(57)【要約】5'-AACACUG-3' をシード配列として含むmiRNA、および 5'-AAUACUG-3' をシード配列として含むmiRNAの両者を阻害することにより、インビボにおける腫瘍増殖が有意に抑制されることを見出した。この阻害は、腫瘍細胞のサブポピュレーションの比率を有意に変化させると共に、いずれのサブポピュレーションにおいても造腫瘍活性を低下させた。またこの阻害は、既に形成された腫瘍に対しても顕著な縮小効果を発揮した。本発明は、腫瘍に対する新たな治療可能性を提供するものである。
2017057312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAの両者を阻害することを特徴とする、腫瘍を抑制する方法。
【請求項２】
腫瘍の抑制が、該腫瘍の細胞集団中の造腫瘍活性が高い細胞群による腫瘍形成の抑制、および造腫瘍活性が低い細胞群からの造腫瘍活性が高い細胞への移行の抑制の両方を達成するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくともmiR-200cおよびmiR-141を阻害することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
当該miRNAのシード配列に結合する核酸またはその類縁体を用いて阻害する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
腫瘍がカルシノーマである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
腫瘍が大腸癌、肺癌、または乳癌である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該阻害により該腫瘍の上皮間葉転換が促進される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAを、単独または組み合わせにおいて阻害する１つまたは複数のmiRNA阻害剤を投与して腫瘍を抑制するための剤の製造における、該阻害剤の使用。
【請求項９】
該腫瘍の抑制において少なくともmiR-200cおよびmiR-141が阻害される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
該miRNA阻害剤が、miRNAのシード配列に結合する核酸またはその類縁体を含む、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに結合する第１のmiRNA結合配列、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに結合する第２のmiRNA結合配列を単独または組み合わせにおいて含むmiRNA阻害剤、および薬学的に許容される担体を含有する腫瘍抑制剤。
【請求項１２】
該miRNA阻害剤がTuDである、請求項１１に記載の腫瘍抑制剤。
【請求項１３】
5'-CAGUGUU-3' を含むmiRNA結合配列、および 5'-CAGUAUU-3' を含むmiRNA結合配列を、単独または組み合わせにおいて含む１または複数のTuD分子、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１４】
TuDが該２つのmiRNA結合配列を単一分子内に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
TuDが合成TuD（S-TuD）である、請求項１３または１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、miRNAの阻害により腫瘍を抑制する方法、およびそのために用いられるmiRNA阻害剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
個体中の癌やこれから樹立した細胞株において、癌細胞は幾つかの異なる表現型の状態で存在しており、そのような状態の幾つかが癌開始細胞の形質を反映していると考えられている（Gupta et al, Cell 146: 633-644, 2011; Al-Hajj et al, PNAS 100: 3983-3988, 2003）。ある表現型の状態にある精製された癌細胞分画は、長期培養の後、平衡な比率に向けて表現型が戻って行くが、それらをモジュレートする鍵となる調節因子はほとんど解明されていない。また、癌開始細胞の比率に特異的に影響する鍵となる調節因子の同定や、それらの機能解析、その調節因子の活性をモジュレートする方法はまだ確立していない。【０００３】
ところで、マイクロRNA（miRNA）は、細胞型特異的な遺伝子調節ネットワークを形成することにより、発生を含む多くの生物学的システムにおいて重要な役割を果たしており、miRNAを阻害する種々の阻害剤が開発されている（WO2010/047216）。例えば、マイクロRNA-200（miR-200）を含む細胞外小胞は乳癌細胞の肺転移を促進することが報告されている（Le M.T. et al., J Clin Invest. 2014, 124(12):5109-28）。しかしながら、miRNAの抑制により腫瘍の増殖を抑制できることは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO2010/047216
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Gupta et al, Cell 146: 633-644, 2011
【非特許文献２】Al-Hajj et al, PNAS 100: 3983-3988, 2003
【非特許文献３】Le M.T. et al., J Clin Invest. 2014, 124(12):5109-28
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、miRNAを阻害することを特徴とする、腫瘍を抑制する方法、特に、インビボにおける腫瘍の増殖を効果的に抑制する方法を提供する。また本発明は、当該方法に有用なmiRNA阻害剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、まず腫瘍細胞の形質変化に対するmiRNAの効果をより詳細に解析するため、特定のmiRNAの活性を長期間にわたって、また、厳密に調節可能な様式で阻害する方法を開発した。そのために、標的miRNAに対する特異的で強力なインヒビターであるTuD（Tough Decoy）RNAに関してテトラサイクリン誘導性発現システムを組み合わせ、このシステムを適用してヒト大腸癌細胞株におけるmiR-200cおよびmiR-141の発現をTuDの発現により同時に抑制したところ、上皮間葉転換（EMT）の誘導を含む癌細胞のサブポピュレーションの顕著な変化が誘導されることが判明した。【０００８】
miR-200ファミリーの阻害が腫瘍細胞に及ぼす影響をさらに調べるために、ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞を用いてさらに解析を行った。トリプルネガティブ乳癌細胞の細胞集団に含まれる特定のサブポピュレーションを細胞表面マーカーを基に同定すると共に、それらの細胞がサブポピュレーション間を相互変換する様式を観察したところ、意外なことに、上皮形質を持ったサブポピュレーションが、有意に高い造腫瘍活性を示すことを見出した。【０００９】
さらにこれらの腫瘍細胞においてmiR-200ファミリーの複数のメンバーを同時に阻害すると、造腫瘍活性は有意に低下することが判明した。また、ESA(-) の腫瘍細胞のサブポピュレーションにおいてmiR-200ファミリーメンバーの複数を同時阻害すると、もともと低かった造腫瘍活性は全く観察されなくなることが示された。【００１０】
これらの結果は、miR-200ファミリーメンバーは造腫瘍活性、特に原発巣における原発腫瘍の増殖に深く関与しており、miR-200ファミリーメンバーを有効に阻害することによって、極めて効率的に造腫瘍活性を低下させることが可能であることを示している。従来、腫瘍細胞の中でも、より未分化な状態に近い間葉系（mesenchymal）の表現型を持つ細胞の方が造腫瘍活性は高いと考えられてきた。しかし本発明は、上皮系（epithelial）の表現型を持つ細胞が造腫瘍活性に強く貢献することを明らかにし、また、腫瘍におけるEMTを促進するmiR-200ファミリーメンバーを阻害して腫瘍細胞のポピュレーションの平衡を上皮系から間葉系に傾けることによって腫瘍増殖を抑制できることを実証した。すなわち本発明は、miR-200ファミリーメンバーの阻害を通して原発性腫瘍の腫瘍増殖を効果的に抑制し、また既に形成された腫瘍の縮退をも実現できることを初めて実証するものである。特に本発明により、癌幹細胞を標的として腫瘍を抑制するだけではなく、非癌幹細胞から癌幹細胞が生じるのを防ぐことを一括して行うことが可能となる。【００１１】
以上の通り本発明は、miRNAを阻害することを特徴とする腫瘍を抑制する方法、および腫瘍抑制のためのmiRNA阻害剤等に関し、より具体的には、以下の発明に関する。
〔１〕  5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAの両者を阻害することを特徴とする、腫瘍を抑制する方法。
〔２〕  腫瘍の抑制が、該腫瘍の細胞集団中の造腫瘍活性が高い細胞群による腫瘍形成の抑制、および造腫瘍活性が低い細胞群からの造腫瘍活性が高い細胞への移行の抑制の両方を達成するものである、〔１〕に記載の方法。
〔３〕  少なくともmiR-200cおよびmiR-141を阻害することを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕  当該miRNAのシード配列に結合する核酸またはその類縁体を用いて阻害する、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕  腫瘍がカルシノーマである、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕  腫瘍が大腸癌、肺癌、または乳癌である、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕  該阻害により該腫瘍の上皮間葉転換が促進される、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕  5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAを、単独または組み合わせにおいて阻害する１つまたは複数のmiRNA阻害剤を投与して腫瘍を抑制するための剤の製造における、該阻害剤の使用。
〔９〕  該腫瘍の抑制において少なくともmiR-200cおよびmiR-141が阻害される、〔８〕に記載の使用。
〔１０〕  該miRNA阻害剤が、miRNAのシード配列に結合する核酸またはその類縁体を含む、〔８〕または〔９〕に記載の使用。
〔１１〕  5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに結合する第１のmiRNA結合配列、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに結合する第２のmiRNA結合配列を単独または組み合わせにおいて含むmiRNA阻害剤、および薬学的に許容される担体を含有する腫瘍抑制剤。
〔１２〕  該miRNA阻害剤がTuDである、〔１１〕に記載の腫瘍抑制剤。
〔１３〕  5'-CAGUGUU-3' を含むmiRNA結合配列、および 5'-CAGUAUU-3' を含むmiRNA結合配列を、単独または組み合わせにおいて含む１または複数のTuD分子、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
〔１４〕  TuDが該２つのmiRNA結合配列を単一分子内に含む、〔１３〕に記載の組成物。
〔１５〕  TuDが合成TuD（S-TuD）である、〔１３〕または〔１４〕に記載の組成物。【００１２】
なお上記の各項において、同一の項を引用する各項に記載の発明の２つまたはそれ以上を任意に組み合わせた発明は、それらに引用される上位の項に記載の発明において、既に意図されている。また、本明細書に記載した任意の発明要素およびその任意の組み合わせは、本明細書において意図されている。また、それらの発明において、本明細書に記載の任意の要素またはその任意の組み合わせを除外した発明も、本明細書に意図されている。また本明細書は、明細書中に例えば好ましいとしてある特定の態様を記載した場合、それを開示するのみならず、その態様を含むより上位の本明細書に開示された発明から、その態様を除外した発明も開示するものである。【００１３】
本発明の腫瘍抑制において、miR-141が属するmiR-200のサブファミリー およびmiR-200cが属するmiR-200のサブファミリーの2つのサブファミリーを同時に阻害することは極めて効率的に作用した（図４A, B）。レポーターアッセイにより、miR-141 およびmiR-200cを同時に阻害できるハイブリッド型のTuD分子 TuD-141/200c は、標的miRNAの活性を完全に阻害したことが示された（図４A, B）。TuD-200cレンチウイルスベクターをSUM149PT細胞株で用いた解析では、TuD-141/200c と比べてEMT誘導能の明確な低下が示されたことから（図１３, ２３）、miR-200の2つのサブファミリーの同時阻害による幅広い標的遺伝子の制御が本発明の腫瘍抑制の効果を発揮させるために本質的な貢献を果たすことが示唆される。【００１４】
実施例に例示したmiRNAインヒビターの誘導系は、インビボの幾つかの系に対しても適用し得る。例えば、動物疾患モデルにおいて、特定のmiRNAの抑制が治療可能性を有するのか否かを試験することができる。Dox処理の期間をスクリーニングすることによって、そのmiRNAの阻害開始の適切なタイミングや、必要な阻害期間を評価することができる。動物疾患モデルにおいてTuD発現ベクターを用いてそのような概念実証が得られれば、S-TuDなどのmiRNAインヒビターの投与期間や投与量に関する治療戦略は容易に設計することが可能である。【００１５】
また本発明は、乳癌細胞を用いて上記と同様にmiRNAを阻害してEMTの誘導を確認すると共に、造腫瘍活性（tumorigenicity）およびインビボにおける腫瘍の増殖に対するmiRNA阻害の効果を検証した。乳癌などの腫瘍細胞は異なる表現型の特徴を持つ複数のサブポピュレーションが含まれている。実施例において本発明者らは、腫瘍細胞のESA（epithelial specific antigen）(+) 画分において増強するmiR-200ファミリーメンバーの発現レベルは、上皮細胞形質の主要な決定要因であることを証明した。ESA(+) またはESA(-) 画分のいずれかにおいてmiR-200ファミリーを抑制すると、 ESA(+) 画分においては強い造腫瘍活性は劇的に低下し、ESA(-) 画分においても、おそらくインビボにおいてESA(-)からESA(+)に確率論的に変換した細胞に由来すると推定される、ESA(-) 画分が持つ僅かな造腫瘍活性は完全に抑制された。さらに、ESA(+) 画分の異種移植により形成させた腫瘍は、異種移植片においてmiR-200ファミリーメンバーのインヒビターにより有意に縮小した。これらの結果は、腫瘍細胞における上皮形質が癌開始細胞（cancer initiating cells）の本質的な特性であり、miR-200ファミリーの活性を抑制することで間葉様の表現型に固定して細胞の可塑性を喪失させることが、治療的価値を有することを示している。【００１６】
実施例２に示した通り、上皮細胞形質を持つESA(+) サブポピュレーションは高い造腫瘍活性を持ち（図１１−２B）、これらのESA(+)サブポピュレーションにおいてmiR-200ファミリーの活性を安定に抑制することは、複数のパラメーターで判断する限りEMTを誘導し（図１３）、また、マウス異種移植モデルにおいて腫瘍の進行を強力に抑制し、さらに、形成した腫瘍でさえ縮小させた（図１８）。一方で、間葉細胞様の形質を持つESA(-)サブポピュレーションは、同じマウス異種移植モデルにおいて僅かな造腫瘍活性しか持たず（図１１−２B）、これらのサブポピュレーションにおける miR-200c および -141の外来的な発現は、上皮と間質の中間的な性質を持つ細胞をも含むMET様のプロセスを誘導し（図１５、１６）、造腫瘍活性を有意に増強させた（図１７）。【００１７】
このように本発明は、miR-200 ファミリーの活性を阻害することで腫瘍抑制が引き起こされることを初めて実証した。図２３に示されている通り、miR-200c または miR-141だけを抑制してもESA(+) からESA(-)細胞への転換は十分には誘導されず、十分な転換には、両者を阻害することが必要であった。すなわち本発明は、2種のmiRNAを阻害することにより、効果的な腫瘍抑制を達成できることを初めて示すものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、miRNA阻害による新たな腫瘍抑制方法が提供された。本発明の方法により、造腫瘍活性の有意な低下が誘導され、インビボにおける腫瘍増殖の抑制が達成される。本発明は、従来では治療が困難であった腫瘍に対して有望な治療手段となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】TuDの基本構造の一例を模式的に表す図である。なお、IおよびIIの塩基対の数は図示されている縦線の数に限定されるものではない。また、IおよびIIは完全な二本鎖でなくても、ギャップ等の塩基対を形成していない塩基が存在していてもよい。また、aおよびbは完全な一本鎖に限定されず、部分的に二本鎖を形成していてもよい。
【図２】Tet誘導性TuD RNA発現系。（A） Tet誘導性TuD RNA発現レンチウイルスベクターpLSB-Tete7SK-TuDのプロウイルスの構造。（B） pLSB-Tete7SK-TuD-200cによる miR-200c阻害活性のドキシサイクリン用量依存性。 HCT116-TetON III細胞にpLSB-Tete7SK-TuD-200c またはpLSB-Tete7SK-TuD-NC（ネガティブコントロール）を導入し、ブラストサイジンで選択した。これらの細胞にデュアルルシフェラーゼレポーターベクター T200c およびUT（図５）をトランスフェクションし、幾つかの用量のDox存在下で増殖させた。トランスフェクションの48時間後にデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した。miR-200c-RL/FLのUT-RL/FLに対する発現の比を平均±SD（n = 3）で表した。
【図３−１】pLSB-Tete7SK-TuD-141/200cにより誘導されるEMT。（A） miR-200 ファミリーのメンバーを同時に阻害するハイブリッドTuD RNAである TuD-141/200cの配列および構造。下の部分にmiR-200 ファミリーのメンバーの配列およびそれらのシード配列（四角の囲み）を示した。 （B） pLSB-Tete7SK-TuD-141/200c またはpLSB-Tete7SK-TuD-NCをHCT116-TetOn III細胞に導入し、Doxの非存在下（Dox-）または存在下（Dox+）で増殖させ続けた。Day 18に、Dox+で培養していた細胞の一部をDox-の条件に変えて培養を続けた（Dox+/-）。図示した時間にESA 発現プロフィールをFACS で解析した（B）。
【図３−２】図３−１の続き。（C） pLSB-Tete7SK-TuD-141/200c またはpLSB-Tete7SK-TuD-NCをHCT116-TetOn III細胞に導入し、Doxの非存在下（Dox-）または存在下（Dox+）で増殖させ続けた。Day 18に、Dox+の培養の半数からDoxを除去して増殖させ続けた（Dox+/-）。図示した時間に細胞形態を位相差顕微鏡で観察した。バーは100μmを示す。
【図４】内在性miR-200c（A）またはmiR-141（B）の活性のタイムコース解析。 図３−１Bで用いた並行培養に、図示した時間の48時間前にデュアルルシフェラーゼレポーターをトランスフェクションした。 miR-200c-RL/FL のUT-RL/FL に対する発現の比、またはmiR-141-RL/FL のUT-RL/FLに対する発現の比を平均±SD（(n = 3）で表した。矢印はDoxを除去した時点を示す。
【図５】TuD-200cおよびTuD-141/200cが miR-200c および miR-141に及ぼす影響。Tete7SK-TuD-200c発現レンチウイルスベクターおよびTete7SK-TuD-141/200c発現レンチウイルスベクターをHCT116-TetOnIII細胞に導入し、薬剤選択を行い、それぞれHCT116-TetOn-TuD-200c、HCT116-TetOn-TuD-141/200cと名付けた。これらの細胞をDox+で30日以上培養した。レポータープラスミドをトランスフェクションして２日後にルシフェラーゼ活性を測定することにより、miR-200c およびmiR-141 の両方の活性を決定した。
【図６】本実験で用いたルシフェラーゼレポーターの構造。 デュアルルシフェラーゼレポータープラスミド psiCHECK2-UT (A)、psiCHECK2-T21 (B)、psiCHECK2-T200c (C)、および psiCHECK2-T141 (D) の構造。psiCHECK2-T21、-T200c、および -T141 は、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の直下に、それぞれ成熟 miR-21 (22bp)、miR-200c (23bp)、およびmiR-141 (23bp) と完全に相補的な挿入配列を持つ。
【図７】TuD RNA発現に対するpolIII プロモーターの比較。（A）h7SK およびe7SK プロモーターの配列。TATAボックス、オクタマーモチーフ、PSEおよびCACCCボックスの位置が示されている。e7SK プロモーターの改変した配列は太字で示されている。e7SK プロモーターの２つの矢印は、改変により生成させたオクタマーモチーフの逆転リピートを示す。（B）polIII プロモーターにより駆動されるTuD RNA 発現ベクターによる miRNA阻害活性。HCT116細胞にルシフェラーゼレポーターベクターおよびTuD RNA発現ベクターを幾つかの用量でトランスフェクションした。デュアルルシフェラーゼアッセイをトランスフェクションの48時間後に実施した。miR-21-RL/FL のUT-RL/FLに対する発現の比を平均±SD（n = 3）で表した。
【図８】本実験で構築し、試験したTet誘導性polIIIプロモーター。（A） 元となった親e7SK プロモーターおよびO2-型のテトラサイクリンオペレーターの挿入を持つ派生体の模式図。矢印は転写開始部位を示す。（B） HCT116-TetOn III 細胞に、ルシフェラーゼレポーターおよび（A）に示されているプロモーターにより駆動される各TuD RNA発現ベクターをトランスフェクションし、ドキシサイクリンの存在下または非存在下で増殖させ続けた。トランスフェクションの48時間後に、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施した。miR-21-RL/FL のUT-RL/FL に対する比は平均±SD（n = 3）で発現レベルとして表した。
【図９】HCT116-TetOn-TuD-141/200c 細胞およびHCT116-TetOn-TuD-NC細胞におけるESA 発現プロフィールのFACS解析。Dox-、Dox+、およびDox+/- 培養は図３−１Bの説明文に記載されているように調製した。黒線および灰色線はそれぞれ HCT-116-TetOn-TuD-141/200c 細胞およびHCT-116-TetOn-TuD-NC 細胞のESA 発現プロフィールを表す。
【図１０−１】SUM149PT 細胞の４つのサブポピュレーションESA(+)/CD24(+), ESA(+)/CD24(-), ESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-)の分離。(A) 親SUM149PTで見いだされたESA(-)細胞をFACSでソートし増殖させ続けた。ESA/CD24 または ESA/CD49fの発現プロフィールを、ソートからそれぞれ28 または 15日後にFACSで解析した。(B) ESA(+)/CD24(+), ESA(+)/CD24(-), ESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) 細胞の細胞形態。バーは100μmを示す。
【図１０−２】図１０−１の続き。 (C) 単一細胞ソーティングの1 または 2箇月後に、各サブポピュレーションに由来する細胞クローンのESA/CD24発現プロフィールをFACSで解析した。
【図１１−１】SUM149PT細胞の４つのサブポピュレーションの造腫瘍活性。(A) 1回または連続4回のFACSソーティング後、18-19日間増殖させた各サブポピュレーションのESA/CD24の発現プロフィール。
【図１１−２】図１１−１の続き。図１０−１A（下パネル）に示したのと類似した混合培養から各サブポピュレーションをソートした直後に、30000 細胞 (B) および300細胞 (C) をマウス乳腺に注入した。腫瘍体積を測定し、平均+SD（n=5）で表し、Tukey のポストホックテストを用いたtwo-way ANOVA により解析した（*P < 0.05; **P < 0.01）。
【図１２】４つのサブポピュレーション中で観察されたmiR-200c, -141 および -205の発現パターンの分布。(A) ESA(+)/CD24(+), ESA(+)/CD24(-), ESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) 細胞にデュアルルシフェラーゼレポーターをトランスフェクションし、48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。 (B, C および D) ESA(+)/CD24(+), ESA(+)/CD24(-), ESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) 細胞にTuD RNAまたはmiRNAの発現ユニットを搭載するレンチウイルスベクターを導入して薬剤選択した。これらの安定な導入細胞にデュアルルシフェラーゼレポーターをトランスフェクションし、48時間培養してルシフェラーゼアッセイを実施した。miR-200c-RL/FL のUT-RL/FL に対する発現の比 (A および B)、miR-141-RL/FL のUT-RL/FL に対する発現の比 (A および C) または miR-205-RL/FL の UT-RL/FL に対する発現の比 (A および D) を平均±SD（n = 3）で表した。データはStudent's t testで分析した（**P < 0.01; ***P < 0.001）。
【図１３】ESA/CD24の発現プロフィールに及ぼすTuD-141/200c または miR-141+miR-200cベクター導入の効果。図１０−１A（下パネル）で用いた細胞の並行培養にTuD-141/200c または miR-141+miR-200cベクターを導入した。導入の2日後に、これらの導入細胞からESA(+)/CD24(+), ESA(+)/CD24(-), ESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) 画分をFACSでソートし、18日間培養した。これらの細胞におけるESA/CD24の発現プロフィールをFACSで解析した。
【図１４】空ベクター、TuD-141/200c および miR-141/200cベクターを導入した各サブポピュレーションにおける腫瘍様塊形成活性。(A) 各導入細胞からソートした単一細胞による腫瘍様塊の形成効率。球状（マンモスフェア腫瘍様塊）、シート状、および中間型のコロニーを別々にカウントし、コロニー形成効率（％）を平均±SD（n = 3）で表した。 (B) 球状、シート状、および中間型のコロニーの形態。バーは100μmを示す。
【図１５−１】miR-200 ファミリーメンバーの標的および転写リプレッサーの標的、Zeb1 および Zeb2の発現レベルに及ぼすmiR-200c/141活性の外来的モジュレーションの効果。 (A) miR-200 ファミリーメンバーの直接の標的であるZeb1 および Zeb2、ESRP1およびESRP2 mRNAの発現レベルをリアルタイムRT-PCRにより決定した。標準化した発現レベルは、空ベクターを導入したESA(+)/CD24(+) 細胞を1.0として、平均±SD（n = 3）で表した。
【図１５−２】図１５−１の続き。 (B) pri-miR-200c/141転写産物およびすべてのタイプのCD44 (pan-CD44), CD44v8-10 および 標準タイプのCD44 (CD44s) mRNA の発現レベル。 GAPDH mRNA を内部標準として用いた。 pri-miR-200c/141用のPCRプライマーは成熟miR-200c および miR-141は検出しない。標準化した発現レベルは、空ベクターを導入したESA(+)/CD24(+) 細胞を1.0として、平均±SD（n = 3）で表した。
【図１６】miR-200c/141活性の外来的モジュレーションが及ぼすEMTの幾つかのマーカーのmRNAレベルに対する効果。ESA, CDH1, および CDH3 (上皮マーカー), Vimentin, CDH2（間葉マーカー）, Twist, Snail および Slug （間葉特異的転写因子）の発現レベルをリアルタイムPCRで決定した。GAPDH を内部標準として用いた。相対発現レベルを、空ベクターを導入したESA(+)/CD24(+) 細胞を1.0として、平均±SD（n = 3）で表した。
【図１７】４つのサブポピュレーションの造腫瘍活性に対するTuD-141/200c および miR-141+miR-200cベクターの効果。30000 または 300 の導入細胞を乳腺脂肪体（mammary fat pads）に注入した。腫瘍体積を測定して平均+SD（n = 5）で表し、Tukey のポストホックテストを用いたtwo-way ANOVA により分析した（*P < 0.05; **P < 0.01）。
【図１８】SUM149PT異種移植片におけるTuD-141/200c発現の誘導による腫瘍の縮小。SUM149PT-TetOn-TuD-141/200c または SUM149PT-TetOn-Empty (500,000 細胞) を図２５に示した通りに調製し、乳腺脂肪体（mammary fat pads）に注入した。 Dox(+)マウスには、移植の25日後から、2 mg/ml doxycycline および 5% ショ糖を含む水を与えた。腫瘍体積を測定し、平均+SD（n = 5）で表し、Tukey のポストホックテストを用いたtwo-way ANOVA により分析した（**P < 0.01）。
【図１９】４つのサブポピュレーションそれぞれから単離した２つの単一コロニーのESA/CD24の発現プロフィール。図１０−２(C) のそれぞれの細胞コロニーをFACSにより調製し、単一細胞ソーティングから１箇月後に発現プロフィールを解析した。
【図２０】４回の連続ソーティングにより精製したESA(+)/CD24(+), ESA(+)/CD24(-), ESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) 細胞による腫瘍形成。各サブポピュレーションからの30000 (A) または 300 (B) の細胞を乳腺脂肪体に注入した。腫瘍体積を測定して平均+SD（n = 4）で表し、Tukey のポストホックテストを用いたtwo-way ANOVA により分析した（*P < 0.05; **P < 0.01）。
【図２１】miRNAマイクロアレイ解析により決定した４つのサブポピュレーションにおけるmiR-200ファミリーメンバーの発現レベル。発現レベルは相対単位で示した。
【図２２】本実験で用いたルシフェラーゼレポーターの構造。デュアルルシフェラーゼレポータープラスミド psiCHECK2-UT (A), psiCHECK2-T141 (B), およびpsiCHECK2-T200c (C) の構造。psiCHECK2-T141 および -T200c は、Renilla ルシフェラーゼ遺伝子の直後にそれぞれ成熟 miR-141 (23bp) および miR-200c (23bp) と完全に相補的な挿入配列を持つ (D)。
【図２３】ESA/CD24の発現プロフィールに及ぼすmiR-200c および miR-141 の活性制御の効果。 (A および B) 図１０−１A（下パネル）で用いた細胞の並行培養にTuD-200c, TuD-141, miR-200c または miR-141 発現レンチウイルスベクターを導入した。導入の２日後に、ESA(+)/CD24(+), ESA(+)/CD24(-), ESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-)のサブポピュレーションをFACSでソートし、27日間培養し、その後、ESA/CD24の発現プロフィールをFACSで解析した。
【図２４】各サブポピュレーションおよびその導入細胞の増殖能。(A) ソートしていない親SUM149PT、そのESA(+)/CD24(+), ESA(+)/CD24(-), ESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) サブポピュレーションの細胞数をCellTiterGlo アッセイでモニターし、ソートしていないSUM149PT細胞のday 0におけるそれで標準化して平均±SD（n = 3）で表した。 (B) TuD-141/200c または miR-141+miR-200c レンチウイルスベクターを導入したESA(+)/CD24(+), ESA(+)/CD24(-), ESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) 細胞をCellTiterGlo アッセイでモニターし、空レンチウイルスベクターを導入した細胞のday 0におけるそれで標準化して平均±SD（n = 3）で表した。
【図２５】Tet誘導型TuD-141/200cカセットを保持するESA(+)細胞であるSUM149PT-TetOn-TuD-141/200c細胞の調製 (A) および特性解析 (B) 。(A) SUM149PT-TetOn-TuD-141/200c細胞の調製の図式。pXL001を保持するSUM149PT 細胞にpLSB-Tete7SK-TuD-141/200c または pLSB-Emptyのいずれかを導入し、blasticidinで選択した。 (A) 前記の導入細胞のESA(+)画分をDox 存在下で13日間維持し、ESA(-)画分をソートし、その後、Dox非存在下で15日間増殖させ続けた。この培養からESA(+)画分をソートし、Dox非存在下で増殖させた。Dox処理に高い感受性で応答するこの細胞画分SUM149pT-TetOn-TuD-141/200cをマウスに注入した。(B) pLSB-Empty を導入した細胞をソートし、ESA(+) 細胞を39日間増殖させ続けた。この培養、SUM149pT-TetOn-Empty、をマウスに注入した。(C) 図１８に示したマイクロインジェクションで用いたSUM149PT-TetOn-TuD-141/200c細胞の並行培養をDox(-) または Dox(+) のいずれかの条件下で32日間インビトロで培養し、ESA/CD24の発現プロフィールをFACSで解析した。 (D) もう一つの並行培養をDox(-) または Dox(+) のいずれかの条件下でインビトロで培養し、図示した時間の48時間前にデュアルルシフェラーゼレポーターを導入した。miR-200c-RL/FL のUT-RL/FL に対する発現の比、およびmiR-141-RL/FL のUT-RL/FLに対する発現の比を平均±SD（n = 3）で表した。
【図２６】非小細胞肺がん細胞株におけるESA/CD44の発現プロフィールに及ぼすTuD-141/200c または TuD-NC(コントロール)ベクター導入の効果。非小細胞肺がん細胞株H596細胞、A-427細胞、HCC827細胞にTuD-141/200c またはTuD-NCベクターを導入した。導入から2週間以上経過後に、これらの細胞におけるESA/CD44の発現プロフィールをFACSまたはMACSで解析した。
【図２７】TuD-NC(コントロール)ベクター、TuD-141/200cベクターを導入した非小細胞肺がん細胞株A-427における腫瘍様塊形成活性。ウイルス導入A-427細胞からソートした単一細胞による腫瘍様塊の形成効率。球状のスフェア腫瘍様塊をカウントし、コロニー形成効率（％）を平均±SD（n =3）で表した。
【図２８】TuD-NC(コントロール)ベクター、TuD-141/200cベクターを導入した非小細胞肺がん細胞株H596における造腫瘍活性。10000000 の導入細胞を右腹側部に注入した。腫瘍体積を測定して平均+SD（n = 5）で表し、Tukeyのポストホックテストを用いたtwo-way ANOVA により分析した（**P < 0.01）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAの両者を阻害することを特徴とする、腫瘍を抑制する方法に関する。ここで腫瘍の抑制とは、腫瘍細胞の造腫瘍活性（tumorigenicity）の抑制、腫瘍の形成もしくは増殖の抑制、または腫瘍の縮退のいずれであってよい。これらは、例えば腫瘍細胞を個体に注入した場合のインビボにおける腫瘍塊形成（例えばその頻度）や、その大きさ、または成長速度などを指標として測定することができる。
【００２１】
また本発明による腫瘍抑制は、癌幹細胞を標的とするだけではなく、非癌幹細胞から癌幹細胞が生じるのを防ぐことを一括して行えることにも特徴がある。すなわち本発明における腫瘍の抑制には、(i) 癌幹細胞の腫瘍形成を抑制すること、(ii) 非癌幹細胞から癌幹細胞が生じることを抑制すること、の両方を達成することが含まれる。具体的には、本発明による腫瘍抑制は、腫瘍の細胞集団の中でも、造腫瘍活性が相対的に上昇したサブポピュレーション（亜集団）による腫瘍形成を抑制するだけでなく、造腫瘍活性が相対的に上昇したサブポピュレーションに属する細胞を、造腫瘍活性が相対的に低いサブポピュレーションの細胞に変換する作用も発揮し、また、造腫瘍活性が相対的に低いサブポピュレーションに属する細胞が、造腫瘍活性が相対的に上昇した細胞に変換することを抑制する。これにより、本発明の腫瘍抑制は、既に生じた造腫瘍活性が高い癌細胞（例えば癌幹細胞）に対して、その造腫瘍活性を抑制するのみならず、それらの癌細胞を、より造腫瘍活性の低い癌細胞（非癌幹細胞）に変換し、また造腫瘍活性の低い癌細胞から造腫瘍活性が高い癌細胞へと変換することも抑制できる。このように、癌幹細胞を標的とするだけではなく、非癌幹細胞から癌幹細胞が生じるのを防ぐことを一括して行うことが可能な本発明の腫瘍抑制は、臨床適用において極めて高い有用性を持っている。また癌の発症前後の初期ステージにおいては、本発明の腫瘍抑制により予防的に腫瘍形成を抑制することも期待できる。すなわち本発明において「腫瘍の抑制」は、その好ましい態様において、該腫瘍の抑制が、腫瘍の細胞集団において造腫瘍活性が上昇した腫瘍細胞サブポピュレーションの腫瘍形成の抑制、および該造腫瘍活性が上昇した腫瘍細胞サブポピュレーションの生成の抑制の両方が達成される抑制である。
【００２２】
腫瘍の細胞集団のサブポピュレーションへの分画は、所望のマーカー等を用いて行うことができる。例えば、上皮マーカーを指標にサブポピュレーションに分画することができる。上皮マーカーとしては、例えばESA（epithelial specific antigen）, CDH1（Cadherin-1）, CDH3（Cadherin-3）, および ESRP1（epithelial splicing regulatory protein 1）等から任意に選択してよく、より好ましくはESAが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これらのマーカーを組み合わせて用いてもよい。上皮マーカー陽性のサブポピュレーションが陰性のサブポピュレーションよりも造腫瘍活性が相対的に高い場合は、当該陽性のサブポピュレーションは造腫瘍活性が相対的に上昇したサブポピュレーション（造腫瘍活性が高い細胞群）であり、当該陰性のサブポピュレーションは、造腫瘍活性が相対的に低いサブポピュレーション（造腫瘍活性が低い細胞群）である。
【００２３】
またシード配列とは、miRNAの5'末端から数えて2番目から8番目の塩基の配列を言う。5'-AACACUG-3' をシード配列として含むmiRNAとしては、miR-200a（5'-UAACACUGUCUGGUAACGAUGU-3'、配列番号：1）およびmiR-141（5'-UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG-3'、配列番号：2）が含まれる。また5'-AAUACUG-3' をシード配列として含むmiRNAとしては、miR-200b（5'-UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA-3'、配列番号：3）、miR-200c（5'-UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA-3'、配列番号：4）、およびmiR-429（5'-UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3'、配列番号：5）が含まれる。
【００２４】
実施例１−３に示す通り、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含むmiR-200cに対する阻害剤のみで阻害しても、5'-AACACUG-3' をシード配列として含むmiR-141の活性はほとんど抑えることはできない（図５）。これは、両者のシード配列に存在する１塩基の違いにより、一方のmiRNAに対する阻害剤は他方のmiRNAを有効に阻害することはできないことを示している。本発明は、それぞれのmiRNAを阻害する2種のmiRNAを組み合わせることによって、本発明において示された顕著な抗腫瘍活性を発揮させることが可能となることを見出した。
【００２５】
上記の本発明の方法は、好ましくは、少なくともmiR-200cおよびmiR-141を阻害する。阻害した細胞における各miRNAの活性は、非阻害時の各miRNAの活性と比較して、例えば1/3以下、好ましくは、例えば1/4以下、1/5以下、1/6以下、1/7以下、1/8以下、または1/9以下である。より好ましくは、例えば10％以下、8％以下、5％以下、または3%以下である。より好ましくは、本発明の方法は、miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141 および miR-429 のすべてを阻害する。各miRNAの活性は、非阻害時の各miRNAの活性と比較して、例えば1/3以下、好ましくは、例えば1/4以下、1/5以下、1/6以下、1/7以下、1/8以下、または1/9以下である。より好ましくは、例えば10％以下、8％以下、5％以下、または3%以下である。好ましくは、本発明の方法は、miR-200ファミリーのすべてのメンバーを阻害する。活性の測定は、例えば実施例に示したレポーターアッセイにより実施することができる。
【００２６】
miRNAの阻害方法は特に限定されず、当業者に知られた方法を適宜用いてよい。例えば、当該miRNAのシード配列に結合する核酸またはその類縁体を用いて阻害することができる。そのような核酸またはその類縁体は、シード配列に相補的な配列を持っている。そのようなmiRNA阻害剤としては当業者に公知のものを適宜用いることができ、例えば antagomiR（Krutzfeldt, J. et al., 2005, Nature 438: 685-689）、miRNA target mimicry、および miRNA sponge（Chitwood, D.H. and Timmermans, M.C., 2007, Nat Genet 39: 935-936; Ebert, M.S. et al., 2007, Nat Methods 4: 721-726; Franco-Zorrilla, J.M. et al., 2007, Nat Genet 39: 1033-1037）、その他のデコイ、例えばTuD（WO2010/047216）等を用いることができる。
【００２７】
また、例えばmiRIDIAN（Thermo Scientific社）、miRCURY（Exiqon社）、miR-Zip（System Bioscience社）、およびmiRNA eraser（MBC, 2008 19(8), 3272-3282）等を用いることもできる。
【００２８】
また、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAの阻害と、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAの阻害は、それぞれ異なる阻害剤、あるいは１つの阻害剤で両者を阻害する場合であっても、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAを阻害する部位、および5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAを阻害する部位を別々に持ち、これらの２つの異なる阻害部位により阻害されることが好ましい。このようなmiRNA阻害剤を、本発明においては、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA（第1のmiRNA）、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA（第2のmiRNA）の両者を異なる阻害部位を用いて阻害すると呼ぶ。この場合、第1のmiRNAを阻害するmiRNA阻害剤の阻害部分は、第2のmiRNAを阻害するmiRNA阻害剤の阻害部分とは異なっている。具体的には、例えば第1のmiRNAを阻害するmiRNA阻害剤の阻害部分は、第1のmiRNAのシード配列と相補的な配列を含んでおり、第2のmiRNAを阻害するmiRNA阻害剤の阻害部分は、第2のmiRNAのシード配列と相補的な配列を含んでいる。そのような阻害の例としては、例えば、第1のmiRNAのシード配列と相補的な配列を含むmiRNA阻害剤分子と、第2のmiRNAのシード配列と相補的な配列を含むmiRNA阻害剤分子とを用いてmiRNA阻害を行うことが挙げられる。また別の例としては、実施例に示した通り、第1のmiRNAのシード配列と相補的な配列を含むmiRNA阻害部分と、第2のmiRNAのシード配列と相補的な配列を含むmiRNA阻害部分とを同一分子内に含むmiRNA阻害剤を用いてmiRNA阻害を行うことが挙げられる。
【００２９】
このように、２種以上のmiRNA阻害部位を有するmiRNA阻害剤であって、それぞれの部位が、miRNAの異なる部分を標的とするように（例えば異なるmiRNAを標的とするように）設計されているmiRNA阻害剤を、本発明においてハイブリッドmiRNA阻害剤と呼ぶ。本発明のmiRNA阻害剤は、好ましくは5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに対する阻害部位と、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに対する阻害部位とを有するハイブリッドmiRNA阻害剤である。
【００３０】
本発明において抑制の対象となる癌に特に制限はないが、例えばカルシノーマなど、上皮由来または上皮形質を少なくとも部分的に有する癌が好ましい。本発明において抑制の対象となる癌は、好ましくは上皮マーカーを発現する細胞のポピュレーションを少なくとも含む癌であり、より好ましくは、上皮マーカーを発現する細胞のポピュレーションを主要な細胞のポピュレーションとして含む癌（すなわちいずれの上皮マーカーも発現しない細胞のポピュレーションが半分未満である癌）である。上皮マーカーとしては、例えばESA（epithelial specific antigen）, CDH1（Cadherin-1）, CDH3（Cadherin-3）, および ESRP1（epithelial splicing regulatory protein 1）等から任意に選択してよく、より好ましくはESAが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、これらのマーカーを組み合わせて用いてもよい。このような癌は、いずれかの上皮マーカー（例えばESA）を発現する細胞（例えばESA+細胞）を、0.3％以上、好ましくは0.5％以上、1％以上、2％以上、3％以上、5％以上、7％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、または90％以上含む。本発明は、腫瘍細胞において上皮マーカー陽性細胞が含まれることを確認する工程を含む、癌の検査方法を提供する。また本発明において抑制の対象となる癌は、好ましくは5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAの両者を阻害することにより上皮間葉転換が促進および/または間葉上皮転換が抑制される。また本発明において抑制の対象となる癌は、好ましくは 5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAの両者を発現させることにより間葉上皮転換が促進および/または上皮間葉転換が抑制される。また好ましくは、本発明において抑制の対象となる癌は、miR-200cおよびmiR-141の阻害により上皮間葉転換が促進および/または間葉上皮転換が抑制される。また本発明において抑制の対象となる癌は、好ましくはmiR-200cおよびmiR-141の両者を発現させることにより間葉上皮転換が促進および/または上皮間葉転換が抑制される。
【００３１】
また必須ではないが、腫瘍抑制に先立って、腫瘍細胞において上皮マーカーを発現する細胞のポピュレーションを少なくとも含むことを確認してもよい。すなわち本発明の方法は、その一態様において、腫瘍抑制に先立って、腫瘍細胞において上皮マーカーを発現する細胞のポピュレーションを少なくとも含むことを確認する工程を含む方法が含まれる。例えば本発明の方法は、その一態様において、腫瘍抑制に先立って、腫瘍細胞において上皮マーカーを発現する細胞のポピュレーションを少なくとも含むことを確認する工程、および該促進されることが確認された腫瘍を抑制する方法が含まれる。また必須ではないが、腫瘍抑制に先立って、腫瘍細胞において当該miRNAの阻害により上皮間葉転換が促進されることを確認してもよい。すなわち本発明の方法は、その一態様において、腫瘍抑制に先立って、腫瘍細胞において当該miRNAの阻害により上皮間葉転換が促進されることを確認する工程を含む方法が含まれる。例えば本発明の方法は、その一態様において、腫瘍抑制に先立って、腫瘍細胞において当該miRNAの阻害により上皮間葉転換が促進されることを確認する工程、および該促進されることが確認された腫瘍を抑制する方法が含まれる。しかし本発明はそのような方法に限定されないことは言うまでもない。また本発明は、腫瘍細胞において当該miRNAの阻害により上皮間葉転換が促進されることを確認する工程を含む癌の検査方法を提供する。
【００３２】
また本発明において抑制の対象となる癌は、例えば上皮形質を有するサブポピュレーション（spE）と間葉形質を有するサブポピュレーション（spM）とを含む癌であってよい。このような癌は、例えば上皮マーカー陽性の細胞のサブポピュレーションと、上皮マーカー陰性（もしくは低発現）または間葉マーカー陽性の細胞のサブポピュレーションとを含む。好ましくは、本発明において抑制の対象となる癌は、上皮マーカーを発現する細胞のサブポピュレーションと上皮マーカー陰性もしくは低発現（または間葉マーカー陽性）細胞のサブポピュレーションとの両方を、それぞれ0.3％以上、好ましくは0.5％以上、1％以上、2％以上、3％以上、5％以上、7％以上、10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、または30％以上含む。サブポピュレーションの割合は、採取した癌細胞を直接、あるいは所望の培地中で癌細胞を培養して決定してよく、例えばDMEM培地やHam's F-12培地等を使用できる。適宜、5-10% ウシ胎児血清（FBS）等を加えてアッセイを行うことができる。また、腫瘍抑制に先立って、腫瘍細胞において上皮マーカーを発現する細胞のサブポピュレーションと上皮マーカー陰性もしくは低発現（または間葉マーカー陽性）細胞のサブポピュレーションとの割合を確認してもよいが、本発明はそのような発明に限定されない。
【００３３】
また、本発明において抑制の対象となる癌は、好ましくは上皮形質を有するサブポピュレーション（spE）に癌幹細胞を含む。癌幹細胞とは、本願実施例に記載の腫瘍様塊形成アッセイにおいて腫瘍様塊形成能を有する細胞、あるいは動物を用いた腫瘍形成実験において、腫瘍を形成する能力を有する細胞を言う。上皮形質を有するサブポピュレーション（spE）に属する癌幹細胞を、上皮形質性癌幹細胞または上皮性癌幹細胞と呼ぶ。癌幹細胞を含むことは、その細胞集団に造腫瘍性があることを確認すればよく、例えば腫瘍様塊の形成を実施例の記載にしたがってアッセイしたり、細胞をマウス等へ移植して腫瘍形成を試験したりすることで確認することができる。
【００３４】
腫瘍抑制に先立って、対象とする腫瘍が上皮形質性癌幹細胞を含むかを確認してもよい。すなわち本発明の方法は、その一態様において、腫瘍抑制に先立って、対象とする癌に上皮形質性癌幹細胞を含むことを確認する工程を含む方法が含まれる。例えば本発明の方法は、その一態様において、腫瘍抑制に先立って、対象とする癌に上皮形質性癌幹細胞を含むことを確認する工程、および該確認された癌を、本発明の上記方法に従って抑制する方法が含まれる。
【００３５】
また本発明において抑制の対象となる癌は、上皮形質を有するサブポピュレーション（spE）の造腫瘍性が、残りのポピュレーション（例えば間葉形質を有するサブポピュレーション；spM）や癌細胞全体の造腫瘍性よりも高い癌が好ましい。本明細書ではこのような癌を、上皮形質サブポピュレーション造腫瘍性腫瘍（spE造腫瘍性腫瘍）、または、上皮形質造腫瘍性腫瘍と称す。腫瘍形成性は、例えば腫瘍様塊の形成を実施例の記載にしたがってアッセイしたり、細胞をマウス等へ移植し、腫瘍形成の有無または腫瘍サイズを計測したりすることにより測定することができる。例えば腫瘍細胞から上皮形質を有するサブポピュレーション（spE）を分離する。残りのポピュレーション（例えば間葉形質を有するサブポピュレーション；spM）や癌細胞全体を対照群とし、同数の細胞で造腫瘍性のアッセイを実施する。spEの造腫瘍性の方が高い場合、その癌は上皮形質を有するサブポピュレーション（spE）の造腫瘍性が、残りのポピュレーションや癌細胞全体の造腫瘍性よりも高い上皮形質造腫瘍性腫瘍であると判断される。上皮形質を有するサブポピュレーションは、適宜上皮マーカーを用いて分離・同定することができ、上皮マーカーとしては、上述の通り、例えばESA, CDH1, CDH3, および ESRP1等から任意に選択することができる。また本発明は、腫瘍において、上皮形質を有するサブポピュレーション（spE）における造腫瘍性が上皮形質を有しないサブポピュレーションまたは癌細胞全体よりも高いことを確認する工程を含む、癌の検査方法および分類方法にも関する。
【００３６】
また本発明においては、腫瘍抑制に先立って、対象とする腫瘍において、上皮形質を有するサブポピュレーション（spE）の造腫瘍性が、残りのポピュレーション（例えば間葉形質を有するサブポピュレーション；spM）や癌細胞全体における造腫瘍性よりも高いことを確認してもよい。すなわち本発明の方法は、その一態様において、腫瘍抑制に先立って、対象とする腫瘍において、上皮形質を有するサブポピュレーション（spE）の造腫瘍性が、残りのポピュレーション（例えば間葉形質を有するサブポピュレーション；spM）や癌細胞全体の造腫瘍性よりも高いことを確認する工程を含む方法が含まれる。例えば本発明の方法は、その一態様において、腫瘍抑制に先立って、対象とする腫瘍が、上皮形質を有するサブポピュレーション（spE）の造腫瘍性が、残りのポピュレーション（例えば間葉形質を有するサブポピュレーション；spM）や癌細胞全体の造腫瘍性よりも高いことを確認する工程、および該高いことが確認された腫瘍を本発明の上記方法に従って抑制する方法が含まれる。
【００３７】
また本発明において抑制の対象となる癌は、好ましくは5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAの両者の発現が陽性の癌である（miR-200の二亜集団陽性腫瘍）。具体的には、このような癌は、miR-200aおよびmiR-141の少なくともいずれか１つ（より好ましくはmiR-141）、ならびに、miR-200b、miR-200cおよびmiR-429の少なくともいずれか１つ（より好ましくはmiR-200c）が少なくとも陽性の癌である。また本発明においては、腫瘍抑制に先立って、対象とする腫瘍が、miR-200の二亜集団陽性腫瘍であることを確認してもよい。すなわち本発明の方法は、その一態様において、腫瘍抑制に先立って、対象とする腫瘍が、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAの両者の発現が陽性であることを確認する工程を含む方法が含まれる。例えば本発明の方法は、その一態様において、腫瘍抑制に先立って、対象とする腫瘍が、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAの両者の発現が陽性であることを確認する工程、および該確認された腫瘍を本発明の上記方法に従って抑制する方法が含まれる。
【００３８】
また本発明において抑制の対象となる癌は、好ましくはmiR-200ファミリーの２つの染色体座のそれぞれから、少なくとも１つのmiR-200ファミリーメンバーが発現している癌（miR-200の二遺伝子座陽性腫瘍）が好ましい。具体的には、このような癌は、miR-200a, miR-200b および miR-429 の少なくともいずれか１つの発現と、miR-200c およびmiR-141の少なくともいずれか１つの発現とが陽性の癌である。また本発明においては、腫瘍抑制に先立って、対象とする腫瘍が、miR-200の二遺伝子座陽性腫瘍であることを確認してもよい。すなわち本発明の方法は、その一態様において、腫瘍抑制に先立って、対象とする腫瘍が、miR-200a, miR-200b および miR-429 の少なくともいずれか１つ、ならびに、miR-200c およびmiR-141の少なくともいずれか１つが陽性であることを確認する工程を含む方法が含まれる。例えば本発明の方法は、その一態様において、腫瘍抑制に先立って、対象とする腫瘍が、miR-200a, miR-200b および miR-429 の少なくともいずれか１つの発現と、miR-200c およびmiR-141の少なくともいずれか１つの発現とが陽性であることを確認する工程、および該確認された腫瘍を本発明の上記方法に従って抑制する方法が含まれる。
【００３９】
本発明において抑制の対象となる癌は、具体的には、大腸癌、肺癌、および乳癌が含まれる。本発明において抑制の対象となる癌は、特にプロゲステロン受容体（PR）、エストロゲン受容体（ER）、およびHER2のいずれかがネガティブの腫瘍（例えば乳癌など）が挙げられ、より好ましくは、少なくともプロゲステロン受容体（PR）がネガティブの腫瘍（例えば乳癌）、最も好ましくは、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、およびHER2がすべてネガティブであるトリプルネガティブ乳癌が挙げられる。また本発明において抑制の対象となる癌には、前立腺癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、および腎臓癌が含まれるが、これらに限定されるものではない。また本発明において抑制の対象となる癌は、好ましくはヒトの癌である。
【００４０】
本発明の腫瘍抑制は、例えば腫瘍の発生および増大等の抑制に特に有用であり、中でも、原発性腫瘍に対する抑制に高い効果を発揮する。ここで原発性腫瘍とは、腫瘍が由来する器官または組織と当該腫瘍が存在する器官または組織とが一致することを言う。例えば乳癌であれば、乳房における乳癌の増殖、大腸癌であれば、大腸における大腸癌の増殖、前立腺癌、非小細胞肺癌、および腎臓癌であれば、それぞれ前立腺、肺、および腎臓における各癌の増殖の抑制に、特に本発明は有用である。
【００４１】
また、例えば原発性腫瘍の増殖・進展は、腫瘍の転移とはメカニズムが異なることが知られている。転移には、原発巣からの癌細胞の離脱と脈管（血管やリンパ管）への浸潤、脈管内での移動、転移臓器の血管内皮への接着、および転移臓器への浸潤などの過程が必要である。また、転移が成立するためには、それらの全ての過程において癌細胞は免疫排除機構から逃れて生存できることが求められる。したがって、転移の抑制はそれらのいずれかのプロセスが阻害されれば達成できるのに対し、原発性腫瘍を抑制するためには、原発性腫瘍の増殖性や生存性、抗アポトーシス活性等が阻害されなければ達成することはできない。
【００４２】
また本発明は、本発明のmiRNA阻害剤の、腫瘍を抑制するための使用、および、腫瘍を抑制するための剤の製造における使用に関する。すなわち本発明は、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAを単独または組み合わせにおいて阻害する１つまたは複数の阻害剤の、腫瘍の抑制のための使用、および腫瘍を抑制するための剤の製造における使用に関する。また本発明は、腫瘍を抑制するために用いられる、当該miRNA阻害剤に関する。
【００４３】
より具体的には、本発明は、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAを、単独または組み合わせにおいて阻害する１つまたは複数のmiRNA阻害剤を投与して腫瘍を抑制するための剤の製造における、該miRNA阻害剤の使用に関する。また本発明は、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAを、単独または組み合わせにおいて阻害する１つまたは複数のmiRNA阻害剤を投与して腫瘍細胞の上皮間葉転換を促進、および/または、間葉上皮転換を抑制するための剤の製造における、該miRNA阻害剤の使用に関する。当該単独または組み合わせにおいては、miR-200cおよびmiR-141 が少なくとも阻害されることが好ましく、より好ましくは、miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141および miR-429からなるmiR-200ファミリーメンバーのすべてが阻害される。ここでmiRNAの阻害とは、好ましくは標的となるmiRNAに阻害剤が結合（相互作用）することにより直接阻害されることを言う。すなわち本発明においては、miRNA阻害剤はmiR-200cおよびmiR-141 に結合（相互作用）することにより直接阻害することが好ましく、miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141および miR-429からなるmiR-200ファミリーメンバーのすべてにmiRNA阻害剤が相互作用することにより直接阻害することがより好ましい。
【００４４】
また本発明は、本発明のmiRNA阻害剤、および薬学的に許容される担体を含有する腫瘍抑制剤に関する。より好ましくは、本発明は、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに結合する第１のmiRNA結合配列、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに結合する第２のmiRNA結合配列を単独または組み合わせにおいて含むmiRNA阻害剤、および薬学的に許容される担体を含有する腫瘍抑制剤を提供する。ここで薬理学的に許容される担体には所望の生理的溶液等が含まれ、例えば蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が例示できる。
【００４５】
miRNA阻害剤としては特に限定されず、当業者に知られたmiRNA阻害剤を適宜用いることができる。例えば、標的となるmiRNAのシード配列に結合する核酸またはその類縁体が好適である。具体的には、上述の通り、例えば antagomiR（Krutzfeldt, J. et al., 2005, Nature 438: 685-689）、miRNA target mimicry、および miRNA sponge（Chitwood, D.H. and Timmermans, M.C., 2007, Nat Genet 39: 935-936; Ebert, M.S. et al., 2007, Nat Methods 4: 721-726; Franco-Zorrilla, J.M. et al., 2007, Nat Genet 39: 1033-1037）、miRIDIAN、miRCURY、miR-Zip、およびmiRNA eraser、その他のmiRNAデコイ、ならびにTuD（WO2010/047216）等を用いることができる。
【００４６】
本発明においては、miRNA阻害剤として特にTuD（tough decoy）を好適に用いることができる。本発明においてTuDとは、それぞれ少なくとも１つのmiRNA結合配列を含む一対の鎖を持ち、一対の多重鎖（例えば二本鎖および/または四本鎖）に挟まれるように、該miRNA結合配列を含む一対の鎖の両端が、一対の多重鎖のそれぞれの片端に結合している構造からなるmiRNA阻害剤を言う。当該miRNA阻害剤は、RNAで構成されていてもよく、また、その他の核酸や核酸類縁体、またはそれらの組み合わせで構成されていてもよい。
【００４７】
本発明のmiRNA阻害剤（miRNAインヒビターとも言う）は、好ましくは 5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAを、１つのmiRNA阻害分子で阻害できるものである。ここで分子とは、原子が共有結合で結合している一塊の粒子を言うのみならず、それらの粒子が水素結合により安定に結合して形成された一塊の物質も「分子」と言う。また水素結合により安定に結合とは、例えば核酸またはその類縁体において、合計8対以上の塩基対により結合していることを言い、好ましくは合計10対以上、より好ましくは合計12対以上、より好ましくは合計15対以上の塩基対により結合していることを言う。
【００４８】
例えばmiRNA阻害分子に、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに対するmiRNA結合配列、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに対するmiRNA結合配列を含ませることで、1分子のmiRNA阻害分子で両方のmiRNAを阻害することができる。このように、2種類のmiRNA結合配列を含み、少なくとも2種のmiRNAを１分子で阻害するmiRNAインヒビターをハイブリットmiRNAインヒビターと呼ぶ。各miRNA結合配列は、それぞれのmiRNAのシード配列に相補的な核酸またはその類縁体を含んでいる。具体的には本発明のmiRNA阻害剤は、少なくともmiR-200cおよびmiR-141を阻害することが好ましく、そのようなmiRNA阻害剤は、例えばmiR-200cに対するmiRNA結合配列、およびmiR-141に対するmiRNA結合配列を含んでいる。そのようなmiRNA阻害剤は、具体的には、5'-AACACUG-3' に対して相補的な配列、および 5'-AAUACUG-3' に対して相補的な配列を含む。5'-AACACUG-3' に対して相補的な配列は、例えば 5'-CAGUGUU-3' であり、5'-AAUACUG-3' に対して相補的な配列は、例えば 5'-CAGUAUU-3' である。
【００４９】
より具体的には、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAを阻害するmiRNA結合配列としては、5'-CAGUGUU-3' を含むmiRNA結合配列が挙げられ、例えばその一例として 5'-CCAUCUUUACCACAUAGACAGUGUUA-3'（配列番号：6）が挙げられるが、それに限定されるものではない。また、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAを阻害するmiRNA結合配列としては、5'-CAGUAUU-3' を含むmiRNA結合配列が挙げられ、例えばその一例として 5'-UCCAUCAUUACCCCACUGGCAGUAUUA-3'（配列番号：7）が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００５０】
例えば本発明のTuDとしては、CN特許第ZL200980152926.X号（CN102264898(B)）に記載のmiRNA阻害複合体が含まれ、具体的には、「RNAまたはその類縁体を含むmiRNA阻害複合体であって、二本鎖構造を含み、miRNA結合配列を含む鎖が、該二本鎖構造の片端の２つの鎖にそれぞれ一本ずつ結合しており、二本鎖または四本鎖から選択される第２の多重鎖構造を含み、該二本鎖構造と該第２の多重鎖構造とに挟まれるように、該miRNA結合配列を含む２つの鎖のそれぞれの他端が、該第２の多重鎖構造の片端の２つの鎖にそれぞれ結合しており、これにより図１に示された構造を含み、図１のIは該二本鎖構造であって、IIは該第２の多重鎖構造であって二本鎖または四本鎖であり、図１のａおよびｂにそれぞれ少なくとも１つのmiRNA結合配列を含む、miRNA複合体」が含まれる（CN特許第ZL200980152926.X号（CN102264898(B)））。ここで、IおよびIIの縦線は多重鎖であることを表すが、塩基対の数は縦線の数に限定されるものではない。また図１のａおよびｂは、図２(a)に示すように部分的に二本鎖を形成していてもよい。
【００５１】
また本発明のTuDとしては、EP特許第2363467号（EP出願番号09821914.0号）に記載のmiRNA阻害複合体が含まれ、具体的には、「RNAまたはその類縁体を含むmiRNA阻害複合体であって、二本鎖構造および第２の多重鎖構造を含み、miRNA結合配列を含む鎖が、該二本鎖構造の片端の２つの鎖の１つずつにそれぞれ結合しており、該鎖が該二本鎖構造および該多重鎖構造の間に位置するように、該鎖の他端が、第２の多重鎖構造の２つの鎖の１つずつにそれぞれ結合している、複合体」が含まれる（EP2363467(B1)）。
【００５２】
また本発明のTuDとしては、JP特許第4936343号に記載のmiRNA阻害複合体が含まれ、具体的には、「RNAまたはその類縁体を含むmiRNA阻害複合体であって、二本鎖構造を含み、該二本鎖構造の片端の2つの鎖に、miRNA結合配列を含む２つの鎖の末端が、それぞれ１〜５塩基のリンカーを介して１本ずつ結合しており、二本鎖または四本鎖から選択される第２の多重鎖構造を含み、該二本鎖構造と該第２の多重鎖構造とに挟まれるように、該miRNA結合配列を含む２つの鎖のそれぞれの他端が、該第２の多重鎖構造の片端の2つの鎖に、それぞれ１〜５塩基のリンカーを介して結合している、miRNA阻害複合体であって、該miRNA結合配列を含む２つの鎖は、それぞれの鎖がmiRNA結合配列を含み、miRNA結合配列を含む鎖が２つあるものである、miRNA阻害複合体。」が含まれる（JP特許第4936343号）。
【００５３】
また本発明のTuDとしては、US特許第8,563,709号に記載のmiRNA阻害複合体が含まれ、具体的には、「RNAまたはその類縁体を含むmiRNA阻害複合体であって、
（ａ）二本鎖構造、
（ｂ）多重鎖構造、
（ｃ）miRNA結合配列をそれぞれ含む複数の鎖であって、該複数の鎖が該二本鎖構造および該多重鎖構造の間に挟まれるように、該複数の鎖が、該二本鎖構造の片端の２つの鎖の１つずつにそれぞれ結合しており、該複数の鎖の他端が、該多重鎖構造の１つの鎖の１つずつにそれぞれ結合している、複合体。」が含まれる（US特許第8,563,709号）。
【００５４】
上述の通りTuDなどのmiRNA阻害剤は、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNA、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAを、１つのmiRNA阻害剤分子で阻害できるものであってよく、そのために２つのmiRNA結合配列を単一分子内に含んでよい。2種のmiRNA結合配列を持つTuDは、本発明においてハイブリッドTuDとも言う。ハイブリッドTuDは、例えば 5'-CAGUGUU-3' および 5'-CAGUAUU-3' を含むものが好ましく、具体的には、5'-CAGUGUU-3' を含むmiRNA結合配列（MBS）、および 5'-CAGUAUU-3' を含むMBSの２つのMBSを少なくとも含むことが好ましい。
【００５５】
また本発明のmiRNA阻害剤は、天然の核酸であってよく、人工の核酸や核酸類縁体であってもよい。天然の核酸であれば、例えばベクターから転写させることにより生産することができ、人工の核酸や核酸類縁体は、合成等により生産することができる。本発明において合成のTuDをS-TuD（Synthetic TuD）とも言い、S-TuDはTuDに包含される。また、TuDを発現するベクターも、本発明においてTuDと称す。
【００５６】
TuDなどの本発明のmiRNA阻害剤は、本発明の腫瘍抑制剤として有用であり、腫瘍増殖の抑制等のために好適に用いることができる。
【００５７】
より具体的に例示すると、例えばTuDなどの本発明のmiRNAインヒビター（miRNA阻害複合体）は、二本鎖構造を含み、miRNA結合配列（MBS）を含む少なくとも１つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の2つの鎖に結合している。なお本発明においては、この二本鎖構造を「第一の」二本鎖構造と呼ぶことで、本発明のmiRNAインヒビターに含まれ得るさらなる二本鎖構造と区別できるようにすることがある（後述）。本発明においてmiRNAインヒビターは、一本鎖または複数の鎖で構成されていてよい。例えば二本鎖構造の片端の2つの鎖に、MBSを含むRNA鎖が、それぞれ一本ずつ結合した、二本鎖RNAからなるmiRNAインヒビターはTuDとして好適である。また、例えば二本鎖構造の片端の2つの鎖に、少なくとも1つのMBSを含む一本のRNA鎖が結合していてもよい。この場合、MBSを含むRNA鎖により、二本鎖構造の片端の2つの鎖はつながれることになる（例えばWO2010/047216の図１）。二本鎖構造の2つの鎖をつなぐRNAには、MBSが少なくとも１つ含まれているが、例えば2つ、3つ、またはそれ以上含まれていてもよい（例えばWO2010/047216の図２A）。
本発明においてTuDなどのmiRNAインヒビターは、二本鎖構造を持つ、少なくとも1本のRNAまたはその類縁体を含む構造体であってよい。該構造体は、好ましくはRNAまたはその類縁体を含む分子を1分子または2分子含む。
【００５８】
本発明においてmiRNA結合配列（MBS）とは、miRNAに結合する配列を言う。MBSは、miRNAに結合できるように、miRNAに相補的な部分を少なくも含んでいる。MBSは、miRNAに完全に相補的な配列であってもなくてもよい。例えばMBSは、miRNAが標的とする天然のRNAの配列であってもよい。MBSは、例えばmiRNAに対して、少なくとも10塩基、例えば11塩基以上、12塩基以上、13塩基以上、14塩基以上、15塩基以上、16塩基以上、17塩基以上、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、21塩基以上、22塩基以上、23塩基以上、または24塩基以上の相補的な塩基を連続または非連続に含む。好ましくは、該相補的な塩基は連続しているか、あるいは3箇所以下、2箇所以下、好ましくは1箇所のギャップを有する。ギャップは、MBS側および/またはmiRNA側の不対合（バルジ）であってよく、１箇所のギャップについても、片方の鎖のみにバルジ塩基があるものであってもよく、両方の鎖に不対合の塩基を有していてもよい。好ましくは、少なくともMBS側に不対合塩基を含むように設計する。バルジおよびミスマッチの塩基数は、それぞれ１箇所のバルジおよびミスマッチあたり、片鎖あたり例えば6塩基以下、好ましくは5塩基以下、4塩基以下、3塩基以下、2塩基以下、または1塩基である。本発明において、バルジを形成し得るMBSは、完全に相補的な配列からなるMBSよりも高いmiRNA阻害効果を示す（WO2010/047216の実施例４）。従って、より高いmiRNA阻害効果を得るためには、バルジを形成するようにMBSを設計することが好ましい。例えば、MBSの3'末端から10番目および/または11番目の塩基が、miRNAと相補的になっていないか、あるいは10番目と11番目の間に余計な塩基を含むMBS（あるいは、miRNA中の標的配列（MBSとハイブリダイズする配列）の5'末端から10番目および/または11番目の塩基がMBSと相補的な塩基となっていないか、あるいは10番目と11番目のヌクレオチドの間に不対合の塩基を含むMBS）は、分解を受けにくく、高い活性が期待できる。この場合、例えばmiRNAの5'末端から10番目および11番目を含む塩基が不対合となるようにMBSを設計してもよく、例えば9〜11番目、10〜12番目、または9〜12番目が不対合となるようにMBSを設計してもよい。また、miRNA側には不対合となる塩基はないが、MBS側に、3'末端から10番目と11番目の間（あるいは、miRNA中の標的配列（MBSとハイブリダイズする配列）の5'末端から10番目および11番目に相当する部位の間）に不対合となる塩基を有していてもよい。不対合となる塩基は、miRNA側および/またはMBS側に存在してよいが、好ましくは少なくともMBS側に存在する。各鎖で不対合になるヌクレオチドの数は適宜調整することができるが、例えば1〜6ヌクレオチドであり、好ましくは1〜5ヌクレオチドであり、より好ましくは3〜5、例えば3、4または5ヌクレオチドである。
【００５９】
また、miRNAのターゲットの認識には、miRNAの5'端から2〜7番目あるいは3〜8番目の塩基（seed領域と呼ばれる）がマッチすることが重要であることが知られている（Jackson AL et al., RNA 12(7):1179-1187, 2006; Lewis BP et al., Cell 120: 15-20, 2005; Brennecke et al. PLoS BIOLOGY 3, 0404-0418, 2005; Lewis et al. Cell 115, 787-798, 2003; Kiriakidou et al. Genes & Development 18, 1165-1178, 2004）。実際、miRNA阻害RNAは、seed領域しかマッチしておらず、他の領域とは低い相補性しか有さないMBSを持つものであっても、miRNAを効果的に阻害できる（WO2010/047216の実施例６、図12）。本発明におけるMBSとしては、miRNAのseed領域（miRNAの5'端から2〜7番目および/または3〜8番目の塩基）が完全に相補的であるものが好ましい。この場合、G:U対（U:G対）も相補的とみなしてよいが、好ましくはG:C（C:G）およびA:U（U:A）のみを相補的とみなす。また本発明におけるMBSとしては、miRNAのseed領域（miRNAの5'端から2〜7番目および/または3〜8番目の塩基）が完全に相補的であって、miRNAに対して、少なくとも8塩基、より好ましくは9塩基、より好ましくは10塩基の相補的な塩基を連続して含むものが好ましい。さらに本発明におけるMBSは、miRNAに対して、合計11塩基以上、より好ましくは12塩基以上、より好ましくは13塩基以上の相補的な塩基を含むことが好ましい。
【００６０】
MBSは、好ましくは、miRNA配列と生理的条件下でハイブリダイズする配列である。生理的条件下とは、例えば150 mM NaCl、15 mM sodium citrate、pH 7.0、37℃ である。より好ましくは、MBSは、miRNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列である。ストリンジェントな条件とは、例えば1×SSC（1×SSCは150 mM NaCl、15 mM sodium citrate、pH 7.0）または0.5×SSC、42℃の条件であり、より好ましくは1×SSCまたは0.5×SSC、45℃の条件であり、より好ましくは1×SSCまたは0.5×SSC、50℃の条件である。ハイブリダイゼーションにおいては、例えばmiRNA配列を含むRNAまたはMBSを含むRNAのどちらかを標識し、他方を膜に固定して、両者をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5xSSC、7%(W/V) SDS、100 μg/ml 変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、及び0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、例えば37℃、または45℃、または50℃で行えばよい。十分な時間（例えば3、4、5または6時間以上）インキュベートした後、上記の条件で洗浄を行い、標識した核酸がハイブリダイズしているかを検出することにより、当該条件で核酸がハイブリダイズするか否かを決定することができる。
【００６１】
あるいはMBSは、好ましくは、miRNA配列の相補配列と高いホモロジーを示す。高いホモロジーとは、例えば70%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、93%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上の同一性を有する塩基配列である。塩基配列の同一性は、例えばBLASTプログラム（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990）を用いて決定することができる。例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいて、デフォルトのパラメーターを用いて検索を行うことができる（Altschul S.F. et al., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden, T.L. et al., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang J. & Madden T.L., Genome Res. 7:649-656, 1997）。例えば２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al., FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, 1999）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。miRNA配列の塩基配列の外側のギャップは無視し、内側のギャップは例えばミスマッチと同様に扱い、アライメントにおけるmiRNA配列の塩基配列全体（配列の内側に入れたギャップを加算したトータルの塩基の長さ）に対する同一性の値を計算する。但し、実施例に示した通り、MBSとmiRNAとのミスマッチはmiRNAの阻害活性を上昇させ得る。従って、例えばアライメントの内側においてmiRNA配列に挿入したギャップは無視して同一性を算出することが好ましい。
【００６２】
あるいはMBSは、好ましくは、miRNA配列の相補配列に対して、1または数個の塩基を挿入、置換、および/または欠失させた配列からなる。好ましくは、MBSは、miRNA配列の相補配列に対して8塩基以内、7塩基以内、6塩基以内、5塩基以内、4塩基以内、3塩基以内、2塩基以内、または1塩基の挿入、置換、および/または欠失を有する配列からなる。より好ましくは、MBSは、miRNA配列の相補配列に対して8塩基以内、7塩基以内、6塩基以内、5塩基以内、4塩基以内、3塩基以内、2塩基以内、または1塩基の挿入を有する配列からなる。MBSは、miRNA配列と完全に相補的な配列よりも、ミスマッチを有する配列の方がmiRNAの阻害活性が高いことが示されている（WO2010/047216）。これはMBSが完全に相補的であると、miRNAを含むRISCにより切断を受け、それによりmiRNA阻害RNAの発現レベルが低下することに起因すると考えられる。特に、MBSがmiRNAとハイブリダイズしたときに、MBSの3'末端から10番目および/または11番目の塩基が不対合となる（あるいは、MBSとハイブリダイズするmiRNA側の標的配列の5'末端から10番目および/または11番目の塩基がMBSとハイブリダイズさせたときに不対合となる）か、あるいは10番目と11番目のヌクレオチドの間に不対合の塩基を含むように設計したMBSは高い活性が期待できる。このような不対合は、例えばMBS側のバルジであってよく、バルジを形成する塩基は1〜6塩基、好ましくは1〜5塩基、より好ましくは3〜5塩基（例えば3、4または5塩基）である。
【００６３】
MBSは、RNAからなっていてもよく、あるいは核酸類縁体を含んだり、または核酸類縁体からなっていてもよい。特にMBSの切断される部位（MBSの3'末端から10番目および/または11番目の塩基等）を、切断が起こらないように核酸類縁体することで、miRNA阻害効果の上昇が期待できる。また、ホスホチオエートや2'-O-メチルなどのバックボーンや糖を有する核酸を用いることも好適である（Krutzfeldt, J. et al., Nucleic Acids Res. 35: 2885-2892; Davis, S. et al., 2006, Nucleic Acids Res. 34: 2294-2304）。
【００６４】
また本発明においてTuDなどの上記miRNAインヒビターは、第１の二本鎖構造に加え第２の二本鎖構造をさらに含み、第１の二本鎖構造においてMBSが結合している方の末端の２つの鎖は、MBSを含むRNA鎖がそれぞれ１本ずつ結合する構造となっており、第１の二本鎖構造と第２の二本鎖構造の間に挟まれるように、該RNA鎖のそれぞれの他端が、該第２の二本鎖構造の2つの鎖にそれぞれ結合しているmiRNAインヒビターであってもよい。当該miRNAインヒビターは、少なくとも２つの二本鎖構造を有し、該２つの二本鎖構造を構成する4つのRNA鎖のそれぞれが、残る3つのいずれの鎖も介することなく、MBSを含むRNAに結合している構造を有している。このようなmiRNAインヒビターをより分かりやすく言えば、MBSを含む２本のRNA鎖が、２つの二本鎖構造に挟まれるように、２つの二本鎖構造の各鎖にそれぞれ結合しているmiRNAインヒビターである（図１）。MBSを含む２本のRNA鎖は、二本鎖構造の対合しているそれぞれの鎖に結合しているので、RNA鎖の方向は互いに反対方向となる（WO2010/047216の図２、#12〜#16）。このように二本鎖の各鎖にそれぞれMBSを付加することにより、より高いmiRNA阻害活性を発揮させることが可能となる。
【００６５】
２つの二本鎖構造に挟まれるように存在するMBSを含む2本のRNA鎖には、それぞれ１つ以上のMBSが含まれている。それらのMBSは同じ配列であってもよく、違っていてもよい。また同じmiRNAを標的とするものであってもよく、異なる標的miRNAに結合する配列であってもよい。例えば、１つの鎖に2つ以上、例えば2、3、4、または5個のMBSが含まれていてよい（WO2010/047216の図２、#12〜#16）（例えばハイブリッドTuD）。例えば、2つの二本鎖構造に挟まれた各鎖に1つまたは2つのMBSを含んでよい。例えば、TuDなどの本発明のmiRNAインヒビターは、トータルで2つのMBSを含むものであってよく、それら2つのMBSは、同一の配列、または同一のmiRNAに結合する配列であってよい。また、その構造を一単位としてタンデムに繰り返す構造を持つTuDも好適である（実施例参照）。繰り返しの数は適宜決定してよいが、例えば2〜10、好ましくは2〜5、または3〜5であり、例えば3である。
【００６６】
本発明のmiRNAインヒビターに含まれる二本鎖の対合するそれぞれの鎖は、上述の通り別々のRNA鎖であっても（すなわち共有結合でつながっていなくても）よいし、二本鎖の一方または両方の末端がつながっており、直鎖状または環状となっていてもよい。直鎖状一本鎖RNAにより構成されるmiRNAインヒビターは、例えば一回のRNA合成により作製し得るし、また発現ベクター等を用いて１つの発現ユニットから発現させることもできる。例えば、２つの二本鎖構造を含む場合、第２の二本鎖構造の一端（MBSが結合していない側）の２つの鎖をループにより連結して全体を一本鎖とすることができる。二本鎖をつなぐ配列中には、1つまたはそれ以上のMBSが含まれていてよい（WO2010/047216の図２、#2、#11、#14、#16）。配列をなるべくコンパクトにするには、二本鎖を短いループにより連結させることができる。例えば1〜10塩基、好ましくは1〜8塩基、2〜6塩基、3〜5塩基、例えば4塩基の配列で二本鎖を結合させることができる。配列は特に制限はない。例えば 5'-GUCA-3' が挙げられる（図３−１A）。
【００６７】
miRNAインヒビターに含まれる二本鎖構造は、配列に特に制限はないが、好ましくは4塩基対以上の長さを有する。特に、miRNAインヒビターに含まれる二本鎖構造の少なくとも１つ（すなわち第一の二本鎖構造）は、当該インヒビターの核外輸送に重要な機能を持つ。この二本鎖の鎖長は、例えば15〜50塩基対であってよく、好ましくは15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、または45塩基、あるいはそれらのいずれか以上であり、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、または18塩基、あるいはそれらのいずれか以下である。より好ましい態様では、二本鎖構造の塩基対の長さは、例えば15〜30、好ましくは16〜28、好ましくは17〜25、好ましくは17〜24、例えば17、18、19、20、21、22、23、または24である。20bpを超えても高い活性を発揮することはできるが、20bpを超えるdsRNAは、細胞質においてDicerによる切断の潜在的な標的となり得ることから、それを避けるために、本発明のmiRNAインヒビターに含まれる二本鎖構造は20bp以下、例えば19bp以下、または18bp以下とすることができる。
【００６８】
一例を挙げれば、配列番号：73の1-18番目、および配列番号：73の104-121番目からなる二本鎖構造が挙げられるが、それに限定されるものではない。なお3'末端にはUUを付加することができる。
【００６９】
本発明のmiRNAインヒビターに第二またはそれ以上の二本鎖構造が含まれる場合においては、これらの二本鎖構造の配列やその長さに特に制限はない。これらの二本鎖構造は、例えばmiRNAインヒビター全体をコンパクトにするために、第一の二本鎖構造の長さよりも短くしてもよい。各二本鎖の鎖長は適宜調整してよいが、例えば4bp〜20bpであり、例えば5bp〜15bp、5bp〜12bp、5bp〜10bp、6bp〜9bp、または7bp〜8bpとしてよい。
【００７０】
一例を挙げれば、配列番号：73の51-58番目（5'-GUAUUCUG-3'）および配列番号：73の63-70番目（5'-CAGAAUAC-3'）からなる二本鎖構造が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００７１】
二本鎖構造を形成する塩基対の配列は、miRNAインヒビターの中で特異的かつ安定に二本鎖を形成できるように適宜設計することができる。例えば、同じ塩基が長く（例えば8塩基以上、好ましくは7塩基以上、より好ましくは5塩基以上、より好ましくは4塩基以上、より好ましくは3塩基以上）連続するホモポリメリックな配列は避けることが好ましい。また、二塩基繰り返し配列や3〜4塩基繰り返し配列などの、数塩基の配列がタンデムに繰り返す配列も避けることが好ましい。二本鎖部分のGC含量は適宜調整してよいが、例えば12％〜85％、好ましくは15％〜80％、20％〜75％、25％〜73％、32％〜72％、35％〜70％、37％〜68％、または40％〜65％である。これまで例示したものとは異なる他の一例を挙げれば、WO2010/047216の図６Aに示されているステムIおよびステムIIの配列を例示することができるが、それらに限定されるものではない。
【００７２】
MBSと二本鎖構造は、直接連結させてもよいし、他の配列を介して連結させてもよい。例えば、適当なリンカーまたはスペーサー配列を介して、MBSを二本鎖構造の端に結合させることができる。MBSを二本鎖部分に直接繋げても有意な阻害活性を得ることができるが、リンカー（またはスペーサーとも言う）を付加することにより、miRNAに対する阻害効果がより上昇する（WO2010/047216の実施例４）。MBS配列と二本鎖構造との間のリンカーまたはスペーサー配列は、MBSがRISCに存在するmiRNAへのアクセシビリティーを増加させる可能性がある。リンカーまたはスペーサーの長さは適宜調整してよいが、例えば1〜10塩基、好ましくは1〜9塩基、1〜8塩基、1〜7塩基、1〜6塩基、1〜5塩基、1〜4塩基、または1〜3塩基である。例えば、2つ以上のMBSをつなげる場合であっても、リンカーまたはスペーサーを介して連結させるとよい。リンカーまたはスペーサーの配列は特に制限はないが、例えばAおよび/またはCからなる配列、あるいはAおよび/またはCをその他の塩基よりも多く含む配列とすることができる。またリンカーまたはスペーサー配列は、向かい合ったリンカーまたはスペーサー配列や、MBSとの間で安定な塩基対を形成しないよう配慮することが好ましい。一例を挙げれば、AAC、CAA、ACC、CCA、またはそれらのいずれかを含む配列等を例示できる。MBSに両側に付加する一対のリンカーまたはスペーサー配列は、インバートした配列（鏡像配列）にしてもよい。例えばMBSの5'側にAAC、3'側にCAAを付加することができる。
【００７３】
また本発明のmiRNAインヒビターを構成する核酸は修飾されていてもよい。例えば核酸を構成するヌクレオチドは、天然のヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、人工のヌクレオチド、またはそれらの組み合わせであってよい。また本発明のmiRNAインヒビターに含まれる核酸は、RNAからなっていてもよく、またはRNA・DNAキメラであってよく、あるいはその他の核酸類縁体を含んでもよく、それらの任意の組み合わせを含んでよい。核酸には、リン酸ジエステル結合により結合しているもののみならず、アミド結合やその他のバックボーンを有するもの（ペプチド核酸(PNA)等）が含まれる。核酸類縁体には、例えば天然および人工の核酸が含まれ、核酸誘導体、核酸アナログ、核酸派生体等であってよい。そのような核酸類縁体は当該分野において周知であり、例えばホスホロチオエート、ホスホアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2'-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）が含まれるが、これらに限定されない。PNAの骨格には、アミノエチルグリシン、ポリアミド、ポリエチル、ポリチオアミド、ポリスルフィナミド、ポリスルホンアミド、またはそれらの組み合わせからなる骨格を含んでよい（Krutzfeldt, J. et al., Nucleic Acids Res. 35: 2885-2892; Davis, S. et al., 2006, Nucleic Acids Res. 34: 2294-2304; Boutla, A. et al., 2003), Nucleic Acids Res. 31: 4973-4980; Hutvagner, G. et al., 2004, PLoS Biol. 2: E98; Chan, J.A. et al., 2005, Cancer Res. 65: 6029-6033; Esau, C. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279: 52361-52365; Esau, C. et al., 2006, Cell Metab. 3: 87-98）。
【００７４】
核酸の修飾は、エンドヌクレアーゼによる分解を阻害するために行われ得る。特に好ましい修飾には、2'または3'糖修飾、例えば2'-O-メチル（2'-O-Me）化ヌクレオチドまたは2'-デオキシヌクレオチド、または2'-フルオロ、ジフルオロトルイル、5-Me-2'-ピリミジン、5-アリルアミノ-ピリミジン、2'-O-メトキシエチル（2'-O-MOE）、2'-O-アミノプロピル（2'-O-AP）、2'-O-N-メチルアセタミド（2'-O-NMA）、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル（2'-DMAEOE）、2'-O-ジメチルアミノエチル（2'-O-DMAOE）、2'-O-ジメチルアミノプロピル（2'-O-AP）、2'-ヒドロキシヌクレオチド、ホスホロチオエート、4'-チオヌクレオチド、2'-O-トリフルオロメチルヌクレオチド、2'-O-エチル-トリフルオロメトキシヌクレオチド、2'-O-ジフルオロメトキシ-エトキシヌクレオチド、または2'-アラ−フルオロヌクレオチド、Locked核酸（LNA）、2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸 (2'-O,4'-C-ethylene bridged nucleic acid (ENA)) などのエチレン核酸、その他の bridged nucleic acid (BNA)、ヘキシトール核酸（hexitol nucleic acid; HNA）、モルホリノ核酸、トリシクロ-DNA（tcDNA）、ポリエーテル核酸（US Pat. No. 5,908,845）、シクロヘキセン核酸（CeNA）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。またジフルオロトルイル（DFT）修飾、例えば2,4-ジフルオロトルイルウラシル、またはグアニジンのイノシンへの置換を行ってもよい。
【００７５】
また、核酸は末端に結合体を含んでよい。結合体としては、例えば親油性物質、テルペン、タンパク質結合物質、ビタミン、炭水化物、レチノイド、およびペプチド等が挙げられる。具体的には、C5-アミノアルキルdT、ナプロキセン、ニトロインドール、葉酸、コラン酸、イブプロフェン、レチノイド、ポリエチレングリコール（PEG）、C5ピリミジンリンカー、グリセリド脂質（例えばジアルキルグリセリド誘導体）、ビタミンE、コレステロール、チオコレステロール、dU-コレステロール、アルキル鎖、アリール基、複素環式複合体、および修飾糖（D-リボース、デオキシリボース、グルコースなど）が例示できる。結合体と核酸は、例えば任意のリンカーを介して結合させることができ、具体的には、ピロリジンリンカー、セリノールリンカー、アミノオキシ、またはヒドロキシプロリノールリンカー等が挙げられる。
【００７６】
miRNAインヒビターは直鎖状の一本鎖核酸により構成されるように設計することができる（WO2010/047216の図２）。特に、MBSの全てが、ある二本鎖構造（WO2010/047216の図２のステムI）の片側（WO2010/047216の図２においては右側）に集中しており、該二本鎖構造の各鎖は、その側で閉じた構造となっており（すなわちMBSを含む配列によりつながっており）、該二本鎖構造の反対側に一本鎖RNAの両端があるような複合体は好ましい（WO2010/047216の図２）。MBSを含む配列中には、さらなる二本鎖構造（WO2010/047216の図２のステムIIやIIIなど）を含んでもよい。一本鎖RNAの長さは適宜決めてよいが、例えば500塩基内、好ましくは450塩基以内、420塩基以内、400塩基以内、380塩基以内、360塩基以内、340塩基以内、320塩基以内、300塩基以内、280塩基以内、260塩基以内、240塩基以内、220塩基以内、200塩基以内、180塩基以内、160塩基以内、140塩基以内、120塩基以内、100塩基以内、または80塩基以内である。例えば２つの二本鎖構造と２つのMBSを持つ複合体を形成する一本鎖RNAの長さは、例えば60〜300塩基、好ましくは70〜250塩基、80〜200塩基、90〜180塩基、または100〜150塩基である。第一の二本鎖構造（一本鎖RNAの両端に近い二本鎖構造）は、例えば15〜30bp、好ましくは16〜28bp、好ましくは17〜25bp、好ましくは17〜24bp、例えば17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、または24bpとすることができ、第二の二本鎖構造（MBSを含む配列中に含まれるさらなる二本鎖構造）は、全体をコンパクトにするために、第一の二本鎖構造の長さよりも短くしてもよく、例えば4bp〜20bpであり、例えば5bp〜15bp、5bp〜12bp、5bp〜10bp、6bp〜9bp、または7bp〜8bpとしてよい。
【００７７】
また本発明は、本発明のmiRNAインヒビターを構成するRNA（ここでRNAとしては、天然のRNAおよび核酸類縁体を含む）、および該RNAをコードする核酸（DNAまたはRNA）に関する。miRNAインヒビターが一続きの1本のRNA鎖により構成されている場合は、そのRNAの分子内アニーリングにより、また2本以上のRNA鎖により構成されている場合は、それらのRNAをアニーリングさせることにより、本発明のmiRNAインヒビターを構築することができる。これらのRNAは適宜合成することができる。例えば、RNAの化学合成により所望のRNAを製造することができる。あるいは、該RNAを発現する発現ベクターにより、RNAを発現させることもできる。発現ベクターは特に制限はなく、例えば大腸菌などのバクテリア、酵母等の真核細胞、昆虫細胞、植物細胞、または動物細胞等で発現する所望の発現ベクターを用いることができる。例えば、植物、昆虫、動物等の高等真核生物の細胞で発現するベクターを用いて、それらの細胞中でRNAを発現させ、miRNAの機能を阻害することが考えられる。RNAを転写させるためのプロモーターは特に制限はなく、Pol Iプロモーター、Pol IIプロモーター、Pol IIIプロモーター、バクテリオファージのプロモーター等を用いることができる。例えばバクテリオファージの転写酵素とそのプロモーターを有するベクターを同時に導入して用いる場合には、T4ファージやT7ファージのRNAポリメラーゼやプロモーターを例示することができる。またポリメラーゼII（Pol II）プロモーターとしては、例えばCMVプロモーターやβ-globinプロモーター等を例示することができる。数百塩基以内の比較的短いRNAを発現させるためには、Pol IIよりも高い発現量が見込めるポリメラーゼIII（Pol III）プロモーターを利用することが好ましい。Pol IIIプロモーターとしては、U6プロモーター、H1プロモーター、tRNAプロモーター、7SKプロモーター、7SLプロモーター、Y3プロモーター、5S rRNAプロモーター、Ad2 VAIおよびVAIIプロモーター等を例示することができる（Das, G. et al., 1988, EMBO J. 7:503-512; Hernandez, N., 1992, pp. 281-313, In S. L. McKnight and K. R. Yamamoto (ed.), Transcriptional regulation, vol. 1. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Kunkel, G. R., 1991, Biochim. Biophys. Acta 1088:1-9; Lobo, S. M., and N. Hernandez, 1989, Cell 58:55-67; Mattaj, I. W. et al., 1988, Cell 55:435-442; Geiduschek, E.P. and G.A. Kassavetis, 1992, pp.247-280, In Transcriptional regulation. Monograph 22 (ed. S.L. McKnight and K.R. Yamamoto), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.）。特に、数多くのsnRNAや細胞質RNA遺伝子に見出されるClass 3プロモーターが例示でき、例えばU6, 7SK, hY1 および hY3, H1, および MRP/Th RNA遺伝子のプロモーターが挙げられる（Hernandez, N., 1992, pp. 281-313, In Transcriptional regulation. Monograph 22 (ed. S. McKnight and K.R. Yamamoto), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）。例えばhuman U6、human H1あるいは mouse U6プロモーター等を好適に用いることができる。Pol IIIプロモーターを用いる場合、転写させるRNAをコードするDNAの下流に、例えば4〜7塩基程度のポリ(T) tractを付加することにより、転写のターミネーターとして機能させることができる。
【００７８】
また、誘導性プロモーターを用いて発現誘導を行うこともできる。誘導性プロモーターとしては、例えばテトラサイクリン誘導性プロモーターが挙げられるが、それに限定されるものではない。テトラサイクリン誘導性プロモーターにおけるテトラサイクリンオペレーター配列（TetO配列）としては、例えば配列番号：10の128-146番目の配列が挙げられるが、それに限定されるものではない。
【００７９】
TetO配列は、プロモーター中に適宜配置することができ、また、1コピーだけでなく、複数コピー配置してもよい。複数コピー配置する場合は、一箇所にタンデムに配置してもよく、複数個所に分散して配置してもよい。例えば、PolIIIプロモーター中にTetO配列を配置する場合、近位配列因子（proximal sequence element; PSE）とその直前（5'側）にあるオクタマーモチーフとの間にTetO配列（1〜3コピー、好ましくは2コピー）を配置することが好ましい。また、さらに好ましくは、TATAボックスの直後（3'側）にも、TetO配列（1〜2コピー、好ましくは1コピー）を配置することが好ましい。PSEとその直前（5'側）にあるオクタマーモチーフとの間にTetO配列を2コピー配置し、かつTATAボックスの直後（3'側）にTetO配列を1コピー配置したPolIIIプロモーターは、顕著に優れたテトラサイクリン応答性を示すテトラサイクリン誘導性プロモーターである。なお、当該テトラサイクリン誘導性プロモーターには、さらにTetO配列を含むものも包含され、例えばPSEの直前（5'側）にあるオクタマーモチーフより上流領域に存在する別のオクタマーモチーフの周辺領域に、1〜5コピー、好ましくは1〜3コピーのTetO配列をさらに含むものであってよい。PolIIIプロモーターとしては所望のものが用いられるが、例えばヒト7SK RNAプロモーターが好適である。7SK RNAプロモーターとしては、天然由来のプロモーター（配列番号：74）であってもよく、改変されたもの（e7SK；配列番号：75）であってもよい。好ましい例として、例えば配列番号：76（Tet-e7SK6）または配列番号：77（Tet-e7SK10）を含むプロモーターが例示できるが、それに限定されるものではない。
【００８０】
このようにして構築した転写ユニットは、そのまま発現に用いることもできるし、さらに別のベクター系に組み込んで用いることもできる。ベクターとしては、特に制限はなく、発現プラスミドや所望のウイルスベクター等を利用することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに制限されない（Miller, A.D. et al. (1991) J. Virol. 65, 2220-2224; Miyake, S. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8802-8806; Samulski, R. J. et al. (1989) J. Virol. 63, 3822-3828）。例えば、Pol IIIプロモーターを含む転写ユニットは、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）のLTR中に組み込んで用いられてもよい。レトロウイルスベクターに組み込むことにより、標的細胞へ高い効率で遺伝子を導入することができるようになる他、導入遺伝子が染色体に組み込まれるため、長期間安定してmiRNAを阻害することが可能となる。用いられるレトロウイルスとしては特に制限はなく、例えばエコトロピックウイルスベクター（Kitamura, T. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 9146-9150）、アンフォトロピックウイルスベクター、VSV-G等によりシュードタイプ化されたウイルスベクター（Arai, T. et al. (1998) J. Virol. 72, 1115-1121）、HIVベクター、SIVベクター、FIVベクター等のレンチウイルスベクター（Shimada, T. et al. (1991) J. Clin. Inv. 88, 1043-1047）などが含まれる。例えばMoMLVベースのレトロウイルスベクターや、HIVベースのレンチウイルスベクターを用いることができる。LTRに組み込む場合、例えばU3領域に欠失（ΔU3）を有するLTRのΔU3領域に組み込むことができる（図２）。このましい態様においては、ベクターは、細胞に導入後1週間以上、好ましくは2週間以上、3週間以上、4週間以上、または1箇月以上にわたり、miRNA阻害RNAを発現し、miRNAの機能を阻害することができる。
【００８１】
また本発明は、本発明のmiRNAインヒビターを構成するRNAをコードする核酸を製造するための核酸（例えばDNA）であって、5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに対するmiRNA結合配列、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに対するmiRNA結合配列を少なくともコードする核酸および/またはその相補鎖に関する。当該核酸は、例えば 5'-CAGUGUU-3' および 5'-CAGUAUU-3' を含むものが好ましく、具体的には、5'-CAGUGUU-3' を含むmiRNA結合配列、および 5'-CAGUAUU-3' を含むmiRNA結合配列の２つのmiRNA結合配列を少なくとも含む。また本発明は、本発明のmiRNAインヒビターを構成するRNAをコードする核酸（例えばDNA）を製造するための組成物であって、上記の5'-AACACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに対するmiRNA結合配列、および、5'-AAUACUG-3' をシード配列として含む少なくとも１つのmiRNAに対するmiRNA結合配列を少なくともコードする核酸および/またはその相補鎖を含む組成物に関する。
【００８２】
本発明のmiRNAインヒビター、または該インヒビターを構成するRNA（ここでRNAとしては、天然のRNAおよび類縁体を含む）、あるいは該RNAを発現するベクターは、miRNAを阻害するための組成物とすることができる。本発明の組成物は、標的miRNAを特異的かつ効率的に阻害できるので、miRNAの阻害を介した遺伝子の機能制御に有用である。本発明の組成物は、必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。薬理学的に許容される所望の担体には、通常核酸の懸濁に用いられる所望の溶液が挙げられ、例えば蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が例示できる。また植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。また本発明の組成物は、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などを担体として組み合わせることもできる。本発明の組成物は、所望の試薬として、または医薬組成物として使用できる。また本発明は、本発明の組成物、本発明のmiRNAインヒビター、または該インヒビターを構成するRNAもしくは該RNAを発現するベクターの、miRNAを阻害するための使用を提供する。また本発明は、それらのいずれかを含むmiRNA阻害剤を提供する。また本発明は、本発明の組成物、本発明のmiRNAインヒビター、または該インヒビターを構成するRNAもしくは該RNAを発現するベクターの、腫瘍を抑制するための使用を提供する。また本発明は、それらのいずれかを含む腫瘍抑制剤を提供する。
【００８３】
インヒビターの導入はin vitro、ex vivoまたはin vivoで行うことができる。投与ルートは、腫瘍に十分な量のインヒビターが到達するように適宜選択してよく、好ましくは腫瘍に直接投与される。適宜、適当なDDSと組み合わせて、腫瘍内注射、または静脈注射などで導入することができる。細胞を介して投与する場合は、適当な培養細胞または接種対象動物から採取した細胞などに導入する。核酸の導入としては、リン酸カルシウム共沈殿法、リポフェクション、DEAEデキストラン法、注射針等により直接DNA溶液を組織に注入する方法、ジーンガンによる導入などが挙げられる。ウイルスベクター等を用いて投与してもよい。投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、投与対象動物、投与部位、投与回数などに応じて適宜調整してよく、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができる。投与対象は、好ましくは哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む）である。具体的には、ヒト、サル等の非ヒト霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、およびその他の哺乳動物が含まれる。
【実施例】
【００８４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。【００８５】
[実施例１]  miR-200ファミリーの機能的阻害による上皮間葉転換の誘導
＜材料および方法＞
細胞培養
ヒト結腸腺癌細胞株HCT116（ATCCより入手）は10% ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM中で37℃で培養した。テトラサイクリン誘導実験においては、細胞を10%のTetシステム仕様のFBS（Tet-approved FBS (Clontech)）を含み、Dox（Doxycycline (Sigma)）を含むまたは含まないDMEM中で37℃で培養した。【００８６】
プラスミドの構築
H1プロモーター型、e7SK (enhanced 7SK) プロモーター型、およびTete7SK (Tetracycline-responsive e7SK) プロモーター型のTuDシャトルベクターの構築のために、表１にリストとして示したDNA断片をGenscript (NJ, USA) により合成した。これらのPolIII-TuDシャトル断片をBamHI およびEcoRIで消化し、pCR2.1のBamHI-EcoRI 部位にクローン化して、それぞれpH1-TuD-shuttle、pe7SK-TuD-shuttle、およびpTete7SK-TuD-shuttle ベクターを生成した。他の２つのPolIII-TuDshuttle ベクター、pmU6-TuD-shuttleおよびph7SK-TuD-shuttleは既に記載されている（Nucleic Acids Res. 37: e43, 2009; Nucleic Acids Res. 40: e58, 2012）。【００８７】
【表１】
2017057312.tif 000003
（上から順に配列番号8〜10）【００８８】
レンチウイルスの構築のために、pLenti6/V5-GW/lacZ (Life Technologies) をAgeIで消化し、Klenow fragmentで処理した後KpnIで消化した。pLSP（Nucleic Acids Res. 37: e43, 2009）をClaIで消化し、Klenow fragmentで処理した後KpnIで消化した。これらの0.9kb断片と5.1kb断片をリガーゼで結合させてpLSBを生成させた。Tet誘導型のTuD RNA発現レンチウイルスベクターを構築するために、pTete7SK-TuD-200c、pTete7SK-TuD-141/200cおよびpTete7SK-TuD-NCのBamHI-EcoRI 断片をレンチウイルスベクターpLSB にサブクローン化し、それぞれ pLSB-Tete7SK-TuD-200c、pLSB-Tete7SK-TuD-141/200cおよび pLSB-Tete7SK-TuD-NCを生成した。ルシフェラーゼレポータープラスミドの構築のために、表２にリストとして挙げたオリゴヌクレオチドのペアをアニーリングさせ、psiCHECK2 (Promega) のXhoI-NotI部位にクローン化して、それぞれpsiCHECK2-T21、psiCHECK2-T200c およびpsiCHECK2-T141を生成させた。【００８９】
【表２】
2017057312.tif 000004
（上から順に配列番号11〜16）【００９０】
テトラサイクリン誘導性細胞株の構築
HCT116細胞を6ウェルプレートにウェルあたり1x105 細胞で撒き、8μg/mlのポリブレンの存在下でpXL001 (for PolIII system; Addgene plasmid 26122) ウイルスストック（<1x104 TU）を導入し、導入の24時間後からpuromycin (1μg/ml) で選択した。10日間の選択の後、培地からpuromycin を除いた。 FACS Aria (BD) を用いたFACSソーティングにより幾つかの安定なクローンを単離し、それらの１つを選択してHCT116-TetONIIIと名付けた。HCT116-TetOnIII細胞を10% FBSを含むDMEM中、6ウェルプレートでウェルあたり1x105 細胞で撒いた。24時間後、8μg/mlのポリブレンの存在下でpLSB-Tete7SK-TuD-141/200c または pLSB-Tete7SK-TuD-NCのウイルスストック (3x105 TU) をそれぞれ細胞に導入し、それぞれHCT116-TetOn-TuD-141/200c 細胞およびHCT116-TetOn-TuD-NC 細胞を生成した。さらに24時間後に10% FBSおよびblasticidin (10μg/ml)を含むDMEMに培地を置換した。7日間の選択の後、培地からblasticidin を除いた。【００９１】
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
トランスフェクションの前日に、10％FBSを含むDMEM中、24ウェルプレートにウェルあたり1x105 細胞の密度で細胞を撒いた。 HCT116-TetOnIII細胞にPEI-MAX (Polysciences Inc.) および 200ng のデュアルルシフェラーゼ標的レポータープラスミド (図６)、および10-300 ng のTuD RNA 発現プラスミドをトリプリケートでトランスフェクションした。HCT-116-Tet-On-TuD141/200c 細胞および HCT-116-Tet-On-TuDNC 細胞にPEI-MAX および 200ng のデュアルルシフェラーゼ標的レポータープラスミドをトリプリケートでトランスフェクションした。すべてのアッセイはトランスフェクションの48時間後にデュアルルシフェラーゼアッセイ (Promega, Madison, WI) を用いて Glomax (Promega) 上で実施した。【００９２】
[実施例１−１]  PolIII駆動性TuD発現ベクター
PolIII で駆動するプロモーターにおいては、マウスU6, ヒトHI, ヒト7SK およびその改変型 (e7SK) のプロモーターを試験した (図７A)。これらのプロモーターの中で、TuD-21を産生する配列の上流に位置させたe7SK プロモーターが最も高いmiRNA阻害活性を示し、上記と同じレポーター系を用いた場合に、内在性のmiR-21が誘導するRNA干渉をほとんど相殺した（図７B）。そこで調節可能ベクターを作製するための基盤となる親ベクターとしてe7SK プロモーターを用いることにした。また、PolII またはPolIII プロモーターを持つこれらのTuD発現プラスミドをトランスフェクションした場合、OAS1, OAS2, MX1, IRF9 およびIFITM1 などのインターフェロン応答遺伝子の発現は検出されなかったことから、S-TuD（合成TuD）RNAのトランスフェクションで報告されているのと同様に、これらのTuD転写産物はいずれも、意図しない免疫刺激を誘導しないことが示された。【００９３】
[実施例１−２]  テトラサイクリン誘導TuD RNA発現系の開発
Tet誘導性 PolIII-プロモーター駆動TuD RNA発現系を開発するため、テトラサイクリン応答配列を含む10タイプのe7SK プロモーター派生体（#1-#10）を構築して当該配列の最適な部位と数をスクリーニングした（図８A）。 また、tTR-KRAB 発現レンチウイルスベクター（pXL001）を導入後の細胞をクローン化し、HCT116-TetOnIIIと名付けた。 これらの10タイプの各プロモーターを搭載するTuD-21のための発現プラスミドをトランスフェクションしたところ、Tet#6 プロモーター（配列番号：76）およびTet#10プロモーター（配列番号：77）はDox-の条件下でmiR-21を全く阻害しない一方、Dox 存在下では阻害効果を完全に保持した（図８B）。#6プロモーターをTete7SKプロモーターと名づけ、続く解析に用いた。【００９４】
Tete7SKプロモーターはTuD-200c産生DNA配列の上流に配置され、レンチウイルスベクターに導入された（図２A）。 このベクターをHCT116-TetOnIII細胞に導入すると、レポーターアッセイで判断する限り、Dox 非存在下ではmiRNA阻害効果は観察されなかった一方、Dox濃度 10 nM〜1μM の用量においては、内在性miR-200c活性のほぼ完全な抑制が観察された（図２B）。 このDoxのレンジでは細胞障害または細胞増殖抑制効果（cytopathic or cytostatic effects）は観察されないことから、この系は内在性miRNAの全か無かのスイッチングの解析に適用可能と考えられたため、それ以後の解析には0.1μMのDoxでTuD発現を誘導した。【００９５】
[実施例１−３]  miR-200ファミリー活性の調節性阻害によるEMTおよびMETの誘導
miR-200 ファミリーのメンバーは、EMTの鍵となるレギュレーターの１つである。 HCT116 細胞株のmiRNAマイクロアレイ解析は、２つのmiR-200遺伝子座が基底レベルで転写されており、一方、miR-200c/-141 (12番染色体から転写される) の産生は他のmiR-200メンバー（1番染色体から転写される）のそれよりもはるかに高いことを示している。最近、コア配列中の単一ヌクレオチドの違い（5'末端から2から8 bp）のために、miR-200a およびmiR-200bは異なる標的特異性を有しており、一方、それらの間で、相当数の標的遺伝子が重複していることが報告されている。miR-200cのコア配列はmiR-200b およびmiR-429と共通しており、miR-200aのそれはmiR-141と同じ（図３−１A）であることを考慮し、すべてのmiR-200ファミリーメンバーを効率的に阻害するために、２つのマイクロRNA結合部位がそれぞれ miR-200cおよびmiR-141と相補的なハイブリッド型TuDを設計した（図３−１A）。これは、TuD分子の各MBSは標的miRNAと同じコア配列を有するmiRNAを効率良く阻害できるからである。【００９６】
Tete7SK-TuD-141/200c発現レンチウイルスベクターをHCT116-TetOnIII細胞に導入し、薬剤選択を行い、HCT116-TetOn-TuD-141/200cと名付けた。これらの細胞培養はDox非存在下（Dox-）で継続して増殖させ続けるか、あるいはday 0 でDoxを加えた（Dox+）。 Dox+培養の半数から、day 18でDoxを除去し（Dox+/-）、他の半数はDox存在下でさらに増殖させ続けた（Dox+）。【００９７】
これらの過程において３日毎に、ESAの発現プロフィールをFACSで調べ（図３−１B および図９）、細胞の形態を観察した（図３−２C）。Dox+細胞は立方体様構造（cuboidal structure）を喪失し始め、day 6辺りで、延びた間葉系様（elongated mesenchymal-like）の形態をとった。Dox+のESA 発現プロフィールの全体のピークは、day 9のDox-のそれの約1/4となるピークにシフトしたことから、EMTはこれらの培養の集団全体で起きていることが示された。Dox+/- 細胞においては、形態およびFACS で検出されたESAの発現レベルは、day 30（Dox除去の12日後）までにDox-の状態に完全に戻った。【００９８】
図示した時点の2日前にトランスフェクションしたレポータープラスミドのルシフェラーゼ活性を測定することにより、miR-200c およびmiR-141 の両方の活性を決定した（それぞれ図４A および B）。Day 6では、Dox+細胞におけるmiR-200c またはmiR-141のいずれかのレポーター活性は標的配列を持たないレポーター活性（untargeted, UT）と似たレベルに達したことから、miR-200c またはmiR-141のいずれかによるRNA干渉はほとんど完全に抑制されたことが示された。それとは対照的に、miR-200c およびmiR-141の活性はday 27 （Dox除去の9日後）までにもともとの状態に復帰した。DOX除去後のレポーター活性の減少のカイネティクスから、TuD-141/200cのインビボにおける半減期はおよそ2.2日だと概算することができた。【００９９】
Tete7SK-TuD-200c発現レンチウイルスベクターをHCT116-TetOnIII細胞に導入し、薬剤選択を行い、HCT116-TetOn-TuD-200cと名付けた。これらの細胞培養をDox+で30日以上行った。レポータープラスミドをトランスフェクションして２日後にルシフェラーゼ活性を測定することにより、miR-200c およびmiR-141 の両方の活性を決定した（図５）。miR-200cのレポーター活性は標的配列を持たないレポーター活性と似たレベルに達したことから、miR-200cによるRNA干渉はほとんど完全に抑制されたことが示された。【０１００】
一方、miR-141のレポーター活性は標的配列を持たないレポーター活性と比べて低いままであったことから、miR-141によるRNA干渉はほとんど抑制されていないことが示された。以上からTuD-141/200cと比べてTuD-200cはmiR-200cの活性は抑制するが、シード配列が1塩基異なるファミリーであるmiR-141は抑制しないことが分かった。【０１０１】
[実施例２]  miR-200ファミリーの機能的阻害による乳がん腫瘍抑制
＜材料および方法＞
細胞培養
トリプルネガティブ乳癌細胞株SUM149PT（SUM149とも言う）はAsterand から入手し、5% foetal bovine serum (FBS), 10mM HEPES, 5μg/ml Insulin, 1μg/ml Hydrocortisone および5μg/ml Gentamicin を含むHam's F-12培地 (SUM149PT培地) 中、37℃で培養した。テトラサイクリン誘導実験では、1μg/ml Doxycycline (Sigma-Aldrich) を含むまたは含まない、5% Tet-approved FBS (Clontech), 10mM HEPES, 5μg/ml Insulin, 1μg/ml Hydrocortisone および 5μg/ml Gentamicin を含むHam's F-12培地中、37℃で細胞を培養した。【０１０２】
抗体染色およびFACS解析
SUM149PT細胞をαESA-APC (324208, BioLegend)、αCD24-PE (311106, BioLegend)、αCD44-FITC (338804, BioLegend)、αESA-PE (324206, BioLegend) およびαCD49f-FITC (313606, BioLegend) で染色し、FACS Calibur (BD) で解析した。【０１０３】
RNA調製およびmiRNA用miArray
SUM149PT細胞からmiRVana (Life Technologies) を用いて全RNAを調製した。これらのRNA試料に対し、ヒトmiRNA解析のための3D-Gene miArrayをToray Industries Inc. にて実施した。【０１０４】
プラスミド構築
レンチウイルスベクタープラスミドを構築するため、pLSP (Haraguchi T. et al., Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e43) をClaIで消化しKlenow fragmentで処理後、KpnIで消化した。またpLenti6/V5-GW/lacZ (Life Technologies) をAgeIで消化しKlenow fragmentで処理後、KpnIで消化した。これらの5.1kb断片および 0.9kb 断片をライゲーションに供してpLSBを生成した。
PolIIIプロモーター駆動TuD RNA発現プラスミドを構築するため、一連のオリゴヌクレオチド対（表３）をアニーリングさせ、BsmBIで消化した PolIII-型-TuD-シャトルベクター（ph7SK-TuD-shuttle (Haraguchi T. et al., Nucleic Acids Res. 2012;40(8):e58) およびpTete7SK-TuD-shuttle ）中にクローン化してPolIII-駆動TuD RNA発現カセットを生成した。これらのカセットをpLSPまたはpLSB のBamHI-EcoRI部位にサブクローン化してPolIII-駆動TuD RNA発現レンチウイルスベクタープラスミドを生成した。【０１０５】
【表３】
2017057312.tif 000005
（上から順に配列番号17〜24）【０１０６】
miR-200c 発現カセットを構築するため、オリゴヌクレオチド対（表４）を鋳型なしでPCRに用い、産物を pCR2.1 (Life Technologies) にサブクローン化した。このプラスミドのBbsI-EcoRI断片をpmU6 (Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99, 6047-6052) のBbsI-EcoRI部位にサブクローン化してmU6-driven miR-200c発現カセットを生成した。mU6-driven miR-141 およびmiR-205発現カセットを構築するため、表５にリストで示したDNA断片をGenscriptにて合成した。これらのカセットをpLSPの BamHI-EcoRI部位にサブクローン化してmU6-駆動miRNA発現レンチウイルスベクタープラスミドpLSP-miR141, pLSP-miR200c および pLSP-miR205 を生成した。このpLSP-miR141をEcoRIで消化し、Klenow fragmentで処理した後、NheIで消化した。pLSP-miR200cをBamHIで消化し、Klenow fragmentで処理した後、NheIで消化した。これらの0.4kb断片および6.5kb断片をライゲーションに供してpLSP-miR141+miR200cを生成した。【０１０７】
【表４】
2017057312.tif 000006
（それぞれ配列番号25、26）【０１０８】
【表５】
2017057312.tif 000007
（それぞれ配列番号27、28）【０１０９】
ルシフェラーゼレポータープラスミドを構築するため、表６にリストで示したオリゴヌクレオチド対をアニーリングさせ、psiCHECK2 (Promega) のXhoI-NotI部位にクローン化して、それぞれpsiCHECK2-T141, psiCHECK2-T200c および psiCHECK2-T205 を生成した。インビボイメージングシステムのためのルシフェラーゼレポータープラスミドを構築するため、pTK4.12 (Haraguchi T. et al., Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e43) をClaI で部分消化し、さらにHindIIIで消化した。これらのpLSP の0.4kb ClaI-HindIII 断片と4.0kb 断片をライゲーションに供した。このプラスミドをXhoIで消化し、Klenow fragmentで処理した後、XbaIで消化した。またpIRESneoをBglIIで消化し、Klenow fragmentで処理した後、XbaIで消化した。これらの4.3kb断片と1.5kb断片をライゲーションに供した。産物をClaI および XbaIで消化し、3.5kb 断片をpLSP のClaI-XbaI部位にクローン化してpLenti-SV40-FLuc-IRES-Neoを生成した。【０１１０】
【表６】
2017057312.tif 000008
（上から順に配列番号29〜34）【０１１１】
ウイルス導入
SUM149PT細胞を、SUM149PT培地中、6ウェルプレートにウェル当り1x105 細胞で撒いた。24時間後、それらの細胞に各TuD RNAウイルスストック（3x105 TU）またはmiRNA ウイルスストック（3x105 TU）を、8μg/ml のポリブレンの存在下で導入した。さらに24時間後、培地をpuromycin (1μg/ml)またはblasticidin （10μg/ml）を含むSUM149PT培地に交換した。10日間の選択後、培地からblasticidin を除いた。【０１１２】
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
トランスフェクションの前日に、SUM149PT培地中、24-ウェルプレートにウェル当り1x105 細胞で細胞を撒いた。SUM149PT細胞にPEI-MAX および 200ngのデュアルルシフェラーゼターゲットレポータープラスミドをトリプリケートでトランスフェクションを実施した（図２２）。すべてのアッセイは、トランスフェクションの48時間後にデュアルルシフェラーゼアッセイ（Promega）をGlomax (Promega) にて実施した。【０１１３】
腫瘍様塊アッセイ
SUM149PT 細胞をFACS Aria (BD) でソートし、MammoCult Medium (STEMCELL Technologies社)中、ultra-low attachment round bottom 96 ウェルプレート（Corning）にウェルあたり単一細胞で撒いた。３日毎にHydrocortisoneを添加した。【０１１４】
RNA 調製および定量的RT-PCR
細胞から Direct-zol (Zymo Research) を用いて全RNAを調製した。その後、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TAKARA) を用いて第一鎖cDNAを合成した。StepOne real-time PCR system (Life Technologies) を用い、SYBR Select Master Mix (Life Technologies) をレポーターとしてリアルタイムRT-PCRを実施した。データはGAPDH 発現を用いて標準化した。リアルタイムRT-PCRに用いたプライマーの配列は表７にリストにして示した。【０１１５】
【表７】
2017057312.tif 000009
（上から順に配列番号35〜72）【０１１６】
細胞増殖アッセイ
SUM149PT細胞をSUM149PT培地中、96ウェルプレートにウェル当り1x103 細胞で撒いた。24時間毎に、luminescent ATPベースのアッセイ系である CellTiter GLO (Promega) を用い、製造元の説明書に従ってGLOMAX上で細胞の代謝活性を決定した。【０１１７】
テトラサイクリン誘導細胞株の構築
SUM149PT 細胞を6ウェルプレートにウェル当り1x105 細胞で撒き、8μg/mlのポリブレンの存在下、pXL001 (Addgene plasmid 26122) ウイルスストック (<1x104 TU) を導入し、導入の24時間後からピューロマイシン (1μg/ml) で選択した。選択の10日後、ピューロマイシンを培地から除去した。これらの細胞を6ウェルプレートにウェル当り1x105 細胞で撒き、8μg/mlのポリブレン存在下、pLSB または pLSB-Tete7SK-TuD-141/200c ウイルスストック（3x105 TU）を導入し、導入の24時間後からBlasticidin （10μg/ml）で選択した。10日間の選択後、培地からblasticidin を除去した。これらの細胞のESA+画分を、DoxycyclineなしでFACS Aria (BD) でソートした。pLSB導入細胞からソートした細胞を SUM149PT-TetOn-Emptyと名付けた。ソートの4日後に、pLSB-Tete7SK-TuD-141/200c 導入細胞をDoxycycline（1μg/ml）と共に13日間培養し、ESA- 細胞をFACSソーティングで選択した。その後、これらの細胞をDoxycycline なしで15日間培養し、ESA+ 細胞をFACSソーティングで選択した。この細胞をSUM149PT-TetOn-TuD-141/200cと名付けた。【０１１８】
動物実験
雌BALB/cヌードマウスをJapan SLCより購入し、すべての実験で6週齢のマウスを使用した。細胞をSUM149PT 培地に懸濁し、等量のMatrigel (BD) を混合し、乳腺脂肪体に注入した。腫瘍体積はデジタルノギスで計測した。ルシフェラーゼ発現ウイルスベクターを導入したSUM149PT細胞を移植したマウスに150 mg/kgのVivoGlo Luciferin (Promega) を皮下注射し、全身の発光画像をIVIS 100 (Xenogen)で撮影した。
インビボテトラサイクリン誘導実験では、5 x 105 細胞を乳腺脂肪体に注入した。移植の25日後から、マウスを水（対照）または2mg/ml Doxycycline 5% sucrose水の不断給餌で維持した。Doxycycline 水は遮光ボトルに入れ、週２回交換した。【０１１９】
統計解析
ルシフェラーゼレポーターのデータは両側スチューデントt検定で分析した。腫瘍体積データはTukey のポストホックテストを用いたtwo-way ANOVA により分析した。p値 < 0.05で有意と考えられる。腫瘍体積の線グラフにおいては、データは平均+SDで表した。他のグラフではデータは平均±SDで表した。【０１２０】
[実施例２−１]  表面マーカーESA およびCD24による腫瘍細胞のサブポピュレーションの分離
まず、トリプルネガティブ乳癌細胞株SUM149PT の元々の細胞培養のESA およびCD24 の発現レベルをFACS を用いて調べたところ、SUM149PT細胞の99％より多くがESA(+)細胞であり、CD24発現は広い分布を示すことを見出した（図１０−１A）。これらのESA(-) 細胞をソートし、28日間培養してFACSで解析したところ、ESA(-)細胞の割合は20％に増加していた。これらの細胞のCD24の発現レベルは、ESAの発現状態とは独立に、再び広く分布していた（図１０−１A）。SUM149PT のサブポピュレーションの分離には、ESA/CD49f およびCD44/CD24 もマーカーとして用いられうることから、図１０−１Aに示したのと同じ細胞培養をこれらの２つの表面マーカーの対を用いてソートした。CD49f（図１０−１A）もCD44 （データ非提示）も本実施例の条件においては細胞集団を有意に分離しなかったことから、以後の解析にはESA/CD24マーカーを分離に用いることに決定した。これらの細胞から ESA(+)/CD24(+)、ESA(+)/CD24(-)、ESA(-)/CD24(+)、およびESA(-)/CD24(-) の細胞をセルソーティングにより単離して増殖させ続けると、これらの４つのタイプのサブポピュレーションは異なる細胞形態をとった（図１０−１B）。特に、ESA(+) 細胞は立方体状の形体（cuboidal shape）を示す一方、ESA(-)はより延びたスピンドル状の形体（elongated and spindle-shape）をとっていた。【０１２１】
FACSによる各画分から単一細胞を単離して一箇月間培養し、FACSにおいて元の細胞のアイソレートと同じESA/CD24発現パターンをほぼ発現しているクローナルな培養（各画分について３クローン）を得た（図１０−２C, および図１９）。重要なことに、各細胞クローンとも、２箇月より長く培養すると、CD24 またはESAの発現レベルが異なる他のサブポピュレーションに見いだされる、表現型が異なる細胞のタイプが増加し始めた（図１０−２C）。これらの細胞は単一細胞に由来することから、これらの移行をソーティングの過程におけるコンタミネーションで説明することはできない。これらの結果は、ESA およびCD24の発現状態によりSUM149PT 細胞は４つの細胞状態のいずれかとして存在し得るものであり、それらは様々な頻度で確率論的に相互変換可能であることを示している。【０１２２】
[実施例２−２]  ESA(+) 細胞が持つ高度な造腫瘍活性
クローナルな細胞解析に伴う潜在的な問題回避するため、図１０−１A（下パネル）に示したものと類似した培養からFACSにより分離した各サブポピュレーション ESA(+)/CD24(+), ESA(+)/CD24(-), ESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) から104 細胞以上を集めた（図１１−１A）。SUM149PT細胞はマウス乳腺に注入するとインビボで非転移性の原発腫瘍を形成する。そこで、上記で調製したこれら４つのサブポピュレーションからの細胞をヌードマウスの乳腺脂肪体（fad pads）に注入した。ESA(+)サブポピュレーションを30000細胞注入して４週間以内に、宿主マウスは目視可能な乳癌を示した（図１１−２B）。しかしESA(-)/CD24(-) 細胞はより後のステージで小さな腫瘍を形成し、ESA(-)/CD24(+)細胞は全く腫瘍を形成しなかった。300細胞の注入では、ESA(+)細胞は依然として腫瘍を形成したが、ESA(-) 細胞はいかなる腫瘍も形成しなかった（図１１−２C）。間葉系の性質を持つ小さな（minorな）細胞集団ではなく、元々のSUM149PTにおいて上皮細胞の性質を持つ主要な細胞画分が癌開始細胞（癌幹細胞）形質を示すことは予想外のことであった。【０１２３】
ESA(+)/CD24(+), ESA(+)/CD24(-), ESA(-)/CD24(+) およびESA(-)/CD24(-) のサブポピュレーションを、６週間毎に連続して４回FACSにて精製し、元々の混合培養から直接ソートしたサブポピュレーションに関して記載したのと同じようにマウス乳腺脂肪体に注入した（図１０−１A参照）。元々の混合培養から１回のみソートしたサブポピュレーションとは異なり、長期培養のESA(-)のサブポピュレーションは２つとも、300または30000細胞の注入のいずれにおいても造腫瘍活性は完全に喪失した（図２０AB）。もともとの混合培養からソートしたESA(-)細胞（特にESA(-)/CD24(-)）（図１０−１A）は、連続的に４回精製した培養と比べて、ESA(-)からESA(+)への遥かに高い移行頻度を持っていたので（図１１−１A）、ESA(-)から変換したESA(+) 細胞は、この画分による腫瘍形成に貢献する機能的な幹細胞様細胞（functional stem-like cells）であることが示唆された。【０１２４】
さらに特筆すべきことに、連続ソートしたESA(+)/CD24(-)サブポピュレーションの造腫瘍活性は、連続ソートしたESA(+)/CD24(+)のそれより遥かに高かった。 これらの観察から、元々の混合培養から直接ソートしたサブポピュレーションにおいて観察されたESA(+)/CD24(+) からESA(+)/CD24(-)への急速な移行が癌開始細胞の画分を見えにくくさせた可能性があり、癌開始細胞（癌幹細胞）は主にESA(+)/CD24(-)サブポピュレーションに含まれていることが示唆される。続く実施例においては、動的な相互変換における細胞の特性および振る舞いを再現・観察するために、元々の混合培養から直接ソートしたサブポピュレーションに焦点を当てた。【０１２５】
[実施例２−３]  ESA(+) 細胞におけるmiRNAの増強
miRNAの特定のサブセットがサブセルラーポピュレーションにおける表現型の平衡をモジュレートしていると仮定し、これら４つのサブポピュレーションにおけるmiRNA発現パターンを細胞ソーティングの直後に解析した。miR-200ファミリーメンバーのすべて（miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141 および miR-429）の発現レベルはサブポピュレーションによって明らかに異なっていた（図２１）。すべてのmiR-200ファミリーメンバーは、CD24の発現状態とは独立に、ESA(-)細胞よりもESA(+)細胞において遥かに高いレベルで発現していた。miR-200ファミリーの５つのすべてのメンバーは２つの染色体座から産生されることが知られている；miR-200b, miR-200a および miR-429 は1番染色体上にクラスターを形成している一方、miR-200c およびmiR-141 は12番染色体上にグループを形成し、いずれのクラスターもポリシストロニックな転写産物として発現される。miR-200c およびmiR-141の発現レベルは他よりも高いので（図２１）、miR-200c/miR-141 座が、この細胞株におけるmiR-200ファミリーメンバー産生の主要な部位と考えられた。一方、両方の座の発現はサブポピュレーションの中で同様に調節されているようであった。重要なことに、miR-141, -200a および miR-200c, -200b, -429 の間ではシード配列が異なり、mRNA結合特性はmiR-200 ファミリー中で異なっている。そこで、シード配列の２つのサブグループをモジュレートするため、それぞれmiR-141 およびmiR-200c を用いることにした。【０１２６】
各miRNAのために設計したルシフェラーゼレポーターを４つのサブポピュレーションにトランスフェクションすることにより（T141 および T200, 図２２）、それらのレポーター活性が、これらのmiRNAの量と一致していることを確認した（図１２A）。これらの観察から、もしこれらのmiRNAが細胞の平衡に対して原因となる効果を有しているのなら、miR-200 ファミリーの発現はESA(-) からESA(+)細胞への移行をサポートするだろうと予測した。【０１２７】
これら４つのサブポピュレーションそれぞれにおいてmiR-205, -141 および-200cの内在性活性をモジュレートするため、miRNA発現レンチウイルスベクターまたはTuD RNA発現レンチウイルスベクターを、図１０−１A（下パネル）に示したものと類似した混合細胞集団に導入した。導入の2日後に、これらの導入細胞を４つのサブポピュレーションにソートした。これらのベクターの効果を評価するため、これらの安定な導入細胞をすべて19日間増殖させ続け、その後、上記と同じルシフェラーゼレポーターをトランスフェクションした（図１２BCD）。ESA(+)/CD24(-), ESA(-)/CD24(+) およびESA(-)/CD24(-) へのmiR-205ベクターの導入は、miR-205 活性を、ESA(+)/CD24(+) のそれよりも上昇（ルシフェラーゼの活性を低下）させた一方、TuD-205のESA(+)/CD24(+) への導入は、miR-205活性を、ESA(+)/CD24(-)のそれと同程度に低下させた。miR-141 またはmiR-200c発現ベクターの導入は、ESA(-)細胞におけるmiRNA活性を、それぞれESA(+)細胞の対応する内在性レベルと同程度または僅かに低い程度にまで増加させた。それに対して、対応するTuD RNA発現レンチウイルスベクターを導入したESA(+)細胞では、各miRNAの活性は効率的に阻害された。【０１２８】
４週間増殖させた後のこれらの導入細胞のFACS解析（図２３）により、 ESA(+)/CD24(+) またはESA(+)/CD24(-) 細胞にTuD-200c またはTuD-141を導入した場合、ESA(-)画分においてより大きなポピュレーションが見いだされた。miR-200c発現レンチウイルスベクターを導入したESA(-)/CD24(+) または ESA(-)/CD24(-) 細胞のより大きなポピュレーションがESA(+)細胞に変換された一方、外来性miR-141発現による変換はより低い程度であった（図２３）。【０１２９】
以上の結果から、これらのサブポピュレーション間の平衡を変化させるために、これらのサブポピュレーションにおいてmiR-200c および -141 をモジュレートすることが有用であることが判明した。【０１３０】
[実施例２−４]  miR-141 および -200cによるESA(-)からESA(+)への移行の促進と、miR-141 および -200cの阻害によるESA(+)からESA(-)への移行の促進
miR-200c またはmiR-141のみの機能レベルをモジュレートすることにより誘導される相互変換は明らかではあるが、依然として部分的なものに留まる。これは、miR-200c およびmiR-141の標的は有意に重複しているがこれらの２つのmiRNAは異なる標的遺伝子もあるという以前の観察を反映していると考えられる（Bracken et al., EMBO J. 33: 2040-20506, 2014）。そこで、それらの両方を、単一のベクターにより同時に発現または阻害してその効果を検証した。高レベルの同時発現のため、レンチウイルスベクター中にmiR-141 およびmiR-200c発現ユニットをタンデムに配置した（miR-141+miR-200c 発現ベクター）。また、同時阻害のために、２つのmiRNA 結合部位がそれぞれmiR-141 および miR-200cの相補配列からなるハイブリッド型のTuD分子を発現するレンチウイルスベクターを用いた（実施例１）。それらを上記の混合細胞集団に導入したが、後のインビボ解析のために、前もってルシフェラーゼ遺伝子の発現ベクターを導入しておいた。それらの各々を導入して２日後に、これらの導入細胞を４つのサブポピュレーションにソートし、３週間増殖させ、ESA および CD24の発現レベルをFACS解析により決定した（図１３）。miR-141+miR-200c 発現ベクターを導入したESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-)細胞のほとんどすべてはESA(+) 細胞への変換を示した。一方、TuD-141/200cを導入したESA(+)/CD24(+) および ESA(+)/CD24(-) 細胞の約80％はESA(-)細胞へ転換した。ESA(+)/CD24(+) および ESA(+)/CD24(-) のポピュレーションをソートして16日間増殖させた並行培養を用いて、それらのそれぞれからESA(-) 細胞のみをソートした。 空ベクターを導入したものと違い、TuD-141/200cを導入したESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) 細胞ではESA(+)細胞への変換は全く検出されなかったことから、標的miRNAがもともと僅かで、後に確率論的に誘導が起こる細胞であっても、TuD RNAはここで予防的に作用したことを示唆している。【０１３１】
[実施例２−５]  miR-200ファミリーの活性抑制による腫瘍様塊形成活性の喪失
腫瘍様塊（mammosphere）形成は癌幹細胞形質の評価によく用いられていることから、上記で調製したすべての導入細胞を単一細胞としてソートし、低接着プレートを用い、腫瘍様塊アッセイ培地中で増殖させ続けた。図１４Aに示した通り、空ベクターを導入したESA(+)細胞はすべて、10％より高い頻度で典型的な腫瘍様塊を形成した一方、 TuD-141/200cベクターを導入したESA(+)細胞では、空ベクターを導入したESA(-)細胞と同じくらいにまで劇的に腫瘍様塊形成が低下した（およそ2％）。miR-141/200cベクターを導入したESA(-)細胞は10％より高いレベルに腫瘍様塊形成頻度が上昇した。重要なことに、これらの観察はCD24の発現レベルによって全く影響されなかった。また特筆すべきことに、ここで調べたすべての導入細胞は、単層培養で測定しても増殖速度に有意な違いを示さなかった（図２４）ことから、観察されたサブポピュレーション間の変換は、異なる状態における増殖速度の違いでは説明できない。全体として、これらの知見はmiR-200cの高レベルの発現は腫瘍様塊形成活性と強く相関していることを示している。
このアッセイの過程において、空ベクターを導入した ESA(-)細胞は、TuD-141/200cベクターを導入した ESA(+) 細胞と同様に、低接着プレートにおいてシート様のコロニーを形成することが見いだされた（図１４B）。【０１３２】
シート様コロニー形成の頻度はESA(-)細胞で高いことから、シート様コロニーにより表わされる生物学的特性は非上皮形質に関連している可能性がある。また、特筆すべきことにmiR-200c/141を導入した ESA(-)細胞は両方のタイプのコロニーを形成すると共に、中間的なタイプのコロニーも形成した（図１４AB）ことから、それらには、非上皮および上皮細胞タイプの間の転換状態が異なる細胞集団が混ざっていることが示唆される。【０１３３】
[実施例２−６]  miRNA200ファミリーの阻害により誘導される遺伝子発現プロフィールの変化
４つのサブポピュレーションそれぞれの情報をさらに得るために、Zeb1、Zeb2、およびTGFβ2 mRNA（これらはmiR-200ファミリーの標的としてよく知られている）、ESRP1（図１５）および CDH1（E-Cad）（図１６）mRNAなどの転写産物（これらはZeb1/Zeb2の転写サプレッサーの標的）、ESAおよびCDH3（上皮マーカー）、およびvimentinおよび CDH2 mRNAs（間葉マーカー）などの転写産物を定量するためにリアルタイムRT-PCR を実施した（図１６）。空ベクターを導入した各サブポピュレーションの細胞中のRNA転写産物のレベルを比較すると、ESA(+)細胞は高レベルの ESA, CDH1, CDH3, および ESRP1 (上皮マーカー) を発現していたのに対し、ESA(-)細胞は高レベルの Zeb1, Zeb2, vimentin および CDH2 を発現していた（図１５〜１６）。ちなみに、EMTを促進する鍵となる分子スイッチとしてしばしば報告されているSnail, Slug およびTwist の発現レベルは、この細胞系においてはESA(+) および ESA(-) 細胞の間で著しい差はなかった（図１６）。これらの結果は、親SUM149PTで観察されるESA(+) および ESA(-) サブポピュレーション間の自発的な相互転換は、それぞれ、典型的なEMTおよびMETだと解釈することができることを示しており、この細胞株が持つ上皮性の可塑性（epithelial plasticity）を実証している。重要なことに、ダブルネガティブフィードバックループを形成することが報告されている内在性のpri-miR-200c/141 および Zeb1は、相互移動可能な様式で確率論的に変化し、高pri-miR-200c/141 転写産物および 僅かなZeb1 mRNAを含む ESA(+) 細胞（メジャーなサブポピュレーション）、またはpri-miR-200c/141 および高Zeb1を含む ESA(-) 細胞（マイナーなサブポピュレーション）として存在していた。【０１３４】
TuD-141/200cを発現するベクターでESA(+)サブポピュレーションのmiR-200ファミリーの活性を阻害すると、上皮の表現型は、間葉の表現型へと変化し、それらは空ベクターを導入したESA(-) サブポピュレーションの表現型と非常に類似していた。一方、miR-200c + miR-141ベクターをESA(-)サブポピュレーションに導入すると、それらの間葉の表現型は上皮様の表現型に変化し、それらはvimentin および CDH2 mRNAsを除き、空ベクターを導入したESA(+) サブポピュレーションの表現型と近いものであった。vimentin および CDH2 mRNAsの発現レベルはESA(+)サブポピュレーションにおいてはほとんど無視できるほどであったが、miR-200c + miR-141 ベクターを導入したESA(-) サブポピュレーションではそれらを有意なレベルで発現した。これら２つの遺伝子はZeb-1/Zeb-2によってポジティブに間接的な調節を受けていることが報告されている。これは、上記の観察は、それらには非上皮細胞型および上皮細胞型の間の異なる転換状態の細胞集団が混ざっていることを部分的に反映している可能性を示唆している。【０１３５】
[実施例２−７]  腫瘍細胞のいずれのサブポピュレーションに対しても発揮されるmiRNA200ファミリー阻害による腫瘍抑制作用
上記のように調製したmiR-141+miR-200c 発現レンチウイルスベクターまたはTuD-141/200c発現レンチウイルスベクターを導入した細胞をヌードマウスの乳腺脂肪体（fat pad）に注入し造腫瘍活性を調べた（図１７）。TuD-141/200cはESA(+)/CD24(+) および ESA(+)/CD24(-)細胞の造腫瘍活性を有意に低下させた。それらからソートしたESA(-) 画分は腫瘍を有意に形成しなかったことから、それらに残存する造腫瘍活性は、完全にESA(-) に変換していない細胞画分に由来すると考えられる。これとは対照的に、miR-141+miR-200cベクターを導入したESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) 細胞は、後期に小さな腫瘍を形成する空ベクターを導入したそれらの細胞よりもはるかに高率で腫瘍を形成した。さらに、TuD-141/200cベクターを導入したESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) 細胞は全く腫瘍を形成しなかった。【０１３６】
IVISによりマウス個体内の腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性を画像化したところ、day 57においてすべての場合で転移は検出されなかった。さらに、IVISを用いた解析により、空ベクターを導入したESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) 細胞を移植したマウスにおいてのみ、注入部位に小さな癌細胞が検出されたが、TuD-141/200cを導入したマウスでは、day 127においてさえ、いかなる腫瘍も全く形成しなかった。TuD-141/200cはESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-) 細胞から ESA(+) 細胞への変換を完全に失わせたことから、空ベクターを導入したESA(-)/CD24(+) および ESA(-)/CD24(-)に由来するESA(+) 細胞が造腫瘍活性の原因であり、ESA(-)の非腫瘍開始細胞（ESA(-) non-tumour initiating cells）から確率論的に生じる腫瘍開始細胞（tumour initiating cells）を含んでいると考えられる。TuD-141/200cは、標的であるmiR-200c および -141がほとんど発現していない細胞においても予防的に造腫瘍活性を阻害したことは、miR-200c および -141が造腫瘍活性において鍵となる因子であることを支持している。【０１３７】
[実施例２−８]  形成された腫瘍のTuD-141/200cによる退縮
TuD-141/200cの治療可能性をさらに実証するために、Dox（テトラサイクリンの派生体）- 依存性TuD発現ユニット（Tet-ON）を搭載するレンチウイルスベクター系（実施例１）を用いて、TuD-141/200c発現を厳格に調節できるマウスモデル系を構築した。Tet誘導性のTuD-141/200cベクターおよび空ベクターを搭載するSUM149PT 細胞の調製の詳細は図２５に示されている。Day 25にこれらの細胞をマウスに注入し、サイズが42-60mm3 の腫瘍が形成されたとき、マウスの半数（各5頭）にDox（doxycycline）を含む水を与えた。その結果、Dox誘導性TuD-141/200cを持つマウスの腫瘍サイズは、Dox水を与えた場合のみ減少した（図１８）。これらのマウスの腫瘍サイズの減少は、Dox水の投与後14日間持続した。腫瘍サイズは後期において増加し始めたが、その増加速度はDox- の水を継続して与えたマウスと比較して有意に低かったことから、miR-200c および -141 の同時阻害は、既に形成された腫瘍に対しても有意な治療効果を発揮することが確認された。【０１３８】
[実施例３]  miR-200ファミリー阻害治療の他臓器由来がんへの適用
乳癌細胞株で見られたmiR-200ファミリー阻害による腫瘍の幹細胞遺伝子マーカーの発現パターン変動、腫瘍様塊形成効率の減少およびマウス体内での腫瘍形成の減少が他の臓器に由来する癌細胞においても誘導されることを確認するため、肺がん細胞において解析を行った。
＜材料および方法＞
細胞培養
非小細胞肺がん細胞株H596, A-427, HCC827はATCC から入手した。H596細胞は10% ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM中で37℃で培養した。A-427細胞は10% ウシ胎児血清（FBS）を含むEMEM中で37℃で培養した。HCC827細胞は10% ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI1640中で37℃で培養した。
ウイルス導入
H596細胞を、DMEM培地中、6ウェルプレートにウェル当り1x105 細胞で撒いた。24時間後、それらの細胞に各TuD RNAウイルスストック（3x105 TU）を、8μg/ml のポリブレンの存在下で導入した。さらに24時間後、培地をpuromycin (1μg/ml)を含むDMEM培地に交換した。7日間の選択後、培地からpuromycinを除いた。A-427細胞を、EMEM培地中、6ウェルプレートにウェル当り1x105 細胞で撒いた。24時間後、それらの細胞に各TuD RNAウイルスストック（3x105 TU）を、8μg/ml のポリブレンの存在下で導入した。さらに24時間後、培地をpuromycin (1μg/ml)を含むEMEM培地に交換した。7日間の選択後、培地からpuromycinを除いた。
HCC827細胞を、RPMI1640培地中、6ウェルプレートにウェル当り1x105 細胞で撒いた。24時間後、それらの細胞に各TuD RNAウイルスストック（3x105 TU）を、8μg/ml のポリブレンの存在下で導入した。さらに24時間後、培地をpuromycin (1μg/ml)を含むRPMI1640培地に交換した。7日間の選択後、培地からpuromycinを除いた。
抗体染色およびFACS解析、MACS解析
H596, A-427, HCC827細胞をαESA-APC (324208, BioLegend)、αCD24-PE (311106, BioLegend)およびαCD44-FITC (338804, BioLegend)で染色し、FACS Calibur (BD)またはMACSQuant(Miltenyi Biotec) で解析した。
腫瘍様塊アッセイ
ウイルス導入したA-427, HCC827細胞をFACS Aria (BD) でソートし、20ng/ml human bFGF(Sigma-Aldrich社), 20ng/ml human EGF(Sigma-Aldrich社), 1 x B27 (Life Technologies社)および4μg/ml heparin(Stem cell Technology社)を含むPhenol-red free DMEM/F12 (Life Technologies社)中、ultra-low attachment round bottom 96 ウェルプレート（Corning）にウェルあたり単一細胞で撒いた。３日毎にhuman bFGF, human EGFおよびheparinを添加した。
動物実験
雌BALB/cヌードマウスをJapan SLCより購入し、すべての実験で6週齢のマウスを使用した。ウイルス導入したH596細胞をDMEM培地に懸濁し、等量のMatrigel (BD) を混合し、右腹側部に注入した。腫瘍体積はデジタルノギスで計測した。
統計解析
腫瘍体積データはTukey のポストホックテストを用いたtwo-way ANOVA により分析した。p値 < 0.05で有意と考えられる。腫瘍体積の線グラフにおいては、データは平均+SDで表した。他のグラフではデータは平均±SDで表した。【０１３９】
[実施例３−１]  非小細胞肺がん細胞株における miR-141 および -200cの阻害によるESA(+)からESA(-)への移行の促進
miR-141 および miR-200cの同時阻害のために、２つのmiRNA 結合部位がそれぞれmiR-141 および miR-200cの相補配列からなるハイブリッド型のTuD分子を発現するレンチウイルスベクターを用いた（実施例１）。このベクターをH596細胞, A-427細胞およびHCC827細胞に導入し、puromycin選択後に、2-3週間増殖させ、ESA, CD44および CD24の発現レベルをFACS解析およびMACS解析により決定した。非小細胞肺がん細胞株においてはCD24よりもCD44の方が細胞集団の分離に優れていたことから、以後の解析にはESA/CD44マーカーを用いることとした。（図２６）。
TuD-141/200cを導入したH596細胞においてはもともと1%程度存在していたESA(+)細胞がほぼ喪失した。TuD-141/200cを導入したA-427細胞においてはESA(+)細胞の約80％がESA(-)細胞へ転換した。TuD-141/200cを導入したHCC827細胞においてはESA(+)細胞の約40％がESA(-)細胞へ転換した。【０１４０】
[実施例３−２]  miR-200ファミリーの活性抑制による腫瘍様塊形成活性の喪失
腫瘍様塊（sphere）形成は癌幹細胞形質の評価によく用いられていることから、TuD-NC(ネガティブコントロール)またはTuD-141/200cを導入したA-427細胞を単一細胞としてソートし、低接着プレートを用い、腫瘍様塊アッセイ培地中で増殖させ続けた。図２７Ａに示した通り、TuD-NCベクターを導入したA-427細胞は6％程度の形成効率で典型的な腫瘍様塊を形成した一方、TuD-141/200cベクターを導入したA-427細胞では、腫瘍様塊形成効率が1%未満まで低下した。
またHCC827細胞においても、ネガティブコントロールTuDベクターを導入した細胞と比べ、TuD-141/200cを導入した細胞では、腫瘍様塊形成率の低下が観察された。
ウイルスを導入していないHCC827細胞のうちESA(+)細胞またはESA(-)細胞、TuD-NC(ネガティブコントロール) を導入したHCC827細胞、TuD-141/200cを導入したHCC827細胞のうちESA(+)細胞またはESA(-)細胞をそれぞれ単一細胞としてソートし、低接着プレートを用い、腫瘍様塊アッセイ培地中で増殖させ続けた。その結果、ウイルスを導入していないHCC827細胞のうちESA(+)細胞は腫瘍様塊を形成した一方、ESA(-)細胞は全く腫瘍様塊を形成しなかった。同様にTuD-141/200cベクターを導入したことにより増大したESA(-)画分の細胞は全く腫瘍様塊を形成しなかったことから、ESA(+)の細胞集団に腫瘍様塊形成能を有する細胞（癌幹細胞）が存在しているものと考えられる。
全体として、これらの知見は肺がん細胞においてもmiR-200cの高レベルの発現は腫瘍様塊形成活性と強く相関しており、miR-200ファミリーを阻害することにより腫瘍を効果的に抑制できることを示している。【０１４１】
[実施例３−３]  非小細胞肺がん細胞株H596細胞に対しても発揮されるmiRNA200ファミリー阻害による腫瘍抑制作用
TuD-141/200c発現レンチウイルスベクターを導入したH596細胞をヌードマウスの右腹側部に注入し、造腫瘍活性を調べた（図２８）。TuD-NCを導入したH596細胞は造腫瘍活性を示したが、TuD-141/200cを導入したH596細胞は移植から2か月半以上経過しても全く腫瘍を形成しなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４２】
本発明により、miRNAの阻害による腫瘍の抑制方法が提供された。本発明は、腫瘍に対する新たな治療法を提供するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年2月9日(2017.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−ＡＡＣＡＣＵＧ−３’をシード配列として含む少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、および、５’−ＡＡＵＡＣＵＧ−３’をシード配列として含む少なくとも１つのｍｉＲＮＡの両者を阻害することを特徴とする、腫瘍を抑制する方法。
【請求項２】
腫瘍の抑制が、該腫瘍の細胞集団中の造腫瘍活性が高い細胞群による腫瘍形成の抑制、および造腫瘍活性が低い細胞群からの造腫瘍活性が高い細胞への移行の抑制の両方を達成するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくともｍｉＲ−２００ｃおよびｍｉＲ−１４１を阻害することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
当該ｍｉＲＮＡのシード配列に結合する核酸またはその類縁体を用いて阻害する、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
腫瘍がカルシノーマである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
腫瘍が大腸癌、肺癌、または乳癌である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該阻害により該腫瘍の上皮間葉転換が促進される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
５’−ＡＡＣＡＣＵＧ−３’をシード配列として含む少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、および、５’−ＡＡＵＡＣＵＧ−３’をシード配列として含む少なくとも１つのｍｉＲＮＡを、単独または組み合わせにおいて阻害する１つまたは複数のｍｉＲＮＡ阻害剤を投与して腫瘍を抑制するための剤の製造における、該阻害剤の使用。
【請求項９】
該腫瘍の抑制において少なくともｍｉＲ−２００ｃおよびｍｉＲ−１４１が阻害される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
該ｍｉＲＮＡ阻害剤が、ｍｉＲＮＡのシード配列に結合する核酸またはその類縁体を含む、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
５’−ＡＡＣＡＣＵＧ−３’をシード配列として含む少なくとも１つのｍｉＲＮＡに結合する第１のｍｉＲＮＡ結合配列、および、５’−ＡＡＵＡＣＵＧ−３’をシード配列として含む少なくとも１つのｍｉＲＮＡに結合する第２のｍｉＲＮＡ結合配列を単独または組み合わせにおいて含むｍｉＲＮＡ阻害剤、および薬学的に許容される担体を含有する腫瘍抑制剤。
【請求項１２】
該ｍｉＲＮＡ阻害剤がＴｕＤである、請求項１１に記載の腫瘍抑制剤。
【請求項１３】
５’−ＣＡＧＵＧＵＵ−３’を含むｍｉＲＮＡ結合配列、および５’−ＣＡＧＵＡＵＵ−３’を含むｍｉＲＮＡ結合配列を、単独または組み合わせにおいて含む１または複数のＴｕＤ分子、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１４】
ＴｕＤが該２つのｍｉＲＮＡ結合配列を単一分子内に含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ＴｕＤが合成ＴｕＤ（Ｓ−ＴｕＤ）である、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
該ｍｉＲＮＡ阻害剤が、ｍｉＲ−２００ｃに結合する第１のｍｉＲＮＡ結合配列、およびｍｉＲ−１４１に結合する第２のｍｉＲＮＡ結合配列を単独で含むＴｕＤである、請求項１２に記載の腫瘍抑制剤。
【請求項１７】
該ｍｉＲＮＡ阻害剤が配列番号：７３に記載の塩基配列を含むＴｕＤである、請求項１２に記載の腫瘍抑制剤。
【請求項１８】
腫瘍がカルシノーマである、請求項１７に記載の腫瘍抑制剤。
【請求項１９】
ＴｕＤがｍｉＲ−２００ｃに結合するｍｉＲＮＡ結合配列およびｍｉＲ−１４１に結合するｍｉＲＮＡ結合配列を単一分子内に含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
ＴｕＤが配列番号：７３に記載の塩基配列を含む、請求項１４に記載の組成物。
【国際調査報告】
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