(57)【要約】  本発明は、簡便で、かつ様々な種類の植物細胞及びタンパク質に広く適用可能な、植物へのタンパク質導入方法を提供することを課題とする。  本発明は、標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質及びキャリアペプチドを含む複合体、該複合体を用いる標的植物細胞に目的のタンパク質を導入する方法、並びに標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質及びキャリアペプチドを含むキット等により、上記課題を解決する。
2017126604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞透過性配列と、ポリカチオン配列又はポリアニオン配列とを含むキャリアペプチド、及び
標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質
を含む、キャリアペプチド/タンパク質複合体。
【請求項２】
前記細胞透過性配列が、KKLFKKILKYL（配列番号1）である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ポリカチオン配列がリシン（K）、アルギニン（R）及びヒスチジン（H）から選択される少なくとも3個のアミノ酸残基を含む、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項４】
前記ポリカチオン配列がKHの3〜20の繰り返し配列又はKの3〜20の連続配列を含む、請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
前記ポリアニオン配列がアスパラギン酸（D）及びグルタミン酸（E）から選択される少なくとも3個のアミノ酸残基を含む、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項６】
前記キャリアペプチドが、KKLFKKILKYLKKLFKKILKYLKKKKKKKK（配列番号23）、又はKKLFKKILKYLKHKHKHKHKHKHKHKHKH（配列番号24)のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の複合体。
【請求項７】
前記複合体の平均流体力学的直径が150〜700 nmである、請求項１又は２に記載の複合体。
【請求項８】
前記目的のタンパク質の分子量が、5 kDa〜200 kDaである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
前記目的のタンパク質が、TALEN-L若しくはTALEN-R、ZFN、又はCas9である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のキャリアペプチド/タンパク質複合体を製造する方法であって、
キャリアペプチドを目的のタンパク質と混合して請求項１〜９のいずれか一項に記載のキャリアペプチド/タンパク質複合体を形成させる工程
を含む、前記方法。
【請求項１１】
標的植物細胞に目的のタンパク質を導入する方法であって、
キャリアペプチドを目的のタンパク質と混合して請求項１〜９のいずれか一項に記載のキャリアペプチド/タンパク質複合体を形成させる工程、及び
得られた複合体を標的植物細胞に接触させる工程
を含む、前記方法。
【請求項１２】
ゲノム改変植物細胞を生産する方法であって、
キャリアペプチドを標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質と混合してキャリアペプチド/タンパク質複合体を形成させる工程、及び
得られた複合体を標的植物細胞に接触させる工程
を含み、
キャリアペプチドが細胞透過性配列と、ポリカチオン配列又はポリアニオン配列とを含み、
目的のタンパク質が、TALEN-L若しくはTALEN-R、ZFN、又はCas9である、前記方法。
【請求項１３】
ゲノム改変植物を生産する方法であって、
請求項１２に記載の方法により得られたゲノム改変植物細胞から、ゲノム改変植物を作出する工程
を含む、前記方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法により得られたゲノム改変植物細胞、又は請求項１３に記載の方法により得られたゲノム改変植物。
【請求項１５】
前記複合体を形成させる工程において、混合するキャリアペプチドと目的のタンパク質のモル比が2:1〜25:1である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的植物細胞が、イネ科、アブラナ科、ナス科、マメ科、又はヤナギ科に属する植物である、請求項１０〜１３又は１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
細胞透過性配列とポリカチオン配列又はポリアニオン配列とを含む、キャリアペプチドからなる、標的植物細胞への目的のタンパク質の導入剤。
【請求項１８】
標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質、及び
請求項１〜６のいずれか一項に規定されるキャリアペプチド
を含む、標的植物細胞に目的のタンパク質を導入するためのキット。
【請求項１９】
前記目的のタンパク質がTALEN-L若しくはTALEN-R、ZFN、又はCas9である、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質及びキャリアペプチドを含むキャリアペプチド/タンパク質複合体、該複合体の製造方法、該複合体を用いて標的植物細胞に目的のタンパク質を導入する方法、並びに標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質及びキャリアペプチドを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換えは、作物の生産性を改善し適応度を高めるために、広く用いられている植物育種技術の一つである。本技術によって改善され得る性質の例として、収量、栄養の質、除草剤耐性、乾燥耐性、農薬耐性、及びウイルス耐性等が挙げられる。また、改変された遺伝子組換え植物は、例えば、ホルモン、ワクチン、香料、及び着色料等の生産のための生物工場として用いることができる。【０００３】
現在のところ、遺伝子組換え植物は主にDNA形質転換法、例えば、アグロバクテリウム形質転換、プロトプラスト形質転換、及び微粒子銃等を用いて作製されている。しかしながら、このDNA形質転換法には、幾つかの潜在的問題、例えば、内因性の遺伝子を破壊する植物核ゲノム又はオルガネラゲノムへの外来性のDNAの予期せぬ組込み、又は遺伝子の水平伝播を介する土壌中の病原性細菌による抗生物質耐性の取り込み等が存在する（非特許文献１）。したがって、より安全に改変植物を作製し利用するためには、簡便で、かつ様々な種類の植物細胞及びタンパク質に広く適用可能な方法の開発が不可欠である。そのような方法として近年、遺伝子導入によらない直接的なタンパク質送達システムが注目されている。遺伝子導入によらない直接的なタンパク質送達システムは、動物においてはin vitro及びin vivoで広く開発されている（非特許文献２〜４）。しかしながら、植物の場合、厚く強固な細胞壁を有すること、タンパク質が一般に巨大分子であること、また植物細胞がタンパク質分解活性を有すること等の理由から、従来困難とされてきた。これらの点から、従来、安全にかつ多くの植物を改変して、改良された新しい品種の植物を作成することが困難であった。【０００４】
また、近年、TALEN、CRISPR/Cas9システム、及びZFNのようなゲノム編集技術が脚光を浴びている。ゲノム編集技術は、ゲノム上の任意遺伝子のノックアウトやゲノム上への外来遺伝子のノックイン等の遺伝子改変をゲノムレベルで可能にする技術である（非特許文献５）。一度の改変処理で継代可能な遺伝子改変植物を作成できる点で極めて優れた技術ではあるが、一方で一世代限りの一過的な遺伝子改変植物を作製することは困難である。一方、遺伝子発現を抑制する他の技術として、当該分野ではsiRNA等に代表されるRNAi（RNA干渉）技術が知られている（非特許文献６）。RNAi技術は、多くの場合、その効果が一世代〜数世代に限られるため、一過的な遺伝子改変植物を作製するという点では便利ではあるが、mRNAレベルでの抑制機構を利用した技術であって、ゲノム編集技術のようなゲノムレベルでの改変技術ではない。それ故に、ゲノムレベルで特定の遺伝子を改変し、かつその効果を一世代に限定できるような新たな技術が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nielsen K.M. et al., 1998, FEMS Microbiol. Rev., 22, pp. 79-103
【非特許文献２】Liang X. et al., 2015, J. Biotechnol., 208, pp. 44-53
【非特許文献３】Sarker S.R. et al., 2014, Mol. Pharm., 11, pp. 164-174
【非特許文献４】Schwarze S.R. et al., 1999, Science, 285, pp. 1569-1572
【非特許文献５】Esvelt KM. et al., 2013, Mol. Syst. Biol., 9, 641
【非特許文献６】Mahmood-ur-Rahman et al., Biotechnol. Adv., 26, 3, pp. 202-209
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、簡便で、かつ様々な種類の植物細胞及びタンパク質に広く適用可能な、植物へのタンパク質導入方法を提供すること、及び当該タンパク質の植物への導入により、一過的又は継代可能なゲノム改変植物を作出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、目的のタンパク質を植物細胞内へ送達するキャリアペプチドとして細胞透過性配列とポリカチオン配列とを組み合わせた融合ペプチドを構築した。そして、当該キャリアペプチドを導入すべき目的のタンパク質と混合することにより、植物細胞に対して優れたタンパク質導入効率を達成できるキャリアペプチド/タンパク質複合体が形成されることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００８】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
（１）細胞透過性配列と、ポリカチオン配列又はポリアニオン配列とを含むキャリアペプチド、及び
標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質
を含む、キャリアペプチド/タンパク質複合体。
（２）前記細胞透過性配列が、KKLFKKILKYL（配列番号1）である、（１）に記載の複合体。
（３）前記ポリカチオン配列がリシン（K）、アルギニン（R）及びヒスチジン（H）から選択される少なくとも3個のアミノ酸残基を含む、（１）又は（２）に記載の複合体。
（４）前記ポリカチオン配列がKHの3〜20の繰り返し配列又はKの3〜20の連続配列を含む、（３）に記載の複合体。
（５）前記ポリアニオン配列がアスパラギン酸（D）及びグルタミン酸（E）から選択される少なくとも3個のアミノ酸残基を含む、（１）又は（２）に記載の複合体。
（６）前記キャリアペプチドが、KKLFKKILKYLKKLFKKILKYLKKKKKKKK（配列番号23）、又はKKLFKKILKYLKHKHKHKHKHKHKHKHKH（配列番号24)のアミノ酸配列を含む、（４）に記載の複合体。
（７）前記複合体の平均流体力学的直径が150〜700 nmである、（１）又は（２）に記載の複合体。
（８）前記目的のタンパク質の分子量が、5 kDa〜200 kDaである、（１）〜（７）のいずれかに記載の複合体。
（９）前記目的のタンパク質が、TALEN-L若しくはTALEN-R、ZFN、又はCas9である、（１）〜（８）のいずれかに記載の複合体。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載のキャリアペプチド/タンパク質複合体を製造する方法であって、
キャリアペプチドを目的のタンパク質と混合して（１）〜（９）のいずれかに記載のキャリアペプチド/タンパク質複合体を形成させる工程
を含む、前記方法。
（１１）標的植物細胞に目的のタンパク質を導入する方法であって、
キャリアペプチドを目的のタンパク質と混合して（１）〜（９）のいずれかに記載のキャリアペプチド/タンパク質複合体を形成させる工程、及び
得られた複合体を標的植物細胞に接触させる工程
を含む、前記方法。
（１２）ゲノム改変植物細胞を生産する方法であって、
キャリアペプチドを標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質と混合してキャリアペプチド/タンパク質複合体を形成させる工程、及び
得られた複合体を標的植物細胞に接触させる工程
を含み、
キャリアペプチドが細胞透過性配列と、ポリカチオン配列又はポリアニオン配列とを含み、
目的のタンパク質が、TALEN-L若しくはTALEN-R、ZFN、又はCas9である、前記方法。
（１３）ゲノム改変植物を生産する方法であって、
（１２）に記載の方法により得られたゲノム改変植物細胞から、ゲノム改変植物を作出する工程
を含む、前記方法。
（１４）（１２）に記載の方法により得られたゲノム改変植物細胞、又は（１３）に記載の方法により得られたゲノム改変植物。
（１５）前記複合体を形成させる工程において、混合するキャリアペプチドと目的のタンパク質のモル比が2:1〜25:1である、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１６）前記標的植物細胞が、イネ科、アブラナ科、ナス科、マメ科、又はヤナギ科に属する植物である、（１０）〜（１３）又は（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）細胞透過性配列とポリカチオン配列又はポリアニオン配列とを含む、キャリアペプチドからなる、標的植物細胞への目的のタンパク質の導入剤。
（１８）標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質、及び
（１）〜（６）のいずれかに規定されるキャリアペプチド
を含む、標的植物細胞に目的のタンパク質を導入するためのキット。
（１９）前記目的のタンパク質がTALEN-L若しくはTALEN-R、ZFN、又はCas9である、（１８）に記載のキット。【０００９】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-009207号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、簡便で、かつ様々な種類の植物細胞及びタンパク質に広く適用可能な、植物細胞へのタンパク質導入方法が提供される。また、この導入方法を用いることにより、安全にかつ多くの植物の品種改良を容易に行うことができるようになる。さらに、本発明により、ゲノムレベルで特定の遺伝子を改変して、かつその遺伝子改変効果を一過的なものに制限することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1は、キャリアペプチド/BSA-RhB複合体のAFM（Atomic Force Microscope、原子間力顕微鏡）による観察結果を示す。キャリアペプチドは、（a）〜（d）では(BP100)2K8であり、（e）〜（h）ではBP100(KH)9である。キャリアペプチドとBSA-RhBのモル比は、（a）では1:1、（b）では5:1、（c）では10:1、（d）では25:1、（e）では1:1、（f）では5:1、（g）では10:1、（h）では25:1である。
【図２】図2は、ペプチド/BSA-RhB複合体の粒子サイズのAFMによる測定結果を示す。(a)〜（h）は図1の(a)〜（h）に対応する（ただし、n=50）。横軸は粒子の直径（nm）を、縦軸は粒子の数を示す。
【図３】図3は、キャリアペプチドによるBSA-RhBの送達効率を示す。図3(a)は、BSA-RhBに対するキャリアタンパク質のモル比1〜25で調製した(BP100)2K8/BSA-RhB複合体、及びBP100(KH)9/BSA-RhB複合体と接触させた6時間後のシロイヌナズナの葉から抽出した全粗タンパク質のSDS-PAGEの結果を示す。BSA-RhBの蛍光バンドを、蛍光イメージアナライザーにより検出した。陰性対照は、複合体未接触のシロイヌナズナの葉から抽出した全粗タンパク質である。陽性対照はBSA-RhBを直接SDS-PAGEに供した結果を示す。図3(b)は(BP100)2K8/BSA-RhB複合体を、図3(c)はBP100(KH)9/BSA-RhBを接触させた後にシロイヌナズナの葉から抽出したBSA-RhBの量（%）を示す棒グラフである。示した全てのデータは3回の試験の平均値±S.Dであり、*は、ペプチド/モル比1で接触させた複合体と比べて、統計的に有意に異なることを示す（Turkey's HSD試験、p<0.05）。
【図４】キャリアペプチドとタンパク質のモル比が10：1での(BP100)2K8/BSAキャリアペプチドによるBSA-RhB送達の経時分析を示す。(BP100)2K8/BSA-RhB複合体をYFP発現シロイヌナズナの葉に所定の時間接触後（0、1、3、6、12、24及び48時間後）にCLSM（Confocal Laser Scanning Microscopy、共焦点レーザー顕微鏡）で観察した。（a）はYFP発現シロイヌナズナの葉のサイトゾルで発現したYFP（黄色蛍光タンパク質）を、（b）は導入したBSA-RhB由来のRhBの蛍光を、（c）は細胞のプラスチド（葉緑体）の自家蛍光を、（d）は明視野の結果を、（e）は（a）〜（d）の四つのイメージの統合図を示す。スケールバーは20μmである。
【図５】図5は、(BP100)2K8/ADH-RhB複合体との接触6時間後の葉のCLSMによる観察結果を示す。スケールバーは50 μmである。(a)〜（e）は図4の(a)〜（e）に対応する（ただし、（b）は導入したADH-RhB由来のRhBの蛍光を示す）。
【図６】図6は、CLSMによる導入タンパク質の細胞内局在の分析結果を示す。（a）は陰性対象として(BP100)2K8/citrine複合体を、（b）は(BP100)2K8/citrine-NLS複合体を導入したシロイヌナズナの葉を示す。核は、DAPI（4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）により染色した。（c）は陰性対象として(BP100)2K8/citrine複合体を、（d）は(BP100)2K8/citrine-PTS複合体を導入したGFP-PTSを発現するシロイヌナズナの葉を示す。ペルオキシオームはGFP蛍光により可視化した。スケールバーは20μmである。
【図７】図7は、YFP発現シロイヌナズナの葉へTALEN-YFPを導入した際（接触1日後、3日後、6日後、8日後、10日後、及び14日後）のCLSMによる観察結果を示す。（a）は対照として水を導入した場合の、（b）はキャリアペプチド/TALEN-YFPを導入した場合の結果を示す。YFPはYFPの蛍光を、YFP+DICは、YFPの蛍光図と微分干渉図（differential interference contrast）の統合図を示す。
【図８】図8は、YFP発現ポプラの葉にTALEN-YFPを接触させた2日後のCLSMによる観察結果を示す。(a)は対照として(BP100)2K8を導入した場合の、(b)はキャリアペプチド/TALEN-YFPを導入した場合の結果を示す。YFPはYFPの蛍光を、YFP+DICは、YFPの蛍光図と微分干渉図（differential interference contrast）の統合図を示す。スケールバーは50μmである。
【図９】図9は、GFP発現トマト（マイクロトム、micro-tom）の葉にTALEN-GFPを導入した3日後のCLSMによる観察結果を示す。(a)は対照として(BP100)2K8を導入した場合の、(b)はキャリアペプチド/TALEN-GFPを導入した場合の結果を示す。GFPはGFPの蛍光を、GFP+DICは、GFPの蛍光図と微分干渉図（differential interference contrast）の統合図を示す。スケールバーは50μmである。
【図１０】図10は、Yfp1gRNA及びYfp2gRNAについて、Cas9、gRNA、Cas9-gRNA、及びCas9-gRNAとペプチドの複合体（ペプチド／Cas9-gRNAのモル比は1、5、10、又は25）の流体力学的直径（a）及びゼータ電位（b）を示したグラフである。
【図１１】図11は、YFP発現シロイヌナズナの葉にCas9及びYFPを標的とするガイドRNAを導入した6日後のCLSMによる観察結果を示す。(a)は対照として水を導入した場合の、(b)はキャリアペプチド/Cas9-gRNAを導入した場合の結果を示す。YFPはYFPの蛍光を、YFP+DICは、YFPの蛍光図と微分干渉図（differential interference contrast）の統合図を示す。スケールバーは50μmである。
【図１２】図12は、GFP発現マイクロトマトにCas9及びYFPを標的とするガイドRNAを導入した0日目及び8日目のCLSMによる観察結果を示す。(a)は対照としてキャリアペプチドのみを導入した場合の、(b)はキャリアペプチド/Cas9-gRNAを導入した場合の結果を示す。YFPはYFPの蛍光を、YFP+DICは、YFPの蛍光図と微分干渉図（differential interference contrast）の統合図を示す。スケールバーは50μmである。
【図１３】図13は、GFP発現イネにCas9及びYFPを標的とするガイドRNAを導入した0日目及び8日目のCLSMによる観察結果を示す。(a)は対照としてキャリアペプチドのみを導入した場合の、(b)はキャリアペプチド/Cas9-gRNAを導入した場合の結果を示す。YFPはYFPの蛍光を、YFP+DICは、YFPの蛍光図と微分干渉図（differential interference contrast）の統合図を示す。スケールバーは50μmである。
【図１４】図14は、NPT II／キャリアペプチド複合体（MPT II）又は水（対照）を浸透させたリンゴの葉に、75mg/mLの濃度のカナマイシン溶液を0日間〜10日間浸透させた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜キャリアペプチド/タンパク質複合体＞
一態様において、本発明は、標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質、及び細胞透過性配列と、ポリカチオン配列又はポリアニオン配列とを含むキャリアペプチドを含む、キャリアペプチド/タンパク質複合体に関する。
１．標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質
本明細書において、「標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質」（以下、単に「目的のタンパク質」とも記載する）の種類及び性質は、特に限定しない。例えば、構造タンパク質、分泌タンパク質、酵素、抗体、標識タンパク質、調節タンパク質、及び選択マーカータンパク質（例えばカナマイシン耐性を生ずるNPT（neomycin phosphotransferase）II、アンピシリン耐性を生ずるβラクタマーゼ等）、等のいずれであってもよい。具体的には、例えばBSA（Bovine serum albumin）、ADH（alcohol dehydrogenase）、改変YFPであるCitrine、NPT II等が挙げられる。目的タンパク質の好ましい例として、ゲノム編集タンパク質が挙げられる。本明細書において、「ゲノム編集」又は「ゲノム改変」とは、ゲノム上の標的部位を特異的に切断及び編集、例えば野生型のゲノム遺伝子に対して、特定の遺伝子をノックイン又はノックアウト等することを指す。ゲノム編集タンパク質の例として、TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）、Cas9（CRISPR associated protein 9）、及びZFN（zinc finger nuclease）、好ましくはTALEN及びCas9が挙げられる。2以上の目的タンパク質を同時に標的植物細胞に導入することもでき、例えば選択マーカータンパク質と他の目的のタンパク質を同時に導入することで、選択マーカーに基づいてタンパク質が導入された細胞を選択することが可能となり得る。
【００１３】
本明細書において「TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）」とは、核酸結合ドメインである転写活性化因子様エフェクター（Transcription activator-like effector、TALE）と、ヌクレアーゼドメインとを含むタンパク質を意味する。転写活性化因子様エフェクター(TALE)は、約34個のアミノ酸からなる反復配列を複数、例えば10〜30又は13〜25、好ましくは15〜20含む、キサントモナス等の細菌種由来のタンパク質である。各反復配列は標的核酸配列の1ヌクレオチド塩基に特異的な2アミノ酸残基を位置12及び13(反復可変二残基、RVD)に含む。反復配列の例として、LTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHG（配列番号26）が挙げられる（但し、本配列中の位置12及び13の配列は、標的ヌクレオチドの配列に応じて変更し得る。したがって、反復配列は、LTPEQVVAIASXXGGKQALETVQRLLPVLCQAHG（配列番号27）（ただし、12位及び13位のアミノ酸は標的ヌクレオチドへの結合に応じて規定される）であってよい）。また、配列番号26又は27のアミノ酸配列において、1個から複数個のアミノ酸残基が置換、挿入、及び/又は欠失し、かつDNAへの結合特異性を維持するアミノ酸配列を用いることもできる。本明細書において、「複数個」とは、例えば10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、6個以下、好ましくは5個以下又は4個以下、さらに好ましくは3個以下又2個以下を意味する。ヌクレオチドを特異的に認識するRVDの例として：Cを認識するHD；Tを認識するNG；Aを認識するNI；G又はAを認識するNN；及びA、C、G又はTを認識するNS等が挙げられる。RVD及びその認識配列の詳細については、例えばWO2011/072246号を参照されたい。別の実施形態において、RVDの12及び13位のアミノ酸は、ヌクレオチドA、T、C及びGに対するそれらの特異性を増強するために他のアミノ酸残基に変異されてもよい。
【００１４】
TALENにおけるヌクレアーゼドメインは、好ましくはエンドヌクレアーゼ活性を有するドメイン(例えばI-TevI、ColE7、NucA及びFokI等、好ましくはFokI）である。これらのドメインのアミノ酸配列は当業者には知られており、例えばFokIは、配列番号25のアミノ酸配列を含む。ヌクレアーゼドメインとして、配列番号25のアミノ酸配列において、1個から複数個のアミノ酸残基が置換、挿入、及び/又は欠失したアミノ酸配列を含み、かつエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、並びに配列番号25のアミノ酸配列に対し70%以上、80%以上、例えば90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつエンドヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを用いてもよい。本明細書において、同一性の値は、複数の配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。ヌクレアーゼドメインとして、特異性及びを高めるために改変されたFokIを用いることもできる（例えば、Doyon Y. et al., Nature Methods, 2010, 8 (1), pp. 74-79、及びSzczepek M. et al., Nature Biotechnology, 2007, 25 (7), pp. 786-793）。FokIは二量体となった場合に活性となるため（Bitinaite et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, pp. 10,570-10,575）、FokIをヌクレアーゼドメインとして用いた場合、標的DNA配列の二本鎖の異なる鎖に結合した場合にのみ活性が生じる。この場合、TALENがヌクレアーゼ活性を有するためには、TALEN-L（TALEN-LEFT）及びTALEN-R（TALEN-RIGHT）の二種類のTALENが必要であり、TALEN-L及びTALEN-Rは、標的DNA配列の二本鎖の異なる鎖に、例えば8〜40、10〜34、又は12〜32のスペーサー配列を介して結合する。TALENの作製方法及び使用方法の詳細については、例えばWO2011/072246号を参照されたい。
【００１５】
本明細書において、「Cas9（CRISPR associated protein 9）」とは、guide RNAと共に、Cas9/CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）系を構成するタンパク質である。Cas9/CRISPR系は配列特異的なDNA結合及び切断を利用する系であり、その配列特異性はガイドRNAによって決定される（Hendel A. et al., Nature Biotechnology, 2015, 33, pp. 985-989）。Cas9タンパク質の由来となる生物種は特に制限しないが、例えばStreptococcus pyogenes serotype M1由来のCas9（SwissProtデータベース中のアクセッション番号Q99ZW2、Cas9のアミノ酸配列を配列番号30で示す）であってよく、また配列番号51のアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いることもできる。Cas9タンパク質を改変してもよく、改変されたCas9タンパク質の例として、配列番号30又は51のアミノ酸配列において、1個から複数個のアミノ酸残基が置換、挿入、及び/又は欠失したアミノ酸配列を含み、かつヌクレアーゼ活性を有するポリペプチド、並びに配列番号30又は51のアミノ酸配列に対し70%以上、80%以上、例えば90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。
【００１６】
ガイドRNA（gRNA）は、PAM（protospacer adjacent motif）配列（NNG）の下流の配列に相補的であるヌクレオチドを含む。ガイドヌクレオチドの長さは特に限定されないが、例えば15〜30ヌクレオチド又は18〜24ヌクレオチド、好ましくは19〜22ヌクレオチドである。当業者であれば、標的ヌクレオチド配列に基づいて、ガイドヌクレオチドの配列を容易に設計することができる。Cas9タンパク質は、gRNAが結合した標的DNAに結合し、DNAを切断する。配列特異性を高めるため、Cas9に含まれる2つの独立したヌクレアーゼドメイン（それぞれ、HNH及びRuvCエンドヌクレアーゼに対して相同性を有する）のいずれかを突然変異させることによって、Cas9タンパク質をニッカーゼに変換することができる（Cong L. et al., Science, 2013, 339, pp. 819-823）。この場合、標的DNA配列の切断には、標的DNA配列の異なる鎖を切断する2つのガイドRNAが必要となる。本発明において、標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質がCas9である場合、Cas9とgRNAの同時送達を可能とするため、本発明の複合体はさらにgRNAを含むことが好ましい。gRNAは、例えばキャリアペプチドとのイオン相互作用により複合体に結合させることができる。
【００１７】
本明細書において、「ZFN（zinc finger nuclease）」とは、少なくとも一つのジンクフィンガーDNA結合ドメインと、該結合ドメインに機能可能に連結されたDNA切断ドメインとを含むキメラタンパク質を意味する。DNA切断ドメインは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインのC末端側に連結されていることが好ましい。通常、一つのジンクフィンガーDNA結合ドメインは3つの塩基を認識し、ZFNは、典型的に3〜6のジンクフィンガーDNA結合ドメインを含むため、これにより9〜18の塩基を認識する。ジンクフィンガードメインは、例えばジンクフィンガー転写因子TFIIIA又はSp1によって表されるCis2His2型のジンクフィンガーを含んでよい。ZFNのDNA認識特異性及び/又は結合特異性は、任意の部位で遺伝子組換えを生じるように改変することができる。このような改変は、公知の分子生物学的技術及び/又は化学的合成技術を使用して行うことができる（例えば、M. Bibikova et al., Genetics, 2002, 161, pp. 1169-1175を参照）。DNA切断ドメインは、非特異的DNA切断ドメイン（例えば、FokI等のII型制限酵素のDNA切断ドメイン）に由来する。上記の通り、FokIは二量体となった場合に活性となるため、標的DNA配列の異なる鎖に結合するジンクフィンガーDNA結合ドメイン-FokI融合タンパク質を2つ使用することで、特異的にDNAを切断することができる。
【００１８】
本発明において、目的のタンパク質の分子量は特に制限されず、例えば5 kDa以上、10 kDa以上、15 kDa以上、好ましくは20 kDa以上、25 kDa以上、30 kDa以上、40 kDa以上、又は50 kDa以上、また300 kDa以下、250 kDa以下、200 kDa以下、好ましくは190 kDa以下、180 kDa以下、170 kDa以下、又は160 kDa以下であってよい。
【００１９】
また、目的のタンパク質の電荷は、以下で記載するキャリアペプチドとイオン相互作用により複合体を形成できる限り、特に限定しない。キャリアペプチドが正に荷電している場合には目的のタンパク質は負に荷電しているのが好ましく、キャリアペプチドが負に荷電している場合には目的のタンパク質は正に荷電しているのが好ましい。キャリアペプチドとのイオン相互作用を容易にするために、目的のタンパク質は、当業者に公知の手法により改変されていてもよい。例えば、キャリアペプチドと反対の電荷を有するアミノ酸を含むペプチドを目的のタンパク質に付加することで、キャリアペプチドと目的のタンパク質のイオン相互作用を強めることができる。
２．標的植物細胞
本発明において標的植物細胞の種類は特に制限されず、単子葉植物及び双子葉植物を含む被子植物、裸子植物、コケ植物、シダ植物、草本植物及び木本植物等いずれの植物細胞にも本発明を適用できる。植物の具体例としては、例えば、ナス科［ナス（Solanum melongena L.）、トマト（Solanum lycopersicum）、ピーマン（Capsicum annuum L. var. angulosum Mill.）、トウガラシ（Capsicum annuum L.）、タバコ（Nicotiana tabacum L.）等］、イネ科［イネ（Oryza sativa）、コムギ（Triticum aestivum L.）、オオムギ（Hordeum vulgare L.）、ペレニアルライグラス（Lolium perenne L.）、イタリアンライグラス（Lolium multiflorum Lam.）、メドウフェスク（Festuca pratensis Huds.）、トールフェスク（Festuca arundinacea Schreb.）、オーチャードグラス（Dactylis glomerata L.）、チモシー（Phleum pratense L.）等］、アブラナ科［シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、アブラナ（Brassica campestris L.）、キャベツ（Brassica oleracea L. var. capitata L.）、ダイコン（Raphanus sativus L.）、ナタネ（Brassica campestris L., B. napus L.）等］、マメ科［ダイズ（Glycine max）、アズキ（Vigna angularis Willd.）、インゲン（Phaseolus vulgaris L.）、ソラマメ（Vicia faba L.）等］、ウリ科［キュウリ（Cucumis sativus L.）、メロン（Cucumis melo L.）、スイカ（Citrullus vulgaris Schrad.）、カボチャ（C. moschata Duch., C. maxima Duch.）等］、ヒルガオ科［サツマイモ（Ipomoea batatas）等］、ユリ科［ネギ（Allium fistulosum L.）、タマネギ（Allium cepa L.）、ニラ（Allium tuberosum Rottl.）、ニンニク（Allium sativum L.）、アスパラガス（Asparagus officinalis L.）等］、シソ科［シソ（Perilla frutescens Britt. var. crispa）等］、キク科［キク（Chrysanthemum morifolium）、シュンギク（Chrysanthemum coronarium L.）、レタス（Lactuca sativa L. var. capitata L.）、ハクサイ（Brassica pekinensis Rupr.）等］、バラ科［バラ（Rose hybrida Hort.）、イチゴ（Fragaria x ananassa Duch.）等］、ミカン科［ミカン（Citras unshiu）、サンショウ（Zanthoxylum piperitum DC.）等］、フトモモ科［ユーカリ（Eucalyptus globulus Labill）等］、ヤナギ科［ポプラ（Populas nigra L. var. italica Koehne）等］、アカザ科［ホウレンソウ（Spinacia oleracea L.）、テンサイ（Beta vulgaris L.）等］、リンドウ科［リンドウ（Gentiana scabra Bunge var. buergeri Maxim.）等］、ナデシコ科［カーネーション（Dianthus caryophyllus L.）等］の植物が挙げられる。とりわけイネ科植物、アブラナ科植物、ナス科植物、マメ科植物、及びヤナギ科植物、中でもシロイヌナズナ等のアブラナ科植物、トマト等のナス科植物、及びポプラ等のヤナギ科植物が好ましく使用される。
【００２０】
植物細胞としては、任意の組織に由来する植物細胞を使用でき特に制限されないが、例えば、胚、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、茎及び組織培養物等に由来する植物細胞を使用できる。
３．キャリアペプチド
本発明において、キャリアペプチドは、タンパク質とのイオン性相互作用によりキャリアペプチド/タンパク質複合体（以下、単に「複合体」とも記載する）を形成し、植物細胞へのタンパク質の導入を仲介する輸送単体として機能し得るペプチドである。本発明のキャリアペプチドは、細胞透過性配列とポリカチオン配列又はポリアニオン配列とを含むことを特徴とする。上記の通り、キャリアペプチドはイオン性相互作用によりタンパク質と複合体を形成することから、目的のタンパク質が負に荷電している場合には、ポリカチオン配列を含み、目的のタンパク質が正に荷電している場合には、ポリアニオン配列を含む。本発明においてキャリアペプチドは、糖鎖、脂質、及び/又はリン酸残基を含んでいてもよい。
【００２１】
「細胞透過性配列」とは、細胞透過性ペプチド（CPP：Cell Penetrating Peptide）の配列を意味する。細胞透過性ペプチドとは、細胞膜を透過して細胞内に侵入し得るペプチドを意味する。細胞透過性ペプチドとしては、例えば、BP100（Appl Environ Microbiol 72 (5), 3302, 2006）、HIV Tat (Journal Biological Chemistry, 272, pp.16010-16017, 1997)、Tat2（Biochim Biophys Acta 1768 (3), 419, 2007）、Penetratin、pVEC、pAntp(Journal Biological Chemistry, 269, pp.10444-10450, 1994)、HSV-1 VP22(Cell, 88, pp.223-233, 1997)、MAP(Model amphiphilic peptide)（Biochimica Biophysica Acta, 1414, pp.127-139, 1998）、Transportan（FEBS Journal, 12, pp.67-77, 1998）、R7（Nature Medicine, 6, pp.1253-1257, 2000）、MPG（Nucleic Acid Research 25, pp.2730-2736, 1997）、及びPep-1（Nature Biotechnology, 19, pp.1173-1176, 2001）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
細胞透過性配列の具体例としては、例えば以下の配列：KKLFKKILKYL(配列番号1)、RKKRRQRRRRKKRRQRRR(配列番号2)、RKKRRQRRR(配列番号3)、PLSSIFSRIGDP(配列番号4)、PISSIFSRTGDP(配列番号5)、AISSILSKTGDP(配列番号6)、PILSIFSKIGDL(配列番号7)、PLSSIFSKIGDP(配列番号8)、PLSSIFSHIGDP(配列番号9)、PLSSIFSSIGDP(配列番号10)、RQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号11)、DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD(配列番号12)、AAVALLPAVLLALLAP(配列番号13)、AAVLLPVLLAAP(配列番号14)、VTVLALGALAGVGVG(配列番号15)、GALFLGWLGAAGSTMGA(配列番号16)、MGLGLHLLVLAAALQGA(配列番号17)、LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP(配列番号18)、GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(配列番号19)、及びKLALKLALKALKAALKLA(配列番号20)を挙げることができる。これらのペプチド配列に含まれる１個から複数個のアミノ酸残基が置換、挿入、及び/又は欠失し、かつ細胞透過性を有するペプチド配列を好適に使用できる場合もある。上記の配列に加えて、使用可能な細胞透過性配列の例を以下の表1に示す。
【００２３】
【表１】
2017126604.tif 000003
【００２４】
2017126604.tif 000004
【００２５】
表1に記載の参考文献の詳細は以下の通りである。
2017126604.tif 000005
【００２６】
2017126604.tif 000006
【００２７】
一実施形態において、細胞透過性配列は、配列番号1〜20、22、及び63〜113で示されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列に含まれる１個から複数個のアミノ酸残基が置換、挿入、及び/又は欠失し、かつ細胞透過性を有する配列を含む。
【００２８】
一実施形態において、細胞透過性配列は以下で記載するポリカチオン配列、例えば配列番号4〜9で示されるアミノ酸配列を含んでよい。この場合、本発明のキャリアペプチドは、細胞透過性配列として機能するポリカチオン配列に加えて、さらに同一の又は異なるポリカチオン配列又はポリアニオン配列を含む。
【００２９】
細胞透過性ペプチドとして、2種以上の細胞透過性ペプチドを組み合わせて用いてもよい。目的の特定の細胞に対して特異的な細胞透過性ペプチドを選択することも好ましい。
【００３０】
本明細書において、「ポリカチオン配列」は、リシン（K）、アルギニン（R）及びヒスチジン（H）から選ばれる少なくとも3個のアミノ酸残基を含み、かつ生理学的条件下で負に荷電したタンパク質とイオン結合を介して安定した結合を形成するペプチド配列である。正に荷電したアミノ酸残基（カチオン性アミノ酸残基）のリシン、アルギニン及びヒスチジンの他に、ポリカチオン成分は、その全体的な性質が十分にカチオン性を保持して生理学的条件下でタンパク質と安定した結合を形成するという条件で、中性アミノ酸を含むこともできる。これはタンパク質を添加する簡単な実験で検査できる。例えば、キャリアペプチドを目的のタンパク質と混合し、混合物中の粒子のゼータ電位及び／又は粒子径を測定することにより検査できる。例えば、負の電荷を有する目的のタンパク質にキャリアペプチドを加えたときに、ゼータ電位が負の値から正の値へ変化するかどうかを決定することにより、キャリアペプチドとタンパク質の複合体の形成の有無を調べることができる。
【００３１】
キャリアペプチドのポリカチオン配列は少なくとも3個のリシン、アルギニン又はヒスチジンを含むが、その上限は限定されない。ポリカチオン配列は最高450個のアミノ酸残基を含むことができ、それでもなお機能することが知られている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 3410-3414)。しかしながら、ポリカチオン配列の長さは5〜100個のアミノ酸残基であることが好ましく、より好ましくは5〜50個、さらに好ましくは7〜20個のアミノ酸残基である。ポリカチオン配列中のカチオン性アミノ酸残基の割合は、好ましくは40モル％以上であり、より好ましくは60モル％以上、さらに好ましくは80モル％以上、最も好ましくは90モル％以上である。ポリカチオン性アミノ酸残基のみからなるポリカチオン配列が最も好ましく使用される。
【００３２】
ポリカチオン配列は、好ましくは4個以上、より好ましくは5個以上、さらに好ましくは7個以上で、好ましくは30個以下、より好ましくは25個以下、さらに好ましくは20個以下のリシン、アルギニン及び/又はヒスチジン残基を含む。さらに、ポリカチオン配列は、好ましくは3個以上、さらに好ましくは5個以上、特に好ましくは7個以上の連続したリシン、アルギニン及び/又はヒスチジン残基を有する。カチオン性アミノ酸残基のうち、アルギニンの割合が高いと細胞内への導入が早くなる傾向があり、ヒスチジン及びリシンの割合が高いと細胞内への導入が遅くなる傾向がある。したがってポリカチオン配列を適宜選択することによって、後述するオルガネラ特異的な導入等、本発明の複合体の使用目的に応じて、細胞内への導入速度を制御することができる。ポリカチオン配列の好ましい例として、KHの繰り返し配列、例えば、KHの3〜20個の繰り返し配列、より好ましくはKHの5〜15個の繰り返し配列、さらに好ましくはKHの7〜12個の繰り返し配列が挙げられる。ポリカチオン配列の例として、アルギニン（R）の連続配列、例えば、Rの3〜20個の連続配列、好ましくはRの5〜15個の連続配列、さらに好ましくはRの7〜12個の連続配列、リシン（K）の連続配列、例えば、Kの3〜20個の連続配列、好ましくはKの5〜15個の連続配列、さらに好ましくはKの7〜12個の連続配列、ヒスチジン（H）の連続配列、例えば、Hの3〜20個の連続配列、好ましくはHの5〜15個の連続配列、さらに好ましくはHの7〜12個の連続配列が挙げられる。ポリカチオン配列の具体例としては、例えば次の配列：KKKKKKKK（配列番号21）及びKHKHKHKHKHKHKHKHKH（配列番号22）を挙げることができる。
【００３３】
本明細書において、「ポリアニオン配列」は、アスパラギン酸（D）及びグルタミン酸（E）から選ばれる少なくとも3個のアミノ酸残基を含み、かつ生理学的条件下で正に荷電したタンパク質と安定した結合を形成するペプチド配列である。負に荷電したアミノ酸残基（アニオン性アミノ酸残基）のアスパラギン酸及びグルタミン酸の他に、ポリアニオン成分は、その全体的な性質が十分にアニオン性を保持して生理学的条件下でタンパク質と安定した結合を形成するという条件で、中性アミノ酸を含むこともできる。これはポリカチオン配列と同様にタンパク質を添加する簡単な実験で検査できる。例えば、キャリアペプチドを目的のタンパク質と混合し、混合物中の粒子のゼータ電位及び／又は粒子径を測定することにより検査できる。例えば、正の電荷を有する目的のタンパク質にキャリアペプチドを加えたときに、ゼータ電位が正の値から負の値へ変化するかどうかを決定することにより、キャリアペプチドとタンパク質の複合体の形成の有無を調べることができる。
【００３４】
キャリアペプチドのポリアニオン配列は少なくとも3個のアスパラギン酸又はグルタミン酸を含むが、その上限は限定されない。ポリアニオン配列の長さは5〜100個のアミノ酸残基であることが好ましく、より好ましくは5〜50個、さらに好ましくは7〜20個のアミノ酸残基である。ポリアニオン配列中のアニオン性アミノ酸残基の割合は、好ましくは40モル％以上であり、より好ましくは60モル％以上、さらに好ましくは80モル％以上、最も好ましくは90モル％以上である。ポリアニオン性アミノ酸残基のみからなるポリアニオン配列が最も好ましく使用される。
【００３５】
ポリアニオン配列は、好ましくは4個以上、より好ましくは5個以上、さらに好ましくは7個以上で、好ましくは30個以下、より好ましくは25個以下、さらに好ましくは20個以下のアスパラギン酸及び/又はグルタミン酸残基を含む。さらに、ポリアニオン配列は、好ましくは3個以上の、さらに好ましくは5個以上、特に好ましくは7個以上の連続したアスパラギン酸及び/又はグルタミン酸残基を有する。ポリアニオン配列の好ましい例として、アスパラギン酸（D）の繰り返し配列、例えば、Dの3〜20個の繰り返し配列、より好ましくはDの5〜15個の繰り返し配列、さらに好ましくは7〜12個の繰り返し配列が挙げられる。アルギニン（R）の連続配列、例えば、Rの3〜20個の連続配列、好ましくはRの5〜15個の連続配列、さらに好ましくはRの7〜12個の連続配列、グルタミン酸（E）の連続配列、例えば、Eの3〜20個の連続配列、好ましくはEの5〜15個の連続配列、さらに好ましくはEの7〜12個の連続配列もポリアニオン配列の例として挙げられる。
【００３６】
本発明のキャリアペプチドは、細胞透過性配列とポリカチオン配列又はポリアニオン配列の線状融合体に相当する。この融合体においては、ポリカチオン配列又はポリアニオン配列が細胞透過性配列のN末端及び/又はC末端に結合されることが好適である。細胞透過性配列に対して上記のポリカチオン配列又はポリアニオン配列を1個又は2個以上、好ましくは1個から複数個、より好ましくは1個から3個程度結合することができる。特に好ましくは細胞透過性配列に対してポリカチオン配列又はポリアニオン配列を1個結合することができる。細胞透過性配列に対してポリカチオン配列又はポリアニオン配列を結合させたペプチドは、例えば、固相法等の一般的なペプチドの合成方法に従って合成することもできるし、遺伝組換えを用いて生物工学学的に作製することもできる。また、別に調製した細胞透過性配列とポリカチオン配列又はポリアニオン配列を、例えば架橋反応により化学的に結合することもできる。ポリカチオン配列又はポリアニオン配列に対して細胞透過性配列を結合するにあたり、両者の間に適宜オリゴペプチドリンカー等を介在させることもできる。例えば、1個から複数個のアミノ酸からなるリンカーを介在させることができるが、該リンカーを構成するアミノ酸残基は適宜選択することができる。細胞透過性ペプチドはN末端でその特性を顕著に示すので、細胞透過性配列はポリカチオン配列又はポリアニオン配列のN末側に結合することが好ましい。本発明のキャリアペプチドを組み換えDNA技術により作製する場合、例えば、ポリカチオン配列又はポリアニオン配列をコードするDNA断片を、細胞透過性配列をコードするDNA断片の一端又は両端に、適当なDNAアダプターとの連結反応により結合する。かかる遺伝子操作法は分子生物学の分野で当業者によく知られている。
【００３７】
本発明のキャリアペプチドは、細胞透過性配列及びポリカチオン配列又はポリアニオン配列に加えて、任意の配列、例えばオルガネラ移行配列をさらに含むことができる。オルガネラ移行配列は、特定の細胞内オルガネラに対して親和性又は透過性を有するペプチドの配列を指す。オルガネラ移行配列を加えることで、植物細胞内の任意のオルガネラに、目的のタンパク質を送達することが可能となる。オルガネラ移行配列の例として、例えば、核を標的とする核移行シグナル（nuclear localization signal、NLS）、及びペルオキシソーム標的シグナル（peroxisomal targeting signal、PTS）等が挙げられる。また、ミトコンドリア又は葉緑体に対して親和性又は透過性を有するペプチドの配列を用いることもできる。より具体的には、クラミドモナスフェレドキシン（Cf）及びクラミドモナスRubiscoアクチバーゼ（CRa）起源の葉緑体移行ペプチド、ミトコンドリアマトリックス標的シグナルペプチド(Biochemical and Biophysical Research Communications, 1996, 226, pp.561-565）、ミトコンドリア内膜標的シグナルペプチドであるSS01、SS02、SS31、及びSS20（The AAPS Journal, 2006, 8, pp.E277-E283）、50Sリボソームタンパク質L28、50Sリボソームタンパク質L24、50Sリボソームタンパク質L27、RuBisCoスモールチェーン、LHCII type 1等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００３８】
オルガネラ移行配列の具体例としては、例えば以下の配列：PKKKRKV（配列番号31）、SKL（配列番号32）、MAMAMRSTFAARVGAKPAVRGARPASRMSCMA(配列番号33)、MQVTMKSSAVSGQRVGGARVATRSVRRAQLQV(配列番号34)、MATMVAGISLRGPVMSSHRTFSVTKRASLPQSKLSSELSFVTSQLSGLKISSTHFISSSAPLSVPFKPSLQPVA(配列番号35)、MAALQSSFAGLSTSFFGQRFSPPLSLPPLVKSTEGPCLIQA(配列番号36)、MAVSFSLVGAFKGLSLASSSSFLKGDFGAAFPVAPKFSVSFPLKSPLTIES(配列番号37)、MASSVLSSAAVATRSNVAQANMVAPFTGLKSAASFPVSRKQNLDITSIASNGGRVQC(配列番号38)、MAASTMALSSPAFAGKAVKLSPAASEVLGSGRVTMRKTV(配列番号39)、MLSLRQSIRFFK(配列番号40)を挙げることができる。これらのペプチド配列に含まれる1個から複数個のアミノ酸残基が置換、挿入、及び/又は欠失したペプチド配列を好適に使用できる場合もある。これらのうちの1種又は2種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００３９】
本発明のキャリアペプチドの配列の例として、例えばKKLFKKILKYLKKLFKKILKYLKKKKKKKK（配列番号23、(BP100)2K8）、又はKKLFKKILKYLKHKHKHKHKHKHKHKHKH（配列番号24、BP100(KH)9)を含むアミノ酸配列、好ましくはKKLFKKILKYLKKLFKKILKYLKKKKKKKK（配列番号23）を含むアミノ酸配列が挙げられる。
【００４０】
キャリアペプチドとタンパク質との複合体の形態に限定はないが、通常粒子の形態であり、その平均流体力学的直径は、好ましくは100 nm以上、より好ましくは150 nm以上、さらに好ましくは200 nm以上であり、また、好ましくは700 nm以下、より好ましくは600 nm以下、さらに好ましくは550 nm以下である。平均流体力学的直径は、動的光散乱（DLS）法によって測定することができる。本発明者らは、このような平均流体力学的直径を有する複合体により、植物細胞に対して高いタンパク質導入効率を達成できることを見出した。
【００４１】
本発明の複合体は、キャリアペプチドと目的のタンパク質以外に、他の物質を含んでいてもよい。例えば、目的のタンパク質がCas9である場合には、Cas9とガイドRNAの同時送達を可能とするために、複合体はガイドRNAを含んでいることが好ましい。
＜キャリアペプチド/タンパク質複合体の製造方法＞
一態様において、本発明は、キャリアペプチドを標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質と混合してキャリアペプチド/タンパク質複合体を形成させる工程を含む、キャリアペプチド/タンパク質複合体の製造方法に関する。
【００４２】
本態様において、キャリアペプチド、目的のタンパク質、キャリアペプチド/タンパク質複合体、及び標的植物細胞の構成については上記の通りであるからここでは記載を省略する。
【００４３】
キャリアペプチドを目的のタンパク質と混合する工程においては、目的のタンパク質に対するキャリアペプチドのモル比は好ましくは1以上であり、さらに好ましくは2以上、3以上、4以上、最も好ましくは5以上であり、また、好ましくは50以下であり、さらに好ましくは40以下、30以下、25以下、20以下、又は15以下、最も好ましくは10以下である。したがって、混合工程におけるキャリアペプチドと目的のタンパク質のモル比は、例えば1:1〜50:1、2:1〜25：1、好ましくは3:1〜20：1又は5:1〜10：1である。上記範囲のモル比でキャリアペプチドとタンパク質とを混合して複合体を形成することにより、植物細胞に対して高いタンパク質導入効率を達成できる。
【００４４】
キャリアペプチドとタンパク質とを混合して複合体を形成させる工程は、例えばキャリアペプチドとタンパク質とを溶液中で混合することにより実施できるが、その場合、キャリアペプチドの濃度は、通常10μg/mL〜10mg/mL、好ましくは100μg/mL〜1mg/mLであり、キャリアペプチド溶液の濃度は、通常1μg/mL〜10mg/mL、好ましくは10μg/mL〜1mg/mLである。
【００４５】
キャリアペプチドとタンパク質とを混合して複合体を形成させる工程の条件は特に限定しないが、例えば常温（20〜35℃の温度）で、数分〜数時間、例えば5分〜6時間、10分〜3時間、好ましくは20分〜1時間インキュベーションすることにより行うことができる。
＜標的植物細胞に目的のタンパク質を導入する方法＞
一態様において、本発明は、キャリアペプチドを標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質と混合して本発明のキャリアペプチド/タンパク質複合体を形成させる工程、及び得られた複合体を標的植物細胞に接触させる工程を含む、標的植物細胞に目的のタンパク質を導入する方法に関する。
【００４６】
本態様において、キャリアペプチド、目的のタンパク質、キャリアペプチド/タンパク質複合体、及び標的植物細胞、並びにキャリアペプチドを目的のタンパク質と混合する工程の構成については上記の通りであるからここでは記載を省略する。
【００４７】
複合体を標的植物細胞に接触させる工程は、当技術分野で公知の方法により実施でき、特に制限されない。例えば本発明のキャリアペプチドとタンパク質との複合体の溶液を標的植物細胞に接触させ、例えば常温（20〜35℃の温度の温度）で、一日当たり8時間〜18時間の一定光の下、インキュベーター中でインキュベートすることにより実施できる。インキュベーション時間は、好ましくは1時間〜150時間、さらに好ましくは3時間〜50時間より好ましくは5時間〜30時間である。本発明のタンパク質導入方法は、比較的短時間にタンパク質導入を行うために特に優れている。また、接触工程は、培養細胞等の細胞に対して行うこともできるし、例えば植物の胚、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、花、種子、さや、茎等の植物組織、及び組織培養物に対して直接行うこともできる。
【００４８】
本方法は、複合体を標的植物細胞に接触させる工程の前に、任意に標的植物細胞に目的のタンパク質の導入を容易にするための工程を含んでもよい。そのような工程として、例えば標的植物細胞に対する高強度の光の照射が挙げられる。光強度の例として、20 μmol/m2sec〜500 μmol/m2sec、50 μmol/m2sec〜200 μmol/m2sec、好ましくは80 μmol/m2sec〜100 μmol/m2secが挙げられ、照射時間の例として、例えば2時間〜20時間、4時間〜15時間、好ましくは6時間〜10時間が挙げられる。
＜植物のゲノム改変方法＞
目的のタンパク質がTALEN、Cas9、及びZFN等のゲノム編集タンパク質である場合、本発明のタンパク質導入方法は、ゲノム編集方法として用いることができる。すなわち、一実施形態において、本発明は、標的植物細胞のゲノムを編集若しくは改変する方法、又はゲノム改変植物細胞を生産する方法に関し、本方法は、キャリアペプチドを標的植物細胞に導入すべきゲノム編集タンパク質と混合して本発明のキャリアペプチド/タンパク質複合体を形成させる工程、及び得られた複合体を標的植物細胞に接触させる工程を含む。キャリアペプチド、目的のタンパク質、キャリアペプチド/タンパク質複合体、及び標的植物細胞、並びにキャリアペプチドを目的のタンパク質と混合する工程、及び得られた複合体を標的植物細胞に接触させる工程の構成については上記の通りであるからここでは記載を省略する。
【００４９】
本方法は、内因性の遺伝子を破壊する植物核ゲノム又はオルガネラゲノムへの外来性のDNAの予期せぬ組込み、又は遺伝子の水平伝播を介する土壌中の病原性細菌による抗生物質耐性の取り込み等の問題が生じ得ないため、後代にゲノム編集の影響を残し得る従来の方法に比べて優れている。
【００５０】
本方法を植物体に直接適用することで、一過的なゲノム改変植物の作出に用いることができる。本明細書において、「一過的なゲノム改変」とは、改変されたゲノムが後代に伝わらず、ゲノム改変の効果が処理を行った植物にのみ限定されることを意味する。また、本方法を植物細胞に適用し、この植物細胞から植物体を作出することで、継代可能なゲノム改変植物を得ることもできる。本明細書において、「継代可能なゲノム改変」とは、改変されたゲノムが後代に伝わり、ゲノム改変の効果が処理を行った植物の後代にまで及ぶことを意味する。
【００５１】
したがって、一実施形態において、本発明は、上記の方法により得られたゲノム改変植物細胞から、ゲノム改変植物を作出する工程を含む、ゲノム改変植物を生産する方法に関する。ゲノム改変植物細胞からゲノム改変植物を作出する工程は当業者には公知でる。例えば、胚及び種子等の生殖細胞に本発明のゲノム改変方法を適用し、これを成長させることによって、ゲノム改変植物を得ることができる。また、葉、葯、根、根端、花、種子等の植物組織に本発明のゲノム改変方法を適用し、これを脱分化させてカルスを得た後、カルスを細分化させてゲノム改変植物を得ることもできる。植物及び組織の種類によっては、脱分化及び細分化の工程を省略することもできる。得られたゲノム改変植物を、必要に応じて抗生物質等によりスクリーニングしてもよい。本発明の方法により、任意の遺伝子を改変した植物を得ることがでるため、本発明の方法は品種改良等に役立てることができる。
【００５２】
また、本発明は、上記の方法により得られたゲノム改変植物細胞、又はゲノム改変植物に関する。本発明のゲノム改変植物は、ゲノム編集タンパク質の標的となる部位以外に外来の遺伝子等の組み込みを有さない点で、他の方法により得られるゲノム改変植物とは異なり得る。
【００５３】
ゲノム編集タンパク質がCas9である場合、ゲノムを編集又は改変するためには、ガイドRNAを導入する必要がある。ガイドRNAは本発明の複合体に含まれ、Cas9と共に細胞内に送達されることが好ましいが、他の手法により細胞内に導入されてもよい。そのような手法として、ガイドRNA、又はガイドRNAを含むプラスミド等のベクターのトランスフェクション等が挙げられる。
＜キャリアペプチドからなる目的のタンパク質の導入剤＞
一態様において、本発明は、細胞透過性配列とポリカチオン配列又はポリアニオン配列とを含む、キャリアペプチドからなる、標的植物細胞への目的のタンパク質の導入剤に関する。本態様において、キャリアペプチドは目的のタンパク質と、イオン性相互作用によりキャリアペプチド/タンパク質複合体を形成する。本態様において、キャリアペプチド、標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質、標的植物細胞、及びキャリアペプチド/タンパク質複合体の構成については上記の通りであるからここでは記載を省略する。
【００５４】
また、本発明は上記目的のタンパク質の導入剤を含む、目的のタンパク質を標的植物に導入するための組成物に関する。本組成物は、上記導入剤に加えて、例えば、水又は油等の媒体、緩衝剤、及び／又は塩等を含んでよい。
＜標的植物細胞に目的のタンパク質を導入するためのキット＞
一態様において、本発明は、標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質、及びキャリアペプチドを含む、標的植物細胞に目的のタンパク質を導入するためのキットに関する。      
【００５５】
本態様において、キャリアペプチド、標的植物細胞に導入すべき目的のタンパク質、及び標的植物細胞の構成については上記の通りであるからここでは記載を省略する。本発明のキットは、取り扱い説明書、複合体形成や細胞導入のための試薬、器具等を含んでもよい。
【実施例】
【００５６】
＜実施例１：様々なペプチド/タンパク質モル比での複合体の形成とその特徴づけ＞
（方法）
キャリアペプチドの合成
(BP100)2K8（KKLFKKILKYLKKLFKKILKYLKKKKKKKK（配列番号23）、理論pI/Mw：10.75/3851.13 Da）及びBP100(KH)9（KKLFKKILKYLKHKHKHKHKHKHKHKHKH（配列番号24）、理論pI/Mw：10.81/3809.71 Da）を、標準的な9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）固層ペプチド合成により合成し、高速液体クロマトグラフィーによって精製した（Fields G.B. and Noble R.L., Int. J. Pept. Protein Res., 1990, 35, pp. 161-214）。ペプチドの分子量を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOFMS）により確認した。
ローダミンBイソチオシアネートで標識されたタンパク質の調製
Saccharomyces cerevisiae由来のローダミンBイソチオシアネート（RhB）（Mw：536.08 g/mol）、BSA、及びADHを、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）から購入し、以下の実験に使用した。【００５７】
まず最初に、10 mgの粉末状のBSA又はASHを1 mLの炭酸ナトリウム溶液（0.1 M、pH 9.0）に溶解することによって、10.0 g/Lの溶液を調製した。また、1 mgの粉末状のRhBを100 μLのジメチルスルホキシドに溶解することによって、10.0 g/Lの溶液を調製した。続いて、RhBの溶液をタンパク質溶液に、穏やかに撹拌しながら滴下混和し、連続的に撹拌しながら一晩4℃でインキュベートすることによって、Rhbをタンパク質にコンジュゲートさせた。遊離のRhBを、25℃でのSephadex G-25カラム（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）を用いたゲル濾過クロマトグラフィーによってBSA-RHBコンジュゲート又はADH-RhBコンジュゲートから除いた。精製したBSA-RhBコンジュゲート又はADH-RhBコンジュゲートの濃度を、280 nm及び555 nmの吸光度で、UV-vis分光光度計によって測定した。標識の程度を、以下の式を用いて計算した：（RhBのOD555 nm×タンパク質のMw）/（タンパク質濃度g/L×RhBのモル吸光係数）。RhBのモル吸光係数は106000 M-1cm-1である。本実施例では、一分子のBSAに四分子のRhBがコンジュゲートし、一分子のADHに六分子のRhBがコンジュゲートした。
様々なペプチド/タンパク質モル比でのキャリアペプチド/タンパク質複合体の調製及び特徴づけ
1.0 g/Lのペプチド（(BP100)2K8又はBP100(KH)9）を2 μgのタンパク質（BSA-RhBコンジュゲート）と様々なペプチド/タンパク質モル比（1、5、10、及び25）で25℃、約5分間混合してキャリアペプチド/タンパク質複合体を調製し、オートクレーブした超純水（MilliQ水）で最終容量100 μLに希釈した。その後、10 μLの溶液を採取し、さらに最終容量100 μLに希釈した。複合体の平均流体力学的径を、Zetasizer Nano-ZS（Malvern Instruments, Ltd., Worcestershire, UK）を用いて、動的光散乱法（DLS）によって測定した。多分散指数（PDI）を、ゼータナノサイザー（Zetasizerソフトウェアver 6.20）によって、633nm He-Neレーザーを使用して、25℃で、173°の後方散乱検出角度で決定した。その後、サンプルをオートクレーブした超純水（MilliQ水）で総容量750 μLにさらに希釈し、Zetasizer Nano-ZSを用いるレーザードップラーミクロ電気泳動によってゼータ電位を分析した。サンプルのゼータ電位及びゼータ偏位を3回測定し、Zetasizerソフトウェアver 6.20を用いて平均値を得た。【００５８】
原子間力顕微鏡による形態の特徴づけのために、様々なペプチド/タンパク質モル比で調製した10 μLのキャリアペプチド/タンパク質複合体溶液（1.0 mg/L）を、切断した雲母上に滴下し、30秒間雲母基質上に吸着させた（Mori O. and Imae T., 1996, Colloid Surface B 9, 31-36）。その後、サンプルをオートクレーブした超純水（MillQ水）で徹底的に洗浄し、全てのバッファー成分を除いた。雲母表面から残留水を排出させた後、雲母を一晩室温で風乾させた。サンプルを、空気中室温でシリコンカンチレバーを使用して、1.3 N/mのスプリング定数でタッピングモードAFM（AFM5300E、日立ハイテクサイエンス社、日本）で観察した。
（結果）
BP100(KH)9及び(BP100)2K8のそれぞれとBSA-RhBを様々なペプチド/タンパク質モル比で混合し（タンパク質のモル濃度を一定に保ち、ペプチドのモル濃度を1から25まで増加させた）、キャリアペプチド/タンパク質複合体（BP100(KH)9/BSA-RhB及び(BP100)2K8/BSA-RhB）を形成させた。【００５９】
キャリアペプチド/タンパク質複合体の流体力学的直径、PDI、ゼータ電位を測定した結果を以下の表2及び3に示す。【００６０】
【表２】
2017126604.tif 000007
【００６１】
【表３】
2017126604.tif 000008
【００６２】
複合体を形成していないBSA-RhBの流体力学的径は92±2 nmであった。(BP100)2K8/BSA-RhBの平均流体力学的直径はペプチド/タンパク質モル比1.0で341±73 nmであり、ペプチド/タンパク質モル比が増加するにつれて、341±73 nmから173±8 nmまで低下した（表1）。【００６３】
対照的に、BP100(KH)9/BSA-RhB複合体の平均流体力学的直径は、ペプチド/タンパク質モル比が増加するにつれて、329±12 nmから586±82 nmまで増加した（表2）。【００６４】
BSA-RhBは、-35.3±1.5 mVの負の表面電荷を有していた。ペプチド/タンパク質モル比が増加するにつれて、(BP100)2K8/BSA-RhB複合体及びBP100(KH)9/BSA-RhB複合体の両方のゼータ電位が、負の値から正の値まで増加した（表1及び2）。これは、BSA-RhBの表面がカチオン性の融合ペプチドによって覆われ、それによってイオン複合体が形成され、ゼータ電位が増加したことを示している。【００６５】
AFMによる測定の結果、モル比5又は10の(BP100)2K8/BSA-RhB、及びモル比1のBP100(KH)9/BSA-RhBは、均一な球状の形態を示した（図1及び2）。
＜実施例２：BSA-RhB及びADH-RhBの細胞内への導入＞
（方法）
YFP導入植物の調製
トランスジェニックなYFP（黄色蛍光タンパク質）発現シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を、Agrobacterium tumefaciens（GV3101(pMP90)株）が媒介する、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター及びIn-YFP遺伝子を含むバイナリーベクターの野生型シロイヌナズナ（Columbia）への形質転換によって作製した（Ohtani M. et al., Plant Cell, 2013, 25, pp. 2056-2069）。野生型のシロイヌナズナ及びトランスジェニックなシロイヌナズナの両方の種を、土壌（Pro-Mix; Premier Tech Ltd, Quebec, Canada）とバーミキュライト（Vs kakou, Tokyo, Japan）の2:1の比の混合物を含む植物培地を含むポットに播種した。
キャリアペプチド/タンパク質複合体の葉への導入
約100 μLの実施例１で調製したキャリアペプチド/タンパク質複合体溶液（(BP100)2K8/BSA-RhB又はBP100(KH)9/BSA-RhB複合体）を、様々なペプチド/タンパク質モル比（1、5、10、及び25）で、針のないシリンジを用いてYFP発現シロイヌナズナの葉に直接接触させた。同様に、約100μLの実施例1で調製したキャリアペプチド/タンパク質複合体溶液（(BP100)2K8/ADH-RhB）を、ペプチド/タンパク質モル比10でYFP発現シロイヌナズナの葉に直接接触させた。
キャリアペプチド/タンパク質複合体の細胞への取り込み
タンパク質の細胞への取り込みを、共焦点レーザー走査型顕微鏡（CLSM, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany）によって定量的に測定した。ペプチド/BSA-RhB複合体又はペプチド/ADH-RhB複合体の、YFP発現シロイヌナズナの葉への細胞内送達を、YFPの蛍光の検出については488nmの励起光、RhBの検出については555 nmの励起光を用いて観察した。
ペプチド送達効率の定量
トランスジェニックなYFP発現シロイヌナズナの葉を、(BP100)2K8/BSA-RhB又はBP100(KH)9/BSA-RhB複合体による接触の6時間後に回収し、その後PBS（D-PBS（-）、和光純薬工業、大阪、日本）で二回洗浄し、葉の表面上の過剰なBSA-RhBを除いた。接触させた葉から1×溶解バッファー（Promega, Madison, USA）を用いて抽出した全粗タンパク質を、100 Vの定電圧で4〜15%トリスグリシンドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）（Bio-rad, California, USA）に供した。その後、BSA-RhBの蛍光を、520 nmの励起及び605 nmの放出によって、ルミノイメージアナライザー（LAS-3000、富士フィルム、東京、日本）を用いて検出した。蛍光の検出後、ゲルをクマシーブルーG250（Bio-rad, California, USA）で染色して、Rubisco大サブユニットを検出した。BSA-RhB蛍光バンドの濃さ及びクマシーブルーで染色したrbcLバンドの濃さを、Image J64（NIH, Bethesda, MD）により定量し、BSA-RhBバンドの濃さを、rbcLのバンドの濃さによって標準化した。標準化したデータに基づいて、SDS-PAGEを再び行った。各サンプルについて供試する粗タンパク質の容量は、標準化された蛍光強度を有するBSA-RhBバンドを得るために、試験した全てのサンプルについてクマシーブルーで染色したrbcLバンドの濃さが同等であるように調製した。さらに、既知の量（μg）のBSA-RhBタンパク質（陽性対照）に対するBSA-RhB強度検量線を作成した。接触させた葉から回収できたBSA-RhBタンパク質の総量を以下の通り計算した。【００６６】
接触させた葉あたりの抽出されたBSA-RhBタンパク質の総量（μg）＝（ゲルのレーンあたりの測定されたRhB強度に対応するタンパク質の量（μg）/ゲルのレーンあたり供試された粗タンパク質の容量（μL））×抽出された粗タンパク質の総容量（μL）。【００６７】
接触させた葉あたりの抽出されたBSA-RhBタンパク質の割合（%）＝抽出されたBSA-RhBタンパク質の総量（μg）/接触させたタンパク質の最初の量（2 μg）×100。
統計解析
得られたデータを、平均値±三回の試験の標準偏差（SD）として表した。SPSS 22.0（IBM Armonk, NY）を、統計解析のために用いた。統計的な差は、p < 0.05の統計的有意性のレベルを用いて、分散分析（analysis of variance（ANOVA））と共に、テューキーのHSD（Honestly Significant Difference）試験によって決定した。
（結果）
BSA送達効率を、接触させた葉から回収できたインタクトなBSA-RhBに基づいて定量した。様々なペプチド/タンパク質モル比で試験し、全葉由来の総タンパク質を、接触の6時間後に抽出した。抽出したタンパク質溶解物をSDS-PAGEで分析し、BSA-RhB（66kDa）を励起させ、蛍光システム下で可視化した。【００６８】
図3に示す通り、BSA-RhBはキャリアペプチドを用いた場合にのみ葉から抽出された（図3）。全てのペプチド/タンパク質モル比で、(BP100)2K8融合ペプチドは、BP100(KH)9融合ペプチドよりも優れたタンパク質送達能力を示した（図3）。(BP100)2K8融合ペプチドではペプチド/タンパク質モル比10で回収されたタンパク質の量が最も多く、BP100(KH)9融合ペプチドではペプチド/タンパク質モル比5で、回収されたタンパク質の量が最も多かった（図3）。【００６９】
続いて、ペプチド/タンパク質モル比10で、(BP100)2K8/BSA-RhB複合体をYFP発現シロイヌナズナの葉に6時間接触させ、蛍光画像をCLSMにより得た。トランスジェニックYFP発現シロイヌナズナのサイトゾル及び核で発現されるYFPの蛍光を、細胞外の空間と細胞内の空間を区別するために用いた。BSA-RhBシグナルは、早くも接触の1時間〜3時間後に観察され、シグナル強度は6時間でピークに達し、12時間〜24時間ではそれを維持し、48時間で低下した（図4）。接触後1時間〜3時間ではBSA-RhBの蛍光は主として細胞外表面で検出されたが、接触後6時間〜48時間では、YFPの蛍光と共局在していることが示され、これはBSA-RhBが細胞内空間に位置していたことを示している。サイトゾル内への局在の他に、BSA-RhBシグナルは、接触後6時間〜24時間では液胞においても見出された。【００７０】
次に、より高分子量のタンパク質であるADH（150 kDa）の細胞内送達を、キャリアペプチドとして(BP100)2K8を用い、ペプチド/タンパク質モル比10で調べた。【００７１】
複合体を形成していないADH-RhBは負のゼータ電位（-43.1±1.1 mV）を示し、その流体力学的直径は168±7 nmであった。ペプチド/タンパク質モル比10で混合した(BP100)2K8/ADH-RhBの平均流体力学的直径は308±53 nmであり、PDI値は0.21±0.07であり、表面電荷は11.1±1.9 mVであった。-43.1 mVから11.1 mVへのゼータ電位の増加は、ADH-RhBの表面がカチオン性の(BP100)2K8により覆われ、イオン性の複合体が形成されたことを示している。AFMによる測定の結果、(BP100)2K8/ADH-RhB複合体は、均一な球状の形態を示した（データ示さず）。次に、複合体をYFPシロイヌナズナの葉に6時間接触させ、蛍光画像をCLSMにより得た。BSAの送達において観察された結果と同様に、ADH-RhBは接触後6時間でサイトゾルの内部及び液胞において検出された（図5）。さらに、ADH-RhBシグナルは、(BP100)2K8/ADH-RhBを接触させた野生型のシロイヌナズナの葉においても検出され（データ示さず）、これによって蛍光がADH-RhBに由来することが確かめられた。【００７２】
ADH-RhBが、(BP100)2K8/ADH-RhB複合体を接触させた葉からも回収されることを、native PAGEにより検出した（データ示さず）。ADH-RhBシグナルは、ADH-RhBのみを接触させた葉では検出されなかった（データ示さず）。これは、ADH-RhBが、キャリアペプチドがなければ細胞に輸送され得ないことを支持している。ADH-RhBの送達の成功は、融合ペプチド媒介タンパク質送達系が、比較的高い分子量を有するタンパク質に対しても有効であることを示している。
＜実施例３：オルガネラ移行配列を含むタンパク質の細胞内への導入＞
（方法）
GFP-PTSを発現するシロイヌナズナの作製
トランスジェニックなGFP-PTS発現シロイヌナズナを、Agrobacterium tumefaciens（EHA101株）が媒介する、sGFP遺伝子を含むpMAT137の野生型シロイヌナズナ（Columbia）への形質転換によって作製した（Mano S. et al., Plant Cell Physiol., 2002, 43, pp. 331-341）。種子を、1%寒天及びカナマイシンを含むMurashige and Skoog（MS）培地に播種した。カナマイシン耐性の苗木を発芽させ、MS培地で1週間維持した。1週間後、植物を、土壌とバーミキュライトの2:1の比の混合物を含む植物培地を含むポットに播種した。シロイヌナズナを、長日条件（16h 明/8h 暗）で21℃で、Biotron NK system（株式会社 日本医化器械製作所、大阪、日本）において成長させた。
citrine、citrine-NLS、及びcitrine-PTSの無細胞合成
透析モード無細胞合成法（Numata K et al., Biomacromolecules, 2012, 13, pp. 3450-3455、及びSpirin A.S. et al., Science, 1988, 242, pp.1162-1164）を用いた。手短には、転写及び翻訳に必要な基質、バッファー、プラスミド、及び酵素を含む内部溶液（9 mL）を調製した。本溶液における成分は、（1.7 mMのジチオスレイトールを含む）pH 7.5の55 mM HEPES-KOH、68 μMのL(-)-5-ホルミル-5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸、0.05 %のアジ化ナトリウム、4.0 %のポリエチレングリコール（平均分子量8,000 g/mL）、210 mMのグルタミン酸カリウム、27.5 mMの酢酸アンモニウム、10.7 mMの酢酸マグネシウム、2.7 mLのS30抽出物、1.2 mMのアデノシン-5'-三リン酸（pH 7.0）、各0.8mMのシチジン三リン酸（pH 7.0）、グアノシン-5'-三リン酸（pH 7.0）、及びウリジン-5'-三リン酸（pH 7.0）、80 mMのクレアチンリン酸、0.64 mMの3',5'-環状アデノシン一リン酸、各1.0 mMの20種のアミノ酸、175 μg/mLの大腸菌のトータルRNA、プラスミド構築物（pDES17-citrineプラスミド又はpDES17-citrine-NLSプラスミド又はpDES17-citrine-PTSプラスミド）、250 μg/mLのクレアチンキナーゼ、93 μg/mLのT7 RNAポリメラーゼであった。S30抽出物は、E.coli BL21 codon-plus RIL株（Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA）から、以前記載した通りに調製した（Kitagawa T., J. Struct. Funct. Genomics, 2004, 5, pp.63-68）。15kDaの分子量カットオフの透析膜（Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて、無細胞大スケール透析によって、9 mLの内部溶液を90 mLの外部溶液に対して透析した。反応溶液は、撹拌しながら16時間30℃でインキュベートした。
citrine、citrine-NLS、及びcitrine-PTSの精製
9 mLの内部溶液をAKTA Express（GE Healthcare, Little Chalfont, UK）によって精製した。内部溶液を3,000×gで30分間遠心し、上清をバッファーA（300 mM塩化ナトリウム、20 mMイミダゾール、及び1 mMトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP, Hampton Research, Aliso, Viejo, CA）を含む20 mM Tris-HClバッファー（pH 8.0））と混合した。タンパク質溶液を5 mLのHistrap（GE Healthcare, Little Chalfont, UK）に供し、樹脂をバッファーで洗浄した。タンパク質をバッファーB（300 mM塩化ナトリウム、500 mMイミダゾール、及び1 mM TCEPを含む20 mM Tris-HClバッファー）で溶出させた。【００７３】
ペプチド/タンパク質複合体のモル比10での調製、及び植物細胞への接触、並びにその評価は、実施例1及び2に記載の通りに行った。
（結果）
核を標的とする核移行シグナル（nuclear localization signal、NLS）ペプチドとコンジュゲートしたCitrine、及びペルオキシソームを標的とするペルオキシソーム標的シグナル（peroxisomal targeting signal、PTS）とコンジュゲートしたCitrineをモデルタンパク質として用いた。シグナルペプチドを含まないCitrineを、陰性対照として用いた。【００７４】
上記Citrineタンパク質、及びCitrineタンパク質と(BP100)2K8の複合体をDLS、ゼータ電位、及びAFMによって特徴づけた。AFMによる観察、及びサイズ分布グラフによれば、全ての複合体が均一な球状の複合体を形成していた（データ示さず）。【００７５】
キャリアペプチドを含まないCitrineタンパク質は、いずれも負のゼータ電位を示し、その流体力学的直径は約200nmであった（表4）。Citrineタンパク質と(BP100)2K8の複合体は正に荷電しており、そのサイズは218±13 nm〜263±7 nmであった（表5）。【００７６】
【表４】
2017126604.tif 000009
【００７７】
【表５】
2017126604.tif 000010
【００７８】
オルガネラ移行配列を含まないcitrineは、細胞内の特定の区画に局在していなかった（図6）。一方、citrine-NLSは、核の位置を示すDAPI染色と重複する所定の領域に、接触の72時間後に蓄積していることが確認された（図6b）。citrine-PTSとGFP-PTSの蛍光の共局在によって示されるように、citrine-PTSはペルオキシソームに局在していた（図6d）。citrine-PTSは、接触の12時間後にペルオキシソームに送達されていた。【００７９】
これらの結果は、キャリアペプチド/タンパク質複合体の細胞内への送達能力がオルガネラ移行配列によって阻害されず、また、本発明の複合体のタンパク質にオルガネラ移行配列を付加することで、タンパク質をオルガネラ特異的に送達できることを示している。
＜実施例４：ゲノム編集モジュールの細胞内への導入＞
（方法）
GFP発現トマト、及びYFP発現ポプラの作製
GFP発現トマトは、アグロバクテリウム形質転換法により作製した。詳細は、Sun H. J. et al., Plant Cell Physiol., 2006, 47, pp. 426-431に記載の方法に従った。【００８０】
YFP発現ポプラは、Ohtani M. et al., Plant J., 2011, 67, pp. 499-512に記載の方法に従って作製した。【００８１】
GFP発現イネは、Hiroaki Saika et al., Plant Cell Reports, 2009, Vol. 28, Issue 4, pp. 619-626に記載の方法に従って作製した。
Cas9、gRNA及びそれらの複合体の調製
YFPの遺伝子配列（配列番号41）を基に、2つの標的部位（配列番号42及び配列番号43）について、gRNA（guide RNA）をMEGAscript T7 Transcription kit (Ambion)を用いて調製した（それぞれYfp1gRNA及びYfp2gRNAとする）。Cas9を、実施例3のCitrineと同様に、無細胞合成により合成した。ただし、プラスミド構築物は、Cas9のcDNA（塩基配列を配列番号50で、アミノ酸配列を配列番号51で示す）をフォワードプライマー（配列番号52）及びリバースプライマー（配列番号53）を用いて増幅し、増幅DNA断片をpDESTTM17ベクター（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）に導入することにより調製した。粗Cas9タンパク質を、His trapアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及びゲル濾過クロマトグラフィーにより精製した。100 mMのCas9及び200 nMのgRNAを結合バッファー（20mM HEPESバッファー、150mM塩化カリウム、10%グリセロール及び1mM DTT）に溶解し、得られた溶液を15分間22℃でインキュベートした。
TALENの調製
YFPを標的とするTALEN-R及びTALEN-LをコードするプラスミドDNAを、以前の報告（Nakagawa et al., Exp. Anim., 2014, 63, pp. 79-84）に従って調製した。手短には、合成したTALEリピートをpBluescript SKにクローニングし、Goldenクローニング法を用いてアセンブルした（Ochiai H et al., 2013, Sci. Rep., 3, 3379）。TALEのN及びC末端ドメインは、pTALEN_v2（Addgene, Cambridge, MA, USA）から得た（Sanjana N.E. et al., Nat. Biotechnol., 31, 23-24）。YFPの標的配列を、TCTTCAAGGACGACGGCAACT（配列番号54）、及びTCGCCCTCGAACTTCACCT（配列番号55）、としてL-TALEN及びR-TALENをそれぞれ調製した。製造業者のインストラクション、及びSakuma T. et al., Genes Cells, 18, 315-326に従って、TALENのmRNAを、mMessage mMachine T7 Ultra Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて、SmaI消化によって線状化したプラスミドから調製し、RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)によって精製した。TALENタンパク質を、実施例3のCitrineと同様に無細胞合成系を用いて合成し、His trapアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
ゲノム編集モジュール（TALEN又はCas9/gRNA）とペプチドの複合体の調製
BP100とオリゴリシンの融合ペプチドである(BP100)2K8（KKLFKKILKYLKKLFKKILKYLKKKKKKKK（配列番号23）、理論pI/Mw：10.75/3851.13 Da）を、実施例1に記載の通りに合成及び精製し、分子量を測定した。0.4 μLのペプチド溶液（1.0mg/ml）を99.6 μlのCas9/gRNA（100 nmのCas9）と混合し、22℃で30分間インキュベートしてペプチド/Cas9/gRNA複合体を調製した。また、2 μgのTALENと320 mgのペプチドを30分間混合し、超純水（MilliQ水）で懸濁して（最終容量：50 μL）、ペプチド/TALEN複合体を調製した。ペプチド/TALEN-R複合体及びペプチド/TALEN-L-複合体を、植物体への接触の直前に混合した。
植物への複合体の接触
複合体を、針のないシリンジを用いて植物に接触させた。YFP発現シロイヌナズナ、YFP発現ポプラ、GFP発現マイクロトマト（micro-tom）、及びGFP発現イネの一以上を標的植物として用いた。導入を容易にするために、接触の前に、植物を高光強度（90 μmol/m2sec）で、約8時間植物インキュベーターで保持した。計100 μLのペプチド/TALEN-R複合体及びペプチド/TALEN-L-複合体の混合溶液又はペプチド/Cas9/gRNA複合体を、植物の葉に接触させた。接触後、植物を短日条件（8h明条件/16h暗条件）でインキュベートした。
ゲノム編集の効率及び編集された配列の評価
接触させた葉を、共焦点レーザー走査型顕微鏡（CLSM）観察及びDNAシーケンシングのために1日〜14日において回収した。レポーター遺伝子のサイレンシングは、CLSMによって観察した。シーケンシングのために、ゲノムDNAを、接触させた葉から、DNAeasy Mini Kit（Qiagen）を用いて抽出した。標的配列を以下の表5に記載のプライマーを用いて増幅し、QIAquick Purification Kit（Qiagen）を用いて精製した。表中、TALEN(foward-1)及びTALEN(reverse-1)、並びにTALEN(foward-2)及びTALEN(reverse-2)は、TALENの試験で用いた二種類のプライマーセットを意味する。同様に、Cas9(YFP1-foward)及びCas9(YFP1-reverse)の試験で標的部位YFP1に対して用いたプライマーセットを意味し、Cas9(YFP2-foward)及びCas9(YFP2-reverse)の試験で標的部位YFP2に対して用いたプライマーセットを意味する。【００８２】
【表６】
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【００８３】
DNA配列解析のために、PCR産物をTAクローニングキット（東洋紡）にサブクローニングした。クローニングベクターを大腸菌に形質転換し、LB寒天培地37度にて培養して得られたコロニーを用いて、M13フォワードプライマー（GTTTTCCCAGTCACGAC（配列番号28））及びM13リバースプライマー（CAGGAAACAGCTATGAC（配列番号29））を用いてコロニーPCRを行った。
（結果）
Cas9、gRNA、及びTALENが無事に調製、精製されたことをSDS-PAGEにより確かめた（データ示さず）。【００８４】
CLSMによる観察は、YFPを標的とするTALENとペプチドの複合体によってYFP発現シロイヌナズナのゲノムが編集され、サイレンシングされるのに、3日で十分であることを示した（図7）（このとき、葉の外観上、有意な細胞毒性は認められなかった（データ示さず））。続いて、抽出したゲノムDNAをサブクローニングし、シーケンシングした結果、標的配列は、約5%の効率で編集されていた（20/400クローン）。YFPを標的とするTALENとペプチドの複合体をYFP発現ポプラの葉に接触させたところ、接触の2日後にYFPのサイレンシングが生じた（図8）。GFP発現マイクロトマト（micro-tom）の場合は、GFPは3日以内にサイレンシングされた（図9）（このとき、葉の外観上、有意な細胞毒性は認められなかった（データ示さず））。【００８５】
調製したCas9、gRNA、Cas9-gRNA、及びCas9-gRNAとペプチドの複合体（ペプチド／Cas9-gRNAのモル比は1、5、10、又は25）の流体力学的直径及びゼータ電位を図10に示す。【００８６】
続いて、調製したCas9/ Yfp2gRNAとペプチドの複合体について試験した結果、該複合体もYFP発現シロイヌナズナの葉に導入することができ、CLSMによってYFPのサイレンシングが認められた（図11）。ゲノムDNAの配列解析も行ったところ、ゲノム編集が成功したことを確かめることができた（データ示さず）。同様に、Cas9/ Yfp2gRNAとペプチドの複合体は、GFP発現マイクロトマト及びGFP発現イネに導入することができ、GFPのサイレンシングを引き起こした（それぞれ図12及び図13）。【００８７】
これらの結果は、ゲノム編集モジュールを本発明の複合体により植物細胞へ導入することが可能であり、これにより植物ゲノムを編集可能であることを示している。
＜実施例５：NPT IIの細胞内への導入＞
（方法）
NPT IIの合成
NPT（neomycin phosphotransferase）IIの合成には、透析モード無細胞合成法（Numata K et al., Biomacromolecules, 2012, 13, pp. 3450-3455、及びSpirin A.S. et al., Science, 1988, 242, pp.1162-1164）を用いた。手短には、NPT II遺伝子を、pMpGWB401バイナリーベクター（Ishizaki K et al., PLos One, 2015, 10: e0138876）を鋳型として、以下のプライマー：ATATCCATGGGGATTGAACAAGATGGATTGCACGC（配列番号58）及びATATGGATCCCGGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGAT（配列番号59）を用いて増幅させた。増幅したDNA断片をpET28b(+)のNcoI及びBamHI部位にクローニングし、配列を確認した。その後、クローニングしたNPT II遺伝子を、以前の報告（Yabuki T et al., J. Struct. Funct. Genomics, 2007, 8: 173-191）に従ってツーステップPCRにより増幅した。手短には、3μLの50倍希釈バッファー、各50nMのNPT IIに対するフォワードプライマー及びリバースプライマー、各0.2mMのデオキシリボヌクレオチド三リン酸、1×Expand Hi-Fiバッファー（Roche）、及び0.5U Expand Hi-Fi酵素（Roche）を含む、20μLの反応混合物において第一のPCRを行った。続いて、5μLの5倍希釈第一PCR産物、50pMのT7Pフラグメント（GCTCTTGTCATTGTGCTTCGCATGATTACGAATTCAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAGATCATCTCATCCACAATCATCACAAACATGAGCACGCTCATGCCGAACATACTGAGAACCTGTACTTCCAGGG（配列番号60））、50pMのT7Tフラグメント（AATGATTGATTGATCCCCGCCCAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATAACCTCGAGCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGAAGCACAATGACAAGAGC（配列番号61））、1μMのU2ユニバーサルプライマー（GCTCTTGTCATTGTGCTTCG（配列番号62））、各0.2mMのdNTP、1×Expand Hi-Fiバッファー、及び0.5U Expand Hi-Fi酵素を含む、20μLの反応混合物において第二のPCRを行った。本試験において用いたHisタグは、天然のポリヒスチジンタグを改変したものである（Yabuki et al., 上掲）。【００８８】
無細胞合成は、実施例３と同様に行った。続いて、タグを付したNPT IIタンパク質を、ニッケル−ニトロトリ酢酸アガロースカラムで以前記載した通りに（Numata K et al., Biochemistry, 2015, 54:1401-1407）精製した。タンパク質の収率を、Bio-Rad Protein Assay Kitによって、ウシ血清アルブミンを標準として用いてBradford法で決定した。
キャリアペプチドの合成、複合体の調製及び細胞内への導入
実施例１に記載した通りに、(BP100)2K8を合成した。続いて、2μg（約0.062nmol）のNPT IIと約2.4μg（0.62 nmol）の融合ペプチドを混合することによって複合体を形成させた。2μgのNPT IIを含む15μLの複合体溶液を、針のないシリンジを用いて植物に接触させ、リンゴの葉に導入した。リンゴの品種はJM1を用い、上水道で水耕培養した1週〜2週齢のリンゴの木の葉を用いた。【００８９】
木の葉に、カナマイシンを含む溶液を10日間浸透させ（各葉あたり2〜4箇所）、木の葉の色の変化（緑色から茶色への変化）を目視することによって、細胞死を評価した。
（結果）
9mLスケールの無細胞合成で6.3mgのNPT IIが得られた。また、SDS-PAGE後のゲルをCBB染色することによってNPT IIが調製されたことを確認した（データ示さず）。【００９０】
予備試験として、カナマイシンの濃度を0、25、50、75、100及び200mg/Lで試験し、最適な試験濃度を75mg/mLと決定した（データ示さず）。【００９１】
75mg/mLの濃度のカナマイシン溶液を木の葉に暴露した結果を図14に示す。NPT IIを含まない対照実験（水）では、リンゴの葉は、75mg/Lのカナマイシンによって1日後に死滅したが、NPT IIを浸透させた細胞は、75mg/mLのカナマイシンへの曝露後2日間生存した（図14c）。また、75mg/Lのカナマイシンの存在下で、3日目以降ではNPT II浸透細胞もある程度死滅していた（図14d〜f）。【００９２】
これらの結果は、抗生物質耐性タンパク質を本発明の複合体により植物細胞へ導入することが可能であることを示している。【００９３】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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