(57)【要約】  本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする。上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、シアル酸を２個以上有するガングリオシドであることが好ましい。上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドは、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが好ましい。また、上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、下記式（１）で表される構造を有することが好ましい。［化１］2017094705.tif 000011［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
2017094705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ３促進炎症抑制剤。
【請求項２】
上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質が、シアル酸を２個以上有するガングリオシドである請求項１に記載のＧＭ３促進炎症抑制剤。
【請求項３】
上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドが、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドである請求項２に記載のＧＭ３促進炎症抑制剤。
【請求項４】
上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質が、下記式（１）で表される構造を有する請求項１に記載のＧＭ３促進炎症抑制剤。
【化１】
2017094705.tif 000009
［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
【請求項５】
ＧＭ３により促進された炎症性サイトカインの産生を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする炎症性サイトカイン産生抑制剤。
【請求項６】
上記ＧＭ３により促進された炎症性サイトカインの産生を抑制する物質が、シアル酸を２個以上有するガングリオシドである請求項５に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
【請求項７】
上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドが、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドである請求項６に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
【請求項８】
上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質が、下記式（１）で表される構造を有する請求項５に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
【化２】
2017094705.tif 000010
［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＭ３促進炎症抑制剤及び炎症性サイトカイン産生抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、高脂肪食マウスおよび遺伝子改変による肥満モデルマウスでは、活性化した組織マクロファージから炎症性サイトカインが分泌され、近傍の脂肪細胞に作用することによって、インスリン抵抗性の原因となるＧＭ３が発現誘導されることが示されている。その一方で、ＧＭ３の産生が起こらないＧＭ３合成酵素ノックアウトマウスでは、インスリン抵抗性が改善されるだけでなく、上流に位置するマクロファージからの炎症性サイトカインの産生までもが低下し、肥満時の慢性炎症状態から解放されていることが明らかとなっている。このことから、ＧＭ３は、肥満時における慢性炎症を惹起する内因性リガンドの主本体であることが強く示唆される。【０００３】
また、ＧＭ３を含むガングリオシドには、セラミド構造と糖鎖部分の多様性によって非常に多くの分子種が存在し、それらの多くが免疫系において発現している。これらのことは、ＧＭ３だけでなく、さまざまなガングリオシド分子種においても、肥満時における慢性炎症の惹起および抑制の分子メカニズムが存在することを示唆している。実際、これまでに、数多くの細胞種において、さまざまなガングリオシド分子種を用いた検討が試みられてきているが、ＧＭ３も含めたガングリオシドによる、炎症応答に対する活性化および抑制効果について、統一的な知見はほとんど得られていない。その原因は、これまでの報告が、実際の病態を反映するガングリオシド分子種や真の標的細胞が未解明である時点で得られた、知見の集合であるためと考えられる。【０００４】
例えば、W. Shenらの報告によると、ＧＭ１以上の糖鎖構造をもつ一部のガングリオシド（ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ）は、さまざまな病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）によるToll-like receptor（ＴＬＲ）の活性化を抑制する作用を持ち、ＧＭ３は抑制効果も活性化効果も持たないとされる（非特許文献１）。
しかしながら、この報告は、分画されていないヒト末梢血単核球を用いた実験に基づいており、自然免疫系細胞又はリンパ系細胞の何れの寄与によるものかは全く明らかではないため、ガングリオシドと免疫系の相互作用とその影響の程度について正確に規定することが難しい。【０００５】
また、非特許文献１と全く反対の結果を示す結果がI. Jouらによって示されている（非特許文献２）。この報告によれば、ラット脳神経系由来ミクログリアにおいて、ＧＭ１以上の糖鎖構造をもつ一部のガングリオシド（ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、および混合物）は、ＴＬＲ４を活性化することが示されている。
しかしながら、この報告で用いられた実験系は、主にＴＬＲ４の内在化を測定するフローサイトメトリー解析に終始しており、実際のＴＬＲ４シグナル伝達の活性化を直接反映したものではない。一部のガングリオシドについては、ＴＬＲ４活性化によって産生されるTumor Necrosis Factor-alpha（ＴＮＦ−α）のｍＲＮＡの増加が示されているが、ＲＴ−ＰＣＲ法によって微弱な増加を非定量的解析によって捉えた結果に終始しており、ミクログリア活性化を実際に証明するＴＮＦ−αの分泌を示すデータは確認されていない。【０００６】
更に、HJ. Sennらの報告では、哺乳動物の血清中には、生理活性を発揮するに十分な量のガングリオシドが存在していることを示している（非特許文献３）。I. Jouらの報告は、５％以上のウシ胎児由来血清の存在下において種々のガングリオシドを添加しているため、個々のガングリオシドの生理活性を正確に反映した結果ではなく、血清由来のガングリオシドの持ち込みの背景が付与された結果であると考えられる。そのため、ガングリオシドの生理活性とその作用濃度についての正確なデータを示した報告としてみなすには疑問を呈するものであり、それゆえの相反する結果であるとも考えられる。【０００７】
以上のように、多くの報告はガングリオシドの生物活性について矛盾した結果を示しているのが現状である。【０００８】
また、特許文献１には、ガングリオシド等のスフィンゴ脂質を含むプロスタグランジンＥ２産生抑制剤が開示されている。プロスタグランジンＥ２は、炎症時の発熱や、血管透過性亢進作用を有する炎症性因子であるが、炎症抑制効果があったガングリオシドの具体的な分子種等は示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−１８７３４１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Shen, W. et al., J Immunol., 180:4425-32, 2008
【非特許文献２】Jou, I. et al., Am J Pathol., 168:1619-30, 2006
【非特許文献３】Senn, HJ. et al., Eur J Biochem., 181: 657-62, 1989
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記背景技術に鑑みてなされたものであり、その課題は、炎症抑制作用を有する物質を有効成分として含有する新規の抗炎症剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、血清中に存在するガングリオシドについて正確にその活性を反映させた系を構築することで、これまで明らかになっていなかったＧＭ３による強力な炎症惹起作用を見出した。また更に、ＧＭ３以外の血清ガングリオシド分子種による強力な炎症抑制作用を見出した。【００１３】
また、発明者らのこれまでの研究（Tagami S. et al., J. Biol. Chem., 277:3085-92, 2002; Kabayama K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 104:13678-83, 2007; Nagafuku M. et al., Glycobiology, 25:303-318, 2015; Veillon L. et al., Plos One, 2015）によって明らかとなってきた肥満時におけるガングリオシドを介した慢性炎症状態の発症メカニズムに焦点を当て、ＧＭ３を含む多様なガングリオシドによる、マクロファージ細胞における慢性炎症の惹起と抑制のメカニズムを検証した。
その結果、ＧＭ３は、「ＬＰＳ（lipopolysaccharide；リポ多糖）によるマクロファージの活性化が惹起する炎症反応」を促進することを初めて見出し、そして、糖鎖部分に関し特定の糖鎖構造を有するＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ等は、「ＧＭ３依存性のマクロファージ活性化」に拮抗する抗炎症作用を有することも見出した。【００１４】
また、意外なことに、セラミド部分の脂肪酸に関し特定の構造を有するＧＭ３が、ＬＰＳによるマクロファージの活性化が惹起する炎症反応に拮抗する抗炎症作用を有することも見出して、本発明を完成するに至った。【００１５】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とするＧＭ３促進炎症抑制剤。【００１６】
［２］上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質が、シアル酸を２個以上有するガングリオシドである［１］に記載のＧＭ３促進炎症抑制剤。【００１７】
［３］上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質が、下記式（１）で表される構造を有する［１］に記載のＧＭ３促進炎症抑制剤。
【化１】
2017094705.tif 000003
［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］【００１８】
［４］上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドが、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドである［２］に記載の促進炎症抑制剤。【００１９】
［５］ＧＭ３により促進された炎症性サイトカインの産生を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする炎症性サイトカイン産生抑制剤。【００２０】
［６］上記ＧＭ３により促進された炎症性サイトカインの産生を抑制する物質が、シアル酸を２個以上有するガングリオシドである［５］に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。【００２１】
［７］上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドが、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドである［６］に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。【００２２】
［８］上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質が、下記式（１）で表される構造を有する［５］に記載の炎症性サイトカイン産生抑制剤。
【化２】
2017094705.tif 000004
［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
【発明の効果】
【００２３】
本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤や炎症性サイトカイン産生抑制剤によれば、前記問題点を解消し前記課題を解決し、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する効果を有し、慢性炎症疾患や全身性炎症状態を改善する効果を有する。【００２４】
また、本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤や炎症性サイトカイン産生抑制剤は、ヒト等に対して安全であり、対象者にとって負担や副作用が少ないという効果を奏する。【００２５】
また、ＧＭ３は肥満時に発現上昇するガングリオシドであり、本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤や炎症性サイトカイン産生抑制剤は、肥満時における慢性炎症を抑制する効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】哺乳動物におけるガングリオシド分子種の生合成経路を示す図である。
【図２】血清ガングリオシドミミックによるＬＰＳ依存性ＴＮＦ−α産生の抑制効果を示すグラフである。
【図３】ＧＭ３特異的なＬＰＳとの協調的なＴＮＦ−α産生の増強効果と、その他の血清ガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＤ３）による抑制効果を示すグラフである。
【図４】ＬＰＳ依存的なＴＮＦ−α産生に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる濃度依存的な抑制作用を示すグラフである。
【図５】「ＬＰＳとＧＭ３による協調的なＴＮＦ−α産生」に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる濃度依存的な抑制作用を示すグラフである。
【図６】骨髄由来マクロファージにおけるＬＰＳ依存的なＴＮＦ−α産生に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる抑制作用を示すグラフである。
【図７】「骨髄由来マクロファージにおけるＬＰＳとＧＭ３による協調的なＴＮＦ−α産生」に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる抑制作用を示すグラフである。
【図８】ＬＰＳ依存的なヒトＩＬ−６産生に対するガングリオシド分子種による亢進又は抑制作用を示すグラフである。
【図９】ＬＰＳ依存的なヒトＩＬ−１β産生に対するガングリオシド分子種による亢進又は抑制作用を示すグラフである。
【図１０】ＬＰＳ依存的なヒトＴＮＦ−α産生に対するガングリオシド分子種による亢進又は抑制作用を示すグラフである。
【図１１】ＧＭ３及び／又はＬＰＳ依存的なヒトＩＬ−６産生に対する、ガングリオシド分子種による抑制作用を示すグラフである。
【図１２Ａ】ＧＭ３によるＴｏｌｌ様受容体選択的な炎症促進および炎症抑制効果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】ＧＭ３によるＴｏｌｌ様受容体選択的な炎症促進および炎症抑制効果を示すグラフである。
【図１３】ガングリオシド分子種による、ＬＰＳ依存的な炎症の予想される亢進又は抑制メカニズムを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明について説明するが、本発明は以下の実施の具体的態様に限定されるものではなく、本発明の範囲内で任意に変形することができる。
【００２８】
＜ＧＭ３促進炎症抑制剤＞
本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする。ＧＭ３による強力な炎症惹起作用は、これまで明らかになっていなかったので、「『ＧＭ３により促進された炎症』を抑制する剤」は、本発明において初めて見出された。
【００２９】
本明細書において、「ＧＭ３促進炎症抑制剤」とは、「ＧＭ３により促進・誘導される（ＧＭ３依存性）炎症」を抑制する作用を有する抑制剤のことをいう。
【００３０】
一般に「ガングリオシド（Ganglioside）」とは、糖鎖上に少なくとも１つのシアル酸が結合しているスフィンゴ糖脂質のことをいう。
本明細書において、「ＧＭ３」とは、「ガングリオシドＧＭ３」のことをいい、ヒトの場合には、スフィンゴ糖脂質の糖鎖が、下記「    」内であるものをいう。
「α−Ｎｅｕ５Ａｃ−（２−３）β−Ｇａｌ−（１−４）−β−Ｇｌｃ−（１−１）−セラミド」
ここで、「α−Ｎｅｕ５Ａｃ」は、Ｎ−アセチル−α−ノイラミン酸；「β−Ｇａｌ」は、β−ガラクトース；「β−Ｇｌｃ」は、β−グルコースを示す。
【００３１】
また、「脂肪酸残基が炭素数２０以上の飽和脂肪酸残基であるＧＭ３」で上記炎症は促進されるので、上記「ＧＭ３により促進された炎症」とは、「脂肪酸残基が炭素数２０以上の飽和脂肪酸残基であるＧＭ３により促進された炎症」であることが好ましい（炎症を促進するＧＭ３が括弧「    」内に特定される場合がある）。
また、「置換基としてＯＨ基を有していてもよい、脂肪酸残基が炭素数２４の飽和脂肪酸残基であるＧＭ３」で上記炎症は促進されるので、上記「ＧＭ３により促進された炎症」とは、「置換基としてＯＨ基を有していてもよい、脂肪酸残基が炭素数２４の飽和脂肪酸残基であるＧＭ３により促進された炎症」であることがより好ましい（炎症を促進するＧＭ３が括弧「    」内に特定される場合がある）。
【００３２】
本実施例により初めて、ＧＭ３分子種の中には、炎症を亢進するＧＭ３（脂肪酸が炭素数２０以上の飽和脂肪酸であるＧＭ３）と、炎症を抑制するＧＭ３（脂肪酸が炭素数１８以下の脂肪酸であるＧＭ３、又は脂肪酸が炭素数２０以上の不飽和脂肪酸（特に炭素数２４の不飽和脂肪酸）であり、該不飽和脂肪酸の炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３）が存在することが明らかになった。
【００３３】
本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤の有効成分である、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、１種の成分から成っていても、２種以上の成分から成っていてもよい。
また、該ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、天然物から単離・精製されたものでもよく、合成されたものであってもよい。該「合成されたもの」には、自然界に存在する物質（の誘導体）の合成物、自然界に存在が確認されていない物質の合成物が含まれる。
【００３４】
上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、本発明の効果を発揮する点等で、セラミドに糖鎖がグリコシド結合したスフィンゴ糖脂質であることが好ましく、該糖鎖がシアル酸を２個以上有するものであることがより好ましい。
また、該ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、前記スフィンゴ糖脂質と同様の効果を有する、前記スフィンゴ糖脂質の誘導体であってもよい。
【００３５】
また、上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、本発明の効果を発揮する点や安全である点等で、シアル酸を２個以上有するガングリオシドであることが好ましい。
【００３６】
上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドは、本発明の効果を発揮する点や安全である点等で、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが好ましく、ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることがより好ましく、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが特に好ましい。これらのガングリオシドの模式図を図１に示す。
これらから選ばれる１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００３７】
また、上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、下記式（１）で表される構造を有するＧＭ３であることが好ましい。
【化３】
2017094705.tif 000005
［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
【００３８】
上記式（１）で表される構造を有するＧＭ３は、本発明の効果を発揮する点や安全である点等で、脂肪酸が炭素数１６以上１８以下の炭化水素基であるＧＭ３、又は脂肪酸が炭素数２０以上の炭化水素基であり、該炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３であることが好ましい。
また、同様の点から、該脂肪酸残基の炭素数が１６又は１８であるＧＭ３、又は、該不飽和脂肪酸残基の炭素数が２４であり、該不飽和脂肪酸残基の炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３であることが好ましい。
【００３９】
本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤は、有効成分である、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質に加えて、「その他の成分」を含有することができる。
【００４０】
前記ＧＭ３促進炎症抑制剤における、上記「その他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、薬学的に許容され得る担体等が挙げられる。
かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記ＧＭ３促進炎症抑制剤中の前記「その他の成分」の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。
具体的には、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶剤、懸濁剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散布剤等が挙げられる。
【００４２】
前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等が挙げられる。
前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
【００４３】
前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００４４】
前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。
【００４５】
本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤中の有効成分である、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質の、ＧＭ３促進炎症抑制剤全体に対する含有量は、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＧＭ３促進炎症抑制剤全体を１００質量部としたときに、ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質の合計量として、０．００１〜１００質量部の含量で配合することが好ましく、より好ましくは０．０１〜９９質量部、特に好ましくは０．１〜９５質量部、更に好ましくは１〜９０質量部の含量で配合することができる。
【００４６】
本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤の投与対象動物としては、特に制限はないが、例えば、ヒト；マウス；ラット；サル；ウマ；ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ等の家畜；ネコ、イヌ等のペット；等が挙げられる。
【００４７】
また、前記ＧＭ３促進炎症抑制剤の投与方法としては、特に制限はなく、例えば、前記ＧＭ３促進炎症抑制剤の剤型等に応じ、適宜選択することができ、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射、腸内への注入等が挙げられる。
また、前記ＧＭ３促進炎症抑制剤の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である個体の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、成人への１日の投与量は、有効成分の量として、１ｍｇ〜３０ｇが好ましく、１０ｍｇ〜１０ｇがより好ましく、１００ｍｇ〜３ｇが特に好ましい。
また、前記ＧＭ３促進炎症抑制剤の投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
【００４８】
＜炎症性サイトカイン産生抑制剤＞
本発明の炎症性サイトカイン産生抑制剤は、ＧＭ３により促進された炎症性サイトカインの産生を抑制する物質を有効成分として含有することを特徴とする。
【００４９】
上記ＧＭ３により促進された炎症性サイトカインの産生を抑制する物質は、本発明の効果を発揮する点や安全である点等で、シアル酸を２個以上有するガングリオシドであることが好ましい。
【００５０】
上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドが、本発明の効果を発揮する点や安全である点等で、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが好ましく、ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることがより好ましく、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが特に好ましい。
これらから選ばれる１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００５１】
また、上記ＧＭ３により促進された炎症を抑制する物質は、下記式（１）で表される構造を有するＧＭ３であることが好ましい。
【化４】
2017094705.tif 000006
［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
【００５２】
上記式（１）で表される構造を有するＧＭ３は、本発明の効果を発揮する点や安全である点等から、脂肪酸の炭素数が１６以上１８以下であるＧＭ３、又は脂肪酸が炭素数２０以上であり、該炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３であることが好ましい。
また、同様の点から、該脂肪酸残基の炭素数が１６又は１８であるＧＭ３、又は、該不飽和脂肪酸残基の炭素数が２４であり、該不飽和脂肪酸残基の炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３であることが好ましい。
【００５３】
本発明の炎症性サイトカイン産生抑制剤は、上記ＧＭ３促進炎症抑制剤と同様に、本発明の効果を損なわない範囲内で、有効成分に加えて「その他の成分」を含有していてもよい。
また、その剤型も特に制限はなく、例えば、前述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができる。
【００５４】
＜炎症を抑制又は治療する方法＞
本発明の他の態様は「炎症を抑制又は治療する方法」に係るものである。本発明の炎症を抑制又は治療する方法は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制又は治療する方法であって、セラミドに「シアル酸を２個以上有する糖鎖」がグリコシド結合したスフィンゴ糖脂質を投与することによって、該スフィンゴ糖脂質の血中濃度を上昇させる工程を含むことを特徴とする。
また、前記スフィンゴ糖脂質と同様の効果を有すれば、前記スフィンゴ糖脂質の誘導体を投与してもよい。
【００５５】
また、本発明の炎症を抑制又は治療する方法は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制又は治療する方法であって、シアル酸を２個以上有するガングリオシドを投与することによって、該ガングリオシドの血中濃度を上昇させる工程を含むことを特徴とする。
【００５６】
本発明の炎症を抑制又は治療する方法において、本発明の効果を発揮する点等で、上記シアル酸を２個以上有するガングリオシドが、ＧＤ１ｃ、ＧＤ１ａ、ＧＴ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＴ３、ＧＴ２、ＧＴ１ｃ、ＧＱ１ｃ及びＧＰ１ｃよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが好ましく、ＧＤ１ａ、ＧＤ３、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることがより好ましく、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂよりなる群から選ばれる少なくとも１種のガングリオシドであることが特に好ましい。
これらから選ばれる１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００５７】
また、本発明の炎症を抑制又は治療する方法は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制又は治療する方法であって、下記式（１）で表される構造を有するガングリオシドを投与することによって、該式（１）で表される構造を有するガングリオシドの血中濃度を上昇させる工程を含むことを特徴とする。
また、前記式（１）で表される構造を有するガングリオシド同様の効果を有すれば、前記式（１）で表される構造を有するガングリオシドの誘導体を投与してもよい。
【化５】
2017094705.tif 000007
［式（１）中、Ｒ１がガングリオシドＧＭ３を構成する糖鎖を示し、
Ｒ２−Ｃ（＝Ｏ）−が、炭素数１８以下の脂肪酸残基、又は炭素数２０以上の不飽和脂肪酸残基を示す。］
【００５８】
上記式（１）で表される構造を有するＧＭ３は、本発明の効果を発揮する点や安全である点等で、脂肪酸が炭素数１６以上１８以下の炭化水素基であるＧＭ３、又は脂肪酸が炭素数２０以上の炭化水素基であり、該炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３であることが好ましい。
また、同様の点から、該脂肪酸残基の炭素数が１６又は１８であるＧＭ３、又は、該不飽和脂肪酸残基の炭素数が２４であり、該不飽和脂肪酸残基の炭化水素基中に１つの二重結合を有するＧＭ３であることが好ましい。
【００５９】
また、本発明の炎症を抑制又は治療する方法は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制又は治療する方法であって、前記のＧＭ３促進炎症抑制剤を投与することによって、該ＧＭ３促進炎症抑制剤の血中濃度を上昇させる工程を含むことを特徴とする。
【００６０】
本発明の炎症を抑制又は治療する方法において、上記スフィンゴ糖脂質、ガングリオシド、又はＧＭ３促進炎症抑制剤を投与する手段は、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、注射投与；経口投与；腹腔内投与；腸内投与等が挙げられる。
上記スフィンゴ糖脂質（ガングリオシド、又はＧＭ３促進炎症抑制剤）の投与量は、症状、年齢、性別、剤形、投与方法、１日の投与回数等を考慮して適宜選択すればよい。
【実施例】
【００６１】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。実施例中の「％」は、特に断りのない限り「質量％」を示す。【００６２】
実施例１
［ＧＭ３以外の血清ガングリオシドの炎症抑制作用］
非特許文献３の報告に基づくヒト血清中のガングリオシド組成を表１に示す。ヒト血清中には主にＧＭ３が含まれており、続いてＧＤ３、ＧＭ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、「ＧＱ１ｂ以上の複合ガングリオシド」の順で含まれている。
上記これらのガングリオシド組成を模した血清ガングリオシドミミックを用いて、培地中血清を除去・低減したマクロファージ様培養細胞株：ＲＡＷ２６４．７細胞（０．５％ウシ胎児由来血清）を処理した。そして、ＴＬＲ４リガンド（ＬＰＳ）刺激による実際のＴＮＦ−α産生に対する影響を検討した。
０．５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一晩培養したＲＡＷ２６４．７細胞に対して、０．５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（lipopolysaccharide；リポ多糖）と血清ガングリオシド組成を模した濃度のガングリオシド（血清ガングリオシドミミック）で共刺激を行い、１８時間後の培養上清中のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ法によって定量した。【００６３】
【表１】
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【００６４】
ＥＬＩＳＡ法の結果を図２に示す。図２中、一番左のカラムはコントロール、中央のカラムは培地にＬＰＳを添加した結果、一番右のカラムは培地にＬＰＳ及び血清カングリオシドミミックを添加した結果を示す。縦軸の数値が大きくなるほど、マクロファージ活性による炎症が促進されていることを示す。
血清ガングリオシドミミック処理によって、ＬＰＳによるマクロファージからのＴＮＦ−α産生は、ほぼ完全に抑制されることが分かった。この結果は、血清中のガングリオシド組成は、循環血液中におけるマクロファージ系細胞（主に単球等）の不用意な活性化を抑制するためのものであることを示唆している。【００６５】
更に、血清中の個々のガングリオシド（ＬａｃＣｅｒ、ＧＭ３、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ及びＧＤ３）によるＴＮＦ−α産生への影響を評価した。
０．５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一晩培養したＲＡＷ２６４．７細胞に対して、ＬＰＳ（０．５ｎｇ／ｍＬ）と各スフィンゴ糖脂質（１．０μＭ）で共刺激を行い、１８時間後の培養上清中のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ法によって定量した。【００６６】
結果を図３に示す。図３中、一番左のカラムはコントロール、左から２番目のカラムはＬＰＳのみを培地に添加した結果を示す。
驚くべきことに、ＧＭ３単独による処理は、ＬＰＳによるＴＮＦ−α産生を著しく増大させることが分かった。
その一方で、ＧＭ３以外の血清ガングリオシド分子種は、ＬＰＳによるＴＮＦ−α産生を強力に抑制する作用を示した。ＬａｃＣｅｒとＧＭ１は、ＬＰＳのみを添加した結果と同等のＴＮＦ−αであった。
シアル酸を２個以上有する、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ及びＧＤ３は、ＬＰＳによるＴＮＦ−α産生を強力に抑制していた。特に、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂは著しく強力にＬＰＳによるＴＮＦ−α産生を抑制していた。【００６７】
以上の血清ガングリオシドの個々の作用は、培地中血清を低減した環境下で観測・評価されたものである。これらの結果は、これまで全く明らかとなっていなかったＧＭ３単独の炎症促進作用と、ＧＭ３以外の血清ガングリオシドの炎症抑制作用を初めて明確に規定したものであると言える。
また、以上の結果は、健常人の循環血液中では、ＧＭ３及びＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂが共存することで、血中におけるマクロファージの好ましくない炎症反応が抑制されていることを強く示唆した。【００６８】
実施例２
［ＲＡＷ２６４．７細胞における各種ガングリオシドの炎症抑制作用］
次に、ＬＰＳ及びＧＭ３によって誘導される炎症性サイトカインの産生に対する、複合型ガングリオシド分子種による抑制作用における濃度依存性を検討した。上記に示したように、マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞は、大腸菌由来成分であるＬＰＳ及び肥満時に発現上昇するＧＭ３に対して多量のＴＮＦ−αを産生する。【００６９】
まず、ＬＰＳ依存的なＴＮＦ−α産生に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる濃度依存的な抑制作用を検討した。
０．５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一晩培養したＲＡＷ２６４．７細胞に対して、ＬＰＳ（２．０ｎｇ／ｍＬ）と各スフィンゴ糖脂質（０．２５〜２．０μＭ）で共刺激を行い、１８時間後の培養上清中のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ法によって定量した。【００７０】
結果を図４に示す。図４中、一番左のカラムはコントロール、左から２番目のカラムはＬＰＳのみを培地に添加した結果を示す。
ＬＰＳにより促進された炎症が、各ガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂ）を添加することにより、濃度依存的に抑制されることが分かった。【００７１】
また、ＬＰＳとＧＭ３による協調的なＴＮＦ−α産生に対する血清中の、ＧＭ３以外のガングリオシドによる濃度依存的な抑制作用を検討した。
０．５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一晩培養したＲＡＷ２６４．７細胞に対して、各スフィンゴ糖脂質（０．２５〜１．０μＭ）、ＬＰＳ（０．５ｎｇ／ｍＬ）、ＧＭ３（５．０μＭ）で共刺激を行い、１８時間後の培養上清中のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ法によって定量した。【００７２】
結果を図５に示す。図５中、一番左のカラムはコントロールであり、ＬＰＳのみを培地に添加した結果を示し、左から２番目のカラムはＬＰＳとＧＭ３のみを培地に添加した結果を示す。
ＧＭ３及びＬＰＳによる相乗的なＴＮＦ−αの産生増加（炎症促進）が、各ガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂ）を添加することにより、濃度依存的に抑制されることが分かった。【００７３】
また、１μＭ（ＧＭ３比１０：１）以下の複合型ガングリオシドＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂを添加することによって、どちらのＴＮＦ−α産生もほぼ完全に抑制されることが分かった（図４、５）。
各複合型ガングリオシドの抑制効果を比較した結果、ＬＰＳ刺激に対する各ガングリオシドの５０％阻害濃度は、ＧＤ１ａ：０．５μＭ、ＧＤ１ｂ：０．５μＭ、ＧＴ１ｂ：０．５μＭ、ＧＱ１ｂ：０．２５μＭであるのに対し（図４）、ＬＰＳとＧＭ３の協調的活性化に対する５０％阻害濃度は、ＧＤ１ａ：０．５μＭ、ＧＤ１ｂ：０．５μＭ、ＧＴ１ｂ：０．２５μＭ、ＧＱ１ｂ：０．１２５μＭであった（図５）。これらのシアル酸を２個以上その分子内に有するガングリオシド分子は、ＬＰＳとＧＭ３による協調的活性化に対しての抑制作用が大きいことが分かった。【００７４】
以上の結果から、ＧＭ３以外のガングリオシドによる炎症抑制効果は、肥満時に発現上昇するＧＭ３によって惹起されたマクロファージ活性化に対して、より強力に作用することが示唆された。また、本実施例で初めて、生理的環境下の濃度又はそれ以下のガングリオシド濃度で、炎症を抑制することを見出した（表１、図４、図５）。【００７５】
実施例３
［マウス骨髄由来マクロファージにおける各種ガングリオシドの炎症抑制作用］
次に、骨髄由来マクロファージにおけるＬＰＳ依存的なＴＮＦ−α産生に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる抑制作用について検討した。
Ｃ５７／ＢＬ６マウスの大腿骨および脛骨より採取した骨髄由来細胞に対し、２０ｎｇ／ｍＬの組み換えマクロファージコロニー刺激因子（recombinant macrophage colony-stimulating factor（Ｍ−ＣＳＦ））を用いて１週間分化誘導した。得られた骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ、bone marrow-derived macrophage）を、０．５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一晩培養したのち、ＬＰＳ（０．５ｎｇ／ｍＬ）と各スフィンゴ糖脂質（１０μＭ）で共刺激を行い、１８時間後の培養上清中のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ法によって定量した。【００７６】
結果を図６に示す。図６中、一番左のカラムはコントロール、左から２番目のカラムはＬＰＳのみを培地に添加した結果を示す。
骨髄由来マクロファージにおけるＬＰＳ依存的なＴＮＦ−α産生（炎症促進）が、各ガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂ）を添加することにより抑制されることが分かった。【００７７】
また、骨髄由来マクロファージにおけるＬＰＳとＧＭ３による協調的なＴＮＦ−α産生に対する血清中の抑制性ガングリオシドによる抑制作用を検討した。
Ｃ５７／ＢＬ６マウスの大腿骨および脛骨より採取した骨髄由来細胞に対し、２０ｎｇ／ｍＬの組み換えマクロファージコロニー刺激因子（recombinant macrophage colony-stimulating factor（Ｍ−ＣＳＦ））を用いて１週間分化誘導して得た骨髄由来マウロファージ（ＢＭＤＭ）を、０．５％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中で一晩培養したのち、ＬＰＳ（０．５ｎｇ／ｍＬ）、ＧＭ３（１０μＭ）、各スフィンゴ糖脂質（１０μＭ）で共刺激を行い、１８時間後の培養上清中のＴＮＦ−αをＥＬＩＳＡ法によって定量した。【００７８】
結果を図７に示す。図７中、一番左のカラムはコントロールであり、ＬＰＳのみを培地に添加した結果を示し、左から２番目のカラムはＬＰＳとＧＭ３のみを培地に添加した結果を示す。
骨髄由来マクロファージにおける「ＬＰＳ及びＧＭ３による協調的なＴＮＦ−α産生（炎症促進）」が、各ガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂ）を添加することにより強力に抑制されることが分かった（図７）。
また、図６と図７を比較すると、各ガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂ）による炎症抑制効果は、肥満時等に発現上昇するＧＭ３によって惹起されたマクロファージ活性化に対して、より強力に奏されることが示唆された。【００７９】
実施例４
［ＧＭ３促進炎症抑制剤の製剤化］
＜＜錠剤＞＞
ＧＤ１ｂ２０．０ｍｇ、ラクトース４０ｍｇ、デンプン２０ｍｇ、及び、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース５ｍｇを均一に混合した後、ヒドロキシプロピルメチルセルロース８質量％水溶液を結合剤として湿式造粒法で打錠用顆粒を製造した。該打錠用顆粒に滑沢性を与えるのに必要なステアリン酸マグネシウムを０．５ｍｇ〜１．５ｍｇ加えてから打錠機を用いて打錠し錠剤とした。【００８０】
＜＜液剤＞＞
ＧＴ１ｂ１０．０ｍｇを、２質量％の２−ヒドロキシプロピル−β−サイクロデキストリン水溶液１０ｍＬに溶解し注射用液剤とした。【００８１】
実施例５
［ヒトにおける各種ガングリオシドの炎症亢進又は抑制作用］
ヒト末梢血由来単球（ＣＤ１４陽性細胞）を、０．５％ＦＣＳ及び２５ｎｇ／ｍＬ顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子含有ＤＭＥＭ（Low Glucose）中、０．１２５ｎｇ／ｍＬ大腸菌由来リポ多糖（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉＯ１１１：Ｂ４）、及び、１．２５、２．５、５．０μＭのＮ−ｍｉｘ（中性スフィンゴ糖脂質混合物（Ｇｌｃ−Ｃｅｒ、Ｌａｃ−Ｃｅｒ、Ｇｂ３、Ｇｂ４））又は各ガングリオシド分子種を用いて共刺激した。１８時間後にＥＬＩＳＡ法を用いて、培養上清中に分泌された炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）を定量した。結果を図８〜１０に示す。【００８２】
図８〜１０中、一番左のカラムはコントロール、左から２番目のカラムはＬＰＳのみを培地に添加した結果を示す。
各ＧＭ３種の構造について、例えば「ＧＭ３Ｃ１６」の場合、ＧＭ３の脂肪酸が炭素数１６の炭化水素基であることを示す。また、「ＧＭ３ｈＣ２４」は、ＧＭ３の脂肪酸が炭素数２４の炭化水素基であり、該脂肪酸に置換基としてＯＨ基を有することを示す。また、「ＧＭ３Ｃ２４：１」は、ＧＭ３の脂肪酸が炭素数２４の炭化水素基であり、該炭化水素基中に１つの二重結合を有することを示す。【００８３】
図８〜１０の結果、驚くべきことに、ＧＭ３分子種のうち、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び「ＧＭ３Ｃ２４：１」が、ＬＰＳによるＩＬ−６、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α産生を抑制する作用を示した。
一方、ＧＭ３分子種のうち、脂肪酸にＯＨ基を有さず、炭化水素基中に二重結合を有さない、「ＧＭ３Ｃ２２」、「ＧＭ３Ｃ２４」、及び脂肪酸にＯＨ基を有する「ＧＭ３ｈＣ２４」は、ＬＰＳによるＩＬ−６、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α産生を著しく増大させた。【００８４】
実施例６
［ヒトにおける、ＧＭ３Ｃ１６、ＧＭ３Ｃ１８及びＧＭ３Ｃ２４：１の炎症抑制作用］
次に、ＧＭ３分子種のうち、脂肪酸にＯＨ基を有さず、炭化水素基中に二重結合を有さない、「ＧＭ３Ｃ２２」及び「ＧＭ３Ｃ２４」によって生じるＴＬＲ４選択的な炎症性サイトカイン産生の促進に対して、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び、炭化水素基中に二重結合を有する「ＧＭ３Ｃ２４：１」が拮抗的に炎症抑制作用を示すかどうかを、ヒト単球において調べた。
実施例５と同様の培養条件下、炎症を促進する「ＧＭ３Ｃ２２」又は「ＧＭ３Ｃ２４」に対して、炎症を抑制する「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」又は「ＧＭ３Ｃ２４：１」を組み合わせて単球に添加し、さらにＴＬＲ４活性化因子である０．０６ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激した。１８時間後にＥＬＩＳＡ法を用いて、培養上清中に分泌された炎症性サイトカインＩＬ−６を定量した。結果を図１１に示す。【００８５】
図１１の結果中、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び「ＧＭ３Ｃ２４：１」は、ＬＰＳ刺激に対してだけでなく、「ＧＭ３Ｃ２２」及び「ＧＭ３Ｃ２４」の添加によって促進した刺激に対しても、ＩＬ−６の産生を強力に抑制した。興味深いことに、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び「ＧＭ３Ｃ２４：１」は、ＬＰＳ単独によるＴＬＲ４活性化時と比べて、「ＧＭ３Ｃ２２」および「ＧＭ３Ｃ２４」の添加によって促進されたＴＬＲ４活性化時において、より強力にＩＬ−６の産生を抑制した。【００８６】
実施例７
[ＧＭ３によるＴｏｌｌ様受容体選択的な炎症促進および炎症抑制効果]
ヒト単球の活性化に伴う炎症は、ヒト単球上のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性化によって生じることが知られており、ＴＬＲ４に対する活性化因子であるＬＰＳ以外にも、その他のＴＬＲに対する様々な活性化因子が存在する。
そこで、実施例５と同様の培養条件下、ＴＬＲ４活性化因子である０．１２５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ、ＴＬＲ４及びＴＬＲ２活性化因子である５．０μｇ／ｍＬのHigh Mobility Group Box 1（ＨＭＧＢ１）、ＴＬＲ１及びＴＬＲ２活性化因子である２０ｎｇ／ｍＬのＰａｍ３Ｃｓｋ４、ＴＬＲ２及びＴＬＲ６活性化因子である１．０ｎｇ／ｍＬのＭＡＬＰ−２、ＴＬＲ５活性化因子である５０ｎｇ／ｍＬのフラジェリン（Flagellin）、並びにＴＬＲ７及びＴＬＲ８活性化因子である２５０ｎｇ／ｍＬのＲ−８４８のいずれかと、５μＭのＧＭ３分子種を用いて、ヒト単球を刺激した。１８時間後にＥＬＩＳＡ法を用いて、培養上清中に分泌された炎症性サイトカインＩＬ−６を定量した。結果を図１２Ａ及びＢに示す。【００８７】
図１２Ａ及びＢの結果中、ＧＭ３分子種のうち、脂肪酸にＯＨ基を有さず、炭化水素基中に二重結合を有さない、「ＧＭ３Ｃ２２」、「ＧＭ３Ｃ２４」、及び脂肪酸にＯＨ基を有する「ＧＭ３ｈＣ２４」は、ＴＬＲ４を活性化する因子であるＬＰＳ及びＨＭＧＢ１によるＩＬ−６産生を選択的に増大させた。一方、その他のＴＬＲ活性化因子については、ＩＬ−６産生の増大は見られなかった。
さらに、ＧＭ３分子種のうち、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び「ＧＭ３Ｃ２４：１」が、ＴＬＲ４を活性化する因子であるＬＰＳおよびＨＭＧＢ１によるＩＬ−６産生を抑制する作用を示した（図１２Ａ）。この抑制作用は、ＴＬＲ２を活性化する因子であるＰａｍ３Ｃｓｋ４によるＩＬ−６産生に対しても見られたが、ＴＬＲ４を活性化する因子であるＬＰＳ及びＨＭＧＢ１によるＩＬ−６産生に対する抑制作用の方が、より顕著であった。【００８８】
［実施例のまとめ］
ヒト血清中のガングリオシド組成に注目すると、最も優勢なＧＭ３（５μＭ）に対して、およそ０．５〜１．０μＭのＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂが含まれることが報告されている（表１）。このことから、ＧＭ３及び複合体ガングリオシドを含むヒト血液中では、ＬＰＳによる自然免疫細胞の活性化は、非常に強力な抑制を受けていると考えられる。
また、実施例で非常に強力にＬＰＳによるＴＮＦ−α産生を抑制していた、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ及びＧＱ１ｂは、哺乳動物において、ＧＤ３から生合成される点で共通している（図１）。【００８９】
血中を循環する多くの自然免疫細胞は、感染組織や標的臓器に到達して初めて活性化され、免疫応答を起こす。一方、血中における不用意な自然免疫活性化は、敗血性ショックや慢性的炎症疾患等に代表される、全身性の免疫機能不全を引き起こす要因の一つと考えられる。血中のガングリオシドは、循環中の自然免疫細胞が活性化するのを未然に防ぐ役割を持つと考えられ、これらを人為的に投与することによっても、コントロール不良な慢性炎症疾患や、全身性の炎症状態に対して、より効果的に対処できる。【００９０】
ＧＭ３のＬＰＳによるマクロファージ活性化を、ＧＤ３、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ等の特定のガングリオシドが抑制することが確認されたが、ＬＰＳ以外の、飽和脂肪酸（パルミチン酸）、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ、pathogen-associated molecular patterns）、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ、damage-associated molecular patterns）等によるＧＭ３依存性マクロファージ活性化の抑制も可能である。【００９１】
特に、ヒト単球においては、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び「ＧＭ３Ｃ２４：１」が炎症抑制効果を示し（図８〜１０）、ＬＰＳ単独によるＴＬＲ４活性化よりも、「ＧＭ３Ｃ２２」及び「ＧＭ３Ｃ２４」といったＧＭ３分子種によって促進されたＴＬＲ４活性化をより強力に抑制することがわかった（図１１）。さらに、ＧＭ３分子種はＴＬＲ４に対して選択的に作用することで、炎症促進と炎症抑制を生じることが明らかとなった（図１２Ａ及びＢ）。
これらの結果から、ＧＭ３及びＧＭ３構造をもとにした炎症抑制剤は、敗血症、慢性炎症及びメタボリックシンドローム等で生じるＴＬＲ４活性化や、ＧＭ３によって促進されたＴＬＲ４活性化を選択的かつ強力に抑制できるという特性をもつ。さらに、その他のＴＬＲの活性化を阻害しにくいことから、これまでに知られている免疫抑制剤で顕著に見られるような、免疫系全体に対する抑制に伴う免疫不全等の副作用を生じにくいという、画期的な特性を併せ持つ。【００９２】
本実施例の結果から予想される、各ガングリオシド分子種のＬＰＳ依存的な炎症の亢進又は抑制メカニズムを図１３に示す。
「ＧＭ３Ｃ２４」や「ＧＭ３ｈＣ２４」は、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体と直接又は間接に作用することにより、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体の結合によるＮＦ−κＢ活性化を亢進し、炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）の産生を促進していると考えられる。
一方、「ＧＭ３Ｃ１６」、「ＧＭ３Ｃ１８」及び「ＧＭ３Ｃ２４：１」は、ＴＬＲ４／ＭＤ２複合体又は他のＴＬＲ（Toll-like receptor）と直接又は間接に作用することにより、ＮＦ−κＢ活性化を抑制し、炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）の産生を抑制していると考えられる。
また、シアル酸を２個以上有するガングリオシド（ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＴ１ｂ、ＧＱ１ｂ、ＧＤ３等）は、シアル酸結合グロブリン様レクチンであるシグレック（Siglecs, sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin）と直接又は間接に作用することにより、ＮＦ−κＢ活性化を抑制し、炎症性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）の産生を抑制していると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明のＧＭ３促進炎症抑制剤は、ＧＭ３により促進された炎症を抑制し、安全であり、慢性炎症疾患、全身性炎症状態等に対して効果を奏することが期待されるので、医薬品分野、医療分野等で広く利用が可能である。【００９４】
本願は、２０１５年１１月３０日に出願した日本の特許出願である特願２０１５−２３２５６４、及び２０１６年６月８日に出願した日本の特許出願である特願２０１６−１１４１８８に基づくものであり、それらの出願の全ての内容はここに引用し、本願発明の明細書の開示として取り込まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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