(57)【要約】  本発明の課題は、短時間で製造することができ、かつ所定以上の大きさを有する細胞構造体、及び上記細胞構造体の製造方法を提供することである。本発明によれば、生体親和性高分子ブロックと、２種類以上の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、２種類以上の細胞が、血管内皮細胞、心筋細胞、膵島細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、角膜上皮細胞及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第一の細胞と、間葉系細胞、間質細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第二の細胞とを含む、細胞構造体が提供される。
2017010414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体親和性高分子ブロックと、２種類以上の細胞とを含み、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、前記２種類以上の細胞が、血管内皮細胞、心筋細胞、膵島細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、角膜上皮細胞及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第一の細胞と、間葉系細胞、間質細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第二の細胞とを含む、前記細胞構造体。
【請求項２】
前記第一の細胞と前記第二の細胞との細胞数の比率が９：１〜１：９９である、請求項１に記載の細胞構造体。
【請求項３】
前記生体親和性高分子ブロックの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の細胞構造体。
【請求項４】
厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下である、請求項１から３の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項５】
前記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下である、請求項１から４の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項６】
前記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が架橋されている、請求項１から５の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項７】
前記生体親和性高分子ブロックの架橋度が２以上であり、かつ前記生体親和性高分子ブロックの吸水率が３００％以上である、請求項６に記載の細胞構造体。
【請求項８】
前記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子を含有する固形物を粉砕することにより得られる生体親和性高分子ブロックである、請求項１から７の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項９】
前記固形物が、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得られた固形物である、請求項８に記載の細胞構造体。
【請求項１０】
細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項１から９の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１１】
生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項１から１０の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１２】
リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、請求項１１に記載の細胞構造体。
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項１３】
リコンビナントゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、請求項１１又は１２に記載の細胞構造体。
【請求項１４】
前記第一の細胞が、血管内皮細胞又は肝細胞であり、前記第二の細胞が、線維芽細胞、平滑筋細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１から１３の何れか一項に記載の細胞構造体。
【請求項１５】
生体親和性高分子ブロックと、２種類以上の細胞を含有する培養液との混合物をインキュベートすることを含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の細胞構造体の製造方法であって、前記２種類以上の細胞が、血管内皮細胞、心筋細胞、膵島細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、角膜上皮細胞及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第一の細胞と、間葉系細胞、間質細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第二の細胞とを含む、前記製造方法。
【請求項１６】
前記２種類以上の細胞を含有する培養液における前記第一の細胞と前記第二の細胞との細胞数の比率が９：１〜１：９９である、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞構造体及び細胞構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を図る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織を、細胞、足場及び成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。近年では、細胞を使った治療が徐々に実現されつつある。例えば、自家細胞を用いた培養表皮、自家軟骨細胞を用いた軟骨治療、間葉系幹細胞を用いた骨再生治療、筋芽細胞を用いた心筋細胞シート治療、角膜上皮シートによる角膜再生治療、及び神経再生治療などが挙げられる。これら新たな治療は、従来の人工物による代替医療（例えば、人工骨補填剤やヒアルロン酸注射など）とは異なり、生体組織の修復・再生を図るものであり、高い治療効果を得られる。実際、自家細胞を用いた培養表皮や培養軟骨などの製品が市販されてきた。【０００３】
特許文献１には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献１に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。特許文献１の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて高い細胞生存活性が実証されている。また、特許文献２には、生体親和性を有する高分子ブロックと少なくとも一種類の細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞移植用細胞構造体が記載されている。さらに特許文献３には、グルタルアルデヒドを含まない生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞移植用細胞構造体であって、生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であるか、又は高分子ブロックの二次元断面像における断面積の平方根÷周囲長の値が０．０１以上０．１３以下である、細胞移植用細胞構造体が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号
【特許文献２】特開２０１４−１２１１４号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１４／１３３０８１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１から３に記載の細胞構造体を製造するに際して、使用する細胞の種類によっては、所望の大きさの細胞構造体を構築する時間をより短縮することが望まれる場合や、より大きな立体状の細胞構造体を形成することが望まれる場合があった。本発明は、短時間で製造することができ、かつ所定以上の大きさを有する細胞構造体を提供することを課題とした。更に本発明は、上記細胞構造体の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体親和性高分子ブロックと細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体において、上記の細胞として、細胞構造体の形成に比較的時間がかかる第一の細胞と、基材への接着力が強くかつ細胞塊を形成しやすい第二の細胞とを組み合わせて使用することによって、所定以上の大きさを有する細胞構造体を短時間で製造することに成功した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【０００７】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）生体親和性高分子ブロックと、２種類以上の細胞とを含み、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、上記２種類以上の細胞が、血管内皮細胞、心筋細胞、膵島細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、角膜上皮細胞及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第一の細胞と、間葉系細胞、間質細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第二の細胞とを含む、上記細胞構造体。
（２）上記第一の細胞と上記第二の細胞との細胞数の比率が９：１〜１：９９である、（１）に記載の細胞構造体。
（３）上記生体親和性高分子ブロックの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、（１）又は（２）に記載の細胞構造体。
（４）厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下である、（１）から（３）の何れか一に記載の細胞構造体。
（５）上記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下である、（１）から（４）の何れか一に記載の細胞構造体。【０００８】
（６）上記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が架橋されている、（１）から（５）の何れか一に記載の細胞構造体。
（７）上記生体親和性高分子ブロックの架橋度が２以上であり、かつ上記生体親和性高分子ブロックの吸水率が３００％以上である、（６）に記載の細胞構造体。
（８）上記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子を含有する固形物を粉砕することにより得られる生体親和性高分子ブロックである、（１）から（７）の何れか一に記載の細胞構造体。
（９）上記固形物が、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得られた固形物である、（８）に記載の細胞構造体。
（１０）細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、（１）から（９）の何れか一に記載の細胞構造体。【０００９】
（１１）生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、（１）から（１０）の何れか一に記載の細胞構造体。
（１２）リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、（１１）に記載の細胞構造体。
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
（１３）リコンビナントゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（１１）又は（１２）に記載の細胞構造体。
（１４）上記第一の細胞が、血管内皮細胞又は肝細胞であり、上記第二の細胞が、線維芽細胞、平滑筋細胞又は間葉系幹細胞である、（１）から（１３）の何れか一に記載の細胞構造体。【００１０】
（１５）生体親和性高分子ブロックと、２種類以上の細胞を含有する培養液との混合物をインキュベートすることを含む、（１）から（１４）の何れか一に記載の細胞構造体の製造方法であって、上記２種類以上の細胞が、血管内皮細胞、心筋細胞、膵島細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、角膜上皮細胞及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第一の細胞と、間葉系細胞、間質細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第二の細胞とを含む、上記製造方法。
（１６）上記２種類以上の細胞を含有する培養液における上記第一の細胞と上記第二の細胞との細胞数の比率が９：１〜１：９９である、（１５）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の細胞構造体は、短時間で製造することができ、かつ所定以上の大きさを有する。また、本発明の細胞構造体の製造方法によれば、所定以上の大きさを有する細胞構造体を短時間で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例の条件Ａの液温プロファイルを示す。
【図２】図２は、実施例の条件Ｂの液温プロファイルを示す。
【図３】図３は、実施例の条件Ｃの液温プロファイルを示す。
【図４】図４は、HepG2細胞（ヒト肝癌由来細胞）とhMSC（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）のモザイク細胞塊の形成を示す。
【図５】図５は、HepG2細胞（ヒト肝癌由来細胞）とhMSC（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）のモザイク細胞塊の形成を示す。
【図６】図６は、HepG2細胞（ヒト肝癌由来細胞）とNHDF（正常ヒト皮膚線維芽細胞）のモザイク細胞塊の形成を示す。
【図７】図７は、HepG2細胞（ヒト肝癌由来細胞）とNHDF（正常ヒト皮膚線維芽細胞）のモザイク細胞塊の形成を示す。
【図８】図８は、HUVEC細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）とhMSC（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）のモザイク細胞塊の形成を示す。
【図９】図９は、HUVEC細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）とhMSC（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）のモザイク細胞塊の形成を示す。
【図１０】図１０は、HUVEC細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）とNHDF（正常ヒト皮膚線維芽細胞）のモザイク細胞塊の形成を示す。
【図１１】図１１は、HUVEC細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）とNHDF（正常ヒト皮膚線維芽細胞）のモザイク細胞塊の形成を示す。
【図１２】図１２は、HUVEC細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）とBdSMC（正常ヒト膀胱平滑筋細胞）のモザイク細胞塊の形成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、生体親和性高分子ブロックと、２種類以上の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体であって、２種類以上の細胞が、血管内皮細胞、心筋細胞、膵島細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、角膜上皮細胞及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第一の細胞と、間葉系細胞、間質細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第二の細胞とを含む、細胞構造体に関する。なお、本発明の細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。
【００１４】
本発明において、第一の細胞は、細胞構造体の形成に比較的時間がかかる細胞であり、第二の細胞は、基材への接着力が強くかつ細胞塊を形成しやすい細胞である。本発明においては、第一の細胞に対して第二の細胞を組み合わせて使用することによって、第一の細胞のみを使用して細胞構造体を製造した場合と比較して、所定以上の大きさを有する細胞構造体を短時間で製造できるようになった。
【００１５】
「所定以上の大きさを有する細胞構造体を短時間で製造できる」とは、第一の細胞に対して第二の細胞を組み合わせて使用することによって、第一の細胞のみを使用して細胞構造体を製造した場合と比較して、所定以上の大きさを有する細胞構造体を短時間で製造できることを意味し、「所定以上の大きさ」及び「短時間」については具体的には限定されるものではない。「所定以上の大きさを有する細胞構造体を短時間で製造できる」ことの一例としては、２×１０4個の細胞と０．０２ｍｇの生体親和性高分子ブロックを用いて直径１ｍｍ程度の球体を細胞非接着性Ｕ字底９６ウエルプレートの１ウエル内で製造する際に、１日（２４時間）以内に上部から見て直径１．５ｍｍ以内の大きさの細胞構造体を形成できる程度を意味するが、上記の実験条件は一例であり、本発明の範囲は、この条件に限定されるものではない。
【００１６】
上記した通りの第一の細胞と第二の細胞とを組み合わせて使用することによって、第一の細胞のみを使用して細胞構造体を製造した場合と比較して、所定以上の大きさを有する細胞構造体を短時間で製造することが可能になることは本発明により初めて見出された知見であり、従来からは全く予想できない意外なことである。
本発明の結果から考察するに、細胞−細胞間の相互作用の強さと、細胞−基材間の相互作用の強さ、加えて、細胞−細胞間の相互作用においても積層化しやすい細胞であるか、等の要因によって、この第一の細胞と第二の細胞は分類され得ると考えられた。おそらく第二の細胞として分類される細胞群は、上記３つの観点において、全てに優れていることから、第一の細胞が細胞構造体を形成する上で、第一の細胞同士の間、また第一の細胞と基材の間、における接着剤の役割を果たしていると考えられた。即ち、第二の細胞が強い糊の役割を果たし、細胞構造体形成に必要な接着力を増強することで、集合体としての細胞構造体形成を加速させることに成功しているのだと考えられる。
【００１７】
（１）生体親和性高分子ブロック
（１−１）生体性親和性高分子
生体性親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、及びＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的にはリコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、及びキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、１．「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
【００１８】
リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチン又は化学合成セラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。
【００１９】
化学合成ペプチド又は化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチド又はゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中後記の（１−３）リコンビナントゼラチンに記載した内容を当てはめることができる。
リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
【００２０】
本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００２１】
本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用する。
【００２２】
本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用する。
【００２３】
（１−２）架橋
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培地中で培養する際及び生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
【００２４】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基及びグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００２５】
架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、更に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００２６】
（１−３）リコンビナントゼラチン
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、US特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００２７】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然セラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００２８】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
【００２９】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成及び配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００３０】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００３１】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
【００３２】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００３３】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは６、更に好ましくは８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００３４】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００３５】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式１：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２〜１０の整数を示し、より好ましくは３〜５の整数を示す。ｎは３〜１００の整数が好ましく、１５〜７０の整数がさらに好ましく、５０〜６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００３６】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、  式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００３７】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。
【００３８】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオン及びアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
【００３９】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００４０】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである
【００４１】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４２】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００４３】
（１−４）生体親和性高分子ブロック
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用する。
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状及びシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状及び多孔質状である。不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状（顆粒）の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
【００４４】
本発明における生体親和性高分子ブロックの形状は上記の通り特に限定されるものではないが、タップ密度が、好ましくは１０ｍｇ／ｃｍ3以上５００ｍｇ／ｃｍ3以下であり、より好ましくは２０ｍｇ／ｃｍ3以上４００ｍｇ／ｃｍ3以下であり、さらに好ましくは４０ｍｇ／ｃｍ3以上２２０ｍｇ／ｃｍ3以下であり、特に好ましくは５０ｍｇ／ｃｍ3以上１５０ｍｇ／ｃｍ3以下である。
【００４５】
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であることが分かる。生体親和性高分子ブロックのタップ密度とは、生体親和性高分子ブロックの表面構造の複雑性、及び生体親和性高分子ブロックを集合体として集めた場合に形成される空隙の量を表していると考えられる。タップ密度が小さい程、高分子ブロック間の空隙が多くなり、細胞の生着領域が多くなる。また、小さ過ぎないことで、細胞同士の間に適度に生体親和性高分子ブロックが存在でき、細胞構造体とした場合に同構造体内部への栄養分送達を可能とすることから、上記の範囲に収まることが好適であると考えられる。
【００４６】
本明細書でいうタップ密度は、以下のように測定できる。測定のために（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ3）の容器（以下、キャップと記載する）を用意する。まず、キャップのみの質量を測定する。その後、キャップにロートを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込む。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにする。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定する。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めることができる。
【００４７】
本発明における生体親和性高分子ブロックの架橋度は、特に限定されないが、好ましくは２以上であり、さらに好ましくは２以上３０以下であり、さらに好ましくは４以上２５以下であり、特に好ましくは４以上２２以下である。
【００４８】
高分子ブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）の測定方法は、特に限定されないが、例えば、後記実施例に記載のＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法で測定することができる。具体的には、高分子ブロック、ＮａＨＣＯ3水溶液及びＴＮＢＳ水溶液を混合して３７℃で３時間反応させた後に反応停止したサンプルと、高分子ブロック、ＮａＨＣＯ3水溶液及びＴＮＢＳ水溶液を混合した直後に反応停止させたブランクとをそれぞれ調製し、純水で希釈したサンプル及びブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）、及び（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出することができる。
【００４９】
（式２）  （As-Ab）／１４６００×V／ｗ
（式２）は、高分子ブロック１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗは高分子ブロック質量（ｍｇ）を示す。）
【００５０】
（式３）  １−（サンプル（式２）/未架橋の高分子（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。
【００５１】
本発明における生体親和性高分子ブロックの吸水率は、特に限定されないが、好ましくは３００％以上、より好ましくは４００％以上、さらに好ましくは５００％以上、特に好ましくは７００％以上、最も好ましくは８００％以上である。なお吸水率の上限は特に限定されないが、一般的には４０００％以下、又は２０００％以下である。
【００５２】
生体親和性高分子ブロックの吸水率の測定方法は、特に限定されないが、例えば、後記実施例に記載の方法により測定することができる。具体的には、２５℃において３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させ、それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って吸水率を求めることができる。
【００５３】
（式４）
吸水率＝（ｗ２−ｗ１−ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）
【００５４】
本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは１μｍ以上７００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上７００μｍ以下であり、さらに好ましくは１０μｍ以上３００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、特に好ましくは５３μｍ以上１０６μｍ以下である。生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を良好にすることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
【００５５】
ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６〜１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３〜１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５〜５３μｍの大きさのブロックとすることができる。
【００５６】
（１−５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含有する固形物（生体親和性高分子の多孔質体など）を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子を含有する固形物（多孔質体など）は、例えば、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得ることができる。
【００５７】
上記の通り、生体親和性高分子を含有する固形物を粉砕することにより、表面形状が均一でない不定形の生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
【００５８】
生体親和性高分子の多孔質体の製造方法の一例としては、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、及び
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができる。
【００５９】
生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、又は０．９℃以上でもよい。
【００６０】
工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材（好ましくは、テフロン（登録商標））を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
【００６１】
好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前〜１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。
【００６２】
好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点−５℃以下であり、より好ましくは溶媒融点−５℃以下かつ溶媒融点−２０℃以上であり、更に好ましくは溶媒融点−６℃以下かつ溶媒融点−１６℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。
【００６３】
工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結されるための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、更に好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。
【００６４】
工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。
【００６５】
本発明では好ましくは、上記工程（ｃ）で得られた多孔質体を粉砕することによって、生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
【００６６】
（２）細胞
本発明の細胞構造体は、２種類以上の細胞を含む。本発明においては、血管内皮細胞、心筋細胞、膵島細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、角膜上皮細胞及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第一の細胞と、間葉系細胞、間質細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、間葉系幹（ＭＳＣ）細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第二の細胞とを使用する。
【００６７】
第一の細胞として使用する細胞は、１種類でも２種類以上でもよく、好ましくは１〜３種類、より好ましくは１又は２種類、さらに好ましくは１種類である・
第二の細胞として使用する細胞は、１種類でも２種類以上でもよく、好ましくは１〜３種類、より好ましくは１又は２種類、さらに好ましくは１種類である・
好ましくは、第一の細胞は、血管内皮細胞又は肝細胞であり、第二の細胞が、線維芽細胞、平滑筋細胞又は間葉系幹細胞である。また、第一の細胞についての好ましいさらに別の例としては、筋細胞、膵島細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、角膜上皮細胞及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の細胞である。
特に好ましい組み合わせとしては、第一の細胞が、肝細胞であり、第二の細胞が、線維芽細胞、又は間葉系幹細胞である。
【００６８】
上記した各細胞は、各用語の最も広義の範囲を意味するものとし、生体から採取した細胞、生体から採取した細胞に操作（遺伝子導入操作など）を施した細胞、並びに他の細胞からの転換により得られる細胞（例えば、ｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞及び神経細胞など）などのいずれでもよい。
【００６９】
ある細胞（以下、対象細胞と称する）が、上記した所定の細胞であるかどうかの確認は、対象細胞が、各細胞の機能を有するかどうかを確認することにより行うことができ、あるいは対象細胞が、各細胞に特異的なマーカーを発現するかどうかを確認することによっても行うことができるが、特に限定されない。
【００７０】
使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
【００７１】
例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患においては、自家及び他家から摘出した心筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞などを好適に使用することができる。脳虚血・脳梗塞部位への神経細胞の移植、あるいは、心筋梗塞部位・骨格筋虚血部位への血管内皮細胞の移植が可能である。また、糖尿病性の臓器障害に対する細胞移植に使用される細胞が挙げられる。例えば、腎臓、膵臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対して、種々検討されている細胞移植治療法用の細胞が挙げられる。例えば、インスリン分泌能が低下した膵臓に膵島細胞を移植する試みが検討されており、このような細胞を使用することができる。その他の臓器においても、上記した第一の細胞及び第二の細胞として適宜移植細胞を選択することができる。
【００７２】
本発明において、血管内皮細胞、心筋細胞、膵島細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、角膜上皮細胞及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第一の細胞は、細胞構造体の形成に時間を要する細胞である。間葉系細胞、間質細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、間葉系幹（ＭＳＣ）細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第二の細胞は、細胞構造体を高速度で形成できる細胞である。本発明においては、上記第一の細胞と上記第二の細胞とを組み合わせて使用することによって、所定以上の大きさを有する細胞構造体を短時間で製造することが可能になった。
【００７３】
本発明の細胞構造体における第一の細胞と第二の細胞との細胞数の比率は、特に限定されないが、好ましくは９：１〜１：９９であり、より好ましくは９：１〜２：８であり、さらに好ましくは８：２〜２：８である。
【００７４】
（３）細胞構造体
本発明においては、生体親和性高分子ブロックと２種類以上の細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって細胞移植のために適した厚みを有することが可能となる。さらに、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元に配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞構造体が形成され、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能となる。
【００７５】
本発明の細胞構造体においては、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。生体親和性高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、生体親和性高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も生体親和性高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
【００７６】
また、生体親和性高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての生体親和性高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、生体親和性高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した生体親和性高分子ブロック間の距離、即ち、生体親和性高分子ブロックとその生体親和性高分子ブロックから最短距離に存在する生体親和性高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。
【００７７】
なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではなく、外部から細胞構造体の内部への栄養送達を可能とすることを意味するものである。
【００７８】
本発明の細胞構造体の厚さ又は直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、２１５μｍ以上であることが好ましく、４００μｍ以上がさらに好ましく、７３０μｍ以上であることが最も好ましい。厚さ又は直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。細胞構造体の厚さ又は直径を上記の範囲内とすることにより、外部から細胞構造体の内部への栄養送達がより良好になる。
【００７９】
本発明の細胞構造体においては、好ましくは、生体親和性高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域とがモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さ又は直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さ又は直径」とする。
【００８０】
本発明の細胞構造体は、細胞と生体親和性高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞１個当りの生体親和性高分子ブロックの比率が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、より好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。細胞と生体親和性高分子ブロックの比率を上記範囲とすることより、細胞をより均一に存在させることができる。下限を上記範囲とすることにより、所望の用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する生体親和性高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、生体親和性高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後述する培地に含まれる成分が挙げられる。
【００８１】
（４）細胞構造体の製造方法
本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、２種類以上の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、本発明の細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、上記細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは生体親和性高分子ブロックを形成したのち、細胞と生体親和性高分子ブロックとを混合する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと、２種類以上の細胞を含有する培養液との混合物をインキュベートすることによって、本発明の細胞構造体を製造することができる。２種類以上の細胞としては、本明細書中上記した細胞を使用することができる。また、上記した２種類以上の細胞を含有する培養液における第一の細胞と第二の細胞との細胞数の比率は特に限定されないが、好ましくは９：１〜１：９９であり、より好ましくは９：１〜２：８であり、さらに好ましくは８：２〜２：８である。
【００８２】
本発明においては、例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックとをモザイク状に配置することができる。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性高分子ブロックとからなる細胞構造体の形成を促進又は制御することが好ましい。
【００８３】
用いられる容器としては、細胞低接着性材料又は細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。
【００８４】
上記の方法で得られた細胞構造体（モザイク細胞塊）は、例えば、
（ａ）別々に調製した細胞構造体（モザイク細胞塊）同士を融合させる、又は
（ｂ）分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、
などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造してもよい。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
【００８５】
例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地又は増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。
【００８６】
別々に調製した細胞構造体同士を融合させる場合には、例えば、複数個の生体親和性高分子ブロックと複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部又は全部に、一又は複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させることができる。上記（ａ）に記載の通り本発明の細胞構造体の複数個を融合させることによって得られる細胞構造体も、本発明の範囲内である。
【００８７】
本発明の細胞構造体の製造方法にかかる「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と生体親和性高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。
【００８８】
上記融合前の各細胞構造体の厚さ又は直径は好ましくは１０μｍ以上１ｃｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上２０００μｍ以下、更に好ましくは１５μｍ以上１５００μｍ以下、最も好ましくは、２０μｍ以上１３００μｍ以下である。融合後の厚さ又は直径は好ましくは４００μｍ以上３ｃｍ以下であり、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下であり、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００８９】
上記した生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体を製造する方法としては、具体的には、複数個の第一の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部又は全部に、一又は複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする方法を挙げることができる。ここで、「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と生体親和性高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。
【００９０】
融合させたい細胞構造体同士は、０以上５０μｍ以下の距離に設置することが好ましく、より好ましくは、０以上２０μｍ以下、更に好ましくは０以上５μｍ以下の距離である。細胞構造体同士を融合させる際、細胞の増殖・伸展によって細胞あるいは細胞が産生する基質が接着剤の役割を果たし、接合させることが考えられ、上記範囲とすることにより、細胞構造体同士の接着が容易となる。
【００９１】
本発明の細胞構造体の製造方法により得られる細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００９２】
細胞構造体に、更に、第二の生体親和性高分子ブロックを添加しインキュベートする際の、第二の生体親和性高分子ブロックの添加するペースは、使用する細胞の増殖の速度に合わせて、適宜、選択することが好ましい。具体的には、第二の生体親和性高分子ブロックを添加するペースが早いと細胞が細胞構造体の外側へと移動し、細胞の均一性が低くなり、添加のペースが遅いと、細胞の割合が多くなる箇所ができ、細胞の均一性が低くなるため、使用する細胞の増殖速度を考慮し、選択する。
【００９３】
（５）細胞構造体の用途
本発明の細胞構造体は、細胞移植のために使用することができる。具体的には、本発明の細胞構造体は、例えば、重症心不全、重度心筋梗塞等の心臓疾患、脳虚血・脳梗塞といった疾患部位に細胞移植の目的で使用できる。また、糖尿病性の腎臓、膵臓、肝臓、末梢神経、眼、四肢の血行障害などの疾患に対しても用いることができる。
【００９４】
移植方法としては、切開、注射、内視鏡といったものが使用可能である。本発明の細胞構造体は、細胞シートといった細胞移植物とは異なり、構造体のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
【００９５】
また、本発明によれば、本発明の細胞構造体を、細胞移植を必要とする患者に移植する工程を含む細胞移植方法が提供される。本発明の細胞移植方法においては、上記した本発明の細胞構造体を用いる。細胞構造体の好適な範囲は上記と同様である。
【００９６】
更に本発明によれば、細胞移植治療剤の製造のための、本発明の細胞構造体の使用が提供される。本発明によれば、好ましくは、細胞構造体の好適な範囲は上記と同様である。
【００９７】
更に本発明によれば、本発明の細胞構造体を含む、細胞移植治療剤が提供される。本発明によれば、細胞構造体の好適な範囲は上記と同様である。
【００９８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００９９】
［実施例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：  ＧＡＰ［（ＧＸＹ）63］3Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G【０１００】
[実施例２] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのPTFEで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。【０１０１】
[アルミ硝子板・円筒形容器]
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。【０１０２】
[温度差の小さい凍結工程、及び乾燥工程]
PTFE厚・円筒形容器、アルミ硝子板・円筒形容器、にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、及び棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。【０１０３】
条件Ａ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【０１０４】
条件Ｂ：
アルミ・硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【０１０５】
条件Ｃ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量１０ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【０１０６】
[各凍結工程での温度測定]
条件Ａ〜条件Ｃのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図１〜図３の通りとなった。【０１０７】
図１、図２、図３から条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃでは棚板温度−１０℃設定区間（−２０℃に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の温度差が２．５℃以下となっていた。なお、本明細書において、「温度差」とは、「非冷却面液温」−「冷却面液温」を意味する。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。【０１０８】
以下に、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃについて、非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。なお、本発明で言う「直前の温度差」とは、イベント（凝固熱発生等）の１秒前〜２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も高い温度のことを表している。【０１０９】
条件Ａ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．１℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．２℃
凝固熱発生直前の温度差：１．１℃【０１１０】
条件Ｂ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．０℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．１℃
凝固熱発生直前の温度差：０．９℃【０１１１】
条件Ｃ
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．８℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：１．１℃
凝固熱発生直前の温度差：２．１℃【０１１２】
[実施例３] 生体親和性高分子ブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
実施例２で得られた条件Ａ及び条件ＢのＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６〜１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の６種類を実施した）を施して、生体親和性高分子ブロック（ＣＢＥ３ブロック）を得た。
以下、４８時間架橋を施した条件Ａの多孔質体由来ブロックをＥ、４８時間架橋を施した条件Ｂの多孔質体由来ブロックをＦと称する。Ｅ及びＦは温度差の小さい凍結工程により製造した多孔質体から作られた温度差小ブロックである。なお、架橋時間の違いは本願の評価においては性能に影響が見られなかったため、以後、４８時間架橋したものを代表として使用した。また、Ｅ及びＦでは性能に差が見られなかった。以下、実施例３で得られた生体親和性高分子ブロックを「花弁状ブロック」とも称する。以下の実施例４から７では、条件Ａ、サイズ５３〜１０６μｍ、架橋時間４８時間で作製した生体親和性高分子ブロックを使用した。【０１１３】
[実施例４] 生体親和性高分子ブロックのタップ密度測定
タップ密度は、ある体積にどれくらいのブロックを密に充填できるかを表す値であり、値が小さいほど、密に充填できない、すなわちブロックの構造が複雑であると言える。  タップ密度は、以下のように測定した。まず、ロートの先にキャップ（直径６ｍｍ、長さ２１．８ｍｍの円筒状：容量０．６１６ｃｍ3）が付いたものを用意し、キャップのみの質量を測定した。その後、ロートにキャップを付け、ブロックがキャップに溜まるようにロートから流し込んだ。十分量のブロックを入れた後、キャップ部分を２００回、机などの硬いところにたたきつけ、ロートをはずし、スパチュラですりきりにした。このキャップにすりきり一杯入った状態で質量を測定した。キャップのみの質量との差からブロックのみの質量を算出し、キャップの体積で割ることで、タップ密度を求めた。
その結果、実施例３の生体親和性高分子ブロックのタップ密度は９８ｍｇ/ｃｍ3であった。【０１１４】
[実施例５] 生体親和性高分子ブロックの架橋度測定
実施例３で架橋したブロックの架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。測定はＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法を用いた。
＜サンプル調製＞
ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４％ＮａＨＣＯ3水溶液（１ｍＬ）及び１質量％のＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、混合物を３７℃で３時間振とうさせた。その後、３７質量％塩酸（１０ｍＬ）及び純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、サンプルとした。【０１１５】
＜ブランク調整＞
ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ3水溶液（１ｍＬ）及び１質量％ＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、直後に３７質量％塩酸（３ｍＬ）を加え、混合物を３７℃で３時間振とうした。その後、３７質量％塩酸（７ｍＬ）及び純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、ブランクとした。
純水で１０倍希釈したサンプル、及び、ブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）、及び（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。【０１１６】
（式２）  （As-Ab）／１４６００×V／ｗ
（式２）は、リコンビナントペプチド１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗはリコンビナントペプチド質量（ｍｇ）を示す。）【０１１７】
（式３）  １−（サンプル（式２）/未架橋リコンビナントペプチド（式２））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。【０１１８】
その結果、実施例３の生体親和性高分子ブロックの架橋度は、４．２であった。【０１１９】
[実施例６] 生体親和性高分子ブロックの吸水率測定
実施例３で作製した生体親和性高分子ブロックの吸水率を算出した。
２５℃において、３ｃｍ×３ｃｍのナイロンメッシュ製の袋の中に、生体親和性高分子ブロック約１５ｍｇを充填し、２時間イオン交換水中で膨潤させた後、１０分風乾させた。それぞれの段階において質量を測定し、（式４）に従って、吸水率を求めた。【０１２０】
（式４）
吸水率＝（ｗ２−ｗ１−ｗ０）／ｗ０
（式中、ｗ０は、吸水前の材料の質量、ｗ１は吸水後の空袋の質量、ｗ２は吸水後の材料を含む袋全体の質量を示す。）【０１２１】
その結果、実施例３のブロックの吸水率は、７８６％であった。【０１２２】
[実施例７]  複数種の細胞からなる細胞構造体（モザイク細胞塊）の作製
下記の表１に記載のような比率となるように、第一の細胞と第二の細胞とを培地中に混合した細胞懸濁液を、細胞の合計濃度が１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培地で調整した。培地としては、第二の細胞培養用の培地を使用したが、第一の細胞培養の培地で行っても、得られる結論は変わらなかった。MSC用の培地はLonza社のMSCGM BulletKitTM。NHDF用培地はLonza社のFGMTM-2 BulletKitTM。BdSMC用の培地はLonza社のSmGMTM-2 BulletKitTM。HUVEC用培地はLonza社のEGMTM-2 or EGMTM BulletKitTM。
上記の細胞懸濁液に、実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック（５３−１０６μｍ）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた。上記で得た混合物２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２９時間静置することで花弁状ブロックと２種類の細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞１個当たり０．００１μｇの生体親和性高分子ブロック）。この２９時間の経時変化をＵ字底ウエルの上から観察した。上から観察しているため、球体状のモザイク細胞塊が形成されていく過程で、上から見た細胞塊の面積が徐々に小さくなっていくことになる（より立体化していく）。この経時変化を上から観察して撮影した写真を、図４、図６、図８、図１０及び図１２に示す。この細胞塊の面積を計測し、円換算したときの直径を縦軸に、経過時間を横軸にとったグラフを、図５、図７、図９、図１１及び図１２に示す。【０１２３】
写真の円形状が小さくなるほど、モザイク細胞塊の形成が早く進んだことを示している。グラフでは縦軸の直径が早く小さくなるほど、モザイク細胞塊の形成が早く進んだことを示している。【０１２４】
モザイク細胞塊形成が早く進んだことの指標としては、２９時間（ｈｒ）以内に上部から見て１．５ｍｍ直径に収まるか、あるいは第一の細胞のみで作ったサイズから０．５ｍｍ以上小さいサイズに形成できるか、を指標として考えることもできる。【０１２５】
なお、「本実施例で作製したモザイク細胞塊の直径は何れも、１．０ｍｍ以上３．０ｍｍ以下であった。【０１２６】
なお、本実施例で使用した細胞の増殖速度を考慮すると、１時間から２９時間までの培養後におけるモザイク細胞塊における第一の細胞と第二の細胞の細胞数の比率はそれぞれ、細胞懸濁液における第一の細胞と第二の細胞の細胞数の比率（表１に記載した比率）と実質的に同等である。【０１２７】
図４及び図５においては、第一の細胞としてHepG2細胞（ヒト肝癌由来細胞）を、第二の細胞としてhMSC（ヒト骨髄由来間葉系幹細胞）を使用してモザイク細胞塊を形成させた場合には、HepG2細胞単独（１００％）で形成させるのに比べてhMSCを１０％混ぜることによってモザイク細胞塊の形成の加速が観察された。またhMSCの細胞数の比率を２０％、３０％と増やすことによって、モザイク細胞塊の形成はさらに加速された。一方、hMSCの細胞数の比率を４０％、５０％程度まで増やしても、上記比率が３０％の場合と比較して、モザイク細胞塊の形成が顕著に加速されることは見られず、この細胞の組み合わせでは３０％程度のhMSC添加で十分な加速が得られることも分かった。【０１２８】
図６及び図７においては、第一の細胞としてHepG2細胞を、第二の細胞としてNHDF（正常ヒト皮膚線維芽細胞）を使用してモザイク細胞塊を形成させた場合、HepG2細胞単独（１００％）で形成させるのに比べて、NHDFを１０％混ぜることによってモザイク細胞塊の形成の加速が観察された。また、NHDFの細胞数の比率を１０％、２０％、３０％、４０％、５０％と増やすことで、モザイク細胞塊の形成の加速が増幅されることも分かった。この細胞の組み合わせではNHDFを加える程、モザイク細胞塊の形成の加速が増幅されることが分かった。【０１２９】
図８及び図９においては、第一の細胞としてHUVEC細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を、第二の細胞としてhMSCを使用してモザイク細胞塊を形成させた場合、HUVEC細胞単独（１００％）で形成させるのに比べて、hMSCを１０％混ぜることによってモザイク細胞塊の形成の加速が観察された。【０１３０】
図１０及び図１１においては、第一の細胞としてHUVEC細胞を、第二の細胞としてNHDF（正常ヒト皮膚線維芽細胞）を使用してモザイク細胞塊を形成させた場合、HUVEC細胞単独（１００％）で形成させるのに比べて、NHDFを１０％又は２０％以上混ぜることによって、モザイク細胞塊の形成の加速が観察された。【０１３１】
図１２においては、第一の細胞としてHUVEC細胞を、第二の細胞としてBdSMC（正常ヒト膀胱平滑筋細胞）を使用してモザイク細胞塊を形成させた場合、HUVEC細胞単独（１００％）で形成させるのに比べて、BdSMCを２０％混ぜることによってモザイク細胞塊の形成の加速が観察された。【０１３２】
上記の通り、単独でのモザイク細胞塊形成が遅い細胞に対して、ある種の細胞を加えることによって、想定外に、高分子ブロックを含んだ状態でのモザイク細胞塊形成を加速できることが明らかになった。【０１３３】
【表１】
2017010414.tif 000003
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2017010414000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月27日(2016.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体親和性高分子ブロックと、２種類以上の細胞とを含み、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記生体親和性高分子ブロックが配置されている、細胞構造体の製造方法であって、前記２種類以上の細胞が、血管内皮細胞、心筋細胞、膵島細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、角膜上皮細胞及び網膜色素上皮細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第一の細胞と、間葉系細胞、間質細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、筋芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞及び臍帯由来幹細胞からなる群から選択される少なくとも一種の第二の細胞とを含み、前記生体親和性高分子ブロックと、前記２種類以上の細胞を含有する培養液との混合物をインキュベートすることを含む、前記細胞構造体の製造方法。
【請求項２】
前記第一の細胞と前記第二の細胞との細胞数の比率が９：１〜１：９９である、請求項１に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項３】
前記生体親和性高分子ブロックの大きさが１０μｍ以上３００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項４】
厚さ又は直径が４００μｍ以上３ｃｍ以下である、請求項１から３の何れか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項５】
前記生体親和性高分子ブロックのタップ密度が１０ｍｇ／ｃｍ３以上５００ｍｇ／ｃｍ３以下である、請求項１から４の何れか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項６】
前記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が架橋されている、請求項１から５の何れか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項７】
前記生体親和性高分子ブロックの架橋度が２以上であり、かつ前記生体親和性高分子ブロックの吸水率が３００％以上である、請求項６に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項８】
前記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子を含有する固形物を粉砕することにより得られる生体親和性高分子ブロックである、請求項１から７の何れか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項９】
前記固形物が、生体親和性高分子を含有する水溶液を凍結乾燥して得られた固形物である、請求項８に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項１０】
細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項１から９の何れか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項１１】
生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項１から１０の何れか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項１２】
リコンビナントゼラチンが、下記式で示される、請求項１１に記載の細胞構造体の製造方法。
式：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ］ｍ−Ｂ
式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【請求項１３】
リコンビナントゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、請求項１１又は１２に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項１４】
前記第一の細胞が、血管内皮細胞又は肝細胞であり、前記第二の細胞が、線維芽細胞、平滑筋細胞又は間葉系幹細胞である、請求項１から１３の何れか一項に記載の細胞構造体の製造方法。
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【国際調査報告】
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