(57)【要約】  標的RNAの標的編集部位に存在する標的塩基アデノシンを塩基イノシンに変換してRNA変異を修復することからなる部位特異的RNA変異導入方法を提供すること。  本発明の部位特異的RNA変異導入方法は、標的RNAの標的塩基アデノシンが存在する標的RNAと、該標的RNAと相補鎖を形成するように構築された標的編集ガイドとを反応させて二本鎖複合体を作成し、この二本鎖複合体にADARを作用させてA-I編集能を誘導することによって標的塩基アデノシンを塩基イノシンに変換することができる。変換されたイノシンはグアノシンにさらに翻訳される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式 [LA]:
【化１】
2017010556.tif 000099
（式中、標的側相補領域は、末端側標的相補領域と、ガイド側標的相補領域と、編集標的塩基（Ａ＊）とから構成され、
末端側標的相補領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数が、一般には４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個程度である塩基配列から構成され、
ガイド側標的相補領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数は、一般的には１〜１５個、好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個程度の塩基配列からなる塩基領域を意味し、Ａ＊は、A-I編集の標的である標的編集部位（＊印）に存在する標的塩基アデニンを意味する）
で表される５'−標的RNAと、式［LIA］：
【化２】
2017010556.tif 000100
（式中、アンチセンス領域は、末端側標的認識領域と、標的編集誘導塩基Ｘ（△印）と、コア側標的認識領域のＸ隣接部分領域とから構成され、
末端側標的認識領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、その塩基数は特に限定されないが、一般には４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個程度の塩基配列を意味するとともに、標的RNAの末端側標的相補領域の各対応構成塩基とそれぞれ塩基対合して塩基対を構成し、
標的編集誘導塩基Ｘ（△印）は、塩基シトシン、グアニン、アデニンまたはウラシルのいずれか１種からなる標的塩基（Ａ）とミスマッチ塩基であって、標的RNAの標的塩基（Ａ＊印）である塩基アデニンに対して標的編集誘導する塩基を意味し、
コア側標的認識領域のＸ隣接部分領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数が、一般的には１〜１５個、好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個程度の塩基配列からなり、標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であって、それぞれ塩基対合して塩基対を構築し、
ADAR結合領域は、コア側標的認識領域のADAR隣接部分領域と、ADAR結合コア領域と、ガイド側分断領域とからなり、それぞれアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、コア側標的認識領域のADAR隣接部分領域とガイド側分断領域のそれぞれの塩基数は、同数であって、一般的には０〜１０個、好ましくは５個以下の塩基配列からなる塩基領域を意味し、そのADAR隣接部分領域とガイド側分断領域の各対応構成塩基はそれぞれ塩基対合して塩基対を形成し、
ADAR結合コア領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列であって、その領域内にステムループ構造と、複数の塩基対の他に、単数もしくは複数のミスマッチ塩基対を有する不完全二本鎖RNA構造を有し、その塩基数が、一般的には１０〜４０個、好ましくは２０〜３０個からなり、ADAR結合コア領域の１末端側にガイド側分断領域、別の末端側に標的認識領域のADAR隣接部分領域が結合した構造であり、
ガイド側分断領域の塩基配列は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列であって、その塩基数はコア側標的認識領域のADAR隣接部分と同数であって、一般的には０〜１０個、好ましくは５個以下の塩基配列からなる塩基領域を意味し、そのガイド側分断領域はADAR隣接部分領域とそれぞれ塩基対を形成する構造である）
で表される３'−標的編集ガイドRNAを反応して複合体化して式［LIIA］：
【化３】
2017010556.tif 000101
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体を二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR）の作用によりA-I編集し式［LIIIA］：
【化４】
2017010556.tif 000102
で表される５'−編集標的RNAに変換し、該標的RNAの標的塩基アデノシン（Ａ）（＊印）がイノシン（Ｉ）に変換することを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項２】
請求項１に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記３'−標的編集ガイドRNA［LIA］が式［LIB］：
【化５】
2017010556.tif 000103
（式中、Ｃ（矢じり印）は塩基シトシンを意味し、それ以外の要素は前記と同じ意味を有する。）
で表される３'−標的編集ガイドRNAであり、および前記５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［LIIA］が式［LIIB］：
【化６】
2017010556.tif 000104
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体であることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項３】
式 [LVA]:
【化７】
2017010556.tif 000105
（式中、標的側相補領域は、末端側標的相補領域と、ガイド側標的相補領域と、編集標的塩基（Ａ＊）とから構成され、
末端側標的相補領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数が、一般には４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個程度である塩基配列から構成され、
ガイド側標的相補領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数は、一般的には１〜１５個、好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個程度の塩基配列からなる塩基領域を意味し、Ａ＊は、A-I編集の標的である標的編集部位（＊印）に存在する標的塩基アデニンを意味する）
で表される３'−標的RNAと、式［LVIA］：
【化８】
2017010556.tif 000106
（式中、アンチセンス領域は、末端側標的認識領域と、標的編集誘導塩基Ｘ（△印）と、コア側標的認識領域のＸ隣接部分領域とから構成され、
末端側標的認識領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、その塩基数は特に限定されないが、一般には４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個程度の塩基配列を意味するとともに、標的RNAの末端側標的相補領域の各対応構成塩基とそれぞれ塩基対合して塩基対を構成し、
標的編集誘導塩基Ｘ（△印）は、塩基シトシン、グアニン、アデニンまたはウラシルのいずれか１種からなる標的塩基（Ａ）とミスマッチ塩基であって、標的RNAの標的塩基（Ａ＊印）である塩基アデニンに対して標的編集誘導する塩基を意味し、
コア側標的認識領域のＸ隣接部分領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数が、一般的には１〜１５個、好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個程度の塩基配列からなり、標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であって、それぞれ塩基対合して塩基対を構築し、
ADAR結合領域は、コア側標的認識領域のADAR隣接部分領域と、ADAR結合コア領域と、ガイド側分断領域とからなり、それぞれアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、コア側標的認識領域のADAR隣接部分領域とガイド側分断領域のそれぞれの塩基数は、同数であって、一般的には０〜１０個、好ましくは５個以下の塩基配列からなる塩基領域を意味し、そのADAR隣接部分領域とガイド側分断領域の各対応構成塩基はそれぞれ塩基対合して塩基対を形成し、
ADAR結合コア領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列であって、その領域内にステムループ構造と、複数の塩基対の他に、単数もしくは複数のミスマッチ塩基対を有する不完全二本鎖RNA構造を有し、その塩基数が、一般的には１０〜４０個、好ましくは２０〜３０個からなり、ADAR結合コア領域の１末端側にガイド側分断領域、別の末端側に標的認識領域のADAR隣接部分領域が結合した構造であり、
ガイド側分断領域の塩基配列は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列であって、その塩基数はコア側標的認識領域のADAR隣接部分と同数であって、一般的には０〜１０個、好ましくは５個以下の塩基配列からなる塩基領域を意味し、そのガイド側分断領域はADAR隣接部分領域とそれぞれ塩基対を形成する構造である）
で表される５'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［LVIIA］：
【化９】
2017010556.tif 000107
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）（＊印）が二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR）の作用によるA-I編集によりイノシン（Ｉ）に変換された式［LVIIIA］：
【化１０】
2017010556.tif 000108
で表される３'−編集標的RNAを得ることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項４】
請求項３に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記５'−標的編集ガイドRNA［LVIA］が式［LVIB］：
【化１１】
2017010556.tif 000109
で表される３'−標的編集ガイドRNAであり、および前記５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［LVIIA］が式［LVIIB］：
【化１２】
2017010556.tif 000110
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体であることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項５】
式 [LXA]:
【化１３】
2017010556.tif 000111
（式中、５'−標的相補領域は前記と同じ意味を有する。）
で表される５'−標的RNAと、式［LIA］：
【化１４】
2017010556.tif 000112
（式中、３'−標的認識領域およびADAR結合領域はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表される３'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［LXIA］：
【化１５】
2017010556.tif 000113
（式中、末端側標的認識領域、コア側標的認識領域、Ｘ（△印）、ADAR結合コア領域およびガイド側分断領域はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）（＊印）がADARの作用によりA-I編集によりイノシン（Ｉ）に変換された式［LXIIA］：
【化１６】
2017010556.tif 000114
（式中、末端側標的相補領域、ガイド側標的相補領域およびＩ（＊印）はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表される５'−編集標的RNAを得ることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項６】
請求項５に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記５'−標的編集ガイドRNA［LIA］が式［LIB］：
【化１７】
2017010556.tif 000115
で表される３'−標的編集ガイドRNAであり、および前記５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［LXIA］が式［LXIB］：
【化１８】
2017010556.tif 000116
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体であることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項７】
式 [LXVA]:
【化１９】
2017010556.tif 000117
（式中、３'−標的相補領域は前記と同じ意味を有する。）
で表される３'−標的RNAと、式［LVIA］：
【化２０】
2017010556.tif 000118
（式中、５'−標的認識領域およびADAR結合領域はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表される５'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［LXVIA］：
【化２１】
2017010556.tif 000119
（式中、末端側標的認識領域、コア側標的認識領域、Ｘ（三角印）、ADAR結合コア領域およびガイド側分断領域はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）（＊印）が二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR）の作用によりA-I編集によりイノシン（Ｉ）に変換された式［LXVIIA］：
【化２２】
2017010556.tif 000120
（式中、末端側標的相補領域、ガイド側標的相補領域およびＩ（＊印）はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表される５'−編集標的RNAを得ることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項８】
請求項７に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記５'−標的編集ガイドRNA［LVIA］が式［LVIB］：
【化２３】
2017010556.tif 000121
で表される５'−標的編集ガイドRNAであり、および前記３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［LXVIA］が式［LXVIB］：
【化２４】
2017010556.tif 000122
で表さ３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体であることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項９】
式［IA］：
【化２５】
2017010556.tif 000123
（式中、記号「aN1・・aNm」は、５'−標的RNAにおける末端側標的相補領域に相当し、記号「aN」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、記号「m」は、塩基数は一般には４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個程度の塩基数を意味し、
記号「bN1bN2・・bNn-1bN」は、５'−標的RNA[LA]におけるガイド端側標的相補領域（１４）に相当し、記号「bN」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「n」は、一般的には、１〜１５個、好ましくは１２個以内、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは５個程度の塩基数を意味し、
Ａ＊は、標的編集部位（＊印）に存在する標的塩基アデニンを意味する。）
で表される５'−標的RNAと、式［IIA］：
【化２６】
2017010556.tif 000124
（式中、記号「cN1cN2……cNp-1cNp」は、３'−標的編集ガイドRNAのガイド側分断領域に相当し、記号「cN」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、記号「p」は、塩基数が、一般的には０〜１５個、好ましくは１２個以下、より好ましくは１０個以下、特に好ましくは５個程度を意味し、
記号「dN1・・dNm」は、３'−標的編集ガイドRNAの末端側標的認識領域に相当し、記号「dN」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「m」は前記と同じ意味を有し、塩基数は塩基数は一般には４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個程度の塩基数を意味し、標的RNAの末端側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であり、かつ、対応する塩基同士は塩基対を形成し、
記号「eN1eN2・・eNn+p」は、標的編集ガイドRNAのコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域とADAR隣接部分領域の塩基配列に相当し、記号「eN」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「n」はコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域の塩基配列の塩基数、記号「p」はコア側標的認識領域のADAR隣接部分領域の塩基数を表し、Ｘ隣接部分領域の塩基配列は複合体化の際に標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基配列と塩基対を形成し、またガイド側分断領域の塩基配列はADR隣接部分領域の塩基配列と塩基対を形成し、
記号「NαNβ-NδNχ」は、標的編集ガイドRNAのADAR結合コア領域に相当し、また記号「Nα」と記号「Nχ」が、記号「Nβ-Nδ」で表されるループ構造を挟んだ２本の一本鎖からなるステムループ構造からなる不完全二本鎖相補RNA構造から構成され、このRNA構造はアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成され、ループ構造は４個〜８個、好ましくは４〜５個の同種または異種の塩基から構成され、また各一本鎖のRNA塩基配列は、特に限定されないが、一般には１０〜４０個、好ましくは２０〜３０個の同種または異種の塩基からなり、さらにその二本鎖は単数もしくは複数のミスマッチ塩基対を有する塩基配列であるとともに、その一方の一本鎖の末端はガイド側分断領域、また別の一本鎖の末端はコア側標的認識領域のADAR隣接部分に結合した構造になっている。）
で表される３'−標的編集ガイドと反応させて、式 [IIIA]:
【化２７】
2017010556.tif 000125
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体を二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR）の作用によりA-I編集して式［IVA］：
【化２８】
2017010556.tif 000126
で表される５'−編集標的RNAに変換して、標的塩基アデノシン（Ａ）をイノシン（Ｉ）に変換することを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記３'−標的編集ガイドRNA［IIA］が式［IIB］：
【化２９】
2017010556.tif 000127
で表される３'−標的編集ガイドRNAであり、および前記５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［IIIA］が式［IIIB］：
【化３０】
2017010556.tif 000128
で表さ５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体であることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項１１】
式 [VIA]:
【化３１】
2017010556.tif 000129
（式中、記号「fN1・・fNm」は、標的RNAにおける末端側標的相補領域に相当し、記号「fN」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、記号「m」は、塩基数は一般には４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個程度の塩基数を意味し、
記号「gN1gN2・・gNn-1gNn」は、標的RNA[LA]におけるガイド端側標的相補領域に相当し、記号「gN」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「n」は、一般的には、１〜１５個、好ましくは１２個以内、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは５個程度の塩基数を意味し、
Ａ＊は、標的編集部位（＊印）に存在する標的塩基アデニンを意味する。）
で表される３'−標的RNAと、式［VIIA］：
【化３２】
2017010556.tif 000130
（式中、記号「kN1kN2……kNp-1kNp」は、３'−標的編集ガイドRNAのガイド側分断領域に相当し、記号「kN」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、記号「p」は、塩基数が、一般的には０〜１５個、好ましくは１２個以下、より好ましくは１０個以下、特に好ましくは５個程度を意味し、
記号「hN1・・hNm」は、３'−標的編集ガイドRNAの末端側標的認識領域に相当し、記号「hN」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「m」は前記と同じ意味を有し、塩基数は塩基数は一般には４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個程度の塩基数を意味し、標的RNAの末端側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であり、かつ、対応する塩基同士は塩基対を形成し、
記号「jN1jN2・・jNn+p」は、標的編集ガイドRNAのコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域とADAR隣接部分領域の塩基配列に相当し、記号「jN」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「n」はコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域の塩基配列の塩基数、記号「p」はコア側標的認識領域のADAR隣接部分領域の塩基数を表し、Ｘ隣接部分領域の塩基配列は複合体化の際に標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基配列と塩基対を形成し、またガイド側分断領域の塩基配列はADR隣接部分領域の塩基配列と塩基対を形成し、
記号「NαNβ-NδNχ」は、標的編集ガイドRNAのADAR結合コア領域に相当し、また記号「Nα」と記号「Nχ」が、記号「Nβ-Nδ」で表されるループ構造を挟んだ２本の一本鎖からなるステムループ構造からなる不完全二本鎖相補RNA構造から構成され、このRNA構造はアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成され、ループ構造は４個〜８個、好ましくは４〜５個の同種または異種の塩基から構成され、また各一本鎖のRNA塩基配列は、特に限定されないが、一般には１０〜４０個、好ましくは２０〜３０個の同種または異種の塩基からなり、さらにその二本鎖は単数もしくは複数のミスマッチ塩基対を有する塩基配列であるとともに、その一方の一本鎖の末端はガイド側分断領域、また別の一本鎖の末端はコア側標的認識領域のADAR隣接部分に結合した構造になっている。）
で表される５'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［VIIIA］：
【化３３】
2017010556.tif 000131
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）が二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR）の作用によりA-I編集によりイノシン（Ｉ）に変換された式［IXA］：
【化３４】
2017010556.tif 000132
で表される３'−編集標的RNAを得ることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記５'−標的編集ガイドRNA［VIIA］が式［VIIB］：
【化３５】
2017010556.tif 000133
で表される５'−標的編集ガイドRNAであり、および前記３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［VIIIA］が式［VIIIB］：
【化３６】
2017010556.tif 000134
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体であることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項１３】
式［XIA］：
【化３７】
2017010556.tif 000135
で表される５'−標的RNAまたは式［XVIA］：
【化３８】
2017010556.tif 000136
で表される３'−標的RNAと、式［IIA］：
【化３９】
2017010556.tif 000137
で表される３'−標的編集ガイドRNAまたは式［VIIA］：
【化４０】
2017010556.tif 000138
で表される５'−標的編集ガイドRNAをそれぞれ反応させて式［XIIIA］：
【化４１】
2017010556.tif 000139
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体または式［XVIIIA］：
【化４２】
2017010556.tif 000140
を得、得られた複合体の標的編集部位（＊印）に存在する標的塩基アデノシン（Ａ）が二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR）の作用によりA-I編集によりイノシン（Ｉ）に変換された式［XIVA］：
【化４３】
2017010556.tif 000141
で表される５'−編集標的RNAまたは式［XIXA］：
【化４４】
2017010556.tif 000142
で表される３'−編集標的RNAをそれぞれ得ることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記３'−標的編集ガイドRNA［IIA］に代えて式［IIB］：
【化４５】
2017010556.tif 000143
で表される３'−標的編集ガイドRNAまたは前記５'−標的編集ガイドRNA［VIIA］に代えて式［VIIB］：
【化４６】
2017010556.tif 000144
で表される５'−標的編集ガイドRNAを、前記５'−標的RNA［XIA］または３'−標的RNA［XVIA］とそれぞれ反応させて複合体化させて式［IIIB］：
【化４７】
2017010556.tif 000145
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体または式［VIIIB］：
【化４８】
2017010556.tif 000146
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体をそれぞれ得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をADARの作用によりA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換された式［IVA］：
【化４９】
2017010556.tif 000147
で表される５'−編集標的RNAまたは式［IXA］：
【化５０】
2017010556.tif 000148
で表される３'−編集標的RNAにそれぞれ変換することを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記５'−標的RNAが式［IA1］：
【化５１】
2017010556.tif 000149
で表される５'−編集標的RNAであり、３'−標的編集ガイドRNAが式［IIA1］：
【化５２】
2017010556.tif 000150
で表される３'−標的編集ガイドRNAであること、
前記５'−標的RNAが式［IA2］：
【化５３】
2017010556.tif 000151
で表される５'−編集標的RNAであり、３'−標的編集ガイドRNAが式［IIA2］：
【化５４】
2017010556.tif 000152
で表される３'−標的編集ガイドRNAであること、または
前記５'−標的RNAが式［IA3］：
【化５５】
2017010556.tif 000153
で表される５'−編集標的RNAであり、３'−標的編集ガイドRNAが式［IIA3］：
【化５６】
2017010556.tif 000154
で表される３'−標的編集ガイドRNAであること、を特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項１６】
請求項１２に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記３'−標的RNAが式［VIA1］：
【化５７】
2017010556.tif 000155
で表される３'−編集標的RNAであり、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［VIIA1］：
【化５８】
2017010556.tif 000156
で表される５'−標的編集ガイドRNAであること、
前記３'−標的RNAが式［VIB2］：
【化５９】
2017010556.tif 000157
で表される３'−編集標的RNAであり、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［VIIB2］：
【化６０】
2017010556.tif 000158
で表される５'−標的編集ガイドRNAであること、または
前記３'−標的RNAが式［VIA3］：
【化６１】
2017010556.tif 000159
で表される３'−編集標的RNAであり、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［VIIA3］：
【化６２】
2017010556.tif 000160
で表される５'−標的編集ガイドRNAであること、を特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記５'−標的RNAが式［XIA1］：
【化６３】
2017010556.tif 000161
で表される５'−編集標的RNAであり、前記３'−標的編集ガイドRNAが式［XIIA1］：
【化６４】
2017010556.tif 000162
で表される３'−標的編集ガイドRNAであること、または
前記５'−標的RNAが式［XIA2］：
【化６５】
2017010556.tif 000163
で表される５'−編集標的RNAであり、前記３'−標的編集ガイドRNAが式［XIIA2］：
【化６６】
2017010556.tif 000164
で表される３'−標的編集ガイドRNAであること、を特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記３'−標的RNAが式［XVIA0］：
【化６７】
2017010556.tif 000165
で表される３'−編集標的RNAであり、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［XVIIA0］：
【化６８】
2017010556.tif 000166
で表される５'−標的編集ガイドRNAであること、
前記３'−標的RNAが式［XVIA1］：
【化６９】
2017010556.tif 000167
で表される３'−編集標的RNAであり、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［XVIIA1］：
【化７０】
2017010556.tif 000168
で表される５'−標的編集ガイドRNAであること、
前記３'−標的RNAが式［XVIA2］：
【化７１】
2017010556.tif 000169
で表される３'−編集標的RNAであり、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［XVIIA2］：
【化７２】
2017010556.tif 000170
で表される５'−標的編集ガイドRNAであること、または
前記３'−標的RNAが式［XVIA3］：
【化７３】
2017010556.tif 000171
で表される３'−編集標的RNAであり、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［XVIIA3］：
【化７４】
2017010556.tif 000172
で表される５'−標的編集ガイドRNAであること、を特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記５'−標的RNAが式［XXIA］：
【化７５】
2017010556.tif 000173
で表される５'−標的RNAと、前記３'−標的編集ガイドRNAが式［XXIIA］：
【化７６】
2017010556.tif 000174
で表される３'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［XXIIIA］：
【化７７】
2017010556.tif 000175
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をADARの作用によりA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換した式［XXIVA］：
【化７８】
2017010556.tif 000176
で表される５'−編集標的RNAを得ることからなる部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記５'−標的RNAが式［XXIA1］：
【化７９】
2017010556.tif 000177
で表される５'−標的RNAと、前記３'−標的編集ガイドRNAが式［XXIIA1］：
【化８０】
2017010556.tif 000178
で表される３'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［XXIIIA1］：
【化８１】
2017010556.tif 000179
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をADARの作用によりA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換した式［XXIVA1］：
【化８２】
2017010556.tif 000180
で表される５'−編集標的RNAを得ることからなる部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記５'−標的RNAが式［XXIA2］：
【化８３】
2017010556.tif 000181
で表される５'−標的RNAと、前記３'−標的編集ガイドRNAが式［XXIIA2］：
【化８４】
2017010556.tif 000182
で表される３'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［XXIIIA2］：
【化８５】
2017010556.tif 000183
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をADARの作用によりA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換した式［XXIVA2］：
【化８６】
2017010556.tif 000184
で表される５'−編集標的RNAを得ることからなる部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項２２】
請求項１４に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記３'−標的RNAが式［XXVIA］：
【化８７】
2017010556.tif 000185
で表される３'−標的RNAと、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［XXVIIA］：
【化８８】
2017010556.tif 000186
で表される５'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［XXVIIIA］：
【化８９】
2017010556.tif 000187
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をADARの作用によりA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換した式［XXIXA］：
【化９０】
2017010556.tif 000188
で表される３'−編集標的RNAを得ることからなる部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記３'−標的RNAが式［XXVIA1］：
【化９１】
2017010556.tif 000189
で表される３'−標的RNAと、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［XXVIIA1］：
【化９２】
2017010556.tif 000190
で表される５'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［XXVIIIA1］：
【化９３】
2017010556.tif 000191
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をADARの作用によりA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換した式［XXIXA1］：
【化９４】
2017010556.tif 000192
で表される３'−編集標的RNAを得ることからなる部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記３'−標的RNAが式［XXVIA2］：
【化９５】
2017010556.tif 000193
で表される３'−標的RNAと、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［XXVIIA2］：
【化９６】
2017010556.tif 000194
で表される５'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［XXVIIIA2］：
【化９７】
2017010556.tif 000195
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をADARの作用によりA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換した式［XXIXA2］：
【化９８】
2017010556.tif 000196
で表される３'−編集標的RNAを得ることからなる部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項２５】
請求項１３に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記５'−標的RNAが式［XXXIA］：
【化９９】
2017010556.tif 000197
で表される５'−標的RNAと、前記３'−標的編集ガイドRNAが式［XXXIIA］：
【化１００】
2017010556.tif 000198
で表される３'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［XXXIIIA］：
【化１０１】
2017010556.tif 000199
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた複合体にADARを作用させてRNA編集能を誘導して式［XXXIVA］：
【化１０２】
2017010556.tif 000200
で表される５'−編集標的RNAを得ることにより、標的塩基アデノシン（Ａ）をA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換したことからなる部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記５'−標的RNAが式［XXXIA1］：
【化１０３】
2017010556.tif 000201
で表される５'−標的RNAと、前記３'−標的編集ガイドRNAが式［XXIIA1］：
【化１０４】
2017010556.tif 000202
で表される３'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［XXXIIIA1］：
【化１０５】
2017010556.tif 000203
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をADARの作用によりA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換した式［XXXIVA1］：
【化１０６】
2017010556.tif 000204
で表される５'−編集標的RNAを得ることからなる部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項２７】
請求項２５に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記５'−標的RNAが式［XXXIA2］：
【化１０７】
2017010556.tif 000205
で表される５'−標的RNAと、前記３'−標的編集ガイドRNAが式［XXXIIA2］：
【化１０８】
2017010556.tif 000206
で表される３'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［XXXIIIA2］：
【化１０９】
2017010556.tif 000207
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をADARの作用によりA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換した式［XXXIVA2］：
【化１１０】
2017010556.tif 000208
で表される５'−編集標的RNAを得ることからなる部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項２８】
請求項１３に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記３'−標的RNAが式［XXXVIA］：
【化１１１】
2017010556.tif 000209
で表される３'−標的RNAと、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［XXXVIIA］：
【化１１２】
2017010556.tif 000210
で表される５'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［XXXVIIIA］：
【化１１３】
2017010556.tif 000211
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をADARの作用によりA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換した式［XXXIXA］：
【化１１４】
2017010556.tif 000212
で表される３'−編集標的RNAを得ることからなる部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記３'−標的RNAが式［XXXVIA1］：
【化１１５】
2017010556.tif 000213
で表される３'−標的RNAと、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［XXXVIIA1］：
【化１１６】
2017010556.tif 000214
で表される５'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［XXXVIIIA1］：
【化１１７】
2017010556.tif 000215
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をADARの作用によりA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換した式［XXXIXA1］：
【化１１８】
2017010556.tif 000216
で表される３'−編集標的RNAを得ることからなる部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記３'−標的RNAが式［XXXVIA2］：
【化１１９】
2017010556.tif 000217
で表される３'−標的RNAと、前記５'−標的編集ガイドRNAが式［XXXVIIA2］：
【化１２０】
2017010556.tif 000218
で表される５'−標的編集ガイドRNAを反応させて式［XXXVIIIA2］：
【化１２１】
2017010556.tif 000219
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体を得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をADARの作用によりA-I編集してイノシン（Ｉ）に変換した式［XXXIXA2］：
【化１２２】
2017010556.tif 000220
で表される３'−編集標的RNAを得ることからなる部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項３１】
請求項１乃至３０のいずれか１項に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記編集標的RNAのイノシンがさらにグアノシンに翻訳されることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項３２】
請求項１乃至３１のいずれか１項に記載の部位特異的RNA変異導入方法であって、前記ADARの作用が生体内ADAR機構によることを特徴とする部位特異的RNA変異導入方法。
【請求項３３】
式［LIA］：
【化１２３】
2017010556.tif 000221
で表される３'−標的編集ガイドRNAまたは式［LVIA］：
【化１２４】
2017010556.tif 000222
（式中、アンチセンス領域は、末端側標的相補領域と、標的誘導部位（Ｘ）と、コア側標的認識領域のＸ隣接部分領域とからなり、
末端側標的認識領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、その塩基数は特に限定されないが、一般には４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個程度の塩基配列を意味し、
標的誘導部位の塩基（Ｘ）は、塩基シトシン、グアニン、アデニンまたはウラシルのいずれか１種から選ばれるの標的RNAの標的部位の塩基（Ａ）とミスマッチとなる塩基であり、
コア側標的認識領域のＸ隣接部分領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数が、一般的には１〜１５個、好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個程度の塩基配列からなり、標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基配列とそれぞれ塩基対合して塩基対を構築し、
ADAR結合領域は、アンチセンス領域のコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域に結合するADAR隣接部分領域と、ADAR結合コア領域と、ガイド側分断領域とからなり、
コア側標的認識領域のADAR隣接部分領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を構成し、その塩基数は、一般的には０〜１５個、好ましくは１０個、より好ましくは５個程度の塩基配列からなる塩基領域を意味し、ガイド側分断領域の対応構成塩基とそれぞれ塩基対合して塩基対を構成し、
ADAR結合コア領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列から構成されるステムループ構造をした不完全二本鎖RNA構造からなり、そのループ構造を挟んだ２本の一本鎖RNA塩基配列のうち、その１方の一本鎖の末端はコア側標的認識領域のADAR隣接部分領域と、またもう一方の一本鎖の末端はガイド側分断領域と結合した塩基配列を構成し、
ガイド側分断領域は、ADAR結合領域のコア側標的認識領域のADAR隣接部分領域と塩基数が同数であってそれぞれ塩基対を形成している構造である）
で表される５'−標的編集ガイドRNAから選ばれる標的編集ガイドRNA。
【請求項３４】
請求項３３に記載の標的編集ガイドRNAであって、前記３'−標的編集ガイドRNAが３'−標的編集ガイドRNA［LIB］：
【化１２５】
2017010556.tif 000223
であり、または５'−標的編集ガイドRNA［LVIB］：
【化１２６】
2017010556.tif 000224
であることを特徴とする標的編集ガイドRNA。
【請求項３５】
請求項３３または３４に記載の標的編集ガイドRNAであって、前記３'−標的編集ガイドRNAが３'−標的編集ガイドRNA［IIA］：
【化１２７】
2017010556.tif 000225
であり、または前記５'−標的編集ガイドRNAが５'−標的編集ガイドRNA［VIIA］：
【化１２８】
2017010556.tif 000226
（式中、記号「cN1cN2…..cNp-1cNp」または「kN1kN2……kNp-1kNp」は、上記ガイド側分断領域の塩基配列を表し、Nはアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基を意味し、N1……Npはかかる塩基から１個からp個からなる塩基配列を意味する。）
であることを特徴とする標的編集ガイドRNA。
【請求項３６】
請求項３３乃至３５のいずれか１項に記載の標的編集ガイドRNAであって、前記３'−標的編集ガイドRNAが３'−標的編集ガイドRNA［IIB］：
【化１３３】
2017010556.tif 000227
であり、または前記５'−標的編集ガイドRNAが５'−標的編集ガイドRNA［VIIB］：
【化１３４】
2017010556.tif 000228
であることを特徴とする標的編集ガイドRNA。
【請求項３７】
請求項３３乃至３６のいずれか１項に記載の標的編集ガイドRNAであって、前記３'−標的編集ガイドRNAが３'−標的編集ガイドRNA［XXIIA］：
【化１３５】
2017010556.tif 000229
であり、前記５'−標的編集ガイドRNAが５'−標的編集ガイドRNA［XXVIIA］：
【化１３６】
2017010556.tif 000230
であることを特徴とする標的編集ガイドRNA。
【請求項３８】
請求項３３乃至３７のいずれか１項に記載の標的編集ガイドRNAであって、前記３'−標的編集ガイドRNAが３'−標的編集ガイドRNA［XXXIIA］：
【化１３７】
2017010556.tif 000231
であり、前記５'−標的編集ガイドRNAが５'−標的編集ガイドRNA［XXXVIIA］：
【化１３８】
2017010556.tif 000232
であることを特徴とする標的編集ガイドRNA。
【請求項３９】
請求項３３乃至３８のいずれか１項に記載の標的編集ガイドRNAであって、前記５'−標的編集ガイドRNAが５'−標的編集ガイドRNA［XLIA］：
【化１３９】
2017010556.tif 000233
または５'−標的編集ガイドRNA［XLI-2］：
【化１４０】
2017010556.tif 000234
であることを特徴とする標的編集ガイドRNA。
【請求項４０】
請求項３９に記載の標的編集ガイドRNAであって、前記５'−標的編集ガイドRNAが、塩基配列［XLVA］：
【化１４１】
2017010556.tif 000235
から得られた５'−標的編集ガイドRNA：
【化１４２】
2017010556.tif 000236
であることを特徴とする標的編集ガイドRNA。
【請求項４１】
請求項３３乃至４０のいずれか１項に記載の標的編集ガイドRNAと標的RNAと複合体化し、ADARの作用によりA-I編集を誘導して該標的RNA部分の標的塩基アデノシンをイノシンに変換するための標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体であって、前記５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体が５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［LIIA］：
【化１４３】
2017010556.tif 000237
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［LIIB］：
【化１４４】
2017010556.tif 000238
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［LXIA］：
【化１４５】
2017010556.tif 000239
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［LXIB］：
【化１４６】
2017010556.tif 000240
であること、また前記３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体が３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［LVIIA］：
【化１４７】
2017010556.tif 000241
または３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［LVIIB］：
【化１４８】
2017010556.tif 000242
または３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［LXVIA］：
【化１４９】
2017010556.tif 000243
または３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［LXVIB］：
【化１５０】
2017010556.tif 000244
であることを特徴とする標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体。
【請求項４２】
請求項４１に記載の標的編集ガイドRNA−標的編集ガイドRNA複合体であって、前記５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体が５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［IIIA］：
【化１５１】
2017010556.tif 000245
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［IIIB］：
【化１５２】
2017010556.tif 000246
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XIIIA］：
【化１５３】
2017010556.tif 000247
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XIIIB］：
【化１５４】
2017010556.tif 000248
であること、また前記５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体が５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［VIIIA］：
【化１５５】
2017010556.tif 000249
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［VIIIB］：
【化１５６】
2017010556.tif 000250
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XVIIIA］：
【化１５７】
2017010556.tif 000251
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XVIIIB］：
【化１５８】
2017010556.tif 000252
であることを特徴とすることを特徴とする標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体。
【請求項４３】
請求項４１または４２に記載の標的編集ガイドRNA−標的編集ガイドRNA複合体であって、前記５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体が５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XXIIIA］：
【化１５９】
2017010556.tif 000253
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XXXIIIA］：
【化１６０】
2017010556.tif 000254
であること、また前記３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体は５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XXVIIIA］：
【化１６１】
2017010556.tif 000255
または３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［XXXVIIIA］：
【化１６２】
2017010556.tif 000256
であることを特徴とする標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体。
【請求項４４】
請求項４１乃至４３のいずれか１項に記載の標的編集ガイドRNA−標的編集ガイドRNA複合体であって、前記５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体が５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XLIIA］：
【化１６３】
2017010556.tif 000257
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XLIIB］：
【化１６４】
2017010556.tif 000258
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XL-3］：
【化１６５】
2017010556.tif 000259
または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XLI-8］：
【化１６６】
2017010556.tif 000260
であること、
また前記３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体が３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［XLII-3］：
【化１６７】
2017010556.tif 000261
または３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［XLII-8］：
【化１６８】
2017010556.tif 000262
または３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［XLIII-8］：
【化１６９】
2017010556.tif 000263
または３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［XLIII-8］：
【化１７０】
2017010556.tif 000264
であること、を特徴とする標的編集ガイドRNA。
【請求項４５】
グルタミン酸受容体mRNA前駆体（GluR-B pre-mRNA）または編集に必要な領域のみを残して構築された人工編集基質（miniSL RNA）を基盤として、この編集基質のADAR結合領域だけを残し、特定位置で分断することによって得られた標的編集ガイドRNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、部位特異的RNA変異導入方法およびそれに使用する標的編集ガイドRNAならびに標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体に関するものである。更に詳細には、本発明は、標的編集部位に標的塩基アデノシン（Ａ）を有する標的RNAをADARの編集能を誘導して部位特異的にRNA変異を導入する部位特異的RNA変異導入方法およびそれに使用する標的編集ガイドRNAならびに標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞内標的遺伝子機能ならびに／もしくは発現を調節する遺伝子工学技術は、生命に関わる生物学上の現象の基礎研究ばかりではなく、医学や治療への応用に関する研究においても広く使用されている（非特許文献１）。これらの方法を使用する一つの目的は、生物学的方法に関係する細胞内タンパク質の機能を調節することである。最近では、いくつもの進化した遺伝子編集技術によって標的遺伝子情報が望むように操作できるようになった（非特許文献１、２、３、４、５）。プログラム可能な調節に加えて、遺伝子改変の最も重要な特長は、標的の細胞内遺伝子に永久的な変化をもたらすことができる点である。この永久的な効果は標的タンパク質の特徴を効率的に抑制することができる一方、かかる方法はもし誤りが発生すれば健康に危険を及ぼすことになる（非特許文献６）。【０００３】
生物の生命現象を担う分子は生体内のタンパク質である。通常、その生体内のタンパク質は、DNAから転写されたメッセンジャーRNA（mRNA）の情報を基に翻訳され合成される。合成されたタンパク質は、生体内の化学反応、構造形成、情報伝達、運動、抗体、栄養の貯蔵・輸送などの実に様々な生命活動の役割を担っている。【０００４】
このように合成される細胞内タンパク質が正常な生命活動を実行するためには、その細胞内タンパク質が正確な構造を有すると共に、正常な生理機能を発揮しなければならない。タンパク質は、DNAのゲノム情報が自己複製し、その塩基（ヌクレオチド）配列がRNAポリメラーゼの作用によりmRNAに転写され、リボソームによりアミノ酸に翻訳されて合成される。RNAポリメラーゼは、DNA二重鎖の一方の鎖（アンチセンス鎖：５'→３'）を鋳型として、そのDNA上を移動しながらDNAの塩基配列をコピーしながら相補的に塩基対合する４種のヌクレオシド（A：アデノシン、U：ウリジン、G：グアノシン、C：シチジン）を重合してmRNAを合成する。この転写によって、アンチセンス鎖のDNA塩基配列に相補的に塩基対合する塩基が取り込まれて、mRNAがセンス鎖（３'→５'）として伸長合成される。【０００５】
以前は、タンパク質の１次構造は全てゲノムDNAが決定すると信じられていて、RNAは、そのゲノムDNAの情報を正確に写し取り、忠実にタンパク質の情報に置き換えていたと考えられていた。しかし、この遺伝情報の流れ（セントラルドグマ）に反する現象が、トリパノソーマ（原鞭毛虫類）のキネトプラスチドDNAの転写過程において、ウリジン（U）の挿入や欠失により、そこで作成されたタンパク質の１次構造が変わっていることが見出された。その後、このような現象が、植物のミトコンドリアや葉緑体のmRNA、粘菌のミトコンドリアmRNA、ウィルスmRNA、哺乳動物のmRNAなどで次々と見つかってきた。つまり、RNAポリメラーゼの作用によるDNAからmRNAへの遺伝情報の転写においても、そのDNA塩基配列の本来転写されるべき特定のDNA塩基配列が異なる塩基に置換されたり、または異なる塩基が挿入されたり、また本来の塩基が欠失したりしてRNA変異が発生する「RNA編集（RNA editing）」といわれる現象が知られている。このようにDNAからRNAへの転写によりRNA変異が生じれば、当然のことながら、その変異RNAに基づいて合成されるタンパク質は、本来生ずべきタンパク質とはその構造や機能などが異なり、機能不全を起こし疾病の病因にもなりかねない。【０００６】
哺乳動物の脳に存在するRNAは、しばしばアデノシンが脱アミノ化されイノシンに変換されることが知られている。イノシンは化学構造上グアノシンと類似しており、シトシンとの塩基対形成が可能であるため、イノシン化修飾によりコドンが変化しアミノ酸配列が編集される。このようなイノシン化修飾は脳や神経系の細胞で多いことが知られており、修飾の欠損が、様々な精神神経疾患や癌などで観測されている。【０００７】
従って、細胞内タンパク質の発現量変化や機能の不全が、疾患の分子レベルでの原因であることは明らかである。つまり、これら細胞内タンパク質の変調を正すことが可能な技術は、医療・創薬技術の基盤として極めて重要である。【０００８】
DNAと対照的に、mRNAは一過性の細胞内分子である。mRNAは、遺伝子情報を保有していて、コードされたタンパク質の機能と発現量を決定している。従って、RNA標的遺伝子操作は、遺伝子情報に損傷を与える危険がなく、遺伝子編集と類似した標的タンパク質の機能を制御することが可能である。細胞内RNAを標的にし、タンパク質の発現を制御するためには、small interference RNA (siRNA)（非特許文献７）やマイクロRNA（ｍｉRNA）（非特許文献８）などの短鎖RNAが一般的に用いられている。これらの短鎖RNAは細胞内RNAサイレンシング機構を利用しているため（非特許文献９）、標的RNA分解は、いかなる外来性タンパク質の過発現なしに短鎖RNAを単に発現または導入することによって効率的に行うことができる。ｓｉRNAやｍｉRNAなどのこれら短鎖RNAは、その単純な構造と使い勝手の良さのために、標的遺伝子ノックダウンの分子ツールとして一般化されていて、核酸医薬としても応用されている（非特許文献１０）。RNA干渉技術とは対照的に、RNAヌクレオチド配列を修飾できるRNA変異誘発（mutagenesis）技術は、生命科学研究における汎用的な遺伝子変異導入ツールとしてばかりではなく、創薬の基本的技術となる大きな潜在性を有しているにも関わらず、未だ一般的な方法は確立していない。【０００９】
近年、ゲノム編集技術は目覚ましい発展を遂げ、高効率かつ特異的にDNAの情報を自在に改変できるようになってきた（非特許文献１１）。一方で、ゲノム編集により遺伝子組換えを施した細胞は、その変異が恒常的に残ってしまうため、医療や創薬においては倫理的な問題も含め多くの解決すべき課題が残っているのも事実である。これら問題点を解決し、細胞内タンパク質機能制御を可能にする一つの方法として、RNAに変異を導入する方法が挙げられる。【００１０】
生体内RNA編集機構の一つとして、DNAから転写されたRNAが二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR：adenosine deaminases acting on RNA）によって、特定のアデノシンがイノシンに変換されるA-I編集（A-to-I RNA editing）機構が、ほぼ全ての高等生物に広く存在する転写後修飾機構である（非特許文献１２、１３、１４）。このA-I編集の重要な役割の一つが、変換されたイノシンが翻訳機構によるグアノシンと読み取りされる転写レベルでの遺伝子情報の再コードである。従って、A-I編集は、標的タンパク質の特定のコドンを変換することによってさまざまなタンパク質の機能を強力に制御できることである。【００１１】
近年のトランスクリプトーム解析の結果、ヒト細胞内RNA上に20,000以上の編集部位が同定され（非特許文献１５）、A-I編集は様々な生命現象に関わっていると考えられている。RNA中のイノシンは、タンパク質合成の際にはグアノシンとして翻訳されるため、RNA編集によってゲノム情報とは異なる情報（機能）を持つタンパク質が合成される。つまり、ADARは細胞内でRNAに変異を導入していることになる。【００１２】
シュードウリジル化（psuedouridylation）(非特許文献１６)や２'−ヒドロキシメチル化（非特許文献１７）のような細胞内リボソームRNA（rRNA）修飾は、ガイドRNA（gRNAs）である小さな核小体RNA（small nucleolar RNAs; snoRNA）と特異的酵素から構成されたリボタンパク質によって処理される（非特許文献１８）。これらのリボタンパク質において、ｇRNAは、そのアンチセンス配列との単純なワトソン−クリック塩基対合によって修飾酵素を標的に向かってガイドする重要な役割を果たしている。従って、修飾活性は、そのｇRNAの人工アンチセンス配列を変換するだけで変えることができる（非特許文献１９、２０、２１）。つまり、ｇRNAは標的RNA修飾を効果的に制御することができる。【００１３】
ADARファミリータンパク質のアイソフォームであるヒトADAR2（hADAR2）は、生体内のさまざまな細胞種において発現している。hADAR2は、２個の二重鎖RNA結合ドメイン（dsRBDs）とデアミナーゼドメインとからなっていて、単鎖RNAではなく、二重鎖RNA（dsRNA）に局在するアデノシンを優先的に標的とする（図２１ａ）。ADARタンパク質はリボタンパク質ではなく、その自身のdsRBSを介して標的RNAに直接結合する。したがって、天然のADAR酵素を特異的な反応に仕向けることは、これまではgRNA手法では不可能と考えられていた。今日では、高機能な人工編集酵素（エディターゼ；editase）が開発され、ＳＮＡＰタグ（SNAP-tag）技術（非特許文献２２、２３、２４）またはRNA−ペプチド結合モチーフ（非特許文献２５）によって人工gRNAをADARの修飾デアミナーゼドメインに繋いでいる。これらのエディターゼは、細胞内での部位特異的A-I編集によって標的タンパク質の機能を調節することには成功している。しかしながら、これらRNA変異導入技術には、外来性タンパク質が必要であり、汎用性及び一般性を考慮すると未だ技術的な困難さが残っている。また、修飾デアミナーゼドメインの残留編集活性がホメオスタシスを維持する本来の編集状態に対して悪影響を及ぼす可能性を有していることから、ヒトに応用すれば健康リスクを増大させる恐れがある。つまり、修飾ADARタンパク質を使用しない、すなわち外来性タンパク質を使用せず、gRNAのみで合目的なRNA編集誘導を達成できる方法論の開発が、一般的に応用可能なRNA変異誘発方法を確立するカギとなる。【００１４】
これまで、ADAAR変異体タンパク質とガイドRNAの人工的な複合体を用いて、標的部位特異的にRNA変異を導入する方法が開発されている（非特許文献２６）。これら方法論は、標的RNAの認識にはガイド領域と呼ばれる相補的なRNA領域を使い、変異導入にはADARの活性ドメインを用いることを原理としており、任意の標的RNAに対して適用可能な画期的な方法である。しかしながら、これら従来の方法には改変したADARタンパク質が必須であり、変異導入を行う際には煩雑な操作が必要になるという短所がある。【００１５】
そこで、本発明者らは、細胞内の内在性ADARを用いて、このRNA編集の原理を利用し、細胞内ADARを自在に誘導してガイドRNAのみで標的部位特異的にRNA変異を導入することができれば、任意の細胞内標的RNAに対して部位特異的なRNA変異導入を可能にする新たな方法を開発できるのではないかとの考えに至った。【００１６】
かかる新たな方法を開発すべく鋭意研究の結果、本発明者らは、生体内でADAR2により特異的に編集されるグルタミン酸受容体mRNA前駆体（GluR-B pre-mRNA）（非特許文献２７）及び、編集に必要な領域のみを残して構築された人工編集基質（miniSL RNA）（非特許文献２８）を基盤として、この編集基質のADAR結合領域だけを残し、特定位置で分断することによって標的編集ガイドRNAと標的RNAに分離できることを見いだした。つまり、本設計で構築した標的編集ガイドRNAは、ADAR結合領域に加え、標的RNAを認識するための相補領域を有しているため、任意の標的RNAに対して適用可能であることを見いだした。【００１７】
つまり、本発明者は、この新たに見出した標的編集ガイドRNAが、細胞内で内在的に発現しているADARを利用し、標的部位特異的にRNA変異を導入することが可能な機能性RNAとして設計することができることを見いだした。この設計に従い構築される標的編集ガイドRNAは、標的RNAと相補鎖を形成する「相補領域」と、天然型ADARとの結合能を有し、且つ標的塩基アデノシンに効果的に編集を誘導できるように空間的配置および配向を規定する「ADAR結合領域」で構成されていることから、この標的編集ガイドRNAを標的RNA配列に合わせて相補領域の配列を設計することで、任意の細胞内RNAに対して、標的部位特異的なA-I変異を導入する標的編集ガイドRNAを構築できることを見いだして、本発明を完成した。【００１８】
さらに、本発明者らは、hADAR2をガイドすることによってA-I編集を直接誘導するADARガイドRNA（AD-gRNA）を開発した（図２１ａ）。この手法を使用すると、特定の部位における特異的なhADAR2編集活性が、プログラム可能なアンチセンス配列により誘導される。また、部位特異的RNA変異誘発が、hADAR2発現細胞に化学合成したAD-gRNAを直接細胞導入する方法に加え、AD-gRNAを発現するプラスミドDNAをトランスフェクトする方法でも達成できる。このAD-gRNA戦略は、設計が単純なうえ、使い勝手がよく、RNA変異誘発の一般的アプローチの基盤技術となると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Heidenreich M, Zhang F. Applications of CRISPR-Cas systems in neuroscience. Nat Rev Neurosci 17, 36-44 (2016)
【非特許文献２】Kim YG, Cha J, Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 1156-1160 (1996).
【非特許文献３】Porteus MH, Carroll D. Gene targeting using zinc finger nucleases. Nat Biotechnol 23, 967-973 (2005).
【非特許文献４】Zhang F, Cong L, Lodato S, Kosuri S, Church GM, Arlotta P. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011).
【非特許文献５】Mali P, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013).
【非特許文献６】Araki M, Ishii T. Providing Appropriate Risk Information on Genome Editing for Patients. Trends Biotechnol 34, 86-90 (2016).
【非特許文献７】Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498 (2001).
【非特許文献８】Ambros V. The functions of animal microRNAs. Nature 431, 350-355 (2004).
【非特許文献９】Carthew RW, Sontheimer EJ. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-655 (2009).
【非特許文献１０】Lam JK, Chow MY, Zhang Y, Leung SW. siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing. Mol Ther Nucleic Acids 4, e252 (2015).
【非特許文献１１】(a) Cho, S. W.; Kim, S.; Kim, J. M.; Kim, J. S., Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol 2013, 31 (3), 230-2; (b) Mali, P.; Yang, L.; Esvelt, K. M.; Aach, J.; Guell, M.; DiCarlo, J. E.; Norville, J. E.; Church, G. MRNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 2013, 339(6121), 823-6.
【非特許文献１２】Bass BL. RNA editing by adenosine deaminases that act on RNA. Annu Rev Biochem 71, 817-846 (2002).
【非特許文献１３】Nishikura K. Functions and regulation of RNA editing by ADAR deaminases. Annu Rev Biochem 79, 321-349 (2010).
【非特許文献１４】Wulff BE, Nishikura K. Substitutional A-to-I RNA editing. WIREs RNA 1, 90-101 (2010).
【非特許文献１５】Peng, Z.; Cheng, Y.; Tan, B. C.; Kang, L.; Tian, Z.; Zhu, Y.; Zhang, W.; Liang, Y.; Hu, X.; Tan, X.; Guo, J.; Dong, Z.; Bao, L.; Wang, J., Comprehensive analysis of RNA-Seq data reveals extensive RNA editing in a human transcriptome. Nat Biotechnol 2012, 30 (3), 253-60.
【非特許文献１６】Ganot P, Bortolin ML, Kiss T. Site-specific pseudouridine formation in preribosomal RNA is guided by small nucleolar RNAs. Cell 89, 799-809 (1997).
【非特許文献１７】Cavaille J, Bachellerie JP. SnoRNA-guided ribose methylation of rRNA: structural features of the guide RNA duplex influencing the extent of the reaction. Nucleic Acids Res 26, 1576-1587 (1998).
【非特許文献１８】Weinstein LB, Steitz JA. Guided tours: from precursor snoRNA to functional snoRNP. Curr Opin Cell Biol 11, 378-384 (1999).
【非特許文献１９】Cavaille J, Nicoloso M, Bachellerie JP. Targeted ribose methylation of RNA in vivo directed by tailored antisense RNA guides. Nature 383, 732-735 (1996).
【非特許文献２０】Zhao X, Yu YT. Targeted pre-mRNA modification for gene silencing and regulation. Nat Methods 5, 95-100 (2008).
【非特許文献２１】Karijolich J, Yu YT. Converting nonsense codons into sense codons by targeted pseudouridylation. Nature 474, 395-398 (2011).
【非特許文献２２】Stafforst T, Schneider MF. An RNA-deaminase conjugate selectively repairs point mutations. Angew Chem Int Ed Engl 51, 11166-11169 (2012).
【非特許文献２３】Schneider MF, Wettengel J, Hoffmann PC, Stafforst T. Optimal guideRNAs for re-directing deaminase activity of hADAR1 and hADAR2 in trans. Nucleic Acids Res 42, e87 (2014).
【非特許文献２４】Vogel P, Schneider MF, Wettengel J, Stafforst T. Improving site-directed RNA editing in vitro and in cell culture by chemical modification of the guideRNA. Angew Chem Int Ed Engl 53, 6267-6271 (2014).
【非特許文献２５】Montiel-Gonzalez MF, Vallecillo-Viejo I, Yudowski GA, Rosenthal JJ. Correction of mutations within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by site-directed RNA editing. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 18285-18290 (2013).
【非特許文献２６】Vollmar W, et al. RNA editing (R/G site) and flip-flop splicing of the AMPA receptor subunit GluR2 in nervous tissue of epilepsy patients. Neurobiol Dis 15, 371-379 (2004).
【非特許文献２７】Lomeli, H.; Mosbacher, J.; Melcher, T.; Hoger, T.; Geiger, J. R.; Kuner, T.; Monyer, H.; Higuchi, M.; Bach, A.; Seeburg, P. H., Control of kinetic properties of AMPA receptor channels by nuclear RNA editing. Science 1994, 266(5191), 1709-13.
【非特許文献２８】Pokharel, S.; Beal, P. A., High-throughput screening for functional adenosine to inosine RNA editing systems. ACS Chem Biol 2006, 1 (12), 761-5.
【非特許文献２９】Nurpeisov V, Hurwitz SJ, Sharma PL. Fluorescent dye terminator sequencing methods for quantitative determination of replication fitness of human immunodeficiency virus type 1 containing the codon 74 and 184 mutations in reverse transcriptase. J Clin Microbiol 41, 3306-3311 (2003).
【非特許文献３０】Pokharel S, Beal PA. High-throughput screening for functional adenosine to inosine RNA editing systems. ACS Chem Biol 1, 761-765 (2006).
【非特許文献３１】Gommans WM, McCane J, Nacarelli GS, Maas S. A mammalian reporter system for fast and quantitative detection of intracellular A-to-I RNA editing levels. Anal Biochem 399, 230-236 (2010).
【非特許文献３２】Fukuda M, Kurihara K, Yamaguchi S, Oyama Y, Deshimaru M. Improved design of hammerhead ribozyme for selective digestion of target RNA through recognition of site-specific adenosine-to-inosine RNA editing. RNA 20, 392-405 (2014).
【非特許文献３３】Hanswillemenke A, Kuzdere T, Vogel P, Jekely G, Stafforst T. Site-Directed RNA Editing in Vivo Can Be Triggered by the Light-Driven Assembly of an Artificial Riboprotein. J Am Chem Soc 137, 15875-15881 (2015).
【非特許文献３４】Stefl R, et al. The solution structure of the ADAR2 dsRBMRNA complex reveals a sequence-specific readout of the minor groove. Cell 143, 225-237 (2010).
【非特許文献３５】Dabiri GA, Lai F, Drakas RA, Nishikura K. Editing of the GLuR-B ion channel RNA in vitro by recombinant double-stranded RNA adenosine deaminase. EMBO J 15, 34-45 (1996).
【非特許文献３６】Yeo J, Goodman RA, Schirle NT, David SS, Beal PA. RNA editing changes the lesion specificity for the DNA repair enzyme NEIL1. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 20715-20719 (2010).
【非特許文献３７】Keegan LP, Leroy A, Sproul D, O'Connell MA. Adenosine deaminases acting on RNA (ADARs): RNA-editing enzymes. Genome Biol 5, 209 (2004).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
したがって、本発明の目的の１つの形態は、ゲノムDNAからmRNAへの転写の際に発生した標的RNA中の標的塩基アデノシン（Ａ）を、二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ADAR：adenosine deaminases acting on RNA）の作用によりRNA編集能を誘導してA-I編集しイノシン（Ｉ）に変換することからなる部位特異的RNA変異導入方法を提供することである。【００２１】
本発明は、この別の形態として、A-I編集したイノシン（Ｉ）をさらにグアノシン（Ｇ）に翻訳することからなる部位特異的RNA変異導入方法を提供することも目的としている。【００２２】
本発明は、別の形態として、標的RNA中のRNA変異をADAR酵素の作用によりRNA編集する部位特異的RNA変異導入方法に利用される標的編集ガイドRNAを提供することを別の目的としている。【００２３】
本発明は、さらに別の形態として、標的RNA中の標的塩基アデノシンをRNA編集する部位特異的RNA変異導入方法において、ADARがRNA編集するために固定されてRNA編集能を誘導する基盤として作用する標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体を提供することを別の目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
上記目的を達成するために、本発明は、１つの形態として、RNA編集対象の標的RNA中の標的塩基アデノシン（Ａ）を、ADARを作用させてRNA編集能を誘導しA-I編集によりイノシン（Ｉ）に変換することからなる部位特異的RNA変異導入方法を提供する。【００２５】
具体的には、本発明は、RNA編集対象となるRNA変異を有する標的RNAを標的編集ガイドRNAと反応させて二本鎖構造を有する標的RNA−標的編集RNA複合体を得、ADAR酵素を作用させてRNA編集能を誘導しA-I編集によってRNA編集対象の標的塩基アデノシン（Ａ）をイノシン（Ｉ）に変換することからなる部位特異的RNA変異導入方法を提供する。【００２６】
本発明はまた、A-I編集により変換されたイノシン（Ｉ）をさらにグアノシン（Ｇ）に変換することからなる部位特異的RNA変異導入方法を提供する。【００２７】
また、本発明は、別の形態として、ADAR酵素によるRNA編集を誘導してイノシンに変換する上記標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体を構築するために、RNA編集対象の標的塩基アデノシンを有する標的RNAと相補関係にある標的編集ガイドRNAを提供する。【００２８】
さらに、本発明は、別の形態として、上記標的塩基アデノシンを有する標的RNAと該標的編集ガイドRNAと相補し二本鎖構造を構築すると共に、ADAR酵素によるRNA編集を誘導して該アデノシンをイノシンに変換する作用を有する標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体を提供する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明に係る部位特異的RNA変異導入方法は、標的編集部位に存在する標的塩基アデノシンを有するあらゆる標的RNAに対し非依存的かつ非特異的に応用することができるという極めて汎用性が高くかつ有用な方法である。【００３０】
また、本発明の方法は、生体内ADAR機構を利用してRNA編集を誘導できるという極めて有用でかつ利用価値の高い方法である。しかだって、本発明の方法は、患者に投与することによって、疾病の病因であるRNA変異をA-I編集して標的塩基アデノシンをイノシンに変換しmRNAに転写し、そのイノシンはグアノシンに翻訳されることができることに加え、疾病の原因タンパク質の機能及び発現量をA-I編集により調節することができる。これにより、本発明の方法は創薬の研究開発の有用なツールとして重要な役割を果たすことが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第１形態を示すスキーム図である。
【図２】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第２態を示すスキーム図である。
【図３】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第１形態の別の態様を示すスキーム図である。
【図４】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第２形態の別の態様を示すスキーム図である。
【図５】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第１形態の具体的な態様を示すスキーム図である。
【図６】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第２形態の具体的な態様を示すスキーム図である。
【図７】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第１形態のより具体的な態様を示すスキーム図である。
【図８】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第２形態のより具体的な態様を示すスキーム図である。
【図９】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第１形態の別の具体的な態様を示すスキーム図である。
【図１０】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第２形態の別の具体的な態様を示すスキーム図である。
【図１１】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第１形態の別の好ましい具体的な態様を示すスキーム図である。
【図１２】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第２形態の別の好ましい具体的な態様を示すスキーム図である。
【図１３】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第１形態の特定の態様を示すスキーム図である。
【図１４】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第２形態の特定の態様を示すスキーム図である。
【図１５】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第１形態の別の特定の態様を示すスキーム図である。
【図１６】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第２形態の別の特定の具体的な態様を示すスキーム図である。
【図１７】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第１形態の別の特定の具体的な態様を示すスキーム図である。
【図１８】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第２形態の別の特定の具体的な態様を示すスキーム図である。
【図１９】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第１形態の別の特定の具体的な態様を示すスキーム図である。
【図２０】本発明の部位特異的RNA変異導入方法の第２形態の別の特定の具体的な態様を示すスキーム図である。
【図２１】部位特異的A-I編集のガイドRNAの構築を示す図である。
【図２２Ａ】ADg-GFP_A200の配列を示す図。
【図２２Ｂ】ADg-GFP_A200の別の配列を示す図。
【図２３】AD-gRNAと標的RNAとの複合体形成を確認するためのゲルモビリテイシフトアッセイ結果を示す図。
【図２４】修飾GluR2 RNAに基づいたフレームワークを用いたAD-gRNAの構築の説明図。 (a) 基質hADAR2構造の配列ならびに予測二次構造を示す。 (b) Sequence of sADg-GFP_A200 (上部) とsADg-rGFP_A200 (下部) の構造を示す。 (c) sADg-GFP_A200とsADg-rGFP_A200のin vitro編集誘導活性を示す。
【図２５】cis型基質RNAを用いた編集特異性の分析結果を示す図。（ａ）eSL_AAA RNAとeSLr_AAA RNAの実際の配列。（ｂ）eSL_AAA RNAとeSLr_AAA RNAのシーケンスクロマトグラフ図。
【図２６】AD-gRNA誘導RNAの隣接特異性の分析結果を示す図。
【図２７】AD-gRNA誘導RNAの特異性ならびに効率に対する追加塩基対合領域の効果を示す図。
【図２８】AD-gRNA誘導 RNA編集による機能性タンパク質発現調節を説明する図、Rluc-W104XからのcDNA（上部パネル）、また ADg-rRluc_A311でin vitro編集したRluc-W104X（下部パネル）のシークエンスクロマトグラフ図。（ｃ）はAD-gRNAで調節した活性なルシフェラーゼ発現確認。
【図２９】ADg-rRluc_A311の配列を示す図。
【図３０】より複雑な環境下でもAD-gRNAの能力を調べた実験の説明図。（ａ）ADg-rRluc_A311、Rluc-W104XならびにhADAR2を用いた、翻訳・編集反応を同時に行う実験系を示す図。（ｂ）ADg-rRluc_A311のA311の編集効率を示す図。上部パネルはガイドRNA なしの場合、下部パネルは ADg-rRluc_A311を用いた場合を示す。
【図３１】部位特異的ＲＮＡ変異誘導のためのAD-gRNAの応用と細胞内標的タンパク質発現調節の説明図。（ａ）はhADAR2発現細胞内単純プラスミドトランスフェクションによる部位特異的ＲＮＡ変異誘導を示す図。（ｂ）はtet-ADAR2細胞内ADg-GFP_A200とADg-rGFP_A200の特異的編集誘導活性を確認した図。（ｃ）は細胞内コドン修復実験の説明図。
【図３２】tet-ADAR2細胞内ADg-GFP_A200のRTならびに定量PCR (qPCR) 結果を示す図。
【図３３】tet-ADAR2細胞内でのhADAR2発現のウエスタンブロット分析結果を示す図。
【図３４】tet-ADAR2細胞内AD-gRNAsで誘導された編集効率を示す図。
【図３５】編集基質RNAの諸点での分割により生成したAD-gRNAsの編集効率を示す図。（ａ）はADg-RNAs生成用ヘアピン基質上の分割線を示す図。（ｂ）は標的RNA (GFP mRNA) と5'-アンチセンスADg-RNAsの配列を示す図。ADg(L3) は図２４で使用したsADg-rGFP_A200のgRNAと同じ。（ｃ）は各gRNAの編集誘導活性を示す図。
【図３６】実験に使用した４種類の編集ガイドRNA（ADg-GFP_A200、ADg-rGFP_A200、sADg-GFP_A200、sADg-rGFP_A200）の配列を示す図。
【図３７】上記編集ガイドRNAによるRNA変異導入を示す図。（ａ）は実験の概要を示す図。（ｂ）はダイレクトシークエンシングによるGFP mRNAの編集解析結果を示す図。（ｃ）はピーク高から求めたA200の編集割合を示す図。
【図３８】編集ガイドRNA導入後の細胞の透過光及び蛍光顕微鏡による観察結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明に係る部位特異的RNA変異導入方法は、RNA編集の対象となる標的塩基アデノシン（Ａ）を含む標的RNAまたはその特定領域に対して標的編集ガイドRNAを反応させて二本鎖複合体を形成し、形成した二本鎖複合体にADARを結合させてそのRNA編集能を誘導し標的RNA中に存在する標的塩基アデノシンをイノシンに変換することを特徴としている。このように変換されたイノシンはさらにグアノシンに翻訳される。
【００３３】
そこで、本発明では、まず、標的RNAとして、RNA編集の対象となる標的塩基アデノシン（Ａ）を含むRNAとして選定するのがよい。かかるRNAは、一般的には、自然界に存在するRNAから選択するのがよく、例えば、セロトニン受容体、グルタミン酸受容体、膜電位依存過多カリウムチャンネルなどが挙げられるが、標的塩基アデノシンを有するあらゆるRNAから選択することができる。
【００３４】
RNA編集の対象とする標的RNAを選定すると、その中からRNA編集対象の標的塩基アデノシンを含む特定の領域を選定する。この特定領域を選定するに当たっては、標的編集部位を挟んで両側に所定の長さの塩基配列からなる特定領域を構築するのがよい。なお、本発明においては、この特定領域だけからなるフラグメントの他に、当然のことながら、かかる特定の領域を含む全長RNAまたは部分長RNAも使用することができる。したがって、本明細書において使用する用語「標的RNA」は、特定領域だけからなるフラグメントばかりではなく、特定領域を含む全長RNAまたは部分長RNAまたは部分長をも包含する意味で使用している。
【００３５】
このように標的RNAの特定領域を選定すれば、次に、標的編集ガイドRNAを、その特定の領域が標的RNAと実質的に対合して相補鎖を形成するように設計・構築する。かかる標的編集ガイドRNAの特定領域が設計・構築されると、その特定領域をADAR結合コア領域に結合するように設計・構築するのがよい。
【００３６】
したがって、本発明に係る部位特異的RNA変異導入方法は、上記のように設計・構築した標的RNAと標的編集ガイドが対応する特定領域同士相補鎖を形成し複合体化して二本鎖構造を構築し、ADARの作用によりA-I編集能が誘導され標的RNAの標的塩基アデノシンがイノシンに変換される方法である。
【００３７】
以下に、本発明の部位特異的RNA変異導入方法の形態について添付図面を参照にして具体的に説明する。なお、以下に説明する本発明の方法は、本発明を実施するための最良の形態を説明するものであって、本発明をいかなる意味においても限定する意図で説明するものではないことを付言する。
【００３８】
本発明は、RNA編集の対象となる標的RNAの配列様式により大きく２つの形態に分類することができる。第１形態は５'−標的RNAと表示する配列様式であり、第２形態は３'−標的RNAと表示する配列様式である。「５'−標的RNA」とは、RNA編集対象である標的RNAの標的塩基アデノシン（Ａ）の左側に（添付図面に対して）５'末端が存在する標的標的RNAを意味する。また、「３'−標的RNA」とは、RNA編集対象である標的塩基アデノシン（Ａ）の左側に（添付図面に対して）３'末端が存在する標的RNAを意味する。なお、本明細書においては、「５'−標的RNA」ならびに「３'−標的RNA」について、厳密に区別して使用せずに単に標的RNAと表示する場合もある。
【００３９】
そこで、本発明の第１形態ならびに第２形態による部位特異的RNA変異導入方法について図１ならびに図２を参照してそれぞれ説明する。
【００４０】
第１形態でよる本発明の部位特異的RNA変異導入方法は、式［LA］：
【化１】
2017010556.tif 000002
で表される５'−標的RNAと、式［LIA］：
【化２】
2017010556.tif 000003
で表される３'−標的編集ガイドRNAを反応させ、式［LIIA］： 
【化３】
2017010556.tif 000004
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体を得ると共に、ADARを作用させてA-I編集を誘導し、式［LIIIA］：
【化４】
2017010556.tif 000005
で表される５'−編集標的RNAに変換し、該複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）（黒三角印）を脱アミノ化してイノシン（Ｉ）に変換することを特徴とする。このように変換されたイノシンはグアノシンに翻訳される。以下、説明を簡単にするために、この形態の方法を第１標的編集スキームともいう。
【００４１】
第２形態による本発明の部位特異的RNA変異導入方法は、第１形態による部位特異的RNA変異導入方法と実質的には同じであり、式［LVA］：
【化５】
2017010556.tif 000006
で表される３'−標的RNAを、式［LVIA］：
【化６】
2017010556.tif 000007
で表される５'−標的編集ガイドRNAと反応させ、式［LVIIA］： 
【化７】
2017010556.tif 000008
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体を得、ADARを作用させてA-I編集を誘導して式［LVIIIA］：
【化８】
2017010556.tif 000009
で表される３'−編集標的RNAに変換して、該複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）（黒三角印）を脱アミノ化してイノシン（Ｉ）に変換することを特徴とする。このように変換されたイノシンはグアノシンに翻訳される。以下、説明を簡単にするために、この形態の方法を第２標的編集スキームともいう。
【００４２】
本発明に使用される第１形態の５'−標的RNA［LA］は５'−標的側相補領域（１０）からなり、その５'−標的側相補領域（１０）は、末端側標的相補領域（１２）と、ガイド側標的相補領域（１４）と、Ａ＊（１５）で表される標的塩基アデノシン（Ａ）とから構成されている。同様に、第２形態の３'−標的RNA［LVA］は３'−標的側相補領域（５０）からなり、その３'−標的側相補領域（５０）は、末端側標的相補領域（５２）と、ガイド側標的相補領域（５）と、Ａ＊（５５）で表される標的塩基アデノシン（Ａ）とから構成されている。
【００４３】
本発明において、標的RNAの末端側標的相補領域（１２，５２）は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からそれぞれ構成される塩基配列であって、その塩基数は、特に限定されないが、一般的には４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個程度の塩基配列からなるように構築するのがよい。
【００４４】
標的RNAのガイド側標的相補領域（１４、５４）は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からそれぞれ構成される塩基配列であって、その塩基数は、特に限定されないが、１〜１５個、好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個程度の塩基配列からなるように構築するのがよい。なお、いずれの標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基配列も、後述する編集ガイドRNAと複合体化するに際しては、編集ガイドRNAのコア側標的認識領域のＸ隣接部分の塩基配列とそれぞれ塩基対を形成するように構築する。
【００４５】
標的RNAにおいて、Ａ＊（１５、５５）は、標的編集部位（＊印）に存在する標的編集対象の標的塩基アデノシンをそれぞれ意味する。
【００４６】
本発明において、標的編集ガイドRNAは、アンチセンス領域（２０、６０）と、ADAR結合領域（２６、６６）とから構成される。アンチセンス領域（２０、６０）は、第１形態の５'−標的RNAまたは第２形態の３'−標的RNAと相補鎖をそれぞれ形成するように構築する。
【００４７】
さらに、３'−標的編集ガイドRNAの３'−アンチセンス領域（２０）は、末端側標的認識領域（２２）と、コア側標的認識領域（２４）のＸ隣接部分領域と、５'−標的RNAの標的塩基アデノシンを標的編集誘導する標的編集誘導塩基Ｘ（２５）（△印）とから構成される。
【００４８】
同様に、５'−標的編集ガイドRNAの５'−アンチセンス領域（６０）は、末端側標的認識領域（６２）と、コア側標的認識領域（６４）のＸ隣接部分領域と、３'−標的RNA［LVA］の標的塩基アデノシン（Ａ）を標的編集誘導する標的編集誘導塩基Ｘ（６５）（△印）とから構成される。
【００４９】
本発明の標的編集ガイドRNAの末端側標的認識領域（２２、６２）は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、その塩基数は、特に限定されないが、一般的には、４０個程度、好ましくは３０個程度、より好ましくは２０個程度の塩基配列から構成される塩基領域をそれぞれ構築するのがよい。ただし、この構成塩基数は、対応する標的RNAの末端側標的相補領域（１２、５２）の塩基数と同数であって、それぞれ対応する塩基同士が対合し塩基対を形成するようにそれぞれ構築する。
【００５０】
またアンチセンス領域のコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数が、一般的には１〜１５個以内、好ましくは１〜１２個以内、より好ましくは１０個以内、特に好ましくは１〜５個程度の塩基配列からなる塩基配列を構成するとともに、標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基配列とそれぞれ塩基対を形成する。このコア側標的認識領域のＸ隣接部分の塩基配列は、標的RNAと複合体を形成する際、そのガイド側分断領域の塩基配列と塩基対合して塩基対を形成するように構築する。
【００５１】
また、アンチセンス領域に隣接するADAR結合領域は、コア側標的認識領域のADAR隣接部分領域とADAR結合コア領域とガイド側分断領域とからなり、それぞれアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、コア側標的認識領域のADAR隣接部分領域とガイド側分断領域のそれぞれの塩基数は、一般的には０〜１０個、好ましくは５個程度の塩基配列からなる塩基領域を意味し、それぞれの構成塩基は互いに塩基対合して塩基対を形成するように構築する。
【００５２】
本発明において、ADARがA-I編集誘導能を発揮できるためには、ADAR結合領域の塩基配列は大きく修飾することなく、ある特定の塩基配列またはそれに類似する塩基配列にある程度固定することも可能である。一方、編集ガイドRNAのアンチセンス領域の塩基配列は、目的とする標的塩基Ａを含む標的RNAはその塩基配列は千差万別であり、極めて多様な塩基配列を有していることから、その塩基配列の種類や長さも自由に変えることができるように構築する必要がある。また、編集ガイドRNAのアンチセンス領域の塩基配列の塩基数、特にそのコア側標的認識領域のＸ隣接部領域の塩基配列の塩基数を増減することによって、ADARのA-I編集能を調節することができる可能性がある。
【００５３】
また、ADAR結合コア領域（２８、６８）は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からそれぞれ構成されるステムループ構造をした不完全２重鎖RNA構造をしている。このステムループ構造は、ループ構造を挟んで２本の不完全相補塩基配列構造をしていて、各一本鎖の塩基配列は、同種または異種の塩基配列であり、その塩基数は、編集誘導能を損なわない限り特に限定されないが、一般的には１０〜４０個、好ましくは２０〜３０個程度であるのがよい。また、ループ構造は、対応する構成塩基同士は互いに相補鎖を形成せず、同種および異種の４個〜８個、好ましくは４〜５個の塩基から構成されている。さらに、この不完全相補二本鎖の一方の一本鎖の塩基配列は、その末端がコア側標的認識領域のADAR隣接部分と、また他方の一本鎖の塩基配列は、その末端がガイド側分断領域にそれぞれ結合した構造になっている。
【００５４】
さらに、ADAR結合コア領域は、ADARが結合することによりADARの作用を誘導する領域であって、標的RNAの標的塩基アデノシンをA-I編集してイノシンに変換する機能を有している。つまり、ADARによるRNA編集は、ADARが標的編集ガイドRNAのADAR固定コア領域に固定されることによりADARのRNA編集能を誘導する機能を発揮することができる。なお、A-I編集能を有するADARとしては、例えば、ADARとしては、例えば、hADAR1、hADAR2が挙げられる。
【００５５】
本発明において、標的RNAと標的編集ガイドRNAが相補して複合体化することにより標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体が形成される。具体的には、標的RNAの標的側相補領域と、標的編集ガイドRNAのアンチセンス領域の１部であるコア側標的認識領域のＸ隣接部分塩基配列が塩基対合して相補鎖を形成することによって標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体が形成される。更に具体的には、標的RNAの末端側標的相補領域と標的編集ガイドRNAの末端側標的認識領域が、また標的RNAのガイド側標的相補領域と標的編集ガイドRNAのコア側標的認識領域が対合して相補鎖をそれぞれ形成することによって標的RNA−標的編集ガイドRNA複合体が形成される。
【００５６】
更に詳細には、本発明の第１標的編集スキームにおいては、５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［LIIA］は、５'−標的RNA［LA］の末端側標的相補領域（１２）の構成塩基と、３'−標的編集ガイドRNA［LIA］の３'−末端側標的認識領域（２２）の構成塩基は、対応する塩基同士が塩基対合して塩基対を形成するように構築する。
【００５７】
同様に、本発明の第２標的編集スキームにおいては、３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［LVIIA］は、３'−標的RNA［LVA］の末端側標的相補領域（５２）の構成塩基と、５'−標的編集ガイドRNA［LIA］の５'−末端側標的認識領域（６２）の構成塩基は、対応する塩基同士が塩基対合して塩基対を形成するように構築する。
【００５８】
一方、該複合体［LIIA］において、５'−標的RNA［LA］のガイド側標的相補領域（１４）の構成塩基は、編集ガイドRNAのコア側標的認識領域（２４）のＸ隣接部分領域の構成塩基と塩基対を構成するとともに、そのADAR隣接部分領域の構成塩基はガイド側分断領域（２７）の構成塩基と塩基対合して塩基対を形成するように構築する。
【００５９】
同様に、該複合体［LVIIA］において、３'−標的RNA［LVA］のガイド側標的相補領域（５４）は、編集ガイドRNA［LVIA］のコア側標的認識領域（６４）のＸ隣接部分領域の構成塩基と塩基対を構成するとともに、そのADAR隣接部分領域はガイド側分断領域（６７）の構成塩基と塩基同士対合して塩基対を形成するように構築する。
【００６０】
前述したように、標的編集ガイドRNAのコア側標的認識領域の塩基数は、標的RNAのガイド側標的相補領域と、標的編集ガイドRNAのガイド側分断領域の合計塩基数と同数であるように構築する。したがって、標的編集ガイドRNAのコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域の塩基配列の塩基数を調節して、ADAR結合領域のガイド側分断領域の塩基配列の塩基数よりも大きく設計するのがよい。このように調節することによって、ADARによるA-I編集能を調節することができる。
【００６１】
本発明において、標的RNAと標的編集ガイドRNAとが複合体化されて二本鎖構造を形成することにより、ADARが該標的編集ガイドRNAのADAR固定コア領域に作用し、RNA編集能が誘導されて、該複合体に結合した標的RNAに存在する標的塩基アデノシン（Ａ）がA-I編集されてイノシン（Ｉ）に変換される。
【００６２】
さらに、上記のように標的塩基アデノシンがイノシンに変換された編集標的RNAは、そのイノシンがグアノシン（Ｇ）に翻訳される。つまり、本発明においてRNA編集された５'−標的RNAの５'−編集標的RNA［LIIIA］ならびに３'−標的RNAの３'−編集標的RNA［LVIIIA］のそれぞれのイノシン（Ｉ）は、５'−翻訳標的RNA［LIVA］：
【化９】
2017010556.tif 000010
ならびに３'−翻訳標的RNA［LIXA］：
【化１０】
2017010556.tif 000011
で示すようにグアノシン（Ｇ）に翻訳される。
【００６３】
上記標的編集スキームにおいて、標的RNAの標的塩基Ａ（＊印）に対応する標的編集部位（△印）に存在する標的編集誘導塩基Ｘ（２５、６５）としては、標的塩基Ａとは相補しないシトシン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、アデノシンならびにウリジンのいずれの塩基が挙げられる。なお、A-I編集能の点からすると、シトシン（Ｃ）を標的編集誘導塩基として使用するのが好ましい。
【００６４】
したがって、本発明は、その好ましい態様として、標的編集部位（△印）に対応する標的編集誘導塩基（Ｘ）を塩基シトシン（Ｃ）として構築した部位特異的RNA変異導入方法を提供する。
【００６５】
つまり、本発明の好ましい態様では、第１標的編集スキ−ムにおける３'−標的編集ガイドRNA［LIA］において標的編集誘導塩基Ｘとしてシトシン（Ｃ）を使用した３'−標的編集ガイドRNA［LIB］：
【化１１】
2017010556.tif 000012
または第２標的編集スキ−ムにおける５'−標的編集ガイドRNA［LVIA］において標的編集誘導塩基Ｘとしてシトシン（Ｃ）を使用した５'−標的編集ガイドRNA［LVIB］:
【化１２】
2017010556.tif 000013
を、対応する標的RNAとそれぞれ反応させて複合体化し得られた５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［LIIB］：
【化１３】
2017010556.tif 000014
または３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［LVIIB］：
【化１４】
2017010556.tif 000015
に対してADARを作用させてA-I編集を誘導して５'−編集標的RNA［LIIIA］：
【化１５】
2017010556.tif 000016
または３'−編集標的RNA［LVIIIA］：
【化１６】
2017010556.tif 000017
にそれぞれ変換し、各標的RNA部の標的塩基アデノシンをイノシンにより効率的にかつ容易に変換することを特徴としている。
【００６６】
上記のようにA-I編集された各編集標的RNAのイノシン（Ｉ）は、５'−翻訳標的RNA［LIVA］または３'−翻訳標的RNA［LIXA］に示すようにグアノシン（Ｇ）に翻訳される。
【００６７】
【化１７】
2017010556.tif 000018
【化１８】
2017010556.tif 000019
【００６８】
さらに、標的RNAとして全長RNAまたは上記標的側相補領域の塩基配列より長い部分長RNAを使用した場合、本発明に係る部位特異的RNA変異導入方法は、図３または図４に示すように、５'−標的RNA［LXA］：
【化１９】
2017010556.tif 000020
または３'−標的RNA［LXVA］：
【化２０】
2017010556.tif 000021
と、３'−標的編集ガイドRNA［LIA］：
【化２１】
2017010556.tif 000022
または５'−標的編集ガイドRNA［LVIA］：
【化２２】
2017010556.tif 000023
をそれぞれ反応させて５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［LXIA］：
【化２３】
2017010556.tif 000024
または３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［LXVIA］：
【化２４】
2017010556.tif 000025
をそれぞれ得、ADARの作用により標的RNAのRNA変異である標的塩基アデノシンをイノシンにA-I編集した５'−編集標的RNA［LXIIA］：
【化２５】
2017010556.tif 000026
または３'−編集標的RNA［LXVIIA］：
【化２６】
2017010556.tif 000027
をそれぞれ得ることから構築される。
【００６９】
同様に、本発明の好ましい態様として、対応する標的RNAの標的塩基アデノシン（Ａ）と対応する標的編集誘導塩基Ｘ（２５、６５）（△印）として、シトシン（Ｃ）を使用した部位特異的RNA変異導入方法は、第１標的編集スキームにおいて、３'−標的編集ガイドRNA［LIA］の代わりに式［LIB］：
【化２７】
2017010556.tif 000028
で表される３'−標的編集ガイドRNAを使用して、または第２標的編集スキームにおいて、５'−標的編集ガイドRNA［LVIA］の代わりに式［LVIB］： 
【化２８】
2017010556.tif 000029
で表される５'−標的編集ガイドRNAを使用して、対応する標的RNAとそれぞれ反応させて式［LXIB］：
【化２９】
2017010556.tif 000030
で表される５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体または式［LXVIB］：
【化３０】
2017010556.tif 000031
で表される３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体をそれぞれ得、各複合体にADARを作用させてA-I編集を誘導して該標的RNAの標的塩基アデノシンをイノシンに変換して式［LXIIB］：
【化３１】
2017010556.tif 000032
で表される５'−編集標的RNAまたは式［LXVIIA］：
【化３２】
2017010556.tif 000033
で表される３'−編集標的RNAをそれぞれ得ることによってRNA編集対象の標的塩基アデノシンをイノシンに変換することができる。
【００７０】
上記のようにイノシンに変換された編集標的RNAは、５'−翻訳標的RNA［LIVA］：
【化３３】
2017010556.tif 000034
または３'−翻訳標的RNA［LIXA］：
【化３４】
2017010556.tif 000035
に変換されて、イノシンはグアノシンに翻訳される。
【００７１】
以上のようにして、本発明に係る部位特異的RNA変異導入方法は、ADARの作用により全長標的RNAまたは部分長標的RNA中に含まれる標的塩基アデノシンをA-I編集してイノシンに簡単に変換することが可能である。
【００７２】
以上、本発明に係る部位特異的RNA変異導入方法について包括的に説明した。以下、本発明に係る部位特異的RNA変異導入方法について図面を参照してより具体的に説明する。
【００７３】
まず、第１標的編集スキームによる本発明の部位特異的RNA変異導入方法について図５を参照して説明する。なお、図５に示す本発明の部位特異的RNA変異導入方法は、図１に示す包括的な形態をより具体的に表するものである。
【００７４】
本発明の部位特異的RNA変異導入方法は、図５に示すように、５'−標的RNA［IA］：
【化３５】
2017010556.tif 000036
（式中、記号「aN1・・aNm」は、上記５’−標的RNA［LA］の末端側標的相補領域（１２）を構成する塩基配列に相当する塩基配列を表し、「aN」がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基からなる同種もしくは異種の塩基の組み合わせで構成される連続塩基配列であり、その塩基数は、特に限定されないが、一般的には４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個程度になるように構築し、
記号「bN1 bN2・・bNn-1bNn」は、５’−標的RNA［LA］のガイド側標的相補領域（１４）を構成する塩基配列に相当する塩基配列を表し、記号「bN」がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基からなる１〜１５個、好ましくは１２個程度、より好ましくは１０個程度、特に好ましくは５個程度の同種または異種の塩基組み合わせで構成される連続塩基配列であるように構築する。）
と、３’−標的編集ガイドRNA［IIA］：
【化３６】
2017010556.tif 000037
（式中、記号「cN1cN2……cNp-1cNp」は、３’−標的編集ガイドRNAのガイド側分断領域 （２７）に相当し、記号「cN」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、記号「p」は、塩基数が、一般的には０〜１５個、好ましくは１２個以下、より好ましくは１０個以下を意味し、
記号「dN1・・dNm」は、３’−アンチセンス領域の末端側標的認識領域（２２）を構成する塩基配列を意味し、記号「dN」がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれか１種の塩基からなり、塩基数が、特に限定されないが、一般的には４０個、好ましくは３０個、より好ましくは２０個程度になる同種または異種の塩基の組み合わせからなる連続塩基配列になるように構築するとともに、５’−標的RNAの末端側標的相補領域（１２）の塩基配列の構成塩基数と同数であるとともに、その末端側標的相補領域の塩基配列と塩基対を構築し、
記号「eN1eN2 ・・eNn+p」は、記号「eN1eN2 ・・eNn」で表されるコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域の塩基配列と、記号「eN1eN2 ・・eNp」で表されるADAR隣接部分領域の塩基配列を意味するとともに、そのＸ隣接部分領域は、記号「eN」がアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基からなり、塩基数が、本発明の目的ならびに機能を損なわない限り特に限定されないが、一般的には、１〜１５個、好ましくは１〜１２個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは５個以下からなる同種または異種の塩基の連続塩基配列を表し、またそのADAR隣接部分領域は、同様に、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはウラシル（Ｕ）から選ばれるいずれかの塩基からなり、塩基数が一般的には０〜１５個、好ましくは１２個以下、より好ましくは１０個以下からなる連続塩基配列を表している。）
と反応させて複合体化させて５’−標的RNA−３’−標的編集ガイドRNA複合体［IIIA］：
【化３７】
2017010556.tif 000038
を得、次いで得られた５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［VIIIA］をADARの作用によりA-I編集し５'−編集標的RNA［IVA］：
【化３８】
2017010556.tif 000039
に変換し、標的塩基アデノシン（Ａ）（＊印）をイノシン（Ｉ）に変換するRNA変異編集から構成される。得られた５'−編集標的RNA［IVA］は続いてそのイノシン（Ｉ）がグアノシン（Ｇ）に翻訳されて５'−翻訳標的RNA［VA］：
【化３９】
2017010556.tif 000040
に変換される。
【００７５】
ただし、５'−標的RNA［IA］において、▲印を付した番号は、標的塩基Ａからの塩基「bN」の塩基数を表している。例えば、番号「０」は標的塩基Ａに隣接するガイド側標的相補領域の塩基が存在しないことを意味し、また番号「１」は標的塩基Ａに隣接するガイド側標的相補領域の塩基が１個存在すること、さらに番号「ｎ」は標的塩基Ａに隣接するガイド側標的相補領域の塩基がｎ個からなる塩基配列を意味している。以下の説明でも同じ意味を有する。
【００７６】
同様に、３'−標的編集ガイドRNA［IIA］において、↓印を付した番号は、ADAR結合コア領域の１末端からの塩基「cN」の塩基数を表している。例えば、番号「０」は標的塩基Ａに隣接するガイド側分断領域の塩基配列が存在しないことを意味し、また番号「１」はガイド側分断領域の塩基が１個存在すること、番号「ｐ」はガイド側分断領域の塩基がｐ個からなる塩基配列を意味している。以下の説明でも同じ意味を有する。
【００７７】
また、３'−標的編集ガイドRNA［IIA］において、例えば、番号が「０」である場合、ADAR結合コア領域の１末端に隣接するガイド側分断領域の塩基が存在しないことになることから、対応するコア側標的認識領域のADAR隣接部分に対応する塩基も存在しないことになる。したがって、この場合は、そのコア側標的認識領域は記号「eN1……eNn」で表されるそのＸ隣接部分領域の塩基配列だけから構成されることになる。一方、番号が「１」である場合、ガイド側分断領域の塩基数は１個になることから、コア側標的認識領域の塩基配列は記号「eN1…..eNn+1」で表される。また、番号が「p」の場合、コア側標的認識領域の塩基配列は記号「eN1…..eNn+p」で表される。以下の説明でも同じ意味を有する。また、例えば、番号が「１」の場合、つまり、記号「eN1」の場合、編集ガイドRNAの該当する塩基「eN1」は、標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基「bN1」と塩基対を構成する。
【００７８】
なお、編集ガイドRNAのコア側標的認識領域の構成塩基数が余り小さくなりすぎて当該標的編集ガイドRNAの３'−標的認識領域内に存在する対応塩基（Ｘ）からADAR結合コア領域までの距離が短くなり過ぎると、ADARによるA-I編集の誘導能が低下して好ましくない場合がある。また、この構成塩基数が余り大きくなりすぎて当該標的編集ガイドRNAの３'−標的認識領域内に存在する対応塩基（Ｘ）からADAR結合コア領域までの距離が長くなり過ぎても、ADARによるA-I編集の誘導能が低下して好ましくない場合がある。
【００７９】
また、ADAR結合領域において、記号「NαNβ-NδNχ」は、前述したように、上記３'−標的編集ガイドRNA［LIA］ならびに５'−標的編集ガイドRNA［LVIA］のADAR結合コア領域（２８、６８）を構成する塩基配列に相当するステムループ構造からなる不完全二本鎖RNA構造からなっている。つまり、ステムループ構造は、ループ構造を挟んで２本の塩基配列からなり、その２本の塩基配列が、相補する塩基対と相補しないミスマッチ塩基対が混在する不完全相補の二本鎖からなる構造である。各一本鎖を構成する塩基（Ｎ）は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種もしくは異種の塩基から構成され、各一本鎖の塩基数は、一般的には１０〜４０個、好ましくは２０〜３０個であるのがよい。また、ループ構造は、対応する構成塩基同士は互いに相補鎖を形成せず、同種および異種の４個〜８個、好ましくは４〜５個の塩基から構成されている。このステムループ構造は、そのループ構造を挟んで結合する不完全相補二本鎖の一末端側は標的認識領域のADAR隣接部分領域の塩基配列と、他の末端側はガイド側分断領域の塩基配列と結合するように構築するのがよい。
【００８０】
記号「Nα-Nχ」は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる互いに同種もしくは異種の塩基で構成されるそれぞれ１本の塩基配列からなり、この塩基対は、単数個もしくは複数個、好ましくは２個ていどのミスマッチ塩基対を有する不完全２本鎖相補領域を表している。記号「Nβ-Nδ」は、塩基数が４〜８個、好ましくは４〜５個の同様な同種または異種の塩基で構成されるループ構造を表している。また、記号「Nα-Nχ」は、その一末端が５'−標的RNAのガイド側標的相補領域または当該標的編集ガイドRNAのガイド側分断領域に結合し、その他の末端は当該標的編集ガイドRNAのコア側標的認識領域に結合した構造である。
【００８１】
上記５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［IIIA］において、記号「aN1・・aNm」と記号「dN1・・dNm」は各構成塩基対（つまり、例えば、「aN1−dN1」、「aNm−dNm」）が実線で結合した状態で示されていて、各構成塩基対が相補鎖を形成していることを表している。
【００８２】
つまり、記号「aN1・・aNm」で表される５'−標的RNAの末端側標的相補領域の塩基配列と、記号「dN1・・dNm」で表される３'−標的編集ガイドRNAの末端側標的認識領域の塩基配列が互いに塩基対合し塩基対を形成するとともに、記号 [bN1……bNn]  で表される５'−標的RNAのガイド側標的相補領域の塩基配列と、記号 [eN1……eNn]で表される３'−標的編集ガイドRNAのコア側標的認識領域のＸ隣接部分の塩基配列とが互いに塩基対合し塩基対を形成して複合体化する。一方、ADAR結合コア領域は、その１端がガイド側分断領域の塩基配列と、また他端がコア側標的認識領域のADAR隣接部分と結合した構造になる。
【００８３】
同様に、第２標的編集スキームによる本発明の部位特異的RNA変異導入方法について図６を参照してより具体的に説明する。なお、図中の各記号は、上記第１標的編集スキームにおける対応する各記号と実質的には同じ意味を有するところから、説明を簡潔にするために、ここでは詳しい説明は省略する。
【００８４】
本発明によれば、５'末端部位に５'−標的RNAが相補する３'−標的編集ガイドRNA［IIA］の場合と同様に、その３'末端部位に３'−標的RNAが相補する３'−標的編集ガイドRNA［IIA］の場合も３'−標的RNAの標的塩基アデノシンはA-I編集を受けてイノシン（Ｉ）に変換される。
【００８５】
第２標的編集スキームによる本発明方法の本発明方法は、図６に示すように、３'−標的RNA［VIA］：
【化４０】
2017010556.tif 000041
と、５'−標的編集ガイドRNA［VIIA］：
【化４１】
2017010556.tif 000042
を反応させて複合体化させて５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［VIIIA］：
【化４２】
2017010556.tif 000043
を得、次いで得られた複合体にADARを作用させてA-I編集能を誘導して５'−編集標的RNA［IXA］：
【化４３】
2017010556.tif 000044
に変換し、標的塩基アデノシン（Ａ）（＊印）をイノシン（Ｉ）に変換するRNA変異編集から構成される。得られた５'−編集標的RNA［IVA］は続いてそのイノシン（Ｉ）がグアノシン（Ｇ）に翻訳されて５'−翻訳標的RNA［XA］：
【化４４】
2017010556.tif 000045
に変換される。
【００８６】
また、上記第１および第２標的編集スキームにおいては、標的編集部位（＊印）に対応する部位（△印）に標的編集誘導塩基（Ｘ）としてシトシン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、アデシノン（Ａ）またはウリジン（Ｕ）のいずれかが配置される態様が構築可能であるが、A-I編集能の誘導の点からすれば、一般的には、シトシン（Ｃ）の方が高いことから、本発明は、好ましい態様として、対応塩基（Ｘ）をシトシン（Ｃ）とした態様を構築することができる。以下においても同様である。
【００８７】
したがって、上記第１標的編集スキームに本発明は、図７に示すように、３'−標的編集ガイドRNA［IIA］を３'−標的編集ガイドRNA［IIB］：
【化４５】
2017010556.tif 000046
に代えて使用することにより５'−標的RNAと複合体化させて５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［IIIB］: 
【化４６】
2017010556.tif 000047
を得、ADARを作用させて５'−標的RNAの標的塩基アデノシンをA-I編集してイノシンに変換する部位特異的RNA変異導入方法を提供する。
【００８８】
同様に、上記第２標的編集スキームによる本発明は、図８に示すように、５'−標的編集ガイドRNA［VIIA］を５'−標的編集ガイドRNA［VIIB］：
【化４７】
2017010556.tif 000048
に代えて使用することにより、３'−標的RNAと複合体化させて３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［VIIIB］: 
【化４８】
2017010556.tif 000049
を得、ADARを作用することにより３'−標的RNAの標的塩基アデノシンをA-I編集してイノシンに変換する部位特異的RNA変異導入方法を提供する。
【００８９】
さらに、上記第１および第２標的編集スキームにおいて、本発明は、標的RNAとして標的RNAフラグメントを含む全長RNA分子または部分長RNA分子を用いた好ましい形態を構築することができる。
【００９０】
つまり、第１標的編集スキームによる本発明の部位特異的RNA変異導入方法は、図９に示すように、５'−標的RNA［IA］に代えて５'−標的RNA［XIA］：
【化４９】
2017010556.tif 000050
を使用することによって、３'−標的編集ガイドRNA［IIA］と複合体化して５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XIIIA］: 
【化５０】
2017010556.tif 000051
を得、ADARを作用することにより５'−標的RNAの標的塩基アデノシンをA-I編集してイノシンに変換する部位特異的RNA変異導入方法を提供する。
【００９１】
また、第２標的編集スキームによる本発明の部位特異的RNA変異導入方法は、図１０に示すように、３'−標的RNA［VIA］に代えて３'−標的RNA［XVIA］：
【化５１】
2017010556.tif 000052
を使用することにより、５'−標的編集ガイドRNA［VIIA］と複合体化して３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［XVIIIA］: 
【化５２】
2017010556.tif 000053
を得、ADARを作用することによりA-I編集能が誘導されて５'−標的RNAの標的塩基アデノシンがイノシンに変換される。
【００９２】
上記第１および第２標的編集スキームのいずれにおいても、標的部位に存在する変換イノシンはグアノシンに翻訳される。
【００９３】
上記標的編集スキームにおいて標的編集部位に対応する部位に存在するRNA塩基（Ｘ）をシトシン（Ｃ）に構築することによって、上記第１および第２標的編集スキームによる本発明は、図１１および図１２にそれぞれ示すように、３'−標的編集ガイドRNA［IIA］に代えて３'−標的編集ガイドRNA［IIB］：
【化５３】
2017010556.tif 000054
または５'−標的編集ガイドRNA［VIIA］に代えて３'−標的編集ガイドRNA［VIIB］：
【化５４】
2017010556.tif 000055
を使用することによって、５'−標的RNA［XIA］または３'−標的RNA［XVIA］と複合体化させて５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XIIIB］:
【化５５】
2017010556.tif 000056
または３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［XVIIIB］:
【化５６】
2017010556.tif 000057
をそれぞれ得、得られた複合体にADARを作用させることによりA-I編集能が誘導され、標的RNA側の標的塩基アデノシンがイノシンに変換され、続いてそのイノシンがグアノシンに翻訳される部位特異的RNA変異導入方法を提供する。
【００９４】
本発明において使用するADAR結合領域を含む標的編集ガイドRNAは次のように設計することができる。前述したように、非特許文献７には、生体内でADAR２により特異的に編集されるグルタミン酸受容体mRNA前駆体（GluR-B pre-mRNA）（非特許文献６）を基盤として、編集に必要な領域のみを残した編集基質RNA (miniSL RNA) が構築されている。本発明者は、この編集基質のADAR結合領域だけを残し、図示する位置で分断することによって標的編集ガイドRNAと標的RNAに分離することによって、本発明の標的編集ガイドRNAとして構築できることを見いだした。したがって、このように構築した標的編集ガイドRNAは、ADAR結合領域に加え、標的RNAを認識するための相補領域を有しているので、任意の標的RNAに対して適用可能であるため、本発明の標的編集ガイドとして利用できる。
【００９５】
具体的には、本発明において、モデル標的RNAとして緑色蛍光タンパク質mRNA配列に対して、標的編集ガイドRNAを設計し、標的編集部位にA-I変異を誘導できるかどうかを確認した。そこで設計した各RNAをin vitro転写反応を用いて合成した後、精製した組換えADAR２を用いてin vitro編集反応を行った。その結果、編集部位は標的編集ガイドRNA依存的に編集されることが分かった。この結果、このような設計により本発明の目的とする機能を有する標的編集ガイドRNAが構築できることを見いだした。
【００９６】
つまり、例えば、上記グルタミン酸受容体mRNA前駆体（GluR-B pre-mRNA）［XLVIIA］：
【化５７】
2017010556.tif 000058
を基盤として編集に必要なADAR結合領域だけを残して編集基質(miniSL RNA) ［XLVIIB］： 
【化５８】
2017010556.tif 000059
を構築することができる。つまり、これにより、編集基質RNA (miniSL RNA) のADAR結合領域を残して分断部位（↓）で分断したところ、標的RNAと標的編集ガイドRNAに分離できることが明らかになった。
【００９７】
そこで、ここで得られた標的編集ガイドを使用した第１標的編集スキームによる本発明の好ましい形態は、図１３に示すように、５'−標的RNA［XXIA］：
【化５９】
2017010556.tif 000060
を３'−標的編集ガイドRNA［XXIIA］：
【化６０】
2017010556.tif 000061
と反応させて複合体化し５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XXIIIA］：
【化６１】
2017010556.tif 000062
を得、得られた複合体にADARを作用させてA-I編集能を誘導し、５'−編集標的RNA［XXIVA］： 
【化６２】
2017010556.tif 000063
に変換して標的塩基アデノシンをイノシンに変換する。変換されたイノシンはグアノシンに翻訳される。
【００９８】
第１標的編集スキームによる本発明のより好ましい態様は、図１５に示すように、３'−標的編集ガイドRNA［XXIIA］として、３'−標的編集ガイドRNA［XXIIB］：
【化６３】
2017010556.tif 000064
を使用して、５'−標的RNA［XXIA］と反応させて複合体化して５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XXIIIB］：
【化６４】
2017010556.tif 000065
を得、ADARを作用させてA-I編集能を誘導して５'−編集標的RNA［XXIVA］：
【化６５】
2017010556.tif 000066
に示すように標的塩基アデノシンをイノシンに変換することを特徴としている。この変換されたイノシンは５'−翻訳標的RNA［XXVA］：
【化６６】
2017010556.tif 000067
に示すようにグアノシンに翻訳される。
【００９９】
また、第２標的編集スキームにおける本発明の方法の好ましい形態は、図１４に示すように、３'−標的RNA［XXVIA］：
【化６７】
2017010556.tif 000068
と５'−標的編集ガイドRNA［XXVIIA］：
【化６８】
2017010556.tif 000069
と反応させて複合体化し、３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［XXVIIIA］：
【化６９】
2017010556.tif 000070
を得、得られた複合体にADARを作用させてA-I編集能を誘導し、５'−編集標的RNA［XXIXA］： 
【化７０】
2017010556.tif 000071
に変換して標的塩基アデノシンをイノシンに変換することができる。この変換されたイノシンは３'−翻訳標的RNA［XXXA］：
【化７１】
2017010556.tif 000072
に示すようにグアノシンに翻訳される。
【０１００】
さらに、本発明のより好ましい態様は、標的編集部位（＊印）の対応部位（三角印）にシトシンを導入することによって構築できる。つまり、本発明のより好ましい態様は、図１５または図１６に示すように、３'−標的編集ガイドRNA［XXIIA］として３'−標的編集ガイドRNA［XXIIB］：
【化７２】
2017010556.tif 000073
または５'−標的編集ガイドRNA［XXVIIA］として５'−標的編集ガイドRNA［XXVIIB］：
【化７３】
2017010556.tif 000074
をそれぞれ使用し、５'−標的RNA［XXIA］または３'−標的RNA［XXVIA］とそれぞれ反応させて複合体化し、５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XXIIIB］：
【化７４】
2017010556.tif 000075
または３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［XXVIIIB］：
【化７５】
2017010556.tif 000076
をそれぞれ得、得られた複合体にADARをそれぞれ作用させA-I編集能を誘導し、それぞれ５'−編集標的RNA［XXIVA］： 
【化７６】
2017010556.tif 000077
または３'−編集標的RNA［XXIXA］：
【化７７】
2017010556.tif 000078
に変換し標的塩基アデノシンをイノシンに変換することができる。いずれの場合も、変換されたイノシンはグアノシンに翻訳される。
【０１０１】
上記第１および第２標的編集スキームにおいて、本発明では、５'−標的RNA［XXIA］または３'−標的RNA［XXVIA］をそれぞれ特定領域としてRNA分子内に有する全長RNAもしくは部分長RNAも当然のことながら使用することができる。したがって、この形態での本発明は、図１７または図１８にそれぞれ示すように、５'−標的RNA［XXIA］として５'−標的RNA［XXXIA］：
【化７８】
2017010556.tif 000079
または３'−標的RNA［XXVIA］として３'−標的RNA［XXXVIA］：
【化７９】
2017010556.tif 000080
を使用することにより、５'−標的編集ガイドRNA［XXXIIA］または３'−標的編集ガイドRNA［XXXVIIA］と複合体化して３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［XXXIIIA］または３'−標的RNA−５'−標的編集ガイドRNA複合体［XXXVIIIA］をそれぞれ得、得られた複合体にADARを作用させてA-I編集能を誘導して５'−編集標的RNA［XXXIVA］または３'−編集標的RNA［XXXIXA］に変換して標的塩基アデノシンがイノシンにそれぞれ変換され、続いて５'−翻訳標的RNA［XXXVA］または３'−翻訳標的RNA［XXXLA］に変換され、イノシンはグアノシンにそれぞれ翻訳される。
【０１０２】
さらに、上記第１および第２標的編集スキームにおいて、標的編集部位に対応する部位の塩基（Ｘ）をRNA塩基シトシンに変えることによって、本発明のより好ましい態様の方法が提供される。
【０１０３】
つまり、本発明のより好ましい態様は、図１９または図２０に示すように、５'−標的RNA［XXXIA］または３'−標的RNA［XXXVIA］を、３'−標的編集ガイドRNA［XXXIIA］または５'−標的編集ガイドRNA［XXXVIIA］とそれぞれ反応させて、５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XXXIIIA］または５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XXXVIIIA］をそれぞれ得、得られた複合体にADARを作用させてA-I編集能を誘導して５'−編集標的RNA［XXXIVA］または３'−編集標的RNA［XXXIXA］に変換して標的塩基アデノシンがイノシンにそれぞれ変換され、続いて５'−翻訳標的RNA［XXXVA］または３'−翻訳標的RNA［XXXXLA］に変換され、イノシンはグアノシンにそれぞれ翻訳される。
【０１０４】
さらに、第１標的編集スキームによる本発明のより好ましい態様は、例えば、標的RNAの各部位（黒三角印で示した）で分断したRNA分子と、それに対応する部位（同じ番号を付した矢印の位置）で分断された標的編集ガイドRNAを使用することによって標的RNAの標的塩基アデノシンをイノシンに変換することができる。他の態様も同様に適用することができる。
【０１０５】
【化８０】
2017010556.tif 000081
【０１０６】
【化８１】
2017010556.tif 000082
【０１０７】
同様に、標的RNAの各部位（黒三角印で示した）で分断することによって、第２標的編集スキームによる本発明のより好ましい態様を次のようにして得ることができる。他の態様も同様に適用することができる。
【０１０８】
【化８２】
2017010556.tif 000083
【０１０９】
【化８３】
2017010556.tif 000084
【０１１０】
ここで、本発明における実際のモデルについて説明する。本発明において、モデル標的RNAとして緑色蛍光タンパク質mRNA配列に対して、標的編集ガイドRNAを設計し、標的編集部位にA-I変異を誘導できるかどうかを確認した。そこで設計した各RNAをin vitro転写反応を用いて合成した後、精製した組換えADAR２を用いてin vitro編集反応を行った。その結果、編集部位は標的編集ガイドRNA依存的に編集されること明らかになった。
【０１１１】
そこで、上記編集基質［XLVIIB］を、その分断部位をさらに１つずつずらして分断すると下記配列の二本鎖からなるADAR結合コア領域を構築することができる。
【０１１２】
【化８４】
2017010556.tif 000085
【０１１３】
したがって、本発明の標的編集ガイドは、ADAR結合コア領域の両端に標的認識領域とガイド側切断領域の塩基配列をそれぞれ結合することによって構築することができる。
【０１１４】
たとえば、標的編集部位（＊印）を含む編集基質（例えばMiniSL RNA［XLA］など）を、該標的編集部位を含む領域と、ADAR結合領域に分断部位（例えば矢印０番から９番のそれぞれの部位）で分断することによって、標的RNAと、標的編集ガイドRNAにそれぞれ分離することができる。例えば、矢印３番の部位で分断した場合、本発明の標的編集スキームは次のように表すことができる。
【０１１５】
【化８５】
2017010556.tif 000086
【０１１６】
また、３'−標的RNAを使用した場合でも、上記５'−標的RNAの場合と同様に標的塩基アデノシンがイノシンに変換される。ここでは、上記編集基質（miniSL RNA）［XLA］の標的編集部位を入れ替えて設計した編集基質（miniSLr RNA）［XLIA］を例に挙げて説明する。
【０１１７】
【化８６】
2017010556.tif 000087
【０１１８】
例えば、編集基質［XLVA］を矢印で示す部位（０〜５）でそれぞれ分断すると、下式にそれぞれ示すように、５'−標的編集ガイドRNA［XLVA-0］〜［XLVA-5］と、３'−標的RNA［XLVIA-0］〜［XLVIA-5］がそれぞれ生成することになる。なお、図示した編集基質においては、図示した分断部位以外の部位、つまりADAR結合コア領域を残した相補領域全て（ここではＡの５'側に存在する９塩基）で分断することができそれぞれ標的RNAと標的編集ガイドRNAとして分離することが可能である。
【０１１９】
【化８７】
2017010556.tif 000088
【０１２０】
【化８８】
2017010556.tif 000089
【０１２１】
これらの標的RNAは、上記標的編集ガイドRNA［XLVA-0］〜［XLVA-5］とそれぞれ相補して複合体を生成し、ADARの作用によりA-I編集能が誘導されて標的塩基アデノシンがイノシンにそれぞれ変換される。
【０１２２】
これらの標的編集ガイドRNAは、当然のことながら、対応するそれぞれの標的RNAを含む全長RNAまたは部分長RNAと相補して複合体化し、ADARが作用することによって標的塩基アデノシンがイノシンに変換される。例えば、矢印３番で分断した標的編集ガイドRNA［XLA-2］を使用した場合、対応する標的RNA［XLA-1］を含む全長RNAまたは部分長RNA［XLA-6］と相補して複合体化して５'−標的RNA−３'−標的編集ガイドRNA複合体［XLA-7］が生成し、次いでADARの作用によってA-I編集脳が誘導されて５'−編集標的RNA［XLA-8］に変換され標的塩基アデノシンがイノシンに変換される。この編集標的RNAのイノシンはグアノシンに翻訳され５'−翻訳標的RNA［XLA-9］に変換される。その他についても同様である。
【０１２３】
【化８９】
2017010556.tif 000090
【０１２４】
本発明は、その他の標的編集ガイドを用いても同様に実施することが可能である。例えば、GFPRNAを使用した場合について説明する。
【化９０】
2017010556.tif 000091
【０１２５】
上記標的RNA［XLIII-1］を全長RNAまたは部分長RNAとして使用した場合も同様である。
【０１２６】
【化９１】
2017010556.tif 000092
【０１２７】
本発明において標的RNAとして使用できるRNAとしては、例えば、セロトニン受容体、グルタミン酸受容体、膜電位依存過多カリウムチャンネルなどが挙げられる。しかし、本発明は、RNAにRNA編集対象の標的塩基アデノシンが存在する限り、その種類は限定されることなく、あらゆるRNAを使用することができる。
【０１２８】
本発明では、上記RNAからある所定のRNAを標的RNAとして選定すると、選定標的RNAからRNA編集対象とする標的編集部位を含む特定領域を選定することができる。なお、RNA編集対象となりうる標的RNAの特定領域の形態は、５'−標的RNAであろうと、３'−標的RNAであろうと、その形態に関係なく使用することができる。例えば、標的編集部位が５'末端近傍に存在して、相補領域に塩基対を構築するのが困難な場合でも、標的編集部位を反対側の対応する側鎖に対応部位と入れ替えたりして相補領域を確保することも可能である。
【０１２９】
標的RNAの特定領域を選定すると、該特定領域と相補鎖を形成する標的編集ガイドRNAの対応する標的認識領域を設計することができる。このように標的編集ガイドRNAの対応標的認識領域が設計できれば、ADAR結合コア領域に結合することによって標的編集ガイドRNAを容易に設計することができる。
【０１３０】
上記のように標的編集ガイドRNAが一旦設計できれば、本発明の標的編集ガイドRNAを常法に従って合成することができる。例えば、本発明の標的編集ガイドRNAは、該標的編集ガイドRNAに対応するDNA分子を合成し、そのDNA分子を鋳型としてインビトロ転写反応などによって合成することができる。つまり、本発明の標的編集ガイドRNAは、この標的編集ガイドRNAを構成する二本鎖の各一本鎖にそれぞれ対応する合成オリゴDNAを合成し、各一本鎖をアニーリング反応などによって合成し、合成したDNA分子を鋳型としてインビトロ転写反応などによって構築することができる。
【０１３１】
また、本発明では、標的編集ガイドRNA（gRNA）を、あらゆる標的RNAの標的編集部位を有する標的相補領域に対応するように構築することができる。これによって、本発明は、標的塩基アデノシンを有するあらゆる標的RNAに対して簡単にかつ汎用的に適用することができる。
【０１３２】
本発明に係るA-I RNA編集反応に使用される編集ガイドRNA（gRNA）としては、例えば、一般式 [LIA] で表される3'-編集ガイドRNAまたは一般式 [LVIA] で表される5'-編集ガイドRNAが挙げられる。より具体的には、3'-編集ガイドRNA [LIA] は、3'-標的認識領域とADAR結合領域とから構成されている。同様に、5'-編集ガイドRNA [LVIA] は、5'-標的認識領域とADAR結合領域とから構成されている。
【０１３３】
更に詳細には、3'-編集ガイドRNA [LIA] の3'-標的認識領域は、3'-[末端側標的認識領域−Ｘ−コア側標的認識領域] から構成され、コア側標的認識領域の5'末端がADAR結合コア領域の3'-末端と結合した構造になっている。一方、5'-編集ガイドRNA [LVIA] の5'-標的認識領域は、5'-[末端側標的認識領域−Ｘ−コア側標的認識領域] から構成され、コア側標的認識領域の3'末端がADAR結合コア領域の5'-末端と結合した構造になっている。なお、標的認識領域はアンチセンス領域ともいう。
【０１３４】
ここで注目すべきことは、編集効率を改善するために、いずれのコア側標的認識領域は、その塩基数が、対応するADAR結合領域のガイド側分断領域の塩基数よりも多く、つまり塩基配列が長くなるように設計するのが好ましい。つまり、コア側標的認識領域の塩基配列の塩基数は、１〜１０個、好ましくは１〜５個であるのがよい。
【０１３５】
図２２Ｂを参照して具体的に説明すると、例えば、編集対象A200を有する3'-gRNA (ADg-GFP_A200) (68 nt) は、アンチセンス領域の塩基数は19 nt、ADAR結合領域 の塩基数が49 ntであり、コア側標的認識領域の塩基数が３個ほど長く設計した。また図２２Ａの場合も同様である。この他の例においても同様である。
【０１３６】
つまり、本発明の主な１つの目的は、本来のhADAR2のA-I RNA編集活性を誘発する単純なgRNA設計を提供し、そのgRNAを部位特異的RNA変異誘導に応用することである。gRNAは、一般に、標的RNAにフィブリラリン（Fibrillarin）やCbf5などの酵素タンパク質を誘導するタンパク質結合領域と、塩基対合を介して標的RNAを仲介するアンチセンス領域とからなる。加えて、gRNAの最も重要な特長は、gRNAに結合したタンパク質が、アンチセンスgRNA領域が標的RNAにハイブリダイズした後、標的部位と効果的に反応するように位置していることである。かかる機能を有するhADAR2をガイドするRNA（AD-gRNA）を構築するために天然の編集基質の二次構造に着目した。
【０１３７】
本発明に係るgRNAとhADAR2の編集反応において、dsRBDは、基質RNA結合を主に制御し、デアミネーゼドメインはアデノシンの加水分解性脱アミノ反応を触媒する（図２１ａ）。したがって、基質の自然構造は、dsRBD結合ならびに酵素活性に要求される二重鎖構造に適応していると考えられる。そこで、天然の編集基質RNAをもとに、dsRBD結合領域（編集部位の周辺の塩基対合を形成するアンチセンス配列を含む）を利用すれば、標的RNAとのハイブリダイゼーションの際に本来の基質構造を再構成することができるAD-gRNAが構築できると考えた（図２１ａ）。図２１ａは発明の部位特異的RNA編集のためのgRNA戦略の概要を示していて、hADAR2によるA-I RNA編集の概要はグレイ色の背景部分に示している。hADAR2は２個のdsRBDとデアミナーゼドメインから構成されている。dsRBDは主に基質RNA結合を制御し、デアミナーゼドメインは加水分解性脱アミノ化を推進する。本発明によれば、特異的A-I RNA編集はADARタンパク質を使用するだけで行うことができる。アンチセンス領域とADAR結合領域とからなるAD-gRNAは、天然の基質RNA構造に基づいて設計した。図中、標的編集部位は〇A印を付している。AD-gRNAが標的RNAとハイブリダイゼーションすることにより、天然基質RNAの構造が誘起される。再構成された基質RNAに対して、hADAR2が部位特異的に編集反応を行うことで、標的部位特異的RNA編集が達成される。図２１ｂには、天然のhADAR2の編集基質である、GluR2 (GRIA2) pre-mRNAの二次構造を基にして設計したAD-gRNAの配列を示している（非特許文献２６）。GluR2 RNA （R/G部位）の既知編集部位は〇A印を付している。GluR2 RNAのステムループ構造は、２個の成分に分離でき、１方の成分は標的編集部位を含む標的ガイドRNAとして考えられ、他方の成分はADAR結合領域ならびにアンチセンス領域を含むプロトタイプのAD-gRNAと考えられる（図２１ｂ）。このGluR2 RNAを２つに分割できる部位を矢じり印で、またAD-gRNAは背景がグレイ色の部分に示している。なお、記号Xは、いずれのヌクレオチドであってもよく、点線は塩基対合を示している。Xが完全に塩基対合すると、同族の編集基質構造が再構成される。この設計図において、アンチセンス領域は標的となるための決定要素として作用し、標的部位によって自由に変えることができる。
【０１３８】
このAD-gRNA設計図の妥当性を検証するために、Anthurium coerulescensから抽出した緑色蛍光タンパク質(AcGFP) mRNA (720 nt; 図２１ｃ) に対するAD-gRNA誘導RNA編集を示した。上述した設計によれば、GFP mRNA (ADg-GFP_A200) のA200を標的とするAD-gRNAは、17-ntアンチセンス領域と49-nt ADAR結合領域（図２１ｂ；詳細な設計図は図２２Ｂ参照）によって達成される。gRNAとGFP mRNAの結合体形成は、A200部位を含むin vitroで合成したADg-RNA_A200とAcGFP RNA (160 nt) の短鎖RNAフラグメントを用いたゲルモビリテイシフトアッセイとアニーリング反応にて確認した（図２３参照）。複合体形成反応後、アニールしたgRNA-mRNAをhADAR2と１時間反応させた。次いで、AD-gRNAの編集誘導効率を、逆転写（ＲＴ）ならびにＰＣＲによって生成したAcGFP cDNAを用いた蛍光ダイターミネーターシークエンシング法（非特許文献２９）にて分析した（図２１ｃ）。図２１ｃはRT-PCRとin vitro編集反応によって得られたGFP cDNAのシークエンスクロマトグラフ図によるAD-gRNAの編集誘導活性を示している。上部パネルはgRNAなしの組換えhADAR2、中央パネルはアンチセンス領域（17 nt）だけ、下部パネルはADg-GFP_A200での結果を示している。なお、標的部位は矢じり印で示す。図示するように、AD-gRNA非存在下の編集反応では、得られたシークエンシングクロマトグラムには、A200の編集は検出されなかった。また、ADg-GFP_A200のアンチセンス領域のみを加え編集反応を行った場合、A200はわずかに編集された。一方、これらとは対照的に、ADg-GFP_A200を加えて編集反応を行った場合は、A200は効率的に編集された（〜８０％；Ｇ／Ａのピーク高の割合から算出）（図２１ｃ）。これらの結果は、AD-gRNAがhADAR2編集活性を標的部位特異的かつ高効率に誘導できることを明白に示している。
【０１３９】
さらに、発明者らは、既に報告されているhADAR2の基質になるヘアピン構造を有するRNA（40 nt）を用いて、AD-gRNA構築における他の基盤構造の有用性を試験した（非特許文献３０、３１）（図２４ａ）。結果、GluR2由来のADAR結合領域より短い配列を使用したとしても、本設計に従って構築したＡＤガイドRNAは、標的mRNAを効率的に編集した（84.9 %）（図２４ｂ、ｃ）。これらの結果は、AD-gRNA構築において、多様なRNA配列をADAR結合領域として適用できることと同時に、AD-gRNAの更なる短鎖化が可能であることを強く示している。
【０１４０】
AD-gRNAの機能的デザインの多様性を拡張した。GluR2 RNAやヘアピン基質などのcis型基質の場合、hADAR2は本来の編集部位とは反対側の鎖上に存在する部位を編集することはできなかった（図２５）。他方、gRNAと標的RNAからなるtrans型基質では、標的RNA中のホスホジエステル結合の喪失により、ADAR結合領域は回転自由度を獲得すると予測される。したがって、ADAR結合領域の５'側にアンチセンス領域を有するAD-gRNAも構築できると考えた。この可能性を試験するために、同一部位（A200）を標的とする修飾AD-gRNAを、アンチセンス配列をADAR結合領域の５'位に導入することによって設計した（ADg-rGFP_A200）（図２２Ａａ）。期待したように、ADg-rGFP_A200はA200に対して特異的な編集誘導活性を示した（図２２Ａｂ）。驚いたことに、この編集活性は、元来のADg-GFP_A200よりも格段に高かった。図２２ＡｂはA200での編集割合の経時的変化を示す。赤色〇印は5 -アンチセンス領域、赤色●印は5 -アンチセンスAD-gRNA (ADg-rGFP_A200)、青色△印は3 -アンチセンス領域、青色▲印は3 -アンチセンスAD-gRNA (ADg-GFP_A200)、黒色△印はgRNAなしの場合である。各編集割合は、ダイレクトシークエンシングクロマトグラフから生成塩基AとGを定量し、式：（Gピーク高）／（Aピーク高＋ Gピーク高）によって算出した。結果は３回の独立した実験の標準偏差値の平均値で表している。また、この特徴はヘアピン基質から生成したガイドRNAにおいても観察された（図２４ｃ）。ADAR結合領域の回転自由度の効果をさらに評価するために、標的RNAとの塩基対合を促進するために、その３'側に配列を追加した拡張AD-gRNA (ADg-rGFPex_A200)について試験した（図２６）。ADg-rGFPex_A200は、ADg-rGFP_A200に比べて異なる編集特異性と効率を示した（図２６）。この結果は、ADAR結合領域の回転自由度が標的編集を誘導するために重要であることを示している。
【０１４１】
原則として、AD-gRNA誘導RNA編集の特異性は、hADAR2のデアミナーゼドメインの固有の選択性に大いに依存する。したがって、AD-gRNA誘導RNA編集の編集パターンは自然編集した基質のそれと類似していると考えられる。実際、AD-gRNA誘導RNA編集の隣接特異性は、ｃｉｓ型基質にて観察されたものとほとんど同一であった（図２５、２７）。このことは、AD-gRNAが天然の基質において発生するものと類似する構造を誘導できることを示している。
【０１４２】
その結果、本発明者らは、アンチセンス領域をADAR結合領域の５'側に導入することによって高活性なAD-gRNAフレームワークの開発に成功した。
【０１４３】
AD-gRNA誘導A-I RNA編集を用いた機能性タンパク質発現のin vitro調節について説明する。部位特異的RNA変異誘発の将来有望な応用としては、特異的なコドンを導入することで標的タンパク質の発現または機能を調節することにあると思われる。かかる応用の可能性があることを示すために、AD-gRNAをin vitro編集ならびにin vitro翻訳系を用いてコドン修復実験を行った。この実験では、レニラルシフェラーゼ（Renilla luciferase（Rluc））mRNAのヌクレオチド311をアデノシン（A311）に変換してTrp104コドン（UGG）をストップコドン（UAG）に変換することによって得られた、Rluc-W104Xをレポーターとして使用した（図２８）。イノシンは翻訳機構によってグアノシンとして読み取られるので、活性な成熟ルシフェラーゼは、A311がADg-rRluc_A311によってI311に編集された後、Trpコドン（UIG；図２８ａ）を再生成したときだけRluc-W104Xから翻訳される。つまり、AD-gRNA誘導A-I RNA編集によるタンパク質発現の調節は、編集レポーターRNA のin vitro翻訳後のルシフェラーゼ活性をモニターすることによって分析することができる。
【０１４４】
まず、5'-アンチセンスフレームワークに基づいてコドン変換を有するAD-gRNAを設計した（ADg-rRluc_A311；図２９）。ADg-rRluc_A311によって誘導されたコドン変換を評価するために、in vitro編集反応後にA311における編集効率をに分析した。ADg-rGFPについて観察された結果と同様に、得られたシークエンシングクロマトグラム図において、A311を効率的かつ部位特異的に編集することができた（図２８ｂ）。つまり、上記反応により、A311がI311に変換されたRluc-W104X mRNAを得ることができた。次に、AD-gRNAによって生起されるコドン変換が活性なルシフェラーゼ発現を制御できるかどうかを実証するために、編集反応後のRluc-W104Xを使用してin vitro翻訳反応した後、ルシフェラーゼアッセイを行った（図２８ｃ）。サンプルのルミネッセンス発光スペクトル分析は、野生型luciferase mRNA (Rluc-WT黒色)、 Rluc-W104X (青色) またはin vitroで編集したRluc-W104X (紫色) とin vitro翻訳反応後に行った。その結果、未編集Rluc-W104Xトランスクリプトを使用した場合、活性なルシフェラーゼ発現は観察できなかった。対照的に、編集反応後のRluc-W104Xトランスクリプトを使用して翻訳したサンプルからは、典型的なルミネッセンス発光スペクトラムを検出した。加えて、そのルミネッセンス強度は、ワイルドタイプRluc mRNA（Rluc-WT）を用いて得られたものと同等の値が得られた。これらの結果は、AD-gRNA戦略が機能性タンパク質発現を調節するのに効果的に応用できることを明らかに示している。
【０１４５】
さらに、より複雑な環境におけるAD-gRNAの可能性を調べるために、同時編集反応を行った（図３０ａ）。この実験では、ADg-rRluc_A311、Rluc-W104XおよびhADAR2をin vitro翻訳に必要な反応成分と一緒に混合した後、３０分間反応後、編集効率とルシフェラーゼ活性を分析した。反応終了後、Rluc-W104X のA311における編集効率は４７％であった（図３０ｂ）。また、同時反応においてもルシフェラーゼ活性は観察され、このルミネッセンス強度は上記単独反応で検出された値のほぼ半分であった（図２８ｃ）。
【０１４６】
続いて、AD-gRNA戦略に基づいて、細胞内RNA変異導入を行った。AD-gRNAの最も重要な利点は、天然のhADAR2の編集活性を誘導する能力である。したがって、細胞内標的RNA変異誘導は、外来タンパク質を必要とせず、AD-gRNAのhADAR2発現細胞中への導入のみで達成できる。このことを実証するために、hADAR2とAcGFPをドキシサイクリン (Dox) 誘導性プロモーターの制御下で同時発現できるtet-ADAR2細胞株（非特許文献３２）をhADAR2発現モデル細胞として使用した（図３１ａ）。この実験では、以前の試験ですでに特徴付けたADg-GFP_A200とADg-rGFP_A200が、tet-ADAR2細胞中でhADAR2の編集活性をAcGFP mRNAにガイドできるかどうかを調べた。今回の実験では、AD-gRNAを細胞内に導入する方法として、プラスミドベクターによって発現させる方法を用いた。また、AD-gRNA戦略の有用性が、これまでのsiRNAやmiRNA技術に匹敵できるかどうかを示すために、発現ベクターには、一般に使用されているpol IIIで短鎖RNAを発現するpSuper neoを用いた。（図３１ａ）。各種AD-gRNAの発現プラスミドは上記短鎖RNA発現ベクターを用いて構築した。hADAR2とAD-gRNAの発現は、ウススタンブロッテイングとリアルタイムPCRでそれぞれ確認した（図３２と図３３）。AD-gRNA誘導性A-I RNA編集の効率を分析するために、GFP mRNAを、プラスミドを形質導入し、Doxと共培養したtet-ADAR2細胞から抽出し、RT-PCR後ダイレクトシークエンシングを行った。その結果、AD-gRNA発現プラスミドの形質導入による、標的部位A200の編集が検出された（図３１）。図３１ｂには、tet-ADAR2細胞内でのADg-GFP_A200とADg-rGFP_A200の特異的編集誘導活性を確認した結果を示している。上部パネルはプラスミドトランスフェクションなし（guide [-]）、中央パネルはADg-GFP_A200また下部パネルはADg-rGFP_A200の発現プラスミドを導入し培養した細胞から得られたGFP cDNAのシークエンスクロマトグラフ図を示す。図中、標的塩基アデノシン（A200）は矢じり印で示している。ADg-GFP_A200とADg-rGFP_A200を発現する細胞からのヌクレオチドA200での編集効率はそれぞれ34.9%と30.5%であった（図３１と図３４）。加えて、抽出されたAcGFP mRNAのアデノシンではいずれも明らかなオフターゲット編集（標的部位ではない非特異的な編集）は検出されなかった。したがって、これらの結果は、AD-gRNAはhADAR2発現細胞内では良好に作用していることを示している。これらの結果によって最も重要な点は、細胞内部位特異的RNA変異誘導がAD-gRNAの単純なプラスミド形質導入で行えることである。
【０１４７】
加えて、AD-gRNA戦略による細胞内タンパク質の機能発現制御が可能であることを実証するため、細胞内コドン修復実験を行った。AD-gRNA誘導コドン修復によって誘起される細胞内タンパク質の機能発現制御を可視化するために、コドンTrp58内のG173を変異させてストップコドンを導入した変異 A173GFP mRNA (GFP-W58X RNA) をレポーター遺伝子として使用した（非特許文献２５、３３）。また、ADg-rGFP_A173は、このストップコドンをTrpコドンに修復するように設計し、対応する発現プラスミドをpSUPER neoベクターを使用して構築した。hADAR2とGFP-W58Xの発現には、タンパク質発現に慣用されているpcDNA 3.1ベクターに基づいて発現プラスミドを構築し、これらのプラスミドを共HEK293細胞に形質導入した後、48時間培養後に細胞内蛍光を蛍光顕微鏡で検出した。GFP-W58Xならびに／もしくはhADAR2プラスミドで形質導入した AD-gRNA発現欠如コントロール細胞を用いた場合は明白な蛍光を有する陽性の細胞は検出されなかった（図３１ｃ）。対照的に、明るい蛍光を有するいくつかの細胞が、AD-gRNA発現プラスミドを形質導入することによって同定された（図３１ｃ）。以上の結果より、ADg-rGFP_A173によるRNA変異導入により、成熟GFPの生合成を調節できることを示した。得られた結果は、 AD-gRNA戦略に基づく標的タンパク質の機能を調節するためのRNA変異誘導の有用性をはっきりと示している。
【０１４８】
前述したような細胞内A-I RNA編集の多様な方法は、実用的な部位特異的RNA変異誘発を確立するための重要な突破口になりえる。以前は、人工gRNAが天然リボタンパク質のRNA修飾活性を指向するために使用されていた（非特許文献１９−２１）。しかしながら生体内におけるA-I RNA編集は、ADARタンパク質のみで行われており、ADARを誘導するgRNAは自然界では発見されていない。したがって、これまでの方法に従ったｇRNA戦略をA-I RNA編集誘導に直接応用することは不可能であった。部位特異的RNA編集は、以前、人工gRNAと修飾したADARタンパク質からなる有用なエテイターゼ (etitases) を使用して達成できたが（非特許文献２２、２３、２４）、これらの方法は内在性修飾機構を利用しgRNA導入のみで目的を達成するという、これまでのgRNA戦略の利点が失われている。そこで、内在性ADARの編集活性を目的部位に自在に誘導できる新規なgRNAを構築することで、内在性A-I RNA編集機構を利用した部位特異的RNA変異導入法が構築できると考えた。
【０１４９】
本発明は、AD-gRNAは、hADAR2発現部位を有する天然もしくは人工編集基質の二次構造に基づいて簡単に設計できる。GluR2 RNAの場合、hADAR2のdsRBDが結合する領域はNMRによる構造解析により明らかにされている（非特許文献３４）。構造情報から判断すると、GluR2 RNAは２つの部分に分割されていて、１つの分割部分は編集部位を有する標的RNAと考えられ、またもう１つの分割部分はADAR結合領域とアンチセンス領域からなるプロトタイプ型AD-gRNAと考えられる（図２１ｂ）。理論的には、分割したRNA同士は、再結合することにより、編集基質構造が再構築される。したがって、AD-gRNAは、アンチセンス領域を変更して標的配列に適合させることによって標的塩基アデノシンのいずれに対しても hADAR2によってA-I編集を誘導することができる。実際、GFP とLuc mRNA上の種々の部位を標的とするAD-gRNAはこの設計で構築することができた。加えて、本発明の結果から、AD-gRNAによって誘導されるRNA編集の隣接特異性は、天然基質において観察された結果と非常に類似していた（図２５、２６）。このことは、AD-gRNAとRNAからなる複合体は、天然の編集基質構造に類似した構造を形成していることを示している。
【０１５０】
本発明のAD-gRNAは、両RNA成分間の分割ラインを標的編集部位のヌクレオチド３個（nt）下流の位置に固定した基本骨格を使用して構築した（図２１ｂ）。この分割ラインが０ntまたは１ntであるときには編集効率は減少したが、距離が２−５nt離れているときにはほぼ一定の編集効率が観察された（図３５）。これらの観察結果から、このAD-gRNAデザインでは、hADAR2との反応を効率的に駆動するためには、標的編集部位とADAR結合領域との間で２個またはそれ以上の塩基対合を含む二本鎖構造が必要であるといえる。したがって、本実験では３bpフレームワークを使用した。別の方法としては、分割ラインを変えることによって、編集効率をある程度変化させることはできることから、AD-gRNA構築において異なる基本骨格が使用できる可能性が示された。
【０１５１】
通常では、アンチセンス領域は、GluR2 RNAに基づいて、このデザインの３'側に位置しているが、AD-gRNAのデザインでは、ADAR結合領域の３'側にも、５'側にも位置することができる。アンチセンス領域の位置がこのように交換可能であると考えられるのは、標的RNA中のホスホジエステル結合の喪失によって生起されるADAR結合領域の回転自由度が増加する結果によると考えられる。この考え方は、配列を３'側に追加導入したときに、標的RNAとの塩基対合が生起され、またADAR結合領域の回転自由度が抑制されることが観察されるようなADg-rGFPexの異なる編集挙動によって支持されている（図２７）。実際、5'-アンチセンスAD-gRNAの編集効率は、3'-アンチセンスAD-gRNAよりも高効率であった。AD-gRNAと標的RNAからなるトランス型基質の場合では、3'-アンチセンスAD-gRNAがhADARの編集誘導にとってより有利な構造を誘導できるかもしれない。
【０１５２】
hADAR2はdsRNA内のアデノシンを優先的に編集するので、単純なアンチセンスRNAもまたガイドRNAとして使用できる強い可能性がある。ADg-GFP_A200のアンチセンス領域は、A-I編集を誘導する能力を示しているが（図２１ｃ）、ADAR結合領域が導入された完全なAD-gRNAにて観察されるよりもその効率は著しく低かった。この結果は、ADg-RNAが効率的な編集を誘導するための高い多能性を有していることを示している。
【０１５３】
しかしながら、非特異的編集は標的の周辺配列に左右されてアンチセンス領域において発生し得る。具体的には、dsRNA構造中では、標的塩基アデノシンから１１塩基離れたｎｔが立体的に同じ表面に位置する。したがって、この位置に存在するアデノシンは、誘導されたADARによって非特異的に編集される可能性がある。加えて、AD-gRNAによって誘導される編集パターンはhADAR2固有の特性に高度に依存している。例えば、もし標的部位が連続するアデノシン配列内に存在する場合、その標的部位に隣接するアデノシンは同時に編集される（図２５、２６）。したがって、本発明のAD-gRNAデザインを使用して、天然のままのhADAR2の固有の性質よりも隣接部位での編集特異性を高く改良するのは難しいと考えられる。ADARによる望ましくない編集は、ミスマッチしたntを、目的のアデノシンに対する相補位置に導入すること、またはアンチセンス領域の隣接ヌクレオチドを修飾することによって、効果的に抑制することができることが報告されている（非特許文献２３）。この人工エジターゼで観察された反応特異性の類似性を考慮すると、AD-gRNA誘導RNA編集のためのこれらの戦略を標的選択性を調節するために応用することは可能であると考えられる。反対に、天然のhADAR2の隣接特異性を利用することで、一度に多数のアデノシンを編集することができる。
【０１５４】
本発明によれば、ADAR結合領域を修飾するのに成功している（図２４）この結果は、GluR2 Q/R部位（非特許文献３５）やNEIL1 K/R部位（非特許文献３６）などの天然の編集基質RNAから、本発明とは異なるADAR結合領域を使用してAD-gRNAを構築できる可能性を強力に示している。GluR2R/G部位は、もう１つのRNA編集酵素であるhADAR1によっても編集されることが知られている。hADAR1はhADAR2と同様のドメイン構造を有することから（非特許文献１３、３７）、本発明のデザイン戦略はhADAR2ガイドRNAばかりではなく、hADAR1ガイドRNAにも同様に適用できる。従って、本発明で開発したAD-gRNAは、そのままhADAR1の編集活性も誘導できると考えた。そこで、hADAR1を用いた編集誘導アッセイを行った。結果、hADAR2の場合と比較して効率は低下したものの、確かに編集誘導が可能であることを明らかにした。本ガイドRNA設計は、hADAR1及びhADAR2ともに有効であることを示した。
【０１５５】
標的選択性と効率は一般的に応用可能な変異誘導方法であるための２つの最も重要な要件であると考えられる。本発明によるAD-gRNAは、in vitroでも、細胞内でも効果的で、部位選択的活性を示したが、さらに最適化することによって、その意図する用途に従ってAD-gRNAの活性を改善することができるものと期待できる。本発明のデザインによる機能的調整の多様性は、編集効率の改善と、非特異的編集の回避に非常に有用である。
【０１５６】
細胞内部位特異的RNA編集は、単にhADAR2発現細胞内においてAD-gRNAを発現することによって達成することができる。その上、この発明によるコドン修復実験（in vitroなんらびに細胞内）において、本発明のAD-gRNA戦略がコドンを変換して、最終的には標的タンパク質の機能を変化させることに応用できることが明白に示された。mRNAのコーデイング領域内に生成したA-I変異によって、理論上、全２０アミノ酸のうち１２アミノ酸（Ser、Thr、His、Lys、 Arg、Asp、Glu、Asn、Gln、Tyr、IleならびにMet/start）を変化させることができる。これらのコドン変換には、金属キレート化部位（一般的には、His、AspならびにGlu）やリン酸化部位（Ser、ThrならびにTyr）が含まれているので、A-I RNA編集は、酵素触媒やタンパク質リン酸化シグナル伝達など、様々な細胞内の重要なタンパク質の機能を強力に制御できる可能性が高い。したがって、本発明のAD-gRNA戦略は、様々な生物学的プロセスの制御に適用可能な新たな部位特異的RNA変異誘導方法として大きな可能性を有している。
【０１５７】
要約すると、本発明の新規なgRNAシステムは、hADAR2を標的部位にガイドすることによってA-I変異を誘導することができる。AD-gRNAはアンチセンス領域にプログラムされた標的部位にA-I変異を特異的に導入することができる。その上、本発明の部位特異的RNA変異導入法はgRNAをADAR発現細胞中に導入するだけで達成することができる。このように本発明のgRNA戦略は、単純なデザインで、使い勝手がよく、一般的なRNA変異誘導を確立するために必要な基本的なフレームワークを提供する。
【０１５８】
以下、本発明について実施例にてより具体的に説明するが、下記実施例は本発明をより具体的に説明する意図であって、あらゆる意味で本発明を一切限定するものではない。当然のことながら、下記実施例から由来または派生するあらゆる改善、変形などは本発明の範疇に包含されるものである。
【実施例１】
【０１５９】
（３'−標的編集ガイドRNAの合成）
合成オリゴDNA（１）（guide RNA_D3_tempT7F）100 mMと合成オリゴDNA（２）（guide RNA_ D3_tempR）100 mMを含む反応溶液を９５℃で３分間、続いて２５度に減温して１５分間処理してアニーリング反応を行ってDNA（guide RNA_D3_tempF/R）を得た。続いて、2.5 mM dNTPと5000 U/mL Klenow fragmentを加え（終濃度：guide RNA_D3_tempF/R 2 mM、dNTP 0.2 mM、Klenow fragment 2.5 U ）を２５ ℃で３０分間伸長し、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりDNAを精製した。得られたDNAを鋳型とし、T7-Scribe Standard RNA IVT KITを用いてin vitro転写（３７℃３時間）によりRNA（３'−標的編集ガイドRNA１）を合成した。その後、DNAse （終濃度：2 U）を加え、３７℃で１５分間処理し、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によってRNAを精製した。得られたRNAを8 M Urea PAGE (8 %)で精製して、粉砕・浸漬によって抽出し、0.22 mmフィルター(DURAPORE)およびゲル濾過 (BIO RAD) によって精製した。【０１６０】
つまり、３'−標的編集ガイドRNAをインビトロで合成するために用いる鋳型DNAは、合成オリゴDNA（１）guide RNA_D3_tempT7Fと合成オリゴDNA（２）guide RNA_D3_tempRを用いて合成した。用いた各合成オリゴDNAの塩基配列は次の通りである。【０１６１】
（１）guide RNA_D3_tempT7F (48 mer)
CTAATACGACTCACTATAGGGTGGAATAGTATACCATTCGTGGTATAG
（２）guide RNA_D3_tempR (44 mer)
TGACCACCCTGAGCTGCGGAGGTGGGATACTATACCACGAATGG
【実施例２】
【０１６２】
（３'−標的編集ガイドRNAの合成）
合成オリゴDNA（３）（guide RNA_D0_tempT7F）100 mMと合成オリゴDNA（４）（guide RNA_D0_tempR）100 mMを含む反応溶液を、実施例１と実質的に同様にして処理してRNA（３'−標的編集ガイドRNA２）を得た。【０１６３】
合成オリゴDNA（３）（guide RNA_D0_tempT7F）および合成オリゴDNA（４）（guide RNA_D0_tempR）の塩基配列は次の通りである。
（３）guide RNA_D0_tempT7F (51 mer)
CTAATACGACTCACTATAGGTGGGTGGAATAGTATACCATTCGTGGTATAG
（４）guide RNA_D0_tempR (44 mer)
TGACCACCCTGAGCTGGGTAGGTGGGATACTATACCACGAATGG
【実施例３】
【０１６４】
（５'−標的編集ガイドRNAの合成）
合成オリゴDNA（５）（guide RNA_D3r_tempT7F）100 mMと合成オリゴDNA（６）（guide RNA_D3r_tempR）100 mMを含む反応溶液を、実施例１と実質的に同様にして処理してRNA（３'−標的編集ガイドRNA３）を得た。【０１６５】
合成オリゴDNA（５）（guide RNA_D3r_tempT7F）および合成オリゴDNA（６）（guide RNA_D3r_tempR）の塩基配列は次の通りである。
（５）guide RNA_D3r_tempT7F (45 mer)
CTAATACGACTCACTATAGGGAAGCACTGCACGCCGCAGCGGGTG
（６）guide RNA_D3r_tempR (49 mer) 
AGGTGGGATACTATACCACGAATGGTATACTATTCCACCCGCTGCGGCG
【実施例４】
【０１６６】
（５'−標的編集ガイドRNAの合成）
合成オリゴDNA（７）（guide RNA_D0r_tempT7F）100 mMと合成オリゴDNA（８）（guide RNA_D0r_tempR）100 mMを含む反応溶液を、実施例１と実質的に同様にして処理してRNA（３'−標的編集ガイドRNA４）を得た。【０１６７】
合成オリゴDNA（７）（guide RNA_D0r_tempT7F）および合成オリゴDNA（８）（guide RNA_D0r_tempR）の塩基配列は次の通りである。
（７）guide RNA_D0r_tempT7F (45 mer)
CTAATACGACTCACTATAGGGAAGCACTGCACGCCGCGGTGGGTG
（８）guide RNA_D0r_tempR (52 mer)：
GGTAGGTGGGATACTATACCACGAATGGTATACTATTCCACCCACCGCGGCG
【実施例５】
【０１６８】
（GFP RNA（標的RNA）の合成）
GFP-Gq-TK Plasmidを鋳型とし、100 mM AcGFP_sRNA01_T7F01プライマー、100 mM AcGFP_sRNA01_R01プライマー、2.5 mM dNTP、1.25 U/mL Prime Star GXLを含む反応溶液中でＰＣＲ（１サイクル（９８℃１０秒間、５５℃ ３０秒間６８℃３０秒間）、３０サイクル）によって増幅した （終濃度：GFP-Gq-TK Plasmid 4.0 pg/mL, AcGFP_sRNA01_T7 F/R 0.3 mM, dNTP 0.2 mM, PrimeStar GXL 2.5 U）。増幅したＰＣＲ製品をフェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりDNAを精製した。得られたDNAを鋳型とし、T7-Scribe Standard RNA IVT KITを用いてin vitro転写（３７℃、３時間）によりRNAを合成した。その後、DNAse（終濃度：2 U）を加え、処理し（３７℃、１５分間）、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によってRNAを精製した。得られたRNAを8 M Urea PAGE (8 %)で精製して、粉砕・浸漬によって抽出し、0.22 mmフィルター(DURAPORE)およびゲル濾過 (BIO RAD)によって精製した。【０１６９】
AcGFP_sRNA01_T7F01プライマーの塩基配列は次の通りである。
CTAATACGACTCACTATAGGGCCACCCTGGTGACCACCC【０１７０】
AcGFP_sRNA01_R01プライマーの塩基配列は次の通りである。
GCGCGCGACTTGTAGTTGCC
【実施例６】
【０１７１】
（標的編集ガイドRNAと基質RNA（標的RNA）の複合体形成反応）
アニーリングバッファー（150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.6)）中で、精製した各標的編集ガイドRNA（終濃度：0.45 mM）と標的RNA（GFP sRNA 01）（終濃度：0.45 mM）のアニーリング反応（８０℃３分間→２５℃１５分間）を行った。反応後、8 % Native PAGEで標的RNA（GFP RNA）と標的編集ガイドRNAの複合体の形成を確認した。【０１７２】
GFP sRNA 01の塩基配列は次の通りである。
GFP sRNA 01:
5'-GGGUGAAUGGCCACAAGUUCAGCGUGAGCGGCGAGGGCGAGGGCGAUGCCACCUACGGCAAGCUGACCCUGAAGUUCAUCUGCACCACCGGCAAGCUGCCUGUGCCCUGGCCCACCCUGGUGACCACCCUGAGCUACGGCGUGCAGUGCUUCUC-3'
【実施例７】
【０１７３】
（標的編集ガイドRNAと基質RNA（標的RNA）の複合体形成反応）
アニーリングバッファー（150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.6)）中で、精製した各標的編集ガイドRNA（終濃度：0.45 mM）と標的RNA（GFP sRNA 01）（終濃度：0.45 mM）のアニーリング反応（８０℃３分間→２５℃１５分間）を行った。反応後、8 % Native PAGEで標的RNA（GFP RNA）と標的編集ガイドRNAの複合体の形成を確認した。
【実施例８】
【０１７４】
（編集ガイドRNAの編集誘導能の評価）
実施例１で精製した５'−標的編集ガイドRNA１）または実施例３で精製した３'−標的編集ガイドRNA３（各終濃度：0.45 mM）と実施例５で合成した標的RNA（GFP RNA）（終濃度：0.45 mM）をアニーリング反応（８０℃３分間→２５℃１５分間）してRNA複合体をそれぞれ得た。得られたRNA複合体（0.45 mM）をTE Bufferで50 mMになるように希釈した。希釈後、RNA複合体（終濃度：5 nM）に精製した組換えhADAR2（終濃度：0.8 mM）を加え、編集反応を行った（３７℃、１時間）。編集反応後、フェノール/クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりRNA複合体１またはRNA複合体２をそれぞれ精製した。得られた各RNA複合体の沈殿をTE Buffer 5 mLに溶解し、Prime Script Reverse Transcription KitとAcGFP_sRNA_R01プライマー（終濃度：2.5 mM）を用いて逆転写反応を行った（６５℃５分間急冷、４２℃４５分間、７０℃１５分間）。得られたcDNAを鋳型として用い、ＰＣＲ（1.25 U/mL Prime Star GXL、AcGFP_sRNA_T7F01プライマー、cGFP_sRNA_R01プライマー、2.5 mM dNTP）（１サイクル（９８℃１０秒間、５５℃１５秒間、６８秒間２０秒間）、２５サイクル）により二本鎖DNAを増幅した。その後、増幅したDNAとBig Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kitを用いて、DNA塩基配列解析を行った。得られたクロマトチャートの標的編集部位のA（T）とG（C）のピーク比 (G / A+G)から編集率を算出した。RNA複合体１およびRNA複合体２のそれぞれの編集率は８８．１％および９１．２％であった。これに対して、標的RNAだけのコントロールはいずれも２．７％であった。
【実施例９】
【０１７５】
３'−標的RNA［XLVIA-0〜XLVIA-5］と５'−標的編集ガイドRNA［XLVA-0 〜XLVA-5］をそれぞれアニーリング反応させて得た複合体について、実施例８と実質同様にして編集率を算出した。その結果を下表１に編集率の経時的変化を示す。
【表１】
2017010556.tif 000093
【実施例１０】
【０１７６】
以下の実施例において使用する材料は下記のとおりである。DNAオリゴヌクレオチドおよび合成RNAはHokkaido System Science Co., Ltd. (Hokkaido, Japan) とSigma genosys (Hokkaido, Japan) から購入した。すべてのDNAオリゴヌクレオチドおよび合成RNAの配列は表２〜表６に示す。
【表２】
2017010556.tif 000094
【表３】
2017010556.tif 000095
【表４】
2017010556.tif 000096
【表５】
2017010556.tif 000097
【表６】
2017010556.tif 000098
【０１７７】
（AD-gRNAならびに 標的RNAの調製法）
まず、AD-gRNAはin vitro転写法にて合成した。In vitro転写用テンプレートdsDNAを合成オリゴヌクレオチドを用いて常法に従って合成した。一般には、T7プロモーター配列を含むフォワードDNAオリゴヌクレオチド1μMと、リバースDNAオリゴヌクレオチド 1μMをアニーリングバッファ（50 mM Tris-HCl [pH 7.6] 、50 mM NaCl）で混合して後、９５℃で３分間変性後、室温で１５分間冷却してアニーリング反応を行った。dsDNAテンプレートを作製するために、アニーリング製品をKlenowポリメラーゼ  (New England BioLabs) を用いて伸長した。得られたdsDNAをフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿にて精製した。この精製dsDNAをテンプレートとして使用して、in vitro転写反応をAmpliScribe T7 Kit (Epicentre Biotechnologies) を用いて製造者プロトコルに従って行った。反応液をフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿して、8 M Ureaを含む 5% ポリアクリルアミドゲルにて変性して AD-gRNAsを精製した。標的RNAは、dsDNAテンプレートを標準PCR反応（PrimeSTAR GXL DNA polymerase (TAKARA BIO)）によるPCRによって調製した後、上述したようにin vitro転写と精製を行った。全てのDNAオリゴヌクレオチドとRNAサンプルの配列は表２〜表６に表示している。【０１７８】
（組換えhADAR2の調製法）
組換えhADAR2は、ヒトADAR2のためのコーデイング領域をcDNA clone (clone ID 6014605, Open Biosystems) からPCRで増幅し、N-末端His-Expressタグ付融合タンパク質をクローン後、Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit (Zymo Research) を用いてINVSc1イースト細胞に形質転換した。得られた形質転換体は液体培地で培養し、組換えhADAR2をHisTrap HPカラム (GE Healthcare) で精製した。hADAR2を含む分画を集めて、保存用バッファ（10 mM Tris-HCl [pH 7.5]、150 mM NaCl、 5% glycerol, 1 mM DTT）で50-kDaの分子量カットオフFloat-A-Lyzer G2 (Spectra/Por) で投石した。精製したhADAR2はDC protein Assay Kit (BioRad) を用いて製造者プロトコルに従って定量した。
【実施例１１】
【０１７９】
（In vitro編集アッセイ）
gRNAsとtarget RNAの複合体は、900 nM AD-gRNAと300 nM標的RNAを８０℃で３分間加熱し、次いでアニーリングバッファ（10 mM Tris-HCl [pH 7.6] 、150 mM NaCl）を用いて１℃／１０秒の割合で２５℃に徐冷した。編集反応は次のように行った。得られた複合体5 nMと濃度を変えた精製hADAR2を反応バッファ（20 mM HEPES-KOH [pH 7.5]、100 mM NaCl、 2 mM MgCl2,、0.5 mM DTT、0.01% TritonX-100、 5% glycerol、 1 U/μl Murine RNAse Inhibitor [New England BioLabs] ）20μlで混合した後、３７℃で２時間培養した。反応終了後、反応したRNAをフェノール／クロロホルム抽出・エタノール沈殿をした。その後、RNAペレットをTEバッファ5μlに溶解した。反応RNAからcDNAを精製RNAから得るために、PrimeScript II Reverse Transcription Kit (TAKARA BIO) を用いて逆転写した。cDNAは、PrimeSTAR GXL DNA polymerase (TAKARA BIO) を用いて標準プロトコルに従ってPCR増幅した。各部位での辺雌雄効率は次のようなダイレクトシークエンシングによって分析した。ゲル精製PCR製品10 ngをリバースプライマーとBigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) でシークエンスし、次に3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) でシークエンスクロマトグラフィーを行った。各部位での編集割合は次のようにして算出した：Ａ／（Ａ＋Ｇ）（式中、ＡとＧは、Sequence Scanner software ver. 1.0 (Applied Biosystems) で測定したアデノシンとグアノシンのピーク高をそれぞれ意味する）。
【実施例１２】
【０１８０】
（in vitro翻訳と結合させたルシフェラーゼレポーターアッセイを用いたin vitroコドン修復実験）
in vitroコドン修復実験用レポーターは、レニラルシフェラーゼmRNA (Renilla luciferase mRNA (Rluc-WT)) に基づいて設計した。このレポーターmRNA (Rluc-W104X) は、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) を用いて、Trp104 (UGG) 内のG311を A311に変異して調製した。このRluc-W104Xレポーターを用いると、全長ワイルドタイプRlucトランスクリプトが合成され、A311がI311に編集された。In vitro編集反応と翻訳反応を連続して行った。まず、5μM Rluc-W104Xと15μM ADg-rLuc_A311を、アニーリングバッファーを用いて一緒に８０℃で３分間加熱し、続いて１℃／１０秒の割合で２５℃に徐冷をしてアニールした。その後、レポーター・gRNA複合体0.5μMを反応バッファ―内で３７℃で２時間処理して1.25μM hADAR2と編集反応を行った。並行して、コントロールサンプル（gRNAを含まない）を同一反応で処理した。【０１８１】
編集したRNAサンプルはフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿をして回復した。活性なRlucが編集されたレポーター mRNAから翻訳できるかどうかを評価するために、 in vitro翻訳を、編集反応で得られたレポーターRNA 1μgを用いてラビット網状赤血球ライセート20μlで行った。３７℃で１時間翻訳した後、Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) を用いて化学発光法を製造プロトコルに従って行い、発光を分光光度計で測定した。反応を同時に行う場合、5μM Rluc-W104Xと15μM ADg-rLuc_A311と 1.25μM hADAR2をラビット網状赤血球ライセート20μlで十分に混合し、３７℃で２０分間培養した。次いで、ルシフェラーゼアッセイを上記条件の下で行った。
【実施例１３】
【０１８２】
（AD-gRNA発現プラスミドの作製）
AD-gRNA発現プラスミドは、H1 RNA polymerase IIIプロモーターに基づいて、短鎖ヘアピンRNAsやmiRNAsなどの細胞内RNAsを発現するために使用されるpSUPER.neo (Oligoengine) を用いて構築された。AD-gRNAsをコードするDNAインサートを調製する際に、テトラウリジンをAD-gRNA配列の3 末端に挿入して特定位置のpol IIIの転写を終了させた。ベクターへのクローニングは、Hind IIIとBgl II制限部位を5 末端と3 末端にそれぞれ導入することによって促進された。DNAインサートは表２〜表６に示す合成オリゴヌクレオチドを用いて作製された。各DNAインサートはpSuper.neoベクターにクローンされ、得られたプラスミドの配列はDNAシークエンシング分析によって確認した。最後に、転写に使用する発現プラスミドはPlasmid Mini kit (Qiagen) を使用して製造者プロトコルに従って調製した。
【実施例１４】
【０１８３】
（細胞培養）
HEK293細胞を、10%ウシ胎児血清を追加したDulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Sigma) に採取した。hADAR2とAcGFPを２方向性プロモーターからTet-on系の制御の下で同時に発現させたtet-ADAR2細胞を発明者の研究室で確立した。tet-ADAR2細胞は、10% Tet system-approvedウシ胎児血清 (Clontech)、1μg/mL puromycin、100μg/mL G418 (Sigma) を補充したDMEM内に単層として5% CO2の存在下３７℃で培養した。tet-ADAR2細胞をDox5μg/mLを追加した上記培地で培養してADAR2とAcGFPの発現を誘導した。
【実施例１５】
【０１８４】
（AD-ガイドRNAの細胞内活性の分析）
Tet-ADAR2細胞(1.6×105) を5μg/mL Doxを含む培地を入れた35-mmデイッシュに追加した。細胞が約８０％のコンフルエンスになったときに、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent (Roche) を用いてAD-gRNA 2μgでトランスフェクトした。７２時間トランスフェクトした後、tet-ADAR2細胞内でhADAR2を用いて同時発現させたAcGFP RNAのA100での編集効率は次のように分析した。全RNAは、トランスフェクトした細胞からSepasol RNA I Super G (Nacalai Tesque)を用いて製造者のプロトコルに従って抽出した。その後、RNAサンプル(30μg) を10 U DNase I (Takara Bio) で３７℃で３時間処理した後、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿をした。精製RNA (0.5μg) をアダプターリンクオリゴ (dT) 17プライマーとTranscriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche) を用いて製造者プロトコルに従って逆転写をした。得られた全RNAをテンプレートとして使用して、AcGFP cDNAをAcGFP-特異的プライマー (AcGFP_F and AcGFP_R) を用いてPCR 増幅した。A100部位でのA-I RNA編集効率は、ダイレクトシークエンシング法で分析した後、AとGの相対的ピーク高を定量し、各編集割合を(A + G) のピーク高で割ったGのピーク高に基づいて算出した。
【実施例１６】
【０１８５】
（AD-gRNAsによる細胞内コドン修復実験）
in vitroコドン修復実験では、G173がA173に変換してストップコドンのコドンW58を変異した変異体GFP mRNA (AcGFP-W58X)を設計して、AD-gRNAが細胞内で機能性遺伝子発現を調節できるかどうかを決定した。AcGFP-W58X発現プラスミドをpcDNA3.1発現ベクター (Invitrogen) に基づいて構築した。さらに、hADAR2発現プラスミドをPCR-amplified hADAR2 cDNAを pcDNA3.1にクローンすることによって構築した。hADAR2、AcGFP-W58X、AD-gRNA発現ベクター各100 ngをサブコンフルエンスなHEK293細胞内に共トランスフェクトした。編集効率はトランスフェクト７２時間後に行った。また細胞内GFP蛍光の回復は蛍光顕微鏡で分析した。
【実施例１７】
【０１８６】
本実施例は、本発明に係る編集ガイドＲＮＡを細胞内ＲＮＡ変異導入した培養細胞内で機能するかを検証した例である。まず、in vitroで編集誘導活性を示した４種類の編集ガイドＲＮＡ（ADg-GFP_A200、ADg-rGFP_A200、sADg-GFP_A200、sADg-rGFP_A200；図３６参照）の細胞内発現プラスミドを構築した。発現ベクターには市販のpSUPER.neo (Oligoengine)を用いた。また、ADAR発現細胞としてtet-ADAR2細胞（HEK293細胞にADAR2発現遺伝子を組み込んで構築した細胞株。ドキシサイクリン濃度依存的にADAR2及びGFPを発現）を用いた。ドキシサイクリン存在下でtet-ADAR2細胞を培養し、ADAR2及びGFPの発現を誘導した後、各種編集ガイドRNA発現プラスミドを導入した（図３７ａ）。培養後、標的部位であるA200（図２１参照）の編集割合は、ダイレクトシークエンシングによるGFP mRNAの編集解析結果により解析した。つまり、細胞から抽出したGFP mRNAを逆転写し、配列解析を行った結果、細胞から抽出したGFP RNAのA200は、編集ガイドRNAを導入した時のみ編集のシグナルが検出された（図３７ｂ）。また、その時の編集割合を得られたクロマトチャートのピークの高さの比（G/A+G）から算出した結果、高いサンプルでおよそ40％編集されていた（図３７ｃ）。以上の結果から、編集ガイドRNAが細胞内ADARを誘導し、標的部位に変異を導入できることを実証した。また、この結果は、ADARを発現している細胞であればプラスミド導入のみで合目的な変異導入が可能であることも同時に示している。
【実施例１８】
【０１８７】
mRNA上のイノシン（I）が、翻訳の際にグアノシン（G）として認識されることから、このA-I変異によるコドン改変により、細胞内標的タンパク質の機能を制御できることになる。そこで、本実施例では、本発明に係るRNA変異導入法がタンパク質機能発現を制御できるかどうかを明らかにした。【０１８８】
具体的には、GFP mRNA (720 nt)の58番目のTrpコドン（UGG）を終止コドン（UAG）に改変したレポーターmRNA（GFP W58X mRNA）を用いて、RNA変異導入により終止コドンをUIGに変異させることで、成熟型のGFPが細胞内で翻訳されるかを検証した（図３７ａ）。まず、標的終止コドンをTrpコドンに改変できるよう、A173を標的とする編集ガイドRNA（ADg-rGFP_A173）を設計し、pSuper.neoを用いて細胞内発現プラスミドを構築した。その後、ADAR2発現プラスミド （pcDNA3.1 (-) Hygro_His-ADAR2）、レポーターRNA発現プラスミド （pcDNA3.1 (-) Hygro_AcGFPW58X）とHEK293細胞に共トランスフェクションした。培養後、編集誘導により蛍光を発する細胞を蛍光顕微鏡により確認した。その結果、編集ガイドRNA発現プラスミドを導入した細胞群にのみ、強い蛍光を発する細胞が検出された（図３８）。以上の結果より、編集ガイドRNAを用いたRNA変異導入により、標的タンパク質の発現制御が可能であることを実証した。
【実施例１９】
【０１８９】
コラーゲンコートした35-mm dishに4.0×105個のTet-ADAR2細胞をピューロマイシン1μg/mL、G418 100μg/mL、Dox 5.0μg/mLを含むTet血清培地中で、37℃、5.0% CO2条件下で培養した。80%コンフルエントになるまで培養した細胞を1.6×105 cells/wellとなるように6-well plateに継代した。４８時間培養後、FuGENE HP Transfection Reagent (Roche) を用いて各々のguide RNA発現プラスミド (pSuper-guide 3-mini, pSuper-guide 3r-mini, pSuper-guide 3-Glu, pSuper-guide 3r-Glu) を2μgトランスフェクションし７２時間培養した。その後、1000μLのセパゾール RNA I Super G  (ナカライ)を用いて全RNAを抽出し、10 U Recombinant DNaseI (TaKaRa)を用いて37℃で１時間DNase 処理を行った。全RNA産物をフェノール/クロロホルム処理、酢酸ナトリウム存在下のエタノール沈殿により精製した。Total RNA 0.5μg 、2.5μM Oligo (dT)17、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche) を用いて変性 80℃、３分、急冷、アニーリング 65℃、１０分、伸長反応 55℃、３０0分、加熱処理85℃、５分の条件で逆転写反応を行い、cDNAを合成した。１０倍希釈したサンプルを鋳型に用い、0.25μM AcGFP RNAf T7F01プライマー、0.25μM 3'-ADPプライマー、0.25 U PrimeStar GXL DNA polymerase (TaKaRa)を用いて1st PCR（変性 98℃、１０秒、アニーリング 55℃、１５秒、伸長反応 68℃、６０秒、３５サイクル）を行った。４００倍希釈した1st PCR産物を鋳型に用い、0.25μM RNAf T7F01プライマー、0.25μM AcGFP-RNAf-R01プライマーを用いてNested PCR（変性 98℃、１０秒、アニーリング 55℃、１５秒、伸長反応 68℃、６０秒、２４サイクル）を行った。PCR反応後、１０倍希釈した増幅産物を鋳型に用い、Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied BiosystemsTM）と0.165μM RNAf T7F01プライマーを用いてシークエンシング反応（変性 96℃、１０秒、アニーリング 50℃、５秒、伸長反応 60℃、３０秒、２５サイクル)を行った。得られたピークの高さの比 G/ (G+A) により編集割合を算出した。その後の操作（ＲＮＡ抽出以降）は上記と同様に行った。
【実施例２０】
【０１９０】
35mm/GLASS BASE DISH (Glass 12φ) (IWAKI)に1.6×105個のHEK293細胞を血清培地中で、37℃、5.0% CO2条件下で４８時間培養した。その後、X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent (Roche)を用いてADAR2発現プラスミドpcDNA3.1 (-) Hygro_His-ADAR2、基質RNA発現プラスミド pcDNA3.1 (-) Hygro_AcGFPW58Xおよび各guide RNA発現プラスミド pSuper-neo-guide 3r-miniW58XまたはpSuper-neo-guide 3r-GluW58Xを700 ngずつ形質導入し７２時間培養した。その後、D-PBS (-) (ナカライ)で細胞を洗浄した後、共焦点蛍光顕微鏡を用いた観察を行った。
【実施例２１】
【０１９１】
本実施例では、AD-gRNAと 標的RNAの複合体が形成されていることをゲル・モビリテイ・シフト・アッセイ（gel-mobility shift assay）にて確認した（図２３）。ADg-GFT_A200 (900 nM)とGFP mRNA断片 (300 nM; 160 nt) を８０℃、３分間アニールした後、アニーリングバッファ−（10 mM Tris-HCl [pH 7/6]、150 mM NaCl）中で２５℃に１０秒間に１℃の割合で徐冷した。徐冷後、8%ポリアクリルアミドで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。第１レーンはGFP RNA、第２レーンはADg-GFP_A200、第３レーンはアニールしたサンプルを示している。シフトしたバンドは矢じり印で示すように得られた結合体であると期待できる。
【実施例２２】
【０１９２】
本実施例では、編集GluR2 RNAに基づくフレームワークを用いたAD-gRNAの構築を確認した（図２４）。sADg-GFP_A200とsADg-rGFP_A200のin vitro編集生起活性は、ＲＴ−ＰＣＲした後、gRNA（上部パネル）、 sADg-GFP_A200 （中央パネル）またはsADg-rGFP_A200 （下部パネル）なしのin vitro編集反応によって得られたGFP cDNAのシークエンシングクロマトグラフ図中のＡとＧピークから編集割合を算出して得た。結果は、３個の別々の実験からの平均値と標準偏差値で示した。
【実施例２３】
【０１９３】
本実施例では、cis−基質RNAを用いて編集特異性を分析した（図２５）。基質RNAの編集特異性を調べるために、下記変異を用いた基質ヘアピン構造に基づいてeSL_AAA RNAとeSLr_AAA RNAを設計した。【０１９４】
eSL_AAA RNAは、標的編集部位に隣接するヌクレオチドをアデノシンに変異し、塩基対合を促進するためにウリジンをこの変異アデノシンの相補位置に導入することによって作製した。eSLr_AAA RNAは、eSL_AAA RNAの標的塩基アデノシンを含む３個のアデノシンを相補的ｎｔで置換することによって作製した。eSL_AAA RNAとeSLr_AAA RNAの実際の配列は図２５（ａ）に示す。図中、各アデノシンを認識しやすいように、標的編集部位をｎｔ位置（０）で示し、隣接５'−アデノシンをｎｔ位置（−１）、３'−アデノシンをｎｔ位置（＋１）と示す。【０１９５】
これらの基質ＲＮＡを使用して、hADAR2とのin vitro編集反応を図２３ａの方法に従って実施した。次に、目的のアデノシンの編集効率を反応時間を変えてダイレクトシークエンシング法で分析した。得られたシークエンスクロマトグラフ図を図２５（ｂ）に示す。図中、各アデノシンの位置は、対応するｎｔ位置番号で表している。加えて、ピークの高さから算出した編集割合は、各反応時間ごとにグラフにプロットした。図中、○印はｎｔ位置（０）で観察された編集パーセンテージ、□印および△印はｎｔ位置（−１）および（＋０）でそれぞれ観察された編集パーセンテージを表している。データは３回別々に実験した結果の平均値と標準偏差値である。
【実施例２４】
【０１９６】
本実施例では、AD-gRNA誘導ＲＮＡ編集の隣接特異性を評価するために、GFPmut RNAを、GFP mRNA中の A200に隣接する隣接ｎｔをアデノシンに変異させることによって作製した。図２６において、ｎｔA200はｎｔ位置０として定義し、５'側ならびに３'側アデノシンはｎｔ−１ならびにｎｔ＋１としてそれぞれ定義した。ADg-RNAに対しては、ADg-rGFT_AAAをADg-rGFP_A200の配列デザインに従って構築した。図２６ａは、GFPmut RNA上の標的編集部位周辺の配列ならびにADg-rGFP_AAAの実際のヌクレオチド配列を含む配列デザインを示す。各部位での編集効率を分析するために、in vitro編集反応を図２３に従って実施した。編集時間の違いに応じた編集効率の変化をグラフにプロットした。グラフ中、○印、△印ならびに□印はｎｔ位置０、＋１ならびに−１における編集パーセンテージをそれぞれ表している。データは３回別々に実験した結果の平均値と標準偏差値である。
【実施例２５】
【０１９７】
本実施例では、塩基対合を追加導入したときのAD-gRNA誘導ＲＮＡ編集の隣接特異性ならびに編集効率に対する効果を分析した。sADg-rGFP_AAA中の ADAR結合部位（図２５）の回転自由度は、３'側に塩基対合を追加導入することによって抑制されるのではないかと調べた。sADg-rGFP_AAAの３'側に５ｎｔ（5'-UCAGG-3'）を追加導入して、塩基対合領域（四角で囲んだ領域）を伸長ように設計した。実施例２４と同様の条件で、hADAR2とのin vitro編集反応を実施し、各部位での編集パーセンテージを分析した。
【実施例２６】
【０１９８】
本実施例では、同時in vitro編集／翻訳反応を行った。図３０ａは反応の概略図である。図３０ｂは、反応後、A311での編集効率を直接シークエンシングで分析した結果を示している。上部パネルはガイドＲＮＡなし、下部パネルはADg-rRluc_A311のシークエンスクロマトグラフィー図をそれぞれ表している。
【実施例２７】
【０１９９】
本実施例では、tet-ADAR2細胞中のADg-GFP_A200をＲＴ−ＰＣＲならびに定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）した。サブコンフルエント（subconfluent）に増殖しているtet-ADAR2細胞をAD-gRNA発現プラスミドベクターを用いてトランスフェクトした。各時間培養した後、全ＲＮＡを抽出し、Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit（Roche）を用いたランダムヘイササマー（hexamer）プライマー（dN6プライマー）を用いて逆転写を行った。ｑＰＣＲは、Power SYBR(R) Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）を用いたADg-GFP_A200の特異的増幅のためにqADg_FとqADg_Rプライマーを用いて行った。全ＲＮＡ量を定量するための内部標準としては、グリセルアルデヒド３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）もまたGAPDA-QFとGAPDH-QRプライマーを用いて定量した。ｑＰＣＲの条件は次のとおりである：変性のための予備加熱（９５℃で１０分間）ならびにLightCycler Nano System（Roche） による増幅（９５℃、１５秒間；６０℃、１分間；５５サイクル）。分析ソフトウエアを用いて、公差閾値（Ｃｔ：crossing threshold）を2nd derivative maximum methodによって蛍光増幅プロットから算出した。各サンプルの公差閾値差（ΔＣｔ）は次のようにして算出した：
ΔＣｔ＝Ct(AD-gRNA) - Ct(GAPDH)
ADg-RNAの相対発現量は、Ｒ＝２^−ΔＣｔによって推定し、グラフに表示した。
【実施例２８】
【０２００】
本実施例では、tet-ADAR2細胞中のhADAR2発現をウエスタンブロッテングで分析した（図３３）。Tet-ADAR2細胞をドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を0、0.05、0.1、0.5、1.5 ug/mL含有する培地で培養し、サブコンフルエントな細胞を採集した。ヘマトサイトメーターで計数後、細胞6.4 x 104個を20μL SDS-PAGEサンプルバッファー（50 mM Tris-HCl [pH 7.6]、 2% SDS, 6% β-メルカプトエタノール、10%グリセロール）で溶菌した。各細胞溶菌液サンプル５uLを８％ポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気分解してタンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜上を電気泳動した。装填した溶菌液の量を標準化するために、膜を切断してhADAR2とβ-アクチンを同一膜上で同時に分析できるようにした。各膜切片は、hADAR2に対する１次抗体（抗ADARB1、Sigma）とβ-アクチンに対する１次抗体ラビット由来抗アクチン抗体、Sigma）と培養し、続いてホースラディッシュパーオキシド結合抗ラビットＩｇＧ（Sigma）を用いて２次抗体との反応を行った。その後、EzWestLumi plus (ATTO) による化学ルミネッセンス反応を行い、タンパク質のバンドをLuminoGraph I (ATTO) で検出した。
【実施例２９】
【０２０１】
本実施例は、tet-ADAR2細胞中でのAD-gRNAによって誘導される編集効率を示している。
【実施例３０】
【０２０２】
本実施例は、編集基質ＲＮＡの異なる部位において生成したAD-gRNAの編集効率を示している。図３５（ａ）はAD-gRNA生成のためのヘアピン基質の分割線を示す。（ｂ）は、標的RNA (GFP mRNA) の配列と、（ａ）で示した部位で分割することによつてフレームワークから構築された5'-アンチセンスADg-RNAの配列を示す。ADg(L3) は、実施例１４に示した実験で用いたsADg-rGFP_A200と同じである。（ｃ）は、各ＲＮＡの編集誘導活性を評価するために、編集アッセイを実施例１６で示した同じ条件で行った。反応時間に応じたA200での編集効率の変化をグラフにプロットした。データは読りとした２回の実験の平均値と標準偏差値を表している。
【産業上の利用可能性】
【０２０３】
本発明に係る部位特異的RNA変異導入方法は、その標的塩基アデノシンが存在するあらゆる標的RNAばかりではなく、かかる標的RNAに対する標的編集ガイドRNAを容易に設計・構築することができることから、ADAR機能を誘導する標的RNAと標的編集ガイドRNAとの二本鎖複合体を容易に設計・構築することができる。従って、本発明では、かかる二本鎖複合体にADARを作用させることにより、そのRNA編集能を誘導して標的塩基アデノシンをイノシンに変換することができる。その上、本発明は、生体外ばかりではなく、生体内においても利用できることから、創薬の研究開発における有用でかつ重要なツールとして利用することが可能である。【０２０４】
本発明に係る部位特異的RNA変異導入方法は、糖鎖修飾部位やリン酸化部位、金属配位等の細胞内タンパク質の機能発現に関わるアミノ酸の変異に適用することができ、これにより細胞内タンパク質の機能を一時的に制御する新たな方法論を提供できる。本発明は、標的編集ガイドRNAを用いたRNA変異導入技術による生体内タンパク質機能制御法を一般化することで、生命科学分野の研究発展に大きく貢献できる分子科学技術を提供する。【０２０５】
また、現在まで、siRNAによる標的タンパク質の発現抑制、またはアプタマーと呼ばれる機能性RNAによる標的タンパク質の機能制御を利用した核酸製剤が開発されている。一方で、mRNAの情報を変換し標的タンパク質の機能を改変する薬剤は未だ開発された例を見ない。したがって、本発明は、これまでにない機能や薬効を示す新規な核酸医薬品、例えば、抗筋ジストロフィー薬、抗多発性硬化症薬、抗アルツハイマー病薬、抗神経組織変性薬、抗パーキンソン氏病薬などの神経疾患薬や、抗がん薬などを生み出す可能性を秘めている。
【符号の説明】
【０２０６】
１０        ５'−標的側相補領域
１２        末端側標的相補領域
１４        ガイド側標的相補領域
２０        アンチセンス領域
２２        末端側標的認識領域
２４        コア側標的認識領域
２６        ADAR結合領域
２７        ガイド側分断領域
２８        ADAR結合コア領域
５０        ３'−標的側相補領域
５２        末端側標的相補領域
５４        ガイド側標的相補領域
６０       アンチセンス領域
６２        末端側標的認識領域
６４        コア側標的認識領域
６６        ADAR結合領域
６７        ガイド側分断領域
６８        ADAR結合コア領域
【図１】
2017010556.tif 000265
【図２】
2017010556.tif 000266
【図３】
2017010556.tif 000267
【図４】
2017010556.tif 000268
【図５】
2017010556.tif 000269
【図６】
2017010556.tif 000270
【図７】
2017010556.tif 000271
【図８】
2017010556.tif 000272
【図９】
2017010556.tif 000273
【図１０】
2017010556.tif 000274
【図１１】
2017010556.tif 000275
【図１２】
2017010556.tif 000276
【図１３】
2017010556.tif 000277
【図１４】
2017010556.tif 000278
【図１５】
2017010556.tif 000279
【図１６】
2017010556.tif 000280
【図１７】
2017010556.tif 000281
【図１８】
2017010556.tif 000282
【図１９】
2017010556.tif 000283
【図２０】
2017010556.tif 000284
【図２１】
2017010556.tif 000285
【図２２Ａ】
2017010556.tif 000286
【図２２Ｂ】
2017010556.tif 000287
【図２３】
2017010556.tif 000288
【図２４】
2017010556.tif 000289
【図２５】
2017010556.tif 000290
【図２６】
2017010556.tif 000291
【図２７】
2017010556.tif 000292
【図２８】
2017010556.tif 000293
【図２９】
2017010556.tif 000294
【図３０】
2017010556.tif 000295
【図３１】
2017010556.tif 000296
【図３２】
2017010556.tif 000297
【図３３】
2017010556.tif 000298
【図３４】
2017010556.tif 000299
【図３５】
2017010556.tif 000300
【図３６】
2017010556.tif 000301
【図３７】
2017010556.tif 000302
【図３８】
2017010556.tif 000303
【配列表】
2017010556000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年1月18日(2018.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式［ＬＸＡ］：
【化１３】
2017010556.tif 000304
（式中、標的側相補領域は、末端側標的相補領域と、ガイド側標的相補領域と、編集標的塩基（Ａ＊）とから構成され、
末端側標的相補領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数が、４０〜２０個である塩基配列から構成され、
ガイド側標的相補領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数が、１〜１０個の塩基配列からなる塩基領域を意味し、Ａ＊は、Ａ−Ｉ編集の標的である標的編集部位（＊印）に存在する標的塩基アデニンを意味する）
で表される５’−標的ＲＮＡと、式［ＬＩＡ］：
【化１４】
2017010556.tif 000305
（式中、アンチセンス領域は、末端側標的認識領域と、標的編集誘導塩基Ｘ（△印）と、コア側標的認識領域のＸ隣接部分領域とから構成され、
末端側標的認識領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、その塩基数が４０〜２０個の塩基配列を意味するとともに、標的ＲＮＡの末端側標的相補領域の各対応構成塩基とそれぞれ塩基対合して塩基対を構成し、
標的編集誘導塩基Ｘ（△印）は、塩基シトシン、グアニンまたはアデニンのいずれか１種からなる標的塩基（Ａ）とミスマッチ塩基であって、標的ＲＮＡの標的塩基（Ａ＊印）である塩基アデニンに対して標的編集誘導する塩基を意味し、
コア側標的認識領域のＸ隣接部分領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数が、１〜１０個の塩基配列からなり、標的ＲＮＡのガイド側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であって、それぞれ塩基対合して塩基対を構築し、
ＡＤＡＲ結合領域は、コア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域と、ＡＤＡＲ結合コア領域と、ガイド側分断領域とからなり、それぞれアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、コア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域とガイド側分断領域のそれぞれの塩基数は、同数であって、１０個以下の塩基配列からなる塩基領域を意味し、そのＡＤＡＲ隣接部分領域とガイド側分断領域の各対応構成塩基はそれぞれ塩基対合して塩基対を形成し、
ＡＤＡＲ結合コア領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列であって、その領域内にステムループ構造と、複数の塩基対の他に、単数もしくは複数のミスマッチ塩基対を有する不完全二本鎖ＲＮＡ構造を有し、その塩基数が、２０〜３０個からなり、ＡＤＡＲ結合コア領域の１末端側にガイド側分断領域、別の末端側に標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域が結合した構造であり、
ガイド側分断領域の塩基配列は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列であって、その塩基数はコア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分と同数であって、１０個以下の塩基配列からなる塩基領域を意味し、そのガイド側分断領域はＡＤＡＲ隣接部分領域とそれぞれ塩基対を形成する構造である）
で表される３’−標的編集ガイドＲＮＡを反応させて式［ＬＸＩＡ］：
【化１５】
2017010556.tif 000306
（式中、末端側標的認識領域、コア側標的認識領域、Ｘ（△印）、ＡＤＡＲ結合コア領域およびガイド側分断領域はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表される５’−標的ＲＮＡ−３’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体を得、得られた５’−標的ＲＮＡ−３’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）（＊印）がＡＤＡＲの作用によりＡ−Ｉ編集によりイノシン（Ｉ）に変換された式［ＬＸＩＩＡ］：
【化１６】
2017010556.tif 000307
（式中、末端側標的相補領域、ガイド側標的相補領域およびＩ（＊印）はいずれも前記と同じ意味を有する。）
で表される５’−編集標的ＲＮＡを得ることを特徴とする部位特異的ＲＮＡ変異導入方法。
【請求項２】
式［ＬＶＡ］：
【化７】
2017010556.tif 000308
（式中、標的側相補領域は、末端側標的相補領域と、ガイド側標的相補領域と、編集標的塩基（Ａ＊）とから構成され、
末端側標的相補領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数が、４０〜２０個である塩基配列から構成され、
ガイド側標的相補領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数は、１〜１０個の塩基配列からなる塩基領域を意味し、Ａ＊は、Ａ−Ｉ編集の標的である標的編集部位（＊印）に存在する標的塩基アデニンを意味する）
で表される３’−標的ＲＮＡと、式［ＬＶＩＡ］：
【化８】
2017010556.tif 000309
（式中、アンチセンス領域は、末端側標的認識領域と、標的編集誘導塩基Ｘ（△印）と、コア側標的認識領域のＸ隣接部分領域とから構成され、
末端側標的認識領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、その塩基数が、４０〜２０個の塩基配列を意味するとともに、標的ＲＮＡの末端側標的相補領域の各対応構成塩基とそれぞれ塩基対合して塩基対を構成し、
標的編集誘導塩基Ｘ（△印）は、塩基シトシン、グアニンまたはアデニンのいずれか１種からなる標的塩基（Ａ）とミスマッチ塩基であって、標的ＲＮＡの標的塩基（Ａ＊印）である塩基アデニンに対して標的編集誘導する塩基を意味し、
コア側標的認識領域のＸ隣接部分領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数が、１〜１０個の塩基配列からなり、標的ＲＮＡのガイド側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であって、それぞれ塩基対合して塩基対を構築し、
ＡＤＡＲ結合領域は、コア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域と、ＡＤＡＲ結合コア領域と、ガイド側分断領域とからなり、それぞれアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、コア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域とガイド側分断領域のそれぞれの塩基数は、同数であって、１０個以下の塩基配列からなる塩基領域を意味し、そのＡＤＡＲ隣接部分領域とガイド側分断領域の各対応構成塩基はそれぞれ塩基対合して塩基対を形成し、
ＡＤＡＲ結合コア領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列であって、その領域内にステムループ構造と、複数の塩基対の他に、単数もしくは複数のミスマッチ塩基対を有する不完全二本鎖ＲＮＡ構造を有し、その塩基数が、２０〜３０個からなり、ＡＤＡＲ結合コア領域の１末端側にガイド側分断領域、別の末端側に標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域が結合した構造であり、
ガイド側分断領域の塩基配列は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列であって、その塩基数はコア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分と同数であって、１０個以下の塩基配列からなる塩基領域を意味し、そのガイド側分断領域はＡＤＡＲ隣接部分領域とそれぞれ塩基対を形成する構造である）
で表される５’−標的編集ガイドＲＮＡを反応させて式［ＬＶＩＩＡ］：
【化９】
2017010556.tif 000310
で表される３’−標的ＲＮＡ−５’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体を得、得られた３’−標的ＲＮＡ−５’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）（＊印）が二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）の作用によるＡ−Ｉ編集によりイノシン（Ｉ）に変換された式［ＬＶＩＩＩＡ］：
【化１０】
2017010556.tif 000311
で表される３’−編集標的ＲＮＡを得ることを特徴とする部位特異的ＲＮＡ変異導入方法。
【請求項３】
式［ＸＩＡ］：
【化３７】
2017010556.tif 000312
（式中、記号「ａＮ１・・ａＮｍ」は、５’−標的ＲＮＡにおける末端側標的相補領域に相当し、記号「ａＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、記号「ｍ」は、４０〜２０の塩基数を意味し、
記号「ｂＮ１ｂＮ２・・ｂＮｎ−１ｂＮｎ」は、５’−標的ＲＮＡ［ＬＡ］におけるガイド端側標的相補領域に相当し、記号「ｂＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「ｎ」は、１〜１０の塩基数を意味し、
Ａ＊は、標的編集部位（＊印）に存在する標的塩基アデニンを意味する。）
で表される５’−標的ＲＮＡまたは式［ＸＶＩＡ］：
【化３８】
2017010556.tif 000313
（式中、記号「ｆＮ１・・ｆＮｍ」は、標的ＲＮＡにおける末端側標的相補領域に相当し、記号「ｆＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、記号「ｍ」は、４０〜２０個の塩基数を意味し、
記号「ｇＮ１ｇＮ２・・ｇＮｎ−１ｇＮｎ」は、標的ＲＮＡ［ＬＡ］におけるガイド端側標的相補領域に相当し、記号「ｇＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「ｎ」は、１〜１０個の塩基数を意味し、
Ａ＊は、標的編集部位（＊印）に存在する標的塩基アデニンを意味する。）
で表される３’−標的ＲＮＡと、式［ＩＩＡ］：
【化３９】
2017010556.tif 000314
（式中、Ｘはシトシン、グアニンまたはアデニンであって、記号「ｃＮ１ｃＮ２……ｃＮｐ−１ｃＮｐ」は、３’−標的編集ガイドＲＮＡのガイド側分断領域に相当し、記号「ｃＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、記号「ｐ」は、１０以下を意味し、
記号「ｄＮ１・・ｄＮｍ」は、３’−標的編集ガイドＲＮＡの末端側標的認識領域に相当し、記号「ｄＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「ｍ」は前記と同じ意味を有し、４０〜２０の塩基数を意味し、標的ＲＮＡの末端側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であり、かつ、対応する塩基同士は塩基対を形成し、
記号「ｅＮ１ｅＮ２・・ｅＮｎ＋ｐ」は、標的編集ガイドＲＮＡのコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域とＡＤＡＲ隣接部分領域の塩基配列に相当し、記号「ｅＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「ｎ」はコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域の塩基配列の塩基数、記号「ｐ」はコア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域の塩基数を表し、Ｘ隣接部分領域の塩基配列は複合体化の際に標的ＲＮＡのガイド側標的相補領域の塩基配列と塩基対を形成し、またガイド側分断領域の塩基配列はＡＤＲ隣接部分領域の塩基配列と塩基対を形成し、
記号「ＮαＮβ−ＮδＮχ」は、標的編集ガイドＲＮＡのＡＤＡＲ結合コア領域に相当し、また記号「Ｎα」と記号「Ｎχ」が、記号「Ｎβ−Ｎδ」で表されるループ構造を挟んだ２本の一本鎖からなるステムループ構造からなる不完全二本鎖相補ＲＮＡ構造から構成され、このＲＮＡ構造はアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成され、ループ構造は、４〜８個の同種または異種の塩基から構成され、また各一本鎖のＲＮＡ塩基配列は、２０〜３０個の同種または異種の塩基からなり、さらにその二本鎖は単数もしくは複数のミスマッチ塩基対を有する塩基配列であるとともに、その一方の一本鎖の末端はガイド側分断領域、また別の一本鎖の末端はコア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分に結合した構造になっている。）
で表される３’−標的編集ガイドＲＮＡまたは式［ＶＩＩＡ］：
【化４０】
2017010556.tif 000315
（式中、Ｘはシトシン、グアニンまたはアデニンであって、記号「ｋＮ１ｋＮ２……ｋＮｐ−１ｋＮｐ」は、３’−標的編集ガイドＲＮＡのガイド側分断領域に相当し、記号「ｋＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、記号「ｐ」は、１０以下を意味し、
記号「ｈＮ１・・ｈＮｍ」は、３’−標的編集ガイドＲＮＡの末端側標的認識領域に相当し、記号「ｈＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「ｍ」は前記と同じ意味を有し、４０〜２０の塩基数を意味し、標的ＲＮＡの末端側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であり、かつ、対応する塩基同士は塩基対を形成し、
記号「ｊＮ１ｊＮ２・・ｊＮｎ＋ｐ」は、標的編集ガイドＲＮＡのコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域とＡＤＡＲ隣接部分領域の塩基配列に相当し、記号「ｊＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「ｎ」はコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域の塩基配列の塩基数、記号「ｐ」はコア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域の塩基数を表し、Ｘ隣接部分領域の塩基配列は複合体化の際に標的ＲＮＡのガイド側標的相補領域の塩基配列と塩基対を形成し、またガイド側分断領域の塩基配列はＡＤＲ隣接部分領域の塩基配列と塩基対を形成し、
記号「ＮαＮβ−ＮδＮχ」は、標的編集ガイドＲＮＡのＡＤＡＲ結合コア領域に相当し、また記号「Ｎα」と記号「Ｎχ」が、記号「Ｎβ−Ｎδ」で表されるループ構造を挟んだ２本の一本鎖からなるステムループ構造からなる不完全二本鎖相補ＲＮＡ構造から構成され、このＲＮＡ構造はアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成され、ループ構造は４〜８個の同種または異種の塩基から構成され、また各一本鎖のＲＮＡ塩基配列は、２０〜３０個の同種または異種の塩基からなり、さらにその二本鎖は単数もしくは複数のミスマッチ塩基対を有する塩基配列であるとともに、その一方の一本鎖の末端はガイド側分断領域、また別の一本鎖の末端はコア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分に結合した構造になっている。）
で表される５’−標的編集ガイドＲＮＡをそれぞれ反応させて式［ＸＩＩＩＡ］：
【化４１】
2017010556.tif 000316
で表される５’−標的ＲＮＡ−３’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体または式［ＸＶＩＩＩＡ］：
【化４２】
2017010556.tif 000317
で表される３’−標的ＲＮＡ−５’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体を得、得られた複合体の標的編集部位（＊印）に存在する標的塩基アデノシン（Ａ）が二本鎖特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）の作用によりＡ−Ｉ編集によりイノシン（Ｉ）に変換された式［ＸＩＶＡ］：
【化４３】
2017010556.tif 000318
で表される５’−編集標的ＲＮＡまたは式［ＸＩＸＡ］：
【化４４】
2017010556.tif 000319
で表される３’−編集標的ＲＮＡをそれぞれ得ることを特徴とする請求項１又は２に記載の部位特異的ＲＮＡ変異導入方法。
【請求項４】
請求項３に記載の部位特異的ＲＮＡ変異導入方法であって、前記５’−標的ＲＮＡが式［ＸＸＸＩＡ］：
【化９９】
2017010556.tif 000320
で表される５’−標的ＲＮＡと、前記３’−標的編集ガイドＲＮＡが式［ＸＸＸＩＩＡ］：
【化１００】
2017010556.tif 000321
で表される３’−標的編集ガイドＲＮＡを反応させて式［ＸＸＸＩＩＩＡ］：
【化１０１】
2017010556.tif 000322
で表される５’−標的ＲＮＡ−３’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体を得、得られた複合体にＡＤＡＲを作用させてＲＮＡ編集能を誘導して式［ＸＸＸＩＶＡ］：
【化１０２】
2017010556.tif 000323
で表される５’−編集標的ＲＮＡを得ることにより、標的塩基アデノシン（Ａ）をＡ−Ｉ編集してイノシン（Ｉ）に変換したことからなる部位特異的ＲＮＡ変異導入方法。
【請求項５】
請求項３に記載の部位特異的ＲＮＡ変異導入方法であって、前記３’−標的ＲＮＡが式［ＸＸＸＶＩＡ］：
【化１１１】
2017010556.tif 000324
で表される３’−標的ＲＮＡと、前記５’−標的編集ガイドＲＮＡが式［ＸＸＸＶＩＩＡ］：
【化１１２】
2017010556.tif 000325
で表される５’−標的編集ガイドＲＮＡを反応させて式［ＸＸＸＶＩＩＩＡ］：
【化１１３】
2017010556.tif 000326
で表される３’−標的ＲＮＡ−５’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体を得、得られた複合体の標的塩基アデノシン（Ａ）をＡＤＡＲの作用によりＡ−Ｉ編集してイノシン（Ｉ）に変換した式［ＸＸＸＩＸＡ］：
【化１１４】
2017010556.tif 000327
で表される３’−編集標的ＲＮＡを得ることからなる部位特異的ＲＮＡ変異導入方法。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の部位特異的ＲＮＡ変異導入方法であって、ｎが３であり、ｐが０である部位特異的ＲＮＡ変異導入方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の部位特異的ＲＮＡ変異導入方法であって、前記ＡＤＡＲの作用が生体内ＡＤＡＲ機構によることを特徴とする部位特異的ＲＮＡ変異導入方法。
【請求項８】
式［ＬＩＡ］：
【化１２３】
2017010556.tif 000328
で表される３’−標的編集ガイドＲＮＡまたは式［ＬＶＩＡ］：
【化１２４】
2017010556.tif 000329
（式中、アンチセンス領域は、末端側標的相補領域と、標的誘導部位（Ｘ）と、コア側標的認識領域のＸ隣接部分領域とからなり、
末端側標的認識領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、その塩基数が、４０〜２０個の塩基配列を意味し、
標的誘導部位の塩基（Ｘ）は、塩基シトシン、グアニンまたはアデニンのいずれか１種から選ばれる標的ＲＮＡの標的部位の塩基（Ａ）とミスマッチとなる塩基であり、
コア側標的認識領域のＸ隣接部分領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であって、塩基数が、１〜１０個の塩基配列からなり、標的ＲＮＡのガイド側標的相補領域の塩基配列とそれぞれ塩基対合して塩基対を構築し、
ＡＤＡＲ結合領域は、アンチセンス領域のコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域に結合するＡＤＡＲ隣接部分領域と、ＡＤＡＲ結合コア領域と、ガイド側分断領域とからなり、
コア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を構成し、その塩基数が、１０個以下の塩基配列からなる塩基領域を意味し、ガイド側分断領域の対応構成塩基とそれぞれ塩基対合して塩基対を構成し、
ＡＤＡＲ結合コア領域は、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列から構成されるステムループ構造をした不完全二本鎖ＲＮＡ構造からなり、そのループ構造を挟んだ２本の一本鎖ＲＮＡ塩基配列のうち、その１方の一本鎖の末端はコア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域と、またもう一方の一本鎖の末端はガイド側分断領域と結合した塩基配列を構成し、
ガイド側分断領域は、ＡＤＡＲ結合領域のコア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域と塩基数が同数であってそれぞれ塩基対を形成している構造である）
で表される５’−標的編集ガイドＲＮＡから選ばれる標的編集ガイドＲＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載の標的編集ガイドＲＮＡであって、前記３’−標的編集ガイドＲＮＡが３’−標的編集ガイドＲＮＡ［ＩＩＡ］：
【化１２７】
2017010556.tif 000330
（式中、Ｘはシトシン、グアニンまたはアデニンであって、記号「ｃＮ１ｃＮ２……ｃＮｐ−１ｃＮｐ」は、３’−標的編集ガイドＲＮＡのガイド側分断領域に相当し、記号「ｃＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、記号「ｐ」は、１０以下を意味し、
記号「ｄＮ１・・ｄＮｍ」は、３’−標的編集ガイドＲＮＡの末端側標的認識領域に相当し、記号「ｄＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「ｍ」は前記と同じ意味を有し、４０〜２０の塩基数を意味し、標的ＲＮＡの末端側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であり、かつ、対応する塩基同士は塩基対を形成し、
記号「ｅＮ１ｅＮ２・・ｅＮｎ＋ｐ」は、標的編集ガイドＲＮＡのコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域とＡＤＡＲ隣接部分領域の塩基配列に相当し、記号「ｅＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「ｎ」はコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域の塩基配列の塩基数、記号「ｐ」はコア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域の塩基数を表し、Ｘ隣接部分領域の塩基配列は複合体化の際に標的ＲＮＡのガイド側標的相補領域の塩基配列と塩基対を形成し、またガイド側分断領域の塩基配列はＡＤＲ隣接部分領域の塩基配列と塩基対を形成し、
記号「ＮαＮβ−ＮδＮχ」は、標的編集ガイドＲＮＡのＡＤＡＲ結合コア領域に相当し、また記号「Ｎα」と記号「Ｎχ」が、記号「Ｎβ−Ｎδ」で表されるループ構造を挟んだ２本の一本鎖からなるステムループ構造からなる不完全二本鎖相補ＲＮＡ構造から構成され、このＲＮＡ構造はアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成され、ループ構造は４〜８個の同種または異種の塩基から構成され、また各一本鎖のＲＮＡ塩基配列は、２０〜３０個の同種または異種の塩基からなり、さらにその二本鎖は単数もしくは複数のミスマッチ塩基対を有する塩基配列であるとともに、その一方の一本鎖の末端はガイド側分断領域、また別の一本鎖の末端はコア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分に結合した構造になっている。）
であり、または前記５’−標的編集ガイドＲＮＡが５’−標的編集ガイドＲＮＡ［ＶＩＩＡ］：
【化１２８】
2017010556.tif 000331
（式中、Ｘはシトシン、グアニンまたはアデニンであって、記号「ｋＮ１ｋＮ２……ｋＮｐ−１ｋＮｐ」は、３’−標的編集ガイドＲＮＡのガイド側分断領域に相当し、記号「ｋＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成される塩基配列であり、記号「ｐ」は、１０以下を意味し、
記号「ｈＮ１・・ｈＮｍ」は、３’−標的編集ガイドＲＮＡの末端側標的認識領域に相当し、記号「ｈＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「ｍ」は前記と同じ意味を有し、４０〜２０の塩基数を意味し、標的ＲＮＡの末端側標的相補領域の塩基配列の塩基数と同数であり、かつ、対応する塩基同士は塩基対を形成し、
記号「ｊＮ１ｊＮ２・・ｊＮｎ＋ｐ」は、標的編集ガイドＲＮＡのコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域とＡＤＡＲ隣接部分領域の塩基配列に相当し、記号「ｊＮ」がアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基からなる塩基配列を意味し、記号「ｎ」はコア側標的認識領域のＸ隣接部分領域の塩基配列の塩基数、記号「ｐ」はコア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分領域の塩基数を表し、Ｘ隣接部分領域の塩基配列は複合体化の際に標的ＲＮＡのガイド側標的相補領域の塩基配列と塩基対を形成し、またガイド側分断領域の塩基配列はＡＤＲ隣接部分領域の塩基配列と塩基対を形成し、
記号「ＮαＮβ−ＮδＮχ」は、標的編集ガイドＲＮＡのＡＤＡＲ結合コア領域に相当し、また記号「Ｎα」と記号「Ｎχ」が、記号「Ｎβ−Ｎδ」で表されるループ構造を挟んだ２本の一本鎖からなるステムループ構造からなる不完全二本鎖相補ＲＮＡ構造から構成され、このＲＮＡ構造はアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルから選ばれる同種および異種の塩基から構成され、ループ構造は４〜８個の同種または異種の塩基から構成され、また各一本鎖のＲＮＡ塩基配列は、２０〜３０個の同種または異種の塩基からなり、さらにその二本鎖は単数もしくは複数のミスマッチ塩基対を有する塩基配列であるとともに、その一方の一本鎖の末端はガイド側分断領域、また別の一本鎖の末端はコア側標的認識領域のＡＤＡＲ隣接部分に結合した構造になっている。）であることを特徴とする標的編集ガイドＲＮＡ。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の標的編集ガイドＲＮＡであって、前記３’−標的編集ガイドＲＮＡが３’−標的編集ガイドＲＮＡ［ＸＸＩＩＡ］：
【化１３５】
2017010556.tif 000332
であり、前記５’−標的編集ガイドＲＮＡが５’−標的編集ガイドＲＮＡ［ＸＸＶＩＩＡ］：
【化１３６】
2017010556.tif 000333
であることを特徴とする標的編集ガイドＲＮＡ。
【請求項１１】
請求項１０に記載の標的編集ガイドＲＮＡであって、ｐが０であり、ｎが３である標的編集ガイドＲＮＡ。
【請求項１２】
請求項８から１１のいずれか１項に記載の標的編集ガイドＲＮＡと標的ＲＮＡとを複合体化し、ＡＤＡＲの作用によりＡ−Ｉ編集を誘導して該標的ＲＮＡ部分の標的塩基アデノシンをイノシンに変換するための標的ＲＮＡ−標的編集ガイドＲＮＡ複合体であって、前記５’−標的ＲＮＡ−３’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体が、５’−標的ＲＮＡ−３’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体［ＬＩＩＡ］：
【化１４３】
2017010556.tif 000334
または５’−標的ＲＮＡ−３’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体［ＬＩＩＢ］：
【化１４４】
2017010556.tif 000335
または５’−標的ＲＮＡ−３’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体［ＬＸＩＡ］：
【化１４５】
2017010556.tif 000336
または５’−標的ＲＮＡ−３’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体［ＬＸＩＢ］：
【化１４６】
2017010556.tif 000337
であること、また前記３’−標的ＲＮＡ−５’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体が３’−標的ＲＮＡ−５’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体［ＬＶＩＩＡ］：
【化１４７】
2017010556.tif 000338
または３’−標的ＲＮＡ−５’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体［ＬＶＩＩＢ］：
【化１４８】
2017010556.tif 000339
または３’−標的ＲＮＡ−５’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体［ＬＸＶＩＡ］：
【化１４９】
2017010556.tif 000340
または３’−標的ＲＮＡ−５’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体［ＬＸＶＩＢ］：
【化１５０】
2017010556.tif 000341
であることを特徴とする標的ＲＮＡ−標的編集ガイドＲＮＡ複合体。
【請求項１３】
請求項１２に記載の標的ＲＮＡ−標的編集ガイドＲＮＡ複合体であって、前記５’−標的ＲＮＡ−３’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体が５’−標的ＲＮＡ−３’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体［ＸＸＩＩＩＡ］：
【化１５９】
2017010556.tif 000342
若しくは５’−標的ＲＮＡ−３’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体［ＸＸＸＩＩＩＡ］：
【化１６０】
2017010556.tif 000343
であること、または前記３’−標的ＲＮＡ−５’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体が３’−標的ＲＮＡ−５’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体［ＸＸＶＩＩＩＡ］：
【化１６１】
2017010556.tif 000344
若しくは３’−標的ＲＮＡ−５’−標的編集ガイドＲＮＡ複合体［ＸＸＸＶＩＩＩＡ］：
【化１６２】
2017010556.tif 000345
であることを特徴とする標的ＲＮＡ−標的編集ガイドＲＮＡ複合体。
【請求項１４】
請求項１３に記載の標的ＲＮＡ−標的編集ガイドＲＮＡ複合体であって、ｐが０であり、ｎが３である標的ＲＮＡ−標的編集ガイドＲＮＡ複合体。
【請求項１５】
グルタミン酸受容体ｍＲＮＡ前駆体（ＧｌｕＲ−Ｂ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）または編集に必要な領域のみを残して構築された人工編集基質（ｍｉｎｉＳＬ  ＲＮＡ）を基盤として、この編集基質のＡＤＡＲ結合領域だけを残し、特定位置で分断することによって得られた請求項８から１１のいずれか１項に記載の標的編集ガイドＲＮＡ。
【国際調査報告】
2017010556.tif 000346
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