(57)【要約】本発明は、核酸または核酸類似体等の固相合成の効率を向上させることを提供する。本発明において、貫通孔を有する無機多孔質体を基材として用いて高い反応効率を有する担体を開発することで使用する試薬量ならびに溶媒量を低減させ、担体単位体積当たりの合成量を大幅に増やすことを達成した。この担体は、結合リンカーを含み、ここで、結合リンカーはアミノ基、水酸基、およびチオール基からなる群より選択される少なくとも１つを含んでいてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
貫通孔を有する無機多孔質体を含む、核酸またはその類縁体を製造するための担体。
【請求項２】
前記核酸またはその類縁体は、ホスホロアミダイト法またはＨ−ホスホネート法により合成され得るものである、請求項１に記載の担体。
【請求項３】
前記核酸またはその類縁体あるいはそれらの原料を結合するための結合リンカーを有する、請求項１または２に記載の担体。
【請求項４】
前記結合リンカーはアミノ基、水酸基、およびチオール基からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項３に記載の担体。
【請求項５】
前記担体は前記製造後に、前記核酸またはその類縁体、それらの結合化合物あるいは該核酸またはその類縁体を連結する結合を分解しない条件で、担体と核酸部分とが開裂できる結合様式を有するリンカー（開裂可能リンカー）を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の担体。
【請求項６】
前記結合様式はエステル、アミド、イミド、チオエステルおよびジスルフィド結合からなる群より選択される結合を含む、請求項５に記載の担体。
【請求項７】
前記結合リンカーはアミノ基、水酸基、リン酸基およびチオール基からなる群より選択される少なくとも１つの基を含み、該基が、エステル、アミド、イミド、チオエステルおよびジスルフィド結合からなる群より選択される結合を介して前記無機多孔質体に結合する、請求項３に記載の担体。
【請求項８】
前記無機多孔質体は、さらに細孔を有する、請求項１に記載の担体。
【請求項９】
前記無機多孔質体は、一体型または粒子型である、請求項１に記載の担体。
【請求項１０】
前記無機多孔質体はシリカゲルまたはシリカガラスを含む、請求項１に記載の担体。
【請求項１１】
前記無機多孔質体は、ペレット構造をとる、請求項１に記載の担体。
【請求項１２】
前記ペレット構造は、棒状、板状または塊状である、請求項１１に記載の担体。
【請求項１３】
前記ペレット構造の細孔は約１００ｎｍ以上である、請求項１１に記載の担体。
【請求項１４】
前記無機多孔質体は、サブマイクロメートルサイズ〜マイクロメートルサイズの三次元網目状に連続した骨格を有し、骨格の間隙にサブマイクロメートルサイズ〜マイクロメートルサイズの三次元に連続した貫通孔と、シリカ骨格中に連続して存在するナノメートルサイズの細孔を有するか、あるいは細孔の孔径を０にし貫通孔のみの網目状の骨格を有する、請求項１に記載の担体。
【請求項１５】
前記貫通孔は、約０．１〜約２０μｍのサイズであり、かつ、前記無機多孔質体の大きさまたは粒子径未満であり、
前記細孔は、存在する場合、約２ｎｍ〜約３００ｎｍであり、かつ、貫通孔の直径未満である。請求項１４に記載の担体。
【請求項１６】
前記結合リンカーは、アミノ基を含み、前記担体表面のケイ素原子からの長さが、炭素原子、窒素原子および酸素原子を合わせて直鎖方向に約１個以上約２０個未満である、請求項３〜１５のいずれかに記載の担体。
【請求項１７】
前記長さは、炭素原子、窒素原子および酸素原子を合わせて直鎖方向に約７個から約１４個である、請求項１６に記載の担体。
【請求項１８】
前記結合リンカーが約１０〜約２５０μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれる、請求項３に記載の担体。
【請求項１９】
前記結合リンカーは、約３０〜約７５μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれる、請求項３に記載の担体。
【請求項２０】
前記開裂可能リンカーは、約３０〜約７５μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれる、請求項５に記載の担体。
【請求項２１】
前記担体は、ゾル−ゲル法で作製される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の担体。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の担体を含む、核酸またはその類縁体の合成機。
【請求項２３】
前記合成は、固相合成によって行われる、請求項２２に記載の合成機。
【請求項２４】
前記担体は、前記核酸またはその類縁体の原料の担持量が約３０〜約７５μｍｏｌ／ｇに調整される、請求項２３に記載の合成機。
【請求項２５】
請求項１〜２１のいずれかに記載の担体または、請求項２２〜２４のいずれかに記載の合成機を用いる核酸またはその類縁体の合成方法。
【請求項２６】
前記合成は、固相合成によって行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記担体は、前記核酸またはその類縁体の原料の担持量が約３０〜約７５μｍｏｌ／ｇに調整される、請求項２５または２６に記載の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゾル−ゲル法等で作製される、貫通孔を有する無機多孔質体を用いた核酸合成用の担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ／ＤＮＡ合成に用いる固相担体は、原料コストの１／４〜１／３を占めている。また、固相上において１塩基の延長に４種類の異なる化学反応が必要となり、各反応の前後で担体を多量の有機溶媒で洗浄する。そこで、高い反応効率を有する担体を開発することが望まれている。【０００３】
特許文献１では、マイクロウェルでの固相合成が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2012-507513
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは鋭意研究した結果、高い反応効率を有する担体を開発することで使用する試薬量ならびに溶媒量を低減させ、担体単位体積当たりの合成量を大幅に増やすことを達成した。その解決手段としては、貫通孔を有する無機多孔質体（一体型や粒子型）を基材として用いることであった。従来核酸合成担体として、特に医薬品合成のように大きなスケールで合成する目的では貫通孔を有する無機多孔質体は使用されていなかったが、本発明では、大規模化し高さを大きくする場合にすばやく溶液を流すために必要となる圧力による機械的制限の問題を、貫通孔を有する無機多孔質体、特に一体型や粒子型を採用することにより解決した。【０００６】
貫通孔を有する無機多孔質体については、各側面において最適な条件の精緻化にも尽力した。貫通孔を有する無機多孔質体のうち、モノリス型とは一体型の多孔質体を意味する。本発明では幅・奥行・高さで定義できる貫通孔を有する無機多孔質体の三辺のうちの一辺の長さが約１ｍｍ以上の連続した多孔質体のブロックを担体として使用し、さらに具体的には、形状(ペレットまたは粉末)、空孔のサイズ、リンカーの種類などを検討し、それらの最適な組み合わせで高い収量での合成を達成することができた。【０００７】
また、貫通孔を有する無機多孔質体には粒子型も存在する。代表的には、貫通孔を有する無機多孔質体は直径約１ｍｍ以下の粒子型とすることで、カラムの大きさに関係せずスケールアップが可能であり、大量合成が可能となった。尚、従来から用いられるマイクロウェル型では、微小空間に多孔質体を充填することから、カラムの大きさが限られており大型化による大量合成は困難であったが、本発明はこのような問題も解決した。したがって、本発明は代表的に以下を提供する。【０００８】
（１）貫通孔を有する無機多孔質体を含む、核酸またはその類縁体を製造するための担体。
（２）前記核酸またはその類縁体は、ホスホロアミダイト法またはＨ−ホスホネート法により合成され得るものである、項目（１）に記載の担体。
（３）前記核酸またはその類縁体あるいはそれらの原料を結合するための結合リンカーを有する、項目（１）または（２）に記載の担体。
（４）前記結合リンカーはアミノ基、水酸基、およびチオール基からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目（３）に記載の担体。
（５）前記担体は前記製造後に、前記核酸またはその類縁体、それらの結合化合物あるいは該核酸またはその類縁体を連結する結合を分解しない条件で、担体と核酸部分とが開裂できる結合様式を有するリンカー（開裂可能リンカー）を有する、項目（１）〜（４）のいずれか１項に記載の担体。
（６）前記結合様式はエステル、アミド、イミド、チオエステルおよびジスルフィド結合からなる群より選択される結合を含む、項目（５）に記載の担体。
（７）前記結合リンカーはアミノ基、水酸基、リン酸基およびチオール基からなる群より選択される少なくとも１つの基を含み、該基が、エステル、アミド、イミド、チオエステルおよびジスルフィド結合からなる群より選択される結合を介して前記無機多孔質体に結合する、項目（３）〜（６）のいずれか１項に記載の担体。
（８）前記無機多孔質体は、さらに細孔を有する、項目（１）〜（７）のいずれか１項に記載の担体。
（９）前記無機多孔質体は、一体型または粒子型である、項目（１）〜（８）のいずれか１項に記載の担体。
（１０）前記無機多孔質体はシリカゲルまたはシリカガラスを含む、項目（１）〜（９）のいずれか１項に記載の担体。
（１１）前記無機多孔質体は、ペレット構造をとる、項目（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の担体。
（１２）前記ペレット構造は、棒状、板状または塊状である、項目（１１）に記載の担体。
（１３）前記ペレット構造の細孔は約１００ｎｍ以上である、項目（１１）または（１２）に記載の担体。
（１４）前記無機多孔質体は、サブマイクロメートルサイズ〜マイクロメートルサイズの三次元網目状に連続した骨格を有し、骨格の間隙にサブマイクロメートルサイズ〜マイクロメートルサイズの三次元に連続した貫通孔と、シリカ骨格中に連続して存在するナノメートルサイズの細孔を有するか、あるいは細孔の孔径を０にし貫通孔のみの網目状の骨格を有する、項目（１）〜（１３）のいずれか１項に記載の担体。
（１５）前記貫通孔は、約０．１〜約２０μｍのサイズであり、かつ、前記無機多孔質体の大きさまたは粒子径未満であり、
前記細孔は、存在する場合、約２ｎｍ〜約３００ｎｍであり、かつ、貫通孔の直径未満である。項目（１４）に記載の担体。
（１６）前記結合リンカーは、アミノ基を含み、前記担体表面のケイ素原子からの長さが、炭素原子、窒素原子および酸素原子を合わせて直鎖方向に約１個以上約２０個未満である、項目（３）〜（１５）のいずれか１項のいずれかに記載の担体。
（１７）前記長さは、炭素原子、窒素原子および酸素原子を合わせて直鎖方向に約７個から約１４個である、項目（１６）に記載の担体。
（１８）前記結合リンカーが約１０〜約２５０μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれる、項目（３）〜（１５）のいずれか１項に記載の担体。
（１９）前記結合リンカーは、約３０〜約７５μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれる、項目（３）〜（１５）のいずれか１項に記載の担体。
（２０）前記開裂可能リンカーは、約３０〜約７５μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれる、項目（５）〜（１５）のいずれか１項に記載の担体。
（２１）前記担体は、ゾル−ゲル法で作製される、項目（１）〜（２０）のいずれか１項に記載の担体。
（２２）項目（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の担体を含む、核酸またはその類縁体の合成機。
（２３）前記合成は、固相合成によって行われる、項目（２２）に記載の合成機。
（２４）前記担体は、前記核酸またはその類縁体の原料（例えば、ヌクレオシドやその類縁体、および導入可能な有機化合物(リンカーや色素誘導体など)等）の担持量が約３０〜約７５μｍｏｌ／ｇに調整される、項目（２２）または（２３）に記載の合成機。
（２５）項目（１）〜（２１）のいずれかに記載の担体または、項目（２２）〜（２４）のいずれかに記載の合成機を用いる核酸またはその類縁体の合成方法。
（２６）前記合成は、固相合成によって行われる、項目（２５）に記載の方法。
（２７）前記担体は、前記核酸またはその類縁体の原料（例えば、ヌクレオシドやその類縁体、および導入可能な有機化合物(リンカーや色素誘導体など)等）の担持量が約３０〜約７５μｍｏｌ／ｇに調整される、項目（２５）または（２６）に記載の合成方法。【０００９】
理論に束縛されることを望まないが、貫通孔を有する無機多孔質体は通常核酸合成に使用されるＣＰＧとは異なるポア構造を有するため、試薬の流れがよくなり、合成の効率化が図ることができると考えられる。【００１０】
従来技術で使用されるＣＰＧは、細孔（空隙）のみを有するものであったが、本発明で用いられる貫通孔を有する無機多孔質体は液通りの良い貫通孔（シリカ内部の決まった流路）を有することから、ＤＮＡ・ＲＮＡを延長していく合成に適していると考えられる。
【発明の効果】
【００１１】
高い反応効率を有する担体を開発することに成功し、使用する試薬や溶媒の削減によるコストダウンが可能となり、また、単位当たりの核酸合成量が大幅に向上することが可能となった。【００１２】
従来型ビーズでは、空隙比を調節できず、流路の形がいびつで抵抗が大きく、細孔径が不均一で拡散長が長く、ポリマー担体は細孔がないので化学修飾は表面のみで可能であったのに対して、本発明では、貫通孔を有する無機多孔質体を用いることから、空隙比が制御可能であり、流路の形が丸く抵抗が小さく、細孔径が均一であり、拡散長が短いという効果が認められ、合成効率が劇的に改善される。【００１３】
本発明では、貫通孔を有する無機多孔質体のうち、特に、粒子型の場合、これまでのシリカゲルやＣＰＧといった担体と同様に扱えつつ、（１）連続した貫通孔を有しているため、更に広い反応場を提供でき、（２）従来の合成装置を利用して、合成可能であり、（３）液通りについても、同等かそれ以下の圧力で溶液を流すことが可能であるため、機械的な制限が少なくなるといった効果が達成される。【００１４】
また、本発明では、貫通孔を有する無機多孔質体のうち、特に、一体型の場合、（１）同一のバッチより好きな大きさ・形に切出せるために、機械に合わせて使用することが可能であり、（２）同一性の高いものが作製可能であり、（３）カラム準備にシリカゲルやＣＰＧの場合は、特殊な機械や技術が必要とされることが多いが、モノリス型カラムでは必要とせず、大型化が可能であるといった効果が達成される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、洗浄前のｂａｒｅ担体と、アミノシラン化後の粒子状態の光学顕微鏡による観察結果を示している。
【図２】図２は、ヌクレオシド担持量の測定結果の例を示している。縦軸は吸光度を示し、横軸は波長（ｎｍ）を示す。
【図３】図３は、合成サンプルの収量と担体のＤＭＴ−ｄＴ担持量の相関を示している。縦軸は収量（ｍｇ）を示し、横軸はＤＭＴ−ｄＴ担持量（μｍｏｌ／ｇ）を示す。
【図４】図４は、実際のろ紙の挿入の代表例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。また、本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。従って、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１７】
最初に本発明において使用される用語および一般的な技術を説明する。
【００１８】
本明細書において「無機多孔質体」とは、内部に無数の微細な孔を有した無機材料をいう。本発明で使用される無機多孔質体は、貫通孔を有することが特徴の一つである。したがって、１つの局面では本発明は「貫通孔を有する無機多孔質体」に関するものである。このような貫通孔を有する無機多孔質体は、代表的には、ゾルーゲル法によって製造される。本発明で使用される無機多孔質体は、さらに細孔を有していてもよい。
【００１９】
本明細書において「貫通孔」とは、マクロ細孔またはスルーポアとも呼ばれ、無機多孔質体における大きなサイズの孔をいい、サブミクロンサイズからマイクロサイズのものであり、代表的には、直径約０．１〜約２０μｍサイズの孔をいう。
【００２０】
本明細書において「細孔」とは、メソ細孔またはメソポアとも呼ばれ、代表的には直径約１〜約３００ｎｍ程度の貫通孔よりも小さな孔をいう。
【００２１】
本発明で使用される貫通孔を有する無機多孔質体は、さらにその形状により、「一体型」（モノリス型）と「粒子型」に分類される。通常、一体型の無機多孔質体は、連続した貫通孔と細孔を有し、粒子型の無機多孔質体は、細孔径を無くし連続した貫通孔のみを有するがこれに限定されず、一体型の無機多孔質体でも貫通孔のみの構造を有するものもあり、粒子型でも細孔を保持しているものもある。
【００２２】
本明細書において「一体型」または「モノリス（型）」（ｍｏｎｏｌｉｔｈ）とは、交換可能に用いられ、構造物の三辺のうちの一辺の長さが１ｍｍ以上の連続した無機多孔質体であり、マイクロメートル前後のオーダーの網目状の骨格が繋がった特徴的な構造をもつ一体型の多孔質体をいう。語源的には一枚の石という意味であり、見た目はチョークのようであり、電子顕微鏡で観察すると、ジャングルジム状の骨格が連なった構造をしている。骨格の隙間をめぐるように、ミクロンスケールの貫通孔と呼ばれる孔（ポア）が無数に開いており、さらに好ましくは、骨格内にはナノスケールの細孔と呼ばれる孔が開いている。貫通孔と細孔は塞がることなく繋がっており、代表的には全容積の約８５％が孔となる高い空隙率を誇るとされる。ナノスケールの細孔が存在する場合は、無数に存在することで高い比表面積を持つ。
【００２３】
本明細書において「粒子型」または「粒（子）状」または「非一体型」とは無機多孔質体の形状をいい、「一体型」以外のものを総称するものであり、「粒子型」無機多孔質体は、無機多孔質体の三辺すべてを１ｍｍ以下とした無機多孔質粒子である。粒子型無機多孔質体は、代表的には一体型の無機多孔質体を粉砕・分級することで得られる破砕状粒子であり、高い空隙率および比表面積を有し、モノリス特有の貫通孔および細孔の二段階のポアを有するため、モノリス特有の高速処理性能をもつ粒子である。無機多孔質体は、ペレット構造をとりうる。
【００２４】
本明細書において無機多孔質体は、シリカまたはチタニア（二酸化チタン）で構成され（この場合それぞれシリカモノリス、チタニアモノリスなどともいう）、その純度は代表的には９９．９％以上である。二段階の異なるサイズを持つ貫通孔と細孔からなる共連続の多孔質体であるモノリスは、材質がシリカの場合、この二段階のポアの大きさは独立して制御可能で（貫通孔（三次元網目状細孔ともいう。）であれば代表的に約０．１〜約１０μｍ、細孔（メソ孔ともいう。）であれば代表的に約１〜約２００ｎｍであるが、これより大きいもの、例えば約３００ｎｍも製造可能である）、使用目的に応じてそれぞれの孔径を最適化できる特徴を持つ。シリカモノリスは高い空隙率と比表面積を誇ることから、低圧でかつ高性能のフィルターや吸着カラムとして、または多くの液体を含むことができるので、薬効成分を含浸・吸着させたモノリスから薬剤をゆっくりと放出する材料としても使用されるが、通常は固相合成には使用されていない。
【００２５】
本明細書において「核酸」とは塩基と糖、リン酸からなるヌクレオチド（本発明の合成の原料でもある）がリン酸ジエステル結合で連なった任意の生体高分子をいい、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を挙げることができる。
【００２６】
本明細書において核酸およびその原料の「類縁体」とは、ホスホロアミダイト法やＨ−ホスホネート法などの固相合成法に用いることが出来る化学修飾が施されたものであって、化学修飾された核酸（またはヌクレオチド）の類縁体、代表的には、糖の２’位の水酸基をアルキル基などで修飾や保護した核酸やF基を導入した修飾核酸、架橋型核酸と呼ばれるＬＮＡやＢＮＡ、ＰＮＡやＵＮＡ、その他核酸配列に導入可能な誘導体（リンカーや色素誘導体など）他、合成可能である限り他の一般的な有機化合物も包含される。
【００２７】
本明細書で使用される核酸またはその類縁体およびそれらの原料の塩基には、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニンなどの他の合成および天然核酸塩基、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含む。他の修飾核酸塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例、９−（２−アミノエトキシル）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾシアジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧ−クランプを含む。修飾核酸塩基には、プリンまたはピリミジン塩基を、他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンなどと置換したものを含むこともある。他の核酸塩基には、ＵＳＰ  Ｎｏ．３，６８７，８０８に開示されたもの、The  Concise  Encyclopedia  Of  Polymer  Science  And  Engineering,  pages  858-859,  Kroschwitz,  J.I.,  ed.  John  Wiley  &  Sons,  1990に開示されたもの、Englisch  et  al.,,  Angewandte  Chemie,  International  Edition,  1991,  30,  613に開示されたもの、およびSanghvi,  Y.S.、15章、Antisense  Research  and  Applications,  pages  289-302,  Crooke,  S.T.  and  Lebleu,  B.,  ed.,  CRC  Press、1993により開示されたものを含む。
【００２８】
これらの若干の核酸塩基は、本発明で合成されるオリゴマー化合物（本発明が対象とする核酸またはその類縁体の例であるオリゴ体、例えば、オリゴヌクレオチド）の結合親和力を増大させるのに特に役立つ。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンなどの、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換基は、核酸の二本鎖の安定性を０．６−１．２℃だけ増加させることが実証されており（Sanghvi,  Y.S.  Crooke,  S.T.  and  Lebleu,  B.,  eds.,  Antisense  Research  and  Applications,  CRCプレス,  Boca  Raton,  1993,  pages  276-278）、および好適な塩基置換基であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と結合したときに更に特に好適である。
【００２９】
上記の若干の修飾核酸塩基のみならず他の修飾核酸塩基またはその類縁体の調製を教示する代表的なUSP（米国特許番号）には以下のものを含むが、それらに限定されない：上記のUSP  3,687,808のみならず次のUSP;  4,845,205;  5,130,302;  5,134,066;  5,175,273;  5,367,066;  5,432,272;  5,457,187;5,459,255;  5,484,908;  5,502,177;  5,525,711;  5,552,540;  5,587,469;  5,594,121;  5,596,091;  5,614,617;  5,645,985;  5,830,653;  5,763,588;  6,005,096;  5,750,692および5,681,941、その各々の内容は、本明細書において参考として援用される。
【００３０】
他の修飾基は、オリゴマーがオリゴヌクレオチドの場合、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドでの糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位でも作ることができる。例えば、本発明で製造されるオリゴマーの例であるオリゴヌクレオチドの場合、一方にリガンドが結合している場合、そのオリゴヌクレオチドの他の修飾基には、そのオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞摂取を高める、１つ以上の他の非リガンド部分またはコンジュゲートのオリゴヌクレオチドへの化学的連結を含んでいてもよい。該部分には以下を含むが限定はしない：コレステロール成分などの脂質部分（Letsinger  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  1989,  86,6553）、コール酸（Manoharan  et  al.,  Bioorg.  Med.  Chem.  Lett.,  1994,  4,1053）、チオエーテル、例、ヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharan  et  al.,  Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.,  1992,  660,306;  Manoharan  et  al.,  Bioorg.  Med.  Chem.  Let.,  1993,  3,2765）、チオコレステロール（Oberhauser  et  al.、Nucl.  Acids  Res.、1992、20,533）、脂肪族鎖、例、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras  et  al.,  EMBO  J.,  1991,  10,111；  Kabanov  et  al.,  FEBS  Lett.,  1990,  259,327；  Svinarchuk  et  al.,  Biochimie,  1993,  75,  49）、リン脂質、例、ジヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホン酸塩（Manoharan  et  al.,  Tetrahedron  Lett.,  1995,  36,  3651；Shea  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  1990,  18,  3777）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan  et  al.,  Nucleosides＆Nucleotides,  1995,  14,  969）、またはアダマンタン酢酸（Manoharan  et  al.,  Tetrahedron  Lett.,  1995,  36,  3651）、パルミチル部分（Mishra  et  al.,  Biochim.  Biophys.  Acta,  1995,  1264,229）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke  et  al.,  J.  Pharmacol.  Exp.  Ther.,  1996,  277、923）。
【００３１】
本発明において対象とされる核酸には、本発明の特定の修飾核酸を含む限り、リン酸ジエステル結合により結合しているもののみならず、アミド結合やその他のバックボーンを有するもの（ペプチド核酸（ＰＮＡ）等）が含まれる。上述のように、核酸およびその類縁体には、例えば天然および人工の核酸が含まれ、核酸誘導体、核酸アナログ、核酸派生体等であってよい。そのような核酸類縁体は当該分野において周知であり、例えばホスホロチオエート、ホスホアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＮＡの骨格には、アミノエチルグリシン、ポリアミド、ポリエチル、ポリチオアミド、ポリスルフィナミド、ポリスルホンアミド、またはそれらの組み合わせからなる骨格を含んでよい（Krutzfeldt,  J.  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  35:  2885-2892;  Davis,  S.  et  al.,  2006,  Nucleic  Acids  Res.  34:  2294-2304;  Boutla,  A.  et  al.,  2003),  Nucleic  Acids  Res.  31:  4973-4980;  Hutvagner,  G.  et  al.,  2004,  PLoS  Biol.  2:  E98;  Chan,  J.A.  et  al.,  2005,  Cancer  Res.  65:  6029-6033;  Esau,  C.  et  al.,  2004,  J.  Biol.  Chem.  279:  52361-52365;  Esau,  C.  et  al.,  2006,  Cell  Metab.  3:  87-98）。
【００３２】
本明細書において核酸またはその類縁体の「原料」とは、核酸またはその類縁体の一部となる任意の材料をいう。このような原料としては、ヌクレオシドやその類縁体、および導入可能な有機化合物(リンカーや色素誘導体など)などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３３】
本明細書において「担体」とは、キャリアとも呼ばれ、他の物質を固定する土台となる物質をいう。本発明では、固相合成等の製造方法において用いられる。担体自体は化学的に安定したもので、目的操作（本発明では、代表的には合成反応)を阻害しないものが望ましい。
【００３４】
本明細書において「結合リンカー」とは、ある物質と別の物質とを結合させるために使用される結合構造をいう。例えば、アミノ基、水酸基（リン酸基なども含まれる）およびチオール基を挙げることができる。これらの置換基を有するシランカップリング剤が市販されており、適宜利用することができる。これらの置換基であれば一般的な有機反応（縮合など）でリンカーを延長可能である。本発明の担体には好ましくは結合リンカーを含ませることができるが必ずしも必要ではない。このような結合リンカーとしては、シランカップリング剤を用いた結合リンカーの他、ホスホン酸系のカップリング剤（Ｄｏｊｉｎｄｏ、表面処理関連試薬として販売されるホスホン酸誘導体；http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr7.nsf/ByChuInfo/08?OpenDocument参照）を用いた結合リンカー含まれ、そのような処理剤として、例えば、シランカップリング剤の例として、3-アミノプロピルトリメトキシシランや3-アミノプロピルトリエトキシシラン、N-2-（アミノエチル）-3-アミノプロピルトリメトキシシラン、3-アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン、3-イソシアネートプロピルトリエトキシシラン等があり、ホスホン酸系の例としては、11-アミノウンデシルホスホン酸、11-ヒドロキシルウンデシルホスホン酸、12-メルカプトドデシルホスホン酸、10-カルボキシデシルホスホン酸等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００３５】
結合リンカーのサイズについても、任意の大きさのものが使用され得るが、担体表面のケイ素原子からの長さが、炭素原子、窒素原子および酸素原子を合わせて直鎖方向に約１個以上約２０個未満であり、好ましくは、約７〜約１４個のものが好ましい。
【００３６】
本明細書で使用される結合リンカーは、約１０〜約２５０μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれることが好ましく、より好ましくは約３０〜約７５μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれる。
【００３７】
本明細書において「開裂可能リンカー」とは、核酸またはその類縁体、それらの結合化合物あるいは該核酸またはその類縁体を連結する結合を分解しない条件で、担体と核酸部分とが開裂できる結合様式を有するリンカーをいう。開裂可能リンカーとしては、例えば、エステル結合、アミド結合、イミド結合、チオエステル結合およびジスルフィド結合を含むリンカー等を挙げることができるがこれらに限定されない。このようなリンカーの例としては、オキサリル酸やスクシニル酸、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ−ジ酢酸誘導体といったジカルボン酸誘導体やユニバーサルリンカーと呼ばれる１，２−ジオール構造を有した化合物、フタルイミド基を有したカルボン酸やジスルフィドなどを挙げることができる。
【００３８】
本明細書で使用される開裂可能リンカーもまた、約１０〜約２５０μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれることが好ましく、より好ましくは約３０〜約７５μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれる。
【００３９】
本明細書で使用される結合リンカーは、アミノ基、水酸基（例えば、リン酸基も含まれる。）およびチオール基からなる群より選択される少なくとも１つの基を含み、該基が、エステル、アミド、イミド、チオエステルおよびジスルフィド結合からなる群より選択される結合が好ましく、これらの結合を有する任意の結合リンカーを用いることができる。
【００４０】
本明細書において「モノリス型シリカ」とは、モノリス構造を有するシリカをいう。モノリス型シリカは、それ自体（例えば、ペレット型）で用いられてもよく、あるいはこれを粉砕等を行うことにより一定の直径に加工し分級して構成される粒子型として用いられてもよい。粉末としてもよい。モノリス型シリカ、およびこれを粉砕した粒子型シリカとしては、貫通孔と細孔とを有するもの、および細孔をなくし、貫通孔のみを有するものを挙げることができる。シリカモノリス、ＣＰＧ（controlled  pore  glass:多孔質シリカガラス）ともに多孔質シリカの1種であるが、ＣＰＧとは異なり、シリカモノリスは有機無機ハイブリッド法により作製され、網目構造中の網目状細孔（貫通孔またはマクロ孔ともいう。）とその骨格中の細孔の2種類のサイズの空孔を有することを特徴とするものである。モノリス型シリカは、ゾル−ゲル法で得ることができる。「ゾル−ゲル法」は、乾燥されてガラス状の粒子またはモノリスになることができるゲルを製造するための幅広い手法をいう。ゾル−ゲル法のプロセスは、意図した材料(例えばシリカ)の前駆体溶液を使用することができる。
【００４１】
（無機多孔質体の製造の例示）
本発明で使用される無機多孔質体は、ゾル−ゲル法等の公知の手法で製造することができる。
【００４２】
本明細書において「ゾル−ゲル法」とは、乾燥されてガラス状の粒子またはモノリスになることができるゲルを製造するための幅広い手法をいう。ゾル−ゲル法の手順は、目的とする材料(例えばシリカ)の前駆体溶液を使用して製造することができる。その手順としては、例えば以下が挙げられる。まず、材料（例えば、Ｓｉ）の溶液または懸濁液を調製し、材料がＳｉの場合、Ｓｉ調製物の酸または塩基等で触媒された加水分解を行い、Ｓｉ−ＯＨ基を形成させる。その反応式は以下のとおりである。
【００４３】
ＳｉＸｎ＋ｎＨ２Ｏ→Ｓｉ（ＯＨ）ｎ＋ｎＨＸ
この方法で得られる混合物は、「ゾル」と呼ばれる溶液またはコロイド懸濁液である。
【００４４】
次いで、次の反応によるＳｉ−ＯＨ基の重縮合を行う。
【００４５】
Ｓｉ−ＯＨ＋Ｓｉ−ＯＨ→Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ＋Ｈ２Ｏ
この段階では、粘度の増加および同時に起こる「ゲル」と呼ばれるマトリックスの形成が生じる。ゲルを乾燥させると、多孔質モノリス型の構造物が形成される。乾燥はキセロゲルを生成する制御された溶媒蒸発またはエアロゲルを生成する溶媒の超臨界抽出により行うことができる。コロイド(ゾル)溶液は、1つまたは複数の（上でＳｉに代表される）金属または半金属酸化物の前駆体を水または水／アルコールとともに酸や塩基などの触媒の存在下で混合して調製することができる。金属または半金属酸化物は、周期表の３、４または５族に属する元素のｎ価のカチオンであってもよいが、特にＳｉ、Ｇｅ、Ｔｉ、Ａｌまたはそれらの任意の組合せであってもよい。上記Ｘは酸化物、アルコキシド、メトキシ、テトラメトキシ、エトキシ、プロポキシもしくはブトキシまたはそれらの任意の組合せを含む群から選択され得る。加水分解段階は室温で約５分間から４時間以上または水和したカチオン酸化物がゾルを形成するまで行うことができる。ゲル化前にゾルに少なくとも１つの既存カチオン酸化物のコロイド懸濁液を添加してもよい。例えば、シリコン酸化物を含む前駆体が利用される場合、水、任意選択でさらに溶媒、ヒュームドシリカ、酸または塩基を混合して調製された溶液／懸濁液をゾルに加えることもできる。ゾルのゲル化は、ゾルを代表的には約９０℃より低い温度で、少なくとも数分間にわたってインキュベートすることで行うことができる。
【００４６】
ゲル化後、ゲルは例えば水またはメタノール等の有機溶媒により、ゲル中の溶媒が非プロトン性溶媒または水およびメタノールにより置換されるように洗浄される。非プロトン性溶媒は、アセトン、ジオキサン、ヒドロフランを含む群から選択され得る。
【００４７】
このようにして得られるゲルはその後、不活性ガスを用いてパージした加圧チャンバー内で、ゲル溶媒の臨界温度より低い温度のときに溶媒臨界圧より低い全圧力を達成するのに適切な圧力で乾燥され得る。このような条件の下、ゾル−ゲル反応すなわちゲル溶媒が蒸発して乾燥ゾル−ゲルを生成するよう予め決められたプログラムに従って加圧チャンバーの温度が上げられる。乾燥ゾル−ゲルはガラス化を受け、通常の大気圧または不活性ガス気圧下で約１００℃から約１６５０℃より高い温度に加熱され得る。ガスは窒素、アルゴン、ヘリウム、酸素、塩素等からなる群から選択され得る。乾燥ゾルゲルは約１０分間から長時間にわたって加熱され得る。
【００４８】
（粒子型の製造の例示）
粒子型無機多孔質体は、上記製造法により製造された一体型無機多孔質体をスプレードライ法での粉砕、Ｗ／Ｏエマルジョンによる方法での粉砕、乳鉢や粉砕機等を用いた衝撃や加圧による粉砕などによる方法により、製造することができる。
【００４９】
（核酸またはその類縁体の合成用担体の製造および核酸またはその類縁体の合成）
（１．無機多孔質体へのリンカーおよび／または出発材料（モノマー等）の結合）
本発明の無機多孔質体担体に対して以下の手順で表面修飾からヌクレオシドの付加反応まで行うことができる。
反応１：担体表面へのリンカーの付加（ｂａｒｅ担体（裸の担体）のみ）
反応２：カルボキシル基の導入
反応３：シラノール基のキャッピング
反応４：３’末端ヌクレオシドの付加
（方法：洗浄）
表面加工していない裸の担体（ｂａｒｅ担体という；たとえば２．９ｇ）を適切な容器（たとえば三角フラスコ）にとり、適切な洗浄液（たとえば２Ｍ塩酸水溶液（１００ｍＬ））に懸濁後、極めてゆっくりと適切な時間（たとえば約１時間）撹拌して微粒子を洗浄する。担体を入れた容器を静置した後に上澄み溶液を除去し、浮遊した微小粒子を除去する。続いて水（たとえば１００ｍＬ）を加え、静置と溶液除去操作を繰り返す（たとえば３回洗浄）。その後アミノシラン化修飾（反応１）を行う。
【００５０】
（方法：リンカーの導入（反応１））
洗浄した担体を減圧下でろ取し（たとえば水、メタノールで洗浄）、乾燥（たとえば４０℃、６０℃、８０℃、各２時間乾燥させた後、１６時間風乾させ、１００℃で２時間さらに乾燥させる）させる。
【００５１】
乾燥させた担体（たとえば１．４１ｇ）に適切な溶媒（たとえばトルエン（４０ｍＬ））と適切なリンカー（たとえば３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＭＷ．２２１．３７，ｄ＝０．９４６ｇ／ｍＬ，１０ｍＬ））を加え、（たとえば１１０℃で）還流させる（たとえば１０時間）。続いて減圧ろ過し、適切な洗浄液（たとえばトルエン、クロロホルム）を用いてそれぞれ（たとえば３回）洗浄した後に風乾し、続いて（たとえば減圧下で数時間）乾燥させる。
【００５２】
（方法：カルボキシル基の導入（反応２））
担体（たとえば１．４〜２ｇ）に適切な溶媒（たとえば水６０ｍＬ）および適切なカルボン酸試薬（たとえば無水コハク酸２ｇ）を添加し、撹拌せずに反応容器を優しく揺らし反応を行う（たとえば室温下、約３０分に一度、容器を手動で撹拌する）。続けて適切な塩基（たとえば２Ｍ水酸化ナトリウム溶液）を加えて反応液を適切なｐＨ（たとえばｐＨ４〜５）に維持し、適切な時間（たとえば３時間）経過後に適切なカルボン酸試薬（たとえば無水コハク酸１ｇ）と適切な塩基（たとえば２Ｍ水酸化ナトリウム）を追加した。適切な時間（たとえば７時間）反応を行った後、担体を（たとえば減圧下で）ろ取し、（たとえば水およびメタノールでそれぞれ３回）洗浄し、得られた担体を風乾する。続いて、担体を適切な条件（たとえば減圧下７０℃で２時間、常圧下で８０℃、２時間）の下で乾燥させる。
【００５３】
（方法：シラノール基のキャッピング（反応３））
無機多孔質体担体（たとえば１〜２ｇ）を適切な溶媒（たとえば無水ピリジン（５０ｍＬ））中に懸濁し、適切なキャッピング剤（たとえばクロロトリメチルシラン（５ｍＬ））を加え（たとえば室温下で）優しく揺らす。（たとえば２時間後）粉末を減圧下ろ取し（（たとえばピリジン、クロロホルムで各３回洗浄）、風乾する。さらに、室温で減圧乾燥（２時間）後にキャッピングされた無機多孔質体担体を回収する。
【００５４】
（方法：無機多孔質体担体へのヌクレオシドの付加（反応４））
各縮合反応には適切な容器（たとえば容量５ｍＬのガラスバイアル瓶）を用い、無機多孔質体担体、ヌクレオシド（たとえば５’−ジメトキシトリチルデオキシチミジン（５’−ＤＭＴ−ｄＴ））、および縮合剤等に溶媒を加えてキャップした後、（たとえば振盪機を用いてバイアル瓶ごと室温で穏やかに）振盪して行う。一定時間振盪した後、（たとえば桐山ロートを用いて）無機多孔質体担体をろ取し、さらに適切な洗浄液（たとえばピリジンおよびジクロロメタン）で担体を洗浄する。
【００５５】
（ヌクレオシド担持量の測定）
ヌクレオシド縮合反応（反応４）終了後、乾燥したヌクレオシド付加無機多孔質体担体（たとえば約１０ｍｇ）を適切な測量器具（たとえばメスフラスコ）に正確に量りとり、適切な試薬（たとえば過塩素酸（７０％水溶液）−エタノールの混合溶液（３：２）１０．０ｍＬ）を加え、ジメトキシトリチルカチオン（ＤＭＴ＋，モル吸光係数：ε５００＝７１，７００）を脱離させる。この溶液を上記混合溶液で（たとえばさらに１０倍に）希釈した後、（たとえば５００ｎｍにおける）吸光度を測定することで、ヌクレオシド担持量（μｍｏｌ／ｇ）を算出する。
【００５６】
（２．固相合成）
合成用の担体が完成すると、その後固相合成を行う。核酸または核酸の類縁体の合成は、Ｈ−ホスホネート法、ホスホエステル法、固相ホスホロアミダイト法等の従来と同様の合成反応により行われる。固相合成の一般的な説明としては、特開２００９−２８０５４４または特表２００８−５１１７４３等を参酌することができる。固相合成は、作製したオリゴ核酸合成用無機多孔質体担体を用い、（たとえば合成機ｎＳ−８（株式会社ジーンデザイン製）を用いて）ホスホロアミダイト法により行い、（たとえば２４塩基の）ＲＮＡを得る。固相ホスホロアミダイト法は、オリゴヌクレオチド等のオリゴマーの合成能力が高く、高純度のオリゴヌクレオチド等のオリゴマーが得られるという理由から好ましく採用される。この方法は、代表的に、以下の４工程を含む。
（１）ジクロロ酢酸等の脱保護剤により、マイクロ流路の内壁面における官能基に結合したヌクレオシドの５’−ＯＨの保護基であるＤＭＴ基（ジメトキシトリチル基；ＤＭＴｒ基とも略する）を外す脱トリチル化工程、
（２）テトラゾール等により活性化したヌクレオシドホスホロアミダイト（アミダイト試薬）を前記の脱保護した５’−ＯＨとの求核置換反応により結合させるカップリング工程、
（３）アミダイト試薬が結合しなかった５’−ＯＨを無水酢酸等によりアセチル化して保護するキャッピング工程、及び
（４）ヨウ素等の酸化剤により、アミダイト試薬に由来する亜リン酸結合を酸化して、リン酸トリエステルの形にする酸化工程。
ホスホロアミダイト法の原理の例示的スキームを以下に示す。
【００５７】
【化１】
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【００５８】
合成は、担体（１つ目のヌクレオシドがついている）上のＤＭＴｒ基（ジメトキシトリチル基）を除去し、５’ヒドロキシル基末端を遊離させることから始める（ステップ１）。アミダイトとテトラゾール等の活性化剤を導入して活性化させ、担体上の５’ヒドロキシル基末端と反応させ（ステップ２）、Ｉ２等の酸化剤で酸化する（ステップ３）。また未反応の５’ヒドロキシル基末端をアセチル化する（キャップ化）。ただし、この操作は短鎖ＤＮＡの合成の場合省略することもある（ステップ４）。この１〜４のステップを繰り返してオリゴマー（例えば、オリゴヌクレオチド）の鎖長を延ばしていく。
【００５９】
ここで使用される核酸モノマーについては、ホスホロアミダイト法またはそれ以外の方法を用いて、この修飾体や類縁体も用いることができることが理解される。なお、Ｈ−ホスホネート法の場合では、活性化剤のテトラゾール類や弱酸性物質の代わりに、酸クロライドや縮合剤（ＤＣＣやＢＯＰ−Ｃｌ）等を用いることができる。また、リン酸エステルへの酸化は、各延長ごとも可能であるが最後にまとめて酸化することも可能となる。加えて、キャッピング剤に関しては、アルキルホスファイトを用いることが一般的である。
【００６０】
合成効率等の確認は、得られた核酸の収量をリファレンスとなるＣＰＧでの合成と比較することによって確認することができる。
【００６１】
（３．固相合成後の切り出し・精製）
固相合成後、適切な試薬（たとえば２８％アンモニア水／４０％メチルアミン水溶液＝１／１（以下、ＡＭＡと略することもある）１ｍＬ）、適切な温度（たとえば室温）適切な時間（たとえば２ｈ）で担体からオリゴマー（例えば、オリゴヌクレオチド）の切出しを行い、適切な洗浄液（たとえば５０％エタノール）でカラムの洗浄を行う。
【００６２】
溶液を（たとえばＳｐｅｅｄＶａｃＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により）乾固させた後、２’位の脱保護を適切な試薬（たとえば３ＨＦ・ＴＥＡ／ＴＥＡ／ＤＭＳＯ（ＴＥＡ：トリエチルアミン、ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド）の混合溶液０．３ｍＬ）中適切な条件（たとえば６５℃で１．５時間）または５５℃で１７時間）の下行い、そのまま適切な温度（たとえば室温）まで冷却した後、精製（たとえばイソプロパノール沈殿）を行うことができる。
【００６３】
サンプルを乾燥させた後、適切な溶媒（たとえばＤＮａｓｅフリーの水ｐＨ７程度のバッファー）に溶解し、吸光度（Ａｂｓ）と液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の測定を行う。
【００６４】
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【００６５】
（固相合成用無機多孔質体担体）
１つの局面において、本発明は、貫通孔を有する無機多孔質体を含む、核酸またはその類縁体を製造するための担体を提供する。本発明が合成し得る物質としては、核酸のほか、その類縁体として、核酸の固相合成法を応用可能な任意の物質を挙げることができる。例えば、そのような核酸またはその類縁体は、ホスホロアミダイト法またはＨ−ホスホネート法により合成され得るものを挙げることができる。このような物質としては、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、アンロックト核酸（ＵＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ），架橋核酸（ＢＮＡ）等の架橋型核酸の他、糖の２’位の水酸基をアルキル基などで修飾や保護した核酸やＦ基を導入した修飾核酸、その他核酸配列に導入可能な誘導体（リンカーや色素誘導体など）本明細書において説明した他の核酸または核酸の類縁体を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６６】
１つの実施形態では、本発明の担体は核酸またはその類縁体あるいはそれらの原料（例えば、ヌクレオシドやその類縁体、および導入可能な有機化合物(リンカーや色素誘導体など）を結合するための結合リンカーを有する。このような結合リンカーは、本発明の担体を核酸またはその類縁体あるいはそれらの原料を結合させることができるリンカーであれば、どのようなものでもよい。そのような結合リンカーは、好ましくは、アミノ基、水酸基およびチオール基からなる群より選択される少なくとも１つを含む。これらの置換基を有するシランカップリング剤が市販されておりシグマアルドリッチ社や信越化学工業社、東京化成工業株式会社などより入手可能である。また、ホスホン酸カップリング剤については、同仁化学やシグマアルドリッチから入手可能である。これらの試薬を用いてリンカーを導入することができる。これらの置換基であれば一般的な有機反応（縮合など）でリンカーを延長可能であると考えられる。より具体的には、このような結合リンカーは、アミノプロピル基、アミノペンチルアミドプロピル基、アミノヘキシルウレイドプロピル基、Ｎ−（２−アミノエチル）アミノプロピル基、アミノヘキシルアミノエチルエーテル基、アミノペンチルアミドプロピル基、Ｎ−ピペラジニルアミドプロピル基、ウレイドプロピル基等を挙げることができるがそれらに限定されない。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明の担体は、さらに、本発明の担体を用いて固相合成を行う後に、合成される核酸またはその類縁体、それらの結合化合物あるいは該核酸またはその類縁体を連結する結合を分解しない条件で、担体と核酸部分とが開裂できる結合様式を有するリンカーである「開裂可能リンカー」を含んでいてもよい。具体的な実施形態では、このような開裂可能リンカーにおいて用いられる結合様式としては、エステル、アミド、イミド、チオエステルおよびジスルフィド結合からなる群より選択される結合を含むがこれらに限定されない。
【００６８】
さらに好ましい実施形態では、本発明の担体は、結合リンカーおよび開裂可能リンカー（この場合、１つのリンカーが結合リンカーおよび開裂可能リンカーとして機能するものであってもよい）を含み、ここで、結合リンカーはアミノ基、水酸基およびチオール基からなる群より選択される少なくとも１つの基を含み、該基が、エステル、アミド、イミド、チオエステルおよびジスルフィド結合からなる群より選択される結合または結合様式を介して本発明の無機多孔質体に結合している。このような結合様式を含むリンカーを含むことによって、核酸またはその類縁体を無機多孔質体に有効に結合させることができ、また、合成後に、核酸またはその類縁体の重合物を開裂させずに無機多孔質体から有利に分離することができる。
【００６９】
１つの実施形態では、本発明で用いられる貫通孔を有する無機多孔質体はさらに細孔を有していてもよい。別の実施形態では、本発明で用いられる無機多孔質体は、一体型または粒子型であってもよい。特定の実施形態では、本発明で用いられる無機多孔質体はシリカゲルまたはシリカガラスを含む。このような場合、例えば、本発明で用いられる無機多孔質体は、モノリス型シリカ（例えば、ペレット型）あるいは粒子型シリカである。粒子型シリカは、粉砕などの方法により一定の直径に加工、分級して生産することができ、貫通孔と細孔を有するもの、あるいは、細孔径を無くし貫通孔のみを有するものがある。モノリス型はブロックの内部に通液することが前提となり、モノリス外部に通液させる方法といった点もモノリス型シリカの好ましい形態として定義されうる。具体的な実施形態では、前記モノリス型シリカは、ペレット型または粒子型であってもよい。
【００７０】
本発明で使用される無機多孔質体は、貫通孔と細孔を有するもの、あるいは、細孔径を無くし連続した貫通孔のみを有するものである。シリカモノリスおよびCPG（controlled  pore  glass：多孔質シリカガラス）は、ともに多孔質シリカの1種であるが、シリカモノリスは有機無機ハイブリッド法により作製され、網目構造中の網目状細孔（貫通孔）とその骨格中の細孔の2種類のサイズの空孔を有することを特徴としているが、CPGには貫通孔はない。
【００７１】
好ましい実施形態では、本発明で使用される無機多孔質体は、サブマイクロメートルサイズ（すなわち、１μｍ未満の大きさであり、通常数十〜数百ｎｍ程度を指す）〜マイクロメートルサイズ（通常、１μｍ以上の大きさで、１ｍｍ未満の範囲を示す。）の三次元網目状に連続した骨格を有し、骨格の間隙にサブマイクロメートルサイズ〜マイクロメートルサイズの三次元に連続した貫通孔と、シリカ骨格中に存在するナノメートルサイズの細孔を有するか、あるいは細孔の孔径を０にし貫通孔のみの網目状の骨格を有する。
【００７２】
１つの実施形態では、本発明で使用される無機多孔質体の貫通孔は、約０．１〜約２０μｍのサイズであり、かつ、無機多孔質体の大きさまたは粒子径以下であり、本発明で使用される無機多孔質体の細孔は、存在する場合、約２ｎｍ〜約３００ｎｍであり、かつ、貫通孔の直径未満であることが好ましいが、これらに限定されない。貫通孔として好ましいサイズの下限は、約０．１μｍ、約０．２μｍ、約０．３μｍ、約０．４μｍ、約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１．０μｍ、約２．０μｍ、約３．０μｍ、約４．０μｍ、約５．０μｍ等を挙げることができ、貫通孔として好ましいサイズの上限としては、例えば、無機多孔質体の大きさまたは粒子径以下で、かつ、約５０μｍ、約４５μｍ、約４０μｍ、約３５μｍ、約３０μｍ、約２５μｍ、約２０μｍ、約１５μｍ、約１０μｍ等を挙げることができ、これらの任意の組合せが使用され得るがこれらに限定されない。
【００７３】
細孔として好ましいサイズの下限は、約１ｎｍ、約２ｎｍ、約３ｎｍ、約４ｎｍ、約５ｎｍ、約６ｎｍ、約７ｎｍ、約８ｎｍ、約９ｎｍ、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ等を挙げることができ、上限としては、約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１００ｎｍを挙げることができ、これらの任意の組合せが使用され得るがこれらに限定されない。モノリスの製造において容易に制御できるのは約２〜約２００ｎｍとされているが、これ以外の範囲でも製造することは可能である。
【００７４】
１つの実施形態では、本発明で使用される無機多孔質体はペレット型でありうる。このようなペレット型の構造としては、例えば、棒状、板状または塊状でありうる。本発明のペレット型の構造の細孔は代表的には約１００ｎｍ以上である。ペレット型の場合にも、細孔として好ましいサイズは、上記任意の組合せの範囲内のものが使用され得ることが理解される。
【００７５】
本発明で使用される結合リンカーは、アミノ基を含み、本発明で使用される担体表面のケイ素原子からの長さが、炭素原子、窒素原子および酸素原子を合わせて直鎖方向に約１個以上約２０個未満であり、好ましくは、炭素原子、窒素原子および酸素原子を合わせて直鎖方向に約７個から約１４個である。好ましい長さの範囲はこれらに限定されるものではなく、担体表面のケイ素原子からの長さが、炭素原子、窒素原子および酸素原子を合わせて直鎖方向に最大で約３０個、約２９個、約２８個、約２７個、約２６個、約２５個、約２４個、約２３個、約２２個、約２１個、約２０個、約１９個、約１８個、約１７個、約１６個、約１５個であり、最小で約０個、約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個であり、これらの任意の組合せの範囲が使用されることが理解される。
【００７６】
１つの好ましい実施形態では、本発明の担体は、粉末で提供され得る。理論に束縛されることを望まないが、粉末で提供されることにより、固相合成の効率や収率が改善されることが示されており、このような効果は従来の技術からは容易に予想できなかったものであるといえる。
【００７７】
１つの実施形態では、本発明の担体で使用される結合リンカーは約１０〜約２５０μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれ、好ましくは約３０〜約７５μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれる。あるいは、別の実施形態では、本発明の担体で使用される開裂可能リンカーは約１０〜約２５０μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれ、好ましくは約３０〜約７５μｍｏｌ／ｇの担持量で含まれる。実施例において示されているように、無機多孔質体担体へのヌクレオシド付加反応は、担持量が約５０〜約７５μｍｏｌ／ｇ程度が最大反応量となることが示されており、約８０μｍｏｌを超えると、減少する傾向がみられるからである。また、約３０μｍｏｌ以上となると従来達成できていなかったレベルの反応量を達成することが見出されており、それゆえ、約３０〜約８０μｍｏｌ／ｇ未満、または約７５μｍｏｌ／ｇの担持量の担体が効率よく固相合成に用いられることが理解される。アミノ基（あるいはカルボキシル基）が高密度に導入された担体（＞約１００μｍｏｌ／ｇ）を用いても、ヌクレオシド付加量は増加しないことから、担体を効率よく使用するためには、このような範囲またはその周辺の担持量で担持された担体を用いることが好ましくあり得る。
【００７８】
得られた粒子は、乾燥して粉末とし、また、アセトニトリル等の適宜の有機溶媒に分散させた分散液とすることができる。場合によっては、得られた粒子を分級する等して、粒子中に含まれる微小粒子、粗大粒子、凝集粒子、異物等を除去する。このようにして、本発明による核酸または核酸類縁体の合成用固相担体を得ることができる。
【００７９】
（核酸または核酸類似体の合成機）
１つの局面において、本発明は、本発明の担体を含む、核酸またはその類縁体の合成機を提供する。ここで、本発明の核酸またはその類縁体合成機は、当該分野で公知の任意の形態を使用することができ、そこで使用される担体（代表的にはＣＰＧ）に代えて本発明の担体を用いることで、収率、反応効率を飛躍的に改善することができる。特に、合成機、合成方法についていえば、本発明は、既存の合成システム、方法をそのまま流用可能で、さらに粉砕した無機多孔質体担体を使用すれば、大きなシステムであっても装置の変更を行うことなく、既存の担体を使用した場合と同じように扱えるうえに良い結果を得られることが本件の特長の一つである。本発明の合成方法において使用される担体としては、本明細書における（固相合成用無機多孔質体担体）において説明した任意の実施形態を利用することができることが理解される。
【００８０】
本発明の合成機は、反応部、流動部および貯蔵部に分けて構成され得る。反応器は容量約０．２〜約２ｍｌ程度であり、材質がフッ素樹脂、ガラス、ステンレス等で上下フィルターを有する管構造で、内部に本発明の担体を封入して反応に供する。反応器には、二つのタイプがあり、一つは、一合成ごとにヌクレオシド化担体を計量、充填する繰り返し型と、もう一つのタイプは担体が充填された反応器を交換するディスポーザブル型とがある。流動部の主機能はバルブシステムである。原料・試薬・溶剤供給部で、昨今の殆どの装置は機械の中に内蔵している。これに加え、制御システムが備えられることが通常であり、制御システムはハードウェアとソフトウェアから構成されている。代表的な実施形態では、ヌクレオシドリンカーを担持させた固相担体を核酸自動合成装置の反応容器に入れ、溶媒としてアセトニトリルを流し込む。そして、核酸自動合成装置が、合成プログラムに従い、前記ヌクレオシドの５’−ＯＨ基の脱保護反応、５’−ＯＨ基へのヌクレオシドホスホロアミダイトのカップリング反応、未反応の５’−ＯＨ基のキャッピング反応及び生成したホスファイトの酸化反応からなるサイクルを繰り返し、目的の配列を有するオリゴヌクレオチド等のオリゴマーが合成される。最終的に合成されたオリゴヌクレオチド等のオリゴマーは、アンモニア等を用いてリンカーを加水分解させ、固相担体から切り出される。このようなオリゴヌクレオチド等のオリゴマーの合成に用いられる固相担体としては、ポリスチレン系樹脂ビーズやガラス系多孔質ビーズ等の粒子担体等が知られているが、本発明では、これの代わりに無機多孔質体を採用することで、効率よく、収量も高い合成機を提供することに成功した。ＤＮＡを合成する場合と比較して、ＲＮＡを合成する場合は、２’−ＯＨ基に保護基が結合したホスホロアミダイトを用いて合成する必要があるため、アミダイトのカップリング効率が低下し、その結果、得られるＲＮＡの純度が低下するという問題がある。可能な限り純度を低下させずにＲＮＡを合成するためには、合成の基点となる固相担体上でのヌクレオシドリンカーの結合量を少なくする必要があるが本発明はこれも解決した。
【００８１】
反応器において使用され得る固相合成用カラム反応容器は、通常の射出成形によって形成することができる。その形状としては、円筒形状の固相合成用カラム反応容器の例が挙げられるが、固相合成の反応はマイクロ流路の内壁面を反応場として行うため、固相合成用カラム反応容器の外形は、接続する配管との接続性やハンドリング性の観点から適した形状であればどのような形状であってもよい。円筒形状の他、四角柱等の多角柱状であってもよい。マイクロ流路の断面形状についても、射出成形が困難でなければ特に限定されるものではなく、円形の他、四角形、六角形等の多角形であってもよい。マイクロ流路には、核酸またはその類縁体の合成のための反応試薬や洗浄液等を送液するが、試薬の利用効率の面からは、マイクロ流路の断面積に対する流路内周の比率が大きくなるように形成されることが望ましい。すなわち、マイクロ流路の内径は約１ｍｍ以下、望ましくは約１〜約１００μｍである。単一のマイクロ流路から構成した場合であるが、別の実施形態として、複数本のマイクロ流路を備え、それら複数本のマイクロ流路をまとめて一体に成形することによって、一度に合成できるオリゴヌクレオチド等のオリゴマーの量を増加させることが可能である。それぞれのマイクロ流路は、入口から出口まで互いに途中で交差することがないように成形することが好ましい。固相合成は、マイクロ流路の内壁面に存在するヒドロキシ基（−ＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、メトキシ基（−ＯＣＨ３）、チオール基（−ＳＨ）等の官能基に結合させるリンカーを介して行うので、固相合成用カラム反応容器の容積当たりに占めるマイクロ流路内壁面の総面積をできるだけ大きくすることが好ましいことが明らかになった。具体的には、マイクロ流路と直交する固相合成用カラム反応容器の断面積当たりのマイクロ流路内周の総計が大きくなるように、すなわち、単位面積当たりのマイクロ流路の数を多くすることが好ましい。複数本のマイクロ流路を一体成形する場合には、各マイクロ流路の断面形状は多角形であることが好ましい。特に、内燃機関やボイラーの排ガスを浄化する触媒用担体として用いられるハニカム構造体のように、隔壁により仕切られた軸方向に貫通する多数の流通孔を有する構造体を形成して固相合成用カラム反応容器とすることが好ましい。一体成形された複数本のマイクロ流路を構成する樹脂としては、アクリル樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレート等）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステル、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。特に、アクリル樹脂（例えば、ポリメチルメタクリレート等）、ポリスチレン及びポリエチレンテレフタレートが好ましい。
【００８２】
１つの実施形態では、本発明において行われる合成は、固相合成である。固相合成とは、化学の（合成実験）技法の一つで、分子を粒子上に連結させ、反応試薬の溶液中に入れることで、合成反応を段階的に行う方法である。ビルディングブロック分子は反応可能なすべての官能基を保護される。そしてビルディングブロック分子と反応液分子の想定される反応に関与する相互二つの官能基だけが脱保護されているように制御される。
【００８３】
別の実施形態では、本発明の担体は、合成される前記核酸またはその類縁体の原料（ヌクレオシドやその類縁体、および導入可能な有機化合物(リンカーや色素誘導体など)等）の担持量が約３０〜約８０μｍｏｌ／ｇに調整され、この範囲は、例えば、上限が約７０μｍｏｌ／ｇ、約７５μｍｏｌ／ｇ、約８０μｍｏｌ／ｇ、約８５μｍｏｌ／ｇ、約９０μｍｏｌ／ｇ、約９５μｍｏｌ／ｇ、約１００μｍｏｌ／ｇであってもよく、下限は、約２０μｍｏｌ／ｇ、約２５μｍｏｌ／ｇ、約３０μｍｏｌ／ｇ、約３５μｍｏｌ／ｇ、約４０μｍｏｌ／ｇ、約４５μｍｏｌ／ｇ、約５０μｍｏｌ／ｇであってもよい。
【００８４】
（合成方法）
本発明は、本発明の担体または本発明の核酸もしくはその類縁体の合成機を用いる核酸またはその類縁体の合成方法を提供する。本発明の合成方法において使用される担体または合成機としては、本明細書における（固相合成用無機多孔質体担体）または（核酸または核酸類似体の合成機）において説明した任意の実施形態を利用することができることが理解される。
【００８５】
1つの実施形態では、本発明の核酸またはその類縁体の合成方法では、合成は、固相合成によって行われることが特徴の一つである。本発明の合成方法では、本明細書において他の箇所において説明した任意の方法を含む公知の方法において、担体を置き換えることによって実施することができる。
【００８６】
別の実施形態では、本発明の担体は、合成される核酸またはその類縁体の原料（ヌクレオシドやその類縁体、および導入可能な有機化合物(リンカーや色素誘導体など)等）の担持量が約３０〜約８０μｍｏｌ／ｇに調整される。
【００８７】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものである。
【００８８】
本明細書において、当該分野に知られる標準法によって、例えば自動化ＤＮＡ合成装置（Biosearch、Applied  Biosystems等から市販されるものなど）において支持体を本発明の担体に置き換えて使用することによって、オリゴヌクレオチド等のオリゴマーを合成することも可能である。例えば、Steinら（Stein  et  al.,  1988,  Nucl.  Acids  Res.  16:3209）の方法によって、ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド等のオリゴマーを合成することも可能であるし、調節孔ガラスポリマー支持体（Sarin  et  al.,1988,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:7448-7451）等に記載された方法において、本発明の担体を使用することによって、メチルホスホネート・オリゴヌクレオチド等のオリゴマーを調製することも可能である。
【００８９】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Gait,  M.J.  (1985).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Gait,  M.J.  (1990).  Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Eckstein,  F.  (1991).  Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Adams,  R.L.  et  al.  (1992).  The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,  Chapman  &  Hall;  Shabarova,  Z.  et  al.  (1994).  Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,  Weinheim;  Blackburn,  G.M.  et  al.  (1996).  Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,  Oxford  University  Press;  Hermanson,  G.T.  (I996).  Bioconjugate  Techniques,  Academic  Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００９０】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。「約」との表現は、特に断らない限り、１０％の許容度を有し、測定値である場合は、有効数字または表示されている数字の１桁下の桁を四捨五入して得られる任意の範囲の数値をいう。
【００９１】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００９２】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００９３】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００９４】
以下、本発明に関連する、ヌクレオシド類縁体、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類縁体等のオリゴマーを下記の合成スキームに従って、合成した。これらの合成は実施例において更に詳しく説明する。なお、担体は、下記製造手順によって製造することもでき、担体の製造には、例えば、R.  Miyamoto,  Y.  Ando,  C.  Kurusu,  H.  Bai,  K.  Nakanishi,  M.  Ippommatsu,  J.  Sep.  Sci.  2013,  36(12):  1890-1896に基づいて製造することができる。【００９５】
（実施例１：オリゴ核酸合成用無機多孔質体担体の作製）
１．オリゴ核酸合成用担体作製の概要
固相担体をオリゴ核酸合成に用いるためには、3’末端のヌクレオシドを結合させた担体を作製しなければならない。合成されたオリゴ核酸は、担体から塩基性条件下で切り出される必要があるため、3’末端ヌクレオシドは、一般にエステル結合によって固定化される。オリゴ核酸合成の収量は、担体上に固定化されたヌクレオシドの密度をはじめ、固相表面からの距離などに影響を受けることが知られている。無機多孔質体担体をオリゴ核酸合成に適用可能かどうかを調べるため、粉末化させた無機多孔質体担体の表面修飾から3’末端ヌクレオシドの付加反応までを行い、オリゴ核酸合成用担体としての可能性を調べた。【００９６】
１−１．使用した無機多孔質体担体
表面加工のされていない担体（ｂａｒｅ）と、あらかじめアミノ基が付加された３種類の無機多孔質体担体（ＧＲＡｍｉｎｏ１９１、１９２、１９６）を用いた（表１）。アミノ基には、アミノプロピル基とアミノペンチルアミドプロピル基の２種類に関して検証することとし、ｂａｒｅ担体に関しては、アミノシラン化反応から行った。【００９７】
【表１】
2017119503.tif 000003
【００９８】
（ｂａｒｅ担体の製造）
希釈酢酸水溶液１０ｍＬ（ミリリットル）にポリエチレンオキシド０．８ｇを添加し、氷冷下でテトラメトキシシラン５ｍＬを加えて３０分攪拌し、得られた均一溶液を樹脂製容器に移して４０℃の恒温槽にて２４時間静置してゲル化させ湿潤ゲルを得た。得られたゲルはアンモニア水中に２４時間浸して熟成させた後、蒸留水とアルコール溶液に浸して各々２４時間静置して洗浄し、湿潤ゲルを取り出して自然乾燥させ乾燥ゲルとした。乾燥ゲルは電気炉にて５００℃で熱処理し、ｂａｒｅ担体を得た。【００９９】
（アミノプロピル基等修飾担体の製造）
ｂａｒｅ担体は１００℃の恒温槽内で８時間以上加熱して脱水し、３−アミノプロピルトリエトキシシランを含有するトルエン溶液に浸して８時間加熱還流した。続いてアルコール溶液に処理済み担体を浸して２４時間静置して洗浄し、湿潤ゲルを取り出して自然乾燥させアミノプロピル基等修飾担体とした。【０１００】
１−２．表面修飾の手順
上記無機多孔質体担体に対して行った表面修飾からヌクレオシドの付加反応までの手順をスキーム１に示した。【０１０１】
【化２】
2017119503.tif 000004
反応１：担体表面への一級アミノ基の付加（アミノシラン化）（ｂａｒｅ担体のみ）
反応２：コハク酸の結合
反応３：シラノール基のキャッピング
反応４：３’末端ヌクレオシドの付加【０１０２】
２．表面加工処理
２−１．ｂａｒｅ担体の洗浄とアミノシラン化
オリゴ核酸合成に用いる担体に、極端に微小な粒子が含まれる場合、合成のフィルターが目詰まりする原因にもなる。そのため、そうした不均一な微粒子は、表面加工前に除去する必要がある。ｂａｒｅ担体を下記の条件によって洗浄後、沈殿せずに浮遊している不均一な微粒子を除去した。【０１０３】
（方法：洗浄）
ｂａｒｅ担体（２．９ｇ）を三角フラスコにとり、２Ｍ塩酸水溶液（１００ｍＬ）に懸濁後、極めてゆっくりと約１時間撹拌して微粒子を洗浄した。フラスコを静置した後に上澄み溶液を除去し、浮遊した微小粒子を除去した。続いて水（１００ｍＬ）を加え、静置と溶液除去操作を繰り返した（３回洗浄）。【０１０４】
洗浄と微粒子除去を繰り返し行ったが、浮遊微粒子の存在が収まらず、完全に取り除くことができなかった。４回目の洗浄として水を添加して１６時間放置したが、浮遊微粒子体が確認された。これは、極微小な微粒子が非常に多く初期サンプル中に存在していることを示している。微粒子の完全な除去は断念し、以下の方法で洗浄後のｂａｒｅ担体を乾燥した後にアミノシラン化修飾（反応１）を行った。【０１０５】
（方法：アミノシラン化（反応１））
洗浄した担体を減圧下でろ取し（水、メタノールで洗浄）、乾燥（４０℃、６０℃、８０℃、各２時間）させた。この際、減圧下での乾燥を試みたが、微粒子が存在して減圧乾燥が困難であった。そのため、１６時間風乾した後、１００℃で２時間さらに乾燥させた。【０１０６】
乾燥させた担体（１．４１ｇ）にトルエン（４０ｍＬ）と３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＭＷ．２２１．３７，ｄ＝０．９４６ｇ／ｍＬ，１０ｍＬ）を加え、１１０℃で還流させた（１０時間）。続いて減圧ろ過し、トルエン、クロロホルムを用いてそれぞれ３回洗浄した後に風乾し、続いて減圧下で数時間乾燥させた。担体の一部を採取してニンヒドリン発色検査を行ったところ、紺色を呈したことからアミノ基が付加されたことを確認した（修飾前のｂａｒｅ担体では無色であった）。【０１０７】
ここで光学顕微鏡を用いて担体の粒子状態を観察した（図１）。洗浄前のｂａｒｅ担体と、アミノシラン化後の粒子状態を比較したところ、洗浄前のｂａｒｅ担体には大きな粒子に加えて極微小の微粒子が存在し、加えて大きな粒子の形状も不均一であることが確認された。また、アミノシラン化された担体は、極微小の粒子の比率が多くなった。理論に束縛されることを望まないが、これは、還流環境下において担体が粉砕されたことが原因と考えている。【０１０８】
２−２．コハク酸の結合
表面にアミノ基を付加した担体に対し、無水コハク酸との結合反応を行った。本ステップは、表１に示した４種類の各粉末化無機多孔質体担体に対して行った。【０１０９】
（方法：コハク酸処理（反応２））
担体（１．４〜２ｇ）に水（６０ｍＬ）および無水コハク酸（２ｇ）を添加した。本来は溶液をゆっくり撹拌させた懸濁溶液に対して無水コハク酸を添加するが、上記の通り無機多孔質体担体は物理的衝撃に極めて弱いことが示唆されたために、撹拌せずに反応容器を優しく揺らし反応を行った（室温下、約３０分に一度、容器を手動で撹拌）。続けて２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加えて反応液をｐＨ４〜５に維持し、３時間後に無水コハク酸（１ｇ）と２Ｍ水酸化ナトリウムを追加した。７時間反応を行った後、担体を減圧下でろ取し、水およびメタノールで洗浄（それぞれ３回）し、得られた担体を風乾した。続いて、担体を減圧下７０℃で２時間、常圧下で８０℃、２時間乾燥させた後、担体の一部を用いてニンヒドリン発色試験を行い、一級アミノ基が担体上に無いことを確認した。【０１１０】
２−３．シラノール基のキャッピング
表面にカルボキシル基が形成された担体には未反応のシラノール基が残存している。これらは水素結合が可能であると共に、酸性を有するためにアミダイト体の担体上における反応を阻害して核酸合成の収量を下げる可能性がある。そこで未反応のシラノール基をキャッピングして不活性化させる処理を行った。本ステップは全ての担体に関して行った。【０１１１】
（方法：キャッピング（反応３））
無機多孔質体担体（１〜２ｇ）を無水ピリジン（５０ｍＬ）中に懸濁し、クロロトリメチルシラン（５ｍＬ）を加え室温下で優しく揺らした。２時間後、粉末を減圧下ろ取し（ピリジン、クロロホルムで各３回洗浄）、風乾した。さらに、室温で減圧乾燥（２時間）後にキャッピングされた無機多孔質体担体を回収した。【０１１２】
３．無機多孔質体担体へのヌクレオシドの付加
３−１．３’末端ヌクレオシド付加（縮合）反応の条件検討
続いて、無機多孔質体担体へのデオキシヌクレオシドモノマー付加反応について、縮合反応の至適条件を明らかにするため、ｂａｒｅ担体より調製したコハク酸修飾担体を用いて検討を行った（スキーム２）。ヌクレオシドモノマーには５’位水酸基がジメトキシトリチル基（ＤＭＴ基またはＤＭＴｒ基）で保護されたデオキシチミジンを用い、脱水縮合剤として通常のcontrolled  pore  glass（ＣＰＧ）樹脂の修飾反応で一般的に利用されている１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）（Damha,  M,  J.,  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  1990,  18,  3813-3821;  Walsh,  A.  J.,  et  al.,  Tetrahedron  Lett.  1997,  38,  1651-1654.）、およびペプチド縮合剤として汎用されているＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢＯＰ）を用い反応を行った（Kim,  M.  H.,  and  Patel,  D.  V.  Tetrahedron  Lett.  1994,  35,  5603-5606；  Albericio,  F.,  Bofill,  et  al.,  J.  Org.  Chem.  1998,  63,  9678-9683;  Pon,  R.  T.,  and  Yu,  S.  Tetrahedron  Lett.  1997,  38,  3331-3334;  Pon,  R.  T.,  et  al.,  Bioconjugate  Chem.  1999,  10,  1051-1057）。反応後、得られた修飾担体のヌクレオシド担持量を比較することで縮合効率を評価した【０１１３】
【化３】
2017119503.tif 000005
【０１１４】
（方法：ヌクレオシドの付加（反応４））
各縮合反応には容量５ｍＬのガラスバイアル瓶を用い、コハク酸修飾無機多孔質体担体（ｂａｒｅ担体より調製したもの）、５’−ジメトキシトリチルデオキシチミジン（５’−ＤＭＴ−ｄＴ（５’−ＤＭＴｒ−ｄＴとも称する））、および縮合剤等に溶媒を加えてキャップした後、振盪機を用いてバイアル瓶ごと室温で穏やかに振盪して行った。なおｂａｒｅ担体より調製した上記無機多孔質体担体では、アミノ基あるいはカルボキシル基の担持量を測定していないため、担持量を１００μｍｏｌ／ｇ程度と仮定して等量等を算出した。一定時間振盪した後、桐山ロートを用いて無機多孔質体担体をろ取し、さらにピリジンおよびジクロロメタンで担体を洗浄した。得られた修飾無機多孔質体担体（ｄＴ化無機多孔質体担体）は、減圧下、室温で４時間乾燥した後、担体に結合したデオキシチミジン由来のＤＭＴ基（ＤＭＴｒ基とも称する）を定量することで、ヌクレオシド担持量を求めた。以下検討を実施した縮合反応条件を示す。【０１１５】
【表２】
2017119503.tif 000006
【０１１６】
【表３】
2017119503.tif 000007
【０１１７】
【表４】
2017119503.tif 000008
【０１１８】
【表５】
2017119503.tif 000009
【０１１９】
（ヌクレオシド担持量の測定）
ヌクレオシド縮合反応（反応４）終了後、乾燥したヌクレオシド付加無機多孔質体担体（ｄＴ化担体）（約１０  ｍｇ）をメスフラスコに正確に量りとり、過塩素酸（７０％水溶液）−エタノールの混合溶液（３：２）１０．０ｍＬを加え、ジメトキシトリチルカチオン（ＤＭＴ＋，モル吸光係数：ε５００＝７１，７００）を脱離させた。この溶液を上記混合溶液でさらに１０倍に希釈した後、５００ｎｍにおける吸光度を測定することで、ヌクレオシド担持量（μｍｏｌ／ｇ）を算出した（スキーム３）。ヌクレオシド担持量の測定例として反応条件１の結果を図２に示す。【０１２０】
【化４】
2017119503.tif 000010
【０１２１】
（縮合反応の結果）
条件検討における各反応の担体収量、およびヌクレオシド担持量を表６に示す。【０１２２】
【表６】
2017119503.tif 000011
【０１２３】
縮合剤としてＰｙＢＯＰ（縮合条件３および４）を用いた時に、最も高いヌクレオシド担持量が得られた。反応時間の延長（２時間から２４時間）により担持量は僅かに増加したが、２時間の処理でも十分な担持量が得られることが分かった（縮合条件３）。縮合剤としてＨＢＴＵを用いた場合では、僅かながらヌクレオシド担持量の減少が確認された（縮合条件２）。一方、ＣＰＧ担体の修飾反応で汎用されているＥＤＣを用いた条件では、２４時間の処理でも担持量はＰｙＢＯＰと比べ３／４程度であった（縮合条件１）。これらの結果より、無機多孔質体担体へのヌクレオシド付加反応にはＰｙＢＯＰが適していることが示された。【０１２４】
なお、いずれの反応においても、得られたヌクレオシド修飾無機多孔質体担体の収量が、反応開始時よりも減少していた。理論に束縛されることを望まないが、これは、本反応に用いた無機多孔質体担体の形状が非常に細かい微粒子状であり、ろ過回収時に無機多孔質体担体微粒子が濾紙に吸着したためであると推測される。【０１２５】
３−２．ヌクレオシド付加無機多孔質体担体の調製
上記条件検討により、ヌクレオシド付加反応の至適条件を見出したので、本条件を用いて４種類の無機多孔質体担体の修飾反応を行った（表７）。なお、前述したように、ｂａｒｅ担体より調製したカルボキシル基修飾無機多孔質体担体は、非常に細かい微粒子状であったが、ＧＲＡｍｉｎｏ１９１、１９２、１９６担体は粒子径が６３〜２１２μｍに揃えられた無機多孔質体担体を用いた。【０１２６】
【表７】
2017119503.tif 000012
【０１２７】
４．まとめ
先ず、ｂａｒｅ担体より調整した無機多孔質体担体では、７２．３μｍｏｌ／ｇと高いヌクレオシド担持量を有する担体を作製することが出来た（縮合反応１）。通常のガラス樹脂（ＣＰＧ樹脂）から作製される担体でのヌクレオシド担持量は、およそ２５〜４０μｍｏｌ／ｇであるので、無機多孔質体担体では１．８倍〜３倍高い担持量を有する担体を作製できることが明らかとなった。アミノプロピル基が高密度で導入されている無機多孔質体担体（ＧＲＡｍｉｎｏ１９１、縮合反応２および３）においても、ヌクレオシド担持量は６８〜７６μｍｏｌ／ｇであり、ｂａｒｅ担体から誘導したものと同等の担持量を有する担体を得ることができた。しかしながらこの値は、縮合反応前のアミノプロピル基の担持量（２７０μｍｏｌ／ｇ）と比較すると、修飾率が２５〜２８％と非常に低収率であった。一方、中密度のアミノプロピル基修飾無機多孔質体担体（ＧＲＡｍｉｎｏ１９２、縮合反応４および５）では、ヌクレオシド担持量５５〜５７μｍｏｌ／ｇを有する修飾担体を得た。この値はＧＲＡｍｉｎｏ１９１担体での担持量と比較すると僅かに減少しているものの、修飾前のアミノプロピル基の担持量（８７μｍｏｌ／ｇ）と比較すると修飾率が６４〜６６％であり、ＧＲＡｍｉｎｏ１９２担体では高い効率で担体表面での縮合反応が進行したことが分かった。理論に束縛されることを望まないが、このような担体表面の修飾密度の増加に伴うヌクレオシド縮合効率の低下は、無機多孔質体担体表面上での立体的な阻害効果が関与していると推測される。すなわち、低〜中密度の無機多孔質体担体では、縮合反応時に担体表面上での近接するカルボキシル基（アミノ基をコハク酸化したもの）間の影響が少ないため、効率的にヌクレオシド縮合反応が進行すると考えられる（スキーム４）。【０１２８】
【化５】
2017119503.tif 000013
【０１２９】
しかし、高密度で修飾された担体では、近接するカルボキシル基の立体的な嵩高さにより、ヌクレオシドモノマーとの縮合反応が阻害されたと考えられる（スキーム５）。【０１３０】
【化６】
2017119503.tif 000014
【０１３１】
これらの結果より、無機多孔質体担体へのヌクレオシド付加反応は、担持量が５０〜７５μｍｏｌ／ｇ程度が最大反応量であり、アミノ基（あるいはカルボキシル基）が高密度に導入された担体（＞１００μｍｏｌ／ｇ）を用いても、ヌクレオシド付加量は増加しないことが示唆された。【０１３２】
一方、アミノペンチルアミドプロピル基により修飾された無機多孔質体担体の修飾反応（ＧＲＡｍｉｎｏ１９６、縮合反応６）では、アミノプロピル基修飾無機多孔質体担体の結果（縮合反応４および５）と比較して大きな差異は観察されず、良好なヌクレオシド担持量（５４．２μｍｏｌ／ｇ、修飾率５４％）を有する担体を得た。理論に束縛されることを望まないが、この結果は、無機多孔質体担体に導入するアミノ基の鎖長は、ヌクレオシドモノマー導入には大きく影響しないことを示している。【０１３３】
ところで、無機多孔質体担体は摩擦等の物理的刺激により容易に破砕し、その結果、微粒子状の担体が生じることが明らかとなっている。このような微細な担体の混入は、オリゴヌクレオチド等のオリゴマーの合成時にフィルターの目詰まりの原因となる。そこで、無機多孔質体担体の破砕を抑えるために、手動で穏やかに撹拌する方法（撹拌条件Ａ）、および振盪機を用いて穏やかに撹拌する方法（撹拌条件Ｂ）の２つの撹拌方法について縮合反応を行った。その結果、手動で撹拌する方法（撹拌条件Ａ）では、担体の粉砕はほとんど観察されずほぼ定量的に修飾担体を回収出来ることが分かった。一方、振盪機を用いて撹拌する方法（撹拌条件Ｂ）では、僅かではあるが反応溶液に懸濁が生じ、担体の部分的な粉砕が示唆された。そこで撹拌条件Ｂでは、無機多孔質体担体を回収する前に懸濁溶液部分を除去・洗浄することで生じた微粒子を除いている。そのため修飾担体の回収量（担体収量）は、僅かに減少している。なお、撹拌条件Ｂで行った縮合反応の方が、僅かに高いヌクレオシド担持量が得られている。【０１３４】
（実施例２：担体の評価）
合成テストを行い、得られた核酸の収量をリファレンスとなるＣＰＧでの合成と比較した。合成テストは以下の手順で行った。
１．実施例１の方法、あるいはあらかじめ作製しておいたヌクレオシド−コハク酸結合体をメタノール中で反応させ一段階で作製する方法で作製した（以下を参照）したオリゴ核酸合成用無機多孔質体担体を用い、合成機ｎＳ−８により、２４塩基のＲＮＡを合成した（０．１Ｍ  ＲＮＡ（ＴＢＤＭＳ）アミダイト／ＭｅＣＮ）（ＴＢＤＭＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）。
２．合成後、２８％アンモニア水／４０％メチルアミン水溶液＝１／１（以下、ＡＭＡと略）  １ｍＬ、室温２ｈで担体からオリゴマー（この場合、オリゴヌクレオチド）の切出しを行い、５０％エタノールでカラムの洗浄を行った。
３．溶液をＳｐｅｅｄＶａｃＴＭにより乾固させた後、２’位の脱保護を３ＨＦ・ＴＥＡ／ＴＥＡ／ＤＭＳＯの混合溶液０．３ｍＬ中６５℃１．５時間または５５℃１７時間行い、そのまま室温まで冷却した後、イソプロパノール沈殿を行った。
４．サンプルを乾燥させた後、２．０Ｍトリエチルアミン−酢酸緩衝液（ＴＥＡＡ）に溶解し、吸光度（Ａｂｓ）と液体クロマトグラフィー（ＬＣ）の測定を行った。【０１３５】
（一段階作製法）
上述したあらかじめ作製しておいたヌクレオチド−コハク酸結合体をメタノール中で反応させ一段階で作製する方法は以下のとおりである。【０１３６】
（１）ヌクレオシド−コハク酸結合体（ＤＭＴ−ｄＴ−Ｓｕｃ）の合成
ＤＭＴ−ｄＴ８４５ｍｇ（１．５５ｍｍｏｌ）、無水コハク酸２８２ｍｇ（２．８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン４８０μｌをジクロロメタン（１０ｍｌ）中で撹拌しながら１７時間反応した。反応液をトリエチルアミン−リン酸緩衝液で分液した後水層をジクロロメタンで洗浄した。集めた有機層に硫酸ナトリウムを加え乾燥した後濃縮乾固し白色固体を得た。収量９２１ｍｇ、収率９２．１％。【０１３７】
（２）アミノシラン化無機多孔質体担体とＤＭＴ−ｄＴ−Ｓｕｃの反応
ＤＭＴ−ｄＴ−Ｓｕｃおよび縮合剤4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ）のメタノール溶液（それぞれ０．１Ｍ）を１：２で混合したものを無機多孔質体担体に加え浸漬、振とうして１７時間反応した。その際ＤＭＴ−ｄＴの仕込み量は無機多孔質体担体のアミノ基量に対して０．４から３当量の間とした。反応終了後、担体をメタノールおよびアセトニトリルで洗浄した後、減圧乾燥してＤＭＴ−ｄＴ修飾無機多孔質体担体を得た。担体へのＤＭＴ−ｄＴ担持量は過塩素酸とエタノールの混合液を用いたトリチル基の定量により決定した。【０１３８】
（結果）
・ペレット状サンプル
以下に検討したペレット型無機多孔質体担体について結果を示す。それぞれのカラム種類は以下のスキーム６に示したリンカー構造と対応している。表８の中でリファレンスのＣＰＧを超える値を示した項目に関してグレー表示で示した。【０１３９】
【化７】
2017119503.tif 000015
【０１４０】
【表８】
2017119503.tif 000016
【０１４１】
上記データから、以下の点について確認できた。
・ポアサイズ、特にマクロポアが小さいものでは収量が低い場合が多い（例：ＧＲＡｍｉｎｏ１３、１５など）
・リンカー種類に関しては短いもの（リンカー１）より長いもの（リンカー２）で収量が高くなっており、１μｍｏｌ当たりでＣＰＧよりも高いものもあった。しかし、リンカー２の担体ではＤＭＴ−ｄＴ担持量が低いものが多いためこのデータのみからは原因の特定は困難であった。【０１４２】
ペレット状の担体では、各ロットでの制作上のばらつきが大きく、場合によっては同一ロットにおいても結果にばらつきが見られた。均一な状態での評価を行う必要と、将来的に作製した担体の品質保証や取扱の簡便さなどを考慮して、無機多孔質体担体を粉砕した粉末状の担体を使用して検討を行ってゆく方向に変更した。【０１４３】
・粒子型サンプル
粒子型無機多孔質体は、一体型無機多孔質体をスプレードライ法、Ｗ／Ｏエマルジョンによる方法、乳鉢や粉砕機等を用いた衝撃や加圧による粉砕などの方法で粉砕することにより、製造する。【０１４４】
粒子型担体についてはポアサイズ、粒子径、リンカーの種類などについて検討を行った。検討の結果を表９に示した。表８と同じくＣＰＧを超える値を示したものをグレー表示で示した。【０１４５】
【表９】
2017119503.tif 000017
【０１４６】
メソポアサイズはペレット型の５０ｎｍよりも１００ｎｍがそれ以下のものよりも良いと考えられ、このポアサイズはＣＰＧのポアサイズと近い。【０１４７】
粒子径についてはＧＲＡｍｉｎｏ９５−９６、ＧＲＡｍｉｎｏ１２５−１３１にていくつかの粒径で検討したが、それほど大きな結果の差は見られなかった。通液が阻害されない粒子径であれば合成可能であった。【０１４８】
リンカー種類の検討では、短いリンカー１よりも比較的長いリンカー２や５のほうが若干収量が良い傾向があった。特にＧＲＡｍｉｎｏ１２２で高い収量を示した。【０１４９】
以上から担体ポアサイズと粒子径をＣＰＧと同等になるように作製して以下の検討を実施した。【０１５０】
・アミノ基担持量を変化させた検討
担持量と収量の相関についてより詳細に考察を行うため、同一のポアサイズ（１．７μｍ、１００ｎｍ）、粒子径（１００〜１５０ｎｍ）を有する粒子型無機多孔質体に異なる担持量でアミノ基を修飾したものを使用して検討を行った。リンカーは１及び５の構造のもので検討した。（一部の担体はトリチル量測定まで実施）。結果を表１０に示した。【０１５１】
【表１０】
2017119503.tif 000018
【０１５２】
ＤＭＴ−ｄＴ担持量が多い場合に（８０μｍｏｌ／ｇ〜）収量が減少する傾向が見られた。リンカーが長い短いにかかわらず同じ傾向であった。【０１５３】
リンカー５を修飾した担体のほうが、リンカー１の担体よりも良い収量を示した。【０１５４】
ＤＭＴ−ｄＴ担持量が収量に対して大きな影響を与えており、高すぎる担持量は収量低下を招くこと、それに加えてリンカー長の寄与も存在することが分かった。【０１５５】
ｂａｒｅ担体より作製したサンプルの通液テスト
ｂａｒｅ担体から作製したＤＭＴ−ｄＴ修飾担体については、作製過程での撹拌などにより粒子がかなり細かくなっていた。そのため合成過程で背圧が高くなってしまう可能性があることから、通液テストを行った。【０１５６】
通液テスト
−条件−
合成機ｎＳ−８用１μｍｏｌ合成用カラムに担体を入れて、アセトニトリルを通液し時間を計測した。
担体はＡＩＳＴ−０３  （担持量７２．３μｍｏｌ／ｇ）  を使用し，以下の条件でテストを行った（ＬＣＡＡ  ＣＰＧはＰｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓの担体にアセチルキャップ処理を行って使用した）。
サンプル１：AIST-03  1μmol分(13.8mg)
サンプル２：AIST-03  1μmol分(13.8mg)  通常のフィルターの手前にろ紙を挟む(図４参照)
サンプル３：AIST-03  1μmol分(13.8mg)にキャップ処理を行ったLCAA  CPG13mgを混合したもの
サンプル４：AIST-03  1μmol分(13.8mg)にキャップ処理を行ったLCAA  CPG26mgを混合したもの
実際のろ紙の挿入の代表例は、図４に示す。
-  通液テスト結果【０１５７】
【表１１】
2017119503.tif 000019
【０１５８】
フィルターの手前にろ紙を挟んだ場合には通液にかかる時間は少しだけ短縮した（サンプル２）。【０１５９】
LCAA  CPGを加えた場合には重量比で倍量加えた場合（サンプル４）に通液時間は元の2/3となった。【０１６０】
主観ではあるが、通液により粒子がフィルターに詰まるというよりはカラム上方に押し付けられ隙間がなくなり背圧上昇、流速低下となっているように見受けられた。【０１６１】
今回の担体に大きな粒子を混ぜ込む事自体は効果があると考えられるが、混ぜ込む比率を多くすればするほど見かけのｄT担持量が下がってしまう問題点がある。【０１６２】
合成テスト
上記サンプルのろ紙を挟んだカラムにて合成を検討する。配列、合成条件などはこれまで行ってきたテストと同じである(24mer  siRNA、TBSアミダイト使用)（TBS：tert-ブチルジメチルシリル）。【０１６３】
ＤＭＴ−ｄＴ担持量を変化させた担体の合成テスト
同じロットの担体で以下に示したように、異なる仕込み量で担体修飾を行い、比較を行った。合成、後処理についてはこれまでと同様に行った。
アミノプロピル基導入の場合（１９１、１９２）
ＧＲＡｍｉｎｏ１９１（アミノ基担持量  ２７０μｍｏｌ／ｇ）
ＧＲＡｍｉｎｏ１９２（アミノ基担持量  ８７μｍｏｌ／ｇ）
作製した担体のＤＭＴ−ｄＴ担持量
１９１Ａ  ７６．２  μｍｏｌ／ｇ
１９２Ａ  ５７．０μｍｏｌ／ｇ
１９１Ｂ  （３ｅｑ．）  １２４．６  μｍｏｌ／ｇ
１９２Ｂ１  （３ｅｑ．）  ９５．４  μｍｏｌ／ｇ
１９２Ｂ２  （０．７ｅｑ．）  ５２．９  μｍｏｌ／ｇ
１９２Ｂ３  （０．４ｅｑ．）  ２４．３  μｍｏl/g
本実施例で言う仕込み比率は表面に存在するアミノ基量に対するＤＭＴ−ｄＴ−ｓｕｃの添加量をいう。３ｅｑであればアミノ基に対して３倍量（過剰）のＤＭｔ−ｄＴ−ｓｕｃを添加した。担持量はアミノ基の混みあい具合に由来すると思われる反応性の違いによりロットごとに差が生じ得る。【０１６４】
【表１２】
2017119503.tif 000020
【０１６５】
１９２Ａ、１９２Ｂ２、１９２Ｂ３において比較対象のＣＰＧと同等の収量を得た。これらは担持量が低めになっている担体であり、ほかの高担持量単体では収量は減少傾向にある。【０１６６】
これまで行ってきた検討と同様に担持量が上昇するほど収量が低下する結果を示している。このことからポアサイズが１００ｎｍでは担持量の限界が約５０〜約７０μｍｏｌ／ｇ付近にあることが示唆された。縮合効率については全ての担体でＣＰＧと同等の値を示した。図３に粗収量をＤＭＴ−ｄＴ担持量に対してプロットしたグラフを示す。【０１６７】
リンカー延長担体（１９６）
仕込み比率を３当量、０．７当量、０．４当量、０．３当量と変化させて行った。【０１６８】
合成テスト、後処理についてはこれまでと同様の方法で行った。【０１６９】
作製した担体のＤＭＴ−ｄＴ担持量
１９６Ａ  ５４．２μｍｏｌ／ｇ
１９２Ｂ１  （３ｅｑ．）  １０７．６μｍｏｌ／ｇ
１９２Ｂ２  （０．７ｅｑ．）  ４５．７μｍｏｌ／ｇ
１９２Ｂ３  （０．４ｅｑ．）  ３７．９μｍｏｌ／ｇ
１９２Ｂ４  （０．３ｅｑ．）  ２９．６μｍｏｌ／ｇ
いずれの製造所でも同様の製法で作製した。【０１７０】
【表１３】
2017119503.tif 000021
【０１７１】
前項の１９１、１９２の場合と比較して、同じ当量の仕込みでＤＭＴ−ｄＴの導入量が少し低くなっている。【０１７２】
合成テストの結果、１９６Ｂ１で収量が低かったが、それ以外のもの（担持量は約３０〜約６０付近）ではＣＰＧと同等かそれ以上の収量となった。特に１９６Ａで単位重量、単位体積あたりの収量も高い結果となっている。また、平均縮合効率については全てＣＰＧの場合と同程度となった。【０１７３】
リンカー延長の有無での検討結果を総合すると、リンカーの有無の影響は存在するが、表面の混みあいの度合いの方が収率に大きな影響を及ぼすことが分かった。【０１７４】
適切な担持量の担体を調整することでＣＰＧを超える収量でオリゴマーを得ることができ、特に担体の担持量が約５０〜約７０の時に単位体積あたりでＣＰＧの２倍以上の収量となった。【０１７５】
まとめ
ＣＰＧ担体とは異なる空孔の様式を有する無機多孔質体担体を使用してＲＮＡの合成テストを行い評価した。【０１７６】
空孔サイズ、リンカー種類、無機多孔質体担体に担持する１塩基目のヌクレオシドの担持量など種々のパラメーターの最適化検討を行い、ヌクレオシド担持量は約５０〜約７０μｍｏｌ／ｇ付近が収量よく生成物を得ることができる上限であり、それ以上の担持量にすると収量の減少を招くことがわかった。また、担体粒子とヌクレオシドを結ぶリンカーの長さは担持量ほど大きな影響は及ぼさないものの、延長を行った場合のほうが高い収率で生成物を得られることがわかった。例えば、リンカーの長さが短い担体（リンカー１）で１塩基目担持量５２．９μｍｏｌ／ｇの担体では核酸粗収量２．６２ｍｇ／μｍｏｌ、担体１ｇ当たりの収量１３８．６ｍｇ、リンカーの長い担体（リンカー５）で１塩基目担持量５２．９μｍｏｌ／ｇの担体では核酸粗収量２．８８ｍｇ／μｍｏｌ、担体１ｇ当たりの収量１５６．１ｍｇ  となった。ＣＰＧ  （担持量２８μｍｏｌ／ｇ、粗収量２．４７ｍｇ／μｍｏｌ、担体１ｇ当たりの収量６９．２ｍｇ）とμｍｏｌ当たり収量では同等以上、単位重量当たりの収量でも上回る結果となった。種々のパラメーターを最適化した担体では単位重量当たりの収量がＣＰＧの場合の２倍以上となっていた。【０１７７】
以下参考文献を示すが、本明細書において必要な情報を参照するために用いるものであって、この記載は、本発明に対する先行技術を示すものではなく、本発明が公知又は容易に想到し得たことを認めるものではないことを付言する。【０１７８】
（参考文献）
Damha,  M,  J.,  Giannaris,  P.  A.,  Zabarylo,  S.  V.  An  improved  procedure  for  derivatization  of  controlled-pore  glass  beads  for  solid-phase  oligonucleotide  synthesis.  Nucleic  Acids  Res.  1990,  18,  3813-3821.
Walsh,  A.  J.,  Clark,  G.  C.,  and  Fraser,  W.  A  direct  and  efficient  method  for  derivatisation  of  solid  supports  for  oligonucleotide  synthesis.  Tetrahedron  Lett.  1997,  38,  1651-1654.
Kim,  M.  H.,  and  Patel,  D.  V.  “BOP”  as  a  reagent  for  mild  and  efficient  preparation  of  esters.  Tetrahedron  Lett.  1994,  35,  5603-5606.
Albericio,  F.,  Bofill,  J.  M.,  Elfaham,  A.,  and  Kates,  S.  A.  Use  of  onium  salt-based  coupling  reagents  in  peptide  synthesis.  J.  Org.  Chem.  1998,  63,  9678-9683.
Pon,  R.  T.,  and  Yu,  S.  Rapid  automated  derivatization  of  solid-phase  supports  for  oligonucleotide  synthesis  using  uronium  or  phosphonium  coupling  reagents.  Tetrahedron  Lett.  1997,  38,  3331-3334.
Pon,  R.  T.,  Yu,  S.,  Sanghvi,  Y.  S.  Rapid  esterification  of  nucleosides  to  solid-phase  supports  for  oligonucleotide  synthesis  using  uranium  and  phosphonium  coupling  reagents.  Bioconjugate  Chem.  1999,  10,  1051-1057。【０１７９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は2016年1月8日に日本国に出願した特願2016-2834に対して優先権を主張するものであり、その内容はその全体が本明細書において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明は、核酸またはその類縁体の製造に関する産業において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2017119503.tif 000028
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