(57)【要約】  PSS2の機能抑制が生じているがん細胞を特異的に標的化するための治療戦略を開発すること。  PSS1とPSS2が合成致死の関係にあり、PSS1を阻害する治療がPSS2機能抑制型がんの治療のための有望なアプローチになることを見出した。また、この治療戦略においては、被験者をPSS2の機能抑制を指標に選別した上で、PSS1阻害剤を投与できるため、コンパニオン診断に基づく効率的な治療が可能であることも明らかとなった。
2016148115.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中におけるホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制の有無を検出し、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が検出された被験者を、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤によるがんの治療への応答性があると判定することを含む、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤によるがんの治療への応答性を予測する方法。
【請求項２】
被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中におけるホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制の有無を検出し、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が検出された被験者を、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤によるがんの治療の対象として選別することを含む、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤によるがんの治療の対象を選別する方法。
【請求項３】
被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中におけるホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制の有無を検出し、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が検出された被験者に対し、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤を投与することを含む、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じているがんの治療方法。
【請求項４】
被験者由来の生物学的試料において、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じている被験者に対し、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤を投与することを含む、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じているがんの治療方法。
【請求項５】
ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じているがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であって、ホスファチジルセリンシンターゼ１を阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程を含む方法。
【請求項６】
ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が、ホスファチジルセリンシンターゼ２のホモ欠損またはヘテロ欠損である請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤を含む、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じているがんの治療剤。
【請求項８】
ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が、ホスファチジルセリンシンターゼ２のホモ欠損またはヘテロ欠損である請求項７に記載のがんの治療剤。
【請求項９】
ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤によるがんの治療の対象を選別するための、被験者由来の生物学的試料中におけるホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制の有無を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制を指標とした、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤によるがんの治療への応答性を予測する方法およびがんの治療の対象を選別する方法に関する。また、本発明は、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤による、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じているがんの治療方法に関する。また、本発明は、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤を含む、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じているがんの治療剤に関する。さらに本発明は、ホスファチジルセリンシンターゼ１の阻害を指標とした、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じているがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホスファチジルセリンは生理的条件下でその極性頭部に負電荷を持つ酸性リン脂質の一つで、細胞膜リン脂質の約５−１５％を占める。ホスファチジルセリンは哺乳動物細胞においてはホスファチジルセリンシンターゼ１（PSS1）およびホスファチジルセリンシンターゼ２（PSS2）の２つの酵素により産生されることが知られている（非特許文献１，２）。【０００３】
PSS1はホスファチジルコリンのコリン部分をＬ−セリンに交換することでホスファチジルセリンを産生する酵素であり、PSS2はホスファチジルエタノールアミンの並行塩基交換反応によりホスファチジルセリンを産生する酵素である（非特許文献１、２）。PSS1とPSS2はアミノ酸配列において28％程度共通している（非特許文献３、４）。【０００４】
PSS1をコードする遺伝子PTDSS1のノックアウトマウスでは明確な表現型が見出されないのに対し、PSS2をコードする遺伝子であるPTDSS2のノックアウトマウスでは雄性低受胎の傾向が観察されたことが報告されている。また、PTDSS1およびPTDSS2のダブルノックアウトマウスでは胎生致死となることから、ホスファチジルセリンは生存に不可欠な分子であると考えられている(非特許文献５)。【０００５】
近年、有望ながんの患者選別療法として合成致死療法が注目されている。ホスファチジルセリンの生合成に関連する代謝酵素群についても、in silico解析により合成致死の関係にある分子の予測が試みられ、PSS1と合成致死の関係にある分子の候補として、PSS2や、ホスファチジルエタノールアミンの産生するであるエタノールアミンホスホトランスフェラーゼ（CEPT1）およびエタノールアミンホスフェートシチジリルトランスフェラーゼ（PCYT2）が提唱された（特許文献１、非特許文献６）。しかし、これらの分子間の合成致死関係について具体的な検証はなされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】US特許公開公報2012/0283956号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Vance, J.E. et al. Biochim. Biophys. Acta 1831, 543-554 (2013)
【非特許文献２】Tomohiro, S. et al. Biochem. J. 418, 421-429 (2009)
【非特許文献３】Saito, K. et al. Biochemistry 273, 17199-17205 (1998)
【非特許文献４】Stone, S. J. et al. Biochem. J. 342, 57-64 (1999)
【非特許文献５】Arikketh et al. J. Biol. Chem. 283, 12888-12897 (2008)
【非特許文献６】Folger, O. et al. Molecular System Biology 7, Article No.501 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、合成致死療法により、安全かつ効果的ながんの治療を目指すものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、合成致死関係にある可能性のある分子の組み合わせをin silicoで予測し、予測された分子の組み合わせについて実際に細胞を用いて検証することにより、合成致死関係にある分子の組み合わせを同定した。具体的には、PSS１およびPSS2が合成致死関係にあることを見出した。【００１０】
これにより、PSS1を阻害する治療がPSS2の機能抑制が生じているがんに対して有望なアプローチになることを見出した。また、このアプローチにおいては、患者をPSS2の機能抑制を指標に選別できるため、コンパニオン診断に基づく効率的な治療が可能であることも明らかである。【００１１】
さらに、本発明者らは、このアプローチに有用なPSS1阻害剤の開発に向け、PSS1阻害剤のスクリーニング系を新たに開発することにも成功し、本発明を完成するに至った。【００１２】
従って、本発明は、PSS2の機能抑制が生じているがん細胞を特異的に標的化するための合成致死療法および当該合成致死療法のためのコンパニオン診断に関するものであり、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
［１］被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中におけるホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制の有無を検出し、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が検出された被験者を、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤によるがんの治療への応答性があると判定することを含む、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤によるがんの治療への応答性を予測する方法。
［２］被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中におけるホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制の有無を検出し、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が検出された被験者を、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤によるがんの治療の対象として選別することを含む、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤によるがんの治療の対象を選別する方法。
［３］被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中におけるホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制の有無を検出し、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が検出された被験者に対し、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤を投与することを含む、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じているがんの治療方法。
［４］被験者由来の生物学的試料において、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じている被験者に対し、ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤を投与することを含む、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じているがんの治療方法。
［５］ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じているがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であって、ホスファチジルセリンシンターゼ１を阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程を含む方法。
［６］ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が、ホスファチジルセリンシンターゼ２のホモ欠損またはヘテロ欠損である［１］から［５］のいずれか１に記載の方法。
［７］ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤を含む、ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が生じているがんの治療剤。
［８］ホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制が、ホスファチジルセリンシンターゼ２のホモ欠損またはヘテロ欠損である［７］に記載のがんの治療剤。
［９］ホスファチジルセリンシンターゼ１阻害剤によるがんの治療の対象を選別するための、被験者由来の生物学的試料中におけるホスファチジルセリンシンターゼ２の機能抑制の有無を検出する方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、PSS2の機能抑制を指標として、効率的に、PSS1阻害剤によるがんの治療への応答性を予測することが可能となった。本発明によれば、被験者由来の生物学的試料におけるPSS2の機能抑制（例えば、不活性型変異、発現低下、ホモ欠損、ヘテロ欠損）の有無を検出し、PSS2の機能抑制が生じている患者を選別した上で、患者に対してPSS1阻害剤によるがんの治療を施すことができる。このため、がん患者の治療成績を大きく向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】各種がん組織におけるPTDSS2遺伝子の状態（欠損、二倍体、増幅）を示した図である。
【図２】各種がん細胞株におけるPTDSS2遺伝子の状態（欠損、増幅）を示した図である。縦軸はPTDSS2のmRNAレベルを示し、横軸はPTDSS2遺伝子のコピー数を示す。
【図３】左図は各種がん細胞株におけるPTDSS2遺伝子およびEGFR遺伝子のコピー数変化を示した図である。右図は各種がん細胞株におけるPTDSS2のmRNAレベルを示した図である。
【図４】PTDSS1ノックダウンのPTDSS2へテロ欠損細胞およびPTDSS2野生型細胞の細胞増殖に及ぼす影響を示した図である。
【図５】PTDSS2変異細胞であるZR-75-1細胞においてPTDSS1ノックダウンにより脂質画分へのセリンの取り込みが、PTDSS2野生型細胞であるHCT116と比較して強く抑制されることを示した図である。左図は脂質画分の14C−セリンの液体シンチレーションカウント量の測定結果を示し、右図は脂質画分をTLCにより分離しオートラジオグラフィを行った結果を示す（PSはホスファチジルセリンを表す。）。
【図６】PTDSS2遺伝子破壊（PTDSS2-KO）HCT116細胞におけるPTDSS1ノックダウンの効果を確認するために作製したPTDSS2-KO HCT116細胞（PTDSS2-KO#3、PTDSS2-KO#16）におけるPTDSS2のmRNAレベルの減少を示した図である。
【図７】PTDSS1に対するRNA干渉による、PTDSS2-KO HCT116細胞（PTDSS2-KO#3、PTDSS2-KO#16）における増殖阻害および脂質へのセリンの取り込み阻害を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明においてホスファチジルセリンシンターゼ１（PPS1）とはPTDSS1遺伝子によりコードされるタンパク質であり、PTDSS1は配列表の配列番号１に示す塩基配列を有し、PSS1タンパク質は配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。PTDSS1はNCBIにGene ID: 9791, RefSEQ: accession NM_014754.2（タンパク質：RefSeq NP_055569.1）として登録されている。
【００１６】
本発明においてホスファチジルセリンシンターゼ２（PPS2）とはPTDSS2遺伝子によりコードされるタンパク質であり、PTDSS2は配列表の配列番号３に示す塩基配列を有し、PSS2タンパク質は配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。PTDSS2はNCBIにGene ID: 81490, RefSEQ :accession NM_030783.1_（タンパク質：RefSeq NP_110410.1）として登録されている。
【００１７】
本発明において、腫瘍、悪性腫瘍、がん、悪性新生物、がん腫、肉腫等を総称して、「腫瘍」または「がん」と表現する。
【００１８】
本発明において「被験者」とは、PSS1阻害剤に対する応答性を予測する方法による検査を受けるヒトおよびヒト以外の哺乳動物を意味する。例えば、PSS1阻害剤による治療効果が期待される疾患に罹患したヒトおよびヒト以外の哺乳動物を意味する。PSS1阻害剤による治療効果が期待される疾患として、がんを好ましく例示できる。ヒト以外の哺乳動物は、哺乳動物として類別される生物であればいかなる生物であってもよく、例えばサル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、等を含む。本発明における「被験者」として、がんを疑われたヒトおよびヒト以外の哺乳動物、およびがんと診断されたヒトおよびヒト以外の哺乳動物を好ましく例示できる。
【００１９】
本発明において「生物学的試料」は、個体から単離された組織、液体、細胞、およびそれらの混合物をいい、例えば腫瘍生検、髄液、胸腔内液、腹腔内液、リンパ液、皮膚切片、血液、尿、糞便、痰、呼吸器、腸管、尿生殖器管、唾液、乳、消化器官、およびこれらから採取された細胞を挙げることができるが、特に限定されない。「生物学的試料」は、例えば、がんの治療目的で行われた手術の際に得られた切除組織の一部、がんを疑われた対象者から生検等によって採取された組織の一部、血液あるいは胸腔内液や腹腔内液に由来する細胞を好ましく例示できる。
【００２０】
生物学的試料は、個体から単離された組織、液体、細胞、およびそれらの混合物等から調製したタンパク質抽出液や核酸抽出液であっても良い。タンパク質抽出液や核酸抽出液の調製は、自体公知のタンパク質調製法や核酸調製法を利用して実施できる。
【００２１】
生物学的試料は、PSS1阻害剤による治療を行う前に採取された生物学的試料が好ましい。このような生物学的試料を使用することにより、PSS1阻害剤による治療を実施する前にPSS1阻害剤に対する感受性予測が可能になり、その結果、被験者に対してPSS1阻害剤を含む治療を適用するか否かの判定、すなわち、PSS1阻害剤を含む治療を適用する被験者の選別を実施することができる。
【００２２】
本発明における「ホスファチジルセリンシンターゼ２（PSS2）の機能抑制」には、PSS2の欠損、発現低下、不活性化等が含まれる。PSS2の欠損には、ホモ欠損およびヘテロ欠損が含まれる。PSS2の発現低下には、転写レベルでの発現の低下及び翻訳レベルでの発現の低下の双方が含まれる。PSS2の不活性化には典型的にはPTDSS2の不活性型変異が含まれる。
【００２３】
本発明における「PSS2の機能抑制の検出」の手法としては、特に制限はないが、例えば、下記の方法が挙げられる。被験者由来の生物学的試料からゲノムDNAまたはRNAを抽出する場合の方法としては特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができ、例えば、ゲノムDNAを抽出する方法としては、SDSフェノール法（尿素を含む溶液又はエタノール中に保存した組織を、タンパク質分解酵素（proteinase K）、界面活性剤（SDS)、及びフェノールで該組織のタンパク質を変性させ、エタノールで該組織からDNAを沈殿させ抽出する方法）、Clean  Columns（登録商標、NexTec社製）、AquaPure（登録商標、Bio−Rad社製）、ZR Plant/Seed DNA Kit(Zymo Research社製）、AquaGenomicSolution（登録商標、Mo Bi Tec社製）、prepGEM（登録商標、ZyGEM社製）、BuccalQuick（登録商標、TrimGen社製）等を用いるDNA抽出方法が挙げられる。また、RNAを抽出する方法としては、例えば、フェノールとカオトロピック塩とを用いた抽出方法（より具体的には、トリゾール（Invitrogen社製）、アイソジェン（和光純薬社製）等の市販キットを用いた抽出方法）や、その他市販キット（RNAPrepトータルRNA抽出キット（Beckman Coulter社製）、RNeasy Mini(QIAGEN社製)、RNA Extraction Kit(Pharmacia Biotech社製)等）を用いた方法が挙げられる。さらに、抽出したRNAからcDNAを調製するのに用いられる逆転写酵素としては特に制限されることなく、例えば、RAV(Rous associated virus)やAMV（Avian myeloblastosis virus）等のレトロウィルス由来の逆転写酵素や、MMLV（Moloney murine leukemia virus）等のマウスのレトロウィルス由来の逆転写酵素が挙げられる。
【００２４】
−PSS2の欠損の検出−
PTDSS2の遺伝子型を解析することによりPSS2の欠損を確認することがでる。PTDSS2の遺伝子型の解析には、公知の方法をいずれも使用できる。例えば、遺伝子型の解析は、PTDSS2  DNAのコピー数変化（copy number variation; CNV）を検出することによって実施できる。CNVとは、染色体上の１kb以上にわたるゲノムDNAが、正常ヒト体細胞、すなわちディプロイドゲノムでは２コピーであるものが、１コピー以下、あるいは３コピー以上となっている現象をいう。遺伝子コピー数が１コピー以下であるときには、ゲノムDNAが欠失しており、３コピー以上であるときにはゲノムDNAが重複していると考えることができる。CNVの検出は公知の方法を利用して実施でき、このような方法として具体的には、アレイCGH法、一塩基多型（SNP）アレイ法、定量的リアルタイムPCR（Quantitative Real Time Polymerase  Chain Reaction; qPCR）法、マルチプレックス  ライゲーション−ディペンデント  プローブ  アンプリフィケーション法、次世代シーケンシング、デジタルPCR法等を挙げることができる。
【００２５】
−PSS2の発現低下の検出−
本明細書において「発現低下」とは、対照（例えば、健常者の平均的発現レベルや同一患者の非がん組織における発現レベル）との比較において、それよりも発現レベルが低いことを意味する。
【００２６】
生物学的試料中のPTDSS2遺伝子の発現の解析は、具体的には、例えば、測定対象の遺伝子の転写産物であるmRNA量を測定するか、または測定対象の遺伝子産物であるタンパク質量を測定することにより実施することができる。
【００２７】
mRNA量を測定する方法としては、公知の遺伝子発現検出方法を用いることができる。例えば、ノーザンブロッティング法、ドットブロット法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、逆転写PCR(RT-PCR)、定量RT-PCR、ハイブリダイゼーション法、およびDNAアレイ法、次世代シーケンシング、デジタルPCR等の数々の分子生物学的手法を使用してmRNA量の測定を実施できる。また、測定対象の遺伝子に対して、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA配列を有するポリヌクレオチドをプローブとして用いて公知の方法でmRNA量の測定を実施できる。例えば、プローブを作製する際に当該プローブに適宜蛍光標識等の標識を結合させておき、これを生物学的試料から単離・精製したmRNAまたは該mRNAから合成したcDNAとハイブリダイズする。その後、ハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光強度を測定することにより、測定対象の遺伝子のmRNA量を検出することができる。なお、プローブは、ガラスビーズやガラス基板等の支持体に固定化して使用することもできる。すなわち、プローブは、測定対象の遺伝子について作製したプローブを支持体上に固定化したDNAアレイまたはDNAチップの形で用いることもできる。支持体としては、ポリヌクレオチドを固定できるものであれば特に限定されるものではなく、どのような形状や材質であっても良い。支持体として、一般的には、例えば、ガラス板、シリコンウエハ、樹脂等の無機素材、また天然高分子材料としてニトロセルロースや合成高分子材料としてナイロン等を挙げることができる。
【００２８】
DNAチップやDNAアレイは市販のものを使用することができる。支持体上に固定するポリヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドであっても良い。合成オリゴヌクレオチドの配列上に蛍光標識が可能な核酸誘導体を導入することも可能である。また、支持体上で目的のオリゴヌクレオチドを合成できるアフィメトリックス型のDNAチップ技術、および、合成したDNA断片をDNAプローブとしてスポッティングすることにより固定するスタンフォード型のDNAチップ技術のいずれも用いることができる。さらに、支持体が３次元構造をした3D-Gene型（東レ株式会社製）の柱状の面に所望のポリヌクレオチドをスポットして固定化することもできる。なお、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、42℃で１×SSC（0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム）、0.1％の硫酸ドデシルナトリウム（SDS）を含む緩衝液による42℃での洗浄処理によってもハイブリダイズを維持することを意味する。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば種々の要素を組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２９】
PTDSS2遺伝子に由来するmRNAやcDNAを定量的に検出するためのプローブおよびプライマーセットは、該mRNAやcDNAを特異的に検出することができる限りにおいて特に限定されないが、１２〜２６塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。このようなプローブおよびプライマーセットは、測定対象の遺伝子の塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、そして、決定した配列を有するオリゴヌクレオチドを、例えば、DNA合成機等を用いて常法に従って合成することができる。また、市販されている遺伝子検出用のプライマーやプローブから所望のものを選択して利用することもできる。
【００３０】
PSS2タンパク質を定量的に測定する方法としては、公知のタンパク質測定法を用いることができる。例えば、PSS2タンパク質に対する抗体を使用した各種の方法を適用できる。具体的には、ウエスタンブロット法、酵素免疫固相法（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay; ELISA）、および放射免疫測定法（Radio Immuno Assay; RIA）等を挙げることができる。
【００３１】
なお、PSS2タンパク質に対する抗体は、PSS2タンパク質を抗原とするものであって、当該抗原に特異的に結合する限り、ヒト型抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体等を適宜用いることができる。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良いが、均質な抗体を安定的に生産できる点で、モノクローナル抗体が好ましい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により作製できる。また、市販されている抗体から所望の抗体を選択して利用することもできる。
【００３２】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、目的の抗原や目的の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用し、これを通常の免疫方法に従って所望の動物に免疫して得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって既知の親細胞と融合させた後、通常のスクリーニング方法で所望のモノクローナル抗体産生細胞（ハイブリドーマ細胞）を選別することにより作製できる。ハイブリドーマの作製は、例えば、ミルステインらの方法（「メソッズ  オブ  エンザイモロジー（Methods of Enzymology)」、1981年、第73巻、p.3-46）等に準じて実施できる。
【００３３】
ここで、モノクローナル抗体を作製する際には、PSS2タンパク質やその断片を抗原として使用することができる。なお、PSS2タンパク質やその断片は、例えばサムブルック等編，「モレキュラークローニング  ア  ラボラトリーマニュアル」、第２版、第１−３巻、コールド＿スプリング＿ハーバー＿ラボラトリー＿プレス出版、ニューヨーク1989年等の成書に記載された方法に準じて、当業者であれば容易に取得できる。
【００３４】
PSS2タンパク質の定量のために、該タンパク質、その断片および抗体を支持体に固定して使用することもできる。支持体は、タンパク質を固定化できるものであれば限定されず、一般的には、ガラス板、シリコンウエハ、樹脂等の無機材料または天然高分子材料のニトロセルロースや合成高分子材料のナイロンやポリスチレン等を例示できる。
【００３５】
PSS2タンパク質の検出は、質量分析法（MS）を使用して行うこともできる。特に液体クロマトグラフィーと連結した質量分析計（LC/MS）による解析は鋭敏であるため有利である。質量分析法による測定は、例えば、生物学的試料からタンパク質を調製し、当該タンパク質を標識し、タンパク質を分画し、分画したタンパク質を質量分析に供し、質量分析値からPSS2タンパク質を同定することにより行うことができる。標識としては、当技術分野で公知の同位体標識試薬を用いることができ、適当な標識試薬を市販品として入手することができる。また分画も当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば市販の強陽イオンカラム等を用いて行うことができる。
【００３６】
一方で、遺伝子の発現低下は、プロモーターの過剰メチル化が要因の一つであることが当該技術分野で公知である。従って、PSS2の機能抑制の有無の検出においては、PSS2遺伝子プロモーターのメチル化を指標として検出することも考えられる。プロモーターのメチル化の検出には、例えば、メチル化されたシトシンをウラシルに変換する活性を有するバイサルファイト処理後の塩基配列の変化を塩基配列決定により直接的に検出する方法や、バイサルファイト処理前の塩基配列は認識できる（切断できる）がバイサルファイト処理後の塩基配列は認識できない（切断できない）制限エンドヌクレアーゼを利用して間接的に検出する方法などの公知の方法を利用することができる。
【００３７】
−PSS2の変異の検出−
本発明において「変異を検出する」とは、原則として、ゲノムDNA上の変異を検出することを意味するが、当該ゲノムDNA上の変異が転写産物における塩基の変化や翻訳産物におけるアミノ酸の変化に反映される場合には、これら転写産物や翻訳産物における当該変化を検出すること（即ち、間接的な検出）をも含む意味である。
【００３８】
本発明の方法の好ましい態様は、被験者由来の生物学的試料中のPTDSS2遺伝子領域の塩基配列を直接決定することにより、変異を検出する方法である。本明細書において「PTDSS2遺伝子領域」とはPTDSS2遺伝子を含むゲノムDNA上の一定領域を意味する。該領域には、PTDSS2遺伝子の発現制御領域（例えば、プロモーター領域、エンハンサー領域）やPTDSS2遺伝子の３’末端非翻訳領域などが含まれる。これら領域における変異は、例えば、PTDSS2遺伝子の転写活性に影響を与えうる。
【００３９】
塩基配列の決定は、マキサムギルバート法やサンガー法など当業者に公知の方法で行うことができる。
【００４０】
決定したDNAもしくはcDNAの塩基配列を対照（例えば、同一患者の非がん組織由来のDNAもしくはcDNAの塩基配列）と比較することにより、被験組織におけるPTDSS2遺伝子領域の変異の有無を判別することができる。
【００４１】
PTDSS2遺伝子領域の変異を検出するための方法は、DNAやcDNAの塩基配列を直接決定する方法以外に、変異の検出が可能な種々の方法によって行うことができる。
【００４２】
例えば、本発明における変異の検出は、以下のような方法によっても行うことができる。まず、生物学的試料からDNAもしくはcDNA試料を調製する。次いで、PTDSS2遺伝子領域の変異を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有し、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素が標識されたオリゴヌクレオチドプローブを調製する。そして、前記DNA試料に、前記オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせ、さらに前記オリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズした前記DNA試料を鋳型として、PTDSS2遺伝子領域の前記変異を含む塩基配列を増幅する。そして、前記増幅に伴うオリゴヌクレオチドプローブの分解により、前記レポーター蛍光色素が発する蛍光を検出し、次いで検出した前記蛍光を対照と比較する。このような方法としては、ダブルダイプローブ法、いわゆるTaqMan（登録商標）プローブ法が挙げられる。
【００４３】
さらに別の方法においては、生物学的試料からDNAもしくはcDNA試料を調製する。次いで、DNA二重鎖間に挿入されると蛍光を発するインターカレーターを含む反応系において、前記DNA試料を鋳型として、PTDSS2遺伝子領域の前記変異を含む塩基配列を増幅する。そして、前記反応系の温度を変化させ、前記インターカレーターが発する蛍光の強度の変動を検出し、検出した前記温度の変化に伴う前記蛍光の強度の変動を対照と比較する。このような方法としては、HRM（high resolution melting、高分解融解曲線解析）法が挙げられる。
【００４４】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からDNAもしくはcDNA試料を調製する。次いで、PTDSS2遺伝子領域の変異部位を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを制限酵素により切断する。次いで、DNA断片をその大きさに応じて分離する。次いで、検出されたDNA断片の大きさを、対照と比較する。このような方法としては、例えば、制限酵素断片長変異（Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP）を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げられる。
【００４５】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からDNAもしくはcDNA試料を調製する。次いで、PTDSS2遺伝子領域の変異部位を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる。次いで、解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する。分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を対照と比較する。このような方法としては、例えばPCR-SSCP（single-strand conformation polymorphism、一本鎖高次構造変異）法が挙げられる。
【００４６】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からDNAもしくはcDNA試料を調製する。次いで、PTDSS2遺伝子領域の変異部位を含むDNAを増幅する。さらに、増幅したDNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル上で分離する。次いで、分離したDNAのゲル上での移動度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（denaturant gradient gel electrophoresis:DGGE）法が挙げられる。
【００４７】
さらに別の方法としては、生物学的試料から調製したPTDSS2遺伝子領域の変異部位を含むDNA、および、該DNAにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが固定された基板、を用いる方法がある。このような方法としては、例えば、DNAアレイ法等が挙げられる。
【００４８】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からDNAもしくはcDNA試料を調製する。また、「PTDSS2遺伝子領域の変異部位の塩基の１塩基３’側の塩基およびその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ―」を調製する。次いで、該DNAを鋳型とし、該プライマーを用いて、ddNTPプライマ―伸長反応を行う。次いで、プライマ―伸長反応産物を質量分析機にかけ、質量測定を行う。次いで、質量測定の結果から遺伝子型を決定する。次いで、決定した遺伝子型を対照と比較する。このような方法としては、例えば、MALDI-TOF/MS法が挙げられる。
【００４９】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からDNAもしくはcDNA試料を調製する。次いで、５’−「PTDSS2遺伝子領域の変異部位の塩基およびその５’側の塩基配列と相補的な塩基配列」−「PTDSS2遺伝子領域の変異部位の１塩基３’側の塩基およびその３’側の塩基配列とハイブリダイズしない塩基配列」−３’（フラップ）からなるオリゴヌクレオチドプローブを調製する。また、「PTDSS2遺伝子領域の変異部位の塩基およびその３’側の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプローブ」を調製する。次いで、調製したDNAに、上記２種類のオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズしたDNAを一本鎖DNA切断酵素で切断し、フラップを遊離させる。本発明において、一本鎖DNA切断酵素としては、特に制限はなく、例えばcleavaseが挙げられる。本方法においては、次いで、フラップと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプローブであって、レポーター蛍光およびクエンチャー蛍光が標識されたオリゴヌクレオチドプローブをフラップにハイブリダイズさせる。次いで、発生する蛍光の強度を測定する。次いで、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Invader法が挙げられる。
【００５０】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からDNAもしくはcDNA試料を調製する。次いで、PTDSS2遺伝子領域の変異部位を含むDNAを増幅する。そして、増幅したDNAを一本鎖に解離させ、解離させた一本鎖DNAのうち、片鎖のみを分離する。次いで、PTDSS2遺伝子領域の変異部位の塩基の近傍より１塩基ずつ伸長反応を行い、その際に生成されるピロリン酸を酵素的に発光させ、発光の強度を測定する。そして、測定した蛍光の強度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、Pyrosequencing法が挙げられる。
【００５１】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からDNAもしくはcDNA試料を調製する。次いで、PTDSS2遺伝子領域の変異部位を含むDNAを増幅する。次いで、「PTDSS2遺伝子領域の変異部位の塩基の１塩基３’側の塩基およびその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ―」を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したDNAを鋳型とし、調製したプライマーを用いて一塩基伸長反応を行う。そして、蛍光の偏光度を測定する。次いで、測定した蛍光の偏光度を対照と比較する。このような方法としては、例えば、AcycloPrime法が挙げられる。
【００５２】
さらに別の方法においては、まず、生物学的試料からDNAもしくはcDNA試料を調製する。次いで、PTDSS2遺伝子領域の変異部位を含むDNAを増幅する。次いで、「PTDSS2遺伝子領域の変異部位の塩基の１塩基３’側の塩基およびその３’側の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドプライマ−」を調製する。次いで、蛍光ラベルしたヌクレオチド存在下で、増幅したDNAを鋳型とし、調製したプライマ−を用いて、一塩基伸長反応を行う。次いで、一塩基伸長反応に使われた塩基種を判定する。次いで、判定された塩基種を対照と比較する。このような方法として、例えば、SNuPE法が挙げられる。なお、変異がPTDSS2タンパク質におけるアミノ酸の変化（例えば、置換、欠失、挿入）を伴うものであれば、生物学的試料から調製される試料はタンパク質であってもよい。このような場合、変異を検出するには、該変異によりアミノ酸の変化が生じた部位に特異的に結合する分子（例えば、抗体）を用いる方法を利用することができる。
【００５３】
本発明において、PSS1とPSS2ががん細胞において合成致死の関係にあり、PSS2の機能抑制が生じているがん細胞においてPSS1を阻害すると、当該がん細胞の増殖を抑制しうることが見出された。この知見に基づけば、PSS2の機能抑制を指標として、PSS1を阻害する化合物によるがんの治療への応答性を評価することができる。従って、本発明は、被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中におけるPSS2の機能抑制の有無を検出し、PSS2の機能抑制が検出された被験者を、PSS1阻害剤によるがんの治療への応答性があると判定することを含む、PSS1阻害剤によるがんの治療への応答性を予測する方法を提供する。
【００５４】
また、こうしてPSS2の機能抑制が検出された被験者は、PSS1阻害剤によるがんの治療に適しており、PSS2の機能抑制を指標として、PSS1阻害剤によるがんの治療を受けるべき患者とそうではない患者とを選別し、効率的な治療を行うことができる。従って、本発明は、被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料におけるPSS2の機能抑制の有無を検出し、PSS2の機能抑制が検出された被験者を、PSS1阻害剤によるがんの治療の対象として選別することを含む、PSS1阻害剤によるがんの治療の対象を選別する方法をも提供する。
【００５５】
本発明において対象となるがんとしては特に制限はなく、全てのがんを対象とすることができる。PSS2の機能抑制が認められるがんとしては、例えば、精巣性胚細胞腫瘍、卵巣がん、膀胱がん、肺がん、乳がん、食道がん等があるが、これらに限定されず、例えば、結腸がん、前立腺がん、胃がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、子宮体がん、腎がん、甲状腺がん、扁平上皮がん、白血病、骨肉腫、メラノーマ、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、頭頚部がん、睾丸腫瘍、大腸がん、血液がん、網膜芽細胞腫、膵臓がん等であってもよい。
【００５６】
一方では、PTDSS2遺伝子の存在する染色体11p15.5のLOH（Loss of Heterozygosity）と非小細胞肺がんの予後不良との相関が報告されていることから(Journal of Clinical Oncology, Vol 20, No 5 (March 1), 2002: pp 1353-1360)、染色体11p15.5のLOHが生じている非小細胞肺がんは本発明の対象となり得ると本発明者は考えている。また、PSS2欠損は肺線がんにおいてEGFR変異、ALK融合遺伝子変異とは重ならない傾向が観察されたことから、本発明は、現状では薬物治療の選択肢が化学療法剤のみとなっているEGFR変異あるいはALK変異が認められない肺腺がん患者における新たな治療法を提供するものである。
【００５７】
他の態様において、本発明は、被験者由来の生物学的試料を用い、該生物学的試料中におけるPSS2の機能抑制の有無を検出し、PSS2の機能抑制が検出された被験者に対し、PSS1阻害剤を投与することを含む、PSS2の機能抑制が生じているがんの治療方法を提供する。また、PSS1阻害剤を含むPSS2の機能抑制が生じているがんの治療剤を提供する。
【００５８】
本発明における「PSS1阻害剤」としては特に制限はなく、公知の化合物であってもよく、後述のスクリーニングにより同定される化合物であってもよい。
【００５９】
PSS1阻害剤は、その特性に応じて、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの各種形態として、がん患者に対して、経口的な投与あるいは非経口的な投与（例えば、静脈投与、動脈投与、局所投与）を行うことができる。投与量は、PSS1を阻害してがんを治療するのに有効な量であれば特に制限はない。化合物の性質の他、がん患者の年齢、体重、症状、健康状態、がんの進行状況などに応じて、適宜選択すればよい。投与頻度としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１日あたりの投与量を、１日に１回で投与してもよいし、複数回に分けて投与してもよい。PSS1を阻害する化合物をヒトに投与する場合、投与量の範囲は、１日当たり、約0.01mg/kg体重〜約500mg/kg体重、好ましくは、約0.1mg/kg体重〜約100mg/kg体重である。ヒトに投与する場合、好ましくは、１日あたり１回、あるいは２から４回に分けて投与され、適当な間隔で繰り返すのが好ましい。また、１日量は、医師の判断により必要によっては上記の量を超えてもよい。
【００６０】
＜がんの治療に用いるPSS1阻害剤のスクリーニング方法＞
本発明は、PSS2の機能抑制が生じているがんの治療に用いる化合物のスクリーニング方法であって、PSS1を阻害するか否かを指標として化合物を選別する工程を含む方法を提供する。
【００６１】
PSS1はホスファチジルセリンを生成する酵素であるので、PSS1によるホスファチジルセリンの生成を確認する試験を用いることにより本発明のスクリーニング系を確立することができる。
【００６２】
本発明のスクリーニング系に適用する被験化合物としては特に制限はなく、例えば、合成低分子化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、ペプチドライブラリー、siRNA、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
【００６３】
本発明のスクリーニングにより同定されたPSS1阻害剤は、薬学上許容される担体と混合し、公知の製剤学的方法で製剤化することにより、医薬品とすることができる。薬学上許容される担体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられるが、これらに制限されない。
【実施例】
【００６４】
[試験例１]  合成致死関係にある遺伝子ファミリーの探索
（in silico予測）
The Cancer Genome Atlas (TCGA) Data(National Cancer Institute提供)を用い、がん患者由来の各種がん組織における遺伝子のコピー数のデータから、がん組織においてホモ欠損が見出された約9000個の遺伝子を抽出した。【００６５】
次に、抽出した遺伝子のうち、ある遺伝子ファミリーに属し、かつ、膵臓がん、肺がん、乳がん、腎臓がんまたは多形性膠芽腫のいずれかのがんの１％以上においてホモ欠損がみられた遺伝子をさらに抽出した。そのうちでも、機能的に重複がある他の１遺伝子とともに２つの遺伝子で遺伝子ファミリーを形成し、かつ、文献情報において前記２つの遺伝子ともにホモ欠損によってもマウス等で致死となる報告がない遺伝子をさらに抽出した。抽出された遺伝子ファミリーは２６ファミリーであった。【００６６】
選択された２６ファミリーのうちの一つに属する遺伝子であるPTDSS2の各種がんにおける遺伝子の状態（ホモ欠損、ヘテロ欠損、二倍体、増幅）を図１に示す。
（PTDSS2遺伝子欠損細胞株の探索）
in silico予測において抽出された遺伝子の一つであるPTDSS2について各種がん細胞株における状態をCancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)データベース（Broad Institute提供）を用いて解析した（図２）。ZR-75-1細胞、MDA-MB-435S細胞およびTE-1細胞において、PTDSS2のコピー数およびmRNAレベルの減少を確認した（図３）。
（PTDSS2欠損株におけるPTDSS1ノックダウンによる増殖阻害）
PTDSS2遺伝子に欠損のない細胞株（HCT-116細胞、ARPE19細胞、MCF10A細胞）およびPTDSS2へテロ欠損細胞株（ZR-75-1細胞、MDA-MB-435S細胞、TE-1細胞）に対するPTDSS1ノックダウンの影響をPTDSS1に対するRNA干渉により検討した。【００６７】
MCF10A以外の各細胞は10％のウシ胎児血清（FBS）で補充した培地中で培養した。細胞と培地の組み合わせは下記の通りである。
ZR-75-1細胞:RPMI-1640(Gibco:A10491-01）
MDA-MB-435S細胞、TE-1細胞、ARPE細胞：RPMI-1640(Gibco:11875-093)
HCT116細胞：McCoy’s 5A改変培地
MCF10A細胞は、MGBM培地に対し、添加物 (Lonza/Clonetics Corporation: Catalog No. CC-3150（GA1000以外）)を加え、さらに100 ng/ml cholera toxinを添加した培地中で培養した。【００６８】
PTDSS1タンパク質をノックダウンするために、ショートヘアピン(sh)RNA発現レンチウイルスベクター作製用プラスミド（PTDSS1 MISSION shRNA Plasmid DNA (Product number: SHCLND-NM_014754 TRC number: TRCN0000045808)）をSIGMA ALDRICHより購入した。陰性対照にはMISSION（登録商標） pLKO.1-puro Non-Mammalian shRNA Control Plasmid DNA (SHC002)を用いた。【００６９】
shRNAの発現に際しては、リポフェクタミン2000(Invitrogen)を使用して、ViraPower Lentiviral Expression System (Life Technologies)とともに上記のプラスミドを、LentiX-293細胞にコトランスフェクトし、shRNA発現カセットの形質導入のためのレンチウイルスを作製した。作製したレンチウイルスを各細胞株に感染させ、ピューロマイシンを用いて感染細胞を選抜した。３日間から１週間選抜した後、各細胞においてPTDSS1遺伝子のmRNAレベルでのノックダウンを確認した。【００７０】
PTDSS1に対するRNA干渉により、PTDSS2欠損株において有意な細胞増殖阻害が観察された。PTDSS2の欠損がない細胞株においてはPTDSS1に対するRNA干渉による細胞増殖阻害は観察されなかった（図４）。
（PTDSS2欠損株におけるPTDSS1ノックダウンによるホスファチジルセリン生成阻害）
PTDSS2へテロ欠損株であるZR-75-1細胞、あるいはPTDSS2野生型であるHCT116細胞を96穴プレートに播種した。翌日、L-[U-14C]-セリン5μCi/ml含有MEM（10%透析済みウシ血清）と培地交換し、30分間培養した。細胞をPBSで2回洗浄したのち、メタノールを添加し30分間静置した。メタノールを回収し、メチルtert-ブチルエーテルと混合し、5分間静置した。さらに水を添加して混合後、10分間静置した。混合液を10分間、3000rpmで遠心分離し有機層を抽出した。有機層の放射活性を液体シンチレーションカウンターにて測定した。あるいは有機層を薄層クロマトグラフィー（分離溶媒：1-ブタノール:酢酸：水＝３：１：１）にて分離後、オートラジオグラフィを行った。播種する細胞数は、液体シンチレーションカウンターで測定する際には7.5×104個/ウェル、薄層クロマトグラフィーで解析する際には2×104個/ウェルで行った。【００７１】
PTDSS1に対するRNA干渉により、PTDSS2へテロ欠損株において、脂質へのセリンの取り込みおよびホスファチジルセリンの生成がPTDSS2野生型細胞株と比較してより強く阻害された（図５）。
（PTDSS2遺伝子破壊（PTDSS2-KO）HCT116細胞におけるPTDSS1ノックダウンの効果）
PTDSS1に対するRNA干渉に際してはON-TARGET plus SMARTpool siRNAをDharmacon社より購入して用いた。Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, 13778-150)を用いてPTDSS1 siRNA（カタログ番号：L-008568-00）あるいは非ターゲティングsiRNA（カタログ番号：D-001810-10-50）を細胞にトランスフェクトした。【００７２】
脂質へのセリン取り込みを観察する際には、トランスフェクトした各細胞を4×104個/ウェル96穴プレートに播種し、他は上記の方法と同様に行った。【００７３】
PTDSS1に対するRNA干渉により、PTDSS2-KO HCT116細胞（PTDSS2-KO#3、PTDSS2-KO#16）において有為な増殖阻害が観察され、脂質へのセリンの取り込みも強く阻害された。一方で親株のHCT116細胞（WT）においてはPTDSS1に対するRNA干渉による増殖阻害は観察されず、脂質へのセリンの取り込み阻害も弱かった（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明により、PSS1の機能抑制が生じているがん細胞を特異的に標的化するための治療戦略が提供された。本発明において、PSS1とPSS2が合成致死の関係にあり、PSS1を阻害する治療が、PSS2欠損型がんの治療のための有望なアプローチになることが判明した。また、この治療戦略においては、がん患者をPSS2の機能抑制を指標に選別した上で、PSS1阻害剤を投与できるため、コンパニオン診断に基づく効率的な治療が可能であることも明らかとなった。従って、本発明は、医療分野、特にがん治療の分野において、大きく貢献しうるものである。
【配列表フリーテキスト】
【００７５】
配列番号１：PSS1タンパク質（配列番号２）をコードするPSS1 mRNA。
配列番号３：PSS2タンパク質（配列番号４）をコードするPSS2 mRNA。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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