(57)【要約】【課題】  本発明は、プロバイオティクス由来の、安全性かつ有効性の高い抗腫瘍剤を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、下記式（１）で示される化合物又はその錯体を有効成分とする抗腫瘍剤に関する；【化１】2017126626.tif 000006  （式中、Ｒ１は水素原子又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ２は水素原子、メチル基又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、それぞれ独立して、メチル基、Ｎ５−（トランス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基、Ｎ５−（シス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基又はＮ５−（トランス−４−カルボキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基を示す）。本発明によれば、安全性かつ有効性の高い抗腫瘍剤を提供することが可能になる。【選択図】図１
2017126626.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される化合物又はその錯体を有効成分とする抗腫瘍剤。
【化１】
2017126626.tif 000005
（式中、Ｒ１は水素原子又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ２は水素原子、メチル基又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、それぞれ独立して、メチル基、Ｎ５−（トランス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基、Ｎ５−（シス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基又はＮ５−（トランス−４−カルボキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基を示す。）
【請求項２】
式中、Ｒ１及びＲ２が水素原子、並びにＲ３〜Ｒ５がいずれもメチル基である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
腫瘍が消化器がんである、請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍剤、特に副作用のおそれが少なく、抗腫瘍効果に優れる抗腫瘍剤及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸（盲腸、結腸、直腸）に発生する大腸がんは、２０１４年の日本における死亡率の高いがん種として、男性では第３位、女性では第１位に挙げられている。【０００３】
大腸がんの発症原因は未だ明らかにはされていない。しかし、肉食を中心とするいわゆる西洋型の食習慣と大腸がん発症の関連性、さらには腸内環境、特に異常な腸内細菌叢と大腸がんとの関連性等が指摘されている（例えば非特許文献１、２）。一方、いわゆる善玉菌（プロバイオティクス）に分類されるラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌又はビフィドバクテリア属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌のいくつかが、抗腫瘍活性を有する物質を産生することも報告されている（例えば、非特許文献３、４）。【０００４】
プロバイオティクスの摂取が有害事象をほとんどもたらすことなく健康維持又は増進に寄与することは、古くから提唱され、また証明されてきている。したがって、プロバイオティクス由来の抗腫瘍活性を有する有用成分を見いだし、これを利用することは、副作用の少ない安全な抗腫瘍剤及びこれを用いたがんの治療法の提供につながるものと期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｒｃｈｅｓｉ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１１；６（５）：ｅ２０４４７．
【非特許文献２】Ｓｏｂｈａｎｉ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１１  Ｊａｎ  ２７；６（１）：ｅ１６３９３．
【非特許文献３】Ｊａｎ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ２００２  Ｆｅｂ；９（２）：１７９−８８．
【非特許文献４】Ｃｏｕｓｉｎ  ＦＪ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１２；７（３）：ｅ３１８９２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、安全性かつ有効性の高い抗腫瘍剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ラクトバチルス属細菌の培養上清中に高い抗腫瘍活性を有する物質を見いだし、下記の各発明を完成させた。【０００８】
（１）下記式（１）で示される化合物又はその錯体を有効成分とする抗腫瘍剤。
【化１】
2017126626.tif 000003
（式中、Ｒ１は水素原子又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ２は水素原子、メチル基又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、それぞれ独立して、メチル基、Ｎ５−（トランス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基、Ｎ５−（シス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基又はＮ５−（トランス−４−カルボキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基を示す。）
（２）式中、Ｒ１及びＲ２が水素原子、並びにＲ３〜Ｒ５がいずれもメチル基である、（１）に記載の抗腫瘍剤。
（３）腫瘍が消化器がんである、（１）又は（２）に記載の抗腫瘍剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、抗腫瘍剤として臨床現場で使用されている５−フルオロウラシル又はシスプラチンと同等以上の抗腫瘍活性を示す一方、肝毒性等の有害事象をもたらすことのない、有効性かつ安全性の高い抗腫瘍剤を提供することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ラクトバチルス属細菌であるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ＧＧ  ＡＴＣＣ５３１０３、Ｌ．ｃａｓｅｉ  ＡＴＣＣ３３４、Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ２５６００及びＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ  ＡＴＣＣ２３２７１の各培養上清の、大腸がん細胞株に対する抗腫瘍活性を示すグラフである。パネルＡは大腸がん細胞株Ｃａｃｏ２／ｂｂｅ、パネルＢは大腸がん細胞株ＳＫＣＯ１、パネルＣは大腸がん細胞株ＳＷ６２０に対する抗腫瘍活性をそれぞれ示す。
【図２】Ｌ．ｃａｓｅｉ  ＡＴＣＣ３３４の培養上清から精製された抗腫瘍活性を示す化合物のＨＰＬＣクロマトグラフィーのチャートである。
【図３】パネルＡは精製された抗腫瘍活性を示す画分の、パネルＢは市販フェリクロームの質量分析結果を示すチャートである。
【図４】大腸がん細胞株Ｃａｃｏ２／ｂｂｅ（パネルＡ）及び大腸がん細胞株ＳＷ６２０（パネルＢ）に対するフェリクロームの抗腫瘍活性の用量依存性を示すグラフである。
【図５】ラット腸上皮細胞ＩＥＣ−１８（パネルＡ）及びマウスプライマリー腸上皮細胞（パネルＢ）に対するフェリクロームの影響を示すグラフである。
【図６】大腸がん細胞株ＳＷ６２０を移植したヌードマウスにフェリクロームを投与したときの腫瘍塊の成長を示す写真である。上は移植後１日、下は移植後９日の写真である。
【図７】大腸がん細胞株ＳＷ６２０を移植したヌードマウスにフェリクロームを投与したときの腫瘍塊の体積変化を示すグラフである。
【図８】フェリクローム（パネルＡ）、５−フルオロウラシル（パネルＢ）及びシスプラチン（パネルＣ）の大腸がん細胞株ＳＷ６２０に対する抗腫瘍効果を比較したグラフである。
【図９】フェリクローム（パネルＡ）、５−フルオロウラシル（パネルＢ）及びシスプラチン（パネルＣ）のラット腸上皮細胞ＩＥＣ−１８に対する影響を比較したグラフである。
【図１０】マウスにフェリクロームを経口又は静脈投与したときの血中ＡＳＴ（パネルＡ）、ＡＬＴ（パネルＢ）及び血清鉄（パネルＣ）の測定結果を示すグラフである。
【図１１】フェリクロームで処理した大腸がん細胞株ＳＷ６２０におけるｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰの発現をウェスタンブロッティングで測定した結果を示す写真である。
【図１２】０．１μｇ／ｍＬのフェリクロームで処理した大腸がん細胞株ＳＷ６２０のＴＵＮＥＬ染色陽性細胞数を示すグラフである。
【図１３】フェリクロームで処理した大腸がん細胞株ＳＷ６２０におけるＤＤＩＴ３の発現量の亢進を、ＲＴ−ＰＣＲ（パネルＡ）及びウェスタンブロッティング（パネルＢ）で測定した結果を示す写真である。
【図１４】フェリクロームで処理した大腸がん細胞株ＳＷ６２０におけるｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ、ＪＮＫ、ＥＲＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ及びＧＳＫ３βの発現をウェスタンブロッティングで測定した結果を示す写真である。
【図１５】フェリクロームと共にＪＮＫ経路の阻害剤であるＳＰ６００１２５を大腸がん細胞株ＳＷ６２０に添加したときの抗腫瘍活性の変化を示すグラフである。
【図１６】膵臓がん細胞株ｂｘｐｃ３（パネルＡ）及びｓｕｉｔ２（パネルＢ）に対するフェリクロームの抗腫瘍活性の用量依存性を示すグラフである。縦軸は細胞密度（５１０ｎｍにおけるＯＤ）を、横軸はフェリクローム添加後の培養時間を表す。
【図１７】胃がん細胞株ＭＫＮ４５（パネルＡ）及びＳＨ−１０−ＴＣ（パネルＢ）に対するフェリクロームの抗腫瘍活性の用量依存性を示すグラフである。縦軸は細胞密度（５１０ｎｍにおけるＯＤ）を、横軸はフェリクローム添加後の培養時間を表す。
【図１８】食道がん細胞株ＯＥ３３に対するフェリクロームの抗腫瘍活性の用量依存性を示すグラフである。縦軸は細胞密度（５１０ｎｍにおけるＯＤ）を、横軸はフェリクローム添加後の培養時間を表す。
【図１９】胃がん細胞株ＭＫＮ４５を移植したヌードマウスにフェリクロームを投与したときの腫瘍塊の成長を示す写真である。
【図２０】胃がん細胞株ＭＫＮ４５を移植したヌードマウスにフェリクロームを投与したときの腫瘍体積比の変化を示すグラフである。
【図２１】膵臓がん細胞株Ｓｕｉｔ２を移植したヌードマウスにフェリクロームを投与したときの、がん細胞移植後１２日目の腫瘍塊を示す写真である。
【図２２】膵臓がん細胞株Ｓｕｉｔ２を移植したヌードマウスにフェリクロームを投与したときの腫瘍体積の変化を示すグラフである。
【図２３】ＰＢＳを経口投与した正常マウス（ＰＢＳ）、ＰＢＳを経口投与した化学発癌マウス（ＡＯＭ−ＤＳＳ，ＰＢＳ）、及びフェリクロームを経口投与した化学発癌マウス（ＡＯＭ−ＤＳＳ，ＦＣ）から摘出した大腸の写真である。
【図２４】ＰＢＳを経口投与した正常マウス（ＰＢＳ）、ＰＢＳを経口投与した化学発癌マウス（ＡＯＭ−ＤＳＳ  ＰＢＳ）、及びフェリクロームを経口投与した化学発癌マウス（ＡＯＭ−ＤＳＳ  ＦＣ）の大腸における腫瘍面積を示すグラフである。
【図２５】ＰＢＳを腹腔内投与した正常マウス（ＰＢＳ）、ＰＢＳを腹腔内投与した化学発癌マウス（ＡＯＭ−ＤＳＳ，ＰＢＳ）、及びフェリクロームを腹腔内投与した化学発癌マウス（ＡＯＭ−ＤＳＳ，ＦＣ）から摘出した大腸の写真である。
【図２６】ＰＢＳを腹腔内投与した正常マウス（ＰＢＳ）、ＰＢＳを腹腔内投与した化学発癌マウス（ＡＯＭ−ＤＳＳ  ＰＢＳ）、及びフェリクロームを腹腔内投与した化学発癌マウス（ＡＯＭ−ＤＳＳ  ＦＣ）の大腸における腫瘍面積を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第一の態様は、下記式（１）で示される化合物又はその錯体を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
【化２】
2017126626.tif 000004
式中、Ｒ１は水素原子又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ２は水素原子、メチル基又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、それぞれ独立して、メチル基、Ｎ５−（トランス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基、Ｎ５−（シス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基又はＮ５−（トランス−４−カルボキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基を示す。
【００１２】
式（１）に示される化合物は、シデロフォア（鉄イオンと安定な錯体を形成する微生物由来のキレート化合物）の一種として、例えば特許文献１（特開２００９−２８０３０号公報）において報告されている環状タンパク質の一種である。式（１）中のＲ１及びＲ２が水素原子、並びにＲ３〜Ｒ５がいずれもメチル基である化合物は、一般にフェリクローム（Ｆｅｒｒｉｃｈｒｏｍｅ）と呼ばれている。特許文献１では、式（１）に示される化合物は、糸状菌の一種である麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）によって産生されるシデロフォアとして報告されている。
【００１３】
本発明者らは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に登録、保存されているプロバイオティクスの一種であるラクトバチルス  カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）ＡＴＣＣ３３４の培養上清が、大腸がん、膵臓がん、胃がん、食道がんといった様々ながん細胞の増殖に対して強い抗腫瘍活性を示し、さらにかかる活性がフェリクロームによってもたらされることを確認した。これまでに２６０種以上のシデロフォアが報告されているが（ＳｉｄｅｒｏｆｏｒｅＢａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｂｅｒｔｒａｎｄｓａｍｕｅｌ．ｆｒｅｅ．ｆｒ／ｓｉｄｅｒｏｐｈｏｒｅ＿ｂａｓｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）、フェリクロームが抗腫瘍活性を有していることは、新規な知見である。なお、式（１）に示される化合物の金属イオン、特に鉄イオンとの錯体も、本発明において利用される化合物に包含される。
【００１４】
式（１）に示される化合物は、前記特許文献１に記載された培養条件でアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）３１２９−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９６１）を培養することによって、製造することができる。
【００１５】
また、フェリクロームは、Ｌ．ｃａｓｅｉ、特にＬ．ｃａｓｅｉ  ＡＴＣＣ３３４を適当な培地で培養することによっても製造することができる。好ましくは、Ｌ．ｃａｓｅｉ  ＡＴＣＣ３３４を、ラクトバチルス属細菌の培養に好適な培地例えばＭａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐｅ（ＭＲＳ）ブロス（Ｄｉｆｃｏ社）、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）などの液体培地で培養して得られる培養上清から、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて精製することで、製造することができる。さらに、フェリクロームは、Ｉｓｏｗａの記載の方法（Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  ４７（１），２１５−２２０, １９７４）に従って化学合成することもできる。
【００１６】
式（１）の化合物、特にフェリクロームは、そのまま抗腫瘍剤として利用してもよく、さらに、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤、賦形剤その他の成分及び／又は他の有効成分を含む医薬組成物の形態で利用してもよい。かかる医薬組成物は、本発明の第二の態様である。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【００１７】
本発明の抗腫瘍剤を含む医薬組成物の形態は任意であり、注射剤、点滴剤などの非経口製剤であっても、又は任意選択で適当なコーティングを施した経口投与剤であってもよい。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトールなどを含む等張液といった水性担体が挙げられる。
【００１８】
本発明の抗腫瘍剤又はこれを含む医薬組成物の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与などを挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の治療剤は、静脈内投与又は経口投与により生体に投与される。本発明の抗腫瘍剤又はこれを含む医薬組成物は、腫瘍の治療に有益なその他の医薬と併用して使用してもよい。
【００１９】
本発明の抗腫瘍剤又はこれを含む医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、疾患の形態、その他の条件などに応じて適宜選択されるが、通常成人に対して体重１ｋｇあたり１０μｇ〜２０００μｇ、好ましくは５０μｇ〜１０００μｇ、より好ましくは１００μｇ〜５００μｇであり、これを１日に１回若しくは複数回に分けて、又は間歇的に投与することができる。
【００２０】
この様に、本発明の抗腫瘍剤又はこれを含む医薬組成物は、腫瘍、特に消化器がんの予防及び／又は治療に用いることができ、したがって、本発明の第三の態様は、前記式（１）の化合物、特にフェリクロームを用いた腫瘍、特に消化器がんの予防及び／又は治療の方法も提供するものであるということができる。
【００２１】
以下、非限定的な実施例を示して、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００２２】
＜細胞株、微生物及びその培養＞
大腸がん細胞株であるＣａｃｏ２／ｂｂｅ（ＡＴＣＣ）、ＳＫＣＯ−１（ＡＴＣＣ）及びＳＷ６２０（ＡＴＣＣ）、膵臓がん細胞株であるｂｘｐｃ３（ＡＴＣＣ）及びＳｕｉｔ２（ヒューマンサイエンス資源バンク）、胃がん細胞株であるＭＫＮ４５（国立研究開発法人  医薬基盤・健康・栄養研究所  ＪＣＲＢ細胞バンク）及びＳＨ−１０−ＴＣ（医療細胞資源センター・細胞バンク）、食道がん細胞株であるＯＥ３３（ＤＳファーマ）、並びにラット腸上皮細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ）株ＩＥＣ−１８（ＡＴＣＣ）を評価に用いた。【００２３】
Ｃａｃｏ２／ｂｂｅ、ＳＫＣＯ１及びＳｕｉｔ２はＤＭＥＭに、またＳＷ６２０、ｂｘｐｃ３、ＭＫＮ−４５、ＳＨ−１０−ＴＣ及びＯＥ３３はＲＰＭＩ１６４０に、それぞれ１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えたものを使用して培養した。ＩＥＣ−１８は、５％ＦＢＳ、１Ｕのインスリン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍＬのペニシリン及び５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭを用いて培養した。【００２４】
マウスプライマリー腸上皮細胞は既報（Ｌｉｕ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２０１２  Ｆｅｂ；１８０（２）：５９９−６０７）の方法に従って調製、培養した。【００２５】
Ｌ．ｃａｓｅｉ  ＡＴＣＣ３３４、ＬＧＧ  ＡＴＣＣ５３１０３、Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ２５６００及びＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ  ＡＴＣＣ２３２７１は、いずれもＡＴＣＣから購入した。これらの微生物を、ＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ社）を用いて３７℃で一晩培養し、さらにＭＥＭに移して一日間培養した。培養後の培地を５０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を回収し、これを０．２μｍのフィルターを通してろ過したものを以下の実施例で培養上清として用いた。【００２６】
＜ＳＲＢアッセイによる抗腫瘍活性の測定＞
９６穴プレートに１．０×１０４個／ウェルとなるように分注した被験細胞（以下、特に指定がないかぎりｎ＝５）を２４時間培養した後、測定試料を終濃度１０ｎｇ〜１０μｇ／ｍＬとなるようにＤＭＥＭに添加してインキュベーションを開始し、２４時間、４８時間、７２時間又は９６時間後にプレートを回収した。培地を除去した後、各ウェルに５％ＴＣＡを添加して４℃で１時間静置し、純水で４回洗浄した。室温でプレートを乾燥させ、０．０５７重量％のＳＲＢ水溶液１００μＬを各ウェルに加えて細胞を染色し、０．１％酢酸で４回洗浄してから乾燥させた。染色された細胞を１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液に溶解したときの５１０ｎｍにおけるＯＤを測定することで、各インキュベーション時間における細胞密度を測定した。【００２７】
＜実施例１＞
１）培養上清の抗腫瘍活性
大腸がん細胞株Ｃａｃｏ２／ｂｂｅ、ＳＫＣＯ−１及びＳＷ６２０を被験細胞とし、ＬＧＧ  ＡＴＣＣ５３１０３、Ｌ．ｃａｓｅｉ  ＡＴＣＣ３３４、Ｌ．ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＡＴＣＣ２５６００及びＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ  ＡＴＣＣ２３２７１の各培養上清を測定試料として、各上清の抗腫瘍活性をＳＲＢアッセイにより測定した。その結果を図１に示す。いずれの大腸がん細胞株に対しても、Ｌ．ｃａｓｅｉ  ＡＴＣＣ３３４の培養上清は強い抗腫瘍活性を示すことが確認された。【００２８】
２）抗腫瘍活性物質の精製
Ｌ．ｃａｓｅｉ  ＡＴＣＣ３３４の培養上清から、分子量３ｋＤａのカットオフスピンカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分子量３ｋＤａ以下の画分を得、次いでこの画分に対してＭｉｃｒｏ  Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた透析を行うことで、分子量０．５ｋＤａ〜３ｋＤａの画分を回収した。【００２９】
分子量０．５ｋＤａ〜３ｋＤａの画分に対して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｌｕｍｎを備えたＡＫＴＡ−ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、抗腫瘍活性が確認されたフラクションを回収した。【００３０】
回収されたフラクションに対して、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いた逆相ＨＰＬＣ（０．１％ギ酸及び０．１％ギ酸／アセトニトリルのリニアグラジエント）を行い、抗腫瘍活性画分を回収した。【００３１】
さらに、ＨｉＴｒａｐ−ＤＥＡＥ、ＣＭ及びＳＰの各カラム（いずれもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーをこの順序で行い、抗腫瘍活性画分を回収した。さらに、ＺＩＣ−ＨＩＬＩＣカラム（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた順相クロマトグラフィーを行い、ＨＰＬＣで単一ピーク（図２）を示す化合物を含む抗腫瘍活性画分を回収した。【００３２】
最終的に得られた抗腫瘍活性画分に対してプロテアーゼ処理を行ったが、抗腫瘍活性に変化は認められなかった。また、アミノ酸分析、糖鎖分析、ペプチドグリカン検出をそれぞれ試みたが、アミノ酸、糖鎖及びペプチドグリカンはいずれも検出されなかった。さらに原子吸光分析を試みたところ、鉄、亜鉛及びカルシウムが検出された。【００３３】
この画分について、Ｎａｎｏ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  ｅｌＤ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈｉｇｈ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて質量分析（ＴＯＦ、イオン化法：マイクロＥＳＩ）を行ったところ、図３Ａに示すチャートが得られた。このチャートにおけるｍ／ｚ７６３．２のピークは、市販のフェリクローム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）について同様に質量分析を行って得られたチャート（図３Ｂ）のそれとほぼ一致した。また、市販のフェリクロームを測定試料とし、大腸がん細胞株ＳＷ６２０を被験細胞として抗腫瘍活性を測定したところ、強い抗腫瘍活性が確認された。【００３４】
以上から、Ｌ．ｃａｓｅｉ  ＡＴＣＣ３３４の培養上清に含まれる抗腫瘍活性を有する化合物は、フェリクロームであると特定された。【００３５】
＜実施例２＞
被験細胞としてＣａｃｏ２／ｂｂｅ及びＳＷ６２０を用い、フェリクロームの抗腫瘍活性の用量依存性をＳＲＢアッセイにより試験した。同時に、ラット腸上皮細胞株ＩＥＣ−１８及びマウスプライマリー腸上皮細胞に対するフェリクロームの影響を調べた。その結果、フェリクロームはＣａｃｏ２／ｂｂｅ及びＳＷ６２０に対して用量依存的に抗腫瘍活性を示した（図４）が、ＩＥＣ−１８及びマウスプライマリー腸上皮細胞に対しては、細胞密度をあまり低下させなかった（図５）。また、フェリクロームは別の大腸がん細胞株ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６及びＳＫＣＯ１に対しても、Ｃａｃｏ２／ｂｂｅ及びＳＷ６２０同様に抗腫瘍活性を示すことが確認された。【００３６】
＜実施例３＞
２×１０６個の大腸がん細胞株ＳＷ６２０を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの背部皮下に注射して移植した。移植の翌日から毎日、１０μｇ／日のフェリクローム（ｎ＝１６）又はＰＢＳ（ｎ＝１６）を移植部位に投与し、各移植部位における腫瘍塊の成長を９日間観察した。移植後１日目及び移植後９日目のマウスの外観を図６に、腫瘍塊の体積変化を図７にそれぞれ示す。図６及び図７に示されるように、フェリクロームは移植細胞による腫瘍塊の成長を顕著に阻害した。【００３７】
＜実施例４＞
被験細胞を大腸がん細胞株ＳＷ６２０及び腸上皮細胞ＩＥＣ−１８とし、フェリクローム、抗がん剤として利用されている５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）及びシスプラチンを測定試料として、ＳＲＢアッセイにより抗腫瘍活性を比較した。その結果、フェリクロームは５−ＦＵ及びシスプラチンを上回るＳＷ６２０に対する抗腫瘍活性を示した（図８）。一方、ＩＥＣ−１８に対しては、５−ＦＵ及びシスプラチンは特に高濃度で用いた際に細胞密度を低下させたが、フェリクロームは細胞密度に大きく影響しないことが確認された（図９）。【００３８】
＜試験例１＞
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（ｎ＝５）に７日間に亘ってフェリクローム１０μｇ又は１００μｇ／日を経口投与又は静脈投与したときの血中ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）及び血清鉄を測定したが、コントロールと比較して有意な変化は観察されなかった（図１０）。【００３９】
＜試験例２＞
フェリクロームで処理した大腸がん細胞株ＳＷ６２０からｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて回収した総タンパク質に対して、ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰそれぞれに対する特異抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いたウェスタンブロッティングを行った。その結果、フェリクロームの添加によってｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰは用量依存的に増加しており、アポトーシスの誘導が認められた（図１１）。アポトーシスの誘導は、ＴＵＮＥＬ染色（Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ａｎｄ  ＴＭＲ  ｒｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ））によっても確認された。図１２に０．１μｇ／ｍＬのフェリクロームで処理したＳＷ６２０のＴＵＮＥＬ染色陽性細胞数の結果を示す。【００４０】
また、フェリクロームで処理した及び処理しなかった大腸がん細胞株ＳＷ６２０の間でのｍＲＮＡ発現量の変化を、ＭｅｔａＣｏｒｅソフトウェアプログラムを用いたハイスループットシーケンス解析を行って測定した。その結果、フェリクローム処理によって小胞体ストレスに関与する遺伝子の発現に変動が見られ、特にＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ３（ＤＤＩＴ３）の発現量に顕著な変化（発現の亢進）が観察された。ＤＤＩＴ３はＢａｘ−Ｂａｋミトコンドリア透過及びＪＮＫシグナリングに関与することが知られているタンパク質である（Ｔａｂａｓ  Ｉ，  Ｒｏｎ  Ｄ．  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１１  Ｍａｒ；１３（３）：１８４−９０）。上記ＤＤＩＴ３の発現の亢進は、ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロッティングでも確認された（図１３）。【００４１】
さらに、フェリクロームで処理したＳＷ６２０から回収した総タンパク質に対して、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ、ＪＮＫ、ＥＲＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＧＳＫ３βそれぞれに対する特異抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いたウェスタンブロッティングを行った結果、ＳＷ６２０におけるリン酸化ＪＮＫの発現が亢進していることが確認された（図１４）。また、フェリクローム（０．１μｇ／ｍＬ）及びＪＮＫ経路の阻害剤であるＳＰ６００１２５（１又は５μＭ）の両方をＳＷ６２０に添加すると、フェリクロームの抗腫瘍活性の抑制が認められ（図１５）、ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰの発現も確認された。このｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３及びＰＡＲＰの発現低下は、フェリクロームを添加したＳＷ６２０をＪＮＫに対するｓｉＲＮＡで処理したときも観察された。【００４２】
以上の結果から、フェリクローム添加によるＳＷ６２０の細胞密度の低下は、ＪＮＫ−ＤＤＩＴ３が関与するアポトーシス経路が活性化されることによるものであると推察された。【００４３】
＜実施例５＞
被験細胞として膵臓がん細胞株ｂｘｐｃ３及びｓｕｉｔ２、胃がん細胞株ＭＫＮ４５及びＳＨ−１０−ＴＣ、並びに食道がん細胞株ＯＥ３３を用い、フェリクロームの抗腫瘍活性の用量依存性をＳＲＢアッセイにより試験した。フェリクロームはいずれの被験細胞に対しても用量依存的に抗腫瘍活性を示した（図１６〜１８）。また、フェリクロームは上記以外の膵臓がん細胞株（ＫＰ３、ＫＰ１Ｎ、ＫＰ３Ｌ、Ｍｉａｐａｃａ）、胃がん細胞株（ＭＫＮ７、ＭＫＮ７４）及び食道がん細胞株（ＯＥ１９）に対しても同様に抗腫瘍活性を示すことが確認された。【００４４】
＜実施例６＞
２群のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝６／群）の背部皮下に１×１０６個の胃がん細胞ＭＫＮ４５を注射して移植した。移植の翌日から毎日、１群にはＰＢＳに溶解したフェリクローム１００μｇを、他の１群にはＰＢＳのみをそれぞれ移植部位に投与しながら、通常の飼育環境下で２１日間飼育した。移植１日後と１９日後の移植部位の写真を図１９に、移植１日後の腫瘍体積を１としたときの腫瘍体積比の変化を図２０に示す。【００４５】
フェリクロームを投与したマウスの腫瘍体積比の増加は、ＰＢＳのみを投与した対照群のそれと比較して抑制され、また移植部位における腫瘍塊の大きさも肉眼で明確に区別することができる程度に抑制されていた。【００４６】
＜実施例７＞
２群のヌードマウス（ｎ＝５／群）に１×１０６個の膵臓がん細胞Ｓｕｉｔ２を皮下移植した２日後から、１群にはＰＢＳに溶解したフェリクローム１００μｇを、他の１群にはＰＢＳのみをそれぞれ２日に１回、腹腔内投与しながら、通常の飼育環境下で１２日間飼育した。移植１２日後の移植部位の写真を図２１に、腫瘍塊の体積変化を図２２に示す。【００４７】
フェリクロームを腹腔内投与したマウスの腫瘍体積の増加は、ＰＢＳのみを投与した対照群のそれと比較して顕著に抑制された。【００４８】
＜実施例８＞
ＢＡＬＢ/ｃマウス（６週齢、♂）にアゾキシメタン（ＡＯＭ）１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。ＡＯＭ処置後１週間飼育し、蒸留水で１．５％に希釈したデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、ＭＰ  ｂｉｏ社製）を１週間自由飲水によりマウスに投与した。１週間休薬したのち、蒸留水で１％に希釈したデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、ＭＰ  ｂｉｏ社製）を１週間自由飲水によりマウスに投与することで、化学発癌モデルを作製した。再度１週間休薬したのち、ＰＢＳに希釈したフェリクローム５０μｇを毎日経口投与しながら通常の飼育環境下で２８日間飼育した。飼育終了後、マウスから大腸を摘出して、腫瘍面積を測定した。【００４９】
ＡＯＭ及びＤＳＳを投与しない正常マウス、及びＰＢＳのみを経口投与した化学発癌マウスをそれぞれ用意し、同様にして大腸における腫瘍面積を測定した。各マウスの大腸の様子を示す写真を図２３に、大腸における腫瘍面積を図２４に示す。【００５０】
フェリクロームを経口投与した化学発癌マウス（ｎ＝７）の大腸における腫瘍面積は、ＰＢＳのみを投与した化学発癌マウス（ｎ＝７）のそれと比較して、有意に抑制された。【００５１】
＜実施例９＞
ＢＡＬＢ/ｃマウス（６週齢、♂）にアゾキシメタン（ＡＯＭ）１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。ＡＯＭ処置後１週間飼育し、蒸留水で１％に希釈したデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、ＭＰ  ｂｉｏ社製）を１週間自由飲水によりマウスに投与した。１週間休薬したのち、ＰＢＳに溶解したフェリクローム１００μｇを２日に１回の頻度で腹腔内投与しながら通常の飼育環境下で４９日間飼育した。飼育終了後、マウスから大腸を摘出して、腫瘍面積を測定した。【００５２】
ＡＯＭ及びＤＳＳを投与しない正常マウス、及びＰＢＳのみを腹腔内投与した化学発癌マウスをそれぞれ用意し、同様にして大腸における腫瘍面積を測定した。各マウスの大腸の様子を示す写真を図２５に、大腸における腫瘍面積を図２６に示す。【００５３】
フェリクロームを腹腔内投与した化学発癌マウス（ｎ＝７）の大腸における腫瘍面積は、ＰＢＳのみを腹腔内投与した化学発癌マウス（ｎ＝６）のそれと比較して、有意に抑制された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の抗腫瘍剤は、医薬の製造における産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年10月24日(2017.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される化合物又はその錯体を有効成分とする、消化器がんに対する抗腫瘍剤。
【化１】
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（式中、Ｒ１は水素原子又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ２は水素原子、メチル基又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、それぞれ独立して、メチル基、Ｎ５−（トランス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基、Ｎ５−（シス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基又はＮ５−（トランス−４−カルボキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基を示す。）
【請求項２】
式中、Ｒ１及びＲ２が水素原子、並びにＲ３〜Ｒ５がいずれもメチル基である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
【請求項３】
消化器がんが、大腸がん、膵臓がん、胃がん又は食道がんである、請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤。
【国際調査報告】
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