(57)【要約】【課題】ペプチド分析による動物種同定により、動物種についての客観的な鑑別方法および鑑別装置を提供する。【解決手段】鑑別対象試料から抽出した動物の線維状タンパク質群（コラーゲンなど）を、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で切断してペプチド断片にした後、ペプチド断片のアミノ酸配列を解析するステップと、解析した全てのペプチド断片から、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を取り除き、少なくとも1種の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を選出するステップと、選出したペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別するステップを備える。選出されたペプチド断片の中で、先ず、特定の１種の動物種に特異的に検出されるペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別し、次に、鑑別できなかった試料に対して、少なくとも２種以上の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を用いて動物種を鑑別する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鑑別対象試料から抽出した動物の線維状タンパク質群を、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で切断してペプチド断片にした後、ペプチド断片のアミノ酸配列を解析するステップと、
解析した全てのペプチド断片から、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を取り除き、少なくとも1種の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を選出するステップと、
選出したペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別するステップ、
を備える動物種鑑別方法。
【請求項２】
選出された前記ペプチド断片について、特定の１種の動物種にのみ特異的に検出されるペプチド断片に基づき試料の動物種を鑑別することを特徴とする請求項１に記載の動物鑑別方法。
【請求項３】
選出された前記ペプチド断片について、特定の１種の動物種にのみ特異的に検出されるペプチド断片に基づき試料の動物種を鑑別した後、未だ鑑別できない試料に対して、少なくとも２種以上の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を用いて動物種を鑑別することを特徴とする請求項１に記載の動物種鑑別方法。
【請求項４】
前記線維状タンパク質群がコラーゲンであることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の動物種鑑別方法。
【請求項５】
タンパク質分解酵素がトリプシンであることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の動物種鑑別方法。
【請求項６】
上記のペプチド断片のアミノ酸配列を解析するステップにおいて、質量分析法により解析することを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の動物種鑑別方法。
【請求項７】
前記質量分析は、液体クロマトグラフ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）を用いたタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）解析により、ペプチド断片のプレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定し、アミノ酸配列を解析してペプチド断片を同定することを特徴とする請求項６に記載の動物種鑑別方法。
【請求項８】
前記鑑別対象試料が、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮であることを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載の動物種鑑別方法。
【請求項９】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、
鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、
配列番号１〜３８のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し、動物種を鑑別することを特徴とする動物種鑑別方法。
【請求項１０】
配列番号５〜１４、配列番号１９〜２２、及び配列番号２５〜３３のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し、動物種を鑑別することを特徴とする請求項９に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１１】
鑑別対象がウシである場合、GLTGPIGPPGPAGAPGDKGEAGPSGPAGPTGAR（配列番号５）、及び、IGQPGAVGPAGIR（配列番号３１）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し動物種を鑑別することを特徴とする請求項８又は９に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１２】
鑑別対象がウマである場合において、GEPGPAGLPGPPGER（配列番号２）、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR（配列番号１１）、GDGGPPGVTGFPGAAGR（配列番号２４）、GLPGVAGSLGEPGPLGIAGPPGAR（配列番号２６）、GEPGPVGSVGPVGAVGPR（配列番号２８）、SGQPGTVGPAGVR（配列番号３２）、及び、GSPGPQGPPGVPGPSGILGLTGAR（配列番号３７）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別しウマであることを鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１３】
鑑別対象がブタである場合において、GETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号８）、SGDRGETGPAGPAGPVGPVGAR（配列番号１２）、GIPGEFGLPGPAGPR（配列番号２０）、GEPGPAGSVGPAGAVGPR（配列番号２９）、GEMGPAGIPGAPGLMGAR（配列番号３５）、及び、GSPGPQGPPGAPGPGGISGLTGAR（配列番号３８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別しブタであることを鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１４】
鑑別対象がヒツジである場合において、AGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号９）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しヒツジであることを鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１５】
鑑別対象の動物種を絞り込む際に、GEPGPAGAVGPAGAVGPR（配列番号２７）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウシかシカに絞込み、動物種を鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１６】
鑑別対象の動物種を絞り込む際に、GEPGPVGAVGPAGAVGPR（配列番号３０）、及び、GFPGSDGVAGPK（配列番号４）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をヒツジかヤギに絞込み、動物種を鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１７】
鑑別対象の動物種を絞り込む際に、GIPGPAGAAGATGAR（配列番号１４）、及び、GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEVGKPGER（配列番号１８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウマかブタに絞込み、動物種を鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１８】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、
鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、
１）配列番号５、配列番号２７及び配列番号３１のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してウシを同定するステップと、
２）配列番号２７及び配列番号３３のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してシカを同定するステップと、
３）配列番号１１又は配列番号２８のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してウマを同定するステップと、
４）配列番号１２又は配列番号２９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してブタを同定するステップと、
５）未だ同定されていない残りの試料に対して、配列番号９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してヒツジを同定し、配列番号７のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してヤギを同定するステップ、
を行うことを特徴とする動物種鑑別方法。
【請求項１９】
上記のペプチド断片の有無の判別において、液体クロマトグラフ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）を用いたタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）解析により、ペプチド断片のプレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定してペプチド断片の有無を判別することを特徴とする請求項９〜１８の何れかに記載の動物種鑑別方法。
【請求項２０】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別装置であって、
鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、
配列番号１〜３８のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別する手段を備え、動物種を鑑別することを特徴とする動物種鑑別装置。
【請求項２１】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別装置であって、
鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、
配列番号５〜１４、配列番号１９〜２２、及び配列番号２５〜３３のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別する手段を備え、動物種を鑑別することを特徴とする動物種鑑別装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物種についての客観的な鑑別方法の技術に関するものであり、特に、皮革の種類を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
革製の鞄，衣料，手袋，家具については、家庭用品品質表示法により雑貨工業品品質表示規定が定められている。そのうち、革または合成皮革を製品の全部または一部に使用して製造した衣料については、表示対象となる動物６種（ウシ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，ウマ，シカ）の鑑別が必須となっている。
昨今は、品質表示を適正に行うために、製品の流通段階で確実な畜種の判定を求められることが増えている。しかし、現状のところ鑑別の公定法は無い。これら雑貨工業品に係る表示に関して、試験や検査で一般的に用いられる鑑別方法としては、外観観察（厚さ，大きさ，色や柄，毛並み，艶，感触など）、顕微鏡観察（毛穴配列，断面構造，毛小皮紋理，毛髄質など）、機器分析（元素，成分，染料，薬剤分析など）、ＤＮＡ鑑別が挙げられる（例えば特許文献１）。【０００３】
ここで、外観観察は、長年の経験を必要とし、また客観的，科学的根拠に乏しく説得力に欠けるという問題がある。また、顕微鏡観察は、現在の主流であるが、繊維構造や銀面模様の差がわかりにくい場合などは判別を迷うケースも多く問題がある。また、機器分析は、あくまでも補助的な方法であり、単独での判別は困難である。そして、ＤＮＡ鑑別については、食肉や穀物等では精度が高く再現性もあるため広く利用されているものの、皮革でのＤＮＡ鑑別は実用化に至っていない。その理由としては、皮革の製造工程にある石灰脱毛や再石灰漬けで皮繊維をほぐす作業中にＤＮＡが損傷し、抽出が困難となり、ＤＮＡが検出されないことがあるからである。また、例えばクロムなめし革については、酵素分解促進のために脱クロム処理をすることが、却ってＤＮＡを損傷してしまうこともある。このようにＤＮＡの検出は容易ではなく、ＤＮＡ鑑別による方法は、通常業務で使用するまでには至っていないのが現状である。【０００４】
機器分析による方法として、コラーゲン由来のジペプチド相当の熱分解生成物を検出する熱分解ガスクロマトグラフィー／質量分析法による天然皮革片の同定方法が知られている（非特許文献１を参照）。この同定方法では、天然皮革の同定可能な指標物質として、汚染による分解の阻害は受けにくいＨｙｐ由来のジペプチド相当の熱分解生成物が検出できるが、それらの熱分解生成物は動物種の違いにより顕著な差はなく、動物種の鑑別は困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−１２５７８１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】倉田正治，“熱分解ガスクロマトグラフィー／質量分析法による天然皮革微小片の同定方法”，BUNSEKI KAGAKU Vol.57, No.7, pp.563-569 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記状況に鑑みて、本発明は、動物の皮革試料などについて、簡便に精度よく動物種を鑑別できる鑑別方法および鑑別装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成すべく、本発明の動物種鑑別方法は、鑑別対象試料から抽出した動物の線維状タンパク質群を、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で切断してペプチド断片にした後、ペプチド断片のアミノ酸配列を解析するステップと、解析した全てのペプチド断片から、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を取り除き、少なくとも1種の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を選出するステップと、選出したペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別するステップを備えることを特徴とする。【０００９】
鑑別対象試料は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、シカの６種の動物種の皮革や、オーストリッチ、サーモン、鯉、ワニ等の皮革、フォックス、ラクーン、ミンク等の毛皮などである。線維状タンパク質は、球状タンパク質に比べて変性し難く、結合組織、腱、骨、骨格筋などを作ることが知られている。線維状タンパク質の例としては、コラーゲン、ケラチン、エラスチンなどがある。線維状タンパク質群を、タンパク質分解酵素で切断してペプチド断片にした後、ペプチド断片のアミノ酸配列を解析する。タンパク質分解酵素としては、トリプシンを好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。ペプチド断片のアミノ酸配列を解析する方法として、質量分析法（mass spectrometry）、ペプチドシーケンサー、配列特異的なペプチド抗体による検出などが好適に用いることができる。【００１０】
本発明の動物種鑑別方法において、選出されたペプチド断片の中で、先ず、特定の１種の動物種に特異的に検出されるペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別し、次に、鑑別できなかった試料に対して、少なくとも２種以上の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を用いて動物種を鑑別することでもよい。
最初に、特定の１種の動物種に特異的に検出されるペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別することにより、効率よく、鑑別対象試料の動物種を鑑別することが可能になる。すなわち、特定の１種の動物種にのみ、特異的に検出されるペプチド断片があるならば、そのペプチド断片の有無を判別し、そのペプチド断片が見つかれば特定の１種の動物種に同定できるのである。【００１１】
上記のアミノ酸配列を解析するステップにおいて、質量分析法により解析する場合、具体的には、液体クロマトグラフ（liquid chromatograph；ＬＣ）−質量分析計（mass spectrometer；ＭＳ）（ＬＣ−ＭＳ）を用いたタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）解析により、ペプチド断片のプレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定し、アミノ酸配列を解析してペプチド断片を同定する。【００１２】
本発明の動物種鑑別方法では、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法である場合、鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、配列番号１〜３８のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し、動物種を鑑別する。
すなわち、Ｃｏｌｌａｇｅｎ I α１，Ｃｏｌｌａｇｅｎ I α２，Ｃｏｌｌａｇｅｎ III α１（以下、それぞれ、ＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２，ＣＯＬ３Ａ１と略する）の部分配列である、GEPGPAGLPGPPGER（配列番号１）、GEPGPTGLPGPPGER（配列番号２）、GFPGADGVAGPK（配列番号３）、GFPGSDGVAGPK（配列番号４）、GLTGPIGPPGPAGAPGDKGEAGPSGPAGPTGAR（配列番号５）、GLTGPIGPPGPAGAPGDKGETGPSGPAGPTGAR（配列番号６）、GETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号７）、GETGPAGRPGEAGPPGPPGPAGEK（配列番号８）、AGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号９）、SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR（配列番号１０）、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR（配列番号１１）、SGDRGETGPAGPAGPVGPVGAR（配列番号１２）、GIPGPVGAAGATGAR（配列番号１３）、GIPGPAGAAGATGAR（配列番号１４）、EGPVGLPGIDGRPGPIGPAGAR（配列番号１５）、EGPAGLPGIDGRPGPIGPAGAR（配列番号１６）、GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGKPGER（配列番号１７）、GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEVGKPGER（配列番号１８）、GIPGEFGLPGPAGAR（配列番号１９）、GIPGEFGLPGPAGPR（配列番号２０）、GPPGESGAAGPTGPIGSR（配列番号２１）、GPPGESGAAGPAGPIGSR（配列番号２２）、GDGGPPGATGFPGAAGR（配列番号２３）、GDGGPPGVTGFPGAAGR（配列番号２４）、GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR（配列番号２５）、GLPGVAGSLGEPGPLGIAGPPGAR（配列番号２６）、GEPGPAGAVGPAGAVGPR（配列番号２７）、GEPGPVGSVGPVGAVGPR（配列番号２８）、GEPGPAGSVGPAGAVGPR（配列番号２９）、GEPGPVGAVGPAGAVGPR（配列番号３０）、IGQPGAVGPAGIR（配列番号３１）、SGQPGTVGPAGVR（配列番号３２）、TGQPGAVGPAGIR（配列番号３３）、GEMGPAGIPGAPGLIGAR（配列番号３４）、GEMGPAGIPGAPGLMGAR（配列番号３５）、GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR（配列番号３６）、GSPGPQGPPGVPGPSGLIGITGAR（配列番号３７）、及び、GSPGPQGPPGAPGPGGISGITGAR（配列番号３８）のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物種を鑑別する。
配列番号１〜３８のペプチド断片は、ＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２及びＣＯＬ３Ａ１について、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物種全てに共通する部分配列ではなく、少なくとも１種の動物種に特異的に存在する部分配列である。配列番号１〜３８のペプチド断片のアミノ酸配列は、コラーゲン分子の安定性から、６種の動物種間において保存性が高いものである。【００１３】
本発明の動物種鑑別方法では、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、配列番号５〜１４、配列番号１９〜２２、及び配列番号２５〜３３のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し、動物種を鑑別することがより好ましい。
配列番号５〜１４、配列番号１９〜２２、及び配列番号２５〜３３のアミノ酸配列のペプチド断片によれば、質量分析機器によらず、安定的に検出できる。【００１４】
本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象がウシである場合は、GLTGPIGPPGPAGAPGDKGEAGPSGPAGPTGAR（配列番号５）、及び、IGQPGAVGPAGIR（配列番号３１）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し動物種を鑑別することでもよい。
配列番号５及び３１のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物の中で、ウシのみに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ウシを同定できる。【００１５】
本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象がウマである場合は、GEPGPAGLPGPPGER（配列番号２）、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR（配列番号１１）、GDGGPPGVTGFPGAAGR（配列番号２４）、GLPGVAGSLGEPGPLGIAGPPGAR（配列番号２６）、GEPGPVGSVGPVGAVGPR（配列番号２８）、SGQPGTVGPAGVR（配列番号３２）、及び、GSPGPQGPPGVPGPSGILGLTGAR（配列番号３７）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別しウマであることを鑑別することでもよい。
配列番号２，１１，２４，２６，２８，３２及び３７のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物の中で、ウマのみに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ウマを同定できる。【００１６】
本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象がブタである場合は、GETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号８）、SGDRGETGPAGPAGPVGPVGAR（配列番号１２）、GIPGEFGLPGPAGPR（配列番号２０）、GEPGPAGSVGPAGAVGPR（配列番号２９）、GEMGPAGIPGAPGLMGAR（配列番号３５）、及び、GSPGPQGPPGAPGPGGISGITGAR（配列番号３８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別しブタであることを鑑別することでもよい。
配列番号８，１２，２０，２９，３５及び３８のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの動物６種の中で、ブタのみに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ブタを同定できる。【００１７】
本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象がヒツジである場合は、AGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号９）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しヒツジであることを鑑別することでもよい。
配列番号９のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物の中で、ヒツジのみに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ヒツジを同定できる。【００１８】
本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象の動物種を絞り込む際に、GEPGPAGAVGPAGAVGPR（配列番号２７）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウシかシカに絞込み、動物種を鑑別することでもよい。
配列番号２７のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物の中で、ウシとシカだけに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ウシかシカに絞り込むか、或は、ウシかシカに同定できる。【００１９】
本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象の動物種を絞り込む際に、GEPGPVGAVGPAGAVGPR（配列番号３０）、及び、GFPGSDGVAGPK（配列番号４）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をヒツジかヤギに絞込み、動物種を鑑別することでもよい。
配列番号４及び３０のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物の中で、ヒツジとヤギだけに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ヒツジかヤギに絞り込むか、或は、ヒツジかヤギに同定できる。【００２０】
本発明の動物種鑑別方法において、鑑別対象の動物種を絞り込む際に、GIPGPAGAAGATGAR（配列番号１４）、及び、GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEVGKPGER（配列番号１８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウマかブタに絞込み、動物種を鑑別することでもよい。
配列番号１４及び１８のペプチド断片は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物の中で、ウマとブタだけに特異的に有るペプチド断片であり、これらのペプチド断片のみで、ウマかブタに絞り込むか、或は、ウマかブタに同定できる。【００２１】
本発明の動物種鑑別方法において、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、下記１）〜５）のステップを行うことが好ましい。
１）配列番号５、配列番号２７及び配列番号３１のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してウシを同定するステップ
２）配列番号２７及び配列番号３３のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してシカを同定するステップ
３）配列番号１１又は配列番号２８のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してウマを同定するステップ
４）配列番号１２又は配列番号２９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してブタを同定するステップ
５）上記１〜４のステップを行っても、未だ同定されていない残りの試料に対して、配列番号９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してヒツジを同定し、配列番号７のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してヤギを同定するステップ【００２２】
ここで、ペプチド断片の有無を判別する方法として、例えば、液体クロマトグラフ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）を用いたタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）解析により、ペプチド断片のプレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定し、ペプチド断片の有無を判別できる。
上記１）〜５）のステップでは、質量電荷比（ｍ／ｚ）の測定結果で、ＣＯＬ１Ａ１の３つのピークとＣＯＬ１Ａ２の２つのピークの計５ピークのみに着目することにより簡便に動物種の同定が可能になる。【００２３】
次に、本発明の動物種鑑別装置について説明する。
本発明の動物種鑑別装置は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別装置であって、鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、配列番号１〜３８のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別する手段を備え、動物種を鑑別することを特徴とする動物種鑑別装置である。【００２４】
また、本発明の動物種鑑別装置は、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別装置であって、鑑別対象試料から抽出したコラーゲンをトリプシンで分解したものに対して、配列番号５〜１４、配列番号１９〜２２、及び配列番号２５〜３３のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別する手段を備え、動物種を鑑別することを特徴とする動物種鑑別装置である。
ここで、ペプチド断片の有無を判別する手段は、液体クロマトグラフ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）を用いたタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）解析により、ペプチド断片のプレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定し、ペプチド断片の有無を判別するのが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の鑑別方法もしくは鑑別装置によれば、動物の皮革試料などから抽出した線維状タンパク質群を分析して、簡便に精度よく動物種を鑑別することが可能になり、皮革製品の品質表示を的確に行えるといった効果を有する。本発明の鑑別方法は、従来から主流となっている顕微鏡法を補完するに留まらず、衣料を含む雑貨工業品等がグローバルに取引される状況下で、国際標準として利用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の動物種鑑別方法のフロー図
【図２】実施例１の動物種鑑別方法のフロー図（１）
【図３】実施例１の動物種鑑別方法のフロー図（２）
【図４】６種の動物種の鑑別処理フロー図
【図５】ウシの同定処理フロー図
【図６】ウマの同定処理フロー図
【図７】ブタの同定処理フロー図
【図８】ヒツジの同定処理フロー図
【図９】ウマ又はシカの同定処理フロー図
【図１０】ヒツジ又はヤギの同定処理フロー図
【図１１】ウマ又はブタの同定処理フロー図
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。【００２８】
本発明の動物種鑑別方法のフローを図１に示す。
上述したように、本発明の動物種鑑別方法では、鑑別対象試料から動物の線維状タンパク質群を抽出し（ステップＳ１０１）、線維状タンパク質群をタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で切断してペプチド断片に分解し（ステップＳ１０２）、ペプチド断片のアミノ酸配列を解析する（ステップＳ１０３）。次に、解析した全てのペプチド断片から、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を除外する（ステップＳ１０４）。
そこで、少なくとも1種の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を選出し（ステップＳ１０５）、その選出したペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別する（ステップＳ１０６）。
【実施例１】
【００２９】
本実施例では、ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，シカの６種の動物の天然皮革に関して、動物種を鑑別する例について説明する。
先ず、天然皮革の動物種に関して、皮の組織および主要な繊維であるコラーゲンについて説明する。動物皮は、表皮層，真皮層並びにその下の皮下結合組織からなっている。表皮層は角質層、顆粒層など４層からなっており、革としては不用な層であり除去される。また、乳頭層中および皮下組織中のエラスチン繊維も、製造工程中の機械的操作や薬品処理でほとんど除去される。さらに、毛を構成するケラチンは、毛皮の場合を除き革の製造には不用で、石灰付け処理で分解除去される。よって、革を構成する繊維は、コラーゲン線維が大部分を占める。真皮層は乳頭層（銀面層）と網状層に分かれる。真皮層の最上層は革でいう銀面層に当たり、この層は網状層より遥かに細かい繊維が緻密に交絡し、繊維の多くは水平方向に走行している。そのため、革の銀面層は網状層に比べ組織が緻密であり、伸びや水分透過性は悪くなる。【００３０】
コラーゲンのアミノ酸配列は、他のタンパク質に比べて特異的である。アミノ酸配列について、１次構造の特徴がＧｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返しで、３残基ごとにグリシンが存在する。Ｘ，Ｙは任意のアミノ酸であるが、その種類によりＸ，Ｙを占める頻度は異なっている。このような３つの組の繰り返しからなるアミノ酸約１０００残基（分子量約１０万）のポリペプチド鎖（α鎖）が３本より合わさってできているのが、コラーゲン分子である。３本鎖構造は非常に強固であり酵素においても分解されない。【００３１】
コラーゲン構造を作っている分子種は、少なくとも６種類（Ｉ〜Ｖ型とＩ型トリマー）ある。コラーゲン分子を構成しているポリペプチド鎖は８種類知られており、この中で量的に最も多いものはＩ型コラーゲンであり、全コラーゲンの８０〜９０％の量に達する。【００３２】
次に、実験で使用した鑑別対象試料について説明する。鑑別対象試料は、家庭用品品質表示法雑貨工業品規定により、衣料品の表示対象となる動物６種（ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，シカ）について、流通量の多いクロムなめし革を主とし、色は濃色と淡色でおこなった。なお、タンニンなめし革も加え、加工ではＤＮＡ法で抽出困難とされる濃色染色品や仕上げ剤の施された試料も用いることとし、履歴が曖昧でなく明確な革を選定した。
以下では、図２及び図３を参照して、上記の鑑別対象試料に対する６種の動物種鑑別方法のフローについて詳細に説明する。【００３３】
＜ステップＳ０１：皮革の脱脂工程＞
ジエチルエーテル（和光純薬製）中に試料を浸漬し、１時間に６回以上循環するようにして２時間洗浄した。ジエチルエーテルが蒸発するよう試料を静置した後、純水に１時間浸漬した。この場合に使用する浴比は１００：１とし、時々かき混ぜる。試料から余分な水を除去した後、試料を静置し自然乾燥した。【００３４】
＜ステップＳ０２：皮革の粉砕工程＞
冷凍粉砕機（日本分析工業製；ＪＦＣ−３００）を使用して、洗浄した繊維を液体窒素で凍結させ１５分間粉砕した。【００３５】
＜ステップＳ０３：皮革の酵素消化工程＞
試料を約０．５ｍｇに秤量しチューブに移し、２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム（和光純薬製）を各チューブに対して５００μＬずつ加え、６０℃でインキュベーターを用い１２５０ｒｐｍにて１時間処理を行い、１０分間室温にて静置した。２０μｇトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ製タンパク質配列決定用）を５０μＬの２５ｍＭ炭酸水素アンモニウム（和光純薬製）で溶かし、各チューブに加えた。インキュベーターを用い３７℃，２５０ｒｐｍにて１８時間酵素反応を行った。【００３６】
＜ステップＳ０４：消化ペプチドの精製・濃縮工程＞
試料（約５５０μＬ）を０．２２μｍフィルター（タカラバイオ製；ＳＵＰＲＥＣＴＭ−０１）を用いて４℃下４９００ｘｇで１０分間フィルトレーションした。その後、試料を−８０℃で１０分間凍結し、凍結乾燥機（東京理科器械製；ＥＹＥＬＡＦＤＵ−１２００）を用いて、−５０℃で真空凍結乾燥をオーバーナイトで行った。
次に、試料を０．１％ギ酸で溶解し、ボルテックスした後、少々遠心して５分間ソニケーションをおこなった。ソニケーションした試料は、再び０．２２μｍフィルターを用いて４℃下４９００ｘｇで１０分間フィルトレーションし、採取した試料のうち２μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析に用いた。ギ酸はＬＣＭＳ用を用いた。【００３７】
＜ステップＳ０５：質量分析工程＞
質量分析には、高速液体クロマトグラフイオントラップ型−飛行時間型質量分析計（島津製作所製；ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ）ならびにトリプル四重極ＬＣＭＳ／ＭＳシステム（アジレント・テクノロジー製；Ｇ６４６０  ＱＱＱ  ＬＣ−ＭＳ）を使用した。【００３８】
＜ステップＳ０６：ペプチド断片の探索工程＞
ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦタンパク質同定ソフト（Ｍａｓｃｏｔ）にあるＥｒｒｏｒ  Ｔｏｌｅｒａｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ（プレカーサーイオンの質量の違いを許容する検索）を用い、動物種に特徴的なペプチド断片を探索した。なお、ヒドロキシプロリン，ヒドロキシリジンを含むペプチドを検索可能にするため、タンパク質翻訳後修飾のパラメーターで、システイン修飾（アルキル化）を外し、一般的に用いるＯｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｍ）のみならず、Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｐ）およびＯｘｉｄａｔｉｏｎ（Ｋ）を加えた。【００３９】
６種（ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，シカ）について、特異的なペプチド断片が有るかについての結果は以下の通りである。
（Ａ）ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ
ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦで分析後おこなったＭａｓｃｏｔサーチで、主にコラーゲン３種（ＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２，ＣＯＬ３Ａ１）が検出された。そこで各コラーゲンについて、６種の動物種でアミノ酸配列が異なる部分を選出した。ＣＯＬ１Ａ１，ＣＯＬ１Ａ２，ＣＯＬ３Ａ１それぞれの結果を、表１，２，３に示す。なお、下記表中の項目ＡＡの表記はウシのアミノ酸配列に相当するアミノ配列の番号を示し、項目Ｏｘは酸化修飾されるアミノ酸の数の総和を示し、項目ｍ／ｚは主に検出されるイオンの質量電荷比を示し、項目Ｍｒ(calc)は 理論分子量（モノアイソトピック質量)を示している。【００４０】
【表１】
2016157250.tif 000003
【００４１】
【表２】
2016157250.tif 000004
【００４２】
【表３】
2016157250.tif 000005
【００４３】
検出されたペプチド断片のアミノ酸配列は動物種間において保存性が高く、コラーゲン分子の安定性を示していた。しかし、部分アミノ酸シークエンス分析により、一残基（Ａ）と（Ｖ）など僅かな違いが認められた。
なお、配列番号１９と同じ質量電荷比、同じ理論分子量のアミノ酸配列が、既存のデータベースに存在する。すなわち、GIPGEFGLPGPAGAR（配列番号１９）とは異なるアミノ酸配列のGLPGEFGLPGPAGAR（配列番号３９）が存在する。これは、ロイシン（Ｌ）とイソロイシン（Ｉ）は同じ分子量で、質量としては差異がないからである。同様に、配列番号３４と同じ質量電荷比、同じ理論分子量のアミノ酸配列が、既存のデータベースに存在する。GEMGPAGIPGAPGLIGAR（配列番号３４）とは異なるアミノ酸配列のGEMGPAGIPGAPGLLGAR（配列番号４０）が存在する。【００４４】
（Ｂ）ＱＱＱ  ＬＣ−ＭＳ
ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ分析結果より明らかとなった動物種同定が可能なペプチド断片のうち、ＱＱＱ  ＬＣ−ＭＳ分析で安定して検出されたペプチド断片を表４に示す。【００４５】
【表４】
2016157250.tif 000006
【００４６】
ＱＱＱ  ＬＣ−ＭＳにて皮革動物種鑑別試験をルーチンでおこなう場合、表４に示した特異的なペプチド断片をさらに絞り込むことで動物種の同定が簡便化できる。ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，シカの６種の動物の皮革であれば、ＣＯＬ１Ａ１の３ピークならびにＣＯＬ１Ａ２の２ピークの計５ピークのみに着目することで簡便に動物種の同定が可能となる。  【００４７】
ウシ，ウマ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，シカの６種の動物の皮革の同定の手順の一例を説明する。
（１）先ず、最も流通量の多いウシに特異的に検出されるｍ／ｚ９５１．８，６０４．８，７６７に着目し、ウシを同定する。
（２）この時、ｍ／ｚ７６７はシカにも共通に検出されるが、シカはｍ／ｚ５９０．８も特異的であるから、これらの検出有無によりシカを同定する。
（３）ウマは、特異的ｍ／ｚ６４９．３あるいはｍ／ｚ８０２．９に着目し同定する。なお、確認のために、ｍ／ｚ５９１．８の有無を確認しても良い。
（４）ブタは、特異的ｍ／ｚ６５４．７あるいはｍ／ｚ７７４．８に着目し、同定する。
（５）ヒツジとヤギは、ヒツジが特異的ｍ／ｚ７２４．９を示し、ヤギが特異的ｍ／ｚ７３９．３を示すという違いに着目して、これらを同定する。【００４８】
動物６種（ウシ，ブタ，ヒツジ，ヤギ，ウマ，シカ）の天然皮革について、上記（１）〜（５）の同定の手順を用いて動物種を鑑別した結果と、ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦを用いて鑑別した結果を比較した。試料は各動物種につき３〜５タイプ準備し、解析精度を評価したところ、ほぼ１００％と高い割合で解析できることがわかった。
ＤＮＡ鑑別法やＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳを用いた分析では、皮革の加工段階での薬剤による損傷や染料、なめし剤等の來雑物が原因で鑑別が困難であるが、本発明の動物種鑑別方法では、いずれの課題も解決されており実用の可能性がある。
【実施例２】
【００４９】
本実施例では、フォックス，ラクーン，ミンク等の毛皮に関して、動物種を鑑別する例について説明する。フォックス，ラクーン，ミンク等の毛皮に対する動物種鑑別方法のフローについても、実施例１と同様に図１のフローに従う。
先ず、フォックス，ラクーン，ミンク等の毛皮からケラチンを抽出する（ステップＳ１０１）。抽出したケラチンをケラチン分解酵素で分解する（ステップＳ１０２）。ケラチン分解酵素としては、トリプシンを用いることができる。
そして、実施例１と同様に、ペプチド断片のアミノ酸配列を解析し（ステップＳ１０３）、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を除外し（ステップＳ１０４）、動物種で特異的に検出されるペプチド断片を選出する（ステップＳ１０５）。そして、選出したペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別する（ステップＳ１０６）。【００５０】
（その他の実施例）
（１）鑑別対象がウシである場合、図５に示すように、配列番号５又は配列番号３１のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しウシであることを鑑別できる。
（２）鑑別対象がウマである場合、図６に示すように、配列番号２、配列番号１１、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３２又は配列番号３７のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しウマであることを鑑別できる。
（３）鑑別対象がブタである場合、図７に示すように、配列番号８、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２９、配列番号３５又は配列番号３８のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しブタであることを鑑別できる。
（４）鑑別対象がヒツジである場合、図８に示すように、配列番号９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しヒツジであることを鑑別できる。
（５）鑑別対象の動物種を絞り込む際、図９に示すように、配列番号２７のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウシかシカに絞込むことができる。
（６）鑑別対象の動物種を絞り込む際に、図１０に示すように、配列番号４又は配列番号３０のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をヒツジかヤギに絞込むことができる。
（７）鑑別対象の動物種を絞り込む際、図１１に示すように、配列番号１４又は配列番号１８のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウマかブタに絞込むことができる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、天然皮革の動物種の鑑別に有用である。
【図１】
2016157250.tif 000007
【図２】
2016157250.tif 000008
【図３】
2016157250.tif 000009
【図４】
2016157250.tif 000010
【図５】
2016157250.tif 000011
【図６】
2016157250.tif 000012
【図７】
2016157250.tif 000013
【図８】
2016157250.tif 000014
【図９】
2016157250.tif 000015
【図１０】
2016157250.tif 000016
【図１１】
2016157250.tif 000017
【配列表】
2016157250000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月2日(2017.6.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、
鑑別対象試料から抽出した動物皮の皮由来コラーゲンを、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で切断してペプチド断片にした後、液体クロマトグラフ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）を用いたタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）解析により、ペプチド断片のプレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定し、アミノ酸配列を解析してペプチド断片を同定してペプチド断片のアミノ酸配列を解析するステップと、
解析した全てのペプチド断片から、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を取り除き、少なくとも１種の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を選出して配列データ群を予め作成するステップと、
作成した配列データ群に含まれるペプチド断片を用いて試料の動物種を鑑別するステップ、
を備える動物種鑑別方法。
【請求項２】
選出された前記ペプチド断片について、特定の１種の動物種にのみ特異的に検出されるペプチド断片に基づき試料の動物種を鑑別することを特徴とする請求項１に記載の動物鑑別方法。
【請求項３】
選出された前記ペプチド断片について、特定の１種の動物種にのみ特異的に検出されるペプチド断片に基づき試料の動物種を鑑別した後、未だ鑑別できない試料に対して、少なくとも２種以上の動物種で特異的に検出されるペプチド断片を用いて動物種を鑑別することを特徴とする請求項１に記載の動物種鑑別方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
タンパク質分解酵素がトリプシンであることを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の動物種鑑別方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
配列番号１〜３８のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し、動物種を鑑別することを特徴とする請求項１〜３，５の何れかに記載の動物種鑑別方法。
【請求項１０】
配列番号５〜１４、配列番号１９〜２２、及び配列番号２５〜３３のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し、動物種を鑑別することを特徴とする請求項９に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１１】
鑑別対象がウシである場合、
ＧＬＴＧＰＩＧＰＰＧＰＡＧＡＰＧＤＫＧＥＡＧＰＳＧＰＡＧＰＴＧＡＲ（配列番号５）、及び、ＩＧＱＰＧＡＶＧＰＡＧＩＲ（配列番号３１）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し動物種を鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１２】
鑑別対象がウマである場合において、ＧＥＰＧＰＡＧＬＰＧＰＰＧＥＲ（配列番号２）、ＳＧＤＲＧＥＡＧＰＡＧＰＡＧＰＩＧＰＶＧＡＲ（配列番号１１）、ＧＤＧＧＰＰＧＶＴＧＦＰＧＡＡＧＲ（配列番号２４）、ＧＬＰＧＶＡＧＳＬＧＥＰＧＰＬＧＩＡＧＰＰＧＡＲ（配列番号２６）、ＧＥＰＧＰＶＧＳＶＧＰＶＧＡＶＧＰＲ（配列番号２８）、ＳＧＱＰＧＴＶＧＰＡＧＶＲ（配列番号３２）、及び、ＧＳＰＧＰＱＧＰＰＧＶＰＧＰＳＧＩＬＧＬＴＧＡＲ（配列番号３７）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別しウマであることを鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１３】
鑑別対象がブタである場合において、ＧＥＴＧＰＡＧＲＰＧＥＶＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＥＫ（配列番号８）、ＳＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＡＧＰＶＧＰＶＧＡＲ（配列番号１２）、ＧＴＰＧＥＦＧＬＰＧＰＡＧＰＲ（配列番号２０）、ＧＥＰＧＰＡＧＳＶＧＰＡＧＡＶＧＰＲ（配列番号２９）、ＧＥＭＧＰＡＧＩＰＧＡＰＧＬＭＧＡＲ（配列番号３５）、及び、ＧＳＰＧＰＱＧＰＰＧＡＰＧＰＧＧＩＳＧＬＴＧＡＲ（配列番号３８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別しブタであることを鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１４】
鑑別対象がヒツジである場合において、ＡＧＥＶＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＥＫ（配列番号９）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しヒツジであることを鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１５】
鑑別対象の動物種を絞り込む際に、ＧＥＰＧＰＡＧＡＶＧＰＡＧＡＶＧＰＲ（配列番号２７）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウシかシカに絞込み、動物種を鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１６】
鑑別対象の動物種を絞り込む際に、ＧＥＰＧＰＶＧＡＶＧＰＡＧＡＶＧＰＲ（配列番号３０）、及び、ＧＦＰＧＳＤＧＶＡＧＰＫ（配列番号４）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をヒツジかヤギに絞込み、動物種を鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１７】
鑑別対象の動物種を絞り込む際に、ＧＩＰＧＰＡＧＡＡＧＡＴＧＡＲ（配列番号１４）、及び、ＧＥＱＧＰＡＧＰＰＧＦＱＧＬＰＧＰＡＧＴＡＧＥＶＧＫＰＧＥＲ（配列番号１８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウマかブタに絞込み、動物種を鑑別することを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１８】
１）配列番号５、配列番号２７及び配列番号３１のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してウシを同定するステップと、
２）配列番号２７及び配列番号３３のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してシカを同定するステップと、
３）配列番号１１又は配列番号２８のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してウマを同定するステップと、
４）配列番号１２又は配列番号２９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してブタを同定するステップと、
５）未だ同定されていない残りの試料に対して、配列番号９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してヒツジを同定し、配列番号７のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してヤギを同定するステップ、
を行うことを特徴とする請求項９又は１０に記載の動物種鑑別方法。
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別装置であって、
鑑別対象試料から抽出した動物皮の皮由来コラーゲンを、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）で分解したものに対して、液体クロマトグラフ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）を用いたタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）解析により、ペプチド断片のプレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）を測定し、アミノ酸配列を解析してペプチド断片を同定してペプチド断片のアミノ酸配列を解析する手段と、
配列番号１〜３８のアミノ酸配列データ群に含まれるペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別する手段を備え、動物種を鑑別することを特徴とする動物種鑑別装置。
【請求項２１】
配列番号５〜１４、配列番号１９〜２２、及び配列番号２５〜３３のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別する手段を備え、動物種を鑑別することを特徴とする請求項２０に記載の動物種鑑別装置。
【請求項２２】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、
鑑別対象試料から抽出した動物皮の皮由来コラーゲンをトリプシンで分解したものに対し、配列番号１〜３８のアミノ酸配列データ群を参照し、
１）鑑別対象がウマである場合において、ＧＥＰＧＰＡＧＬＰＧＰＰＧＥＲ（配列番号２）、ＳＧＤＲＧＥＡＧＰＡＧＰＡＧＰＩＧＰＶＧＡＲ（配列番号１１）、ＧＤＧＧＰＰＧＶＴＧＦＰＧＡＡＧＲ（配列番号２４）、ＧＬＰＧＶＡＧＳＬＧＥＰＧＰＬＧＩＡＧＰＰＧＡＲ（配列番号２６）、ＧＥＰＧＰＶＧＳＶＧＰＶＧＡＶＧＰＲ（配列番号２８）、ＳＧＱＰＧＴＶＧＰＡＧＶＲ（配列番号３２）、及び、ＧＳＰＧＰＱＧＰＰＧＶＰＧＰＳＧＩＬＧＬＴＧＡＲ（配列番号３７）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別しウマであることを鑑別し、
２）鑑別対象がブタである場合において、ＧＥＴＧＰＡＧＲＰＧＥＶＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＥＫ（配列番号８）、ＳＧＤＲＧＥＴＧＰＡＧＰＡＧＰＶＧＰＶＧＡＲ（配列番号１２）、ＧＩＰＧＥＦＧＬＰＧＰＡＧＰＲ（配列番号２０）、ＧＥＰＧＰＡＧＳＶＧＰＡＧＡＶＧＰＲ（配列番号２９）、ＧＥＭＧＰＡＧＩＰＧＡＰＧＬＭＧＡＲ（配列番号３５）、及び、ＧＳＰＧＰＱＧＰＰＧＡＰＧＰＧＧＩＳＧＬＴＧＡＲ（配列番号３８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別しブタであることを鑑別し、
３）鑑別対象がヒツジである場合において、ＡＧＥＶＧＰＰＧＰＰＧＰＡＧＥＫ（配列番号９）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別しヒツジであることを鑑別、することを特徴とする動物種鑑別方法。
【請求項２３】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、
鑑別対象試料から抽出した動物皮の皮由来コラーゲンをトリプシンで分解したものに対し、配列番号１〜３８のアミノ酸配列データ群を参照し、鑑別対象の動物種を絞り込む際に、
１）ＧＥＰＧＰＡＧＡＶＧＰＡＧＡＶＧＰＲ（配列番号２７）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウシかシカに絞込み、動物種を鑑別し、
或は、
２）ＧＩＰＧＰＡＧＡＡＧＡＴＧＡＲ（配列番号１４）、及び、ＧＥＱＧＰＡＧＰＰＧＦＱＧＬＰＧＰＡＧＴＡＧＥＶＧＫＰＧＥＲ（配列番号１８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウマかブタに絞込み、動物種を鑑別、することを特徴とする動物種鑑別方法。
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月23日(2017.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、配列番号１〜３８のアミノ酸配列データ群を参照し、GEPGPAGAVGPAGAVGPR（配列番号２７）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウシかシカに絞込み、動物種を鑑別する動物種鑑別方法。
【請求項２】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、配列番号１〜３８のアミノ酸配列データ群を参照し、GIPGPAGAAGATGAR（配列番号１４）又はGEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEVGKPGER（配列番号１８）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウマかブタに絞込み、動物種を鑑別する動物種鑑別方法。
【請求項３】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、配列番号１〜３８のアミノ酸配列データ群を参照し、１）配列番号５、配列番号２７及び配列番号３１のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してウシを同定するステップと、２）配列番号２７及び配列番号３３のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してシカを同定するステップと、３）配列番号１１又は配列番号２８のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してウマを同定するステップと、４）配列番号１２又は配列番号２９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してブタを同定するステップと、５）未だ同定されていない残りの試料に対して、配列番号９のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してヒツジを同定し、配列番号７のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別してヤギを同定するステップ、を行うことを特徴とする動物種鑑別方法。
【請求項４】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、配列番号１〜３８のアミノ酸配列データ群を参照し、GFPGSDGVAGPK（配列番号４）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をヒツジかヤギに絞込み、動物種を鑑別することを特徴とする動物種鑑別方法。
【請求項５】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、
鑑別対象試料から抽出した動物皮の皮由来コラーゲンをタンパク質分解酵素で分解してペプチド断片にしたものに対し、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を取り除いた後、少なくとも1種の動物種で特異的に検出される配列番号１〜３８のアミノ酸配列データ群を参照し、
１）GEPGPAGAVGPAGAVGPR（配列番号２７）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウシかシカに絞込み、動物種を鑑別し、
或は、
２）GIPGPAGAAGATGAR（配列番号１４）、及び、GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEVGKPGER（配列番号１８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別して、鑑別対象をウマかブタに絞込み、動物種を鑑別、することを特徴とする動物種鑑別方法。
【請求項６】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、
鑑別対象試料から抽出した動物皮の皮由来コラーゲンをタンパク質分解酵素で分解してペプチド断片にしたものに対し、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を取り除いた後、少なくとも1種の動物種で特異的に検出される配列番号１〜３８のアミノ酸配列データ群を参照し、
IGQPGAVGPAGIR（配列番号３１）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別し動物種をウシと鑑別することを特徴とする動物種鑑別方法。
【請求項７】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、
鑑別対象試料から抽出した動物皮の皮由来コラーゲンをタンパク質分解酵素で分解してペプチド断片にしたものに対し、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を取り除いた後、少なくとも1種の動物種で特異的に検出される配列番号１〜３８のアミノ酸配列データ群を参照し、
GEPGPAGLPGPPGER（配列番号２）、SGDRGEAGPAGPAGPIGPVGAR（配列番号１１）、GDGGPPGVTGFPGAAGR（配列番号２４）、GLPGVAGSLGEPGPLGIAGPPGAR（配列番号２６）、GEPGPVGSVGPVGAVGPR（配列番号２８）、SGQPGTVGPAGVR（配列番号３２）、及び、GSPGPQGPPGVPGPSGILGLTGAR（配列番号３７）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し動物種をウマと鑑別することを特徴とする動物種鑑別方法。
【請求項８】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、
鑑別対象試料から抽出した動物皮の皮由来コラーゲンをタンパク質分解酵素で分解してペプチド断片にしたものに対し、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を取り除いた後、少なくとも1種の動物種で特異的に検出される配列番号１〜３８のアミノ酸配列データ群を参照し、
GETGPAGRPGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号８）、SGDRGETGPAGPAGPVGPVGAR（配列番号１２）、GIPGEFGLPGPAGPR（配列番号２０）、GEPGPAGSVGPAGAVGPR（配列番号２９）、GEMGPAGIPGAPGLMGAR（配列番号３５）、及び、GSPGPQGPPGAPGPGGISGLTGAR（配列番号３８）のアミノ酸配列のペプチド断片の中で、少なくとも何れかのペプチド断片の有無を判別し動物種をブタと鑑別することを特徴とする動物種鑑別方法。
【請求項９】
ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びシカの６種の動物から選択される少なくとも１種の動物由来の動物皮の鑑別方法であって、
鑑別対象試料から抽出した動物皮の皮由来コラーゲンをタンパク質分解酵素で分解してペプチド断片にしたものに対し、鑑別する動物種全てに共通して検出されるペプチド断片を取り除いた後、少なくとも1種の動物種で特異的に検出される配列番号１〜３８のアミノ酸配列データ群を参照し、
AGEVGPPGPPGPAGEK（配列番号９）のアミノ酸配列のペプチド断片の有無を判別し動物種をヒツジと鑑別することを特徴とする動物種鑑別方法。
【国際調査報告】
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