(57)【要約】  本発明の目的は、フラビウイルス科のウイルスの感染により発症する疾患を処置する新規の抗ウイルス剤を提供することである。本発明は、特定のポリペプチドまたは遺伝子を含む、抗ウイルス剤を提供することにより、上記課題を解決する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選択されるいずれかのポリペプチドまたは遺伝子を含むことを特徴とする、抗ウイルス剤：
（ａ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｅ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｆ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｇ）配列番号３または４で示される塩基配列からなる遺伝子、および
（ｈ）前記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【請求項２】
前記抗ウイルス剤の処置対象となるウイルスが、フラビウイルス科のウイルスであることを特徴とする、請求項１に記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
前記抗ウイルス剤の処置対象となるウイルスが、デングウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗ウイルス剤。
【請求項４】
前記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｈ）の抗ウイルス活性が、フラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定のポリペプチドまたは遺伝子を含む抗ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス科のウイルスには、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス等が属しているが、これらウイルスの感染により発症する疾患は、一般に重症化するケースが多く存在する。【０００３】
この中でも、特に、デングウイルスによって引き起こされるデング熱およびその重症型であるデング出血熱・デングショック症候群は、東南アジア地域や中南米諸国で毎年流行を繰り返しており、地球規模レベルで保健衛生上の大きな問題を引き起こしている。全世界で毎年２５億人がデングウイルス感染のリスクに曝されており、感染者は、毎年５０００万〜１億人以上である。２０１０年の調査では、デング熱発症患者は約１億人にのぼることが明らかとなり、不顕性感染者（約３億人）を加えると、合計約４億人がこの１年間にデングウイルスに感染したと推定されている。年間のデング出血熱患者数は、確定症例だけでも５０万人以上であり、デング出血熱の死亡率は、約２．５％と高い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Alaa MH El-Bitar et al., Virology Journal (2015) 12: 47
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況下、本願の発明者らは、以前に、サソリの一種であるＳｃｏｒｐｉｏ  ｍａｕｒｕｓ  ｐａｌｍａｔｕｓの毒液が、デングウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスに対する抑制効果を示すことを報告していた。【０００６】
しかしながら、依然として、デングウイルスの治療に関する知見は不十分であり、デングウイルス感染症を予防するワクチンの開発や有効な抗デングウイルス治療薬の開発には至っていないのが現状である。【０００７】
このように、デングウイルスの例でも示されるように、フラビウイルス科のウイルスの感染により発症する疾患は深刻であり、その予防薬・治療薬の開発が求められている。【０００８】
したがって、本発明の目的は、フラビウイルス科のウイルスの感染により発症する疾患を処置する新規の抗ウイルス剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、前記の課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、サソリ毒由来の特定のポリペプチドが、抗ウイルス活性、とりわけ、フラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選択されるいずれかのポリペプチドまたは遺伝子を含むことを特徴とする、抗ウイルス剤である。【００１０】
（ａ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｅ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｆ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｇ）配列番号３または４で示される塩基配列からなる遺伝子、および
（ｈ）前記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のポリペプチドは、強力な抗ウイルス活性を有するため、ウイルス感染症の治療剤として用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の一態様において、特定のポリペプチドまたは遺伝子を含むことを特徴とする、新規の抗ウイルス剤を提供する。本発明は、サソリ毒由来のポリペプチドが、抗ウイルス活性、とりわけ、フラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性を有することを初めて見出したことに基づくものであり、それ故、当該ポリペプチドまたは遺伝子を含む本発明の抗ウイルス剤は、ウイルス感染による疾患、とりわけ、フラビウイルス科のウイルスの感染による疾患を効果的に処置することができる。以下、本発明の実施形態について、〔１．ポリペプチド〕、〔２．遺伝子〕および〔３．抗ウイルス剤〕の順に詳述する。
【００１３】
なお、本明細書に記載された文献の全てが、本明細書において参考として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上（Ａを含みかつＡより大きい）Ｂ以下（Ｂを含みかつＢより小さい）」を意味する。
【００１４】
〔１．ポリペプチド〕
本明細書において「ポリペプチド」なる用語は、「タンパク質」または「ペプチド」と交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、アミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
【００１５】
本発明の一態様において「ポリペプチド」は、アミノ酸がペプチド結合により結合した縮合重合体を意味し、抗ウイルス活性を有している限り別段限定されない。本発明の一態様におけるポリペプチドは、生物毒由来のポリペプチドであり、好ましくは、サソリ毒由来のポリペプチドである。
【００１６】
本発明の一態様におけるポリペプチドは、後述の実施例に示すように、フラビウイルス科のウイルスに対して、極めて高い抗ウイルス活性を有している。一方、治療薬として使用する場合の副作用の指標となる細胞障害活性および溶血活性に関しては、極めて高用量で投与した場合に限り、それぞれの活性を有する。このように、本発明の一態様におけるポリペプチドが、十分に抗ウイルス活性を有する投与量では、細胞障害活性および溶血活性を示さないという効果を奏することは、驚くべき知見であり、このような効果により、処置対象に与える影響を最小限にとどめつつ、効果的にウイルス感染症を処置できるという新規な治療薬を提供することが可能となる。
【００１７】
本発明の一態様において使用されるポリペプチドとしては、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択されるいずれかのポリペプチドが用いられることが好ましい：
（ａ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチド、および
（ｃ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチド。
【００１８】
上記（ａ）のポリペプチドについて具体的に説明する。配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、いずれも、サソリ毒に由来するポリペプチドである。配列番号１は、Ｓｍｐ７６（別名、「ｓｃｏｒｐｉｎｅ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」とも呼ばれる。）と呼ばれるＳｃｏｒｐｉｏ  ｍａｕｒｕｓ  ｐａｌｍａｔｕｓ由来のポリペプチドであり、全長７６ミノ酸残基から構成されるポリペプチドである。また、配列番号２は、Ｓｃｏｒｐｉｎｅと呼ばれるＰａｎｄｉｎｕｓ  ｉｍｐｅｒａｔｏｒ由来のポリペプチドであり、全長７５アミノ酸残基から構成されるポリペプチドである。
【００１９】
上記（ｂ）のポリペプチドは、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等であって、抗ウイルス活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。抗ウイルス活性は、フラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性であることが好ましい。
【００２０】
ここで欠失、置換または付加されてもよいアミノ酸の数は、前記機能を失わせない限り、限定されてないが、部位特異的突然変異誘発法等の公知の導入法によって欠失、置換または付加できる程度の数をいい、好ましくは５アミノ酸以内であり、より好ましくは３アミノ酸以内（例えば、３、２または１アミノ酸）である。また、明細書中において「変異」とは、部位特異的突然変異誘発法等によって人為的に導入された変異を主に意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
【００２１】
置換されるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されていることが好ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）が挙げられる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。さらに、変異後のアミノ酸残基は、共通した性質をできるだけ多く有するアミノ酸残基に変異していることがより好ましい。
【００２２】
本明細書において「機能的に同等」とは、対象となるポリペプチドが、目的とするポリペプチドと同等（同一および／または類似）の生物学的機能や生化学的機能を有することを意図する。生物学的な性質には発現する部位の特異性や、発現量等も含まれ得る。変異を導入したポリペプチドが所望の機能を有するかどうかは、その変異ポリペプチドが抗ウイルス活性を有するかどうか調べることにより判断できる。
【００２３】
本明細書において「抗ウイルス活性」は、ウイルスの感染性、増殖能または免疫回避能を低下させる活性を意味する。
【００２４】
ウイルスの感染性は、ウイルスが宿主細胞に吸着または侵入する性質を意味する。このときの抗ウイルス活性は、例えば、ポリペプチドがウイルス粒子の表面タンパク質と接触することにより、宿主細胞に対するウイルスの吸着または侵入を抑制する活性を示す。すなわち、当該抗ウイルス活性は、ウイルスの中和活性と言い換えることができる。
【００２５】
ウイルスの増殖能は、宿主細胞におけるウイルス粒子の構成タンパク質の合成能、ウイルス粒子の形成能またはウイルス遺伝子の複製能を意味する。このときの抗ウイルス活性は、例えば、宿主細胞において、あるウイルスタンパク質の機能を阻害して成熟したウイルス粒子の形成を抑制する活性を意味する。当該ウイルスタンパク質としては、ウイルスタンパク質の合成を促進するか、もしくは合成に必須なウイルスタンパク質、ウイルス粒子の形成を促進するか、もしくは形成に必須なウイルスタンパク質、またはウイルス遺伝子の複製を促進するか、もしくは複製に必須なウイルスタンパク質が挙げられる。
【００２６】
ウイルスの免疫回避能は、宿主の免疫機構によってウイルスが排除されることを回避する能力を意味する。このときの抗ウイルス活性は、例えば、ウイルス粒子の表面タンパク質に結合して、ウイルス粒子を抗原として認識可能な形態に変化させる活性、または宿主の免疫機構の一部を妨害するウイルスタンパク質を失活させる活性である。
【００２７】
ポリペプチドが、抗ウイルス活性を有するポリペプチドであるか否かを判定するためには、ポリペプチドと、ウイルス（および／または宿主細胞）とを接触させた際に、上記で例示したような抗ウイルス活性が生じるか否かを試験すればよい。すなわち、ポリペプチドと、ウイルス（および／または宿主細胞）とを接触させた際に、例えば、ウイルスの感染性の低下、増殖能の低下、免疫回避能の低下等が生じれば、当該ポリペプチドを、抗ウイルス活性を有するポリペプチドであると判定することができる。
【００２８】
抗ウイルス活性の具体的な判定方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。ポリペプチド、ウイルスおよび宿主細胞との関係を考慮して、例えば、以下の（１）〜（４）の方法が挙げられる。
【００２９】
（１）ポリペプチドと宿主細胞とを接触させて、一定時間処理した後に、当該ポリペプチドを除去し、続いて、ウイルスを前記宿主細胞へ感染させて、余剰の当該ウイルスを除去した後に、当該ポリペプチドを含まない培養液で当該宿主細胞を一定時間培養し、ウイルス感染価を測定する。この方法により、ポリペプチドが、ウイルス感染を抑制する因子（インターフェロン等）の発現を宿主細胞に誘導するか否か（すなわち、ポリペプチドが、宿主細胞へのウイルス感染を阻害するか否か）を判定することができる。
【００３０】
（２）ポリペプチドとウイルスとを接触させて、一定時間反応させた後に、当該ウイルスを宿主細胞へ感染させ、当該ポリペプチドを含まない培養液で当該宿主細胞を一定時間培養し、ウイルス感染価を測定する。この方法により、ポリペプチドが、感染性ウイルス粒子の感染能を直接阻害するか否か（すなわち、ポリペプチドが、宿主細胞へのウイルス感染を阻害するか否か）を判定することができる。
【００３１】
また、ポリペプチドが、感染性ウイルス粒子の感染能を直接阻害するか否かを判定し得る（２）の変法として、以下の（２’）の方法が用いられる。
【００３２】
（２’）ポリペプチドとウイルスとの混合液を宿主細胞と接触させ、一定時間経過後に、当該宿主細胞を固定して、抗ウイルス抗体を用いた間接蛍光抗体法により感染細胞を計測し、当該ポリペプチド・ウイルス混合液中の感染性ウイルス力価を測定する。
【００３３】
（３）ウイルスと宿主細胞とを接触させて、一定時間反応させた後に、当該ウイルスを除去し、ポリペプチドを含む培養液で当該宿主細胞を一定時間培養した後、ウイルス感染価を測定する。この方法により、ポリペプチドが、宿主細胞内に侵入したウイルスの遺伝子複製やウイルスタンパク質の合成、ウイルス粒子の形成・放出等を阻害し得るか否かを判定することができる。
【００３４】
（４）ポリペプチドとウイルスとを接触させて、一定時間反応させた後に、当該ウイルスを宿主細胞へ感染させ、当該ポリペプチドを含む培養液で当該宿主細胞を一定時間培養し、ウイルス感染価を測定する。この方法により、上記（２）および（３）の効果を同時に測定することができる。
【００３５】
上記（ｃ）のポリペプチドは、上記（ｂ）のポリペプチドと同様に、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等を意図しており、抗ウイルス活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。抗ウイルス活性は、フラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性であることが好ましい。
【００３６】
アミノ酸配列の相同性とは、アミノ酸配列全体（または機能発現に必要な領域）で、少なくとも８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有することを意味する。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＮ（核酸レベル）やＢＬＡＳＴＸ（アミノ酸レベル）のプログラム（Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990）を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993）に基づいている。ＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。また、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。
【００３７】
本明細書において「相同性」とは、性質が類似のアミノ酸残基数の割合（ｈｏｍｏｌｏｇｙ、ｐｏｓｉｔｉｖｅ等）を意図しているが、より好ましくは、同一のアミノ酸残基数の割合、すなわち同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）である。なお、アミノ酸の性質については上述したとおりである。
【００３８】
本発明の一態様におけるポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているものであればよいが、これに限定されるものではなく、糖鎖やイソプレノイド基などのポリペプチド以外の構造を含む複合ペプチドであってもよい。アミノ酸の官能基は修飾されていてもよい。アミノ酸はＬ型であることが好ましいが、これに限定されない。
【００３９】
本発明の一態様におけるポリペプチドは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に入手もしくは産生され得る。例えば、本発明の一態様におけるポリペプチドは、精製された天然物、化学合成の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）を用いた組み換え技術によって産生された産物であってもよい。組み換え技術において用いられる宿主に依存して、本発明の一態様におけるポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明の一態様におけるポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００４０】
本発明の一態様におけるポリペプチドの生産方法は、例えば、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いて行われる。この場合、特に、上記ベクターを組み換え発現系において用いることが好ましい。組み換え発現系を用いる場合、本発明の一態様におけるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主（形質転換体）内で翻訳されて得られるポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組み換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。
【００４１】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組み換え技術によって産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【００４２】
本発明の一態様におけるポリペプチドの生産方法は、当該ポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含し得る。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００４３】
本発明の一態様におけるポリペプチドの生産方法の別の例として、当該ポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することができる。当該ポリペプチドを天然に発現するものの例として、サソリ毒が挙げられる。本方法は、抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて本発明の一態様におけるポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することができる。また、本方法は、当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含し得る。
【００４４】
さらに、本発明の一態様におけるポリペプチドの生産方法の別の例として、本発明の一態様におけるポリペプチドを化学合成することが挙げられる。当業者は、本明細書に記載されている本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明のポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。化学合成技術としては、固相法または液相法を挙げることができる。固相法において、例えば、市販の各種ペプチド合成装置（Ｍｏｄｅｌ  ＭｕｌｔｉＰｅｐ  ＲＳ（Ｉｎｔａｖｉｓ  ＡＧ）等）を利用することができる。
【００４５】
以上のように、本発明の一態様におけるポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。
【００４６】
このように、本発明の一態様におけるポリペプチドは、少なくとも、当該ポリペプチドのアミノ酸配列、または当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いて生産すればよいといえる。
【００４７】
〔２．遺伝子〕
本発明の一態様において、上記〔１〕で記載した本発明の一態様におけるポリペプチドをコードする遺伝子を提供する。本発明の一態様におけるポリペプチドが抗ウイルス剤等として有用であるのと同様、本発明の一態様における遺伝子もまた、抗ウイルス剤等として有用である。
【００４８】
本明細書において「遺伝子」なる用語は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書において「塩基配列」なる用語は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００４９】
本発明の一態様において使用される遺伝子としては、以下の（ｄ）〜（ｈ）からなる群より選択されるいずれかの遺伝子が用いられることが好ましい：
（ｄ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｅ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｆ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｇ）配列番号３または４で示される塩基配列からなる遺伝子、および
（ｈ）前記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【００５０】
上記（ｄ）の遺伝子は、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子であり、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述したとおりである。
【００５１】
上記（ｅ）の遺伝子は、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等であって、抗ウイルス活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。抗ウイルス活性は、フラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性であることが好ましい。
【００５２】
なお、「欠失、置換または付加されてもよいアミノ酸の数」や「その導入方法」、「変異」の定義、「変異するアミノ酸残基」の記載、「機能的に同等」の定義、「抗ウイルス活性」の定義等は、上記〔１〕で記載したものと同様である。
【００５３】
上記（ｆ）の遺伝子は、上記（ｅ）の遺伝子と同様に、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の、機能的に同等の変異体、誘導体、バリアント、アレル、ホモログ、オルソログ、部分ペプチド、または他のタンパク質・ペプチドとの融合タンパク質等を意図しており、抗ウイルス活性を有するタンパク質をコードする限り、その具体的な配列については限定されない。抗ウイルス活性は、フラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性であることが好ましい。
【００５４】
なお、「アミノ酸配列の相同性」の定義、「アミノ酸配列の相同性の決定方法」の記載、「相同性」の定義等は、上記〔１〕で記載したものと同様である。
【００５５】
上記（ｇ）の遺伝子について、配列番号３は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列を示す（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＪＺ４６９１１３参照）。また、配列番号４は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列を示す（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．  ＡＪ２９２３６１参照）。
【００５６】
上記（ｈ）の遺伝子は、上記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子を意図する。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、さらに好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。例えば、一例を示すと、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。ただし、前記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する前記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、前記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。このことは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）等に記載されている。
【００５７】
本発明の一態様における遺伝子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００５８】
本発明の一態様における遺伝子は、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００５９】
本発明の一態様において、ベクターは、周知の遺伝子組み換え技術により、本発明の一態様における遺伝子を所定のベクターに挿入することにより作製することができる。上記ベクターとしては、別段限定されるものでなく、組み換え発現ベクターであってもよいし、クローニングベクターであってもよい。ベクターの選択は、目的に応じて、適宜選択可能である。
【００６０】
本発明の一態様における遺伝子を抗ウイルス剤として用いる場合、遺伝子が所定の発現ベクターに挿入されていることが好ましい。本発明の一態様における遺伝子が所定の発現ベクターに挿入されていることにより、例えば、標的部位への遺伝子の送達をより効率的に行うことができたり、標的部位における細胞内への遺伝子の取り込み効率を上げたりすることができる。その結果として、ウイルス感染症を効果的に処置することが可能となる。
【００６１】
このようなベクターは、薬剤送達系（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＤＳ））の分野において開発が進んでおり、所望の送達および発現効果を有するベクターを適宜選択することが可能である。そのようなベクターの一例として、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等）、ＤＮＡベクター（例えば、ｐＵＭＶＣ４ａ等）等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６２】
〔３．抗ウイルス剤〕
本発明の一態様において、上記〔１〕で記載したポリペプチドを含む抗ウイルス剤を提供する。本発明の別の態様において、上記〔２〕で記載した遺伝子を含む抗ウイルス剤を提供する。
【００６３】
本発明の一態様における抗ウイルス剤が標的とするウイルスは、例えば、フラビウイルス科のウイルスであり、例えば、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス等であるがこれらに限定されない。本発明の一態様における抗ウイルス剤の標的は、好ましくは、デングウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスである。
【００６４】
本発明の一態様における上記〔１〕で記載したポリペプチドは、後述の実施例に示すように、フラビウイルス科のウイルスに対して、高い抗ウイルス活性を有している。一方、細胞障害活性および溶血活性に関しては、極めて高用量で投与した場合に限り、それぞれの活性を有する。すなわち、十分に抗ウイルス活性を有する投与量では、細胞障害活性および溶血活性を示さないため、処置対象に与える影響を最小限にとどめつつ、効果的にウイルス感染症を処置することが可能である。
【００６５】
実施例では、特に、上記〔１〕で記載したポリペプチドが、感染性ウイルス粒子の感染能を直接阻害する効果が特に高いこと（換言すれば、宿主細胞外での中和活性が高いこと）が見出されているため、本発明の一態様におけるポリペプチドは、同様の作用機序を有する中和抗体と同じ治療効果を有すると考えられる。すなわち、本発明の一態様におけるポリペプチドは、急性感染症の感染初期の治療薬および重症化の予防薬として、とりわけ有用であり得る。
【００６６】
本発明の一態様における抗ウイルス剤の投与対象は、上記〔１〕で記載したポリペプチドまたは上記〔２〕で記載した遺伝子により処置され得る対象であれば別段限定されない。本発明の一態様における抗ウイルス剤の投与対象は、例えば、フラビウイルス科のウイルス感染症を患う対象であり、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトであり得る。
【００６７】
一実施形態において、本発明の一態様における抗ウイルス剤は、処置対象に対して、直接注入により投与され得る。本発明の一態様における抗ウイルス剤はまた、経口投与、粘膜投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、眼内投与または経皮的投与のために処方され得る。本発明の一態様における抗ウイルス剤の投与量は、当該技術分野における通常の方法に基づいて、適宜設定することができる。
【００６８】
本実施形態において、抗ウイルス剤は、上記〔１〕で記載したポリペプチドおよび上記〔２〕で記載したポリヌクレオチドの他に、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤（それらの組み合わせを含む）を含み得る。
【００６９】
本実施形態において、抗ウイルス剤は、好ましくは、ヒトについての使用のためのものであり、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤の任意の１つ以上を含む。治療的使用のための薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤は、薬学分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤の選択は、意図された投与経路および標準的薬学的慣行に従って、当業者によって容易に選択され得る。また、本実施形態における抗ウイルス剤は、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、被覆剤または可溶化剤をさらに含み得る。
【００７０】
本明細書中の記載に基づけば、当業者は、本実施形態における抗ウイルス剤の別の形態（例えば、キット）や、本発明の一態様における抗ウイルス剤を用いて疾患を処置（予防および／または治療）する方法もまた本発明の範囲内であることを、容易に理解する。
【００７１】
また、他の実施形態において、本発明の一態様における抗ウイルス剤は、ウイルスを除去すべき被処理物からウイルスを除去するために用いられ得る。例えば、本発明の一態様における抗ウイルス剤は、噴霧剤、塗布剤、浸漬剤等の形態であり得、それぞれ、被処理物に対して噴霧、塗布または被処理物を浸漬するために用いられ得る。本実施形態において、抗ウイルス剤は、用途に応じて、公知の抗ウイルス剤、界面活性剤、安定剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、保存料、粘張剤、溶媒等をさらに含んでいてもよい。
【００７２】
＜本発明の構成＞
本発明は、以下の構成を有するものである。
【００７３】
（１）以下の（ａ）〜（ｈ）からなる群より選択されるいずれかのポリペプチドまたは遺伝子を含むことを特徴とする、抗ウイルス剤：
（ａ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｅ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｆ）配列番号１または２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、
（ｇ）配列番号３または４で示される塩基配列からなる遺伝子、および
（ｈ）前記（ｄ）〜（ｇ）のいずれかの遺伝子と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、抗ウイルス活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
【００７４】
（２）前記抗ウイルス剤の処置対象となるウイルスが、フラビウイルス科のウイルスであることを特徴とする、（１）に記載の抗ウイルス剤。
【００７５】
（３）前記抗ウイルス剤の処置対象となるウイルスが、デングウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスの少なくとも一つであることを特徴とする、（１）または（２）に記載の抗ウイルス剤。
【００７６】
（４）前記（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｈ）の抗ウイルス活性が、フラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
【００７７】
その他、上記〔１〕〜〔３〕の各項目で記載した内容は、他の項目においても適宜援用できることを付言する。また、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【実施例】
【００７８】
〔１．被験物質を作用させるアッセイ系の確立〕
デング２型ウイルス（Ｔｒｉｎｉｄａｄ  １７５１株）とＶｅｒｏ細胞とを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染系で、被験物質に関して、抗ウイルス活性を測定した。デング２型ウイルス（Ｔｒｉｎｉｄａｄ  １７５１株）は、Hotta et al. Infect. Immun., 41: 462-469, 1983に記載のウイルス株を用い、Ｖｅｒｏ細胞は、Shibahara, Hotta et al. J. Gen. Virol., 75: 3511-3516, 1994等に記載の細胞を用いた。被験物質としては、エジプト産サソリの一種Ｓｃｏｒｐｉｏ  ｍａｕｒｕｓ  ｐａｌｍａｔｕｓの粗毒を用いた。粗毒は、Al-Azhar大学理学部Alaa Mostafa Hassan Ahmed氏から入手した。また、本実験において、抗ウイルス作用の作用機序を調べる目的で、被験物質を作用させる時期を下記の（１）〜（４）のとおり設定して実験を行った。【００７９】
（１）ウイルス感染の２〜２４時間前からウイルス接種直前まで、被験物質でＶｅｒｏ細胞を処理した。リン酸緩衝液で細胞を洗浄して被験物質を除いた後、被験物質を含まない状態で細胞にウイルスを接種した。１時間のウイルス吸着後に細胞をリン酸緩衝液で洗浄して余剰のウイルスを除き、被験物質を含まない培養液で細胞を２４〜４８時間培養した。一定時間（２４〜４８時間）後に、培養上清を採取して、ウイルス感染価を測定した。「被験物質の濃度］は、０．００１〜１０μｇ／ｍｌとし、「ウイルスの接種量」および「ウイルス感染価の測定法」は、既報の方法に準じて行った（El-Bitar et al., Virol. J., 12: 47, 2015）。「細胞培養液」は、１０％ウシ胎児血清添加ダルベッコ・フォークト変法イーグル最少必須培地を用いた。【００８０】
（２）ウイルスと被験物質とを１００μｌずつ等量混合して２時間反応させた後に、当該ウイルス・被験物質混合液２００μｌを細胞に接種し、１時間のウイルス吸着後に、リン酸緩衝液で細胞を洗浄してウイルスと被験物質を除き、被験物質を含まない培養液で細胞を２４〜４８時間培養した。一定時間（２４〜４８時間）後に、培養上清を採取して、ウイルス感染価を測定した。「被験物質の濃度」、「ウイルスの接種量」、「ウイルス感染価の測定法」および「細胞培養液」は、上記（１）と同様である。【００８１】
また、別途、一連の実験では、ウイルス・被験物質混合液を細胞に接種した２４時間後に、細胞を１００％メタノールで固定して、当該細胞を抗デングウイルスマウスモノクロナール抗体とＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧとを用いた間接蛍光抗体法により染色することによって感染細胞を計測し、ウイルス・被験物質混合液中の感染性ウイルス力価を測定した。【００８２】
（３）被験物質を含まない状態でウイルスを細胞に接種し、１時間のウイルス吸着後に、リン酸緩衝液で細胞を洗浄してウイルスを除き、被験物質を含む培養液で細胞を２４〜４８時間培養した。一定時間（２４〜４８時間）後に、培養上清を採取して、ウイルス感染価を測定した。「被験物質の濃度」、「ウイルスの接種量」、「ウイルス感染価の測定法」および「細胞培養液」は、上記（１）と同様である。【００８３】
（４）ウイルスと被験物質とを混合して２時間反応させた後に、当該ウイルス・被験物質混合液を細胞に接種し、１時間のウイルス吸着後に、被験物質を含む培養液で細胞を２４〜４８時間培養する実験系により、上記（２）と（３）の効果を同時に測定した。「被験物質の濃度」、「ウイルスの接種量」、「ウイルス感染価の測定法」および「細胞培養液」は、上記（１）と同様である。【００８４】
以上の方法で得られたウイルス力価を基にして、被験物質がウイルス感染を５０％抑制する濃度（ＩＣ５０；５０％−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を算出した。【００８５】
その結果、上記（１）〜（４）において、（２）の方法（被験物質をウイルスに直接作用させる方法）を用いた際に、最も強いウイルス阻害活性が観察された。【００８６】
上記の結果に基づいて、以下の実験は、（２）の方法を用いて行った。【００８７】
〔２．サソリ毒由来の被験物質の分画・精製および同定〕
エジプト産サソリの一種Ｓｃｏｒｐｉｏ  ｍａｕｒｕｓ  ｐａｌｍａｔｕｓの粗毒を０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解し、Ｃ１８分析用カラムおよび溶液Ａ（０．１２％ＴＦＡ含有水溶液）と溶液Ｂ（０．１０％ＴＦＡ含有６０％アセトニトリル溶液）との直線勾配溶液を用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｗａｔｅｒｓ  ６２５液体クロマトグラフィーおよびＷａｔｅｒｓ  ９９６フォトダイオードアレイ検出器を使用）で分画を行った。各分画は、２３０ｎｍの波長で吸光度を測定し、多数のピークの存在を確認した。【００８８】
逆相ＨＰＬＣ法により採取した７５種類の分画のうち、吸光度測定により明らかなピークを示す３０分画について、抗ウイルス活性を測定した。【００８９】
その結果、５８番目の分画が、ＩＣ５０＝１０ｎｇ／ｍｌと最も強い抗ウイルス活性を示した。また、タンパク質濃度測定器具（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）でタンパク質量が測定できた他の分画のＩＣ５０は、以下の通りであった。Ｎｏ．１，７，１８，２５−２９，３２，３３，３６,３８，４０，４２，４３，４５，４６，４８−５１（＞１００００ｎｇ／ｍｌ）、Ｎｏ．５６，５９（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｎｏ．５７（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｎｏ．６０−６２，６５（１０００ｎｇ／ｍｌ）、Ｎｏ．６７（６０００ｎｇ／ｍｌ）。その他の分画ではタンパク質含量が検出限界以下であり、抗ウイルス活性の測定は行わなかった。【００９０】
〔３．サソリ毒由来の被験物質のＬＣ−ＭＳ解析およびそれをコードするｃＤＮＡの解析〕
上記２．において採取した各分画を、ロータリーエバポレーター（Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ  ＳＣ２１０Ａ）により乾燥させた。それぞれの分画を１％酢酸含有５０％アセトニトリル溶液に溶解し、液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー（ＬＣ−ＭＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ｄｕｏ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で解析を行った。【００９１】
一方、Ｓｃｏｒｐｉｏ  ｍａｕｒｕｓ  ｐａｌｍａｔｕｓから抽出したＲＮＡを逆転写酵素によりｃＤＮＡを作製し、ｐＤＮＲ−ＬＩＢプラスミドベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）にライゲーション後、当該プラスミドベクターを用いて大腸菌ＤＨ５α株（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）をトランスフェクションして、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。それぞれの遺伝子組み換え大腸菌からプラスミドベクターを回収し、当該プラスミドベクターにライゲーションされているｃＤＮＡの塩基配列を決定した。各々の配列を、データバンク（ＧｅｎＢａｎｋ  ｄｂＥＳＴ）に登録された配列と比較し、単離したサソリ毒構成ペプチド遺伝子の同定を行った。【００９２】
上記２．において、抗ウイルス活性が最も高かった５８番目の分画のＬＣ−ＭＳ解析により、Ｓｍｐ７６（Abdel-Rahman MA, et al., Toxicon. 74:193-207, 2013で報告）と呼ばれるポリペプチドと同一であると考えられるポリペプチド（配列番号１）が同定された。また、Ｓｃｏｒｐｉｏ  ｍａｕｒｕｓ  ｐａｌｍａｔｕｓ由来のｃＤＮＡの解析より、Ｓｍｐ７６は、ダイオウサソリ（Ｐａｎｄｉｎｕｓ  ｉｍｐｅｒａｔｏｒ）から最初に単離されて、ｓｃｏｒｐｉｎｅ（配列番号２）と命名されたポリペプチドと高い相同性を有し、ｓｃｏｒｐｉｎｅ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓと呼ばれているポリペプチドであることが分かった。【００９３】
〔４．デングウイルスに対するＳｍｐ７６およびｓｃｏｒｐｉｎｅの機能解析〕
上記１．（２）と同様の方法により、デングウイルスに対するＳｍｐ７６およびｓｃｏｒｐｉｎｅの抗ウイルス活性の測定を行った。【００９４】
また、Ｓｍｐ７６およびｓｃｏｒｐｉｎｅの細胞障害活性および溶血活性の測定を以下の方法により行った。【００９５】
具体的には、細胞障害活性は、ＷＳＴ−１アッセイ（El-Bitar et al., Virol. J., 12: 47, 2015）により測定した。ＷＳＴ−１アッセイにおいては、培養細胞にＷＳＴ−１試薬を加えて４時間培養した。ＷＳＴ−１試薬は、生細胞に取り込まれてフォルマザンに変換される性質を有しているので、フォルマザンの量を分光光度計（４５０ｎｍおよび６３０ｎｍ）で測定することにより、細胞生存率を求めることができる。この結果を基にして、Ｓｍｐ７６およびｓｃｏｒｐｉｎｅが、培養細胞の５０％を障害する濃度（ＣＣ５０；５０％−ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を算出した。【００９６】
溶血活性の測定においては、ヘパリン添加注射器を用いて、ヒトから静脈血を採取し、低速遠心機により血漿と血球成分（主に赤血球）とを分離した。この血球成分をリン酸緩衝液で３回洗浄後、リン酸緩衝液に浮遊させた。種々の濃度のＳｍｐ７６およびｓｃｏｒｐｉｎｅを、この赤血球浮遊液と等量混合し、３０分間反応させた。赤血球浮遊液に０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えたものを１００％溶血の陽性対照とし、赤血球浮遊液にＳｍｐ７６およびｓｃｏｒｐｉｎｅの代わりにリン酸緩衝液加えたものを陰性対照とした。溶血の有無は、肉眼により判定した。【００９７】
Ｓｍｐ７６およびｓｃｏｒｐｉｎｅの抗デングウイルス活性（ＩＣ５０）、細胞障害活性（ＣＣ５０）および溶血活性（ＨＣ５０）についての結果を下記の表１に示す（Ｓｍｐ７６についての測定を実施例１とし、ｓｃｏｒｐｉｎｅについての測定を実施例２とする。）。【００９８】
Ｓｃｏｒｐｉｏ  ｍａｕｒｕｓ  ｐａｌｍａｔｕｓ由来のＳｍｐ７６は、強い抗デングウイルス活性（ＩＣ５０＝１０ｎｇ／ｍｌ）を示した。また、Ｐａｎｄｉｎｕｓ  ｉｍｐｅｒａｔｏｒ由来のｓｃｏｒｐｉｎｅも、Ｓｍｐ７６程ではないものの、強い抗デングウイルス活性（ＩＣ５０＝１５０ｎｇ／ｍｌ）を示した。【００９９】
一方、Ｓｍｐ７６およびｓｃｏｒｐｉｎｅは、いずれも、１０μｇ／ｍｌ（１００００ｎｇ／ｍｌ）という極めて高い濃度で用いた場合でも、細胞障害活性や溶血活性は認められなかった。【０１００】
【表１】
2017126340.tif 000002
〔５．種々のウイルスに対するＳｍｐ７６の機能解析〕
上記１．（２）と同様の方法により、以下のウイルスに対するＳｍｐ７６の抗ウイルス活性の測定を行った。
・デングウイルス（実施例１）、
・Ｃ型肝炎ウイルス（実施例３）、
・麻疹ウイルス（比較例１）、
・Ａ型インフルエンザウイルス（比較例２）。【０１０１】
なお、上記各ウイルスは、既報の文献（El-Bitar, Hotta et al., Virol. J., 12: 47, 2015）に記載のウイルス株を用いた。【０１０２】
結果を下記の表２に示す。Ｓｍｐ７６は、デングウイルス以外にも、Ｃ型肝炎ウイルスに対して、ＩＣ５０＝１０ｎｇ／ｍｌでの強い抗ウイルス活性を示すことが見出された。【０１０３】
【表２】
2017126340.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明のポリペプチドは、抗ウイルス活性、とりわけ、フラビウイルス科のウイルスに対する抗ウイルス活性を有するため、当該ポリペプチドまたは遺伝子を含む本発明の薬剤は、当該ウイルス感染症の治療薬として有用である。また、本発明は、被処理物からウイルスを除去することが求められるあらゆる技術分野において、とりわけ、医療分野において有用である。
【配列表】
2017126340000001.app
【国際調査報告】
2017126340.tif 000004
2017126340.tif 000005
2017126340.tif 000006