(57)【要約】  化学物質により細胞死が起きるまで時間を経てから、還元発色試薬を用いて残りの生細胞数を測定するのではなく、細胞死が起きるよりも前に、すなわち、従来法よりも迅速かつ高感度に化学物質の有害性を評価する手段を提供する。  片方のRNA鎖に蛍光発光する蛍光色素Ａを標識し、もう片方のRNA鎖に近傍の蛍光色素の発光を消光させる蛍光色素Ｂを標識し、2本鎖の状態では、上記2種類の蛍光色素の間で蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)が生じることで、蛍光が消光した状態になっている、2本鎖RNAプローブ。  当該プローブを細胞内に導入した際、細胞が通常の状態であれば、細胞内RNA分解酵素の働きにより2本鎖RNAは速やかに分解され、FRETの状態が解除されることで、蛍光色素Ａは蛍光発光するようになるが、一方で、細胞に有害な影響があった場合、細胞内RNA分解酵素の働きが抑制されるため、2本鎖RNAは分解されず、蛍光色素Ａは蛍光色素Ｂの影響のため消光したままとなる。  これにより細胞内RNAの分解速度の低下を検出することで、細胞死が起きるよりも前に、迅速かつ高感度に化学物質の有害性を評価することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
片方のRNA鎖に蛍光発光する蛍光色素Ａを標識し、もう片方のRNA鎖に近傍の蛍光色素の発光を消光させる蛍光色素Ｂを標識し、2本鎖の状態では、上記2種類の蛍光色素の間で蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)が生じることで、蛍光が消光した状態になっている、2本鎖RNAプローブ。
【請求項２】
請求項１に記載のプローブを細胞内に導入し、一方で、細胞内RNA分解酵素の働きにより2本鎖RNAが分解され、FRETの状態が解除されることで、蛍光色素Ａは蛍光発光するようになり、他方で、細胞内RNA分解酵素の働きが抑制される場合、2本鎖RNAは分解されず、蛍光色素Ａは蛍光色素Ｂの影響のため消光したままとなることを利用して、蛍光発光を測定することにより、細胞内RNAの分解速度の低下を検出し、細胞内RNA分解酵素の働きを評価する方法。
【請求項３】
細胞に対する有害性の評価対象の化合物と請求項１に記載のプローブとを細胞内に導入し、一方で、細胞内RNA分解酵素の働きにより2本鎖RNAが分解され、FRETの状態が解除されることで、蛍光色素Ａは蛍光発光するようになり、他方で、細胞内RNA分解酵素の働きが抑制される場合、2本鎖RNAは分解されず、蛍光色素Ａは蛍光色素Ｂの影響のため消光したままとなることを利用して、蛍光発光を測定することにより、細胞内RNAの分解速度の低下を検出することで、当該化学物質の細胞に対する有害性を評価する方法。
【請求項４】
化学物質が過酸化水素であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
化学物質がCisplatinであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
化学物質がMercury II Chrolideであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生命科学分野，環境分析分野の技術に関し、特に、培養細胞を用いた有害化学物質の生物学的影響の評価方法の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学物質の生物学的影響の評価法(バイオアッセイ)、特に、化学物質の有害性評価法として、マウスやラットなどを用いた動物実験を代替するために、哺乳動物細胞等の培養細胞を用いた生細胞数の測定方法が確立されており、先行研究として、吸光度測定により生細胞数を測定して、その細胞数の減少を測定する方法が一般的に用いられている。例えば、還元発色試薬と生細胞中のミトコンドリア脱水素酵素活性を利用するMTT法(非特許文献１)や、MTT類似色素へ還元する酵素活性を測定する比色定量法であるXTT法(非特許文献２)、WST法(特許文献１、特許文献２、非特許文献３)などが、測定の安全性や再現性の高さなどの理由から、現在広く利用されている。なかでも、WST法は、試薬の添加後に水溶性ホルマザンが生成されるため、高感度で容易に生細胞数を測定することが可能であり、かつ水溶液調製後の安定性も高い。しかしながら、これらの方法には、培養細胞が化学物質の有害性に応答して、最終的に細胞死を起こす表現型を示すまでには時間がかかるという問題点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第２５９２４３６号公報
【特許文献２】特許第２７５７３４８号公報
【特許文献３】特開２０１２−１０６６７号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Vistica、 D. T. et al., Cancer Res., 51, 2515-2520, 1991
【非特許文献２】Roehm, N. W. et al., J. Immunol. Methods, 142, 257-265, 1991
【非特許文献３】Ishiyama, M. et al., Talanta, 44, 1299-1305, 1997
【非特許文献４】Marras, S.A.E. et al., Nucleic Acids Res., 20, e122, 2002
【非特許文献５】Tani, H. et al., Genome Res., 22, 946-956, 2012
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、上記従来技術の問題点を解消する点にあり、本発明は、化学物質により細胞死が起きるまで時間を経てから、還元発色試薬を用いて残りの生細胞数を測定するのではなく、細胞死が起きるよりも前に、すなわち、従来法よりも迅速かつ高感度に化学物質の有害性を評価する手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、細胞内RNAの分解速度を測定することで培養細胞への化学物質の有害性を評価できることを見出し、また、細胞が正常であり、細胞内RNAが速やかに分解される場合は蛍光が発光し、細胞に有害な影響があり、細胞内RNAが分解されない場合は蛍光が発光しないような、蛍光色素を標識したRNAプローブを作製し、これを細胞内に導入し、細胞内RNAの分解速度の低下を検出することで、細胞死が起きるよりも前に、すなわち、従来法よりも迅速かつ高感度に化学物質の有害性を評価することができることを見出して、上記課題を解決した。
すなわち、本発明者らは、片方のRNA鎖には蛍光発光する蛍光色素Ａを標識し、もう片方のRNA鎖には、近傍の蛍光色素の発光を消光させる蛍光色素Ｂを標識した、2本鎖RNAを設計・作製した。当該2本鎖RNAは、2本鎖の状態では、上記２種類の蛍光色素の間で蛍光共鳴エネルギー転移(FRET; Fluorescence resonance energy transfer)(非特許文献４)が生じることで、蛍光が消光した状態になっている。本発明者らは、この2本鎖RNAを細胞内に導入した際、細胞が通常の状態であれば、細胞内RNA分解酵素の働きにより2本鎖RNAは速やかに分解され、FRETの状態が解除されることで、蛍光色素Ａは蛍光発光するようになるが、一方で、細胞に有害な影響があった場合、細胞内RNA分解酵素の働きが抑制されるため、2本鎖RNAは分解されず、蛍光色素Ａは蛍光色素Ｂの影響のため消光したままとなることを見出し、本発明を完成するに至った(図１：本発明のイメージ図参照)。【０００７】
従来、このような細胞内RNAの分解速度を測定する方法として、ハロゲン化ウリジンを含む培地で細胞を培養することにより、細胞内RNAにハロゲン化ウリジンを取り込ませ、経時的に細胞サンプルを取得し、抗ハロゲン化ウリジン抗体を用いてハロゲン化ウリジン含有RNAを単離する方法が報告されている(特許文献３、非特許文献５)。しかしながら、この方法では、ハロゲン化ウリジンを取り込ませるのに24時間かかり、さらに、そこから経時的にサンプルを取得して、細胞からRNAを抽出し、ハロゲン化ウリジン含有RNAを単離する工程を含むため、細胞内RNAの分解速度の低下を検出するのに時間がかかり、操作も煩雑である。
これに比べて、本発明の方法によれば、以下の実施例において示すように、数時間程度の極めて短時間で、有害物質による細胞内RNAの分解速度の低下を検出することができ、これにより、化学物質の有害性を速やかに評価することができる。【０００８】
すなわち、この出願は以下の発明を提供するものである。
〈１〉片方のRNA鎖に蛍光発光する蛍光色素Ａを標識し、もう片方のRNA鎖に近傍の蛍光色素の発光を消光させる蛍光色素Ｂを標識し、2本鎖の状態では、上記２種類の蛍光色素の間で蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)が生じることで、蛍光が消光した状態になっている、2本鎖RNAプローブ。
〈２〉〈１〉に記載のプローブを細胞内に導入し、一方で、細胞内RNA分解酵素の働きにより2本鎖RNAが分解され、FRETの状態が解除されることで、蛍光色素Ａは蛍光発光するようになり、他方で、細胞内RNA分解酵素の働きが抑制される場合、2本鎖RNAは分解されず、蛍光色素Ａは蛍光色素Ｂの影響のため消光したままとなることを利用して、蛍光発光を測定することにより、細胞内RNAの分解速度の低下を検出し、細胞内RNA分解酵素の働きを評価する方法。
〈３〉細胞に対する有害性の評価対象の化合物と〈１〉に記載のプローブとを細胞内に導入し、一方で、細胞内RNA分解酵素の働きにより2本鎖RNAが分解され、FRETの状態が解除されることで、蛍光色素Ａは蛍光発光するようになり、他方で、細胞内RNA分解酵素の働きが抑制される場合、2本鎖RNAは分解されず、蛍光色素Ａは蛍光色素Ｂの影響のため消光したままとなることを利用して、蛍光発光を測定することにより、細胞内RNAの分解速度の低下を検出することで、当該化学物質の細胞に対する有害性を評価する方法。
〈４〉化学物質が過酸化水素であることを特徴とする、〈３〉に記載の方法。
〈５〉化学物質がCisplatinであることを特徴とする、〈３〉に記載の方法。
〈６〉化学物質がMercury II Chrolideであることを特徴とする、〈３〉に記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、上述の従来技術と比較して、化学物質の有害性により細胞死が起きるまでの時間を経ることなく、蛍光色素を標識した2本鎖RNAを用いて細胞内RNA分解酵素の活性を測定することで、迅速かつ高感度に化学物質の有害性を評価できる。
さらに、従来技術では、化学物質の有害性の評価を、生細胞数を測定することにより行うものであるため、エンドポイントでの測定のみが可能であり、時系列変化を調べるためには、必要なタイムポイント分の細胞系をそれぞれ準備する必要があるが、本発明の方法によれば、リアルタイムでの測定が可能であるため、準備に必要な細胞系を減らすことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のイメージ図。
【図２】本発明に用いる蛍光標識した2本鎖RNAの具体例を示す図。
【図３】本発明の蛍光標識した2本鎖RNAのFRETによる消光、及び、RNA分解酵素によるRNA鎖分解による蛍光の発生を実験により確認した結果を示す図。
【図４】過酸化水素が、細胞外においては、本発明の蛍光標識した2本鎖RNAおよびRNA分解酵素に対し影響を与えないことを示す図。
【図５】本発明の蛍光標識した2本鎖RNAを用いた、過酸化水素の細胞への有害性の評価結果を示す図。
【図６】従来のWST法による生細胞数測定法を用いた、過酸化水素の細胞への有害性の評価結果を示す図。
【図７】本発明の蛍光標識した2本鎖RNAを用いた、Cisplatinの細胞への有害性の評価結果を示す図。
【図８】本発明の蛍光標識した2本鎖RNAを用いた、Mercury II Chrolideの細胞への有害性の評価結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１２】
（実施例１）
蛍光標識した2本鎖RNAのFRETによる消光、及び、RNA分解酵素によるRNA鎖分解による蛍光の発生の確認
本実験においては、蛍光標識した2本鎖RNAがFRETにより消光されていることを確認するとともに、RNA分解酵素により蛍光値が増加するかどうかを検討した(図１)。
まず、レポーター鎖であるFRET-Alexa-RNA；5’-(Alexa Flour 488)-CAUAAUCCACCUCCCACUAUUCC-3’(配列番号１)および、クエンチャー鎖であるFRET-BHQ1-RNA；(5’-GGAAUAGUGGGAGGUGGAUUAUG-(BHQ1)-3’(配列番号２)を用意した。レポーター鎖の5’末端の塩基には、C6リンカーを介してAlexa Flour 488が標識されており、クエンチャー鎖の3’末端の塩基には、リンカーを介さずBHQ1(Black Hole Quencher 1)が標識されている(図２)。
レポーター鎖とクエンチャー鎖を１：２(モル比)になるようにして、50mM HEPES、500mM KCl、25mM MgCl2の溶液中で混合し、その溶液を99℃で5分間、65℃で30分間、25℃で30分間インキュベートすることで2本鎖RNAを作製した。
次に、200nM 2本鎖RNA、Opti-MEM(Life Technologies)の反応液(50μl)を用意し、Microplate Reader SH-9000(Corona Electric)により、488nmで励起し、519nmの蛍光を測定した(0時間後の結果)。
その後、0.4mg/ml Ribonuclease (DNase free) Solution(RNA分解酵素；RNase)(Nippon Gene)を添加して、室温で1時間インキュベートした後、Microplate Reader SH-9000(Corona Electric)により、488nmで励起し、519nmの蛍光を測定した(1時間後の結果)。n=3で実験を行った。
1時間後の蛍光値を0時間後の蛍光値で割った結果を図３に示す。図３の結果より、RNaseの添加により、RNase無添加の場合に比べ、蛍光強度が明らかに増大したことが確認された。この結果は、蛍光標識した2本鎖RNAがFRETにより消光されており、また、RNA分解酵素により当該RNA鎖が分解することによって、蛍光発光することを示している。【００１３】
（実施例２）
蛍光標識した2本鎖RNAおよびRNA分解酵素に対する過酸化水素の影響
本実験においては、蛍光標識した2本鎖RNAおよびRibonuclease (DNase free) Solution(RNA分解酵素；RNase)(Nippon Gene)に対して、過酸化水素がどのような影響を与えるかを調べた。
200nM 2本鎖RNA、Opti-MEM(Life Technologies)の反応液(50μl)を用意し、Microplate Reader SH-9000(Corona Electric)により、488nmで励起し、519nmの蛍光を測定した(0時間後の結果)。その後、過酸化水素を0、または100μM添加した系、かつ、0、または0.4mg/ml Ribonuclease (DNase free) Solution(RNA分解酵素；RNase)(Nippon Gene)を添加した系を準備し、室温で1、2、または4時間インキュベートした後、Microplate Reader SH-9000により、488nmで励起し、519nmの蛍光を測定した(1、2、または4時間後の結果)。n=3で実験を行った。
1、2、または4時間後の蛍光値を0時間後の蛍光値で割った結果を図４に示す。図４の結果より、RNaseなし・過酸化水素ありの系は、RNaseなし・過酸化水素なしの系と蛍光値はほぼ同様であり、また、RNaseあり・過酸化水素ありの系は、RNaseあり・過酸化水素ありの系と蛍光値はほぼ同様であった。
この結果は、過酸化水素はRNA FRET Probeの蛍光値に影響を与えず、かつ、RNaseの活性にも影響を与えないことを示すものである。【００１４】
（実施例３）
蛍光標識した2本鎖RNAを用いた、過酸化水素の細胞への有害性の評価 
本実験においては、細胞に対する有害化学物質として過酸化水素を用い、蛍光標識した2本鎖RNAを哺乳動物細胞に導入し、蛍光値により化学物質の有害性を評価することが可能かどうかを検討した。
反応液として、Opti-MEM(Life Technologies)50μL、Lipofectamine 2000(Life Technologies)1μL、200nM 2本鎖RNA(実施例１と同じ)、過酸化水素(Wako)を0、0.01、1、または100μM添加した系をそれぞれ準備し、混合してから、室温で20分間インキュベートした後、ヒト細胞であるHEK293細胞(2×105cells/ml in 96 well plate)に添加して、0時間後から8時間後まで、1時間おきに、Microplate Reader SH-9000(Corona Electric)により、488nmで励起し、519nmの蛍光を測定した。n=3で実験を行った。
1〜8時間後の蛍光値を0時間後の蛍光値で割った結果を図５に示す。図５の結果より、過酸化水素を添加していない系(0μM)では、蛍光値が時間とともに増加していくのに対して、過酸化水素を添加した系では、蛍光値の増加が抑えられており、かつ、それは過酸化水素の濃度に依存することがわかった。さらに、本系では2時間後には変化が明確に観察できることがわかった。
上述の実施例２で示すとおり、細胞を含まない試験管内の実験では、過酸化水素はRNaseの活性に影響を与えない。従って、細胞内の実験において、過酸化水素によりRNaseの活性が見かけ上低下したのは、過酸化水素により細胞が影響を受けることによって、細胞の示すRNase活性が低下したことによるものであり、このことは、細胞の示すRNase活性の低下が、過酸化水素による細胞への影響の指標として使用し得ることを示している。【００１５】
（実施例４）
蛍光標識した2本鎖RNAを用いた過酸化水素の細胞への有害性の評価の従来法との対比
本実験においては、過酸化水素を実施例３と同条件として、先行技術のWST法に従い、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて、吸光度により生細胞数を測定した。
HEK293細胞(2×105cells/ml in 96 well plate)に対して、DMEM(Wako)を基本とする細胞培養液に、過酸化水素を0、0.01、1、または100μM添加した系をそれぞれ準備し、また、2、4、6、または8時間後の細胞系に対して、Cell Counting Kit-8(Dojindo)を用いて、Microplate Reader SH-9000(Corona Electric)により、450nmの吸光度を測定することで、生細胞数を測定した。n=3で実験を行った。
過酸化水素を添加していない系(0μM)を１としたときの相対的な吸光度の値の結果を図６に示す。図６の結果より、過酸化水素を添加してから8時間後で初めて吸光度の減少がみられた。
すなわち、従来法では、8時間後で細胞死が起き、Cell Counting Kit-8(Dojindo)により測定が可能となったと考えられる。従って、実施例３で示したように、本発明である、蛍光標識した2本鎖RNAで評価した方が迅速に、化学物質の有害性を評価できることがわかった。【００１６】
（実施例５）
蛍光標識した2本鎖RNAを用いた、Cisplatinの細胞への有害性の評価
本実験においては、細胞に対する有害化学物質としてCisplatinを用い、蛍光標識した2本鎖RNAを哺乳動物細胞に導入し、蛍光値により化学物質の有害性を評価することが可能かどうかを検討した。
反応液として、Opti-MEM(Life Technologies)50μL、Lipofectamine 2000(Life Technologies)1μL、200nM 2本鎖RNA(実施例１と同じ)、Cisplatin(Wako)を0ng/ml、1ng/ml、100ng/ml、または100μg/ml添加した系をそれぞれ準備し、混合してから、室温で20分間インキュベートした後、ヒト細胞であるHEK293細胞(2×105cells/ml in 96 well plate)に添加して、0時間後から8時間後まで、1時間おきに、Microplate Reader SH-9000(Corona Electric)により、488nmで励起し、519nmの蛍光を測定した。n=3で実験を行った。
1〜8時間後の蛍光値を0時間後の蛍光値で割った結果を図７に示す。図７の結果より、Cisplatinを添加していない系(0ng/ml)では、蛍光値が時間とともに増加していくのに対して、Cisplatinを添加した系では、蛍光値の増加が抑えられており、かつ、それはCisplatinの濃度に依存することがわかった。さらに、本系では2時間後には変化が明確に観察できることがわかった。【００１７】
（実施例６）
蛍光標識した2本鎖RNAを用いた、Mercury II Chrolideの細胞への有害性の評価
本実験においては、細胞に対する有害化学物質としてMercury II Chrolideを用い、蛍光標識した2本鎖RNAを哺乳動物細胞に導入し、蛍光値により化学物質の有害性を評価することが可能かどうかを検討した。
反応液として、Opti-MEM(Life Technologies)50μL、Lipofectamine 2000(Life Technologies)1μL、200nM 2本鎖RNA(実施例１と同じ)、Mercury II Chrolide(Wako)を0ng/ml、100ng/ml、10μg/ml、または1mg/ml添加した系をそれぞれ準備し、混合してから、室温で20分間インキュベートした後、ヒト細胞であるHEK293細胞(2×105cells/ml in 96 well plate)に添加して、0時間後から8時間後まで、1時間おきに、Microplate Reader SH-9000(Corona Electric)により、488nmで励起し、519nmの蛍光を測定した。n=3で実験を行った。
1〜8時間後の蛍光値を0時間後の蛍光値で割った結果を図８に示す。図８の結果より、Mercury II Chrolideを添加していない系(0ng/ml)では、蛍光値が時間とともに増加していくのに対して、Mercury II Chrolideを添加した系では、蛍光値の増加が抑えられており、かつ、それはMercury II Chrolideの濃度に依存することがわかった。さらに、本系では2時間後には変化が明確に観察できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００１８】
本発明の方法によれば、有害化学物質が生体に与える影響について迅速かつ高感度で、知見を得ることができ、本発明は、有害化学物質についての診断分野、検査分野、研究分野などにおいて使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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