(57)【要約】  高いイムノグロブリン結合能およびアルカリ耐性を保持したアフィニティークロマトグラフィー用担体の提供。イムノグロブリン結合タンパク質であって、少なくとも１つの改変イムノグロブリン結合ドメインを含み、該改変イムノグロブリン結合ドメインは、黄色ブドウ球菌プロテインＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、イムノグロブリン結合タンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノグロブリン結合タンパク質であって、
少なくとも１つの改変イムノグロブリン結合ドメインを含み、
該改変イムノグロブリン結合ドメインは、黄色ブドウ球菌プロテインＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである、
イムノグロブリン結合タンパク質。
【請求項２】
前記Ｂドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインが、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、またはこれらと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインである、
請求項１記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
【請求項３】
前記少なくとも１つの改変イムノグロブリン結合ドメインが、以下からなる群より選択される、請求項１又は２記載のイムノグロブリン結合タンパク質：
配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
配列番号３で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項４】
前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１〜３のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
【請求項５】
前記配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインがＶａｌ１／Ａｌａ２９変異体である、請求項２〜４のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
【請求項６】
２〜１２個の前記改変イムノグロブリン結合ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含む組換え体。
【請求項１０】
請求項７記載のポリヌクレオチドを、無細胞タンパク質合成系により発現させるか、または請求項８記載の組換え体において発現させることを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法であって、
黄色ブドウ球菌プロテインＡに由来するＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入することを含む、
方法。
【請求項１２】
イムノグロブリン結合タンパク質のイムノグロブリン結合能の向上方法であって、
黄色ブドウ球菌プロテインＡに由来するＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入することを含む、
方法。
【請求項１３】
前記Ｂドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインが、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、またはこれらと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインを含む、
請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入すること；
配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入すること；または
配列番号３で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入すること、
を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインがＶａｌ１／Ａｌａ２９変異体である、請求項１３〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入されたイムノグロブリン結合ドメインを２〜１２個連結することをさらに含む、請求項１１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか１項記載のイムノグロブリン結合タンパク質が、水に対して不溶性の基材に固定化されている、アフィニティー担体。
【請求項１９】
請求項１８記載のアフィニティー担体を用いる、イムノグロブリンの単離方法。
【請求項２０】
請求項１８記載のアフィニティー担体を用いる、抗体医薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質、それを用いたアフィニティー担体、ならびに該アフィニティー担体を用いたイムノグロブリンの単離方法および抗体医薬の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アフィニティークロマトグラフィーは、分離または精製を目的とする物質と特異的に結合する物質（リガンド）を不溶性担体に固定化したリガンド固定化担体が充填されたカラムを用いるクロマトグラフィーである。アフィニティークロマトグラフィーは、例えばタンパク質、核酸などの生体関連物質の分離・精製に用いられている（特許文献１）。アフィニティークロマトグラフィー用担体としては、例えば、アガロースゲルに代表される糖鎖の架橋粒子や、合成ポリマーを主成分とする粒子が用いられている。【０００３】
アフィニティークロマトグラフィー用担体の作製においては、目的の物質と特異的に結合する物質であるリガンドを担体に固定化する必要がある。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（ＳｐＡ）およびその変異体は、イムノグロブリンに対して特異的な結合能を有する代表的なアフィニティークロマトグラフィーリガンドとして知られている。ＳｐＡは、抗原に対するイムノグロブリンの高い選択性に対して著しい影響を与えることなく、イムノグロブリンのＦｃ領域と結合する能力をもつため、イムノグロブリンおよびＦｃ領域含有タンパク質を効率的に捕捉および精製することができる。【０００４】
天然型のＳｐＡには、イムノグロブリンに対して結合能を有するドメインとして、Ｎ末端から順にＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣの５つのドメインが含まれる。これらのドメイン、およびＢドメインの改変型ドメインであるＺドメインは、アフィニティークロマトグラフィーリガンドとして使用されている。また、イムノグロブリン結合能を高める目的で、上記ドメインを２個以上連結させたものをリガンドとして用いることも一般的である。【０００５】
上記のＳｐＡのイムノグロブリン結合ドメインには、それぞれ３つのα−ヘリックス構造が含まれ、これらのうちＮ末端側の２つのα−ヘリックス部位がイムノグロブリンとの結合に寄与していることが知られている。さらに、上記のドメインのうちＢおよびＣドメインにおいては、Ｎ末端３位のＡｓｎおよび４位のＬｙｓによってターン構造が形成されていることが報告されている（非特許文献１）。したがって、Ｂドメイン、ＣドメインまたはＢドメインの改変型ドメインであるＺドメインが複数個連結されたリガンドにおいては、上記のターン構造に起因して、各ドメインは互いに屈曲した配置で連結され、この屈曲した配置に起因する立体障害を引き起こしていると推測される。この立体障害は、Ｂドメイン、ＣドメインまたはＺドメインの繰り返し構造をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー用担体を作製するうえで、深刻な問題である。すなわち、上記立体障害に起因してリガンドのイムノグロブリン結合能が低く留まり、結果として一定量のイムノグロブリンを精製するために多くの担体量が要求されることとなる。ＳｐＡをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィー用担体は多くの場合非常に高価であり、多くの担体量が要求されることは、製造コストの観点から望ましくない。【０００６】
アフィニティークロマトグラフィー用担体は、バイオセパレーションにおける用途では、通常繰り返し使用される。そのため通常、クリーニング・イン・プレイス（ＣＩＰ）として知られる夾雑物を除去して担体を元の状態に戻すための洗浄工程が、繰り返し使用の間に行われる。ＣＩＰのための試薬としては、例えば水酸化ナトリウム等のアルカリ性液が使用される。しかしながら、リガンドとしてタンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー用担体にとって、このようなアルカリ性条件は過酷であり、リガンドの失活もしくは切断に伴って、標的分子に対する結合能を失うことがある。かかるアルカリ性条件下におけるリガンドの失活については、その主要因としてＡｓｎおよびＧｌｎ残基の脱アミド化が広く知られている。特に、Ａｓｎはアルカリ条件に対する感受性が高く、かつその脱アミド化は構造依存的であり、Ａｓｎ−ＧｌｙまたはＡｓｎ−Ｓｅｒで表されるアミノ酸配列部位でしばしば発生することが報告されている（非特許文献２）。【０００７】
上記のアルカリ性条件下におけるリガンドの失活を回避するための従来技術としては、Ａｓｎ残基の欠失や改変によりアルカリに対する感受性を低下させたリガンドを得ることが挙げられる。かかるリガンドを用いることにより、アルカリ性溶液を使用したＣＩＰを複数回実施した後でも、そのイムノグロブリン結合能を維持できるアフィニティークロマトグラフィー担体が提供されている。例えば、特許文献２においては、ＳｐＡのＢドメイン、ＣドメインまたはＺドメインを含むアフィニティークロマトグラフィー用担体のリガンドであって、少なくとも１つのドメインの１位または２位から始まるＮ末端側の少なくとも３つの連続したアミノ酸の欠失を含むリガンドが提供されている。また、特許文献３においては、Ｎ末端側３位から６位までの連続したアミノ酸が欠失したＳｐＡのＣドメインを含むアフィニティークロマトグラフィー担体用のリガンドが提供されている。また、特許文献４においては、ＳｐＡのＺドメインやＢドメイン中のＡｓｎ残基を修飾したアフィニティークロマトグラフィー担体用のリガンドが提供されている。しかし、上記の従来技術は、担体のアルカリ耐性を高めることを主な目的としており、担体のイムノグロブリン結合能を高めることに言及していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平６−２８１６３８号公報
【特許文献２】特開２０１２−２５４９８１号公報
【特許文献３】特許第５３４５５３９号公報
【特許文献４】特表２００２−５２７１０７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０１４，２２：１４６７−１４７７
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，８０：１６９−１７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
高いイムノグロブリン結合能およびアルカリ耐性を保持した、効率的でかつ経済的価値の高いアフィニティー担体が求められている。本発明の一形式は、イムノグロブリンに対する結合能を高めた、新規なアフィニティー担体用リガンドを提供することである。また本発明の別の形式は、アルカリ性溶液を使用したＣＩＰを繰り返し実施した場合においても、上述した高いイムノグロブリン結合能を維持することができるアフィニティー担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって一態様において、本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質を提供する。該イムノグロブリン結合タンパク質は、少なくとも１つの改変イムノグロブリン結合ドメインを含み、該改変イムノグロブリン結合ドメインは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（ＳｐＡ）のＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。【００１２】
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の一実施形態において、前記Ｂドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、またはこれらと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインである。【００１３】
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の一実施形態において、前記少なくとも１つの改変イムノグロブリン結合ドメインは以下からなる群より選択される：
配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；
配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；および
配列番号３で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。【００１４】
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の一実施形態において、前記少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つである。【００１５】
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の一実施形態において、前記配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインはＶａｌ１／Ａｌａ２９変異体である。【００１６】
一実施形態において、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、２〜１２個の前記改変イムノグロブリン結合ドメインを含む。【００１７】
別の一態様において、本発明は、上記変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。【００１８】
別の一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。【００１９】
別の一態様において、本発明は、上記ベクターを含む組換え体を提供する。【００２０】
また別の一態様において、本発明は、上記ポリヌクレオチドを、無細胞タンパク質合成系により発現させるか、または上記組換え体において発現させることを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法を提供する。【００２１】
さらなる一態様において、本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法を提供する。該方法は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入することを含む方法である。【００２２】
さらなる一態様において、本発明は、イムノグロブリン結合タンパク質のイムノグロブリン結合能の向上方法を提供する。該方法は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡのＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入することを含む方法である。【００２３】
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の製造方法、およびイムノグロブリン結合能の向上方法の一実施形態において、前記Ｂドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体からなる群より選択されるイムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列、またはこれらと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインである。【００２４】
一実施形態において、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の製造方法、およびイムノグロブリン結合能の向上方法は、以下：
配列番号１で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入すること；
配列番号２で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入すること；または
配列番号３で示されるアミノ酸配列、またはこれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインに対して、配列番号３で示されるアミノ酸配列の３位と４位に相当する位置の間に少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入すること、
を含む。【００２５】
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の製造方法、およびイムノグロブリン結合能の向上方法の一実施形態において、前記少なくとも１つのアミノ酸残基は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つである。【００２６】
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の製造方法、およびイムノグロブリン結合能の向上方法の一実施形態において、前記配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインはＶａｌ１／Ａｌａ２９変異体である。【００２７】
一実施形態において、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質の製造方法、およびイムノグロブリン結合能の向上方法は、前記少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入されたイムノグロブリン結合ドメインを２〜１２個連結することをさらに含む。【００２８】
さらなる一態様において、本発明は、上記イムノグロブリン結合タンパク質が、水に対して不溶性の基材に固定化されている、アフィニティー担体を提供する。【００２９】
さらなる一態様において、本発明は、上記アフィニティー担体を用いる、イムノグロブリンの単離方法を提供する。【００３０】
さらなる一態様において、本発明は、上記アフィニティー担体を用いる、抗体医薬の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー用担体用のリガンドとして有用である。当該変異イムノグロブリン結合タンパク質は、該タンパク質中に含まれるアミノ基、チオール基、またはカルボキシル基等の反応性側鎖が不溶性担体の表面に存在する官能基と化学結合することにより、該担体に固定化され得る。当該変異イムノグロブリン結合タンパク質は、イムノグロブリン結合能が高く、かつアルカリ性溶液を使用したＣＩＰを繰り返し実施した後においても高いイムノグロブリン結合能を維持することができる。したがって、当該変異イムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとして用いたアフィニティークロマトグラフィー用担体は、例えばイムノグロブリンの精製に用いた場合、一定量の担体でより多くのイムノグロブリンを精製することができ、かつ繰り返し使用してもイムノグロブリンの動的結合容量が低下しにくいため、結果としてイムノグロブリン精製のプロセスを低コストで実施することを可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、およびその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【００３３】
本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の配列同一性は、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ―Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−４１，１９８５）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ―Ｗｉｎ（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出される。
【００３４】
本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列に関する「少なくとも７０％の同一性」とは、７０％以上の同一性、好ましくは８０％以上の同一性、より好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、さらにより好ましくは９５％以上の同一性、なお好ましくは９８％以上の同一性、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
【００３５】
本明細書において、アミノ酸配列およびヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列）とを、各アミノ酸配列またはヌクレオチド配列中に存在する保存アミノ酸残基またはヌクレオチドに最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ２およびＣｌｕｓｔａｌ  ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。
【００３６】
本明細書において「イムノグロブリン結合タンパク質」とは、イムノグロブリンに対する結合能を有するタンパク質をいう。本明細書において「イムノグロブリン結合ドメイン」とは、イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる、イムノグロブリン結合に関わるドメインをいい、その例としては、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ（ＳｐＡ）のＡドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、Ｅドメイン、およびＢドメインの改変型ドメインであるＺドメインが挙げられる。
【００３７】
１．アフィニティークロマトグラフィー用担体
１．１．変異イムノグロブリン結合タンパク質
本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、ＳｐＡのＢドメイン、ＣドメインまたはＺドメインに由来する、改変イムノグロブリン結合ドメインを少なくとも１つ含む。該改変イムノグロブリン結合ドメインは、該Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位に相当する位置のＡｓｎ残基と４位に相当する位置のＬｙｓ残基との間に、少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティー担体のリガンドとして使用することができる。
【００３８】
本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる改変イムノグロブリン結合ドメインの親ドメインとしては、ＳｐＡのイムノグロブリン結合能を有するドメインであるＢドメイン、Ｚドメイン、Ｃドメイン、およびそれらの変異体が挙げられる。このうち、Ｂドメイン、ＺドメインおよびＣドメインが好ましい。ＳｐＡのＢドメイン、Ｚドメイン、およびＣドメインは、それぞれ、配列番号１、２、および３で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。これらのドメインは、そのアミノ酸配列中の３位にＡｓｎ残基、４位にＬｙｓ残基を有し、これらのアミノ酸残基から構成されるターン構造を持つ。
【００３９】
上記親ドメインとして使用され得る上記Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインの変異体としては、配列番号１、２または３で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつイムノグロブリン結合能を有してイムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドが挙げられる。さらに、該変異体は、そのアミノ酸配列中の、配列番号１、２または３で示されるアミノ酸配列の３〜４位に相当する位置に、連続するＡｓｎ残基とＬｙｓ残基とを有し、これらのアミノ酸残基から構成されるターン構造を持つ。上記Ｂドメイン、ＺドメインまたはＣドメインの変異体の例としては、配列番号１、２または３で示されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインのＶａｌ１／Ａｌａ２９変異体が挙げられる。
【００４０】
上記変異体は、ＳｐＡのＢドメイン、ＺドメインまたはＣドメインに対して、アミノ酸残基の付加、削除、置換または欠失や、アミノ酸残基の化学的修飾等の改変を施すことによって作製することができる。アミノ酸残基の付加、削除、置換または欠失の手段としては、上記ドメインをコードするポリヌクレオチドに対する部位特異的突然変異（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｉｏｎ）等の公知の手段が挙げられる。
【００４１】
本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる改変イムノグロブリン結合ドメインは、上記親ドメインのアミノ酸配列に対して、上記Ｂ、ＺまたはＣドメインのアミノ酸配列の３位に相当する位置のＡｓｎ残基と４位に相当する位置のＬｙｓ残基との間に、少なくとも１つのアミノ酸残基を挿入することによって得ることができる。例えば、該改変イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１、２または３で示されるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列に対して、その３位のＡｓｎ残基と４位のＬｙｓ残基との間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。あるいは、該改変イムノグロブリン結合ドメインは、配列番号１、２または３で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ、配列番号１、２または３で示されるアミノ酸配列の３〜４位に相当する位置に連続するＡｓｎ残基とＬｙｓ残基とを有するイムノグロブリン結合ドメイン変異体のアミノ酸配列に対して、当該Ａｓｎ残基とＬｙｓ残基との間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。これらのポリペプチドは、イムノグロブリン結合能を有し、イムノグロブリン結合ドメインとして機能する。
【００４２】
上記親ドメインに挿入される少なくとも１つのアミノ酸残基としては、特に限定されるものではないが、例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜２個のアミノ酸残基が挙げられる。これらのうち、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏがより好ましく、次いでＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐが好ましく、次いでＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔが好ましく、次いでＴｈｒ、Ａｌａが好ましい。したがって、上記親ドメインに挿入されるアミノ酸残基は、好適にはＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜２個であり、より好適にはＨｉｓ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜２個であり、さらに好適にはＰｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される少なくとも１つ、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜２個である。上記アミノ酸残基が好ましい理由としては、３位のＡｓｎ残基と４位のＬｙｓ残基とから構成されるターン構造を変化させるとともに、Ａｓｎ−ＧｌｙおよびＡｓｎ−Ｓｅｒで表されるアルカリ感受性の高いアミノ酸配列を回避することができるためであると推定される。挿入されるアミノ酸残基の数が２個以上の場合、それらは、全て異なる種類のアミノ酸残基であっても、または同じ種類のアミノ酸残基を複数含んでいてもよい。さらに好ましくは、上記Ｂ、ＺもしくはＣドメイン、またはそれらの変異体に挿入されるアミノ酸残基は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏから選択されるいずれか１つである。
【００４３】
上記親ドメインへアミノ酸残基を挿入する手段としては、該親ドメインをコードするヌクレオチド配列に対する、上記の挿入すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列の挿入が挙げられる。ヌクレオチド配列の挿入のための具体的な手法としては、部位特異的突然変異、相同組換え法、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１−６８）などを挙げることができ、これらの詳細な手順は当業者に周知である。
【００４４】
本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、上述したＡｓｎとＬｙｓとの間にアミノ酸残基が挿入された改変イムノグロブリン結合ドメインを１つ以上含んでいればよいが、好ましくは、該改変イムノグロブリン結合ドメインを２つ以上含み、より好ましくは２〜１２個、さらに好ましくは３〜８個含む。個々のドメインは、互いに連結されている。より詳細には、あるドメインのＣ末端と隣のドメインのＮ末端とが連結される、またはその逆である。本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、複数の改変イムノグロブリン結合ドメインが直線状に配置された領域を有するため、ドメインの屈曲した配置に起因する立体障害やイムノグロブリン結合阻害を防止することができる。したがって、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、高いイムノグロブリン結合能を有する。
【００４５】
一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、Ｂ、ＺおよびＣドメイン以外のＳｐＡのイムノグロブリン結合ドメイン（例えば、Ａドメイン、ＤドメインまたはＥドメイン）またはその変異体を含んでいてもよい。別の一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、上述した３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間にアミノ酸残基が挿入されていないＢ、ＺもしくはＣドメイン、またはそれらの変異体を含んでいてもよいが、好ましくは、これらのドメインまたは変異体を含まない。好ましい実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質に含まれるイムノグロブリン結合ドメインの全ては、上述したＡｓｎとＬｙｓとの間にアミノ酸残基が挿入されたＢ、ＺもしくはＣドメイン、またはそれらの変異体に由来する改変イムノグロブリン結合ドメインである。
【００４６】
好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号１で示されるＢドメインのアミノ酸配列において、３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号１で示されるＢドメインのアミノ酸配列において、３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される１〜４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号１で示されるＢドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の３〜４位に相当する位置のＡｓｎ−Ｌｙｓの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドを含む。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号１で示されるＢドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号１の３〜４位に相当する位置のＡｓｎ−Ｌｙｓの間に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される１〜４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドを含む。さらなる好ましい一実施形態において、配列番号１で示されるＢドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対してＶａｌ１／Ａｌａ２９の変異を有するアミノ酸配列である。
【００４７】
好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号２で示されるＺドメインのアミノ酸配列において、３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号２で示されるＺドメインのアミノ酸配列において、３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される１〜４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号２で示されるＺドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２の３〜４位に相当する位置のＡｓｎ−Ｌｙｓの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドを含む。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号２で示されるＺドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２の３〜４位に相当する位置のＡｓｎ−Ｌｙｓの間に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される１〜４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドを含む。さらなる好ましい一実施形態において、配列番号２で示されるＺドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対してＶａｌ１／Ａｌａ２９の変異を有するアミノ酸配列である。
【００４８】
好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号３で示されるＣドメインのアミノ酸配列において、３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号３で示されるＣドメインのアミノ酸配列において、３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される１〜４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号３で示されるＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号３の３〜４位に相当する位置のＡｓｎ−Ｌｙｓの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個、２個、３個もしくは４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドを含む。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、配列番号３で示されるＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号３の３〜４位に相当する位置のＡｓｎ−Ｌｙｓの間に、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｒｏからなる群より選択される１〜４個のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合ドメインとして機能するポリペプチドを含む。さらなる好ましい一実施形態において、配列番号３で示されるＣドメインのアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列に対してＶａｌ１／Ａｌａ２９の変異を有するアミノ酸配列である。
【００４９】
本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる上記ポリペプチドは、好ましくは、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列の３位〜４位に相当する位置のＡｓｎ−Ｌｙｓを保存した状態で、それらの残基の間にアミノ酸が挿入されているアミノ酸配列を有する。より好ましくは、２〜４位に相当する位置のＡｓｐ−Ａｓｎ−ＬｙｓまたはＧｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓを保存した状態で、当該ＡｓｎとＬｙｓとの間にアミノ酸が挿入されているアミノ酸配列を有する。さらに好ましくは、１〜４位に相当する位置のＡｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ、またはＶａｌ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｙｓを保存した状態で、当該ＡｓｎとＬｙｓとの間にアミノ酸が挿入されているアミノ酸配列を有する。上記３位に相当する位置のＡｓｎを欠失または変異させると、上記ポリペプチドの当該アルカリ耐性は向上するものの、イムノグロブリン結合能が低下することがある。
【００５０】
好ましくは、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質に含まれる上記ポリペプチドは、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列の１位に相当する位置にＶａｌ残基を有し、および／または、配列番号１〜３のいずれかで示されるアミノ酸配列の２９位に相当する位置にＡｌａ残基を有する。
【００５１】
好ましい一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、上記ポリペプチドを２〜１２個、さらに好ましくは３〜８個含む。当該ポリペプチドの各々は、同じものでも異なるものであってもよい。好ましくは、当該ポリペプチドの各々は、そのＮ末端が、隣接するポリペプチドのＣ末端に連結されている。各ポリペプチドは、隣接するポリペプチドと直接連結してもよく、または１〜１０個のアミノ酸残基を有するペプチドを介して連結してもよい。当該ペプチドの例としては、ＥＦで表されるペプチドが挙げられる。
【００５２】
本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質の好ましい例としては、配列番号４〜２０で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号４〜１９で示されるアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３で示されるアミノ酸配列の１位ＡｌａをＶａｌに、２９位ＧｌｙをＡｌａに置換したアミノ酸配列に対して、３位のＡｓｎと４位のＬｙｓとの間にＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＴｙｒからなる群より選択される１個または２個のアミノ酸残基が挿入されたＣドメインの変異体を４個連結したアミノ酸配列である。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列の１位ＡｌａをＶａｌに、２９位ＧｌｙをＡｌａに置換したアミノ酸配列に対して、３位のＡｓｎと４位のＬｙｓとの間にＩｌｅが挿入されたＺドメインの変異体を４個連結したアミノ酸配列である。
【００５３】
本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質の別の好ましい例としては、配列番号４〜１８のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号４〜１８の４位〜６位、６３位〜６５位、１２２位〜１２４位および１８１位〜１８３位に相当する位置に、それぞれＡｓｎ−Ｘ−Ｌｙｓ（ＸはＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、ＴｒｐまたはＴｙｒ）が配置したアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合能を有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、これらのポリペプチドは、配列番号３の１位に相当する位置にＶａｌを、２９位に相当する位置にＡｌａを有する。
【００５４】
本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質の別の好ましい例としては、配列番号１９で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号１９の４位〜７位、６４位〜６７位、１２４位〜１２７位および１８４位〜１８７位に相当する位置に、それぞれＡｓｎ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓが配置したアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合能を有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、これらのポリペプチドは、配列番号３の１位に相当する位置にＶａｌを、２９位に相当する位置にＡｌａを有する。
【００５５】
本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質の別の好ましい例としては、配列番号２０で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有し、かつ配列番号２０の４位〜６位、６３位〜６５位、１２２位〜１２４位および１８１位〜１８３位に相当する位置に、それぞれＡｓｎ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓが配置したアミノ酸配列からなる、イムノグロブリン結合能を有するポリペプチドが挙げられる。好ましくは、これらのポリペプチドは、配列番号２の１位に相当する位置にＶａｌを、２９位に相当する位置にＡｌａを有する。
【００５６】
１．２．ポリヌクレオチド、ベクター
本発明はまた、上記本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）を提供する。本発明の一実施形態にかかるポリヌクレオチドは、上記本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質あるいはその等機能変異体をコードする。本明細書において、イムノグロブリン結合タンパク質の「等機能変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｒｉａｎｔ）」とは、部分的なアミノ酸残基の付加、削除、置換、アミノ酸残基の化学的修飾等により改変されたイムノグロブリン結合タンパク質であって、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を保持し、上述したＡｓｎ−Ｌｙｓの間に少なくとも１つのアミノ酸残基が挿入された構造を維持し、かつ、イムノグロブリン結合活性において、改変前のイムノグロブリン結合タンパク質と同等のものとして扱うことができるものを意味する。
【００５７】
また、上述したように、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質には、イムノグロブリン結合ドメインを１個以上、好ましくは２〜１２個、より好ましくは３〜８個有するタンパク質が含まれる。このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびそのポリヌクレオチドを含むベクターからなる発現プラスミドは公知の方法で作製することができる。
【００５８】
一実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１〜２０のいずれかで示されるポリペプチドをコードする。別の実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１〜２０のいずれかで示されるイムノグロブリン結合タンパク質の等機能変異体をコードする。また別の実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３〜３９のいずれかで示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドである。また別の実施形態において、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２３〜３９のいずれかで示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号４〜２０のいずれかで示されるイムノグロブリン結合タンパク質の等機能変異体をコードするポリヌクレオチドである。
【００５９】
１．３．変異イムノグロブリン結合タンパク質の製造
上記ポリヌクレオチドまたはベクターから本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質を製造するための標準技術としては、例えば、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  ＡｕｓｂｅｌらによるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙやＳａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用することができる。すなわち、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ等）を含有させた発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、得られた組換え体を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、目的の改変タンパク質を大量かつ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第５，１５１，３５０号明細書に記載されているプラスミドや、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１）などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、形質転換のための宿主としては、特に限定されないが、大腸菌などのバクテリア、真菌類、昆虫細胞、ほ乳類細胞等の組換えタンパク質を発現させるために用いられる公知の宿主を用いることができる。宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）などに記載されている公知の方法を利用することができる。形質転換した組換え体（細菌等）を培養して、発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られており、本発明の実施例にも例示されている。
【００６０】
あるいは、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質は、無細胞タンパク質合成系を用いて発現させてもよい。
【００６１】
１．４．担体
本発明はまた、上記本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質が水に対して不溶性の基材（担体）に固定化されたアフィニティー担体を提供する。該担体の形状としては、粒子の形態であることができ、かかる粒子は多孔性でも非多孔性でもよい。粒子状の担体は充填ベッドとして使用することもできるし、懸濁形態で使用することもできる。懸濁形態には流動層（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ）および純然たる懸濁物として知られるものが包含され、その中では粒子が自由に運動できる。モノリス、充填床および流動層の場合、分離手順は一般に濃度勾配による従来のクロマトグラフィー法に従う。純然たる懸濁物の場合は、回分法が用いられる。好ましくは、当該担体は充填剤である。あるいは、担体は、チップ、キャピラリーまたはフィルターのような形態であってもよい。また、担体として磁性粒子を用いてもよい。磁性粒子としては、磁気誘導により容易に磁化され得るものであれば特に制限はされず、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属や、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる磁性体微粒子、又はこれらの磁性体を内部に含んだ疎水性重合体、親水性重合体などが挙げられる。好適な例としては、特開２００８−３２４１１号公報に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層が形成され、当該第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含む極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。好ましい実施形態において、本発明のアフィニティー担体は、アフィニティークロマトグラフィー用担体である。
【００６２】
本発明の一実施形態にかかわるアフィニティー担体は、好ましくは、１０〜５００μｍ、より好ましくは２０〜２００μｍ、担体が合成ポリマーの場合、さらに好ましくは２０〜１００μｍ、なお好ましくは３０〜８０μｍ、担体が多糖の場合、さらに好ましくは５０〜２００μｍ、なお好ましくは６０〜１５０μｍの粒径を有する。粒径が１０μｍ未満であると、高流速下でカラム圧力が高くなり、実用に耐えない。粒径が５００μｍを超えると、イムノグロブリンがアフィニティー担体に結合する量（結合容量）に劣る場合がある。なお、本明細書における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる体積平均粒径である。
【００６３】
本発明の一実施形態にかかわるアフィニティー担体は、好ましくは、多孔質であり、５０〜１５０ｍ2／ｇ、より好ましくは、８０〜１３０ｍ2／ｇの比表面積を有する。ここで、比表面積が５０ｍ2／ｇ未満であると、結合容量が劣る場合があり、一方、１５０ｍ2／ｇを超えると、担体の強度が劣るために高流速下で担体が破壊されて、カラム圧力が上昇する場合がある。なお、本明細書における「比表面積」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥重量で除した値である。
【００６４】
本発明の一実施形態にかかわるアフィニティー担体は、好ましくは、１００〜１４００ｎｍ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは１００〜４００ｎｍ、さらに好ましくは２００〜３００ｎｍ、担体が多糖の場合、より好ましくは５００〜１４００ｎｍ、さらに好ましくは８００〜１２００ｎｍの体積平均細孔径を有する。ここで、体積平均細孔径が１００ｎｍ未満であると、高流速下の結合容量低下が顕著になる場合があり、一方、１４００ｎｍを超えると、流速にかかわらず結合容量が低下する場合がある。なお、本明細書における「体積平均細孔径」とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の体積平均細孔径である。
【００６５】
担体が上記範囲の粒径、比表面積、および細孔径分布を満たす場合、精製対象溶液の流路となる粒子間の隙間および粒子内の比較的大きな細孔径と、精製対象分子の結合表面積のバランスが最適化され、高流速下の結合容量が高いレベルに維持される。
【００６６】
担体の材質としては、例えば、親水性表面を有するポリマーであり、例えば、外表面に（および存在する場合には内表面にも）ヒドロキシ基（−ＯＨ）、カルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、アミノカルボニル基（−ＣＯＮＨ2、またはＮ置換型）、アミノ基（−ＮＨ2、または置換型）、オリゴまたはポリエチレンオキシ基を有するポリマーである。一実施形態において、ポリマーは、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール系等の合成ポリマーであり得、好ましくは、多官能（メタ）アクリレート、ジビニルベンゼン等の多官能モノマーで架橋された共重合体のような合成ポリマーである。かかる合成ポリマーは公知の方法により容易に製造される（例えば、Ｊ．ＭＡＴＥＲ．ＣＨＥＭ１９９１，１（３），３７１−３７４に記載の方法を参照されたい）。あるいは、トヨパール（東ソー社）のような市販品も使用される。他の実施形態におけるポリマーはデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、アガロース等の多糖類である。かかる多糖類は公知の方法により容易に製造される（例えば特許第４０８１１４３号に記載の方法を参照されたい）。あるいは、セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のような市販品も使用される。その他の実施形態ではシリカ、酸化ジルコニウムなどの無機担体であってもよい。
【００６７】
本発明の一実施形態にかかわるアフィニティー担体において、担体として使用される多孔性粒子の一具体例としては、例えば、１０〜５０質量％の架橋性ビニル単量体と３〜９０質量％のエポキシ基含有ビニル単量体を含有し、粒径が２０〜８０μｍであり、比表面積が５０〜１５０ｍ2／ｇであり、体積平均細孔径が１００〜４００ｎｍである多孔性有機重合体粒子が挙げられる。
【００６８】
なお、本発明の一実施形態にかかわるアフィニティー担体を水銀ポロシメーターで測定した場合の細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の浸入体積（細孔体積）は、好ましくは、１．３〜７．０ｍＬ／ｇ、担体が合成ポリマーの場合、より好ましくは１．３〜２．５ｍＬ／ｇ、担体が多糖の場合、より好ましくは３．０〜６．０ｍＬ／ｇである。
【００６９】
１．５．担体へのリガンドの固定化
本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質（リガンド）と上記担体との結合方法としては、タンパク質を担体に固定化する一般的方法を用いて行うことができる。固定化の手段としては、例えば、担体へのリガンドの物理的吸着、担体とリガンドとの化学的結合などが挙げられる。担体とリガンドとの化学的結合のための方法としては、例えば、カルボキシ基を有する担体を用い、このカルボキシ基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドにより活性化させリガンドのアミノ基と反応させる方法、アミノ基またはカルボキシ基を有する担体を用い、水溶性カルボジイミドなどの脱水縮合剤存在下でリガンドのカルボキシ基またはアミノ基と反応させアミド結合を形成する方法、水酸基を有する担体を用い、臭化シアンなどのハロゲン化シアンで活性化させてリガンドのアミノ基と反応させる方法、または担体の水酸基をトシル化もしくはトレシル化しリガンドのアミノ基と反応させる方法、ビスエポキシド、エピクロロヒドリンなどによりエポキシ基を担体に導入し、リガンドのアミノ基または水酸基またはチオール基と反応させる方法、およびエポキシ基を有する担体を用い、リガンドのアミノ基または水酸基またはチオール基と反応させる方法などが挙げられる。上記のうち、反応を実施する水溶液中での安定性の観点からは、エポキシ基を介してリガンドを導入する結合方法が望ましい。
【００７０】
エポキシ基が開環して生成する開環エポキシ基であるアルコール性水酸基は、担体表面を親水化し、タンパク質などの非特異吸着を防止すると共に、水中で担体の靱性を向上させ、高流速下の担体の破壊を防止する役割を果たす。したがって、リガンドを固定化させた後の担体中にリガンドと結合していない残余のエポキシ基が存在している場合、当該残余のエポキシ基を開環させることが好ましい。担体中のエポキシ基の開環方法としては、例えば、水溶媒中で、酸またはアルカリにより、加熱または室温下で該担体を撹拌する方法を挙げることができる。また、メルカプトエタノール、チオグリセロールなどのメルカプト基を有するブロッキング剤やモノエタノールアミンなどのアミノ基を有するブロッキング剤で、エポキシ基を開環させてもよい。最も好ましい開環エポキシ基は、担体に含まれるエポキシ基をチオグリセロールにより開環させて得られる開環エポキシ基である。チオグリセロールは、原料としてメルカプトエタノールなどよりも毒性が低く、チオグリセロールが付加したエポキシ開環基は、アミノ基を有するブロッキング剤による開環基よりも非特異吸着が低い上に、担体の動的結合量が高くなるといった利点を有する。
【００７１】
また、必要に応じて担体とリガンドの間に任意の長さの分子（スペーサー）を導入してもよい。スペーサーの例としてはポリメチレン鎖、ポリエチレングリコール鎖、糖類などが挙げられる。スペーサーには、例えば担体表面に化学結合でき、かつリガンドとも結合する二官能の化合物を使用することができる。
【００７２】
１．６．作用効果
本発明の一実施形態に係る、本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質を固定化したアフィニティー担体は、初期のイムノグロブリン動的結合容量（ＤＢＣ）が高く、かつアルカリ性条件下での洗浄（例えば０．０１〜０．８Ｍ水酸化ナトリウム等のアルカリ性液を用いた洗浄）に対しても性能の著しい低下がない。
【００７３】
２．イムノグロブリンを単離する方法
本発明の一実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法を説明する。本実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法は、上記本発明の変異イムノグロブリン結合タンパク質を固定化したアフィニティー担体に、イムノグロブリンを含有する試料を接触させ、該担体にイムノグロブリンを吸着させる工程（第一の工程）、および、該担体から該イムノグロブリンを溶出させる工程（第二の工程）を含み、好ましくは該第二の工程の後に、該担体をアルカリ性液で洗浄する工程（第三の工程）をさらに含む。本発明のイムノグロブリン単離方法に用いられる本発明のアフィニティー担体は、懸濁形態であってもよく、カラムに充填された状態であってもよく、あるいはチップ、キャピラリー、フィルターまたは磁性粒子のような形態であってもよい。
【００７４】
好ましい実施形態において、第一の工程では、上記本発明のアフィニティー担体に、イムノグロブリンを含有する試料を、リガンドにイムノグロブリンが吸着する条件にて接触させる。この第一の工程では、試料中のイムノグロブリン以外の物質のほとんどは、リガンドに吸着されず担体上に残留しない。この後、必要に応じて、リガンドに弱く保持された一部の物質を除去するため、担体をＮａＣｌなどの塩を含む中性の緩衝液で洗浄してもよい。
【００７５】
第二の工程では、ｐＨ２〜５の適切な緩衝液を流し、リガンドに吸着されたイムノグロブリンを溶出させる。この溶出液を回収することで、試料からイムノグロブリンを単離することができる。
【００７６】
本実施形態に係るイムノグロブリンを単離する方法においては、好ましくは、上記第二の工程に続いて第三の工程が行われる。第三の工程では、アルカリ性溶液で担体を洗浄（ＣＩＰ洗浄）する。第三の工程に使用されるアルカリ性液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、トリエチルアミン、水酸化テトラブチルアンモニウム等が挙げられる。
【００７７】
本発明のアフィニティー担体は、タンパク質リガンドのアルカリ耐性向上により上記第三の工程での洗浄後もイムノグロブリン結合能を安定に保持しているため、本発明のイムノグロブリン単離方法に繰り返し使用することができる。
【００７８】
本発明のイムノグロブリン単離方法の一実施形態において、単離すべきイムノグロブリンは、抗体またはそれを含む医薬であり得る。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明のアフィニティー担体を用いる抗体医薬の製造方法を提供する。当該方法の手順は、目的とする抗体医薬を含有する試料を用いる以外は、基本的に上述したイムノグロブリン単離方法の手順と同様である。
【実施例】
【００７９】
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに具体的に説明する。また、以下の記載は本発明の態様を概括的に示すものであり、特に理由なく、かかる記載により本発明は限定されるものではない。【００８０】
参考例１  多孔質粒子の合成
グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）８．２ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（サートマー社製）６５．９ｇおよびグリセリンモノメタクリレート（日油社製）９０．６ｇを２−オクタノン（東洋合成工業社製）２４５．８ｇおよびアセトフェノン（和光純薬工業社製）６２ｇに溶解させ、２，２'−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）２ｇを添加し、有機モノマー溶液を調製した。【００８１】
次に、４２４０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）８．５ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）０．４３ｇおよび硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製）２１．３ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液を調製した。【００８２】
次いで、得られた水溶液を７Ｌセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、撹拌翼、および冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、６００ｒｐｍで撹拌を開始した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、水溶液の温度が８５℃になったところで、この水溶液に滴下ロートを用いて上記有機モノマー溶液を添加し、５時間撹拌を行った。【００８３】
次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液を５Ｌのポリプロピレン製ビンに移し、粒子が浮遊するまで静置し、下方から余分な水を吸い出して廃棄した。さらに、この反応液にアセトンを加えて粒子を沈降させた。次に、反応液を３分間静置して、デカンテーションによりアセトンを除去した。この操作を２回繰り返したのち水を加えて、粒子を沈降させた。さらに、３分間静置してデカンテーションを行った。この操作を２回繰り返して粒子を洗浄した。さらに、粒子の分散液をアセトンで再び置換して、一晩風乾したのち、真空乾燥機にて乾燥を行い、多孔質粒子（以下、ＰＢと記す）９０ｇを得た。ＰＢの平均粒径は５３μｍ、比表面積は９５ｍ2／ｇであった。【００８４】
実施例１  Ｃドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質１（ＩｇＧＢＰＣ１）の作製
配列番号４に示すアミノ酸配列をコードするプラスミドを調製し、さらにこれを用いて大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）を形質転換して組換え体を得た。得られた組換え体を、吸光度（ＯＤ６００）が約１０に到達するまで３７℃でインキュベートした。その後、終濃度で１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製）を添加し、さらに４時間３７℃でインキュベートして、組換え型イムノグロブリン結合タンパク質を発現させた。タンパク質発現後、細胞を回収し、ｐＨ９．５のトリス緩衝液中で破砕した。得られた細胞破砕液から、陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）および陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−セファロースＦＦ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）によってイムノグロブリン結合タンパク質を精製した。精製したイムノグロブリン結合タンパク質を、１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．６に対して１６時間透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認されたイムノグロブリン結合タンパク質の純度は９５％以上であった。精製されたイムノグロブリン結合タンパク質を、Ｃドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質１（ＩｇＧＢＰＣ１）とした。このタンパク質は、Ｃドメイン（配列番号３）の変異体を４個含み、各変異体ドメインにおける配列番号３の３位〜４位に対応する位置のＡｓｎ−Ｌｙｓの間にはＰｈｅが挿入されている。またＩｇＧＢＰＣ１中の各ドメインは、アルカリ耐性向上変異Ａ１Ｖ／Ｇ２９Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，２２，１２３０−１２３８）を有する。【００８５】
実施例２〜１６  Ｃドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質２〜１６（ＩｇＧＢＰＣ２〜ＩｇＧＢＰＣ１６）の作製
配列番号５〜１９に示すアミノ酸配列をコードするプラスミドをそれぞれ調製し、以降は実質的に実施例１と同様の工程で組換え型イムノグロブリン結合タンパク質２〜１６（ＩｇＧＢＰＣ２〜ＩｇＧＢＰＣ１６）を製造した。これらのタンパク質は、Ｃドメイン（配列番号３）の変異体を４個含み、各変異体ドメインにおける配列番号３の３位〜４位に対応する位置のＡｓｎ−Ｌｙｓの間には後述する表１に示すアミノ酸が挿入されている。またＩｇＧＢＰＣ２〜１６中の各ドメインは、アルカリ耐性向上変異Ａ１Ｖ／Ｇ２９Ａを有する。【００８６】
実施例１７  Ｚドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質１（ＩｇＧＢＰＺ１）の作製
配列番号２０に示すアミノ酸配列をコードするプラスミドを調製し、以降は実質的に実施例１と同様の工程でＺドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質１（ＩｇＧＢＰＺ１）を製造した。このタンパク質は、Ｚドメイン（配列番号２）の変異体を４個含み、各変異体ドメインにおける配列番号２の３位〜４位に対応する位置のＡｓｎ−Ｌｙｓの間にはＩｌｅが挿入されている。またＩｇＧＢＰＺ１中の各ドメインは、アルカリ耐性向上変異Ａ１Ｖ／Ｇ２９Ａを有する。【００８７】
比較例１  Ｃドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質０（ＩｇＧＢＰＣ０）の作製
配列番号２１に示すアミノ酸配列をコードするプラスミドを調製し、以降は実質的に実施例１と同様の工程でＣドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質０（ＩｇＧＢＰＣ０）を製造した。このタンパク質は、Ｃドメイン（配列番号３）の変異体を４個含むが、各変異体ドメインの配列番号３の３位〜４位に対応する位置のＡｓｎ−Ｌｙｓの間にアミノ酸残基は挿入されていない。なおＩｇＧＢＰＣ０は、アルカリ耐性向上変異体ドメインＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，２２，１２３０−１２３８）を有するアルカリ耐性の高いイムノグロブリン結合タンパク質である。【００８８】
比較例２  Ｚドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質０（ＩｇＧＢＰＺ０）の作製
配列番号２２に示すアミノ酸配列をコードするプラスミドを調製し、以降は実質的に実施例１と同様の工程でＺドメイン組換え型イムノグロブリン結合タンパク質０（ＩｇＧＢＰＺ０）を製造した。このタンパク質は、Ｚドメイン（配列番号２）の変異体を４個含むが、各変異体ドメインの配列番号２の３位〜４位に対応する位置のＡｓｎ−Ｌｙｓの間にアミノ酸残基は挿入されていない。なおＩｇＧＢＰＺ０は、アルカリ耐性向上変異体ドメインＡ１Ｖ／Ｇ２９Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，２２，１２３０−１２３８）を有するアルカリ耐性の高いイムノグロブリン結合タンパク質である。【００８９】
実施例１〜１７および比較例１〜２のイムノグロブリン結合タンパク質を表１に示す。【００９０】
【表１】
2016152946.tif 000002
【００９１】
試験例１  アフィニティークロマトグラフィー用担体のイムノグロブリン結合能
１）担体へのイムノグロブリン結合タンパク質の固定化
参考例１で調製したＰＢを８ｍｇ含むように１５０μＬの純水に懸濁させ、フィルターチューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に移し遠心して純水を除いた。ここに１ｍｇの実施例１で作製したイムノグロブリン結合タンパク質１（ＩｇＧＢＰＣ１）を溶解した４５０μＬの０．８５Ｍ硫酸ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．８を加え、２５℃で５時間振盪させ、イムノグロブリン結合タンパク質をＰＢに結合させた。生成した粒子を濾過した後、１Ｍチオグリセロール４５０μＬと混合し２５℃で１６時間反応させ、残余のエポキシ基をブロッキングし、０．５Ｍ  ＮａＯＨで洗浄後、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）、０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．６）で洗浄し、４５０μＬの結合多孔質粒子（ＩｇＧＢＰＣ１／ＰＢ）を得た。同様の手順で、ＩｇＧＢＰＣ０、ＩｇＧＢＰＣ２〜１６およびＩｇＧＢＰＺ０〜１のいずれかが結合した多孔質粒子（ＩｇＧＢＰＣ１〜１６／ＰＢおよびＩｇＧＢＰＺ０〜１／ＰＢ）を得た。【００９２】
２）担体へのイムノグロブリン結合タンパク質導入量の測定
１ｍｇのＩｇＧＢＰＣ１〜１６／ＰＢおよびＩｇＧＢＰＺ０〜１／ＰＢのいずれかを含む１５０μＬの懸濁液の各々について、ＢＣＡ  Ａｓｓａｙキット（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて、担体に結合したイムノグロブリン結合タンパク質の導入量を測定した。【００９３】
３）ＩｇＧ動的結合容量の測定
ＩｇＧＢＰＣ０〜１６／ＢＰおよびＩｇＧＢＰＺ０〜１／ＰＢの各々を内径０．５ｃｍのカラムにベッド高２０ｃｍまで充填した。カラムを２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化した後、ヒトポリクローナルＩｇＧ（５ｍｇ／ｍＬ）を含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）を、線流速３００ｃｍ／時間で流し、吸光度モニターで溶出液中のヒトポリクローナルＩｇＧ濃度が１０％ブレークスルー（破過）のときのヒトポリクローナルＩｇＧ吸着量と担体体積から動的結合容量（ＤＢＣ）を求めた。【００９４】
４）耐アルカリ性試験
３）で用いた担体充填カラムをＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓにセットし、０．５Ｍ水酸化ナトリウム２０ｍＬをカラム内に流した。カラムを装置から外し、密閉した後室温で一定時間（１５、３０、４５時間）放置した後、３）と同様の手順で、線流速３００ｃｍ／時間におけるヒトポリクローナルＩｇＧのＤＢＣを測定した。０．５Ｍ水酸化ナトリウムで処理する前のＤＢＣを１００％とした時の結合容量維持率（％ＤＢＣ）を求めた。【００９５】
各アフィニティークロマトグラフィー用担体のイムノグロブリン結合タンパク質導入量、ＤＢＣ、耐アルカリ性試験の結果を表２および表３に示す。【００９６】
【表２】
2016152946.tif 000003
【００９７】
【表３】
2016152946.tif 000004
【００９８】
担体に対する実施例１〜１７および比較例１〜２のイムノグロブリン結合タンパク質の結合量はほぼ同等であった。一方で、実施例１〜１７のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化した担体（ＩｇＧＢＰＣ１〜１６／ＰＢおよびＩｇＧＢＰＺ１／ＰＢ）は、比較例１または２のタンパク質を固定化した担体（ＩｇＧＢＰＣ０／ＰＢおよびＩｇＧＢＰＺ０／ＰＢ）と比較して、ＤＢＣが向上していた。また、ＩｇＧＢＰＣ１〜１６／ＰＢおよびＩｇＧＢＰＺ１／ＰＢは、０．５Ｍ水酸化ナトリウムに最大４５時間曝露するという極めて過酷なアルカリ条件下でも、アルカリ耐性向上変異を有するＩｇＧＢＰＣ０／ＰＢまたはＩｇＧＢＰＺ０／ＰＢと同等の高いアルカリ耐性を有し、比較的高いＤＢＣを維持することができた。したがって、ＳｐＡイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列の３位Ａｓｎと４位Ｌｙｓとの間にアミノ酸残基を挿入した改変ドメインを含むイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとして用いることにより、高いＤＢＣとアルカリ耐性とを有するアフィニティークロマトグラフィー用担体を得ることができた。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2016152946.tif 000006
2016152946.tif 000007
2016152946.tif 000008
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