(57)【要約】  本発明の課題は、インフルエンザウイルス等のＲＮＡウイルスを切断することで無効化できる人工ＲＮＡ制限酵素を提供することである。本発明によれば、ＲＮＡと結合するＲＮＡ結合タンパク質と、ＲＮＡの所定の部位を切断する酵素とを、ペプチドリンカーを介して連結して成る人工ＲＮＡ制限酵素とする。さらに、ペプチドリンカーを介して連結する酵素がSNaseの場合には、ペプチドリンカーの長さを５アミノ酸とし、ペプチドリンカーを介して連結する酵素がPINの場合には、ペプチドリンカーの長さを５アミノ酸または１０アミノ酸とすることにも特徴を有する。
2017104796.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡと結合するＲＮＡ結合タンパク質と、ＲＮＡの所定の部位を切断する酵素とを、ペプチドリンカーを介して連結して成る人工ＲＮＡ制限酵素。
【請求項２】
前記酵素がSNaseの場合には、ペプチドリンカーの長さを５アミノ酸とする請求項１に記載の人工ＲＮＡ制限酵素。
【請求項３】
前記酵素がPINの場合には、ペプチドリンカーの長さを５アミノ酸または１０アミノ酸とする請求項１に記載の人工ＲＮＡ制限酵素。
【請求項４】
ＲＮＡと結合するＲＮＡ結合タンパク質が、ヒトPumilio及びFBFホモロジー（hPUF)タンパク質又はその改変体である、請求項１から３の何れか一項に記載の人工ＲＮＡ制限酵素。
【請求項５】
ペプチドリンカーが、GlyGlyGlyGlySerからなるペプチド、又はGlyGlyGlyGlySer GlyGlyGlyGlySerからなるペプチドである、請求項１から４の何れか一項に記載の人工ＲＮＡ制限酵素。
【請求項６】
プロモーター、ＲＮＡと結合するＲＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡ、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡ、及びＲＮＡの所定の部位を切断する酵素をコードするＤＮＡとをこの順に有する組み換え発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工ＲＮＡ制限酵素に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
本発明者は、ＤＮＡを切断する核酸切断剤として、標的切断部位の上流に位置する塩基配列に対して特異的に結合するジンクフィンガータンパク質と、このジンクフィンガータンパク質に結合した核酸切断部とで構成した核酸切断剤を提案した（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００９−５２８８１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
核酸切断剤の考え方をＲＮＡに展開すれば、インフルエンザウイルス等のＲＮＡウイルスに効果的な薬剤となり得ると考えた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の人工ＲＮＡ制限酵素は、ＲＮＡと結合するＲＮＡ結合タンパク質と、ＲＮＡの所定の部位を切断する酵素とを、ペプチドリンカーを介して連結して成る人工ＲＮＡ制限酵素である。【０００６】
さらに、本発明の人工ＲＮＡ制限酵素では、ペプチドリンカーを介して連結する酵素がSNaseの場合には、ペプチドリンカーの長さを５アミノ酸とし、ペプチドリンカーを介して連結する酵素がPINの場合には、ペプチドリンカーの長さを５アミノ酸または１０アミノ酸とすることにも特徴を有するものである。【０００７】
本発明においては、好ましくは、ＲＮＡと結合するＲＮＡ結合タンパク質は、ヒトPumilio及びFBFホモロジー（hPUF)タンパク質又はその改変体である。
本発明において、好ましくは、ペプチドリンカーは、GlyGlyGlyGlySerからなるペプチド、又はGlyGlyGlyGlySer GlyGlyGlyGlySerからなるペプチドである。【０００８】
本発明によればさらに、プロモーター、ＲＮＡと結合するＲＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡ、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡ、及びＲＮＡの所定の部位を切断する酵素をコードするＤＮＡとをこの順に有する組み換え発現ベクターが提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、インフルエンザウイルス等のＲＮＡウイルスを効果的に切断して無害化可能とする人工ＲＮＡ制限酵素を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、人工ＲＮＡ制限酵素による基質ＲＮＡの切断によって生じる反応生成物の電気泳動である。
【図２】図２は、ペプチドリンカーの長さの最適化実験の電気泳動である。
【図３】図３は、ペプチドリンカーの長さの最適化実験の電気泳動である。
【図４】図４は、細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（非複製系）の概要を示す。
【図５】図５は、pCMV(-H)-hPUF-L10-SNase-FLAGのクローニングを示す。
【図６】図６は、pCMV(-H)-hPUF-L10-hPIN-FLAGのクローニングを示す。
【図７】図７は、pCMV(-H)-SNase-FLAGのクローニングを示す。
【図８】図８は、pCMV(-H)-hPIN-FLAGのクローニングを示す。
【図９】図９は、pCMV(-H)-hPUF-L10-SNase-FLAG(-NLS)のクローニングを示す。
【図１０】図１０は、pCMV(-H)-hPUF-L10-hPIN-FLAG(-NLS)のクローニングを示す。
【図１１】図１１は、pCMV(-H)-SNase-FLAG(-NLS)のクローニングを示す。
【図１２】図１２は、pCMV(-H)-hPIN-FLAG(-NLS)のクローニングを示す。
【図１３】図１３は、pCAGGS-hPUF-L10-SNase-FLAG(-NLS)のクローニングを示す。
【図１４】図１４は、pCAGGS-hPUF-L10-hPIN-FLAG(-NLS)のクローニングを示す。
【図１５】図１５は、pCAGGS-SNase-FLAG（-NLS）のクローニングを示す。
【図１６】図１６は、pCAGGS-hPIN-FLAG（-NLS）のクローニングを示す。
【図１７】図１７は、pcDNA-NRE-Lucのクローニングを示す。
【図１８】図１８は、pcDNA-NRE3X-Lucのクローニングを示す。
【図１９】図１９は、pcDNA-NRE6X-Lucのクローニングを示す。
【図２０】図２０は、pcDNA-MT-Lucのクローニングを示す。
【図２１】図２１は、pcDNA-MT3X-Lucのクローニングを示す。
【図２２】図２２は、pcDNA-MT6X-Lucのクローニングを示す。
【図２３】図２３は、細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（非複製系）の結果を示す。
【図２４】図２４は、細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（複製系）の概要を示す。
【図２５】図２５は、pCMV(-H)-hPUF-L5-SNase-FLAGのクローニングを示す。
【図２６】図２６は、pCMV(-H)-hPUF-L5-hPIN-FLAGのクローニングを示す。
【図２７】図２７は、pCAGGS-hPUF-L5-SNase-FLAGのクローニングを示す。
【図２８】図２８は、pCAGGS-hPUF-L5-hPIN-FLAGのクローニングを示す。
【図２９】図２９は、pUC-vRNA(MCS_Luc)(NCR_NS)のクローニングを示す。
【図３０】図３０は、pUC-vRNA(Luc_MCS)(NCR_NS)のクローニングを示す。
【図３１】図３１は、pUC-vRNA(TGTATATA_Luc)(NCR_NS)のクローニングを示す。
【図３２】図３２は、pUC-vRNA[(TGTATATA)3_Luc] (NCR_NS)のクローニングを示す。
【図３３】図３３は、pUC-vRNA(Luc_TGTATATA)(NCR_NS)のクローニングを示す。
【図３４】図３４は、pUC-vRNA[Luc_(TGTATATA)3](NCR_NS) のクローニングを示す。
【図３５】図３５は、vRNAを標的とした際に使用したRNA発現ベクターを示す（図３６に対応）。
【図３６】図３６は、細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（複製系）の結果を示す。
【図３７】図３７は、cRNAを標的とした際に使用したRNA発現ベクターを示す（図３８に対応）。
【図３８】図３８は、細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（複製系）の結果を示す。
【図３９】図３９は、細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（複製系）の概要を示す。
【図４０】図４０は、pUC-vRNA(Luc_Kuma_NP)(NCR_NS)のクローニングを示す。
【図４１】図４１は、pUC-vRNA(Luc_Aki_PA)(NCR_NS)のクローニングを示す。
【図４２】図４２は、Kuma_NPを標的とした際に使用したRNA発現ベクターを示す（図４３に対応）。
【図４３】図４３は、細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（複製系）の結果を示す。
【図４４】図４４は、Aki_PAを標的とした際に使用したRNA発現ベクターを示す（図４５に対応）
【図４５】図４５は、細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（複製系）の結果を示す。
【図４６】図４６は、細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（複製系）の概要を示す。
【図４７】図４７は、Kuma_NPを標的とした際に使用したRNA発現ベクターを示す（図４９に対応）。
【図４８】図４８は、pUC-vRNA(Kuma_NP)(NCR_NS)のクローニングを示す。
【図４９】図４９は、細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（複製系）の結果を示す。
【図５０】図５０は、細胞毒性評価の際に使用したRNA発現ベクターを示す（図５１に対応）。
【図５１】図５１は、細胞毒性評価（複製系）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の人工ＲＮＡ制限酵素は、ＲＮＡと結合するＲＮＡ結合タンパク質と、ＲＮＡの所定の部位を切断する酵素とを、ペプチドリンカーを介して連結して成る人工ＲＮＡ制限酵素である。以下において、本発明の実施形態を具体的に説明する。
【００１２】
本発明における「ＲＮＡと結合するＲＮＡ結合タンパク質」は、ＲＮＡと結合することができるタンパク質であればよく、その種類は特に限定されない。
【００１３】
ＲＮＡと結合するＲＮＡ結合タンパク質としては、ヒトPumilio及びFBFホモロジー（hPUF)タンパク質又はその改変体を使用することが好ましいが、その他のＲＮＡ結合タンパク質を使用してもよい。その他のＲＮＡ結合タンパク質としては、例えば、スプライソソーム複合体に含まれるＵ１ｓｎＲＮＰ、Ｕ２ｓｎＲＮＰ、Ｕ６ｓｎＲＮＰ、あるいはポリＡ結合タンパク質、ＲＮＡ修飾酵素、ＲＩＳＣ複合体等が挙げられる。
【００１４】
hPUFタンパク質は、後記する８つのリピートモチーフR1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8と、N末端のR1’ドメインと、C末端のをR8’ドメインとで構成されている。即ち、天然(野生型) hPUFタンパク質は、R1’-R1-R2-R3-R4-R5-R6-R7-R8 -R8’という構成を有している。hPUFタンパク質の改変体としては、上記したR1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8というモチーフの一部を欠失、置換、又は付加させた改変体を挙げることができる。一例としては、R7をR5に置き換えた改変体等を挙げることができ、この場合には、R1’-R1-R2- R3-R4-R5-R6-R5-R8 -R8’という構成を有することになる。ＲＮＡへの結合能を有する限り、上記したようなhPUFタンパク質の改変体を使用することも可能である。
【００１５】
ＲＮＡの所定の部位を切断する酵素としては、ＲＮＡ切断酵素等の核酸切断酵素を使用することができる。例えば、ＲＮＡ切断酵素の全体又は該酵素の全長の一部である核酸切断ドメインを用いることができる。天然型の核酸切断酵素、例えばスタフィロコッカルヌクレアーゼ(ＳＮａｓｅ)などのほか、遺伝子工学的手法や他の手法により改変された核酸切断酵素を用いてもよい。核酸切断酵素中の核酸切断ドメインは常法により当業者が容易に特定することができ、遺伝子工学的な手法により容易に入手することが可能である。核酸切断酵素としては、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡに対して切断活性を有するＳＮａｓｅ又はその核酸切断ドメイン、あるいはＳＮａｓｅの１又は２以上、好ましくは数個の構成アミノ酸残基を置換、挿入、欠失した変異体ＳＮａｓｅなどを用いることができる。
【００１６】
本発明で用いるペプチドリンカーの種類は、本発明の効果が損なわれない限り特に限定されない。例えば、通常、1から100アミノ酸、好ましくは3から50アミノ酸、より好ましくは5から30アミノ酸、さらに好ましくは5から15アミノ酸からなるペプチドリンカーを使用することができる。
【００１７】
ペプチドリンカーとしては、
Gly-Ser、Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly、 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n、(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n等を使用することができるが（式中、ｎは２〜２０の整数であり、好ましくは２〜１０整数であり、より好ましくは２〜５の整数であり、特に好ましくは２又は３である）、特に限定されない。
【００１８】
本発明において、好ましくは、ペプチドリンカーは、GlyGlyGlyGlySerからなるペプチド、又はGlyGlyGlyGlySer GlyGlyGlyGlySerからなるペプチドである。
【００１９】
本発明の組み換え発現ベクターは、上記した本発明の人工ＲＮＡ制限酵素を発現するためのベクターである。本発明の組み換え発現ベクターは、プロモーター、ＲＮＡと結合するＲＮＡ結合タンパク質をコードするＤＮＡ、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡ、及びＲＮＡの所定の部位を切断する酵素をコードするＤＮＡとをこの順に有する。本発明で用いるプロモーターの種類は特に限定されないが、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどを使用することができる。
【００２０】
ベクターとしては、例えば、非ウイルスベクター又はウイルスベクターの何れでもよい。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクター等）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター又はセンダイウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルスベクター、ＨＳＶベクターなどのウイルスベクターが使用できるまた、ｐＣＭＶ系の各種ベクターを使用することができる。
【００２１】
以下に本発明の具体例をさらに説明する。
【００２２】
＜人工ＲＮＡ制限酵素の作製＞
まず、本発明の人工ＲＮＡ制限酵素を大腸菌を用いて作製可能とするために、ＲＮＡ結合タンパク質の発現ベクターに、ペプチドリンカーをコードする配列を付加したプライマーで増幅した核酸切断酵素を導入して、大腸菌での発現ベクターを構築した。
【００２３】
ここで、ＲＮＡ結合ドメインとしては、実験上、よく利用している、human Pumilio and FBF homology （hPUF)タンパク質誘導体を用いた。hPUFタンパク質は、アミノ酸配列と長さが異なる８つのリピートモチーフR1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8と、N末端のR1’ドメインと、C末端のをR8’ドメインとで構成しており、各ドメインのアミノ酸配列は、以下のようになっている。
R1'：GRSRLLEDFRNNRYPNLQLREIAG （配列番号９）
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ（配列番号１）
R2 ：AAYQLMVDVFGNYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG（配列番号２）
R3 ：HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG（配列番号３）
R4 ：HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG（配列番号４）
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ（配列番号５）
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG（配列番号６）
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS（配列番号７）
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP（配列番号８）
R8'：HIATLRKYTYGKHILAKLEKYYMKNGVDLG  （配列番号１０）
【００２４】
また、変異型であるhPUF_MTは、８つのリピートモチーフR1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8が以下の配列を有している。
R1 ：HIMEFSQDQHGSRFIQLKLERATPAERQLVFNEILQ（配列番号１）
R2 ：AAYQLMVDVFGCYVIQKFFEFGSLEQKLALAERIRG（配列番号１１）
R3 ：HVLSLALQMYGCRVIQKALEFIPSDQQNEMVRELDG（配列番号３）
R4 ：HVLKCVKDQNGNHVVQKCIECVQPQSLQFIIDAFKG（配列番号４）
R5 ：QVFALSTHPYGCRVIQRILEHCLPDQTLPILEELHQ（配列番号５）
R6 ：HTEQLVQDQYGNYVIQHVLEHGRPEDKSKIVAEIRG（配列番号６）
R7 ：NVLVLSQHKFASNVVEKCVTHASRTERAVLIDEVCTMNDGPHS（配列番号７）
R8 ：ALYTMMKDQYANYVVQKMIDVAEPGQRKIVMHKIRP（配列番号８）
【００２５】
また、核酸切断酵素としては、実験上、よく利用している核酸切断酵素であるstaphylococcal nuclease（SNase）を用いた。さらに、ペプチドリンカーとしては、実験上、よく利用しているフレキシブルなGlyGlyGlyGlySerを３つタンデムにつなげたペプチドリンカーを用いた。
【００２６】
上記の発現ベクターを発現用大腸菌株BL21(DE3)に導入した後、OD600が〜0.65になった時にIPTGを添加して、37℃で３時間培養して、人工ＲＮＡ制限酵素を発現させた。
【００２７】
人工ＲＮＡ制限酵素を発現した大腸菌を回収して、超音波により破砕した。粉砕して得られた懸濁液をSDS-PAGEにより解析することで人工ＲＮＡ制限酵素が可溶性であることを確認した。粉砕して得られた懸濁液を遠心分離して上清を得た。この上清をアフィニティーカラムを用いて精製することで人工ＲＮＡ制限酵素を高純度で得ることができた。
【００２８】
＜標的配列を有する基質ＲＮＡの作製＞
標的配列を含むインフルエンザゲノム由来の190塩基からなるＲＮＡをコードするＤＮＡを合成し、これをpET21aベクターのT７プロモーターの下流に導入した。
【００２９】
このベクターのＲＮＡ領域の末端を制限酵素で切断した後、試験管内でT7 RNA polymeraseを用いて転写させた。しかし、RNA生成量が十分ではなかったため、様々な反応条件やキットを試したところ、最終的に、MEGAscript Kit（Invitrogen社製）を用いることにより、十分量の標的配列を有する基質ＲＮＡを一度に得ることができた。
【００３０】
＜標的配列を有する基質ＲＮＡの切断試験＞
上述した方法で得られた基質ＲＮＡを用い、上述した方法で精製した人工ＲＮＡ制限酵素のＲＮＡ切断活性を試験管内で検証した。
【００３１】
反応条件は、標的配列を有する基質ＲＮＡを0.6〜１μｇと、人工ＲＮＡ制限酵素を終濃度５ｎＭで含む反応緩衝液（20 mM Tris-HCl、pH 8.0、150 mM NaCl、10% Glycerol、1μg/μl tRNA）に、終濃度１mMのCa2+を添加することで反応を開始させた。
【００３２】
37℃で所定時間（２分または１０分）反応させた後、EDTAの添加により反応を停止させ、分解しやすいRNAの取り扱いに注意しながら反応生成物を回収した。
【００３３】
回収した反応生成物を10%変性ゲルでの電気泳動により解析した。図１に電気泳動の結果を示す。反応後にみられる切断生成物が、人工ＲＮＡ制限酵素が標的配列を有する基質ＲＮＡ配列に正しく結合して切断したものかどうかは、適切な長さのサイズマーカーの泳動位置との比較により評価した。
【００３４】
さらに、得られた２つの主切断生成物が目的の生成物かどうかを確認するために、基質ＲＮＡ内の標的塩基配列を、人工ＲＮＡ制限酵素のＲＮＡ結合タンパク質が結合できないように変異させ、同様の切断実験を行ったところ、目的の切断生成物と思われるバンドの減少が確認された。すなわち、基質ＲＮＡでの切断が、標的配列への結合により生じていることを確認した。
【００３５】
＜ペプチドリンカー長の最適化＞
上述した人工ＲＮＡ制限酵素では、ペプチドリンカーを、GlyGlyGlyGlySerの５アミノ酸からなるペプチドを３つ繰り返して、１５アミノ酸のペプチドリンカーとしており、この場合の人工ＲＮＡ制限酵素をL15型と呼ぶこととする。
【００３６】
上述した人工ＲＮＡ制限酵素の作製方法と同じ方法で、ペプチドリンカーを、GlyGlyGlyGlySerの５アミノ酸からなるペプチドを２つ繰り返して、１０アミノ酸のペプチドリンカー（GlyGlyGlyGlySer GlyGlyGlyGlySer）を有する人工ＲＮＡ制限酵素をL10型と呼び、ペプチドリンカーを、GlyGlyGlyGlySerの５アミノ酸からなるペプチドで構成した人工ＲＮＡ制限酵素をL5型と呼び、ペプチドリンカーがなく、ＲＮＡ結合タンパク質と核酸切断酵素とを直接結合させた人工ＲＮＡ制限酵素をL0型と呼ぶこととする。
【００３７】
上述したL15型の人工ＲＮＡ制限酵素と同様に、L10型、L5型及びL0型の人工ＲＮＡ制限酵素において、大腸菌でのタンパク質発現を行い、それぞれの作製したベクターをBL21(DE3)に導入して、可溶性を確認した。
【００３８】
L10型、L5型及びL0型の人工ＲＮＡ制限酵素では、L15型の人工ＲＮＡ制限酵素と同じ37℃で３時間培養では可溶性が十分ではなかった。そこで、各種条件で培養を行ったところ、誘導剤終濃度：0.1 mMで、30℃・３時間培養で行った場合が、発現量が高く、かつ可溶量が多かった。そこで、この条件でL10型、L5型及びL0型の人工ＲＮＡ制限酵素を培養した。
【００３９】
図２は、ペプチドリンカー長の異なるL15型、L10型、L5型及びL0型の人工ＲＮＡ制限酵素の切断活性を同一条件下で検証した結果である。図２より、L5型の人工ＲＮＡ制限酵素が最も反応性が高かった。
【００４０】
＜他の実施形態について＞
上述した実施形態では、核酸切断酵素としてSNaseを用いたが、他の核酸切断酵素を用いた場合でも同様の切断活性を有していることを確認するため、SNaseドメインの代わりにＲＮＡを切断することが知られているPINドメインを用いることとした。
【００４１】
すなわち、上述したSNase型の人工ＲＮＡ制限酵素と同じ作製方法により、PIN型の人工ＲＮＡ制限酵素の発現ベクターを構築した。ここで、ペプチドリンカーの長さの異なるL15型、L10型、L5型及びL0型の４種類のPIN型の人工ＲＮＡ制限酵素を作製した。
【００４２】
なお、作製したベクターをそれぞれBL21(DE3)に導入して可溶性を確認したが、37℃で３時間培養では可溶性が十分ではなかったため、誘導剤終濃度：0.1 mMで25℃・７時間培養で行った場合が、発現量が高く、かつ可溶量が多かった。そこで、この条件でL15型、L10型、L5型及びL0型のPIN型の人工ＲＮＡ制限酵素を培養した。
【００４３】
図３は、ペプチドリンカー長の異なるL15型、L10型、L5型及びL0型のPIN型の人工ＲＮＡ制限酵素の切断活性を同一条件下で検証した結果である。図３より、L5型またはL10型の人工ＲＮＡ制限酵素が最も反応性が高かった。
【実施例】
【００４４】
実施例１：細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（非複製系）(図４)
（１）プラスミドの構築（図５〜図２２）
動物細胞用人工RNA制限酵素発現ベクターpCMV(-H)-hPUF_MT-L10-SNase-FLAGとpCMV(-H)-hPUF_MT-L10-hPIN-FLAGのEcoRIサイトとHindIIIサイト間にhPUFをコードするDNA配列をクローニングしてpCMV(-H)-hPUF-L10-SNase-FLAGとCMV(-H)-hPUF-L10-hPIN-FLAGを構築した。次に、pCMV(-H)-hPUF-L5-SNase-FLAGとpCMV(-H)-hPUF-L5-hPIN-FLAGからhPUFをコードするDNA配列を除去するためにEcoRIとHindIIIで切断・平滑化・ライゲーションを行い、pCMV(-H)-SNase-FLAGとpCMV(-H)-hPIN-FLAGを構築した。これらの4種類のプラスミドから核局在化シグナルをコードするDNA配列を除去するために、合成オリゴヌクレオチドのアニーリングにより作製したT7タグをコードするDNA配列をNheIサイトとBamHIサイトの間にクローニングしてpCMV(-H)-hPUF-L10-SNase-FLAG(-NLS)、pCMV(-H)-hPUF-L10-hPIN-FLAG(-NLS)、pCMV(-H)-SNase-FALG(-NLS)、およびpCMV(-H)-hPIN-FLAG(-NLS)を構築した。そして、これらの4種類のプラスミドを鋳型にしてPCRを行い、その増幅産物をそれぞれpCAGGSプラスミドのXhoIサイト間にクローニングしてpCAGGS-hPUF-L10-SNase-FLAG(-NLS)、pCAGGS-hPUF-L10-hPIN-FLAG(-NLS)、pCAGGS-SNase-FLAG(-NLS)、およびpCAGGS-hPIN-FLAG(-NLS)を構築した。【００４５】
CMVプロモーターの一部、その下流にhPUF結合サイトをコードするDNA配列（TGTATATA）とルシフェラーゼ遺伝子をコードするDNA配列を委託合成し、これをpcDNA3.1(+)のNdeIサイトとEcoRIサイト間にクローニングしてレポータープラスミドpcDNA-NRE-Lucを構築した。次に、hPUF結合サイトを3、および6コピーコードするDNA配列を合成オリゴヌクレオチドのアニーリング・ライゲーションにより作製し、これらをpcDNA-NRE-LucのSacIサイトとBamHIサイト間にクローニングしてpcDNA-NRE3X-Luc、およびpcDNA-NRE6X-Lucを構築した。また、同様の方法によりhPUF結合サイトの5か所に変異を導入した変異サイトを1、3、および6コピーコードするDNA配列（TCATATTA）を作製し、これらをpcDNA-NRE-LucのSacIサイトとBamHIサイト間にクローニングしてpcDNA-MT-Luc、pcDNA-MT3X-Luc、およびpcDNA-MT6X-Lucを構築した。【００４６】
（２）レポーターアッセイ（非複製系）(図２３)
poly-D-lysine 96ウェルプレートに2×104個の293T細胞を播種し、10%非働化FBS含有DMEM培地で37℃・CO2 5%培養槽において24時間培養後、人工RNA制限酵素発現プラスミド81 ng、RNA分解ドメイン発現プラスミド81 ng、もしくは空ベクターpcDNA3.1(+) 81 ngをレポータープラスミド9 ng、およびβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMV-b 10 ngとともにLipofectamine 3000を用いて293T細胞へコトランスフェクションした。37℃・CO2 5%培養槽で48時間培養後に1×Passive Lysis Buffer 100 mlで細胞ライセートを調製し、Luciferase Assay Systemを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。また、ウェル間のトランスフェクション効率を標準化するためにLuminescent b-galactosidase Detection Kit IIを用いてβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性値をβ-ガラクトシダーゼ活性値で標準化した後、空ベクターpcDNA3.1(+)をトランスフェクションした条件を基準にして相対的なルシフェラーゼ活性を評価した。測定結果を図２３に示す。標的配列のコピー数に依存してルシフェラーゼ活性が減少した。【００４７】
実施例２：細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（複製系、ルシフェラーゼ遺伝子使用）(図２４)
（１）プラスミドの構築（図２５〜図３４）
動物細胞用人工RNA制限酵素発現ベクターpCMV(-H)-hPUF_MT-L5-SNase-FLAGとpCMV(-H)-hPUF_MT-L5-hPIN-FLAGのEcoRIサイトとHindIIIサイト間にhPUFをコードするDNA配列をクローニングしてpCMV(-H)-hPUF-L5-SNase-FLAGとpCMV(-H)-hPUF-L5-hPIN-FLAGを構築した。そして、これらのプラスミドを鋳型にしてPCRを行い、その増幅産物をそれぞれpCAGGSプラスミドのXhoIサイト間にクローニングしてpCAGGS-hPUF-L5-SNase-FLAGとpCAGGS-hPUF-L5-hPIN-FLAGを構築した。【００４８】
ヒト由来のRNAポリメラーゼIプロモーターの下流にA型インフルエンザウイルス（A/PR/8/34（H1N1））のNSをコードするセグメント由来の5’非翻訳領域（5’NCR）、ルシフェラーゼ遺伝子のマイナス鎖、（A/PR/8/34（H1N1））のNSをコードするセグメント由来の3’非翻訳領域（3’NCR）、およびマウス由来のRNAポリメラーゼIターミネーターを配置した2種類のDNA配列を委託合成した。一つは5’NCRとルシフェラーゼ遺伝子の間にクローニングサイトAgeIとBglIIが配置されていて、もう一つはルシフェラーゼ遺伝子と3’NCRの間にクローニングサイトAgeIとBglIIが配置されている。これらをpUC19のXbaIサイトとAcc65Iサイト間にクローニングして2種類のレポータープラスミド前駆体pUC-vRNA(MCS_Luc)(NCR_NS)とpUC-vRNA(Luc_MCS)(NCR_NS)を構築した。次に、hPUF結合サイトを1、および3コピーコードするDNA配列を合成オリゴヌクレオチドのアニーリングにより作製し、これらをpUC-vRNA(MCS_Luc)(NCR_NS)のAgeIサイトとBglIIサイト間にクローニングしてpUC-vRNA(TGTATATA_Luc)(NCR_NS)とpUC-vRNA[(TGTATATA)3_Luc](NCR_NS)を構築した。また、hPUF結合サイトを1、および3コピーコードするDNA配列を合成オリゴヌクレオチドのアニーリングにより作製し、これらをpUC-vRNA(Luc_MCS)(NCR_NS)のAgeIサイトとBglIIサイト間にマイナス鎖が転写される向きにクローニングしてpUC-vRNA(Luc_TGTATATA)(NCR_NS)とpUC-vRNA[Luc_(TGTATATA)3](NCR_NS)を構築した。【００４９】
（２）レポーターアッセイ（複製系）(図３５〜図３８)
poly-D-lysine 96ウェルプレートに2×104個の293T細胞を播種し、10%非働化FBS含有DMEM培地で37℃・CO2 5%培養槽において24時間培養後、人工RNA制限酵素発現プラスミド86 ng、もしくは空ベクターpcDNA3.1(+) 86 ngを4種類のインフルエンザウイルス由来タンパク質発現プラスミドpCAGGS-PA、pCAGGS-PB1、pCAGGS-PB2、pCAGGS-NP各1 ng、レポータープラスミド0.1 ng、およびβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMV-b 10 ngとともにLipofectamine 3000を用いて293T細胞へコトランスフェクションした。37℃、CO2 5%培養槽で48時間培養後に1×Passive Lysis Buffer 100 mlで細胞ライセートを調製し、Luciferase Assay Systemを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。また、ウェル間のトランスフェクション効率を標準化するためにLuminescent b-galactosidase Detection Kit IIを用いてβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性値をβ-ガラクトシダーゼ活性値で標準化した後、空ベクターpcDNA3.1(+)をトランスフェクションした条件を基準にして相対的なルシフェラーゼ活性を評価した。レポータープラスミドにpUC-vRNA(TGTATATA_Luc)(NCR_NS)とpUC-vRNA[(TGTATATA)3_Luc](NCR_NS)を使用した時はvRNA（マイナス鎖）内にhPUF結合サイトが存在し、pUC-vRNA(Luc_TGTATATA)(NCR_NS)とpUC-vRNA[Luc_(TGTATATA)3](NCR_NS)を使用した時はcRNA（プラス鎖）およびmRNA内にhPUF結合サイトが存在する。【００５０】
測定結果を図３６及び図３８に示す。標的配列のコピー数に依存してルシフェラーゼ活性が減少した。また、図３６及び図３８の対比から、本発明の人工RNA制限酵素は、ｖＲＮＡよりもｃＲＮＡに用いる方が有利であることも示唆される。【００５１】
実施例３：細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（複製系）(図３９)
（１）プラスミドの構築（図４０〜図４１）
A型インフルエンザウイルス（A/chicken/kumamoto/1-7/2014(H5N8)）由来NPをコードするDNA配列を委託合成し、これを鋳型にしてPCRを行い、その増幅産物をpUC-vRNA(Luc_MCS)(NCR_NS)のAgeIサイトとBglIIサイト間にマイナス鎖が転写される向きにクローニングにしてpUC-vRNA(Luc_Kuma_NP)(NCR_NS)を構築した。同様に、A型インフルエンザウイルス（A/whooper swan/Akita/1/2008(H5N1)）由来PAをコードするDNA配列を委託合成し、これを鋳型にしてPCRを行い、その増幅産物をpUC-vRNA(Luc_MCS)(NCR_NS)のAgeIサイトとBglIIサイト間にマイナス鎖が転写される向きにクローニングしてpUC-vRNA(Luc_Aki_PA)(NCR_NS)を構築した。【００５２】
（２）レポーターアッセイ（複製系、ウイルスゲノムにルシフェラーゼ遺伝子を連結）（図４２〜図４５）
poly-D-lysine 96ウェルプレートに2×104個の293T細胞を播種し、10%非働化FBS含有DMEM培地で37℃・CO25%培養槽において24時間培養後、人工RNA制限酵素発現プラスミド85 ng、もしくは空ベクターpcDNA3.1(+) 85 ngを4種類のインフルエンザウイルス由来タンパク質発現プラスミドpCAGGS-PA、pCAGGS-PB1、pCAGGS-PB2、pCAGGS-NP各1 ng、レポータープラスミド1 ng、およびβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMV-b 10 ngとともにLipofectamine 3000を用いて293T細胞へコトランスフェクションした。37℃、CO2 5%培養槽で48時間培養後に1×Passive Lysis Buffer 100 mlで細胞ライセートを調製し、Luciferase Assay Systemを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。また、ウェル間のトランスフェクション効率を標準化するためにLuminescent b-galactosidase Detection Kit IIを用いてβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性値をβ-ガラクトシダーゼ活性値で標準化した後、空ベクターpcDNA3.1(+)をトランスフェクションした条件を基準にして相対的なルシフェラーゼ活性を評価した。レポータープラスミドにpUC-vRNA(Luc_Kuma_NP)(NCR_NS)を使用した時はvRNA（マイナス鎖）内にhPUF結合サイトが存在し、pUC-vRNA(Luc_Aki_PA)(NCR_NS)を使用した時はcRNA（プラス鎖）およびmRNA内にhPUF結合サイトが存在する。【００５３】
測定結果を図４３及び図４５に示す。本発明の人工ＲＮＡ制限酵素によりルシフェラーゼ活性が減少した。【００５４】
実施例４：細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（複製系、ウイルスゲノムを使用した
RNAレベルでの解析）（図４６）
（１）プラスミドの構築（図４７〜図４８）
ヒト由来のRNAポリメラーゼIプロモーターの下流にA型インフルエンザウイルス（A/PR/8/34（H1N1））のNSをコードするセグメント由来の5’非翻訳領域（5’NCR）、A型インフルエンザウイルス（A/chicken/kumamoto/1-7/2014(H5N8)）由来のNP遺伝子のマイナス鎖、（A/PR/8/34（H1N1））のNSをコードするセグメント由来の3’非翻訳領域（3’NCR）、およびマウス由来のRNAポリメラーゼIターミネーターを配置したDNA配列を委託合成した。これをpUC19のXbaIサイトとAcc65Iサイト間にクローニングしてウイルスRNA発現プラスミドpUC-vRNA(Kuma_NP)(NCR_NS)を構築した。【００５５】
（２）定量リアルタイムPCRでのRNAレベルでの解析（複製系、ウイルスゲノムを使用したRNAレベルでの解析）
poly-D-lysine 35 mmディッシュに4×105個の293T細胞を播種し、10%非働化FBS含有DMEM培地で37℃・CO25%培養槽において24時間培養後、人工RNA制限酵素発現プラスミド2400 ng、もしくは空ベクターpcDNA3.1(+) 2400 ngを4種類のインフルエンザウイルス由来タンパク質発現プラスミドpCAGGS-PA、pCAGGS-PB1、pCAGGS-PB2、pCAGGS-NP各25 ng、ウイルスRNA発現プラスミドpUC-vRNA(Kuma_NP)(NCR_NS)2.5 ng、およびβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMV-b 2.5 ngとともにLipofectamine 3000を用いて293T細胞へコトランスフェクションした。37℃、CO2 5%培養槽で48時間培養後にTRIzolとRNeasy Mini kitを用いてトータルRNAを抽出し、DNaseI処理後にウイルスRNA特異的プライマーを用いて逆転写反応をし、RNaseH処理をしてから細胞内で複製したウイルスRNAを定量するためにTaqMan Fast Advanced Master Mixを用いてリアルタイムPCR解析を行った。また、ディッシュ間のトランスフェクション効率を標準化するために抽出したトータルRNAを用いてランダムプライマーで逆転写反応をし、RNaseH処理をしてからβ-ガラクトシダーゼmRNA発現量を定量するためにリアルタイムPCR解析を行った。細胞内のウイルスRNA量をβ-ガラクトシダーゼmRNA発現量で標準化した後、空ベクターpcDNA3.1(+)をトランスフェクションした条件を基準にして相対的なウイルスRNA複製量を評価した。【００５６】
測定結果を図４９に示す。本発明の人工ＲＮＡ制限酵素により相対的なウイルスRNA複製量が減少した。【００５７】
実施例５：細胞内での人工RNA制限酵素の機能評価（複製系、ウイルスゲノムを使用、細胞毒性評価）
poly-D-lysine 96ウェルプレートに2×104個の293T細胞を播種し、10%非働化FBS含有DMEM培地で37℃・CO2 5%培養槽において24時間培養後、人工RNA制限酵素発現プラスミド96 ng、もしくは空ベクターpcDNA3.1(+) 96 ngを4種類のインフルエンザウイルス由来タンパク質発現プラスミドpCAGGS-PA、pCAGGS-PB1、pCAGGS-PB2、pCAGGS-NP各1 ng、ウイルスRNA発現プラスミドpUC-vRNA(Kuma_NP)(NCR_NS)0.2 ng、およびβ-ガラクトシダーゼ発現プラスミドpCMV-b 0.2 ngとともにLipofectamine 3000を用いて293T細胞へコトランスフェクションした。37℃、CO2 5%培養槽で48時間培養後にCell Counting Kit-8のWST-8を10 ml添加し、37℃、CO25%培養槽で培養してからマルチプレートリーダーにて450 nmの吸光度を測定した。空ベクターpcDNA3.1(+)をトランスフェクションした条件を基準にして細胞生存率を評価した。【００５８】
測定結果を図５１に示す。本発明の人工ＲＮＡ制限酵素は細胞毒性を示さないことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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