(57)【要約】  配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物への結合活性を有するタンパク質と、標的物質捕捉分子との結合体により、生物学的に活性なタンパク質を低コストで容易に精製することができる技術を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物への結合活性を有するタンパク質と、
機能性分子との結合体。
【請求項２】
前記機能性分子が標的物質捕捉分子である、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記標的物質捕捉分子が、該標的物質に対する抗体、抗体断片、アプタマー又は受容体である、請求項２に記載の結合体。
【請求項４】
前記標的物質捕捉分子が腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）である、請求項２又は３に記載の結合体。
【請求項５】
前記標的物質がサイトカインである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項６】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物への結合活性を有するタンパク質と、
標的物質に対する抗体、抗体断片、ペプチドアプタマー又は受容体との融合タンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とするベクター。
【請求項７】
薬物と、
−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物を含む担体と、
前記化合物に結合した請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合体と、
を備えたことを特徴とする医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合体を有効成分として含有することを特徴とする医薬。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合体を、固相に固定された−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に接触させる工程を有することを特徴とする結合体の精製方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合体を捕捉するための固相であって、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物が固定されたことを特徴とする結合体捕捉用固相。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合体を含む血漿を、固相に固定された−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に接触させる工程を有することを特徴とする前記結合体の除去方法。
【請求項１２】
標的物質と請求項２〜５のいずれか一項に記載の結合体との複合体を含む血漿を、固相に固定された−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に接触させる工程を有することを特徴とする標的物質除去方法。
【請求項１３】
標的物質を含む血漿を、固相に固定された請求項２〜５のいずれか一項に記載の結合体に接触させる工程を有することを特徴とする標的物質除去方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合体を含む血漿から前記結合体を除去する除去手段を備え、
前記除去手段が、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物が固定された固相を備えることを特徴とする前記結合体の除去装置。
【請求項１５】
標的物質と請求項２〜５のいずれか一項に記載の結合体との複合体を含む血漿から前記複合体を除去する除去手段を備え、
前記除去手段が、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物が固定された固相を備えることを特徴とする標的物質除去装置。
【請求項１６】
標的物質を含む血漿から前記標的物質を除去する除去手段を備え、
前記除去手段が、請求項２〜５のいずれか一項に記載の結合体が固定された固相を備えることを特徴とする標的物質除去装置。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合体を検出するための標識化合物であって、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有することを特徴とする結合体検出用標識化合物。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の結合体に−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する標識化合物を結合させ複合体を形成させる工程と、
該複合体中の標識化合物を検出する工程と、
を有することを特徴とする結合体の検出方法。
【請求項１９】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物への結合活性を有するタンパク質と、
標識物質との結合体であることを特徴とする、
−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物検出用結合体。
【請求項２０】
−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に請求項１９に記載の化合物検出用結合体を結合させ複合体を形成させる工程と、
該複合体中の前記標識物質を検出する工程と、
を有することを特徴とする、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合体及びその使用に関する。本願は、２０１５年３月５日に、日本に出願された特願２０１５−０４３４５９号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬品は、製造過程においてＦｃ領域に結合するプロテインＡ結合樹脂を用いて精製されている（例えば、特許文献１を参照）。プロテインＡ結合樹脂は高額であり、洗浄後の再使用にも制限がある。そのため様々な改良にも関わらず、抗体の精製コストはあまり下がっておらず、抗体医薬品が高価である原因の一端となっている。【０００３】
また、抗体医薬品は高度にヒト化されているため体内に存在する大量の抗体とほとんど違いがなく、投与された抗体医薬品を血漿浄化装置等により選択的に吸着除去することは不可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公昭６１−２９９３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、例えば抗体等の生物学的に活性なタンパク質を低コストで容易に精製することができる技術を提供することを目的とする。本発明はまた、結合体、ベクター、医薬組成物、医薬、結合体の精製方法、結合体捕捉用固相、標的物質除去方法、標的物質除去装置、結合体検出用標識化合物、結合体の検出方法、化合物検出用結合体及び化合物の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の態様を含む。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物への結合活性を有するタンパク質と、機能性分子との結合体。
（２）前記機能性分子が標的物質捕捉分子である、（１）に記載の結合体。
（３）前記標的物質捕捉分子が、該標的物質に対する抗体、抗体断片、アプタマー又は受容体である、（２）に記載の結合体。
（４）前記標的物質捕捉分子が腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）である、（２）又は（３）に記載の結合体。
（５）前記標的物質がサイトカインである、（２）〜（４）のいずれかに記載の結合体。
（６）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物への結合活性を有するタンパク質と、標的物質に対する抗体、抗体断片、ペプチドアプタマー又は受容体との融合タンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とするベクター。
（７）薬物と、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物を含む担体と、前記化合物に結合した（１）〜（５）のいずれかに記載の結合体と、を備えたことを特徴とする医薬組成物。
（８）（１）〜（５）のいずれかに記載の結合体を有効成分として含有することを特徴とする医薬。
（９）（１）〜（５）のいずれかに記載の結合体を、固相に固定された−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に接触させる工程を有することを特徴とする結合体の精製方法。
（１０）（１）〜（５）のいずれかに記載の結合体を捕捉するための固相であって、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物が固定されたことを特徴とする結合体捕捉用固相。
（１１）（１）〜（５）のいずれかに記載の結合体を含む血漿を、固相に固定された−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に接触させる工程を有することを特徴とする前記結合体の除去方法。
（１２）標的物質と（２）〜（５）のいずれかに記載の結合体との複合体を含む血漿を、固相に固定された−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に接触させる工程を有することを特徴とする標的物質除去方法。
（１３）標的物質を含む血漿を、固相に固定された（２）〜（５）のいずれかに記載の結合体に接触させる工程を有することを特徴とする標的物質除去方法。
（１４）（１）〜（５）のいずれかに記載の結合体を含む血漿から前記結合体を除去する除去手段を備え、前記除去手段が、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物が固定された固相を備えることを特徴とする前記結合体の除去装置。
（１５）標的物質と（２）〜（５）のいずれかに記載の結合体との複合体を含む血漿から前記複合体を除去する除去手段を備え、前記除去手段が、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物が固定された固相を備えることを特徴とする標的物質除去装置。
（１６）標的物質を含む血漿から前記標的物質を除去する除去手段を備え、前記除去手段が、（２）〜（５）のいずれかに記載の結合体が固定された固相を備えることを特徴とする標的物質除去装置。
（１７）（１）〜（５）のいずれかに記載の結合体を検出するための標識化合物であって、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有することを特徴とする結合体検出用標識化合物。
（１８）（１）〜（５）のいずれかに記載の結合体に−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する標識化合物を結合させ複合体を形成させる工程と、該複合体中の標識化合物を検出する工程と、を有することを特徴とする結合体の検出方法。
（１９）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物への結合活性を有するタンパク質と、標識物質との結合体であることを特徴とする、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物検出用結合体。
（２０）−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に（１９）に記載の化合物検出用結合体を結合させ複合体を形成させる工程と、該複合体中の前記標識物質を検出する工程と、を有することを特徴とする、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物の検出方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、例えば抗体等の生物学的に活性なタンパク質を低コストで容易に精製することができる技術を提供することができる。また、結合体、ベクター、医薬組成物、医薬、結合体の精製方法、結合体捕捉用固相、標的物質除去方法、標的物質除去装置、結合体検出用標識化合物、結合体の検出方法、化合物検出用結合体及び化合物の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】医薬組成物の１実施形態を説明する模式図である。
【図２】標的物質除去方法及び標的物質除去装置の１実施形態を説明する模式図である。
【図３】標的物質除去方法及び標的物質除去装置の１実施形態を説明する模式図である。
【図４】結合体検出用標識化合物の１実施形態を説明する模式図である。
【図５】化合物検出用結合体の１実施形態を説明する模式図である。
【図６Ａ】実験例１の結果を示す写真である。
【図６Ｂ】実験例１で使用した各ビーズの構造を示す図である。
【図７Ａ】実験例２の結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】実験例２の結果を示すグラフである。
【図７Ｃ】実験例２の結果を示すグラフである。
【図８】実験例３の結果を示すグラフである。
【図９】実験例４の結果を示すグラフである。
【図１０Ａ】実験例５の結果を示す写真である。
【図１０Ｂ】１−モノアシルグリセロール、２−モノアシルグリセロール及びリゾフォスファチジン酸の構造を示す一般式であり、Ｒはアルキル基を表す。
【図１１Ａ】実験例７の結果を示すグラフである。
【図１１Ｂ】実験例７の結果を示す写真である。
【図１２】実験例８の結果を示すグラフである。
【図１３Ａ】実験例９の結果を示すグラフである。
【図１３Ｂ】実験例９の結果を示すグラフである。
【図１４Ａ】実験例１０の結果を示す写真である。
【図１４Ｂ】実験例１０の結果を示す写真である。
【図１５Ａ】実験例１１の結果を示すグラフである。
【図１５Ｂ】実験例１１の結果を示すグラフである。
【図１６】実験例１２の結果を示すグラフである。
【図１７】実験例１３の結果を示すグラフである。
【図１８】実験例１４の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
【００１０】
［結合体］
発明者らは、レクチンの１種であるインテレクチン（ヒトインテレクチン−１のアミノ酸配列を配列番号１に示す。）が、後述するジオール構造に代表される特定構造を有する化合物に特異的に結合することを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
１実施形態において、本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり且つ−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物への結合活性を有するタンパク質と、機能性分子との結合体を提供する。なお、Ｒ１が水素原子である場合、上記の化合物は２つの−ＯＨを有する化合物である。このような化合物としては、例えばジオール類が挙げられ、詳細については後述する。
【００１２】
ここで、１若しくは数個とは、例えば１〜６０個、例えば１〜５５個、例えば１〜５０個、例えば１〜４０個、例えば１〜３０個、例えば１〜２０個、例えば１〜１０個を意味する。また、本明細書において、上記のタンパク質を「インテレクチン又はその変異体」という場合がある。また、Ｒ１がアルキル基である場合、当該アルキル基の炭素数は、例えば１〜６であり、例えば１〜３である。
【００１３】
後述する実施例に示すように、発明者らは、マウスインテレクチン−１も−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物への結合活性を有することを見出した。ヒトインテレクチン−１とマウスインテレクチン−１とは、５１個のアミノ酸残基が異なっている。したがって、本実施形態の結合体におけるインテレクチン又はその変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも５１個の変異を有するものであってもよい。マウスインテレクチン−１のアミノ酸配列を配列番号７に示し、塩基配列を配列番号８に示す。
【００１４】
なお、野生型ヒトインテレクチン−１は３量体を形成するが、３１番目及び４８番目のシステイン残基をそれぞれセリン残基に置換した変異体（Ｃ３１，４８Ｓ）は、ジスルフィド結合を介した３量体を形成せず、単量体として産生される（「Tsuji S., et al., Differential structure and activity between human and mouse intelectin-1: Human intelectin-1 is a disulfide-linked trimer, whereas mouse homologue is a monomer, Glycobiology 17(10), 1045-1051, 2007.」を参照。）
【００１５】
後述する実施例に示すように、発明者らは、ヒトインテレクチン−１のＣ３１，４８Ｓ変異体が、ヒトインテレクチン−１と同様に−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物への結合活性を有することを見出した。
【００１６】
したがって、インテレクチン又はその変異体は、単量体として産生されるものであってもよく、例えば３量体等の多量体として産生されるものであってもよい。
【００１７】
後述する実施例に示すように、インテレクチン又はその変異体の結合活性が高い観点から、上記の化合物は、下記式（１）で示される化合物であることが好ましい。
【００１８】
【化１】
2016140344.tif 000002
【００１９】
式（１）中、Ｒ１は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。Ｙ１は単結合又はメチレン基を表す。Ｒ２〜Ｒ５はそれぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよい有機基を表す。Ｒ２〜Ｒ５のいずれかが有機基である場合、当該有機基は分岐又は環を形成していてもよく、エステル結合、エーテル結合等を有していてもよい。置換基としては、アルキル基、水酸基、アシル基、リン酸基、リン酸エステル基、カルボキシル基、アミノ基、ニトロ基、チオール基、スルホ基、カルボニル基、アセトアミド基、ベンゾイル基、アルキレン基、アルキニル基、アリール基、ケイ素化合物、ハロゲン原子等が挙げられる。
【００２０】
実施例に示すように、インテレクチン又はその変異体は、上記式（１）で表される化合物に対して高い吸着活性（結合活性）を示す。インテレクチン又はその変異体の結合活性がより高い観点から、上記式（１）で表される化合物のＲ１〜Ｒ４は水素原子であることが好ましい。また、上記式（１）で表される化合物のＲ１〜Ｒ４が水素原子である場合、Ｒ５の構造は、インテレクチン又はその変異体の結合活性にあまり影響しない傾向にある。また、上記式（１）で表される化合物のＲ１が水素原子であり、Ｒ２又はＲ３のいずれか一方がアルキル基であり、且つＲ４又はＲ５のいずれか一方がアルキル基である場合（例えば２，３−ジオール構造を有する化合物である場合）、インテレクチン又はその変異体の結合活性がより高い観点から、シス体又はトランス体よりもメソ体であることが好ましい。
【００２１】
式（１）で表される化合物のより具体的な例としては、例えば、Ｌ−リボース、Ｄ−リボース、２−デオキシガラクトース、２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−４−Ｏ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ（Ｇａｌｐ−ＧｌｃＮａｃ）、２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−４−Ｏ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ（Ｇａｌｆ−ＧｌｃＮａｃ）、２−デオキシリボース、Ｄ−キシロース、Ｌ−キシロース、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−リキソース、Ｄ−リキソース、Ｌ−ソルボース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−ラムノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｄ−フコース等の糖；アスコルビン酸等の糖酸；モノブチリン、グリセロール、１，２−ブタンジオール、１，２−プロパンジオール、（Ｒ）−１，２−プロパンジオール、（Ｓ）−１，２−プロパンジオール、３−アミノ−１，２−プロパンジオール、リビトール、グリセロフォスフォリック酸、メソ−２，３−ブタンジオール、（Ｒ，Ｒ）−２，３−ブタンジオール、（Ｓ，Ｓ）−２，３−ブタンジオール、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール等の多価アルコール、Ｔｒｉｓ、モノアシルグリセロール等が挙げられる。
【００２２】
上記式（１）で示される化合物は、複数連結してポリマーを形成していてもよい。上記のポリマーとしては、例えば、下記式（２）で表されるポリマー、ポリビニルアルコール等が挙げられる。
【００２３】
【化２】
2016140344.tif 000003
【００２４】
式（２）中、Ｙ１は上記式（１）におけるＹ１と同じ意味を表し、Ｙ２〜Ｙ４はそれぞれ独立に２価の連結基を表し、ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ独立に０〜１０の整数を表し、ｑは２以上の整数を表す。２価の連結基としては、例えば、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−が挙げられる。またｑの上限は例えば５０００程度である。
【００２５】
上記式（２）で表される化合物としては、ジオール構造を側鎖に導入したポリエチレングリコール、ジオール構造を側鎖に導入したγ−ポリグルタミン酸等が挙げられる。
【００２６】
（機能性分子）
本実施形態の結合体における機能性分子は、所望の機能を有する分子であれば特に制限されず、治療用医薬品、診断用医薬品等であってもよい。上記の医薬品は、例えば、タンパク質等の高分子化合物であってもよく、低分子化合物であってもよい。より具体的な機能性分子としては、例えば、標的物質捕捉分子；抗がん剤、細胞傷害剤、治療用放射線同位体（例えば、Ｐ３２、Ｙ９０、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｓｍ１５３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ａｔ２１１、Ｂｉ２１２、Ｐｂ２１２、Ｌｕ等の放射性同位体）等を結合させた化合物を含有する医薬組成物；コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）等に用いる造影剤；陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）用プローブ等が挙げられる。後述するように、本実施形態の結合体によれば、例えば機能性分子を生体に投与した後、必要に応じて回収することができる。機能性分子である薬剤を回収することを可能にすることにより、副作用の軽減を図ることや、抗体等のタンパク質製剤等における自己抗体の産生のタイミングを遅延させる等の効果が期待できる。結合体は医療用途だけではなく研究ツール等の研究試薬分野に応用することもできる。その場合にも、機能性分子は試薬に利用されるタンパク質、核酸等の高分子化合物であってもよく、低分子化合物であってもよい。
【００２７】
（標的物質捕捉分子）
本実施形態の結合体における標的物質捕捉分子としては、該標的物質に対する抗体、抗体断片、アプタマー、受容体等が挙げられる。
【００２８】
標的物質捕捉分子がヒトへの投与を目的とした抗体又は抗体断片である場合、抗体又は抗体断片はヒト化されたものであることが好ましい。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。抗体又は抗体断片は、抗体医薬品に由来するものであってもよい。抗体医薬品は高度にヒト化されているため体内に存在する抗体とほとんど違いがなく、一度患者に投与すると除去することはできない。これに対し、本実施形態の結合体は、必要に応じて、後述する標的物質除去装置等を使用することにより、患者の体内から除去することができる。
【００２９】
アプタマーとは、標的物質との特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。標的物質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えばｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、標的物質に特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００３０】
標的物質捕捉分子が抗体、抗体断片、ペプチドアプタマー、受容体等のタンパク質である場合、本実施形態の結合体は、標的物質捕捉分子との融合タンパク質であってもよい。また、標的物質捕捉分子が核酸アプタマー等のタンパク質以外の物質である場合、インテレクチン又はその変異体と標的物質捕捉分子とを化学リンカー等を用いて架橋すること等により本実施形態の結合体を得ることができる。
【００３１】
標的物質捕捉分子が、標的物質に対する抗体、抗体断片、アプタマー又は細胞膜抗原に結合する受容体タンパク質である場合、結合体を、抗体医薬品、標的物質を発現した細胞に薬物を送達するドラッグデリバリーシステム、標的物質の存在を検出するためのプローブ、標的物質の回収等に利用することができる。詳細については後述する。
【００３２】
上記の標的物質は、例えば癌抗原であってもよく、例えば細胞膜抗原であってもよく、例えばサイトカインであってもよく、例えば基礎研究等において研究対象である任意のタンパク質等であってもよい。癌抗原としては、特に制限されず、例えば、ＨＥＲ２、ＭＡＧＥ、ＣＥＡ、ＷＴ１、ＫＬ−６等が挙げられる。また、細胞膜抗原としては、ＣＤ３、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１等が挙げられる。サイトカインとしては、例えば炎症性サイトカインが挙げられ、具体的には、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、インターロイキン（ＩＬ）−１β、ＩＬ−６等が挙げられる。
【００３３】
また、標的物質捕捉分子が受容体である場合、受容体としては、サイトカイン受容体、細胞膜抗原に結合する受容体等が挙げられる。サイトカイン受容体としては、例えば腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−６受容体、ＴＲＡＩＬ受容体等が挙げられる。ＴＮＦＲには、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２等が存在するが、ＴＮＦに対する親和性がより高いことからＴＮＦＲ２であることが好ましい。本実施形態の結合体がサイトカイン受容体である場合、結合体を、例えば、血液中のサイトカインの除去等に利用することができる。詳細については後述する。
【００３４】
上述したように、インテレクチン又はその変異体は、単量体として産生させることもできるし、例えば３量体等の多量体として産生させることもできる。一般的に、単量体よりも多量体の方が標的物質に対する親和性が増加することから、標的物質に対する親和性を高くしたい場合には、インテレクチン又はその変異体を多量体として産生させてもよい。また、インテレクチン又はその変異体を、例えば精製タグ等として用いる場合には、単量体として産生させてもよい。
【００３５】
ヒトインテレクチンは血漿タンパク質であり、体液中濃度の多寡によって生理的な反応を誘発しない。したがって、本実施形態の結合体は、医薬品としてヒト又は非ヒト動物に投与した場合においても有害な副作用を示す可能性は低いと考えられる。
【００３６】
［ベクター］
１実施形態において、本発明は、インテレクチン又はその変異体と、標的物質に対する抗体、抗体断片、ペプチドアプタマー又は受容体との融合タンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とするベクターを提供する。インテレクチン又はその変異体をコードする核酸としては、例えば、配列番号２に記載の塩基配列からなる核酸、又は、配列番号２に記載の塩基配列と８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の同一性を有し且つ−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物への結合活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる核酸が挙げられる。なお、配列番号２に示す塩基配列は、ヒトインテレクチン−１の塩基配列である。
【００３７】
本実施形態のベクターは、発現ベクターであることが好適である。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
【００３８】
上記の発現ベクターにおいて、結合体の発現用プロモーターとしては特に制限されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター等を使用することができる。
【００３９】
上記の発現ベクターは、更に、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
【００４０】
［医薬組成物］
１実施形態において、本発明は、薬物と、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物を含む担体と、前記化合物に結合した、上述した結合体と、を備えたことを特徴とする医薬組成物を提供する。本実施形態の医薬組成物は、ドラッグデリバリーシステムであってもよい。上記化合物は、上記式（１）又は（２）で示される化合物であることが好ましい。
【００４１】
図１は、本実施形態の医薬組成物の構造を説明する模式図である。図１において、医薬組成物１００は、薬物１１０及び化合物１２０を含む担体１３０と、化合物１２０に結合した結合体１４０とを備える。化合物１２０は担体１３０の表面に露出していることが好ましい。
【００４２】
結合体１４０は、上述したインテレクチン又はその変異体１４１と、例えば癌抗原に対する抗体１４２との結合体である。担体１３０としては、ドラッグデリバリーシステムに用いられるものであれば特に制限されず、例えばミセル、リポソーム等が挙げられる。
【００４３】
ミセルとしては、ドラッグデリバリーシステムに用いられるものであれば特に制限されず、例えば、親水性領域と疎水性領域を有するブロックコポリマーから形成されるもの等が使用できる。リポソームとしては、ドラッグデリバリーシステムに用いられるものであれば特に制限されず、例えば、リン脂質から形成されるもの等が使用できる。
【００４４】
本実施形態のドラッグデリバリーシステムを製造する場合には、これらのミセルやリポソームの材料に、化合物１２０を添加したうえでミセルやリポソームを形成する。化合物１２０としては、例えば、１−モノオレイン等のモノアシルグリセロール等が挙げられる。
【００４５】
薬物１１０としては、例えばパクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンデシン、エリブリンメシル酸塩、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン等の抗癌剤等が挙げられる。例えば、薬物１１０の存在下でミセルやリポソームを形成することにより、薬物１１０をミセルやリポソーム中に封入することができる。
【００４６】
結合体１４０は、化合物１２０と接触させると容易に結合する。このため、化合物１２０を含む担体１３０と結合体１４０とを混合することにより、医薬組成物１００を容易に製造することができる。本実施形態の医薬組成物１００は、癌抗原を発現する組織や細胞に特異的に薬物１１０を送達することができる。このため、癌細胞特異的に細胞障害活性を奏することができ、副作用を低減させることができる。
【００４７】
（変形例）
本実施形態の医薬組成物は、上述した癌細胞を標的として抗癌剤を特異的に送達するだけでなく、例えば、細菌やウイルス感染細胞を標的として抗菌剤や抗ウイルス剤を特異的に送達する；目的に応じた細胞を標的として、酵素やｓｉＲＮＡ、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー、核酸（遺伝子）等の代謝調節物質を特異的に送達する；目的に応じた細胞を標的として、放射性同位体、蛍光色素、蛍光タンパク質等の標識物質を特異的に送達する等に利用することもできる。
【００４８】
１実施形態において、本発明は、抗癌剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、代謝調節物質又は標識物質と、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物を含む担体と、前記化合物に結合した、癌抗原又は所望の抗原に対する抗体、抗体断片又はアプタマーとインテレクチン又はその変異体との結合体とを備える医薬組成物を、哺乳動物に投与する工程を備える、癌又は感染症の治療又は診断方法を提供する。
【００４９】
１実施形態において、本発明は、癌又は感染症の治療のための、抗癌剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、代謝調節物質又は標識物質と、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物を含む担体と、前記化合物に結合した、癌抗原又は所望の抗原に対する抗体、抗体断片又はアプタマーとインテレクチン又はその変異体との結合体とを備える医薬組成物を提供する。
【００５０】
１実施形態において、本発明は、癌治療用医薬組成物又は感染症治療用医薬組成物を製造するための癌抗原又は所望の抗原に対する抗体、抗体断片又はアプタマーとインテレクチン又はその変異体との結合体の使用を提供する。
【００５１】
［医薬］
１実施形態において、本発明は、上述した結合体を有効成分として含有する、医薬を提供する。
【００５２】
本実施形態の医薬は、例えば抗体医薬であってもよく、例えば高サイトカイン血症治療剤（抗サイトカイン薬）であってもよい。結合体としては、標的物質に対する抗体、抗体断片又はペプチドアプタマーと、インテレクチン又はその変異体との結合体；サイトカイン受容体と、インテレクチン又はその変異体との結合体等が挙げられる。標的物質、サイトカイン及びサイトカイン受容体については上述した通りである。
【００５３】
本実施形態の医薬は、既存の抗体医薬にも適用できる。これにより、抗体医薬を低コストで容易に精製することが可能になる。
【００５４】
本実施形態の医薬が抗サイトカイン薬である場合、対象疾患として、高サイトカイン血症である敗血症等の全身性炎症反応症候群（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＳＩＲＳ）、リウマチ、がん悪液質、乾癬等が挙げられる。例えば、重症ＳＩＲＳには有効な治療法がないが、重症ＳＩＲＳの患者に本実施形態の抗サイトカイン薬を投与することにより、血中の炎症性サイトカインを吸着し、その症状を緩和することができる。また、リウマチ、がん悪液質、乾癬等の患者に本実施形態の抗サイトカイン薬を投与することにより、体内の炎症性サイトカインを吸着し、その症状を緩和することができる。
【００５５】
１実施形態において、本発明は、癌抗原に対する抗体、抗体断片又はアプタマーとインテレクチン又はその変異体との結合体とを備える医薬を、哺乳動物に投与する工程を備える、癌の治療方法を提供する。
【００５６】
１実施形態において、本発明は、癌の治療のための、癌抗原に対する抗体、抗体断片又はアプタマーとインテレクチン又はその変異体との結合体を提供する。
【００５７】
１実施形態において、本発明は、癌治療用医薬を製造するための、癌抗原に対する抗体、抗体断片又はアプタマーとインテレクチン又はその変異体との結合体の使用を提供する。
【００５８】
１実施形態において、本発明は、サイトカインに対する抗体、抗体断片若しくはアプタマー又はサイトカイン受容体とインテレクチン又はその変異体との結合体とを備える医薬を、哺乳動物に投与する工程を備える、高サイトカイン産生に起因する疾患の治療方法を提供する。
【００５９】
１実施形態において、本発明は、高サイトカイン産生に起因する疾患の治療のための、サイトカインに対する抗体、抗体断片若しくはアプタマー又はサイトカイン受容体とインテレクチン又はその変異体との結合体を提供する。
【００６０】
１実施形態において、本発明は、高サイトカイン産生に起因する疾患の治療用医薬を製造するための、サイトカインに対する抗体、抗体断片若しくはアプタマー又はサイトカイン受容体とインテレクチン又はその変異体との結合体の使用を提供する。
【００６１】
［遺伝子組換え体］
１実施形態において、本発明は、上述した結合体を発現する遺伝子組換え体を提供する。遺伝子組換え体としては、上述した結合体の発現ベクターが導入された、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等の培養細胞；上述した結合体の発現ベクターが導入された、カイコ等の昆虫生体；例えば乳中、卵中に上述した結合体を発現するように遺伝子改変された、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリ等の動物等が挙げられる。
【００６２】
本実施形態の遺伝子組換え体により、上述した結合体を製造することができる。製造された結合体は、後述する方法により容易に精製することができる。
【００６３】
［結合体の精製方法］
１実施形態において、本発明は、上述した結合体を、固相に固定された−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に接触させる工程を有することを特徴とする結合体の精製方法を提供する。上記化合物は、上記式（１）又は（２）で示される化合物であることが好ましい。上記化合物が固定された固相（結合体捕捉用固相）については後述する。
【００６４】
本明細書において、「精製」は、「分離」、「回収」、「吸着」、「結合」等といいかえることができる。本実施形態の精製方法によれば、例えば、上述した遺伝子組換え体の培養物、昆虫生体内、乳中、卵中等に発現された結合体を低コストで容易に精製することができる。
【００６５】
具体的には、まず、上述した遺伝子組換え体が発現した、培養物、昆虫生体内、乳、卵中に含まれる結合体と−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物が固定された固相とを接触させる。すると、結合体の、インテレクチン又はその変異体領域が上記化合物に吸着することにより、結合体を固相に吸着させることができる。
【００６６】
続いて、固相に吸着した結合体を緩衝液等で洗浄する。その後、固相に吸着した結合体に、例えば、遊離状態の−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物を含有する緩衝液等を接触させることにより、結合体を固相から解離させ回収することができる。遊離状態の上記化合物としては、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、リボース等が挙げられる。
【００６７】
また、発明者らは、インテレクチン又はその誘導体と−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物との結合は、Ｃａ２＋イオン、Ｓｒ２＋イオン又はＭｎ２＋イオン依存性であること、上記固相に吸着した上記結合体にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む緩衝液等を接触させることによっても結合体を固相から解離させ回収できることを見出した。
【００６８】
後述するように、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物が固定された固相は、例えばプロテインＡ結合樹脂等と比較して非常に安価であり、また、変性洗浄処理に耐性を有している。したがって、結合体が、例えばインテレクチン又はその変異体と抗体医薬品である抗体との結合体である場合、本実施形態の精製方法により、抗体医薬品の製造コストを大幅に下げることができ、抗体医薬品の安価な提供が可能になる。
【００６９】
また、ジオール類に代表される、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物には、安全性と安定性が極めて高い化合物が存在する。例えば、プロピレングリコールは注射溶剤として使用される化合物であり、安全性と安定性が非常に高いものである。したがって、このような化合物を用いて本実施形態の精製方法により精製された結合体は、医薬品として用いる場合においても安全性が高い。
【００７０】
［結合体捕捉用固相］
１実施形態において、本発明は、上述した結合体を捕捉するための固相であって、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物が固定されたことを特徴とする結合体捕捉用固相を提供する。上記化合物は、上記式（１）又は（２）で示される化合物であることが好ましい。固相としては、ビーズ、膜、中空糸膜、プラスチック基板、ウェルプレート、スライドガラス、表面プラズモン共鳴測定装置等の測定機器のセンサーチップ等が挙げられる。例えば、ビーズ、膜等の形態である固相は、カラムに充填されていてもよい。
【００７１】
ジオール類に代表される、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物は、極めて安価且つ随意に樹脂等の表面に導入することが可能である。例えば、架橋剤として用いられているエチレングリコールグリシジルエーテルや１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル等のジエポキシドを過剰量処理し、アルカリ加水分解又は酸加水分解処理を行うことにより、水酸基、アミノ基、チオール基を有する固相に容易に上記化合物を固定することができる。また、カルボキシル基を持つ固相上には、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）を介して３−アミノ−１，２−プロパンジオールを結合させることで上記化合物を固定することができる。また、アミノ基を持つ固相上には、ＥＤＣを介してグリセリン酸を結合させることで上記化合物を固定することができる。
【００７２】
例えばプロテインＡ結合樹脂は、洗浄や殺菌によりプロテインＡが劣化する等の理由から再使用に制限がある。また、プロテインＡ結合樹脂を用いて抗体を精製する場合、酸性緩衝液で抗体を変性溶出後、溶出した抗体を中和し、イオン交換カラムで更に精製する等の操作が必要であり、抗体の精製に要する工程が多い。
【００７３】
これに対し、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物は、酸、アルカリ、高圧蒸気滅菌等を行ってもほとんど劣化しないため、本実施形態の結合体捕捉用固相は、固相が耐えうる洗浄、殺菌方法のほぼすべてが利用可能である。また、結合剤（インテレクチン）との結合速度が速く、精製純度が高く、回収効率も例えば９５％以上と高い。また、グリセロール、プロピレングリコール、リボース等の溶出剤は毒性やタンパク質変性作用が弱いため、例えば、本実施形態の結合体捕捉用固相から溶出した結合体をそのままイオン交換カラムに吸着させることができ、結合体の精製を簡便に行うことができる。
【００７４】
［標的物質除去方法］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、標的物質と上述した結合体との複合体を含む血漿を、固相に固定された−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に接触させる工程を有することを特徴とする標的物質除去方法を提供する。上記化合物は、上記式（１）又は（２）で示される化合物であることが好ましい。本実施形態の標的物質除去方法は、血漿から標的物質を除去する方法、血漿から結合体を除去する方法ということもできる。また、本実施形態の標的物質除去方法は、全血から所望の血液成分を採取する方法である、アフェレーシスの一種であるともいえる。
【００７５】
結合体としては、インテレクチン又はその変異体と抗体又は抗体断片との結合体である抗体医薬品、インテレクチン又はその変異体と標的物質に対する抗体、抗体断片又はペプチドアプタマーとの結合体、インテレクチン又はその変異体とサイトカイン受容体との結合体等が挙げられる。上記の標的物質としては、例えば、毒素、病因物質、炎症性サイトカイン、ウイルス、細菌、プリオン等が挙げられる。血漿は、例えば、患者の血液から膜型血漿分離器等により分離されたものを用いることができる。
【００７６】
図２は、標的物質除去方法の第１実施形態を説明する模式図である。図２では、血漿２２０に、予め、インテレクチン又はその変異体と標的物質に対する抗体、抗体断片、ペプチドアプタマー、サイトカイン受容体等との結合体２３０が投与されており、標的物質２１０は結合体２３０と複合体２４０を形成している。
【００７７】
本実施形態の標的物質除去方法は、上記の血漿２２０に、上述した結合体捕捉用固相２５０を接触させる工程を備える。図２においては、固相２５０はカラム２５５に充填されている。固相２５０には、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物２５１が固定されている。本工程において、血漿２２０に固相２５０を接触させると、複合体２４０を構成する結合体２３０のインテレクチン又はその変異体部分が化合物２５１に結合する。その結果、複合体２４０が固相２５０に吸着され、血漿２２０から標的物質２１０が除去される。図２においては、カラム２５５から排出された血漿２２０’は、標的物質２１０が除去されている。
【００７８】
本実施形態の方法により、血漿２２０中の標的物質２１０を特異的に除去することができる。標的物質２１０が除去された血漿２２０’は、患者の体内に戻すことができる。したがって、結合体２３０は、アフェレーシス用標的物質回収ツールであるともいえる。
【００７９】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、標的物質を含む血漿を、固相に固定された、上述した結合体に接触させる工程を有することを特徴とする標的物質除去方法を提供する。本実施形態の標的物質除去方法は、全血から所望の血液成分を採取する方法である、アフェレーシスの一種であるともいえる。
【００８０】
結合体としては、上述した標的物質除去方法の第１実施形態におけるものと同様のものを使用することができる。
【００８１】
図３は、標的物質除去方法の第２実施形態を説明する模式図である。図３においては、結合体２３０が結合した固相２５０がカラム２５５に充填されている。固相２５０には、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物２５１が固定されており、結合体２３０のインテレクチン又はその変異体部分が化合物２５１に結合することにより、結合体２３０が固相２５０に結合している。
【００８２】
標的物質２１０を含む血漿２２０と固相２５０に結合した結合体２３０とを接触させると、結合体２３０が標的物質２１０と結合する。
【００８３】
その結果、標的物質２１０が固相２５０に吸着され、血漿２２０から標的物質２１０が除去される。図３においては、カラム２５５から排出された血漿２２０’は、標的物質２１０が除去されている。
【００８４】
本実施形態の方法により、血漿２２０中の標的物質２１０を特異的に除去することができる。標的物質２１０が除去された血漿２２０’は、患者の体内に戻すことができる。したがって、本実施形態においても、結合体２３０は、アフェレーシス用標的物質回収ツールであるともいえる。
【００８５】
ところで、全身性炎症反応症候群（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＳＩＲＳ）には有効な治療法がなく、サイトカイン特異的な血漿吸着療法は治療成績を劇的に改善できると期待されているが、既存の技術では実用化が困難である。本実施形態の方法は、安全性、コスト面からも実用的であり、ＳＩＲＳの画期的な治療法となると考えられる。
【００８６】
上述した標的物質除去方法の第１実施形態又は第２実施形態において、結合体２３０としてサイトカインと結合するものを使用すれば、血漿中のサイトカインを除去することができる。これにより、ＳＩＲＳの重症化による多臓器不全を防ぎ、救命率を大幅に改善することが可能となると考えられる。また、本実施形態の方法は、体内のサイトカイン増加が原因の一つである、リウマチ、がん悪液質、乾癬等にも適用できる。
【００８７】
（第３実施形態）
１実施形態において、本発明は、上記の結合体を含む血漿を、固相に固定された−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に接触させる工程を有することを特徴とする前記結合体の除去方法を提供する。本実施形態の除去方法によれば、例えば患者の血液中に投与された上記の結合体を、患者の体内から除去することができる。
【００８８】
より具体的には、例えば、機能性分子として造影剤を有する上記の結合体を患者に投与してコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）等による検査を行った後、血液中の造影剤を除去すること等が挙げられる。これにより、造影剤による副作用を低減することができる。
【００８９】
［標的物質除去装置］
（第１実施形態）
１実施形態において、本発明は、標的物質と上述した結合体との複合体を含む血漿から前記複合体を除去する除去手段を備え、前記除去手段が、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物が固定された固相を備えることを特徴とする標的物質除去装置を提供する。上記化合物は、上記式（１）又は（２）で示される化合物であることが好ましい。
【００９０】
結合体としては、上述した標的物質除去方法の第１実施形態におけるものと同様のものを用いることができる。
【００９１】
図２は、本実施形態の標的物質除去装置３００を説明する模式図である。標的物質除去装置３００は、上述した標的物質除去方法の第１実施形態を実施するのに好適な装置である。
【００９２】
標的物質除去装置３００は、上述した結合体捕捉用固相（除去手段）２５０を備える。標的物質除去装置３００は、更に、患者の血液を循環させる血液回路２６０、血液回路２６０内の血液を移送させるポンプ２７０ａ、血液から血漿を分離する血漿分離装置２８０、血漿分離装置２８０により分離された血漿２２０を循環させる血漿回路２９０、血漿回路２９０内の血漿を移送させるポンプ２７０ｂ等を備えていてもよい。
【００９３】
標的物質除去装置３００を適用する患者には、予め、インテレクチン又はその変異体と標的物質２１０に対する抗体、抗体断片、ペプチドアプタマー、サイトカイン受容体等との結合体２３０が投与されており、患者の血液中において、標的物質２１０は結合体２３０と複合体２４０を形成している。
【００９４】
患者から採取された血液は、ポンプ２７０ａにより血液回路２６０内を循環する。やがて、血液は血漿分離装置２８０において、血漿２２０と血球成分とに分離される。分離された血漿２２０は、ポンプ２７０ｂにより血漿回路２９０内を循環する。やがて、血漿２２０は、除去手段２５０と接触する。
【００９５】
図２においては、除去手段２５０はカラム２５５に充填されている。除去手段２５０には、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物２５１が固定されている。血漿２２０に除去手段２５０を接触させると、複合体２４０を構成する結合体２３０のインテレクチン又はその変異体部分が化合物２５１に結合する。その結果、複合体２４０が除去手段２５０に吸着され、血漿２２０から標的物質２１０が除去される。図２においては、カラム２５５から排出された血漿２２０’は、標的物質２１０が除去されている。標的物質２１０が除去された血漿２２０’は、血液回路２６０に戻される。
【００９６】
本実施形態の標的物質除去装置により、血漿２２０中の標的物質２１０を特異的に除去することができる。標的物質２１０が除去された血漿２２０’は、患者の体内に戻すことができる。
【００９７】
（第２実施形態）
１実施形態において、本発明は、標的物質を含む血漿から前記標的物質を除去する除去手段を備え、前記除去手段が、上述した結合体が固定された固相を備えることを特徴とする標的物質除去装置を提供する。
【００９８】
結合体としては、上述した標的物質除去方法の第１実施形態に置けるものと同様のものを用いることができる。
【００９９】
図３は、本実施形態の標的物質除去装置４００を説明する模式図である。標的物質除去装置４００は、上述した標的物質除去方法の第２実施形態を実施するのに好適な装置である。
【０１００】
標的物質除去装置４００は、上述した結合体捕捉用固相２５０に結合した、上述した結合体（除去手段）２３０を備える。標的物質除去装置４００は、更に、患者の血液を循環させる血液回路２６０、血液回路２６０内の血液を移送させるポンプ２７０ａ、血液から血漿を分離する血漿分離装置２８０、血漿分離装置２８０により分離された血漿２２０を循環させる血漿回路２９０、血漿回路２９０内の血漿を移送させるポンプ２７０ｂ等を備えていてもよい。
【０１０１】
患者から採取された血液は、ポンプ２７０ａにより血液回路２６０内を循環する。やがて、血液は血漿分離装置２８０において、血漿２２０と血球成分とに分離される。分離された血漿２２０は、ポンプ２７０ｂにより血漿回路２９０内を循環する。やがて、血漿２２０は、除去手段２３０と接触する。
【０１０２】
図３においては、除去手段２３０はカラム２５５に充填されている。除去手段２３０は、固相２５０に固定された、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物２５１に結合している。
【０１０３】
標的物質２１０を含む血漿２２０と固相２５０に結合した結合体２３０とを接触させると、結合体２３０が標的物質２１０と結合する。
【０１０４】
その結果、標的物質２１０が固相２５０に吸着され、血漿２２０から標的物質２１０が除去される。図３においては、カラム２５５から排出された血漿２２０’は、標的物質２１０が除去されている。標的物質２１０が除去された血漿２２０’は、血液回路２６０に戻される。
【０１０５】
本実施形態の標的物質除去装置により、血漿２２０中の標的物質２１０を特異的に除去することができる。標的物質２１０が除去された血漿２２０’は、患者の体内に戻すことができる。上述した標的物質除去装置の第１実施形態又は第２実施形態において、結合体２３０としてサイトカインと結合するものを使用すれば、血漿中のサイトカインを除去するサイトカイン除去装置として使用することができる。本装置を用いて患者の血漿中のサイトカインを除去することにより、ＳＩＲＳの重症化による多臓器不全を防ぎ、救命率を大幅に改善することが可能となると考えられる。また、本装置を用いて患者の血漿中のサイトカインを除去することにより、体内のサイトカイン増加が原因の一つである、リウマチ、がん悪液質、乾癬等の治療を行うこともできる。
【０１０６】
（第３実施形態）
１実施形態において、本発明は、上記の結合体を含む血漿から前記結合体を除去する除去手段を備え、前記除去手段が、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物が固定された固相を備えることを特徴とする前記結合体の除去装置を提供する。本実施形態の除去装置によれば、例えば患者の血液中に投与された上記の結合体を、患者の体内から除去することができる。
【０１０７】
［結合体検出用標識化合物］
１実施形態において、本発明は、上述した結合体を検出するための標識化合物であって、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有することを特徴とする結合体検出用標識化合物を提供する。インテレクチン又はその変異体との結合活性が高い観点から、本実施形態の結合体検出用標識化合物は、上記式（２）で表される化合物と、放射性同位体、蛍光物質、酵素、蛍光タンパク質等の標識物質との結合体であることが好ましい。
【０１０８】
より具体的な標識物質としては、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＧＦＰ、ビオチン、ＦＩＴＣ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素等が挙げられる。
【０１０９】
本実施形態の結合体検出用標識化合物は、上述した結合体のインテレクチン又はその変異体部分に特異的に結合する。このため、例えば、インテレクチン又はその変異体部分と標的物質に対する抗体、抗体断片又はペプチドアプタマー部分とを有する結合体を１次抗体の代わりに使用し、本実施形態の結合体検出用標識化合物を２次抗体の代わりに使用することにより、結合体が認識する標的物質の存在を検出することができる。
【０１１０】
図４は、本実施形態の結合体検出用標識化合物を説明する模式図である。結合体検出用標識化合物４００は、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物４１０と、標識物質４２０との結合体である。図４においては、化合物４１０の主鎖はγ−ポリグルタミン酸であり、標識物質４２０は西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【０１１１】
結合体検出用標識化合物４００は、例えば、インテレクチン又はその変異体と抗体との融合タンパク質（結合体）４３０のインテレクチン又はその変異体部分に特異的に結合することができるため、結合体の検出に利用することができる。なお、結合体４３０においては、抗体が結合しているが、抗体の代わりにアプタマーや受容体等が結合していてもよい。
【０１１２】
［結合体の検出方法］
１実施形態において、本発明は、上述した結合体に−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する標識化合物を結合させ複合体を形成させる工程と、該複合体中の標識化合物を検出する工程と、を有することを特徴とする結合体の検出方法を提供する。上記の標識化合物は、上記式（２）で表される化合物であることが好ましい。
【０１１３】
本実施形態の検出方法により、例えば、インテレクチン又はその変異体部分と標的物質に対する抗体、抗体断片又はペプチドアプタマー部分とを有する結合体を１次抗体の代わりに使用し、上述した結合体検出用標識化合物を２次抗体の代わりに使用して、結合体が認識する標的物質の存在を検出することができる。
【０１１４】
結合体検出用標識化合物の検出は、結合体検出用標識化合物中の標識物質が蛍光物質又は蛍光タンパク質等である場合には、蛍光顕微鏡等を用いることにより行うことができる。また、標識物質が酵素である場合には、適切な基質を反応させて発色、発光、蛍光等を検出することにより行うことができる。
【０１１５】
［化合物検出用結合体］
１実施形態において、本発明は、インテレクチン又はその変異体と、標識物質との結合体であることを特徴とする、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物検出用結合体を提供する。
【０１１６】
図５は、本実施形態の化合物検出用結合体を説明する模式図である。化合物検出用結合体５００は、インテレクチン又はその変異体５１０と標識物質５２０との結合体である。標識物質５２０としては、上述した結合体検出用標識化合物における標識物質と同様のものを使用することができる。
【０１１７】
化合物検出用結合体５００は、インテレクチン又はその変異体５１０の部分で−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に特異的に結合することができるため、当該化合物の検出に利用することができる。
【０１１８】
例えば、図５に示すように、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物５３１で標識された抗体５３０を１次抗体として使用し、化合物検出用結合体５００を２次抗体の代わりに使用することにより、抗体５３０が認識する標的物質の存在を検出することができる。
【０１１９】
図５の例では、標識物質５２０は蛍光物質であり、化合物５３１は、ジオール構造を側鎖に導入したポリエチレングリコールである。また、図５においては抗体５３０が示されているが、抗体の代わりにアプタマーや受容体等も用いることができる。
【０１２０】
［化合物の検出方法］
１実施形態において、本発明は、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物に上述した化合物検出用結合体を結合させ複合体を形成させる工程と、該複合体中の前記標識物質を検出する工程と、を有することを特徴とする、−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物の検出方法を提供する。上記の化合物は、上記式（２）で表される化合物であることが好ましい。
【０１２１】
本実施形態の検出方法により、例えば、図５に示す抗体５３０を１次抗体として使用し、化合物検出用結合体５００を２次抗体の代わりに使用することにより、抗体５３０が認識する標的物質の存在を検出することができる。
【０１２２】
−ＯＨ及び−ＯＲ１［Ｒ１は水素原子、アルキル基又は−ＰＯ３Ｈ２を表す。］を有する化合物で標識された、抗体、抗体断片、ペプチドアプタマー、受容体等を１次抗体の代わりに使用し、上述した化合物検出用結合体を２次抗体の代わりに使用して、抗体、抗体断片、ペプチドアプタマー、受容体等が認識する標的物質の存在を検出することができる。
【０１２３】
標識物質の検出は、上述した化合物の検出方法におけるものと同様にして行うことができる。
【実施例】
【０１２４】
以下、実験例により本発明を説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。【０１２５】
［実験例１］
（インテレクチンとジオール基との結合）
表面にジオール基を有するビーズ及び表面にジオール基を有しないビーズを準備した。表面にジオール基を有するビーズとしては、ポリスチレンビーズの表面に３−アミノ−１−プロパンジオールをアミノ基を介して結合させたビーズ（ジオールビーズ）、及び１，４−ビス（２，３−エポキシプロピル）ブタンが導入されたセファロースビーズ（ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のエポキシ基をアルカリ加水分解したもの（ジオールセファロースビーズ）を使用した。また、表面にジオール基を有しないビーズとしては、ポリスチレンビーズ、及びポリスチレンビーズに３−アミノ−１−プロパノールを結合させたビーズ（ヒドロキシビーズ）を使用した。【０１２６】
インテレクチンを含む培地、又はインテレクチンを含まない培地５００μＬに各ビーズを加え、２５℃、１８時間撹拌した。インテレクチンとしては、リコンビナントヒトインテレクチン−１を使用した。続いて、遠心してビーズを回収後、ビーズを緩衝液で一回洗浄し、１５％グリセロールを含む緩衝液で溶出した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で試料を分離後、クマシーブリリアントブルーを用いてタンパク質を染色した。図６Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真であり、図６Ｂは、各ビーズの構造を示す図である。【０１２７】
その結果、インテレクチンはジオールビーズ及びジオールセファロースビーズに選択的に結合することが明らかとなった。【０１２８】
なお、表面にジオール基を有するジオールセファロースビーズとして、１，４−ビス（２，３−エポキシプロピル）ブタンが導入されたセファロースビーズ（ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のエポキシ基を酸加水分解したものを使用した実験を行った場合においても、同様の結果が得られた。【０１２９】
［実験例２］
（各種化合物によるインテレクチンとジオール基との結合の阻害１）
インテレクチンを含む培地３５μＬに７．５μＬのジオールセファロースビーズ及び段階希釈された様々な種類の化合物を含む緩衝液（１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０））６５μＬを加え、４℃で３６時間撹拌した。インテレクチンとしては、リコンビナントヒトインテレクチン−１を使用した。また、上記化合物はジオール基を含む又は含まない化合物であり、具体的には、グリセロール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１−プロパノール、エチレングリコール、エタノールアミン、エタノール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、Ｄ−２，３−ブタンジオール、Ｌ−２，３−ブタンジオール、メソ−２，３−ブタンジオール、３−アミノ−１，２−プロパンジオール、３−アミノ−１−プロパノール、ガラクトース、グルコース、マンノース、リボースであった。【０１３０】
続いて、各試料中の上清を遠心して回収し、上清中に残存したインテレクチンの濃度を、抗インテレクチンモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した。【０１３１】
上記化合物を添加しなかった試料を用いて測定したインテレクチンの濃度を１００％とし、インテレクチンを含まない培地を試料に用いて測定したインテレクチンの濃度を０％として、各試料における、インテレクチンとジオール基との結合の阻害率を計算した。【０１３２】
図７Ａ〜Ｃは実験結果を示すグラフである。インテレクチンは、１，２−ジオール基を有する化合物に高い親和性を示した。また、２，３−ジオール構造を有する化合物にも低い親和性を示した。【０１３３】
［実験例３］
（各種化合物によるインテレクチンとジオール基との結合の阻害２）
ビアコア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、段階希釈された様々な種類の化合物の存在下で、３−アミノ−１−プロパンジオールをアミノ基を介して固定したセンサーチップに対する精製インテレクチンの結合を測定した。インテレクチンとしては、リコンビナントヒトインテレクチン−１を使用した。また、上記化合物はジオール基を含む又は含まない化合物であり、具体的には、グリセロール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１−プロパノール、エチレングリコール、エタノール、２−メトキシエタノール、ガラクトース、２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−４−Ｏ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ（Ｇａｌｐ−ＧｌｃＮａｃ）、２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−４−Ｏ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ（Ｇａｌｆ−ＧｌｃＮａｃ）、Ｄ−リボース、Ｌ−リボースであった。【０１３４】
インテレクチンは終濃度０．５μｇ／ｍＬで使用した。また、測定緩衝液としては１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０３％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いた。上記化合物を添加しなかった試料を用いて測定したインテレクチンの結合量を１００％として、各試料におけるインテレクチンの結合率を測定した。【０１３５】
図８は、実験結果を示すグラフである。インテレクチンは、１，２−ジオール基を有する化合物に高い親和性を示した。また、２，３−ジオール構造を有する化合物にも低い親和性を示した。また、ジオール基をもたない化合物に対してはほとんど親和性を示さなかった。【０１３６】
また、ビアコア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いた測定結果に基づき、様々な化合物によるインテレクチンとジオール基との結合の阻害の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を算出した。表１に、各化合物のＩＣ５０の値を示す。【０１３７】
【表１】
2016140344.tif 000004
【０１３８】
［実験例４］
（インテレクチンとジオール基との解離定数の測定）
ビアコア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、３−アミノ−１−プロパンジオールをアミノ基を介して固定したセンサーチップに対する精製インテレクチンの結合を測定し、解離定数を求めた。【０１３９】
図９は、測定結果を示すグラフである。その結果、結合速度定数Ｋａ＝２．０３×１０−５  Ｍ−１ｓ−１、解離速度定数Ｋｄ＝１．７９×１０−３  ｓ−１、解離定数ＫＤ＝８．８４×１０−９  Ｍと算出された。【０１４０】
［実験例５］
（モノアシルグリセロールとインテレクチンの結合）
モノパルミチンやモノオレインなどのモノアシルグリセロールはミセルやリポソームの構成成分として使用される。インテレクチンを含む培地５００μＬに、終濃度１００μＭの１−モノパルミチン、２−モノパルミチン又は陰性対象としての１−パルミトイルリゾフォスファチジン酸を加え、激しく撹拌し、３７℃、１５分保温した。インテレクチンとしては、リコンビナントヒトインテレクチン−１を使用した。上記の操作により、外側にジオール基を向け、内側にアシル基を向けたミセル様の構造を持つ不溶性凝集物が形成され、表面上にインテレクチンが結合すると予想される。【０１４１】
続いて、４℃で１５分間冷却後、遠心により沈殿を回収し、沈殿を緩衝液で一回洗浄し、サンプルバッファーで溶解した。続いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試料を分離後、クマシーブリリアントブルーにて染色した。【０１４２】
図１０ＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。その結果、インテレクチンは、１−モノパルミチン及び２−モノパルミチンに結合したことが明らかとなった。また、インテレクチンは１−パルミトイルリゾフォスファチジン酸にはわずかにしか結合しないことが明らかとなった。【０１４３】
図１０Ｂは、１−モノパルミチンに代表される１−モノアシルグリセロール、２−モノパルミチンに代表される２−モノアシルグリセロール及び１−パルミトイルリゾフォスファチジン酸に代表されるリゾフォスファチジン酸の構造を示す一般式である。図１０Ｂ中、Ｒは、アルキル基を表す。【０１４４】
［実験例６］
（抗体Ｆａｂ断片とインテレクチンとの結合体の作製）
１６５ＳｅｒをＡｌａに置換し、１６３ＡｓｎのＮ型糖鎖付加を阻害した変異型リコンビナントヒトインテレクチン−１（Ｓ１６５Ａ）の成熟型のＮ末端に、スペーサーとしてグリシン残基１残基を介して抗インターロイキン（ＩＬ）−６モノクローナル抗体ＭＨ１６６のＨ鎖のＦａｂ領域（ＶＨ−ＣＨ１領域）を接続したタンパク質をコードする塩基配列断片を作製し、発現プラスミドに組み込んだ。【０１４５】
上記の発現プラスミドと、モノクローナル抗体ＭＨ１６６のＬ鎖をコードする塩基配列断片を組み込んだ発現プラスミドをウサギ腎細胞株ＲＫ−１３に遺伝子導入し、共発現させた。【０１４６】
変異型リコンビナントヒトインテレクチン−１（Ｓ１６５Ａ）の成熟型タンパク質（スペーサーのグリシン残基１残基を含む）をコードする塩基配列を配列番号３に示す。また、ＭＨ１６６のＨ鎖のＦａｂ領域をコードする塩基配列を配列番号４に示し、ＭＨ１６６のＬ鎖をコードする塩基配列を配列番号５に示す。【０１４７】
続いて、上記細胞株の培養上清を回収し、ジオールセファロースビーズに添加した後、ビーズを洗浄し、１０％１，２−プロパンジオール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。溶出画分をＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（１ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に添加し、０〜１ＭのＮａＣｌ濃度勾配により溶出した。【０１４８】
各画分を還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブリリアントブルーにて染色し、抗体Ｆａｂ断片とインテレクチンとの結合体の発現を確認した。【０１４９】
［実験例７］
（ＴＮＦＲ２とインテレクチンとの結合体の作製）
上述した変異型リコンビナントヒトインテレクチン−１（Ｓ１６５Ａ）の成熟型のＮ末端に、スペーサーとしてのグリシン残基１残基を介してヒトＴＮＦ受容体２（ＴＮＦＲ２）の細胞外領域を接続したタンパク質をコードする塩基配列断片を作製し、発現プラスミドに組み込んだ。使用したヒトＴＮＦＲ２の細胞外領域をコードする塩基配列を配列番号６に示す。上記の発現プラスミドをウサギ腎細胞株ＲＫ−１３に遺伝子導入し、発現させた。【０１５０】
続いて、上記細胞株の培養上清を回収し、ジオールセファロースビーズに添加した後、ビーズを洗浄し、１０％１，２−プロパンジオール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。溶出画分をＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（１ｍＬ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に添加し、０〜１ＭのＮａＣｌ濃度勾配により溶出した。【０１５１】
各画分を還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーブリリアントブルーにて染色し、ＴＮＦＲ２とインテレクチンとの結合体の発現を確認した。【０１５２】
図１１Ａは、陰イオン交換クロマトグラフィーによる結合体の溶出プロファイルを示すグラフである。図１１ＢはＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。その結果、ＴＮＦＲ２とインテレクチンとの結合体はジオールセファロースビーズと陰イオン交換クロマトグラフィーにより高度に精製できることが示された。【０１５３】
［実験例８］
（抗体Ｆａｂ断片とインテレクチンとの結合体の反応性の検討）
実験例６で作製した結合体を用いてＩＬ−６タンパク質のＥＬＩＳＡ解析を行った。【０１５４】
より具体的には、ＩＬ−６タンパク質をＥＬＩＳＡプレートに吸着させ、１次抗体として実験例６で作製した結合体を反応させ、２次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗インテレクチン−１  モノクローナル抗体（２Ｄ２）を反応させ、３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅにより検出した。【０１５５】
図１２は実験結果を示すグラフである。その結果、実験例６で作製した結合体は、ＩＬ−６タンパク質に結合することが明らかとなった。【０１５６】
［実験例９］
（ＴＮＦＲ２とインテレクチンとの結合体の反応性の検討）
実験例７で作製した結合体を用いて、溶液中のＴＮＦ−αの吸着除去試験を行った。ヒトＴＮＦ−αを含む培地５０μＬに、実験例７で作製した結合体を段階希釈して加え、室温で３０分反応させた後、ジオールセファロースビーズ３μＬを用いてＴＮＦ−α及び結合体の複合体を吸収した。続いて、上清中のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ法にて測定し、残存するＴＮＦ−αの存在割合を求めた。実験は独立して２回行った。【０１５７】
図１３Ａ及びＢは、それぞれ１回目及び２回目の実験結果を示すグラフである。その結果、実験例７で作製した結合体は、溶液中のＴＮＦ−αを吸着除去できることが示された。【０１５８】
［実験例１０］
（マウスインテレクチン−１及びヒトインテレクチン−１単量体とジオール基との結合）
表面にジオール基を有するビーズ及び表面にジオール基を有しないビーズを準備した。ビーズとしては、実験例１で使用したジオールビーズ、ジオールセファロースビーズ及びヒドロキシビーズを使用した。【０１５９】
インテレクチンとして、野生型マウスインテレクチン−１、及び変異型ヒトインテレクチン−１を使用した。【０１６０】
野生型マウスインテレクチン−１は単量体として産生される。また、マウスインテレクチン−１は、ヒトインテレクチン−１と比較してアミノ酸レベルで５１個のアミノ酸残基が異なっている。【０１６１】
一方、上述したように、野生型ヒトインテレクチン−１は３量体を形成する。また、ヒトインテレクチン−１の３１番目及び４８番目のシステイン残基をそれぞれセリン残基に置換した変異体（Ｃ３１，４８Ｓ）は、ジスルフィド結合を介した３量体を形成せず、単量体として産生される。配列番号９にヒトインテレクチン−１のＣ３１，４８Ｓ（Ｃ３１Ｓ，Ｃ４８Ｓ）変異体のアミノ酸配列を示す。また、配列番号１０に、ヒトインテレクチン−１のＣ３１，４８Ｓ変異体の塩基配列を示す。【０１６２】
まず、リコンビナントマウスインテレクチン−１を含む培地５ｍＬ、又はヒトインテレクチン−１のＣ３１，４８Ｓ変異体を含む培地１ｍＬに各ビーズを加え、２５℃、１８時間撹拌した。【０１６３】
続いて、遠心してビーズを回収後、ビーズを緩衝液で一回洗浄し、１５％グリセロールを含む緩衝液で溶出した。続いて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で試料を分離後、クマシーブリリアントブルーを用いてタンパク質を染色した。
図１４Ａは、マウスインテレクチン−１のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。図１４Ｂはヒトインテレクチン−１のＣ３１，４８Ｓ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。【０１６４】
その結果、マウスインテレクチン−１及びヒトインテレクチン−１のＣ３１，４８Ｓ変異体は、ヒトインテレクチン−１と同様にジオールビーズ及びジオールセファロースビーズに選択的に結合することが明らかとなった。【０１６５】
この結果は、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも５１個の変異が存在していても、ジオール基への結合活性を有することを示す。この結果はまた、単量体のインテレクチンもジオール基への結合活性を有することを示す。【０１６６】
［実験例１１］
（ＴＮＦＲ２とインテレクチンとの結合体とＴＮＦ−αとの親和性の測定）
ビアコア（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、実験例７で作製した結合体とＴＮＦ−αとの親和性を測定した。対照として、市販の抗ＴＮＦ製剤（エタネルセプト、可溶性ＴＮＦ受容体、商品名「エンブレル（登録商標）」、武田薬品工業とＴＮＦ−αとの親和性も測定した。【０１６７】
ＴＮＦ−αとしてはリコンビナントヒトＴＮＦ−α（ライフテクノロジー社）を用いた。ＴＮＦ−αをアナライトとして用い、実験例７で作製した結合体又はエタネルセプトを、アミノ基を介してセンサーチップに固定しリガンドとして用いた。親和性測定の緩衝液として、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０３％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を用いた。【０１６８】
図１５Ａは、実験例７で作製した結合体とＴＮＦ−αとの親和性を測定した結果を示すグラフである。図１５Ｂは、エタネルセプトとＴＮＦ−αとの親和性を測定した結果を示すグラフである。【０１６９】
その結果、実験例７で作製した結合体とＴＮＦ−αとの親和性は、結合速度定数Ｋａ＝１．１４×１０６  Ｍ−１ｓ−１、解離速度定数Ｋｄ＝５．３６×１０−４  ｓ−１、解離定数ＫＤ＝４．６８×１０−１０  Ｍと算出された。【０１７０】
一方、エタネルセプトとＴＮＦ−αとの親和性は、結合速度定数Ｋａ＝１．０９×１０６  Ｍ−１ｓ−１、解離速度定数Ｋｄ＝３．４２×１０−４  ｓ−１、解離定数ＫＤ＝３．１３×１０−１０  Ｍと算出された。【０１７１】
以上の結果から、実験例７で作製した結合体とエタネルセプトとは、ほぼ同等のＴＮＦ−α結合活性を有することが明らかとなった。【０１７２】
［実験例１２］
（ＴＮＦＲ２とインテレクチンとの結合体の、ＴＮＦ−αによる細胞傷害に対する抑制作用の検討）
マウス由来の細胞株であるＬ９２９細胞株の培地に終濃度２．１２μＭのアクチノマイシンＤ、終濃度１ｎｇ／ｍＬのリコンビナントヒトＴＮＦ−α（ライフテクノロジー社）、及び実験例７で作製した結合体を段階希釈したものを添加し、３７℃で２４時間培養した。続いて、市販のキット（型式「ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（商標）」、プロメガ社）を用いて生細胞数を計測し、細胞生存率を求めた。対照として、実験例７で作製した結合体の代わりに市販の抗ＴＮＦ製剤（エタネルセプト、可溶性ＴＮＦ受容体、商品名「エンブレル（登録商標）」、武田薬品工業）を使用した実験も行った。【０１７３】
図１６は、実験結果を示すグラフである。その結果、実験例７で作製した結合体とエタネルセプトとは、ほぼ同等の細胞傷害阻止活性を有することが明らかとなった。【０１７４】
［実験例１３］
（ＴＮＦＲ２とインテレクチンとの結合体の、マウスにおけるリコンビナントヒトＴＮＦ−α誘発致死に対する抑制作用の検討）
７週齢の雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（一群１０匹）に実験例７で作製した結合体２０μｇを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）１５０μＬを尾静脈注射により投与し、試験群とした。対照群のマウスには、ＰＢＳのみを１５０μＬ尾静脈注射により投与した。【０１７５】
続いて、１８ｍｇのガラクトサミンと１．５μｇのリコンビナントヒトＴＮＦ−α（ライフテクノロジーズ社）との混合物を含むＰＢＳ  １ｍＬを腹腔内に投与し、生存状態を継時的に観察した。【０１７６】
図１７は、実験結果を示すグラフである。その結果、対照群のマウスは１２時間以内に全頭死亡したが、試験群のマウスには、４日後まで衰弱又は死亡する個体がいなかったため、４日後に観察を終了した。【０１７７】
以上の結果から、実験例７で作製した結合体は、マウスにおけるＴＮＦ−α誘発致死を抑制できることが明らかとなった。【０１７８】
［実験例１４］
（ヒト血清中インテレクチンのジオール修飾シリカゲルへの吸着）
１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した又は添加していない、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈した、５０％新鮮ヒト血清４０μＬを、ジオール修飾シリカゲルを坦体とするゲル濾過クロマトグラフィカラム（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬ  東ソー株式会社）に添加し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０−１５０ｍＭ  ＮａＣｌ−５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を溶媒としてゲル濾過を行った。続いて、溶出画分のインテレクチン濃度をＥＬＩＳＡ法により測定した。【０１７９】
図１８は、実験結果を示すグラフである。その結果、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した血清サンプルでは、インテレクチンはカラムに結合せず、溶出液量１１ｍＬ付近にインテレクチンのピークが検出された（図中、矢印で示す。）。これに対し、ＥＤＴＡを添加しなかった血清サンプルでは、いずれの画分においてもインテレクチンは検出されず、インテレクチンがカラムに吸着したことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明によれば、例えば抗体等の生物学的に活性なタンパク質を低コストで容易に精製することができる技術を提供することができる。また、結合体、ベクター、医薬組成物、医薬、結合体の精製方法、結合体捕捉用固相、標的物質除去方法、標的物質除去装置、結合体検出用標識化合物、結合体の検出方法、化合物検出用結合体及び化合物の検出方法を提供することができる。
【符号の説明】
【０１８１】
１００…医薬組成物、１１０…薬物、１２０，２５１…化合物、１３０…担体、１４０，２３０，４３０…結合体（除去手段）、１４１…インテレクチン又はその変異体、１４２…抗体、３００，４００…標的物質除去装置、２１０…標的物質、２２０，２２０’…血漿、２４０…複合体、２５０…固相（除去手段）、２５５…カラム、２６０…血液回路、２７０ａ，２７０ｂ…ポンプ、２８０…血漿分離装置、２９０…血漿回路。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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