(57)【要約】  本発明は、新たな、発毛もしくは育毛を促進する組成物、または脱毛を予防する組成物を提供することに関する。より具体的には、ｉＮＯＳ阻害剤を有効成分として含有する組成物が提供される。ｉＮＯＳ阻害剤を有効成分として含有する組成物を哺乳動物に投与すると発毛もしくは育毛に対して有利な効果が得られる。ｉＮＯＳ阻害剤としては、低分子化合物、抗体、アンチセンスオリゴやｓｉＲＮＡなどの核酸医薬を使用しうる。発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に有効な物質をスクリーニングするための方法も提供される。
2017069113.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための組成物であって、ｉＮＯＳ阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、組成物。
【請求項２】
ｉＮＯＳ阻害剤が１４００Ｗ、アミノグアニジン、ＢＹＫ１９１０２３、ＡＭＴ塩酸塩、ＡＲ−Ｃ１０２２２２、Ｌ−ＮＩＯ、Ｌ−ＮＩＬ、Ｓ−エチルイソチオ尿素、Ｓ−メチルイソチオ尿素、Ｓ−アミノエチルイソチオ尿素、２−イミノピペリジン、ブチルアミン、ＯＮＯ−１７１４、Ｌ−ＮＧ−ニトロアルギニン、Ｌ−ＮＧ−モノメチルアルギニン、Ｌ−ニトロアルギニンメチルエステル、およびデキサメタゾンから成る群から選択される化合物である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ｉＮＯＳ阻害剤がモノクローナル抗体またはその断片である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
ｉＮＯＳ阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
ｉＮＯＳ阻害剤がｓｉＲＮＡである、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
医薬組成物である、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
美容用組成物である、請求項１記載の組成物。
【請求項８】
美容サプリメントである、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
経口剤である、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
注射剤である、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
外皮用剤である、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
哺乳動物における発毛もしくは育毛を促進または脱毛を予防するための方法であって、ｉＮＯＳ阻害剤を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
哺乳動物がヒトである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物がイヌ、ネコ、またはヒツジである、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物における発毛もしくは育毛を促進または脱毛を予防するための方法であって、ｉＮＯＳを阻害する工程を含む、方法。
【請求項１６】
発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための医薬の製造における、ｉＮＯＳ阻害剤の使用。
【請求項１７】
発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に有効な物質をスクリーニングするための方法であって、
ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｉＮＯＳと試験物質とを接触させる工程、
ｉｉ）ｉＮＯＳの活性を測定する工程、および
ｉｉｉ）該試験物質がｉＮＯＳの活性を低下させるか否かを決定する工程
を含む、方法。
【請求項１８】
ｉＮＯＳの活性を増強する組成物を投与してｉＮＯＳの活性を増強する工程を含む、毛髪の成長を阻害する方法。
【請求項１９】
ＮＯを発生させる組成物を対象に投与する工程を含む、毛髪の成長を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発毛もしくは育毛を促進する組成物、脱毛を予防する組成物、または発毛もしくは育毛を促進する物質および脱毛を予防する物質のスクリーニング方法に関する。より具体的には、ｉＮＯＳ阻害剤を含有する組成物、またはｉＮＯＳの阻害活性を指標とするスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛髪の成長は一般に、成長期(anagen)、退行期(catagen)、休止期(telogen)に分類される（非特許文献１）。ヒトの頭髪の場合、成長期が２〜７年続いた後、退行期、休止期を経て、脱毛する。【０００３】
毛髪の主な機能としては、外傷や直射日光からの保護を提供すること、体温喪失の防止などがあるが、毛髪は、社会的コミュニケーションを媒介する上でも重要であり、頭髪量の減少は人々のＱＯＬの低下も招きうる。【０００４】
脱毛の原因は、男性型脱毛症、脂漏性脱毛症、老人性脱毛症、円形脱毛症、制癌剤の投与などが原因の薬物脱毛症、瘢痕性脱毛症、出産後に起こる産後脱毛症などに分類することができる。しかし、これらの脱毛への対処法は、今のところ十分に確立されていない。【０００５】
現在、医薬品として認可されている主な発毛・育毛剤には、ミノキシジルとフィナステリドがある。ミノキシジルは、当初、血管拡張を主作用とする経口の高血圧治療剤として開発された医薬品であるが、高血圧治療剤による治療を受けている患者に適応したところ、血管を拡張し、毛根の再生を促すなどの多毛症が認められたことから、医療用の外用発毛剤として改めて開発された医薬品である。ミノキシジルはＡＴＰ感受性Ｋチャネルの活性化を介して血管拡張する。ミノキシジルの主な作用は、毛包の休止期から初期成長期への移行を促進することで発毛を促す、毛包を成長させて毛髪を太い毛に成長させる、といったものであると考えられている。ＤＨＴ（ジヒドロテストステロン）は皮脂腺の受容体と結びつき、毛の成長を阻害する作用をもつ。フィナステリドは、男性ホルモンテストステロンをＤＨＴへ変換する酵素である２型５−α還元酵素を阻害し、ＤＨＴの生成を抑制することによって作用する。男性ホルモンを原因とする前立腺肥大症の治療薬を男性型脱毛症（ＡＧＡ）の治療薬に応用して開発された医薬品である。【０００６】
これらの医薬品が現在市販されているものの、脱毛対策に関しては、より有効な医薬品が今なお求められている。【０００７】
一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ、ＥＣ１．１４．１３．３９）は、窒素酸化物である一酸化窒素（ＮＯ）の合成に関与する酵素である。ＮＯＳは常時細胞内に一定量存在する構成型ＮＯＳ（ｃＮＯＳ）と、炎症やストレスにより誘導される誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ、ＮＯＳ２）に分類され、さらにｃＮＯＳは、神経型のｎＮＯＳ（ＮＯＳ１）と血管内皮型のｅＮＯＳ（ＮＯＳ３）とに分類される（非特許文献２）。ｉＮＯＳは、炎症性刺激として知られるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）などによって誘導され、免疫系、心血管系、肺などにおいて発現される。ｉＮＯＳは、病原体に対する生体防御に関与することが知られている。これまで、ｉＮＯＳ阻害剤は、抗炎症薬や抗がん剤としての使用、敗血症などの治療を目的として開発されてきたが、美容サプリメントや化粧品などを含め、治療に有効な薬剤の開発までには至っていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】K. S. Stenn and R. Paus, PHYSIOLOGICAL REVIEWS Vol. 81, No. 1, January 2001, pp.449-494
【非特許文献２】Patrick Vallance & James Leiper, Nature Reviews Drug Discovery Vol. 1,No. 12, December 2002, pp.939-950
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新たな発毛もしくは育毛を促進する組成物、または脱毛を予防する組成物を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、発毛もしくは育毛を促進する物質および脱毛を予防する物質の新たなスクリーニング方法を提供することを別の目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、炎症と糖尿病のつながりを解明する目的で作成したｉＮＯＳ欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、発毛が促進されることを見出した。また、ｉＮＯＳ単独欠損マウスにおいても野生型と比較して発毛が促進されることを見出した。そして、既存の複数のｉＮＯＳ阻害剤が発毛に対して効果を発揮することを確認した。本発明は、これらの知見を基礎とするものであり、具体的には以下の事項に関する。【００１１】
［１］発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための組成物であって、ｉＮＯＳ阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、組成物。
［２］ｉＮＯＳ阻害剤が１４００Ｗ、アミノグアニジン、ＢＹＫ１９１０２３、ＡＭＴ塩酸塩、ＡＲ−Ｃ１０２２２２、Ｌ−ＮＩＯ、Ｌ−ＮＩＬ、Ｓ−エチルイソチオ尿素、Ｓ−メチルイソチオ尿素、Ｓ−アミノエチルイソチオ尿素、２−イミノピペリジン、ブチルアミン、ＯＮＯ−１７１４、Ｌ−ＮＧ−ニトロアルギニン、Ｌ−ＮＧ−モノメチルアルギニン、Ｌ−ニトロアルギニンメチルエステル、およびデキサメタゾンから成る群から選択される化合物である、［１］記載の組成物。
［３］ｉＮＯＳ阻害剤がモノクローナル抗体またはその断片である、［１］記載の組成物。
［４］ｉＮＯＳ阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、［１］記載の組成物。
［５］ｉＮＯＳ阻害剤がｓｉＲＮＡである、［１］記載の組成物。
［６］医薬組成物である、［１］記載の組成物。
［７］美容用組成物である、［１］記載の組成物。
［８］美容サプリメントである、［１］記載の組成物。
［９］経口剤である、［１］記載の組成物。
［１０］注射剤である、［１］記載の組成物。
［１１］外皮用剤である、［１］記載の組成物。
［１２］哺乳動物における発毛もしくは育毛を促進または脱毛を予防するための方法であって、ｉＮＯＳ阻害剤を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
［１３］哺乳動物がヒトである、［１２］記載の方法。
［１４］哺乳動物がイヌ、ネコ、またはヒツジである、［１２］記載の方法。
［１５］哺乳動物における発毛もしくは育毛を促進または脱毛を予防するための方法であって、ｉＮＯＳを阻害する工程を含む、方法。
［１６］発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための医薬の製造における、ｉＮＯＳ阻害剤の使用。
［１７］発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に有効な物質をスクリーニングするための方法であって、ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｉＮＯＳと試験物質とを接触させる工程、ｉｉ）ｉＮＯＳの活性を測定する工程、およびｉｉｉ）該試験物質がｉＮＯＳの活性を低下させるか否かを決定する工程を含む、方法。
［１８］ｉＮＯＳの活性を増強する組成物を投与してｉＮＯＳの活性を増強する工程を含む、毛髪の成長を阻害する方法。 
［１９］ＮＯを発生させる組成物を対象に投与する工程を含む、毛髪の成長を阻害する方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ｉＮＯＳ欠損ｏｂ／ｏｂマウスおよびｏｂ／ｏｂマウスの発毛経過（６週間）を示す図面である（上段と下段はそれぞれ別の個体）。
【図２】ｉＮＯＳノックアウトマウスおよび野生型マウスの発毛経過（４週間）を示す図面である（上段と下段はそれぞれ別の個体）。
【図３】生理食塩水投与のｏｂ／ｏｂマウスの発毛経過（４週間）を示す図面である（上段と下段はそれぞれ別の個体）。
【図４】ｉＮＯＳ阻害剤（１４００Ｗ）による発毛促進（４週間）を示す図面である（上段と下段はそれぞれ別の個体）。
【図５】ｉＮＯＳ阻害剤（Ｌ−ＮＩＬ）による発毛促進（４週間）を示す図面である（上段と下段はそれぞれ別の個体）。
【図６】ｉＮＯＳ阻害剤（ＢＹＫ１９１０１３）による発毛促進（４週間）を示す図面である（上段と下段はそれぞれ別の個体）。
【図７】ｉＮＯＳ阻害剤（アミノグアニジン）による発毛促進（４週間）を示す図面である（上段と下段はそれぞれ別の個体）。
【図８】ｉＮＯＳ阻害剤による発毛スコアを示す図面である。
【図９】Ｃ３Ｈマウスにおける、アミノグアニジン塗布（右側の上下２段）による発毛促進（１６日間）を示す図面である（上段と下段はそれぞれ別の個体）。左側の上下２段は対照のマウス。
【図１０】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける、アミノグアニジン塗布（右側）による発毛促進（１２日間）を示す図面である。左側の写真は対照のマウス。
【図１１】１４週齢の野生型マウスとｏｂ／ｏｂマウスを用いた、皮膚片における遺伝子発現量の分析結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明を詳細に説明する。発明者らは、炎症と糖尿病のつながりを解明する目的で作成したｉＮＯＳ欠損ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、発毛が促進されることを見出した。また、ｉＮＯＳ単独欠損マウスにおいても野生型と比較して発毛が促進されることを見出した。加えて、既存のｉＮＯＳ阻害剤が発毛に対して効果を発揮することを発見した。
【００１４】
発毛育毛促進組成物
本発明の実施形態の一つは、発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための組成物であって、ｉＮＯＳ阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする組成物に関する。
【００１５】
ｉＮＯＳ
一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ、ＥＣ１．１４．１３．３９）は、窒素酸化物である一酸化窒素（ＮＯ）の合成に関与する酵素である。ＮＯＳは常時細胞内に一定量存在する構成型ＮＯＳ（ｃＮＯＳ）と、炎症やストレスにより誘導される誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ、ＮＯＳ２）に分類され、さらにｃＮＯＳは、神経型のｎＮＯＳ（ＮＯＳ１）と血管内皮型のｅＮＯＳ（ＮＯＳ３）とに分類される。ｉＮＯＳ（induced Nitric Oxide Synthase）は炎症やストレスにより誘導される誘導型ＮＯＳのうちの一つであり、免疫系、心血管系の組織や細胞、肺などで発現がみられ、病原体に対する生体防御に関与することが知られている。症性サイトカインや細菌毒素の刺激により誘導されるｉＮＯＳは多量のＮＯを産生し，活性酸素と反応することにより周囲の細胞に対して毒性を発揮する。ｉＮＯＳ由来のＮＯは、非自己の細胞に対してのみ毒性を発揮するのではない。たとえば，細菌毒素により血管平滑筋で誘導されたｉＮＯＳ由来の多量のＮＯは、強力な血管拡張と過剰な透過性の亢進を生じ、エンドトキシンショックを誘発する。また、グリア細胞などで誘導されたｉＮＯＳ由来のＮＯにより中枢神経細胞の変性や脱落が生じることやＩ型糖尿病などの自己免疫疾患でみられる細胞障害にもｉＮＯＳの関与が指摘されている。
【００１６】
ｉＮＯＳ阻害剤
ｉＮＯＳ阻害剤は、ｉＮＯＳの活性を阻害するものでも、発現を抑制するものでも良い。また、ｉＮＯＳ阻害剤は、選択的ｉＮＯＳ阻害剤であっても、非選択的ＮＯＳ阻害剤であっても良い。ｉＮＯＳ阻害剤は、例えば、低分子化合物や、抗体、核酸などの高分子でありうる。
【００１７】
低分子ｉＮＯＳ阻害剤
ｉＮＯＳを阻害する低分子化合物としては、例えば、Ｔｏｃｒｉｓ社より市販されている選択的ｉＮＯＳ阻害剤である１４００Ｗを使用することができる。１４００Ｗは、補酵素であるＮＡＤＰＨの結合を阻害する。Ｌ−ＮＩＬは別の低分子阻害剤であり、基質であるアルギニンおよびチオシトルリンのアナログである。アミノグアニジンは、基質であるアルギニンおよびチオシトルリンのアナログであり、非可逆的なｉＮＯＳ阻害剤として働く。ＢＹＫ１９０１２３は、ｉＮＯＳの二量体形成を阻害する（ｉＮＯＳは二量体となることでＮＯを産生できる）。
【００１８】
その他の選択的ｉＮＯＳ阻害剤としては、例えば、Ｓ−エチルイソチオ尿素、Ｓ−メチルイソチオ尿素、Ｓ−アミノエチルイソチオ尿素、２−イミノピペリジン、ブチルアミン、ＯＮＯ−１７１４（融合ピペリジン誘導体；（１Ｓ，５Ｓ，６Ｒ，７Ｒ）−７−クロロ−３−イミノ−５−メチル−２−アザビシクロ［４．１．０］ヘプタンヒドロクロリド）、ＡＭＴ塩酸塩（２−アミノ−５，６−ジヒドロ−６−メチル−４Ｈ−１，３−チアジン塩酸）、ＡＲ−Ｃ１０２２２２などがある。非選択的ＮＯＳ阻害剤としては、Ｌ−ＮＧ−ニトロアルギニン、Ｌ−ＮＧ−モノメチルアルギニン、Ｌ−ニトロアルギニンメチルエステル、Ｌ−ＮＩＯなどがある。ｉＮＯＳ発現抑制剤としては、デキサメタゾンがある。これらのｉＮＯＳ阻害性低分子化合物は、薬学的に許容される塩または誘導体の形で用いることもできる。
【００１９】
抗ｉＮＯＳ抗体
ｉＮＯＳ阻害剤は、抗ｉＮＯＳ抗体であってもよい。抗ｉＮＯＳ抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用できるが、モノクローナル抗体を用いることが好ましい。ｉＮＯＳに対する阻害活性を有する抗体であれば、全長である必要はなく、抗体の断片であっても使用することができる。抗体の由来する哺乳動物は、特に限定されず、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体などを使用できる。ヒトに対して用いる場合、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体のいずれであっても使用することができるが、ヒト抗体であることが好ましい。また、抗体または抗体の断片は、ファージディスプレイ法等によるスクリーニングによって同定されたペプチド配列を含むものであってもよい。さらに、核酸により構成されるアプタマーも通常の抗体と同様に使用できる。
【００２０】
抗ｉＮＯＳアンチセンスオリゴヌクレオチド
ｉＮＯＳ阻害剤は、抗ｉＮＯＳアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、例えば、１０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドをｉＮＯＳ遺伝子の塩基配列に基づき設計することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、その他の修飾核酸を含みうる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的配列に完全に相補的なものであっても、１もしくは複数のミスマッチを含むものであってもよい。ｉＮＯＳ遺伝子の塩基配列は既知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから入手することができる：
NOS2 nitric oxide synthase 2, inducible [ Homo sapiens (human) ]
Gene ID: 4843
mRNA: NM_000625.4
Nos2 nitric oxide synthase 2, inducible [ Mus musculus (house mouse) ] 
Gene ID: 18126
mRNA: NM_001313921.1
【００２１】
ｓｉＲＮＡ
ｉＮＯＳ阻害剤は、ｉＮＯＳを標的としたｓｉＲＮＡであってもよい。ｉＮＯＳ遺伝子の塩基配列は既知であり、例えば、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースから入手することができる。ｓｉＲＮＡの設計法は当業者には既知である。
【００２２】
医薬組成物
本発明の実施形態の一つは、発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための医薬組成物であって、ｉＮＯＳ阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物に関する。言い換えれば、本発明の実施形態の一つは、発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための医薬の製造における、ｉＮＯＳ阻害剤の使用に関する。有効成分として働くｉＮＯＳ阻害剤としては、例えば、上記のような低分子化合物、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなどを使用できる。本発明に係る医薬組成物は、錠剤、粉末、液体、半固体などの任意の形態をとることができ、ｉＮＯＳ阻害剤に加えて、適当な賦形剤、添加剤を含みうる。また、本発明に係る医薬組成物には、ミノキシジルやフィナステリドなどの他の活性成分が配合されていてもよい。各成分の配合量は、医薬として許容される範囲で適宜決定することができる。また、組成物の投与量は、使用する阻害剤の種類、投与する対象に応じて、適宜決定することができる。投与経路についても、使用する阻害剤の種類、投与する対象に応じて、適宜決定することができる。
【００２３】
本発明に係る医薬組成物は、脱毛症もしくは薄毛の治療もしくは予防に使用することができる。脱毛症の類型としては、男性型脱毛症、脂漏性脱毛症、老人性脱毛症、円形脱毛症、制癌剤の投与などが原因の薬物脱毛症、瘢痕性脱毛症、出産後に起こる産後脱毛症、精神疾患の抜毛症を挙げることができるが、これらに限定はされない。
【００２４】
美容用組成物
本発明の実施形態の一つは、発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための美容用組成物であって、ｉＮＯＳ阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする美容用組成物に関する。有効成分として働くｉＮＯＳ阻害剤としては、例えば、上記のような低分子化合物、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなどを使用できる。本発明に係る美容用組成物は、液体、エマルジョン、ゲル、クリームなどの任意の形態をとりうる。ｉＮＯＳ阻害剤の含有量は、使用する阻害剤の種類、適用する対象に応じて、適宜決定することができる。
【００２５】
美容サプリメント
本発明の実施形態の一つは、発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に有用な美容サプリメントであって、ｉＮＯＳ阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする美容サプリメントに関する。有効成分として働くｉＮＯＳ阻害剤としては、例えば、上記のような低分子化合物、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなどを使用できる。本発明に係る美容サプリメントは、錠剤、粉末、液体などの任意の形態をとりうる。本発明に係る美容サプリメントは、例えば、１日１〜３回、食前、食中、食後に経口摂取するものとして調製されうる。
【００２６】
発毛育毛促進方法、脱毛予防方法
本発明の実施形態の一つは、哺乳動物における発毛もしくは育毛を促進または脱毛の予防するための方法に関する。このような方法は、ｉＮＯＳを阻害する工程、より具体的には、例えば、ｉＮＯＳ阻害剤を該哺乳動物に投与することを含みうる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、アルパカ、ウマ、ミンク、キツネ、テン、タヌキ、チンチラ、ラッコ、カワウソ、ビーバー、アザラシなどが含まれる。投与量は、使用する阻害剤の種類、投与する対象に応じて、適宜決定することができる。投与経路についても、使用する阻害剤の種類、投与する対象に応じて、適宜決定することができる。好ましい投与経路としては、例えば、液剤、ローション剤、クリーム剤の脱毛領域への塗布または噴霧、あるいは、液剤の皮下注射、固形剤、液剤の経口投与を挙げることができる。ｉＮＯＳ阻害剤を含有する貼付剤を調製して皮膚に適用してもよい。
【００２７】
スクリーニング方法
本発明の実施形態の一つは、発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に有効な物質をスクリーニングするための方法に関する。このようなスクリーニング方法は、以下の工程ｉ〜ｉｉｉを含みうる：
ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｉＮＯＳと試験物質とを接触させる工程、
ｉｉ）ｉＮＯＳの活性を測定する工程、および
ｉｉｉ）該試験物質がｉＮＯＳの活性を低下させるか否かを決定する工程。
【００２８】
ｉＮＯＳ活性の測定は、当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができる。上記のスクリーニング方法によって同定された物質は、本発明に係る、発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための組成物の成分として有用である。また、本発明に係る、哺乳動物における発毛もしくは育毛を促進または脱毛の予防するための方法において、該哺乳動物に投与する物質としても有用である。
【００２９】
毛髪の成長を阻害する方法
本発明の実施形態の一つは、ｉＮＯＳの活性を増強する工程を含む、毛髪の成長を阻害する方法に関する。このような方法は、ｉＮＯＳの活性を増強する組成物を投与する工程を含みうる。ｉＮＯＳの活性は、例えば、細胞におけるｉＮＯＳの発現を誘導することによって増強しうる。ｉＮＯＳの発現は、例えば、ＬＰＳやサイトカインにより誘導されることが既知であるが、これらに限られるものではなく、ｉＮＯＳの発現を誘導する任意の物質が使用されうる。また、ｉＮＯＳの活性自体を増強する物質またはｉＮＯＳ自体（核酸もしくはタンパク質）も使用されうる。さらに、本発明の別の実施形態の一つとして、ｉＮＯＳの活性を増強する物質を含む、毛髪の成長を阻害する組成物も含まれる。
【００３０】
本発明の実施形態の一つは、ＮＯを発生させる組成物（ＮＯ供与剤、ＮＯドナーを含む組成物）を対象に投与する工程を含む、毛髪の成長を阻害する方法に関する。このようなＮＯを発生させる薬剤として、具体的にはＳＮＡＰ、ＧＳＮＯ、ＣｙｓＮＯ、ＮＯＲ、およびＮＯＣが挙げられるが、これらに限定はされない。投与方法は、使用する薬剤の性質や利便性に基づき、適宜決定することができるが、例えば、液剤、ローション剤、クリーム剤の塗布または噴霧、あるいは、液剤の皮下注射、貼付剤の皮膚への適用などが挙げられる。さらに、本発明の別の実施形態の一つとして、ＮＯを発生させる薬剤（ＮＯ供与剤、ＮＯドナー）を含む、毛髪の成長を阻害するための組成物も含まれる。
【００３１】
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
【実施例】
【００３２】
例１：ｉＮＯＳ欠損マウスを用いた発毛実験
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ社から購入したｉＮＯＳ−ＫＯマウスおよびｏｂ／ｏｂマウスを交配し、ｉＮＯＳ−ＫＯ；ｏｂ／ｏｂマウスを作成した。対照群となるｏｂ／ｏｂマウスは交配の過程で得られたｉＮＯＳ（＋／＋）；ｏｂ（＋／−）の個体を掛け合わせて生まれたｏｂ／ｏｂマウスを用いた。おのおの８週齢の雄性個体を用いて実験を開始した。ｏｂ／ｏｂマウスは麻酔下（塩酸ケタミン・塩酸キシラジン混合麻酔）で全マウスの背中を電気シェーバーで剃毛し、市販の除毛クリーム（クラシエ社製のエピラット除毛クリーム）で除毛した後、１ヶ月以上経過しても発毛が認められない。一方、ｉＮＯＳ−ＫＯ；ｏｂ／ｏｂマウスでは除毛後２週間で皮膚にメラニン色素の沈着が認められ、３週間後には広範囲に渡って発毛が確認され、６週間後にはほぼ元の状態に戻る（図１）。【００３３】
ｏｂ／ｏｂマウス交配の過程で得られる正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統）では、除毛後一週間でメラニン色素の沈着が認められ、１ヵ月後にはほぼ元の状態に毛が生えそろう。一方、ｉＮＯＳ−ＫＯ；ｏｂ／ｏｂマウス交配の過程で得られるｉＮＯＳ単独欠損マウスでは、正常マウスよりも発毛過程が促進されており、除毛後一週間で発毛が認められ、二週間後にほぼ元の状態にまで毛が生えそろう（図２）。【００３４】
これらのｉＮＯＳノックアウトマウスの観察結果は、ｉＮＯＳ活性の抑制により毛髪の成長を促進しうることを示している。また、これらの結果は、遺伝子ノックアウトだけでなく、他の手法によるｉＮＯＳ活性の抑制、例えば任意の低分子阻害剤を用いることによっても、同様な結果が得られることを示唆している。また逆に、これらの観察結果は、ｉＮＯＳ活性の増強により毛髪の成長を抑制できることも示唆していると考えられる。【００３５】
例２：ｉＮＯＳ阻害剤を用いた発毛実験
この実験では、三協ラボより購入したｏｂ／ｏｂマウスを用いた。８週齢の時点で麻酔下（塩酸ケタミン／塩酸キシラジン混合麻酔）で全マウスの背中を電気シェーバーで剃毛し、市販の除毛クリーム（クラシエ社製のエピラット除毛クリーム）で除毛した。実験開始日より各ｉＮＯＳ阻害剤の投与あるいは塗布を行った。用いたｉＮＯＳ阻害剤の用法、用量は以下のとおりである。選択的ｉＮＯＳ阻害剤である１４００Ｗ、Ｌ−ＮＩＬ、およびＢＹＫ１９１０２３はＴｏｃｒｉｓ社より購入し、生理食塩水に溶解し、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇとなるように腹腔内投与した。コントロール群には生理食塩水を腹腔内投与した。月曜日から金曜日までの連続して５日間の投与を１ヶ月続けた。同じく選択的ｉＮＯＳ阻害剤であるアミノグアニジンは東京化成工業株式会社より購入し、１０％（ｗ／ｖ）となるように生理食塩水に溶解し、除毛部に１００μｌ塗布した。コントロール群には生理食塩水を用いた。月曜日から金曜日までの連続して５日間の塗布を１ヶ月続けた。１週間に１度、背面の写真撮影を行い、１２週齢になるまで観察を続けた。投与開始日から７日毎に、刈毛部の発毛状態を、以下の発毛スコア基準を用いて採点した。【００３６】
（発毛スコア基準）
０＝発毛無し
１＝刈毛部の１０％未満に発毛
２＝刈毛部の１０％以上、２０％未満に発毛
３＝刈毛部の２０％以上、３０％未満に発毛
４＝刈毛部の３０％以上、４０％未満に発毛
５＝刈毛部の４０％以上、５０％未満に発毛
６＝刈毛部の５０％以上、６０％未満に発毛
７＝刈毛部の６０％以上、７０％未満に発毛
８＝刈毛部の７０％以上、８０％未満に発毛
９＝刈毛部の８０％以上、９０％未満に発毛
１０＝刈毛部の９０％以上に発毛【００３７】
これまでに知られているように（例えば、ＷＯ２０１２／１２４６１４Ａ１を参照）、ｏｂ／ｏｂマウスに生理食塩水のみを投与したコントロール群では発毛が認められなかった（図３）。１４００Ｗ投与開始から２週間で皮膚にメラニン色素の沈着を認め、４週間で広範囲に渡って発毛が確認された（図４）。Ｌ−ＮＩＬは１４００Ｗと比較してややメラニン色素の沈着時期が遅れ、投与開始から３週間で沈着が確認され、４週間で発毛が確認された（図５）。同じく、ＢＹＫ１９１０２３は投与開始から３週間で沈着が確認され、４週間で発毛が確認された（図６）。Ｌ−ＮＩＬおよびＢＹＫ１９１０２３は１４００Ｗと比較し発毛範囲がすくなかった。アミノグアニジンは塗布開始より１週間で皮膚にメラニン色素の沈着を認め、２週間後には発毛が確認された。塗布開始３週間で広範囲に渡って発毛が確認され、４週間でほぼ元の状態と同じにまで戻った（図７）。各ｉＮＯＳ阻害剤投与群およびコントロール群の発毛スコアを図８に示す。【００３８】
これらのデータは、ｉＮＯＳノックアウトマウスの観察結果から示唆されたように、複数の任意の低分子ｉＮＯＳ阻害剤によって、毛髪の成長を促進できることを示している。すなわち、ｉＮＯＳを阻害する手法によらず、毛髪の成長を制御できると考えてよい。これらの結果は、低分子ｉＮＯＳ阻害剤だけでなく、抗体やアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなどの他の阻害剤も同様な目的で使用可能であることを示唆している。【００３９】
例３：野生型マウスを用いた発毛実験
この実験では、Ｃ３ＨマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した点を除き、実施例２と同様な方法を用いた。８週齢の時点で麻酔下（塩酸ケタミン／塩酸キシラジン混合麻酔）で全マウスの背中を電気シェーバーで剃毛し、市販の除毛クリーム（クラシエ社製のエピラット除毛クリーム）で除毛した。実験開始日よりアミノグアニジンの塗布を行った。用いたアミノグアニジンの用法、用量は以下のとおりである。アミノグアニジンは東京化成工業株式会社より購入し、１０％（ｗ／ｖ）となるように生理食塩水に溶解し、除毛部に１００μｌ塗布した。コントロール群には生理食塩水を用いた。月曜日から金曜日までの連続して５日間の塗布を３週間続け、背面の写真撮影を毎日行った。【００４０】
結果として、アミノグアニジン塗布群では、コントロール群と比較して２〜３日の休毛期の短縮が見られた（図９および１０）。よって、ｏｂ／ｏｂマウスで観察されたｉＮＯＳ阻害剤による毛髪の成長促進は、正常な野生型のマウスでも同様に生じることが示された。【００４１】
例４：皮膚片における遺伝子発現量の分析
この実験では、１４週齢の野生型マウスとｏｂ／ｏｂマウスを用いた。背部除毛後に皮膚片を採取し、ＲＮＡ精製キット（RNeasy Plus Universal Kit、キアゲン社）にてＲＮＡを精製した後、ｃＤＮＡを合成し（High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit、ABI社）、リアルタイムＰＣＲ法によりＲＮＡ量を定量した。サーマルサイクラーはTaKaRa社のThermal Cycler Dice(R) Real Time Systemを使用し、TaqMan probeはABI社TaqMan(R) Gene Expression Assay（NOS2: Mm_0040493_g1）を用いた。【００４２】
結果は、ｏｂ／ｏｂマウスにおいては、野生型と比較して約２．５倍のｉＮＯＳ遺伝子が発現されていることを示している（図１１）。【００４３】
本明細書には、本発明の好ましい実施態様を示してあるが、そのような実施態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明に係る発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための組成物は、実施例において示されているように、顕著な発毛効果を有しており、異なる作用のｉＮＯＳ阻害剤（薬剤による阻害）とノックアウトマウス（遺伝的にｉＮＯＳを阻害）で効果が確認されている。発毛育毛剤は、既存薬が少なく、またその効果も十分ではないため、市場におけるニーズは高いと考えられる。
【図１】
2017069113.tif 000003
【図２】
2017069113.tif 000004
【図３】
2017069113.tif 000005
【図４】
2017069113.tif 000006
【図５】
2017069113.tif 000007
【図６】
2017069113.tif 000008
【図７】
2017069113.tif 000009
【図８】
2017069113.tif 000010
【図９】
2017069113.tif 000011
【図１０】
2017069113.tif 000012
【図１１】
2017069113.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成29年3月27日(2017.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための組成物であって、選択的ｉＮＯＳ阻害剤を有効成分として含有し、該選択的ｉＮＯＳ阻害剤が１４００ＷおよびＢＹＫ１９１０２３から成る群より選択されることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
ｉＮＯＳ阻害剤が１４００Ｗである、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための組成物であって、選択的ｉＮＯＳ阻害剤を有効成分として含有し、該選択的ｉＮＯＳ阻害剤がモノクローナル抗体またはその断片であることを特徴とする、組成物。
【請求項４】
発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための組成物であって、選択的ｉＮＯＳ阻害剤を有効成分として含有し、該選択的ｉＮＯＳ阻害剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、組成物。
【請求項５】
発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に用いるための組成物であって、選択的ｉＮＯＳ阻害剤を有効成分として含有し、該選択的ｉＮＯＳ阻害剤がｓｉＲＮＡであることを特徴とする、組成物。
【請求項６】
医薬組成物である、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
美容用組成物である、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項８】
美容サプリメントである、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
経口剤である、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
注射剤である、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
外皮用剤である、請求項１〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
発毛もしくは育毛の促進または脱毛の予防に有効な物質をスクリーニングするための方法であって、
ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｉＮＯＳと試験物質とを接触させる工程、
ｉｉ）ｉＮＯＳの活性を測定する工程、および
ｉｉｉ）該試験物質がｉＮＯＳの活性を低下させるか否かを決定する工程
を含む、方法。
【国際調査報告】
2017069113.tif 000014
2017069113.tif 000015
2017069113.tif 000016
2017069113.tif 000017
2017069113.tif 000018
2017069113.tif 000019
2017069113.tif 000020
2017069113.tif 000021