる場合、本発明の医薬は、虚血部位の発生直後、1時間以上経過後、3時間以上経過後、4時間以上経過後、又は6時間以上経過後に第1回目の投与を行うように用いられることができる。この際、投与タイミングの上限は、特に制限されないが、虚血部位の発生から例えば10時間、好ましくは8時間、より好ましくは6時間である。
【００６３】
本発明の医薬を梗塞性疾患の予防又は治療に用いる場合は、梗塞性疾患の他の予防又は治療薬と併用してもよい。他の予防又は治療薬としては、例えば、アルテプラーゼ、エダラボン、ヘパリン、低分子ヘパリン、オザグレルナトリウム、アルガトロバン、アスピリン、ブラザキサ、ワルファリン、グリセロール、マンニトール、クロピドグレル、及びシロスタゾール等が挙げられる。他の予防又は治療用医薬は１種又は２種以上を組み併せて用いてもよい。また、その他の疾患の予防又は治療に用いる場合であっても、適切な医薬と併用することができる。
【実施例】
【００６４】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００６５】
実施例１：オリゴペプチドの合成
表１に示すアミノ酸配列のオリゴペプチドをILS株式会社に委託して合成した。HPLC及びMSにより、所望の配列のオリゴペプチドが高純度で合成できたことを確認した。以下、これらのペプチドを総称して「RANKLペプチド」と総称することもある。なお、MHP1のアミノ酸配列は配列番号10に、MHP2のアミノ酸配列は配列番号11に、MHP4のアミノ酸配列は配列番号12に、MHP5のアミノ酸配列は配列番号13に、MHP6のアミノ酸配列は配列番号14に、MHP3のアミノ酸配列は配列番号21に、MHP12のアミノ酸配列は配列番号22に、MHP13のアミノ酸配列は配列番号23に、MHP17のアミノ酸配列は配列番号24に示される配列である。【００６６】
【表１】
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【００６７】
実施例２：RANKLペプチドによる炎症性サイトカインの分泌抑制（ミクログリア細胞）
炎症反応を惹起するリポ多糖（LPS）によってミクログリア細胞から分泌される炎症性サイトカインの量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。【００６８】
MHP1又はMHP2（終濃度50又は100μg/ml）、及びLPS（終濃度2 ng/ml）を含むDMEM培地（＋4％  FBS）中で、MG6細胞（マウス由来ミクログリア細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-6及びTNFαの濃度をELISA法で測定した。なお、本願実施例において、ELISA法は、キット（Quantikine ELISA Mouse TNF-a又はQuantikine ELISA Mouse IL-6、R&D Systems社製）を用いて行った。結果を図１（IL-6）及び図２（TNFα）に示す。【００６９】
図１及び図２より、LPSによる炎症性サイトカイン（IL-6及びTNFα）分泌量増加（左から1つ目のカラムと2つ目のカラムとの比較）が、MHP1及びMHP2によって抑制されることが示された（左から2つ目のカラムと、3〜6つ目のカラムとの比較）。【００７０】
同様の試験をMHP3〜5、12、13及び17についても行ったところ、MHP3はMG6細胞に対する炎症性サイトカインの分泌抑制活性が認められなかったが、MHP4、5、12、13及び17は、MHP1及びMHP2と同様に、炎症性サイトカインの分泌抑制活性を示した。【００７１】
実施例３：RANKLペプチドによる炎症性サイトカインの分泌抑制（マクロファージ細胞）
LPSによってマクロファージ細胞から分泌される炎症性サイトカインの量に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。【００７２】
MHP1（終濃度30、50、又は100μg/ml）、及びLPS（終濃度2 ng/ml）を含むDMEM培地（＋4％  FBS）中で、RAW264.7細胞（マウス由来マクロファージ細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-6及びTNFαの濃度をELISA法で測定した。結果を図３（IL-6）及び図４（TNFα）に示す。【００７３】
図３及び図４より、LPSによる炎症性サイトカイン（IL-6及びTNFα）分泌量増加（左から1つ目のカラムと2つ目のカラムとの比較）が、MHP1によって抑制されることが示された（左から2つ目のカラムと、3〜5つ目のカラムとの比較）。【００７４】
実施例４：RANKLペプチドの神経細胞保護効果（神経細胞−グリア細胞混合培養系）  神経細胞−グリア細胞混合培養系において、LPSによる神経細胞死に対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。【００７５】
受精後21日目（胎生21日目）のマウス胎児から神経組織（神経細胞及びグリア細胞の混合状態）を取り出し、Neurobasal培地（＋B-27、＋5％HS）で9日間培養した後、3群（A〜C群）に分け、以下の処理を行った。【００７６】
＜A群＞
培地をMHP1（終濃度1、10、30、又は50μg/ml）を含む培地（Neurobasal A/N2 supplement）に交換して24時間培養した後、培地にLPS（終濃度10μg/ml）を添加し、さらに24時間培養した。培養後、培地中のTNFαの濃度をELISA法で測定した。結果を図５に示す。【００７７】
＜B群＞
培地をMHP1（終濃度50μg/ml）を含む培地（Neurobasal A/N2 supplement）に交換して24時間培養した後、培地にLPS（終濃度10μg/ml）を添加し、さらに5日間培養した。培養後、神経細胞マーカーであるMAP2に対する抗体（Sigma-Aldrich, M4403）を一次抗体として用いて、定法に従って免疫染色した（一次抗体：1/1000希釈、二次抗体（Invitrogen社製 A 11001）：1/1000希釈）。染色像を観察し、染色された領域（すなわち生存神経細胞が占める領域）の面積が、培養ディッシュ面積に対して占める割合を算出した。結果を図６に示す。【００７８】
＜C群＞
培地をMHP1（終濃度30、又は50μg/ml）、及びLPS（終濃度10μg/ml）を含む培地（Neurobasal A/N2 supplement）に交換して24時間培養した。培養後、培地中のTNFαの濃度をELISA法で測定した。結果を図７に示す。【００７９】
図５及び７より、LPSを添加する前にMHP1を添加（前処理）した場合（A群）、及びLPSの添加と同時にMHP1を添加（同時処理）した場合（C群）のいずれであっても、LPSによる炎症性サイトカイン（TNFα）分泌量増加（左から1つ目のバーと2つ目のバーとの比較）が、MHP1によって抑制されることが示された（左から2つ目のバーと、これよりも右側のバーとの比較）。また、図６より、LPSによる神経細胞死（左から1つ目のバーと2つ目のバーとの比較）が、MHP1によって抑制されることが示された（左から2つ目のバーと、3つ目のバーとの比較）。【００８０】
実施例５：RANKLペプチドのM1シフト抑制
ミクログリア細胞は、炎症性サイトカイン等を産生する神経傷害性のM1と、抗炎症性サイトカイン等を産生する神経保護性のM2の2つの状態が存在する。ミクログリア細胞の状態は、LPSの刺激により、M1（神経傷害性）にシフトすることが知られている。このM1シフトに対して、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。【００８１】
MHP1（終濃度100μg/ml）又はRANKLタンパク質（Recombinant Murin sRANKL Ligand（Cat No.315-11）：PEPROTECH社）（終濃度10 ng/ml）、及びLPS（終濃度2 ng/ml）を含むDMEM培地（＋4％  FBS）中で、MG6細胞（マウス由来ミクログリア細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、細胞をPBSで洗浄し、FcレセプターのブロッキングをマウスIgGにて行った。その後F4/80-FITC（ミクログリアマーカー抗体）およびCD206-APC（M2マーカー抗体）を添加し、4℃で30分間、暗所にて反応させた。反応後、細胞をPBSで洗浄し、FACS解析（BD Biosciences社製、FACSCanto II）により、ミクログリアマーカー陽性且つM2マーカー陽性（M2状態）細胞の割合、及びミクログリアマーカー陽性且つM2マーカー陰性（M1状態）細胞の割合を測定した。結果を図８に示す。【００８２】
図８より、LPSによって引き起こされるM1シフト（左から1つ目のカラムと2つ目のカラムとの比較）が、MHP1によって抑制されることが示された（左から2つ目のカラムと4つ目のカラムとの比較）。【００８３】
実施例６：RANKLペプチドの抗炎症作用のRANK依存性
RANKLペプチドによる炎症性サイトカインの分泌抑制（実施例２等）が、RANK非存在下でも起こるかどうか調べた。具体的には次のように行った。【００８４】
RAW264.7細胞をDMEM培地（+10%FBS）に懸濁し、24ウェルプレートに蒔いて、37℃、CO2濃度5％にて培養した。血清を含まないDMEM培地100μlに、RANKに対するsiRNA（配列番号17に示される配列と配列番号18に示される配列との2本鎖、GeneDesign社製） 37.5ng（終濃度5nM）又はcontrol siRNA（配列番号19に示される配列と配列番号20に示される配列との2本鎖、GeneDesign社製） 37.5ng（終濃度5nM）、及びHiPerFect Transfection Reagent（QIAGEN） 3μl添加し、室温にて10分間放置した。これを、RAW264.7細胞培養培地に添加し、37℃、CO2濃度5％にて、24時間培養後、細胞を回収した。この細胞から、定法に従ってタンパク質抽出液を得て、該抽出液中のRANKを、ウェスタンブロッティング法（抗RANK抗体：R&D Systems社製、anti-mRANK(Cat.No.AF692)、希釈濃度1/100により検出した。結果を図９に示す。図９より、RANKに対するsiRNAにより、RANKがノックダウンされていることが確認された（レーン2とレーン3との比較）。【００８５】
RANKノックダウン細胞を用いて、実施例3と同様にMHP1及びLPSを作用させ、培地中のIL-6及びTNFαの濃度をELISA法で測定した。結果を図１０及び図１１に示す。【００８６】
図１０及び１１より、control siRNA導入細胞ではMHP1による炎症性サイトカイン（IL-6及びTNFα）の分泌抑制が起こっていたのに対して（左から2つ目のカラムと3つ目のカラムとの比較）、RANKに対するsiRNA導入細胞（RANKノックダウン細胞）ではMHP1による炎症性サイトカインの分泌抑制が起こらなかった（左から6つ目のカラムと7つ目のカラムとの比較）。このことからRANKLペプチドによる抗炎症性作用はRANK依存性であることが示唆された。【００８７】
実施例７：RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響の解析1 
近年、RANKLタンパク質をマウスに投与することによって破骨細胞の活性化を引き起こされることが報告されている。そこで、RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響を調べた。具体的には次のように行った。  RAW264.7細胞を培養している培地（DMEM培地（＋4％  FBS））に、MHP1（終濃度100μg/ml）又はRANKLタンパク質（終濃度10 ng/ml）を添加し、10分後及び3日後に細胞を回収した。【００８８】
10分後に回収したサンプルについては、Nuclear extract Kit（Active Motif）を用いて細胞の核タンパクを抽出し、TransAM NFkB p65 kit（Active Motif）によりNFκB（p65）活性化の程度を測定した。一方で、3日後に回収したサンプルについては、Realtime RT-PCRにて、NFATc1及びACP5のmRNAの発現量を解析した。結果を図１２に示す。【００８９】
図１２より、MHP1はNFκBを軽度活性化するが、 破骨細胞関連mRNAの発現を促進しないことが示された。【００９０】
実施例８：RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響の解析2
破骨細胞培養キットV-2（OSC33、コスモ・バイオ社製）を使用した。キットの使用方法に従って、破骨前駆細胞を、A群及びB群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）存在下で、C群及びD群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）及びMHP1（終濃度30、50、又は100μg/ml）存在下で、培養開始した。その後、培養開始24時間後から7日間は、A群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）存在下で、B群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）及びRANKLタンパク質（終濃度50 ng/ml）存在下で、C群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）及びMHP1（終濃度30、50、又は100μg/ml）存在下で、D群はM-CSF（終濃度50 ng/ml）、RANKLタンパク質（終濃度50 ng/ml）、及びMHP1（終濃度30、50、又は100μg/ml）存在下で、培養した。培養後、細胞を定法に従ってTRAP染色及び核染色した。結果を図１３に示す。A群、B群、及びD群のTRAP染色像を図１３（ａ）に、C群のTRAP染色像及び核染色像を図１３（ｂ）に示す。【００９１】
図１３（ａ）より、RANKLによって促進される破骨細胞の分化が、MHP1により抑制されることが示された（B群とC群との比較）。図１３（ｂ）より、MHP1を添加しても、破骨細胞の分化は起こらないことが示された。【００９２】
実施例９：RANKLペプチドによる炎症性サイトカインの分泌抑制（ヒトマクロファージ細胞）
RANKLペプチドによる炎症性サイトカインの分泌抑制（実施例２等）が、ヒト細胞でも起こるかどうか調べた。具体的には次のように行った。【００９３】
MHP6（ヒト由来：終濃度10、30、50、又は100μg/ml）、又はMHP1（マウス由来：終濃度100μg/ml）、及びLPS（終濃度2 ng/ml）を含むDMEM培地（＋4％  FBS）中で、THP1細胞（ヒト由来マクロファージ細胞株）を、24時間、定法に従って培養した。培養後、培地中のIL-6の濃度をELISA法で測定した。結果を図１４に示す。【００９４】
図１４より、ヒト由来であるMHP6及びマウス由来であるMHP1のいずれも、ヒト由来マクロファージ細胞に対して炎症性サイトカイン分泌抑制作用を発揮することが示された。【００９５】
実施例１０：RANKLペプチドによる壊死抑制
脳虚血後の壊死部位のサイズに対する、RANKLペプチドが与える影響を調べた。具体的には次のように行った。【００９６】
野生型マウス（C57BL6/J）に対して、塞栓糸を用いて人為的に脳虚血部位を発生させた。具体的には、右外頸動脈からナイロン糸を頭蓋内内頚動脈に挿入し右中大脳動脈を一過性に閉塞した。虚血部位発生から40分後に塞栓糸を取り除き、血液を再灌流させた。虚血部位発生から4時間後、Neurological severe score 1-2のマウスに、2μlのMHP1溶液（0.625μg/2μl、溶媒は人工脳脊髄液（aCSF））、又は2μlのaCSFを、注射により脳室内に投与した。また、一方で、既知の脳保護剤であるエダラボンを投与した群も作製した（aCSF脳室内投与＋エダラボン3 mg/kg i.p. 12時間おきに投与）。虚血部位発生から72時間後に脳を取り出し、bregmaから前後に1.4、0.7、及び0 mmの位置における、左脳部分及び右脳部分を含む脳切片を作成し、該切片をcresyl violetで染色した。cresyl violet染色部位の面積を脳梗塞面積（壊死部位）とし、下記式により脳梗塞面積の割合を求めた。この結果を図１５に示す。【００９７】
【数１】
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【００９８】
図１５より、MHP1によって、脳虚血後に生じる壊死を抑制できることが示された（Control群とMHP1群との比較）。また、この抑制の程度は、1回のみの投与であるにも関わらず、エダラボン投与の場合よりも高いことが示された（MHP1群とEdaravone群と  さらに、bregmaから0.7 mmの位置において、脳梗塞半球のF4/80陽性細胞（活性化マクロファージ・ミクログリア）の割合（／中大脳動脈領域）、及び該細胞数を測定した。結果を図１６に示す。図１６（ａ）に、脳梗塞半球のF4/80陽性細胞（活性化マクロファージ・ミクログリア）の割合（／中大脳動脈領域）の測定結果を示し、図１６（ｂ）に該細胞数の測定結果を示す。【００９９】
図１６より、MHP1によって、活性化マクロファージ・ミクログリアの発現が抑制されることが示された。【０１００】
実施例１１：RANKLペプチドによる敗血症予防又は治療効果
RANKLペプチドの敗血症予防／治療効果を調べた。具体的には次のように行った。【０１０１】
野生型マウス（Balb/c、雌5週齢）に対して、LPS（10 mg/kg）を腹腔内投与、又はLPS（10 mg/kg）及びMHP-2（5 mg/kg又は10 mg/kg）を腹腔内投与した。投与後、マウスの生存率を測定した。この結果を図１７に示す。【０１０２】
図１７より、LPSのみを投与した群（△）は3匹中2匹が死亡したのに対して、LPSと共にMHP2を投与した群（○及び×）は死亡例が無かった。このことから、RANKLペプチドに敗血症予防／治療効果があることが示された。【０１０３】
実施例１２：RANKLペプチドの安定性
RANKLペプチドの安定性を調べた。具体的には次のように行った。【０１０４】
MHP1を2 mg/mlの濃度で水に溶解し、4℃で208日間保管した。その後、MHP1の終濃度を100μg/mlとする以外は実施例2と同様にして、このMHP1の炎症性サイトカイン分泌抑制効果を調べた。結果を図１８に示す。【０１０５】
図１８より、MHP1は長期間保存後であっても、保存前と同様に炎症性サイトカイン分泌抑制効果を発揮することが示された。このことから、MHP1の安定性が高いことが示された。【０１０６】
実施例１３：RANKLペプチドとRANKL全長タンパク質との比較
MHP1の終濃度を100μg/mlとし、且つ比較対象としてRANKL全長タンパク質を終濃度10 ng/ml又は100 ng/mlで用いる以外は実施例2と同様にして、炎症性サイトカイン分泌抑制効果を調べた。RANKL全長タンパク質の終濃度は、既報の文献（J Immunol 177(6):3799−3805.)、及びShimamura M, et al. (2014) OPG/RANKL/RANK axis is a critical inflammatory signaling system in ischemic brain in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 111(22):8191−8196.）に基づいて算出された、その効果が効率的に発揮される濃度である。結果を図１９に示す。【０１０７】
図１９より、本発明のRANKLペプチドは、RANKL全長タンパク質よりも高い炎症性サイトカイン分泌抑制効果を有することが示された。【０１０８】
実施例１４：TLR2による炎症性サイトカイン分泌に対する、RANKLペプチドの効果
LPSに代えて、TLR2/6のリガンドであるFSL-1を用いる以外は実施例2と同様にして、炎症性サイトカイン分泌抑制効果を調べた。結果を図２０に示す。【０１０９】
図２０より、本発明のRANKLペプチドは、TLR2による炎症性サイトカイン分泌に対しても、炎症性サイトカイン分泌抑制効果を有することが示された。【０１１０】
実施例１５：RANKLペプチドの静脈投与後の動態解析
実施例１０と同様にして、脳梗塞モデルを作成した。一方で、FITCで標識したMHP1 200μgを生理食塩水 200 μlに溶解して投与液を得た。脳梗塞モデル作成から４時間後に、投与液を頸静脈より静注した。投与から5分後と1時間後にsacrificeし、定法に従って脳組織を作成した。脳組織を
抗FITC抗体(Abcam）にて免疫染色し、共焦点顕微鏡で観察した。結果を図２１に示す。【０１１１】
図２１より、本発明のRANKLペプチドは、静脈投与後、脳実質内に浸潤していることが示された。【０１１２】
実施例１６：RANKLペプチドの静脈投与による壊死抑制
実施例１０と同様にして、脳梗塞モデルを作成した。脳梗塞モデル作成4時間後、Neurological severity scoreが1-2のマウスに、300 μg/150 μlのMHP1投与液を頸静脈より投与した。その後、Alzet pumpで336 μgを21時間、持続皮下注投与した。脳梗塞モデル作成から24時間後及び48時間後にNeurological severity scoreを測定した。さらに、脳梗塞モデル作成から48時間後にsacrificeし、実施例１０と同様にして脳梗塞面積の割合を求めた。脳梗塞面積の割合を図２２に示し、Neurological severity scoreを図２３に示す。【０１１３】
図２２及び２３より、MHP1の静脈投与によって、脳虚血後に生じる壊死を抑制でき、さらには脳梗塞症状を緩和できることが示された。【０１１４】
実施例１７：RANKLペプチドの破骨細胞に対する影響の解析3
実施例１０と同様にして、脳梗塞モデルを作成した。脳梗塞モデル作成4時間後、300 μg/150 μlのMHP1投与液を頸静脈より投与した。その後、Alzet pumpで336 μgを21時間、持続皮下注投与した。脳梗塞モデル作成から48時間後に、左手（麻痺側）の橈骨遠位部をTRAP染色し、得られた染色像に基づいて骨領域に占める染色領域（破骨細胞領域）の割合を算出した。結果を図２４に示す。【０１１５】
図２４に示されるように、脳梗塞で、骨の稜線上のTRAP陽性（赤い細胞）の破骨細胞が増加するが、MHP1投与マウスでは、増加が抑制されていた。【０１１６】
実施例１８：脳梗塞6時間目のRANKLペプチド投与による壊死抑制
脳梗塞モデル作成4時間後又は6時間後にMHP1の投与を開始する以外は、実施例１６と同様にして試験した。Neurological severity score及び脳梗塞面積の割合を図２５に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年5月18日(2017.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ＲＡＮＫＬタンパク質のＤＥループ配列を含み、
２）該ＤＥループ配列のＮ末端側に隣接してＲＡＮＫＬタンパク質のβストランドＤ配列を含み、
３）ＲＡＮＫＬタンパク質のＣＤループ配列を含まず、
４）該ＤＥループ配列が（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列であり、
５）該βストランドＤ配列が（ｃ）配列番号２〜５のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は（ｄ）配列番号２〜５のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列であり、且つ
細胞からの炎症性サイトカイン分泌抑制活性を有する、オリゴペプチド。
【請求項２】
前記（ｄ）のアミノ酸配列において、配列番号２及び４のＮ末端のロイシン残基並びに配列番号３及び５のＮ末端から４番目のアミノ酸であるロイシン残基は変異していない、請求項１に記載のオリゴペプチド。
【請求項３】
前記βストランドＤ配列が前記（ｃ）のアミノ酸配列である、請求項１又は２に記載のオリゴペプチド。
【請求項４】
前記ＤＥループ配列のＣ末端側に隣接してＲＡＮＫＬタンパク質のβストランドＥ配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴペプチド。
【請求項５】
前記βストランドＥ配列が下記（ｅ）又は（ｆ）のアミノ酸配列である、請求項４に記載のオリゴペプチド：
（ｅ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（ｆ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【請求項６】
下記（ｇ）又は（ｈ）のアミノ酸配列からなる、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴペプチド：
（ｇ）配列番号１０〜１４、２２及び２３のいずれかに示されるアミノ酸配列、又は
（ｈ）配列番号１０〜１４、２２及び２３のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して１〜２個のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列。
【請求項７】
前記（ｈ）のアミノ酸配列において、置換、欠失、付加又は挿入されているアミノ酸の数が１個である、請求項６に記載のオリゴペプチド。
【請求項８】
前記（ｇ）のアミノ酸配列からなる、請求項３に記載のオリゴペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴペプチドを含有する、医薬。
【請求項１０】
梗塞性疾患、骨粗鬆症、敗血症、多発性骨髄腫による骨病変、及び固形癌転移による骨病変等からなる群より選択される少なくとも１種の疾患の予防又は治療に用いられる、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
梗塞性疾患の予防又は治療に用いられる、請求項９に記載の医薬。
【請求項１２】
請求項３に記載のオリゴペプチドを含有する、梗塞性疾患の予防又は治療用医薬。
【国際調査報告】
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