(57)【要約】  特定のｐＨの溶液中でシステインプロテアーゼと骨組織とを反応させて骨組織分解物を作製し、当該骨組織分解物を用いて、骨組織の再生などに用いることが可能な分化誘導剤および分化誘導方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ２．５以上ｐＨ５．５以下の溶液中で、システインプロテアーゼと骨組織とを反応させる工程を有することを特徴とする、骨組織分解物の製造方法。
【請求項２】
上記溶液は、ｐＨ３．０以上ｐＨ５．５以下の溶液であることを特徴とする、請求項１に記載の骨組織分解物の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の製造方法によって製造された骨組織分解物を含んでいるものであることを特徴とする、幹細胞を骨関連細胞へ分化させるための分化誘導剤。
【請求項４】
上記骨関連細胞は、骨芽細胞、破骨細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、歯根膜細胞、または、骨細胞であることを特徴とする、請求項３に記載の分化誘導剤。
【請求項５】
請求項３または４に記載の分化誘導剤を被覆させた基材上で幹細胞を培養する工程を有することを特徴とする、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる分化誘導方法。
【請求項６】
上記骨関連細胞は、骨芽細胞、破骨細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、歯根膜細胞、または、骨細胞であることを特徴とする、請求項５に記載の分化誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分化誘導剤、分化誘導方法、および、これらに用いられる骨組織分解物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、骨組織を再生するための材料として、コラーゲン、アパタイト、ナノファイバー、ポリ乳酸、または、これらの混合物などが用いられてきた（例えば、特許文献１および２参照）。【０００３】
上述した材料として、例えば、特許文献１には、（ｉ）βリン酸三カルシウム多孔体からなる微小顆粒を含む補填体と、（ｉｉ）ポリテトラフルオロエチレン、ポリ乳酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸および／またはポリカプロラクトンとの混合物、若しくは、これらとコラーゲンとの複合体からなる膜部材と、を備える骨再生材料が開示されている。【０００４】
特許文献２には、（ｉ）繊維と、（ｉｉ）ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリカプロラクトン、キチン、コラーゲン、ポリリジン、ポリアルギニン、ヒアルロン酸、セリシン、セルロース、デキストラン、および、プルランからなる群より選択される少なくとも１種である生体適合性ポリマーと、（ｉｉｉ）β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、α−リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、第２リン酸カルシウム（ＤＣＰＤ）、オクタカルシウムフォスフェート（ＯＣＰ）、テトラカルシウムフォスフェート（４ＣＰ）、アルミナ、ジルコニア、カルシウムアルミネート（ＣａＯ−Ａｌ２Ｏ３）、アルミノシリケート（Ｎａ２Ｏ−Ａｌ２Ｏ３−ＳｉＯ２）、生体活性化ガラス、石英、および、炭酸カルシウムからなる群より選択される少なくとも１種である骨補填材と、を備える骨再生用材料が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２０１２−２２３４４４号公報（２０１２年１１月１５日公開）」
【特許文献２】日本国公開特許公報「特開２０１４−  ５７８４１号公報（２０１４年  ４月  ３日公開）」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、骨組織を新しく再生する技術に対する要求は多く、骨組織の再生などに用いることが可能な、新たな材料および手法の開発が望まれている。【０００７】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、骨組織の再生などに用いることが可能な、分化誘導剤および分化誘導方法、並びに、これらに用いられる骨組織分解物および骨組織分解物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、骨組織分解物の内容物中にこそ、骨組織の分化に必要な成分が含まれているとの独自の仮説に基づいて、骨組織分解物の作製を試みた。【０００９】
本発明者らは、鋭意検討した結果、特定の条件下で骨組織とシステインプロテアーゼとを反応させることにより、（ｉ）広義の骨組織分解物を得ることができること、（ｉｉ）当該骨組織分解物は、幹細胞を、骨関連細胞へ分化させる生理活性を有していること、を見出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
＜１＞本発明の一実施形態に係る骨組織分解物の製造方法は、ｐＨ２．５以上ｐＨ５．５以下の溶液中で、システインプロテアーゼと骨組織とを反応させる工程を有することを特徴している。【００１１】
＜２＞本発明の一実施形態に係る骨組織分解物の製造方法では、上記溶液は、ｐＨ３．０以上ｐＨ５．５以下の溶液であることが好ましい。【００１２】
＜３＞本発明の一実施形態に係る幹細胞を骨関連細胞へ分化させるための分化誘導剤は、本発明の一実施形態に係る骨組織分解物の製造方法製造方法によって製造された骨組織分解物を含んでいるものであることを特徴としている。【００１３】
＜４＞本発明の一実施形態に係る幹細胞を骨関連細胞へ分化させるための分化誘導剤では、上記骨関連細胞は、骨芽細胞、破骨細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、歯根膜細胞、または、骨細胞であることが好ましい。【００１４】
＜５＞本発明の一実施形態に係る、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる分化誘導方法は、本発明の一実施形態に係る幹細胞を骨関連細胞へ分化させるための分化誘導剤を被覆させた基材上で幹細胞を培養する工程を有することを特徴としている。【００１５】
＜６＞本発明の一実施形態に係る、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる分化誘導方法では、上記骨関連細胞は、骨芽細胞、破骨細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、歯根膜細胞、または、骨細胞であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の一実施形態は、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる活性を有する骨組織分解物を得ることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施例における、酵素反応を開始してから５日目のブタ腓骨の状態を示す図である。
【図２】本発明の実施例における、酵素反応を開始してから１１日目のニワトリ尺骨の状態を示す図である。
【図３】本発明の実施例における、酵素反応を開始してから８日目のウシ骨不溶性成分の状態を示す図である。
【図４】本発明の実施例における、アリザリンレッド染色の染色像を示す図である。
【図５】本発明の実施例における、アリザリンレッド染色の染色像を示す図である。
【図６】本発明の実施例における、アリザリンレッド染色の染色像を示す図である。
【図７】（ａ）は、本発明の実施例における、脛骨をｐＨ２．５の条件で可溶化した成分の二次元電気泳動の結果を示し、（ｂ）は、本発明の実施例における、脛骨をｐＨ３．５の条件で可溶化した成分の二次元電気泳動の結果を示し、（ｃ）は、本発明の実施例における、脛骨をｐＨ５．０の条件で可溶化した成分の二次元電気泳動の結果を示す。
【図８】本発明の実施例における、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
【００１９】
〔１．骨組織分解物の製造方法〕
本実施の形態の骨組織分解物の製造方法では、特定のｐＨの溶液中で、システインプロテアーゼと骨組織とを反応させる。
【００２０】
後述する実施例でも述べるように、本発明者は、ｐＨが酸性側であるほど骨組織の分解効率は高くなる傾向を示すが、骨組織分解物が有する、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる活性は低くなる傾向を示し、ｐＨがアルカリ性側であるほど骨組織の分解効率は低くなる傾向を示すが、骨組織分解物が有する、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる活性は高くなる傾向を示すことを見出した。
【００２１】
技術常識にしたがって考えれば、骨組織の分解効率が高いほど（換言すれば、溶液のｐＨが適正な酸性ｐＨであればあるほど）骨組織分解物中に生理活性物質が溶解し、当該骨組織分解物が有する生理活性が高くなると考えられるが、本発明者が見出した上記知見は、技術常識からは予測できない、新たな知見であった。
【００２２】
上述したように、本発明の骨組織分解物は、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる。このとき、幹細胞は、特に限定されず、その具体例として、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来間葉系幹細胞、羊膜由来間葉系幹細胞、ＥＳ細胞（embryonic stem cell）、ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cell）、および、Ｍｕｓｅ細胞（Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell）を挙げることができる。一方、骨関連細胞も、特に限定されず、その具体例として、骨芽細胞、破骨細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、セメント細胞、歯根膜細胞、または、骨細胞を挙げることができる。
【００２３】
本発明では、特定のｐＨの溶液とシステインプロテアーゼとを用いて得られた骨組織分解物によって、幹細胞を骨関連細胞へ分化させることができる。
【００２４】
具体的に、本実施の形態の骨組織分解物の製造方法は、ｐＨ２．５以上ｐＨ５．５以下の溶液中で、システインプロテアーゼと骨とを反応させる工程を有することを特徴としている。
【００２５】
上記溶液のｐＨは、上述したようにｐＨ２．５以上ｐＨ５．５以下であるが、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる活性がより高い骨組織分解物を実現するという観点からは、ｐＨ３．０以上５．５以下（または、ｐＨ３．０よりも高く５．５以下）であることが更に好ましく、ｐＨ３．５以上５．５以下（または、ｐＨ３．５よりも高く５．５以下）であることが更に好ましく、ｐＨ４．０以上５．５以下（または、ｐＨ４．０よりも高く５．５以下）であることが更に好ましく、ｐＨ４．５以上５．５以下（または、ｐＨ４．５よりも高く５．５以下）であることが更に好ましく、ｐＨ５．０以上５．５以下（または、ｐＨ５．０よりも高く５．５以下）であることが最も好ましい。
【００２６】
上記溶液のｐＨは、ｐＨ２．５以上ｐＨ５．５未満であってもよいが、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる活性がより高い骨組織分解物を実現するという観点からは、ｐＨ３．０以上５．５未満（または、ｐＨ３．０よりも高く５．５未満）であることが更に好ましく、ｐＨ３．５以上５．５未満（または、ｐＨ３．５よりも高く５．５未満）であることが更に好ましく、ｐＨ４．０以上５．５未満（または、ｐＨ４．０よりも高く５．５未満）であることが更に好ましく、ｐＨ４．５以上５．５未満（または、ｐＨ４．５よりも高く５．５未満）であることが更に好ましく、ｐＨ５．０以上５．５未満（または、ｐＨ５．０よりも高く５．５未満）であることが最も好ましい。
【００２７】
上記溶液のｐＨは、周知の緩衝液を用いて、所望のｐＨに調節することができる。当該緩衝液としては、特に限定されないが、例えば、塩化カリウム−塩酸緩衝液、ｐ−トルエンスルホン酸−ｐ−ナトリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、フタル酸水素カリウム−塩酸緩衝液、酒石酸−水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液、ｔｒａｎｓ−アコニチン酸−水酸化ナトリウム緩衝液、蟻酸−蟻酸ナトリウム緩衝液、β，β’−ジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、フェニル酢酸−フェニル酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、コハク酸−水酸化ナトリウム緩衝液、フタル酸水素カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、カコジル酸ナトリウム−塩酸緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール−塩酸緩衝液、２，４，６−トリメチルピリジン−塩酸緩衝液、トリエタノールアミン・塩酸−水酸化ナトリウム緩衝液、Ｎ−エチルモルフォリン−塩酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、および、ＨＥＰＥＳ緩衝液を挙げることができる。
【００２８】
上記溶液には、所望の塩が所望の濃度、含まれていてもよい。システインプロテアーゼは、塩の濃度に応じて、基質特異性（換言すれば、システインプロテアーゼによって切断される切断箇所）が変化する。それ故に、上記構成によれば、骨組織分解物に含まれる、生理活性物質の種類、および／または、生理活性物質の量を調節することができる。
【００２９】
上記塩の具体的な構成としては特に限定されないが、塩化物を用いることが好ましい。塩化物としては、特に限定されないが、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌまたはＭｇＣｌ２を用いることが可能である。
【００３０】
上記溶液における塩の濃度は、特に限定されず、０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、１００ｍＭ以上、１５０ｍＭ以上、２００ｍＭ以上、５００ｍＭ以上、１，０００ｍＭ以上、１，５００ｍＭ以上、２，０００ｍＭ以上であってもよい。上記溶液における塩の濃度の上限値は、特に限定されず、２，０００ｍＭであってもよい。上述したように、溶液における塩の濃度は０〜２，０００ｍＭであり得るが、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる活性がより高い骨組織分解物を実現するという観点からは、０ｍＭ〜５００ｍＭが好ましく、０ｍＭ〜２００ｍＭが更に好ましい。
【００３１】
本発明では、予め前処理用の溶液にシステインプロテアーゼを溶解させた後、当該システインプロテアーゼと骨組織とを、特定のｐＨの溶液中で反応させてもよい。この場合の前処理用の溶液としては、上述した所望の塩が所望の濃度含まれている溶液と同じ溶液を用いることができる。前処理用の溶液における塩の濃度は０〜２，０００ｍＭであり得るが、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる活性がより高い骨組織分解物を実現するという観点からは、０ｍＭ〜５００ｍＭが好ましく、０ｍＭ〜２００ｍＭが更に好ましい。当該構成であっても、骨組織分解物に含まれる、生理活性物質の種類、および／または、生理活性物質の量を調節することができる。
【００３２】
本発明では、システインプロテアーゼと骨組織とを反応させるための、特定のｐＨの溶液中に、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、または、マトリックスメタロプロテアーゼなどの、システインプロテアーゼとは別種のタンパク質分解酵素の活性阻害剤を添加することが好ましい。その理由は、当該構成であれば、骨組織由来の可溶物が過分解することを防ぐことができるからである。
【００３３】
セリンプロテアーゼ阻害剤としては、ＰＭＳＦ（phenylmethanesulfonyl fluoride）、トリプスタチン、ロイペプチン、アンチパイン、ＤＥＰ、トリプシンインヒビターなどを挙げることができ、これらを、システインプロテアーゼと骨組織とを反応させるための溶液に適量加えることで所望の効果を得ることができる。アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤としては、ペプスタチン、Ｌ−３６３，５６４、Ｈ−２５６、Ｈ−２６１、Ｈ−７７などを挙げることができ、これらを、システインプロテアーゼと骨組織とを反応させるための溶液に適量加えることで所望の効果を得ることができる。マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤としては、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）、オルト−フェナンスロリン、ＴＩＭＰ（tissue inhibitor of metalloproteinase）、α２−マクログロブリン、オボスタチン、Ｚ−フェニルアラニンなどを挙げることができ、これらを、システインプロテアーゼと骨組織とを反応させるための溶液に適量加えることで所望の効果を得ることができる。この場合の溶液としては、上述した溶液と同じ溶液を用いることができる。
【００３４】
本実施の形態の骨組織分解物の製造方法に用いられるシステインプロテアーゼとしては、塩基性アミノ酸量よりも酸性アミノ酸量の方が多いシステインプロテアーゼ、酸性領域の水素イオン濃度において活性であるシステインプロテアーゼを用いることが好ましい。
【００３５】
このようなシステインプロテアーゼとしては、カテプシンＢ［ＥＣ  ３．４．２２．１］、パパイン［ＥＣ  ３．４．２２．２］、フィシン［ＥＣ  ３．４．２２．３］、アクチニダイン［ＥＣ  ３．４．２２．１４］、カテプシンＬ［ＥＣ  ３．４．２２．１５］、カテプシンＨ［ＥＣ  ３．４．２２．１６］、カテプシンＳ［ＥＣ  ３．４．２２．２７］、ブロメライン［ＥＣ  ３．４．２２．３２］、カテプシンＫ［ＥＣ  ３．４．２２．３８］、アロライン、カルシウム依存性プロテアーゼなどを挙げることが可能である。
【００３６】
これらの中では、パパイン、フィシン、アクチニダイン、カテプシンＫ、アロラインまたはブロメラインを用いることが好ましく、パパイン、フィシン、アクチニダイン、カテプシンＫを用いることが更に好ましい。
【００３７】
上記システインプロテアーゼは、公知の方法によって入手することができる。例えば、化学合成による酵素の作製；細菌、真菌、各種動植物の細胞または組織からの酵素の抽出；遺伝子工学的手段による酵素の作製；などによって入手することができる。勿論、市販の酵素を用いることも可能である。
【００３８】
システインプロテアーゼは、ＳＨ基が活性中心に存在するプロテアーゼであり、還元剤（例えば、ジチオスレイトールなど）によって活性化させることが可能である。それ故に、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる活性がより高い骨組織分解物を実現するという観点からは、上記システインプロテアーゼは、還元剤と反応させたものであることが好ましい。
【００３９】
特定のｐＨの溶液中におけるシステインプロテアーゼの濃度は、適宜設定することが可能であり、例えば、２ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌであってもよいし、１０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌであってもよい。
【００４０】
本実施の形態の骨組織分解物の製造方法に用いられる骨組織の由来は、特に限定されず、哺乳類（例えば、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウサギ、ラット、マウス、または、ヒト）由来の骨組織であってもよいし、鳥類由来の骨組織であってもよいし、両生類由来の骨組織であってもよいし、魚類由来の骨組織であってもよい。
【００４１】
より具体的に、上記骨組織は、硬骨（例えば、長管骨、短骨、扁平骨、含気骨、象牙質、セメント質、または、歯槽骨）であり得る。本実施の形態の骨組織分解物の製造方法では、上述した骨組織を予め細断した後、当該骨組織とシステインプロテアーゼとを、特定のｐＨの溶液中で反応させてもよい。当該構成であれば、骨組織の分解をより効率よく行うことができるので、幹細胞を骨関連細胞へ分化させる活性がより高い骨組織分解物を実現することができる。
【００４２】
特定のｐＨの溶液中における骨組織（例えば、硬骨）の量は、適宜設定することが可能であり、例えば、１０ｇ／Ｌ〜５００ｇ／Ｌであってもよいし、５０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌであってもよい。
【００４３】
システインプロテアーゼと反応させる骨組織は、予め脱灰された硬骨であることが好ましい。当該構成であれば、硬骨から予めカルシウムイオンを除くことができるという利点がある。
【００４４】
具体的には、硬骨成分の７０〜８０％を占めるカルシウムイオンを除くことで、骨の成分を、効率的に抽出することができる。そのため、酵素反応時間の短縮、酵素添加量の低減化、および、酵素反応温度の低温化などの効果が期待できる。
【００４５】
脱灰の具体的な方法としては、カルシウムイオンに配位してキレート化合物を形成するキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）、マグネシウム・クエン酸、または、酸（例えば、蟻酸、塩酸、硝酸、三塩化酢酸、または、プランク・リュクロ））を含む脱灰用の溶液中に、硬骨を浸漬させる方法を挙げることができる。
【００４６】
当該脱灰用の溶液中のキレート剤の濃度は、特に限定されないが、より効果的に硬骨の脱灰を行うという観点から、０．１〜０．９ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．２〜０．８ｍｏｌ／Ｌが更に好ましく、０．３〜０．７ｍｏｌ／Ｌが更に好ましく、０．４〜０．６ｍｏｌ／Ｌが最も好ましい。
【００４７】
脱灰用の溶液中に硬骨を浸漬させるときの溶液の温度は、特に限定されないが、より効果的に硬骨の脱灰を行い、かつ、硬骨に含まれる生理活性物質の活性を損なわないという観点からは、４℃〜２５℃が好ましく、４℃〜２０℃が更に好ましく、４℃〜１０℃が最も好ましい。
【００４８】
脱灰用の溶液中に硬骨を浸漬させる時間は、硬骨の量に応じて適宜設定することが可能であり、特に限定されないが、より効果的に硬骨の脱灰を行うという観点から、例えば３日間〜１０日間であり得る。
【００４９】
本実施の形態の骨組織分解物の製造方法では、以上のようにして脱灰された硬骨とシステインプロテアーゼとを、特定のｐＨの溶液中で反応させればよい。勿論、特定のｐＨの溶液にキレート剤を加え、硬骨の脱灰と、硬骨の分解とを、同時に行ってもよい。
【００５０】
〔２．分化誘導剤〕
〔２−１．分化誘導剤の構成〕
本実施の形態の、幹細胞を骨関連細胞へ分化させるための分化誘導剤は、本発明の製造方法によって製造されたものである骨組織分解物を含んでいるものである。
【００５１】
この場合、「骨組織分解物」としては、特定のｐＨの溶液中でシステインプロテアーゼと骨組織とを反応させた後の反応溶液、つまり、特定のｐＨの溶液と、システインプロテアーゼと、分解された骨組織に由来する成分との混合物、を用いることが可能である。
【００５２】
本実施の形態の分化誘導剤に含まれる骨組織分解物の量は、特に限定されず、例えば、分化誘導剤の全重量のうち、１重量％〜１００重量％、５重量％〜１００重量％、１０重量％〜１００重量％、２０重量％〜１００重量％、３０重量％〜１００重量％、４０重量％〜１００重量％、５０重量％〜１００重量％、６０重量％〜１００重量％、７０重量％〜１００重量％、８０重量％〜１００重量％、９０重量％〜１００重量％、または、１００重量％が、骨組織分解物であってもよい。幹細胞を骨関連細胞へ分化させる活性がより高い分化誘導剤を実現するという観点からは、分化誘導剤に含まれる骨組織分解物の量が多いほど好ましい。
【００５３】
本実施の形態に分化誘導剤は、骨組織分解物以外の構成を含むことも可能である。
【００５４】
例えば、分化誘導剤のｐＨを適切なｐＨに調節するために、周知の緩衝液を含むことも可能であり、骨組織の形成を補助する様々な物質（例えば、ＢＭＰ、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、または、β−ＴＣＰ）を含むことも可能である。
【００５５】
〔２−２．出願時において、本発明の分化誘導剤を構造または特性により直接特定することが不可能である、または、実際的でない事情〕
後述する実施例でも説明するように、本発明の骨組織分解物、および、当該骨組織分解物を含んでいる分化誘導剤には、多種多様な物質が含まれており、出願時において、これらの物質群の中の、何れの物質、または、何れの物質の組み合わせによって、所望の効果を奏するのかを特定することは、困難を極め、過大な経済的支出や時間を要する。
【００５６】
それ故に、本願には、出願時において、本発明の分化誘導剤を構造または特性により直接特定することが不可能である、または、実際的でない事情が存在する。
【００５７】
〔３．分化誘導方法〕
本実施の形態の幹細胞を骨関連細胞へ分化させる分化誘導方法は、本発明の分化誘導剤を被覆させた基材上で幹細胞を培養する工程を有している。
【００５８】
上記基材としては、特に限定されず、その例として、細胞培養用の培養皿、人工骨、人工歯、および、骨充填材を挙げることができる。
【００５９】
基材を分化誘導剤にて被覆する方法は、特に限定されず、その例として、基材に液体状の分化誘導剤を塗る方法、基材にゲル状の分化誘導剤を塗る方法、液体状の分化誘導剤を基材上に固定化する方法、ゲル状の分化誘導剤を基材上に固定化する方法、および、固体状の分化誘導剤を基材上に固定化する方法、を挙げることができる。
【００６０】
上記培養時には、幹細胞から骨関連細胞への分化を更に促進する物質（例えば、分化誘導用培地、ＢＭＰ、ＴＧＦβ、または、ｂＦＧＦ）を幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）へ与えてもよい。
【実施例】
【００６１】
＜１．ブタ腓骨の分解物の作製＞
０．５ｍｏｌ／Ｌの濃度にてＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）を含む溶液中に、４℃の条件下にてブタ腓骨を浸漬して、ブタ腓骨からカルシウムを除去した。当該操作を、数回、繰り返し行うことによって、ブタ腓骨を脱灰した。【００６２】
脱灰されたブタ腓骨を細断した後、当該ブタ腓骨を、様々なｐＨ（具体的には、ｐＨ２．５、ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、または、ｐＨ５．５）に調整された、アクチニダイン（K. Morimoto et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol.68, pp.861-867, 2004を参照）を含有する溶液（具体的な組成は、０．１５ｇ／ｍＬの腓骨と、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、または、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．５））中で、２０℃の条件下にて反応させた。【００６３】
反応を開始してから７日後のブタ腓骨の分解物を、後述する試験に用いた。【００６４】
なお、反応を開始してから５日目のブタ腓骨の分解物を目視にて観察したところ、図１に示すように、上述した全てのｐＨ条件にて、ブタ腓骨は良好に分解されていたが、未分解のブタ腓骨の量は、ｐＨ５．５の場合が最も多く、ｐＨ５．０の場合が２番目に多く、ｐＨ４．５の場合が３番目に多く、ｐＨ３．５の場合が４番目に多く、ｐＨ２．５の場合が最も少なかった。このことは、ｐＨが低い条件ほど、酵素による骨の分解がより進んだことを示唆している。【００６５】
＜２．ブタ腓骨の分解物のＬＣ／ＭＳによる解析＞
上述したブタ腓骨の分解物を、ＬＣ／ＭＳ（liquid chromatography-mass spectrometry）を用いた解析に供し、分解物に含まれる物質の同定を試みた。なお、実際の解析は、近畿大学生物理工学部所有のＥｋｓｐｅｒｔ  ｎａｎｏＬＣ４００（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ社製）、Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ５６００＋（ＡＢＳｃｉｅｘ社製）を利用して行った。また、Ｄａｔａｂａｓｅ検索は、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。【００６６】
以下の表に、ｐＨ２．５〜ｐＨ５．５の条件下で得られた分解物に含まれる物質の代表例を示す。以下の表から明らかなように、分解物には、様々な物質が含まれていることが明らかになった、なお、各表に示す物質は、分解物に含まれる物質の一例にすぎず、今回の試験では、例えば、ｐＨ５．５の条件下で得られた分解物の場合には、略４００種類の物質を同定することに成功した。【００６７】
また、ｐＨがより低い条件下で得られた分解物ほど、分解物に含まれる物質の種類が少なくなる傾向を示した（下述＜７＞参照）。このことは、ｐＨが低い条件ほど、酵素による骨組織を構成する成分の分解がより進んだことを示唆している。【００６８】
【表１】
2017073785.tif 000002
【００６９】
【表２】
2017073785.tif 000003
【００７０】
【表３】
2017073785.tif 000004
【００７１】
【表４】
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＜３．ニワトリ尺骨の分解物の作製＞
０．５ｍｏｌ／Ｌの濃度にてＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）を含む溶液中に、４℃の条件下にてニワトリ尺骨を浸漬して、ニワトリ尺骨からカルシウムを除去した。当該操作を、数回、繰り返し行うことによって、ニワトリ尺骨を脱灰した。【００７２】
脱灰されたニワトリ尺骨を細断した後、当該ニワトリ尺骨を、ｐＨ３．５に調整された、アクチニダイン（K. Morimoto et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol.68, pp.861-867, 2004を参照）を含有する溶液（具体的な組成は、０．１５ｇ／ｍＬのニワトリ尺骨を添加した、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５））中で、２０℃の条件下にて反応させた。【００７３】
対照として、脱灰されたニワトリ尺骨を細断した後、当該ニワトリ尺骨を、ブタペプシンを含有する溶液（具体的な組成は、３０Ｕｎｉｔ／ｍＬのペプシンを含む５０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０））中で、２０℃の条件下にて反応させた。【００７４】
反応を開始してから１１日目のニワトリ尺骨の分解物を目視にて観察したところ、図２に示すように、ニワトリ尺骨は、アクチニダインによって良好に分解された。一方、ニワトリ尺骨は、ペプシンによっては完全に分解されていないことが明らかとなった。このことは、ニワトリ尺骨においても、アクチニダインによる骨の分解が進んだことを示している。【００７５】
＜４．ウシ大腿骨の分解物の作製＞
０．５ｍｏｌ／Ｌの濃度にてＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）を含む溶液中に、４℃の条件下にてウシ大腿骨を浸漬して、ウシ大腿骨からカルシウムを除去した。当該操作を、数回、繰り返し行うことによって、ウシ大腿骨を脱灰した。【００７６】
次に、ウシ大腿骨を４．０ｍｏｌ／Ｌのグアニジン塩酸液中に浸漬して、ウシ大腿骨から可溶化タンパク質を除去した。当該ウシ大腿骨をＰＢＳで数回洗浄した後に、洗浄後のウシ大腿骨をウシ骨不溶性成分とした。【００７７】
ウシ骨不溶性成分を細断した後、当該ウシ骨不溶性成分を、ｐＨ３．５またはｐＨ５．０に調整された、アクチニダイン（K. Morimoto et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol.68, pp.861-867, 2004を参照）を含有する溶液（具体的な組成は、０．１５ｇ／ｍＬのアクチニダインを含む、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）または５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０））中で、２０℃の条件下にて反応させた。【００７８】
対照として、ウシ骨不溶性成分を細断した後、当該ウシ骨不溶性成分を、ブタペプシンを含有する溶液（具体的な組成は、３０Ｕｎｉｔ／ｍＬのペプシンを含む５０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０））中で、２０℃の条件下にて反応させた。陰性コントロールとして、ウシ骨不溶性成分を細断した後、当該ウシ骨不溶性成分を、溶液（具体的な組成は、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、または、５０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０））中で、２０℃の条件下にて反応させた。【００７９】
反応を開始してから８日後のウシ骨不溶性成分の分解物を、後述する試験に用いた。【００８０】
なお、反応を開始してから８日目のウシ骨不溶性成分の分解物を目視にて観察したところ、図３に示すように、ウシ骨不溶性成分は、ｐＨ３．５の条件下でアクチニダインによって良好に分解された。一方、ウシ骨不溶性成分は、ペプシンによっては完全に分解されていないことが明らかとなった。このことは、ウシ骨不溶性成分においても、アクチニダインによる骨の分解が進んだことを示している。【００８１】
＜５．ウシ骨不溶性成分の分解物のＬＣ／ＭＳによる解析＞
上述したウシ骨不溶性成分の分解物を、ＬＣ／ＭＳ（liquid chromatography-mass spectrometry）を用いた解析に供し、分解物に含まれる物質の同定を試みた。なお、実際の解析は、近畿大学生物理工学部所有のＥｋｓｐｅｒｔ  ｎａｎｏＬＣ４００（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ社製）、Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ５６００＋（ＡＢＳｃｉｅｘ社製）を利用して行った。また、Ｄａｔａｂａｓｅ検索は、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて行った。【００８２】
以下の表５に、ｐＨ３．５の条件下でアクチニダインを用いて得られた分解物に含まれる物質の代表例を示す。以下の表から明らかなように、分解物には、様々な物質が含まれていることが明らかになった、なお、表に示す物質は、分解物に含まれる物質の一例にすぎず、今回の試験では、例えば、ｐＨ３．５の条件下でアクチニダインを用いて得られた分解物の場合には、略２７種類の物質を同定することに成功した。【００８３】
【表５】
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＜６．ブタ腓骨の分解物を用いた、骨芽細胞への細胞分化の誘導＞
ヒト間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎＭＳＣｓ）をＬＯＮＺＡ社から購入し、ラット骨髄細胞（ｒａｔＭＭＣｓ）をコスモバイオ社から購入した。【００８４】
試験に供する試料の量を同じ量にするために、様々なｐＨ条件下で得られたブタ腓骨の分解物の各々と、皮膚Ｉ型コラーゲン由来のＬＡＳＣｏｌとを、容量比で２：８に混合した試料を準備した。【００８５】
なお、皮膚Ｉ型コラーゲン由来のＬＡＳＣｏｌは、以下の方法にて作製した。５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。アクチニダイン［ＥＣ  ３．４．２２．１４］を活性化するため、１０ｍＭ  ジチオスレイトールを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した（例えば、K. Morimoto et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol.68, pp.861-867, 2004参照参照）。次いで、５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ブタ由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ブタ由来のＩ型コラーゲンを含む当該溶液と、を７日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物（換言すれば、皮膚Ｉ型コラーゲン由来のＬＡＳＣｏｌ）を作製した。なお、ブタ由来のＩ型コラーゲンは、市販品（Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ  Ｉ−Ｃ、新田ゼラチン株式会社）を用いた。【００８６】
上述した各試料（ブタ腓骨の分解物の各々と、皮膚Ｉ型コラーゲン由来のＬＡＳＣｏｌとの混合物）を、直径３５ｍｍの培養皿の底面上に塗布した後、各培養皿に、同数のヒト間葉系幹細胞（４×１０４個）、または、ラット骨髄細胞（６×１０４個）を播種した。【００８７】
増殖用の培地（ＬＯＮＺＡ社製のヒト間葉系幹細胞用の増殖培地、または、コスモバイオ社製のラット骨髄細胞用の増殖培地）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、ヒト間葉系幹細胞、および、ラット骨髄細胞を１日間培養することによって、各細胞を、培養皿上に接着させた。その後、増殖用の培地を骨芽細胞分化用の培地（ＬＯＮＺＡ社製、または、コスモバイオ社製）に交換し、ヒト間葉系幹細胞、および、ラット骨髄細胞の分化培養を更に続けた。【００８８】
３日毎に骨芽細胞分化用の培地を新鮮な骨芽細胞分化用の培地に交換しながら、ヒト間葉系幹細胞については１５日間、ラット骨髄細胞については７日間、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で分化培養を続けた。その後、ヒト間葉系幹細胞、または、ラット骨髄細胞の石灰化（換言すれば、ヒト間葉系幹細胞、または、ラット骨髄細胞の骨芽細胞への分化後期）を検出するために、アリザリンレッド染色を行った。【００８９】
なお、アリザリンレッド染色には、アリザリンレッド染色キット（ＰＧリサーチ株式会社）を用い、具体的な染色方法は、当該キットに添付のプロトコールにしたがった。【００９０】
図４に、ヒト間葉系幹細胞を用いた場合のアリザリンレッド染色の染色像を示す。図４において、「数字」は、ブタ腓骨を分解したときのｐＨを示す。【００９１】
図４から明らかなように、分化誘導１２日目では、ｐＨ２．５からｐＨ５．０までは中性側に近くなるにつれて、石灰化が亢進していること、換言すれば、ヒト間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化が亢進していることが明らかになった。一方、ｐＨ５．５では、石灰化の亢進効果は低下した。また、ｐＨによる石灰化の亢進効果の差は、分化誘導１５日目には減少した。【００９２】
また、図５に示すように、ラット骨髄細胞を用いた試験でも、ｐＨによる石灰化の亢進効果は、ヒト間葉系幹細胞を用いた試験と同様であった。具体的には、分化誘導７日目には、全てのｐＨ条件下で得られた分解物でコートされた培養皿において、アテロコラーゲンでコートされた培養皿（ＣＯＬ  １、旭テクノグラス社製）や、非コートの培養皿よりも、顕著に高い石灰化亢進効果が確認された。【００９３】
また、図６にはブタの腓骨（ｐＨ５．０）の分解物と皮膚から抽出した分解物（対照品）とを培養皿に塗布してラット骨髄細胞を播種し、分化誘導５日目の当該細胞のアリザリンレドッド染色像を示す。図６に示すように、同じ酵素により得られたブタ皮膚由来コラーゲン分解物と比較しても、骨抽出物から得られた分解物は、非常に高い石灰化亢進効果を示した。特に、図４と図５で示すように、ｐＨ５．０で得られた分解物の石灰化亢進効果が著しかった。【００９４】
＜７．骨組織に由来する可溶化タンパク質に関する試験−２＞
本実施例では、ブタ脛骨の分解物中の可溶化成分に含まれるタンパク質を二次元電気泳動によりゲル上に展開し、タンパク質のスポットの数と量とを調べた。【００９５】
二次元電気泳動用の試料を調製するため、まず、ｐＨ２．５、ｐＨ３．５またはｐＨ５．０の条件下で可溶化させた各試料に対して、各試料の体積の３倍量の予め冷やしておいたアセトンを加え、よく混合した。【００９６】
当該混合物を−２０℃の条件下で一晩静置し、翌日に、４℃の条件下で１０，０００×ｇ、１０分間遠心分離して沈殿物を集めた。【００９７】
各ｐＨで得られた試料の沈殿物に対して、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４．５％ＣＨＡＰＳ、５．５ｍＭ  ＤＴＴ、１．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および適量のブロモフェニルブルーを含む溶液を加え、沈殿物を溶解した。不溶性の成分を除くために、溶解物を１０，０００×ｇで３分間遠心分離に供し、上清を集めた。【００９８】
二次元電気泳動の一次元目の等電点電気泳動では、Ｅｔｔａｎ  ＩＰＧｐｈｏｒ３（ＧＥ  ヘルスケア）を用いて、膨潤液用のストリップホルダーに各上清を入れてさらにＲｅａｄｙＳｔｒｉｐＴＭＩＰＧ  Ｓｔｒｉｐｓ（７ｃｍ、ｐＨ３−１０、ｎｏｎｌｉｎｅａｒ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を置くことで、膨潤を開始した。その条件を下表に示す。【００９９】
【表６】
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一次元目の等電点電気泳動が終了する直前に、二次元目のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の準備を行った。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＡＴＴＯ株式会社製の一体型電気泳動槽を用いて行った。電気泳動用のゲルとしては、常法にしたがって作製した１１％ポリアクリルアミドゲルを用いた。【０１００】
一次元目の等電点電気泳動を終えたストリップは、ＳＤＳ緩衝液に平衡化させるため、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、尿素、グリセロール、ＳＤＳ、ＤＴＴを混合した溶液で１５分間浸漬し、振とうした。その後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、尿素、グリセロール、ＳＤＳ、ヨードアセトアミドを混合した溶液に浸漬し、１５分間振とうした。【０１０１】
次に、二次元目の電気泳動用のゲルの上部に０．５％アガロースを重層し、さらに一次元目の電気泳動を終えたストリップを、ゆっくりと平らになるように設置した。その際、左端のゲルに分子量マーカーを染み込ませたろ紙を接触させた。【０１０２】
ＳＤＳ泳動緩衝液を電気泳動槽の上部と下部とにそれぞれ適量入れ、常法に従い、泳動を開始した。二次元目の電気泳動を終えたゲル内のタンパク質を、ＥｚＳｔａｉｎ  Ｓｉｌｖｅｒ銀染色キット（ＡＴＴＯ社製）を用いて染色した。染色方法はＡＴＴＯ株式会社の銀染色キットに添付の手引書に従った。【０１０３】
二次元電気泳動の結果を図７（ａ）〜図７（ｃ）に示す。図７（ａ）は、脛骨をｐＨ２．５の条件で可溶化した成分の二次元電気泳動の結果を示し、図７（ｂ）は、脛骨をｐＨ３．５の条件で可溶化した成分の二次元電気泳動の結果を示し、図７（ｃ）は、脛骨をｐＨ５．０の条件で可溶化した成分の二次元電気泳動の結果を示す。【０１０４】
電気泳動用のゲルの上下はタンパク質の分子量の大小を示し、下になるほど分子量が小さいことを意味する。分子量はＭｗと表し、分子量の大きさをｋＤａ示した。電気泳動用のゲルの左右はタンパク質の等電点を示し、等電点をｐＩと表した。ｐＩは、電気泳動用のゲルの左端が３、電気泳動用のゲルの右端が１０を示す。【０１０５】
つまり、図７（ａ）〜図７（ｃ）に示す電気泳動用のゲルにおいて、黒く染まっているスポットがタンパク質に対応し、電気泳動用のゲルにおけるタンパク質の位置に基づいて、当該タンパク質の凡その分子量と等電点とを知ることができる。【０１０６】
図７（ａ）〜図７（ｃ）の結果から、図７（ｃ）に示す電気泳動用のゲルには多数のスポットが確認できるので、ｐＨ５．０の条件では、分子量および等電点が異なる多種類のタンパク質が可溶性となり回収されたことが証明できた。さらに分子量１万以上の高分子量のタンパク質も存在することから、本抽出条件では可溶化タンパク質が、天然の状態により近いことが示唆された。一方、図７（ａ）および図７（ｂ）に示す電気泳動用のゲルではスポットの数が少なく、またスポットの濃さも薄いことから、ｐＨ２．５およびｐＨ３．５の条件では、ｐＨ５．０の条件と比較して、多くのタンパク質は回収できていないことが分かった。【０１０７】
＜８．象牙組織の可溶化に関する試験＞
歯は、セメント質、象牙質、およびエナメル質などの結合組織と、セメント芽細胞、象牙芽細胞、およびエナメル芽細胞などの細胞と、から構成されている。歯は、上述した結合組織および細胞の他に、血管や神経などが複雑に入り組んだ構造を有している。【０１０８】
ウシ象牙質を得るため、まず、ウシから歯冠組織を複数個採取し、そのエナメル質を常法により酸性処理し、ウシ象牙質を得た。次に、０．５ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）を含む溶液中に、４℃の条件下にてウシ象牙質を浸漬して、ウシ象牙質からカルシウムを除去した。当該操作を、数回、繰り返し行うことによって、ウシ象牙質を脱灰した。【０１０９】
さらに、脱灰されたウシ象牙質を液体窒素中で金属製の乳鉢（内径４０−８０ｍｍ、深さ４０−８０ｍｍ）を用いて細かく摩砕し、当該摩砕物を生理食塩水で５〜１０回洗浄し、象牙質不溶化物（Ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  Ｄｅｎｔｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ、以下ＩＤＭと省略）を得た。【０１１０】
ＩＤＭを可溶化するため、アクチニダインを用いた。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した（例えば、K. Morimoto et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol.68, pp.861-867, 2004を参照）。アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭ  ジチオスレイトールと５ｍＭＥＤＴＡとを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。【０１１１】
次いで、５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）とＩＤＭ（１００ｍｇ（乾重量））とを混合した。０．５重量％になるように調整したアクチニダインを含む水溶液と、ＩＤＭを含む溶液と、を１６日間、２０℃にて接触させて、ウシ象牙質不溶化物の分解物を作製した。【０１１２】
対照として、５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ２．５）と、ＩＤＭ（１００ｍｇ（乾重量））と、を混合した。０．５重量％になるように調整したブタ・ペプシンを含む水溶液と、ＩＤＭを含む溶液と、を１６日間、２０℃にて接触させて、ウシ象牙質不溶化物の分解物を作製した。【０１１３】
典型的な試験結果として、図８にＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。ウシ象牙質不溶化物は、ペプシンでは何も抽出できなかったが、アクチニダインでは多数のタンパク質が溶解したことが示された。【０１１４】
よって、象牙質不溶化物からのタンパク質の可溶化率は、用いる酵素によって差が生じることは歴然であり、更に、本実施例の方法で得られた象牙質可溶化物は、脛骨可溶化物と同等の用途に用いられることが明らかである。【０１１５】
骨や象牙質は、硬組織に分類され、真皮や腱のような軟組織とは異なり、不溶性組織であって、タンパク質を変性させずに抽出することはこれまでにできなかった。硬組織からタンパク質を未変性で回収する適切な方法は従来報告されておらず、骨あるいは象牙質を加熱変性処理するなどして、骨から変性タンパク質を回収する技術しかなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１６】
本発明は、骨組織の培養、骨組織の形成、骨組織のモデルシステムの構築、および、骨組織のモデルシステムを用いた様々な試験などに利用することができる。例えば、本発明の骨組織分解物は、骨分化作用が著しく早く、かつ、分化効率が良好なので、従来の再生骨誘導材料に比べて短期に骨修復効果が期待できる。また、本発明は、骨組織の再生に優れているので、再生医療に用いられる移植用の幹細胞、または、骨芽細胞の足場材料として、好適に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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