(57)【要約】  本発明は、ヘムタンパク質の変性あるいは分解に対して有効な、新たなヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法を提供することを目的とし、具体的には、ジスルホン酸又はその塩を含むヘムタンパク質の保存液、及びヘムタンパク質を含む試料中にジスルホン酸又はその塩を共存させるヘムタンパク質の安定化方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジスルホン酸又はその塩を含むヘムタンパク質の保存液。
【請求項２】
前記ジスルホン酸又はその塩が、鎖式の炭化水素基又は環式の炭化水素基の少なくとも１つを有するジスルホン酸又はその塩であって、
前記鎖式の炭化水素基が分岐状もしくは直鎖状の炭化水素基であり、かつ分岐状の前記鎖式の炭化水素基の主鎖もしくは直鎖状の前記鎖式の炭化水素基の炭素数が１乃至１０のいずれかであるジスルホン酸又はその塩、
前記環式の炭化水素基がシクロアルキレン基もしくはアリール基であり、かつ前記環式の炭化水素基の炭素数が３乃至１０のいずれかであるジスルホン酸又はその塩、並びに、
前記シクロアルキレン基もしくは前記アリール基が１個以上の置換された窒素原子を有するジスルホン酸又はその塩からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１に記載のヘムタンパク質の保存液。
【請求項３】
前記ジスルホン酸又はその塩が、メタンジスルホン酸、エタンジスルホン酸、プロパンジスルホン酸、ブタンジスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）又はその塩からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１又は２に記載のヘムタンパク質の保存液。
【請求項４】
前記ジスルホン酸又はその塩の濃度が０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ以下である請求項１乃至３のいずれか１項に記載のヘムタンパク質の保存液。
【請求項５】
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸をさらに含む請求項１乃至４のいずれか１項に記載のヘムタンパク質の保存液。
【請求項６】
標準試料又はコントロール試料として用いられる、ヘムタンパク質をさらに含む請求項１乃至５のいずれか１項に記載のヘムタンパク質の保存液。
【請求項７】
免疫学的測定に用いられる請求項１乃至６のいずれか１項に記載のヘムタンパク質の保存液。
【請求項８】
ヘムタンパク質を含む試料中に、ジスルホン酸又はその塩を共存させるヘムタンパク質の安定化方法。
【請求項９】
前記ジスルホン酸又はその塩の濃度が０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ以下である請求項８記載のヘムタンパク質の安定化方法。
【請求項１０】
ヘムタンパク質と抗ヘムタンパク質抗体とをジスルホン酸又はその塩の存在下で接触させる工程を含む、ヘムタンパク質の免疫学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法に関する。特に、免疫学的測定法において有用なヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がんの罹患率が増加していることに伴い、大腸がん検診の一次検査や下部消化管疾患のスクリーニング法として、糞便中の血液を検出する便潜血検査が広く行われている。便潜血検査は、ヘムタンパク質であるヘモグロビンの持つペルオキシダーゼ様活性を利用した化学的な発色反応に基づく化学的測定法や、ヒトヘモグロビンに特異的な抗体を利用した免疫学的測定法によって行われ、特に、免疫学的測定法は、化学的測定法と比較して検査前の食事制限や服薬制限を必要とせず、簡便で迅速な測定が可能であるため、便潜血検査の主な検査方法として定着している。【０００３】
しかしながら、ヘモグロビンは溶液中で非常に不安定であり、変性あるいは分解しやすいことが知られている。この変性あるいは分解によって、ヘモグロビンの立体構造が破壊され、その抗原性が低下するため、ヘモグロビンの免疫学的測定法において誤った測定結果が導かれてしまう。ヘモグロビンの変性あるいは分解の原因としては、保存温度の上昇、時間経過、細菌や酵素等様々なものが挙げられるが、例えば、保存温度については、溶液中のヘモグロビンは凍結又は冷蔵状態では比較的安定であるが、室温又はそれ以上の温度では変性あるいは分解が進むことが知られている。【０００４】
特に、便潜血検査においては、被験者自身が自宅等で糞便を採取し、便検体用希釈液を含む密閉容器に糞便を懸濁して検査に供する場合が多く、この場合、糞便中のヒトヘモグロビンは、溶液中で数日間放置され、郵便等の輸送手段を利用することによって高温下に置かれることもある。さらに、病院や検査機関では、多数の検体及び他項目の検査を実施しているため、測定結果を得るまでに多くの時間を要することもある。それゆえ、便潜血検査では、温度上昇や時間経過等の原因が重なり合い、ヘモグロビンの変性あるいは分解が生じやすい。【０００５】
さらに、便潜血検査では、多くの検体を正確かつ迅速に測定できる自動分析装置を用いて測定が行われることが多い。自動分析装置を用いた測定では、試薬や装置の変化が検査結果の精度に影響するため、既知濃度のヘモグロビンを含む標準試料及び既知濃度のヘモグロビンを含むコントロール試料を用いて定期的に自動分析装置のキャリブレーションや精度管理が行われている。キャリブレーションでは、複数の既知濃度の測定対象物質を含む標準試料を自動分析装置で測定して、検量線を作成し、自動分析装置の校正を行い、精度管理では、既知濃度の測定対象物質を含むコントロール試料を自動分析装置で測定し、測定値が所定範囲内に収まっているか否かにより、分析精度を判定する。しかしながら、標準試料及びコントロール試料中に含まれるヘモグロビンが変性あるいは分解していると、キャリブレーションや精度管理を正確に行うことができず、測定の誤りを招くこととなる。【０００６】
従って、ヘモグロビンの変性あるいは分解を抑制し、正確な測定結果を得るために、これまで、ヘモグロビンを安定化するための様々な方法が提案されてきた。例えば、チメロサールやクロルヘキシジン等抗菌剤を添加する方法（例えば、特許文献１参照）、ヒト以外の動物ヘモグロビンを添加する方法（例えば、特許文献２参照）、ヒト以外の動物血清を添加する方法（例えば、特許文献３参照）、グリコシダーゼ型溶菌酵素を添加する方法（例えば、特許文献４参照）、亜硫酸や二亜硫酸等を添加する方法（例えば、特許文献５参照）、アシルアルギニンエステル及びカチオン性界面活性剤を添加する方法（例えば、特許文献６参照）、グリオキシル酸を添加する方法（例えば、特許文献７参照）等が提案されている。【０００７】
さらに、本出願人は、フェロシアン化合物等の水溶性遷移金属錯体を添加する方法（例えば、特許文献８、特許文献９参照）、ヘモグロビンの酵素分解産物を添加する方法（例えば、特許文献１０参照）、遷移金属類を添加する方法（例えば、特許文献１１参照）、リンゴ酸等の有機酸を添加する方法（例えば、特許文献１２参照）、脱脂アルブミンを添加する方法（例えば、特許文献１３参照）、イミノカルボン酸を添加する方法（例えば、特許文献１４参照）等を既に提案している。【０００８】
しかしながら、ヘモグロビンは非常に不安定であることから、これらのヘモグロビンの安定化方法であっても、その変性あるいは分解を十分に防ぐには至っていないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開昭６３−２７１１６０号公報
【特許文献２】特開平２−２９６１４９号公報
【特許文献３】特開平４−１４５３６６号公報
【特許文献４】特公平５−６９４６６号公報
【特許文献５】特開２０００−２５８４２０号公報
【特許文献６】特開２００９−２２２７１０号公報
【特許文献７】特開２０１３−２５７２１６号公報
【特許文献８】特開平７−２２９９０２号公報
【特許文献９】特開平１１−１１８８０６号公報
【特許文献１０】特開平１１−２１８５３３号公報
【特許文献１１】特開２００１−２４９１３２号公報
【特許文献１２】特開２００３−１４７６８号公報
【特許文献１３】特開２００３−１９４８２５号公報
【特許文献１４】特開２００９−０９７９５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような問題を解決するため、本発明は、ヘモグロビンに代表されるヘムタンパク質の変性あるいは分解に対して有効な、新たなヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のヘムタンパク質の保存液は、ジスルホン酸又はその塩を含むことを特徴とする。また、本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、ヘムタンパク質を含む試料中にジスルホン酸又はその塩を共存させることを特徴とする。【００１２】
すなわち、本発明は、以下を包含する。【００１３】
（１）  ジスルホン酸又はその塩を含むヘムタンパク質の保存液。【００１４】
（２）  ジスルホン酸又はその塩が、鎖式の炭化水素基又は環式の炭化水素基の少なくとも１つを有するジスルホン酸又はその塩であって、
前記鎖式の炭化水素基が分岐状もしくは直鎖状の炭化水素基であり、かつ分岐状の前記鎖式の炭化水素基の主鎖もしくは直鎖状の前記鎖式の炭化水素基の炭素数が１乃至１０のいずれかであるジスルホン酸又はその塩、
前記環式の炭化水素基がシクロアルキレン基もしくはアリール基であり、かつ前記環式の炭化水素基の炭素数が３乃至１０のいずれかであるジスルホン酸又はその塩、並びに、
前記シクロアルキレン基もしくは前記アリール基が１個以上の置換された窒素原子を有するジスルホン酸又はその塩からなる群より選択される少なくとも１種である（１）に記載のヘムタンパク質の保存液。【００１５】
（３）  ジスルホン酸又はその塩が、メタンジスルホン酸、エタンジスルホン酸、プロパンジスルホン酸、ブタンジスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）又はその塩からなる群より選択される少なくとも１種である（１）又は（２）に記載のヘムタンパク質の保存液。【００１６】
（４）  ジスルホン酸又はその塩の濃度が０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ以下である（１）乃至（３）のいずれかに記載のヘムタンパク質の保存液。【００１７】
（５）  Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸をさらに含む（１）乃至（４）のいずれかに記載のヘムタンパク質の保存液。【００１８】
（６）  標準試料又はコントロール試料として用いられる、ヘムタンパク質をさらに含む（１）乃至（５）のいずれかに記載のヘムタンパク質の保存液。【００１９】
（７）  免疫学的測定に用いられる（１）乃至（６）のいずれかに記載のヘムタンパク質の保存液。【００２０】
（８）  ヘムタンパク質を含む試料中に、ジスルホン酸又はその塩を共存させるヘムタンパク質の安定化方法。【００２１】
（９）  ジスルホン酸又はその塩の濃度が０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｏｌ／Ｌ以下である（８）記載のヘムタンパク質の安定化方法。【００２２】
（１０）  ヘムタンパク質と抗ヘムタンパク質抗体とをジスルホン酸又はその塩の存在下で接触させる工程を含む、ヘムタンパク質の免疫学的測定方法。【００２３】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-070667号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法によれば、ヘムタンパク質の変性あるいは分解を抑制し、ヘムタンパク質を安定的に保存することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２６】
本発明のヘムタンパク質の保存液は、ジスルホン酸又はその塩を含む。また、本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、ヘムタンパク質を含む試料中にジスルホン酸又はその塩を共存させる。
【００２７】
本発明に用いられるジスルホン酸又はその塩は、特に限定されるものではなく、公知のものから選択することができる。本発明に用いられるジスルホン酸は、飽和又は不飽和結合を有していてもよい鎖式又は環式の炭化水素基を少なくとも１つ有するジスルホン酸であり、特に、鎖式又は環式の炭化水素基と、２つのスルホン基とからなるジスルホン酸であることが好ましい。本発明に用いられるジスルホン酸は、鎖式の炭化水素基又は環式の炭化水素基のいずれかを有してもよく、両方を有していてもよい。
【００２８】
特に、本発明に用いられるジスルホン酸が有する鎖式炭化水素基は、分岐状又は直鎖状の炭化水素基である。分岐状の炭化水素基の主鎖又は直鎖状の炭化水素基の炭素数は、好ましくは１乃至１０、より好ましくは１乃至４、さらに好ましくは１又は２のいずれかである。分岐状の炭化水素基の主鎖又は直鎖状の炭化水素基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキレン基、アルケニレン基、もしくはアルキニレン基であることが好ましい。アルキレン基を有するジスルホン酸としては、例えば、メタンジスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸（以下、１，２−ＥＤＳという）、１，３−プロパンジスルホン酸、１，４−ブタンジスルホン酸、１，５−ペンタンジスルホン酸、１，６−ヘキサンジスルホン酸等が挙げられる。
【００２９】
また、本発明に用いられるジスルホン酸が有する環式の炭化水素基の炭素数は、３乃至１０のいずれかであることが好ましい。環式の炭化水素基は、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、シクロアルキニル基、又はアリール基であることが好ましい。特に、アリール基は、好ましくはフェニレン基又はナフチレン基である。フェニレン基もしくはナフチレン基を有するジスルホン酸としては、例えば、１，２−ベンゼンジスルホン酸、１，３−ベンゼンジスルホン酸、１，４−ベンゼンジスルホン酸、１，６−ナフタレンジスルホン酸、２，６−ナフタレンジスルホン酸、２，７−ナフタレンジスルホン酸等が挙げられる。
【００３０】
また、環式の炭化水素基は、分岐状の炭化水素基であってもよい。また、環式の炭化水素基は、１個以上、好ましくは１乃至３個、より好ましくは１乃至２個のいずれかの窒素原子で置換されていてもよい。窒素原子で置換されている炭化水素基を有するジスルホン酸としては、例えば、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）を挙げることができる。
【００３１】
また、より好ましくは、本発明に用いられるジスルホン酸は、鎖式又は環式の炭化水素基に２つのスルホン基が結合したジスルホン酸である。さらに、鎖式の炭化水素基を有するジスルホン酸は、２つのスルホン基を、分岐状の炭化水素基の主鎖もしくは直鎖状の炭化水素基の異なる炭素原子に有することが好ましく、より好ましくはこれらの各末端に有する。本発明に用いられるジスルホン酸は、１，２−エタンジスルホン酸（１，２−ＥＤＳ）であることが好ましい。
【００３２】
本発明に用いられるジスルホン酸の炭化水素基は、ハロゲン基及び／又はヒドロキシ基等の置換基を有してもよい。また、分岐状の炭化水素基を有するジスルホン酸では、分岐鎖が炭化水素からなることが好ましい。また、本発明に用いられるジスルホン酸又はその塩は、少なくとも１種であり、２種以上を混合した混合物であってもよい。
【００３３】
本発明によれば、保存液又は試料中にヘムタンパク質とジスルホン酸又はその塩とを含むことによって、ヘムタンパク質の変性あるいは分解を抑制することができる。特に、本発明によれば、ジスルホン酸がエタンジスルホン酸を含むことによって、ヘムタンパク質の安定性をより高めることができる。本発明に用いられるジスルホン酸は、測定に悪影響を及ぼさず、特にラテックス免疫凝集法を用いる免疫測定方法に好適である。
【００３４】
本発明に用いられるジスルホン酸の塩は、特に限定されないが、ジスルホン酸の１価、２価、又は３価の金属塩である。ジスルホン酸の塩としては、例えば、アルカリ金属塩、アンモニウム塩、アルカリ土類金属塩、鉄塩、又はアルミニウム塩等が挙げられる。アルカリ金属としては、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムが挙げられる。アルカリ土類金属としては、例えばカルシウム、ストロンチウム、バリウム、ラジウムが挙げられる。
【００３５】
本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料に含まれるジスルホン酸又はその塩の濃度の上限は、０．３ｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０．２ｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．１５ｍｏｌ／Ｌ以下であり、下限は０．００１ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは０．００５ｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上、最も好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌ以上である。ジスルホン酸又はその塩の濃度が０．００１ｍｏｌ／Ｌ未満であると、ヘムタンパク質の安定化効果が不十分になる。一方、ジスルホン酸又はその塩の濃度が０．３ｍｏｌ／Ｌを超えると、免疫反応が阻害され、測定に影響を及ぼしやすくなる他、十分なヘムタンパク質の安定化効果が得られなくなる。
【００３６】
本発明が対象とするヘムタンパク質及び本発明の試料に含まれるヘムタンパク質は、ヘムを構成成分とするタンパク質の中から適宜選択することができる。ヘムタンパク質としては、例えば、ヘモグロビン、ミオグロビン、ペルオキシターゼ又はカタラーゼ等が挙げられる。特に、本発明が対象とするヘムタンパク質及び本発明の試料に含まれるヘムタンパク質は、好ましくは免疫学的な分析対象となるヘムタンパク質であり、より好ましくはヒトヘモグロビンである。免疫学的測定法では、検出対象の抗原性を維持することが重要であるが、本発明によればヘムタンパク質の抗原性を維持することができるため、より精確なヘムタンパク質の測定が可能となる。特に、本発明が対象とするヘムタンパク質及び本発明の試料に含まれるヘムタンパク質を生体試料中のヘモグロビンとすることで、大腸がん等の疾病の診断における測定結果の誤りを防ぐことが期待できる。ヘモグロビンは、便中に含まれるヘモグロビン、赤血球より調製したヘモグロビンを含む標準試料又はコントロ−ルとして市販されているヘモグロビン、及び凍結乾燥ヘモグロビン等を含むことができる。
【００３７】
また、本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料は、ヘムタンパク質を溶解できる溶液を含むことができる。溶液としては、ヘムタンパク質を溶解できる溶液であればよく、例えば、緩衝液を挙げることができ、緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、グッド緩衝剤やリン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤等が挙げられる。
【００３８】
さらに、グッド緩衝剤としては、例えば、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、トリシン［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等が挙げられる。特に、本発明では、グッド緩衝剤の中でもＨＥＰＥＳを用いることが好ましく、ジスルホン酸又はその塩を共存させることで、ヘムタンパク質の安定性を著しく高めることができる。
【００３９】
緩衝剤の濃度は、測定に適した濃度であれば特に限定されないが、０．００１乃至２．０ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００５乃至１．５ｍｏｌ／Ｌ、さらに好ましくは０．０１乃至１．０ｍｏｌ／Ｌである。
【００４０】
また、本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料のｐＨは、中性域が好ましく、５乃至１０が好ましく、より好ましくは６乃至８の範囲である。ｐＨが５より低い、あるいは１０より高い場合は、ヘムタンパク質の安定性が損なわれ、ヘムタンパク質が変性あるいは分解しやすくなる。ｐＨは、公知の方法で調整でき、ＮａＯＨや適当な緩衝剤を用いて調整してもよい。
【００４１】
さらに、本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料は、水溶性遷移金属錯体、フェロシアン化合物、ヘモグロビンの酵素分解産物、遷移金属類、有機酸、イミノカルボン酸、アルブミンやゼラチンに代表される不活性タンパク質、及びアジ化ナトリウム等、公知のタンパク質保護剤を含むことができる。また、微生物の不必要な繁殖を防ぐための抗菌剤等を含んでもよい。さらに、本発明の効果を損なわない範囲において、必要に応じて、塩、凝集促進剤、その他の成分を含んでもよい。本発明によれば、従来のタンパク質保護剤や抗菌剤等の作用を阻害することなく、従来のタンパク質保護剤や抗菌剤等と共にヘムタンパク質の安定性を高めることができる。
【００４２】
また、本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料がアルブミンを含む場合には、アルブミンとして、牛、馬、豚、羊、兎、ヒト、ラット等のアルブミンを用いることができ、アルブミンを含有する血清を用いるようにしてもよい。本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料中のアルブミンの濃度は、０．０００５乃至２．０ｗ／ｖ％、より好ましくは０．０１乃至０．５ｗ／ｖ％である。
【００４３】
ヘムタンパク質の測定方法は、特に限定されるものではないが、抗ヘムタンパク質抗体(ヘムタンパク質に特異的に結合する抗体)を用いた免疫学的測定法、好ましくは、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学的測定法である。具体的には、試料において、ヘムタンパク質(例えば、ヒトヘモグロビン)と抗ヘムタンパク質抗体(例えば、抗ヒトヘモグロビン抗体)とをジスルホン酸又はその塩の存在下で接触させ、抗原抗体反応を生じさせ、形成した免疫複合体に基づいて当該試料中のヘムタンパク質を検出又は測定する。ヘムタンパク質がヒトヘモグロビンである場合には、ヒトヘモグロビンの免疫学的測定法としては、例えば、寒天平板内で抗ヒトヘモグロビン抗体と被検試料中のヒトヘモグロビンの結合による免疫複合体による沈降線の発現を確認する一元放射状免疫拡散法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したラテックス粒子を用いるラテックス免疫凝集法、酵素や放射性元素で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を用いる酵素免疫測定法や放射免疫測定法、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した金コロイド粒子を用いる金コロイド凝集比色法、ニトロセルロース膜等のメンブレンにおいて、金属コロイド等で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体及び当該抗ヒトヘモグロビン抗体とヒトヘモグロビンとの免疫複合体を捕捉する捕捉抗体を用いるイムノクロマト法等が挙げられる。具体的に、ラテックス免疫凝集法では、抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したラテックス粒子と試料中のヒトヘモグロビンとを反応させ、免疫複合体の形成によりラテックス粒子が凝集し、当該ラテックスの凝集による濁度の変化に基づいて、ヒトヘモグロビンを測定する。また、イムノクロマト法では、ニトロセルロース膜等のメンブレンにおいて、試料を供給し、試料中のヒトヘモグロビンは金属コロイド等で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を保持する標識試薬保持部で抗ヒトヘモグロビン抗体と反応して免疫複合体を形成し、さらに免疫複合体が毛細管現象によってメンブレン中を移動し、メンブレンの所定の位置に固定された捕捉抗体により当該免疫複合体が捕捉され、当該捕捉による呈色に基づいてヒトヘモグロビンを検出する。いずれの測定方法においても、ジスルホン酸又はその塩を含む本発明のヘムタンパク質の保存液又はヘムタンパク質を含む試料によれば、ヘムタンパク質の抗原活性を保護し、測定値の誤りを抑制することができる。
【００４４】
本発明のヘムタンパク質の保存液は、ヘムタンパク質を保存するための溶液として様々な用途に用いることができ、例えば、糞便、尿、及び血液等、生体試料由来のヘムタンパク質の溶解用溶液や、希釈液及び抽出液等の溶液として用いることができる。特に、ヘムタンパク質の検出を行うための検査、例えば便潜血検査の便検体用希釈液として有用である。
【００４５】
また、本発明のヘムタンパク質の保存液は、上述の本発明が対象とするヘムタンパク質を含んでいてもよく、ヘムタンパク質を含む様々な溶液として使用できる。同様に、本発明のヘムタンパク質の安定化方法は、ヘムタンパク質を含む様々な試料に適用できる。例えば、本発明のヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質を含む試料は、ヘムタンパク質を含む標準試料又はヘムタンパク質を含むコントロール試料等、特に自動分析装置のキャリブレーション又は精度管理用のヘムタンパク質を含む標準試料又はヘムタンパク質を含むコントロール試料として使用できる。ヘムタンパク質を含む標準試料及びコントロール試料は、長期的に保存された場合においても、ヘムタンパク質の測定値が変動しないことが必要とされるが、本発明によれば、比較的高温で保存された場合においても標準試料及びコントロール試料中のヘムタンパク質の変性あるいは分解を抑制できるため、ヘムタンパク質の測定値の安定化に貢献することができる。従って、本発明のヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質を含む試料は、ヘムタンパク質を含む標準試料及びコントロール試料として好適である。
【００４６】
さらに、本発明のヘムタンパク質の保存液は、例えば便潜血検査等に使用される、ヘムタンパク質(例えば、ヒトヘモグロビン)の免疫学的測定用キットとして提供することもできる。当該キットは、本発明のヘムタンパク質の保存液の他に、採便容器等の試料保存容器、キットの取扱説明書や、例えば免疫学的測定法がラテックス免疫凝集法である場合には抗ヘムタンパク質抗体を感作したラテックス液、希釈液等、あるいは免疫学的測定法がイムノクロマト法である場合にはイムノクロマトグラフデバイス(例えば、試料供給部と、金属コロイド等で標識した抗ヘムタンパク質抗体を保持する標識試薬保持部と、所定の位置に固定された捕捉抗体を含む検出部とを有する、支持体に担持されたニトロセルロース膜等のメンブレン)等を含むことができる。
【００４７】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例１
０．３ｗ／ｖ％の牛血清アルブミン、ＮａＯＨ、及び緩衝液として０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液を含み、残部を純水とするｐＨ７．０の溶液を調製した。この溶液に、添加物として１，２−ＥＤＳを表１に示す各濃度（０．０１乃至０．２ｍｏｌ／Ｌ）となるように添加し、各濃度の溶液を調製した。この調製した各溶液１０ｍＬに溶血ヘモグロビンを６００ｎｇ／ｍＬとなるように添加し、試料とした。【００４９】
ヘモグロビンの添加直後に、各試料のヘモグロビン濃度を測定した（添加直後濃度）。次いで、各試料を３７℃で保存した。ヘモグロビンの添加時点を保存０時間として、６時間保存後及び２４時間保存後に各試料のヘモグロビン濃度を測定した（６時間保存後濃度及び２４時間保存後濃度）。【００５０】
ヘモグロビンの濃度測定は、ＯＣセンサーＤＩＡＮＡ分析機（栄研化学（株）製）を用いて、免疫学的測定法の一種であるラテックス凝集反応を測定原理とする専用試薬（ＯＣヘモディアオートＩＩＩ:栄研化学（株）製）を用いて行った。詳細には、試料から３５μＬを採取して試験液とし、この試験液にラテックス乳液（２０ｖｏｌ％の抗ヒトヘモグロビンウサギポリクローナル抗体感作ラテックス液）６０μＬ及び希釈液（１１．９２ｍｇ／ｍＬのＨＥＰＥＳ）３００μＬを加え、波長６６０ｎｍで吸光度を測定した。予め作成した検量線に基づき、得られた測定値から試験液中のヘモグロビン濃度を決定した。各試料について、３重測定を行い、測定結果の平均値を各試料のヘモグロビン濃度とした。【００５１】
測定したヘモグロビン濃度から、以下の式に基づいてヘモグロビンの残存率を求めた。【００５２】
６時間保存後又は２４時間保存後のヘモグロビンの残存率［％］  ＝  １００  ×  ヘモグロビンの６時間保存後濃度又は２４時間保存後濃度［ｎｇ／ｍＬ］  ／  対照試料の添加直後濃度［ｎｇ／ｍＬ］
すなわち、各試料のヘモグロビンの残存率は、対照試料におけるヘモグロビンの添加直後濃度を１００％とする相対値である。本実施例における対照試料は、牛血清アルブミン及びＮａＯＨを含むリン酸緩衝液（１，２−ＥＤＳを含まない）であり、対照試料の添加直後濃度は５８３ｎｇ／ｍＬであった。結果を表１に示す。【００５３】
【表１】
2016159203.tif 000002
【００５４】
表１に示す通り、ジスルホン酸である１，２−ＥＤＳを含む試料は、対照試料と比較して、６時間保存後及び２４時間保存後の残存率が高く、１，２−ＥＤＳがヘモグロビンの安定化効果を有することが分かる。さらに、１，２−ＥＤＳの濃度の増加に伴い、残存率が高くなり、ヘモグロビンの安定化効果を高めていることが分かる。【００５５】
実施例２
リン酸緩衝液の代わりに、０．０５ｍｏｌ／ＬのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（以下、ＨＥＰＥＳという）を用いた点、表２に示す各濃度（０．００５乃至０．２ｍｏｌ／Ｌ）となるように１，２−ＥＤＳを添加した点以外は、実施例１と同様にして試料を調製し、ヘモグロビン濃度を測定した。結果を表２に示す。なお、各試料の残存率は、対照試料（牛血清アルブミン及びＮａＯＨを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（１，２−ＥＤＳを含まない））における添加直後濃度（５７６ｎｇ／ｍＬ）を１００％とする相対値で示した。【００５６】
【表２】
2016159203.tif 000003
【００５７】
表２に示す通り、ジスルホン酸である１，２−ＥＤＳを含む試料は、対照試料と比較して６時間保存後及び２４時間保存後の残存率が高く、１，２−ＥＤＳがヘモグロビンの安定化効果を有することが分かる。特に、ＨＥＰＥＳと１，２−ＥＤＳとを含むことによって、１，２−ＥＤＳの添加濃度が５ｍＭという低濃度である試料においても６時間保存後及び２４時間保存後の残存率が高いことが分かる。さらに、１，２−ＥＤＳの添加濃度の増加に伴い、残存率が高くなり、ヘモグロビンの安定化効果を高めていることが分かる。【００５８】
実施例３
リン酸緩衝液の代わりに、０．０５ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、０．０５ｍｏｌ／Ｌのピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（以下、ＰＩＰＥＳという）、又は０．０５ｍｏｌ／Ｌの２−モルホリノエタンスルホン酸（以下、ＭＥＳという）を用いた点、１，２−ＥＤＳを表３に示す濃度となるように添加した点以外は、実施例１と同様にして試料を調製し、ヘモグロビン濃度を測定した。結果を表３に示す。なお、各試料の残存率は、対照試料（牛血清アルブミン及びＮａＯＨを含むリン酸緩衝液（１，２−ＥＤＳを含まない））における添加直後濃度（５８３ｎｇ／ｍＬ）を１００％とする相対値で示した。【００５９】
【表３】
2016159203.tif 000004
【００６０】
表３に示す通り、緩衝液が異なる試料においても、１，２−ＥＤＳによるヘモグロビンの安定化効果がみられた。特に、ＨＥＰＥＳと、１，２−ＥＤＳとを含む試料は、ＨＥＰＥＳを緩衝液として１，２−ＥＤＳを含まない試料と比較して、６時間保存後及び２４時間保存後の残存率が著しく高く、ヘモグロビンの変性あるいは分解の抑制効果が極めて高いことが分かると共に、長期的にヘモグロビンを安定化できることが示唆された。また、ＨＥＰＥＳと、１，２−ＥＤＳとを含む試料は、グッド緩衝剤であるＰＩＰＥＳやＭＥＳと、１，２−ＥＤＳとを含む試料と比較しても、６時間保存後及び２４時間保存後の残存率が高く、ヘモグロビンの変性あるいは分解の抑制効果をより高めていることから、相乗的なヘモグロビン安定化効果を有することが分かる。【００６１】
実施例４
１，２−ＥＤＳの代わりに、１，４−ブタンジスルホン酸（以下、１，４−ＢＤＳという）、又は２，６−ナフタレンジスルホン酸（以下、２，６−ＮＤＳという）、ＰＩＰＥＳを表４に示す濃度となるように添加した点、及びリン酸緩衝液の代わりに、０．０５ｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳを用いた点以外は、実施例１と同様にして試料を調製し、ヘモグロビン濃度を測定した。結果を表４に示す。なお、各試料の残存率は、対照試料（牛血清アルブミン及びＮａＯＨを含むリン酸緩衝液（ジスルホン酸を含まない））における添加直後濃度（５４８ｎｇ／ｍＬ）を１００％とする相対値で示した。【００６２】
【表４】
2016159203.tif 000005
【００６３】
表４に示す通り、ジスルホン酸である１，４−ＢＤＳ、２，６−ＮＤＳ、及びＰＩＰＥＳがヘモグロビンの安定化効果を有することが分かる。【００６４】
比較例１
１，２−ＥＤＳの代わりに８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（以下、ＡＮＳという）もしくは２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（以下、ＭＥＳＳという）を０．０１ｍｏｌ／Ｌとなるように添加した点以外は、実施例１と同様にして試料を調製し、ヘモグロビン濃度を測定した。結果を表５に示す。なお、各試料の残存率は、対照試料（牛血清アルブミン及びＮａＯＨを含むリン酸緩衝液（添加物を含まない））における添加直後濃度（５８３ｎｇ／ｍＬ）を１００％とする相対値で示した。【００６５】
【表５】
2016159203.tif 000006
【００６６】
表５に示す通り、ジスルホン酸ではないスルホン酸を含む試料では、ヘモグロビンの変性あるいは分解が進んでいる可能性があることが分かる。【００６７】
従って、１，４−ＢＤＳ、２，６−ＮＤＳ、及び１，２−ＥＤＳ等のジスルホン酸を含む保存液及び試料は、３７℃という高温下で保存された場合においても、６時間保存後及び２４時間保存後のヘモグロビンの残存率を高く保つことが可能であることが示された。この結果から、本発明のジスルホン酸を含む保存液及び試料は、温度上昇及び時間経過を伴う場合においてもヘモグロビンの変性あるいは分解を抑制し、ヘモグロビンの安定化効果を有することが分かる。【００６８】
また、実施例１乃至実施例４及び比較例１の各試料に便検体を添加し、同様の測定を行ったところ、実施例１乃至実施例４及び比較例１の測定結果と同様の傾向がみられた。【００６９】
以上より、ジスルホン酸又はその塩を含む本発明のヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法によれば、ヘムタンパク質の変性あるいは分解を抑制し、ヘムタンパク質を安定化できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明のヘムタンパク質の保存液及びヘムタンパク質の安定化方法によれば、ヘムタンパク質の変性あるいは分解を抑制し、ヘムタンパク質を安定的に保存することができ、便潜血検査の便検体用希釈液、ヘムタンパク質を含む標準試料、及びヘムタンパク質を含むコントロール試料等のヘムタンパク質を安定的に保存することができる。【００７１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【国際調査報告】
2016159203.tif 000007
2016159203.tif 000008