(57)【要約】  本発明は、EphA7陽性であることを特徴とする、単離された間葉系幹細胞様のヒト多能性（multipotent）幹細胞集団、前記細胞集団を含む医療材料、及び毛細血管を含む組織由来の付着性細胞からEphA7陽性細胞を分離することを特徴とする前記細胞集団の製造方法に関する。
2017022649.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
EphA7陽性であることを特徴とする、単離された間葉系幹細胞様のヒト多能性（multipotent）幹細胞集団。
【請求項２】
１以上の周細胞マーカーが陽性である、請求項１記載の細胞集団。
【請求項３】
１以上の神経幹細胞マーカーが陽性である、請求項１又は２記載の細胞集団。
【請求項４】
CD34及びCD45陰性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項５】
脳由来ではない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項６】
毛細血管を含む組織に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項７】
スフェア形成能を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項８】
間葉系細胞に分化可能である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項９】
神経系細胞に分化可能である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項１０】
血管新生能を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞集団。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞集団を含む、組織又は器官再生用の医療材料。
【請求項１２】
組織又は器官が間葉系及び神経系の組織又は器官から選ばれる、請求項１１記載の医療材料。
【請求項１３】
毛細血管を含む組織に由来する付着性細胞からEphA7陽性の細胞群を分離することを特徴とする、多能性（multipotent）幹細胞集団の製造方法。
【請求項１４】
毛細血管を含む組織の細胞から付着性の細胞群を分離する工程、前記付着細胞群から周細胞マーカー陽性細胞群を分離する工程、及び、前記周細胞マーカー陽性細胞群からEphA7陽性の細胞群を分離する工程を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
毛細血管を含む組織が皮下脂肪組織、骨格筋組織、心臓組織、腎臓組織、及び内臓脂肪組織から選ばれるいずれかである、請求項１３又は１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１５−１５１６０１号（２０１５年７月３１日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
［技術分野］
本発明は、ヒトに由来する特定の表面マーカーを発現する間葉系幹細胞様細胞集団と前記細胞集団を含む組織又は器官再生用の医療材料（医薬組成物、医療機器、及び医療製品）に関する。
【背景技術】
【０００２】
成体組織内には、間葉系幹細胞（mesenchymal stem cells; MSCs）などの組織幹細胞が存在し、臓器・組織の構造や機能の維持や、各種疾患病態下における組織再生やリモデリングに深く関わっている。近年では、こうした間葉系幹細胞の再生能を積極的に利用した細胞導入法などの再生医療への応用も期待されている。【０００３】
周細胞（Pericytes;PCs）は、毛細血管の構造安定化とともに、血管壁の透過性や収縮性などの機能に関わっている。 最近、様々な組織内の毛細血管周細胞の中で間葉系幹細胞様の多分化能を有する細胞（周幹細胞）が相ついで報告されている。【０００４】
周幹細胞は、（１）体内組織の隅々に分布する毛細血管の構造細胞であること、（２）幹細胞として維持できる特別な組織内環境が血管周囲に存在すること（Vascular Niche）の知見と相まって、組織幹細胞のなかでも、組織再生や線維化などのリモデリングに関わる基盤的な幹細胞として注目されている。【０００５】
周幹細胞を正常ヒト組織から分離する方法の確立は、周幹細胞の特性解析、さらに同細胞を利用した（ないし標的とした）臨床応用において必要不可欠である。周細胞は一般的な周細胞マーカー(NG2, PDGFRβ, CD146)で同定されるが、多分化能をもつ周幹細胞を選択的に同定する方法はなかった（非特許文献１）。 最近、Nestinやβ3Tubulin発現周細胞が、多分化能をもつ周細胞であると報告されている（非特許文献２、３）。 しかし、これらはすべて細胞内に局在するマーカーであり、その遺伝子発現と連関して蛍光発光する遺伝子改変動物を使う以外には、ヒト組織はもちろん、実験動物組織から生細胞として周幹細胞を分離する方法は確立していない。【０００６】
発明者らは、温度感受性SV40T抗原発現マウスを用いて、末梢組織毛細血管由来の10系統のクローン周細胞株を樹立し、この中から、多分化能を有する複数の周幹細胞株を見出した（特許文献１）。このクローン細胞は、従来報告されている間葉系幹細胞様の多分化能に加えて、神経系細胞への分化能をもつ神経幹細胞（Neural stem cells；NSCs)様細胞であり、また自ら内皮・周細胞に分化し、組織再生に不可欠な機能的な血管を構築することができ、優れた組織再生能を保持していることが確認されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１３／１１８７８６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Armulik A. et al., Dev Cell. 2011 Aug 16;21(2):193-215.
【非特許文献２】Birbrair A. et al., Stem Cell Res. 2013 Jan;10(1):67-84.
【非特許文献３】Stapor PC1, Murfee WL., Microvasc Res. 2012 Mar;83(2):257-62.
【非特許文献４】Kabara M, Kawabe J, et al. Lab Invest. 2014;94:1340-1354.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、血管新生能と組織実質細胞を供給する組織幹細胞としての機能を有するヒト周幹細胞を選択的に同定する細胞表面マーカーを特定し、これを利用して正常ヒト組織から周幹細胞を簡便に分離し、組織再生に応用することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するために、発明者らはマウスの末梢組織毛細血管由来の10系統のクローン周細胞株（前掲）から、分化能の程度が異なる３種の周幹細胞株を選び、その発現遺伝子について網羅的アレイ比較解析を行った。これらの細胞株は、単一の細胞からクローン化したものであるため遺伝子背景が均一であり、それぞれの株ごとの細胞機能（多分化能）が１０数継代にわたって安定して保持されている。それゆえ、発現遺伝子の網羅的アレイ比較解析により、分化能という細胞機能に連関する遺伝子群を効率よく抽出することができる。【００１１】
かくして、発明者らは、細胞表面に局在する候補因子から、周幹細胞を同定・分離できるマーカーとしてEphA7を見出し、これを用いてヒト周幹細胞を単離することに成功した。【００１２】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１５）に関する。
（１）EphA7陽性であることを特徴とする、単離された間葉系幹細胞様のヒト多能性（multipotent）幹細胞集団。
（２）１以上の周細胞マーカー、好ましくはNG2、PDGFRβ、CD13、CD146、NGFR、α-smooth muscle actin、Desmin、及びRGS5から選ばれる１以上の周細胞マーカー、より好ましくはNG2が陽性である、上記（１）記載の細胞集団。
（３）１以上の神経幹細胞マーカー、好ましくはNestin、β3Tubulin、S100A、RC2、Sox2、CD133、及びFABP7から選ばれる１以上の神経幹細胞マーカー、より好ましくはNestin、β3Tubulin、及びS100Aから選ばれる１以上が陽性である、上記（１）又は（２）記載の細胞集団。
（４）CD34及びCD45陰性である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞集団。
（５）脳由来ではない、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の細胞集団。
（６）毛細血管を含む組織に由来する、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の細胞集団。
（７）スフェア形成能を有する、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の細胞集団。
（８）間葉系細胞に分化可能である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞集団。
（９）神経系細胞に分化可能である、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の細胞集団。
（１０）血管新生能を有する、上記（１）〜（９）のいずれかに記載の細胞集団。
（１１）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の細胞集団を含む、組織又は器官再生用の医療材料（前記医療材料には、医薬組成物、医療機器、及び医療製品を含む）。
（１２）組織又は器官が間葉系の組織又は器官（たとえば、骨、軟骨、腱、脂肪、血管、骨格筋、及び心筋）及び神経系の組織又は器官から選ばれる、上記（１１）記載の医療材料。
（１３）毛細血管を含む組織に由来する付着性細胞からEphA7陽性の細胞群を分離することを特徴とする、多能性（multipotent）幹細胞集団の製造方法。
（１４）毛細血管を含む組織の細胞から付着性の細胞群を分離する工程、前記付着細胞群から周細胞マーカー、好ましくはNG2、PDGFRB、及びCD146から選ばれる１以上、より好ましくはNG2の周細胞マーカー陽性細胞群を分離する工程、及び、前記周細胞マーカー陽性細胞群からEphA7陽性の細胞群を分離する工程を含む、上記（１３）記載の方法。
（１５）毛細血管を含む組織が皮下脂肪組織、骨格筋組織、心臓組織、腎臓組織、及び内臓脂肪組織から選ばれるいずれかである、上記（１３）又は（１４）記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の細胞集団は、生体に存在する基盤組織幹細胞であり、従来知られている細胞表面マーカーで単離された間葉系幹細胞に比べて組織再生に必要十分な純度の細胞である。そのため、癌化のリスクが少なく、また患者由来の細胞を利用できるため倫理的問題や拒絶反応のリスクが少ない。
本発明の細胞集団は、高い脈管形成・再生能を有し、栄養・酸素の供給路である脈管系を構築し、幹細胞機能維持のための環境（Vascular Niche）を提供することができる。すなわち、組織再生・維持に必要不可欠な要素をそれ自体で供給できる細胞集団である。
本発明の細胞集団は多分化能（multipotency）を有し、脈管形成とともに、さまざまな組織実質細胞を供給する。すなわち、脈管構築して組織再生の基礎を作るとともに、組織幹細胞としてはたらき、間葉系細胞（脂肪、骨、軟骨、骨格筋等）、神経系細胞（グリア細胞、シュワン細胞等）に分化する。【００１４】
本発明の細胞集団は、毛細血管構成細胞として体中に広く分布し、臓器再生の基本となる毛細血管を構築する一方で、幹細胞として組織実質細胞を再生することができる、臓器再生にとって合理的な幹細胞である。それゆえ、様々な疾患における組織再生用医薬又は医療用材料として極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１はマウスCapillary stem cells（CapSCs）(NG2陽性EphA7陽性細胞））の調製手順を示す。
【図２Ａ】図２ＡはマウスCapSCs（NG2陽性EphA7陽性細胞）の脂肪細胞及び神経細胞への分化を粗脂肪組織間質細胞(crude adipose stromal cells; ASCs))及び crude pericytes (NG2陽性EphA7陰性細胞）)と比較して示した免疫染色像（左：脂肪細胞分化：FABP4による免疫染色、右：神経オリゴ細胞分化： marker O4（OligoM4）による免疫染色（いずれも上から、crude ASCs、crude PCs、CapSCs））。
【図２Ｂ】図２ＢはマウスCapSCs（NG2陽性EphA7陽性細胞）の骨芽細胞への分化をPCs（NG2陽性EphA7陰性細胞）と比較して示したオステオポンチンによる免疫染色像（上：CapSCs、下：PCs（いずれも、左は高倍率、右は低倍率）。
【図２Ｃ】図２ＣはマウスCapSCs（NG2陽性EphA7陽性細胞）の神経幹細胞への分化をPCs（NG2陽性EphA7陰性細胞）と比較して示したNestinによる免疫染色像（左：CapSCs、右：PCs（いずれも、上は分化誘導なし、下は分化誘導あり、左は高倍率、右は低倍率））。
【図２Ｄ】図２ＤはマウスCapSCs（NG2陽性EphA7陽性細胞）の神経系細胞（アストロサイトおよび神経細胞）への分化をPCs（NG2陽性EphA7陰性細胞）と比較して示した免疫染色像（左：CapSCs、右：PCs（いずれも上はGFAPによる免疫染色、下はTubulinβ3による免疫染色）。
【図３】図３はマウスCapSCsの増殖能をPCsと比較して示したもの（上：４代継代（p4）、下右：７代継代(p7)、下左：CapSCsによるスフェア形成）。マウスCapSCsはPCsに比べて増殖能が高く、7代継代後スフェアを形成した。
【図４Ａ】図４ＡはマウスCapSCsの遺伝子発現プロファイルを、PCs及びASCsと比較して、定量的RT-PCRで解析した結果を示す。マウスCapSCsは、既知のPCマーカー（NG2、PDGFRβ、CD146）及びNSCマーカー（Nestin、β3Tubulin、S100A）では、PCs及びASCsと区別できず、EphA7でのみ区別することができた。
【図４Ｂ】図４ＢはマウスCapSCsの表面マーカー発現プロファイルを2 colorフローサイトメトリーで解析した結果を示す。マウスCapSCsは、既知のMSCマーカー（CD29、44、106、Sca1）陽性、造血幹細胞（hematopoietic stem cells; HSC）マーカー（CD34）陰性、及び骨髄・血球系マーカー（CD45）陰性であった。
【図５】図５はヒトCapSCs（NG2陽性EphA7陽性細胞）の調製手順を示す。
【図６Ａ】図６ＡはヒトCapSCs（NG2陽性EphA7陽性細胞）の脂肪細胞への分化を示すFABP（赤）および脂肪滴蓄積を示すBODIPY（緑）による免疫染色像（左：ヒトCapSCs、右：ヒトPCs）。
【図６Ｂ】図６ＢはヒトCapSCs（NG2陽性EphA7陽性細胞）の神経系細胞への分化を示すGFAP（上）及びTubulinβ3（下）による免疫染色像（左：ヒトCapSCs、右：ヒトPCs）。
【図７】図７はヒトCapSCsの三次元ゲル上での毛細血管形成を示す（上：左からVEGF 5ng/ml, 10 ng/ml, 50 ng/ml、下：左はヒトPCs、右はヒトCapSCs）。
【図８】図８はヒトCapSCsのスフェア形成を示す。
【図９】図９はヒトCapSCsの表面マーカー発現プロファイルを2 colorフローサイトメトリー（左）及び定量的RT-PCR（右）で解析した結果を示す。ヒトCapSCsは、既知のMSCマーカー（CD44、90、105）陽性、既知のPCマーカー（NG2、CD146）陽性、及びHSCマーカー（CD34）、骨髄・血球系マーカー（CD45）陰性であった。また、ヒトCapSCsは、既知のPCマーカー（NG2、PDGFRβ3）では、PCsと区別できず、EphA7でのみ区別することができた。
【図１０】図１０は、ヌードマウス重症下肢虚血モデルにおけるマウスCapSCs細胞導入療法の効果を示す（Ａ：虚血下肢（左）とドップラー計測（右）の写真、Ｂ：血流ドップラー計測結果（%RBF））。CapSCs投与群では、細胞非投与群あるいはPC(NG2陽性EphA7陰性細胞）（対照）に比べて、顕著な組織再生（Ａ左）及び下肢虚血の有意な回復（Ａ右及びＢ）が認められた。
【図１１】図１１は、cardiotoxin（CTX）による障害腓腹筋におけるマウスCapSCs細胞導入の効果を示す（Ａ：（上）腓腹筋組織の短軸切片のHE染色、（下）腓腹筋組織の短軸切片の面積、Ｂ：腓腹筋組織の短軸および長軸切片を蛍光観察した結果）。CapSCsは対照細胞（PCs）に比較して、顕著な障害腓腹筋改善効果を示し、2-3週間で非障害腓腹筋（CTX(-)）と同等骨格筋量にまで回復した。GFP蛍光発光Capscを導入した2週後、GFP陽性骨格筋および血管（レクチンで赤蛍光染色）に分化して組織に生着していることが確認できた。
【図１２】図１２は、酸素誘発発生網膜血管新生モデル(OIR)（未熟児網膜症モデル）におけるマウスCapSCs導入効果を示す（左：対照眼（細胞非投与）、右：CapSCs投与眼）。CapSCs投与群では、無血管領域が減少、病的新生血管形成が改善した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．本発明の細胞集団（CapSCs)
本発明は、EphA7陽性で特徴づけられる、単離された間葉系幹細胞様の多能性（multipotent）幹細胞集団に関する。後述するように、本発明の細胞集団は毛細血管を含む組織から単離されたため、本明細書ではこの細胞集団をCapSCs （capillary stem cells)と記載することもある。
【００１７】
本明細書において、「間葉系幹細胞様」とは、間葉系幹細胞類似の特性を有することを意味する。具体的に言えば、間葉系幹細胞に特徴的なマーカー（好ましくは、CD29 、CD44、CD90、CD105、CD106（マウスの場合Sca1）等から選ばれる１又は２以上）を発現し、間葉系に属する組織の細胞（脂肪、骨、軟骨、骨格筋等）に分化可能であり、間葉系幹細胞に特有の特性・形態を有することを意味する。
【００１８】
（１）マーカー
本発明の細胞集団はEphA7陽性で特徴づけられる。「EphA7（Ephrin type-A receptor 7）」は、プロテインキナーゼファミリーのephrin受容体サブファミリーに属するタンパクである。ephrin及びephrin関連受容体は、発生、特に神経系の発生に関連すると考えられている。ephrin受容体は、細胞外ドメイン配列とそのリガンドへの結合親和性から２つのグループ：ephrin-Aとephrin-Bに大別される。「EphA7」は、脳・神経系の発生に重要であることが知られており、幹細胞、特に間葉系幹細胞や周細胞での発現は報告されていない。発明者らは、樹立した周幹細胞株において、この「EphA7」が多分化能に関連した遺伝子であることを特定した。
【００１９】
本発明の細胞集団は、間葉系幹細胞に特徴的なマーカーに加えて、神経系幹細胞に特徴的なマーカーを発現している。神経系幹細胞に特徴的なマーカーとしては、例えば、Nestin、Tubulinβ3、S100A、RC2、Sox2、CD133、FABP7などを挙げることができる。本発明の細胞集団は、これらの神経系幹細胞マーカーの１以上、好ましくはNestin、β3Tubulin、及びS100Aから選ばれる１以上が陽性である。本発明の細胞集団は、さらに周細胞に特徴的なマーカーを発現していても良い。周細胞に特徴的なマーカーとしては、例えばNG2、PDGFRβ、CD13、CD146、NGFR、α-smooth muscle actin、Desmin、及びRGS5などを例示することができる。本発明の細胞集団は、これらの周細胞マーカーの１以上、好ましくはNG2が陽性である。
【００２０】
一方、本発明の細胞集団は、HSCマーカーであるCD34は陰性であり、また骨髄・血球系マーカーであるCD45も陰性である。
【００２１】
マーカーの遺伝子レベルでの発現は、常法にしたがい、RT-PCR、DNAチップ等を用いて、定量的に確認することができる。表面マーカーの場合であれば、該マーカー（抗原）に特異的な標識抗体を用いた免疫染色やフローサイトメトリー等を利用することで、タンパクレベルでの発現を簡便かつ定量的に確認することができる。なお、表面マーカーを利用した細胞の分離については次項で詳述する。
【００２２】
（２）由来
本発明の細胞集団は、ヒトの全身に広く存在する組織幹細胞であり、その由来は特に限定されないが、脳由来でないことが好ましい。本発明の細胞集団は、組織毛細血管あるいは毛細血管を含む組織から効率的に単離することができ、「毛細血管を含む組織」としては、例えば、皮下脂肪組織、骨格筋組織、心臓組織、腎臓組織、内臓脂肪組織等をあげることができる。
【００２３】
本発明の細胞集団は、ヒト組織から直接単離された細胞であってもよく、当該細胞を継代培養して得た細胞であってもよく、これらの細胞を株化した細胞株であっても良い。本発明の細胞集団に含まれる個々のCapSCは、天然においては上記のように全身の組織に分散して存在しており、局所におけては、その環境に適した密度で存在し、その微小環境に適した機能を発現している。本発明では、後述の通り、EphA7という特異的マーカーによりCapSCを分離し、CapSCを純化・富化した細胞集団とすることによって、疾患の治療、組織再生等の、天然の状態では為しえなかった優れた作用効果を発揮することができる。このことは、実施例４〜６において、天然のCapSCが存在するコントロール群と比較して、CapSCの細胞集団を適用した群において、明らかな治療効果が示されていることにより裏付けられる。すなわち、本発明の細胞集団は、天然状態の細胞と比較して、顕著に優れた特性を有しているものである。
【００２４】
（３）増殖能
本発明の細胞集団は、後述する間葉系幹細胞に適した条件の培養下において優れた増殖能を有し、また培養容器として細胞非接着性のものを用いる等、接着しない条件下で培養することによりスフェアを形成する（以下、「スフェア形成能」と言う）。
【００２５】
（４）分化能
本発明の細胞集団は、「間葉系幹細胞様」の多能性幹細胞であり、間葉系細胞（脂肪、骨、軟骨、骨格筋等）に分化可能であるが、神経系細胞（グリア細胞、シュワン細胞など）にも分化可能であり、さらに、毛細血管幹細胞としての血管形成能も有する分化多能性（multipotent）の幹細胞である。なお、本明細書において「多能性（multipotent）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へ分化できる能力を意味し、三胚葉の全てに分化可能（pluripotent）であることを必ずしも意味しない。分化能は、たとえば、前掲Kabara M, Kawabe J, et al. Lab Invest. 2014;94:1340-1354に基づいて確認することができる。
【００２６】
（５）形態
細胞の形態は、間葉系幹細胞に特徴的な紡錘形ないし多角形を示し、接着性であるが、前述のとおり接着しない条件下で培養すると、増殖性が高い幹細胞の特徴である「スフェア形成能」を示す。
【００２７】
本発明の細胞集団は間葉系幹細胞と同様に免疫抑制能と炎症・組織傷害部位への集積性を有するとともに、周幹細胞の有する虚血組織における血管形成や傷害組織の再生能を有する。それゆえ、本発明の細胞集団は、各種疾患病態下での組織再生やリモデリングを促し、組織や器官の再生医療に応用できる。
【００２８】
２．CapSCsの調製方法
本発明の細胞集団は、毛細血管を含む組織に由来する付着性の細胞からEphA7陽性の細胞群を分離することにより調製することができる。
【００２９】
（１）細胞の単離
まず、毛細血管を含む組織から細胞を単離する。「毛細血管を含む組織」としては、前述のとおり、皮下脂肪組織、骨格筋組織、心臓組織、腎臓組織、内臓脂肪組織等を挙げることができる。細胞は、常法にしたがい、酵素（コラゲナーゼ、プロテアーゼ等）あるいは市販の細胞分散バッファー等でこれらの組織を処理することにより単離する。
【００３０】
（２）細胞の培養
単離した細胞は、間葉系細胞の培養に通常使用される培地に播種し、3〜４日間、好ましくは少なくとも２代以上継代培養する。得られた付着性の細胞は、トリプシン又はトリプシン・EDTA等で処理して容器から分離・回収する。所望により、得られた付着性の細胞から、さらに周細胞マーカー、たとえばNG2、PDGFRB、及びCD13から選ばれる１以上、好ましくはNG2陽性の細胞を分離してもよい。細胞の分離方法については後述する。
【００３１】
培地としては、間葉系細胞の培養に適した培地である限り、特に限定されない。標準的な培地としては、MEM培地、DMEM培地、BME培地、DME培地、α-MEM培地、IMEM培地、ES培地、DM-160培地、Fisher培地、F12培地、WE培地、RPMI培地、StemSpan培地、StemPro培地及びこれらの混合物を挙げることができる。あるいは市販の間葉系幹細胞培養用培地を用いてもよい。
【００３２】
培地には、血清又は血清代替物を加えてもよい。血清代替物としては、例えば、Knockout Serum Replacement(KSR:Invitrogen）、B-27サプリメント、N2-サプリメント、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）等が挙げられ、本発明の目的を損なわない範囲において、血清に代えて使用することができる。培地中の濃度は、使用する血清又は血清代替物によって適宜設定される。また培地には、必要に応じて、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、2-ME、3’チオールグリセロール等を加えてもよい。
【００３３】
培養は、通常間葉系細胞の培養に用いられる条件において行われ、例えば温度３７℃、酸素濃度２０％程度で行われる。当該分野で周知のとおり、培地における細胞の密度は、細胞の性質および分化の方向性に影響を与える。一般的には、適宜培地を交換しながら継代して、細胞密度が一定の密度（例えば、５，０００個／ｃｍ２）を超えないように継代培養することが好ましい。
【００３４】
（３）細胞の分離
次いで、分離した付着性細胞、又は周細胞マーカー、たとえばNG2、PDGFRB、及びCD13から選ばれる１以上、好ましくはNG2陽性の付着性細胞から、EphA7陽性の細胞を分離する。NG2、PDGFRB、CD13、EphA2はいずれも細胞表面抗原（マーカー）であるため、該抗原に特異的な抗体を利用することで、これらの表面マーカーを発現している細胞を簡便に分離することができる。換言すれば、本発明の細胞集団は、上記周細胞マーカー及びEphA7の発現により純化され、富化された細胞集団である。抗体を利用した分離方法としては、例えば、細胞分離ビーズ、磁気細胞分離、蛍光細胞分離等による方法等を挙げることができる。
【００３５】
細胞分離ビーズは、目的とする表面マーカーに対応する抗体を、化学結合あるいは物理吸着で表面に結合できるビーズであり、抗体を結合させたビーズを細胞と反応させることで、目的とする表面マーカー陽性細胞をビーズに結合させ、当該ビーズを遠心分離法等で回収することができる。あるいは、表面マーカーに対する抗体（一次抗体）と細胞を反応させた後、二次抗体を結合させたビーズを前記細胞と反応させて、目的とする表面マーカー陽性細胞を回収することができる。ビーズに結合した細胞は、ストレーナー等を用いて溶出し、回収することができる。
【００３６】
磁気細胞分離（例えば、MACS（登録商標）：Maginetic-activated cell sorting）は、表面マーカーに対応する抗体を結合させた磁気ビーズを用いて、特定の細胞を磁石で捕集することにより分離する手法である。大がかりな装置を必要とせず、大量の細胞を一度に処理できるが、分離精度の点では後述するFACSに劣る。MACSを自動で行う自動磁気細胞分離装置も市販されており、より簡便に細胞を分離・回収することができる。
【００３７】
蛍光細胞分離（例えば、FACS（登録商標）：Fluorescence activated cell sorting）は、蛍光抗体で標識した細胞を液流に流してレーザー光の焦点を通過させ、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって、細胞表面にある抗原量を測定するとともに、特定の細胞をセルソーターで分離する手法である。蛍光細胞分離は、磁気細胞分離に比較して費用と時間はかかるが、細胞損失は少ない。
【００３８】
本発明において、各表面マーカーによる細胞の分離は、上述した方法に限定されず、公知のいずれの方法を用いてもよく、試料や分離すべき細胞の量、解析や利用目的等に応じて、適宜選択すればよい。
【００３９】
細胞の培養は、好ましくはＧＭＰ基準の細胞調製施設「ＣＰＣ（Cell Processing Center）」で行う。対象へ投与する「臨床グレードの細胞」の調製は、無菌状態で細胞を操作すべく特別に設計された施設、より具体的には、空調制御、室圧制御、温湿度制御、パーティクルカウンター、ＨＥＰＡフィルターなどにより清潔度が担保されたＣＰＣで行うことが好ましい。また、ＣＰＣ施設自体のみならず、ＣＰＣ内で使用する全ての機器は、バリデーションにより性能が保障され、その機能を、随時モニタリング・記録することが好ましく、ＣＰＣでの細胞処理操作は、全て「標準手順書」によって厳格に管理・記録することが望ましい。
【００４０】
３．組織又は器官再生用の医療材料（医薬組成物、医療機器、医療製品）
本発明の細胞集団は、臓器再生の基本となる毛細血管を構築する一方で、幹細胞として組織実質細胞（間葉系細胞及び神経系細胞）を再生することができる、臓器再生にとって合理的な幹細胞である。それゆえ、本発明の細胞集団は組織又は器官再生用の医療材料として利用することができる。なお、本発明の「医療材料」には、国や地域の法令・規格上、医薬品（医薬組成物）、医療機器、医療製品に分類されるものの全てを含む。
【００４１】
医療材料として用いられる細胞集団は、自家細胞であっても、他家細胞であってもよく、また株化された細胞であってもよい。感染や拒絶反応等が問題となる場合には、患者の組織から調製された患者由来の細胞を利用することが好ましい。
【００４２】
対象となる組織又は器官は、本発明の細胞集団が分化しうるものである限り特に限定されず、例えば骨、軟骨、腱、脂肪、血管、骨格筋、心筋等の間葉系の組織又は器官、及び神経系の組織又は器官を挙げることができる。具体的には、本発明の細胞集団は間葉系細胞に分化して、筋ジストロフィーにおける骨格筋再生、重症下肢虚血における血管や骨格筋の再生、心筋梗塞における心筋再生の治療に利用することができる。また、本発明の細胞集団は神経系細胞に分化することで、網膜症における血管、神経再生及び血管安定化、脱髄疾患（EAE）における神経再生、脳梗塞等の治療に利用することができる。さらに、本発明の細胞集団は血管系細胞に分化することで、あらゆる臓器再生、修復に利用することができる。
【００４３】
なお、「組織又は器官の再生」とは、損傷した組織又は器官あるいはその機能の修復や再生を意味し、例えば、神経系組織であれば、神経の保護作用（例えば、軸索の再有髄化）、神経栄養作用（例えば、神経膠細胞の補充）、脳血管新生作用、神経再生等を含む。脳の損傷であれば、浮腫の低減、軸索の再有髄化、神経膠細胞の増加、血管新生、神経再生等に加えて、脳血流の回復、麻痺の回復、痛みやしびれの軽減も含む。再生効果は、損傷組織の物理学的検査、例えば、X線検査、CT、MRI、超音波検査、内視鏡検査、バイオプシーのほか、種々の血液学的検査、生化学検査、内分泌学的検査、運動機能検査、脳機能検査、認知機能検査等により確認することができる。
【００４４】
本発明の医療材料（医薬組成物、医療機器、医療製品）の生体への適用方法は特に限定されず、適用部位に応じて、外科的手段による局所移植、静脈内投与、腰椎穿刺投与、局所注入投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、脳内投与、脳室内投与、又は静脈投与などが考えられる。
【００４５】
本発明の細胞集団は、間葉系幹細胞に特徴的な、免疫抑制能、炎症・組織傷害部位への集積性を有する。腫瘍部位を含む虚血組織における血管形成や傷害組織の再生能を有するため、これらの部位に局在することで、血管を修復し、組織を再生させる。
【００４６】
本発明の医療材料は、細胞の維持・増殖、患部への投与を補助する足場材料や成分、他の医薬的に許容しうる担体を含んでいてもよい。細胞の維持・増殖に必要な成分としては、炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラル、塩類、各種サイトカイン等の培地成分、あるいはマトリゲルTM等の細胞外マトリックス調製品、が挙げられる。
【００４７】
患部への投与を補助する足場材料や成分としては、生分解性ポリマー；例えば、コラーゲン、ポリ乳酸、ヒアルロン酸、セルロース、及びこれらの誘導体、ならびにその２種以上からなる複合体、注射用水溶液；例えば生理食塩水、培地、ＰＢＳなどの生理緩衝液、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液（例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等と併用してもよいが挙げられる。
【００４８】
その他、必要に応じて、医薬的に許容される有機溶剤、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤等を含んでいてもよい。
【００４９】
実際の添加物は、本発明の医療材料の形態に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれるが、これらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばTween80、Tween20、ゼラチン等、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、メチルパラベン等の保存剤、ベンジルアルコール等の局麻剤などを含んでいてもよい。また、他の組織再生を促す薬剤等を併用することもできる。
【００５０】
本発明の医療材料の形状・形態は、適用する部位や組織に応じて適宜決定される。たとえば、通常の細胞製剤のほか、シートやディスクの形状に加工して使用してもよい。また、in vivoでの器官・組織再生に加えて、in vitroで器官・組織再生にも利用できる。
【００５１】
本発明の医療材料の対象となりうる症状・疾患としては、虚血部位の再生、骨格筋の再生、心筋の再生、神経の再生等により治療若しくは改善される症状又は疾患である。
虚血部位の再生については、例えば、床ずれ・皮膚潰瘍、手術瘢痕、難治性消化性潰瘍を含む創傷、潰瘍性大腸炎、クローン病などの慢性炎症性腸疾患を含む炎症性疾患、重症四肢虚血、心筋梗塞・狭心症・心不全を含む虚血性心疾患、脳梗塞、糖尿病性ニューロパチー、重症虚血を伴うがん等、血管や虚血部位の再生を必要とするあらゆる疾患が含まれる。とくに、通常の医薬では治療が困難な、重症慢性下肢虚血（閉塞性動脈硬化症、バージャー病）、治療不応性虚血性心疾患、重症虚血を伴うがん、網膜症を含めた糖尿病性血管障害等が対象疾患として好ましい。
【００５２】
神経の再生については、例えば、脳虚血、外傷、脳・脊髄損傷、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、癌性疼痛、てんかん、脳梗塞及びその後遺症、パーキンソン病など、神経再生を必要とするあらゆる疾患を挙げることができる。
【００５３】
骨格筋の再生については、例えば、先天性又は進行性筋ジストロフィー、先天性又は遠位型ミオパチー、筋強直性ジストロフィー、ミオトニア症候群、ミトコンドリア病、周期性四肢麻痺、悪性高熱症、イオンチャネル病を挙げることができる。
【００５４】
心筋の再生については、心不全、心筋梗塞、虚血性心疾患、拡張型心筋症等を挙げることができる。
【００５５】
網膜の再生については、例えば、糖尿病網膜症、緑内障、加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞症、中心窩毛細血管拡張症、未熟児網膜症、高血圧網膜症など、網膜血管や網膜神経の再生を必要とするあらゆる疾患を挙げることができる。
【００５６】
その他、臓器移植に伴う移植片対宿主病（GVDH)等への応用も期待できる。
【００５７】
本発明の医療材料は、治療的有効量で投与される。「治療的有効量」とは、対象の症状又は疾患の予防、治療、軽減、改善に十分な量を意味する。「治療的有効量」は、適用する病態やその程度、投与経路、投与回数等に応じて適宜決定される。経静脈的に投与する場合であれば、疾病の種類、程度等にもよるが、例えば１×１０４〜１×１０１０、好ましくは１×１０５〜１×１０８の細胞（１〜複数回に分けて投与してもよい）を投与することができる。本発明の細胞は再生能力が高く、従来の間葉系幹細胞等で知られている通常の使用量に比較して少ない量で充分な再生効果を得ることができる。上記のとおり、本発明の細胞は、血管網と組織実質細胞を供給する細胞ソースとして、普遍的な再生医療用ツールとなりうる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５９】
実施例１：CapSCs細胞株のアレイ解析
温度感受性SV40T抗原発現マウスから樹立した、末梢組織毛細血管由来の10系統のクローン周細胞株（ＷＯ２０１３／１１８７８６参照）から、分化能の程度が異なる3種の細胞株（CapSCs #7（高分化）, CapSCs #9（低分化）、CapSCs #3（中間）,）を選び、RNA発現アレイ（東レ  3D-Gene array）を用いて発現遺伝子の網羅的アレイ比較解析を行った。【００６０】
まずＲＮＡ発現量について、#7-3-9の順で増減変化する遺伝子群を抽出した。次いで、変化比の閾値1.5倍以上の850因子を抽出した。Gene Ontology (ＧＯ)等によるクラスター解析（遺伝子相同性、遺伝子の機能や細胞内局在）、パスウェイ解析等の結果を考慮して、125候補因子を絞り出した。さらに、この中から細胞マーカーになり得る細胞表面に局在する因子（ＧＯ解析）として22因子を抽出した。22因子から、実際に高分化能周細胞株（CapSCs #7）に特異的に発現し、特異的抗体を用いたフローサイトメトリー解析で認識できる因子として、最終的にEphA７を選定した。【００６１】
上記のとおり、我々が樹立した分化能の異なる３種の周細胞株を用いて、様々な分析やwet解析を介して最終的に特異的因子のEphA７の選定にいたった。【００６２】
実施例２：マウスCapSCsの分離と解析
１．特異的細胞マーカーによるマウスCapSCsの分離（図１）
マウス皮下脂肪組織（0.5g wet）からコラゲナーゼI/IIとAccumax処理により細胞を単離し、10％FBSを含むDMEM培地を用いて２〜３日培養した。さらに培地を交換して３〜４日培養し、付着細胞（脂肪間質細胞：ASC）をトリプシン処理により回収した。【００６３】
回収した細胞から、抗NG2抗体を固定したマイクロビースを用いた磁気細胞分離（MACS）により、NG2陽性細胞を分離した。さらに、NG2陽性細胞から抗EphA7抗体を用いたフローサイトメトリー（FACS）により、EphA7陽性細胞を分離した。最終的に脂肪間質細胞の10〜15％のNG2陽性EphA7陽性細胞が得られた。細胞の調製工程を図１に示す。【００６４】
FACSによる表面マーカーの発現では、従来のMSCsやPCsマーカーでは、crude PCsとCapSCsに相違はなく、これらのマーカーではCapSCsは分離できないことが理解できる。【００６５】
２．マウスCapSCsの分化能（図２）
（１）脂肪細胞分化能及び神経細胞分化能
前項で調製したNG2陽性EphA7陽性細胞（マウスCapSCs）の脂肪細胞及び神経細胞への分化能を評価した。
脂肪細胞への分化能は、Stem Cell Kits, #SC010（R&D systems）を使用し、adipogenic supplement（hydrocortisone, isobutylmethilxanthine, indomethacin）を添加したαMEM培地（10%FBS及び抗生剤含有）で、細胞を7-14日間培養し、抗FABP-4抗体による免疫染色、Oil Red O染色、BODIPY(boron-dipyrromethene)による蛍光染色を行って確認した。
神経細胞への分化は、Human/Mouse/Rat Neural Lineage Functional Identification Kit, #SC028（R&D systems）を使用し、maintenance supplement（Recombinant human FGF-basic, recombinant human EGF）を添加したDMEM培地（N2-MAX Media Supplementと抗生剤含有）で細胞を2日間培養した後、differentiation supplement（IGF-1, fetal bovine serum ）を含む前記DMEM培地で7-10日間培養し、Nestin、β3Tubulin、marker O4（OligoM4）、S100抗体による免疫染色を行って確認した。対照として、crude PCs（NG2陽性EphA7陰性細胞）及びcrude ASCsについても同様に培養し染色を行った。【００６６】
NG2陽性EphA7陽性細胞は、対照に比較して、脂肪細胞および神経細胞により効率的に分化した（図２Ａ）。この結果から、NG2陽性EphA7陽性のマウスCapSCs細胞は、胚葉を超えて、間葉系細胞と神経細胞に分化する、多分化能を有する細胞であることが確認された。【００６７】
（２）骨芽細胞分化能
NG2陽性EphA7陽性細胞（マウスCapSCs）の骨芽細胞への分化能を評価した。Stem Cell Kits, #SC010（R&D systems）を使用し、osteogenic supplement（ascorbate-phosphate, β-glycerolphosphate, recombinant human BMP-2）を添加したαMEM培地（10%FBS及び抗生剤含有）で、細胞を14-21日間培養し、抗オステオポンチン抗体による免疫染色、alizarin-red染色を行った。対照として、周細胞を同様に培養して染色を行った。その結果、マウスCapSCs細胞は、対照に比較して、より効率的にオステオポンチン陽性骨芽細胞へ分化することが確認された（図２Ｂ）。【００６８】
（３）神経細胞分化能
NG2陽性EphA7陽性細胞（マウスCapSCs）を、上記（１）と同様に、Human/Mouse/Rat Neural Lineage Functional Identification Kit, #SC028（R&D systems）を使用して培養し、Nestin（図２Ｃ）、GFAP及びヒツジIgG AF594（図２Ｄ）、β3Tubulin及びマウスIgG AF594（図２Ｄ）に対する抗体を用いた免疫染色を行った。対照として、周細胞を同様に培養して免疫染色した。その結果、マウスCapSCs細胞は、対照に比較して、より効率的に神経細胞へ分化することが確認された。【００６９】
３．マウスCapSCsの増殖能・スフェア形成能（図３）
NG2陽性EphA7陽性細胞（マウスCapSCs）をFGF（10ng/ml）を加えたDMEM培地で７代継代培養した。マウスCapSCs細胞は、対照に比べて、より効率的に増殖してスフェアを形成することが確認された（図３）。【００７０】
４．マウスCapSCsの遺伝子発現プロファイル（図４）
マウスCapSCsの遺伝子発現プロファイルを定量的RT−PCRで解析した。対照として、crude PCs（NG2陽性EphA7陰性細胞）及びcrude ASCsについても同様に遺伝子発現プロファイルを解析した。その結果、既知のPCマーカー（NG2、PDGFRβ、CD146）の発現は、マウスCapSCs と対照との間で差異はなく、これらのマーカーでは分別できないことが確認された（図４Ａ上）。【００７１】
また、NSCマーカー（Nestin、β3Tubulin、S100A）についても、周細胞よりβ3Tubulinは高く発現しているものの他のマーカーは差異がなかった。【００７２】
EphA7はCapSCsでのみ特異的に発現しており、マウスCapSCsはEphA7＋/β3Tubulin＋＋で特徴づけられることが確認された（図４Ａ下）。【００７３】
さらに、2 color フローサイトメトリーを用いてマウスCapSCsの表面マーカー発現プロファイルを定量解析した。その結果、マウスCapSCs は既知のMSCマーカーCD29、44、106、Sca1は陽性であり、他のPCsとは区別できないことが分かった。また、HSCマーカーであるCD34は陰性であり、骨髄・血球系マーカーであるCD45も陰性であることが確認された（図４Ｂ）。【００７４】
実施例３：ヒトCapSCsの分離と解析
１．特異的細胞マーカーによるヒトCapSCsの分離（図５）
ヒト神経芽腫（1 month-old, female）由来の皮下脂肪組織（0.3g wet）をコラゲナーゼI/IIとAccumaxで処理して細胞を単離し、10％FBSを含むDMEM培地を用いて2代継代培養し、付着細胞（脂肪間質細胞：hAPCs）をトリプシン処理により回収した。【００７５】
回収した細胞から、抗NG2抗体を固定したマイクロビースを用いた磁気細胞分離（MACS）により、NG2陽性細胞を分離した。さらに、NG2陽性細胞から抗EphA7抗体を用いたフローサイトメトリー（FACS）により、EphA7陽性細胞を分離した。最終的に脂肪間質細胞の10〜15％のNG2陽性EphA7陽性細胞が得られた。細胞の調製工程を図５に示す。【００７６】
２．ヒトCapSCsの分化能（図６）
（１）脂肪細胞分化能
前項で調製したNG2陽性EphA7陽性細胞（ヒトCapSCs）の脂肪細胞への分化能を評価した。Human/Mouse/Rat Neural Lineage Functional Identification Kit, #SC028（R&D systems）を使用し、adipogenic supplement（hydrocortisone, isobutylmethylxanthine, indomethacin）を添加したαMEM培地（10%FBS及び抗生剤含有）で細胞を7-21日間培養し、抗FABP4抗体による免疫染色を行った。対照として、crude hPCsについても同様に培養し、免疫染色した。NG2陽性EphA7陽性細胞は、対照に比較して、脂肪細胞により効率的に分化することが確認された（図６Ａ）。【００７７】
（２）神経細胞分化能
NG2陽性EphA7陽性細胞（ヒトCapSCs）の神経細胞分化能を評価した。Human/Mouse/Rat Neural Lineage Functional Identification Kit, #SC028（R&D systems）を使用し、maintenance supplement（Recombinant human FGF-basic, recombinant human EGF）を添加したDMEM培地（N2-MAX Media Supplementと抗生剤含有）で2日間培養した後、differentiation supplement（IGF-1, fetal bovine serum ）を含む前記DMEM培地で7-10日間培養し、Nestin、β3Tubulin、marker O4（OligoM4）、S100抗体による免疫染色を行った。対照として、NG2陽性EphA7陰性細胞を同様に培養して免疫染色した。その結果、ヒトCapSCs細胞は神経細胞に分化するが、対照であるNG2陽性EphA7陰性は神経細胞に分化しないことが確認された（図６Ｂ）。【００７８】
３．ヒトCapSCsの血管新生（図７）
それぞれ5ng/ml, 10ng/ml, 50ng/mlのVEGFを含む３次元ゲル培養下で、NG2陽性EphA7陽性細胞（ヒトCapSCs）を培養したときの顕微鏡観察像を示す（図７上）。対照として、crude hPCsを5ng/mlのVEGFを含む３次元ゲル培養したときの顕微鏡観察像と同様に培養したヒトCapSCsの顕微鏡観察像を比較して示す（図７下）。この結果から、ヒトCapSCsは優れた血管新生能を有することが確認できた。【００７９】
４．ヒトCapSCsの増殖能・スフェア形成能（図８）
NG2陽性EphA7陽性細胞（ヒトCapSCs）をFGF（10ng/ml）を加えたDMEM培地で30代まで継代培養した。ヒトCapSCs細胞は効率よく増殖し、単一細胞からスフェアを形成した（図８）。【００８０】
５．ヒトCapSCsの表面マーカー発現プロファイル（図９）
ヒトCapSCsの表面マーカー発現プロファイルを2 color フローサイトメトリーで解析した。解析した。その結果、既知のPCマーカー（NG2、CD146）、MSCマーカー（CD44、CD90、CD105）の発現は確認されたが、HSCマーカー（Sca1、CD34）の発現は認められなかった（図９左）。【００８１】
また、定量的RT-PCRにより、hPCsを対照としてNG2、PDGFRβ3、EphA7の発現を比較したところ、NG2、PDGFRβ3の発現はヒトCapSCs とhPCsとの間で差異はなく、EphA7のみがCapSCsで特異的に発現していることが確認された（図９右）。【００８２】
実施例４：マウスCapSCsによる重症下肢虚血モデルにおける虚血改善・組織再生能
12週齢、オスのBalb/c nude mouseを用いて左大腿動静脈を結紮・摘出して下肢虚血モデルを作成し、３日後に各群（n＝8）1 x104個のマウスCapSCsを５カ所に分けて虚血肢に局注した。 手術後、経時的（１〜２８日）にレーザードップラーによる下腿の血流評価（治療直後の虚血肢／健側肢比の改善割合）を実施した。また、NG2陽性EphA7陰性細胞、及び細胞浮遊用の生理食塩水（対照）を投与した群についても同様の評価を行った。【００８３】
２週間後の虚血肢及びドップラー計測の写真（図１０Ａ）、並びに安静時皮膚血流量（%RBF）を3群で比較した結果を示す（図１０Ｂ）。CapSCs投与群では、細胞非投与群（対照）に比べて顕著な組織再生、及び下肢虚血の有意な回復が認められた。以上より、ヒトCapSCsは血管新生に加えて組織再生を促進する能力を有し、下肢虚血を著明に改善しうることが確認された。【００８４】
実施例５：マウスCapSCsによる障害腓腹筋の改善効果
8-10週齢、オスのSCIDマウスの腓腹筋にcardiotoxin（CTX、Sigma-Aldrich; 100 μl of 0.25 mg/ml in saline per mouse）を局注し、骨格筋を障害させた（各群 n=7）。4時間後に1x105個のDsRed発現マウスCapSCsを200μlの生理食塩水に懸濁して障害腓腹筋に局注した。対照として、NG2陽性EphA7陰性周細胞（PCs）を同様に障害腓腹筋に局注した。障害から2-3週間後に尾静脈からRhodamine-Lectinを注入し、パラホルムアルデヒトで還流固定後に腓腹筋を摘出した。【００８５】
腓腹筋の短軸切片はヘマトトキシリンエオジン（HE）染色を行うとともに（図１１Ａ上）、同切片の面積を測定して骨格筋量を評価した（図１１Ａ下）。CapSCsは対照細胞（PCs）に比較して、顕著な障害腓腹筋改善効果を示し、2-3週間で非障害（(-)cardiotoxin）腓腹筋と同等骨格筋量にまで回復した。また、腓腹筋組織の短軸および長軸切片を蛍光観察した（図１１Ｂ）。蛍光観察の結果から、CapSCsは骨格筋細胞だけでなく毛細血管にも分化することで、優れた骨格筋再生能を示すことが確認された。特にCapSCsの一部は、本来の存在部位である毛細血管周囲に局在することにより、組織幹細胞として再生した組織に保持され、本来の組織のもつ自己修復能の獲得にも一部寄与している可能性がある。【００８６】
実施例６：マウスCapSCsによる網膜症改善効果
網膜症モデルとして酸素誘発網膜血管新生（Oxygen-induced retinopathy: OIR）モデルを用いた。日齢７日目のC57BL/6J マウスに７５％酸素を５日間与えることにより、日齢１２日目に広範な網膜無還流領域が形成される。その後７５％酸素から通常の酸素濃度下の環境に戻して５日間飼育することにより日齢１７日目までに病的網膜新生血管が発生する。本研究では日齢１２日目に同一個体のOIRマウスの片眼のみに1x104個のマウスCapSCsを投与し（投与眼）、反対側は、細胞非投与＝対照眼とした。日齢１７日目に尾静脈からRhodamine-Lectinを注入し循環血管を可視化した後、眼球を摘出し、フォールマウント標本を作成して病的網膜血管新生に対するCapSCsの効果を検討した。【００８７】
図１２に示した蛍光顕微鏡観察から、対照眼では瘤状の病的な新生血管が広範囲に観察されたのに対して、投与眼では劇的に病的な網膜新生血管が抑制され、正常な網膜血管構造が再構築された。以上より、マウスCapSCsは正常な網膜血管の再生を促進し、網膜症を顕著に抑制することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の細胞集団は、臓器再生の基本となる毛細血管を構築する一方で、幹細胞として組織実質細胞を再生することができる、臓器再生にとって合理的な幹細胞である。それゆえ、様々な疾患における組織再生用医薬として極めて有用である。【００８９】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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