(57)【要約】  本発明は、巨核球細胞の培養物から精製血小板を製造する方法であって、  前記培養物を150×g〜550×gの遠心力で遠心分離する第１の遠心分離工程と、  第１の遠心分離工程で回収された液体成分を600×g〜4000×gの遠心力で遠心分離する第２の遠心分離工程とを含む、方法を提供する。
2017065280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
巨核球細胞の培養物から精製血小板を製造する方法であって、
前記培養物を150×g〜550×gの遠心力で遠心分離する第１の遠心分離工程と、
第１の遠心分離工程で回収された液体成分を600×g〜4000×gの遠心力で遠心分離する第２の遠心分離工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記遠心分離工程が、
遠心力に応じて比重の大きい物質を付着させる内壁と、分離後の液体成分を流出させる流出口とを備えた、回転可能な分離ボウルと、
前記流出口から流出した液体成分を回収する回収手段と、を備えた遠心分離装置で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、第２の遠心分離工程後、前記分離ボウルに洗浄液を加えて回転させる洗浄工程と、
前記洗浄工程後、回収液を加えて回転させる血小板回収工程と、
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１の遠心分離工程は、前記培養物を自然落下によって分離ボウルに注入する、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記巨核球細胞の培養物は、
巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子及びポリコーム遺伝子を強制発現させる工程と、
前記細胞でBcl-xL遺伝子を強制発現させる工程と、
前記強制発現をすべて解除する工程と、
で得られたものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載された方法で製造された精製血小板と、他の成分とを混合する工程を含む、血液製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、巨核球細胞の培養物から精製血小板を製造する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板製剤は、手術時や傷害時の大量出血、或いは、抗がん剤治療後の血小板減少に伴う出血傾向を呈する患者に対して、その症状の治療および予防を目的として投与される。現在、血小板製剤の製造は、健常ボランティアによる献血に依存している。しかし、日本では人口構成に起因して献血者数が減少しており、2027年には約100万人分の献血が不足すると推測されている。したがって、血小板の安定供給は当技術分野の重要な課題である。【０００３】
また、従来の血小板製剤は、細菌汚染によるリスクが高いため、血小板製剤の移植後に重篤な感染症を引き起こす可能性がある。そのため、臨床現場では、常に、より安全な血小板製剤が求められている。そのニーズに応えるべく、今日では、in vitroで培養した巨核球細胞から血小板を産生する方法が開発されている。【０００４】
血小板製剤を輸血する際、稀に輸血副作用（蕁麻疹やアナフィラキシー反応など）を発症する場合がある。これは、血小板製剤に含まれている血漿が原因の一つと考えられている。そこで、輸血副作用を予防するために、血小板製剤中の血漿を人工的に調製した液（洗浄保存液）で置換する方法が開発されている。例えば、濃厚血小板製剤の血小板を洗浄するために、分離ボウルを備えた遠心分離装置を用いて血小板を洗浄する方法がある。ここで言う濃厚血小板製剤とは、血液成分採血により、白血球の大部分を除去して採取した血小板を血漿に浮遊させたものである。【０００５】
一方、in vitroで巨核球細胞を培養して血小板を産生する場合、血小板を巨核球細胞から分離して濃縮する必要がある。両者は表面マーカーが同じであるため、セルソーターで分離することができず、血小板と巨核球細胞の分離には、大きさの違いを利用してフィルターや中空糸膜で分離する方法や、遠心管を用いる遠心分離による方法が用いられてきた。しかしながら、フィルターや中空糸膜を用いる方法では、表面タンパク質の損傷等により血小板の生理活性が失われる上に、回収率も10％程度と低い。また、遠心分離を用いる方法では、機能が低下しないように低い遠心速度を採用するため、巨核球細胞の除去率が低く、血小板回収率も10％程度にしかならず、また一度に精製できる量が遠心管の容積に制限されるという問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、巨核球細胞の培養物から、高い回収率で、且つ一度に大量に血小板を分離精製して高品質な精製血小板を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、所定の遠心力で巨核球細胞の培養物を遠心処理した後、当該遠心処理で得られた液体成分をより高い遠心力でもう一度遠心処理することにより、巨核球細胞の培養物から、高品質な血小板を高回収率で精製できることを見出した。【０００８】
すなわち本発明は、
〔１〕巨核球細胞の培養物から精製血小板を製造する方法であって、
前記培養物を150×g〜550×gの遠心力で遠心分離する第１の遠心分離工程と、
第１の遠心分離工程で回収された液体成分を600×g〜4000×gの遠心力で遠心分離する第２の遠心分離工程とを含む、方法；
〔２〕前記遠心分離工程が、
遠心力に応じて比重の大きい物質を付着させる内壁と、分離後の液体成分を流出させる流出口とを備えた、回転可能な分離ボウルと、前記流出口から流出した液体成分を回収する回収手段と、を備えた遠心分離で実施される、〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記第２の遠心分離工程後、前記分離ボウルに洗浄液を加えて回転させる洗浄工程と、
前記洗浄工程後、回収液を加えて回転させる血小板回収工程と、
を含む、〔２〕に記載の方法；
〔４〕第１の遠心分離工程は、前記培養物を自然落下によって分離ボウルに注入する、〔２〕又は〔３〕に記載の方法；
〔５〕前記巨核球細胞の培養物は、
巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子及びポリコーム遺伝子を強制発現させる工程と、
前記細胞でBcl-xL遺伝子を強制発現させる工程と、
前記強制発現をすべて解除する工程と、
で得られたものである、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法；
〔６〕〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載された方法で精製された血小板と、他の成分とを混合する工程を含む、血液製剤の製造方法；
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、巨核球細胞の培養物から、高品質な血小板を高い回収率で、且つ一度に大量に精製することができるので、細菌汚染リスクの低い安全な血小板製剤を大量に生産し、供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明に係る精製方法による精製前後の血小板数を測定した結果を示す。
【図２】図２は、本発明に係る精製方法による精製後の血小板の生理活性を測定した結果を示す。
【図３】図３は、本発明に係る精製方法による精製後の異常血小板の割合を測定した結果を示す。
【図４】図４は、本発明に係る精製方法で精製してから6日後に、血小板の生理活性を測定した結果を示す。
【図５】図５は、本発明に係る精製方法で精製してから6日後に、異常血小板の割合を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係る血小板の製造方法は、巨核球細胞を含む試料を異なる遠心力で２回以上の遠心分離する工程を含む。例えば、第１の遠心分離工程は約150×g〜約550×gの遠心力で、第２の遠心分離工程は約600×g〜約4000×gの遠心力で実施され得る。遠心分離工程は、遠心力に応じて比重の大きい物質を付着させる内壁と、分離後の液体成分を流出させる流出口とを備えた回転可能な分離ボウルと、
流出口から流出した液体成分を回収する回収手段とを備えた遠心分離で実施してもよい。
【００１２】
当該遠心分離装置では、分離ボウルをその底面の中心を通り底面に垂直な軸を中心に回転させながら、液体混合物を注入すると、遠心力に応じて、比重の大きい成分は分離ボウルの内壁に付着・堆積し、比重の小さい成分は液体中に残る。
【００１３】
比重の小さい成分を含む液体は、回収手段により回収される。回収手段は、例えば、分離ボウルの流出口に接続したチューブと、チューブに交換可能に接続した回収バッグから構成される。回収バッグは、血小板の品質に影響を与えないものであれば特に限定されないが、市販の血液や血液成分の保存用バッグを用いてもよい。
【００１４】
当該遠心分離装置は、分離ボウルに液体混合物を所定の速度で注入しながら、遠心分離を行い、同時に分離された液体を回収手段で回収できるので、分離ボウルの容量とは関係なく、大量の液体混合物を連続的に分離することができる。
【００１５】
本発明に係る精製血小板製造方法に用いられる遠心分離装置としては、例えば、特開2005−296675号公報に開示された装置や、特開平7−284529号公報に開示された装置などを用いることができる。また、血液成分の分離に使用される市販の遠心分離装置や、従来、濃厚血小板製剤の血小板の洗浄に用いられている市販の装置を使用することもできる。例えば、HAEMONETICS社のACP215、テルモ社のCOBE2991を使用してもよい。
【００１６】
特定の態様において、第1の遠心分離工程は、分離ボウルを約150×g〜約550×gの遠心力で回転させて行ってもよい。遠心力は、好ましくは約160×g〜約500×g、より好ましくは約170×g〜約400×g、更に好ましくは約180×g〜約300×gである。遠心力をこの範囲として遠心分離を行うことにより、培養物中の巨核球細胞が分離ボウルの内側に付着・堆積する。これ以上遠心力を大きくすると、血小板にシェアストレスがかかるために、血小板の生理活性が発現して凝集してしまう。
なお、遠心力（g）と回転数（rpm）と回転半径（cm）との間には以下の関係が成立するので、使用する回転ボウルに大きさによって回転数を決めることができる。
遠心力（g）＝1119×回転半径（cm）×（回転数（rpm））2×10-8
【００１７】
この工程では、巨核球細胞の培養物に、血小板保存液を加えてもよい。例えば、生物学的製剤基準血液保存液A液（Acid-Citrate-Dextrose；ACD-A）が挙げられる。ACD-Aは、血液・血小板抗凝固作用を有し、血小板のエネルギー源であるグルコース供給源としても機能する。
【００１８】
第1の遠心分離工程の際、巨核球細胞の培養物を分離ボウルに注入する方法は特に限定されず、装置に備えられたポンプを使用してもよく、培養物を入れた容器と分離ボウルをチューブで接続し、当該容器を高い位置に吊るし、チューブを通して培養物をボウル内に自然落下させてもよい。注入速度は、例えば、約50ml/min〜約150ml/min、約80ml/min〜約130ml/min、又は約100ml/minとすることができる。
【００１９】
第1の遠心分離工程は、室温で行うことができる。第1の遠心分離工程の時間は、培養物の体積を、培養物の注入速度で除した時間、又はそれ以上とすることができる。
第1の遠心分離工程では、血小板は溶液中に残り、回収手段に回収される。
【００２０】
本発明に係る血小板の精製方法の第2の遠心分離工程は、第1の遠心分離工程で回収された液体成分から血小板を分離する工程である。
第1の遠心分離工程後、分離ボウルを交換又は洗浄した後、分離ボウルを回転させながら、第1の遠心分離工程で回収された液体成分を注入する。注入は、第1の遠心分離工程と同様に行うことができる。第1の遠心分離工程で用いた回収バッグを、そのまま高い位置に吊るし、チューブを通して自然落下により分離ボウルに注入してもよい。
【００２１】
特定の態様において、第2の遠心分離工程は、分離ボウルを、約600×g〜約4000×gの遠心力で回転させて行ってもよい。遠心力は、好ましくは約800×g〜約3000×g、更に好ましくは約1000×g〜約2000×gとしてもよい。遠心力をこの範囲として遠心分離を行うことにより、血小板を、その生理活性が失われることなく、分離ボウル内壁に付着・堆積させることができる。
第2の遠心分離工程は室温で行うことができる。第1の遠心分離工程の時間は、第1の遠心分離工程で回収された液体成分の体積を、当該液体の注入速度で除した時間、又はそれ以上とすることができる。
第2の遠心分離工程で分離される液体成分は、回収手段に回収し、廃棄する。
【００２２】
別の態様において、第2の遠心分離工程の後、洗浄工程を行ってもよい。第2の遠心分離工程では、血小板と共に培地や添加物も分離ボウルの内壁に付着・堆積する。この培地を除去するための洗浄工程である。
洗浄工程では、分離ボウル内に洗浄液を加え、約600×g〜約3600×gの遠心力で回転させる。洗浄液としては、重炭酸リンゲル溶液、例えばビカーボンを用いてもよい。また、ビカーボンに血小板保存液を加えても良い。血小板保存液は、例えばACD液を加えてもよい。なお、分離ボウルに洗浄液を加える際は、一定速度で洗浄液を注入する。このとき、血小板は分離ボウルの内壁に付着したまま維持され、培地や添加物を含んだ洗浄液は、回収手段により回収される。
【００２３】
別の態様において、洗浄工程の後、血小板の回収工程を行ってもよい。回収工程では、分離ボウルの内壁に付着した血小板を回収するために回収液を加え、約600×g〜約3600×gの遠心力で回転させる。これにより、血小板は分離ボウルから振り落とされ、回収液に浮遊する。回収液としては、例えば、ビカーボンを用いることができ、これを分離ボウルに一定速度で注入する。ビカーボンに5%のACDを加えてもよい。血小板を含む回収液は分離ボウルの流出口から流出し、回収バッグなどの回収手段に回収される。これを最終製品とすることもできる。
【００２４】
本明細書において「巨核球細胞」とは、生体内においては骨髄中に存在する最大の細胞であり、血小板を放出することを特徴とする。巨核球細胞は、細胞表面マーカーCD41a、CD42a、及びCD42b陽性で特徴づけられ、他に、CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131、及びCD203cからなる群より選択されるマーカーをさらに発現していることもある。巨核球細胞は、多核化（多倍体化）すると、通常の細胞の16〜32倍のゲノムを有する。本明細書において、単に「巨核球細胞」という場合、上記の特徴を備えている限り、多核化した巨核球細胞と多核化前の巨核球細胞の双方を含む。「多核化前の巨核球細胞」は、「未熟な巨核球細胞」又は「増殖期の巨核球細胞」とも同義である。
【００２５】
巨核球細胞は、公知の様々な方法で得ることができる。巨核球細胞の製造方法の非限定的な例として、国際公開第2011/034073号に記載された方法が挙げられる。同方法では、「巨核球細胞より未分化な細胞」において、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させることにより、無限に増殖する不死化巨核球細胞株を得ることができる。また、国際公開第2012/157586号に記載された方法に従って、「巨核球細胞より未分化な細胞」において、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させることによっても、不死化巨核球細胞株を得ることができる。これらの不死化巨核球細胞株は、遺伝子の強制発現を解除することにより、多核化が進み、血小板を放出するようになる。
【００２６】
巨核球細胞を得るために、上記の文献に記載された方法を組み合わせてもよい。その場合、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現は、同時に行ってもよく、順次行ってもよい。例えば、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させ、当該強制発現を抑制し、次にアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させ、当該強制発現を抑制して、多核化巨核球細胞を得てもよい。また、癌遺伝子とポリコーム遺伝子とアポトーシス抑制遺伝子を同時に強制発現させ、当該強制発現を同時に抑制して、多核化巨核球細胞を得ることもできる。まず、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させ、続いてアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させ、当該強制発現を同時に抑制して、多核化巨核球細胞を得ることもできる。
【００２７】
本明細書において「巨核球細胞より未分化な細胞」とは、巨核球への分化能を有する細胞であって、造血幹細胞系から巨核球細胞に至る様々な分化段階の細胞を意味する。巨核球より未分化な細胞の非限定的な例としては、造血幹細胞、造血前駆細胞、CD34陽性細胞、巨核球・赤芽球系前駆細胞（MEP）が挙げられる。これらの細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血から単離して得ることもできるし、より未分化な細胞であるES細胞、iPS細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得ることもできる。
【００２８】
本明細書において「癌遺伝子」とは、生体内において細胞の癌化を誘導する遺伝子のことをいい、例えば、MYCファミリー遺伝子（例えば、c-MYC、N-MYC、L-MYC）、SRCファミリー遺伝子、RASファミリー遺伝子、RAFファミリー遺伝子、c-Kit、PDGFR、Ablなどのプロテインキナーゼファミリー遺伝子が挙げられる。
【００２９】
本明細書において「ポリコーム遺伝子」とは、CDKN2a（INK4a/ARF）遺伝子を負に制御し、細胞老化を回避するために機能する遺伝子として知られている（小倉ら, 再生医療 vol.6, No.4, pp26-32；Jseus et al., Jseus et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology vol.7, pp667-677, 2006；Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.100, pp211-216, 2003）。ポリコーム遺伝子の非限定的な例として、BMI1、Mel18、Ring1a/b、Phc1/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、Eed、Suz12、HADC、Dnmt1/3a/3bが挙げられる。
【００３０】
本明細書において「アポトーシス抑制遺伝子」とは、細胞のアポトーシスを抑制する機能を有する遺伝子をいい、例えば、BCL2遺伝子、BCL−xL遺伝子、Survivin遺伝子、MCL1遺伝子などが挙げられる。
【００３１】
遺伝子の強制発現及び強制発現の解除は、国際公開第2011/034073号、国際公開第2012/157586号、国際公開第2014/123242またはNakamura S et al, Cell Stem Cell. 14, 535-548, 2014に記載された方法、その他の公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。
【００３２】
本明細書において「血小板」は、血液中の細胞成分の一つであり、CD41a陽性及びCD42b陽性で特徴づけられる。血小板は、血栓形成と止血において重要な役割を果たすとともに、損傷後の組織再生や炎症の病態生理にも関与する。出血等により血小板が活性化されると、その膜上にIntegrin αIIBβ3（glycoprotein IIb/IIIa; CD41aとCD61の複合体）などの細胞接着因子の受容体が発現する。その結果、血小板同士が凝集し、血小板から放出される各種の血液凝固因子によってフィブリンが凝固することにより、血栓が形成され、止血が進む。
【００３３】
本発明の方法で精製された血小板は、高品質である。本明細書において高品質な精製血小板とは、巨核球細胞が実質的に除去された結果、画分当たりの生理活性が高く維持され、異常血小板が十分に少ない血小板をいう。
【００３４】
血小板の生理活性は、公知の方法により測定し評価することができる。例えば、活性化した血小板膜上のIntegrin αIIBβ3に特異的に結合するPAC-1に対する抗体を用いて、活性化した血小板量を測定することができる。また、同様に血小板の活性化マーカーであるCD62p（P-selectin）を抗体で検出し、活性化した血小板量を測定してもよい。例えば、フローサイトメトリーを用い、活性化非依存性の血小板マーカーCD61又はCD41に対する抗体でゲーティングを行い、その後、抗PAC-1抗体や抗CD62p抗体の結合を検出することにより行うことができる。これらの工程は、アデノシン二リン酸（ADP）存在下で行ってもよい。
【００３５】
また、血小板の機能の評価は、ADP存在下でフィブリノーゲンと結合するか否かを見て行うこともできる。血小板がフィブリノーゲンと結合することにより、血栓形成の初期に必要なインテグリンの活性化が生じる。
さらに、血小板の機能の評価は、国際公開第2011/034073号の図６に示されるように、in vivoでの血栓形成能を可視化して観察する方法で行うこともできる。
【００３６】
一方、血小板のCD42bの発現率が低い場合や、アネキシンV陽性率が低い場合は、血小板が劣化又は異常であると評価される。これらの血小板は、血栓形成や止血機能を十分に有さず、臨床的に有用でない。
【００３７】
本明細書において「血小板の劣化」とは、血小板表面のCD42b（GPIbα）が減少することをいう。したがって、劣化した血小板には、CD42bの発現が低下した血小板や、シェディング反応によってCD42bの細胞外領域が切断された血小板が含まれる。血小板表面のCD42bがなくなると、フォン・ウィルブランド因子（von Willebrand factor：VWF）との会合ができなくなり、結果的に、血小板の血液凝固機能が失われる。血小板の劣化は、血小板分画中のCD42b陽性率（又はCD42b陽性粒子数）に対するCD42b陰性率（又はCD42b陰性粒子数）を指標として評価することができる。CD42b陽性率に対するCD42b陰性率高いほど、又は、CD42b陽性粒子数に対するCD42b陰性粒子数が多いほど、血小板は劣化している。CD42b陽性率とは、血小板分画に含まれる血小板のうち、抗CD42b抗体が結合できる血小板の割合を意味し、CD42b陰性率とは、血小板分画に含まれる血小板のうち、抗CD42b抗体が結合しない血小板の割合を意味する。
【００３８】
本明細書において「異常な血小板」とは、陰性電荷リン脂質であるホスファチジルセリンが脂質二重層の内側から外側に露出した血小板を言う。生体内においては、ホスファチジルセリンは血小板の活性化に伴って表面に露出し、そこに多くの血液凝固因子が結合することによって、血液凝固カスケード反応が増幅されることが知られている。一方、異常な血小板では、常に多くのホスファチジルセリンが表面に露出しており、かかる血小板が患者に投与されると、過剰な血液凝固反応を引き起こし、播種性血管内凝固症候群などの重篤な病態に繋がる可能性がある。ホスファチジルセリンにはアネキシンVが結合するので、血小板表面上のホスファチジルセリンは、蛍光標識したアネキシンVの結合量を指標にしてフローサイトメータを用いて検出することができる。よって、異常な血小板の量は、血小板分画中のアネキシンV陽性率、すなわちアネキシンが結合する血小板の割合又は数で評価することができる。アネキシンV陽性率が高いほど、又はアネキシンV粒子数が多いほど、異常な血小板が多い。
【００３９】
本発明における巨核球細胞の培養条件は、通常の条件とすることができる。例えば、温度は約35℃〜約42℃、約36℃〜約40℃、又は約37℃〜約39℃とすることができ、5〜15%CO2及び／又は20％O2としてもよい。
【００４０】
巨核球細胞を培養する際の培地は特に限定されず、巨核球細胞から血小板が産生されるのに好適な公知の培地やそれに準ずる培地を適宜使用することができる。例えば、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地が挙げられる。
【００４１】
培地には、血清又は血漿が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオグリセロール（MTG）、脂質、アミノ酸（例えばL-グルタミン）、アスコルビン酸、ヘパリン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。サイトカインとは、血球系分化を促進するタンパク質であり、例えば、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、トロンボポエチン（TPO）、各種TPO様作用物質、Stem Cell Factor（SCF）、ITS（インスリン−トランスフェリン−セレナイト）サプリメント、ADAM阻害剤、などが例示される。本発明において好ましい培地は、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、アスコルビン酸、TPOを含むIMDM培地である。さらにSCFを含んでいてもよく、さらにヘパリンを含んでいてもよい。それぞれの濃度も特に限定されないが、例えば、TPOは、約10ng/mL〜約200ng/mL、又は約50ng/mL〜約100ng/mLとすることができ、SCFは、約10ng/mL〜約200ng/mL、又は約50ng/mLとすることができ、ヘパリンは、約10U/mL〜約100U/mL、又は約25U/mLとすることができる。ホルボールエステル（例えば、ホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート；PMA）を加えてもよい。
【００４２】
血清を用いる場合はヒト血清が望ましい。また、血清に代えて、ヒト血漿等を用いてもよい。本発明に係る方法によれば、これらの成分を用いても、血清を用いたときと同等の血小板が得られうる。
【００４３】
遺伝子の強制発現及びその解除のために、Tet-on（登録商標）又はTet-off（登録商標）システムのような薬剤応答性の遺伝子発現誘導システムを用いてもよい。その場合、強制発現する工程においては、対応する薬剤、例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンを培地に含有させ、これらを培地から除くことによって強制発現を抑制することができる。
【００４４】
本発明における巨核球細胞の培養工程は浮遊培養によって行われるので、フィーダー細胞なしで実施することができる。
【００４５】
本発明に係る「巨核球細胞の培養物」は、上述の培養工程で得られる培養物であり、巨核球細胞と、種々の添加物を含む培養液を含む。
【００４６】
本発明は、本発明に係る方法で精製した血小板も包含する。
【００４７】
本発明に係る血液製剤の製造方法は、本発明に係る方法で血小板製剤を製造する工程と、当該血小板製剤を他の成分と混合する工程と、を含む。他の成分としては、例えば赤血球細胞が挙げられる。
本発明は、この方法で精製した血液製剤も包含する。
血小板製剤及び血液製剤には、その他、細胞の安定化に資する他の成分を加えてもよい。
【００４８】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。【００５０】
１．不死化巨核球細胞の作製
１−１．iPS細胞からの造血前駆細胞の調製
ヒトiPS細胞（TKDN SeV2：センダイウイルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来iPS細胞）から、Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830 (2010)に記載の方法に従って、血球細胞への分化培養を実施した。即ち、ヒトES/iPS細胞コロニーを20ng/mL VEGF (R&D SYSTEMS)存在下でC3H10T1/2フィーダー細胞と14日間共培養して造血前駆細胞（Hematopoietic Progenitor Cells；HPC）を作製した。培養条件は20% O2、5% CO2で実施した（特に記載がない限り、以下同条件）。【００５１】
１−２．遺伝子導入システム
遺伝子導入システムは、レンチウイルスベクターシステムを利用した。レンチウイルスベクターは、Tetracycline制御性のTet-on（登録商標）遺伝子発現誘導システムベクターである。LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G（Kobayashi, T., et al. Cell 142, 787-799 (2010)）のmOKSカセットをc-MYC、BMI1、BCL-xLに組み替えることで作製した。それぞれ、LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G、LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G、およびLV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2Gとした。
ウイルス粒子は、293T細胞へ上記レンチウイルスベクターで遺伝子導入することにより作成した。
かかるウイルス粒子を目的の細胞に感染させることによって、BMI1、MYC、及びBCL-xLの遺伝子が目的の細胞のゲノム配列に導入される。安定的にゲノム配列に導入されたこれらの遺伝子は、培地にドキシサイクリン (clontech #631311)を加えることによって強制発現させることができる。【００５２】
１−３．造血前駆細胞へのc-MYC及びBMI1ウイルス感染
予めC3H10T1/2フィーダー細胞を播種した6 well plate上に、上記の方法で得られたHPCを5x104cells/wellずつ播種し、レンチウイルス法にてc-MYCおよびBMI1を強制発現させた。このとき、細胞株1種類につき6 wellずつ使用した。即ち、それぞれMOI 20になるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（32℃ 900rpm、60分間遠心）で感染させた。本操作は、12時間おきに2回実施した。
培地は、基本培地（15% Fetal Bovine Serum (GIBCO)、1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO)、1% Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS-G) (GIBCO)、0.45mM 1-Thioglycerol (Sigma-Aldrich)、50μg/mL L-Ascorbic Acid (Sigma-Aldrich)を含有するIMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) (Sigma-Aldrich)）に50ng/mL Human thrombopoietin (TPO) (R&D SYSTEMS)、50ng/mL Human Stem Cell Factor (SCF) (R&D SYSTEMS)および2μg/mL Doxycycline (Dox)を添加した培地（以下、分化培地）に、更に、Protamineを最終濃度10μg/mL加えたものを使用した。【００５３】
１−４．巨核球自己増殖株の作製および維持培養
上記の方法でcMYC及びBMI1ウイルス感染を実施した日を感染0日目として、以下の通り、cMYC及びBMI1遺伝子導入型巨核球細胞を培養することで、巨核球自己増殖株をそれぞれ作製した。BMI1遺伝子、c-MYC遺伝子の強制発現は、培地にドキシサイクリン (clontech #631311) 1μg/mLを加えることにより行った。【００５４】
・感染2日目〜感染11日目
ピペッティングにて上記の方法で得られたウイルス感染済み血球細胞を回収し、1200rpm、5分間遠心操作を行って上清を除去した後、新しい分化培地で懸濁して新しいC3H10T1/2フィーダー細胞上に播種した(6well plate)。感染9日目に同様の操作をすることによって継代を実施した。細胞数を計測後1×105 cells/2mL/wellでC3H10T1/2フィーダー細胞上に播種した(6well plate)。【００５５】
・感染12日目〜感染13日目
感染2日目と同様の操作を実施した。細胞数を計測後3×105cells/10mL/100mm dishでC3H10T1/2フィーダー細胞上に播種した(100mm dish)。【００５６】
・感染１４日目
ウイルス感染済み血球細胞を回収し、細胞1.0×105個あたり、抗ヒトCD41a-APC抗体(BioLegend)、抗ヒトCD42b-PE抗体(eBioscience)、抗ヒトCD235ab-pacific blue（BioLegend）抗体をそれぞれ2μL、1μL、1μLずつを用いて抗体反応した。反応後に、FACS Verse（BD）を用いて解析した。感染14日目において、CD41a陽性率が50%以上であった細胞を、巨核球自己増殖株とした。【００５７】
１−４．巨核球自己増殖株へのBCL-xLウイルス感染
前記感染14日目の巨核球自己増殖株に、レンチウイルス法にてBCL-xLを遺伝子導入した。MOI 10になるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（32℃ 900rpm、60分間遠心）で感染させた。BCL-xL遺伝子の強制発現は、培地にドキシサイクリン (clontech #631311) 1μg/mLを加えることにより行った。【００５８】
１−５．巨核球不死化株の作成及び維持培養
・感染14目〜感染18日目
前述の方法で得られたBCL-xLを遺伝子導入した巨核球自己増殖株を回収し、1200rpm、5分間遠心操作を行った。遠心後、沈殿した細胞を新しい分化培地で懸濁した後、新しいC3H10T1/2フィーダー細胞上に2×105cells/2mL/wellで播種した（6well plate）。【００５９】
・感染18日目：継代
細胞数を計測後、3×105 cells/10mL/100mm dishで播種した。【００６０】
・感染24日目：継代
細胞数を計測後、1×105 cells/10mL/100mm dishで播種した。以後、4-7日毎に継代を行い、維持培養を行った。【００６１】
感染24日目にBCL-xLを遺伝子導入した巨核球自己増殖株を回収し、細胞1.0×105個あたり、抗ヒトCD41a-APC抗体(BioLegend)、抗ヒトCD42b-PE抗体(eBioscience)、抗ヒトCD235ab-Pacific Blue（Anti-CD235ab-PB; BioLegend）抗体をそれぞれ2μL、1μL、1μLずつを用いて免疫染色した後にFACS Verse（BD）を用いて解析して、感染24日目においても、CD41a陽性率が50%以上である株を不死化巨核球細胞株とした。感染後24日以上増殖することができたこれらの細胞を、不死化巨核球細胞株SeV2-MKCLとした。【００６２】
得られたSeV2-MKCLを、10cmディッシュ（10mL/ディッシュ）で静置培養した。培地は、IMDMを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は終濃度）。
FBS（シグマ#172012 lot.12E261）15％
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 2mM
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μM
アスコルビン酸 (sigma #A4544) 50μg/mL
Puromycin (sigma #P8833-100MG) 2μg/mL
SCF (和光純薬 #193-15513) 50ng/mL
TPO様作用物質  200ng/mL
培養条件は、37℃、5%CO2とした。【００６３】
２．血小板の生産
次に、ドキシサイクリンを含まない培地で培養することで強制発現を解除した。具体的には、１．の方法で得た不死化巨核球細胞株（SeV2-MKCL）を、PBS(-)で2度洗浄し、下記の血小板の生産のための培地に懸濁した。細胞の播種密度は、1.0x105 cells/mLとした。【００６４】
血小板生産培地で6日間培養して、血小板を産生させた。【００６５】
血小板の生産のための培地（血小板生産培地）は、IMDMを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は終濃度）。
FBS  15％
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 2mM
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μM
アスコルビン酸 (sigma #A4544) 50μg/mL
SCF (和光純薬 #193-15513) 50ng/mL
TPO様作用物質  200ng/mL
ADAM阻害剤  15μM
SR1  750nM
ROCK阻害剤  10μM【００６６】
３．血小板の精製
３−１．巨核球除去
先ず、無菌接合装置を用いて、ACP215ディスポーザブルセットの廃液バッグを回収用バッグに置換した。回収用バッグは、ハイカリックＩＶＨバック（テルモ  HC-B3006A）を用いた。
次に、血小板の生産工程で得られた巨核球および産生血小板を含む培養液2.4Ｌを調製した。かかる培養液量2.4Lに対して10％量のACD-A液を添加した。その後、ACD-A液を添加した培養液を、細胞バッグに注入した。細胞バッグは、ハイカリックIVHバック（テルモ  HC-B3006A）を用いた。
次に、無菌接合装置を用いて、培養液を含む細胞バッグをACP215ディスポーザブルセットに接合した。
ACP215をサービスモードで立ち上げ、遠心速度を2000rpm（223.8×g）にセットした。
ACP215にACP215ディスポーザブルセットをセットし、培地の入った細胞バッグはスタンドに設置した。
ACP215をスタートさせ、細胞バッグ中の培養液を約100mL/minで分離ボウルに注入した。ボウルより溶出する溶出液は、回収バッグに回収した。
細胞バッグ中の培養液の全量を分離ボウルに添加後、さらに500mLの洗浄液を追加した。
洗浄液を分離ボウルに注入した後、遠心を止めてチューブシーラーを用いて回収液（血小板を含む）を含む回遊バッグを切り離した。【００６７】
３−２．濃縮、洗浄、製剤化
（１）濃縮工程
新しいACP215ディスポーザブルセットへ、無菌接合装置を用いて回収液（血小板を含む）を含んだ回収バッグを接合した。
ACP215を通常モードで立ち上げた。プログラム設定はWPCを選択し、機器の指示に従い、上述の回収バッグを接合したACP215ディスポーザブルセットをセットした。尚、回収液を含んだ回収バッグはスタンドに設置した。
次に、ACP215の遠心速度を5000rpm（1398.8×g）に変更し、遠心をスタートさせた。
分離ボウルへの回収液が注入され始めたとき、自動注入から手動注入に変更した。具体的には、回収液を約100mL/minで分離ボウルに注入させた。回収液全量を分離ボウルに添加後、さらに500mLの洗浄液を追加した。
（２）洗浄工程
洗浄は、ACP215のプログラムに従って、2000mLの洗浄液で洗浄した。
（３）製剤化
ACP215のプログラムに従って、200mLの洗浄済み血小板を血小板製剤バッグに回収した。【００６８】
４．巨核球数、血小板数、血小板の生理活性、異常血小板の測定
４−１．測定方法
精製した血小板製剤中の巨核球数、血小板数、血小板の生理活性、異常血小板などを、フローサイトメータを用いて測定した。
巨核球数、血小板数、血小板の生理活性の測定では、1.5mLマイクロチューブに希釈液900μLを添加し、巨核球細胞の培養物又は血小板精製後の回収物100μLを添加し、混合した。得られた溶液200μLをFACSチューブに分注し、標識抗体を添加して染色を行った。
異常血小板の測定では、巨核球細胞の培養物又は血小板精製後の回収物100μLをFACSチューブに分注し、標識抗体及びタンパク質を添加して染色を行い、フローサイトメータ分析直前にアネキシンV binding buffer（BD）で5倍希釈し、分析した。
抗体は、以下を用いた。
（１）巨核球数、血小板数の測定
1.0μL 抗CD41a抗体 APC標識（Bio Legend 303710）
1.0μL 抗CD42a抗体PB標識（eBioscience  48-0428-42）
1.0μL 抗CD42b抗体PE標識（Bio Legend  303906）
（２）血小板の生理活性の測定
0.5μL 抗CD42a抗体PB標識（eBioscience  48-0428-42）
0.5μL 抗CD42b抗体PE標識（Bio Legend   303906）
0.5μL 抗CD62p抗体APC標識（Bio Legend 304910）
10μL 抗PAC-1抗体FITC標識（BD 303704）
（３）異常血小板数の測定
1.0μL 抗CD41a抗体 APC標識（Bio Legend 303710）
1.0μL 抗CD42b抗体PE標識（Bio Legend   303906）
5μL  Annexin V FITC標識（BD 556419）【００６９】
４−２．巨核球数、血小板数の測定結果
CD41a陽性CD42b陽性の粒子数を血小板数とし、陽性の粒子数を巨核球細胞数とした。精製前の培養物（Versusを使用して6日間培養した培養物）と、精製後の回収物に含まれる血小板数と巨核球数をそれぞれ測定した。
結果を下表と図１に示す。
【表１】
2017065280.tif 000003
精製前
（2600mL）
精製後
（200mL）
収率（%）
血小板
2.40×1010
7.41×109
30.8
巨核球数
6.91×108
1.60×107
3.3
【００７０】
表１から血小板回収率は30.8％であった。また、巨核球数は、精製前の2.3%に減少した（巨核球除去率97.7％）。従来の方法（フィルターを使用する方法や遠心管を用いる遠心分離法）に比較して、血小板回収率が3倍上昇した。【００７１】
４−３．血小板の生理活性の測定結果
血小板の刺激を、PMA 0.2μM(Phorbol 12-myristate 13-acetate, sigma #P1585-1MG)、又は、ADP 100μM(sigma #A2754)およびThrombin 0.5 U/mL（sigma）で室温にて行った。刺激開始から30分後にBD社FACSverceにて測定を実施した。
CD42a陽性の血小板画分における、刺激前後のPAC-1陽性率及びCD62p（p-selectin）
陽性率を測定し、生理活性を比較評価した。
結果を図２に示す。刺激後にPAC-1陽性及びCD62p（p-selectin）陽性細胞が増加し、精製血小板が高い生理活性を維持していることが確認された。【００７２】
４−４．異常血小板の測定結果
アネキシンV陽性の粒子数を異常血小板数とした。結果を図３に示す。
アネキシンV陽性率は14.5％と低く、血小板の異常は十分に抑えられた。【００７３】
４−５．精製６日後の血小板の生理活性及び異常の測定結果
上記３−２．及び３−３と同様の方法で、精製6日後の血小板の生理活性と異常を測定した。
結果を図４及び図５に示す。
精製６日後でも、血小板の生理活性は高く維持され、異常血小板も十分に少なかった。
【図１】
2017065280.tif 000004
【図２】
2017065280.tif 000005
【図３】
2017065280.tif 000006
【図４】
2017065280.tif 000007
【図５】
2017065280.tif 000008
【国際調査報告】
2017065280.tif 000009
2017065280.tif 000010
2017065280.tif 000011
2017065280.tif 000012
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