(57)【要約】  ＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防薬としての、ＬＰＡ１拮抗物質、例えば、特定の構造を有するα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩の医薬用途の提供。  ＬＰＡ１拮抗物質、例えば、一般式（Ｉ）：2017086430.tif 000028［式中、Ｒ１は、水素原子、又は、メトキシ基を示し；Ｒ２は、水素原子、又は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基を示し；Ｘは、ハロゲン原子を示し；Ａは、以下の基：2017086430.tif 000029からなる群より選択される基を示す。］で表される化合物、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
2017086430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＰＡ１拮抗物質を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
【請求項２】
ＬＰＡ１拮抗物質が、一般式（Ｉ）：
【化１６】
2017086430.tif 000026
（式中、
Ｒ１は、水素原子、又は、メトキシ基を示し、
Ｒ２は、水素原子、又は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基を示し、
Ｘは、ハロゲン原子を示し、
Ａは、以下の基：
【化１７】
2017086430.tif 000027
からなる群より選択される。）
で示されるα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩である、請求項１記載のＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
【請求項３】
一般式（Ｉ）において、Ｘがフッ素原子、又は、塩素原子である請求項２記載のα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
【請求項４】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子である請求項３記載のα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
【請求項５】
一般式（Ｉ）において、Ｒ１がメトキシ基である請求項３記載のα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
【請求項６】
（Ｒ）−１−［４’−（５−クロロ−３−｛［（１−フェニルエトキシ）カルボニル］アミノ｝チオフェン−２−イル）−２’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル］シクロプロパンカルボン酸、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
【請求項７】
（Ｒ）−１−｛４’−［５−クロロ−３−（｛［１−（２，５−ジフルオロフェニル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）チオフェン−２−イル］−２’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
【請求項８】
（Ｒ）−１−｛４’−［３−（｛［１−（２−クロロフェニル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）−５−フルオロチオフェン−２−イル］−２’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
【請求項９】
（Ｒ）−１−｛４’−［５−クロロ−３−（｛［１−（チオフェン−３−イル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）チオフェン−２−イル］−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
【請求項１０】
（Ｒ）−１−｛４’−［５−フルオロ−３−（｛［１−（４−メチルチオフェン−３−イル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）チオフェン−２−イル］−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リゾフォスファチジン酸受容体（ＬＰＡ１）拮抗物質、例えば、特定の構造を有するα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とする医薬組成物に関する。本発明のＬＰＡ１拮抗物質、例えば、特定の構造を有するα位ハロゲン置換チオフェン化合物は、ＬＰＡ１拮抗作用を有することから、ＬＰＡにより引き起こされる非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療、及び／又は、予防に有用である。
【背景技術】
【０００２】
中性脂肪が肝臓に蓄積する疾患を脂肪肝といい、アルコールの過剰摂取以外の原因で生じる脂肪肝を非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）という。更にＮＡＦＬＤは、病理学的に肝細胞障害が見られない単純性脂肪肝（ＮＡＦＬ）と肝細胞障害を伴う炎症像を示す非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に分類される。ＮＡＳＨの病態はアルコール性肝障害に類似し、進行すると肝硬変を経て肝細胞癌に移行する（非特許文献１）。【０００３】
ＮＡＳＨの治療薬は抗酸化剤、インスリン抵抗性改善薬などが使用されているが、十分な治療効果を示す薬物は未だ見出されていない（非特許文献２）。【０００４】
リゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ）は種々の生理作用を示す脂質メディエーターである。ＬＰＡはＧ蛋白共役受容体（ＬＰＡ１，ＬＰＡ２，ＬＰＡ３，ＬＰＡ４，ＬＰＡ５，ＬＰＡ６）に結合して細胞内にシグナルを伝達し、細胞の増殖、分化、生存、遊走、接着、浸潤、形態形成を調節している。また、ＬＰＡは、各種の疾患に関与することが知られている（非特許文献３）。【０００５】
ＬＰＡは肝臓に発症する種々の疾患にも関与している。肝線維化の過程で重要な役割を示す星細胞の増殖、あるいは筋線維芽細胞の遊走をＬＰＡが促進することが報告されている（非特許文献４，５を参照）。またＣ型慢性肝炎患者では血漿中のＬＰＡ濃度が増加しており、ＬＰＡ濃度と肝臓の線維化の程度に相関関係があることが報告されている（非特許文献６）。更に、ＬＰＡ合成酵素であるオートタキシン（ＡＴＸ）がＮＡＦＬＤ患者の血清中で増加しており、ＡＴＸが肝臓の脂肪変性に関連があることが報告され、ＡＴＸによるＬＰＡの産生が脂肪変性に寄与することが示唆されている（非特許文献７）。【０００６】
これまでに、ＬＰＡ１拮抗作用を有する化合物としては、特許文献１乃至２９、非特許文献８乃至１１に（［１，１’−ビフェニル］−４−イル）酢酸誘導体が開示されている。また、特許文献１乃至３、１０乃至１３、１５、及び、１９、非特許文献８乃至１０には薬理試験として網膜症、肺線維症、強皮症、骨髄損傷等の病態モデル動物における薬効データが記載されている。しかしながら、病態モデル動物を用いた薬効データから、ＬＰＡ１拮抗作用を有する化合物について、ＮＡＳＨの治療、又は、予防に関する効果の記載は一切無く、示唆も無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０７７８８２号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１０／０７７８８３号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１０／１４１７６１号公報
【特許文献４】ＷＯ２０１０／１４１７６８号公報
【特許文献５】ＷＯ２０１１／０１７３５０号公報
【特許文献６】ＷＯ２０１１／０４１４６１号公報
【特許文献７】ＷＯ２０１１／０４１４６２号公報
【特許文献８】ＷＯ２０１１／０４１６９４号公報
【特許文献９】ＷＯ２０１１／０４１７２９号公報
【特許文献１０】ＷＯ２０１１／０９１１６７号公報
【特許文献１１】ＷＯ２０１１／１５９６３２号公報
【特許文献１２】ＷＯ２０１１／１５９６３３号公報
【特許文献１３】ＷＯ２０１１／１５９６３５号公報
【特許文献１４】ＷＯ２０１２／０７８５９３号公報
【特許文献１５】ＷＯ２０１２／０７８８０５号公報
【特許文献１６】ＷＯ２０１２／１３８６４８号公報
【特許文献１７】ＷＯ２０１２／１３８７９７号公報
【特許文献１８】ＷＯ２０１３／０２５７３３号公報
【特許文献１９】ＷＯ２０１３／０７０８７９号公報
【特許文献２０】ＷＯ２０１３／０８５８２４号公報
【特許文献２１】ＷＯ２０１３／１８９８６２号公報
【特許文献２２】ＷＯ２０１３／１８９８６４号公報
【特許文献２３】ＷＯ２０１３／１８９８６５号公報
【特許文献２４】ＷＯ２０１４／１０４３７２号公報
【特許文献２５】ＷＯ２０１４／１１３４８５号公報
【特許文献２６】ＷＯ２０１４／１４５８７３号公報
【特許文献２７】ＵＳ２０１４０２００２１５号公報
【特許文献２８】ＷＯ２０１５／０６６４５６号公報
【特許文献２９】ＣＮ１０４４１８８２０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，４４（２００６）８６５−８７３
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，６２（２０１５）Ｓ６５−Ｓ７５
【非特許文献３】Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３３，（２０１５）１７１−１７７
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２４８（１９９８）４３６−４４０
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０（２００３）３５２−３５８
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，４１（２００７）６１６−６２３
【非特許文献７】Ｏｂｅｓｉｔｙ，２３（２０１５）９６５−９７２
【非特許文献８】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３３６（２０１１）６９３−７００
【非特許文献９】Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１６０（２０１０）１６９９−１７１３
【非特許文献１０】Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ   ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，６３（２０１１）１４０５−１４１５
【非特許文献１１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５（２０１２）７９２０−７９３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者等は、ＮＡＳＨの優れた治療薬もしくは予防薬の開発を目指して研究を行った。その結果、優れたＬＰＡ１拮抗作用を持つ、特定の構造を有するα位ハロゲン置換チオフェン化合物が、ＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防薬として有用であることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
本発明は、ＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防薬（好ましくは治療薬）としての、ＬＰＡ１拮抗物質、例えば、特定の構造を有するα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩の医薬用途を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下を提供する。【００１２】
（１）ＬＰＡ１拮抗物質を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
（２）ＬＰＡ１拮抗物質が、一般式（Ｉ）：
【化１】
2017086430.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、水素原子、又は、メトキシ基を示し、
Ｒ２は、水素原子、又は、Ｃ１−Ｃ６アルキル基を示し、
Ｘは、ハロゲン原子を示し、
Ａは、以下の基：
【化２】
2017086430.tif 000004
からなる群より選択される。）
で示されるα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩である、（１）記載のＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
（３）一般式（Ｉ）において、Ｘがフッ素原子、又は、塩素原子である（２）記載のα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
（４）一般式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子である（３）記載のα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
（５）一般式（Ｉ）において、Ｒ１がメトシキ基である（３）記載のα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
（６）（Ｒ）−１−［４’−（５−クロロ−３−｛［（１−フェニルエトキシ）カルボニル］アミノ｝チオフェン−２−イル）−２’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル］シクロプロパンカルボン酸、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
（７）（Ｒ）−１−｛４’−［５−クロロ−３−（｛［１−（２，５−ジフルオロフェニル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）チオフェン−２−イル］−２’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
（８）（Ｒ）−１−｛４’−［３−（｛［１−（２−クロロフェニル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）−５−フルオロチオフェン−２−イル］−２’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
（９）（Ｒ）−１−｛４’−［５−クロロ−３−（｛［１−（チオフェン−３−イル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）チオフェン−２−イル］−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
（１０）（Ｒ）−１−｛４’−［５−フルオロ−３−（｛［１−（４−メチルチオフェン−３−イル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）チオフェン−２−イル］−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸、又は、その薬理上許容される塩を有効成分とするＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための医薬組成物。
（１１）ＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための方法であって、それを必要とする対象に、ＬＰＡ１拮抗物質、例えば、（２）〜（１０）のいずれか記載の一般式（Ｉ）で示されるα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩の有効量を投与することを含む方法。
（１２）ＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防に使用するための、ＬＰＡ１拮抗物質、例えば、（２）〜（１０）のいずれか記載の一般式（Ｉ）で示されるα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩。
（１３）ＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のための、ＬＰＡ１拮抗物質、例えば、（２）〜（１０）のいずれか記載の一般式（Ｉ）で示されるα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩の使用。
（１４）ＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防用の医薬を製造するための、ＬＰＡ１拮抗物質、例えば、（２）〜（１０）のいずれか記載の一般式（Ｉ）で示されるα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩の使用。【００１３】
本発明のＬＰＡ１拮抗物質は、ＬＰＡ１に対して拮抗作用を有するものであれば、特に制限されず、例えば、本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。ＬＰＡ１拮抗物質は、強力なＬＰＡ１拮抗作用を有し、良好なＮＡＳＨの治療及び／又は予防効果を奏する点で、そのＬＰＡ１拮抗作用に対するＩＣ５０値は好ましくは０．００１ｎＭ〜５００ｎＭであり、より好ましくは０．００１ｎＭ〜１００ｎＭである。【００１４】
また、本発明は、ＮＡＳＨの治療及び／又は予防用の化合物をスクリーニングするための方法であって、候補化合物のＬＰＡ１に対する拮抗作用を評価することを含む方法にも関する。例えば、候補化合物のＬＰＡ１拮抗作用に対するＩＣ５０値を測定し、その値が０．００１ｎＭ〜１０００ｎＭ、好ましくは０．００１ｎＭ〜５００ｎＭ、より好ましくは０．００１ｎＭ〜１００ｎＭである化合物を、ＮＡＳＨの治療及び／又は予防用の化合物としてスクリーニングしてもよい。【００１５】
なお、上記のＬＰＡ１拮抗作用に対するＩＣ５０値は、本願の試験例１に記載される方法で測定される。【００１６】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物の具体例としては、例えば、下記表１に示すような化合物を挙げることができる。なお、下記表１中、Ａ基は下記式Ａ１〜Ａ５で示される基を示し、Ｍｅはメチル基を示し、Ｅｔはエチル基を示し、ｎ−Ｐｒはｎ−プロピル基を示し、ｉｓｏ−Ｐｒはイソプロピル基を示し、Ｆはフッ素原子を示し、Ｃｌはクロロ原子を示し、Ｂｒはブロモ原子を示し、ＯＭｅはメトキシ基を示し、「ラセミ」、及び、「（Ｒ）−」は、下記の一般式（Ｉ）中の「＊」を付した炭素原子の立体配置を示す：【００１７】
【化３】
2017086430.tif 000005
【００１８】
【化４】
2017086430.tif 000006
【００１９】
【表１】
2017086430.tif 000007
2017086430.tif 000008
2017086430.tif 000009
2017086430.tif 000010
2017086430.tif 000011
2017086430.tif 000012
2017086430.tif 000013
【発明の効果】
【００２０】
本発明のＬＰＡ１拮抗物質、例えば、一般式（Ｉ）で表されるα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩は、強力なＬＰＡ１拮抗作用を有すことより、ＮＡＳＨの治療薬、及び／又は、予防薬として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
前記一般式（Ｉ）で示される化合物において、各置換基の好ましい形態を以下に示す。
【００２２】
Ｘの示す「ハロゲン原子」は、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又は、ヨウ素原子である。
【００２３】
Ｘの示す「ハロゲン原子」として好ましくは、フッ素原子、塩素原子、又は、臭素原子であり、より好ましくはフッ素原子、又は、塩素原子である。
【００２４】
Ｒ２の示す「Ｃ１−Ｃ６アルキル基」は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１−エチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、１−エチルブチル基、２−エチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、３，３−ジメチルブチル基、１−エチル−１−メチルプロピル基、１−エチル−２−メチルプロピル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、又は、１，２，２−トリメチルプロピル基等の直鎖若しくは分岐状のＣ１−Ｃ６アルキル基が挙げられる。
【００２５】
Ｒ２の示す「Ｃ１−Ｃ６アルキル基」として、好ましくはＣ１−Ｃ３アルキル基、より好ましくはエチル基である。
【００２６】
Ｒ２は好ましくは水素原子、又は、エチル基であり、より好ましくは水素原子である。
【００２７】
本発明の一般式（Ｉ）で表わされる化合物に光学異性体、幾何異性体、又は、回転異性体が存在する場合、それらの異性体も本発明の範囲に含まれ、また、プロトン互変異性が存在する場合には、それらの互変異性体も本発明の範囲に含まれる。
【００２８】
一般式（Ｉ）中、基：
【化５】
2017086430.tif 000014
は、好ましくは以下の基である：
【化６】
2017086430.tif 000015
【００２９】
本発明の一般式（Ｉ）で表わされる化合物は、Ｒ２が水素原子である場合、塩基で処理し、薬理上許容される塩基性塩にしてもよい。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩若しくはマグネシウム塩等の金属塩；アンモニウム塩等の無機塩；又は、トリエチルアミン塩若しくはグアニジン塩等の有機アミン塩等が挙げられる。
【００３０】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物、又は、その薬理上許容される塩は、水和物、又は、溶媒和物を形成することができ、その各々、又は、それらの混合物は、本発明に含まれる。
【００３１】
本発明の式（Ｉ）で表される塩は、構成する原子の一つ、又は、複数で非天然の比率の原子同位体を含むこともある。原子同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ)、トリチウム（３Ｈ)、炭素−１４（１４Ｃ）、フッ素−１８（１８Ｆ）、硫黄−３５（３５Ｓ）、又は、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）などが挙げられる。これらの化合物は、治療又は予防剤、研究試薬、例えば、アッセイ試薬、及び診断剤、例えば、インビボ画像診断剤として有用である。本発明の式（Ｉ）で表される塩のすべての同位体変種は、放射性であるかどうかにかかわらず、本発明に包含される。
【００３２】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物、又は、その薬理上許容される塩として、強力なＬＰＡ１拮抗作用を有し、良好なＮＡＳＨの治療及び／又は予防効果を奏する点で、化合物番号Ｉ−５６、Ｉ−６０、Ｉ−１１６、Ｉ−１２０、Ｉ−１４６、Ｉ−１５０、Ｉ−１７０、Ｉ−２０６、及びＩ−２１０の化合物、又は、その薬理上許容される塩が好ましく、特に、化合物番号Ｉ−６０、Ｉ−１２０、Ｉ−１５０、Ｉ−１７０、及びＩ−２１０の化合物、又は、その薬理上許容される塩が好ましく、とりわけ、化合物番号Ｉ−１５０及びＩ−１７０の化合物、又は、その薬理上許容される塩が好ましい。
【００３３】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物、又は、その薬理上許容される塩は、公知の製造方法、例えば、特許文献２４（ＷＯ２０１４／１０４３７２号公報）に記載の方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。
【００３４】
本発明の医薬組成物は、本発明のＬＰＡ１拮抗物質、例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物、及び、その薬理上許容される塩以外に、他の医薬活性成分、例えば、ＮＡＳＨの治療及び／又は予防に使用される物質などを含んでいてもよい。
【００３５】
また、本発明の医薬組成物は、本発明の効果を損なわない限り、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、矯味矯臭剤、又は、希釈剤等の薬理上許容される添加剤を含んでいてもよく、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、縣濁剤、乳剤、経皮吸収剤、座剤、軟膏剤、ローション、吸入剤、又は、注射剤等の形態で、経口、又は、非経口（静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、経気道投与、皮内投与、又は、皮下投与等）で投与することができる。
【００３６】
本発明のＬＰＡ１拮抗物質、例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物、又は、その薬理上許容される塩を、ＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防用の医薬として使用する場合には、それ自体（原末のままで）投与することができ、或いは、本発明の効果を損なわない限り、適宜、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、矯味矯臭剤、又は、希釈剤等の薬理上許容される添加剤と混合して製造される、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、縣濁剤、乳剤、経皮吸収剤、座剤、軟膏剤、ローション、吸入剤、又は、注射剤等の形態で、経口、又は、非経口（静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮投与、経気道投与、皮内投与、又は、皮下投与等）で投与することができる。
【００３７】
これ等の製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、矯味矯臭剤、又は、希釈剤等の薬理上許容される添加剤を使用して、周知の方法で製造される。
【００３８】
賦形剤は、例えば、有機系賦形剤、又は、無機系賦形剤が挙げられる。有機系賦形剤は、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール若しくはソルビトール等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α−デンプン若しくはデキストリン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；又は、プルラン等が挙げられる。無機系賦形剤は、例えば、軽質無水珪酸；又は、硫酸カルシウム等の硫酸塩等が挙げられる。
【００３９】
滑沢剤は、例えば、ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム若しくはステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズワックス若しくはゲイロウ等のワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；Ｄ，Ｌ−ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム；無水珪酸若しくは珪酸水和物等の珪酸類；又は、上記の賦形剤におけるデンプン誘導体等が挙げられる。
【００４０】
結合剤は、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴール、又は、上記の賦形剤で示された化合物等が挙げられる。
【００４１】
崩壊剤は、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム若しくは内部架橋カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；架橋ポリビニルピロリドン；又は、カルボキシメチルスターチ若しくはカルボキシメチルスターチナトリウム等の化学修飾されたデンプン若しくはセルロース誘導体が挙げられる。
【００４２】
乳化剤は、例えば、ベントナイト若しくはビーガム等のコロイド性粘土；ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤；又は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル若しくはショ糖脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤等が挙げられる。
【００４３】
安定剤は、例えば、メチルパラベン若しくはプロピルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール若しくはフェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール若しくはクレゾール等のフェノール類；チメロサール；無水酢酸；又は、ソルビン酸が挙げられる。
【００４４】
矯味矯臭剤は、例えば、サッカリンナトリウム若しくはアスパラテーム等の甘味料；クエン酸、リンゴ酸若しくは酒石酸等の酸味料；又は、メントール、レモンエキス若しくはオレンジエキス等の香料等が挙げられる。
【００４５】
希釈剤は、通常希釈剤として使用される化合物であり、例えば乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ショ糖、硫酸カルシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、デンプン、ポリビニルピロリドン、又は、これらの混合物等が挙げられる。
【００４６】
本発明では、ＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防のために、それを必要とする対象に本発明の医薬組成物、又はＬＰＡ１拮抗物質、例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物、又は、その薬理上許容される塩の有効量が投与される。上記対象として、例えば、動物、例えば、ヒトなどの哺乳類が挙げられ、典型的には、ＮＡＳＨの患者が挙げられる。
【００４７】
また、本発明のＬＰＡ１拮抗物質、例えば、一般式（Ｉ）で表される化合物、又は、その薬理上許容される塩の有効量は、前記対象の症状、年齢、体重等の条件により変化し得るが、経口投与の場合には、各々、１回当たり下限０．００１ｍｇ／Ｋｇ（好ましくは０．０１ｍｇ／Ｋｇ）、上限２０ｍｇ／Ｋｇ（好ましくは１０ｍｇ／Ｋｇ）を、非経口投与の場合には、各々、１回当たり下限０．０００１ｍｇ／Ｋｇ（好ましくは０．０００５ｍｇ／Ｋｇ）、上限１０ｍｇ／Ｋｇ（好ましくは５ｍｇ／Ｋｇ）を、成人に対して１日当たり１乃至６回、症状に応じて投与することができる。
【実施例】
【００４８】
以下に製造例（製造例１〜９）、試験例（試験例１〜５）、及び、製剤例（製剤例１〜３）を示して本発明を更に詳細に説明するが、これらの例示は本発明をよりよく理解するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
また、特記なき限り化学構造式中のＭｅはメチル基を、Ｅｔはエチル基を表す。【００４９】
［製造例］
（製造例１）
（Ｒ）−１−｛４’−［５−クロロ−３−（｛［１−（チオフェン−３−イル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）チオフェン−２−イル］−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸  エチルエステル（化合物番号Ｉ−５６）
【化７】
2017086430.tif 000016
【００５０】
特許文献２４（ＷＯ２０１４／１０４３７２号公報）の実施例１１１に記載の方法に従い製造した。
マススペクトル（ＤＵＩＳ−，ｍ／ｚ）：５５０［Ｍ−１］−。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：7.69-7.63 (2H, m), 7.63-7.51 (3H, m), 7.48-7.40 (4H, m), 7.31 (1H, dd, J = 5.0, 2.9 Hz), 7.28-7.26 (1H, m), 7.11 (1H, dd, J = 5.0, 1.3 Hz), 6.72 (1H, s), 5.99 (1H, q, J = 6.6 Hz), 4.13 (2H, q, J = 7.1 Hz), 1.64 (2H, dd, J = 7.0, 4.0 Hz), 1.62 (3H, d, J = 6.5 Hz), 1.23 (2H, dd, J = 7.0, 4.0 Hz), 1.19 (3H, t, J = 7.1 Hz)。【００５１】
（製造例２）
（Ｒ）−１−［４’−（５−クロロ−３−｛［（１−フェニルエトキシ）カルボニル］アミノ｝チオフェン−２−イル）−２’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル］シクロプロパンカルボン酸  エチルエステル（化合物番号Ｉ−１４６）
【化８】
2017086430.tif 000017
【００５２】
特許文献２４（ＷＯ２０１４／１０４３７２号公報）の実施例５１に記載の方法に従い製造した。
マススペクトル（ＣＩ，ｍ／ｚ）：５７５［Ｍ］＋。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：9.39 (1H, brs), 7.40-7.26 (10H, m), 7.23-7.16 (2H, m), 7.10 (1H, dd, J = 7.8, 1.6 Hz), 5.75 (1H, q, J = 6.4 Hz), 4.06 (2H, q, J= 7.1 Hz), 3.73 (3H, s), 1.56-1.41 (5H, m), 1.23 (2H, dd, J = 7.0, 4.0 Hz), 1.13 (3H, t, J = 7.0 Hz)。【００５３】
（製造例３）
（Ｒ）−１−｛４’−［５−フルオロ−３−（｛［１−（４−メチルチオフェン−３−イル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）チオフェン−２−イル］−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸  エチルエステル（化合物番号Ｉ−１１６）
【化９】
2017086430.tif 000018
【００５４】
特許文献２４（ＷＯ２０１４／１０４３７２号公報）の実施例１３７に記載の方法に従い製造した。
マススペクトル（ＤＵＩＳ−，ｍ／ｚ）：５４８［Ｍ−１］−。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：9.31 (1H, brs), 7.74-7.68 (2H, m), 7.66-7.61 (2H, m), 7.57-7.40 (5H, m), 7.17-7.13 (1H, m), 6.83 (1H, brs), 5.74 (1H, q, J = 6.5 Hz), 4.05 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.17 (3H, brs), 1.60-1.43 (3H, m), 1.51 (2H, dd, J = 6.8, 4.0 Hz), 1.23 (2H, dd, J = 7.1, 4.1 Hz), 1.11 (3H, t, J = 7.1 Hz)。【００５５】
（製造例４）
（Ｒ）−１−｛４’−［３−（｛［１−（２−クロロフェニル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）−５−フルオロチオフェン−２−イル］−２’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸  エチルエステル（化合物番号Ｉ−２０６）
【化１０】
2017086430.tif 000019
【００５６】
特許文献２４（ＷＯ２０１４／１０４３７２号公報）の実施例９２に記載の方法に従い製造した。
マススペクトル（ＥＩ，ｍ／ｚ）：５９３［Ｍ］＋。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：7.52-7.48 (2H, m), 7.43-7.17 (9H, m), 7.06 (1H, dd, J = 7.8, 1.6 Hz), 6.97 (1H, d, J = 1.6 Hz), 6.23 (1H, q, J = 6.7 Hz), 4.13 (2H, q, J = 7.1 Hz), 3.82 (3H, s), 1.63 (2H, dd, J = 6.9, 3.9 Hz), 1.57 (3H, d, J = 6.7 Hz), 1.24 (2H, dd, J = 7.0, 4.0 Hz), 1.20 (3H, t, J = 7.2 Hz)。【００５７】
（製造例５）
（Ｒ）−１−｛４’−［５−クロロ−３−（｛［１−（チオフェン−３−イル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）チオフェン−２−イル］−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸（化合物番号Ｉ−６０）
【化１１】
2017086430.tif 000020
【００５８】
特許文献２４（ＷＯ２０１４／１０４３７２号公報）の実施例１１２に記載の方法に従い製造した。
マススペクトル（ＤＵＩＳ−，ｍ／ｚ）：５２２［Ｍ−１］−。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：12.37 (1H, brs), 9.33 (1H, brs), 7.74-7.68 (2H, m), 7.65-7.60 (2H, m), 7.58-7.50 (3H, m), 7.48-7.37 (3H, m), 7.25-7.07 (2H, m), 5.82 (1H, q, J = 6.4 Hz), 1.56-1.44 (3H, m), 1.48 (2H, dd, J = 6.7, 3.8 Hz), 1.19-1.16 (2H, m)。【００５９】
（製造例６）
（Ｒ）−１−［４’−（５−クロロ−３−｛［（１−フェニルエトキシ）カルボニル］アミノ｝チオフェン−２−イル）−２’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル］シクロプロパンカルボン酸（化合物番号Ｉ−１５０）
【化１２】
2017086430.tif 000021
【００６０】
特許文献２４（ＷＯ２０１４／１０４３７２号公報）の実施例５２に記載の方法に従い製造した。
マススペクトル（ＤＵＩＳ−，ｍ／ｚ）：５４６［Ｍ−１］−。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：12.34 (1H, brs), 9.40 (1H, brs), 7.45-7.25 (10H, m), 7.21-7.16 (2H, m), 7.09 (1H, dd, J = 7.9, 1.6 Hz), 5.75 (1H, q, J = 6.4 Hz), 3.73 (3H, s), 1.54-1.41 (5H, m), 1.18-1.12 (2H, m)。【００６１】
（製造例７）
（Ｒ）−１−｛４’−［５−フルオロ−３−（｛［１−（４−メチルチオフェン−３−イル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）チオフェン−２−イル］−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸（化合物番号Ｉ−１２０）
【化１３】
2017086430.tif 000022
【００６２】
特許文献２４（ＷＯ２０１４／１０４３７２号公報）の実施例１３８に記載の方法に従い製造した。
マススペクトル（ＤＵＩＳ−，ｍ／ｚ）：５２０［Ｍ−１］−。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：12.38 (1H, brs), 9.33 (1H, brs), 7.73-7.67 (2H, m), 7.65-7.59 (2H, m), 7.57-7.50 (2H, m), 7.49-7.38 (3H, m), 7.19-7.12 (1H, m), 6.83 (1H, brs), 5.74 (1H, q, J = 6.4 Hz), 2.17 (3H, brs), 1.59-1.44 (3H, m), 1.48 (2H, dd, J = 6.7, 3.8 Hz), 1.18 (2H, dd, J = 6.9, 3.9 Hz)。【００６３】
（製造例８）
（Ｒ）−１−｛４’−［３−（｛［１−（２−クロロフェニル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）−５−フルオロチオフェン−２−イル］−２’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸（化合物番号Ｉ−２１０）
【化１４】
2017086430.tif 000023
【００６４】
特許文献２４（ＷＯ２０１４／１０４３７２号公報）の実施例９３に記載の方法に従い製造した。
マススペクトル（ＤＵＩＳ−，ｍ／ｚ）：５６４［Ｍ−１］−。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：12.35 (1H, brs), 9.55 (1H, brs), 7.60-7.28 (9H, m), 7.18 (1H, d, J = 1.5 Hz), 7.09 (1H, dd, J = 7.8, 1.4 Hz), 6.84 (1H, d, J = 2.5 Hz), 6.00 (1H, q, J = 6.1 Hz), 3.77 (3H, s), 1.55-1.39 (5H, m), 1.21-1.10 (2H, m)。【００６５】
（製造例９）
（Ｒ）−１−｛４’−［５−クロロ−３−（｛［１−（２，５−ジフルオロフェニル）エトキシ］カルボニル｝アミノ）チオフェン−２−イル］−２’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−４−イル｝シクロプロパンカルボン酸（化合物番号Ｉ−１７０）
【化１５】
2017086430.tif 000024
【００６６】
特許文献２４（ＷＯ２０１４／１０４３７２号公報）の実施例６８に記載の方法に準じて製造した。
マススペクトル（ＤＵＩＳ−，ｍ／ｚ）：５８２［Ｍ−１］−。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：12.35 (1H, brs), 9.54 (1H, brs), 7.44-7.39 (2H, m), 7.39-7.19 (7H, m), 7.18 (1H, d, J = 1.6 Hz), 7.10 (1H, dd, J = 7.9, 1.6 Hz), 5.91 (1H, q, J = 6.5 Hz), 3.76 (3H, s), 1.56-1.43 (3H, m), 1.47 (2H, dd, J = 6.7, 3.7 Hz), 1.18 (2H, dd, J = 6.8, 4.0 Hz)。【００６７】
［試験例１］
ＬＰＡ１拮抗作用試験
ヒトＬＰＡ１を発現させたＲＨ７７７７細胞の膜画分（Ａ３２４、ＣｈａｎＴｅｓｔ製）５μｇを反応緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＧＤＰ、５μｇサポニン、０．２％ＢＳＡ、０．１ｎＭ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（ＮＥＧ０３０Ｘ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製）、ｐＨ７．４）に懸濁した後、濃度を変えてＤＭＳＯに溶解した試験化合物をそれぞれ加えた。３０℃で１５分間プレインキュベートした後、ＬＰＡ（Ｌ７２６０、Ｓｉｇｍａ製、終濃度１００ｎＭ）を加えて３０℃で３０分間インキュベートした。セルハーベスター（Ｍ３０、Ｂｒａｎｄｅｌ製）を使用して膜画分をガラス繊維ろ紙（ＧＦ／Ｂ、Ｗｈａｔｍａｎ製）に回収し、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。液体シンチレーションアナライザー（２９００ＴＲ、Ｐａｃｋａｒｄ製）を使用して膜画分の放射活性を測定し、ＬＰＡ１と［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの結合を５０％阻害する試験化合物濃度（ＩＣ５０）を、ＥＸＳＡＳ（アームシステックス製）を使用した非線形回帰分析にて求めた。【００６８】
本試験において本発明の化合物は優れた活性を示し、製造例６、７、および、８の化合物のＩＣ５０値は１００ｎＭ以下であった。【００６９】
［試験例２］
細胞遊走試験
細胞遊走試験はＣｈｅｍｏ−Ｔｘ（登録商標）（１１６−８、Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ製）を使用した。Ａ２０５８ヒトメラノーマ細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅから入手）を無血清ＥＭＥＭ培地で約２４時間培養した後、０．１％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地に再懸濁し、細胞懸濁液とした。濃度を変えてＤＭＳＯに溶解した試験化合物を、それぞれ細胞懸濁液に加えて３７℃で１５分間培養した（最終ＤＭＳＯ濃度０．５％）。０．１％ＢＳＡ及び０．５％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ培地に溶解したＬＰＡ（終濃度１００ｎＭ）をＣｈｅｍｏ−Ｔｘ９６穴プレートに加え、０．００１％Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎにて両面をコートしたＣｈｅｍｏ−Ｔｘフィルターをプレートに乗せた。培養した細胞懸濁液（細胞数５００００個）をフィルター上面に加えて、更に３７℃で３時間培養した後、フィルター上面の細胞を除去した。フィルターを取り出して乾燥させた後、ＤｉｆｆＱｕｉｋ染色液（１６９２０、Ｓｙｓｍｅｘ製）を使用して、フィルターの下面に遊走した細胞を染色した。フィルターの吸光度（５７０ｎｍ）を測定し、ＬＰＡの細胞遊走活性を５０％阻害する試験化合物濃度（ＩＣ５０）を、ＥＸＳＡＳ（アームシステックス製）を使用した非線形回帰分析にて求めた。【００７０】
本試験において本発明の化合物は優れた活性を示し、製造例５〜９の化合物のＩＣ５０値は２００ｎＭ以下であった。【００７１】
［試験例３］
ヒト肝臓星細胞α−ＳＭＡ ｍＲＮＡ発現試験
ヒト初代肝臓星細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）を、２％ＦＢＳおよび１％星細胞増殖サプリメントを含む星細胞培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）に懸濁し２４穴プレート に播種した。１４時間培養した後、培地を除去して星細胞培地を加え更に３時間培養した。培地を除去し０．１％ＢＳＡを含む星細胞培地を加え、濃度を変えて０．１％ＢＳＡを含む星細胞培地に溶解した試験化合物および０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳに溶解したＬＰＡ（終濃度１０μＭ）を添加した。２４時間培養した後、培地を除去し、１Ｍジチオスレイトールを含む溶解バッファー（マッハライ・ナーゲル製）を添加して星細胞を溶解した。
星細胞溶解液からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ（マッハライ・ナーゲル製）を使用してＲＮＡの抽出および精製を行った後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標） ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｅｒａｓｅｒ（タカラバイオ製）およびＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｇｒａｄｉｅｎｔ（タカラバイオ製）を使用してｃＤＮＡを合成し、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  II（タカラバイオ製）およびＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  II（タカラバイオ製）を使用して定量ＰＣＲを行い、星細胞中のα−ＳＭＡ  ｍＲＮＡおよびＲｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｌａｒｇｅ，Ｐ０  ｍＲＮＡの発現量を測定した。
Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｌａｒｇｅ，Ｐ０の発現量でα−ＳＭＡの発現量を補正し、ＬＰＡの誘発によるα−ＳＭＡ  ｍＲＮＡ発現亢進作用に対する試験化合物の抑制率（％）を求めた。【００７２】
本試験において本発明の化合物は優れた活性を示し、１００ｎＭの濃度で、製造例５〜９の化合物の抑制率は５０％以上であった。【００７３】
［試験例４］
マウスＬＰＡ誘発ヒスタミン遊離試験
マウスＬＰＡ誘発ヒスタミン遊離試験はＳｗａｎｅｙらの方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３３６（２０１１）６９３−７００頁）に準じて行った。試験化合物は０．５％メチルセルロース溶液（１３３−１４２５５、和光純薬工業製）に懸濁し、雄性ＣＤ１マウス（体重３０〜４０ｇ、日本チャールス・リバー社供給）に１０ｍＬ／ｋｇの用量で経口投与した。投与４時間後に０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳに溶解したＬＰＡ（８５７１３０Ｐ、Ａｖａｎｔｉ製）を尾静脈から投与（マウス当り３００μｇ）した。ただちにマウスをイソフルランを用いて麻酔し、ＬＰＡ投与から２分後に静脈から血液を採取した。血液はＥＤＴＡを含む試験管に移し、４℃で２，０００×ｇ、１０分間遠心分離して血漿を得た。【００７４】
血漿中のヒスタミン濃度はＥＩＡキット（６２ＨＴＭＰＥＢ、Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ製）で測定した。【００７５】
試験化合物を投与したマウスの血漿中ヒスタミン濃度から、０．５％メチルセルロース溶液投与群に対する抑制率（％）を個体ごとに算出し、抑制率８０％以上を示す個体の割合を有効率（％）として表した。【００７６】
本試験において本発明の化合物は優れた活性を示し、１０ｍｇ／ｋｇの投与で、製造例５〜９の化合物の有効率は５０％以上であった。【００７７】
［試験例５］
マウス非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデル
ＮＡＳＨモデルとしてＳＴＡＭ（登録商標）マウス（株式会社ステリック再生医科学研究所製）を使用した。ＳＴＡＭ（登録商標）マウスは、２日齢の雄マウスにストレプトゾトシン（シグマアルドリッチ製）２００μｇを背部皮下に１回投与し、生後４週齢から高脂肪食（Ｈｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ  ３２、日本クレア製）で飼育することによって作製（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，  ４６（２０１３）１４１−１５２頁）した。【００７８】
試験化合物は５あるいは６週齢から毎日経口投与した。９あるいは１０週齢時に麻酔下に血液および肝臓を採取し、血液は生化学検査を実施した。肝臓は湿重量を測定した後、一部からＲＮＡを抽出し、炎症及び線維化のマーカー遺伝子の発現を定量ＰＣＲ法にて測定した。更に肝組織中のヒドロキシプロリン量またはコラーゲン量を測定した。肝臓の一部からパラフィン切片あるいは凍結切片を作成して病理組織学的検査を実施し、ＮＡＦＬＤ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ、Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ａｒｅａあるいはＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｒｅａを測定した。結果は、ＥＸＳＵＳ（ＣＡＣエクシケア製）あるいはＰｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ製）を使用して統計学的解析を行った。【００７９】
上記試験において、試験化合物を３０ｍｇ／ｋｇ、１日２回、６から９週齢までの３週間投与した際の結果を表２に示した。【００８０】
【表２】
2017086430.tif 000025
【００８１】
本試験において、例えば本発明の製造例６、及び、製造例９の化合物は優れた活性を示し、ＮＡＦＬＤ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅを有意（ｐ＜０．０５）に減少させた。【００８２】
前記試験例１〜５の結果より、本発明のα位ハロゲン置換チオフェン化合物は、ＬＰＡ１拮抗作用を有し、ＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防薬（好ましくは治療薬）として有用である。【００８３】
今回、ＬＰＡ１拮抗作用を有する化合物が、ＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防に有用であることが実験的に確認されたので、同様にＬＰＡ１拮抗物質がＮＡＳＨの治療、及び／又は、予防に有用であることが推認される。【００８４】
［製剤例１］ハ−ドカプセル剤
標準二分式ハ−ドゼラチンカプセルに、粉末状の製造例の化合物の塩（１００ｍｇ）、ラクト−ス（１５０ｍｇ）、セルロ−ス（５０ｍｇ）、及び、ステアリン酸マグネシウム（６ｍｇ）を充填して、ハ−ドカプセルを製造し、洗浄した後、乾燥する。【００８５】
［製剤例２］ソフトカプセル剤
大豆油、オリ−ブ油のような消化性油状物、及び、製造例の化合物の塩の混合物を、１００ｍｇの活性成分を含有するようにゼラチン中に注入してソフトカプセルを製造し、洗浄した後、乾燥する。【００８６】
［製剤例３］錠剤
製造例の化合物の塩（１００ｍｇ）、コロイド性二酸化ケイ素（０．２ｍｇ）、ステアリン酸マグネシウム（０．２ｍｇ）、微結晶性セルロ−ス（０．２ｍｇ）、デンプン（０．２ｍｇ）、及び、ラクト−ス（９８．８ｍｇ）を用いて、製剤学の分野で周知の方法に従って錠剤を製造する。得られた錠剤には、必要に応じてコーティングを施すことができる。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明のＬＰＡ１拮抗物質、例えば、一般式（Ｉ）で表されるα位ハロゲン置換チオフェン化合物、又は、その薬理上許容される塩は、強力なＬＰＡ１拮抗作用、薬効の持続性等の点で優れた性質を有し、ＮＡＳＨの治療薬、及び／又は、予防薬として有用である。
【国際調査報告】
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