(57)【要約】  ＰＣＲを行うことなく、マイクロＲＮＡをはじめとするターゲットを直接的に検出するための新たなターゲット分析チップおよび分析方法を提供する。  本発明のターゲット分析チップは、基板を有し、前記基板が、ターゲットを含む試料と試薬とを反応させる反応部、標識検出の対象領域である検出部、および前記反応部と前記検出部とを連通する流路を有し、前記試薬は、担体を有し、前記担体は、前記ターゲットに結合する標識プローブが固定化されており、且つ前記ターゲットとの結合体を形成するものであり、前記流路が、前記担体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段を有し、前記移動制御手段が、前記流路における疎水性の内壁を有し、前記移動制御手段により、前記結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする。
2016117700.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板を有し、
前記基板が、ターゲットを含む試料と試薬とを反応させる反応部、標識検出の対象領域である検出部、および前記反応部と前記検出部とを連通する流路を有し、
前記試薬は、担体を有し、
前記担体は、前記ターゲットに結合する標識プローブが固定化されており、且つ前記ターゲットとの結合体を形成するものであり、
前記流路が、前記担体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段を有し、
前記移動制御手段が、前記流路における疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする、ターゲット分析チップ。
【請求項２】
前記流路が、前記反応部側から前記検出部側に向かって、狭窄する構造である、請求項１記載の分析チップ。
【請求項３】
前記検出部の高さが、１〜５００μｍである、請求項１または２記載の分析チップ。
【請求項４】
前記検出部の内部空間の容積が、前記反応部の内部空間の容積よりも小さい、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項５】
前記担体が、ビーズである、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項６】
前記ビーズの直径が、１００ｎｍ〜４μｍである、請求項５記載の分析チップ。
【請求項７】
前記担体が、シリカ製である、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項８】
前記流路の側面が、前記反応部から前記検出部側に向かってテーパー状に狭まる曲面である、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項９】
前記標識プローブの標識が、前記標識プローブが前記ターゲットに結合することにより、シグナル変化する物質である、請求項１から８のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項１０】
前記標識が、ピレンを含む物質である、請求項９記載の分析チップ。
【請求項１１】
前記標識プローブが、さらにソラレンで修飾されたプローブである、請求項１０記載の分析チップ。
【請求項１２】
前記ターゲットが、マイクロＲＮＡである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項１３】
前記標識プローブの量が、１ｚｍｏｌ〜１ｎｍｏｌである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項１４】
前記試薬が、さらに界面活性剤を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項１５】
前記反応部が、前記試料が導入される試料導入部を兼ねる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項１６】
前記基板が、さらに前記試料が導入される試料導入部および前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路を含み、
前記試料導入部における前記試料は、前記遠心力（Ｃ２）未満の遠心力（Ｃ１）によって、前記反応部に移動できる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項１７】
前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路が、さらにフィルタを有する、請求項１６記載の分析チップ。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のターゲット分析チップを用い、
前記反応部に、試料および試薬を導入する工程、
前記反応部において、前記試料と、前記標識プローブが固定化された担体とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記標識プローブとを結合反応させることにより、前記ターゲットと前記標識プローブとの結合体を形成する工程、
前記反応部における結合体を、前記流路の内壁の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）によって、前記検出部に移動させる工程、および、
前記検出部において、前記ターゲットが結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程を含むことを特徴とする、ターゲット分析方法。
【請求項１９】
前記反応部において、前記試料と前記担体とを含む混合物を撹拌する、請求項１８記載の分析方法。
【請求項２０】
前記標識プローブの標識が、前記標識プローブが前記ターゲットに結合することにより、シグナル変化する物質であり、
前記検出部において、前記標識のシグナル変化を検出する、請求項１８または１９記載の分析方法。
【請求項２１】
前記標識が、ピレンを含む物質であり、
前記検出部に紫外光を照射し、波長４５０〜５１０ｎｍの蛍光シグナルを検出する、請求項２０記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲット分析チップおよびターゲット分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、血中マイクロＲＮＡ等のＲＮＡと疾患との関連性が注目されており、前記ＲＮＡの検出を、疾患の早期発見等のため医療に利用することが試みられている。【０００３】
マイクロＲＮＡの定量方法としては、例えば、ターゲットのマイクロＲＮＡをポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）により特異的に増幅して検出する方法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、ＰＣＲが必須であるため、温度コントールを行う装置、ＤＮＡへの逆転写等が必要であり、操作が煩雑となる。また、前記方法では、少量の試料に含まれるＲＮＡから、逆転写によりＤＮＡを得て、さらにＰＣＲを行うことで増幅させている。しかし、このような逆転写ＰＣＲは、前記試料中のＲＮＡの間接的な検出であって、直接的な検出ではないため、定量分析の場合、精度が十分ではないという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許５１９２２２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、例えば、ＰＣＲを必須とすることなく、マイクロＲＮＡをはじめとするターゲットを直接的に検出するための新たなターゲット分析チップおよび分析方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記本発明の課題を解決するために、本発明のターゲット分析チップ（以下、「分析チップ」ともいう。）は、基板を有し、
前記基板が、ターゲットを含む試料と試薬とを反応させる反応部、標識検出の対象領域である検出部、および前記反応部と前記検出部とを連通する流路を有し、
前記試薬は、担体を有し、
前記担体は、前記ターゲットに結合する標識プローブが固定化されており、且つ前記ターゲットとの結合体を形成するものであり、
前記流路が、前記担体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段を有し、
前記移動制御手段が、前記流路における疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする。【０００７】
本発明のターゲット分析方法（以下、「分析方法」ともいう。）は、前記本発明のターゲット分析チップを用い、
前記反応部に、試料および試薬を導入する工程、
前記反応部において、前記試料と、前記標識プローブが固定化された担体とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記標識プローブとを結合反応させることにより、前記ターゲットと前記標識プローブとの結合体を形成する工程、
前記反応部における結合体を、前記流路の内壁の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）によって、前記検出部に移動させる工程、および、
前記検出部において、前記ターゲットが結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ＰＣＲを使用することなく、試料中のターゲットを直接的に分析できる。また、前記標識プローブが固定化された担体を使用する本発明は、前記流路が、前記移動制御手段として前記疎水性の内壁を有することで、前記反応部から前記検出部への前記担体の移動を制御でき、前記ターゲットと前記標識プローブとの結合体に、前記流路の内壁の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）を負荷することによって、例えば、前記検出部に高濃度の状態で回収できる。このため、試料中のターゲットの分析において、優れた感度および精度を実現でき、例えば、前記ターゲット分析チップに供する試料が微量であっても、分析可能である。したがって、本発明は、例えば、マイクロＲＮＡをはじめとするターゲットの分析が行われる医療分野等において有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明のターゲット分析チップの一例を示す概略図であり、（Ａ）は、斜視図、（Ｂ）は、上面図、（Ｃ）は、（Ａ）のＩ−Ｉ方向の断面図である。
【図２】図２は、遠心装置の一例を示す断面図である。
【図３】図３は、遠心装置にターゲット分析チップを配置した状態の一例を示す概略図である。
【図４】図４は、本発明のターゲット分析チップの一例を示す概略図であり、（Ａ）は、斜視図、（Ｂ）は、上面図、（Ｃ）は、（Ａ）のＩ−Ｉ方向の断面図である。
【図５】図５は、実施例２における平均蛍光強度を示すグラフである。
【図６】図６において、（Ａ）は、実施例３における平均蛍光強度を示すグラフであり、（Ｂ）は、実施例３における吸光度を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例４において使用した分析チップの内部の端面図である。
【図８】図８は、実施例４における補正後の総蛍光量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の分析チップは、例えば、前記流路が、前記反応部側から前記検出部側に向かう前記担体の移動を促進する移動促進手段を有する。
【００１１】
本発明の分析チップは、例えば、前記流路が、前記反応部側から前記検出部側に向かって、断面積が小さくなる構造である。
【００１２】
本発明の分析チップは、例えば、前記流路が、前記反応部側から前記検出部側に向かって、狭窄する構造である。
【００１３】
本発明の分析チップは、例えば、さらに前記検出部の内壁が、疎水性である。
【００１４】
本発明の分析チップは、例えば、前記検出部の内部空間の容積が、前記試料の体積よりも小さい。
【００１５】
本発明の分析チップは、例えば、前記検出部の高さが、１〜５００μｍである。
【００１６】
本発明の分析チップは、例えば、前記検出部の内部空間の容積が、前記反応部の内部空間の容積よりも小さい。
【００１７】
本発明の分析チップは、例えば、前記担体が、ビーズである。前記ビーズの直径が、例えば、１００マイクロメートル未満、１００ｎｍ〜４μｍである。
【００１８】
本発明の分析チップは、例えば、前記担体が、シリカ製である。
【００１９】
本発明の分析チップは、例えば、前記流路の側面が、前記反応部から前記検出部側に向かってテーパー状に狭まる曲面である。
【００２０】
本発明の分析チップは、例えば、前記標識プローブの標識が、前記標識プローブが前記ターゲットに結合することにより、シグナル変化する物質である。
【００２１】
本発明の分析チップは、例えば、前記標識が、ピレンを含む物質である。
【００２２】
本発明の分析チップは、例えば、前記標識プローブが、さらにソラレンで修飾されたプローブである。
【００２３】
本発明の分析チップは、例えば、ターゲットが、マイクロＲＮＡである。
【００２４】
本発明の分析チップは、例えば、前記標識プローブの量が、１ｚｍｏｌ〜１ｎｍｏｌである。
【００２５】
本発明の分析チップは、例えば、前記検出部が、光透過性部材で形成されている。
【００２６】
本発明の分析チップは、例えば、前記試薬が、さらに界面活性剤を含む。
【００２７】
本発明の分析チップは、例えば、前記反応部が、前記試料が導入される試料導入部を兼ねる。
【００２８】
本発明の分析チップは、例えば、前記基板が、さらに前記試料が導入される試料導入部および前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路を含み、
前記試料導入部における前記試料は、前記遠心力（Ｃ２）未満の遠心力（Ｃ１）によって、前記反応部に移動できる。
【００２９】
本発明の分析チップは、例えば、前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路が、さらにフィルタを有する。
【００３０】
本発明の分析方法は、例えば、前記反応部において、前記試料と前記担体との混合物を撹拌する。
【００３１】
本発明の分析方法は、例えば、前記標識プローブの標識が、前記標識プローブが前記ターゲットに結合することにより、シグナル変化する物質であり、
前記検出部において、前記標識のシグナル変化を検出する。
【００３２】
本発明の分析方法は、例えば、前記標識が、ピレンを含む物質であり、
前記検出部に紫外光を照射し、波長４５０〜５１０ｎｍの蛍光シグナルを検出する。
【００３３】
本発明の分析方法は、例えば、分析対象のターゲットが、マイクロＲＮＡである。
【００３４】
［１］ターゲット分析チップ
本発明のターゲット分析チップは、基板を有し、
前記基板が、ターゲットを含む試料と試薬とを反応させる反応部、標識検出の対象領域である検出部、および前記反応部と前記検出部とを連通する流路を有し、
前記試薬は、担体を有し、
前記担体は、前記ターゲットに結合する標識プローブが固定化されており、且つ前記ターゲットとの結合体を形成するものであり、
前記流路が、前記担体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段を有し、
前記移動制御手段が、前記流路における疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする。
【００３５】
本発明の分析チップは、前記流路が、前記移動制御手段として前記疎水性の内壁を有することで、前記反応部から前記検出部への前記担体の移動を制御できることにより、例えば、前記反応部から前記検出部への自発的な毛管現象が発生せず、所定の遠心力によって、毛管現象が発生する。このため、本発明の分析チップは、例えば、前記反応部から前記検出部方向への自発的な毛管現象が発生せず、所定の遠心力によって、毛管現象が発生するチップということもできる。本発明の分析チップにおいて、前記反応部から前記検出部への移動を制御される担体は、例えば、前記結合体を形成している担体および前記結合体を形成していない担体の一方であってもよいし、両者であってもよく、好ましくは、両者である。
【００３６】
本発明の分析チップは、前記本発明の分析方法に使用するチップであり、後述する本発明の分析方法における説明を援用できる。本発明において分析とは、例えば、定性分析および定量分析のいずれの意味も含む。
【００３７】
本発明の分析チップにおいて、前記反応部および前記検出部は、例えば、一方向に向いて順に配置されている。本発明の分析チップにおいて、面方向上であって、前記反応部から前記検出部に向かう方向を、「長手方向」、または前記試料および前記担体の「移動方向」ともいい、面方向上であって、前記長手方向に対する垂直方向を、「幅方向」ともいい、また、前記面方向に対して垂直方向（前記長手方向および前記幅方向に対して垂直方向）を、「厚み方向」または「深さ方向」ともいう。また、後述するように、本発明の分析チップが試料導入部を含む場合、本発明の分析チップにおいて、前記試料導入部、前記反応部および前記検出部は、例えば、一方向に向いて順に配置されていることが好ましい。この場合、本発明の分析チップにおいて、面方向上であって、前記試料導入部から前記反応部を経て前記検出部に向かう方向を、「長手方向」または前記試料および前記担体の「移動方向」ともいう。本発明において、前記標識プローブが固定化された担体を、以下、「分析用担体」ともいう。また、本発明において、前記反応部と前記検出部とを連通する流路を、「第２流路」ともいい、前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路を、「第１流路」ともいう。
【００３８】
（実施形態１）
本実施形態の分析チップは、前記反応部が、試料が導入される試料導入部を兼ねる形態である。前記試料導入部は、例えば、前記反応部の上面の開口として形成できる。本実施形態の分析チップは、例えば、前記試料導入部を別途設ける必要がなく、前記分析チップをコンパクトにできる。
【００３９】
本実施形態の分析チップにおいて、前記基板は、例えば、下基板と上基板とを含んでもよい。この場合、例えば、前記下基板と前記上基板とを積層することで、前記反応部、前記第２流路および前記検出部が形成されることが好ましい。
【００４０】
第１の具体例として、例えば、前記下基板の上表面（前記上基板との積層表面）が、平らであり、前記上基板が、前記反応部へ試料を導入する開口となる貫通孔を有し、前記上基板の下表面（前記下基板との積層表面）が、前記反応部、前記第２流路および前記検出部となる凹部を有し、前記貫通孔と前記凹部とがつながっている形態があげられる。この場合、前記下基板と前記上基板とを積層することで、前記上基板の貫通孔と前記下基板の上表面とにより、前記開口が形成され、前記上基板の凹部と前記下基板の上表面とにより、前記反応部、前記第２流路および前記検出部が連通して形成される。
【００４１】
第２の具体例として、例えば、前記上基板の下表面（前記下基板との積層表面）が、平らであり、前記下基板が、前記反応部へ試料を導入する開口となる貫通孔を有し、前記下基板の上表面（前記上基板との積層表面）が、前記反応部、前記第２流路および前記検出部となる凹部を有し、前記貫通孔と前記凹部とがつながっている形態があげられる。この場合、前記下基板と前記上基板とを積層することで、前記下基板の貫通孔と前記上基板の下表面とにより、前記開口が形成され、前記下基板の凹部と前記上基板の下表面とにより、前記反応部、前記第２流路および前記検出部が連通して形成される。
【００４２】
本実施形態の分析チップにおいて、前記反応部の大きさおよび形状は、特に制限されない。
【００４３】
前記反応部は、例えば、その底面が、前記下基板の上表面によって形成され、その上面が、前記上基板の下表面により形成された形態である。前記反応部は、例えば、中空の柱状（筒状ともいう）であり、具体的には、前記分析チップの厚み方向を軸方向とする柱状が好ましい。前記柱状は、例えば、円柱状、角柱状等である。前記反応部は、例えば、空気孔を有してもよく、前記空気孔は、例えば、前記反応部の上面側において、前記上基板に貫通孔として形成できる。
【００４４】
本実施形態の分析チップにおいて、前記第２流路は、例えば、その底面が、前記下基板の上表面によって形成され、その上面が、前記上基板の下表面により形成された形態である。前記第２流路は、中空であり、具体的には、前記分析チップの長手方向を軸方向とする中空である。前記第２流路は、前記軸方向に垂直な断面（中空の断面）が、例えば、真円、楕円等の円形；正方形、長方形等の多角形である。
【００４５】
前記第２流路は、例えば、前記反応部側から前記検出部側に向かう前記分析用担体の移動を促進する移動促進手段を有することが好ましい。前記移動促進手段を有することで、例えば、効率良く前記分析用担体を移動させ、前記検出部において前記分析用担体を回収することができる。前記第２流路における前記移動促進手段は、特に制限されず、例えば、後述するように、前記反応部側から前記検出部側に向かって、断面積が小さくなる構造でもよい。
【００４６】
前記第２流路は、例えば、前記反応部側から前記検出部側に向かって、断面積が小さくなる構造があげられる。前記構造は、例えば、前記反応部側から前記検出部側に向かって、狭窄する構造ということもできる。前記第２流路の断面積は、例えば、前記分析チップの長手方向に垂直な断面の面積であり、前記第２流路における中空の断面の面積である。
【００４７】
前記断面積は、前記反応部側から前記検出部側に向かって、例えば、連続的に断面積が小さくなってもよいし、非連続的に（段階的に）断面積が小さくなってもよい。具体例として、前記第２流路は、例えば、軸方向に平行な断面の形状が、前記反応部側から前記検出部側に向かって、テーパー状に狭まっている形状でもよい。具体的には、前記第２流路は、例えば、前記分析チップの側面から見た断面の形状が、反応部側から前記検出部側に向かって、テーパー状に狭まっている形状でもよいし、前記分析チップの上表面（もしくは下表面）から見た断面の形状が、反応部側から前記検出部側に向かって、テーパー状に狭まっている形状でもよいし、両方であってもよい。
【００４８】
前記第２流路の側面が、例えば、前記反応部から前記検出部側に向かってテーパー状に狭まる曲面であることが好ましい。前記第２流路の側面をこのようなこのような形状とすることで、効率良く前記分析用担体を移動させ、前記検出部において前記分析用担体を回収することができる。前記曲面の曲率半径Ｒは、より効率良く前記分析用担体を前記検出部に回収できることから、例えば、１〜５ｍｍ、１．５〜４．５ｍｍ、３ｍｍ前後（例えば、２．５〜３．５ｍｍ）である。前記曲面の曲率半径Ｒは、例えば、前記テーパー状に狭まる曲面の曲率半径である。
【００４９】
前記第２流路は、前述のように、前記分析用担体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段を有する。前記移動制御手段により、前記反応部における結合体（結合体を形成している担体）は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）を負荷された場合、前記第２流路を介して前記検出部に移動できる。具体的に、前記第２流路が、前記移動制御手段として、疎水性の内壁を有することで、前記結合体に、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）が負荷されない場合、例えば、前記反応部から前記検出部への自発的な毛管現象が発生しないため、前記分析用担体を前記反応部に維持でき、前記結合体に、前記抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）が負荷された場合、前記反応部から前記検出部への毛管現象が発生するため、前記結合体を前記反応部から前記検出部に移動させることができる。このため、本発明の分析チップにおいて、疎水性とは、例えば、自発的な毛管現象による前記反応部から前記検出部への液体画分の移動が発生しない程度の疎水性を意味する。本発明において、前記結合体に加え、前記結合体を形成していない分析用担体が、例えば、前記遠心力（Ｃ２）が負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できてもよい。前記第２流路の疎水性の内壁は、例えば、後述するように前記第２流路を疎水性部材により形成することにより、疎水性を付与することができる。前記第２流路において、例えば、上下面および側面の全ての内壁が、疎水性でもよいし、一部の内壁が、疎水性でもよい。具体例として、前記分析チップが上基板と下基板とによって形成される場合、例えば、前記上基板により形成される第２流路の内壁が、疎水性であってもよいし、前記下基板により形成される第２流路の内壁が、疎水性であってもよいし、前記上基板および前記下基板により形成される第２流路の内壁が、疎水性であってもよい。本実施形態の分析チップにおいて、さらに、前記検出部の内壁を疎水性とし、前記移動制御手段が、前記検出部の疎水性の内壁を含んでもよい。前記抵抗力（Ｒ）および遠心力（Ｃ２）については、後述する。
【００５０】
前記第２流路の内部空間の大きさは、特に制限されない。前記第２流路の高さ（深さ）は、例えば、１〜３０００μｍ、１００〜５００μｍである。前記第２流路の幅は、例えば、１〜３０００μｍ、１００〜５００μｍである。前記第２流路の高さおよび幅は、例えば、それぞれ、前記第２流路の内部空間における高さおよび幅である。
【００５１】
本実施形態の分析チップにおいて、前記検出部の形状は、特に制限されない。前記検出部は、例えば、中空であり、前記第２流路の延長であってもよい。すなわち、本発明の分析チップにおいて、前記検出部は、例えば、前記反応部に連通する前記第２流路において、前記反応部と反対側の末端領域であってもよい。前記検出部の形状は、特に制限されず、前記軸方向に垂直な断面（例えば、中空の断面）が、例えば、真円、楕円等の円形；正方形、長方形等の多角形である。
【００５２】
前記検出部の内部空間の容積は、例えば、前記試料の体積よりも小さいことが好ましい。このように、前記検出部の容積を、例えば、前記試料と比較して相対的に小さく設計することで、前記検出部における前記分析用担体の濃度を相対的に高く設定することができる。前記検出部の内部空間の容積は、前記試料の体積に対して、例えば、１×１０２分の１〜１×１０６分の１である（例えば、１×１０４分の１）。また、前記検出部の容積は、下限が、例えば、前記反応部に配置されている前記分析用担体全量の体積を超えることが好ましい。前記検出部の内部空間の容積は、例えば、前記反応部の内部空間の容積よりも小さいことが好ましい。このように、前記検出部の容積を、例えば、前記反応部の内部空間の容積と比較して相対的に小さく設計することで、前記検出部における前記分析用担体の濃度を相対的に高く設定することができる。前記検出部の内部空間の容積は、前記反応部の内部空間の容積に対して、例えば、１×１０分の１〜１×１０６分の１、１×１０２分の１〜１×１０５分の１である（例えば、１×１０４分の１）。前記検出部の高さ（深さ）は、特に制限されず、例えば、１〜３０００μｍ、１０〜３００μｍ、１００μｍ前後（例えば、５０〜１５０μｍ）等があげられる。前記検出部をこのような高さにすることで、例えば、前記検出部に移動した担体において、検出できる標識の割合がより増加する。前記検出部の幅は、特に制限されず、例えば、１〜３０００μｍ、１０〜３００μｍである。前記検出部の高さおよび幅は、例えば、それぞれ、前記検出部の内部空間における高さおよび幅である。
【００５３】
本実施形態の分析チップにおいて、前記反応部は、前述のように、前記ターゲットに結合する標識プローブが固定化された担体（前記分析用担体）を有する。また、前記分析用担体は、後述するターゲットとの結合体を形成する担体である。前記標識プローブは、標識物質により修飾（以下、「標識」ともいう。）されたプローブである。前記プローブは、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ等があげられ、好ましくは、ＲＮＡである。前記ＲＮＡは、例えば、非修飾ＲＮＡでもよいし、修飾ＲＮＡでもよいし、両者を含んでもよい。前記修飾ＲＮＡは、例えば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ等があげられる。また、前記ＤＮＡは、例えば、修飾ＤＮＡでもよいし、非修飾ＤＮＡでもよいし、両者を含んでもよい。前記プローブは、例えば、人工核酸モノマーを含んでもよい。前記人工核酸モノマーは、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記標識物質による前記プローブの修飾方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記プローブは、例えば、分析対象のターゲットに基づいて、適宜設計できる。前記ターゲットが前記ターゲット核酸の場合、前記標識プローブの配列は、例えば、前記ターゲット核酸に部分的または完全に相補的な配列があげられる。前記標識プローブの標識位置は、特に制限されず、例えば、前記標識プローブの３’末端の塩基でもよいし、５’末端の塩基でもよいし、それ以外の塩基でもよい。
【００５４】
前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光標識物質、放射性標識物質等があげられる。前記蛍光標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光団等の蛍光物質等があげられる。前記蛍光標識物質は、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光標識物質は、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（登録商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（登録商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（登録商標、ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（登録商標、モレキュラー・プローブ社製）等があげられる。
【００５５】
前記標識プローブが前記蛍光標識物質で標識された蛍光標識プローブの場合、前記蛍光標識プローブの蛍光標識物質は、例えば、前記蛍光標識プローブが前記ターゲット（例えば、ターゲット核酸、ターゲットＲＮＡ）に結合することにより、シグナル変化する物質であることが好ましい。前記シグナルは、例えば、蛍光シグナルである。このような蛍光標識であれば、例えば、前記ターゲットが結合した前記蛍光標識プローブと、前記ターゲットが未結合の前記蛍光標識プローブとを分離する必要がなく、分析精度をさらに向上でき、また、さらに簡便である。
【００５６】
前記蛍光標識物質の具体例としては、例えば、ピレンを含む物質（以下、「ピレン含有物質」ともいう）があげられる。前記蛍光標識物質は、例えば、ピレンを含むものでもよいし、ピレンそのものでもよい。前記蛍光標識物質がピレン含有物質の場合、前記蛍光標識プローブの設計は、例えば、特許第４２３８３８１号の記載を援用できる。前記ピレン含有物質は、例えば、ウリジン残基および／またはシチジン残基を修飾することが好ましく、具体的には、ウリジン残基の２’位の水酸基および／またはシチジン残基の２’位の水酸基に共有結合していることが好ましい。前記蛍光標識プローブは、例えば、前記ピレン含有物質が共有結合したウリジンを含むＲＮＡ、または前記ピレン含有物質が共有結合したウリジンおよび／またはシチジンを含むＤＮＡもしくはＤＮＡ／ＲＮＡであることが好ましい。前記ピレン含有物質で修飾した前記蛍光標識プローブは、例えば、前記ターゲット核酸（例えば、ターゲットＲＮＡ）と結合し、二重鎖構造を形成することで蛍光を発する。このため、前記蛍光のシグナルを検出することで、前記ターゲット核酸の分析が可能である。前記蛍光は、例えば、紫外光照射で励起することで、発光させることができる。前記照射光の波長は、例えば、３２５〜３５０ｎｍ（例えば、３４０ｎｍ）であり、蛍光の検出波長は、例えば、４５０〜５１０ｎｍ（例えば、４８０ｎｍ）である。
【００５７】
前記蛍光標識プローブは、例えば、さらにソラレンで修飾されていることが好ましい。前記蛍光標識プローブがソラレンを有する場合、例えば、前記蛍光標識プローブと前記ターゲット核酸との二重鎖に紫外光を照射すると、前記二重鎖において、前記蛍光標識プローブのソラレンが、前記ターゲット核酸におけるウラシル残基と共有結合する。このため、前記ターゲット核酸と前記蛍光標識プローブとの二重鎖結合を、より安定化でき、例えば、前記分析チップに対して、後述するような様々な処理を施している間においても、前記蛍光標識プローブから前記ターゲット核酸が解離することを十分に防止でき、また、感度もより向上できる。
【００５８】
前記標識プローブを固定化する前記担体は、特に制限されず、例えば、比重が１より大きく、且つ光透過性を有する素材で形成された担体があげられる。具体例として、前記担体は、例えば、シリカゲル製担体、シリカ製担体、アガロース製担体、ガラス（例えば、ホウケイ酸ガラス、ライムガラス）製担体、ポリスチレン製担体、アクリル樹脂担体、ポリビニルアルコール樹脂製担体、ポリカーボネート製担体等があげられる。また、前記担体は、例えば、磁性担体でもよい。前記磁性担体の場合、例えば、磁力によって、前記反応部において前記磁性担体を動かすことができるため、後述するように、前記反応部において、前記試料と前記分析用担体との混合物を撹拌できる。前記担体の大きさは、特に制限されない。前記担体の形状は、特に制限されず、例えば、楕円、真円等の球状があげられ、具体例として、球状ビーズ等のビーズがあげられる。前記担体が前記ビーズの場合、その直径は、下限が、例えば、０．１μｍ（１００ｎｍ）、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍであり、上限が、例えば、１００μｍ未満であり、１０μｍ以下、５μｍ以下、４μｍ以下、１μｍ以下、８００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下であり、その範囲は、例えば、１００ｎｍ〜４μｍ、１００〜８００ｎｍ、０．２μｍ〜０．８μｍ、２５０〜４００ｎｍである。前記検出部の高さが１〜５００μｍの場合、前記検出部に移動する前記担体の割合が向上し、且つ検出できる標識の割合がより増加することから、前記担体の直径は、例えば、１００ｎｍ〜４μｍ、１００〜８００ｎｍ、２５０〜４００ｎｍであることが好ましい。
【００５９】
前記分析用担体において、前記担体に固定化する前記標識プローブの量は、特に制限されず、例えば、前記担体の表面積あたりの量として、適宜設定できる。前記分析用チップに配置される標識プローブの量は、特に制限されず、例えば、試料中に含まれるターゲットの量に応じて適宜決定できる。前記標識プローブの量は、例えば、１ｚｍｏｌ〜１ｎｍｏｌ、１ａｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ、１０ａｍｏｌ〜１０ｐｍｏｌである。また、前記反応部に配置される前記分析用担体の量は、特に制限されず、例えば、前記反応部の底部の面積あたりの量として、適宜決定できる。
【００６０】
本発明の分析チップは、例えば、前記試薬として、前記分析用担体を有してもよい。本発明の分析チップは、例えば、前記分析用担体を前記分析チップと別個に有してもよいし、前記分析チップ内に有してもよい。前者の場合、本発明の分析チップは、例えば、ターゲット分析キットということもできる。後者の場合、前記反応部が、例えば、前記分析用担体を有す。この場合、前記分析用担体は、例えば、前記反応部において遊離状態でもよい。また、前記分析用担体は、例えば、前記反応部（前記反応部の内壁）において、遊離可能なように固定化された状態でもよい。後者の場合、前記分析用担体は、例えば、水溶性材料によって、前記反応部に固定化されていることが好ましい。この場合、例えば、前記反応部の開口から導入された試料により、前記反応部（前記反応部の内壁）から、前記分析用担体が遊離される。前記水溶性材料は、例えば、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体、ポリアクリル酸系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、デンプン、ゼラチン等の水溶性ポリマー、スクロース、トレハロース、マンニトール、ラクトース等の少糖類等があげられる。
【００６１】
本実施形態の分析チップは、例えば、前記試薬として、前記分析用担体の他に、さらにその他の物質を含んでもよい。前記その他の物質は、特に制限されず、例えば、界面活性剤、緩衝剤、塩類、水溶性高分子、糖類等があげられる。前記界面活性剤は、例えば、非イオン系界面活性剤、イオン系界面活性剤等があげられ、前記ターゲットと前記標識プローブとの反応を促進することから、好ましくは、非イオン系界面活性剤である。前記非イオン系界面活性剤は、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、しょ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等があげられる。
【００６２】
本発明の分析チップにおいて、前記反応部は、さらに、撹拌素子を有してもよい。この場合、前記撹拌素子によって、前記反応部において、前記試料と前記反応部に配置された前記分析用担体との混合液を撹拌し、前記試料中のターゲットと前記分析用担体に固定化された標識プローブとを、効率よく接触させることができる。前記撹拌素子は、例えば、磁性撹拌素子が使用でき、具体例として、例えば、磁性ビーズ等のスターラー等があげられる。前記撹拌素子の材料は、特に制限されず、例えば、ＳＵＳ等の磁性体が好ましい。前記撹拌素子の形状は、例えば、球形であり、その大きさは、例えば、直径０．１〜５ｍｍ（例えば、１ｍｍ）である。
【００６３】
本発明の分析チップにおいて、前記基板の材質は、特に制限されず、例えば、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス；ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ポリスチレン、アクリル樹脂、シクロオレフィン系樹脂、ポリエチレンテレフタレート等の樹脂等が使用でき、後述する疎水性部材を使用することが好ましい。また、前記基板が、前述のように、前記下基板と前記上基板とを有する場合、前記両基板は、例えば、同じ部材でもよいし、異なる部材でもよい。
【００６４】
本実施形態の分析チップにおいて、前記検出部は、例えば、光透過性部材で形成されており、好ましくは、紫外光透過性部材である。前記光透過性部材は、例えば、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス、ＰＤＭＳ等の樹脂等があげられる。
【００６５】
本実施形態の分析チップにおいて、前記第２流路の内壁は、前述のように、疎水性である。前記疎水性の内壁は、例えば、前記基板として疎水性部材を使用することにより構成してもよいし、前記基板の表面に、疎水性部材を積層することにより構成してもよいし、前記基板の表面を疎水性に改変することにより構成してもよい。前記疎水性部材としては、例えば、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ポリスチレン、アクリル樹脂、シクロオレフィン系樹脂、フッ素系樹脂等の疎水性樹脂等があげられる。また、疎水性への改変方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。
【００６６】
（実施形態２）
本実施形態の分析チップは、前記反応部と独立して、試料が導入される試料導入部を有する形態である。前記本実施形態の分析チップにおいて、前記試料導入部は、例えば、前記試料導入部と前記反応部との間が、第１流路で連通され、下記条件（３）を満たす。本実施形態の分析チップによれば、例えば、２回の遠心で簡便にターゲットの分析ができる。本実施形態の分析チップは、例えば、前記基板が、さらに前記試料が導入される試料導入部および前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路を含み、前記試料導入部における前記試料は、前記遠心力（Ｃ２）未満の遠心力（Ｃ１）によって、前記反応部に移動できる分析チップということもできる。また、本実施形態の分析チップによれば、前記第１流路にフィルタを配置することで、夾雑物を含む試料等についても、前処理による夾雑物の除去を経ずに分析することができる。
（３）前記試料導入部に導入された試料は、遠心力（Ｃ１）によって、前記反応部に移動し、前記反応部の前記担体は、前記遠心力（Ｃ１）によって、前記検出部に実質的に移動しない
【００６７】
本実施形態の分析チップは、前記反応部が開口を有さず、前記試料導入部および前記第１流路を有する点を除き、前記実施形態１の分析チップと同様であり、特に言及しない限り、その説明を援用できる。
【００６８】
本実施形態の分析チップにおいて、前記基板は、例えば、下基板と上基板とを含んでもよい。この場合、例えば、前記下基板と前記上基板とを積層することで、前記試料導入部、前記第１流路、前記反応部、前記第２流路および前記検出部が形成されることが好ましい。
【００６９】
第１の具体例として、例えば、前記下基板の上表面（前記上基板との積層表面）が、平らであり、前記上基板が、前記試料導入部となる貫通孔を有し、前記上基板の下表面（前記下基板との積層表面）が、前記第１流路、前記反応部、前記第２流路および前記検出部となる凹部を有し、前記貫通孔と前記凹部とがつながっている形態があげられる。この場合、前記下基板と前記上基板とを積層することで、前記上基板の貫通孔と前記下基板の上表面とにより、前記試料導入部が形成され、前記上基板の凹部と前記下基板の上表面とにより、前記第１流路、前記反応部、前記第２流路および前記検出部が連通して形成される。
【００７０】
第２の具体例として、例えば、前記上基板の下表面（前記下基板との積層表面）が、平らであり、前記下基板が、前記試料導入部となる貫通孔を有し、前記下基板の上表面（前記上基板との積層表面）が、前記第１流路、前記反応部、前記第２流路および前記検出部となる凹部を有し、前記貫通孔と前記凹部とがつながっている形態があげられる。この場合、前記下基板と前記上基板とを積層することで、前記下基板の貫通孔と前記上基板の下表面とにより、前記試料導入部が形成され、前記下基板の凹部と前記上基板の下表面とにより、前記第１流路、前記反応部、前記第２流路および前記検出部が連通して形成される。
【００７１】
本発明の分析チップにおいて、前記試料導入部、前記反応部および前記第１流路の大きさおよび形状は、特に制限されない。
【００７２】
前記試料導入部は、例えば、その底面が、前記下基板の上表面によって形成され、上部は、前記上基板の貫通孔により開口した形態があげられる。前記試料導入部は、例えば、有底且つ中空の柱状（筒状ともいう）であり、具体的には、前記分析チップの厚み方向を軸方向とする柱状が好ましい。前記柱状は、例えば、円柱状、角柱状等である。
【００７３】
前記反応部は、例えば、その底面が、前記下基板の上表面によって形成され、その上面が、前記上基板の下表面により形成された形態である。前記反応部は、例えば、中空の柱状（筒状ともいう）であり、具体的には、前記分析チップの厚み方向を軸方向とする柱状が好ましい。前記柱状は、例えば、円柱状、角柱状等である。前記反応部は、例えば、空気孔を有してもよく、前記空気孔は、例えば、前記反応部の上面側において、前記上基板に貫通孔として形成できる。
【００７４】
前記試料導入部と前記反応部とを連結する前記第１流路は、例えば、その底面が、前記下基板の上表面によって形成され、その上面が、前記上基板の下表面により形成された形態である。前記第１流路は、中空であり、具体的には、前記分析チップの長手方向を軸方向とする中空である。前記第１流路は、前記軸方向に垂直な断面（中空の断面）が、例えば、真円、楕円等の円形；正方形、長方形等の多角形である。
【００７５】
前記第１流路には、例えば、さらにフィルタを有してもよい。前記フィルタを有することで、例えば、夾雑物を含む試料等についても、前処理による夾雑物の除去を経ずに分析することができる。前記フィルタの種類は、特に制限されず、例えば、ろ紙、不織布、ガラス繊維等の繊維構造を有するもの、スポンジ状の多孔性構造を有するもの、多孔性の膜構造を有するもの等があげられる。前記第１流路における前記フィルタの配置位置は、特に制限されず、任意の位置とできる。
【００７６】
本発明の分析チップは、前述のように、例えば、遠心装置にセットして、遠心力をかけることから、さらに、前記遠心装置への配置部位を有することが好ましい。
【００７７】
本発明の分析チップに導入する試料は、ターゲットを含む試料であるが、本発明はこれに限定されず、前記試料は、例えば、ターゲットを含まない試料、ターゲットを含むか不明の試料等であってもよい。前記試料の形態は、特に制限されず、例えば、液体試料である。前記液体試料は、例えば、生体由来の検体があげられ、また、前記検体の希釈液、懸濁液等でもよい。前記検体は、例えば、血液、尿、胃液、喀痰、羊水、腹膜液等の体液、大腸、肺等の組織、口腔内細胞、生殖細胞、爪、毛等の細胞等があげられる。前記血液は、例えば、全血、血漿、血清、溶血液等があげられる。前記液体試料は、例えば、前処理したものを使用してもよい。前記前処理は、特に制限されず、例えば、前記検体に含まれる細胞からターゲット（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ等の核酸等）を放出させる処理等があげられる。
【００７８】
本発明の分析チップに導入する試料の量は、特に制限されず、前記分析チップ１個あたり、例えば、１〜１００μＬ（例えば、５０μＬ）である。
【００７９】
本発明の分析チップにより分析するターゲットの種類は、特に制限されず、例えば、ターゲット核酸等があげられる。前記ターゲット核酸は、例えば、ターゲットＲＮＡ、ターゲットＤＮＡ等があげられる。前記ターゲットＲＮＡは、例えば、マイクロＲＮＡ、ウィルス由来ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ等があげられる。前記ターゲットＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡまたはその断片、ｃＤＮＡ、血中遊離ＤＮＡ、血中循環腫瘍細胞等の血液に含まれる細胞由来のＤＮＡ等があげられる。
【００８０】
［２］ターゲット分析方法
本発明のターゲット分析方法は、前述のように、前記本発明のターゲット分析チップを用い、
前記反応部に、試料および試薬を導入する工程（導入工程）、
前記反応部において、前記試料と、前記標識プローブが固定化された担体とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記標識プローブとを結合反応させることにより、前記ターゲットと前記標識プローブとの結合体を形成する工程（反応工程）、
前記反応部における結合体を、前記流路の内壁の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）によって、前記検出部に移動させる工程（担体移動工程）、および、
前記検出部において、前記ターゲットが結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程（分析工程）を含むことを特徴とする。
【００８１】
本発明のターゲット分析方法は、前記本発明のターゲット分析チップを使用する方法であり、前記本発明のターゲット分析チップにおける説明を援用できる。本発明のターゲット分析方法は、例えば、ＰＣＲ工程を含まない。
【００８２】
前記導入工程は、前述のように、前記反応部に、試料および試薬を導入する。前記導入工程において、前記試料および前記試薬は、例えば、前記分析チップの前記反応部の開口から導入する。前記試料および前記試薬の導入順序は、特に制限されず、例えば、前記試料の導入の前または後に前記試薬を導入してもよいし、両者を同時に導入してもよい。また、前述のように、前記反応部が前記分析用担体を有す場合、前記導入工程は、例えば、前記試料および前記試薬に代えて、前記試料を導入する。そして、前記反応部において、前述のように、前記分析用担体が固定化されている場合、前記試料が導入されることによって、例えば、前記分析用担体の固定化が解除され遊離する。
【００８３】
前記分析チップとして、前記反応部と独立して、前記試料導入部を有する場合、前記分析方法は、例えば、前記導入工程に代えて、前記試料導入部に、試料を導入する工程（試料導入工程）、および前記試料導入部に導入された試料を、前記遠心力（Ｃ２）未満の遠心力（Ｃ１）によって、前記反応部に移動させる工程（試料移動工程）を含んでもよい。前記試料導入工程において、前記試料は、例えば、前記分析チップの前記試料導入部の開口から導入する。
【００８４】
前記試料移動工程は、例えば、前述のように、遠心力（Ｃ１）によって、前記試料導入部に導入された試料を、前記反応部に移動させる。前記遠心力（Ｃ１）は、例えば、後の担体移動工程における遠心力（Ｃ２）未満の遠心力である。前記遠心力（Ｃ２）未満の遠心力（Ｃ１）とすることで、例えば、前記反応部の前記分析用担体が、前記検出部に実質的に移動しない。前記遠心力（Ｃ１）の下限は、特に制限されない。前記反応部において、前述のように、前記分析用担体が固定化されている場合、前記試料が導入されることによって、例えば、前記分析用担体の固定化が解除され遊離する。
【００８５】
本発明において、前記分析チップへの遠心力は、例えば、遠心装置を使用することにより付与できる。この場合、前記分析チップは、例えば、さらに、前記遠心装置への配置部位を有することが好ましい。そして、例えば、前記配置部位において、前記分析チップを前記遠心装置に配置し、前記遠心装置により、前記分析チップに遠心力をかけることができる。
【００８６】
前記反応工程では、前述のように、前記反応部において、前記試料と、前記標識プローブが固定化された担体とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記標識プローブとを結合反応させることにより、前記ターゲットと前記標識プローブとの結合体を形成する。この際、前記反応部において、例えば、前記反応部に導入した試料または前記試料導入部から移動した試料と前記担体との混合物を、撹拌することが好ましい。前記撹拌の方法は、特に制限されない。
【００８７】
前記撹拌方法としては、例えば、前記撹拌素子を用いた方法があげられる。この場合、前記分析チップの前記反応部が、さらに、前記撹拌素子を有し、前記撹拌素子によって、前記反応部において前記混合物を撹拌することが好ましい。前記撹拌素子を用いた撹拌は、例えば、前記分析チップの外部に磁石を配置し、前記磁石により前記撹拌素子を動かすことで行える。前記撹拌素子は、例えば、自転させてもよいし、公転させてもよいし、ランダムに動かしても良い。
【００８８】
前記撹拌方法としては、例えば、前記標識プローブを固定化する担体として、前述のような磁性担体を用いる方法があげられる。この場合、前記標識プローブを固定化した磁性担体を、前記撹拌素子として同様に使用することができる。具体的には、前記分析チップの外部に磁石を配置し、前記磁石により、前記磁性担体を動かすことで行える。前記磁性担体は、例えば、自転させてもよいし、公転させてもよいし、ランダムに動かしてもよい。
【００８９】
また、前記撹拌方法としては、例えば、遠心装置を利用する方法があげられる。前記分析チップは、例えば、前述のように、前記試料導入部から前記反応部への試料の移動または前記反応部から前記検出部への前記担体の移動に遠心力を利用することから、例えば、遠心装置にセットして使用できる。このため、前記反応工程において、前記分析チップを遠心することで撹拌することもできる。前記遠心は、例えば、同一方向の遠心でもよいし、交互に逆回転させる遠心でもよい。
【００９０】
前記反応工程において、前記試料と前記分析用担体との接触条件（例えば、温度、時間等）は、特に制限されない。
【００９１】
つぎに、前記担体移動工程は、前述のように、前記反応部における前記結合体を、前記流路の内壁の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）によって、前記検出部に移動させる工程である。また、前述のように、前記遠心力（Ｃ２）は、前記遠心力（Ｃ１）より大きいことから、前記担体移動工程は、例えば、前記遠心力（Ｃ１）よりも大きい遠心力（Ｃ２）によって、前記反応部における前記結合体を前記検出部に移動させる工程ということもできる。
【００９２】
前記抵抗力（Ｒ）は、例えば、前記第２流路の内壁の疎水性の程度に応じて、適宜算出できる。具体例として、前記抵抗力（Ｒ）は、例えば、前記試料および前記試薬の混合物の表面張力、前記第２流路の内壁と前記試料および前記試薬の混合物との接触角、前記分析チップの第２流路の幅および高さ等から算出することができ、具体的には、下記式（１）で表される。前記第２流路の内壁と前記試料および前記試薬の混合物との接触角（θ）が９０°以上の場合、前記抵抗力（Ｒ）は、例えば、下記式（１）により好適に算出できる。
【００９３】
Ｒ＝−２ｗｈγｃｏｓθ（１／ｗ＋１／ｈ）    ・・・（１）
Ｒ：抵抗力（Ｎ）
γ：試料および試薬の混合物の表面張力（Ｎ／ｍ）
θ：第２流路の内壁と試料および試薬の混合物との接触角
ｗ：第２流路の幅（ｍ）
ｈ：第２流路の高さ（ｍ）
【００９４】
前記遠心力（Ｃ２）は、特に制限されず、例えば、前記結合体を前記検出部に移動できればよい。本発明の分析方法において、前記試料および前記試薬の混合物は、例えば、前記遠心力（Ｃ２）によって、前記第２流路に導入される。さらに、前記遠心力（Ｃ２）によって、前記混合物における前記分析用担体（例えば、結合体）が、例えば、前記分析チップの検出部における前記第２流路の反対端側に集積する。このとき、前記分析用担体が前記検出部に集積するのに要する時間（Δｔ）は、例えば、前記混合物の粘度、密度、前記分析用担体の密度、前記分析用担体の半径、遠心時の回転速度、回転半径の始点および終点等から算出することができ、具体的には、下記式（２）で表される。下記式（２）によれば、例えば、所望の遠心時間内に前記分析用担体を前記検出部に集積をする場合の分析用担体の密度および半径、遠心力（Ｃ２）、すなわち、回転半径および回転速度（回転の角速度）を算出（推定）することができる。
【００９５】
Δｔ＝［１８μ／(４ω２Ｒ２（ρｓ−ρｌ））］ｌｎ（ｒ２／ｒ１）  ・・・（２）
Δｔ：回転半径の始点ｒ１から回転半径の終点ｒ２に分析用担体が移動するのに要する時間（ｓｅｃ）
μ：試料および試薬の混合物の粘度（Ｐａ×ｓ）
ρｌ：試料および試薬の混合物の密度（ｋｇ／ｍ３）
ρｓ：分析用担体の密度（ｋｇ／ｍ３）
Ｒ：分析用担体の半径（ｍ）
ω：回転の角速度（ｒａｄ／ｓｅｃ）
ｒ１：回転半径の始点（遠心時の軸から反応部までの最短距離）（ｍ）
ｒ２：回転半径の終点（軸から検出部までの最長距離）（ｍ）
【００９６】
つぎに、前記分析工程は、前記検出部において、前記ターゲットが結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程である。前記標識の検出は、特に制限されず、例えば、前記標識の種類に応じて、適宜決定できる。
【００９７】
前記標識プローブの前記標識は、例えば、前述のように、前記標識プローブが前記ターゲットに結合することにより、シグナル変化する物質であることが好ましい。この場合、前記分析工程では、例えば、前記検出部において、前記標識のシグナル変化を検出する。具体例として、前記標識が、前記ピレン含有物質の場合、前記検出部に紫外光を照射して、ピレンに起因する蛍光シグナルを検出する。前記蛍光シグナルの検出条件は、例えば、前述の通りである。
【００９８】
以下に、本発明の実施形態として、本発明の分析チップおよびこれを用いた本発明の分析方法の具体例について、図面を用いて説明する。なお、前記分析チップとして、前記実施形態１の分析チップまたは前記実施形態２の分析チップを用い、前記標識プローブとして、前記蛍光標識プローブを用い、前記ターゲットとして、ターゲットＲＮＡを分析する場合の分析方法を例にあげて説明するが、本発明は、これらの例示には限定されない。
【００９９】
（実施形態３）
本実施形態は、前記実施形態１の分析チップを用い、前記標識プローブとして、前記蛍光標識プローブを用い、前記反応部に前記試薬が配置され、前記ターゲットとしてターゲットＲＮＡを分析する場合の分析方法の一例である。なお、以下の図１から図４において、同一部分には、同一符号を付している。
【０１００】
図１は、本発明の分析チップの一例を示す概略図であり、（Ａ）は、斜視図、（Ｂ）は、上面図、（Ｃ）は、前記（Ａ）のＩ−Ｉ方向断面図である。
【０１０１】
図１に示すように、分析チップ１’は、下基板１０ａと上基板１０ｂとからなる基板１０を有する。上基板１０ｂは、貫通孔と、下表面における凹部１３、１４、１５とを有し、これらは、上基板１０ｂと下基板１０ａとの積層により、それぞれ、反応部の開口、反応部１３、第２流路１４、検出部１５を構成している。反応部１３と検出部１５は、第２流路１４で連通する。図１（Ｃ）において、矢印Ｘは、分析チップ１’における試料の流れ方向（分析チップ１’の長手方向）を示す。
【０１０２】
分析チップ１’の大きさは、特に制限されず、以下の条件が例示できる。
反応部１３
直径１〜３０ｍｍ（例えば、８ｍｍ）
導入する試料の体積１〜１０００μＬ（例えば、５０μＬ）
第２流路１４
長さ１０〜５０００μｍ（例えば、２５００μｍ）
反応部１３端の幅  １００〜５０００μｍ（例えば、１０００μｍ）
反応部１３端の深さ１００〜５０００μｍ（例えば、２０００μｍ）
検出部１５端の幅  １０〜１０００μｍ（例えば、１５０μｍ）
検出部１５端の深さ１０〜１０００μｍ（例えば、１５０μｍ）
検出部１５
長さ１０〜１０００μｍ（例えば、２２０μｍ）
幅  １０〜１０００μｍ（例えば、１５０μｍ）
深さ１０〜１０００μｍ（例えば、１５０μｍ）
容積０．００１〜１０００ｎＬ（例えば、５ｎＬ）
【０１０３】
第２流路１４は、図１に示すように、反応部１３側から検出部１５側に向かって、狭まっていく狭窄形状である。具体的には、分析チップ１’の上表面から見た場合、図１（Ｂ）に示すように、反応部１３側から検出部１５側に向かって、両側からテーパー状に狭まっており、また、分析チップ１’の側面から見た場合、図１（Ｃ）に示すように、反応部１３側から検出部１５側に向かって、上面がテーパー状に狭まっていく形状である。
【０１０４】
分析チップ１’の反応部１３には、前記分析用担体が配置されている（図示せず）。前記分析用担体は、前述のように、前記水溶性材料により固定化されていることが好ましい。
【０１０５】
分析チップ１’を用いた試料中のＲＮＡの分析は、例えば、以下のようにして行うことができる。以下の実施形態では、前記蛍光標識プローブの蛍光標識がピレン含有物質であり、前記蛍光標識プローブが固定化された担体が磁性担体である場合の一例とする。
【０１０６】
まず、分析チップ１’の反応部１３に、前記開口から試料を導入する。そして、分析チップ１’の外部に配置された磁石により、反応部１３における前記分析用担体（分析用磁性担体）を自転させることにより、反応部１３において、試料と前記分析用担体とを接触させる。これによって、前記試料中のターゲットＲＮＡと前記分析用担体における前記蛍光標識プローブとが結合する。
【０１０７】
つぎに、分析チップ１’を遠心し、遠心力（Ｃ２）により、反応部１３から、第２流路１４を介して検出部１５に、前記分析用担体を移動させる。そして、検出部１５に、分析チップ１’の上方向から紫外光（例えば、３４０ｎｍ）を照射し、ターゲットＲＮＡと前記蛍光標識プローブとの結合により発するピレン由来の蛍光を、所定の波長（例えば、４８０ｎｍ）で光検出器により検出する。ピレンで修飾された前記蛍光標識プローブは、ターゲットＲＮＡと結合した状態でのみ蛍光を発するため、ピレンに由来する蛍光の有無および量は、ターゲットＲＮＡの有無および量と相関関係を示す。このため、前記蛍光の検出により、ターゲットＲＮＡを定性分析または定量分析できる。
【０１０８】
本発明において、前記分析チップに対する遠心力は、前述のように、例えば、遠心装置を使用することができる。図２および図３に、遠心装置の一例の概略図を示す。
【０１０９】
図２は、遠心装置の断面図であり、遠心装置２は、基板２０と、モーター２１と、軸２２と、ステージ２３とを有する。ステージ２３には、配置した前記分析チップを固定化するための固定部２４ａ、２４ｂを有する。図３は、遠心装置２のステージ２３の上面の平面図である。
【０１１０】
遠心装置２への前記分析チップの配置は、例えば、以下のように行える。まず、ステージ２３上に分析チップ１’を配置する。この際、分析チップ１’の反応部側が、軸２２側となるように配置する。そして、分析チップ１’を固定部２４ａ、２４ｂでステージ２３に固定する。つぎに、モーター２１を駆動させ、軸２２を中心として、ステージ２３を回転させる。これによって、分析チップ１’の反応部側から検出部側に向かって矢印Ｙ方向の遠心力がかかり、分析チップ１’において矢印Ｘ方向に前記試料の移動または前記分析用担体の移動を行うことができる。
【０１１１】
（実施形態４）
本実施形態は、前記実施形態２の分析チップを用い、前記ターゲットとしてターゲットＲＮＡを分析する場合の分析方法の一例である。本実施形態の分析方法は、前記実施形態１の分析チップに代えて、前記実施形態２のチップを用いた以外は、前記実施形態３の分析方法と同様であり、特に言及しない限り、その説明を援用できる。
【０１１２】
図４は、本発明の分析チップの一例を示す概略図であり、（Ａ）は、斜視図、（Ｂ）は、上面図、（Ｃ）は、前記（Ａ）のＩ−Ｉ方向断面図である。
【０１１３】
図４に示すように、分析チップ１は、下基板１０ａと上基板１０ｂとからなる基板１０を有する。上基板１０ｂは、貫通孔１１と、下表面における凹部１２、１３、１４、１５とを有し、これらは、上基板１０ｂと下基板１０ａとの積層により、それぞれ、試料導入部１１、ならびに、第１流路１２、反応部１３、第２流路１４、検出部１５を構成している。試料導入部１１と反応部１３とは、第１流路１２で連通し、反応部１３と検出部１５は、第２流路１４で連通する。図４（Ｃ）において、矢印Ｘは、分析チップ１における試料の流れ方向（分析チップ１の長手方向）を示す。
【０１１４】
分析チップ１の大きさは、特に制限されず、以下の条件が例示できる。
試料導入部１１
直径１〜１０ｍｍ（例えば、５ｍｍ）
導入する試料の体積１〜１０００μＬ（例えば、５０μＬ）
反応部１３
直径１〜３０ｍｍ（例えば、８ｍｍ）
第２流路１４
長さ１０〜５０００μｍ（例えば、２５００μｍ）
反応部１３端の幅  １００〜５０００μｍ（例えば、１０００μｍ）
反応部１３端の深さ１００〜５０００μｍ（例えば、２０００μｍ）
検出部１５端の幅  １０〜１０００μｍ（例えば、１５０μｍ）
検出部１５端の深さ１０〜１０００μｍ（例えば、１５０μｍ）
検出部１５
長さ１０〜１０００μｍ（例えば、２２０μｍ）
幅  １０〜１０００μｍ（例えば、１５０μｍ）
深さ１０〜１０００μｍ（例えば、１５０μｍ）
容積０．００１〜１０００ｎＬ（例えば、５ｎＬ）
【０１１５】
第２流路１４は、図４に示すように、反応部１３側から検出部１５側に向かって、狭まっていく狭窄形状である。具体的には、分析チップ１の上表面から見た場合、図４（Ｂ）に示すように、反応部１３側から検出部１５側に向かって、両側からテーパー状に狭まっており、また、分析チップ１の側面から見た場合、図４（Ｃ）に示すように、反応部１３側から検出部１５側に向かって、上面がテーパー状に狭まっていく形状である。
【０１１６】
分析チップ１の反応部１３には、前記分析用担体が配置されている（図示せず）。前記分析用担体は、前述のように、前記水溶性材料により固定化されていることが好ましい。
【０１１７】
分析チップ１を用いた試料中のＲＮＡの分析は、例えば、以下のようにして行うことができる。以下の実施形態では、前記蛍光標識プローブの蛍光標識がピレン含有物質であり、前記蛍光標識プローブが固定化された担体が磁性担体である場合の一例とする。
【０１１８】
まず、分析チップ１の試料導入部１１に、試料を導入する。そして、分析チップ１を遠心し、遠心力（Ｃ１）により、試料導入部１１から、第１流路１２を介して反応部１３に、試料を移動させる。そして、遠心終了後、分析チップ１の外部に配置された磁石により、反応部１３における前記分析用担体（分析用磁性担体）を自転させることにより、反応部１３において、前記試料と前記分析用担体とを接触させる。これによって、前記試料中のターゲットＲＮＡと前記分析用担体における前記蛍光標識プローブとが結合する。
【０１１９】
つぎに、分析チップ１を遠心し、遠心力（Ｃ２）により、反応部１３から、第２流路１４を介して検出部１５に、前記分析用担体を移動させる。そして、検出部１５に、分析チップ１の上方向から紫外光（例えば、３４０ｎｍ）を照射し、ターゲットＲＮＡと前記蛍光標識プローブとの結合により発するピレン由来の蛍光を、所定の波長（例えば、４８０ｎｍ）で光検出器により検出する。ピレンで修飾された前記蛍光標識プローブは、ターゲットＲＮＡと結合した状態でのみ蛍光を発するため、ピレンに由来する蛍光の有無および量は、ターゲットＲＮＡの有無および量と相関関係を示す。このため、前記蛍光の検出により、ターゲットＲＮＡを定性分析または定量分析できる。
【０１２０】
本発明において、前記分析チップに対する遠心力は、前述のように、例えば、遠心装置を使用することができる。
【０１２１】
遠心装置２への前記分析チップの配置は、例えば、以下のように行える。まず、ステージ２３上に分析チップ１を配置する。この際、分析チップ１の試料導入部側が、軸２２側となるように配置する。そして、分析チップ１を固定部２４ａ、２４ｂでステージ２３に固定する。つぎに、モーター２１を駆動させ、軸２２を中心として、ステージ２３を回転させる。これによって、分析チップ１の試料導入部側から検出部側に向かって矢印Ｙ方向の遠心力がかかり、分析チップ１において矢印Ｘ方向に前記試料の移動または前記分析用担体の移動を行うことができる。
【実施例】
【０１２２】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例により制限されない。【０１２３】
（実施例１）
図４に示す分析チップを作製し、サンプル中のｍｉＲＮＡの分析を行った。【０１２４】
（１）流路構造体の製造
以下に示す方法により、図４の分析チップの上基板１０ｂを作製した。なお、前記分析チップについて、各部位の大きさおよび材質は、以下の通りとした。
試料導入部１１：直径６ｍｍの円形貫通孔
反応部１３：深さ２ｍｍ、直径８ｍｍ、円形
第１流路１２：長さ２ｍｍ、幅１ｍｍ、深さ１ｍｍ
検出部１５：幅０．１５ｍｍ、深さ０．１５ｍｍ、長さ０．３ｍｍ、直方体形状
第２流路１４：長さ３．３ｍｍ、幅０．５ｍｍ、上流側から下流側に向かって、深さが１ｍｍから０．１５ｍｍにスロープ状に変化
材質：ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製【０１２５】
まず、前記構造の流路構造体を製造するために、鋳型となるアルミ製の流路金型を切削加工により作製した。そして、ＰＤＭＳプレポリマー溶液を、前記流路金型に流し入れ、７０℃のオーブンに１時間入れて熱硬化させた。熱硬化後、硬化したＰＤＭＳ成型体を、静かに前記流路金型から引き剥がし、前記流路構造体を得た。前記ＰＤＭＳプレポリマー混合液は、ＰＤＭＳのプレポリマーと硬化剤（商品名シルポット（東レダウコーニング製）の主剤と硬化剤）を、重量比１０：１で均一になるまで混合した後、その混合液をデシケータに入れて減圧処理し、混合時に発生した気泡を除去して調製した。【０１２６】
（２）ピレンＲＮＡプローブの固定化
蛍光標識プローブとして、ピレンで標識化したプローブ（ピレンＲＮＡプローブ）を以下のようにして作製した。ｍｉＲＮＡであるｌｅｔ−７ａに対して相補的な配列（AAC  AU  ACA  ACC  UAC  UAC CUC  A（配列番号１））からなるポリリボヌクレオチドを合成した。そして、前記ＲＮＡ中の２箇所のシトシン（前記配列における下線部の塩基）をピレンで修飾し、５’末端の塩基をソラレンで修飾した。これをピレンＲＮＡプローブとした。【０１２７】
つぎに、前記ピレンＲＮＡプローブを、以下のようにしてビーズに固定化した。ビーズとして、直径が１μｍであり、表面がカルボキシル基で修飾されているシリカ製ビーズ（商品名ｓｉｃａｓｔａｒ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ製）を使用した。前記ビーズを、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩とヒドロキシスクシンイミドとを含む水溶液中で混合することにより、前記ビーズのカルボキシル基を活性化した。前記水溶液において前記ビーズの量は、１０ｍｇとし、前記１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩の量は３８ｍｇ、前記ヒドロキシスクシンイミドの量は３ｍｇとした。そして、活性化後、前記ビーズのカルボキシル基と反応しなかった前記１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩と前記ヒドロキシスクシンイミドとを除去するため、前記水溶液の遠心、上清の除去、および蒸留水の添加という一連の洗浄操作を、３回繰り返した。その後、前記ピレンＲＮＡプローブと前記ビーズとを、１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で混合することにより、前記ピレンＲＮＡプローブと前記ビーズ表面の活性化カルボキシル基とを反応させ、前記ビーズ表面に前記ピレンＲＮＡプローブを固定化した。前記リン酸緩衝液中において、前記ピレンＲＮＡプローブの量は、０．１ｎｍｏｌとした。そして、前記ビーズ表面に固定化されなかった前記ピレンＲＮＡプローブを除去するため、前記ビーズと前記ピレンＲＮＡプローブとを含む前記リン酸緩衝液を遠心し、上清を除去した後、さらに蒸留水を加えるという洗浄操作を３回繰り返した。このようにして、ピレンＲＮＡプローブが固定化されたビーズを作製した。【０１２８】
（３）反応試薬液の調製
前記ビーズ、マンニトール、ウシ血清アルブミンを、それぞれ、蒸留水に、０．０５ｗ／ｖ％、２ｗ／ｖ％、１ｗ／ｖ％となるように混合して、反応試薬液を調製した。【０１２９】
（４）前記反応試薬の固定化
厚み０．１７ｍｍのホウケイ酸ガラス板の表面に、前記反応試薬液５μＬを滴下し、さらに、滴下した前記反応試薬液の上に、直径０．５ｍｍのステンレス球を載せた後、前記ガラス板を、温度２５℃、湿度０％の恒温恒湿器内で２４時間インキュベートし、前記反応試薬液を乾燥させるとともに、前記ステンレス球を前記ガラス板上に固定した。【０１３０】
（５）分析チップ
前記（１）の前記流路構造体について、流路の形成面（前記ガラス板との貼り合わせ面）を酸素プラズマ処理した。そして、処理後の前記流路構造体と前記ガラス板とを貼り合せ、分析チップを作製した。前記両者の貼り合わせは、前記流路構造体の反応部と前記ガラス基板上の前記反応試薬との位置が対向するようにして、行った。【０１３１】
（６）分析
Ｌｅｔ−７ａ  １ｐｇを、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．１ｍＬに混合して、ｍｉＲＮＡサンプルを調製した。そして、前記ｍｉＲＮＡサンプル５０μＬを、前記分析チップの試料導入部１１に滴下した後、前記分析チップを図２に示す遠心装置２のステージ２３に固定化した。前記分析チップを、１５００ｒｐｍ(回転半径５０ｍｍ)で１０秒間回転させ、図３に示すように矢印Ｙ方向に遠心力を発生させ、前記分析チップにおいて、前記ｍｉＲＮＡサンプルを、試料導入部１１から反応部１３（矢印Ｘ方向）に移動させた。この際、前記分析チップにおいて、反応部１３と検出部１５とを連通する第２流路１４は、その断面積が第１流路１２の断面積よりも小さく、また、前記分析チップの素材ＰＤＭＳが疎水性（蒸留水に対する接触角が１１０°）であることから、第２流路１４の管抵抗（抵抗力（Ｒ））が第１流路１２の管抵抗よりも大きいため、前記遠心力では、前記ｍｉＲＮＡサンプルは、第１流路１２を通過するものの、第２流路１４を通過できない。このため、前記ｍｉＲＮＡサンプルは、試料導入部１１から反応部１３へと移動するものの、第２流路１４へは進入せず、反応部１３に留まる。【０１３２】
つぎに、前記分析チップの反応部１３に、波長３６５ｎｍのＬＥＤを照射しながら、反応部１３内の前記ステンレス球を、磁力で回転（２００ｒｐｍ）させ、前記ｍｉＲＮＡサンプルにより前記反応試薬を溶解し、前記ｍｉＲＮＡと前記反応試薬とを混合させた。この操作を、１０分間行った。前記混合により、前記ｍｉＲＮＡサンプル中のｌｅｔ−７ａと前記反応試薬（前記ピレンＲＮＡプローブが固定化されたビーズ）とを結合させ、波長３６５ｎｍのＬＥＤ照射によって、前記ピレンＲＮＡプローブのソラレンとｌｅｔ−７ａとを共有結合させた。これによって、前記両者の結合を安定化して、前記両者の乖離を防止できるため、前記ｍｉＲＮＡサンプル中のｌｅｔ−７ａを、効率よく前記反応試薬のビーズ表面に捕捉できる。【０１３３】
つぎに、前記分析チップを、４０００ｒｐｍ(回転半径５０ｍｍ)で６０秒間回転させ、反応部１３内の前記ビーズを検出部１５に移動させた。前記ビーズは、比重が２程度であり、前記ｍｉＲＮＡサンプルよりも大きな比重を有するため、検出部１５に集積される。前記反応試薬中のビーズの総容積は、５ｎＬであるため、一辺０．１５ｍｍの正方形の断面を有する検出部１５において、下流の先端から長さ０．２〜０．３ｍｍの領域に、前記ビーズが集積する。【０１３４】
そして、蛍光顕微鏡を用い、前記分析チップの検出部１５の先端に集積した前記ビーズに、波長３４０ｎｍの励起光を照射し、波長４８０ｎｍの蛍光強度を測定した。【０１３５】
（実施例２）
図１に示す分析チップを作製し、サンプル中のｍｉＲＮＡの分析を行った。【０１３６】
（１）分析チップ
以下に示す方法により、図１の分析チップの上基板１０ｂを作製した。なお、前記分析チップについて、各部位の大きさおよび材質は、以下の通りとした以外は、実施例１（１）〜（５）と同様にして、分析チップを作製した。
反応部１３：深さ２ｍｍ、直径８ｍｍ、円形、直径６ｍｍの円形貫通孔
検出部１５：幅０．１５ｍｍ、深さ０．１５ｍｍ、長さ０．３ｍｍ、直方体形状
第２流路１４：長さ３．３ｍｍ、幅０．５ｍｍ、上流側から下流側に向かって、深さが１ｍｍから０．１５ｍｍにスロープ状に変化
材質：ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製【０１３７】
（２）分析
Ｌｅｔ−７ａを所定濃度（０ｍｏｌ／Ｌ、５０もしくは２００ｆｍｏｌ／Ｌ、または２、２０もしくは２００ｐｍｏｌ／Ｌ）となるように、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に混合して、ｍｉＲＮＡサンプルを調製した。そして、前記ｍｉＲＮＡサンプル５０μＬを、前記分析チップの反応部１３に滴下した後、前記分析チップを図２に示す遠心装置２のステージ２３に固定化した。【０１３８】
前記分析チップの反応部１３に、波長３６５ｎｍのＬＥＤを照射しながら、反応部１３内の前記ステンレス球を、磁力で回転（２００ｒｐｍ）させ、前記ｍｉＲＮＡサンプルにより前記反応試薬を溶解し、前記ｍｉＲＮＡと前記反応試薬とを混合させた。この操作を、１０分間行った。前記混合により、前記ｍｉＲＮＡサンプル中のｌｅｔ−７ａと前記反応試薬（前記ピレンＲＮＡプローブが固定化されたビーズ）とを結合させ、波長３６５ｎｍのＬＥＤ照射によって、前記ピレンＲＮＡプローブのソラレンとｌｅｔ−７ａとを共有結合させた。これによって、前記両者の結合を安定化して、前記両者の乖離を防止できるため、前記ｍｉＲＮＡサンプル中のｌｅｔ−７ａを、効率よく前記反応試薬のビーズ表面に捕捉できる。【０１３９】
つぎに、前記分析チップを、４０００ｒｐｍ(回転半径５０ｍｍ)で６０秒間回転させ、反応部１３内の前記ビーズを検出部１５に移動させた。前記ビーズは、比重が２程度であり、前記ｍｉＲＮＡサンプルよりも大きな比重を有するため、検出部１５に集積される。前記反応試薬中のビーズの総容積は、５ｎＬであるため、一辺０．１５ｍｍの正方形の断面を有する検出部１５において、下流の先端から長さ０．２〜０．３ｍｍの領域に、前記ビーズが集積する。【０１４０】
そして、蛍光顕微鏡を用い、前記分析チップの検出部１５の先端に集積した前記ビーズに、波長３４０ｎｍの励起光を照射し、波長４８０ｎｍの平均蛍光強度を測定した。【０１４１】
この結果を図５に示す。図５は、平均蛍光強度を示すグラフである。図５において、（Ａ）は、全てのｍｉＲＮＡサンプルの結果を示し、（Ｂ）は、０〜２ｐｍｏｌ／ＬのｍｉＲＮＡサンプルの結果を示す。また、図５において、横軸は、ｍｉＲＮＡの濃度を示し、縦軸は、平均蛍光強度を示す。図５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ｍｉＲＮＡの濃度依存的に平均蛍光強度が増加した。また、前記分析チップによれば、ＰＣＲを使用することなく、５０ｆｍｏｌ／Ｌという極めて低濃度のｍｉＲＮＡを検出できることが分かった。これらの結果から、本発明の分析チップおよび分析方法によれば、試料中のターゲットの分析において、優れた感度および精度を実現できることが分かった。【０１４２】
（実施例３）
異なる深さの検出部を有する分析チップと異なる直径を有するビーズを使用し、前記ビーズを前記検出部に回収できることを確認した。【０１４３】
（１）分析チップ
検出部１５の深さを４０、７０、１００または１５０μｍとし、前記ピレンＲＮＡプローブを固定化したビーズに代えて、直径３００もしくは８００ｎｍ、または５もしくは１０μｍのローダミン蛍光標識シリカ製ビーズ（micromod  Partikeltechnologie  GmbH社製）を用いた以外は、前記実施例２（１）と同様に、分析チップを作製した。【０１４４】
（２）分析
前記リン酸緩衝液５０μＬを、前記分析チップの反応部１３に滴下した後、前記分析チップを図２に示す遠心装置２のステージ２３に固定化した。【０１４５】
前記分析チップの反応部１３内の前記ステンレス球を、磁力で回転（２００ｒｐｍ）させ、前記ｍｉＲＮＡサンプルにより前記反応試薬を溶解した。この操作を、１０分間行った。つぎに、前記分析チップを、４０００ｒｐｍ(回転半径５０ｍｍ)で６０秒間回転させ、反応部１３内の前記ビーズを検出部１５に移動させた。【０１４６】
そして、蛍光顕微鏡を用い、前記分析チップの検出部１５の先端に集積した前記ビーズに、波長５１０−５６０ｎｍの励起光を照射し、波長４９０ｎｍ以上の平均蛍光強度および吸光度を測定した。【０１４７】
これらの結果を図６に示す。図６は、平均蛍光強度または吸光度を示すグラフである。図６において、（Ａ）は、平均蛍光強度の結果を示し、（Ｂ）は吸光度の結果を示し、図中の三角（△）は、３００ｎｍビーズの結果を示し、菱形（◇）は、８００ｎｍのビーズの結果を示し、丸（○）は、５μｍのビーズの結果を示し、バツ（×）は、１０μｍのビーズの結果を示す。また、図６（Ａ）において、横軸は、検出部１５の深さを示し、縦軸は、平均蛍光強度を示し、（Ｂ）において、横軸は、検出部１５の深さを示し、縦軸は、吸光度を示す。図６（Ａ）に示すように、いずれの直径のビーズにおいても、検出部１５の深さが増加するについて、平均蛍光強度が増加した。また、各ビーズの中でも、３００ｎｍのビーズは、検出部１５の深さが増加する際の平均蛍光強度の増加割合が高く、且つ増加割合が一定であり、前記担体として特に好適に使用できることが分かった。また、図６（Ｂ）に示すように、いずれの直径のビーズにおいても、検出部１５の深さが増加するにつれて、吸光度が増加した。また、３００ｎｍ、５μｍ、および１０μｍのビーズは、検出部１５の深さがいずれの深さの場合においても、吸光度が低減されており、例えば、光学的な方法により標識を検出する際に、検出漏れが低減できることが分かった。【０１４８】
（実施例４）
第２流路１４の側面が、反応部１３から検出部側１５に向かってテーパー状に狭まる曲面であり、前記曲面の曲率半径が異なる分析チップと異なる濃度の界面活性剤を使用し、前記ビーズを前記検出部に回収できることを確認した。【０１４９】
（１）分析チップ
図７（Ａ）〜（Ｃ）に示すように、第２流路１４の側面を、反応部１３から検出部１５側に向かってテーパー状に狭まる曲面とし、検出部１５の深さを１００μｍとし、前記ピレンＲＮＡプローブを固定化したビーズに代えて、３００μｍまたは５μｍのローダミン標識シリカ製ビーズを用いた以外は、前記実施例２（１）と同様に、分析チップを作製した。なお、図７（Ａ）〜（Ｃ）の分析チップにおいて、テーパー状に狭まる曲面における各曲面の曲率半径Ｒは、それぞれ、１．５、３、および４．５ｍｍとした。【０１５０】
（２）分析
０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）またはＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０μＬを前記分析チップの反応部１３に滴下後、前記実施例３（２）と同様にして、検出部１５に前記ビーズを集積させた。そして、蛍光顕微鏡を用い、前記分析チップの検出部１５の先端に集積した前記ビーズに、波長５１０−５６０ｎｍの励起光を照射し、前記ビーズの集積部分の波長４９０ｎｍ以上の蛍光強度の総和（総蛍光量）を算出した。また、前記ビーズ添加前に、同様にして、総蛍光量を算出し、前記ビーズ添加後に算出された総蛍光量から前記ビーズ添加前に算出された総蛍光量を除くことで、総蛍光量を補正した（補正後の総蛍光量）。【０１５１】
この結果を図８に示す。図８は、補正後の総蛍光量を示すグラフであり、（Ａ）は、５μｍのビーズを用いた場合の結果であり、（Ｂ）は、３００ｎｍのビーズを用いた場合の結果である。図８において、横軸は、界面活性剤の種類を示し、縦軸は、補正後の総蛍光量を示す。図８に示すように、第２流路１４の側面がいずれの曲率半径を有する曲面であっても、補正後の総蛍光量が高く、効率良く前記ビーズが回収できることが分かった。また、図８に示すように、界面活性剤を含む場合、界面活性剤を含まない場合に対して、補正後の総蛍光量が有意に増加した。すなわち、前記試薬として界面活性剤を用いることで、効率良く前記ビーズが回収できることが分かった。【０１５２】
以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。【０１５３】
この出願は、２０１５年１月２２日に出願された日本出願特願２０１５−０１０６３９を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明によれば、ＰＣＲを使用することなく、試料中のターゲットを直接的に分析できる。また、前記標識プローブが固定化された担体を使用する本発明は、前記流路が、前記移動制御手段として前記疎水性の内壁を有することで、前記反応部から前記検出部への前記担体の移動を制御でき、前記ターゲットと前記標識プローブとの結合体に、前記流路の内壁の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）を負荷することによって、例えば、前記検出部に高濃度の状態で回収できる。このため、試料中のターゲットの分析において、優れた感度および精度を実現でき、例えば、前記ターゲット分析チップに供する試料が微量であっても、分析可能である。したがって、本発明は、例えば、マイクロＲＮＡをはじめとするターゲットの分析が行われる医療分野等において有用といえる。
【符号の説明】
【０１５５】
１、１’        分析チップ
２              遠心装置
１０ａ          下基板
１０ｂ          上基板
１０、２０      基板
１１            試料導入部
１２            第１流路
１３            反応部
１４            第２流路
１５            検出部
２１            モーター
２２            軸
２３            ステージ
２４ａ、２４ｂ  固定部
【図１】
2016117700.tif 000003
【図２】
2016117700.tif 000004
【図３】
2016117700.tif 000005
【図４】
2016117700.tif 000006
【図５】
2016117700.tif 000007
【図６】
2016117700.tif 000008
【図７】
2016117700.tif 000009
【図８】
2016117700.tif 000010
【配列表】
2016117700000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年7月27日(2016.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板を有し、
前記基板が、ターゲットを含む試料と試薬とを反応させる反応部、標識検出の対象領域である検出部、および前記反応部と前記検出部とを連通する流路を有し、
前記試薬は、担体を有し、
前記担体は、比重が１より大きく、前記ターゲットに結合する標識プローブが固定化されており、且つ前記ターゲットとの結合体を形成するものであり、
前記流路が、前記担体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段を有し、
前記移動制御手段が、前記流路における疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする、ターゲット分析チップ。
【請求項２】
前記流路が、前記反応部側から前記検出部側に向かって、狭窄する構造である、請求項１記載の分析チップ。
【請求項３】
前記検出部の高さが、１〜５００μｍである、請求項１または２記載の分析チップ。
【請求項４】
前記検出部の内部空間の容積が、前記反応部の内部空間の容積よりも小さい、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項５】
前記担体が、ビーズである、請求項１から５のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項６】
前記ビーズの直径が、１００ｎｍ〜４μｍである、請求項５記載の分析チップ。
【請求項７】
前記担体が、シリカ製である、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項８】
前記流路の側面が、前記反応部から前記検出部側に向かってテーパー状に狭まる曲面である、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項９】
前記標識プローブの標識が、前記標識プローブが前記ターゲットに結合することにより、シグナル変化する物質である、請求項１から８のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項１０】
前記標識が、ピレンを含む物質である、請求項９記載の分析チップ。
【請求項１１】
前記標識プローブが、さらにソラレンで修飾されたプローブである、請求項１０記載の分析チップ。
【請求項１２】
前記ターゲットが、マイクロＲＮＡである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項１３】
前記標識プローブの量が、１ｚｍｏｌ〜１ｎｍｏｌである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項１４】
前記試薬が、さらに界面活性剤を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項１５】
前記反応部が、前記試料が導入される試料導入部を兼ねる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項１６】
前記基板が、さらに前記試料が導入される試料導入部および前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路を含み、
前記試料導入部における前記試料は、前記遠心力（Ｃ２）未満の遠心力（Ｃ１）によって、前記反応部に移動できる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項１７】
前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路が、さらにフィルタを有する、請求項１６記載の分析チップ。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のターゲット分析チップを用い、
前記反応部に、試料および試薬を導入する工程、
前記反応部において、前記試料と、前記標識プローブが固定化された担体とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記標識プローブとを結合反応させることにより、前記ターゲットと前記標識プローブとの結合体を形成する工程、
前記反応部における結合体を、前記流路の内壁の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）によって、前記検出部に移動させる工程、および、
前記検出部において、前記ターゲットが結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程を含むことを特徴とする、ターゲット分析方法。
【請求項１９】
前記反応部において、前記試料と前記担体とを含む混合物を撹拌する、請求項１８記載の分析方法。
【請求項２０】
前記標識プローブの標識が、前記標識プローブが前記ターゲットに結合することにより、シグナル変化する物質であり、
前記検出部において、前記標識のシグナル変化を検出する、請求項１８または１９記載の分析方法。
【請求項２１】
前記標識が、ピレンを含む物質であり、
前記検出部に紫外光を照射し、波長４５０〜５１０ｎｍの蛍光シグナルを検出する、請求項２０記載の分析方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月21日(2017.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板を有し、
前記基板が、ターゲットを含む試料と試薬とを反応させる反応部、標識検出の対象領域である検出部、および前記反応部と前記検出部とを連通する流路を有し、
前記試薬は、担体を有し、
前記担体は、比重が１より大きく、前記ターゲットに結合する標識プローブが固定化されており、且つ前記ターゲットとの結合体を形成するものであり、
前記流路が、前記担体の前記反応部から前記検出部への移動を制御する移動制御手段を有し、
前記移動制御手段が、前記流路における疎水性の内壁を有し、
前記移動制御手段により、前記結合体は、前記流路の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）を負荷された場合、前記流路を介して前記検出部に移動できることを特徴とする、ターゲット分析チップ。
【請求項２】
前記流路が、前記反応部側から前記検出部側に向かって、狭窄する構造である、請求項１記載のターゲット分析チップ。
【請求項３】
前記検出部の高さが、１〜５００μｍである、請求項１または２記載のターゲット分析チップ。
【請求項４】
前記検出部の内部空間の容積が、前記反応部の内部空間の容積よりも小さい、請求項１から３のいずれか一項に記載のターゲット分析チップ。
【請求項５】
前記担体が、ビーズである、請求項１から４のいずれか一項に記載のターゲット分析チップ。
【請求項６】
前記ビーズの直径が、１００ｎｍ〜４μｍである、請求項５記載のターゲット分析チップ。
【請求項７】
前記担体が、シリカ製である、請求項１から６のいずれか一項に記載のターゲット分析チップ。
【請求項８】
前記流路の側面が、前記反応部から前記検出部側に向かってテーパー状に狭まる曲面である、請求項１から７のいずれか一項に記載のターゲット分析チップ。
【請求項９】
前記標識プローブの標識が、前記標識プローブが前記ターゲットに結合することにより、シグナル変化する物質である、請求項１から８のいずれか一項に記載のターゲット分析チップ。
【請求項１０】
前記標識が、ピレンを含む物質である、請求項９記載のターゲット分析チップ。
【請求項１１】
前記標識プローブが、さらにソラレンで修飾されたプローブである、請求項１０記載のターゲット分析チップ。
【請求項１２】
前記ターゲットが、マイクロＲＮＡである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のターゲット分析チップ。
【請求項１３】
前記標識プローブの量が、１ｚｍｏｌ〜１ｎｍｏｌである、請求項１から１２のいずれか一項に記載のターゲット分析チップ。
【請求項１４】
前記試薬が、さらに界面活性剤を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のターゲット分析チップ。
【請求項１５】
前記反応部が、前記試料が導入される試料導入部を兼ねる、請求項１から１４のいずれか一項に記載のターゲット分析チップ。
【請求項１６】
前記基板が、さらに前記試料が導入される試料導入部および前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路を含み、
前記試料導入部における前記試料は、前記遠心力（Ｃ２）未満の遠心力（Ｃ１）によって、前記反応部に移動できる、請求項１から１４のいずれか一項に記載のターゲット分析チップ。
【請求項１７】
前記試料導入部と前記反応部とを連通する流路が、さらにフィルタを有する、請求項１６記載のターゲット分析チップ。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載のターゲット分析チップを用い、
前記反応部に、試料および試薬を導入する工程、
前記反応部において、前記試料と、前記標識プローブが固定化された担体とを接触させ、前記試料中のターゲットと前記標識プローブとを結合反応させることにより、前記ターゲットと前記標識プローブとの結合体を形成する工程、
前記反応部における結合体を、前記流路の内壁の疎水性により生じる抵抗力（Ｒ）より大きい遠心力（Ｃ２）によって、前記検出部に移動させる工程、および、
前記検出部において、前記ターゲットが結合した前記標識プローブの標識を検出することにより、前記試料中のターゲットを分析する工程を含むことを特徴とする、ターゲット分析方法。
【請求項１９】
前記反応部において、前記試料と前記担体とを含む混合物を撹拌する、請求項１８記載のターゲット分析方法。
【請求項２０】
前記標識プローブの標識が、前記標識プローブが前記ターゲットに結合することにより、シグナル変化する物質であり、
前記検出部において、前記標識のシグナル変化を検出する、請求項１８記載のターゲット分析方法。
【請求項２１】
前記標識が、ピレンを含む物質であり、
前記検出部に紫外光を照射し、波長４５０〜５１０ｎｍの蛍光シグナルを検出する、請求項２０記載のターゲット分析方法。
【国際調査報告】
2016117700.tif 000011
2016117700.tif 000012
2016117700.tif 000013
2016117700.tif 000014