(57)【要約】  本発明は、ヒト細胞からアストロサイト様細胞をインビトロで調製する方法であって、以下の工程：（１）少なくとも２種類の誘導因子をヒト細胞に導入する工程；及び（２）前記ヒト細胞を分化誘導してアストロサイト様細胞を得る工程を含み、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記調製方法に関する。
2017057523.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞からアストロサイト様細胞をインビトロで調製する方法であって、以下の工程：
（１）少なくとも２種類の誘導因子をヒト細胞に導入する工程；及び
（２）前記ヒト細胞を分化誘導してアストロサイト様細胞を得る工程
を含み、
ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、
前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記調製方法。
【請求項２】
前記誘導因子が、ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤを含む、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
前記ヒト細胞が、ヒト線維芽細胞である、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項４】
前記ヒト細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒト神経幹細胞である、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項５】
前記ヒト細胞が、神経系疾患患者由来の細胞であるか、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項６】
前記工程（１）における誘導因子の導入が、前記誘導因子をコードする核酸を含む少なくとも１つのベクターを導入することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項７】
前記工程（１）において、
ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害するか、
ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つを阻害するか、
ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか、又は
ＭＤＭ２、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＥ２Ｆから選択される少なくとも１つを活性化すること
をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法で調製される、アストロサイト様細胞。
【請求項９】
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）神経系疾患患者由来の細胞、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞から、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；及び
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞と被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項１０】
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）健常者由来の細胞から、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞において、神経系疾患関連遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程；及び
（３）工程（２）で得られたアストロサイト様細胞と被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項８に記載のアストロサイト様細胞とニューロンとを含む、インビトロの神経組織モデル。
【請求項１２】
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）神経系疾患患者由来の細胞、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞から、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養して、神経組織モデルを調製する工程；
（３）工程（２）で得られた神経組織モデルと被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項１３】
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）健常者由来の細胞から、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞において、神経系疾患関連遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程；
（３）工程（２）で得られたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養して、神経組織モデルを調製する工程；
（４）工程（３）で得られた神経組織モデルと被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項１４】
少なくとも２種類の誘導因子、又は前記誘導因子をコードする核酸を含む少なくとも１つのベクターを成分として含む、ヒト細胞からアストロサイト様細胞への誘導剤であって、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記誘導剤。
【請求項１５】
少なくとも２種類の誘導因子、又は前記誘導因子をコードする核酸を含む少なくとも１つのベクター；及び、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法が記載された取扱説明書を含む、ヒト細胞からアストロサイト様細胞への誘導キットであって、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記キット。
【請求項１６】
ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現阻害剤、及び／又は
ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つの阻害剤、及び／又は
ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現増強剤、及び／又は
ＭＤＭ２、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＥ２Ｆから選択される少なくとも１つの活性化剤
をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト細胞からアストロサイト様細胞をインビトロで調製する方法、当該方法で調製されるアストロサイト様細胞、アストロサイト様細胞とニューロンとを含む、インビトロの神経組織モデル、神経系疾患患者由来のアストロサイト様細胞を用いて神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法、ヒト細胞からアストロサイト様細胞への誘導剤、及びヒト細胞からアストロサイト様細胞への誘導キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アストロサイトは、多くの神経系疾患の病理生理学における主要な役割を果たすことが徐々に認識されつつある神経系細胞である。（非特許文献１）。【０００３】
神経系疾患に対するアストロサイトの病理生理学的役割を研究するために、ヒトアストロサイトの迅速かつ大量の供給が必要とされる。しかし現時点において、ヒトアストロサイトの供給源は限られている。生きている神経系疾患患者から生検によりアストロサイトを入手することは倫理的に不可能である。神経系疾患患者の死後脳からアストロサイトを入手することが可能であるが、大量供給は極めて困難である。【０００４】
ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から分化誘導してアストロサイトを調製する方法が報告されている（非特許文献２）。【０００５】
また、マウスの線維芽細胞に対して、ＮＦＩＡ (Nuclear factor I/A）、ＮＦＩＢ (Nuclear factor I/B)及びＳＯＸ９ (SRY (sex determining region Y)-box 9)を導入してアストロサイト様細胞を直接誘導する方法が報告されている（非特許文献３）。当該文献中において、当該３因子をヒト線維芽細胞に導入してアストロサイト様細胞へと誘導することが試みられている。【０００６】
ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座に存在するｐ１４ＡＲＦ遺伝子およびｐ１６ＩＮＫ４遺伝子、またはｐ１６ＩＮＫ４遺伝子をノックダウンすることにより、ヒト線維芽細胞からｉＰＳ細胞へのリプログラミングの効率を向上させることができることが報告されている(非特許文献４）。また、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子座に存在するｐ１４ＡＲＦ遺伝子又はｐ１６ＩＮＫ４遺伝子をノックダウンすることにより、ヒト線維芽細胞からニューロンへのダイレクト・リプログラミングの効率を向上させることができることが報告されている(非特許文献５）。【０００７】
ｐ１４ＡＲＦ及びｐ１６ＩＮＫ４は、互いに異なるシグナル伝達経路に存在する分子であるが、いずれのシグナル伝達経路も細胞のアポトーシス及び老化に関与する。第一のシグナル伝達経路におけるｐ１４ＡＲＦの下流には、ＭＤＭ２、ｐ５３及びｐ２１が存在する。また、第二のシグナル伝達経路におけるｐ１６ＩＮＫ４の下流には、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、Ｒｂ及びＥ２Ｆが存在する。【０００８】
上記第一のシグナル伝達経路におけるｐ１４ＡＲＦの下流に存在するｐ５３遺伝子をノックダウンすることにより、又はｐ５３タンパク質の機能を阻害するｐ５３ドミナントネガティブ変異体をヒト線維芽細胞に導入することにより、ヒト線維芽細胞からｉＰＳ細胞へのリプログラミングの効率を向上させることができることが報告されている(非特許文献６）。また、ｐ５３ドミナントネガティブ変異体を細胞に導入することにより、ヒト線維芽細胞からニューロンへのダイレクト・リプログラミングの効率を向上させることができることが報告されている(非特許文献７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Molofsky, A.V. 他, Genes & development, 2012, 26, 891-907
【非特許文献２】Krencik, R. 他, Nature biotechnology, 2011, 29, 528-534.
【非特許文献３】Caiazzo, 他, Stem Cell Reports, 2015, 4, 25-36
【非特許文献４】Li, H. 他, Nature, 2009, 460, 1136-1139
【非特許文献５】Sun, C., 他, Nature Communications, 5, Article Number: 4112, June 17, 2014
【非特許文献６】Hong, H., 他, Nature, 2009, 460, 1132-1135
【非特許文献７】Liu, X., 他, Science China Life Sciences, 2014, 57, 867-875
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ｉＰＳ細胞から分化誘導してアストロサイトを調製する場合、数か月もの期間が必要であり、ヒトアストロサイトの迅速な供給という要求を満たすことができない。【００１１】
また、非特許文献３にて報告されている方法では、ヒト新生児線維芽細胞に対してＮＦＩＡ、ＮＦＩＢ及びＳＯＸ９を導入後、３週間の培養後においてもアストロサイト様細胞が全体の２％程度しか観察されず、その誘導効率は極めて低い。【００１２】
従って本発明は、取得が極めて困難なヒトアストロサイトと同様の特性を有するアストロサイト様細胞を、取得容易なヒト細胞を用いて迅速かつ高効率に調製することを可能とする新規手法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、ヒト体細胞に特定の誘導因子（ＮＩＣＤ (Notch 1 intercellular domain) 及びＴｅｔ２ＣＤ (TET (Ten-eleven translocation)2 catalytic domain)の少なくとも１つ、及びＮＦＩＡ）を導入することで、ｉＰＳ細胞の調製を経ることなく、ヒトアストロサイト様細胞を極めて短期間で高効率に調製することができることを見出した。さらに本発明者らは、ｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞、及び神経幹細胞のような成体幹細胞に対して上記と同様の誘導因子を導入した場合においても、ヒトアストロサイト様細胞を極めて短期間で高効率に調製することができることを見出した。本発明は、これらの驚くべき知見に基づく。【００１４】
すなわち本発明は、以下の態様を有する。
［１］
ヒト細胞からアストロサイト様細胞をインビトロで調製する方法であって、以下の工程：
（１）少なくとも２種類の誘導因子をヒト細胞に導入する工程；及び
（２）前記ヒト細胞を分化誘導してアストロサイト様細胞を得る工程
を含み、
ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、
前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記調製方法。
［２］
前記誘導因子が、ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤを含む、［１］に記載の調製方法。
［３］
前記ヒト細胞が、ヒト線維芽細胞である、［１］又は［２］に記載の調製方法。
［４］
前記ヒト細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒト神経幹細胞である、［１］又は［２］に記載の調製方法。
［５］
前記ヒト細胞が、神経系疾患患者由来の細胞であるか、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞である、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の調製方法。
［６］
前記工程（１）における誘導因子の導入が、前記誘導因子をコードする核酸を含む少なくとも１つのベクターを導入することを含む、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の調製方法。
［７］
前記工程（１）において、
ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害するか、
ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つを阻害するか、
ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか、又は
ＭＤＭ２、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＥ２Ｆから選択される少なくとも１つを活性化すること
をさらに含む、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の調製方法。
［８］
［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法で調製される、アストロサイト様細胞。
［９］
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）神経系疾患患者由来の細胞、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞から、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；及び
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞と被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
［１０］
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）健常者由来の細胞から、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞において、神経系疾患関連遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程；及び
（３）工程（２）で得られたアストロサイト様細胞と被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
［１１］
［８］に記載のアストロサイト様細胞とニューロンとを含む、インビトロの神経組織モデル。
［１２］
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）神経系疾患患者由来の細胞、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞から、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養して、神経組織モデルを調製する工程；
（３）工程（２）で得られた神経組織モデルと被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
［１３］
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）健常者由来の細胞から、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞において、神経系疾患関連遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程；
（３）工程（２）で得られたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養して、神経組織モデルを調製する工程；
（４）工程（３）で得られた神経組織モデルと被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
［１４］
少なくとも２種類の誘導因子、又は前記誘導因子をコードする核酸を含む少なくとも１つのベクターを成分として含む、ヒト細胞からアストロサイト様細胞への誘導剤であって、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記誘導剤。
［１５］
少なくとも２種類の誘導因子、又は前記誘導因子をコードする核酸を含む少なくとも１つのベクター；及び、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法が記載された取扱説明書を含む、ヒト細胞からアストロサイト様細胞への誘導キットであって、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記キット。
［１６］
ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現阻害剤、及び／又は
ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つの阻害剤、及び／又は
ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現増強剤、及び／又は
ＭＤＭ２、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＥ２Ｆから選択される少なくとも１つの活性化剤
をさらに含む、［１５］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法によれば、ヒトアストロサイトを迅速かつ大量に供給することが可能となる。また、本発明の方法で得られたヒトアストロサイトを用いて、インビトロの新規疾患モデルを構築することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＮＦＩＡをコードする核酸を含むレンチウィルスベクター、ＮＩＣＤをコードする核酸を含むレンチウィルスベクター、及びＴｅｔ２ＣＤをコードする核酸を含むレンチウィルスベクターをヒト線維芽細胞に導入し、１１日間培養した後における、誘導されたＧＦＡＰ発現細胞の割合を示す。縦軸は、ＤＡＰＩ陽性細胞数に対する、ＧＦＡＰ陽細胞数の割合を示す。図中、「Ｆｉｂｒｏ」は、誘導因子を導入していないヒト線維芽細胞を示す。「ＮＦＩＡ」、「Ｔｅｔ２ＣＤ」、「ＮＩＣＤ」はそれぞれ、ＮＦＩＡ、Ｔｅｔ２ＣＤ、ＮＩＣＤが導入されたヒト線維芽細胞を示す。図中、「ＮＦＩＡ／Ｔｅｔ２ＣＤ」、「Ｔｅｔ２ＣＤ／ＮＩＣＤ」、「ＮＩＣＤ／ＮＦＩＡ」はそれぞれ、ＮＦＩＡとＴｅｔ２ＣＤが導入されたヒト線維芽細胞、Ｔｅｔ２ＣＤとＮＩＣＤが導入されたヒト線維芽細胞、ＮＩＣＤとＮＦＩＡが導入されたヒト線維芽細胞を示す。図中、「ＮＩＦＡ／ＮＩＣＤ／Ｔｅｔ２ＣＤ」は、ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤが導入されたヒト線維芽細胞を示す。
【図２】アストロサイト様細胞をニューロンと共培養した後における、蛍光顕微鏡による当該ニューロンの画像、及びニューロンから伸長した神経突起の長さの測定結果を示す。画像におけるスケールバーは１００μｍである。蛍光顕微鏡画像は、抗MAP2抗体（Sigma社）を用いてニューロンを標識して得た。グラフの縦軸は、ニューロン１細胞当たりの神経突起長さの平均を示す。また、図中、「w/o」は、アストロサイト様細胞と共培養しない場合（すなわち、ニューロンのみ）を示す。図中、「ｗ／ＮＨＤＦ−Ａｄ」は、ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ａｄ）とニューロンとを共培養した場合を示す。図中、「ｗ／ＮＨＤＦ−Ｎｅｏ」は、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ｎｅｏ）とニューロンとを共培養した場合を示す。図中、「ｗ／ｉＡｓ（ＮＨＤＦ−Ａｄ）」は、ヒト成人皮膚線維芽細胞から誘導されたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養した場合を示す。図中、「ｗ／ｉＡｓ（ＮＨＤＦ−Ｎｅｏ）」は、ヒト新生児皮膚線維芽細胞から誘導されたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養した場合を示す。図中、「ｗ／ｈＡｓｔｒｏｃｙｔｅｓ」は、ヒトアストロサイトとニューロンとを共培養した場合を示す。
【図３】アストロサイト様細胞のグルタミン酸取り込み能力の測定結果を示す。
【図４】ＮＦＩＡをコードする核酸を含むレトロウィルスベクター、ＮＩＣＤをコードする核酸を含むレトロウィルスベクター、及びＴｅｔ２ＣＤをコードする核酸を含むレトロウィルスベクターをヒトｌｔ−ＮＥＳ細胞 (long-term self-renewing neuroepithelial stem cells) に導入し、１週間、及び２週間培養した後における、誘導されたＧＦＡＰ発現細胞の割合を示す。縦軸は、全細胞数に対するＧＦＡＰ陽細胞数の割合を示す。図中、「ｌｔ−ＮＥＳ  ｉＡ」は、ｌｔ−ＮＥＳ細胞から誘導されたアストロサイト様細胞を示す。
【図５】ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ、及びＴｅｔ２ＣＤをコードする核酸を全て含むレンチウィルスベクターを用いて、ヒト成人線維芽細胞及びｌｔ−ＮＥＳ細胞から誘導された、アストロサイト様細胞の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図６】ｌｔ−ＮＥＳ細胞から分化誘導して得られた、アレキサンダー病のインビトロモデルにおいて、ＣＲＹＡＢの発現量が対照群と比較して上昇したことを示す。縦軸は、ＧＦＡＰ陽性細胞数に対する、ＧＦＡＰ陽性かつＣＲＹＡＢ(Alpha-crystallin B chain) 陽性細胞数の割合を示す。図中、「Control」は、ミスセンス点変異(C715T)を導入していないｌｔ−ＮＥＳ細胞から誘導されたアストロサイト様細胞を示し、「AxD」は、ミスセンス点変異(C715T)が導入されたｌｔ−ＮＥＳ細胞から誘導されたアストロサイト様細胞を示す。
【図７】MeCP2に対するショートヘアピンＲＮＡ（shRNA）を発現するレンチウィルスベクターを線維芽細胞由来のアストロサイト様細胞に導入した後にマウスE15.5初代培養大脳皮質ニューロンと共培養した場合の、蛍光顕微鏡による当該ニューロンの画像、及びニューロンから伸長した神経突起の長さの測定結果を示す。蛍光顕微鏡画像は、抗MAP2抗体（Sigma社）を用いてニューロンを標識して得た。図中、「w/ iA (control)」は、MECP2に対するshRNAを発現させていないアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養したもの（対照群）の結果を示す。図中、「w/ iA (shMeCP2)」は、MECP2に対するshRNAを発現させたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養したもの結果を示す。図中、「w/ iA (Rescue)」は、MECP2に対するshRNAおよび、shRNAにより発現を抑制されない野生型MECP2の両方を発現するアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養したものを示す。グラフの縦軸は、対照群におけるニューロン１細胞当たりの神経突起長さ平均に対する共培養群の神経突起長さ平均の比率を示す。
【図８】MeCP2に対するshRNAを発現するレンチウィルスベクターをｌｔ−ＮＥＳ細胞由来のアストロサイト様細胞に導入した後にマウスE15.5初代培養大脳皮質ニューロンと培養した場合の、ニューロンから伸長した神経突起の長さの測定結果を示す。縦軸は、ニューロン１細胞当たりの神経突起長さの平均を示す。図中、「w/ iA (shMeCP2)」は、MECP2に対するshRNAを発現させたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養したものの結果を示す。図中、「w/ iA (Rescue)」は、MECP2に対するshRNAおよび、shRNAにより抑制されない変異型MECP2の両方を発現するアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養したものを示す。
【図９】ヒト線維芽細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導において、ｐ１６ＩＮＫ４ａを細胞に導入した場合の結果を示す。図中、「3 factors」は、ＮＦＩＡをコードする核酸を含むレンチウィルスベクター、ＮＩＣＤをコードする核酸を含むレンチウィルスベクター、及びＴｅｔ２ＣＤをコードする核酸を含むレンチウィルスベクターを導入したヒト線維芽細胞であることを示す。図中、「+p16INK4a」は、上記３因子をコードするベクターの他に、ｐ１６ＩＮＫ４ａをコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを細胞に導入した場合の結果を示す。図中、「+Ctl」は、ｐ１６ＩＮＫ４ａをコードする核酸を含むレンチウイルスベクターの代わりに、発現させるべき遺伝子配列を含まない空のレンチウィルスベクターを用いた場合の結果を示す。左の棒グラフの縦軸(% of GFAP(+)/DAPI)は、誘導因子をコードするベクターを細胞に導入して１１日間培養した後おけるＧＦＡＰ陽性細胞数の、ＤＡＰＩ陽性細胞数に対する割合（ＧＦＡＰ陽性細胞数／ＤＡＰＩ陽性細胞数）を％表示で示す。右の棒グラフの縦軸(% of GFAP(+)/Initial cells)は、誘導因子をコードするベクターを細胞に導入して１１日間培養した後おいて回収されたＧＦＡＰ陽性細胞数の、培養開始時の初期細胞数に対する割合（ＧＦＡＰ陽性細胞数／初期細胞数）を％表示で示す。
【図１０】ヒト線維芽細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導において、細胞内のｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子をノックダウンした場合の結果を示す。図中、「3 factors」、「% of GFAP(+)/DAPI」及び「% of GFAP(+)/DAPI」の定義は、図９と同一である。図中、「+shp16INK4a」は、上記３因子をコードするベクターの他に、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｐ１６ＩＮＫ４ａ）をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを細胞に導入した場合の結果を示す。図中、「+Ctl」は、ｓｈｐ１６ＩＮＫ４ａをコードする核酸を含むレンチウイルスベクターの代わりに、ヒトには存在しない配列を標的配列とするショートヘアピンＲＮＡをコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを細胞に導入した場合の結果を示す。
【図１１】ヒト線維芽細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導において、細胞内のｐ５３遺伝子をノックダウンした場合の結果を示す。図中、「3 factors」、「% of GFAP(+)/DAPI」及び「% of GFAP(+)/DAPI」の定義は、図９と同一である。図中、「+shp53」は、３因子の他に、ｐ５３遺伝子に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｐ５３）をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを細胞に導入した場合の結果を示す。図中、「+Ctl」は、ｓｈｐ５３をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターの代わりに、ヒトには存在しない配列を標的配列とするショートヘアピンＲＮＡをコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを細胞に導入した場合の結果を示す。
【図１２】ヒト線維芽細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導において、細胞内のｐ１４ＡＲＦ遺伝子をノックダウンした場合の結果を示す。図中、「3 factors」、「% of GFAP(+)/DAPI」及び「% of GFAP(+)/DAPI」の定義は、図９と同一である。図中、「+shp14ARF」は、３因子の他に、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｐ１４ＡＲＦ）をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを細胞に導入した場合の結果を示す。図中、「+Ctl」は、ｓｈｐ１４ＡＲＦをコードする核酸を含むベクターの代わりに、ヒトには存在しない配列を標的配列とするショートヘアピンＲＮＡをコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを細胞に導入した場合の結果を示す。
【図１３】ヒト線維芽細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導において、細胞内のｐ２１遺伝子をノックダウンした場合の結果を示す。図中、「3 factors」、「% of GFAP(+)/DAPI」及び「% of GFAP(+)/DAPI」の定義は、図９と同一である。図中、「+shp21」は、３因子の他に、ｐ２１遺伝子に対するショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｐ２１）をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを細胞に導入した場合の結果を示す。図中、「+Ctl」は、ｓｈｐ２１をコードする核酸を含むベクターの代わりに、ヒトには存在しない配列を標的配列とするショートヘアピンＲＮＡをコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを細胞に導入した場合の結果を示す。
【図１４】マウスＮＩＣＤ、マウスＴｅｔ２ＣＤ、マウスＮＦＩＡ、及びマウスＲＥＳＴ／ＮＲＳＦ−ＶＰ１６のうち、１つ、２つ又は３つをマウス線維芽細胞に導入し、培養した後における、誘導されたＧＦＡＰ発現細胞の割合を示す。縦軸は、１ｃｍ2当たりのＧＦＡＰ発現細胞の数を示す。横軸には、導入された誘導因子を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の一態様は、ヒト細胞からアストロサイト様細胞をインビトロで調製する方法であって、以下の工程：（１）少なくとも２種類の誘導因子をヒト細胞に導入する工程；及び（２）前記ヒト細胞を分化誘導してアストロサイト様細胞を得る工程を含み、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記調製方法に関する。以下で、当該調製方法を「本発明のアストロサイト様細胞の調製方法」又は「本発明の調製方法」とも呼ぶ。
【００１８】
本明細書において、「アストロサイト様細胞」とは、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞をインビトロにて分化誘導することによって得られる細胞であって、アストロサイトと同様の特性を有する細胞のことである。具体的には、以下の特性を有する。
（１）アストロサイトに特異的なマーカーであるグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を発現する。
（２）ニューロンからの神経突起の成長を支援する能力を有する。
（３）グルタミン酸を取り込む能力を有する。
なお本明細書において、アストロサイト様細胞のことを、「誘導アストロサイト細胞（induced Astrocyte）」、又は「ｉＡ細胞」とも呼ぶ。
【００１９】
本明細書において「誘導因子」とは、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞及びヒト成体幹細胞をアストロサイト様細胞へと分化誘導することができるタンパク質のことである。本発明のアストロサイト様細胞の調製方法において使用される誘導因子は、ＮＦＩＡ（Nuclear factor I/A）を含み、かつＮＩＣＤ（Notch 1 intercellular domain）及びＴｅｔ２ＣＤ（Tet2 catalytic domain）の少なくとも１つを含む。具体的には、誘導因子は、ＮＦＩＡ及びＮＩＣＤを含んでも良く、ＮＦＩＡ及びＴｅｔ２ＣＤを含んでも良く、ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤを含んでもよい。好ましくは、誘導因子は、ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤを含む。誘導因子は、野生型タンパク質の他、当該野生型タンパク質のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、野生型タンパク質と同等のアストロサイト様細胞への誘導化能力を有する変異タンパク質であってもよい。例えば、誘導因子としてマウスＮＦＩＡ、マウスＮＩＣＤ及びマウスＴｅｔ２ＣＤを選択した場合、それらの野生型タンパク質（それぞれ配列番号８、９及び１０）の使用のみならず、それらの配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有し、アストロサイト様細胞への誘導化能力を有する変異タンパク質の使用も、本願発明の調製方法における誘導因子の使用に含まれる。また誘導因子は、誘導因子タンパク質それ自体の他、当該タンパク質と他のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドなどとの融合タンパク質の形態であってもよい。当該他のタンパク質、ポリペプチド又はペプチドは特に限定されないが、例えばＨｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、V5タグ、PAタグ及びＨＡタグのようなプロテインタグ、及びＨIVウィルス由来のＴＡＴペプチドのような細胞膜透過性ペプチドを含む。当該融合タンパク質がアストロサイト様細胞への誘導化能力を有する限り、当該融合タンパク質の使用も本願発明の調製方法の誘導因子の使用に含まれる。
【００２０】
本発明の調製方法で使用される誘導因子の由来は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくは霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ又はフェレット由来であり、特に好ましくはマウス又はヒト由来である。本発明の調製方法で使用される誘導因子の組み合わせは、異種由来の誘導因子の組み合わせでもよいし、同一種由来の誘導因子の組み合わせでもよい。好ましくは、本発明の調製方法で使用される誘導因子の組み合わせは、同一種由来の誘導因子の組み合わせである。
【００２１】
本明細書において「体細胞」とは、生殖系列にある細胞（例えば、卵細胞、精子細胞、卵原細胞や精原細胞等とそれらの前駆細胞）または発生初期胚由来の万能性未分化細胞（例えば胚性幹細胞）以外の、動物個体を構成する分化細胞のことである。動物個体は、成体であっても胎児や胚であってもよい。体細胞は、株化された細胞であっても、組織から単離された初代培養細胞であってもよいが、染色体数などが正常であることが好ましい。体細胞の由来となる組織や器官も特に限定されず、皮膚、肝臓、血液などを含む。体細胞の性状としては、受精細胞が有する全分化能を一部でも失った細胞であれば特に限定されず、例えば、線維芽細胞、上皮細胞、肝細胞、末梢血細胞などを含む。
【００２２】
本発明のアストロサイト様細胞の調製方法において、出発細胞として使用されるヒト体細胞としては、アストロサイト様細胞が分化誘導される細胞であれば特に限定されないが、ヒト線維芽細胞又はヒト末梢血細胞が好ましい。
【００２３】
本明細書において、「多能性幹細胞」とは、胎盤以外のすべての細胞に分化可能な分化多能性を有する細胞すべてを含み、胚性幹細胞（Embryonic Stem cell（ＥＳ細胞））及び人工多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem cells (ｉＰＳ細胞)）を含む。
【００２４】
「ＥＳ細胞」とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞のことである。
【００２５】
「ｉＰＳ細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に特定の因子を導入することにより、ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有するように再プログラミング（初期化）された細胞のことである。
【００２６】
ｉＰＳ細胞は、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃの４因子を導入することにより、初めて樹立された（Takahashi K, Yamanaka S., Cell,(2006)126:663-676）。その後、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入することにより、ヒトｉＰＳ細胞も樹立され（Takahashi K, Yamanaka S.他, Cell,(2007)131:861-872.）、さらにｃ−Ｍｙｃを含まない方法等（Nakagawa M, Yamanaka S., Nature Biotechnology,(2008)26,101-106）、腫瘍形成誘導が低いより安全性の高いｉＰＳ細胞を樹立する方法の確立にも成功している。
【００２７】
また、上記とは異なる因子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８）をヒト線維芽細胞に導入して作製された人工多能性幹細胞が報告されている（Yu J., Thomson JA.他, Science, 2007, 318:1917-1920.）。また、皮膚細胞にＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｃ−ＭＹＣ、ｈＴＥＲＴ、ｍＳＶ４０ｌａｒｇｅ Ｔの６遺伝子を導入して作製した人工多能性幹細胞が報告されている（Park IH,Daley GQ.他, Nature, 2007, 451:141-146）。このほか、ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、低分子化合物をマウス神経前駆細胞等に導入して作製された人工多能性幹細胞（Shi Y., Ding S.他, Cell Stem Cell, 2008, Vol3,Issue 5,568-574）、ＳＯＸ２，Ｃ−ＭＹＣを内因性に発現しているマウス神経幹細胞にＯＣＴ３／４，ＫＬＦ４を導入して作製された人工多能性幹細胞（Kim JB.,Scholer HR.他,Nature,(2008)454,646-650）、Ｃ−ＭＹＣを用いることなく、Ｄｎｍｔ阻害剤やＨＤＡＣ阻害剤を利用して作製された人工多能性幹細胞（Huangfu D.,Melton,DA.他,Nature Biotechnology,(2008)26,No7,795-797）が報告されている。
【００２８】
本明細書において「人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）」は、上記の定義を満たし、本発明の目的を損なわない限りにおいて、公知の人工多能性幹細胞、及びこれと等価な人工多能性幹細胞のすべてを含み、細胞源、導入因子、導入方法等は特に限定されない。
【００２９】
本明細書において、「成体幹細胞」とは、分化組織に見られる非分化細胞であり、増殖し、一以上の細胞種へ分化する能力を有する。成体幹細胞としては、例えば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。本発明のアストロサイト様細胞の調製方法で使用される成体幹細胞としては、神経幹細胞が好ましい。なお、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法で使用される成体幹細胞の由来は特に限定されず、ヒト生体から入手されたものであってもよいし、多能性幹細胞から誘導して得られたものであっても良い。本発明のアストロサイト様細胞の調製方法で使用される成体幹細胞としては、多能性幹細胞から誘導された成体幹細胞が好ましく、ヒトｉＰＳ細胞から誘導されたヒト神経幹細胞（例えばヒトｉＰＳ細胞から誘導されたｌｔ−ＮＥＳ細胞）がより好ましい。
【００３０】
本発明のアストロサイト様細胞の調製方法の一実施形態において、出発細胞であるヒト細胞は、神経系疾患患者由来の細胞であってもよい。当該神経系疾患としては、特に限定されないが、例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、自閉症、アレキサンダー病、レット症候群などが挙げられる。
【００３１】
本発明のアストロサイト様細胞の調製方法の一実施形態において、出発細胞であるヒト細胞は、神経系疾患を患っていない健常者由来の細胞であってもよい。当該健常者由来の細胞は、神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を遺伝子に導入された、健常者由来の細胞であってもよい。変異の導入は、当業者に周知の方法（例えば、CRISPR-Cas9系 (Ran, F.A.他, Cell, 2013, 154, 1380-1389)を用いるゲノム編集法、 ZFNによる遺伝子改変（Urnov, F. 他, Nature, 2005, 435, 646-651）、又はTALENによる遺伝子改変（Mahfouz, M 他, PNAS, 2011, 108, 2623-2628）)によって行うことができる。
【００３２】
本発明のアストロサイト様細胞の調製方法において、出発細胞であるヒト細胞への誘導因子の導入手法は特に限定されず、例えば、誘導因子自体を細胞へ直接導入してもよく（タンパク質導入法）、あるいは、誘導因子をコードする核酸を含む少なくとも１つのベクターをヒト細胞に導入して、誘導因子を発現させてもよい（遺伝子導入法）。
【００３３】
ヒト細胞への誘導因子の導入を、タンパク質自体の導入により行う方法は、特に限定されず、当業者に周知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）もしくは細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００３４】
一方、誘導因子をヒト細胞へ導入するための遺伝子導入法が用いられる場合、まず当業者に周知の方法を用い、誘導因子をコードする核酸をヒト細胞で発現させるための適切なプロモーターの下流に挿入した少なくとも１つのベクターを作製する。本明細書において「誘導因子をコードする核酸」は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。また、当該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは、当該核酸は二本鎖ＤＮＡ、特にｃＤＮＡである。誘導因子をコードする核酸は、発現されるタンパク質が野生型の誘導因子と同等のアストロサイト様細胞への誘導化能力を有する限り、その変異配列であってもよい。本明細書において「誘導因子をコードする核酸を含む少なくとも１つのベクター」とは、別個のベクター上に当該核酸の各々を組み込んでもよいし、１つのベクターに２種類以上、好ましくは２〜３種類の当該核酸を組み込んでもよいことを示す。
【００３５】
本発明のアストロサイト様細胞の調製方法において使用され得るベクターは特に制限されず、例えばプラスミドベクター、ウィルスベクター（例えばレトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、センダイウィルスベクター）、人工染色体ベクター、エピソーマルベクターなどが挙げられる。本発明のアストロサイト様細胞の調製方法において使用されるベクターとしては、レンチウィルスベクターが好ましい。
【００３６】
ヒト細胞へのベクターの導入方法は、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、または、ウィルス感染を介する方法等、当業者に周知のいずれの方法を用いてもよい。このように、誘導因子を発現することができるベクターをヒト細胞に導入し、そのヒト細胞で誘導因子を発現させることによって、誘導因子をヒト細胞に導入することができる。
【００３７】
誘導因子が導入されたヒト細胞を培養することによって、アストロサイト様細胞へと分化誘導することができる。用いる培地は特に限定されないが、例えばダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、アストロサイト増殖培地（AGM培地（商標）、Lonza社）を使用することができる。培養温度は、好ましくは３３〜３７℃であり、より好ましくは３７℃である。培養期間は、アストロサイト様細胞が回収できるようになる限り、特に限定されないが、通常、１〜２週間程度で回収できるようになる。
【００３８】
細胞のアポトーシス及び老化に関与するシグナル伝達経路として、ｐ１４ＡＲＦ、ＭＤＭ２、ｐ５３及びｐ２１を介するシグナル伝達経路が存在する。具体的には、ｐ１４ＡＲＦはＭＤＭ２を阻害する。また、ＭＤＭ２は、ｐ５３による転写調節を阻害したり、ｐ５３の分解を促進したり、ｐ５３の核外輸送を促進することによって、ｐ５３の活性化を阻害する。また、ｐ５３は、ｐ２１遺伝子の転写活性化によってｐ２１を活性化する。また、ｐ２１は、アポトーシス及び老化に関連する遺伝子の発現調節することによって、細胞のアポトーシス及び老化を促進する。
【００３９】
また、細胞のアポトーシス及び老化に関与する別のシグナル伝達経路として、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、Ｒｂ及びＥ２Ｆを介するシグナル伝達経路が存在する。具体的には、ｐ１６ＩＮＫ４ａは、サイクリンＤ１とＣＤＫ４／６との結合を阻害することで、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６の活性化を阻害する。また、サイクリンＤ１とＣＤＫ４／６との複合体は、Ｒｂをリン酸化することで、ＲｂとＥ２Ｆとの結合を阻害する。Ｅ２ＦはＲｂタンパク質の結合により抑制されているため、Ｒｂのリン酸化により、転写活性化作用を有する。Ｅ２Ｆはアポトーシス及び老化に関連する遺伝子の発現調節することによって、細胞のアポトーシス及び老化を抑制する。
【００４０】
上記の２つの経路におけるｐ１４ＡＲＦまたはｐ１６ＩＮＫ４ａを起点とするシグナル伝達を阻害することで、ｉＰＳ細胞又はニューロンへの誘導効率が増大することが報告されている。驚くべきことに、当該シグナル伝達を阻害することでアストロサイト様細胞への誘導効率も増大することが明らかとなった。
【００４１】
したがって、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法の工程（１）において、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害するか、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つを阻害するか、ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか、又はＭＤＭ２、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＥ２Ｆから選択される少なくとも１つを活性化することを更に含んでも良い。好ましくは、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法の工程（１）において、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害するか、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つを阻害するか、ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させることを更に含んでも良い。より好ましくは、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法の工程（１）において、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害するか、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つを阻害することを更に含んでも良い。さらに好ましくは、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法の工程（１）において、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することを更に含んでも良い。特に好ましくは、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法の工程（１）において、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子及びｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害することを更に含んでも良い。
【００４２】
ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する方法は特に限定されず、当業者に周知の任意の方法により行うことができる。例えば核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉＲＮＡなどの、ＲＮＡｉを引き起こすもの）をヒト細胞に導入することによって行われても良い。また、CRISPR-Cas9系 (Ran, F.A.他, Cell, 2013, 154, 1380-1389)を用いるゲノム編集によるノックアウト、ZFNを用いる遺伝子改変（Urnov, F. 他, Nature, 2005, 435, 646-651）によるノックアウト、又はTALENを用いる遺伝子改変（Mahfouz, M 他, PNAS, 2011, 108, 2623-2628）) によるノックアウトにより行われても良い。上記遺伝子の発現の阻害は、好ましくは標的遺伝子をノックダウンするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを用いて行われ、より好ましくはｓｈＲＮＡを用いて行われる。
【００４３】
上記遺伝子の発現の阻害がｓｈＲＮＡを用いて行われる場合、特に限定されないが、好ましくは、配列番号１４で示される塩基配列を有するＤＮＡ若しくは配列番号１５で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるＲＮＡ（ｐ１４ＡＲＦ遺伝子をノックダウンするｓｈＲＮＡ）、配列番号１６で示される塩基配列を有するＤＮＡ若しくは配列番号１７で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるＲＮＡ（ｐ５３遺伝子遺伝子をノックダウンするｓｈＲＮＡ）、配列番号１８で示される塩基配列を有するＤＮＡ若しくは配列番号１９で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるＲＮＡ（ｐ２１遺伝子をノックダウンするｓｈＲＮＡ）、又は、配列番号２０で示される塩基配列を有するＤＮＡ若しくは配列番号２１で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるＲＮＡ（ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子をノックダウンするｓｈＲＮＡ）を用いて行われる。
【００４４】
ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つを阻害する方法は特に限定されず、当業者に周知の任意の方法により行うことができる。例えば、ｐ５３を阻害するｐ５３ドミナントネガティブ変異体、不活性型Ｒｂ変異体、及びピフィスリン−α（ｐ５３の転写阻害剤）などをヒト細胞に導入することによって行われても良い。
【００４５】
ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させる方法は特に限定されず、当業者に周知の任意の方法により行うことができる。例えば、上記遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いて、ヒト細胞内でこれらの遺伝子を強制発現させること、または、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ１２８などの転写活性化因子と融合した不活性型ＺＦＮヌクレアーゼ（Sanchez, JP.他, Plant Biotechnol J, 2006, 4(1), 103-114）、不活性型ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ（Perez-Pinera, P. 他, Nat Methods, 2013, 10, 239-242）もしくは不活性型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Konermann, S.他, Nature, 2015, 517, 583-588）を利用し、上記遺伝子の内在性の転写産物を増加させることにより行われても良い。
【００４６】
ＭＤＭ２、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＥ２Ｆから選択される少なくとも１つを活性化する方法は特に限定されず、当業者に周知の任意の方法により行うことができる。
【００４７】
上記の遺伝子の発現阻害及び増大、並びに当該遺伝子の遺伝子産物の阻害及び活性化は、誘導因子のヒト細胞への導入と同時に行われても良いし、またそれと前後して行われても良い。
【００４８】
本発明の一態様は、本発明の調製方法により調製される、アストロサイト様細胞に関する。本発明の一実施形態は、以下の工程：（１）少なくとも２種類の誘導因子をヒト細胞に導入する工程；及び（２）前記ヒト細胞を分化誘導してアストロサイト様細胞を得る工程、を含む方法により調製されるアストロサイト様細胞であって、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記アストロサイト様細胞に関する。
【００４９】
例えば、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法における出発細胞として、神経系疾患患者由来の細胞が使用される場合、又は神経系疾患患者由来の細胞に特異的に存在する変異が人為的に導入された健常者の細胞が使用される場合、調製されたアストロサイト様細胞は、当該神経系疾患固有の遺伝的特性を保持している。したがって当該アストロサイト様細胞は、神経系疾患モデルとして、当該神経系疾患の発症原因や病態進展機序の解明のために利用することができる。また当該アストロサイト様細胞を利用して、当該神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価することができ、創薬研究のために利用することができる。
【００５０】
本発明の一態様は、神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：（１）神経系疾患患者由来の細胞から、又は神経系疾患患者由来の細胞に特異的に存在する変異が導入された健常者由来の細胞から、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；及び、（２）前記アストロサイト様細胞と被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程を含む、前記方法に関する。当該神経系疾患としては、特に限定されないが、例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、自閉症、アレキサンダー病、レット症候群などが挙げられる。
【００５１】
健常者由来の細胞から本発明の調製方法により調製されるアストロサイト様細胞は、神経系疾患関連遺伝子がノックアウト又はノックダウンされてもよい。本明細書において、「神経系疾患関連遺伝子」とは、当該遺伝子が突然変異などによって正常に機能しなくなることで、神経系疾患を直接的又は間接的に引き起こすことが明らかな、又は引き起こす可能性がある遺伝子のことである。ノックアウト又はノックダウンは、当業者に周知の方法（例えば、CRISPR-Cas9系 (Ran, F.A.他, Cell, 2013, 154, 1380-1389)を用いるゲノム編集によるノックアウト、ZFNを用いる遺伝子改変（Urnov, F. 他, Nature, 2005, 435, 646-651）によるノックアウト、TALENを用いる遺伝子改変（Mahfouz, M 他, PNAS, 2011, 108, 2623-2628）によるノックアウト、及び、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを用いるＲＮＡｉによるノックダウン）によって行うことができる。得られたアストロサイト様細胞は、神経系疾患モデルとして利用することができる。
【００５２】
本発明の一態様は、神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：（１）健常者由来の細胞から、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞において、神経系疾患関連遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程；及び（３）工程（２）で得られたアストロサイト様細胞と被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程を含む、前記方法に関する。当該神経系疾患としては、特に限定されないが、例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、自閉症、アレキサンダー病、レット症候群などが挙げられる。
【００５３】
本発明の一態様は、本発明の調製方法により調製されるアストロサイト様細胞とニューロンとを含む、インビトロの神経組織モデルに関する。以下で、当該神経組織モデルを「本発明の神経組織モデル」とも呼ぶ。
【００５４】
本発明の神経組織モデルにおいて使用されるアストロサイト様細胞は、神経系疾患患者由来の細胞から分化誘導された細胞あってもよく、健常者由来の細胞から分化誘導された細胞であってもよく、又は神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞であってもよい。
【００５５】
また、本発明の神経組織モデルにおいて使用されるアストロサイト様細胞は、健常者由来の細胞から分化誘導された細胞であって、神経系疾患関連遺伝子がノックアウト又はノックダウンされた細胞であってもよい。
【００５６】
本発明の神経組織モデルにおいて使用されるニューロンは、哺乳動物由来のニューロンである限り特に限定はないが、例えばマウスニューロン又はヒトニューロンである。また、ニューロンは、神経系疾患患者由来のニューロンであってもよく、健常者由来のニューロンであってもよく、神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を遺伝子に導入された健常者由来のニューロンであってもよい。またニューロンは、神経系疾患患者由来の多能性幹細胞又は成体幹細胞から分化誘導されたニューロンであってもよく、健常者由来の多能性幹細胞又は成体幹細胞から分化誘導されたニューロンであってもよい。
【００５７】
本発明の神経組織モデルは、本発明の調製方法により調製されるアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養することで得られる。共培養において用いられる培地は特に限定されないが、神経細胞が生存可能な培地が望ましい。例えば、Gibco （登録商標） B27（登録商標） Supplement (Thermo Fisher Scientific社)を添加したNeurobasal （登録商標） 培地 (Life Technologies社)やN2 supplement (Thermo Fisher Scientific社)やB27 （登録商標） Supplementを添加したDMEM/F12培地を使用することができる。培養温度は、好ましくは３３〜３７℃であり、より好ましくは３７℃である。培養期間は、特に限定されないが、通常、１〜２週間程度で解析可能である。
【００５８】
本発明の一態様は、神経組織モデルを調製する方法であって、以下の工程：（１）少なくとも２種類の誘導因子をヒト細胞に導入する工程；（２）前記ヒト細胞を分化誘導してアストロサイト様細胞を得る工程；及び、（３）工程（２）で得られたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養する工程、を含み、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記調製方法に関する。
【００５９】
本発明の一態様は、神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：（１）神経系疾患患者由来の細胞、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞から、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養して、神経組織モデルを調製する工程；（３）工程（２）で得られた神経組織モデルと被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程を含む、前記方法に関する。また、本発明の一態様は、神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：（１）健常者由来の細胞から、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞において、神経系疾患関連遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程；（３）工程（２）で得られたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養して、神経組織モデルを調製する工程；（４）工程（３）で得られた神経組織モデルと被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程を含む、前記方法に関する。神経系疾患としては、特に限定されないが、例えばアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、自閉症、アレキサンダー病、レット症候群などが挙げられる。
【００６０】
本発明の一態様は、少なくとも２種類の誘導因子、又は前記誘導因子をコードする核酸を含む少なくとも１つのベクターを成分として含む、ヒト細胞からアストロサイト様細胞への誘導剤であって、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記誘導剤に関する（以下、「本発明の誘導剤」とも呼ぶ）。本発明の誘導剤は、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法において使用することができる。例えば、当該誘導剤をヒト細胞と接触させて、誘導因子、又は誘導因子をコードする核酸を含む少なくとも１つのベクターを当該細胞へ導入し、その後適当な条件で培養することで当該細胞をアストロサイト様細胞へと分化誘導することができる。
【００６１】
本発明の一態様は、少なくとも２種類の誘導因子、又は前記誘導因子をコードする核酸を含む少なくとも１つのベクター；及び、本発明のアストロサイト様細胞の調製方法が記載された取扱説明書を含む、ヒト細胞からアストロサイト様細胞への誘導キットであって、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記キットに関する（以下、「本発明のキット」とも呼ぶ）。本発明のキットにおける取扱説明書は、本発明のキットに同梱されることなくウェブ上で提供される形態であってもよい。
【００６２】
本発明のキットは、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現阻害剤、及び／又は、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つの阻害剤、及び／又は、ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現増強剤、及び／又は、ＭＤＭ２、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＥ２Ｆから選択される少なくとも１つの活性化剤をさらに含んでもよい。好ましくは、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現阻害剤、及び／又は、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つの阻害剤、及び／又は、ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現増強剤をさらに含んでもよい。より好ましくは、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現阻害剤、及び／又は、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つの阻害剤をさらに含んでもよい。さらに好ましくは、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現阻害剤をさらに含んでもよい。特に好ましくは、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子及びｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現阻害剤をさらに含んでもよい。
【００６３】
ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子の発現阻害剤並びにこれらの遺伝子の遺伝子産物の阻害剤としては特に限定されないが、当該遺伝子の発現を阻害するために使用され得るものとして上で挙げたもの（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ（例えば、配列番号１４〜２１で示される塩基配列を有するＤＮＡによりコードされるＲＮＡ）及びｍｉＲＮＡのような核酸）、及び当該遺伝子産物を阻害するために使用され得るものとして上で挙げたもの（例えば、ｐ５３ドミナントネガティブ変異体、不活性型Ｒｂ変異体、及びピフィスリン−α）を使用することができる。
【００６４】
ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子の発現増強剤並びにこれらの遺伝子の遺伝子産物の活性化剤としては、特に限定されないが、当該遺伝子の発現を増加させるために使用され得るものとして上で挙げたもの（例えば、これらの遺伝子の発現ベクター、不活性型ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、不活性型ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ及び不活性型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）、及び当該遺伝子産物の活性化を行うことができるものとして当業者に周知のものを使用することができる。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例及び参考例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６６】
実施例１  ヒト線維芽細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導
（１）誘導因子をコードする核酸を含むレンチウィルスベクターの作製
ＮＦＩＡをコードする核酸（配列番号１）を含むレンチウィルスベクター、ＮＩＣＤをコードする核酸（配列番号２）を含むレンチウィルスベクター、及びＴｅｔ２ＣＤをコードする核酸（配列番号３）を含むレンチウィルスベクターをそれぞれ作製した。具体的には、CBhプロモーター下流において誘導因子（ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ又はＴｅｔ２ＣＤ）を発現するレンチウイルスプラスミドを、pCAG-HIVgpおよびpCMV-VSV-G-RSV-Revプラスミド（理化学研究所 三好浩之 博士より入手）と共に、Gibco（登録商標）FreeStyle（商標） 293 Expression Medium（Invitrogen社製）（以下、単に「Freestyle (商標)」とも呼ぶ）中で293T細胞に導入した。導入16〜20時間後、培地を新鮮な培地と交換した。さらに48時間培養した後、培養上清を0.45μmフィルターを用いて濾過した。得られた上清は原液、もしくは濃縮した後に、レンチウイルスベクターとして各種細胞に導入した。【００６７】
（２）ヒト線維芽細胞へのレンチウィルスベクターの導入及び分化誘導
ヒト成人線維芽細胞（NHDF-Ad, Lonza社）を含むDMEM培地を、6ウェルのプレートまたは10cmのディッシュにそれぞれ5×104細胞／ウェルまたは3×105細胞／ディッシュの密度で播種した。播種の24時間後、培地を、（１）で調製したレンチウィルスベクターと4μg/mLのポリブレンを含む培地と交換した。感染の16〜20時間後、培地を新鮮な培地と交換した。細胞を培地中でさらに48時間維持した後、AGM培地（商標）（Lonza社）を用いて増殖させた。当該培地は、分析するまで3日ごとに交換した。分析は、感染後2〜3週間後に行った。【００６８】
（３）免疫細胞化学法による分析
Kohyama, J. 他，The Journal of cell biology, 2010, 189, 159-170に記載の方法にしたがって、得られたアストロサイト様細胞の免疫細胞化学法による分析を行った。具体的には、細胞を室温にて4%パラフォルムアルデヒドで固定した。固定後、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)で細胞を洗浄後、１次抗体入り0.3%Triton/5%FBS/PBS溶液(抗体希釈溶液)で細胞を室温で３時間、もしくは4度で一晩処理した。１次抗体処理後、細胞をPBSで洗浄したのち、蛍光マーカーを結合した２次抗体入りの抗体希釈溶液で、室温で60〜90分処理し、PBS洗浄した。核はDAPIもしくはHoechstで染色した。染色した細胞はスライドガラスにマウントした。【００６９】
（４）結果
ＮＦＩＡをヒト線維芽細胞へと導入した場合、ＧＦＡＰ発現細胞は観察されなかった。なお、マウス神経線維芽細胞を用いた場合にはＮＦＩＡのみを導入することで、ＧＦＡＰ発現細胞へと分化誘導することができた（以下の参考例１を参照）。
ＮＦＩＡ及びＮＩＣＤをヒト線維芽細胞へと導入した場合、ＮＦＩＡ及びＴｅｔ２ＣＤをヒト線維芽細胞へと導入した場合、並びにＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤをヒト線維芽細胞へと導入した場合において、ＧＦＡＰを発現するアストロサイト様細胞へと分化誘導することができた。特に、３つの誘導因子を導入した場合には、45.1％と高効率でアストロサイト様細胞へと分化誘導することができた（図１）。
得られたアストロサイト様細胞は、線維芽細胞であれば通常発現している平滑筋アクチン（ＳＭＡ）を発現していないことが確認された。【００７０】
実施例２
アストロサイト様細胞とニューロンとを共培養した場合における、ニューロンからの神経突起の長さの定量
アストロサイトの機能的特徴として、ニューロンからの神経突起の成長を支援する能力が挙げられる。実施例１で得られたアストロサイト様細胞が当該機能を有することを明らかとするために、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ｎｅｏ）及びヒト成人皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ａｄ）（いずれもLonza 社より購入）を出発細胞として、実施例１に記載の方法と同様にして、ＮＦＩＡのｃＤＮＡ（配列番号１）を組み込んだレンチウィルスベクター、ＮＩＣＤのｃＤＮＡ（配列番号２）を組み込んだレンチウィルスベクター、及びＴｅｔ２ＣＤのｃＤＮＡ（配列番号３）を組み込んだレンチウィルスベクターを導入し、２〜３週間培養して分化誘導したアストロサイト様細胞を、Millicell セルカルチャーインサート（２４穴、ＰＣＦ膜、0.4 μm、Millipore社より購入）内に播種し、37℃で一日培養した。また、E15.5マウス由来大脳皮質ニューロンを、Gibco（登録商標）B27（登録商標） Supplementを添加したDMEM/F12培地を用いてガラスカバースリップ上に播種し、37℃で一日培養した。アストロサイト様細胞を播種したMillicell セルカルチャーインサート内の培地を B27/ DMEM/ F12培地に置換した後、Millicell セルカルチャーインサートをカバースリップ上に３日間セットし、37℃で共培養を行った。対照群として、ヒト新生児線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ｎｅｏ）、ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ａｄ）及びヒト初代培養アストロサイト（ＨＮＡ）のそれぞれをE15.5マウス由来の大脳皮質ニューロンと共培養したものを用いた。なお、神経突起の長さの定量は、抗MAP2抗体（Sigma社）を用いてニューロンを標識した後に、蛍光顕微鏡によって画像を取得し、ニューロンJプラグインを有するImage Jソフトウエア（Meijering 他, Journal of the International Society for Analytical Cytology, 2004, 58, 167-176）を用いて行った。結果を図２に示す。アストロサイト様細胞とニューロンとを共培養した場合において、対照群である線維芽細胞とニューロンと共培養した場合と比較して、ニューロンからの神経突起の伸長促進が有意に認められた。【００７１】
実施例３
アストロサイト様細胞のグルタミン酸取り込み能力の測定
アストロサイトの機能的特徴として、グルタミン酸を取り込む能力が挙げられる。実施例１で得られたアストロサイト様細胞が当該機能を有することを明らかとするために、以下の実験を行った。ヒト成人皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ａｄ）、実施例１においてＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤを導入して得られたアストロサイト様細胞およびヒト初代培養アストロサイトをpoly-L-Lysine (Sigma社)でコートした24ウェルプレートに播種した。各種細胞を、Ｌ−グルタミン酸(Nacalai社)およびトリチウム標識したL-グルタミン酸(L-[2,3,4-3H])(American Radiolabeled Chemicals Inc.社)を添加した、ナトリウムイオン含有緩衝液もしくはナトリウムイオン不含緩衝液を用いて、37℃にてインキュベートした。インキュベート後、ナトリウムイオン不含緩衝液を用いて細胞を洗浄し、0.1N NaOH 溶液を用いて細胞を溶解した。細胞溶解液を液体シンチレーションカクテル(National Diagnostics社)と混合し、液体シンチレーションカウンターを用いて放射線量を測定した。また、各種細胞の総タンパク質量をBCA法にて定量した。グルタミン酸取り込み量は、ナトリウムイオン依存性取り込み量を、総タンパク質量にて補正し、評価した。結果を図３に示す。【００７２】
実施例４  ヒトｌｔ−ＮＥＳ細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導
ヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞から誘導された神経幹細胞は、アストロサイト様細胞への分化に抵抗することが知られている（Falk, A. 他, PloS ONE , 2012, Vol. 7 (1), e29597）。そのような神経幹細胞に対して、本願発明で使用される誘導因子を導入することによる効果を試験した。【００７３】
出発細胞として、ヒトｉＰＳ細胞から誘導したｌｔ−ＮＥＳ細胞（Austin Smith 博士、ケンブリッジ大学より入手）を用いた。ｌｔ−ＮＥＳ細胞は、発達している脳内で、初期神経上皮細胞として、安定した増殖可能な能力と特性を維持する。ｌｔ−ＮＥＳ細胞は、グリア形成特性がより弱いことが知られている（Falk, A. 他, PloS ONE , 2012, Vol. 7 (1), e29597）。【００７４】
ＮＦＩＡのｃＤＮＡを組み込んだプラスミドベクター、ＮＩＣＤのｃＤＮＡを組み込んだプラスミドベクター、及びＴｅｔ２ＣＤのｃＤＮＡを組み込んだプラスミドベクター（Cell Biolabs, Incより入手）を用いて、以下のようにしてレトロウィルスベクターを作製した。
上記プラスミドベクターをFreeStyle（商標）中でＰｌａｔ−Ｅ細胞に導入した。導入16〜20時間後、培地を新鮮な培地と交換した。さらに48時間培養した後、培養上清を0.45μmフィルターを用いて濾過した。得られた上清は原液、もしくは濃縮した後に、レトロウイルスベクターとして本実施例で使用した。
UbCプロモーター下流においてマウスSlc7a1を発現するレンチウイルスプラスミド (Takahashi, K.他, Cell, 2007,131(5) :861-72.)、pCAG-HIVgpおよびpCMV-VSV-G-RSV-Revプラスミドと共にFreeStyle（商標）中で293T細胞に導入し、作成されたレンチウイルスをｌｔ−ＮＥＳ細胞に導入した。
その後、当該ｌｔ−ＮＥＳ細胞を含む培地(1% N2 Supplement, 0.1% B27 Supplementを含むDMEM/F12培地（以下、「ｌｔ−ＮＥＳ用培地」とも呼ぶ））に、上記で調製したレトロウィルスベクターを加え、37℃で24時間培養し、その後1%FBSを含むｌｔ−ＮＥＳ用培地へと培地交換し、ＧＦＡＰを発現するアストロサイト様細胞を調製した。レトロウィルスベクターを導入して一週間経過後におけるＧＦＡＰ発現細胞の割合は全体の２０％超であった。さらに、２週間経過後においては、ほぼ全てのｌｔ−ＮＥＳ細胞がＧＦＡＰ発現細胞へと誘導された（図４）。【００７５】
実施例５  ヒトｉＰＳ細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導
ヒトｉＰＳ細胞（京都大学ｉＰＳ細胞研究所より入手）を、iMatrix-511(株式会社ニッピより購入)を用いてコーティングした培養容器、およびAK03培地(味の素株式会社より購入)を用いて維持培養した。実施例１（１）と同様にして、誘導因子をコードする核酸を含むレンチウイルスベクターを調製し、ヒトｉＰＳ細胞に導入した。レンチウィルスベクターを導入したiPS細胞は、導入72時間後に、AGM培地を用い、iMatrix-511コーティングしていない培養容器へ継代した。培地を3〜4日毎に交換し、ヒトｉＰＳ細胞からＧＦＡＰを発現するアストロサイト様細胞を調製した。なお、誘導因子としては、ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの３種類を使用した。ベクターを導入して２週間経過後におけるＧＦＡＰ発現細胞の割合は全体の約８０％であった。【００７６】
実施例６  ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤをコードする核酸を全て含むウィルスベクター、もしくはエピソーマルベクターを用いた、アストロサイト様細胞の調製
（１）Ｔｅｔ２ＣＤ、ＮＦＩＡ及びＮＩＣＤのｃＤＮＡをporcine teschovirus-1由来2AペプチドｃＤＮＡを用いて連結した。この配列を組み込んだレンチウイルスベクターをヒト成体線維芽細胞（NHDF-Ad, Lonza社）に導入し、１１日間培養した。得られた細胞は、ＧＦＡＰ陽性であった。蛍光顕微鏡写真を図５に示す。
（２）Ｔｅｔ２ＣＤおよびＮＦＩＡ、ＮＩＣＤのｃＤＮＡをporcine teschovirus-1由来2AペプチドｃＤＮＡを用いて連結し、この配列を組み込んだエピソーマルベクターを調製した。
その後、当該ｌｔ−ＮＥＳ細胞に、上記で調製されたエピソーマルベクターを導入し、1%FBSを含むｌｔ−ＮＥＳ用培地を用いて７日間培養した。その後、AGM培地を用いてさらに７日間培養した。得られた細胞はＧＦＡＰ陽性であった。蛍光顕微鏡写真を図５に示す。【００７７】
実施例７  アレキサンダー病のインビトロ疾患モデルの作製
アレキサンダー病は、ＧＦＡＰ遺伝子変異によって起こる疾患であることが知られている（Brenner, M. 他, Nature genetics, 2001, 27, 117-120）。アレキサンダー病患者のＧＦＡＰ遺伝子は、当該遺伝子中のミスセンス点変異（C715T）によって、ＧＦＡＰのアルギニン２３９がシステインへ変異している（R239C）。また、アレキサンダー病患者のアストロサイトにおいて、αＢクリスタリン（CRYAB）の発現が亢進することが知られている（Der Perng, M.他, American journal of human genetics, 2006, 79, 197-213）。また、アレキサンダー病患者のアストロサイトでは、変異ＧＦＡＰタンパク質が凝集してローゼンタール線維が生じることが知られている (Dinda, A.K.他, Acta neuropathologica, 1990, 79,456-460)。【００７８】
アレキサンダー病のインビトロ疾患モデルにおいて、本願発明のアストロサイト様細胞が使用できるか否かを試験した。
CRISPR-Cas9系 (Ran, F.A.他, Cell, 2013, 154, 1380-1389)を用いて、ＧＦＡＰ遺伝子中にミスセンス点変異（C715T）を有するｌｔ−ＮＥＳ細胞を調製した。その後当該細胞に、実施例４と同様にして、ＮＦＩＡをコードする核酸を含むレトロウイルスベクター、ＮＩＣＤをコードする核酸を含むレトロウイルスベクター、及びＴｅｔ２ＣＤをコードする核酸を含むレトロウイルスベクターを導入し、ＧＦＡＰを発現するアストロサイト様細胞を調製した。【００７９】
得られたアストロサイト様細胞では、対照群（ミスセンス点変異（Ｃ７１５Ｔ）を導入する前のｌｔ−ＮＥＳ細胞から誘導されたアストロサイト様細胞）と比較して有意に高いＣＲＹＡＢの発現が認められた（図６）。さらに、得られたアストロサイト様細胞では、ローゼンタール線維が観察された。得られたアストロサイト様細胞は、アレキサンダー病のインビトロ疾患モデルとして、当該疾患の分子機構や病因の解明、及び当該疾患治療薬のスクリーニングのために利用することができる。【００８０】
実施例８  レット症候群のインビトロ疾患モデルの作製
レット症候群はX染色体上に存在するMECP2遺伝子の変異によって引き起こされる。マウス遺伝子に関する最近の知見では、アストロサイトがレット症候群の発症に重要な役割を果たしていることが示唆されている（Ballas, N 他, Nature neuroscience, 2009, 12, 311-317；Nguyen, M.V. 他, The Journal of neuroscience, 2012, 32, 10021-10034）。また、レット症候群患者に由来するiPS細胞から誘導されたアストロサイト様細胞は、ニューロンの成熟に不利な影響を与えることが報告されている（Williams他、 Hum Mol Genet. 2014 Jun 1; 23(11): 2968-80）。【００８１】
レット症候群のインビトロ疾患モデルにおいて、本願発明のアストロサイト様細胞が使用できるか否かを試験した。
実施例１においてＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤを導入して調製されたヒト成人線維芽細胞由来のアストロサイト様細胞、及び実施例４で調製されたｌｔ−ＮＥＳ細胞由来のアストロサイト様細胞において、ＭＥＣＰ２タンパク質の発現を抑制するために、レンチウイルスによりＭＥＣＰ２の標的配列（配列番号２４）に対するｓｈＲＮＡを発現させた。また、当該ｓｈＲＮＡと同時に当該ｓｈＲＮＡにより抑制されない変異型ＭＥＣＰ２を発現するレンチウイルスを導入した。これらの細胞を用い、Ｅ１５．５マウス由来の大脳皮質ニューロンと共に３日間培養した。結果を図７及び８に示す。【００８２】
ＭＥＣＰ２に対するｓｈＲＮＡを発現させたアストロサイト様細胞上に播種したニューロンは、対照群と比較して、優位に神経突起の伸長が阻害された。ＭＥＣＰ２に対するｓｈＲＮＡを発現させたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養した神経組織モデルは、レット症候群のインビトロ疾患モデルとして、当該疾患の分子機構や病因の解明、及び当該疾患治療薬のスクリーニングのために利用することができる。【００８３】
実施例９  ヒト成人線維芽細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導における、ｐ１６ＩＮＫ４ａの影響
ｐ１６ＩＮＫ４ａのｃＤＮＡ（配列番号２５）を組み込んだレンチウィルスベクターを、実施例１（１）と同様にして調製した。また、当該ｃＤＮＡを組みこんでいない空のレンチウィルスベクターを調製してコントロールとして用いた。【００８４】
調製されたレンチウィルスベクターを、実施例１（１）で調製したＮＦＩＡのｃＤＮＡ（配列番号１）を組み込んだレンチウィルスベクター、ＮＩＣＤのｃＤＮＡ（配列番号２）を組み込んだレンチウィルスベクター、及びＴｅｔ２ＣＤのｃＤＮＡ（配列番号３）と共にヒト成人皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ａｄ）（Lonza 社より購入）に導入し、１１日間培養した。培養後のＧＦＡＰ陽性細胞数とＤＡＰＩ陽性細胞数との割合、及び培養後のＧＦＡＰ陽性細胞数と培養開始時の初期細胞数との割合を図９に示す。ｐ１６ＩＮＫ４ａを導入した場合、ヒト成人線維芽細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導効率がコントロールと比較して有意に減少した。【００８５】
実施例１０  ヒト成人線維芽細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導における、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子及びｐ２１遺伝子のノックダウンの影響
ｐ１４ＡＲＦ遺伝子に対するｓｈＲＮＡをコードする核酸（配列番号１４及び１５）を組みこんだレンチウィルスベクター、ｐ５３遺伝子に対するｓｈＲＮＡをコードする核酸（配列番号１６及び１７）を組みこんだレンチウィルスベクター、ｐ２１遺伝子に対するｓｈＲＮＡをコードする核酸（配列番号１８及び１９）を組みこんだレンチウィルスベクター、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子に対するｓｈＲＮＡをコードする核酸（配列番号２０及び２１）を組みこんだレンチウィルスベクター、及びヒト成人線維芽細胞の遺伝子中には存在しない塩基配列を標的とするｓｈＲＮＡをコードする核酸（配列番号２２及び２３）を組みこんだレンチウィルスベクター（コントロール）を、実施例１（１）と同様にして調製した。【００８６】
調製された上記レンチウィルスベクターをそれぞれ、実施例１（１）で調製したＮＦＩＡのｃＤＮＡ（配列番号１）を組み込んだレンチウィルスベクター、ＮＩＣＤのｃＤＮＡ（配列番号２）を組み込んだレンチウィルスベクター、及びＴｅｔ２ＣＤのｃＤＮＡ（配列番号３）と共にヒト成人皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ａｄ）（Lonza 社より購入）に導入し、１１日間培養した。培養後のＧＦＡＰ陽性細胞数とＤＡＰＩ陽性細胞数との割合、及び培養後のＧＦＡＰ陽性細胞数と培養開始時の初期細胞数との割合を図１０〜１３に示す。コントロールのｓｈＲＮＡを導入した場合と比較して、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ１４ＡＲＦ遺伝子及びｐ２１遺伝子をノックダウンするｓｈＲＮＡを導入した場合において、ヒト成人線維芽細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導効率が有意に上昇した。【００８７】
参考例１  マウス線維芽細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導
誘導因子候補として、マウスＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ、Ｔｅｔ２ＣＤ、ＲＥＳＴ／ＮＲＳＦ−ＶＰ１６を選択した。これらの各誘導因子をコードする核酸（それぞれ、配列番号１〜４）を含むレトロウィルスベクターを、実施例４と同様にして調製した。当該レトロウィルスベクターをマウス胚性線維芽細胞（MEF）に導入した。導入において、上記レトロウィルスベクターのうちの１種類を用いるか、又はそれらのうちの２種類又は３種類を組み合わせて用いた。ＧＦＡＰの発現を因子の導入の４日後に調べた。ＧＦＡＰ発現細胞の割合を図１４に示す。【００８８】
マウス線維芽細胞からアストロサイト様細胞への分化誘導には、誘導因子としてＮＦＩＡのみで十分であった。また、ＮＦＩＡと他の因子とを組み合わせることで、分化誘導効率が上昇することが明らかとなった。【００８９】
以下に本願実施例及び参考例にて使用された核酸の塩基配列、並びに本願発明において使用され得るペプチドのアミノ酸配列及び核酸の塩基配列を示す。【００９０】
配列番号１：マウスＮＦＩＡのｃＤＮＡの塩基配列。配列中、下線部はＨＡタグ配列を示す。
【化１】
2017057523.tif 000003
【００９１】
配列番号２：マウスＮＩＣＤのｃＤＮＡ配列。配列中、波線部はＭｙｃタグ配列を示し、下線部はリンカー配列を示す。
【化２】
2017057523.tif 000004
【化３】
2017057523.tif 000005
【００９２】
配列番号３：マウスＴｅｔ２ＣＤのｃＤＮＡの塩基配列。配列中、下線部はＦＬＡＧタグ配列を示す。
【化４】
2017057523.tif 000006
【化５】
2017057523.tif 000007
【００９３】
配列番号４：ｍＲＥＳＴ／ＮＲＳＦ−ＶＰ１６のｃＤＮＡの塩基配列。配列中、破線部はＦＬＡＧタグ配列を示し、下線部はｍＲＥＳＴ／ＮＲＳＦをコードする配列を示し、波線部はリンカー配列を示し、イタリック部分はＶＰ１６をコードする配列を示す。
【化６】
2017057523.tif 000008
【００９４】
配列番号５：ヒトＮＦＩＡのｃＤＮＡの塩基配列(NM_001145511.1)。
【化７】
2017057523.tif 000009
【００９５】
配列番号６：ヒトＮＩＣＤのｃＤＮＡの塩基配列(NM_017617.4の一部)。
【化８】
2017057523.tif 000010
【化９】
2017057523.tif 000011
【００９６】
配列番号７：ヒトＴｅｔ２ＣＤのｃＤＮＡの塩基配列(NM_001127208.2の一部)。
【化１０】
2017057523.tif 000012
【化１１】
2017057523.tif 000013
【００９７】
配列番号８：マウスＮＦＩＡのアミノ酸配列(NP_035035.1)。
【化１２】
2017057523.tif 000014
【００９８】
配列番号９：マウスＮＩＣＤのアミノ酸配列(NP_032740.3の一部)。
【化１３】
2017057523.tif 000015
【００９９】
配列番号１０：マウスＴｅｔ２ＣＤのアミノ酸配列(NP_001035490.2の一部)。
【化１４】
2017057523.tif 000016
【０１００】
配列番号１１：ヒトＮＦＩＡのアミノ酸配列(NP_001138983.1)。
【化１５】
2017057523.tif 000017
【０１０１】
配列番号１２：ヒトＮＩＣＤのアミノ酸配列(NP_060087.3)。
【化１６】
2017057523.tif 000018
【０１０２】
配列番号１３：ヒトＴｅｔ２ＣＤのアミノ酸配列(NP_001120680.1)。
【化１７】
2017057523.tif 000019
【０１０３】
配列番号１４：ｓｈｐ１４ＡＲＦをコードするＤＮＡのフォアード鎖の塩基配列。配列中、大文字部分が標的に対して相補的な部分を示す。
【化１８】
2017057523.tif 000020
【０１０４】
配列番号１５：ｓｈｐ１４ＡＲＦをコードするＤＮＡのリバース鎖の塩基配列。配列中、大文字部分が標的に対して相補的な部分を示す。
【化１９】
2017057523.tif 000021
【０１０５】
配列番号１６：ｓｈｐ５３をコードするＤＮＡのフォアード鎖の塩基配列。配列中、大文字部分が標的に対して相補的な部分を示す。
【化２０】
2017057523.tif 000022
【０１０６】
配列番号１７：ｓｈｐ５３をコードするＤＮＡのリバース鎖の塩基配列。配列中、大文字部分が標的に対して相補的な部分を示す。
【化２１】
2017057523.tif 000023
【０１０７】
配列番号１８：ｓｈｐ２１をコードするＤＮＡのフォアード鎖の塩基配列。配列中、大文字部分が標的に対して相補的な部分を示す。
【化２２】
2017057523.tif 000024
【０１０８】
配列番号１９：ｓｈｐ２１をコードするＤＮＡのリバース鎖の塩基配列。配列中、大文字部分が標的に対して相補的な部分を示す。
【化２３】
2017057523.tif 000025
【０１０９】
配列番号２０：ｓｈｐ１６ＩＮＫ４ａをコードするＤＮＡのフォアード鎖の塩基配列。配列中、大文字部分が標的に対して相補的な部分を示す。
【化２４】
2017057523.tif 000026
【０１１０】
配列番号２１：ｓｈｐ１６ＩＮＫ４ａをコードするＤＮＡのリバース鎖の塩基配列。配列中、大文字部分が標的に対して相補的な部分を示す。
【化２５】
2017057523.tif 000027
【０１１１】
配列番号２２：実施例１０においてコントロールとして使用したｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡのフォアード鎖の塩基配列。配列中、大文字部分が標的に対して相補的な部分を示す。
【化２６】
2017057523.tif 000028
【０１１２】
配列番号２３：実施例１０においてコントロールとして使用したｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡのリバース鎖の塩基配列。配列中、大文字部分が標的に対して相補的な部分を示す。
【化２７】
2017057523.tif 000029
【０１１３】
配列番号２４：実施例８において使用したｓｈＲＮＡが標的とする、ＭＥＣＰ２遺伝子中の塩基配列。
【化２８】
2017057523.tif 000030
【０１１４】
配列番号２５：ｐ１６ＩＮＫ４ａのｃＤＮＡの塩基配列（NM_000077.4)。
【化２９】
2017057523.tif 000031
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明の方法によれば、従来取得困難であったアストロサイトと同様の特性を有するアストロサイト様細胞を、取得容易なヒト細胞から迅速かつ高効率で大量に取得可能である。また、当該アストロサイト様細胞を用いてインビトロ疾患モデルを構築し、疾患の分子機構や病因の解明、及び当該疾患治療薬のスクリーニングのために利用することができる。【０１１６】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本明細書の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図１】
2017057523.tif 000032
【図２】
2017057523.tif 000033
【図３】
2017057523.tif 000034
【図４】
2017057523.tif 000035
【図５】
2017057523.tif 000036
【図６】
2017057523.tif 000037
【図７】
2017057523.tif 000038
【図８】
2017057523.tif 000039
【図９】
2017057523.tif 000040
【図１０】
2017057523.tif 000041
【図１１】
2017057523.tif 000042
【図１２】
2017057523.tif 000043
【図１３】
2017057523.tif 000044
【図１４】
2017057523.tif 000045
【配列表】
2017057523000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年12月18日(2017.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞からアストロサイト様細胞をインビトロで調製する方法であって、以下の工程：
（１）少なくとも２種類の誘導因子をコードする核酸を含む、少なくとも１つのレンチウィルスベクターをヒト細胞に導入する工程；及び
（２）前記ヒト細胞を分化誘導してアストロサイト様細胞を得る工程
を含み、
ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、
前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記調製方法。
【請求項２】
前記誘導因子が、ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤを含む、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
前記ヒト細胞が、ヒト線維芽細胞である、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項４】
前記ヒト細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒト神経幹細胞である、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項５】
前記ヒト細胞が、神経系疾患患者由来の細胞であるか、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
前記工程（１）において、
ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害するか、
ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つを阻害するか、
ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか、又は
ＭＤＭ２、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＥ２Ｆから選択される少なくとも１つを活性化すること
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項８】
請求項１〜５及び７のいずれか１項に記載の方法で調製される、アストロサイト様細胞。
【請求項９】
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であつて、以下の工程：
（１）神経系疾患患者由来の細胞、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞から、請求項１〜５及び７のいずれか１項に記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；及び
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞と被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項１０】
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であつて、以下の工程：
（１）健常者由来の細胞から、請求項１〜５及び７のいずれか１項に記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞において、神経系疾患関連遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程；及び
（３）工程（２）で得られたアストロサイト様細胞と被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項８に記載のアストロサイト様細胞とニューロンとを含む、インビトロの神経組織モデル。
【請求項１２】
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）神経系疾患患者由来の細胞、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞から、請求項１〜５及び７のいずれか１項に記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養して、神経組織モデルを調製する工程；
（３）工程（２）で得られた神経組織モデルと被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項１３】
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）健常者由来の細胞から、請求項１〜５及び７のいずれか１項に記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞において、神経系疾患関連遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程；
（３）工程（２）で得られたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養して、神経組織モデルを調製する工程；
（４）工程（３）で得られた神経組織モデルと被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項１４】
少なくとも２種類の誘導因子をコードする核酸を含む、少なくとも１つのレンチウィルスベクターを成分として含む、ヒト細胞からアストロサイト様細胞への誘導剤であって、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記誘導剤。
【請求項１５】
少なくとも２種類の誘導因子をコードする核酸を含む、少なくとも１つのレンチウィルスベクター；及び、請求項１〜５及び７のいずれか１項に記載の方法が記載された取扱説明書を含む、ヒト細胞からアストロサイト様細胞への誘導キットであって、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記キット。
【請求項１６】
ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現阻害剤、及び／又は
ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つの阻害剤、及び／又は
ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現増強剤、及び／又は
ＭＤＭ２、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＥ２Ｆから選択される少なくとも１つの活性化剤
をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
ヒト細胞からアストロサイト様細胞をインビトロで調製する方法であって、以下の工程：
（１）２種類の誘導因子をコードする核酸を含む、少なくとも１つのレンチウィルスベクターをヒト細胞に導入する工程；及び
（２）前記ヒト細胞を分化誘導してアストロサイト様細胞を得る工程
を含み、
ここで、前記２種類の誘導因子は、ＮＦＩＡ及びＮＩＣＤであるか、又はＮＦＩＡ及びＴｅｔ２ＣＤであり、
前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞であり、
ただし、前記工程（１）において、ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤをコードする核酸を含む、少なくとも１つのレンチウィルスベクターをヒト細胞に導入することを除く、
前記調製方法。
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月26日(2018.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト細胞からアストロサイト様細胞をインビトロで調製する方法であって、以下の工程：
（１）少なくとも２種類の誘導因子をコードする核酸を含む、少なくとも１つのレンチウィルスベクターをヒト細胞に導入する工程；及び
（２）前記ヒト細胞を分化誘導してアストロサイト様細胞を得る工程
を含み、
ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、
前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記調製方法。
【請求項２】
前記誘導因子が、ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤを含む、請求項１に記載の調製方法。
【請求項３】
前記ヒト細胞が、ヒト線維芽細胞である、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項４】
前記ヒト細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒト神経幹細胞である、請求項１又は２に記載の調製方法。
【請求項５】
前記ヒト細胞が、神経系疾患患者由来の細胞であるか、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項６】
前記工程（１）において、
ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害するか、
ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つを阻害するか、
ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させるか、又は
ＭＤＭ２、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＥ２Ｆから選択される少なくとも１つを活性化すること
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法で調製される、アストロサイト様細胞。
【請求項８】
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）神経系疾患患者由来の細胞、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞から、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；及び
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞と被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項９】
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）健常者由来の細胞から、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞において、神経系疾患関連遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程；及び
（３）工程（２）で得られたアストロサイト様細胞と被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項１０】
請求項７に記載のアストロサイト様細胞とニューロンとを含む、インビトロの神経組織モデル。
【請求項１１】
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）神経系疾患患者由来の細胞、又は前記神経系疾患患者由来の細胞の遺伝子に特異的に存在する変異を人為的に遺伝子に導入された健常者由来の細胞から、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養して、神経組織モデルを調製する工程；
（３）工程（２）で得られた神経組織モデルと被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項１２】
神経系疾患に対する被験物質の有効性又は毒性を評価する方法であって、以下の工程：
（１）健常者由来の細胞から、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法により、アストロサイト様細胞を調製する工程；
（２）工程（１）で得られたアストロサイト様細胞において、神経系疾患関連遺伝子をノックアウト又はノックダウンする工程；
（３）工程（２）で得られたアストロサイト様細胞とニューロンとを共培養して、神経組織モデルを調製する工程；
（４）工程（３）で得られた神経組織モデルと被験物質とを接触させて、被験物質の有効性又は毒性を評価する工程
を含む、前記方法。
【請求項１３】
少なくとも２種類の誘導因子をコードする核酸を含む、少なくとも１つのレンチウィルスベクターを成分として含む、ヒト細胞からアストロサイト様細胞への誘導剤であって、ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記誘導剤。
【請求項１４】
少なくとも２種類の誘導因子をコードする核酸を含む、少なくとも１つのレンチウィルスベクター；及び、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法が記載された取扱説明書
を含む、ヒト細胞からアストロサイト様細胞への誘導キットであって、
ここで、前記誘導因子が、ＮＦＩＡを含み、かつＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤの少なくとも１つを含み、前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞である、前記キット。
【請求項１５】
ｐ１４ＡＲＦ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、ｐ１６ＩＮＫ４ａ遺伝子及びＲｂ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現阻害剤、及び／又は
ｐ１４ＡＲＦ、ｐ５３、ｐ２１、ｐ１６ＩＮＫ４ａ及びＲｂから選択される少なくとも１つの阻害剤、及び／又は
ＭＤＭ２遺伝子、サイクリンＤ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＤＫ６遺伝子及びＥ２Ｆ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現増強剤、及び／又は
ＭＤＭ２、サイクリンＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６及びＥ２Ｆから選択される少なくとも１つの活性化剤
をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
ヒト細胞からアストロサイト様細胞をインビトロで調製する方法であって、以下の工程：
（１）２種類の誘導因子をコードする核酸を含む、少なくとも１つのレンチウィルスベクターをヒト細胞に導入する工程；及び
（２）前記ヒト細胞を分化誘導してアストロサイト様細胞を得る工程
を含み、
ここで、前記２種類の誘導因子は、ＮＦＩＡ及びＮＩＣＤであるか、又はＮＦＩＡ及びＴｅｔ２ＣＤであり、
前記ヒト細胞が、ヒト体細胞（アストロサイトを除く）、ヒト多能性幹細胞又はヒト成体幹細胞であり、ただし、前記工程（１）において、ＮＦＩＡ、ＮＩＣＤ及びＴｅｔ２ＣＤをコードする核酸を含む、少なくとも１つのレンチウィルスベクターをヒト細胞に導入することを除く、前記調製方法。
【国際調査報告】
2017057523.tif 000046
2017057523.tif 000047
2017057523.tif 000048
2017057523.tif 000049