(57)【要約】  ＧＧＴに認識されて生理活性物質を速やかに遊離することができるグルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩とポリエチレングリコールセグメントと疎水性基を有するポリアミノ酸セグメントが連結したブロック共重合体を組み合せた組成物とすることで、ＧＧＴ認識プロドラッグであるグルタミン酸誘導体の有効性をより一層発揮させることができる好適な医薬製剤を提供することができる。特に、生理活性物質として抗腫瘍性化合物を用いたグルタミン酸誘導体による該組成物は、グルタミン酸誘導体を腫瘍患部に効果的に集積させることができ、腫瘍に対してより優れた効果を示すとともに、ＧＧＴの発現率の低い骨髄組織では生理活性物質の遊離を抑制できるため、抗腫瘍性薬剤の使用において問題となる骨髄抑制などの副作用を回避できる。【選択図】図１２
2017086392.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ｉ）  一般式（１）
【化１】
2017086392.tif 000031
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、置換基を有していても良いアルキル基及び置換基を有していても良いアルコキシカルボニル基からなる群から選択される基を示し、Ｒ３は、水素原子又は置換基を有していても良いアルキル基を示し、Ａ１及びＡ２は、Ｃ−Ｒ６、Ｃ−Ｒ７及び窒素原子からなる群から選択される基であり、該Ｒ６は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、置換基を有していても良いアルキル基及び置換基を有していても良いアルコキシ基からなる群から選択される１種以上の基を示し、該Ｒ７は下記一般式（２）
【化２】
2017086392.tif 000032
［式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子又は置換基を有していても良いアルキル基を示し、Ｌは酸素原子、オキシカルボニル基及び結合からなる群から選択される結合基を示し、Ｘは脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基、アミノ基及びカルボキシ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質の結合残基を示し、
（ａ）前記Ｘが脂肪族性水酸基及びアミノ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質の結合残基である場合、前記Ｌはオキシカルボニル基であり、
（ｂ）前記Ｘがカルボキシ基を有する生理活性物質の結合残基である場合、前記Ｌは酸素原子であり、
（ｃ）前記Ｘが芳香族性水酸基を有する生理活性物質の結合残基である場合、前記Ｌは結合又はオキシカルボニル基である。］で表され、
ここで、前記Ａ１及び前記Ａ２は何れか一方が前記Ｃ−Ｒ７であって、他方が前記Ｃ−Ｒ６又は窒素原子であり、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、それぞれ独立して前記Ｃ−Ｒ６又は窒素原子である。］で表されるグルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩、
並びに（ＩＩ）  ポリエチレングリコールセグメント及び疎水性官能基を有するポリアミノ酸セグメントが連結したブロック共重合体、
を含有する組成物。
【請求項２】
前記ブロック共重合体（ＩＩ）における前記ポリアミノ酸が、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸及びポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）共重合体からなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ブロック共重合体（ＩＩ）における前記疎水性官能基が、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキル基、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ２〜Ｃ３０）アルケニル基、置換基を有していても良い直鎖状または分岐鎖状の炭素数（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキル基、置換基を有していても良いアリール基、置換基を有していても良い複素環アリール基及び生理活性物質の結合残基からなる群から選択される１種以上の基である請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ブロック共重合体（ＩＩ）におけるポリエチレングリコールセグメントの重量平均分子量が１キロダルトン〜５００キロダルトンであり、前記ポリアミノ酸の重合数が２〜２００である請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ブロック共重合体（ＩＩ）が、一般式（３）
【化３】
2017086392.tif 000033
［式中、Ｒ１１は水素原子若しくは直鎖状又は分岐鎖状の（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル基を示し、Ｒ１２は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｒ１３はメチレン基及び／又はエチレン基を示し、Ｒ１４は水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基及び（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１種を示し、
Ｒ１５は置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキル基、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ２〜Ｃ３０）アルケニル基、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキル基、置換基を有していても良いアリール基、置換基を有していても良い複素環アリール基、並びに生理活性物質の結合残基からなる群から選択される１種類以上の基を示し、
Ｒ１６は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）を示し、ここでＲ１７及びＲ１８は、同一でも異なっていても良く、直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ３〜Ｃ８）アルキル基若しくは３級アミノ基で置換されていても良い（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を示し、
Ｌ１は結合基又は結合を示し、ｔは２０〜１１５００の整数を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅはそれぞれ独立して０〜１００の整数を示し、ポリアミノ酸セグメントの総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）は１０〜１００の整数を示し、（ａ＋ｂ）は３〜１００の整数を示し、Ｒ１５及びＲ１６が結合した各構成単位、並びに側鎖カルボキシ基の分子内環化型構成単位は、それぞれ独立してランダムに配列したセグメント構造である。］で示されるブロック共重合体である、請求項１〜４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ブロック共重合体（ＩＩ）における前記疎水性官能基が、疎水性官能基で修飾されたアミノ酸誘導体の結合残基、ステロール誘導体の結合残基、置換基を有していても良い（Ｃ７〜Ｃ２０）アラルキル基、アントラサイクリン系抗生物質、カンプトテシン誘導体及び核酸代謝拮抗剤からなる群から選択される１種以上の基である請求項１〜５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記一般式（１）で表されるグルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）において、Ｒ７は下記一般式（４）
【化４】
2017086392.tif 000034
［式中、Ｒ４及びＲ５は前記と同義であり、Ｘは脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基及びアミノ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質の結合残基である。］である、請求項１〜６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
Ｘで示される前記生理活性物質の結合残基における該生理活性物質が、カンプトテシン及びその誘導体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
Ｘで示される前記生理活性物質の結合残基における該生理活性物質が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン及びアムルビシンからなる群から選択される生理活性物質である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｘで示される前記生理活性物質の結合残基における該生理活性物質が、ゲムシタビン、エチニルシチジン、シタラビン及びＣＮＤＡＣ（２’−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン）からなる群から選択される生理活性物質である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｒ７は下記一般式（５）
【化５】
2017086392.tif 000035
［式中、Ｒ４及びＲ５は前記と同義であり、Ｘは芳香族性水酸基を有する生理活性物質の結合残基である。］で表される請求項１〜６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｘで示される前記生理活性物質の結合残基における該生理活性物質が、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、ノギテカン及びその誘導体からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記グルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）及び前記ブロック共重合体（ＩＩ）が、質量比において（Ｉ）：（ＩＩ）＝１：０．５〜５０である、請求項１〜１２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記グルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）が、前記ブロック共重合体（ＩＩ）と会合している、請求項１〜１３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１４の何れか一項に記載の組成物を含有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なグルタミン酸誘導体であって、標的部位で酵素選択的に活性化される新規化合物とブロック共重合体を含む組成物及びその用途に関するものである。より詳細には、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ，  Ｅ．Ｃ．  ２．３．２．２）によって活性化されるプロドラッグである新規グルタミン酸誘導体と親水性セグメント及び疎水性セグメントを有するブロック共重合体を含有する組成物及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロドラッグは、生体内で代謝された後に活性型の薬剤に変化するものである。薬剤をプロドラッグ化する目的としては、安定性の改善、溶解性の改善、吸収性の改善、副作用の軽減、作用時間の改善（作用の持続化）、特定部位での作用発現などが挙げられる。これまで、幾つかの薬剤がプロドラッグとして開発されてきており、様々な疾病に対する治療用医薬品として臨床使用されている。【０００３】
がんの化学療法に用いられる抗腫瘍剤の多くは、がん細胞のみならず正常細胞にも細胞増殖阻害作用を示すため、このことに起因する副作用が問題となっている。このため、抗腫瘍剤をがん細胞に対して選択的に作用させることができれば、副作用が軽減した抗腫瘍剤を提供することができる。そこで、抗腫瘍剤をプロドラッグ化して、腫瘍組織などの標的部位で選択的に活性化することができれば、副作用が軽減されると同時に治療効果を大きく向上させることが期待できる。【０００４】
標的部位で選択的に活性化合物に変換させる方法として、標的組織に高発現している酵素を利用する方法が考えられている。標的部位の酵素特異的反応を利用した薬剤のプロドラッグ化の手法として、酵素認識部位と薬剤間に自己開裂型リンカーを介在させる手法が知られている（非特許文献１）。これは酵素特異的反応により酵素認識部位が開裂し、それにより生じたリンカーと薬剤の結合体において、リンカー部が自己開裂することにより薬剤を遊離させることを可能としている。【０００５】
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）は、グルタチオン（γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）及びグルタチオン抱合体の代謝分解の初発段階をつかさどる酵素で、高等動植物から微生物までほとんどあらゆる生物に普遍的に存在することが知られている（非特許文献２、非特許文献３、及び非特許文献４）。ＧＧＴは、グルタチオンのγ−グルタミル結合を加水分解する酵素であり、ＧｌｕとＣｙｓ−Ｇｌｙを生成する一方、各種アミノ酸やジペプチド、アミン類を受容体として、γ−グルタミル転移生成物を与える。【０００６】
ＧＧＴは、多種多様ながん細胞で高発現していることが知られており、がん化学療法の薬物ターゲットとしてＧＧＴを指摘する報告もある（非特許文献５）。
特許文献１には、抗腫瘍剤をγ−グルタミル化した化合物が開示されている。自己開裂リンカーを利用したプロドラッグとして、トリプシンにより切断することが可能であるプロドラッグが挙げられている（非特許文献１）。しかしながら、ＧＧＴに認識され、自己開裂リンカーを利用することにより薬剤放出を促進させるプロドラッグについては述べられていない。また、非特許文献６には、抗腫瘍剤をグルタミル化した化合物が挙げられており、酵素に依存した細胞毒性が示されている。しかしながら、非常に高い酵素濃度において、薬理活性型化合物を解離されるものであり、生体内環境でプロドラッグとして機能できるものではない。また、非特許文献７には、グルタミン酸γ位に薬剤を結合させた化合物として、適当なリンカーを介したプロドラッグ型化合物が挙げられている。【０００７】
抗腫瘍剤の副作用軽減や治療効果を向上させる手段として、プロドラッグ化以外にも、高分子担体等を用いたＤＤＳ製剤化することにより抗腫瘍剤の薬物動態を変える方法がある。代表的には、ＰＥＧ化やリポソーム製剤化、ミセル製剤化などが知られている。
特許文献２及び３には、ドキソルビシン塩酸塩、イリノテカン塩酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ドセタキセル、インドメタシン等の医薬品を高分子ミセル担体に包含させる製剤について報告している。しかし、ＧＧＴ等の組織選択的活性化を意図したプロドラッグを、更に高分子担体等を用いてＤＤＳ製剤化した事例は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７９８９１８８号明細書
【特許文献２】国際公開第２００７／１２６１１０号
【特許文献３】国際公開第２００７／１３６１３４号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，  ２４，４７９−４８０（１９８１）
【非特許文献２】Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ  ．，  ７２  ，  ２３９  −  ２７８（１９９８）
【非特許文献３】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１３，４００−４１９（１９８５）
【非特許文献４】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１３，４１９−４３７（１９８５）
【非特許文献５】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ７１，  ２３１−２３８（２００６）
【非特許文献６】Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ３２，３７７−３８６（１９９８）
【非特許文献７】Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４９，１３８９−１３９１（２０１３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ＧＧＴによって認識されるプロドラッグは、ＧＧＴ高発現組織において、選択的に活性型化合物を遊離させることができることから、副作用が軽減され、治療効果が向上した医薬品となることが期待できる。しかしながら、医薬品として求められる安定性や効果を十分に発揮するものは得られておらず、医薬品として使用可能なＧＧＴ認識プロドラッグ製剤が望まれている。また、該ＧＧＴ認識プロドラッグの有効性を効率的に発揮させる組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、適当なγ−グルタミル芳香族アミドと生理活性物質を結合させたグルタミン酸誘導体が、生理的環境下において極めて安定である一方、ＧＧＴに認識されると速やかに生理活性物質を遊離させることを見出した。さらに、該ＧＧＴ認識プロドラッグであるグルタミン酸誘導体を、ポリエチレングリコールセグメントと疎水性官能基を有するポリアミノ酸セグメントが連滑したブロック共重合体を組み合わせて組成物とすることで、該ＧＧＴ認識プロドラッグの薬理活性を増強し、且つ、副作用を軽減し得ることを見出した。本発明者はこれらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本願は以下の［１］〜［１５］に示された発明を要旨とする。
［１］  （Ｉ）  一般式（１）
【化１】
2017086392.tif 000003
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、置換基を有していても良いアルキル基及び置換基を有していても良いアルコキシカルボニル基からなる群から選択される基を示し、Ｒ３は、水素原子又は置換基を有していても良いアルキル基を示し、Ａ１及びＡ２は、Ｃ−Ｒ６、Ｃ−Ｒ７及び窒素原子からなる群から選択される基であり、該Ｒ６は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、置換基を有していても良いアルキル基及び置換基を有していても良いアルコキシ基からなる群から選択される１種以上の基を示し、該Ｒ７は下記一般式（２）
【化２】
2017086392.tif 000004
［式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子又は置換基を有していても良いアルキル基を示し、Ｌは酸素原子、オキシカルボニル基及び結合からなる群から選択される結合基を示し、Ｘは脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基、アミノ基及びカルボキシ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質の結合残基を示し、
（ａ）前記Ｘが脂肪族性水酸基及びアミノ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質の結合残基である場合、前記Ｌはオキシカルボニル基であり、
（ｂ）前記Ｘがカルボキシ基を有する生理活性物質の結合残基である場合、前記Ｌは酸素原子であり、
（ｃ）前記Ｘが芳香族性水酸基を有する生理活性物質の結合残基である場合、前記Ｌは結合又はオキシカルボニル基である。］で表され、
ここで、前記Ａ１及び前記Ａ２は何れか一方が前記Ｃ−Ｒ７であって、他方が前記Ｃ−Ｒ６又は窒素原子であり、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、それぞれ独立して前記Ｃ−Ｒ６又は窒素原子である。］で表されるグルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩、
並びに（ＩＩ）  ポリエチレングリコールセグメント及び疎水性官能基を有するポリアミノ酸セグメントが連結したブロック共重合体、
を含有する組成物。
本願は、新規なＧＧＴ認識プロドラックであるグルタミン酸誘導体（Ｉ）を有効成分として、これにブロック共重合体（ＩＩ）を医薬品添加剤として組み合わせた、薬理活性作用を向上すると共に、副作用が低減された有用な組成物に関する発明である。【００１３】
本発明は、以下のブロック共重合体（ＩＩ）を用いることが好ましい。
［２］  前記ブロック共重合体（ＩＩ）における前記ポリアミノ酸がポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸及びポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）共重合体からなる群から選択される１種以上である前記［１］に記載の組成物。
［３］  前記ブロック共重合体（ＩＩ）における前記疎水性官能基が、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキル基、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状または環状の（Ｃ２〜Ｃ３０）アルケニル基、置換基を有していても良い直鎖状または分岐鎖状の炭素数（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキル基、置換基を有していても良いアリール基、置換基を有していても良い複素環アリール基及び生理活性物質の結合残基からなる群から選択される１種以上の基である前記［１］又は［２］に記載の組成物。
［４］  前記ブロック共重合体（ＩＩ）におけるポリエチレングリコールセグメントの重量平均分子量が１キロダルトン〜５００キロダルトンであり、前記ポリアミノ酸の重合数が２〜２００である前記［１］〜［３］の何れか一項に記載の組成物。
［５］  前記ブロック共重合体（ＩＩ）が、一般式（３）
【化３】
2017086392.tif 000005
［式中、Ｒ１１は水素原子若しくは直鎖状又は分岐鎖状の（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル基を示し、Ｒ１２は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｒ１３はメチレン基及び／又はエチレン基を示し、Ｒ１４は水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基及び（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルオキシカルボニル基からなる群から選択され、
Ｒ１５は置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキル基、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ２〜Ｃ３０）アルケニル基、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ７〜Ｃ３０）アラルキル基、置換基を有していても良いアリール基、置換基を有していても良い複素環アリール基、並びに生理活性物質の結合残基からなる群から選択される１種類以上の基を示し、
Ｒ１６は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）を示し、ここでＲ１７及びＲ１８は、同一でも異なっていても良く、直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ３〜Ｃ８）アルキル基若しくは３級アミノ基で置換されていても良い（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基を示し、
Ｌ１は結合基又は結合を示し、ｔは２０〜１１５００の整数を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅはそれぞれ独立して０〜１００の整数を示し、ポリアミノ酸セグメントの総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）は１０〜１００の整数を示し、（ａ＋ｂ）は３〜１００の整数を示し、Ｒ１５及びＲ１６が結合した各構成単位、並びに側鎖カルボキシ基の分子内環化型構成単位は、それぞれ独立してランダムに配列したセグメント構造である。］で示されるブロック共重合体である、前記［１］〜［４］の何れか一項に記載の組成物。
［６］  前記ブロック共重合体（ＩＩ）における疎水性官能基が、疎水性官能基で修飾されたアミノ酸誘導体の結合残基、ステロール誘導体の結合残基、置換基を有していても良い（Ｃ７〜Ｃ２０）アラルキル基、アントラサイクリン系抗生物質、カンプトテシン誘導体及び核酸代謝拮抗剤からなる群から選択される１種以上の基である前記［１］〜［５］の何れか一項に記載の組成物。【００１４】
本発明は、有効成分として以下のグルタミン酸誘導体を用いることが好ましい。
［７］  前記一般式（１）で表されるグルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）において、Ｒ７は下記一般式（４）
【化４】
2017086392.tif 000006
［式中、Ｒ４及びＲ５は前記と同義であり、Ｘは脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基及びアミノ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質の結合残基である。］である、前記［１］〜［６］の何れか一項に記載の組成物。
すなわち、脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基、アミノ基を有する生理活性物質を用いる場合、一般式（２）のＬで示される結合基がオキシカルボニル基を用いることが好ましく、その一態様を示したものである。
［８］  Ｘで示される前記生理活性物質の結合残基における該生理活性物質が、カンプトテシン及びその誘導体である、前記［７］に記載の組成物。
［９］  Ｘで示される前記生理活性物質の結合残基における該生理活性物質が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン及びアムルビシンからなる群から選択される生理活性物質である、前記［７］に記載の組成物。
［１０］  Ｘで示される前記生理活性物質の結合残基における該生理活性物質が、ゲムシタビン、エチニルシチジン、シタラビン及びＣＮＤＡＣ（２’−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン）からなる群から選択される生理活性物質である、前記［７］に記載の組成物。【００１５】
また、芳香族性水酸基を有する生理活性物質を用いる場合、一般式（２）のＬで示される結合基は結合であり、すなわち、結合基を介さずに該生理活性物質を直接的に結合させる態様が好ましく、その一態様を以下のように示すことができる。
［１１］  Ｒ７は下記一般式（５）
【化５】
2017086392.tif 000007
［式中、Ｒ４及びＲ５は前記と同義であり、Ｘは芳香族性水酸基を有する生理活性物質の結合残基である。］で表される前記［１］〜［６］の何れか一項に記載の組成物。
［１２］  Ｘで示される前記生理活性物質の結合残基における該生理活性物質が、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、ノギテカン及びその誘導体からなる群から選択される、前記［１１］に記載の組成物。【００１６】
本発明の組成物のより好ましい態様を以下に示す。
［１３］  前記グルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）及び前記ブロック共重合体（ＩＩ）が、質量比において（Ｉ）：（ＩＩ）＝１：０．５〜５０である、前記［１］〜［１２］の何れか一項に記載の組成物。
［１４］  前記グルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）が、前記ブロック共重合体（ＩＩ）と会合している、前記［１］〜［１３］の何れか一項に記載の組成物。
［１５］  前記［１］〜［１４］の何れか一項に記載の組成物を含有する医薬。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のグルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩は、ＧＧＴに認識されて、生理活性物質を速やかに遊離する物性を有する。ＧＧＴは多くの悪性腫瘍において高発現していることが知られている。したがって、本発明のグルタミン酸誘導体は、抗腫瘍効果を有する生理活性物質に適用することで、標的組織選択的に抗腫瘍活性を発揮する化合物を遊離させることができ、副作用が軽減され、治療効果が向上した抗腫瘍性薬剤を提供することができる。
さらに、該グルタミン酸誘導体とポリエチレングリコールセグメントと疎水性基を有するポリアミノ酸セグメントが連結したブロック共重合体を組み合せた組成物とすることで、ＧＧＴ認識プロドラッグであるグルタミン酸誘導体の有効性をより一層発揮させることができる好適な医薬製剤を提供することができる。特に、生理活性物質として抗腫瘍性化合物を用いたグルタミン酸誘導体による該組成物は、グルタミン酸誘導体を腫瘍患部に効果的に集積させることができ、腫瘍に対してより優れた効果を示すとともに、ＧＧＴの発現率の低い骨髄組織では生理活性物質の遊離を抑制できるため、抗腫瘍性薬剤の使用において問題となる骨髄抑制などの副作用を回避できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＯＳ−ＲＣ−２細胞に対する合成例１の細胞増殖抑制試験の結果である。
【図２】ＳＫ−ＯＶ−３細胞に対する合成例１の細胞増殖抑制試験の結果である。
【図３】ＧＧＴ阻害剤存在下、ＯＳ−ＲＣ−２細胞に対する合成例１の細胞増殖抑制試験の結果である。
【図４】ＯＳ−ＲＣ−２細胞に対する合成例６の化合物の細胞増殖抑制試験の結果である。
【図５】ＳＫ−ＯＶ−３細胞に対する合成例６の化合物の細胞増殖抑制試験の結果である。
【図６】ＧＧＴ阻害剤存在下、ＯＳ−ＲＣ−２細胞に対する合成例６の化合物の細胞増殖抑制試験の結果である。
【図７】合成例１の組織中薬剤濃度推移の結果である。
【図８】ＯＳ−ＲＣ−２腫瘍に対する合成例１の抗腫瘍効果試験の結果である。
【図９】ＳＨＩＮ−３腫瘍に対する合成例１の抗腫瘍効果試験の結果である。
【図１０】ＯＳ−ＲＣ−２腫瘍に対する合成例６の抗腫瘍効果試験の結果である。
【図１１】実施例１の血漿中薬剤濃度推移の結果である。
【図１２】ＯＳ−ＲＣ−２腫瘍に対する実施例６の抗腫瘍効果試験の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、一般式（１）で表されるグルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）及びポリエチレングリコールセグメント及び疎水性官能基を有するポリアミノ酸セグメントが連結したブロック共重合体（ＩＩ）を含有する組成物に関する。また、該組成物の医薬品としての用途に関する。以下に本発明の詳細を述べる。
【００２０】
初めに、グルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）について説明する。本発明のグルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）は、下記一般式（１）
【化６】
2017086392.tif 000008
［式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、置換基を有していても良いアルキル基及び置換基を有していても良いアルコキシカルボニル基からなる群から選択される基を示し、Ｒ３は、水素原子又は置換基を有していても良いアルキル基を示し、Ａ１及びＡ２は、Ｃ−Ｒ６、Ｃ−Ｒ７及び窒素原子からなる群から選択される基であり、該Ｒ６は、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、置換基を有していても良いアルキル基及び置換基を有していても良いアルコキシ基からなる群から選択される１種以上の基を示し、該Ｒ７は下記一般式（２）
【化７】
2017086392.tif 000009
［式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素原子又は置換基を有していても良いアルキル基を示し、Ｌは酸素原子、オキシカルボニル基及び結合からなる群から選択される結合基を示し、Ｘは脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基、アミノ基及びカルボキシ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質の結合残基を示し、
（ａ）前記Ｘが脂肪族性水酸基及びアミノ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質の結合残基である場合、前記Ｌはオキシカルボニル基であり、
（ｂ）前記Ｘがカルボキシ基を有する生理活性物質の結合残基である場合、前記Ｌは酸素原子であり、
（ｃ）前記Ｘが芳香族性水酸基を有する生理活性物質の結合残基である場合、前記Ｌは結合又はオキシカルボニル基である。］で表され、ここで、前記Ａ１及び前記Ａ２は何れか一方が前記Ｃ−Ｒ７であって、他方が前記Ｃ−Ｒ６又は窒素原子であり、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、それぞれ独立して前記Ｃ−Ｒ６又は窒素原子である。］で表されるグルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩である。
【００２１】
一般式（１）におけるＲ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、置換基を有していても良いアルキル基又は置換基を有していても良いアルコキシカルボニル基である。
前記置換基を有していても良いアルキル基における、該アルキル基とは炭素数１〜３０の直鎖状、分岐状又は環状アルキル基を示す。直鎖状アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−へキシル基、ｎ―ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基等が挙げられる。分岐状アルキル基としては、例えば、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、１−メチル−プロピル基、２−メチル−プロピル基、２，２−ジメチルプロピル基等が挙げられる。環状アルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基等が挙げられる。
【００２２】
前記置換基を有していても良いアルコキシカルボニル基における、該アルコキシカルボニル基とは、炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基を示す。例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等の他、適当な芳香族置換基を有する、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基等の１級アルコキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｓｅｃ−ブトキシカルボニル基等の２級アルコキシカルボニル基、若しくはｔ−ブトキシカルボニル基等の３級アルコキシカルボニル基が挙げられる。
【００２３】
前記アルキル基及びアルコキシカルボニル基における有していても良い置換基としては、例えば、メルカプト基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素環又は複素環アリール基、炭素数１〜８のアルキルチオ基、アリールチオ基、炭素数１〜８のアルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、炭素数１〜８のアルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、アリールオキシ基、脂肪族又は芳香族アミノ基、脂肪族アミノ基が置換された炭素数１〜８のアルキル基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、若しくはシリル基等を挙げることができる。芳香環上の置換位置は、オルト位でも、メタ位でも、パラ位でもよい。
【００２４】
前記一般式（１）におけるＲ１及びＲ２における置換基を有していても良いアルキル基又は置換基を有していても良いアルコキシカルボニル基は、アミノ基の保護基であることが好ましい。すなわち、有機合成反応におけるアミノ基の保護基であれば、特に制限なく用いることができる。特に好ましくは、前記アルコキシカルボニル基であり、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ基）、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｏｃ基）等を挙げることができる。
前記Ｒ１及びＲ２としては、水素原子及び／又は置換基を有していても良いアルコキシカルボニル基であることが好ましい。Ｒ１及びＲ２が両方とも水素原子である場合、又は水素原子と置換基を有していても良いアルコキシカルボニル基の組み合せである場合が好ましい。
【００２５】
一般式（１）におけるＲ３としては、水素原子又は置換基を有していても良いアルキル基が挙げられる。
前記置換基を有していても良いアルキル基における、該アルキル基とは炭素数１〜３０の直鎖状、分岐状又は環状アルキル基を示す。直鎖状アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−へキシル基、ｎ―ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基等が挙げられる。分岐状アルキル基としては、例えば、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、１−メチル−プロピル基、２−メチル−プロピル基、２，２−ジメチルプロピル基等が挙げられる。環状アルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基等が挙げられる。また、適当な芳香族置換基を有する、ベンジル基、９−フルオレニルメチル基等が挙げられる。該Ｒ３のアルキル基における置換基としては、前述と同義である。
該Ｒ３の置換基を有していても良いアルキル基としては、カルボン酸の保護基が用いられることが好ましい。有機合成反応におけるカルボン酸の保護基であれば、特に制限なく用いることができる。特に好ましくは、メチル基、エチル基、ｔ−ブチル基、アリル基、ベンジル基、９−フルオレニルメチル基である。
【００２６】
一般式（１）において、Ａ１及びＡ２は、Ｒ６で置換された炭素原子であるＣ−Ｒ６、Ｒ７で置換された炭素原子であるＣ−Ｒ７及び窒素原子からなる群から選択される基である。また、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、それぞれ独立してＲ６で置換された炭素原子であるＣ−Ｒ６又は窒素原子である。
【００２７】
前記Ｒ６としては、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、置換基を有していても良いアルキル基及び置換基を有していても良いアルコキシ基からなる群から選択される１種以上の置換基である。
前記ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子である。
前記置換基を有していても良いアルキル基における該アルキル基とは、炭素数１〜３０の直鎖状、分岐状又は環状アルキル基を示す。直鎖状アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−へキシル基、ｎ―ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基等が挙げられる。分岐状アルキル基としては、例えば、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、１−メチル−プロピル基、２−メチル−プロピル基、２，２−ジメチルプロピル基等が挙げられる。環状アルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基等が挙げられる。
【００２８】
前記置換基を有していても良いアルコキシ基における該アルコキシ基とは、炭素数１〜１０のアルコキシ基を示す。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ベンジルオキシ基等の１級アルコキシ基、イソプロポキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基等の２級アルコキシ基、若しくはｔ−ブトキシ基等の３級アルコキシ基が挙げられる。
【００２９】
前記アルキル基及びアルコキシ基における有していても良い置換基としては、例えば、メルカプト基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、炭素数２〜１０のアルケニル基、炭素数２〜１０のアルキニル基、炭素環又は複素環アリール基、炭素数１〜８のアルキルチオ基、アリールチオ基、炭素数１〜８のアルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、炭素数１〜８のアルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、アリールオキシ基、脂肪族又は芳香族アミノ基、脂肪族アミノ基が置換された炭素数１〜８のアルキル基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、若しくはシリル基、等を挙げることができる。芳香環上の置換位置は、オルト位でも、メタ位でも、パラ位でもよい。
【００３０】
前記Ａ１、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２及びＢ３は、窒素原子であっても良い。すなわち、該Ａ１〜Ｂ３で構成される６員環芳香族基は含窒素複素環であっても良い。該含窒素複素環としては、該Ａ１〜Ｂ３において、１〜３個の窒素原子を含有する複素環基を含む。例えば、ピリジン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環又はトリアジン環である。前記含窒素複素環は、置換基を有していても良い。該置換基としては、前記Ｒ６で規定される置換基である。
【００３１】
前記Ｒ４及びＲ５としては、それぞれ独立して、水素原子又は置換基を有していても良いアルキル基が挙げられる。
置換基を有していても良いアルキル基における該アルキル基とは、炭素数１〜３０の直鎖状、分岐状又は環状アルキル基を示す。直鎖状アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−へキシル基、ｎ―ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基等が挙げられる。分岐状アルキル基としては、例えば、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、１−メチル−プロピル基、２−メチル−プロピル基、２，２−ジメチルプロピル基等が挙げられる。環状アルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基等が挙げられる。有していても良い置換基としては、前述のＲ１及びＲ２における置換基と同義である。
【００３２】
前記Ｒ７は、前記一般式（２）で表される基である。該一般式（２）において、Ｌは、酸素原子、オキシカルボニル基及び結合からなる群から選択される結合基を示し、Ｘは脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基、アミノ基及びカルボキシ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質の結合残基を示し、
（ａ）前記Ｘが脂肪族性水酸基及びアミノ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質の結合残基である場合、前記Ｌはオキシカルボニル基であり、
（ｂ）前記Ｘがカルボキシ基を有する生理活性物質の結合残基である場合、前記Ｌは酸素原子であり、
（ｃ）前記Ｘが芳香族性水酸基を有する生理活性物質の結合残基である場合、前記Ｌは結合又はオキシカルボニル基である。Ｌは結合であることが好ましい。
なお、生理活性物質の結合残基とは、前記Ｌで示される結合基と該生理活性物質が結合した残基を意味する。すなわち、脂肪族水酸基及びアミノ基、若しくは芳香族性水酸基から水素原子を除いた残基であり、カルボキシ基から水酸基を除いた残基である。当該結合残基と結合基とが結合した具体的な態様を以下に例示する。
該Ｘ基が、脂肪族性水酸基又は芳香族性水酸基を有する生理活性物質の結合残基である場合、これら水酸基がオキシカルボニル基とカーボネート結合している形式での結合残基である。一方、該Ｘ基がアミノ基を有する生理活性物質の結合残基である場合、該アミノ基がオキシカルボニル基とウレタン結合している形式での結合残基である。
また、該Ｘ基がカルボキシ基を有する生理活性物質での結合残基である場合、結合基Ｌとして酸素原子を介し、該生理活性物質由来のカルボニル基とエステル結合している形式での結合残基である。
さらに、該Ｘ基が芳香族性水酸基を有する生理活性物質の結合残基である場合、該Ｘ基は前記生理活性物質の芳香族水酸基の酸素原子を介してエーテル結合した結合残基である。
【００３３】
また、前記グルタミン酸誘導体（Ｉ）の態様の一つとして、前記Ｒ７は、下記一般式（４）
【化８】
2017086392.tif 000010
［式中、Ｒ４及びＲ５は前記と同義であり、Ｘは脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基及びアミノ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質の結合残基である。］で表される。
【００３４】
本発明のもう一つの態様として、前記Ｒ７は、下記一般式（５）
【化９】
2017086392.tif 000011
［式中、Ｒ４及びＲ５は前記と同義であり、Ｘは芳香族性水酸基を有する生理活性物質の結合残基である。］で表される。
【００３５】
前記Ｘにおける生理活性物質としては、生体内に投与することにより薬理機能を示す化学物質であって、脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基、アミノ基及びカルボキシ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する化合物であれば特に制限なく使用することができる。
一般式（２）において、該Ｘが脂肪族性水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基である場合、該Ｌはオキシカルボニル基を結合基として用い、カーボネート結合及び／又はウレタン結合した化合物となる。該Ｘがカルボキシ基を有する生理活性物質の結合残基である場合、該Ｌは酸素原子となり、生理活性物質由来のカルボニル基とエステル結合した化合物となる。該Ｘが芳香族性水酸基を有する生理活性物質の結合残基である場合、該Ｌは結合又はオキシカルボニル基が用いられ、エーテル結合又はカーボネート結合した化合物となる。
【００３６】
該脂肪族性水酸基は、１級水酸基、２級水酸基又は３級水酸基の何れの置換基であっても良い。また該アミノ基は、１級アミノ基、２級アミノ基又は３級アミノ基の何れの置換基であっても良い。
【００３７】
前記Ｘにおける生理活性物質としては、脂肪族性水酸基及び／又は芳香族性水酸基とアミノ基が共存する生理活性物質であっても良い。脂肪族性水酸基及び／又は芳香族性水酸基とアミノ基が共存した化合物の場合は、該Ｘ基は一般的にはアミノ基による結合残基であることが考えられるが、反応条件や立体的要素を考慮して該脂肪族性水酸基及び／又は芳香族性水酸基と該アミノ基の何れかの活性官能基による結合残基であっても良く、該脂肪族性水酸基及び／又は芳香族性水酸基による結合残基と該アミノ基による結合残基の混合物であっても良い。
【００３８】
また、前記Ｘにおける生理活性物質として脂肪族性水酸基及び／又は芳香族性水酸基及び／又はアミノ基と、カルボキシ基が共存する生理活性物質であっても良い。脂肪族性水酸基及び／又は芳香族性水酸基及び／又はアミノ基と、カルボキシ基が共存した生理活性物質を用いる場合は、反応条件により、結合様式を適宜選択することができる。
【００３９】
当該生理活性物質における生理活性は、特に限定されるものではないが疾病治療に係る薬理活性であることが好ましく、疾病治療用薬理活性化合物を用いることが好ましい。ＧＧＴは悪性腫瘍で高発現していることから、当該生理活性物質としては、抗腫瘍活性物質であることが好ましく、抗腫瘍剤を適用することが好ましい。すなわち、一般式（２）のＸで示される生理活性物質は、脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基、アミノ基及びカルボキシ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する抗腫瘍剤であることが好ましい。
【００４０】
一般式（２）のＸで示される生理活性物質として好適な抗腫瘍剤としては、シロリムス系抗腫瘍剤、アンスラサイクリン系抗腫瘍剤、シチジン系抗腫瘍剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、光線力学療法剤、微小管重合阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤及びその他の細胞分裂阻害作用を有する抗腫瘍剤を挙げることができる。
【００４１】
前記シロリムス系抗腫瘍剤としては、例えば、エベロリムス、テムシロリムス、タクロリムス、ラパマイシン等を挙げることができる。
【００４２】
前記シチジン系抗腫瘍剤としては、例えば、エチニルシチジン、ＣＮＤＡＣ（２’−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン）、ゲムシタビン、シタラビン等を挙げることができる。
【００４３】
前記チロシンキナーゼ阻害剤としては、水酸基及び／又はアミノ基を有するチロシンキナーゼ阻害剤であり、例えば、クリゾチニブ、ダサチニブ等が挙げられる。
【００４４】
前記ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、カンプトテシン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、イリノテカン、ノギテカン、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン等のＤＮＡトポイソメラーゼＩ型阻害剤であるカンプトテシン系抗腫瘍剤が挙げられる。また、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ型阻害剤として、エトポシド、テニポシド等を挙げることができる。また、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムルビシン等のアンスラサイクリン系抗腫瘍剤等を挙げることができる。
【００４５】
前記ホルモン療法剤としては、ラロキシフェン、ゴセレリン、リュープロレリン等を挙げることができる。
【００４６】
前記光線化学療法剤としては、２−ブチルアミノ−２−デメトキシヒポクレリン等を挙げることができる。
【００４７】
前記微小管重合阻害剤としては、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン系抗腫瘍剤、コンブレタスタチン及びその誘導体、ポドフィロトキシン、エリブリン、オーリスタチンを挙げることができる。
【００４８】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤としては、ガネテスピブ、マクベシン、ラディシコル等を挙げることができる。
【００４９】
また、一般式（２）のＸにおいて、カルボキシ基を有する生理活性物質として好適な抗腫瘍剤とは、例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、ＤＭＸＡＡ（５，６−ジメチルキサンテノン−４−酢酸）、ベキサロテン、タミバロテン等が挙げられる。
【００５０】
また、一般式（２）のＸにおいて、アミノ基又はカルボキシ基を有する生理活性物質として、生理活性ペプチド類であってもよい。該アミノ基又はカルボキシ基を有する生理活性ペプチド類は、末端アミノ基又はカルボキシ基を用いて結合する様式とすることができる。
該生理活性ペプチド類として、例えば、ベスタチン（Ｂｅｓｔａｔｉｎ）及びベスタチンメチルエステル等のエステル誘導体、グルファニド（Ｇｌｕｆａｎｉｄｅ）、グレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）、テルトモチド（Ｔｅｒｔｏｍｏｔｉｄｅ）、ＰＲ１、オクトレオチド（Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）、ランレオチド（Ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）、パシレオチド（Ｐａｓｉｒｅｏｔｉｄｅ）等が挙げられる。
【００５１】
一般式（２）のＸは、脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基及びアミノ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質の結合残基であることが好ましい。この場合、一般式（２）における結合基Ｌはオキシカルボニル基が用いられる。すなわち、この場合、該Ｒ７は前記一般式（４）で表される置換基である。
該脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基及びアミノ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質としては、カンプトテシン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、イリノテカン、ノギテカン、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン等のカンプトテシン誘導体であることが好ましい。これらは、ラクトン環の３級水酸基や、芳香族性水酸基、アミノ基を具備し、これらの置換基により前記結合基であるオキシカルボニル基とカーボネート結合及び／又はウレタン結合を形成している。
また、該脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基及びアミノ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質として、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムルビシン等のアンスラサイクリン系抗腫瘍剤も好ましい。より好ましくは、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、アムルビシンである。これらは、水酸基及び／又はアミノ基を具備し、これらの置換基により前記結合基であるオキシカルボニル基とカーボネート結合及び／又はウレタン結合を形成している。
更に、該脂肪族性水酸基、芳香族性水酸基及びアミノ基からなる群から選択される１種以上の官能基を有する生理活性物質として、ゲムシタビン、エチニルシチジン、シタラビン、ＣＮＤＡＣ（２’−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン）等のシチジン系抗腫瘍剤であることが好ましい。これらは水酸基及び／又はシチジン塩基のアミノ基を有し、これらの置換基により前記結合基であるオキシカルボニル基とカーボネート結合及び／又はウレタン結合を形成している。
【００５２】
また、別の態様として、一般式（２）のＸは芳香族性水酸基を有する生理活性物質の結合残基であることが好ましい。この場合、一般式（２）における結合基Ｌは結合又はオキシガルボニル基が用いられる。結合基Ｌは結合であることが好ましい。すなわち、好ましくは、該Ｒ７は前記一般式（５）で表される置換基である。
芳香族性水酸基を有する生理活性物質として、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンまたはノギテカンを用いることが好ましく、該Ｘは、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンまたはノギテカンの１０位水酸基によりエーテル結合した結合残基であることが好ましい。
【００５３】
本発明に係るグルタミン酸誘導体（Ｉ）は、前記Ａ１及びＡ２の何れか１つが、Ｃ−Ｒ７であることを特徴とする。すなわち、本発明の１つの態様としては、Ａ１がＣ−Ｒ７である下記一般式（６）で表されるグルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）である。
【化１０】
2017086392.tif 000012
一般式（６）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ａ２、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｌ及びＸは、前述と同義である。
【００５４】
また、本発明に係るグルタミン酸誘導体（Ｉ）のもう１つの態様としては、Ａ２がＣ−Ｒ７である下記一般式（７）で表されるグルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）である。
【化１１】
2017086392.tif 000013
一般式（７）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ａ１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｌ及びＸは、前述と同義である。
【００５５】
本発明の一般式（１）で表されるグルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）において、ＧＧＴ認識されるためには、γ−グルタミン酸結合部分構造が遊離アミノ酸構造であることが必要である。すなわち、当該グルタミン酸誘導体（Ｉ）が、ＧＧＴに認識され活性化されるプロドラッグとして機能するためには、前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３がいずれも水素原子であることが必要である。したがって、当該グルタミン酸誘導体が薬理活性を発揮させるための医薬として使用する場合は、前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３がいずれも水素原子であることが好ましい。
しかしながら、前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の何れかが、アミノ基又はカルボキシ基の保護基であり、生体内へ投与した後に該保護基が解離して、該Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の全てが水素原子の構造となる場合も、医薬用途の当該グルタミン酸誘導体（Ｉ）の態様として含まれる。
なお、前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３が置換基を有していても良いアルキル基やアルコキシカルボニル基である化合物は、当該医薬用途化合物の製造上の中間体として有用な化合物であり、本発明の内容に含まれる。
【００５６】
一般式（１）で表されるグルタミン酸誘導体（Ｉ）は、薬理学的に許容される塩として存在して良い。当該塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを挙げることができる。もっとも、本発明の化合物の塩は、これらに限定されるものではない。
【００５７】
一般式（１）で表されるグルタミン酸誘導体及びその塩（Ｉ）は、置換基の種類に応じて１個又は２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
【００５８】
一般式（１）で表されるグルタミン酸誘導体及びその塩（Ｉ）は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を挙げることができる。水和物又は溶媒和物の結合数は特に限定されるものではなく、単離可能な安定型の水和物又は溶媒和物であれば良い。
【００５９】
本明細書の実施例には、一般式（１）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されているので、当業者は本明細書の開示を参照することにより、及び必要に応じて出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、一般式（１）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。
【００６０】
本発明の一般式（１）で表されるグルタミン酸誘導体（Ｉ）は、Ａ２がＣ−Ｒ７であって、Ｘが脂肪族性水酸基及び／又は芳香族性水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質の結合残基であり、Ｌがオキシカルボニル基である場合、例えば以下のように製造することができる。
［スキーム１］
【化１２】
2017086392.tif 000014
スキーム１）中、Ｒ１〜Ｒ３、Ｘ、Ａ１、Ｂ１〜Ｂ３は、前述と同義である。ここでＲ１及び／又はＲ２はアミノ基の保護基であり、Ｒ３はカルボン酸の保護基である。ＬＧはハロゲン原子、ｐ−ニトロフェノキシ基あるいはヒドロキシスクシンイミド基等の脱離基を表す。以下に各工程を説明する。
【００６１】
［工程Ａ］：アミノ基及びα−カルボキシ基を保護したグルタミン酸誘導体を、芳香族アミンでアミド化して、γ−グルタミン酸アミド誘導体（Ａ−１）を合成する工程である。本工程は、アミド化縮合反応であり、一般的な縮合剤を用いて反応させることができる。縮合剤として、例えば、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）を用い、ジクロロメタン等の溶媒中、０℃から１５０℃、好ましくは０℃から３０℃の温度で反応させることにより実施できる。縮合剤としては、例えば、カルボジイミド系縮合剤、イミダゾール系脱水縮合剤、トリアジン系縮合剤、ホスホニウム系脱水縮合剤、ウロニウム系縮合剤、ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）、ＢＯＰ試薬、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）等を用いることができる。必要に応じ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール等の活性化剤の共存させることができる。
【００６２】
［工程Ｂ］：一般式（Ａ−１）で表されるγ−グルタミン酸アミド誘導体から、一般式（Ａ−２）で表されるカルボニル誘導体を合成する工程である。本工程は、例えば、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニルをピリジン存在下、テトラヒドロフラン等の溶媒中、−３０℃から１５０℃、好ましくは−１０℃から３０℃の温度で反応させることにより実施できる。
【００６３】
［工程Ｃ］：一般式（Ａ−２）で表されるカルボニル誘導体から、一般式（Ａ−３）で表される生理活性物質結合誘導体を合成する工程である。本工程は、例えば、脂肪族性水酸基及び／又は芳香族性水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質を、ジイソプロピルエチルアミン存在下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の溶媒中、０℃から１５０℃、好ましくは０℃から３０℃の温度で反応させることにより実施できる。
【００６４】
［工程Ｄ］：一般式（Ａ−１）で表されるγ−グルタミン酸アミド誘導体から、一般式（Ａ−３）で表される生理活性物質結合誘導体を、一段階で合成するための工程経路である。本工程は、例えば、一般式（Ｉ−１）で表されるカルボニル化生理活性物質誘導体を、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン存在下、ジクロロメタン等の溶媒中、０℃から１５０℃、好ましくは０℃から３０℃の温度で反応させることにより実施できる。
一般式（Ｉ−１）で表されるカルボニル化生理活性物質誘導体は、脂肪族性水酸基及び／又は芳香族性水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質Ｘを、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン存在下、ジクロロメタン等の溶媒中、０℃から１５０℃、好ましくは０℃から３０℃の温度で、トリホスゲンと反応させることにより製造できる。または、例えば、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニルをピリジン存在下、ジクロロメタン等の溶媒中、０℃から１５０℃、好ましくは０℃から３０℃の温度で反応させることにより製造できる。
【００６５】
［工程Ｅ］：一般式（Ａ−３）で表される生理活性物質結合誘導体における、γ−グルタミン酸結合部分のアミノ基及びカルボキシル基の脱保護反応を行う工程である。
Ｒ１及びＲ２の何れか一方がｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で、他方が水素原子であり、Ｒ３がｔ−ブチル基の場合、酸性条件下で該工程Ｅの脱保護を実施することができる。酸としては、塩酸、硫酸等の無機酸、酢酸、トリフロロ酢酸等のカルボン酸等が使用できる。その他、ｔ−ブトキシカルボニル基あるいはｔ−ブチルエステルを脱保護できることが知られている触媒であって、保護基以外の部分に影響を与えない触媒であれば、特に制限なく使用することができる。
また、該Ｒ１及びＲ２の何れか一方が９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で、他方が水素原子であり、該Ｒ３がフルオレニルメチル基の場合、塩基性条件下で該工程Ｅを実施することができる。塩基としては、アンモニア、あるいはピペリジン、モルホリンなどの有機塩基等を使用できる。その他、フルオレニルメトキシカルボニル基あるいはフルオレニルメチルエステルを脱保護できることが知られている触媒であって、保護基以外の部分に影響を与えない触媒であれば、何れの脱保護反応条件であっても使用することができる。
また、該Ｒ１及びＲ２の何れか一方がアリルオキシカルボニル基（Ａｌｏｃ基）で、他方が水素原子であり、該Ｒ３がアリル基の場合、パラジウム触媒存在下で該工程Ｅを実施することができる。パラジウム触媒としては、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）等を使用できる。その他、アリルオキシカルボニル基あるいはアリルエステルを脱保護できることが知られている触媒であって、保護基以外の部分に影響を与えない触媒であれば、何れの脱保護反応条件であっても使用することができる。
【００６６】
Ｘがアミノ基を有する生理活性物質の結合残基である場合、一般式（Ａ−３）で表される誘導体は、例えば以下のように製造することができる。
［スキーム２］
【化１３】
2017086392.tif 000015
スキーム２中、Ｒ１〜Ｒ３、Ｘ、Ａ１、Ｂ１〜Ｂ３は、前述と同義であり、Ｒ１及び／又はＲ２はアミノ基の保護基であり、Ｒ３はカルボン酸の保護基である。以下に各工程を説明する。
【００６７】
［工程Ｆ］：一般式（Ａ−１）で表されるγ−グルタミン酸アミド誘導体から、一般式（Ａ−３）で表される生理活性物質結合誘導体を合成する工程である。本工程は、例えば、アミノ基を有する生理活性物質Ｘのイソシアネート誘導体を、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン存在下、ジクロロメタン等の溶媒中、０℃から１５０℃、好ましくは０℃から３０℃の温度で反応させることにより実施できる。
アミノ基を有する生理活性物質Ｘのイソシアネート誘導体は、例えば、アミノ基を有する生理活性物質Ｘを、炭酸水素カリウム水溶液及びジクロロメタン等の混合溶媒中、０℃から１５０℃、好ましくは０℃から３０℃の温度で、トリホスゲンと反応させることにより製造できる。
【００６８】
Ｘがカルボキシル基を有する生理活性物質であり、Ｌが酸素原子である場合、一般式（Ａ−３）で表される生理活性物質結合誘導体は、例えば以下のように製造することができる。
［スキーム３］
【化１４】
2017086392.tif 000016
スキーム３中、Ｒ１〜Ｒ３、Ｘ、Ａ１、Ｂ１〜Ｂ３は、前述と同義であり、Ｒ１及び／又はＲ２はアミノ基の保護基であり、Ｒ３はカルボン酸の保護基である。以下に各工程を説明する。
【００６９】
［工程Ｇ］：一般式（Ａ−１）で表されるγ−グルタミン酸アミド誘導体と、カルボキシル基を有する生理活性物質を縮合反応により、エステル化する工程である。本工程は、一般的な縮合剤を用いることができ、例えば、縮合剤として１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を用い、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の溶媒中、０℃から１５０℃、好ましくは０℃から３０℃の温度で反応させることにより実施できる。縮合剤としては、他にカルボジイミド系縮合剤、イミダゾール系脱水縮合剤、トリアジン系縮合剤、ホスホニウム系脱水縮合剤、ウロニウム系縮合剤、ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）、ＢＯＰ試薬、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）等を用いることができる。必要に応じ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン等の活性化剤を共存させることができる。
【００７０】
また、Ａ２がＣ−Ｒ７でＸが芳香族性水酸基を有する生理活性物質であり、Ｌが結合である本発明の一般式（１）で表されるグルタミン酸誘導体は、例えば以下のように製造することができる。
［スキーム４］
【化１５】
2017086392.tif 000017
スキーム４中、Ｒ１〜Ｒ３、Ｘ、Ａ１、Ｂ１〜Ｂ３は、前述と同義である。ここで、Ｒ１及び／又はＲ２はアミノ基の保護基であり、Ｒ３はカルボン酸の保護基である。ＬＧはハロゲン原子、メタンスルホニルオキシ基等の脱離基を表す。以下に各工程を説明する。
【００７１】
［工程Ａ］：一般式（Ａ−１）で表されるγ−グルタミン酸アミド誘導体から、一般式（Ａ−５）で表される誘導体を合成する工程である。一般式（Ａ−５）におけるＬＧは脱離基であり、例えばメタンスルホニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基等を挙げることができる。本工程は、例えば、該脱離基がメタンスルホニルオキシ基である場合、メタンスルホニルクロリドをＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン存在下、ジクロロメタン等の溶媒中、−３０℃から１５０℃、好ましくは−１０℃から３０℃の温度で反応させることにより実施できる。
【００７２】
［工程Ｂ］：一般式（Ａ−５）で表される誘導体から、一般式（Ａ−６）で表される生理活性物質結合誘導体を合成する工程である。本工程は、例えば、芳香族性水酸基を有する生理活性物質を、炭酸セシウム存在下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の溶媒中、０℃から１５０℃、好ましくは０℃から３０℃の温度で反応させることにより実施できる。
【００７３】
［工程Ｃ］：一般式（Ａ−１）で表されるγ−グルタミン酸アミド誘導体から、一般式（Ａ−６）で表される生理活性物質結合誘導体を、一段階で合成するための工程経路である。本工程は、例えば、芳香族性水酸基を有する化合物を、トリフェニルホスフィン、アゾジカルボン酸ジイソプロピル存在下、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の溶媒中、０℃から１５０℃、好ましくは０℃から３０℃の温度で反応させることにより実施できる。
【００７４】
［工程Ｄ］：一般式（Ａ−６）で表される生理活性物質結合誘導体における、γ−グルタミン酸結合部分のアミノ基及びカルボキシ基の脱保護反応を行う工程である。
Ｒ１及びＲ２の何れか一方がｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で、他方が水素原子であり、Ｒ３がｔ−ブチル基の場合、酸性条件下で該工程Ｅの脱保護を実施することができる。酸としては、塩酸、硫酸等の無機酸、酢酸、トリフロロ酢酸等のカルボン酸等が使用できる。その他、ｔ−ブトキシカルボニル基あるいはｔ−ブチルエステルを脱保護できることが知られている触媒であって、保護基以外の部分に影響を与えない触媒であれば、特に制限なく使用することができる。
また、該Ｒ１及びＲ２の何れか一方が９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）で、他方が水素原子であり、該Ｒ３がフルオレニルメチル基の場合、塩基性条件下で該工程Ｅを実施することができる。塩基としては、アンモニア、あるいはピペリジン、モルホリンなどの有機塩基等を使用できる。その他、フルオレニルメトキシカルボニル基あるいはフルオレニルメチルエステルを脱保護できることが知られている触媒であって、保護基以外の部分に影響を与えない触媒であれば、何れの脱保護反応条件であっても使用することができる。
また、該Ｒ１及びＲ２の何れか一方がアリルオキシカルボニル基（Ａｌｏｃ基）で、他方が水素原子であり、該Ｒ３がアリル基の場合、パラジウム触媒存在下で該工程Ｅを実施することができる。パラジウム触媒としては、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）等を使用できる。その他、アリルオキシカルボニル基あるいはアリルエステルを脱保護できることが知られている触媒であって、保護基以外の部分に影響を与えない触媒であれば、何れの脱保護反応条件であっても使用することができる。
【００７５】
次にポリエチレングリコールセグメント及び疎水性官能基を有するポリアミノ酸セグメントが連結したブロック共重合体（ＩＩ）について説明する。
本発明は、ポリエチレングリコールセグメント及び疎水性官能基を有するポリアミノ酸セグメントが連結したブロック共重合体（ＩＩ）が用いられる。該ブロック共重合体（ＩＩ）は、ポリエチレングリコールセグメントとポリアミノ酸セグメントが適当な連結基にて結合したＡＢブロック共重合体であり、該ポリアミノ酸セグメントは疎水性官能基を有しており、親水性のポリエチレングリコールセグメントが併存することにより親水性−疎水性の両親媒性ブロック共重合体である。
【００７６】
該ポリエチレングリコールセグメントとは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位構造の重合度が５〜２０，０００のポリエチレングリコール鎖を含むポリマー部を示す。好ましくは、該重合度が２０〜１１，５００である。特に好ましくは、該重合度が４０〜２，５００のポリエチレングリコール鎖を含むポリマー部である。該ポリエチレングリコールセグメントのポリエチレングリコール相当の平均分子量は、０．２キロダルトン〜９００キロダルトン、好ましくは１キロダルトン〜５００キロダルトンであり、特に好ましくは２キロダルトン〜１００キロダルトンである。なお、該ポリエチレングリコールセグメントの分子量とは、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により測定されるピークトップ分子量である。
【００７７】
前記疎水性官能基を有するポリアミノ酸セグメントとしては、前記ポリエチレングリコールセグメントと比較して、相対的に疎水性を示すポリマーセグメントであれば特に限定されずに用いることができる。例えば、疎水性側鎖を有するアミノ酸及び／又は疎水性官能基で修飾されたアミノ酸誘導体を１ユニット以上で含むポリアミノ酸セグメントが挙げられる。
疎水性側鎖を有するアミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、トリプトファン、プロリン、アスパラギン、グルタミン等が挙げられる。アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、プロリンを用いることが好ましい。天然アミノ酸に限らず、合成アミノ酸を用いても良い。
疎水性官能基で修飾されたアミノ酸誘導体としては、アスパラギン酸、グルタミン酸の側鎖カルボキシ基や、リジンの側鎖アミノ基に疎水性官能基を修飾したアミノ酸誘導体が挙げられる。
【００７８】
前記ポリアミノ酸セグメントとしては、疎水性の程度を容易に調整することが可能である理由から、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の重合体であるポリ（カルボキシ基）含有ポリマーセグメントを用い、このカルボキシ基に複数の疎水性置換基をエステル結合及び／又はアミド結合により導入したポリカルボン酸エステル及び／又はアミドを用いることが好ましい。好ましくは、ポリアスパラギン酸の側鎖に疎水性官能基を結合させたポリアスパラギン酸エステル及び／又はアミド、ポリグルタミン酸の側鎖に疎水性官能基を結合させたポリグルタミン酸エステル及び／又はアミド、若しくはポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）の側鎖に疎水性官能基を結合させたポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）エステル及び／又はアミドである。
該ポリアミノ酸セグメントの主鎖は単一組成構造のポリマーセグメントであることが好ましく、ポリアスパラギン酸の側鎖に疎水性官能基を結合させたポリアスパラギン酸エステル及び／又はアミド、若しくはポリグルタミン酸の側鎖に疎水性官能基を結合させたポリグルタミン酸エステル及び／又はアミドを用いることが好ましい。
ここで、該ポリアミノ酸セグメントが具備する疎水性官能基は、単一種類の官能基であっても、複数種類の官能基であっても良い。
【００７９】
前記ポリアミノ酸セグメントの分子量は、前記ポリエチレングリコールセグメントに対し疎水性を示し、該ブロック共重合体（ＩＩ）が親水性−疎水性の両親媒性を示すことができる程度の疎水性官能基数を具備し得る程度の繰り返し重合数であることに基づく分子量であれば、特に制限なく用いることができる。したがって、該ポリアミノ酸セグメントは、ポリエチレングリコールセグメントの分子量に応じて適宜設定されるべきである。
該ブロック共重合体（ＩＩ）において、前記ポリエチレングリコールセグメントの平均分子量が１キロダルトン〜１００キロダルトンである場合、該ポリアミノ酸セグメントの相当分子量は、セグメント相当の平均分子量として１キロダルトン〜１００キロダルトンの構造部分が好ましく、特に好ましくは３キロダルトン〜６０キロダルトンである。
該ポリアミノ酸セグメントとして、ポリアスパラギン酸やポリグルタミン酸又はポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）を用いる場合、疎水基を導入するためのカルボキシ基当量に基づき該ポリアミノ酸セグメントの分子量を規定することになる、ポリアミノ酸重合数を決めることが好ましい。該カルボキシ基当量は、ポリアミノ酸セグメント当りカルボキシ基が１０モル当量〜３００モル当量が好ましく、より好ましくはカルボキシ基が１０モル当量〜１００モル当量である。すなわち、ポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸を用いた場合、その重合数としては１０〜３００が好ましく、重合数１０〜１００がより好ましい。
【００８０】
前記ポリアミノ酸セグメントとして、前記疎水性官能基で修飾されたアミノ酸誘導体の重合体を用いる場合、該疎水性官能基としてはアルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、複素環アリール基及び生理活性物質の結合残基からなる群から選択される１種以上であることが挙げられる。好ましくは、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルキル基、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ２〜Ｃ３０）のアルケニル基、置換基を有していても良い直鎖状又は分岐鎖状（Ｃ７〜Ｃ３０）のアラルキル基、置換基を有していても良いアリール基、置換基を有していても良い複素環アリール基及び生理活性物質の結合残基からなる群から選択される１種以上の疎水性官能基を用いる事である。該疎水性官能基は、該ポリアミノ酸セグメントにおいて複数個存在する場合、単一種類の官能基であっても良く、複数種類の官能基が混在していても良い。
これらの疎水性官能基は、アスパラギン酸、グルタミン酸の側鎖カルボキシ基や、リジンの側鎖アミノ基に、適当な結合基を介して付与される。
【００８１】
前記直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−へキシル基、シクロへキシル基、シクロへキシルメチル基、シクロへキシルエチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基、イソオクチル基、イソデシル基、イソドデシル基、イソテトラデシル基、イソヘキサデシル基、イソオクタデシル基、ｔ−オクチル基、ｔ−デシル基、ｔ−ドデシル基、ｔ−テトラデシル基、ｔ−ヘキサデシル基、ｔ−オクタデシル基等が挙げられる。前記アルキル基としては、（Ｃ８〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基がより好ましい。
【００８２】
前記直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ２〜Ｃ３０）のアルケニル基としては、いずれか１カ所に炭素―炭素二重結合を有するアルケニル基である。例えば、エテニル基、１−プロペニル基、１−ブテニル基、２−メチル−２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−メチル−１，３−ブタジエニル基、１―オクテニル基、１−デセニル基、１−テトラデセニル基、９−ヘキサデセニル基、ｃｉｓ−９−オクタデセニル基、ｃｉｓ、ｃｉｓ−９、１２−オクタデカジエニル基等が挙げられる。前記アルケニル基としては、（Ｃ８〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基がより好ましい。
【００８３】
前記直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ７〜Ｃ３０）のアラルキル基としては、いずれか１カ所の水素原子がアリール基で置換されている直鎖または分岐鎖アルキル基である。例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。好ましくは４−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。
【００８４】
前記置換基を有していても良いアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基等を挙げることができる。
置換基を有していても良い複素環アリール基としては、ピリジル基、キノリル基、ピリミジル基、ピラジル基、ベンゾピロリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチオフェニル基、キノキサリル基等を挙げることができる。
前記生理活性物質の結合残基としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、アムルビシン等のアントラサイクリン誘導体、カンプトテシン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、ノギテカン（９−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル）−１０−ヒドロキシカンプトテシン）等のカンプトテシン誘導体、ゲムシタビン、シタラビン、エチニルシチジン、ＣＮＤＡＣ（２’−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン）等の核酸代謝拮抗剤、デキサメタゾン、プレドニゾロン等のステロイド誘導体、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン誘導体、等が、それぞれ分子内に具備する水酸基やアミノ基により結合したその結合残基を挙げることができる。
【００８５】
疎水性官能基として用いられる前記アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、複素環アリール基及び生理活性物質の結合残基は、それぞれ適当な置換基を有していても良い。
置換基としては、メルカプト基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、炭素環アリール基、複素環アリール基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換または無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基またはシリル基等を挙げることができる。芳香環上の置換位置は、オルト位でも、メタ位でも、パラ位でもよい。
前記炭素環アリール基としては、例えば、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
前記複素環アリール基としては、例えば、ピリジル基、ピリミジニル基、キノリル基、キナゾリニル基、ナフチリジニル基、フリル基、ピロリル基、インドリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソキサゾリル基、トリアゾリル基等が挙げられる。
前記アルキルチオ基としては（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルチオ基を示し、例えば、メチルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ−ヘキシルチオ基、ベンジルチオ基等が挙げられる。
前記アリールチオ基としては、例えば、フェニルチオ基、ナフチルチオ基、ピリジルチオ基等が挙げられる。
前記アルキルスルフィニル基としては、（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルスルフィニル基を示し、例えば、メチルスルフィニル基、イソプロピルスルフィニル基、シクロヘキシルスルフィニル基、ベンジルスルフィニル基等が挙げられる。
前記アリールスルフィニル基としては、例えば、フェニルスルフィニル基、ナフチルスルフィニル基、ピリジルスルフィニル基等が挙げられる。
前記アルキルスルホニル基としては、（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルスルホニル基を示し、例えば、メチルスルホニル基、イソプロピルスルホニル基、ベンジルスルホニル基等が挙げられる。
前記アリールスルホニル基としては、例えば、フェニルスルホニル基、ナフチルスルホニル基、ピリジルスルホニル基等が挙げられる。
前記スルファモイル基としては、例えば、ジメチルスルファモイル基、フェニルスルファモイル基等が挙げられる。
【００８６】
前記アルコキシ基としては、（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシ基を示し、例えばメトキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、ｎ−オクチルオキシ基、ベンジルオキシ基等の１級アルコキシ基、イソプロポキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基等の２級アルコキシ基、若しくはｔ−ブトキシ基等の３級アルコキシ基を挙げることができる。
前記アリールオキシ基としては、例えば、フェノキシ基、ナフチルオキシ基、ピリジルオキシ基等が挙げられる。
前記アシルオキシ基としては、（Ｃ１〜Ｃ８）のアシルオキシ基を示し、例えば、アセトキシ基、ベンゾイルオキシ基等が挙げられる。
前記アルコキシカルボニルオキシ基としては（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニルオキシ基を示し、例えば、メトキシカルボニルオキシ基、トリフルオロメトキシカルボニルオキシ基等が挙げられる。
前記カルバモイルオキシ基としては、例えば、ジメチルカルバモイルオキシ基、フェニルカルバモイルオキシ基等が挙げられる。
【００８７】
前記置換または無置換アミノ基としては、例えば、無置換アミノ基、非環状の脂肪族１級アミノ基または非環状の脂肪族２級アミノ基、若しくは環状の脂肪族２級アミノ基を示す。
前記非環状の脂肪族１級アミノ基としては、（Ｃ１〜Ｃ１０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基が、Ｎ−モノ置換したアミノ基である。例えば、メチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ネオペンチルアミノ基、ｎ−ヘキシルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基等が挙げられる。
前記非環状の脂肪族２級アミノ基としては、同一であっても異なっていても良く、（Ｃ１〜Ｃ１０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基が、Ｎ，Ｎ−ジ置換したアミノ基である。例えばジメチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、Ｎ−メチル−Ｎ−シクロヘキシルアミノ基等が挙げられる。
前記環状の脂肪族２級アミノ基としては、モルホリノ基、ピペラジン−１−イル基、４−メチルピペラジン−１−イル基、ピペリジン−１−イル基、ピロリジン−１−イル基等が挙げられる。
前記アシルアミノ基としては、例えば、アセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基等が挙げられる。
前記アルコキシカルボニルアミノ基としては、例えば、メトキシカルボニルアミノ基、エトキシカルボニルアミノ基、ベンジルオキシカルボニルアミノ基等が挙げられる。
前記ウレイド基としては、例えば、トリメチルウレイド基、１−メチル−３−フェニル−ウレイド基等が挙げられる。
前記スルホニルアミノ基としては、例えば、メタンスルホニルアミノ基、ベンゼンスルホニルアミノ基等が挙げられる。
前記スルファモイルアミノ基としては、例えば、ジメチルスルファモイルアミノ基等が挙げられる。
【００８８】
前記アシル基としては、例えば、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、ピリジンカルボニル基等が挙げられる。
前記アルコキシカルボニル基としては、例えば、メトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等が挙げられる。
前記カルバモイル基としては、例えば、ジメチルカルバモイル基、フェニルカルバモイル基等が挙げられる。
前記シリル基としては、トリメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等が挙げられる。
【００８９】
前記疎水性官能基を、アスパラギン酸、グルタミン酸の側鎖カルボキシ基や、リジンの側鎖アミノ基に具備させる場合、適当な結合基を介して付与される。
該疎水性官能基とカルボキシ基やアミノ基等のポリアミノ酸側鎖の結合を介する結合基とは、片末端がカルボキシ基やアミノ基との結合性官能基であり、もう一方の片末端が、前記炭化水素基との結合性官能基を有する連結基である。
例えば、酸素原子（−Ｏ−）、−ＮＨ−、硫黄原子（−Ｓ−）、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ’−（ｘ’は１〜１０の整数を示す。）、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ’−Ｏ−（ｘ’は１〜１０の整数を示す。）、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ’−ＮＨ−（ｘ’は１〜１０の整数を示す。）、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ’−Ｓ−（ｘ’は１〜１０の整数を示す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｙ’−（ｙ’は１〜１０の整数を示す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｙ’−Ｏ−（ｙ’は１〜１０の整数を示す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｙ’−ＮＨ−（ｙ’は１〜１０の整数を示す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｙ’−Ｓ−（ｙ’は１〜１０の整数を示す。）、−ＣＯ―Ｏ―、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ’−Ｏ−（ｘ’は１〜１０の整数を示す。）、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ’−ＮＨ−（ｘ’は１〜１０の整数を示す。）、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ’−Ｓ−（ｘ’は１〜１０の整数を示す。）、−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ’−Ｏ−（ｘ’は１〜１０の整数を示す。）、−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ’−ＮＨ−（ｘ’は１〜１０の整数を示す。）、−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ２）ｘ’−Ｓ−（ｘ’は１〜１０の整数を示す。）等を挙げることができる。
また、該結合基としてアミノ酸を用いても良い。アミノ酸としては、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸のいずれでも良い。結合基としてのアミノ酸は、Ｎ末端アミノ基がポリマー主鎖のカルボニル基とアミド結合し、もう一方のＣ末端カルボニル基が、エステル結合又はアミド結合を介して、前記疎水性基と結合した態様を挙げることができる。
【００９０】
前記ポリアミノ酸セグメントとして、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の重合体であるポリ（カルボキシ基）含有ポリマーセグメントを用いる場合、前記の疎水性官能基は、ポリカルボン酸含有ポリマーのカルボキシ基とエステル型及び／又はアミド型で結合されることが好ましい。したがって、前記疎水性官能基としては、対応する疎水性官能基を有するアルコール誘導体又はアミン誘導体としてポリカルボン酸含有ポリマーに導入される態様が好ましい。
【００９１】
該疎水性官能基を有するアルコール誘導体又はアミン誘導体としては、生体親和性の疎水性該誘導体を用いることが好ましい。このようなアルコール誘導体としては、コレステロール、プレグネノロン、β−シトステロール等のステロール誘導体を挙げることができる。また、このようなアミン誘導体としては、Ｃ末カルボキシ基及び／又は側鎖官能基が疎水性官能基により修飾されたアミノ酸誘導体を用いることができる。
これらのステロール誘導体及びアミノ酸誘導体は、前記疎水性官能基において、適当な置換基を有している直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ１〜３０）アルキル基に包含されるものである。
【００９２】
また、該疎水性官能基を有するアルコール誘導体又はアミン誘導体として、水酸基及び／又はアミノ基を有する生理活性物質を用いることもできる。前記生理活性物質の結合残基としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、アムルビシン等のアントラサイクリン誘導体、カンプトテシン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、ノギテカン（９−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル）−１０−ヒドロキシカンプトテシン）等のカンプトテシン誘導体、ゲムシタビン、シタラビン、エチニルシチジン、ＣＮＤＡＣ（２’−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン）等の核酸代謝拮抗剤、デキサメタゾン、プレドニゾロン等のステロイド誘導体、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン誘導体、等の結合残基を挙げることができる。これらは、分子内にある水酸基及び／又はアミノ基によりエステル結合及び／又はアミド結合を介して、ポリ（カルボキシ基）含有ポリマーセグメントに結合させることができる。
これらは、前述のグルタミン酸誘導体（Ｉ）の一般式（１）におけるＸで示される生理活性物質と同じ又は類似構造の生理活性物質を用いることが好ましい。すなわち、グルタミン酸誘導体（Ｉ）として、ドキソルビシンを用いた化合物を一般式（１）に係るＸに用いた場合、当該ブロック共重合体（ＩＩ）における該疎水性官能基としては、同様にドキソルビシンを用いるか、又はその類似構造であるアントラサイクリン誘導体を採用することが好ましい。
【００９３】
前記疎水性官能基は、該ブロック共重合体（ＩＩ）のポリアミノ酸セグメントの疎水性物性を構成するものであり、該疎水性官能基の導入量及び導入率によりポリアミノ酸セグメントの疎水性物性が決定される。すなわち、該疎水性官能基の導入量が多く、また該疎水性官能基の導入率が高い程、高い疎水性物性となる。前記ポリエチレングリコールセグメントに対し疎水性を示し、本発明に係るブロック共重合体（ＩＩ）が親水性−疎水性の両親媒性を示すことができる程度の疎水性官能基数を具備していれば、特に制限なく用いることができる。したがって、該ポリアミノ酸セグメントは、ポリエチレングリコールセグメントの分子量に応じて適宜設定されるべきである。
前記疎水性官能基は、当該ポリアミノ酸セグメントの全てのアミノ酸ユニットが具備していても良く、一部のアミノ酸ユニットが具備する態様であっても良い。
【００９４】
ポリアミノ酸セグメントとして、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の重合体であるポリ（カルボキシ基）含有ポリマーセグメントを用い、疎水性官能基を側鎖カルボキシ基へエステル型及び／又はアミド型で導入する場合において、前記疎水性官能基は、ポリ（カルボキシ基）含有ポリマーの全てのカルボキシ基に導入されていても良く、一部のカルボキシ基に導入されていても良い。好ましくは、ポリ（カルボキシ基）含有ポリマーセグメントの総カルボキシ基当量の１０〜１００％に前記疎水性官能基が導入されており、より好ましくは２０〜９０％のカルボキシ基当量に疎水性官能基が修飾されているポリアミノ酸セグメントである。
該疎水性官能基が導入されないカルボキシ基は、遊離酸態様であっても、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩又はアンモニウム塩等のカルボン酸塩であっても、その他の置換基が導入された構造であってもよい。
【００９５】
本発明のポリエチレングリコールセグメントとポリアミノ酸セグメントが連結したブロック型共重合体ブロック共重合体（ＩＩ）の好ましい態様として、下記一般式（３）
【化１６】
2017086392.tif 000018
［式中、Ｒ１１は水素原子若しくは直鎖状又は分岐鎖状の（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキル基を示し、Ｒ１２は（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレン基を示し、Ｒ１３はメチレン基及び／又はエチレン基を示し、Ｒ１４は水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基及び（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルオキシカルボニル基からなる群から選択され、Ｒ１５は置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ１〜Ｃ３０）アルキル基、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ２〜Ｃ３０）アルケニル基、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ７〜Ｃ３０）の直鎖状又は分岐鎖状のアラルキル基、置換基を有していても良いアリール基、置換基を有していても良い複素環アリール基、並びに生理活性物質の結合残基からなる群から選択される１種類以上の基を示し、Ｒ１６水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）を示し、ここでＲ１７及びＲ１８は、同一でも異なっていても良く、直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ３〜Ｃ８）アルキル基若しくは３級アミノ基で置換されていても良い（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｌ１は結合基又は結合を示し、ｔは２０〜１１５００の整数を示し、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは独立に０〜２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体及び／又はポリグルタミン酸誘導体の単位構成の総重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）は１０〜１００の整数を示し、（ａ＋ｂ）は３〜１００の整数を示し、Ｒ１５が結合した構成単位、Ｒ１６が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型構成単位は、それぞれ独立してランダムな配列である。］で示されるブロック共重合体を挙げることができる。
【００９６】
前記Ｒ１１における（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルキル基としては、置換基を有していても良い直鎖状又は分岐鎖状の（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルキル基を示す。直鎖状アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−へキシル基、ｎ−デシル基等を挙げることができる。分岐鎖状アルキル基としては、例えばイソプロピル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、１−メチル−プロピル基、２−メチル−プロピル基、２，２−ジメチルプロピル基等が挙げられる。環状アルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基等が挙げられる。
【００９７】
一般式（３）におけるｔは、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位構造の重合度を示し、２０〜１１，５００である。好ましくはｔが４０〜２，５００である。
【００９８】
前記Ｒ１２は、ポリエチレングリコールセグメントと、ポリアスパラギン酸セグメント又はポリグルタミン酸セグメントを結合するための連結基であり、（Ｃ１〜６）のアルキレン基である。例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基を挙げられる。
【００９９】
前記Ｒ１３は、メチレン基及び／又はエチレン基を示す。前記Ｒ１３がメチレン基の場合、アスパラギン酸ユニットとなる。一方、前記Ｒ１３がエチレン基の場合、グルタミン酸ユニットとなる。前記Ｒ１３はメチレン基又はエチレン基のどちらか一方であって該ポリアミノ酸セグメントがポリアスパラギン酸セグメント又はポリグルタミン酸セグメントであっても良く、若しくはメチレン基及びエチレン基が混在していてポリ（アスパラギン酸−グルタミン酸）セグメントであっても良い。該ポリアミノ酸セグメントは、単一組成のセグメント構造であることが好ましく、ポリアスパラギン酸セグメント又はポリグルタミン酸セグメントであることが好ましい。
一般式（３）において、Ｒ１３がメチレン基の場合、該アスパラギン酸ユニットは、α−アミド型構成単位、β−アミド型構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位の何れか一つの重合形式の構成単位となる。一方、Ｒ１３がエチレン基の場合、該ポリグルタミン酸ユニットも同様に、主鎖の構成単位はα−アミド型構成単位、γ−アミド型構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位の何れか一つの構成単位となる。したがって、一般式（３）において、ポリアミノ酸セグメント構造は、前記のα−アミド型構成単位、β（γ）−アミド型構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型の構成単位の単一構成単位の重合体構造であっても良く、これらが混在した構成単位の重合体構造であっても良い。
【０１００】
前記Ｒ１４の（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、シクロプロピルカルボニル基、シクロペンタンカルボニル基等が挙げられる。
前記Ｒ１４における（Ｃ１〜Ｃ６）のアルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、シクロへキシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【０１０１】
前記Ｒ１５の直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ１〜Ｃ３０）のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−へキシル基、シクロへキシル基、シクロへキシルメチル基、シクロへキシルエチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基、イソオクチル基、イソデシル基、イソドデシル基、イソテトラデシル基、イソヘキサデシル基、イソオクタデシル基、ｔ−オクチル基、ｔ−デシル基、ｔ−ドデシル基、ｔ−テトラデシル基、ｔ−ヘキサデシル基、ｔ−オクタデシル基等が挙げられる。前記アルキル基としては、（Ｃ８〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルキル基がより好ましい。
【０１０２】
前記Ｒ１５の直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ２〜Ｃ３０）のアルケニル基としては、いずれか１カ所に炭素−炭素二重結合を有するアルケニル基である。例えば、エテニル基、１−プロペニル基、１−ブテニル基、２−メチル−２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−メチル−１，３−ブタジエニル基、１―オクテニル基、１−デセニル基、１−テトラデセニル基、９−ヘキサデセニル基、ｃｉｓ−９−オクタデセニル基、ｃｉｓ、ｃｉｓ−９、１２−オクタデカジエニル基等が挙げられる。前記アルケニル基としては、（Ｃ８〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状または環状のアルケニル基がより好ましい。
【０１０３】
前記Ｒ１５の直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ７〜Ｃ３０）のアラルキル基としては、いずれか１カ所の水素原子がアリール基で置換されている直鎖または分岐鎖アルキル基である。例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。好ましくは４−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。
【０１０４】
前記Ｒ１５の置換基を有していても良いアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、アントラセニル基、フェナントレニル基等を挙げることができる。
前記Ｒ１５の置換基を有していても良い複素環アリール基としては、ピリジル基、キノリル基、ピリミジル基、ピラジル基、ベンゾピロリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチオフェニル基、キノキサリル基等を挙げることができる。
前記Ｒ１５の生理活性物質の結合残基としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、アムルビシン等のアントラサイクリン誘導体、カンプトテシン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、ノギテカン（９−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル）−１０−ヒドロキシカンプトテシン）等のカンプトテシン誘導体、ゲムシタビン、シタラビン、エチニルシチジン、ＣＮＤＡＣ（２’−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン）等の核酸代謝拮抗剤、デキサメタゾン、プレドニゾロン等のステロイド誘導体、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン誘導体、等の水酸基及び／又はアミノ基を有する薬理活性物質が、エステル結合及び／又はアミド結合を介して結合した態様の結合残基として例示することができる。なお、該結合残基とは、後述するＬ１と該生理活性物質が結合した残基であり、水酸基及び／又はアミノ基から水素原子が除かれた残基を示す。
【０１０５】
疎水性官能基として用いられる前記アルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アリール基、複素環アリール基及び生理活性物質の結合残基は、それぞれ適当な置換基を有していても良い。置換基としては、メルカプト基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、炭素環アリール基、複素環アリール基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換または無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基またはシリル基等を挙げることができる。芳香環上の置換位置は、オルト位でも、メタ位でも、パラ位でもよい。各置換基の詳細については、前述と同義である。
【０１０６】
一般式（３）におけるＬ１は、ポリアミノ酸セグメントのカルボニル基とＲ１５を連結するための結合基である。該Ｌ１における結合基としては、片末端がカルボニル基と結合性を示す官能基を有する連結基である。例えば、酸素原子（−Ｏ−）、−ＮＨ−、硫黄原子（−Ｓ−）、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−Ｏ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｒ−Ｏ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−Ｓ−（ＣＨ２）ｒ−Ｏ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−Ｓ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣＯ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣＯ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−Ｓ−（ＣＨ２）ｒ−ＮＨＣＯ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−ＣＯＮＨ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｒ−ＣＯＮＨ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−Ｓ−（ＣＨ２）ｒ−ＣＯＮＨ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ−ＣＯ−Ｏ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−Ｏ−（ＣＨ２）ｒ−ＣＯ−Ｏ−（ｒは０〜６の整数を示す。）、−Ｓ−（ＣＨ２）ｒ−ＣＯ−Ｏ−（ｒは０〜６の整数を示す。）等を挙げることができる。
また、Ｌ１は該カルボニル基とＲ１５が直接結合できる場合であって、相当する結合性官能基がない場合は、該Ｌ１は結合を表す。
更に、Ｌ１としてアミノ酸結合残基を結合基して用いても良い。なお、アミノ酸結合残基とは、Ｎ末アミノ基から水素原子、Ｃ末カルボキシ基から水酸基を除いた残基である。結合基として用いられるアミノ酸は、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸のいずれでもよい。Ｌ１がアミノ酸結合残基であり、該結合基としてアミノ酸を用いる場合、ポリアミノ酸セグメントのカルボニル基と、該アミノ酸のＮ末アミノ基が結合し、他方Ｃ末カルボキシ基とエステル結合又はアミド結合を介してＲ１５基を結合させる態様を挙げることができる。したがって、Ｌ１としてアミノ酸結合残基を用いる場合、Ｌ１は−ＮＨ−Ｃ（Ｒ２０）−ＣＯＯ−（Ｒ２０は用いるアミノ酸の側鎖を示す。）で示される結合基である。
【０１０７】
前記Ｒ１５に係る該疎水性官能基は、生体親和性化合物の結合残基を用いることが好ましい。結合残基とは、結合可能な水酸基及び／又はアミノ基から水素原子、若しくはカルボキシ基から水酸基を除いた残基を示す。生体親和性化合物としては、コレステロール、プレグネノロン、β−シトステロール等のステロール誘導体を挙げることができる。また、Ｃ末カルボキシ基及び／又は側鎖官能基が疎水性官能基により修飾されたアミノ酸誘導体を用いることができる。
これらのステロール誘導体及びアミノ酸誘導体は、本発明に係る疎水性官能基において、置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ１〜３０）アルキル基に包含されるものであり、前記一般式（３）におけるＲ１５及びＬ１に相当する官能基である。
【０１０８】
該疎水性官能基としてステロール誘導体を用いる場合、ステロイド骨格のＡ環３位のヒロドキシ基が結合性官能基として機能してエステル型結合の態様となる。すなわち、一般式（３）において、Ｒ１５がステロール誘導体のステロイド骨格部分を示し、Ｌ１がステロール誘導体の３位酸素原子を含む気を示す態様となる。
【０１０９】
一方、該疎水性官能基として前記アミノ酸誘導体を用いる場合、Ｎ末アミノ基が結合性官能基として機能してアミド型結合の態様となる。すなわち、一般式（３）において、Ｒ１５が該アミノ酸誘導体のα炭素骨格部分を示し、Ｌ１が該アミノ酸誘導体のＮ末アミノ基を含む基を示す態様となる。
前記疎水性官能基として用いられるＣ末カルボキシ基及び／又は側鎖官能基が疎水性官能基により修飾されたアミノ酸誘導体とは、天然型アミノ酸、非天然型アミノ酸のいずれでもよく、少なくとも該アミノ酸のＣ末カルボキシ基がエステル誘導体又はアミド誘導体として変換された置換基を示す。
該エステル誘導体は置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルキルエステルが好ましい。直鎖状アルキルエステルとしては、例えばメチルエステル、エチルエステル、ｎ−プロピルエステル、ｎ−ブチルエステル、ｎ−へキシルエステル、ｎ−デシルエステル、ベンジルエステル、２−フェニルエチルエステル、４−フェニルブチルエステル等を挙げることができる。分岐鎖状アルキルエステルとしては、例えばイソプロピルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル、１−メチル−プロピルエステル、２−メチル−プロピルエステル、２，２−ジメチルプロピルエステル等が挙げられる。環状アルキルエステルとしては、例えばシクロプロピルエステル、シクロブチルエステル、シクロペンチルエステル、シクロヘキシルエステル、アダマンチルエステル等が挙げられる。
該アミド誘導体としては、直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルアミドが好ましい。直鎖状アルキルアミドとしては、例えばメチルアミド、エチルアミド、ｎ−プロピルアミド、ｎ−ブチルアミド、ｎ−へキシルアミド、ｎ−デシルアミド、ベンジルアミド、２−フェニルエチルアミド、４−フェニルブチルアミド等を挙げることができる。分岐鎖状アルキルアミドとしては、例えばイソプロピルアミド、ｔｅｒｔ−ブチルアミド、１−メチル−プロピルアミド、２−メチル−プロピルアミド、２，２−ジメチルプロピルアミド等が挙げられる。環状アルキルアミドとしては、例えばシクロプロピルアミド、シクロブチルアミド、シクロペンチルアミド、シクロヘキシルアミド、アダマンチルアミド等が挙げられる。
【０１１０】
該疎水性官能基として、生理活性物質を用いることもできる。前記生理活性物質の結合残基としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、アムルビシン等のアントラサイクリン誘導体、カンプトテシン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、ノギテカン（９−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル）−１０−ヒドロキシカンプトテシン）等のカンプトテシン誘導体、ゲムシタビン、シタラビン、エチニルシチジン、ＣＮＤＡＣ（２’−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン）等の核酸代謝拮抗剤、デキサメタゾン、プレドニゾロン等のステロイド誘導体、パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン誘導体、等の結合残基を挙げることができる。なお、生理活性物質の結合残基とは、前記Ｌ１に生理活性物質が結合した残基である。
前記アントラサイクリン誘導体はアミノ基及び水酸基を有することから、これらを結合性官能基としてアミド結合型及び／又はエステル結合型で結合させることができる。前記カンプトテシン誘導体は水酸基を有することから、これを結合性官能基としてエステル結合型で結合させることができる。前記核酸代謝拮抗剤はアミノ基及び水酸基を有することから、これらを結合性官能基としてアミド結合型及び／又はエステル結合型で結合させることができる。デキサメタゾン、プレドニゾロン等のステロイド誘導体は水酸基を有することから、これを結合性官能基としてエステル結合型で結合させることができる。パクリタキセル、ドセタキセル等のタキサン誘導体は水酸基を有することから、これを結合性官能基としてエステル結合型で結合させることができる。
すなわち、疎水性官能基として生理活性物質を用いる場合、一般式（３）において、Ｌ１がアミノ基及び／又水酸基の結合性官能基のアミノ基及び／又は酸素原子を含む基であり、Ｒ１５が該生理活性物質の前記結合性官能基を除いた残基部分を示す態様となる。
【０１１１】
疎水性官能基として生理活性物質を用いる場合、前述のグルタミン酸誘導体（Ｉ）の一般式（１）におけるＸで示される生理活性物質と同じ又は類似構造の生理活性物質を用いることが好ましい。すなわち、グルタミン酸誘導体（Ｉ）として、一般式（１）に係るＸとしてドキソルビシンを用いた化合物を用いた場合、当該ブロック共重合体（ＩＩ）における該疎水性官能基としては、同様にドキソルビシンを用いるか、又はその類似構造であるアントラサイクリン誘導体を採用することが好ましい。同様にグルタミン酸誘導体（Ｉ）として、一般式（１）に係るＸとして７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンを用いた場合、当該ブロック共重合体（ＩＩ）における該疎水性官能基としては、同様に７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシンを用いるか、又はその類似構造であるカンプトテシン誘導体を採用することが好ましい。
【０１１２】
前記Ｒ１６は水酸基及び／又は−Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）である。該−Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）におけるＲ１７及びＲ１８は、同一でも異なっていても良く、（Ｃ３〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状アルキル基、若しくは３級アミノ基で置換されていても良い（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基である。
該（Ｃ３〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状アルキル基としては、１−プロピル基、２−プロピル基、シクロペンチル基、シクロへキシル基が挙げられる。該３級アミノ基で置換されていても良い（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基としては、３−ジメチルアミノプロピル基、５−ジメチルアミノペンチル基等が挙げられる。
【０１１３】
前記Ｒ１６は水酸基である場合、アスパラギン酸ユニット及び／又はグルタミン酸ユニットが存在することとなる。この場合、側鎖カルボン酸は遊離酸態様であっても良く、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩又はアンモニウム塩等のカルボン酸塩であっても、該Ｒ１６が水酸基である場合に含まれる。
【０１１４】
一般式（３）におけるａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、ポリアミノ酸セグメントのポリマー主鎖にＲ１５が結合した構成単位、Ｒ１６が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型構成単位において、それぞれの含有量を示す。該ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、それぞれ独立に０〜２００の整数を示し、ポリアスパラギン酸誘導体又はポリグルタミン酸誘導体の単位構成の総重合数で、ポリアミノ酸セグメントであるポリアスパラギン酸誘導体又はポリグルタミン酸誘導体のポリマー主鎖の重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）は１０〜１００の整数である。そのうち、Ｒ１５が結合した構成単位は必須構成であり、その総含量数（ａ＋ｂ）は３〜１００の整数である。なお、Ｒ１６が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型構成単位は、任意の構成である。
なお、一般式（３）において、ポリアミノ酸セグメントであるポリアスパラギン酸誘導体セグメント及び／又はポリグルタミン酸誘導体セグメントにおいて、Ｒ１５が結合した構成単位、Ｒ１６が結合した構成単位及び側鎖カルボキシ基が分子内環化型構成単位は、それぞれ独立してランダムな配列である。すなわち、ポリアスパラギン酸誘導体セグメント及び／又はポリグルタミン酸誘導体セグメントの側鎖カルボキシ基に、Ｒ１５が結合した構成単位及びＲ１６が結合した構成単位、並びに側鎖カルボキシ基が分子内環化型構造をとる構成単位が、それぞれ任意の順番で配列した態様であってもよく、それぞれの構成単位が局在化して偏局した配列の態様であってもよく、それぞれの構成単位に規則性がないランダム配列で構成されたポリマー構造であってもよい。
【０１１５】
ポリアミノ酸セグメントとして、アスパラギン酸及び／又はグルタミン酸の重合体であるポリ（カルボキシ基）含有ポリマーセグメントを用い、疎水性官能基を側鎖カルボキシ基へエステル型及び／又はアミド型で導入する場合において、前記疎水性官能基は、ポリ（カルボキシ基）含有ポリマーの全てのカルボキシ基に導入されていても良く、一部のカルボキシ基に導入されていても良い。
前記疎水性官能基は、該ブロック共重合体（ＩＩ）のポリアミノ酸セグメントの疎水性物性を構成するものであり、該疎水性官能基の導入量及び導入率によりポリアミノ酸セグメントの疎水性物性が決定される。すなわち、該疎水性官能基の導入率が高い程、高い疎水性物性となる。疎水基導入率は、ブロック共重合体（ＩＩ）の両親媒性を考慮して決定するべきである。
【０１１６】
ポリアミノ酸セグメントであるポリアスパラギン酸誘導体又はポリグルタミン酸誘導体のポリマー主鎖の重合数である（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）は１０〜８０の整数であり、Ｒ１５基が結合した構成単位の総含量数（ａ＋ｂ）が６〜８０の整数であることが好ましい。
【０１１７】
本発明のブロック共重合体（ＩＩ）における疎水性官能基としては、疎水性官能基で修飾されたアミノ酸誘導体の結合残基、ステロール誘導体の結合残基、置換基を有していても良い（Ｃ７〜Ｃ２０）アラルキル基、アントラサイクリン系抗生物質、カンプトテシン誘導体及び核酸代謝拮抗剤からなる群から選択される１種以上の基であることが好ましい。
前記疎水性官能基における修飾されたアミノ酸誘導体の結合残基として、好ましくはバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファンの置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルキルエステル又は置換基を有していても良い直鎖状、分岐鎖状又は環状の（Ｃ１〜Ｃ１０）のアルキルアミドが好ましい。アルキルエステル及びアルキルアミドの具体例は、前記疎水性官能基として用いられるＣ末カルボキシ基及び／又は側鎖官能基が疎水性官能基により修飾されたアミノ酸誘導体で記載された置換基と同義である。
また、前記疎水性官能基におけるステロール誘導体の結合残基としては、コレステロール、プレグネノロン、β−シトステロール等のステロール誘導体を挙げることができる。
前記疎水性官能基における、置換基を有していても良い（Ｃ７〜Ｃ２０）アラルキル基としては、ベンジル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基を挙げることができる。
【０１１８】
前記疎水性官能基におけるアントラサイクリン誘導体としては、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、アムルビシンを挙げることができる。
前記疎水性官能基におけるカンプトテシン誘導体としては、カンプトテシン、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン、ノギテカン（９−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル）−１０−ヒドロキシカンプトテシン）を挙げることができる。
前記疎水性官能基における核酸代謝拮抗剤としては、ゲムシタビン、シタラビン、エチニルシチジン、ＣＮＤＡＣ（２’−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン）が挙げられる。
【０１１９】
次に、本発明のポリエチレングリコールセグメントとポリアミノ酸セグメントを連結した構造体であるブロック共重合体（ＩＩ）の製造方法について説明する。
本発明のブロック共重合体（ＩＩ）の製造方法は特に限定されるものではないが、あらかじめそれぞれ調製したポリエチレングリコールセグメントとポリアミノ酸セグメントを結合する方法でもよく、ポリエチレングリコールセグメントに対し、ポリアミノ酸セグメントの重合性モノマー体を逐次重合反応させてブロック型共重合体を構築する方法であってもよい。若しくは、ポリエチレングリコールとポリアミノ酸セグメントの前駆体を結合させたＡＢブロック型共重合体をあらかじめ調製し、これに適当な疎水性官能基を導入して調製する方法であってもよい。
好ましくは、ポリアミノ酸セグメントの前駆体として、ポリアスパラギン酸等のポリカルボン酸ポリマーセグメントを用い、ポリエチレングリコールとポリカルボン酸ポリマーセグメントを結合させたＡＢブロック型共重合体をあらかじめ調製し、これに適当な疎水性官能基をアミド結合様式及び／又はエステル結合様式により、適当な縮合条件で反応させることで製造することができる。縮合条件は、通常の有機合成反応で用いることができる方法を適宜使用することができる。
【０１２０】
当該ブロック共重合体（ＩＩ）は例えば、国際公開第２００６／０３３２９６号（特許文献４）、特開平７−６９９００号（特許文献５）及び特開平６−２０６８１５号（特許文献６）に記載されているものも含んでおり、その記載に準じて調製することができる。以下に、前記ブロック共重合体（ＩＩ）の主鎖ポリマーとして、好ましく用いられるポリエチレングリコールセグメントとポリアスパラギン酸セグメントが連結したＡＢブロック型共重合体を用い、これに疎水性官能基を導入して該ブロック共重合体（ＩＩ）を得る製造方法の一態様を説明する。
【０１２１】
一方の末端がアミノ基であるポリエチレングリコール誘導体（例えば、メトキシポリエチレングリコール−１−プロピルアミン）に、β−ベンジルエステル等の適当な側鎖カルボキシ基保護のＮ−カルボニルアスパラギン酸無水物を順次反応させて、逐次重合によりポリエチレングリコールセグメントとポリアスパラギン酸セグメントが連結したＡＢブロック型共重合体骨格を構築する。その後、適当な脱保護反応を施し、複数のカルボン酸を備えるＡＢブロック型共重合体を合成する。ポリアスパラギン酸側鎖がβ−ベンジルエステルの場合、アルカリ条件下での加水分解や、加水素分解反応により脱保護基反応をすることができる。
この複数のカルボン酸を備えるＡＢブロック型共重合体に対し、アミノ基及び／又は水酸基を有する炭化水素基等の疎水性基含有化合物を、カルボジイミド脱水縮合剤等の縮合反応条件にて反応させればよい。
【０１２２】
アミノ基を有する疎水性基含有化合物を用いて、アミド結合で疎水性化合物を結合させる際、反応はペプチド結合生成法として知られる常法に準じて行うことができる。例えば、酸ハロゲン化物法、酸無水物法、カップリング法等が使用できるが、縮合剤を使用するカップリング法が望ましい。縮合剤としては１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルポジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、カルボニルイミダゾール（ＣＤＩ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリン（ＥＥＤＱ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、等が使用できる。
縮合剤は、疎水性化合物に対して０．５〜２０倍モル用いるのが好ましく、特に１〜１０倍モル用いるのが好ましい。またこの際、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＨＯＮＳｕ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）等を共存させてもよい。
【０１２３】
水酸基を有する疎水性基含有化合物を用いて、エステル結合で疎水性化合物を結合させる際、反応はエステル結合生成法として知られる常法に準じて行うことができる。例えば、酸ハロゲン化物法、酸無水物法、カップリング法等が使用できるが、縮合剤を使用するカップリング法が望ましい。縮合剤としては１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルポジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣ１）、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、カルボニルイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノカルベニウムヘキサフルオロホスファート（ＣＯＭＵ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリン（ＥＥＤＱ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）等が使用できる。
縮合剤は、疎水性化合物に対して０．５〜２０倍モル用いるのが好ましく、特に１〜１０倍モル用いるのが好ましい。  またこの際、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、  Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＢＮ）、４−ジメチルアミノビリジン（ＤＭＡＰ）、ジメシチルアンモニウムペンタフルオロベンゼンスルホナート、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン等の反応助剤を共存させてもよく、中でもＤＭＡＰが好ましい。
【０１２４】
原料ブロック共重合体に疎水性化合物を結合させる反応を行なう際に疎水性化合物の使用量は特に限定されないが、通常原料ブロック型共重合体のカルボキシ基１当量に対し、０．１〜２モル用いる。
縮合反応は溶媒中で行うのが好ましく、溶媒としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、水及びそれらの混合溶媒等種々のものが使用でき、特に限定されない。溶媒の使用量は、特に限定されないが、通常原料共重合体に対して１〜５００重量倍用いる。
縮合反応は、−１０〜５０℃で行うのが好ましく、特に、−５〜４０℃で行うのが好ましい。反応は２〜４８時間行えば十分である。
ブロック共重合体（ＩＩ）の炭化水素基等の疎水性官能基の導入量は、脱水縮合反応において、各疎水性基含有化合物の仕込み量を適宜増減させることで調整することができる。
【０１２５】
なお、当該ブロック共重合体（ＩＩ）をカルボジイミド縮合剤を用いて製造した場合、一般式（３）に係るＲ１６において、相当する−Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）基がＲ１５に係る疎水性官能基の結合反応と同時に導入することができる。すなわち、カルボジイミド縮合剤としてジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いた場合、−Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）のＲ１７及びＲ１８は何れもシクロへキシル基となる。ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）を用いて縮合反応を行った場合、Ｒ１７及びＲ１８は何れもイソプロピル基となる。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）を用いた場合、−Ｎ（Ｒ１７）ＣＯＮＨ（Ｒ１８）のＲ１７及びＲ１８はエチル基と３−ジメチルアミノプロピルの混合置換体となる。
前記反応終了後に、任意の精製工程を経由して本発明のブロック共重合体（ＩＩ）を製造することができる。精製工程としては、特に限定されるものではなく、通常用いられる工程を採用することができる。
【０１２６】
前記ブロック共重合体（ＩＩ）のポリアミノ酸セグメントとして、好ましく用いられるポリグルタミン酸の合成方法は、前述の合成例におけるＮ−カルボニルアスパラギン酸無水物に代えて、Ｎ−カルボニルグルタミン酸無水物を用いてポリグルタミン酸を得て、その後、該炭化水素基含有化合物を導入させれば、ポリアミノ酸セグメントがポリグルタミン酸のブロック型共重合体（ＩＩ）を合成することができる。
【０１２７】
本発明は、前記グルタミン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩（Ｉ）並びに前記ブロック共重合体（ＩＩ）を含有する組成物に関する。
本発明の組成物は該グルタミン酸誘導体（Ｉ）と該ブロック共重合体（ＩＩ）を混合したものである。その混合比率は任意に調整し得るものである。該ブロック共重合体（ＩＩ）は医薬製剤の添加剤に相当する化合物であり、特に薬理活性を有することがない限り、その使用量の上限は、医薬品としての使用利便性を考慮して設定して良い。好ましくは、それぞれの成分の質量比で（Ｉ）：（ＩＩ）で１：０．５〜１００で組み合わせることが好ましい。より好ましくはで１：０．５〜５０であり、１：１〜５０であることがより好ましく、１：２〜２０で組み合わせることが特に好ましい。
【０１２８】
本発明の組成物は、前記グルタミン酸誘導体（Ｉ）並びに前記ブロック共重合体（ＩＩ）が相互作用による複合体を形成する態様で用いることが好ましい。
前記ブロック共重合体（ＩＩ）のような両親媒性ポリマーを医薬品の担体として利用し、薬物動態を改善することにより、薬効向上及び／又は副作用低減を達成させる医薬組成物とする方法が知られている。これらの医薬組成物は、有効成分である医薬化合物と該両親媒性ポリマーとが相互作用に基づく複合体を形成して一体となることにより、特異な薬物動態を奏しているものと考えられる。したがって、本発明の組成物も、斯様な複合体形成を指向した調製方法より得られる組成物であることが好ましい。
【０１２９】
両親媒性ポリマーを医薬製剤担体として用いた医薬組成物の調製方法としては、例えば、特許第２７７７５３０号公報に記載の下記のａ）〜ｃ）の方法や、特開２００１−２２６２９４号公報に記載の下記ｄ）の方法が知られている。
ａ）攪拌による薬物の封入法
疎水性薬物を、必要により水混和性の有機溶媒に溶解して、ブロック共重合体分散水溶液攪拌混合する方法。なお、攪拌混合時に加熱することも可能である。
ｂ）溶媒揮散法
疎水性薬物の水非混和性の有機溶媒溶液と、ブロック共重合体分散水溶液とを混合し、攪拌しながら有機溶媒を揮散させる方法。
ｃ）透析法
水混和性の有機溶媒に疎水性薬物及びブロック共重合体を分散溶解した後、得られる溶液を透析膜により緩衝液及び／又は水に対して透析する方法。
ｄ）乳化揮散法
水非混和性の有機溶媒に疎水性薬物及びブロック共重合体を分散溶解して得られる溶液を水と混合した後、攪拌して水中（Ｏ／Ｗ）型エマルジョンを形成し、次いで有機溶媒を揮散させる方法。
【０１３０】
また、特開２００３−３４２１６８号公報や非特許文献（例えば、Ｐａｒｋｅｔ．  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙｔｏｗａｒｄ  Ｎｅｗ  Ｍｅｌｌｅｎｉｕｍ，  ２０００，  ３２１−３３２；Ｌａｖａｓａｎｉｆａｒｅｔ．  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ７７（２００１）１５５−１６０）には下記方法ｅ）が記載されている。
ｅ）固溶体法
疎水性薬物とブロック共重合体を有機溶媒に溶解し、両者を均一に混合した後溶媒を留去して固溶体を調製する。次いで固溶体を４０〜６０℃で水に溶解させることで調製する方法。
【０１３１】
上記の組成物調製方法において有機溶媒を使用する場合、蒸発又は透析により除去可能なものであれば制限されずに用いることができる。好ましい使用溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、酢酸、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、アセトン、メタノール、エタノール、２−プロパノール、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）、酢酸メチル、酢酸エチル、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン等又はそれらの混合溶媒を挙げられる。
これらの有機溶媒の使用量は、薬剤やブロック共重合体が溶解できる量であれば特に問題なく、その調製態様に応じて適宜設定すれば良い。
【０１３２】
本発明の組成物を調製する場合、上述のとおりいくつかの方法があり、何れの方法でも特に制限されるものではないが、一例として上記ｅ）固溶体法による調製方法を以下に示す。
それぞれ所定量のグルタミン酸誘導体（Ｉ）とブロック共重合体（ＩＩ）を１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）等の揮発性有機溶媒に分散溶解する。溶媒は単一溶媒であっても良く、溶解を促すために他の揮発性溶媒と混合して用いても良い。必要であれば少量の水を混和してもよい。分散溶解は、グルタミン酸誘導体の安定性を考慮して任意に溶媒の沸点まで加熱しても良い。好ましくは、常温以下、溶媒の凝固点を超える温度で溶質を均質撹拌することにより溶解させる。
十分に分散溶解した後に、該揮発性有機溶媒を必要により減圧下で蒸散除去する。本発明では、溶媒は必ずしも完全に除去する必要はないが、溶媒除去後の残存物がペースト状ないし固形状を保つようになればよい。
グルタミン酸誘導体（Ｉ）とブロック共重合体（ＩＩ）が一体となった固溶体を、水性媒体と混合（該固溶体に水性媒体を加えるか、または水性媒体に固溶体を加えてもよい）する。該水性媒体は、水を用いることが好ましく、医薬製剤として用いられえる製剤添加剤を含む水溶液であっても良い。例えば、リン酸やクエン酸緩衝剤を含む緩衝水溶液、グルコース、マルトース、乳糖等の糖類の水溶液、生理食塩水等の無機塩水溶液、及びこれらの添加剤が混合した水溶液であっても良い。該固溶体と水性媒体の量比は、分散可能な適当量であれば特に制限されるものではないが、質量／容量（ｗ／ｖ）比で１：１０〜１０００の範囲で調製すれば良い。
これを、適当な温度、例えば４０℃以下、好ましくは３０℃以下の温度で撹拌する。必要により、超音波処理をしてもよい。この撹拌は、グルタミン酸誘導体（Ｉ）及びブロック共重合体（ＩＩ）を含む固溶体が、ほぼ完全に均一分散されるのに十分な時間行われる。グルタミン酸誘導体及びブロック共重合体の種類や含有量によって、均一分散される時間は変動するので限定されない。その後、得られた均一分散溶液はそのまま、あるいは不溶物や析出物を濾過処理してもよい。使用する濾過膜に制限はないが、好まくは孔径が０．１〜１μｍ程度の膜である。以上の方法で、グルタミン酸誘導体（Ｉ）及びブロック共重合体（ＩＩ）が相互作用を及ぼし得る好ましい態様の本発明に係る組成物を溶液状態として調製することできる。なお、更にこの溶液状態の組成物は、任意に濃縮処理や限外濾過処理により、所定の濃度に脳出することができる。また、更なる溶媒溜去処理や凍結乾燥により、固体状態の組成物を調製することができる。
【０１３３】
上記の方法により調製された好ましい態様の本発明の組成物は、水溶液中において、会合体を形成していても良い。上記の方法で調製された組成物水溶液は、光散乱粒度測定装置による分析にて、平均粒径として好ましくは１〜１０００ｎｍの粒子として検出される。好ましい態様である場合、平均粒径として１〜５００ｎｍであり、特に好ましくは１〜１００ｎｍの粒径の粒子を形成していることが検出される。
本発明の組成物は、両新媒性のブロック共重合体（ＩＩ）を用いていることから、水性媒体中で疎水性のポリアミノ酸セグメントを内核（コア）として、親水性のポリエチレングリコールセグメントを外殻（シェル）とするコア‐シェル型のミセル様会合体を形成することが考えられる。ここで、疎水的物性のグルタミン酸誘導体（Ｉ）は、疎水性のポリアミノ酸セグメントと相互作用するため、該ミセル様会合体の内核部に取り込まれるように複合体を形成するものと考えられる。本発明の組成物は、グルタミン酸誘導体（Ｉ）とブロック共重合体（ＩＩ）が相互作用を及ぼして複合体を形成する態様であることが好ましい。
【０１３４】
本発明のグルタミン酸誘導体又はその製薬上許容される塩（Ｉ）とブロック共重合体（ＩＩ）を含有する組成物は、生理活性を有するグルタミン酸誘導体（Ｉ）を含有することから、該グルタミン酸誘導体を有効成分とする医薬組成物として用いることができる。
本発明の組成物は、通常は、医薬品として許容される添加剤と併せて医薬製剤を調製し、医薬品として用いることが好ましい。
該添加剤としては、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、流動化剤、コーティング剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、保存剤、矯味剤、着香剤、希釈剤、溶解補助剤等の製薬上許容し得る添加剤が挙げられ、これらと混合して医薬品製剤を調製する。
該製剤としては、粉剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、カプセル剤、注射剤、座剤、軟膏剤等の製剤形態で、経口又は非経口的（全身投与、局所投与等）に安全に投与される。
本発明の製剤は注射剤としての使用が好ましく、通常、水、生理食塩水、５％ブドウ糖又はマンニトール液、水溶性有機溶媒（例えば、グリセロール、エタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ポリエチレングリコール、クレモホール等及びそれらの混合液）並びに水と該水溶性有機溶媒の混合液等が使用される。
【０１３５】
当該組成物の投与量は、投与経路、患者の年齢並びに予防又は治療すべき実際の症状等により異なり、特に限定されるものではない。本発明の組成物は、悪性腫瘍に高発現されるＧＧＴに認識され、生理活性物質を遊離するグルタミン酸誘導体（Ｉ）を含有することから、抗腫瘍剤として用いることが好ましい。
抗腫瘍剤として用いる場合には、例えば成人に経口投与する場合、有効成分として１日０．０１ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０００ｍｇとすることができ、１日１回又は数回に分けて投与できる。また、経静脈投与等の非経口的に投与する場合は、体表面積当りの有効成分として０．０１ｍｇ〜２０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｍ２とすることができ、１日１回又は数回に分けて投与することが好ましい。注射による投与は、静脈、動脈、皮下、患部（腫瘍部）等に行われる。
【実施例】
【０１３６】
次に本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって何ら制限されるものではない。【０１３７】
合成例１〜３、比較例１、２の化合物の検出及び同定、並びに純度測定のためのＬＣ／ＭＳ測定条件は次のとおりである。
機  種  ：島津  ＬＣＭＳ−２０１０Ａ
カラム  ：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、
移動相Ａ：アセトニトリル／ギ酸  （９９．９／０．１）
移動相Ｂ：水／ギ酸  （９９．９／０．１）
グラジェント：時間（分）０．０  ５．５  ６．５  ６．５１  １０．０
Ａ濃度（％）  ５    ９０    ９０        ５        ５
流  速  ：０．３ｍＬ／分【０１３８】
合成例４〜６の化合物の検出及び同定、並びに純度測定のためのＬＣ／ＭＳ測定条件は次のとおりである。
機  種  ：島津  ＬＣＭＳ−２０２０
カラム  ：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、
移動相Ａ：アセトニトリル／ギ酸  （９９．９／０．１）
移動相Ｂ：水／ギ酸  （９９．９／０．１）
グラジェント：時間（分）０．０  ５．５  ６．５  ６．５１  １０．０
Ａ濃度（％）２０    ９０    ９０      ２０      ２０
流  速  ：０．３ｍＬ／分【０１３９】
合成例１
（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）ドキソルビシンの合成
［スキーム５]
【化１７】
2017086392.tif 000019
【０１４０】
合成例１−１
（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエートの合成
（Ｓ）−５−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸（０．１８２ｇ）と４−アミノベンジルアルコール（０．０４９ｇ）の乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）溶液中に、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン  （ＥＥＤＱ）（０．１０３ｇ）を加え、室温で１８時間撹拌した。１規定塩酸を加え、生じた結晶を濾過し、粗生成物として（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．１７３ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ］ｐｐｍ：１．８１−１．９０（１Ｈ，ｍ），２．０１−２．１２（１Ｈ，ｍ），２．４０−２．４６（２Ｈ，ｍ），４．１７−４．４３（９Ｈ，ｍ），７．２２−７．３３（６Ｈ，ｍ），７．３７−７．４４（４Ｈ，ｍ），７．５５（２Ｈ，ｄ），７．６８−７．７６（４Ｈ，ｍ），７．８６−７．９６（５Ｈ，ｍ），９．８９（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：７．３分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：６５３［Ｍ＋Ｈ］＋【０１４１】
合成例１−２
（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエートの合成
（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．１４５ｇ）とピリジン（０．０４４８ｍＬ）の乾燥テトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液中に、０℃で４−ニトロフェニルクロロホルメート（０．０８９ｇ）の乾燥テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）溶液を滴下して加え、室温で１８時間撹拌した。水を加えた後、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧下で留去し、粗生成物として（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．１３０ｇ）を得た。
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：８．１分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：８４０［Ｍ＋Ｎａ］＋【０１４２】
合成例１−３
（（（（４−（（Ｓ）−５−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）−４−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）ドキソルビシンの合成
粗製の（Ｓ）−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル  ２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．０５ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）に溶解し、塩酸ドキソルビシン（０．０３ｇ）を加えた後、ジイソプロピルエチルアミン（０．１３ｍＬ）を加えた。室温で１５時間撹拌後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下で留去し、粗生成物として（（（（４−（（Ｓ）−５−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）−４−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）ドキソルビシン（０．０９ｇ）を得た。
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：７．８分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：１２４５［Ｍ＋Ｎａ］＋【０１４３】
合成例１−４
（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）ドキソルビシンの合成
粗製の（（（（４−（（Ｓ）−５−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）−４−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）ドキソルビシン（０．０８５ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．１７２５ｍＬ）に溶解し、氷冷下ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１０％、０．２７５ｍＬ）を滴下し、３０分撹拌した。水（４ｍＬ）を加え、混合溶液を分取ＨＰＬＣで精製し、（（（４−（４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）ドキソルビシン（合成例１、０．０２５ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ］ｐｐｍ：１．１１（３Ｈ，ｄ），１．３７−１．５１（２Ｈ，ｍ），１．７６−１．９２（４Ｈ，ｍ），２．０７−２．２２（２Ｈ，ｍ），２．６２−２．６９（１Ｈ，ｍ），２．９８−３．１２（３Ｈ，ｍ），３．１９−３．２８（１Ｈ，ｍ），３．６７−３．７６（１Ｈ，ｍ），３．９８（３Ｈ，ｓ），４．１０−４．１７（１Ｈ，ｍ），４．５６（２Ｈ，ｓ），４．６９−４．７３（１Ｈ，ｍ），４．８７−４．９８（５Ｈ，ｍ），５．２２（１Ｈ，ｓ），５．４６（１Ｈ，ｓ），６．８４（１Ｈ，ｄ），７．２３（２Ｈ，ｄ），７．５３（２Ｈ，ｄ），７．６３（１Ｈ，ｄ），７．８８−７．９５（２Ｈ，ｍ），１０．４２（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：４．０分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：８２２［Ｍ＋Ｈ］＋【０１４４】
合成例２
（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−１０−オキシ−７−エチルカンプトテシンの合成
［スキーム６］
【化１８】
2017086392.tif 000020
【０１４５】
合成例２−１
ｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエートの合成
（Ｓ）−５−（ｔ−ブトキシ）−４−（（ｔ−ブトキシ）カルボニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸（１．００ｇ）と４−アミノベンジルアルコール（０．４８７ｇ）の乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液中に、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン  （ＥＥＤＱ）（１．０１９ｇ）を加え、室温で１８時間撹拌した。１規定塩酸を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をジエチルエーテルで洗浄し、ｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．８９０ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ］ｐｐｍ：１．４６（９Ｈ，ｓ），１．４７（９Ｈ，ｓ），１．８２−１．８９（１Ｈ，ｍ），２．２７−２．３０（２Ｈ，ｍ），２．４４（２Ｈ，ｔ），４．２１−４．２４（１Ｈ，ｍ），４．６６（２Ｈ，ｓ），５．３５−５．３７（１Ｈ，ｍ），７．３３（２Ｈ，ｄ），７．６２（２Ｈ，ｄ），８．８７（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：５．５分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：４３１［Ｍ＋Ｎａ］＋【０１４６】
合成例２−２
ｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエートの合成
ｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．１０ｇ）とピリジン（０．０４９４ｍＬ）の乾燥テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）溶液中に、０℃で４−ニトロフェニルクロロホルメート（０．０９８７ｇ）の乾燥テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）溶液を滴下して加え、室温で２時間撹拌した。クエン酸水溶液を加えた後、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、ｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．０３８ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ］ｐｐｍ：１．４６（９Ｈ，ｓ），１．４８（９Ｈ，ｓ），１．７９−１．９０（１Ｈ，ｍ），２．２６−２．２８（１Ｈ，ｍ），２．４５（２Ｈ，ｔ），４．２０−４．２８（１Ｈ，ｍ），５．２６（２Ｈ，ｓ），５．３８−５．４０（１Ｈ，ｍ），７．３７（２Ｈ，ｄ），７．４１（２Ｈ，ｄ），７．６９（２Ｈ，ｄ），８．２７（２Ｈ，ｄ），９．１５（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：７．１分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：５９６［Ｍ＋Ｎａ］＋【０１４７】
合成例２−３
（（（４−（（Ｓ）−５−（ｔ−ブトキシ）−４−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−１０−オキシ−７−エチルカンプトテシンの合成
ｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．１２５ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（８ｍＬ）に溶解し、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（０．０８５５ｇ）を加えた後、ジイソプロピルエチルアミン（０．３７ｍＬ）を加えた。室温で１８時間撹拌後、水を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下で留去し、粗生成物として（（（４−（（Ｓ）−５−（ｔ−ブトキシ）−４−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−１０−オキシ−７−エチルカンプトテシン（０．２２７ｇ）を得た。
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：６．６分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：８２７［Ｍ＋Ｈ］＋【０１４８】
合成例２−４
（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−１０−オキシ−７−エチルカンプトテシンの合成
粗製の（（（（４−（（Ｓ）−５−（ｔ−ブトキシ）−４−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−１０−オキシ−７−エチルカンプトテシン（０．０２ｇ）に４規定塩酸ジオキサン溶液（２．０ｍＬ）に溶解し、３０分撹拌した。溶媒を留去し、水（４ｍＬ）を加え、混合溶液を分取ＨＰＬＣで精製し、（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）−１０−オキシ−７−エチルカンプトテシン（合成例２、０．００１５ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ］ｐｐｍ：０．８８（３Ｈ，ｔ），１．２９（３Ｈ，ｔ），１．８４−２．１１（６Ｈ，ｍ），３．１６−３．２９（３Ｈ，ｍ），５．２８（２Ｈ，ｓ），５．３６（２Ｈ，ｓ），５．４５（２Ｈ，ｓ），６．５５（１Ｈ，ｓ），７．３４（１Ｈ，ｓ），７．４４（２Ｈ，ｄ），７．６５（２Ｈ，ｄ），７．７８−７．８０（１Ｈ，ｍ），８．１８−８．２５（２Ｈ，ｍ），１０．２１（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：３．９分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：６７１［Ｍ＋Ｈ］＋【０１４９】
合成例３
（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）カンプトテシンの合成
［スキーム７］
【化１９】
2017086392.tif 000021
【０１５０】
合成例３−１
（（（４−（（Ｓ）−５−（ｔ−ブトキシ）−４−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）カンプトテシンの合成
カンプトテシン（０．０５０ｇ）とトリホスゲン（０．０１５８ｇ）の乾燥ジクロロメタン（６ｍＬ）懸濁液に、ジメチルアミノピリジン（０．０５６１ｇ）のジクロロメタン（２ｍＬ）溶液をゆっくり滴下した。３０分撹拌後、ｔ−ブチル  （Ｓ）−２−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．０５９ｇ）を加え、室温で１８時間撹拌した。１規定塩酸（５０ｍＬ）を加え、ジクロロメタンで２回抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、粗生成物として（（（４−（（Ｓ）−５−（ｔ−ブトキシ）−４−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）カンプトテシン（０．１０８ｇ）を得た。
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：６．８分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：８０５［Ｍ＋Ｎａ］＋【０１５１】
合成例３−２
（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）カンプトテシンの合成
粗製の（（（４−（（Ｓ）−５−（ｔ−ブトキシ）−４−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）カンプトテシン（０．０２８ｇ）に４規定塩酸酢酸エチル溶液（３．０ｍＬ）に０℃で溶解し、３時間撹拌した。溶媒を留去し、得られた残渣を分取ＨＰＬＣで精製し、（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）カンプトテシン（合成例３、０．００１７ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ］ｐｐｍ：０．９０（３Ｈ，ｔ），１．９０−１．９７（３Ｈ，ｍ），２．１３−２．２１（３Ｈ，ｍ），３．１６−３．２８（１Ｈ，ｍ），５．０９（２Ｈ，ｑ），５．３３（２Ｈ，ｓ），５．５２（２Ｈ，ｓ），７．０２（１Ｈ，ｓ），７．２７（２Ｈ，ｄ），７．５３（２Ｈ，ｄ），７．７４（１Ｈ，ｔ），７．８９（１Ｈ，ｔ），８．１５−８．２１（２Ｈ，ｍ），８．７３（１Ｈ，ｓ），１０．２９（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：３．９分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：６２７［Ｍ＋Ｈ］＋【０１５２】
合成例４
（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）エピルビシンの合成
［スキーム８］
【化２０】
2017086392.tif 000022
【０１５３】
合成例４−１
アリル  （Ｓ）−２−（アリルオキシカルボニルアミノ）−５−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエートの合成
アリル  （Ｓ）−２−（（アリルオキシカルボニル）アミノ）−５−（（４−（ヒドロキシメチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．４００ｇ）とピリジン（０．２１４ｍＬ）の乾燥テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）溶液中に、０℃で４−ニトロフェニルクロロホルメート（０．４２８ｇ）の乾燥テトラヒドロフラン（１ｍＬ）溶液を滴下して加え、室温で１８時間撹拌した。１規定塩酸（１０ｍＬ）を加えた後、酢酸エチルで抽出し、有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、アリル  （Ｓ）−２−（（アリルオキシカルボニル）アミノ）−５−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．６３３ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ］ｐｐｍ：１．９６−２．０８（１Ｈ，ｍ），２．３４−２．４４（１Ｈ，ｍ），２．４８−２．５３（２Ｈ，ｍ），４．４２−４．５０（１Ｈ，ｍ），４．６２（２Ｈ，ｄ），４．７０（２Ｈ，ｄ），５．２４−５．３９（６Ｈ，ｍ），５．６３（１Ｈ，ｂｒｄ），５．８６−５．９７（２Ｈ，ｍ），７．３９（２Ｈ，ｄ），７．４３（２Ｈ，ｄ），７．６５（２Ｈ，ｄ），８．３０（２Ｈ，ｄ），８．４１（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：６．６分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：５６４［Ｍ＋Ｎａ］＋【０１５４】
合成例４−２
（（（４−（（Ｓ）−５−アリル−４−（アリルオキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）エピルビシンの合成
アリル  （Ｓ）−２−（アリルオキシカルボニルアミノ）−５−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．１３０ｇ）及びエピルビシン塩酸塩（０．１２７ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（０．０９２８ｍＬ）を加えた。室温で６時間撹拌後、反応液をジイソプロピルエーテル（２００ｍＬ）に滴下して加えた。生じた固体をクロロホルムに溶解し、溶媒を減圧下で留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１）で精製し、（（（４−（（Ｓ）−５−アリル−４−（アリルオキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）エピルビシン（０．２２２ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ］ｐｐｍ：１．１８（３Ｈ，ｄ），１．５３−１．６４（１Ｈ，ｍ），１．７９−１．９１（２Ｈ，ｍ），２．０２−２．２４（３Ｈ，ｍ），２．３８−２．４６（２Ｈ，ｍ），２．９０−３．０２（３Ｈ，ｍ），３．４９−３．５９（１Ｈ，ｍ），３．８４−３．９３（１Ｈ，ｍ），３．９８（３Ｈ，ｓ），４．０６−４．１３（１Ｈ，ｍ），４．４５―４．４９（２Ｈ，ｍ），４．５３−４．６１（４Ｈ，ｍ），４．８３−４．８８（３Ｈ，ｍ），４．９３−４．９８（２Ｈ，ｍ），５．１６−５．２３（３Ｈ，ｍ），５．２６−５．３４（２Ｈ，ｍ），５．４９（１Ｈ，ｓ），５．８３−５．９６（２Ｈ，ｍ），７．０２（１Ｈ，ｄ），７．２３（２Ｈ，ｄ），７．５３（２Ｈ，ｄ），７．６５（１Ｈ，ｔ），７．７５（１Ｈ，ｄ），７．９１（２Ｈ，ｄ），９．９３（１Ｈ，ｓ），１３．２７（１Ｈ，ｂｒｓ），１４．０３（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：６．２分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：９６８［Ｍ＋Ｎａ］＋【０１５５】
合成例４−３
（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）エピルビシンの合成
（（（４−（（Ｓ）−５−アリル−４−（アリルオキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）エピルビシン（０．２００ｇ）をジクロロメタン（４．５ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）に溶解し、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０．０１２ｇ）及びフェニルシラン（０．０２６ｍＬ）を加え、アルゴン雰囲気下、３０分撹拌した。反応液を１０％メタノール含有ジイソプロピルエーテル（４５０ｍＬ）に滴下して加えた。生じた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／水＝１３／６／１）で精製し、（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）エピルビシン（合成例４、０．０８０ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ］ｐｐｍ：
１．１８（３Ｈ，ｄ），１．５２−１．６７（１Ｈ，ｍ），１．８０−１．９７（３Ｈ，ｍ），２．１３−２．２３（２Ｈ，ｍ），２．９０−３．０５（３Ｈ，ｍ），３．１５−３．２３（２Ｈ，ｍ），３．４９−３．６１（１Ｈ，ｍ），３．８４−３．９３（１Ｈ，ｍ），３．９９（３Ｈ，ｓ），４．５６（２Ｈ，ｓ），４．８７（２Ｈ，ｓ），４．９２−５．０１（２Ｈ，ｍ），５．２１（１Ｈ，ｓ），５．５１（１Ｈ，ｓ），７．０３（１Ｈ，ｄ），７．２３（２Ｈ，ｄ），７．５４（２Ｈ，ｄ），７．６６（１Ｈ，ｔ），７．９１（２Ｈ，ｄ），１０．３６（１Ｈ，ｓ），１４．０４（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：４．４分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：８２２［Ｍ＋Ｈ］＋【０１５６】
合成例５
（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）シタラビンの合成
［スキーム９］
【化２１】
2017086392.tif 000023
【０１５７】
合成例５−１
（（（４−（（Ｓ）−５−アリル−４−（アリルオキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）シタラビンの合成
アリル  （Ｓ）−２−（アリルオキシカルボニルアミノ）−５−（（４−（（（（４−ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）フェニル）アミノ）−５−オキソペンタノエート（０．０３０ｇ）をテトラヒドロフラン（１．８５ｍＬ）に溶解し、シタラビン（０．０１４ｇ）を加えた後、１規定水酸化ナトリウム水溶液（０．１５ｍＬ）を加えた。室温で３時間撹拌後、酢酸エチルを加え有機層を得た。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下で留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝２０／１から５／１）で精製し，（（（４−（（Ｓ）−５−アリル−４−（アリルオキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）シタラビン（０．０１６ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ］ｐｐｍ：１．７９−１．９３（１Ｈ，ｍ），２．０２−２．３４（１Ｈ，ｍ），３．４９−３．６３（２Ｈ，ｍ），４．０５−４．１６（１Ｈ，ｍ），４．４７（２Ｈ，ｄ），４．６０（２Ｈ，ｄ），４．９２−５．０９（３Ｈ，ｍ），５．１６−５．３４（４Ｈ，ｍ），５．６８（１Ｈ，ｄ），５．８３（１Ｈ，ｄ），５．８４−５．９７（２Ｈ，ｍ），６．１７（１Ｈ，ｄ），７．２４（２Ｈ，ｄ），７．５６（２Ｈ，ｄ），７．６３（１Ｈ，ｄ），７．７６（１Ｈ，ｄ），１０．００（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：３．６分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：６４６［Ｍ＋Ｈ］＋【０１５８】
合成例５−２
（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）シタラビンの合成
（（（４−（（Ｓ）−５−アリル−４−（アリルオキシカルボニルアミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）シタラビン（０．０１６ｇ）をジクロロメタン（２．０ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下，テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）（０．００２８ｇ）及びフェニルシラン（０．００３０ｍＬ）を加え，室温で４５分撹拌した後、そのまま１８時間静置した。溶媒を留去し、残渣を分取ＨＰＬＣで精製し、（（（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）シタラビン（合成例５、０．００１５ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ］ｐｐｍ：２．０２−２．１４（２Ｈ，ｍ），３．５３−３．６５（２Ｈ，ｍ），３．７３−３．８１（１Ｈ，ｍ），３．９０−３．９９（１Ｈ，ｍ），４．０６−４．１２（１Ｈ，ｍ），４．９４−５．１１（４Ｈ，ｍ），５．７１−５．５．７５（１Ｈ，ｍ），５．８２−５．８５（１Ｈ，ｍ），６．１６（１Ｈ，ｄ），７．２５（２Ｈ，ｄ），７．５７（２Ｈ，ｄ），７．９５（１Ｈ，ｓ），８．０５−８．３０（２Ｈ，ｍ），１０．０８（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：０．８分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：５２２［Ｍ＋Ｈ］＋【０１５９】
合成例６
１０−（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジルオキシ）−７−エチルカンプトテシン  ２トリフルオロ酢酸塩の合成
［スキーム１０］
【化２２】
2017086392.tif 000024
【０１６０】
合成例６−１
５−（（４−ヒドロキシメチル）ベンジルアミノ）−１−（ｔ−ブチル）  Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタメートの合成
１−ｔ−ブチル  Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタメート（１．００ｇ）と４−アミノベンジルアルコール（０．４８７ｇ）の乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）溶液中に、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン  （ＥＥＤＱ）（１．０１９ｇ）を加え、室温で１８時間撹拌した。１規定塩酸を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を留去し、残渣をジエチルエーテルで洗浄し、５−（（４−ヒドロキシメチル）ベンジルアミノ）−１−（ｔ−ブチル）  Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタメート（０．８９０ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ］ｐｐｍ：１．４６（９Ｈ，ｓ），１．４７（９Ｈ，ｓ），１．８２−１．８９（１Ｈ，ｍ），２．２７−２．３０（２Ｈ，ｍ），２．４４（２Ｈ，ｔ），４．２１−４．２４（１Ｈ，ｍ），４．６６（２Ｈ，ｓ），５．３５−５．３７（１Ｈ，ｍ），７．３３（２Ｈ，ｄ），７．６２（２Ｈ，ｄ），８．８７（１Ｈ，ｂｒｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：５．６分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：４３１［Ｍ＋Ｎａ］＋【０１６１】
合成例６−２
５−（（４−クロロメチル）ベンジルアミノ）−１−（ｔ−ブチル）  Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタメートの合成
アルゴン雰囲気中、氷冷撹拌下、５−（（４−ヒドロキシメチル）ベンジルアミノ）−１−（ｔ−ブチル）  Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタメート（８８ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）の乾燥ジクロロメタン（４．３ｍＬ）溶液中に、ジイソプロピルエチルアミン（０．０７３ｍL、０．４３ｍｍｏｌ）、及び、メタンスルホニルクロリド（０．０２５ｍL、０．３２ｍｍｏｌ）をこの順で加え、氷冷下２時間５分撹拌した。反応液に酢酸エチル（４０ｍＬ）を加えて希釈し、０．３モル炭酸水素ナトリウム水溶液（３ｍＬ）−水（１０ｍL）、水（１０ｍL)、及び、食塩水（１０ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾去、減圧下溶媒を留去して、５−（（４−クロロメチル）ベンジルアミノ）−１−（ｔ−ブチル）  Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタメート（８３．７ｍｇ）を得た。このものを、精製することなく次の縮合反応に用いた。【０１６２】
合成例６−３
１０−（（（４−（（Ｓ）−５−（ｔ−ブトキシ）−４−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジルオキシ）−７−エチルカンプトテシンの合成
アルゴン雰囲気中、室温撹拌下、７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン（ＥＨＣ  ２９ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）の乾燥ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）懸濁液中に、炭酸セシウム（２４ｍｇ、０．０７４ｍｍｏｌ）を加え、得られた淡黄色懸濁液を室温で９分撹拌して、橙色均一溶液とした。次いで、室温撹拌下、粗製の５−（（４−クロロメチル）ベンジルアミノ）−１−（ｔ−ブチル）  Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタメート（３６ｍｇ，０．０８４ｍｍｏｌ）の乾燥ジメチルホルムアミド（１．５ｍＬ）溶液を加え、得られた橙色溶液を室温で２時間４０分、次いで、氷冷下１．５時間撹拌した。氷冷撹拌下、反応液に酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて希釈し、塩化アンモニウム水溶液（６ｍＬ）を加えて反応を停止した。有機層を分取し，水（８ｍL、２回)、及び、食塩水（６ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを濾去、減圧下溶媒を留去して、淡黄色固体（６１ｍｇ）を得た。このものを，分取薄層クロマトグラフィー（シリカゲル，酢酸エチル）により精製し、１０−（（（４−（（Ｓ）−５−（ｔ−ブトキシ）−４−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジルオキシ）−７−エチルカンプトテシン（１９ｍｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ］ｐｐｍ：１．０３３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．３５３（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），１．４５９（９Ｈ，ｓ），１．４７３（９Ｈ，ｓ），１．８０−１．９５（３Ｈ，ｍ），２．２８９（１Ｈ、ｍ），２．４５３（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．１０８ （２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．７Ｈｚ），３．８２８（１Ｈ，ｓ），４．２２９（１Ｈ，ｍ），５．２０５（２Ｈ，ｓ），５．２２０（２Ｈ，ｓ），５．２９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ），５．３８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），５．７４５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，７．３６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ），７．４６３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．５１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２．６Ｈｚ），７．６００（１Ｈ，ｓ），７．６９３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），８．１２５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ），９．０６２（１Ｈ，ｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：６．９分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ、ＮＥＧ）：７８１［Ｍ−Ｈ］−【０１６３】
合成例６−４
１０−（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジルオキシ）−７−エチルカンプトテシン  ２トリフルオロ酢酸塩の合成
アルゴン雰囲気中、氷冷撹拌下、１０−（（（４−（（Ｓ）−５−（ｔ−ブトキシ）−４−（（ｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ベンジルオキシ）−７−エチルカンプトテシン（３３．７ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロエタン（３ｍＬ）溶液中に、トリフロロ酢酸（１ｍL）を加え、得られた黄色溶液を、氷冷下５分、次いで室温（２１°Ｃ）で２時間撹拌した。反応液を減圧乾固し、残査に１，２−ジクロロエタン（８ｍＬ）を加えて再度減圧乾固して、黄色固体（４１ｍｇ）を得た。このものに、ジメチルホルムアミド（１ｍL)、アセトニトリル（ＭｅＣＮ、７ｍL)、及び、水（４ｍL)を加えて溶解し、得られた溶液（１２ｍL)を分取液体クロマトグラフィーにより分離精製した（４ｍL、３回）。不純物を含まない画分を合して減圧下溶媒を留去し、１０−（４−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ベンジルオキシ）−７−エチルカンプトテシン  ２トリフルオロ酢酸塩（合成例６、２１．８ｍｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ］ｐｐｍ：０．８７４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．２７２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．８６４（２Ｈ，ｍ），２．０８２（２Ｈ，ｍ），２．５６６（ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ），３．１８５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．９８０（ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ），５．２９９，５．３０９，５．４２９（ｅａｃｈ  ２Ｈ，ｓ），６．５０（１Ｈ，ｂ），７．２６９（１Ｈ，ｓ），７．４７−７．６５（６Ｈ，ｍ），８．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），８．２６２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ），１０．１０５（１Ｈ，ｓ），１３．９（１Ｈ，ｂ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：４．１分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：６２８［Ｍ＋２Ｈ］＋【０１６４】
比較例１
（Ｓ）−（４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ドキソルビシンの合成
比較例１−１
（Ｓ）−５−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）−４−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−オキソペンタン酸（０．１００ｇ）、ドキソルビシン塩酸塩（０．０９５ｇ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（３ｍｇ）及びトリエチルアミン（０．０２４ｍＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解し、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（０．１００ｇ）を加え、室温で２２時間撹拌した。水（４０ｍＬ）を加え、生じた析出物を濾過した。析出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、（４−（（Ｓ）−５−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）−４−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ドキソルビシン（０．０９０ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ］ｐｐｍ：１．１３（３Ｈ，ｄ），１．４２−１．５４（１Ｈ，ｍ），１．６４−１．９４（３Ｈ，ｍ），２．０６−２．２５（４Ｈ，ｍ），２．９０−３．０４（２Ｈ，ｍ），３．９０−４．３８（１０Ｈ，ｍ），４．５９（２Ｈ，ｄ），４．７７（１Ｈ，ｄ），４．８８−４．９９（２Ｈ，ｍ），５．２０−５．２６（１Ｈ，ｍ），５．５０（１Ｈ，ｓ），７．２０−７．８９（１９Ｈ，ｍ），１３．２８（１Ｈ，ｓ），１４．０７（１Ｈ，ｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：７．６分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：１０９６［Ｍ＋Ｎａ］＋【０１６５】
比較例１−２
（４−（（Ｓ）−５−（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）−４−（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）−５−オキソペンタナミド）ドキソルビシン（０．０２０ｇ）をジクロロメタン（０．１３６５ｍＬ）に溶解し、ピペリジンのジクロロメタン溶液（１０％ｖ／ｖ，０．６３５ｍＬ）を０℃で加え、３．５時間撹拌した。ジクロロメタン（１ｍＬ）を加えた後、ピペリジンのジクロロメタン溶液（１０％ｖ／ｖ，０．０１５８ｍＬ）を０℃で加え、２時間撹拌を続けた。析出物を濾過し、酢酸エチルで洗浄した。得られた析出物を分取ＨＰＬＣで精製し、（Ｓ）−（４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）ドキソルビシン（比較例１、０．００２１ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ＴＭＳ］ｐｐｍ：１．１７（３Ｈ，ｄ），１．６１−１．７４（１Ｈ，ｍ），１．７６−１．９３（２Ｈ，ｍ），１．９４−２．０４（２Ｈ，ｍ），２．１１−２．２０（１Ｈ，ｍ），２．２４−２．５０（３Ｈ，ｍ），２．６６−２．７８（１Ｈ，ｍ）３．５９（２Ｈ，ｍ），３．７５（３Ｈ，ｓ），３．９９−４．１６（２Ｈ，ｍ），５．２５（１Ｈ，ｍ），７．０２−７．１５（２Ｈ，ｍ），７．３５−７．４２（１Ｈ，ｍ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：３．８分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：６７３［Ｍ＋Ｈ］＋【０１６６】
比較例２
９−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）カンプトテシンの合成
［スキーム１１］
【化２３】
2017086392.tif 000025
【０１６７】
比較例２−１
（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ−５−オキソペンタン酸（０．１７３ｇ）を９−アミノカンプトテシン（０．０９０ｇ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）溶液に加えた後、ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．００５ｇ）及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（０．２９７ｇ）を加え、室温で２時間撹拌後、２日間静置した。水（１０ｍＬ）を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧下留去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／５から０／１）で精製し、９−（（４−（（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ−５−オキソ）ペンタナミド）カンプトテシン（０．０２４ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ］ｐｐｍ：０．８９（３Ｈ，ｔ），１．８１−２．０２（４Ｈ，ｍ），２．１３−２．２９（１Ｈ，ｍ），２．５８−２．７０（２Ｈ，ｍ），４．２２−４．３０（１Ｈ，ｍ），５．０８（２Ｈ，ｄ），５．１７（２Ｈ，ｓ），５．２８（２Ｈ，ｓ），５．４４（２Ｈ，ｓ），６．５６（１Ｈ，ｓ），７．２３−７．４０（１１Ｈ，ｍ），７．７６−７．８７（２Ｈ，ｍ），７．９２（１Ｈ，ｄ），８．０３（１Ｈ，ｄ），８．７５（１Ｈ，ｓ），１０．２０（１Ｈ，ｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：５．８分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：７１７［Ｍ＋Ｈ］＋【０１６８】
比較例２−２
９−（（４−（（Ｓ）−５−（ベンジルオキシ）−４−（ベンジルオキシカルボニル）アミノ−５−オキソ）ペンタナミド）カンプトテシン（０．０２０ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム炭素（０．００５ｇ）を加え、水素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応液をセライト濾過し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）と水（８ｍＬ）の混合溶液で洗浄した。濾液を分取ＨＰＬＣで精製し、９−（（Ｓ）−４−アミノ−４−カルボキシブタンアミド）カンプトテシン（０．０１２ｇ）を得た。
ＮＭＲ［４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ＴＭＳ］ｐｐｍ：０．８６（３Ｈ，ｔ），１．８５（２Ｈ，ｑ），２．２６（２Ｈ，ｑ），２．７１−２．８２（２Ｈ，ｍ），３．９７（１Ｈ，ｍ），５．２４−５．３５（２Ｈ，ｍ），７．２１（１Ｈ，ｓ），７．３９−７．４４（１Ｈ，ｍ），７．４９（２Ｈ，ｄ），８．３０（１Ｈ，ｓ）．
ＬＣ／ＭＳ  保持時間：１．２分；ｍ／ｚ（ＥＳＩ，ＰＯＳ）：４９３［Ｍ＋Ｈ］＋【０１６９】
試験例１；γ‐グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）酵素認識試験
合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体（０．４９ｍｇ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（０．２９８ｍＬ）に溶解し、２ｍＭドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体ＰＢＳ溶液を調製した。
該ドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体（プロドラッグ）ＰＢＳ溶液０．１５０ｍＬに、ＧＧＴ（０．２２ｍｇ、８Ｕ／ｍｇ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をＰＢＳ（０．８８０ｍＬ）に溶解した２Ｕ／ｍＬのＧＧＴ溶液を０．１５０ｍＬ加え、３７℃で反応させた。
反応液をＨＰＬＣ分析することにより、ドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体（プロドラッグ）の残存率及びドキソルビシンの生成率を求めた。結果を表１にまとめた。【０１７０】
【表１】
2017086392.tif 000026
【０１７１】
比較試験例１；ＧＧＴ酵素認識試験
比較例１で得られたドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体（０．１７ｍｇ）を、ＰＢＳ（０．１２６５ｍＬ）に溶解し、２ｍＭドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体ＰＢＳ溶液を調製した。
該ドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体ＰＢＳ溶液０．１００ｍＬに、ＧＧＴ（０．３８ｍｇ、８Ｕ／ｍｇ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をＰＢＳ（１．５２０ｍＬ）に溶解した２Ｕ／ｍＬのＧＧＴ溶液を０．１００ｍＬ加え、３７℃で反応させた。
６時間後、反応液をＨＰＬＣ分析したところ、ドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は９３％残存していた。このことから、比較例１に係るドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体はＧＧＴに認識されず、生理活性物質であるドキソルビシンを遊離することができないことが示された。【０１７２】
試験例１の結果から、合成例１に係るドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴ存在下で速やかに、薬理活性を有するドキソルビシンを遊離できることが示された。一方、比較試験例１は、ドキソルビシンに直接γ−グルタミン酸を結合させた比較例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴによるドキソルビシンの解離反応がほとんど起こらない結果であった。したがって、ＧＧＴの認識による速やかな解離反応には、γ−グルタミン酸結合部位と薬剤との間に、適当なリンカーセグメントを介在させることが必要であり、本発明の芳香族アミド型リンカーセグメントが、優位なＧＧＴ認識能を発揮させることができることが明らかとなった。【０１７３】
試験例２；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液安定性試験
合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体（０．４９ｍｇ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（０．２９８ｍＬ）に溶解し、ドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体ＰＢＳ溶液を調製した。
該ドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体ＰＢＳ溶液０．１４８ｍＬを、ＰＢＳ溶液０．１４８ｍＬに溶解し、３７℃で反応させた。６．５時間後、反応液をＨＰＬＣ分析したところ、ドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体の減少は確認されなかった。
したがって、本発明に係る合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は、ＰＢＳ溶液中においてドキソルビシンを遊離せず、化学的に安定であることが示された。【０１７４】
試験例３；細胞増殖阻害活性試験
ＧＧＴ活性の高いＯＳ−ＲＣ−２細胞（理研バイオリソースセンター）及びＧＧＴ活性の低いＳＫ−ＯＶ−３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を用いて、合成例１に係るドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体の細胞増殖阻害活性を評価した。
９６穴プレートに、ＧＧＴ活性の高いＯＳ−ＲＣ−２細胞及びＧＧＴ活性の低いＳＫ−ＯＶ−３細胞を、それぞれ４，０００  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養後、合成例１に係るドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体を終濃度０．０３９〜１０μＭ添加した。６時間培養後にウェル内を洗浄し、さらに３日間培養後、細胞をメタノールで固定し、メチレンブルー色素を用いて染色した。染色後色素を０．３％塩酸水で抽出し、６６０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度について、化合物を添加しない細胞から測定された吸光度に対する減少率により細胞増殖抑制活性を評価した。
同様の操作により、グルタミン酸誘導体化していないドキソルビシンを用いて、その吸光度から細胞増殖抑制活性を評価した。結果を図１（ＧＧＴ活性の高いＯＳ−ＲＣ−２細胞）及び図２（ＧＧＴ活性の低いＳＫ−ＯＶ−３細胞）に示した。【０１７５】
試験例４；グルタミン酸誘導体化プロドラッグのＧＧＴ依存性の確認試験
ＧＧＴ活性の高いＯＳ−ＲＣ−２細胞を用いて、合成例１に係るドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体（プロドラッグ）の、細胞増殖阻害活性におけるＧＧＴ活性依存性を評価した。
試験例３と同様の方法でＯＳ−ＲＣ−２細胞を播種して1日培養後、ＧＧＴ阻害剤であるＧＧｓＴｏｐ（和光純薬工業株式会社）を終濃度１０μＭ添加し、１時間培養後、合成例１に関わるドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体を終濃度０．０３９〜１０μＭ添加した。６時間培養後にウェル内を洗浄し、さらに３日間培養後、試験例３と同様の方法で細胞増殖抑制活性を評価した。
同様の操作により、グルタミン酸誘導体化していないドキソルビシンを用いて、その吸光度から細胞増殖抑制活性を評価した。結果を図３に示した。【０１７６】
試験例３の結果、ＧＧＴ活性の高いＯＳ−ＲＣ−２細胞において、１０μＭのドキソルビシンを添加した場合、細胞増殖阻害活性は７７％だった。これに対し、合成例１に係るドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体を１０μＭ添加した場合、７６％の細胞増殖阻害活性を示した。
一方、ＧＧＴ活性の低いＳＫ−ＯＶ−３細胞において、１０μＭのドキソルビシンを添加した場合、細胞増殖阻害活性は７７％だった。これに対し、合成例１に係るドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体を１０μＭ添加した場合、１３％の細胞増殖阻害活性を示した。【０１７７】
ＧＧＴ活性の高い細胞とＧＧＴ活性の低い細胞における細胞増殖阻害活性の結果を比較すると、本発明に係る合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴによりドキソルビシンを遊離し、細胞増殖阻害活性を示すと共に、ＧＧＴが存在しない場合は、細胞増殖阻害活性が低く、殺細胞性をほとんど示さないことが明らかとなった。このことから、合成例１に係るドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴ活性に依存した細胞増殖抑制活性を発揮する物性であることが示された。
また、試験例４の結果、ＧＧＴ活性の高いＯＳ−ＲＣ−２細胞において、ＧＧＴ阻害剤はドキソルビシンの細胞増殖抑制活性に影響を与えなかったが、ドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体の活性を完全に阻害した。このことから、本発明に係るドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴ活性に依存した細胞増殖抑制活性を発揮する物性であることが示された。【０１７８】
試験例５；ＧＧＴ酵素認識試験
試験例１と同様にして、合成例４のエピルビシン結合グルタミン酸誘導体の２ｍＭＰＢＳ溶液及び、２Ｕ／ｍＬのＧＧＴ溶液を用いて、３７℃で反応させた。
反応液を経時的にＨＰＬＣ分析することにより、エピルビシン結合グルタミン酸誘導体は酵素反応によって分解されることが確認され、６時間後のエピルビシン結合グルタミン酸誘導体残存率は５％だった。
このことから、合成例４に係るエピルビシン結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴ存在下で速やかに、薬理活性を有するエピルビシンを遊離できることが示された。【０１７９】
試験例６；ＧＧＴ酵素認識試験
試験例１と同様にして、合成例５で得られたシタラビン結合グルタミン酸誘導体の１ｍＭＰＢＳ溶液及び、２Ｕ／ｍＬのＧＧＴ溶液を用いて、３７℃で反応させた。
反応液を経時的にＨＰＬＣ分析することにより、シタラビン結合グルタミン酸誘導体は酵素反応によって分解されることが確認され、６．５時間後のシタラビン結合グルタミン酸誘導体残存率は３４％だった。
このことから、合成例５に係るシタラビン結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴ存在下で速やかに、薬理活性を有するシタラビンを遊離できることが示された。【０１８０】
比較試験例２；ＧＧＴ酵素認識試験
比較試験例１と同様にして，比較例２で得られた９−アミノカンプトテシン結合グルタミン酸誘導体の２ｍＭのＰＢＳ溶液を調製及び、２Ｕ／ｍＬのＧＧＴ溶液を用いて、３７℃で反応させた。
６時間後、反応液をＨＰＬＣ分析したところ、９−アミノカンプトテシン結合グルタミン酸誘導体は９９％残存していた。このことから、比較例２に係る９−アミノカンプトテシン結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴに認識されず、生理活性物質である９−アミノカンプトテシンを遊離することができないことが示された。
比較例２の９−アミノカンプトテシン結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴによる９−アミノカンプトテシンの解離反応がほとんど起こらない結果であったことから、ＧＧＴの認識による速やかな解離反応には、γ−グルタミン酸結合部位と薬剤との間に、適当なリンカーセグメントを介在させることが必要であり、本発明の芳香族アミド型リンカーセグメントが、優位なＧＧＴ認識能を発揮させることができることが明らかとなった。【０１８１】
試験例７；ＰＢＳ中での安定性試験
合成例２のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体の６０ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ溶液（０．００５ｍＬ）にＰＢＳ（０．２２０ｍＬ）を加えＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体溶液を調製した。該ＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体溶液（０．１００ｍＬ）に、ＰＢＳ（０．１００ｍＬ）を加え、３７℃で反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析することにより、ＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体の残存率を求めたところ、３．５時間後のグルタミン酸誘導体プロドラッグの残存率は５２％であった。
合成例３のカンプトテシン結合グルタミン酸誘導体６．３ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ溶液（０．０７３ｍＬ）にＰＢＳ（０．２９４ｍＬ）を加えカンプトテシン結合グルタミン酸誘導体溶液を調製した。該カンプトテシン結合グルタミン酸誘導体溶液（０．１１７ｍＬ）に、ＰＢＳ（０．１１７ｍＬ）を加え、３７℃で反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析することにより、該グルタミン酸誘導体の残存率を求めたところ、３時間後の該グルタミン酸誘導体の残存率は７４％であった。
合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体０．８６４ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ溶液（０．０５０ｍＬ）に、ＰＢＳ（０．４５０ｍＬ）を加え、３７℃で反応させた。反応液をＨＰＬＣ分析することにより、ＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体の残存率を求めたところ、２４時間後ＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体は９０％残存していた。【０１８２】
試験例８；マウス血漿中での安定性試験
合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体０．８５６ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ溶液（０．０２０ｍＬ）に、マウス血漿（０．１８０ｍＬ）を加え、３７℃で反応させた。
反応液をＨＰＬＣ分析することにより、ＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体の残存率を求めたところ、２４時間後のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体プロドラッグは９４％残存していた。
したがって、本発明に係る合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体は、マウス血漿中においても、化学的に安定であることが示された。【０１８３】
試験例９：ＧＧＴ酵素認識試験
合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体を、ＤＭＳＯに溶解し、０．３４ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。該溶液（０．３００ｍＬ）にＰＢＳ（０．３００ｍＬ）を加え、ＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体溶液（２）を調製した。
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をＰＢＳに溶解し０．２２７ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。
該ＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体溶液（２）（０．２５０ｍＬ）に、ＧＧＴ溶液（０．２５０ｍＬ）を加え、３７℃で反応させた。
反応液をＨＰＬＣ分析することにより、ＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体の残存率及びＥＨＣの生成率を求めた。
試験例９の結果、合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体は、反応１時間で速やかに消失し，ＥＨＣを生成した。この結果は、合成例６の化合物がＧＧＴに認識され、速やかにエーテル結合を介したγ−グルタミル芳香族アミドリンカーを開裂させ、生理活性物質であるＥＨＣを生成できることを示す結果である。【０１８４】
試験例７、８の結果から、合成例６に係るＥＨＣプロドラッグは、ＰＢＳ溶液及びマウス血漿存在下の溶液において、安定な物性であることが示された。さらに、合成例６に係るＥＨＣプロドラッグは、ＧＧＴ存在下で、速やかに薬理活性を有するＥＨＣを遊離できることが示された。【０１８５】
試験例１０；細胞増殖阻害活性試験
ＧＧＴ活性が高いことが知られているＯＳ−ＲＣ−２細胞（理研バイオリソースセンター）及びＧＧＴ活性が低いことが知られているＳＫ−ＯＶ−３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を用いて、合成例６に係るＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体の細胞増殖阻害活性を評価した。
９６穴プレートに、ＧＧＴ高活性のＯＳ−ＲＣ−２細胞及びＧＧＴ低活性のＳＫ−ＯＶ−３細胞を、それぞれ４，０００  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養後、合成例６に係るＥＨＣプロドラッグを、終濃度０．０００１〜１μＭで添加した。６時間培養後にウェル内を洗浄し、さらに３日間培養した。培養後、細胞をメタノールで固定し、メチレンブルー色素を用いて染色した。染色後色素を０．３％塩酸水で抽出し、６６０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度について、化合物を添加しない細胞から測定された吸光度に対する減少率により細胞増殖抑制活性を評価した。
同様の操作により、合成例６の有効成分であるＥＨＣをそのまま用いて、その吸光度から細胞増殖抑制活性を評価した。
結果を図４（ＧＧＴ高活性のＯＳ−ＲＣ−２細胞）及び図５（ＧＧＴ低活性のＳＫ−ＯＶ−３細胞）に示した。【０１８６】
試験例１１；ＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体のＧＧＴ依存性の確認試験
ＧＧＴ活性が高いことが知られているＯＳ−ＲＣ−２細胞を用いて、合成例６に係るＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体の細胞増殖阻害活性におけるＧＧＴ活性依存性を評価した。
試験例１０と同様の方法でＯＳ−ＲＣ−２細胞を播種して１日培養後、ＧＧＴ阻害剤であるＧＧｓＴｏｐ（和光純薬工業株式会社）を終濃度１０μＭ添加し、１時間培養した。その後、合成例６に関わるＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体を終濃度０．０００１〜１μＭで添加した。６時間培養後にウェル内を洗浄し、さらに３日間培養後、試験例１０と同様の方法で細胞増殖抑制活性を評価した。
同様の操作により、合成例６の有効成分であるＥＨＣをそのまま用いて、その吸光度から細胞増殖抑制活性を評価した。
結果を図６に示した。【０１８７】
試験例１０の結果、ＧＧＴ活性が高いことが知られているＯＳ−ＲＣ−２細胞において、０．０１μＭのＥＨＣを添加した場合、細胞増殖阻害活性は２６％だった。また、合成例６に係るＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体を０．０１μＭ添加した場合、２５％の細胞増殖阻害活性を示した。
一方、ＧＧＴ活性が低いことが知られているＳＫ−ＯＶ−３細胞において、０．０１μＭのＥＨＣを添加した場合、細胞増殖阻害活性は２７．７％だった。一方、合成例６に係るＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体を０．０１μＭ添加した場合、１．３％の細胞増殖阻害活性を示した。
ＧＧＴ活性の高い細胞とＧＧＴ活性の低い細胞における細胞増殖阻害活性の結果を比較すると、本発明に係る合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴによりＥＨＣを遊離し、細胞増殖阻害活性を示すと共に、ＧＧＴが存在しない場合は、細胞増殖阻害活性が低く、殺細胞性をほとんど示さないことが明らかとなった。このことから、合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴ活性に依存した細胞増殖抑制活性を発揮できることが示された。
また、試験例１１の結果、ＧＧＴ活性の高いＯＳ−ＲＣ−２細胞において、ＧＧＴ阻害剤はＥＨＣの細胞増殖抑制活性に影響を与えなかったが、ＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体の活性を阻害した。このことから、合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴ活性に依存した細胞増殖抑制活性を発揮する物性であることが示された。【０１８８】
試験例１２；合成例１の薬物動態試験
ＳＣＩＤマウス皮下で継代培養しているヒト腎細胞がんＯＳ−ＲＣ−２腫瘍を約２ｍｍ角のブロックにし、套管針を用いてＳＣＩＤマウス皮下に移植した。腫瘍生着確認後に合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体を、ＤＭＳＯ／５％グルコース水溶液＝１：１９溶液に懸濁し、ドキソルビシン換算として５ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与した。また対照薬として、ドキソルビシン塩酸塩（ＤＸＲ・ＨＣｌ）を生理食塩水に溶解し、ドキソルビシン換算として５ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与した。
投与後５分、３、２４時間に、エーテル麻酔下、血漿、心臓，肝臓、骨髄及び腫瘍の各組織を採取した。各組織中における活性体であるドキソルビシン及び合成例１の未変化体であるドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体の薬物濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により以下の測定機器及び条件で定量分析した。
機    種  ：ＡＢＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ４０００
島津  ＬＣ−２０ＡＤ
カ  ラ  ム：株式会社資生堂  ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫＣ１８  ＭＧIII、
２．０ｍｍ×７５ｍｍ
移動相Ａ  ：ギ酸／アセトニトリル／水  （１／２００／８００）
移動相Ｂ  ：ギ酸／アセトニトリル      （１／１０００）
移動相Ｃ  ：ギ酸／アセトニトリル／水  （１／５００／５００）
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化（正イオン）
検  出  法：多重反応モニタリング【０１８９】
各時点の組織中における活性体であるドキソルビシン（ＤＸＲ）及び未変化体である合成例１に係るドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体の経時的濃度推移を図７に示した。また、各組織中における合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体の活性化率として、投与５分値における未変化体（合成例１化合物）に対する活性体（ＤＸＲ）の比率を求めて表２に示した。【０１９０】
【表２】
2017086392.tif 000027
【０１９１】
試験例１２の結果、合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は、ドキソルビシン塩酸塩と比較し、該グルタミン酸誘導体から生じるドキソルビシンがＧＧＴ低発現の血漿、肝臓、骨髄、心臓で低く、ＧＧＴを高発現する腫瘍では高い結果であった。また、合成例１のドキソルビシンへの活性化比率（５分値比較）は、ＧＧＴ低発現の血漿、肝臓、骨髄、心臓で０．０２〜０．２倍程度と低い活性化率であった。これに対し、ＧＧＴを高発現する腫瘍においては、活性化率が１．６５倍と顕著に高値を示しており、腫瘍にて選択的に活性化されていることが示された。
このことから、合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験において、生体内でもＧＧＴを高発現する腫瘍において選択的に生理活性物質であるドキソルビシンを遊離させることができる物性であることが示された。一方、骨髄や心臓といったＧＧＴが低発現の組織においては、ドキソルビシン塩酸塩投与群と比較してドキソルビシン濃度が低値であり、これらの組織では活性化されないことが示された。以上の活性化の関する組織選択性は、合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体が、ドキソルビシンの副作用である骨髄抑制や心臓毒性を軽減させて、抗腫瘍効果を選択的に発揮させることができる可能性を示すものである。【０１９２】
試験例１３；合成例１の抗腫瘍効果試験
試験例１２と同様の操作で、ヒト腎細胞がんＯＳ−ＲＣ−２腫瘍をＳＣＩＤマウス皮下に移植し、腫瘍生着確認した。その後、合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体を５及び２０ｍｇ／ｋｇを１４日おきに計２回尾静脈内投与した。対照薬としてドキソルビシン塩酸塩（ＤＸＲ・ＨＣｌ）を５ｍｇ／ｋｇを同スケジュールで尾静脈内投与した。
投与後、腫瘍の長径（Ｌ）及び短径（Ｗ）をキャリバーを用いて２〜３日間隔で計測し、腫瘍体積を（Ｌ×Ｗ２）／２により計算し、投与開始日からの腫瘍体積変化率を求めた。各薬剤投与群における相対腫瘍体積の経時変化を図８に示した。【０１９３】
試験例１３の結果、合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は用量依存的に抗腫瘍効果を示した。２０ｍｇ／ｋｇ投与群は、対照群であるドキソルビシン塩酸塩投与群（５ｍｇ／ｋｇ）と同等の抗腫瘍効果を示した。したがって、合成例１に係るドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は、医薬品として充分な抗腫瘍効果を有することが示された。【０１９４】
試験例１４；合成例１の抗腫瘍効果試験
試験例１２と同様の操作により、ヒト卵巣がんＳＨＩＮ−３腫瘍をＳＣＩＤマウス皮下に移植し、腫瘍生着確認した。その後、合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体を５及び２０ｍｇ／ｋｇを、７日おきに計３回尾静脈内投与した。対照薬としてドキソルビシン塩酸塩（ＤＸＲ・ＨＣｌ）５ｍｇ／ｋｇを同スケジュールで尾静脈内投与した。
投与後、腫瘍の長径（Ｌ）及び短径（Ｗ）をキャリバーを用いて２〜３日間隔で計測し、腫瘍体積を（Ｌ×Ｗ２）／２により計算し、投与開始日からの投与開始日からの腫瘍体積変化率を求めた。各薬剤投与群における相対腫瘍体積の経時変化を図９に示した。【０１９５】
試験例１４の結果、合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は、用量依存的に抗腫瘍効果を示した。対照としたドキソルビシン塩酸塩（５ｍｇ／ｋｇ）は、投与２回目で毒性のため死亡した。合成例１は２０ｍｇ／ｋｇ投与群において、対照薬と同等の抗腫瘍効果を示し、投与計画を完遂できており、十分な忍容性が確認された。したがって、合成例１に係るドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体は、医薬品として充分な抗腫瘍効果を有することが示された。また、対照薬より安全性が高い事が示唆された。【０１９６】
試験例１５；合成例６の薬物動態試験
マウス皮下で継代培養しているヒト腎細胞がんＯＳ−ＲＣ−２腫瘍を約２ｍｍ角のブロックにし、套管針を用いてマウス皮下に移植した。腫瘍生着確認後に、合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体をＤＭＳＯ／５％グルコース水溶液＝１：９溶液に懸濁し、ＥＨＣ換算として２０ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与した。また対照薬として、ＥＨＣのプロドラッグである塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）を５％グルコース水溶液に溶解し、ＥＨＣ換算として２０ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与した。
投与後５分、１、３、６時間に、エーテル麻酔下、血漿、肝臓、骨髄及び腫瘍の各組織を採取した。各組織中における合成例６の活性体であるＥＨＣ、合成例６未変化体、及びＣＰＴ−１１未変化体の薬物濃度を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法により以下の測定機器及び条件で定量分析した。
機  種    ：ＡＢＳｃｉｅｘ  ＡＰＩ４０００
島津  ＬＣ−２０ＡＤ
カ  ラ  ム：Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ、Ｃ１８、２．１ｍｍ×５０ｍｍ
移動相Ａ  ：ギ酸／水              （１／１０００）
移動相Ｂ  ：ギ酸／アセトニトリル  （１／１０００）
イオン化法：エレクトロスプレーイオン化（正イオン）
検  出  法：多重反応モニタリング【０１９７】
各時点の組織中ＥＨＣ、合成例６に係るＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体及びＣＰＴ−１１濃度から、投与開始後６時間までの各成分のＡＵＣ０−６ｈｒ(μｇ・ｈｒ／ｍＬ  ｏｒ  ｇ)を算出した。各組織中における合成例６及びＣＰＴ−１１のプロドラッグ活性化率として、未変化体に対する活性体のＡＵＣ０−６ｈｒ比率（ＡＵＣＥＨＣ／ＡＵＣ合成例６未変化体及びＡＵＣＥＨＣ／ＡＵＣＣＰＴ−１１）を求めた。結果を表３に示した。【０１９８】
【表３】
2017086392.tif 000028
【０１９９】
試験例１５の結果、合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体はＥＨＣプロドラッグとしての活性率を示すＡＵＣＥＨＣ／ＡＵＣ合成例６未変化体は、ＧＧＴ低発現の血漿、肝臓、骨髄では０．０３〜０．１６倍と低い結果であった。これに対し、ＧＧＴ高発現の腫瘍では１．０倍と高く、腫瘍選択的に活性化されていることが示された。一方、対照薬であるＣＰＴ−１１のＡＵＣＥＨＣ／ＡＵＣＣＰＴ−１１はいずれも０．１以下と低く、組織選択性も乏しい結果であった。
合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体は、ＧＧＴ低活性の血漿、肝臓、骨髄でＣＰＴ−１１と比較し、１．１倍〜９．４倍の活性化率であった。これに対し、ＧＧＴを高発現する腫瘍においては、合成例６はＣＰＴ−１１投与群と比較して６１．８倍と顕著に高値を示した。このことから、本発明に係る合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体は、組織中でＧＧＴ依存的に活性化され、ＧＧＴを高現する組織において選択的にＥＨＣを放出できる物性であることが示された。これらの選択性は、本発明に係る合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体がＣＰＴ−１１の副作用である骨髄抑制を回避して、抗腫瘍効果を示す可能性が示唆された。【０２００】
試験例１６；合成例６の抗腫瘍効果試験
試験例１５と同様の操作で、ヒト腎細胞がんＯＳ−ＲＣ−２を移植したマウスに、腫瘍移植後１７日目に合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体を２０、４０及び８０ｍｇ／ｋｇを、４日おきに計３回尾静脈内投与した。
投与後、腫瘍の長径（Ｌ）及び短径（Ｗ）を、キャリバーを用いて２〜３日間隔で計測し、腫瘍体積を（Ｌ×Ｗ２）／２により計算し、投与開始日からの腫瘍体積変化率を求めた。各薬剤投与群における相対腫瘍体積の経時変化を図１０に示した。【０２０１】
試験例１６の結果、合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体は用量依存的な抗腫瘍効果を示した。８０ｍｇ／ｋｇ投与群では顕著な腫瘍縮小効果を示しており、優れた抗腫瘍作用を発揮する物性であることが示された。【０２０２】
合成例７；疎水性官能基としてコレステロールを有するブロック共重合体の合成
特開平６−２０６８１５号（特許文献６）記載の方法に準じて、ポリエチレングリコールセグメント（平均分子量１２，０００）とポリアスパラギン酸セグメント（ポリアスパラギン酸；平均重合数４３）が連結したブロック共重合体を調製した。
このブロック共重合体（１０．００ｇ）およびコレステロール（４．８８ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１４５ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ  ０．３１ｇ）を加えた後、２５℃でジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ、８．９１ｍＬ）を滴下して加えた。２３時間撹拌後、更にＤＩＰＣＩ（４．４６ｍＬ）を加え、４時間撹拌した。反応溶液をジイソプロピルエーテル（３Ｌ）に撹拌下滴下して加え、生じた析出物をろ過回収した。析出物を５０％アセトニトリル水溶液（８００ｍＬ）に溶解後、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ｗ８（ダウ・ケミカル社製）２００ｍＬを０℃で加え、５時間撹拌した。陽イオン交換樹脂をろ過により除き、ろ液を減圧下濃縮後、凍結乾燥して、疎水性官能基としてコレステロールを有するブロック共重合体を１２．５２ｇ得た。
該ブロック共重合体におけるコレステロールの結合率は，反応率よりポリアスパラギン酸セグメント重合数の２８％であった。【０２０３】
合成例８
疎水性官能基としてトリプトファンベンジルエステルを有するブロック共重合体の合成
特開平６−２０６８１５号（特許文献６）記載の方法に準じてポリエチレングリコールセグメント（平均分子量１２，０００）とポリアスパラギン酸セグメント（ポリアスパラギン酸；平均重合数４３）が連結したブロック共重合体を調製した。
このブロック共重合体（０．５０ｇ）およびトリプトファンベンジル塩酸塩（０．２１ｇ）をＤＭＦ（７ｍＬ）に溶解し、ＤＭＡＰ（１６ｍｇ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、０．１１ｍＬ）を加えた後、１５℃でＤＩＰＣＩ（０．４５ｍＬ）を滴下して加えた。３時間撹拌後、更にＤＩＰＣＩ（０．２３ｍＬ）を加え、２５℃で３時間撹拌した。反応溶液をジイソプロピルエーテル（２１０ｍＬ）に撹拌下滴下して加え、生じた析出物をろ過回収した。析出物を５０％アセトニトリル水溶液（４０ｍＬ）に溶解後、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ｗ８（ダウ・ケミカル社製）１０ｍＬを０℃で加え、４時間撹拌した。陽イオン交換樹脂をろ過により除き、ろ液を減圧下濃縮後、凍結乾燥することにより、疎水性官能基としてトリプトファンベンジルエステルを有するブロック共重合体を０．７３ｇ得た。
該ブロック共重合体中におけるトリプトファンの結合率は、反応率よりブロック共重合体のポリアスパラギン酸セグメント重合数の５０％であった。【０２０４】
合成例９
疎水性官能基としてコレステロールおよびトリプトファンベンジルエステルを有するブロック共重合体の合成
特開平６−２０６８１５号（特許文献６）記載の方法に準じてポリエチレングリコールセグメント（平均分子量１２，０００）とポリアスパラギン酸セグメント（ポリアスパラギン酸；平均重合数４３）が連結したブロック共重合体を調製した。
このブロック共重合体（２．００ｇ）、コレステロール（０．９８ｇ）およびトリプトファンベンジル塩酸塩（０．４２ｇ）をＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（０．２１ｍＬ）およびＤＭＡＰ（６２ｍｇ）を加えた。２５℃でＤＩＰＣＩ（１．７８ｍＬ）を滴下して加え、２１時間撹拌後、更にＤＩＰＣＩ（０．８９ｍＬ）を加え、４時間撹拌した。反応溶液をジイソプロピルエーテル（１５００ｍＬ）に撹拌下滴下して加え、生じた析出物をろ過回収した。析出物を５０％アセトニトリル水溶液（１６０ｍＬ）に溶解後、陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０ｗ８（ダウ・ケミカル社製）４０ｍＬを０℃で加え、２．５時間撹拌した。陽イオン交換樹脂をろ過により除き、ろ液を減圧下濃縮後、凍結乾燥してブロック共重合体を２．５０ｇ得た。
該ブロック共重合体中におけるトリプトファンおよびコレステロールの結合率は、反応率よりブロック共重合体のポリアスパラギン酸セグメント重合数の、それぞれ２５％および１３％であった。【０２０５】
合成例１０
疎水性官能基としてドキソルビシンを有するブロック共重合体の合成
特開平７−６９９００号（特許文献５）記載の方法に準じてポリエチレングリコールセグメント（平均分子量５，０００）とポリアスパラギン酸セグメント（ポリアスパラギン酸ユニット含量４１％）が連結したブロック共重合体より、疎水性官能基としてドキソルビシンを有するブロック共重合体を得た。
該ブロック共重合体中におけるドキソルビシンの結合率は、ブロック共重合体のポリアスパラギン酸セグメント重合数の４５％であった。【０２０６】
合成例１１
疎水性官能基としてフェニルブタノールを有するブロック共重合体の合成
国際公開第２００６／０３３２９６号（特許文献４）記載の方法に準じてポリエチレングリコールセグメント（平均分子量１２，０００）とポリアスパラギン酸セグメント（ポリアスパラギン酸ユニット含量２８％）が連結したブロック共重合体より、疎水性官能基としてフェニルブタノールを有するブロック共重合体を得た。
該ブロック共重合体中におけるフェニルブタノールの結合率は、ブロック共重合体のポリアスパラギン酸セグメント重合数の１５％であった。【０２０７】
合成例１２
疎水性官能基としてベンジルアルコールを有するブロック共重合体の合成
特開平６−２０６８１５号（特許文献６）記載の方法に準じてポリエチレングリコールセグメント（平均分子量１２，０００）とポリアスパラギン酸ベンジルエステルセグメント（ポリアスパラギン酸ベンジルエステル；平均重合数４３）が連結したブロック共重合体を調製した。【０２０８】
［実施例１］
合成例１のグルタミン酸誘導体（Ｉ）と合成例１０のブロック共重合体（ＩＩ）の組成物
合成例１のドキソルビシンが結合したグルタミン酸誘導体（１．０ｍｇ）及び合成例１０のブロック共重合体（１０ｍｇ）を、ＤＭＦ（８０μＬ）に溶解した後、水（３２０μＬ）を加えた。これを透析キット（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、Ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ  １ｋＤａ  ｃｕｔ―ｏｆｆ、分画分子量＝１，０００）を用いて、水に対して終夜透析を行った。得られた透析溶液を１ｍＬメスフラスコにとり、水を加えて１ｍＬにすることで、実施例１に係る組成物を１ｍｇ／ｍＬ水溶液として得た。【０２０９】
［実施例２］
合成例１のグルタミン酸誘導体（Ｉ）と合成例１１のブロック共重合体（ＩＩ）の組成物
合成例１のドキソルビシンが結合したグルタミン酸誘導体（１．０ｍｇ）及び合成例１１のブロック共重合体（３０ｍｇ）を、ＤＭＦ（１２０μＬ）およびＤＭＳＯ（１２０μＬ）に溶解した後、水（３６０μＬ）を加えた。これを透析膜（スペクトラムラボラトリーズ、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）、分画分子量＝６，０００〜８，０００）を用いて、水に対して終夜透析を行った。得られた透析液を５ｍＬメスフラスコにとり、水を加えて５ｍＬにすることで、実施例２に係る組成物を０．６ｍｇ／ｍＬ水溶液として得た。【０２１０】
［実施例３］
合成例１のグルタミン酸誘導体（Ｉ）と合成例７のブロック共重合体（ＩＩ）の組成物
合成例１のドキソルビシンが結合したグルタミン酸誘導体（１．０ｍｇ）及び合成例７のブロック共重合体（１０ｍｇ）を、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ、４００μＬ）に溶解した後、減圧下溶媒を留去した。残渣に４０ｍｇ／ｍＬマルトース水溶液（１ｍＬ）を加え、終夜撹拌した。得られた溶液にマルトース（２０ｍｇ）を加え、凍結乾燥することにより、実施例３に係る組成物を得た。
実施例３の組成物中における合成例１に係るドキソルビシンが結合したグルタミン酸誘導体含量は１．４％であった。【０２１１】
［実施例４］
合成例１のグルタミン酸誘導体（Ｉ）と合成例８のブロック共重合体（ＩＩ）の組成物
合成例１のドキソルビシンが結合したグルタミン酸誘導体（１．６ｍｇ）をＤＭＦ（１６０μＬ）及び水（１６０μＬ）に溶解し、合成例８のブロック共重合体（７．５ｍｇ）のＤＭＦ（１５０μＬ）溶液と混合し、透析キット（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、Ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ  １ｋＤａ  ｃｕｔ―ｏｆｆ、分画分子量＝１，０００）を用いて、水に対して１昼夜透析を行った。得られた透析液にマクロゴール（１０ｍｇ）を加え、得られた水溶液を凍結乾燥することにより、実施例４に係る組成物を得た。
実施例４の組成物中における合成例１に係るドキソルビシンが結合したグルタミン酸誘導体含量は８．４％であった。【０２１２】
［実施例５］
合成例１のグルタミン酸誘導体（Ｉ）と合成例９のブロック共重合体（ＩＩ）の組成物
合成例１のドキソルビシンが結合したグルタミン酸誘導体（１．２ｍｇ）をＤＭＦ（１５０μＬ）及び水（１２０μＬ）に溶解し、合成例９のブロック共重合体（７．５ｍｇ）のＤＭＦ（１５０μＬ）溶液と混合し、透析キット（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス、Ｍｉｎｉ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ  １ｋＤａ  ｃｕｔ―ｏｆｆ、分画分子量＝１，０００）を用いて、水に対して１昼夜透析を行った。得られた透析液にマクロゴール（１０ｍｇ）を加え、得られた水溶液を凍結乾燥することにより、実施例５に係る組成物を得た。
実施例５の組成物中における合成例１に係るドキソルビシンが結合したグルタミン酸誘導体含量は６．４％であった。【０２１３】
［実施例６］
合成例４のグルタミン酸誘導体（Ｉ）と合成例１０のブロック共重合体（ＩＩ）の組成物
合成例４のエピルビシンが結合したグルタミン酸誘導体（４２．２ｍｇ）をＤＭＦ（２．１１ｍＬ）及び水（２．１１ｍＬ）に溶解し、合成例１０のブロック共重合体（４２２ｍｇ）のＤＭＦ（８．４４ｍＬ）溶液と混合し、透析膜（スペクトラムラボラトリーズ、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）、分画分子量＝６，０００〜８，０００）中、水に対して１昼夜透析を行った。得られた透析液にマクロゴール（８４０ｍｇ）を加え、得られた水溶液を凍結乾燥することにより、実施例６に係る組成物（１．２７ｇ）を得た。
ＨＰＬＣによる含量分析により、合成例４に係るエピルビシンが結合したグルタミン酸誘導体含量は１．８％であった。【０２１４】
［実施例７］
合成例６のグルタミン酸誘導体（Ｉ）と合成例１１のブロック共重合体（ＩＩ）の組成物
合成例６のカンプトテシンが結合したグルタミン酸誘導体（５ｍｇ）をＨＦＩＰ（２５０μＬ）に溶解し、合成例１１のブロック共重合体（１００ｍｇ）の４０ｍｇ／ｍＬマルトース水溶液（５ｍＬ）に滴下して加えた。２昼夜撹拌後、マクロゴール（１００ｍｇ）を加え、得られた溶液を凍結乾燥することにより、実施例７に係る組成物を得た。
ＨＰＬＣによる含量分析により、合成例６に係るカンプトテシンが結合したグルタミン酸誘導体含量は１．１％であった。【０２１５】
［実施例８］
合成例６のグルタミン酸誘導体（Ｉ）と合成例７のブロック共重合体（ＩＩ）の組成物
合成例６のカンプトテシンが結合したグルタミン酸誘導体（５ｍｇ）及び合成例７のブロック共重合体（２１ｍｇ）をＨＦＩＰに溶解した後、減圧下溶媒を留去した。残渣を４０ｍｇ／ｍＬマルトース水溶液（２ｍＬ）に溶解し、終夜撹拌した。マクロゴール（２０ｍｇ）を加え、得られた溶液を凍結乾燥することにより、実施例８に係る組成物を得た。
実施例８の組成物中における合成例６に係るカンプトテシンが結合したグルタミン酸誘導体含量は０．８２％であった。【０２１６】
［実施例９］
合成例６のグルタミン酸誘導体（Ｉ）と合成例９のブロック共重合体（ＩＩ）の組成物
合成例６のカンプトテシンが結合したグルタミン酸誘導体（５ｍｇ）をＨＦＩＰ（２５０μＬ）に溶解し、合成例９のブロック共重合体（１００ｍｇ）の４０ｍｇ／ｍＬマルトース水溶液（５ｍＬ）に、滴下して加えた。２昼夜撹拌後、マクロゴール（１００ｍｇ）を加えた。得られた溶液を凍結乾燥することにより、実施例９に係る組成物を得た。
ＨＰＬＣによる含量分析により、合成例６に係るカンプトテシンが結合したグルタミン酸誘導体含量は１．１％であった。【０２１７】
［実施例１０］
合成例６のグルタミン酸誘導体（Ｉ）と合成例１２のブロック共重合体（ＩＩ）の組成物
合成例６のカンプトテシンが結合したグルタミン酸誘導体（１ｍｇ）及び合成例１２のブロック共重合体（２１ｍｇ）をＨＦＩＰに溶解した後、減圧下溶媒を留去した。残渣に４０ｍｇ／ｍＬマルトース水溶液（２ｍＬ）を加え、２４時間撹拌した。マクロゴール（２０ｍｇ）を加え、得られた溶液を凍結乾燥することにより、実施例１０に係る組成物を得た。
実施例１０の組成物中における合成例６に係るカンプトテシンが結合したグルタミン酸誘導体含量は０．８２％であった。【０２１８】
試験例１７；実施例１の薬物動態試験
実施例１の組成物を蒸留水に溶解し、ドキソルビシン（ＤＸＲ）換算として１０ｍｇ／ｋｇをマウスに尾静脈内投与した。また対照薬として、合成例１のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体（ＤＸＲプロドラッグ）をＤＭＳＯ／５％グルコース水溶液（１：１９（ｖ／ｖ））溶液に懸濁し、ＤＸＲ換算として１０ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与した。
投与後５分、１、３、６時間に、エーテル麻酔下で血漿を採取した。未変化体のＤＸＲプロドラッグ薬物濃度及び活性体であるドキソルビシン（ＤＸＲ）濃度を試験例１２と同じ方法で定量分析した。
実施例１及び合成例１投与後の血漿中のドキソルビシン結合グルタミン酸誘導体（ＤＸＲプロドラッグ）濃度推移の結果を図１１に示した。また、血漿中における活性体（ＤＸＲ）及び未変化体（ＤＸＲプロドラッグ）のＡＵＣ０−６ｈｒを算出し、表４に示した。【０２１９】
【表４】
2017086392.tif 000029
【０２２０】
試験例１７の結果、実施例１の組成物は、合成例１のＤＸＲプロドラッグと比較して血漿からの消失が遅く、血中滞留性が著しく向上していることが示された。実施例１の未変化体（ＤＸＲプロドラッグ）のＡＵＣ０−６ｈｒ(μｇ・ｈｒ／ｍＬ)は、合成例１と比較して１３倍と著明に上昇した。
実施例１の薬物動態は、高分子化担体により医薬製剤に見られる特有の薬物動態特性を示したことから、合成例１に係るドキソルビシン結合グルタミン酸（Ｉ）と合成例１０に係るブロック共重合体（ＩＩ）が相互作用に基づく複合体が形成されていることが考察される。高分子担体との複合体形成による医薬組成物は、長時間の血中滞留した後、腫瘍患部に蓄積していくことが知られている。したがって実施例１の組成物は、腫瘍集積性が向上し、腫瘍中のＧＧＴ酵素活性により効率的に活性体が生成して、抗腫瘍効果を発揮させることができることが示唆された。【０２２１】
試験例１８；実施例７及び９の薬物動態試験
実施例７及び９の組成物を５％グルコースに溶解し、ＥＨＣ換算として１０ｍｇ／ｋｇをヌードマウスに尾静脈内投与した。また、対照薬として合成例６のＥＨＣ結合グルタミン酸誘導体（ＥＨＣプロドラッグ）を、ＤＭＳＯ／５％グルコース水溶液（１：９（ｖ／ｖ））溶液に懸濁し、ＥＨＣ換算として１０ｍｇ／ｋｇで尾静脈内投与した。
投与後５分、６、２４時間に、イソフルラン麻酔下で血漿を採取した。未変化体のＥＨＣプロドラッグ薬物濃度を試験例１５と同じ方法で定量分析した。
実施例７及び９並びに合成例６の組成物の血漿におけるＥＨＣプロドラッグのＡＵＣ０−２４ｈｒを算出した。実施例７及び９と合成例６のＥＨＣプロドラッグと血中滞留性をＡＵＣ地に基づき比較して結果を表５に示した。【０２２２】
【表５】
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【０２２３】
試験例１８の結果、実施例７及び９の組成物は、合成例６のＥＨＣプロドラッグと比較して、血中滞留性が著しく向上していることが示された。実施例７及び９の未変化体（ＥＨＣプロドラッグ）のＡＵＣ０−２４ｈｒ(μｇ・ｈｒ／ｍＬ)は、合成例６と比較して１０．４倍及び６．５倍と向上した。
実施例７及び９の薬物動態は、高分子化担体により医薬製剤に見られる特有の薬物動態特性を示したことから、相当するグルタミン酸誘導体とブロック共重合体とが複合体を形成して、一体となって体内動態していることが示唆された。したがって実施例７及び９の組成物は、受動的に腫瘍集積性を示し、腫瘍中のＧＧＴ酵素活性により効率的に活性体が生成して、抗腫瘍効果を発揮させることができることが示唆された。【０２２４】
試験例１９；実施例６の抗腫瘍効果試験  
試験例１５と同様にヌードマウスにヒト腎細胞がんＯＳ−ＲＣ−２を移植し、腫瘍生着確認後に本発明に係る実施例６の組成物を５％グルコースに溶解し、エピルビシン換算として１０及び２０ｍｇ／ｋｇを単回尾静脈内投与した。また、対照薬としてエピルビシン塩酸塩を生理食塩液に溶解し、エピルビシン換算として１０及び２０ｍｇ／ｋｇで単回尾静脈内投与した。
投与後、腫瘍の長径（Ｌ）及び短径（Ｗ）を、キャリバーを用いて２〜３日間隔で計測し、腫瘍体積を（Ｌ×Ｗ２）／２により計算し、投与開始日からの腫瘍体積変化率を求めた。抗腫瘍効果の結果を図１２に示した。【０２２５】
試験例１９の結果、実施例６の組成物は、用量依存的に抗腫瘍効果を示した。対照としたエピルビシン塩酸塩（２０ｍｇ／ｋｇ）は、投与８日後に毒性のため死亡した。実施例６は２０ｍｇ／ｋｇ投与群において、対照薬と同等の抗腫瘍効果を示し、投与計画を完遂できており、十分な忍容性が確認された。したがって、実施例６の組成物は、医薬品として充分な抗腫瘍効果を有することが示された。また、対照薬より安全性が高い事が示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2017086392.tif 000041
【図７】
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【図８】
2017086392.tif 000043
【図９】
2017086392.tif 000044
【図１０】
2017086392.tif 000045
【図１１】
2017086392.tif 000046
【図１２】
2017086392.tif 000047
【国際調査報告】
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2017086392.tif 000049
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