(57)【要約】  標本形状測定方法は、所定の照明領域を通過する照明光を準備するステップＳ１０と、照明光を標本に照射するステップＳ２０と、所定の処理ステップＳ３０と、を有し、所定の照明領域は、照明光学系の瞳位置にて光軸を含まないように設定されると共に、照明光が観察光学系の瞳位置にて該瞳の内側の一部分と該瞳の外側に照射されるように設定され、照明光は標本を透過し、標本から出射した光は観察光学系に入射し、所定の処理ステップＳ３０は、観察光学系から出射した光を受光するステップＳ３１と、受光した光の光量を求めるステップＳ３２と、光量と基準の光量との差又は比を算出するステップＳ３３と、差又は比から、標本の表面における傾き量を算出するステップＳ３４と、を有する。
2016185729.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の照明領域を通過する照明光を準備するステップと、
前記照明光を標本に照射するステップと、
所定の処理ステップと、を有し、
前記所定の照明領域は、照明光学系の瞳位置にて光軸を含まないように設定されると共に、前記照明光が観察光学系の瞳位置にて該瞳の内側の一部分と該瞳の外側に照射されるように設定され、
前記照明光は前記標本を透過し、
前記標本から出射した光は前記観察光学系に入射し、
前記所定の処理ステップは、
前記観察光学系から出射した光を受光するステップと、
前記受光した光の光量を求めるステップと、
前記光量と基準の光量との差又は比を算出するステップと、
前記差又は比から、前記標本の表面における傾き量を算出するステップと、を有することを特徴とする標本形状測定方法。
【請求項２】
前記所定の照明領域に、面光源が配置されるか、又は前記面光源の像が形成され、
前記受光するステップにおいて、前記観察光学系から出射した光を、複数の微小領域で受光することを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定方法。
【請求項３】
前記微小領域の各々について、前記光量を求めるステップ、前記差又は比を算出するステップ及び前記傾き量を算出するステップが実行されることを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定方法。
【請求項４】
１つの前記微小領域よりも広い範囲を所定の領域として設定するステップを有し、
前記光量を求めるステップでは、前記所定の領域に含まれる前記微小領域に基づいて得られた光量を、前記所定の領域における光量として求め、
前記差又は比を算出するステップでは、前記所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出し、
前記傾きを算出するステップでは、前記所定の領域に対応する前記標本の表面における傾き量を算出し、
前記所定の領域は、前記標本の表面を格子状に区分けしたときの１つの領域に対応し、
前記標本の表面における傾き量を、前記所定の領域を１単位として算出することを特徴とする請求項２に記載の標本形状測定方法。
【請求項５】
前記所定の照明領域を通過する照明光が平行光束であることを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定方法。
【請求項６】
前記光軸と直交する面内で、前記照明光と前記標本とを相対移動させることを特徴とする請求項５に記載の標本形状測定方法。
【請求項７】
前記傾き量から標本の形状を計算し、前記計算した形状から標本の形状を画像化するステップを有することを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定方法。
【請求項８】
前記基準の光量は、前記標本が存在していない状態での光量であることを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定方法。
【請求項９】
前記照明光を準備するステップと前記照明光を標本に照射するステップとの間に、前記基準の光量を設定するステップを有することを特徴とする請求項８に記載の標本形状測定方法。
【請求項１０】
前記基準の光量を設定するステップでは、前記照明光学系から出射した前記照明光を前記観察光学系に入射させて光量を測定し、
測定した前記光量に基づいて前記基準の光量を設定することを特徴とする請求項９に記載の標本形状測定方法。
【請求項１１】
前記光量の測定を、最初の標本の測定よりも前に行うことを特徴とする請求項１０に記載の標本形状測定方法。
【請求項１２】
測定した光量を記憶しておき、
最初の標本の測定よりも前に前記記憶した光量を読み出して、前記基準の光量を設定することを特徴とする請求項１０に記載の標本形状測定方法。
【請求項１３】
前記傾き量を算出するステップでは、予め求めておいた対応関係に基づいて前記傾き量を算出することを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定方法。
【請求項１４】
前記対応関係は、光量と傾き量とをパラメータとするルックアップテーブルで表わされていることを特徴とする請求項１３に記載の標本形状測定方法。
【請求項１５】
前記対応関係は、光量と傾き量とをパラメータとする式で表わされていることを特徴とする請求項１３に記載の標本形状測定方法。
【請求項１６】
前記所定の照明領域の像が前記瞳の縁の一部を含むように、前記所定の照明領域が設定されていることを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定方法。
【請求項１７】
前記所定の照明領域の位置を変更するステップを有し、
前記位置を変更するステップは、１回目の前記所定の処理ステップが終わった後に実行され、
前記位置を変更するステップの実行によって、前記所定の照明領域の位置が、前記１回目の前記処理ステップが実行されたときの位置とは異なる位置に移動し、
前記位置を変更するステップが終わった後に、２回目の前記所定の処理ステップが実行されることを特徴とする請求項１６に記載の標本形状測定方法。
【請求項１８】
前記所定の照明領域の像が前記瞳の縁を全て含むように、前記所定の照明領域が設定されていることを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定方法。
【請求項１９】
前記光軸に沿って、前記観察光学系と前記標本とを相対移動させるステップを備えることを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定方法。
【請求項２０】
瞳倍率は、前記照明光学系における瞳の径と前記観察光学系における瞳の径との比であって、
前記瞳倍率の変化は、標本によって生じ、
前記瞳倍率の変化に伴って生じる誤差を補正するステップを有することを特徴とする請求項１に記載の標本形状測定方法。
【請求項２１】
照明光学系と、観察光学系と、保持部材と、検出素子と、処理装置と、を備え、
前記照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、
前記観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、
前記保持部材は標本を保持すると共に、前記照明光学系と前記観察光学系との間に配置され、
前記照明光学系により前記標本に照射された照明光は、前記標本を透過し、
前記標本から出射した光は前記観察光学系に入射し、
前記検出素子は、前記観察光学系から出射した光を受光し、
前記処理装置は、
前記受光した光に基づく光量を求め、
前記光量と基準の光量との差又は比を算出し、
前記差又は比から、前記標本の表面における傾き量を算出することを特徴とする標本形状測定装置。
【請求項２２】
前記検出素子は、二次元配置された受光検出画素を持ち、
前記受光検出画素よりも広い範囲を所定の領域として設定し、
前記所定の領域に含まれる前記受光検出画素に基づいて得られた光量を、前記所定の領域における光量として求め、
前記所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出し、
前記算出結果から、前記所定の領域に対応する前記標本の表面における傾き量を算出する傾き量算出回路を有し、
前記所定の領域は、標本の表面を格子状に区分けしたときの１つの領域に対応し、
前記傾き量算出回路において、前記標本の表面位置における傾き量を、前記所定の領域を１単位として算出することを特徴とする請求項２１に記載の標本形状測定装置。
【請求項２３】
前記処理装置は、前記複数の傾き量から標本の形状を計算し、前記計算した形状から標本の形状を画像化する画像化回路を有することを特徴とする請求項２１に記載の標本形状測定装置。
【請求項２４】
前記処理装置は、
前記光量と前記傾き量とで構成されたルックアップテーブルを有し、前記ルックアップテーブルを用いて前記傾き量を算出することを特徴とする請求項２１に記載の標本形状測定装置。
【請求項２５】
光路に挿入離脱する第１の開口部材と第２の開口部材とを有し、
前記第１の開口部材は、前記コンデンサレンズの光軸を含む個所が遮光部であり、前記光軸に対して偏心した位置に第１の開口部を有し、
前記第２の開口部材は、前記コンデンサレンズの光軸を含む個所が遮光部であり、前記光軸に対して偏心した位置に第２の開口部を有し、
前記第１の開口部材を光路に挿入したときの前記光軸と第１の開口部重心を結ぶ方向と、前記第２の開口部材を光路に挿入したときの前記光軸と第２の開口部重心を結ぶ方向と、は交差することを特徴とする請求項２１又は２４に記載の標本形状測定装置。
【請求項２６】
前記開口部材は、前記コンデンサレンズの光軸を含む個所が遮光部であり、前記光軸に対して偏心した位置に第１の開口部と第２の開口部とを有し、
前記開口部材を光路に挿入したときの前記光軸と第１の開口部重心を結ぶ方向と、前記光軸と第２の開口部重心を結ぶ方向と、は交差することを特徴とする請求項２１又は２４に記載の標本形状測定装置。
【請求項２７】
前記開口部材は、前記コンデンサレンズの光軸を含む個所が遮光部であり、前記光軸に対して偏心した位置に開口部を有し、
前記光軸と開口部重心を結ぶ方向を変更可能であることを特徴とする請求項２１又は２４に記載の標本形状測定装置。
【請求項２８】
前記処理装置は、前記光軸と前記開口部重心を結ぶ複数方向における前記光量と前記傾き量との関係を表わすルックアップテーブルをデータとして有し、前記ルックアップテーブルを用いて前記傾き量及び傾き方向を算出することを特徴とする請求項２５又は２７に記載の標本形状測定装置。
【請求項２９】
前記照明光学系の照明光が前記観察光学系の瞳位置にて該瞳の一部分と該瞳外に照射されるように、前記開口部が設けられることを特徴とする請求項２５から２８のいずれか一項に記載の標本形状測定装置。
【請求項３０】
照明光学系と、観察光学系と、保持部材と、検出素子と、処理装置と、を備え、
前記照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、
前記観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、
前記保持部材は標本を保持すると共に、前記照明光学系と前記観察光学系との間に配置され、
前記開口部材は、遮光部と、開口部と、を有し、
前記遮光部は、前記コンデンサレンズの光軸を含むように設けられ、
前記開口部は、前記光軸に対して偏心した位置に設けられ、
前記開口部の像は、前記観察光学系の瞳位置の近傍に形成されると共に、前記観察光学系の瞳の外縁の一部と重なるように形成され、
前記照明光学系により前記標本に照射された照明光は、前記標本を透過し、
前記標本から出射した光は前記観察光学系に入射し、
前記検出素子は、前記観察光学系から出射した光を受光し、
前記処理装置は、
前記受光した光に基づく光量を求め、
前記光量と基準の光量との差又は比を算出し、
前記差又は比から、前記標本の表面における傾き量を算出することを特徴とする標本形状測定装置。
【請求項３１】
前記開口部材は、前記遮光部と前記開口部とを区分する境界線を有し、
前記境界線は、前記光軸と直交する１本の直線と平行な線で構成されていることを特徴とする請求項３０に記載の標本形状測定装置。
【請求項３２】
前記開口部材は第１の開口部材であって、
前記第１の開口部材は、遮光部と開口部とを区分する境界線を有し、
所定の２点を結ぶ直線が、境界線と光軸との間に位置することを特徴とする請求項３０に記載の標本形状測定装置。
ここで、所定の２点は、第１の開口部材に照明光学系の瞳を重ねたときに、所定の線と照明光学系の瞳の外縁とが交わる２点である。
【請求項３３】
前記開口部材は第２の開口部材であって、
前記第２の開口部材は、遮光部と開口部とを区分する境界線を有し、
境界線が、所定の２点を結ぶ直線と光軸との間に位置することを特徴とする請求項３０に記載の標本形状測定装置。
ここで、所定の２点は、第２の開口部材に照明光学系の瞳を重ねたときに、所定の線と照明光学系の瞳の外縁とが交わる２点である。
【請求項３４】
前記保持部材と、透明な平行平板と、を有し、
前記保持部材は、液体を保持する保持部を有し、
前記透明な平行平板は、前記液体の液面と接するように配置されていることを特徴とする請求項３０から３３のいずれか一項に記載の標本形状測定装置、
【請求項３５】
前記遮光部の大きさと前記対物レンズの標本側開口数の少なくとも一方が変更可能であることを特徴とする請求項３０から３４のいずれか１項に記載の標本形状測定装置。
【請求項３６】
前記対物レンズの標本側開口数の変更は、一つの対物レンズで行うことを特徴とする請求項３５に記載の標本形状測定装置。
【請求項３７】
前記対物レンズの標本側開口数の変更は、複数の対物レンズを切り替えて行うことを特徴とする請求項３５に記載の標本形状測定装置。
【請求項３８】
前記開口部を通過する照明光の光強度は、前記開口部の全ての位置で略等しいことを特徴とする請求項３０から３７のいずれか１項に記載の標本形状測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標本の表面における傾きや形状を測定する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
標本の３次元形状を測定する装置として、特許文献１に開示された装置や、特許文献２に開示された装置がある。【０００３】
特許文献１の装置では、縞投影法によって標本の３次元形状を測定している。特許文献１の装置では、撮像手段は、投光部、受光部、照明光出力部、ステージ及び測定制御部を含む。投光部はパターン生成部を有し、パターン生成部で生成されたパターンが標本に照射される。標本に照射されたパターンは受光部で撮像され、これにより縞画像が得られる。特許文献１の装置では、縞画像を用いて、標本の３次元形状を測定している。【０００４】
特許文献２の装置では、像のコントラストが、合焦点位置よりも合焦点位置の前後で高くなる現象を利用している。この現象は、非回折光と回折光との干渉によって生じる。特許文献２の装置では、合焦点位置の前後の画像から差分画像を取得する。そして、差分画像のコントラスト値を算出し、コントラスト値が最大となる位置を合焦点位置としている。特許文献２の装置では、標本面の各位置について合焦点位置を検出することで、標本の３次元形状を測定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１０９４９２号公報
【特許文献２】特開２００８−２０４９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１の装置では、標本から反射した光を検出している。そのため、透明で表面の反射率の低い標本、例えば、細胞については、高い精度で形状を測定することが困難である。【０００７】
特許文献２の装置では、非回折光と回折光との干渉を利用している。ここで、表面形状が滑らかな標本、例えば、細胞では、非回折光の光強度に比べて回折光の光強度が小さくなる。そのため、表面形状が滑らかになっている標本に対して、合焦点位置を正確に求めることは難しい。このようなことから、表面形状が滑らかな標本については、高い精度で形状を測定することが困難である。【０００８】
本発明は、このような課題に鑑みてなされたもので、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本面の傾きや形状を測定できる標本形状測定方法及び標本形状測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明の標本形状測定方法は、
所定の照明領域を通過する照明光を準備するステップと、
照明光を標本に照射するステップと、
所定の処理ステップと、を有し、
所定の照明領域は、照明光学系の瞳位置にて光軸を含まないように設定されると共に、照明光が観察光学系の瞳位置にて該瞳の内側の一部分と該瞳の外側に照射されるように設定され、
照明光は標本を透過し、
標本から出射した光は観察光学系に入射し、
所定の処理ステップは、
観察光学系から出射した光を受光するステップと、
受光した光の光量を求めるステップと、
光量と基準の光量との差又は比を算出するステップと、
差又は比から、標本の表面における傾き量を算出するステップと、を有することを特徴とする。【００１０】
また、本発明の標本形状測定装置は、
照明光学系と、観察光学系と、保持部材と、検出素子と、処理装置と、を備え、
照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、
観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、
保持部材は標本を保持すると共に、照明光学系と観察光学系との間に配置され、
照明光学系により標本に照射された照明光は、標本を透過し、
標本から出射した光は観察光学系に入射し、
検出素子は、観察光学系から出射した光を受光し、
処理装置は、
受光した光に基づく光量を求め、
光量と基準の光量との差又は比を算出し、
差又は比から、標本の表面における傾き量を算出することを特徴とする。【００１１】
また、本発明の別の標本形状測定装置は、
照明光学系と、観察光学系と、保持部材と、検出素子と、処理装置と、を備え、
照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、
観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、
保持部材は標本を保持すると共に、照明光学系と観察光学系との間に配置され、
開口部材は、遮光部と、開口部と、を有し、
遮光部は、コンデンサレンズの光軸を含むように設けられ、
開口部は、光軸に対して偏心した位置に設けられ、
開口部の像は、観察光学系の瞳位置の近傍に形成されると共に、観察光学系の瞳の外縁の一部と重なるように形成され、
照明光学系により標本に照射された照明光は、標本を透過し、
標本から出射した光は観察光学系に入射し、
検出素子は、観察光学系から出射した光を受光し、
処理装置は、
受光した光に基づく光量を求め、
光量と基準の光量との差又は比を算出し、
差又は比から、標本の表面における傾き量を算出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本面の傾きや形状を測定できる標本形状測定方法及び標本形状測定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】第１の状態における照明光の様子と結像光の様子を示す図である。
【図２Ａ】第１の状態における照明光の様子を示す図である。
【図２Ｂ】第１の状態における結像光の様子を示す図である。
【図３】第２の状態における照明光の様子と結像光の様子を示す図である。
【図４Ａ】第２の状態における照明光の様子を示す図である。
【図４Ｂ】第２の状態における結像光の様子を示す図である。
【図５】第３の状態における照明光の様子と結像光の様子を示す図である。
【図６Ａ】第３の状態における照明光の様子を示す図である。
【図６Ｂ】第３の状態における結像光の様子を示す図である。
【図７】傾斜角θsと面積Ｓの関係を表すグラフである。
【図８】基本測定方法のフローチャートである。
【図９】第１実施形態の標本形状測定方法が実施されるときの光学系を示す図である。
【図１０】微小領域の例を示す図である。
【図１１】第３実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。
【図１２Ａ】所定の領域の設定例１を示す図である。
【図１２Ｂ】所定の領域の設定例２を示す図である。
【図１３】第４実施形態の標本形状測定方法が実施されるときの光学系を示す図である。
【図１４】本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。
【図１５】本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。
【図１６】ルックアップテーブルの例である。
【図１７】本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。
【図１８Ａ】第１の位置における照明光の様子を示す図である。
【図１８Ｂ】第１の位置における結像光の移動の様子を示す図である。
【図１９Ａ】第１の位置における照明光の様子を示す図である。
【図１９Ｂ】第１の位置における結像光の移動の様子を示す図である。
【図２０】第１の位置における傾斜角θsと面積Ｓの関係を表すグラフである。
【図２１Ａ】第２の位置における照明光の様子を示す図である。
【図２１Ｂ】第２の位置における結像光の移動の様子を示す図である。
【図２２】仮想標本における高さの分布を示す図である。
【図２３Ａ】第１の位置における傾斜角の分布を示す図である。
【図２３Ｂ】第２の位置における傾斜角の分布を示す図である。
【図２４】所定の画素における傾き方向と傾き量を示す図である。
【図２５】仮想標本の高さ分布を示す図である。
【図２６Ａ】照明光の様子を示す図である。
【図２６Ｂ】結像光の様子を示す図である。
【図２７】本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。
【図２８】本実施形態の標本形状測定方法による測定の様子を示す図である。
【図２９】本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。
【図３０Ａ】保持部の面積が小さい場合の光学系を示す図である。
【図３０Ｂ】標本部を平凹レンズに置き換えたときの光学系を示す図である。
【図３１Ａ】標本が存在しない状態での、対物レンズの瞳と結像光の様子を示す図である。
【図３１Ｂ】培養液のみが存在する状態での、対物レンズの瞳と結像光の様子を示す図である。
【図３２】傾斜角θsと面積Ｓの関係を表すグラフである。
【図３３】本実施形態の標本形状測定装置の構成を示す図である。
【図３４】本実施形態の別の標本形状測定装置の構成を示す図である。
【図３５Ａ】第１の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。
【図３５Ｂ】第２の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。
【図３６Ａ】変形例１の第１の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。
【図３６Ｂ】変形例１の第２の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。
【図３７Ａ】変形例２の第１の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。
【図３７Ｂ】変形例２の第２の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。
【図３８】開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。
【図３９】開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。
【図４０Ａ】照明光の様子を示す図である。
【図４０Ｂ】結像光の様子を示す図である。
【図４１Ａ】変形例３の開口部材を用いたときの照明光の様子を示す図である。
【図４１Ｂ】変形例３の開口部材を用いたときの結像光の様子を示す図である。
【図４２Ａ】タイプ１の境界線における結像光の様子を示す図である。
【図４２Ｂ】タイプ２の境界線における結像光の様子を示す図である。
【図４２Ｃ】照明光の光量分布が均一な場合の相関特性を示す図である。
【図４３Ａ】変形例３の開口部材の別の例を示す図である。
【図４３Ｂ】変形例３の開口部材の別の例を示す図である。
【図４４Ａ】変形例４の開口部材を用いたときの照明光の様子を示す図である。
【図４４Ｂ】変形例４の開口部材を用いたときの結像光の様子を示す図である。
【図４５Ａ】タイプ１の境界線における結像光の様子を示す図である。
【図４５Ｂ】タイプ３の境界線における結像光の様子を示す図である。
【図４５Ｃ】照明光の光量分布が均一な場合の相関特性を示す図である。
【図４６Ａ】変形例４の開口部材１３０の別の例を示す図である。
【図４６Ｂ】変形例４の開口部材１３０の別の例を示す図である。
【図４７Ａ】平行平板が配置されていない場合の液体の様子を示す図である。
【図４７Ｂ】平行平板が配置されている場合の液体の様子を示す図である。
【図４８Ａ】タイプ１の境界線における相関特性を示すグラフである。
【図４８Ｂ】タイプ１の境界線における結像光の様子を示す図である。
【図４９】遮光部面積とθsとの関係を示すグラフである。
【図５０】標本を示す図である。
【図５１Ａ】測定方法１で得られた電子画像である。
【図５１Ｂ】測定方法２で得られた電子画像である。
【図５１Ｃ】測定方法３で得られた電子画像である。
【図５２Ａ】電子画像１における明るさの分布を示す図である。
【図５２Ｂ】電子画像２における明るさの分布を示す図である。
【図５２Ｃ】電子画像３における明るさの分布を示す図である。
【図５３Ａ】標準試料の第１例を示す図である。
【図５３Ｂ】標準試料の第２例を示す図である。
【図５３Ｃ】標準試料の第３例を示す図である。
【図５４】本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。
【図５５Ａ】開口部材を回転させる第１例を示す図である。
【図５５Ｂ】開口部材を回転させる第２例を示す図である。
【図５６】本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に、本発明に係る標本形状測定方法及び標本形状測定装置の実施形態及び実施例を、図面に基づいて詳細に説明する。なお、この実施形態及び実施例によりこの発明が限定されるものではない。
【００１５】
まず、本実施形態の標本形状測定方法における測定原理について説明する。本実施形態の標本形状測定方法では、偏射照明光を標本に照射している。そのために、照明光学系の絞り（開口絞り）に、照明光の光束の一部を遮光する遮光部材を用いている。
【００１６】
まず、第１の状態における照明光と結像光の関係について説明する。第１の状態における照明光の様子と結像光の様子を、図１に示す。第１の状態では、標本の表面が平坦で、標本の表面の法線（以下、「面の法線」という）が光軸と平行になっている。
【００１７】
図１に示すように、照明光学系１と観察光学系２が、ステージ３を挟んで対向するように配置されている。照明光学系１は、遮光部材４とコンデンサレンズ５とを有する。観察光学系２は対物レンズ６を有する。対物レンズ６は絞り７を有する。
【００１８】
遮光部材４には、例えば、矩形状の金属板が用いられる。遮光部材４は、遮光領域４ａと透過領域４ｂとで構成されている。遮光領域４ａは金属板で形成されている。透過領域４ｂには何も存在しない。
【００１９】
遮光部材４は、光軸１０を含むように配置されている。よって、遮光領域４ａには光軸１０が含まれるが、透過領域４ｂには光軸１０は含まれない。透過領域４ｂは、光軸１０から離れた位置に形成される。
【００２０】
遮光部材４が光路中に配置されることで、照明光ＬIL1は、遮光領域４ａで遮光される光と、透過領域４ｂを通過する光とに分かれる。
【００２１】
遮光部材４に、透明板が用いられても良い。この場合、例えば、遮光塗料の塗布や、遮光部材の貼付によって、遮光領域４ａが形成される。一方、透過領域４ｂには、遮光塗料の塗布や遮光部材の貼付は行わない。よって、透過領域４ｂには、透明板のみが存在することになる。
【００２２】
遮光部材４の形状は矩形で無くても良い。例えば、遮光部材４の形状は円形、楕円形、多角形であっても良い。
【００２３】
絞り７は、遮光部７ａと透過部７ｂとを有する。絞り７には、例えば、円形状の金属板や透明板が用いられる。絞り７に金属板が用いられた場合、遮光部７ａは金属板で、透過部７ｂは金属板に形成された孔である。絞り７に透明板が用いられた場合、遮光塗料の塗布や、遮光部材の貼付によって、遮光部７ａが形成される。透過部７ｂには透明板のみが存在する。
【００２４】
絞り７は、対物レンズ６の瞳と光学的に等価である。よって、この位置に、光束の通過を制限する部材、例えば、上述の金属板や透明板が存在していなくても良い。
【００２５】
ステージ３の上には、標本８が載置されている。標本８と対物レンズ６との間は、液浸媒質９（以下「浸液９」という）で満たされている。ここでは、標本８は屈折率がｎの液体、浸液９は屈折率がｎ’の液体としている。また、ｎ＞ｎ’である。
【００２６】
照明光ＬIL1は平行な光束であって、光束中に光軸１０が含まれるように形成されている。照明光ＬIL1は、照明光学系１の光路を標本８に向かって進行する。照明光学系１の光路中には、遮光部材４とコンデンサレンズ５が配置されている。
【００２７】
第１の状態における照明光の様子を、図２Ａに示す。図２Ａでは、照明光ＬIL1の領域が実線の円で示されている。照明光ＬIL1は、遮光領域４ａで遮光される光と透過領域４ｂを通過する光とに分かれる。遮光領域４ａが光軸１０を含むように、遮光部材４は配置されている。そのため、透過領域４ｂには光軸１０は含まれていない。透過領域４ｂを通過したとき、照明光ＬIL2の領域の形状は弓形になる。
【００２８】
遮光部材４は、コンデンサレンズ５と対物レンズ６によって、絞り７と共役になっている。よって、遮光部材４の位置には、絞りの像７’が形成される。図２Ａには、遮光部材４の位置に形成された絞りの像７’が破線で示されている。絞りの像７’は、破線で示すように円形の像である。絞りの像７’は、対物レンズ６の瞳の像でもある。
【００２９】
図２Ａに示すように、実線で示す円は、破線で示す円よりも大きい。これは、絞りの像７’よりも広い範囲を照明するように、照明光ＬIL1の光束径が設定されていることを意味している。照明光ＬIL2についても、同じことが言える。すなわち、照明光ＬIL2は、絞りの像７’の外側にも分布するような大きさに設定されている。
【００３０】
図１に戻って説明を続ける。透過領域４ｂを通過した照明光ＬIL2は、コンデンサレンズ５に入射する。照明光ＬIL2は、光軸１０から離れた位置を進むため、照明光ＬIL2は、コンデンサレンズ５の周辺部に入射する。
【００３１】
コンデンサレンズ５に入射した照明光ＬIL2は、コンデンサレンズ５で屈折される。コンデンサレンズ５からは、照明光ＬIL3が出射する。照明光ＬIL3は標本８上の観察点１１に入射し、これにより観察点１１が照明される。
【００３２】
観察点１１では、照明光ＬIL3が光軸１０と交差するように照明が行われる。これは、特定の方向に偏斜された照明光による照明、すなわち、偏射照明光による照明が行われていることを意味する。
【００３３】
照明光ＬIL3は、標本８を透過する。標本８から出射した光（以下、「結像光」という）は、対物レンズ６に到達する。対物レンズ６に到達した結像光ＬSP1のうち、一部の結像光は対物レンズ６の有効径によってけられ、残りの結像光が対物レンズ６に入射する。対物レンズ６に入射した結像光ＬSP2のうち、一部の結像光は絞り７によってけられ、残りの結像光ＬSP3が対物レンズ６から出射する。
【００３４】
第１の状態における結像光の様子を、図２Ｂに示す。絞り７には、結像光ＬSP2が入射する。結像光ＬSP2を示す領域の形状は弓形である。結像光ＬSP2のうち、一部の結像光は透過部７ｂの外側に位置している。よって、この一部の結像光は遮光部７ａで遮光される。結像光ＬSP2のうち、残りの結像光が透過部７ｂを通過する。
【００３５】
透過部７ｂは、結像光が通過する領域と結像光が存在しない領域に分かれる。結像光が通過する領域の形状は、弓形である。この弓形の領域を結像光ＬSP3が通過する。
【００３６】
図２Ｂにおいて、Ｒは透過部７ｂの半径を示している。絞り７は対物レンズ６の瞳と光学的に等価なので、Ｒは対物レンズの瞳の半径を表しているといえる。Ｌは光軸１０から結像光ＬSP3までの距離のうち、最も短い距離を示している。
【００３７】
第１の状態では、所定の光線について、以下の式（１）が成立する。所定の光線は、標本に入射する光のうち、光軸から最も近い位置を通過する光線である。
【数１】
2016185729.tif 000003
ここで、
θ’inは、所定の光線と光軸とのなす角、
θminは、所定の光線と光軸とのなす角、
ｎは標本の屈折率、
ｎ’は浸液の屈折率、
である。
【００３８】
このとき、対物レンズから出射する結像光の面積Ｓ0は、以下の式（２）で表される。
【数２】
2016185729.tif 000004
【００３９】
また、ＲとＬは、各々以下の式（３）、（４）で表される。
【数３】
2016185729.tif 000005
【数４】
2016185729.tif 000006
ここで、
ｆは対物レンズの焦点距離、
θNAは対物レンズの標本側開口数、
である。
【００４０】
次に、第２の状態における照明光と結像光の関係について説明する。第２の状態における照明光の様子と結像光の様子を図３に示す。第２の状態では、標本の表面は平坦であるが、面の法線が光軸と非平行になっている。
【００４１】
面の法線が光軸と非平行な状態では、標本の表面が傾斜している。図３に示すように、面の法線１２と光軸１０とのなす角はθsであるので、標本８の表面は傾斜角θsで傾斜していることになる。角度の正負は、光軸１０を基準にして、反時計周りの方向に面の法線１２が位置する場合を正、時計周りの方向に面の法線１２が位置する場合を負とする。第２の状態では、θsは正の値である。
【００４２】
標本８から出射した結像光は、対物レンズ６に到達する。対物レンズ６に到達した結像光ＬSP1のうち、一部の結像光は対物レンズ６の有効径によってけられ、残りの結像光が対物レンズ６に入射する。
【００４３】
ここで、第２の状態では、標本８の表面が傾斜角＋θsで傾斜している。この場合、標本８の表面における屈折角が大きくなる。そのため、対物レンズ６に入射する結像光ＬSP1の位置は、第１の状態と比べてより外側の方向にシフトする。その結果、対物レンズ６に入射した結像光ＬSP2の光束の大きさは、第１の状態と比べて小さくなる。
【００４４】
対物レンズ６に入射した結像光ＬSP2のうち、一部の結像光は絞り７によってけられ、残りの結像光ＬSP3が対物レンズ６から出射する。結像光ＬSP2の光束の大きさは第１の状態と比べて小さいので、結像光ＬSP3の光束の大きさも第１の状態と比べて小さくなる。
【００４５】
第２の状態における結像光の様子を、図４Ａに示す。また、比較のために、第１の状態における結像光の様子を、図４Ｂに示す。図４Ａと図４Ｂでは、遮光部７ａの図示は省略している。
【００４６】
図４Ａと図４Ｂを比較して分かるように、第２の状態における結像光ＬSP3の光束は、第１の状態における結像光ＬSP3の光束の位置よりも、光軸１０から更に離れる方向にΔＳ１だけシフトした状態になっている。そのため、第２の状態における結像光ＬSP3の光束の大きさは第１の状態と比べて小さくなる。よって、第２の状態では、絞り７を通過する光量が第１の状態から減少する。
【００４７】
次に、第３の状態における照明光と結像光の関係について説明する。第３の状態における照明光の様子と結像光の様子を図５に示す。第３の状態では、標本の表面は平坦であるが、面の法線が光軸と非平行になっている。
【００４８】
第３の状態でも面の法線が光軸と非平行な状態になっている。図５に示すように、法線１２と光軸１０とのなす角はθsであるので、標本８の表面は傾斜角θsで傾斜している面のことになる。ただし、第２の状態とは異なり、第３の状態ではθsは負の値になっている。
【００４９】
標本８から出射した結像光は、対物レンズ６に到達する。対物レンズ６に到達した結像光ＬSP1のうち、一部の結像光は対物レンズ６の有効径によってけられ、残りの結像光が対物レンズ６に入射する。
【００５０】
ここで、第３の状態では、標本８の表面が傾斜角−θsで傾斜している。この場合、標本８の表面における屈折角が小さくなる。そのため、対物レンズ６に入射する結像光ＬSP1の位置は、第１の状態と比べてより内側の方向にシフトする。その結果、対物レンズ６に入射した結像光ＬSP2の光束の大きさは、第１の状態と比べて大きくなる。
【００５１】
対物レンズ６に入射した結像光ＬSP2のうち、一部の結像光は絞り７によってけられ、残りの結像光ＬSP3が対物レンズ６から出射する。結像光ＬSP2の光束の大きさは第１の状態と比べて大きいので、結像光ＬSP3の光束の大きさも第１の状態と比べて大きくなる。
【００５２】
第３の状態における結像光の様子を、図６Ａに示す。また、比較のために、第１の状態における結像光の様子を、図６Ｂに示す。図６Ａと図６Ｂでは、遮光部７ａの図示は省略している。
【００５３】
図６Ａと図６Ｂを比較して分かるように、第３の状態における結像光ＬSP3の光束は、第１の状態における結像光ＬSP3の光束の位置から、光軸１０に近づく方向にΔＳ２だけシフトした状態になっている。そのため、第３の状態における結像光ＬSP3の光束の大きさは第１の状態と比べて大きくなる。よって、第３の状態では、絞り７を通過する光量が第１の状態から増加する。
【００５４】
第２の状態と第３の状態では、所定の光線について、以下の式（５）が成立する。
【数５】
2016185729.tif 000007
ここで、
θ’inは、所定の光線と光軸とのなす角、
θsは、標本の表面の法線と光軸とのなす角、
θminは、所定の光線と光軸とのなす角、
ｎは標本の屈折率、
ｎ’は浸液の屈折率、
角度の正負は、光軸を基準にして、反時計周りの方向に標本の表面の法線が位置する場合が正、時計周りの方向に標本の表面の法線が位置する場合が負、
である。
【００５５】
例えば、図３に示した方向に標本が傾斜している場合、面の法線の回転方向は正方向となり、θsは正の値をとる。一方、図５に示した方向に標本が傾斜している場合、面の法線の回転方向は負方向となり、θsは負の値をとる。
【００５６】
このとき、対物レンズから出射する結像光の面積Ｓは、以下の式（６）で表される。
【数６】
2016185729.tif 000008
ここで、Ｒは上記の式（３）で表され、Ｌは下記の式（７）で表される。
【数７】
2016185729.tif 000009
【００５７】
式（７）においてθin＝θmin、θs＝0とすれば、式（７）の右辺は式（４）の右辺と同じになる。この場合、式（６）の右辺も式（２）の右辺と同じになる。よって、面積Ｓと傾斜角θsは、式（３）、（６）及び（７）で表すことができる。
【００５８】
傾斜角θsと面積Ｓの関係を表すグラフを図７に示す。対物レンズから出射した結像光は、例えば、結像レンズで集光される。集光位置には標本８の像が形成される。対物レンズから出射する結像光の面積Ｓが変化すると、標本８の像の輝度が変化する。また、傾斜角θsが変化すると、標本の表面の光軸に対する傾き角が変化する。そこで、図７に示すグラフでは、傾き角を傾斜角θsに置き換え、像の輝度を面積Ｓに置き換えて、傾き角と像の輝度との関係を示している。
【００５９】
また、各パラメータの値は、以下の通りである。
ｎ’＝１．３３、
ｎ＝１．３５、
ｆ＝１８［ｍｍ］、
θNA＝９．２［ｄｅｇ.］(ＮＡ＝０．１６)、
θmin＝６．５[ｄｅｇ.]
【００６０】
傾斜角θsと面積Ｓの関係を表す曲線（以下、「特性曲線」という）から分かるように、傾斜角θsの値が大きくなるに従って、像の輝度は単調に減少する。このように、像の輝度と傾斜角θsは一対一で対応する。
【００６１】
そこで、特定の方向に偏斜された照明光を標本に照射し、標本の２次元画像を取得する。そして、取得した２次元画像の各画素について、光量（輝度）の情報を取得する。ここで、標本の屈折率（平均的屈折率）ｎ、浸液の屈折率ｎ’、対物レンズの焦点距離ｆ、対物レンズの標本側開口数θNA、及び角度θminは既知である。よって、これらを用いて、画素ごとに傾斜角θsを導出することが可能となる。すなわち、標本の表面における傾き量の分布を導出することが可能となる。
【００６２】
このように、本実施形態の標本形状測定方法における測定原理では、特定の方向に偏斜された照明光を標本に照射しているだけである。そのため、標本の表面における傾き量の分布の導出では、標本から出射した光、すなわち、標本を透過した光を利用しているだけで、像のコントラストや非回折光と回折光との干渉を利用していない。よって、本実施形態の標本形状測定方法によれば、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。
【００６３】
本実施形態の標本形状測定方法について説明する。まず、基本となる測定方法（以下、「基本測定方法」という）について説明する。その後、好ましい実施形態の標本形状測定方法について説明する。以下の説明では、絞り７の代わりに、対物レンズの瞳７を用いている。
【００６４】
基本測定方法は、所定の照明領域を通過する照明光を準備するステップと、照明光を標本に照射するステップと、所定の処理ステップと、を有し、所定の照明領域は、照明光学系の瞳位置にて光軸を含まないように設定されると共に、照明光が観察光学系の瞳位置にて該瞳の内側の一部分と該瞳の外側に照射されるように設定され、照明光は標本を透過し、標本から出射した光は観察光学系に入射し、所定の処理ステップは、観察光学系から出射した光を受光するステップと、受光した光の光量を求めるステップと、光量と基準の光量との差又は比を算出するステップと、差又は比から、標本の表面における傾き量を算出するステップと、を有することを特徴とする。
【００６５】
基本測定方法について説明する。図８は、基本測定方法のフローチャートである。基本測定方法は、照明光を準備するステップＳ１０と、照明光を照射するステップＳ２０と、所定の処理ステップＳ３０と、を有し、所定の処理ステップＳ３０は、結像光を受光するステップＳ３１と、結像光の光量を求めるステップＳ３２と、差又は比を算出するステップＳ３３と、傾き量を算出するステップＳ３４と、を有する。
【００６６】
基本測定方法では、まず、ステップＳ１０が実行される。ステップＳ１０は、照明光を準備するステップである。ステップＳ１０では、照明光学系内に、所定の照明領域が設定される。所定の照明領域は、照明光が通過する領域である。所定の照明領域は、図１に示す透過領域４ｂである。照明光学系１の光路に遮光部材４を配置することで、所定の照明領域の設定が行われる。このとき、光軸１０を含み、且つ照明光ＬIL1の光束の一部を遮光するように、遮光部材４が配置される。
【００６７】
また、遮光部材４は、照明光学系１の瞳位置、具体的には、コンデンサレンズ５の瞳位置に配置されている。コンデンサレンズ５の瞳の位置は、観察光学系２の瞳位置、具体的には、対物レンズの瞳７の位置と共役になっている。よって、対物レンズの瞳７の位置に、所定の照明領域の像が形成される。このとき、所定の照明領域の像は、対物レンズの瞳７の内側と外側の両方に分布するように形成される。
【００６８】
このように、所定の照明領域は、照明光学系の瞳位置にて光軸を含まないように設定されると共に、所定の照明領域を通過した照明光が、観察光学系の瞳位置にて該瞳の内側の一部分と該瞳の外側に照射されるように設定される。
【００６９】
ステップＳ１０が終わると、ステップＳ２０が実行される。ステップＳ２０は、照明光を照射するステップである。ステップＳ２０では、照明光が標本に照射される。このとき、標本には、偏射照明光が照射される。すなわち、光束が標本位置において光軸と交差するように、照明光は標本に照射され、標本を透過する。標本が照明されることで、標本から結像光が出射する。標本から出射した光は、観察光学系に入射する。
【００７０】
ステップＳ２０が終わると、ステップＳ３０が実行される。ステップＳ３０は、所定の処理を行うステップである。ステップＳ３０では、ステップＳ３１、ステップＳ３２、ステップＳ３３及びステップＳ３４が実行される。
【００７１】
ステップＳ３０では、まず、ステップＳ３１が実行される。ステップＳ３１は、結像光を受光するステップである。結像光は、観察光学系から出射した光である。
【００７２】
ステップＳ３１が終わると、ステップＳ３２が実行される。ステップＳ３２は、結像光の光量を求めるステップである。結像光の光量は、ステップＳ３１で受光した光の光量である。
【００７３】
ステップＳ３２が終わると、ステップＳ３３が実行される。ステップＳ３３は、差又は比を算出するステップである。ステップＳ３３では、ステップＳ３１で受光した光の光量、すなわち、結像光の光量と基準の光量との差又は比が算出される。
【００７４】
ステップＳ３３が終わると、ステップＳ３４が実行される。ステップＳ３４は、傾き量を算出するステップである。ステップＳ３４では、ステップＳ３３で算出された結果から、標本の表面における傾き量が算出される。
【００７５】
このように、基本測定方法では、特定の方向に偏斜された照明光を標本に照射しているだけである。そのため、標本の表面における傾き量の分布の導出では、標本から出射した光、すなわち、標本を透過した光を利用しているだけで、像のコントラストや非回折光と回折光との干渉を利用していない。本実施形態の標本形状測定方法は、この基本測定方法を用いている。よって、本実施形態の標本形状測定方法によれば、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、後述のように、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。
【００７６】
第１実施形態の標本形状測定方法は、基本測定方法を備え、所定の照明領域に、面光源が配置されるか、又は面光源の像が形成され、受光するステップにおいて、観察光学系から出射した光を、複数の微小領域で受光することが好ましい。
【００７７】
第１実施形態の標本形状測定方法について説明する。第１実施形態の標本形状測定方法では、所定の照明領域に、面光源が配置されるか、又は面光源の像が形成されている。そして、結像光を受光するステップＳ３１では、観察光学系から出射した光を、複数の微小領域で受光する。
【００７８】
図９は、第１実施形態の標本形状測定方法が実施されるときの光学系を示す図である。図９に示す光学系では、所定の照明領域に、面光源２０が配置されている。また、面光源２０の両端から出射した照明光が示されている。面光源２０の一端から出射した照明光は点線で示され、面光源２０の他端から出射した照明光は破線で示されている。
【００７９】
点線で示す照明光と破線で示す照明光は、共に、コンデンサレンズ５から平行光束となって出射する。よって、標本８は、広がりを持った照明光で照明される。
【００８０】
照明された標本８からは、結像光が出射する。標本８の点Ｐ１から出射した結像光は、対物レンズ６と結像レンズ２１とによって、像位置に集光される。像位置には、点Ｐ１の像Ｐ１’が形成される。標本８の点Ｐ２から出射した結像光も、対物レンズ６と結像レンズ２１とによって、像位置に集光される。像位置には、点Ｐ２の像Ｐ２’が形成される。このように、像位置には、２次元の像が形成される。
【００８１】
ステップＳ３１では、複数の微小領域で結像光の受光が行われる。図１０に微小領域の例を示す。図１０では、２５６個の微小領域２２が２次元に配列されている。
【００８２】
第１実施形態の標本形状測定方法では、観察光学系から出射した光によって、２次元の像が形成された状態になる。ステップＳ３１では、２次元の像を形成する光を、複数の微小領域で受光する。よって、第１実施形態の標本形状測定方法では、２次元の像が複数の微小領域に分割され、各微小領域で受光が行われることになる。その結果、標本の表面の形状を、広い範囲にわたって１回で測定することができる。
【００８３】
第２実施形態の標本形状測定方法は、第１実施形態の標本形状測定方法を備え、微小領域の各々について、光量を求めるステップ、差又は比を算出するステップ及び傾き量を算出するステップが実行されることが好ましい。
【００８４】
第２実施形態の標本形状測定方法について説明する。第２実施形態の標本形状測定方法では、微小領域の各々について、ステップＳ３２、ステップＳ３３及びステップＳ３４が実行される。このようにすることで、光軸と直交する面における空間分解能を高くすることができる。よって、標本の表面形状を、高い空間分解能で測定することができる。
【００８５】
第３実施形態の標本形状測定方法は、第１実施形態の標本形状測定方法を備えると共に、１つの微小領域よりも広い範囲を所定の領域として設定するステップを有し、光量を求めるステップでは、所定の領域に含まれる微小領域に基づいて得られた光量を、所定の領域における光量として求め、差又は比を算出するステップでは、所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出し、傾きを算出するステップでは、所定の領域に対応する標本の表面における傾き量を算出し、所定の領域は、標本の表面を格子状に区分けしたときの１つの領域に対応し、標本の表面における傾き量を、所定の領域を１単位として算出することが好ましい。
【００８６】
第３実施形態の標本形状測定方法について説明する。図１１は、第３実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。図８のフローチャートと同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。第３実施形態の標本形状測定方法は、所定の領域を設定するステップＳ４０を有する。
【００８７】
上述のように、複数の微小領域の各々について傾き量を算出することで、標本の表面形状を、高い空間分解能で測定することができる。しかしながら、微小領域における光量が少ないと、ＳＮ比が悪化する。その結果、標本の表面における傾き量を、高い精度で算出することが難しくなる。
【００８８】
そこで、最初に、ステップＳ４０が実行される。ステップＳ４０は、所定の領域を設定するステップである。ステップＳ４０では、１つの微小領域よりも広い範囲を所定の領域として設定する。ステップＳ４０では、例えば、所定の領域の面積が１つの微小領域の面積の２倍以上となるように、所定の領域を設定すれば良い。
【００８９】
図１２Ａは、所定の領域の設定例１を示す図、図１２Ｂは、所定の領域の設定例２を示す図である。
【００９０】
設定例１では、図１２Ａに示すように、所定の領域２３は４つの微小領域２２からなる。この場合、所定の領域２３における光量は、４つの微小領域２２の各々における光量の和になる。そのため、所定の領域２３における光量は、１つの微小領域２２における光量に比べて大きくなる。
【００９１】
その結果、所定の領域２３を設定した場合のＳＮ比は、所定の領域２３を設定しない場合に比べて向上するので、標本の表面における傾き量を高い精度で算出することができる。ただし、光軸と直交する面における空間分解能は低下する。
【００９２】
設定例２では、図１２Ｂに示すように、所定の領域２４は１６の微小領域２２からなる。この場合も、所定の領域２４を設定した場合のＳＮ比は、所定の領域２４を設定しない場合に比べて向上するので、標本の表面における傾き量を高い精度で算出することができる。ただし、光軸と直交する面における空間分解能は低下する。
【００９３】
所定の領域２３や所定の領域２４は、標本の表面を格子状に区分けしたときの１つの領域に対応する。所定の領域２４の面積は、所定の領域２３の面積に比べて広い。よって、標本の表面における区分けの粗さは、所定の領域２４に対応する格子状の区分けの方が、所定の領域２３に対応する区分けよりも粗くなっている。
【００９４】
ステップＳ４０が終わると、ステップＳ１０とステップＳ２０が実行される。ステップＳ２０が終わると、ステップＳ３０が実行される。第３実施形態の標本形状測定方法では、所定の領域がされているので、所定の領域に基づいてステップＳ３０が実行される。
【００９５】
ステップＳ３０では、ステップＳ３１が実行される。第３実施形態の標本形状測定方法では、第１実施形態の標本形状測定方法と同様に、複数の微小領域で結像光の受光が行われる。よって、ステップＳ３１の処理は、第３実施形態の標本形状測定方法と第１実施形態の標本形状測定方法とで同じになる。
【００９６】
ステップＳ３１が終わると、ステップＳ３２が実行される。ステップＳ３２では、結像光の光量を求める。上述のように、所定の領域が設定されている。よって、ステップＳ３２では、所定の領域に含まれる微小領域に基づいて得られた光量を、所定の領域における光量として求める。
【００９７】
ステップＳ３２が終わると、ステップＳ３３が実行される。ステップＳ３３では、差又は比を算出する。上述のように、所定の領域が設定されている。よって、ステップＳ３３では、所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出する。
【００９８】
ステップＳ３３が終わると、ステップＳ３４が実行される。ステップＳ３４では、傾き量を算出する。上述のように、所定の領域が設定されている。よって、ステップＳ３４では、ステップＳ３３で算出された結果から、所定の領域に対応する標本の表面における傾き量をする。
【００９９】
所定の領域は、標本の表面を格子状に区分けしたときの１つの領域に対応する。よって、第３実施形態の標本形状測定方法では、標本の表面における傾き量が、所定の領域を１単位として算出される。
【０１００】
第３実施形態の標本形状測定方法によれば、標本の表面形状が滑らかになっていても、高い精度で標本の表面形状を測定できる。また、所定の領域を設定しているので、所定の領域を設定しない場合に比べてＳＮ比が向上する。よって、標本の表面における傾き量を高い精度で算出することができる。
【０１０１】
図１１に示すフローチャートでは、ステップＳ４０が最初に実行されている。しかしながら、ステップＳ４０の実行は、ステップＳ３０の実行より前に行えば良い。
【０１０２】
第４実施形態の標本形状測定方法は、基本測定方法を備え、所定の照明領域を通過する照明光が平行光束であることが好ましい。
【０１０３】
第４実施形態の標本形状測定方法について説明する。第４実施形態の標本形状測定方法は、基本測定方法を備え、所定の照明領域を通過する照明光が平行光束になっている。
【０１０４】
図１３は、第４実施形態の標本形状測定方法が実施されるときの光学系を示す図である。図１３に示す光学系では、遮光部材４に対して平行光束が照射さている。よって、所定の照明領域を通過する照明光も、平行光束になる。
【０１０５】
照明光はコンデンサレンズ５に入射する。コンデンサレンズ５に入射した照明光は、標本８の位置に集光する。よって、標本８は点状の照明光で照明される。
【０１０６】
照明された標本８からは、結像光が出射する。標本８の点Ｐ３から出射した結像光は、対物レンズ６と結像レンズ２１とによって、像位置に集光される。像位置には、点Ｐ３の像Ｐ３’が形成される。
【０１０７】
このように、所定の照明領域を通過する照明光が平行光束の場合、標本８の１点にしか照明光は照射されない。この場合、結像光も、標本８の１点からの光のみになる。そのため、ステップＳ３０が実行されると、算出されるのは、標本８の１点における傾き量のみになる。
【０１０８】
また、第４実施形態の標本形状測定方法は、光軸と直交する面内で、照明光と標本とを相対移動させることが好ましい。
【０１０９】
上述のように、第４実施形態の標本形状測定方法は、標本８の１点における傾き量のみしか算出されない。そこで、光軸と直交する面内で、照明光と標本とを相対移動させる。これにより、標本８の複数の位置における傾き量を算出することができる。
【０１１０】
また、基本測定方法、及び第１実施形態の標本形状測定方法から第４実施形態の標本形状測定方法（以下、「本実施形態の標本形状測定方法」という）では、基本測定方法を備え、傾き量から標本の形状を計算し、計算した形状から標本の形状を画像化するステップを有することが好ましい。
【０１１１】
本実施形態の標本形状測定方法について説明する。図１４は、本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。図８のフローチャートと同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。本実施形態の標本形状測定方法は、基本測定方法を備え、標本の形状を画像化するステップＳ５０を有する。
【０１１２】
本実施形態の標本形状測定方法では、ステップＳ３４が終わると、ステップＳ５０が実行される。ステップＳ５０では、傾き量から標本８の形状を計算し、計算した形状から標本８の形状を画像化する。このようにすることで、標本の形状を視覚的に把握することができる。ステップＳ３０がステップＳ５０を含んでいても良い。
【０１１３】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、基準の光量は、標本が存在していない状態での光量であることが好ましい。
【０１１４】
同じ標本を、異なる光量の照明光で照明すると、結像光の光量も異なる。そのため、結像光の光量だけを用いて傾き量を算出すると、標本が同じであっても、面形状は照明光の光量によって変化してしまう。そこで、本実施形態の標本形状測定方法では、結像光の光量と基準の光量との差又は比を算出している。このようにすることで、照明光の光量が変化しても、標本の表面形状を正しく求めることができる。
【０１１５】
基準の受光量は、標本が存在していない状態の光量なので、照明光の光量になる。よって、基準の光量を用いて結像光の光量との差又は比を算出することで、照明光の光量が変化しても、標本の表面形状を正しく求めることができる。
【０１１６】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、照明光を準備するステップと照明光を標本に照射するステップとの間に、基準の光量を設定するステップを有することが好ましい。
【０１１７】
本実施形態の標本形状測定方法について説明する。ここでは、基本測定方法を用いて説明する。図１５は、本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。図８のフローチャートと同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。本実施形態の標本形状測定方法は、照明光を準備するステップＳ１０と照明光を照射するステップＳ２０との間に、基準の光量を設定するステップＳ６０を有する。
【０１１８】
ステップＳ１０が終わると、ステップＳ６０が実行される。ステップＳ６０では、基準の光量を設定する。基準の光量は、上述のように、標本が存在していない状態での光量である。ステップＳ３３では、基準の光量を用いて結像光の光量との差又は比を算出する。これにより、照明光の光量が変化しても、標本の表面形状を正しく求めることができる。
【０１１９】
ステップＳ６０が終わると、標本をステージ上に載置する。そして、ステップＳ２０が実行される。
【０１２０】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、基準の光量を設定するステップは、照明光学系から出射した照明光を観察光学系に入射させて光量を測定し、測定した光量に基づいて基準の光量を設定することが好ましい。
【０１２１】
ステップＳ６０では、標本が存在していない状態で、照明光学系から出射した照明光を観察光学系に入射させて光量を測定する。これにより、標本が存在していない状態での光量を求めることができる。そして、測定した光量に基づいて基準の光量を設定する。
【０１２２】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、光量の測定を、最初の標本の測定よりも前に行うことが好ましい。
【０１２３】
このようにすると、標本形状を測定する直前に、基準の光量が測定されることになる。そのため、ステップＳ３３で算出した差又は比の精度を高めることができる。その結果、正確に傾き量を算出することができる。
【０１２４】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、測定した光量を記憶しておき、最初の標本の測定よりも前に記憶した光量を読み出して、基準の光量を設定することが好ましい。
【０１２５】
このようにすると、標本形状を測定するたびに、基準の光量を測定する必要がなくなる。よって、測定時間を短縮することができる。
【０１２６】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、傾き量を算出するステップでは、予め求めておいた対応関係に基づいて傾き量を算出することが好ましい。
【０１２７】
上述のように、本実施形態の標本形状測定方法では、結像光の光量に基づいて、傾き量を算出する。そこで、結像光の光量と傾き量との対応関係を、予め求めておく。このようにしておくと、対応関係に基づいて、求めた結像光の光量から、傾き量を迅速に算出することができる。
【０１２８】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、対応関係は、光量と傾き量とをパラメータとするルックアップテーブルで表わされていることが好ましい。
【０１２９】
図１６は、ルックアップテーブルの例である。図１６に示すように、ルックアップテーブルは、輝度と傾斜角とをパラメータとして有する。輝度は結像光の光量を表し、傾斜角は標本の表面における傾き量を表している。
【０１３０】
ルックアップテーブルを作成するためには、標本の屈折率が必要になる。標本が細胞の場合、細胞内には様々な物質が存在する。そのため、細胞全体の屈折率は、これらの物質の屈折率を平均したときの屈折率（以下、「細胞の平均屈折率ｎAVE」という）になる。細胞の平均屈折率ｎAVEは、細胞内に存在する物質の種類によって変化する。よって、細胞の平均屈折率ｎAVEの値は１つに限られない。
【０１３１】
また、例えば、標本が細胞の場合、細胞の周囲には培養液や保存液が存在することもある。そのため、ルックアップテーブルを作成するためには、培養液の屈折率や保存液の屈折率が必要になる。
【０１３２】
図１６に示すルックアップテーブルは、標本が細胞の場合のルックアップテーブルである。このルックアップテーブルでは、培養液の屈折率又は保存液の屈折率を１．３３としてテーブルを作成している。また、細胞の平均屈折率ｎAVEについては、３通り（１．３４、１．３５、１．３６）の屈折率を想定し、各屈折率から求めた結果を１つのテーブルにまとめている。
【０１３３】
ステップＳ３３では、結像光の光量と基準の光量との差又は比が算出される。算出された値は、結像光の光量を表している。そこで、算出された値と一致する値を、ルックアップテーブルの輝度の中から探す。算出された値と一致した値があれば、その値に対応する傾斜角を、ルックアップテーブルから求める。これにより、標本の表面における傾き量を迅速に求めることができる。
【０１３４】
一方、算出された値と一致する値が、ルックアップテーブルの中に存在しない場合もある。この場合、算出された値に対して最も近い２つの値を、ルックアップテーブルの輝度の中から抽出する。そして、抽出した２つの値を用いて、傾斜角を求めればよい。これにより、標本の表面における傾き量を求めることができる。
【０１３５】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、対応関係は、光量と傾き量とをパラメータとする式で表わされていることが好ましい。
【０１３６】
上述のように、対物レンズから出射する結像光の面積Ｓと傾斜角θsは式（３）、（６）及び（７）で表される。面積Ｓは結像光の光量を表し、傾斜角θsは標本の表面における傾き量を表している。
【０１３７】
ステップＳ３３では、結像光の光量と基準の光量との差又は比が算出される。算出された値は、結像光の光量を表している。そこで、算出された値を面積Ｓに代入して、傾斜角θsを求める。このようにすることで、標本の表面における傾き量を求めることができる。
【０１３８】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、所定の照明領域の像が瞳の縁の一部を含むように、所定の照明領域が設定されていることが好ましい。
【０１３９】
このようにすることで、標本の表面における傾きの方向と傾き量とを求めることができる。
【０１４０】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、所定の照明領域の位置を変更するステップを有し、位置を変更するステップは、１回目の所定の処理ステップが終わった後に実行され、位置を変更するステップの実行によって、所定の照明領域の位置が、１回目の処理ステップが実行されたときの位置とは異なる位置に移動し、位置を変更するステップが終わった後に、２回目の所定の処理ステップが実行されることが好ましい。
【０１４１】
本実施形態の標本形状測定方法について説明する。図１７は、本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。図８のフローチャートと同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。
【０１４２】
本実施形態の標本形状測定方法は、所定の照明領域の位置を変更するステップＳ７０を有する。ステップＳ７０は、所定の照明領域の移動を確認するステップＳ７１と、所定の照明領域を移動させるステップＳ７２と、を有する。
【０１４３】
ステップＳ１０では、照明光学系内の任意の位置に、所定の照明領域が設定される。ここでは、ステップＳ１０で設定した位置を、第１の位置とする。第１の位置における照明光の様子を、図１８Ａ、図１９Ａに示す。また、第１の位置における結像光の移動の様子を、図１８Ｂ、図１９Ｂに示す。ここでは、紙面内の左右方向をＸ方向、紙面内の上下方向をＹ方向とする。また、照明光ＬIL2が所定の照明領域を表している。
【０１４４】
図１８Ａに示すように、第１の位置では、照明光ＬIL2はＸ軸上で、光軸１０に対して左側に位置している。一方、図１８Ｂに示すように、第１の位置では、結像光ＬSP2はＸ軸上で、光軸１０に対して右側に位置している。そのため、Ｘ方向については、結像光ＬSP2が僅かに移動しただけで、結像光ＬSP2の光量が変化する。よって、第１の位置では、Ｘ方向について、標本の表面における傾き量を求めることができる。
【０１４５】
そこで、第１の位置で、ステップＳ３０が実行される。このステップＳ３０は、１回目の所定の処理ステップである。これにより、Ｘ方向について、標本の表面における傾き量を求める。
【０１４６】
一方、図１９Ｂに示すように、第１の位置では、Ｙ方向については、結像光ＬSP2が破線の位置まで移動しないと、結像光ＬSP2の光量は変化しない。よって、Ｙについては、第１の位置では、標本の表面における傾き量を求めることができない範囲が生じる。
【０１４７】
第１の位置における傾斜角θsと面積Ｓの関係を表すグラフを図２０に示す。図７と同様に、傾斜角θsは、標本の表面における傾き量を表している。また、像の輝度は面積Ｓ、すなわち、結像光の光量を表している。図２０では、Ｘ方向の変化を実線で示し、Ｙ方向の変化を破線で示している。図２０に示すように、第１の位置では、±−２０°の範囲で、Ｘ方向の変化は検出できているが、Ｙ方向の変化は検出できていない。
【０１４８】
そこで、第１の位置での所定の処理ステップが終わった後に、ステップＳ７０が実行される。ステップＳ７０では、ステップＳ７１が実行される。ステップＳ７１は、所定の照明領域の移動について、移動の完了を確認するステップである。
【０１４９】
確認した結果、移動が完了していなければ、ステップＳ７２が実行される。ステップＳ７２では、所定の照明領域が、第２の位置に移動する。第２の位置は、第１の位置と異なる位置である。
【０１５０】
ステップＳ７２の実行によって、所定の照明領域が、第１の位置から第２の位置に移動する。第２の位置における照明光の様子を、図２１Ａに示す。また、第２の位置における結像光の移動の様子を、図２１Ｂに示す。
【０１５１】
図２１Ａに示すように、第２の位置は、第１の位置を９０°回転させた位置である。第２の位置では、照明光ＬIL2はＹ軸上で、光軸１０に対して上側に位置している。第２の位置における照明光ＬIL2の面積は、第１の位置における照明光ＬIL2の面積と等しい。
【０１５２】
一方、図２１Ｂに示すように、第２の位置では、結像光ＬSP2はＹ軸上で、光軸１０に対して下側に位置している。そのため、Ｙ方向については、結像光ＬSP2が僅かに移動しただけで、結像光ＬSP2の光量が変化する。よって、第２の位置では、Ｙ方向について、標本の表面における傾き量を求めることができる。
【０１５３】
そこで、第２の位置で、ステップＳ３０が実行される。このステップＳ３０は、２回目の所定の処理ステップである。これにより、Ｙ方向について、標本の表面における傾き量を求める。
【０１５４】
このように、本実施形態の標本形状測定方法によれば、標本の表面における傾きの方向と傾き量とを求めることができる。
【０１５５】
シミュレーションの例を次に示す。図２２は、仮想標本における高さの分布を示す図である。仮想標本では、中央部が最も高く、周辺に向かって高さが低くなっている。
【０１５６】
図２３Ａは、第１の位置における傾斜角の分布を示す図である。図２３Ｂは、第２の位置における傾斜角の分布を示す図である。図２３Ａと図２３Ｂに示す傾斜角の分布は、仮想標本における傾斜角の分布である。
【０１５７】
図２３Ａに示す傾斜角の分布は、所定の照明領域を第１の位置に移動させたときの傾斜角の分布である。第１の位置は、Ｘ軸上に位置している。よって、図２３Ａに示す傾斜角の分布は、Ｘ方向の傾斜角の分布を表している。
【０１５８】
図２３Ｂに示す傾斜角の分布は、所定の照明領域を第２の位置に移動させたときの傾斜角の分布である。第２の位置は、Ｙ軸上に位置している。よって、図２３Ｂに示す傾斜角の分布は、Ｙ方向の傾斜角の分布を表している。
【０１５９】
シミュレーションでは、高さの分布や傾斜角の分布を算出する際に、仮想標本における傾き量がゼロの場合の光量を、予め算出している。図２２に示す高さの分布や、図２３Ａと図２３Ｂに示す傾斜角の分布は、傾き量がゼロの場合の光量との差分を示している。
【０１６０】
図２４は、所定の画素における傾き方向と傾き量を示す図である。所定の画素における傾き方向と傾き量は、図２３Ａと図２３Ｂに示された傾斜角の分布、すなわち、各画素のＸ方向のＹ方向の傾き量から算出している。図２４の「×」は解析点を示し、矢印の向きは解析点における傾きの方向、矢印の長さは傾き量（絶対値）を示している。解析点は、所定の画素の位置を示している。所定の画素は、全画素から離散的に抽出されている。よって、解析点も離散的に分布している。
【０１６１】
図２５は、仮想標本の高さ分布を示す図である。この高さ分布は、図２４の結果を用いて導出したものである。高さ分布については、上記の結果を用いて、隣接する画素の傾きの方向と傾き量が滑らかに繋がるように解析しても良い。このようにすることで、標本面の高さ分布を滑らかに導出することが可能となる。解析手法としては、フィッティング処理やスプライン処理がある。
【０１６２】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、所定の照明領域の像が瞳の縁を全て含むように、所定の照明領域が設定されていることが好ましい。
【０１６３】
照明光の様子を図２６Ａに示す。遮光部材３０は光軸１０を含むように配置されている。更に、遮光部材３０は、照明光ＬIL1の一部を遮光するように配置されている。遮光部材３０は円形の平板で、絞りの像７’よりも内側の照明光ＬIL1を遮光するように設けられている。よって、照明光ＬIL2の領域は円環になっている。
【０１６４】
結像光の様子を図２６Ｂに示す。照明光ＬIL2の領域が円環状なので、結像光ＬSP2を示す領域の形状も円環である。結像光ＬSP2のうち、一部の結像光は透過部７ｂの外側に位置している。よって、この結像光は遮光部７ａで遮光される。結像光ＬSP2のうち、残りの結像光が透過部７ｂを通過する。
【０１６５】
透過部７ｂは、結像光が通過する領域と結像光が通過しない領域に分かれる。結像光が通過する領域の形状は円環である。この円環の領域を結像光ＬSP3が通過する。
【０１６６】
本実施形態の標本形状測定方法では、所定の照明領域は、照明光学系の瞳位置にて光軸を含まないように設定されると共に、照明光が観察光学系の瞳位置にて該瞳の内側の一部分と該瞳の外側に照射されるように設定されている。よって、本実施形態の標本形状測定方法でも、標本の表面における傾き量を求めることができる。
【０１６７】
ただし、本実施形態の標本形状測定方法では、所定の照明領域の像が瞳の縁を全て含むように、所定の照明領域が設定されている。そのため、傾きの方向は検出できない。標本によっては、傾きの方向が既知の場合があるので、本実施形態の標本形状測定方法を用いることで、標本の表面における傾き量を求めることができる。
【０１６８】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、光軸に沿って、観察光学系と標本とを相対移動させるステップを備えることが好ましい。
【０１６９】
本実施形態の標本形状測定方法について説明する。図２７は、本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。図８のフローチャートと同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。本実施形態の標本形状測定方法は、観察光学系と標本とを相対移動させるステップＳ８０を有する。
【０１７０】
基本測定方法では、結像光の光量に基づいて、標本の表面における傾き量を算出している。結像光の光量は、標本の表面における傾き量によって変化するが、標本が観察光学系の焦点からずれることでも変化する。標本が観察光学系の焦点位置から大きくずれた状態では、標本の表面における傾き量を正確に求めることはできない。更に、この状態では、光軸と直交する面における空間分解能が低下する。
【０１７１】
このように、本実施形態の標本形状測定方法では、光軸に沿う方向に関して、標本の表面における傾き量を正確に求めることができる範囲が制限される。この範囲は、例えば、１．２×λ／ＮＡob２で表される。そのため、標本の高さがこの範囲を超える場合、１回の測定では、標本の形状を測定することができない。このようなことから、本実施形態の標本形状測定方法では、観察光学系と標本とを相対移動させるステップＳ８０を有している。
【０１７２】
ステップＳ８０は、測定項目を設定するステップＳ８１と、測定項目を確認するステップＳ８２と、測定回数を設定するステップＳ８３と、測定項目を確認するステップＳ８４と、移動量を設定するステップＳ８５と、反復回数を初期化するステップＳ８６と、反復回数を確認するステップＳ８７と、観察光学系と標本との間隔を変化させるステップＳ８８と、反復回数の値を増加するステップＳ８９と、を有する。
【０１７３】
ステップＳ８０では、ステップＳ８１が実行される。ステップＳ８１は測定項目を設定するステップである。ステップＳ８１では、測定回数Ｎ、測定範囲ＨＲ、移動量ΔＨのうち２項目が設定される。
【０１７４】
ステップＳ８１が終わると、ステップＳ８２が実行される。ステップＳ８２は測定項目を確認するステップである。測定範囲ＨＲと移動量ΔＨが設定された場合、ステップＳ８３が実行される。ステップＳ８３は、測定回数を設定するステップである。ステップＳ８３では、測定範囲ＨＲと移動量ΔＨから、測定回数Ｎが設定される。ステップＳ８３が終わると、ステップＳ８６が実行される。
【０１７５】
測定範囲ＨＲと移動量ΔＨが設定されていない場合、ステップＳ８４が実行される。ステップＳ８４は、測定項目を確認するステップである。測定範囲ＨＲと測定回数Ｎが設定された場合、ステップＳ８５が実行される。ステップＳ８５は、移動量ΔＨを設定するステップである。ステップＳ８５では、測定範囲ＨＲと測定回数Ｎから、移動量ΔＨが設定される。ステップＳ８５が終わると、ステップＳ８６が実行される。
【０１７６】
測定回数Ｎと測定範囲ＨＲが設定されていない場合、移動量Δと測定回数Ｎが設定されたことになる。よって、ステップＳ８６が実行される。
【０１７７】
ステップＳ８６は、反復回数を初期化するステップである。ステップＳ８６では、反復回数の初期化が行われる。具体的には、反復回数を表す変数ｎの値を１にする。
【０１７８】
ステップＳ８６が終わると、ステップＳ１０からステップＳ３０までが実行され、これにより１回目の測定が行われる。
【０１７９】
ステップＳ３０が終わると、ステップＳ８７が実行される。ステップＳ８７では、反復回数ｎの確認が行われる。反復回数ｎの値が測定回数Ｎと一致しない場合、ステップＳ８８が実行される。ステップＳ８８は、観察光学系と標本との間隔を変化させるステップである。ステップＳ８８では、観察光学系の位置は変えずに標本の移動が行われるか、又は、標本の位置は変えずに観察光学系の移動が行われる。
【０１８０】
ステップＳ８８が終わると、ステップＳ８９が実行される。ステップＳ８９では、反復回数の値の変更が行われる。具体的には、反復回数を表す変数ｎの値に１を加える。ステップＳ８８が終わると、ステップＳ３０に戻る。そして、再び、ステップＳ３０が実行される。
【０１８１】
ステップＳ３０の実行によって、２回目の測定が行われる。ここで、１回目の測定位置とは異なる位置に測定位置が移動している。よって、２回目の測定は、標本上の異なる高さで行われる。
【０１８２】
上述の処理を、反復回数を表す変数ｎの値が測定回数Ｎと一致するまで行う。これにより、測定範囲よりも広い範囲を測定することができる。
【０１８３】
本実施形態の標本形状測定方法による測定の様子を図２８に示す。左側の図は１回目の測定の様子を示し、中央の図が２回目の測定の様子を示し、右側の図が３回目の測定の様子を示している。
【０１８４】
測定回数が増加するにつれて、対物レンズ６が標本８から離れる方向にΔＨだけ移動している。そして、対物レンズの移動に伴って、標本８における測定位置が、位置ｈ０、ｈ１、位置ｈ２へと移動する。
【０１８５】
また、傾き量を正確に求めることができる範囲は、位置ｈ０から位置ｈ１までの範囲、位置ｈ１から位置ｈ２までの範囲、位置ｈ２から位置ｈ３までの範囲、というように、下から上に移動している。３回の測定を合計することで、位置ｈ０から位置ｈ３までの広い範囲にわたって、標本の表面における傾き量を正確に求めることができる。
【０１８６】
また、本実施形態の標本形状測定方法では、瞳倍率は、照明光学系における瞳の径と観察光学系における瞳の径との比であって、瞳倍率の変化は、標本によって生じ、瞳倍率の変化に伴って生じる誤差を補正するステップを有することが好ましい。
【０１８７】
本実施形態の標本形状測定方法について説明する。図２９は、本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。図８のフローチャートと同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。本実施形態の標本形状測定方法は、誤差を補正するステップステップＳ９０を有する。
【０１８８】
本実施形態の標本形状測定方法では、ステップＳ３４が終わると、ステップＳ９０が実行される。ステップＳ９０は、瞳倍率の変化に伴って生じる誤差を補正するステップである。瞳倍率は、照明光学系における瞳の径と観察光学系における瞳の径との比である。この瞳倍率の変化は、標本によって生じる。
【０１８９】
以下、倒立顕微鏡の光学系を用いて説明する。図３０Ａは、保持部の面積が小さい場合の光学系を示す図である。ここでは、照明光学系をコンデンサレンズ５に置き換え、観察光学系を対物レンズ６に置き換えて説明する。コンデンサレンズの瞳４０と、対物レンズの瞳４１は共役になっている。瞳倍率は、瞳４０の径と瞳４１の径との比で求まる。
【０１９０】
上述のように、細胞４２の観察では、培養液や保存液のような液体４３に細胞４２を、保持部４４で保持した状態で観察が行われる。保持部４４の面積が大きい場合は、液体４３の液面は平坦になる。この場合、標本部４５は平行平板とみなすことができる。よって、保持部４４の面積が大きい場合は、コンデンサレンズ５と対物レンズ６との間に、平行平板が配置された状態になる。
【０１９１】
ここで、コンデンサレンズ５や対物レンズ６を薄肉レンズとみなす。そうすると、コンデンサレンズ５と対物レンズ６とで構成される光学系の倍率が、瞳４０の径と瞳４１の径との比を表している。よって、瞳倍率βpは以下の式（Ａ）で表される。
βp＝ｆob／ｆc      （Ａ）
ここで、
ｆobは対物レンズの焦点距離、
ｆcはコンデンサレンズの焦点距離、
である。
【０１９２】
一方、保持部４４の面積が小さい場合は、液体４３のコンデンサレンズ５側の液面は凹面になる。この場合、標本部４５は平凹レンズとみなすことができる。図３０Ｂは、標本部を平凹レンズに置き換えたときの光学系を示す図である。図３０Ｂに示すように、保持部４４の面積が小さい場合は、コンデンサレンズ５と対物レンズ６との間に、平凹レンズ４６が配置された状態になる。
【０１９３】
平凹レンズ４６の焦点距離は、液体４３の凹面における曲率半径と、液体４３の屈折率によって決まる。また、液体４３がほぼ水と同じ親水性を持つので、保持部４４の面積が小さい程凹面の曲率半径が小さくなる。そのため、保持部４４を複数持つマイクロウェルプレートでは、凹面の曲率半径がとても小さい。
【０１９４】
対物レンズ６と平凹レンズ４６との合成焦点距離ｆlen-obは、以下の式（Ｂ）で表される。
ｆlen-ob＝（ｆlen×ｆob）／（ｆlen＋ｆob-ｄ）      （Ｂ）
ここで、
ｆlenは平凹レンズの焦点距離、
ｆobは対物レンズの焦点距離、
ｄは対物レンズと平凹レンズとの間隔、
である。
【０１９５】
図３０Ｂに示す光学系では、コンデンサレンズ５、平凹レンズ４６及び対物レンズ６とで構成される光学系の倍率が、瞳４０の径と瞳４１の径との比を表している。よって、瞳倍率βp’は以下の式（Ｃ）で表される。
βp’＝ｆlen-ob／ｆc
＝｛（ｆlen×ｆob）／（ｆlen＋ｆob−ｄ）｝／ｆc
＝（ｆlen×ｆob）／｛ｆc×（ｆlen＋ｆob−ｄ）｝
＝（βp×ｆlen）／（ｆlen＋ｆob−ｄ）
＝βp／（１＋（ｆob−ｄ）／ｆlen）      （Ｃ）
【０１９６】
上述のように、対物レンズ６や平凹レンズ４６を薄肉レンズとみなしているので、レンズの厚みは無いものとなる。そうすると、間隔ｄは、対物レンズ６の主点と平凹レンズ４６の主点との間隔になる。通常の観察では、液体４３の凹面よりも対物レンズ６側を観察するのでｆob＜ｄであり、また、液体４３の凹面は負の屈折力を持つのでｆlen＜０である。つまり、（（ｆob−ｄ）／ｆlen）＞０になる。
【０１９７】
これを式（Ｃ）に代入すると、瞳倍率βp’は以下の式に示すように、瞳倍率βpに比べて小さくなる。
βp’＝βp／（１＋（ｆob−ｄ)／ｆlen）＜βp
【０１９８】
例えば、倒立顕微鏡の光学系では、ｆob＝２０ｍｍ、ｆlen＝−４ｍｍ、ｄ＝２１ｍｍとすると、以下のように、瞳倍率βp’は瞳倍率βpに比べて倍率が小さくなる。
βp’＝βp／（１＋（ｆob−ｄ）／ｆlen）＝０．８０βp
【０１９９】
標本部４５が平凹レンズとみなせる場合、正立顕微鏡においても瞳倍率が変化する。ただし、正立顕微鏡の光学系では、瞳倍率βp’は瞳倍率βpに比べて大きくなる。
【０２００】
このように、瞳倍率の変化は、平凹レンズ４６の負の屈折力の作用、すなわち、標本によって生じる。瞳倍率が変化すると、対物レンズの瞳４１を通過する結像光の光量が変化する。この光量の変化は、標本の表面における傾きによって生じたものではないので、測定誤差になる。
【０２０１】
瞳倍率βp’を求めるには、式（Ｃ）に示すように、平凹レンズ４６の焦点距離が必要である。平凹レンズ４６の焦点距離は、上述のように、液体４３の凹面における曲率半径と、液体４３の屈折率によって決まる。このうち、液体４３の凹面における曲率半径を求めることは難しい。そのため、平凹レンズ４６の焦点距離を求めることは容易ではない。よって、式（Ｃ）を用いて瞳倍率βp’を求めることは困難である。
【０２０２】
しかしながら、瞳倍率βp’は、別の方法で求めることができる。例えば、対物レンズの瞳の情報を、標本が存在しない状態と培養液のみが存在する状態とから取得することができる。対物レンズの瞳の情報は、例えば、ベルトランレンズを用いて取得することができる。標本が存在しない状態とは、標本部４５自体が存在しない状態である。培養液のみが存在する状態とは、標本部４５において、液体４３のみが存在している状態である。
【０２０３】
対物レンズと結像レンズとの間は、平行光束になっている。この平行光路内にベルトランレンズを配置する。これにより、対物レンズと結像レンズとで形成される像位置に、対物レンズの瞳の像を形成させることができる。
【０２０４】
図３１Ａは、標本が存在しない状態での、対物レンズの瞳と結像光の様子を示す図である。図３１Ｂは、培養液のみが存在する状態での、対物レンズの瞳と結像光の様子を示す図である。対物レンズの瞳の像と結像光の様子も、図３１Ａや図３１Ｂと同じになる。
【０２０５】
図３１Ａと図３１Ｂを比較すると分かるように、標本が存在しない状態と培養液のみが存在する状態とでは、結像光４７と遮光部４８との境界の位置が異なる。そこで、この境界の位置の違いを利用して、瞳倍率βp’を求めることができる。
【０２０６】
標本が存在しない状態では、瞳倍率βpは上記の式（Ａ）で求めることができる。コンデンサレンズの焦点距離と対物レンズの焦点距離は容易に求めることができる。よって、瞳倍率βpは容易に求めることができる。
【０２０７】
一方、培養液のみが存在する状態では、瞳倍率βp’は以下の式（Ｄ）で求めることができる。
βp’＝ＬＢ／ＬＡ×βp      （Ｄ）
ここで、
ＬＡは、標本が存在しない状態での、光軸から所定の境界までの距離、
ＬＢは、培養液のみが存在する状態での、光軸から所定の境界までの距離、
所定の境界は、結像光と遮光部との境界、
である。
【０２０８】
瞳倍率βp、距離ＬＡ及び距離ＬＢは容易に求めることができる。このように、ベルトランレンズを用いることで、瞳倍率βp’も容易に求めることができる。
【０２０９】
本実施形態の標本形状測定方法では、ステップＳ３０が終わると、ステップＳ９０が実行される。ステップＳ９０は、瞳倍率の変化に伴って生じる誤差を補正するステップである。瞳倍率の変化は、瞳倍率βpと瞳倍率βp’とから求める。求めた結果を用いて、誤差を補正する。
【０２１０】
図３２は、傾斜角θsと面積Ｓの関係を表すグラフである。図３２では、誤差を補正する前の様子を破線で示し、誤差を補正した後の様子を実線で示している。誤差を補正することで、標本の表面における傾き量を正確に求めることができる。
【０２１１】
本実施形態の標本形状測定装置について説明する。本実施形態の標本形状測定装置は、照明光学系と、観察光学系と、保持部材と、検出素子と、処理装置と、を備え、照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、保持部材は標本を保持すると共に、照明光学系と観察光学系との間に配置され、照明光学系により標本に照射された照明光は、標本を透過し、標本から出射した光は観察光学系に入射し、検出素子は、観察光学系から出射した光を受光し、処理装置は、受光した光に基づく光量を求め、光量と基準の光量との差又は比を算出し、差又は比から、標本の表面における傾き量を算出することを特徴とする。
【０２１２】
本実施形態の標本測定装置について、図３３を用いて説明する。図３３は本実施形態の標本形状測定装置の構成を示す図である。
【０２１３】
標本形状測定装置５０は、例えば、正立型顕微鏡であって、照明光学系と観察光学系とを備える。照明光学系は、光源５１と、コンデンサレンズ５４と、開口部材５５とを有する。なお、必要に応じて、照明光学系は、レンズ５２やレンズ５３を有する。一方、観察光学系は、対物レンズ５８と結像レンズ６０とを有する。
【０２１４】
光源５１から出射した光は、レンズ５２とレンズ５３を通過して、コンデンサレンズ５４に到達する。コンデンサレンズ５４には、開口部材５５が設けられている。ここでは、コンデンサレンズ５４と開口部材５５とが、一体で構成されている。しかしながら、開口部材５５とコンデンサレンズ５４とを、それぞれ別体で構成しても良い。開口部材５５は、図１における遮光部材４に相当する。開口部材５５には、金属板が用いられている。
【０２１５】
また、コンデンサレンズ５４の代わりに、反射面を有するコンデンサ部を用いても良い。コンデンサ部は、例えば、円錐ミラーと凹面ミラーとで構成できる。円錐ミラーは光軸上に配置されている。凹面ミラーは円環状の反射面を有し、円錐ミラーを取り囲むように配置されている。
【０２１６】
開口部材５５と光源５１とは共役な関係になっている。よって、光源５１から出射した照明光は、開口部材５５の位置で集光する。すなわち、開口部材５５の位置に光源５１の像が形成される。
【０２１７】
開口部材５５から出射した照明光は、コンデンサレンズ５４に入射する。ここで、開口部材５５の位置は、コンデンサレンズ５４の焦点位置（あるいは、コンデンサレンズ５４の瞳位置）と一致している。そのため、コンデンサレンズ５４から出射する照明光は、平行光になる。コンデンサレンズ５４から出射する照明光は、観察光学系の光軸（照明光学系の光軸）と交差するように出射する。
【０２１８】
コンデンサレンズ５４から出射した照明光は、標本５７に到達する。標本５７は保持部材５６上に載置されている。標本５７は、例えば細胞であって、無色透明である。保持部材５６は、保持部を有する。スライドガラスでは、スライドガラスの表面が保持部に該当する。シャーレでは、シャーレの凹部が保持部に該当する。マイクロウェルプレートでは、各ウェルの凹部が保持部に該当する。
【０２１９】
標本５７を透過した光、すなわち、結像光は顕微鏡対物レンズ５８（以下、「対物レンズ」という）に入射する。この対物レンズ５８は、例えば、明視野観察用の顕微鏡対物レンズである。よって、対物レンズ５８の光路中にはレンズが存在するだけで、位相板や変調板のように光の強度や位相を変化させる光学部材は存在していない。
【０２２０】
図１に示すように、標本５７を透過した平行光は、対物レンズの瞳５９に集光する。このように、対物レンズの瞳５９と開口部材５５とは共役な関係になっている。よって、対物レンズの瞳５９の位置に開口部材５５の像が形成される。
【０２２１】
対物レンズ５８から出射した結像光は、結像レンズ６０に入射する。そして、結像レンズ６０を出射した結像光によって、像位置６１に標本５７の光学像が形成される。
【０２２２】
像位置６１には、検出素子６２が配置されている。検出素子６２は光電変換素子である。検出素子６２としては、例えば、フォトダイオード、ＣＣＤ、ＣＯＭＳ等がある。
【０２２３】
光学像の光強度は、検出素子６２によって電気信号に変換される。変換された電気信号は、標本５７の画像データとして処理装置６３に送信される。画像データは、光学像の光量を表している。
【０２２４】
処理装置６３では、図８に示すフローチャートに従って処理が実行される。すなわち処理装置６３では、結像光の光量を求め（ステップＳ３２）、光量と基準の光量との差又は比を算出し（ステップＳ３３）、算出結果から、標本の表面における傾き量を算出する（ステップＳ３４）。ここで、所定の領域が設定されているので、ステップＳ３２では、画像データのうちの所定の領域について、光量を求める処理が行われる。
【０２２５】
このように、本実施形態の標本測定装置では、特定の方向に偏斜された照明光を標本に照射しているだけである。そのため、標本の表面における傾き量の分布の導出では、標本から出射した光、すなわち、標本を透過した光を利用しているだけで、像のコントラストや非回折光と回折光との干渉を利用していない。よって、本実施形態の標本測定装置によれば、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾き量を測定できる。また、後述のように、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。
【０２２６】
また、本実施形態の標本形状測定装置では、検出素子は、二次元配置された受光検出画素を持ち、受光検出画素よりも広い範囲を所定の領域として設定し、所定の領域に含まれる受光検出画素に基づいて得られた光量を、所定の領域における光量として求め、所定の領域における光量と基準の光量との差又は比を算出し、算出結果から、所定の領域に対応する標本の表面における傾き量を算出する傾き量算出回路を有し、所定の領域は、標本の表面を格子状に区分けしたときの１つの領域に対応し、傾き量算出回路において、標本の表面位置における傾き量を、所定の領域を１単位として算出することが好ましい。
【０２２７】
本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本の表面形状が滑らかになっていても、高い精度で標本の表面形状を測定できる。また、所定の領域を設定しているので、所定の領域を設定しない場合に比べてＳＮ比が向上する。よって、標本の表面における傾き量を高い精度で算出することができる。
【０２２８】
また、本実施形態の標本形状測定装置では、処理装置は、複数の傾き量から標本の形状を計算し、計算した形状から標本の形状を画像化する画像化回路を有することが好ましい。
【０２２９】
このようにすることで、標本の形状を視覚的に把握することができる。
【０２３０】
また、処理装置６３では、コントラスト強調、ノイズ除去、色変換等の処理が行えるようになっている。
【０２３１】
また、本実施形態の標本形状測定装置では、処理装置は、光量と傾き量とで構成されたルックアップテーブルを有し、ルックアップテーブルを用いて傾き量を算出することが好ましい。
【０２３２】
このようにすることで、標本の表面における傾き量を迅速に求めることができる。
【０２３３】
また、本実施形態の標本形状測定装置では、光路に挿入離脱する第１の開口部材と第２の開口部材とを有し、第１の開口部材は、コンデンサレンズの光軸を含む個所が遮光部であり、光軸に対して偏心した位置に第１の開口部を有し、第２の開口部材は、コンデンサレンズの光軸を含む個所が遮光部であり、光軸に対して偏心した位置に第２の開口部を有し、第１の開口部材を光路に挿入したときの光軸と第１の開口部重心を結ぶ方向と、第２の開口部材を光路に挿入したときの光軸と第２の開口部重心を結ぶ方向と、は交差することが好ましい。
【０２３４】
図３４は、本実施形態の別の標本形状測定装置の構成を示す図である。なお、図３３と同じ構成については同じ番号を付し、説明は省略する。
【０２３５】
標本形状測定装置７０は、第１の開口部材７１と第２の開口部材７２とを備えている。第１の開口部材７１と第２の開口部材７２には、透明板が用いられている。
【０２３６】
第１の開口部材７１と第２の開口部材７２は、共に、移動機構７３に保持されている。移動機構７３としては、例えば、スライダーやターレットがある。移動機構７３がスライダーの場合、第１の開口部材７１と第２の開口部材７２は、照明光学系の光軸７４（以下、「光軸７４」という）と直交する方向に移動する。移動機構７３がターレットの場合、第１の開口部材７１と第２の開口部材７２は、光軸７４と平行な軸を中心に回転する。
【０２３７】
図３５Ａは、第１の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。図３５Ｂは、第２の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。
【０２３８】
第１の開口部材７１は、遮光部７１ａと第１の開口部７１ｂとを有する。第１の開口部材７１では、光軸７４を含む個所が遮光部７１ａになっている。第１の開口部材７１は、光軸７４に対して偏心した位置に第１の開口部７１ｂを有している。
【０２３９】
第２の開口部材７２は、遮光部７２ａと第２の開口部７２ｂとを有する。第２の開口部材７２では、光軸７４を含む個所が遮光部７２ａになっている。第２の開口部材７２は、光軸７４に対して偏心した位置に第２の開口部７２ｂを有している。
【０２４０】
そして、光軸７４と第１の開口部７１ｂの重心を結ぶ方向と、光軸７４と第２の開口部７２ｂの重心を結ぶ方向とは、第１の開口部材７１を光路に挿入したときと第２の開口部材７２を光路に挿入したときとで交差する。図３５Ａや図３５Ｂでは、直交する２つの直線のうちの一方の直線上に第１の開口部７１ｂが位置し、他方の直線上に第２の開口部７２ｂが位置している。
【０２４１】
第１の開口部７１ｂを通過する照明光の面積は、第２の開口部７２ｂを通過する照明光の面積と等しい。よって、特性曲線は、第１の開口部材７５を光路に挿入したときと、第２の開口部材７６を光路に挿入したときとで同じになる。第１の開口部材７５を光路に挿入したときも、第２の開口部材７６を光路に挿入したときも、特性曲線は、図７に示す右下がりの曲線になる。
【０２４２】
第１の開口部７１ｂにおける分光透過率特性は、第２の開口７２ｂにおける分光透過率特性と等しい。この場合、１つの光源を用いて測定を行うことができる。光源５１から出射する光の波長域は、広くても良く、狭くても良い。
【０２４３】
第１の開口部７１ｂにおける分光透過率特性を、第２の開口７２ｂにおける分光透過率特性と異ならせても良い。この場合、測定方法としては、照明光の波長を変えずに測定を行う方法と、照明光の波長を変えて測定を行う方法とがある。
【０２４４】
照明光の波長を変えずに測定を行う方法では、光源５１には、出射光の波長域が広い光源を用いる。出射光の波長域が広い光源としては、白色光源がある。また、検出素子６２には、複数の光電変換素子を使用する。複数の光電変換素子で構成された検出素子としては、例えば、三板式のカメラがある。
【０２４５】
三板式のカメラは、３つのＣＣＤを備えている。第１のＣＣＤには赤色のフィルタが配置され、第２のＣＣＤには緑色のフィルタが配置され、第３のＣＣＤには青色のフィルタが配置されている。
【０２４６】
そこで、例えば、第１の開口部７１ｂにおける分光透過率特性を、赤色のフィルタの分光透過率特性と一致させ、第２の開口７２ｂにおける分光透過率特性を、緑色のフィルタの分光透過率特性と一致させておく。
【０２４７】
そして、測定では、白色光源を光路中に配置し、第１の開口部材７１を光路に挿入したときは、第１のＣＣＤで測定を行い、第２の開口部材７２を光路に挿入したときは、第２のＣＣＤで測定を行えば良い。
【０２４８】
照明光の波長を変えて測定を行う方法では、複数の光源を用いる場合と１つの光源を用いる場合とがある。
【０２４９】
複数の光源を用いる場合は、例えば、光源５１とは別に、光源６４を用意しておく。そして、光源５１から出射する光の波長域と、光源６４から出射する光の波長域とを異ならせておく。更に、第１の開口部７１ｂにおける分光透過率特性を、光源５１から出射する光の波長域と一致させ、第２の開口７２ｂにおける分光透過率特性を、光源６４から出射する光の波長域と一致させておく。
【０２５０】
そして、測定では、第１の開口部材７１を光路に挿入したときは、光源５１を用いて測定を行い、第２の開口部材７２を光路に挿入したときは、光源６４を用いて測定を行えば良い。
【０２５１】
１つの光源を用いる場合は、光学フィルタを複数用意しておく。例えば、光学フィルタ６５と光学フィルタ６６とを用意しておく。また、第１の開口部７１ｂにおける分光透過率特性を、光学フィルタ６５の分光透過率特性と一致させ、第２の開口部７２ｂにおける分光透過率特性を、光学フィルタ６６の分光透過率特性と一致させておく。
【０２５２】
そして、測定では、第１の開口部材７１を光路に挿入したときは、光学フィルタ６５を用いて測定を行い、第２の開口部材７２を光路に挿入したときは、光学フィルタ６６を用いて測定を行えば良い。
【０２５３】
標本形状測定装置７０では、結像光の光量の変化を、どの方向においても検出することができる。よって、本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本の表面における傾きの方向と傾き量とを求めることができる。
【０２５４】
第１の開口部材と第２の開口部材の変形例について説明する。図３６Ａは、変形例１の第１の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。図３６Ｂは、変形例１の第２の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。
【０２５５】
第１の開口部材７５は、遮光部７５ａと第１の開口部７５ｂとを有する。第１の開口部材７５では、コンデンサレンズの光軸７４を含む個所が遮光部７５ａになっている。第１の開口部材７５は、光軸７４に対して偏心した位置に第１の開口部７５ｂを有している。
【０２５６】
第２の開口部材７６は、遮光部７６ａと第２の開口部７６ｂとを有する。第２の開口部材７６では、コンデンサレンズの光軸７４を含む個所が遮光部７６ａになっている。第２の開口部材７６は、光軸７４に対して偏心した位置に第２の開口部７６ｂを有している。
【０２５７】
そして、光軸７４と第１の開口部７５ｂの重心を結ぶ方向と、光軸７４と第２の開口部７６ｂの重心を結ぶ方向とは、第１の開口部材７５を光路に挿入したときと、第２の開口部材７６を光路に挿入したときとで正反対になっている。図３６Ａや図３６Ｂでは、同一直線上の一方の側に第１の開口部７５ｂが位置し、他方の側に第２の開口部７６ｂが位置している。
【０２５８】
第１の開口部７５ｂを通過する照明光の面積は、第２の開口部７６ｂを通過する照明光の面積と等しい。よって、特性曲線は、第１の開口部材７５を光路に挿入したときと、第２の開口部材７６を光路に挿入したときとで異なる。第１の開口部材７５を光路に挿入したとき、特性曲線は、図７に示す右下がりの曲線になる。第２の開口部材７６を光路に挿入したとき、特性曲線は右上がりの曲線になる。
【０２５９】
２つの線が交差する点が、傾斜角θs＝０となる点である。よって、本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本の透過率にかかわらず、傾き量がゼロの箇所を検出することができる。
【０２６０】
第１の開口部７５ｂにおける分光透過率特性は、第２の開口部７６ｂにおける分光透過率特性と等しい。ただし、上述のように、第１の開口部７５ｂにおける分光透過率特性を、第２の開口部７６ｂにおける分光透過率特性と異ならせても良い。
【０２６１】
図３７Ａは、変形例２の第１の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。図３７Ｂは、変形例２の第２の開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。
【０２６２】
第１の開口部材７７は、遮光部７７ａと第１の開口部７７ｂとを有する。第１の開口部材７７では、コンデンサレンズの光軸７４を含む個所が遮光部７７ａになっている。第１の開口部材７７は、光軸７４に対して偏心した位置に第１の開口部７７ｂを有している。
【０２６３】
第２の開口部材７８は、遮光部７８ａと第２の開口部７８ｂとを有する。第２の開口部材７８では、コンデンサレンズの光軸７４を含む個所が遮光部７８ａになっている。第２の開口部材７８は、光軸７４に対して偏心した位置に第２の開口部７８ｂを有している。
【０２６４】
そして、光軸７４と第１の開口部７７ｂの重心を結ぶ方向と、光軸７４と第２の開口部７８ｂの重心を結ぶ方向とは、第１の開口部材７７を光路に挿入したときと、第２の開口部材７８を光路に挿入したときとで同じになっている。図３７Ａや図３７Ｂでは、同一直線上の一方の側に第１の開口部７７ｂと第２の開口部７８ｂが位置している。
【０２６５】
第１の開口部７７ｂを通過する照明光の面積は、第２の開口部７８ｂを通過する照明光の面積よりも小さい。よって、特性曲線は、第１の開口部材７７を光路に挿入したときと、第２の開口部材７８を光路に挿入したときとで異なる。第１の開口部材７７を光路に挿入したとき、特性曲線は、図７に示す右下がりの曲線になる。第２の開口部材７８を光路に挿入したとき、特性曲線は右下がりの曲線になる。
【０２６６】
ただし、特性曲線の傾きは、第１の開口部材７７を光路に挿入したときに比べて、第２の開口部材７８を光路に挿入したときの方が緩やかになる。特性曲線の傾きの度合いを傾斜角の検出感度とすると、第２の開口部材７８を光路に挿入したときの検出感度は、第１の開口部材７７を光路に挿入したときの検出感度よりも低くなる。
【０２６７】
よって、本実施形態の標本形状測定装置によれば、検出感度を切り替えて、標本の表面における傾きの方向と傾き量とを求めることができる。
【０２６８】
第１の開口部７７ｂにおける分光透過率特性は、第２の開口部７８ｂにおける分光透過率特性と等しい。ただし、上述のように、第１の開口部７７ｂにおける分光透過率特性を、第２の開口部７８ｂにおける分光透過率特性と異ならせても良い。
【０２６９】
また、上述の第１の開口部材や第２の開口部材は、開口部の透過領域を可変にする透過領域可変部を備えてもよい。透過領域可変部は、例えば、液晶シャッターで構成しても良い。このようにすれば、１つの開口で、第１の開口部材と第２の開口部材とを実現できる。また、この場合、移動機構が不要になる。
【０２７０】
また、本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材は、コンデンサレンズの光軸を含む個所が遮光部であり、光軸に対して偏心した位置に第１の開口部と第２の開口部とを有し、開口部材を光路に挿入したときの光軸と第１の開口部重心を結ぶ方向と、光軸と第２の開口部重心を結ぶ方向と、は交差することが好ましい。
【０２７１】
図３８は、開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。開口部材８０は、遮光部８０ａと、第１の開口部８０ｂと、第２の開口部８０ｃを有する。開口部材８０では、コンデンサレンズの光軸７４を含む個所が遮光部８０ａになっている。開口部材８０は、光軸７４に対して偏心した位置に第１の開口部８０ｂと第２の開口部８０ｃとを有している。
【０２７２】
そして、光軸７４と第１の開口部８０ｂの重心を結ぶ方向と、光軸７４と第２の開口部８０ｃの重心を結ぶ方向とは、交差する。図３８では、直交する２つの直線のうちの一方の直線上に第１の開口部８０ｂが位置し、他方の直線上に第２の開口部８０ｃが位置している。
【０２７３】
第１の開口部８０ｂを通過する照明光の面積は、第２の開口部８０ｃを通過する照明光の面積と等しい。よって、傾斜角θsを変化させたときの、面積Ｓの変化の様子は、第１の開口部８０ｂを照明光が通過したときと、第２の開口部８０ｃを照明光が通過したときとで同じになる。第１の開口部８０ｂを照明光が通過したときも、第２の開口部８０ｃを照明光が通過したときも、変化を示す線は、図７に示すように右下がりになる。
【０２７４】
第１の開口部８０ｂにおける分光透過率特性は、第２の開口部８０ｃにおける分光透過率特性と異ならせておく必要がある。検出素子６２に複数の光電変換素子を使用するか、又は、照明光の波長を変えることで、開口部材８０を、常に光路中に配置したままで測定を行うことができる。
【０２７５】
本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材を移動させることなく、結像光の光量の変化を、どの方向においても検出することができる。よって、本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本の表面における傾きの方向と傾き量とを求めることができる。
【０２７６】
また、本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材は、コンデンサレンズの光軸を含む個所が遮光部であり、光軸に対して偏心した位置に開口部を有し、光軸と開口部重心を結ぶ方向を変更可能であることが好ましい。
【０２７７】
図３９は、開口部材を光路に挿入した状態を示す図である。開口部材９０は、遮光部９０ａを有する。開口部材９０では、コンデンサレンズの光軸７４を含む個所が遮光部９０ａになっている。開口部材９０は、光軸７４に対して偏心した位置に開口部を有している。
【０２７８】
本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材９０を実線で示す位置から、一点鎖線で示す位置に移動可能になっている。すなわち、光軸と開口部重心を結ぶ方向を変更可能になっている。
【０２７９】
開口部材９０を実線で示す位置に移動させることで、図３５Ａと同じ状態を実現できる。また、開口部材９０を一点鎖線で示す位置に移動させることで、図３５Ｂと同じ状態を実現できる。
【０２８０】
本実施形態の標本形状測定装置では、結像光の光量の変化を、どの方向においても検出することができる。よって、本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本の表面における傾きの方向と傾き量とを求めることができる。
【０２８１】
また、本実施形態の標本形状測定装置では、処理装置は、光軸と開口部重心を結ぶ複数方向における光量と傾き量との関係を表わすルックアップテーブルをデータとして有し、ルックアップテーブルを用いて傾き量及び傾き方向を算出することが好ましい。
【０２８２】
このようにすることで、標本の表面における傾き量を迅速に求めることができる。
【０２８３】
また、本実施形態の標本形状測定装置では、照明光学系の照明光が観察光学系の瞳位置にて該瞳の一部分と該瞳外に照射されるように、開口部が設けられることが好ましい。
【０２８４】
このようにすることで、本実施形態の標本形状測定装置では、結像光の光量の変化を、どの方向においても検出することができる。よって、本実施形態の標本形状測定装置によれば、標本の表面における傾きの方向と傾き量とを求めることができる。
【０２８５】
本実施形態の標本形状測定装置では、受光検出画素よりも広い範囲を所定の領域として設定しているが、１つの受光検出画素と同じ範囲を、所定の領域として設定しても良い。このようにすることで、光軸と直交する面における空間分解能を高くすることができる。よって、標本の表面形状を、高い空間分解能で測定することができる。
【０２８６】
また、本実施形態の標本形状測定装置では、光源に面光源を用いているが、光源に点光源を用いても良い。点光源を用いる場合は、光軸と直交する面内で、照明光と標本とを相対移動させることが好ましい。これにより、標本の複数の位置における傾き量を算出することができる。
【０２８７】
本実施形態の標本形状測定装置は、照明光学系と、観察光学系と、保持部材と、検出素子と、処理装置と、を備え、照明光学系は、光源と、コンデンサレンズと、開口部材と、を有し、観察光学系は、対物レンズと、結像レンズと、を有し、保持部材は標本を保持すると共に、照明光学系と観察光学系との間に配置され、開口部材は、遮光部と、開口部と、を有し、遮光部は、コンデンサレンズの光軸を含むように設けられ、開口部は、光軸に対して偏心した位置に設けられ、開口部の像は、観察光学系の瞳位置の近傍に形成されると共に、観察光学系の瞳の外縁の一部と重なるように形成され、照明光学系により標本に照射された照明光は、標本を透過し、標本から出射した光は観察光学系に入射し、検出素子は、観察光学系から出射した光を受光し、処理装置は、受光した光に基づく光量を求め、光量と基準の光量との差又は比を算出し、差又は比から、標本の表面における傾き量を算出することを特徴とする。
【０２８８】
図３３に示す標本形状測定装置５０では、開口部材５５が用いられている。開口部材５５の一例を図４０Ａに示す。図４０Ａは、照明光の様子を示す図である。開口部材９５は、遮光部９５ａと開口部９５ｂとを有する。遮光部９５ａは、光軸１０を含むように設けられている。開口部９５ｂは、光軸１０から離れた位置に設けられている。光軸１０は、標本形状測定装置５０における光学系全体の光軸である。よって、光軸１０は、必要に応じて「コンデンサレンズの光軸」と読み替えることができる。
【０２８９】
光軸１０に対する遮光部９５ａの位置や開口部９５ｂの位置は、開口部材９５を照明光学系の光路に配置することで決まる。よって、遮光部９５ａが光軸１０を含むように開口部材５５を配置することで、開口部９５ｂは、光軸１０に対して偏心した場所に位置することになる。
【０２９０】
図４０Ｂに示すように、開口部の像は、観察光学系の瞳位置の近傍に形成される。図４０Ｂは、結像光の様子を示す図である。図４０Ｂでは、開口部９５ｂを通過した光束は図示されているが、開口部９５ｂの輪郭の図示は省略されている。開口部９５ｂの輪郭は図示されていないが、開口部９５ｂの像は、対物レンズの瞳７の外縁の一部と重なるように形成されている。
【０２９１】
このように、標本形状測定装置５０では、開口部材９５の開口部９５ｂが光軸１０に対して偏心した位置に設けられている。これにより、標本の表面における傾き量と結像光の光量との間に、特定の相関関係が生じる。そのため、結像光の光量の変化から、標本の表面における傾き量を測定できる。また、測定した傾き量を用いることで、高い精度で標本の表面形状を測定できる。
【０２９２】
本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材は、遮光部と開口部とを区分する境界線を有し、境界線は光軸と直交する一本の直線と平行な線で構成されていることが好ましい。
【０２９３】
本実施形態の標本形状測定装置で測定を行う場合、本実施形態の標本形状測定方法では、観察光学系から出射した光は、光束透過領域を通過した光であり、光束透過領域は、外側境界線と第１の境界線とで囲まれた領域であり、外側境界線は、観察光学系の瞳の外縁の一部で構成され、第１の境界線は、光軸と直交する一本の直線と平行な線で構成されていることが好ましい。
【０２９４】
このようにすることで、開口部材を容易に作製することができる。
【０２９５】
図４０Ａには、開口部材９５に照射された照明光の様子が示されている。照明光の照射範囲は、照明光学系の瞳と見なすことができる。よって、図４０Ａでは、開口部材９５に照明光学系の瞳を重ねた状態が示されていることになる。
【０２９６】
開口部材９５は、遮光部９５ａと開口部９５ｂとを有する。開口部材９５が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材９５は、遮光部９５ａが光軸１０を含むように配置される。開口部９５ｂは、光軸１０に対して偏心した場所に位置している。
【０２９７】
遮光部９５ａと開口部９５ｂとの間には、境界線９６が形成されている。境界線９６によって、遮光部９５ａと開口部９５ｂとが区分されている。境界線９６は、光軸１０と直交する一本の直線と平行な線である。
【０２９８】
図４０Ｂには、対物レンズの瞳７の位置における結像光の様子が示されている。境界線９７は、第１の境界線である。境界線９７は、境界線９６の像である。境界線９８は、外側境界線である。境界線９８は、対物レンズの瞳７の外縁の一部で構成されている。光束透過領域９９は、境界線９７と境界線９８とで囲まれている。光束透過領域とは、対物レンズの瞳７を通過する光の領域のことである。
【０２９９】
光軸側に位置する境界線が、光軸と直交する一本の直線と平行な線で構成されている場合、その境界線を「タイプ１の境界線」とする。境界線９６や境界線９７は、タイプ１の境界線になる。
【０３００】
本実施形態の標本形状測定装置は、開口部材として、第１の開口部材を有し、第１の開口部材は、遮光部と開口部とを区分する境界線を有し、所定の２点を結ぶ直線が、境界線と光軸との間に位置することが好ましい。ここで、所定の２点は、第１の開口部材に照明光学系の瞳を重ねたときに、所定の線と照明光学系の瞳の外縁とが交わる２点である。
【０３０１】
本実施形態の標本形状測定装置で測定を行う場合、本実施形態の標本形状測定方法では、観察光学系から出射した光は、光束透過領域を通過した光であり、光束透過領域は、外側境界線と第２の境界線とで囲まれた領域であり、外側境界線は、観察光学系の瞳の外縁の一部で構成され、外側境界線と第２の境界線は、共に凸状であり、凸の向きは、外側境界線と第２の境界線とで同一であることが好ましい。
【０３０２】
図４１Ａは、変形例３の開口部材を用いたときの照明光の様子を示す図である。図４１Ｂは、変形例３の開口部材を用いたときの結像光の様子を示す図である。図４１Ａには、開口部材１００に照射された照明光の様子が示されている。照明光の照射範囲は、照明光学系の瞳と見なすことができる。よって、図４１Ａでは、開口部材１００に照明光学系の瞳を重ねた状態が示されていることになる。
【０３０３】
変形例３の開口部材１００は、遮光部１００ａと開口部１００ｂとを有する。開口部材１００が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材１００は、遮光部１００ａが光軸１０を含むように配置される。開口部１００ｂは、光軸１０に対して偏心した場所に位置している。
【０３０４】
遮光部１００ａと開口部１００ｂとの間には、境界線１０１が形成されている。境界線１０１によって、遮光部１００ａと開口部１００ｂとが区分されている。
【０３０５】
開口部材１００に照明光学系の瞳を重ねたとき、境界線１０１と照明光学系の瞳の外縁とが、点１０２と点１０３とで交わっている。点１０２と点１０３は所定の２点である。直線１０４は、点１０２と点１０３とを通過する直線である。
【０３０６】
境界線１０１は、円弧で構成されている。円弧は、遮光部１００ａから開口部１００ｂに向かって凸となるように形成されている。よって、開口部材１００では、直線１０４が、境界線１０１と光軸１０との間に位置する。
【０３０７】
開口部材１００では、境界線１０１は、１本の曲線で構成された線である。しかしながら、境界線１０１は、複数の直線で構成された線、複数の曲線で構成された線、あるいは曲線と直線とで構成された線のいずれでも良い。
【０３０８】
図４１Ｂには、対物レンズの瞳７の位置における結像光の様子が示されている。境界線１０５は、第２の境界線である。境界線１０５は、境界線１０１の像である。境界線１０６は、外側境界線である。境界線１０６は、対物レンズの瞳７の外縁の一部で構成されている。光束透過領域１０７は、境界線１０５と境界線１０６とで囲まれている。
【０３０９】
境界線１０５と境界線１０６は、共に凸状になっている。そして、凸の向きは、境界線１０５と境界線１０６とで同一になっている。この場合、光束透過領域１０７の形状は、光軸１０側に凹部を向けたメニスカス形状になっている。よって、境界線１０５は、光軸１０側に向かって凹の線で構成されているということができる。
【０３１０】
光軸側に位置する境界線が、光軸側に向かって凹の線で構成されている場合、その境界線を「タイプ２の境界線」とする。境界線１０１や境界線１０５は、タイプ２の境界線になる。
【０３１１】
標本の表面における傾き量と結像光の光量との相関関係を示す特性（以下、「相関特性」という）は、境界線の形状によって異なる。図４２Ａは、タイプ１の境界線における結像光の様子を示す図である。図４２Ｂは、タイプ２の境界線における結像光の様子を示す図である。
【０３１２】
標本の表面における傾き量に応じて、光束透過領域がシフトする。そして、光束透過領域のシフトに応じて、光束透過領域の面積が変化する。結像光の光量は、光束透過領域内の光強度の総和（以下、「光強度の総和」という）である。よって、上述の相関特性は、光束透過領域のシフト量を変化させたときの光強度の総和の変化で示すことができる。光強度の総和は、光束透過領域内の各点における光強度を積算することで求めることができる。
【０３１３】
図４２Ｃは、照明光の光量分布が均一な場合の相関特性を示す図である。Ｉsumは、光強度の総和を表している。図４２Ｃには、タイプ１の境界線における相関特性と、タイプ２の境界線における相関特性とが示されている。図４２Ｃのグラフは、シミュレーションの結果を示したグラフである。
【０３１４】
タイプ１の境界線におけるシミュレーションでは、図４２Ａに示すように、対物レンズの瞳７の半径をｒ、光軸１０から境界線９７までの距離を０．８×ｒとしている。
【０３１５】
タイプ２の境界線におけるシミュレーションでは、図４２Ｂに示すように、対物レンズの瞳７の半径をｒ、光軸１０から境界線１０５までの距離を０．８×ｒとしている。境界線１０５は、半径が１．５×ｒの円の円弧で構成されている。
【０３１６】
ここでは、Ｘ方向に光束透過領域が移動するものとしている。光軸１０から境界線９７までの距離や、光軸１０から境界線１０５までの距離は、光束透過領域がシフトする方向における距離である。
【０３１７】
光束透過領域の面積とは、光束透過領域９９や光束透過領域１０７の面積のことである。シフト量とは、光束透過領域の移動量のことである。図４２Ａでは、光束透領域９９の移動量がΔＨで示されている。図４２Ｂでは、光束の移動の様子やシフト量ΔＨの図示は省略されている。
【０３１８】
図４２Ｃのグラフでは、タイプ２の境界線におけるシミュレーション結果が実線で示され、タイプ１の境界線におけるシミュレーション結果が破線で示されている。どちらのシミュレーションにおいても、縦軸の値は、ΔＨ／２ｒ＝０のときの値で規格化されている。
【０３１９】
図４２Ｃに示すように、実線における傾きは、破線における傾きより小さい。これは、タイプ２の境界線における検出感度が、タイプ１の境界線における検出感度よりも低いことを意味している。この点について説明する。
【０３２０】
図１において、例えば、結像光ＬSP1が紙面の左方向にシフトすると、結像光ＬSP2における一部の領域（以下、「移動領域ＭＡ」という）が対物レンズの瞳７の内側に入ってくる。
【０３２１】
タイプ２の境界線における移動領域ＭＡの面積は、タイプ１の境界線における移動領域ＭＡよりも若干大きい。しかしながら、その差はわずかである。そのため、ここでは、両者の移動領域ＭＡの面積は同じものとして説明する。
【０３２２】
タイプ１の境界線におけるシフト量ΔＨと、タイプ２の境界線におけるシフト量ΔＨが同じ場合、移動領域ＭＡの面積は両者で同じである。照明光の光強度分布が均一の場合、移動領域ＭＡの面積が両者で同じであれば、移動領域ＭＡにおける光量ＩMAも両者で同じである。
【０３２３】
タイプ１の境界線（図４２Ａ）とタイプ２の境界線（図４２Ｂ）とを比較すると、光束透過領域１０７の面積は、光束透過領域９９の面積よりも広い。この場合、光束透過領域１０７における光量Ｉtype2は、光束透過領域９９における光量Ｉtype1よりも多くなる。
【０３２４】
光束透過領域のシフトが生じると、Ｉtype1とＩtype2の両方に、ＩMAが加わる。この場合、Ｉtype2に対するＩMAの割合は、Ｉtype1に対するＩMAの割合よりも小さくなる。そのため、タイプ２の境界線における検出感度は、タイプ１の境界線における検出感度よりも低くなる。
【０３２５】
しかしながら、検出感度が低いと、検出範囲は広くなる。よって、タイプ２の境界線における検出範囲は、タイプ１の境界線における検出範囲よりも広くなる。その結果、タイプ２の境界線では、タイプ１の境界線に比べて、より大きな傾き量を検出することができる。
【０３２６】
このように、変形例３の開口部材１００を用いると、開口部材９５を用いた場合に比べて結像光の光量変化が小さくなるため、傾き量を測定できる範囲が広くなる。よって、変形例３の開口部材１００を用いることで、より大きな傾き量を持つ標本の表面を測定することができる。
【０３２７】
以上の説明では、タイプ１の境界線とタイプ２の境界線とで移動領域ＭＡの面積が同じであることを前提としている。しかしながら、上述のように、移動領域ＭＡの面積は、タイプ１の境界線とタイプ２の境界線とで異なる。この場合であっても、光束透過領域の面積の差の方が、移動領域ＭＡの面積の差に比べて非常に大きいため、移動領域ＭＡの面積の差は無いものと考えることができる。よって、移動領域ＭＡの面積に差があったとしても、タイプ２の境界線における検出感度は、タイプ１の境界線における検出感度よりも低くなる。
【０３２８】
変形例３の開口部材１００の別の例を図４３Ａと図４３Ｂに示す。図４３Ａは、２本の直線で構成された開口部材を示す図である。図４３Ｂは、３本の直線で構成された開口部材を示す図である。
【０３２９】
図４３Ａに示すように、開口部材１１０は、遮光部１１０ａと開口部１１０ｂとを有する。開口部材１１０が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材１１０は、遮光部１１０ａが光軸１０を含むように配置される。開口部１１０ｂは、光軸１０に対して偏心した場所に位置している。
【０３３０】
遮光部１１０ａと開口部１１０ｂとの間には、境界線１１１が形成されている。境界線１１１によって、遮光部１１０ａと開口部１１０ｂとが区分されている。
【０３３１】
開口部材１１０に照明光学系の瞳を重ねたとき、境界線１１１と照明光学系の瞳の外縁とが、点１１２と点１１３とで交わっている。点１１２と点１１３は所定の２点である。直線１１４は、点１１２と点１１３とを通過する直線である。
【０３３２】
境界線１１１は、２本の直線で構成されている。２本の直線は、遮光部１１０ａから開口部１１０ｂに向かって凸となるように形成されている。よって、開口部材１１０では、直線１１４が、境界線１１１と光軸１０との間に位置する。
【０３３３】
境界線１１１は、タイプ２の境界線である。よって、開口部材１１０を用いることで、より大きな表面の傾き量を持つ標本を測定することができる。
【０３３４】
図４３Ｂに示すように、開口部材１２０は、遮光部１２０ａと開口部１２０ｂとを有する。開口部材１２０が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材１２０は、遮光部１２０ａが光軸１０を含むように配置される。開口部１２０ｂは、光軸１０に対して偏心した場所に位置している。
【０３３５】
遮光部１２０ａと開口部１２０ｂとの間には、境界線１２１が形成されている。境界線１２１によって、遮光部１２０ａと開口部１２０ｂとが区分されている。
【０３３６】
開口部材１２０に照明光学系の瞳を重ねたとき、境界線１２１と照明光学系の瞳の外縁とが、点１２２と点１２３とで交わっている。点１２２と点１２３は所定の２点である。直線１２４は、点１２２と点１２３とを通過する直線である。
【０３３７】
境界線１２１は、３本の直線で構成されている。３本の直線は、遮光部１２０ａから開口部１２０ｂに向かって凸となるように形成されている。よって、開口部材１２０では、直線１２４が、境界線１２１と光軸１０との間に位置する。
【０３３８】
境界線１２１は、タイプ２の境界線である。よって、開口部材１２０を用いることで、より大きな表面の傾き量を持つ標本を測定することができる。
【０３３９】
本実施形態の標本形状測定装置では、開口部材として、第２の開口部材を有し、第２の開口部材は、遮光部と開口部とを区分する境界線を有し、境界線が、所定の２点を結ぶ直線と光軸との間に位置することが好ましい。ここで、所定の２点は、開口部材に照明光学系の瞳を重ねたときに、所定の線と照明光学系の瞳の外縁とが交わる２点である。
【０３４０】
本実施形態の標本形状測定装置で測定を行う場合、本実施形態の標本形状測定方法では、観察光学系から出射した光は、光束透過領域を通過した光であり、光束透過領域は、外側境界線と第３の境界線とで囲まれた領域であり、外側境界線は、観察光学系の瞳の外縁の一部で構成され、外側境界線と第３の境界線は、共に凸状であり、凸の向きは、外側境界線と第３の境界線とで正反対であることが好ましい。
【０３４１】
図４４Ａは、変形例４の開口部材を用いたときの照明光の様子を示す図である。図４４Ｂは、変形例４の開口部材を用いたときの結像光の様子を示す図である。図４４Ａには、開口部材１３０に照射される照明光の様子が示されている。照明光の照射範囲は、照明光学系の瞳と見なすことができる。よって、図４４Ａでは、開口部材１３０に照明光学系の瞳を重ねた状態が示されていることになる。
【０３４２】
変形例４の開口部材１３０は、遮光部１３０ａと開口部１３０ｂとを有する。開口部材１３０が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材１３０は、遮光部１３０ａが光軸１０を含むように配置される。開口部１３０ｂは、光軸１０に対して偏心した場所に位置している。
【０３４３】
遮光部１３０ａと開口部１３０ｂとの間には、境界線１３１が形成されている。境界線１３１によって、遮光部１３０ａと開口部１３０ｂとが区分されている。
【０３４４】
開口部材１３０に照明光学系の瞳を重ねたとき、境界線１３１と照明光学系の瞳の外縁とが、点１３２と点１３３とで交わっている。点１３２と点１３３は所定の２点である。直線１３４は、点１３２と点１３３とを通過する直線である。
【０３４５】
境界線１３１は、円弧で構成されている。円弧は、開口部１３０ｂから遮光部１３０ａに向かって凸となるように形成されている。よって、開口部材１３０では、境界線１３１が、直線１３４と光軸１０との間に位置する。
【０３４６】
開口部材１３０では、境界線１３１は、１本の曲線で構成された線である。しかしながら、境界線１３１は、複数の直線で構成された線、複数の曲線で構成された線、あるいは曲線と直線とで構成された線のいずれでも良い。
【０３４７】
図４４Ｂには、対物レンズの瞳７の位置における結像光の様子が示されている。境界線１３５は、第３の境界線である。境界線１３５は、境界線１３１の像である。境界線１３６は、外側境界線である。境界線１３６は、対物レンズの瞳７の外縁の一部で構成されている。光束透過領域１３７は、境界線１３５と境界線１３６とで囲まれている。
【０３４８】
境界線１３５と境界線１３６は、共に凸状になっている。そして、凸の向きは、境界線１３５と境界線１３６とで正反対になっている。この場合、光束透過領域１３７の形状は、両凸形状になっている。よって、境界線１３５は、光軸１０側に向かって凸の線で構成されているということができる。
【０３４９】
光軸側に位置する境界線が、光軸側に向かって凸の線で構成されている場合、その境界線を「タイプ３の境界線」とする。境界線１３１や境界線１３５は、タイプ３の境界線になる。
【０３５０】
上述のように、相関特性は、境界線の形状によって異なる。図４５Ａは、タイプ１の境界線における結像光の様子を示す図である。図４５Ｂは、タイプ３の境界線における結像光の様子を示す図である。
【０３５１】
上述のように、標本の表面における傾き量に応じて、光束透過領域がシフトする。そして、光束透過領域のシフトに応じて、光束透過領域の面積が変化する。結像光の光量は、光強度の総和である。よって、上述の相関特性は、光束透過領域のシフト量を変化させたときの結像光の光量の変化で示すことができる。
【０３５２】
図４５Ｃは、照明光の光量分布が均一な場合の相関特性を示す図である。図４５Ｃには、タイプ１の境界線における相関特性と、タイプ３の境界線における相関特性とが示されている。図４５Ｃのグラフは、シミュレーションの結果を示したグラフである。
【０３５３】
タイプ１の境界線におけるシミュレーションでは、図４５Ａに示すように、対物レンズの瞳７の半径をｒ、光軸１０から境界線９７までの距離を０．８×ｒとしている。
【０３５４】
タイプ３の境界線におけるシミュレーションでは、図４５Ｂに示すように、対物レンズの瞳７の半径をｒ、光軸１０から境界線１３５までの距離を０．８×ｒとしている。境界線１３５は、半径が１．５×ｒの円の円弧で構成されている。
【０３５５】
ここでは、Ｘ方向に光束透過領域が移動するものとしている。光軸１０から境界線９７までの距離や、光軸１０から境界線１３５までの距離は、光束透過領域がシフトする方向における距離である。
【０３５６】
光束透過領域の面積とは、光束透過領域９９や光束透過領域１３７の面積のことである。シフト量とは、光束透過領域の移動量のことである。図４５Ａでは、光束透領域９９の移動量がΔＨで示されている。図４５Ｂでは、光束の移動の様子やシフト量ΔＨの図示は省略されている。
【０３５７】
図４５Ｃのグラフでは、タイプ３の境界線におけるシミュレーション結果が実線で示され、タイプ１の境界線におけるシミュレーション結果が破線で示されている。どちらのシミュレーションにおいても、縦軸の値は、ΔＨ／２ｒ＝０のときの値で規格化されている
【０３５８】
４２Ｃに示すように、実線における傾きは、破線における傾きより大きい。これは、タイプ３の境界線における検出感度が、タイプ１の境界線における検出感度よりも高いことを意味している。この点について説明する。
【０３５９】
タイプ３の境界線における移動領域ＭＡの面積は、タイプ１の境界線における移動領域ＭＡよりも若干小さい。しかしながら、その差はわずかである。そのため、ここでは、両者の移動領域ＭＡの面積は同じものとして説明する。
【０３６０】
タイプ１の境界線におけるシフト量ΔＨと、タイプ３の境界線におけるシフト量ΔＨが同じ場合、移動領域ＭＡの面積は両者で同じである。照明光の光強度分布が均一の場合、移動領域ＭＡの面積が両者で同じであれば、移動領域ＭＡにおける光量ＩMAも両者で同じである。
【０３６１】
タイプ１の境界線（図４５Ａ）とタイプ３の境界線（図４５Ｂ）とを比較すると、光束透過領域１３７の面積は、光束透過領域９９の面積よりも狭い。この場合、光束透過領域１３７における光量Ｉtype3は、光束透過領域９９における光量Ｉtype1よりも少なくなる。
【０３６２】
光束透過領域のシフトが生じると、Ｉtype1とＩtype3の両方に、ＩMAが加わる。この場合、Ｉtype3に対するＩMAの割合は、Ｉtype1に対するＩMAの割合よりも大きくなる。そのため、タイプ３の境界線における検出感度は、タイプ１の境界線における検出感度よりも高くなる。
【０３６３】
このように、変形例４の開口部材１３０を用いると、開口部材９５を用いた場合に比べて、結像光の光量変化が大きくなるため、測定可能な傾き量の最小値が小さくなる。よって、変形例４の開口部材１３０を用いることで、より小さな傾き量を持つ標本の表面を測定することができる。
【０３６４】
ただし、検出感度が高いと、検出範囲は狭くなる。よって、タイプ３の境界線における検出範囲は、タイプ１の境界線における検出範囲よりも狭くなる。
【０３６５】
以上の説明では、タイプ１の境界線とタイプ３の境界線とで移動領域ＭＡの面積が同じであることを前提としている。しかしながら、上述のように、移動領域ＭＡの面積は、タイプ１の境界線とタイプ３の境界線とで異なる。この場合であっても、光束透過領域の面積の差の方が、移動領域ＭＡの面積の差に比べて非常に大きいため、移動領域ＭＡの面積の差は無いものと考えることができる。よって、移動領域ＭＡの面積に差があったとしても、タイプ３の境界線における検出感度は、タイプ１の境界線における検出感度よりも高くなる。
【０３６６】
変形例４の開口部材１３０の別の例を図４６Ａと図４６Ｂに示す。図４６Ａは、２本の直線で構成された開口部材を示す図である。図４６Ｂは、３本の直線で構成された開口部材を示す図である。
【０３６７】
図４６Ａに示すように、開口部材１４０は、遮光部１４０ａと開口部１４０ｂとを有する。開口部材１４０が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材１４０は、遮光部１４０ａが光軸１０を含むように配置される。開口部１４０ｂは、光軸１０に対して偏心した場所に位置している。
【０３６８】
遮光部１４０ａと開口部１４０ｂとの間には、境界線１４１が形成されている。境界線１４１によって、遮光部１４０ａと開口部１４０ｂとが区分されている。
【０３６９】
開口部材１４０に照明光学系の瞳を重ねたとき、境界線１４１と照明光学系の瞳の外縁とが、点１４２と点１４３とで交わっている。点１４２と点１４３は所定の２点である。直線１４４は、点１４２と点１４３とを通過する直線である。
【０３７０】
境界線１４１は、２本の直線で構成されている。２本の直線は、遮光部１４０ａから開口部１４０ｂに向かって凹となるように形成されている。よって、開口部材１４０では、境界線１４１が、直線１４４と光軸１０との間に位置する。
【０３７１】
境界線１４１は、タイプ３の境界線である。よって、開口部材１４０を用いることで、より小さな傾き量を持つ標本の表面を測定することができる。
【０３７２】
図４６Ｂに示すように、開口部材１５０は、遮光部１５０ａと開口部１５０ｂとを有する。開口部材１５０が照明光学系の光路に挿入された場合、開口部材１５０は、遮光部１５０ａが光軸１０を含むように配置される。開口部１５０ｂは、光軸１０に対して偏心した場所に位置している。
【０３７３】
遮光部１５０ａと開口部１５０ｂとの間には、境界線１５１が形成されている。境界線１５１によって、遮光部１５０ａと開口部１５０ｂとが区分されている。
【０３７４】
開口部材１５０に照明光学系の瞳を重ねたとき、境界線１５１と照明光学系の瞳の外縁とが、点１５２と点１５３とで交わっている。点１５２と点１５３は所定の２点である。直線１５４は、点１５２と点１５３とを通過する直線である。
【０３７５】
境界線１５１は、３本の直線で構成されている。３本の直線は、遮光部１５０ａから開口部１５０ｂに向かって凹となるように形成されている。よって、開口部材１５０では、境界線１５１が、直線１５４と光軸１０との間に位置する。
【０３７６】
境界線１５１は、タイプ３の境界線である。よって、開口部材１５０を用いることで、より小さな傾き量を持つ標本の表面を測定することができる。
【０３７７】
本実施形態の標本形状測定装置では、保持部材と、透明な平行平板と、を有し、保持部材は、液体を保持する保持部を有し、透明な平行平板は、液体の液面と接するように配置されていることが好ましい。
【０３７８】
標本の保持は、保持部材で行われる。標本が生細胞の場合、標本は液体と共に保持部材で保持される。この場合、液体を保持するために、保持部材は保持部を有する。
【０３７９】
図４７Ａは、平行平板が配置されていない場合の液体の様子を示す図である。図４７Ｂは、平行平板が配置されている場合の液体の様子を示す図である。
【０３８０】
図４７Ａに示すように、保持部材１６０は、保持部１６１を有する。保持部１６１は、透明な側面１６０ａと透明な底面１６０ｂとで囲まれた空間である。保持部１６１には、液体１６２が保持されている。
【０３８１】
保持部１６１の面積が小さくなっていくと、図４７Ａに示すように、液面１６３は凹面になる。この場合、液体１６２は負レンズとして作用する。そのため、液体１６２に入射した平行光束１６４は、実線で示すように、発散光束１６５となって底面１６０ｂから出射する。
【０３８２】
これに対して、保持部１６１の面積が大きくなると、液面１６３は平面になる（不図示）。この場合、液体１６２は平行平板とみなせるので、液体１６２ではレンズとしての作用が生じない。そのため、液体１６２に入射した平行光束１６４は、破線で示すように、平行光束１６６となって底面１６０ｂから出射する。
【０３８３】
底面１６０ｂから出射する光束の一部は、光束透過領域の面積に対応している。底面１６０ｂから出射する光束が平行光束１６６の場合、光束透過領域の面積は、図３１Ａに示す結像光４７の領域になる。底面１６０ｂから出射する光束が発散光束１６５の場合、光束透過領域の面積は、図３１Ｂに示す結像光４７の領域になる。
【０３８４】
底面１６０ｂから出射する光束の形状は、標本の表面における傾き量に応じて変化する。しかしながら、上述のように、標本が無い場合であっても、底面１６０ｂから出射する光束の形状は常に同じではなく、液面１６３の形状によって変化することがある。また、上述のように、底面１６０ｂから出射する光束の一部は、光束透過領域の面積に対応している。そのため、光束透過領域の面積も、液面１６３の形状によって変化することがある。
【０３８５】
上述のように、光束透過領域の面積は、標本の表面における傾き量を表している。よって、標本の表面における傾き量が同じであっても、例えば、液面１６３の形状が平面の場合と凹面の場合とでは測定結果が異なってしまう。すなわち、液面１６３の形状によっては、測定結果に誤差が生じる可能性がある。
【０３８６】
そこで、図４７Ｂに示すように、透明な平行平板１６７を、液体１６２の液面１６３と接するように配置する。このようにすることで、凹面であった液面１６３の形状が平面になる。その結果、実線で示すように、標本が無い場合であっても、液体１６２に入射した平行光束１６４は、常に平行光束１６６となって底面１６０ｂから出射する。すなわち、液面１６３の形状によって誤差が生じない。
【０３８７】
傾き量の算出では、上述のように、光量と傾き量とをパラメータとするルックアップテーブルや、光量と傾き量とをパラメータとする式が用いられる。本実施形態の標本形状測定装置では、液面１６３の形状によって誤差が生じないので、ルックアップテーブルを用いる場合や、式を用いる場合であっても、液面１６３の形状の影響を考慮する必要がない。
【０３８８】
本実施形態の標本形状測定装置では、遮光部の大きさと対物レンズの標本側開口数の少なくとも一方が変更可能であることが好ましい。
【０３８９】
図４８Ａは、タイプ１の境界線における相関特性を示すグラフである。図４８Ｂは、タイプ１の境界線における結像光の様子を示す図である。図４８Ｂでは、見易さのために、対物レンズの瞳の外側の光束は図示を省略している。
【０３９０】
図４８Ａに示すように、光強度の総和は、ΔＨ／２ｒ＝−０．１のときにゼロになる。この時、光束透過領域では、図４８Ｂに示すように、境界線９７が、対物レンズの瞳７の外縁１７０と一致した状態になる。すなわち、光束透過領域９９が、対物レンズの瞳７の外側に位置している。そのため、この場合、対物レンズの瞳７を通過する光束は存在しないので、傾き量の測定はできない。
【０３９１】
ΔＨ／２ｒ＝−０．１よりもマイナス側で傾き量の測定をできるようにするためには、ΔＨ／２ｒ＝−０．１よりもマイナス側でも、光束透過領域９９が対物レンズの瞳７の内側に位置する状態になっている必要がある。
【０３９２】
θsmaxを、検出可能な最大角とする。θsmaxは、境界線９７が、対物レンズの瞳７の外縁１７０と一致した状態における標本の表面の法線と光軸とのなす角になる。θsmaxは、以下の式（８）で表される。
【数８】
2016185729.tif 000010
ここで、
θminは、所定の光線と光軸とのなす角、
θNAは対物レンズの標本側開口数、
ｎは標本の屈折率、
ｎ’は浸液の屈折率、
である。
【０３９３】
式（８）に基づいて、θsmaxを算出した結果を図４９に示す。図４９は遮光部面積とθsとの関係を示すグラフである。図４９において、実線はθNA＝０．４のとき、破線はθNA＝０．２５のとき、一点鎖線はθNA＝０．１３のときを示している。遮光部面積は、総面積に占める割合で表されている。総面積は、遮光部面積と透過部面積との和である。
【０３９４】
θNAは対物レンズの標本側開口数であって、対物レンズの瞳の径を決めるパラメータの一つである。θNAの値が大きくなると、対物レンズの瞳の径が大きくなる。対物レンズの瞳の径が大きくなると、光束透過領域が対物レンズの瞳の内側に位置する状態になる。よって、θNAの値を大きくすることで、測定可能な傾き量の上限値を大きくすることができる。
【０３９５】
このことは、図４９にも示されている。図４９には、θNAの値が大きくなるほど、θsmaxの値は大きくなることが示されている。
【０３９６】
また、θminは所定の光線と光軸とのなす角であって、遮光部と透過部との境界を決めるパラメータである。θminの値が小さくなると透過部面積が大きくなるので、光束透過領域の面積が広がる。光束透過領域の面積が広がると、光束透過領域が対物レンズの瞳の内側に位置する状態になる。よって、θminの値を小さくすることで、測定可能な傾き量の上限値を大きくすることができる。
【０３９７】
また、θminの値が小さくなると、遮光部面積は小さくなる。よって、遮光部面積を小さくすることで、測定可能な傾き量の上限値を大きくすることができる。
【０３９８】
このことは、図４９にも示されている。図４９には、遮光部面積が小さくなるほど、θsmaxの値は大きくなることが示されている。
【０３９９】
図４９に示すように、θNAの値が大きくなるほど、θsmaxの値は大きくなっている。これは、θNAの値が大きくなるほど、測定範囲が広くなることを意味している。よって、例えば、θNA＝０．４のときの測定範囲は、θNA＝０．１３のときの測定範囲よりも広い。ただし、θNAの値が大きくなるほど、変動割合は小さくなる。よって、例えば、θNA＝０．４のときの検出感度は、θNA＝０．１３のときの検出感度よりも低くなる。
【０４００】
また、図４９に示すように、遮光部面積が小さくなるほど、θsmaxの値は大きくなっている。これは、遮光部面積が小さくなるほど、測定範囲が広くなることを意味している。よって、例えば、遮光部面積が７０％のときの測定範囲は、遮光部面積が９５％のときの測定範囲よりも広い。ただし、遮光部面積が小さくなるほど、変動割合は小さくなる。よって、例えば、遮光部面積が７０％のときの検出感度は、遮光部面積が９５％のときの検出感度よりも低くなる。
【０４０１】
測定例を示す。図５０は標本を示す図である。標本は平凸レンズ１８０である。平凸レンズ１８０の最も外側の点における傾きは、±１７°である。平凸レンズ１８０の屈折率は１．８５である。傾き量の測定は、屈折率が１．７の液体を介して行っている。
【０４０２】
平凸レンズ１８０を測定した画像を示す。図５１Ａは、測定方法１で得られた電子画像（以下、「電子画像１という」）である。図５１Ｂは、測定方法２で得られた電子画像（以下、「電子画像２という」）である。図５１Ｃは、測定方法３で得られた電子画像（以下、「電子画像３という」）である。
【０４０３】
電子画像１、電子画像２及び電子画像３は、図８におけるステップＳ３２を実行することで得られる。各電子画像では、結像光の光量の多少が、明暗で表されている。上述のように、結像光の光量は、標本の表面における傾き量を表している。よって、各電子画像における明暗は、標本の表面における傾き量の多少を表している。
【０４０４】
また、各電子画像の中央部における断面図を示す。図５２Ａは、電子画像１における明るさの分布を示す図である。図５２Ｂは、電子画像２における明るさの分布を示す図である。図５２Ｃは、電子画像３における明るさの分布を示す図である。
【０４０５】
図５２Ａ、５２Ｂ及び５２Ｃに示す断面図は、ステップＳ３３を実行した結果の電子画像における断面図である。ステップＳ３３では、結像光の光量と基準の光量との差又は比が算出される。よって、図５２Ａ、５２Ｂ及び５２Ｃに示す断面図は、図５１Ａ、５１Ｂ及び５１Ｃに示す電子画像における明るさの分布を示しているわけではない。
【０４０６】
対物レンズ開口数の値と、遮光部の面積の値は以下の通りである。
θNA          遮光部の面積
測定方法１    ０．４            ７０％
測定方法２    ０．４            ９５％
測定方法３    ０．１３          ９５％
【０４０７】
測定方法１では、０°から約４３．５°までの範囲を測定することができる（図４９を参照）。ただし、測定方法１では、測定方法２や測定方法３と比べると、測定感度が低い。そのため、電子画像１では、電子画像２や電子画像３と比べると、紙面の左側と右側とのコントラストの差が小さい。これは、図５２Ａ、図５２Ｂ及び図５２Ｃの比較からも明らかである。
【０４０８】
測定方法２では、０°から約１９．２°までの範囲を測定することができる（図４９を参照）。測定方法２では、測定方法１と比べると、測定感度が高い。そのため、電子画像２では、電子画像１と比べると、コントラストの差が大きくなっている。これは、図５２Ａと図５２Ｂとの比較からも明らかである。
【０４０９】
測定方法３では、０°から約８．６°までの範囲を測定することができる（図４９を参照）。測定方法３では、測定方法１や測定方法２と比べると、測定感度が高い。そのため、電子画像３では、電子画像１や電子画像２と比べると、コントラストの差が大きくなっている。これは、図５２Ａ、図５２Ｂ及び図５２Ｃの比較からも明らかである。
【０４１０】
ただし、測定方法３では、測定が可能な傾きは最大で約８．６°である。そのため、電子画像３の左半分のうち、傾きが８．６°よりも大きい傾きを持つ範囲は測定ができていない。電子画像では、測定できていない範囲は、理想的には黒色で表される。しかしながら、実際にはノイズ等の影響で、必ずしも黒色にはならない。
【０４１１】
電子画像３では、測定できていない範囲は、ほぼ黒色になっている。ただし、図５２Ｃに示すように、測定できていない範囲では、算出した値がゼロではなく、ほぼゼロに近い値になっている（実線がゼロを表している）。また、矢印で示すように、測定できていない範囲は、ほぼ平坦になっている。
【０４１２】
画像の右半分には、絶対値での傾きが８．６°よりも大きい傾きを持つ範囲が存在する。しかしながら、画像の右半分では、この範囲について測定ができている。画像の右半分では、傾きが大きくなるほど、光束透過領域が光軸に近づく。そのため、対物レンズの瞳の外側に位置する光束の幅を十分に広くしておけば、傾きに応じて、結像光の光量が増加する。測定方法３では、対物レンズの瞳の外側に位置する光束の幅を十分に広くしているので、測定ができている。
【０４１３】
以上のように、遮光部面積（透過部面積）と対物レンズの標本側開口数の少なくとも一方を変更することで、測定範囲と測定感度を変化させることができる。よって、測定の途中で、遮光部面積や対物レンズの標本側開口数を変更することで、様々な傾き量を持つ標本を測定することができる。
【０４１４】
また、光束透過領域は、透過部を通過する照明光の像である。透過部の対物レンズの瞳位置への投影は、コンデンサレンズと対物レンズによって行われる。この時の投影倍率は、コンデンサレンズの倍率と対物レンズの倍率で決まる。よって、対物レンズの倍率を変更することで、光束透過領域の広さを変えることができる。すなわち、対物レンズの倍率を大きくすることで、光束透過領域が対物レンズの瞳の内側に位置する状態を実現することができる。このように、対物レンズの倍率を大きくすることでも、測定可能な傾き量の上限値を大きくすることができる。
【０４１５】
標本の測定では、例えば、以下のような順番で、対物レンズの倍率、対物レンズの標本側開口数及び遮光部面積を決定すれば良い。測定では、最適な視野で測定を行うことが好ましい。よって、最初に、対物レンズの倍率を決めるのが良い。また、標本の表面を細かく測定することが好ましい。そこで、次に、対物レンズの開口数を決めれば良い。最後に、標本の表面における傾き角の最大値を考慮して、遮光部面積を決めれば良い。
【０４１６】
光の吸収が生じるような標本では、結像光の光量損失を最小にする必要がある。結像光の光量は、対物レンズの標本側開口数や遮光部面積に依存する。そのため、このような標本の測定では、最初に、対物レンズの標本側開口数や遮光部面積を決めても良い。
【０４１７】
標本の表面における傾き角の最大値が不明な場合は、測定範囲が最大となるように、対物レンズの倍率、対物レンズの標本側開口数及び遮光部面積を決定すれば良い。また、標本の表面における傾き角が微小な場合は、測定感度が最大となるように、対物レンズの倍率、対物レンズの標本側開口数及び遮光部面積を決定すれば良い。
【０４１８】
本実施形態の標本形状測定装置では、対物レンズの標本側開口数の変更は、一つの対物レンズで行うことが好ましい。
【０４１９】
このようにすることで、様々な傾き量を持つ標本を、スムーズに測定することができる。対物レンズの標本側開口数の変更は、例えば、ズーム対物レンズを使用すれば良い。ズーム対物レンズでは、倍率の変化に応じて標本側開口数が変化するようにしておけば良い。あるいは、対物レンズの瞳位置に液晶を配置し、透過領域を変化させて対物レンズの標本側開口数を変更しても良い。
【０４２０】
本実施形態の標本形状測定装置では、対物レンズの標本側開口数の変更は、複数の対物レンズを切り替えて行うことが好ましい。
【０４２１】
このようにすることで、様々な傾き量を持つ標本を測定することができる。複数の対物レンズとしては、例えば、倍率が同じで標本側開口数が異なる対物レンズがある。このような複数の対物レンズを使用すれば、対物レンズを切り替えることで、倍率を変更せずに、測定範囲と測定感度を変えることができる。
【０４２２】
本実施形態の標本形状測定装置では、開口部を通過する照明光の光強度は、開口部の全ての位置で略等しいことが好ましい。
【０４２３】
このようにすると、開口部の形状を変えることで、測定範囲と測定感度を変化させることができる。その結果、様々な傾き量を持つ標本を簡単に測定することができる。
【０４２４】
上述のように、本実施形態の標本形状測定方法では、光量と傾き量とをパラメータとするルックアップテーブルを用いて傾斜角を求めることができる。このルックアップテーブルは、以下のようにして作成しても良い。
【０４２５】
本実施形態の標本形状測定方法は、標準試料を測定するステップを有し、測定した結果に基づいて、光量と傾き量とをパラメータとするルックアップテーブルを作成しても良い。
【０４２６】
図５３Ａは、標準試料の第１例を示す図である。第１例の標準試料は、平凸レンズ１９０である。平凸レンズ１９０では、表面の各点における傾き量が既知である。θMAXはプラスの角度において絶対値が最大となるときの角度、θMINはマイナスの角度において絶対値が最大となるときの角度である。
【０４２７】
平凸レンズ１９０では、θMINから０°までの全ての角度、及び０°からθMAXまでのすべての角度が含まれている。よって、平凸レンズ１９０を１回測定するだけで、様々な角度（傾き量）のデータを得ることができる。
【０４２８】
図５３Ｂは、標準試料の第２例を示す図である。第２例の標準試料は、複数の楔１９１で構成されている。複数の楔１９１は、楔１９２、楔１９３、及び楔１９４を有する。楔１９２、楔１９３、及び楔１９４の各々では、表面の傾き量が既知である。楔の数は３つに限られない。
【０４２９】
図５３Ｃは、標準試料の第３例を示す図である。第３例の標準試料は、楔１９５である。楔１９５では、高さ（矢印の方向の長さ）が連続的に変化する。楔１９５としては、例えば、バリアングルプリズムがある。楔１９５では、各高さでの表面の傾き量が既知である。
【０４３０】
本実施形態の標本形状測定方法について説明する。図５４は、本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。図８のフローチャートと同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。本実施形態の標本形状測定方法は、標準試料を測定するステップＳ１００を有する。
【０４３１】
図５４に示すように、本実施形態の標本形状測定方法では、最初に、ステップＳ１００が実行される。ステップＳ１００では、標準試料の測定が行われる。標準試料には、上述の平凸レンズ１８０、複数の楔１９１及び楔１９５のいずれかを用いれば良い。
【０４３２】
標準試料では、標本の表面における傾き量が既知である。ステップＳ１００を実行することで、光量と傾き量との関係を示すデータが得られる。このデータを用いて、ルックアップテーブルを作成する。また、既にルックアップテーブルが作成されている場合は、必要に応じて、ルックアップテーブルのデータの更新を行う。ルックアップテーブルの使用方法については既に説明したので、ここでの説明は省略する。
【０４３３】
本実施形態の標本形状測定方法を用いる装置では、装置を構成する部材の各々に、製造公差の範囲内でばらつきが発生する。例えば、対物レンズの開口数の値や倍率の値は、製造公差の範囲内でばらつく。また、開口部と遮光部との境界も、製造公差の範囲内でばらつく。
【０４３４】
標本の形状測定では、標本に応じて、観察光学系の構成や照明光学系の構成の変更が行われる。観察光学系では、例えば、最適な視野や分解能を得るために、標本Ａの測定では対物レンズＡが用いられ、標本Ｂの測定では対物レンズＢが用いられる。同様に、照明光学系では、例えば、標本Ａの測定では開口部材Ａが用いられ、標本Ｂの測定では開口部材Ｂが用いられる。
【０４３５】
そのため、装置を構成する部材の各々に、製造公差の範囲内でのばらつきが存在すると、結像光の光量と傾き量との対応関係が、理想状態での対応関係と異なってしまう。その結果、測定誤差が生じる。
【０４３６】
また、個々の部材、例えば、開口部と遮光部との境界にばらつきが無い場合であっても、開口部材を照明光学系の光路に配置するたびに、配置位置にばらつきが生じる。その結果、開口部と遮光部との境界にばらつきが生じる。その結果、測定誤差が生じる。
【０４３７】
また、例えば、光源、光学フィルタ又はコンデンサレンズが変更されることもある。このような構成の変更が生じると、観察光学系の構成や照明光学系の構成ごとで、結像光の光量と傾き量との対応関係が異なってしまう。
【０４３８】
そこで、ステップＳ１００を実行することで、実際の測定に即した対応関係を得ることができる。その結果、標本の表面における傾き量をより正確に求めることができる。また、標本の表面における傾き量はルックアップテーブルを用いて算出されるので、煩雑な計算の工程を省くことができる。
【０４３９】
ステップＳ１００の実行は、最初の測定時に行えば良い。しかしながら、測定を行うたびに、ステップＳ１００を実行しても良い。
【０４４０】
上述のばらつきが非常に小さい場合、ステップＳ１００の実行を、装置の製造時に行っても良い。この場合、観察光学系の構成と照明光学系の構成の組み合わせを様々に変えて、ステップＳ１００の実行を行う。そして各組み合わせで得た結果に基づいて、ルックアップテーブルを作成すれば良い。
【０４４１】
ステップＳ１００の実行で得た結果を、基準の光量で校正しても良い。このようにすることで、標本の表面における傾き量を更に正確に求めることができる。
【０４４２】
本実施形態の標本形状測定方法では、光軸と直交する面内における開口部の位置を異ならせて測定を行っても良い。
【０４４３】
図５５Ａは、開口部材を回転させる第１例を示す図である。開口部材２００は、遮光部２００ａと開口部２００ｂとを有する。第１例の回転では、開口部材２００を、光軸と直交する面内で回転させている。この回転により、回転後の開口部２００ｂは、回転前の位置から時計回りに９０°回転した位置に移動する。
【０４４４】
第１例の測定では、回転前の位置で、図８に示すステップＳ１０、ステップＳ２０、ステップＳ３１及びステップＳ３２を実施する。次に、回転後の位置で、ステップＳ３１とステップＳ３２を実施する。このようにすることで、結像光の光量の取得が２回行われる。取得された２つの結像光の光量を用いて、例えば平均をとれば良い。このようにすることで、ショットノイズなどによる測定誤差を抑えることができる。
【０４４５】
図５５Ｂは、開口部材を回転させる第２例を示す図である。第２例の回転では、開口部材２００を、光軸と直交する面内で回転させている。この回転により、回転後の開口部２００ｂは、回転前の位置から時計回りに４５°ごとに回転した位置に移動する。
【０４４６】
第２例の測定も、第１例の測定と同様である。第１例の測定と異なる点は、回転後の位置での測定が７回行われる点である。第２例の測定では、結像光の光量の取得が８回行われる。取得された８つの結像光の光量を用いて、例えば平均をとれば良い。このようにすることで、ショットノイズなどによる測定誤差を抑えることができる。
【０４４７】
開口部材として液晶を用いても良い。液晶を用いた場合は、開口部材を回転させること無く、光軸と直交する面内における開口部の位置を変えることができる。
【０４４８】
開口部の位置を異ならせる場合は、開口部は理想的な位置と一致していることが好ましい。開口部が理想的な位置と一致していない場合は、開口部の位置を変えずに、結像光の光量の取得を複数回行なう。そして、取得された８つの結像光の光量を用いて、例えば平均をとれば良い。
【０４４９】
このようにすることで、ショットノイズなどによる測定誤差を抑えることができる。開口部が理想的な位置と一致している場合であっても、開口部の位置を変えずに、結像光の光量の取得を複数回行なっても良い。
【０４５０】
本実施形態の標本形状測定方法では、光軸と直交する面内における第１の位置と第２の位置に開口部を位置させて測定を行っても良い。ここで、第２の位置は、第１の位置を１８０°回転させた位置である。
【０４５１】
開口部を第１の位置に移動させて測定を行う（以下、「測定１」という）。このとき、標本の表面における傾き量の最大値が、測定範囲をわずかに超えていたとする。これは、例えば、上述の測定方法３のような場合である。この場合、測定１では、図５１Ｃや図５２Ｃで説明したように、画像の左半分のうち、傾きが８．６°（絶対値）よりも大きい傾きを持つ範囲は測定ができていない。一方、画像の右半分では、傾きが８．６°（絶対値）よりも大きい傾きを持つ範囲が測定できている。
【０４５２】
そこで、開口部を第２の位置に移動させて測定を行う（以下、「測定２」という）。第２の位置は、第１の位置を１８０°回転させた位置である。そのため、測定２では、測定１における現象とは逆の現象が生じる。すなわち、測定２では、画像の左半分では、傾きが８．６°（絶対値）よりも大きい傾きを持つ範囲が測定できている。一方、画像の右半分のうち、傾きが８．６°（絶対値）よりも大きい傾きを持つ範囲は測定ができていない。
【０４５３】
このように、本実施形態の標本形状測定方法では、測定１で測定できなかった画像の左半分のうちの一部が、測定２では測定できる。よって、測定１の結果と測定２の結果を用いることで、標本の表面における傾きを全て求めることができる。また、ショットノイズなどによる測定誤差を抑えることができる。
【０４５４】
本実施形態の標本形状測定方法は、標本の透過率分布を設定するステップと、結像光の光量を校正するステップと、を有しても良い。
【０４５５】
図５６は、本実施形態の標本形状測定方法のフローチャートである。図８のフローチャートと同じステップについては同じ番号を付し、説明は省略する。本実施形態の標本形状測定方法は、標本の透過率分布を設定するステップＳ１１０と、結像光の光量を校正するステップＳ１１１と、を有する。
【０４５６】
図５６に示すように、本実施形態の標本形状測定方法では、最初に、ステップＳ１１０が実行される。ステップＳ１１０では、標本の透過率分布の設定が行われる。そのために、ステップＳ１１０では、最初に、明視野観察の状態で標本から出射した光を受光する。次に、受光した光の光量を求める。最後に、求めた光量と基準の光量とから、標本の透過率分布を算出する。
【０４５７】
基準の光量は、標本が存在していない状態での光量である。基準の光量も明視野観察の状態で求める。標本に吸収があると、標本が存在する場合と存在しない場合とで、受光した光の光量に違いが生じる。この違いから、標本の透過率分布を求めることができる。標本の透過率分布は、例えば、求めた光量と基準の光量との比から算出すれば良い。
【０４５８】
ステップＳ１１０が終ると、ステップＳ１０から、ステップＳ３２までが実行される。ステップＳ３２の実行によって、結像光の光量が求まる。ただし、標本に吸収がある場合、ここでの結像光の光量は、吸収による光量損失が生じた後の光量になる。
【０４５９】
上述のように、結像光の光量の変化は、標本の表面における傾き量に応じて変化する。そのため、このままでは、吸収による光量変動が、傾き量の変化によって生じたものと見なされてしまう。その結果、測定誤差が生じる。
【０４６０】
そこで、ステップＳ１１０で求めた標本の透過率分布を用いて、結像光の光量を校正する。結像光の光量の校正は、結像光の光量と標本の透過率分布との比を求めれば良い。このようにすることで、測定誤差の発生を防止することができる。
【０４６１】
標本が生細胞の場合、標本の表面における傾き量の測定は、培養液のような液体を介して行われる。この場合、標本は、生細胞と液体になるので、標本の透過率分布は、液体の透過率が反映されたものになる。
【０４６２】
ステップＳ１１０の実行を、装置の製造時に行っても良い。この場合、様々な測定対象（標本や液体）について、明視野観察での受光、光量の算出、及び透過率の算出を行う。そして、算出した透過率を、記憶部に記憶しておく。
【０４６３】
このようにすると、測定対象に対応する透過率を、記憶部から読み出すことで、ステップＳ１１０を実行することができる。そのため、測定を開始するまでの準備時間を短縮することができる。
【０４６４】
測定対象に対応する透過率が記憶部に存在しない場合は、上述のように、明視野観察の状態で標本から出射した光を受光して、透過率を求めれば良い。
【０４６５】
本実施形態の標本形状測定方法は、観察光学系と標本とを相対移動させるステップと、ＸＹ方向のズレを修正するステップと、を有しても良い。
【０４６６】
上述のように、観察光学系と標本とを相対移動させるステップを実行することで、焦点深度よりも広い範囲で、標本の表面における傾き量を正確に求めることができる。
【０４６７】
焦点深度よりも標本の高さが高い場合、焦点深度に入っていない標本面にはピントが合っていない。そのため、これらの標本面の像は、非合焦像になる。非合焦像では、光軸と直交する面内で像のずれ（以下「横ずれという」）が生じている。非合焦像を撮像すると、得られた電子画像にも横ずれが発生する。標本の表面における傾き量を正確に求めるためには、横ずれを補正する必要がある。しかしながら、横ずれを補正することは非常に難しい。
【０４６８】
本実施形態の標本形状測定方法では、焦点深度よりも高さのある標本であっても、全ての標本面にピントが合った電子画像を最終的に取得することができる。すなわち、１回目の測定時に焦点深度に入っていない標本面があったとしても、その標本面についても、最終的に横ずれのない電子画像を取得することができる。このように、取得した複数枚の電子画像は、いずれもピントの合った電子画像になる。よって、取得した複数枚の電子画像から、正しい各ＸＹの位置での傾き量や形状（高さ）を求めることができる。
【０４６９】
本実施形態の標本形状測定方法は、高周波数成分を除去するステップを有しても良い。
【０４７０】
基準の光量の測定では、標本は存在していない。しかしながら、基準の光量は、光学系に付着したごみや空気中のごみ等の影響を受ける。基準の光量に基づいて取得した電子画像では、これらのごみによる影響は、高周波成分として現れる。そこで、高周波数成分を除去するステップを実行することで、基準の光量の電子画像、すなわち基準の光量のデータから、ごみ等による影響を除去することができる。その結果、標本の表面における傾き量を正確に求めることができる。
【０４７１】
高周波数成分を除去するには、例えば、ローパスフィルタによる演算を実行すれば良い。
【産業上の利用可能性】
【０４７２】
以上のように、本発明は、表面の反射率が低く、表面形状が滑らかな標本であっても、高い精度で標本の表面における傾きや形状を測定できる標本形状測定方法及び標本形状測定装置に適している。
【符号の説明】
【０４７３】
１  照明光学系
２  観察光学系
３  ステージ
４  遮光部材
４ａ  遮光領域
４ｂ  透過領域
５  コンデンサレンズ
６  対物レンズ
７  絞り（対物レンズの瞳）
７ａ  遮光部
７ｂ  透過部
７’  絞りの像（対物レンズの瞳の像）
８  標本
９  液浸媒質（浸液）
１０  光軸
１１  観察点
１２  面の法線
２０  面光源
２１  結像レンズ
２２  微小領域
２３、２４  所定の領域
３０  遮光部材
４０  コンデンサレンズの瞳
４１  対物レンズの瞳
４２  細胞
４３  液体
４４  保持部
４５  標本部
４６  平凹レンズ
４７  結像光
４８  遮光部
５０  標本形状測定装置
５１  光源
５２、５３  レンズ
５４  コンデンサレンズ
５５  開口部材
５６  保持部材
５７  標本
５８  対物レンズ
５９  対物レンズの瞳
６０  結像レンズ
６１  像位置
６２  検出素子
６３  処理装置
６４  光源
６５、６６  光学フィルタ
７０  標本形状測定装置
７１、７５、７７  第１の開口部材
７１ａ、７５ａ、７７ａ  遮光部
７１ｂ、７５ｂ、７７ｂ  第１の開口部
７２、７６、７８  第２の開口部材
７２ａ、７６ａ、７８ａ  遮光部
７２ｂ、７６ｂ、７８ｂ  第２の開口部
７３  移動機構
７４  光軸（照明光学系の光軸）
８０  開口部材
８０ａ  遮光部
８０ｂ  第１の開口部
８０ｃ  第２の開口部
９０  開口部材
９０ａ  遮光部
９５  開口部材
９５ａ  遮光部
９５ｂ  開口部
９６  境界線
９７  境界線（第１の境界線）
９８  境界線（外側境界線）
９９  光束透過領域
１００、１１０、１２０  開口部材
１００ａ、１１０ａ、１２０ａ  遮光部
１００ｂ、１１０ｂ、１２０ｂ  開口部
１０１、１１１、１２１  境界線
１０２、１０３、１１２、１１３、１２２、１２３  所定の点
１０４、１１４、１２４  直線（所定の２点を結ぶ直線）
１０５  境界線（第２の境界線）
１０６  境界線の像（外側境界線）
１０７  光束透過領域
１３０、１４０、１５０  開口部材
１３０ａ、１４０ａ、１５０ａ  遮光部
１３０ｂ、１４０ｂ、１５０ｂ  開口部
１３１、１４１、１５１  境界線
１３２、１３３、１４２、１４３、１５２、１５３  所定の点
１３４、１４４、１５４  直線（所定の２点を結ぶ直線）
１３５  境界線（第３の境界線）
１３６  境界線（外側境界線）
１３７  光束透過領域
１６０  保持部材
１６０ａ  透明な側面
１６０ｂ  透明な底面
１６１  保持部
１６２  液体
１６３  液面
１６４、１６６  平行光束
１６５  発散光束
１６７  透明な平行平板
１７０  対物レンズの瞳の外縁
１８０  平凸レンズ
１９０  平凸レンズ（標準試料）
１９１  複数の楔（標準試料）（標準試料）
１９２、１９３、１９４，１９５  楔
２００  開口部材
２００ａ  遮光部
２００ｂ  開口部
ＬIL1、ＬIL2、ＬIL3  照明光
ＬSP1、ＬSP2、ＬSP3  結像光
【図１】
2016185729.tif 000011
【図２Ａ】
2016185729.tif 000012
【図２Ｂ】
2016185729.tif 000013
【図３】
2016185729.tif 000014
【図４Ａ】
2016185729.tif 000015
【図４Ｂ】
2016185729.tif 000016
【図５】
2016185729.tif 000017
【図６Ａ】
2016185729.tif 000018
【図６Ｂ】
2016185729.tif 000019
【図７】
2016185729.tif 000020
【図８】
2016185729.tif 000021
【図９】
2016185729.tif 000022
【図１０】
2016185729.tif 000023
【図１１】
2016185729.tif 000024
【図１２Ａ】
2016185729.tif 000025
【図１２Ｂ】
2016185729.tif 000026
【図１３】
2016185729.tif 000027
【図１４】
2016185729.tif 000028
【図１５】
2016185729.tif 000029
【図１６】
2016185729.tif 000030
【図１７】
2016185729.tif 000031
【図１８Ａ】
2016185729.tif 000032
【図１８Ｂ】
2016185729.tif 000033
【図１９Ａ】
2016185729.tif 000034
【図１９Ｂ】
2016185729.tif 000035
【図２０】
2016185729.tif 000036
【図２１Ａ】
2016185729.tif 000037
【図２１Ｂ】
2016185729.tif 000038
【図２２】
2016185729.tif 000039
【図２３Ａ】
2016185729.tif 000040
【図２３Ｂ】
2016185729.tif 000041
【図２４】
2016185729.tif 000042
【図２５】
2016185729.tif 000043
【図２６Ａ】
2016185729.tif 000044
【図２６Ｂ】
2016185729.tif 000045
【図２７】
2016185729.tif 000046
【図２８】
2016185729.tif 000047
【図２９】
2016185729.tif 000048
【図３０Ａ】
2016185729.tif 000049
【図３０Ｂ】
2016185729.tif 000050
【図３１Ａ】
2016185729.tif 000051
【図３１Ｂ】
2016185729.tif 000052
【図３２】
2016185729.tif 000053
【図３３】
2016185729.tif 000054
【図３４】
2016185729.tif 000055
【図３５Ａ】
2016185729.tif 000056
【図３５Ｂ】
2016185729.tif 000057
【図３６Ａ】
2016185729.tif 000058
【図３６Ｂ】
2016185729.tif 000059
【図３７Ａ】
2016185729.tif 000060
【図３７Ｂ】
2016185729.tif 000061
【図３８】
2016185729.tif 000062
【図３９】
2016185729.tif 000063
【図４０Ａ】
2016185729.tif 000064
【図４０Ｂ】
2016185729.tif 000065
【図４１Ａ】
2016185729.tif 000066
【図４１Ｂ】
2016185729.tif 000067
【図４２Ａ】
2016185729.tif 000068
【図４２Ｂ】
2016185729.tif 000069
【図４２Ｃ】
2016185729.tif 000070
【図４３Ａ】
2016185729.tif 000071
【図４３Ｂ】
2016185729.tif 000072
【図４４Ａ】
2016185729.tif 000073
【図４４Ｂ】
2016185729.tif 000074
【図４５Ａ】
2016185729.tif 000075
【図４５Ｂ】
2016185729.tif 000076
【図４５Ｃ】
2016185729.tif 000077
【図４６Ａ】
2016185729.tif 000078
【図４６Ｂ】
2016185729.tif 000079
【図４７Ａ】
2016185729.tif 000080
【図４７Ｂ】
2016185729.tif 000081
【図４８Ａ】
2016185729.tif 000082
【図４８Ｂ】
2016185729.tif 000083
【図４９】
2016185729.tif 000084
【図５０】
2016185729.tif 000085
【図５１Ａ】
2016185729.tif 000086
【図５１Ｂ】
2016185729.tif 000087
【図５１Ｃ】
2016185729.tif 000088
【図５２Ａ】
2016185729.tif 000089
【図５２Ｂ】
2016185729.tif 000090
【図５２Ｃ】
2016185729.tif 000091
【図５３Ａ】
2016185729.tif 000092
【図５３Ｂ】
2016185729.tif 000093
【図５３Ｃ】
2016185729.tif 000094
【図５４】
2016185729.tif 000095
【図５５Ａ】
2016185729.tif 000096
【図５５Ｂ】
2016185729.tif 000097
【図５６】
2016185729.tif 000098
【国際調査報告】
2016185729.tif 000099
2016185729.tif 000100
2016185729.tif 000101
2016185729.tif 000102
2016185729.tif 000103
2016185729.tif 000104