(57)【要約】  経時的に変化する細胞情報を有する細胞において、特定の細胞情報を有する細胞を細胞群より回収することを可能とする方法を提供する。  経時的に変化する細胞情報を有する複数の細胞からなる細胞群から、特定の細胞を回収する方法であって、（ａ）細胞群を構成する各細胞において所望の指標を時間軸に沿って検出または測定する工程と、（ｂ）指標に所定の変化が生じた細胞を回収する工程であって、指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点における細胞を回収する工程とを含む、細胞の回収方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
経時的に変化する細胞情報を有する複数の細胞からなる細胞群から、特定の細胞を回収する方法であって、
（ａ）前記細胞群を構成する各細胞において所望の指標を時間軸に沿って検出または測定する工程と
（ｂ）前記指標に所定の変化が生じた細胞を回収する工程であって、前記指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点における細胞を回収する工程と
を含む、細胞の回収方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）の後であって前記工程（ｂ）の前に、
（ｉ）前記工程（ａ）により得られた検出値または測定値と予め設定した閾値とを比較して、閾値を超えた値を有する細胞を、前記指標に所定の変化が生じた細胞として、前記細胞群より回収すべき細胞と判断する工程
をさらに含む、細胞の回収方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記工程（ａ）の後であって前記工程（ｂ）の前に、
（ｉｉ）前記工程（ａ）により得られた検出値または測定値およびそれらの時間軸情報と、予め設定した閾値とを比較することにより閾値を超えた時点を特定する工程であって、前記特定された時点を前記指標に所定の変化が生じた時点と判断する工程
をさらに含む、細胞の回収方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、前記工程（ｂ）の後に、
（ｃ）回収した細胞について、経時的に取得した前記指標の情報を基に前記指標に所定の変化が生じた時点を修正し、修正した指標に所定の変化が生じた時点から細胞を回収した時点までの経過時間を算出する工程
をさらに含む、細胞の回収方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）における細胞の回収が、1細胞単位での回収である、細胞の回収方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法であって、
前記各工程が、各ウェルに１細胞ずつ含むウェルを複数備えたアレイチップ上で行われる、細胞の回収方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ａ）および（ｂ）を複数回繰り返し、これにより特定の細胞を複数個回収する、細胞の回収方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、
前記予め設定した時間として互いに異なる時間を２以上設定し、これにより異なる状態にある特定の細胞を２以上のグループとして回収する、細胞の回収方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）が、前記指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点において細胞を固定し、固定された細胞を回収する工程である、細胞の回収方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）が、回収した細胞を固定液または培養液に移す工程である、細胞の回収方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法であって、
前記指標が細胞外に分泌されるタンパク質であり、かつ、前記指標の検出または測定が、ウェル底面近傍のみにエバネッセント光を生じさせて、当該エバネッセント光を励起波長として用いるサンドイッチイムノアッセイにより行われる、細胞の回収方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により回収した細胞を細胞情報解析のために調製する方法であって、
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法における前記工程（ｂ）が、培養液中の細胞を精製水または無機塩水中に移す工程であって、精製水または無機塩水全体に対する前記培養液の割合が２０％以下（ｖ／ｖ）となるように、前記培養液とともに細胞を回収する工程であり、
前記精製水または無機塩水中において、回収した細胞を固定する工程をさらに含む
細胞の調製方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により回収した細胞、または、請求項１２に記載の方法により調製した細胞の細胞情報を解析する工程を含む、細胞解析方法。
【請求項１４】
経時的に変化する細胞情報を有する複数の細胞からなる細胞群から、特定の細胞を回収するシステムであって、
検出部により前記細胞群を構成する各細胞における所望の指標が時間軸に沿って検出または測定され、
解析部により前記指標に所定の変化が生じた細胞、指標に所定の変化が生じた時点、および、指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点が特定され、
回収部により前記指標に所定の変化が生じた細胞であって、前記指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点における細胞が回収されるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経時変化の情報を基に細胞を回収する方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞情報は、遺伝子のDNA配列情報（ゲノム）、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報（エピゲノム）、遺伝子１次転写物（ｍRNAなど）情報（トランスクリプトーム）、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報（プロテオーム）、代謝産物情報（メタボローム）などがある。ゲノムやエピゲノムは時間の経過に対して比較的安定な情報であるが、トランスクリプトームやプロテオームといった情報は時には分の単位で変動することが知られている（非特許文献１）。一方で、細胞の状態変化は全ての細胞に一律に外部刺激を与えたとしても細胞間において必ずしも同じタイミングで推移せず、個々の細胞毎に変化の開始時点がばらつくことが知られている（非特許文献２）。【０００３】
これまで、細胞情報の解析に用いられる試料は、例えば、外部刺激を与えた後、一定時間が経過した測定の終点において一括に回収された細胞群を含むものが一般的であった。このようなバルク解析の試料中に含まれる細胞の情報、特に分の単位で変動する細胞情報には、各細胞にばらつきが生じている可能性があった。とりわけトランスクリプトームやプロテオームのような分単位で変化が生じる解析においては、個々の細胞の状態変化のタイミングがばらついているため、細胞個々の状態変化の情報を細胞数だけ積算してしまうと分単位などの時系列で変化する細胞情報がほとんど埋もれてしまう。
よって、分単位などで変化する細胞情報を調べる、または、利用するためには、個々の細胞指標の変化に応じて1細胞単位で回収するのみではなく、指標の変化に対する時間情報を得ることが望まれる。【０００４】
細胞の特定の指標の変化に基づいて多数の細胞から特定の細胞を回収する方法の一つとして、例えば、フローサイトメトリー／セルソーターが知られている。フローサイトメトリーで、個々の細胞に対して光学的に特定の指標の分析を行い、セルソーターで当該指標の結果により細胞を分取する手法である。しかしながら、当該手法は、指標の変化に対する経時情報を与えるものではない。
また、細胞の特定の指標の変化に基づいて多数の細胞から特定の細胞を回収する方法として、蛍光強度や画像情報によって多数の細胞群より目的細胞を特定し、マイクロキャピラリ―を用いて前記目的細胞を1細胞単位で回収する1細胞ピッキング技術が知られている。しかしながら、当該方法も、指標の変化に対する経時情報を得ることはできない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Coulon A. et al., “Eukaryotic transcriptional dynamics: from single molecules to cell populations.” Nature Reviews Genetics (2013) 14, 572-584
【非特許文献２】Liu T. et al., “Single-cell imaging of caspase-1 dynamics reveals an all-or-none inflammasome signaling response.” Cell Rep. (2014) 8(4):974-982
【非特許文献３】Shirasaki Y. et al., “Real-time single-cell imaging of protein secretion” Scientific reports (2014) 4:4736;DOI: 10.1038/srep04736
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記課題を鑑み、本発明は、従来の細胞回収方法では埋もれてしまっていた分単位などの時系列で変化する細胞情報を取得する細胞の回収方法であって、特定の細胞情報を有する細胞を細胞群より回収することを可能とする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
時々刻々と変化する細胞内の状態を、このような細胞毎の反応開始時点のばらつきに影響されずに正確に知るためには、“個々の細胞毎”に細胞状態の指標の変化の時点を分単位などの高い時間分解能で実時間検出し、分単位などの時間分解能で予め設定した時間経過Δｔで実時間回収し、細胞情報の時間推移を瞬間的に停止させた上で、細胞内情報を１細胞レベルで定量的解析する必要がある。
なお、分単位などで変化する細胞情報を観察する手法としては、個々の細胞ごとに特定の指標を測定するライブセルイメージング技術が報告されている。例えば、非特許文献３には、外的刺激後に単球がサイトカインを分泌開始する様子を1細胞ごとに分単位でモニタリングする1細胞分泌イメージング技術を開示している。
本発明者らは、ライブセルイメージング技術を応用し、分単位などの時間分解能で特定の指標が変化した時点より予め設定した時間が経過した時点（Δｔ）における特定の状態にある細胞を回収（実時間回収）する手法を着想するに至った。
本発明者らは、上記の着想に基づき、実際に、マウス２型自然リンパ球（マウスナチュラルヘルパー細胞：マウスNH細胞）に対してインターロイキン-33（以下全大文字“IL”はインターロイキンタンパク質を示す）またはIL-2/IL-25で刺激し、当該刺激に対するIL-13の分泌応答を計測した。そして、分泌応答開始時点から予め設定した時間（Δｔ）経過時点においてマウス２型自然リンパ球を１細胞ずつ回収した結果、Il13 mRNAは、IL-33またはIL-2/IL-25の刺激の違いにより、それぞれ動的遺伝子発現または静的遺伝子発現の発現様式をとるという知見を新たに発見した。このことは、本発明の方法が、従来の測定終点における一括回収では埋もれてしまっていた細胞情報を見出すことが可能であることを示す。【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
本発明は、一実施の態様において、
〔１〕経時的に変化する細胞情報を有する複数の細胞からなる細胞群から、特定の細胞を回収する方法であって、
（ａ）前記細胞群を構成する各細胞において所望の指標を時間軸に沿って検出または測定する工程と
（ｂ）前記指標に所定の変化が生じた細胞を回収する工程であって、前記指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点における細胞を回収する工程と
を含む、細胞の回収方法に関する。
また、本発明の方法は、一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載の方法であって、前記工程（ａ）の後であって前記工程（ｂ）の前に、
（ｉ）前記工程（ａ）により得られた検出値または測定値と予め設定した閾値とを比較して、閾値を超えた値を有する細胞を、前記指標に所定の変化が生じた細胞として、前記細胞群より回収すべき細胞と判断する工程
をさらに含むことを特徴とする。
また、本発明の方法は、一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載の方法であって、前記工程（ａ）の後であって前記工程（ｂ）の前に、
（ｉｉ）前記工程（ａ）により得られた検出値または測定値およびそれらの時間軸情報と、予め設定した閾値とを比較することにより閾値を超えた時点を特定する工程であって、前記特定された時点を前記指標に所定の変化が生じた時点と判断する工程
をさらに含むことを特徴とする。
また、本発明の方法は、一実施の形態において、
〔４〕上記〔３〕に記載の方法であって、前記工程（ｂ）の後に、
（ｃ）回収した細胞について、経時的に取得した前記指標の情報を基に前記指標に所定の変化が生じた時点を修正し、修正した指標に所定の変化が生じた時点から細胞を回収した時点までの経過時間を算出する工程
をさらに含むことを特徴とする。【０００９】
また、本発明の方法は、一実施の形態において、
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程（ｂ）における細胞の回収が、１細胞単位での回収であることを特徴とする。
また、本発明の方法は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の方法であって、
前記各工程が、各ウェルに１細胞ずつ含むウェルを複数備えたアレイチップ上で行われることを特徴とする。
また、本発明の方法は、一実施の形態において、
〔７〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程（ａ）および（ｂ）を複数回繰り返し、これにより特定の細胞を複数個回収することを特徴とする。【００１０】
また、本発明の方法は、一実施の形態において、
〔８〕上記〔７〕に記載の方法であって、
前記予め設定した時間として互いに異なる時間を２以上設定し、これにより異なる状態にある特定の細胞を２以上のグループとして回収することを特徴とする。
また、本発明の方法は、一実施の形態において、
〔９〕上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程（ｂ）が、前記指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点において細胞を固定し、固定された細胞を回収する工程であることを特徴とする。
また、本発明の方法は、一実施の形態において、
〔１０〕上記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法であって、
前記工程（ｂ）により回収した細胞を、固定液または培養液に移す工程をさらに含むことを特徴とする。
また、本発明の方法は、一実施の形態において、
〔１１〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法であって、
前記指標が細胞外に分泌されるタンパク質であり、かつ、前記指標の検出または測定が、ウェル底面近傍のみにエバネッセント光を生じさせて、当該エバネッセント光を励起波長として用いるサンドイッチイムノアッセイにより行われることを特徴とする。
また、本発明の方法は、別の態様において、
〔１２〕上記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法により回収した細胞を細胞情報解析のために調製する方法であって、
〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法における前記工程（ｂ）が、培養液中の細胞を精製水または無機塩水中に移す工程であって、精製水または無機塩水全体に対する前記培養液の割合が２０％以下（ｖ／ｖ）となるように、前記培養液とともに細胞を回収する工程であり、
前記精製水または無機塩水中において、回収した細胞を固定する工程をさらに含む
細胞の調製方法に関する。【００１１】
また、本発明の方法は、別の態様において、
〔１３〕上記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法により回収した細胞の細胞情報を解析する工程を含む、細胞解析方法に関する。【００１２】
また、本発明の方法は、別の態様において、
〔１４〕経時的に変化する細胞情報を有する複数の細胞からなる細胞群から、特定の細胞を回収するシステムであって、
検出部により前記細胞群を構成する各細胞における所望の指標が時間軸に沿って検出または測定され、
解析部により前記指標に所定の変化が生じた細胞、指標に所定の変化が生じた時点、および、指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点が特定され、
回収部により前記指標に所定の変化が生じた細胞であって、前記指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点における細胞が回収されるシステムに関する。【００１３】
なお、本発明の細胞の回収方法は、細胞の調製方法と読み替えることもできる。
すなわち、本発明は、
〔１’〕経時的に変化する細胞情報を有する複数の細胞からなる細胞群から、特定の細胞を調製する方法であって、
（ａ）前記細胞群を構成する各細胞において所望の指標を時間軸に沿って検出または測定する工程と
（ｂ）前記指標に所定の変化が生じた細胞を回収する工程であって、前記指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点における細胞を回収する工程と
を含む細胞の調整方法を提供する。
また、上記〔１’〕細胞の調製方法において、上記〔２〕〜〔１１〕に記載の細胞の回収方法における特徴の一つまたは複数の組み合わせを含む調製方法も提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法により回収された細胞は、ゲノム解析、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析やリン酸化解析など様々な網羅的解析に対して、細胞の経時情報を付加することが可能となる。このように、本発明の方法は、従来の方法では埋もれていた経時変化する細胞情報を得ることができる。
また例えば、従来、詳細な時間の前後関係がない遺伝子発現網羅的解析（相関解析）であったものが、個々の遺伝子発現の時間的前後関係を明らかにする因果解析へと発展させることが可能となる。すなわち、本発明の方法を用いることで、細胞内情報伝達機序のさらなる解明や、新薬ターゲットの発見が期待される。
また、本発明の方法は、特定の状態にある細胞を細胞群より回収した後、異なる培養環境に移送することも可能である。これにより、例えば、iPS細胞の効率的な分化誘導法など、利用価値の高い細胞を効率的に作成・回収することを可能する。一般的にiPS細胞をはじめとする幹細胞は全ての細胞が目的の細胞に分化されることはない。分化されない幹細胞はガン化などを引き起こす可能性があり、確実に分化する利用価値の高い細胞のみを回収することが今後の再生医療において求められている。また、例えば、Kato R. et al.は、多能性幹細胞のコロニーの形態的特徴のパラメーター解析により多能性幹細胞の品質を管理する手法を提案している（Kato R. et al., “Parametric analysis of colony morphology of non-labelled live human pluripotent stem cells for cell quality control.” Scientific reports (2016) 6:34009;DOI:10.1038/srep34009）。本発明の手法を用いることで分化誘導に最適な細胞や多能性を維持する細胞の時系列状態変化を捉え、それを指標に回収することで幹細胞の品質管理に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、IL-33（図１上段）または、IL-2/IL-25（図１下段）刺激後のマウス２型自然リンパ球から分泌されたIL-13分泌量を、蛍光標識抗体を用いて経時的に測定した結果を示すグラフである。細胞が存在しないウェル中の平均蛍光強度に標準偏差の3倍量を加算した値を閾値として、当該閾値を超えた時間を分泌開始時点（経過時間０）とした。
【図２】図２は、本願明細書中の実施例２で行った試験における、細胞の撮像から回収・凍結までのフローチャートを示す。
【図３】図３は、IL-33刺激後にIL-13を分泌したマウス２型自然リンパ球であって、分泌開始時点から３０分後に回収したマウス２型自然リンパ球（５例のうちの一つ）のIL-13分泌量を、蛍光標識抗体を用いて経時的に測定した結果を示すグラフである。回収した細胞の閾値を超える直前の時点を分泌開始時点（t=0）として時間経過を横軸に示し、IL-13分泌による蛍光強度の増加を縦軸に示す。破線は検出に用いた閾値を示し、矢印は回収した時点を示す。閾値は、細胞が存在しないウェル中の平均蛍光強度に標準偏差を加算した値である。
【図４】図４は、IL-33刺激後にIL-13を分泌したマウス２型自然リンパ球であって、測定終点における1細胞が存在するウェル中のIL-13分泌量を○で示したグラフである。図４のグラフにおける縦軸はIL-13分泌量に相当する蛍光強度を示す。破線は閾値を示す。閾値は、細胞が存在しないウェル中の平均蛍光強度に標準偏差の3倍量を加算した。当該閾値を越えた細胞を分泌陽性マウス２型自然リンパ球とし、一部を一括に回収した（６例）。回収した分泌陽性マウス２型自然リンパ球は●で示した。
【図５】図５は、IL-33刺激前に一括回収したマウス２型自然リンパ球、または、IL-33刺激後に、IL-13の分泌を指標として実時間回収（分泌開始時点より３０分後に回収）したマウス２型自然リンパ球、または、測定終点において一括回収した分泌陽性におけるIl13 mRNA量をターゲット特異的マルチプレックス逆転写定量PCR法により測定した結果を示すグラフである。ΔCt値は、Gapdh mRNAのCt値からIl13 mRNAのCt値を減算して算出した。また、＊はP<0.05（Ｕ検定）を示す。
【図６】図６は、IL-2/IL-25刺激後にIL-13を分泌したマウス２型自然リンパ球であって、測定終点における1細胞が存在するウェル中のIL-13分泌量を○で示したグラフである。図６のグラフにおける縦軸はIL-13分泌量に相当する蛍光強度を示す。破線は閾値を示す。閾値は、細胞が存在しないウェル中の平均蛍光強度に標準偏差の3倍量を加算した。当該閾値を越えた細胞を分泌陽性マウス２型自然リンパ球とし、一部を一括に回収した（１５例）。回収した分泌陽性マウス２型自然リンパ球は●で示した。
【図７】図７は、IL-2/IL-25刺激前に一括回収したマウス２型自然リンパ球、または、IL-2/IL-25刺激後に、IL-13の分泌を指標として実時間回収（分泌開始時点より３０分後に回収）したマウス２型自然リンパ球、または、測定終点において一括回収した分泌陽性マウス２型自然リンパ球におけるIl13 mRNA量をターゲット特異的マルチプレックス逆転写定量PCR法により測定した結果を示すグラフである。ΔCt値は、Gapdh mRNAのCt値からIl13 mRNAのCt値を減算して算出した。
【図８】IL-33刺激によるマウス２型自然リンパ球のIl13 mRNA発現量およびIL-13分泌量の経時的変化（動的遺伝子発現）、および、IL-2/IL-25刺激によるマウス２型自然リンパ球のIl13 mRNA発現量およびIL-13分泌量の経時的変化（静的遺伝子発現）を模式的に示すグラフである。
【図９】IL-2/IL-33刺激により活性化したマウス２型自然リンパ球を、培養液またはPBSに懸濁後回収し、培地から回収した細胞（Ｍシリーズ）とPBSから回収した細胞（Ｐシリーズ）とについて、Gapdh、Rplp0、Il13、および、Il5のmRNA発現量を示す棒グラフである。
【図１０】IL-33/IL-2/TSLP刺激により活性化したヒト末梢血２型自然リンパ球（type 2 innate immune cell: ILC2）を、実時間回収（分泌開始時点より２時間後に回収）または測定終点における一括回収（刺激より８０時間後に回収）した各サンプルの明視野およびIL-13分泌シグナル蛍光像を示す。
【図１１】IL-33/IL-2/TSLP刺激により活性化したヒト末梢血２型自然リンパ球（type 2 innate immune cell: ILC2）であって、実時間回収した細胞について経時的にIL-13分泌シグナルの蛍光強度を測定した結果を示すグラフである。
【図１２】IL-33/IL-2/TSLP刺激により活性化したヒト末梢血２型自然リンパ球（type 2 innate immune cell: ILC2）であって、測定終点における一括回収した細胞について経時的にIL-13分泌シグナルの蛍光強度を測定した結果を示すグラフである。
【図１３】IL-33/IL-2/TSLP刺激により活性化したヒト末梢血２型自然リンパ球（type 2 innate immune cell: ILC2）を、実時間回収（分泌開始時点より２時間後に回収）または測定終点における一括回収（刺激より８０時間後に回収）した各サンプルにおけるIL-13およびIL-5のmRNA量を次世代シーケンサーにより解析した結果（FPKM値）を示す。
【図１４】IL-33/IL-2/TSLP刺激により活性化したヒト末梢血２型自然リンパ球（type 2 innate immune cell: ILC2）を、実時間回収（分泌開始時点より２時間後に回収）または測定終点における一括回収（刺激より８０時間後に回収）した各サンプルの全遺伝子に対するFPKM値をクラスター解析した結果を示す。
【図１５】IL-33/IL-2/TSLP刺激により活性化したヒト末梢血２型自然リンパ球（type 2 innate immune cell: ILC2）を、実時間回収（分泌開始時点より２時間後に回収）または測定終点における一括回収（刺激より８０時間後に回収）した各サンプルの全遺伝子に対するFPKM値を２値化法により分類したベン図を示す。
【図１６】ヒト人工多能性幹細胞IM-E1-5株をE8 Medium中で培養した際の位相差像（上段）、当該位相差像について閾値を設定し二値化して細胞領域を同定した画像（中断）、および、当該位相差像についてEdges Detectionを行って特徴量画像としたもの（下段）を示す。
【図１７】ヒト人工多能性幹細胞IM-E1-5株について、E8 Mediumを用いた培養中に取得した特徴量画像のシグナル変化を測定してプロットしたグラフを示す。上段のグラフは、特徴量画像の各細胞領域内における平均シグナル強度の変動を示し、下段のグラフはシグナル分散の変動を示す。
【図１８】ポリ（dA・dT）DNAで刺激したマウス骨髄由来マクロファージ細胞株iBMMについて、明視野における細胞の形態変化およびSYTOX orangeの蛍光を、経時的に観察した結果を示す。
【図１９】ポリ（dA・dT）DNAで刺激したマウス骨髄由来マクロファージ細胞株iBMMにおけるSYTOX Orange蛍光強度の時間変化をプロットしたグラフを示す。図中、○は、閾値を超えた時点を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、経時的に変化する細胞情報を有する複数の細胞からなる細胞群から、特定の細胞を回収する方法に関する。なお、当該方法は、一つの態様において、
（ａ）前記細胞群を構成する各細胞において所望の指標を時間軸に沿って検出または測定する工程と
（ｂ）前記指標に所定の変化が生じた細胞を回収する工程であって、前記指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点における細胞を回収する工程とを含む。
【００１７】
ここで、本明細書において、「細胞情報」とは、細胞の機能や性質、状態を示す情報であり、以下に限定されないが、例えば、遺伝子のDNA配列情報（ゲノム）、遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな情報（DNAメチル化、ヒストンメチル化、アセチル化、リン酸化）、遺伝子１次転写物（ｍRNA、非翻訳RNA、マイクロRNAなど）情報（トランスクリプトーム）、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報（プロテオーム）、代謝産物情報（メタボローム）、細胞内水素イオン濃度指数（pH）、細胞内ATP濃度、イオン濃度（カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムなど）、細胞内温度などを挙げることができる。
【００１８】
ここで、経時的に変化する細胞情報とは、時間の経過に沿って変化する細胞情報をいう。なお、本発明の好ましい実施の形態においては、例えば、秒、分単位で変化する細胞情報を意味する。秒、分単位で変化する細胞情報としては、例えば、遺伝子１次転写物（mRNAなど）情報（トランスクリプトーム）、タンパク質の翻訳量やリン酸化、酸化、糖化等の修飾情報（プロテオーム）、代謝産物情報（メタボローム）などを挙げることができる。
本発明の方法は、このような時間の単位で変化する細胞情報も互いに区別して細胞を回収するものであり、また、経時変化する細胞情報に対する時間分解能を損なわずに細胞を回収するものである。
【００１９】
また、本明細書において「特定の細胞」とは、対象の細胞における所望の指標の変化を測定した際に、当該指標に変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点（△ｔ）の状態にある、特定の細胞情報を有する細胞をいう。本発明の方法は、このような特定の細胞情報を有する細胞を回収するものである。
なお、本発明の方法の対象となる細胞としては、経時的に変化する細胞情報を有する生細胞であって、所望の指標を設定することにより、当該指標の変化を検出・測定できる細胞であれば特に制限されない。このような細胞としては、以下に限定されず、例えば、免疫細胞、神経細胞、iPS細胞やES細胞を含む幹細胞、ガン細胞、内分泌細胞、外分泌細胞などを挙げることができる。また、細胞の由来もヒトを含む動物に限定されず、植物由来の細胞や真菌、大腸菌などの細菌など、経時的に変化する細胞情報を有する生細胞であって、所望の指標を設定することにより、当該指標の変化を検出・測定できる細胞であればよい。
また、本明細書において「細胞」とは、一つの単位として指標の検出もしくは測定、または、回収ができる限りにおいて、1細胞であっても、2細胞以上が接着した細胞群や細胞塊、コロニーなどであってもよい。よって、2細胞以上が接着した細胞群や細胞塊、コロニーなどを一つの単位として扱う場合には、本明細書における「1細胞単位」は、細胞群、細胞塊、コロニーなどを意味する。なお、好ましい実施の形態においては、「細胞」は1細胞を意味する。すなわち、前記好ましい実施の形態においては、1細胞ごとに所望の指標が検出または測定され、1細胞ごとに細胞群より特定の細胞が回収される。しかしながら、上述のように、2細胞以上が接着した細胞群や細胞塊、コロニーを一つの単位として、指標の検出もしくは測定または回収が行われても良い。
【００２０】
ここで、本発明において用いられる「指標」としては、取得したい細胞の細胞情報を損なわずに、細胞の状態変化を可視化できるものであれば制限されず、例えば、細胞の形態（細胞の大きさや構造）、細胞活性、タンパク質の発現、mRNAの転写などの細胞情報を用いることができる。そして、以下に限定されないが、細胞の形態、細胞活性、タンパク質の発現、mRNAの転写などにおける定性的または定量的な変化を「指標の所定の変化」とすることができる。これらの指標を検出または測定する方法は、例えば、前方散乱光（FSC：Forward Scattered Light）や側方散乱光（SSC：Side Scattered Light）の利用、結合特異性を有する蛍光色素の利用、人工的に蛍光標識したタンパク質や核酸の利用、抗体による検出、細胞活性指示薬など、採用する指標ごとに公知の方法を適宜採用することができる。なお、「指標」として好ましくは、細胞外に分泌される物質（例えば、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロン、TNFなどのタンパク質、アドレナリンなどの神経伝達物質、ホルモンなど）である。
なお、細胞外に分泌される物質（タンパク質など）を指標とする場合、例えば、細胞外に分泌されたタンパク質に対する抗体を用いたサンドイッチイムノアッセイなどにより当該タンパク質を検出または測定することができる。このように、細胞外に分泌される物質を指標とする場合、回収する細胞に対して非侵襲な手法で指標の変化を測定できる点において好ましい。
【００２１】
また、本発明の方法において、「指標」および「指標の所定の変化」は、回収したい細胞または調べたい細胞の機能や性質ごとに適宜設定することができる。例えば、サイトカインを分泌する細胞においては、サイトカインを「指標」とし、細胞外にサイトカインが分泌されたことを「指標の所定の変化」とすることができる。この場合、「指標に変化が生じた時点」とは、当該サイトカインが分泌された時点を意味する。なお、細胞に対して、指標に変化を惹起させるような外的刺激を細胞に加えてもよい。
また、「指標」は2つ以上を組み合わせて用いることもでき、採用する「指標」とその数に合わせて「指標の所定の変化」も適宜設定することができる。「指標に所定の変化が生じた時点」は、採用する「指標」とそれぞれに設定した「指標の所定の変化」とを考慮して適宜設定することができる。なお、以下に限定されないが、一実施の形態として、例えば、AとBとを「指標」として採用する際には、AとBとの両方においてそれぞれ設定した所定の変化が観察された時点を「指標に所定の変化が生じた時点」とすることができる。
【００２２】
本発明の方法は、上述する「指標」に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点の状態にある細胞を回収するものである。
ここで、「予め設定した時間」とは、指標に変化が生じた時点を、計測を開始する時点（ｔ＝０）として予め設定した時間（△ｔ）であり、指標に変化が生じた時点から当該予め設定した時間が経過した時点において、回収対象の細胞が回収される。この「予め設定した時間」は、最終的に回収したい細胞が有する特定の細胞情報ごとに適宜設定することができる。なお、「予め設定した時間」として設定可能な時間分解能は、「指標」の検出または測定における時間分解能と同等かそれより大きくなる。一実施の形態において、「所望の時間」として設定する好ましい時間分解能としては、「指標」の時間軸に沿った検出または測定における時間分解能と同等の時間分解能である。なお、「予め設定した時間」は、例えば、指標の変化した時点より３０秒後、６０秒後、９０秒後、５分後、１０分後、３０分後、６０分後のように適宜設定することができる。
【００２３】
本発明の方法は、上述のように、（ａ）「細胞群を構成する各細胞において所望の指標を時間軸に沿って検出または測定する工程」を含む。
ここで、本発明の方法の対象となる細胞群は、培養液を含むウェル内で所望の指標が測定される。本発明の方法に使用するウェルは、個々の細胞の「指標」の変化を検出または測定でき、回収すべき細胞ごとに回収可能なウェルであれば特に制限されず、対象の細胞ごとに適宜好ましいウェルを用いることができる。なお、細胞を配置するウェルは、１つのウェル内に複数の細胞（細胞群）を含むものであってもよいし、細胞群を構成する各細胞が１細胞単位でそれぞれ区切られたウェル内に配置できるものであってもよい。
【００２４】
なお、好ましい一実施の形態においては、本発明の方法は、各ウェルに１細胞ずつ含むウェルを複数備えたアレイチップ上で行われる。このようなアレイチップとしては、測定したい細胞を各ウェルに１細胞ずつ収容できるアレイチップであれば制限されず、市販のものを用いることができる。アレイチップ上の各ウェル内に１細胞ずつ細胞を収容する方法は公知であり（条件により、例えば、２個〜１０個程度とすることも可能）、適当数の細胞を含む培養液を調製後、アレイチップ上に当該培養液を注入し、遠心沈降等を行うことで実施することができる。
【００２５】
使用する培養液も、用いる細胞や測定する指標に応じて、適宜好ましい培養液を用いることができる。また、細胞群を含むウェルはインキュベータ内に設置し、温度やＣＯ２の培養条件を整えることが好ましい。
【００２６】
なお、指標は、上述のように適宜設定することができるため、測定手法は当該指標を測定可能な公知の手法（光学的手法や電気的手法）および当該手法に用いられる装置を採用することができる。光学的手法により指標を測定する際には、生細胞を経時的に測定できる光学検出システムであればよく、公知の光学顕微鏡などを用いることができる。
また、工程（ａ）において、所望の指標は、指標に変化が生じる時点を特定するために、時間軸に沿って検出または測定する。よって、指標の検出または測定は時間軸に沿って継続して行われることが好ましいが、指標に変化が生じた時点を特定できる限りにおいて、一定の間隔ごと（例えば、５分毎など）に繰り返し行うこともできる。
【００２７】
本発明の一実施の形態においては、上記の工程（ａ）の後であって、下記に記載する工程（ｂ）の前に、以下の工程「（ｉ）前記工程（ａ）により得られた検出値または測定値と予め設定した閾値とを比較して、閾値を超えた値を有する細胞を、前記指標に所定の変化が生じた細胞として、前記細胞群より回収すべき細胞と判断する工程」をさらに含む。
このように、本発明の方法における一実施の形態としては、指標に所定の変化が生じた細胞を特定するために、閾値を予め設定して用いても良い。すなわち、工程（ａ）により得られた検出値または測定と予め設定した閾値とを比較することにより、指標に所定の変化が生じたことを判断する。閾値は、対象とする細胞や採用する指標に応じて適宜設定すればよい。また工程（ｉ）は、閾値を超えた細胞を細胞群より回収すべき細胞として、空間的に認識するものである。
このような、検出値または測定値と閾値とを比較する手段、および／または、閾値を超えた細胞を空間的に認識し、空間・位置情報を保持する手段としては、当業者が適宜設計したプログラムや公知のプログラムを用いることができる。
【００２８】
また、本発明の一実施の形態においては、上記の工程（ａ）の後であって、下記に記載する工程（ｂ）の前に、以下の工程「（ｉｉ）前記工程（ａ）により得られた検出値または測定値およびそれらの時間軸情報と、予め設定した閾値とを比較することにより閾値を超えた時点を特定する工程であって、前記特定された時点を前記指標に所定の変化が生じた時点と判断する工程」をさらに含む。
このように、本発明の方法における一実施の形態としては、指標に所定の変化が生じた時点を特定するために、検出値または測定値およびそれらの時間軸情報と予め設定した閾値とを用いることができる。なお、時間軸に沿った検出または測定の時間分解能に依存して、指標が閾値を超えた時点を正確に捉えることができない場合があるが、この場合にも、指標に所定の変化が生じた時点を適宜決定することができる。例えば、閾値を超えた直前の検出または測定時点を指標に所定の変化が生じた時点とすることもできるし、また、連続した検出値または測定値から近似曲線等を算出して求めるなどしても良い。
このような、検出値または測定値およびそれらの時間軸情報と、予め設定した閾値とを比較する手段、および／または、閾値を超えた時点を特定し、指標に所定の変化が生じた時点と判断する手段としては、当業者が適宜設計したプログラムや公知のプログラムを用いることができる。
【００２９】
また、本発明の方法は、（ｂ）「前記指標に所定の変化が生じた細胞を回収する工程であって、前記指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点における細胞を回収する工程」を含む。
工程（ａ）により各細胞における所望の指標が検出または測定された後、当該指標に変化が生じたと判断された細胞は、当該指標に変化が生じた時点より予め設定した時間の経過後に回収される。なお、指標に変化が生じた時点より予め設定した時間が経過した時点を判断する手段は、当業者が適宜設計したプログラムや公知のプログラムを用いることができる。
また、細胞の回収は、回収すべき細胞をその細胞ごとに回収可能な手法であれば制限されず、ガラスキャピラリー、ガラスキャピラリーを装着したマイクロインジェクターと電動マニュピレーターとを備えたシステム（例えば、自動マニュピレーターや特開2010-29178号公報等に開示される１細胞ピッキングシステム）などを用いて行うことができる。なお、プログラムからの指示により細胞を自動的に回収可能な自動装置を用いることで、より詳細な時間分解能で正確に細胞を回収することができる点において好ましい。
【００３０】
なお、一実施の形態において、工程（ｂ）は1細胞単位で細胞を回収する。すなわち、本発明の方法は一実施の形態において、1細胞単位で特定の細胞情報を有する細胞を母集団の細胞群より回収することを可能とするものである。このような実施の形態によれば、母集団となる細胞が僅かしか得られない場合であっても特定の細胞情報を有する細胞を1細胞単位（好ましくは、一つの細胞ごとに）回収することができる。
その際には、工程（ａ）および（ｂ）を複数回繰り返すことで、特定の状態にある細胞を複数個回収できる。このような実施形態は、１細胞解析では感度が足りない解析、例えば、プロテオーム解析などにおいて、特定の細胞情報を有する複数の細胞から構成される試料を提供できるため、従来の回収法では得られなかった細胞情報を解析可能とすることができ好ましい。
ここで、本発明の方法が、工程（ａ）および（ｂ）に加えて、工程（ｉ）および／または（ｉｉ）を含む実施形態の場合には、工程（ｉ）及び／または（ｉｉ）もそれぞれ複数回繰り返す。すなわち、「工程（ａ）および（ｂ）を複数回繰り返す」とは、工程（ａ）、（ｉ）、（ｂ）の組み合わせ、工程（ａ）、（ｉｉ）、（ｂ）の組み合わせ、または、工程（ａ）、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｂ）の組み合わせをそれぞれ繰り返す実施形態を含む。
【００３１】
また、本発明の方法の一実施の形態においては、工程（ｂ）の後に、工程（ｃ）「回収した細胞について、経時的に取得した指標の情報を基に指標に所定の変化が生じた時点を修正し、修正した指標に所定の変化が生じた時点から細胞を回収した時点までの経過時間を算出する工程」をさらに含む。
「回収した細胞について、経時的に取得した指標の情報を基に前記指標に所定の変化が生じた時点を修正する」とは、回収した各細胞について、指標の経時的な測定データから、指標に所定の変化が生じた時点を算出し直すことである。そして、修正した指標に所定の変化が生じた時点から、細胞を回収した時点までの経過時間を算出し直すことができる。指標の経時的な測定データから、指標に所定の変化が生じた時点を算出する方法は、例えば、測定データに対して直線回帰解析を行うことで算出することができる。
この工程（ｃ）によれば、「指標に所定の変化が生じた時点」をさらに正確に把握することができ、また、回収した時点までの経過時間も正確に把握することができる。よって、例えば、回収した細胞の情報を解析する際に、より正確な時間軸情報を付与することができる。
本発明の方法は、実時間回収を行う際に、指標の所定の変化時点や当該所定の変化時点から予め設定した時間が経過した時点を算出するために、指標の測定および解析を行う必要がある。このとき、選択した指標や、実時間回収のための解析プログラムの精度や性能によっては解析処理時間が長くかかってしまい、予め設定した細胞の回収の時間分解能を低下させてしまう場合がある。例えば、このような場合に、上記工程（ｃ）により、細胞の回収後に正確な指標の所定の変化時点や、細胞を回収した時点までの経過時間を算出し直すことができる。    
【００３２】
また、本発明の方法の一実施の形態においては、予め設定した時間として互いに異なる時間を２以上設定することもできる。これにより、異なる状態にある特定の細胞を２以上のグループとして回収することができる。例えば、サイトカイン分泌細胞を回収する際に、サイトカインの分泌を指標の変化とし、所定の時間として３０分、６０分、９０分を設定することで、サイトカイン分泌開始時点から３０分後、６０分後、９０分後に、当該細胞を３つのグループとして回収することができる。このような回収方法の形態によれば、遺伝子発現解析に時間軸情報を付与することができ、個々の遺伝子発現の因果関係の解析を行うことができる。
【００３３】
また、本発明の方法により回収した後の細胞は、速やかに固定液や凍結保存により固定することが好ましい。使用する固定液や凍結保存条件は、固定後の細胞情報に関する網羅的解析ごとに適宜好ましいものを選択すればよい。
ここで、回収後の細胞を、酵素活性を利用した解析手法に適応する場合、培養液中の細胞を精製水もしくは無機塩水中に回収することが好ましい。次世代シーケンシングなど解析手法のためのサンプル調製において用いる精製水もしくは無機塩水としては、RNA分解酵素を含まない、もしくはRNA分解酵素を不活性化したものが望ましい。また、無機塩水は、以下に限定されないが、例えば、リン酸緩衝溶液（Phosphate buffered saline, PBS）、Hank's平衡塩溶液、Earle’s平衡塩溶液、Gey’s平衡塩溶液、および、Puck’s平衡塩溶液を用いることができる。また、次世代シーケンシングなどに用いる無機塩水の塩濃度は少ないほど好ましい。例えば、Ying ZhuらによるとRT-PCR法においてPBSは濃度依存的に増幅効率を低下させることが報告されている（Ying Zhu et al., “Printing 2-Dimentional Droplet Array for Single-Cell Reverse Transcription Quantitative PCR Assay with a Microfluidic Robot” Scientific reports (2015) 5:9551;DOI: doi:10.1038/srep09551）。
さらに、回収後の細胞を精製水もしくは無機塩水中に回収する際、回収する細胞外液の洗浄や交換を行わず、後続の解析に影響を与えない程度の微量の培養液を持ち込むことが好ましく、精製水もしくは無機塩水へ回収後はすぐに固定処理を行うことが好ましい細胞の回収時に持ち込む培養液は、少ないほど好ましく、無機塩水全体に対する割合が２０％以下（ｖ／ｖ）とすることが好ましい。細胞の回収時に培養液と共に細胞を回収することで、より正確に遺伝子発現解析の情報を得ることができる。一方で、培養液の持ち込み量が無機塩水全体に対して２０％（ｖ／ｖ）を超えると、細胞の溶解処理において、細胞の溶解が部分的に阻害され、かつ、核が残ってしまう。
【００３４】
また、一実施の形態においては、ウェル上にある回収すべき細胞について、指標に変化が生じた時点より所定の時間の経過時点において、当該ウェル内に直接固定液を注入してもよい。直接固定液をウェル内に注入することで、より正確な時間情報とともに細胞情報を固定することができる。
また、回収後の細胞は、速やかに異なる培養環境に移送してもよい。本発明の方法を用いれば、細胞の分化方法における分化効率の改善に寄与することができる。例えば、本発明の方法を用いることで、未分化な状態の細胞と分化した状態の細胞を含む細胞群より、分化した細胞であって、指標の変化から一定の時間が経過した好ましい状態にある細胞（例えば、次の培養条件に移すのに最適な状態にある細胞）のみを回収することができる。また、例えば、特定の物質について生産性の高い細胞を細胞群より回収することも可能である。このようにして回収した細胞は、適宜好ましい培養条件の培地等に移すこともできる。
【００３５】
なお、本発明の方法における好ましい一実施の形態においては、細胞外に分泌されるタンパク質を指標として、1細胞分泌イメージング技術により当該分泌タンパク質を測定する方法である。
1細胞分泌イメージング技術は、全反射蛍光照明によるエバネッセント光を用いたサンドイッチイムノアッセイ法である。なお、1細胞分泌イメージング技術に用いるアレイチップとしては、例えば、Sci Rep. 4:4736, 2014（非特許文献３）等の文献情報に記載の方法により作成したものを用いることができる。当該アレイチップは、光学顕微鏡グレードのカバーガラスと樹脂とを重ね合わせて作製されるものであり、例えば、ポリジメチルシロキサンや日本化薬社SU-8（登録商標）、東京応化社 TMMR NR-0034（登録商標）等の細胞毒性の低く、μmサイズの加工が可能な感光樹脂によってウェル構造を形成したアレイチップを使用することができる。当該アレイチップのウェル構造を形成する樹脂とガラスの間には、例えば旭硝子社CYTOP（登録商標）などの
水の屈折率（1.334）と同等の屈折率を有する樹脂を接着層として使用することで、全反射照明によるエバネッセント光を均質に形成させることができる。これらの樹脂とガラス間の接合はアセトン、アルコール、各種水溶液等の浸漬によって剥離しない程度の強度を有することが望ましく、アミノシラン表面処理や空気プラズマによる表面改質によって実現できる。
また、全反射蛍光照明には公知の全反射蛍光照明光学を備えた顕微鏡などを用いることができる。
このようなアレイチップを用いることで、全反射蛍光照明を用いてアレイチップ内の各凹ウェル底面近傍100 nm程度をエバネッセント光によって局所的に蛍光励起することが可能となる。これにより、例えば、ウェル底面に結合させた指標に対する抗体と蛍光検出抗体とを用いるサンドイッチイムノアッセイにより、ウェル底面の抗体と結合した指標を特異的に測定することができる。
1細胞分泌イメージング技術は、細胞より分泌される物質であって、サンドイッチイムノアッセイにより検出できるものであれば、指標として検出または測定が可能である。
【００３６】
なお、本発明は、別の態様として、上記本発明に係る方法を実施するシステムを提供する。一つの好ましい実施形態において、当該システムは、（１）ウェル、（２）検出部、（３）解析部、（４）回収部から構成される。
【００３７】
（１）ウェル
ウェルは、上述のように、個々の細胞の「指標」の変化を検出または測定でき、回収すべき細胞ごとに回収可能なものであれば大きさや形状等、特に制限されず、適宜好ましいウェルを用いることができる。
ウェル内には対象となる細胞が配置され、検出部により各細胞ごとに「指標」の検出または測定が行われる。
【００３８】
（２）検出部
「指標」ごとに適宜好ましい検出装置を採用することができる。例えば、光学的に「指標」を時間軸に沿って検出または測定する場合には、蛍光顕微鏡などを用いて経時的に画像を取得することができる。また、1細胞分泌イメージング技術を使用する際には、全反蛍光射照明光学を備えた顕微鏡を用いて経時的に画像を取得することができる。また、検出部より取得された画像データは、解析部に送られる。
なお、百〜千単位の細胞を配置可能なアレイチップを用いる場合には、一度にアレイチップ上の全ての細胞を撮像できない場合がある。このような場合、例えば、１つのアレイチップを複数の区分に分けて、区分ごとに順番に撮像することができる。そのため、特定の細胞に対する１回目の撮像と２回目の撮像との間には一定の時間間隔生じ、当該細胞は一定の間隔で連続的に撮像される。
【００３９】
（３）解析部
解析部は、検出部により検出した画像を解析する。解析部には、ｉ）検出部により得られた画像から検出値または測定値を算出し算出した検出値または測定値から回収すべき細胞を判断する手段、ｉｉ）検出値または測定値およびそれらの時間軸情報から指標に所定の変化が生じた時点を判断する手段、および／または、ｉｉｉ）指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点を判断する手段を含む。
なお、ｉ）算出した検出値または測定値から回収すべき細胞と判断する手段は、一実施の形態において、検出値または測定値と予め設定した閾値とを比較して、閾値を超えた値を有する細胞を回収すべき細胞を判断することができる。また、解析部は、得られた画像より細胞の空間・位置情報も取得、保持する。当該空間・位置情報は、回収すべきと判断した細胞の位置を特定するために回収部へ伝えられる。また、ｉｉ）検出値または測定値およびそれらの時間軸情報から指標に所定の変化が生じた時点を判断する手段は、一実施の形態において、検出値または測定値およびそれらの時間軸情報と、予め設定した閾値とを比較することにより閾値を超えた時点を特定し、指標に所定の変化が生じた時点を判断することができる。
【００４０】
（４）回収部
回収部は解析部と連動している。解析部において、指標に所定の変化が生じた細胞であって、指標に所定の変化が生じた時点から予め設定した時間が経過した時点にある細胞として特定された細胞は、自動的にマニュピレーターなどにより吸引され、固定液や別の培養液などを含むウェルに吐出・回収される。
また、本発明のシステムは、一実施の形態において、（１）ウェル、（２）検出部、（３）解析部、および、（４）回収部のうちの２つ以上（好ましくは、全て）を統合して制御する（５）制御部を有することもできる。
【００４１】
また、本発明は、別の態様において、本発明の方法により回収した細胞を解析する方法を提供する。本発明により回収した細胞が有する細胞情報は、ゲノム解析、トランスクリプトーム解析、プロテオーム解析やリン酸化解析など、種々の観点における解析の対象とすることができる。よって、本発明の方法により回収した細胞の解析方法は、細胞情報を解析するものである限り、特に限定されない。なお、本発明の方法は、従来の方法では埋もれてしまっていた、時間軸情報を付与した細胞情報を提供するものであり、当該細胞情報より新たな知見が得られることが期待される。
【００４２】
なお、本明細書に用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、本発明を限定する意図で用いられてはいない。
【００４３】
また、本明細書における「含む」の用語は、本明細書の記載から明らかに異なる解釈をすべき場合を除き、記述された事項（工程、要素など）が存在することを意図し、かつ、それ以外の事項（工程、要素など）が存在することを排除するものではない。
【００４４】
また、本明細書に用いられる用語は、異なる定義が無い限り、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
また、本明細書中に記載の文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００４５】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により実施することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【００４６】
これより以下、本発明の具体的な一実施例として、生きた細胞の細胞状態の指標の変化を起点として予め設定した時間経過Δｔにおいて当該細胞を１細胞単位で回収する方法、および、回収した細胞が保持する細胞情報を解析する実施例を示す。【００４７】
本実施例では、生きた細胞の細胞状態の変化の指標として「細胞分泌」を採用し、指標の計測方法として「１細胞分泌計測」を利用した。細胞分泌は、外部刺激もしくは自発的細胞内状態変化を起因として細胞が周囲に出力する細胞情報である。小胞輸送を介した古典的細胞分泌においては、その分泌量は分泌タンパク質の合成鋳型となるメッセンジャーRNA(mRNA)の転写量に比例すると一般に考えられているが、多細胞解析からは詳細が明らかに出来ていない（Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19(4):978-81(2010)）。【００４８】
本実施例では、マウス２型自然リンパ球（Nature. 463, 540-4, 2010）のIL-33刺激またはIL-2/IL-25刺激に対するIL-13の分泌応答を計測し、分泌応答開始時点からΔｔ後に１細胞ずつ回収をした上で凍結固定を行い、各細胞に対してそれぞれ細胞内Il13 mRNA（以下先頭大文字の“Il”はインターロイキン mRNAを示す）の発現量解析を行った。【００４９】
＜実施例１：細胞状態の変化を指標とした細胞分泌の分単位での測定＞
まず、Sci Rep. 4:4736, 2014（非特許文献３）に示された1細胞分泌実時間イメージング技術に基づき、各々の細胞分泌を分単位で観測した。以下詳細に説明する。
マウス２型自然リンパ球はマウス腸管膜脂肪組織内リンパ球集積 FALC（Fat-associated lymphoid cluster）から採取・精製し、IL-2（最終濃度 10 ng/mL, Recombinant Mouse IL-2 protein, 402-ML, R&D Systems）存在下において、培養液（RPMI1640培地、1x MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACID SOLUTION、10 mM HEPES、１ mM Sodium Pyruvate、100 U/ml Penicillin、100 μg/ml Streptmycin、55 μM 2-Mercaptoethanol、50 ng/ml ゲンタマイシン硫酸塩 、10% FCS）中、37℃、5% CO2インキュベータ内にて長期培養したものを用いた。測定に用いた凹ウェルアレイチップは、直径40μmの貫通孔を配列した厚さ45μmのポリジメチルシロキサン樹脂（SYLGARD（登録商標） 184 SILICONE ELASTOMER KIT、ダウコーニング）を光学顕微鏡グレードのカバーガラス（丸カバーガラス CO25001、松浪硝子工業株式会社）に接合して作製した。凹ウェルのガラス底面には、抗マウスIL-13捕捉抗体（Cat#MAB413、R&D systems）を固相化した。凹ウェルアレイチップにマウス２型自然リンパ球を1000凹ウェルあたり400〜800個程度導入し、100 x g ３０秒の条件にて遠心沈降によって無作為に凹ウェルに配置した。凹ウェル外の細胞は培地交換によって除去した。観察培地には、アビジン-ビオチンを介して蛍光標識した抗マウスIL-13検出抗体（Cat#BAF413、R&D systems及び CF660R Streptavidin、Cat#29040、Biotium）を30nMで添加した。測定は全反射蛍光照明光学を備えた電動倒立顕微鏡システム（ECLIPSE Ti-E、株式会社ニコン）によって行った。撮像は上記システムに搭載された高感度EM-CCDカメラ（ImagEM-1K、浜松ホトニクス株式会社）で行った。凹ウェルアレイチップを設置後、マウスIL-33（最終濃度 10 ng/mL、Recombinant Mouse IL-33 Protein、Cat#3626-ML、R&D systems）またはマウスIL-2/IL-25（最終濃度 各10 ng/mL、Recombinant Mouse IL-17E Protein、Cat#1399-IL、 R&D systems）を添加し、IL-13分泌量の測定を行った。各細胞から分泌されたIL-13は分泌後すみやかに凹ウェル底面の抗体によって捕捉され、続けて培地中の蛍光検出抗体によって染色される。一般的なサンドイッチイムノアッセイでは、未結合の蛍光検出抗体を除去した後に残った結合検出抗体の蛍光量を測定することで抗原を定量するが、本実施例における1細胞分泌実時間イメージング技術では、全反射蛍光照明を用いて凹ウェル底面近傍100 nm程度をエバネッセント光によって局所的に蛍光励起することで、未結合の蛍光検出抗体存在下で抗原に結合した検出抗体の蛍光量を特異的に測定できる。この手法によって、162個または180個の1細胞からのIL-13分泌を27分毎に1200分間継続的に測定した。図１にIL-33、IL-2/IL-25刺激下において分泌量の多かった上位10細胞の蛍光増加量、すなわち分泌されたIL-13の蓄積量、の分泌開始時点からの時間経過を示した。分泌開始時点は細胞がいない凹ウェルの平均蛍光強度に標準偏差の3倍量を加算した値を閾値として判別した。【００５０】
図1に示すように、IL-33刺激されたマウス２型自然リンパ球からのシグナルは上昇し続けており、IL-13を継続的に分泌する傾向が見られた。これに対して、IL-2/IL-25刺激されたマウス２型自然リンパ球は数時間のシグナル上昇の後に変化が見られなくなることから、IL-13を過渡的に分泌し、その後分泌は停止する傾向が見られた。これらの結果から、マウス２型自然リンパ球内のIl13 mRNAは、IL-33刺激下においては持続的に存在するが、IL-2/IL-25刺激下では過渡的に転写され速やかに分解されることが予想された。【００５１】
＜実施例２：細胞分泌の開始を細胞状態の指標の変化として、予め設定した時間経過時点における回収（実時間細胞回収）および細胞情報の固定＞
上記実施例１の知見に基づき、マウス２型自然リンパ球のIL-33刺激におけるIL-13分泌開始を細胞状態の変化の指標として用いた。マウス２型自然リンパ球は、IL-13分泌開始より３０分経過後に実時間回収し（すなわち、指標が変化した時点からの所定の時間経過を３０分に設定し、回収を行い）、凍結処理により細胞情報の固定を実施した。IL-13分泌の測定手法は上記実施例１と同様に行った。ただし、実施例１では撮像のみを実時間で行っていたのに対し、本実施例２では図２のフローチャートに示すように撮像に続き、取得した画像からの蛍光強度解析と分泌判断および時間経過判断を顕微鏡制御撮像プログラム（NIS-Elements AR、株式会社ニコン）及び自作プログラム（Visual Basic、Microsoft Co.）によって実時間で行った。細胞の分泌開始時の判断には、細胞が存在しないウェルを予め指定し、それらのウェルの平均蛍光強度に標準偏差を加算した値を閾値として用いた。分泌判断で陽性と判断された細胞には直前の撮像時点（分泌判断に用いた撮像の１つ前の撮像）を分泌開始時点として与え、分泌開始時点から30分経過した時点で当該細胞の回収を１細胞単位で行った。回収は内径15μmのガラスキャピラリー（L-Tip 15μm 60°15mm、ヨダカ技研株式会社）を装着した空圧マイクロインジェクター（IM-11-2、株式会社 成茂科学器械研究所 ）と電動マニピュレーター（電動マイクロマニピュレーター トランスファーマンNK2、エッペンドルフ株式会社）によって顕微観察しながら手動で微量の培地と共に吸い上げ、0.2ml PCRチューブ ドームキャップの蓋内に分注した2.5μLの2 X Reaction Mix（CellsDirect One-Step qRT-PCR kits構成試薬, ThermoFisher Scientific）に吐出した。吐出後は速やかに蓋を閉め、卓上微量遠心機（PMC-060、株式会社 トミー精工）によってスピンダウンした後に液体窒素で急速凍結し、−80℃で保存した。【００５２】
上記の作業によって、分泌を指標として5細胞を実時間回収した。図3に、回収した細胞の一例について、経時的に測定した蛍光強度の測定結果のグラフを示す。図3には分泌開始時点を０とした時間経過を横軸に示し、IL-13分泌による蛍光強度の増加を縦軸に示した。破線は検出に用いた閾値、矢印は回収した時点を示している。
実時間回収に先だって、IL-33刺激を行う前の細胞2例を1細胞単位に回収し、同様に急速凍結しておいた。
実時間回収に引き続き、対比として、指標の変化に対する経時情報を有しない測定終点における分泌陽性細胞の回収（測定終点一括回収）を同様に行った。測定終点は刺激後8時間とした。具体的には、測定終点において分泌陽性であった細胞6例（図４）を１細胞単位で回収し、同様に急速凍結した。なお、終点回収時点において、分泌陽性と判断された細胞の分泌開始時点からの時間経過を確認したところ、60分から120分の間でばらづきがあった。【００５３】
＜実施例３：IL-13分泌を指標に実時間回収したマウス２型自然リンパ球の細胞内情報の解析＞
上記実施例２においてIL-13分泌を指標に実時間回収し、凍結保存したマウス２型自然リンパ球を用いて、細胞内情報であるIl13 mRNA量をGapdh mRNA量と供にターゲット特異的マルチプレックス逆転写定量PCR法（Nat Protoc. 9(7):1713-26,2014）によって測定した。測定結果は、Gapdhを基準としたΔCt法によって比較し、算出した。また、同様に、測定終点において一括回収したマウス２型自然リンパ球（分泌陽性細胞・分泌陰性細胞ともに）についてもIl13 mRNA量を測定した。
具体的には、2.5μLの2 X Reaction Mixに吐出後に凍結した各マウス２型自然リンパ球を融解後、SuperScript（登録商標） III RT/Platinum（登録商標） Taq Mix 0.1μL、Gapdh mRNA、IL-13 mRNAをターゲットとした定量PCRアッセイ（PrimeTime（登録商標） Predesigned qPCR Assay Mix、Assay ID：Mm.PT.39a.1、Integrated DNA Technologies, Inc. / TaqMan（登録商標） Gene Expression Assay Mix、Assay ID：Mm00434204_m1、ThermoFisher Scientific）を終濃度0.05 x（各45 nMプライマー、12.5 nM二重標識プローブ）で添加し、DEPC-treated waterで全液量5μLとした。反応液は50℃、15分の逆転写の後、95℃、15秒の熱変性と60℃、4分の合成のステップを14サイクル繰り返す条件でプレ増幅を行った。増幅産物はDEPC-treated waterで全液量50μLに希釈し、内1μLをテンプレートとしてTaqMan Fast Universal PCR Master Mixの使用説明書に従い、Applied Biosystems社StepOnePlus Real-Time PCR systemsを用いて定量PCRを行った。それぞれの細胞、遺伝子の定量値Ctは装置付随のソフトウェア（StepOne ソフトウェア、 Applied Biosystems）によって算出した。それぞれの細胞のIl13 mRNA発現量はGapdh mRNAのCt値からIl13 mRNAのCt値を減算したΔCt値として比較した。【００５４】
その結果を図５に示す。図５は、刺激前、分泌を指標とした実時間回収、または、測定終点一括回収（分泌陽性）したマウス２型自然リンパ球のIl13 mRNAのΔCt値をOriginPro 2015を用いて点列及び箱ひげ図で示す。点列における各点が1細胞に相当する。ΔCt値が大きいほど各細胞内のIl13 mRNAが多い。有意差はU検定によって評価した。分泌を指標として実時間回収した各細胞からは高値のIl13 mRNAΔCtが検出され、一括回収した分泌陽性細胞よりも比較的大量のIl13 mRNAを発現していることが示された。一方、刺激前のマウス２型自然リンパ球はIl13 mRNAを発現していないか、もしくは非常に少ない値であった。これらの実験結果から、IL-33刺激によってIL-13を分泌するマウス２型自然リンパ球は分泌開始直後、すなわち分泌が盛んに行われている時点では大量のIl13 mRNAを保持しているが、その量は維持されずに60分から120分後には減少することが明らかとなった。図１で見られたIL-33刺激におけるIL-13分泌量の時間的変動は、Il13 mRNAの動的な変動を反映していると考えられる。【００５５】
＜実施例4: 刺激による遺伝子発現様式の相違＞
上記実施例１で示されたように、マウス２型自然リンパ球はIL-2/ IL-25刺激においてもIL-13タンパク質を分泌する。しかしながら、IL-2/ IL-25刺激されたマウス２型自然リンパ球は、IL-33刺激されたマウス２型自然リンパ球とは異なり、一過的にIL-13タンパク質を分泌した後に分泌を停止する傾向が見られている。本実験では、IL-2/IL-25刺激時の細胞内Il13 mRNAの量がIL-13分泌と同様に一過的に増加し、速やかに減少するのか否かを調べた。上記実施例２と同様に分泌開始時点から30分経過時点における細胞を３例実時間回収し、凍結した。対比としての測定終点での細胞を回収した。IL-2/IL-25刺激ではIL-13分泌がIL-33刺激と比較して少ないことがこれまでも知られており（Nature. 463, 540-4, 2010）、本実験においてもIL-13分泌陽性細胞が少なかったことから、測定終了後、多くの細胞が応答するに十分な時間を与え、刺激後24時間において2,400ウェルの蛍光強度を測定し（図６）、分泌陽性細胞を15例一括回収し、同様に凍結した。凍結後の細胞は上記実施例３と同様にして、Gapdh mRNAに対するIl13 mRNAのΔCt値を定量PCRによって測定・算出した。その結果を図７に示す。図７に示すように、当初の予想に反して測定終点における分泌陽性細胞のIl13 mRNA量は実時間回収と比べて減少していなかった。この結果から、IL-2/IL-25刺激においては、IL-13分泌停止後もIl13 mRNA量は維持されることが示唆された。【００５６】
マウス２型自然リンパ球はIL-33刺激の応答としてIL-13を分泌するが、その分泌様式は分泌量を増減させながら持続的なものであった。分泌開始後30分、つまり分泌が盛んに行われている時点で実時間回収した細胞のIl13 mRNA量は測定終点で一括回収した細胞のmRNA量よりも有意に多かったことから、Il13 mRNAは時々刻々と量を変動させる動的遺伝子発現であることが示唆される。一方で、マウス２型自然リンパ球はIL-2／IL-25刺激の応答としてIL-13を一過的に分泌したが、実時間回収した細胞と刺激後十分に時間が経過した時点で一括回収した細胞のIl13 mRNA量はほとんど差がなかったことから、Il13 mRNAは転写後その量を保持する静的遺伝子発現であることが示唆される（図８）。動的遺伝子発現はその瞬間での細胞の状態を強く反映する性質から、細胞活性を示す細胞情報として利用可能であり、静的遺伝子発現は細胞の状態変化を長期間反映する性質から、細胞の分類に利用可能な細胞情報であると言える。同種細胞の同種遺伝子であっても刺激によってその遺伝子発現の静・動性が変化し得ることは本実施例によって初めて明らかとなった興味深い発見である。
本実施例から、実時間回収は細胞毎のバラバラのタイミングで起こる状態変化を指標にそのタイミングを強制的に揃えることで、回収した細胞の状態を統一させることができ、その結果細胞内の遺伝子発現の経時的性質を明らかにすることが実証された。【００５７】
なお、本実施例では、手動の回収法であったが、指標の検出・測定手段、指標の変化を判断する手段、指標の変化から予め設定した時間経過を判断する手段等の情報や判断に基づいて自動的に細胞を回収可能なマニュピレーター等の装置を用いて実施することができる。回収の自動化等により作業効率を上げることで時間経過Δｔでの実時間回収の作業を向上させることが可能である。
また、本実施例では2種類の遺伝子に対するmRNA発現解析を行ったが、既存の1細胞ターゲット特異的マルチプレックス逆転写定量PCR法（Nat Protoc. 9(7):1713-26,2014）や、1細胞RNA-seq（Genome Biol. 14(4):R31, 2013）を利用することで、経時的遺伝子発現解析を網羅的に行える事は容易に想像できる。【００５８】
＜実施例５＞
本実施例では、あらかじめ設定した時間経過Δtにおいて当該細胞を１細胞単位で回収し、細胞が保持するpolyA RNAの発現量を次世代シーケンシング法により網羅的に解析する事例において、細胞活性計測環境から１細胞を回収する条件が解析結果に与えうる影響について検討を行った。【００５９】
本実施例においては、１細胞を回収する手法として、ガラスキャピラリーによる吸引回収法を用いた。当該手法のように細胞と一緒に細胞外液を回収する方法において、回収後のサンプルを酵素活性を利用した解析手法に適応する場合、持ち込み溶液の酵素活性に対する阻害等の影響が一般的に考え得る。例えば、次世代シーケンシング用サンプルの一般的な調製法において、細胞の培養上清の持ち込み量が結果に深刻な影響を与え得ること、細胞をカルシウム、マグネシウムを含まないリン酸緩衝液（Phosphate buffered saline, PBS（−））などの無機塩水に置換することが示唆されている。そこで、本実施例では、１細胞からのpolyA RNAを次世代シーケンシング法で解析する際に先だって行うcDNA増幅工程における持ち込み溶液の影響を検証した。【００６０】
用いた細胞は上記実施例１と同じ、マウス２型自然リンパ球を用いた。細胞を懸濁する溶液として前述の培養液、0.1 x PBS（PBS（−）とRNase-free waterを1:9（v/v）で混合したもの）、あるいはこれらの混合液を用意し、各溶液中（10μL）にマウス２型自然リンパ球を懸濁しておいたものに対して、poly A RNA からcDNAの合成と増幅を行う試薬キット（SMART-Seq（登録商標）v4 3’ DE Kit（635040、クロンテック））に含まれる10 x Lysis Bufferを1μL加え、細胞が溶解して形態が変化するかどうかを顕微鏡で観察した。19%培養液／81% 0.1 x PBS混合溶液以下の培養液の混入では、10 x Lysis Bufferを加えると細胞の境界が不明瞭になったことから溶解が起こったと判定できた。一方25%培養液／75% 0.1 x PBS混合溶液中の細胞は、10 x Lysis Bufferを加えると細胞自体の膨潤や細胞膜の不明瞭化がみられ、一部溶解が進んでいることが確認できたが、核が残った。100%培養液中の細胞については、10 x Lysis Bufferを加えても形態変化を示さなかったため、細胞溶解が阻害されていることがわかった。これらの結果から細胞溶解を効率的に行うためには、培養液よりもPBS（−）が好ましく、また、培養液を持ち込む場合は、持ち込まれた培養液の割合がサンプルに含まれる溶液全体の２割以下に抑えることが好ましいことが示された。【００６１】
次に、PBS（−）の遺伝子発現に与える影響を検証した。IL-2/IL-33で刺激してあらかじめ活性化したマウス２型自然リンパ球を用意し、培養液中あるいはPBS（−）中にそれぞれ活性化マウス２型自然リンパ球を懸濁した。その後、培養液から1細胞ずつ10個（Ｍシリーズ）、PBS（−）から１細胞ずつ10個（Ｐシリーズ）の細胞を内径15μmのガラスキャピラリー（L-Tip 15μm 60°15mm、ヨダカ技研株式会社）を装着した空圧マイクロインジェクター（IM-11-2、株式会社 成茂科学器械研究所 ）と電動マニピュレーター（電動マイクロマニピュレーター トランスファーマンNK2、エッペンドルフ株式会社）によって手動で微量の外液と共に吸い上げ、0.2ml PCRチューブ ドームキャップの蓋内に分注した4μLのRNase-free water（Nacalai tesque, 06442-95）に吐出した。吐出後は速やかに蓋を閉め、卓上微量遠心機（PMC-060、株式会社 トミー精工）によってスピンダウンした後に液体窒素で急速凍結し、−80℃で保存した。以降、SMART-Seq（登録商標）v4 3’ DE Kitの推奨プロトコールに従い、cDNAの増幅を行った。具体的には凍結保存した細胞を氷上で融解し、それぞれに6.5μLのMaster mix（同キットに含まれる10 x Lysis Buffer、RNase Inhibitor、Nuclease-free water、ならびにERCC RNA Spike-In Mix（4456740、サーモフィッシャーサイエンティフィック）をNuclease-free waterで187.5万倍希釈した溶液をそれぞれ19：1：95：15（v/v）で混合した溶液）を加えた。室温にして５分放置した後、同キットに含まれるOligo dT In-line 1-12 primerを1μLずつ加えた。72℃、3分の熱変性の後氷上に移し、2分後に同キット5 x Ultra Low First-Strand Buffer、SMART-Seq v4 Oligonucleotide、RNase Inhibitor、および、SMARTScribe Reverse Transcriptaseをそれぞれ8：2：1：4（v/v）の割合で混合したものを7.5μL加えてから42℃、90分の逆転写と70℃10分の熱変性を行い、4℃で保存した。次いで、同キットに含まれる2 x SeqAmp PCR Buffer、PCR Primer II A、SeqAmp DNA Polymerase、および、Nuclease-free waterを25：1：1：3（v/v）で混合した溶液を30μL加え、95℃、1分の熱変性後、98℃、10秒の熱変性、65℃、30秒のアニーリング、68℃、3分の合成の３ステップを18回繰り返す条件で増幅を行い、最後に72℃で10分間伸長反応を行った。
得られた増幅産物はそれぞれ1μLを別のPCRチューブにとりわけ、Nuclease-free waterで160倍希釈を行い、内1μLをテンプレートとしてTaqMan Fast Universal PCR Master Mixの使用説明書に従い、Applied Biosystems社StepOnePlus Real-Time PCR systemsを用いて定量PCRを行った。それぞれの細胞、遺伝子の定量値Ctは装置付随のソフトウェア（StepOne ソフトウェア、 Applied Biosystems）によって算出した。それぞれの細胞のGapdh、Rplp0、Il13、Il5 mRNA発現量はERCC RNA Spike-In Mix中のERCC-00130、ERCC-00136、ERCC-00131 mRNAのCt値から増幅効率が同じと仮定して換算したコピー数として比較した。【００６２】
その結果を図９に示す。図９は培地から回収した細胞（Ｍシリーズ）とPBSから回収した細胞（Ｐシリーズ）について、ERCC RNA Spike-InのCt値から換算したコピー数を相対発現量として棒グラフで示したものである。培地中より回収した方が10倍以上多い遺伝子発現が認められた。本研究で用いているガラスキャピラリーによる回収システムでは培地持ち込み量が定量的に評価できないため、細胞溶解の阻害による各種遺伝子発現の低下が懸念された。しかしながら、培養液から回収した細胞の遺伝子発現は概してPBS（−）から回収した細胞よりも多く、本研究で用いているガラスキャピラリーによる回収システムでは培地のみ持ち込みは十分少量であることが示された。また、PBS（−）から回収した細胞は培養液から回収した細胞に比べて遺伝発現量が一桁近く低いことから、細胞外液をPBS（−）に置換する行為は、細胞内のpoly A RNA自体を減少させる、もしくはcDNAとして増幅できない状態に移行させる等の理由から、活性化状態の細胞の遺伝子発現情報がcDNA量として正確に反映されていないことが示された。これらの結果から、細胞の活性を測定し、時間経過Δｔにおいて当該細胞を回収し、当該細胞内の活性情報を反映した遺伝子発現情報を得るためには、細胞外液の交換を行わず、後続の解析工程に影響を与えない程度の微量の培養液と共に細胞を回収し、可能な限り迅速に細胞内遺伝子発現情報を凍結等によって固定することが望ましいことが示された。【００６３】
＜実施例６＞
本実施例では、生きた細胞の状態の変化を経時測定し、あらかじめ設定した時間経過Δtにおいて当該細胞を１細胞単位で回収し、細胞が保持するpolyA RNAの発現量を次世代シーケンシング解析などの網羅的遺伝子発現解析を行い、Δｔ特異的な発現遺伝子を検出する手法を示す。本実施例では、生きた細胞の細胞状態の変化の指標として、上記実施例１と同様に「細胞分泌」を採用し、指標の計測方法として「１細胞分泌計測」を利用した。
本実施例では、ヒト末梢血２型自然リンパ球（type 2 innate immune cell, ILC2）のIL-33/IL-2/TSLP刺激に対するIL-13の分泌応答を計測し、分泌応答開始時間から2.4時間後の１細胞１検体、ならびに、刺激を加えて120時間後のIL-13分泌陰性細胞（１細胞を４検体）およびIL-13分泌陽性細胞（8細胞から32細胞の複数細胞を３検体）を各々回収した直後に凍結固定を行い、各８検体に対して次世代シーケンシングによる遺伝子発現量解析を行った。以下各工程を具体的に説明する。【００６４】
ILC2は健常人末梢血20 mLより、培養液（RPMI1640培地、1x MEM NON-ESSENTIAL AMINO ACID SOLUTION、10 mM HEPES、1 mM Sodium Pyruvate、100 U/ml Penicillin、100 μg/ml Streptmycin、55 μM 2-Mercaptoethanol、50 ng/ml ゲンタマイシン硫酸塩、10 ng/mL Recombinant Human IL-2 protein（イムネーム注35、087-03356, 塩野義製薬）、10% FCS）中に精製・採取したものを用いた。
測定に用いた凹ウェルアレイチップは実施例１と同様の手法で作製した。ただし、各凹ウェルの形状及び大きさは、80μm四方、深さ80μmのものを用いた。凹ウェルのガラス底面には、抗ヒトIL-13捕捉抗体（Cat#MAB213、R&D systems）を固相化した。凹ウェルアレイチップにILC2を1000凹ウェルあたり400〜600個程度導入し、100 x g ３０秒の条件にて遠心沈降によって無作為に１つの凹ウェルに対してILC2を１細胞ずつ配置した。凹ウェル外の細胞は培地交換によって除去した。観察培地には、アビジン-ビオチンを介して蛍光標識した抗ヒトIL-13検出抗体（Cat#BAF213、R&D systems及び CF660R Streptavidin、Cat#29040、Biotium）を終濃度30nMで添加した。測定は全反射蛍光照明光学を備えた電動倒立顕微鏡システム（ECLIPSE Ti-E、株式会社ニコン）によって行った。撮像は上記システムに搭載されたデジタルCMOSカメラ（ORCA-Flash4.0 V2（C11440-22CU）、浜松ホトニクス株式会社）で行った。凹ウェルアレイチップを設置後、ヒトIL-33/IL-2/TSLP（Recombinant Human IL-33 Protein、Cat#3625-IL/CF、R&D systems、イムネーム注35、087-03356, 塩野義製薬、Recombinant Human TSLP Protein、1398-TS/CF、R&D systems）を最終濃度がそれぞれ50 ng/mL、20 U/mL、50 ng/mLとなるように添加した。【００６５】
ILC2細胞のIL-33/IL-2/TSLP刺激における活性化は実施例１と同様にIL-13分泌開始を指標として用いた。IL-13の分泌開始は、実施例１同様に図２のフローチャートに従い、実時間で行った。ただし、ヒトILC2の活性化の割合はマウス２型自然リンパ球よりも頻度が低いことが事前検討から見込まれたため、測定時間隔を長くし、測定凹ウェル数を増やすことで検出される活性化細胞を増やした。具体的には、636個の凹ウェルアレイ領域に含まれる196個の1細胞からのIL-13分泌を１５分毎に８０時間継続的に測定した。細胞の分泌開始時の判断には、細胞が存在しないウェルを予め指定し、それらのウェルの平均蛍光強度に標準偏差を加算した値を閾値として用いた。分泌判断で陽性と判断された細胞には直前の撮像時点（分泌判断に用いた撮像の１つ前の撮像）を分泌開始時点として与え、分泌開始時点から２時間で実時間回収を行った（図10上段：明視野、図10下段：IL-13分泌シグナル蛍光像）。ただし、実時間回収後の測定データから詳細解析において、分泌開始前後の輝度データに直線回帰解析を行い、相転移時点を算出したところ、実際の分泌開始からの経過時間Δｔは2.4時間であった（図11）。回収は内径15μmのガラスキャピラリー（L-Tip 15μm 60°15mm、ヨダカ技研株式会社）を装着した空圧マイクロインジェクター（IM-11-2、株式会社 成茂科学器械研究所 ）と電動マニピュレーター（電動マイクロマニピュレーター トランスファーマンNK2、エッペンドルフ株式会社）によって顕微観察しながら手動で微量の培養液と共に吸い上げ、0.2ml PCRチューブ ドームキャップの蓋内に分注した4μLのRNase-free water（Nacalai tesque, 06442-95）に吐出した。吐出後は速やかに蓋を閉め、卓上微量遠心機（PMC-060、株式会社 トミー精工）によってスピンダウンしPCRチューブ底に細胞浮遊液を落としこんだ後に液体窒素で急速凍結し、−80℃で保存した。
上記の作業によって、分泌を指標として１細胞を経過時間Δt=2.4時間で実時間回収した。図10に、実時間回収した細胞（R１）の測定・回収終了後に行った経過時間Δｔの詳細解析例を示した。分泌開始点と回収点を矢印で示すが、回収点でシグナル上昇が止まっている。【００６６】
実時間回収に引き続き、対比として、指標の変化に対する経時情報を有しない測定終点における分泌陰性・分泌陽性細胞の回収（測定終点一括回収）を行った。上記経時観察の範囲外の凹ウェル（996個）において刺激後120時間後のIL-13分泌を測定した（図10上に最終的に回収した明視野像ならびにIL-13分泌シグナル蛍光像）。図10に示すように刺激後120時間後のIL-13分泌測定については、細胞を1個以上含む248個の凹ウェルから得られた分泌シグナルを比較し、シグナル値が0付近の凹ウェルについて、これを分泌陰性細胞を含む凹ウェルとした。これらのうち、１細胞を含む凹ウェルからランダムに4個の凹ウェルを選び、含まれる細胞について上記装置を用いてそれぞれ回収した（図10中、Ｎ１〜Ｎ４と記載）。また、明確な分泌シグナルが見られる蛍光強度値200以上の凹ウェルについて、これを分泌陽性とした。これらのうち、ランダムに3個の凹ウェルを選び、ウェル内に含まれる細胞群をそれぞれ回収した（図10中、Ｐ１〜Ｐ３と記載）。それぞれの凹ウェルには１細胞から分裂したと考えられる32、8、8個の細胞が含まれていた。これらのクローン細胞群は、細胞体のサイズが明らかに肥大しており、前述の内径15μｍのガラスキャピラリーでは回収が困難であるため、内径50μmのガラスキャピラリー（L-Tip 50μm 60°15mm、ヨダカ技研株式会社）によって、同様に回収を行った。
上記においてIL-13分泌を指標に実時間回収し凍結保存したILC2、ならびに測定終点において一括回収したILC2細胞（分泌陰性細胞・分泌陽性細胞ともに）について、SMART-Seq（登録商標）v4 Ultra（登録商標）Low Input RNA Kit for Sequencingを用いてcDNA調製を行い、これを医学生物学研究所（MBL）の次世代シーケンシング受託サービス（実施場所：かずさDNA研究所）に依頼してライブラリ調製に供し、次世代シーケンサーによる遺伝子発現量解析を行った。得られたFastqファイルより実時間回収で特異的にみられる遺伝子発現パターンを検索した。【００６７】
以下、cDNA調製について具体的に記載する。基本的には同キットの推奨プロトコールの半量プロトコールに従った。同キットに含まれる10 x Lysis Buffer、RNase Inhibitor、Nuclease-free waterを19:1:30（v/v）で混合したものを1.25μLと、同キットに含まれる3’ SMART-Seq CDS Primer II AをNuclease-free waterと等量混合したものを1μLずつ混合し、working solutionとした。4μLのRNase-free waterに吐出後に凍結した各ILC2を含む PCRチューブを-80℃から室温に取り出した後、すみやかに2.25μL の working solutionを加え、72℃、3分の熱変性の後氷上に移し、2分後に同キット5 x Ultra Low First-Strand Buffer、SMART-Seq v4 Oligonucleotide、RNase Inhibitor、SMARTScribe Reverse Transcriptaseを8:2:1:4（v/v）の割合で混合したものを3.75μL加えてから42℃、90分の逆転写と70℃10分の熱変性を行い、4℃で保存した。次いで、同キットに含まれる2 x SeqAmp PCR Buffer、PCR Primer II A、SeqAmp DNA Polymerase、Nuclease-free waterを25:1:1:3（v/v）で混合した溶液を15μL加え、95℃、1分の熱変性後、98℃、10秒の熱変性、65℃、30秒のアニーリング、68℃、3分の合成の３ステップをＲ１、Ｎ１〜Ｎ４については24回、Ｐ１については18回、Ｐ２、Ｐ３については20回繰り返す条件で増幅を行い、最後に72℃で10分間伸長反応を行った。25μLの増幅cDNA産物に対し、同キットの10 x Lysis Bufferを1μL加えたのち、室温に戻してよく懸濁したAgencourt AMPure XP beads（A63881、ベックマンコールター）を50μL加えてボルテックスで均一になるまで懸濁、室温で８分間放置した。軽くスピンダウンした後、磁気スタンド（NGS MagnaStand（YS-Model）8Ch x 0.2mL PCRチューブ用、FG-SSMAG2、日本ジェネティクス）に移して、溶液が無色透明になるまで５分以上置いた。そのままの状態で上清を取り除いて200μLの80%エタノールを入れ、30秒放置した後上清を取り除いた。再度200μLの80%エタノールを入れ、30秒放置した後上清を取り除き、磁気スタンドから外して軽くスピンダウンした後、磁気スタンドに戻して30秒放置した。残っている溶液を取り除いて、チューブの蓋を開けたまま数分放置して磁気ビーズを乾かした後、同キットに含まれるElution Bufferを17μL加えた。磁気スタンドからチューブを外し、タッピングによって磁気ビーズをよく懸濁して室温で２分間放置した。軽くスピンダウンをした後磁気スタンドに再び戻し、上清が無色透明になるまで１分以上放置した。無色透明の上清を非吸着チューブ（トレフPCRチューブ0.2mL、96.10560.9.01、株式会社トーホー）に移し冷凍保存した。調製したcDNAサンプルはQubit（登録商標） dsDNA HS assay kit（Q32851、サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて定量し、SMART-Seq（登録商標）v4 Ultra（登録商標）Low Input RNA Kit for Sequencingに含まれるElution Bufferを用いて10 ng/35μLに揃えたのち、かずさDNA研究所に送付した。依頼内容は、ライブラリ調製（KAPA HyperPlus Library Preparation Kit）ならびにillumina HiSeqでの50 bp Single-Read解析である。【００６８】
次に、受託解析結果であるFastqファイルからのデータ処理過程を記載する。
まず、FastQCプログラム（http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）のquality trimmerを用いてFastqファイルをトリミングした。クオリティー値が20未満の塩基を取り除き、30塩基以下の断片長を破棄した。次に、TopHat ver2.1.0（https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml）を用いてトリミング後のFastqファイルからマッピングを行い、BAMファイルを作成した。マッピングに際し、アノテーションファイル、リファレンスゲノムファイルとしてNCBIのbuild37.2を、用いた。その後、cufflinks v2.2.1を使用してこのBAMファイルからFPKMを計算し、遺伝子発現量データとした。
Ｎ１〜Ｎ４、Ｒ１、Ｐ１〜Ｐ３について得られたFPKMデータについて、まずは活性化の指標として用いたIL-13タンパク質をコードする遺伝子IL13、ならびに、IL-13と同様に活性化ILC2から大量に分泌されることがわかっているIL-5タンパク質をコードする遺伝子IL5について、各サンプルでのFPKM値を比較した（図１３）。どちらも分泌陰性細胞（Ｎ１〜Ｎ３）では非常に小さな値を示すのに対し、分泌を呈した細胞（Ｒ１、Ｐ１〜Ｐ３）では比較的大きな値を示すことから、上記手順によって得たFPKM値が細胞内状態を反映していることが確認できた。次に、全遺伝子に対するFPKM値について、以下の２種類の解析を行った。まずはクラスター解析を行った（図１４）。クラスタリングにはcluster 3.0ソフトウェア（http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm）を用いた。クラスター解析には、得られたFPKM値に1を加えた値の10を底とする対数を用いた。データはある遺伝子について７サンプルの少なくともどれか１つで対数値が2.0以上で、かつ７サンプル間の最大値と最小値の差が１以上になったもののみ（24901遺伝子中3301遺伝子）を対象とし、各遺伝子内での相対値に変換した。サンプル間の距離尺度はCity-block距離を、遺伝子間の距離尺度はピアソン相関係数を基に類似性を決定し、重心法によってクラスターを形成した。得られたクラスターのうち、相関係数が0.9以上のノード毎に、詳細な検討を行った。その結果、Ｒ１で値が高く、Ｐでは値の小さいクラスター（Ｒ＋＋Ｐ＋）や、R１で値が高く、Pでも同等に値が高いクラスター（Ｒ＋Ｐ＋）、Ｐでのみ値の高いクラスター（Ｐ＋）などが見いだされた。次に２値化法によって実時間回収によって発現パターンに特徴が見られるかどうかを検証した。具体的には、FPKMの中程度発現閾値を100とし、各遺伝子についてＲ１について閾値を超えているかどうか、Ｎ１〜Ｎ４やＰ１〜Ｐ３に関してはそれぞれ少なくともどれか１サンプルが閾値を超えているかどうか、を判定基準とした。図１５において、この判定によって全24,901遺伝子を分類した結果をベン図で示した。その結果、Ｒ１特異的に発現が中程度以上と分類された遺伝子が190種類見いだされた。
以上２種類の分類について、その関係性を調べて下記表１にまとめた。
【表１】
2017126615.tif 000002
２値化法によって得られたＲ１特異的遺伝子のうち、129遺伝子がＲ＋＋Ｐ＋及びＲ＋Ｐ＋のクラスターに含まれた。２値化法で得られたＲ１特異的遺伝子は、Ｐ＋クラスターには含まれず、実時間回収によってのみ特定される分泌開始時特異的遺伝子群を見出すことに成功した。【００６９】
＜実施例７＞
本実施例では、生きた細胞の細胞状態の変化の指標として「形態変化」を採用し、指標の計測方法として「位相差顕微鏡法によるタイムラプス撮影」を利用した。
本実施例では、ヒト人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell, iPS細胞）がEssential 8 Medium（E8 Medium; A1517001、サーモフィッシャーサイエンティフィック）において長期培養中に一過性に示す特徴的な形態変化を検出する方法を記載する。
本実施例に用いたiPS細胞はIM-E1-5株（Stem Cells Transl. Med., 4, 468-75, 2015）である。当該細胞をGeltrex（登録商標） LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix（A1413301、サーモフィッシャーサイエンティフィック）をコートした6ウェルプレートに播種し、E8 Medium中で培養した。図１６に２０倍対物レンズ（S Plan Fluor ELWD 20x Ph1、ニコン）を用いて観察した当該細胞の位相差像を載せた。典型的な形態はやや伸展の度合いが高い上皮細胞様であり、細胞同士は接着しているものの数十μmに渡って伸展する像が得られる（図１６中１および２の矢印で示す像）。しかしながら、10分に１回の頻度でタイムラプス撮影を行うと、１〜数細胞にほぐして分散させた細胞を発端とするコロニーにおいて、培養開始後４８時間あたりからコロニーがドーム状に隆起し、各細胞の境界が不明瞭になる形態変化が数十分間だけ過渡的に生じる現象が見られた。そこで、一過性の当該形態を画像処理によって迅速に検出し、これを細胞状態の変化の指標とすることが可能か検討した。
形態変化の特徴を定量的に抽出するため、当該細胞の位相差像に対してImageJを用いた画像処理を施した。具体的には元画像からバックグラウンドを差し引いたものに対し、Edges Detectionを行った（特徴量画像）。これとは別に元画像からバックグラウンドを差し引いたものに対してDetect Peakを行った後Low Pass filterをかけ、細胞が形成するコロニーの存在範囲が抽出できるような閾値で二値化して細胞領域を同定した。各細胞領域について、上記特徴量画像のシグナル変化を測定してプロットした。図１７に図１６中１〜３の矢印で特定される細胞コロニーについて定量した特徴量の時間変動をプロットした。ここでは、特徴量画像の各細胞領域内における平均シグナル強度変動（図１７上段）、ならびにシグナル分散変動（図１７下段）を定量した。どちらもコロニー１、コロニー２においては変動が小さい一方で、コロニー３においては76時間あたりから急激な上昇が見られ、大きく変動しながらも78時間までには上昇前の状態に戻った。破線にて示した時点における各コロニーの形態をグラフ中に掲載したが、コロニー３の76時間あたりのシグナル上昇は、コロニーの厚肥（位相差像の細胞周囲のハロ（光のにじみ）の増大より検出される）ならびにコロニーに含まれる各細胞の境界が不明瞭になる現象を追従していると考えられる。78時間あたりではコロニーに含まれる個々の細胞の輪郭が次第に明瞭になっていくが、それに追随してシグナルも安定化した。これに対しコロニー１、コロニー２は位相差像にもほとんど変化が見られなかった。以上より、数日中数十分間過渡的に生じるiPS細胞コロニーの形態変化について、簡単な画像処理によって特徴量として定量化することに成功した。
このように、例えば、iPS細胞コロニーのスフェロイド様の形態変化を指標として、当該指標の変化から一定の時間経過後のiPS細胞を回収することができる。
本実施例では、輝度値として形態情報を定量化したが、その他にも様々な画像特徴量検出法が使用できる。例えば、コロニーの面積、真円度などの外周形状やコロニー内強度分布、コロニー内に検出できる線形状パターンの長さ、本数など画像解析によって数値化できる特徴量の中から各細胞形態変化に適した情報量を採用できる。さらには、前もって所望の形態情報を有する教師画像ライブラリ及び比較のための教師画像ライブラリを用意することで機械学習や深層学習による画像分類に基づく検出も可能である。【００７０】
＜実施例８＞
本実施例では、生きた細胞の細胞状態の変化の指標として「細胞活性指示薬」を採用し、指標の計測方法として「ライブセルイメージングによるタイムラプス撮影」を利用した。
現在、ライブセルイメージングに用いることができる細胞活性指示薬は多種存在する。ライブセルイメージングに使用できる細胞活性指示薬とは、細胞のすべての活性を阻害しないもしくは目的の細胞活性を調べるのに影響を与えない程度の阻害を有し、目的の細胞活性の程度を蛍光または化学発光の強度変化や細胞内局在の変化として検出することを可能とする低分子化合物もしくは遺伝的改変されたタンパク質を指す（「新・生細胞蛍光イメージング」原口徳子・木村宏・平岡泰  編、共立出版  など参照）。
本実施例では、細胞死検出低分子蛍光指示薬SYTOX（登録商標）Orange Nucleic Acid Stain（S11368、サーモフィッシャーサイエンティフィック）により、典型的な細胞活性の一種である制御された細胞死の検出を行った。細胞死は進行すると概して細胞内の情報（DNA、RNA、タンパク質等）は分解されるため、細胞死を検出してからのΔｔによって細胞内情報は大きく変動すると予想される。SYTOX Orangeは細胞死の１過程である細胞膜の開孔に伴い、細胞内に浸透し、核DNAと結合することで発蛍光化するため、蛍光シグナルの上昇として細胞死を検出できる。
本実施例に用いた細胞は、遺伝子導入によって不死化されたマウス骨髄由来マクロファージ細胞株であるiBMMである（J. Biol. Chem., 286, 9587-97, 2011）。
直径80μmの開口型ウェルアレイチップに細胞を導入し、SYTOX orangeを 0.01μMで培地に添加した状態で細胞を7分毎にタイムラプス観察した（図１８）。Ｔ＝０でポリ（dA・dT）DNA（Poly(deoxyadenylic-thymidylic) acid sodium salt, double-stranded alternating copolymer, P0883-10UN,  SIGMA）をトランスフェクションしたところ、刺激後数十分から十時間以上にわたる広い範囲で蛍光強度の突発的な上昇が見られ、細胞毎にさまざまなタイミングで細胞死を起こしていることが観察された。細胞内のSYTOX Orange蛍光強度の時間変化をプロットすると（図１９）、非常に急峻にシグナルが立ち上がることがわかり、背景光と区別するために閾値を設け、その閾値を越える点を同定することで、実時間で細胞死に伴う細胞膜の開孔のタイミングを検出することが可能となった。このタイミングを指標に、前述の実施例同様細胞を回収し、遺伝子発現解析等に資することができる。
【図１】
2017126615.tif 000003
【図２】
2017126615.tif 000004
【図３】
2017126615.tif 000005
【図４】
2017126615.tif 000006
【図５】
2017126615.tif 000007
【図６】
2017126615.tif 000008
【図７】
2017126615.tif 000009
【図８】
2017126615.tif 000010
【図９】
2017126615.tif 000011
【図１０】
2017126615.tif 000012
【図１１】
2017126615.tif 000013
【図１２】
2017126615.tif 000014
【図１３】
2017126615.tif 000015
【図１４】
2017126615.tif 000016
【図１５】
2017126615.tif 000017
【図１６】
2017126615.tif 000018
【図１７】
2017126615.tif 000019
【図１８】
2017126615.tif 000020
【図１９】
2017126615.tif 000021
【国際調査報告】
2017126615.tif 000022
2017126615.tif 000023
2017126615.tif 000024
2017126615.tif 000025
2017126615.tif 000026
2017126615.tif 000027