(57)【要約】  蛍光性のon/off及び蛍光励起波長の全てが独立したタイプの光切替型蛍光蛋白質であって、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度が向上した蛍光蛋白質の提供。  一実施形態において、配列番号１に少なくともＳ２０８Ｇの変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。その他の実施形態において、配列番号１に少なくともＩ４７Ｖ、Ｍ１５３Ｔ、及びＳ２０８Ｇの３つの変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。さらにその他の実施形態において、配列番号１に少なくともＩ４７Ｖ、Ｔ５９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｓ２０８Ｇ、及びＭ２３３Ｔの５つの変異導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。さらにその他の実施形態において、配列番号１に少なくともＩ４７Ｖ、Ｔ５９Ｓ、Ｍ６９Ｑ、Ｍ１５３Ｔ、Ｓ２０８Ｇ、及びＭ２３３Ｔの６つの変異導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。
2016182019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列に少なくともＳ２０８Ｇの変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列に少なくともＩ４７Ｖ、Ｍ１５３Ｔ、及びＳ２０８Ｇの３つの変異が導入されたアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の蛍光蛋白質。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列に少なくともＩ４７Ｖ、Ｔ５９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｓ２０８Ｇ、及びＭ２３３Ｔの５つの変異導入されたアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の蛍光蛋白質。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列に少なくともＩ４７Ｖ、Ｔ５９Ｓ、Ｍ６９Ｑ、Ｍ１５３Ｔ、Ｓ２０８Ｇ、及びＭ２３３Ｔの６つの変異導入されたアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれかに記載の蛍光蛋白質。
【請求項５】
配列番号２から４のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項１から４のいずれかに記載の蛍光蛋白質。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の蛋白質のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、無蛍光性から蛍光性とするための波長と蛍光性から無蛍光性とするための波長と蛍光励起のための波長とが全て異なり、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度が配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質のそれよりも速い、蛍光蛋白質。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の蛍光蛋白質が融合された融合蛋白質であって、該蛍光蛋白質の部分は、無蛍光性から蛍光性とするための波長と蛍光性から無蛍光性とするための波長と蛍光励起のための波長とが全て異なり、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度が配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質のそれよりも速い、融合蛋白質。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項９】
請求項１から７のいずれかに記載の蛋白質を発現可能な、或いは、請求項８に記載のＤＮＡを有するベクター。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれかに記載の蛋白質を発現する形質転換体。
【請求項１１】
請求項１から７のいずれかに記載の蛋白質、請求項８に記載のＤＮＡ、請求項９に記載のベクター、又は、請求項１０に記載の形質転換体を用いるイメージング方法。
【請求項１２】
前記イメージング方法が、超解像蛍光顕微鏡観察法である、請求項１１に記載のイメージング方法。
【請求項１３】
請求項１から７のいずれかに記載の蛋白質を含むフォトクロミック材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、蛍光蛋白質、該蛋白質のＤＮＡ、ベクター、及び形質転換体、並びにそれらを用いたイメージング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光蛋白質によってライブセルイメージングが簡便に実施可能となり、細胞内の様々な構造や機能が解明されてきている。近年では、可逆的に蛍光性を光切替可能な蛍光蛋白質（Reversibly Photo-Switchable Fluorescent Protein, RSFP）を利用した超解像法が開発され、光学顕微鏡の回折限界を超えたイメージングが可能となっている。RSFPとしては、例えば、１）蛍光励起しない特定の波長の光照射によって無蛍光性から蛍光性になり、蛍光励起のための光照射によって蛍光性から無蛍光性になるネガティブ光切替型（例えば、Dronpa（特許文献１)、rsEGFP）、２）蛍光励起のための光照射によって無蛍光性から蛍光性になり、蛍光励起しない特定の波長の光照射によって蛍光性から無蛍光性になるポジティブ光切替型（例えば、Padron(非特許文献1)）、及び、３）蛍光性のon/off及び蛍光励起波長の全てが独立したタイプ（例えば、Dreiklang（非特許文献２)）がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO2005/113772
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Tanja Brakemann et al, J. Biol. Chem. 2010, 285:14603-14609
【非特許文献２】Tanja Brakemann et al, Nat Biotechnol. 29 (2011):942-947
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記３）のタイプの光切替型蛍光蛋白質では、Dreiklangが報告されて以降、改変型は報告されていない。DreiklangはPALM（Photo Activated Localization Microscopy）と呼ばれる超解像顕微鏡法や、PALM以外の他の超解像顕微鏡法にも適用可能であるといった長所があるが、光スイッチング速度が遅く、超解像時の時間分解能の遅さが問題となっていた。【０００６】
本開示は、一又は複数の実施形態において、蛍光性のon/off及び蛍光励起波長の全てが独立したタイプの光切替型蛍光蛋白質の改変体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、一又は複数の実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列に少なくともＳ２０８Ｇの変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質に関する。【０００８】
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列に少なくともＩ４７Ｖ、Ｍ１５３Ｔ、及びＳ２０８Ｇの３つの変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質に関する。
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列に少なくともＩ４７Ｖ、Ｔ５９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｓ２０８Ｇ、及びＭ２３３Ｔの５つの変異導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質に関する。
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列に少なくともＩ４７Ｖ、Ｔ５９Ｓ、Ｍ６９Ｑ、Ｍ１５３Ｔ、Ｓ２０８Ｇ、及びＭ２３３Ｔの６つの変異導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質に関する。【０００９】
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、本開示に係る蛍光蛋白質を含む融合蛋白質に関する。【００１０】
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、本開示に係る蛍光蛋白質又は融合蛋白質を用いるイメージング方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本開示によれば、一又は複数の実施形態において、蛍光性のon/off及び蛍光励起波長の全てが独立したタイプの光切替型蛍光蛋白質であって、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度が向上した蛍光蛋白質を提供できる。その他の一又は複数の実施形態において、本開示によれば、蛍光性のon/off及び蛍光励起波長の全てが独立したタイプの光切替型蛍光蛋白質であって、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度がDreiklang（配列番号１）よりも向上した蛍光蛋白質を提供できる。【００１２】
本開示に係る蛍光蛋白質によれば、一又は複数の実施形態において、超解像イメージングにおける空間解像能及び時間解像能を向上できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、Dreiklang（配列番号１）、PSFP2（配列番号２）、PSFP3（配列番号３）、及びPSFP4（配列番号４）のアミノ酸配列のアライメントである。
【図２】図２は、PSFP3におけるDreiklangからの５つの変異の箇所を示す図である。
【図３】図３は、PSFP2、PSFP3、PSFP4及びDreiklangについて、光を照射して蛍光性がoffになった後、熱平衡によって蛍光性がon状態になるまでの回復速度を、測定したグラフの一例である。
【図４】図４は、PSFP2、PSFP3、及びDreiklangについて、蛍光性onからoffへの光切替の速さを測定したグラフの一例である。
【図５】図５は、PSFP2、PSFP3、PSFP4及びDreiklangについて、ブリーチングによる蛍光の経時変化を測定したグラフの一例である。
【図６】図６は、PSFP3とDreiklangについて、連続光切替の一例を示すグラフである。
【図７】図７は、PSFP3の融合蛋白質の局在化を観察した一例を示すイメージである。
【図８】図８は、DSSM（Decoupled stochastic switching microscopy）の測定原理を説明する図である。
【図９】図９は、PSFP3を用いたビメンチンの全視野顕微鏡の画像の一例（左）と超解像顕微鏡観察（DSSM）の画像の一例である（右）。
【図１０】図１０は、局在化したPSFP3の融合蛋白質の蛍光の光切替を観察した一例を示すイメージである。
【図１１】図１１は、PSFP3の融合蛋白質の局在化を観察したその他の例を示すイメージである。
【図１２】図１２は、タイムラプス超解像イメージングの観察スキームの一例の概要を示す図である。
【図１３】図１３は、タイムラプス超解像イメージングの観察の一例を示すイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示は、無蛍光性から蛍光性とするための波長と蛍光性から無蛍光性とするための波長と蛍光励起のための波長とが全て異なるタイプの光切替型蛍光蛋白質であるDreiklang（配列番号１）にS208Gの変異を導入する事で、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度（蛍光性がOffから自発的にOnになる速度）がDreiklangに比べて３倍となり、光照射により蛍光性から無蛍光性となる速度（OnからOffへの光切替速度）がDreiklangに比べて２倍になる、という知見に基づく。
【００１５】
本開示は、また、S208Gの変異に加えてI47VとM153Tの合計３つの変異をDreiklangに導入した蛍光蛋白質（PSFP2）は、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度がDreiklangに比べて３倍となり、光照射により蛍光性から無蛍光性となる速度がDreiklangに比べて２倍になり、さらに、S208Gの単独変異導入時に比べて蛍光状態における輝度が上昇するという知見に基づく。
【００１６】
本開示は、さらにまた、前記PSFP2にT59SとM233Tの２つ変異を導入した蛍光蛋白質（すなわち、DreiklangにS208G、I47V、M153T、T59S、及びM233Tの５つ変異を導入した蛍光蛋白質）（PSFP3）は、光照射により蛍光性から無蛍光性となる速度がDreiklangに比べて３．７倍に向上する、という知見に基づく。
【００１７】
PSFP3における５つの変異の箇所は、Dreiklangにおいて図２に示すような部位に位置する。これらの変異の箇所はいずれもDreiklangの発色団があるβバレル構造から離れた箇所であり、これらの箇所の変異が、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度の向上、及び、光照射により蛍光性から無蛍光性となる速度の向上をもたらすことは技術常識から予測できない効果といえる。なお、本発明の範囲及び本発明の効果は、上述した又は後述する効果に関する「ｘ倍」という数値に限定して解釈されない。
【００１８】
本開示は、さらにまた、前記PSFP3にM69Qの変異を導入した蛍光蛋白質（すなわち、DreiklangにS208G、I47V、M153T、T59S、M233T、及びM69Qの６つ変異を導入した蛍光蛋白質）（PSFP4）は、蛍光の光安定性（ブリーチングによる蛍光の減衰抑制）がDreiklangに比べて２．８倍に向上する、という知見に基づく。
【００１９】
［蛍光蛋白質］
本開示に係る蛍光蛋白質は、無蛍光性から蛍光性とするための波長と蛍光性から無蛍光性とするための波長と蛍光励起のための波長とが全て異なるタイプの光切替型蛍光蛋白質である。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質であるDreiklangは、このタイプの光切替型蛍光蛋白質である。
【００２０】
本開示において「光切替型蛍光蛋白質」とは、一又は複数の実施形態において、蛍光性状態のonとoff（すなわち、蛍光性と無蛍光性）を波長の異なる２つの光照射によって制御ができ、かつ、onとoffの切り替えが繰り返し行うことができる蛋白質をいう。
【００２１】
本開示において“X1nX2”で表される変異は、一般的な変異の表記方法であって、アミノ酸配列のｎ番目のアミノ酸残基Ｘ1（一文字表記のアミノ酸残基）が、アミノ酸残基Ｘ2（一文字表記のアミノ酸残基）に置換される変異を表す。
【００２２】
本開示は、一態様として、配列番号１のアミノ酸配列に、少なくともS208Gの変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質に関する。
上記S208Gの変異が導入されることで、該変異の導入前と比較して、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度が向上する。その他の一又は複数の実施形態においては、上記S208Gの変異が導入されることで、該変異の導入前と比較して、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度が向上し、かつ、光照射により蛍光性から無蛍光性となる速度が向上されうる。
【００２３】
本開示に係る蛍光蛋白質の一又は複数の実施形態として、配列番号１のアミノ酸配列に、S208Gの変異と、I47V、T59S、M69Q、M153T、及びM233Tからなる群から選択される１又は２〜５つの変異とが少なくとも導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。
本実施形態の蛍光蛋白質は、該変異の導入前と比較して、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度が向上した光切替型蛍光蛋白質となりうる。
前記変異のうち、I47V若しくはM153T、又は、I47V及びM153Tの変異は、蛍光の輝度の向上に貢献しうる。
前記変異のうち、T59S若しくはM233T、又は、T59S及びM233Tの変異は、光照射により蛍光性から無蛍光性となる速度の向上に貢献し得る。
前記変異のうち、M69Qの変異は、蛍光の光安定性の向上に寄与しうる。
【００２４】
本開示に係る蛍光蛋白質の一又は複数の実施形態として、配列番号１のアミノ酸配列に、少なくともI47V、M153T、及びS208Gの３つの変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。配列番号１に前記３つの変異が導入されたアミノ酸配列が配列番号２（PSFP2）である。
本実施形態の蛍光蛋白質では、S208Gの変異に加えてI47V及びM153Tの変異が導入されることで、S208Gのみが導入された場合に比べて、蛍光状態における輝度が向上されうる。
【００２５】
本開示に係る蛍光蛋白質の一又は複数の実施形態として、配列番号１のアミノ酸配列に少なくともI47V、T59S、M153T、S208G、及びM233Tの５つの変異導入されたアミノ酸配列を有するが挙げられる。配列番号１に前記５つの変異が導入されたアミノ酸配列が配列番号３（PSFP3）である。
本実施形態の蛍光蛋白質では、I47V、M153T、及びS208Gの変異に加えてT59S及びM233Tの変異が導入されることで、T59S及びM233Tの変異導入前に比べて、光照射により蛍光性から無蛍光性となる速度がいっそう向上されうる。
【００２６】
配列番号１のアミノ酸配列に少なくともI47V、T59S、M69Q、M153T、S208G、及びM233Tの６つの変異導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。配列番号１に前記６つの変異が導入されたアミノ酸配列が配列番号４（PSFP4）である。
本実施形態の蛍光蛋白質では、I47V、T59S、M153T、S208G、及びM233Tの５つの変異に加えてM69Qの変異が導入されることで、M69Qの変異導入前に比べて、蛍光の光安定性が向上されうる。
【００２７】
本開示において、「熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度」、「光照射により蛍光性から無蛍光性となる速度」、及び「蛍光の光安定性」は、実施例に記載の方法で測定及び評価されうる。
【００２８】
本開示に係る蛍光蛋白質は、一又は複数の実施形態において、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度がDreiklang（配列番号１）のそれよりも速いことが好ましい。
本開示に係る蛍光蛋白質は、一又は複数の実施形態において、光照射により蛍光性から無蛍光性となる速度がDreiklang（配列番号１）のそれよりも速いことが好ましい。
本開示に係る蛍光蛋白質は、一又は複数の実施形態において、蛍光の光安定性がDreiklang（配列番号１）のそれよりも高いことが好ましい。
【００２９】
本開示に係る蛍光蛋白質は、一又は複数の実施形態において、無蛍光性から蛍光性とするための波長と蛍光性から無蛍光性とするための波長と蛍光励起のための波長とが全て異なるタイプの光切替型蛍光蛋白質の機能を維持できる範囲で、前記６つの変異（I47V、T59S、M69Q、M153T、S208G、及びM233T）以外の変異を有していてもよい。前記６つの変異以外の変異としては、１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加が挙げられ、「１から数個」とは、一又は複数の実施形態において、１〜４、１〜３、１〜２、又は１個を含む。
本開示に係る蛍光蛋白質は、一又は複数の実施形態において、前記６つの変異以外の変異を含む場合であっても、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度がDreiklang（配列番号１）のそれよりも速いことが好ましい。
本開示に係る蛍光蛋白質は、一又は複数の実施形態において、前記６つの変異以外の変異を含む場合であっても、光照射により蛍光性から無蛍光性となる速度がDreiklang（配列番号１）のそれよりも速いことが好ましい。
本開示に係る蛍光蛋白質は、一又は複数の実施形態において、前記６つの変異以外の変異を含む場合であっても、蛍光の光安定性がDreiklang（配列番号１）のそれよりも高いことが好ましい。
【００３０】
本開示に係る蛍光蛋白質は、一又は複数の実施形態において、化学合成により合成した蛋白質であってもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換え蛋白質であってもよい。遺伝子組み換え技術による組み換え蛋白質の作製としては、一又は複数の実施形態において、本開示に係る蛍光蛋白質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて作製する方法が挙げられる。
【００３１】
本開示に係る蛍光蛋白質は、一又は複数の実施形態において、上述した本開示に係る蛍光蛋白質が他の蛋白質又はペプチドと融合した融合蛋白質であって、該蛍光蛋白質の部分が、無蛍光性から蛍光性とするための波長と蛍光性から無蛍光性とするための波長と蛍光励起のための波長とが全て異なる光切替型蛍光蛋白質として機能可能な融合蛋白質である。
本開示に係る融合蛋白質は、一又は複数の実施形態において、該蛍光蛋白質の部分は、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度がDreiklang（配列番号１）のそれよりも速いことが好ましい。
本開示に係る融合蛋白質は、一又は複数の実施形態において、該蛍光蛋白質の部分は、光照射により蛍光性から無蛍光性となる速度がDreiklang（配列番号１）のそれよりも速いことが好ましい。
本開示に係る融合蛋白質は、一又は複数の実施形態において、該蛍光蛋白質の部分は、蛍光の光安定性がDreiklang（配列番号１）のそれよりも高いことが好ましい。
【００３２】
本開示に係る融合蛋白質において、本開示に係る蛍光蛋白質に結合（融合）される蛋白質は、限定されない一又は複数の実施形態において、シグナル配列、発現タグ、又は、蛋白質（必要に応じてリンカー配列）が挙げられる。前記シグナル配列及び前記蛋白質としては、一又は複数の実施形態において、イメージングをする観点から、細胞内の細胞骨格（マイクロフィラメント、中間径フィラメント、微小管）や細胞小器官（核、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、エンドソーム、リソソーム等）に局在化できるシグナル配列や蛋白質が挙げられる。
【００３３】
本開示に係る蛍光蛋白質は、光切替速度が速く、また繰り返しの蛍光の読み出しが可能であるため、一又は複数の実施形態において、超解像イメージング、超高密度光メモリー及び超高感度蛍光イメージング等に用いることができる。また、本開示に係る蛍光蛋白質は、一又は複数の実施形態において、光切替型蛍光蛋白質を利用した蛍光性機能指示薬、発光蛋白質、発光性機能指示薬として使用することができる。
【００３４】
［ＤＮＡ］
本開示は、一態様において、本開示に係る蛍光蛋白質又は本開示に係る融合蛋白質をコードするＤＮＡに関する。本開示のＤＮＡによれば、一又は複数の実施形態において、本開示のＤＮＡを含む組み換えベクターを宿主に導入することによって、本開示に係る蛍光蛋白質を発現し、産生することができる。本開示のＤＮＡは、一又は複数の実施形態において、特異的プライマーを用いたＰＣＲや、ホスホアミダイト法等によって製造することができる。
【００３５】
［ベクター］
本開示は、一態様において、本開示に係る蛍光蛋白質又は本開示に係る融合蛋白質を発現可能なベクターに関する。本開示のベクターは、一又は複数の実施形態において、本開示のＤＮＡを有するベクターである。本開示のベクターは、一又は複数の実施形態において、本開示のＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって得ることができる。本開示のＤＮＡを挿入するベクターとしては、一又は複数の実施形態において、宿主中で複製可能なものであれば特に制限されず、プラスミド、及びファージ等が挙げられる。
【００３６】
プラスミドとしては、一又は複数の実施形態において、大腸菌由来のプラスミド、枯菌草由来のプラスミド、及び酵母菌由来のプラスミド等が挙げられる。
【００３７】
［形質転換体］
本開示は、一態様において、本開示に係る蛍光蛋白質又は本開示に係る融合蛋白質を発現する形質転換体に関する。本開示の形質転換体は、一又は複数の実施形態において、本開示に係る蛍光蛋白質又は本開示に係る融合蛋白質を発現する細胞、又は、該細胞を含む組織、器官、生体である。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する形質転換体に関する。本開示の形質転換体は、一又は複数の実施形態において、本開示のＤＮＡ又は組み換えベクターを宿主に導入することによって作成することができる。
【００３８】
宿主としては、一又は複数の実施形態において、通常使用される公知の微生物、及び培養細胞等が挙げられる。微生物としては、一又は複数の実施形態において、大腸菌又は酵母等が挙げられる。培養細胞としては、一又は複数の実施形態において、動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、又はＣＯＳ細胞）又は昆虫細胞（例えば、ＢｍＮ４細胞）等が挙げられる。
【００３９】
［イメージング方法］
本開示は、一態様において、本開示に係る蛍光蛋白質若しくは本開示に係る融合蛋白質、本開示のＤＮＡ、又は、本開示のベクターを用いるイメージング方法に関する。本開示のイメージング方法は、一又は複数の実施形態において、本開示に係る蛍光蛋白質又は本開示に係る融合蛋白質を細胞等に導入すること、本開示に係る蛍光蛋白質又は本開示に係る融合蛋白質の光切替を行い蛍光性をon及び／又はoffすること、及び／又は、本開示に係る蛍光蛋白質又は本開示に係る融合蛋白質の蛍光シグナルを検出することを含む。本開示のイメージング方法は、一又は複数の実施形態において、超解像イメージングであって、一又は複数の実施形態において、DSSM（Decoupled stochastic switching microscopy）、PALM（photoactivated localization microscopy）、STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）、RESOLFT（reversible saturable optical fluorescence transition）、又は、SOFI（superresolution optical fluctuation imaging）が挙げられる。本開示に係る蛍光蛋白質は、自発的に蛍光性がOnになる速度（熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度）が向上しているため、一又は複数の実施形態において、簡便な超解像イメージング法であるＤＳＳＭに好ましく利用できる。
【００４０】
［フォトクロミック材料］
本開示に係る蛍光蛋白質は、フォトクロミズム効果を示すため、一又は複数の実施形態において、ＣＤ、ＤＶＤ、ホログラフィー記録媒体、スマートカードなどの光記録媒体の用途、広告板、蛍光板、ＴＶ、コンピュータモニターなどの表示素子の用途、或いは、レンズ、バイオセンサー、バイオチップ、フォトクロミック繊維素材などの用途に適用できるフォトクロミック材料とすることができる。
【００４１】
本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
〔１〕  配列番号１のアミノ酸配列に少なくともＳ２０８Ｇの変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。
〔２〕  配列番号１のアミノ酸配列に少なくともＩ４７Ｖ、Ｍ１５３Ｔ、及びＳ２０８Ｇの３つの変異が導入されたアミノ酸配列を有する、〔１〕に記載の蛍光蛋白質。
〔３〕  配列番号１のアミノ酸配列に少なくともＩ４７Ｖ、Ｔ５９Ｓ、Ｍ１５３Ｔ、Ｓ２０８Ｇ、及びＭ２３３Ｔの５つの変異導入されたアミノ酸配列を有する、〔１〕又は〔２〕に記載の蛍光蛋白質。
〔４〕  配列番号１のアミノ酸配列に少なくともＩ４７Ｖ、Ｔ５９Ｓ、Ｍ６９Ｑ、Ｍ１５３Ｔ、Ｓ２０８Ｇ、及びＭ２３３Ｔの６つの変異導入されたアミノ酸配列を有する、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の蛍光蛋白質。
〔５〕  配列番号２から４のいずれかのアミノ酸配列を有する、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の蛍光蛋白質。
〔６〕  〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の蛋白質のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、無蛍光性から蛍光性とするための波長と蛍光性から無蛍光性とするための波長と蛍光励起のための波長とが全て異なり、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度が配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質のそれよりも速い、蛍光蛋白質。
〔７〕  〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の蛍光蛋白質が融合された融合蛋白質であって、該蛍光蛋白質の部分は、無蛍光性から蛍光性とするための波長と蛍光性から無蛍光性とするための波長と蛍光励起のための波長とが全て異なり、熱平衡による無蛍光性から蛍光性への回復速度が配列番号１のアミノ酸配列からなる蛋白質のそれよりも速い、融合蛋白質。
〔８〕  〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ。
〔９〕  〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の蛋白質を発現可能な、或いは、〔８〕に記載のＤＮＡを有するベクター。
〔１０〕  〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の蛋白質を発現する形質転換体。
〔１１〕  〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の蛋白質、〔８〕に記載のＤＮＡ、〔９〕に記載のベクター、又は、〔１０〕に記載の形質転換体を用いるイメージング方法。
〔１２〕  前記イメージング方法が、超解像蛍光顕微鏡観察法である、〔１１〕に記載のイメージング方法。
〔１３〕  〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の蛋白質を含むフォトクロミック材料。
【００４２】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００４３】
［光切替型蛍光蛋白質（PSFP）の作製］
無蛍光性から蛍光性とするための波長と蛍光性から無蛍光性とするための波長と蛍光励起のための波長とが全て異なる光切替型蛍光蛋白質であるDreiklang（配列番号４のアミノ酸配列からなる蛋白質）に下記変異１、３及び４の３つの変異を導入して光切替型蛍光蛋白質PSFP2を作成した（配列番号２のアミノ酸配列からなる蛋白質）。
PSFP2に、さらに、下記変異２及び５の２つの変異を導入して光切替型蛍光蛋白質PSFP3を作成した（配列番号３のアミノ酸配列からなる蛋白質）。変異１〜５の５つの変異箇所を図１及び図２に示す。
PSFP3に、さらに、Ｍ６９Ｑの変異を導入して光切替型蛍光蛋白質PSFP4を作成した（配列番号４のアミノ酸配列からなる蛋白質）。
変異１：Ｉ４７Ｖ
変異２：Ｔ５９Ｓ
変異３：Ｍ１５３Ｔ
変異４：Ｓ２０８Ｇ
変異５：Ｍ２３３Ｔ【００４４】
［バクテリア発現ベクターの作製］
PSFPのバクテリア発現ベクターは、PSFP（PSFP2,PSFP3及びPSFP4）をコードする遺伝子（それぞれ、配列番号５，６及び７）をバクテリア発現ベクターｐＲＳＥＴＢに導入して作製した。同様にDreiklangについても同様にバクテリア発現ベクターを作製した。【００４５】
［哺乳類発現ベクターの作製］
PSFPの哺乳類発現ベクターは、PSFP（PSFP2,PSFP3及びPSFP4）をコードする遺伝子を哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３に導入して作製した。
また、下記のシグナル配列又はシグナル蛋白質をPSFP（PSFP2,PSFP3及びPSFP4）と融合させた融合蛍光蛋白質の哺乳類発現ベクターも作製した。すなわち、１）ヒトシトクロムｃオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩ（ＣＯＸ-VIII）の前駆体由来の重複ミトコンドリア標的シグナル、２）β−Ｎ−アセチルグルコサニル−グリコペプチドβ−１，4−ガラクトシルトランスフェラーゼのゴルジ体局在シグナル配列、３）ＤＮＡ結合蛋白質Ｈ２Ｂ、及び４）核小体蛋白質フィブリラリンを、それぞれ、ミトコンドリア、ゴルジ体、核、及び核小体を標的とするため、PSFPに融合させた。
さらに、βアクチン、ビメンチン、パキシリン、ザイキシン、及びクラスリンをそれぞれPSFPと１７アミノ酸長のリンカー配列（GGSGGSGGSGGSGGQFQ：配列番号８）を介して融合させた融合蛋白質の哺乳類発現ベクターも作製した。【００４６】
［PSFPの精製］
Ｎ末にポリヒスチジンタグを持つPSFP（PSFP2,PSFP3及びPSFP4）をバクテリア発現ベクターｐＲＳＥＴＢに導入し、大腸菌で発現させた。２３℃６５時間ＬＢ培地で培養した後、菌体をフレンチプレスで破砕し、上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースアフィニティカラム（Qiagen社製）、及びＰＤ−１０カラム（GE Healthcare社製）によるゲルろ過で精製し、さらに、AKTA 10S (GE Healthcare)Hi-load 20/60 Superdex 200 pgカラムで再精製した。【００４７】
［PSFPのキャラクタライゼーション］
PSFP（PSFP2,PSFP3及びPSFP4）の蛍光励起、並びに、蛍光性の光切替のon及びoffは、それぞれ、475±28ｎｍ、360±20ｎｍ、及び410±10ｎｍのＬＥＤ光源で行った。吸収スペクトルは、V-630 BIO スペクトロフォトメーター（JASCO社製）を用いて測定した。蛍光励起及び蛍光発光スペクトルはF-7000蛍光スペクトロフォトメーター（Hitachi社製）を用いて測定した。モル吸光係数は、ブラッドフォードアッセイにより測定した既知濃度の精製蛋白質の吸光度を使用して計算した。蛍光量子収率は、QuantaurusQY-C11347（浜ホトニクス社製）を使用して測定した。この測定において蛋白質吸光度を0.05未満に調節した。上記全ての測定は、20 mM HEPESバッファー中の蛋白質を用い、生理学的ｐＨ条件下で行った。
光誘導on/offの量子収率は、吸光度における照射依存変化をV-630 BIO スペクトロフォトメーター（JASCO社製）にて測定することで算出した。具体的な方法は、Gayda, S., Nienhaus, K. &Nienhaus, G. U. Biophysical journal 103, 2521-31 (2012).に記載される方法に従った。
蛍光性offからonへの熱緩和時間の測定は、10 mlの20μM蛋白質溶液（20 mM HEPESバッファー, pH 7.4）を測定前に438±20ｎｍ波長光で蛍光性offしてから、蛍光スペクトルを測定した。【００４８】
［熱平衡によるOff状態からの回復速度］
蛍光性がOffの状態からの熱平衡により蛍光性がOnの状態となる回復速度を、PSFP2,PSFP3及びPSFP4について測定し、そのカウンターパートであるDreiklangと比較した。具体的には、蛍光性の回復は511nmの吸収スペクトルを測定した。その結果、熱平衡による回復速度の時定数は、PSFP2が218秒、PSFP3が298秒、PSFP4が526秒、Dreiklangが603秒であった（表１、図３）。【００４９】
【表１】
2016182019.tif 000003
【００５０】
［光切替速度］
PSFP（PSFP2及びPSFP3）の光切替特性をそのカウンターパートであるDreiklangと比較した。蛍光性onからoffへの光切替の半減期（t1/2）は、PSFP2が4.3秒、PSFP3が2.4秒、Dreiklangが8.8秒であった（表２、図４）。【００５１】
【表２】
2016182019.tif 000004
【００５２】
［光安定性］
PSFP（PSFP2,PSFP3及びPSFP4）の蛍光性のブリーチングによる蛍光の減衰を、そのカウンターパートであるDreiklangと比較した。具体的には、それぞれの試料に励起光を照射し、蛍光強度の変化を測定した。その結果、蛍光の減衰の半減期（t1/2）は、PSFP2が48秒、PSFP3が78秒、PSFP4が123秒、Dreiklangが43秒であった（表３、図５）。【００５３】
【表３】
2016182019.tif 000005
【００５４】
［光切替サイクル数］
実施例１の蛍光蛋白質における蛍光性on/offのスピードの向上と光安定性の向上により、光切替回数の向上をもたらした（図６）。すなわち、蛍光強度が50%減少するまでのサイクル数は、PSFP3が230サイクル、Dreiklangが195サイクルであった。【００５５】
［融合蛍光蛋白質の局在］
HeLa細胞で、PSFP3単独、又は、PSFP3とβアクチン、パキシリン若しくはビメンチンとの融合蛋白質を発現させて蛍光顕微鏡観察した。その結果を図７に示す。同図に示す通り、PSFP3単独では細胞質と核に局在し、βアクチン、パキシリン若しくはビメンチンとの融合蛋白質は、それぞれ、アクチン、パキシリン、及びビメンチンに局在し、かつ、蛍光性を示した。【００５６】
［DSSMによる超解像イメージング］
PSFP3とビメンチンとの融合蛋白質をHeLa細胞で発現させ、ＤＳＳＭ（Decoupled stochastic switching microscopy）による超解像イメージングを行った。ＤＳＳＭイメージングの概要は図８に示す。すなわち、初めに、蛍光性がon状態であるPSFP3に、405 nmの光を照射する事で蛍光性をOffにする。PSPF3は熱平衡により自発的に蛍光性がonになる。次に、488 nmの励起光を照射し、１分子蛍光観察を行うと同時に蛍光分子を褪色させることにより、画面上の１分子輝点をまばらに計測した。その結果を広視野イメージ（左）とともに図９に示す。本実施例のDSSMによる超解像イメージングにおいて、空間分解能34 nm、及び時間分解能20秒という従来報告されてきた値より高い空間分解能値、及び時間分解能での取得に成功した。【００５７】
［局在した融合蛍光蛋白質の蛍光光切替の一例］
上記で作製したビメンチン−PSFP3融合蛋白質を発現させた、生きたHeLa細胞で、蛍光の光切替を行って観察した。具体的には、515 nmの励起光を照射しつつ、405 nmの光で蛍光性をOffにし、その後、365 nmの光で蛍光性をonにする光切替を行った。結果を図１０に示す。
同図に示す通り、生きたHeLa細胞の局在した融合蛍光蛋白質において、光切替が観察された。【００５８】
［融合蛍光蛋白質の局在（追加）］
βアクチン、パキシリン、及びビメンチンに加え、チューブリン、ザイキシン、Src型チロシンキナーゼLyn、ヒストンH2B、Smac/DIABLO、フィブリラリン、クラスリン、ゴルジ体、小胞体（ER）、ミトコンドリア、核膜孔（Nucleopore）のタンパク質又は局在化シグナルとのPSFP3融合蛋白質を作製し、HeLa細胞内で発現させて蛍光顕微鏡観察した。その結果を図１１に示す。同図に示す通り、各融合蛋白質は、それぞれ局在し、かつ、蛍光性を示した。【００５９】
［PSFPを発現するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター］
２種類のプロモータ（CAGとhSyn）に結合したPSFP3遺伝子を有するpAAV-CAG-PSFP3及びpAAV2-hSyn-PSFP3を用い、AAVベクターを作製した。これらのAAVベクターを、それぞれ、HEK293T細胞及び海馬神経細胞の初代培養細胞に感染させたところ、PSFP3の発現と蛍光が確認された。【００６０】
［LifeAct−PSFP3融合蛋白質］
F-アクチン（G-アクチンの糸状重合体）へ結合するペプチドLifeAct(J. Riedlら、Nature Methods 5, 605-607, 2008)とのPSFP3融合蛋白質をコードする遺伝子を有する発現ベクターを作製した（LifeAct-PSFP3-pcDNA3）。【００６１】
［タイムラプス超解像イメージング］
上記LifeAct−PSFP3融合蛋白を生きたHeLa細胞で発現させ、図１２に示すような、DSSMイメージングを繰り返し行うタイムラプス超解像イメージングを行った。その結果を図１３に示す。
図１３に示す通り、タイムラプス超解像イメージングにより、アクチンネットワークの形態変化が観察できた。
【配列表フリーテキスト】
【００６２】
配列番号１：Ｄｒｅｉｋｌａｎｇのアミノ酸配列
配列番号２：ＰＳＦＰ２のアミノ酸配列
配列番号３：ＰＳＦＰ３のアミノ酸配列
配列番号４：ＰＳＦＰ４のアミノ酸配列
配列番号５：ＰＳＦＰ２の塩基配列
配列番号６：ＰＳＦＰ３の塩基配列
配列番号７：ＰＳＦＰ４の塩基配列
配列番号８：リンカーのアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
2016182019000001.app
【国際調査報告】
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