(57)【要約】  本発明は、異常な血管を正常化させることができる薬剤および方法を提供することを目的としたものである。本発明者らは、異常な血管形成のモデルに、アルクチゲニンを含むゴボウシエキスを投与したところ、ペリサイト被覆血管を増加させ、正常な血管網を形成させ、血流状態を改善し、低酸素領域を顕著に低下させることから、アルクチゲニンが異常な血管を正常化させる作用を有することを見出した。本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、アルクチゲニンを有効成分として含有する。
2017061559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルクチゲニンを有効成分として含有する、血管壁細胞により被覆された血管を増加させる血管壁強化剤。
【請求項２】
前記アルクチゲニンが、ゴボウ、ゴボウシ、ゴボウスプラウト、若ゴボウまたはレンギョウ由来である、請求項1に記載の血管壁強化剤。
【請求項３】
アルクチゲニンを有効成分として含有する、血管網形成抑制剤。
【請求項４】
前記アルクチゲニンが、ゴボウ、ゴボウシ、ゴボウスプラウト、若ゴボウまたはレンギョウ由来である、請求項3に記載の血管網形成抑制剤。
【請求項５】
血管壁の強化を必要とする対象にアルクチゲニンおよび/またはアルクチインを摂取させる工程を含む、血管壁を強化する方法。
【請求項６】
前記アルクチゲニンおよび/またはアルクチインが、ゴボウ、ゴボウシ、ゴボウスプラウト、若ゴボウまたはレンギョウ由来である、請求項5に記載の血管壁を強化する方法。
【請求項７】
血管網形成の抑制を必要とする対象にアルクチゲニンおよび/またはアルクチインを摂取させる工程を含む、血管網形成を抑制する方法。
【請求項８】
前記アルクチゲニンおよび/またはアルクチインが、ゴボウ、ゴボウシ、ゴボウスプラウト、若ゴボウまたはレンギョウ由来である、請求項7に記載の血管網形成を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無秩序に伸長する異常な血管網の形成を抑制し、また、未熟で壊れやすい血管を補強することで、組織の正常な血流を再構成させるための血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、既存の血管から新たに血管が形成されて血管網を構築する過程をいう。成熟した血管の形成は、主に血管の内腔を一層に覆う血管内皮細胞にペリサイトあるいは血管平滑筋細胞といった血管壁細胞が接着して、血管構造が安定化することによりもたらされる。一般的に正酸素状態では、血管壁細胞が血管内皮細胞を裏打ちして血管構造が安定化している。しかし、低酸素や強い炎症刺激等、種々の血流内外の環境因子の変化に応じて組織で血管が必要になると、新しい血管が既存の血管から急激に伸長することで、強度が低下した未熟な血管の形成が誘導される。【０００３】
正常な血管新生は、生理的には妊娠初期の体組織の発達（胎盤形成や胎児の発生過程）、創傷治癒過程（手術後やケガ）および虚血部位周囲での側副血行路の形成（心筋梗塞や閉塞性動脈硬化症など）などにおいて、重要な役割を担っていることが知られている。一方で血管新生の異常は、循環器疾患や皮膚疾患および悪性腫瘍など様々な疾患の原因となる。たとえば腫瘍組織では、組織の急激な増大に伴って無秩序な血管網の形成がなされ、また血管自体も脆く出血を頻繁に繰り返すため、高度なストレス環境が作り出され、慢性的な低酸素環境や低栄養状態が引き起こされる。そのような厳しい環境下で生き延びた癌細胞は、より高い悪性度と治療抵抗性を持つようになると報告されている。【０００４】
このように未熟な腫瘍血管を持つ癌組織では、血管は新生されるが循環不全のため、低酸素状態が持続する。低酸素状態において癌細胞の浸潤および転移能は亢進し、さらに未熟な腫瘍血管は癌細胞が血管内に侵入する経路を与え、癌転移は助長される。【０００５】
腫瘍組織の循環不全は低酸素および低栄養になるだけではなく、抗癌剤の腫瘍組織への送達性にも影響を生じることが指摘されている。そのため、抗癌剤を腫瘍組織へ送達するためのシステムや組成物が提案されている。たとえば、血管新生を促進する作用を持った血管内皮増殖因子（VEGF（vascular endothelial growth factor））は、低酸素で誘導される。このVEGFを標的にした抗VEGF抗体（ベバシズマブ）は、無秩序な血管網の形成を抑制することで血流を改善し、そのことが抗癌剤の癌組織への送達性を改善するであろうと指摘されている（非特許文献1）。しかし、抗VEGF抗体（ベバシズマブ）の効果は一時的であり、時間の経過とともに成熟した腫瘍血管も退縮して腫瘍組織が低酸素状態になる。また、投与量を増加した場合には、正常な血管内皮細胞の傷害に基づく副作用が増強する。したがって、抗VEGF抗体（ベバシズマブ）と抗癌剤とを併用するための適切な投与期間と投与量の調整が難しい（非特許文献2）。【０００６】
また、薬物送達システムとして、APJ（7回膜貫通型G蛋白共役受容体）を標的とする方法が開示されている。しかし、この方法は、正常組織の成熟血管には薬物を送達させず、成熟した血管を含む腫瘍組織の血管に薬物送達させるものであり、低酸素および低栄養領域を増加させるため、癌においては治療抵抗性をさらに高める可能性がある（特許文献1）。【０００７】
また、癌以外でも、心筋梗塞、脳梗塞および糖尿病性の血流障害などでは、組織細胞は慢性的な低酸素および低栄養条件に置かれる。このような組織では、組織を回復させるため急激な血管新生を行うことが知られており、未熟で壊れやすい血管が形成される。そのため、脳出血、血栓の形成および梗塞の再発の原因、ならびに糖尿病性網膜症および新血管性緑内障などの疾患の原因となると考えられている。また、慢性的な炎症では、免疫細胞の組織への送達のために異所性に無秩序な血管新生が誘導されることがあり、滲出型加齢黄班変性、慢性関節リウマチおよび乾癬などの原因ともなる。また、このような無秩序な血管新生は、炎症自体も増悪させると考えられている。【０００８】
近年の研究から、細胞老化に伴うSASP（細胞老化関連分泌現象、senescence-associated secretory phenotype）が、加齢に伴う慢性炎症の本態である可能性が指摘されてきた。これは、老化とともに体組織に蓄積する老化細胞が炎症亢進に寄与するという考えである。この細胞老化の副作用として、発がんの促進や慢性炎症疾患が引き起こされる可能性があると考えられる。加齢に伴うDNA損傷、活性酸素種の蓄積およびテロメアの短縮などによりp53、RASおよびp16INK4aシグナル経路が活性化され、細胞老化が誘導される。その結果、IL-1β、IL-6およびIL-8などの炎症性サイトカインや血管内皮細胞増殖因子（VEGF）などが分泌される。これがSASPであり、これにより周辺細胞のさらなる細胞老化、慢性炎症が蔓延し、老年症候群を経て最終的に個体の死に至ると考えられるようになってきた。【０００９】
このようにSASPは慢性炎症を引き起こすが、病変局所では細胞の増殖及び代謝亢進に伴う細胞内のエネルギー消費が低酸素環境を引き起こす。この低酸素環境が病態増悪の一因になると考えられる。組織に低酸素状態が生じると、血管内皮細胞と結合組織、細胞外マトリックスおよび基底膜との接着が弱くなり、血管内皮細胞は容易に移動できるようになる。これにより、新しい血管の分枝と伸長が起こり、（血管リモデリング）血管障害を引き起こす。細胞障害の結果、種々の細胞内物質が放出され、これら細胞障害関連分子パターン（DAMPs）が、その受容体を介して炎症応答を惹起し、血管の細胞老化を引き起こす。老化した血管は未熟な血管より形成されており、血液成分の漏出による間質圧上昇と相まって血液循環が不良であり、そのため組織の低酸素および低栄養が持続するため慢性疾患がさらに進行する悪循環を引き起こしていると考えられる。このような加齢による血管老化に伴う慢性疾患に対しても、血管の強度の増強や血管網の整備効果をもつ血管正常化剤が効果を発揮し得ると考えられる。【００１０】
このような癌、糖尿病、炎症性疾患（加齢に伴う炎症を含む）および循環器疾患を予防および治療するために、異常な血管を正常化させる方法の開発が望まれる。また、他にも、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患（IBD）、アテローム性動脈硬化並びに子宮内膜症など、未熟な血管形成が重要な寄与要因であると考えられている疾患は数多く存在する。したがって、異常な血管を成熟した正常な血管網へ整える方法の開発は、これらの疾患の予防、治療および改善に大きな貢献をもたらすと考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第2012/102363号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Jain RK:Nat Med,7:987-989,2001
【非特許文献２】実験医学：33(5)129-133、2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
無秩序に伸長する異常な血管網の形成は、上述したように種々の疾患の要因となり得る。また、異常な血管網を持つ組織では、血管が未熟で壊れやすいため、循環不全に陥ることにより低酸素および低栄養という特殊な微小環境がつくられ、治療薬の送達性に影響を与えることが大きな問題となっている。したがって、異常な血管網の形成を抑制し、血管壁を強化し、異常な血管を正常化させる方法の開発が求められている。【００１４】
本発明は、異常な血管を正常化させることができる薬剤および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、異常な血管形成のモデルであるヒト膵臓癌細胞を移植したマウスに、アルクチゲニンを含むゴボウシエキスを投与したところ、腫瘍組織内の血流状態を改善することを見出した。また、アルクチゲニンを含むゴボウシエキスを投与することにより、腫瘍内の低酸素領域が顕著に低下すること、増殖期にある細胞が増加していること、およびペリサイト被覆血管が増加したことを見出した。さらに、本発明者らは、アルクチゲニンを含むゴボウシエキスの投与によって、腫瘍内部の血管が無秩序に密集したり蛇行したり隣接する血管と絡み合ったりすることなく、正常な血管網が形成されることを見出した。これらの結果から、本発明者らは、アルクチゲニンが血管壁を強化し、異常な血管網形成を抑制し、異常な血管を正常化させる作用を有することを見出し、本発明を完成させた。【００１６】
すなわち、本発明は、アルクチゲニンを有効成分として含有する、血管壁細胞により被覆された血管を増加させる血管壁強化剤を提供する。【００１７】
また、本発明は、アルクチゲニンが、ゴボウ、ゴボウシ、ゴボウスプラウト、若ゴボウまたはレンギョウ由来である、上記血管壁強化剤を提供する。【００１８】
また、本発明は、アルクチゲニンを有効成分として含有する、血管網形成抑制剤を提供する。【００１９】
また、本発明は、アルクチゲニンが、ゴボウ、ゴボウシ、ゴボウスプラウト、若ゴボウまたはレンギョウ由来である、上記血管網形成抑制剤を提供する。【００２０】
また、本発明は、血管壁の強化を必要とする対象にアルクチゲニンおよび/またはアルクチインを摂取させる工程を含む、血管壁を強化する方法を提供する。【００２１】
また、本発明は、アルクチゲニンおよび/またはアルクチインが、ゴボウ、ゴボウシ、ゴボウスプラウト、若ゴボウまたはレンギョウ由来である、上記血管壁を強化する方法を提供する。【００２２】
また、本発明は、血管網形成の抑制を必要とする対象にアルクチゲニンおよび/またはアルクチインを摂取させる工程を含む、血管網形成を抑制する方法を提供する。【００２３】
また、本発明は、アルクチゲニンおよび/またはアルクチインが、ゴボウ、ゴボウシ、ゴボウスプラウト、若ゴボウまたはレンギョウ由来である、上記血管網形成を抑制する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、異常な血管を正常化させることにより血流状態を改善し、異常な血管に起因する各種の疾患の予防、改善および治療に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】アルクチゲニン高含有ゴボウシエキスを投与した後の腫瘍内の血流状態を示す図。
【図２】アルクチゲニン高含有ゴボウシエキスを投与した後の腫瘍内ピモニダゾールの陽性領域の割合（％）を示す図。
【図３】アルクチゲニン高含有ゴボウシエキスを投与した後の腫瘍内BrdU陽性細胞の割合（％）を示す図。
【図４】アルクチゲニン高含有ゴボウシエキスを投与した後の腫瘍内ペリサイト被覆血管の割合（％）を示す図。
【図５】アルクチゲニン高含有ゴボウシエキスを投与した後の腫瘍血管構造を示す図。
【図６】アルクチゲニン高含有ゴボウシエキスを投与した後の血中および腫瘍内のCPT-11の濃度を示す図。
【図７】アルクチゲニン高含有ゴボウシエキスとベバシズマブとを併用投与した後の腫瘍内潰瘍組織の出現頻度を示す図。
【図８】アルクチゲニン高含有ゴボウシエキスとベバシズマブとを併用投与した後の生存率を示す図。
【図９】アルクチゲニン高含有ゴボウシエキスとゲムシタビンとを膵臓癌同所移植マウスに併用投与した後の生存率を示す図。
【図１０】膵臓癌モデルに対する既存化学療法剤、アルクチゲニン高含有ゴボウシエキスおよびこれらの併用による腫瘍サイズの変動を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、アルクチゲニンを有効成分として含有する、血管壁強化剤を提供する。本発明の血管壁強化剤は、血管壁細胞により被覆された血管を増加させることにより血管壁を強化する。本発明の血管壁強化剤は、新たに形成される血管または既存の未熟な血管が血管壁細胞によって被覆される頻度を高めることで血管壁を強化し、血管強度を改善することができる。また、本発明の血管壁強化剤は、血管壁を強化することによって、異常な血管網の形成を抑制することができ、血管網形成抑制剤として用いることができる。本発明の血管網形成抑制剤は、異常な血管網を作り出す最初のランダムな微小血管の発芽（スプラウト）の顕著な減少を誘導することができる。
【００２７】
また、本発明の血管壁強化剤および血管網形成抑制剤は、血管壁を強化し、また異常な血管網の形成を抑制することによって、血管を正常化させることができる。したがって、本発明の血管壁強化剤および血管網形成抑制剤は、血管正常化剤として用いることができる。
【００２８】
本明細書において「血管壁を強化する」とは、血管壁細胞により被覆された血管を増加させることをいう。本明細書において「血管壁細胞」には、ペリサイト（周皮細胞）および平滑筋細胞などが含まれる。本明細書において「血管網形成を抑制する」とは、血管網、特に異常な血管網を減少させることをいい、異常な血管網を作り出す最初のランダムな微小血管の発芽（スプラウト）を減少させることをも含む。
【００２９】
本明細書において「血管を正常化させる」とは、異常な血管あるいは血管網を正常化あるいは成熟化させ、正常な血管あるいは血管網を形成させることをいう。本明細書において「異常な血管」または「未熟な血管」とは、血管壁細胞により被覆されていない未熟で脆い血管、奇形血管、過度で異常に蛇行している血管、隣接する血管と絡み合っている血管、過度な枝分かれがある血管および血管の末端が他の血管と接続されておらず循環しない血管などをいう。また、本明細書において「異常な血管網」あるいは「無秩序な血管網」とは、上述した異常な血管を含む血管網、密集して複雑に入り組んでいる血管網、隣接する血管が絡み合っている血管網および血管同士が接続されておらず循環しない血管網などをいう。本明細書において「正常な血管」または「成熟した血管」とは、途中で途切れずにつながっている血管、血管壁細胞によって被覆された血管、過度に蛇行や枝分かれしていない血管および末端が他の血管と接続されており十分に循環する血管などをいう。本明細書において「正常な血管網」とは、上述した正常な血管からなる血管網、規則的で、階層構造(ヒエラルキー)を持った血管網、密集せず均一に広がっている血管網および末端が互いに接続されており十分に循環する血管網などをいう。
【００３０】
本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、虚血性状態または炎症状態によって引き起こされる、異常な蛇行や過度の血管発芽に起因する複雑に枝分かれした無秩序な血管網の形成を抑制し、または、この状態で形成される未熟で壊れやすい血管を、正常な強度を維持した血管へ補強する。本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、異常な血管網の形成を抑制するとともに血管壁を強化することにより、最終的に正常な循環機能を持った血管網を形成させることができる。
【００３１】
本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、血管を正常化させることにより、組織の血流状態を改善し、低酸素領域を減少させることができる。また、本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、無秩序な血管網の形成を抑制し、また未熟な血管から、血管壁細胞で被覆された正常な強度を持つ血管へと成熟させることで、血管透過性の亢進(出血傾向の抑制を含める)を抑制し、また血管網を整えることで、組織の正常な血流を再構成させることができる。
【００３２】
また、本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、血流状態を改善することによって、損傷組織の修復や発達を改善することができ、また治療対象組織への治療薬の送達性を向上させることができる。さらに、異常な血管網が形成されている原因が腫瘍や感染組織であった場合、血流状態を改善することによって、病変細胞や病原体を排除する免疫細胞の病変組織への送達性も改善することができる。また癌においては、低酸素環境が引き金となり、癌細胞に上皮間葉形質転換と呼ばれる細胞状態の変化が起こり、高い治療耐性を持った細胞へ変化することが知られているが、血流状態を改善することによって、このようながん組織の悪性化を抑制することができる。また腫瘍の酸素状態が改善されることによって、放射線療法の感度の改善も期待することができる。
【００３３】
本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤に用いるアルクチゲニンは、アルクチゲニンを含有する植物由来であってもよい。アルクチゲニンを含有する植物は、特に限定されないが、たとえばゴボウ、ゴボウスプラウト、ゴボウの葉、ゴボウの根茎、ゴボウシ、若ゴボウ、ベニバナ、ヤグルマギク、アメリカオニアザミ、サントリソウ（ギバナアザミ）、カルドン、ゴロツキアザミ、アニウロコアザミ、アイノコレンギョウ、チョウセンレンギョウ、レンギョウ、シナレンギョウ、ゴマ、モミジヒルガオ、シンチクヒメハギ、チョウセンテイカカズラ、テイカカズラ、ムニンテイカカズラ、ヒメテイカカズラ、トウキョウチクトウ、ケテイカカズラ、リョウカオウ、オオケタデ、ヤマザクラ、シロイヌナズナ、アマランス、クルミ、エンバク、スペルタコムギ、軟質コムギ、メキシコイトスギおよびカヤなどを含む。なかでも、ゴボウ、ゴボウシ、ゴボウスプラウト、若ゴボウおよびレンギョウは、アルクチゲニン含有量が高いため好ましい。アルクチゲニンは、これらの植物からの抽出物として含有されてもよい。
【００３４】
本発明において、アルクチゲニンがゴボウシ由来である場合には、後述するゴボウシ抽出物の製造方法を用いて得られるゴボウシ抽出物を用いることができる。そのため、製造時の生産性を向上させることができ、安価にかつ簡便に血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤を調製することができる。また、ゴボウシ以外の植物を用いる場合にも、後述する製造方法を利用することにより、アルクチゲニンを含有する抽出物を容易に得ることが可能である。
【００３５】
ゴボウシは、リグナン配糖体に分類されるアルクチインを約7％含み、かつアルクチインのアグリコンであるアルクチゲニンを約0.6％含む。後述するゴボウシ抽出物の製造方法は、アルクチインに対するアルクチゲニンの含有量を大幅に高めることができるため、この製造方法によって得られる抽出物は、アルクチゲニンを高含量で含有する。したがって、このゴボウシ抽出物の製造方法によって得られる抽出物を使用すれば、従来のゴボウシ抽出物と比較して、優れた効果を有する血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤とすることができる。
【００３６】
また、本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、さらにアルクチインを含有してもよい。アルクチインは、アルクチインを含有する植物由来であってもよく、たとえばゴボウシ、レンギョウまたはシナレンギョウ由来であってもよい。本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、アルクチゲニンを含有する植物からの抽出物、たとえばゴボウシから得たゴボウシ抽出物を含有することにより、このゴボウシ抽出物に含まれるアルクチインをさらに含有してもよい。
【００３７】
本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、アルクチゲニンおよびアルクチインを、アルクチゲニン／アルクチインの重量比が0.7以上となるように含有してもよい。アルクチゲニン／アルクチインの重量比は、特に限定されないが、1.3以下であってもよい。本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、アルクチゲニンおよびアルクチインを、アルクチゲニン／アルクチイン＝0.7〜1.3の重量比にて含有する植物の抽出物、たとえばゴボウシ抽出物を含有してもよい。また、本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、アルクチゲニンを3％以上含有するゴボウシ抽出物を含有してもよい。このようなゴボウシ抽出物は、後述するゴボウシ抽出物の製造方法により得ることができる。本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、後述するゴボウシ抽出物の製造方法により得られたゴボウシ抽出物を含有することにより、従来のゴボウシ抽出物を含有する場合よりも高い血管正常化効果を提供することができる。
【００３８】
本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、後述するゴボウシ抽出物の製造方法によって得られた抽出物粉末を、そのままの形で使用することもできる。
【００３９】
本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、さらに任意の成分を含むことができる。たとえば、本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、薬学的に許容される基剤、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤および着色剤などを含む形態にて提供することができる。
【００４０】
血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤に使用する担体および賦形剤の例には、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、デキストリン、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウムおよび結晶セルロースなどを含む。
【００４１】
また、結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、シロップ、トラガントゴム、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースなどを含む。
【００４２】
また、崩壊剤の例には、デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびカルボキシメチルセルロースカルシウムなどを含む。
【００４３】
また、滑沢剤の例には、ステアリン酸マグネシウム、水素添加植物油、タルクおよびマクロゴールなどを含む。また、着色剤は、医薬品に添加することが許容されている任意の着色剤を使用することができる。
【００４４】
また、血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、必要に応じて、白糖、ゼラチン、精製セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレートおよびメタアクリル酸重合体などで一層以上の層で被膜してもよい。
【００４５】
また、血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、必要に応じて、pH調節剤、緩衝剤、安定化剤および可溶化剤などが添加されてもよい。
【００４６】
また、血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、任意の形態の製剤として提供することができる。たとえば、血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、経口投与製剤として、糖衣錠、バッカル錠、コーティング錠およびチュアブル錠等の錠剤、トローチ剤、丸剤、散剤およびソフトカプセルを含むカプセル剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、ドライシロップを含むシロップ剤、ならびにエリキシル剤等の液剤であることができる。
【００４７】
また、血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、非経口投与のために、静脈注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、経皮投与、経鼻投与、経肺投与、経腸投与、口腔内投与および経粘膜投与などの投与のための製剤であることができる。たとえば、注射剤、経皮吸収テープ、エアゾール剤および坐剤などであることができる。また、植物等からの抽出物を使用する場合には、抽出物が特有のえぐみを有することから、抽出物をマスキングする製剤としたり、被覆剤で被覆するフィルムコート剤としたりすることができる。
【００４８】
本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、たとえば哺乳動物に対して投与することができる。哺乳動物には、たとえばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマおよびサルなどが含まれる。
【００４９】
本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、アルクチゲニンを1日あたりの投与量が成人一人あたり10〜2000mgとなるように含むことができる。また、アルクチゲニンは、特に限定されないが、週1〜7日投与されてもよい。たとえば、アルクチゲニンは、連日または週5もしくは6回投与されてもよい。
【００５０】
本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、任意の薬剤と併用して投与されてもよい。任意の薬剤とは、たとえば任意の疾病を予防、改善または治療するための薬剤であり、たとえば抗癌剤である。本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、治療対象部位の血管を正常化させることにより、併用して投与される薬剤の治療対象部位への薬剤送達を増強させることができる。
【００５１】
たとえば腫瘍や慢性炎症などのように、未熟な血管が多く形成されるような環境においては、循環不全になりやすく、薬剤の送達性が悪くなり、薬剤が効きにくくなると考えられている。したがって、本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤によって未熟な血管を正常化して血流状態を改善させれば、併用される薬剤が効きやすくなると考えられる。後述する試験例5〜8において、アルクチゲニンと既存の抗癌剤とを併用投与した場合には、抗癌剤を単独で投与した場合よりも、潰瘍形成の阻害を増強し、腫瘍増大を抑制し、癌幹細胞の腫瘍内比率を減少させ、および生存期間を延長させることが示された。このように、本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、血管を正常化させることによって薬剤の送達性を高め、薬剤による効果を高めることができる。
【００５２】
本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、たとえば医薬品、病者用食品、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品およびサプリメントなどの形態をとることができる。本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤はまた、血管壁を強化させる効果がある旨の表示、血管網形成を抑制する効果がある旨の表示および血管を正常化させる効果がある旨の表示などを付した機能性表示食品の形態であってもよい。
【００５３】
本発明はまた、アルクチゲニンを有効成分として含有する、血管壁細胞により被覆された血管を増加させる血管壁強化用食品組成物を提供する。本発明はまた、アルクチゲニンを有効成分として含有する、血管網形成抑制用食品組成物を提供する。本発明はまた、アルクチゲニンを有効成分として含有する、血管正常化用食品組成物を提供する。本発明の血管壁強化用食品組成物、血管網形成抑制用食品組成物および血管正常化用食品組成物は、上述した血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤と同様に構成することができる。
【００５４】
本明細書において「食品組成物」には、一般的な飲食品だけでなく、病者用食品、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品およびサプリメントなどが含まれる。一般的な飲食品には、たとえば各種飲料、各種食品、加工食品、液状食品（スープ等）、調味料、栄養ドリンクおよび菓子類などが含まれる。本明細書において「加工食品」とは、天然の食材（動物および植物など）に対し加工および／または調理を施したものをいい、たとえば肉加工品、野菜加工品、果実加工品、冷凍食品、レトルト食品、缶詰食品、瓶詰食品およびインスタント食品などが含まれる。本発明の食品組成物は、血管壁を強化する旨の表示、血管網形成を抑制する旨の表示または血管を正常化する旨の表示を付した食品であってもよい。また、本発明の食品組成物は、袋および容器等に封入された形態で提供されてもよい。本発明において使用する袋および容器は、食品に通常使用される任意の袋および容器であることができる。
【００５５】
本発明はまた、血管壁の強化を必要とする対象にアルクチゲニンおよび/またはアルクチインを摂取させる工程を含む、血管壁を強化する方法を提供する。本発明はまた、血管網形成の抑制を必要とする対象にアルクチゲニンおよび/またはアルクチインを摂取させる工程を含む、血管網形成を抑制する方法を提供する。本発明はまた、血管の正常化を必要とする対象にアルクチゲニンおよび/またはアルクチインを摂取させる工程を含む、血管を正常化させる方法を提供する。
【００５６】
本発明の方法が適用される対象には、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマおよびサルなどの哺乳動物が含まれる。血管壁の強化を必要とする対象、血管網形成の抑制を必要とする対象および血管の正常化を必要とする対象とは、異常な血管形成を発症している対象および異常な血管形成が要因となっていると考えられる疾患を患う対象などである。対象となる疾患には、たとえば癌、循環器疾患、慢性炎症を伴う各種疾患、例えば、糖尿病合併症（腎症、網膜症、神経症）、加齢性黄斑変性および新血管性緑内障などの眼内新生血管性疾患、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの炎症性腸疾患（IBD）、アテローム性動脈硬化、子宮内膜症、動脈硬化、乾癬、脳および心筋梗塞、慢性腎臓病、非アルコール性脂肪性肝炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、肥満および生活習慣病、並びに皮膚光老化などが含まれる。
【００５７】
アルクチインは、アルクチゲニンの前駆体であり、生体内で代謝されてアルクチゲニンになることが知られている。本発明の方法では、アルクチゲニンまたはアルクチインの一方のみを摂取させてもよいし、アルクチゲニンおよびアルクチインの両方を摂取させてもよい。
【００５８】
本発明の方法において、アルクチゲニンおよび／またはアルクチインは、アルクチゲニンおよび／またはアルクチインを含有する植物由来であってもよく、たとえばゴボウ、ゴボウシ、ゴボウスプラウト、若ゴボウおよびレンギョウ由来であってもよい。また、アルクチゲニンおよび／またはアルクチインは、後述するゴボウシ抽出物の製造方法を用いて得られるゴボウシ抽出物として摂取させてもよい。また、アルクチゲニンおよび／またはアルクチインとともに、さらに任意の成分を摂取させてもよい。任意の成分には、たとえば薬学的に許容される基剤、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤および着色剤などが含まれる。
【００５９】
アルクチゲニンおよび／またはアルクチインは、経口または非経口(注射剤、塗布剤、貼付剤、座薬、点眼薬、点鼻薬、吸入剤、含嗽剤、舌下吸収剤およびインプラント剤など)にて摂取させてもよい。また、アルクチゲニンおよび／またはアルクチインは、1日あたりの摂取量が成人一人あたり10〜2000mgとなるように摂取させてもよい。また、アルクチゲニンおよび／またはアルクチインは、特に限定されないが、週1〜7日摂取させてもよい。たとえば、アルクチゲニンおよび／またはアルクチインは、連日または週5もしくは6回摂取させてもよい。
【００６０】
本発明の方法は、アルクチゲニンおよび／またはアルクチインを医薬的だけでなく非医薬的に摂取させる態様を含む。たとえば、本発明の方法は、アルクチゲニンおよび／またはアルクチインを、病者用食品、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品およびサプリメントなどの形態で対象に摂取させる態様を含む。
【００６１】
〔ゴボウシ抽出物の製造方法〕
本発明に適したゴボウシ抽出物は、生薬切裁工程、抽出工程（酵素変換工程および有機溶媒による抽出工程）、固液分離工程、濃縮工程および乾燥工程を経て製造される。
【００６２】
(生薬切裁工程)
生薬切裁工程では、原料とするゴボウシを抽出に適した大きさに切裁する。原料となる生薬は、植物の様々な部位や鉱物、動物など種々の大きさ、形状、固さがあり、その特質に応じた切裁が必要となる。ゴボウシは、当業者に公知の任意の手段を使用して切裁することができる。たとえば、市販の切裁機を使用することができる。
【００６３】
本発明に適したゴボウシ抽出物の製造方法では、ゴボウシに内在する酵素であるβ-グルコシダーゼの活性を事前に測定し、適したゴボウシを選択することができる。β-グルコシダーゼの活性を測定する方法としては、たとえばｐ-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシド（C12H15NO8：分子量301.25）（SIGMA-ALDRICH社製）を基質として、ゴボウシ粉砕品を作用させることで生成するｐ-ニトロフェノールを400nmの吸光度の変化を測定することにより、酵素活性を測定できる。酵素活性を表す単位として1分間に1マイクロモルのｐ-ニトロフェノールを生成する酵素量を1単位（U）として表すことができる。
【００６４】
本発明に適したゴボウシ抽出物を得るためには、ゴボウシに内在するβ-グルコシダーゼの活性が、たとえば0.4U/g以上、好ましくは１U/ｇ以上のゴボウシを用いることができる。0.4U/g未満の場合は、加水分解が不十分となり、アルクチゲニンの重量比が下がり、所望のゴボウシ抽出物を効率的に得られなくなる。
【００６５】
また、本発明に適したゴボウシ抽出物の製造方法では、任意の粒径に切裁されたゴボウシを使用することができる。切裁されたゴボウシの粒径が小さいほど酵素変換が促進され、抽出物収率も上昇すると考えられる。その反面、粒径が小さすぎると、酵素変換が速過ぎてプロセス管理が困難になったり、後の工程において正確な固液分離に支障が生じたりすることがある。
【００６６】
本発明に適したゴボウシ抽出物を得るためには、以下の実施例に示したように、ゴボウシは、9.5mm以下の粒径に、たとえば9.5mmの篩を全通するように切裁される。また、本発明に適したゴボウシ抽出物を得るためには、ゴボウシの粒径が、9.5mm篩を全量通過し、たとえば0.85mmの篩に60〜100％が分布するように、さらに好ましくは0.85mmの篩に65〜80％が分布するように切裁されることが望ましい。
【００６７】
（抽出工程）
抽出工程は、生薬抽出物粉末製造工程中で、品質上最も重要な工程である。この抽出工程により、生薬抽出物粉末の品質が決まる。本発明に適したゴボウシ抽出物の製造方法では、ゴボウシ抽出物を抽出するために、酵素変換工程と有機溶媒による抽出工程の2段階に分けて抽出を行う。
【００６８】
（酵素変換工程）
酵素変換工程は、本発明に適したゴボウシ抽出物の製造方法において重要な工程である。酵素変換工程は、ゴボウシに内在する酵素であるβ-グルコシダーゼにより、ゴボウシに含まれているアルクチインをアルクチゲニンに酵素変換する工程である。
【００６９】
具体的には、上記工程で準備したゴボウシ切裁物を、適切な温度に保持することによりβ-グルコシダーゼを作用させて、アルクチインからアルクチゲニンへの反応を進行させる。たとえば、切裁したゴボウシに水などの任意の溶液を加えて、30℃付近の温度にて攪拌することなどにより、ゴボウシを任意の温度に保持することができる。
【００７０】
本発明に適したゴボウシ抽出物を得るためには、切裁したゴボウシを30℃付近の温度、たとえば20〜50℃の間の温度に保持する。20℃未満の場合は、加水分解が不十分となり、アルクチゲニンの重量比が下がり、所望のゴボウシ抽出物を効率的に得られなくなる。一方、50℃より高温の場合は、酵素が失活し、アルクチゲニンの重量比が下がり、所望のゴボウシ抽出物を効率的に得られなくなる。
【００７１】
また、保持時間は、上記温度において保持する限り特に限定されず、たとえば約30分保持させることができる。20〜50℃の間に保持することにより、保持時間にかかわらず、適切な量のアルクチインがアルクチゲニンに酵素変換され、本発明に適したゴボウシ抽出物を得ることができる。
【００７２】
（有機溶媒による抽出工程）
有機溶媒による抽出工程は、任意の適切な有機溶媒を使用して、ゴボウシからアルクチゲニンおよびアルクチインを抽出する工程である。すなわち、上記の酵素変換工程によりアルクチゲニンが高含量となった状態で、適切な溶媒を添加して、ゴボウシ抽出物を抽出する工程である。たとえば、ゴボウシ抽出物に適切な溶媒を添加して、適切な時間加熱攪拌してゴボウシ抽出物を抽出する。また、加熱攪拌以外にも、加熱還流、ドリップ式抽出、浸漬式抽出または加圧式抽出法などの当業者に公知の任意の抽出法を使用して、ゴボウシ抽出物を抽出することができる。
【００７３】
アルクチゲニンは水難溶性であることから、有機溶媒を添加することにより、アルクチゲニンの収率を向上させることができる。有機溶媒は、任意の有機溶媒を使用することができる。たとえば、メタノール、エタノールおよびプロパノールなどのアルコール、並びにアセトンを使用することができる。安全性の面を考慮すると、本発明に適したゴボウシ抽出物の製造方法では、有機溶媒としてエタノールを使用することが好ましい。
【００７４】
加熱攪拌によってゴボウシ抽出物を抽出する場合、加熱攪拌は、任意の温度にて行うことができるが、本発明に適したゴボウシ抽出物を得るためには、80℃以上の温度、たとえば80〜90℃の間の温度に保持する。また、加熱攪拌する時間は、上記温度において加熱攪拌する限り、特に限定されず、約30分間、たとえば30〜60分間加熱攪拌することにより、溶媒中にゴボウシからアルクチゲニンおよびアルクチインを抽出させることができる。
【００７５】
アルクチゲニンおよびアルクチインの收率は、加熱攪拌の時間が長いほど向上する。しかし、加熱攪拌の時間が長いと、不要な油脂類が多く溶け出し、濃縮工程の負荷が大きくなってしまう。したがって、加熱攪拌の時間は、状況に応じて適宜決定すればよい。
【００７６】
また、アルクチゲニンおよびアルクチインの收率は、エタノール量が多いほどアルクチゲニンおよびアルクチインの溶解度が高くなるため、収率も向上する。しかし、エタノール量が多いと、不要な油脂類も多く溶け出し、濃縮工程の負荷が大きくなってしまう。したがって、投入量は、状況に応じて適宜決定すればよい。なおこの工程での加熱攪拌により、同時にゴボウシ抽出物を滅菌および殺菌することができる。
【００７７】
（固液分離工程）
固液分離工程は、抽出の終わったゴボウシを抽出液から分離する工程である。固液分離は、当業者に公知の任意の方法を使用して行うことができる。固液分離法には、たとえば濾過法、沈降法および遠心分離法などがある。工業的には、遠心分離法が望ましい。
【００７８】
（濃縮工程）
濃縮工程は、乾燥に先立ちゴボウシ抽出液から溶媒を除去する工程である。ゴボウシ抽出液からの溶媒の除去は、当業者に公知の任意の方法を使用して行うことができる。しかし、上記工程によって得られたゴボウシからの抽出液が、さらに高温に長時間曝されることがないようにすることが好ましい。たとえば、減圧濃縮法を使用することにより、高温に長時間曝されることなく、ゴボウシ抽出液を濃縮することができる。
【００７９】
ゴボウシ抽出液の濃縮は、所望の濃度のゴボウシ抽出物が得ることができる濃度まで濃縮することができる。たとえば、以下の乾燥工程において乾燥を適正に行うことができる程度まで濃縮することが望ましい。また、以下の工程においてゴボウシ抽出物を乾燥させて粉末製剤にした場合に、適切な製剤特性が得られる濃度まで濃縮を行うことが望ましい。
【００８０】
アルクチゲニンおよびアルクチインは、水難溶性であるため、アルクチゲニンおよびアルクチインが以下の乾燥工程における製造装置内に付着する量が多く、最終的な収率が大幅に低下する。そこで、製造装置にアルクチゲニンおよびアルクチインが付着するのを防止するために、この濃縮工程で得られたゴボウシ抽出液にデキストリンを添加することができる。デキストリンの添加量は、たとえば濃縮液の固形分に対して15〜30％程度が望ましい。
【００８１】
（乾燥工程）
上記工程によって得られたゴボウシ抽出物を粉末状に仕上げる工程である。乾燥は、当業者に公知の任意の方法を使用して行うことができる。たとえば、乾燥法として、凍結乾燥および噴霧乾燥などが知られているが、実験室レベルであれば前者、量産レベルであれば後者を用いるのが一般的である。
【００８２】
以上の製造工程により、アルクチゲニンを高含量にて含有するゴボウシ抽出物を得ることができる。このゴボウシ抽出物の製造方法は、20℃〜50℃の温度で酵素変換を行う工程を含まなければならないが、その他の工程の全てを含む必要はない。
【００８３】
また、以上の製造工程により、アルクチゲニンの濃度が高いゴボウシ抽出物を、安価にかつ簡便に得ることができる。したがって、この方法により得られたゴボウシ抽出物を用いることによって、本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤を安価にかつ簡便に製造することができる。
【００８４】
また、以上の製造工程により得られるゴボウシ抽出物のアルクチゲニン濃度が高いため、従来のゴボウシ抽出物を用いた場合と比較して、血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤の1日当たりの全体量を少なくすることができる。したがって、患者の負担を軽減させることができる。
【実施例】
【００８５】
〔実施例1〕
以下の方法により、アルクチゲニンを含有するゴボウシエキスを調製した。【００８６】
ゴボウシ（酵素活性7.82U/g）を切裁し、9.5mmの篩を全通するものをさらに0.85mmの篩に通し、75％が残ることを確認した。このゴボウシ細切80kgを30〜32℃に保温した水560Lに加えて30分間攪拌した後、エタノール253Lを加えて85℃に昇温し、さらに40分間加熱還流した。この液を遠心分離し、得られた抽出液を得た。この操作を2回繰り返して得られた抽出液を合わせて、減圧濃縮し、抽出物固形分に対してデキストリン25％を加えて、噴霧乾燥した。アルクチゲニンおよびアルクチイン含量は、それぞれ6.4％および7.2％であり、アルクチゲニン／アルクチイン（重量比）＝0.89のゴボウシ抽出物粉末（デキストリン25％含有）が得られた。【００８７】
〔試験例1〕
異常な血管のモデルとして、腫瘍細胞を移植したマウスを用いた。アルクチゲニン含有ゴボウシエキス反復投与による腫瘍内微小環境変化を機能学的に解析するため、腫瘍内の血流を評価した。【００８８】
ヒト膵臓癌細胞Suit2の1×106 Cells/200μlをBALB/cAJc1-nu/nuマウス（日本クレア）の皮下に移植した。移植21日目に、移植マウスを、（a）未治療群、（b）ゴボウシエキス投与群、（c）ベバシズマブ投与群、および（d）ゲムシタビン投与群の4つの群に分け、4週間治療を継続した。ゴボウシエキスは、実施例1のゴボウシエキスを餌に0.5％(w/w)配合したものをマウスに与えた。マウスの一日の餌の摂取量を3〜5ｇとして計算すると、アルクチゲニンは、15〜25mg/匹/日投与されたことになる。ベバシズマブは、アバスチン点滴静注用100mg/4ml（中外製薬）を使用して、5mg/kgを週1回、腹腔内投与した。ゲムシタビンは、点滴用ゲムシタビン製剤（イーライリリー社）を使用して、100mg/kgを週2回、腹腔内投与した。【００８９】
（腫瘍サイズ）
治療開始4週間後の各群の平均腫瘍サイズは、（a）未治療群が228mm2、（b）ゴボウシエキス投与群が189 mm2、（c）ベバシズマブ投与群が56 mm2、および（d）ゲムシタビン投与群が68 mm2であった。【００９０】
（腫瘍組織におけるガドリニウムDTPAの取り込み）
治療開始4週間後に、各群のマウス腫瘍組織におけるガドリニウムDTPAの取り込みを評価した。ガドリニウムDTPAを急速静注した後120秒まで、9.4テスラMRI装置（BIOSPEC 94/20USR）を用いて、腫瘍のダイナミック造影T1強調画像（時間分解能1.8-5.3秒）を撮影した。この画像から、腫瘍組織内のガドリニウムDTPAのシグナル強度を測定した。図1は、ガドリニウムDTPA静注後0秒のシグナル強度を100としたときの、30秒ごとのシグナル強度の平均値を示すグラフである。腫瘍組織内のガドリニウムDTPAのシグナル強度の増加は、腫瘍組織内へのガドリニウムDTPAの取り込みを意味する。腫瘍組織内へのガドリニウムDTPAの取り込みの度合いは、腫瘍組織内の血流状態の指標となる。【００９１】
（腫瘍内微小環境変化の機能学的解析）
図1に示すように、ガドリニウムDTPA静注後90〜120秒において、アルクチゲニン含有ゴボウシエキス投与群における治療後の腫瘍組織中心部のシグナル強度は、118.1 ± 13.7%まで増加した。一方、未治療群では、90〜120秒において102.6 ± 3.4%であり、増加しなかった。したがって、ゴボウシエキス投与群では、未治療群と比較して血流が良い傾向であった（P <0.05, t-test）。また、抗腫瘍効果が見られたゲムシタビン治療群では、未治療群と同様に腫瘍組織中心部のシグナル強度が増加していなかった（図示せず）。一方、血管新生阻害作用を持つベバシズマブ治療群では、シグナル強度が増加する傾向にあった（図示せず）。【００９２】
以上の結果から、アルクチゲニン含有ゴボウシエキスの投与により腫瘍組織の乏血流領域が縮小し、富血流領域が残存する可能性が示唆された。【００９３】
〔試験例2〕
アルクチゲニン含有ゴボウシエキスの反復投与による腫瘍内微小環境変化を病理学的に解析するため、低酸素領域（Pimonidazole）および細胞増殖（BrdU）を免疫染色法で評価した。また、腫瘍内血管のうち、ペリサイトで覆われている血管の割合をCD31およびαSMAの二重免疫染色法により評価した。【００９４】
ヒト膵臓癌細胞のMiapaca-2（ATCC CRL 1420） 5×106 Cells/200μlをBALB/cAJc1-nu/nuマウス（日本クレア）の皮下に移植した。移植16日目に、移植マウスを、（a）未治療群、（b）ゴボウシエキス投与群、（c）ベバシズマブ投与群、および（d）ゲムシタビン投与群の4つの群に分け、4週間治療を継続した。ゴボウシエキス投与群は、ゴボウシエキスを2.0％(w/w)配合した餌をマウスに与えた。マウスの餌の一日摂取量を3〜5ｇとして計算すると、アルクチゲニンは、60〜100mg/匹/日投与されたことになる。ベバシズマブは、アバスチン点滴静注用100mg/4ml（中外製薬）を使用して、5mg/kgを週1回、腹腔内投与した。ゲムシタビンは、点滴用ゲムシタビン製剤（イーライリリー社）を使用して、100mg/kgを週2回、腹腔内投与した。【００９５】
（腫瘍サイズ）
治療開始4週間後の各群の平均腫瘍サイズは、（a）未治療群が1851mm2、（b）ゴボウシエキス投与群が1035 mm2、（c）ベバシズマブ投与群が911 mm2、および（d）ゲムシタビン投与群が949 mm2であった。【００９６】
（治療開始4週間後の、腫瘍内微小環境変化の病理学的解析）
治療開始4週間後に、BrdU（Sigma-Aldrich）20mg/mLを100μL、ピモニダゾール（pimonidazole）16mg/mLを100μL、それぞれ腹腔内投与し1時間後に腫瘍を採取した。採取した各群の腫瘍切片において、腫瘍内微小環境変化を病理学的に解析するため、低酸素領域（ピモニダゾール）および細胞増殖（BrdU）を免疫染色で評価した。また、腫瘍内血管のうち、ペリサイトで覆われている血管の割合をCD31およびαSMAの二重免疫染色法により評価した。【００９７】
ピモニダゾールは2-ニトロイミダゾール系の化合物で，酸素分圧10mmHg以下の強い低酸素下で還元され，細胞内タンパク質などと結合し，付加体を形成する性質をもち、現在、最も汎用されている低酸素プローブである。【００９８】
BrdUはチミジンアナログであり、細胞周期のS期において新たに合成されたDNAに取り込まれる。BrdUでラベル化されたDNAは、抗BrdU抗体で検出することができるため、抗BrdU抗体はDNA複製を行う増殖細胞の検出ツールとなる。【００９９】
ペリサイトによる血管外部の裏打ちが行われることにより、血液は漏出することなく流れる事が出来る。しかしながら、腫瘍内部の血管では、内皮細胞でのみ構成された虚弱な血管が多く形成されるため、血液が漏出し腫瘍内部への抗癌剤の送達が阻害されている。ベバシズマブに代表される血管新生阻害剤は、ペリサイトが覆われていない血管の割合を下げることにより、併用される抗癌剤の効果を高められると考えられる。【０１００】
（治療後の腫瘍内微小環境の変化）
各治療後の腫瘍内ピモニダゾールの陽性領域の割合（％）を図2に示す。腫瘍内ピモニダゾールの陽性領域の割合（％）は、未治療群で40％、ベバシズマブ投与群で18％、ゴボウシエキス投与群で19％、ゲムシタビン投与群で30％であった。この結果から、ベバシズマブ治療およびゴボウシエキス治療によって低酸素領域が顕著に低下することが明らかになった。これは、血管が正常化したことによると考えられる。【０１０１】
各治療後の腫瘍内BrdU陽性細胞の割合（％）を図3に示す。腫瘍内BrdU陽性細胞の割合（％）は、未治療群で7%、ベバシズマブ投与群で15%、ゴボウシエキス投与群で11%、ゲムシタビン投与群で6%であった。この結果から、ベバシズマブ治療およびゴボウシエキス治療によって増殖細胞が増加していることが明らかになった。これは、血管が正常化したことによると考えられる。【０１０２】
各治療後の腫瘍内ペリサイト被覆血管の割合（％）を図4に示す。ペリサイトの割合は、CD31およびαSMA二重陽性面積をCD31陽性面積で割ることによって求めた。ペリサイト被覆血管の割合は、未治療群で23.3%、ゴボウシエキス投与群で35.2％となった。したがって、ゴボウシエキス投与によって血管が正常化し、ペリサイト被覆血管が増加したことが示唆される。この結果は、アルクチゲニンが、ペリサイトなどの血管壁細胞により被覆された血管を増加させる血管壁強化剤として用いることができることを示す。【０１０３】
したがって、アルクチゲニンを投与することにより、腫瘍組織内の血管が正常化したことが示唆される。また、血管が正常化することにより、薬剤が送達されやすい環境が整うことが示唆される。そのため、抗癌剤をアルクチゲニンと併用投与することにより、抗癌剤の腫瘍組織への薬剤送達が増強され、その結果、抗癌剤の薬効が増強されることが示唆される。【０１０４】
〔試験例3〕
血管鋳型法を用いて、アルクチゲニン含有ゴボウシエキスの反復投与による腫瘍内血管構造の変化を検討した。【０１０５】
ヒト膵臓癌細胞のMiapaca-2（ATCC CRL 1420） 5×106 Cells/200μlをBALB/cAJc1-nu/nuマウス（日本クレア）の皮下に移植し、腫瘍サイズが約200mm3になったものを選別し、治療対象マウスとした。作製した移植マウスを、未治療群およびゴボウシエキス投与群に分け、4週間治療を継続した。ゴボウシエキス投与群は、アルクチゲニンを10％配合したエキス750mg/kgを週5回、経口投与した。【０１０６】
（血管鋳型の作成）
治療開始4週間後、マウスを深麻酔後、開胸し、心臓より生理食塩水をかん流し、血液を除去した。血液除去後、加速剤（Ladd research industry）を加えた40％メタクリル酸メチル（日新EM株式会社）を含むMercox（Ladd research industry）10mLを心臓からかん流した。その後、マウスを60℃の温水中に、60分浸水させ樹脂の硬化を行った。腫瘍を切り離し、20％NaOHで組織を腐食させ血管鋳型標本を取り出し、走査型電子顕微鏡を用いて、腫瘍内血管の構造変化を検討した。【０１０７】
（治療後の腫瘍血管構造の変化）
各治療後の腫瘍内部の血管を図5に示す。未治療群の腫瘍では、血管は密集し、複雑に入り組んだ構造を形成しており、また血管の末端部分においても蛇行し隣接する血管と絡み合うような構造をしていた。一方で、アルクチゲニン含有ゴボウシエキス治療を行った腫瘍では、未治療群で見られたような血管の密集した構造は見られず、また血管の末端部分においても、血管の蛇行も少なく、隣接する血管と絡み合う構造は見られなかった。したがって、アルクチゲニン含有ゴボウシエキス投与によって血管が正常化し、正常な血管網が形成されたことが示唆される。この結果は、アルクチゲニンが、血管網、特に異常な血管網の形成を抑制する血管網形成抑制剤として用いることができることを示す。【０１０８】
〔試験例4〕
アルクチゲニン含有ゴボウシエキスの反復投与による、腫瘍内における抗癌剤の薬物動態変化を解析するため、血中および腫瘍内CPT-11濃度を評価した。【０１０９】
ヒト膵臓癌細胞のMiapaca-2（ATCC CRL 1420） 5×106 Cells/200μlをBALB/cAJc1-nu/nuマウス（日本クレア）の皮下に移植し、腫瘍サイズが約200mm3になったものを選別し、治療対象マウスとした。作製した移植マウスを、未治療群およびゴボウシエキス投与群に分け、4週間治療を継続した。ゴボウシエキス投与群は、アルクチゲニンを10％配合したエキス750mg/kgを週5回、経口投与した。【０１１０】
治療開始4週間後、未治療群およびゴボウシエキス投与群に、カンプト点滴静注（ヤクルト）50mg/kgを腹腔内投与し、それぞれ30分、1時間、3時間後に深麻酔下で腫瘍および血液を回収した。回収した血液は、1200×g、20分、4℃の遠心分離を行い、血漿を回収した。血漿200μLを採取し、アセトニトリルを等量加え、12,000rpm、4℃、10分間の遠心分離を行った。腫瘍は、回収後100mg程度を測りとり、100mg/200μL MilliQでホモジナイズし、アセトニトリル300μLを加え、12,000rpm、4℃、10分間の遠心分離を行った。各々上清を回収し、10μLずつ注入して、HPLC分析を行った。標品については、CPT-11は10mgを5mLのメタノールに溶解し、10μLずつ注入して、HPLC分析を行った。【０１１１】
（治療後の血中および腫瘍内抗癌剤の薬物動態の変化）
各治療群へのカンプト点滴静注投与後の各時間における、血中および腫瘍内のCPT-11の濃度を図6に示した。未治療群およびゴボウシエキス投与群の各時間帯におけるCPT-11血中濃度は、両群に明らかな変化は認められなかった。一方で、腫瘍内におけるCPT-11濃度は、30分、1時間後で両群に変化は認められないが、投与3時間後の腫瘍内CPT-11濃度は、未治療群で4μg/g tumor、アルクチゲニン治療群で8.7μg/g tumorとなった。アルクチゲニン治療により、血中CPT-11濃度に影響を与えることなく、腫瘍内CPT-11の濃度を上昇させることが出来ることが明らかとなった。
〔試験例5〕
腫瘍が増大する過程においては、増大した腫瘍組織全体にわたって栄養や酸素が血管を通して供給されていなければならない。しかしながら、多くの腫瘍においては、未熟な血管形成のため、これらが十分に供給されておらず、部分的な組織壊死を起こし、組織が潰瘍状になる部位が発生すると考えられている。そこで、前述のゴボウシエキスの血管正常化効果を組織状態から検証するため、それぞれの治療後の腫瘍組織における潰瘍形成を観察した。【０１１２】
ヒト大腸癌細胞のLS174T (ATCC CL-188) 5×105 Cells/200μlをBALB/cAJc1-nu/nuマウス（日本クレア）の皮下に移植した。移植14日目に、移植マウスを、（a）未治療群、（b）ゴボウシエキスの投与群、（c）ベバシズマブの投与群、および（d）ゴボウシエキスとベバシズマブの併用投与群の4つの群に分け、5週間治療を継続した。ゴボウシエキス投与群は、アルクチゲニンを10％配合したエキス250mg/kgを週5回、経口投与した。ベバシズマブ投与群は、アバスチン点滴静注用100mg/4ml（中外製薬）を使用して、5mg/kgを週1回、腹腔内投与した。【０１１３】
各治療群における腫瘍に潰瘍を生じたマウスの比率（％）を図7に示す。50％潰瘍形成率は、未治療群が8日、ゴボウシエキス投与群が20日、ベバシズマブ投与群が10日、併用投与群が24日であった。したがって、ゴボウシエキス投与群および併用投与群では、未治療群およびベバシズマブ投与群と比較して、腫瘍における潰瘍形成の抑制効果が認められた。ベバシズマブ投与群では、未治療群と比較して潰瘍形成の抑制効果が認められたが、一過性であった。この効果は、ベバシズマブの持つ血管新生阻害作用による効果と考えられる。一方、ベバシズマブに加えてゴボウシエキスを併用投与した場合、潰瘍形成の阻害が増強された。これは、ベバシズマブ単剤での腫瘍に対する血流改善効果に対して、ゴボウシエキス治療による血管正常化効果による血流改善効果が、併用増強されたためであると考えられる。このように、アルクチゲニンとの併用投与により、血管正常化によって低酸素および低栄養状態にある領域を顕著に縮小することができるため、癌の悪性化を抑制することが期待される。【０１１４】
（併用による延命効果）
上述した治療を5週間継続した後に、治療を中止し、生存期間の追跡を実施した。各群における生存率を図8に示す。50％生存期間は、図8に示すように未治療群が103日、ゴボウシエキス投与群が114日、ベバシズマブ投与群が107日、併用投与群が137日であった。したがって、併用投与群では、未治療群および単独投与群と比較して、それぞれ33%および20-28%の生存期間延長効果が認められた。【０１１５】
〔試験例6〕
ゴボウシエキスおよびゲムシタビンの併用投与による抗腫瘍効果を評価した。【０１１６】
ヒト膵臓癌細胞Miapaca-2（ATCC CRL 1420） 5×106 Cells/200μlを、BALB/cAJcl nu/nuマウス(日本クレア)の脇下皮下に移植し、腫瘍サイズが約100mm3になったものを選別し、治療対象マウスとした。【０１１７】
治療対象マウスを、（a）未治療群、（b）ゲムシタビン投与群、（c）ゴボウシエキス投与群、並びに（d）ゴボウシエキスおよびゲムシタビンを併用して投与する群（併用投与群）、の4つの群に分け、4週間治療を継続した。ゴボウシエキスは、実施例1のゴボウシエキス250mg/kg（アルクチゲニンとして25mg/kg以上）を連日（週5回）、経口投与した。ゲムシタビンは、点滴用ゲムシタビン製剤（イーライリリー社）を使用して、150mg/kgを週2回、腹腔内投与した。【０１１８】
（腫瘍重量）
治療試験後、各投与群について腫瘍重量を測定した。その結果、治療試験後の腫瘍重量は、未治療群では2.05g、ゲムシタビン投与群では1.24g、ゴボウシエキス投与群では0.98g、および併用投与群では0.82gであった。したがって、ゲムシタビン投与群、ゴボウシエキス投与群および併用投与群のいずれにおいても、未治療群と比較して、40〜60％程度の腫瘍重量の抑制が認められた。【０１１９】
この結果から、ゴボウシエキスおよびゲムシタビンを併用することによって、腫瘍増大を抑制させることが示された。これは、ゴボウシエキスにより血管が正常化することによってゲムシタビンが腫瘍に作用しやすくなったからと考えられる。したがって、ゴボウシエキスおよびゲムシタビンの併用剤は、これらをそれぞれ単独で投与したときの効果から予想されるより顕著に高い抗癌活性を有することが示された。【０１２０】
〔試験例7〕
膵臓癌の診断後の5年生存率は2013年時点で5％を切っており、またその平均生存時間は、4-6ヶ月に止まっている。これは他の癌に比べて極端に低い数値であり、有効な対策が求められている。上述した実施例6において、膵臓腫瘍移植モデルに対するアルクチゲニン高含有ゴボウシエキスとゲムシタビンとの併用治療により、単剤治療に比べて腫瘍の増大抑制傾向が認められた。そこで、より実際の病巣に近いモデルとして、マウス膵臓への膵臓癌同所移植モデルを作製し、ゲムシタビンおよびゴボウシエキスによる併用治療が生存率に与える影響を評価した。【０１２１】
ヒト膵臓癌細胞Miapaca-2細胞を5×106cells/50μlにて高濃度マトリゲル溶液(BD bioscience)に懸濁した。8週齢、メスのBALB/cAJcl-nu/nu(日本クレア)を麻酔下に開腹し、上記細胞懸濁液を膵臓組織へ注入および固化させた後、縫合および閉腹した。【０１２２】
移植後のマウスを、未治療群、ゴボウシエキス投与群、ゲムシタビン投与群、およびこれらを併用投与する群の4群各7匹に分け、マウスがすべて死亡するまで治療を継続した。ゴボウシエキス投与群は、アルクチゲニン10％配合エキス250mg/kgを週5回、経口投与した。ゲムシタビン投与群は、点滴用ゲムシタビン製剤（イーライリリー社）を使用して、150mg/kgを週2回、腹腔内投与した。【０１２３】
（生存率の解析）
生存率は、Kaplan-Mayer法を使って生存率曲線および生存率中央値MSTを計算および描出することにより算出した（GraphPad-PRISM 6.2, MDF社）。有意差は、Logrank（Mantel-COX）およびGehan-Breslow-Wilcoxon検定で評価した。【０１２４】
各治療群の生存率（％）の変化を図9の上のグラフに示す。生存期間中央値(MST)は、未治療群（Non treat）では65日、ゲムシタビン投与群（Gemcitabine）では86日(32.3%伸び)、ゴボウシエキス投与群（GBS-01）では88日(35.4%伸び)、併用治療（Combination）では117日(80%伸び)であった。また、有意差は、Gehan-Breslow-Wilcoxon検定およびLog-RANK(Mantel-Cox)検定のどちらを用いた場合でも、治療群と未治療群との間に有意差が見られた。【０１２５】
この結果、膵臓癌同所移植モデルにおいては、図9に示すように、未治療群と比較して、ゴボウシエキス投与群とゲムシタビン投与群は、ほぼ同程度の延命効果を示した。一方、これらの薬剤を併用した併用投与群では、未治療群および単独投与群と比較して顕著な延命効果を示した。したがって、抗癌剤とアルクチゲニンとを併用投与することにより、生存期間を進展することが困難な膵臓癌においても、大きく生存率を伸ばすことができることが示された。【０１２６】
〔試験例8〕
膵臓癌移植モデルを用いて、既存の各種抗癌剤、アルクチゲニン高含有ゴボウシエキスおよびこれらの組み合わせによる治療を行い、腫瘍サイズの変動を評価した。【０１２７】
ヒト膵臓癌細胞のMiapaca-2（ATCC CRL 1420） 5×106 Cells/200μlをBALB/cAJc1-nu/nuマウス（日本クレア）の脇下皮下に移植し、約2週間飼育後、約100mm3または約600mm3程度のサイズになったものを、治療対象マウスとした。【０１２８】
作製した移植マウスを、未治療群、各種の抗癌作用を有する成分である既存抗癌剤投与群、ゴボウシエキス投与群およびこれらの併用投与群の各群に分け、各群の5〜6腫瘍に対して、約4週間程度にわたって治療を継続した。既存抗癌剤としては、カルボプラチン（CBDCA、Bristol-Myers、60mg/kgを週１回腹腔投与）、ドキソルビシン（Doxorubicin、協和発酵、10mg/kgを週2回腹腔投与）、オキサリプラチン（Oxaliplatin、ヤクルト、8mg/kgを週1回腹腔投与）、エベロリムス（Everolimus、ノバルティス、5mg/kgを週5回経口投与）、ボルテゾミブ（Bortezomib、ヤンセンファーマ、1mg/kgを週2回腹腔投与）、イリノテカン（Irinotecan、ヤクルト、25mg/kgを週2回腹腔投与）およびヒドロキシクロロキン（Hydroxychloroquine、サノフィー、100mg/kgを週5回腹腔投与）を用いた。ゴボウシエキスは、アルクチゲニン10％配合エキス750mg/kgを週5回、経口投与した。【０１２９】
（腫瘍サイズの測定）
治療開始後、3-4日毎に、マウスを保定して精密デジタルノギスで腫瘍の長径(L)、短径(W)および高さ(H)を測定し、腫瘍サイズ= 4/3 * pi * L/2 * H/2 * W/2 (pi=3.14)の式を用いてサイズを求めた。また、高さが測定できない場合は、簡易的に、腫瘍サイズ = 4/3 * pi * L/2 * (W/2)2を使用した。【０１３０】
各治療群の腫瘍サイズの変動を図10に示す。既存抗癌剤とゴボウシエキスとの併用治療の結果、カルボプラチンおよびオキサリプラチンでは、ゴボウシエキス単剤に比較して2.3〜2.1倍（P<0.05）および抗癌剤単剤に比較して1.8〜1.9倍（P<0.05）の腫瘍サイズの低下が認められた。また、イリノテカンでは、ゴボウシエキス単剤に比較して2.1倍（P<0.05）および抗癌剤単剤に比較して1.5倍の腫瘍サイズの低下が認められた。ドキソルビシンでは、ゴボウシエキス単剤に比較して1.4倍および抗癌剤単剤に比較して1.5倍（P<0.05）程度の腫瘍サイズの低下が認められた。エベロリムスでは、ゴボウシエキス単剤に比較して2.1倍（P>0.05）および抗癌剤単剤に比較して1.4倍の腫瘍サイズの低下が認められた。ボルテゾミブでは、ゴボウシエキス単剤に比較して1.8倍（P<0.05）および抗癌剤単剤に比較して1.4倍の腫瘍サイズの低下が認められた。マラリアや自己免疫疾患などの治療薬であるハイドロキクロロキンでは、ゴボウシエキス単剤に比較して1.9倍および抗癌剤単剤に比較して2.5倍（P<0.05）の腫瘍サイズの低下が認められた。【０１３１】
以上の結果から、アルクチゲニン高含有ゴボウシエキスは、様々な薬効機序を持った既存の抗癌剤と組み合わせることで、強い抗腫瘍効果を期待できる薬剤であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明の血管壁強化剤、血管網形成抑制剤および血管正常化剤は、異常な血管の形成に起因する各種の疾患の予防、治療および改善に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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