(57)【要約】  本発明の課題は、薬物の十分な担持量と好ましい分解速度とを両立した製剤およびその製造方法を提供すること、並びに上記した本発明の製剤において使用するための製剤用部材およびその製造方法を提供することである。本発明によれば、アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体、およびカチオン性薬物を含む製剤；凍結工程、乾燥工程、架橋工程および薬物添加工程を含む上記製剤の製造方法；アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体からなる製剤用部材：並びに上記製剤用部材の製造方法が提供される。
2017170487.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体、およびカチオン性薬物を含む製剤。
【請求項２】
局所投与される、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドのモル比が１：３〜３：１である、請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドがそれぞれ、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体またはその化学修飾物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５】
アニオン性ポリペプチドがカチオン性ポリペプチドの化学修飾物である、または、カチオン性ポリペプチドがアニオン性ポリペプチドの化学修飾物である、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体がGly-X-Yで示される配列の繰り返しを有し、XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、分子量が10kDa以上90kDa以下である、請求項４または５に記載の製剤。
【請求項７】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体が、
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
で示され、上記式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい、請求項４〜６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体が、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、カチオン性薬物を担持する作用を有するアミノ酸配列を有する、
請求項４〜７のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項９】
アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体が、熱処理による架橋体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
カチオン性薬物が、ポリペプチドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体からなる製剤用部材。
【請求項１２】
アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドのモル比が１：３〜３：１である、請求項１１に記載の製剤用部材。
【請求項１３】
アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドが、それぞれコラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体またはその化学修飾物である、請求項１１または１２に記載の製剤用部材。
【請求項１４】
アニオン性ポリペプチドがカチオン性ポリペプチドの化学修飾物である、または、カチオン性ポリペプチドがアニオン性ポリペプチドの化学修飾物である、請求項１３に記載の製剤用部材。
【請求項１５】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体がGly-X-Yで示される配列の繰り返しを有し、XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、分子量が10kDa以上90kDa以下である、請求項１３または１４に記載の製剤用部材。
【請求項１６】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体が、
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
で示され、上記式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の製剤用部材。
【請求項１７】
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体が、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、カチオン性薬物を担持する作用を有するアミノ酸配列を有する、
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の製剤用部材。
【請求項１８】
アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体が、熱処理による架橋体である、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の製剤用部材。
【請求項１９】
アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを含む溶液を凍結する凍結工程；
前記凍結工程で得られた凍結物を乾燥する乾燥工程；および
前記乾燥工程で得られた乾燥物のアニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを架橋する架橋工程：
を含む、請求項１１〜１８の何れか一項に記載の製剤用部材の製造方法。
【請求項２０】
アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを含む溶液を凍結する凍結工程；
前記凍結工程で得られた凍結物を乾燥する乾燥工程；
前記乾燥工程で得られた乾燥物のアニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを架橋する架橋工程：および
前記乾燥工程で得られたアニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体にカチオン性薬物を包含させる薬物添加工程
を含む、請求項１〜１０の何れか一項に記載の製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとカチオン性薬物とを含む製剤、並びにアニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとを含む製剤用部材に関する。本発明はさらに、上記製剤の製造方法および上記製剤用部材の製造方法に関する。本発明の製剤および製剤用部材は、医薬品に利用することができる。
【背景技術】
【０００２】
薬物を製剤用部材に含ませて製剤化することは広く行われている。例えば、薬物を徐放させるために、薬物を製剤用部材に含ませて徐放製剤を製造することが知られている。特許文献１には、繊維性部材、細胞増殖因子を徐放することができる部材、および細胞増殖因子を含む血管閉塞用組成物が記載されている。特許文献２には、インターロイキン−１１、アニオン性高分子およびカチオン性高分子を含む３成分複合体を含有する徐放性医薬組成物が記載されている。特許文献２には、アニオン性高分子としてヒアルロン酸などを使用し、カチオン性高分子としてプロタミンなどを使用することが記載されている。【０００３】
特許文献３には、有効成分、マトリックス形成成分Ａ、およびマトリックス形成成分Ａに結合可能なマトリックス形成成分Ｂを同時に噴霧することによってマイクロ微粒子を製造する方法が記載されている。特許文献３には、マトリックス形成成分Ａとしてカチオン性解離基を持つ化合物を使用し、マトリックス形成成分Ｂとしてアニオン性解離基を持つ化合物を使用することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００３−４８８４１号公報
【特許文献２】特開２００６−９６７５１号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２０１５／０２５９７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記の通り、薬物、アニオン性高分子およびカチオン性高分子を含む徐放製剤は知られているが、薬物の十分な担持量と好ましい分解速度とを両立した製剤についての検討はなされていない。本発明は、薬物の十分な担持量と好ましい分解速度とを両立した製剤およびその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記した本発明の製剤において使用するための製剤用部材およびその製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとを架橋した架橋体を、カチオン性薬物を含有する製剤用の部材として使用することによって、上記課題を解決した製剤を提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］  アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体、およびカチオン性薬物を含む製剤。
［２］  局所投与される、［１］に記載の製剤。
［３］  アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドのモル比が１：３〜３：１である、［１］または［２］に記載の製剤。
［４］  アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドがそれぞれ、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体またはその化学修飾物である、［１］〜［３］のいずれか一に記載の製剤。
［５］  アニオン性ポリペプチドがカチオン性ポリペプチドの化学修飾物である、または、カチオン性ポリペプチドがアニオン性ポリペプチドの化学修飾物である、［４］に記載の製剤。
［６］  コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体がGly-X-Yで示される配列の繰り返しを有し、XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、分子量が10kDa以上90kDa以下である、［４］または［５］に記載の製剤。
［７］  コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体が、
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
で示され、上記式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい、［４］〜［６］のいずれか一に記載の製剤。
［８］  コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体が、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、カチオン性薬物を担持する作用を有するアミノ酸配列を有する、
［４］〜［７］のいずれか一に記載の製剤。
［９］  アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体が、熱処理による架橋体である、［１］〜［８］のいずれか一に記載の製剤。
［１０］  カチオン性薬物が、ポリペプチドである、［１］〜［９］のいずれか一に記載の製剤。【０００８】
［１１］  アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体からなる製剤用部材。
［１２］  アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドのモル比が１：３〜３：１である、［１１］に記載の製剤用部材。
［１３］  アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドが、それぞれコラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体またはその化学修飾物である、［１１］または［１２］に記載の製剤用部材。
［１４］  アニオン性ポリペプチドがカチオン性ポリペプチドの化学修飾物である、または、カチオン性ポリペプチドがアニオン性ポリペプチドの化学修飾物である、［１３］に記載の製剤用部材。
［１５］  コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体がGly-X-Yで示される配列の繰り返しを有し、XおよびYはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、複数個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよく、分子量が10kDa以上90kDa以下である、［１３］または［１４］に記載の製剤用部材。
［１６］  コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体が、
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
で示され、上記式中、Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい、［１３］〜［１５］のいずれか一に記載の製剤用部材。
［１７］  コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する遺伝子組み換え体が、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、または
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有し、カチオン性薬物を担持する作用を有するアミノ酸配列を有する、
［１３］〜［１６］のいずれか一に記載の製剤用部材。
［１８］アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体が、熱処理による架橋体である、［１１］〜［１７］のいずれか一に記載の製剤用部材。【０００９】
［１９］  アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを含む溶液を凍結する凍結工程；
上記凍結工程で得られた凍結物を乾燥する乾燥工程；および
上記乾燥工程で得られた乾燥物のアニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを架橋する架橋工程：
を含む、［１１］〜［１８］の何れか一に記載の製剤用部材の製造方法。
［２０］  アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを含む溶液を凍結する凍結工程；
上記凍結工程で得られた凍結物を乾燥する乾燥工程；
上記乾燥工程で得られた乾燥物のアニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを架橋する架橋工程：および
上記乾燥工程で得られたアニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体にカチオン性薬物を包含させる薬物添加工程
を含む、［１］〜［１０］の何れか一に記載の製剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の製剤は、薬物を十分に担持できるとともに、好ましい分解速度を示す。本発明の製剤用部材および本発明の方法によれば、薬物を十分に担持できるとともに、好ましい分解速度を示す製剤を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、各経過時点での製剤のリゾチーム担持率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
［製剤］
本発明による製剤は、アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体、およびカチオン性薬物を含む製剤である。
【００１３】
本発明においては、アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体を使用し、上記架橋体とカチオン性薬物とを組み合わせることにより、薬物の十分な担持量と好ましい分解速度とを両立できることが見出された。特許文献１には、部分架橋ゼラチンを細胞増殖因子の徐放部材として用いることが記載されているが、カチオン性ポリペプチドとアニオン性ポリペプチドからなる徐放部材ではない。特許文献２には、インターロイキン−１１、アニオン性高分子およびカチオン性高分子の３成分複合体を含有する徐放製剤が記載されているが、アニオン性高分子とカチオン性高分子との架橋体ではない。特許文献３には、有効成分、マトリックス形成成分Ａ、およびマトリックス形成成分Ｂを用いてマイクロ微粒子を製造する方法が記載されているが、マトリックス形成成分Ａおよびマトリックス形成成分Ｂの架橋体を形成するものではない。
【００１４】
本明細書で後記する実施例および比較例において示す通り、アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体を使用することにより、十分に高い酸分解残存率、即ち好ましい分解速度を示す製剤を提供できることが実証された。従来技術においては、薬物の十分な担持量と好ましい分解速度とを両立するという課題は十分に検討されていない。本発明は、アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体とカチオン性薬物とを使用するという構成により、上記薬物の十分な担持量と好ましい分解速度とを両立できることに特徴がある。
【００１５】
（１）アニオン性ポリペプチド
アニオン性ポリペプチドとは、生理条件（pH7.4）で負に帯電する性質を有するポリペプチドを意味する。
【００１６】
アニオン性ポリペプチドとしては、アルカリ処理ゼラチン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ウシ血清由来アルブミンまたはそれらの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体が挙げられる。
【００１７】
アニオン性ポリペプチドとしては、カチオン性ポリペプチド（例えば、酸処理ゼラチン、コラーゲン、プロタミン、ポリアルギニンおよびそれらの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体など）を化学反応によりアニオン性に改質したものでもよい。化学反応としては、無水コハク酸もしくは無水マレイン酸の処理により、カチオン性のアミノ基をアニオン性のカルボキシル基に改質する方法または無水酢酸、N-ヒドロキシスクシンイミドアセテート、N-アセチルスクシンイミド、フェニルイソシアネートもしくはアセトアルデヒドにより、カチオン性のアミノ基を非電荷性の官能基に改質する方法が挙げられる。上記の通り、カチオン性ポリペプチドを化学反応によりアニオン性に改質したものを、カチオン性ポリペプチドの化学修飾物と称する。
【００１８】
アニオン性ポリペプチドは、好ましくは、カチオン性ポリペプチド（例えば、酸処理ゼラチン、コラーゲンおよびそれらの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体）を化学反応によりアニオン性に改質したものである。アニオン性ポリペプチドは、より好ましくは、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体を無水コハク酸処理によりアニオン性に改質したものである。
「コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体」については後記する。
【００１９】
アニオン性ポリペプチドは、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドの何れでもよい。
【００２０】
本発明において、化学合成ペプチドとは、人工的に合成したペプチドを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。
【００２１】
（２）カチオン性ポリペプチド
カチオン性ポリペプチドとは、生理条件（ｐＨ７．４）で正に帯電する性質を有するポリペプチドを意味する。
【００２２】
カチオン性ポリペプチドとしては、酸処理ゼラチン、コラーゲン、プロタミン、ポリアルギニンまたはそれらの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体が挙げられ、酸処理ゼラチン、コラーゲンまたはそれらの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体が好ましく、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体がより好ましい。
【００２３】
カチオン性ポリペプチドとしては、アニオン性ポリペプチドを化学反応によりカチオン性に改質したものでもよい。化学反応としては、エチレンジアミンなどのジアミンにより、アニオン性のカルボキシル基をカチオン性のアミノ基に改質する方法、２−アミノエタンチオールなどのアミノチオールもしくは２−アミノアルコールなどのアミノアルコールにより、アニオン性のカルボキシル基を非電荷性の官能基に改質する方法、または５−エチル−メチルピリジンボランなどによる還元的アミノ化により、アニオン性のカルボキシル基を非電荷性の官能基に改質する方法が挙げられる。上記の通り、アニオン性ポリペプチドを化学反応によりカチオン性に改質したものを、アニオン性ポリペプチドの化学修飾物と称する。
【００２４】
「コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体」については後記する。
【００２５】
カチオン性ポリペプチドは、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチドまたは化学合成ペプチドの何れでもよい。
【００２６】
（３）アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドの比率
アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドのモル比は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは１：５〜５：１であり、より好ましくは１：３〜３：１であり、さらに好ましくは１：２〜２：１であり、特に好ましくは１：１である。
【００２７】
（４）コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体
コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体とは、遺伝子組み換え技術により作られたコラーゲンあるいはゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質である。コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列の遺伝子組み換え体は、本明細書中においてリコンビナントゼラチンとも称する。
【００２８】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（ＸおよびＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００２９】
リコンビナントゼラチンとしては、例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００３０】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度および分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００３１】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ（キロダルトン）以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
【００３２】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、ＸおよびＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成および配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。ＸおよびＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００３３】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンおよびアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が好ましくは５％以上２０％未満であり、より好ましくは５％以上１０％未満である。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００３４】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有するものでもよい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、およびＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列およびＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。
【００３５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００３６】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、さらに好ましくは少なくとも０．８％であり、さらに一層好ましくは少なくとも１．０％であり、特に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは６、さらに好ましくは８、特に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００３７】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００３８】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式１：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２〜１０の整数を示し、より好ましくは３〜５の整数を示す。ｎは３〜１００の整数が好ましく、１５〜７０の整数がさらに好ましく、５０〜６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸またはアミノ酸配列を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００３９】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、  式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００４０】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、またはV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、またはIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウスまたはラットであり、より好ましくはヒトである。
【００４１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ ２，Ｅｄｉｔｏｒ Ｃｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオンおよびアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。
【００４２】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００４３】
リコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつカチオン性薬物を担持する作用を有するペプチド；または
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつカチオン性薬物を担持する作用を有するペプチド；
の何れかである
【００４４】
本発明における配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（アラインメント長）］×１００
２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（(Basic Local Alignment Search Tool)）プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。
【００４５】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４６】
リコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００４７】
リコンビナントゼラチンの親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００４８】
リコンビナントゼラチンの「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなる。
【００４９】
リコンビナントゼラチンについて、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』および『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
【００５０】
リコンビナントゼラチンのＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなる。
【００５１】
（５）アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体
本発明においては、アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドは架橋されている。アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体を使用することにより、十分に高い酸分解残存率、即ち好ましい分解速度を示す製剤を提供することができる。
【００５２】
一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、または酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
【００５３】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼおよびラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基およびグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００５４】
架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、さらに好ましくは５０℃〜３００℃であり、さらに一層好ましくは１００℃〜２５０℃であり、特に好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００５５】
架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応時間は特に限定されないが、一般的には１時間から７２時間であり、好ましくは２時間から４８時間であり、より好ましくは３時間から３６時間である。
【００５６】
本発明における架橋体の架橋度（１分子当たりの架橋数）は、特に限定されないが、好ましくは０．５以上であり、さらに好ましくは０．５以上３０以下であり、さらに一層好ましくは１以上２５以下であり、特に好ましくは１以上２０以下である。
【００５７】
架橋体の架橋度（１分子当たりの架橋数）の測定方法は、特に限定されないが、例えば、ＴＮＢＳ（2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸）法で測定することができる。具体的には、架橋体、ＮａＨＣＯ3水溶液およびＴＮＢＳ水溶液を混合して３７℃で３時間反応させた後に反応停止したサンプルと、架橋体、ＮａＨＣＯ3水溶液およびＴＮＢＳ水溶液を混合した直後に反応停止させたブランクとをそれぞれ調製し、純水で希釈したサンプルおよびブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式１）、および（式２）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出することができる。
【００５８】
（式１）  （As-Ab）／１４６００×V／ｗ
（式１）は、架橋体１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
（式中、Asはサンプル吸光度、Abはブランク吸光度、Vは反応液量（ｇ）、ｗは架橋体の質量（ｍｇ）を示す。）
【００５９】
（式２）  １−（サンプル（式２）/未架橋のポリペプチド（式２））×３４
（式２）は、１分子あたりの架橋数を示す。
【００６０】
（６）カチオン性薬物
カチオン性薬物とは、生理条件（ｐＨ７．４）で正に帯電する性質を有する薬物を意味する。カチオン性薬物としては、ポリペプチドが好ましい。ポリペプチドとしては、細胞増殖因子、酵素、およびサイトカインなどが挙げられるが特に限定されない。
【００６１】
カチオン性薬物についてのポリペプチドとは、複数のアミノ酸がペプチド結合により重合した物質を意味する。ポリペプチドは、好ましくは、１０個以上のアミノ酸が重合した物質である。タンパク質はポリペプチドの一種である。
【００６２】
細胞増殖因子とは、動物体内において、特定の細胞の増殖や分化を促進する内因性のタンパク質を意味する。細胞増殖因子としては、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）およびグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）などが挙げられる。
【００６３】
酵素とは、生体で起こる化学反応に対して触媒として機能する分子を意味する。酵素としては、リゾチーム、トリプシン、αーキモトリプシン、ウロキナーゼ、エラスターゼ、チトクロームＣ、ブロメラインおよびパパインなどが挙げられる。
【００６４】
サイトカインとは、免疫システムの細胞から分泌されるタンパク質で、標的細胞は特定されない情報伝達をするものを意味する。サイトカインとしては、インターフェロン、インターロイキンおよびエリスロポエチンなどが挙げられる。
【００６５】
本発明の製剤におけるカチオン性薬物の含有量は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体の質量に対して、一般的には０．００１質量％〜１０質量％であり、好ましくは０．０１質量％〜１０質量％であり、より好ましくは０．０１質量％〜５質量％である。
【００６６】
（７）製剤の使用方法
本発明の製剤は、カチオン性薬物を含有するものであり、医薬として疾患の治療剤として使用することができる。本発明の製剤は、好ましくは徐放製剤であり、カチオン性薬物を適切な速度で放出することができる。
【００６７】
徐放製剤とは、一般的には、長期間にわたり薬物濃度を一定に保つことを目的としたものであり、薬物が徐々に製剤から溶出されるような製剤を意味する。
【００６８】
本発明の製剤は、その使用目的に合わせて用量、投与形態、剤型を適宜決定することができる。例えば、本発明の製剤は、生体内の目的部位に直接投与してもよいし、あるいは注射用蒸留水、注射用生理食塩水、ｐＨ５〜８の緩衝液（リン酸系、クエン酸系等）等の水性溶媒等の液状賦形剤に懸濁して、例えば注射、塗布等により投与してもよい。また、本発明の製剤は、適当な賦形剤と混合し、軟膏状、ゲル状、クリーム状等にしてから塗布してもよい。
【００６９】
本発明の製剤の投与形態は、経口投与又は非経口投与（例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与等）でもよく、また局所投与でもよい。例えば、心疾患などの治療のためには、カテーテルを用いての心室内腔より心筋肉への直接注入や、冠状動脈内の狭窄または閉塞部分にカテーテルを用いて局所に放出または塗布することも挙げられる。
【００７０】
剤型としては、例えば錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤、または注射剤（例えば静脈内注射剤、筋肉内注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤等）等の非経口投与剤を挙げることができる。局所に投与する場合、本発明の製剤の形態は特に規定はないが、例えばスポンジ、フィルム、不織布、ファイバー（チューブ）、粒子、メッシュなどが挙げられる。
【００７１】
本発明の製剤の投与量は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、一般的には１０ｇ以下であり、好ましくは５ｇ以下であり、より好ましくは１ｇ以下である。
【００７２】
本発明の製剤の製剤化は、当業者に公知の方法に従って行うことができる。例えば、製剤用担体が液体の場合は、溶解または分散させ、また、製剤用担体が粉末の場合は、混合または吸着させることができる。さらに必要に応じて、薬学的に許容される添加物（例えば、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、滑沢剤、着色剤、芳香剤、矯味剤、剤皮、懸濁化剤、乳化剤、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、塑性剤、界面活性剤または無痛化剤等）を含有させることもできる。
【００７３】
［製剤用部材］
上記の通り、本発明の製剤は、アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体、およびカチオン性薬物を含むものである。本発明の製剤において、アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体は、薬物の十分な担持量と好ましい分解速度とを両立するための部材として使用されている。即ち、本発明によればさらに、アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体からなる製剤用部材が提供される。本発明の製剤用部材を構成するアニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体の詳細、および好ましい範囲については、本明細書中上記した通りである。
【００７４】
［アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体からなる製剤用部材の製造方法］
本発明はさらに、
アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを含む溶液を凍結する凍結工程；
上記凍結工程で得られた凍結物を乾燥する乾燥工程；および
上記乾燥工程で得られた乾燥物のアニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを架橋する架橋工程：
を含む、本発明の製剤用部材の製造方法を提供する。
【００７５】
凍結工程は、常法により行うことができる。
凍結工程の一例としては、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドの溶液を、未凍結状態に冷却する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で得られたアニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドの溶液を凍結する工程
により行うことができる。
【００７６】
アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドの溶液を未凍結状態に冷却する際に、最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、または０．９℃以上でもよい。
【００７７】
工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
【００７８】
好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前〜１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。
【００７９】
好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点−５℃以下であり、より好ましくは溶媒融点−５℃以下かつ溶媒融点−２０℃以上であり、さらに好ましくは溶媒融点−６℃以下かつ溶媒融点−１６℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドの溶液の溶媒である。
【００８０】
工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られたアニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドの溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結されるための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、さらに好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。
【００８１】
乾燥工程は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより乾燥を行うことができる。
乾燥時間は特に限定されず、一般的には１２時間〜１４４時間程度行うことができる。上記のように溶媒の融点より低い温度での真空乾燥と、室温（２０℃）での真空乾燥とを行う場合には、例えば、溶媒の融点より低い温度での真空乾燥を６時間〜４８時間行い、室温（２０℃）での真空乾燥を、６時間〜９６時間行うことができる。
【００８２】
乾燥工程で得られた乾燥物のアニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを架橋する架橋工程は、本明細書中において上記した通りに行うことができる。
【００８３】
本発明における架橋体の形状は特に限定されるものではない。例えば、定形、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘状、扁平状およびシート状などが挙げられる。なお不定形とは、表面形状が均一でない形状を示し、例えば、岩のような凹凸を有する形状を示す。なお、上記の形状の例示はそれぞれ別個のものではなく、例えば、粒子状（顆粒）の下位概念の一例として不定形となる場合もある。
【００８４】
［本発明の製剤の製造方法］
本発明はさらに、
アニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを含む溶液を凍結する凍結工程；
上記凍結工程で得られた凍結物を乾燥する乾燥工程；
上記乾燥工程で得られた乾燥物のアニオン性ポリペプチドおよびカチオン性ポリペプチドを架橋する架橋工程：および
上記乾燥工程で得られたアニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体にカチオン性薬物を包含させる薬物添加工程
を含む、本発明の製剤の製造方法を提供する。
【００８５】
乾燥工程および架橋工程は、本明細書中上記した通り行うことができる。
薬物添加工程は、架橋体にカチオン性薬物を包含させることができる限り特に限定されないが、例えば、架橋体にカチオン性薬物を含む溶液を添加し、架橋体に上記溶液を浸み込ませることにより、架橋体にカチオン性薬物を包含させることができる。
【００８６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００８７】
［カチオン性ポリペプチド］
カチオン性ポリペプチドとして以下に記載のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３
分子量：５１．６ｋＤａ
構造：ＧＡＰ［（ＧＸＹ）63］3Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシンおよびシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３【００８８】
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G【００８９】
［アニオン性ポリペプチドとしてのコハク化ＣＢＥ３の作製］
６．３質量％のＣＢＥ３および１．５質量％のホウ酸を含み、ｐＨを１０に調整した水溶液を作製し、上記水溶液１００ｍＬを容量３００ｍＬの３つ口フラスコに投入した。上記３つ口フラスコ中の水溶液に無水コハク酸を０．８質量％となるように添加し、混合物を３７℃で攪拌しながら２時間反応させた。分画分子量（Molecular Weight Cut Off : MWCO）が３０００の透析膜を用い、１５０倍量の蒸留水に対して透析を３回行い、反応生成物を精製し、コハク化ＣＢＥ３を得た。以後の実験においては、アニオン性ポリペプチドとしてコハク化ＣＢＥ３を用いた。【００９０】
［アニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体からなる製剤用部材の製造（実施例１）]
ＣＢＥ３およびコハク化ＣＢＥ３の混合水溶液を調整し、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製の円筒容器に８ｍＬ投入した。この時、ポリペプチドの濃度（ＣＢＥ３およびコハク化ＣＢＥ３の合計濃度）は４質量％となるようにした。
この際の水溶液中のＣＢＥ３およびコハク化ＣＢＥ３の割合の組み合わせは、以下に記載の通り用意した。
「Ａ」ＣＢＥ３とコハク化ＣＢＥ３のモル比が１：３
「Ｂ」ＣＢＥ３とコハク化ＣＢＥ３のモル比が１：１
「Ｃ」ＣＢＥ３とコハク化ＣＢＥ３のモル比が３：１【００９１】
混合水溶液を入れたＰＴＦＥ製円筒容器を真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面から冷却した。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。上記で得られた凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。上記により多孔質体を得た。【００９２】
得られた多孔質体を窒素雰囲気下、１３５℃で２４時間熱処理を行い、架橋した。【００９３】
[架橋されていないアニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとを含む製剤用部材の製造（比較例１）]
ＣＢＥ３およびコハク化ＣＢＥ３の混合水溶液を調整し、ＰＴＦＥ製の円筒容器に８ｍＬ投入した。この時、ポリペプチドの濃度（ＣＢＥ３およびコハク化ＣＢＥ３の合計濃度）は４質量％となるようにした。
この際の混合水溶液中のＣＢＥ３およびコハク化ＣＢＥ３の割合の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
「Ｄ」ＣＢＥ３とコハク化ＣＢＥ３のモル比が１：３
「Ｅ」ＣＢＥ３とコハク化ＣＢＥ３のモル比が１：１
「Ｆ」ＣＢＥ３とコハク化ＣＢＥ３のモル比が３：１【００９４】
混合水溶液を入れたＰＴＦＥ製円筒容器を真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面から冷却した。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。上記で得られた凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【００９５】
［アニオン性ポリペプチドまたはカチオン性ポリペプチドのみから成る製剤用部材の作製（比較例２）］
ＣＢＥ３の水溶液、およびコハク化ＣＢＥ３の水溶液を調整し、それぞれを別々に、ＰＴＦＥ製の円筒容器に８ｍＬ投入した。この時、ポリペプチドの濃度（ＣＢＥ３の濃度、またはコハク化ＣＢＥ３の濃度）は４質量％となるようにした。
この際の水溶液中のＣＢＥ３およびコハク化ＣＢＥ３の組み合わせは、以下に記載の通り用意した。
「Ｇ」ＣＢＥ３とコハク化ＣＢＥ３のモル比が１：０（ＣＢＥ３のみ）
「Ｈ」ＣＢＥ３とコハク化ＣＢＥ３のモル比が０：１（コハク化ＣＢＥ３のみ）【００９６】
各水溶液を入れたＰＴＦＥ製円筒容器を真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面から冷却した。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。上記で得られた凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【００９７】
得られた多孔質体を窒素雰囲気下、１３５℃で２４時間熱処理を行い、架橋した。【００９８】
［酸分解性の評価］
実施例１、比較例１および比較例２で製造した製剤用部材について、直径５ｍｍ、厚さ２ｍｍに成形した。
成形した部材を、予め質量を測った２．０ｍＬのプラスチックチューブに２個ずつ加え、質量を精密に測った。測定された質量から、チューブの質量を差し引くことにより、反応前の検体質量を求めた。その後、１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を１．７ｍＬ加え、よく混合した。さらに、２．０ｍＬチューブを３７℃に加温したヒートブロック（ＤＴＵ−２Ｂ：タイテック製）に差し込み、３時間反応させた。反応終了後、氷の入った発泡スチロール容器に２．０ｍＬチューブを回収した。【００９９】
回収した２．０ｍＬチューブを攪拌した後、１０，０００ｇ、１分、４℃で遠心した。次に、上清を１０００μＬ取り除き、水１０００μＬを加え、攪拌した後、１０，０００ｇ、１分、４℃で遠心した。その後、上清を９００μＬ取り除き、水９００μＬを加え、攪拌した後、１０，０００ｇ、１分、４℃で遠心した。さらに、上清を９００μＬ取り除き、水９００μＬを加え、攪拌した後、１０，０００ｇ、１分、４℃で遠心した。
蓋を開けた状態で２．０ｍＬチューブをチューブ用ラックに立て、−８０℃で凍結させた。【０１００】
凍結後、２．０ｍＬチューブをチューブ用ラックごと真空乾燥機（ＦＤＵ−１０００、ＥＹＥＬＡ）に移し一晩真空乾燥した。
２．０ｍＬチューブを取り出し、質量を精密に測った。測定された質量が、下記の式における「反応後の総質量」である。
下記の式で、酸分解残存率を算出した。下記の式における「風袋質量」とは、チューブの質量である。【０１０１】
【数１】
2017170487.tif 000003
【０１０２】
酸分解残存率より、部材の生体中での分解速度を予測することができる。薬物を生体中で長期間保持するためには酸分解残存率が大きい（分解しにくい）方が好ましい。ここでは、酸分解残存率が５０％以上を良好、５０％未満を不良と評価した。【０１０３】
実施例１、比較例１、および比較例２で作製した部材の酸分解性の評価結果を表１、表２、および表３に示す。【０１０４】
【表１】
2017170487.tif 000004
【０１０５】
【表２】
2017170487.tif 000005
【０１０６】
【表３】
2017170487.tif 000006
【０１０７】
表１の結果が示すように、ＣＢＥ３とコハク化ＣＢＥ３との架橋体からなる製剤用部材は酸分解残存率が十分に高く、好ましい物性を示した。
表２の結果が示すように、架橋工程を含まない場合、酸分解残存率は低く、好ましい物性を示さなかった。
表３の結果が示すように、コハク化ＣＢＥ３のみからなる製剤用部材は酸分解残存率が低く、好ましい物性を示さなかった。一方で、ＣＢＥ３のみからなる製剤用部材は酸分解残存率が高く、好ましい物性を示した。【０１０８】
［リゾチーム担持率の評価］
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用い、リゾチーム１ｍｇを蛍光標識した。
実施例２で製造したアニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドとの架橋体からなる製剤用部材「Ａ」、「Ｂ」、「Ｃ」、および、比較例２で製造したＣＢＥ３とコハク化ＣＢＥ３のモル比が１：０の製剤用部材「Ｇ」を直径５ｍｍの生検トレパンでくり抜き、上下を削ぐことで成形し、２．５ｍｇのスポンジ試料を得た。【０１０９】
比較例１で製造した架橋されていないアニオン性ポリペプチドとカチオン性ポリペプチドからなる製剤用部材「Ｄ」、「Ｅ」、「Ｆ」、および、比較例２のＣＢＥ３とコハク化ＣＢＥ３のモル比が０：１の部材「Ｈ」は、酸分解残存率が基準を満たさず不良であったことから、評価は行わなかった。【０１１０】
試料を１．５ｍｌのプラスチックチューブ（プロテオセーブＳＳ：住友ベークライト）に入れ、１ｍｇ／ｍｌに調整した蛍光ラベル化リゾチーム２５μｌを各試料に添加し、冷蔵庫で一晩静置した。
その後、各試料に超純水で１０倍希釈したリン酸緩衝生理食塩水を５００μｌ添加した。
添加直後、１時間後、３時間後、７時間後に各試料から上清１０μｌを分取し、９６穴黒色プレートに添加した。
分取試料に、超純水で１０倍希釈したリン酸緩衝生理食塩水を１９０μｌ添加し、プレートリーダーを用いて蛍光量を評価した。
蛍光リゾチームの検量線を作成し、分取試料中の蛍光リゾチーム量を算出した。
下記の計算を行い、各時点でのリゾチーム担持率を計算した。【０１１１】
【数２】
2017170487.tif 000007
【０１１２】
図１に各時点での各製剤のリゾチーム担持率を示した。
３時間後にはリゾチームの担持率が安定したことから、３時間時点でのリゾチーム担持率で各試料を比較し、結果を表４および表５に示した。【０１１３】
リゾチームはカチオン性薬物の一形態である。リゾチームの担持率から、各製剤用部材とカチオン性薬物との相互作用を予測することができる。リゾチーム担持率が高いことは、カチオン性薬物との相互作用が強いことを示しており、カチオン性薬物の徐放部材として好ましい。ここでは、３０％以上を良好とし、３０％未満を不良と評価した。【０１１４】
【表４】
2017170487.tif 000008
【０１１５】
【表５】
2017170487.tif 000009
【０１１６】
表４の結果が示すように、ＣＢＥ３とコハク化ＣＢＥ３との架橋体からなる製剤用部材は、リゾチーム担持率が高く、カチオン性薬物の徐放部材として好ましい物性を示した。
表５の結果が示すように、ＣＢＥ３のみからなる製剤用部材はリゾチーム担持率が低く、カチオン性薬物の徐放部材として好ましい物性を示さなかった。【０１１７】
［まとめ］
上記した酸分解残存率とリゾチーム担持率の評価の結果のまとめを以下に記載する。【０１１８】
【表６】
2017170487.tif 000010
【０１１９】
酸分解残存率は、９０％以上をＡ、５０％以上８０％未満をＢ、５０％未満をＣと評価した。
リゾチーム担持率は、５０％以上をＡ、２５％以上５０％未満をＢ、２５％未満をＣと評価した。
本発明の構成により、良好な酸分解残存率と良好なリゾチーム担持率とを両立できることが示された。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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