(57)【要約】本発明の腫瘍の治療剤は、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ（ＡＩＭ）又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体を有効成分として含有し、補体を実質的に含有しないものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ（ＡＩＭ）又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体を有効成分として含有し、補体を実質的に含有しないことを特徴とする腫瘍の治療剤。
【請求項２】
配列番号１に示すアミノ酸配列と同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ、腫瘍細胞に対する殺細胞効果を有するタンパク質、その誘導体、又はこれらの塩若しくはエステルを有効成分として含有する請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
腫瘍が肉腫（サルコーマ）である請求項１又は２に記載の治療剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療剤、及び薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含むことを特徴とする腫瘍の治療用医薬組成物。
【請求項５】
ＡＩＭ又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
【請求項６】
前記哺乳動物は非ヒト哺乳動物である請求項５に記載の腫瘍の治療方法。
【請求項７】
前記非ヒト哺乳動物がイヌである請求項６に記載の腫瘍の治療方法。
【請求項８】
腫瘍の治療剤を製造するためのＡＩＭ又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の治療剤、腫瘍の治療用医薬組成物、腫瘍の治療方法、及び前記腫瘍の治療剤を製造するためのＡＩＭ又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体の使用に関する。
本願は、２０１５年５月２８日に、米国に出願された仮出願第６２／１６７，２７４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
非上皮細胞由来の悪性腫瘍（いわゆる肉腫）は、骨、軟部組織、血管及び血液系等に起きる中胚葉由来の悪性腫瘍である。切除可能なものは外科手術の適応対象となるが、転移が進行している、多発性に発症している、又は血液に及ぶ腫瘍である場合には、化学療法が一般的な治療法となる。これまでに様々な抗がん剤が研究及び開発されており、進歩を遂げてきたが、従来の抗がん剤は副作用が強く、使用が困難な場合がある。一方、分子標的薬による化学療法は、特異的で強力に効果を発揮することができるものの、標的分子が発現しているごく一部のがん細胞にしか効果を発揮しないため、より広範で有効な分子標的薬の開発が望まれている。【０００３】
Ａｐｏｔｏｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ（ＡＩＭ）は、マクロファージに特異的に発現する、分子量約４０ｋのタンパク質である。ＡＩＭはアポトーシス抑制因子として発見され、肝細胞癌において補体を介した抗がん作用を有することが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Maehara et al., “Circulating AIM Prevents Hepatocellular Carcinoma through Complement Activation”, Cell Reports, 9, p61-74, 2014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
非特許文献１において、肝細胞癌において細胞表面にＡＩＭが蓄積することで、補体が活性化し細胞傷害が生じて癌細胞特異的な壊死が惹起されることが開示されているが、その他にＡＩＭに関する続報はほとんどなされていない。【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、多種の悪性腫瘍に対して著効を示す新規の腫瘍の治療剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＡＩＭが補体を介さないメカニズムにより多種の悪性腫瘍への殺細胞効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ（ＡＩＭ）又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体を有効成分として含有し、補体を実質的に含有しないことを特徴とする腫瘍の治療剤。
［２］配列番号１に示すアミノ酸配列と同一性が６０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ、腫瘍細胞に対する殺細胞効果を有するタンパク質、その誘導体、又はこれらの塩若しくはエステルを有効成分として含有する［１］に記載の治療剤。
［３］腫瘍が肉腫（サルコーマ）である［１］又は［２］に記載の治療剤。
［４］［１］〜［３］のいずれか一つに記載の治療剤、及び薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含むことを特徴とする腫瘍の治療用医薬組成物。
［５］ＡＩＭ又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体の有効量を、哺乳動物に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
［６］前記哺乳動物は非ヒト哺乳動物である［５］に記載の腫瘍の治療方法。
［７］前記非ヒト哺乳動物がイヌである［６］に記載の腫瘍の治療方法。
［８］腫瘍の治療剤を製造するためのＡＩＭ又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、多種の悪性腫瘍に対して著効を示す腫瘍の治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１における各濃度のＡＩＭを添加した各種腫瘍細胞での細胞生存率を示すグラフである。
【図２】実施例１におけるＡＩＭ添加又は無添加の組織球性肉腫細胞株（ＣＨＳ−５）でのゲノムＤＮＡ電気泳動法によるアポトーシスの有無を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜＜腫瘍の治療剤＞＞
一実施形態において、本発明は、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ（ＡＩＭ）又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体を有効成分として含有し、補体を実質的に含有しない腫瘍の治療剤を提供する。
【００１２】
本実施形態の腫瘍の治療剤によれば、多種の悪性腫瘍を効果的に治療することができる。
【００１３】
なお、本明細書において、「有効成分として含有する」とは、治療的に有効量のペプチドを含有することを意味する。
また、本明細書において、「補体を実質的に含有しない」とは、補体を全く含有しない、又は活性化して細胞障害を生じさせない程度の微量しか含有しないことを意味する。
よって、本実施形態の腫瘍の治療剤において、ＡＩＭ又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体は、補体を介さない新たなメカニズムにより腫瘍細胞に対する殺細胞効果を有するものである。
【００１４】
一般的に、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ（ＡＩＭ）」とは、分化成熟したマクロファージが特異的に産生する、分子量４０ｋのタンパク質であり、３つのｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｙｓｔｅｉｎ−ｒｉｃｈ（ＳＲＣＲ）ドメインからなることが知られている。
【００１５】
本実施形態において使用するＡＩＭは、哺乳動物に由来するものであればよく、前記哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、マーモセット、サル、ヒト等が挙げられ、これらに限定されない。
【００１６】
また、ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体とは、例えば、ＡＩＭのアミノ酸配列と同一性が６０％以上であり、好ましくは７０％以上であり、より好ましくは８０％以上であり、さらに好ましくは９０％以上であり、特に好ましくは９５％以上であるタンパク質等を挙げることができる。
【００１７】
また、ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体とは、例えば、ＡＩＭのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、１〜１５個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。
【００１８】
さらに、前記タンパク質改変体は、ＡＩＭと実質的に同等の活性、すなわち、腫瘍細胞に対する殺細胞効果を有する。
なお、本明細書において、「腫瘍細胞に対する殺細胞効果」とは、例えば、アポトーシスを促進させること等により、腫瘍細胞を特異的に死滅させる効果を意味する。
【００１９】
本明細書において、「腫瘍」とは、主に悪性腫瘍（がん）を示し、遺伝子変異によって自律的で制御されない増殖を行うようになった細胞集団（腫瘍）の中で周囲の組織に浸潤し、または転移を起こす悪性新生物を意味する。
また、本明細書において、「癌」とは、診断名を表す際に用いられ、「がん」とは、悪性新生物の総称を表す際に用いられる。
一般的に、腫瘍の種類は発症する細胞により区別され、腫瘍細胞が集まって孤立性病変を生じる「固形がん」と、造血組織の異常により腫瘍細胞が主に血液中に展開する「液性がん」に大別される。さらに、「固形がん」には、上皮系細胞由来の悪性腫瘍と、それ以外の非上皮系細胞由来の悪性腫瘍に分けられる。
【００２０】
前記固形がんとしてより具体的には、例えば、乳腺腫瘍（例えば、浸潤性乳管癌、非浸潤性乳管癌、炎症性乳癌等）、前立腺癌、消化管腫瘍（例えば、消化管間質腫瘍、消化管腺癌）、肺がん（例えば、肺腺癌、肺の扁平上皮癌、悪性中皮腫）、リンパ腫（例えば、皮膚型リンパ腫、鼻腔内リンパ腫、消化器型リンパ腫、多中心型リンパ腫）、肝臓がん（例えば、肝細胞癌、肝カルチノイド、肝外胆管癌）、腎臓がん（例えば、腎細胞癌、腎芽腫）、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん（例えば、インスリノーマ、グルカゴノーマ）、卵巣腫瘍、子宮平滑筋肉腫、膀胱がん（例えば、移行上皮癌）、皮膚がん（例えば、扁平上皮癌、悪性黒色腫、皮膚組織球腫）、甲状腺癌、血管肉腫、血管線維肉腫、肛門周囲腺癌、肛門嚢アポクリン腺癌、精巣腫瘍（例えば、セルトリ細胞腫、精細胞腫、ライディッヒ細胞腫）、神経鞘腫、脳腫瘍（例えば、髄膜腫、神経膠腫）、副腎腫瘍、下垂体腺癌、骨肉腫、耳垢腺癌、肥満細胞腫、組織球性肉腫（例えば、ランゲルハンス細胞組織球症、血球貪食性組織球症）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２１】
また、前記液性がんとしてより具体的には、急性リンパ性白血病 （ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２２】
本実施形態の腫瘍の治療剤の適用対象となる腫瘍としては、上述に挙げられたものであれば特別な限定はないが、中でも、本実施形態の腫瘍の治療剤は肉腫（サルコーマ）に対して使用することが好ましい。
【００２３】
また、配列番号１はイヌにおけるＡＩＭのアミノ酸配列である。
ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体としてより具体的には、例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列と同一性が６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）であるアミノ酸配列を含み、かつ、腫瘍細胞に対する殺細胞効果を有するタンパク質、その誘導体、又はこれらの塩若しくはエステルを有効成分として含有するもの等が挙げられる。
【００２４】
また、ＡＩＭ、又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又はこれらの組み合わせからなるものであってもよい。Ｌ−アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であり、Ｄ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸残基のキラリティーが反転しているものである。また、腫瘍細胞に対する殺細胞効果を増加させるために、又は他の物性を最適化するために化学的修飾を受けていてもよい。
即ち、本実施形態の腫瘍の治療剤は、前記ＡＩＭ、又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体とともに、又はそれに代えて、前記ＡＩＭ、又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体の誘導体を含んでいてもよい。
【００２５】
また、本実施形態の腫瘍の治療剤は、細胞膜に接触さえすれば所望の効果を発揮するため、細胞内への透過性を有していなくともよい。
【００２６】
本実施形態の腫瘍の治療剤は、前記ＡＩＭ、若しくは該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体、及び／又は、前記ＡＩＭの誘導体、若しくは該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体の誘導体とともに、或いは、それに代えて、前記ＡＩＭの塩、若しくは該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体の塩、若しくはエステル、及び／又は、前記ＡＩＭの誘導体、若しくは該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体の誘導体の塩若しくはエステルを含んでいてもよい。
【００２７】
塩としては、医薬として生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。
酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等の無機酸との塩；酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等の有機酸との塩等が挙げられる。
塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム等の無機塩基との塩；カフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩等が挙げられる。
エステルとしては、例えば、カルボキシル基を有する場合の当該カルボキシル基における医薬として許容され得る慣用的なものが好ましい。具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基等の低級アルキル基とのエステル；アリル基、２−ブテニル基等の低級アルキル基とのエステル；メトキシメチル基、２−メトキシエチル基、２−エトキシエチル基等の低級アルコキシ低級アルキル基とのエステル等が挙げられる。ここで低級アルキル基とは、炭素数１〜６のアルキル基を意味する。
【００２８】
本実施形態の腫瘍の治療剤は、他の成分として、例えば、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液；アジ化ナトリウム、グリセロール等の添加剤等を含んでいてもよい。
【００２９】
本実施形態においては、上述の腫瘍の治療剤を用いて、腫瘍の治療方法を提供することができる。腫瘍としては、上述において例示されたものと同様のものが挙げられる。
治療対象として限定はされず、ヒト又は非ヒト動物を含む哺乳動物が挙げられる。哺乳動物としては、上述において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００３０】
＜腫瘍の治療剤の製造方法＞
本実施形態の腫瘍の治療剤において用いられるＡＩＭは、天然由来のものであってもよく、人工的に化学合成して得られたものであってもよい。
天然物由来のＡＩＭは、非ヒト哺乳動物由来の体液試料（例えば、血液試料等）、組織、又は細胞から公知の回収法及び精製法により直接得てもよいし、又は、公知の遺伝子組換え技術により、当該ペプチドをコードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法及び精製法により得てもよい。あるいは、市販のキット、例えば、試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡社製）、ＴＮＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡社製）及びＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）等を用いた無細胞タンパク質合成系により当該ＡＩＭを産生し、公知の回収法及び精製法により得てもよく、限定はされない。
また、化学合成によるＡＩＭは、公知のタンパク質合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のタンパク質合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィー等の公知の精製法を組み合わせてＡＩＭを精製することができる。
【００３１】
ＡＩＭの合成方法としてより具体的には、例えば次のような方法により作製することができる。
まず、ＡＩＭをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて、宿主を形質転換する。続いて、当該宿主を培養してＡＩＭを発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、ＡＩＭが効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現したＡＩＭを適宜の方法により精製することにより、ＡＩＭが得られる。
【００３２】
＜腫瘍の治療剤の投与方法＞
本実施形態の腫瘍の治療剤の投与量は、被検動物（ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物）の年齢、性別、体重、症状、治療方法、投与方法、処理時間等を勘案して適宜調節される。
例えば、ＡＩＭ、又は該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体を注射剤により静脈内注射する場合、被検動物に対し、１回の投与においてＡＩＭの局所濃度が、健常者におけるＡＩＭの血中濃度の２倍以上、すなわち、２００μＭ以上となるように投与することが好ましく、２００μＭ以上２００ｍＭ以下となるように投与することがより好ましく、２ｍＭ以上２０ｍＭ以下となるように投与することが特に好ましい。
【００３３】
また、本実施形態の腫瘍の治療剤は、投与から３０分後には腫瘍細胞の死滅を確認することができ、好ましくは４時間以上４８時間以下、より好ましくは８時時間以上３０時間以下、さらに好ましくは１２時間以上２４時間以下に９５％以上の腫瘍細胞の死滅させることができる。本実施形態の腫瘍の治療剤は、従来の抗がん剤よりも迅速に腫瘍細胞を死滅させることができ、さらに、この迅速な殺細胞効果は、従来の補体を介したメカニズムに寄らない、新たなメカニズムによるものであると考えられる。
【００３４】
投与回数としては、１週間平均当たり、１回〜数回投与することが好ましい。
投与形態としては、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、点眼、点鼻、点耳、気管支内投与、経口投与、又は経皮吸収等による投与形態が挙げられ、中でも、静脈内注射が好ましい。
注射剤は、非水性の希釈剤（例えば、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤、又は乳濁剤として調製することもできる。このような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤等の配合により行うことができる。注射剤は、用事調製の形態として製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって、無菌の固体組成物とし、使用前に注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用することができる。
【００３５】
＜＜腫瘍の治療用医薬組成物＞＞
本実施形態の腫瘍の治療用医薬組成物は、治療的に有効量の上述の腫瘍の治療剤、及び薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む。
【００３６】
薬学的に許容されうる担体又は希釈剤は、賦形剤、稀釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味料、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤、添加剤等が挙げられる。これら担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、又はシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。
【００３７】
また、担体としてコロイド分散系を用いることもできる。コロイド分散系は、ペプチドの生体内安定性を高める効果や、特定の臓器、組織、又は細胞へ、ペプチドの移行性を高める効果が期待される。コロイド分散系としては、例えばポリエチレングリコール、高分子複合体、高分子凝集体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油系の乳化剤、ミセル、混合ミセル、リポソームを包含する脂質等を挙げることができ、特定の臓器、組織、又は細胞へ、ペプチドを効率的に輸送する効果のある、リポソームや人工膜の小胞が好ましい。
【００３８】
本実施形態の腫瘍の治療用医薬組成物における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。
または、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体又は希釈剤、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。
【００３９】
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【００４０】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
【００４１】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【００４２】
＜＜腫瘍の治療剤及び腫瘍の治療用医薬組成物の使用方法＞＞
また、本発明の一側面は、腫瘍の治療のための上述のＡＩＭ、若しくは該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体、これらの誘導体、又はこれらの塩若しくはエステルを提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の上述のＡＩＭ、若しくは該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体、これらの誘導体、又はこれらの塩若しくはエステル、及び薬学的に許容されうる担体又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、上述の腫瘍の治療用医薬組成物を含む、腫瘍の治療剤を提供する。
【００４３】
また、本発明の一側面は、腫瘍の治療剤を製造するための上述のＡＩＭ、若しくは該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体、これらの誘導体、又はこれらの塩若しくはエステルの使用を提供する。
【００４４】
また、本発明の一側面は、上述のＡＩＭ、若しくは該ＡＩＭと実質的に同等の活性を有するタンパク質改変体、これらの誘導体、又はこれらの塩若しくはエステルの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、腫瘍の治療方法を提供する。
【００４５】
上述の治療方法が適用される腫瘍としては、上述の＜＜腫瘍の治療剤＞＞に例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、上述の治療方法が適用される動物としては、ヒト又は非ヒト哺乳動物が挙げられる。非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、マーモセット、サル等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、上述の治療方法が適用される非ヒト哺乳動物としては、イヌであることが好ましい。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例及び比較例等を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。【００４７】
［実施例１］
（１）組換えイヌＡＩＭの調製
（１−１）ＨＡタグ付きイヌＡＩＭ発現ベクターの作製
配列番号２はイヌＡＩＭをコードする核酸の塩基配列である。イヌＡＩＭをコードする核酸を鋳型として、表１に示すプライマーを用いて、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたＰＣＲにより、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩの制限酵素サイトを５’末端及び３’末端それぞれに有するＰＣＲ産物を得た。次いで、ｐＣＡＧＧＳベクター（ｐＣＡＧＧＳ−Ｌｅａｄｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ＨＮＸ−ＨＡ）に、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩによる制限酵素処理を行い、イヌＡＩＭをコードする核酸（配列番号２）を挿入して、イヌＡＩＭ発現ベクターを作製した。作製したベクターは、サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβ−グロブリンエクソン及びイントロン、ＨＡポリペプチドをコードする核酸、並びにイヌＡＩＭをコードする核酸を含む。【００４８】
【表１】
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【００４９】
（１−２）イヌ組織球性肉腫細胞株ＣＨＳ−５へのＨＡタグ付きイヌＡＩＭ発現ベクターのトランスフェクション
次いで、イヌ組織球性肉腫細胞株ＣＨＳ−５を９０ｍｍのディッシュに１．０×１０６細胞となるように播種し、１０％ウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）１０ｍＬを加えて３７℃で２４時間培養した。次いで、培養したＣＨＳ−５細胞に１．２５μｇ／ｍＬとなるようにＨＡタグ付きイヌＡＩＭ発現ベクターをトランスフェクションし、３７℃で４８時間培養した。【００５０】
（１−３）ＨＡタグ付きイヌＡＩＭの精製
次いで、トランスフェクション後の細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、１ｍＬのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（０．５ｍＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＬの１．５Ｍ  ＮａＣｌ、及び１μＬのＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、０．４ｍＬの超純水含有)を用いて、細胞溶解液を調製した。次いで、Ａｎｔｉ−ＨＡ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ＨＡタグ付きイヌＡＩＭを精製した。溶出液は、５０ｍＭグリシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎを１００ｍＬの超純水に溶解し、ｐＨ２．０になるように調製した。また、４℃にて２４時間かけて系内をＰＢＳに置換した。次いで、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ３０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた限外濾過により濃縮し、ＨＡタグ付きイヌＡＩＭを得た。得られたＨＡタグ付きイヌＡＩＭの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｌｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて計測した結果、０．７ｍｇ／ｍＬであった。得られたＨＡタグ付きイヌＡＩＭは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色及び抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより確かめた（図示せず）。【００５１】
（２）多種の腫瘍細胞における組換えＡＩＭによる殺細胞効果についての検証
５種類のイヌ組織球性肉腫細胞株（ＣＨＳ−４、ＣＨＳ−５、ＣＨＳ−７、ＭＨＴ−２、ＤＨ８２）と、５種類のその他の腫瘍細胞株（悪性黒色腫２種（ＣＭＭ１、ＣＭＭ１１）、乳腺腫瘍２種（ＣＴＢｐ、ＣＨＭｐ）、移行上皮癌（ＴＣＣＵＢ））とを、９６ウェルプレートにそれぞれ１．０×１０４細胞となるように播種し、１００μＬの上述の実施例１の（１−２）で用いたＤＭＥＭを加え、５％ＣＯ２下で３７℃にて２４時間培養した。次いで、０Ｍ、１．５８×１０−９Ｍ（５．８５ｎｇ／１００μＬ  ＤＭＥＭ）、５×１０−９Ｍ（１８．５ｎｇ／１００μＬ  ＤＭＥＭ）、１．５８×１０−８Ｍ（５８．５ｎｇ／１００μＬ  ＤＭＥＭ）、５×１０−８Ｍ（１８５ｎｇ／１００μＬ  ＤＭＥＭ）、１．５８×１０−７Ｍ（５８５ｎｇ／１００μＬ  ＤＭＥＭ）、５×１０−７Ｍ（１．８５μｇ／１００μＬ  ＤＭＥＭ）の各濃度の（１）で調製した組換えＡＩＭを含むＤＭＥＭに交換し、２４時間培養した。次いで、培養後の細胞数をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学社製）を用いて計測した。各細胞種における組換えＡＩＭ無添加（０Ｍ）での細胞数を１００％として、組換えＡＩＭの各濃度における細胞の生存率を算出した。結果を図１に示す。図１において、縦軸は細胞の生存数（％）を示し、横軸は組換えＡＩＭの濃度を示す。【００５２】
図１から、５種類のイヌ組織球性肉腫細胞株では、全て組換えＡＩＭの濃度依存的に細胞数が減少することが明らかとなった。また、悪性黒色腫であるＣＭＭ１１及び乳腺腫瘍であるＣＨＭｐにおいても、組換えＡＩＭの濃度依存的に細胞数が減少することが明らかとなった。また、悪性黒色腫であるＣＭＭ１において、組換えＡＩＭが１×１０−７Ｍ以上の濃度では、顕著に細胞数が減少することが明らかとなった。
以上のことから、組換えＡＩＭは、多くの種類の腫瘍細胞に対し、殺細胞効果を有し、特に肉腫（サルコーマ）に対して殺細胞効果が顕著であることが明らかとなった。【００５３】
（３）組織球性肉腫細胞株（ＣＨＳ−５）におけるＡＩＭによるアポトーシス促進作用の検証
イヌ組織球性肉腫細胞株ＣＨＳ−５を６ウェルプレートに２．０×１０５細胞／ウェルとなるように播種し、２ｍＬの上述の実施例１の（１−２）で用いたＤＭＥＭを加え、３７℃で２４時間培養した。次いで、３．２×１０−７Ｍ（１．２μｇ／１００μＬ  ＤＭＥＭ）の（１）で調製した組換えＡＩＭを含むＤＭＥＭに交換し、３７℃で３０分培養した。ネガティブコントロールとして、組換えＡＩＭ無添加のものを、ポジティブコントロールとして、１０ｎｇ／ｍＬのビンクリスチン硫酸塩（シグマ社製）添加を準備した。次いで、ＰＢＳで洗浄後、細胞を２００μＬの細胞溶解液で回収した。次いで、得られた細胞溶解液は４μＬのＲＮａｓｅＡ（２０ｍｇ／ｍＬ、キアゲン社製）、及び４μＬのプロテナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ、キアゲン社製）を加えて５０℃で３０分静置した。次いで、２０μＬの１２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０μＬの３Ｍ酢酸、及び４８０μＬのイソプロピルアルコールを加えてよく混ぜた。次いで、１４，０００回転、１５分、４℃で遠心後、沈渣を１５μＬの超純水に溶かした。次いで、得られたＤＮＡ溶解液を２．０％ＴＢＥアガロースゲルにて電気泳動により展開した。１００Ｖで約４０分の泳動の後、エチジウムブロマイドにてＤＮＡを染色した。結果を図２に示す。図２において、Ｍはマーカーを示し、Ｐはポジティブコントロールを示し、Ｎはネガティブコントロールを示し、ＡはＡＩＭ添加群を示す。【００５４】
図２から、組換えＡＩＭ添加群では、ＤＮＡの断片化（アポトーシス）が顕著に増加することが定性的に示された。
また、組換えＡＩＭ添加から３０分で顕著なＤＮＡ断片化が観察され、従来の抗がん剤と比較して、迅速にアポトーシスが誘導されていることが示唆された。【００５５】
［実施例２］
（１）組換えイヌＡＩＭの調製
トランスフェクションする細胞として、イヌ組織球性肉腫細胞株ＣＨＳ−５の代わりにＨｅＬａ細胞を用いた以外は実施例１の（１）と同様の方法を用いて、ＨＡタグ付きイヌＡＩＭを調製した。【００５６】
（２）多種の腫瘍細胞における組換えＡＩＭによる殺細胞効果についての検証
以下の表２に示す細胞種を、１ｍＬの上述の実施例１の（１−２）で用いたＤＭＥＭに懸濁し、それぞれ２４ウェルプレートに１．０×１０５細胞／ウェルとなるように播種し、３７℃で２４時間培養した。次いで、（１）で調製した組換えＡＩＭを１×１０−７Ｍとなるように添加し、３７℃で４８時間培養した。
次いで、培養後の細胞をＰＢＳで２回洗浄し、生細胞数及び死細胞数をＡＯＰＩ（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて計測し、細胞の生存率を算出した。結果を表２に示す。表２において、感受性とは、ＤＨ８２及びＨｅＬａ細胞におけるＡＩＭ感受性を中程度としたときのその他のＡＩＭ感受性を評価した結果である。ＤＨ８２及びＨｅＬａ細胞と比較して、細胞生存率が高いものでは、ＡＩＭ感受性を低とし、細胞生存率が同程度のものでは、ＡＩＭ感受性を中とし、細胞生存率が低いのものでは、ＡＩＭ感受性を高とした。【００５７】
【表２】
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【００５８】
表２から、骨肉腫であるＤ１７、乳腺骨肉腫であるＭＣＯ−Ｙ４、繊維肉腫ＦＣ８１．Ｔ、赤白血病であるＦ２５において、顕著な殺細胞効果が見られた。また、リンパ腫であるＦ１Ｂにおいて、ＤＨ８２及びＨｅＬａと同程度の殺細胞効果が見られた。
よって、組換えＡＩＭは、あらゆる種類の腫瘍細胞に対し、殺細胞効果を有し、特に肉腫（サルコーマ）に対して殺細胞効果が顕著であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の治療剤によれば、多種の悪性腫瘍を効果的に治療することができる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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