(57)【要約】  工業生産に適した簡便且つ安価な方法により、着色が少なく色調が良好であり、臭気が少ない微生物産生樹脂の製造方法を提供する。  下記（ａ）工程および（ｂ）工程を含むことを特徴とする微生物産生樹脂の製造方法。（ａ）：油脂に過酸化水素を含有させて加熱処理する工程（ｂ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂を含む培養液で微生物を培養する工程【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）工程および（ｂ）工程を含むことを特徴とする微生物産生樹脂の製造方法。
（ａ）：油脂に過酸化水素を含有させて加熱処理する工程
（ｂ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂を含む培養液で微生物を培養する工程
【請求項２】
前記（ａ）工程において、５０℃以上１５０℃未満の温度で加熱処理することを特徴とする請求項１に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
【請求項３】
前記油脂が、植物由来の油脂を含有していることを特徴とする請求項１または２に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
【請求項４】
前記油脂が、残渣油を含有していることを特徴とする請求項１または２に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
【請求項５】
前記油脂が、パームやし由来の油脂を含有していることを特徴とする請求項１または２に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
【請求項６】
前記油脂が、パームやし由来の残渣油を含有していることを特徴とする請求項１または２に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
【請求項７】
（ｃ）：前記（ｂ）工程で培養した微生物から樹脂成分を取り出す工程を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
【請求項８】
（ｄ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に界面活性剤を含有させて、前記油脂を乳化させる工程を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
【請求項９】
（ｄ’）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に界面活性剤及び水酸化ナトリウムを含有させて、前記油脂を乳化させる工程を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
【請求項１０】
前記微生物産生樹脂がポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法により製造された微生物産生樹脂。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物産生樹脂の製造方法及び微生物産生樹脂に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物産生樹脂、中でもポリヒドロキシアルカノエート（以後、ＰＨＡと称することがある。）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルである。微生物によって天然の有機酸や油脂を炭素源に生産されるＰＨＡは、土中や水中の微生物により完全に生分解され、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることになるため、生態系への悪影響がほとんどない環境調和型のプラスチック材料である。近年、合成プラスチックが環境汚染、廃棄物処理、石油資源の観点から深刻な社会問題となるに至り、ＰＨＡが環境に優しいグリーンプラスチックとして注目され、その実用化が切望されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料、薬物担体などの生体適合性プラスチックとして利用が可能と考えられており、実用化が期待されている。【０００３】
しかしながら、微生物産生のＰＨＡには、その製造に際し、培養工程などで着色してしまうという課題があった。特許文献１には、微生物が産生したＰＨＡを含有する微生物細胞の水性懸濁液に酵素処理を行った後、アルカリ及び界面活性化剤を添加し、比較的低温で物理的破砕処理を行うことで、黄色度指数（ＹＩ値）が１５．０以下のＰＨＡを得る方法が記載されている。しかしながら、ＰＨＡの分子量の低下を防ぐために処理温度等の処理条件や処理に用いる添加物の種類や量等が制限されてしまうという、加工性の点で改善の余地があった。さらに、ＰＨＡの色調を改善するために、薬剤を多量に要する、設備が大規模となるという点で、この方法は、実用化が困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−１１５１４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、工業生産に適した簡便且つ安価な方法により、着色が少なく色調が良好であり、臭気が少ない微生物産生樹脂の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、下記［１］〜［９］の微生物産生樹脂の製造方法、および下記［１０］の微生物産生樹脂を提供する。
［１］下記（ａ）工程および（ｂ）工程を含むことを特徴とする微生物産生樹脂の製造方法。
（ａ）：油脂に過酸化水素を含有させて加熱処理する工程
（ｂ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂を含む培養液で微生物を培養する工程
［２］前記（ａ）工程において、５０℃以上１５０℃未満の温度で加熱処理することを特徴とする［１］に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［３］前記油脂が、植物由来の油脂を含有していることを特徴とする［１］または［２］に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［４］前記油脂が、残渣油を含有していることを特徴とする［１］または［２］に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［５］前記油脂が、パームやし由来の油脂を含有していることを特徴とする［１］または［２］に記載の微生物産生樹脂の製造方法
［６］（ｃ）：前記（ｂ）工程で培養した微生物から樹脂成分を取り出す工程を含むことを特徴とする［１］〜［５］のいずれか１に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［７］（ｄ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に界面活性剤を含有させて、前記油脂を乳化させる工程を含むことを特徴とする［１］〜［６］のいずれか１に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［８］（ｄ’）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に界面活性剤及び水酸化ナトリウムを含有させて、前記油脂を乳化させる工程を含むことを特徴とする［１］〜［６］のいずれか１に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［９］前記微生物産生樹脂がポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする［１］〜［８］のいずれか１に記載の微生物産生樹脂の製造方法。
［１０］［１］〜［９］のいずれか１に記載の製造方法により製造された微生物産生樹脂。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の製造方法によれば、工業生産に適した簡便且つ安価な方法により、着色が少なく色調が良好であり、臭気が少ない微生物産生樹脂を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、好ましい実施の形態の一例を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【０００９】
微生物産生樹脂の製造方法は、下記（ａ）工程および（ｂ）工程を含む。
（ａ）：油脂に過酸化水素を含有させて加熱処理する工程
（ｂ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂を含む培養液で微生物を培養する工程
【００１０】
本発明者は、微生物産生樹脂の着色の原因は、微生物による樹脂産生時に生成するユビキノン類、特にユビキノン−８であることを見出した。本発明の微生物産生樹脂の製造方法は、微生物培養時のユビキノン−８の生成量を抑制することにより、簡便且つ安価に、着色が少なく色調が良好な樹脂を製造するものである。
【００１１】
以下に各工程について詳細に説明する。
［（ａ）加熱処理工程］
（ａ）工程は、油脂に過酸化水素を含有させて加熱処理する工程である。加熱工程における加熱温度は、培養液中のユビキノン−８の生成が抑制できる油脂が得られればとくに限定されないが、ユビキノン−８の生成が抑制され、着色が少なく、ＹＩ値が低い樹脂が得られやすい点や、油脂の着色が少ないことや脱臭等の効果がより得られやすい点で、処理温度の下限は、５０℃以上が好ましく、６０℃以上がより好ましく、７０℃以上が特に好ましい。また、油脂の分解や高温になりすぎることによる着色を抑制しやすい点で、処理温度の上限は、１５０℃未満が好ましく、１３０℃未満がより好ましく、１２０℃未満が特に好ましい。上記温度範囲で油脂を処理することにより、ユビキノン−８の生成がより抑制され、着色の少ない樹脂が得られる。
【００１２】
また、加熱処理の時間としては、ユビキノン−８の生成が抑制できる油脂が得られれば特に制限は無いが、油脂の着色が少ないことや脱臭等の効果が得られやすい点で、下限が０．５時間以上が好ましく、１．５時間以上がより好ましく、２．０時間以上がさらに好ましい。また、加熱処理時間の上限は、生産性の確保や油脂の着色が抑制しやすい点で、６時間以下が好ましく、５時間以下がより好ましい。
【００１３】
加熱処理を行う間、過酸化水素を含有した油脂を撹拌することが好ましい。その撹拌方法は、油脂と過酸化水素が均一に混合できれば特に制限されないが、液滴が細かく均一になりやすい方法としてタービン翼を高回転数で回転させて混合する方法を好ましく用いることができる。
【００１４】
（油脂）
油脂は、微生物を培養することができれば特に限定されず、飽和脂肪酸・不飽和脂肪酸の含有率に関係なく使用することができる。具体的には、例えば、牛脂、骨油、豚脂、鶏油、鯨油、羊脂、山羊脂、馬油、乳脂、皮脂及び魚油など動物由来の油脂；パーム油、パーム核油、パームオレイン油などのパームやし（アブラヤシとも称する）由来の油脂、ココヤシ由来のヤシ油、コーン油、オリーブ油、ミツバ種子油、油綿実油、ヒマシ油、大豆油、菜種油、ひまわり油、米油及びサフラワー油等の植物由来の油脂；あるいは、それら油脂の残渣油を用いることができる。また、残渣油の中でも、特に油脂精製時の脱酸工程で発生した脂肪酸等からなるダーク油を用いることができる。
【００１５】
ここで、残渣油とは、油脂の精製時における油脂の蒸留工程で、蒸留後に蒸留容器内に残った油脂を含む、油脂の精製により生じた精製により目的とする部分を除いた残りの部分のことを指し、蒸留成分（製品としての油脂）よりも色調が高い成分である。残渣油は、着色や臭気が強いため、一般的には、微生物産生樹脂の製造には適しておらず使用されないが、本発明の製造方法に依れば、残渣油を使用したとしても、着色や臭気が少なく実用に耐えうる微生物産生樹脂を製造することができる。
【００１６】
また、ダーク油とは、残渣油のうち、油脂の精製時の脱酸工程で発生したソーダ油滓を硫酸分解した脂肪酸が主体の油脂をいう。油脂の種類は動物由来および植物由来を問わない。
【００１７】
上記油脂の中でも、入手性の観点からは、植物由来の油脂を用いることが好ましい。費用や入手性の点で、パーム油、パーム核油などのパームやし由来の油脂を用いることが好ましい。また、色調や臭気の面で好ましくないものの、廃棄物及び非可食原料を使用するため、環境負荷が少ない点及び費用の点で、残渣油が好ましい。入手性の観点から、残渣油の中でも特に、パーム核油などのパームやし由来の油脂の残渣油を用いることが好ましい。
【００１８】
（過酸化水素）
過酸化水素は、ユビキノン−８の生成を抑制することができれば限定されず、気体状、水や有機溶媒などの溶媒に溶解した液体状でも好ましく用いることが出来るが、油脂との均一混合が容易であるという点で、過酸化水素を水に混合させた過酸化水素水を用いることがより好ましい。
【００１９】
過酸化水素水を用いる場合、過酸化水素水における過酸化水素濃度は、ユビキノン−８の生成を抑制し、色調低減効果に優れる点において、１重量％以上が望ましく、５重量％がより好ましく、１０重量％以上が特に好ましい。また、過酸化水素水における過酸化水素濃度の上限は、入手性や取り扱い性の点で、７０重量％以下が好ましく、６５重量％がより好ましく、６０重量％が特に好ましい。
【００２０】
過酸化水素水の油脂類への添加濃度としては、濃度が高い方が好ましいが、油脂および最終的に得られる微生物産生樹脂の色調低減効果が得られやすい点から、下限が、０．０１重量％以上が好ましく、０．１重量％以上がより好ましく、１重量％以上が特に好ましい。また、油脂の分解を抑制しやすい点で、添加濃度の上限は９０重量％以下が好ましく、８５重量％以下がより好ましく、８０重量％以下が特に好ましい。
【００２１】
また、過酸化水素添加時に、油脂のユビキノン−８の生成をより抑制させるため、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属の水酸化物塩または炭酸塩を添加することが好ましい。特に、後の工程として（ｄ）工程を有する場合に、界面活性剤の使用量を抑制出来る点で、アルカリ金属の水酸化物塩を用いることが好ましい。
【００２２】
アルカリ金属の水酸化物塩または炭酸塩を用いる場合、添加濃度の下限は、最終的に得られる微生物産生樹脂の色調低減効果が得られやすい点で、過酸化水素水の量に対して、０．０１重量％以上が好ましく、０．０５重量％以上がより好ましく、０．１重量％以上が特に好ましい。また、油脂の分子量の低下を抑制しやすい点で、添加濃度の上限は、５重量％以下が好ましく、４．５重量％以下がより好ましく、４．０重量％以下が特に好ましい。以下に、本発明の生分解性プラスチックの製造方法の一態様について、詳細に説明するが、本発明の製造方法は、これに限定されない。
【００２３】
［（ｂ）培養工程］
（ｂ）工程は、前記（ａ）工程で加熱処理した油脂を含む培養液で微生物を培養する工程である。培養工程としては、微生物の培養方法については特に限定はないが、例えば特開平０５−９３０４９号公報等に挙げられる方法を好ましく用いることができる。
【００２４】
（培養液）
国際公開第２００８／０１０２９６号に記載されるような公知の組成の培地を用いて、培養液を調製することができる。培養液には、（ａ）工程で過酸化水素を含有させて加熱処理した油脂が含まれるが、その培養液における油脂の含有量の下限値としては、０．０１重量％以上が好ましく、０．０５重量％以上がより好ましく、０．１重量％以上が最も好ましい。培養中に油脂が枯渇することによって、微生物の増殖が停止、または微生物内に蓄積した樹脂が減少しないようにするためである。また、上限値としては、５重量％以下が好ましく、１重量％以下がより好ましく、０．５重量％以下が最も好ましい。培養中に基質阻害や発泡トラブルを起こすことによって、微生物の増殖が停止しないようにするためである。
【００２５】
（微生物）
微生物産生ＰＨＡを生産する微生物としては、ＰＨＡ類生産能を有する微生物であれば特に限定されない。例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）（以下、「ＰＨＢ」と略称する。）生産菌としては、１９２５年に発見されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍが最初で、他にもカプリアビダス・ネケイター（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）（旧分類：アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、ラルストニア・ユートロフア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ））、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ）などの天然微生物が知られており、これらの微生物ではＰＨＢが菌体内に蓄積される。
【００２６】
また、ヒドロキシブチレートとその他のヒドロキシアルカノエートとの共重合体生産菌としては、ＰＨＢＶおよびＰＨＢＨ生産菌であるアエロモナス・キヤビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）、Ｐ３ＨＢ４ＨＢ生産菌であるアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）などが知られている。特に、ＰＨＢＨに関し、ＰＨＢＨの生産性を上げるために、ＰＨＡ合成酵素群の遺伝子を導入したアルカリゲネス・ユートロファス  ＡＣ３２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＣ３２，  ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８）（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｔｅｒｉｏｌ．，１７９，ｐ４８２１−４８３０（１９９７））などがより好ましく、これらの微生物を適切な条件で培養して菌体内にＰＨＢＨを蓄積させた微生物菌体が用いられる。また上記以外にも、生産したいＰＨＡに合わせて、各種ＰＨＡ合成関連遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物を用いても良いし、微生物に合わせて培地成分を含む培養条件を最適化することが好ましい。
【００２７】
［（ｃ）精製工程］
上記（ａ）工程および（ｂ）工程の他、（ｃ）：前記（ｂ）工程で培養した微生物から樹脂成分を取り出す工程を含むことが好ましい。このように微生物から樹脂成分を取り出す工程は精製工程ともいう。これにより、目的とする微生物産生樹脂の純度を高めた状態とすることができる。
【００２８】
微生物から樹脂成分を取り出す方法としては、特に限定はなく、公知の方法を用いることができ、例えば、特開２０１２−１１５１４５号公報に挙げられる方法を好ましく用いることができる。
【００２９】
［（ｄ）乳化工程］
上記（ａ）工程および（ｂ）工程の他、（ｄ）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に界面活性剤を含有させて、前記油脂を乳化させる工程を含むことが好ましく、（ｄ’）：前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に界面活性剤及びアルカリを含有させて、前記油脂を乳化させる工程を含むことがさらに好ましい。このように、油脂を乳化させる工程を、乳化工程ともいう。
【００３０】
（ｄ）または（ｄ’）乳化工程は、（ａ）加熱処理工程と（ｂ）培養工程の間に含む。
【００３１】
前記（ａ）工程で加熱処理した油脂に、界面活性剤を含有させる方法について述べる。界面活性剤は、水に溶解させ、これを乳化液として用いることができる。その含有方法として、具体的には、（ａ）工程で得られた油脂に当該乳化液を添加し、または、当該乳化液に（ａ）工程で得られた油脂を添加した後、乳化機により、強撹拌を行い油脂を乳化させることが挙げられる。強撹拌を行い均一に乳化させることにより、微生物の培養をより促進させることが出来る。ここで、乳化機は、油脂と水を均一に乳化させることができる装置であれば特に限定されないが、例えば、高圧ホモジナイザー、超音波破砕機、乳化分散機、ビーズミル等が挙げられる。
【００３２】
（ｄ）または（ｄ’）工程で使用する界面活性剤としては、陰イオン界面活性化剤、陽イオン界面活性化剤、両性界面活性化剤、非イオン界面活性化剤が挙げられる。
【００３３】
陰イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸セッケン（例えば、ラウリン酸アトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）；高級アルキル硫酸エステル塩（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸カリウム等）；アルキルエーテル硫酸エステル塩（例えば、ＰＯＥラウリル硫酸トリエタノールアミン等）；リン酸エステル塩（ＰＯＥオレイルエーテルリン酸ナトリウム、ＰＯＥステアリルエーテルリン酸等）；スルホコハク酸塩（例えば、ジ−２−エチルヘキシルスルホコハク酸ナトリウム、モノラウロイルモノエタノールアミドポリオキシエチレンスルホコハク酸ナトリウム、ラウリルポリプロピレングリコールスルホコハク酸ナトリウム等）；アルキルベンゼンスルホン酸塩（例えば、リニアドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、リニアドデシルベンゼンスルホン酸トリエタノールアミン、リニアドデシルベンゼンスルホン酸等）；高級脂肪酸エステル硫酸エステル塩（例えば、硬化ヤシ油脂肪酸グリセリン硫酸ナトリウム等）；Ｎ−アシルグルタミン酸塩（例えば、Ｎ−ラウロイルグルタミン酸モノナトリウム、Ｎ−ステアロイルグルタミン酸ジナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｌ−グルタミン酸モノナトリウム等）；硫酸化油（例えば、ロート油等）；ＰＯＥアルキルエーテルカルボン酸；ＰＯＥアルキルアリルエーテルカルボン酸塩；α−オレフィンスルホン酸塩；高級脂肪酸エステルスルホン酸塩；二級アルコール硫酸エステル塩；高級脂肪酸アルキロールアミド硫酸エステル塩；ラウロイルモノエタノールアミドコハク酸ナトリウム；Ｎ−パルミトイルアスパラギン酸ジトリエタノールアミン；カゼインナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００３４】
陽イオン界面活性化剤としては、例えば、第４級アンモニウム塩（例えば、塩化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、塩化テトラブチルアンモニウム等）；アルキルアミン塩（例えば、モノメチルアミン塩酸塩、ジメチルアミン塩酸塩、トリメチルアミン塩酸塩等）；ピリジン環を有する物質（例えば、塩化ブチルピリジニウム、塩化ドデシルピリジニウム、塩化セチルピリジニウム等）等が挙げられる。
【００３５】
親油性非イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノイソステアレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタントリオレエート、ペンタ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン、テトラ−２−エチルヘキシル酸ジグリセロールソルビタン等）；グリセリンポリグリセリン脂肪酸類（例えば、モノ綿実油脂肪酸グリセリン、モノエルカ酸グリセリン、セスキオレイン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、α，α’−オレイン酸ピログルタミン酸グリセリン、モノステアリン酸グリセリンリンゴ酸等）；プロピレングリコール脂肪酸エステル類（例えば、モノステアリン酸プロピレングリコール等）；硬化ヒマシ油誘導体；グリセリンアルキルエーテル等が挙げられる。
【００３６】
親水性非イオン性界面活性剤としては、例えば、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンモノステアレート、ＰＯＥソルビタンモノオレエート、ＰＯＥソルビタンテトラオレエート等）；ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（例えば、ＰＯＥソルビットモノラウレート、ＰＯＥソルビットモノオレエート、ＰＯＥソルビットペンタオレエート、ＰＯＥソルビットモノステアレート等）；ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（例えば、ＰＯＥグリセリンモノステアレート、ＰＯＥグリセリンモノイソステアレート、ＰＯＥグリセリントリイソステアレート等）；ＰＯＥ脂肪酸エステル類（例えば、ＰＯＥジステアレート、ＰＯＥモノジオレエート、ジステアリン酸エチレングリコール等）；ＰＯＥアルキルエーテル類（例えば、ＰＯＥラウリルエーテル、ＰＯＥオレイルエーテル、ＰＯＥステアリルエーテル、ＰＯＥベヘニルエーテル、ＰＯＥ−２−オクチルドデシルエーテル、ＰＯＥコレスタノールエーテル等）；プルロニック型類（例えば、プルロニック等）；ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（例えば、ＰＯＥ・ＰＯＰセチルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰ−２−デシルテトラデシルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰモノブチルエーテル、ＰＯＥ・ＰＯＰ水添ラノリン、ＰＯＥ・ＰＯＰグリセリンエーテル等）；テトラＰＯＥ・テトラＰＯＰエチレンジアミン縮合物類（例えば、テトロニック等）；ＰＯＥヒマシ油硬化ヒマシ油誘導体（例えば、ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油モノイソステアレート、ＰＯＥ硬化ヒマシ油トリイソステアレート、ＰＯＥ硬化ヒマシ油モノピログルタミン酸モノイソステアリン酸ジエステル、ＰＯＥ硬化ヒマシ油マレイン酸等）；ＰＯＥミツロウ・ラノリン誘導体（例えば、ＰＯＥソルビットミツロウ等）；アルカノールアミド（例えば、ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド、ヤシ油脂肪酸モノエタノールアミド、ラウリン酸モノエタノールアミド、脂肪酸イソプロパノールアミド等）；ＰＯＥプロピレングリコール脂肪酸エステル；ＰＯＥアルキルアミン；ＰＯＥ脂肪酸アミド；ショ糖脂肪酸エステル；アルキルエトキシジメチルアミンオキシド；トリオレイルリン酸等が挙げられる。
【００３７】
両性界面活性剤としては、例えば、レシチン、アミドプロピルベタイン類（例えば、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、ミリスチン酸アミドプロピルベタイン、パーム核油脂肪酸アミドプロピルベタイン等）；アミドスルホベタイン類（ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン等）；アミドアミンオキシド類（ラウリン酸アミドプロピルジメチルアミンオキシド等）；カルボベタイン類（例えば、ヒドロキシアルキル（Ｃ１２−１４）ヒドロキシエチルメチルグリシン等）が挙げられる。
【００３８】
（ｄ）または（ｄ’）工程で使用する界面活性剤の中でも、特に培養および乳化させやすい点で、陰イオン性界面活性剤であるカゼインナトリウムが好ましい。
【００３９】
乳化工程において界面活性剤を乳化液として用いる場合に、その乳化液のｐＨは、油脂を乳化させやすい点で、乳化液のｐＨを７〜１１の範囲にすることが好ましい。乳化液のｐＨの調製は、アルカリを添加することにより行うことができる。よって、その乳化液の調製には、界面活性剤と共にアルカリを添加することが好ましい。
【００４０】
使用できるアルカリとしては、乳化液のｐＨを７〜１１に調整することが出来れば特に限定されるものではなく、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等を含めたアルカリ金属の水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属の炭酸塩；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属の炭酸水素塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の有機酸のアルカリ金属塩；ホウ砂等のアルカリ金属のホウ酸塩；リン酸３ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、りん酸水素二ナトリウム１２水、リン酸水素２ナトリウム、リン酸３カリウム、リン酸水素２カリウム等のアルカリ金属のリン酸塩；水酸化バリウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；あるいはアンモニア水等が挙げられる。この中でも、工業生産に適し、また価格の点で、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムが好ましく、水酸化ナトリウムが特に好ましい。また、タンパク質を併用している場合、乳化が安定化できる点で、りん酸水素二ナトリウムが好ましい。
【００４１】
（ｄ）または（ｄ’）乳化工程において界面活性剤を乳化液として用いる場合における、乳化液の調製について具体的に述べる。（ａ）工程で得られた油脂に当該乳化液を添加し、または、当該乳化液に（ａ）工程で得られた油脂を添加する時の乳化液と油脂の温度は、油脂の融点以上が望ましく、界面活性剤の分解を抑制し乳化させやすい点で、３０〜８０℃に調整することが好ましい。
【００４２】
（ａ）工程で得られた油脂に、界面活性剤を含有させる際のそれぞれの含有量について述べる。界面活性剤を乳化液として用いる場合、水に対する（ａ）工程で得られた油脂の濃度は、培養しやすい点で、油脂が水の４０〜７０重量％であることが好ましい。また、（ａ）工程で得られた油脂に対する界面活性剤の濃度は、良好な乳化状態がえられやすい点で、界面活性剤が（ａ）工程で得られた油脂の０．０１〜１重量％であることが好ましい。
【００４３】
（微生物産生樹脂）
上記の製造方法で製造される微生物産生樹脂は、微生物産生樹脂を含有する樹脂組成物であれば特に制限されないが、生分解性に優れている点で、下記一般式（１）
［−ＣＨＲ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｏ−］  （１）
（式中、ＲはＣｎＨ２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上１５以下の整数である。）、ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと称することがある。）で表されるポリヒドロキシアルカノエートであることが好ましい。
【００４４】
ＰＨＡは、ＰＨＡ単位構造の単重合体であっても、２種以上が共重合した共重合体であってもよい。例えば、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）、〔ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３-ヒドロキシバレレート−ｃｏ−３-ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＶ３ＨＨ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（ＰＨＢＨ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）（Ｐ３ＨＢ４ＨＢ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシオクタノエート）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシオクタデカノエート）等を工業的に生産が容易である点から好ましい。これらのなかでも特に、機械的特性や生分解性等の特性バランスに優れている点で、ＰＨＢ、ＰＨＢＶ、Ｐ３ＨＢ３ＨＶ３ＨＨ、ＰＨＢＨ、Ｐ３ＨＢ４ＨＢが好ましい。
【００４５】
前記微生物産生ＰＨＡの繰り返し単位の平均組成比は、柔軟性と強度のバランスの観点から、ポリ（３−ヒドロキシブチレート）の組成比が８０モル％〜９９モル％であることが好ましく、８５モル％〜９７モル％であることがより好ましい。ポリ（３−ヒドロキシブチレート）の組成比が８０モル％未満であると剛性が不足する傾向があり、９９モル％より多いと柔軟性が不足する傾向がある。
【００４６】
前記ＰＨＡの共重合樹脂中の繰り返し単位である各モノマー比率は、以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定できる。乾燥ＰＨＡ約２０ｍｇに、２ｍｌの硫酸／メタノール混液（１５／８５（重量比））と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ＰＨＡ分解物のメチルエステルを得る。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生が止まるまで放置する。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、上清中のＰＨＡ分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析することにより、共重合樹脂中の各モノマー比率を求められる。
【００４７】
前記ガスクロマトグラフとしては、島津製作所社製「ＧＣ−１７Ａ」を用い、キャピラリーカラムにはＧＬサイエンス社製「ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１」（カラム長：２５ｍ、カラム内径：０．２５ｍｍ、液膜厚：０．４μｍ）を用いる。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧を１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌ注入する。温度条件は、８℃／分の速度で初発温度１００℃から２００℃まで昇温し、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温する。
【００４８】
本発明の製造方法により製造される微生物産生樹脂は、臭いや着色が少ないため、農業、漁業、林業、園芸、医学、衛生品、食品産業、衣料、非衣料、包装、自動車、建材、その他の分野に好適に用いることができる。特に、薬物担体などの生体適合性プラスチック等の医学、衛生品分野に特に好適に用いることが出来る。
【実施例】
【００４９】
次に本発明を以下の実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、以下の例に限定されるものではない。【００５０】
＜色調（吸光度）の測定＞
油脂の色調の測定は以下のとおり行った。油脂をその油脂の融点以上に加温し、十分溶融させた状態で、測定用セルにセッティングし、吸光度計「ＵＶ−１７００」（島津製作所社製）にて、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し色調を評価した。過酸化水素を含有させて加熱処理した油脂については、油脂を静置して得られた油層部分の油脂を回収し、その回収した油脂について色調（吸光度）の測定を行った。尚、吸光度の高い油脂は、強く着色していることを示す。【００５１】
＜色調（ＨＰＬＣ分析）の測定＞
色調（ＨＰＬＣ分析）の測定は、以下のとおり行った。ＰＨＡ乾燥紛体０．５ｇに、メタノール３ｍｌ添加し、超音波で３０分間処理し、着色の原因物質を抽出し、これを０．４５μｍのＰＴＦＥ製メンブランフィルターで濾過して、「Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ」（島津製作所製）にてＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析結果のチャートから、ＰＨＡ中の着色の原因物質であるユビキノン−８のピークの面積を算出することにより色調の度合いを評価した。ユビキノン−８を多く含む材料は、着色が強いことを示している。【００５２】
＜色調官能評価＞
培養液の色調官能評価は、培養が終了した直後の培養液について１０名の評価者に何色といえるか判断してもらい、６人以上が白またはクリーム色と判断した場合を○、６人以上が黄色または茶色等の明らかな着色があると判断した場合を×とした。また、乾燥ＰＨＡの色調官能評価は、乾燥ＰＨＡをスクリュー管に５０ｇはかり取り、培養液の場合と同様の方法により評価した。【００５３】
＜色味（ＹＩ値）の測定＞
色味（ＹＩ値）の測定は、以下のとおり行った。ＰＨＡのプレスシートを作製し、そのＹＩ値を測定した。ＰＨＡのプレスシートの作製は、乾燥させたＰＨＡ３．０ｇを、１５ｃｍ四方の金属板で挟み、さらに金属板の四隅に厚さ０．５ｍｍの金属板を挿入して、これを実験用小型プレス機（高林理化株式会社製Ｈ−１５型）にセットして、１６０℃にて７分間加温後、約５Ｍｐｓにて２分間加熱しながらプレスし、プレス後は室温に放置してＰＨＡを硬化させたる方法で行った。ＹＩ値は、色差計「ＳＥ−２０００」（日本電色社製）にて、３０ｍｍ測定板を使ってプレスシートを載せ、その上に白色標準板を被せて測定した。【００５４】
＜臭気官能評価＞
油脂の臭気官能評価は、油脂をスクリュー管に５０ｍｌはかり取り、１０名の評価者に臭いを嗅いでもらい、６人以上が臭気が弱いと感じた場合を○、６人以上が臭気が強いと感じた場合を×とした。乾燥ＰＨＡの臭気官能評価は、乾燥ＰＨＡをスクリュー管に５０ｇはかり取り、油脂の場合と同様の方法により評価した。【００５５】
（油脂の評価）
パームやし由来の油脂の残渣油であるＰａｌｍ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｅ（以下、ＰＦＡＤ油と称することがある）、パームやし由来の油脂の残渣油であるＥｍｐｔｙ  Ｆｒｕｉｔ  Ｂｕｎｃｈｅｓ圧搾油（以下、ＥＦＢ圧搾油と称することがある。）、及び食用油を製造する過程の脱酸工程で分離される脂肪酸を主とした副産物であるダーク油のそれぞれについて、色調（吸光度）の測定と臭気官能評価を行い、その結果を表１に示した。【００５６】
（調製例１）
パームやし由来の油脂の残渣油であるＰＦＡＤ油を、１Ｌのセパラブルフラスコに５００ｇとり、一段タービン翼により撹拌し、９５℃まで昇温した。その後、３０ｗｔ％の過酸化水素水を５０ｇ添加し、３．５時間反応させた。得られた処理後の油脂について、色調（吸光度）の測定と臭気官能評価を行い、その結果を表１に示した。【００５７】
（調製例２）
パームやし由来の油脂の残渣油であるＥＦＢ圧搾油を、１Ｌのセパラブルフラスコに５００ｇとり、一段タービン翼により撹拌し、９０℃まで昇温した。その後、３０ｗｔ％の過酸化水素水を５０ｇ添加し、１．５時間反応させた。得られた処理後の油脂について、色調（吸光度）の測定と臭気官能評価を行い、その結果を表１に示した。【００５８】
（調製例３）
食用油を製造する過程の脱酸工程で分離される脂肪酸を主とした副産物であるダーク油を、１Ｌのセパラブルフラスコに５００ｇとり、一段タービン翼により撹拌し、７０℃まで加熱した。その後、３０ｗｔ％の過酸化水素水を１５０ｇと３０ｗｔ％水酸化ナトリウムを２１０μＬ添加し、５時間反応させた。得られた処理後の油脂について、色調（吸光度）の測定と臭気官能評価を行い、その結果を表１に示した。【００５９】
（調製例４）
ＰＦＡＤ油の温度を９５℃まで昇温したことに代えて、１２０℃まで昇温した以外は、調製例１と同様の方法で、ＰＦＡＤ油を処理した。得られた処理後の油脂について、色調（吸光度）の測定と臭気官能評価を行い、その結果を表１に示した。【００６０】
（調製例５）
水７０ｇにりん酸水素二ナトリウムを０．９４５ｇとカゼインナトリウムを０．６５ｇを混合し、均一になるまで室温で撹拌し、乳化液を作製した。【００６１】
【表１】
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【００６２】
調製例１〜調製例４の結果から、（ａ）加熱処理工程により、油脂の色調と臭気を低減できていることが分かる。【００６３】
（実施例１）
培養精製には、国際公開第２００８／０１０２９６号段落［００４９］に記載のラルストニア・ユートロファＫＮＫ−００５株を、同段落［００５０］〜［００５３］に記載の方法と同様の方法で培養し、ＰＨＡを含有する菌体を含む菌体培養液を得た。以下に詳述する。炭素源としては、調製例１で調製した処理後の油脂１３０重量部に、調製例５で作成した乳化液７０重量部を添加して混合したものを用いた。【００６４】
種母培地の組成は、１％（ｗ／ｖ）  Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１％（ｗ／ｖ）  Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２％（ｗ／ｖ）  Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９％（ｗ／ｖ）  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１５％（ｗ／ｖ）  ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。前培養培地の組成は、１．１％（ｗ／ｖ）  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９％（ｗ／ｖ）  ＫＨ２ＰＯ４、１．２９％（ｗ／ｖ）  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５％（ｗ／ｖ）パームダブルオレイン油、０．５％（ｖ／ｖ）  微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６％（ｗ／ｖ）  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１％（ｗ／ｖ）  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６％（ｗ／ｖ）  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２％（ｗ／ｖ）  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、とした。【００６５】
樹脂生産培地の組成は０．３８５％（ｗ／ｖ）  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７％（ｗ／ｖ）  ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１％（ｗ／ｖ）  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％（ｗ／ｖ）  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％（ｖ／ｖ）  微量金属塩溶液（０．１Ｎ  塩酸に１．６％（ｗ／ｖ）  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１％（ｗ／ｖ）  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６％（ｗ／ｖ）  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２％（ｗ／ｖ）  ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）、０．０５％（ｗ／ｖ）  ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。炭素源は調製例１で調製した処理後の油脂を単一炭素源として用い、培養全般を通じ、比基質供給速度が０．０８〜０．１（ｇ油脂）×（ｇ正味乾燥菌体重量)−１×（ｈ）−１となるように流加した。【００６６】
ＫＮＫ−００５株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０％（ｖ／ｖ）接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。【００６７】
次に、前培養液を６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ−１０００型）に５．０％（ｖ／ｖ）接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、３．６Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源として調製例１で調製した処理後の油脂を使用した。培養は６４時間行った。得られた菌体培養液を６０℃で３０分間滅菌した。その後、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、酵素処理および高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で４５０〜５５０ｋｇｆ／ｃｍ２の圧力で高圧破砕を行った。【００６８】
高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を排除し、回収したＰＨＡ溶液を凝集し、乾燥した。得られたＰＨＡ乾燥紛体について臭気官能評価、色味（ＹＩ値）の測定、色調（ＨＰＬＣ分析）の測定を行い、その結果を表２に示した。【００６９】
（実施例２）
培地に用いる炭素源として、調製例１で調製した処理後の油脂に代えて調製例４で調製した処理後の油脂を用いて得られた乳化液を用いた以外は、実施例１と同様の方法でＰＨＡ乾燥粉体を得た。得られたＰＨＡ乾燥紛体について臭気官能評価、色味（ＹＩ値）の測定、色調（ＨＰＬＣ分析）の測定を行い、その結果を表２に示した。【００７０】
（比較例１）
培地に用いる炭素源として、調製例１の処理をしないＰＦＡＤ油を用いた以外は、実施例１と同様の方法でＰＨＡ乾燥粉体を得た。得られたＰＨＡ乾燥紛体について臭気官能評価、色味（ＹＩ値）の測定、色調（ＨＰＬＣ分析）の測定を行い、その結果を表２に示した。【００７１】
【表２】
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【００７２】
本発明の製造方法で製造された実施例１のＰＨＡは、過酸化水素水で処理していない油脂を用いて製造された比較例１のＰＨＡに比べ、色調（ＨＰＬＣ分析）の測定によるユビキノン−８のピーク面積が小さく、つまり不純物であるユビキノン−８の含有量がきわめて少なく、また、ＹＩ値も小さく、つまり着色も少なかった。また、９５℃で処理した油脂よりも着色の少ない、１２０℃で加熱処理した油脂を用いて製造された実施例２のＰＨＡは、実施例１にＰＨＡに比べ色調は（ＨＰＬＣ分析）の測定によるユビキノン−８のピーク面積はやや高いものの、比較例１のＰＨＡに比べ、ユビキノン−８の含有量が少なく、また、着色も少なかった。【００７３】
（実施例３）
培地に用いる炭素源として、調製例１で調製した処理後の油脂に代えて調製例２で調製した処理後の油脂を用いて得られた乳化液を用いた以外は、実施例１と同様の方法で培養した。得られた菌体培養液について色調官能評価を行い、その結果を表３に示した。【００７４】
（比較例２）
培地に用いる炭素源として、調製例２の処理をしないＥＦＢ圧搾油を用いた以外は、実施例３と同様の方法で培養した。得られた菌体培養液について色調官能評価を行い、その結果を表３に示した。【００７５】
（実施例４）
培地に用いる炭素源として、調製例１で調製した処理後の油脂に代えて調製例３で調製した処理後の油脂を用いて得られた乳化液を用いた以外は、実施例１と同様の方法で培養を行い、ＰＨＡ乾燥粉体を得た。得られた菌体培養液及びＰＨＡ乾燥粉体について、それぞれ色調官能評価を行い、その結果を表３に示した。【００７６】
（比較例３）
培地に用いる炭素源として、調製例３の処理をしないダーク油を用いた以外は、実施例４と同様の方法で培養い、ＰＨＡ乾燥粉体を得た。得られた菌体培養液及びＰＨＡ乾燥粉体について、それぞれ色調官能評価を行い、その結果を表３に示した。【００７７】
【表３】
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【００７８】
本発明の製造方法で製造されたＰＨＡを含む実施例３及び４の培養液は、それぞれ過酸化水素水で処理していない油脂を用いて製造されたＰＨＡを含む比較例２及び３の培養液に比べ、明らかに着色が少なかった。また、ＰＨＡ乾燥粉体を得た実施例４は、比較例３に比べ、明らかに着色が少なかった。【００７９】
表２及び表３に示されるように、油脂を過酸化水素により処理することによって、培養液及び乾燥ＰＨＡのいずれにおいても、色調及び臭気を低減する効果が見られた。
【国際調査報告】
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