(57)【要約】  導電層と、特定のウィルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖と、前記導電層と前記オリゴ糖とを結合する中間層と、を有するバイオセンサ用デバイス。
2017126617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電層と、特定のウィルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖と、前記導電層と前記オリゴ糖とを結合する中間層と、を有するバイオセンサ用デバイス。
【請求項２】
前記中間層は、自己組織化単分子膜である請求項１に記載のバイオセンサ用デバイス。
【請求項３】
前記自己組織化単分子膜は、前記導電層にチオール基で固定されたチオール化合物で形成されている請求項２に記載のバイオセンサ用デバイス。
【請求項４】
前記自己組織化単分子膜は、オキシルアミノ基またはヒドラジド基を有するチオール化合物を含む請求項３に記載のバイオセンサ用デバイス。
【請求項５】
前記中間層は、導電性高分子を含む請求項１に記載のバイオセンサ用デバイス。
【請求項６】
前記導電性高分子が、ポリチオフェン系導電性ポリマー、ポリフェニレン系導電性ポリマー、ポリピロール系導電性ポリマー、ポリアニリン系導電性ポリマー、ポリフルオレン系導電性ポリマーおよびポリインドール系導電性ポリマーからなる群より選択される少なくとも１つである請求項５に記載のバイオセンサ用デバイス。
【請求項７】
前記導電性高分子が、
（Ａ）オキシルアミノ基またはヒドラジド基の少なくとも１つと、
（Ｂ）チエニル基、フェニル基、ピロール基、アニリン基、フルオレン基、およびインドール基からなる群より選択される少なくとも１つと、
を含むモノマーから形成される構造単位を含む、請求項５または請求項６に記載のバイオセンサ用デバイス。
【請求項８】
前記導電性高分子が電解重合法または酸化重合法によって形成される、請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載のバイオセンサ用デバイス。
【請求項９】
前記オリゴ糖は、特定のインフルエンザウィルスを選択的に捕捉するオリゴ糖である請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載のバイオセンサ用デバイス。
【請求項１０】
前記導電層が、電界効果トランジスタのゲート電極又は前記ゲート電極と電気的に接続されている電極である請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載のバイオセンサ用デバイス。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載のバイオセンサ用デバイスを備えたバイオセンサ。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載のバイオセンサ用デバイスを複数備え、それぞれのバイオセンサ用デバイスの前記オリゴ糖が、互いに異なった特定のウィルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖である請求項１１に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
少なくとも一つのバイオセンサ用デバイスの前記オリゴ糖がシアル酸残基を含む請求項１１又は請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１４】
電位、振動数及び屈折率から選択されるいずれか一つの変化に基いてウィルス又は細菌を検出する請求項１１〜請求項１３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウィルスおよび細菌検出バイオセンサ用デバイス、及びバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
感染症は社会的な問題であり、その克服には、感染したか否かの迅速な判断が要求される。
ウィルスや細菌に感染したか否かを迅速にモニタリングする方法として、バイオセンサを用いる方法がある。バイオセンサには、より高感度でかつ多くの種類のウィルス又は細菌等を容易にモニタリングする能力が求められる。
インフルエンザウィルスのモニタリング技術に関しては、例えば、動物の健康状態をモニタリングすることによって間接的にインフルエンザウィルスを検出する方法（特開２０１２−２４２２５０号公報）が報告されている。また、インフルエンザウィルスを捕捉する手段によって検出する方法として、インフルエンザウィルスに対する抗体を用いた検出方法（特開２０１４−０３８１１５号公報、特開２００７−２６１９８８号公報、特開２０１４−０９５７２０号公報、特開２０１３−１７４６０７号公報、Ｂｉｏｓｅｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１５，６５，２１１−２１９）も報告されている。
一方、インフルエンザウィルスのヘマグルチニンを検出する手段として電界効果型トランジスタのゲート絶縁膜に、オリゴ糖を固定化したデバイスを用いた検出方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３，８５，５６４１−５６４４）も報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
オリゴ糖をウィルス又は細菌の検出手段に用いることは、標的となるウィルス又は細菌を選択的に検出できることが予想される上に、オリゴ糖は抗体よりも安価に供給できるという利点がある。また、上記のインフルエンザ以外のウィルスや細菌を検出できるセンサの開発も望まれる。【０００４】
そこで、本発明では、ウィルス又は細菌を選択的かつ高感度に検出するバイオセンサ用デバイス及びバイオセンサの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
課題を解決するための具体的手段には、以下の形態が含まれる。
＜１＞導電層と、特定のウィルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖と、前記導電層と前記オリゴ糖とを結合する中間層と、を有するバイオセンサ用デバイス。
＜２＞前記中間層は、自己組織化単分子膜である＜１＞に記載のバイオセンサ用デバイス。
＜３＞前記自己組織化単分子膜は、前記導電層にチオール基で固定されたチオール化合物で形成されている＜２＞に記載のバイオセンサ用デバイス。
＜４＞前記自己組織化単分子膜は、オキシルアミノ基またはヒドラジド基を有するチオール化合物を含む＜３＞に記載のバイオセンサ用デバイス。
＜５＞前記中間層は、導電性高分子を含む＜１＞に記載のバイオセンサ用デバイス。
＜６＞前記導電性高分子が、ポリチオフェン系導電性ポリマー、ポリフェニレン系導電性ポリマー、ポリピロール系導電性ポリマー、ポリアニリン系導電性ポリマー、ポリフルオレン系導電性ポリマーおよびポリインドール系導電性ポリマーからなる群より選択される少なくとも１つである、＜５＞に記載のバイオセンサ用デバイス。
＜７＞前記導電性高分子が、ポリチオフェン系導電性ポリマーである＜５＞に記載のバイオセンサ用デバイス。
＜８＞前記導電性高分子が、オキシルアミノ基またはヒドラジド基を有する、＜５＞〜＜７＞のいずれか１つに記載のバイオセンサ用デバイス。
＜９＞前記導電性高分子が、（Ａ）オキシルアミノ基またはヒドラジド基の少なくとも１つと、（Ｂ）チエニル基、フェニル基、ピロール基、アニリル基、フルオレン基およびインドール基からなる群より選択される少なくとも１つと、を含むモノマーから形成される構造単位を含む、＜６＞に記載のバイオセンサ用デバイス。
＜１０＞前記導電性高分子が電解重合法または酸化重合法によって形成される、＜５＞〜＜９＞のいずれか１つに記載のバイオセンサ用デバイス。
＜１１＞前記オリゴ糖は、特定のインフルエンザウィルスを選択的に捕捉するオリゴ糖である＜１＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載のバイオセンサ用デバイス。
＜１２＞前記導電層が、電界効果トランジスタのゲート電極又は前記ゲート電極と電気的に接続されている電極である＜１＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載のバイオセンサ用デバイス。
＜１３＞＜１＞〜＜１２＞のいずれか１つに記載のバイオセンサ用デバイスを備えたバイオセンサ。
＜１４＞＜１＞〜＜１３＞のいずれか１つに記載のバイオセンサ用デバイスを複数備え、それぞれのバイオセンサ用デバイスの前記オリゴ糖が、互いに異なった特定のウィルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖である＜１３＞に記載のバイオセンサ。
＜１５＞少なくとも一つのバイオセンサ用デバイスの前記オリゴ糖がシアル酸残基を含む＜１３＞又は＜１４＞に記載のバイオセンサ。
＜１６＞電位、振動数及び屈折率から選択されるいずれか一つの変化に基いてウィルス又は細菌を検出する＜１３＞〜＜１５＞のいずれか１つに記載のバイオセンサ。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、ウィルス又は細菌を選択的かつ高感度に検出するバイオセンサ用デバイス及びバイオセンサを提供できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】本発明の第１実施形態に係るバイオセンサ用デバイス及びＦＥＴバイオセンサの構成例を示す模式図である。（Ａ）は、オリゴ糖が結合しているＳＡＭを固定化した電極の構成例を示す模式図である。
【図１Ｂ】本発明の第１実施形態に係るバイオセンサ用デバイス及びＦＥＴバイオセンサの構成例を示す模式図である。（Ｂ）は、フローティングゲート型の電極を備えたＦＥＴバイオセンサの構成例を示す側面模式図である。
【図２】本発明の第１実施形態に係るバイオセンサの構成例を示す摸式的斜視図であり、延長ゲート型の電極を備えたＦＥＴバイオセンサの構成例を示す摸式的斜視図である。
【図３Ａ】（Ａ）は、本発明の第１実施形態に係るバイオセンサ用デバイスと、演算増幅器を有するＦＥＴとを備えたＦＥＴバイオセンサの概略平面及び電気回路図である。
【図３Ｂ】（Ｂ）は、本発明の第１実施形態に係るバイオセンサ用デバイスを、演算増幅器、差動増幅器、増幅回路及び位相補償キャパシタを有するＦＥＴに組み合わせたＦＥＴバイオセンサの電気回路図である。
【図４】本発明の第２実施形態に係るＱＣＭバイオセンサの構成例を示す模式図である。
【図５】本発明の第３実施形態に係るＳＰＲバイオセンサの構成例を示す模式図である。
【図６】本発明のバイオセンサ用デバイスの作製方法の一例を示した模式図である。
【図７】参照電極を備えたＦＥＴバイオセンサで測定されたインフルエンザウィルスの、計測時間に対する電位を示すグラフである。
【図８Ａ】（Ａ）は、対照１で用いた、α２，３−シアリルラクトースを有するバイオセンサ用デバイスを備えたＦＥＴバイオセンサで測定されたＡ型インフルエンザウィルスの、計測時間に対する表面電位を示すグラフである。
【図８Ｂ】（Ｂ）は、実施例１で用いた、α２，６−シアリルラクトースを有するバイオセンサ用デバイスを備えたＦＥＴバイオセンサで測定されたＡ型インフルエンザウィルスの、計測時間に対する電位を示すグラフである。
【図９Ａ】実施例及び対照で得られた電位と、参照電極を備えたＦＥＴバイオセンサによる測定によって得られた電位との差を、それぞれＡ型インフルエンザウィルスの濃度に対して示したグラフである。（Ａ）実施例１及び対照１での初期の電位が高い場合のグラフである。
【図９Ｂ】実施例及び対照で得られた電位と、参照電極を備えたＦＥＴバイオセンサによる測定によって得られた電位との差を、それぞれＡ型インフルエンザウィルスの濃度に対して示したグラフである。（Ｂ）実施例１及び対照１での初期の電位が小さい場合のグラフである。
【図１０】ＱＣＭバイオセンサで測定されたＡ型インフルエンザウィルスの、計測時間に対する共振周波数の差（ΔＦｒｅｑｕｅｎｃｙ（Ｈｚ））の変化を示す図である。
【図１１Ａ】各割合でのＥＤＯＴＡＯモノマーの電解重合プロセスのキャパシタンスの変化と膜厚の変化を示す図である。（ａ）〜（ｅ）サイクリックボルタンモグラム：１０ ｍＭモノマー（ＥＤＯＴに対するＥＤＯＴＡＯが、０ｍｏｌ％（ａ）、 ２５ｍｏｌ％（ｂ）、５０ｍｏｌ％（ｃ）、７５ｍｏｌ％（ｄ）、１００ｍｏｌ％（ｅ））水溶液、ドーパンドは１００ｍＭ ＮａＣｌＯ４。カウンター電極、Ｐｔ；参照電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌ（ｉｎ  ３．３Ｍ  ＫＣｌ  ａｑ）; スキャンレート、０．１Ｖ  ｓ−１。（ｆ）：各ＥＤＯＴＡＯ割合での電解重合プロセスで、サイクルの変化に対するキャパシタンスの変化。
【図１１Ｂ】（ｇ）〜（ｌ）： Ａｕ電極表面に、ＥＤＯＴに対するＥＤＯＴＡＯモノマー０ｍｏｌ％（ｇ）、２５ｍｏｌ％（ｈ）、５０ｍｏｌ％（ｉ）、７５ｍｏｌ％（ｊ）および１００ｍｏｌ％（ｌ）を１０サイクル電解重合した時の膜厚の変化、ドーパンドは１００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４。表示のデータは平均値±標準誤差；ｎ＝３。
【図１２】ＸＰＳ高分解スペクトルを示す図である。（ａ）Ｎ１ｓと（ｂ）Ｓ２ｐ： Ａｕ電極表面にＥＤＯＴに対するＥＤＯＴＡＯが０ｍｏｌ％、２５ｍｏｌ％、および、５０ｍｏｌ％のモノマーを、それぞれ電解重合した。ドーパントは１００ｍＭ  ＮａＣｌＯ４。ＥＤＯＴＡＯの供給量とＥＤＯＴＡＯの理論導入率及び実際導入量の関係（ｃ）。 表示のデータは平均値±標準誤差；ｎ＝４。
【図１３Ａ】ガラス電極上の導電性コポリマーの低インピーダンス表面を示す図である。（ａ）導電性コポリマー膜のナイキストプロット、差し込み図は高周波数領域のナイキストプロットなる。測定溶液は５ｍＭ ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ／ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅのバッファー溶液（０．０１  ＤＰＢＳ、ｐＨ７．４）、カウンター電極、 Ｐｔ；参照電極は、Ａｇ／ＡｇＣｌ  ｉｎ  （ｉｎ  ３．３Ｍ  ＫＣｌ  ａｑ）； ＤＣ バイアス、０．１８Ｖ；ＡＣ増幅、５０ｍＶ；ＡＣ 周波数領域、１０ｋＨｚ〜０．１Ｈｚ。
【図１３Ｂ】（ｂ）ＥＤＯＴＡＯの供給量に対しＣＰＥ（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｐｈａｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）の変化を示した。Ｒａｎｄｌｅ’ｓ の等価回路を用いてフィッティングした（差し込み図）。表示のデータは平均値±標準誤差；ｎ＝３。
【図１４Ａ】水滴接触角計による親水性の評価を示す図である。（ａ）：糖鎖導入前の導電性ポリマーの接触角。
【図１４Ｂ】水滴接触角計による親水性の評価を示す図である。（ｂ）：糖鎖導入後の導電性ポリマーの接触角。
【図１４Ｃ】水滴接触角計による親水性の評価を示す図である。（ｃ）：糖鎖導入前と後のＱＣＭセンサ表面の重さの変化。表示のデータは平均値±標準誤差；ｎ＝３。
【図１５Ａ】ＱＣＭセンサによるインフルエンザウィルス（Ｈ１Ｎ１）の特異的検出を示す図である。（ａ）は、様々なインフルエンザウィルスの濃度における、２，６−シアリルラクトース糖鎖または２，３−（糖鎖をそれぞれ修飾した電極の分子認識反応に由来する重さの変化を周波数の変化で示したときの経時変化である。表示のデータは平均値±標準誤差；ｎ＝３。
【図１５Ｂ】ＱＣＭセンサによるインフルエンザウィルス（Ｈ１Ｎ１）の特異的検出について示す図である。（ｂ）は、（ａ）において各インジェクションが平衡になった時の周波数変化である(＊ｐ ＜０．０１)。表示のデータは平均値±標準誤差；ｎ＝３。
【図１６】電位測定によるインフルエンザウィルス（Ｈ１Ｎ１）の特異的検出について示す図である。インフルエンザウィルスの濃度と、α２，６−シアリルラクトース糖鎖またはα２，３−シアリルラクトース糖鎖をそれぞれ修飾した電極の分子認識反応に由来する電位変化を表示した。表示のデータは平均値±標準誤差；ｎ＝３。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明について具体的に説明する。以下の説明において数値範囲を表す「〜」はその上限値及び下限値として記載されている数値を含む範囲を表す。
【０００９】
≪バイオセンサ用デバイス≫
本発明のバイオセンサ用デバイスは、導電層と、特定のウィルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖と、前記導電層と前記オリゴ糖とを結合する中間層と、を有する。本発明のデバイスの各構成について詳述する。
なお、本明細書において「バイオセンサ」とは、ウィルス又は細菌の検出のために用いられる装置を意味する。
【００１０】
（導電層）
「導電層」とは、中間層を構成する化合物を固定化した導電性を有する層のことをいい、導電層は、中間層を形成する材料を介して、オリゴ糖と結合している。なお、中間層を形成する材料を「中間層形成材料」と称することがある。中間層形成材料も導電性を有していてよい。
導電層は、導電性を有する材料で形成され、上記の中間層形成材料を固定化することができれば、特にその材料の種類や形状は限定されず、本発明のデバイスを用いたウィルス又は細菌の検出方法等を考慮して、金属及びその他の導電性を有する材料を、適宜、目的の形状で用いることが好ましい。
【００１１】
このような導電層は、金属単体でも、合金でもよく、さらに、ガラスカーボン、導電性高分子、または、導電性無機化合物のような金属以外の材料でもよい。
例えば、金属であれば、金、銀、白金、タンタル、アルミニウム、チタン、マグネシウム、亜鉛、珪素、錫等が挙げられる。中でも、中間層形成材料との親和性が良い金属が好ましい。中間層形成材料として、例えば、アルカンチオールを用いる場合には、硫黄原子との親和性が良い金属であることが好ましく、具体的には、銀、白金、または亜鉛であることが好ましく、金であることがより好ましい。
例えば、導電性高分子であれば、ポリチオフェン系導電性ポリマー、ポリフェニレン系導電性ポリマー、ポリピロール系導電性ポリマー、ポリアニリン系導電性ポリマー、ポリフルオレン系導電性ポリマー、ポリインドール系導電性ポリマーおよび炭素系材料等が挙げられる。具体例として、例えば、ポリエチレンジオキシチオフェン、ポリ（p-フェニレン）、ポリ（p-フェニレンビニレン）、ポリ（p-フェニレンスルフィド）、ポリチエニレンビニレン、エウメラニン、ガラスカーボン、グラフェン等が挙げられる。中でも、中間層形成材料との親和性が良い導電性高分子が好ましい。中間層形成材料として、例えば、オリゴ糖導入用モノマーを用いる場合には、電界重合等の電気化学的付着が容易な導電性高分子であることが好ましく、具体的には、ポリエチレンジオキシチオフェン、エウメラニン、またはグラッシーカーボンであることが好ましく、ポリエチレンジオキシチオフェンであることがより好ましい。
例えば、導電性無機化合物であれば、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、インジウム―ガリウム―亜鉛―酸素（ＩＧＺＯ）が挙げられる。
また、導電層としての形状は、薄膜であれば特に制限されず、上面視の形状は、円形でもよいし、楕円形でもよいし、矩形でもよいし、三角形でもよいし、多角形でもよいし、不定形でもよい。
【００１２】
導電層は、表面の一部または全部が、金属塩および金属酸化物の少なくとも一方で形成されていてもよい。
本発明のデバイスを適用して、バイオセンサとして、後述する電界効果型トランジスタ（Ｆｉｅｌｄ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ、以下、ＦＥＴという）によるバイオセンサを用いるときは、導電層の表面の一部または全部が、金属塩および金属酸化物の少なくとも一方で形成され、当該被覆部分がウィルス又は細菌を含む水溶液と接触していることで、水溶液と導電層との固液界面における電位の安定性を向上させることができる。
【００１３】
金属塩としては、例えば、特開２０１３−２４６０６０号公報に記載される金属酸化物と同じ材料を用いることができる。また、これらの中でも、ウィルス又は細菌を含む水溶液は、塩化物イオンを多く含むことから、金属塩は、金属塩化物であることが好ましい。また、金属塩を構成する金属は、中間層形成材料、特に自己組織化単分子膜（Self-Assembled Monolayer、以下、「ＳＡＭ」と称する）との親和性が良いものが好ましい。中間層形成材料として、例えば、アルカンチオールを用いる場合には、金属塩を構成する金属が、硫黄原子との親和性が良い金属であることが好ましく、具体的には、金、銀、白金、または亜鉛であることが好ましく、金であることがより好ましい。
【００１４】
金属酸化物としては、例えば、特開２０１３−２４６０６０号公報に記載される金属材料と同じ材料を用いることができ、好ましいものも同じである。
【００１５】
導電層としては、ガラスカーボンやＩＴＯ、ＩＧＺＯもまた好ましい。中間層形成材料として、例えば、ポリチオフェン系導電性高分子を用いる場合には、ロール・ツー・ロール印刷法や電界重合法を適用することができるため、容易かつ安価・大量に薄膜を形成することができる。
【００１６】
導電層が平板状の場合においては、その厚さは適宜調整されることが好ましいが、０．０５μｍ〜１μｍであることが好ましい。０．０５μｍ以上であることで、デバイスとしての導電性をより十分に確保でき、デバイスとしての強度をより十分に確保できる。また、１μｍ以下であることで、製造コストを抑制することができる。
【００１７】
また、導電層は、後述するＦＥＴの電極となり得るが、この場合に、導電層は、ウィルス又は細菌の検出感度の点から、ＦＥＴのゲート電極又はゲート電極に接続した電極であることが好ましい。
【００１８】
（中間層）
中間層を形成する中間層形成材料は、導電層とオリゴ糖の両方に結合していれば、どのような材料で構成されていてもよい。中間層形成材料は導電層を形成する物質と同じ物質を用いてもよい。また、中間層がその一部に導電層と同じ物質を含んでいてもよい。
検出感度の向上および容易な製造、という点からは、ＳＡＭであることが好ましい。ＳＡＭとは、外からの細かい制御を加えていない状態で、膜材料そのものがもつ機構によって形成される一定の秩序をもつ組織をもった薄膜のことをいう。この自己組織化により、非平衡の状況で秩序がある構造やパターンが形成される。アルカンチオールやアルカンジスルフィド類などの含硫黄化合物は、金、銀等の貴金属、貴金属で構成される金属塩、または貴金属で構成される酸化物等、貴金属を含む基板上に、自発的に吸着し単分子サイズの薄膜を与える。従って、電極表面に中間層を容易に形成することができ、かつ、中間層を介して高密度でオリゴ糖を固定化することができ、ウィルス又は細菌の検出の精度をより高くすることができる。
【００１９】
ＳＡＭを形成し得る材料としては、例えば、含硫黄化合物、シリル基含有化合物等が挙げられる。
含硫黄化合物としては、アルキル鎖を有するアルカンチオール等に代表されるチオール基含有化合物やジスルフィド基含有化合物などが挙げられる。なお、ジスルフィド基含有化合物は、チオール基を形成するための原料である。
シリル基含有化合物としては、アルキル鎖を有するアルキルアルコキシシランなどが挙げられる。
含硫黄化合物、シリル基含有化合物とも、アルキル鎖に代えて、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に代表されるポリマー鎖を有する含硫黄化合物またはシリル基含有化合物であってもよい。
上記の化合物の中でも、バイオセンサとしての感度の点から、ＳＡＭは、導電層にチオール基で固定された含硫黄化合物が好ましい。また、含硫黄化合物としてはチオール基含有化合物がより好ましく、さらにアルキル鎖を有するチオール基含有化合物が特に好ましい。
【００２０】
また、ＳＡＭを形成する化合物としては、導電層及びオリゴ糖の両方に結合するという点から、少なくとも２種以上の異なる官能基を有していることが好ましい。さらに、導電層への結合のし易さから、ＳＡＭを形成する化合物は、チオール基含有化合物であって、チオール基以外にも官能基を有していることが好ましい。このように、異なる２種以上の官能基を有していることで、導電層上に、オリゴ糖を結合したＳＡＭを形成しやすくなるので有効である。
【００２１】
前記官能基としては、上記したチオール基以外には、オキシルアミノ基、ヒドラジド基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アジド基、アルキニル基、エポキシ基及びイソシアネート基等が挙げられる。さらに、チオール基以外の官能基としては、オリゴ糖の還元末端炭素との結合性から、オキシルアミノ末端またはヒドラジド末端であることが好ましい。ＳＡＭを形成する分子の末端（オリゴ糖と結合する側の末端）がオキシルアミノ基またはヒドラジド末端であることで、オリゴ糖側に、ＳＡＭ等との結合のための官能基を付与することを必要としないため、オリゴ糖をそのままＳＡＭ等との結合のために用いることができる点でも有利である。
【００２２】
また、ＳＡＭを形成する場合に用いる化合物において、例えば、上記のチオール基含有化合物又はジスルフィド基含有化合物は、チオール基以外の官能基又はジスルフィド基以外の官能基も有する１種類の化合物であってもよいし、チオール基以外の官能基又はジスルフィド基以外の官能基も有する複数種類の化合物であってもよい。
【００２３】
ＳＡＭを形成させる場合に、例えば、金属電極の表面に固定化された分子数の密度（ＳＡＭ密度）、上記化合物中のオリゴ糖を結合させる官能基の含有率、あるいはオリゴ糖を結合させる反応条件を調整することで、ＳＡＭ上の一定面積中でのオリゴ糖の結合量、すなわちＳＡＭに結合したオリゴ糖間の距離を調整することができる。このことにより、細菌やウィルスが有するレクチン等のオリゴ糖に対する複数の認識領域（オリゴ糖認識サイト）あるいは複数のレクチン等のオリゴ糖認識サイトに適合するように、ＳＡＭ上でのオリゴ糖間の距離を調整することができる。従って、本発明におけるバイオセンサ用デバイスは、ウィルス又は細菌が有するレクチン等と該デバイス上の複数のオリゴ糖との多点結合を形成させて、バイオセンサとしたときの検出感度を飛躍的に向上させることが可能である。
【００２４】
なお、ＳＡＭ密度（ｍｏｌ／ｎｍ２）は、サイクリックボルタメントリー（ＣＶ）測定等によって求めることができる。
【００２５】
また、ジスルフィド基を有し、さらに、ジスルフィド基以外の官能基を有する化合物は、導電層である金属電極上で、ジスルフィド結合を乖離させて、前記化合物中のジスルフィド結合を介した２つの部分（Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｂ）のＡ及びＢを、金属電極上にチオール結合で固定させることができる。これによって、金属電極上に、異なる官能基を有する２種の化合物を、互いに近傍に配置させることができる。このような化合物がＳＡＭを形成する場合、金属電極上に、一定の厚さ（単分子分の厚さ）を有し、それぞれの官能基を用いた２種の固定化が可能である。例えば、ターゲットを捕捉する分子と、非特異吸着を抑制する分子を同じＳＡＭの表面に固定化することができる。このため、このようなＳＡＭを用いて、ターゲット認識能が高いバイオセンサ用デバイスを作製することができる。
【００２６】
中間層を、導電層上に形成する場合は、例えば、中間層形成材料であるＳＡＭを形成する化合物が溶解している溶液を、導電層上に付与し、ＳＡＭが形成されるまで溶液が乾燥しないように保持し、ＳＡＭを形成した後に洗浄すればよい。
オリゴ糖は、上記のように中間層を形成した後に、中間層形成材料に結合させればよい。また、オリゴ糖と中間層形成材料とを予め結合させた後に、これを溶媒に溶かし、溶液として、導電層上に付与してもよい。
【００２７】
導電層上への溶液の付与方法としては、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布等の塗布により溶液を付与する方法、さらには、滴下法、スプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等により付与する方法が挙げられる。中間層形成材料、または、オリゴ糖が結合した中間層形成材料を溶解した溶液は、金属電極上、または、金属塩ないし金属酸化物等で構成される導電層上に、ランダム状に付与してもよいし、アレイ状に配列させて付与してもよいし、ドメイン状に一塊に付与してもよい。また、パターン状に付与してもよい。
【００２８】
中間層形成材料、または、オリゴ糖が結合した中間層形成材料を溶解する溶媒としては、水、アルコール、または、これらの混合溶媒が用いられる。中間層形成材料のみを溶解する場合は、非水溶性有機溶媒を用いてもよいが、オリゴ糖が結合した中間層形成材料を溶解する場合は、水、アルコール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ），アセトニトリル、アセトン等の水溶性溶媒、または、これらの混合溶媒が用いられる。中でも、水、エタノール、ＤＭＳＯまたは、これらの混合溶媒が好ましい。
【００２９】
中間層形成材料としては、導電性高分子もまた好ましい。導電性高分子は、オリゴ糖を導入可能で、導電層に結合し中間層を形成し得るものであれば特に限定されない。導電性高分子としては、ポリチオフェン系導電性ポリマー、ポリフェニレン系導電性ポリマー、ポリピロール系導電性ポリマー、ポリアニリン系導電性ポリマー、ポリフルオレン系導電性ポリマーまたはポリインドール系導電性ポリマー等が挙げられる。具体例として、例えば、ポリエチレンジオキシチオフェン、ポリ（p-フェニレン）、ポリ（p-フェニレンビニレン）、ポリ（p-フェニレンスルフィド）、ポリチエニレンビニレン、グラフェン等が挙げられる。導電性高分子は、ホモポリマーであってもよいし、２以上のモノマーから形成される共重合体であってもよい。また、導電性高分子は、エチレングリコール（ＥＧ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、スルホラン等、導電性を高めるために用いる添加剤、またはその他の目的で用いられる添加剤を含んでいてもよい。中間層として用いる導電性高分子は、公知の方法で合成してもよいし、市販品を用いてもよい。導電性との結合性の観点から、適当なモノマーを用いて電解重合または酸化重合によって導電層上に形成することが好ましい。
【００３０】
導電性高分子の中でも、ポリチオフェン系導電性ポリマーの１つである、ポリエチレンジオキシチオフェンは、電気伝導度が高く、化学的に安定であり、ホール注入性やドーピング特性を有し、希少元素または有毒元素を含まず、柔軟性や伸縮性に富む、等の観点から、中間層形成材料として好ましく用いられる。また、ポリチオフェン系導電性ポリマーは水や有機溶媒の分散液として用いることができるため、塗布・加工に適している。例えば、繊維に組み込んで衣服型のウェアラブルセンサとすることも可能であり、バイオセンサの汎用性を高めることができる。
【００３１】
導電性高分子を中間層として形成する場合に用いるモノマーとしては、水や有機溶媒に溶解し、かつ、ドーパントとなる無機アニオンやポリアニオンとの相溶性を有し、かつ、水や有機溶媒の電気分解が起こらない低い酸化還元電位を有するモノマーであることが好ましい。このようなモノマーとして、チオフェン系モノマーを挙げることができる。
チオフェン系モノマーとしては、３，４−エチレンジオキシチオフェン、３，４−ジメチルオキシチオフェン、５，５’’’’−ビス（２’’’’’，２’’’’’−ジシアノビニル）−２，２’：５’，２’’：５’’，２’’’：５’’’，２’’’’−クインケチオフェン（ＤＣＶ５Ｔ）、５，５’’’−ビス（トリデカフルオロヘキシル）−２，２’：５’，２  ’’：５’’，２’′’−クアテルチオフェン、２，５−ビス（トリメチルスタニル）−チエノ［３，２−ｂ］チオフェン、２，５−ビス（トリメチルスタニル）チオフェン、２，２’−ビチエノ［３，２−ｂ］チオフェン、２，３’−ビチオフェン、２−ブロモ−５−ドデシルチオフェン、２−ブロモ−３−（２−エチルヘキシル）チオフェン、５−ブロモ−５’−ヘキシル−２，２’−ビチオフェン、３，４−ジアミノチオフェン  ジヒドロクロリド、３，３’−ジブロモ−５，５’−ビス（トリメチルシリル）−２，２’−ビチオフェン、２，５−ジブロモ−３−シクロヘキシルチオフェン、２，５−ジブロモ−３−デシルチオフェン、５，５’−ジブロモｏ−４，４’−ジドデシル−２，２’−ビチオフェン、２，５−ジブロモ−３，４−ジヘキシルチオフェン、２，５−ジブロモ−３，４−ジニトロチオフェン、５，５’−ジブロモ−４，４’−ジテトラデシル−２，２’−ビチオフェン、２，６−ジブロモジチエノ［３，２−ｂ：２’，３’−ｄ］チオフェン、２，５−ジブロモ−３，４−エチレンジオキシチオフェン、２，５−ジブロモ−３−（２−エチルヘキシル）チオフェン、２，５−ジブロモ−３−オクチルチオフェン、２，５−ジブロモチエノ［３，２−ｂ］チオフェン、３，４−（２’，２’−ジエチルプロピレン）ジオキシチオフェン、５，５’−ジヘキシル−２，２’−ビチオフェン、３，４−ジヒドロキシチオフェン−２，５−ジカルボン酸ジエチルエステル、３，４−（２，２−ジメチルプロピレンジオキシ）チオフェン、３，４−エチレンジチオチオフェン、３−（２−エチルヘキシル）チオフェン、５−パーフルオロヘキシル−２，２’−ビチオフェン、３−フェニルチオフェン、３，４−プロピレンジオキシチオフェン、３，４−プロピレンジオキシチオフェン−２，５−ジカルボン酸、３，３’，５，５’−テトラブロモ−２，２’−ビチオフェン、チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２−カルボキシアルデヒド、チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２，５−ジボロン酸  ビス（ピナコールエステル）、チエノ［２，３−ｂ］チオフェン−２，５−ジカルボキシアルデヒド、チエノ［３，２−ｂ］チオフェン−２，５−ジカルボキシアルデヒド、チオフェン−２−ボロン酸  ピナコールエステル、チオフェン−２，５−ジボロン酸  ビス（ピナコール）エステル、３，４−チオフェンジカルボン酸、５−へキシル−２−チオフェンボロン酸ピナコールエステル、ジチエノ［３，２−ｂ：２’，３’−ｄ］チオフェン、３，３”’−ジドデシル−２，２’：５’，２”：５”，２”’−クアテルチオフェン、５，５’−ジ（４−ビフェニルイル）−２，２’−ビチオフェン、５，５’’−ジブロモ−２，２’：５’，２’’−テルチオフェン、２，５−ジブロモ−３−ドデシルチオフェン、３，３’−ジブロモ−２，２’−��チオフェン、５，５’−ジブロモ−２，２’−ビチオフェン、２，５−ジブロモ−３−ブチルチオフェン、２，５−ジブロモ−３−ヘキシルチオフェン、３，３”’−ジヘキシル−２，２’：５’，２”：５”，２”’−クアテルチオフェン、,５’’’’’−ジヘキシル−２，２’：５’，２’’：５’’，２’’’：５’’’，２’’’’：５’’’’，２’’’’’−セキシチオフェン、３，４−ジヘキシルチオフェン、３，４−ジメトキシチオフェン、５，５’−ジヨード−２，２’−ビチオフェン、α−セキシチオフェン、チエノ［２，３−ｂ］チオフェン、チエノ［３，２−ｂ］チオフェン、２，２’：５’，２”−テルチオフェン、２，２’：５’，２”−テルチオフェン−５−ボロン酸 ピナコールエステル、３−デシルチオフェン、３−ドデシルチオフェン、５，５’−ビス（トリメチルスタンニル）−２，２’−ビチオフェン、２，２’−ビチオフェン、２，２’−ビチオフェン−５，５’−ジボロン酸 ビス（ピナコール）エステル、２，２’−ビチオフェン−５−ボロン酸ピナコールエステル、５−フルオロ−２，３−チオフェンジカルボキシアルデヒド、２−ブロモ−３−オクチルチオフェン、２−ブロモ−３−ドデシルチオフェン、２−ブロモ−３−（ブロモメチル）チオフェン、２−ブロモ−３−ヘキシルチオフェン、５−ブロモ−２−ヘキシルチオフェン、３−ブロモ−４−メチルチオフェン、３−ヘキシルチオフェン−２−ボロン酸 ピナコール エステル、５−ヘキシル−２，２’−ビチオフェン、５’−ヘキシル-２，２’−ビチオフェン−５−ボロン酸ピナコールエステル等が挙げられる。
中でも、３，４−エチレンジオキシチオフェンが特に好ましい。
【００３２】
導電性高分子を形成するモノマーとしては、少なくとも１種類の、オリゴ糖と結合可能な官能基を有するモノマーを用いることが好ましい。前記官能基としては、チオール基、オキシルアミノ基、ヒドラジド基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、カルボニル基、アジド基、アルキニル基、エポキシ基及びイソシアネート基等が挙げられる。オリゴ糖の還元末端炭素との結合性の観点から、オキシルアミノ基またはヒドラジド基を有することが好ましい。導電性高分子がオキシルアミノ基またはヒドラジド基を有することによって、オリゴ糖側に、導電性高分子との結合のための官能基を付与することを必要としないため、オリゴ糖をそのまま中間層との結合のために用いることができる。オリゴ糖と結合可能な官能基を有するモノマーは、１種類を用いてもよいし、複数の種類を用いて共重合体を形成してもよい。
【００３３】
導電性高分子を形成するモノマーとしては、オリゴ糖と結合可能な官能基（Ａ）と、チエニル基、フェニル基、アニリル基、フルオレン基、インドール基またはピロール基（Ｂ）とを有するモノマー（以下、オリゴ糖導入用モノマーということがある）が特に好ましい。
オリゴ糖導入用モノマーは、導電性高分子を形成するモノマーとして記載したモノマーにオリゴ糖と結合可能な官能基を導入することによって得ることができる。オリゴ糖と結合可能な官能基をモノマーに導入する方法は当業者に公知である。あるいは、市販品を用いてもよい。
好ましいオリゴ糖導入用モノマーは、３，４−エチレンジオキシチオフェン−ＯＮＨ２または３，４−エチレンジオキシチオフェン−ＯＮＨＮＨ２であり、３，４−エチレンジオキシチオフェン−ＯＮＨ２（ＥＤＯＴＡＯ）が特に好ましい。
【００３４】
導電性高分子は、オリゴ糖導入用モノマーと、少なくとも１種類の他のモノマーとの共重合体であってもよい。他のモノマーは特に限定されないが、オリゴ糖導入用モノマーから、オリゴ糖と結合可能な官能基を除いた構造を有するモノマー（つまり、官能基が導入される前のオリゴ糖導入用モノマー）であることが好ましい。他のモノマーとしてこのようなモノマーを用いることによって、高分子主鎖の共役系を乱さず、導電性が高い共重合体を得ることができる。他のモノマーは、１種類を用いてもよいし、複数の種類を用いてもよい。
【００３５】
特に好ましいオリゴ糖導入用モノマーと他のモノマーとの共重合体として、３，４−エチレンジオキシチオフェン（ＥＤＯＴ）とＥＤＯＴ−ＯＮＨ２（ＥＤＯＴＡＯ）との共重合体等が挙げられる。
【００３６】
導電性高分子として共重合体を用いる場合、共重合体の重合比は特に限定されない。例えば、１種類のオリゴ糖導入用モノマーと１種類の他のモノマーの共重合体を用いる場合には、導電性とウィルス認識性の観点から９：１〜１：９の範囲とすることが好ましく、８：２〜６：４であることがさらに好ましい。
例えば、ＥＤＯＴとＥＤＯＴＡＯとの共重合体を用いる場合、モノマーの重合比は特に限定されないが、導電性とウィルス認識性の観点から、ＥＤＯＴ：ＥＤＯＴＡＯが、モル比で９：１〜１：９であることが好ましく、８：２〜６：４であることがさらに好ましい。
【００３７】
中間層形成材料として用いる導電性高分子は、重合反応を電気的に制御することによって導電性等の特性を制御できること、および、均一な薄膜を形成できること、等の観点から、電解重合によって導電層上に形成することが好ましい。電解重合は、例えば、過塩素酸ナトリウム水溶液またはポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ）水溶液などの溶媒にモノマーを混合し、導電層を電極表面の少なくとも一部に有する作用電極、カウンター電極をモノマー混合液に接触させ、モノマーの酸化電位以上の電位を作用電極に印加することによって行うことができる。参照電極をさらに用いてもよい。
使用する電極、印加する電圧・電流および通電時間等の電解重合の条件は、当業者が適宜設定することができる。電極としては、例えば、グラッシーカーボン作用電極、白金カウンター電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極などを好ましく用いることができる。電気的な条件としては、例えば、サイクリック電位−０．６〜＋１．１〜−０．６Ｖ （ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極）、走査速度０．１Ｖ／ｓｅｃとすることができるが、これに限定はされない。
電解重合は、モノマーとオリゴ糖とを結合させてから行ってもよいが、電解重合の後に、中間層にオリゴ糖を結合させることが望ましい。これは、電界重合によってオリゴ糖が酸化還元されるのを防止するためである。
【００３８】
中間層は、導電層上にさらに形成される以外に、付与されていてもよい。
例えば、導電性高分子を中間層として導電層上に形成する方法としては、酸化重合法等の別の方法によって合成した導電性高分子をスピンコート法やロール・ツー・ロール法によって塗布すること、等によって行うことができる（Yan H. Jo T., Okuzaki H, Highly Conductive and Transparent Poly(3,4-ethylenedioxythiophene)/Poly(4-styrenesulfonate) (PEDOT/PSS) Thin Films, Polymer Journal, 2009, 41(12), 1028-9;Santos G.H., Gavim A.X., Silva R.F., Rodrigues P.C., Kamikawachi R.C., de Deus J.F., Macedo A.G., Roll-to-roll processed PEDOT:PSS thin films: application in flexible electrochromic devices, Journal of Materials Science: Materials in Electronics, 2016, Volume 27, Issue 10, pp 11072-9）。
中間層形成材料および導電層形成材料として同じ材料を用いる場合、導電層と中間層を一体に形成してもよい。中間層と導電層との境界が明確に設けられていなくとも、一体に形成されたものが本発明の中間層および導電層としての機能を有する限りは本発明の範囲に含まれる。
【００３９】
導電層上に、中間層形成材料が固定化されていることは、例えば、該金属電極の表面について、ＸＰＳ（X-ray Photoelectron Spectroscopy)、ＥＳＣＡ(Electron Spectroscopy for Chemical Analysis）等のＸ線光電子分光分析を行うことで確認することができる。例えば、ＳＡＭとしてアルカンチオールを用いた場合、アルカンチオールが金属電極上に固定化されているときは、硫黄原子に由来するピークが検出される。
また、オリゴ糖が、例えば、ＳＡＭに結合されていることは、例えば、螢光分子で生体分子を標識し、螢光検出を行なうことで確認することができる。
【００４０】
（オリゴ糖）
オリゴ糖は、前記中間層と結合し、かつ、特定のウィルス又は細菌を選択的に捕捉できるものであれば特に限定されない。オリゴ糖の種類、すなわち、前記オリゴ糖を構成する糖残基の配列や糖残基数は、ターゲットとなるウィルス又は細菌に固有のものであるため、検出したいウィルスや細菌に応じて、より親和性の高いオリゴ糖が適宜選択される。
このように、オリゴ糖は、バイオセンサの細菌やウィルスに対する検出感度が高いものであることが好ましい。
【００４１】
また、中間層とオリゴ糖が結合したときの、中間層の導電層に接する位置からオリゴ糖の末端までの長さ（以後、プローブ層厚と称することがある）は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、バイオセンサとしたときの検出感度の点から、０．１ｎｍ〜１００ｎｍであることが好ましい。さらに、１ｎｍ〜１０ｎｍであることがより好ましい。中間層の厚さは、例えば、ＳＡＭに用いる化合物の主鎖の長さ等を選択することで調整でき、オリゴ糖の長さは、上述のオリゴ糖の糖残基数で調整することができる。
また、電解重合によって導電性高分子を形成する場合には、電解重合の際の電気量や使用するモノマーの組成等によって導電性高分子の膜厚を制御することができる。当業者は、適切な膜厚を得るためのモノマー組成と電気量を適宜決定することができる。
【００４２】
また、オリゴ糖は、天然に存在するものでも存在しないものであってもよく、さらにオリゴ糖の一部が修飾されたものであってもよい。
【００４３】
このようなオリゴ糖としては、例えば、Ｎ結合型糖蛋白質糖鎖、Ｏ結合型糖蛋白質糖鎖、多糖類、シクロデキストリンなどが挙げられる。中でも、ウィルス検出を目的としたオリゴ糖としては、シアル酸を含有するオリゴ糖であることが好ましい。シアル酸を含有するオリゴ糖としては、例えば、Ａ型インフルエンザウィルスを捕捉するα２，６−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ）、鳥インフルエンザウィルスを捕捉するα２，３−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ）、ヒトコロナウィルスを捕捉するシアリル２，６−ガラクトース（Ｎｅｕ５，９Ａｃ２（（α２，６）Ｇａｌ）、ウシコロナウィルスを捕捉するシアリル２，３−ガラクトースＮｅｕ５，９Ａｃ２（（α２，３）Ｇａｌ）、マウス肝炎ウィルスを捕捉するシアル酸残基（Ｎｅｕ４，５Ａｃ２）、アデノウィルスを捕捉するガングリオシド（ＧＤ１a）（Ｎｅｕ４Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（Ｎｅｕ４Ａｃα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ−ＯＨ）が挙げられる。
これらの中でも、インフルエンザウィルスを捕捉するオリゴ糖は、ヒトや鳥などの特定の種に感染する特定のインフルエンザウィルスを選択的に捕捉することができ、前記オリゴ糖を用いたデバイスをバイオセンサとした場合に、高感度で検出できる。
【００４４】
ここで、Ｇａｌ、Ｎｅｕ、Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃは糖残基の種類を表し、Ｇａｌはガラクトース残基、Ｎｅｕはシアル酸残基であるＮアセチルノイラミン酸残基、Ｇｌｃはグルコース残基、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミン残基を表す。また、各糖残基間の表記は、結合の様式及び結合位置を示す。例えばＮｅｕ４Ａｃα２，３Ｇｌｃであれば、Ｎｅｕ４Ａｃの２位とＧｌｃの３位とが、αでグリコシド結合していることを表す。また、Ｎｅｕ４，５Ａｃ２とは、Ｎアセチルノイラミン酸残基の４位と５位にアセチル基が結合していることを示す。
【００４５】
上記のオリゴ糖は、天然物から公知の方法によって調製してもよいし、公知の方法によって化学的あるいは酵素的に調製してもよい。また、市販されているものをそのまま、あるいは化学的あるいは酵素的に誘導して調製してもよい。市販されているものとしては、例えばα２，３−シアリルラクトース及びα２，６−シアリルラクトースが挙げられる。
【００４６】
オリゴ糖と中間層形成材料とが結合する場合のオリゴ糖における結合の位置は、本発明の効果を奏する限り特に限定されず、中間層形成材料と、オリゴ糖を構成する糖残基のどの部位とが結合してもよい。しかし、中間層形成材料との結合のしやすさからは、オリゴ糖の還元可能なヘミアセタール構造を有する末端の炭素と、中間層形成材料との結合であることが好ましい。ここで、中間層形成材料がオキシルアミノ末端を有している場合、オリゴ糖の還元末端のヘミアセタールが、還元条件によって容易にアルデヒドとなるので、該アルデヒドが、中間層形成材料の表面のオキシルアミノ基と反応することにより、安定なオキシム構造を形成することができる。
また、上記のオキシルアミノ基は、他の官能基よりもオリゴ糖と結合しやすく、さらにこの結合によって水溶液中で安定であるオキシムを生じる。このため、中間層形成材料としてオキシルアミノ基と他の官能基を有している化合物、あるいは、オキシルアミノ基を有する化合物と他の官能基を有する複数種類の化合物を混合して用いることにより、オリゴ糖とオキシルアミノ基とのみ結合させて、オリゴ糖と他の官能基とを結合させないようにすることができるので、導電層に固定された分子の他の官能基にオリゴ糖以外の置換基を導入することが可能となる。
【００４７】
中間層へのオリゴ糖の結合は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、例えば、ＳＡＭを構成する官能基に、国際公開第２００４０５８６８７号に記載の“グライコブロッティング法”を使用してオリゴ糖を導入することができる。この場合に、例えば、オリゴ糖と中間層のオキシルアミノ基とを反応させる場合の反応の条件としては、５０℃〜７０℃で１４０分間〜２４０分間であることが好ましい。また、グライコブロッティング法の使用においては、市販のキット、例えば、住友ベークライト社製のキット（BlotGlyco)を利用できる。
【００４８】
本発明のバイオセンサの検査対象となるウィルス又は細菌は、オリゴ糖によって捕捉されるうるウィルス又は細菌であれば特に限定されない。このような細菌としては、マイコプラズマ、結核菌、レンサ球菌、百日咳菌、レジオネラ菌、緑膿菌、各種病原性大腸菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、ディフシル菌、ヘリコバクターピロリ菌、赤痢菌、髄膜炎菌などの病原性を有し、かつオリゴ糖によって捕捉されうる可能性のある細菌が挙げられる。また、一部の乳酸菌（ビフィズス菌を含む）や病原性を有しない細菌も、オリゴ糖によって捕捉されうる可能性のある細菌は、本発明のバイオセンサの検査対象となり得る。
また、ウィルスとしては、インフルエンザウィルス、パラインフルエンザウィルス、ノロウィルス、アデノウィルス、デングウィルス、ヘルペスウィルス、コロナウィルス、ライノウィルス、マウス肝炎ウィルス（ＭＨＶ）などのオリゴ糖によって捕捉されうる可能性のあるウィルスは、本発明のバイオセンサの検査対象となり得る。
【００４９】
また、バイオセンサに供する細菌の濃度は、公知の方法、例えば、一定体積中の菌数で表すことができ、菌数は濁度やコロニー形成単位（ｃｆｕ）で求めることができる。これにより、バイオセンサで検出された電位等の大きさによって、検体中のオリゴ糖に捕捉された細菌の存在及びその濃度を算出することができる。
ウィルスは種類や型によって生体への感染力が異なるため、物理的なウィルスの量（単位体積あたりのウィルスの個数）と感染力の関係は一定でない。そのため、感染力を示す指標であるウィルス力価を使用することとする。検体に対してバイオセンサで電位等の大きさを測定し、その電位と予め算出された力価での電位の検量線とを比較することにより、検体に含まれるウィルス量を把握することができる。例えば、インフルエンザウィルスの場合には、赤血球凝集アッセイなどにより求められる力価での電位等の大きさと、検体の電位の大きさとを比較することで、検体に含まれるウィルスを力価の観点から定量的に判断することができる。
【００５０】
≪バイオセンサ≫
本発明のバイオセンサは、上記のバイオセンサ用デバイスを備える。前記バイオセンサは、前記デバイスのオリゴ糖が特定のウィルス又は細菌を捕捉することによって、当該ウィルス又は細菌を検出することができる限り、バイオセンサ用デバイスをどのような形態で備えていてもよい。例えば、１種類のウィルス又は細菌を検出する目的であれば、バイオセンサは１つのバイオセンサ用デバイスを備えていることで対応できる。また、バイオセンサを、複数種類のウィルス又は細菌を検出するために用いるのであれば、バイオセンサは、バイオセンサ用デバイスを複数備え、それぞれのバイオセンサ用デバイスのオリゴ糖が、互いに異なった特定のウィルス又は細菌を選択的に捕捉するオリゴ糖であってよい。
この場合のオリゴ糖としての種類は上述のように、標的とするウィルス又は細菌の種類によって適宜選択されることが好ましい。異なった種類のオリゴ糖が配置されたバイオセンサ用デバイスであることで、異なった種類のウィルス又は細菌を選択的に感度よく検出することができる。
【００５１】
また、バイオセンサは、バイオセンサ用デバイスの導電層上に固定化されたオリゴ糖の密度（ｍｏｌ／ｍｍ２）の異なる複数種類のデバイスを備えてもよい。オリゴ糖の密度が異なったバイオセンサ用デバイスを備えることで、複数のウィルス又は細菌に対する選択性や検出感度を向上させることができる。
また、異なった種類のオリゴ糖のそれぞれについて、異なった密度で配置されたバイオセンサ用デバイスを備えたバイオセンサであってもよい。
【００５２】
また、上記のバイオセンサ用デバイスを備えたバイオセンサは、特定のウィルス又は細菌を検出することができる限り、前記デバイスから得られるどのような変化に基いてウィルス又は細菌を検出してもよいが、ウィルス又は細菌を選択的に感度よく検出するという観点からは、電位、振動数及び屈折率から選択されるいずれか一つの変化に基いてウィルス又は細菌を検出することができる。電位の変化としては、ＦＥＴによって得られる変化が挙げられる。振動数の変化としては、水晶発振子マイクロバランス（Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ、以下、ＱＣＭという）によって得られる変化が挙げられる。また、屈折率の変化としては、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、以下、ＳＰＲという）によって得られる変化が挙げられる。
この中でも特に電位の変化に基いてウィルス又は細菌を検出することがより好ましい。また、電位の変化は、ＦＥＴによって得られる変化であることが好ましい。
【００５３】
また、以下、ＦＥＴによって得られる電位の変化に基いてウィルス又は細菌を検出するバイオセンサを、ＦＥＴバイオセンサと称し、ＱＣＭによって得られる振動数の変化に基いてウィルス又は細菌を検出するバイオセンサを、ＱＣＭバイオセンサと称し、ＳＰＲによって得られる屈折率の変化に基いてウィルス又は細菌を検出するバイオセンサを、ＳＰＲバイオセンサと称する。
【００５４】
また、ＦＥＴバイオセンサが有する電極の形態としては、例えば、フローティングゲート型、延長ゲート型などが挙げられる。中でも延長ゲート型の電極は、検出における操作性に優れる。なお、延長ゲート型の電極を有するＦＥＴバイオセンサを、延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサと称することがある。
【００５５】
以下、添付の図面に基づき、本発明の実施の形態をさらに具体的に説明する。
【００５６】
（第１実施形態）
<バイオセンサ用デバイス>
図１（Ａ）は、ＦＥＴバイオセンサに用いられるバイオセンサ用デバイスの構成例を示す模式図である。図１（Ａ）に示すように、バイオセンサ用デバイス１０は、導電層を構成する金電極１２上に、オリゴ糖１６と結合してオキシム（−Ｏ−Ｎ＝Ｃ−）を形成しているアルキルチオール化合物、及びオリゴ糖と結合していない官能基１８を有するアルキルチオール化合物が、それぞれチオール基で固定されていることで、中間層であるＳＡＭ１４を形成している。また、オリゴ糖であるα２，６−シアリルラクトースのグルコースの還元末端の炭素が、前記アルキルチオールと結合している。
ＳＡＭ１４は、導電層の片側の表面すべてに配置されていてもよいし、該表面の一定面積だけに配置されていてもよい。なお、中間層は、ＳＡＭ以外のものでもよい。
【００５７】
また、金電極１２の層の厚さは、ＦＥＴバイオセンサとした場合の、検出感度の点から、０．０５μｍ〜１μｍであることが好ましい。
さらに、ＦＥＴバイオセンサに用いるバイオセンサ用デバイスのプローブ層厚としては、検出感度の点から、１ｎｍ〜１０ｎｍであることが好ましい。さらに、１ｎｍ〜５ｎｍであることがより好ましい。
【００５８】
上記のバイオセンサ用デバイスを用いたセンサとしたときに高感度の測定が出来る理由については、以下のように考えることができる。通常のレクチンにおいて、糖鎖との親和性（解離定数）は１０−２〜１０−５オーダーであるが、こうした糖鎖認識部位はウィルスや細菌上に数多く存在している。このため、該センサの表面上にある複数のオリゴ糖と、上記レクチンの糖鎖認識部位とが多点で相互作用するために、該ウィルス等がセンサの電極表面に強く吸着し、それが電位変化としてあらわれて、効果的に検出感度が向上するものと推測される。
【００５９】
<ＦＥＴバイオセンサ>
ＦＥＴバイオセンサは、ウィルス又は細菌が有する電荷によって変化する電位に基づいてウィルス又は細菌を検出するバイオセンサであり、具体的には、ウィルス又は細菌がオリゴ糖に捕捉されることにより生じるバイオセンサ表面上の微弱な電位変化を測定することができる。
ＦＥＴバイオセンサを用いたウィルス又は細菌の検出については、標的とするウィルス又は細菌を捕捉可能なオリゴ糖が固定化された電極（以下、プローブ固定電極と称することがある）を、ウィルス又は細菌を含有する溶液（以下、検体溶液と称することがある）中に浸すことで、オリゴ糖がウィルス又は細菌を捕捉し、捕捉したウィルス又は細菌の電気信号を電位の変化で捕らえる。
【００６０】
捕捉したウィルス又は細菌の電気信号を電位の変化で捕らえる電位方式は、オリゴ糖が、電荷を有するウィルス又は細菌を捕捉することにより生じる電極（固体）と溶液（液体）との固／液界面（固液界面とも称する）の電位の変化（表面電荷密度の変化）を検出するものである。
【００６１】
ウィルス又は細菌の検出においては、捕捉したウィルス又は細菌の電気信号を電流の変化で捕らえる電流方式を適用してもよい。
電流方式では、通常、電極上での酸化還元反応を利用する手法がとられる。しかしながら、ウィルス又は細菌を含む溶液中に、酸化物質または還元物質（例えば、アスコルビン酸）が存在すると、酸化または還元に基づく電流が流れ、ウィルス又は細菌の検出が妨げられる場合がある。また、電流計測に伴い、電極上で電極反応が進行する。電極反応は不可逆で非平衡反応であるため、電極の腐食、ガスの生成等が生じ、電流測定の安定性が損なわれ、特に繰返し測定する場合に検出精度が劣化することがある。
従って、オリゴ糖が捕捉したウィルス又は細菌の電気信号は、電位の変化で捕らえることが好ましい。
【００６２】
ＦＥＴバイオセンサは、本発明のバイオセンサ用デバイスの導電層をゲート電極として適用した電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）であり、ゲート電極以外の構成は公知の電界効果トランジスタの構成を用いることができる。ＦＥＴバイオセンサの構成例を、図１（Ｂ）を用いて説明する。
図１（Ｂ）は、フローティングゲート型の電極を備えたＦＥＴバイオセンサの構成例を示す側面模式図である。なお、フローティングゲート型のＦＥＴバイオセンサを、フローティングゲート型ＦＥＴバイオセンサと称することがある。
図１（Ｂ）に示すように、フローティングゲート型ＦＥＴバイオセンサ２０は、シリコン基板３２中にソース２２Ｓ、ドレイン２４Ｄが離間して配置され、前記シリコン基板３２、酸化ケイ素で形成された層２８、窒化ケイ素で形成された層２６、及びゲート電極として、上記のバイオセンサ用デバイス１０がこの順で積層された構造を有する。この場合に、酸化ケイ素で形成された層２８及び窒化ケイ素で形成された層２６はゲート絶縁膜として機能する層である。
トランジスタにおいては、一般に、ドレイン−ソース間のチャネル領域上にフローティング電極を形成し、フローティング電極によって電位を検出する。従って、フローティングゲート型ＦＥＴバイオセンサ２０では、バイオセンサ用デバイス１０の垂直下方の領域に、ドレイン２４Ｄおよびソース２２Ｓの間のチャネル領域が位置している。
【００６３】
図１の（Ｂ）に示す層構成とすることで、バイオセンサは、標的となるウィルス又は細菌を選択的にかつ感度よく検出することができる。
【００６４】
図２は、図１の（Ａ）で表されるバイオセンサ用デバイス１０を、延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサのプローブ固定電極として備えたＦＥＴバイオセンサ４０を説明するための模式図である。なお、プローブ固定電極部１０ａは、バイオセンサ用デバイス１０と同様の構成である。
図２において、延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサ４０は、シリコン基板４６と、シリコン基板４６の一部に、離間して設けられているドレイン４４Ｄおよびソース４２Ｓと、シリコン基板４６、ドレイン４４Ｄおよびソース４２Ｓの上に設けられているゲート絶縁膜４８と、ゲート絶縁膜４７と、を備えている。また、ゲート絶縁膜４８の内部に、ゲート電極１５として、導電性多結晶シリコンで形成されたゲート電極部１３を備えている。さらに、プローブ固定電極部１０ａは、ゲート電極部１３と接続されて、ゲート電極１５を構成する。
このように、プローブ固定電極部１０ａに接続したゲート電極部１３を備えることで、ドレイン４４Ｄおよびソース４２Ｓの間のチャネル領域を、上記のフローティング電極のように、プローブ固定電極の垂直下方の領域に位置づける必要がなく、プローブ固定電極部１０ａに接続したゲート電極部１３を、位置にとらわれず自由に形成することができる。また、ゲート電極部１３は、導電性を有する材料で形成されているので、延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサにおいての、プローブ固定電極部１０ａ以外の部分とプローブ固定電極部１０ａとの間の形状は自由に設定できる。また、図２には、ゲート電極部１３は多結晶シリコンを用いて形成されているが、ゲート電極部１３を形成する材料は、導電性を有するものであれば、所望とする形状等を考慮して、適宜選択されるのが好ましい。
【００６５】
フローティングゲート型ＦＥＴバイオセンサ及び延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサにおいて、ゲート絶縁膜２８，４８は、酸化シリコン（ＳｉＯ２）、窒化シリコン（ＳｉＮ）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）などの材料を単独または組み合わせて用い、通常はトランジスタ動作を良好に保つため、酸化シリコン（ＳｉＯ２）の上に窒化シリコン（ＳｉＮ）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）あるいは酸化タンタル（Ｔａ２Ｏ５）を積層した二層構造とする。
ゲート電極部１３は、ポリシリコン（Ｐｏｌｙ−Ｓｉ）が望ましく、ポリシリコンゲートを通してイオン注入によるソース４２Ｄ、ドレイン４４Ｄを形成する、いわゆるセルフアラインプロセスとの整合性がよい。
電極１２は、金、白金、銀、パラジウムなどの貴金属、あるいは、カーボン材料などの導電性物質を用いることができる。
なお、カーボン材料としては、具体的には、例えば、グラッシーカーボン、グラファイト、グラフェン、カーボンナノチューブなどのような導電性カーボン材料が挙げられる。
【００６６】
延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサにおいて、ゲート電極部１３は、配線としてもよく、この場合に、低抵抗でエッチングなど加工性の良い材料が好ましく、その材料としてはポリシリコン（Ｐｏｌｙ−Ｓｉ）、アルミニウム、モリブデンなどを用いることができる。
また、ゲート電極部１３とゲート電極部１３に接続した電極１２とを、例えば金のような同じ材料で形成することもできる。
【００６７】
また、ウィルス又は細菌の検出に用いるＦＥＴバイオセンサは、上記のようなＦＥＴバイオセンサの構成そのものを用いてもよいが、図３の（Ａ）に示すように、例えば、上記の延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサ１０ｂを入力段の一部に用いた集積回路により演算増幅器（オペアンプ）を構成して、ＦＥＴバイオセンサ５０としてもよい。
また、ＦＥＴバイオセンサは、図３の（Ｂ）に示すように、図３の（Ａ）で示したような機能に、さらに、延長ゲート型トランジスタ６３、位相補償キャパシタ６２、差動増幅器６４、増幅回路６６及び出力バッファソースフォロア６８等を備えて高機能化したＦＥＴバイオセンサ６０としてもよい。
【００６８】
上記のように高機能化したＦＥＴバイオセンサは、ウィルス又は細菌の捕捉の有無によって生じる微弱な電位の違いを、より高感度で検出することができる。また、図３に示したようなＦＥＴバイオセンサは、オリゴ糖を固定化したバイオセンサ用デバイス（プローブ固定電極１０ｂ）を、トランジスタから着脱することができ、プローブ固定電極１０ｂのみで交換可能となるので、バイオセンサとしての経済性及び使用性に優れている。
【００６９】
また、上記のＦＥＴバイオセンサによるウィルス又は細菌の検出は塩濃度を低くした状態で行う必要があるため、例えば、検体溶液を適宜希釈し、プローブ固定電極を浸漬させたり、検体溶液を前記電極上に滴下したりすることで行うことができる。この場合に、希釈前の検体溶液に含まれるウィルスや細菌の濃度が、検出において重要となるが、例えば、インフルエンザウィルスの場合では、ウィルス力価において、１／１００ＨＡＵ〜１０ＨＡＵの条件で検出可能であることが望ましい。本発明のバイオセンサは、従来のイムノクロマトグラフィーよりも低いウィルス濃度で迅速に検出できるため、従来法に代わる迅速な高感度検出法であると言える。ＨＡＵは、ウィルスの力価を表す。ウィルスの力価は、公知の血液凝集アッセイによって求めることができる。
【００７０】
（第２実施形態）
<ＱＣＭバイオセンサ>
ＱＣＭバイオセンサは、少なくとも、バイオセンサ用デバイスであるプローブ固定電極と、水晶振動子と、水晶振動子の振動を検出する発振回路とを有して構成され、水晶振動子マイクロバランス法に基づき、ウィルス又は細菌を検出するバイオセンサである。
ここで、水晶振動子マイクロバランス法とは、薄い板状の水晶の両面に電極を取り付けた積層体を用い、各電極に交流電場を印加すると、水晶振動子が一定の周波数（共振周波数）で振動する性質を利用して、電極に付着した物質の質量を測定する手法である。
ＱＣＭバイオセンサでは、水晶振動子に隣接する電極にウィルス又は細菌が付着すると、付着したウィルス又は細菌の質量に応じて共振周波数が低下する性質を利用し、付着したウィルス又は細菌の質量変化を計測することで、付着したウィルス又は細菌を検出することができる。
ＱＣＭバイオセンサの構成例を、図４を用いて説明する。
【００７１】
図４には、金電極１１２ｂと、水晶振動子（水晶板）１１８と、金電極１１２ａと、中間層であるＳＡＭ１１４とが、この順に積層され、ＳＡＭ１１４にオリゴ糖１１６が結合されたＱＣＭバイオセンサ１００が示されている。電極１１２ａと電極１１２ｂには、図示しない発振回路が導線により繋がっている。このように、ＱＣＭバイオセンサ１００がＱＣＭバイオセンサ用デバイスを備えている。
また、ＱＣＭバイオセンサ用デバイスは、上記のＦＥＴバイオセンサ用デバイス１０と同様である。
電極１１２ａと、電極１１２ｂとは、特に区別されず、どちらがオリゴ糖１１６を結合した電極（プローブ固定電極）になってもよいし、電極１１２ａと、電極１１２ｂとの両方がプローブ固定電極になってもよい。
【００７２】
ＱＣＭバイオセンサにおける測定においては、プローブ固定電極を、ウィルス又は細菌が溶液中に存在する検体に浸したり、プローブ固定電極の表面に該検体を滴下したり、該検体中にＱＣＭバイオセンサを浸漬すればよい。
【００７３】
以上の測定によって得られる水晶発振子の振動に基づく共振周波数（Ｈｚ）の変化によって、プローブ固定電極の表面のオリゴ糖に選択的に結合したウィルス又は細菌の存在を高感度で定量的に検出することができる。
【００７４】
（第３実施形態）
<ＳＰＲバイオセンサ>
ＳＰＲバイオセンサは、少なくとも、プローブ固定電極と、光照射装置と、反射光を受光し反射率を検出する受光装置とを有して構成され、表面プラズモン共鳴を利用した電極の屈折率の変化により、ウィルス又は細菌を検出するセンサである。
ＳＰＲバイオセンサの構成例を、図５を用いて説明する。
【００７５】
図５には、プリズム２１８上に、電極（金薄膜）２１２と、中間層２１４とが、この順に積層され、さらに中間層２１４にオリゴ糖２１６が結合したＳＰＲバイオセンサ２００が示されている。
ＳＰＲバイオセンサ２００では、図示しない光照射装置（レーザー発振器）ＬＶから、プリズム２１８を通して入射した後、金薄膜２１２に入射角θで光（ｈν）が照射され、金薄膜２１２で反射した後、プリズム２１８を通って図示しない受光装置（レーザー検出器）Ｌｄで受光する。この際、入射角θを変化させた場合に、反射光が最も減衰した時の角度（共鳴角）が、金薄膜２１２へのウィルス又は細菌の付着の有無によって変化することを利用し、当該変化から金薄膜２１２上でのウィルス又は細菌の吸着を確認することができる。受光装置としては、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラなどを用いてもよい。また、金薄膜２１２とプリズム２１８の間にはガラス基板を配置してもよい。
【００７６】
また、金薄膜上へレーザー光照射時にしみ出すエバネッセント波は、金薄膜から離れるほど影響を受けなくなり、共鳴角の変化に影響を及ぼさなくなる。そのため、プローブ層厚は薄ければ薄い程よい。ＳＰＲバイオセンサのプローブ固定電極におけるプローブ層厚は、検出感度の点から、１ｎｍ〜１０ｎｍであることが好ましい。
【００７７】
このような構成とすることで、ＳＰＲバイオセンサは、ウィルス又は細菌を選択的にかつ高感度で検出することができる。
【実施例】
【００７８】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」及び「部」は質量基準である。【００７９】
[実施例１]
＜バイオセンサ＞
（ＦＥＴバイオセンサ用デバイスの作製）
図６に、実施例に用いた、ＦＥＴバイオセンサに用いるバイオセンサ用デバイス７０、すなわちオリゴ糖が固定化された金電極の作製方法を説明する模式図を示す。まず、図６に示すように、中間層形成材料として、オキシルアミノ基を有するウンデカンジスルフィド（Ｈ２Ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）１１−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）１１−ＯＨ、Ｈ２Ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）１１−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２）１１−ＮＨ２）（１ｍｍｏｌ／Ｌ）をＰａｒｋらの文献（Langmuir, 2008, Vol. 24, 6201-6207）を参考に合成を行った。得られた中間層形成材料をエタノールに溶解させ、ＳＡＭ形成用溶液を調製した。また、導電層として用いる金電極７２として、Φ０．５ｍｍの円状の金電極（Ａｕ）の板を用意した。得られたＳＡＭ形成用溶液を、金電極７２に塗布して、金電極７２上にＳＡＭを形成した。金電極７２の表面上のチオール基を有する分子の該表面中での密度は、事前にＣＶによって測定することで、３．８５±０．８１ｍｍｏｌ／ｎｍ２であることが示された。
上記のようにして作製したＳＡＭ７６ａが固定化された金電極７２に対し、α２，６−シアリルラクトース（東京化成工業株式会社製）を、縮合反応（６０℃、２４０分間）によってＳＡＭ７６ａのオキシルアミノ基に結合させ、前記α２，６−シアリルラクトースのグルコース残基の還元末端炭素とＳＡＭ７６ｂとがオキシムを介して結合されることにより、オリゴ糖７４を固定化した金電極、すなわち、以下の延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサに用いるバイオセンサ用デバイス７０を作製した。【００８０】
（延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサ）
上記で作製したバイオセンサ用デバイス７０の金電極７２に、図２に示すような導電性多結晶シリコンで形成されたゲート電極部を接続し、延長ゲート型電極とした。これを、図３に示すようなオペアンプ等を装備したＦＥＴに装着し、延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサ８０を作製し、以下の測定を行った。【００８１】
（参照電極を備えた延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサ）
実施例１において、金電極上にＳＡＭを形成したものにα２，６−シアリルラクトースを結合したものを作製し、銀／塩化銀電極を参照電極としてバイオセンサに組み込み、実施例１と同様に、延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサとしたものを、延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサ８２として用いた。【００８２】
[対照１]
実施例１において、ＦＥＴバイオセンサに用いるバイオセンサ用デバイスの作製に用いたα２，６−シアリルラクトースをα２，３−シアリルラクトースに変更した他は同じにして、バイオセンサ用デバイスを作製し、実施例１と同様に延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサ８１を作製して、以下の測定を行った。【００８３】
（検体溶液）
実施例及び対照に用いる検体溶液の原液として、０．０５％ホルマリン処理により、無害化されたＡ型インフルエンザウィルスＨ１Ｎ１（ＨＡ価２５６）を含む溶液を調製した。また、ＨＡ価はウィルスが血液凝集能を示す指標であり、感染力の指標として扱われる。前記検体溶液の原液は、２５６倍まで希釈したウィルス液が血液凝集能を示したため、ＨＡ価２５６（２５６ＨＡＵ）である。【００８４】
＜測定及び結果＞
参照電極を備えた延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサ８２を、まず緩衝液（０．０１％のリン酸緩衝生理食塩水）に浸し、電位のドリフトラインが安定化するまで緩衝液を適宜交換しなから静置した。その後、最終ウィルス濃度が１／１２８０〜４／５ＨＡＵになる範囲で前記ＦＥＴバイオセンサ８２を１０分間隔で濃度が薄い方から順次浸漬し、測定を行った。結果を図７に示す。なお、電位測定においては、測定前のウィルスを緩衝液中で得られた電位と経過時間との関係を表すグラフ中のドリフトラインについて、該ドリフトラインを直線と近似した近似直線を作成し、ウィルスを添加した溶液を測定した場合に、該近似直線からどれだけ電位変化が得られたかを計測している。なお、ドリフトラインは緩やかな曲線であるため厳密な電位変化を示したものではないが、上記の計測方法によって、α２，６−シアリルラクトース表面とα２，３−シアリルラクトース表面の電位変化を相対的に比較することができる。【００８５】
次に、上記のセンサ８２を用いて行った場合と同様に、実施例１として、延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサ８０を用いた場合の測定結果を図８の（Ｂ）、対照１として、延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサ８１を用いた場合の測定結果を図８の（Ａ）にそれぞれ示す。各破線は、上記の延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサ８２を用いた場合に得られた近似直線である。【００８６】
図８に示すように、対照１と実施例１の電位と経過時間との関係を示す曲線は、ともにウィルスの濃度を増やすに従って、近似直線から傾きが緩やかになり、近似直線から電位差が大きくなっていることがわかる。さらに実施例１においては、近似直線からの電位差は対照１よりも顕著に大きいことが示された。【００８７】
上記で得られた、電位の差について、検体溶液の原液の希釈倍率と電位の差（ΔＶ）との関係を示したグラフを図９に示す。また、これらの実施例１で得られた電位差と対照１で得られた電位差（ΔＶ）とを比較して、有意な差が存在したかについてもｔ検定によって求めたｐ値として濃度ごとに付記している。また図９におけるそれぞれのグラフは同じ実験を２回ずつ行ったものである。【００８８】
図９の結果からウィルス濃度が１／１２８０〜４／５ＨＡＵの範囲において、α２，３−シアリルラクトース表面よりもα２，６−シアリルラクトース表面のほうが有意にΔＶは大きいことが示された。これはウィルスがα２，６−シアリルラクトース表面に特異的に吸着して、電位が変化したことを示している。
このように、延長ゲート型ＦＥＴバイオセンサによって、ウィルスにおけるヒト感染型か鳥類感染型かの違いを判別できる高感度なセンサであることが示された。【００８９】
[実施例２]
（ＱＣＭバイオセンサ用のバイオセンサ用デバイス）
ＱＣＭバイオセンサに用いるバイオセンサ用デバイスの作製において、株式会社日本電波工業社製の「ＮａＰｉＣＯＳ」を用いた。ＮａＰｉＣＯＳは、図４に示されるように、２枚の金電極に相当する金板と水晶が接着している構造を有する。また前記バイオセンサ用デバイスの作製においては、金電極と水晶以外は、実施例１と同じものを用いた。
実施例１と同様に、前記の金電極上にＳＡＭを固定し、ＳＡＭにα２，６−シアリルラクトースを結合させ、以下のＱＣＭバイオセンサに用いるバイオセンサ用デバイスを作製した。
（ＱＣＭバイオセンサ）
上記で作製したバイオセンサ用デバイスに、ハミルトン社製の２５０μＬのシリンジを用いてサンプルループ内にウィルス溶液を充填し、適宜流していく。本センサは、一定の流速の溶液中に、バイオセンサ用デバイスを浸しながら、該デバイス中の水晶板の共鳴振動によって生じる周波数が、インフルエンザウィルスの吸着による重量増加によって減少することを利用して、インフルエンザ吸着量を測定するものである。【００９０】
[対照２]
実施例２において、ＱＣＭバイオセンサに用いるバイオセンサ用デバイスの作製に用いたα２，６−シアリルラクトースを、α２，３−シアリルラクトースに変更した他は同じにして、バイオセンサ用デバイスを作製した後、実施例２と同様にＱＣＭバイオセンサを作製し、以下の測定を行った。【００９１】
＜測定及び結果＞
まず、０．０１倍のリン酸緩衝液をＱＣＭバイオセンサに流速３．０ｍｌ／ｈで導入した。その後、周波数が安定していることを確認し、検体溶液の原液を０．０１倍のリン酸緩衝液で段階的に希釈した溶液を、薄い濃度から順に流路内に２００μＬずつ５分間隔で導入した（１／３２ＨＡＵから１ＨＡＵまで）。また、実施例２及び対照２の測定は、それぞれ３回ずつ行った。図１０にそれぞれ３回ずつ行った結果示す。【００９２】
結果から、実施例２における周波数の減少量（ΔＦｒｅｑｕｅｎｃｙ（Ｈｚ））が、対照２に比べて明らかに大きいことが示された。従って、α２，６−シアリルラクトースを固定化した電極を有するＱＣＭバイオセンサは、Ａ型インフルエンザを、選択的に、かつ高感度で検出できることが示された。
このように、ＱＣＭバイオセンサによって、インフルエンザウィルスにおけるヒト感染型か鳥類感染型かの違いを判別できる高感度なセンサであることが示された。【００９３】
[実施例３]
ポリチオフェン系導電性ポリマーを中間層として用いたバイオセンサ
（モノマーの合成）
ＥＤＯＴ−ＯＮＨ２（ＥＤＯＴＡＯ）モノマーの合成は、以下に示す５つのステップによって行った（Luo, S. C.; Ali, E. M.; Tansil, N. C.; Yu, H. H.; Gao, S.; Kantchev, E. A. B.; Ying, J. Y., Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) nanobiointerfaces: Thin, ultrasmooth, and functionalized PEDOT films with in vitro and in vivo biocompatibility. Langmuir 2008, 24 (15), 8071-8077）。
【化１】
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【００９４】
・第１ステップ：ＥＤＯＴ−Ｃｌの合成
１００ｍＬ二口ナスフラスコに脱水したトルエン２８ｍＬを加えて攪拌しながら脱気した。次に反応系全体を窒素置換しながら３，４−ジメトキシチオフェン（１．３６ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルフォネート（０．１６ｇ、０．９ｍｍｏｌ）と３−クロロ−１，２−プロパンチオール（２．６０ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）を加えて９０℃で２４時間反応させた。その後、窒素置換しながら３−クロロ−１，２−プロパンジオール（２．６０ｇ、２３．１ｍｍｏｌ）を加えて９０℃で３時間反応させた。次に、エバポレートして、カラムクロマトグラフィー法（シリカゲル、ジクロロメタン／ヘキサン＝２／８）によって精製を行った。薄い黄色のオイル状の反応生成物ＥＤＯＴ−Ｃｌを得た。収率は５６％であった。 【００９５】
・第２ステップ：ＥＤＯＴ−Ｎ３の合成
１００ｍＬの二口ナスフラスコに３０ｍＬのＤＭＦ、ＥＤＯＴ−Ｃｌ（１．１８ｇ、６．２ｍｍｏｌ）とＮａＮ３（０．４８ｇ、７．４ｍｍｏｌ）を加えて１２０℃で９０分間反応させた。溶液を放冷した後Ｈ２Ｏを１５ｍＬ加えて、酢酸エステルで分液を行い（３×1５ｍＬ)、有機層をまとめてＨ２Ｏで洗浄し（３×１５ｍＬ)、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した後、エバポレートをして茶色のオイル状の反応生成物ＥＤＯＴ−Ｎ３を得た。収率は８１％であった。【００９６】
・第３ステップ：ＥＤＯＴ−ＮＨ２の合成
１００  ｍＬのナスフラスコに１０  ｍＬのＴＨＦ、１０ｍＬの２ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ、ＥＤＯＴ−Ｎ３（０．９９ｇ、５．１ｍｍｏｌ）とトリフェニルホスフィン（１．６０ｇ、６．１ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で３時間反応させた。混合溶液が室温になったらエバポレートしてＴＨＦを除去した。次に１ＭのＨＣｌ水溶液を用いて溶液のｐＨを２未満に調製し、ジクロロメタンで分液を行った（３×１５ｍＬ)。有機層を廃棄し、１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨを用いて水層のｐＨを１２より大きく調製した。ジクロロメタンを用いて分液し（３×１５ｍＬ）、有機層をまとめて無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過した。最後にエバポレートして薄い黄色のオイル状ＥＤＯＴ−ＮＨ２を得た。収率は７５％であった。  【００９７】
・第４ステップ：ＥＤＯＴ−ＯＮＨ−Ｂｏｃの合成
１００ｍＬのナスフラスコにＥＤＯＴ−ＮＨ２（０．６５ｇ、３．８ｍｍｏｌ）、２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノオキシ）酢酸（０．８０ｇ、４．２ｍｍｏｌ）、 Ｈ２Ｏを７ｍｌと１３ｍＬのエタノールを加えて室温で１０分間攪拌した。その後、ＤＭＴ−ＭＭ（１．５７ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を加えてさらに３時間反応させた。混合溶液をエバポレートした後、１５ｍＬの飽和Ｎａ２ＣＯ３を加えて、ジエチルエーテルで分液した（３×１５ｍＬ）。有機層をまとめて、１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ水溶液で洗浄した後、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。最後にエバポレートして透明なオイル状ＥＤＯＴ−ＯＮＨ−Ｂｏｃを得た。収率は７０％であった。【００９８】
・第５ステップ：ＥＤＯＴ−ＯＮＨ２の合成
１００ｍＬのナスフラスコに、ＥＤＯＴ−ＯＮＨ−Ｂｏｃ（０．４６ｇ、１．３３ｍｍｏｌ）、１５ｍＬのＭｅＯＨと５ｍＬのＨ２Ｏを加えて、攪拌しながら１０ｍＬの濃塩酸をゆっくり滴下し、室温で１時間反応させた。反応終了後、２０ｍＬのＨ２Ｏを加えてエバポレートした。ジエチルエーテルで分液し（３×１５ｍＬ）、水層をまとめて、ｐＨを１２より大きくなるまで調製し、ジエチルエーテルで分液し（３×１５ｍＬ）、有機層をまとめて、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。最後に、エバポレートして透明なオイル状ＥＤＯＴ−ＯＮＨ２を得た。収率は６２％であった。全体収率は１６％であった。【００９９】
（ＥＤＯＴ−ＯＮＨ２（ＥＤＯＴＡＯ）とＥＤＯＴとの電解重合および電解重合膜の評価）
ＥＤＯＴＡＯとＥＤＯＴ（３，４−エチレンジオキシチオフェン）モノマーの電解重合を行い、水溶液中ガラスカーボン電極表面にランダムに共重合体を付着させた。
【化２】
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【０１００】
作用電極は市販されているガラスカーボン電極（ｉｎｎｅｒ  ｄｉａｍｅｔｅｒ  ３  ｍｍ、ＣＨ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社（ＴＸ、ＵＳＡ）製）を用いた。使用前、電極表面をアルミニウムパウダー（粒子サイズ０．０５μｍ（Ｂａｉｋｏｗｓｋｉ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ、ＮＣ、ＵＳＡ製）で丁寧に磨き、ｍｉｌｉＱ水で洗浄した。ＥＤＯＴＡＯおよびＥＤＯＴを、ＥＤＯＴＡＯ：ＥＤＯＴのモル比が０：１００（以下、０ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯということがある。）、２５：７５（以下、２５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯということがある。）、５０：５０（以下、５０ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯということがある。）、７５：２５（以下、７５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯということがある。）、または１００：０（以下、１００ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯということがある。）で１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で含む過塩素酸ナトリウム（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）水溶液１  ｍＬをガラスセルに加えた。ガラスカーボン作用電極、白金カウンター電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ（ｉｎ  ３．３ｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌａｑ）参照電極の三電極をガラスセルに取り付け、ポテンシャルスタット（Ｖｅｒｓａ  ＳＴＡＴ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）と接続した。サイクリック電位（−０．６〜 ＋１．１〜  −０．６Ｖｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ  ａｔ  ０．１Ｖ／ｓｅｃ）の電位を印加し、１０サイクル連続掃引した。重合膜の形成に必要な酸化電位（フォワードスキャン）は＋１Ｖ（ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ)付近であることが観測された（図１１Ａ、（ａ）〜（ｅ））。サイクリック数の増加と共に電流密度の増加することは重合膜の成長プロセスを表している。サイクルごとの単位界面キャパシタンス（Ｃ、ｍＦ／ｃｍ２)は＋０．２Ｖ付近のフォワードスとリバース電流密度の差分（ΔＩ、ｍＡ)で決められ、サイクリック数の増加と共に増加した(図１１Ａ、（ｆ））。
Ｃ＝ΔＩ／νＡ      式（１）【０１０１】
ν（Ｖ／ｓｅｃ）はスキャンレート、Ａ（ｃｍ２）は電極表面積を表す。０ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯと５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡ２の場合、キャパシタンスが著しく増加したことは電極表面導電性高分子膜が形成されたことを表す。これに対し、５０ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡ〜１００ｍｏｌ％のＥＤＯＴＡ場合、キャパシタンス増加がみられなかった。ＥＤＯＴＡＯの含有量が高い場合、電解重合膜の導電性が低下したことを示唆する。【０１０２】
重合膜の膜厚は、重合電気量によって制御でき、電解重合モノマーの組成によって変わる。そのため、段差計（ＤｅｋＴａｋ  １５０、ＵＬＶＡＣ社製）を用いて、金基板の表面に固定したｐｏｌｙ（ＥＤＯＴＡＯ−ｃｏ−ＥＤＯＴ）電解重合膜の膜厚と表面粗さの測定を行った。ＥＤＯＴＡＯモノマーの割合が増えるとともに膜厚が薄くなり、表面粗さも小さくなった(図１１Ｂ、（ｇ）〜（ｉ））。ＥＤＯＴＡＯモノマーのＥＤＯＴ骨格の側鎖がπ共役形成に立体障害を与え、重合しにくくなり、導電性が下がったと考えられる。【０１０３】
電解重合膜表面の元素組成をＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）（ＡＸＩＳ−ＨＳｉ１６５；  ４０８  Ｓｈｉｍａｄｚｕ−Ｋｒａｔｏｓ社（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）製）による観察を行った。光源がＭｇＫα線、加速電圧１５  ｋＶ、入射角９０°。高分解能スペクトルのカーブフェッテイングはガウス関数に基づいて解析された。平均値と標準偏差は４つ測定ポイントから得られた。金基板表面にモノマーの組成を変えて（０ｍｏｌ％〜５０ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯ)、１０サイクル電解重合を行った。ＥＤＯＴＡＯが０ｍｏｌ％の場合、Ｎ１ｓのピークが観測されなかったが、ＥＤＯＴＡＯの割合が増えるとともに（２５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯ、５０ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯ）、窒素の原子割合が増加した (図１２、（ａ）)。共重合膜表面におけるＥＤＯＴとＥＤＯＴＡＯのモル比をそれぞれｍ、ｎとすると次の関係が成り立つ：
Ｎ＝２ｎ、Ｓ=ｍ＋ｎ          式（２）
以下に導電性共重合ポリマーの構造を示す。
【化３】
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【０１０４】
電解重合膜表面のＥＤＯＴＡＯ組成の導入率を式（３）ように示すことができる。
ｎ／（ｍ＋ｎ）＝Ｎ／２Ｓ      式（３）
Ｎ、Ｓは窒素と硫黄の実際に測定した元素割合を表す。導電性共重合ポリマーのＥＤＯＴＡＯ組成の割合は、電解重合の際ＥＤＯＴＡＯモノマーの供給量と比例することがわかった(図１２、（ｃ）)。【０１０５】
固／液界面での低インピーダンス界面は、導電性ポリマーのバイオセンシングやバイオエレクトロニクス応用の材料として重要な性質の一つである。そのため、電気化学インピーダンス測定（ＥＩＳ）を行った。ＰＧＳＴＡＴ  ３０２  ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ （Ｍｅｔｒｏｈｍ  Ａｕｔｏｌａｂ社製）を導電性ポリマーが固定されたガラスカーボン作用電極、Ａｇ／ＡｇＣｌ（ｉｎ  ３．３  ｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌａｑ）参照電極と、Ｐｔカウンター電極から組成される三電極セルと接続した。測定溶液は５ｍＭ  ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ／ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅを含有する１００倍に水で希釈したＤＰＢＳ（０．０１ｘＤＰＢＳ  ｐＨ７．４、ダルベッコ社製）を用いた。【０１０６】
周波数範囲０．１ｋＨｚ〜１０ｋＨｚ（一桁ごとに１０点測定ポイント)、５０  ｍＶ  ＡＣ電位、ＤＣバイアス＋０．２Ｖ  ｖｓ  Ａｇ／ＡｇＣｌ。電荷移動抵抗はナイキストプロットをＲａｎｄｌｅの等価回路モデルにフィテイングで得られた。平均値と標準誤差が四つの独自測定から得られた。ガラスカーボン電極上に電解重合したｐｏｌｙ（ＥＤＯＴＡＯ−ｃｏ−ＥＤＯＴ）膜の電気化学インピーダンス測定を行った。ナイキストプロットの高周波側の半円形の部分がｆｅｒｒｉｃｙｎａｎｉｄｅ／ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ［Ｆｅ（ＣＮ）６３−／ Ｆｅ（ＣＮ）６４−］酸化還元反応の電荷移動限界プロセスに属し、低周波数側の線形部分がそれの拡散限界プロセスに属する（図１３Ａ）。０ｍｏｌ％ＥＤＰＴＡＯ（ｉ．ｅ．，ＰＥＤＯＴ）重合膜のナイキストプロットは線形応答し、キャパシタのような挙動を示した。Ｒａｎｄｌｅの等価回路に基づきフィッティングしたデータから、ＥＤＯＴＡＯの比率の増加と共に電荷移動抵抗（Ｒｃｔ）が増えることがみられた（図１３Ｂ）。ＥＤＯＴＡＯの比率の変化に対するＣＰＥ（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｐｈａｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）の振るまいがＣＶから得られた界面キャパシタンス（図１１Ａ）と近いという傾向が示された。ＥＤＯＴＡＯ組成が高いほどオキシアミン側鎖がチオフェン骨格に対し立体障害が増え、膜導電性が低下し、それ故、共重合膜のインピーダンスが上昇したと考えられる。共重合膜のオキシアミングループの割合と膜の電子／イオン伝導性が相殺するため、総合的に考えて、以下の実験には２５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯの共重合体を用いた。  【０１０７】
ガラスカーボン電極表面に電解重合した共重合膜にグライコブロッティング 反応（Hideshima, S.; Hinou, H.; Ebihara, D.; Sato, R.; Kuroiwa, S.; Nakanishi, T.; Nishimura, S.; Osaka, T., Attomolar detection of influenza A virus hemagglutinin human H1 and avian H5 using glycan-blotted field effect transistor biosensor. Anal Chem 2013, 85 (12), 5641-4.）を用いて糖鎖（２，６−シアリルラクトース、２，３−シアリルラクトース）を導入した。【０１０８】
洗浄後の金基板表面に０ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯまたは２５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯを電解重合した後、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄した。酢酸水溶液中２，６−シアリルラクトースまたは２，３−シアリルラクトースの糖鎖を、それぞれ最終濃度０．１  ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ５．３）になるように調製した。その後６０℃、１２時間グライコブロッティング反応を行った。【０１０９】
糖鎖導入前後の膜表面のぬれ性は接触角計（ＤＭ−５０１、協和界面科学社製）を用いての評価した（図１４Ａ、図１４Ｂ）。糖鎖導入前の、０ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯおよび２５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯ電解重合膜の水滴接触角は、それぞれ６８．８±０．２°および６３．８±０．２°であった（図１４Ａ）。糖鎖導入後の、０ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯおよび２５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯ電解重合膜の水滴接触角は、それぞれ４０．５±０．５°および４°＞であり、糖鎖導入後に接触角の数値が下がった（図１４Ｂ）。【０１１０】
２５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯ重合膜表面の接触角が著しく低下したことがグライコブロッティング反応によって糖鎖が導入され、重合膜表面が超親水性になったと考えられる。 ０ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯ（ｉ．ｅ．，  ＰＥＤＯＴ）の場合、接触角が低下した原因は、糖鎖の非特異的な吸着によるもの考えられる。【０１１１】
グライコブロッティング 反応を定量的に評価するため、ＱＣＭセンサを用いて評価した。
ＱＣＭの測定は、ツインＱＣＭセンサ（３０ＭＨｚ、１Ｈｚ（ΔＦ）＝３５  ｐｇ／ｃｍ２）とＱＣＭアナライザー（日本電子工業社（東京、日本）社製）を用いて２５℃で行った。０ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯまたは２５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯをＱＣＭセンサに電解重合した後、重合膜からドーパントの過塩素酸ナトリウムを抜くため、ＱＣＭセンサをｍｉｌｌｉＱ水に１２時間浸してから測定を行った。その後、上記と同様の条件で糖鎖を導入し、ｍｉｌｌｉＱ水で洗浄した後測定を行った（図１４Ｃ）。糖鎖導入後、２５ｍｏｌ％  ＥＤＯＴＡＯを電解重合したＱＣＭセンサの場合、糖鎖の付着に由来する周波数の低下が確認され、９．４  μｇ／ｃｍ２付着したことがわかった。０ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯの場合、周波数が増えたことは、導電性ポリマーに微量に残存するドーパントのＮａＣｌＯ４が溶液中に抜け出たことが原因であると推測される。【０１１２】
（インフルエンザウィルスの特異的検出）
・ＱＣＭセンサによるインフルエンザウィルスのリアルタイム検出
インフルエンザウィルスサンプルは失活させたＡ型ヒトインフルエンザウィルス（Ｈ１Ｎ１，ＰＲ８，ｓｔｒａｉｎ）を用いた。感染度は２５６  ＨＡ  ｕｎｉｔ(ＨＡＵ、ニワトリ赤血球凝集実験)である。ＱＣＭの測定はツインＱＣＭセンサ（３０  ＭＨｚ）とＱＣＭアナライザー（日本電子工業（東京, 日本）社製）を用いて行った。インフルエンザウィルス測定用のＱＣＭセンサは、２５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯをＱＣＭセンサ表面に１０サイクル電解重合させ、０．１ｍＭ糖鎖（２，６−シアリルラクトースまたは２，３−シアリルラクトース）の酢酸水溶液（ｐＨ５．３） と６０℃、１２時間反応させて作製した。測定条件：送液バッファー  １００倍に水で希釈したＤＰＢＳ（０．０１ｘＤＰＢＳ  ｐＨ７．４、ダルベッコ社製）、流速５０  μＬ／ｍｉｎで、インフルエンザウィルスサンプルの量２００ μＬ、インフルエンザウィルス濃度は０．１２５、０．２５、０．５、１．０、２．０  ＨＡＵとした。測定温度２５±０．０２℃。インジェクションは７分間隔で行った。つまり、１回目に０．１２５ＨＡＵのインフルエンザウィルスサンプルをインジェクションし、その７分後に０．２５ＨＡＵのサンプルをインジェクションし、２．０  ＨＡＵまでのサンプルを７分毎に順次インジェクションした。平均値と標準偏差は４つの平衡測定データから得られた。【０１１３】
図１５Ａは、インフルエンザウィルスの濃度を変えたときに、２，６−シアリルラクトース糖鎖または糖鎖を修飾した電極の分子認識反応に由来する重さの変化を周波数として示したときの経時変化を示す。図１５Ｂは、各インジェクションが平衡になった時の周波数をインフルエンザウィルス濃度に対しプロットした図である。
ｐｏｌｙ（ＥＤＯＴＡＯ−ｃｏ−ＥＤＯＴ）に２，３−シアリルラクトースを固定したＱＣＭセンサは、２ＨＡＵインフルエンザウィルスをインジェクションするまで顕著な応答が見られなかったが、ｐｏｌｙ（ＥＤＯＴＡＯ−ｃｏ−ＥＤＯＴ）に２，６−シアリルラクトースを固定したＱＣＭセンサはインフルエンザウィルスサンプルの最初のインジェクションから著しく応答した（図１５Ａ）。
図１５Ｂから、インフルエンザウィルス濃度が高い場合ほど、糖鎖がインフルエンザウィルスを捕捉したことに由来する周波数の減少が大きくなり、周波数の変化に濃度依存性があることが示された。また、インフルエンザウィルス濃度が最も低い０．１２５  ＨＡＵの場合においても、インフルエンザウィルスの付着量はｐ＜０．０１で高い有意差があった。インフルエンザウィルスは２，６−シアリルラクトースを有するＱＣＭセンサに対し選択的に結合することが確認された。【０１１４】
・電位測定によるインフルエンザウィルスの検出
電位測定装置を用いて、インフルエンザウィルスと糖鎖の結合反応の累積線量応答を測定した。電位測定は、１０チャンネル円形Ａｕ微小電極（直径５００ μｍ)を用いて行った（Goda, T.; Higashi, D.; Matsumoto, A.; Hoshi, T.; Sawaguchi, T.; Miyahara, Y., Dual aptamer-immobilized surfaces for improved affinity through multiple target binding in potentiometric thrombin biosensing. Biosensors and Bioelectronics 2015, 73, 174-180.）。インフルエンザウイル（Ｈ１Ｎ１）を検出するために、１０チャンネル円形Ａｕ微小電極表面に２５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯを、記述の方法と同様に１０サイクル電解重合した。その後、グライコブロッティング 反応によって２，６−シアリルラクトース糖鎖または２，３−シアリルラクトース糖鎖をそれぞれ導入した。【０１１５】
インフルエンザウィルスの濃度を０．０１５、０．０３１、０．０６２、０．１２、０．２５、０．５０、１．０  ＨＡＵとした場合の、修飾したＡｕ電極の電位応答をｈｉｇｈ−ｉｎｐｕｔ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  （Ｋｅｙｔｈｌｅｙ  ６５１７Ｂ，  Ｋｅｙｔｈｌｅｙ社製）を用いてＡｇ／ＡｇＣｌ（ｉｎ  ３．３  ｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌaq）参照電極に対し直流バイアスない状態で測定した。はじめに、修飾した１０チャンネル円形Ａｕ微小電極（直径５００ μｍ)を１００倍に水で希釈したＤＰＢＳ（０．０１ｘＤＰＢＳ  ｐＨ７．４、ダルベッコ社製）に１５０分浸けて、Ａｕ電極表面電位を安定させた。その後、インフルエンザウィルスの濃度を０．１５〜１．０ＨＡＵまで、低い濃度から高い濃度の順に１０分間隔で導入し、表面電位の変化を測定した（図１６）。【０１１６】
糖鎖末端のシアル酸がマイナス電荷を持ち、インフルエンザウィルス（Ｈ１Ｎ１）のヘマグルチニンの認識部位（プラス電荷を有する）と結合するため、インフルエンザウィルス濃度が高くなるとともに２，６−シアリルラクトース糖鎖または２，３−シアリルラクトース糖鎖をそれぞれ導入した電極の界面電位は、どちらも上昇する傾向が見られた。しかし、２，６−シアリルラクトース糖鎖を導入した電極では、２，３−シアリルラクトース糖鎖を導入した電極と比較して界面電位が著しく上昇した。このことは、２，６−シアリルラクトース糖鎖を導入した電極表面に、より多く正電荷を持つインフルエンザウィルスが付着したことを示す。０．０１ｘＤＰＢＳ溶液中、溶液の電気二重層は約７．４  ｎｍであった。糖鎖の長さは２  ｎｍ以下であるため、電気二重層内での検出が可能である。糖鎖はマイナスチャージを持ち、プラスネット電荷を持つインフルエンザウィルスヘマグルチニン（Huang, Q.; Opitz, R.; Knapp, E. W.; Herrmann, A., Protonation and stability of the globular domain of influenza virus hemagglutinin. Biophysical Journal 2002, 82(2), 1050-1058.）を引き付けるため、電気二重層内のプラスネット電荷の密度が高くなり、電位の上昇が起きたと考えられる。【０１１７】
インフルエンザウィルスと特異的に結合する糖鎖を末端に導入した導電性ポリマーで修飾した電極を用いて、インフルエンザウィルスをラベルフリー検出する方法を開発した。ＰＥＤＯＴにウィルス表面のタンパク質であるヘマグルチニンと特異的に反応する糖鎖等などのリガンド分子を導入した。幾つかの合成ステップを経て、モノマーとなるＥＤＯＴの側鎖にオキシルアミン（−Ｏ−ＮＨ２）基を置換基として導入し、ＥＤＯＴ誘導体（ＥＤＯＴＡＯ）の合成に成功した。合成したモノマーは、ＮＭＲおよびＥＳＩ−ＭＳで評価をおこない、目的物の合成を確認した。次に、電解重合によってリガンド分子が影響を受ける可能性を排除するために、先にＥＤＯＴＡＯを電極基板に導入し、その後カップリング反応をおこなってリガンド分子の導入を行った。ＥＤＯＴとＥＤＯＴＡＯを用いて、電解重合法によって電極表面に共重合体を共有結合的に導入した。母材となるモデル電極材料としてガラスカーボン（ＧＣ）を用いた。電界重合時のドーパント種としてプロトン酸塩であるＮａＣｌＯ４を用いた。オキシルアミン基をリンカーとして、還元末端を有する糖鎖をグリコブロッティング反応により共有結合で導入した。Ｈ１型インフルエンザウィルスのヘマグルチニンに対して特異的な糖鎖として２，６−シアリルラクトースを、Ｈ５型ヘマグルチニンに対して特異的な糖鎖として２，３−シアリルラクトースを用いた。作製した表面はサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）、交流インピーダンス測定（ＥＩＳ）、ＳＥＭ、ＸＰＳ、段差測定、ＱＣＭにより評価を行った。２５ｍｏｌ％ＥＤＯＴＡＯの組成のモノマーを電極上で電解重合した場合に、特に良好な結果が得られた。上記の電極を用いてインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ウィルスの検出をおこなった。ＱＣＭ測定により、２，６−シアリルラクトース導入電極表面に対するウィルスの特異的な結合を確認した。さらに、電位測定によりウィルスのラベルフリーな電気的検出を実現した。従来の赤血球凝集試験と比べて感度は数百倍以上高く、迅速かつリアルタイムなインフルエンザウィルスの高感度特異的検出を可能にした。【０１１８】
２０１６年１月１９日に出願された日本国特許出願２０１６−００８０８４の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
また、この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。【０１１９】
＜符号の説明＞
１０  バイオセンサ用デバイス、１０ａ  プローブ固定電極部、１２  電極（導電層）、１３  ゲート電極部、１４  中間層、１５  ゲート電極、１６  オリゴ糖、２０  バイオセンサ、２２Ｓ  ソース、２４Ｄ  ドレイン、２８  ゲート絶縁膜、３２  シリコン基板、４７  ゲート絶縁膜
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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