(57)【要約】  試料由来の各種イオンをイオントラップ内に捕捉したあと、特定のm/zを有する目的イオン以外の不要なイオンをイオントラップから排出する（Ｓ１、Ｓ２）。そのあと、イオントラップ内に捕捉されている目的イオンを水素ラジカル付着解離（HAD）により解離させ、それによって生成されたプロダクトイオンを低m/z側から順に目的イオンのm/z直前まで共鳴励起排出する、という操作を複数回繰り返す（Ｓ３〜Ｓ７）。共鳴励起排出されたイオンを検出器で検出してMS/MSスペクトルデータを取得し、複数回の共鳴励起排出で得られたデータを積算することで最終的なMS/MSスペクトルを作成する（Ｓ５、Ｓ８）。HADはプリカーサイオンの解離効率が低いが、１回のイオン化で生成された目的イオンに対しHADによる解離操作と共鳴励起排出操作とを複数回繰り返すことで、プロダクトイオンの量を増大させ高SN比、高感度のMS/MSスペクトルを得ることができる。
2017126006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の電極から成るイオントラップの内部空間に試料由来のイオンを捕捉し、該イオンを所定のイオン解離手法により解離させ、それにより得られたプロダクトイオンを前記イオントラップから排出して検出するイオントラップ質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
a)前記イオントラップに捕捉されているイオンのうち、特定の質量電荷比を有する目的イオン以外のイオンを該イオントラップから排出するイオン選別ステップと、
b)前記イオン選別ステップによって前記イオントラップに残された前記目的イオンを所定の解離手法によって解離させるイオン解離操作、及び、その解離操作後に前記イオントラップに捕捉されているイオンのうち前記目的イオンの質量電荷比よりも質量電荷比が小さいイオンを低質量電荷比側から質量電荷比が高くなる方向に又はその逆方向に質量走査しながら排出するイオン排出操作、を複数回繰り返し行うイオン解離・排出ステップと、
c)前記イオン解離・排出ステップにおける複数回のイオン排出操作時に前記イオントラップから排出されたイオンを検出した結果に基づいてマススペクトルを作成するマススペクトル作成ステップと、
を有することを特徴とする質量分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の質量分析方法であって、
前記イオン解離・排出ステップでは、前記イオントラップに捕捉されているイオンを低質量電荷比側から質量電荷比が高くなる方向に順に前記目的イオンの質量電荷比の直前まで質量走査しながらイオンを排出するイオン排出操作を行うことを特徴とする質量分析方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の質量分析方法であって、
前記イオン解離手法は、水素ラジカル付着解離、電子移動解離、又は電子捕獲解離の一つを含むことを特徴とする質量分析方法。
【請求項４】
請求項３に記載の質量分析方法であって、
前記イオン解離・排出ステップにおいて繰り返し行われる複数回のイオン解離操作では同一のイオン解離手法が用いられることを特徴とする質量分析方法。
【請求項５】
請求項３に記載の質量分析方法であって、
前記イオン解離・排出ステップにおいて繰り返し行われる複数回のイオン解離操作では互いに異なる二つ以上のイオン解離手法が用いられることを特徴とする質量分析方法。
【請求項６】
複数の電極から成るイオントラップの内部空間に試料由来のイオンを捕捉し、該イオンを所定のイオン解離手法により解離させ、それにより得られたプロダクトイオンを前記イオントラップから排出して検出するイオントラップ質量分析装置であって、
a)前記イオントラップに捕捉されているイオンのうち、特定の質量電荷比を有する目的イオン以外のイオンを該イオントラップから排出する電場を形成するように、該イオントラップを構成する少なくとも一つの電極に所定の電圧を印加するイオン選別実行部と、
b)前記イオン選別実行部によるイオン選別操作によって前記イオントラップに残された前記目的イオンを所定の解離手法によって解離させるイオン解離操作、及び、その解離操作後に前記イオントラップに捕捉されているイオンのうち前記目的イオンの質量電荷比よりも質量電荷比が小さいイオンを低質量電荷比側から質量電荷比が高くなる方向に又はその逆方向に質量走査しながら排出するように前記イオントラップを構成する少なくとも一つの電極に所定の電圧を印加するイオン排出操作、を複数回繰り返し行うイオン解離・排出実行部と、
c)前記イオン解離・排出実行部による複数回のイオン排出操作時に前記イオントラップから排出されたイオンを検出した結果に基づいてマススペクトルを作成するマススペクトル作成部と、
を備えることを特徴とするイオントラップ質量分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高周波電場の作用によってイオンを捕捉することが可能であるイオントラップを備えたイオントラップ質量分析装置、及び該装置を用いた質量分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析装置の一つの種類として、高周波電場の作用によってイオンを捕捉することが可能であるイオントラップを用いたイオントラップ質量分析装置が知られている。典型的なイオントラップは、ドーナツ状のリング電極を挟んで一対のエンドキャップ電極が対向配置された三次元四重極型のイオントラップであるが、互いに平行に配置された４本のロッド電極の両端部の外側にエンドキャップ電極がそれぞれ配置されたリニア型のイオントラップも知られている。以下、特に断らない限り三次元四重極型のイオントラップを用いたイオントラップ質量分析装置を例に挙げて説明する。【０００３】
イオントラップ質量分析装置では、通常、一対のエンドキャップ電極の電位を０Ｖにしリング電極に高周波電圧を印加することでイオントラップ内の空間に四重極高周波電場を形成し、該電場の作用によってイオンを捕捉する。イオントラップ内空間に捕捉されるこのイオンの挙動はマシュー（Mathieu）の方程式で表されることがよく知られている。イオントラップ内空間にイオンが捕捉されている状態でリング電極に印加する高周波電圧の振幅値を徐々に上げていくと、質量電荷比が小さいイオンから順に軌道が不安定になり、エンドキャップ電極に穿設されている開口を通して外部に排出される。この原理を利用して、イオンを質量電荷比に応じて分離したり特定の質量電荷比を有するイオンを選択的にイオントラップ内空間に残したりすることができる（非特許文献１など参照）。【０００４】
従来の多くのイオントラップ質量分析装置では、リング電極に印加される高周波電圧は正弦波状電圧であるが、非特許文献２などに開示されているように、リング電極に矩形波状の高周波電圧を印加するイオントラップ質量分析装置も知られている。こうしたイオントラップは慣用的にデジタルイオントラップと呼ばれる。デジタルイオントラップを用いた質量分析装置では、リング電極に印加する矩形波電圧の電圧値（波高値）を一定に保ちつつ該矩形波電圧の周波数を制御することによって、イオンを質量電荷比に応じて分離したり特定の質量電荷比を有するイオンを選択的にイオントラップ内空間に残したりすることができる。【０００５】
上述したようなイオントラップ質量分析装置では、試料由来の各種イオンをイオントラップに一旦捕捉したあと、特定の質量電荷比を有する目的イオンのみを選択的にイオントラップ内空間に残し、該イオンをプリカーサイオンとしてイオントラップ内空間で解離させることで生成したプロダクトイオンを質量分離しつつ検出することで、ＭＳ／ＭＳ分析又はＭＳn分析を行うことができる。イオンを解離させる手法として最も一般的であるのは、イオンをガス（通常は不活性ガス）と衝突させて解離を促す衝突誘起解離（Collision Induced Dissociation＝ＣＩＤ）であるが、それ以外に、イオンに非荷電粒子である水素ラジカルを照射して解離を促す水素ラジカル付着解離（Hydrogen radical Attachment Dissociation＝ＨＡＤ）、イオンに電子を供給して解離を促す電子移動解離（Electron Transfer Dissociation＝ＥＴＤ）や電子捕獲解離（Electron Capture Dissociation＝ＥＣＤ）、イオンに赤外レーザ光を照射して解離を促す（InfraRed Multi-Photon Dissociation＝ＩＲＭＰＤ）などがある（非特許文献３、特許文献１など参照）。【０００６】
同じプリカーサイオンであってもイオンの解離手法が異なると、生成されるプロダクトイオンが異なり、その結果、得られるイオンの構造情報が異なることが知られている。例えば、非特許文献４によれば、ペプチドに糖鎖が結合した糖ペプチドの場合、ＣＩＤを用いると糖鎖構造情報が、ＥＴＤを用いるとペプチド構造情報及び糖鎖結合部位情報が得られる。したがって、ＣＩＤを利用したＭＳn分析結果とＥＴＤを利用したＭＳn分析結果とを併用することによって、糖鎖構造情報、ペプチド構造情報、及び糖鎖結合部位情報を併せて得ることができ、糖ペプチドの詳細な構造解析を行うことができる。これはＣＩＤとＥＴＤのみならず、ＣＩＤとＥＣＤ、ＣＩＤとＨＡＤなどでも同様である。【０００７】
しかしながら、上記のようなＭＳn分析には次のような問題がある。
上述したような手法によればイオンを解離させることが可能であるものの、その解離効率は手法によって異なり、例えばＣＩＤではイオンを励振させる際の電圧や反応時間を変更することによって、またＩＲＭＰＤではレーザ光パワーやレーザ光照射時間を変更することによって、解離対象であるプリカーサイオンをほぼ完全に解離させることができる。つまりプリカーサイオンの解離効率はほぼ１００％である。これに対し、ＨＡＤ、ＥＣＤ、ＥＴＤはＣＩＤ等に比べるとプリカーサイオンの解離効率が低い。例えばＥＣＤにおけるプリカーサイオンの解離効率はペプチドで１５％程度、タンパク質では３０％程度であることが非特許文献５で報告されている。【０００８】
こうしたプリカーサイオンの解離効率が低い解離手法を利用した場合、それだけプロダクトイオンの生成量は少なくなるから、プロダクトイオン由来の信号のＳＮ比や検出感度は低くなる。そのため、例えば、もともと生成量が少ないプロダクトイオンに対応するピークはＭＳ／ＭＳスペクトル上で観測できなくなるおそれがある。
図７はイオン解離手法としてＣＩＤ及びＨＡＤを用いたときのＭＳ／ＭＳスペクトルの比較を示す図である。図７（ａ）に示すようにＣＩＤを用いた場合には、プリカーサイオンの信号強度は非常に低くなり、プロダクトイオンの信号強度は全体的に高くなる。これに対し、図７（ｂ）に示すようにＨＡＤを用いた場合には、多くの量のプリカーサイオンが解離されずに残るため該プリカーサイオンの信号強度は高く、逆に、プロダクトイオンの信号強度は全体的に低くなってしまう。【０００９】
信号のＳＮ比や検出感度を高めるには、同じ試料に対するＭＳn分析を複数回繰り返し行い、各ＭＳn分析で得られた信号強度を積算する必要がある。しかしながら、そうすると試料の消費量が多くなり、試料が枯渇するおそれがある。また、十分な量の試料が用意できない場合には品質の高いＭＳ／ＭＳスペクトルが得られず、目的成分の構造解析等に支障をきたすおそれがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開２０１５／１３３２５９号
【特許文献２】特開２０１２−４９０５６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】レイモンド（Raymond E. M.）、「アン・イントロダクション・トゥー・クァドルポール・イオン・トラップ・マス・スペクトロメトリー（An Introduction to Quadrupole Ion Trap Mass Spectrometry）」、ジャーナル・オブ・マス・スペクトロメトリー（Journal of Mass Spectrometry）、Vol.32、1997年、pp.351-369
【非特許文献２】ディン（Ding L.）、ほか４名、「ア・デジタル・イオン・トラップ・マス・スペクトロメーター・カップルド・ウィズ・アトモスフェリック・プレッシャー・イオン・ソーシズ（A digital ion trap mass spectrometer coupled with atmospheric pressure ion sources）」、ジャーナル・オブ・マス・スペクトロメトリー（Journal of Mass Spectrometry）、Vol.39、2004年、pp.471-484
【非特許文献３】レクハ（Lekha S.）、ほか１名、「イオン・アクティベイション・メソッズ・フォー・タンデム・マス・スペクトロメトリー（Ion activation methods for tandem mass spectrometry）」、ジャーナル・オブ・マス・スペクトロメトリー（Journal of Mass Spectrometry）、Vol.39、2004年、pp.1091-1112
【非特許文献４】Reiko Kiyonami、ほか８名、「インクリーズド・セレクティビティー、アナリティカル・プレシジョン、アンド・スループット・イン・ターゲッテッド・プロテオミクス（Increased Selectivity, Analytical Precision, and Throughput in Targeted Proteomics）」、モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Molecular & cellular proteomics）、10.2、2011年
【非特許文献５】マクファーランド（McFarland M. A.）、ほか４名、「エバリュエイション・アンド・オプティマイゼイション・オブ・エレクトロン・キャプチャー・ディソシエイション・エフィシェンシー・イン・フーリエ・トランスフォーム・イオン・サイクロトロン・リゾナンス・マス・スペクトロメトリー（Evaluation and Optimization of Electron Capture Dissociation Efficiency in Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry）」、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ソサイエティ・フォー・マス・スペクトロメトリー（Journal of the American Society for Mass Spectrometry）、Vol.16、2005年、pp.1060-1066
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは、プリカーサイオンの解離効率が低い解離手法によるイオン解離を行う際に、試料の使用量を抑えながら信号強度のＳＮ比や検出感度を向上させることができるイオントラップ質量分析装置及び該装置を用いた質量分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するためになされた本発明に係る質量分析方法は、複数の電極から成るイオントラップの内部空間に試料由来のイオンを捕捉し、該イオンを所定のイオン解離手法により解離させ、それにより得られたプロダクトイオンを前記イオントラップから排出して検出するイオントラップ質量分析装置を用いた質量分析方法であって、
a)前記イオントラップに捕捉されているイオンのうち、特定の質量電荷比を有する目的イオン以外のイオンを該イオントラップから排出するイオン選別ステップと、
b)前記イオン選別ステップによって前記イオントラップに残された前記目的イオンを所定の解離手法によって解離させるイオン解離操作、及び、その解離操作後に前記イオントラップに捕捉されているイオンのうち前記目的イオンの質量電荷比よりも質量電荷比が小さいイオンを低質量電荷比側から質量電荷比が高くなる方向に又はその逆方向に質量走査しながら排出するイオン排出操作、を複数回繰り返し行うイオン解離・排出ステップと、
c)前記イオン解離・排出ステップにおける複数回のイオン排出操作時に前記イオントラップから排出されたイオンを検出した結果に基づいてマススペクトルを作成するマススペクトル作成ステップと、
を有することを特徴としている。【００１４】
また上記課題を解決するためになされた本発明に係るイオントラップ質量分析装置は、上記本発明に係る質量分析方法を実施するための装置であり、複数の電極から成るイオントラップの内部空間に試料由来のイオンを捕捉し、該イオンを所定のイオン解離手法により解離させ、それにより得られたプロダクトイオンを前記イオントラップから排出して検出するイオントラップ質量分析装置であって、
a)前記イオントラップに捕捉されているイオンのうち、特定の質量電荷比を有する目的イオン以外のイオンを該イオントラップから排出する電場を形成するように、該イオントラップを構成する少なくとも一つの電極に所定の電圧を印加するイオン選別実行部と、
b)前記イオン選別実行部によるイオン選別操作によって前記イオントラップに残された前記目的イオンを所定の解離手法によって解離させるイオン解離操作、及び、その解離操作後に前記イオントラップに捕捉されているイオンのうち前記目的イオンの質量電荷比よりも質量電荷比が小さいイオンを低質量電荷比側から質量電荷比が高くなる方向に又はその逆方向に質量走査しながら排出するように前記イオントラップを構成する少なくとも一つの電極に所定の電圧を印加するイオン排出操作、を複数回繰り返し行うイオン解離・排出実行部と、
c)前記イオン解離・排出実行部による複数回のイオン排出操作時に前記イオントラップから排出されたイオンを検出した結果に基づいてマススペクトルを作成するマススペクトル作成部と、
を備えることを特徴としている。【００１５】
ここで、イオントラップは、三次元四重極型イオントラップ、リニア型イオントラップなどである。また、所定のイオン解離手法とは特に限定されないが、典型的には、プリカーサイオンの解離効率が低い、ＨＡＤ、ＥＴＤ、ＥＣＤなどである。また、異なる種類の解離手法を併用しても構わない。【００１６】
本発明に係る質量分析方法において、例えばイオン源で試料から生成された各種イオンはイオントラップに導入され、該イオントラップの内部空間に形成される高周波電場によって捕捉される。イオン選別ステップでは、イオントラップを構成する複数の電極の少なくとも一つに印加する電圧を制御することにより、イオントラップに捕捉されているイオンのうち、特定の質量電荷比を有する目的イオン以外のイオンを該イオントラップから排出して除去する。その結果、イオントラップの内部空間には目的イオンのみが捕捉される。【００１７】
次に、イオン解離・排出ステップでは、まずイオントラップの内部空間に捕捉されている目的イオンを所定の解離手法によって解離させるイオン解離操作が実施される。当然のことながら、このイオン解離操作の具体的な内容は解離手法によって異なる。例えばＨＡＤであれば、イオントラップ内に捕捉されている目的イオンに対し所定流量の水素ラジカルを照射する。これによって、目的イオンは解離し、各種のプロダクトイオンが生成されてイオントラップ内空間に捕捉される。ＨＡＤ、ＥＴＤ等の解離効率が低い解離手法が用いられた場合、或いは、ＣＩＤ等の解離手法であっても反応時間が短い等、解離条件が適切でなかった場合には、イオン解離操作の終了時点でも目的イオンつまりはプリカーサイオンは残存する。【００１８】
イオン解離操作の終了後には、イオントラップを構成する複数の電極の少なくとも一つに印加する電圧を制御することにより、低質量電荷比側から目的イオンの質量電荷比の直前まで質量電荷比が高くなる方向に順に質量走査しながら、又はその逆方向に質量走査しながらイオンを排出するイオン排出操作が実施される。質量走査は目的イオンの質量電荷比よりも低い質量電荷比範囲に対してのみ行われるから、目的イオンが解離して生じたプロダクトイオンのみが排出され、目的イオンはそのままイオントラップ内空間に残ることになる。上記イオン排出操作時にはイオントラップから質量電荷比の小さい順に又は逆に大きい順にイオンが排出されるから、この排出されるイオンを検出部で順次検出することで、質量電荷比に対応するイオン強度信号を得ることができる。【００１９】
上述したようにイオン排出操作が行われても、その直前のイオン解離操作によって解離しなかった目的イオンは排出されずにイオントラップ内空間に残る。そこでイオン解離・排出ステップでは、この残っている目的イオンに対し再びイオン解離操作を行い、それによって生成されたプロダクトイオンを排出するイオン排出操作を実施する。このイオン排出操作の際にも、排出されるイオンを検出部で検出することで質量電荷比に対応するイオン強度信号を得ることができる。イオン解離操作を繰り返す毎にイオントラップ内空間に捕捉されている目的イオンは減少してゆくから、例えば規定の回数、或いは得られるイオン強度信号が所定の閾値以下になるまで、イオン解離操作及びイオン排出操作を繰り返す。そして、マススペクトル作成ステップでは、複数回のイオン排出操作時にイオントラップから排出されたイオンを検出した結果、つまりは質量電荷比とイオン強度信号との関係を示すマススペクトル情報を積算することで最終的なマススペクトルを作成する。【００２０】
なお、複数回のイオン解離操作時に同じ解離手法、例えばＨＡＤを用いれば、その解離手法に対応する構造情報が高い感度で観測されるマススペクトルを得ることができるし、複数回のイオン解離操作時に二以上の異なる解離手法、例えばＨＡＤとＣＩＤを用いれば、一種の解析手法では得られない多様な構造情報が観測されるマススペクトルを得ることができる。また、複数回のイオン解離操作時に二以上の異なる解離手法を用いる際に、異なる解離手法に対して得られたデータを積算せずに、その解離手法毎に個別のマススペクトルを作成するようにしてもよい。これによれば、一つの試料に対し異なる種類の構造情報が観測される複数のマススペクトルを得ることができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係る質量分析方法及びイオントラップ質量分析装置によれば、イオントラップに捕捉した目的イオンを無駄に廃棄することなく、複数回解離させ、各解離操作で生成されたプロダクトイオンを質量分析してその結果を反映したマススペクトルを取得することができる。それにより、ＨＡＤやＥＴＤ、ＥＣＤのようにイオン解離効率が低い解離手法を用いる場合であっても、試料の使用量を抑えつつ、プロダクトイオンの信号強度のＳＮ比や検出感度が高いマススペクトルを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一実施例であるイオントラップ質量分析装置の全体構成図。
【図２】本実施例のイオントラップ質量分析装置における特徴的なＭＳ／ＭＳ分析動作のフローチャート。
【図３】本実施例のイオントラップ質量分析装置におけるＭＳ／ＭＳ分析動作を説明するためのマススペクトル（積算スペクトル）を示す図。
【図４】本実施例のイオントラップ質量分析装置におけるＰ物質のマススペクトルの実測例を示す図。
【図５】本実施例のイオントラップ質量分析装置においてＨＡＤを３回繰り返したときのＰ物質のマススペクトルの実測例を示す図。
【図６】図４に示したデータを取得したときのプリカーサイオン量の変化を示す図。
【図７】イオン解離手法としてＣＩＤ及びＨＡＤを用いたときのマススペクトルの比較を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明に係る質量分析方法及びイオントラップ質量分析装置の一実施例について、添付図面を参照して説明する。
図１は本実施例のイオントラップ質量分析装置の全体構成図である。
【００２４】
本実施例のイオントラップ質量分析装置は、真空雰囲気に維持される図示しない真空チャンバの内部に、目的試料中の成分をイオン化するイオン源１と、イオン源１で生成されたイオンを高周波電場の作用により捕捉するイオントラップ２と、イオントラップ２から排出されたイオンを検出する検出器３と、検出器３による検出信号をデジタル化するアナログデジタル変換部（ＡＤＣ）４と、得られたデータを処理するデータ処理部５と、イオントラップ２内に捕捉されているイオンをＨＡＤにより解離させるべく該イオントラップ２内に水素ラジカルを導入するための水素ラジカル照射部６と、イオントラップ２内にクーリングガスなどの所定のガスを導入するためのガス導入部７と、イオントラップ２を構成する電極に電圧を印加するトラップ電圧発生部８と、各部の動作を制御する制御部９と、を備える。
【００２５】
イオン源１は例えばＭＡＬＤＩ法などの適宜のイオン化法を用いたイオン源である。イオントラップ２は、ドーナツ状のリング電極２１と、該リング電極２１を挟んで対向配置された一対のエンドキャップ電極２２、２４と、を含む三次元四重極型のイオントラップである。制御部９による指示に応じてトラップ電圧発生部８は、上記電極２１、２２、２４それぞれに対し、所定のタイミングで高周波電圧、直流電圧のいずれか一方又はそれらを合成した電圧を印加する。水素ラジカル照射部６は、水素ラジカルを貯留した又は水素ラジカルを生成する水素ラジカル供給源６１と、流量を調整可能であるバルブ６２と、水素ラジカルを細径の噴出流として噴出する加熱されたタングステンキャピラリであるノズル６３と、を含む。ガス導入部７は、ガス供給源７１と、流量を調整可能であるバルブ７２と、を含む。また、データ処理部５は機能ブロックとしてマススペクトル積算部５１を含む。なお、データ処理部５や制御部９の機能の一部は、汎用のパーソナルコンピュータに予めインストールした専用の処理・制御用ソフトウエアを該コンピュータ上で実行することで実現する構成とすることができる。
【００２６】
本実施例のイオントラップ質量分析装置における通常のＭＳ／ＭＳ分析動作を概略的に説明する。
イオン源１において目的試料から生成された各種イオンはパケット状にイオン源１から射出され、入口側エンドキャップ電極２２に形成されているイオン導入孔２３を経てイオントラップ２の内部に導入される。イオントラップ２内に導入された試料由来のイオンは、トラップ電圧発生部８からリング電極２１に印加される高周波電圧によってイオントラップ２内に形成される高周波電場に捕捉される。そのあと、トラップ電圧発生部８からリング電極２１等に所定の電圧が印加され、それによって特定の質量電荷比を有する目的イオン以外の質量電荷比範囲に含まれるイオンは励振され、イオントラップ２から排除される。これにより、イオントラップ２内に、特定の質量電荷比を有する目的イオン、つまりプリカーサイオンが選択的に捕捉される。
【００２７】
それに続き、ガス導入部７においてバルブ７２が開放され、イオントラップ２内にクーリングガスとしてヘリウムなどの不活性ガスが導入されることで、プリカーサイオンのクーリングが行われる。これにより、プリカーサイオンはイオントラップ２の中心付近に収束される。その状態で、水素ラジカル照射部６のバルブ６２が開放され、水素ラジカル（水素原子）が細径のビーム状となってノズル６３から噴出し、リング電極２１に穿設されているラジカル粒子導入口２６を通過する。この水素ラジカルはイオントラップ２内に導入され、イオントラップ２内に捕捉されているプリカーサイオンに照射される。このとき、イオンに照射される水素ラジカルの流量が所定流量以上になるように、バルブ６２の開度は予め調整される。また、水素ラジカルの照射時間も予め適宜に設定される。それによって、プリカーサイオンは不対電子誘導型の解離を生じる。特許文献１に開示されているように、試料がペプチドである場合には、ペプチド由来のｃ／ｚ系列のプロダクトイオンが主として生成される。
【００２８】
生成された各種プロダクトイオンはイオントラップ２内に捕捉される。そのあと、制御部９の制御によりトラップ電圧発生部８はエンドキャップ電極２２、２４等に所定の高周波電圧を印加し、これによりイオントラップ２に捕捉されていたイオンは質量電荷比の昇順又は降順に励振されてイオン射出孔２５を通して排出される。イオントラップ２から排出されたイオンは検出器３により検出され、その検出信号はＡＤＣ４でデジタル化されてデータ処理部５に入力される。データ処理部５は、入力されたデータに基づいて横軸が質量電荷比、縦軸がイオン強度であるＭＳ／ＭＳスペクトルを作成する。
【００２９】
上記のような手順によって目的イオンに対するＭＳ／ＭＳスペクトル（プロダクトイオンスペクトル）を作成することができるものの、上述したようにＨＡＤは比較的イオンの解離効率が低いため、必ずしも信号のＳＮ比や検出感度が高いマススペクトルを得ることができない。そこで、本実施例のイオントラップ質量分析装置では、以下に述べる特徴的なＭＳ／ＭＳ分析を行うことで信号のＳＮ比や検出感度が高いマススペクトルを得ることができるようにしている。
図２はこのＭＳ／ＭＳ分析動作のフローチャート、図３はこのＭＳ／ＭＳ分析動作を説明するためのマススペクトル（積算スペクトル）を示す図である。なお、図３は実測結果ではなく、Ｐ物質（Substance P）を試料としたときに得られると推定される積算スペクトルの概念図である。
【００３０】
まず、イオン源１において目的試料から生成された各種イオンをイオントラップ２内空間に導入して高周波電場により捕捉する（ステップＳ１）。次に、目的イオン（プリカーサイオン）の振動周波数にノッチがある広帯域の周波数スペクトルを有する信号をエンドキャップ電極２２、２４に印加することにより、目的イオン以外の様々な不要なイオンをイオントラップ２から排除する。このような広帯域信号としては、ＦＮＦ（＝Filtered Noise Field）信号がよく用いられるが、そのほかＳＷＩＦＴ（＝Stored Wave Inverse Fourier Transform）信号なども知られている。ここまでの動作は一般的なＭＳ／ＭＳ動作と同じである。
【００３１】
目的イオンのみをイオントラップ２内空間に残すような操作を行ったあと、該目的イオンをクーリングし、水素ラジカル照射部６から水素ラジカルを所定流量で所定時間、イオントラップ２内の目的イオンに照射することで該イオンの解離を促す。それによって目的イオンは解離して各種プロダクトイオンが生成され、このプロダクトイオンは解離しなかった目的イオンと共にイオントラップ２内空間に捕捉される（ステップＳ３）。
【００３２】
次に、制御部９の制御の下でトラップ電圧発生部８はエンドキャップ電極２２、２４に印加する電圧を所定範囲で走査することにより、イオントラップ２に捕捉されているイオンを質量電荷比の小さい順にイオントラップ２から共鳴励起排出させる。この際、従来であれば、目的イオンの質量電荷比を含む広い質量電荷比範囲についての質量走査が行われるように印加電圧を制御するが、ここでは、最も低い質量電荷比から排出するイオンの質量走査を開始し、目的イオンの質量電荷比の直前、具体的には目的イオンの質量電荷比Ｍよりも所定の質量電荷比差ΔＭだけ低い質量電荷比Ｍ−ΔＭを終了点とするようにイオン排出のための質量走査を行う（ステップＳ４）。なお、この質量電荷比差ΔＭは、或る質量電荷比のイオンを排出するように所定の電圧をエンドキャップ電極２２、２４に印加したときに、実際に排出されるイオンの質量電荷比幅などに基づいて予め決めておくことができる。また、上述したように、質量電荷比が大きくなる方向に共鳴励起排出の質量走査を行う代わりに、質量電荷比Ｍ−ΔＭから質量電荷比が小さくなる方向に共鳴励起排出の質量走査を行ってもよい。前者は特許文献２等に記載のフォワードスキャンに相当し、後者はリバーススキャンに相当する。
【００３３】
上述したように共鳴励起排出するイオンの質量電荷比を走査する際に、検出器３はイオントラップ２から排出されたイオンを検出する。検出信号をデジタル化したデータはデータ処理部５に入力され、該データはマススペクトル積算部５１に内蔵されたメモリに一時的に格納される。このデータは、目的イオンよりも低い質量電荷比範囲に存在するプロダクトイオンの質量電荷比とイオン強度との関係を示すＭＳ／ＭＳスペクトルを示すデータである（ステップＳ５）。
【００３４】
図３は、ＨＡＤによるプリカーサイオンの解離効率を２０％、Ｃ4系列イオンの生成量はプリカーサイオン量の２５％であると仮定した場合の例であり、プリカーサイオンピーク及びプロダクトイオンｃ4ピークの上部の数値は任意単位のイオン量を示している。図３（ａ）に示すように、１回のＨＡＤでは、捕捉されていた目的イオンのうちの２０％のみが解離してプロダクトイオンが生成されるので、スペクトル上の各プロダクトイオンのピーク強度は低い。
【００３５】
上記共鳴励起排出の操作が実施されると、目的イオンよりも低い質量電荷比範囲のプロダクトイオンはイオントラップ２内から除去されるが、先のＨＡＤによって解離しなかった目的イオンは除去されずにイオントラップ２内にほぼそのまま残る。そこで、制御部９は例えば予め設定された所定の繰り返し回数だけステップＳ４、Ｓ４の操作を繰り返したか否かを判定し（ステップＳ６）、所定の繰り返し回数に達していなければステップＳ７に進む。即ち、ステップＳ３と同様に、水素ラジカル照射部６から水素ラジカルを所定流量で所定時間、イオントラップ２内の目的イオンに照射することで該イオンの解離を促す。それによって、残存していた目的イオンの少なくとも一部は解離して各種プロダクトイオンが生成され、このプロダクトイオンは解離しなかった目的イオンと共にイオントラップ２内空間に捕捉される。
【００３６】
ステップＳ７のイオン解離操作の実行後、ステップＳ４へと戻り、共鳴励起排出の操作とイオントラップ２から排出されたイオンの検出を再び実行する。したがって、このときにも、目的イオンよりも低い質量電荷比範囲に存在するプロダクトイオンの質量電荷比とイオン強度との関係を示すＭＳ／ＭＳスペクトルを示すデータが得られる。マススペクトル積算部５１は先にメモリに格納されたスペクトルデータと新たに取得されたスペクトルデータとを質量電荷比毎に積算し、メモリの内容を積算結果のデータに更新する。
【００３７】
ステップＳ６で所定の繰り返し回数に達したと判断されるまで、ステップＳ４〜Ｓ７の操作及び処理が繰り返される。したがって、例えば所定の繰り返し回数が５である場合には、５回のイオン解離操作が実施され、それぞれのイオン解離操作で生成されたプロダクトイオンのイオン強度を全て加算したＭＳ／ＭＳスペクトルデータがスペクトル積算部５１で得られることになる。即ち、図３（ｂ）〜（ｅ）に示すように、ＨＡＤ１回毎にＭＳ／ＭＳスペクトル（積算スペクトル）上のプロダクトイオンのピーク強度は増大する。
【００３８】
そして、ステップＳ６で所定の繰り返し回数に達したと判断されると、イオンに対する操作を終了し、その時点でスペクトル積算部５１で得られている積算済みのＭＳ／ＭＳスペクトルデータに基づくＭＳ／ＭＳスペクトルを例えば表示部（図示せず）等に表示する（ステップＳ８）。表示されるＭＳ／ＭＳスペクトルは、試料由来の目的イオンの多く又は殆どが解離した結果、生成されたプロダクトイオンを反映したものであるため、ＨＡＤのようにイオン解離効率が低いイオン解離手法を用いても、信号のＳＮ比が高く、検出感度も高いＭＳ／ＭＳスペクトルを得ることができる。
【００３９】
なお、上記説明では、ステップＳ６において所定の繰り返し回数だけステップＳ４、Ｓ４の操作を繰り返したか否かを判定していたが、それ以外の方法で繰り返し終了か否かを判断するようにしてもよい。例えば検出された全てのプロダクトイオンの信号強度の加算値を算出し、その加算値が所定の閾値以下になったときに繰り返しを終了するようにしてもよい。いずれにしても、イオントラップ２に捕捉されている目的イオンの量が十分に減少し、それ以上、イオン解離操作及びイオン排出操作を繰り返しても信号強度の増加がそれほど期待できないような状態になったならば繰り返しを終了するとよい。或いは、測定時間に限りがある場合には、測定時間が所定の制限時間を超えた時点で繰り返しを打ち切るようにしてもよい。
【００４０】
次に、上述した特徴的なＭＳ／ＭＳ分析による実測結果について述べる。この実測に用いた試料は物質Ｐ（分子量：1347.6）であり、ＭＡＬＤＩ用サンプル調製に利用したマトリクスはα-Cyano-4-hydroxycinnamic acid（ＣＨＣＡ）である。また、測定に使用したイオントラップ質量分析装置は、図１に示した構成と同様の、水素ラジカル粒子照射機構を具備したデジタルイオントラップ質量分析装置である。
【００４１】
図４は、ＨＡＤを用いた通常のＭＳ／ＭＳ分析（つまりはＨＡＤが１回のみ）によるＰ物質のＭＳ／ＭＳスペクトルの実測例である。図４では、連続したｃ系列のプロダクトイオンが観測されてはいるものの、プリカーサイオンも高い強度で観測されている。即ち、これはイオントラップ内に捕捉されているプリカーサイオンの一部しかＨＡＤによって解離されていないことを示している。
【００４２】
図５は、上述した特徴的なＭＳ／ＭＳ分析の手順に従って、ＨＡＤを３回繰り返したときの各回のＰ物質のＭＳ／ＭＳスペクトル及び積算したＭＳ／ＭＳスペクトルの実測例である。また、プリカーサイオン選択時のプリカーサイオン及びＨＡＤを３回実施したときに残存しているプリカーサイオンの実測のマススペクトルを図６に示す。なお、ＨＡＤ１回目及び２回目は、プロダクトイオンのみをイオントラップから排出して検出しているため、図６に示したようなプリカーサイオンのピークは観測することができない。
【００４３】
図５に示した実測結果によれば、プリカーサイオンの解離効率及び検出されるプロダクトイオン量はＨＡＤ毎にばらつきがあるものの、１回のイオン化によって得られたプリカーサイオンに対してＨＡＤを３回繰り返したときにそれぞれ得られたマススペクトルを積算することによって、高いＳＮ比のマススペクトルが得られていることが分かる。従来のＭＳ／ＭＳ分析の手法では、これと同様の積算したマススペクトルを得るためにはイオン源におけるイオン化を３回繰り返す必要があるのに対し、本実施例における特徴的なＭＳ／ＭＳ分析手法では僅か１回のイオン化を行うだけで同等のマススペクトルを得ることができる。これは、同等のＳＮ比のマススペクトルを得るために試料の使用量が１／３で済むことを意味しており、本実施例の手法は試料の量が微量である或いは試料が高価（又は貴重）であるような場合に特に有用であるということができる。
【００４４】
上記実施例では、イオントラップ２に捕捉した目的イオンをＨＡＤを用いて解離させる例について述べたが、ＨＡＤと同様に、プリカーサイオンの解離効率が低いＥＴＤやＥＣＤを用いて解離を行う場合にも、上述したのと全く同じ手法でＭＳ／ＭＳスペクトルの品質を向上させることができることは明らかである。また、ＣＩＤやＩＲＭＰＤはプリカーサイオンの解離効率は高いものの解離条件によっては解離効率を十分に高くできない場合がある。例えばＩＲＭＰＤを行う場合であって装置の制約上レーザ光パワーを大きくできないような場合である。そうした場合にも、上述した手法でＭＳ／ＭＳスペクトルの品質を向上させることができることは明らかである。
【００４５】
また、１回のイオン化によって生成したプリカーサイオンに対して、ＨＡＤのような一種類の解離操作を繰り返すのではなく、異なる複数の種類の解離操作を順番に実行するようにしてもよい。上述したように、プリカーサイオンが同じであっても解離手法が異なると、プリカーサイオンにおける異なる結合が切断され異なる種類のプロダクトイオンが生成される場合がある。そのため、得られるプロダクトイオンが異なるイオン解離手法を適切に組み合わせることによって、得られるイオンの構造情報を増やすことができ、その結果、イオンの構造解析の精度を向上させることが可能である。
【００４６】
例えば、糖ペプチドイオンの構造解析においては、ＣＩＤやＩＲＭＰＤを用いたＭＳ／ＭＳ分析では主にペプチド配列情報及び糖鎖構造情報が得られる。一方、ＨＡＤやＥＣＤ、ＥＴＤを用いたＭＳ／ＭＳ分析ではペプチド配列情報及び糖鎖結合部位情報が得られる。そのため、糖ペプチドイオンに対して最初の１又は複数回のイオン解離操作にＨＡＤを行い、そのあとイオントラップ内に残存しているプリカーサイオンに対してＣＩＤを行うことによって、一回の試料のイオン化によって生成されたプリカーサイオンから、ＨＡＤとＣＩＤとの両方のプロダクトイオンが得られ、糖ペプチドの構造解析の精度が向上する。このとき、積算スペクトルはＨＡＤによるＭＳ／ＭＳスペクトルとＣＩＤによるＭＳ／ＭＳスペクトルの両方を積算してもよいし、データ解析の複雑さを低減させるために、ＨＡＤによるＭＳ／ＭＳスペクトルとＣＩＤによるＭＳ／ＭＳスペクトルとを別々に取得するようにしてもよい。
【００４７】
また、上記実施例やそのほかの各種変形例も本発明の一例にすぎないから、上記記載以外の点について、本発明の趣旨の範囲で適宜、変形、追加、修正を行っても、本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００４８】
１…イオン源
２…イオントラップ
２１…リング電極
２２、２４…エンドキャップ電極
２３…イオン導入孔
２５…イオン射出孔
２６…ラジカル粒子導入口
３…検出器
４…アナログデジタル変換部
５…データ処理部
５１…マススペクトル積算部
６…水素ラジカル照射部
６１…水素ラジカル供給源
６２…バルブ
６３…ノズル
７…ガス導入部
７１…ガス供給源
７２…バルブ
８…トラップ電圧発生部
９…制御部
【図１】
2017126006.tif 000003
【図２】
2017126006.tif 000004
【図３】
2017126006.tif 000005
【図４】
2017126006.tif 000006
【図５】
2017126006.tif 000007
【図６】
2017126006.tif 000008
【図７】
2017126006.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月31日(2018.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
上記共鳴励起排出の操作が実施されると、目的イオンよりも低い質量電荷比範囲のプロダクトイオンはイオントラップ２内から除去されるが、先のＨＡＤによって解離しなかった目的イオンは除去されずにイオントラップ２内にほぼそのまま残る。そこで、制御部９は例えば予め設定された所定の繰り返し回数だけステップＳ４、Ｓ５の操作を繰り返したか否かを判定し（ステップＳ６）、所定の繰り返し回数に達していなければステップＳ７に進む。即ち、ステップＳ３と同様に、水素ラジカル照射部６から水素ラジカルを所定流量で所定時間、イオントラップ２内の目的イオンに照射することで該イオンの解離を促す。それによって、残存していた目的イオンの少なくとも一部は解離して各種プロダクトイオンが生成され、このプロダクトイオンは解離しなかった目的イオンと共にイオントラップ２内空間に捕捉される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
ステップＳ７のイオン解離操作の実行後、ステップＳ４へと戻り、共鳴励起排出の操作とイオントラップ２から排出されたイオンの検出を再び実行する。したがって、このときにも、目的イオンよりも低い質量電荷比範囲に存在するプロダクトイオンの質量電荷比とイオン強度との関係を示すＭＳ／ＭＳスペクトルを示すデータが得られる。マススペクトル積算部５１は先にメモリに格納されたスペクトルデータと新たに取得されたスペクトルデータとを質量電荷比毎に積算し、メモリの内容を積算結果のデータに更新する（ステップＳ５）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
ステップＳ６で所定の繰り返し回数に達したと判断されるまで、ステップＳ４〜Ｓ７の操作及び処理が繰り返される。したがって、例えば所定の繰り返し回数が５である場合には、５回のイオン解離操作が実施され、それぞれのイオン解離操作で生成されたプロダクトイオンのイオン強度を全て加算したＭＳ／ＭＳスペクトルデータがマススペクトル積算部５１で得られることになる。即ち、図３（ｂ）〜（ｅ）に示すように、ＨＡＤ１回毎にＭＳ／ＭＳスペクトル（積算スペクトル）上のプロダクトイオンのピーク強度は増大する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
そして、ステップＳ６で所定の繰り返し回数に達したと判断されると、イオンに対する操作を終了し、その時点でマススペクトル積算部５１で得られている積算済みのＭＳ／ＭＳスペクトルデータに基づくＭＳ／ＭＳスペクトルを例えば表示部（図示せず）等に表示する（ステップＳ８）。表示されるＭＳ／ＭＳスペクトルは、試料由来の目的イオンの多く又は殆どが解離した結果、生成されたプロダクトイオンを反映したものであるため、ＨＡＤのようにイオン解離効率が低いイオン解離手法を用いても、信号のＳＮ比が高く、検出感度も高いＭＳ／ＭＳスペクトルを得ることができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
なお、上記説明では、ステップＳ６において所定の繰り返し回数だけステップＳ４、Ｓ５の操作を繰り返したか否かを判定していたが、それ以外の方法で繰り返し終了か否かを判断するようにしてもよい。例えば検出された全てのプロダクトイオンの信号強度の加算値を算出し、その加算値が所定の閾値以下になったときに繰り返しを終了するようにしてもよい。いずれにしても、イオントラップ２に捕捉されている目的イオンの量が十分に減少し、それ以上、イオン解離操作及びイオン排出操作を繰り返しても信号強度の増加がそれほど期待できないような状態になったならば繰り返しを終了するとよい。或いは、測定時間に限りがある場合には、測定時間が所定の制限時間を超えた時点で繰り返しを打ち切るようにしてもよい。
【国際調査報告】
2017126006.tif 000010
2017126006.tif 000011
2017126006.tif 000012
2017126006.tif 000013