(57)【要約】一般式［１］2017061466.tif 000007（式中、Ｒ１は、置換されてもよいアリール基などを示し；Ｒ２は、置換されてもよいアリール基などを示し；Ｒ３は、水素原子などを示す。）で表される化合物またはその塩を含有する抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
2017061466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［１］
【化１】
2017061466.tif 000006
（式中、
Ｒ１は、置換されてもよいアリール基または置換されてもよい複素環式基を示し；
Ｒ２は、置換されてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されてもよいアリール基または置換されてもよい複素環式基を示し；
Ｒ３は、水素原子またはカルボキシル保護基を示す。）
で表される化合物またはその塩を含有する、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
【請求項２】
Ｒ１が、置換されてもよいアリール基である、請求項１に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
【請求項３】
Ｒ１が、置換されてもよいフェニル基である、請求項１に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
【請求項４】
Ｒ１が、置換されてもよい複素環式基である、請求項１に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
【請求項５】
Ｒ１が、置換されてもよい二環式複素環式基である、請求項１に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
【請求項６】
Ｒ２が、置換されてもよいアリール基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
【請求項７】
Ｒ２が、置換されてもよいフェニル基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
【請求項８】
Ｒ２が、置換されてもよい複素環式基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
【請求項９】
Ｒ２が、置換されてもよい単環の複素環式基である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎とは、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染することで発症するウイルス性肝炎の一つであり、全世界で約３億５０００万人がＢ型肝炎に感染していると考えられている。
Ｂ型肝炎の治療には、インターフェロンおよび核酸アナログなどが使用されているが、その効果は十分ではない。
一方、抗菌活性を有するピリドンカルボン酸誘導体が知られている（特許文献１）。しかし、特許文献１に記載されているピリドンカルボン酸誘導体が、抗ウイルス活性を有することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特公平２−６１９４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、新規な抗ＨＢＶ剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このような状況下、本発明者らは、鋭意研究を行った結果、一般式［１］で表される化合物またはその塩が、優れた抗ＨＢＶ活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
＜１＞
一般式［１］
【化１】
2017061466.tif 000003
「式中、Ｒ１は、置換されてもよいアリール基または置換されてもよい複素環式基を示し；Ｒ２は、置換されてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されてもよいアリール基または置換されてもよい複素環式基を示し；Ｒ３は、水素原子またはカルボキシル保護基を示す。」で表される化合物またはその塩を含有する、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
＜２＞
Ｒ１が、置換されてもよいアリール基である、＜１＞に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
＜３＞
Ｒ１が、置換されてもよいフェニル基である、＜１＞に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
＜４＞
Ｒ１が、置換されてもよい複素環式基である、＜１＞に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
＜５＞
Ｒ１が、置換されてもよい二環式複素環式基である、＜１＞に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
＜６＞
Ｒ２が、置換されてもよいアリール基である、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
＜７＞
Ｒ２が、置換されてもよいフェニル基である、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
＜８＞
Ｒ２が、置換されてもよい複素環式基である、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
＜９＞
Ｒ２が、置換されてもよい単環の複素環式基である、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載の、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の一般式［１］で表される化合物またはその塩は、優れた抗ＨＢＶ活性を有し、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤として有用である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明について以下に詳述する。
本発明において、特に断らない限り、％は質量％である。
本発明において、特に断らない限り、各用語は、次の意味を有する。
【０００９】
ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味する。
Ｃ１−３アルキル基とは、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピル基を意味する。
Ｃ１−６アルキル基とは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチルおよびヘキシル基などの直鎖状または分枝鎖状のＣ１−６アルキル基を意味する。
Ｃ３−８シクロアルキル基とは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシル基などのＣ３−８シクロアルキル基を意味する。
アリール基とは、フェニルまたはナフチル基を意味する。
アルＣ１−６アルキル基とは、ベンジル、ジフェニルメチル、トリチル、フェネチルおよびナフチルメチル基などのアルＣ１−６アルキル基を意味する。
【００１０】
Ｃ１−３アルコキシ基とは、メトキシ、エトキシ、プロポキシまたはイソプロポキシ基を意味する。
Ｃ１−６アルコキシ基とは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシおよびヘキシルオキシ基などの直鎖状または分枝鎖状のＣ１−６アルコキシ基を意味する。
Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基とは、メトキシメチルおよび１−エトキシエチル基などのＣ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基を意味する。
アルＣ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基とは、ベンジルオキシメチルおよびフェネチルオキシメチル基などのアルＣ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基を意味する。
【００１１】
Ｃ２−６アルカノイル基とは、アセチル、プロピオニル、バレリル、イソバレリルおよびピバロイル基などの直鎖状または分枝鎖状のＣ２−６アルカノイル基を意味する。
アロイル基とは、ベンゾイルまたはナフトイル基を意味する。
アシル基とは、ホルミル基、Ｃ２−６アルカノイル基またはアロイル基を意味する。
Ｃ１−６アルコキシカルボニル基とは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルおよび１，１−ジメチルプロポキシカルボニル基などの直鎖状または分枝鎖状のＣ１−６アルコキシカルボニル基を意味する。
アルＣ１−６アルコキシカルボニル基とは、ベンジルオキシカルボニルおよびフェネチルオキシカルボニル基などのアルＣ１−６アルコキシカルボニル基を意味する。
【００１２】
Ｃ１−６アルキルスルホニル基とは、メチルスルホニル、エチルスルホニルおよびプロピルスルホニル基などのＣ１−６アルキルスルホニル基を意味する。
アリールスルホニル基とは、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニルまたはナフタレンスルホニル基を意味する。
Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ基とは、メチルスルホニルオキシ、エチルスルホニルオキシおよびプロピルスルホニルオキシ基などのＣ１−６アルキルスルホニルオキシ基を意味する。
アリールスルホニルオキシ基とは、ベンゼンスルホニルオキシ、ｐ−トルエンスルホニルオキシまたはナフタレンスルホニルオキシ基を意味する。
【００１３】
Ｃ１−３アルキルアミノ基とは、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノまたはイソプロピルアミノ基を意味する。
Ｃ１−６アルキルアミノ基とは、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ブチルアミノ、ｓｅｃ−ブチルアミノ、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ、ペンチルアミノおよびヘキシルアミノ基などの直鎖状または分枝鎖状のＣ１−６アルキルアミノ基を意味する。
ジ（Ｃ１−３アルキル）アミノ基とは、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、（エチル）（メチル）アミノおよび（メチル）（プロピル）アミノ基などの直鎖状または分枝鎖状のジ（Ｃ１−３アルキル）アミノ基を意味する。
ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基とは、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジイソプロピルアミノ、ジブチルアミノ、ジ（ｔｅｒｔ−ブチル）アミノ、ジペンチルアミノ、ジヘキシルアミノ、（エチル）（メチル）アミノおよび（メチル）（プロピル）アミノ基などの直鎖状または分枝鎖状のジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基を意味する。
【００１４】
環状アミノ基とは、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ホモピペリジニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、モルホリニル、ホモモルホリニルおよびチオモルホリニルなどの該環を形成する異項原子として一つ以上の窒素原子を含み、さらに一つ以上の酸素原子または硫黄原子を含んでもよい環状アミノ基を意味する。
【００１５】
単環の含窒素複素環式基とは、アゼチジニル、ピロリジニル、ピロリニル、ピロリル、ピペリジル、テトラヒドロピリジル、ピリジル、ホモピペリジニル、オクタヒドロアゾシニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピペラジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ホモピペラジニル、トリアゾリルおよびテトラゾリル基などの該環を形成する異項原子として窒素原子のみを含む単環の含窒素複素環式基を意味する。
単環の含酸素複素環式基とは、テトラヒドロフラニル、フラニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニルまたはピラニル基を意味する。
単環の含硫黄複素環式基とは、チエニル基を意味する。
単環の含窒素・酸素複素環式基とは、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリルおよびモルホリニル基などの該環を形成する異項原子として窒素原子および酸素原子のみを含む単環の含窒素・酸素複素環式基を意味する。
単環の含窒素・硫黄複素環式基とは、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、チオモルホリニル、１−オキシドチオモルホリニルおよび１，１−ジオキシドチオモルホリニル基などの該環を形成する異項原子として窒素原子および硫黄原子のみを含む単環の含窒素・硫黄複素環式基を意味する。
単環の複素環式基とは、単環の含窒素複素環式基、単環の含酸素複素環式基、単環の含硫黄複素環式基、単環の含窒素・酸素複素環式基または単環の含窒素・硫黄複素環式基を意味する。
【００１６】
二環式の含窒素複素環式基とは、インドリニル、インドリル、イソインドリニル、イソインドリル、ピロロピリジニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、テトラヒドロキノリニル、ジヒドロキノリニル、キノリニル、ジヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロイソキノリニル、イソキノリニル、ジヒドロキナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ジヒドロキノキサリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル、プリニル、プテリジニルおよびキヌクリジニル基などの該環を形成する異項原子として窒素原子のみを含む二環式の含窒素複素環式基を意味する。
二環式の含酸素複素環式基とは、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、クロマニル、クロメニル、イソクロマニル、１，３−ベンゾジオキソリル、１，３−ベンゾジオキサニルおよび１，４−ベンゾジオキサニル基などの該環を形成する異項原子として酸素原子のみを含む二環式の含酸素複素環基を意味する。
二環式の含硫黄複素環基とは、２，３−ジヒドロベンゾチエニルおよびベンゾチエニル基などの該環を形成する異項原子として硫黄原子のみを含む二環式の含硫黄複素環式基を意味する。
二環式の含窒素・酸素複素環式基とは、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾモルホリニル、ジヒドロピラノピリジル、ジヒドロジオキシノピリジルおよびジヒドロピリドオキサジニル基などの該環を形成する異項原子として窒素原子および酸素原子のみを含む二環式の含窒素・酸素複素環式基を意味する。
二環式の含窒素・硫黄複素環式基とは、ジヒドロベンゾチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリルおよびベンゾチアジアゾリル基などの該環を形成する異項原子として窒素原子および硫黄原子を含む二環式の含窒素・硫黄複素環式基を意味する。
二環式複素環式基とは、二環式の含窒素複素環式基、二環式の含酸素複素環式基、二環式の含硫黄複素環式基、二環式の含窒素・酸素複素環式基または二環式の含窒素・硫黄複素環式基を意味する。
【００１７】
複素環式基とは、単環の複素環式基または二環式複素環式基を意味する。
【００１８】
置換基群Ａ：ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、保護されてもよいヒドロキシル基、置換基群Ｂから選択される一つ以上の基で置換されてもよいＣ１−６アルキル基、置換基群Ｂから選択される一つ以上の基で置換されてもよいアリール基、置換基群Ｂから選択される一つ以上の基で置換されてもよいＣ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、置換基群Ｂから選択される一つ以上の基で置換されてもよい複素環式基、オキソ基。
【００１９】
置換基群Ａ１：ハロゲン原子、保護されてもよいヒドロキシル基、Ｃ１−３アルキル基、Ｃ１−３アルコキシ基。
【００２０】
置換基群Ａ２：ハロゲン原子、置換基群Ｂ１から選択される一つ以上の基で置換されてもよいフェニル基、Ｃ１−３アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−３アルキル）アミノ基、環状アミノ基、単環の複素環式基。
【００２１】
置換基群Ｂ：ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、Ｃ１−６アルキル基、アリール基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、複素環式基、オキソ基。
【００２２】
置換基群Ｂ１：ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基。
【００２３】
カルボキシル保護基としては、通常のカルボキシル基の保護基として使用し得るすべての基を含み、たとえば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Greene's Protective Groups in Organic Synthesis）第5版、第686〜836頁、2014年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons,INC.）に記載されている基が挙げられる。具体的には、Ｃ１−６アルキル基、アルＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基またはアルＣ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基などが挙げられる。これらの基は、置換基群Ａから選択される一つ以上の基で置換されてもよい。
【００２４】
ヒドロキシル保護基としては、通常のヒドロキシル基の保護基として使用し得るすべての基を含み、たとえば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Greene's Protective Groups in Organic Synthesis）第5版、第17〜471頁、2014年、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley & Sons,INC.）に記載されている基が挙げられる。具体的には、たとえば、Ｃ１−６アルキル基、アルＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基、アシル基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、アルＣ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロピラニル基が挙げられる。これらの基は、置換基群Ａから選ばれる一つ以上の基で置換されていてもよい。
【００２５】
脱離基としては、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ基またはアリールスルホニルオキシ基が挙げられる。Ｃ１−６アルキルスルホニルオキシ基およびアリールスルホニルオキシ基は、置換基群Ａから選ばれる一つ以上の基で置換されてもよい。
【００２６】
本発明に使用される一般式［１］で表される化合物において、好ましい化合物としては、以下の化合物が挙げられる。
【００２７】
Ｒ１は、置換されてもよいアリール基または置換されてもよい複素環式基である。
Ｒ１のアリール基および複素環式基は、置換基群Ａから選ばれる一つ以上の基で置換されてもよい。
Ｒ１が、置換されてもよいアリール基である化合物が好ましく、置換されてもよいフェニル基である化合物がより好ましく、置換基群Ａ１から選ばれる一つ以上の基で置換されてもよいフェニル基である化合物がさらに好ましい。
別の態様として、Ｒ１が、置換されてもよい複素環式基である化合物が好ましく、置換されてもよい二環式複素環式基である化合物がより好ましく、置換基群Ａ１から選ばれる一つ以上の基で置換されてもよい二環式複素環式基である化合物がさらに好ましい。
【００２８】
Ｒ２は、置換されてもよいＣ３−８シクロアルキル基、置換されてもよいアリール基または置換されてもよい複素環式基である。
Ｒ２のＣ３−８シクロアルキル基、アリール基および複素環式基は、置換基群Ａから選ばれる一つ以上の基で置換されてもよい。
Ｒ２が、置換されてもよいアリール基である化合物が好ましく、置換されてもよいフェニル基である化合物がより好ましく、置換基群Ａ２から選ばれる一つ以上の基で置換されてもよいフェニル基である化合物がさらに好ましい。
別の態様として、Ｒ２が、置換されてもよい複素環式基である化合物が好ましく、置換されてもよい単環の複素環式基である化合物がより好ましく、置換基群Ａ２から選ばれる一つ以上の基で置換されてもよい単環の複素環式基である化合物がさらに好ましい。
【００２９】
Ｒ３は、水素原子またはカルボキシル保護基である。
Ｒ３が、水素原子である化合物が好ましい。
【００３０】
一般式［１］で表される化合物の塩としては、通常知られているアミノ基などの塩基性基またはヒドロキシルもしくはカルボキシル基などの酸性基における塩を挙げることができる。
【００３１】
塩基性基における塩としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硝酸および硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。
【００３２】
酸性基における塩としては、たとえば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、４−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミンおよびＮ、Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などが挙げられる。
【００３３】
上記した塩の中で、好ましい塩としては、薬理学的に許容される塩が挙げられる。
一般式［１］で表される化合物において、異性体（たとえば、光学異性体、幾何異性体および互変異性体など）が存在する場合、本発明は、それらの異性体を包含し、また、溶媒和物、水和物および種々の形状の結晶を包含するものである。
さらに、本発明は、一般式［１］で表される化合物のプロドラッグも包含する。
【００３４】
一般式［１］で表される化合物またはその塩を医薬品として用いる場合、通常、製剤化に使用される賦形剤、担体および希釈剤などの製剤補助剤を適宜混合してもよい。
これらは、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、粉体製剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤または注射剤などの形態で経口または非経口で投与することができる。また、投与方法、投与量および投与回数は、患者の年齢、体重および症状に応じて適宜選択することができる。通常、成人に対しては、経口または非経口（たとえば、注射、点滴および直腸部位への投与など）投与により、１日、0.01〜1000mg／kgを１回から数回に分割して投与すればよい。
【００３５】
次に一般式［１］で表される化合物の製造法について説明する。
一般式［１］で表される化合物は、自体公知の方法を組み合わせることにより製造されるが、たとえば、次に示す製造法にしたがって製造することができる。
【００３６】
［製造法１］
2017061466.tif 000004
（式中、Ｒ３ａは、カルボキシル保護基を示し；Ｒ１およびＲ２は、前記と同様な意味を有する。）
【００３７】
（１）
一般式［Ｓ２］で表される化合物は、一般式［Ｓ１］で表される化合物にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドジメチルアセタールなどのアセタール類を反応させたのち、一般式Ｒ１ＮＨ２で表される化合物を反応させることにより、製造することができる。
この反応は、特許文献１に記載の方法に従って行えばよい。
【００３８】
（２）
一般式［Ｓ３］で表される化合物は、一般式［Ｓ２］で表される化合物を閉環反応に付すことにより、製造することができる。
この反応は、特許文献１に記載の方法に従って行えばよい。
【００３９】
（３）
一般式［１ａ］で表される化合物は、一般式［Ｓ３］で表される化合物を脱水素反応に付すことにより、製造することができる。
この反応は、特許文献１に記載の方法に従って行えばよい。
【００４０】
（４）
一般式［１ｂ］で表される化合物は、一般式［１ａ］で表される化合物を脱保護反応に付すことにより、製造することができる。
この反応は、特許文献１に記載の方法に従って行えばよい。
【００４１】
次に、本発明を試験例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
試験化合物として、化合物１〜１６を使用した。
【００４２】
試験例１  抗HBVアッセイ
肝芽細胞腫（hepatoblastoma）細胞株HepG2にHBVゲノムが導入された、持続的にウイルスを産生する細胞であるHepG2.2.15細胞（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1005-1009, 1987）を用いて、化合物１〜１６の抗HBV活性を以下の手順で評価した。
培地として、以下を用いた。
DMEM/F-12，GlutaMAX（Invitrogen社製）＋5μg/mLインスリン（Wako社製）＋1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Sigma社製）＋10mmol/L HEPES（Sigma社製）＋50μmol/Lヒドロコルチゾン（Sigma社製）＋10％FBS
さらに上記培地に、試験化合物のジメチルスルホキシド（DMSO）混合物をDMSOの終濃度が1％（v/v）となるようを加え、各化合物の種々濃度の試験液を調製した。また、薬物非添加の対照として上記培地にDMSOのみを終濃度1％（v/v）となるよう加えた試験液を調製した。
【００４３】
（１）HepG2.2.15細胞を上記培地に懸濁し、1.5×105cells/mLのHepG2.2.15細胞懸濁液を調製した。この懸濁液を用いて、96穴マイクロタイタープレートに播種し（100μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で1日間インキュベートした。
（２）培養上清を除き、細胞をPBS（-）（100μL/ウェル）で2回洗浄した後、上記培地（100μL/ウェル）で1回洗浄した。
（３）試験液を（２）のプレートに加え（100μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で3日間インキュベートした。
（４）培養上清を除き、再度試験液をプレートに加え（100μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で3日間インキュベートした。
（５）培養上清を回収し、Buffer AL（QIAGEN社製）およびProteinase K（Invitrogen社製）の混合物で処理した。得られた溶液中のHBV DNA量を、リアルタイムPCR法にて定量した。また培養上清中のHBsAg（hepatitis B surface antigen）を、ルミパルスHBsAg-HQ（富士レビオ社製）を用いた化学発光酵素免疫測定法にて定量した。それぞれについて、化合物非添加ウェルに対する化合物添加ウェルの相対ウイルス量(％)を算出した。濃度を対数、相対ウイルス量を実数でプロットし、Microsoft Office Excel 2007のFORECAST関数（1次回帰法）を用いて化合物のIC50を算出した。
結果を表１に示す。
【００４４】
【表１】
2017061466.tif 000005
【００４５】
化合物１〜１６は、優れた抗ＨＢＶ活性を示した。
【００４６】
試験例２  PXB-cellsでの抗HBVアッセイ
PXBマウス（ヒト肝細胞キメラマウス）から採取した新鮮肝細胞（PXB-cells, フェニックスバイオ社製）を用いて、化合物８の抗HBV活性を以下の手順で評価した。
培地として、以下を用いた。
500mL DMEM（Sigma社製）＋0.25μg/mLインスリン（Wako社製）＋1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Sigma社製）＋20mmol/L HEPES（Sigma社製）＋15μg/mL L-プロリン（Sigma社製）＋50nmol/Lデキサメタゾン（Sigma社製）＋5ng/mL EGF（Peprotech社製）＋0.1mmol/L アスコルビン酸２リン酸（wako社製）＋10％FBS＋2％DMSO
さらに上記培地に化合物８を加え、10μmol/L濃度の試験液を調製した。
【００４７】
（１）2.1×105cells/cm2の播種密度で48穴マイクロタイタープレートに播種されたPXB-cellsを、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。
（２）PXBマウス血清由来HBV（genotype AeUS）を、4％PEG-8000含上記培地に懸濁し、約10 copies/cellとなるよう（１）のプレートに加えて感染させ（250μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で1日間インキュベートした。
（３）培養上清を除き、細胞を10％FBS 1％ペニシリン/ストレプトマイシン含DMEMで3回洗浄した後、上記培地を加え（250μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で1日間インキュベートした。
（４）培養上清を除き、細胞を10％FBS 1％ペニシリン/ストレプトマイシンDMEMで3回洗浄した後、上記培地を加え（250μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。
（５）培養上清を除き、上記培地をプレートに加え（250μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。
（６）感染後12日目の培養上清を除き、上記培地をプレートに加え（250μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。
（７）感染後17日目の培養上清を除き、試験液をプレートに加え（250μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。薬物非添加の対照には、上記培地をプレートに加え（250μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。
（８）感染後22日目の培養上清を除き、試験液をプレートに加え（250μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で５日間インキュベートした。薬物非添加の対照には、上記培地をプレートに加え（250μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。
（９）感染後27日目の培養上清を除き、試験液をプレートに加え（250μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。薬物非添加の対照には、上記培地をプレートに加え（250μL/ウェル）、5％CO2インキュベーターにて37℃で5日間インキュベートした。
（１０）感染後32日目の培養上清を回収した。
（１１）回収した感染後32日目の培養上清を、QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN社製）で精製した。得られた溶液中のHBV DNA量を、リアルタイムPCR法にて定量した。また培養上清中のHBsAg（hepatitis B surface antigen）量を、ルミパルスHBsAg-HQ（富士レビオ社製）を用いた化学発光酵素免疫測定法にて定量した。それぞれについて化合物非添加の対照に対する相対ウイルス量(％)を算出した。
【００４８】
相対ウイルス量は、HBV DNA量で16％、HBsAg量で29％であった。化合物８は、優れた抗ＨＢＶ活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
一般式［１］で表される化合物またはその塩は、優れた抗ＨＢＶ活性を示し、抗Ｂ型肝炎ウイルス剤として有用である。
【国際調査報告】
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