(57)【要約】  中型〜大型の家畜動物においても、ヒト等の異種動物由来の血液細胞を高率に保有した状態を長期にわたって維持する血液キメラ動物を作出可能な新規な手段が開示されている。本発明による異種動物由来の血液細胞を保有する非ヒト動物の製造方法は、異種動物の造血系細胞であって、造血系に作用する遺伝子の機能が改変された細胞を、非ヒト動物に移植することを含む。造血系に作用する遺伝子は、例えばLnk遺伝子である。本発明の方法によれば、ブタ等の中型〜大型哺乳動物をレシピエントとした場合でも、異種動物由来の造血系細胞の生着率が劇的に向上し、生後１６か月齢においても血液のキメリズムが１０％以上の状態を維持できる。
2016208532.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種動物由来の血液細胞を保有する非ヒト動物の製造方法であって、異種動物の造血系細胞を非ヒト動物に移植することを含み、前記造血系細胞は、造血系に作用する遺伝子の機能が改変された細胞である、方法。
【請求項２】
前記非ヒト動物は中型〜大型哺乳動物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記非ヒト動物はブタである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記異種動物が哺乳動物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
造血系に作用する遺伝子の機能の改変は、該遺伝子の機能の阻害である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
造血系に作用する遺伝子がLnk遺伝子である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記造血系細胞は、造血幹細胞を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
異種動物に由来する造血系細胞であって、造血系に作用する遺伝子の機能が改変された造血系細胞が生着し、循環血中に異種動物由来の血液細胞を保有する、異種動物由来の血液細胞を保有する非ヒト動物。
【請求項９】
中型〜大型哺乳動物である、請求項８記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
ブタである、請求項９記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
前記異種動物が哺乳動物である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
造血系に作用する遺伝子の機能の改変は、該遺伝子の機能の阻害である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
造血系に作用する遺伝子がLnk遺伝子である、請求項１２記載の非ヒト動物。
【請求項１４】
前記造血系細胞は、造血幹細胞を含む、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の非ヒト動物。
【請求項１５】
請求項８〜１４のいずれか１項に記載の非ヒト動物から血液を採取し、前記異種由来の血液細胞を分離することを含む、血液細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種動物の血液細胞を高率に保有する血液キメラ非ヒト動物の作出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの血液細胞を高率に保有する非ヒト動物は、薬剤や疾病、ウイルス感染等に対する反応を評価する評価系として非常に有望であり、医学・医療分野の発展において非常に重要なモデル動物になると期待される。現在までのところ、超免疫不全マウスにヒトの造血幹細胞を移植してヒトの造血細胞を高率に保有する血液ヒト化マウスが作出されている。血液ヒト化マウスでは長期試験は困難であり、またヒトと解剖学的、生理学的特徴が異なる部分があるため、ヒトとの類似点が多いブタや非ヒト霊長類でヒト血液細胞を高率に保有する動物を作出することが望まれる。しかしながら、これまでに非ヒト霊長類や中型〜大型の家畜動物ではヒト血液細胞を高率に保有する動物は作出できていない。【０００３】
ヒト血液キメラ動物の作出方法として、免疫寛容状態の非ヒト動物胎仔にヒト造血幹細胞を移植することによってヒト血液キメラ個体を作出できることが知られている（特許文献１）。本願発明者らが開発した技術であり、該方法では、ブタやヒツジ等の大動物でもヒトの血液細胞を保有する血液キメラ個体を作出できる。しかしながら、造血幹細胞の生着率は低く、血液のキメリズムは数％以下である。出生後から造血幹細胞の生着数は減少し始め、異種の血液細胞を長期にわたって維持することができない。【０００４】
また、造血に関与する遺伝子であるHOXB4遺伝子を過剰発現させたヒト造血幹細胞をドナー細胞としてヒツジ胎仔に移植する方法も報告されていが（非特許文献１）、この方法でも、造血幹細胞の生着率は10％に満たず、血液キメラ状態を高率に長期間維持することはできない。【０００５】
一方、Lnk（Sh2b3とも呼ばれる）は、主に造血系細胞及びリンパ組織に発現する細胞内アダプタータンパク質であり、巨核球の増殖及び成熟、造血幹細胞の増幅及び造血能に対し抑制的に作用することが知られている。胚性幹細胞においてLnk遺伝子をノックアウトないしはノックダウンすることで巨核球への分化を促進し、血小板の生産を増大する技術も知られている（特許文献２）。しかしながら、Lnk遺伝子を破壊した造血幹細胞の異種動物への生着性は不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２２９８０２号公報
【特許文献２】特開２００７−０８９４３２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Abe T et al. Ex vivo expansion of human HSCs with Sendai virus vector expressing HoxB4 assessed by sheep in utero transplantation. Exp Hematol. 39(1), 47-54 (2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、中型〜大型の家畜動物においても、ヒト等の異種動物由来の血液細胞を高率に保有した状態を長期にわたって維持する血液キメラ動物を作出可能な新規な手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、胎仔への造血幹細胞移植による血液キメラ動物の作出技術の条件を鋭意検討した結果、主に造血系細胞及びリンパ組織に発現する細胞内アダプタータンパク質であるSh2b3/Lnkを欠損させたマウス造血幹細胞をドナー細胞としてブタ胎仔に移植することにより、マウス造血幹細胞のブタでの生着率を格段に向上させることができ、１６か月齢においても１０％以上という高い血液キメリズムを維持した血液キメラブタが得られることを見出した。従って、Lnk遺伝子や、造血系に作用するその他の適当な遺伝子の機能をドナー細胞において改変することで、異種由来のドナー造血系細胞の生着率を大幅に向上させることができ、長期にわたって血液キメラ状態を維持する非ヒト動物を作出できることを見出し、本願発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、異種動物由来の血液細胞を保有する非ヒト動物の製造方法であって、異種動物の造血系細胞を非ヒト動物に移植することを含み、前記造血系細胞は、造血系に作用する遺伝子の機能が改変された細胞である、方法を提供する。また、本発明は、異種動物に由来する造血系細胞であって、造血系に作用する遺伝子の機能が改変された造血系細胞が生着し、循環血中に異種動物由来の血液細胞を保有する、異種動物由来の血液細胞を保有する非ヒト動物を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の非ヒト動物から血液を採取し、前記異種由来の血液細胞を分離することを含む、血液細胞の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、高いキメリズムを長期間維持する血液キメラ非ヒト動物を提供することが可能になる。本発明の方法によれば、ブタ等の中型〜大型哺乳動物をレシピエントとした場合でも、異種動物由来の造血系細胞の生着率が劇的に向上し、生後１６か月齢においても血液のキメリズムが１０％以上の状態を維持できる。異種動物の血液細胞を１０％以上という高い割合で安定的に保有する動物は、非ヒト霊長類及び中型〜大型の家畜哺乳動物においては作出例がなく、本発明により初めて提供可能となる。免疫不全症状を呈しない通常の非ヒト動物を用いて血液キメラ動物を作出した場合には、クリーンルームのような特殊な環境は不要であり、通常の飼育環境下で高キメリズムを維持したまま飼育することができる。異種動物の血液を高率に保有する血液キメラ動物は、薬剤や疾患、ウイルス感染等の評価モデルとして利用することができ、薬剤のスクリーニングに有用である。また、ブタ等の家畜動物でヒトの移植用臓器を作製する技術も研究されているが、ヒト血液細胞を高率に保有する家畜動物はヒト細胞に対して免疫寛容となっていると考えられるので、ヒトの移植用臓器の生産の場としても好適であり、またヒト臓器の保存にも有効活用できると考えられる。さらに、ヒト血球を高率に保有する血液キメラ動物を大型動物で作出すれば、ヒト血液細胞の大量生産が可能になるので、献血の代替技術としても非常に有望である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例で作出したブタ産仔の４５日齢における血液サンプルのフローサイトメトリーによる解析結果である。aは、抗マウスCD45抗体を用いたマウス血液キメラブタ産仔の血液サンプルのフローサイトメトリーの１パラメータヒストグラムの一例である。bは、血液サンプル中の全有核血球に占めるマウス有核血球の割合を算出した結果である。cは、マウス血液キメラブタ産仔の血液サンプル中の顆粒球及びB細胞を検出した２パラメータヒストグラムの一例である。dは、マウス血液キメラブタ産仔の血液サンプル中の顆粒球及びT細胞を検出した２パラメータヒストグラムの一例である。
【図２】PE標識抗マウスCD45抗体で１６か月齢のブタ産仔の血液中に存在するマウス成熟白血球を検出した結果である。
【図３】FITC標識抗マウスGr-1抗体で１６か月齢のブタ産仔の血液中に存在するマウス成熟顆粒球を検出した結果である。
【図４】１６か月齢のブタ産仔の血液サンプルについて、マウスCD45陽性細胞でゲーティングし、マウス白血球中の顆粒球の割合を調べた結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明による血液キメラ非ヒト動物の製造方法では、造血系に作用する遺伝子の機能が改変された造血系細胞を非ヒト動物に移植する。造血系細胞は、レシピエントとなる非ヒト動物とは異なる動物の造血系細胞であり、造血幹細胞でも造血前駆細胞でもよい。通常は、主として造血幹細胞を含む細胞集団である。
【００１４】
非ヒト動物は、好ましくは中型〜大型の哺乳動物であり、例えば中型〜大型の家畜哺乳動物であり得る。中型〜大型哺乳動物の具体例としては、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、シカ、ラクダ等の偶蹄類、及びウマ等の奇蹄類を含む各種の有蹄動物、並びにサル等を挙げることができるが、これらに限定されない。家畜動物は、典型的には有蹄動物であり得る。非霊長類にヒトの血液を作らせる場合、ヒトとの解剖学的類似性等の観点から、ブタを特に好ましく用いることができる。
【００１５】
異種動物は、造血系細胞の移植を受ける非ヒト動物とは異なる種類の動物であれば特に限定されないが、典型的には哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
【００１６】
遺伝子機能の改変は、遺伝子機能の阻害又は促進である。一般に、造血系に対し抑制的に作用する遺伝子の場合には、その遺伝子の機能を阻害すればよく、造血系に対し促進的に作用する遺伝子の場合には、その遺伝子の機能を促進すればよい。
【００１７】
「遺伝子の機能を阻害する」とは、移植に用いる造血系細胞において、ゲノム上の当該遺伝子領域の少なくとも一部を改変すること等により、本来コードしているmRNA又はタンパク質の生成又は蓄積を低下又は欠失させることをいい、遺伝子の機能の低下から機能の完全な欠損まで包含される。特定の遺伝子の機能を阻害するための遺伝子改変方法はこの分野で広く知られており、当業者であれば適宜選択して実行できる。大別すると、遺伝子の機能を欠損させる遺伝子破壊法（ノックアウト法）と、遺伝子の機能を低下させる遺伝子ノックダウン法がある。ノックアウト法の具体例としては、ターゲティングベクターを用いた相同組換えによるノックアウト法、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）法（Porteus, M.H. et al. Gene targeting using zinc finger nucleases. Nat. Biotechnol. 23, 967-973 (2005).）、TALEN法（Christian, M. et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics 186, 757-761 (2010).）、及びCRISPR/Cas9法（Sander, J.D. et al. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol 32, 347-355 (2014).）などを挙げることができる。ノックダウン法の具体例としては、アンチセンス法、RNAi等を挙げることができる。高い効率でノックダウンを行なえば、ノックアウトと同等の結果を得ることができる。また、ドミナントネガティブ変異の導入により遺伝子の機能を阻害することも可能である。
【００１８】
「遺伝子の機能を促進する」とは、移植に用いる造血系細胞において、当該遺伝子のmRNA又はタンパク質の生成量又は蓄積量を増大させることをいう。遺伝子の機能の促進は、当該遺伝子を過剰発現させること等により達成できる。
【００１９】
造血系に作用する遺伝子の機能が改変された造血系細胞は、そのように遺伝子機能が改変された動物の骨髄細胞や臍帯血から得ることができる。また、そのような遺伝的改変を有しない動物の骨髄細胞や臍帯血から造血系細胞を回収し、それら細胞に対して所望の遺伝子機能の改変を行なってもよい。あるいはまた、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）等の分化多能性を有する細胞（以下、多能性細胞という）において、所望の遺伝子機能の改変を行ない、その後に造血系細胞を分化誘導させることにより、造血系に作用する遺伝子の機能が改変された造血系細胞を調製することができる。多能性細胞から造血幹細胞を分化誘導した場合、得られる細胞集団には、造血幹細胞の他に造血前駆細胞も含まれ得る。そのような細胞集団を造血系細胞として非ヒト動物への移植に用いてよい。
【００２０】
多能性細胞から造血系細胞を分化誘導する場合に使用可能な多能性細胞の具体例としては、上記した胚性幹細胞（ES細胞）、人工多能性細胞（iPS細胞）の他、胚性腫瘍細胞（EC細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、多能性生殖細胞（mGS細胞）等を挙げることができる。
【００２１】
造血系に作用する遺伝子の好ましい具体例として、第一にLnk遺伝子（Sh2b3遺伝子とも呼ばれる）を挙げることができる。Lnkは、巨核球の増殖及び成熟、造血幹細胞の増幅及び造血能に対し抑制的に作用することが知られている。従ってLnk遺伝子の場合、Lnk遺伝子の機能が阻害された造血系細胞を調製すればよい。
【００２２】
例えば、Lnk遺伝子の機能が阻害されたヒト造血系細胞は、ヒトの多能性細胞株においてLnk遺伝子の機能を阻害する遺伝的改変を行ない、得られたLnk遺伝子阻害株を造血系細胞に分化誘導することにより調製することができる。この場合、ヒト胚を破壊することなく作製できるという倫理的な観点から、ヒトiPS細胞を好ましく用いることができる。iPS細胞は、この分野で周知の通り、動物個体の体細胞に細胞初期化因子を導入することにより調製される、ES細胞様の分化多能性を有する細胞である。体細胞からiPS細胞を調製する方法は周知である。
【００２３】
Lnk遺伝子は、ヒトを含め各種の動物で同定され公知となっている。ヒトのLnk遺伝子は第12番染色体上に存在し（12q24, Annotation release 107, GRCh38.p2 (GCF_000001405.28), NC_000012.12 (111405108..111451624)）、配列等の情報がNCBIのデータベースにGene ID: 10019、Accession No. NM_005475で登録されている。配列表の配列番号１及び２に示す配列は、NM_005475で登録されているヒトLnk遺伝子のcDNA配列及びこれにコードされるアミノ酸配列である。ヒトLnkタンパク質は、aa1-193のダイマー形成ドメイン、aa206-307のプレクストリン相同（pleckstrin homology; PH）ドメイン、及びaa364-462のSrc相同（Src homology 2; SH2）ドメインを有する。
【００２４】
ヒトの多能性細胞株においてLnk遺伝子の機能を阻害する方法としては、Lnk遺伝子のノックアウト、Lnk遺伝子に対するsiRNAを利用したRNAi、ドミナントネガティブ変異の導入等を挙げることができる。
【００２５】
Lnk遺伝子のノックアウトは、例えば、多能性細胞のゲノムの両アリルにおいて、Lnk遺伝子のコード領域やプロモーター領域を欠失させたり、あるいは、正常なLnkタンパク質を産生できないようにストップコドンを挿入したりアミノ酸の置換・挿入等の変異を導入することにより実施できる。コード領域を欠失させる場合、コード領域の全てを欠失させてもよいし、一部を欠失させてもよい。下記実施例で用いられているLnkホモKOマウスは、Lnk遺伝子のコード領域のうちエクソン２〜７を欠失させたマウスであり、ヒト細胞においてもこれらの領域を欠失させることでLnk遺伝子をノックアウトできると考えられる。ノックアウト細胞株のスクリーニングの便宜のため、Lnk遺伝子コード領域の全部又は一部を薬剤耐性や蛍光タンパク質等のマーカー遺伝子配列に置き換えてもよい。
【００２６】
ターゲティングベクターを用いたノックアウト法では、欠失させたい領域の上流側及び下流側のゲノム配列を異種動物のゲノムDNAからPCRにより増幅して上流側相同領域及び下流側相同領域を調製し、これらの相同領域及びマーカー遺伝子を順次適当なプラスミドベクターに挿入して、上流側相同領域−マーカー遺伝子−下流側相同領域の順に並んだ遺伝子破壊用DNAコンストラクトを含むターゲティングベクターを構築し、これをエレクトロポレーション等の常法により異種動物の多能性細胞に導入すればよい。このようなターゲティングベクターを細胞に導入すると、相同組換えにより遺伝子破壊用コンストラクトがゲノム上の所期の位置に導入され、Lnk遺伝子の一部又は全部がマーカー遺伝子に置き換えられた変異アレルが生じる。
【００２７】
上流側相同領域及び下流側相同領域のサイズは相同組換えの効率に影響し、効率の低い生物種ではサイズの大きな相同領域が用いられる。哺乳動物の遺伝子破壊においては、一般に用いられる相同領域は数kb程度のサイズである。一方の相同領域を1〜3kb程度（短腕）、他方の相同領域を5kb程度以上（長腕）とするのが一般的であるが、両者を5kb程度のサイズとしてもよい。ヒトをはじめ各種の動物において全ゲノム配列情報（BAC配列やショットガンシークエンス等）が同定され、データベースに登録されているので、相同領域の調製に必要な配列情報はそのようなデータベースから入手することができる。
【００２８】
哺乳動物細胞においては、相同組換えによる遺伝子破壊用コンストラクトのゲノムへの導入頻度は、相同組換えによらないランダムな導入の頻度に比べて非常に低い。そのため、ヒト等の哺乳動物の多能性細胞でLnk遺伝子をノックアウトする場合には、薬剤耐性を与えるポジティブ選択マーカーと薬剤感受性を与えるネガティブ選択マーカーを併用することが好ましい。上記の遺伝子破壊用コンストラクトにおいて、２つの相同領域の間に連結するマーカー遺伝子をポジティブ選択マーカー遺伝子とし、２つの相同領域の外側（上流側相同領域の5'側又は下流側相同領域の3'側）にネガティブ選択マーカー遺伝子を連結しておけばよい。該コンストラクトが相同組換えによりゲノムに導入されていれば、コンストラクトのうち相同領域の外側の領域はゲノムに導入されないので、ネガティブ選択マーカー遺伝子により薬剤感受性が付与されることはない。一方、該コンストラクトが相同組換えによらずにゲノムに導入された場合、ネガティブ選択マーカー遺伝子もゲノムに導入されるため、そのような形質転換細胞には薬剤感受性が付与されることになる。よって、遺伝子破壊用コンストラクトを多能性細胞に導入後、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーによるスクリーニングを行えば、相同組換えにより適切な位置にコンストラクトが導入されLnk遺伝子が破壊された多能性細胞を効率よく選抜することができる。
【００２９】
一般に使用されるマーカー遺伝子の具体例を挙げると、ポジティブ選択マーカーとしてはネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられ、ネガティブ選択マーカーとしてはチミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素Aフラグメント（DT-A)等が挙げられるが、これらに限定されない。それぞれ適当なプロモーターとの組み合わせで用いられるが、当業者であればマーカー遺伝子の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
マーカーによるスクリーニングの後、PCRやサザンブロッティングによる遺伝子破壊の確認を行ない、Lnk遺伝子が破壊されたアレルを有する細胞を取得する。PCRに使用するプライマーやサザンブロッティングに使用するプローブは、当業者であれば、遺伝子破壊用DNAコンストラクトの構造に応じて適宜設計することができる。
【００３１】
上述した通り、哺乳動物細胞における相同組換えの頻度は非常に低いため、両アレルで同時に相同組換えが生じる可能性は極めて低く、通常はヘテロのノックアウトとなる。ホモでノックアウトされた細胞を得るためには、ヘテロノックアウトであることを確認した細胞株を用いて、上述した遺伝子破壊用コンストラクトの導入とスクリーニングを再度繰り返せばよい。ヘテロノックアウト細胞の調製に使用する遺伝子破壊用DNAコンストラクトと、ホモノックアウト細胞の調製に使用する遺伝子破壊用DNAコンストラクトとで、異なる薬剤耐性ポジティブ選択マーカーを用いれば、ホモノックアウト細胞を適切に選抜することができる。
【００３２】
相同組換えの効率を上げるため、Lnk遺伝子ノックアウト処理に加えてBML遺伝子のノックダウン処理を行なってもよい。ヒト細胞を用いた研究で、BML遺伝子のノックダウン処理が相同組換え効率を上げるとの報告があり（So S et al. Genes to Cells 2006; 11(4):363-371.）、ヒト及びヒト以外の動物においても同様にBML遺伝子のノックダウンが相同組換え効率の向上に有効であると考えられる。BML遺伝子も配列情報等が公知であり、各種動物種のBML遺伝子をノックダウンするための核酸試薬が市販されているので、当業者であれば適宜そのような市販品を用いてBML遺伝子のノックダウン処理を実施できる。
【００３３】
RNAiによる目的遺伝子のノックダウン方法も周知であり、確立した技術となっている。RNAiにより恒常的にLnk遺伝子をノックダウンした細胞株を得るためには、プラスミドベクターやウイルスベクター等の発現ベクターを用いて細胞内でsiRNAを生産させればよい。一般には、ヘアピン型RNA（shRNA）を発現するベクターを調製し、該ベクターを細胞に導入し、細胞内でRNAiを生じさせる方法が用いられる。細胞内で発現したshRNAは、細胞内のダイサーにより認識・切断されてsiRNAが生じる。Lnk遺伝子に対するsiRNAやshRNAも、Lnk遺伝子の配列情報に基づいて設計することができる。細胞内でsiRNAを生産させるための発現ベクターは各種のものが公知である。また、siRNA・shRNAの設計やRNAi用発現ベクターの作製、RNAiによるノックダウン細胞株の調製等の受託サービスを提供する業者も多数存在するので、そのような業者を利用してもよい。
【００３４】
ヒト多能性細胞におけるLnk遺伝子のノックアウト及びノックダウンの実例が記載されている文献として、Felix C. Giani, et al., "Targeted Application of Human Genetic Variation Can Improve Red Blood Cell Production from Stem Cells", Cell Stem Cell 18, 73-78, January 7, 2016が挙げられる。Gianiらは、Lnk遺伝子のエクソン３内の領域（SHドメイン内の領域）を対象に、CRISPR/Cas9法によるノックアウト、及びRNAiによるノックダウンを行なっている。具体的には、CRISPR/Cas9法によるノックアウトでは、第261番アルギニンをコードするCGGをPAM（protospacer adjacent motif）として利用し、その直前の20塩基（配列番号１の1118〜1137位の領域）を標的としてガイドRNAを設計して、エクソン３内（SHドメイン内）でDNA二本鎖切断を誘発させ、フレームシフトを生じさせることでLnk遺伝子のノックアウトを行なっている。Lnkをノックアウトしたヒト多能性細胞を造血系細胞に分化させると赤血球細胞の産生が大幅に上昇したことも確認されている。RNAiによるノックダウンでも、エクソン３内の領域（SHドメイン内の領域）を標的としてshRNAを設計している。Gianiらが用いたshRNAコンストラクトの配列を配列番号３及び４に示す。レンチウイルスベクターにより造血幹・前駆細胞内でshRNAを発現させ、Lnkをノックダウンしたところ、赤血球分化が促進したことが確認されている。Gianiらが行なった方法は、本発明においてLnk遺伝子をノックアウト又はノックダウンしたヒト造血系細胞を調製する場合にも好ましく採用できる。
【００３５】
また、Gianiらの上記文献には、Lnkの機能を欠失ないしは大きく損なわせることができる天然のミスセンス変異として、E208Q、S213R、I257R、E301K、S370C、S394G、E395K、E400K、R425C、I446V、R518*が記載されている。Lnkの両アレルにこれらの変異を導入することによって、Lnk遺伝子の機能を阻害することもできる。
【００３６】
Lnkのドミナントネガティブ変異も知られている。例えば、特開2007-89432号公報には、マウスLnkのドミナントネガティブ変異体が記載されており、ヒトLnkでも同様にドミナントネガティブ変異体として利用可能と考えられる。Lnkのドミナントネガティブ変異体の具体例としては、SH2ドメインの変異（例えば第364番アルギニンのグルタミン酸への置換変異）、PHドメインの欠失変異、C末端ドメインの欠失変異、及びこれらの変異の組み合わせを挙げることができる。なお、配列番号２に示すヒトLnkのアミノ酸配列中、PHドメインは第194番〜第309番アミノ酸、SH2ドメインは第355番〜第451番アミノ酸、C末端ドメインはチロシンリン酸化領域を含む第452番〜第575番アミノ酸であり、マウスにおいて公知のドミナントネガティブなC末端欠失変異の領域は、ヒトのLnkでは第526番〜第575番アミノ酸の領域に相当する。このようなドミナントネガティブ変異体を多能性細胞に導入することで、ゲノム上のLnk遺伝子の機能を阻害することができる。ドミナントネガティブ変異体の細胞への導入は、例えばウイルスベクター等を用いて実施できる。
【００３７】
以上、Lnk遺伝子を主な例としてノックアウト及びノックダウン操作について説明したが、造血系に作用する他の遺伝子についても同様にしてノックアウト及びノックダウンを実施することができる。
【００３８】
なお、ノックアウト・ノックダウン等の遺伝子改変操作により、造血系細胞のゲノム上にマーカー遺伝子が導入される場合があり、このような場合、該造血系細胞から分化した血液細胞のうち有核血球のゲノム上にもマーカー遺伝子が存在することになる。マーカー遺伝子の存在が望ましくない場合には、ゲノム上にマーカー遺伝子が残らない遺伝子改変方法（例えばTALENやCRISPR/Cas9を利用した方法、RNAiによるノックダウン等）を用いてLnk遺伝子等の造血系に作用する遺伝子の機能改変を行えばよい。あるいは、loxP/Cre組換えシステムを利用することにより、ゲノム中のマーカー遺伝子を除去することも可能である。例えば、Lnkをノックアウトした造血系細胞の移植によりヒトの血液を非ヒト動物に生産させる場合、あらかじめマーカー遺伝子の3’末端および5’末端の位置にloxP配列を挿入したマーカー遺伝子を使用してノックアウトベクターを構築し、ヒトの多能性細胞のLnkノックアウト株を作製する。このLnkノックアウト株、又は該株から分化誘導したLnkノックアウト造血系細胞に対して、Cre組換え酵素を発現するアデノウイルス等を感染処理することにより、loxP配列で挟まれたマーカー遺伝子領域をLnkノックアウト細胞のゲノム中から除去することができる。
【００３９】
多能性細胞からの造血系細胞の分化誘導方法としては、例えば、テラトーマ形成を介した分化誘導方法が知られている（WO 2011/071085）。
【００４０】
該方法では、多能性細胞を非ヒト哺乳動物の皮下や精巣、骨髄等に移植し、該非ヒト哺乳動物体内でテラトーマを形成させる。分化誘導の効率の向上のため、多能性細胞と共に共培養細胞を移植してもよい。共培養細胞としては、フィーダー細胞、ストローマ細胞を挙げることができ、例えばOP-9細胞を好ましく用いることができる。マウスにヒトiPS細胞を移植する場合には、約１〜１０×１０６個のiPS細胞と、その１／１０〜１／２程度の量の共培養細胞を移植すればよい。
【００４１】
移植後の非ヒト哺乳動物には、幹細胞因子（SCF）、トロンボポエチン（TPO）等の分化誘導剤を投与する。分化誘導剤は、通常は浸透圧ポンプを用いる等して皮下に連続的に投与する。
【００４２】
移植後の非ヒト哺乳動物に十分なサイズのテラトーマが形成されるまで、適当な期間該動物を飼育する。通常は移植後４〜１２週程度で十分なサイズのテラトーマが形成される。このテラトーマから造血幹細胞等の造血系細胞を分離することができる。また、分化した造血系細胞はテラトーマから移動して骨髄にも生着するので、骨髄からも目的の造血系細胞を回収することができる。例えば、テラトーマ組織や骨髄細胞からヒトの造血幹細胞を分離回収する場合、ヒト造血幹細胞の表面抗原である抗ヒトCD34抗体、抗ヒトCD117抗体、抗ヒト133抗体等を使用して磁気細胞分離法又はセルソーティング法でヒト造血幹細胞を特異的に選別して回収できる。もっとも、上記した造血系細胞の分離回収法は一例であり、これ以外のいかなる方法を用いてもよい。
【００４３】
以上のようにして、例えばマウス等の実験動物の体内でヒトiPS細胞から造血幹細胞等の造血系細胞を分化誘導し、本発明で用いる移植用の造血系細胞集団を得ることができる。もっとも、上記したテラトーマ形成を介する分化誘導法は多能性細胞からの造血系細胞の分化誘導方法の一例であり、これ以外のいかなる方法を用いてもよい。
【００４４】
造血系細胞の移植は、非ヒト動物の胎仔に対して行なってもよいし、また、出生後の非ヒト動物個体に対して行なってもよい。出生後の個体に移植する場合、一般的な骨髄移植法を利用すればよく、免疫不全症状を呈する非ヒト動物個体を用いる場合には免疫抑制剤の投与は省略可能である。胎仔への細胞移植は経子宮移植により行なうことができる。経子宮移植は、母体を開腹して行なってもよいし、開腹せず経皮的に行なってもよい。そのような経子宮移植法は公知であり、例えば特開2005-229802号公報等に具体的手順が記載されている。
【００４５】
経子宮移植法では、妊娠した非ヒト動物を全身麻酔し、皮膚を剃毛して十分に洗浄・消毒し、超音波断層装置により皮膚の上から又は子宮表面から子宮内の胎仔を観察しながら造血系細胞を移植する。細胞移植は注射針又は穿刺針により行なう。用いる針の太さは、非ヒト動物の種類にもよるが、中型〜大型の哺乳動物の場合には通常２２〜２７ゲージ程度である。
【００４６】
移植時の胎仔の日齢は、免疫系の機能が不全の非ヒト動物胎仔への移植の場合には特に限定されない。免疫不全症状を示さない通常の非ヒト動物を用いる場合、免疫寛容状態にある時期の胎仔に対して移植を行なう必要がある。ブタの場合、約50日齢を超えると免疫寛容が失われ始めるので、60日齢程度以下、例えば20〜60日齢、20〜55日齢、30日齢〜55日齢、30〜52日齢、又は30〜50日齢の胎仔に対して移植を行なうことが好ましい。ここで、胎仔の日齢とは、受精日ないしは交配日を0日齢として表現した胎齢である。なお、ブタにおいても免疫不全症状を呈する系統が知られており（例えば特開2015-002719号公報など）、このような免疫不全ブタの胎仔に移植する場合には、より胎齢の進んだ胎仔でも移植可能である。
【００４７】
造血系細胞を移植する部位は特に限定されない。一般的には、胎仔の心臓に移植することでドナー細胞の高い生着率を達成できる。近年の超音波画像診断装置の性能の向上により、数十日齢以下の胎仔でも心臓の位置を確認して細胞を移植できるようになった。もっとも、肝臓等の他の臓器や、腹腔内等の他の部位に移植してもよい。細胞移植後、必要に応じて胎仔の腹腔内や羊水腔内に抗生物質を注入する。移植操作後の母体にも感染症を予防する目的で抗生物質を投与することが好ましい。
【００４８】
ブタなどの多胎妊娠動物の場合、通常は子宮内の胎仔の一部（例えば２〜５頭程度）にのみ細胞移植が行われる。出産時に移植仔と非移植仔を簡便に区別できるようにするため、金属製の短いワイヤー等をレントゲンで同定可能なマーカーとしてレシピエント胎仔の腹腔内等の適当な部位に挿入してもよい。
【００４９】
細胞を移植した胎仔を母体内で生育させ、自然分娩又は帝王切開により出産させることで、異種動物由来の血液細胞を保有する血液キメラの非ヒト動物個体を得ることができる。該非ヒト動物は、血液のキメリズムが１０％以上であり、例えば１１％以上、１２％以上、１３％以上、１４％以上、又は１５％以上であり得る。本発明の方法によれば、血液のキメリズムが２０％以上の非ヒト動物個体を作出することも可能である。本発明の方法により得られる血液キメラ動物は、上記のように高い血液のキメリズムを長期にわたって維持することができる。例えば、本発明の血液キメラ動物は、造血系細胞の移植後３か月、６か月、１０か月、又は１２か月の時点で、あるいは、非ヒト動物の胎仔に造血系細胞を移植して作出された血液キメラ動物の場合には、３か月齢、６か月齢、１０か月齢、又は１２か月齢の時点で、上記のように高いキメリズムを維持している。
【００５０】
本発明において、「血液のキメリズム」とは、循環血中に存在する血液細胞のうち異種動物由来の血液細胞が占める割合をいう。血液細胞には、赤血球、白血球及び血小板が包含される。白血球には、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、リンパ球、単球が包含される。有核血球には、白血球、赤芽球、巨核球、造血幹細胞、造血前駆細胞が包含される。循環血中に存在する有核血球は主として白血球であり、赤芽球、巨核球、造血幹細胞及び造血前駆細胞は循環血中にも存在するがその量はごく少量である。従って、本発明における「血液のキメリズム」という語には、白血球（有核血球）のキメリズム、赤血球のキメリズム、及び血小板のキメリズムが包含される。
【００５１】
血液のキメリズムは、末梢血のフローサイトメトリー解析により容易に調べることができる。典型的な表面マーカーの具体例として、白血球ではCD45、赤血球ではTER-119、血小板ではCD41、顆粒球ではGr-1が挙げられる。これらに対する標識抗体を用いて末梢血サンプルのフローサイトメトリー解析を行えばよい。
【００５２】
異種動物の血液を高率に保有する血液キメラ動物は、薬剤や疾患、ウイルス感染等の評価モデルとして利用することができ、薬剤のスクリーニングに有用である。また、ブタ等の家畜動物でヒトの移植用臓器を作製する技術も研究されているが、ヒトの血液を高率に保有するブタであれば、ヒトの移植用臓器の生産にも好適である。
【００５３】
さらにまた、ヒト血球を高率に保有する血液キメラ動物を大型動物で作出すれば、ヒト血液細胞の大量生産が可能になるので、献血の代替技術としても有望である。血液キメラ動物の血液中には本来の当該動物の血液細胞も含まれるが、例えば、該動物から血液を回収し、目的の異種由来血液細胞に特異的な表面抗原に対する抗体（例えば、ブタに作らせたヒト赤血球を回収する場合には、ヒトTER-119に対する抗体）を用いてソーティングすることにより、目的の異種由来血液細胞を分離回収することができる。異種動物由来の赤血球や血小板の保有量をさらに高めたい場合には、例えば、血液キメラ動物に対し、エリスロポエチンやトロンボポエチン等のサイトカインを投与し、骨髄中に生着した異種動物由来の造血幹細胞からの赤血球や血小板の産生を促進すればよい。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００５５】
１．Lnk遺伝子がノックアウトされたマウス造血幹細胞の調製
Lnkホモノックアウトマウスは、東京大学医科学研究所動物実験施設にて病原体フリーの特殊条件で維持されている公知のマウス系統（Takaki et al., 2000. Control of B cell production by the adaptor protein lnk. Definition of a conserved family of signal-modulating proteins. Immunity. 13:599-609.; 特開２００７−８９４３２号公報）を用いた。当該マウス系統は、Lnk遺伝子のコード領域をターゲティングベクターにより破壊したマウスES細胞からLnkヘテロノックアウトマウスを作出し、該ヘテロノックアウトマウスを掛け合わせることにより作出された系統である。【００５６】
ブタ胎仔への移植に供する造血幹細胞は、Lnkホモノックアウトマウスより骨髄を採取し、比重遠心法により有核細胞を分離し、磁気細胞分離又はセルソーティングすることにより、造血幹細胞が濃縮された細胞集団として得た。【００５７】
２．ブタ胎仔への造血幹細胞移植
特開2005-229802号公報に記載の方法に準じて、超音波ガイド下でブタ胎仔の肝臓内にLnkホモKOマウス由来の造血幹細胞を経子宮移植した。人工授精により受胎したデュロック種と大ヨークシャー種の交雑種のブタ胎仔（交配日２０１３年４月１日、経子宮移植日２０１３年５月１０日、胎齢３９日）を造血幹細胞移植に用いた。ブタの繁殖及び飼育管理はSPF環境下で行なった。【００５８】
(１)  麻酔
移植当日、妊娠ブタに対しミダゾラム、メデトミジン、硫酸アトロピンの筋注により前麻酔をおこない、その後マスクによる吸入麻酔をおこなった。吸入麻酔には笑気、酸素、イソフルレンを用いた。【００５９】
(２)  消毒及び開腹
妊娠ブタに麻酔導入後、腹部を剃毛し充分にポビドンヨード製剤で腹部を洗浄した後、イソジンにて充分に消毒した。母体を開腹し、子宮を露出させた。【００６０】
(３)  超音波によるブタ胎仔の描出
ブタ胎仔の同定及び細胞の注入には超音波断層装置Aloka ultrasound diagnostic equipment SSD-500（ALOKACO., LTD. Tokyo, Japan）を使用し、子宮越しに移植を行なった。超音波プローブには7.5MHz electronic linear probe（Aloka; UST-5820-5）を使用した。【００６１】
(４)  穿刺針
胎仔への造血幹細胞導入のための穿刺針には、25ゲージの注射針（NIPRO, Osaka, Japan）を用いた。超音波画像より臓器の位置を確認し、胎仔の肝臓にLnkホモKOマウスの造血幹細胞を注入した。胎内のブタ胎仔のうちの一部（５頭）に細胞移植を行なった。【００６２】
(５)  細胞の注入
レシピエント胎仔１頭当たり0.2mLのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した造血幹細胞3.47×106個を穿刺針を通じて注入した。その後抗生物質を胎仔腹腔内に0.2ml注入し、穿刺針を抜去し、閉腹した。【００６３】
(６)  術後の抗生物質の投与
妊娠ブタにはその後２日間にわたり抗生物質を筋注により投与した。【００６４】
(７)  分娩
分娩は２０１３年７月２５日に自然分娩により行なった。【００６５】
３．出生仔の解析
(１)  方法
産仔は約１週齢、約４５日齢、約１６か月齢で末梢血の採血を行ない、フローサイトメトリー解析により血液細胞のキメリズムを調べた。ネガティブコントロールとして野生型ブタ末梢血、ポジティブコントロールとして野生型C57BL/6マウス末梢血を用いた。またレシピエント産仔と同腹の非移植産仔を同腹コントロールとした。【００６６】
有核血球の解析には赤血球を除去した試料を用いた。採取した血液試料に溶血液を加えて赤血球を除去し、ウシ胎児血清添加リン酸緩衝生理食塩水で洗浄後、抗マウス抗体を混合した。斜光、冷蔵条件下で抗体反応させた後、ウシ胎児血清添加リン酸緩衝生理食塩水を加えて洗浄し調製したものをフローサイトメトリー解析に用いた。【００６７】
45日齢では、FITC標識抗マウスCD45抗体によりマウスの成熟白血球（全ての有核血球）を、PE標識抗マウスGr-1Mac1抗体によりマウスの成熟顆粒球を、APC標識マウスCD3e抗体によりマウスのT細胞を、APC-Cy7標識マウスB220抗体によりマウスのB細胞を、それぞれ検出した。【００６８】
16か月齢では、PE標識抗マウスCD45抗体によりマウスの成熟白血球（全ての有核血球）を、FITC標識抗マウスGr-1抗体によりマウスの成熟顆粒球を、それぞれ検出した。また、マウスCD45陽性細胞でゲーティングしてマウスGr-1陽性細胞数を解析し、マウス白血球中のマウス顆粒球の割合を調べた。【００６９】
(２)  結果
細胞移植を受けた胎仔５頭のうち、１頭は生後１０日齢程度で死亡したため、４５日齢以降の解析は残りの４頭についてのみ行なった。【００７０】
図１は、得られたブタ産仔の４５日齢における血液サンプルを有核血球について解析した結果である。個体ID 30048, 30050, 30051, 30052が細胞移植したブタ産仔であり、個体ID 30053が同腹の非移植産仔である。図１bに示す通り、生存したレシピエント産仔４頭はいずれも有核血球の一部としてマウス有核血球を保有した血液キメラであった。４頭のうちの３頭（30048, 30050, 30052）は１５％を超えるキメリズムを示した。分化傾向としては、顆粒球系がほとんどを占め、T細胞及びB細胞は検出されなかった。【００７１】
図２〜図４は、得られたブタ産仔の１６か月齢における血液サンプルの解析結果である。１６か月齢でも高いキメリズムを維持していることが確認された。以下、各解析結果を説明する。【００７２】
図２は、抗マウスCD45抗体で１６か月齢のブタ産仔の血液中に存在するマウス成熟白血球を検出した結果である。表面抗原CD45は全ての有核血球上で発現しており、末梢血（循環血）中の有核血球は主として白血球である。30050, 30051, 30052の３頭では、循環血中の全有核血球のうちの１０％以上がマウス血球であり、高いキメリズムを維持していた。最もキメリズムの高い個体は、全有核血球のうちの２０％に上るマウス有核血球を保有していた。【００７３】
図３は、抗マウスGr-1抗体で１６か月齢のブタ産仔の血液中に存在するマウス成熟顆粒球を検出した結果である。高いキメリズムが確認された３頭では、循環血中の顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）の数％程度がマウスの顆粒球であった。なお、通常の野生型ブタでは、血液細胞中に占める各顆粒球の割合は、好中球が4.4〜62.1％、好酸球が0〜11％、好塩基球が0〜3.6％といわれている。【００７４】
図４は、マウスCD45陽性細胞でゲーティングし、マウス白血球中の顆粒球の割合を調べた結果である。高いキメリズムが確認された３頭では、マウス有核血球のうちの約２５〜３３％が顆粒球であった。【００７５】
30048の個体は１６か月齢時点で血液のキメリズムが著しく低下しており、移植したマウス造血幹細胞がいったんは骨髄中に生着したものの安定して定着しなかったものと考えられる。【００７６】
また30051の個体では、４５日齢でのキメリズムが非常に低かったが、１６か月齢時には有核血球のキメリズムが大幅に上昇していた。循環血中に存在する血球のうちの造血幹細胞の割合は非常に低いことが知られている。この個体では、４５日齢において、マウス造血幹細胞が骨髄中に生着していたが、そこから分化した血球が少なかったため、末梢血中の有核血球のキメリズムには反映されなかった可能性があると考えられる。【００７７】
以上、Lnkをノックアウトしたマウス造血幹細胞をブタに移植することにより、マウスの血液細胞を高い割合で安定的に保有するブタを作出できることを示した。ヒト−ブタ間、ヒト−非ヒト霊長類間では、マウス−ブタ間よりも遺伝的背景が近く、解剖学的・生理学的特徴の類似点が多い。そのため、Lnk遺伝子の機能を阻害したヒト造血系細胞をブタや非ヒト霊長類に移植すれば、マウス造血系細胞と同等又はそれ以上に高い生着率を達成できると考えられる。
【図１】
2016208532.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2016208532000001.app
【国際調査報告】
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2016208532.tif 000008
2016208532.tif 000009
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