(57)【要約】  エルゴチオネイン生産能を有する微生物を培養し、菌体外に産生されたエルゴチオネインを取得することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法であって、該微生物がエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物である方法、ならびに上記方法において微生物がヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物である方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エルゴチオネイン生産能を有する微生物を培養し、菌体外に産生されたエルゴチオネインを取得することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法であって、該微生物がエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物である方法。
【請求項２】
該微生物がヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
該微生物が、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現するものである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該微生物が放線菌、腸内細菌または酵母である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
該微生物が放線菌である請求項４記載の方法。
【請求項６】
エルゴチオネインを菌体外に生産する能力を有する微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物。
【請求項７】
ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた請求項６記載の微生物。
【請求項８】
マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現するものである請求項６または７記載の微生物。
【請求項９】
放線菌、腸内細菌または酵母である請求項６〜８のいずれか１項記載の微生物。
【請求項１０】
放線菌である請求項９記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は含硫アミノ酸の製造方法に関する。詳細には、本発明はエルゴチオネインの発酵生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エルゴチオネインは含硫アミノ酸の一種で、抗酸化能をはじめとする多様な生理活性を有することが知られている。また、その抗酸化能はビタミンＣ、ビタミンＥ、システイン、グルタチオンよりも高いことが示唆されている。エルゴチオネインは紫外線吸収効果、メラニン産生抑制作用、活性酸素種の消去能、しわやたるみの形成を抑えるエラスターゼ活性阻害作用、シミの形成を抑えるチロシナーゼ活性阻害作用を有することも示されている。したがって、エルゴチオネインはとりわけ美容・食品業界で注目されている化合物の１つである。【０００３】
エルゴチオネインは一部の微生物、特に担子菌類に多く含まれており、動植物にも微量含まれている。哺乳動物はエルゴチオネインを生合成することができないが、担子菌類を含むキノコなどを摂食することで体内に取り込み、一部の臓器にエルゴチオネインが蓄積することが知られている。エルゴチオネインの製造方法として、担子菌類等の微生物の培養・抽出法および有機合成法が知られている（特許文献１、２等参照）。しかしながら、担子菌類等からの抽出法は、生産性が低い、微生物の培養に長期間を有する、菌体内に蓄積するため菌体内から抽出するための製造プロセスが複雑である、微生物の改良が困難である等の理由から普及するに至っていない。有機合成法も、反応が多段階で複雑である、有害な原料を使用することがある、高価な原料を使用するため費用が高くつく等の理由から普及に至っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−００４０３０号公報
【特許文献２】特開２００７−１００２９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、現状では、エルゴチオネインは価格が高く、その供給に課題がある。したがって、安価かつ大量にエルゴチオネインを製造する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行い、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物の培養液中に予想外にエルゴチオネインが著量産生されることを見出した。さらに、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させたエルゴチオネイン生産能を有する微生物の培養液中にエルゴチオネインがさらに多く産生されることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
したがって本発明は以下のものを提供する。
（１）エルゴチオネイン生産能を有する微生物を培養し、菌体外に産生されたエルゴチオネインを取得することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法であって、該微生物がエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物である方法。
（２）該微生物がヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物である（１）記載の方法。
（３）該微生物が、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現するものである（１）または（２）記載の方法。
（４）該微生物が放線菌、腸内細菌または酵母である（１）〜（３）のいずれか記載の方法。
（５）該微生物が放線菌である（４）記載の方法。
（６）エルゴチオネインを菌体外に生産する能力を有する微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物。
（７）ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた（６）記載の微生物。
（８）マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現するものである（６）または（７）記載の微生物。
（９）放線菌、腸内細菌または酵母である（６）〜（８）のいずれか記載の微生物。
（１０）放線菌である（９）記載の微生物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、強力な抗酸化作用をはじめとする多様な生理活性を持つ有用物質であるエルゴチオネインを安価かつ大量に製造することができる。さらに、本発明ではエルゴチオネインが菌体外に産生されるので、製造プロセスを簡略化でき、純度の高いエルゴチオネインを容易に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６の野生株（ＷＴ）、野生型エルゴチオネイン生産株（ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）およびＳＬＩ＿５２０５遺伝子が破壊されたエルゴチオネイン生産株（ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）の菌体内外を合わせたエルゴチオネインの総生産量を示すグラフである。
【図２】図２は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６の野生株（ＷＴ）、野生型エルゴチオネイン生産株（ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）およびＳＬＩ＿５２０５遺伝子が破壊されたエルゴチオネイン生産株（ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）の菌体外に産生されたエルゴチオネイン量を示すグラフである。
【図３】図３は、ストレプトマイセス・アヴェルミチリスのコントロール株（ＷＴ／ｐＩＪ１０１）（S. avermitilisと表記）およびＥＧＴ生産株（ＷＴ／ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）（S. avermitilis/pEGTと表記）の菌体外に産生されたエルゴチオネイン量を示すグラフである。
【図４】図４は、ストレプトマイセス・アヴェルミチリス野生株ＭＡ−４６８０（ＮＩＴＥ寄託番号： ＮＢＲＣ１４８９３Ｔ）（ＭＡ−４６８０と表記）およびＳＵＫＡ１７株の菌体外に産生されたエルゴチオネイン量を示すグラフである。
【図５】図５は、空ベクターｐＣＳＤ、ｐＣＧを導入したコリネバクテリウム・グルタミカム（ｐＣＳＤ、ｐＣＧと表記）およびＥＧＴ生合成遺伝子過剰発現ベクターｐＣＳＤ−ｅｇｔＡＢＣＤＥ、ｐＣＧ−ｅｇｔＡＢＣＤＥをそれぞれ導入したコリネバクテリウム・グルタミカム（ｐＣＳＤ−ｅｇｔＡＢＣＤＥ、ｐＣＧ−ｅｇｔＡＢＣＤＥと表記）の体外に産生されたエルゴチオネイン量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、第１の態様において、エルゴチオネイン（本明細書においてＥＧＴと略称することがある）生産能を有する微生物を培養し、菌体外に産生されたエルゴチオネインを取得することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法であって、該微生物がエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物である方法に関する。
【００１１】
微生物を用いた物質生産においては、生産性を高めるために目的物質を菌体外に産生させることが重要であることが知られている。しかし、エルゴチオネインは、輸送体等を介さずには細胞膜を通過できないことが知られている。高等動物等においては細胞内にエルゴチオネインを取り込む輸送体としてOCTN1が知られているが、細胞外へエルゴチオネインを排出する輸送体は生物種を問わず同定されていないため、輸送体等を過剰発現させるなどの方法は現状困難である。物理的や化学的な処理以外で、エルゴチオネインを菌体外に排出する方法は、宿主がもつ内在性の輸送体が同物質を排出していることが考えられる。
【００１２】
本発明に用いるＥＧＴ生産能を有する微生物は、菌体外にＥＧＴを産生し、かつエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物である。該微生物はＥＧＴを菌体外に産生するものであれば、ＥＧＴを菌体内に産生するものであってもよい。菌体内よりも菌体外に多くのＥＧＴを生産する微生物が好ましい。菌体外にＥＧＴを産生するとは、菌体からＥＧＴを遊離させること、ならびに菌体表面にＥＧＴを産生することを包含する。菌体からＥＧＴが遊離される場合は、培養物の菌体外画分、例えば培養上清からＥＧＴを回収することができる。菌体表面にＥＧＴを産生する場合は、撹拌、超音波処理、界面活性剤処理等の公知の手法によりＥＧＴを菌体から遊離させ、遊離されたＥＧＴを回収することができる。
【００１３】
菌体から遊離されたＥＧＴの回収は公知の方法によって行うことができる。例えば、培養物を遠心分離あるいは濾過等の固液分離に供して培養上清を得て、培養上清をイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の公知のクトマトグラフィーに供してＥＧＴを得ることができる。
【００１４】
上述のごとく、本発明に用いる微生物はＥＧＴ生合成遺伝子を過剰発現させた微生物である。ＥＧＴ生合成遺伝子は、ＥＧＴの生合成に関与する酵素をコードする遺伝子である。ＥＧＴの生合成に関与する酵素およびＥＧＴ生合成遺伝子は公知であり、いくつかの遺伝子はヌクレオチド配列も公知である。当業者は、過剰発現させるＥＧＴ生合成遺伝子を適宜選択することができる。例えばマイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Schizosaccharomyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりＥＧＴ生合成遺伝子を過剰発現する微生物を用いることが好ましいが、これらの微生物に限定されない。マイコバクテリウム属のＥＧＴ生合成遺伝子に関しては、F. P. Seebeck, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 6632-6633を参照することができる。シゾサッカロマイセス属のＥＧＴ生合成遺伝子に関しては、T. Pluskal et al, PLOS ONE. 2014 May; 9(5): e97774を参照することができる。ノイロスポラ属のＥＧＴ生合成遺伝子に関しては、W. Hu et al, Org. Lett. 2014, 16, 5382-5385を参照することができる。また、ストレプトマイセス属のＥＧＴ生合成遺伝子に関しては、S. Nakajima et al, J. Biosci. Bioeng. 2015 (in press)を参照することができる。各種微生物におけるＥＧＴ生合成遺伝子に関しては、G. W. Jones et al, Gene 549 (2014) 161-170を参照することができる。
【００１５】
遺伝子を過剰発現するとは、親株または野生株と比較して当該遺伝子の発現量が多いことを意味する。親株または野生株の２倍以上の発現量であることが好ましく、５倍以上の発現量であることがより好ましく、１０倍以上の発現量であることがさらに好ましい。遺伝子発現の定量は、ノーザンブロッティングやリアルタイムＰＣＲ等の公知の方法にて行うことができる。
【００１６】
相当する遺伝子とは、ある微生物のエルゴチオネイン生合成経路においてある反応を触媒する酵素をコードする遺伝子に対して、別の微生物のエルゴチオネイン生合成経路において当該酵素と同じまたは類似の反応を触媒する酵素をコードする遺伝子をいう。ある遺伝子と、それに相当する遺伝子が同じヌクレオチド配列を有していてもよく、異なるヌクレオチド配列を有していてもよい。例えば、ある遺伝子と、ある遺伝子に相当する遺伝子のヌクレオチド配列同一性は５０％以上であってもよく、７０％以上、８０％以上、あるいは９０％以上であってもよい。さらに、ある遺伝子によりコードされる酵素タンパクと、ある遺伝子に相当する遺伝子によりコードされる酵素タンパクが同じアミノ酸配列を有していてもよく、異なるアミノ酸配列を有していてもよい。例えば、ある遺伝子によりコードされる酵素タンパクと、ある遺伝子に相当する遺伝子によりコードされる酵素タンパクのアミノ酸配列同一性は５０％以上であってもよく、７０％以上、８０％以上、あるいは９０％以上であってもよい。
【００１７】
ＥＧＴ生合成遺伝子の過剰発現は、公知の遺伝子過剰発現方法を用いて行うことができる。発現の強いプロモーターの制御下にＥＧＴ生合成遺伝子を置く方法が一般的である。例えば、ＥＧＴ生合成遺伝子の発現に適したプロモーターとＥＧＴ生合成遺伝子を組み込んだ発現ベクターを微生物に導入することによって、または相同組み換え等により宿主のゲノムにＥＧＴ生合成遺伝子を組み込むことによって、ＥＧＴ生合成遺伝子を過剰発現させてもよい。ベクターとしてはプラスミドベクターやウイルスベクターを用いることができる。ベクターの構築に際して、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子や代謝酵素遺伝子などのマーカー遺伝子などのベクターの構成要素を適宜選択し、使用することができる。微生物への遺伝子導入方法も公知である。導入すべき遺伝子をそのまま、あるいはベクターに組み込んで、微生物に導入することができる。遺伝子導入方法の例としては、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、ポリマーを用いる方法、電気穿孔法、パーティクルガン法などがあり、遺伝子導入する微生物の種類や導入する遺伝子に応じてこれらの方法を適宜選択することができる。また、ＥＧＴ生合成遺伝子の過剰発現は、ゲノム上の特定の遺伝子もしくは領域を欠失させることで、内在性のＥＧＴ生合成遺伝子の発現を誘導させてもよい。
【００１８】
ＥＧＴ生合成遺伝子の過剰発現方法は上記方法に限定されない。また、本発明に用いる微生物は、自然変異の結果としてＥＧＴ生合成遺伝子を過剰発現するものであってもよい。ＥＧＴ生合成遺伝子の過剰発現は、ノーザンブロッティングやリアルタイムＰＣＲ等の公知の方法にて確認することができる。あるいは、実際に微生物を培養して、菌体外（培養液中）に産生されるＥＧＴを定量することにより、ＥＧＴ生合成遺伝子の過剰発現を確認することもできる。
【００１９】
微生物において過剰発現させるＥＧＴ生合成遺伝子は１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。ＥＧＴ生合成に関与する複数の酵素をコードする遺伝子を、クラスターとして微生物に導入してもよい。異属または異種微生物由来のＥＧＴ生合成遺伝子を導入して過剰発現させてもよく、同属または同種微生物由来のＥＧＴ生合成遺伝子を導入して過剰発現させてもよい。同属または近縁属由来のＥＧＴ生合成遺伝子を導入して過剰発現させることが好ましく、同種または近縁種由来のＥＧＴ生合成遺伝子を導入して過剰発現させることがより好ましい。同種由来のＥＧＴ生合成遺伝子を導入して過剰発現させることがさらに好ましい。
【００２０】
本発明に用いるＥＧＴ生産能を有する微生物は、ＥＧＴ生合成遺伝子を過剰発現させた微生物であって、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物であることが好ましい。ヒスチジンはＥＧＴ生合成の材料の１つであり、ヒスチジンの代謝に関連するヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させることによって、ＥＧＴ生合成に使われるヒスチジンを増加させ、ＥＧＴ生産量を増加させることができる。ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減させた微生物とは、その親株または野生株よりもヒスチジンアンモニアリアーゼ活性が低下している微生物である。ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性の低下の割合は、好ましくはその親株または野生株の５０％未満、より好ましくは２５％未満、さらに好ましくは１０％未満である。ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を消失させた微生物が最も好ましい。ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を消失させた微生物とは、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性が全く検出されない微生物である。あるいは、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた微生物は、ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物ということもできる。ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現の低下の割合は、好ましくはその親株または野生株の５０％未満、より好ましくは２５％未満、さらに好ましくは１０％未満である。ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子の発現を消失させた微生物が最も好ましい。ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を消失させた微生物とは、ヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現が全く検出されない微生物である。なお、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性、およびヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子の発現は公知の方法にて測定可能である（Hartwell L. H. and Magasanik B., 1963, J. Molecular Biology, 7:401-420.）。
【００２１】
ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させる方法、ならびにヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させる方法も公知であり、例えば、相同組換えやＲＮＡ干渉などによりヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子をノックアウトまたはノックダウンする方法、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼを阻害する物質を微生物に投与する方法などが挙げられるが、これらの方法に限定されない。また、本発明に用いる微生物は、自然変異の結果としてヒスチジンアンモニアリアーゼ活性が低減または消失しているものであってもよい。
【００２２】
本発明に用いるＥＧＴ生産能を有する微生物はいかなる種類のものであってもよい。例えば放線菌、腸内細菌、子嚢菌または担子菌であってもよい。本発明に、用いることができる放線菌としてはストレプトマイセス（Streptomyces）属、アクチノマイセス（Actinomyces）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属の放線菌が例示されるが、これらに限定されない。本発明に用いることができる腸内細菌としてはエシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、及びサルモネラ（Salmonella）属の細菌が例示されるが、これらに限定されない。また、上記の細菌以外としてはメタノール資化性菌である、メチロバクテリウム（Methyrobacterium）属細菌を用いてもよい。本発明に用いることができる子嚢菌としてはシゾサッカロマイセス（Shizosaccaromyces）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）、キャンディダ（Candida）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、及びペニシリウム（Penicillium）属、ノイロスポラ（Neurospora）属の子嚢菌が例示されるがこれらに限定されない。本発明に用いることができる担子菌としてはタモギタケ、ササクレヒトヨタケ、ブナシメジ、キツブナラタケ、ヒラタケ、エリンギ、エノキタケ、ヤナギマツタケ、ハタケシメジ、チャウロコタケ、スギタケ、ウスキモリノカサ、シイタケ、クロアワビタケ、ウスヒラタケ、プレオロータス  及びヤマブシタケなどの担子菌が例示されるが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明において、放線菌、腸内細菌または酵母、が好ましく用いられる。好ましい放線菌としてはストレプトマイセス属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属などの放線菌が挙げられる。好ましい腸内細菌としては、エシェリヒア属、パントエア属、サルモネラ属などの腸内細菌が挙げられる。好ましい酵母としては、シゾサッカロマイセス属、サッカロマイセス属などの酵母が挙げられる。本発明において特に好ましく用いられる放線菌はストレプトマイセス属の放線菌であり、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・アヴェルミチリス（Streptomyces avermitilis）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces  griseus）、ストレプトマイセス・アルバス（Streptomyces albus）、ストレプトマイセス・アルブルス（Streptomyces albulus）などが挙げられる。
【００２４】
本発明のＥＧＴ製造方法における微生物の培養は、通常の方法にて行うことができる。微生物の種類に応じて培地組成や培養温度、培養時間、ｐＨ、通気条件等の諸条件を選択することができる。上記微生物を公知の培地にて培養することにより、ＥＧＴを菌体外に産生させることができるが、ＥＧＴ産生量を増加させるために、システイン、ヒスチジンなどのＥＧＴ生合成に寄与する化合物あるいはそれらの前駆体を培地に添加してもよい。例えば用いる微生物が放線菌である場合は、放線菌用の半合成培地（６％グルコース、０．２％ ＮａＣｌ、０．０５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％ 酵母抽出物、０．００５％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００５％ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．００５％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％ ＣａＣＯ３）、ＴＳＢ培地（０．２５％ グルコース、１．７％ カゼイン膵消化物、０．３％ 大豆パパイン消化物、０．５％ ＮａＣｌ、０．２５％ Ｋ２ＨＰＯ４）、またはＳＹＮ培地（０．７％ カザミノ酸、０．２％ 酵母抽出物、０．２６４％ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２３８％ ＫＨ２ＰＯ４、０．５５６％ Ｋ２ＨＰＯ４、０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００６４％ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００１１％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００７９％ ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、０．００１５％ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％ ＣａＣＯ３）などを用いることができる。腸内細菌を用いる実施形態では、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、ＮＺＹ培地、Ｍ９培地、ＳＯＣ培地、またはＹＰＤ培地などを用いることができる。酵母を用いる実施形態では、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地、またはＹＰＡＤ培地などを用いることができる。上記の培地を用いて、菌体外にＥＧＴを産生させることができるが、用いる培地はこれらに限定されない。
【００２５】
本発明は、第２の態様において、ＥＧＴを菌体外に生産する能力を有する微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物に関する。
【００２６】
本発明のＥＧＴを菌体外に生産する能力を有する微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物としては、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Schizosaccaromyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりＥＧＴ生合成遺伝子を過剰発現させた微生物が好ましいが、これらの微生物に限定されない。
【００２７】
本発明のＥＧＴを菌体外に生産する能力を有する微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物が、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物であることが好ましい。ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性の低減または消失、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現の低下については上で説明したとおりである。
【００２８】
かかる微生物およびその作製については上で説明したとおりである。当業者は、公知の手段・方法を用いてかかる微生物を容易に作製することができる。したがって、本発明は、第３の態様において、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させることを特徴とする、ＥＧＴを菌体外に生産する能力を有する微生物の製造方法に関する。好ましくは、上記製造方法においてヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させること、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させることが好ましい。エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させる工程を、ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させる工程、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させる工程の前に行ってもよく、後に行ってもよい。
【００２９】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり改変した方法を用いて、実験を実施した。また、％は、特に明記しない限りｗ／ｖ ％を表す。
【実施例１】
【００３０】
ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans） １３２６株（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ  １５６７５）を宿主に用いてＥＧＴ生産株を作製し、培養液中におけるＥＧＴ産生量の比較、検討を行った。【００３１】
１−１．ＥＧＴ生産株の構築
１−１−１．ストレプトマイセス・リビダンスにおけるＥＧＴ生合成酵素遺伝子の発現強化
ＥＧＴ生合成酵素遺伝子として、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株由来のＳＬＩ＿１１３９（配列番号１）、ＳＬＩ＿１１４０（配列番号２）、ＳＬＩ＿１１４１（配列番号３）、ＳＬＩ＿１１４２（配列番号４）遺伝子を用いた。上記４遺伝子はストレプトマイセス・リビダンス１３２６株ゲノム上でクラスターを形成している。これらの遺伝子は、それぞれ、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤに相当する遺伝子である。【００３２】
表１のプライマーを用いてストレプトマイセス・リビダンス１３２６株のゲノム抽出物を鋳型に、上記４遺伝子を含むクラスター配列を増幅した。増幅したクラスター配列を、ストレプトマイセス・アヴェルミチリス（Streptomyces avermitilis） ＭＡ−４６８０株のＳＡＶ＿２７９４遺伝子のプロモーター（配列番号５）制御下にてｐＩＪ１０１の複製起点を有するベクターに連結し、遺伝子発現ベクターｐＩＪ１０１＿ＥＧＴを構築した。この遺伝子発現ベクターを用いて、ストレプトマイセス・リビダンス  １３２６株を形質転換し、ＥＧＴ生産株（ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）を得た。形質転換は、放線菌に関する遺伝子操作技術についての「Genetic Manipulation of Streptomyces」（Hopwood,D.A.ら、1985年、Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manual，the John Innes Foundation，Norwich）に記載の方法に従って行った。
【表１】
2017150304.tif 000002
【００３３】
１−１−２．ストレプトマイセス・リビダンスにおけるヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子（ＳＬＩ＿５２０５）の破壊
ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株のＳＬＩ＿５２０５遺伝子（配列番号８）内の部分配列を、表２のプライマーを用いて同菌株のゲノム抽出物を鋳型に増幅した。増幅産物をｐＧＭ１６０の複製起点を有するベクター（Mol. Gen. Genet.,1989, 219, 341-348を参照）にクローニングすることで、ＳＬＩ＿５２０５遺伝子破壊用ベクターを得た。同ベクターにより１−１記載のＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴを形質転換することで、相同組み換えによりゲノム上のＳＬＩ＿５２０５遺伝子内に、遺伝子破壊用ベクターが挿入されたＳＬＩ＿５２０５遺伝子破壊株（ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）を得た。
【表２】
2017150304.tif 000003
【００３４】
１−２．ＥＧＴ生産株によるＥＧＴの発酵生産
１−２−１．放線菌の培養
ストレプトマイセス・リビダンス１３２６の野生株（ＷＴ）、上記１−１で得た野生型ＥＧＴ生産株（ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）、上記１−２で得たＳＬＩ＿５２０５遺伝子が破壊されたＥＧＴ生産株（ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）、それぞれのグリセロールストックを５ｍＬのＴＳＢ培地（以下、表３を参照のこと）を含む試験管に添加し、２８℃、１６０ｒｐｍで４８時間振盪培養し前培養液を得た。５００ｍＬ容バッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地（以下、表３を参照のこと）に、１％量の前培養液を添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へグルコースをさらに追加した。同培養液を２８℃、１６０ｒｐｍで１週間振盪培養し、培養液中にＥＧＴを産生させた。培養期間中は、炭素源であるグルコースが枯渇しないよう、適時グルコースを添加した。また、培養試験はＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ株、ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ株共に３検体ずつ実験を行い、生産量は３株の平均値を用いて評価した。
【表３】
2017150304.tif 000004
【００３５】
１−２−２．ＥＧＴの定量
本培養の間、所定の時間に培養液１ｍＬを採取し培養サンプルを評価した。採取した培養液を１４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して、菌体外培養液と沈殿物（菌体）とに分離した。沈殿物は熱水抽出（６０℃、１０分）により、細胞内成分を抽出し、菌体内サンプルとした。菌体内サンプル及び、分離した菌体外培養液（菌体外サンプル）中のＥＧＴ含量を、ＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ測定条件は以下の表４の通りで、保持時間１０分付近に生じるＥＧＴのピークをもとに、定量を行った。また、分離した沈殿物（菌体）からあらかじめ、乾燥菌体重量（ＤＣＷ）を求めた。
【表４】
2017150304.tif 000005
【００３６】
１−２−３．結果
１−２−１、１−２−２の培養試験の結果、各菌株の菌体内外合わせたＥＧＴの総生産量（図１）を比較した場合、ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴはＷＴに対して約１１倍、ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴはＷＴに対して約１３倍、それぞれ増加した。また、各菌株の菌体外に産生されるＥＧＴ生産量（表５及び図２）を比較した場合、ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴはＷＴに対して約６７倍、ΔＳＬＩ＿５２０５/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴはＷＴに対して約１２８倍、とそれぞれ想定以上に顕著にＥＧＴの菌体外生産性が向上した。
【表５】
2017150304.tif 000006
【実施例２】
【００３７】
ストレプトマイセス・アヴェルミチリス（Streptomyces avermitilis） ＭＡ−４６８０（ＮＩＴＥ寄託番号： ＮＢＲＣ１４８９３Ｔ）を宿主に用いてＥＧＴ生産株を作製し、培養液中におけるＥＧＴ産生量の比較、検討を行った。【００３８】
２−１．ＥＧＴ生産株の構築
コントロールとして遺伝子が連結されていないｐＩＪ１０１と実施例１で構築したｐＩＪ１０１＿ＥＧＴそれぞれを用いて、ストレプトマイセス・アヴェルミチリスＭＡ−４６８０株を形質転換し、コントロール株（ＷＴ／ｐＩＪ101）とＥＧＴ生産株（ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）を得た。形質転換は、放線菌に関する遺伝子操作技術についての「Genetic Manipulation of Streptomyces」（Hopwood,D.A.ら、1985年、Genetic Manipulation of Streptomyces: a Laboratory Manual，the John Innes Foundation，Norwich）に記載の方法に従って行った。【００３９】
２−２．ストレプトマイセス・アヴェルミチリスＥＧＴ生産株によるＥＧＴの発酵生産
２−２−１．培養
上記２−１で得たストレプトマイセス・アヴェルミチリスのコントロール株（ＷＴ／ｐＩＪ１０１）、ＥＧＴ生産株（ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴ）、それぞれのグリセロールストックを５ｍＬのＴＳＢ培地（上記、表３を参照のこと）を含む試験管に添加し、２８℃、１６０ｒｐｍで４８時間振盪培養し前培養液を得た。５００ｍＬ容バッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地（上記、表３を参照のこと）に、１％量の前培養液を添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へグルコースをさらに追加した。同培養液を２８℃、１６０ｒｐｍで５日間振盪培養し、培養液中にＥＧＴを産生させた。培養期間中は、炭素源であるグルコースが枯渇しないよう、適時グルコースを添加した。【００４０】
２−２−２．ＥＧＴの定量
実施例１の１−２-２と同様に行った。【００４１】
２−２−３．結果
２−２−１、２−２−２の培養試験の結果、ストレプトマイセス・アヴェルミチリスの各菌株の菌体外に産生されるＥＧＴ生産量（図３）を比較した場合、ＷＴ/ｐＩＪ１０１＿ＥＧＴはＷＴ／ｐＩＪ１０１に対して約２６倍と想定以上に顕著にＥＧＴの菌体外生産性が増加した。
【実施例３】
【００４２】
ストレプトマイセス・アヴェルミチリスＭＡ−４６８０のゲノム大規模欠失株であるＳＵＫＡ１７（茨城県つくば市高野台３−１−１にある理研バイオリソースセンター寄託番号： ＪＣＭ  １８２５１）による菌体外培養液へのＥＧＴ生産の検証を行った。ＳＵＫＡ１７株は、親株であるストレプトマイセス・アヴェルミチリスＭＡ−４６８０ゲノムにおいて複数の内在性代謝産物の生合成遺伝子クラスターを欠失させた菌株であり、これらのクラスター欠失により内在性のＥＧＴ生合成遺伝子の発現が誘導された菌株である。【００４３】
３−１．ＳＵＫＡ１７株によるＥＧＴの発酵生産
３−１−１．培養
ストレプトマイセス・アヴェルミチリスＭＡ−４６８０（ＮＩＴＥ寄託番号： ＮＢＲＣ１４８９３Ｔ）と上記ＳＵＫＡ１７株それぞれのグリセロールストックを５ｍＬのＴＳＢ培地（上記、表３を参照のこと）を含む試験管に添加し、２８℃、１６０ｒｐｍで４８時間振盪培養し前培養液を得た。５００ｍＬ容バッフル付フラスコ中の５０ｍＬのＴＳＢ培地（上記、表３を参照のこと）に、１％量の前培養液を添加した。なお、グルコースの初期濃度が５０ｇ／Ｌとなるように、培養開始時にＴＳＢ培地へグルコースをさらに追加した。同培養液を２８℃、１６０ｒｐｍで５日間振盪培養した。培養期間中は、炭素源であるグルコースが枯渇しないよう、適時グルコースを添加した。【００４４】
３−１−２．ＥＧＴの定量
実施例１の１−２−２と同様に行った。【００４５】
３−１−３．結果
３−１−１、３−１−２の培養試験の結果(図４)、ＳＵＫＡ１７株はストレプトマイセス・アヴェルミチリスのＭＡ−４６８０株よりも、菌体外へのＥＧＴ生産性が意外にも約３４倍と顕著に向上することを見出だした。
【実施例４】
【００４６】
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）を用いて、ＥＧＴ生産株を作製し、培養液中におけるＥＧＴ産生量の比較、検討を行った。【００４７】
４−１．ＥＧＴ生産株の構築
４−１−１．コリネバクテリウム・グルタミカムへのＥＧＴ生合成遺伝子の導入
ＥＧＴ生合成遺伝子としてマイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)ゲノム上でクラスターを形成するｅｇｔＡ（ＭＳＭＥＧ＿６２５０:配列番号１１）、ｅｇｔＢ（ＭＳＭＥＧ＿６２４９:配列番号１２）、ｅｇｔＣ（ＭＳＭＥＧ＿６２４８:配列番号１３）、ｅｇｔＤ（ＭＳＭＥＧ＿６２４７:配列番号１４）、ｅｇｔＥ（ＭＳＭＥＧ＿６２４６:配列番号１５）の５遺伝子を用いた。
上記５遺伝子を含むクラスターを、表６記載のプライマーを用いてマイコバクテリウム・スメグマティス（ＮＩＴＥ寄託番号：ＮＢＲＣ  ３０８２）のゲノムを鋳型に、３つのＰＣＲ断片（Ｆｒ１、Ｆｒ２、Ｆｒ３）として増幅した。ベクターは、ｐＢＬ１の複製起点を有するｐＣＨ（Appl Microbiol Biotechnol (2007) 77:533-541を参照）のプロモーター領域をコリネバクテリウム・グルタミカム由来のｇａｐＡ遺伝子、ＳＯＤ遺伝子（Appl Microbiol Biotechnol (2008) 81:291-301を参照）のプロモーターにそれぞれ置換したｐＣＧ（ｇａｐＡプロモーター）とｐＣＳＤ（ＳＯＤプロモーター）を用いた。増幅した3断片とＢａｍＨＩ処理したベクターｐＣＧまたはｐＣＳＤを合わせた４断片をＮＥＢ社のギブゾンアッセンブリーマスターミックスを用いて連結した。ギブゾンアッセンブリー法はＮＥＢ社のプロトコールに従って行った。上記の通り、ｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤ、ｅｇｔＥの５遺伝子をタンデムにｐＣＧ、ｐＣＳＤにクローニングしたｐＣＧ−ｅｇｔＡＢＣＤＥとｐＣＳＤ−ｅｇｔＡＢＣＤＥをそれぞれ構築した。
空ベクターｐＣＧ、ｐＣＳＤ、構築したｐＣＧ−ｅｇｔＡＢＣＤＥとｐＣＳＤ−ｅｇｔＡＢＣＤＥをそれぞれ用いてコリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ寄託番号：２１７９９）にエレクトロポレーション法により導入した。エレクトロポレーション法は、従来公知の方法に従って行った。
【表６】
2017150304.tif 000007
【００４８】
４−２．コリネバクテリウム・グルタミカムＥＧＴ生産株によるＥＧＴの発酵生産
４−２−１．培養
４−１で構築した菌株をBrain Heart Infusion (ＢＨＩ：表７記載)プレート（寒天１．５％）にストリーク後30℃で一晩培養した。得られたコロニーを５０ ml 容試験管に入れた１０ｍｌの ＢＨＩ培地に白金耳で１かき植菌し、３０℃、１８０ｒｐｍで２４時間振盪培養し前培養液とした。滅菌済みの２４穴ディープウェルにＢＨＩ培地（終濃度100mg/L L-シスチン、終濃度100mg/L L-メチオニンを含む）を２ｍｌずつ分注し、得られた前培養液１０μｌを植菌し７２時間１０００ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後、培養液１ｍｌをサンプリングし、菌体外へのＥＧＴ生産量を調べた。
【表７】
2017150304.tif 000008
【００４９】
４−２−２．ＥＧＴの定量
実施例１の１−２-２と同様に行った。【００５０】
４−２−３．結果
４−２−１の培養試験の結果（図５）、コリネバクテリウム・グルタミカムはＥＧＴ生合成遺伝子をゲノムにもたないため空ベクターｐＣＧ、ｐＣＳＤを導入したコリネバクテリウム・グルタミカムは菌体外にＥＧＴを生産しなかった。しかし、ＥＧＴ生合成遺伝子過剰発現ベクターｐＣＧ−ｅｇｔＡＢＣＤＥとｐＣＳＤ−ｅｇｔＡＢＣＤＥをそれぞれ導入したコリネバクテリウム・グルタミカムは共に菌体外培養液中にＥＧＴを蓄積した。以上の通り、もともとＥＧＴ生産能をもたないコリネバクテリウムにおいて菌体外へＥＧＴを生産させることに成功した。
以上より、上記のような各種微生物を用いて菌体外にＥＧＴを生産させることで、より大量に効率的にＥＧＴを製造できることを見出だした。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、強力な抗酸化作用をはじめとする多様な生理活性を有するエルゴチオネインを安価かつ大量に製造することができるので、本発明は、医薬品、化粧品、食品等の幅広い分野において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
配列番号：１は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株由来のＳＬＩ＿１１３９遺伝子の塩基配列である。
配列番号：２は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株由来のＳＬＩ＿１１４０遺伝子の塩基配列である。
配列番号：３は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株由来のＳＬＩ＿１１４１遺伝子の塩基配列である。
配列番号：４は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株由来のＳＬＩ＿１１４２遺伝子の塩基配列である。
配列番号：５は、ストレプトマイセス・アヴェルミチリスＭＡ−４６８０株のＳＡＶ＿２７９４遺伝子のプロモーターの塩基配列である。
配列番号：６は、ＥＧＴ生合成酵素のクラスターを増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：７は、ＥＧＴ生合成酵素のクラスターを増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：８は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株のＳＬＩ＿５２０５遺伝子の塩基配列である。
配列番号：９は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株のＳＬＩ＿５２０５遺伝子の部分配列を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：１０は、ストレプトマイセス・リビダンス１３２６株のＳＬＩ＿５２０５遺伝子の部分配列を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：１１は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ遺伝子の塩基配列である。
配列番号：１２は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＢ遺伝子の塩基配列である。
配列番号：１３は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＣ遺伝子の塩基配列である。
配列番号：１４は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＤ遺伝子の塩基配列である。
配列番号：１５は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＥ遺伝子の塩基配列である。
配列番号：１６は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ〜ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：１７は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ〜ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：１８は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ〜ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：１９は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ〜ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：２０は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ〜ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
配列番号：２１は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ〜ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのフォワードプライマーの塩基配列である。
配列番号：２２は、マイコバクテリウム・スメグマティスのｅｇｔＡ〜ｅｇｔＥ遺伝子を含むクラスターを得るための断片を増幅するためのリバースプライマーの塩基配列である。
【図１】
2017150304.tif 000009
【図２】
2017150304.tif 000010
【図３】
2017150304.tif 000011
【図４】
2017150304.tif 000012
【図５】
2017150304.tif 000013
【配列表】
2017150304000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年4月19日(2017.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エルゴチオネイン生産能を有する微生物を培養し、菌体外に産生されたエルゴチオネインを取得することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法であって、該微生物がエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物であり、１３０ｍｇ／Ｌ以上のエルゴチオネインを菌体外に生産するものである方法。
【請求項２】
該微生物がヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
該微生物が、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現するものである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
該微生物が放線菌、腸内細菌または酵母である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
該微生物が放線菌である請求項４記載の方法。
【請求項６】
エルゴチオネインを菌体外に生産する能力を有する微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物であり、１３０ｍｇ／Ｌ以上のエルゴチオネインを菌体外に生産する微生物。
【請求項７】
ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた請求項６記載の微生物。
【請求項８】
マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)のｅｇｔＡ、ｅｇｔＢ、ｅｇｔＣ、ｅｇｔＤまたはｅｇｔＥに相当する遺伝子のいずれか１つまたはそれ以上、シゾサッカロマイセス・ポムベ（Shizosaccaromyces pombe）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方、あるいはノイロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）のＥｇｔ１またはＥｇｔ２に相当する遺伝子のいずれかまたは両方の発現を増強することによりエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現するものである請求項６または７記載の微生物。
【請求項９】
放線菌、腸内細菌または酵母である請求項６〜８のいずれか１項記載の微生物。
【請求項１０】
放線菌である請求項９記載の微生物。
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月27日(2017.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エルゴチオネイン生産能を有する微生物を培養し、菌体外に産生されたエルゴチオネインを取得することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法であって、該微生物がエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物であり、１３０ｍｇ／Ｌ以上のエルゴチオネインを菌体外に生産するものである方法。
【請求項２】
該微生物がヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
該微生物が放線菌である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
エルゴチオネインを菌体外に生産する能力を有する微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物であり、１３０ｍｇ／Ｌ以上のエルゴチオネインを菌体外に生産する微生物。
【請求項５】
ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた請求項４記載の微生物。
【請求項６】
放線菌である請求項４または５記載の微生物。
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月25日(2017.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エルゴチオネイン生産能を有するストレプトマイセス属の微生物を培養し、菌体外に産生されたエルゴチオネインを取得することを特徴とするエルゴチオネインの製造方法であって、該微生物がエルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物であり、１３０ｍｇ／Ｌ以上のエルゴチオネインを菌体外に生産するものである方法。
【請求項２】
該微生物がヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた微生物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
エルゴチオネインを菌体外に生産する能力を有するストレプトマイセス属の微生物であって、エルゴチオネイン生合成遺伝子を過剰発現させた微生物であり、１３０ｍｇ／Ｌ以上のエルゴチオネインを菌体外に生産する微生物。
【請求項４】
ヒスチジンアンモニアリアーゼ活性を低減または消失させた、あるいはヒスチジンアンモニアリアーゼ遺伝子発現を低下または消失させた請求項３記載の微生物。
【国際調査報告】
2017150304.tif 000014
2017150304.tif 000015
2017150304.tif 000016
2017150304.tif 000017