(57)【要約】  本発明は、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドと、それを用いた遺伝子発現阻害剤を提供することを目的とする。本発明の偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを製造するために、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチドであって、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドに対して、第３の領域と第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有し、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｎ＋１）の領域と第（３ｎ＋２）の領域と第（３ｎ＋３）の領域を有する第（ｎ＋１）のポリヌクレオチド（ｎは１以上の奇数）に対して、第１の領域と第（３ｎ＋３）の領域とはそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有する、第１のポリヌクレオチドを用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチドであって、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドに対して、第３の領域と第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有し、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｎ＋１）の領域と第（３ｎ＋２）の領域と第（３ｎ＋３）の領域を有する第（ｎ＋１）のポリヌクレオチド（ｎは１以上の奇数）に対して、第１の領域と第（３ｎ＋３）の領域とはそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有する、第１のポリヌクレオチド。
【請求項２】
第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、及び第（ｎ＋１）のポリヌクレオチドが、それぞれ２９個から９９個のヌクレオチドからなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
第２の領域および第（３ｎ＋２）の領域のうちの少なくとも一つが、０〜６個のヌクレオチドからなる、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
ｎ＝１である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の第１のポリヌクレオチド。
【請求項５】
リボデオキシヌクレオチドで構成されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の第１のポリヌクレオチド。
【請求項６】
リボデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドで構成されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の第１のポリヌクレオチド。
【請求項７】
第１のポリヌクレオチドを構成する前記ヌクレオチドが、修飾されているヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の第１のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記修飾が、ポリエチレングリコール、葉酸、またはコレステロールである、請求項７に記載の第１のポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項４に記載の第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドペア。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドペアを含有するキット。
【請求項１１】
５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチド、及び３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドの２個のポリヌクレオチドからなる偽環状二重鎖ポリヌクレオチドであって、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第１のポリヌクレオチドの第１の領域と第２のポリヌクレオチドの第６の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成している、偽環状二重鎖ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
ｐ個のポリヌクレオチドからなる偽環状二重鎖ポリヌクレオチドであって（ｐは４以上の偶数）、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチドの第３の領域と、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第２のポリヌクレオチドの第６の領域と、５‘方向から３’方向へ、順に第７の領域と第８の領域と第９の領域を有する第３のポリヌクレオチドの第７の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ−２）の領域と第（３ｍ−１）の領域と第３ｍの領域を有する第ｍのポリヌクレオチドの第３ｍの領域と、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｍ＋１）の領域と第（３ｍ＋２）の領域と第（３ｍ＋３）の領域を有する第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋１）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋３）の領域と、５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ＋４）の領域と第（３ｍ＋５）の領域と第（３ｍ＋６）の領域を有する第（ｍ＋２）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋４）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し（ｍは３以上（ｐ−１）以下の奇数）、第ｐのポリヌクレオチドの第３ｐの領域と第１のポリヌクレオチドの第１の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成している、偽環状二重鎖ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項９に記載のポリヌクレオチドペアを有効成分として含む遺伝子発現抑制剤。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載の偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを有効成分として含む遺伝子発現抑制剤。
【請求項１５】
前記第１の領域と前記第３の領域が、それぞれ以下のいずれかである請求項１２に記載の遺伝子発現抑制剤。
（１）発現抑制対象の第１の遺伝子のセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のセンス鎖
（２）発現抑制対象の第１の遺伝子のセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のアンチセンス鎖
（３）発現抑制対象の第１の遺伝子のアンチセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のセンス鎖
（４）発現抑制対象の第１の遺伝子のアンチセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のアンチセンス鎖
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は偽環状二重鎖ポリヌクレオチドと、それを用いた遺伝子発現阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の標的遺伝子の遺伝子発現を抑制する方法として、近年、簡便性のためにＲＮＡ干渉（RNA interference; RNAi）が最もよく利用されている。【０００３】
ＲＮＡ干渉法では、典型的には、標的遺伝子と相同な配列を有する２１−２３塩基長の二本鎖リボヌクレオチド（siRNA）が用いられ、このsiRNAを細胞内に導入することにより、標的遺伝子の遺伝子発現を抑制できる（米国特許公報US2004/0259247）。【０００４】
これまで、ＲＮＡの構造体を構築することで、より機能的な技術にする試みがなされている（Nat Mater. 2012 vol.11 (No.4): pp.316-22.；Nat Nanotechnol.2011 vol.6 (No.2): pp.116-20.；Nat Chem. 2010 vol.2 (No.9): pp.772-9.；J Am Chem Soc. 2007 vol.129 (No.49): pp.15108-9.）が、実用化されたものは存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドと、それを用いた遺伝子発現阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一実施態様は、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチドであって、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドに対して、第３の領域と第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有し、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｎ＋１）の領域と第（３ｎ＋２）の領域と第（３ｎ＋３）の領域を有する第（ｎ＋１）のポリヌクレオチド（ｎは１以上の奇数）に対して、第１の領域と第（３ｎ＋３）の領域とはそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有する、第１のポリヌクレオチドである。第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、及び第（ｎ＋１）のポリヌクレオチドが、それぞれ２９個から９９個のヌクレオチドからなるものでもよい。第２の領域および第（３ｎ＋２）の領域のうちの少なくとも一つが、０〜６個のヌクレオチドからなっていてもよい。上記第１のポリヌクレオチドは、リボデオキシヌクレオチドで構成されていても、リボデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドで構成されていてもよい。また、第１のポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドが、修飾されているヌクレオチドを含んでもよく、修飾は、ポリエチレングリコール、葉酸、またはコレステロールによるものでもよい。【０００７】
本発明の他の実施態様は、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドペアである。ポリヌクレオチドペアを含有するキットであってもよい。【０００８】
本発明のさらなる実施態様は、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチド、及び３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドの２個のポリヌクレオチドからなる偽環状二重鎖ポリヌクレオチドであって、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第１のポリヌクレオチドの第１の領域と第２のポリヌクレオチドの第６の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成している、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドである。【０００９】
本発明のさらなる実施態様は、ｐ個のポリヌクレオチドからなる偽環状二重鎖ポリヌクレオチドであって（ｐは４以上の偶数）、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチドの第３の領域と、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第２のポリヌクレオチドの第６の領域と、５‘方向から３’方向へ、順に第７の領域と第８の領域と第９の領域を有する第３のポリヌクレオチドの第７の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ−２）の領域と第（３ｍ−１）の領域と第３ｍの領域を有する第ｍのポリヌクレオチドの第３ｍの領域と、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｍ＋１）の領域と第（３ｍ＋２）の領域と第（３ｍ＋３）の領域を有する第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋１）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋３）の領域と、５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ＋４）の領域と第（３ｍ＋５）の領域と第（３ｍ＋６）の領域を有する第（ｍ＋２）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋４）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し（ｍは３以上（ｐ−１）以下の奇数）、第ｐのポリヌクレオチドの第３ｐの領域と第１のポリヌクレオチドの第１の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成している、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドである。【００１０】
本発明のさらなる実施態様は、前記ポリヌクレオチドペア、または前記いずれかの偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを有効成分として含む遺伝子発現抑制剤である。前記偽環状二重鎖ポリヌクレオチドにおいて、前記第１の領域と前記第３の領域が、それぞれ以下のいずれかであってもよい。【００１１】
（１）発現抑制対象の第１の遺伝子のセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のセンス鎖
（２）発現抑制対象の第１の遺伝子のセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のアンチセンス鎖
（３）発現抑制対象の第１の遺伝子のアンチセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のセンス鎖
（４）発現抑制対象の第１の遺伝子のアンチセンス鎖と発現抑制対象の第２の遺伝子のアンチセンス鎖
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施態様において、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドが２個のポリヌクレオチドで形成される場合の、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドの模式図である。
【図２】本発明の一実施例において、偽環状二重鎖RNAの構造を確認するための、RNaseRを用いた分解試験の結果を表す図である。
【図３】本発明の一実施例において、偽環状二重鎖RNAの構造を確認するための、RNaseS1を用いた分解試験の結果を表す図である。
【図４】本発明の一実施例において、偽環状二重鎖RNAがsiRNAとして機能することを示すためのDicer処理試験の結果を表す図である。
【図５】本発明の一実施例において、偽環状二重鎖RNAが、細胞抽出液中で安定に存在することを示すための安定性評価実験の結果を表す図である。
【図６】本発明の一実施例において、偽環状二重鎖RNAが、遺伝子発現抑制機能を有することを示すための実験の結果図である。
【図７】本発明の一実施例において、偽環状二重鎖RNAが、遺伝子発現抑制機能を有することを示すための実験の結果図である。
【図８】本発明の一実施例において、偽環状二重鎖RNAが形成されていることを確認するための実験の結果図である。
【図９Ａ】本発明の一実施例において、偽環状二重鎖RNAが、リンカーの長さに関わらず遺伝子発現抑制機能を有することを示すための実験において、対照実験の結果を示す図である。
【図９Ｂ】本発明の一実施例において、偽環状二重鎖RNAが、リンカーの長さに関わらず遺伝子発現抑制機能を有することを示すための実験において、偽環状二重鎖RNAの結果を示す図である。
【図１０】本発明の一実施例において、偽環状二重鎖RNAが、長期間にわたって遺伝子発現抑制機能を有することを示すための実験の結果図である。
【図１１】本発明の一実施例において、偽環状二重鎖RNAが、インターフェロン応答を誘導しないことを示す実験の結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００１４】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１５】
なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をこれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１６】
本明細書で、二重鎖とは、二重になった２本のポリヌクレオチド鎖からなる領域を言い、１重のポリヌクレオチド鎖からなる領域は含まないものとする。一方、二本鎖とは、２本のポリヌクレオチド鎖からなればよく、オーバーハングなど１重のポリヌクレオチド鎖からなる領域を含んでも構わないものとする。
【００１７】
＝＝ポリヌクレオチド＝＝
本発明のポリヌクレオチドは、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する２９個から９９個のヌクレオチドからなる第１のポリヌクレオチドであって、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する２９個から９９個のヌクレオチドからなる第２のポリヌクレオチドに対して、第３の領域と第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有し、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｎ＋１）の領域と第（３ｎ＋２）の領域と第（３ｎ＋３）の領域を有する２９個から９９個のヌクレオチドからなる第（ｎ＋１）のポリヌクレオチド（ｎは１以上の奇数）に対して、第１の領域と第（３ｎ＋３）の領域とはそれぞれ対合して二重鎖を形成する塩基配列を有する、第１のポリヌクレオチドである。第３の領域の３‘側に、第５の領域と対合しないようにオーバーハング（例えば、ＴＴのダイマー）を結合させておいてもよい。
【００１８】
第１の領域、第２の領域、第３の領域の各領域のヌクレオチド数は特に限定されないが、第３の領域及び第１の領域と、第４の領域及び第（３ｎ＋３）の領域は、それぞれ対合して二重鎖を形成し、二重鎖単独または二重鎖＋オーバーハング部位で切断された場合に遺伝子発現抑制機能を有する長さであればよい。従って、第１および第３の各領域のヌクレオチドの個数は、例えば、１７個以上であればよく、１８個以上であることが好ましく、１９個以上であることがより好ましく、また、５０個以下であればよく、３０個以下であることが好ましく、２７個以下であることがより好ましい。一方、第２の領域におけるヌクレオチド数は、第３の領域と第４の領域からなる二重鎖及び第１の領域と第（３ｎ＋３）の領域からなる二重鎖のリンカーとして機能する個数であればよく、例えば、０個以上であればよく、１個以上であることが好ましく、２個以上であることがより好ましく、また、７０個以下であればよく、８個以下であることが好ましく、６個以下であることがより好ましい。
【００１９】
なお、ヌクレオチドは、二重鎖単独で切断された場合に遺伝子発現抑制機能を有するのであれば、リボデオキシヌクレオチドのみで構成されていても、リボデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドの両方で構成されていても構わない。また、ポリヌクレオチドを構成するリボデオキシヌクレオチドやデオキシヌクレオチドは、遺伝子発現抑制機能を失わない限り、2'-O-メチル、2'-フルオロなどによって、任意に修飾されていても構わない。また、ポリエチレングリコール、葉酸、コレステロールなどのRNA干渉作用を害さない有機分子で修飾されていてもよい。
【００２０】
＝＝偽環状二重鎖ポリヌクレオチド＝＝
偽環状二重鎖ポリヌクレオチドが２個のポリヌクレオチドで形成される場合、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し、第１のポリヌクレオチドの第１の領域と第２のポリヌクレオチドの第６の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有する。従って、図１に示すように、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第１のポリヌクレオチドの第１の領域と第２のポリヌクレオチドの第６の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第２の領域および第５の領域は二重鎖に対するリンカーとなるため、第１及び第２のポリヌクレオチドは、二重鎖を有するヘテロ偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを形成することが可能になる。構造的に、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドの１分子ずつが偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを形成することができるが、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドが交互に結合して、２分子ずつ、４分子ずつなど、２の倍数個の分子が偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを形成してもよい。
【００２１】
一般に、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドがｐ個のポリヌクレオチドから形成される場合（ｐは４以上の偶数）、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し、第２のポリヌクレオチドの第６の領域と第３のポリヌクレオチド（５‘方向から３’方向へ、順に第７の領域と第８の領域と第９の領域を有する）の第７の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し、第ｍのポリヌクレオチド（５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ−２）の領域と第（３ｍ−１）の領域と第３ｍの領域を有する）の第３ｍの領域と第（ｍ＋１）のポリヌクレオチド（３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｍ＋１）の領域と第（３ｍ＋２）の領域と第（３ｍ＋３）の領域を有する）の第（３ｍ＋１）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し、第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋３）の領域と第（ｍ＋２）のポリヌクレオチド（５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ＋４）の領域と第（３ｍ＋５）の領域と第（３ｍ＋６）の領域を有する）の第（３ｍ＋４）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し（ｍは３以上（ｐ−１）以下の奇数）、第ｐのポリヌクレオチドの第３ｐの領域と第１のポリヌクレオチドの第１の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有する。従って、第１のポリヌクレオチドの第３の領域と第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第２のポリヌクレオチドの第６の領域と第３のポリヌクレオチドの第７の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第ｍのポリヌクレオチドの第３ｍの領域と第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋１）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋３）の領域と第（ｍ＋２）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋４）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成する配列を有し、第ｐのポリヌクレオチドの第３ｐの領域と第１のポリヌクレオチドの第１の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第２の領域、第５の領域、第（３ｍ−１）の領域、および第（３ｍ＋２）の領域は二重鎖に対するリンカーとなるため、第１〜第ｐのポリヌクレオチドは、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを形成することが可能になる。ここで、各ポリヌクレオチドは、「ポリヌクレオチド」の項で述べた第１のポリヌクレオチドと同様の構成（ヌクレオチドの個数、種類、修飾など）を有する。なお、ｐ個のポリヌクレオチドは、全て異なっていても、一部同じであってもよく、上述の構造を採っていれば、ポリヌクレオチドの種類は限定されない。
【００２２】
第１〜第ｐのポリヌクレオチドからなるヘテロ偽環状二重鎖ポリヌクレオチドは、ｐ個のポリヌクレオチドを化学合成してアニールすることで得られる。ポリヌクレオチドの化学合成は、周知の方法で行うことができる。アニーリングは、ｐ個のポリヌクレオチドを混合し、加熱した後で、冷却することで行うことができる。加熱の温度は特に限定されず、ポリヌクレオチドの塩基配列を考慮して、当業者が容易に決定することができるが、例えば、５０℃〜１００℃、６０℃〜９０℃、あるいは７０℃〜８０℃などの範囲にまで加熱すればよい。冷却は、徐々に冷却させてもよいが、一定温度で所定時間インキュベートしてもよい。温度は特に限定されず、適切な温度を選択することは当業者には容易であるが、例えば、２０℃〜６０℃、３０℃〜５０℃、あるいは３５℃〜４５℃などの範囲でインキュベートすればよい。時間も特に限定されず、例えば、３０秒〜１０分、１〜５分、あるいは２〜４分などの範囲でインキュベートすればよい。なお、アニーリングの後、リガーゼなどの酵素によってポリヌクレオチドの端同士を結合する必要はない。
【００２３】
＝＝遺伝子抑制剤＝＝
本発明のヘテロ偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを細胞に投与すると、第２の領域、第５の領域、第（３ｍ−１）の領域、および第（３ｍ＋２）の領域で構成されるリンカー部分が分解され、各二重鎖がそれぞれ分離し、独立にｓｉＲＮＡとして機能する。従って、各二重鎖の配列をｓｉＲＮＡの配列として設計することによって、１つの細胞内に等モルで各ｓｉＲＮＡを導入することや、１つの細胞内で最大二重鎖の個数分まで複数の遺伝子の発現をノックダウンすることや、１つの細胞内に任意の比率で種類の異なる複数のｓｉＲＮＡを導入することが可能になる。
【００２４】
たとえば、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドが２個のポリヌクレオチドで形成される場合、各ポリヌクレオチドの各領域を、以下の表１の（１）〜（４）のように設計することによって、発現抑制対象の第１の遺伝子及び第２の遺伝子の発現抑制剤として機能させることができる。
【００２５】
【表１】
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なお、遺伝子発現抑制のためのポリヌクレオチド配列は、当業者に公知であるルールなどを用いて容易に設計することができる。
【００２６】
このように、siRNAを偽環状二重鎖ポリヌクレオチドとすることにより、細胞内で免疫反応が活性化されず、細胞毒性が低いこと、二本のポリヌクレオチドで２つ以上の遺伝子を同一細胞で同時にノックダウンすることができること、リンカーが分解されるまで遺伝子抑制機能が発現しないので、遺伝子抑制の遺伝子発現抑制機能の発現を遅らせたり、リンカーの長さを調節することで半減期を調節したりすることができること、などの効果が得られる。
【００２７】
なお、本明細書で「遺伝子発現抑制」とは、二重鎖ポリヌクレオチドを用いて、遺伝子発現によるタンパク質の細胞内産生を抑制することであって、典型的な例としてRNA干渉が挙げられる。
【実施例】
【００２８】
［実施例１］
［１］レポーターアッセイ用プラスミドDNAの調製
eGFP、DsRed、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼを発現するプラスミドDNA（pcDNA3-EGFDP、pCMV DsRed-Express、pRL-TK、pGL3）を大腸菌JM109コンピテントセルに導入した後、アンピシリン100mg/mlを含有したＬＢ培地200mlにそれぞれ植菌し、37℃で16時間振盪培養を行った。その後PureYieldTM Plasmid Midipreps System (Promega社製)を用いてプラスミドDNAを回収した。【００２９】
［２］siRNAの調製
レポーターアッセイにおいて、eGFPに対するsiRNA配列（EGFP1 siRNA）およびホタルルシフェラーゼに対するsiRNA配列（Luc428 siRNA）をそれぞれポジティブコントロール及びネガティブコントロールとして実験に使用した。なお、各RNAは受託有機合成（JBios社）により得た。各配列を以下に示す。【００３０】
eGFPに対するsiRNA配列：
Sense: AAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号１）
Antisense: GGUGCAGAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号２）
ホタルルシフェラーゼに対するsiRNA配列：
Sense: CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUU（配列番号３）
Antisense: UAUUUUUUGGAUGAUUGGGA（配列番号４）【００３１】
［３］偽環状二重鎖RNAの調製
受託有機合成（JBios社）により得たLG sense RNA及びLG anti RNAを50μMになるように滅菌水で溶解し、30μlずつのRNAと5×anneling Buffer 15μlを混合した。混合溶液を90℃で1分間加熱し、37℃で60分静置し、アニーリングを行うことによって、20μM偽環状二重鎖RNAを得た。また、同様の手順で、異なる組み合わせの一本鎖RNA(LG sense RNA及びLG anti AA RNA)より偽環状二重鎖AA RNAを調製した。これらの偽環状二重鎖RNAは、eGFP及びホタルルシフェラーゼのレポータープラスミドの転写産物における共通配列をターゲットとする。【００３２】
各配列を以下に示す。【００３３】
LG sense: 
CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAAAAAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号５）
LG anti: 
UAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCCCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号６）
LG anti AA: 
AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCCCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号７）【００３４】
［４］RNaseによる分解試験
［３］で得られた偽環状二重鎖RNAが、図１で示されるような偽環状構造を形成していることを確認するために、RNaseR、RNaseS1を用いた分解試験を行った。本実施例では、コントロールとして、既に環状構造を有していることが知られているCHR-SAT6 RNAを使用した。【００３５】
［４−１］RNaseR分解試験
偽環状二重鎖RNA作製に用いた一本鎖RNA、偽環状二重鎖RNA、CHR-SAT6 RNA（各5 pmol相当）に10×Buffer 1 μlを加え、RNaseR 0.5 μl（10 units）を混合して、滅菌水で10 μlに調整した。得られたRNA溶液を30℃で15分間反応させた後、5 μlに6×Loading Dye 1 μlを加え、12 % native PAGEにてRNaseR反応処理前後の各RNAの泳動位置の変化を確認した。【００３６】
RNaseRは、１本鎖RNAを両端から分解する酵素である。図２に示すように、一本鎖RNAは分解されたが、偽環状二重鎖RNAは、２個のポリヌクレオチドで構成されているもの及び４個のポリヌクレオチドで構成されているものは、両方ともRNaseRに耐性を示した。すなわち、偽環状二重鎖RNAは一本鎖端を持たないことを示している。なお、環状であることが知られているCHR-SAT6 RNAも、RNaseRに耐性を示した。【００３７】
［４−２］RNaseS1分解試験
偽環状二重鎖RNA作製に用いた一本鎖RNA、偽環状二重鎖RNA溶液、CHR-SAT6 RNA（各5 pmol相当）に10×Buffer 1 μlを加え、RNaseS1 1 μl（6.3 units）を混合して、滅菌水で10 μlに調整した。得られたRNA溶液を30℃で15 min反応させた後、5 μlに6×Loading Dye 1 μlを加え、12 % native PAGEにてRNaseR反応処理前後の各RNAの泳動位置の変化を確認した。【００３８】
RNaseS1は、１本鎖RNAを非特異的に分解する酵素である。図３に示すように、一本鎖RNAは分解され、一方、偽環状二重鎖RNAも分解されたが、二重鎖RNAのみが分解されずに残っている。なお、環状であることが知られているCHR-SAT6 RNAは、RNaseRに耐性を示した。【００３９】
［４−３］Dicer処理試験
細胞内でRNA干渉を誘導するためには、導入したRNAがDicerによってsiRNAへとプロセシングされる必要がある。そこで調製した偽環状二重鎖RNAのDicer処理試験を行った。【００４０】
Recombinant Dicer Enzyme Kit (Genlantis社）に従い、一本鎖RNA(LG sense RNA)、偽環状RNA 各3 μl、10 mM ATP 4.0 μl、50mM MgCl2 2.0 μl、Reaction Buffer 16 μl、Dicer Enzyme （4 units）8 μlを混合し、滅菌水を用いて40 μlに調製した。その後、37 ℃にてインキュベーションし、目的の時間ごとに8 μlサンプリングしてDicer stop solution 2 μlと混合し、-20 ℃にて凍結保存した。全てのサンプリング終了後、回収したサンプルを氷上で緩やかに溶解し、12 % native PAGEにて偽環状RNAの分解挙動を確認した。（図４）
図４に示されるように、一本鎖RNAであるLG sense RNAは加水分解による分解が確認されたがDicerによる切断産物は確認されなかった。一方、偽環状二重鎖RNAはDicerによる切断が確認された。このように、偽環状二重鎖RNAは、siRNAとして機能しうる。【００４１】
［５］細胞抽出液処理試験
本実験ではHEK293細胞より抽出した細胞抽出液を実験に使用した。【００４２】
［５−１］細胞抽出液の調製
10cmシャーレを用いて、HEK293細胞を80%コンフルエントになるまで培養した。培地を除去して1×PBS 3 μlで細胞を洗った後、1×PBS 5 μlを用いて、ピペッティングによりHEK293細胞をシャーレより剥がした。剥がした細胞を含む溶液を遠心して上清を除去し、M-PER（登録商標） Mammalian Protein Extraction Reagent 100 μlを加え、素早くピペッティングをおこなうことでペレット状の細胞を溶解した。溶解液を遠心して上清を回収し、-80℃で保存した。【００４３】
［５−２］細胞抽出液中でのRNAの安定性評価実験
［５−１］で調製した細胞抽出液とRNAを37℃で、0分、10分、60分、及び90分の各時間インキュベートし、変性PAGEあるいはPAGEによってRNAの安定性を評価した。（図５）
図５に示されるように、一本鎖RNAであるLG sense RNAは60分以内に分解されたのに対し、偽環状RNAおよび環状RNA（CHR-SAT6）の分解はほとんど認められなかった。このように、偽環状RNAは一本鎖RNAより安定に存在しうる。【００４４】
［６］細胞導入
HEK293細胞に、レポーター発現プラスミドに加え、各レポーター遺伝子に対するsiRNA（ポジティブコントロール）、ランダムな配列を有するsiRNA（ネガティブコントロール）、偽環状二重鎖RNA作製に用いた一本鎖RNA(LG sense RNA)、または偽環状二重鎖RNAをリポフェクタミン3000を用いて導入し、24時間後のeGFPおよびDsRedの蛍光を位相差蛍光顕微鏡にて観察した。【００４５】
図６に示すように、レポーター特異的な、ポジティブコントロールまたは偽環状二重鎖RNAを導入したときに、レポーター発現の抑制が観察された。このように、偽環状二重鎖RNAは、遺伝子抑制剤として有効である。【００４６】
次に、HEK293細胞に、レポーター発現プラスミドに加え、各レポーター遺伝子に対するsiRNA（ポジティブコントロール）、溶媒のみ（図７では-siRNAと記す）、偽環状二重鎖RNA作製に用いた一本鎖RNA(LG sense RNA、LG anti RNA、またはLG anti AA RNA)、偽環状二重鎖RNA、または偽環状二重鎖AA RNAをリポフェクタミン3000を用いて導入し、ホタルルシフェラーゼ遺伝子およびウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の発現を、Dual-Glo Luciferase Assay Systen（プロメガ社）を用いて定量し、ウミシイタケルシフェラーゼの発光強度をもとにホタルルシフェラーゼ遺伝子の相対的なノックダウン効率を算出した。溶媒のみの場合の平均発現レベルを１００とした相対発現量を図７に示す。【００４７】
その結果、一本鎖RNAを導入したときには、レポーター発現の抑制は観察されず、偽環状二重鎖を導入したときに、レポーター発現の抑制が観察された。このように、偽環状二重鎖RNAは、遺伝子抑制剤として有効である。【００４８】
［実施例２］
本実施例では、eGFP遺伝子発現のノックダウンをアッセイ系とし、リンカーのヌクレオチドの個数が、偽環状二重鎖の効果に影響がないことを示す。
まず、下記配列を有するヌクレオチドを用い、実施例１と同様にして、センス鎖３通りとアンチセンス鎖３通りの合計９通りの偽環状二重鎖RNAを調製した。例えば、LG sense A1とLG anti AA C1からなる偽環状二重鎖RNAを偽環状Ａ１Ｃ１と称し、他も同様に命名した。
LG sense A1：
CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号８）
LG sense A3：
CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAAAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号９）
LG sense A6：
CCAAUCAUCCAAAAAAUUAUUAAAAAAGGUGCACAUGAACUUCAGGGUCAGCUU（配列番号１０）
LG anti AA C1：
AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号１１）
LG anti AA C3：
AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号１２）
LG anti AA C6：
AAUAAUUUUUUGGAUGAUUGGGACCCCCCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACC（配列番号１３）
調製物を12 % native PAGEで分離することで、偽環状二重鎖RNAが形成されていることを確認した。その結果を図８に示す。
次に、実施例１と同様にして、レポーター遺伝子の発現に対する、これらのヌクレオチド及び偽環状二重鎖RNAの効果を、レポーター遺伝子からのeGFPによる蛍光を観察することにより調べたところ、図９に示すように、ヌクレオチド単独及びluc428（陰性対照）では発現抑制が観察されず、偽環状二重鎖RNAおよびEGFP1（陽性対照）では発現抑制が観察された。
このように、偽環状二重鎖RNAのリンカー長は、遺伝子抑制効果に影響を及ぼさない。【００４９】
［実施例３］ルシフェラーゼ遺伝子発現の長期ノックダウン
本実施例では、ルシフェラーゼ遺伝子発現のノックダウンをアッセイ系とし、偽環状二重鎖の効果が長期的に続くことを示す。
実施例２で調製した偽環状二重鎖RNAを用い、実施例１と同様にレポーター遺伝子と偽環状二重鎖を細胞に導入した後、レポーターであるルシフェラーゼの発現を定量化した。なお、実施例１では２４時間後に発現を測定したが、本実施例では、その後、３日後と５日後にも発現を測定した。その結果を図１０に示す。
偽環状二重鎖RNAを用いても、luc428（陽性対照）と同様に、細胞導入して５日後でも、遺伝子発現抑制活性が観察された。
このように、偽環状二重鎖RNAの遺伝子発現抑制活性は、長期にわたって維持される。【００５０】
［実施例４］インターフェロン応答の誘導
哺乳動物細胞において、siRNAがインターフェロン応答を誘導し、非特異的に遺伝子発現を抑制することが知られている。インターフェロン応答が誘導された場合、ＳＴＡＴの発現が亢進し、かつリン酸化によって活性化される。本実施例では、偽環状二重鎖RNAがインターフェロン応答を誘導しないことを示す。【００５１】
まず、実施例１と同様の培養条件で、２４ウェルプレートに、ＨＥＫ２９３細胞を１ウェルあたり１５０００個となるように播種し、一晩培養した。各プレートにおいて、
（１）何も処理しない（陰性対照）
（２）luc428をリポフェクタミン3000で導入
（３）polyICをリポフェクタミン3000で導入（陽性対照）
（４）偽環状Ａ３Ｃ３をリポフェクタミン3000で導入
（５）リポフェクタミン3000のみ（RNAなし）（陰性対照）
（６）luc428のみ（リポフェクタミン3000なし）（陰性対照）
（７）偽環状Ａ３Ｃ３のみ（リポフェクタミン3000なし）（陰性対照）
の各処理を行った（ヌクレオチドは、それぞれ20 pmol）。そして、２４時間後にＰＢＳで細胞を洗浄した後で細胞を回収し、M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent(PIERCE)を用いて抽出物を得て、ウエスタンブロッティングを行った。一次抗体として、抗ＳＴＡＴ１抗体（Stat1 Rabbit mAb(42H3)（ＣＳＴジャパン））及び抗リン酸化ＳＴＡＴ１抗体（Phospho-Stat1(Tyr701)Rabbit mAb(D4A7)（ＣＳＴジャパン））を用い、二次抗体として、Anti Mouse IgG, HRP-linked Whole Antibody（ＧＥヘルスケア）を用い、Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（ＧＥヘルスケア）を用いた化学発光によって、ＳＴＡＴ１の発現及びＳＴＡＴ１のリン酸化を検出したところ、図１１に示すように、偽環状二重鎖RNAも、luc428と同様に、インターフェロン応答の誘導活性は有さなかった。
このように、偽環状二重鎖RNAは、インターフェロン応答の誘導活性を有しない。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によって、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドと、それを用いた遺伝子発現阻害剤を提供することができるようになった。
【図１】
2017135383.tif 000003
【図２】
2017135383.tif 000004
【図３】
2017135383.tif 000005
【図４】
2017135383.tif 000006
【図５】
2017135383.tif 000007
【図６】
2017135383.tif 000008
【図７】
2017135383.tif 000009
【図８】
2017135383.tif 000010
【図９Ａ】
2017135383.tif 000011
【図９Ｂ】
2017135383.tif 000012
【図１０】
2017135383.tif 000013
【図１１】
2017135383.tif 000014
【配列表】
2017135383000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月27日(2017.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
ｐ個のポリヌクレオチドからなる偽環状二重鎖ポリヌクレオチドであって（ｐは４以上の偶数）、５‘方向から３’方向へ、順に第１の領域と第２の領域と第３の領域を有する第１のポリヌクレオチドの第３の領域と、３‘方向から５’方向へ、順に第４の領域と第５の領域と第６の領域を有する第２のポリヌクレオチドの第４の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第２のポリヌクレオチドの第６の領域と、５‘方向から３’方向へ、順に第７の領域と第８の領域と第９の領域を有する第３のポリヌクレオチドの第７の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ−２）の領域と第（３ｍ−１）の領域と第３ｍの領域を有する第ｍのポリヌクレオチドの第３ｍの領域と、３‘方向から５’方向へ、順に第（３ｍ＋１）の領域と第（３ｍ＋２）の領域と第（３ｍ＋３）の領域を有する第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋１）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し、第（ｍ＋１）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋３）の領域と、５‘方向から３’方向へ、順に第（３ｍ＋４）の領域と第（３ｍ＋５）の領域と第（３ｍ＋６）の領域を有する第（ｍ＋２）のポリヌクレオチドの第（３ｍ＋４）の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成し（ｍは３以上（ｐ−１）以下の奇数）、第ｐのポリヌクレオチドの第３ｐの領域と第１のポリヌクレオチドの第１の領域はそれぞれ対合して二重鎖を形成している、偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを有効成分として含む遺伝子発現抑制剤。
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
第１〜第ｐのポリヌクレオチドが、それぞれ２９個から９９個のヌクレオチドからなる、請求項１２に記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項１７】
リボデオキシヌクレオチドで構成されている、請求項１２または１６に記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項１８】
リボデオキシヌクレオチドとデオキシヌクレオチドで構成されている、請求項１２または１６に記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項１９】
偽環状二重鎖ポリヌクレオチドを構成する前記ヌクレオチドが、修飾されているヌクレオチドを含む、請求項１２、１６〜１８のいずれか１項に記載の遺伝子発現抑制剤。
【請求項２０】
前記修飾が、ポリエチレングリコール、葉酸、またはコレステロールである、請求項１９に記載の遺伝子発現抑制剤。
【国際調査報告】
2017135383.tif 000015
2017135383.tif 000016
2017135383.tif 000017
2017135383.tif 000018