(57)【要約】  分子標的医薬に対して特異的に結合し得るＤＮＡアプタマー、該ＤＮＡアプタマーを含む組成物及び当該ＤＮＡアプタマーを用いる分子標的医薬の検出方法を提供することを課題とする。  分子標的医薬に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマー、当該ＤＮＡアプタマーを含む、分子標的医薬の検出用組成物、分子標的医薬の検出用キット、当該ＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とする、分子標的医薬の検出方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子標的医薬に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマー。
【請求項２】
分子標的医薬に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマーのヌクレオチド配列において、１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列を有することを特徴とするＤＮＡアプタマー。
【請求項３】
分子標的医薬に対して特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、
５’−Ｐ１−Ｘ−Ｐ２−３’
で表されるヌクレオチド配列を有し、ここで、
Ｘは、分子標的医薬に対して特異的に結合するヌクレオチド配列、又は当該配列から選択されるヌクレオチド配列において１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列であり、
Ｐ１及びＰ２は、ＰＣＲ増幅のために導入された第１及び第２プライマー認識配列である
該ＤＮＡアプタマー。
【請求項４】
Ｐ１は、配列番号２で示される第１プライマー認識配列であり、及び
Ｐ２は、配列番号３で示される第２プライマー認識配列である、請求項３に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項５】
糖鎖部分での化学的置換、リン酸エステル部分での化学的置換及び核酸塩基部分での化学的置換から成る群より選択される、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１〜４のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項６】
５’末端又は３’末端に蛍光標識を有する、請求項１〜５のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項７】
前記蛍光標識が、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、蛍光たんぱく質、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、ＰＣ５、ＰＣ７、Ｃｙ色素、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴｅｘａｓＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、  ＳＰＲＤ、  テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ１１０、ｍＣ１Ｂ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＣＦＳＥ、ＪＣ−１、ＰＫＨ、ＤＣＦＨ−ＤＡ、ＤＨＲ、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、ａｃｒｉｄｉｎｅ（Ａｃｄ）、ｄａｎｓｙｌ（Ｄｎｓ）、７−ジメチルアミノクマリン−４−アセティックアシッド（ＤＭＡＣＡ）、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホニックアシッド（ＥＤＡＮＳ）、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン９から選ばれる一種以上である、請求項６に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項８】
前記蛍光標識が量子ドットである請求項６記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項９】
５’末端又は３’末端を蛍光標識された請求項１〜８のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーが金属ナノ粒子表面に吸着されているＤＮＡアプタマー。
【請求項１０】
前記金属ナノ粒子に用いられる金属が金、銀、銅、鉄または珪素である請求項９記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項１１】
分子標的医薬がベバシズマブであり、分子標的医薬に特異的に結合する配列が配列番号１で表される請求項１〜１０記載のアプタマー。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含む、分子標的医薬の検出用組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含む、分子標的医薬の検出用キット。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とする、分子標的医薬の検出方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡアプタマーを血液、血清、血漿、唾液、及び喀痰よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料とＤＮＡアプタマーとの結合による応答を観測することによって分子標的医薬の存在を検出する工程を含む、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記応答が、蛍光応答である、請求項１５に記載の検出方法。
【請求項１７】
前記応答が、ラマン散乱応答である、請求項１５に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子標的医薬に対して特異的に結合し得るＤＮＡアプタマー、該ＤＮＡアプタマーを含む組成物及び当該ＤＮＡアプタマーを用いる分子標的医薬の検出方法を提供することを課題とする。
【背景技術】
【０００２】
がんは疾患による死因として依然として高い比率を占めており、がんの治療に対し多くの分子標的薬が開発されている。これら治療に用いられる抗がん剤の使用効果については、診断時の抗がん剤血中濃度を測定することで高めることができる。このように薬剤の血中滞留状態を知ることは医学、生物学を含む学際領域の最も重要な課題である。【０００３】
タンパク質は特定の立体構造を有し、その構造が特異性を発現している。特に抗体タンパク質のFab部の立体構造は生体内で特定抗原の検出には必須の構造であり、抗体反応の一翼を担うものである。近年これら抗体タンパク質の特異的認識能に着目した分子標的薬の開発が急速に進み、がん患者の５年生存率を飛躍的に向上させている。例えば、抗体分子標的薬の１つであるベバシズマブ(bevacizumab)は、アバスチンの商品名で販売されており、血管新生を阻害することによりがんの増殖速度を低下させる特徴を有する。がん細胞は一般に正常細胞に比べ細胞増殖を活発に行うため正常細胞より栄養や酸素を必要とし、がん組織周辺に血管をつくる。血管新生には血管内皮細胞増殖因子（VEGF）が必要であるが、ベバシズマブはこの血管内皮細胞増殖因子を阻害する効果がある。このようにベバシズマブはがん細胞周辺の血管新生を阻害し、がん細胞に対する栄養を遮断することでがん細胞の増殖を阻害するものである。よってベバシズマブはがん細胞に対する毒性はなく、他の抗がん剤と併用できるなどのメリットがあり、広くがん治療薬として用いられている。ベバシズマブは、結腸がん・直腸がん・非小細胞肺がん・卵巣がん・乳がんの治療に用いられている（例えば、非特許文献１及び２）。【０００４】
治療における血中ベバシズマブ濃度の測定には抗体免疫法が用いられるが、操作が非常に煩雑であること、また検査キットが高価であるため頻繁に行うことはできないという欠点を有している。【０００５】
一本鎖核酸はその塩基配列により様々な立体的構造をとるため、特定の抗原に対して親和性を有する塩基構造を見出すことができる。これら目的とするターゲットに対して特異的に吸着する核酸をアプタマーという。新規のアプタマーの探索には試験管内進化法（ＩＮ ＶＩＴＲＯ ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ法）が最も有効な手段として用いられている。特にＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ of Ｌｉｇａｎｄｓ by Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法は大きく分けて目的核酸分子の選別と選別されたアプタマーの増幅の2ステップがある。（例えば特許文献１）。目的核酸分子の選別と増幅を選択性を高めながら繰り返すことにより、高い親和性を有する核酸断片が得られる。さらに、近年では様々な改良が加えられ、より少ないサイクル回数でアプタマーを回収できる、効率・選択性において優れた手法や、低分子やタンパク質だけでなく細胞や組織（正確には、表面に存在する分子）に結合するアプタマーを得る手法（Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法；例えば、非特許文献３）などが報告されている。この手法は従来のSELEX法に比べ、たんぱく質の解析が不要であること、細胞表面に存在する様々な膜たんぱく質のアプタマーを同時に選別できること、さらに、目的細胞とより特異的に結合するアプタマーを選抜できると言った特徴がある。これらアプタマーは従来診断、治療に用いられてきた抗体の特性でもあるターゲットに対する高親和性や特異性は言うまでも無く、化学的に短時間で合成することが可能であり、さらにその分子修飾に関しても安価に行うことができ、作用機序が単純で、免疫原性もほとんどないという、抗体にはない利点がある。【０００６】
細胞以外でも例えば抗体タンパク質に対し親和性を有する核酸配列を見出すこともProtein A beads(Thermosicentific  社製)  磁性粒子を用いることで容易に行うことができる。見出された抗体に親和性を有するアプタマーを診断、検査に用いる場合はその末端に蛍光色素を導入し、蛍光顕微鏡での検出が多く用いられる（例えば非特許文献２）。【０００７】
がん内科的治療においては、抗がん剤の併用が効果的である場合がある。ここで、分子標的薬以外の２剤併用治療はそれまでの治療に比べ優れた成績を上げていたが、どの組み合わせも同等な成績であり、治療成績は頭打ちとなったのに対して、分子標的薬等の抗体医薬は画期的な成績を挙げた。日本における分子標的薬の第一号はイレッサ（ゲフェチニブ）で劇的な治療成績を挙げた症例があるにも関わらず、統計的な効果は示されなかったが、非喫煙者、腺がん患者に対しては比較的効果が高いとされてきた。２００９年にアリタムが認可され、シスプラチンと併用することで扁平上皮がんを除く非小細胞肺がんで生存期が伸びることが示された。続いて認可されたベバシズマブは血管新生阻害剤と呼ばれ、血管内皮増殖因子を補足することにより血管新生が抑制されがん細胞への栄養供給を抑制し、がんの増殖を抑えることができる。ベバシズマブはがん自体に対する毒性はないため、他の抗がん剤と併用されるが、たとえば、カルボプラチン、パクリタキセルとの併用で１４．２か月全生存期間が延長した。【０００８】
このように抗体医薬は現在最もよくがん治療に用いられる分子標的薬である。また、がん以外にも関節リウマチ、クローン病、ぜんそくなどの疾患の治療に適した抗体医薬も開発されている。そして、これらの抗体医薬は、低分子医薬と同様に過剰投与による副作用の問題が生じうるが、抗体医薬は低分子医薬に比較すると血中濃度の測定が困難である。そのため、現在、更に治療効果を上げるため、分子標的薬の血中濃度の簡易な測定技術が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ／９１１９８１３
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Yaxin Jiang, Xiahong Fang, and Chunli Bai.,Anal chem.., 76(17): 5230-3235, 2004.
【非特許文献２】Yen-An Shieh, Shu-Jyuan Yang, Ming-Feng Wei and Ming-JiumShieh., ACS NANO., Vol.4, No.3, 1433-1442, 2010.
【非特許文献３】Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ.，Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.Ｓｃｉ.，９(４)：６６８，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上のような背景の下に、本発明は、分子標的医薬の血中濃度を測定する目的で、分子標的医薬と特異的に結合する新規ＤＮＡアプタマーを提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、ＳＥＬＥＸ法を用いることによって分子標的医薬に対して特異的な結合能を有するヌクレオチド配列を特定し、当該特定の配列を有するＤＮＡが分子標的医薬に対する特異的アプタマーとして機能し得ることを新規に見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明は、一つの態様において、
（１）分子標的医薬に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマー。
（２）分子標的医薬に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマーのヌクレオチド配列において、１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列を有することを特徴とするＤＮＡアプタマー。
（３）分子標的医薬に対して特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、
５’−Ｐ１−Ｘ−Ｐ２−３’
で表されるヌクレオチド配列を有し、ここで、
Ｘは、分子標的医薬に対して特異的に結合するヌクレオチド配列、又は当該配列から選択されるヌクレオチド配列において１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列であり、
Ｐ１及びＰ２は、ＰＣＲ増幅のために導入された第１及び第２プライマー認識配列である上記（１）または（２）に記載のＤＮＡアプタマー。
（４）  Ｐ１は、配列番号２で示される第１プライマー認識配列であり、及びＰ２は、配列番号３で示される第２プライマー認識配列である、上記（３）に記載のＤＮＡアプタマー。
（５）糖鎖部分での化学的置換、リン酸エステル部分での化学的置換及び核酸塩基部分での化学的置換から成る群より選択される、少なくとも１つの化学修飾を含む、上記（１）〜（４）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー；
（６）５’末端又は３’末端に蛍光標識を有する、上記（１）〜（５）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー；
（７）前記蛍光標識が、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、蛍光たんぱく質、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、ＰＣ５、ＰＣ７、Ｃｙ色素、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴｅｘａｓＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、  ＳＰＲＤ、  テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ１１０、ｍＣ１Ｂ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＣＦＳＥ、ＪＣ−１、ＰＫＨ、ＤＣＦＨ−ＤＡ、ＤＨＲ、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、ａｃｒｉｄｉｎｅ（Ａｃｄ）、ｄａｎｓｙｌ（Ｄｎｓ）、７−ジメチルアミノクマリン−４−アセティックアシッド（ＤＭＡＣＡ）、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホニックアシッド（ＥＤＡＮＳ）、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン９から選ばれる一種以上を含む発光波長４２１nmから７１２nmの有機系蛍光分子である  上記（６）に記載のＤＮＡアプタマー；
（８）前記蛍光標識が量子ドットである上記（６）に記載のＤＮＡアプタマー； 
（９）５’末端又は３’末端を蛍光標識された上記（１）〜（８）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーが金属ナノ粒子表面に吸着されているＤＮＡアプタマー；及び
（１０）前記金属ナノ粒子に用いられる金属が金、銀、銅、鉄または珪素である上記（９）記載のＤＮＡアプタマー。
（１１）分子標的医薬がベバシズマブであり、分子標的医薬に特異的に結合する配列が配列番号１で表される上記（１）〜（１０）のいずれか１に記載のアプタマー。【００１４】
別の態様において、本発明は、上記ＤＮＡアプタマーによる分子標的医薬の検出に関し、詳細には、
（１２）上記（１）〜（１１）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含む、分子標的医薬の検出用組成物；
（１３）上記（１）〜（１１）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含む、分子標的医薬の検出用キット；
（１４）上記（１）〜（１１）のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とする、分子標的医薬の検出方法；
（１５）前記ＤＮＡアプタマーを分子標的医薬投与患者の、血液、血清、血漿、唾液、及び喀痰よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料とＤＮＡアプタマーとの結合による応答を観測することによって分子標的医薬の存在を検出する工程を含む、上記（１４）に記載の検出方法；
（１６）前記応答が、蛍光応答である、上記（１５）に記載の検出方法；及び
（１７）前記応答が、ラマン散乱応答である上記（１５）記載の検出方法
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、分子標的医薬に対して特異的に結合する新規ＤＮＡアプタマーを用いることによって、かかる分子標的医薬の効率的な検出が可能となる。特に、蛍光標識等の検出部位を付与したＤＮＡアプタマーを含むキット等に応用することで、生体から採取した血液中の分子標的医薬を測定対象とする簡便かつハイスループットな検出又はイメージングを行うことができる。また、さらに前記の蛍光標識を施したＤＮＡアプタマーを金属ナノ粒子に固着させた分散液を含むキット等に応用することで、生体から採取した血中の分子標的医薬を測定対象とする簡便かつハイスループットな検出又はイメージングを行うことができる。そのような血中の分子標的医薬の検出によって、がんの治療効果を改善することが可能となる。【００１６】
さらに、本発明のＤＮＡアプタマーにおけるコンセンサス配列は、わずか３０塩基程度の比較的短い領域であることから、製造のための手間やコストを抑制すること、及び種々の用途に応じて所望の化学修飾や更なる機能の付加を行うことが容易であるという利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、磁性粒子を用いた２本鎖ＤＮＡの１本鎖化を示す模式図である。
【図２】図２は、配列番号１を有するＤＮＡアプタマーによるベバシズマブ吸着磁性粒子の実像図である。
【図３】図３は、配列番号１を有するＤＮＡアプタマーによるベバシズマブ吸着磁性粒子の蛍光イメージング図である。
【図４】図４は、ベバシズマブ固定化表面に対するアプタマー分子の吸着特性を示す図である。
【図５】図５は、ベバシズマブ固定化表面に対するアプタマー分子の吸着特性から得られた速度解析法による解離定数を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１９】
本明細書において、分子標的医薬とは、がん、自己免疫疾患、臓器移植などの治療に用いられる薬剤のうち、疾患に特有な分子や、過剰に発現している分子、たとえば、がんの細胞分裂に必要な分子等を特定の標的として攻撃し、その機能を抑えることにより、当該疾患の治療や拒絶反応の抑制等の効果を奏する薬剤を意味する本発明の対象となる分子標的医薬としては、例えば、マウスモノクローナルIgG1抗体、抗ヒトTNF-α抗体、マウス・ヒトキメラ抗体、ヒト化抗ヒトIgEモノクローナル抗体、抗IL-5モノクローナル抗体、抗RSウイルス抗体、抗血管内皮細胞増殖因子（VEGF）抗体、PEG化 抗ヒトTNF-α抗体、ヒト化抗CD20受容体抗体、抗CCケモカイン受容体4ヒト化モノクローナル抗体、ヒト化抗CD5抗体、抗HER2抗体、抗CD52抗体、抗CD22抗体、抗CD20抗体、ヒト型抗上皮成長因子受容体（EGFR）モノクローナル抗体、CTLA-4（細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4、CD152）ヒト化抗体、抗VEGFR2 IgG1抗体等の、抗がん剤や自己免疫疾患治療薬として用いられる抗体医薬が挙げられる。以下、分子標的医薬がベバシズマブ（商品名：アバスチン）である場合について説明する。
【００２０】
１．ＤＮＡアプタマー
本願において「ＤＮＡアプタマー」とは、ターゲットとなる分子や物質を特異的に認識できる一本鎖オリゴＤＮＡを意味し、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、ベバシズマブに対して特異的に結合する機能を有する一本鎖オリゴＤＮＡである。典型的な態様において、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、以下に示す配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有する。なお、ヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端方向に左から右に記載する。
＜配列番号１＞
CCGTGTGGTGGGGGTTGGGGGTTGTCGTTCGCCG
【００２１】
本発明に係るＤＮＡアプタマーは、ベバシズマブに対して特異的に結合するという機能を有する限り、上記配列番号１で示される配列における１もしくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、又は付加された配列であってもよい。好ましくは、当該置換、欠失、又は付加されるヌクレオチドは、１〜３個であり、より好ましくは１又は２個であり、さらに好ましくは１個である。また、かかるヌクレオチドの置換、欠失、又は付加が存在する場合、本発明に係るＤＮＡアプタマーの配列は、上記配列番号１で示される配列と９０％以上、好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９６％以上の相同性である配列（以下、「相同体」という場合がある。）であることができる。ここで、本明細書で用いる場合、用語「相同性」は、当該技術分野で一般に認められた意味を示す。該用語は、典型的には配列解析プログラムによって（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，ＰＮＡＳ  ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，ＰＮＡＳ  ９０：５８７３−５８７７）または目視検査によって調べたとき、参照核酸配列の同一のヌクレオチドにマッチした主題の核酸配列のヌクレオチドの数をいう。
【００２２】
１もしくは複数のヌクレオチドが置換される場合、当該置換はユニバーサル塩基によってなされることができる。用語「ユニバーサル塩基」は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。すなわち、該用語は、一般的に、標準ＤＮＡ／ＲＮＡの各塩基とほとんど区別なく塩基対を形成し、細胞内酵素によって認識されるヌクレオチド塩基類似体をいう（例えば、Ｌｏａｋｅｓら，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２７０：４２６−４３５）。ユニバーサル塩基の非限定的な例としては、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族の誘導体、イノシン、アゾールカルボザミド（ｃａｒｂｏｚａｍｉｄｅ）、ならびにニトロアゾール誘導体（３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、及び６−ニトロインドールなど）が挙げられる（Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：２４３７）。
【００２３】
また、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、ベバシズマブに対して特異的に結合するという機能を有する限り、その長さに上限はない。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、本実施の形態におけるＤＮＡアプタマーの長さは、上限としては、例えば２００塩基以下、好ましくは１５０塩基以下、より好ましくは１００塩基以下である。全塩基の数が少ない場合、化学合成及び大量生産がより容易で、かつ費用面における長所も大きい。また、化学修飾も容易で生体内の安全性も高く、毒性も低くなる。下限としては、上記配列番号１における塩基数以上、すなわち３４塩基以上である。ＤＮＡアプタマーは１本鎖（ｓｓＤＮＡ）であることが好ましいが、ヘアピンループ型の構造をとることにより部分的に２本鎖構造を形成する場合であっても、そのＤＮＡアプタマーの長さは１本鎖の長さとして計算するものとする。
【００２４】
好ましい実施態様において、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、上記配列番号１で示される配列、及びその５’及び３’末端側にそれぞれプライマー認識配列よりなるヌクレオチド配列であることができる。すなわち、この場合、当該ＤＮＡアプタマーは、
５’−Ｐ１−Ｘ−Ｐ２−３’
で表されるヌクレオチド配列を有する。ここで、Ｘは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列、又はそれらの配列において１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列である。Ｐ１及びＰ２は、ＰＣＲ増幅のために導入された第１及び第２プライマー認識配列である。好ましくは、Ｐ１は、ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＣＣＴ(配列番号２)であり、及びＰ２は、ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＣＣＣ（配列番号３）である。
【００２５】
本発明に係るＤＮＡアプタマーは、生体内における安定性の増大のために、化学修飾されていてもよい。そのような化学修飾の非限定的な例としては、糖鎖部分での化学的置換（例えば、２’−０メチル化）、リン酸エステル部分での化学的置換（例えば、ホスホロチオエート化、アミノ基、低級アルキルアミン基またはアセチル基等の化学修飾）、及び塩基部分での化学的置換が挙げられる。同様に、５’又は３’末端に付加的な塩基を有することもできる。該付加的塩基の長さは通常５塩基以下である。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとアプタマーの安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
また、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、後述のベバシズマブの検出方法又は当該検出用キットにおいて用いるために、例えば５’末端又は３’末端に連結した検出標識を有することができる。かかる検出標識としては、蛍光標識が好ましいが、ラマン散乱標識、酵素標識、さらに赤外線標識を用いてもよい。
【００２７】
蛍光標識は、当該技術分野において慣用されている蛍光標識剤を用いることができるが、例えば、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、蛍光たんぱく質、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、ＰＣ５、ＰＣ７、Ｃｙ色素、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴｅｘａｓＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、  ＳＰＲＤ、  テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ１１０、ｍＣ１Ｂ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＣＦＳＥ、ＪＣ−１、ＰＫＨ、ＤＣＦＨ−ＤＡ、ＤＨＲ、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、ａｃｒｉｄｉｎｅ（Ａｃｄ）、ｄａｎｓｙｌ（Ｄｎｓ）、７−ジメチルアミノクマリン−４−アセティックアシッド（ＤＭＡＣＡ）、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホニックアシッド（ＥＤＡＮＳ）、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン９から選ばれる一種以上が挙げられる。
好ましくは、例えば６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ（商標））、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル（ＦＡＭ）、シアニン系蛍光色素（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５，Ｃｙ５，Ｃｙ５．５）など市販のオリゴヌクレオチド固相合成サービスで導入できる蛍光団が挙げられる。
【００２８】
さらに、蛍光物質の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。酵素標識の例としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が挙げられる。また、発光基質として、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などを標識剤として用いてもよい。
【００２９】
ラマン散乱標識に関しては、前記の蛍光標識されたアプタマーの例えば５’末端又は３’末端に金属表面と結合能を有する置換基として特に限定するものではないが、チオール（ＳＨ）基、アルキルアミノ基、芳香族アミノ基及びカルボキシル基から選ばれる基を導入し、これを例えば、金ナノ粒子表面に吸着させることにより当該アプタマー吸着金属粒子から発せられる増強ラマン散乱光を検出することで細胞認識を行うものである。この場合、特に限定するものではないが、金属ナノ粒子として、金、銀、鉄、量子ドットなどを用いることができる。
【００３０】
２．ＤＮＡアプタマーの選別
本発明のＤＮＡアプタマーは、当該技術分野において周知のインビトロセレクション法を用いて選別及び取得することができる。そのような手法の好ましい例として、試験管内進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＳＥＬＥＸ法）が用いられる。当該ＳＥＬＥＸ法は、ターゲット物質に結合する核酸リガンド（アプタマー）の選別と、ＰＣＲによる指数関数的な増幅を複数回繰り返すことにより，ターゲット物質に親和性を有する核酸分子（一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ）を得るというものである。また、その改良手法として、例えばＧｕｏ，ｅｔ ａｌ.，Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.Ｓｃｉ.，９(４)：６６８，２００８に記載されているようなＳＥＬＥＸ法を応用することが好ましい。即ち、タンパク質を固定化した磁性粒子を調整し、核酸ライブラリーと混合させ、磁性粒子上のタンパク質に親和性を有する核酸のみを抽出し、PCR増幅をおこなうSELEX法である。
【００３１】
上述のとおり、「インビトロセレクション法」は、ランダムなヌクレオチド配列を含む核酸分子のプール（いわゆる、ＤＮＡプール）からターゲットとする分子や細胞に対して親和性を持つアプタマー分子を選択し、親和性を持たない分子を排除する方法である。この方法によれば、当該選択されたアプタマー分子のみをＰＣＲ法等で増幅し、さらに親和性による選択をするというサイクルを繰り返すことにより、強い結合能を持つアプタマー分子を濃縮することができる。
【００３２】
具体的には、まず、２０〜３００塩基、好ましくは３０〜１５０、より好ましくは３０〜１００塩基程度のランダムなヌクレオチド配列（塩基配列）領域を含む１本鎖核酸分子、例えば、オリゴＤＮＡを調製する。オリゴＤＮＡは、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ    Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）増幅を可能にするために、その両端にプライマーとなるべき塩基配列を有するものを用いることが好ましい。プライマー認識配列部分は、ＰＣＲ増幅後にプライマー部分を制限酵素によって切除し得るように適当な制限酵素サイトを有するようにしてもよい。用いるプライマー認識配列部分の長さは、特に限定されるものではないが、約２０〜５０、好ましくは２０〜３０塩基程度である。また、ＰＣＲ増幅後の１本鎖ＤＮＡを電気泳動などで分離可能とするために、５’側末端に、放射標識、蛍光標識などによる標識を行ってもよい。
【００３３】
次に、上記で得られたランダムなヌクレオチド配列を有する核酸分子（ライブラリープール）と、ターゲットタンパク質を固定した磁性粒子とを適当な濃度比で混合し、適当な条件下でインキュベートする。インキュベート後、磁気スタンドに静置し、核酸分子−ターゲットタンパク質複合体と遊離核酸分子とを分離する。分離溶液の上澄み部分を除去し、得られた核酸分子−ターゲットタンパク質複合体を用いてＰＣＲ反応を行うことでタンパク質結合性核酸配列の増幅を行う。この後、ターゲットタンパク質と複合体を形成している核酸分子を当該技術分野において周知の手法に従って一本鎖化する。そのような手法としては、例えば、ストレプトアビジン固定化磁性粒子とビオチンとの結合を利用する分離が挙げられる。これにより、増幅した核酸二重鎖のうちターゲットタンパク質結合能を有するｓｓＤＮＡを分離することができ、さらにＤＮＡポリメラーゼなどのＰＣＲ反応溶液中に含まれる不要な共存物質を除去することができる。その後、回収されたｓｓＤＮＡをライブラリープールとして用いて同様の操作を行う。
【００３４】
上述の核酸分子とターゲットタンパク質との混合、ターゲットタンパク質と結合した核酸分子の分離、ＰＣＲ増幅、増幅された核酸分子を再びターゲットタンパク質との結合に使用するまでの一連の操作は数ラウンドを行う。ラウンドを繰り返し行うことにより、より特異的にターゲット細胞と結合する核酸分子を選別することができる。得られた核酸分子は、当該技術分野において周知の手法によりその配列解析を行うことができる。
【００３５】
３．ベバシズマブの検出用組成物、検出方法、及びキット
上述のように、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、ベバシズマブに対して特異的に結合する機能を有することから、当該ベバシズマブの血中濃度検出において好適に用いることができる。
【００３６】
具体的には、本発明のＤＮＡアプタマーを含む検出用組成物を血液、血清、血漿、唾液、及び喀痰よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させ、その後、当該試料とＤＮＡアプタマーとの結合による応答（シグナルの有無）を観測することによってベバシズマブの存在を検出する。「生体から採取された試料」は、動物、好ましくはヒトから採取したものであって、最小侵襲で確保可能な試料または分泌体液、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養液成分試料等であれば、その形態は特に限定されない。また、ベバシズマブの存在を検出するための「応答」は、蛍光応答もしくはラマン散乱応答であることが好ましく、そのため上記で述べたとおり、蛍光応答においてはＤＮＡアプタマーの５’末端又は３’末端にＴＡＭＲＡ（商標）、ＦＩＴＣ等の蛍光標識剤を連結させることが好ましい。またラマン散乱応答においてはＤＮＡアプタマーの５’末端又は３’末端にCy3.5（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）、ＦＩＴＣ等の蛍光標識剤を連結させ、さらに前記のチオール（ＳＨ）基、アルキルアミノ基、芳香族アミノ基及びカルボキシル基から選ばれる基を導入し、これを例えば、金ナノ粒子表面に吸着させることが好ましい。
【００３７】
また、本発明のベバシズマブの検出用組成物は、その簡便性や携帯性を高めるためＤＮＡアプタマーを含むキットとして提供することもできる。当該キットにおいてＤＮＡアプタマーは、通常、適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様で、或いは該ＤＮＡアプタマーが固相担体上に固定されたＤＮＡアレイの態様で提供されることができる。例えば、ＤＮＡアプタマーの末端にビオチンを結合させて複合体を形成し、固相担体の表面にストレプトアビジンを固定化させて、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用によってＤＮＡアプタマーを固相担体表面に固定化することができる。当該キットには、必要に応じて他の試薬等を適宜含んでいても良く、例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
【００３８】
本発明の測定対象となる分子標的医薬が、上記に挙げたものであって、ベバシズマブ以外である場合も、上記と同様に、本発明を実施することができる。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。【００４１】
実施例１：アプタマーの選別
ＳＥＬＥＸ法を用いて、ランダムな配列を有するＤＮＡプールから肺がん分子標的薬であるベバシズマブに特異的に結合するアプタマーの選別を行った。当該ＳＥＬＥＸ法における各工程は以下のとおりである。
１）  ＤＮＡプールの調製（ＤＮＡアプタマー候補群の溶液調製）
２）  ターゲット物質−ベバシズマブ固定磁性粒子の調製及び混合
３）  ターゲット結合性ＤＮＡと非結合性ＤＮＡの分離
４）  ターゲット結合性ＤＮＡの複製（ターゲット物質と結合したＤＮＡアプタマーを増幅する工程）
５）  ターゲット結合性ＤＮＡの精製（増幅したＤＮＡアプタマーを１本鎖ＤＮＡに精製する工程）
６）  ターゲット結合性核酸のクローンニング（得られたＤＮＡアプタマーの配列解析の前処理）
７）  これら１）〜６）の工程を６ラウンド実行
８）  ターゲット結合性核酸の配列解析（シーケンサーによるＤＮＡアプタマーのヌクレオチド配列の解析）
より詳細な実験手順は、以下のとおりである。
ＤＮＡプールは、以下の配列を有する全長が７０塩基でランダム配列部分（Ｎ）が３４塩基のオリゴＤＮＡを用いた。
ＤＮＡ  ｐｏｏｌ:Ｒａｎｄｏｍ３４（つくばオリゴ社製）
・配列:  ５’-ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＣＣＴ(Ｎ３４)ＣＧＣ  Ｔ  ＴＡ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＣＣＣ−３’
・長さ:  ７０塩基(ランダム配列は中央の３４塩基)
・分子量:  ２１３９１．３  ｇ／ｍｏｌ
・モル吸光係数:  ６３０４７５  Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ
ランダム配列の両側は、後のＰＣＲにおいてプライマーによって認識され、増幅を可能にするための配列である。
磁性粒子表面へのベバシズマブの固定化は、アバスチンに添付してある説明書に従って行った。磁性粒子はThermo Scientific社製Protein A Magnetic Beads (product 88845)を用いた。【００４２】
磁性粒子を用いたSELEXの実施例
ベバシズマブ固定磁性粒子を１７μLとり、リン酸バッファー（ｐH7.4、Ca,Mgフリー、２ｍM  EDTA、０．１％HAS）で洗浄、これに、１０μMに調整したDNAライブラリーを２０μL添加する。室温で３０分静置したのち磁気スタンドを用いて磁性粒子を回収し、リン酸バッファー（２ｍM  EDTA、０．１％BSA）で洗浄、最終的に２０μL  TEバッファーで置換し、９５℃ヒートブロックに１０分間静置し、磁性粒子上のベバシズマブに吸着したDNAを脱離させる。回収したDNAライブラリーをPCRにより増幅したのち、目的とするDNA配列を回収する。
精製したＤＮＡにストレプトアビジンを加えて磁性粒子に吸着させ、磁石により磁性粒子を回収したのち上澄みを除去、その後アルカリバッファー変性により上澄み中に磁性粒子と結合していない１本鎖ＤＮＡを回収した（図１）。その後アルカリバッファーをＰＢＳバッファーに置換することで、磁性粒子と結合した目的物である１本鎖ＤＮＡを回収した。これを１ラウンドとし、この操作を６回行った。
６ラウンド後、ビオチン非修飾の１８塩基プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物をシークエンサー解析した。【００４３】
実施例２：蛍光標識ＤＮＡアプタマーによるベバシズマブの染色
ProteinA  Magnetic Beadsに固定したベバシズマブを１．５  ｍL遠心チューブに入れ、これにシークエンサー解析により見出されたベバシズマブに対して親和性のあるヌクレオチド配列からなるＤＮＡアプタマーの５‘末端をCy3.5（商標）で修飾し、このＤＮＡを超純水により１００μＭに調製したアプタマー溶液を２０μＬとり、１ｍＬリン酸バッファー液を有する１．５ｍL遠心チューブに分散させながら添加した。これを３７℃１時間インキュベーターに静置した。その後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄した後、さらにＰＢＳを２ｍＬ添加した状態でオリンパス製の倒立型蛍光顕微鏡ＩＸ７１により観察した。配列番号１を有するＤＮＡアプタマーによる結果を、それぞれ図２及び３に示す。これらの蛍光標識ＤＮＡアプタマーが磁性粒子上のベバシズマブに特異的に結合し、それによってベバシズマブに対する良好な蛍光イメージング画像が得られることが明らかとなった。【００４４】
実施例３  ベバシズマブに対する結合定数の測定
ベバシズマブ（１００  ｍｇ/４  ｍL）溶液２００  μLを水晶振動子マイクロバランス（AFFINIXQ8  株式会社アルバック社製）用センサーチップ装着カップに添加した。その後37℃で2時間静置し、その後、ベバシズマブ溶液をピペットを用いて慎重に除去し、さらにリン酸バッファー（Gibco DPBS  ）２００μLで３回洗浄し、最後に２００μLのリン酸バッファー液をカップに入れて、装置に装着した。センサーカップが装着されたら、これに攪拌機を設置し、撹拌を行いながらセンサースイッチをオンした。水晶振動子上の圧力変動が収まったところで、センサーカップ１から４にそれぞれアプタマー濃度が1.48 μM、1.98  μM、2.32 μM、2.91 μMになるようにアプタマーを添加し吸着曲線が安定するまで測定を行った。【００４５】
図４と図５にそれぞれ、ベバシズマブ固定化表面に対するアプタマー分子の吸着特性と速度解析法により算出された解離定数を示す。
本アプタマーのベバシズマブに対する解離定数はおよそ９．１×１０−６  Ｍであり、強くベバシズマブに結合していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本願発明のアプタマーは、分子標的医薬の血中濃度の測定等に極めて有用であり、医療分野での応用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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