(57)【要約】本発明は、ＢＩＧ３とＰＨＢ２との相互作用を阻害するＢＩＧ３のドミナントネガティブペプチドの一部を、ステープリング構造で置き換えた構造を含むペプチドを提供する。本発明のペプチドは、優れた細胞増殖抑制作用を有する。またその細胞増殖抑制作用は、ステープリング構造を持たないペプチドに比べて長い時間継続する。そのため、がんの治療において、臨床応用に適した特徴を備える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：９に記載のアミノ酸配列またはその部分配列において、ｎ対（ｎは自然数）のアミノ酸残基が、ｎ個のステープリング構造で置き換えられたアミノ酸配列を含むペプチド、またはその塩。
【請求項２】
ｎ対のアミノ酸残基が、以下の（ａ）または（ｂ）の１対のアミノ酸残基である、請求項１に記載のペプチド、またはその塩：
（ａ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から３番目および７番目のアミノ酸残基；
（ｂ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２番目および６番目のアミノ酸残基。
【請求項３】
配列番号：９に記載のアミノ酸配列の部分配列が、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列である、請求項１または２に記載のペプチド、またはその塩。
【請求項４】
ｎ対のアミノ酸残基が、以下の（ａ）または（ｂ）の１対のアミノ酸残基である、請求項３に記載のペプチド、またはその塩：
（ａ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列のＮ末端から３番目および７番目のアミノ酸残基；
（ｂ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２番目および６番目のアミノ酸残基。
【請求項５】
ステープリング構造が下記式（Ｉ）で表される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド、
2017126461.tif 000017
（式中、実線と点線の二重線は単結合または二重結合を示す。）
またはその塩。
【請求項６】
下記式（ＩＩ）で表される、請求項５に記載のペプチド、
2017126461.tif 000018
（式中、実線と点線の二重線は単結合または二重結合であり；
Ａ１、Ａ２およびＡ３の組み合わせは以下から選択される：
Ａ１＝Ｑ、Ａ２＝ＬＳＤおよびＡ３＝ＴＬＱＬＲＱＲ（配列番号：１４）；
Ａ１＝ＱＭ、Ａ２＝ＳＤＬおよびＡ３＝ＬＱＬＲＱＲ（配列番号：１５）； 
Ａ１＝ＱＭ、Ａ２＝ＳＤＬおよびＡ３＝−ＯＨ；ならびに
Ａ１＝Ｑ、Ａ２＝ＬＳＤおよびＡ３＝Ｔ。）
またはその塩。
【請求項７】
Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸残基のいずれかまたは両方が修飾されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド、またはその塩。
【請求項８】
Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸残基のいずれかまたは両方が、アセチル化、アミド化およびＨＡタグ付加のいずれかまたはこれらの組み合わせにより修飾されている、請求項７に記載のペプチド、またはその塩。
【請求項９】
Ｎ末端のアミノ酸残基がアセチル化されており、かつＣ末端のアミノ酸残基がアミド化されている、請求項８に記載のペプチド、またはその塩。
【請求項１０】
全てのアミノ酸残基がＤ型のアミノ酸残基に置き換えられた、請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド、またはその塩。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のペプチドのレトロインバース体であるペプチド、またはその塩。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド、またはその塩と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
がん治療用である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
がんが乳がんまたは前立腺がんである、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
がんがエストロゲン受容体陽性のがんである、請求項１３または１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん治療に有用なペプチド及びそれを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エストロゲン受容体α（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＲα）は、乳がんの発生と進行に中心的な役割を果たす。近年の乳がんに対する内分泌療法は、選択的ＥＲαモジュレーター（例えば、タモキシフェン及びラロキシフェン）、ＥＲαダウンレギュレーター（例えば、フルベストラント）、およびアロマターゼ阻害剤（ａｒｏｍａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＡＩ）を使用するものであり、ＥＲαシグナリングを主に標的としている（非特許文献１〜３）。これらの治療法のうち、ＥＲαへの競合的結合を介して乳がん細胞の増殖を阻害するタモキシフェンを用いる方法は、ＥＲα陽性乳がん患者に対する標準療法である。しかしながら、タモキシフェン療法は、しばしば有効でない場合があり、患者は内分泌療法耐性腫瘍を再発して死亡することもある（非特許文献４、５）。また、エストロゲン合成をブロックするＡＩは、タモキシフェンと比較して、良好な有効性、無再発生存期間の有意な延長、および閉経女性における再発期間の延長のような実質的な臨床効果をもたらすが、ＡＩ療法を受けた一部の患者は再発する（非特許文献６、７）。これらの内分泌療法の有効性に影響を与える正確な分子事象は、未だ解明されていない。【０００３】
がんタンパク質であるブレフェルジンＡ阻害グアニンヌクレオチド交換タンパク質３（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ−ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３：ＢＩＧ３）と腫瘍サプレッサーであるプロヒビチン２（ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ  ２：ＰＨＢ２）との複合体は、ＥＲα陽性乳がんにおけるエストロゲンシグナル調節において中心的な役割を果たす（非特許文献８、９）。ＢＩＧ３は、ＰＨＢ２と結合してエストロゲン依存性転写活性化を抑制するＰＨＢ２の能力を阻害し、恒常的なＥＲα活性をもたらす。
これらの知見に基づき、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用の阻害によりＢＩＧ３との複合体からＰＨＢ２を遊離させ、ＰＨＢ２の腫瘍抑制活性を発揮させるという戦略は、乳がんの新規療法となりうる。この戦略に基づき、本発明者らは、以前、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用を特異的に阻害するＢＩＧ３のドミナントネガティブペプチドを開発した（特許文献１）。このペプチドは、ＰＨＢ２の腫瘍抑制活性を再活性化することにより、乳がん増殖をもたらすＥＲαシグナルパスウェイを阻害し、乳がん増殖を抑制することが確認されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／０１８６９０
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Johnston, S. R., Clin. Cancer Res. 16, 1979-1987 (2010).
【非特許文献２】Fisher, B. et al., J. Natl. Cancer Inst. 97, 1652-1662 (2005).
【非特許文献３】Jordan, V. C., Nature Rev. Drug Discov. 2, 205-213 (2003).
【非特許文献４】Clarke, R. et al., Pharmacol. Rev. 53, 25-71 (2001).
【非特許文献５】Fisher, B. et al., J. Natl. Cancer Inst. 93, 684-690 (2001).
【非特許文献６】Chlebowski, R. et al., Breast 2, S1-11 (2009).
【非特許文献７】Chumsri, S. et al., J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 125, 13-22 (2011).
【非特許文献８】Kim, J. W. et al., Cancer Sci. 100, 1468-1478 (2009).
【非特許文献９】Yoshimaru, T. et al., Nat. Commun. 4, 2443 (2013).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記ドミナントネガティブペプチドは、安定性が高いとはいえず、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用に対する阻害効果の持続期間はそれほど長くない。臨床応用のためには、その阻害効果がより長い期間持続することが望まれる。【０００７】
そのため、本発明は、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用に対する阻害効果の持続期間がより長いペプチドを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記ドミナントネガティブペプチドの分子内にステープリング構造（ｓｔａｐｌｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を導入することにより、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用に対する阻害効果の持続時間が改善されることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のペプチド、ならびにその用途を提供する：【０００９】
［１］配列番号：９に記載のアミノ酸配列またはその部分配列において、ｎ対（ｎは自然数）のアミノ酸残基が、ｎ個のステープリング構造で置き換えられたアミノ酸配列を含むペプチド、またはその塩；
［２］ｎ対のアミノ酸残基が、以下の（ａ）または（ｂ）の１対のアミノ酸残基である、［１］記載のペプチド、またはその塩：
（ａ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から３番目および７番目のアミノ酸残基；
（ｂ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２番目および６番目のアミノ酸残基；
［３］配列番号：９に記載のアミノ酸配列の部分配列が、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列である、［１］または［２］に記載のペプチド、またはその塩；
［４］ｎ対のアミノ酸残基が、以下の（ａ）または（ｂ）の１対のアミノ酸残基である、［３］記載のペプチド、またはその塩：
（ａ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列のＮ末端から３番目および７番目のアミノ酸残基；
（ｂ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２番目および６番目のアミノ酸残基；
［５］ステープリング構造が下記式（Ｉ）で表される、［１］〜［４］のいずれか一項に記載のペプチド、
2017126461.tif 000002
（式中、実線と点線の二重線は単結合または二重結合を示す。）
またはその塩；
［６］下記式（ＩＩ）で表される、［５］に記載のペプチド、
2017126461.tif 000003
（式中、実線と点線の二重線は単結合または二重結合であり；
Ａ１、Ａ２およびＡ３の組み合わせは以下から選択される：
Ａ１＝Ｑ、Ａ２＝ＬＳＤおよびＡ３＝ＴＬＱＬＲＱＲ（配列番号：１４）；
Ａ１＝ＱＭ、Ａ２＝ＳＤＬおよびＡ３＝ＬＱＬＲＱＲ（配列番号：１５）； 
Ａ１＝ＱＭ、Ａ２＝ＳＤＬおよびＡ３＝−ＯＨ；ならびに
Ａ１＝Ｑ、Ａ２＝ＬＳＤおよびＡ３＝Ｔ。）
またはその塩；
［７］Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸残基のいずれかまたは両方が修飾されている、［１］〜［６］のいずれか一項に記載のペプチド、またはその塩；
［８］Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸残基のいずれかまたは両方が、アセチル化、アミド化およびＨＡタグ付加のいずれかまたはこれらの組み合わせにより修飾されている、［７］に記載のペプチド、またはその塩；
［９］Ｎ末端のアミノ酸残基がアセチル化されており、かつＣ末端のアミノ酸残基がアミド化されている、［８］に記載のペプチド、またはその塩；
［１０］全てのアミノ酸残基がＤ型のアミノ酸残基に置き換えられた、［１］〜［９］のいずれか一項に記載のペプチド、またはその塩；
［１１］［１］〜［９］のいずれか一項に記載のペプチドのレトロインバース体であるペプチド、またはその塩；
［１２］［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のペプチド、またはその塩と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物；
［１３］がん治療用である、［１２］に記載の医薬組成物；
［１４］がんが乳がんまたは前立腺がんである、［１３］に記載の医薬組成物；ならびに
［１５］がんがエストロゲン受容体陽性のがんである、［１３］または［１４］に記載の医薬組成物。【００１０】
あるいは本発明は、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載のペプチド、またはその塩を、治療を必要とする対象に投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。また本発明は、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載のペプチド、またその塩の、がんの治療用医薬組成物の製造における使用に関する。更に本発明は、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載のペプチド、またはその塩の、がんの治療における使用に関する。そして本発明は、前記［１］〜［１１］のいずれかに記載のペプチド、またはその塩を、担体と混合あるいは配合する工程を含む、がんの治療用医薬組成物の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用に対する阻害効果の持続期間がより長いペプチドが提供される。本発明のペプチドを含む医薬組成物は、がんの治療に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１は、ステープルドＥＲＡＰ合成のスキーム図である。図１Ａは、ステープルドＥＲＡＰ合成のために使用したアミノ酸誘導体の合成スキームを示す。（ｉ）〜（ｖｉ）は各反応における試薬およびアミノ酸合成の条件を示す：（ｉ）２，４−ジメトキシベンズアルデヒド、ＡｃＯＨ、ＭｇＳＯ４、ＣＨ２Ｃｌ２；（ｉｉ）ＮａＢＨ４、ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２、収率８７％（２段階）；（ｉｉｉ）化合物２、ＥＤＣ・ＨＣｌ、ＤＩＰＥＡ、ＣＨ２ＣＨ２、収率７６％；（ｉｖ）ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ、ＴＨＦ、ＭｅＯＨ、Ｈ２Ｏ、収率９２％；（ｖ）ＴＢＳＯＴｆ、２，６−ルチジン、ＣＨ２ＣＨ２；（ｖｉ）Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ、Ｎａ２ＣＯ３、ＴＨＦ、Ｈ２Ｏ、収率９０％（２段階）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、閉環オレフィンメタセシスによるＥＲＡＰのステープリング合成のスキームを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、分子内アミド化を介したＥＲＡＰのステープリング合成のスキームを示す。
【図２Ａ】図２は、ステープルドＥＲＡＰが長期安定的にＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用に対する阻害作用を有することを示す。図２Ａは、ＥＲＡＰ（Ｎｏ．９）およびステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．１〜８）の一次構造を示す。アミノ酸配列中、下線太字はＰＨＢ２結合に重要なアミノ酸残基を示し、斜体太字はステープリングしたアミノ酸残基を示す。アミノ酸配列は、いずれも左端をＮ末端として右に向けてＣ末端方向に記載した。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７細胞の１７β−エストラジオール（Ｅ２）依存性細胞増殖に対する１１Ｒ−ＥＲＡＰおよびステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．２〜６）の阻害効果を評価したＭＴＴアッセイの結果を示す。Ｅ２添加群では、Ｅ２は１０ｎＭ添加した。各グラフの左上に添加したペプチドの種類を示した。各グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒三角▲：Ｅ２＋０．５μＭペプチド；黒四角■：Ｅ２＋１μＭペプチド；黒菱形◆：Ｅ２＋１０μＭペプチド。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ヒト乳腺上皮細胞株ＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞増殖に対する１１Ｒ−ＥＲＡＰおよびステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．２〜６）の阻害効果を評価したＭＴＴアッセイの結果を示す。各グラフの左上に添加したペプチドの種類を示した。各グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒三角▲：０．５μＭペプチド；黒四角■：１μＭペプチド；黒菱形◆：１０μＭペプチド。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定）。
【図２Ｄ】図２Ｄは、１１Ｒ−ＥＲＡＰまたはステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．２〜６）の添加によって阻害されたＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖およびＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞増殖の阻害割合を示す。阻害割合の数値は、図２Ｂおよび図２ＣのＭＴＴアッセイの結果より算出した。図２Ｄ上の表中の各ペプチドのアミノ酸配列において、下線太字はＰＨＢ２結合に重要なアミノ酸残基を示し、斜体太字はステープリングしたアミノ酸残基を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞増殖に対する１１Ｒ−ＥＲＡＰおよびステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．２〜６）の阻害効果を評価したＭＴＴアッセイの結果である。図２Ｃにおける４８時間時点の値を棒グラフに表した。グラフ中、「（−）」は未処理を示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定）。
【図２Ｆ−１】図２Ｆ−１は、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．３処理とステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．６処理とで、ＭＣＦ−１０Ａ細胞で差次的に発現する遺伝子を解析した結果を示す。上図は、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．３処理またはステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．６処理を行ったＭＣＦ−１０Ａ細胞において、処理後２４時間および４８時間での遺伝子発現を解析したヒートマップイメージである。下図は、処理後４８時間の時点で、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．３処理と比較して、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．６処理で、ＭＣＦ−１０Ａ細胞において１００倍以上有意に上方制御または下方制御された２８４遺伝子について、ＤＡＶＩＤに基づく遺伝子アノテーションエンリッチメント解析を行った結果である。
【図２Ｆ−２】図２Ｆ−２は、処理後４８時間の時点で、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．３処理と比較して、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．６処理で、ＭＣＦ−１０Ａ細胞において１００倍以上有意に上方制御または下方制御された２８４遺伝子について、ＧｅｎｅＭＡＮＩＡソフトウェアに基づく解析を行った結果を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ＭＣＦ−７細胞においてＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用に対するステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．２およびＮｏ．３）処理の阻害効果を評価した免疫共沈降の結果を示す。１１Ｒ−ＥＲＡＰはＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用阻害の陽性対照として用いた。図中、「ＩＰ」は免疫沈降に使用した抗体、「ＷＣＬ」は全細胞溶解液（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）、「（−）」はＥ２未処理、および「−」はペプチド未処理をそれぞれ示す。メンブレン上で反応させた抗体を右端に示した。メンブレン下の数字は、左端レーンの反応強度を１．０としたときの各レーンの反応強度の相対値を示す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、Ｈｉｓタグ組換えＰＨＢ２に対する１１Ｒ−ＥＲＡＰおよびステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．２およびＮｏ．３）の親和性を評価した表面プラズモン共鳴相互作用解析の結果を示す。
【図２Ｉ】図２Ｉは、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）におけるＥＲＡＰおよびステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．２およびＮｏ．３）のＣＤスペクトルを示す。
【図２Ｊ】図２Ｊは、ＭＣＦ−７細胞において測定された、ＥＲα標的遺伝子発現に対する１１Ｒ−ＥＲＡＰおよびステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．２およびＮｏ．３）の阻害効果の継続時間を示す。結果は、０時間における未処理細胞での発現量を１．０とした場合の倍数で示した。上部３つのグラフはＴＦＦ１遺伝子の発現を示し、下部３つのグラフはＣＣＮＤ１遺伝子の発現を示す。各グラフの左上に添加したペプチドの種類を示した。各グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；黒丸●：Ｅ２単独；黒四角■：Ｅ２＋１μＭペプチド；黒菱形◆：Ｅ２＋１０μＭペプチド。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定）。
【図３Ａ】図３は、オレフィンを有さないステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．１２）が長期安定的にＥ２依存性応答を抑制することを示す。図３Ａは、オレフィンを有さないステープルドＥＲＡＰであるステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２とそのＨＡタグペプチドであるＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の一次構造を示す。アミノ酸配列中、下線太字はＰＨＢ２結合に重要なアミノ酸残基を示し、斜体太字はステープリングしたアミノ酸残基を示す。アミノ酸配列は、いずれも左端をＮ末端として右に向けてＣ末端方向に記載した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＥＲＡＰおよびステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．３およびＮｏ．１２）のＣＤスペクトルを示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖（左図）およびＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞増殖（右図）に対するステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の阻害効果を評価したＭＴＴアッセイの結果を示す。Ｅ２添加群では、Ｅ２は１０ｎＭ添加した。各グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒三角▲：Ｅ２＋０．５μＭペプチド（左図）または０．５μＭペプチド（右図）；黒四角■：Ｅ２＋１μＭペプチド（左図）または１μＭペプチド（右図）；黒菱形◆：Ｅ２＋１０μＭペプチド（左図）または１０μＭペプチド（右図）。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定）。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ＭＣＦ−７細胞においてＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用に対する１１Ｒ−ＥＲＡＰおよびステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．３およびＮｏ．１２）処理の阻害効果を評価した免疫共沈降の結果を示す。図中、「ＩＰ」は免疫沈降に使用した抗体、「ＷＣＬ」は全細胞溶解液（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）、「（−）」はＥ２未処理、および「−」はペプチド未処理をそれぞれ示す。メンブレン上で反応させた抗体を右端に示した。メンブレン下の数字は、左端レーンの反応強度を１．０としたときの各レーンの反応強度の相対値を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＥＲα標的遺伝子発現に対する１１Ｒ−ＥＲＡＰならびにステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．３およびＮｏ．１２）の阻害効果を示す。結果は、各時間における未処理細胞での発現量を１．０とした場合の倍数で示した。図中、「（−）」はＥ２未処理を示し、「−」はペプチド未処理を示す。上図はＴＦＦ１遺伝子の発現を示し、下図はＣＣＮＤ１遺伝子の発現を示す。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、両側スチューデントｔ検定）。
【図３Ｆ】図３Ｆは、Ｅ２存在下または非存在下における、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２およびＰＨＢ２の細胞内局在を示した代表的な免疫蛍光写真である。Ｅ２存在下または非存在下においてＭＣＦ−７細胞をＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で処理し、処理後１時間において、抗ＨＡタグ抗体および抗ＰＨＢ２抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。
【図３Ｇ】図３Ｇは、Ｅ２存在下または非存在下における、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２およびＰＨＢ２の細胞内局在を示した代表的な免疫蛍光写真である。Ｅ２存在下または非存在下においてＭＣＦ−７細胞をＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で処理し、処理後２４時間において、抗ＨＡタグ抗体および抗ＰＨＢ２抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。
【図３Ｈ】図３Ｈは、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖に対するＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の阻害効果を評価したＭＴＴアッセイの結果を示す。グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒三角▲：Ｅ２＋０．５μＭペプチド；黒四角■：Ｅ２＋１μＭペプチド；黒菱形◆：Ｅ２＋１０μＭペプチド。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定）。
【図３Ｉ】図３Ｉは、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖に対するＥＲＡＰの阻害効果を評価したＭＴＴアッセイの結果を示す。グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒菱形◆：Ｅ２＋１０μＭペプチド。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。
【図３Ｊ】図３Ｊは、タモキシフェン耐性（ＴＡＭ−Ｒ）ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖に対する１１Ｒ−ＥＲＡＰ（上図）およびステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（下図）の阻害効果を評価したＭＴＴアッセイの結果を示す。ＴＡＭ−Ｒ  ＭＣＦ−７細胞を、１μＭタモキシフェンの存在下で、各濃度の１１Ｒ−ＥＲＡＰまたはステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で処理した。Ｅ２添加群では、Ｅ２は１０ｎＭ添加した。グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒三角▲：Ｅ２＋０．５μＭペプチド；黒四角■：Ｅ２＋１μＭペプチド；黒菱形◆：Ｅ２＋１０μＭペプチド。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定）。
【図３Ｋ】図３Ｋは、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖に対する、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２と、タモキシフェンまたはフルベストラントとの組み合わせ阻害効果を評価したＭＴＴアッセイの結果を示す。図中、濃いグレーのバーはステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２未処理を示し、薄いグレーのバーは０．５μＭステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での処理を示す。また「ＴＡＭ」は１０ｎＭタモキシフェン、「Ｆｌｕ」は２μＭフルベストラント、「（−）」はＥ２未処理、ならびに「−」はタモキシフェンおよびフルベストラントのいずれも未処理をそれぞれ示す。グラフには処理後２４時間の結果を示した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定）。
【図４Ａ】図４は、ステープルドＥＲＡＰがヒトＥＲα陽性乳がんの異種同所性移植マウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を有することを示す。図４Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のスキーム図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスモデルでの腫瘍増殖に対する、１．４ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２処理の阻害効果を示す。左図はペプチドを毎日投与した群での結果であり、右図はペプチドを４日毎に投与した群での結果である。各グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒三角▲：Ｅ２＋１１Ｒ−ＥＲＡＰ；黒四角■：Ｅ２＋ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２。腫瘍サイズのデータは、各群の平均±ＳＥを示す（ｎ＝５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、両側スチューデントｔ検定）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスモデルでの腫瘍増殖に対する、１４ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２処理の阻害効果を示す。左図はペプチドを毎日投与した群での結果であり、右図はペプチドを４日毎に投与した群での結果である。各グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒三角▲：Ｅ２＋１１Ｒ−ＥＲＡＰ；黒四角■：Ｅ２＋ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２。腫瘍サイズのデータは、各群の平均±ＳＥを示す（ｎ＝５、＊＊Ｐ＜０．０１、両側スチューデントｔ検定）。
【図４Ｄ】図４Ｄは、１．４ｍｇ／ｋｇの１１Ｒ−ＥＲＡＰ（左図）またはステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（右図）で処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスの体重変動を示す。各グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒三角▲：Ｅ２＋毎日のペプチド処理；黒四角■：Ｅ２＋４日毎のペプチド処理。体重データは、各群の平均±ＳＥを示す（ｎ＝５）。
【図４Ｅ】図４Ｅは、腫瘍における、ＰＨＢ２の細胞内局在を調べたイムノブロットの結果を示す。イムノブロットには、１．４ｍｇ／ｋｇの１１Ｒ−ＥＲＡＰまたはステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で毎日（上図）または４日毎（下図）に処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから摘出した腫瘍を使用した。α／βチューブリンおよびラミンＢをそれぞれ細胞質画分および核画分のローディングコントロールとして使用した。メンブレン上で反応させた抗体を右端に示した。メンブレン下の数字は、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２処理の左端レーンの反応強度を１．０としたときの各レーンの反応強度の相対値を示し、「ｎｄ」は検出されなかったこと（ｎｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ）を示す。
【図４Ｆ】図４Ｆは、ＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスモデルにおいて、１４ｍｇ／ｋｇのＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で毎日または４日毎に処理した場合の腫瘍増殖阻害効果を示す。グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒三角▲：Ｅ２＋毎日のペプチド処理；黒四角■：Ｅ２＋４日毎のペプチド処理。腫瘍サイズのデータは、各群の平均±ＳＥを示す（ｎ＝５、＊＊Ｐ＜０．０１、両側スチューデントｔ検定）。
【図４Ｇ】図４Ｇは、腫瘍における、ＰＨＢ２およびステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の細胞内局在を調べた免疫共沈降の結果を示す。免疫共沈降には、１４ｍｇ／ｋｇのＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で毎日（左図）または４日毎（右図）に処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから摘出した腫瘍を使用した。図中、「ＩＰ」は免疫沈降に使用した抗体を示し、「ＷＣＬ」は全細胞溶解液（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）を示す。メンブレン上で反応させた抗体を右端に示した。α／βチューブリンおよびラミン  Ｂをそれぞれ細胞質画分および核画分のローディングコントロールとして用いた。
【図４Ｈ】図４Ｈは、腫瘍における、ＰＨＢ２およびステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の細胞内局在を調べた代表的な免疫組織化学染色写真を示す。免疫組織化学染色には、１４ｍｇ／ｋｇのＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（ＨＡタグＮｏ．１２）で４日毎に処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから摘出した腫瘍を用いた。また染色には抗ＰＨＢ２抗体を用いた。
【図４Ｉ】図４Ｉは、腫瘍でのＥＲα標的遺伝子の発現に対するステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の阻害効果を評価したボックスプロットを示す。上図はＴＦＦ１の発現を示し、下図はＣＣＮＤ１の発現を示す。解析には、１．４ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で毎日または４日毎に処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから摘出した腫瘍を用いた。結果は、未処理腫瘍での発現量を１．０とした場合の倍数で示した。データは、５個の独立した腫瘍の平均±ＳＤを示す（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、両側スチューデントｔ検定）。
【図４Ｊ】図４Ｊは、ステープルドＥＲＡＰ処理した腫瘍におけるＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化レベルを調べたイムノブロットの結果を示す。イムノブロットには、１．４ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で毎日（上図）または４日毎（下図）に処理されたＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから摘出した腫瘍を用いた。メンブレン上で反応させた抗体を右端に示した。メンブレン下の数字は、左端レーンの反応強度を１．０としたときの各レーンの反応強度の相対値を示す。
【図４Ｋ】図４Ｋは、１４ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で４日毎に処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから摘出した心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓および脳の代表的なヘマトキシリン・エオシン染色写真を示す。
【図４Ｌ】図４Ｌは、１４ｍｇ／ｋｇのＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で毎日処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから摘出した心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓および脳の代表的なヘマトキシリン・エオシン染色写真を示す。
【図４Ｍ】図４Ｍは、ＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスにおける腫瘍増殖に対する、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での４日毎処理（上図）または７日毎処理（下図）の阻害効果を示す。各グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒菱形◆：Ｅ２＋０．０２ｍｇ／ｋｇペプチド；黒三角▲：Ｅ２＋０．１ｍｇ／ｋｇペプチド；黒四角■：Ｅ２＋１ｍｇ／ｋｇペプチド。腫瘍サイズのデータは、各群の平均±ＳＥを示す（ｎ＝５）。
【図４Ｎ】図４Ｎは、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で４日毎または７日毎に処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから摘出した腫瘍において、ＥＲα標的遺伝子の発現を調べた結果を示す。上図はＴＦＦ１の発現を示し、下図はＣＣＮＤ１の発現を示す。グラフの横軸は、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の１回の処理での投与量を示す。また図中「（−）」はＥ２未処理を示す。結果は、未処理腫瘍での発現量を１．０とした場合の倍数で示した。データは、５個の独立した腫瘍の平均±ＳＤを示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、両側スチューデントｔ検定）。
【図５Ａ】図５は、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２が、ヒト前立腺がん細胞株２２Ｒｖ１において、細胞増殖を抑制し、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用を阻害することを示す。図５Ａは、２２Ｒｖ１細胞の細胞増殖に対するステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の阻害効果を評価した試験の結果を示す。グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；黒菱形◆：２０μＭステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２；黒四角■：５０μＭステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２；黒三角▲：未処理。
【図５Ｂ】図５Ｂは、２２Ｒｖ１細胞において内在性ＢＩＧ３−ＰＨＢ２の相互作用に対するステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の阻害効果を評価した免疫共沈降試験の結果を示す。図中、「ＩＰ」は免疫沈降に使用した抗体を示し、「ＷＣＬ」は全細胞溶解液（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）を示す。メンブレン上で反応させた抗体を右端に示した。メンブレン下の数字は、左端レーンの反応強度を１．００としたときの各レーンの反応強度の相対値を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞増殖に対するステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の阻害効果を評価した試験の結果を示す。グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；黒丸●：未処理；黒三角▲：１０μＭステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２；黒四角■：２０μＭステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２；黒菱形◆：５０μＭステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２。
【図６Ａ】図６は、ステープルド−Ｄ−ＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（Ｄ−Ｎｏ．１２）、ステープルドレトロインバースＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（ＲＩ−Ｎｏ．１２）、ショートステープルドレトロインバースＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（ｓｈＲＩ−Ｎｏ．１２）が、長期安定的にＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用を阻害することを示す。図６Ａは、ステープルドＥＲＡＰアナログの一次構造を示す。アミノ酸配列中、下線太字はＰＨＢ２結合に重要なアミノ酸残基を示し、斜体太字はステープリングしたアミノ酸残基を示す。また小文字はＤ−アミノ酸を示す。アミノ酸配列は、いずれも左端をＮ末端として右に向けてＣ末端方向に記載した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖（左図）およびＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞増殖（右図）に対するステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（１段目）、Ｄ−Ｎｏ．１２（２段目）、ＲＩ−Ｎｏ．１２（３段目）およびｓｈＲＩ−Ｎｏ．１２（４段目）の阻害効果を評価したＭＴＴアッセイの結果を示す。Ｅ２添加群では、Ｅ２は１０ｎＭ添加した。各グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒三角▲：Ｅ２＋０．１μＭペプチド（左図）または０．１μＭペプチド（右図）；黒四角■：Ｅ２＋０．５μＭペプチド（左図）または０．５μＭペプチド（右図）；黒菱形◆：Ｅ２＋１．０μＭペプチド（左図）または１．０μＭペプチド（右図）；アスタリスク＊：Ｅ２＋１０μＭペプチド（左図）または１０μＭペプチド（右図）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（左上図）、Ｄ−Ｎｏ．１２（右上図）、ＲＩ−Ｎｏ．１２（左下図）またはｓｈＲＩ−Ｎｏ．１２（右下図）で処理したＭＣＦ−７細胞における、処理後９６時間でのＥ２依存性細胞増殖に対する上記ステープルドＥＲＡＰの阻害効果を示す。Ｅ２添加群では、Ｅ２は１０ｎＭ添加した。グラフの横軸は、ペプチドの処理濃度を示す。また図中「（−）」はＥ２未処理を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、Ｄ−Ｎｏ．１２（上図）、ＲＩ−Ｎｏ．１２（下図）またはｓｈＲＩ−Ｎｏ．１２（下図）で処理したＭＣＦ−７細胞において、処理後７日間にわたってＥ２依存性細胞増殖に対する上記ペプチドの阻害効果を評価した結果を示す。Ｅ２添加群では、Ｅ２は１０ｎＭ添加し、各ペプチドは１μＭ添加した。各グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒三角▲：Ｅ２＋Ｎｏ．１２；黒四角■：Ｅ２＋Ｄ−Ｎｏ．１２（上図）またはＥ２＋ＲＩ−Ｎｏ．１２（下図）；黒菱形◆：Ｅ２＋ｓｈＲＩ−Ｎｏ．１２。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用に対するＤ−  Ｎｏ．１２、ＲＩ−Ｎｏ．１２およびｓｈＲＩ−Ｎｏ．１２の阻害効果を評価するために行った抗ＢＩＧ３抗体を用いた免疫共沈降の結果を示す。免疫共沈降は、ＭＣＦ−７細胞を１μＭの各ペプチドで処理した後、２４時間（左図）または９６時間（右図）経過した時点の細胞を用いて行った。図中、「ＩＰ」は免疫沈降に使用した抗体を示し、「ＷＣＬ」は全細胞溶解液（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）を示す。メンブレン上で反応させた抗体を右端に示した。メンブレン下の数字は、左端レーンの反応強度を１．０としたときの各レーンの反応強度の相対値を示す。図中、「（−）」はＥ２未処理を示し、「−」はペプチド未処理を示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスモデルでの腫瘍増殖に対する、ＲＩ−Ｎｏ．１２での４日毎処理（左図）および７日毎処理（右図）の阻害効果を示す。各グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒菱形◆：Ｅ２＋０．０２ｍｇ／ｋｇ  ＲＩ−Ｎｏ．１２；黒三角▲：Ｅ２＋０．１ｍｇ／ｋｇ  ＲＩ−Ｎｏ．１２：黒四角■：Ｅ２＋１ｍｇ／ｋｇ  ＲＩ−Ｎｏ．１２。腫瘍サイズのデータは、各群の平均±ＳＥを示す（ｎ＝５）。
【図６Ｇ】図６Ｇは、ＲＩ−Ｎｏ．１２で４日毎または７日毎に処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから摘出した腫瘍における、ＥＲα標的遺伝子ＴＦＦ１（左図）およびＣＣＮＤ１（右図）の発現抑制を示す。グラフの横軸は、ＲＩ−Ｎｏ．１２の１回の処理での投与量を示す。また図中「（−）」はＥ２未処理を示す。結果は、未処理腫瘍での発現量を１．０とした場合の倍数で示した。データは、５個の独立した腫瘍の平均±ＳＤを示す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、両側スチューデントｔ検定）。
【図７】図７は、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖に対するＥＲＡＰ−８Ｒ（Ｎｏ．１０；左図）および部分ＥＲＡＰ−８Ｒ（Ｎｏ．１１；右図）の阻害効果を評価したＭＴＴアッセイの結果を示す。Ｅ２添加群では、Ｅ２は１０ｎＭ添加した。各グラフの上に示したアミノ酸配列中、下線太字はＰＨＢ２結合に重要なアミノ酸残基を示す。各グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸○：未処理；黒丸●：Ｅ２単独；黒三角▲：Ｅ２＋０．５μＭペプチド；黒四角■：Ｅ２＋１μＭペプチド；黒菱形◆：Ｅ２＋１０μＭペプチド。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定）。
【図８】図８は、ステープルドＥＲＡＰ(Ｎｏ.１２)で処理したタモキシフェン耐性乳癌細胞株におけるｍＴОＲとＳ６Ｋのリン酸化レベルを調べたイムノブロットの結果を示す。メンブレン上で反応させた抗体を右端に示した。メンブレン下の数字は、左端レーンの反応強度を１．０としたときの各レーンの反応強度の相対値を示す。
【図９】図９は、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖に対するステープルドＥＲＡＰ(Ｎｏ.１２)とタモキシフェン、フルベストラント、エベロリムスとの併用効果を評価したＭＴＴアッセイの結果を示す。図中、濃いグレーのバーは未処理、薄いグレーのバーは１１Ｒ-ＥＲＡＰでの処理、白いバーはステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での処理を示す。また「ＴＡＭ」はタモキシフェン、「Ｆｌｕ」はフルベストラント、「Ｅｖｅｒ」はエベロリムスをそれぞれ示す。グラフには処理後２４時間（左図）と９６時間（右図）の結果を示した。データは、３回の独立した実験の平均±ＳＤを示す（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側スチューデントｔ検定）。
【図１０】図１０はステープルドＥＲＡＰ(Ｎｏ.１２)の尾静脈投与による抗腫瘍効果を示す。グラフ中の各シンボルはそれぞれ以下を示す；白丸：未処理；黒丸：Ｅ２単独；黒菱形：Ｅ２＋０．１ｍｇ／ｋｇペプチド；黒三角：Ｅ２＋１ｍｇ／ｋｇペプチド；黒四角：Ｅ２＋１０ｍｇ／ｋｇペプチド。
【図１１】図１１は、ステープルドＥＲＡＰ(Ｎｏ.１２)処理した移植マウス摘出腫瘍におけるＢＩＧ３とＰＨＢ２の相互作用を評価した免疫共沈降試験の結果を示す。図中、「ＩＰ」は免疫沈降に使用した抗体を示し、「ＷＣＬ」は全細胞溶解液（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）を示す。メンブレン上で反応させた抗体を右端に示した。
【図１２】図１２は、ステープルドＥＲＡＰ(Ｎｏ.１２)処理した移植マウス摘出腫瘍におけるＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化レベルを調べたイムノブロットの結果を示す。メンブレン上で反応させた抗体を右端に示した。メンブレン下の数字は、左端レーンの反応強度を１．０としたときの各レーンの反応強度の相対値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料をここに記載する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本明細書に記載の特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載に使用する専門用語は特定の型または態様のみを説明する目的のためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである。
【００１４】
定義
本明細書で使用する「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特に明記しない限り「少なくとも１つの」を意味する。
【００１５】
本明細書においては、特に断りの無い限り、大文字で表記されるアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸を表す。一方、小文字で表記されるアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸を表す。また、本明細書において表記されるＬ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基および側鎖のいずれかが修飾されたものも含み得る。好ましい修飾の例としては、アミノ基のアセチル化、カルボキシル基のアミド化、およびＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ等のタグペプチドの付加等が挙げられる。
【００１６】
また、本明細書においては、特に断りのない限り、アミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置を示す番号は、Ｎ末端のアミノ酸残基から順に付与したものである。
【００１７】
本明細書で使用する「ＢＩＧ３」という用語は、ブレフェルジンＡ阻害グアニンヌクレオチド交換タンパク質３（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ−ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をさす。ＢＩＧ３は、ＰＨＢ２と複合体を形成することにより、Ｅ２依存的転写活性化を抑制するＰＨＢ２の機能を阻害する。ＢＩＧ３は、「ＡＲＦＧＥＦ３（ＡＲＦＧＥＦ ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ３）」または「Ａ７３２２」とも称される。ヒトＢＩＧ３遺伝子の代表的な塩基配列の例を配列番号：２３（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２０３４０．４）に、またそれによってコードされるアミノ酸配列を配列番号：２４に示す。本発明において、ＢＩＧ３は前記塩基配列にコードされるものに限定されず、これらのアイソフォームや変異体も包含する。
【００１８】
本明細書で使用する「ＰＨＢ２」という用語は、プロヒビチン２（ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ  ２）をさす。ＰＨＢ２は、エストロゲン受容体と結合してエストロゲン受容体シグナル伝達経路を阻害し、エストロゲン依存性細胞増殖を抑制する。ＰＨＢ２は、「ＲＥＡ（Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）」とも称される。ヒトＰＨＢ２遺伝子の代表的な塩基配列の例を配列番号：２５（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１１４４８３１．１）および配列番号：２７（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００１２６７７００．１）に、またそれらによってコードされるアミノ酸配列を配列番号：２６および配列番号：２８にそれぞれ示す。本発明において、ＰＨＢ２は前記塩基配列にコードされるものに限定されず、これらのアイソフォームや変異体も包含する。
【００１９】
本明細書において使用される「エストロゲン受容体」という用語は、エストロゲン受容体α（ＥＲα）およびエストロゲン受容体β（ＥＲβ）の両方を包含する。エストロゲン受容体はエストロゲンが結合すると核内に移行し、ＤＮＡ上のエンハンサー配列であるＥＲＥに結合して細胞増殖に関連する遺伝子の転写活性化を引き起こす。これにより、エストロゲン依存性細胞増殖が誘導される。ＥＲαおよびＥＲβはそれぞれＥＳＲ１遺伝子およびＥＳＲ２遺伝子によってコードされている。代表的なヒトＥＳＲ１遺伝子の塩基配列を配列番号：２９（ＧｅｎＢｅｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿０００１２５．３）に示す。また、代表的なヒトＥＳＲ２遺伝子の塩基配列を配列番号：３１（ＧｅｎＢｅｎｋ  Ａｃｃｅｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＭ＿００１４３７．２）に示す。本発明において、ＥＲαおよびＥＲβは前記塩基配列にコードされるものに限定されず、これらのアイソフォームや変異体も包含する。本発明の好ましい態様では、エストロゲン受容体はＥＲαである。
【００２０】
本明細書において使用される「ＥＲＡＰ」という用語は、配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるペプチドをさす。また「ショートＥＲＡＰ」という用語は、配列番号：９に記載のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチドをさす。配列番号：９に記載のアミノ酸配列は、ＢＩＧ３のアミノ酸配列（配列番号：２４）の１６５〜１７７番目のアミノ酸残基からなる配列であり、ＰＨＢ２との結合に重要なアミノ酸残基（配列番号：２４に記載のアミノ酸配列中、１６５番目のグルタミン（Ｑ）、１６９番目のアスパラギン酸（Ｄ）および１７３番目のグルタミン（Ｑ））を含む。ＥＲＡＰは、ＰＨＢ２に対する結合能を有し、ＰＨＢ２に競合的に結合することにより、ＢＩＧ３がＰＨＢ２と複合体を形成することを阻害する。また、本明細書においては、細胞透過性ペプチドとしてポリアルギニンをＥＲＡＰのＮ末端またはＣ末端に結合させたペプチドを、１１Ｒ−ＥＲＡＰおよびＥＲＡＰ−８Ｒ（「Ｒ」の前の数字はアルギニン残基の数）等と記載する。
【００２１】
本明細書において使用される「ステープリング構造」という用語は、ペプチドを構成するアミノ酸配列中２つ（１対）のアミノ酸残基が、架橋されている構造をさす。そして、１つまたは複数のステープリング構造によって元のアミノ酸残基が置換されているペプチドを、本明細書においては「ステープルドペプチド」という。たとえば、ステープルドＥＲＡＰとは、配列番号：９に記載のアミノ酸配列からなるペプチド（ＥＲＡＰ）において少なくとも１対のアミノ酸残基がステープリング構造で置き換えられたペプチドである。また、ショートステープルドＥＲＡＰとは、配列番号：９に記載のアミノ酸配列の部分配列からなるペプチド（ショートＥＲＡＰ）において少なくとも１対のアミノ酸残基がステープリング構造で置き換えられたペプチドである。本明細書において、ショートステープルドＥＲＡＰは、「ｓｈステープルドＥＲＡＰ」とも表記される。
【００２２】
本明細書において使用される「治療」という用語は、対象疾患によって生じる少なくとも1つの症状を緩和・改善すること、疾患の進行を抑制すること、および疾患部位の拡大を抑制すること等を包含する。例えば、「がんの治療」には、がん細胞の増殖抑制、がんの進行抑制、がんの退縮・寛解の誘導、がんに伴う症状の緩和・改善、がんの転移の抑制、術後の再発抑制、および生存期間延長の誘導などが含まれる。
【００２３】
本発明のペプチド
本発明のペプチドは、配列番号：９に記載のアミノ酸配列またはその部分配列において、ｎ対（ｎは自然数）のアミノ酸残基が、ｎ個のステープリング構造で置き換えられたアミノ酸配列を含むペプチドである。ｎは３以下であることが好ましく、２であることがより好ましく、１であることがさらに好ましい。したがって、本発明において、ｎ対のアミノ酸残基とは、通常１〜３対、あるいは１対または２対、好ましくは１対のアミノ酸残基をさす。
【００２４】
本発明のペプチドにおいて、配列番号：９に記載のアミノ酸配列の部分配列は、配列番号：９に記載のアミノ酸配列の連続した６残基以上の配列であることが好ましく、７残基以上の配列であることがより好ましい。また、配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１番目のグルタミン（Ｑ）、５番目のアスパラギン酸（Ｄ）および９番目のグルタミン（Ｑ）は、ＰＨＢ２との結合に重要なアミノ酸残基であるため、これらのアミノ酸残基のうちの少なくとも１つ、より好ましくは２つ以上を含むことが好ましい。配列番号：９に記載のアミノ酸配列の部分配列の好ましい例としては、配列番号：１３に記載のアミノ酸配列（ＱＭＬＳＤＬＴ）が挙げられる。
【００２５】
本発明のペプチドにおいて、ステープリング構造で置き換えるアミノ酸残基は、特に限定されないが、ＰＨＢ２に対する結合親和性の観点からは、配列番号：９（ＱＭＬＳＤＬＴＬＱＬＲＱＲ）に記載のアミノ酸配列のＮ末端から１番目のグルタミン（Ｑ）、５番目のアスパラギン酸（Ｄ）および９番目のグルタミン（Ｑ）以外のアミノ酸残基から選択することが好ましい。
【００２６】
ステープリング構造で置き換えるアミノ酸残基の例としては、例えば、以下のアミノ酸残基の対を挙げることができる；
（ａ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から３番目（Ｌ）および７番目のアミノ酸残基（Ｔ）； 
（ｂ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２番目（Ｍ）および６番目のアミノ酸残基（Ｌ）；
（ｃ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から４番目（Ｓ）および８番目のアミノ酸残基（Ｌ）；および
（ｄ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から６番目（Ｌ）および１０番目のアミノ酸残基（Ｌ）。
【００２７】
上記（ａ）〜（ｄ）のうち、特に好ましいアミノ酸残基の対としては、（ａ）および（ｂ）のアミノ酸残基の対を挙げることができる。
【００２８】
配列番号：９に記載のアミノ酸配列の部分配列として配列番号：１３に記載のアミノ酸配列（ＱＭＬＳＤＬＴ）を用いた場合、ステープリング構造で置き換えるアミノ酸残基の例としては、例えば、以下のアミノ酸残基の対を挙げることができる；
（ａ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列のＮ末端から３番目（Ｌ）および７番目のアミノ酸残基（Ｔ）；および
（ｂ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２番目（Ｍ）および６番目のアミノ酸残基（Ｌ）。
【００２９】
本発明のペプチドにおいて、ステープリング構造は特に限定されない。ペプチドのステープリング技術は公知であるため（例えば、Blakwell, H. E. et al., Angew. Chem., Int. Ed. 37, 3281-3284 (1994); Aihara, K. et al., Tetrahedron 71, 4183-4191 (2015) 等）、これら公知のステープリング技術を用いてステープリング構造を形成することができる。例えば、アルケニル基等の置換基を有するアミノ酸誘導体を組み込んで固相合成等によってペプチドを合成し、前記アミノ酸誘導体の置換基間でオレフィンメタセシス反応や分子内アミド化反応を行うことにより、ステープリング構造を形成することができる。ステープリング構造形成のためのアミノ酸誘導体は、市販のものを用いることができる。
【００３０】
本発明のペプチドにおいて、好ましいステープリング構造の例としては、例えば、下記式（Ｉ）で表される構造を挙げることができる。
2017126461.tif 000004
（式中、実線と点線の二重線は単結合または二重結合を示す。）
【００３１】
上記式（Ｉ）のステープリング構造の形成は、例えば、図１Ｂまたは図１Ｃに示したスキームに従って行うことができる。図１Ｂに示したスキーム（以下「スキーム（Ｉ）」）は、オレフィンメタセシス反応によりステープリング構造を形成する例である。一方、図１Ｃに示したスキーム（以下「スキーム（ＩＩ）」）は、分子内アミド化反応によりステープリング構造を形成する例である。
【００３２】
スキーム（Ｉ）に示されるオレフィンメタセシス反応によりステープリング構造を形成する場合、ステープリングのためのアミノ酸誘導体としては、下記式（ＩＩＩ）で表されるグルタミン誘導体（４−｛アリル−［２−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−４−メトキシ−ベンジル］−カルボニル｝−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−酪酸）を用いることができる。
2017126461.tif 000005
【００３３】
式（ＩＩＩ）のグルタミン誘導体は、例えば、以下のスキーム（ＩＩＩ）に従って合成することができる（Aihara, K. et al., Tetrahedron 71, 4183-4191 (2015)）。
【００３４】
スキーム（ＩＩＩ）
2017126461.tif 000006
上記スキーム（ＩＩＩ）において、（ｉ）〜（ｖｉ）はそれぞれ以下を示す；（ｉ）３−アミノ−１−プロペン、ＡｃＯＨ、ＭｇＳＯ４、ＣＨ２Ｃｌ２；（ｉｉ）ＮａＢＨ４、ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２；（ｉｉｉ）化合物２、ＤＣＣ、ＣＨ２Ｃｌ２；（ｉｖ）ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ、ＴＨＦ、ＭｅＯＨ、Ｈ２Ｏ；（ｖ）ＴＢＳＯｔｆ、２，６−ルチジン；（ｖｉ）Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ、Ｎａ２ＣＯ３、ＴＨＦ、Ｈ２Ｏ。
【００３５】
スキーム（ＩＩＩ）に示すように、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンズアルデヒド（化合物１）を３−アミノ−１−プロペンで還元的にアミノ化して、２−アリルアミノメチル−５−メトキシ−フェノール（化合物２）を得る。続いて、化合物２をＮ−α−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン酸αメチルエステル（化合物３）とカップリングさせて、４−［アリル−（２−ヒドロキシ−４−メトキシ−ベンジル）カルバモイル］−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−酪酸メチルエステル（化合物４）を得る。次に、化合物４のメチルエステルを加水分解して、４−［アリル−（２−ヒドロキシ−４−メトキシ−ベンジル）−カルバモイル］−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−酪酸（化合物５）を得る。さらに、化合物５のＢｏｃ基をＦｍｏｃ基に置換し、Ｈｍｂ基のフェノール部分をＴＢＳで保護することにより、式（ＩＩＩ）のグルタミン誘導体を得ることができる。なお、スキーム（ＩＩＩ）の実施に必要な試薬類は、全て市販のものを用いることができる。
【００３６】
一方、スキーム（Ｉ）によるステープルドＥＲＡＰの合成は、上記式（ＩＩＩ）のグルタミン誘導体を用いて、例えば、以下のように行うことができる。まず、配列番号：９に記載のアミノ酸配列またはその部分配列において、ステープリング構造を形成したい位置のアミノ酸残基の対を式（ＩＩＩ）のグルタミン誘導体で置き換えて、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成によりペプチドを合成する。続いて、Ｆｍｏｃ保護されたペプチドＮ末端を脱保護およびアセチル化した後、アセチル化ペプチドをＨｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ第２世代触媒で処理してオレフィンメタセシス反応を行う。さらに、ＴＦＡ／ｍ−クレソール／チオアニソール／１，２−エタンジチオール／Ｈ２Ｏカクテルを用いて、酸不安定保護基の脱保護およびペプチドのレジンからの切り離しを行う。これにより、式（Ｉ）のステープリング構造（実線と点線の二重線が二重結合）を有するステープルドＥＲＡＰまたはｓｈステープルドＥＲＡＰを得ることができる。なお、スキーム（Ｉ）により合成したステープルドＥＲＡＰまたはｓｈステープルドＥＲＡＰにおいて、ステープリング構造の間に介在させるアミノ酸残基の数は、特に限定されないが、通常、３残基であることが好ましい。
【００３７】
また、図１Ｃに示すスキーム（ＩＩ）に示される分子内アミド化反応によりステープリング構造を形成する場合、ステープリングのためのアミノ酸誘導体としては、下記式（ＩＶ）で表されるＮ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン酸γアリルエステルおよび下記式（Ｖ）で表される（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）５−（（４−（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）ブチル）（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ）−５−オキソペンタン酸を用いることができる。
2017126461.tif 000007
【００３８】
また、上記２種類のアミノ酸誘導体のうち、式（ＩＶ）のグルタミン酸誘導体は、市販のものを用いることができる。また、式（Ｖ）のグルタミン誘導体は、例えば、図１Ａに示したスキーム（以下「スキーム（ＩＶ）」）に従って合成することができる。スキーム（ＩＶ）に示すように、アリル（４−アミノブチル）カルバメート（化合物１）を２，４-ジメトキシベンズアルデヒドとカップリングさせて、アリル［４−｛（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ｝ブチル］カルバメート（化合物２）を得る。続いて、化合物２をＮ−α−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン酸αメチルエステル（化合物３）とカップリングさせて、（Ｓ）−メチル−５−｛（４−［｛（アリルオキシ）カルボニル｝アミノ］ブチル）（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ｝−２−｛（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ｝−５−オキソペンタノアート（化合物４）を得る。次に、化合物４のメチルエステルを加水分解して、（Ｓ）−５−｛（４−［｛（アリルオキシ）カルボニル｝アミノ］ブチル）（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ｝−２−｛（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ｝−５−オキソペンタン酸（化合物５）を得る。さらに、化合物５のＢｏｃ基をＦｍｏｃ基に置換することにより、式（Ｖ）のグルタミン誘導体を得ることができる。なお、スキーム（ＩＶ）の実施に必要な試薬類は、全て市販のものを用いることができる。
【００３９】
一方、スキーム（ＩＩ）によるステープルドＥＲＡＰの合成は、上記式（ＩＶ）のグルタミン酸誘導体および式（Ｖ）のグルタミン誘導体を用いて、例えば、以下のように行うことができる。まず、配列番号：９に記載のアミノ酸配列またはその部分配列において、ステープリング構造を形成したい位置のアミノ酸残基の対を式（ＩＶ）のグルタミン酸誘導体および式（Ｖ）のグルタミン誘導体で置き換えて、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成によりペプチドを合成する。続いて、Ｆｍｏｃ保護されたペプチドをテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（ＰＰｈ３）４）のＣＨＣｌ３／ＡｃＯＨ／Ｎ−メチルモルホリン溶液と混合し、グルタミン誘導体残基の置換基を還元する。続いて、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ）を用いてグルタミン誘導体残基をカップリングさせることにより、分子内アミド化を行う。さらに、ＴＦＡ／ｍ−クレソール／チオアニソール／１，２−エタンジチオール／Ｈ２Ｏカクテルを用いて、酸不安定保護基の脱保護およびペプチドのレジンからの切り離しを行う。これにより、式（Ｉ）のステープリング構造（実線と点線の二重線が単結合）を有するステープルドＥＲＡＰまたはｓｈステープルドＥＲＡＰを得ることができる。なお、スキーム（ＩＩ）により合成したステープルドＥＲＡＰまたはｓｈステープルドＥＲＡＰにおいて、ステープリング構造の間に介在させるアミノ酸残基の数は、特に限定されないが、通常、３残基であることが好ましい。
【００４０】
本発明のペプチドの具体例としては、例えば、下記式（ＩＩ）で表されるペプチドを挙げることができる。
2017126461.tif 000008
（式中、実線と点線の二重線は単結合または二重結合であり；
Ａ１、Ａ２およびＡ３の組み合わせは以下から選択される：
Ａ１＝Ｑ、Ａ２＝ＬＳＤおよびＡ３＝ＴＬＱＬＲＱＲ（配列番号：１４）；
Ａ１＝ＱＭ、Ａ２＝ＳＤＬおよびＡ３＝ＬＱＬＲＱＲ（配列番号：１５）； 
Ａ１＝ＱＭ、Ａ２＝ＳＤＬおよびＡ３＝−ＯＨ；ならびに
Ａ１＝Ｑ、Ａ２＝ＬＳＤおよびＡ３＝Ｔ。）
【００４１】
上記式（ＩＩ）で表されるペプチドは、配列番号：９（ＱＭＬＳＤＬＴＬＱＬＲＱＲ）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、以下の（ａ）または（ｂ）の１対のアミノ酸残基が、式（Ｉ）のステープル構造で置き換えられたペプチドであるともいえる；
（ａ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から３番目（Ｌ）および７番目のアミノ酸残基（Ｔ）； ならびに
（ｂ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２番目（Ｍ）および６番目のアミノ酸残基（Ｌ）。
あるいは、配列番号：１３（ＱＭＬＳＤＬＴ）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、以下の（ｃ）または（ｄ）の１対のアミノ酸残基が、式（Ｉ）のステープル構造で置き換えられたペプチドである；
（ｃ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列のＮ末端から３番目（Ｌ）および７番目のアミノ酸残基（Ｔ）；ならびに
（ｄ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２番目（Ｍ）および６番目のアミノ酸残基（Ｌ）。
【００４２】
式（ＩＩ）で表されるペプチドのうち、特に好ましいペプチドとしては、（ＩＩ）の式中、Ａ１、Ａ２およびＡ３の組み合わせが、以下から選択されるペプチドを挙げることができる；
Ａ１＝Ｑ、Ａ２＝ＬＳＤおよびＡ３＝ＴＬＱＬＲＱＲ（配列番号：１４）；
Ａ１＝ＱＭ、Ａ２＝ＳＤＬおよびＡ３＝ＬＱＬＲＱＲ（配列番号：１５）；または
Ａ１＝ＱＭ、Ａ２＝ＳＤＬおよびＡ３＝−ＯＨ。
これらのペプチドは、以下のペプチドに対応する；
（ｉ）配列番号：９（ＱＭＬＳＤＬＴＬＱＬＲＱＲ）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、以下の（ａ）または（ｂ）の１対のアミノ酸残基が、式（Ｉ）のステープル構造で置き換えられたペプチド；
（ａ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から３番目（Ｌ）および７番目のアミノ酸残基（Ｔ）；ならびに
（ｂ）配列番号：９に記載のアミノ酸配列のＮ末端から２番目（Ｍ）および６番目のアミノ酸残基（Ｌ）；あるいは、
（ｉｉ）配列番号：１３（ＱＭＬＳＤＬＴ）に記載のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて、以下の１対のアミノ酸残基が、式（Ｉ）のステープル構造で置き換えられたペプチド；
（ｃ）配列番号：１３に記載のアミノ酸配列のＮ末端から３番目（Ｌ）および７番目のアミノ酸残基（Ｔ）。
【００４３】
なお、本発明のペプチドは、Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸残基のいずれかまたは両方が修飾されたものも包含する。修飾の種類は、特に限定されないが、ＰＨＢ２に対する親和性や細胞透過性を低下させないものであることが好ましい。好ましい修飾の例としては、例えば、Ｎ末端のアミノ酸残基のアセチル化、Ｃ末端のアミノ酸残基のアミド化、およびＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ等のタグペプチドの付加等を挙げることができる。また、本発明のペプチドの特に好ましい例としては、上記式（ＩＩ）で表されるペプチドにおいて、Ｎ末端のアミノ酸残基がアセチル化されており、Ｃ末端のアミノ酸残基がアミド化されているペプチドを挙げることができる。なお、Ｎ末端およびＣ末端のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基は修飾されていないことが好ましい。
【００４４】
本発明のペプチドは、Ｌ−アミノ酸から構成されるものに限定されず、１つ以上のＤ−アミノ酸を含むものであってもよい。ペプチド中のＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の構成比は特に限定されないが、αヘリックス構造維持のためには、全てのアミノ酸残基がＬ型であるか（以下「Ｌ型ペプチド」）、または全てのアミノ酸残基がＤ型である（以下「Ｄ型ペプチド」）ことが好ましい。したがって、上記の本発明のペプチドのいずれかにおいて、全てのアミノ酸残基がＤ型のアミノ酸残基に置き換えられたペプチドもまた、本発明のペプチドの好ましい態様として挙げられる。本発明のペプチドがＤ型ペプチドである場合、好ましいペプチドとしては、例えば、式（ＩＩ）で表されるペプチドにおいて、全てのアミノ酸残基がＤ型のアミノ酸残基で置き換えられたペプチドを挙げることができる。本発明のペプチドがＤ型ペプチドである場合、そのアミノ酸配列を構成するアミノ酸のうち、例えば８０％以上、通常９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上がＤ型のアミノ酸残基である。
【００４５】
さらに本発明のペプチドは、上記の本発明のペプチドのいずれかのレトロインバース体であってもよい。レトロインバース体では、元のペプチドとはアミノ酸配列が逆になっており、全てのアミノ酸残基がＤ型のアミノ酸残基に置き換えられている。すなわち、レトロインバース体は、元のペプチドとは逆向きのアミノ酸配列を有するＤ型ペプチドである。したがって、上記の本発明のペプチドのいずれかのレトロインバース体であるペプチドもまた、本発明のペプチドの好ましい態様として挙げられる。本発明のペプチドがレトロインバース体である場合、好ましいペプチドとしては、例えば、式（ＩＩ）で表されるペプチドのレトロインバース体であるペプチドを挙げることができる。本発明のペプチドがレトロインバース体である場合、そのアミノ酸配列を構成するアミノ酸のうち、例えば８０％以上、通常９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上がＤ型のアミノ酸残基である。
【００４６】
本発明のペプチドがＤ型ペプチドである場合には、上記したような方法において、Ｌ−アミノ酸に替えてＤ−アミノ酸を用いることにより、Ｄ型のステープルドＥＲＡＰまたはｓｈステープルドＥＲＡＰを合成することができる。なお、Ｄ型のステープルドＥＲＡＰまたはｓｈステープルドＥＲＡＰの合成においては、ステープリング構造形成のためのアミノ酸誘導体もまたＤ型のものを用いる。ステープリング構造形成に使用できるＤ型アミノ酸誘導体の幾つかは市販されているので、これら市販のＤ型アミノ酸誘導体を用いてもよい。
【００４７】
また、図１Ｂに示されるスキーム（Ｉ）により、Ｄ型のステープルドＥＲＡＰまたはｓｈステープルドＥＲＡＰを合成する場合には、ステープリングのためのアミノ酸誘導体として、式（ＩＩＩ）で表されるグルタミン誘導体のＤ型光学異性体（以下「式（ＩＩ）のＤ−グルタミン誘導体」）を用いればよい。式（ＩＩ）のＤ−グルタミン誘導体は、上記スキーム（ＩＩＩ）において、Ｎ−α−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン酸αメチルエステル（化合物３）に替えてＮ−α−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−グルタミン酸αメチルエステルを用いることにより、合成することができる。そして、配列番号：９に記載のアミノ酸配列またはその部分配列において、ステープリング構造を形成したい位置のアミノ酸残基の対を式（ＩＩ）のＤ−グルタミン誘導体で置き換えて、Ｄ−アミノ酸を用いて標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成によりＤ型ペプチドを合成し、スキーム（Ｉ）に従ってオレフィンメタセシス反応を行うことにより、Ｄ型のステープルドＥＲＡＰまたはｓｈステープルドＥＲＡＰを得ることができる。なお、ステープルドＥＲＡＰまたはｓｈステープルドＥＲＡＰのレトロインバース体を合成する場合には、配列番号：９に記載のアミノ酸配列またはその部分配列の逆向きのアミノ酸配列に基づいて、ペプチド固相合成を行えばよい。その際に、ステープリング構造を形成したい位置のアミノ酸残基の対を式（ＩＩ）のＤ−グルタミン誘導体で置き換え、ペプチド合成後にオレフィンメタセシス反応を行うことは上記と同様である。
【００４８】
一方、図１Ｃに示されるスキーム（ＩＩ）により、Ｄ型のステープルドＥＲＡＰまたはｓｈステープルドＥＲＡＰを合成する場合には、ステープリングのためのアミノ酸誘導体として、式（ＩＩＶ）で表されるグルタミン酸誘導体のＤ型光学異性体（以下「式（ＩＶ）のＤ−グルタミン酸誘導体」）および、式（Ｖ）で表されるグルタミン誘導体のＤ型光学異性体（以下「式（Ｖ）のＤ−グルタミン誘導体」）を用いればよい。式（ＩＶ）のＤ−グルタミン酸誘導体は、市販のものを用いることができる。また式（Ｖ）のＤ−グルタミン誘導体は、図１Ａで示されるスキーム（ＩＶ）において、Ｎ−α−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン酸αメチルエステル（化合物３）に替えてＮ−α−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−Ｄ−グルタミン酸αメチルエステルを用いることにより、合成することができる。そして、配列番号：９に記載のアミノ酸配列またはその部分配列において、ステープリング構造を形成したい位置のアミノ酸残基の対を式（ＩＶ）のＤ−グルタミン酸誘導体および式（Ｖ）のＤ−グルタミン誘導体で置き換えて、Ｄ−アミノ酸を用いて標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成によりＤ型ペプチドを合成し、スキーム（ＩＩ）に従って分子内アミド化反応を行うことにより、Ｄ型のステープルドＥＲＡＰまたはｓｈステープルドＥＲＡＰを得ることができる。なお、ステープルドＥＲＡＰまたはｓｈステープルドＥＲＡＰのレトロインバース体を合成する場合には、配列番号：９に記載のアミノ酸配列またはその部分配列の逆向きのアミノ酸配列に基づいて、ペプチド固相合成を行えばよい。その際に、ステープリング構造を形成したい位置のアミノ酸残基の対を式（ＩＶ）のＤ−グルタミン酸誘導体および式（Ｖ）のＤ−グルタミン誘導体で置き換え、ペプチド合成後に分子内アミド化反応を行うことは上記と同様である。
【００４９】
また本発明のペプチドは、塩の形態であってもよい。塩の形態は特に限定されないが、薬学的に許容される塩であることが好ましい。なお、本明細書において「薬学的に許容される塩」とは、ペプチドの薬理学的または薬学的な有効性および特性を保持する塩をさす。塩の好ましい例としては、アルカリ金属（リチウム、カリウム、ナトリウムなど）との塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウムなど）との塩、その他の金属（銅、鉄、亜鉛、マンガンなど）との塩、有機塩基との塩、アミンとの塩、有機酸（酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸など）との塩、および無機酸（塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸など）との塩等を挙げることができる。これらの塩は、公知の方法に従って調製することができる。
【００５０】
医薬組成物
本発明のペプチドまたはその塩は、薬学的に許容される担体とともに、医薬組成物として製剤化することができる。
【００５１】
本発明のペプチドは、ＰＨＢ２に対する結合能を有し、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用を競合的に阻害する。ＢＩＧ３−ＰＨＢ２複合体の形成は、エストロゲン依存性転写活性を亢進させ、がん細胞の増殖を導く。そのため、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用を阻害してＢＩＧ３−ＰＨＢ２複合体の形成を抑制する本発明のペプチドは、特にがんを治療するための医薬組成物として有用である。
【００５２】
ＢＩＧ３−ＰＨＢ２複合体の形成によるエストロゲン依存性転写活性の亢進は、主にエストロゲン受容体陽性細胞において起こる。したがって、本発明のペプチドは、エストロゲン受容体陽性のがんを治療するための医薬組成物として特に有用である。そのようなエストエストロゲン受容体陽性のがんの例としては、乳がん、子宮体がん、卵巣がん、前立腺がん（Nelles JL, et al., Expert Rev Endocrinol Metab. 2011 May;6(3):437-451.）、肺がん（特に非小細胞肺がん）（Stabile LP, et al., Cancer Res. 2005 Feb 15;65(4):1459-70.; Marquez-Garban DC, et al., Steroids. 2007 Feb;72(2):135-43.）等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、本発明の医薬組成物を適用するがんは、ＢＩＧ３およびＰＨＢ２を発現していることが好ましいが、エストロゲン受容体陽性のがんは、一般的に、ＢＩＧ３およびＰＨＢ２を発現している。がんがエストロゲン受容体陽性か否かは、ＥＬＩＳＡ法や免疫組織化学染色法等の公知の方法により確認することができる。
【００５３】
さらに、本発明のペプチドは、タモキシフェン耐性のエストロゲン受容体陽性のがんに対しても増殖抑制効果を有する。そのため、本発明の医薬組成物は、タモキシフェン耐性のエストロゲン受容体陽性のがんに適用してもよい。本発明の医薬組成物を適用するタモキシフェン耐性のエストロゲン受容体陽性のがんの例としては、例えば、タモキシフェン耐性エストロゲン受容体陽性乳がんが挙げられる。したがって、本発明の医薬組成物の好ましい投与対象の例として、タモキシフェン療法不応のエストロゲン受容体陽性乳がんを有する患者を挙げることができる。
【００５４】
一方、本発明のペプチドは、実施例３に示されるように、エストロゲン非依存性のがん細胞増殖に対しても抑制効果を有する。したがって、本発明のペプチドは、エストロゲン受容体陰性のがんを治療するための医薬組成物としても有用である。本発明の医薬組成物を適用するエストロゲン受容体陰性のがんは、特に限定されないが、ＢＩＧ３とＰＨＢ２を発現しているがんである必要がある。そのようながんの例としては、例えば、エストロゲン受容体陰性の乳がんおよび前立腺がんが挙げられる。
【００５５】
本発明の医薬組成物は、本発明のペプチドまたはその塩と、薬学的に許容される担体とを配合して、公知の製剤化技術を用いて製造することができる。なお、本明細書において「薬学的に許容される担体」とは、薬物のための希釈剤または溶媒剤として使用する不活性な物質をさす。本発明の医薬組成物に使用する薬学的に許容される担体は、調製する医薬組成物の剤形に応じて、一般的な医薬品に使用される担体を適宜選択すればよい。
【００５６】
本発明の医薬組成物の剤形は、特に限定されず、液剤、錠剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の医薬品に一般的に使用される剤形を適宜選択することができる。また、選択した剤形に応じて、適宜、賦形剤、安定剤、懸濁液、保存剤、界面活性剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、凝集抑制剤等の添加物を添加することができる。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、薬学的有効量の本発明のペプチドまたはその塩を含む。薬学的有効量は、医薬組成物の剤形、投与間隔、投与対象の年齢、性別、体重、体表面積、疾患の種類等に応じて、適宜選択することができる。例えば、本発明の医薬組成物における本発明のペプチドまたはその塩の含有量の例として、０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜３０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
また、本発明の医薬組成物は、任意で、他の薬剤を含んでもよい。他の薬剤の例としては、抗炎症剤、鎮痛剤、解熱剤、他のがん治療剤等が挙げられる。本発明の医薬組成物に使用できる他のがん治療剤は特に限定されないが、エストロゲン陽性のがんに使用する場合には、選択的ＥＲαモジュレーター（例えば、タモキシフェン及びラロキシフェン）、ＥＲαダウンレギュレーター（例えば、フルベストラント）、アロマターゼ阻害剤、ＬＨ−ＲＨアゴニスト製剤、プロゲステロン製剤等のホルモン療法剤を挙げることができる。またこれらの薬剤は、プロドラッグや薬学的に許容される塩の形で配合してもよい。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、剤形に応じて、適宜適切な投与経路を選択して、対象に投与することができる。投与経路は、特に限定されないが、例えば、経口投与、ならびに皮内、皮下、筋肉内、骨内、腹膜および静脈内注射等を挙げることができる。また、全身投与および疾患部位の近傍への局所投与のいずれであってもよいが、局所投与が好ましい。
【００６０】
本発明の医薬組成物の投与間隔もまた、投与対象の年齢、性別、体重、体表面積、および疾患の種類等、ならびに本医薬組成物の剤形および投与経路等に応じて、適宜選択することができる。投与間隔の例としては、例えば、毎日、４日毎、７日毎等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
本発明の医薬組成物の用量もまた、投与対象の年齢、性別、体重、体表面積、および疾患の種類等、ならびに本医薬組成物の剤形および投与経路等に応じて、適宜選択することができる。
本発明のペプチドまたはその塩の用量の例としては、例えば、０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日、０．００５〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、投与対象の状態に応じて、他の医薬品と併用してもよい。併用する医薬品は特に限定されないが、エストロゲン受容体陽性のがんに使用する場合には、選択的ＥＲαモジュレーター（例えば、タモキシフェン及びラロキシフェン）、ＥＲαダウンレギュレーター（例えば、フルベストラント）、アロマターゼ阻害剤、ＬＨ−ＲＨアゴニスト製剤、プロゲステロン製剤等のホルモン療法剤を挙げることができる。これらのホルモン療法剤のうち、特に好ましいものとしては、タモキシフェンおよびフルベストラントを挙げることができる。
【００６３】
本発明の医薬組成物をがんの治療のために使用する場合には、投与の前に、治療対象のがんがＢＩＧ３およびＰＨＢ２を発現しているか否かを調べてもよい。治療対象のがんがＢＩＧ３およびＰＨＢ２を発現しているか否かは、対象から採取された試料においてこれらの遺伝子の転写産物や翻訳産物を検出することにより確認することができる。検出方法には公知の方法を用いることができ、例えば、転写産物をプローブやＰＣＲ法により検出する方法（例えば、ｃＤＮＡマイクロアレイ法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法など）、および翻訳産物を抗体等により検出する方法（例えば、ウェスタンブロット法、免疫染色法など）等を用いることができる。
【００６４】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含む製品またはキットを提供する。本発明の製品またはキットは、本発明の医薬組成物を収容した容器を含み得る。適切な容器の例としては、ボトル、バイアル、および試験管が挙げられるが、これらに限定されない。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器には、ラベルが貼付されていてもよく、ラベルには、本発明の薬学的組成物が使用されるべき疾患または疾患の状態を記載することができる。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
【００６５】
本発明の製品またはキットは、本発明の医薬組成物を収容した容器に加えて、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収容した第２の容器をさらに含み得る。本発明の製品またはキットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジ、および使用説明を記載した添付文書などの、商業上の観点および使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。
【００６６】
本発明の医薬組成物はまた、必要に応じて、有効成分を含む１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置にて、提供することができる。該パックは、例えば、ブリスターパックのように金属ホイルまたはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与に関する説明書が添付され得る。
【００６７】
別の態様において、本発明はまた、以下の使用および方法等を提供する：
（ａ）がんを治療するための医薬組成物の製造における、本発明のペプチドまたはその塩の使用；
（ｂ）がんの治療において用いるための本発明のペプチドまたはその塩；
（ｃ）がんを治療するための医薬組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドまたはその塩と、薬学的に許容される担体とを製剤化する段階を含む方法または工程；
（ｄ）がんを治療するための医薬組成物を製造するための方法または工程であって、本発明のペプチドまたはその塩を薬学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程；および
（ｅ）本発明のペプチドまたはその塩を対象に投与することを含む、がんを治療するための方法。
【００６８】
以下、実施例を参照して本発明をより詳細に記載する。しかしながら、以下の材料、方法および実施例は、本発明のある形態の作製および使用において当業者を支援するために役立ち得る一方、本発明の局面を説明するためのものにすぎず、したがって本発明の範囲を決して限定することを意図しない。当業者は、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができる。
【００６９】
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００７０】
実施例１  ステープルドペプチドの合成
ＥＲＡＰペプチドの合成
ＢＩＧ３−ＰＨＢ２の相互作用を特異的に阻害するように設計したドミナントネガティブペプチド（１１Ｒ−ＥＲＡＰ；11R-GGG-QMLSDLTLQLRQR（配列番号：９））を以前記載したように合成した（T. Yoshimaru, et al., Nat. Commun. 4, 2443 (2013).）。全ての化学薬品は分析グレードのものを使用した。１１Ｒ−ＥＲＡＰを構成する「１１Ｒ」は、１１残基のアルギニン残基からなるポリアルギニン（ポリＲ）を示す。ポリＲと配列番号：９の間にある「ＧＧＧ」は、両者のリンカーとして導入された３残基のグリシンである。１１Ｒは、ＥＲＡＰ（配列番号：９）に細胞透過性を付与することを目的に導入されたものである。【００７１】
ステープルドペプチド合成のためのアミノ酸誘導体
オレフィン担持ステープルドペプチドの合成に使用したアミノ酸誘導体は、Ａｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ（Tetrahedron, 71, 4183-4191 (2015)）に記載の方法に基づき合成した。アミノ酸誘導体の原料となるアミノ酸は、株式会社ペプチド研究所（大阪、日本）から購入した。
オレフィンを有さないステープルドペプチドの合成に使用した２種のアミノ酸誘導体のうち、グルタミン酸誘導体（Ｎ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン酸γアリルエステル）は、渡辺化学工業（広島、日本）から入手した。一方、グルタミン誘導体（（（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）５−（（４−（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）ブチル）（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ）−５−オキソペンタン酸）は、図１Ａに示すスキームに従って合成した。【００７２】
なお、カラムクロマトグラフィーには、シリカゲル６０Ｎ（球状、中性、粒子径６３−２１０μｍ）（関東ケミカル、東京、日本）を使用した。質量スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ＭＩＣＲＯＭＡＳＳＲ  ＬＣＴ  ＰＲＥＭＩＥＲＴＭ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）で記録した。ＮＭＲスペクトルは、ＪＥＯＬ  ＧＳＸ３００スペクトロメータを使用して測定した。ＨＰＬＣ分離には、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩ分析カラム（４．６ｘ２５０ｍｍ、流速１ｍＬ／分）（ナカライテスク、京都、日本）およびＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−ＩＩセミ分取カラム（１０×２５０ｍｍ、流速３．０ｍＬ／分）（ナカライテスク）を使用し、溶出物は２２０ｎｍの紫外線で検出した。０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液（ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａ）と０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ  ＭｅＣＮ溶液（ｓｏｌｖｅｎｔ  Ｂ）をＨＰＬＣ溶液として用い、３０分かけて分析した。旋光度は、ＪＡＳＣＯ  Ｐ２２００旋光計で測定した。【００７３】
アミノ酸誘導体の合成は、図１Ａに示すように行った。まず、２，４−ジメトキシベンズアルデヒド（７８１ｍｇ、４．７０ｍｍｏｌ）、ＭｇＳＯ４（２．２６ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）およびＡｃＯＨ（２６．９ｍＬ、０．４７ｍｍｏｌ）を、アリル（４−アミノブチル）カルバメート（化合物１，８１０ｍｇ、４．７ｍｍｏｌ）（M. Hurevich, et. al., J. Pept. Sci. 16, 178-185 (2010).）メタノール溶液（４７ｍＬ）に添加した。生じた混合物を室温で３時間撹拌し、ろ過してＭｇＳＯ４を除去した。得られた反応混合物を０℃に冷却し、ＮａＢＨ４（３５５ｍｇ、９．４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を室温まで温め、１時間撹拌した。反応混合物の入った容器を氷水に浸して４℃まで冷却し、５％（ｗ／ｖ）ＫＨＳＯ４水溶液を添加した。得られた溶液をＮａＨＣＯ３飽和水溶液で塩基性化し、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水（ｂｒｉｎｅ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過した。減圧濃縮後、残留物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝３０：１（ｖ／ｖ））で精製し、１．３２ｇの化合物２（アリル［４−｛（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ｝ブチル］カルバメート、４．０９ｍｍｏｌ、８７％）を淡黄色オイルとして得た；
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）δ＝１．４２−１．５８（４Ｈ，ｍ），２．５６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），３．１５（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．０および６．０Ｈｚ），３．６７（２Ｈ，ｓ），３．７７（３Ｈ，ｓ），３．７８（３Ｈ，ｓ），４．５２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），５．１７（１Ｈ，ｄｄｔ  Ｊ＝１０．５および１．５，１．５Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄｄｔ  Ｊ＝１７．３，１．５および１．５Ｈｚ），５．３５（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），５．８９（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１７．３，１０．５および５．５Ｈｚ），６．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．１および２．４Ｈｚ），６．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ），７．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，７５ＭＨｚ）  δ＝２７．４，２７．９，４１．０，４８．６，４８．９，５５．３，５５．４，６５．４，９８．６，１０３．７，１１７．４，１２０．９，１３０．５，１３３．２，１５６．４，１５８．６，１６０．１；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ１７Ｈ２７Ｎ２Ｏ４  （［Ｍ＋Ｈ］＋）：３２３．１９７１，  ｆｏｕｎｄ：３２３．１９６３。【００７４】
化合物２（１．２２ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ−ＨＣｌ）（７９８ｍｇ、４．１６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（９７８ｍｇ、７．５７ｍｍｏｌ）を、０℃のＮ−α−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン酸αメチルエステル（化合物３）（９８９ｍｇ、３．７８ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロエタン溶液（１８．９ｍＬ）に添加し、混合物を室温で５時間撹拌した。５％（ｗ／ｖ）ＫＨＳＯ４水溶液を添加後、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１：２（ｖ／ｖ））で精製し、１．６２ｇの化合物４（（Ｓ）−メチル−５−｛（４−［｛（アリルオキシ）カルボニル｝アミノ］ブチル）（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ｝−２−｛（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ｝−５−オキソペンタノアート、２．８６ｍｍｏｌ、７６％）を淡黄色オイルとして得た；
［α］１９Ｄ−５．３３（ｃ  １．２４，ＭｅＯＨ）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ，８０℃）δ＝１．３８（９Ｈ，ｓ），１．２７−１．５３（２Ｈ，ｍ），１．２７−１．５３（２Ｈ，ｍ），１．４６−１．９２（１Ｈ，ｍ），１．９２−２．１０（１Ｈ，ｍ），２．４２（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝４．５および６．６Ｈｚ），２．９７（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．０および６．３Ｈｚ），３．１９（２Ｈ，ｂｒ  ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．６２（３Ｈ，ｓ），３．７６（３Ｈ，ｓ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．９４−４．１４（１Ｈ，ｍ），４．３９（２Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．４６（２Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．５，１．７および１．３Ｈｚ），５．１６（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１０．４，１．８および１．３Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１７．２，１．８および１．７Ｈｚ），５．９０（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１７．２，１０．４および５．５Ｈｚ），６．３９−６．５３（１Ｈ，ｂｒ  ｍ），６．５３−６．６３（１Ｈ，ｂｒ  ｍ），６．７０−６．９２（２Ｈ，ｂｒ  ｍ），６．９６（１Ｈ，ｂｒ  ｄ，７．９Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ，８０℃）δ＝２４．０，２５．２，２６．４，２６．５，２７．８，２８．３，４１．６，４４．４，４５．３，４６．１，５１．１，５３．１，５４．９，５５．１，６３．７，７７．９，７８．７，９８．４，１０４．７，１１６．３，１１７．０，１２８．０，１２８．８，１３３．５，１５４．９，１５５．５，１５７．８，１５９．５，１５９．８，１７１．０，１７２．４；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２８Ｈ４３Ｎ３ＮａＯ９  （［Ｍ＋Ｎａ］＋）：５８８．２８９７，ｆｏｕｎｄ：５８８．２９０２。【００７５】
化合物４のＴＨＦ溶液（５ｍＬ）に、ＬｉＯＨ・Ｈ２Ｏ（９１．８ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）、メタノール（２．５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２ｍＬ）を０℃で添加し、反応混合物を２時間撹拌した。５％（ｗ／ｖ）ＫＨＳＯ４水溶液を添加して反応を停止し、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝５０：１−１０：１（ｖ／ｖ）、０．１％（ｖ／ｖ）ＡｃＯＨ含有）で精製し、７４７ｍｇの化合物５（（Ｓ）−５−｛（４−［｛（アリルオキシ）カルボニル｝アミノ］ブチル）（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ｝−２−｛（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ｝−５−オキソペンタン酸、１．３５ｍｍｏｌ、９２％）を白色粉末として得た；
［α］１８Ｄ−０．６５（ｃ  ０．９５０，ＭｅＯＨ）；１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ，８０℃）  δ＝１．３９（９Ｈ，ｓ），１．２７−１．５３（２Ｈ，ｍ），１．２７−１．５３（２Ｈ，ｍ），１．７６−１．９４（１Ｈ，ｍ），１．９４−２．１３（１Ｈ，ｍ），２．４４（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７．５および４．２Ｈｚ），２．９９（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．３および６．１Ｈｚ），３．２０（２Ｈ，ｂｒ  ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ），３．７６（３Ｈ，ｓ），３．８０（３Ｈ，ｓ），３．８９−４．０８（１Ｈ，ｍ），４．４１（２Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．４７（２Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．４，１．５および１．５Ｈｚ），５．１６（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１０．５，１．７および１．５Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１７．４，１．７および１．５Ｈｚ），５．９０（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１７．４，１０．５および５．４Ｈｚ），６．３８−６．５３（１Ｈ，ｂｒ  ｍ），６．５６（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），６．６６（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），６．７８（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），６．９８（１Ｈ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ｄ−ＤＭＳＯ，７５ＭＨｚ，８０℃）δ＝２４．２，２５．３，２６．６，２６．７，２７．９，２８．６，３９．９，４１．８，４４．４，４５．４，４６．３，５３．１，５５．０，５５．２，６３．８，７７．８，９８．５，１０４．８，１１６．３，１１７．１，１１７．８，１２８．１，１２８．８，１３３．５，１５５．１，１５５．６，１５７．９，１５９．６，１５９．９，１７１．３，１７３．３；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２７Ｈ４１Ｎ３ＮａＯ９（［Ｍ＋Ｎａ］＋）：５７４．２７４１，ｆｏｕｎｄ：５７４．２７４０。【００７６】
化合物５（６２１ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（１１．３ｍＬ）に、０℃のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル  トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＢＳＯＴｆ）（１．０４μＬ、４．５ｍｍｏｌ）および２，６−ルチジン（７８７μＬ、６．７５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をゆっくりと室温に温め、４時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、その後ＴＨＦ（８ｍＬ）で希釈した。希釈後の溶液を０℃のＮａＯＨの２Ｍ水溶液（２ｍＬ）で中和し、Ｎａ２ＣＯ３の１０％（ｗ／ｖ）水溶液（８ｍＬ）およびＦｍｏｃ−ＯＳｕ（５７２ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１２時間撹拌した後、反応混合物をＨＣｌの１Ｍ水溶液で酸性化し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、減圧濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝５０：１−１０：１（ｖ／ｖ）、０．１％（ｖ／ｖ）ＡｃＯＨ含有）で精製し、６８０ｍｇの化合物６（（Ｓ）−２−（（（（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）５−（（４−（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）ブチル）（２，４−ジメトキシベンジル）アミノ）−５−オキソペンタン酸、１．０１ｍｍｏｌ、９０％）を白色粉末として得た；
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００ＭＨｚ，８０℃）δ＝１．２９-１．６１（４Ｈ，ｍ），１．８７-２．０２（１Ｈ，ｍ），２．０３−２．２１（１Ｈ，ｍ），２．４５−２．５６（２Ｈ，ｍ），３．００（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６．０および６．４Ｈｚ），３．２３（２Ｈ，ｂｒ  ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．７４（３Ｈ，ｓ），３．７９（３Ｈ，ｓ），４．０５−４．１８（１Ｈ，ｍ），４．２２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），４．３１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），４．４３（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），４．４８（２Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．７，１．７および１．５Ｈｚ），５．１２（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１０．２，１．７および１．５Ｈｚ），５．２７（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１７．１，１．７および１．７Ｈｚ），５．９１（１Ｈ，ｄｄｔ，Ｊ＝１７．１，１０．２および５．７Ｈｚ），６．４２-６．５２（１Ｈ，ｂｒ  ｍ），６．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ），６．８０（１Ｈ，ｂｒ  ｓ），６．９１−７．１０（１Ｈ，ｂｒ  ｍ），７．３１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５  Ｈｚ），７．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．７０（２Ｈ，ｂｒ  ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，７５ＭＨｚ，８０℃）δ＝２４．２，２５．３，２６．６，２８．６，３９．９，４１．８．４４．３，４５．３，４６．６，５３．４，５４．９，５５．１，６３．８，６５．６，９８．４，１０４．７，１０８．６，１１６．３，１１７．０，１１７．７，１１９．６，１２０．９，１２４．８，１２６．６，１２６．６，１２６．８，１２７．２，１２８．２，１２８．５，１２８．９，１３３．５，１３９．２，１４０．４，１４０．４，１４３．６，１４３．６，１５５．６，１５５．６，１５７．８，１５９．６，１５９．９，１７１．２，１７３．１；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ  ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３７Ｈ４３Ｎ３ＮａＯ９  （［Ｍ＋Ｎａ］＋）：６９６．２８９７，ｆｏｕｎｄ：６９６．２９２８。【００７７】
ステープルドＥＲＡＰの合成
標準Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成を用いて、Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＡＭレジン（０．６２ｍｍｏｌ  アミン／ｇ）上でペプチドを合成した。Ｆｍｏｃ基切断は、２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンＤＭＦ溶液を用いて室温で１０分間行った。レジンをＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｘａａ−ＯＨ）を、ＤＭＦ中のＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）および１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ）を用いて、室温で２時間カップリングさせ、続いてＤＭＦで洗浄した。【００７８】
オレフィン担持ステープルドペプチドの合成は、図１Ｂに示すように、閉環メタセシスにより行った。保護ペプチドの構築後、Ｎ末端のＦｍｏｃ基を切断し、得られたレジンを、Ｎ末端アミノ基のアセチル化のために、無水酢酸溶液およびＤＭＦ中のピリジンで、室温で３０分間処理した。固相担体上のＮ末端アセチル化ペプチドを、脱気ｏ−ジクロロベンゼン中のＨｏｖｅｙｄａ−Ｇｒｕｂｂｓ第２世代触媒４０ｍＭ溶液で、８０℃で１０分間処理した。レジンからのペプチドの切断後、反応をＨＰＬＣでモニタリングした。レジンからのペプチド放出を伴う酸不安定保護基の脱保護を、ＴＦＡ／ｍ−クレソール／チオアニソール／１，２−エタンジチオール／Ｈ２Ｏ（９０：２．５：２．５：２．５：２．５（ｖ／ｖ）、５０μＬ／１ｍｇレジン）カクテルを用いて、室温で９０分間行った。レジン結合ペプチドをジクロロメタンで洗浄して減圧乾燥し、その後、ペプチドをレジンから切断し、セミ分取ＨＰＬＣで精製して凍結乾燥した。【００７９】
オレフィンを有さないステープルドペプチドの合成は、図１Ｃに示すように、分子内アミド化を介して行った。レジンに結合したＮ末端キャップペプチドをＣＨＣｌ３／ＡｃＯＨ／Ｎ−メチルモルホリン（９２．５／５／２．５（ｖ／ｖ））中のＰｄ（ＰＰｈ３）４の２０ｍＭ溶液と混合し、室温で２時間振とうした。その後、レジンをＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、乾燥した。次に、ＤＩＰＣＤＩおよびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏを用いて、室温で２時間カップリングさせ、続いてＤＭＦで洗浄し、分子内アミド化を行った。レジンからのペプチドの切断は、上記の標準Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成プロトコールに従って行った。具体的には、レジンからのペプチド放出を伴う酸不安定保護基の脱保護を、ＴＦＡ／ｍ−クレソール／チオアニソール／１，２−エタンジチオール／Ｈ２Ｏ（９０：２．５：２．５：２．５：２．５（ｖ／ｖ）、５０μＬ／１ｍｇレジン）カクテルを用いて、室温で９０分間行った。レジン結合ペプチドをジクロロメタンで洗浄して減圧乾燥し、その後、ペプチドをレジンから切断し、セミ分取ＨＰＬＣで精製して凍結乾燥した。【００８０】
実施例２  Ｅ２依存性乳がん細胞に対するステープルドＥＲＡＰの効果
材料と方法
細胞株および培養条件
ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７、および乳腺上皮細胞株ＭＣＦ−１０Ａは、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA, USA）から購入した。乳がん細胞株ＫＰＬＣ−３Ｃ株（J. Kurebayashi, et al., Br. J. Cancer 74, 200-207 (1996)）は、紅林淳一博士（川崎医科大学）の厚意により提供された。全ての細胞株は、１０％ＦＢＳを補充した適切な培地で単層培養した。５％ＣＯ２を含む加湿空気の雰囲気下で３７℃で細胞を維持した。【００８１】
各実験において、各細胞は、４８ウェルプレート（２×１０４細胞／ｍＬ）、６ウェルプレート（３×１０５細胞／ｍＬ）または１０ｃｍディッシュ（２×１０６細胞／１０ｍＬ）に播種した。ＭＣＦ−７細胞は、１０％ＦＢＳ（ニチレイバイオサイエンス、東京、日本）、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ（Thermo Fisher Scientific）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Thermo Fisher Scientific）および１０μｇ／ｍＬインスリン（Sigma, St. Louis, MO, USA）を補充したＭＥＭ（Thermo Fisher Scientific）に播種した。ＫＰＬＣ−３Ｃ細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを補充したＲＰＭＩ（Thermo Fisher Scientific）に播種した。ＭＣＦ−１０Ａ細胞は、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓキット（ＢＰＥ、ヒドロコルチゾン、ｈＥＧＦ、インスリン、ゲンタマイシン／アンホテリシン−Ｂ）（Lonza, Walkersville, MD, USA）および１００ｎｇ／ｍＬのコレラトキシンを補充したＭＥＢＭ（Lonza）に播種した。ＭＣＦ−７およびＫＰＬ−３については、１７β−エストラジオール（Ｅ２）（Sigma）刺激のために、播種の次の日、１０％ＦＢＳ、１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．１ｍＭ  ＮＥＡＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０μｇ／ｍＬインスリンを補充したフェノールレッドフリーのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Thermo Fisher Scientific）に培地を変更した。２４時間後、１０ｎＭ  Ｅ２およびペプチド（例えば、１１Ｒ−ＥＲＡＰまたはステープルドＥＲＡＰ）または１０ｎＭ  Ｅ２のみで、細胞を処理した。【００８２】
タモキシフェン（Sigma）またはフルベストラント（LKT laboratories, St. Paul, MN, USA）処理を行う場合には、上記Ｅ２およびペプチドでの処理またはＥ２単独での処理と同時に、１０ｎＭのタモキシフェンまたは２μＭのフルベストラントで細胞を処理した。【００８３】
細胞増殖アッセイ
ＭＣＦ−７、ＫＰＬ−３ＣおよびＭＣＦ−１０Ａにおける細胞増殖アッセイは、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）（同仁堂、熊本、日本）を用いて、以前記載したように行った（T. Yoshimaru, et al., Nat. Commun. 4, 2443 (2013)）。データは３つの独立した実験の平均±ＳＥで示した。【００８４】
円偏光二色性（ＣＤ）スペクトル測定
１８５〜２６５ｎｍの範囲におけるＣＤスペクトルを、光路長２ｍｍの石英キュベットを用いて２５℃で記録した（円二色性分散計Ｊ１５００：日本分光株式会社、東京、日本）。ペプチド濃度は、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）中で５０μｇ／ｍＬとした。モル楕円率（θ）は文献に従って計算した（T. Wieprecht, et al., Biophys. Chem. 96, 191-201 (2002)）。【００８５】
抗体およびイムノブロット解析
イムノブロット解析は、以前記載したように行った（T. Yoshimaru, et al., Nat. Commun. 4, 2443 (2013)）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質をブロットしたメンブレンを４％ブロックエース溶液（大日本製薬、大阪、日本）で３時間ブロッキングし、その後、以下のタンパク質に対する抗体とインキュベートした：ＢＩＧ３（１：１，０００）（T. Yoshimaru, et al., Nat. Commun. 4, 2443 (2013)）；ＰＨＢ２（１：１，０００）（Abcam, Cambridge, UK）；Ａｋｔ，リン酸化Ａｋｔ（Ｓ４７３）（５８７Ｆ１１、１：１，０００）；ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ，リン酸化ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）（１：１，０００）；α／β−チューブリン（１：１，０００）（Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA）；およびＬＭＮＢ１（１：１００）（Sigma）。ＨＲＰ標識二次抗体（抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ、１：５，０００；抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ、１：５，０００；抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ、１：１，０００）（Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA）と１時間インキュベートした後、ブロットを増強化学発光（ＥＣＬ）システム（GE Healthcare, Buckinghamshire, UK）で展開し、Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ＬＡＳ−３０００  ｍｉｎｉ（富士フィルム、東京、日本）を用いてスキャンした。全ての実験は、少なくとも３回行った。【００８６】
免疫沈降
免疫沈降解析は、以前記載したように行った（T. Yoshimaru, et al., Nat. Commun. 4, 2443 (2013)）。細胞溶解物を、ノーマルＩｇＧとｒｅｃ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Thermo Fisher Scientific）を用いて、４℃で３時間プレクリアした。その後、上清を、ＢＩＧ３に対する抗体またはＰＨＢ２に対する抗体５μｇと４℃で１２時間インキュベートした。次に、抗原抗体複合体をｒｅｃ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを用いて４℃で１時間沈降した。免疫沈降されたタンパク質複合体をライシスバッファーで数回洗浄した。続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析を上記のように行った。【００８７】
核／細胞質分画
ＭＣＦ−７細胞の核および細胞質画分をＮＥ−ＰＥＲ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Thermo Fisher Scientific）を用いて、以前記載したように行った（T. Yoshimaru, et al., Nat. Commun. 4, 2443 (2013)）。α／β−チューブリンとラミンＢを、それぞれ細胞質画分と核画分のローディングコントロールとして使用した。【００８８】
ＰＨＢ２およびＨＡタグステープルドＥＲＡＰの免疫細胞染色
ＭＣＦ−７細胞を５×１０４細胞／ウェルで８ウェルチャンバー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−Ｔｅｋ  ＩＩ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）（Nalgene, Nunc International）に播種し、４８時間インキュベートした。その後、Ｅ２およびＨＡタグステープルドＥＲＡＰまたはＥ２単独で２４時間処理した。染色手順は、以前記載した通りに行った（T. Yoshimaru, et al., Nat. Commun. 4, 2443 (2013)）。【００８９】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＥＲα標的遺伝子（ＴＦＦ１およびＣＣＮＤ１）の発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより、以前記載したように評価した（T. Yoshimaru, et al., Nat. Commun. 4, 2443 (2013)）。各サンプルをβ２−ＭＧ  ｍＲＮＡ含量で標準化し、未処理細胞における発現量を１．０とした場合の倍数で結果を示した。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＤで示した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは以下のとおりである；
ＴＦＦ１    5'-GGCCTCCTTAGGCAAATGTT-3'（配列番号：１７）  および
5'-CCTCCTCTCTGCTCCAAAGG-3' （配列番号：１８）；
ＣＣＮＤ１  5'-CAGAAGTGCGAGGAGGAGGT-3' （配列番号：１９）  および
5'-CGGATGGAGTTGTCGGTGT-3' （配列番号：２０）；
β２−ＭＧ  5'-AACTTAGAGGTGGGGAGCAG-3' （配列番号：２１）  および
5'-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3' （配列番号：２２）。【００９０】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害
ＫＰＬ−３Ｃ細胞縣濁液（１×１０７細胞／マウス）を等量のマトリゲル（ＢＤ）と混合し、６週齢メスＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（Charles River Laboratories、東京、日本）の乳房脂肪体に注射した（全量２００μＬ）。該マウスを無菌隔離施設において１２時間の明暗周期で収容し、げっ歯類固形飼料と水を不断給餌した。腫瘍は数日にわたって増殖し、およそ１００ｍｍ３のサイズ（１／２×（幅×長さ２）として計算）に達した。マウスを以下の１１処理群（５匹／群）にランダム化した：
１）未処理；
２）Ｅ２（６μｇ／日、毎日：以下同じ）；
３）Ｅ２＋１．４ｍｇ／ｋｇ／日  １１Ｒ−ＥＲＡＰ  毎日；
４）Ｅ２＋１．４ｍｇ／ｋｇ／日  １１Ｒ−ＥＲＡＰ  ４日毎；
５）Ｅ２＋１４ｍｇ／ｋｇ／日  １１Ｒ−ＥＲＡＰ  毎日；
６）Ｅ２＋１４ｍｇ／ｋｇ／日  １１Ｒ−ＥＲＡＰ  ４日毎；
７）Ｅ２＋１．４ｍｇ／ｋｇ／日  ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２  毎日；
８）Ｅ２＋１．４ｍｇ／ｋｇ／日  ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２  ４日毎；
９）Ｅ２＋１４ｍｇ／ｋｇ／日  ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２  毎日；
１０）Ｅ２＋１４ｍｇ／ｋｇ／日  ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２  ４日毎；
１１）Ｅ２＋１４ｍｇ／ｋｇ／日  ＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２  毎日；
１２）Ｅ２＋１４ｍｇ／ｋｇ／日  ＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２  ４日毎。
Ｅ２は頸部皮膚への溶液塗布を介して投与し、他の処理は別の投与方法を明記している場合を除いて腹腔内注射を介して投与した。腫瘍体積を２８日間ノギスで計測し、その後、動物を計画死させて腫瘍を切除した。全ての実験は徳島大学の動物施設ガイドラインに従って行った。【００９１】
マイクロアレイ解析
全ＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩシステム（タカラクロンテック、日本）を用いて、製造者の説明書に従って精製した。ＲＮＡ増幅とラベリングを、Ａｇｉｅｎｔ  Ｌｏｗ−Ｉｎｐｕｔ  ＱｕｉｃｋＡｍｐラベリングキット（Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）を用いて、製造者の説明書に従って行った。簡潔に述べると、各サンプル由来の全ＲＮＡの１００ｎｇを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、Ｃｙ３ラベルＣＴＰを取り込ませながら増幅した。その後、Ｃｙ３ラベル化されたｃＲＮＡの６００ｎｇを断片化し、Ａｇｉｅｎｔ  Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ８×６０Ｋスライド（Agilent Technologies）上でハイブリダイズさせ、６５℃で１８時間、回転しながらインキュベートした。その後、スライドを洗浄し、オゾン保護ドラフト内で、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙスキャナーシステムによりスキャンした。該スキャンイメージファイルを、Ａｇｉｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．５）（Agilent Technologies）を用いて抽出した。データは、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １３．０）を用いて解析した。全てのチップと遺伝子のマイクロアレイデータをｑｕａｎｔｉｌｅ正規化により正規化し、ベースラインを全てのサンプルの中央値に対するシグナル値に変換した。最後に、発現レベルに基づく品質コントロールとフィルタリング工程を行った。有意に発現量が変化している遺伝子を同定するために、各解析間のシグナル強度値を比較した。
統計解析
スチューデントｔ検定を用いて、実験群間の有意差を求めた。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。【００９２】
結果
オレフィン担持ステープルドＥＲＡＰの効果
本発明者らは、以前、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用を標的とするドミナントネガティブペプチドであるＥＲＡＰを設計した（T. Yoshimaru, et al., Nat. Commun. 4, 2443 (2013)）。長期安定性やＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用の阻害機能のような生物学的および生物物理学的性質の両方を改善するために、ＥＲＡＰの化学修飾を行った。図２Ａに示すように、異なる位置にステープリング構造を有する一連のステープルドＥＲＡＰの作製を試みた。その後、作製したステープルドＥＲＡＰを、細胞増殖阻害活性によりスクリーニングした。ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１、７および８は、合成できなかったが、他のステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ．２〜６）は合成できた。【００９３】
ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．２、３、４および６では、ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ−７細胞（ＥＲα陽性、ＢＩＧ３陽性、ＰＨＢ２陽性）において、ペプチドおよびＥ２での処理後９６時間におけるＥ２依存性細胞増殖（それぞれＩＣ５０＝０．８９μＭ、１．０２μＭ、０．８１μＭおよび０．６８μＭ）が、１１Ｒ−ＥＲＡＰ（ＩＣ５０＝７．９７μＭ）と比較して、用量依存的に有意に減少した（図２Ｂ、図２Ｄ）。一方、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．５は、処理後９６時間におけるＥ２依存性細胞増殖において、１１Ｒ−ＥＲＡＰと比較して、わずかに優位な阻害を示した（ＩＣ５０＝７．８９μＭ）（図２Ｂ、図２Ｄ）。特に、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．２および３の処理では、正常乳腺上皮細胞株であるＭＣＦ−１０Ａ細胞（ＥＲα陰性、ＢＩＧ３陰性）の細胞増殖に対しては有意な影響を示さなかった（図２Ｃ〜Ｅ）。一方、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．４、５および６での処理は、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞増殖に非特異的な阻害効果をもたらす可能性が示唆された（図２Ｃ〜Ｅ）。【００９４】
これらの非特異的阻害効果を明らかにするために、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．３または６で処理したＭＣＦ−１０Ａ細胞を用いて、処理後２４時間および４８時間における遺伝子発現プロファイルをＤＮＡマイクロアレイにより解析した。処理後４８時間の細胞を用いた遺伝子発現プロファイル解析により、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．３で処理した細胞と比較して、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．６で処理した細胞で１００倍以上上方制御された転写物を９３個、下方制御された転写物を１９１個同定した（図２Ｆ上図、表２）。【００９５】
一方、処理後２４時間においては、Ｎｏ．３とＮｏ．６との間で差次的に発現した遺伝子は４個のみであった（図２Ｆ上図、表１）。処理後４８時間においてＮｏ．３とＮｏ．６との間で差次的に発現していた上記２８４個の遺伝子について、ＤＡＶＩＤアルゴリズムおよびＧｅｎｅＭＡＮＩＡソフトウェアを用いて遺伝子アノテーションエンリッチメント解析を行った結果、細胞外マトリクス関連遺伝子の遺伝子サブセットが多かった（図２Ｆ下図、図２Ｆ−２）。このことは、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．４、５および６が、正常乳房上皮細胞において、細胞外マトリクス経路に対する潜在的なオフターゲット効果を有することを示唆する。【００９６】
【表１】
2017126461.tif 000009
【００９７】
【表２】
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【００９８】
続いて、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．２および３がＢＩＧ３−ＰＨＢ２の相互作用を阻害するか否か調査するために、抗ＢＩＧ３抗体を用いて、免疫共沈降試験を行った。その結果、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．２および３は、１１Ｒ−ＥＲＡＰと同様に、ＥＲα陽性乳がん細胞株であるＭＣＦ−７細胞において、内在性のＢＩＧ３とＰＨＢ２の複合体形成を用量依存的に阻害した（図２Ｇ）。【００９９】
次に、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．２および３によるＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用の直接的な阻害を調査した。表面プラズモン共鳴（ＢｉＡｃｏｒｅ）相互作用解析により、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．２（ＫＤ＝４．６８μＭ）およびＮｏ．３（ＫＤ＝３．５２μＭ）は、１１Ｒ−ＥＲＡＰ（ＫＤ＝１２．８０μＭ）と比較して、Ｈｉｓタグ組換えＰＨＢ２に対して高い親和性を示した（図２Ｈ）。これらのデータは、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．２および３が、直接ＰＨＢ２に結合することにより、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２複合体形成の特異的阻害をもたらすことを示唆する。【０１００】
さらに、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．２および３の生物物理学的特性を調べるために、ＣＤ分光法により、それらの配座特性を解析した。重要なことに、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．３は、ＣＤ分光法によるヘリックス含量４１．７％（２２２ｎｍの値より算出）という高度なαへリックス構造を示した（図２Ｉ）。このことは、オレフィンメタセシスを介したステープリングにより、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．３のαヘリックス構造の安定性が増したことを示唆する。さらに、ＭＣＦ−７細胞において、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．２または３での処理がＥＲα標的遺伝子発現に及ぼす影響を調べたところ、ペプチド処理後９６時間の間、ＥＲα標的遺伝子であるＴＦＦ１およびＣＣＮＤ１のＥ２依存的発現が有意に抑制されていた（図２Ｊ）。細胞増殖阻害とＥＲα標的遺伝子発現の長期的阻害ならびに高いαヘリシティーの維持を考慮すれば、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．２もまたＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用の特異的阻害により細胞増殖の有意な減少をもたらすものの、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．３が最もクリティカルなステープリング構造を有する。総合すれば、これらの知見は、ＥＲα陽性乳がん細胞のＥ２依存性細胞増殖に対するステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．３の阻害的効果が、１１Ｒ−ＥＲＡＰよりもはるかに高くかつ長く持続することを示唆する。【０１０１】
オレフィンを有さないステープルドＥＲＡＰの効果
ルテニウム触媒によるオレフィンメタセシスはコストがかかるため、分子内アミド化を介して、オレフィンを有さないステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．３の代替物（ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２）を新規に合成した（図３Ａ）。このステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２もまたステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．３に匹敵する４２．５％のヘリシティーを維持し（図３Ｂ）、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖とＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用を有意に長期間阻害した（図３Ｃ、３Ｄ）。一方、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２は、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞増殖は阻害しなかった（図３Ｃ）。さらに、ＥＲα標的遺伝子であるＴＦＦ１およびＣＣＮＤ１の発現に対するステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の阻害的効果は、１１Ｒ−ＥＲＡＰと比較して、処理後９６時間の時点でも高いレベルで維持されていた（図３Ｅ）。【０１０２】
次に、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の細胞内分布を調べるために、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２のＮ末端にＨＡタグを付加したＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（図３Ａ）を作製した。Ｅ２非存在下において、ＭＣＦ−７細胞を１０μＭのＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で処理したところ、ＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２は、処理後わずかに１時間で、細胞質内に局在した（図３Ｆ）。このことは、ステープリング立体構造の迅速な細胞透過性を示す。一方、Ｅ２の存在下では、ＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２は、処理後わずかに１時間で、内在性のＰＨＢ２とともに核に移行し、処理後２４時間後も核内に存在し続けた（図３Ｆ、３Ｇ）。また、ＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２は、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖を抑制した（図３Ｈ）。一方、ポリＲを有さないＥＲＡＰは、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖に影響を示さなかった（図３Ｉ）。これらの結果は、ステープリング構造の導入がＥＲＡＰの細胞透過性を増大させ、それによりステープルドＥＲＡＰが迅速に細胞内に透過してＥ２依存性細胞増殖を阻害することを示す。【０１０３】
次に、タモキシフェン耐性（ＴＡＭ−Ｒ）ＭＣＦ−７細胞を用いて、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２のＥ２依存性細胞増殖を阻害する能力を調べた。図３Ｊに示すように、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での処理は、処理後９６時間の間、Ｅ２およびタモキシフェンの存在下で、タモキシフェン耐性ＭＣＦ−７細胞の細胞増殖を有意に低下させた。一方、１１Ｒ−ＥＲＡＰの阻害効果は、２４時間しか維持されなかった。さらに、Ｅ２依存性細胞増殖に対する、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（０．５μＭ）と、タモキシフェン（選択的ＥＲαモジュレーター、１０ｎＭ）またはフルベストラント（ＥＲαダウンレギュレーター、２μＭ）との組み合わせ効果をそれぞれ調べた。ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２と、タモキシフェンまたはフルベストラントとのいずれの組み合わせの処理においても、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２、タモキシフェンまたはフルベストラント単独での処理と比較して、ＭＣＦ−７細胞におけるＥ２依存性細胞増殖を有意に抑制した（図３Ｋ）。特に、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２とタモキシフェンとの組合せ処理において、顕著な相乗的抑制効果が観察された。このことは、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２が、ＥＲα陽性乳がん細胞のタモキシフェンに対する応答性を増強することを示唆する。【０１０４】
ステープルドＥＲＡＰによるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害効果
ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２のｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を調べるために、ＫＰＬ−３Ｃ同所性乳がん異種移植片をヌードマウス内で増殖させた。腫瘍が完全に樹立された時点で、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（１．４および１４ｍｇ／ｋｇ）、１１Ｒ−ＥＲＡＰ（１．４および１４ｍｇ／ｋｇ）、ＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（１４ｍｇ／ｋｇ）または溶媒単独（ｖｅｈｉｃｌｅ  ａｌｏｎｅ）を、毎日または４日毎に、２８日間腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した（図４Ａ）。Ｅ２処理（６μｇ／日）もまた毎日動物に行った。毎日のＥ２処理は、経時依存的にＫＰＬ−３Ｃ腫瘍を増殖させる。一方、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２または１１Ｒ−ＥＲＡＰでの毎日の処理は、１．４ｍｇ／ｋｇおよび１４ｍｇ／ｋｇのいずれの用量においても、Ｅ２依存性腫瘍増殖の有意な阻害を引き起こした（図４Ｂ、図４Ｃ）。特に、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での処理は、１１Ｒ−ＥＲＡＰでの処理とは異なり、４日毎の投与であっても有意な阻害効果を持続した（図４Ｂ、４Ｃ）。このことは、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２が、治療的観点から、優れた治療指数（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を有することを示唆する。なお、毒性および有意な体重減少は観察されなかった（図４Ｄ）。したがって、今回の条件の下では、有害な副作用は観察されなかったと言える。【０１０５】
次にステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果のメカニズムを明らかにするために、１．４ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で毎日または４日毎にＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスを処理し、処理開始後２８日の時点でマウスを計画死させ、腫瘍を摘出してＰＨＢ２の細胞内分布を調べた。マウスから摘出した腫瘍細胞を細胞質画分と核画分に分画し、それぞれの画分について抗ＰＨＢ２抗体を用いて免疫共沈降を行った。その結果、Ｅ２の存在下では、１１Ｒ−ＥＲＡＰまたはステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での処理は細胞質内ＰＨＢ２の減少を導き、それにより核内ＰＨＢ２量が大幅に増加することが示された（図４Ｅ）。さらに、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の細胞内分布を調べるために、１．４ｍｇ／ｋｇまたは１４ｍｇ／ｋｇのＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で毎日または４日毎に処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから腫瘍を摘出し、抗ＰＨＢ２抗体を用いた免疫共沈降試験および免疫組織化学的検査を行った。それらの結果は、ＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２が主に核内でＰＨＢ２と相互作用することを示し、細胞質内ＰＨＢ２と相互作用して核内に移行することを示唆した（図４Ｆ〜Ｈ）。さらに、１．４ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で毎日または４日毎に処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから腫瘍を摘出し、ＥＲα標的遺伝子（ＴＦＦ１およびＣＣＮＤ１）の発現を調べた。ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２でのいずれの処理も、腫瘍におけるＴＦＦ１およびＣＣＮＤ１のＥ２依存性発現を有意に抑制した（図４Ｉ）。これらの知見は、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２が腫瘍における内在的ＢＩＧ３−ＰＨＢ２複合体の形成を効果的に阻害する結果、ＰＨＢ２の核移行をもたらし、それによりＥ２依存性ゲノム活性化の抑制が起こることを示唆する。【０１０６】
次に、腫瘍における非ゲノム的ＥＲαシグナリング経路の活性化に対するステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の効果を調べた。１．４ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で毎日または４日毎に処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから摘出した腫瘍において、抗リン酸化Ａｋｔ抗体および抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体を用いてＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化レベルを検出した。その結果、予想されたように、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２でのいずれの処理においても、Ａｋｔリン酸化およびＭＡＰＫリン酸化の顕著な抑制が観察された（図４Ｊ）。１１Ｒ−ＥＲＡＰと異なり、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２は、４日毎の処理であっても、Ｅ２依存性リン酸化レベルを明らかに抑制し、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２が長期間の強いｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を有することを実証した（図４Ｊ）。【０１０７】
さらに、１４ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で４日毎に処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスから心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脳を摘出し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行ったところ、これら重要臓器において、組織病理学的変化はほとんど観察されなかった（図４Ｋ）。また、１４ｍｇ／ｋｇのＨＡタグステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２で毎日処理したＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植マウスからも心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脳を摘出し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行ったところ、同様に組織病理学的変化はほとんど観察されなかった（図４Ｌ）。【０１０８】
さらに、ＫＰＬ−３Ｃ異種同所性移植ヌードマウスモデルを用いて、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の長期ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を調べた。腫瘍が完全に樹立された時点で、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（０．０２、０．１および１ｍｇ／ｋｇ）または溶媒単独（ｖｅｈｉｃｌｅ  ａｌｏｎｅ）を、２８日間にわたって４日毎または７日毎に、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した（図４Ｍ）。Ｅ２処理（６μｇ／日）もまた毎日動物に行った。１ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での７日毎の処理は、２８日目までＥ２依存性腫瘍増殖を完全に阻害した（図４Ｍ）。さらに、０．１および０．０２ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での７日毎の処理は、それぞれ２１日目および１８日目までＥ２依存性腫瘍増殖を完全に阻害した。さらに、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での４日毎または７日毎の処理は、腫瘍において、ＥＲα標的遺伝子ＴＦＦ１およびＣＣＮＤ１のＥ２依存性発現もまた有意に抑制した（図４Ｎ）。【０１０９】
実施例３  前立腺がん細胞に対するステープルドＥＲＡＰの効果
材料と方法
細胞株および培養条件
ヒト前立腺がん細胞株、２２Ｒｖ１は、American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)から購入した。２２Ｒｖ１は、１０％ＦＢＳを補充した適切な培地で単層培養し、５％ＣＯ２加湿空気の雰囲気下で３７℃で維持した。２２Ｒｖ１細胞は、１０％ＦＢＳ（Thermo Fisher Scientific）および１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（和光、東京、日本）を補充したＲＰＭＩ（Thermo Fisher Scientific）中で、４８ウェルプレート（３×１０４細胞／ｍＬ）または１０ｃｍディッシュ（８×１０６細胞／ディッシュ）に播種した。４８時間後、細胞を１０μＭ（免疫沈降の場合のみ）、２０μＭおよび５０μＭのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２でそれぞれ処理した。【０１１０】
細胞増殖アッセイ
細胞増殖アッセイは、死細胞をトリパンブルーで染色し、全細胞数をＣｏｕｎｔｅｓｓ  ＩＩ（Thermo Fisher Scientific）で評価した。細胞生存率は、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  ＩＩ自動セルカウンター（Thermo Fisher Scientific）を用いて、製造者の説明書に従って、２４時間毎に測定した。
免疫沈降
免疫沈降は、実施例２と同様に行った。【０１１１】
結果
前立腺がん細胞株２２Ｒｖ１細胞（ＥＲα陰性、ＢＩＧ３陽性、ＰＨＢ２陽性）を用いて、Ｅ２非依存性細胞増殖に対するステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の阻害効果を試験した。図５Ａに示すように、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での処理は、経時依存的および用量依存的に、２２Ｒｖ１細胞の細胞増殖を有意に抑制した。【０１１２】
さらに、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２がＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用を阻害するか否かを調べるために、抗ＢＩＧ３抗体を用いた免疫共沈降試験を行った。その結果、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２は、２２Ｒｖ１細胞において、内在性のＢＩＧ３およびＰＨＢ２複合体形成を用量依存的に阻害することが示された（図５Ｂ）。【０１１３】
また、１０、２０または５０μＭのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での処理は、ＥＲαおよびＢＩＧ３を発現しないＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞増殖には影響を及ぼさなかった（図５Ｃ）。このことは、これらの濃度でのステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２処理は、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞増殖に非特異的な阻害効果を誘導しないことを示唆する。【０１１４】
実施例４  ステープルドＥＲＡＰのＤ型ペプチドおよびレトロインバース体
タンパク質分解に対してより抵抗性のある立体配置のペプチドを同定するために、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２のＤ型ペプチドおよびレトロインバース体を合成した（図６Ａ； M. Chorev, et al., Trends. Biotechnol. 13, 438-445 (1995); C. Bonny, et al., Diabetes 50, 77-82 (2001); M. Taylor, et al., Biochemistry 49, 3261-3272 (2010); T. Weeden, et al., J. Pept. Sci. 17, 47-55 (2011)）。レトロインバース体では、全てのＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に置換することによってアミノ酸のキラリティーが逆になっているだけでなく、アミノ酸配列もまた逆になっている。ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２のＤ型ペプチドおよびレトロインバース体の合成は、ペプチド合成の際にＬ−アミノ酸に替えてＤ−アミノ酸を使用する以外は、Ｌ型ペプチドのステープルドＥＲＡＰの合成と同様に行った。【０１１５】
作製したステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２のＤ型ペプチド（以下「ステープルド―Ｄ―ＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２」）およびステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２のレトロインバース体（以下「ＲＩステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２」）は、ナノモルレベルの用量依存性でＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖を阻害した（図６Ｂ左）。一方、ＭＣＦ−１０Ａ細胞の細胞増殖は阻害しなかった（図６Ｂ右）。ステープルド−Ｄ−ＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２およびＲＩステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２のＩＣ５０は、処理後９６時間の時点で、それぞれ０．４４μＭおよび０．５０μＭであった（図６Ｃ）。一方、ステープルドＥＲＡＰ Ｎｏ．１２のＩＣ５０は、０．５９μＭであった（図６Ｃ）。【０１１６】
さらに、ＥＲＡＰのＮ末端部分配列（QMLSDLT（配列番号：１３））のレトロインバース体であるショートステープルドレトロインバースＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（以下「ｓｈＲＩステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２」）を合成した（図６Ａ）。このｓｈＲＩステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２は、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖を抑制し（ＩＣ５０＝０．５３）、このＮ末端ショート配列のステープルドペプチドが乳がん細胞のＥ２依存性細胞増殖を有意に抑制する能力を有することを示した（図６Ｂ、Ｃ）。【０１１７】
次に、上記の各種ステープルドＥＲＡＰによる、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖の長期阻害効果について調べた。１μＭのステープルド−Ｄ−ＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２、ＲＩステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２またはｓｈＲＩステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での処理は、７日間、有意な細胞増殖阻害効果を持続した。一方、ステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２は、４日間、有意な細胞増殖阻害効果を持続した（図６Ｄ）。【０１１８】
次に、これらのステープルドＥＲＡＰがＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用を阻害するか否かを調べるために、抗ＢＩＧ３抗体を用いて免疫共沈降試験を行った。免疫共沈降は、ＭＣＦ−７細胞を１μＭの各ペプチドで処理した後、２４時間または９６時間経過した時点の細胞を用いて行った。その結果、ステープルド−Ｄ−ＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２、ＲＩステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２およびｓｈＲＩステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２は、処理後２４時間においてもＭＣＦ−７細胞において内在性のＢＩＧ３およびＰＨＢ２の複合体形成を阻害することが示された（図６Ｅ）。特に、内在性のＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用に対するこれらのステープルドＥＲＡＰの阻害効果は、処理後９６時間でも維持された。【０１１９】
さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＩステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２の抗腫瘍活性を調査した。腫瘍が完全に樹立した時点で、ＲＩステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（０．０２、０．１および１ｍｇ／ｋｇ）または溶媒のみ（ｖｅｈｉｃｌｅ  ａｌｏｎｅ）を、４日毎または７日毎に、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。Ｅ２（６μｇ／日）処理もまた毎日動物に行った。１ｍｇ／ｋｇまたは０．１ｍｇ／ｋｇのＲＩステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２での４日毎または７日毎の処理は、処理後２８日目までＥ２依存性腫瘍増殖をほぼ完全に阻害した（図６Ｆ）。さらに、ＲＩステープルドＥＲＡＰ  Ｎｏ．１２（０．０２、０．１および１ｍｇ／ｋｇ）での４日毎または７日毎の処理は、腫瘍におけるＥＲα標的遺伝子ＴＦＦ１およびＣＣＮＤ１のＥ２依存性発現もまた有意に抑制した（図６Ｇ）。【０１２０】
実施例５  Ｃ末端に細胞透過性ポリアルギニン残基を付加したＥＲＡＰ
ＥＲＡＰおよびその部分配列のＣ末端に膜透過性ポリアルギニン残基（８Ｒ）を付加したペプチドをそれぞれ設計した（QMLSDLTLQLRQR-8R（配列番号１０）およびQMLSDLTLQL-8R（配列番号：１１）；図７）。ＭＣＦ−７細胞をこれらのペプチドで処理したところ、これらのペプチドでの処理は、ＭＣＦ−７細胞のＥ２依存性細胞増殖に対して、１１Ｒ−ＥＲＡＰと類似した阻害効果を示した（それぞれＩＣ５０＝７．７８μＭおよび７．９８μＭ）（図７）。【０１２１】
実施例６  タモキシフェン耐性乳癌細胞株のｍＴＯＲとＳ６Ｋのリン酸化に及ぼすステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）の抑制効果
タモキシフェン（ＴＡＭ）耐性ＭＣＦ７細胞はＴＡＭ存在下で顕著なｍＴＯＲとＳ６Ｋのリン酸化を誘導し、２４時間Ｅ２添加時とほぼ同じリン酸化強度であったが、ステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）および１１Ｒ−ＥＲＡＰの２４時間処理は各リン酸化をほぼ完全に抑制し、ネガティブ・コントロール（ＴＡＭ非存在下の未処理細胞）以下であった（図８）。
また、ＴＡＭ存在下で９６時間のＥ２添加によるｍＴＯＲとＳ６Ｋのリン酸化強度は２４時間反応とほとんど同じであったが、１１Ｒ−ＥＲＡＰ処理の抑制効果は２４時間反応と比べて顕著に減弱していた（図８）。一方、ステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）処理はほぼ完全な抑制効果を９６時間反応でも維持しており、ＴＡＭ耐性乳がん症例に対しても長期安定的に抑制できると考えられた。【０１２２】
実施例７  Ｅ２依存性細胞増殖に対するステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）とタモキシフェン、フルベストラント、エベロリムスとの併用効果
２４時間反応では１１Ｒ−ＥＲＡＰおよびステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）はＥ２依存性の細胞増殖をほぼ完全に抑制し、タモキシフェン（抗エストロゲン剤）、フルベストラント（ＥＲαモジュレーター）、エベロリムス（ｍＴＯＲ阻害剤）と併用することで、相乗的な抑制効果を認め、その生細胞数は未処理による生細胞数以下まで減少させた（図９右）。
９６時間反応ではステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）はほぼ完全な抑制効果を継続し、２４ 時間反応と同様に既存の阻害薬と相乗的な抑制効果を示した（図９左）。一方、１１Ｒ−ＥＲＡＰはＥ２依存性増殖に対して４５%の抑制率に減弱していたが、既存薬との併用効果は２４時間反応とほぼ同じ生細胞数になり、２４時間の時点で細胞死を誘導していた可能性が考えられた。【０１２３】
実施例８  ステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）の尾静脈投与による抗腫瘍効果
ステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）のｉｎ ｖｉｖｏにおける静脈投与による抗腫瘍効果を調べるために、ＫＰＬ−３Ｃ同所性乳がん異種移植片をヌードマウス内で増殖させて、腫瘍が完全に樹立された時点で、ステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２） （０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇ）または溶媒単独を連日または７日毎に、３５日間尾静脈注射により投与した。Ｅ２ （６μg／日）もまた連日投与した。毎日のＥ２処理は、経時依存的にＫＰＬ‐３Ｃ腫瘍を増殖させた（図１０左）。一方、ステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）の連日ならびに７日毎投与はともにＥ２依存性の腫瘍増大を投与量依存的に有意に抑制し、これまで得られている腹腔内投与による抗腫瘍効果と同様に、１０ｍｇ／ｋｇで、ほぼ完全な抗腫瘍効果が得られた（図１０）。【０１２４】
実施例９  ステープルドERAP（No.12）処理した移植マウス摘出腫瘍のＢＩＧ３とＰＨＢ２の相互作用
移植マウス摘出腫瘍におけるＢＩＧ３とＰＨＢ２の相互作用に対するステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）の効果を調べた。１０ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）で毎日または７日毎に処理したＫＰＬ‐３Ｃ異種同所性移植マウスから摘出した腫瘍において、抗ＢＩＧ３抗体を用いて免疫共沈降試験を行った。その結果、未処理群およびＥ２連日投与群ではＢＩＧ３とＰＨＢ２が強固に結合していることを認めたが、１０ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）の３５日連日投与および７日毎投与した腫瘍はＰＨＢ２の共沈がほとんど検出されず、１０ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）がＢＩＧ３とＰＨＢ２の相互作用をほぼ完全に阻害して、腫瘍の増大を抑制していることが示された（図１１）。【０１２５】
実施例１０  ステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）処理した腫瘍のＡｋｔとＭＡＰＫのリン酸化
腫瘍におけるＡｋｔとＭＡＰＫのリン酸化に対するステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）の効果を調べた。１０ｍｇ／ｋｇのステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）で毎日または７日毎に処理したＫＰＬ‐３Ｃ異種同所性移植マウスから摘出した腫瘍において、抗リン酸化Ａｋｔ抗体および抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体を用いてＡｋｔおよびＭＡＰＫのリン酸化レベルを検出した。その結果、ステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）処理は毎日投与および７日毎投与においてＡｋｔリン酸化およびＭＡＰＫリン酸化の顕著な抑制が観察された（図１２）。【０１２６】
実施例１１  ステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）のｉｎ ｖｉｔｒｏ 血液脳関門透過性試験
ＢＩＧ３は弱いながら脳にも発現している（Kim, J. W. et al., Cancer Sci. 100, 1468-1478 (2009)）。このことから、ステープルドＥＲＡＰが脳に移行することによる副作用の懸念があったため、ステープルドＥＲＡＰの血液脳関門透過性試験を行った。ステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）の血液脳関門透過性試験は、血液脳関門透過性キットのインサート内側（血管腔側）にステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）を入れ、３０分間に脳内移行性検定特化型フィルターを通過し、プレートのウェル内（脳実質側）に漏れでてきたステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）の濃度を測定することで行った。また、そのときの透過係数（Ｐａｐｐ）を算出した（２以下：透過性はかなり低い、２−１０：低い、１０−２０：高い、２０以上：かなり高い）。その結果、ステープルドＥＲＡＰ（Ｎｏ.１２）の血液脳関門透過係数は２以下を示し、脳内に移行する可能性は低いと考えられ、脳内移行による副作用の懸念はないことが示唆された（表３）。【０１２７】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明は、ＢＩＧ３−ＰＨＢ２相互作用に対する阻害効果の持続期間がより長いペプチドを提供する。本発明のペプチドは、細胞透過性を有し、かつ血液脳関門透過性が低い。本発明のペプチドまたはその塩を含む医薬組成物は、がん、特にエストロゲン受容体陽性のがんや、エストロゲン受容体陰性の乳がんおよび前立腺がんを治療するために使用することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2017126461.tif 000025
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ−１】
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【図２Ｆ−２】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３Ａ】
2017126461.tif 000033
【図３Ｂ】
2017126461.tif 000034
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
2017126461.tif 000043
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図４Ｎ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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