(57)【要約】  この出願は、（ａ）配列表の配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び該アミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、（ｂ）上記配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、及び該ポリペプチドのアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、及び（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド、から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、あるいは上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含む免疫誘導剤を提供する。
2016175309.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチド類から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能にする組換えベクター、を有効成分として含む免疫誘導剤。
（ａ）配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び該アミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、及び該ポリペプチドのアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
【請求項２】
前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の免疫誘導剤。
【請求項３】
抗原提示細胞の処理用である、請求項１又は２に記載の免疫誘導剤。
【請求項４】
癌の治療及び／又は予防用である、請求項１又は２に記載の免疫誘導剤。
【請求項５】
前記癌がＣＳＰＧ５を発現する癌である、請求項４に記載の免疫誘導剤。
【請求項６】
前記癌が脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、又は神経芽腫である、請求項４又は５に記載の免疫誘導剤。
【請求項７】
免疫増強剤をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
【請求項８】
前記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、並びにＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも一つである、請求項７に記載の免疫誘導剤。
【請求項９】
請求項１に定義するポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ  ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法。
【請求項１０】
前記抗原提示細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の方法によって得られる抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ  ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、請求項１に定義するポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法。
【請求項１２】
請求項９又は１０に記載の方法によって得られる、かつ請求項１に定義するポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含むことを特徴とする、抗原提示細胞。
【請求項１３】
請求項１１記載の方法によって得られる、かつ請求項１に定義するポリペプチドに特異的であることを特徴とする、細胞障害性Ｔ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規な免疫誘導剤に関する。【０００２】
本発明はまた、癌免疫療法に使用するための抗原提示細胞又は細胞障害性Ｔ細胞、或いは該細胞の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原や癌抗原をコードする遺伝子が同定されたことにより、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている。【０００４】
免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド又はタンパク質は、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが必要とされる。１９９１年、ベルギーＬｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献１）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）法が報告され（特許文献１、非特許文献２）、この方法により、いくつかの癌抗原が単離されている。さらに、その一部をターゲットにして癌免疫療法の臨床試験が開始されている。【０００５】
一方、ヒトと同様、イヌやネコにも乳腺腫瘍、扁平上皮癌など多数の腫瘍が知られており、イヌやネコの疾病統計でも上位にランクされている。しかしながらイヌやネコの癌に対する有効な治療薬、予防薬及び診断薬は現在のところ存在しない。大部分のイヌやネコの腫瘍は、進行して腫瘤が大きくなってから飼い主が気付くケースがほとんどで、来院して外科的手術により切除したり、人体薬（抗癌剤など）を投与したりしても、すでに手遅れで処置後まもなく死亡することが多い。このような現状の中で、イヌやネコに有効な癌の治療薬及び予防薬が入手可能になれば、イヌの癌に対する用途が開かれると期待される。【０００６】
Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ５（ＣＳＰＧ５）は１型の膜貫通タンパク質であり、ニューレグリンファミリータンパク質の１つである。また、ＥｒｂＢ３に結合し増殖因子として作用すること、ＢＲＣＡ１に変異がある卵巣癌において発現が上昇していることが報告されている（非特許文献３，４）。また、ＣＳＰＧ５は網膜神経節細胞やプルキンエ細胞、海馬等の神経系の組織で高発現し、神経細胞の増殖・分化因子として作用することで神経軸索突起の伸長に関与することが知られる（非特許文献５，６，７）。しかし、ＣＳＰＧ５タンパク質が癌細胞に対する免疫誘導活性を有し、それによって該タンパク質が癌の治療や予防に有用であるという報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５６９８３９６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Bruggen, P. et al., Science, 254:1643-1647（1991）
【非特許文献２】Sahin, U et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813（1995）
【非特許文献３】Kinugasa, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 321:1045（2004）
【非特許文献４】Press, JZ. et al., Neoplasia. Dec;12（12）:993-1002.（2010）
【非特許文献５】Yasuda, Y. et al., Neurosci. Res. 32:313（1998）
【非特許文献６】Aono, S. et al., J. Neurosci. Res.83:110（2006）
【非特許文献７】Nakanishi, K. et al., J. Biol. Chem. 281:24970（2006）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規なポリペプチドを見出し、該ポリペプチドの免疫誘導剤への使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、そのｃＤＮＡを基にして、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するイヌＣｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ５（以下、「ＣＳＰＧ５」と記載する）のポリペプチドを作製した。また、取得した遺伝子のヒト、ネコ及びマウス相同性遺伝子を基にして、配列番号４，６，８，１０、１２、１４及び１６で示されるアミノ酸配列を有するヒト、ネコ及びマウスＣＳＰＧ５ポリペプチドを作製した。そしてこれらＣＳＰＧ５ポリペプチドが乳癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、白血病、悪性リンパ腫、腺癌、肥満細胞腫、扁平上皮癌、メラノーマ又は神経芽腫の組織又は細胞に特異的に発現していることを見出した。さらにまた、これらＣＳＰＧ５を生体に投与することによって、生体内にＣＳＰＧ５に対する免疫細胞を誘導することができること、及びＣＳＰＧ５を発現する生体内の腫瘍を退縮させることができることを見出した。さらにまた、ＣＳＰＧ５のポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドを発現可能な組換えベクターが、ＣＳＰＧ５を発現する癌に対し生体内で抗腫瘍効果を誘導することを見出した。【００１１】
さらにまた、ＣＳＰＧ５のポリペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有すること、このため、該ポリペプチドが癌の治療及び／又は予防に有用であり、また、該ポリペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防に有用であることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
従って、本発明は、以下の特徴を有する。
（１）（ｉ）以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチド類から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能にする組換えベクター、を有効成分として含む免疫誘導剤。
（ａ）配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び該アミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、及び該ポリペプチドのアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
（２）前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、前記（１）に記載の免疫誘導剤。
（３）抗原提示細胞の処理用である、前記（１）又は（２）に記載の免疫誘導剤。
（４）癌の治療及び／又は予防用である、前記（１）又は（２）に記載の免疫誘導剤。
（５）前記癌がＣＳＰＧ５を発現する癌である、前記（４）に記載の免疫誘導剤。
（６）前記癌が脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、又は神経芽腫である、前記（４）又は（５）に記載の免疫誘導剤。
（７）免疫増強剤をさらに含む、前記（１）〜（６）のいずれかに記載の免疫誘導剤。
（８）前記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、並びにＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも一つである、前記（７）に記載の免疫誘導剤。
（９）前記（１）に定義するポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ  ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法。
（１０）前記抗原提示細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞である、前記（９）に記載の方法。
（１１）前記（９）又は（１０）に記載の方法によって得られる抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ  ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、前記（１）に定義するポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法。
（１２）前記（９）又は（１０）に記載の方法によって得られる、かつ前記（１）に定義するポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含むことを特徴とする、抗原提示細胞。
（１３）前記（１１）に記載の方法によって得られる、かつ前記（１）に定義するポリペプチドに特異的であることを特徴とする、細胞障害性Ｔ細胞。【００１３】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-093354号の開示内容を包含する。【００１４】
本発明により、癌の治療及び／又は予防等に有用な新規な免疫誘導剤が提供される。後述の実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするベクターを被験体に投与すると、被験体の生体内において免疫細胞を誘導することができ、さらに、既に生じている癌を縮小もしくは退縮させることができる。従って、該ポリペプチド又は該ベクターは癌の治療や予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】同定したＣＳＰＧ５遺伝子の、図示したイヌ腫瘍組織あるいは癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；イヌＣＳＰＧ５遺伝子のイヌの各組織及び細胞株での発現パターン、参照番号２；イヌＧＡＰＤＨ遺伝子のイヌの各組織及び細胞株での発現パターン。
【図２】同定したＣＳＰＧ５遺伝子の、図示したヒト腫瘍組織あるいは癌細胞株での発現パターンを示す図である。ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のヒトの各組織及び細胞株での発現はすべて認められた。
【図３】同定したＣＳＰＧ５遺伝子の、図示したマウス腫瘍組織あるいは癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号３；マウスＣＳＰＧ５遺伝子のマウスの各組織及び細胞株での発現パターン、参照番号４；マウスＧＡＰＤＨ遺伝子のマウスの各組織及び細胞株での発現パターンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明をさらに詳細に説明する。
１．ポリペプチド
本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれる、免疫誘導活性を有するポリペプチドとしては、以下の（ａ）〜（ｃ）のものが挙げられる。
【００１７】
（ａ）配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、又は該ポリペプチドのアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
【００１８】
本明細書において「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長タンパク質も包含され、本発明では配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列を有するＣＳＰＧ５の全長タンパク質も包含される。
【００１９】
本明細書において、「アミノ酸配列を有する」とは、特に断らない限り、アミノ酸配列に示された順序でアミノ酸残基が配列していることを意味する。従って、例えば、「配列番号８によって表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号８に示されるＭｅｔ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｌａ，Ｇｌｙ・・（中略）・・Ａｓｎ，Ａｓｎ，Ｌｅｕ，Ｔｈｒのアミノ酸配列をもつ、５６６アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号８によって表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号８のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。これらの場合、「アミノ酸配列を有する」又は「塩基配列を有する」における「有する」という用語は、特に断らない限り、「からなる」という表現で置き換えてもよい。
【００２０】
本明細書において、「免疫誘導活性」とは、被験体の生体内でインターフェロン等のサイトカインを分泌する免疫細胞を誘導する能力を意味する。
【００２１】
本明細書において、「被験体」とは、癌（もしくは腫瘍）の治療又は予防のために本発明の免疫誘導剤による免疫誘導を必要とする動物、好ましくは哺乳動物を指し、例えばヒト、イヌやネコなどのペット動物、動物園等で飼育されるパンダなどの動物、ウシなどの家畜動物、ウマなどの競技用動物などを含む。
【００２２】
上記ポリペプチドが免疫誘導活性を有するか否かは、例えば公知のエリスポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ  Ａｓｓａｙ；Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ａｓｓａｙ）等を用いて確認することができる。具体的には、例えば後述の実施例に記載されるように、免疫誘導活性を評価すべきポリペプチドが投与された動物から末梢血単核球等の細胞を得て、該細胞を該ポリペプチドと共存培養し、該細胞からのサイトカイン産生量を、特異抗体を用いて測定することにより、該細胞中の免疫細胞数を測定することができるので、これにより免疫誘導活性を評価することができる。
【００２３】
また、後述の実施例に記載されるように、上記（ａ）〜（ｃ）のポリペプチド（好ましくは、組換えポリペプチド）を担癌生体に投与すると、その免疫誘導活性により腫瘍を退縮させることができる。よって、上記免疫誘導活性は、癌細胞の増殖を抑制し又は癌組織（腫瘍）を縮小若しくは消滅させる能力（以下、「抗腫瘍活性」という）として評価することもできる。ポリペプチドの抗腫瘍活性は、例えば後述の実施例に具体的に記載されるように、実際に該ポリペプチドを担癌動物に投与して腫瘍が縮小等されるか否かを調べることよって確認することができる。また、該ポリペプチドを担癌動物に投与して誘導された細胞障害性Ｔ細胞が、腫瘍に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによってポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。生体内におけるＴ細胞の細胞障害活性の測定は、例えばＴ細胞を生体内から除去する抗体を担癌動物に投与し、腫瘍が縮小等されるか否かを調べることよって確認することができるがこれに限定されない。
【００２４】
あるいは、上記ポリペプチドで刺激したＴ細胞（すなわち、該ポリペプチドを提示する抗原提示細胞と接触させたＴ細胞）が、生体外で腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによって、ポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。Ｔ細胞と抗原提示細胞との接触は、後述するように、両者を液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。細胞障害活性の測定は、例えばＤ．Ｄ．  Ｋｈａｒｋｅｖｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：３１７−３２３，１９９４に記載された５１Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法により行なうことができる。上記ポリペプチドを癌の治療及び／又は予防用途に用いる場合には、特に限定されないが、抗腫瘍活性を指標として免疫誘導活性を評価することが好ましい。
【００２５】
本発明が開示する配列表の配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列は、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に存在する特異的な抗体と結合するポリペプチド及びそのヒト、ネコ、およびマウス相同因子として単離された、ＣＳＰＧ５のアミノ酸配列である（実施例１参照）。イヌＣＳＰＧ５のヒト相同因子であるヒトＣＳＰＧ５では、配列同一性が塩基配列８７％、アミノ酸配列８７％であり、ネコ相同因子であるネコＣＳＰＧ５では配列同一性は塩基配列９２％、アミノ酸配列９１％であり、マウス相同因子であるマウスＣＳＰＧ５では配列同一性は塩基配列８４％、アミノ酸配列８５％である。
【００２６】
上記（ａ）のポリペプチドは、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上、好ましくは連続する８、９又は１０個以上のアミノ酸からなるポリペプチドであって、免疫誘導活性を有するものである。より好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号８で示されるアミノ酸配列と配列同一性が８５％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、特に好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列を有する。なお、この分野で公知の通り、約７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性及び免疫原性を発揮できる。従って、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４のアミノ酸配列中の連続する７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば、免疫誘導活性を有し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。
【００２７】
また、癌抗原ポリペプチドを投与することによる免疫誘導の原理として、ポリペプチドが抗原提示細胞に取り込まれ、その後該細胞内でペプチダーゼによる分解を受けてより小さな断片となり、該細胞の表面上に提示され、それを細胞障害性Ｔ細胞等の免疫細胞が認識し、その抗原を提示している細胞を選択的に死滅させることが知られている。抗原提示細胞の表面上に提示されるポリペプチドのサイズは比較的小さく、アミノ酸数で７〜３０程度である。従って、抗原提示細胞上に提示させるという観点からは、上記（ａ）のポリペプチドとしては、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列中の連続する７〜３０程度であることが好ましい態様のひとつであり、より好ましくは８〜３０もしくは９〜３０程度のアミノ酸からなるものであれば十分である。これら比較的小さなサイズのポリペプチドは、抗原提示細胞内に取り込まれることなく、直接抗原提示細胞上の細胞表面に提示される場合もある。
【００２８】
また、抗原提示細胞に取り込まれたポリペプチドは、該細胞内のペプチダーゼによりランダムな位置で切断を受けて、種々のポリペプチド断片が生じ、これらのポリペプチド断片が抗原提示細胞表面上に提示されるので、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４の全長領域のように大きなサイズのポリペプチドを投与すれば、抗原提示細胞内での分解によって、抗原提示細胞を介する免疫誘導に有効なポリペプチド断片が必然的に生じる。従って、抗原提示細胞を介する免疫誘導にとっても、サイズの大きなポリペプチドを好ましく用いることができ、アミノ酸数を３０以上、さらに好ましくは１００以上、さらに好ましくは２００以上、さらに好ましくは２５０以上、さらに好ましくは配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４の全長領域のポリペプチドとしてもよい。
【００２９】
上記（ｂ）のポリペプチドは、上記（ａ）に記載の配列表の配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのうちの少数の（好ましくは、１個もしくは数個の）アミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加もしくは挿入された、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチド、あるいは、未改変の元の配列と８５％以上、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加もしくは挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、上記（ｂ）のポリペプチドも免疫誘導活性を発揮し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。また、上記（ｂ）のポリペプチドは、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列のうち、１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加もしくは挿入されたポリペプチドであることも好ましい。本明細書中の「数個」とは、２〜１０の整数、好ましくは２〜６の整数、さらに好ましくは２〜４の整数を表す。
【００３０】
本明細書において、アミノ酸配列（又は塩基配列）の「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列（又は塩基配列）のアミノ酸残基（又は塩基）ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列（又は塩基配列）を整列させ、一致したアミノ酸残基数（又は一致した塩基数）を全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のアルゴリズムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
【００３１】
なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）のように類似の性質を有するものにグループ分けが可能であり、グループ内のアミノ酸間での置換であればポリペプチドの性質が変化しない場合が多いことが知られている。従って、上記（ａ）のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループ内のアミノ酸間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなるため、好ましい。
【００３２】
上記（ｃ）のポリペプチドは、上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。すなわち、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの一端又は両端に他の少なくとも１個のアミノ酸残基又は他の（単数若しくは複数の）ポリペプチドが付加されたものであって、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドも、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。
【００３３】
上記ポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の公知のペプチド合成法などの化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
【００３４】
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡは、イヌ染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡであれば、上記鋳型としてヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを使用することにより同様に調製できる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。また、本明細書中の配列表のそれぞれ配列番号１及び３に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてイヌやヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２、４のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラバイオロジー（ジョン・ウイリィ・アンド・サンズ）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、上記（ａ）のポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができるので、そのようなポリヌクレオチドも、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に合成することができる。
【００３５】
上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、シャイン−ダルガルノ配列（もしくは、リボソーム結合部位）、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。
【００３７】
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
【００３８】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の周知の方法を用いることができる。
【００３９】
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
以上の方法によって得られるポリペプチドには、上述した通り、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はＨｉｓタグとの融合タンパク質などが例示できる。このような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、上記（ｃ）のポリペプチドとして本発明の範囲に含まれる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、免疫誘導活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
２．免疫誘導剤
後述の実施例に具体的に記載される通り、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチドを担癌動物に投与すると、既に生じている腫瘍を退縮させることができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療及び／又は予防用として用いることができる。また、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチドは、免疫誘導による癌の治療及び／又は予防方法に用いることができる。
【００４１】
本明細書において、「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
【００４２】
この場合、対象となる癌としては、ＣＳＰＧ５を発現している癌であることが好ましく、より好ましくは乳癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、白血病、悪性リンパ腫、腺癌、肥満細胞腫、扁平上皮癌、メラノーマ又は神経芽腫であり、特に好ましくは乳癌、肺癌、脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、肥満細胞腫、メラノーマ又は神経芽腫である。
【００４３】
また、対象となる動物（被験体）は、上記のとおり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは霊長類、ペット動物、動物園等で飼育されている動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、特に好ましくはヒト、イヌ又はネコである。
【００４４】
本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。癌の治療目的で該免疫誘導剤を用いる場合には、抗癌作用を高めるため、後述の実施例に記載するように、治療対象となる腫瘍の近傍の所属リンパ節に投与することもできる。投与量は、免疫誘導するのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよい。癌の治療及び／又は予防に有効な量は、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象動物に対し１日当りの有効量として０．０００１〜１０００μｇ、好ましくは０．００１〜１０００μｇであり、１回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。後述の実施例に具体的に示されるとおり、本発明の免疫誘導剤は、既に形成されている腫瘍を退縮させることができる。従って、発生初期の少数の癌細胞にも抗癌作用を発揮し得るので、癌の発症前や癌の治療後に用いれば、癌の発症や再発を防止することができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療と予防の双方に有用である。
【００４５】
本発明の免疫誘導剤は、ポリペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、製薬上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。ここで「製剤」は、「免疫誘導用組成物」及び「免疫誘導用医薬品」と互換的に使用してもよい。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。添加剤の具体例としては、生理緩衝液のような希釈剤；砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等のような賦形剤；シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等のような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等の滑沢剤等が挙げられるが、これらに限定されない。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。
【００４６】
本発明の免疫誘導剤は、生体内での免疫学的応答を強化することができる免疫増強剤と組み合わせて用いることができる。免疫増強剤は、本発明の免疫誘導剤に含まれていてもよいし、別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与してもよい。
【００４７】
上記免疫増強剤としては、例えばアジュバントを挙げることができる。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外又はマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、抗癌作用を高めることができる。従って、特に、本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防に用いる場合、免疫誘導剤は、有効成分たる上記ポリペプチドに加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。多数の種類のアジュバントが当業界で周知であり、いずれのアジュバントでも用いることができる。アジュバントの具体例としては、ＭＰＬ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、サルモネラ属のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｒｅ  ５９５リポ多糖類の精製及び酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、Ｑｕｉｌｌｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８及びＱＳ−Ｌ１（ソ（Ｓｏ）ら、「モレキュルズ・アンド・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｓ）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８−１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン若しくは水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Ｋｒｅｉｇ）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３７４巻、ｐ．５４６−５４９を参照）；ポリＩＣ及びその誘導体（ポリＩＣＬＣ等）ならびにスクアレン及び／又はトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルション；αガラクトシルセラミドなどが挙げられる。中でも、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体並びにＣｐＧオリゴヌクレオチドが好ましい。上記アジュバントとポリペプチドの混合比は、典型的には約１：１０〜１０：１、好ましくは約１：５〜５：１、より好ましくは約１：１である。ただし、アジュバントは上記例示に限定されず、当業界で公知の上記以外のアジュバントも本発明の免疫誘導剤を投与する際に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Ｇｏｄｉｎｇ）著，「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、第２版、１９８６年を参照）。ポリペプチド及びアジュバントの混合物又はエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。
【００４８】
また、上記免疫増強剤としては、上記アジュバント以外にも、対象の免疫応答を刺激する因子を用いることもできる。例えば、リンパ球や抗原提示細胞を刺激する特性を有する各種サイトカインを免疫増強剤として本発明の免疫誘導剤と組み合わせて用いることができる。そのような免疫学的応答を増強可能な多数のサイトカインが当業者に公知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ及びＦｌｔ３リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。このような因子も上記免疫増強剤として用いることができ、本発明の免疫誘導剤に含ませて、又は別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与することができる。
【００４９】
また、上記ポリペプチドと（被験体由来の）抗原提示細胞とをｅｘ  ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、上記した（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理用として使用し得る。ここで、抗原提示細胞としては、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＭＨＣクラスＩ分子が同定されており、周知である。ヒトにおけるＭＨＣ分子はＨＬＡと呼ぶ。ＨＬＡクラスＩ分子としては、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃを挙げることができ、より具体的には、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ０２０１、ＨＬＡ−Ａ０２０４、ＨＬＡ−Ａ０２０５、ＨＬＡ−Ａ０２０６、ＨＬＡ−Ａ０２０７、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ａ３１、ＨＬＡ−Ａ６８０１、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ２７０５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｃｗ０４０１、ＨＬＡ−Ｃｗ０６０２などを挙げることができる。
【００５０】
上記ポリペプチドを抗原提示細胞の処理用として使用する例として、下記３．で説明するように、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞を作製すること、及び、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を作製することなどへのポリペプチドの使用を挙げることができる。
【００５１】
ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）とＩＬ−３（あるいはＩＬ−４）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。
【００５２】
この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血又は骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で１０〜１０００ｎｇ／ｍＬ程度が好ましく、より好ましくは２０〜５００ｎｇ／ｍＬ程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である３７℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、５％ＣＯ２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常３日〜２週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。
【００５３】
さらにまた、本発明によれば、上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ、該ポリペプチドを投与するのと同等の癌に対する上記治療及び予防等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。後述の実施例に示されるように、このような抗原ポリペプチドを発現可能な組換えベクターは、遺伝子ワクチンとも呼ばれる。
【００５４】
遺伝子ワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。
【００５５】
遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で０．１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ程度である。
【００５６】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み、これを対象動物に感染させる方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
【００５７】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００５８】
本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ方法、及び対象動物からある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ方法があるが（日経サイエンス（日本），１９９４年４月，ｐ２０−４５、月刊薬事（日本），１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３−４８、実験医学増刊（日本），１９９４年，第１２巻，第１５号、及びこれらの引用文献等）、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法がより好ましい。
【００５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、製薬上許容可能な担体（例えば、生理食塩水、緩衝液、等）を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソーム又は膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００６０】
なお、本発明において、「配列番号１に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、「配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。
３．抗原提示細胞又は細胞障害性Ｔ細胞
本発明はさらに、上記のポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ  ｖｉｖｏ又はインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法を提供する。
【００６１】
本発明はまた、この方法によって得られる、かつ上記のポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含むことを特徴とする、抗原提示細胞を提供する。
【００６２】
上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをｅｘ  ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させる方法自体は、周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地については、市販の抗原提示細胞培養培地を使用することができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは５〜２０μｇ／ｍｌ程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常１０３〜１０７細胞／ｍｌ程度、好ましくは５×１０４〜５×１０６細胞／ｍｌ程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをｅｘ  ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。
【００６３】
上記したポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、該ポリペプチドが抗原提示細胞のＭＨＣ分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。このような抗原提示細胞は、生体内又は、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ポリペプチドを提示し、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。
【００６４】
本発明はさらに、上記の抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ  ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、上記のポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法を提供する。
【００６５】
本発明はまた、この方法によって得られる、かつ上記のポリペプチドに特異的であることを特徴とする、細胞障害性Ｔ細胞を提供する。
【００６６】
上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とｅｘ  ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で約１：１〜約１：１００、好ましくは約１：５〜約１：２０である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、約１００〜１０００万細胞／ｍｌ、好ましくは約１００００〜１００万細胞／ｍｌである。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。培地については、市販の抗原提示細胞／Ｔ細胞培養培地を使用することができる。培養時間は、特に限定されないが、通常、約２日〜３週間、好ましくは約４日〜２週間程度である。また、共存培養は、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７及びＩＬ−１２のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、ＩＬ−２及びＩＬ−７の濃度は、通常約５〜２０Ｕ／ｍｌ、ＩＬ−６の濃度は通常約５００〜２０００Ｕ／ｍｌ、ＩＬ−１２の濃度は通常約５〜２０ｎｇ／ｍｌであるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。
【００６７】
上記の共存培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞を調製することができる。
【００６８】
後述の実施例に記載される通り、ＣＳＰＧ５遺伝子は、乳癌細胞、乳癌組織、肺癌細胞、肺癌組織、肝臓癌細胞、肝臓癌組織、脳腫瘍細胞、脳腫瘍組織、卵巣癌細胞、卵巣癌組織、白血病、悪性リンパ腫、腺癌細胞、腺癌組織、肥満細胞腫、扁平上皮癌細胞、メラノーマ細胞又は神経芽腫細胞に特異的に発現している。従って、これらの癌腫においては、ＣＳＰＧ５が正常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。したがって、癌細胞内に存在するＣＳＰＧ５のポリペプチドの一部が癌細胞表面上のＭＨＣ分子に提示されるよう、上記のようにして調製した細胞障害性Ｔ細胞が生体内に投与されると、これを目印として細胞障害性Ｔ細胞が癌細胞を障害することができる。また、ＣＳＰＧ５のポリペプチドの一部を提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害することができる。すなわち、上記ポリペプチドを用いて調製された上記細胞障害性Ｔ細胞や上記抗原提示細胞もまた、本発明の免疫誘導剤と同様に、癌の治療及び／又は予防用として有用である。
【００６９】
上記した単離抗原提示細胞や単離Ｔ細胞を生体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。
【００７０】
抗原提示細胞又は単離Ｔ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常１個〜１０兆個、好ましくは１００万個〜１０億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲は、該実施例によって制限されないものとする。
［実施例１］
＜ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの取得＞
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
犬の精巣から酸グアニジウム−フェノール−クロロフォルム法（Ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造株式会社、京都、日本国）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ  ＲＮＡを精製した。【００７２】
この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ，Ｚａｐ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは１×１０６ｐｆｕ／ｍｌであった。【００７３】
（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
上記作製したｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２３４０クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ'）に感染させ、４２℃、３〜４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｃ  Ｅｘｔｒａ：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｃｅ社）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２〜３時間反応させた。【００７４】
上記患犬血清としては、乳癌の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１−ＢＬｕｅ  ＭＲＦ'）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次で０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ−カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。【００７５】
かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含ＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  Ｄｏｇ  ＩｇＧ−ｈ＋Ｉ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、室温１時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％  ゼラチン  ｐＨ７．５）５００μｌに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する９１１０個のファージクローンをスクリーニングして、１個の陽性クローンを単離した。【００７６】
（３）単離抗原遺伝子の配列同一性検索
上記方法により単離した１個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ'）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１００μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ  （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５〜３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い、上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μｌをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。【００７７】
精製したプラスミドは、配列番号１７に記載のＴ３プライマーと配列番号１８に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号１に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を用いて、配列同一性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を行い既知遺伝子との配列同一性検索を行った結果、得られた遺伝子はＣＳＰＧ５遺伝子であることが判明した。イヌＣＳＰＧ５のヒト相同因子であるヒトＣＳＰＧ５では、配列同一性が塩基配列８７％、アミノ酸配列８７％であり、ネコＣＳＰＧ５では、配列同一性が塩基配列９２％、アミノ酸配列９１％であり、マウス相同因子であるマウスＣＳＰＧ５では、配列同一性が塩基配列８４％、アミノ酸配列８５％であった。ヒトＣＳＰＧ５の塩基配列を配列番号３、５、７、９又は１１、アミノ酸配列を配列番号４、６、８、１０又は１２に、ネコＣＳＰＧ５の塩基配列を配列番号１３、アミノ酸配列を配列番号１４に、マウスＣＳＰＧ５の塩基配列を配列番号１５、アミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。【００７８】
（４）各組織での発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ、ヒト及びマウスの各種ヒト正常組織及び各種癌組織および癌細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０〜１００ｍｇ及び各細胞株５〜１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、海馬、精巣、結腸、胎盤）のｃＤＮＡは、ジーンプールｃＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（クロンテック社）及びＬａｒｇｅ−Ｉｎｓｅｒｔ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテック社）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（イヌプライマーは配列番号１９及び２０、ヒトプライマーは配列番号２１及び２２、マウスプライマーは配列番号２３及び２４に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社）を用いて、９４℃−３０秒、５５℃−３０秒、７２℃−１分のサイクルを３０回繰り返して行った。比較対照のため、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（イヌ及びヒトＧＡＰＤＨプライマーは配列番号２５及び２６、マウスＧＡＰＤＨプライマーは配列番号２７及び２８に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、イヌＣＳＰＧ５遺伝子は、健常なイヌ組織ではほとんどの組織で発現が見られず、一方イヌ腫瘍組織では強い発現が見られた。ヒト及びマウスＣＳＰＧ５遺伝子の発現も、イヌＣＳＰＧ５遺伝子と同様、ヒト及びマウス正常組織ではほとんど発現が確認できず、癌細胞では乳癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、白血病、悪性リンパ腫の細胞株で発現が検出された（図２、図３）。
［実施例２］
＜ＣＳＰＧ５の生体内での癌抗原性の解析＞
（１）生体内でＣＳＰＧ５を発現する組換えベクターの作製
配列番号１５の塩基配列を基に、以下の方法にて、生体内でＣＳＰＧ５を発現する組換えベクターを作製した。ＰＣＲは、実施例１において発現の見られたマウス神経芽腫細胞株１（Ｎ２ａ：ＡＴＣＣより購入）より調製した。ｃＤＮＡを１μｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号２９及び３０に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社）となるように各試薬と添付バッファーを加えて全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社）を用いて、９８℃−１０秒、５５℃−１５秒、７２℃−４分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号１５のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。【００７９】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ制限酵素で処理した哺乳類発現ベクターＰＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した。このベクターの使用により哺乳類の細胞内でＣＳＰＧ５タンパクが産生される。【００８０】
上記で作製したプラスミドＤＮＡ１００μｇに５０μｇの金粒子（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）、スペルミジン１００μｌ（ＳＩＧＭＡ社）、１Ｍ  ＣａＣｌ２  １００μｌ（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ボルテックスによって攪拌し１０分室温で静置した（以後「金−ＤＮＡ粒子」と記載する）。３０００ｒｐｍで１分遠心した後、上清を捨て１００％エタノール（ＷＡＫＯ社）によって３回洗浄した。金−ＤＮＡ粒子に１００％エタノール６ｍｌを加えボルテックスによって十分に攪拌した後、金−ＤＮＡ粒子をＴｅｆｚｅｌ  Ｔｕｂｉｎｇ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）に流し込み、壁面に沈殿させた。金−ＤＮＡ粒子が付着したＴｅｆｚｅｌ  Ｔｕｂｉｎｇのエタノールを風乾し、遺伝子銃に適した長さにカットした。【００８１】
（２）ＤＮＡワクチン法によるＣＳＰＧ５の抗腫瘍効果
１０匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）に対して、上記で作製したチューブを遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与した後に（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）マウス神経芽腫細胞株Ｎ２ａ細胞を移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、ＣＳＰＧ５遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを各モデルで１０匹ずつ投与した。【００８２】
抗腫瘍効果は、腫瘍の大きさ（長径×短径２／２）及び生存マウスの割合で評価した。本検討の結果、予防モデルにおいて、２１日後には、コントロール群及びＣＳＰＧ５プラスミド投与群で、それぞれ、１８６６ｍｍ３、４５９ｍｍ３となり、ＣＳＰＧ５プラスミド投与群では腫瘍の顕著な退縮が観察された。また、生存の経過を観察した結果、予防モデルにおいて、コントロール群では投与後５４日で全例死亡したのに対し、ＣＳＰＧ５プラスミド投与群では、６０％のマウスが生存していた。以上の結果から、ＣＳＰＧ５プラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、各種癌に対して抗腫瘍活性を発揮するポリペプチドを含む免疫誘導剤を提供するため、癌の治療及び／又は予防に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列番号１７：Ｔ３プライマー
配列番号１８：Ｔ７プライマー
配列番号１９：イヌＲＴプライマーセンス
配列番号２０：イヌＲＴプライマーアンチセンス
配列番号２１：ヒトＲＴプライマーセンス
配列番号２２：ヒトＲＴプライマーアンチセンス
配列番号２３：マウスＲＴプライマーセンス
配列番号２４：マウスＲＴプライマーアンチセンス
配列番号２５及び２６：ＧＡＰＤＨプライマー
配列番号２７及び２８：ＧＡＰＤＨプライマー
配列番号２９：ｍｕｓ−ｆｕｌｌＣＳＰＧ５プライマーセンス
配列番号３０：ｍｕｓ−ｆｕｌｌＣＳＰＧ５プライマーアンチセンス
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2016175309.tif 000003
【図２】
2016175309.tif 000004
【図３】
2016175309.tif 000005
【配列表】
2016175309000001.app
【国際調査報告】
2016175309.tif 000006
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2016175309.tif 000008
2016175309.tif 000009
2016175309.tif 000010
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