(57)【要約】  一般式（Ｉ）：      ＳＯＤ’（Ｑ−Ｂ）ｍ          （Ｉ）（式中、ＳＯＤ’はスーパーオキサイドジスムターゼの残基を、Ｑは化学的架橋を、Ｂはグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンにおけるその水酸基の水素原子を除いた残基を、ｍはスーパーオキサイドジスムターゼ１分子に対するリゾレシチンの平均結合数であって、１以上の整数を表す）で表されるレシチン化スーパーオキサイドジスムターゼを有効成分とする急性呼吸促迫症候群の治療剤。
2017073255.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）：
ＳＯＤ’(Ｑ−Ｂ)ｍ          （Ｉ）
（式中、ＳＯＤ’はスーパーオキサイドジスムターゼの残基を表し、Ｑは化学的架橋を表し、Ｂはグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンにおけるその水酸基の水素原子を除いた残基を表し、ｍはスーパーオキサイドジスムターゼ１分子に対するリゾレシチンの平均結合数であって、１以上の整数を表す）
で表されるレシチン化スーパーオキサイドジスムターゼを有効成分とすることを特徴とする急性呼吸促迫症候群の治療剤。
【請求項２】
式（Ｉ）において、Ｑが−Ｃ(Ｏ)−(ＣＨ２)ｎ−Ｃ(Ｏ)−（式中、ｎは２以上の整数を表す）であることを特徴とする請求項１に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤。
【請求項３】
ＳＯＤ’が、ヒトのスーパーオキサイドジスムターゼの残基であることを特徴とする請求項１または２に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤。
【請求項４】
ＳＯＤ’が、ヒトのスーパーオキサイドジスムターゼのアミノ酸配列における１１１位のアミノ酸がＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）システインとなったスーパーオキサイドジスムターゼ修飾体の残基であることを特徴とする請求項１または２に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤。
【請求項５】
スーパーオキサイドジスムターゼが、活性中心に銅と亜鉛を含むスーパーオキサイドジスムターゼであることを特徴とする請求項３または４に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤。
【請求項６】
ｎが２〜１０の整数である請求項２ないし５のいずれか１項に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤。
【請求項７】
ｍが１〜１２の整数である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤。
【請求項８】
さらに安定化剤を含有することを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤。
【請求項９】
安定化剤が糖であることを特徴とする請求項８に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤。
【請求項１０】
糖がシュークロースであることを特徴とする請求項９に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤。
【請求項１１】
シュークロースが、活性炭処理されたシュークロースであることを特徴とする請求項１０に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、急性呼吸促迫症候群治療剤に係わり、詳細には、レシチン化スーパーオキサイドジスムターゼ（以下、「ＰＣ−ＳＯＤ」と記載する場合もある）を有効成分として含有する急性呼吸促迫症候群に対する治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ：Acute Respiratory Distress Syndrome、以下、「ＡＲＤＳ」と記載する場合もある）は、急性呼吸窮迫症候群とも称されており、集中治療中における患者の主な死亡原因の一つであり、公衆衛生上においてかなりの重要度を有する疾患である。ＡＲＤＳ患者は、アメリカにおいて、年間２００，０００人にも達しており、この疾患に対する確実な対処法はいまだ確立しておらず、死亡率はかなり高い（４０〜５０％）のが現状である。【０００３】
ＡＲＤＳは、浮腫、および心充満圧を伴う急性低酸素性呼吸不全、両側性肺浸潤と定義される致命的な臨床症候群であり、時として、タンパク質を豊富に含む浮腫液の肺胞中への漏出により、サーファクタント作用の減少と、肺エラスタンスの上昇を招く肺胞毛細血管壁の傷害と特徴付けられる敗血症、および肺炎と関係している。
上皮および内皮の傷害は、また重篤な炎症応答（例えば、白血球の補充と活性化、並びに炎症性サイトカイン前駆体の産生）を誘発し、血管透過性（浮腫）の上昇、および肺のみならず、すべての組織における凝固系を活性化し、その結果、多機能不全を生じる。【０００４】
ＡＲＤＳは、敗血症、大量輸血、重症肺炎、胸部外傷、肺塞栓、人工呼吸、純酸素吸入、急性膵炎等で重症の患者に突然起きる疾患であり、その初期段階における病態生理はさまざまであるが、最終的に発症に至る経緯は、ほぼ同じである。
こうした背景のある患者においては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）やインターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８等が血流中に放出されている。肺は体内を循環する血液が必ず通る臓器であるため、その影響を受け易く、好中球が誘引され、肺組織において活性酸素やプロテアーゼを放出して肺胞毛細血管上皮や肺胞上皮組織を傷害する。肺に定着した好中球は、更にＧ−ＣＳＦやＧＭ−ＣＳＦを放出し、局所の炎症を増幅させる。こうして血管透過性が増し、間質さらには肺胞内まで血性の滲出液で満たされてしまう。【０００５】
換気血流不均衡と死腔の増大により、ＣＯ２の呼出には通常より多くの換気が必要となる。しかし、初期には滲出液で満たされた肺胞が、そして後期には線維化した肺がコンプライアンスの低下（肺の硬化）をもたらし、高い圧での人工呼吸が必要となる。
肺胞の毛細血管は、換気が悪いと収縮し、換気の良い部位の血流を増大させる作用がある。しかしながらＡＲＤＳにおいては、肺の多くの部位で換気が悪くなるため、それらの部位の毛細血管が収縮し、肺高血圧症をもたらす。
集中治療室（ＩＣＵ）に収容中の患者の１５％、人工呼吸を受けている患者の２０％に発症するとされている。【０００６】
最近に至り、ＡＲＤＳに対する治療としてステロイド剤が使用されているが、その効果はいまだ証明されているものではない。その他種々の治療手段、例えばβ−アドレナリン作動薬、活性化プロテインＣ、スタチン系薬剤の投与が検討されているが、その効果は極めて限定的なものである。【０００７】
また、人工呼吸器（ＭＶ：Mechanical Ventilation、以下「ＭＶ」と記す場合もある）は、ＡＲＤＳ患者にとっての救命治療として重要なものであるが、高い１回換気量であり、その繰り返される強制換気によるガスの流入で、人工呼吸器誘発肺傷害（ＶＩＬＩ：ventilator-induced lung injury）を引き起こし、このＶＩＬＩは、ＡＲＤＳ患者の死亡率を高めている。
その点から、臨床的には低換気量によるＭＶが推奨されているが、最近の研究では、低換気量によるＭＶであっても、ＶＩＬＩが生じており、肺胞傷害が生じるとされている。
したがって、ＡＲＤＳの生存率を向上させるためには、ＡＲＤＳの抑圧のみならず、ＶＩＬＩの抑圧もまた重要な事項である。【０００８】
ところで、活性酸素（ＲＯＳ：Reactive Oxygen Species：以下、「ＲＯＳ」と記す場合もある）は、ＡＲＤＳのみならず、ＶＩＬＩにおける肺の障害に重要な役割をはたしている。ＡＲＤＳ患者では、浸潤白血球、および人工呼吸器による高酸素環境下で、ＲＯＳが高度に産生されている。人工呼吸器はまた、肺組織を過剰に拡張させることにより、活性酸素の産生を刺激する。ＲＯＳは、肺並びに他の器官において、直接的に、または非直接的に炎症応答を誘発、すなわち炎症反応を活性化して、血管透過性および凝固系の活性化を誘発する。ＡＲＤＳ患者、及び人工呼吸器下にある患者においては、血漿、排出呼気凝縮液、および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ：Broncholveolar Lavage Fluid）中で、活性酸素（ＲＯＳ）、例えば、スーパーオキサイドアニオンのレベルの上昇が報告されている。この活性酸素レベルの上昇は、腹膜炎モデルである腸管穿孔術（ＣＬＰ術：Cecal Ligation and Puncture、以下「ＣＬＰ」と記す場合もある）、リポ多糖体（ＬＰＳ：lipopolysaccharide、以下、「ＬＰＳ」と記す場合もある）の投与、或いは、肺におけるＭＶ−誘発性組織障害（人工呼吸器誘発組織障害）等のモデル動物においても認められている。【０００９】
シベレスタット（シベレスタットナトリウム水和物）は、好中球エラスターゼ阻害薬であり、日本において、ＡＲＤＳ患者に適用されている薬物である。好中球エラスターゼは、好中球より産生されるプロテアーゼであり、好中球エラスターゼ阻害薬は、動物モデルにおいて、急性肺傷害を予防する。しかしながら、シベレスタットの臨床的効果は、必ずしも十分なものではない。例えば、シベレスタットの投与で、ＡＲＤＳ患者の死亡率が減少することはなかった。
このことは、シベレスタットが直接的にＲＯＳ産生抑制に有効ではないためであることを示すものであり、ＡＲＤＳにおけるＲＯＳ介在の組織傷害に対する治療は、臨床的に、シベレスタットでは達し得ないことを示している。【００１０】
一方、生体では、抗酸化機能が働いている。例えば、細胞内のペルオキシソームに存在し、過酸化水素を使って酸化・解毒をおこなうカタラーゼ、細胞内に発生した活性酸素を分解する酵素であるスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）、及びグルタチオンペルオキシダーゼ（glutathione peroxidase）による抗酸化機能が、酸化系に対してよく対応している。
ＳＯＤは、活性酸素アニオンを消去する酵素であり、これまでにＳＯＤのアイソザイム型（Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ）、マグネシウム−ＳＯＤ、および細胞外型（ＥＣ）−ＳＯＤ等の存在が知られている。この種の抗酸化酵素の活性、並びに発生のレベルの減少がＡＲＤＳ、およびＶＩＬＩ患者、並びに動物モデルにおいて観察されている。【００１１】
したがって、これらの抗酸化酵素はＡＲＤＳへの有効な治療薬となり得るものであり、かかる考え方に従った多くの臨床、非臨床報告がなされている。
例えば、ＡＲＤＳ患者の肺機能が、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）抗酸化物質療法に応答し改善されており、α−トコフェロール、アスコルビン酸等の抗酸化物質のサプリメントの服用で、器官不全の発生を減少させており、ＡＲＤＳ患者のＩＣＵ治療室（中央治療室）での治療期間を短縮させている。その他、この種の抗酸化酵素の有効性のレポートも数多くなされている。【００１２】
ところで、遺伝子組み換えＳＯＤ誘導体であるアイソザイム（iso）型ＳＯＤ（Ｃｕ／Ｚｎ−ＳＯＤ）が提案されており、その臨床的な応用もなされているが、このものの組織親和性が低いこと、並びに血漿中での安定性が低いことから、不成功であった。
これらの点を鑑み、本発明者らは、レシチン化ＳＯＤ（ＰＣ−ＳＯＤ）を開発してきている（特許文献１、特許文献２）。このＰＣ−ＳＯＤは、遺伝子組み換え技術によりＣｕ／Ｚｎ−ヒトスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）を調製した後、化学的にレシチン誘導体（フォスファチジルコリン誘導体：ＰＣ）をＳＯＤ１分子（２量体）あたり平均４分子結合させたレシチン化ＳＯＤである。【００１３】
その上で、本発明者らは、ＰＣ−ＳＯＤの投与が、臨床的に、潰瘍性大腸炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）等の疾患に有効なものであることを確認している。
さらに、本発明者らは、このＰＣ−ＳＯＤのインハレーション（吸入剤）を開発し、動物レベルでの確認ではあるが、ブレオマイシン誘発肺線維症、エラスターゼ誘発、および喫煙誘発肺炎、並びに肺気腫症（慢性閉塞性肺疾患：ＣＯＰＤ）に有効であることを確認している（特許文献３）。【００１４】
上記した慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、気道の持続的な気流制限によって起こる気管支と肺胞の疾患であり、肺胞壁が壊され気管が肥大していることを特徴とするものであるが、ＡＲＤＳとは、基本的にその発症因子が異なっている。
今回本発明者らは、ＰＣ−ＳＯＤについて、ＡＲＤＳ、並びにＶＩＬＩに対する効果を検討した。その結果、ＰＣ−ＳＯＤは、ステロイド剤或いはシベレスタットでは効果のない、肺及び他の器官における浮腫、組織傷害、炎症に対して有効であることを確認し、ＡＲＤＳおよび、ＶＩＬＩに対する治療薬となり得ることを見出した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開平９−１１７２７９号公報
【特許文献２】特開２００１−６４１９９号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１０／６４５２２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、本発明は、上記の現状に鑑み、ＡＲＤＳ（急性呼吸促迫症候群）に対する治療剤、特に、レシチン化スーパーオキサイドジスムターゼ（ＰＣ−ＳＯＤ）を有効成分として含有する急性呼吸促迫症候群に対する治療剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
具体的に本発明は、
（１）下記一般式（Ｉ）：
ＳＯＤ’(Ｑ−Ｂ)ｍ          （Ｉ）
（式中、ＳＯＤ’はスーパーオキサイドジスムターゼの残基を表し、Ｑは化学的架橋を表し、Ｂはグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンにおけるその水酸基の水素原子を除いた残基を表し、ｍはスーパーオキサイドジスムターゼ１分子に対するリゾレシチンの平均結合数であって、１以上の整数を表す）
で表されるレシチン化スーパーオキサイドジスムターゼを有効成分とすることを特徴とする急性呼吸促迫症候群の治療剤である。【００１８】
より具体的に本発明は、以下の態様からなる。
（２）式（Ｉ）において、Ｑが−Ｃ(Ｏ)−(ＣＨ２)ｎ−Ｃ(Ｏ)−（式中、ｎは２以上の整数を表す）であることを特徴とする上記（１）項に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤；
（３）ＳＯＤ’が、ヒトのスーパーオキサイドジスムターゼの残基であることを特徴とする上記（１）または（２）項に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤；
（４）ＳＯＤ’が、ヒトのスーパーオキサイドジスムターゼのアミノ酸配列における１１１位のアミノ酸がＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）システインとなったスーパーオキサイドジスムターゼ修飾体の残基であることを特徴とする上記（１）または（２）項に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤；
（５）スーパーオキサイドジスムターゼが、活性中心に銅と亜鉛を含むスーパーオキサイドジスムターゼであることを特徴とする上記（３）または（４）項に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤；
（６）ｎが２〜１０の整数である上記（２）ないし（５）項のいずれかに記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤；
（７）ｍが１〜１２の整数である上記（１）ないし（６）項のいずれかに記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤；
（８）さらに安定化剤を含有することを特徴とする上記（１）ないし（７）項のいずれかに記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤；
（９）安定化剤が糖であることを特徴とする上記（８）項に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤；
（１０）糖がシュークロースであることを特徴とする上記（９）項に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤；および
（１１）シュークロースが、活性炭処理されたシュークロースであることを特徴とする上記（１）項に記載の急性呼吸促迫症候群の治療剤；
である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、ＰＣ−ＳＯＤを有効成分として含有する急性呼吸促迫症候群治療剤が提供され、これまでステロイド剤或いはシベレスタットでは効果のない、肺及び他の器官における浮腫、組織傷害、炎症に対して有効であり、ＡＲＤＳおよび、ＶＩＬＩに対する治療に光明を与えるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】試験例１の結果（ＡおよびＢ：生存率）を示した図である。
【図２】試験例２の結果（Ａ〜Ｄ）を示した図である。
【図３】試験例３の結果（Ａ〜Ｃ）を示した図である。
【図４．１】試験例４の結果（Ａ、Ｂ）を示した図である。
【図４．２】試験例４の結果（Ｃ〜Ｅ）を示した図である。
【図５．１】試験例５の結果（Ａ〜Ｄ）を示した図である。
【図５．２】試験例５の結果（Ｅ）を示した図である。
【図６】試験例６の結果（Ａ〜Ｄ）を示した図である。
【図７．１】試験例７の結果（ＡおよびＢ）を示した図である。
【図７．２】試験例７の結果（ＣおよびＤ）を示した図である。
【図７．３】試験例７の結果（ＥおよびＦ）を示した図である。
【図８】試験例８の結果（Ａ〜Ｄ）を示した図である。
【図９】試験例９の結果（ＡおよびＢ）を示した図である。
【図１０】試験例１０の結果（ＡおよびＢ）を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明が提供する急性呼吸促迫症候群の治療剤において使用されるレシチン化スーパーオキサイドジスムターゼ（ＰＣ−ＳＯＤ）において、「レシチン」とはフォスファチジルコリンを意味する通常のレシチンをいい、「リゾレシチン」とはレシチンのグリセロールの２位に結合している脂肪酸１分子がとれて、２位の炭素原子に水酸基が結合した化合物をいう。
【００２２】
本発明で使用するＰＣ−ＳＯＤは、通常リゾレシチンの２位の水酸基に化学的架橋剤を結合させたレシチン誘導体を、ＳＯＤに１個以上結合させて得ることができる。このＰＣ−ＳＯＤは、次式（Ｉ）：
ＳＯＤ’(Ｑ−Ｂ)ｍ          （Ｉ）
（式中、ＳＯＤ’はスーパーオキサイドジスムターゼの残基を表し、Ｑは化学的架橋を表し、Ｂはグリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンにおけるその水酸基の水素原子を除いた残基を表し、ｍはスーパーオキサイドジスムターゼ１分子に対するリゾレシチンの平均結合数であって、１以上の整数を表す）
で表すことができる。
【００２３】
ここで使用するＳＯＤ’は、生体内の活性酸素（Ｏ２−）の分解というその本来の機能を発揮し得る限りにおいて、その起源は特に限定されるものではなく、各種の動植物または微生物に由来するＳＯＤ残基を広く用いることができる。しかしながら、医薬品としての用途を考慮した場合には生体内での抗原性を可能な限り減らすことが好ましい。したがって、使用するＳＯＤ’としては、本発明の急性呼吸促迫症候群治療剤を投与する対象に応じて適宜適切なＳＯＤ残基を選択することが好ましい。
【００２４】
例えば、現実の急性呼吸促迫症候群の患者を対象に投与しようとするものであるから、投与による生体内における抗原性をできるだけ減らすために、ヒト由来のＳＯＤ残基を用いることが好ましい。したがって、本発明の急性呼吸促迫症候群治療剤としては、抗原性を考慮し、ヒト由来のＳＯＤを使用するのがよい。
【００２５】
ヒト由来のＳＯＤとしては、ヒト由来のＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ（活性中心に銅と亜鉛を含むヒト由来のＳＯＤ；以下、ヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤと略記する場合もある）が、細胞内における発現量が多く、また遺伝子工学的手法による生産技術が既に確立しており、大量に調製することが可能であるために、特に好ましく使用される。
【００２６】
このヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤには、ヒト組織または培養細胞から製造される天然のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ；遺伝子工学的手法により製造されるヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ；天然のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤと実質上同一のアミノ酸配列を有する組み換えヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤ；これらのヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤにおけるアミノ酸配列式中の一部のアミノ酸を欠失、付加、置換、あるいは化学的に修飾若しくは改変したＳＯＤ等があり、いずれのヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤであってもよい。
【００２７】
そのなかでも、天然のヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤのアミノ酸配列式における１１１位のアミノ酸（システイン：Ｃｙｓ）がＳ−（２−ヒドロキシエチルチオ）システインとなったヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤが好ましい。かかるヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤは、例えば特開平９−１１７２７９号公報にその詳細が記載されており、その方法に従って得ることができる。
したがって、特開平９−１１７２７９号公報に記載されるヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤの調製は、本明細書の一部を構成し、本発明で使用するＰＣ−ＳＯＤは、これらのヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤを素材として得ることができる。
【００２８】
本発明で使用する式（Ｉ）で表されるＰＣ−ＳＯＤにおいて、Ｂで示される「グリセロールの２位に水酸基を有するリゾレシチンにおけるその水酸基の水素原子を除いた残基」は、具体的には次式（ＩＩ）：
−Ｏ−ＣＨ(ＣＨ２ＯＲ)[ＣＨ２ＯＰ(Ｏ)(Ｏ−)(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＋(ＣＨ３)３)]
（ＩＩ）
（式中、Ｒは脂肪酸残基（アシル基）である）
で表される。
【００２９】
Ｒで示される脂肪酸残基（アシル基）としては、炭素数１０〜２８の飽和または不飽和脂肪酸残基が好ましく、より好ましくは、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、イコサノイル基、ドコサノイル基、その他の炭素数１４〜２２の飽和脂肪酸残基であり、特に好ましくは炭素数１６を有する飽和脂肪酸残基であるパルミトイル基である。
【００３０】
また、一般式（Ｉ）においてＱで示される化学的架橋は、ＳＯＤとレシチンとを架橋して化学的に結合（共有結合）させ得るものであれば特に限定されない。そのような化学的架橋としては、残基：−Ｃ(Ｏ)−(ＣＨ２)ｎ−Ｃ(Ｏ)−（式中、ｎは２以上の整数を表す）が特に好ましい。この残基は、式：ＨＯ−Ｃ(Ｏ)−(ＣＨ２)ｎ−Ｃ(Ｏ)−ＯＨで表される直鎖状のジカルボン酸、その無水物、エステル、ハロゲン化物等の両端に存在する水酸基（但し、無水物、エステル、ハロゲン化物の場合には、両端に存在する水酸基に該当する部分）を除いた残基である。
【００３１】
一般式（Ｉ）においてＱが上記の直鎖状のジカルボン酸残基である場合には、Ｑはその一端において前記した式（ＩＩ）のリゾレシチン残基の水酸基由来の酸素とエステル結合により結合している。また、エステル結合をしたＱの他端は、ＳＯＤのアミノ基とアミド結合などにより直接結合している。
なお、上記化学的架橋の残基においてｎとしては２以上の整数であり、好ましくは２〜１０の整数である。
【００３２】
また、式（Ｉ）においてｍとしてはＳＯＤ１分子に対するリゾレシチンの平均結合数を表している。したがって、ｍは１以上の整数であり、１〜１２、特に４であることが好ましい。
【００３３】
本発明で使用するＰＣ−ＳＯＤの製造方法、すなわちレシチン誘導体とＳＯＤ、好ましくはヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤの結合方法は、例えば、特開平９−１１７２７９号公報に記載の方法により行うことができる。
【００３４】
その好ましいＰＣ−ＳＯＤの化学構造を模式的に示すと、以下のＰＣ−ＳＯＤが特に好ましい。
【００３５】
【化１】
2017073255.tif 000003
（ｍは、結合したレシチン誘導体数）
【００３６】
すなわち、E. coliを宿主として遺伝子組み換えにより製造したヒトＣｕ／Ｚｎ ＳＯＤの遊離アミノ基に、レシチン誘導体を平均４分子共有結合させたものである。
【００３７】
本発明の急性呼吸促迫症候群治療剤において用いるＰＣ−ＳＯＤは、医薬として使用できる程度に精製され、かつ、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まないものであることが好ましい。例えば、ＰＣ−ＳＯＤは、２，５００Ｕ／ｍｇ以上の比ＳＯＤ活性を有する精製されたものを用いるのが好ましく、３，０００Ｕ／ｍｇ以上の比ＳＯＤ活性を有する精製されたものがより好ましい。
なお、本発明において１Ｕ（ユニット）とは、ｐＨ７．８／３０℃の条件下でＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）を用いてJ. Biol. Chem., vol.244, No.22 6049-6055 (1969) に記載の方法に準じて測定し、ＮＢＴの還元速度を５０％阻害するＰＣ−ＳＯＤの酵素量を表す。
【００３８】
本発明が提供する急性呼吸促迫症候群の治療剤は、かくして調製されたＰＣ−ＳＯＤを有効成分とする急性呼吸促迫症候群治療剤であるが、好ましくはＰＣ−ＳＯＤと共に安定化剤を含有するものがよい。そのような安定化剤としては、例えば糖成分をあげることができる。糖成分としては医薬的に使用される糖成分であれば特に限定されないが、なかでもシュークロースが好ましい。したがって、本発明が提供する最も好ましい急性呼吸促迫症候群治療剤は、ＰＣ−ＳＯＤと共にシュークロースを含有する組成物である。シュークロースとしては医薬品として使用できる程度に精製されたものが好ましく、特に活性炭で処理されたシュークロースを用いるのがよい。かかるシュークロースをＰＣ−ＳＯＤと共に使用することにより、長期間保存によるＰＣ−ＳＯＤの活性低下を防ぐことができ、安定性が高く、凍結乾燥した場合であっても、その性状が特に良好な組成物として調製することができる。
【００３９】
本発明の急性呼吸促迫症候群治療剤におけるＰＣ−ＳＯＤとシュークロースの配合比率は、投与量、製剤の形態等に応じて適宜決定することができ、特に限定されるものでない。しかしながら、ＰＣ−ＳＯＤとシュークロースの重量比として、０．１／１００〜８０／１００程度の範囲内にあることが好ましく、０．４／１００〜６０／１００程度がより好ましい。
【００４０】
本発明の急性呼吸促迫症候群治療剤には、ＰＣ−ＳＯＤの活性に影響を与えず、且つ製剤の効果に影響を与えない限り、他の医薬活性成分や、慣用されている製剤成分、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等を添加することができる。
【００４１】
本発明が提供する急性呼吸促迫症候群治療剤の調製は、ＰＣ−ＳＯＤおよびシュークロースを用いて、製剤学的に公知であり、慣用されている方法により行うことができる。なお、本発明の製剤組成物に使用するＰＣ−ＳＯＤは、溶液状、凍結状、または凍結乾燥状の形態が好ましい。
【００４２】
本発明が提供する急性呼吸促迫症候群治療剤は、その一つの態様として、好ましくは注射剤の形態で投与することができる。注射剤としては、溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解型固形製剤等の形態であることが好ましく、これらの製剤は、日本薬局方の製剤総則に記載の方法に準じ調製することができる。
【００４３】
また、本発明が提供する急性呼吸促迫症候群治療剤は、また別の態様として、好ましくは吸入剤の形態で投与することができる。
かかる吸入剤とは、気管、気管支、肺等へ到達させるための医薬組成物を意味し、好適には、点鼻剤又は経鼻若しくは経肺投与に適した組成物であり、特に経肺投与に適した組成物である。
【００４４】
吸入剤としては、上記したＰＣ−ＳＯＤを有効成分として用いて、粉末、溶液又は懸濁液の形態として製造することができる。
【００４５】
吸入剤を粉末として製造する場合には、有効成分である上記したＰＣ−ＳＯＤをそのまま、若しくは賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定化剤、矯味・矯臭剤などの添加剤を加えて微細化することにより製造することができる。
【００４６】
また、吸入剤を溶液または懸濁剤として製造する場合には、例えば、ＰＣ−ＳＯＤを水または水と補助溶媒、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールのようなアルコール系の補助溶媒の混合物に溶解又は懸濁させることにより製造することができる。そのような溶液又は懸濁液は、さらに防腐剤、可溶化剤、緩衝剤、等張化剤、吸収促進剤、増粘剤等を含有することができる。
【００４７】
上記のようにして製造した吸入剤は、吸入剤の分野での一般的な手段、例えば、スポイト、ピペット、カニューレ又はアトマイザーやネブライザーなどの噴霧器を用いて霧状をして鼻腔内又は口腔内に、或いは気管、気管支、肺等へ直接投与される。噴霧器を用いる場合には、適当な噴射剤（例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン若しくはジクロロテトラフルオロエタンのようなクロロフルオロカーボン、または二酸化炭素等のガス等）と共に加圧バッグの形にされたエアゾールとして噴霧するか、ネブライザーを用いて投与することができる。
【００４８】
本発明の急性呼吸促迫症候群治療剤における有効成分であるＰＣ−ＳＯＤの量および製剤の投与量は、製剤調製の方法、剤形、対象疾患の程度、患者の年齢、体重によって異なり、一概に限定できないが、例えば臨床量として成人１人１日当たり５〜５００ｍｇ（１．５〜１５０万Ｕ）、好ましくは、４０〜２００ｍｇ（１２〜６０万Ｕ）を例示することができる。また投与回数についても一概に限定できないが、１日１回ないし１日数回の投与を行うことも可能である。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明を、実施例に代え、本発明者らが具体的に検討した試験例を説明することにより、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらの記載に限定されるものではない。【００５０】
＜材料及び方法＞
ＬＰＳ（リポ多糖体：lipopolysaccharide）は、大腸菌由来のものであり、Sigma社（セントルイス、MO）から購入した。
Diff-Quikは、Sysmex社（神戸）より購入した。
DRI-CHEM slide（ＢＵＮ同定に使用）は、富士フィルム社より購入した。
Ｌ−０１２（発光プローブ）、LabAssay creatinine、エバンスブルーは、和光純薬工業社より購入した。
Novo-Heparin（5000単位）は、持田製薬社より購入した。
ペントバルビタールは、東京化成社より購入した。
ＩＣＲマウス（６−７週齢）は、チャールスリバー社から購入した。【００５１】
＜腸管穿孔術：ＣＬＰ術：Cecal Ligation and Puncture＞
マウスをペントバルビタール（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、盲腸を露出するため小さく腹部正中切開した。その後盲腸を２ｃｍ程絹糸で結索し、１８Ｇ針（テルモ社製）にて２回穿刺後、閉腹した。
Sham（偽手術群）は、盲腸結索及び穿刺を除き、同様の操作を行った。
生存率は、１２時間毎に観察し、ＣＬＰ誘発性多臓器不全は、ＣＬＰ処理後８時間時に観察した。【００５２】
＜マウスにおけるＭＶ（人工呼吸器）術＞
小動物人工呼吸器を、人工呼吸器誘発肺傷害（ＶＩＬＩ）を誘発するために使用した。マウスは、ペントバルビタール（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、気管支切開を行い、８ｍｍ金属チューブを気管に挿入した。マウスは、機械的に一回換気量１７．５ｍＬ／ｋｇ、０ｃｍＨ２Ｏ終末呼吸陽圧で、１５０回呼吸／分の速度で換気した。
総呼吸器エラスタンスは３０分ごとに１２０分までスナップショット技術によって測定した。
データは、FlexiVentソフトウエア（バージョン5.3 SCIREQ）を用いて分析した。【００５３】
＜マウスに対するリポ多糖体（ＬＰＳ），ＰＣ−ＳＯＤ及び他薬剤での処理＞
マウスをイソフルランで麻酔し、マイクロピペット（Ｐ２００）を用いて、１ｍｇ／ｋｇＬＰＳ（０．９％ＮａＣｌ中）を一回気管内投与した。ＰＣ−ＳＯＤ又はデキサメタゾンは、イソフルラン麻酔下で、２６Ｇ針を用いて３又は１５ＫＵ／ｋｇ（１又は５ｍｇ／ｋｇ）のＰＣ−ＳＯＤ（０．４５％ＮａＣｌ中）、または、２０又は２００μｇ／マウスのデキサメタゾン（０．９％ＮａＣｌ中）を静脈内投与した。シベレスタットは、２１Ｇ針を用いて１０又は１００ｍｇ／ｋｇのシベレスタット（０．９％ＮａＣｌ中）を腹腔内投与した。【００５４】
＜薬物投与時期＞
ＣＬＰ、ＬＰＳ、ＭＶ後の薬物初回投与時期は、ＰＣ−ＳＯＤおよびデキサメタゾンについては手技直前、シベレスタットについては手技３０分前に実施した。【００５５】
＜多臓器不全と全身性炎症の評価＞
定量的に臓器の透過性を調べるために、マウスの屠殺２時間前にエバンスブルー（ＥＢＤ）（３０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した。組織（肺、肝臓及び腎臓）のサンプルは小片に切断し、２４時間６０℃でホルムアルデヒド溶液と共にインキュベートした。試料は、上清を得るために遠心分離し、その試料について６２０ｎｍの吸光度を用いてＥＢＤの量を測定した。
肺の湿潤／乾燥重量比を決定するため、最初に肺の湿潤量を測定した。その後、肺を６０℃で一夜乾燥させ、再度乾燥重量を測定した。
血液中のＢＵＮの量及びクレアチニンは、プロトコールに従って、それぞれＤＲＩ−ＣＨＥＭ slide、またはLabAssay creatinineを用いて測定した。血漿中の炎症性サイトカインの量は、プロトコールに従って、Elisaキットで測定した。【００５６】
＜気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）の調製＞
ＢＡＬＦは、気管にカニューレを挿入し、５０Ｕ／ｍＬのヘパリン（無菌の０．９％ＮａＣｌ中）１ｍＬで洗浄を２回することにより採取した。各マウスから通常約１．８ｍＬのＢＡＬＦを採取した。ＢＡＬＦ中のタンパク質の量は、Bradford法により測定した。炎症性サイトカインの量は、上記のようにElisaキットで測定した。【００５７】
＜in vivo imaging解析による活性酸素の測定＞
マウスの活性酸素（ＲＯＳ）の測定は、in vivo imaging解析にいくつかの変更を加えた実施した。
電子倍増型ＣＣＤカメラを装備したチャンバーを持つ撮像システム（Lumazone、インビボイメージングシステム、SHOSHIN EM、岡崎、日本）を使用した。マウスは、静脈内に発光プローブであるＬ−０１２（生理食塩水中）を７５ｍｇ／ｋｇ投与した。
ＣＬＰモデルでは、Ｌ−０１２注射２分後に安楽死させ、腹部正中切開を行い、映像化した（５分間間隔）。
ＬＰＳおよびＭＶモデルの場合、Ｌ−０１２注射５分後に安楽死させ、肺を迅速に解剖し、映像化した（５分間隔）。
データは、SlideBook6ソフトウェア（インテリジェントイメージングイノベーション社、デンバー、CO）を用いて分析した。【００５８】
＜病理組織学的分析＞
組織サンプルは、２４時間、１０％ホルマリン中性緩衝液で固定し、次いで４μｍ厚の切片に切断される前に、パラフィンに包埋した。切片を、最初にマイヤーヘマトキシリン、次いで、１％エオシンアルコール溶液で染色（Ｈ＆Ｅ染色）した。サンプルはマリノール（封入剤）でマウントし、NanoZoomer-XRデジタルスライドスキャナ（浜松ホトニクス社）を使用してスキャンした。
すべてのスキャン画像は、NDP-view2ソフトウェア（浜松ホトニクス社）およびImageJソフトウェアを用いて分析した。【００５９】
以上の試験による結果を、図面に示した結果を参照しながら、以下に記載する。【００６０】
試験１：腸管穿孔術（ＣＬＰ術）を施したマウスの生存率に対するＰＣ−ＳＯＤの効果の検討
雄性ＩＣＲマウスにＣＬＰ術を行い、ＰＣ−ＳＯＤ（ｋＵ／ｋｇ）またはvehicleを投与した。
その結果を図１に示した。
図中に示した（Ａ）は、ＣＬＰ術操作直前、およびＣＬＰ操作後１２、２４、４８時間後に投与された場合の結果である。
図中に示した（Ｂ）は、ＣＬＰ操作後１、１２、２４、４８時間後に投与された場合の結果である。
その両結果から判明するように、ＰＣ−ＳＯＤの投与（ＣＬＰ操作直前、ＣＬＰ操作後１、２４、４８時間後）は、用量依存的に生存率を改善させていた（結果Ａ）。
また、ＰＣ−ＳＯＤ投与（ＣＬＰ操作後１、２４、４８時間後）でも、生存率を改善させていた（結果Ｂ）。【００６１】
試験２：ＣＬＰ誘発性多臓器不全へのＰＣ−ＳＯＤと他の薬剤の影響の検討
雄性ＩＣＲマウスにＣＬＰ操作、またはSham操作を施した。
各薬剤の投与は、ＣＬＰ操作、或いはSham操作前に１回行い、ＰＣ−ＳＯＤ（ｋＵ／ｋｇ）及びデキサメタゾン（μｇ／マウス）は、静脈内投与した。シベレスタット（ｍｇ／ｋｇ）にあっては、腹腔内投与した。ＥＢＤ（エバンスブルー色素）（３０ｍｇ／ｋｇ）は、ＣＬＰ操作６時間後に静脈投与し、２時間後、腎臓、肝臓から抽出し、測定した。
また、ＣＬＰ操作８間後に、血漿サンプルを調製し、ＢＵＮ及びクレアチニン量を測定した。
それらの結果を、図２に示した。【００６２】
図中（Ａ）は、ＰＣ−ＳＯＤを静脈内投与した結果を示したものであるが、ＰＣ−ＳＯＤの投与は、ＣＬＰによる血管透過性の上昇（腎臓、肝臓）を抑制していた。
図中（Ｂ）は、ＰＣ−ＳＯＤを静脈内投与した結果を示したものであるが、ＰＣ−ＳＯＤの投与は、ＣＬＰによるＢＵＮ（血中尿素窒素）とクレアチニン（腎機能の指標）の上昇を抑制していた。
図中（Ｃ、Ｄ）は、デキサメタゾン並びにシベレスタットを投与した結果を示したものであるが、図中に示した結果からも判明するように、ＣＬＰによるＢＵＮとクレアチニンの上昇は、現在臨床で使用されているステロイド剤（デキサメタゾン：Dex）やシベレスタット（Siv）投与では抑制されなかった。
以上の結果から、ステロイド剤（デキサメタゾン）やシベレスタットとは異なり、本発明のＰＣ−ＳＯＤの効果の特異性がよく理解できるものであった。【００６３】
試験３：ＣＬＰ誘発性の全身性炎症に対するＰＣ−ＳＯＤと他の薬剤の効果の検討
雄性ＩＣＲマウスにＣＬＰ操作、またはSham操作を施した。
各薬剤の投与は、ＣＬＰ操作、或いはSham操作前に１回行い、ＰＣ−ＳＯＤ（ｋＵ／ｋｇ）及びデキサメタゾン（μｇ／マウス）は、静脈内投与した。シベレスタット（ｍｇ／ｋｇ）にあっては、腹腔内投与した。ＥＢＤ（エバンスブルー色素）（３０ｍｇ／ｋｇ）は、ＣＬＰ操作８時間後に静脈投与した。血漿サンプルを調製し、血漿中の炎症性サイトカイン量を測定した。
それらの結果を図３に示した。【００６４】
図中（Ａ）は、ＰＣ−ＳＯＤを静脈内投与した結果を示したものであるが、ＰＣ−ＳＯＤの投与は、ＣＬＰによる炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、およびＩＬ−６の上昇を抑制していた。
これに対して、図中（Ｂ）及び（Ｃ）はデキサメタゾン（Dex）及びシベレスタット（Siv）を投与した結果を示したものであるが、これらの投与では、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の上昇を抑制することはできなかった。
以上の結果からも、ステロイド剤（デキサメタゾン）やシベレスタットとは異なり、本発明のＰＣ−ＳＯＤの効果の特異性がよく理解できるものであった。【００６５】
試験４：リポ多糖体（ＬＰＳ）誘発肺傷害に対するＰＣ−ＳＯＤの効果の検討
雄性ＩＣＲマウスの気管内に１回ＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）を投与、またはVehicleを投与した（コントロール）。
ＰＣ−ＳＯＤ（ｋＵ／ｋｇ）またはvehicleを、リポ多糖体（ＬＰＳ）投与直前に一度静脈内投与した。ＥＳＤ（エバンスブルー色素）（３０ｍｇ／ｋｇ）は、ＣＬＰ操作６時間後に静脈内注射し、２時間後、肺、肝臓から抽出し、その量を測定した（試験Ａ）。
肺組織の切片は、ＬＰＳ投与２４時間後に調製し、組織病理学的検査（Ｈ＆Ｅ染色）した（試験Ｂ）。病変領域は、ImageJソフトウェアによって決定した（試験Ｃ）。ＬＰＳ投与４８時間後にＢＡＬＦを調製し、タンパク質（試験Ｄ）、および炎症性サイトカイン（試験Ｅ）の量を測定した。【００６６】
それらの結果を図４．１および図４．２に示した。なお、図中（Ａ）〜（Ｅ）は、それぞれ試験Ａ〜Ｅの結果を示したものである。【００６７】
図中（Ａ）に示した結果から判明するように、リポ多糖体（ＬＰＳ）による血管透過性の上昇（肺、肝臓）を、ＰＣ−ＳＯＤ投与は抑制していた。
図中（Ｂ）に示した結果からは、リポ多糖体（ＬＰＳ）による肺胞出血、白血球浸潤、肺間質浮腫を、ＰＣ−ＳＯＤ投与は抑制しているものであった。
また、図中（Ｃ）の結果から判明するように、リポ多糖体（ＬＰＳ）による肺障害部位を、ＰＣ−ＳＯＤ投与は抑制していた。
さらに、図中（Ｄ）に示したように、リポ多糖体（ＬＰＳ）によるＢＡＬＦ（気管支肺胞洗浄液）内のタンパクの上昇（この上昇は、肺傷害と浮腫の指標となる）を、ＰＣ−ＳＯＤ投与は抑制しており、図中（Ｅ）の結果から、リポ多糖体（ＬＰＳ）によるＢＡＬＦ（気管支肺胞洗浄液）内のＴＮＦ−αとＩＬ−１βと、ＩＬ−６（炎症性サイトカイン）の上昇を、ＰＣ−ＳＯＤは抑制しているものであった。【００６８】
試験５：人工呼吸器（ＭＶ）誘発性肺傷害および肺力学への変化に対するＰＣ−ＳＯＤの効果
雄性ＩＣＲマウスをＭＶ（人工呼吸器）操作、またはＭＶ操作をしなかった（コントロール）。
ＰＣ−ＳＯＤ（１５ｋＵ／ｋｇ）またはvehicleを、ＭＶ操作直前に一度静脈内投与した。ＥＢＤ（エバンスブルー色素）（３０ｍｇ／ｋｇ）を、同時に静脈注射し、ＭＶ操作２時間後、肺から抽出し、測定した（試験Ａ）。
ＭＶ操作２時間後、肺の湿潤／乾燥重量比を測定した（試験Ｂ）。
肺組織の切片は、ＭＶ操作２時間後に調製し、組織病理学的検査（Ｈ＆Ｅ染色）した（試験Ｃ）。
病変領域は、ImageJソフトウェアによって決定した（試験Ｄ）。
総呼吸器エラスタンスは３０分毎に１２０分まで測定した（試験Ｅ）。【００６９】
これらの結果を図５．１および図５．２に示した。なお、図中（Ａ）〜（Ｅ）は、それぞれ試験Ａ〜Ｅの結果を示したものである。【００７０】
図中（Ａ）に示した結果は、ＭＶによる血管透過性の上昇（肺）を、ＰＣ−ＳＯＤ投与は抑制していることを示している。
また、（Ｂ）に示した結果からも、ＭＶによる肺浮腫を、ＰＣ−ＳＯＤ投与は抑制していることを示した。
さらに、図中（Ｃ、Ｄ）に示した結果から明らかなように、ＭＶによる肺傷害を、ＰＣ−ＳＯＤ投与は抑制しており、（Ｅ）の結果からは、ＭＶによる肺エラスタンスの上昇を、ＰＣ−ＳＯＤ投与は抑制していた。【００７１】
試験６：人工呼吸器（ＭＶ）誘発性肺傷害および肺力学への変化に対するデキサメタゾンおよびシベレスタットの効果（比較検討）
雄性ＩＣＲマウスを、上記試験５と同様に、ＭＶ操作、またはＭＶ操作をしなかった（コントロール）。
デキサメタゾン（Dex）（２００μｇ／マウス）またはvehicleを、ＭＶ操作直前に一度静脈内投与した。
シベレスタット（Siv）（１００ｍｇ／ｋｇ）またはvehicleを、ＭＶ操作直前に一度腹腔内投与した。
ＭＶ操作２時間後、肺の湿潤／乾燥重量比を測定した（試験Ａ、Ｃ）。総呼吸器エラスタンスは３０分毎に１２０分まで測定した（試験Ｂ、Ｄ）。【００７２】
それらの結果を図６に示した。なお、図中（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれ試験Ａ〜Ｄの結果を示したものである。【００７３】
図中（Ａ、Ｃ）に示した結果からも判明するように、ＭＶによる肺浮腫は、ステロイド（デキサメタゾン：Dex）やシベレスタット（Siv）投与では抑制されなかった。
また、図中（Ｂ、Ｄ）に示した結果からも判明するように、ＭＶによる肺エラスタンスの上昇についても、ステロイド（デキサメタゾン：Dex）やシベレスタット（Siv）の投与では抑制されていなかった。【００７４】
試験７：生体内での活性酸素（ＲＯＳ）量へのＰＣ−ＳＯＤの効果の検討
ＣＬＰ操作（試験Ａ、Ｂ）、ＬＰＳ投与（試験Ｃ、Ｄ）、ＭＶ操作（試験Ｅ、Ｆ）は、上記したように行った。上述のように、ＣＬＰ操作、ＬＰＳ投与、ＭＶ操作前にＰＣ−ＳＯＤ（３又は１５ｋＵ／ｋｇ）を一度静脈内投与した。（７５ｍｇ／ｋｇ）発光プローブ（Ｌ−０１２）は、それぞれ、ＣＬＰ操作４時間後、ＬＰＳ投与６時間後、ＭＶ操作２時間後に投与した。マウスの腹腔（試験Ａ）、または肺（試験Ｃ、Ｅ）は、in vivoイメージングシステム Lumazoneを用いて画像化した。活性酸素（ＲＯＳ）の合計強度は、Slide Book6ソフトウェアによって決定した（試験Ｂ、Ｄ、Ｆ）。【００７５】
これらの結果を図７．１〜図７．３に示した。なお、図中（Ａ）〜（Ｆ）は、それぞれ試験Ａ〜Ｆの結果を示したものである。【００７６】
図中（Ｂ）に示した試験Ｂの結果からも明らかなように、ＣＬＰ操作における腹腔の活性酸素の上昇を、ＰＣ−ＳＯＤ投与は抑制していた。
また、リポ多糖体（ＬＰＳ）による肺の活性酸素の上昇、並びに人工呼吸器（ＭＶ）による肺の活性酸素の上昇についても、ＰＣ−ＳＯＤ投与は抑制していた。
これらの結果は、図中（Ａ）に示したマウス腹腔内（試験Ａ）または、図中（Ｃ、Ｅ）に示した肺（試験Ｃ、Ｅ）におけるin vivoイメージングシステム Lumazone を用いて画像化した結果からも支持されていた。【００７７】
試験８：生体内での活性酸素（ＲＯＳ）量へのデキサメタゾンまたはシベレスタットの効果（比較検討）
試験７に対する比較試験として、デキサメタゾン（Dex）およびシベレスタット（Siv）の効果の検討を行った。
雄性ＩＣＲマウスをＣＬＰ操作した。ＣＬＰ操作前に１回、デキサメタゾン（２００μｇ／マウス）を静脈内投与した（試験Ａ、Ｃ）。また、シベレスタット（１００ｍｇ／ｋｇ）は、腹腔内投与した（試験Ｂ、Ｄ）。（７５ｍｇ／ｋｇ）発光プローブ（Ｌ−０１２）を、それぞれ、ＣＬＰ操作４時間後に投与した。マウスの腹腔はin vivoイメージングシステムLumazoneを用いて画像化した（試験Ａ、Ｂ）。ＲＯＳの合計強度は、SlideBook6ソフトウェアによって決定した（試験Ｃ、Ｄ）。【００７８】
それらの結果を図８に示した。なお、図中（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれ試験Ａ〜Ｄの結果を示したものである。【００７９】
図中（Ｃ、Ｄ）に示した結果からも明らかなように、腸管穿刺術（ＣＬＰ）による活性酸素の上昇は、ステロイド（デキサメタゾン）やシベレスタット投与では抑制されていなかった。
これらの点は、図中（Ａ、Ｂ）に示した、マウスの腹腔 in vivoイメージングシステムLumazoneを用いた画像化からも判明するものであった。
以上から判断すると、ＡＲＤＳでの活性酸素の上昇については、ステロイド（デキサメタゾン）或いはシベレスタットでは抑制できないが、本発明のＰＣ−ＳＯＤは有意に抑制をしており、本願発明の特異性が、よく理解できるものであった。【００８０】
試験９：ＣＬＰ誘発性腎機能障害および全身性炎症への熱不活性化ＰＣ−ＳＯＤの効果の検討
本発明のＰＣ−ＳＯＤの効果の確認のため、熱により不活性化したＰＣ−ＳＯＤの効果を検討した。
ＰＣ−ＳＯＤ溶液を不活性化のため６０分間１００℃で加熱した。
雄性ＩＣＲマウスをＣＬＰ操作またはSham操作をした。ＣＬＰ操作前に１回、熱不活性化ＰＣ−ＳＯＤ（ｋＵ／ｋｇ；熱不活性化前のｋＵ）を静脈内投与した。ＣＬＰ捜査８時間後に、血漿サンプルを調製し、ＢＵＮおよびクレアチニン量（試験Ａ）、および炎症性サイトカイン量（試験Ｂ）を測定した。【００８１】
その結果を図９に示した、
図中の（Ａ）及び（Ｂ）として示した結果からも判明するように、ＣＬＰによるＢＵＮとクレアチニン、ＴＮＦ−αとＩＬ−６の上昇は、熱をかけて非活性化したＰＣ−ＳＯＤ（Heat-PC）では抑制されていなかった。【００８２】
試験１０：ＣＬＰ誘発性腎機能障害および全身性炎症へのＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン）または非修飾ＳＯＤの効果の検討
試験例９と同様、本発明のＰＣ−ＳＯＤの効果の確認のため、ＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン、または非修飾ＳＯＤの効果を検討した。
雄性ＩＣＲマウスをＣＬＰ操作またはSham操作をした。ＣＬＰ操作前に１回、ＮＡＣ（ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与、または非修飾ＳＯＤ（ｋＵ／ｋｇ）を静脈内投与した。ＣＬＰ操作８時間後に、血漿サンプルを調製し、ＢＵＮおよびクレアチニン量（試験Ａ）、および炎症性サイトカイン量（試験Ｂ）を測定した。【００８３】
その結果を図１０に示した、
図中の（Ａ）及び（Ｂ）として示した結果からも判明するように、ＣＬＰによるＢＵＮとクレアチニン、ＴＮＦ−αとＩＬ−６の上昇は、ＮＡＣや非修飾ＳＯＤでは抑制されていなかった。
以上の試験例９及び１０の結果から判断すると、本発明のＰＣ−ＳＯＤは、ＣＬＰ誘発性腎機能障害および全身性炎症に対して特異的なものである点が理解される。【００８４】
以上の各試験例の結果より、本発明のＰＣ−ＳＯＤは、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）患者に有益であることが示唆された。【００８５】
現時点では、ＡＲＤＳ（急性呼吸促迫症候群）を明瞭に改善する治療薬はない。そのため、人工呼吸器（ＭＶ：mechanical ventilation）が、救命治療として使用されているが、人工呼吸器は、高い１回換気量であり、人工呼吸器誘発肺傷害（ＶＩＬＩ）を引き起こしており、それがため、ＡＲＤＳの死亡率が高いものとなっている。
また、活性酸素（ＲＯＳ）として、例えばスーパーオキサイドアニオンがＡＲＤＳ或いはＶＩＬＩ発症の要因となっている。ＳＯＤ（スーパーオキサイドジスムターゼ）は、スーパーオキサイドアニオンの不均化を触媒するものであるが、低い組織親和性、血漿（プラズマ）中での低い安定性のため、ＳＯＤの臨床的な効果は、期待するほど得られていない。【００８６】
本発明が提供するＰＣ−ＳＯＤは、上記に示した各試験例からも判明するように、マウスにおける腸管穿孔術（ＣＬＰ：cecal ligation and puncture：腹膜炎モデル）、リポ多糖体（ＬＰＳ：lipopolysaccharide）の投与、或いは、肺におけるＭＶ−誘発性組織障害（人工呼吸器誘発組織障害）、浮腫、炎症に対し、極めて効果的なものであることが判明する。
また、ＰＣ−ＳＯＤの静脈内投与は、ＣＬＰ術を行ったマウスにおいて、生存率を向上させ、血管透過性を減少させており、デキサメタゾン或いはシベレスタットと異なりＣＬＰにより誘発された、腎臓のみならず、全身性の炎症を抑制していた。
特に、リポ多糖類（ＬＰＳ）投与により肺における血管透過性、組織傷害及び炎症が誘発されるが、これらの誘発された症状は、ＰＣ−ＳＯＤを投与することによって、全て抑制された。【００８７】
さらに、ＭＶにより誘発された肺における血管透過性、浮腫、組織傷害、並びに機械的変化は、ＰＣ−ＳＯＤにより全て抑制されたが、デキサメタゾン、シベレスタットは抑制しなかった。
また、ＣＬＰ操作、及びＬＰＳ投与、並びにＭＶによってもたらされるＲＯＳ（活性酸素）のin vivoイメージング分析では、ＲＯＳ（活性酸素）のレベルを上昇させ、その上昇は、ＰＣ−ＳＯＤの投与によって抑制されたが、デキサメタゾン、シベレスタットは抑制されなかった。
これらの結果は、ＰＣ−ＳＯＤの静脈内投与は、ＡＲＤＳ患者に有益なものであることを示唆しているものである。【００８８】
製剤例１：静脈注射剤
ＰＣ−ＳＯＤ１％（ｗ／ｗ）、シュークロース１０％（ｗ／ｗ）、塩化ベンザルコニウム０．０５％（ｗ／ｗ）を５％キシリトール水溶液に溶解した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥剤に、別にバイアル充填した０．５％カルメロースあるいは注射用水を加えることにより静脈注射用剤を得た。【００８９】
実施例２：吸入剤
吸入用液剤（１）
ＰＣ−ＳＯＤ１％（ｗ／ｗ）、シュークロース１０％（ｗ／ｗ）、塩化ベンザルコニウム０．０５％（ｗ／ｗ）を５％キシリトール水溶液に溶解し、吸入用液剤を調製する。【００９０】
吸入用液剤（２）
ＰＣ−ＳＯＤ１％（ｗ／ｗ）、シュークロース１０％（ｗ／ｗ）、塩化ベンザルコニウム０．０５％（ｗ／ｗ）、ポリエチレングリコール１０％（ｗ／ｗ）、プロピレングリコール２０％（ｗ／ｗ）、残部精製水で吸入用液剤を調製する。【００９１】
吸入用散剤
ＰＣ−ＳＯＤが５％（ｗ／ｗ）、残部シュークロース（微細粉末状）で吸入用散剤を調製する。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
以上記載したように、本発明が提供する急性呼吸促迫症候群の改善剤は、特異的なＰＣ−ＳＯＤを有効成分とするものであり、従来のＳＯＤに比較して細胞膜等への親和性に優れたものであり、病変部位におけるスーパーオキサイドアニオンを消去する能力が高いものである。
したがって、本発明により、ＰＣ−ＳＯＤを有効成分として含有する急性呼吸促迫症候群治療剤が提供され、これまでステロイド剤或いはシベレスタットでは効果のない、肺及び他の器官における浮腫、組織傷害、炎症に対して有効であり、ＡＲＤＳおよび、ＶＩＬＩに対する治療に光明を与えるものであり、医療上の価値は多大なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４．１】
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【図４．２】
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【図５．１】
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【図５．２】
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【図６】
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【図７．１】
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【図７．２】
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【図７．３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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