(57)【要約】【課題】  被験者におけるｃｔＤＮＡ量を測定することにより、当該被験者における悪性新生物に対する治療の効果を評価する方法を提供すること。【解決手段】  被験者における悪性新生物に対する治療の効果を評価する方法であって、（ａ）悪性新生物に対する当該治療開始前の前記被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ量を測定する工程と、（ｂ）悪性新生物に対する当該治療開始後の前記被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ量を測定する工程と、（ｃ）工程ｂで得た値を、工程ａで得た値で除算する工程と、を有する、方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における悪性新生物に対する治療の効果を評価する方法であって、
（ａ）悪性新生物に対する当該治療開始前の前記被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ量を測定する工程と、
（ｂ）悪性新生物に対する当該治療開始後の前記被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ量を測定する工程と、
（ｃ）工程ｂで得た値を、工程ａで得た値で除算する工程と、
を有する、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、工程ｃで得た値が１／１０以下になる場合、前記被験者における悪性新生物が縮小していることを示す、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記被験者は非小細胞肺癌患者または肺癌患者である、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、工程ａは、前記悪性新生物に対する当該治療開始前２ヶ月以内のいずれかの時点でｃｔＤＮＡ量を測定する、方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、工程ｂは、前記悪性新生物に対する当該治療開始後２ヶ月以内のいずれかの時点でｃｔＤＮＡ量を測定する、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記悪性新生物に対する治療は、シスプラチン、ペメトレキセド、カルボプラチン、ｎａｂ−パクリタキセル、パクリタキセル、ベバシズマブ、ドセタキセル、アムルビシン、ＥＧＦＲ阻害剤、及び化学療法剤から選択される１またはそれ以上の薬剤の投与である、方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブまたはエルロチニブである、方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記被験者は、工程ａの前に、前記悪性新生物に対する治療とは異なる他の治療が施されている、方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法において、前記他の治療は、外科的手術、放射線治療、または薬物治療であり、前記薬物治療は、シスプラチン、ペメトレキセド、カルボプラチン、ｎａｂ−パクリタキセル、パクリタキセル、ベバシズマブ、ドセタキセル、アムルビシン、ＥＧＦＲ阻害剤、及び化学療法剤から選択される１またはそれ以上の薬剤の投与である、方法。
【請求項１０】
被験者における悪性新生物に対する治療の効果を評価する治療効果評価システムであって、
（ａ）悪性新生物に対する当該治療開始前の前記被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ量を測定する手段と、
（ｂ）悪性新生物に対する当該治療開始後の前記被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ量を測定する手段と、
（ｃ）手段ｂで得た値を、手段ａで得た値で除算する手段と、
を有する、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者における悪性新生物に対する治療の効果を評価する方法、特に、被験者におけるｃｔＤＮＡ量を測定することによる悪性新生物に対する治療の効果を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌や脳腫瘍、および白血病やリンパ腫等の造血細胞悪性腫瘍等の悪性新生物（悪性腫瘍）を病因とする疾患に対しては、その腫瘍が存在する部位や進行度等の病状に応じて、外科療法・化学療法・放射線療法等の治療法が施されている。【０００３】
この複数の治療法において、外科療法と放射線療法は局所的な治療に有効であり、一方で、例えば癌の化学療法は、抗癌剤を静脈注射または経口投与することにより血液中に投薬し、全身に存在する癌細胞の分裂を抑え、かつ破壊することができるため、全身のどこに癌細胞があっても治療効果が期待でき、全身的な治療に効果がある。【０００４】
また、化学療法においては、特定の癌や白血病に対する治療薬が数多く開発されているため、外科療法や放射線療法と組み合わせることにより、全身転移した病巣や進行癌等の治療に利用されている。【０００５】
ところで、この化学療法による治療において、特定の癌や白血病に対する治療薬は、治療初期においては非常に有効であるが、継続して治療を続けることにより悪性新生物が当該治療薬に対して耐性（抵抗性）を備えてしまい、それ以上の治療効果を望めなくなることがある。例えば、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，ＥＧＦＲ−ＴＫＩｓ）であるゲフィチニブ（イレッサ）は、一部の非小細胞肺癌患者に対しては７０〜８０％と高い奏功率で抗腫瘍効果を示すことが知られている（非特許文献１）。しかし、ゲフィチニブは最終的には投与した全ての患者において耐性を生じてしまい、その多くは投与開始後約１年以内に現れ、耐性獲得後は再び腫瘍が増大する（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒｉｅｌｙ，Ｇ．Ｊ．，Ｐｏｌｉｔｉ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ａ．，ｅｔａｌ．（２００６）．Ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１２，７２３２−７２４１．
【非特許文献２】Ｓｅｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｖ．，Ｂｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｌｙｎｃｈ，Ｔ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｈａｂｅｒ，Ｄ．Ａ．（２００７）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５，５８７−５９５．
【０００７】
こうした治療薬に対する耐性獲得や治療薬の効果判定は、現在においては、患者の生体組織や臓器の一部を採取してバイオプシーによる検査を行うことにより確認しているが、バイオプシー検査は侵襲性であり、患者の身体への負担が大きいため好ましくはない。また画像診断により標的病巣における腫瘍の変化（増大または減少）を確認することもできるが、画像診断の場合には、治療効果の浸透を待つために、治療薬投与から数ヶ月（多くの場合、２ヶ月以上）の期間をあけてから画像を取得することになり、治療薬の効果を判定するまでに時間がかかってしまう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、被験者におけるｃｔＤＮＡ量を測定することにより、当該被験者における悪性新生物に対する治療の効果を評価する方法を提供することを目的とする。  
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、非小細胞肺癌または肺癌の一部の症例において、患者における治療前後の血中腫瘍ＤＮＡ量とその治療効果との間に、所定の相関関係が存在するという知見を得、血中腫瘍ＤＮＡ量を測定することによる治療効果の評価の可能性に着目した。【００１０】
そして、本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、患者における治療前後のｃｔＤＮＡ量を測定し、その比率と治療薬の奏効率との関係を明らかにすることを通じて、患者における悪性新生物に対する治療の効果を評価することができることを見出した。【００１１】
具体的には、本発明の第一の主要な観点によれば、被験者における悪性新生物に対する治療の効果を評価する方法であって、（ａ）悪性新生物に対する当該治療開始前の前記被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ量を測定する工程と、（ｂ）悪性新生物に対する当該治療開始後の前記被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ量を測定する工程と、（ｃ）工程ｂで得た値を、工程ａで得た値で除算する工程と、を有する、方法が提供される。【００１２】
このような構成によれば、評価対象となる治療の所定期間前後のｃｔＤＮＡ量を測定するだけで、そのｃｔＤＮＡ量の比率に相関する臨床状態（治療効果）を評価するための客観的な方法を提供することができる。また、また、このような構成によれば、非侵襲的かつ簡便に被験者における悪性新生物に対する治療の効果を評価することができ、これを通して、被験者に適した治療法を選択するための材料として資することができる。【００１３】
また、ｃｔＤＮＡ量の変化は治療後に比較的早く血流に現れるため、本発明に係る方法によれば、腫瘍自体の画像診断よりも早く当該治療の効果を評価することができ、患者個々人の健康または病状を管理する上で、客観的かつ迅速に情報提供をすることができる。【００１４】
また、本発明の一実施形態によれば、このような方法において、工程ｃで得た値が１／１０以下になる場合、前記被験者における悪性新生物が縮小していることを示すことができる。【００１５】
また、本発明の他の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点の方法において、前記被験者は非小細胞肺癌患者または肺癌患者であることが好ましい。【００１６】
また、本発明の別の一実施形態によれば、このような方法において、工程ａは、前記悪性新生物に対する当該治療開始前２ヶ月以内のいずれかの時点でｃｔＤＮＡ量を測定することが好ましく、また工程ｂは、前記悪性新生物に対する当該治療開始後２ヶ月以内のいずれかの時点でｃｔＤＮＡ量を測定することが好ましい。【００１７】
また、本発明のさらに別の一実施形態によれば、このような方法において、前記悪性新生物に対する治療は、シスプラチン、ペメトレキセド、カルボプラチン、ｎａｂ−パクリタキセル、パクリタキセル、ベバシズマブ、ドセタキセル、アムルビシン、ＥＧＦＲ阻害剤、及び化学療法剤から選択される１またはそれ以上の薬剤の投与であることが好ましく、この場合、前記ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブまたはエルロチニブであることが好ましい。【００１８】
また、本発明の他の一実施形態によれば、上述の本発明の第一の主要な観点の方法において、前記被験者は、工程ａの前に、前記悪性新生物に対する治療とは異なる他の治療が施されていても良く、この場合、前記他の治療は外科的手術、放射線治療、または薬物治療である。薬物治療は、シスプラチン、ペメトレキセド、カルボプラチン、ｎａｂ−パクリタキセル、パクリタキセル、ベバシズマブ、ドセタキセル、アムルビシン、ＥＧＦＲ阻害剤、及び化学療法剤から選択される１またはそれ以上の薬剤の投与であることが好ましい。【００１９】
本発明の第二の主要な観点によれば、上述の第一の主要な観点に係る方法を実行するシステムが提供され、具体的には、被験者における悪性新生物に対する治療の効果を評価する治療効果評価システムであって、（ａ）悪性新生物に対する当該治療開始前の前記被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ量を測定する手段と、（ｂ）悪性新生物に対する当該治療開始後の前記被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ量を測定する手段と、（ｃ）手段ｂで得た値を、手段ａで得た値で除算する手段と、を有する、システムが提供される。【００２０】
なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１ａは、本願発明の一実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ初回投与後のＰＤ患者とＰＲ患者とのそれぞれについて、ＭＡＲＴをプロットしたグラフである。    図１ｂは、本願発明の一実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ獲得耐性による疾患進行後の諸治療についてＰＤまたはＳＤ患者とＰＲ患者とのそれぞれについて、ＭＡＲＴをプロットしたグラフである。
【図２】図２は、本発明の一実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ初回投与前後のＰＭスコアの変化を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の一実施形態において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療におけるｃｔＤＮＡ量の変動を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明の一実施形態において、タイプＩ患者およびＩＩ患者のｃｔＤＮＡ量の変動を示すグラフである。縦軸はＥＧＦＲ変異のＰＭスコア（左）、またはＣＥＡ（腫瘍マーカー）のタンパク質濃度（μｇ／ｍＬ）（右）である。横軸はＥＧＦＲ−ＴＫＩの投与開始からの日数である。各パネルの上部の水平線は治療を示し、垂直線は治療の開始点を示し、矢頭は治療の終了点を示す。水平線の下の灰色の矢印は放射線治療を示す。各パネルの下部にある黒い矢印はＰＤポイントを示す。各パネルの白い矢印はＩＰポイントを示す。実線表示データのうちＰＭスコアの高いほうが活性化変異、低いほうが耐性変異を持つｃｔＤＮＡである。図４ｃのみＰＭスコアの高いほうが耐性変異、低いほうが活性化変異を持つｃｔＤＮＡである。なお、実線表示データが１つの場合は活性化変異を持つｃｔＤＮＡである。黒の破線はＣＥＡを示す。検出閾値（ＰＭスコア）を超えるデータがないか、またはデータが正常範囲（ＣＥＡ）内にある患者については、データを示していない。    （ａ）患者１（タイプＩ）。（ｂ）患者５（タイプＩ）。（ｃ）患者１１（タイプＩ）。（ｄ）患者１２（タイプＩＩ）。（ｅ）患者１３（タイプＩＩ）。（ｆ）患者１４（タイプＩＩ）。    略語は以下のとおりである：ＣＤＤＰ（シスプラチン）；ＰＥＭ（ペメトレキセド）；ＣＢＤＣＡ（カルボプラチン）；ｎａｂＰＴＸ（ｎａｂ−パクリタキセル）；ＰＴＸ（パクリタキセル）；ＢＥＶ（ベバシズマブ）
【図５】図５は、本発明の一実施形態において、最初の疾患進行後の長期観察期間を伴う患者９（タイプＩ）のｃｔＤＮＡ量の変動を示す模式図である。パネルの詳細は図４と同じである。略語は以下のとおりである：ＤＯＣ（ドセタキセル）；ＡＭＲ（アムルビシン）
【図６】図６は、本発明の一実施形態において、図４および５に示されない患者のｃｔＤＮＡ量の変動を示す模式図である。患者１５（タイプＩＩ）以外のすべての患者は、タイプＩに属する。パネルの詳細は図４と同じである。（ａ）患者２。（ｂ）患者３。（ｃ）患者４。（ｄ）患者６。（ｅ）患者７。（ｆ）患者８。（ｇ）患者１０。（ｈ）患者１５。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本願発明に係る一実施形態および実施例を、図面を参照して説明する。  
上記のとおり、本願発明は、被験者における悪性新生物に対する治療の効果を評価する方法であって、（ａ）悪性新生物に対する当該治療開始前の前記被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ量を測定する工程と、（ｂ）悪性新生物に対する当該治療開始後の前記被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ量を測定する工程と、（ｃ）工程ｂで得た値を、工程ａで得た値で除算する工程と、を有するものである。【００２３】
本願明細書において、「悪性新生物」又は「悪性腫瘍」とは、他組織に浸潤あるいは転移することにより、全身において増大可能な腫瘍等を指す。一般には、癌や白血病等のことを意味するものであるが、上皮内新生物、異形成上皮、腺腫、肉腫、悪性リンパ腫、骨肉腫、筋肉腫等、細胞が異常増殖するものであればこれらに限定されない。【００２４】
また、本願明細書において、「悪性新生物に対する治療の効果」の評価とは、悪性新生物を有する患者（被験者）に対して所定の治療を施した際に、当該治療または治療薬がどの程度効いているかを評価することをいう。例えば、腫瘍に対する抗癌剤の効果を判定する場合、標的病変における客観的な腫瘍縮小効果について、ＲＥＣＩＳＴガイドラインが規定されており、抗癌剤の効果を以下のように分類している。完全奏効（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＣＲ）：すべての標的病変の消失。部分奏効（ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＰＲ）：ベースライン長径和と比較して標的病変の最長径の和が３０％以上減少。進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＰＤ）：治療開始以降に記録された最小の最長径の和と比較して標的病変の最長径の和が２０％以上増加。安定（ｓｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＳＤ）：ＰＲとするには腫瘍の縮小が不十分で，かつＰＤとするには治療開始以降の最小の最長径の和に比して腫瘍の増大が不十分。また、各種疾患または治療において、悪性新生物に対する治療の効果を評価する基準は１種類に限定されるものではなく、本願発明においては、「悪性新生物に対する治療の効果」の評価を１の効果基準を用いて表すこともでき、または複数の効果基準を組み合わせて治療効果を評価しても良い。【００２５】
また、本願明細書において、「被験者由来の血液中のｃｔＤＮＡ」とは、被験者の血液中に浮遊している腫瘍由来の遊離ＤＮＡであり、血液中腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ：ｃｔＤＮＡ）を指す。なお、一般的に、血液中に存在するＤＮＡのうち、ｃｔＤＮＡは、正常細胞ＤＮＡに比べて非常に微量でしか存在しないことが知られている。【００２６】
また、本願明細書において、「ｃｔＤＮＡ量」とは上記のｃｔＤＮＡを定量化した値であり、「ＰＭ（Ｐｌａｓｍａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）スコア」として算出することもできる。この「ＰＭスコア」とは、母数となるリード（例えば、１００，０００リード）中の活性化変異の数（欠失変異および置換変異を含む。後述の活性化変異の説明も参照。）として定義することができる。すなわち、血中ＤＮＡにおける活性化変異の数とは、血中における腫瘍由来のＤＮＡであるため、「ｃｔＤＮＡ量」とすることができる。【００２７】
また、本願明細書において、「活性化変異」または「活性化突然変異」とは、分子標的薬が作用する標的遺伝子または標的タンパク質に存在する疾患の原因となる変異、あるいは正常細胞では存在しない異常タンパク質そのものを指す。また、「耐性変異」とは、特定の分子標的薬を投与した際の耐性獲得の原因となる変異を指す。【００２８】
また、本願発明に係る方法では、患者が有する活性化変異および耐性変異を検出することを通じてｃｔＤＮＡ量を定量的に測定し、ＭＡＲＴを算出することによって、当該被験者における悪性新生物に対する治療の効果を評価することが可能となる。【００２９】
具体的には、効果判定の目的となる治療（治療法または治療薬）の所定期間前のｃｔＤＮＡ量（Ａ）と、当該治療の所定期間後のｃｔＤＮＡ量（Ｂ）とを測定し、ＢをＡで除算することにより、その比率（Ｂ／Ａ）を算出する。本願明細書においては、この比率を「治療における突然変異対立遺伝子比（ＭＡＲＴ：Mutation allele ratio in therapy）」と呼ぶ。そして、その除算した結果の値が小さくなればなるほど、例えば１／１０以下になると、ＰＲまたはＣＲになる確率があがり、１／１０以上の場合にはＰＤになる確率があがる。【００３０】
また、効果判定の目的となる治療前のｃｔＤＮＡ量の測定のタイミングは、治療前２ヶ月以内のいずれの時点であっても良く、例えば治療５０日前、治療４０日前、治療３５日前、治療３０日前、治療２８日前、治療２１日前、治療２０日前、治療１５日前、治療１４日前、治療１０日前、治療５日前などの時点である。【００３１】
また、効果判定の目的となる治療後のｃｔＤＮＡ量の測定のタイミングは、治療後２ヶ月以内のいずれの時点であっても良く、例えば治療５０日後、治療４０日後、治療３５日後、治療３０日後、治療２８日後、治療２１日後、治療２０日後、治療１５日後、治療１４日後、治療１０日後、治療５日後などの時点である。治療後２ヶ月以内に測定することにより、画像診断による治療効果の判定よりも早期に治療効果を評価することができる。【００３２】
また、効果判定の目的となる悪性新生物に対する治療には、シスプラチン、ペメトレキセド、カルボプラチン、ｎａｂ−パクリタキセル、パクリタキセル、ベバシズマブ、ドセタキセル、アムルビシン、ＥＧＦＲ阻害剤、及び化学療法剤から選択される１またはそれ以上の薬剤の投与を含むことができ、ｃｔＤＮＡ量を測定した患者に対して、当該測定後２ヶ月以内に上記の治療を施し、その後、治療後２ヶ月以内に、再度ｃｔＤＮＡ量を測定する。また、ＥＧＦＲ阻害剤は、ゲフィチニブまたはエルロチニブが好ましい。また、本願発明の一実施形態において、被験者は、これらの治療の前にすでに他の治療を受けていても良く、すなわち、すでに何らかの治療が施された患者を被験者とし、当該被験者のｃｔＤＮＡ量を測定し、その測定後２ヶ月以内に上記の治療を施し、その後、治療後２ヶ月以内に、再度ｃｔＤＮＡ量を測定する。【００３３】
本願発明の一実施形態において、悪性新生物に対する治療の効果を評価可能な被験者として非小細胞肺癌患者や肺癌患者が挙げられる。非小細胞肺癌は肺癌の一種であり、一部の症例では上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）が関与していることが明らかになっている。ＥＧＦＲとは、分子量約１７万の膜貫通型糖タンパクであり、癌の増殖、維持に関与していることが明らかとなっており、非小細胞肺癌をはじめとして様々な癌でその発現が確認されている。ＥＧＦＲは非活性化状態では一量体として存在するが、ＥＧＦなどの増殖因子が受容体に結合すると二量体を形成し、細胞内領域にあるチロシンキナーゼ部位においてＡＴＰを利用することで受容体細胞内領域のチロシン残基をリン酸化させる。その結果、シグナル伝達経路の下流に位置するタンパク質のチロシンリン酸化を連鎖的に引き起こし、増殖シグナルが核まで伝達することで細胞周期をＧ１期からＳ期へと進行させ細胞の増殖をもたらす。さらにＥＧＦＲチロシンキナーゼの活性化は、細胞内のＴＧＦ−α、ｂＦＧＦなどの増殖因子の産生を亢進させ、自己分泌あるいは傍分泌経路により細胞の増殖を刺激するとともに、血管内皮細胞成長因子ＶＥＧＦの産生を亢進して癌の血管新生を促進する。これら一連の変化により癌の悪性度が増し病勢の進行がもたらされると考えられている。【００３４】
そして、上記のとおり、効果判定の目的となる悪性新生物に対する治療として、非小細胞肺癌患者に対してＥＧＦＲ阻害剤を投与することができ、好ましくはゲフィチニブまたはエルロチニブを投与することができる。このゲフィチニブはｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅを基本骨格としておりＡＴＰのアデニンとの構造上の類似性から、ＥＧＦＲの細胞内チロシンキナーゼ部位のＡＴＰ結合部位に可逆的に結合することでＡＴＰの結合を阻害し、活性化を抑制するというメカニズムを持つ。【００３５】
一部の非小細胞肺癌患者において、このゲフィチニブが抗腫瘍効果を示すことが知られており、その患者の大半はＥＧＦＲチロシンキナーゼ部位に対応する遺伝子に変異を有していることが明らかになっている。これらの変異はＥＧＦＲを恒常的に活性化状態に保つ一方でゲフィチニブが容易に結合する構造へと変化させるためその効果が表れると考えられている（活性化変異）。この活性化変異の例としては、正常ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９位の欠失変異（ΔＥ７４６−Ａ７５０、ΔＥ７４６−Ｔ７５１、ΔＥ７４６−Ａ７５０（ｉｎｓ  ＲＰ）、ΔＥ７４６−Ｔ７５１（ｉｎｓ  Ａ／Ｉ）、ΔＥ７４６−Ｔ７５１（ｉｎｓ  ＶＡ）、ΔＥ７４６−Ｓ７５２（ｉｎｓ  Ａ／Ｖ）、ΔＬ７４７−Ｅ７４９（Ａ７５０Ｐ）、ΔＬ７４７−Ａ７５０（ｉｎｓ  Ｐ）、ΔＬ７４７−Ｔ７５１、ΔＬ７４７−Ｔ７５１（ｉｎｓ  Ｐ／Ｓ）、ΔＬ７４７−Ｓ７５２（）、ΔＬ７４７−７５２（Ｅ７４６Ｖ）、ΔＬ７４７−７５２（Ｅ７５３Ｓ）、ΔＬ７４７−Ｓ７５２（ｉｎｓ  Ｑ）、ΔＬ７４７−Ｐ７５３、ΔＬ７４７−Ｐ７５３（ｉｎｓ  Ｓ）、ΔＳ７５２−Ｉ７５９等）、Ｌ８５８Ｒ点変異、Ｇ７１９Ｃ、Ｇ７１９Ｓ、Ｇ７１９Ａ、Ｖ６８９Ｍ、Ｎ７００Ｄ、Ｅ７０９Ｋ／Ｑ、Ｓ７２０Ｐ、Ｖ７６５Ａ、Ｔ７８３Ａ、Ｎ８２６Ｓ、Ａ８３９Ｔ、Ｋ８４６Ｒ、Ｌ８６１Ｑ、Ｇ８６３Ｄなどが挙げられるが、ＥＧＦＲを恒常的に活性化状態に保つことができる変異であればそのすべてが含まれる。本発明の一実施形態においては、非小細胞肺癌の正常なマーカー遺伝子としてＥＧＦＲ遺伝子を利用している。【００３６】
また、ゲフィチニブ及びエルロチニブは、投与した患者において耐性を生じることも知られている。その多くは投与開始後約１年以内に現れ、耐性獲得後は再び腫瘍が増大する。その原因は、約半数において、ＥＧＦＲ遺伝子の７９０番目のアミノ酸であるｔｈｒｅｏｎｉｎｅがｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅへと置換されていることによる（耐性変異、Ｔ７９０Ｍ点変異）。結晶構造解析によると、このアミノ酸変化でより分子量の大きいｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅに置換されることで立体障害が起こりゲフィチニブ及びエルロチニブのＥＧＦＲチロシンキナーゼに対する親和性を低下させている可能性が示されている。また、本発明の一実施形態において、このような耐性変異としては、Ｔ７９０Ｍ以外に、Ｄ７６１Ｙ、Ｄ７７０＿Ｎ７７１（ｉｎｓ  ＮＰＧ）、Ｄ７７０＿Ｎ７７１（ｉｎｓ  ＳＶＱ）、Ｄ７７０＿Ｎ７７１（ｉｎｓ  Ｇ）、Ｎ７７１Ｔ、Ｖ７６９Ｌ、Ｓ７６８Ｉ等が挙げられるが、ゲフィチニブまたはエルロチニブへの耐性獲得への原因となる変異であればそのすべてが含まれる。【００３７】
本発明の一実施形態においては、非小細胞肺癌患者における、上記のようなＥＧＦＲ遺伝子の活性化変異と耐性変異を検出することを通じてｃｔＤＮＡ量を定量的に測定し、ＭＡＲＴを算出することによって、当該非小細胞肺癌患者における悪性新生物に対する治療の効果を評価することが可能となる。【００３８】
また、本願明細書において、「マーカー遺伝子」とは癌細胞で体細胞突然変異が起きる遺伝子である。「マーカー遺伝子」は分子標的薬の標的遺伝子を含む。詳細には、特定の疾患においてその原因遺伝子およびその原因遺伝子に作用する分子標的薬が判明している場合、分子標的薬の標的となる原因遺伝子を指す。また、本願明細書において、「正常なマーカー遺伝子」とは、特定の疾患における「マーカー遺伝子」が、体細胞突然変異を持つ場合、正常な細胞が有する体細胞突然変異を持たない当該遺伝子（正常な遺伝子）を指す。また、特定の疾患における原因遺伝子が、１又は複数の遺伝子に体細胞突然変異が生じることにより、正常細胞では存在しない異常タンパク質が生じる等の１又は複数のタンパク質に異常が生じる場合であるときには、当該突然変異が生じた１又は複数の遺伝子に対応する、正常な細胞が有する体細胞突然変異を持たない１又は複数の遺伝子（正常な遺伝子群）を指す。【００３９】
また、本発明の一実施形態において、活性化変異もしくは耐性変異の定量的な検出、またはｃｔＤＮＡ量の定量的な測定は、ＢＥＡＭｉｎｇ法などの定量性のある手法によって行われる。ここで、ＢＥＡＭｉｎｇとはオイルエマルジョン中でＰＣＲ反応を行い１個のナノ粒子に１分子由来のＰＣＲ産物を固定した後、当該部位の正常及び変異塩基を異なった蛍光色素で標識・検出する方法である。また、このＢＥＡＭｉｎｇや次世代シーケンサーにおいてはエマルジョンＰＣＲを用いて１分子毎のＤＮＡの増幅を行うこととしているが、本発明に係る方法においては、正常及び変異塩基を識別できるものであれば、任意の定量的解析を用いることができる。例えば、ＤＮＡチップ、マイクロアレイ法、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット法、ドットブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等の種々の分子生物学的手法を用いることもできる。なお、ＢＥＡＭｉｎｇにおいては、エマルジョンＰＣＲを用いて１分子毎のＤＮＡの増幅を行った後にフローサイトメトリーを用いることによって各分子を回収している。また、次世代シーケンサーとしては、ＤＮＡ１分子を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成を行い、１塩基ごとの反応を蛍光・発光等で検出することにより、リアルタイムで塩基配列を決定するものであれば、いかなる種類の次世代シーケンサーであってもよく、次世代シーケンサーにおいて行われる塩基認識方法やリード長、試薬等は任意のものでも良い。【００４０】
なお、上述のような悪性新生物に対する治療の効果の評価は、患者のｃｔＤＮＡ量についての蓄積サンプル数が多ければ多いほど好ましく、本発明に係る評価方法の精度も高くなる。また、本願発明においては、このような蓄積サンプルに係るデータを、任意のデータベースに格納できる構成を取り得る。すなわち、本願発明は、このようなデータを格納するデータベースと、当該データ及び比較解析に必要なプログラム等を読み出して実行する解析装置またはシステムをも提供することができる。このような解析装置またはシステムによれば、対象となる被験者毎に、効果判定の目的となる治療の所定期間前後のｃｔＤＮＡ量に関するデータと、画像診断等で判明した実際の治療評価（ＰＤやＰＲ等）の情報とを蓄積し、必要に応じて蓄積データを取り出し、更新することにより、被験者における悪性新生物に対する治療の効果をいつでも簡便に評価することができる。【００４１】
また、このようなシステムは、コンピュータシステムに内蔵されたＣＰＵにシステムバスを介してＲＡＭ、ＲＯＭやＨＤＤ、磁気ディスクなどの外部記憶装置及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）が接続されて構成されることができる。入出力Ｉ／Ｆには、キーボードやマウスなどの入力装置、ディスプレイなどの出力装置、及びモデムなどの通信デバイスが夫々接続されている。外部記憶装置は、ｃｔＤＮＡ量情報ＤＢ、画像診断情報ＤＢ、及びプログラム格納部とを備え、いずれも記憶装置内に確保された一定の記憶領域である。【００４２】
さらに、このようなシステムは、ｃｔＤＮＡ量を測定および解析するシステムを有することができ、このｃｔＤＮＡ量測定・解析するシステムは、被験者から分子診断用採血管等で採取された核酸を含む生体サンプルを元に核酸分析を行う核酸分析装置や、その分析結果を元にＭＡＲＴ分析を行うＭＡＲＴ分析装置を含むことができ、それぞれ、専用回線や公衆回線等の通信ネットワークによって電子的に接続されることができる。
【実施例】
【００４３】
以下に、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４４】
（実験手法および材料）
以下に、本発明において用いる実験手法および材料について説明する。なお、本実施形態において、以下の実験手法を用いているが、これら以外の実験手法を用いても、同様の結果を得ることができる。【００４５】
（被験者）
以前に何らかの治療を受けたか否かに関わらず、ＥＧＦＲ活性化突然変異を有する肺癌患者を、２０１１年１１月から２０１４年３月まで、大阪府立成人病センターで募集し（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ＵＭＩＮ０００００６７６４）、すべての参加者から書面による同意が得られた。本実施例に係る研究は、大阪府立成人病センターの倫理委員会で承認され、その方法は、承認ガイドラインに従って実施された。【００４６】
（血液サンプリング）
ｃｔＤＮＡアッセイのための血液サンプリングは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療の開始前、ならびに開始後２週間および４週間（１４日後および２８日後）のタイミングで行った。このタイミングには、休日を数えずに±４日の余裕をもたせた。この期間後はサンプリング間隔２ヵ月を目標値として採血を行った。採血は少なくとも客観的な疾患の進行が始まるまで、また可能な限りこの時点を超えて継続した。血液サンプリングは２０１４年６月３０日に終了した。【００４７】
（治療応答および疾患進行の臨床評価）
ＲＥＣＩＳＴバージョン１．１を用いて、最初のＥＧＦＲ−ＴＫＩの治療開始約２ヶ月後における、治療に対する応答の評価を行った。ＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療中の疾患の進行の評価も、ＲＥＣＩＳＴ基準に基づいて行った。また、肺癌の治療と診断のガイドライン（日本肺癌協会）で推奨された基準も適用した。【００４８】
（ｃｔＤＮＡアッセイ）
アッセイシステムでは、ディープシーケンシング、つまり、多数の遺伝子断片を配列決定することによって突然変異を検索した。ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン１９、２０、及び２１を患者の血漿ＤＮＡからＰＣＲで独立して増幅し、イオントレントＰＧＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてディープシーケンシングを行った。血漿突然変異（ＰＭ）スコアと呼ばれる診断スコアを、１００，０００回の読み取りにおいて、欠失（エクソン１９欠失）または置換（エクソン２０、Ｔ７９０Ｍ；エクソン２１；Ｌ８５８Ｒ、Ｌ８６１Ｑ）を有するリード数として定義した。検出限界（ＬＯＤ）および定量限界（ＬＯＱ）に対応するパラメータを推定し、それらを突然変異検出のための閾値を定義した。ＥＧＦＲ−ＴＫＩの開始前及び開始後２ヶ月までの閾値は、エクソン１９欠失はＬＯＱ、Ｌ８５８ＲはＬＯＤとして設定した。疾患の進行を評価する場合は、検出の閾値をＬＯＱ（ＰＭスコア＝３００）として設定した。この研究と併せて行われた多施設研究によれば、この設定では偽陽性の可能性を無視できることがわかり、エクソン１９欠失、Ｌ８５８Ｒ、およびＴ７９０Ｍの偽陽性率の推定値はそれぞれ２％、０％、および１％であった。【００４９】
ｃｔＤＮＡアッセイの実験手順は、本研究がシーケンシング試薬の最新のものを使用したことを除いて、Kukita, Y. et al. Quantitative identification of mutant alleles derived from lung cancer in plasma cell-free DNA via anomaly detection using deep sequencing data. PLoS One 8, e81468, doi: 10.1371/journal.pone.0081468 (2013).に記載されたものと同じである。アッセイは、２０１２年１１月から２０１４年９月までのサンプリング日の順で、週当たり１２〜２４サンプルの割合で実施した。【００５０】
（結果）
（被験者およびサンプル集団）
計５２人の患者がこの研究に参加し、その患者集団の臨床的特徴を表１に示す。【００５１】
【表１】
2017094805.tif 000002
【００５２】
患者情報はＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療の開始に対応し、血液サンプルの総数は５３０である。全てのサンプルにおいてＥＧＦＲエクソン断片のＰＣＲ増幅が成功し、全てのサンプルから突然変異データが得られた。【００５３】
（ＥＧＦＲ−ＴＫＩに対する初期応答の評価）
本発明者らは、ｃｔＤＮＡの動態を用いてＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療の効果を評価できるかどうかを調べた。５人の患者については、対応する時点のサンプルを欠いていたため、４７人の患者のサンプルを分析に用いた。ｃｔＤＮＡの初期レベルが閾値を超えていた３０人の患者（６３．８％）のサンプルを以下の定量分析に用いた。この患者亜集団の臨床的特徴は表１に示した。【００５４】
治療における突然変異対立遺伝子比（ＭＡＲＴ：Mutation allele ratio in therapy）は、治療開始後の活性化突然変異のＰＭスコアと、治療開始前の活性化突然変異のＰＭスコアとの比として定義し、治療応答の指標として使用した。治療開始後２週間または４週間のＰＭスコアから２７症例でＭＡＲＴを計算した。患者をＰＤ（疾患進行）の症例と、ＰＲ（部分奏功）の症例とに分類して、そのＭＡＲＴを図１にプロットした。３例すべてのＰＤ患者のＭＡＲＴは０．１を超えていた。これに対し、ＭＡＲＴはＰＲ（１例のＣＲを含む）２４例のうち６件で０．１を超えていた。これらの９例のＰＭスコアは図２にプロットした。ＰＤ患者のＰＭスコアは、ＰＲ／ＣＲ患者のＰＭスコアよりも有意に高かった。【００５５】
（長期間の時間的解析に適した症例の特定）
次に、本発明者らは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療中におけるｃｔＤＮＡの動態を用いて疾患進行の開始を推定できるかどうかを調べた。標的とした期間は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩの治療開始後１ヶ月から、疾患進行を検出した時点までとした。ＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療中に獲得耐性により客観的な疾患進行（ＰＤ）を示した患者のみをこの分析に用いた。１１人の患者については、初期応答におけるＰＤ（３人）、死亡（３人）、副作用（４人）、および患者の意向（１人）によって、獲得耐性によるＰＤとなる前にＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療を停止した。６人の患者は観察期間（中央値 ３５８日、最小値 １９８日、最大値 ７４７日）中にＰＤを発症しなかった。残りの３５人の患者はＰＤとなった。これらのケースにおいて、ＰＤとなる期間の統計は以下のとおりである。中央値 ３３５日、最小値５７日間、最大値、８３８日。【００５６】
データが不十分な症例を除外するため、ＰＤ時点を含む３００日の範囲内で４つ以上のサンプルを有する症例を選択し、２８症例がこの基準を満たした。これらの臨床情報は表２に示され、要約統計量は表１（サンプル数＝３５１；サンプリング間隔：中央値＝４３日、下位四分位＝２２日、上位四分位＝６３日）に示した。【００５７】
（ｃｔＤＮＡの動態と疾患進行の開始との相関）
以前に本発明者らは、後ろ向きデータセットを用いて、活性化突然変異およびＴ７９０Ｍ突然変異のｃｔＤＮＡレベルが、ＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療中に、客観的な疾患進行の開始まで抑制されるものの、その後増加することを明らかにしている（Uchida, J. et al. Dynamics of circulating tumor DNA represented by the activating and resistant mutations in the EGFR-TKI treatment. Cancer Sci. 2016, 107:353-358.）。ｃｔＤＮＡの動態を画像診断によって同定された客観的な疾患進行と比較するため、抑制後のｃｔＤＮＡレベルが閾値を超え始める最初の時点として初期陽性（ＩＰ）ポイントを定義した。本発明者らは、各患者のＩＰポイントを同定し、その値を客観的な疾患進行を画像診断で検出した最初の時点（ＰＤポイント）と比較した。ｃｔＤＮＡ動態の概略図を、ＩＰポイントおよびＰＤポイントの理解を容易にするための図３に示した。ＩＰポイントおよびＰＤポイントは、ＥＧＦＲ−ＴＫＩの治療開始日からの時間間隔（日数）として示した（表２）。【００５８】
【表２】
2017094805.tif 000003
【００５９】
患者１〜１１の「タイプＩ」患者では、ＩＰポイントとＰＤポイントとの時間間隔は±１００日の範囲内であり（ＩＰ  ｆｒｏｍ  ＰＤ、表２）、その間のデータポイント数は１または０であった（図４ａ〜ｃ、図５、図６ａ〜ｇ）。診断テスト間の時間間隔を考慮すると、ｃｔＤＮＡ動態および画像診断は、病状の同じ変化を捉えている可能性が高い。６人の患者では、ｃｔＤＮＡレベルは新しい治療開始時に減少した（図４ｂ〜ｃ、図５、図６ｄ）。なお、図４（図４ｃを除く）、図５、及び図６において、２つの実線表示データのうちＰＭスコアの高いほうが活性化変異、低いほうが耐性変異を持つｃｔＤＮＡである。図４ｃのみＰＭスコアの高いほうが耐性変異、低いほうが活性化変異を持つｃｔＤＮＡである。なお、実線表示データが１つの場合は活性化変異を持つｃｔＤＮＡである。【００６０】
「タイプＩＩ」患者と名付けた患者１２〜１５では、ＩＰポイントはＰＤポイントよりも１００日以上先行しており（ＩＰ  ｆｒｏｍ  ＰＤ、表２）、その間に２つのデータポイントがあった（図４ｄ〜ｆ、図６ｈ）。これらの患者では、ｃｔＤＮＡ動態は画像診断と異なっており、客観的な疾患進行よりも前に上昇していた。タイプＩ患者のｃｔＤＮＡ動態の均一性とは対照的に、タイプＩＩ患者のものはより多様であった。患者１２では、ｃｔＤＮＡレベルはＩＰポイントの後に絶えず増加していた（図４ｄ）。患者１３では、活性化突然変異のｃｔＤＮＡレベルが上昇し、ＰＤポイントまで一定のレベルを維持し、その後Ｔ７９０ＭのｃｔＤＮＡの増加とともに増加した（図４ｅ）。患者１５では、変動パターンは患者１３のものと類似していたが、ｃｔＤＮＡは、おそらく化学療法剤の介入のため、客観的な疾患進行で増加しなかった（図６ｈ）。患者１４のｃｔＤＮＡ動態は複雑だが、その理由の一つは他の療法の介入のためである（図４ｆ）。【００６１】
活性化突然変異およびＴ７９０Ｍ突然変異の両方とも、８人の患者でＩＰポイント後に上昇した（図４ａ、ｂ、ｄ〜ｆ、図５、図６ａ、ｃ、ｄ）。これらの患者においては、Ｔ７９０ＭのｃｔＤＮＡレベルは、活性化突然変異のｃｔＤＮＡレベルよりも常に低く、多くの場合、上昇した。本発明者らは、患者１１のみはＴ７９０ＭのｃｔＤＮＡに注目し（図４ｃ）、Ｔ７９０ＭのｃｔＤＮＡを用いてＩＰポイントを決定した。【００６２】
患者１６〜２８では、ＰＤに関連する上昇を呈しておらず、「タイプＩＩＩ」と分類した（表２）。Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型の患者数はそれぞれ１１．３（３９．３％）、４（１４．３％）、および１３（４６．４％）であった。【００６３】
すべての症例において、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のレベルを測定した。客観的な疾患進行と並行したＣＥＡの増加が、２８人の患者のうち９人（３２．１％）で観察された。【００６４】
（さまざまな治療法への応答）
患者９は、最初の疾患進行の後に長期間にわたって異なる治療を行っており、例として図５に示した。この患者は、ゲフィチニブの再度の投与を含む様々な薬剤で治療されている。活性化突然変異およびＴ７９０ＭのｃｔＤＮＡはいずれも、最初のＰＤ後に上昇したが、これらはすぐに化学療法剤で抑制された。種々の化学療法剤による治療の間、Ｔ７９０ＭのｃｔＤＮＡは抑制されたが、活性化突然変異は疾患進行と並行して上昇した。ゲフィチニブを投与すると、Ｔ７９０ＭのｃｔＤＮＡは増加したが、Ｔ７９０Ｍを標的とするＥＧＦＲ−ＴＫＩであるＡＺＤ９２９１では、Ｔ７９０ＭのｃｔＤＮＡは抑制された。ｃｔＤＮＡの動態は、Ｔ７９０ＭのｃｔＤＮＡが、主要な癌細胞集団のものとは異なる薬剤感受性を伴う癌細胞集団を表すことを示している。疾患進行の長い病歴を有する他の患者、すなわち患者１０および１５は、図６ｇ、ｈに示した。【００６５】
（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ以外の治療）
続いて、ＥＧＦＲ−ＴＫＩが既に投与された患者であって、かつＰＤとなった患者につて、ＰＤポイント後の諸治療について、当該治療前後のｃｔＤＮＡ量と当該治療の効果との間に相関関係がみられるかどうかを確かめた。まず、最初の疾患進行後のすべての治療の変化を表３に示した。これらについて、放射線治療以外のケースについてＲＥＣＩＳＴによる判定により分類し、ＭＡＲＴをプロットした（図１ｂ）。また、計算には、治療開始に隣接する時点のデータを使用した。関連するデータを表３に示した。【００６６】
【表３】
2017094805.tif 000004
【００６７】
ＥＧＦＲ−ＴＫＩの解析で導かれた閾値（ＭＡＲＴ＝０．１）を適用すると、ＰＤ／ＳＤとＰＲを区別する精度は９４．７％（９５％信頼区間、７３．５〜１００）であった。ＥＧＦＲ−ＴＫＩおよびこれらの治療法の結果によれば、ＭＡＲＴは治療応答を評価するための主要なパラメータであることがわかる。【００６８】
その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。
【図１】
2017094805.tif 000005
【図２】
2017094805.tif 000006
【図３】
2017094805.tif 000007
【図４】
2017094805.tif 000008
【図５】
2017094805.tif 000009
【図６−１】
2017094805.tif 000010
【図６−２】
2017094805.tif 000011
【国際調査報告】
2017094805.tif 000012
2017094805.tif 000013
2017094805.tif 000014
2017094805.tif 000015