(57)【要約】  脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を含んだ融合蛋白質が開示されている。該融蛋白質は，ＢＤＮＦと特定範囲のヒト抗トランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であり，血中に投与されたＢＤＮＦが血液脳関門通過することを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor，ＢＤＮＦ）と抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，以下の（１）〜（１４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）ＣＤＲ１に配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号１０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（２）ＣＤＲ１に配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１３若しくは配列番号１４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含み，且つ及びＣＤＲ３に配列番号１５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列ものである，；
（３）ＣＤＲ１に配列番号１６又は配列番号１７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１８若しくは配列番号１９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号２０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（４）ＣＤＲ１に配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号２３若しくは配列番号２４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号２５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（５）ＣＤＲ１に配列番号２６又は配列番号２７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号２８若しくは配列番号２９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号３０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（６）ＣＤＲ１に配列番号３１又は配列番号３２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号３３若しくは配列番号３４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号３５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（７）ＣＤＲ１に配列番号３６又は配列番号３７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号４０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（８）ＣＤＲ１に配列番号４１又は配列番号４２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号４３若しくは配列番号４４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号４５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（９）ＣＤＲ１に配列番号４６又は配列番号４７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号４８若しくは配列番号４９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号５０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１０）ＣＤＲ１に配列番号５１又は配列番号５２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号５３若しくは配列番号５４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号５５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１１）ＣＤＲ１に配列番号５６又は配列番号５７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号５８若しくは配列番号５９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号６０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１２）ＣＤＲ１に配列番号６１又は配列番号６２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号６３若しくは配列番号６４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号６５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１３）ＣＤＲ１に配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号６８若しくは配列番号６９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号７０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；及び
（１４）ＣＤＲ１に配列番号７１又は配列番号７２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号７３若しくは配列番号７４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号７５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１のＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，以下の（１）〜（１４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）ＣＤＲ１に配列番号６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（２）ＣＤＲ１に配列番号１１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（３）ＣＤＲ１に配列番号１６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号２０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（４）ＣＤＲ１に配列番号２１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号２３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号２５のアミノ酸配列，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（５）ＣＤＲ１に配列番号２６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号２８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号３０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（６）ＣＤＲ１に配列番号３１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号３３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号３５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（７）ＣＤＲ１に配列番号３６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号３８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号４０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（８）ＣＤＲ１に配列番号４１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号４３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号４５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（９）ＣＤＲ１に配列番号４６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号４８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号５０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（１０）ＣＤＲ１に配列番号５１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号５３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号５５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（１１）ＣＤＲ１に配列番号５６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号５８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号６０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（１２）ＣＤＲ１に配列番号６１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号６３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号６５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（１３）ＣＤＲ１に配列番号６６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号６８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号７０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；及び
（１４）ＣＤＲ１に配列番号７１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号７３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号７５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列。
【請求項３】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の軽鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列が，請求項１又は２の何れかの軽鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列とそれぞれ８０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
【請求項４】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の軽鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列が，請求項１又は２の何れかの軽鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列とそれぞれ９０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
【請求項５】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，請求項１又は２の何れかの軽鎖のＣＤＲの少なくとも１つにおいて，これを構成するアミノ酸配列中１〜５個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
【請求項６】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，請求項１又は２の何れかの軽鎖のＣＤＲの少なくとも１つにおいて，これを構成するアミノ酸配列中，１〜３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
【請求項７】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，以下の（１）〜（１４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）ＣＤＲ１に配列番号７６又は配列番号７７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号７８又は配列番号７９のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号８０又は配列番号８１のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（２）ＣＤＲ１に配列番号８２又は配列番号８３のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号８４又は配列番号８５のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号８６又は配列番号８７のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（３）ＣＤＲ１に配列番号８８又は配列番号８９のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号９０又は配列番号９１のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号９２又は配列番号９３のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（４）ＣＤＲ１に配列番号９４又は配列番号９５のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号９６又は配列番号９７のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号９８又は配列番号９９のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（５）ＣＤＲ１に配列番号１００又は配列番号１０１のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１０２又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１０４又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（６）ＣＤＲ１に配列番号１０６又は配列番号１０７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１０８のアミノ酸配列又は配列番号２６６のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１０９又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（７）ＣＤＲ１に配列番号１１１又は配列番号１１２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１１３又は配列番号１１４のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１１５又は配列番号１１６のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（８）ＣＤＲ１に配列番号１１７又は配列番号１１８のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１１９のアミノ酸配列又は配列番号２６７のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１２０又は配列番号１２１のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（９）ＣＤＲ１に配列番号１２２又は配列番号１２３のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１２４又は配列番号１２５のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１２６又は配列番号１２７のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１０）ＣＤＲ１に配列番号１２８又は配列番号１２９のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１３０又は配列番号１３１のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１３２又は配列番号１３３のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１１）ＣＤＲ１に配列番号１３４又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１３６又は配列番号１３７のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１３８又は配列番号１３９のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１２）ＣＤＲ１に配列番号１４０又は配列番号１４１のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１４２又は配列番号１４３のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１４４又は配列番号１４５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１３）ＣＤＲ１に配列番号１４６又は配列番号１４７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１４８又は配列番号１４９のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１５０又は配列番号１５１のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；及び
（１４）ＣＤＲ１に配列番号１５２又は配列番号１５３のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１５４又は配列番号１５５のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１５６又は配列番号１５７のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列。
【請求項８】
請求項７のＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，以下の（１）〜（１４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）ＣＤＲ１に配列番号７６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号７８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号８０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（２）ＣＤＲ１に配列番号８２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号８４のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号８６のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（３）ＣＤＲ１に配列番号８８のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号９０のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号９２のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（４）ＣＤＲ１に配列番号９４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号９６のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号９８のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（５）ＣＤＲ１に配列番号１００のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１０２のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１０４のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（６）ＣＤＲ１に配列番号１０６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１０８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１０９のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（７）ＣＤＲ１に配列番号１１１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１１３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１１５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（８）ＣＤＲ１に配列番号１１７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１１９のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１２０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（９）ＣＤＲ１に配列番号１２２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１２４のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１２６のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（１０）ＣＤＲ１に配列番号１２８のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１３０のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１３２のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（１１）ＣＤＲ１に配列番号１３４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１３６のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１３８アミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（１２）ＣＤＲ１に配列番号１４０のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１４２のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１４４のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（１３）ＣＤＲ１に配列番号１４６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１４８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１５０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；及び
（１４）ＣＤＲ１に配列番号１５２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１５４のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１５６のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列。
【請求項９】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の重鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列が，請求項７又は８の何れかの重鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列とそれぞれ８０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
【請求項１０】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の重鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列が，請求項７又は８の何れかの重鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列とそれぞれ９０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
【請求項１１】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，請求項７又は８の何れかの重鎖のＣＤＲの少なくとも１つにおいて，これを構成するアミノ酸配列中，１〜５個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
【請求項１２】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，請求項７又は８の何れかの重鎖のＣＤＲの少なくとも１つにおいて，これを構成するアミノ酸配列中，１〜３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
【請求項１３】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が，以下の（１）〜（１４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号１０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号７６又は配列番号７７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号７８又は配列番号７９のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号８０又は配列番号８１のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（２）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１３若しくは配列番号１４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号１５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号８２又は配列番号８３のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号８４又は配列番号８５のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号８６又は配列番号８７のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（３）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１６又は配列番号１７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１８若しくは配列番号１９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号２０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号８８又は配列番号８９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号９０又は配列番号９１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号９２又は配列番号９３のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（４）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号２１又は配列番号２２を，ＣＤＲ２として配列番号２３若しくは配列番号２４のアミノ酸配列，又はＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号２５のアミノ酸配列のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号９４又は配列番号９５のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号９６又は配列番号９７のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号９８又は配列番号９９のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（５）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号２６又は配列番号２７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号２８若しくは配列番号２９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号３０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１００又は配列番号１０１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０２又は配列番号１０３のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１０４又は配列番号１０５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（６）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号３１又は配列番号３２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号３３若しくは配列番号３４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号３５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１０６又は配列番号１０７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０８又は配列番号２６６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１０９又は配列番号１１０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（７）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号３６又は配列番号３７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号４０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１１１又は配列番号１１２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１１３又は配列番号１１４のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１１５又は配列番号１１６のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
（８）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号４１又は配列番号４２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号４３若しくは配列番号４４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号４５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域がＣＤＲ１として配列番号１１７又は配列番号１１８のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１１９又は配列番号２６７のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２０又は配列番号１２１のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（９）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号４６又は配列番号４７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号４８若しくは配列番号４９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号５０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１２２又は配列番号１２３のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１２４又は配列番号１２５のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２６又は配列番号１２７のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１０）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号５１又は配列番号５２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号５３若しくは配列番号５４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号５５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１２８又は配列番号１２９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１３０又は配列番号１３１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１３２又は配列番号１３３のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１１）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号５６又は配列番号５７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号５８若しくは配列番号５９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号６０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１３４又は配列番号１３５のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１３６又は配列番号１３７のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１３８又は配列番号１３９にアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１２）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号６１又は配列番号６２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号６３若しくは配列番号６４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号６５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１４０又は配列番号１４１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１４２又は配列番号１４３のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１４４又は配列番号１４５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１３）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号６８若しくは配列番号６９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号７０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１４６又は配列番号１４７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１４８又は配列番号１４９のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１５０又は配列番号１５１のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；及び
（１４）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号７１又は配列番号７２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号７３若しくは配列番号７４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号７５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１５２又は配列番号１５３のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５４又は配列番号１５５のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１５６又は配列番号１５７のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの。
【請求項１４】
請求項１３のＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が，以下の（１）〜（１４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号６，ＣＤＲ２に配列番号８，及びＣＤＲ３に配列番号１０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号７６，ＣＤＲ２に配列番号７８，及びＣＤＲ３に配列番号８０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（２）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１１，ＣＤＲ２に配列番号１３，及びＣＤＲ３に配列番号１５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号８２，ＣＤＲ２に配列番号８４，及びＣＤＲ３に配列番号８６のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（３）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１６，ＣＤＲ２に配列番号１８，及びＣＤＲ３に配列番号２０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号８８，ＣＤＲ２に配列番号９０，及びＣＤＲ３に配列番号９２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（４）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号２１，ＣＤＲ２に配列番号２３，及びＣＤＲ３に配列番号２５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号９４，ＣＤＲ２に配列番号９６，及びＣＤＲ３に配列番号９８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（５）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号２６，ＣＤＲ２に配列番号２８，及びＣＤＲ３に配列番号３０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１００，ＣＤＲ２に配列番号１０２，及びＣＤＲ３に配列番号１０４のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（６）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号３１，ＣＤＲ２に配列番号３３，及びＣＤＲ３に配列番号３５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１０６，ＣＤＲ２に配列番号１０８，及びＣＤＲ３に配列番号１０９のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（７）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号３６，ＣＤＲ２に配列番号３８，及びＣＤＲ３に配列番号４０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１１１，ＣＤＲ２に配列番号１１３，及びＣＤＲ３に配列番号１１５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（８）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号４１，ＣＤＲ２に配列番号４３，及びＣＤＲ３に配列番号４５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１１７，ＣＤＲ２に配列番号１１９，及びＣＤＲ３に配列番号１２０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（９）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号４６，ＣＤＲ２に配列番号４８，及びＣＤＲ３に配列番号５０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１２２，ＣＤＲ２に配列番号１２４，及びＣＤＲ３に配列番号１２６のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１０）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号５１，ＣＤＲ２に配列番号５３，及びＣＤＲ３に配列番号５５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１２８，ＣＤＲ２に配列番号１３０，及びＣＤＲ３に配列番号１３２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１１）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号５６，ＣＤＲ２に配列番号５８，及びＣＤＲ３に配列番号６０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１３４，ＣＤＲ２に配列番号１３６，及びＣＤＲ３に配列番号１３８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１２）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号６１，ＣＤＲ２に配列番号６３，及びＣＤＲ３に配列番号６５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１４０，ＣＤＲ２に配列番号１４２，及びＣＤＲ３に配列番号１４４のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１３）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号６６，ＣＤＲ２に配列番号６８，及びＣＤＲ３に配列番号７０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１４６，ＣＤＲ２に配列番号１４８，及びＣＤＲ且つ３に配列番号１５０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；及び
（１４）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号７１，ＣＤＲ２に配列番号７３，及びＣＤＲ３に配列番号７５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１５２，ＣＤＲ２に配列番号１５４，及びＣＤＲ３に配列番号１５６のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの。
【請求項１５】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖及び重鎖のそれぞれにおけるＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列が，請求項１３又は１４の軽鎖と重鎖の組合せの何れかにおける軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
【請求項１６】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖及び重鎖のそれぞれにおけるＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列が，請求項１３又は１４の軽鎖と重鎖の組合せの何れかにおける軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
【請求項１７】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，請求項１３又は１４の軽鎖と重鎖の組合せの何れかにおける軽鎖及び重鎖のそれぞれにつき，ＣＤＲの少なくとも１つにおいて，これを構成するアミノ酸配列中１〜５個が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
【請求項１８】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，請求項１３又は１４の軽鎖と重鎖の組合せの何れかにおける軽鎖及び重鎖のそれぞれにつき，ＣＤＲの少なくとも１つにおいて，これを構成するアミノ酸配列中１〜３個が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
【請求項１９】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖の可変領域が，配列番号１５８，配列番号１５９，配列番号１６０，配列番号１６１，配列番号１６２，及び配列番号１６３のアミノ酸配列からなる群より選ばれる何れかのアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，配列番号１６６，配列番号１６７，配列番号１６８，配列番号１６９，配列番号１７０，及び配列番号１７１のアミノ酸配列からなる群より選ばれる何れかのアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
【請求項２０】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖の可変領域が，配列番号１７４，配列番号１７５，配列番号１７６，配列番号１７７，配列番号１７８，及び配列番号１７９のアミノ酸配列からなる群より選ばれる何れかのアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，配列番号１８２，配列番号１８３，配列番号１８４，配列番号１８５，配列番号１８６，及び配列番号１８７のアミノ酸配列からなるより選ばれる何れかのアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
【請求項２１】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖の可変領域が，配列番号１９０，配列番号１９１，配列番号１９２，配列番号１９３，配列番号１９４，及び配列番号１９５のアミノ酸配列からなる群より選ばれる何れかのアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，配列番号２０４，配列番号２０５，配列番号２０６，配列番号２０７，配列番号２０８，及び配列番号２０９のアミノ酸配列からなる群より選ばれる何れかのアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
【請求項２２】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，次の（１ａ）〜（３ｄ）からなる群より選ばれるものである融合蛋白質：
（１ａ）該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１６３のアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が配列番号１７１のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（２ａ）該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１７９のアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が配列番号１８７のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ａ）該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１９１のアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が配列番号２０５のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｂ）該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１９３のアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が配列番号２０５のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｃ）該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１９４のアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が配列番号２０５のアミノ酸配列を含んでなるもの，及び
（３ｄ）該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１９５のアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が配列番号２０５のアミノ酸配列を含んでなるもの。
【請求項２３】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，次の（１ｂ）〜（３ｌ）からなる群より選ばれるものである融合蛋白質：
（１ｂ）該抗体の軽鎖が配列番号１６４のアミノ酸配列を含んでなり，且つ該抗体の重鎖が配列番号１７２のアミノ酸配列を含むもの，
（２ｂ）該抗体の軽鎖が配列番号１８０のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号１８８のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｅ）該抗体の軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｆ）該抗体の軽鎖が配列番号１９８のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｇ）該抗体の軽鎖が配列番号２００のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｈ）該抗体の軽鎖が配列番号２０２のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｉ）該抗体の軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｊ）該抗体の軽鎖が配列番号１９８のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｋ）該抗体の軽鎖が配列番号２００のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列を含んでなるもの，及び
（３ｌ）該抗体の軽鎖が配列番号２０２のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列を含んでなるもの。
【請求項２４】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，請求項１９〜２３の何れかの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列に関して，それぞれ８０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
【請求項２５】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，請求項１９〜２３の何れかの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列に関して，それぞれ９０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
【請求項２６】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，請求項１９〜２３の何れかの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中，１〜１０個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
【請求項２７】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，請求項１９〜２３の何れかの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中，１〜３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
【請求項２８】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，請求項１９〜２３の何れかの重鎖の可変領域のアミノ酸配列中，１〜１０個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
【請求項２９】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，請求項１９〜２３の何れかの重鎖の可変領域のアミノ酸配列中，１〜３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
【請求項３０】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，請求項１９〜２３の何れかの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列の各々を構成するアミノ酸のうち，それぞれ１〜１０個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
【請求項３１】
ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，請求項１９〜２３の何れかの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列の各々を構成するアミノ酸のうち，それぞれ１〜３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
【請求項３２】
請求項１〜３１の何れかの融合蛋白質であって，該ＢＤＮＦが，該抗体の軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に結合したものである，融合蛋白質。
【請求項３３】
請求項３２の融合蛋白質であって，該ＢＤＮＦが，該抗体の軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，直接又はリンカーを介して結合したものである，融合蛋白質。
【請求項３４】
該リンカーが，１〜５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである，請求項３３の融合蛋白質。
【請求項３５】
該リンカーが，グリシン，セリン，アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ），配列番号３，配列番号４，配列番号５，及びこれらのアミノ酸配列が１〜１０個連続してなる配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである，請求項３３の融合蛋白質。
【請求項３６】
請求項１〜３１の何れかの融合蛋白質であって，該ＢＤＮＦが，該抗体の重鎖のＣ末端側又はＮ末端側に結合したものである，融合蛋白質。
【請求項３７】
請求項３６の融合蛋白質であって，該ＢＤＮＦが，該抗体の重鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，直接又はリンカーを介して結合したものである，融合蛋白質。
【請求項３８】
該リンカーが，１〜５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである，請求項３７の融合蛋白質。
【請求項３９】
該リンカーが，アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ），配列番号３，配列番号４，及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである，請求項３７の融合蛋白質。
【請求項４０】
該ＢＤＮＦがヒトＢＤＮＦである，請求項１〜３９の何れかの融合蛋白質。
【請求項４１】
該ヒトＢＤＮＦが，配列番号２４７のアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列を含んでなるものであるか，または配列番号２４７で表される蛋白質と同質の機能を有するものである，請求項４０の融合蛋白質。
【請求項４２】
請求項１〜４１の何れかの融合蛋白質であって，ヒトトランスフェリン受容体の細胞外領域及びサルトランスフェリン受容体の細胞外領域の双方に対して親和性を有するものである，融合蛋白質。
【請求項４３】
請求項４２の融合蛋白質であって，該抗トランスフェリン受容体抗体が，ヒトトランスフェリン受容体の細胞外領域との解離定数が１×１０−８Ｍ以下であり，サルトランスフェリン受容体の細胞外領域との解離定数が５×１０−８Ｍ以下のものである，融合蛋白質。
【請求項４４】
請求項４０の融合蛋白質であって，次の（１）〜（４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が配列番号１６４のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖がそのＣ末端側で，リンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，全体として配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有するもの；
（２）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が配列番号１８０のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖がそのＣ末端側で，リンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，全体として配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有するもの；及び
（３）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号１９６のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，リンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，全体として配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有するものである，融合蛋白質。
（４）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号１９６のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，全体として配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有するものである，融合蛋白質。
【請求項４５】
該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が抗原結合性断片である，請求項１〜４３の何れかに記載の融合蛋白質。
【請求項４６】
抗原結合性断片のＮ末端側に直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，請求項４５に記載の融合蛋白質。
【請求項４７】
該抗原結合性断片が一本鎖抗体である，請求項４５又は４６に記載の融合蛋白質。
【請求項４８】
該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域が，軽鎖と重鎖を結合するリンカー配列を介して結合したものである，請求項４７に記載の融合蛋白質。
【請求項４９】
該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域のＣ末端側に，軽鎖と重鎖を結合するリンカー配列を介して，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の重鎖可変領域が結合したものである，請求項４８に記載の融合蛋白質。
【請求項５０】
該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の重鎖可変領域のＣ末端側に，軽鎖と重鎖を結合するリンカー配列を介して，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域が結合したものである，請求項４８に記載の融合蛋白質。
【請求項５１】
該軽鎖と重鎖を結合するリンカー配列が，２〜５０個のアミノ酸残基からなるものである，請求項４８〜５０に記載の融合蛋白質。
【請求項５２】
該軽鎖と重鎖を結合するリンカー配列が，アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ），配列番号３，配列番号４，配列番号５，及びこれらのアミノ酸配列が２〜１０個連続してなる配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項５１に記載の融合蛋白質。
【請求項５３】
一本鎖抗体が配列番号２０５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号１９１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体である，請求項４７〜５２に記載の融合蛋白質。
【請求項５４】
一本鎖抗体が配列番号２５７のアミノ酸配列からなる一本鎖抗体であり，そのＮ末端側に直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，請求項５３に記載の融合蛋白質。
【請求項５５】
一本鎖抗体が配列番号２５７のアミノ酸配列からなる一本鎖抗体であり，そのＮ末端側にリンカーを介してヒトプロＢＤＮＦが結合した，配列番号２５９のアミノ酸配列を含んでなる，請求項５４に記載の融合蛋白質。
【請求項５６】
一本鎖抗体が配列番号２５７のアミノ酸配列からなる一本鎖抗体であり，そのＮ末端側にリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合した，配列番号２６０のアミノ酸配列を含んでなる，請求項５４に記載の融合蛋白質。
【請求項５７】
該抗原結合性断片が，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，又はＦ（ａｂ’）の何れかのものである，請求項４５又は４６に記載の融合蛋白質。
【請求項５８】
Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，又はＦ（ａｂ’）の何れかの重鎖のＮ末端側に直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，請求項５７に記載の融合蛋白質。
【請求項５９】
軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列からなり，且つ重鎖が配列番号２６１のアミノ酸配列からなるＦａｂ重鎖であり，該重鎖のＮ末端側に直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，請求項５８に記載の融合蛋白質。
【請求項６０】
軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列からなり，且つＦａｂ重鎖とそのＮ末端側に直接又はリンカーを介して結合したヒトプロＢＤＮＦとからなる部分が配列番号２６３のアミノ酸配列からなる，請求項５９に記載の融合蛋白質。
【請求項６１】
軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列からなり，且つＦａｂ重鎖とそのＮ末端側に直接又はリンカーを介して結合したヒトＢＤＮＦとからなる部分が配列番号２６４のアミノ酸配列からなる，請求項５９に記載の融合蛋白質。
【請求項６２】
請求項１〜６１の何れかの融合蛋白質をコードする，ＤＮＡ断片。
【請求項６３】
請求項６２のＤＮＡ断片を組み込んでなる，発現ベクター。
【請求項６４】
請求項６３の発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
【請求項６５】
ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療のための薬剤であって，請求項１〜６１の何れかの融合蛋白質を有効成分として含む，薬剤。
【請求項６６】
該疾患又は障害が，神経系の疾患又は障害である請求項６５の薬剤。
【請求項６７】
該神経系の疾患又は障害が，神経変性疾患，うつ病，統合失調症，てんかん，自閉症，Ｒｅｔｔ症候群，Ｗｅｓｔ症候群，新生児痙攣，認知症に伴う問題行動，不安症，疼痛，ヒルシュスブルング病又はレム睡眠行動障害である，請求項６６の薬剤。
【請求項６８】
該神経変性疾患が，脳神経変性疾患，脊髄変性疾患，網膜変性疾患又は末梢神経変性疾患である，請求項６７の薬剤。
【請求項６９】
該脳神経変性疾患が，脳神経系の神経変性疾患，脳虚血性疾患，外傷性脳損傷，白質脳症又は多発性硬化症である，請求項６８の薬剤。
【請求項７０】
該脳神経系の神経変性疾患が，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン病，レビー小体型認知症，ピック病，多系統萎縮症，進行性上行性麻痺又はダウン症候群である，請求項６９の薬剤。
【請求項７１】
ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療のための，請求項１〜６１の何れかの融合蛋白質の使用。
【請求項７２】
ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療用の医薬の製造のための，請求項１〜６１の何れかの融合蛋白質の使用。
【請求項７３】
ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療の方法であって，当該疾患又は傷害を有する患者の血中に，請求項１〜６１の何れかの融合蛋白質の治療上有効量を含有する医薬組成物を投与することを含むものである，方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，血液脳関門の通過を可能にしたＢＤＮＦに関し，より詳しくは抗ヒトトランスフェリン受容体抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質，その製造法及びその使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳室周囲器官（松果体，脳下垂体，最後野等）を含む幾つかの領域を除き脳の大半の組織に血液を供給する毛細血管は，筋肉等その他の組織に存在する毛細血管と異なり，その内皮を形成している内皮細胞同士が強固な細胞間接合によって密着し合っている。そのため，血液から脳への物質の受動輸送が妨げられ，例外はあるものの，脂溶性の高い物質，又は分子量が小さく（２００〜５００ダルトン以下）且つ生理ｐＨ付近において電気的に中性な物質以外，毛細血管から脳へ移行しにくい。このような，脳内の毛細血管内皮を介した，血液と脳の組織液との間での物質交換を制限する機構は，血液脳関門（Blood-Brain Barrier，ＢＢＢ）と呼ばれている。また，血液脳関門は，脳のみならず，脳及び脊髄を含む中枢神経系の組織液と血液との間の物質交換をも制限している。【０００３】
血液脳関門の存在により，中枢神経系の細胞の大半は，血中のホルモン，リンホカイン等の物質の濃度の変動等の影響を受けることなく，その生化学的な恒常性が保たれる。【０００４】
しかしながら，血液脳関門の存在は，薬剤開発のうえで問題を提起する。例えば，脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ; Brain-derived neurotrophic factor）は，ニューロトロフィンファミリーの一つであり，その二量体が標的細胞表面上にある高親和性ＢＤＮＦ受容体（ＴｒｋＢ；Tyrosine receptor kinase B, Tropomyosin receptor kinase B, 又はTropomyosin-related Kinase Bとも呼ばれる）に特異的に結合し，中枢および末梢神経系の細胞の分化，機能維持，シナプス形成，および損傷時の再生および修復などに重要な役割を果たすことが知られている（非特許文献１及び２）。このことから，ＢＤＮＦはアルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン病などの神経変性疾患，筋萎縮性側策硬化症などの脊髄変性疾患，この他，糖尿病性神経障害，脳虚血性疾患，発達障害，統合失調症，うつ病およびＲｅｔｔ症候群等，多様な疾患の治療剤としての開発が期待されている。（非特許文献３〜８）。しかしながら高分子蛋白質は一般的に血液脳関門を極めて通過し難いため，ＢＤＮＦ自身を中枢神経系の疾患治療薬または中枢神経系に作用する疾患治療薬として末梢投与により用いるには大きな障壁があった。【０００５】
中枢神経系において作用させるべきそのような蛋白質等の高分子物質に血液脳関門を通過させるための方法が，種々開発されている。例えば，神経成長因子の場合，これを内包させたリポソームを脳内毛細血管の内皮細胞の細胞膜と融合させることにより，血液脳関門を通過させる方法が試みられているが，実用化に至っていない（非特許文献９）。α−Ｌ−イズロニダーゼの場合，１回当たりに投与される酵素の量を増加させてその血中濃度を高めることにより，血液脳関門における酵素の受動輸送を高める試みが行われ，ハーラー症候群の動物モデルを用いて，この手法により中枢神経系（ＣＮＳ）の異常が緩解することが示されている（非特許文献１０）。【０００６】
また，血液脳関門を回避し，高分子物質を髄腔内又は脳内に直接投与する試みも行われている。例えば，ハーラー症候群（ムコ多糖症Ｉ型）の患者の髄腔内にヒトα−Ｌ−イズロニダーゼを投与する方法（特許文献１），ニーマン−ピック病の患者の脳室内にヒト酸スフィンゴミエリナーゼを投与する方法（特許文献２），ハンター症候群のモデル動物の脳室内にイズロン酸２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を投与する方法（特許文献３）が報告されている。このような手法によれば，確実に中枢神経系に薬剤を作用させることができると考えられる一方，侵襲性が極度に高いという問題がある。【０００７】
血液脳関門を通して高分子物質を脳内に到達させる方法として，脳内毛細血管の内皮細胞上に存在する膜蛋白質との親和性を持つように高分子物質を修飾する方法が種々報告されている。脳内毛細血管の内皮細胞上に存在する膜蛋白質としては，インスリン，トランスフェリン，インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ，ＩＧＦ−ＩＩ），ＬＤＬ，レプチン等の化合物に対する受容体が挙げられる。【０００８】
例えば，神経成長因子（ＮＧＦ）をインスリンとの融合蛋白質の形で合成し，インスリン受容体との結合を介してこの融合蛋白質に血液脳関門を通過させる技術が報告されている（特許文献４〜６）。また，神経成長因子（ＮＧＦ）を抗インスリン受容体抗体との融合蛋白質の形で合成し，インスリン受容体との結合を介してこの融合蛋白質に血液脳関門を通過させる技術が報告されている（特許文献４及び７）。【０００９】
脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を抗インスリン受容体抗体との融合蛋白質の形で合成し，この融合蛋白質をインスリン受容体との結合を介して血液脳関門を通過させる技術が報告されている（非特許文献１１）。神経成長因子（ＮＧＦ）をトランスフェリンとの融合蛋白質の形に合成し，トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）との結合を介してこの融合蛋白質に血液脳関門を通過させる技術が報告されている（特許文献８）。また，神経成長因子（ＮＧＦ）を抗トランスフェリン受容体抗体（抗ＴｆＲ抗体）との融合蛋白質の形で合成し，ＴｆＲとの結合を介してこの融合蛋白質に血液脳関門を通過させる技術が報告されている（特許文献４及び９）。また，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を付加した脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をマウス抗ラットトランスフェリン受容体抗体（抗ＴｆＲ抗体）とストレプトアビジン−ビオチンリンカーを介して化学的に結合したコンジュゲートの形で合成し，ラットにおいて，このコンジュゲートをＴｆＲとの結合を介して血液脳関門を通過させる技術が報告されている（非特許文献１２）。【００１０】
抗ＴｆＲ抗体を用いた技術について更にみると，抗ＴｆＲ抗体と結合させることにより薬剤に血液脳関門を通過させる技術において，ストレプトアビジンの場合は一本鎖抗体を使用できることが報告されている（非特許文献１３）。また，ヒトＴｆＲ（ｈＴｆＲ）との解離定数が比較的大きい抗ｈＴｆＲ抗体（低親和性抗ｈＴｆＲ抗体）が，薬剤をして血液脳関門を通過させる技術において好適に利用できることが報告されている（特許文献１０及び１１，非特許文献１４）。更には，ｈＴｆＲとの親和性がｐＨ依存的に変化する抗ＴｆＲ抗体が，薬剤に血液脳関門を通過させるためキャリアとして使用できることが報告されている（特許文献１２，非特許文献１５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特表２００７−５０４１６６号公報
【特許文献２】特表２００９−５２５９６３号公報
【特許文献３】特開２０１２−６２３１２号公報
【特許文献４】米国特許５１５４９２４号公報
【特許文献５】特開２０１１−１４４１７８号公報
【特許文献６】米国特許２００４／０１０１９０４号公報
【特許文献７】特表２００６−５１１５１６号公報
【特許文献８】特開Ｈ０６−２２８１９９号公報
【特許文献９】米国特許５９７７３０７号公報
【特許文献１０】ＷＯ２０１２／０７５０３７
【特許文献１１】ＷＯ２０１３／１７７０６２
【特許文献１２】ＷＯ２０１２／１４３３７９
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｏｓｅｓ  Ｖ．  Ｃｈａｏ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．  ４．  ２９９−３０９（２００３）
【非特許文献２】Ｔａｂａｋｍａｎ  Ｒ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  １４６．  ３８７−４０１（２００４）
【非特許文献３】Ｂｏｌｌｅｎ  Ｅ．  Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２５７Ｃ．  ８−１２（２０１３）
【非特許文献４】Ａｌｔａｒ  Ｃ．  Ａｎｔｈｏｎｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ６３．  １０２１−３２（１９９４）
【非特許文献５】Ｚｕｃｃａｔｏ  Ｃ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ８１．  ２９４−３３０（２００７）
【非特許文献６】Ｄａｆａｎｇ  Ｗｕ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  ２．  １２０−８（２００５）
【非特許文献７】Ｄａｖｉｄ  Ｍ．  Ｋａｔｚ．  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．  ２２０．  ４８１−９５（２０１４）
【非特許文献８】Ｅ．  Ｃａｓｔｒｅｎ．  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．  ２２０．  ４６１−７９（２０１４）
【非特許文献９】Ｘｉｅ  Ｙ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  １０５．  １０６−１９（２００５）
【非特許文献１０】Ｏｕ  Ｌ．  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ．  １１１．  １１６−２２  （２０１４）
【非特許文献１１】Ｒｕｂｅｎ  Ｊ．Ｂ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ９７．  １３７６−１３８６（２００７）
【非特許文献１２】Ｄａｆａｎｇ  Ｗ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，    ９６．  ２５４−２５９（１９９９）
【非特許文献１３】Ｌｉ  ＪＹ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  １２．  ７８７−９６（１９９９）
【非特許文献１４】Ｂｉｅｎ−Ｌｙ  Ｎ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２１１．  ２３３−４４  （２０１４）
【非特許文献１５】Ｓａｄａ  Ｈ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．  ９．  Ｅ９６３４０  （２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
上記背景の下で，本発明の目的は，血中に投与したＢＤＮＦが脳内で作用できるよう，血液脳関門を通過可能にしたものである，抗ＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質，その製造方法，使用方法，及び当該融合蛋白質を投与することによる，所定範囲の疾患の予防及び／又は治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，本明細書において詳述する抗体作製法により得られる，ｈＴｆＲの細胞外領域を認識する抗ヒトトランスフェリン受容体抗体（抗ｈＴｆＲ抗体）が，血中に投与したとき効率よく血液脳関門を通過することを見出し，しかも当該抗体とＢＤＮＦを融合させたものも血液脳関門を通過することも見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を提供する。【００１５】
１．脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor，ＢＤＮＦ）と抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，以下の（１）〜（１４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）ＣＤＲ１に配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号１０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（２）ＣＤＲ１に配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１３若しくは配列番号１４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含み，且つ及びＣＤＲ３に配列番号１５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列ものである，；
（３）ＣＤＲ１に配列番号１６又は配列番号１７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１８若しくは配列番号１９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号２０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（４）ＣＤＲ１に配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号２３若しくは配列番号２４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号２５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（５）ＣＤＲ１に配列番号２６又は配列番号２７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号２８若しくは配列番号２９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号３０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（６）ＣＤＲ１に配列番号３１又は配列番号３２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号３３若しくは配列番号３４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号３５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（７）ＣＤＲ１に配列番号３６又は配列番号３７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号４０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（８）ＣＤＲ１に配列番号４１又は配列番号４２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号４３若しくは配列番号４４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号４５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（９）ＣＤＲ１に配列番号４６又は配列番号４７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号４８若しくは配列番号４９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号５０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１０）ＣＤＲ１に配列番号５１又は配列番号５２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号５３若しくは配列番号５４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号５５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１１）ＣＤＲ１に配列番号５６又は配列番号５７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号５８若しくは配列番号５９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号６０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１２）ＣＤＲ１に配列番号６１又は配列番号６２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号６３若しくは配列番号６４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号６５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１３）ＣＤＲ１に配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号６８若しくは配列番号６９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号７０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；及び
（１４）ＣＤＲ１に配列番号７１又は配列番号７２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号７３若しくは配列番号７４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを含み，且つＣＤＲ３に配列番号７５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列。
２．上記１のＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，以下の（１）〜（１４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）ＣＤＲ１に配列番号６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（２）ＣＤＲ１に配列番号１１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（３）ＣＤＲ１に配列番号１６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号２０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（４）ＣＤＲ１に配列番号２１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号２３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号２５のアミノ酸配列，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（５）ＣＤＲ１に配列番号２６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号２８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号３０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（６）ＣＤＲ１に配列番号３１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号３３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号３５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（７）ＣＤＲ１に配列番号３６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号３８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号４０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（８）ＣＤＲ１に配列番号４１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号４３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号４５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（９）ＣＤＲ１に配列番号４６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号４８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号５０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（１０）ＣＤＲ１に配列番号５１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号５３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号５５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（１１）ＣＤＲ１に配列番号５６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号５８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号６０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（１２）ＣＤＲ１に配列番号６１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号６３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号６５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；
（１３）ＣＤＲ１に配列番号６６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号６８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号７０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列；及び
（１４）ＣＤＲ１に配列番号７１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号７３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号７５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものであるアミノ酸配列。
３．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の軽鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列が，上記１又は２の何れかの軽鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列とそれぞれ８０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
４．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の軽鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列が，上記１又は２の何れかの軽鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列とそれぞれ９０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
５．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，上記１又は２の何れかの軽鎖のＣＤＲの少なくとも１つにおいて，これを構成するアミノ酸配列中１〜５個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
６．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，上記１又は２の何れかの軽鎖のＣＤＲの少なくとも１つにおいて，これを構成するアミノ酸配列中，１〜３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
７．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，以下の（１）〜（１４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）ＣＤＲ１に配列番号７６又は配列番号７７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号７８又は配列番号７９のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号８０又は配列番号８１のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（２）ＣＤＲ１に配列番号８２又は配列番号８３のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号８４又は配列番号８５のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号８６又は配列番号８７のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（３）ＣＤＲ１に配列番号８８又は配列番号８９のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号９０又は配列番号９１のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号９２又は配列番号９３のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（４）ＣＤＲ１に配列番号９４又は配列番号９５のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号９６又は配列番号９７のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号９８又は配列番号９９のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（５）ＣＤＲ１に配列番号１００又は配列番号１０１のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１０２又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１０４又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（６）ＣＤＲ１に配列番号１０６又は配列番号１０７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１０８のアミノ酸配列又は配列番号２６６のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１０９又は配列番号１１０のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（７）ＣＤＲ１に配列番号１１１又は配列番号１１２のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１１３又は配列番号１１４のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１１５又は配列番号１１６のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（８）ＣＤＲ１に配列番号１１７又は配列番号１１８のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１１９のアミノ酸配列又は配列番号２６７のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１２０又は配列番号１２１のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（９）ＣＤＲ１に配列番号１２２又は配列番号１２３のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１２４又は配列番号１２５のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１２６又は配列番号１２７のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１０）ＣＤＲ１に配列番号１２８又は配列番号１２９のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１３０又は配列番号１３１のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１３２又は配列番号１３３のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１１）ＣＤＲ１に配列番号１３４又は配列番号１３５のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１３６又は配列番号１３７のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１３８又は配列番号１３９のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１２）ＣＤＲ１に配列番号１４０又は配列番号１４１のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１４２又は配列番号１４３のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１４４又は配列番号１４５のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；
（１３）ＣＤＲ１に配列番号１４６又は配列番号１４７のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１４８又は配列番号１４９のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１５０又は配列番号１５１のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列；及び
（１４）ＣＤＲ１に配列番号１５２又は配列番号１５３のアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２に配列番号１５４又は配列番号１５５のアミノ酸配列を含み，且つＣＤＲ３に配列番号１５６又は配列番号１５７のアミノ酸配列を含むものである，アミノ酸配列。
８．上記７のＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，以下の（１）〜（１４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）ＣＤＲ１に配列番号７６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号７８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号８０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（２）ＣＤＲ１に配列番号８２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号８４のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号８６のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（３）ＣＤＲ１に配列番号８８のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号９０のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号９２のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（４）ＣＤＲ１に配列番号９４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号９６のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号９８のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（５）ＣＤＲ１に配列番号１００のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１０２のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１０４のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（６）ＣＤＲ１に配列番号１０６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１０８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１０９のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（７）ＣＤＲ１に配列番号１１１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１１３のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１１５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（８）ＣＤＲ１に配列番号１１７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１１９のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１２０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（９）ＣＤＲ１に配列番号１２２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１２４のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１２６のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（１０）ＣＤＲ１に配列番号１２８のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１３０のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１３２のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（１１）ＣＤＲ１に配列番号１３４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１３６のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１３８アミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（１２）ＣＤＲ１に配列番号１４０のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１４２のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１４４のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；
（１３）ＣＤＲ１に配列番号１４６のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１４８のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１５０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列；及び
（１４）ＣＤＲ１に配列番号１５２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２に配列番号１５４のアミノ酸配列を，且つＣＤＲ３に配列番号１５６のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列。
９．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の重鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列が，上記７又は８の何れかの重鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列とそれぞれ８０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
１０．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の重鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列が，上記７又は８の何れかの重鎖のＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列とそれぞれ９０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
１１．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，上記７又は８の何れかの重鎖のＣＤＲの少なくとも１つにおいて，これを構成するアミノ酸配列中，１〜５個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
１２．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，上記７又は８の何れかの重鎖のＣＤＲの少なくとも１つにおいて，これを構成するアミノ酸配列中，１〜３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
１３．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が，以下の（１）〜（１４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号１０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号７６又は配列番号７７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号７８又は配列番号７９のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号８０又は配列番号８１のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（２）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１３若しくは配列番号１４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号１５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号８２又は配列番号８３のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号８４又は配列番号８５のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号８６又は配列番号８７のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（３）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１６又は配列番号１７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１８若しくは配列番号１９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号２０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号８８又は配列番号８９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号９０又は配列番号９１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号９２又は配列番号９３のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（４）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号２１又は配列番号２２を，ＣＤＲ２として配列番号２３若しくは配列番号２４のアミノ酸配列，又はＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号２５のアミノ酸配列のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号９４又は配列番号９５のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号９６又は配列番号９７のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号９８又は配列番号９９のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（５）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号２６又は配列番号２７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号２８若しくは配列番号２９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号３０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１００又は配列番号１０１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０２又は配列番号１０３のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１０４又は配列番号１０５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（６）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号３１又は配列番号３２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号３３若しくは配列番号３４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号３５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１０６又は配列番号１０７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０８又は配列番号２６６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１０９又は配列番号１１０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（７）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号３６又は配列番号３７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号４０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１１１又は配列番号１１２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１１３又は配列番号１１４のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１１５又は配列番号１１６のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
（８）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号４１又は配列番号４２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号４３若しくは配列番号４４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号４５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域がＣＤＲ１として配列番号１１７又は配列番号１１８のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１１９又は配列番号２６７のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２０又は配列番号１２１のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（９）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号４６又は配列番号４７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号４８若しくは配列番号４９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号５０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１２２又は配列番号１２３のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１２４又は配列番号１２５のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２６又は配列番号１２７のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１０）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号５１又は配列番号５２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号５３若しくは配列番号５４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号５５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１２８又は配列番号１２９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１３０又は配列番号１３１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１３２又は配列番号１３３のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１１）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号５６又は配列番号５７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号５８若しくは配列番号５９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号６０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１３４又は配列番号１３５のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１３６又は配列番号１３７のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１３８又は配列番号１３９にアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１２）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号６１又は配列番号６２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号６３若しくは配列番号６４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号６５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１４０又は配列番号１４１のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１４２又は配列番号１４３のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１４４又は配列番号１４５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１３）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号６８若しくは配列番号６９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号７０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１４６又は配列番号１４７のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１４８又は配列番号１４９のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１５０又は配列番号１５１のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；及び
（１４）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号７１又は配列番号７２のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号７３若しくは配列番号７４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒを，及びＣＤＲ３として配列番号７５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１として配列番号１５２又は配列番号１５３のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５４又は配列番号１５５のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１５６又は配列番号１５７のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの。
１４．上記１３のＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，当該抗体の軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が，以下の（１）〜（１４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号６，ＣＤＲ２に配列番号８，及びＣＤＲ３に配列番号１０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号７６，ＣＤＲ２に配列番号７８，及びＣＤＲ３に配列番号８０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（２）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１１，ＣＤＲ２に配列番号１３，及びＣＤＲ３に配列番号１５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号８２，ＣＤＲ２に配列番号８４，及びＣＤＲ３に配列番号８６のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（３）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１６，ＣＤＲ２に配列番号１８，及びＣＤＲ３に配列番号２０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号８８，ＣＤＲ２に配列番号９０，及びＣＤＲ３に配列番号９２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（４）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号２１，ＣＤＲ２に配列番号２３，及びＣＤＲ３に配列番号２５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号９４，ＣＤＲ２に配列番号９６，及びＣＤＲ３に配列番号９８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（５）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号２６，ＣＤＲ２に配列番号２８，及びＣＤＲ３に配列番号３０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１００，ＣＤＲ２に配列番号１０２，及びＣＤＲ３に配列番号１０４のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（６）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号３１，ＣＤＲ２に配列番号３３，及びＣＤＲ３に配列番号３５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１０６，ＣＤＲ２に配列番号１０８，及びＣＤＲ３に配列番号１０９のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（７）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号３６，ＣＤＲ２に配列番号３８，及びＣＤＲ３に配列番号４０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１１１，ＣＤＲ２に配列番号１１３，及びＣＤＲ３に配列番号１１５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（８）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号４１，ＣＤＲ２に配列番号４３，及びＣＤＲ３に配列番号４５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１１７，ＣＤＲ２に配列番号１１９，及びＣＤＲ３に配列番号１２０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（９）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号４６，ＣＤＲ２に配列番号４８，及びＣＤＲ３に配列番号５０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１２２，ＣＤＲ２に配列番号１２４，及びＣＤＲ３に配列番号１２６のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１０）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号５１，ＣＤＲ２に配列番号５３，及びＣＤＲ３に配列番号５５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１２８，ＣＤＲ２に配列番号１３０，及びＣＤＲ３に配列番号１３２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１１）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号５６，ＣＤＲ２に配列番号５８，及びＣＤＲ３に配列番号６０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１３４，ＣＤＲ２に配列番号１３６，及びＣＤＲ３に配列番号１３８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１２）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号６１，ＣＤＲ２に配列番号６３，及びＣＤＲ３に配列番号６５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１４０，ＣＤＲ２に配列番号１４２，及びＣＤＲ３に配列番号１４４のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；
（１３）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号６６，ＣＤＲ２に配列番号６８，及びＣＤＲ３に配列番号７０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１４６，ＣＤＲ２に配列番号１４８，及びＣＤＲ且つ３に配列番号１５０のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの；及び
（１４）軽鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号７１，ＣＤＲ２に配列番号７３，及びＣＤＲ３に配列番号７５のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，ＣＤＲ１に配列番号１５２，ＣＤＲ２に配列番号１５４，及びＣＤＲ３に配列番号１５６のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの。
１５．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖及び重鎖のそれぞれにおけるＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列が，上記１３又は１４の軽鎖と重鎖の組合せの何れかにおける軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
１６．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖及び重鎖のそれぞれにおけるＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列が，上記１３又は１４の軽鎖と重鎖の組合せの何れかにおける軽鎖及び重鎖のそれぞれのＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の各アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
１７．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，上記１３又は１４の軽鎖と重鎖の組合せの何れかにおける軽鎖及び重鎖のそれぞれにつき，ＣＤＲの少なくとも１つにおいて，これを構成するアミノ酸配列中１〜５個が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
１８．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，上記１３又は１４の軽鎖と重鎖の組合せの何れかにおける軽鎖及び重鎖のそれぞれにつき，ＣＤＲの少なくとも１つにおいて，これを構成するアミノ酸配列中１〜３個が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
１９．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖の可変領域が，配列番号１５８，配列番号１５９，配列番号１６０，配列番号１６１，配列番号１６２，及び配列番号１６３のアミノ酸配列からなる群より選ばれる何れかのアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，配列番号１６６，配列番号１６７，配列番号１６８，配列番号１６９，配列番号１７０，及び配列番号１７１のアミノ酸配列からなる群より選ばれる何れかのアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
２０．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖の可変領域が，配列番号１７４，配列番号１７５，配列番号１７６，配列番号１７７，配列番号１７８，及び配列番号１７９のアミノ酸配列からなる群より選ばれる何れかのアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，配列番号１８２，配列番号１８３，配列番号１８４，配列番号１８５，配列番号１８６，及び配列番号１８７のアミノ酸配列からなるより選ばれる何れかのアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
２１．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖の可変領域が，配列番号１９０，配列番号１９１，配列番号１９２，配列番号１９３，配列番号１９４，及び配列番号１９５のアミノ酸配列からなる群より選ばれる何れかのアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が，配列番号２０４，配列番号２０５，配列番号２０６，配列番号２０７，配列番号２０８，及び配列番号２０９のアミノ酸配列からなる群より選ばれる何れかのアミノ酸配列を含んでなるものである，融合蛋白質。
２２．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，次の（１ａ）〜（３ｄ）からなる群より選ばれるものである融合蛋白質：
（１ａ）該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１６３のアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が配列番号１７１のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（２ａ）該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１７９のアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が配列番号１８７のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ａ）該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１９１のアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が配列番号２０５のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｂ）該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１９３のアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が配列番号２０５のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｃ）該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１９４のアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が配列番号２０５のアミノ酸配列を含んでなるもの，及び
（３ｄ）該抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１９５のアミノ酸配列を含んでなり，且つ重鎖の可変領域が配列番号２０５のアミノ酸配列を含んでなるもの。
２３．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，次の（１ｂ）〜（３ｌ）からなる群より選ばれるものである融合蛋白質：
（１ｂ）該抗体の軽鎖が配列番号１６４のアミノ酸配列を含んでなり，且つ該抗体の重鎖が配列番号１７２のアミノ酸配列を含むもの，
（２ｂ）該抗体の軽鎖が配列番号１８０のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号１８８のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｅ）該抗体の軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｆ）該抗体の軽鎖が配列番号１９８のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｇ）該抗体の軽鎖が配列番号２００のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｈ）該抗体の軽鎖が配列番号２０２のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｉ）該抗体の軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｊ）該抗体の軽鎖が配列番号１９８のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列を含んでなるもの，
（３ｋ）該抗体の軽鎖が配列番号２００のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列を含んでなるもの，及び
（３ｌ）該抗体の軽鎖が配列番号２０２のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列を含んでなるもの。
２４．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記１９〜２３の何れかの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列に関して，それぞれ８０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
２５．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の融合蛋白質であって，該抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記１９〜２３の何れかの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列に関して，それぞれ９０％以上の相同性を有するものである，融合蛋白質。
２６．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，上記１９〜２３の何れかの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中，１〜１０個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
２７．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，上記１９〜２３の何れかの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中，１〜３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
２８．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，上記１９〜２３の何れかの重鎖の可変領域のアミノ酸配列中，１〜１０個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
２９．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，上記１９〜２３の何れかの重鎖の可変領域のアミノ酸配列中，１〜３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
３０．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，上記１９〜２３の何れかの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列の各々を構成するアミノ酸のうち，それぞれ１〜１０個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
３１．ＢＤＮＦと抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって，上記１９〜２３の何れかの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列の各々を構成するアミノ酸のうち，それぞれ１〜３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである，融合蛋白質。
３２．上記１〜３１の何れかの融合蛋白質であって，該ＢＤＮＦが，該抗体の軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に結合したものである，融合蛋白質。
３３．上記３２の融合蛋白質であって，該ＢＤＮＦが，該抗体の軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，直接又はリンカーを介して結合したものである，融合蛋白質。
３４．該リンカーが，１〜５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである，上記３３の融合蛋白質。
３５．該リンカーが，グリシン，セリン，アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ），配列番号３，配列番号４，配列番号５，及びこれらのアミノ酸配列が１〜１０個連続してなる配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである，融合蛋白質。
３６．上記１〜３１の何れかの融合蛋白質であって，該ＢＤＮＦが，該抗体の重鎖のＣ末端側又はＮ末端側に結合したものである，融合蛋白質。
３７．上記３６の融合蛋白質であって，該ＢＤＮＦが，該抗体の重鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，直接又はリンカーを介して結合したものである，融合蛋白質。
３８．該リンカーが，１〜５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである，上記３７の融合蛋白質。
３９．該リンカーが，アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ），配列番号３，配列番号４，及び配列番号５からなる群群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである，上記３７の融合蛋白質。
４０．該ＢＤＮＦがヒトＢＤＮＦである，上記１〜３９の何れかの融合蛋白質。
４１．該ヒトＢＤＮＦが，配列番号２４７のアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列を含んでなるものであるか，または配列番号２４７で表される蛋白質と同質の機能を有するものである，上記４０の融合蛋白質。
４２．上記１〜４１の何れかの融合蛋白質であって，ヒトトランスフェリン受容体の細胞外領域及びサルトランスフェリン受容体の細胞外領域の双方に対して親和性を有するものである，融合蛋白質。
４３．上記４２の融合蛋白質であって，該抗トランスフェリン受容体抗体が，ヒトトランスフェリン受容体の細胞外領域との解離定数が１×１０−８Ｍ以下であり，サルトランスフェリン受容体の細胞外領域との解離定数が５×１０−８Ｍ以下のものである，融合蛋白質。
４４．上記４０の融合蛋白質であって，次の（１）〜（４）からなる群より選ばれるものである，融合蛋白質：
（１）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が配列番号１６４のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖がそのＣ末端側で，リンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，全体として配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有するもの；
（２）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が配列番号１８０のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖がそのＣ末端側で，リンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，全体として配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有するもの；及び
（３）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号１９６のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，リンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，全体として配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有するものである，融合蛋白質。
（４）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号１９６のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，全体として配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有するものである，融合蛋白質。
４５．該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が抗原結合性断片である，上記１〜４３の何れかに記載の融合蛋白質。
４６．抗原結合性断片のＮ末端側に直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，上記４５に記載の融合蛋白質。
４７．該抗原結合性断片が一本鎖抗体である，上記４５又は４６に記載の融合蛋白質。
４８．該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域が，軽鎖と重鎖を結合するリンカー配列を介して結合したものである，上記４７に記載の融合蛋白質。
４９．該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域のＣ末端側に，軽鎖と重鎖を結合するリンカー配列を介して，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の重鎖可変領域が結合したものである，上記４８に記載の融合蛋白質。
５０．該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の重鎖可変領域のＣ末端側に，軽鎖と重鎖を結合するリンカー配列を介して，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖可変領域が結合したものである，上記４８に記載の融合蛋白質。
５１．該軽鎖と重鎖を結合するリンカー配列が，２〜５０個のアミノ酸残基からなるものである，上記４８〜５０に記載の融合蛋白質。
５２．該軽鎖と重鎖を結合するリンカー配列が，アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ），配列番号３，配列番号４，配列番号５，及びこれらのアミノ酸配列が２〜１０個連続してなる配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるものである，上記５１に記載の融合蛋白質。
５３．一本鎖抗体が配列番号２０５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号１９１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体である，上記４７〜５２に記載の融合蛋白質。
５４．一本鎖抗体が配列番号２５７のアミノ酸配列からなる一本鎖抗体であり，そのＮ末端側に直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，上記５３に記載の融合蛋白質。
５５．一本鎖抗体が配列番号２５７のアミノ酸配列からなる一本鎖抗体であり，そのＮ末端側にリンカーを介してヒトプロＢＤＮＦが結合した，配列番号２５９のアミノ酸配列を含んでなる，上記５４に記載の融合蛋白質。
５６．一本鎖抗体が配列番号２５７のアミノ酸配列からなる一本鎖抗体であり，そのＮ末端側にリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合した，配列番号２６０のアミノ酸配列を含んでなる，上記５４に記載の融合蛋白質。
５７．該抗原結合性断片が，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，又はＦ（ａｂ’）の何れかのものである，上記４５又は４６に記載の融合蛋白質。
５８．Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，又はＦ（ａｂ’）の何れかの重鎖のＮ末端側に直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，上記５７に記載の融合蛋白質。
５９．軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列からなり，且つ重鎖が配列番号２６１のアミノ酸配列からなるＦａｂ重鎖であり，該重鎖のＮ末端側に直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，上記５８に記載の融合蛋白質。
６０．軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列からなり，且つＦａｂ重鎖とそのＮ末端側に直接又はリンカーを介して結合したヒトプロＢＤＮＦとからなる部分が配列番号２６３のアミノ酸配列からなる，上記５９に記載の融合蛋白質。
６１．軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列からなり，且つＦａｂ重鎖とそのＮ末端側に直接又はリンカーを介して結合したヒトＢＤＮＦとからなる部分が配列番号２６４のアミノ酸配列からなる，上記５９に記載の融合蛋白質。
６２．上記１〜６１の何れかの融合蛋白質をコードする，ＤＮＡ断片。
６３．上記６２のＤＮＡ断片を組み込んでなる，発現ベクター。
６４．上記６３の発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
６５．ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療のための薬剤であって，上記１〜６１の何れかの融合蛋白質を有効成分として含む，薬剤。
６６．該疾患又は障害が，神経系の疾患又は障害である上記６５の薬剤。
６７．該神経系の疾患又は障害が，神経変性疾患，うつ病，統合失調症，てんかん，自閉症，Ｒｅｔｔ症候群，Ｗｅｓｔ症候群，新生児痙攣，認知症に伴う問題行動，不安症，疼痛，ヒルシュスブルング病又はレム睡眠行動障害である，上記６６の薬剤。
６８．該神経変性疾患が，脳神経変性疾患，脊髄変性疾患，網膜変性疾患又は末梢神経変性疾患である，上記６７の薬剤。
６９．該脳神経変性疾患が，脳神経系の神経変性疾患，脳虚血性疾患，外傷性脳損傷，白質脳症又は多発性硬化症である，上記６８の薬剤。
７０．該脳神経系の神経変性疾患が，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン病，レビー小体型認知症，ピック病，多系統萎縮症，進行性上行性麻痺又はダウン症候群である，上記６９の薬剤。
７１．ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療のための，上記１〜６１の何れかの融合蛋白質の使用。
７２．ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療用の医薬の製造のための，上記１〜６１の何れかの融合蛋白質の使用。
７３．ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療の方法であって，当該疾患又は傷害を有する患者の血中に，上記１〜６１の何れかの融合蛋白質の治療上有効量を含有する医薬組成物を投与することを含むものである，方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は，血液脳関門を通過できないものである脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）につき，これを特定の抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質の形とすることにより，血液脳関門を通過可能にする。従って，ＢＤＮＦを，そのような融合蛋白質の形で静脈注射等により血中に投与することによって中枢神経系に作用させることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】抗ｈＴｆＲ抗体を単回静脈内投与した後の，カニクイザルの大脳皮質の抗ｈＴｆＲ抗体に対する免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真。（ａ）は抗ｈＴｆＲ抗体を非投与，（ｂ）は抗ｈＴｆＲ抗体番号１を投与，（ｃ）は抗ｈＴｆＲ抗体番号２を投与，（ｄ）は抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与した，大脳皮質の染色図。各写真の右下のバーは５０μｍを表すゲージである。
【図２】抗ｈＴｆＲ抗体を単回静脈内投与した後の，カニクイザルの海馬の抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真。（ａ）は抗ｈＴｆＲ抗体を非投与，（ｂ）は抗ｈＴｆＲ抗体番号１を投与，（ｃ）は抗ｈＴｆＲ抗体番号２を投与，（ｄ）は抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与した，海馬の染色図。各写真の右下のバーは５０μｍを表すゲージである。
【図３】抗ｈＴｆＲ抗体を単回静脈内投与した後の，カニクイザルの小脳の抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真。（ａ）は抗ｈＴｆＲ抗体を非投与，（ｂ）は抗ｈＴｆＲ抗体番号１を投与，（ｃ）は抗ｈＴｆＲ抗体番号２を投与，（ｄ）は抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与した，小脳の染色図。各写真の右下のバーは５０μｍを表すゲージである。
【図４】単回静脈内投与した後の，カニクイザルの脳以外の各種臓器へのヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の蓄積量を示す図。縦軸は，各臓器の湿重量当たりのヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の量（μｇ／ｇ湿重量）を示す。白バーは左から順に，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４），及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）を，それぞれ投与，黒バーは，トラスツズマブ（ハーセプチンＴＭ）を投与したサルの各臓器での蓄積量を示す。ＮＤは未測定を意味する。
【図５】単回静脈内投与した後の，カニクイザルの大脳皮質の，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に対する免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真。（ａ）ハーセプチンを投与，（ｂ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与，（ｃ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２を投与，（ｄ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）を投与，（ｅ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）を投与した大脳皮質の染色図。各写真の右下のバーは２０μｍを表すゲージである。
【図６】単回静脈内投与した後の，カニクイザルの海馬のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に対する免疫組織化学染色の結果を示す図。（ａ）ハーセプチンを投与，（ｂ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与，（ｃ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２を投与，（ｄ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）を投与，（ｅ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）を投与した海馬の染色図。各写真の右下のバーは２０μｍを表すゲージである。
【図７】単回静脈内投与した後の，カニクイザルの小脳のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に対する免疫組織化学染色の結果を示す図。（ａ）ハーセプチンを投与，（ｂ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与，（ｃ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２を投与，（ｄ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）を投与，（ｅ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）を投与した小脳の染色図。各写真の右下のバーは２０μｍを表すゲージである。
【図８】単回静脈内投与した後の，カニクイザルの延髄のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す図面代用写真。（ａ）ハーセプチンを投与，（ｂ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与，（ｃ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２を投与，（ｄ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）を投与，（ｅ）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）を投与した延髄の染色図。各写真の右下のバーは２０μｍを表すゲージである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明において，「抗体」の語は，主としてヒト抗体，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体，及びマウス抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体の何れかをいうが，特定の抗原に特異的に結合する性質を有するものである限り，これらに限定されるものではなく，また，抗体の動物種にも特に制限はない。但し，好ましいのは，ヒト化抗体である。
【００１９】
本発明において，「ヒト抗体」の語は，その蛋白質全体がヒト由来の遺伝子にコードされている抗体をいう。但し，遺伝子の発現効率を上昇させる等の目的で，元のヒトの遺伝子に，元のアミノ酸配列に変化を与えることなく変異を加えた遺伝子にコードされる抗体も，「ヒト抗体」に含まれる。また，ヒト抗体をコードする２つ以上の遺伝子を組み合わせて，あるヒト抗体の一部を他のヒト抗体の一部に置き換えて作製した抗体も，「ヒト抗体」である。ヒト抗体は，免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。免疫グロブリン軽鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。免疫グロブリン重鎖の３箇所のＣＤＲも，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。あるヒト抗体のＣＤＲを，その他のヒト抗体のＣＤＲに置き換えることにより，ヒト抗体の抗原特異性，親和性等を改変した抗体も，ヒト抗体に含まれる。
【００２０】
本発明において，元のヒト抗体の遺伝子を改変することにより，元の抗体のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，「ヒト抗体」に含まれる。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１〜２０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜２０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗体である。アミノ酸を付加する場合，元の抗体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１〜２０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗体である。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。即ち，本発明において「ヒト由来の遺伝子」というときは，ヒト由来の元の遺伝子に加えて，これに改変を加えることにより得られる遺伝子も含まれる。
【００２１】
本発明において，「マウス抗体」というときは，その蛋白質全体がマウス由来の遺伝子にコードされる抗体をいう。但し，遺伝子の発現効率を上昇させる等の目的で，元のマウスの遺伝子に，元のアミノ酸配列に変化を与えることなく変異を加えた遺伝子にコードされる抗体も，「マウス抗体」に含まれる。また，マウス抗体をコードする２つ以上の遺伝子を組み合わせて，あるマウス抗体の一部を他のマウス抗体の一部に置き換えた抗体も，マウス抗体に含まれる。マウス抗体は，免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）有する。免疫グロブリン軽鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。免疫グロブリン重鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。例えば，あるマウス抗体のＣＤＲを，他のマウス抗体のＣＤＲに置き換えることにより，マウス抗体の抗原特異性，親和性等を改変した抗体も，マウス抗体に含まれる。
【００２２】
本発明において，元のマウス抗体の遺伝子を改変することにより，元の抗体のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，「マウス抗体」に含まれる。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１〜２０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜２０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，「マウス抗体」に含まれる。アミノ酸を付加する場合，元の抗体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１〜２０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，「マウス抗体」に含まれる。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示す。即ち，本発明において「マウス由来の遺伝子」というときは，マウス由来の元の遺伝子に加えて，これに改変を加えることにより得られる遺伝子も含まれる。
【００２３】
本発明において，「ヒト化抗体」の語は，可変領域の一部（例えば，特にＣＤＲの全部又は一部）のアミノ酸配列がヒト以外の哺乳動物由来であり，それ以外の領域がヒト由来である抗体のことをいう。例えば，ヒト化抗体として，ヒト抗体を構成する免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を，他の哺乳動物のＣＤＲに置き換えることによって作製された抗体が挙げられる。ヒト抗体の適切な位置に移植されるＣＤＲの由来となる他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウス及びラットであり，更に好ましくはマウスである。
【００２４】
本発明において，「キメラ抗体」の語は，２つ以上の異なる種に由来する，２つ以上の異なる抗体の断片が連結されてなる抗体のことをいう。
【００２５】
ヒト抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体とは，ヒト抗体の一部がヒト以外の哺乳動物の抗体の一部によって置き換えられた抗体である。抗体は，以下に説明するＦｃ領域，Ｆａｂ領域及びヒンジ部とからなる。このようなキメラ抗体の具体例として，Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域が他の哺乳動物の抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又は他の哺乳動物の抗体のいずれかに由来する。逆に，Ｆｃ領域が他の哺乳動物に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又は他の哺乳動物の抗体のいずれかに由来する。
【００２６】
また，抗体は，可変領域と定常領域とからなるということもできる。キメラ抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（Ｃｌ）がヒト抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）が他の哺乳動物の抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（Ｃｌ）が他の哺乳動物の抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がヒト抗体に由来するものも挙げられる。ここで，他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，例えばマウスである。
【００２７】
マウス抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体とは，マウス抗体の一部がマウス以外の哺乳動物の抗体の一部に置き換えられた抗体である。このようなキメラ抗体の具体例として，Ｆｃ領域がマウス抗体に由来する一方でＦａｂ領域が他の哺乳動物の抗体に由来するキメラ抗体や，逆に，Ｆｃ領域が他の哺乳動物に由来する一方でＦａｂ領域がマウス抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ここで，他の哺乳動物の生物種は，好ましくはヒトである。
【００２８】
ヒト抗体とマウス抗体のキメラ抗体は，特に，「ヒト／マウスキメラ抗体」という。ヒト／マウスキメラ抗体には，Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域がマウス抗体に由来するキメラ抗体や，逆に，Ｆｃ領域がマウス抗体に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又はマウス抗体のいずれかに由来する。ヒト／マウスキメラ抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（Ｃｌ）がヒト抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がマウス抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（Ｃｌ）がマウス抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がヒト抗体に由来するものも挙げられる。
【００２９】
抗体は，本来，２本の免疫グロブリン軽鎖と２本の免疫グロブリン重鎖の計４本のポリペプチド鎖からなる基本構造を有する。但し，本発明において，「抗体」というときは，この基本構造を有するものに加え，
（１）１本の免疫グロブリン軽鎖と１本の免疫グロブリン重鎖の計２本のポリペプチド鎖からなるものや，以下に詳述するように，
（２）免疫グロブリン軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体，及び
（３）免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体も含まれる。また，
（４）本来の意味での抗体の基本構造からＦｃ領域が欠失したものであるＦａｂ領域からなるもの及びＦａｂ領域とヒンジ部の全部若しくは一部とからなるもの（Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２を含む）も，
本発明における「抗体」に含まれる。
【００３０】
ここでＦａｂとは，可変領域とＣＬ領域（軽鎖の定常領域）を含む軽鎖と，可変領域とＣＨ１領域（重鎖の定常領域の部分１）を含む重鎖が，それぞれに存在するシステイン残基同士でジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Ｆａｂにおいて，重鎖は，可変領域とＣＨ１領域（重鎖の定常領域の部分１）に加えて，更にヒンジ部の一部を含んでもよいが，この場合のヒンジ部は，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠くものである。Ｆａｂにおいて，軽鎖と重鎖とは，軽鎖の定常領域（ＣＬ領域）に存在するシステイン残基と，重鎖のＣＨ１領域又はヒンジ部に存在するシステイン残基との間で形成されるジスルフィド結合により結合する。Ｆａｂは，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠いており，１本の軽鎖と１本の重鎖とからなる。Ｆ（ａｂ’）においては，その重鎖は可変領域とＣＨ１領域に加えて，重鎖どうしを結合するシステイン残基を含むヒンジ部の全部または一部を含む。Ｆ（ａｂ’）２は２つのＦ（ａｂ’）が互いのヒンジ部に存在するシステイン残基同士でジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。また，複数の抗体が直接又はリンカーを介して結合したものである，ニ量体，三量体等の重合体も抗体である。更に，これらに限らず，免疫グロブリン分子の一部を含み，且つ，抗原に特異的に結合する性質を有するものは何れも，本発明でいう「抗体」に含まれる。即ち，本発明において免疫グロブリン軽鎖というときは，免疫グロブリン軽鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。また，免疫グロブリン重鎖というときは，免疫グロブリン重鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。従って，可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有する限り，例えば，Ｆｃ領域が欠失したものも，免疫グロブリン重鎖である。
【００３１】
また，ここでＦｃ又はＦｃ領域とは，抗体分子中の，ＣＨ２領域（重鎖の定常領域の部分２），及びＣＨ３領域（重鎖の定常領域の部分３）からなる断片を含む領域のことをいう。Ｆｃ又はＦｃ領域は，ＣＨ２領域とＣＨ３領域に加えて，ヒンジ部の一部を含んでもよい。
【００３２】
更には，本発明において，「抗体」というときは，
（５）上記（４）で示したＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）又はＦ（ａｂ’）２を構成する軽鎖と重鎖を，リンカー配列を介して結合させて，それぞれ一本鎖抗体としたｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），及びｓｃＦ（ａｂ’）２も含まれる。ここで，ｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），及びｓｃＦ（ａｂ’）２にあっては，軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖を結合させてなるものでもよく，また，重鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖を結合させてなるものでもよい。更には，軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域をリンカー配列を介して結合させて一本鎖抗体としたｓｃＦｖも，本発明における抗体に含まれる。ｓｃＦｖにあっては，軽鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖の可変領域を結合させてなるものでもよく，また，重鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖の可変領域を結合させてなるものでもよい。
【００３３】
更には，本明細書でいう「抗体」には，完全長抗体，上記（１）〜（３）に示されるものに加えて，上記（４）及び（５）を含む概念である完全長抗体の一部が欠損している抗原結合性断片（抗体フラグメント）のいずれの形態も含まれる。
【００３４】
「抗原結合性断片」という用語は，抗原との特異的結合活性の少なくとも一部を保持している抗体の断片のことをいう。結合性断片の例としては，例えば上記（４）及び（５）に示されるものに加えて，可変領域（Ｆｖ），重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを適当なリンカーで連結させた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ），重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチドの二量体であるダイアボディ，ｓｃＦｖの重鎖（Ｈ鎖）に定常領域の一部（ＣＨ３）が結合したものの二量体であるミニボディ，その他の低分子化抗体等を包含する。但し，抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また，これらの結合性断片には，抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず，遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
【００３５】
本発明において，「一本鎖抗体」というときは，免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質をいう。例えば，上記（２），（３）及び（５）に示されるものは一本鎖抗体に含まれる。また，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質も，本発明における「一本鎖抗体」である。免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖が結合した一本鎖抗体にあっては，通常，免疫グロブリン重鎖は，Ｆｃ領域が欠失している。免疫グロブリン軽鎖の可変領域は，抗体の抗原特異性に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）を３つ有している。同様に，免疫グロブリン重鎖の可変領域も，ＣＤＲを３つ有している。これらのＣＤＲは，抗体の抗原特異性を決定する主たる領域である。従って，一本鎖抗体には，免疫グロブリン重鎖の３つのＣＤＲが全てと，免疫グロブリン軽鎖の３つのＣＤＲの全てとが含まれることが好ましい。但し，抗体の抗原特異的な親和性が維持される限り，ＣＤＲの１個又は複数個を欠失させた一本鎖抗体とすることもできる。
【００３６】
一本鎖抗体において，免疫グロブリンの軽鎖と重鎖との間に配置されるリンカー配列は，好ましくは２〜５０個，より好ましくは８〜５０個，更に好ましくは１０〜３０個，更により好ましくは１２〜１８個又は１５〜２５個，例えば１５個若しくは２５個のアミノ酸残基から構成されるペプチド鎖である。そのようなリンカー配列は，これにより両鎖が連結されてなる抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲに対する親和性を保持する限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンのみ又はグリシンとセリンから構成されるものである。例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４），アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５），又はこれらのアミノ酸配列の２〜１０個或いは２〜５個が連続したものに相当する配列を含むものが挙げらられる。例えば，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全領域からなるアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖の可変領域を結合させる場合，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）の３個が連続したものに相当する計１５個のアミノ酸からなるリンカー配列を含むものが好適である。
【００３７】
本発明において，「ヒトトランスフェリン受容体」又は「ｈＴｆＲ」の語は，配列番号１のアミノ酸配列を有する膜蛋白質である。本発明の一実施態様において，ＢＤＮＦと融合させるべき抗ｈＴｆＲ抗体は，配列番号１のアミノ酸配列中Ｎ末端から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの部分（ｈＴｆＲの細胞外領域）に対して特異的に結合するものであるが，これに限定されない。また，本発明において「サルトランスフェリン受容体」又は「サルＴｆＲ」の語は，特に，カニクイザル（Macaca fascicularis）由来の，配列番号２のアミノ酸配列を有する膜蛋白質である。本発明の抗ｈＴｆＲ抗体は，その一実施態様において，配列番号２のアミノ酸配列の中で，Ｎ末端から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの部分（サルＴｆＲの細胞外領域）に対しても結合するものであるが，これに限定されない。
【００３８】
ｈＴｆＲに対する抗体の作製方法としては，ｈＴｆＲ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した細胞を用いて，組換えヒトトランスフェリン受容体（ｒｈＴｆＲ）を作製し，このｒｈＴｆＲを用いてマウス等の動物を免疫して得る方法が一般的である。免疫後の動物からｈＴｆＲに対する抗体産生細胞を取り出し，これとミエローマ細胞とを融合させることにより，抗ｈＴｆＲ抗体産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製することができる。
【００３９】
また，マウス等の動物より得た免疫系細胞を体外免疫法によりｒｈＴｆＲで免疫することによっても，ｈＴｆＲに対する抗体を産生する細胞を取得できる。体外免疫法を用いる場合，その免疫系細胞が由来する動物種に特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，モルモット，イヌ，ネコ，ウマ，及びヒトを含む霊長類であり，より好ましくは，マウス，ラット及びヒトであり，更に好ましくはマウス及びヒトである。マウスの免疫系細胞としては，例えば，マウスの脾臓から調製した脾細胞を用いることができる。ヒトの免疫系細胞としては，ヒトの末梢血，骨髄，脾臓等から調製した細胞を用いることができる。ヒトの免疫系細胞を体外免疫法により免疫した場合，ｈＴｆＲに対するヒト抗体を得ることができる。
【００４０】
体外免疫法により免疫系細胞を免疫した後，細胞をミエローマ細胞と融合させることにより，抗体産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製することができる。また，免疫後の細胞からｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し，このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応により免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し，これらを用いて人工的に抗体遺伝子を再構築することもできる。
【００４１】
上記方法により得られたままのハイブリドーマ細胞には，ｈＴｆＲ以外の蛋白質を抗原として認識する抗体を産生する細胞も含まれる。また，抗ｈＴｆＲ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の全てが，ｈＴｆＲに対して高親和性示す抗ｈＴｆＲ抗体を産生するとも限らない。
【００４２】
同様に，人工的に再構築した抗体遺伝子には，ｈＴｆＲ以外の蛋白質を抗原として認識する抗体をコードする遺伝子も含まれる。また，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子の全てが，ｈＴｆＲに対して高親和性を示す抗ｈＴｆＲ抗体をコードする等の所望の特性を備えるとも限らない。
【００４３】
従って，上記で得られたままのハイブリドーマ細胞から，所望の特性（ｈＴｆＲに対する高親和性等）を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択するステップが必要となる。また，人工的に再構築した抗体遺伝子にあっては，当該抗体遺伝子から，所望の特性（ｈＴｆＲに対する高親和性等）を有する抗体をコードする遺伝子を選択するステップが必要となる。ｈＴｆＲに対して高親和性を示す抗体（高親和性抗体）を産生するハイブリドーマ細胞，又は高親和性抗体をコードする遺伝子を選択する方法として，以下に詳述する方法が有効である。なお，ｈＴｆＲに対して高親和性を示す抗体とは，実施例７に記載の方法により測定されるｈＴｆＲとの解離定数（ＫＤ）が，好ましくは１×１０−８Ｍ以下のものであり，より好ましくは１×１０−９Ｍ以下のものであり，更に好ましくは１×１０−１０以下のものであり，尚も更に好ましくは１×１０−１１以下のものである。例えば好適なもとして，解離定数が１×１０−１３Ｍ〜１×１０−９Ｍであるもの，１×１０−１３Ｍ〜１×１０−１０であるものを挙げることができる。
【００４４】
例えば，抗ｈＴｆＲ抗体に対して高親和性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する場合，組換えｈＴｆＲをプレートに添加してこれに保持させた後，ハイブリドーマ細胞の培養上清を添加し，次いで組換えｈＴｆＲと結合していない抗体をプレートから除去し，プレートに保持された抗体の量を測定する方法が用いられる。この方法によれば，プレートに添加したハイブリドーマ細胞の培養上清に含まれる抗体のｈＴｆＲに対する親和性が高いほど，プレートに保持される抗体の量が多くなる。従って，プレートに保持された抗体の量を測定し，より多くの抗体が保持されたプレートに対応するハイブリドーマ細胞を，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生する細胞株として選択することができる。この様にして選択された細胞株から，ｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し，このｃＤＮＡを鋳型として，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いて増幅することにより，高親和性抗体をコードする遺伝子を単離することもできる。
【００４５】
上記の人工的に再構築した抗体遺伝子から，高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択する場合は，一旦，人工的に再構築した抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み，この発現ベクターをホスト細胞に導入する。このとき，ホスト細胞として用いる細胞としては，人工的に再構築した抗体遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入することにより抗体遺伝子を発現させることのできる細胞であれば原核細胞，真核細胞を問わず特に限定はないが，ヒト，マウス，チャイニーズハムスター等の哺乳動物由来の細胞が好ましく，特にチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞，又はマウス骨髄腫に由来するＮＳ／０細胞が好ましい。また，抗体遺伝子をコードする遺伝子を組み込んで発現させるために用いる発現ベクターは，哺乳動物細胞内に導入させたときに，該遺伝子を発現させるものであれば特に限定なく用いることができる。発現ベクターに組み込まれた該遺伝子は，哺乳動物細胞内で遺伝子の転写の頻度を調節することができるＤＮＡ配列（遺伝子発現制御部位）の下流に配置される。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位としては，例えば，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子−１アルファ（ＥＦ−１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター等が挙げられる。
【００４６】
このような発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現ベクターに組み込まれた上述の人工的に再構築した抗体を発現するようになる。このようにして得た，人工的に再構築した抗体を発現する細胞から，抗ｈＴｆＲ抗体に対して高親和性を有する抗体を産生する細胞を選択する場合，組換えｈＴｆＲをプレートに添加してこれに保持させた後，組換えｈＴｆＲに細胞の培養上清を接触させ，次いで，組換えｈＴｆＲと結合していない抗体をプレートから除去し，プレートに保持された抗体の量を測定する方法が用いられる。この方法によれば，細胞の培養上清に含まれる抗体のｈＴｆＲに対する親和性が高いほど，プレートに保持された抗体の量が多くなる。従って，プレートに保持された抗体の量を測定し，より多くの抗体が保持されたプレートに対応する細胞を，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生する細胞株として選択することができ，ひいては，ｈＴｆＲに対して高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択できる。このようにして選択された細胞株から，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法を用いて増幅することにより，高親和性抗体をコードする遺伝子を単離することができる。
【００４７】
上記の人工的に再構築した抗体遺伝子からの，高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子の選択は，人工的に再構築した抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを大腸菌に導入し，この大腸菌を培養して得た培養上清又は大腸菌を溶解させて得た抗体を含む溶液を用いて，上述のハイブリドーマ細胞を選択する場合と同様の方法で，所望の遺伝子を有する大腸菌を選択することによってもできる。選択された大腸菌株は，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を発現するものである。この細胞株から，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択できる。大腸菌の培養上清中に抗体を分泌させる場合には，Ｎ末端側に分泌シグナル配列が結合するように抗体遺伝子を発現ベクターに組み込めばよい。
【００４８】
高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択する他の方法として，上述の人工的に再構築した抗体遺伝子にコードされた抗体をファージ粒子上に保持させて発現させる方法がある。このとき，抗体遺伝子は，一本鎖抗体をコードする遺伝子として再構築される。抗体をファージ粒子上に保持する方法は，国際公開公報（ＷＯ１９９７／０９４３６，ＷＯ１９９５／１１３１７）等に記載されており，周知である。人工的に再構築した抗体遺伝子にコードされた抗体を保持するファージから，抗ｈＴｆＲ抗体に対して高親和性を有する抗体を保持するファージを選択する場合，組換えｈＴｆＲを，プレートに添加して保持させた後，ファージを接触させ，次いでプレートから組換えｈＴｆＲと結合していないファージを除去し，プレートに保持されたファージの量を測定する方法が用いられる。この方法によれば，ファージ粒子上に保持された抗体のｈＴｆＲに対する親和性が高いほど，プレートに保持されたファージの量が多くなる。従って，プレートに保持されたファージの量を測定し，より多くのファージが保持されたプレートに対応するファージ粒子を，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生するファージ粒子として選択することができ，ひいては，ｈＴｆＲに対して高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択できる。このようにして選択されたファージ粒子から，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法を用いて増幅することにより，高親和性抗体をコードする遺伝子を単離することができる。
【００４９】
酵素免疫測定法（ＥＩＡ，ＥＬＩＳＡ）を用いた直接及び間接サンドイッチアッセイ，フローサイトメトリー，表面プラズモン共鳴法（以下「ＳＰＲ法」という），バイオレイヤー干渉法（以下「ＢＬＩ法」という），又は免疫沈降アッセイ等の周知の結合アッセイを用い，ｈＴｆＲに対して高親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択することができる。当該高親和性抗体産生細胞からｃＤＮＡを調製し，これを鋳型として，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖，又は抗ｈＴｆＲ抗体である一本鎖抗体の，全て又はその一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法等により増幅して単離することができる。同様にして，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法等により増幅して単離することもできる。
【００５０】
この高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の全てまたはその一部を，発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを用いて哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換し，得られた形質転換細胞を培養することにより，高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生させることができる。単離された抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子の塩基配列から抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列を翻訳し，このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を人工的に合成することもできる。ＤＮＡ断片を人工的に合成する場合，適切なコドンを選択することにより，ホスト細胞における抗ｈＴｆＲ抗体の発現量を増加させることもできる。
【００５１】
元の抗ｈＴｆＲ抗体にアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えるために，単離されたＤＮＡ断片に含まれる抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子に，適宜変異を加えることもできる。変異を加えた後の抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子は，元の遺伝子と，好ましくは８０％以上の相同性を有するものであり，より好ましくは９０％以上の相同性を有するものであるが，相同性に特に制限はない。アミノ酸配列に変異を加えることにより，抗ｈＴｆＲ抗体と結合する糖鎖の数，糖鎖の種類を改変し，生体内における抗ｈＴｆＲ抗体の安定性を増加させることもできる。
【００５２】
抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子に変異を加える場合にあっては，変異を加えた後の遺伝子は，元の遺伝子と，好ましくは８０％以上の相同性を有するものであり，より好ましくは９０％以上の相同性を有するものであるが，相同性に特に制限はない。軽鎖の可変領域のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，更により好ましくは１〜２個である。軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個であり，より好ましくは１〜５個であり，更に好ましくは１〜３個であり，更により好ましくは１〜２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。軽鎖の可変領域にアミノ酸を付加する場合，軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，更により好ましくは１〜２個アミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は，元の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。特に，ＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個，より好ましくは１〜３個，更に好ましくは１〜２個であり，更により好ましくは１個である。ＣＤＲのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１〜２個であり，更により好ましくは１個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。アミノ酸を付加する場合，当該アミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１〜５個，より好ましくは１〜３個，更に好ましくは１〜２個，更により好ましくは１個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた各ＣＤＲのアミノ酸配列は，元の各ＣＤＲのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。
【００５３】
抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子に変異を加える場合にあっては，変異を加えた後の遺伝子は，元の遺伝子と，好ましくは８０％以上の相同性を有するものであり，より好ましくは９０％以上の相同性を有するものであるが，相同性に特に制限はない。重鎖の可変領域のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，尚も更に好ましくは１〜２個である。重鎖の可変領域のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，尚も更に好ましくは１〜２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。重鎖の可変領域にアミノ酸を付加する場合，重鎖の可変領域のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，更により好ましくは１〜２個アミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた重鎖の可変領域のアミノ酸配列は，元の重鎖の可変領域のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。特に，ＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１〜２個であり，更により好ましくは１個である。ＣＤＲのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１〜２個であり，更により好ましくは１個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。アミノ酸を付加する場合，当該アミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１〜５個，より好ましくは１〜３個，更に好ましくは１〜２個，更により好ましくは１個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた各ＣＤＲのアミノ酸配列は，元の各ＣＤＲのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。
【００５４】
上記の抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の可変領域への変異と，上記の抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域への変異とを組み合わせて，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と重鎖の可変領域の両方に変異を加えることもできる。
【００５５】
上記の抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸による置換としては，例えば，酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸との相互の置換，アミド型アミノ酸であるアスパラギンとグルタミンとの相互の置換，塩基性アミノ酸であるリシンとアルギニンとの相互の置換，分枝アミノ酸であるバリン，ロイシン及びイソロイシンとの相互の置換，脂肪族アミノ酸であるグリシンとアラニンとの相互の置換，ヒドロキシアミノ酸であるセリンとトレオニンとの相互の置換，芳香族アミン酸であるフェニルアラニンとチロシンとの相互の置換等が挙げられる。
【００５６】
なお，抗ｈＴｆＲ抗体に変異を加えてＣ末端又はＮ末端にアミノ酸を付加した場合において，その付加したアミノ酸が，抗ｈＴｆＲ抗体をＢＤＮＦと融合させたときに抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの間に位置することとなった場合，当該付加したアミノ酸は，リンカーの一部を構成する。抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質において，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの間に配置されるリンカー配列については後に詳述する。
【００５７】
上記の方法等によって選択されたｈＴｆＲに対して比較的高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生する細胞を培養して得られる抗ｈＴｆＲ抗体，及び，高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を発現させて得られる抗ｈＴｆＲ抗体は，そのアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を導入することにより所望の特性を有する抗体に改変させることもできる。抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列への変異の導入は，そのアミノ酸配列に対応する遺伝子に変異を加えることによって行われる。
【００５８】
抗ｈＴｆＲ抗体は，その抗体の可変領域のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えることにより，抗体のｈＴｆＲに対する親和性を適宜調整することができる。例えば，抗体と抗原との親和性が高く，水性液中での解離定数が著しく低い場合，これを生体内に投与したときに，抗体が抗原と解離せず，その結果，機能上の不都合が生じる可能性がある。このような場合に，抗体の可変領域に変異を導入することにより，解離定数を，元の抗体の２〜５倍，５〜１０倍，１０〜１００倍等と段階的に調整し，目的に合致した最も好ましい抗体を獲得し得る。逆に，当該変異の導入により，解離定数を，元の抗体の１／２〜１／５倍，１／５〜１／１０倍，１／１０〜１／１００倍等と段階的に調整することもできる。
【００５９】
抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列への置換，欠失，付加等の変異の導入は，例えば，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を鋳型にして，ＰＣＲ等の方法により，遺伝子の塩基配列の特定の部位に変異を導入するか，又はランダムに変異を導入することにより行うことができる。
【００６０】
抗体とｈＴｆＲとの親和性の調整を目的とした，抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列への変異の導入は，例えば，一本鎖抗体である抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子をファージミドに組み込み，このファージミドを用いてカプシド表面上に一本鎖抗体を発現させたファージを作製し，変異原等を作用させることにより一本鎖抗体をコードする遺伝子上に変異を導入させながらファージを増殖させ，増殖させたファージから，所望の解離定数を有する一本鎖抗体を発現するファージを，上述の方法により選択するか，又は一定条件下で抗原カラムを用いて精製することにより，得ることができる。
【００６１】
前記ハイブリドーマ細胞により産生される抗体は，実施例７に記載の方法により測定されるｈＴｆＲとの解離定数（ＫＤ）が，好ましくは１×１０−８Ｍ以下であるものであり，より好ましくは１×１０−９Ｍ以下であるものであり，更に好ましくは１×１０−１０Ｍ以下のものであり，尚も更に好ましくは１×１０−１１Ｍ以下のものである。例えば好適なもとして，解離定数が１×１０−１３Ｍ〜１×１０−９Ｍであるもの，１×１０−１３Ｍ〜１×１０−１０Ｍであるものを挙げることができる。抗体が一本鎖抗体であっても同様である。一旦得られた抗体は，その抗体をコードする遺伝子に変異を導入する等して，所望の特性を有するように適宜改変することができる。
【００６２】
抗ｈＴｆＲ抗体から，サルのＴｆＲに対する親和性を有する抗体を選択することにより，ヒト及びサルのＴｆＲの何れにも親和性を有する抗体を得ることができる。サルのＴｆＲに対する親和性を有する抗体は，例えば，遺伝子組換え技術を用いて作製した組換えサルＴｆＲを用いたＥＬＩＳＡ法等により選択することができる。このＥＬＩＳＡ法では，組換えサルＴｆＲをプレートに添加してこれに保持させた後，抗ｈＴｆＲ抗体を接触させ，次いで組換えサルＴｆＲと結合していない抗体をプレートから除去し，プレートに保持された抗体の量を測定する。組換えサルＴｆＲに対する親和性が高いほどプレートに保持される抗体の量が多くなるので，より多くの抗体が保持されたプレートに対応する抗体を，サルＴｆＲに親和性を有する抗体として選択することができる。なお，ここでいう「サル」とは，好ましくはヒトを除く真猿類に分類されるものであり，より好ましくはオナガザル科に分類されるものであり，更に好ましくはマカク属に分類されるものであり，例えば，カニクイザル又はアカゲザルであり，特にカニクイザルは，評価に用いる上で都合が良い。
【００６３】
ヒト及びサルのｈＴｆＲのいずれにも親和性を有する抗体は，この抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質を投与したときの生体内での動態を，サルを用いて観察できるという有利な効果を有する。例えば，本発明の抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦの融合蛋白質を医薬開発する場合，当該医薬の薬物動態試験をサルで実施できるため，当該医薬の開発を著しく促進することができる。
【００６４】
ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗体であって，ヒト及びサルのＴｆＲのいずれにも親和性を有する抗体は，実施例７に記載の方法により測定されるサルのＴｆＲとの解離定数が，好ましくは５×１０−８Ｍ以下のものであり，より好ましくは２×１０−８Ｍ以下のものであり，更に好ましくは１×１０−８Ｍ以下のものである。例えば好適なものとして，解離定数が１×１０−１３Ｍ〜２×１０−８Ｍのもの，１×１０−１３Ｍ〜２×１０−８Ｍのものを挙げることができる。抗体が一本鎖抗体であっても同様である。
【００６５】
上記の高親和性抗体を産生する細胞を選択する方法により得られた，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗体は，ヒト以外の動物の抗体である場合，ヒト化抗体とすることができる。ヒト化抗体とは，抗原に対する特異性を維持しつつ，ヒト以外の動物の抗体の可変領域の一部（例えば，特にＣＤＲの全部又は一部）のアミノ酸配列を用い，ヒト抗体の適切な領域を，当該配列で置き換えること（ヒト抗体への当該配列の移植）により得られる抗体のことである。例えば，ヒト化抗体として，ヒト抗体を構成する免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を，他の哺乳動物のＣＤＲで置き換えた抗体が挙げられる。ヒト抗体に組み込まれるＣＤＲが由来する生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，ヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウス及びラットであり，更に好ましくはマウスである。
【００６６】
ヒト化抗体の作製法は，当該技術分野で周知であり，ウインター（Winter）らが考案した，ヒト抗体の可変領域にある相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を，非ヒト哺乳動物の抗体のＣＤＲに置き換える方法（Verhoeyen M. Science. 239. 1534-1536 (1988)）に基づくものが，最も一般的である。ここで，非ヒト哺乳動物の抗体のＣＤＲのみならず，ＣＤＲの構造保持あるいは抗原との結合に関与しているＣＤＲ外の領域のアミノ酸配列により，アクセプターとなるヒト抗体の対応する箇所を置き換えることが，ドナー抗体の持つ本来の活性を再現するために必要である場合があることも周知である（Queen C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86. 10029-10033 (1989)。ここで，ＣＤＲ外の領域は，フレームワーク領域（ＦＲ）ともいう。
【００６７】
ヒト化抗体の作製は，ヒト抗体の可変領域ＣＤＲ（と場合によりその周辺のＦＲ）に代えて，非ヒト哺乳動物の抗体のＣＤＲ（と場合によりその周辺のＦＲ）を移植する作業を含む。この作業において，元となるヒト抗体の可変領域のフレームワーク領域は，生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公共のDNAデータベース等から得ることができる。例えば，ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は，「VBase」ヒト生殖細胞系配列データベース（インターネットにおいてwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで入手可能）から選択することができる。この他，公表された文献，例えば「Kabat EA. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 米国保健福祉省, NIH Publication No. 91-3242 (1991)」，「Tomlinson IM. J. Mol. Biol. 227. 776-98 (1992)」，「Cox JPL. Eur. J Immunol. 24:827-836 (1994)」等に記載されたＤＮＡ配列及びアミノ酸配列から選択することもできる。
【００６８】
以上のように，ヒト化抗体において，元のヒト抗体の可変領域に移植される非ヒト哺乳動物の抗体は領域は，一般に，ＣＤＲそれ自体，又はＣＤＲとの周辺のＦＲを含む。但し，ＣＤＲとともに移植されるＦＲも，ＣＤＲの構造保持あるいは抗原との結合に関与しており，実質的に抗体の相補性を決定する機能を有すると考えられることから，本発明において「ＣＤＲ」の語は，ヒト化抗体を作製する場合に，非ヒト哺乳動物の抗体からヒト化抗体に移植される領域，又は移植され得る領域のことをいう。即ち，ＣＤＲには，一般にＦＲとされる領域であっても，それがＣＤＲの構造保持あるいは抗原との結合に関与しており，実質的に抗体の相補性を決定する機能を有していると考えられるものである限り，本発明においてはＣＤＲに含まれる。
【００６９】
本発明における抗ｈＴｆＲ抗体は，これを静脈注射等により生体内に投与した場合，脳内の毛細血管の内皮細胞上に存在するｈＴｆＲに効率良く結合することができる。また，ｈＴｆＲと結合した抗体は，エンドサイトーシス，トランスサイトーシス等の機構により血液脳関門を通過して脳内に取り込まれる。従って，ＢＤＮＦを本発明の抗ｈＴｆＲ抗体と結合させておくことにより，ＢＤＮＦに効率良く血液脳関門を通過させて脳内に到達させることができる。また，本発明の抗ｈＴｆＲ抗体は，血液脳関門を通過した後に，大脳の脳実質，海馬の神経様細胞，小脳のプルキンエ細胞等に，または少なくともこれらのいずれかに到達できる。そして，大脳の線条体の神経様細胞及び中脳の黒質の神経様細胞へ到達することも予想される。従って，ＢＤＮＦを，本発明の抗ｈＴｆＲ抗体と結合させることにより，これら組織又は細胞に到達させることができる。
【００７０】
通常であれば血液脳関門を通過することができず，そのため静脈内投与では脳内で機能させることができないＢＤＮＦを，血中から脳内に到達させて脳内で機能を発揮させる上で，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦの融合蛋白質を用いることは有効な手段となり得る。特に，本発明の抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦの融合蛋白質は，血液脳関門を通過した後に，大脳の脳実質，海馬の神経様細胞，小脳のプルキンエ細胞等に，または少なくともこれらのいずれかに到達する。そして，大脳の線条体の神経様細胞及び中脳の黒質の神経様細胞へ到達することも予想される。従って，ＢＤＮＦを本発明の抗ｈＴｆＲ抗体分子と結合した形として静脈内投与等により血中投与することにより，これら脳の組織又は細胞においてＢＤＮＦの機能を発揮させ又は強化することが可能となる。
【００７１】
本明細書において，ＢＤＮＦは1982年にBardeらによって発見され，1990年にJonesらによってクローニングされた公知の蛋白質であり（EMBO J, (1982) 1:549-553,Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 8060-8064），一例として，配列番号２４７のヒト成熟ＢＤＮＦのアミノ酸配列を示すが，これと実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質や，他の温血動物（例えば，モルモット，ラット，マウス，ニワトリ，ウサギ，イヌ，ブタ，ヒツジ，ウシ，サルなど）由来のＢＤＮＦであってもよい。
【００７２】
また，本明細書において，ＢＤＮＦとは，ヒト成熟ＢＤＮＦを示す特定のアミノ酸配列（配列番号２４７）で表される「蛋白質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく，これらと同質の機能を有することを限度として，その同族体（ホモログやスプライスバリアント），変異体，誘導体及びアミノ酸修飾体なども包含される。
【００７３】
ここで「同質の機能」とは，例えば生理学的に，あるいは薬理学的にみて，その性質が定性的に同じであることを意味し，機能の程度（例，約０．１〜約１０倍，好ましくは０．５〜２倍）や，蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。また，天然のＢＤＮＦが有している機能，例えば，（１）ＢＤＮＦ受容体（ＴｒｋＢ）に対する結合親和性，（２）ＢＤＮＦ受容体のリン酸化活性，（３）神経細胞に対する増殖促進作用，（４）神経細胞に対する生存維持作用，（５）神経細胞に対する神経突起伸展作用を有するか，又は（６）配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る蛋白質を，ＢＤＮＦと「同質の機能を有する蛋白質」と見なす。
【００７４】
上述したＢＤＮＦの機能は，後述の（２）「ＢＤＮＦの機能」の項に記載したような公知の種々の評価方法や，本明細書の実施例１８〜２２に記載した方法を用いて，調べることができる。
【００７５】
ここでホモログとしては，ヒトの蛋白質に対応するマウスやラットなど他生物種の蛋白質が例示でき，これらはMaisonpierre等（Genomics (1991) 10: 558-568）により報告されているものの他，UniProtに掲載された蛋白質のアミノ酸配列（P21237-1, P23363-1, P25429-1, Q7YRB4-1, P14082-1, Q5IS78-1,Q95106-1）等から演繹的に同定することができる。また変異体には，天然に存在するアレル変異体，天然に存在しない変異体，及び人為的に欠失，置換，付加または挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお，上記変異体としては，変異のない蛋白質または（ポリ）ペプチドと，少なくとも７０％，好ましくは８０％，より好ましくは９０％，さらにより好ましくは９５％，いっそう好ましくは９７％，特に好ましくは９８％，最も好ましくは９９％相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には，天然に存在するアミノ酸修飾体，天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され，具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。
【００７６】
更に，本明細書において，「ＢＤＮＦ」とは，ＢＤＮＦと同質の機能を発揮し得る上記ＢＤＮＦの前駆体（プレプロ体）または当該前駆体からシグナル配列が切断されたプロ体であってもよく，ヒトＢＤＮＦ前駆体を示す特定のアミノ酸配列（UniProt ID No.P23560-1）で示される「蛋白質」または「（ポリ）ペプチド」だけでなく，これらと同質の機能を有することを限度として，その同族体（ホモログやスプライスバリアント），変異体，誘導体，プロ体及びアミノ酸修飾体などが包含される。ヒトＢＤＮＦのプロ体（プロＢＤＮＦ）としては，配列番号２５６のアミノ酸配列が挙げられる。
【００７７】
ここでＢＤＮＦ前駆体と同質の機能とは，ＢＤＮＦ前駆体が有する機能，例えばＢＤＮＦのプロ体（プロＢＤＮＦ）又は成熟ＢＤＮＦを生成し得ることを意味し，ＢＤＮＦのプロ体と同質の機能とは，ＢＤＮＦのプロ体が有する機能，例えばｐ７５受容体に対する結合親和性を意味する。
【００７８】
ここでヒトＢＤＮＦ前駆体のスプライスバリアントとしては，UniProtに掲載された蛋白質のアミノ酸配列（P23560-2,P23560-3,P23560-4,P23560-5）などを挙げることができる。また，これらのヒトＢＤＮＦ前駆体蛋白質をコードする遺伝子も公知であり，例えば，http://www.ncbi.nlm.nih.govに掲載された遺伝子の塩基配列（NM_001143805.1, NM_001143806.1, NM_001143807.1, NM_001143808.1, NM_001143809.1, NM_001143810.1, NM_001143811.1, NM_001143812.1, NM_001143813.1, NM_001143814.1, NM_001143816.1, NM_001709.4, NM_170731.4, NM_170732.4, NM_170733.3, NM_170734.3, NM_170735.5）等を挙げることができる。
【００７９】
ＢＤＮＦ前駆体のホモログおよびそのスプライスバリアントとしては，ヒトの蛋白質に対応するマウスやラットなど他生物種の蛋白質およびそのスプライスバリアントが例示でき，これらはhttp://www.ncbi.nlm.nih.govに掲載された遺伝子の塩基配列（NM_001048139.1, NM_001048141.1, NM_001048142.1, NM_001285416.1, NM_001285417.1, NM_001285418.1, NM_001285419.1, NM_001285420.1, NM_001285421.1, NM_001285422.1, NM_007540.4等のマウスＢＤＮＦ遺伝子の塩基配列，NM_001270630.1, NM_001270631.1, NM_001270632.1, NM_001270633.1, NM_001270634.1, NM_001270635.1, NM_001270636.1, NM_001270637.1, NM_001270638.1, NM_012513.4等のラットＢＤＮＦ遺伝子の塩基配列）等から演繹的に同定することができる。
【００８０】
またＢＤＮＦ前駆体の変異体には，天然に存在するアレル変異体，天然に存在しない変異体，及び人為的に欠失，置換，付加または挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお，上記変異体としては，変異のない蛋白質または（ポリ）ペプチドと，少なくとも７０％，好ましくは８０％，より好ましくは９０％，更に好ましくは９５％，尚も更に好ましくは９７％，特に好ましくは９８％，最も好ましくは９９％相同なものを挙げることができる。またアミノ酸修飾体には，天然に存在するアミノ酸修飾体，天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され，具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。
【００８１】
配列番号２４７のアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列としては，以下の（Ａ）〜（Ｅ）が挙げられる：
（Ａ）配列番号２４７のアミノ酸配列，
（Ｂ）配列番号２４７のアミノ酸配列において，１若しくは複数のアミノ酸が欠失，付加，挿入もしくは置換され，且つ配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る，アミノ酸配列，
（Ｃ）配列番号２４７のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有し，且つ配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る，アミノ酸配列，
（Ｄ）配列番号２４６の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列，又は
（Ｅ）配列番号２４６の塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ，かつ配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る，アミノ酸配列。
【００８２】
具体的には，配列番号２４７のアミノ酸配列からなるヒト蛋白質の他の哺乳動物におけるオルソログのアミノ酸配列，又は配列番号２４７のアミノ酸配列からなるヒト蛋白質もしくはそのオルソログのスプライスバリアント，アレル変異体もしくは多型バリアントにおけるアミノ酸配列が挙げられる。
【００８３】
ここで「相同性」とは，当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の，最適なアラインメント（好ましくは，該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における，オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸及び類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し，例えば，芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ），脂肪族アミノ酸（Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ），極性アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ），塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ），酸性アミノ酸（Ｇｌｕ，Ａｓｐ），水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ），側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は，蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち，保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり，種々の文献に記載されている（例えば，Bowieら, Science, 247:1306-1310(1990)を参照）。
【００８４】
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は，相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い，以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては，例えば，Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877(1993) に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら， Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402(1997)）］，Needlemanら, J. Mol. Biol., 48: 444-453(1970) に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］，Myerｓ及びMiller, CABIOS, 4: 11-17(1988) に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（version 2.0）に組み込まれている］，Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448(1988) に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ，それらも同様に好ましく用いられ得る。
【００８５】
上記（Ｅ）におけるストリンジェントな条件とは，例えば，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,6.3.1-6.3.6, 1999に記載される条件，例えば，６×ＳＳＣ（sodium chloride/sodium citrate）／４５℃でのハイブリダイゼーション，次いで０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ／５０〜６５℃での一回以上の洗浄等が挙げられるが，当業者であれば，これと同等のストリンジェンシーを与えるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することができる。
【００８６】
より好ましくは，「配列番号２４７のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」として，配列番号２４７のアミノ酸配列と，約７０％以上，好ましくは約８０％以上，より好ましくは約９０％以上，更に好ましくは約９５％以上，尚も更に好ましくは約９７％以上，特に好ましくは約９８％以上，最も好ましくは約９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
【００８７】
本発明における蛋白質：ＢＤＮＦとして，例えば，
（ｉ）配列番号２４７のアミノ酸配列中の１〜３０個，好ましくは１〜２０個，より好ましくは１〜１０個，更に好ましくは１〜数（６，５，４，３若しくは２）個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列，
（ｉｉ）配列番号２４７のアミノ酸配列に１〜３０個，好ましくは１〜２０個，より好ましくは１〜１０個，更に好ましくは１〜数（６，５，４，３若しくは２）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列，
（ｉｉｉ）配列番号２４７のアミノ酸配列に１〜３０個，好ましくは１〜２０個，より好ましくは１〜１０個，更に好ましくは１〜数（６，５，４，３若しくは２）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列，
（ｉｖ）配列番号２４７のアミノ酸配列中の１〜３０個，好ましくは１〜２０個，より好ましくは１〜１０個，さらに好ましくは１〜数（６，５，４，３若しくは２）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列，又は
（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質などのいわゆるムテインも含まれる。
【００８８】
上記のようにアミノ酸配列が挿入，欠失，付加又は置換されている場合，その挿入，欠失，付加又は置換の位置は，そのような変更が加えられた蛋白質が，配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する，あるいは配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る限り，特に限定されない。例えば，配列番号２４７のアミノ酸配列から成る成熟ＢＤＮＦの他，そのＮ末端にメチオニンの付加したＭｅｔ−ＢＤＮＦ等も，配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する限り，ＢＤＮＦとして本発明の融合蛋白質に使用しうる。
【００８９】
ここでアミノ酸の欠失，付加，挿入又は置換を人為的に行う場合の手法としては，例えば，配列番号２４７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して慣用の部位特異的変異導入を施し，その後このＤＮＡを常法により発現させる手法が挙げられる。ここで部位特異的変異導入法としては，例えば，アンバー変異を利用する方法（ギャップド・デュプレックス法，Nucleic Acids Res., 12,9441-9456(1984)），変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
【００９０】
ＢＤＮＦの好ましい例としては，例えば，配列番号２４７のアミノ酸配列からなるヒト蛋白質，又はそのアレル変異体若しくは多型バリアントなどがあげられる。
【００９１】
「ＢＤＮＦをコードする遺伝子」は，上記（Ａ）〜（Ｅ）で示される，配列番号２４７のアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を表す。具体的には，以下の（Ｆ）〜（Ｊ）：
（Ｆ）配列番号２４７のアミノ酸配列をコードする塩基配列，
（Ｇ）配列番号２４７のアミノ酸配列において，１又は複数のアミノ酸が欠失，付加，挿入若しくは置換され，且つ配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得るアミノ酸配列をコードする塩基配列，
（Ｈ）配列番号２４７のアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有し，かつ，配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得るアミノ酸配列をコードする塩基配列，
（Ｉ）配列番号２４６の塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をコードする塩基配列，又は
（Ｊ）配列番号２４６の塩基配列を有するＤＮＡに対し相補性を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡによりコードされ，かつ配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号２４７のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得るアミノ酸配列をコードする塩基配列，を有する遺伝子が挙げられる。
【００９２】
尚，ここで遺伝子とは，ｃＤＮＡ若しくはゲノムＤＮＡ等のＤＮＡ，又はｍＲＮＡ等のＲＮＡのいずれでもよく，また一本鎖の核酸配列及び二本鎖の核酸配列を共に含む概念である。また，本明細書において，配列番号１６５，配列番号１７３，配列番号１８１，配列番号１８９，配列番号１９７，配列番号１９９，配列番号２０１，配列番号２０３，配列番号２１１，列番号２１３，配列番号２４６，配列番号２４９，配列番号２５１，配列番号２５３等に示される核酸配列は，便宜的にＤＮＡ配列であるが，ｍＲＮＡなどＲＮＡ配列を示す場合には，チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）として解する。
【００９３】
また，本発明に使用されるＢＤＮＦとしては，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の蛋白質安定化作用を有する分子等で修飾された誘導体などであってもよい（Drug Delivery System (1998); 13:173-178）。
【００９４】
本発明における抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の一例として，抗ｈＴｆＲ抗体を構成する「重鎖」のＣ末端に，リンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して，ヒトＢＤＮＦが融合しているタイプのものが挙げられる。このような融合蛋白質として，
（１）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が配列番号１６４のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖がそのＣ末端側で，リンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，全体として配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有するもの；
（２）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が配列番号１８０のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖がそのＣ末端側で，リンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，全体として配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有するもの；
（３）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号１９６のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，リンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，全体として配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有するものである，融合蛋白質；及び
（４）該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号１９６のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，リンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸配列からなるリンカー配列を介して，ヒトＢＤＮＦと結合しており，全体として配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有するものである，融合蛋白質，
が例示できる。
【００９５】
上記の（１）〜（４）に記載の融合蛋白質は，
（１）配列番号１６４のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，配列番号１７２のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側にリンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して配列番号２４７で示されるヒトＢＤＮＦが結合したものとを含む，融合蛋白質；
（２）配列番号１８０のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，配列番号１８８のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側にリンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して配列番号２４７で示されるヒトＢＤＮＦが結合したものとを含む，融合蛋白質；
（３）配列番号１９６のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，配列番号２１０のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側にリンカー配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介して配列番号２４７で示されるヒトＢＤＮＦが結合したものとを含む，融合蛋白質；及び
（４）配列番号１９６のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，配列番号２１０のアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側にアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して配列番号２４７で示されるヒトＢＤＮＦが結合したものとを含む，融合蛋白質，
である。
【００９６】
このような融合蛋白質は，例えば，配列番号２５０のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２５１）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターと，配列番号１８０のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖をコードする塩基配列（配列番号１８１）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターで，哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換させ，このホスト細胞を培養することにより製造することができる。
【００９７】
本発明における，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の更なる具体的な態様の一例として，抗ｈＴｆＲ抗体重鎖のＣ末端側に，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，ヒトＢＤＮＦを融合させたものが挙げられる。このような融合蛋白質として，軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列からなり，且つ重鎖のＣ末端側に当該リンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合してなるペプチドが，配列番号２５４のアミノ酸配列からなるものが，例示できる。
【００９８】
このような融合蛋白質は，例えば，配列番号２５４のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２５５）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターと，配列番号１９６のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖をコードする塩基配列（配列番号１９７）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターで，哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換させ，このホスト細胞を培養することにより製造することができる。
【００９９】
なお，配列番号２５４のアミノ酸配列で示される蛋白質は，配列番号２１０に記載の抗ｈＴｆＲ抗体重鎖のＣ末端側に，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，ヒトＢＤＮＦが結合したものである。ここで，抗ｈＴｆＲ抗体重鎖として，配列番号２１０のものに代えて配列番号１８８のものを用いてもよく，その場合，抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖としては，配列番号１９６のものが好適に用いられる。またここで，抗ｈＴｆＲ抗体重鎖として，配列番号２１０のものに代えて配列番号１７２のものを用いてもよく，その場合，抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖としては，配列番号１６４のものが好適に用いられる。
【０１００】
ヒトＢＤＮＦを結合させる抗ｈＴｆＲ抗体の１つの好ましい態様としては，該抗体の抗原結合性断片，具体的には，一本鎖抗体，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２等が挙げられる。
【０１０１】
抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体である場合の，本発明におけるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の具体的な態様の一例として，ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸からなる第１のリンカー配列を介して，一本鎖抗体が結合したものである，配列番号２５９又は２６０のアミノ酸配列からなるものが例示できる。ここで，一本鎖抗体は，配列番号２０５のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体重鎖の可変領域のＣ末端に，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）が３個連続してなる計１５個のアミノ酸からなる第２のリンカー配列を介して，配列番号１９１のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖の可変領域が結合したものである，配列番号２５７のアミノ酸配列を有するものである。従って，抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体である場合の，本発明におけるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の具体的な態様の一例として，配列番号２０５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と配列番号１９１のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体のＮ末端側に，直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質が挙げられる。
【０１０２】
抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体であるこのような融合蛋白質は，例えば，配列番号２５９のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２５８）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターで哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換させ，このホスト細胞を培養することにより製造することができる。
【０１０３】
なお，本発明において，１つのペプチド鎖に複数のリンカー配列が含まれる場合，便宜上，各リンカー配列はＮ末端側から順に，第１のリンカー配列，第２のリンカー配列という。
【０１０４】
抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂである場合における，本発明のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の具体的な態様の一例として，ヒトＢＤＮＦのＣ末端側に，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，抗ｈＴｆＲ抗体重鎖の可変領域とＣＨ１領域を含む領域を融合させたものが挙げられる。このときＣＨ１領域に加えてヒンジ部の一部が含まれてもよいが，当該ヒンジ部は重鎖間のジスフィルド結合を形成するシステイン残基を含まない。配列番号２６３及び２６４のものは，その好適な一例である。配列番号２６３及び２６４における抗ｈＴｆＲ抗体重鎖のアミノ酸配列は，配列番号２１０で示されるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のアミノ酸配列のＮ末端から１番目〜２２６番目の部分に相当するアミノ酸配列（配列番号２６１）からなる。なお，配列番号２１０のＮ末端から１番目〜１１８番目の部分が，配列番号２０５（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列２）に相当し，１１９番目〜２１６番目の部分がＣＨ１領域に相当し，２１７番目〜２２６番目の部分がヒンジ部に相当する。抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂである場合の，本発明におけるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の具体的な態様の一例として，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）２又はＦ（ａｂ’）のいずれかの重鎖のＮ末端側に，直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質が好適な一態様として挙げられる。
【０１０５】
抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂである場合の，本発明におけるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦとの融合蛋白質の具体的な態様の一例として，軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列からなり，且つ重鎖が配列番号２６１のアミノ酸配列からなるＦａｂ重鎖であり，該重鎖のＮ末端側に直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質が挙げられる。さらに具体的には，軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列からなり，且つＦａｂ重鎖とそのＮ末端側に直接又はリンカーを介して結合したヒトプロＢＤＮＦとからなる部分が配列番号２６３のアミノ酸配列からなるものである，融合蛋白質；軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列からなり，且つＦａｂ重鎖とそのＮ末端側に直接又はリンカーを介して結合したヒトＢＤＮＦとからなる部分が配列番号２６４のアミノ酸配列からなるものである；融合蛋白質，が挙げられる。
【０１０６】
抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂであるこのような融合蛋白質は，例えば，配列番号２６３のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２６２）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターと，配列番号１９６のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖をコードする塩基配列（配列番号１９７）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターで，哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換させ，このホスト細胞を培養することによっても製造することができる。
【０１０７】
抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂであるこのような融合蛋白質は，例えば，配列番号２６４のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列番号２６５）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターと，配列番号１９６のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖をコードする塩基配列（配列番号１９７）を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターで，哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換させ，このホスト細胞を培養することによっても製造することができる。
【０１０８】
なお，ヒトＢＤＮＦ（ｈＢＤＮＦ）に変異を加えてＣ末端又はＮ末端にアミノ酸を付加した場合において，その付加したアミノ酸が，ｈＢＤＮＦを抗ｈＴｆＲ抗体と融合させたときにｈＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との間に位置することとなった場合，当該付加したアミノ酸は，リンカーの一部を構成する。
【０１０９】
抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとを結合させる方法としては，非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーを介して結合させる方法がある。非ペプチドリンカーとしては，ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール，エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体，ポリオキシエチル化ポリオール，ポリビニルアルコール，多糖類，デキストラン，ポリビニルエーテル，生分解性高分子，脂質重合体，キチン類，及びヒアルロン酸，又はこれらの誘導体，若しくはこれらを組み合わせたものを用いることができる。ペプチドリンカーは，ペプチド結合した１〜５０個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖若しくはその誘導体であって，そのＮ末端とＣ末端が，それぞれ抗ｈＴｆＲ抗体又はＢＤＮＦの何れかと共有結合を形成することにより，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとを結合させるものである。
【０１１０】
非ペプチドリンカーとしてＰＥＧを用いて本発明の抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとを結合させたものは，特に，抗ｈＴｆＲ抗体−ＰＥＧ−ＢＤＮＦという。抗ｈＴｆＲ抗体−ＰＥＧ−ＢＤＮＦは，抗ｈＴｆＲ抗体とＰＥＧを結合させて抗ｈＴｆＲ抗体−ＰＥＧを作製し，次いで抗ｈＴｆＲ抗体−ＰＥＧとＢＤＮＦとを結合させることにより製造することができる。又は，抗ｈＴｆＲ抗体−ＰＥＧ−ＢＤＮＦは，ＢＤＮＦとＰＥＧとを結合させてＢＤＮＦ−ＰＥＧを作製し，次いでＢＤＮＦ−ＰＥＧと抗ｈＴｆＲ抗体を結合させることによっても製造することができる。ＰＥＧを抗ｈＴｆＲ抗体及びＢＤＮＦと結合させる際には，カーボネート，カルボニルイミダゾール，カルボン酸の活性エステル，アズラクトン，環状イミドチオン，イソシアネート，イソチオシアネート，イミデート，又はアルデヒド等の官能基で修飾されたＰＥＧが用いられる。これらＰＥＧに導入された官能基が，主に抗ｈＴｆＲ抗体及びＢＤＮＦ分子内のアミノ基と反応することにより，ＰＥＧとｈＴｆＲ抗体及びＢＤＮＦが共有結合する。このとき用いられるＰＥＧの分子量及び形状に特に限定はないが，その平均分子量（ＭＷ）は，好ましくはＭＷ＝５００〜６００００であり，より好ましくはＭＷ＝５００〜２００００である。例えば，平均分子量が約３００，約５００，約１０００，約２０００，約４０００，約１００００，約２００００等であるＰＥＧは，非ペプチドリンカーとして好適に使用することができる。
【０１１１】
例えば，抗ｈＴｆＲ抗体−ＰＥＧは，抗ｈＴｆＲ抗体とアルデヒド基変性ＰＥＧ（ＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ）とを，該抗体に対する該変性ＰＥＧのモル比が１１，１２．５，１５，１１０，１２０等になるように混合し，これにＮａＣＮＢＨ３等の還元剤を添加して反応させることにより得られる。次いで，抗ｈＴｆＲ抗体−ＰＥＧを，ＮａＣＮＢＨ３等の還元剤の存在下で，ＢＤＮＦと反応させることにより，抗ｈＴｆＲ抗体−ＰＥＧ−ＢＤＮＦが得られる。逆に，先にＢＤＮＦとＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤとを結合させてＢＤＮＦ−ＰＥＧを作製し，次いでＢＤＮＦ−ＰＥＧと抗ｈＴｆＲ抗体を結合させることによっても，抗ｈＴｆＲ抗体−ＰＥＧ−ＢＤＮＦを得ることができる。
【０１１２】
ＢＤＮＦは，その二量体が標的細胞表面上にある高親和性ＢＤＮＦ受容体に結合するため，二量体で作用すると考えられるが，抗ｈＴｆＲ抗体と結合するＢＤＮＦは，１分子であっても，２分子であってもよい。例えば，抗ｈＴｆＲ抗体に１分子のＢＤＮＦが結合してなる融合蛋白質とＢＤＮＦとを反応させて，２量体としてもよいし，抗ｈＴｆＲ抗体にＢＤＮＦが２分子結合した融合蛋白質としてもよい。また，その結合は，以下に示すように抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦをコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込んで得ることも可能であるし，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦを各々製造したのちに化学的に結合させることで作製してもよい。具体的には，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとは，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，リンカー配列を介して又は直接に，それぞれＢＤＮＦのＮ末端又はＣ末端をペプチド結合により結合させることにより，一体化させることができる。ＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質の１つの好ましい態様としては，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端側に，リンカー配列を介して又は直接に，ＢＤＮＦのＣ末端を結合させた融合蛋白質が挙げられる。
【０１１３】
前述のとおり，ヒトＢＤＮＦを結合させる抗ｈＴｆＲ抗体の１つの好ましい態様としては，該抗体の抗原結合性断片，具体的には，一本鎖抗体，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２が挙げられる。従って，ＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質の１つの好ましい態様として，以下のようなものを例示することができる。
（１）ＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質であって，該抗ｈＴｆＲ抗体が抗原結合性断片であり，この抗原結合性断片のＮ末端側に，直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質。
（２）ＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質であって，該抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体であり，この一本鎖抗体のＮ末端側に，直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質。
（３）ＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質であって，該抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，又はＦ（ａｂ’）の何れかであり，これらＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，又はＦ（ａｂ’）の重鎖又は軽鎖のＮ末端側に，直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質。
ここで，上記（３）の場合は，ヒトＢＤＮＦは，抗ｈＴｆＲ抗体のＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，又はＦ（ａｂ’）の何れかの重鎖のＮ末端側と，特に好適に結合させることができる。従って，より具体的には，以下のようなものを例示することができる。
（４）ＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質であって，該抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，又はＦ（ａｂ’）の何れかであり，これらＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）２，又はＦ（ａｂ’）の重鎖のＮ末端側に，直接又はリンカーを介してヒトＢＤＮＦが結合したものである，融合蛋白質。
【０１１４】
抗ｈＴｆＲ抗体を構成している「軽鎖」のＣ末端側にＢＤＮＦを結合させたタイプの融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，軽鎖のＣ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
【０１１５】
抗ｈＴｆＲ抗体を構成している「重鎖」のＣ末端側にＢＤＮＦを結合させたタイプの融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，重鎖のＣ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
【０１１６】
抗ｈＴｆＲ抗体を構成している「軽鎖」のＮ末端側にＢＤＮＦを結合させたタイプの融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，軽鎖のＮ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
【０１１７】
抗ｈＴｆＲ抗体を構成している「重鎖」のＮ末端側にＢＤＮＦを結合させたタイプの融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，重鎖のＮ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
【０１１８】
このような抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質は，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖又は軽鎖をコードするｃＤＮＡの３’末端側又は５’末端側に，直接に又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を介して，ＢＤＮＦをコードするｃＤＮＡ（配列番号２４６）がインフレームで配置されてなるＤＮＡ断片を，哺乳動物細胞用発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を培養することにより得ることができる。ＢＤＮＦをコードするＤＮＡ断片を重鎖と結合させる場合にあっては，抗ｈＴｆＲ抗体を構成している軽鎖をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターも同じホスト細胞に併せて導入され，またＢＤＮＦをコードするＤＮＡ断片を軽鎖と結合させる場合にあっては，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用の発現ベクターも同じホスト細胞に併せて導入される。
【０１１９】
ここで，哺乳動物細胞には，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖（又は軽鎖）のＣ末端に直接又はリンカー配列を介してＢＤＮＦを結合してなる融合蛋白質をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターと，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖（又は重鎖）をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターとを，同じホスト細胞に併せて導入することにより，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖（又は軽鎖）のＣ末端側にＢＤＮＦが結合した融合蛋白質と，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖（又は軽鎖）とからなる，融合蛋白質を作製することができる。
【０１２０】
また，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖（又は軽鎖）のＮ末端に直接又はリンカー配列を介してＢＤＮＦを結合してなる融合蛋白質をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターと，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖（又は重鎖）をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクターとを，同一のホスト細胞に導入することにより，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖（又は軽鎖）のＮ末端側にＢＤＮＦが結合してなる融合蛋白質と，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖（重鎖）とからなる融合蛋白質を作製することもできる。
【０１２１】
抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体である場合，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとを結合させてなる融合蛋白質は，ＢＤＮＦをコードするｃＤＮＡの５’末端又は３’末端に，直接又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を介して，一本鎖抗ｈＴｆＲ抗体をコードするｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を，哺乳動物細胞，酵母等の真核生物又は大腸菌等の原核生物細胞用の発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入したそれら対応する細胞中で発現させることにより，得ることができる。
【０１２２】
抗ｈＴｆＲ抗体がＦａｂである場合，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとを結合させた融合蛋白質は，ＢＤＮＦをコードするｃＤＮＡの５’末端又は３’末端に直接又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を介して当該Ｆａｂの重鎖と軽鎖の何れか一方をコードするｃＤＮＡ断片を連結してなるＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクター（哺乳動物細胞，酵母等の真核生物又は大腸菌等の原核生物細胞用）と，当該Ｆａｂ重鎖と軽鎖の他方をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターとを，同じホスト細胞に導入し，細胞中で発現させることにより，得ることができる。
【０１２３】
抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの間にリンカー配列を配置する場合，リンカー配列は，好ましくは１〜５０個のアミノ酸から構成される。ここに，アミノ酸の個数は，１〜１７個，１〜１０個，１０〜４０個，２０〜３４個，２３〜３１個，２５〜２９個，２７個等と適宜調整される。そのようなリンカー配列は，これより連結された抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲと親和性を保持し，且つ連結されたＢＤＮＦが，生理的条件下でその生理活性を発揮できる限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものである。例えば，グリシン又はセリンのいずれか１個のアミノ酸からなるもの，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４），アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５），又はこれらのアミノ酸配列が１〜１０個，あるいは２〜５個連結してなる，５０個以下のアミノ酸からなる配列，２〜１７個，２〜１０個，１０〜４０個，２０〜３４個，２３〜３１個，２５〜２９個，又は２７個のアミノ酸からなる配列等を含むものが挙げらられる。例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸配列を含むものは，リンカー配列として好適に用いることができる。
【０１２４】
抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦの融合蛋白質において，抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体である場合，免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とは，一般にリンカー配列を介して結合される。このとき，抗ｈＴｆＲ抗体のｈＴｆＲに対する親和性が保持される限り，免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合したものであってもよく，また免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合したものであってもよい。
【０１２５】
免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の間に配置されるリンカー配列は，好ましくは２〜５０個，より好ましくは８〜５０個，更に好ましくは１０〜３０個，更により好ましくは１２〜１８個又は１５〜２５個，例えば１５個若しくは２５個のアミノ酸から構成される。そのようなリンカー配列は，これにより両鎖が連結されてなる抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲと親和性を保持し，且つ当該抗体に結合したＢＤＮＦが，生理的条件下でその生理活性を発揮できる限り，アミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンのみ又はグリシンとセリンから構成されるものである。例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４），アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５），又はこれらのアミノ酸配列が２〜１０個，或いは２〜５個連続してなる配列を含むものが挙げらられる。例えば，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全領域からなるアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖の可変領域を結合させる場合，配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）が３個連続してなる計１５個のアミノ酸を含むものリンカー配列が好適である。
【０１２６】
抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの融合蛋白質の具体的な態様の一例として，抗ｈＴｆＲ抗体重鎖のＣ末端にリンカー配列としてアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒを介してヒトＢＤＮＦを融合させてなる，配列番号２５２のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。この融合蛋白質をコードする配列番号２５３の塩基配列を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターと，配列番号１９６のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖をコードする配列番号１９７の塩基配列を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターとを合わせて導入して形質転換したホスト細胞を用いることにより，抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＢＤＮＦの融合蛋白質を作製することができる。
【０１２７】
抗ｈＴｆＲ抗体が，ヒト以外の動物のものである場合，これをヒトに投与したときに，当該抗体に対する抗原抗体反応を惹起し，好ましくない副作用が生じるおそれが高い。ヒト以外の動物の抗体は，ヒト化抗体とすることにより，そのような抗原性を減少させることができ，ヒトに投与したときの抗原抗体反応に起因する副作用の発生を抑制できる。また，サルを用いた実験によれば，ヒト化抗体は，マウス抗体と比較して，血中でより安定であることが報告されており，治療効果をそれだけ長期間持続させることができると考えられる。抗原抗体反応に起因する副作用の発生は，抗ｈＴｆＲ抗体としてヒト抗体を用いることによっても抑制することができる。
【０１２８】
抗ｈＴｆＲ抗体が，ヒト化抗体又はヒト抗体である場合について，以下に更に詳しく説明する。ヒト抗体の軽鎖には，λ鎖とκ鎖がある。抗ｈＴｆＲ抗体を構成する軽鎖は，λ鎖とκ鎖のいずれであってもよい。また，ヒトの重鎖には，γ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖及びε鎖があり，それぞれ，ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＥに対応している。抗ｈＴｆＲ抗体を構成する重鎖は，γ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖及びε鎖のいずれであってもよいが，好ましくはγ鎖である。更に，ヒトの重鎖のγ鎖には，γ１鎖，γ２鎖，γ３鎖及びγ４鎖があり，それぞれ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に対応している。抗ｈＴｆＲ抗体を構成する重鎖がγ鎖である場合，そのγ鎖は，γ１鎖，γ２鎖，γ３鎖及びγ４鎖のいずれであってもよいが，好ましくは，γ１鎖又はγ４鎖である。抗ｈＴｆＲ抗体が，ヒト化抗体又はヒト抗体であり，且つＩｇＧである場合，ヒト抗体の軽鎖はλ鎖とκ鎖のいずれでもあってもよく，ヒト抗体の重鎖は，γ１鎖，γ２鎖，γ３鎖及びγ４鎖のいずれであってもよいが，好ましくは，γ１鎖又はγ４鎖である。例えば，好ましい抗ｈＴｆＲ抗体の一つの態様として，軽鎖がλ鎖であり重鎖がγ１鎖である抗ｈＴｆＲ抗体が挙げられる。
【０１２９】
抗ｈＴｆＲ抗体がヒト化抗体又はヒト抗体である場合，抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとは，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端（又はＣ末端）に，リンカー配列を介して又は直接に，ＢＤＮＦのＣ末端（又はＮ末端）をそれぞれペプチド結合により結合させることにより，連結することができる。ＢＤＮＦを抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＮ末端側（又はＣ末端側）に結合させる場合，抗ｈＴｆＲ抗体のγ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖又はε鎖のＮ末端（又はＣ末端）に，リンカー配列を介し又は直接に，ＢＤＮＦのＣ末端（又はＮ末端）がペプチド結合によりそれぞれ結合される。抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖のＮ末端側（又はＣ末端側）にＢＤＮＦを結合させる場合，抗ｈＴｆＲ抗体のλ鎖とκ鎖のＮ末端（又はＣ末端）に，リンカー配列を介し又は直接に，ＢＤＮＦのＣ末端（又はＮ末端）がペプチド結合によりそれぞれ結合される。但し，抗ｈＴｆＲ抗体が，Ｆｃ領域を欠失したものであるＦａｂ領域からなるもの又はＦａｂ領域とヒンジ部の全部若しくは一部とからなるもの（Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２）の場合，ＢＤＮＦは，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ａｂ’）を構成する重鎖又は軽鎖のＮ末端（又はＣ末端）に，リンカー配列を介して又は直接に，そのＣ末端又はＮ末端をペプチド結合によりそれぞれ結合させることができる。
【０１３０】
ヒト化抗体又はヒト抗体である抗ｈＴｆＲ抗体の「軽鎖」のＣ末端側にＢＤＮＦを結合させたタイプの融合蛋白質において，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体は，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，この軽鎖のＣ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
【０１３１】
ヒト化抗体又はヒト抗体である抗ｈＴｆＲ抗体の「重鎖」のＣ末端側にＢＤＮＦを結合させたタイプの融合蛋白質において，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体は，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，この重鎖のＣ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
【０１３２】
ヒト化抗体又はヒト抗体である抗ｈＴｆＲ抗体の「軽鎖」のＮ末端側にＢＤＮＦを結合させた融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，この軽鎖のＮ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
【０１３３】
ヒト化抗体又はヒト抗体である抗ｈＴｆＲ抗体の「重鎖」のＮ末端側にＢＤＮＦを結合させた融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ＢＤＮＦが，この重鎖のＮ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とＢＤＮＦとは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
【０１３４】
抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの間にリンカー配列を配置する場合，リンカー配列は，好ましくは１〜５０個，より好ましくは１０〜４０個，更に好ましくは２０〜３４個，例えば２７個のアミノ酸から構成される。リンカー配列を構成するアミノ酸の個数は，１〜１７個，１〜１０個，１０〜４０個，２０〜３４個，２３〜３１個，２５〜２９個，２７個等と適宜調整される。そのようなリンカー配列は，これより連結された抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲに対する親和性を保持し，連結されたＢＤＮＦが，生理的条件下でその生理活性を発揮できる限り，アミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものである。例えば，グリシン又はセリンのいずれか１個のアミノ酸からなるもの，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号４），アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号５），又はこれらのアミノ酸配列が１〜１０個，或いは２〜５個連続してなる，５０個以下のアミノ酸からなる配列，２〜１７個，２〜１０個，１０〜４０個，２０〜３４個，２３〜３１個，２５〜２９個，又は２７個のアミノ酸からなる配列等を含むものが挙げらられる。例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号３）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸配列を含むものは，リンカー配列として好適に用いることができる。
【０１３５】
抗ｈＴｆＲ抗体のｈＴｆＲに対する特異的親和性は，主に抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲのアミノ酸配列に依存する。それらのＣＤＲのアミノ酸配列は，抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲに対する特異的な親和性を有するものである限り，特に制限はない。但し，本発明の抗ｈＴｆＲ抗体は，好ましくは，実施例７に記載の方法により測定されるｈＴｆＲとの解離定数（ＫＤ）が，好ましくは１×１０−８Ｍ以下のものであり，より好ましくは１×１０−９Ｍ以下のものであり，更に好ましくは１×１０−１０Ｍ以下のものであり，尚も更に好ましくは１×１０−１１Ｍ以下のものである。例えば好適なものとして，解離定数が１×１０−１３Ｍ〜１×１０−９Ｍであるもの，１×１０−１３Ｍ〜１×１０−１０Ｍであるものを挙げることができる。また，本発明の抗ｈＴｆＲ抗体がサルＴｆＲに対しても親和性を有するものである場合，実施例７に記載の方法により測定される抗ｈＴｆＲ抗体のサルＴｆＲとの解離定数は，好ましくは５×１０−８Ｍ以下であり，より好ましくは２×１０−８Ｍ以下であり，更に好ましくは１×１０−８Ｍ以下のものである。例えば好適なものとして，解離定数が１×１０−１３Ｍ〜２×１０−８Ｍのもの，１×１０−１３Ｍ〜２×１０−８Ｍのものを挙げることができる。抗体が一本鎖抗体であっても同様である。
【０１３６】
ＢＤＮＦと融合させるべきｈＴｆＲに親和性を有する抗体の好ましい実施形態として，抗体の軽鎖のＣＤＲが以下に示す（１）〜（１４）に記載のアミノ酸配列を有するものが例示できる。すなわち，
（１）ＣＤＲ１として配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号１０のアミノ酸配列，
（２）ＣＤＲ１として配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１３若しくは配列番号１４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号１５のアミノ酸配列，
（３）ＣＤＲ１として配列番号１６又は配列番号１７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１８若しくは配列番号１９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号２０のアミノ酸配列，
（４）ＣＤＲ１として配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号２３若しくは配列番号２４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号２５のアミノ酸配列，
（５）ＣＤＲ１として配列番号２６又は配列番号２７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号２８若しくは配列番号２９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号３０のアミノ酸配列，
（６）ＣＤＲ１として配列番号３１又は配列番号３２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号３３若しくは配列番号３４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号３５のアミノ酸配列，
（７）ＣＤＲ１として配列番号３６又は配列番号３７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号４０のアミノ酸配列，
（８）ＣＤＲ１として配列番号４１又は配列番号４２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号４３若しくは配列番号４４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号４５のアミノ酸配列，
（９）ＣＤＲ１として配列番号４６又は配列番号４７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号４８若しくは配列番号４９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号５０のアミノ酸配列，
（１０）ＣＤＲ１として配列番号５１又は配列番号５２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号５３若しくは配列番号５４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号５５のアミノ酸配列，
（１１）ＣＤＲ１として配列番号５６又は配列番号５７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号５８若しくは配列番号５９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号６０のアミノ酸配列，
（１２）ＣＤＲ１として配列番号６１又は配列番号６２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号６３若しくは配列番号６４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号６５のアミノ酸配列，
（１３）ＣＤＲ１として配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号６８若しくは配列番号６９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号７０のアミノ酸配列，
（１４）ＣＤＲ１として配列番号７１又は配列番号７２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号７３若しくは配列番号７４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号７５のアミノ酸配列。
【０１３７】
ＢＤＮＦと融合させるべき，ｈＴｆＲに親和性を有する抗体のより具体的な実施形態として，抗体の軽鎖のＣＤＲが以下に示す（１）〜（１４）に記載のアミノ酸配列を有するものが例示できる。すなわち，
（１）ＣＤＲ１として配列番号６，ＣＤＲ２として配列番号８，及びＣＤＲ３として配列番号１０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（２）ＣＤＲ１として配列番号１１，ＣＤＲ２として配列番号１３，及びＣＤＲ３として配列番号１５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（３）ＣＤＲ１として配列番号１６，ＣＤＲ２として配列番号１８，及びＣＤＲ３として配列番号２０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（４）ＣＤＲ１として配列番号２１，ＣＤＲ２として配列番号２３，及びＣＤＲ３として配列番号２５に記載のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（５）ＣＤＲ１として配列番号２６，ＣＤＲ２として配列番号２８，及びＣＤＲ３として配列番号３０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（６）ＣＤＲ１として配列番号３１，ＣＤＲ２として配列番号３３，及びＣＤＲ３として配列番号３５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（７）ＣＤＲ１として配列番号３６，ＣＤＲ２として配列番号３８，及びＣＤＲ３として配列番号４０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（８）ＣＤＲ１として配列番号４１，ＣＤＲ２として配列番号４３，及びＣＤＲ３として配列番号４５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（９）ＣＤＲ１として配列番号４６，ＣＤＲ２として配列番号４８，及びＣＤＲ３として配列番号５０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（１０）ＣＤＲ１として配列番号５１，ＣＤＲ２として配列番号５３，及びＣＤＲ３として配列番号５５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（１１）ＣＤＲ１として配列番号５６，ＣＤＲ２として配列番号５８，及びＣＤＲ３として配列番号６０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（１２）ＣＤＲ１として配列番号６１，ＣＤＲ２として配列番号６３，及びＣＤＲ３として配列番号６５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（１３）ＣＤＲ１として配列番号６６，ＣＤＲ２として配列番号６８，及びＣＤＲ３として配列番号７０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列
（１４）ＣＤＲ１として配列番号７１，ＣＤＲ２として配列番号７３，及びＣＤＲ３として配列番号７５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列。
【０１３８】
ＢＤＮＦと融合させるべき，ｈＴｆＲに親和性を有する抗体の好ましい実施形態として，抗体の重鎖のＣＤＲが以下に示す（１）〜（１４）に記載のアミノ酸配列を有するものが例示できる。すなわち，
（１）ＣＤＲ１として配列番号７６又は配列番号７７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号７８又は配列番号７９のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号８０又は配列番号８１のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（２）ＣＤＲ１として配列番号８２又は配列番号８３のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号８４又は配列番号８５のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号８６又は配列番号８７のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（３）ＣＤＲ１として配列番号８８又は配列番号８９のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号９０又は配列番号９１のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号９２又は配列番号９３のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（４）ＣＤＲ１として配列番号９４又は配列番号９５のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号９６又は配列番号９７のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号９８又は配列番号９９のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（５）ＣＤＲ１として配列番号１００又は配列番号１０１のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１０２又は配列番号１０３のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１０４又は配列番号１０５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（６）ＣＤＲ１として配列番号１０６又は配列番号１０７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１０８のアミノ酸配列又は配列番号２６６のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１０９又は配列番号１１０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（７）ＣＤＲ１として配列番号１１１又は配列番号１１２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１１３又は配列番号１１４のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１１５又は配列番号１１６のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（８）ＣＤＲ１として配列番号１１７又は配列番号１１８のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１１９のアミノ酸配列又は配列番号２６７のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１２０又は配列番号１２１のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（９）ＣＤＲ１として配列番号１２２又は配列番号１２３のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１２４又は配列番号１２５のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１２６又は配列番号１２７のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（１０）ＣＤＲ１として配列番号１２８又は配列番号１２９のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１３０又は配列番号１３１のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１３２又は配列番号１３３のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（１１）ＣＤＲ１として配列番号１３４又は配列番号１３５のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１３６又は配列番号１３７のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１３８又は配列番号１３９のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（１２）ＣＤＲ１として配列番号１４０又は配列番号１４１のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１４２又は配列番号１４３のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１４４又は配列番号１４５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（１３）ＣＤＲ１として配列番号１４６又は配列番号１４７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１４８又は配列番号１４９のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１５０又は配列番号１５１のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，及び
（１４）ＣＤＲ１として配列番号１５２又は配列番号１５３のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１５４又は配列番号１５５のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１５６又は配列番号１５７のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列。
【０１３９】
ＢＤＮＦと融合させるべき，ｈＴｆＲに親和性を有する抗体のより具体的な実施形態として，抗体の重鎖のＣＤＲが以下に示す（１）〜（１４）に記載のアミノ酸配列を有するものが例示できる。すなわち，
（１）ＣＤＲ１として配列番号７６，ＣＤＲ２として配列番号７８，及びＣＤＲ３として配列番号８０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（２）ＣＤＲ１として配列番号８２，ＣＤＲ２として配列番号８４，及びＣＤＲ３として配列番号８６のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列鎖，
（３）ＣＤＲ１として配列番号８８，ＣＤＲ２として配列番号９０，及びＣＤＲ３として配列番号９２のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（４）ＣＤＲ１として配列番号９４，ＣＤＲ２として配列番号９６，及びＣＤＲ３として配列番号９８のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（５）ＣＤＲ１として配列番号１００，ＣＤＲ２として配列番号１０２，及びＣＤＲ３として配列番号１０４のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（６）ＣＤＲ１として配列番号１０６，ＣＤＲ２として配列番号１０８，及びＣＤＲ３として配列番号１０９のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（７）ＣＤＲ１として配列番号１１１，ＣＤＲ２として配列番号１１３，及びＣＤＲ３として配列番号１１５のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（８）ＣＤＲ１として配列番号１１７，ＣＤＲ２として配列番号１１９，及びＣＤＲ３として配列番号１２０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（９）ＣＤＲ１として配列番号１２２，ＣＤＲ２として配列番号１２４，及びＣＤＲ３として配列番号１２６のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（１０）ＣＤＲ１として配列番号１２８，ＣＤＲ２として配列番号１３０，及びＣＤＲ３として配列番号１３２のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（１１）ＣＤＲ１として配列番号１３４，ＣＤＲ２として配列番号１３６，及びＣＤＲ３として配列番号１３８のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（１２）ＣＤＲ１として配列番号１４０，ＣＤＲ２として配列番号１４２，及びＣＤＲ３として配列番号１４４のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，
（１３）ＣＤＲ１として配列番号１４６，ＣＤＲ２として配列番号１４８，及びＣＤＲ３として配列番号１５０のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列，及び
（１４）ＣＤＲ１として配列番号１５２，ＣＤＲ２として配列番号１５４，及びＣＤＲ３として配列番号１５６のアミノ酸配列を，それぞれ含むものである，アミノ酸配列。
【０１４０】
ＢＤＮＦと融合させるべき，ｈＴｆＲに親和性を有する抗体の好ましい軽鎖と重鎖の組み合わせとしては，ＣＤＲが以下に示す（１）〜（１４）に記載のものが例示できる。すなわち，
（１）ＣＤＲ１として配列番号６又は配列番号７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号７６又は配列番号７７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号７８又は配列番号７９のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号８０又は配列番号８１のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（２）ＣＤＲ１として配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１３若しくは配列番号１４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号８２又は配列番号８３のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号８４又は配列番号８５のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号８６又は配列番号８７のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（３）ＣＤＲ１として配列番号１６又は配列番号１７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１８若しくは配列番号１９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号８８又は配列番号８９のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号９０又は配列番号９１のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号９２又は配列番号９３のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（４）ＣＤＲ１として配列番号２１又は配列番号２２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号２３若しくは配列番号２４のアミノ酸配列，又はＡｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号９４又は配列番号９５のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号９６又は配列番号９７のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号９８又は配列番号９９のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（５）ＣＤＲ１として配列番号２６又は配列番号２７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号２８若しくは配列番号２９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１００又は配列番号１０１のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１０２又は配列番号１０３のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１０４又は配列番号１０５のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（６）ＣＤＲ１として配列番号３１又は配列番号３２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号３３若しくは配列番号３４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ），及びＣＤＲ３として配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１０６又は配列番号１０７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１０８のアミノ酸配列又は配列番号２６６のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１０９又は配列番号１１０のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（７）ＣＤＲ１として配列番号３６又は配列番号３７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号３８若しくは配列番号３９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｇｌｎ−ｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１１１又は配列番号１１２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１１３又は配列番号１１４のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１１５又は配列番号１１６のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（８）ＣＤＲ１として配列番号４１又は配列番号４２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号４３若しくは配列番号４４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１１７又は配列番号１１８のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１１９のアミノ酸配列又は配列番号２６７のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１２０又は配列番号１２１のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（９）ＣＤＲ１として配列番号４６又は配列番号４７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号４８若しくは配列番号４９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１２２又は配列番号１２３のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１２４又は配列番号１２５のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１２６又は配列番号１２７のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（１０）ＣＤＲ１として配列番号５１又は配列番号５２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号５３若しくは配列番号５４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１２８又は配列番号１２９のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１３０又は配列番号１３１のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１３２又は配列番号１３３のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（１１）ＣＤＲ１として配列番号５６又は配列番号５７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号５８若しくは配列番号５９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１３４又は配列番号１３５のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１３６又は配列番号１３７のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１３８又は配列番号１３９のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（１２）ＣＤＲ１として配列番号６１又は配列番号６２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号６３若しくは配列番号６４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１４０又は配列番号１４１のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１４２又は配列番号１４３のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１４４又は配列番号１４５のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（１３）ＣＤＲ１として配列番号６６又は配列番号６７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号６８若しくは配列番号６９のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号７０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１４６又は配列番号１４７のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１４８又は配列番号１４９のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１５０又は配列番号１５１のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，及び
（１４）ＣＤＲ１として配列番号７１又は配列番号７２のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号７３若しくは配列番号７４のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ，及びＣＤＲ３として配列番号７５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１５２又は配列番号１５３のアミノ酸配列，ＣＤＲ２として配列番号１５４又は配列番号１５５のアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として配列番号１５６又は配列番号１５７のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ。
【０１４１】
ＢＤＮＦと融合させるべき，ｈＴｆＲに親和性を有する抗体の軽鎖と重鎖の組み合わせの具体的態様としては，ＣＤＲが以下に示す（１）〜（１４）に記載のアミノ酸配列の組合せを有するものが例示できる。すなわち，
（１）ＣＤＲ１として配列番号６，ＣＤＲ２として配列番号８，及びＣＤＲ３として配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号７６，ＣＤＲ２として配列番号７８，及びＣＤＲ３として配列番号８０のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（２）ＣＤＲ１として配列番号１１，ＣＤＲ２として配列番号１３，及びＣＤＲ３として配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号８２，ＣＤＲ２として配列番号８４，及びＣＤＲ３として配列番号８６のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（３）ＣＤＲ１として配列番号１６，ＣＤＲ２として配列番号１８，及びＣＤＲ３として配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号８８，ＣＤＲ２として配列番号９０，及びＣＤＲ３として配列番号９２のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（４）ＣＤＲ１として配列番号２１，ＣＤＲ２として配列番号２３，及びＣＤＲ３として配列番号２５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号９４，ＣＤＲ２として配列番号９６，及びＣＤＲ３として配列番号９８のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（５）ＣＤＲ１として配列番号２６，ＣＤＲ２として配列番号２８，及びＣＤＲ３として配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１００，ＣＤＲ２として配列番号１０２，及びＣＤＲ３として配列番号１０４のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（６）ＣＤＲ１として配列番号３１，ＣＤＲ２として配列番号３３，及びＣＤＲ３として配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１０６，ＣＤＲ２として配列番号１０８，及びＣＤＲ３として配列番号１０９のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（７）ＣＤＲ１として配列番号３６，ＣＤＲ２として配列番号３８，及びＣＤＲ３として配列番号４０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１１１，ＣＤＲ２として配列番号１１３，及びＣＤＲ３として配列番号１１５のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（８）ＣＤＲ１として配列番号４１，ＣＤＲ２として配列番号４３，及びＣＤＲ３として配列番号４５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１１７，ＣＤＲ２として配列番号１１９，及びＣＤＲ３として配列番号１２０のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（９）ＣＤＲ１として配列番号４６，ＣＤＲ２として配列番号４８，及びＣＤＲ３として配列番号５０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１２２，ＣＤＲ２として配列番号１２４，及びＣＤＲ３として配列番号１２６のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（１０）ＣＤＲ１として配列番号５１，ＣＤＲ２として配列番号５３，及びＣＤＲ３として配列番号５５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１２８，ＣＤＲ２として配列番号１３０，及びＣＤＲ３として配列番号１３２のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（１１）ＣＤＲ１として配列番号５６，ＣＤＲ２として配列番号５８，及びＣＤＲ３として配列番号６０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１３４，ＣＤＲ２として配列番号１３６，及びＣＤＲ３として配列番号１３８のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（１２）ＣＤＲ１として配列番号６１，ＣＤＲ２として配列番号６３，及びＣＤＲ３として配列番号６５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１４０，ＣＤＲ２として配列番号１４２，及びＣＤＲ３として配列番号１４４のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，
（１３）ＣＤＲ１として配列番号６６，ＣＤＲ２として配列番号６８，及びＣＤＲ３として配列番号７０のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１４６，ＣＤＲ２として配列番号１４８，及びＣＤＲ３として配列番号１５０のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ，及び
（１４）ＣＤＲ１として配列番号７１，ＣＤＲ２として配列番号７３，及びＣＤＲ３として配列番号７５のアミノ酸配列を有する軽鎖と，ＣＤＲ１として配列番号１５２，ＣＤＲ２として配列番号１５４，及びＣＤＲ３として配列番号１５６のアミノ酸配列を有する重鎖の組み合わせ。
【０１４２】
ＢＤＮＦと融合させるべき，ｈＴｆＲに親和性を有するヒト化抗体の好ましい実施形態として，配列番号２１８〜配列番号２４５で示されるマウス抗ヒトＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列をＣＤＲとして用いて作製されたヒト化抗体を挙げることができる。ヒト化抗体は，これらマウス抗ヒトＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列で，ヒト抗体の可変領域の適切な位置に移植することにより作製される。
【０１４３】
例えば，配列番号２１８のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３４番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５０番目〜５６番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８９番目〜９７番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。また，配列番号２１９のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５０番目〜６６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９７番目〜１０５番目に位置する任意の連続した３個以上又は７個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１４４】
また例えば，配列番号２２０のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３４番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５０番目〜５６番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８９番目〜９７番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。また，配列番号２２１のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５０番目〜６６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９７番目〜１１２番目に位置する任意の連続した３個以上又は１４個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１４５】
更に，例えば，配列番号２２２のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３９番目に位置する任意の連続した３個以上又は１１個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５５番目〜６１番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９４番目〜１０２番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができ，配列番号２２３のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５０番目〜６６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９７番目〜１０７番目に位置する任意の連続した３個以上又は９個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１４６】
更に，例えば，配列番号２２４のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３３番目に位置する任意の連続した３個以上又は５個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として４９番目〜５５番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８８番目〜９６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。また，配列番号２２５のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５１番目〜６６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９７番目〜１１１番目に位置する任意の連続した３個以上又は１３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１４７】
更に，例えば，配列番号２２６のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３３番目に位置する任意の連続した３個以上又は５個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として４９番目〜５５番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８８番目〜９５番目に位置する任意の連続した３個以上又は７個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。配列番号２２７のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５１番目〜６６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９７番目〜１０７番目に位置する任意の連続した３個以上又は９個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１４８】
更に，例えば，配列番号２２８のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３４番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５０番目〜５６番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８９番目〜９７番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。また，配列番号２２９のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５０番目〜６５番目に位置する任意の連続した３個以上又は７個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９６番目〜１０１番目に位置する任意の連続した３個以上又は４個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１４９】
更に，例えば，配列番号２３０のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３３番目に位置する任意の連続した３個以上又は５個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として４９番目〜５５番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８８番目〜９６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。また，配列番号２３１のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５１番目〜６６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９７番目〜１０９番目に位置する任意の連続した３個以上又は１１個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１５０】
更に，例えば，配列番号２３２のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３３番目に位置する任意の連続した３個以上又は５個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として４９番目〜５５番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８８番目〜９６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。また，配列番号２３３のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５０番目〜６５番目に位置する任意の連続した３個以上又は７個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９６番目〜１０１番目に位置する任意の連続した３個以上又は４個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１５１】
更に，例えば，配列番号２３４のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３３番目に位置する任意の連続した３個以上又は５個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として４９番目〜５５番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８８番目〜９６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。また，配列番号２３５のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５１番目〜６６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９７番目〜１０６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１５２】
更に，例えば，配列番号２３６のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３４番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５０番目〜５６番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８９番目〜９７番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。また，配列番号２３７のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５１番目〜６６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９７番目〜１０９番目に位置する任意の連続した３個以上又は１１個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１５３】
更に，例えば，配列番号２３８のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３４番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５０番目〜５６番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８９番目〜９７番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。また，配列番号２３９のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５１番目〜６６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９７番目〜１０７番目に位置する任意の連続した３個以上又は９個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１５４】
更に，例えば，配列番号２４０のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３４番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５０番目〜５６番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８９番目〜９７番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。また，配列番号２４１のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５１番目〜６６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９７番目〜１０８番目に位置する任意の連続した３個以上又は１０個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１５５】
更に，例えば，配列番号２４２のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３４番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５０番目〜５６番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８９番目〜９７番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。また，配列番号２４３のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５１番目〜６６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９７番目〜１０７番目に位置する任意の連続した３個以上又は９個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１５６】
更に，例えば，配列番号２４４のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２４番目〜３３番目に位置する任意の連続した３個以上又は５個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として４９番目〜５５番目に位置する任意の連続した３個以上又は６個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として８８番目〜９６番目に位置する任意の連続した３個以上又は９個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の軽鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の軽鎖とすることができる。また，配列番号２４５のアミノ酸配列において，ＣＤＲ１として２６番目〜３５番目に位置する任意の連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，ＣＤＲ２として５１番目〜６６番目に位置する任意の連続した３個以上又は８個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列，及びＣＤＲ３として９７番目〜１０７番目に位置する任意の連続した３個以上又は９個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列により，ヒト抗体の重鎖の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を置き換えたものを，ヒト化抗体の重鎖とすることができる。こうして得られたヒト化抗体の軽鎖と重鎖を組み合わせてヒト化抗体を作製することができる。
【０１５７】
ＢＤＮＦと融合させるべき，ｈＴｆＲに親和性を有するヒト化抗体の好ましい実施形態としては，以下に示す（１）〜（３）に記載のアミノ酸配列を有するものが例示できる。すなわち，
（１）抗ｈＴｆＲ抗体であって，軽鎖の可変領域が，配列番号１５８，配列番号１５９，配列番号１６０，配列番号１６１，配列番号１６２，及び配列番号１６３に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなり，重鎖の可変領域が，配列番号１６６，配列番号１６７，配列番号１６８，配列番号１６９，配列番号１７０，及び配列番号１７１に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなる，抗ｈＴｆＲ抗体，
（２）抗ｈＴｆＲ抗体であって，軽鎖の可変領域が，配列番号１７４，配列番号１７５，配列番号１７６，配列番号１７７，配列番号１７８，及び配列番号１７９に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなり，重鎖の可変領域が，配列番号１８２，配列番号１８３，配列番号１８４，配列番号１８５，配列番号１８６，及び配列番号１８７に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなる，抗ｈＴｆＲ抗体，
（３）抗ｈＴｆＲ抗体であって，軽鎖の可変領域が，配列番号１９０，配列番号１９１，配列番号１９２，配列番号１９３，配列番号１９４，及び配列番号１９５に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなり，重鎖の可変領域が，配列番号２０４，配列番号２０５，配列番号２０６，配列番号２０７，配列番号２０８及び配列番号２０９に記載のアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなる，抗ｈＴｆＲ抗体。
【０１５８】
配列番号１５８，配列番号１５９，配列番号１６０，配列番号１６１，配列番号１６２，及び配列番号１６３に記載の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は，ＣＤＲ１に配列番号６又は７，ＣＤＲ２に配列番号８又は９，及びＣＤＲ３に配列番号１０のアミノ酸配列を含むものである。但し，配列番号１５８〜１６２に記載の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列において，ＣＤＲというときは，ＣＤＲの配列はこれらに限定されるものではなく，これらＣＤＲのアミノ酸配列を含む領域，これらＣＤＲのアミノ酸配列の任意の連続した３個以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列もＣＤＲとし得る。
【０１５９】
配列番号１６６，配列番号１６７，配列番号１６８，配列番号１６９，配列番号１７０，及び配列番号１７１に記載の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は，ＣＤＲ１に配列番号７６又は７７，ＣＤＲ２に配列番号７８又は７９，及びＣＤＲ３に配列番号８０又は８１のアミノ酸配列を含むものである。但し，配列番号１６６〜１７１に記載の重鎖の可変領域のアミノ酸配列において，ＣＤＲというときは，ＣＤＲの配列はこれらに限定されるものではなく，これらＣＤＲのアミノ酸配列を含む領域，これらＣＤＲのアミノ酸配列の任意の連続した３個以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列もＣＤＲとし得る。
【０１６０】
配列番号１７４，配列番号１７５，配列番号１７６，配列番号１７７，配列番号１７８，及び配列番号１７９に記載の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は，ＣＤＲ１に配列番号１１又は１２，ＣＤＲ２に配列番号１３又は１４，及びＣＤＲ３に配列番号１５のアミノ酸配列を含むものである。但し，配列番号１７４〜１７９に記載の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列において，ＣＤＲというときは，ＣＤＲの配列はこれらに限定されるものではなく，これらＣＤＲのアミノ酸配列を含む領域，これらＣＤＲのアミノ酸配列の任意の連続した３個以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列もＣＤＲとし得る。
【０１６１】
配列番号１８２，配列番号１８３，配列番号１８４，配列番号１８５，配列番号１８６，及び配列番号１８７に記載の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は，ＣＤＲ１に配列番号８２又は８３，ＣＤＲ２に配列番号８４又は８５，及びＣＤＲ３に配列番号８６又は８７のアミノ酸配列を含むものである。但し，配列番号１８２〜１８７に記載の重鎖の可変領域のアミノ酸配列において，ＣＤＲというときは，ＣＤＲの配列はこれらに限定されるものではなく，これらＣＤＲのアミノ酸配列を含む領域，これらＣＤＲのアミノ酸配列の任意の連続した３個以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列もＣＤＲとし得る。
【０１６２】
配列番号１９０，配列番号１９１，配列番号１９２，配列番号１９３，配列番号１９４，及び配列番号１９５に記載の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は，ＣＤＲ１に配列番号１６又は１７，ＣＤＲ２に配列番号１８又は１９，及びＣＤＲ３に配列番号２０のアミノ酸配列を含むものである。但し，配列番号１９０〜１９５に記載の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列において，ＣＤＲというときは，ＣＤＲの配列はこれらに限定されるものではなく，これらＣＤＲのアミノ酸配列を含む領域，これらＣＤＲのアミノ酸配列の任意の連続した３個以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列もＣＤＲとし得る。
【０１６３】
配列番号２０４，配列番号２０５，配列番号２０６，配列番号２０７，配列番号２０８及び配列番号２０９に記載の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は，ＣＤＲ１に配列番号８８又は８９，ＣＤＲ２に配列番号９０又は９１，及びＣＤＲ３に配列番号９２又は９３のアミノ酸配列を含むものである。但し，配列番号２０４〜２０９に記載の重鎖の可変領域のアミノ酸配列において，ＣＤＲというときは，ＣＤＲの配列はこれらに限定されるものではなく，これらＣＤＲのアミノ酸配列を含む領域，これらＣＤＲのアミノ酸配列の任意の連続した３個以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列もＣＤＲとし得る。
【０１６４】
ＢＤＮＦと融合させるべき，ｈＴｆＲに親和性を有するヒト化抗体のより具体的な実施形態としては，
（１ａ）軽鎖の可変領域が配列番号１６３のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号１７１のアミノ酸配列を含むもの，
（２ａ）軽鎖の可変領域が配列番号１７９のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号１８７のアミノ酸配列を含むもの，
（３ａ）軽鎖の可変領域が配列番号１９１のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号２０５のアミノ酸配列を含むもの，
（３ｂ）軽鎖の可変領域が配列番号１９３のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号２０５のアミノ酸配列を含むもの，
（３ｃ）軽鎖の可変領域が配列番号１９４のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号２０５のアミノ酸配列を含むもの，及び
（３ｄ）軽鎖の可変領域が配列番号１９５のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号２０５のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
【０１６５】
ＢＤＮＦと融合させるべき，ｈＴｆＲに親和性を有するヒト化抗体のより具体的な実施形態としては，
（１ｂ）軽鎖が配列番号１６４のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号１７２のアミノ酸配列を含むもの，
（２ｂ）軽鎖が配列番号１８０のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号１８８のアミノ酸配列を含むもの，
（３ｅ）軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列を含むもの，
（３ｆ）軽鎖が配列番号１９８のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列を含むもの，
（３ｇ）軽鎖が配列番号２００のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列を含むもの，
（３ｈ）軽鎖が配列番号２０２のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１０のアミノ酸配列を含むもの，
（３ｉ）軽鎖が配列番号１９６のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列を含むもの，
（３ｊ）軽鎖が配列番号１９８のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列を含むもの，
（３ｋ）軽鎖が配列番号２００のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列を含むもの，及び
（３ｌ）軽鎖が配列番号２０２のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号２１２のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
【０１６６】
ｈＢＤＮＦと融合させるべき，ｈＴｆＲに親和性を有するヒト化抗体の好ましい実施形態を上記のごとく例示した。これらの抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖は，その可変領域のアミノ酸配列に，抗ｈＴｆＲ抗体とｈＴｆＲの親和性を所望なものに調整等する目的で，適宜，置換，欠失，付加等の変異を加えることができる。又，ｈＢＤＮＦの機能等を所望なものに調整する目的で，ｈＢＤＮＦに適宜，置換，欠失，付加等の変異を加えることもできる。
【０１６７】
軽鎖の可変領域のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，更により好ましくは１〜２個である。軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，尚も更に好ましくは１〜２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。
【０１６８】
軽鎖の可変領域にアミノ酸を付加する場合，軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，更により好ましくは１〜２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は，元の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。
【０１６９】
特に，軽鎖の各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１〜２個であり，更により好ましくは１個である。各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１〜２個であり，更により好ましくは１個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。
【０１７０】
軽鎖の各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列中にアミノ酸を付加する場合，当該アミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１〜５個，より好ましくは１〜３個，更に好ましくは１〜２個，更により好ましくは１個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列は，元の各ＣＤＲのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。
【０１７１】
重鎖の可変領域のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，更により好ましくは１〜２個である。重鎖の可変領域のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，尚も更に好ましくは１〜２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。
【０１７２】
重鎖の可変領域にアミノ酸を付加する場合，重鎖の可変領域のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１〜１０個，より好ましくは１〜５個，更に好ましくは１〜３個，更により好ましくは１〜２個アミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた重鎖の可変領域のアミノ酸配列は，元の重鎖の可変領域のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。
【０１７３】
特に，重鎖の各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１〜２個であり，更により好ましくは１個である。各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１〜５個であり，より好ましくは１〜３個であり，更に好ましくは１〜２個であり，更により好ましくは１個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。
【０１７４】
重鎖の各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列中にアミノ酸を付加する場合，当該アミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１〜５個，より好ましくは１〜３個，更に好ましくは１〜２個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列は，元の各ＣＤＲのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。
【０１７５】
上記の抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の可変領域への変異と，上記の抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域への変異とを組み合わせて，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と重鎖の可変領域の両方に変異を加えることもできる。
【０１７６】
上記の抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸による置換としては，例えば，酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸との相互の置換，アミド型アミノ酸であるアスパラギンとグルタミンとの相互の置換，塩基性アミノ酸であるリシンとアルギニンとの相互の置換，分枝アミノ酸であるバリン，ロイシン及びイソロイシンとの相互の置換，脂肪族アミノ酸であるグリシンとアラニンとの相互の置換，ヒドロキシアミノ酸であるセリンとトレオニンとの相互の置換，芳香族アミン酸であるフェニルアラニンとチロシンとの相互の置換等が挙げられる。
【０１７７】
なお，抗ｈＴｆＲ抗体又はｈＢＤＮＦに変異を加えてＣ末端又はＮ末端にアミノ酸を付加した場合において，その付加したアミノ酸が，抗ｈＴｆＲ抗体をＢＤＮＦと融合させたときに抗ｈＴｆＲ抗体とＢＤＮＦとの間に位置することとなった場合，当該付加したアミノ酸は，リンカーの一部を構成する。
【０１７８】
本発明の融合蛋白質は，後述の実施例に記載された方法又は本分野で周知の方法により製造することができる。
例えば，本明細書の実施例１６及び１７に記載したように，取得した抗ヒトトランスフェリン抗体の重鎖のＣ末端に，直接又はリンカー（例えば，Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を介して，ＢＤＮＦのＮ末端又はＣ末端を融合させたものである融合蛋白質をコードするＤＮＡを有する発現用ベクターと，当該抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを有する動植物細胞発現用ベクターをそれぞれ構築して，適当なホスト細胞に併せて導入することにより，本発明の融合蛋白質を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。あるいは，取得した抗ヒトトランスフェリン抗体の軽鎖のＣ末端に，直接又はリンカー（例えば，Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を介してＢＤＮＦのＮ末端又はＣ末端を融合させたものである融合蛋白質をコードするＤＮＡを有する発現用ベクターと，当該抗体の重鎖をコードするＤＮＡを有する発現用ベクターをそれぞれ構築して，適当なホスト細胞に併せて導入することにより，本発明の融合蛋白質を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。
【０１７９】
前記のように構築した融合蛋白質遺伝子は，公知の方法により発現させ，取得することができる。融合蛋白質の発現量を最大化するため，融合蛋白質遺伝子の塩基配列は，融合蛋白質の発現に使用される細胞又は動物種のコドン使用頻度に合わせ，最適化してもよい。哺乳類細胞の場合，常用される有用なプロモーター，発現される抗体遺伝子，その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡ又はそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては，ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer）を挙げることができる。
【０１８０】
また，その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして，レトロウイルス，ポリオーマウイルス，アデノウイルス，シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（ｈＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いればよい。
【０１８１】
例えば，ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合，Mulliganらの方法（Mulligan, R.C. et al., Nature (1979) 277, 108-114），また，ｈＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合，Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）に従えば，容易に実施することができる。
【０１８２】
大腸菌の場合，常用される有用なプロモーター，抗体分泌のためのシグナル配列，発現させるべき抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては，ｌａｃＺプロモーター，ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合，Wardらの方法（Ward, E.S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E.S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427），ａｒａＢプロモーターを使用する場合，Betterらの方法（Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043）に従えばよい。
【０１８３】
抗体分泌のためのシグナル配列としては，大腸菌のペリプラズムに産生させる場合，ｐｅｌＢシグナル配列（Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383）を使用すればよい。（例えば，国際公開第９６／３０３９４号を参照）。
【０１８４】
複製起源としては，ＳＶ４０，ポリオーマウイルス，アデノウイルス，ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ，さらに，ホスト細胞系で遺伝子コピー数増幅のため，発現ベクターは選択マーカーとして，アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子，チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子，大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子，ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
【０１８５】
真核細胞を使用する場合，動物細胞，植物細胞，又は真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては，（１）哺乳類細胞，例えば，ＣＨＯ，ＨＥＫ２９３，ＣＯＳ，ミエローマ，ＢＨＫ（baby hamster kidney），ＨｅＬａ，Ｖｅｒｏなど，（２）両生類細胞，例えば，アフリカツメガエル卵母細胞，又は（３）昆虫細胞，例えば，ｓｆ９，ｓｆ２１，Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては，ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が知られており，これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては，酵母，例えば，サッカロミセス（Saccharomyces）属，例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae），糸状菌，例えばアスペルギルス属（Aspergillus）属，例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。
【０１８６】
原核細胞を使用する場合，細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては，大腸菌（E. coli），枯草菌が知られている。
【０１８７】
これらの細胞に，目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し，形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は，公知の方法に従い行う。例えば，培養液として，ＤＭＥＭ，ＭＥＭ，ＲＰＭＩ１６４０，ＩＭＤＭを使用することができ，ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。また，抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより，in vivoにて抗体を産生してもよい。
【０１８８】
in vivoの産生系としては，動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合，哺乳類動物，昆虫を用いる産生系などがある。
【０１８９】
哺乳類動物としては，ヤギ，ブタ，ヒツジ，マウス，ウシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993）。また，昆虫としては，カイコを用いることができる。植物を使用する場合，例えばタバコを用いることができる。
【０１９０】
これらの動物又は植物に融合蛋白質遺伝子を導入し，動物又は植物の体内で融合蛋白質を産生させ，回収する。例えば，融合蛋白質遺伝子をヤギβ−カゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し，この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から所望の融合蛋白質を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の融合蛋白質を含む乳汁量を増加させるために，適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702）。
【０１９１】
また，カイコを用いる場合，目的の融合蛋白質遺伝子を挿入したバキュロウイルスをカイコに感染させ，このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594）。さらに，タバコを用いる場合，目的の融合蛋白質遺伝子を植物発現用ベクター，例えばｐＭＯＮ  ５３０に挿入し，このベクターをAgrobacterium tumefaciensのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ，例えばNicotiana tabacumに感染させ，本タバコの葉より所望の融合蛋白質を得る（Julian, K.-C.Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138）。
【０１９２】
前記のように産生，発現された融合蛋白質は，細胞内外，ホスト細胞から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される融合蛋白質の分離，精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては，例えば，プロテインＡカラム，プロテインＧカラム，プロテインＬカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として，例えば，Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．等が挙げられる。その他，通常の蛋白質で使用されている分離，精製方法を使用すればよく，何ら限定されるものではない。必要に応じて，上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー，濾過，限外濾過，塩析，透析等を組み合わせることにより，本発明に使用される抗体を分離，精製することもできる。クロマトグラフィーとしては，例えば，イオン交換クロマトグラフィー，疎水性クロマトグラフィー，ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography）に適用し得る。また，逆相ＨＰＬＣ（reverse phase HPLC）を用いてもよい。
【０１９３】
ＢＤＮＦは，そのホモ二量体が標的細胞表面上にあるＢＤＮＦ受容体（ＴｒｋＢ）へ特異的に結合し，中枢および末梢神経系の細胞の分化，機能維持，シナプス形成，および損傷時の再生および修復などに重要な役割を果たす（非特許文献１，非特許文献２）。このような作用から，ＢＤＮＦは，中枢及び末梢の神経に障害を有する疾患の治療に広く応用可能な蛋白質として注目されている。
【０１９４】
また，ハンチントン病，パーキンソン病，アルツハイマー病等，種々の神経系の疾患においてＢＤＮＦの発現低下や量の低下が報告されており（Nuerosci. Lett. (1999) 270: 45-48），浸透圧ポンプ等を用いこれらの疾患モデル動物の脳内又は髄腔内へＢＤＮＦを持続的に注入すると線条体の神経細胞死の抑制，運動障害の改善，記憶能力の改善などの効果を示すことが知られている（J. Nuerosci. (2004) 24:7727-7739,Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89:11347-11351), Nat. Med. (2009) 15: 331-337）。
【０１９５】
さらには，ＢＤＮＦは歯の関連細胞や血管内皮細胞の増殖，分化促進，摂食調節，糖代謝等，多様な作用を有することも知られている（Tissue Eng. (2005) 11: 1618-629,肥満研究 (2009) 15: 97-99）。
【０１９６】
このことから，ＢＤＮＦは，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン病などの神経変性疾患，筋萎縮性側策硬化症などの脊髄変性疾患，この他，糖尿病性神経障害，脳虚血性疾患，発達障害，統合失調症，うつ病およびＲｅｔｔ症候群等，様々な疾患の治療剤としての開発が期待されている（非特許文献３，非特許文献４，非特許文献５，非特許文献６，非特許文献７，非特許文献８，ＷＯ９１／０３５６８）。
【０１９７】
ＢＤＮＦは血液脳関門（ＢＢＢ；Blood-Brain Barrier）を通過することができないが，本発明の融合蛋白質（ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質）はＢＢＢを通過することが可能であるため，末梢投与した本発明の融合蛋白質が脳内に移行し，ＢＤＮＦが本来有する効果を発揮し得る。このようなＢＤＮＦの機能は，以下のような方法で確認することができる。
【０１９８】
ＢＤＮＦの機能は，ＢＤＮＦ受容体（ＴｒｋＢ）に対する結合親和性（Eur J Neurosci (1994) 6:1389-1405），ＢＤＮＦ受容体のリン酸化を指標としたＢＤＮＦ受容体の活性化（Biochim Biophys Acta (2015) 1852:862-872），ＢＤＮＦ受容体の活性化に伴う細胞内カルシウム増加等の細胞内シグナル伝達増強活性（Nature Reviews Neuroscience (2009)10:850-860），ＴｒｋＢ発現神経細胞に対する増殖促進作用（岐阜薬科大学紀要 (2006) 55:53-54），生存維持作用（Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry (2015) 60:11-17），神経突起伸展作用（J Biol Chem (2007) 282:34525-34534）等を調べることによりインビトロで評価できる。インビトロで用いる細胞としては，ＴｒｋＢを内在性に発現する細胞であっても外来性に強制発現させた細胞であってもよい。例えば，ＢＡＦ細胞，ＣＨＯ細胞，ＰＣ−１２細胞等にＴｒｋＢ遺伝子を導入して強制発現させた細胞や，海馬や線条体等の初代培養神経細胞を用いることができる。
【０１９９】
また，ＢＤＮＦの機能は，パーキンソン病，ハンチントン病，アルツハイマー病等の疾患モデル動物に対する治療効果（Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1994) 91:8920-8924）を調べることによりインビボで評価することができる。例えば，本発明の融合蛋白質（ＴｆＲ抗体−ＢＤＮＦ融合蛋白質）の in vivo でのＢＤＮＦ生物活性は，実施例２〜５に記載するような方法を用いてパーキンソン病モデル動物における運動機能障害改善作用，線条体ドパミン量回復効果，線条体ドパミン神経再生効果等を調べることにより評価できる。パーキンソン病モデルとしては，ドパミン神経を特異的に破壊することが知られているＭＰＴＰ処置を行ったマウスおよびサルが利用できる。
【０２００】
なお，ある疾患モデル動物，例えばパーキンソン病モデル動物において本発明の融合蛋白質（ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質）を末梢から投与することにより当該疾患又は障害が改善されたということは，ＢＤＮＦが本来有する効果を発揮し得る程度に本発明の融合蛋白質が必要部位（例えば脳内）に到達したことを示しており，このことは，本発明の融合蛋白質は，当該疾患に限らず，ＢＤＮＦへの曝露によって利益を得ることができる疾患および障害を治療するのに広く使用することができることを意味する。
【０２０１】
本発明は，本発明の融合蛋白質の治療有効量を有効成分として含有する医薬組成物を投与することによって，ＢＤＮＦの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害を治療するのに使用することができる。従って，本発明はまた，本発明の融合蛋白質を有効成分として含有してなるＢＤＮＦの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び／又は治療剤を提供する。ここで「治療」なる用語は，完全治癒だけでなく症状の改善をも含む意味である。
【０２０２】
本発明の融合蛋白質への曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害としては，ＢＤＮＦの発現もしくは量が低下することによって起こる疾患又は障害だけでなく，ＢＤＮＦが作用することによって治療可能な疾患又は障害も含まれ，例えば，神経系の疾患又は障害（神経変性疾患，うつ病，統合失調症，てんかん，自閉症，Ｒｅｔｔ症候群，Ｗｅｓｔ症候群，新生児痙攣，認知症に伴う問題行動（例，徘徊，攻撃的行為など），不安症，疼痛，ヒルシュスブルング病，レム睡眠行動障害等）およびその他の疾患又は障害が挙げられる。神経変性疾患としては，以下の脳神経変性疾患，脊髄変性疾患，網膜変性疾患，末梢神経変性疾患等が挙げられる。
【０２０３】
脳神経変性疾患としては，例えば，脳神経系の神経変性疾患（アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン病，レビー小体型認知症，ピック病，多系統萎縮症，進行性上行性麻痺，ダウン症候群など），脳虚血性疾患（脳卒中，脳梗塞，一過性脳虚血発作，クモ膜下出血，虚血性脳症，脳梗塞（ラクナ梗塞，アテローム血栓性脳梗塞，心原性脳梗塞症，出血性脳梗塞，その他の梗塞）など），外傷性脳損傷，白質脳症，および多発性硬化症などが挙げられる。
【０２０４】
脊髄変性疾患としては，例えば，筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ），脊髄損傷，種々の原因による脊髄障害，脊髄性進行性筋萎縮症，および脊髄小脳変性症などが挙げられる。
網膜変性疾患としては，例えば，加齢黄斑変性症（ＡＭＤ），糖尿病性網膜症，網膜色素変性症，高血圧性網膜症，および緑内症などが挙げられる。
【０２０５】
末梢神経変性疾患としては，例えば，糖尿病性神経障害，末梢神経損傷，外傷性末梢神経障害，中毒，他の毒性物質による末梢神経障害，がん化学治療法による末梢神経障害，Guillain-Barre 症候群，ビタミン等の欠乏による末梢神経障害，アミロイド末梢神経障害，虚血性末梢神経障害，悪性腫瘍に伴う末梢神経障害，尿毒症性末梢神経障害，物理的原因による末梢神経障害，Charcot-Marie-Tooth病，アルコール性末梢神経障害，自律神経異常（無自覚性低血糖，胃不全麻痺，神経因性下痢および便秘，勃起不全，起立性低血圧，不整脈，心不全，無痛性心筋梗塞，発汗異常，神経因性膀胱など），膀胱機能障害（例，無抑制膀胱，反射性膀胱，自律性膀胱，知覚麻痺性膀胱，運動麻痺性膀胱など）などが挙げられる。
【０２０６】
その他の疾患又は障害としては，例えば，歯周病，糖尿病，糖尿病性心筋症，糖尿病性足病変，炎症性腸疾患（例，潰瘍性大腸炎，クローン病など），聴覚障害，骨疾患（例，骨粗しょう症など），関節疾患（例，シャルコー関節，変形性関節症，リウマチなど）などが挙げられる。
【０２０７】
本発明の融合蛋白質は，血中に投与して中枢神経系（ＣＮＳ）において薬効を発揮させるべき薬剤として使用することができる。かかる薬剤は，概ね点滴静脈注射等による静脈注射，皮下注射，筋肉注射により患者に投与されるが，投与経路には特に限定はない。
【０２０８】
本発明の融合蛋白質は，薬剤として，凍結乾燥品，又は水性液剤等の形態で医療機関に供給することができる。水性液剤の場合，薬剤を，安定化剤，緩衝剤，等張化剤を含有する溶液に予め溶解したものを，バイアル又は注射器に封入した製剤として供給できる。注射器に封入された製剤は，一般にプレフィルドシリンジ製剤と呼称される。プレフィルドシリンジ製剤とすることにより，患者自身による薬剤の投与を簡易にすることができる。
【０２０９】
水性液剤として供給される場合，水性液剤に含有される抗ｈＴｆＲ抗体と結合させたＢＤＮＦの濃度は，用法用量によって適宜調整されるべきものであるが，例えば０．０１〜５ｍｇ／ｍＬである。また，水性液剤に含有される安定化剤は，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，非イオン性界面活性剤が好適に使用できる。このような非イオン性界面活性剤としては，ポリソルベート，ポロキサマー等を単独で又はこれらを組合せて使用できる。ポリソルベートとしてはポリソルベート２０，ポリソルベート８０が，ポロキサマーとしてはポロキサマー１８８（ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール）が特に好適である。また，水性液剤に含有される非イオン性界面活性剤の濃度は，０．０１〜１ｍｇ／ｍＬであることが好ましく，０．０１〜０．５ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく，０．１〜０．５ｍｇ／ｍＬであることが更に好ましい。安定化剤として，ヒスチジン，アルギニン，メチオニン，グリシン等のアミノ酸を使用することもできる。安定化剤として使用する場合の，水性液剤に含有されるアミノ酸の濃度は，０．１〜４０ｍｇ／ｍＬであることが好ましく，０．２〜５ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく，０．５〜４ｍｇ／ｍＬであることが更に好ましい。水性液剤に含有される緩衝剤は，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，リン酸塩緩衝剤が好ましく，特にリン酸ナトリウム緩衝剤が好ましい。緩衝剤としてリン酸ナトリウム緩衝剤を使用する場合の，リン酸ナトリウムの濃度は，好ましくは０．０１〜０．０４Ｍである。また，緩衝剤によって調整される水性液剤のｐＨは，好ましくは５．５〜７．２である。水性液剤に含有される等張化剤は，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，塩化ナトリウム，マンニトールを単独で又は組み合わせて等張化剤として好適に使用できる。
【０２１０】
本発明の融合蛋白質を含有する上記医薬の投与量は，投与対象，対象疾患，症状，投与ルートなどによっても異なるが，例えば，神経変性疾患の治療・予防のために使用する場合には，投与量は，有効量，例えば，治療有効量として，脳内のＢＤＮＦとしての濃度が，少なくとも約０．００１ｎｇ／ｇ以上，好ましくは０．０１，０．１，１，１０又は１００ｎｇ／ｇ脳を上回るようにする。また，１回投与してから数日間（１，２，３，４，５，６，７日間），２週間，さらには１ヶ月間を過ぎてもＢＤＮＦの脳内レベルが上昇したまま維持されることが好ましく，脳内維持濃度として例えば，約１ｎｇ／ｇ脳，約１０ｎｇ／ｇ脳，約１００ｎｇ／ｇ脳，または約１００ｎｇ／ｇ脳を上回ったまま維持されることが好ましい。
【０２１１】
例えば，投与量は，これらに限定されるものではないが，いくつかの実施形態では，１回投与量として，０．０００１〜１，０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内で選択することができる。あるいは，患者あたり，０．００１〜１００，０００ｍｇの範囲内で選択することもできる。通常，約０．０１〜１０００ｍｇ，約０．１〜１００ｍｇ，約１〜１００ｍｇ，約０．０５〜５００ｍｇ，約０．５〜５０ｍｇ，または約５ｍｇ〜５０ｍｇの投与量で，例えば，静脈内投与で投与される。症状が特に重い場合には，その症状に応じて増量してもよい。
【０２１２】
本発明の組成物，例えば，本発明の融合蛋白質は，単独で用いてもよいし，または，本発明の効果を損なわない範囲において，必要に応じ，他の医薬品又は他の治療法と共に，同一の製剤内または別々の組成物として，患者に投与される。例えば，アルツハイマー型認知症において本発明の医薬組成物と併用される医薬としては，アルツハイマー病治療薬，例えば，塩酸ドネペジル，リバスチグミン，ガランタミン臭化水素塩酸などのアセチルコリンエステラーゼ阻害薬，もしくはメマンチン塩酸塩が挙げられる。また，現在臨床開発段階にあるソラネズマブ（N Engl J Med. (2014) 370: 311-21）やガンテネルマブ（Arch Neurol. (2012) 69: 198-207）などの抗Ａβ抗体や，ベルベセスタット（AAIC 2013, Boston: Abs 01-06-05, Jul 2013）やＡＺＤ−３２９３（AAIC 2014, Copenhargen: Abs P1-363, Jul 2014）などのβアミロイド産生阻害剤なども挙げられる。アルツハイマー型認知症において本発明の医薬組成物と併用される治療法としては，脳活性型リハビリテーション療法などが挙げられる。パーキンソン病において本発明の医薬組成物と併用される医薬としては，パーキンソン病治療薬，例えば，レボドパなどのドパミン補充療法薬，タリペキソール，プラミペキソール，ブロモクリプチンなどのドパミン受容体作動薬，ＭＡＯ−Ｂ阻害剤やＣＯＭＴ阻害剤などのドパミン分解酵素阻害薬，アマンタジンやノウリアストなどのドパミン遊離促進薬が挙げられる。パーキンソン病において本発明の医薬組成物と併用される治療法としては，視床刺激術，淡蒼球刺激術，視床下核刺激術などが挙げられる。ハンチントン病において本発明の医薬組成物と併用される医薬としては，ハンチントン病治療薬，例えば，テトラベナジンなどのモノアミン小胞トランスポーター２阻害薬が挙げられる。脳虚血性疾患において本発明の医薬組成物と併用される医薬としては，ラジカットなどの脳保護薬，が挙げられる。脳虚血性疾患において本発明の医薬組成物と併用される治療法としては，血栓溶解療法，リハビリテーション療法などが挙げられる。
【０２１３】
本発明の医薬組成物を投与するタイミングは特に限定は無く，適宜他医薬の投与もしくは治療の前後もしくは同時であってよい。
【実施例】
【０２１４】
以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。【０２１５】
〔実施例１〕ｈＴｆＲ発現用ベクターの構築
ヒト脾臓Ｑｕｉｃｋ  Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（Clontech社）を鋳型として，プライマーｈＴｆＲ５’（配列番号２１４）及びプライマーｈＴｆＲ３’（配列番号２１５）を用いて，ＰＣＲによりヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）をコードする遺伝子断片を増幅させた。増幅させたｈＴｆＲをコードする遺伝子断片を，ＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Promega社）のＭｌｕＩとＮｏｔＩ間に挿入した。得られたベクターを，ｐＣＩ−ｎｅｏ（ｈＴｆＲ）と名付けた。次いで，このベクターを，ＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化して，ｈＴｆＲをコードする遺伝子断片を切り出し，国際公開公報（ＷＯ２０１２／０６３７９９）に記載された発現ベクターであるｐＥ−ｍＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込むことにより，ｈＴｆＲ発現用ベクターであるｐＥ−ｍＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏ（ｈＴｆＲ）を構築した。【０２１６】
〔実施例２〕組換えｈＴｆＲの作製
エレクトロポレーション法により，ＣＨＯ−Ｋ１細胞にｐＥ−ｍＩＲＥＳ−ＧＳ−ｐｕｒｏ（ｈＴｆＲ）を導入した後，メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）及びピューロマイシンを含むＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯＴＭ培地（Invitrogen社）を用いて細胞の選択培養を行い，組換えｈＴｆＲ発現細胞を得た。この組換えｈＴｆＲ発現細胞を培養して，組換えｈＴｆＲを調製した。【０２１７】
〔実施例３〕組換えｈＴｆＲを用いたマウスの免疫
実施例２で調製した組換えｈＴｆＲを抗原として用いてマウスを免疫した。免疫は，マウスに抗原を静脈内投与又は腹腔投与内して行った。【０２１８】
〔実施例４〕ハイブリドーマの作製
最後に細胞を投与した日の約１週間後にマウスの脾臓を摘出してホモジナイズし，脾細胞を分離した。得られた脾細胞をマウスミエローマ細胞株（Ｐ３．Ｘ６３．Ａｇ８．６５３）とポリエチレングリコール法を用いて細胞融合させた。細胞融合終了後，（１Ｘ）ＨＡＴサプリメント（Life Technologies社）及び１０％  Ultra low ＩｇＧウシ胎児血清（Life Technologies社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に細胞を懸濁させ，細胞懸濁液を９６ウェルプレート２０枚に２００μＬ／ウェルずつ分注した。炭酸ガス培養器（３７℃，５％  ＣＯ２）で細胞を１０日間培養した後，各ウェルを顕微鏡下で観察し，単一のコロニーが存在するウェルを選択した。【０２１９】
各ウェルの細胞がほぼコンフルエントになった時点で培養上清を回収し，これをハイブリドーマの培養上清として，以下のスクリーニングに供した。【０２２０】
〔実施例５〕高親和性抗体産生細胞株のスクリーニング
組換えｈＴｆＲ溶液（Sino Biologics社）を５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５〜９．６）で希釈して５μｇ／ｍＬの濃度に調整し，これを固相溶液とした。固相溶液を，Nunc MaxiSorpＴＭ flat-bottom ９６ウェルプレート（基材：ポリスチレン，Nunc社製）の各ウェルに５０μＬずつ添加した後，プレートを室温で１時間静置し，組換えｈＴｆＲをプレートに吸着させて固定した。固相溶液を捨て，各ウェルを２５０μＬの洗浄液（０．０５％ Tween20 を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した後，各ウェルにブロッキング液（１％  ＢＳＡを含有するＰＢＳ）を２００μＬずつ添加し，プレートを室温で１時間静置した。【０２２１】
ブロッキング液を捨て，各ウェルを２５０μＬの洗浄液（０．０５％ Tween20 を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した後，各ウェルにマウス抗ヒトトランスフェリン受容体抗体（マウス抗ｈＴｆＲ抗体）を産生するハイブリドーマの培養上清を５０μＬずつ添加し，プレートを室温で１時間静置し，培養上清に含まれるマウス抗ｈＴｆＲ抗体を組換えｈＴｆRに結合させた。このとき，コントロールとして，マウス抗ｈＴｆＲ抗体を産生しないハイブリドーマの培養上清をウェルに５０μＬ添加したものを置いた。また，各培養上清を加えたウェルの横のウェルに，ハイブリドーマの培養用培地を５０μＬ添加したものを置き，これをモックウェルとした。測定はｎ＝２で実施した。次いで，溶液を捨て，各ウェルを２５０μＬの洗浄液（０．０５％ Tween20 を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。【０２２２】
上記の各ウェルに１００μＬのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体溶液（プロメガ社）を添加し，プレートを室温で１分間静置した。次いで，溶液を捨て，各ウェルを２５０μＬの洗浄液（０．０５％ Tween20 を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。次いで，各ウェルに５０μＬの発色用基質液TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase（プロメガ社）を添加し，室温で１０〜２０分間静置した。次いで，各ウェルに１００μＬの停止液（２Ｎ硫酸）を添加した後，プレートリーダーを用いて各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。各培養上清及びコントロールの２つのウェルの平均値をとり，これらの平均値から，各培養上清及びコントロール毎に置いた２つのモックウェルの平均値をそれぞれ減じたものを測定値とした。【０２２３】
高い測定値を示したウェルに添加した培養上清に対応する１４種類のハイブリドーマ細胞を，ｈＴｆＲに対して高親和性を示す抗体（高親和性抗ｈＴｆＲ抗体）を産生する細胞株（高親和性抗体産生細胞株）として選択した。これら１４種の細胞株を，クローン１株〜クローン１４株と番号付けた。また，クローン１株〜クローン１４株が産生する抗ｈＴｆＲ抗体を，それぞれ抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜抗ｈＴｆＲ抗体番号１４とした。【０２２４】
〔実施例６〕高親和性抗ｈＴｆＲ抗体の可変領域のアミノ酸配列の解析
実施例５で選択したクローン１株〜クローン１４株からｃＤＮＡを調製し，これらのｃＤＮＡを鋳型として抗体の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を増幅させた。増幅させた遺伝子の塩基配列を翻訳し，各細胞株の産生する抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の抗体のそれぞれについて，軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定した。【０２２５】
抗ｈＴｆＲ抗体番号１は，軽鎖の可変領域に配列番号２１８のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２１９のアミノ酸配列とを含むものであった。また，軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号６又は７，ＣＤＲ２に配列番号８又は９，及びＣＤＲ３に配列番号１０のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号７６又は７７，ＣＤＲ２に配列番号７８又は７９，及びＣＤＲ３に配列番号８０又は８１のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２２６】
抗ｈＴｆＲ抗体番号２は，軽鎖の可変領域に配列番号２２０のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２２１のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１１又は１２，ＣＤＲ２に配列番号１３又は１４，及びＣＤＲ３に配列番号１５のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号８２又は８３，ＣＤＲ２に配列番号８４又は８５，及びＣＤＲ３に配列番号８６又は８７のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２２７】
抗ｈＴｆＲ抗体番号３は，軽鎖の可変領域に配列番号２２２のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２２３のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１６又は１７，ＣＤＲ２に配列番号１８又は１９，及びＣＤＲ３に配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号８８又は８９，ＣＤＲ２に配列番号９０又は９１，及びＣＤＲ３に配列番号９２又は９３のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２２８】
抗ｈＴｆＲ抗体番号４は，軽鎖の可変領域に配列番号２２４のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２２５のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号２１又は２２，ＣＤＲ２に配列番号２３又は２４，及びＣＤＲ３に配列番号２５のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号９４又は９５，ＣＤＲ２に配列番号９６又は９７，及びＣＤＲ３に配列番号９８又は９９のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２２９】
抗ｈＴｆＲ抗体番号５は，軽鎖の可変領域に配列番号２２６のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２２７のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号２６又は２７，ＣＤＲ２に配列番号２８又は２９，及びＣＤＲ３に配列番号３０アミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１００又は１０１，ＣＤＲ２に配列番号１０２又は１０３，及びＣＤＲ３に配列番号１０４又は１０５のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２３０】
抗ｈＴｆＲ抗体番号６は，軽鎖の可変領域に配列番号２２８のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２２９のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号３１又は３２，ＣＤＲ２に配列番号３３又は３４，及びＣＤＲ３に配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１０６又は１０７，ＣＤＲ２に配列番号１０８又は２６６，及びＣＤＲ３に配列番号１０９又は１１０に記載のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２３１】
抗ｈＴｆＲ抗体番号７は，軽鎖の可変領域に配列番号２３０に記載のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２３１アミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号３６又は３７，ＣＤＲ２に配列番号３８又は３９，及びＣＤＲ３に配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１１１又は１１２，ＣＤＲ２に配列番号１１３又は１１４，及びＣＤＲ３に配列番号１１５又は１１６に記載のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２３２】
抗ｈＴｆＲ抗体番号８は，軽鎖の可変領域に配列番号２３２に記載のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２３３に記載のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号４１又は４２，ＣＤＲ２に配列番号４３又は４４，及びＣＤＲ３に配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１１７又は１１８，ＣＤＲ２に配列番号１１９又は２６７，及びＣＤＲ３に配列番号１２０又は１２１に記載のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２３３】
抗ｈＴｆＲ抗体番号９は，軽鎖の可変領域に配列番号２３４に記載のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２３５に記載のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号４６又は４７，ＣＤＲ２に配列番号４８又は４９，及びＣＤＲ３に配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１２２又は１２３，ＣＤＲ２に配列番号１２４又は１２５，及びＣＤＲ３に配列番号１２６又は１２７に記載のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２３４】
抗ｈＴｆＲ抗体番号１０は，軽鎖の可変領域に配列番号２３６に記載のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２３７に記載のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号５１又は５２，ＣＤＲ２に配列番号５３又は５４，及びＣＤＲ３に配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１２８又は１２９，ＣＤＲ２に配列番号１３０又は１３１，及びＣＤＲ３に配列番号１３２又は１３３に記載のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２３５】
抗ｈＴｆＲ抗体番号１１は，軽鎖の可変領域に配列番号２３８に記載のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２３９に記載のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号５６又は５７，ＣＤＲ２に配列番号５８又は５９，及びＣＤＲ３に配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１３４又は１３５，ＣＤＲ２に配列番号１３６又は１３７，及びＣＤＲ３に配列番号１３８又は１３９に記載のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２３６】
抗ｈＴｆＲ抗体番号１２は，軽鎖の可変領域に配列番号２４０に記載のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２４１に記載のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号６１又は６２，ＣＤＲ２に配列番号６３又は６４，及びＣＤＲ３に配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１４０又は１４１，ＣＤＲ２に配列番号１４２又は１４３，及びＣＤＲ３に配列番号１４４又は１４５に記載のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２３７】
抗ｈＴｆＲ抗体番号１３は，軽鎖の可変領域に配列番号２４２に記載のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２４３に記載のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号６６又は６７，ＣＤＲ２に配列番号６８又は６９，及びＣＤＲ３に配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１４６又は１４７，ＣＤＲ２に配列番号１４８又は１４９，及びＣＤＲ３に配列番号１５０又は１５１に記載のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２３８】
抗ｈＴｆＲ抗体番号１４は，軽鎖の可変領域に配列番号２４４に記載のアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号２４５に記載のアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号７１又は７２，ＣＤＲ２に配列番号７３又は７４，及びＣＤＲ３に配列番号７５に記載のアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１５２又は１５３，ＣＤＲ２に配列番号１５４又は１５５，及びＣＤＲ３に配列番号１５６又は１５７に記載のアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。【０２３９】
抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の，軽鎖及び重鎖の可変領域に含まれるアミノ酸配列の配列番号を，表１にまとめて示す。【０２４０】
【表１】
2016208696.tif 000002
【０２４１】
抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の，軽鎖の可変領域のＣＤＲ１〜３と重鎖の可変領域のＣＤＲ１〜３に含まれるアミノ酸配列の配列番号を，表２にまとめて示す。但し，表２は各ＣＤＲのアミノ酸配列を例示するものであり，各ＣＤＲのアミノ酸配列は表２に記載のアミノ酸配列に限られるものではなく，これらのアミノ酸配列を含む領域のアミノ酸配列，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとし得ると考えられる。【０２４２】
【表２】
2016208696.tif 000003
【０２４３】
〔実施例７〕抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性の測定
抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性の測定は，バイオレイヤー干渉法（BioLayer Interferometry：ＢＬＩ）を用いた生体分子相互作用解析システムであるOctetRED96（ForteBio社，a division of Pall Corporation）を用いて実施した。バイオレイヤー干渉法の基本原理について，簡単に説明する。センサーチップ表面に固定された生体分子の層（レイヤー）に特定波長の光を投射したとき，生体分子のレイヤーと内部の参照となるレイヤーの二つの表面から光が反射され，光の干渉波が生じる。測定試料中の分子がセンサーチップ表面の生体分子に結合することにより，センサー先端のレイヤーの厚みが増加し，干渉波に波長シフトが生じる。この波長シフトの変化を測定することにより，センサーチップ表面に固定された生体分子に結合する分子数の定量及び速度論的解析をリアルタイムで行うことができる。測定は，概ねOctetRED96に添付の操作マニュアルに従って実施した。ヒトＴｆＲとしては，Ｎ末端にヒスチジンタグが付加した，配列番号１に示されるアミノ酸配列の中でＮ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの，ｈＴｆＲの細胞外領域のアミノ酸配列を有する組換えヒトＴｆＲ（ｒヒトＴｆＲ：Sino Biological社）を用いた。サルＴｆＲとしては，Ｎ末端にヒスチジンタグが付加した，配列番号２に示されるアミノ酸配列の中でＮ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの，カニクイザルのＴｆＲの細胞外領域のアミノ酸配列を有する組換えサルＴｆＲ（ｒサルＴｆＲ：Sino Biological社）を用いた。【０２４４】
実施例５で選択したクローン１株〜クローン１４株を，それぞれ細胞濃度が約２Ｘ１０５個／ｍＬとなるように，（１Ｘ）ＨＡＴサプリメント（Life Technologies社）及び１０％ Ultra low IgGウシ胎児血清（Life Technologies社）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で希釈し，１Ｌの三角フラスコに２００ｍＬの細胞懸濁液を加え，３７℃で，５％ＣＯ２と９５％空気からなる湿潤環境で約７０ｒｐｍの撹拌速度で６〜７日間培養した。培養上清を遠心操作により回収し，０．２２μｍフィルター（Millipore社）でろ過して，培養上清とした。回収した培養上清を，予め１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むカラム体積３倍容の２０ｍＭ Tris緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化しておいたProteinGカラム（カラム体積：１ｍL，ＧＥヘルスケア社）に負荷した。次いで，カラム体積の５倍容の同緩衝液によりカラムを洗浄した後，１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むカラム体積の４倍容の５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）で，吸着した抗体を溶出させ，溶出画分を採取した。溶出画分を１Ｍ Tris緩衝液（ｐＨ８．０）を添加してｐＨ７．０に調整した。これを抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の精製品としてとして以下の実験に用いた。【０２４５】
精製した各抗体（抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜抗ｈＴｆＲ抗体番号１４）を，それぞれＨＢＳ−Ｐ＋（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０μＭ  ＥＤＴＡ及び０．０５％ Surfactant P20を含む１０ｍＭ HEPES）で２段階希釈し，０．７８１２５〜５０ｎＭ（０．１１７〜７．５μｇ／ｍＬ）の７段階の濃度の抗体溶液を調製した。この抗体溶液をサンプル溶液とした。ｒヒトＴｆＲとｒサルＴｆＲとを，それぞれＨＢＳ−Ｐ＋で希釈し，２５μｇ／ｍＬの溶液を調製し，それぞれｒヒトＴｆＲ−ＥＣＤ（Histag）溶液及びｒサルＴｆＲ−ＥＣＤ（Histag）溶液とした。【０２４６】
上記２段階希釈して調製したサンプル溶液を，96 well plate, black（greiner bio-one社）に２００μＬ／ウェルずつ添加した。また，上記調製したｒヒトＴｆＲ−ＥＣＤ（Histag）溶液又はｒサルＴｆＲ−ＥＣＤ（Histag）溶液を，所定のウェルにそれぞれ２００μＬ／ウェルずつ添加した。ベースライン，解離用及び洗浄用のウェルには，ＨＢＳ−Ｐ＋を２００μＬ／ウェルずつ添加した。再生用のウェルには，１０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，  ｐＨ１．７を２００μＬ／ウェルずつ添加した。活性化用のウェルには，０．５ｍＭ  ＮｉＣｌ２溶液を２００μＬ／ウェルずつ添加した。このプレートと，バイオセンサー（Biosensor／Ni-NTA：ForteBio社，a division of Pall Corporation）を，OctetRED96の所定の位置に設置した。【０２４７】
ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６を下記の表３に示す条件で作動させてデータを取得後，OctetRED96付属の解析ソフトウェアを用いて，結合反応曲線を１：１結合モデルあるいは２：１結合モデルにフィッティングし，抗ｈＴｆＲ抗体と，ｒヒトＴｆＲ及びｒサルＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）を測定し，解離定数（Ｋｄ）算出した。なお，測定は２５〜３０℃の温度下で実施した。【０２４８】
【表３】
2016208696.tif 000004
【０２４９】
表４に抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜１４（表中，抗体番号１〜１４にそれぞれ対応）のヒトＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）の測定結果，及び解離定数（ｋＤ）を示す。【０２５０】
【表４】
2016208696.tif 000005
【０２５１】
表５に抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜１４（表中，Ｎｏ．１〜１４にそれぞれ対応）のサルＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）の測定結果，及び解離定数（ｋＤ）を示す。【０２５２】
【表５】
2016208696.tif 000006
【０２５３】
抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲへの親和性の測定の結果，全ての抗体で，ヒトＴｆＲとの解離定数は１×１０−８Ｍ以下であり，抗体番号１０を除く１３種類の抗体ではヒトＴｆＲとの解離定数は１×１０−９Ｍ以下であり，特に抗体番号３，８，１３及び１４では，ヒトＴｆＲとの解離定数が１×１０−１２Ｍ以下であった（表４）。これらの結果は，１４種類の抗体が全てヒトＴｆＲと高い親和性を有する抗体であることを示す。次いで，抗ｈＴｆＲ抗体のサルＴｆＲへの親和性の測定の結果をみると，全ての抗体で，サルＴｆＲとの解離定数は５×１０−８Ｍ以下であり，特に，抗体番号１及び３では，サルＴｆＲとの解離定数が１×１０−１２Ｍ以下であった（表５）。これらの結果は，１４種類の抗体が全てヒトＴｆＲのみならずサルＴｆＲとも高い親和性を有する抗体であることを示す。【０２５４】
〔実施例７−２〕抗ｈＴｆＲ抗体のマウスを用いた脳移行評価
次いで，抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜９及び１１〜１４の１３種類の抗体について，各抗体がＢＢＢを通過して脳内に移行することを，マウストランスフェリン受容体の細胞外領域をコードする遺伝子をヒトトランスフェリン受容体遺伝子の細胞外領域をコードする遺伝子に置換したｈＴｆＲノックインマウス（ｈＴｆＲ−ＫＩマウス）を用いて評価した。ｈＴｆＲ−ＫＩマウスは，概ね下記の方法で作製した。また，抗ｈＴｆＲ抗体としては，実施例７に記載の精製品を用いた。【０２５５】
細胞内領域がマウスｈＴｆＲのアミノ酸配列であり，細胞外領域がヒトｈＴｆＲのアミノ酸配列であるキメラｈＴｆＲをコードするｃＤＮＡの３’側に，ｌｏｘＰ配列で挟み込んだネオマイシン耐性遺伝子を配置した，配列番号２５３で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を化学的に合成した。このＤＮＡ断片を，５’アーム配列として配列番号２５４で示される塩基配列，３’アーム配列として配列番号２５５で示される塩基配列を有するターゲッティングベクターに，常法により組み込み，これをマウスＥＳ細胞にエレクトロポレーション法により導入した。遺伝子導入後のマウスＥＳ細胞を，ネオマイシン存在下で選択培養し，ターゲッティングベクターが相同組換えにより染色体に組み込まれたマウスＥＳ細胞を選択した。得られた遺伝子組換えマウスＥＳ細胞を，ＩＣＲマウスの８細胞期胚（宿主胚）へ注入し，精管結紮を行ったマウスとの交配によって得られた偽妊娠マウス（レシピエントマウス）に移植した。得られた産仔（キメラマウス）について毛色判定を行い，ＥＳ細胞が生体の形成に高効率で寄与した個体，すなわち全体毛に対する白色毛の占める比率の高い個体を選別した。このキメラマウス個体をＩＣＲマウスと掛け合わせてＦ1マウスを得た。白色のＦ１マウスを選別し，尻尾の組織より抽出したＤＮＡを解析し，染色体上でマウストランスフェリン受容体遺伝子がキメラｈＴｆＲに置き換わっているマウスをｈＴｆＲ−ＫＩマウスとした。【０２５６】
上記１３種類の抗ｈＴｆＲ抗体を，Fluorescein Labeling Kit-NH2（同仁化学研究所）を用いて，添付の操作マニュアルに従ってフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）により蛍光標識した。このＦＩＴＣ蛍光標識した１３種類の抗ｈＴｆＲ抗体を含むＰＢＳ溶液をそれぞれ調製した。この抗体溶液を，投与される抗ｈＴｆＲ抗体の用量が３ｍｇ／ｋｇとなるように，それぞれ１匹のｈＴｆＲ−ＫＩマウス（雄，１０〜１２週齢）に静脈注射した。また，コントロールとして，同様にして調製したＦＩＴＣ蛍光標識したマウスＩｇＧ１（シグマ社）を含むＰＢＳ溶液を，３ｍｇ／ｋｇの用量で１匹のｈＴｆＲ−ＫＩマウス（雄，１０〜１２週齢）に静脈注射した。静脈注射してから約８時間後に生理食塩液で全身灌流し，脳（大脳と小脳を含む部分）を採取した。摘出した脳の重量（湿重量）を測定した後，Protease Inhibitor Cocktail(シグマ社)を含むT-PER（Thermo Fisher Scientific社) を添加して脳組織をホモジネートした。ホモジネートを遠心して上清を回収し，上清中に含まれるＦＩＴＣ蛍光標識した抗体の量を以下の方法で測定した。まず，抗FITC Antibody(Bethyl社)をHigh Bind Plate（Meso Scale Diagnostics社）の各ウェルに１０μＬずつ添加し，１時間静置してプレートに固定させた。次いで，各ウェルにSuperBlock blocking buffer in PBS（Thermo Fisher Scientific社）を１５０μＬずつ添加し，１時間振盪してプレートをブロッキングした。次いで，各ウェルに脳組織のホモジネートの上清を２５μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにSULFO-TAG Anti-Mouse Antibody(Goat)（Meso Scale Diagnostics社）を２５μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにRead buffer T（Meso Scale Diagnostics社）を１５０μＬずつ添加し，SectorＴＭ Imager 6000 readerで各ウェルからの発光量を測定した。濃度既知のＦＩＴＣ蛍光標識した抗ｈＴｆＲ抗体の標準試料の測定値から検量線を作成し，これに各検体の測定値を内挿することにより，脳のグラム重量（湿重量）当たりに含まれる抗体の量（脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度）を算出した。その結果を表５−２に示す。【０２５７】
コントロールと比較して，抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜９及び１１〜１４の抗体の脳組織中の濃度は，いずれも２５倍以上であった。抗ｈＴｆＲ抗体番号５及び６では，その濃度がコントロールと比較して１００倍以上であり，特に抗ｈＴｆＲ抗体番号６では約１６０倍にまで達した。これらの結果は，抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜９及び１１〜１４の抗体が，ＢＢＢを積極的に通過して脳内に移行する性質を有することを示すものである。【０２５８】
【表５−２】
2016208696.tif 000007
【０２５９】
〔実施例８〕抗ｈＴｆＲ抗体サルを用いた薬物動態解析
抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜３の抗体を，それぞれ，５．０ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ雄性カニクイザルに単回静脈内投与し投与８時間後に生理食塩液で全身潅流を実施した。また，陰性対照として，抗ｈＴｆＲ抗体を非投与の１匹の個体を同様に全身潅流した。潅流後，延髄を含む脳組織を摘出した。この脳組織を用いて，以下の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定及び免疫組織化学染色を行った。また，抗ｈＴｆＲ抗体としては，実施例７に記載の精製品を用いた。【０２６０】
脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定は，概ね以下の手順で行った。採取した組織を，脳組織を大脳，小脳，海馬及び延髄に分けてから，それぞれProtease Inhibitor Cocktail（Sigma-Aldrich社）を含むRIPA Buffer（和光純薬工業株式会社）でホモジネートし遠心して上清を回収した。Affinipure Goat Anti mouse IgG Fcγ pAb（Jackson ImmunoResearch社）をHigh Bind Plate（Meso Scale Diagnostics社）の各ウェルに１０μＬずつ添加し，１時間静置してプレートに固定した。次いで，各ウェルにSuperBlock blocking buffer in PBS（Thermo Fisher Scientific社）を１５０μＬずつ添加し，１時間振盪し，プレートをブロッキングした。次いで，各ウェルに脳組織のホモジネートの上清を２５μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにAffinipure Goat Anti mouse IgG Fab-Biotin（Jackson ImmunoResearch社）を２５μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにSULFO-Tag-Streptavidin（Meso Scale Diagnostics社）を２５μＬずつ添加し，０．５時間振盪した。各ウェルにRead buffer T（Meso Scale Diagnostics社）を１５０μＬずつ添加し，SectorＴＭ Imager 6000 reader（Meso Scale Diagnostics社）を用いて各ウェルからの発光量を測定した。濃度既知の抗ｈＴｆＲ抗体の標準試料の測定値から検量線を作成し，これに各検体の測定値を内挿することにより，各脳組織のグラム重量（湿重量）当たりに含まれる抗体の量（脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度）を算出した。【０２６１】
脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定の結果を表６に示す。抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜抗ｈＴｆＲ抗体番号３の抗体ともに，大脳，小脳，海馬及び延髄での蓄積が認められたが，その量は，抗ｈＴｆＲ抗体番号１＜抗ｈＴｆＲ抗体番号３＜抗ｈＴｆＲ抗体番号２と，抗ｈＴｆＲ抗体番号１で最も少なく，抗ｈＴｆＲ抗体番号２で最も多かった。ｈＴｆＲ抗体番号２では，抗ｈＴｆＲ抗体番号１と比較して，大脳で約４．３倍，小脳で約６．６倍，海馬で約４．６倍，及び延髄で約２倍の，抗体の蓄積が認められた。これらの結果は，これら３種類の抗体が血液脳関門を通過して脳組織に蓄積する性質を有することを示すものであり，脳組織内で機能させるべき薬剤であるＢＤＮＦをこれらの抗体と結合させることにより，その薬剤を効率良く脳組織に蓄積させることができること示すものである。【０２６２】
【表６】
2016208696.tif 000008
【０２６３】
脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色は，概ね以下の手順で行った。ティシューテッククライオ３ＤＭ（サクラファインテック株式会社）を用いて採取した組織を−８０℃にまで急速冷凍し，組織の凍結ブロックを作製した。この凍結ブロックを４μｍに薄切後，ＭＡＳコートスライドガラス（松浪ガラス株式会社）に貼り付けた。組織薄片に４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）を４℃で５分間反応させ，組織薄片をスライドガラス上に固定した。続いて，組織薄片に０．３％過酸化水素水を含むメタノール溶液（和光純薬工業株式会社）を３０分間反応させ，内因性ペルオキシダーゼを失活させた。次いでスライドガラスをSuperBlock blocking buffer in PBSに３０分間室温で反応させてブロッキングした。次いで，組織薄片にMouse IgG-heavy and light chain Antibody（Bethyl Laboratories社）を１時間室温で反応させた。組織薄片を，ＤＡＢ基質（3,3’-diaminobenzidine，Vector Laboratories社）で発色させ，マイヤー・ヘマトキシリン（Merck社）で対比染色を行い，脱水，透徹した後に封入し，光学顕微鏡で観察した。【０２６４】
図１に大脳皮質の抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与したサルの大脳皮質では，血管の特異的な染色が確認された（それぞれ図１ｂ〜ｄ）。特に，抗ｈＴｆＲ抗体番号２を投与したサルと抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与したサルの大脳皮質（それぞれ図１ｃ及び図１ｄ）では，脳血管外の脳実質領域にも広範に特異的な染色が確認された。なお，コントロールとしておいた抗ｈＴｆＲ抗体を非投与のサルの大脳皮質では染色は認められず，バックグラウンドの染色は殆どないことが示された（図１ａ）。【０２６５】
図２に海馬の抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与したサルの大脳では，血管の特異的な染色が確認された（それぞれ図２ｂ〜ｄ）。特に，抗ｈＴｆＲ抗体番号２を投与したサルと抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与したサルの海馬（それぞれ図２ｃ及び図２ｄ）では，神経様細胞にも特異的な染色が確認され，更に，脳血管外の脳実質領域にも広範に特異的な染色が確認された。なお，コントロールとしておいた抗ｈＴｆＲ抗体を非投与のサルの海馬では染色は認められず，バックグラウンドの染色は殆どないことが示された（図２ａ）。【０２６６】
図３に小脳の抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与したサルの小脳では，血管の特異的な染色が確認された（それぞれ図３ｂ〜ｄ）。特に，抗ｈＴｆＲ抗体番号２を投与したサルと抗ｈＴｆＲ抗体番号３を投与したサルの小脳（それぞれ図３ｃ及び図３ｄ）では，プルキンエ細胞にも特異的な染色が確認された。なお，コントロールとしておいた抗ｈＴｆＲ抗体を非投与のサルの小脳では染色は認められず，バックグラウンドの染色は殆どないことが示された（図３ａ）。【０２６７】
以上の大脳，海馬及び小脳の免疫組織化学染色の結果から，抗ｈＴｆＲ抗体番号１は脳血管内皮表面に存在するｈＴｆＲへは結合することができるが，抗ｈＴｆＲ抗体番号２及び３と比較して脳実質への移行する量は比較的少ないと考えられた。一方で，抗ｈＴｆＲ抗体番号２及び３は，脳血管内皮表面に存在するｈＴｆＲへ結合することができ，且つ，ｈＴｆＲへの結合後，血液脳関門を通過して脳実質内へ移行し，さらに海馬においては脳実質内から神経様細胞にまで，小脳においてはプルキンエ細胞にまで取り込まれることがわかった。【０２６８】
〔実施例９〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の作製
表１に示す抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜３の軽鎖及び重鎖の可変領域に含まれるアミノ酸配列のヒト化を試みた。抗ｈＴｆＲ抗体番号１については，配列番号１５８〜配列番号１６３に示されるアミノ酸配列を有するヒト化された軽鎖の可変領域と，配列番号１６６〜配列番号１７１に示されるアミノ酸配列を有するヒト化された重鎖の可変領域を得た。抗ｈＴｆＲ抗体番号２については，配列番号１７４〜配列番号１７９に示されるアミノ酸配列を有するヒト化された軽鎖の可変領域と，配列番号１８２〜配列番号１８７に示されるアミノ酸配列を有するヒト化された重鎖の可変領域を得た。抗ｈＴｆＲ抗体番号３については，配列番号１９０〜配列番号１９５に示されるアミノ酸配列を有するヒト化された軽鎖の可変領域と，配列番号２０４〜配列番号２０９に示されるアミノ酸配列を有するヒト化された重鎖の可変領域を得た。【０２６９】
〔実施例１０〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子の構築
上記の抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜３について，それぞれヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域を含む，軽鎖及び重鎖の全長をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を人工的に合成した。このとき，軽鎖の全長をコードする遺伝子の５’側には，5’端から順にＭｌｕＩ配列とリーダーペプチドをコードする配列とを，３’側にはＮｏｔＩ配列を導入した。また，重鎖の全長をコードする遺伝子の５’側には，5’端から順にＭｌｕＩ配列とリーダーペプチドをコードする配列とを，３’側にＮｏｔＩ配列を導入した。なお，ここで導入したリーダーペプチドは，ヒト化抗体の軽鎖及び重鎖をホスト細胞である哺乳動物細胞で発現させたときに，軽鎖及び重鎖が細胞外に分泌されるように，分泌シグナルとして機能するものである。【０２７０】
抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖については，可変領域に配列番号１６３で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号１６４で示されるアミノ酸配列の軽鎖（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖）の全長をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号１６５）を合成した。抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖については，可変領域に配列番号１７１で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号１７２で示されるアミノ酸配列の重鎖（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖）の全長をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号１７３）を合成した。配列番号１７３で示されるＤＮＡ断片にコードされるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖はＩｇＧ１である。【０２７１】
抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖については，可変領域に配列番号１７９で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号１８０で示されるアミノ酸配列の軽鎖（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖）の全長をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号１８１）を合成した。抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖については，可変領域に配列番号１８７で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号１８８で示されるアミノ酸配列の重鎖（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖）の全長をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号１８９）を合成した。配列番号１８９で示されるＤＮＡ断片にコードされるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖はＩｇＧ１である。【０２７２】
抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖については，可変領域に配列番号１９１で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号１９６で示されるアミノ酸配列の軽鎖（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖）の全長をコードするＤＮＡ断片（配列番号１９７）を合成した。【０２７３】
抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖については，可変領域に配列番号１９３で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号１９８で示されるアミノ酸配列の軽鎖（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２の軽鎖）の全長をコードするＤＮＡ断片（配列番号１９９）と，可変領域に配列番号１９４で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号２００で示されるアミノ酸配列の軽鎖（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−３の軽鎖）の全長をコードするＤＮＡ断片（配列番号２０１）と，可変領域に配列番号１９５で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号２０２で示されるアミノ酸配列の軽鎖（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−４の軽鎖）の全長をコードするＤＮＡ断片（配列番号２０３）も合成した。抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖については，可変領域に配列番号２０５で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号２１０で示されるアミノ酸配列の重鎖（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖）の全長をコードするＤＮＡ断片（配列番号２１１）を合成した。配列番号２１１で示されるＤＮＡ断片にコードされるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖はＩｇＧ１である。【０２７４】
更に，抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖については，可変領域に配列番号２０５で示されるアミノ酸配列を有する，配列番号２１２で示されるアミノ酸配列の重鎖（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＩｇＧ４）の全長をコードするＤＮＡ断片（配列番号２１３）を合成した。この配列番号２１３で示されるＤＮＡ断片にコードされるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖はＩｇＧ４である。【０２７５】
〔実施例１１〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体発現ベクターの構築
ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｎｕｃベクター（インビトロジェン社）を，ＫｐｎＩとＮｃｏＩで消化し，ＥＦ−１αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を切り出し，これをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理した。ｐＣＩ−ｎｅｏ（インビトロジェン社）を，ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して，ＣＭＶのエンハンサー／プロモーターおよびイントロンを含む領域を切除した後に，Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のＥＦ−１αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を挿入して，ｐＥ−ｎｅｏベクターを構築した。ｐＥ−ｎｅｏベクターを，ＳｆｉＩおよびＢｓｔＸＩで消化し，ネオマイシン耐性遺伝子を含む約１ｋｂｐの領域を切除した。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（インビトロジェン社）を鋳型にしてプライマーＨｙｇ−Ｓｆｉ５’（配列番号２１６）およびプライマーＨｙｇ−ＢｓｔＸ３’（配列番号２１７）を用いて，ＰＣＲ反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した。増幅したハイグロマイシン遺伝子を，ＳｆｉＩおよびＢｓｔＸＩで消化し，上記のネオマイシン耐性遺伝子を切除したｐＥ−ｎｅｏベクターに挿入して，ｐＥ−ｈｙｇｒベクターを構築した。【０２７６】
ｐＥ−ｈｙｇｒベクター及びｐＥ−ｎｅｏベクターをそれぞれＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化した。実施例１０で合成したヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号１６５）と重鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号１７３）をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，それぞれｐＥ−ｈｙｇｒベクターとｐＥ−ｎｅｏベクターのＭｌｕＩ−ＮｏｔＩ間に挿入した。得られたベクターを，それぞれヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖発現用ベクターのｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ１）とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖発現用ベクターのｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ１）として以下の実験に用いた。【０２７７】
同様に，実施例１０で合成したヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号１８１）と重鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号１８９をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，それぞれｐＥ−ｈｙｇｒベクターとｐＥ−ｎｅｏベクターのＭｌｕＩ−ＮｏｔＩ間に挿入した。得られたベクターを，それぞれヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖発現用ベクターのｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ２），ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖発現用ベクターのｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ２）として以下の実験に用いた。【０２７８】
更に同様に，実施例１０で合成したヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖コードするＤＮＡ断片（配列番号１９７）と重鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号２１１）をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，それぞれｐＥ−ｈｙｇｒベクターとｐＥ−ｎｅｏベクターのＭｌｕＩ−ＮｏｔＩ間に挿入した。得られたベクターを，それぞれヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖発現用ベクターのｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３），ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖発現用ベクターのｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ３）として以下の実験に用いた。【０２７９】
更に，抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖については，実施例１０で合成したヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２の軽鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号１９９），ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−３の軽鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号２０１），及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−４の軽鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号２０３）をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ−ｈｙｇｒベクターのＭｌｕＩ−ＮｏｔＩ間に挿入し，それぞれヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２の軽鎖発現用ベクターのｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３−２），ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−３の軽鎖発現用ベクターのｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３−３），及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−４の軽鎖発現用ベクターのｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３−４）を構築した。【０２８０】
更に同様に，抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖については，実施例１０で合成したヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＩｇＧ４をコードするＤＮＡ断片（配列番号２１３）をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ−ｎｅｏベクターのＭｌｕＩ−ＮｏｔＩ間に挿入し，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＩｇＧ４発現用ベクターのｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ３−ＩｇＧ４）を構築した。【０２８１】
〔実施例１２〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体発現用細胞の構築
ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１：American Type Culture Collectionから入手）を，下記の方法により，GenePulser（Bio-Rad社）を用いて，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ１）及び重鎖発現用ベクターｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ１）で形質転換した。細胞の形質転換は概ね以下の方法で行った。５×１０５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞をCD OptiCHOＴＭ培地（ライフテクノロジー社）を添加した３．５ｃｍ培養ディッシュに播種し，３７℃，５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。培地をOpti-MEMＴＭ I培地（ライフテクノロジー社）に交換し，細胞を５×１０６細胞／ｍＬの密度となるように懸濁した。細胞懸濁液１００μＬを採取し，これにOpti-MEMＴＭＩ培地で１００μｇ／ｍＬに希釈したｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ１）及びｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ１）プラスミドＤＮＡ溶液を５μＬずつ添加した。GenePulser（Bio-Rad社）を用いて，エレクトロポレーションを実施し，細胞にプラスミドを導入した。細胞を，３７℃，５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した後，０．５ｍｇ／ｍＬのハイグロマイシン及び０．８ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を添加したCD OptiCHOＴＭ培地で選択培養した。
次いで，限界希釈法により，１ウェルあたり１個以下の細胞が播種されるように，９６ウェルプレート上に選択培養で選択された細胞を播種し，各細胞が単クローンコロニーを形成するように約１０日間培養した。単クローンコロニーが形成されたウェルの培養上清を採取し，培養上清中のヒト化抗体含量をＥＬＩＳＡ法にて調べ，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体高発現細胞株を選択した。【０２８２】
このときのＥＬＩＳＡ法は概ね以下の方法で実施した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc社）の各ウェルに，ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体溶液を０．０５ Ｍ炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９．６）で４μｇ／ｍＬに希釈したしたものを１００μＬずつ加え，室温で少なくとも１時間静置して抗体をプレートに吸着させた。次いで，リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に０．０５％ Tween 20を添加したもの（ＰＢＳ−Ｔ）で各ウェルを３回洗浄後，Starting Block（ＰＢＳ） Blocking Buffer（Thermo Fisher Scientific社）を各ウェルに２００μＬずつ加えてプレートを室温で３０分静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後，ＰＢＳに０．５％ ＢＳＡ及び０．０５％ Tween 20 を添加したもの（ＰＢＳ−ＢＴ）で適当な濃度に希釈した培養上清又はヒトＩｇＧ標準品を，各ウェルに１００μＬずつ加え，プレートを室温で少なくとも１時間静置した。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後，ＰＢＳ−ＢＴで希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧポリクロ−ナル抗体溶液を，各ウェルに１００μＬずつ加え，プレートを室温で少なくとも１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄後，リン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ  ５．０）を含む０．４ｍｇ／ｍＬｏ−フェニレンジアミンを１００μＬずつ各ウェルに加え，室温で８〜２０分間静置した。次いで，１ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００μＬずつ各ウェルに加えて反応を停止させ，９６ウェルプレートリーダーを用いて，各ウェルの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。高い測定値を示したウェルに対応する細胞を，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の高発現細胞株とした。これを抗体番号１発現株とした。【０２８３】
同様にして，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ２）及び重鎖発現用ベクターｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ２）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の高発現細胞株を得た。これを抗体番号２発現株とした。【０２８４】
更に同様にして，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ−−ｈｙｇｒ（ＬＣ３）及び重鎖発現用ベクターｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ３）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の高発現株を得た。これを抗体番号３発現細胞株とした。【０２８５】
更に同様にして，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３−２）及び重鎖発現用ベクターｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ３）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２の高発現細胞株を得た。これを抗体番号３−２発現株とした。【０２８６】
更に同様にして，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３−３）及び重鎖発現用ベクターｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ３）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−３の高発現細胞株を得た。これを抗体番号３−３発現株とした。【０２８７】
更に同様にして，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３−４）及び重鎖発現用ベクターｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ３）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−４の高発現細胞株を得た。これを抗体番号３−４発現株とした。【０２８８】
更に同様にして，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３）及び重鎖発現用ベクターｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ３−ＩｇＧ４）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）の高発現細胞株を得た。これを抗体番号３（ＩｇＧ４）発現株とした。【０２８９】
更に同様にして，実施例１１で構築した軽鎖発現用ベクターｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３−２）及び重鎖発現用ベクターｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ３−ＩｇＧ４）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換させて，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）の高発現細胞株を得た。これを抗体番号３−２（ＩｇＧ４）発現株とした。【０２９０】
〔実施例１３〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の精製
実施例１２で得られた抗体番号１発現株，抗体番号２発現株，抗体番号３発現株，抗体番号３−２発現株，抗体番号３−３発現株及び抗体番号３−４発現株を，それぞれ細胞濃度が約２Ｘ１０５個／ｍＬとなるように，CD OptiCHOＴＭ培地で希釈し，１Ｌの三角フラスコに２００ｍＬの細胞懸濁液を加え，３７℃で，５％ＣＯ２と９５％空気からなる湿潤環境で約７０ｒｐｍの撹拌速度で６〜７日間培養した。培養上清を遠心操作により回収し，０．２２μｍフィルター（Millipore社）でろ過して，培養上清とした。回収した培養上清に，１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５倍容の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し，予め１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むカラム体積３倍容の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化しておいたProteinAカラム（カラム体積：１ｍL，Bio-Rad社）に負荷した。次いで，カラム体積の５倍容の同緩衝液によりカラムを洗浄した後，１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むカラム体積の４倍容の５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）で，吸着したヒト化抗ｈＴｆＲ抗体を溶出させ，これを抗体の精製品とした。【０２９１】
ここで，抗体番号１発現株の培養上清から精製された抗体を，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１とした。抗体番号２発現株の培養上清から精製された抗体は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２とした。抗体番号３発現株の培養上清から精製された抗体は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３とした。抗体番号３−２発現株の培養上清から精製された抗体は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２とした。抗体番号３−３発現株の培養上清から精製された抗体は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−３とした。また，抗体番号３−４発現株の培養上清から精製された抗体は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−４とした。【０２９２】
また，実施例１２で得られた抗体番号３（ＩｇＧ４）発現株，及び抗体番号３−２（ＩｇＧ４）発現株についても上記と同様に培養して，その培養上清から，それぞれ精製されたヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）を得た。これら２種の抗体は，実施例１５に記載されたサルを用いた薬物動態解析に用いた。【０２９３】
〔実施例１４〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性の測定
実施例１３で得たヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性を，実施例７に記載の方法で測定した。表７にヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜３−４（表中，Ｎｏ．１〜３−４にそれぞれ対応）のヒトＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）の測定結果，及び解離定数（ｋＤ）を示す。【０２９４】
【表７】
2016208696.tif 000009
【０２９５】
表８にヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜３−４（表中，抗体番号１〜３−４にそれぞれ対応）のサルＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）の測定結果，及び解離定数（ｋＤ）を示す。【０２９６】
【表８】
2016208696.tif 000010
【０２９７】
ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１〜３−４のヒトＴｆＲへの親和性の測定の結果，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１，２，３，及び３−４抗体で，ヒトＴｆＲとの解離定数は１×１０−１２Ｍ未満であった（表７）。また，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２及び３−３のヒトＴｆＲとの解離定数は，それぞれ２．３９×１０−１１Ｍと２．０９×１０−１１Ｍであった。一方，これら抗体に対応するヒト化前の抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲとの解離定数は，抗体番号１については５．０９×１０−１２Ｍであり，抗体番号２については１．１２×１０−１１Ｍであり，抗体番号３については１×１０−１２Ｍ未満であった（表４）。これらの結果は，抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲへの高い親和性が，抗体をヒト化する前後で維持されることを示すものであり，抗ｈＴｆＲ抗体番号４〜１４についても，抗体をヒト化した後も，ヒトＴｆＲへの親和性が維持され得ることを示すものである。【０２９８】
次いで，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のサルＴｆＲへの親和性の測定の結果をみると，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１は，抗体をヒト化する前後で解離定数は１×１０−１２Ｍ未満と親和性が維持され，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２も，ヒト化前の解離定数が４．１８×１０−１１Ｍであったものが，ヒト化後の解離定数は７．５５×１０−１１Ｍと親和性が維持された（表５，表８）。一方，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３〜３−４は，ヒト化前のこれら抗体に対応する抗ｈＴｆＲ抗体番号３のサルＴｆＲとの解離定数が１×１０−１２Ｍ未満であったものが，ヒト化後は２．６０×１０−１０Ｍ〜１．９１×１０−９Ｍと，サルＴｆＲへの親和性の低下が観察された。ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３では，サルＴｆＲへの親和性の低下が観察されたものの，これらの結果は，抗ｈＴｆＲ抗体のサルＴｆＲへの高い親和性は，抗体をヒト化する前後で喪失することなく概ね維持されることを示すものであり，抗ｈＴｆＲ抗体番号４〜１４についても，抗体をヒト化した後も，サルＴｆＲへの親和性が維持され得ることを示すものである。【０２９９】
〔実施例１５〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のサルを用いた薬物動態解析
ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）の４種の抗体を用いて，サルを用いた薬物動態解析を行った。なお，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３は重鎖がＩｇＧ１であり，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖を可変領域はそのままにしてＩｇＧ４としたものである。また，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２は重鎖がＩｇＧ１であり，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２の重鎖を可変領域はそのままにしてＩｇＧ４としたものである。これら４種の抗体を，それぞれ，５．０ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれ雄性カニクイザルに単回静脈内投与し，投与前，投与後２分，３０分，２時間，４時間及び８時間後に末梢血を採取し，採血後に全身潅流を実施した。また，陰性対照として，ＨＥＲ２蛋白に対するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチンＴＭ，中外製薬）を，同様にして一匹の個体に投与し，投与前，投与後２分，３０分，２時間，４時間及び８時間後に末梢血を採取し，採血後に全身潅流を実施した。潅流後，延髄を含む脳組織，脊髄組織及びその他の組織（肝臓，心臓，脾臓及び骨髄を含む）を摘出した。この脳組織，脊髄組織及びその他の組織を用いて，以下のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定及び免疫組織化学染色を行った。【０３００】
組織中及び末梢血中のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定は，概ね以下の手順で行った。なお，脳については採取した組織を，大脳皮質，小脳，海馬及び延髄に分けてからヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定を行った。採取した組織を，それぞれProtease Inhibitor Cocktail（Sigma-Aldrich社）を含むRIPA Buffer（和光純薬工業株式会社）でホモジネートし遠心して上清を回収した。末梢血については血清を分離した。Affinipure Goat Anti mouse IgG Fcγ pAb（Jackson ImmunoResearch社）をHigh Bind Plate（Meso Scale Diagnostics社）の各ウェルに１０μＬずつ添加し，１時間静置して固相化した。次いで，各ウェルにSuperBlock blocking buffer in PBS（Thermo Fisher Scientific社）を１５０μＬずつ添加し，１時間振盪し，プレートをブロッキングした。次いで，各ウェルにホモジネートの上清又は血清を２５μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにAffinipure Goat Anti mouse IgG Fab-Biotin（Jackson ImmunoResearch社）を２５μＬずつ添加し，１時間振盪した。次いで，各ウェルにSULFO-Tag-Streptavidin（Meso Scale Diagnostics社）を２５μＬずつ添加し，０．５時間振盪した。各ウェルにRead buffer T（Meso Scale Diagnostics社）を１５０μＬずつ添加し，SectorＴＭ Imager 6000 readerを用いて各ウェルからの発光量を測定した。濃度既知の抗ｈＴｆＲ抗体の標準試料の測定値から検量線を作成し，これに各検体の測定値を内挿することにより，各組織中及び末梢血中に含まれる抗体の量を算出した。濃度の測定は各サンプルにつき３回繰り返し行った。【０３０１】
脳組織及び脊髄組織中のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定の結果を表９に示す。
【表９】
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【０３０２】
ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）の抗体ともに，大脳皮質，小脳，海馬，延髄及び脊髄での蓄積が認められた（表９）。その量は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３では，陰性対照のトラスツズマブ（ハーセプチンＴＭ）と比較して，大脳皮質で約８２倍，小脳で約６８倍，海馬で約９２倍，延髄で約５４倍，脊髄で約３．１倍であり，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２では，陰性対照のトラスツズマブと比較して，大脳皮質で約１２８倍，小脳で約８０倍，海馬で約１３６倍，延髄で約６３倍，脊髄で約３．１倍であり，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）では，陰性対照のトラスツズマブと比較して，大脳皮質で約７９倍，小脳で約６６倍，海馬で約１０６倍，延髄で約５４倍，脊髄で約３．１倍であり，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）では，陰性対照のトラスツズマブと比較して，大脳皮質で約９３倍，小脳で約６３倍，海馬で約１１７倍，延髄で約６６倍，脊髄で約３．２倍であった（表１０）。これらの結果は，これら４種のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体が，血液脳関門を通過して脳組織に蓄積する性質を有することを示すものであり，脳組織内で機能させるべき薬剤であるＢＤＮＦをこれらの抗体と結合させることにより，その薬剤を効率良く脳組織に蓄積させることができること示すものである。【０３０３】
【表１０】
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【０３０４】
次いで，肝臓，心臓，脾臓及び骨髄の各組織中のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の濃度測定の結果を図４に示す。肝臓，及び脾臓では，４種類のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体及び陰性対照のトラスツズマブのいずれにおいても蓄積が認められたが，その量はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とトラスツズマブで同等であった。心臓では，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体が陰性対照のトラスツズマブと比較して，蓄積量が多い傾向にあったが，その量は陰性対照の１．５倍〜２．８倍程度に留まった。骨髄では，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体が，陰性対照のトラスツズマブと比較して，顕著に蓄積量が多い傾向にあり，その量は陰性対照の３．５〜１６倍であった。骨髄へのヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の蓄積は，造血器官である骨髄ではＴｆＲの発現量が多く，ＴｆＲと結合することにより多くのヒト化抗ｈＴｆＲ抗体が陰性対照と比較して蓄積したためと考えられる。これらのデータは，これら４種のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体が，中枢神経系である大脳，小脳，海馬及び延髄に特異的に蓄積する性質を有することを示すものであり，脳組織内で機能させるべき薬剤であるＢＤＮＦをこれらの抗体と結合させることにより，その薬剤を効率良く脳組織に蓄積させることができること示すものである。【０３０５】
次いで，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の血中動態の測定結果を表１１に示す。４種類のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体は，陰性対照のトラスツズマブと同様に，投与後８時間においても血中濃度が６０μｇ／ｍＬ以上の高値を示し，血中で安定であることが示された（表１１）。【０３０６】
【表１１】
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【０３０７】
脳組織中のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色は，概ね以下の手順で行った。ティシューテッククライオ３ＤＭ（サクラファインテック株式会社）を用いて，採取した組
織を−８０℃にまで急速冷凍し，凍結ブロックを４μｍに薄切後，ＭＡＳコートスライドガラス（松浪ガラス株式会社）に貼り付けた。組織薄片に４％パラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）を４℃で５分間反応させ，組織薄片をスライドガラス上に固定した。続いて，組織薄片に０．３％過酸化水素水を含むメタノール溶液（和光純薬工業株式会社）を３０分間反応させ，内因性ペルオキシダーゼを失活させた。次いでスライドガラスをSuperBlock blocking buffer in PBSに３０分間室温で反応させブロッキングした。次いで，組織薄片にMouse IgG-heavy and light chain Antibody（Bethyl Laboratories）を１時間室温で反応させた。組織薄片を，ＤＡＢ基質（3,3’-diaminobenzidine，Vector Laboratories社）で発色させ，マイヤー・ヘマトキシリン（Merck社）で対比染色を行い，脱水，透徹した後に封入し，光学顕微鏡で観察した。【０３０８】
図５に大脳皮質のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）を投与したサルの大脳皮質では，血管及び神経様細胞の特異的な染色が確認された（それぞれ図５ｂ〜ｅ）。特に，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２を投与したサルの大脳皮質（図５ｃ）では，脳血管外の脳実質領域にも広範に特異的な染色が確認された。なお，コントロールとしておいたハーセプチンを投与したサルの大脳皮質では染色は認められず，図５ｂ〜ｅで観察された組織染色が，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に特異的なものであることが示された（図５ａ）。【０３０９】
図６に海馬のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）を投与したサルの海馬では，血管及び神経様細胞の特異的な染色が確認された（それぞれ図６ｂ〜ｅ）。なお，コントロールとしておいたハーセプチンを投与したサルの海馬では染色は認められず，図６ｂ〜ｅで観察された組織染色が，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に特異的なものであることが示された（図６ａ）。【０３１０】
図７に小脳のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）を投与したサルの小脳では，血管及びプルキンエ細胞の特異的な染色が確認された（それぞれ図７ｂ〜ｅ）。なお，コントロールとしておいたハーセプチンを投与したサルの小脳では染色は認められず，図７ｂ〜ｅで観察された組織染色が，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に特異的なものであることが示された（図７ａ）。【０３１１】
図８に延髄のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の免疫組織化学染色の結果を示す。ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３（ＩｇＧ４）及びヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３−２（ＩｇＧ４）を投与したサルの延髄では，血管及び神経様細胞の特異的な染色が確認された（それぞれ図８ｂ〜ｅ）。なお，コントロールとしておいたハーセプチンを投与したサルの延髄では染色は認められず，図８ｂ〜ｅで観察された組織染色が，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体に特異的なものであることが示された（図８ａ）。【０３１２】
実施例８の大脳及び小脳の免疫組織化学染色の結果からは，ヒト化前のマウス抗体である抗ｈＴｆＲ抗体番号１は脳血管内皮表面に存在するｈＴｆＲへは結合することができるが，脳実質への移行する量は少ないと考えられた。一方で，ヒト化前のマウス抗体である抗ｈＴｆＲ抗体番号２及び３は，脳血管内皮表面に存在するｈＴｆＲへは結合することができ，且つ，ｈＴｆＲへの結合後，血液脳関門を通過して脳実質内へ移行し，さらに海馬においては脳実質内から神経様細胞にまで，小脳においてはプルキンエ細胞にまで取り込まれることを示すものであった。【０３１３】
この実施例１５の大脳，海馬，小脳及び延髄の免疫組織化学染色の結果からは，実験に供した抗ｈＴｆＲ抗体番号３をヒト化して得られた４種類のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体は，脳血管内皮表面に存在するｈＴｆＲへ結合し，且つ，ｈＴｆＲへの結合後，血液脳関門を通過して脳実質内へ移行し，さらに大脳皮質においては神経様細胞にまで，海馬においては脳実質内から神経様細胞にまで，小脳においてはプルキンエ細胞にまで，延髄においては神経様細胞に取り込まれることがわかった。【０３１４】
〔実施例１６〕ｈＢＤＮＦ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質（ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質）発現用細胞の作製
ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｎｕｃベクター（インビトロジェン社）を，ＫｐｎＩとＮｃｏＩで消化し，ＥＦ−１αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を切り出し，これをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化処理した。ｐＣＩ−ｎｅｏ（インビトロジェン社）を，ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して，ＣＭＶのエンハンサー／プロモーターおよびイントロンを含む領域を切除した後に，Ｔ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のＥＦ−１αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を挿入して，ｐＥ−ｎｅｏベクターを構築した。ｐＥ−ｎｅｏベクターを，ＳｆｉＩおよびＢｓｔＸＩで消化し，ネオマイシン耐性遺伝子を含む約１ｋｂｐの領域を切除した。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）（インビトロジェン社）を鋳型にしてプライマーＨｙｇ−Ｓｆｉ５’（配列番号２１６）およびプライマーＨｙｇ−ＢｓｔＸ３’（配列番号２１７）を用いて，ＰＣＲ反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した。増幅したハイグロマイシン遺伝子を，ＳｆｉＩおよびＢｓｔＸＩで消化し，上記のネオマイシン耐性遺伝子を切除したｐＥ−ｎｅｏベクターに挿入して，ｐＥ−ｈｙｇｒベクターを構築した。【０３１５】
配列番号１７２で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側にリンカー配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を介して配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦを結合させた蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号２４９で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工的に合成した。このＤＮＡ断片は，配列番号２４８で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖にリンカー配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を介してｈＢＤＮＦが結合した蛋白質をコードする。また，このＤＮＡ断片は，５’側には，5’端から順にＭｌｕＩ配列と，分泌シグナルとして機能するリーダーペプチドをコードする配列とを有し，３’側にはＮｏｔＩ配列を有する。このＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ−ｎｅｏベクターのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ−ＢＤＮＦ−１）を構築した。【０３１６】
配列番号１８８で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側にリンカー配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を介して配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦを結合させた蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号２５１で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工的に合成した。このＤＮＡ断片は，配列番号２５０で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖にリンカー配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を介してｈＢＤＮＦが結合した蛋白質をコードする。また，このＤＮＡ断片は，５’側には，5’端から順にＭｌｕＩ配列と，分泌シグナルとして機能するリーダーペプチドをコードする配列とを有し，３’側にはＮｏｔＩ配列を有する。このＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ−ｎｅｏベクターのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ−ＢＤＮＦ−２）を構築した。【０３１７】
配列番号２１０で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側にリンカー配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を介して配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦを結合させた蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号２５３で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工的に合成した。このＤＮＡ断片は，配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖にリンカー配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を介してｈＢＤＮＦが結合した蛋白質をコードする。また，このＤＮＡ断片は，５’側には，5’端から順にＭｌｕＩ配列と，分泌シグナルとして機能するリーダーペプチドをコードする配列とを有し，３’側にはＮｏｔＩ配列を有する。このＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ−ｎｅｏベクターのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ−ＢＤＮＦ−３）を構築した。【０３１８】
配列番号２１０で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いて配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが５回繰り返される計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦを融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号２５５で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工的に合成した。このＤＮＡ断片は，配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖に上記リンカー配列を介してｈＢＤＮＦが結合した蛋白質をコードする。また，このＤＮＡ断片は，５’側には，5’端から順にＭｌｕＩ配列と，分泌シグナルとして機能するリーダーペプチドをコードする配列とを有し，３’側にはＮｏｔＩ配列を有する。このＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ−ｎｅｏベクターのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ−ＢＤＮＦ−４）を構築した。【０３１９】
配列番号２５６で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦのプロ体のＣ末端側に，Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いて配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが５回繰り返される計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号２５７で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体（ｓｃＦｖ）を融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号２５８で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工的に合成した。ここで，配列番号２５７で示されるアミノ酸配列において，Ｎ末端側から１番目〜１１８番目のアミノ酸配列が配列番号２０５で示されるアミノ酸配列，１１９番目〜１３３番目のアミノ酸配列がリンカー配列，１３４番目からＣ末端までのアミノ酸配列が配列番号１９１で示されるアミノ酸配列にそれぞれ相当する。すなわち，この融合蛋白質のヒト化抗ｈＴｆＲ抗体ｓｃＦｖ部分は，配列番号２０５（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列２）のＣ末端側に，配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが３回繰り返される計１５個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号１９１（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列２）を融合させたものである。このＤＮＡ断片は，配列番号２５９で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体（ｓｃＦｖ）の融合蛋白質をコードする。配列番号２５９で示されるアミノ酸配列を有する融合蛋白質は，発現後にプロセシングを受けて，配列番号２６０で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体ｓｃＦｖの融合蛋白質となる。配列番号２５９で示されるアミノ酸配列において，Ｎ末端側から１番目〜１１０番目のアミノ酸配列が，ｈＢＤＮＦがプロ体から成熟型へプロセシングされる際に除去される部分である。このＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ−ｎｅｏベクターのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ｐＥ−ｎｅｏ（ＢＤＮＦ−ｓｃＦｖ）を構築した。なお，ｐＥ−ｎｅｏ（ＢＤＮＦ−ｓｃＦｖ）でコードされるＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の融合蛋白質において，ＢＤＮＦとｓｃＦｖ間のリンカー配列が第１のリンカー配列であり，ｓｃＦｖにおいて重鎖と軽鎖間のリンカー配列が第２のリンカー配列である。【０３２０】
配列番号２５６で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦのプロ体のＣ末端側に，Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いて配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが５回繰り返される計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号２６１で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖を融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号２６２で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工的に合成した。ここで，配列番号２６１で示されるアミノ酸配列は，配列番号２１０で示されるアミノ酸配列のＮ末端側から１番目〜２２６番目に相当する。ここでＮ末端側から１番目〜１１８番目のアミノ酸配列が配列番号２０５（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列２）に相当し，１１９番目〜２１６番目のアミノ酸配列がＣＨ１領域に相当し，２１７番目〜２２６番目のアミノ酸配列がヒンジ部に相当する。【０３２１】
このＤＮＡ断片は，配列番号２６３で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖の融合蛋白質をコードする。配列番号２６３で示されるアミノ酸配列を有する融合蛋白質は，発現後にプロセシングを受けて，配列番号２６４で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖の融合蛋白質となる。配列番号２５９で示されるアミノ酸配列において，Ｎ末端側から１番目〜１１０番目のアミノ酸配列が，ｈＢＤＮＦがプロ体から成熟型へプロセシングされる際に除去される部分である。このＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ−ｎｅｏベクターのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ｐＥ−ｎｅｏ（ＢＤＮＦ−Ｆａｂ  ＨＣ−１）を構築した。【０３２２】
配列番号２４７で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦのＣ末端側に，Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いて配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが５回繰り返される計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号２６１で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖を融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を含む，配列番号２６５で示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を人工的に合成した。ここで，配列番号２６１で示されるアミノ酸配列は，配列番号２１０で示されるアミノ酸配列のＮ末端側から１番目〜２２６番目に相当する。ここでＮ末端側から１番目〜１１８番目のアミノ酸配列が配列番号２０５（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列２）に相当し，１１９番目〜２１６番目のアミノ酸配列がＣＨ１領域に相当し，２１７番目〜２２６番目のアミノ酸配列がヒンジ部に相当する。【０３２３】
このＤＮＡ断片は，配列番号２６４で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖の融合蛋白質をコードする。このＤＮＡ断片をＭｌｕＩとＮｏｔＩで消化し，ｐＥ−ｎｅｏベクターのＭｌｕＩとＮｏｔＩの間に組み込み，ｐＥ−ｎｅｏ（ＢＤＮＦ−Ｆａｂ  ＨＣ−２）を構築した。【０３２４】
ＣＨＯ細胞（CHO-K1 : American Type Culture Collectionから入手）を，実施例１２に記載方法により，ｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ−ＢＤＮＦ−１）と実施例１１で構築したｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ１）で形質転換し，ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質を発現する細胞株を得た。この細胞株を，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株１とした。この細胞株が発現するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体１とした。【０３２５】
同様にして，ＣＨＯ細胞を，ｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ−ＢＤＮＦ−２）と実施例１１で構築したｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ２）で形質転換し，ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質を発現する細胞株を得た。この細胞株を，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株２とした。この細胞株が発現するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体２とした。【０３２６】
更に同様にして，ＣＨＯ細胞を，ｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ−ＢＤＮＦ−３）と実施例１１で構築したｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３）で形質転換し，ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質を発現する細胞株を得た。この細胞株を，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株３とした。この細胞株が発現するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体３とした。【０３２７】
更に同様にして，ＣＨＯ細胞を，ｐＥ−ｎｅｏ（ＨＣ−ＢＤＮＦ−４）と実施例１１で構築したｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３）で形質転換し，ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質を発現する細胞株を得た。この細胞株を，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株４とした。この細胞株が発現するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体４とした。【０３２８】
更に同様にして，ＣＨＯ細胞を，ｐＥ−ｎｅｏ（ＢＤＮＦ−ｓｃＦｖ）で形質転換し，ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質を発現する細胞株を得た。この細胞株を，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株５とした。この細胞株が発現するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体５とした。【０３２９】
同様にして，ＣＨＯ細胞を，ｐＥ−ｎｅｏ（ＢＤＮＦ−Ｆａｂ  ＨＣ−１）と実施例１１で構築したｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３）で形質転換し，ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質を発現する細胞株を得た。この細胞株を，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株６とした。この細胞株が発現するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体６とした。【０３３０】
更に同様にして，ＣＨＯ細胞を，ｐＥ−ｎｅｏ（ＢＤＮＦ−Ｆａｂ  ＨＣ−２）と実施例１１で構築したｐＥ−ｈｙｇｒ（ＬＣ３）で形質転換し，ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質を発現する細胞株を得た。この細胞株を，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株７とした。この細胞株が発現するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質をｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体７とした。【０３３１】
〔実施例１７〕ｈＢＤＮＦ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の製造
ｈＢＤＮＦ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質は，以下の方法で製造することができた。実施例１６で得たｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株５，６及び７を，それぞれ細胞濃度が約２Ｘ１０５個／ｍＬとなるように，CD OptiCHOＴＭ培地で希釈し，１Ｌの三角フラスコに２００ｍＬの細胞懸濁液を加え，３７℃で，５％ＣＯ２と９５％空気からなる湿潤環境で約７０ｒｐｍの撹拌速度で６〜７日間培養した。培養上清を遠心操作により回収し，０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過して，培養上清とした。上記の回収した培養上清に，カラム体積の５倍容の１５０ｍＬ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Tris緩衝液（ｐＨ８．０）を添加し，カラム体積３倍容の１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ Tris緩衝液（ｐＨ８．０）で予め平衡化しておいたＰｒｏｔｅｉｎＡカラム  （Bio-Rad社）又はProteinLカラム（カラム体積：１ｍＬ，ＧＥヘルスケア社）に負荷した。ここで，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株１，２，３及び６についてはProteinAカラムを使用し，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体発現株４，５，７についてはProteinLカラムを使用した。次いで，カラム体積の５倍容の同緩衝液を供給してカラムを洗浄した後，１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むカラム体積の４倍容の５０ｍＭ  グリシン緩衝液（ｐＨ２．８）で，吸着したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体を溶出させた。溶出後直ちに１Ｍ Tris緩衝液（ｐＨ８．０）を用いてｐＨ７．０に調整した。これらをｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質（ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体５，６及び７）の精製品として以下の試験に用いた。【０３３２】
〔実施例１８〕ＢＤＮＦ受容体（ＴｒｋＢ）発現細胞を用いたｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のＢＤＮＦ活性の評価
実施例１７で製造したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質が有するＢＤＮＦ生物活性は，ＴｒｋＢ遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞）に導入したＣＨＯ−ＴｒｋＢ細胞におけるＣａ濃度変化を指標とした細胞内シグナル伝達増強活性の測定により評価した。【０３３３】
ＣＨＯ細胞を継代用培地（Nutrient Mixture F-12 Ham，１０％ウシ胎児血清）にて培養した。その後，評価用培地（Nutrient Mixture F-12 Ham，３％ウシ胎児血清，１０ｍＭ  Hepes（ｐＨ７．４））へ交換し，細胞懸濁液を作製した。細胞にアポエクオリンおよびヒトＴｒｋＢ（GenBank Acc. No.NP_001018074.1）を発現するウイルスを導入し，２×１０３細胞／ウェルとなるように黒色３８４細胞培養用bottom clear plateに播種後，ＣＯ２インキュベーター（３７℃，９５％Ａｉｒ，５％  ＣＯ２）内で一晩静置培養した。【０３３４】
１μＭのViviren（プロメガ）を含むＨＨＢＳ液（１×Hanks’ Balanced Salt Solution，２０ｍＭ HEPES（ｐＨ７．４））を２０μＬ／wellで添加し，室温にて４時間静置した。０．１％のBovine serum albuminを含むＨＨＢＳ液で，ＢＤＮＦおよびｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質（ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体５，６及び７）を，それぞれ目的の濃度へ希釈し，添加後，ＦＤＳＳ７０００（浜松ホトニクス）で経時的に発光強度を測定した。１１１ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（#450-02，Peprotech社）が示す発光強度を１００％として，得られた発光強度から相対的なＴｒｋＢ作動活性を計算し，その用量反応曲線からＥＣ５０を算出してＢＤＮＦ活性とした。
表１２にｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の評価結果を示す。【０３３５】
【表１２】
2016208696.tif 000014
【０３３６】
〔実施例１８−２〕ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のｈＴｆＲへの親和性の測定
ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のｈＴｆＲへの親和性をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡ法による測定は概ね以下の方法で行った。ヒトＴｆＲとしては，Ｎ末端にヒスチジンタグが付加した，配列番号１に示されるアミノ酸配列の中でＮ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの，ｈＴｆＲの細胞外領域のアミノ酸配列を有する組換えヒトＴｆＲ（ｒヒトＴｆＲ：Sino Biological社）を用いた。サルＴｆＲとしては，Ｎ末端にヒスチジンタグが付加した，配列番号２に示されるアミノ酸配列の中でＮ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの，カニクイザルのＴｆＲの細胞外領域のアミノ酸配列を有する組換えサルＴｆＲ（ｒサルＴｆＲ：Sino Biological社）を用いた。測定は，実施例１７で得たｈＢＤＮＦ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質中，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体３，４及び６について実施した。【０３３７】
組換えヒトおよびサルＴｆＲ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を０．５ｕｇ／ｍＬに希釈し，この希釈液を９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社）の各ウェルに１００μＬずつ添加し１時間静置した。固相溶液を捨て，各ウェルにブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）を３００μＬずつ添加し，１時間静置した。ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体６をＴＢＳ−Ｔ（シグマアルドリッチ社）で２０ｎｍｏｌ／Ｌに希釈し，さらに９段階の３倍希釈を行いサンプル溶液とした。ブロックエースを捨て，各ウェルにサンプル溶液を１００μＬずつ添加し，１時間静置した。このとき，ブランクのウェルには１００μＬのＴＢＳ−Ｔを添加した。溶液を捨てＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後，各ウェルにＴＢＳ−Ｔで０．５μｇ／ｍＬの濃度に希釈したビオチン標識ウサギ抗ＢＤＮＦ抗体（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）を１００μＬずつ添加し，１時間静置した。溶液を捨てＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後，各ウェルにＴＢＳ−Ｔで２００倍に希釈希釈したストレプトアビジン溶液（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社））を１００μＬずつ添加し，１時間静置した。溶液を捨てＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した後，各ウェルにＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液（ナカライテスク社）を５０μＬずつ添加し，５分間室温で反応させ，次いで各ウェルに０．５Ｎ  ＨＣｌを１００μＬずつ添加し，反応を停止させた。プレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。４パラメーター解析による曲線を描き，当該曲線から，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体６のヒトおよびサルＴｆＲに対するＥＣ５０を算出した。【０３３８】
ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体３のヒトＴｆＲに対するＥＣ５０は１．６×１０−９Ｍであり，サルＴｆＲへの結合活性はＥＣ５０は２．０×１０−９Ｍであった。ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体４のヒトＴｆＲに対するＥＣ５０は８．３×１０−１０Ｍであり，サルＴｆＲへの結合活性はＥＣ５０は２．１×１０−９Ｍであった。また，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体６のヒトＴｆＲに対するＥＣ５０は６．３×１０−１０  Ｍであり，サルＴｆＲへの結合活性はＥＣ５０は２．３×１０−９Ｍであった。【０３３９】
ここで，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体３は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側にリンカー配列（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）を介してｈＢＤＮＦが結合した，配列番号２５２で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質と，配列番号１９６で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖とからなる，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体である。また，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体４は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，Ｇｌｙ−Ｓｅｒに続いて配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが５回繰り返される計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介してｈＢＤＮＦが結合した，配列番号２５４で示されるアミノ酸配列を有する蛋白質と，配列番号１９６で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖とからなる，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体である。また，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体６は，ｈＢＤＮＦのＣ末端側にＧｌｙ−Ｓｅｒに続いて配列番号３で示されるアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒが５回繰り返される計２７個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号２６１で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖を融合させた，全体として配列番号２６３で示されるアミノ酸配列を有するｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖が結合した蛋白質と，配列番号１９６で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体軽鎖とからなる，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体である。従って，これらの測定結果は，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，直接又はリンカー配列を介してｈＢＤＮＦを結合させることにより，又は，ｈＢＤＮＦのＣ末端側に，リンカー配列を介してヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖を結合させることにより，ヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲのいずれにも高い親和性を有する，ｈＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体との融合蛋白質を取得し得ることを示すものである。また，これらの測定結果は，配列番号２１８〜２４５で示されるマウス抗体のＣＤＲを移植して得られるヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に，直接又はリンカー配列を介して，又は，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のＦａｂの重鎖のＮ末端側に，リンカー配列を介してｈＢＤＮＦを結合させて融合蛋白質とすることにより，ｈＢＤＮＦを，融合蛋白質として，高い親和性をもってヒトＴｆＲに結合させることができることを示すものであり，ひいては，ｈＢＤＮＦをしてＢＢＢを通過させて脳内でその機能を発揮させ得ることを示すものである。【０３４０】
なお，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体３のヒト化抗体部分に相等する，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３のｈＴｆＲへの親和性を，本測定法により測定したところ，ヒトＴｆＲに対するＥＣ５０は９．０×１０−１１Ｍであり，サルＴｆＲへの結合活性はＥＣ５０は２．５×１０−１０Ｍであった。実施例７に記載の方法で測定したヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３のヒトＴｆＲに対する解離定数（ｋＤ）は１．０×１０−１２Ｍ未満であり，サルＴｆＲに対する解離定数（ｋＤ）は１．１２×１０−９Ｍであった（実施例１４）。【０３４１】
〔実施例１９〕ｈＢＤＮＦ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のＫＩマウスおよびサルを用いた薬物動態解析
実施例１７で製造したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏ  での脳内移行性は，例えば，実施例７−２，８，１５に記載の方法と同様に，ｈＴｆＲノックインマウスまたはカニクイザルに投与した後，一定時間後に生理食塩水で全身灌流し，脳組織中のｈＢＤＮＦ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の濃度及びｈＢＤＮＦを測定することにより評価することができる。ｈＢＤＮＦ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質は，実施例７−２と同様に，投与する前に，必要に応じＦＩＴＣ等で蛍光標識してもよい。
脳組織中のｈＢＤＮＦ−ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の濃度を測定する場合は，概ね以下の手順で行う。 採取した組織を，脳組織を大脳，小脳，海馬及び延髄に分けてから，それぞれＰｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを含むＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（ナカライテスク）でホモジネートし遠心して上清を回収する。Ａｎｔｉ-Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ ｐｒｅ-ａｄｓｏｒｂｅｄ（ａｂｃａｍ社）をＮｏｒｍａｌ  Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）の各ウェルに添加し，１時間静置してプレートに固定する。次いで，各ウェルにＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ｉｎ  ＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を添加し，１時間振盪し，プレートをブロッキングする。次いで，プレートに脳組織のホモジネートの上清を添加し，１時間振盪する。次いで，ＳＵＬＦＯ−Ｔａｇ−Ａｎｔｉ-ＢＤＮＦ 抗体 ［３５９２８．１１］（ａｂｃａｍ社）を添加し，１時間振盪する。Ｒｅａｄ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）を添加し，Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）を用いて発光量を測定する。濃度既知の標準試料の測定値から検量線を作成し,これに各検体の測定値を内挿することにより，各脳組織のグラム重量（湿重量）当たりに含まれる抗体の量（脳組織中の抗ｈＴｆＲ抗体の濃度）を算出する。
また，脳組織中のｈＢＤＮＦの濃度を測定する場合は，概ね以下の手順で行う。
Ｈｕｍａｎ ＢＤＮＦ Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）の各ウェルに脳組織のホモジネートの上清を添加し，１時間振盪する。次いで，ＳＵＬＦＯ−Ｔａｇ−Ｈｕｍａｎ ＢＤＮＦ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）を添加し，１時間振盪する。Ｒｅａｄ  ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）を添加し，Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ社）を用いて発光量を測定する。濃度既知の標準試料の測定値から検量線を作成し,これに各検体の測定値を内挿することにより，各脳組織のグラム重量（湿重量）当たりに含まれるＢＤＮＦ濃度を算出する。【０３４２】
〔実施例１９−２〕１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）処置パーキンソン病モデルマウスを用いた本発明の融合蛋白質による運動機能改善作用の検討
実施例１７で製造したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のin vivo でのＢＤＮＦ生物活性は，例えば，以下に記載するような方法を用いてＭＰＴＰ処置したマウスにおけるパーキンソン病症状改善効果によって評価できる。【０３４３】
（１）パーキンソン病モデルマウスの作成
Ｃ５７ＢＬ／６系雄性マウス（８−１５週齢）を用い，検疫・順化が終了したマウスに対し，生理的食塩液もしくは生理的食塩液に溶解させたＭＰＴＰ（２５あるいは３０ｍｇ／ｋｇ）を，１日１回，５日間腹腔内投与，あるいは２０  ｍｇ／ｋｇを１日の内に２時間おきに４回腹腔内投与する。
最終投与の３日以後に，Ｐｏｌｅ試験によりブラジキネジア症状を，またはロータロッド（Rota-rod）試験により協調運動能の低下を評価する。【０３４４】
（２）Ｐｏｌｅ試験
ＭＰＴＰ処置マウスを, 垂直に立てた木製の棒の上部5cm付近に頭部を上向きにつかまらせる。マウスが棒につかまってから下向きへ向きを変えるまでの時間（Ｔｔｕｒｎ）, およびつかまってから床面に下りるまでの時間（ＴＬＡ）を測定する。加えて, マウスの動きを観察し，その症状を以下のようにスコア付けする。
０：四肢を上手に使って下りる/正常な動き。
１：棒の上部で向きを変える際にぎこちなさが見られる。
２：棒を跨ぎきれずに横すべりのような行動を取る。
３：落下する。【０３４５】
初めに１回トレーニングを行った後, 5分毎に1回, 試験を３回繰り返し行う。３回の平均時間を群分け用データに用いる。体重とPole試験のデータを元に，多変数完全無作為化割り付けによりＭＰＴＰ処置マウスを３又は４群に分ける。【０３４６】
生理的食塩液処置マウス（溶媒処置群），ＭＰＴＰ処置マウス（溶媒処置群，本発明の融合蛋白質０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ処置群）の計４〜５群において，１週間に１〜２回，４〜８週間，反復静脈内投与を行う。最終投与から１週間後に再びＰｏｌｅ試験（上記の群分け用データ取り時と同じプロトコール）を行い，ブラジキネジア症状の改善作用を評価する。静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が脳内に移行し，脳内でＢＤＮＦ活性を発揮することにより，パーキンソン病モデル動物におけるブラジキネジア等の運動機能の障害を改善し得る。【０３４７】
このようにして静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が疾患モデル動物（マウス）の脳内に移行してＢＤＮＦ活性を発揮し得ることを確認できる。【０３４８】
（３）ロータロッド（Rota-rod）試験
マウスをRota-rod装置（ＭＫ−６１０Ａ，室町機械）の回転軸に１レーン毎に１匹ずつ乗せ，３０秒間静置したのち１分間８ｒｐｍで軸の回転に順化させ，その後，３分間で２５ｒｐｍまで回転数が上がる条件でトレーニングを行う。トレーニングの１時間後に以下の評価試験を行う。【０３４９】
本試験では，８ｒｐｍで回転する軸の動きに３０秒間マウスを順化させたのち，５分間で４０ｒｐｍまで回転数が上がる条件で軸よりマウスが落下するまでの時間を測定する。１時間の間隔をあけて本試験を３回繰り返し，３回の平均時間を群分け用データに用いる。体重とRota-rod試験のデータを元に，多変数完全無作為化割り付けによりＭＰＴＰ処置マウスを４群に分ける。【０３５０】
生理的食塩液処置マウス（溶媒処置群），ＭＰＴＰ処置マウス（溶媒処置群，本発明の融合蛋白質０．３，１，３ｍｇ／ｋｇ処置群）の計５群において，１週間に１回，４〜８週間，反復静脈内投与を行う。最終投与から１週間後に再びRota-Rod試験（上記（１）の群分け時と同じプロトコール）を行い，協調運動能力の改善作用を評価する。静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が脳内に移行し，脳内でＢＤＮＦ活性を発揮することにより，パーキンソン病モデル動物における協調運動能力等の運動機能の障害を改善し得る。【０３５１】
このようにして静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が疾患モデル動物（マウス）の脳内に移行してＢＤＮＦ活性を発揮し得ることを確認できる。【０３５２】
（３）ロータロッド（Rota-rod）試験
マウスをＲｏｔａ−ｒｏｄ装置（ＭＫ−６１０Ａ，室町機械）の回転軸に１匹ずつ乗せ，３０秒間静置したのち１分間８ｒｐｍで軸の回転に順化させ，その後，３分間で２５ｒｐｍまで回転数が上がる条件でトレーニングを行う。トレーニングの１時間後に以下の評価試験を行う。
本試験では，８ｒｐｍで回転する軸の動きに３０秒間マウスを順化させたのち，５分間で４０ｒｐｍまで回転数が上がる条件で軸よりマウスが落下するまでの時間を測定する。１時間の間隔をあけて本試験を３回繰り返し，３回の平均時間を群分け用データに用いる。体重とRota-rod試験のデータを元に，ＳＡＳ（SAS Institute Inc., Ver. 9.2）およびStat Preclinica（Takumi Information Technology Inc., Ver. 1.2）の多変数完全無作為化割り付けを用いてＭＰＴＰ処置マウスを４群に分ける。
生理的食塩液処置マウス（溶媒処置群），ＭＰＴＰ処置マウス（溶媒処置群，本発明の融合蛋白質０．３，  １，  ３  ｍｇ／ｋｇ処置群）の計５群において，１週間に１回，４〜８週間，反復静脈内投与を行う。最終投与から１週間後に再びＲｏｔａ−Ｒｏｄ試験（上記（１）の群分け時と同じプロトコール）を行い，協調運動能力の改善作用を評価する。静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が脳内に移行し，脳内でＢＤＮＦ活性を発揮することにより，パーキンソン病モデル動物における協調運動能力等の運動機能の障害を改善し得る。【０３５３】
このようにして静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が疾患モデル動物（マウス）の脳内に移行してＢＤＮＦ活性を発揮し得ることを確認できる。【０３５４】
〔実施例２０〕１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）処置パーキンソン病モデルサルを用いた本発明の融合蛋白質による運動機能改善効果の検討
実施例１７で製造したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のin vivo でのＢＤＮＦ生物活性は，例えば，以下に記載するような方法を用いてＭＰＴＰ処置したサルにおけるパーキンソン病様症状改善効果によって評価できる。【０３５５】
ＭＰＴＰ処置前の５日間，正常な行動をあらかじめ評価した雄性アカゲザル（５〜８歳）あるいはカニクイザル（４〜８歳）にＭＰＴＰ（０．２ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上で，２ｍｇ／ｋｇを上限とする）を１週間に最大連続５日間，４週間以上の静脈内投与，あるいは筋肉内投与，もしくは皮下投与を行い，ＵＰＤＲＳのスコアの低下あるいは運動量の低下を確認する。もしくは，内頸動脈の片側のみにＭＰＴＰ（０．２ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上で，２ｍｇ／ｋｇを上限とする）を１回あるいは２回投与し，ＵＰＤＲＳスコア（J Neurosci Methods. 2000; 96:71-76），運動量，さらに旋回運動量を指標にして，パーキンソン病様症状を確認し，ＭＰＴＰの処置を終了する。【０３５６】
ＭＰＴＰの最終投与から１週間後以降でパーキンソン病様症状が安定したのを確認した後，１週間に１回，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質（０．０３〜１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し，ＵＰＤＲＳ，運動量，もしくは旋回運動の評価によって運動機能の改善度を評価する。静脈内に投与したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質が脳内に移行し，脳内でＢＤＮＦ活性を発揮することにより，パーキンソン病モデル動物における運動機能の障害を改善し得る。【０３５７】
このようにして静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が疾患モデル動物（サル）の脳内に移行してＢＤＮＦ活性を発揮し得ることを確認できる。【０３５８】
〔実施例２１〕１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）処置パーキンソン病モデルマウスを用いた本発明の融合蛋白質による線条体ドパミン量回復効果の検討
実施例１７で製造したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質による線条体ドパミン量回復効果は，例えば，以下に記載するような方法を用いてＭＰＴＰ処置を行った動物の線条体におけるドパミン量を測定することにより評価できる。【０３５９】
実施例１９−２の方法に従い，ＭＰＴＰ処置によりパーキンソン病モデルを作成後，溶媒，もしくはｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質（運動機能の改善を示した用量を用いる）を１週間に１回，４〜８週間，反復静脈内投与を行う。最終投与から７〜１０日後に，マイクロウェーブ装置（ＴＭＷ−６４０２，東芝）用いて頭部へマイクロウェーブ（５．０〜５．２ｋｗ，１．０〜１．１秒）を照射する。線条体を摘出後，ドライアイス上で凍結させ，神経伝達物質の抽出操作まで−８０℃にて保存する。【０３６０】
凍結線条体を０．０１％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ−２Ｎａ及び２０ｎｇ／ｍＬ  ５−ヒドロキシ−トリプトフォール（内部標準物質）を含む１Ｍ ギ酸・アセトン（１５：８５）溶液（線条体湿重量の５０倍量）に加え，ホモジナイズする。ホモジネートを遠心（４℃，１０，０００ｒｐｍ×１５分）し，上清を１００μＬ分取して遠心エバポレーター（ＣＥ１Ｄ，ＴＰ−８０，日立）で９０分間蒸発乾固し，定量操作まで−２０℃で保存する。【０３６１】
蒸発乾固したサンプルに０．０１Ｍ酢酸溶液（０．０１％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有）を１００μＬずつ加えて溶解し，遠心（４℃，９，０００ｒｐｍ×１５分）を行った後，上清中のドパミン，ドパミン代謝物（ＤＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルグリコール及びおよびホモバニリン酸）をＨＰＬＣで測定する。
この結果，本発明の融合蛋白質を静脈内に投与することにより疾患モデル動物の線条体ドパミン量を回復させるというＢＤＮＦの機能を発揮し得ることを確認できる。【０３６２】
〔実施例２２〕１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）処置パーキンソン病モデルマウス／サルを用いた本発明の融合蛋白質による黒質線条体ドパミン神経再生効果の検討
実施例１７で製造したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質によるドパミン神経再生効果は，例えば，以下に記載するような方法を用いてＭＰＴＰ処置後の動物の黒質線条体におけるドパミン神経細胞を当該細胞マーカーであるチロシン水酸化酵素（ＴＨ）に対する抗体を用いて染色する病理組織学的検討により評価できる。【０３６３】
実施例１９−２及び２０の方法に従い，ＭＰＴＰ処置によりパーキンソン病モデルを作成後，溶媒，もしくはｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質を１週間に１回，４〜８週間，反復静脈内投与を行う。【０３６４】
最終投与から７〜１０日後，４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて還流固定し，脳を摘出する。４％ＰＦＡでの後固定を行い，黒質及び／又は線条体を含む部分を切り出し（マウスについてはブレインスライサーを用いる），１０％中性緩衝ホルマリンにて一晩再固定したのち，パラフィンブロックを作製する。パラフィンブロックは厚さ約４μｍに薄切し，MAS-GP Type A コートされたスライドグラスに貼り付けて，免疫染色に供する。【０３６５】
必要に応じて抗原賦活のために酵素処理または加熱処理等を行う。例えば，黒質及び／又は線条体部分のパラフィン切片を，１０倍希釈し６０℃程度に温めたSEROTEC TARGET UNMASKING FLUID MARK2（UNIVERSAL）（BUF025B，AbD Serotec）等の抗原賦活化試薬に浸して，蒸気の上がった圧力鍋内に入れ，高圧モードにて１０分間処理することで抗原賦活化を行う。その後，マウス組織切片については３％Ｈ２Ｏ２，マウスステインキット（４１４３２２，ニチレイバイオサイエンス）のブロッキング試薬Ａを，サル組織切片については３％Ｈ２Ｏ２，４％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）を用いてブロッキングを行い，賦活効果のある抗体希釈液（IMMUNO SHOT immunostaining,Mild,IS-M-20，コスモ・バイオ）にて適宜希釈した一次抗体（anti-TH antibody,clone LNC1, MAB318, Millipore）を処置して室温で３０分間あるいは４℃で一晩反応させる。反応後，ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ＴＷＥＥＮ２０含有ＰＢＳ）で洗浄を行い，マウス組織切片についてはマウスステインキットのブロッキング試薬Ｂを１０分間処置し，二次抗体（マウスステインキットのヒストファイン  シンプルステインマウスＭＡＸ−ＰＯ（Ｍ））を滴下して１０分間，サル組織切片については二次抗体（ヒストファイン  シンプルステインＭＡＸ−ＰＯ（Ｍ））を滴下して３０分間反応させる。ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Tween 20 含有ＰＢＳ）で洗浄した後，ＤＡＢ液（ＤＡＢ基質キット，４２５０１１，ニチレイバイオサイエンス）に１０分間浸して発色を行う。【０３６６】
染色切片は風乾，封入した後，Aperio（登録商標）  ＡＴ２（ライカバイオシステムズ）を用いてスキャンし，デジタル化する。デジタル化した切片を，画像解析ソフトＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ（ライカバイオシステムズ）を用いて解析し，ＴＨ陽性領域の面積を定量する。【０３６７】
このようにして静脈内に投与した本発明の融合蛋白質が疾患モデル動物の脳内に移行し，黒質線条体ドパミン神経を再生するというＢＤＮＦの機能を発揮し得ることを確認できる。【０３６８】
〔実施例２３〕ハンチントン病モデルマウス（Ｒ６／２マウス）を用いた本発明の融合蛋白質による病状進行抑制効果の検討
実施例１７で製造したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏでのＢＤＮＦ生物活性は，例えば，非特許文献（Ｇｉｒａｌｔ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１．  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．  ６；  ７１−８６．，  ＤｅＭａｒｃｈ  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８．  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．  ３０；  ３７５−３８７．）に報告されているような行動薬理学的手法を用いて，Ｒ６／２マウス（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｃｅｌｌ  ８７；  ４９３−５０６．）における病状進行抑制効果により評価できる。【０３６９】
（１）体重変化と生存率
野生型マウス（溶媒処置群）およびＲ６／２マウス（溶媒処置１群，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置２−３群）に対して，４週齢より１週間に１回，反復静脈内投与を行う。
体重の変化および生存率をＲ６／２マウスの溶媒処置群とｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置群を比較することにより，ハンチントン病モデル動物における病状の進行抑制効果が評価できる。【０３７０】
（２）Rota-rod試験
野生型マウス（溶媒処置群）およびＲ６／２マウス（溶媒処置１群，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置２−３群）に対して，４週齢から１週間に１回，反復静脈内投与を行う。Ｒｏｔａ−Ｒｏｄ試験は１週間もしくは２週間に１度実施され，継時的な協調運動能力の低下に対しｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白の進行抑制効果を評価する。
マウスをＲｏｔａ−ｒｏｄ装置（ＭＫ−６１０Ａ，室町機械）の回転軸に１レーン毎に１匹ずつ乗せ，３０秒間静置したのち１分間２  ｒｐｍで軸の回転に順化させ，その後，３分間で１５ｒｐｍまで回転数が上がる条件でトレーニングを行う。トレーニングの１時間後に本試験を行う。本試験では，４  ｒｐｍで回転する軸の動きに３０秒間マウスを順化させたのち，５分間で３０  ｒｐｍまで回転数が上がる条件で軸よりマウスが落下するまでの時間を測定する。１時間の間隔をあけて本試験を３回繰り返し，３回の平均時間を各個体のデータとする。Ｒ６／２マウスの溶媒処置群とｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置群を比較することにより，ハンチントン病モデル動物における協調運動能力低下の進行抑制効果が評価できる。【０３７１】
（３）Clasping 試験
野生型マウス（溶媒処置群）およびＲ６／２マウス（溶媒処置１群，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置２−３群）に対して，４週齢より１週間に１回，反復静脈内投与を行う。Clasping 試験は１週間に１度実施され，四肢反射異常（四肢の足組み）の発現時間もしくは有無を評価することによりｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の中枢神経変性の進行抑制効果を評価する。
マウスの尻尾をつまみ，約４０ｃｍの高さに尻尾から吊るす。１分間の吊り下げ状態のうち四肢反射異常（四肢の足組み）を示す時間をストップウォッチで測定する。３回測定を行い，その平均値をデータとする。Ｒ６／２マウスの溶媒処置群とｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置群とを比較することにより，ハンチントン病モデル動物における中枢神経変性の進行抑制効果が評価できる。また，非特許文献（Guyenet S.J. et al., 2010. J. Vis. Exp. 21; pii: 1787）に報告されているように，懸垂直後（１０秒以内）における四肢異常の出現に対して，例えば以下に示すようなスコア付けにより薬効を評価することもできる：０，なし；１，片方の後肢を引き寄せる；２，両方の後肢を引き寄せる；３，四肢を引き寄せる。【０３７２】
（４）新奇物体認識試験
野生型マウス（溶媒処置群）およびＲ６／２マウス（溶媒処置１群，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置２−３群）に対して，４週齢より１週間に１回，反復静脈内投与を行う。新規物体認識試験は１−２週間に１度実施され，第２試行における既知物体と新奇物体への探索時間の長さおよび探索時間より算出した識別係数（ＤＩ）を評価することによりｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白の認知機能増強効果を評価する。
マウスを２つの同形の物体が入った試験箱の中に入れ５分間自由に探索させる（第１試行）。物体に対する探索時間を計測し，１時間後に第２試行を行う。第２試行では，第１試行で探索時間の長かった物体を残し，一つを新奇物体に替える。第２試行（５分間）における既知および新奇物体の探索時間を計測し，ＤＩを算出する（ＤＩ＝（新奇物体探索時間−既知物体探索時間）／（新奇物体探索時間＋既知物体探索時間））。Ｒ６／２マウスの溶媒処置群とｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置群のＤＩを比較することにより，ハンチントン病モデル動物における認知機能増強効果が評価できる。【０３７３】
〔実施例２４〕筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）モデルマウス（Wobblerマウス）を用いた本発明の融合蛋白質による病状進行抑制効果の検討
実施例１７で製造したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質のin vivoでのＢＤＮＦ生物活性は，例えば，非特許文献（Ishiyama T. et al., 2004. Brain Res. 1019; 226-236.）に報告されているような行動薬理学的手法を用いて，Wobblerマウスにおける神経筋機能低下の進行抑制効果により評価できる。【０３７４】
（１）Ｇｒｉｐ試験
野生型マウス（溶媒処置群）およびWobblerマウス（溶媒処置１群，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置２−３群）に対して，３−４週齢から１週間に１回，反復静脈内投与を行う。Ｇｒｉｐ試験は１週間に１度実施され，握力を評価することによりｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白の神経筋機能低下の進行抑制効果が評価できる。
マウスを握力計（ＮＳ−ＴＲＭ−Ｍ，ニューロサイエンス）のバーに掴まらせ尾を引く。バーを離すまでの力を握力として記録し，５回測定の平均値を各個体のデータとする。Wobblerマウスの溶媒処置群とｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置群を比較することにより，ＡＬＳモデル動物における神経筋機能低下の進行抑制効果が評価できる。【０３７５】
（２）Rota-rod試験
野生型マウス（溶媒処置群）およびWobblerマウス（溶媒処置１群，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置２−３群）に対して，３−４週齢から１週間に１回，反復静脈内投与を行う。Rota-Rod試験は１週間もしくは２週間に１度実施され，継時的な協調運動能力の低下に対しｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白の進行抑制効果を評価する。
マウスをRota-rod装置（ＭＫ−６１０Ａ，室町機械）の回転軸に１レーン毎に１匹ずつ乗せ，３０秒間静置したのち１分間２ｒｐｍで軸の回転に順化させ，その後，３分間で１５ｒｐｍまで回転数が上がる条件でトレーニングを行う。トレーニングの１時間後に本試験を行う。本試験では，４ｒｐｍで回転する軸の動きに３０秒間マウスを順化させたのち，５分間で３０ｒｐｍまで回転数が上がる条件で軸よりマウスが落下するまでの時間を測定する。１時間の間隔をあけて本試験を３回繰り返し，３回の平均時間を各個体のデータとする。Ｗｏｂｂｌｅｒマウスの溶媒処置群とｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置群とを比較することにより，ＡＬＳモデル動物における神経筋機能低下の進行抑制効果が評価できる。【０３７６】
〔実施例２５〕レット症候群モデルマウス（MeCP2(methyl-CpG binding protein 2）ノックアウトマウス）を用いた本発明の融合蛋白質による病状改善効果の検討
実施例１７で製造したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の in vivo でのＢＤＮＦ生物活性は，例えば，非特許文献（Derecki N.C. et al., 2012. Nature 484; 105-109.）に報告されているような行動薬理学的手法を用いて，ＭｅＣＰ２ノックアウト（ＫＯ）マウスにおける病状改善効果により評価できる。【０３７７】
（１）体重変化と生存率
野生型マウス（溶媒処置群）およびＭｅＣＰ２  ＫＯマウス（溶媒処置１群，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置２−３群）に対して，３−４週齢から１週間に１回，反復静脈内投与を行う。
体重の変化および生存率をＭｅＣＰ２  ＫＯマウスの溶媒処置群とｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置群を比較することにより，レット症候群モデル動物における病状改善効果が評価できる。【０３７８】
（２）呼吸機能評価
野生型マウス（溶媒処置群）およびＭｅＣＰ２  ＫＯマウス（溶媒処置１群，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置２−３群）に対して，３−４週齢から１週間に１回，反復静脈内投与を行う。呼吸機能評価は１週間に１度実施され，無呼吸回数を評価することによりｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白の呼吸機能の改善効果を評価する。
マウスを呼吸機能測定装置（Biosystem XA, Buxco）のチャンバーへ入れ，自発呼吸を１時間測定する。体動が認められない時間における無呼吸回数（１秒以上呼吸がない状態の回数）をデータとする。ＭｅＣＰ２  ＫＯマウスの溶媒処置群とｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置群とを比較することにより，レット症候群モデル動物における呼吸機能の改善効果が評価できる。【０３７９】
（３）Clasping 試験
野生型マウス（溶媒処置群）およびＭｅＣＰ２  ＫＯマウス（溶媒処置１群，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置２−３群）に対して，３−４週齢から１週間に１回，反復静脈内投与を行う。Clasping 試験は１週間に１度実施され，四肢反射異常（四肢の足組み）の発現時間もしくは有無を評価することによりｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白の中枢神経変性の進行抑制効果を評価する。
マウスの尻尾をつまみ，約４０ｃｍの高さに尻尾から吊るす。１分間の吊り下げ状態のうち四肢反射異常を示す時間をストップウォッチで測定する。３回測定を行い，その平均値をデータとする。ＭｅＣＰ２  ＫＯマウスの溶媒処置群とｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置群とを比較することにより，レット症候群モデル動物における中枢神経変性の進行抑制効果が評価できる。また，非特許文献（Guyenet S.J. et al., 2010. J. Vis. Exp. 21; pii: 1787）に報告されているように，懸垂直後（１０秒以内）における四肢異常の出現において，例えば以下に示すようなスコア付けを行い薬効を評価することもできる：０，なし；１，片方の後肢を引き寄せる；２，両方の後肢を引き寄せる；３，四肢を引き寄せる。【０３８０】
〔実施例２６〕アルツハイマー病モデルマウス（Ｔｇ２５７６マウス）を用いた本発明の融合蛋白質による認知機能改善効果の検討
実施例１７で製造したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の in vivo でのＢＤＮＦ生物活性は，例えば，非特許文献（Iwasaki Y. et al., 2012. J Neurosci. Res. 90; 981-989. Cuadrado-Tejedor M. et al., 2010. Br. J. Pharmacol. 164; 2029-2041.）に報告されているような行動薬理学的手法を用いて，Ｔｇ２５７６マウスにおける認知機能障害の改善効果により評価できる。【０３８１】
（１）Ｍｏｒｒｉｓ型水迷路試験
野生型マウス（溶媒処置群）およびＴｇ２５７６マウス（溶媒処置１群，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置２−３群）に対して，１４−１６か月齢から１週間に１回，反復静脈内投与を行う。４週間以後に水迷路試験は実施され，訓練試行でのプラットホームまでの到達時間の短さおよびプローブ試験でのプラットホーム存在領域の滞在時間の長さを評価することによりｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白の認知機能増強効果を評価する。
マウスを，水を満たした直径１．２ｍの円形プールに入れ，プール周辺に目印が無く，プラットホームが見える条件で１日８試行３日間トレーニングする。次にプール周辺環境に目印があり，プラットホームが水没した条件で１日４試行，８日間トレーニングする。９日目にプローブ試験を行う。プローブ試験では，プラットホームを取り除き，プラットホームの存在したプール４分の１の領域を泳ぐ時間を計測する。Ｔｇ２５７６マウスの溶媒処置群とｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置群のトレーニングにおけるプラットホーム到達時間よびプローブ試験での遊泳時間を比較することにより，アルツハイマー病モデル動物における認知機能の増強効果が評価できる。【０３８２】
〔実施例２７〕神経変性モデルマウスを用いた本発明の融合蛋白質による神経再生／神経変性進行抑制効果の検討
実施例１７で製造したｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質の in vivo でのＢＤＮＦ生物活性は，例えば，ハンチントン病モデルマウスでは非特許文献(Giralt A. et al., 2011. Mol Neurodegener. 6; 71-86., DeMarch Z. et al., 2008. Neurobiol Dis. 30; 375-387．），筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）モデルマウスでは非特許文献（Ishiyama T. et al., 2004. Brain Res. 1019; 226-236.），アルツハイマー病モデルマウスでは非特許文献（Iwasaki Y. et al., 2012. J Neurosci. Res. 90; 981-989. Cuadrado-Tejedor M. et al., 2010. Br. J. Pharmacol. 164; 2029-2041.）  に報告されているような免疫組織学的手法あるいはウェスタンブロティング法を用いて，神経再生効果あるいは神経変性進行抑制効果により評価できる。【０３８３】
野生型マウス（溶媒処置群）およびモデルマウス（溶媒処置１群，ｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置２−３群）に対して，１週間に１回，反復静脈内投与を行う。ある期間融合蛋白の投与を継続した後，免疫組織学的評価のためには放血致死後４％パラホルムアルデヒドにて灌流固定して，脳サンプルを採取し，ウェスタンブロッティング評価のためには断頭致死後脳を摘出して必要な部位を切り分けてサンプルを採取する。評価対象は，上述の非特許文献にて報告されているように，VGLUT1, PSD-95, Calbindin, DARPP32，エンケファリン含有神経細胞，Synaptophysin，ＮｅｕＮ，ＳＭＩ−３２のほか，コリンアセチルトランスフェラーゼやチロシンヒドロキシラーゼなどが挙げられる。モデルマウスの溶媒処置群とｈＢＤＮＦ−抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質処置群とを比較することにより，神経再生効果／神経変性進行抑制効果が評価できる。
【産業上の利用可能性】
【０３８４】
本発明のｈＢＤＮＦと抗ｈＴｆＲ抗体の融合蛋白質は，血液脳関門を通過させることができるので，ｈＢＤＮＦを中枢神経系において作用させる手段を提供するものとして有用性が高い。
【符号の説明】
【０３８５】
１  血管
２  脳実質
３  神経様細胞
４  プルキンエ細胞
【配列表フリーテキスト】
【０３８６】
配列番号３：リンカー例１のアミノ酸配列
配列番号４：リンカー例２のアミノ酸配列
配列番号５：リンカー例３のアミノ酸配列
配列番号６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号２０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号４の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号２２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号４の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号２３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号４の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号２４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号４の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号２５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号４の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号５の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号２７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号５の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号２８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号５の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号２９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号５の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号３０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号５の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号６の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号３２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号６の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号３３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号６の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号３４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号６の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号３５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号６の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号３６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号７の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号３７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号７の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号３８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号７の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号３９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号７の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号４０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号７の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号８の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号４２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号８の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号４３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号８の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号４４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号８の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号４５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号８の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号４６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号９の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号４７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号９の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号４８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号９の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号４９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号９の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号５０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号９の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号５１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号５２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号５３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号５４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号５５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号５６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号５７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号５８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号５９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号６０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号６２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号６３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号６４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号６５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号６６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号６７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号６８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号６９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号７０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号７２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号７３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号７４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号７５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号７６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号７７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号７８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号７９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号８０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号８１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号８２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号８３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号８４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号８５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号８６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号８７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号８８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号８９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号９０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号９１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号９２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号９３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号９４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号４の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号９５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号４の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号９６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号４の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号９７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号４の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号９８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号４の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号９９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号４の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１００：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号５の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１０１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号５の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１０２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号５の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１０３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号５の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１０４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号５の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１０５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号５の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１０６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号６の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１０７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号６の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１０８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号６の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１０９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号６の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１１０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号６の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１１１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号７の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１１２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号７の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１１３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号７の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１１４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号７の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１１５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号７の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１１６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号７の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１１７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号８の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１１８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号８の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１１９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号８の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号１２０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号８の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１２１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号８の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１２２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号９の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１２３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号９の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１２４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号９の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１２５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号９の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１２６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号９の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１２７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号９の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１２８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１２９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１３０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１３１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１３２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１３３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１３４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１３５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１３６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１３７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１３８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１３９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１４０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１４１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１４２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１４３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１４４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１４５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１４６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１４７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１４８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１４９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１５０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１５１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１５２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１５３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１５４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１５５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１５６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１５７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１５８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列１
配列番号１５９：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列２
配列番号１６０：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列３
配列番号１６１：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列４
配列番号１６２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列５
配列番号１６３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列６
配列番号１６４：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の，可変領域としてアミノ酸配列６を含む軽鎖のアミノ酸配列，合成配列
配列番号１６５：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の，可変領域としてアミノ酸配列６を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号１６６：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列１
配列番号１６７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列２
配列番号１６８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列３
配列番号１６９：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列４
配列番号１７０：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列５
配列番号１７１：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列６
配列番号１７２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の，可変領域としてアミノ酸配列６を含む重鎖のアミノ酸配列
配列番号１７３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列６を含む重鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号１７４：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列１
配列番号１７５：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列２
配列番号１７６：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列３
配列番号１７７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列４
配列番号１７８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列５
配列番号１７９：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列６
配列番号１８０：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の，可変領域としてアミノ酸配列６を含む軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１８１：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の，可変領域としてアミノ酸配列６を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む塩基配列，合成配列
配列番号１８２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖の可変領域のアミノ酸配列１
配列番号１８３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖の可変領域のアミノ酸配列２
配列番号１８４：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖の可変領域のアミノ酸配列３
配列番号１８５：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖の可変領域のアミノ酸配列４
配列番号１８６：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖の可変領域のアミノ酸配列５
配列番号１８７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖の可変領域のアミノ酸配列６
配列番号１８８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の，可変領域としてアミノ酸配列６を含む重鎖のアミノ酸配列
配列番号１８９：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号２の，可変領域としてアミノ酸配列６を含む重鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む塩基配列，合成配列
配列番号１９０：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列１
配列番号１９１：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列２
配列番号１９２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列３
配列番号１９３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列４
配列番号１９４：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列５
配列番号１９５：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列６
配列番号１９６：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列２を含む軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１９７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列２を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号１９８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列４を含む軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１９９：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列４を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２００：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列５を含む軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２０１：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列５を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２０２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列６を含む，可変領域として
配列番号２０３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列６を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２０４：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列１
配列番号２０５：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列２
配列番号２０６：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列３
配列番号２０７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列４
配列番号２０８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列５
配列番号２０９：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列６
配列番号２１０：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列２を含む重鎖のアミノ酸配列
配列番号２１１：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列２を含む重鎖のアミノ酸配列コードする塩基配列，合成配列
配列番号２１２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列２を含む重鎖（ＩｇＧ４）のアミノ酸配列
配列番号２１３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の，可変領域としてアミノ酸配列２を含む重鎖（ＩｇＧ４）のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２１４：プライマーｈＴｆＲ５’，合成配列
配列番号２１５：プライマーｈＴｆＲ３’，合成配列
配列番号２１６：プライマーＨｙｇ−Ｓｆｉ５’，合成配列
配列番号２１７：プライマーＨｙｇ−ＢｓｔＸ３’，合成配列
配列番号２１８：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２１９：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２０：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２１：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２２：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２３：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２４：抗ｈＴｆＲ抗体番号４の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２５：抗ｈＴｆＲ抗体番号４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２６：抗ｈＴｆＲ抗体番号５の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２７：抗ｈＴｆＲ抗体番号５の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２８：抗ｈＴｆＲ抗体番号６の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２９：抗ｈＴｆＲ抗体番号６の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３０：抗ｈＴｆＲ抗体番号７の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３１：抗ｈＴｆＲ抗体番号７の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３２：抗ｈＴｆＲ抗体番号８の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３３：抗ｈＴｆＲ抗体番号８の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３４：抗ｈＴｆＲ抗体番号９の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３５：抗ｈＴｆＲ抗体番号９の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３６：抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３７：抗ｈＴｆＲ抗体番号１０の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３８：抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３９：抗ｈＴｆＲ抗体番号１１の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２４０：抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２４１：抗ｈＴｆＲ抗体番号１２の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２４２：抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２４３：抗ｈＴｆＲ抗体番号１３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２４４：抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２４５：抗ｈＴｆＲ抗体番号１４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２４８：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖（ヒト化６）とｈＢＤＮＦの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号２４９：抗ｈＴｆＲ抗体番号１の重鎖（ヒト化６）とｈＢＤＮＦの融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２５０：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖（ヒト化６）とｈＢＤＮＦの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号２５１：抗ｈＴｆＲ抗体番号２の重鎖（ヒト化６）とｈＢＤＮＦの融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２５２：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖（ヒト化２）とｈＢＤＮＦの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号２５３：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖（ヒト化２）とｈＢＤＮＦの融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２５４：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖（ヒト化２）とｈＢＤＮＦの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号２５５：抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖（ヒト化２）とｈＢＤＮＦの融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２５６：ｈＢＤＮＦのプロ体のアミノ酸配列
配列番号２５７：一本鎖抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列
配列番号２５８：ｈＢＤＮＦのプロ体と一本鎖抗ｈＴｆＲ抗体の融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２５９：ｈＢＤＮＦのプロ体と一本鎖抗ｈＴｆＲ抗体の融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号２６０：ｈＢＤＮＦと一本鎖抗ｈＴｆＲ抗体の融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号２６１：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖のアミノ酸配列
配列番号２６２：ｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖の融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２６３：ｈＢＤＮＦのプロ体とヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖の融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号２６４：ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖の融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号２６５：ｈＢＤＮＦとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体Ｆａｂ重鎖の融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２６６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号６の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号２６７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号８の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
【図１】
2016208696.tif 000015
【図２】
2016208696.tif 000016
【図３】
2016208696.tif 000017
【図４】
2016208696.tif 000018
【図５】
2016208696.tif 000019
【図６】
2016208696.tif 000020
【図７】
2016208696.tif 000021
【図８】
2016208696.tif 000022
【配列表】
2016208696000001.app
【国際調査報告】
2016208696.tif 000023
2016208696.tif 000024
2016208696.tif 000025
2016208696.tif 000026
2016208696.tif 000027
2016208696.tif 000028