(57)【要約】  オレフィン化合物を高い生産性にて製造することを可能とする方法、及び該方法に用いられる酵素を提供することを目的とし、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）の様々な部位に、アミノ酸置換を伴う変異を導入し、ＭＶＤの変異体を多数調製した。そして、それら変異体について、イソプレン等のオレフィン化合物の生成に関する触媒活性を評価した結果、２０９位のスレオニンが他のアミノ酸に置換されたＭＶＤは、前記触媒活性を有していることを見出し、２０９位の他、更に７４位のアルギニンも他のアミノ酸に置換されたＭＶＤは、より高い前記触媒活性を有していることを明らかにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの存在下、下記式（１）で表される化合物とＡＴＰとを反応させる工程を含む、オレフィン化合物の製造方法
【化１】
2017022804.tif 000019
［式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１５のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基又はハロゲン原子を示す（前記アルキル基及びアルケニル基は、各々独立に、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基によって任意に置換されていてもよい）］。
【請求項２】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞を、培養し、該宿主細胞及び／又はその培養物において生成されたオレフィン化合物を採取する工程を含む、オレフィン化合物の製造方法。
【請求項３】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン、セリン又はヒスチジンである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが、更に配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼである、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン又はアラニンであり、かつ配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが変異してなる他のアミノ酸が、メチオニン、ヒスチジン、グルタミン又はリシンである、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記オレフィン化合物がイソプレンである請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記オレフィン化合物がブタジエンである請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの製造方法であって、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンを他のアミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法。
【請求項９】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン、セリン又はヒスチジンである、請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンを他のアミノ酸に変異させる工程を更に含む、請求項８又は９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン又はアラニンであり、かつ配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが変異してなる他のアミノ酸が、メチオニン、ヒスチジン、グルタミン又はリシンである、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記オレフィン化合物がイソプレンである請求項８〜１１のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記オレフィン化合物がブタジエンである請求項８〜１１のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが他のアミノ酸に変異している、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項１５】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン、セリン又はヒスチジンである、請求項１４に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項１６】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが他のアミノ酸に更に変異している、請求項１４又は１５に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項１７】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン又はアラニンであり、かつ配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが変異してなる他のアミノ酸が、メチオニン、ヒスチジン、グルタミン又はリシンである、請求項１６に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のうちのいずれか一項に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１８に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項２０】
請求項１８に記載のＤＮＡ又は請求項１９に記載のベクターが導入された宿主細胞。
【請求項２１】
請求項２０に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の製造方法。
【請求項２２】
請求項１４〜１７のうちのいずれか一項に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、該ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを含む、下記式（１）で表される化合物とＡＴＰとを反応させ、オレフィン化合物の生成を促進するための剤。
【化２】
2017022804.tif 000020
［式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１５のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基又はハロゲン原子を示す（前記アルキル基及びアルケニル基は、各々独立に、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基によって任意に置換されていてもよい）］。
【請求項２３】
前記オレフィン化合物がイソプレンである請求項２２に記載の剤。
【請求項２４】
前記オレフィン化合物がブタジエンである請求項２２に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を用いたオレフィン化合物の製造方法に関する。また本発明は、前記変異体、及びその製造方法に関し、さらに、前記変異体をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡが挿入されているベクターにも関する。また本発明は、前記ＤＮＡ又は前記ベクターが導入された宿主細胞を用いたオレフィン化合物の製造方法に関し、さらにまた、前記変異体、前記ＤＮＡ又は前記ベクターを含む、オレフィン化合物の生成を促進するための剤にも関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレン、イソブテン等のオレフィン化合物は、合成ゴム等の様々な合成ポリマーの原料として極めて有用であり、これら化合物は、石油の分留といった化学的方法によって得ることができる。【０００３】
しかしながら、このような化学的方法においても、その収率は低く、製造コストがかかり、また時間を要する。さらに、昨今の環境問題を考慮するに、化学的方法に代わって、限られた資源を無駄にすることなく環境に優しい持続可能なオレフィン化合物の製造方法の開発が求められている。【０００４】
かかる状況を鑑み、微生物等の代謝経路を利用又は改変して、オレフィン化合物を製造することが試みられている。例えば、メバロン酸経路に関与するジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ等に変異を導入し、当該変異酵素を利用したイソプレン、イソブテン等の製造方法が開示されている（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０９２５６７号
【特許文献２】国際公開第２０１５／００４２１１号
【特許文献３】国際公開第２０１５／０２１０４５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、オレフィン化合物を高い生産性にて製造することを可能とする酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、先ず、５−ジホスホメバロン酸を基質とし、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが関与する、イソペンテニル二リン酸の生成（下記式  参照）を、イソプレン等のオレフィン化合物の製造に応用することを着想した。【０００８】
【化１】
2017022804.tif 000002
【０００９】
すなわち、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸に変異を導入し、当該酵素（ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体）の基質特異性を、元来の５−ジホスホメバロン酸から３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテート等に対するものに変更することで、下記式に示すような反応を経て、イソプレン等を製造することを着想した。【００１０】
【化２】
2017022804.tif 000003
【００１１】
そこで、本発明者らは、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの様々な部位に、アミノ酸置換を伴う変異を導入し、多数のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異体を調製した。そして、それら変異体について、５−ジホスホメバロン酸を基質とするイソペンテニル二リン酸の生成に関する触媒活性と、３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの生成に関する触媒活性とを評価した。【００１２】
その結果、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいては、変異が導入されることにより、５−ジホスホメバロン酸に対する基質特異性が概して低下することが明らかになった。特に、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの２０９位のスレオニンが他のアミノ酸（セリン、アルギニン、ヒスチジン等）に置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、イソプレンを生成する触媒活性を有していることが認められた。【００１３】
さらに、７４位のアルギニンがヒスチジンに置換され、かつ２０９位のスレオニンがアルギニンに置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒ）は、群を抜いてイソプレンの生成に関する極めて高い触媒活性を示すことが明らかになった。より具体的には、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにかかる２重変異を導入することにより、イソペンテニル二リン酸の生成に関する触媒活性においては野生型と比して約３分の１となった一方で、イソプレンの生成に関するそれにおいては野生型と比して約６０〜８０倍に向上した。また、このイソプレンの生成に関する触媒活性は、後述の図３Ｂ及び図４Ｂに示す通り、他の変異体と比較しても顕著に高いものであった。【００１４】
また、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒについて、他のオレフィン化合物（イソブテン）の生成に関する触媒活性についても評価した。その結果、イソプレン生成の際同様に、野生型と比して極めて高いイソブテンの生成に関する触媒活性が認められた。【００１５】
また、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、７４位及び２０９位は、各々アルギニン及びスレオニンに限らず、他のアミノ酸（７４位においては、メチオニン、ヒスチジン、グルタミン、リシン等、２０９位においては、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン等）に置換しても、イソプレン生成における触媒反応において、野生型のそれよりも概して高い触媒活性を示すことも確認された。【００１６】
さらに、イソプレン生成における触媒活性において、上述のＲ７４ＨＴ２０９Ｒと、７４位のアルギニンがメチオニンに置換され、かつ２０９位のスレオニンがアルギニンに置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体（Ｒ７４ＭＴ２０９Ｒ）とを比較した結果、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒと比しても、Ｒ７４ＭＴ２０９Ｒは、なお１．２８倍も高い触媒活性を示すことも確認された。【００１７】
さらにまた、イソブテンの生成においてもＲ７４ＭＴ２０９Ｒは高い触媒活性を示すことも確認された。また、前記イソプレンの生成同様に、Ｒ７４ＭＴ２０９Ｒの方がＲ７４ＨＴ２０９Ｒよりも、イソブテンの生成における触媒活性においても高いことが確認され、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下を提供するものである。
＜１＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの存在下、下記式（１）で表される化合物とＡＴＰとを反応させる工程を含む、オレフィン化合物の製造方法【００１８】
【化３】
2017022804.tif 000004
【００１９】
［式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１５のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基又はハロゲン原子を示す（前記アルキル基及びアルケニル基は、各々独立に、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基によって任意に置換されていてもよい）］。
＜２＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターが導入された宿主細胞を、培養し、該宿主細胞及び／又はその培養物において生成されたオレフィン化合物を採取する工程を含む、オレフィン化合物の製造方法。
＜３＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン、セリン又はヒスチジンである、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼが、更に配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼである、＜１＞〜＜３＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜５＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン又はアラニンであり、かつ配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが変異してなる他のアミノ酸が、メチオニン、ヒスチジン、グルタミン又はリシンである、＜４＞に記載の製造方法。
＜６＞  前記オレフィン化合物がイソプレンである、＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜７＞  前記オレフィン化合物がブタジエンである、＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜８＞  オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの製造方法であって、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンを他のアミノ酸に変異させる工程を含む、製造方法。
＜９＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン、セリン又はヒスチジンである、＜８＞に記載の製造方法。
＜１０＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンを他のアミノ酸に変異させる工程を更に含む、＜８＞又は＜９＞に記載の製造方法。
＜１１＞  前記ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン又はアラニンであり、かつ配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが変異してなる他のアミノ酸が、メチオニン、ヒスチジン、グルタミン又はリシンである、＜１０＞に記載の製造方法。
＜１２＞  前記オレフィン化合物がイソプレンである、＜８＞〜＜１１＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜１３＞  前記オレフィン化合物がブタジエンである、＜８＞〜＜１１＞のうちのいずれか一に記載の製造方法。
＜１４＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが他のアミノ酸に変異している、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
＜１５＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン、セリン又はヒスチジンである、＜１４＞に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
＜１６＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが他のアミノ酸に更に変異している、＜１４＞又は＜１５＞に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
＜１７＞  配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる他のアミノ酸が、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン又はアラニンであり、かつ配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンが変異してなる他のアミノ酸が、メチオニン、ヒスチジン、グルタミン又はリシンである、＜１６＞に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ。
＜１８＞  ＜１４＞〜＜１７＞のうちのいずれか一に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ。
＜１９＞  ＜１８＞に記載のＤＮＡを含むベクター。
＜２０＞  ＜１８＞に記載のＤＮＡ又は＜１９＞に記載のベクターが導入された宿主細胞。
＜２１＞  ＜２０＞に記載の宿主細胞を培養し、該宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の製造方法。
＜２２＞  ＜１４＞〜＜１７＞のうちのいずれか一に記載のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、該ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを含む、下記式（１）で表される化合物とＡＴＰとを反応させ、オレフィン化合物の生成を促進するための剤。【００２０】
【化４】
2017022804.tif 000005
【００２１】
［式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１５のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基又はハロゲン原子を示す（前記アルキル基及びアルケニル基は、各々独立に、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基によって任意に置換されていてもよい）］。
＜２３＞  前記オレフィン化合物がイソプレンである、＜２２＞に記載の剤。
＜２４＞  前記オレフィン化合物がブタジエンである、＜２２＞に記載の剤。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、オレフィン化合物を高い生産性にて製造することを可能とする酵素、並びに当該酵素を用いたオレフィン化合物の製造方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（図中「Ｗｔ」にて示す）と、その変異体とについて、５−ジホスホメバロン酸を基質とするイソペンテニル二リン酸の生成に関する酵素活性（図中、縦軸に示す）及び３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの生成に関する酵素活性（図中、横軸に示す）を解析した結果を示すプロット図である。なお、図中「Ｔ２０９Ｈ」等は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの各変異体を示し、数字は当該酵素においてアミノ酸置換を伴う変異が導入された部位（２０９位等）を表し、数字の左側のアルファベットは置換される前のアミノ酸（Ｔ／スレオニン等）を表し、数字の右側のアルファベットは置換された後のアミノ酸（Ｈ／ヒスチジン等）を表す。
【図２】ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを強制的に発現する大腸菌（図中「Ｗｔ」にて示す）と、２０９位のスレオニンがアルギニンに置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを強制的に発現する大腸菌（図中「Ｔ２０９Ｒ」にて示す）とを培養し、各々において生成されたイソプレンの量を測定した結果を示すグラフである。
【図３Ａ】ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（図中「Ｗｔ」にて示す）と、その変異体とについて、５−ジホスホメバロン酸を基質とするイソペンテニル二リン酸の生成に関する酵素活性（図中、縦軸に示す）及び３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの生成に関する酵素活性（図中、横軸に示す）を解析した結果を、横軸に関しては１４００μｇ/Ｌ迄示したプロット図である。なお、図３Ａ及び以下の図面において「Ｔ２０９Ｒ，Ｉ１４５Ｆ」等は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの各アミノ酸置換体の解析結果を示し、数字は当該酵素においてアミノ酸置換を伴う変異が導入された部位（１４５位、２０９位等）を表し、数字の左側のアルファベットは置換される前のアミノ酸（Ｔ／スレオニン、Ｉ／イソロイシン等）を表し、数字の右側のアルファベットは置換された後のアミノ酸（Ｒ／アルギニン、Ｆ／フェニルアラニン等）を表す。また、図中、縦軸と横軸との交点付近に密集している点群（図中、楕円にて囲んでいる点群）は、Ｓ１２０Ｃ、Ｔ４６Ｄ、Ｓ１２１Ｃ、Ｓ１５３Ａ、Ｔ２０９Ｃ、Ｔ２０９Ｑ、Ｔ２０９Ｅ、Ｔ２０９Ａ、Ｔ２０９Ｙ、Ｔ２０９Ｄ、Ｔ７５Ｉ、Ｔ２０９Ｎ、Ｎ２８Ｒ、Ｎ２８Ｅ、Ｓ１５３Ｃ、Ｎ２８Ｗ、Ｓ１０８Ｔ、Ｎ２８Ｈ、Ｌ６３Ｑ、Ｇ１５４Ｉ、Ｇ１５４Ｌ、Ｓ１０８Ｃ、Ｓ１０８Ｄ、Ｎ１１０Ｍ、Ｎ１１０Ｑ、Ｓ１０８Ｎ、Ｎ１１０Ｉ、Ｇ１５４Ｍ、Ｇ１５４Ｗ、Ｋ２２Ｙ、Ｔ４６Ｃ、Ｒ７４Ｗ、Ｌ６１Ｅ、Ｌ６３Ｅ、Ｒ７４Ｙ、Ｌ６３Ｎ、Ｎ１１０Ｅ、Ｔ４８Ｓ、Ｔ４６Ｖ、Ｇ１５４Ｆ、Ａ１１９Ｃ、Ａ１２２Ｃ、Ｇ１５４Ｅ、Ｋ２２Ｆ、Ａ１２３Ｓ、Ｋ２２Ｒ、Ｋ２２Ｗのアミノ酸置換体の解析結果を示すものである。
【図３Ｂ】ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼと、その変異体とについて、５−ジホスホメバロン酸を基質とするイソペンテニル二リン酸の生成に関する酵素活性（図中、縦軸に示す）及び３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの生成に関する酵素活性（図中、横軸に示す）を解析した結果を、横軸に関しては２５０００μｇ/Ｌ迄示したプロット図である。
【図４Ａ】ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼと、その変異体とについて、３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの生成に関する酵素活性を解析した結果を、１５００μｇ／Ｌ迄示したグラフである。なお、図４Ａ及びＢにおいて、「超純水」は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの代わりにｍｉｌｌｉＱ（登録商標）水を用いて解析した結果（陰性対照）を示す。
【図４Ｂ】ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼと、その変異体とについて、３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの生成に関する酵素活性を解析した結果を、３００００μｇ／Ｌ迄示したグラフである。
【図５】ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを強制的に発現する大腸菌と、その変異体を各々強制的に発現する大腸菌とを培養し、各々において生成されたイソプレンの量を測定した結果を示すグラフである。なお、図中「ＬＢ２＊菌なし」は、陰性対照実験として、ＬＢ培地、基質及びＩＰＴＧのみからなるサンプルを解析した結果を示す。
【図６Ａ】７４位のアルギニンがヒスチジンに置換され、かつ２０９位のスレオニンがアルギニンに置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（図中「Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒ」にて示す）と、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとについて、各々の存在下におけるイソプレン合成量の経時変化を示すグラフである。縦軸は合成されたイソプレン量を示し、横軸は反応時間を示す。
【図６Ｂ】図６Ａにおける縦軸を対数表示に変換したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
＜オレフィン化合物の製造方法  １＞
後述の実施例において示すように、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの２０９位のスレオニンを他のアミノ酸に置換することによって、該酵素の元来の基質である５−ジホスホメバロン酸に対する基質特異性が低減される。また、かかるジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異体は、オレフィン化合物を生成する下記反応を促進する触媒活性（「オレフィン化合物を生成する触媒活性」とも称する）を有していることを見出した。
【００２５】
【化５】
2017022804.tif 000006
【００２６】
したがって、本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニン（以下、単に「２０９位のスレオニン」とも称する）が他のアミノ酸に変異している、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（以下、「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体」とも称する）の存在下、前記式（１）で表される化合物とＡＴＰ（アデノシン三リン酸）とを反応させる工程を含む、オレフィン化合物の製造方法を提供する。
【００２７】
本発明において「オレフィン化合物」は、炭素間二重結合を少なくとも１つ有する炭化水素化合物を意味し、またヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基等の置換基、ハロゲン原子等の原子が導入されているものであってもよい。このような化合物としては、例えば、イソブテン、エテン、プロペン、２−メチル−１−ブテン、イソプレノール、３−ヒドロキシ−３−メチル−４−ペンテン酸等のモノオレフィン化合物、イソプレン、ブタジエン（１，３−ブタジエン）、ピペリレン、２，３−ジメチルブタジエン、１，３−ヘキサジエン、２−メチル−１，３−ペンタジエン、クロロプレン、３−メチル−２，４−ペンタジエン酸といった共役ジエン化合物等のジオレフィン化合物が挙げられる。
【００２８】
本発明においてオレフィン化合物を製造するための原料となる下記式（１）で表される化合物において、Ｒ１及びＲ２については特に制限はなく、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１５のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基又はハロゲン原子を示す（前記アルキル基及びアルケニル基は、各々独立に、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基によって任意に置換されていてもよい）。
【００２９】
【化６】
2017022804.tif 000007
【００３０】
また、本発明において、共役ジエン化合物を製造する場合には、以下の反応式に示すように、上記式（１）で表される化合物のより具体的な態様として、下記式（４）で表される化合物が好適に用いられる。
【００３１】
【化７】
2017022804.tif 000008
【００３２】
前記式（４）で表される化合物において、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５については特に制限はなく、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、ハロゲン原子、炭素数２〜１５のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択される置換基を示す。
【００３３】
また本発明において、炭素数１〜１０のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、（シクロヘキシル）メチル基、（１−メチルシクロヘキシル）メチル基、（１−メチルシクロペンチル）メチル基、（１−エチルシクロヘキシル）メチル基が挙げられる。また、炭素数２〜１５のアルケニル基としては、例えば、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、３−ブテニル基、５−ヘキセニル基、７−オクテニル基が挙げられ、炭素数６〜２０のアリール基としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、アセナフチル基、フェナントリル基、アントリル基が挙げられる。また、ハロゲン原子は、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子を示す。
【００３４】
このような前記式（１）で表される化合物は、後述の実施例において示すように、市販の製品として購入することができる。また、当業者であれば、公知の合成方法（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８８年、２０巻、１５号、１７６３〜１７６６ページに記載の方法）を適宜参酌しながら、合成することもできる。
【００３５】
後述のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の存在下、前記式（１）で表される化合物とＡＴＰとの反応の条件については、当該反応が促進され、オレフィン化合物が生成される条件であればよく、当業者であれば、反応液の組成、反応液のｐＨ、反応温度、反応時間等を適宜調整し、設定することができる。
【００３６】
例えば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体と、その基質である前記式（１）で表される化合物及びＡＴＰとが添加される反応液においては、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの補因子であるマグネシウムイオンが、通常１〜５０ｍＭ、好ましくは５〜２０ｍＭ含まれていればよく、その他の組成、ｐＨについては前述の通り、前記反応を妨げない限り、特に制限はないが、好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液であり、より好ましくはｐＨ７〜８のトリス塩酸緩衝液である。
【００３７】
また、反応温度としても、前記反応を妨げない限り、特に制限はないが、通常２０〜４０℃であり、好ましくは２５〜３７℃である。さらに、反応時間としては、オレフィン化合物が生成し得る時間であればよく、特に制限はないが、通常３０分〜７日であり、好ましくは１２時間〜２日である。
【００３８】
また、このような条件にて生成されるオレフィン化合物は、大概気化し易いため、揮発性ガスの公知の回収、精製方法により採取することができる。かかる採取方法としては、ガスストリッピング、分留、吸着、脱着、パーベーパレーション、固相に吸着させたイソプレンの熱若しくは真空による固相からの脱着、溶媒による抽出、又はクロマトグラフィー（例えば、ガスクロマトグラフィー）等が挙げられる。また、生成されるオレフィン化合物が液体である場合にも、公知の回収、精製方法（蒸留、クロマトグラフィー等）を適宜利用し、採取することができる。さらに、これらの方法は単独にて行ってもよく、また適宜組み合わせて多段階的に実施し得る。
【００３９】
＜オレフィン化合物の製造方法  ２＞
また、後述の実施例において示す通り、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが他のアミノ酸に変異している、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを発現するように形質転換された宿主細胞を、培養することにより、オレフィン化合物を生産性高く製造することができる。したがって、本発明においては、後述のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするＤＮＡ又はベクターが導入された宿主細胞を培養し、該宿主細胞及び／又はその培養物において生成されたオレフィン化合物を採取する工程を含む、オレフィン化合物の製造方法も提供される。
【００４０】
宿主細胞の培養条件については、後述の通りであるが、培地には、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの基質である前記（１）式にて表される化合物、補因子であるマグネシウムイオンが添加されていることが好ましく、これら化合物全てが添加されていることがより好ましい。また、培養温度は、用いる宿主細胞の種類に合わせて適宜設計変更し得るが、通常２０〜４０℃であり、好ましくは２５〜３７℃である。
【００４１】
また、本発明において、「培養物」とは、宿主細胞を培地で培養することによって得られる、増殖した宿主細胞、該宿主細胞の分泌産物及び該宿主細胞の代謝産物等を含有する培地のことであり、それらの希釈物、濃縮物を含む。
【００４２】
このような宿主細胞及び／又は培養物からのオレフィン化合物の採取についても、特に制限はなく、上述の公知の回収、精製方法を用いて行うことができる。また、採取の時期としては、用いる宿主細胞の種類に合わせて適宜調整され、オレフィン化合物が生成し得る時間であればよいが、通常３０分〜７日であり、好ましくは１２時間〜２日である。
【００４３】
＜ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体＞
次に、上述の本発明のオレフィン化合物の製造方法において用いられる、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体について説明する。本発明において「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」とは、ＭＶＤ（Ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）とも称され、またＥＣ番号：４．１．１．３３として登録されている酵素であり、５−ジホスホメバロン酸及びＡＴＰからイソペンテニル二リン酸、ＡＤＰ、リン酸及び二酸化炭素を生成する、下記反応を触媒とするカルボキシリアーゼの一種である。
【００４４】
【化８】
2017022804.tif 000009
【００４５】
本発明において、後述の変異が導入されるジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとしては、特に制限はなく、様々な生物由来のものを用いることができる。このような酵素としては、例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＭＶＤ（配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）、出芽酵母（ＹＪＭ７株）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ａ６ＺＳＢ７にて特定されるタンパク質）、出芽酵母（ＲＭ１１−１ａ株）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｂ３ＬＰＫ０にて特定されるタンパク質）、カンジダ酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｂ９Ｗ６Ｇ７にて特定されるタンパク質）、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｃ４ＱＸ６３にて特定されるタンパク質）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｏ１３９３６３にて特定されるタンパク質）、アシュビア（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ７５１Ｄ８にて特定されるタンパク質）、デバリオマイセス  ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＢＹ０７にて特定されるタンパク質）、キイロタマホコリカビ（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ５４ＹＱ９にて特定されるタンパク質）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ２ＵＧＦ４にて特定されるタンパク質）、エンセファリトゾーン・クニクリ（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ  ｃｕｎｉｃｕｌｉ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ８ＳＲＲ７にて特定されるタンパク質）、フェオダクチラム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｂ７Ｓ４２２にて特定されるタンパク質）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ａ９ＺＮ０３にて特定されるタンパク質）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｌａｎｇｓｄｏｒｆｆｉｉ  ｘ  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｓａｎｄｅｒａｅ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｂ３Ｆ８Ｈ５にて特定されるタンパク質）、ムラサキ（Ａｒｎｅｂｉａ  ｅｕｃｈｒｏｍａ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ０９ＲＬ４にて特定されるタンパク質）、ジャポニカ米（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｓｕｂｓｐ．ｊａｐｏｎｉｃａ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６ＥＴＳ８にて特定されるタンパク質）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ８ＬＢ３７にて特定されるタンパク質）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ａ８ＷＢＸ７にて特定されるタンパク質）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ａ５Ａ７Ａ２にて特定されるタンパク質）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ５Ｕ４０３にて特定されるタンパク質）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９９ＪＦ５又はＱ３ＵＹＣ１にて特定されるタンパク質）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ６２９６７にて特定されるタンパク質）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｑ０Ｐ５７０にて特定されるタンパク質）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＭＶＤ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ５３６０２にて特定されるタンパク質）が挙げられる。これらの中では、出芽酵母由来のＭＶＤが好ましく、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質がより好ましい。また、自然界においてヌクレオチド配列が変異することにより、タンパク質のアミノ酸配列の変化が生じ得ることは理解されたい。
【００４６】
さらに、本発明の「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位のスレオニン以外に、人工的に変異が導入されているものであってもよい。すなわち、本発明の「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」には、「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列（配列番号：２に記載のアミノ酸配列等）の２０９位以外において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質」も含まれる。ここで「複数」とは、特に制限はないが、通常１〜８０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個（例えば、１〜８個、１〜４個、１〜２個）である。
【００４７】
また、本発明の「ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニン以外に、変異が導入される部位としては、オレフィン化合物を生成する触媒活性を有する限り特に制限はないが、後述の実施例に示す通り、当該活性がより高くなる傾向にあるという観点から、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニン（以下、単に「７４位のアルギニン」とも称する）であることが好ましい。
【００４８】
本発明において、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが変異してなる「他のアミノ酸」とは、特に制限はないが、後述の実施例に示す通り、オレフィン化合物の生成において高い触媒活性を発揮し易いという観点から、好ましくは、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、アラニン、セリン又はヒスチジンである。
【００４９】
また、後述の実施例に示す通り、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、変異が導入される部位が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンのみである場合には、野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼよりも、５−ジホスホメバロン酸に対する基質特異性が低く、かつオレフィン化合物を生成する触媒活性を有するという観点から、好ましくはヒスチジン、セリン、アルギニンであり、更に、野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼよりもオレフィン化合物を生成する触媒活性が高いという観点から、より好ましくはヒスチジンである。
【００５０】
また、後述の実施例に示す通り、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、変異が導入される部位が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンに加え、少なくとも配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位又は該部位に対応するアルギニンである場合には、オレフィン化合物の生成においてより高い触媒活性を有し易いという観点から、２０９位のスレオニンが変異してなる他のアミノ酸は、好ましくは、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン又はアラニンであり、より好ましくはアルギニンである。さらに、かかる場合、７４位のアルギニンが変異してなる他のアミノ酸は、好ましくは、メチオニン、ヒスチジン、グルタミン又はリシンであり、より好ましくは、メチオニン又はヒスチジンである。
【００５１】
なお、本発明において、「対応する部位」とは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列解析ソフトウェア（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ等）やＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を利用し、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と、他品種に由来するＭＶＤ等のアミノ酸配列とを整列させた際に、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における７４位又は２０９位と同列になる部位のことである。
【００５２】
また「野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位のスレオニンにおける変異、さらには前述の人工的な変異が導入される前のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼであり、例えば、前記出芽酵母等の様々な生物由来のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ及びその天然の変異体が挙げられる。
【００５３】
さらに、野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼよりも「５−ジホスホメバロン酸に対する基質特異性」が低いかどうかは、例えば、後述の実施例に示す通り、５−ジホスホメバロン酸を基質とするイソペンテニル二リン酸の合成において生じる遊離リン酸量を、比色検出試薬（製品名：Ｂｉｏｍｏｌ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ試薬、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて測定し、その量を野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとそのアミノ酸変異体とで比較することで判定することができる。なお、５−ジホスホメバロン酸に対する基質特異性に関し、例えば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体において生じる遊離リン酸量が、野生型のそれの７０％以下であることが好ましく、５０％以下であることがより好ましく、３０％以下であることがさらに好ましく、１０％以下であることがより好ましく、１％以下であることが特に好ましい。
【００５４】
また、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体が、オレフィン化合物を生成する触媒活性を有するか否かは、例えば、後述の実施例に示す通り、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）にて、直接オレフィン化合物の量を測定することにより判定することができ、さらに野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおける量と比較することで、野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼよりもオレフィン化合物を生成する触媒活性が高いか否かも判定することができる。
【００５５】
本発明において、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体は、オレフィン化合物を生成する触媒活性において、野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼに対し、２倍以上（例えば、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上）であることが好ましく、１０倍以上（例えば、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上）であることがより好ましく、６０倍以上であることがさらに好ましく、７０倍以上であることがよりに好ましく、８０倍以上（例えば、９０倍以上、１００倍以上）であることが特に好ましい。
【００５６】
本発明において、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体は、後述の実施例に示すＧＣ−ＭＳ分析の結果、当該酵素１ｍｇあたり、３７℃、１２時間のインキュベーションにて、０．５ｍｇ／Ｌ以上のイソプレンを生産し得る触媒活性を有していることが好ましく、５ｍｇ／Ｌ以上のイソプレンを生産し得る触媒活性を有していることがより好ましく、１０ｍｇ／Ｌ以上のイソプレンを生産し得る触媒活性を有していることがさらに好ましく、５０ｍｇ／Ｌ以上のイソプレンを生産し得る触媒活性を有していることがより好ましい。
【００５７】
なお、本発明においては上述の通り、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体は野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼよりもオレフィン化合物を生成する触媒活性が高いことが好ましい。しかしながら、当該活性が野生型よりも低くとも、後述の実施例において示す通り、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体は、オレフィン化合物の生合成において、元来の基質である５−ジホスホメバロン酸に対する活性が低下しているため、結果としてオレフィン化合物の製造量は、野生型のそれよりも多くなり得る。
【００５８】
さらに、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体は、他の化合物が直接又は間接的に付加されていてもよい。かかる付加としては特に制限はなく、遺伝子レベルでの付加であってもよく、化学的な付加であってもよい。また付加される部位についても特に制限はなく、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体のアミノ末端（以下「Ｎ末端」とも称する）及びカルボキシル末端（以下「Ｃ末端」とも称する）のいずれかであってもよく、その両方であってもよい。遺伝子レベルでの付加は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするＤＮＡに、他のタンパク質をコードするＤＮＡを読み枠を合わせて付加させたものを用いることにより達成される。このようにして付加される「他のタンパク質」としては特に制限はなく、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の精製を容易にする目的の場合には、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−）タグ（ｔａｇ）タンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の精製用タグタンパク質が好適に用いられ、またジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の検出を容易にする目的の場合には、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化学発光タンパク質等の検出用タグタンパク質が好適に用いられる。化学的な付加は、共有結合であってもよく、非共有結合であってもよい。「共有結合」としては特に制限はなく、例えば、アミノ基とカルボキシル基とのアミド結合、アミノ基とアルキルハライド基とのアルキルアミン結合、チオールどうし間のジスルフィド結合、チオール基とマレイミド基又はアルキルハライド基とのチオエーテル結合が挙げられる。「非共有結合」としては、例えば、ビオチン−アビジン間結合が挙げられる。また、このようにして化学的に付加される「他の化合物」としては、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の検出を容易にする目的の場合には、例えば、Ｃｙ３、ローダミン等の蛍光色素が好適に用いられる。
【００５９】
また、本発明のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体は、他の成分と混合して用いてもよい。他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、保存剤が挙げられる。
【００６０】
＜ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異体をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡを有するベクター＞
次に、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするＤＮＡ等について説明する。後述の実施例において示す通り、かかるＤＮＡを導入することによって、宿主細胞の形質を転換し、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を当該細胞において製造させること、ひいてはオレフィン化合物を製造させることが可能となる。
【００６１】
本発明のＤＮＡは、天然のＤＮＡに人為的に変異が導入されたＤＮＡであってもよく、人工的に設計されたヌクレオチド配列からなるＤＮＡであってもよい。さらに、その形態について特に制限はなく、ｃＤＮＡの他、ゲノムＤＮＡ、及び化学合成ＤＮＡが含まれる。これらＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、出芽酵母等からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作製し、これを展開して、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（例えば、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、出芽酵母から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
【００６２】
そして、このように調製したＤＮＡに、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位のスレオニンを他のアミノ酸に置換する変異を導入することは、当業者であれば、公知の部異特異的変異導入法を利用することで行うことができる。部異特異的変異導入法としては、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９８５年、８２巻、２号、４８８〜４９２ページ）、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ−ｂｙ−ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．、Ｇｅｎｅ、１９８９年、７７巻、５１〜５９ページ）が挙げられる。
【００６３】
また、当業者であれば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの２０９位のスレオニンを他のアミノ酸に置換してあるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を人工的に設計し、該配列情報に基づき、自動核酸合成機を用いて、本発明のＤＮＡを化学的に合成することもできる。
【００６４】
無論、これらの方法によれば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、２０９位のスレオニン以外（例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列の７４位）のアルギニンも、人工的に他のアミノ酸に置換することができる。
【００６５】
さらに、本発明のＤＮＡは、コードするジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の発現効率を後述の宿主細胞においてより向上させるという観点から、当該宿主細胞の種類に合わせて、コドンを最適化したジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするＤＮＡの態様もとり得る。
【００６６】
また、本発明においては、前述のＤＮＡを宿主細胞内において複製することができるよう、当該ＤＮＡが挿入されているベクターも提供される。
【００６７】
本発明において「ベクター」は、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、その宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
【００６８】
このようなベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージＤＮＡが挙げられる。また、プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）が挙げられる。ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、宿主細胞が昆虫由来であれば、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを、植物由来であればＴ−ＤＮＡ等、動物由来であればレトロウイルス、アデノウイルスベクター等の動物ウイルスベクターも、本発明のベクターとして用いることもできる。また、本発明のベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。例えば、本発明のＤＮＡをベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。
【００６９】
また、本発明のベクターは、前記ＤＮＡがコードするジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を宿主細胞内にて発現可能な状態で含んでなる発現ベクターの形態であってもよい。本発明にかかる「発現ベクター」は、これを宿主細胞に導入してジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を発現させるために、前記ＤＮＡの他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換された宿主細胞を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいるのが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）及びターミネーター等がこれに含まれる。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主細胞と同種若しくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、前記発現を制御するＤＮＡ配列以外に発現を誘導するＤＮＡ配列を含んでいても良い。かかる発現を誘導するＤＮＡ配列としては、宿主細胞が細菌である場合には、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。本発明における遺伝子マーカーは、形質転換された宿主細胞の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００７０】
また、本発明のＤＮＡ又はベクターは、他の成分と混合して用いてもよい。他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、保存剤が挙げられる。
【００７１】
＜オレフィン化合物の生成を促進するための剤＞
上述の通り、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体、該変異体をコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを用いることにより、下記式（１）で表される化合物とＡＴＰとを反応させ、オレフィン化合物の生成を促進することが可能となる。したがって、本発明は、少なくとも配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンが他のアミノ酸に変異しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、該ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡが挿入されているベクターを含む、下記式（１）で表される化合物とＡＴＰとを反応させ、オレフィン化合物の生成を促進するための剤も提供する。
【００７２】
【化９】
2017022804.tif 000010
【００７３】
［式（１）中、Ｒ１及びＲ２は、各々独立に、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１５のアルケニル基、炭素数６〜２０のアリール基又はハロゲン原子を示す（前記アルキル基及びアルケニル基は、各々独立に、ヒドロキシ基及び／又はカルボキシ基によって任意に置換されていてもよい）］。
【００７４】
このような剤としては、上述のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体等を含むものであれば良いが、他の成分と混合していても用いてもよい。かかる他の成分としては特に制限はなく、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、ＤＮａｓｅ阻害剤、保存剤が挙げられる。
【００７５】
また、本発明は、このような剤を含むキットをも提供することができる。本発明のキットにおいて、上記剤は、本発明のＤＮＡ等が導入され、形質転換された、後述の宿主細胞の態様にて含まれていてもよい。さらに、このような剤の他、前記式（１）で表される化合物、本発明のＤＮＡ等を導入するための宿主細胞、該宿主細胞を培養するための培地、及びそれらの使用説明書等が、本発明のキットに含まれていてもよい。また、このような使用説明書は、本発明の剤等を上述のオレフィン化合物の製造方法に利用するための説明書である。説明書は、例えば、本発明の製造方法の実験手法や実験条件、及び本発明の剤等に関する情報（例えば、ベクターのヌクレオチド配列等が示されているベクターマップ等の情報、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の配列情報、宿主細胞の由来、性質、当該宿主細胞の培養条件等の情報）を含むことができる。
【００７６】
＜ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするＤＮＡ等が導入された宿主細胞＞
次に、本発明のＤＮＡ又はベクターが導入された宿主細胞について説明する。後述の実施例に示す通り、前述のＤＮＡ又はベクターの導入によって形質転換された宿主細胞を用いれば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を製造することが可能となり、ひいてはオレフィン化合物を製造させることも可能となる。
【００７７】
本発明のＤＮＡ又はベクターが導入される宿主細胞は特に限定されず、例えば、微生物（大腸菌、出芽酵母、分裂酵母、枯草菌、放線菌、糸状菌等）、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞が挙げられるが、比較的安価な培地にて、短時間にて高い増殖性を示し、ひいては生産性高いオレフィン化合物の製造に寄与し得るという観点から、微生物を宿主細胞として利用することが好ましく、大腸菌を利用することがより好ましい。
【００７８】
また、本発明のＤＮＡ又はベクターの導入も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。例えば、大腸菌等の微生物への導入方法としては、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法が挙げられ、植物細胞への導入方法としては、アグロバクテリウムを用いる方法やパーティクルガン法が挙げられ、昆虫細胞への導入方法としては、バキュロウィルスを用いる方法やエレクトロポレーション法が挙げられ、動物細胞への導入方法としては、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法が挙げられる。
【００７９】
このようにして宿主細胞内に導入されたＤＮＡ等は、宿主細胞内において、そのゲノムＤＮＡにランダムに挿入されることによって保持されてもよく、相同組み換えによって保持されてもよく、またベクターであれば、そのゲノムＤＮＡ外の独立体として複製され保持し得る。
【００８０】
＜ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の製造方法＞
後述の実施例に示す通り、本発明のＤＮＡ等が導入された宿主細胞を培養することにより、該宿主細胞内にてジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を製造することができる。したがって、本発明は、前述の宿主細胞を培養し、該宿主細胞に発現したタンパク質を採取する工程を含む、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の製造方法をも提供することができる。
【００８１】
本発明において、「宿主細胞を培養する」条件は、前記宿主細胞がジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を製造できる条件であればよく、当業者であれば、宿主細胞の種類、用いる培地等に合わせて、温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のｐＨ、培養温度、培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができる。
【００８２】
かかる培地としては、宿主細胞が資化し得るものが含有されていればよく、炭素源、窒素源、硫黄源、無機塩類、金属、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、カゼイン加水分解物、血清等が含有物として挙げられる。また、かかる培地には、例えば、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体をコードするＤＮＡの発現を誘導するためのＩＰＴＧや、本発明にかかるベクターがコードし得る薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（例えば、アンピシリン）や、本発明にかかるベクターがコードし得る栄養要求性を相補する遺伝子に対応する栄養物（例えば、アルギニン、ヒスチジン）を添加してもよい。
【００８３】
そして、このようにして培養した宿主細胞から、「該細胞に発現したタンパク質を採取する」方法としては、例えば、宿主細胞を濾過、遠心分離等により培地から回収し、回収した宿主細胞を、細胞溶解、磨砕処理又は加圧破砕等によって処理し、さらに、限外濾過処理、塩析、硫安沈殿等の溶媒沈殿、クロマトグラフィー（例えば、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）等によって、宿主細胞において発現したタンパク質を精製、濃縮する方法が挙げられる。また、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体に、前述の精製タグタンパク質が付加されている場合には、該タグタンパク質が吸着する基質を用いて精製し、採取することもできる。さらに、これらの精製、濃縮方法は単独にて行ってもよく、また適宜組み合わせて多段階的に実施し得る。
【００８４】
また、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体は、上記生物学的合成に限定されることなく、本発明のＤＮＡ等及び無細胞タンパク質合成系を用いても製造することができる。かかる無細胞タンパク質合成系としては特に制限はないが、例えば、コムギ胚芽由来、大腸菌由来、ウサギ網状赤血球由来、昆虫細胞由来の合成系が挙げられる。さらに、当業者であれば、市販のペプチド合成機等を用い、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を化学的に合成することもできる。
【００８５】
また、本発明は、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、少なくとも配列番号：２に記載のアミノ酸配列の２０９位又は該部位に対応するスレオニンを他のアミノ酸に変異させる工程を含む、オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの製造方法をも提供することができる。
【００８６】
「オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ」とは、２０９位のスレオニン等に変異が導入されることにより、その導入前と比較してオレフィン化合物を生成する触媒活性が高いジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼを意味し、その比較対象は通常、上記出芽酵母等の様々な生物由来のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ及びその天然の変異体である。
【００８７】
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおける「他のアミノ酸の変異」導入は、コードするＤＮＡの改変によって行うことができる。「ＤＮＡの改変」は、このようなＤＮＡの改変は、上記の通り、当業者においては公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発法、改変された配列情報に基づくＤＮＡの化学的合成法を用いて、適宜実施することが可能である。また、「他のアミノ酸の変異」導入は、上記の通り、ペプチドの化学的合成法を用いても行うことができる。
【００８８】
また、このような変異導入によって、オレフィン化合物を生成する触媒活性が高められたかどうかは、上記の通り、ＧＣ−ＭＳ分析等により評価することができる。
【実施例】
【００８９】
＜ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の作製及び評価１＞
本発明者らは、オレフィン化合物を高い生産性にて製造することを可能とすべく、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（以下「ＭＶＤ」とも称する）のアミノ酸に変異を導入し、当該酵素（ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体）の基質特異性を、元来の５−ジホスホメバロン酸から３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテート等に対するものに変更することで、下記式に示すような反応を経て、イソプレン等を製造することを着想した。【００９０】
【化１０】
2017022804.tif 000011
【００９１】
そこで、本発明者らは、以下に示す方法等にて、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの様々な部位に、アミノ酸置換を伴う変異を導入し、多数のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異体を調製した。そして、それら変異体について、５−ジホスホメバロン酸を基質とするイソペンテニル二リン酸の生成に関する触媒活性と、３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの生成に関する触媒活性とを評価した。【００９２】
＜プラスミドベクターの調製＞
先ず、出芽酵母由来のＭＶＤ（ｓｃＭＶＤ、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）を大腸菌にて効率良く発現させるために、それをコードする野生型ヌクレオチド配列（配列番号：１に記載のヌクレオチド配列）を、大腸菌におけるコドンの使用頻度を考慮して改変した。次いで、かかる改変ヌクレオチド配列（配列番号：３に記載のヌクレオチド配列）からなるＤＮＡを常法に沿って化学合成した。そして、このようにして調製したＤＮＡを、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のマルチクローニングサイト（ＮｄｅＩ認識サイトとＢａｍＨＩ認識サイトとの間）に挿入することにより、当該野生型のｓｃＭＶＤを、ポリヒスチジンタグをそのＮ末端に融合させた形態にて、大腸菌において発現可能なプラスミドベクター（ｓｃＭＶＤベクター）を調製した。【００９３】
次に、下記表１に示す通り、各部位におけるアミノ酸置換を伴う変異をｓｃＭＶＤに導入すべく、各変異が導入されたアミノ酸配列をコードするプライマーを設計し、合成した。【００９４】
【表１】
2017022804.tif 000012
【００９５】
そして、前記ｓｃＭＶＤベクターを鋳型として、このようなプライマーと部位特異的突然変異誘発キット（製品名：ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）とを用い、そのキット添付のプロトコルに従って、各変異が導入されたｓｃＭＶＤを、ポリヒスチジンタグをそのＮ末端に融合させた形態にて、大腸菌において発現可能なプラスミドベクターを調製した。【００９６】
＜酵素溶液の調製＞
前記の通り調製したプラスミドベクターを各々、大腸菌（ＢＬ２１）に、ヒートショック法により導入し、野生型のｓｃＭＶＤ又は各ｓｃＭＶＤ変異体を発現する形質転換体を調製した。次いで、これら形質転換体を各々、０．４ｍＭのＩＰＴＧとアンピシリンとを添加したＬＢ培地にて一晩培養した。当該培養後の形質転換体を遠心分離により集菌し、ＤＮａｓｅIを添加したタンパク質抽出試薬（製品名：Ｂ−ＰＥＲ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を加え、溶菌した。このようにして得られた各溶菌液に遠心分離を施し、得られた各上清をポリヒスチジン精製用カラム（製品名：ＴＡＬＯＮ（登録商標）カラム、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に添加した。次いで、各カラムに溶出液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭ  イミダゾール）を添加し、各ポリヒスチジンタグが融合しているｓｃＭＶＤを溶出させた。そして、各溶出液を緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）にて透析した後、限外ろ過スピンカラム（製品名：アミコンウルトラ、ミリポア社製）によって濃縮し、酵素溶液を調製した。また、このようにして調製した溶液中の酵素（ポリヒスチジンタグが融合している、ｓｃＭＶＤ又はその変異体）の濃度を、タンパク質定量キット（製品名：ＢＣＡアッセイキット、ＴａＫａＲａ社製）を用い、添付のプロトコールに沿って測定した。【００９７】
＜酵素活性の測定１＞
５−ジホスホメバロン酸を基質とするイソペンテニル二リン酸の合成における、各酵素活性を以下のようにして測定した。【００９８】
先ず、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１００ｍＭ  ＫＣｌ）に、２５μＭ  （Ｒ）−メバロン酸５−ピロリン酸  四リチウム塩（シグマ社製）と、２５μＭ  ＡＴＰとを添加し、酵素反応液を調製した。【００９９】
そして、この反応液を３７℃に保温した上で、その１００μＬに対し、前記にて調製した各酵素溶液（酵素含有量：５０〜１００ｎｇ）を添加し、酵素反応を開始した。次いで、当該反応を開始してから３分後に、酵素反応液中の遊離リン酸量を測定し、各酵素活性を算出した。なお、遊離リン酸量の測定は、酵素反応液に等量の比色検出試薬（製品名：Ｂｉｏｍｏｌ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ試薬、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を添加し、室温にて２０分間反応させた後  波長６２０ｎｍにおける吸光度の測定を介して行った。また、このようにして測定した遊離リン酸量（単位：μｍｏｌ）に基づき、各酵素１ｍｇあたり、１分間に生成される反応産物量を、各酵素の活性として算出した。得られた結果の一部を図１の縦軸に示す。【０１００】
＜酵素活性の測定２＞
３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの合成における、各酵素活性を以下のようにして測定した。【０１０１】
先ず、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ）に、０．５ｍＭ  ３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテート（カタログ番号：ＥＮ３００−１８１９３８、３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔ−４−ｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ、Ｅｎａｍｉｎｅ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋｓ社製）と、５ｍＭ  ＡＴＰとを添加した。【０１０２】
なお、本実施例において行ってはいないが、イソプレンの合成において生じるＡＤＰを、ＮＡＤＨの酸化を介して、酵素活性として検出することも可能にすべく、０．４ｍＭ  ＮＡＤＨ、１ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸、３Ｕ／ｍｌ  乳酸脱水素酵素及び１．５Ｕ／ｍｌ  ピルビン酸キナーゼをも添加し、酵素反応液を調製した。すなわち、当該酵素反応液によれば、先ず、イソプレン合成において生じたＡＤＰとホスホエノールピルビン酸とを基質とし、ピルビン酸キナーゼによって、ピルビン酸とＡＴＰとが生成される。さらに、生じたピルビン酸とＮＡＤＨとを基質とし、乳酸脱水素酵素によって、乳酸とＮＡＤ＋が生成される。そのため、波長３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨに由来する吸光度の減少を測定することにより、酵素活性を検出することも可能となる。【０１０３】
そして、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）用の１０ｍｌバイアルに、この反応液２．５ｍｌと、１０ｍｇの前記酵素とを添加し、その直後にバイアルのキャップを閉め、酵素反応を開始した。当該酵素反応は３７℃にて行い、反応を開始してから数日後（約２日後）にバイアルのヘッドスペース中に生成されたイソプレン量を、ＧＣ−ＭＳ（製品名：ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０  Ｕｌｔｒａ、島津製作所社製）によって測定した。得られた測定値に基づき、各酵素１ｍｇあたり生成される反応産物量（単位：μｇ／Ｌ）を、各酵素の活性として算出した。得られた結果の一部を図１の横軸に示す。【０１０４】
＜大腸菌培養液中のイソプレン量の測定＞
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの２０９位のスレオニンがアルギニンに置換された酵素（以下「Ｔ２０９Ｒ」とも称する）を発現する形質転換体に関しては、アンピシリンを添加したＬＢ培地、３７℃にて培養した。次いで、波長６００ｎｍにおけるＯＤが０．４〜０．６に達した培養液２．５ｍｌを、ＧＣ−ＭＳ用の１０ｍｌバイアルに移し、ＩＰＴＧをその最終濃度が０．４ｍＭになるよう、さらに３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートをその最終濃度が０．５ｍＭになるように添加してキャップを閉め、２５℃にて培養した。その培養を開始してから反応を開始してから数日後（約２日後）に、バイアルのヘッドスペース中のイソプレン量をＧＣ−ＭＳによって直接測定した。得られた結果を図２に示す。【０１０５】
図１に示した結果から明らかなように、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、変異が導入されることにより、５−ジホスホメバロン酸に対する基質特異性が、野生型のそれと比較し、概して低下することが明らかになった。さらに、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの２０９位のスレオニンが他のアミノ酸（セリン、アルギニン、ヒスチジン等）に置換された酵素（ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体）は、イソプレンの生成に関する触媒活性を有していることが認められた。【０１０６】
また図１に示す通り、Ｔ２０９Ｒは、イソプレンの生成に関する触媒活性自体は野生型のそれよりも低い。しかしながら、図２に示す通り、図１において示される５−ジホスホメバロン酸に対する基質特異性の低さを反映してか、Ｔ２０９Ｒを発現する大腸菌から産生されるイソプレンの量は、野生型のそれよりも多かった。【０１０７】
すなわち、このような結果となった理由は必ずしも定かではないが、野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼに関しては、基質間（５−ジホスホメバロン酸と３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートとの間）で当該酵素の取り込まれにおいて拮抗が生じたのに対し、Ｔ２０９Ｒでは、５−ジホスホメバロン酸の取り込みが低下しているため、かかる拮抗が抑えられ、当該酵素に３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートの方が基質としてより多く取り込まれたことが想定される。そして、その結果、Ｔ２０９Ｒのイソプレンの生成に関する触媒活性自体は野生型のそれよりも低いにも関わらず、大腸菌が生産するイソプレンの量としては、野生型よりも多くなったと推察されえる。【０１０８】
＜ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の作製及び評価２＞
上記＜プラスミドベクターの調製＞及び＜酵素溶液の調製＞に記載の方法にて、下記表２及び３に示す、更なるジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を調製し、上記＜酵素活性の測定１＞に記載の方法にて解析した。得られた結果の一部を図３Ａ及びＢの縦軸に示す。【０１０９】
【表２】
2017022804.tif 000013
【０１１０】
【表３】
2017022804.tif 000014
【０１１１】
なお、表中の記載に関し、例えば、「Ｒ７４ＨＩ１４５ＦＴ２０９Ｈ」は、ｓｃＭＶＤの７４位のアルギニンをヒスチジンに置換し、１４５位のイソロイシンをフェニルアラニンに置換し、２０９位のスレオニンをヒスチジンに置換したジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異体であることを示す。また、例えば、「ｄＲ２３−Ｌ２７」は、ｓｃＭＶＤにおいて２３位のアルギニンから２７位のロイシンが欠失しているジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼの変異体であることを示す。【０１１２】
また、表２及び３に示す、更なるジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体については、３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質とするイソプレンの合成における酵素活性を、以下の方法を用いて測定した。【０１１３】
＜酵素活性の測定３＞
先ず、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ）に、０．５ｍＭ  ３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートと、５ｍＭ  ＡＴＰとを添加した。【０１１４】
そして、ＧＣ−ＭＳ用の１０ｍｌバイアルに、この反応液２．５ｍｌと、０．５ｍｇの前記酵素とを添加し、その直後にバイアルのキャップを閉め、酵素反応を開始した。当該酵素反応は３７℃にて行い、反応を開始してから一晩（１２時間）後にバイアルのヘッドスペース中に生成されたイソプレン量を、サンプル平衡化のために５０℃にて３０分間加熱した後、ＧＣ−ＭＳによって測定した。得られた測定値に基づき、各酵素反応液１Ｌあたり生成される反応産物量（単位：μｇ／Ｌ）を、各酵素の活性として算出した。得られた結果の一部を図３Ａ及びＢの横軸、並びに図４Ａ及びＢに示す。【０１１５】
さらに、表２及び３に示す、更なるジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を産生する形質転換体の一部については、上記＜大腸菌培養液中のイソプレン量の測定＞に記載の方法も用い解析した。得られた結果を図５に示す。【０１１６】
また、ｓｃＭＶＤと、その７４位のアルギニンをヒスチジンに置換し、さらに２０９位のスレオニンをアルギニンに置換したジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体（以下、「Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒ」）とについて、イソプレンの合成量の経時変化を、以下に記載の方法にて測定した。【０１１７】
＜酵素活性の測定４＞
酵素反応及びＧＣ−ＭＳによる測定は、上記＜酵素活性の測定３＞同様に行ったが、イソプレンの合成量の経時変化を測定するために、各測定時点において酵素反応液が入ったバイアル瓶ごと液体窒素につけ凍結させることで酵素反応を中断させた。そして、上記同様にサンプル平衡化処理を施した後に、バイアルのヘッドスペース中に生成されたイソプレン量を測定した。得られた結果を図６Ａ及びＢに示す。【０１１８】
なお、図中において、ｓｃＭＶＤ（図中においては「ｗｔ」）及びＲ７４ＨＴ２０９Ｒのいずれにおいても、測定開始時点からイソプレンが検出されているが、これは前記の通り、サンプル平衡化処理（５０℃にて３０分間）によって、酵素反応が進んでしまったことによる。【０１１９】
図３Ａ及びＢの横軸に示した結果から明らかなように、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼは、変異が導入されることにより、５−ジホスホメバロン酸に対する基質特異性が、野生型のそれと比較し、概して低下することが明らかになった。【０１２０】
一方、３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを基質として得られるイソプレンの合成量は、作製した変異体の殆どにおいて１４００μｇ／Ｌ以下であったのに対し、７４位のアルギニンがヒスチジンに置換され、かつ２０９位のスレオニンがアルギニンに置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体（Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒ）が、唯一群を抜いてイソプレンの生成に関する極めて高い触媒活性（イソプレンの合成量：約２００００μｇ／Ｌ）を有していることが明らかになった。【０１２１】
さらに、図４Ｂに示す通り、さらに１４５位のイソロイシンをフェニルアラニンに置換したジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体（Ｒ７４ＨＩ１４５ＦＴ２０９Ｒ）は、当該置換がされていないもの（Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒ）よりも、イソプレンの合成量において劣るものの、７４位のアルギニンがヒスチジンに置換され、かつ２０９位のスレオニンがアルギニンに置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体はいずれも、他の多数の変異体に比べイソプレンの生成に関する極めて高い触媒活性を有していることも明らかになった。【０１２２】
また、図５に示す通り、上述のイソプレンの生成に関する極めて高い触媒活性を反映し、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒを発現する大腸菌から産生されるイソプレンの量は、他のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を発現する大腸菌から産生されるそれよりも顕著に多いものであった。【０１２３】
さらに、図６Ａ及びＢに示す通り、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒと野生型のジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼとにおいて、産生されるイソプレン量の経時変化を測定した結果、上述のイソプレンの生成に関する極めて高い触媒活性を反映し、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒによって産生されるイソプレンと野生型のそれとの量差は時間を経るごとに一層顕著になっていった。また、反応開始から２４時間目に関しては、８回測定して比較した結果、いずれの測定回においてもＲ７４ＨＴ２０９Ｒによって産生されるイソプレン量は野生型のそれの６０〜８０倍であり、上記同様、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒは、イソプレンの生成に関する極めて高い触媒活性を有していることが確認された。【０１２４】
また、特許文献３（国際公開第２０１５／０２１０４５号）において、イソプレンの製造を可能とする酵素として、Ｍ３Ｋ（ＥＣ２．７．１．１５８）が開示されている。そこで、イソプレンへの変換率（イソプレン生産量／（基質量・酵素量））に関して比較したところ、Ｒ７４ＨＴ２０９ＲのそれはＭ３Ｋの１．２×１０３倍であり、公知の酵素と比較してもイソプレンの生成に関する極めて高い触媒活性を有していることが明らかになった。【０１２５】
なお、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒによって産生されるイソプレン量は、上述の通り、野生型のそれの約７０倍（６０〜８０倍）である。また、このイソプレン量を得るのに供したＲ７４ＨＴ２０９Ｒの量は４．５μＭであり、基質量は０．５ｍＭであった。一方、特許文献３の図１４等によれば、Ｍ３Ｋによって産生されるイソプレン量は野生型のそれの約５０倍となっている。また、このイソプレン量を得るのに供したＭ３Ｋの量は２００μＭであり、基質量は１０ｍＭとなっている。そこで、これら数値に基づき、上記の通り、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒのイソプレンへの変換率は、Ｍ３Ｋのそれの１．２×１０３倍であると評価した。【０１２６】
＜酵素活性の測定５＞
次に、本発明者らは、イソプレン生成において極めて高い触媒活性を示した上述のＲ７４ＨＴ２０９Ｒに関し、他のオレフィン化合物の生成でも利用できることを確認した。すなわち、β−ヒドロキシイソ吉草酸を基質とするイソブテンの合成（下記式に示す反応）における、各酵素活性を以下のようにして評価した。【０１２７】
【化１１】
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【０１２８】
先ず、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ）に、０．５ｍＭ  β−ヒドロキシイソ吉草酸（東京化成工業株式会社製、製品コード：Ｈ０７０１、β−Ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ  Ａｃｉｄ）と、５ｍＭ  ＡＴＰとを添加した。【０１２９】
そして、ＧＣ−ＭＳ用の１０ｍｌバイアルに、この反応液２．５ｍｌと、１０ｍｇの前記酵素とを添加し、その直後にバイアルのキャップを閉め、酵素反応を開始した。当該酵素反応は３７℃にて行い、反応を開始してから数日後（約２日後）にバイアルのヘッドスペース中に生成されたイソブテン量を、サンプル平衡化のために５０℃にて３０分間加熱した後、ＧＣ−ＭＳ（製品名：ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０  Ｕｌｔｒａ、島津製作所社製）によって測定した。次いで、得られたイソブテンに由来するピークの面積値を算出した。なお、対照としてＲ７４ＨＴ２０９Ｒの代わりにｓｃＭＶＤを用いて前記同様に面積値を算出した。また、陰性対照として酵素の代わりに超純水（ｍｉｌｌｉＱ水）を用いて前記同様に面積値を算出した。得られた結果を表４に示す。【０１３０】
さらに、β−ヒドロキシイソ吉草酸の代わりに、３−ヒドロキシ−３−メチルペント−４−エノテートを用い、イソプレンの合成における各酵素活性も、前記イソブテン同様に評価した。得られた結果を表４に示す。【０１３１】
【表４】
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【０１３２】
表４に示した結果から明らかなように、上記イソプレン生成同様に、イソブテンのそれにおいてもＲ７４ＨＴ２０９Ｒは高い触媒活性を示すことが確認された。【０１３３】
＜ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体の作製及び評価３＞
上記＜プラスミドベクターの調製＞及び＜酵素溶液の調製＞に記載の方法にて、下記表５に示す、更なるジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体を調製し、上記＜酵素活性の測定３＞に記載の方法にて解析した。得られた結果も表５に示す。なお、表５においては、各ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体によるイソプレン生成量を、野生型によるそれに対する相対的な比率を示す。また表中「―」は変異を導入していない（２０９位がスレオニンのままである）ことを示す。【０１３４】
【表５】
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【０１３５】
表５に示した結果から明らかなように、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼにおいて、７４位及び２０９位は、各々アルギニン及びスレオニンに限らず、他のアミノ酸に置換しても、イソプレン生成における触媒反応において、野生型のそれよりも概して高い触媒活性を示すことが確認された。【０１３６】
さらに、７４位のアルギニンがメチオニンに置換され、かつ２０９位のスレオニンがアルギニンに置換されたジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体（Ｒ７４ＭＴ２０９Ｒ）を上記＜プラスミドベクターの調製＞及び＜酵素溶液の調製＞に記載の方法にて調製した。そして、上記＜酵素活性の測定３＞に記載の方法にて解析し、イソプレン生成における触媒活性において、上述のＲ７４ＨＴ２０９Ｒと比較した。その結果、Ｒ７４ＭＴ２０９Ｒは、Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒと比してもなお１．２８倍も高い触媒活性を示すことも確認された。【０１３７】
次に、イソプレン生成において極めて高い触媒活性を示すこれらジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ変異体（Ｒ７４ＨＴ２０９Ｒ、Ｒ７４ＭＴ２０９Ｒ）について、上記＜酵素活性の測定５＞に記載の方法にて、イソブテンの生成における触媒活性を評価した。得られた結果を表６に示す。【０１３８】
【表６】
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【０１３９】
表６に示した結果から明らかなように、イソブテンの生成においてもＲ７４ＭＴ２０９Ｒは高い触媒活性を示すことが確認された。また、前記イソプレンの生成同様に、Ｒ７４ＭＴ２０９Ｒの方がＲ７４ＨＴ２０９Ｒよりも、イソブテンの生成における触媒活性において高いことも確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
以上説明したように、本発明によれば、オレフィン化合物を高い生産性にて製造することを可能とする酵素、並びに当該酵素を用いたオレフィン化合物の製造方法を提供することが可能となる。また、本発明によれば、化学合成によらず、生合成によってオレフィン化合物を製造できるため、環境への負荷が少ない。したがって、本発明は、イソプレンやイソブテンといった、合成ゴム等の様々な合成ポリマーの原料の製造において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４１】
配列番号：３
＜２２３＞  大腸菌における発現のためにコドンが最適化された配列
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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