(57)【要約】本発明によれば、ヒト多能性幹細胞を、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得る工程を含む、ヒト細胞由来の人工栄養膜細胞の製造方法、等が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞を、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得る工程
を含む、ヒト細胞由来の人工栄養膜細胞の製造方法。
【請求項２】
ヒト多能性幹細胞を、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる１つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した合胞体栄養膜細胞を含む培養物を得る工程
を含む、ヒト細胞由来の人工合胞体栄養膜細胞の製造方法。
【請求項３】
培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる１つ以上との前記接触が、培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前に開始される、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる１つ以上との前記接触が、培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前から、GCM1 mRNAが発現する細胞が出現した後まで行われる、請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる１つ以上との前記接触が、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地中での培養の全期間にわたって行われる、請求項１から４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地が、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含みＦＧＦシグナル伝達活性化物質を含まない培地である請求項１から５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
ＢＭＰシグナル伝達活性化物質が、Bone Morphogenetic Protein 4である請求項１から６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前に、培養中の細胞にＦＧＦシグナル伝達阻害物質をさらに接触させる、請求項１から７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる１つ以上が、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質と、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とである、請求項１から８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる１つ以上が、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質である、請求項１から９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
ヒト多能性幹細胞が、単一に分散された後、維持培養されたヒト多能性幹細胞である、請求項１から１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である、請求項１から１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞を含有するキット。
【請求項１５】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞に被験物質を接触させ、該物質の該細胞に対する透過性を検定することを含む、被験物質の細胞層透過性検定方法。
【請求項１６】
請求項１から１２のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞の、毒性または薬効評価用試薬としての使用。
【請求項１７】
請求項１から１２のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞に被験物質を接触させ、該物質が該細胞に及ぼす影響を検定することを含む、被験物質の毒性または薬効評価方法。
【請求項１８】
請求項１から１２のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞を用いて当該細胞が関与する物質輸送またはホルモン分泌を調べることを含む、胎盤組織の障害に基づく疾患の病態解析方法。
【請求項１９】
請求項１から１２のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞の、胎盤組織の障害に基づく疾患の病態解析用試薬としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト多能性幹細胞から人工合胞体栄養膜細胞及びその前駆細胞を製造する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
妊婦に取り込まれた物質は、胎盤を透過すると胎児に曝露される。物質が胎盤を透過するか否かは、当該物質による胎児への発生毒性の発現に大きく影響することから、物質のヒト胎盤透過性を評価するためのin vitro試験系の開発が求められている。
合胞体栄養膜細胞（syncytiotrophoblast）は、胎盤絨毛において最も外側に位置し母体血と接触する細胞層を構成する。胎盤絨毛において合胞体栄養膜細胞の内側に存在する細胞性栄養膜細胞（cytotrophoblast）が分化し融合して、合胞体栄養膜細胞が形成される。
合胞体栄養膜細胞は、細胞性栄養膜細胞や血管内皮等と共に血液胎盤関門を構成する。合胞体栄養膜細胞は、血液胎盤関門において最も外側に存在し母体血に接する。合胞体栄養膜細胞は細胞間で密着結合を形成し、血液胎盤関門における物質の拡散透過を制限する。また、合胞体栄養膜細胞は、様々な種類の排出トランスポーター（例えば、MDR1）及び取り込みトランスポーター（例えば、GLUT1）を発現しており、これらのトランスポーターを介して物質の選択的な排出及び取込みが行われる。このように、合胞体栄養膜細胞は、母体と胎児間の物質移行の血液胎盤関門での制御に主要な役割を果たしている。【０００３】
ヒト胚性幹細胞をBone morphogenetic protein (以下、BMPと記すこともある。) 4等のＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地で培養して栄養膜細胞（trophoblast）への分化を誘発する方法が知られている（特許文献1）。ヒト胚性幹細胞を、BMP4と、線維芽細胞増殖因子(以下、ＦＧＦと記すこともある。)シグナル伝達阻害物質及びアクチビンシグナル伝達阻害物質とを含む培地で培養すると、合胞体栄養膜細胞への分化が誘導されたと報告されている（非特許文献１）。ヒト胚性幹細胞を、BMP4と、ＦＧＦ２シグナル伝達阻害物質及びアクチビンシグナル伝達阻害物質とを含む培地で培養すると、合胞体栄養膜細胞様細胞と絨毛外栄養膜細胞(extravillous trophoblast)様細胞とが出現したとの報告もある（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００３／０７８５９９
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】STEM CELLS AND DEVELOPMENT, Volume: 21, Pages: 2987-3000(2012)
【非特許文献２】Proceedings of the National Academy of Sciences, Volume: 110, Pages: 1212-1221(2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ヒト細胞由来の人工合胞体栄養膜細胞及びその前駆細胞をin vitroで高効率に製造する方法の開発が切望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヒト多能性幹細胞から人工合胞体栄養膜細胞及びその前駆細胞を製造する方法等を提供する。
即ち、本発明は、
項１．ヒト多能性幹細胞を、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得る工程
を含む、ヒト細胞由来の人工栄養膜細胞の製造方法（以下、本発明製造方法１と記すこともある。）；
項２．ヒト多能性幹細胞を、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した合胞体栄養膜細胞を含む培養物を得る工程
を含む、ヒト細胞由来の人工合胞体栄養膜細胞の製造方法（以下、本発明製造方法２と記すこともある。）；
項３．培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる１つ以上との前記接触が、培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前に開始される、項１又は２に記載の製造方法；
項４．培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる１つ以上との前記接触が、培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前から、GCM1 mRNAが発現する細胞が出現した後まで行われる、項１から３のいずれか１項に記載の製造方法；
項５．培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上との前記接触が、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地中での培養の全期間にわたって行われる、項１から４のいずれか１項に記載の製造方法；
項６．ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地が、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含みＦＧＦシグナル伝達活性化物質を含まない培地である項１から５のいずれか１項に記載の製造方法；
項７．ＢＭＰシグナル伝達活性化物質が、Bone Morphogenetic Protein 4である項１から６のいずれか１項に記載の製造方法；
項８．培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前に、培養中の細胞にＦＧＦシグナル伝達阻害物質をさらに接触させる、項１から７のいずれか１項に記載の製造方法；
項９．γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる１つ以上が、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質と、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とである、項１から８のいずれか１項に記載の製造方法；
項１０．γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる１つ以上が、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質である、項１から９のいずれか１項に記載の製造方法；
項１１．ヒト多能性幹細胞が、単一に分散された後、維持培養されたヒト多能性幹細胞である、項１から１０のいずれか１項に記載の製造方法；
項１２．多能性幹細胞が、胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞と記すことがある。）又は人工多能性幹細胞である、項１から１１のいずれか１項に記載の製造方法；
項１３．項１から１２のいずれか１項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞；
項１４．項１から１２のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞を含有するキット；
項１５．項１から１２のいずれか１項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞に被験物質を接触させ、該物質の該細胞に対する透過性を検定することを含む、被験物質の細胞層透過性検定方法；
項１６．項１から１２のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞の、毒性または薬効評価用試薬としての使用；
項１７．項１から１２のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞に被験物質を接触させ、該物質が該細胞に及ぼす影響を検定することを含む、被験物質の毒性または薬効評価方法；
項１８．項１から１２のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞を用いて当該細胞が関与する物質輸送またはホルモン分泌を調べることを含む、胎盤組織の障害に基づく疾患の病態解析方法；及び
項１９．項１から１２のいずれか1項に記載の方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞の、胎盤組織の障害に基づく疾患の病態解析用試薬としての使用；
等を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明製造方法によれば、ヒト細胞由来の人工合胞体栄養膜細胞及びその前駆細胞をin vitroで高効率に製造することが可能となる。本発明製造方法によって製造された人工合胞体栄養膜細胞及びその前駆細胞は、化学物質等の毒性または薬効の評価や病態解析などに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＧＣＭ１遺伝子のプロモーター下流に緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）をコードする塩基配列がノックインされたヒトＥＳ細胞を分化培地で培養した際のＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を示すグラフである。
【図２】図２は、ヒトＥＳ細胞を分化培地で培養して得られた細胞におけるSyncytin遺伝子のmRNA量を相対発現量として示すグラフである。
【図３】図３は、ヒトＥＳ細胞を培養して得られた細胞におけるSyncytin遺伝子のmRNA量を相対発現量として示すグラフである。
【図４】図４は、ＧＣＭ１遺伝子のプロモーター下流に緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）をコードする塩基配列がノックインされたヒトＥＳ細胞を分化培地で培養して得られた細胞を、抗ＧＦＰ抗体及び核染色剤で免疫染色した像を示す。
【図５】図５は、ヒトＥＳ細胞を培養して得られた細胞における各種マーカー遺伝子のmRNA量を相対発現量として示すグラフである。
【図６】図６は、ヒトＥＳ細胞を分化培地で培養して得られた細胞におけるGCM1遺伝子のmRNA量及びSyncytin遺伝子のmRNA量を相対発現量として示すグラフである。
【図７】図７は、ヒトＥＳ細胞を分化培地で培養して得られた細胞におけるＫＲＴ７遺伝子のmRNA量、GCM1遺伝子のmRNA量及びSyncytin遺伝子のmRNA量を相対発現量として経時的に示すグラフである。
【図８】図８は、ＧＣＭ１遺伝子のプロモーター下流に緑色蛍光プロテイン（ＧＦＰ）をコードする塩基配列がノックインされたヒトＥＳ細胞を分化培地で培養した際のＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を示すグラフである。
【図９】図９は、ヒトＥＳ細胞を培養して得られた細胞におけるSyncytin遺伝子のmRNA量を相対発現量として示すグラフである。
【図１０】図１０は、ヒトＥＳ細胞を分化培地で培養して得られた細胞における被験物質の透過量と、満期胎盤を用いた胎盤還流法による透過性試験で測定された当該物質の透過量（文献値）との相関性を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ヒト人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）を分化培地で培養して得られた細胞におけるSyncytin遺伝子のmRNA量を相対発現量として示すグラフである。
【図１２】図１２は、ヒト人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）を分化培地で培養して得られた細胞における被験物質の透過量と、満期胎盤を用いた胎盤還流法による透過性試験で測定された当該物質の透過量（文献値）との相関性を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ヒトＥＳ細胞を分化培地で培養して得られた細胞またはＢｅＷｏ細胞におけるＴＥＥＲ値を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ヒトＥＳ細胞を分化培地で培養して得られた細胞またはＢｅＷｏ細胞を、抗Ｍｄｒ１抗体及び核染色剤で免疫染色した像を示す。
【図１５】図１５は、ヒトＥＳ細胞を分化培地で培養して得られた細胞またはＢｅＷｏ細胞におけるBCRP遺伝子のmRNA量、およびplacenta total RNAにおけるBCRP遺伝子のmRNA量を相対発現量として示すグラフである。
【図１６】図１６は、ヒトＥＳ細胞またはＢｅＷｏ細胞を培養して得られた細胞におけるカルセイン蛍光強度を相対量として示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００１１】
本発明における遺伝子操作技術で使用される原核生物細胞としては、例えば、Eschericia属、Serratia属、Bacillus属、Brevibacterium属、Corynebacterium属、Microbacterium属、Pseudomonas属等に属する原核生物細胞、例えば、Eschericia XL1-Blue、Eschericia XL2-Blue、Eschericia DH1等を挙げることができる。このような細胞は、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual（3rd edition）」 Sambrook，J and Russell, D.W., ed., Appendix 3（Volume３），Vectors and Bacterial strains. A3.2（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）に具体的に記載されている。
【００１２】
本発明における「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターを意味する。このようなベクターとしては、例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体もしくは植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能であるか、又は、染色体中への組込みが可能であって、ポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているもの等を挙げることができる。
このようなベクターのうち、クローニングに適したベクターは、通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual （3rd edition）」 Sambrook, J and Russell, D.W., ed., Appendix 3 (Volume 3)， Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) に代表的なものが記載されており、このようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。
【００１３】
本発明における「ベクター」は、「発現ベクター」、「レポーターベクター」、「組換えベクター」も含む。「発現ベクター」とは、構造遺伝子及びその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主細胞の中で作動し得る状態で連結されている核酸配列を意味する。「調節エレメント」としては、例えば、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー、及び、エンハンサーを含む核酸配列等を挙げることができる。
【００１４】
本発明における核酸分子を細胞内に導入する技術としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション等を挙げることができる。このような導入技術としては、具体的には例えば、Ausubel F. A.ら編（１９８８）Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY；「Molecular Cloning: A Laboratory Manual （3rd edition）」 Sambrook, J and Russell, D.W., ed., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社（１９９７）等に記載される方法等を挙げることができる。遺伝子が細胞内に導入されたことを確認する技術としては、例えば、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析又は他の周知慣用技術等を挙げることができる。
【００１５】
本発明において細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製すればよい。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、F-12培地、DMEM/F-12培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、又は、これらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることができる培地を挙げることができる。
本発明において細胞の培養に用いられる培地には、必要に応じて、無調整又は未精製の血清が添加される。「血清」としては、例えば、牛血清、仔牛血清、牛胎児血清、馬血清、仔馬血清、馬胎児血清、ウサギ血清、仔ウサギ血清、ウサギ胎児血清、ヒト血清等の哺乳動物の血清を挙げることができる。当該培地は、脂肪酸、脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を更に含有してもよい。
【００１６】
本発明において、「物質Ｘを含む培地」とは、外因性（exogeneous）の物質Ｘが添加された培地または外因性の物質Ｘを含む培地を意味し、「物質Ｘを含まない培地」とは、外因性の物質Ｘが添加されていない培地または外因性の物質Ｘを含まない培地を意味する。ここで、「外因性の物質Ｘ」とは、その培地で培養される細胞または組織にとって外来の物質Ｘを意味し、その細胞または組織が産生する内在性（endogenous）の物質Ｘはこれに含まれない。
例えば、「ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地」とは、外因性のＢＭＰシグナル伝達活性化物質が添加された培地または外因性のＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地である。「ＦＧＦシグナル伝達活性化物質を含まない培地」とは、外因性のＦＧＦシグナル伝達活性化物質が添加されていない培地または外因性のＦＧＦシグナル伝達活性化物質を含まない培地である。
【００１７】
本発明製造方法１は、ヒト細胞由来の人工栄養膜細胞の製造方法であって、
ヒト多能性幹細胞を、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得る工程を含む。
本発明製造方法２は、ヒト細胞由来の人工合胞体栄養膜細胞の製造方法であって、
ヒト多能性幹細胞を、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させ、前記ヒト多能性幹細胞から分化した合胞体栄養膜細胞を含む培養物を得る工程を含む。
【００１８】
本発明において「幹細胞」としては、例えば、分裂して自分と同じ細胞を作る能力、すなわち自己複製能と、別の種類の細胞に分化する能力とを持ち、持続的に増殖できる細胞を挙げることができる。
【００１９】
本発明における「多能性幹細胞」としては、例えば、in vitroにおいて培養することが可能で、且つ、三胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）由来の組織に分化しうる能力、すなわち多能性(pluripotency)を有する幹細胞を挙げることができる。「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、または組織内幹細胞等から樹立することができる。本発明における「多能性幹細胞」のより具体的な例としては、胚性幹細胞（embryonic stem cell）、または、体細胞から誘導された多能性幹細胞を挙げることができる。
本発明における「ヒト多能性幹細胞」とは、ヒトの細胞由来の多能性幹細胞を意味する。例えば、ヒトの受精卵、クローン胚、生殖幹細胞もしくは組織内幹細胞等から樹立された多能性幹細胞、または、ヒトの体細胞から誘導された多能性幹細胞が挙げられる。
【００２０】
本発明における「胚性幹細胞」（以下、ＥＳ細胞と記すこともある。）としては、例えば、自己複製能を有し、多能性（pluripotency）を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞を挙げることができる。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。
胚性幹細胞は、将来胎児などの胚体組織へと分化する細胞の集団である内部細胞塊より樹立された細胞であり、従来、胎盤などの胚体外組織へは分化しないと考えられてきた。しかし、近年、胚性幹細胞を特定の条件下で培養することにより、胎盤を含む胚体外組織へ分化させ得る可能性が示されるようになった。例えば、ヒトＥＳ細胞を、ＢＭＰ４を添加した培地に接触させて培養を行うこと（Nature Biotechnology, 2002, 20, p1261-1264）により、将来胎盤などの胚体外組織へと分化する栄養外胚葉系列の細胞への分化が起こることが報告されている。
【００２１】
本発明における「体細胞から誘導された多能性幹細胞」としては、体細胞を初期化することにより、胚性幹細胞に似た多能性を人工的に持たせた細胞を挙げることができ、具体的には、線維芽細胞等の分化した細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc等の遺伝子の発現により初期化して多分化能を誘導した人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）（以下、ｉＰＳ細胞と記すこともある。）を挙げることができる。2006年、山中らによりマウス線維芽細胞から人工多能性幹細胞が樹立された（Cell, 2006, 126(4), p663-676）。2007年にはヒト線維芽細胞から、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する人工多能性幹細胞が樹立された（Cell, 2007, 131(5),p861-872; Science, 2007, 318(5858), p1917-1920; Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p101-106）。
【００２２】
多能性幹細胞は、所定の機関より入手でき、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
多能性幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、ヒト幹細胞は、KnockOutTM Serum Replacement（以下、KSRと記すこともある。）及び塩基性線維芽細胞増殖因子(以下、bFGFと記すこともある。)を用いて培養することにより維持できる。
【００２３】
本発明において用いられる多能性幹細胞は、遺伝子改変された多能性幹細胞であってもよい。遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、胎盤組織の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。遺伝子改変としては、例えば、細胞マーカー遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子を発現させるために、目的とする細胞マーカー遺伝子のプロモーター領域の下流にレポータータンパク質をコードする塩基配列をノックインする改変、疾患関連遺伝子に変異を導入する改変等が挙げられる。レポータータンパク質としては、ホタルルシフェラーゼ（firefly luc）、ウミシイタケルシフェラーゼ（renilla luc）、β-ガラクトシダーゼ、もしくはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素、緑色蛍光プロテイン（GFP）、青色蛍光プロテイン（CFP）、黄色蛍光プロテイン（YFP）もしくは赤色蛍光プロテイン（dsRed）等の蛍光プロテイン等が挙げられる。遺伝子改変された多能性幹細胞としては、例えば、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子の1つであるＧＣＭ１遺伝子のプロモーターの下流にＧＦＰ等のレポータータンパク質をコードする塩基配列がノックインされた多能性幹細胞を挙げることができる。
【００２４】
染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９９４）；Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法を用いて行うことができる。
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離されたゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press（１９８９）やCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons（１９８７−１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Genome Systems製）やUniversal GenomeWalker Kits（CLONTECH製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することもできる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリＡ選択などの方法を用いることができる。 
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。
【００２５】
本発明製造方法１及び本発明製造方法２（以下、まとめて本発明製造方法と記すこともある。）においては、ヒト多能性幹細胞を、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養する。当該培養（以下、本分化培養と記すこともある。）について説明する。
本発明における「接着培養する」とは、細胞を培養器材等に接着した状態で培養することをいう。
本分化培養で用いられる培養器材としては、細胞の接着培養が可能なものであればその形状は特に限定されない。このような培養器材としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル、セルカルチャーインサート、オーガンオンチップ等を挙げることができる。
好ましい培養器材としては、細胞接着性の培養器材を挙げることができる。細胞接着性の培養器材としては、例えば、細胞との接着性を向上させる目的で培養面が人工的に処理された細胞培養器材を挙げることができる。細胞との接着性を向上させるための処理としては、例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理が挙げられる。コーティングに用いられる細胞外マトリクス等としては、基底膜成分として市販されている商品（例えばMatrigelTM；ベクトン・ディッキンソン社製）や、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えばI型コラーゲン、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど）等が挙げられる。細胞は、例えば、器材の底面、側面、底面の裏面（例えば、着脱式セルカルチャーインサートのカップの裏面）等に接着させることができ、浮遊状態でなければ、接着箇所は特に限定されない。
【００２６】
MatrigelTMは、Engelbreth Holm Swarn (ＥＨＳ)マウス肉腫由来の基底膜調製物である。MatrigelTMの主成分はＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンであり、これらに加えてＴＧＦ−β、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、組織プラスミノゲン活性化因子、ＥＨＳ腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。MatrigelTMの「growth factor reduced (ＧＦＲ)製品」は、通常のMatrigelTMよりも増殖因子の濃度が低い。本発明では、ＧＦＲ製品の使用が好ましい。
【００２７】
本分化培養には、上述したような培地にＢＭＰシグナル伝達活性化物質が添加された培地が用いられる。例えば、１０％  Fetal Bovine Serum（以下、ＦＢＳと記すことがある。）、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin及び１００μｇ／ｍｌ  streptomycinに加えて、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地が挙げられる。
【００２８】
「ＢＭＰシグナル伝達活性化物質」とは、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質をいう。ＢＭＰシグナル伝達活性化物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４もしくはＢＭＰ７等のＢＭＰ、Growth differentiation factor 7（ＧＤＦ７）等のＧＤＦ蛋白、抗ＢＭＰ受容体抗体、又は、ＢＭＰ部分ペプチドなどが挙げられる。ＢＭＰ２、ＢＭＰ４及びＢＭＰ７は例えばR＆D Systemsから、ＧＤＦ７蛋白は例えば和光純薬から入手可能である。
ＢＭＰシグナル伝達活性化物質の濃度は、ヒト多能性幹細胞の栄養膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばＢＭＰ４は、培地中の濃度が約1ng/mlから約1000ng/ml、好ましくは約10ng/mlから約300ng/ml、より好ましくは約100ng/mlとなるように培地に添加する。
【００２９】
本分化培養に用いられる「ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地」は、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含み、ＦＧＦシグナル伝達活性化物質を含まない培地であることが好ましい。
ＦＧＦシグナル伝達活性化物質としては、ＦＧＦにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質を挙げることができる。ＦＧＦシグナル伝達活性化物質としては、例えば、ＦＧＦファミリーに属する蛋白（例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子）やＦＧＦ類似物質（例えば、SUN 11602）等が挙げられる。
【００３０】
ヒト多能性幹細胞を、上述のような「ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地」中で、上述のような培養器材を用いて接着培養する。本分化培養開始時の細胞濃度は、例えば、９６穴培養プレートの１ウェルあたり、約５×１０２細胞から約２×１０４細胞、好ましくは約７．５×１０２細胞から約６×１０３細胞、より好ましくは約１×１０３細胞から約４×１０３細胞である。
【００３１】
本分化培養に用いられるヒト多能性幹細胞としては、単一に分散された後、維持培養された細胞が好ましい。
単一に分散された細胞とは、細胞塊（コロニー）の状態ではなく、単一細胞の状態にまで分散処理された細胞を意味する。細胞を単一に分散する方法としては、細胞塊を細胞分散試薬で処理する方法等が挙げられる。例えば、トリプシン−ＥＤＴＡ、もしくは、TrypLE Express（Life Technologies）等のトリプシン代替物等により酵素処理する方法、または、酵素を含まない細胞分散試薬で処理した後、ピペッティングする方法等が挙げられる。細胞へのダメージが小さい方法が好ましい。
単一に分散されたヒト多能性幹細胞を、一定期間、未分化状態のまま維持培養した後、本分化培養に供する。単一に分散されたヒト多能性幹細胞の維持培養開始時の細胞濃度は、例えば、９６穴培養プレートの１ウェルあたり、約５×１０２細胞から約１×１０４細胞、好ましくは約７．５×１０２細胞から約３×１０３細胞、より好ましくは約１×１０３細胞から約２×１０３細胞とする。維持培養の方法としては、多能性幹細胞を未分化状態のまま培養するために通常用いられる培地中で、ヒト多能性幹細胞を接着培養する方法を挙げることができる。例えば、単一に分散され播種されたヒト多能性幹細胞が培養器材に接着して増殖を開始した後、約１００個程度の細胞からなる細胞塊が形成されるまでの間に、維持培養を終了させ本分化培養を開始させる。好ましくは約５０個程度、より好ましくは約２０個程度の細胞からなる細胞塊が形成されるまでの間に、本分化培養を開始させる。維持培養の具体的な日数は、培養する細胞の種類や状態、培地の成分、および培養条件等によって異なるが、例えば、約1日間から約３日間が挙げられる。
例えば、ヒト多能性幹細胞のコロニーを、細胞分散試薬等を用いて単一に分散した後、接着培養用の９６穴培養プレートに１ウェルあたり約１．５×１０３細胞となるように培地に懸濁して播種し、３７℃、２％ ＣＯ２条件下で維持培養する。その際の培地には、例えば、２０％  ＫＳＲ等を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地でマウス線維芽細胞（以下、ＭＥＦと記すことがある。）を一晩培養した上清に、ｂＦＧＦを１０ｎｇ／ｍｌ 、Y-27632を２０μＭとなるように添加した培地を用いる。例えば、維持培養開始から２日後に、培地を上述のようなＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地に交換して、本分化培養を開始する。
【００３２】
本発明製造方法においては、本分化培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させる。
【００３３】
上記細胞と上記物質との接触は、本分化培養の一部の期間、又は、全期間において行われる。当該接触は、本分化培養の培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前に開始されることが好ましい。GCM1 mRNAとは、ＤＮＡ結合タンパク質であるglial cells missing 1をコードするmRNAである。当該接触は、本分化培養の培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前に開始され、GCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前に終了されてもよいが、GCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前から、GCM1 mRNAを発現する細胞が出現した後まで継続して行われることが好ましく、本分化培養の全期間にわたって行われることがより好ましい。
GCM1 mRNAを発現する細胞が本分化培養の培養物中に出現しているか否かは、培養系内に存在する細胞がGCM1 mRNAを含むか否かを、通常の生化学的手法を用いて測定することにより確認することができる。具体的には、培養系内に存在する細胞からtotal RNAを抽出して逆転写反応を行い、GCM1 mRNAを検出可能なプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、GCM1 mRNAの発現有無を調べることができる。後述する実施例１に記載されるように、ＧＦＰをコードする塩基配列がGCM1遺伝子座にノックインされたヒト多能性幹細胞を用いた場合は、ＧＦＰが発する蛍光を検出することにより、GCM1 mRNAの発現を確認することができる。例えば、培養系内に存在する細胞から、通常の生化学的手法によりGCM1 mRNAが検出されたら、GCM1 mRNAを発現する細胞が本分化培養の培養物中に出現していると判断する。GCM1 mRNAを発現する細胞が本分化培養の培養物中に出現するタイミングが、あらかじめ判っている場合には、上記のような確認操作を行わずに、所定のタイミングで上記細胞と上記物質との接触を行えばよい。
本分化培養の「培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前」の期間は、培養する細胞の種類や状態、培地の成分、および培養条件等によって異なるが、例えば、本分化培養の開始から２日間から３日間以内を挙げることができる。例えば、本分化培養の開始と同時に、または、開始から２日間から３日間以内に、上記細胞と上記物質との接触を開始する。当該接触は、１日間程度で終了してもよいが、２日間以上継続して行われることが好ましい。
【００３４】
本発明製造方法においては、培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前に、培養中の細胞にＦＧＦシグナル伝達阻害物質をさらに接触させてもよい。例えば、本分化培養の開始時から３日目までの間、当該接触を行う。当該細胞とＦＧＦシグナル伝達阻害物質との接触は、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上と、当該細胞との接触と、同じタイミングで行われてもよい。
【００３５】
上記細胞と上記物質とを接触させるには、例えば、上記物質を含む培地で上記細胞を培養する。具体的には、上記細胞を培養している培地に上記物質を添加するか、上記細胞を培養する培地を、上記物質を含む培地に交換する。
【００３６】
本発明における「γアミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡと記すこともある。）Ｂ受容体活性化物質」とは、ＧＡＢＡＢ受容体を活性化し得る物質をいう。ＧＡＢＡＢ受容体活性化物質としては、例えば、ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストやＧＡＢＡＢ受容体positive allosteric modulator（以下、ＰＡＭと記すこともある。）が挙げられる。
【００３７】
ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストとしては、例えば、GABA、γ-Amino-β-hydroxybutyric acid等のGABA類縁体、Baclofen、SKF 97541、又はAcamprosateが挙げられる。ＧＡＢＡＢ受容体アゴニストは、例えばBaclofenの場合では、培地中の濃度が約10μMから約1mM、好ましくは約300μMとなるように培地に添加する。
【００３８】
ＧＡＢＡＢ受容体ＰＡＭとしては、例えば、CGP 7930、rac BHFF、CGP 13501、又はGS 39783が挙げられる。ＧＡＢＡＢ受容体ＰＡＭは、例えばCGP 7930の場合では、約10nMから約100μM、好ましくは約0.1μMから約10μMの濃度となるように培地に添加する。
【００３９】
本発明における「ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（以下、ＰＰＡＲγと記すこともある。）活性化物質」とは、ＰＰＡＲγを活性化し得る物質をいう。ＰＰＡＲγ活性化物質としては、例えば、ＰＰＡＲγアゴニストが挙げられる。ＰＰＡＲγアゴニストとしては、例えば、S26948、GW 1929、Ciglitazone、LG 100754、nTZDpa、Pioglitazone、15-deoxy-Δ-12,14-Prostaglandin J2、Rosiglitazone、Telmisartan、又はTroglitazoneが挙げられる。
ＰＰＡＲγ活性化物質は、例えばS26948の場合では、培地中の濃度が約10nMから約10μM、好ましくは約100nMから約1μMとなるように培地に添加する。
【００４０】
本発明における「レチノイドＸ受容体（以下、ＲＸＲと記すこともある。）活性化物質」とは、ＲＸＲを活性化し得る物質をいう。ＲＸＲ活性化物質としては、例えば、ＲＸＲアゴニストが挙げられる。ＲＸＲアゴニストとしては、例えば、SR 11237、Fluorobexarotene、Docosahexaenoic acid、Isotretinoin、又はCD 3254が挙げられる。
ＲＸＲ活性化物質は、例えばSR 11237の場合では、培地中の濃度が約1nMから約1μM、好ましくは約10nMから約100nMとなるように培地に添加する。
【００４１】
本発明における「レチノイン酸受容体（以下、ＲＡＲと記すことがある。）活性化物質」とは、ＲＡＲを活性化し得る物質をいう。ＲＡＲ活性化物質としては、例えば、ＲＡＲアゴニストが挙げられる。ＲＡＲアゴニストとしては、例えば、レチノイン酸、BMS 753、AM 580、Ch 55、AC 261066、AC 55649、Adapalene、AM 80、BMS 961、CD 1530、CD 2314、CD 437、Isotretinoin、Tazarotene又はTTNPBが挙げられる。
ＲＡＲ活性化物質は、例えばレチノイン酸の場合では、培地中の濃度が約0.1nMから約100nM、好ましくは約1nMから約10nMの濃度となるように培地に添加する。
【００４２】
ＦＧＦシグナル伝達阻害物質とは、FGFにより媒介されるシグナル伝達を阻害し得る物質である。ＦＧＦシグナル伝達阻害物質としては、例えば、ＦＧＦ受容体阻害物質が挙げられる。ＦＧＦ受容体阻害物質とは、ＦＧＦ受容体の機能を阻害し得る物質をいう。ＦＧＦ受容体阻害物質としては、例えば、PD 173074、SU-5402、AP 24534、FIIN 1 hydrochloride、PD 161570、PD 166285 dihydrochloride、R 1530、又はSU 6668が挙げられる。
ＦＧＦシグナル伝達阻害物質は、例えばPD173074の場合では、約1nMから約10μM、好ましくは約0.1μMから約3μMの濃度となるように培地に添加する。
【００４３】
「ＧＡＢＡＢ受容体活性化物質、ＰＰＡＲγ活性化物質、ＲＸＲ活性化物質及びＲＡＲ活性化物質からなる群から選ばれる１つ以上」としては、例えば、ＰＰＡＲγ活性化物質、ＲＸＲ活性化物質及びＲＡＲ活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とＧＡＢＡＢ受容体活性化物質とを挙げることができ、ＧＡＢＡＢ受容体活性化物質、ＰＰＡＲγ活性化物質、ＲＸＲ活性化物質及びＲＡＲ活性化物質であることが、好ましい。細胞と接触させる上記のような１以上の物質には、それぞれＧＡＢＡＢ受容体活性化物質、ＰＰＡＲγ活性化物質、ＲＸＲ活性化物質またはＲＡＲ活性化物質である、異なる２以上の物質が含まれてもよい。
【００４４】
維持培養および本分化培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件はそれぞれ適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約２％から約５％である。Ｏ２濃度は、例えば約２０％から約７０％、好ましくは約２０％から約６０％、より好ましくは約２０％である。
【００４５】
本発明製造方法においては、ヒト多能性幹細胞を、ＢＭＰシグナル伝達活性化物質を含む培地で接着培養し、当該培養の間に、培養中の細胞と、γアミノ酪酸Ｂ受容体活性化物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ活性化物質、レチノイドＸ受容体活性化物質及びレチノイン酸受容体活性化物質からなる群から選ばれる1つ以上とを接触させる。係る培養を行うと、培養物中に、上記ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞が出現し、その後、さらに分化した合胞体栄養膜細胞が出現する。
本発明製造方法においては、目的とする細胞、すなわち栄養膜細胞又は合胞体栄養膜細胞、の出現が培養物中に認められるまで、適宜培地交換を行いながら本分化培養を継続し、目的とする細胞を含む培養物を得る。目的とする細胞が培養物中に出現するタイミングが、あらかじめ判っている場合には、後述のような確認操作を行わずに、所定のタイミングで所望の細胞を含む培養物を得ればよい。
【００４６】
本発明製造方法１により製造される「ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞」は、融合して合胞体栄養膜細胞を形成するに至る前の栄養膜細胞、すなわち、合胞体栄養膜細胞の前駆細胞であって、細胞性栄養膜細胞を含んでいてもよい。当該「ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞」は、Cytokeratin7(以下、KRT7と記すこともある。)をコードするmRNAを発現し、SyncytinをコードするmRNAを発現していない細胞として確認することができる。KRT7 mRNAを発現しSyncytin mRNAを発現していない細胞が培養物中に出現しているか否かは、培養系内に存在する細胞が前記2種のmRNAを含むか否かを、通常の生化学的手法を用いて測定することにより確認することができる。具体的には、培養系内に存在する細胞からtotal RNAを抽出して逆転写反応を行い、KRT7 mRNA及びSyncytin mRNAをそれぞれ検出可能なプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、KRT7 mRNA及びSyncytin mRNAの発現有無を調べることができる。例えば、培養系内に存在する細胞から、通常の生化学的手法により、KRT7 mRNAが検出されSyncytin mRNAが検出されなかったら、本分化培養の培養物中に、KRT7 mRNAを発現しSyncytin mRNAを発現していない細胞が出現していると判断する。
【００４７】
本発明製造方法１により得られる「ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物」としては、ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞を含み、ヒト多能性幹細胞から分化した合胞体栄養膜細胞を含まない培養物が挙げられる。かかる培養物を得るまでの培養期間は、培養条件、培地の種類、細胞の種類や状態等によって異なるが、例えば、本分化培養開始から約１日間から約２日間である。
【００４８】
本発明製造方法１により得られる「ヒト多能性幹細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物」に含まれる細胞を、後述のような毒性や薬効の評価、疾患の病態解析、又は治療薬スクリーニング等に用いてもよい。上記培養物から細胞を回収し、回収された細胞を、目的に応じた培養器材に播種して、必要に応じてさらに培養した後、毒性や薬効の評価、疾患の病態解析、又は治療薬スクリーニング等に用いてもよい。上記培養物から回収された細胞を、後述のようなキットの構成要素としてもよい。上記培養物から回収された細胞を適当な細胞分離技術を用いて選別することにより、より高純度な栄養膜細胞を得てもよい。
【００４９】
本発明製造方法２により製造される「ヒト多能性幹細胞から分化した合胞体栄養膜細胞」は、栄養膜細胞同士が融合した形態を示し、顕微鏡観察等で確認が可能である。
合胞体栄養膜細胞への分化は、マーカー遺伝子の発現を通常の生化学的手法を用いて測定することによっても確認が可能である。マーカー遺伝子の発現を測定する方法としては、例えば、細胞を含む培養物からtotal RNAを抽出して逆転写反応を行い、得られたＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲを行うことによりマーカー遺伝子の発現有無又はその程度を調べる方法や、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質に対する抗体を用いて細胞を免疫染色することにより、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質の発現有無又はその程度を調べる方法を挙げることができる。
合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子としては、GCM1遺伝子、Syncytin1遺伝子、CGA遺伝子、CGB遺伝子、CSH1遺伝子、HOPX遺伝子、TFAP2A遺伝子等が挙げられる。
【００５０】
「ヒト多能性幹細胞から分化した合胞体栄養膜細胞」を含む培養物を得るまでの培養期間は、培養条件、培地の種類、細胞の種類や状態等によって異なるが、通常、本分化培養開始から約３日間から約１２日間であり、好ましくは約４日間から約６日間である。
【００５１】
本発明製造方法２により得られる「ヒト多能性幹細胞から分化した合胞体栄養膜細胞を含む培養物」に含まれる細胞を、後述のような毒性や薬効の評価、疾患の病態解析、又は治療薬スクリーニング等に用いてもよい。上記培養物から細胞を回収し、回収された細胞を、目的に応じた培養器材に播種して、必要に応じてさらに培養した後、毒性や薬効の評価、疾患の病態解析、又は治療薬スクリーニング等に用いてもよい。上記培養物から回収された細胞を、後述のようなキットの構成要素としてもよい。上記培養物から回収された細胞を適当な細胞分離技術を用いて選別することにより、より高純度な合胞体栄養膜細胞を得てもよい。
【００５２】
本発明は、本発明製造方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞の毒性や薬効の評価用試薬としての使用、本発明製造方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞の、胎盤組織の障害に基づく疾患の病態解析用試薬としての使用、及び、本発明製造方法により製造される人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞を含むキット等も含む。
【００５３】
本発明製造方法により製造された人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞は、in vitroヒト胎盤透過性試験法、該試験法による毒性または薬効評価、ヒト胎盤細胞に対する毒性または薬効評価、胎盤組織の障害に基づく疾患の病態解析、該疾患に対する治療薬スクリーニング等に利用可能である。例えば、本発明製造方法により製造された人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞に被験物質を接触させ、該物質の該細胞に対する透過性、または、該物質が該細胞に及ぼす影響を検定することにより、該物質の毒性または薬効を評価する。本発明製造方法により製造された人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞を用いて、例えば、当該細胞に係る物質透過性、細胞増殖または遺伝子発現等を試験し、当該細胞が関与する生体内物質輸送やホルモン分泌等を調べることにより、胎盤組織の障害に基づく疾患の病態解析を行う。
胎盤組織の障害に基づく疾患としては、妊娠高血圧腎症（preeclampsia）、妊娠高血圧（gestational hypertension）、加重型妊娠高血圧腎症（superimposed preeclampsia）及び子癇（eclampsia）等を含む妊娠高血圧症候群（ＰＩＨ）、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、絨毛癌、胞状奇胎、奇胎妊娠等が挙げられる。
【００５４】
本発明製造方法により製造された人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞を含有するキットは、上記のような胎盤透過性試験、毒性または薬効評価、胎盤組織の障害に基づく疾患の病態解析、該疾患に対する治療薬スクリーニング等に利用可能である。当該キットには、本発明製造方法により製造された人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞以外に、必要に応じて、その他の器材や試薬等を添付してもよい。その他の器材や試薬としては、例えば、化合物の透過性を評価することが可能な培養器材（例えば、Corning  Cat.3470のトランズウェルクリアー等）や、本発明製造方法により製造された人工栄養膜細胞又は人工合胞体栄養膜細胞が培養されるウェルと、当該細胞以外の細胞が培養されるウェルとが連結された培養器材（例えば、オーガンオンチップ等）、又は、凍結された細胞の復元や培養に用いられる培地等が挙げられる。
【００５５】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５６】
実施例1：ＧＣＭ１ノックインヒトＥＳ細胞の樹立
合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子の1つであるＧＣＭ１遺伝子座にＧＦＰをコードする塩基配列がノックインされたヒトＥＳ細胞株を以下のように作製した。
ヒトＥＳ細胞株 ＫｈＥＳ−１（京都大学より入手）のゲノムＤＮＡ上のＧＣＭ１遺伝子における翻訳開始点の１５塩基上流から、翻訳開始点の２０塩基下流までの塩基配列（配列番号１に示される塩基配列；TGGCCTGACCTTATCatggaaCCTGACGACTTTGAT）を標的とするZinc Finger Nuclease（ＺＦＮ）をコードするｍＲＮＡをSigma-Aldrich社から購入した。ＡｃＧＦＰ遺伝子（タカラバイオ）及びネオマイシン耐性遺伝子を含むノックインベクターを作製した。単一に分散したヒトＥＳ細胞株 ＫｈＥＳ−１に、エレクトロポレーション法により、上記ＺＦＮをコードするｍＲＮＡと作製したノックインベクターとを共導入し、前記導入処理後の細胞をマイトマイシンＣ（Sigma-Aldrich）処理したネオマイシン耐性マウス線維芽細胞（オリエンタル酵母）上へ播種した。播種翌日から培地中にＧ４１８（ナカライテスク）を添加し、薬剤選択を行った。得られた耐性クローンのコロニーをピックアップして培養を続け、ＰＣＲ法により、ＧＣＭ１コード領域における開始コドン直後にＡｃＧＦＰをコードする塩基配列が対立遺伝子座の一方にのみノックインされた細胞を選別した。選別された細胞を、以下、ＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞と記す。【００５７】
実施例２：ヒトＥＳ細胞から分化した合胞体栄養膜細胞の製造
（１）ＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞の調製
実施例１にて作製されたＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」、「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に倣い、マイトマイシンC処理したマウス線維芽細胞（リプロセル）上に播種し、３７℃、２％  ＣＯ２条件下で維持培養した。その際の培地には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma-Aldrich）に、２０％  KnockOutTM  Serum Replacement（ＫＳＲ、Invitrogen）、０．１ｍＭ  nonessential amino acids（ＮＥＡＡ、Invitrogen）、２ｍＭ  L-glutamine（Sigma-Aldrich）、及び０．１ｍＭ  2−メルカプトエタノール（Wako）が添加された培地（以下、ｈＥＳ培地と記す。）に、ｂＦＧＦ（Wako）を１０ｎｇ／ｍｌ添加して用いた。
維持培養されたＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞を、セルカルチャーディッシュに接着したままで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Invitrogen）で２回洗浄した後、０．２５％  トリプシン（Invitrogen）、１ｍｇ／ｍｌ  collagenaseＩＶ（Invitrogen）、２０％  ＫＳＲ、及び１mM  ＣａＣｌ２（ナカライテスク）が添加されたＰＢＳを当該ディッシュに添加し、３７℃、２％ ＣＯ２条件下で５分間インキュベートした。前記ディッシュにｈＥＳ培地を添加した後、ピペッティングにより細胞を剥離して、細胞を含む培地を回収し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、３分間）を行った。遠心分離された前記培養物から上清を除去した後、沈殿に、Y-27632（Wako）を２０μＭ添加したhES培地を添加して細胞塊を懸濁した後、得られた細胞塊懸濁液を０．１％ゼラチン（Sigma-Aldrich）でコートしたセルカルチャーディッシュ（BD Falcon）上に播種し、３７℃、２％  ＣＯ２条件下で１．５時間乃至２時間インキュベートした。ディッシュに接着していないＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞塊を培地とともに回収することにより、ＭＥＦが含まれないＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞塊の懸濁液を得た（当該操作を、以下、ＭＥＦ除去操作と記すことがある。）。
（２）ＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞の合胞体栄養膜細胞への分化誘導
上記のようにして調製されたＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞塊をTrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を９６穴培養プレート１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％  ＣＯ２条件下で維持培養した。その際の培地には、ＭＥＦをｈＥＳ培地で一晩培養した上清（以下、ＭＥＦ−ＣＭと記す。）に、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y-27632を添加した培地を用いた。維持培養開始から２日後に、上記培地を、１０％  ＦＢＳ（コーニング）、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin（Penicillin‐Streptomycin Mixed Solution、ナカライテスク）、及び３ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４(Ｒ＆Ｄ) が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（以下、基礎分化培地Ａと記す。）、または、基礎分化培地Ａに、０．１％  ＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich）、1μM  S26948（PPARγ agonist、Tocris Bioscience） 、1μM  GW 1929（PPARγ agonist、Tocris Bioscience）、1μM  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator、Tocris Bioscience）、1μM  SR 11237（RXR agonist、Tocris Bioscience）、もしくは1nM  レチノイン酸（RAR agonist、Sigma-Aldrich）のいずれかが添加された分化培地に置換し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の3日後に、それぞれ同じ組成の分化培地への培地交換を行った。各分化培地の組成を表1に記す。S26948、GW 1929、CGP 7930及びSR 11237は各々１ｍMとなるように、レチノイン酸は10mMとなるように、各々ＤＭＳＯに溶解させ、各DMSO溶液を基礎分化培地Ａへ添加した。【００５８】
【表１】
2016186078.tif 000002
基礎分化培地A：１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin及び３ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地
【００５９】
分化培地を用いた培養の6日目に、細胞をPBS（Invitrogen）にて２回洗浄した後、４％  パラホルムアルデヒド（Wako）を用いて１５分間固定した。前記細胞を０．３％  トライトンＸ−１００（Wako）を添加したＰＢＳを用いて５分間膜透過処理したのち、細胞をPBSにて３回洗浄した。次いで、前記細胞を３％  Bovine Serum Albumin（BSA、Sigma-Aldrich）を用いて１時間乃至２時間ブロッキングしたのち、５μｇ／ｍｌ  chicken anti-GFP antibody（Abcam）、２μｇ／ｍｌ  goat anti-chicken IgG antibody Alexa 488（Life technologies）および１μｇ／ｍｌ  Hoechst 33342（同仁化学）を用いて免疫染色した。得られた染色試料について、全自動イメージアナライザーArrayscan（Thermo Scientific）を用いて、ＧＣＭ１遺伝子が発現したことを示すＧＦＰ陽性細胞の割合を定量した。結果を図1に示す。溶媒であるＤＭＳＯのみを添加した対照（Control A）と比べ、PPARγ agonistであるS26948（１−１）もしくはGW 1929（１−２）、GABABR positive allosteric modulatorであるCGP 7930（１−３）、または、RXR agonistであるSR 11237（1−4）の添加により、ＧＦＰ陽性細胞の割合が２０％程度増加した。RAR agonistであるレチノイン酸（１−５）の添加により、レチノイン酸非添加の対照（Control B）と比べて、ＧＦＰ陽性細胞の割合が６％程度増加した。【００６０】
実施例３：ヒトＥＳ細胞から分化した合胞体栄養膜細胞の製造
実施例２の（１）に記載の方法に倣って、ＫｈＥＳ−１細胞を維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付した。ＭＥＦ除去操作を行ったＫｈＥＳ−１細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を９６穴培養プレート１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％  ＣＯ２条件下で維持培養した。その際の培地には、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y-27632を添加した培地を用いた。維持培養開始から２日後に、上記培地を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin 、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、および３００ｎＭ  PD 173074（ＦＧＦシグナル伝達阻害物質、Sigma-Aldrich）が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（以下、基礎分化培地Ｂと記す。）；基礎分化培地Ｂに、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、１０μＭ  GW 1929（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）もしくは１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）のいずれかが添加された分化培地；基礎分化培地Ｂに、０．１μＭ  S26948、０．１μＭ  CGP 7930および１０ｎＭ  SR 11237が添加された分化培地；基礎分化培地Ｂに、０．１μＭ  S26948、０．１μＭ  CGP 7930および１ｎＭ  レチノイン酸が添加された分化培地；基礎分化培地Ｂに、０．１μＭ  S26948、０．１μＭ  CGP 7930、１０ｎＭ  SR 11237および１ｎＭ  レチノイン酸が添加された分化培地；または、基礎分化培地Ｂに、1０μＭ  GW 1929、０．１μＭ  CGP 7930、１０ｎＭ  SR 11237および１ｎＭ  レチノイン酸が添加された分化培地に置換し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への培地交換を行った。各分化培地の組成を、表２に記す。S26948、GW 1929、CGP 7930及びSR 11237は、各々100mMとなるように、レチノイン酸は10mMとなるように、各々ＤＭＳＯに溶解させ、各DMSO溶液を基礎分化培地Bへ添加した。【００６１】
【表２】
2016186078.tif 000003
基礎分化培地B：１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin 、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４ 、および３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地
【００６２】
分化培地を用いた培養の５日目に、RNeasy Micro Kit（QIAGEN）を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAをSuperScript III（Invitrogen）を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe（Applied biosystems）およびTaqMan Fast advanced master mix（Applied biosystems）を用いたリアルタイムＰＣＲにより、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子であるSyncytin遺伝子の発現量を調べた。上記各培養で得られた細胞について、Syncytin遺伝子のｍＲＮＡ量およびハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。Syncytin遺伝子のｍＲＮＡ量をＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量で除して得られる値をSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量の補正値とし、基礎分化培地Ｂで培養した細胞（Control）におけるSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を１として、他の各培地で培養した細胞におけるSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を相対発現量として示した。上記の細胞培養からｍＲＮＡ量の測定までを３回反復して実施した。結果を図２に示す。図２において、相対発現量の標準誤差をエラーバーで示す。Controlの相対発現量に対して統計的に有意に差がある相対発現量にアスタリスクを付す（**はＰ値０．００１以上０．０１未満を、***はP値０．００１未満を意味する）。基礎分化培地Ｂで培養した細胞（Control）に比べて、PPARγ agonistであるS26948（２−１）もしくはGW 1929（２−２）、GABABR positive allosteric modulatorであるCGP 7930（２−３）、RXR agonistであるSR 11237（２−４）またはRAR agonistであるレチノイン酸（２−５）のいずれか添加された分化培地で培養した細胞において、Syncytin遺伝子の相対発現量が増加した。PPARγ agonistであるS26948もしくはGW 1929と、GABABR positive allosteric modulatorであるCGP 7930、RXR agonistであるSR 11237およびRAR agonistであるレチノイン酸からなる群より選ばれる２つ以上とが添加された分化培地で培養した細胞（２−６及び２−７）においては、Syncytin遺伝子の相対発現量がより増加した。PPARγ agonistであるS26948もしくはGW 1929と、GABABR positive allosteric modulatorであるCGP 7930、RXR agonistであるSR 11237およびRAR agonistであるレチノイン酸とが添加された分化培地で培養した細胞（２−８及び２−９）においては、Syncytin遺伝子の相対発現量がさらに増加した。【００６３】
実施例４：ヒトＥＳ細胞から分化した合胞体栄養膜細胞の製造
ＫｈＥＳ−１細胞を実施例２の（１）に記載の方法に倣って、維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付した。
ＭＥＦ除去操作を行ったＫｈＥＳ−１細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％  ＣＯ２条件下で維持培養した。
一方、ＭＥＦ除去操作を行ったＫｈＥＳ−１細胞塊を、１０００μｌフィルターチップ（日本ジェネティクス）を用いて１０回乃至２０回ピペッティングを行うことにより数十個の細胞からなる細胞塊とし、得られた細胞塊を１ウェルあたり約１．５×１０３細胞乃至約４×１０３細胞相当となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％ＣＯ２条件下で維持培養した。
上記いずれの細胞播種条件においても、維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに１０ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ及び２０μＭ Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、上記培地を、基礎分化培地Ｂ（１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、および３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）、および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地に置換し（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行い、更に２日間培養した。
比較例として、上記の２種の条件で播種したＫｈＥＳ−１細胞をそれぞれ、上記と同様に維持培養し、維持培養開始から２日後に、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、１μＭ  A83-01（アクチビンシグナル伝達阻害物質Wako）および０．１μＭ  PD 173074（ＦＧＦシグナル伝達阻害物質）を添加した分化培地（非特許文献２に記載）への培地交換を行って（この時をday 0とする。）、その後３日間培養し、同じ組成の分化培地への培地交換を行って更に２日間培養した。培養は３７℃、５％  ＣＯ２条件下で行った。
分化を誘導しない対照として、上記の２種の条件で播種したＫｈＥＳ−１細胞をそれぞれ、上記と同様に維持培養し、維持培養開始から２日後に、ＭＥＦ−ＣＭに４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加した培地への培地交換を行って（この時をday 0とする。）、その後３日間培養し、同じ組成の培地への培地交換を行って更に２日間培養した。培養は３７℃、２％  ＣＯ２条件下で行った。
播種条件とday 0以後に用いた培地の組成を、表３に記す。【００６４】
【表３】
2016186078.tif 000004
基礎分化培地B：１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin 、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４ 、および３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地
【００６５】
day 0から５日目に、RNeasy Micro Kit（QIAGEN）を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAを、SuperScript III（Invitrogen）を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe（Applied biosystems）およびTaqMan Fast advanced master mix（Applied biosystems）を用いたリアルタイムPCRにより、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子であるSyncytin遺伝子の発現量を調べた。上記各培養で得られた細胞について、Syncytin遺伝子のｍＲＮＡ量およびハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。Syncytin遺伝子のｍＲＮＡ量をＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量で除して得られる値をSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量の補正値とし、３−２の条件で播種し培養した細胞におけるSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を１として、他の各条件で培養した細胞におけるSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を相対発現量として示した。上記の細胞培養からｍＲＮＡ量の測定までを３回反復して実施した。結果を図３に示す。図３において、相対発現量の標準誤差をエラーバーで示す。比較例３−２の相対発現量に対して統計的に有意に差がある相対発現量にアスタリスクを付す（*はＰ値０．０１以上０．０５未満を、***はＰ値０．００１未満を意味する）。PPARγ agonistであるS26948、GABABR positive allosteric modulatorであるCGP 7930、RXR agonistであるSR 11237およびRAR agonistであるレチノイン酸を含む分化培地で培養した細胞（３−３、３−６）において、細胞塊を播種した場合と単一に分散した細胞を播種した場合のいずれでも、比較例（３−２、３−５）と比べて、Syncytin遺伝子の相対発現量が増加することが示された。細胞塊を播種する（３−３）よりも、単一に分散した細胞を播種した（３−６）方が、Syncytin相対遺伝子の発現量が増加することが示された。【００６６】
実施例５：ヒトＥＳ細胞から分化した合胞体栄養膜細胞の製造
実施例１で作製されたＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞を実施例２の（１）に記載の方法に倣って、維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付した。
（１）本発明製造例
本発明の製造例として、ＭＥＦ除去操作を行ったＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％ＣＯ２条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、上記培地を、基礎分化培地Ｂ（１０％  FBS、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４ 、および３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）  および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地に置換し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行った。
（２）比較製造例
比較製造例として、MEF除去操作を行ったＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞の塊を、１０００μｌフィルターチップ（日本ジェネティクス）を用いて１０回乃至２０回ピペッティングを行うことにより数十個の細胞からなる細胞塊とし、得られた細胞塊を１ウェルあたり約１．５×１０３細胞乃至約４×１０３細胞相当となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％ＣＯ２条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、 1μＭ  A83-01および０．１μＭ  PD 173074を添加した分化培地（非特許文献２に記載）への培地交換を行って、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日後に、同じ組成の分化培地への培地交換を行った。
（３）細胞観察
分化培地を用いた培養の５日目に、細胞をＰＢＳにて２回洗浄した後、４％  パラホルムアルデヒドを用いて１５分間固定した。前記細胞を０．３%  トライトンＸ−１００（Wako）を添加したＰＢＳを用いて５分間膜透過処理したのち、細胞をPBSにて３回洗浄した。次いで、前記細胞を３％  ＢＳＡにより１時間乃至２時間ブロッキングした後、５μｇ／ｍｌ  chicken anti-GFP antibody（Abcam）, ２μｇ／ｍｌ  goat anti-chicken IgG antibody Alexa 488（Life technologies）および１μｇ／ｍｌ  Hoechst 33342 (同仁化学)を用いて免疫染色した。得られた染色試料の免疫染色像を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。
比較製造例では、ＧＣＭ１遺伝子が発現したことを示すＧＦＰ陽性細胞が５割程度しか認められなかった（図４Ａ）のに対し、本発明の製造例では、９割程度がＧＦＰ陽性細胞であった（図４Ｂ）。さらに、本発明の製造例では、合胞体性栄養膜細胞の特徴である融合した細胞様の形態が観察された（図４Ｂ）。【００６７】
実施例６：ヒトＥＳ細胞から分化した合胞体栄養膜細胞の製造
ＫｈＥＳ−１細胞を実施例２の（１）に記載の方法に倣って、維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付した。
（１）本発明製造例
本発明の製造例として、ＭＥＦ除去操作を行ったＫｈＥＳ−１細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％ＣＯ２条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、上記培地を、基礎分化培地Ｂ（１０％  FBS、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４ 、および３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）  および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地に置換し（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行った。
（２）比較製造例
比較例として、MEF除去操作を行ったＫｈＥＳ−１細胞の塊を、１０００μｌフィルターチップ（日本ジェネティクス）を用いて１０回乃至２０回ピペッティングを行うことにより数十個の細胞からなる細胞塊とし、得られた細胞塊を１ウェルあたり約１．５×１０３細胞乃至約４×１０３細胞相当となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％ＣＯ２条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、 1μＭ  A83-01および０．１μＭ  PD 173074を添加した分化培地（非特許文献2に記載）への培地交換を行って（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日後に、同じ組成の分化培地への培地交換を行った。
（３）対照（未分化維持培養）
分化を誘導しない対照として、MEF除去操作を行ったＫｈＥＳ−１細胞の塊を、１０００μｌフィルターチップ（日本ジェネティクス）を用いて１０回乃至２０回ピペッティングを行うことにより数十個の細胞からなる細胞塊とし、得られた細胞塊を１ウェルあたり約１．５×１０３細胞乃至約４×１０３細胞相当となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％ＣＯ２条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、ＭＥＦ−ＣＭに４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加した培地への培地交換を行って（この時をday 0とする。）、その後３日間培養し、同じ組成の培地への培地交換を行って更に２日間培養した。培養は３７℃、２％  ＣＯ２条件下で行った。
（４）遺伝子発現解析
day ０から５日目に、RNeasy Micro Kit（QIAGEN）を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAを、SuperScript III（Invitrogen）を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe（Applied biosystems）およびTaqMan Fast advanced master mix（Applied biosystems）を用いたリアルタイムＰＣＲにより、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子として知られるＧＣＭ１遺伝子、Syncytin遺伝子、ＨＯＰＸ遺伝子、ＴＦＡＰ２Ａ遺伝子およびＣＧＡ遺伝子、ならびに、合胞体栄養膜細胞とは異なる系列の胎盤系細胞である絨毛外栄養膜細胞のマーカー遺伝子として知られるＨＬＡ−Ｇ遺伝子の発現量を調べた。上記各培養で得られた細胞について、上記各合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡ発現量、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子のｍＲＮＡ発現量およびハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。上記各合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子のｍＲＮＡ量をＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量で除して得られる値を当該合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子ｍＲＮＡ量の補正値とし、比較製造例（（２）に記載）で得られた細胞における合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を１として、本発明製造例（（１）に記載）または対照（（３）に記載）で得られた細胞における合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を相対発現量として示した。ＨＬＡ−Ｇ遺伝子のｍＲＮＡ量についても、同様のデータ処理を行い、相対発現量として示した。上記の細胞培養からｍＲＮＡ量の測定までを３回反復して実施した。結果を図５に示す。図５において、対照（未分化維持培養）の細胞における相対発現量を白棒グラフで、比較例の細胞における相対発現量を灰色棒グラフで、本発明製造例の細胞における相対発現量を黒棒グラフで示す。相対発現量の標準誤差をエラーバーで示す。比較製造例の相対発現量に対して統計的に有意に差がある相対発現量にアスタリスクを付す（**はP値０．００１以上０．０１未満を、***はP値０．００１未満を意味する）。本発明製造例で得られた細胞では、比較製造例で得られた細胞と比べて、各合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子の相対発現量が５倍から２０倍有意に増加し（図５Ａ）、絨毛外栄養膜細胞マーカー遺伝子の相対発現量が約４割に減少していた（図５Ｂ）。
この結果から、本発明製造方法により、ヒトＥＳ細胞から、合胞体栄養膜細胞を高効率に製造可能であることが示された。【００６８】
実施例７：ヒトＥＳ細胞から分化した合胞体栄養膜細胞の製造
ＫｈＥＳ−１細胞を実施例２の（１）に記載の方法に倣って維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付した。ＭＥＦ除去操作を行ったＫｈＥＳ−１細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％  ＣＯ２条件下で維持培養した。その際の培地には、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y−27632を添加した培地を用いた。
（１）対照
維持培養開始から２日後に、上記培地を、基礎分化培地Ｂ（１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、及び３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に置換し（この時を分化培養のday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で5日間培養した（Control）。前記培地置換の３日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行った。
（２）本発明製造例
維持培養開始から２日後に、基礎分化培地Ｂ、又は、基礎分化培地Ｂに０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）  および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地（以下、分化培地Ｂと記すことがある。）への置換を行い（この時を分化培養のday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で5日間培養した。
維持培養開始から２日後に基礎分化培地Ｂへの培地置換を行ったウェルの一部については、基礎分化培地Ｂを用いた培養開始から１、２、３または４日目に、分化培地Ｂへの置換を行い、５日目まで培養を継続した。
維持培養開始から２日後に分化培地Ｂへの培地置換を行ったウェルの一部については、分化培地Ｂを用いた培養開始から１、２、３または４日目に、基礎分化培地Ｂへの置換を行い、５日目まで培養を継続した。
すなわち、分化培養０日から５日、分化培養２日から５日、分化培養３日から５日、もしくは分化培養４日から５日（図６Ａ）、分化培養０日から２日、分化培養０日から３日、分化培養０日から４日、もしくは分化培養０日から５日（図６Ｂ）、または、分化培養０日から１日、分化培養１日から５日、もしくは分化培養０日から５日（図６Ｃ）の期間は、分化培地Ｂを用いて培養し、その他の期間は基礎分化培地Ｂを用いて培養した。
いずれの場合も、分化培養３日目からは、PD 173074を含まないこと以外は上記と同じ組成の培地を用いた。
（３）遺伝子発現解析
分化培養５日目に、RNeasy Micro Kit（QIAGEN）を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAを、SuperScript III（Invitrogen）を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe（Applied biosystems）およびTaqMan Fast advanced master mix（Applied biosystems）を用いたリアルタイムPCRにより、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子であるGCM1遺伝子及びSyncytin遺伝子の発現量を調べた。ＧＣＭ１遺伝子、Syncytin遺伝子およびハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。Syncytin遺伝子のｍＲＮＡ量をＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量で除して得られる値をSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量の補正値とし、対照（（１）に記載）で得られた細胞におけるSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を１として、本発明製造例（（２）に記載）で得られた細胞におけるSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を相対発現量として示した。ＧＣＭ１遺伝子のｍＲＮＡ量についても、同様のデータ処理を行い、相対発現量として示した。結果を図６に示す。図６において、本発明製造例を、分化培地Bでの培養期間（日）で特定して示し、ＧＣＭ１遺伝子の相対発現量を灰色棒グラフで、Syncytin遺伝子の相対発現量を黒棒グラフで示す。
分化培養開始から２日目以降に、分化培地Ｂでの培養を開始した場合、基礎分化培地Ｂのみで５日間培養した場合（Control）と比べて、合胞体栄養膜細胞マーカー遺伝子であるＧＣＭ１遺伝子およびSyncytin遺伝子の発現量の大きな増加は認められなかった（図６Ａ：２−５、３−５及び４−５）。分化培養２日目より前に分化培地Ｂでの培養を開始した場合、Controlと比べて、ＧＣＭ１遺伝子およびSyncytin遺伝子の発現量が２倍以上増加し、分化培養５日目より前に基礎分化培地Bへ置換しても、ＧＣＭ１遺伝子およびSyncytin遺伝子の発現量がControlよりも高かった（図６Ｂ及びＣ）。５日間の分化培養の全期間において、基礎分化培地ＢにPPARγ agonistであるS26948、GABABR positive allosteric modulatorであるCGP 7930、RXR agonistであるSR 11237およびRAR agonistであるレチノイン酸を含む分化培地（分化培地Ｂ）で培養した場合、Controlと比べ、ＧＣＭ１遺伝子およびSyncytin遺伝子の発現量が２倍乃至４倍程度増加した（図６Ａ、Ｂ及びＣ）。【００６９】
実施例８：ヒトＥＳ細胞から分化した栄養膜細胞及び合胞体栄養膜細胞の製造
ＫｈＥＳ−１細胞を、実施例２の（１）に記載の方法に倣って、維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付した。ＭＥＦ除去操作を行ったＫｈＥＳ−１細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％  ＣＯ２条件下で維持培養した。その際の培地には、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、２０μＭ  Y−27632を添加した培地を用いた。維持培養開始から２日後に、上記培地を、基礎分化培地Ｂ（１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、 １００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ SR 11237（RXR agonist）および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地に置換し（この時を分化培養のday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で5日間培養した。分化培養３日目に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の培地への交換を行った。
分化培養０、１、２、３、４および５日目に、RNeasy Micro Kit（QIAGEN）を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAを、SuperScript III（Invitrogen）を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe（Applied biosystems）およびTaqMan Fast advanced master mix（Applied biosystems）を用いたリアルタイムPCRにより、栄養膜細胞マーカーＫＲＴ７遺伝子、ならびに、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子であるＧＣＭ１遺伝子及びSyncytin遺伝子の発現量を調べた。ＫＲＴ７遺伝子、ＧＣＭ１遺伝子、Syncytin遺伝子およびハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。Syncytin遺伝子のｍＲＮＡ量をＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量で除して得られる値をSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量の補正値とし、分化培養５日目で得られた細胞におけるSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を１として、分化培養０、１、２、３又は４日目で得られた細胞におけるSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を相対発現量として示した。ＫＲＴ７遺伝子及びＧＣＭ１遺伝子のｍＲＮＡ量についても、同様のデータ処理を行い、相対発現量として示した。結果を図７に示す。図７において、ＫＲＴ７遺伝子の相対発現量を白色棒グラフで、ＧＣＭ１遺伝子の相対発現量を灰色棒グラフで、Syncytin遺伝子の相対発現量を黒棒グラフで示す。
分化培養0日目では、ＫＲＴ７遺伝子、ＧＣＭ１遺伝子及びSyncytin遺伝子のすべての発現が検出されなかった。ＫＲＴ７遺伝子の発現量は、分化培養１日目から検出され、分化培養５日目に最も高くなった。ＧＣＭ１遺伝子の発現量は、分化培養２日目から増加し、分化培養４日目に最も高くなった。Syncytin遺伝子の発現量は、分化培養３日目から増加し、分化培養５日目に最も高くなった。
実施例７において、ＧＣＭ１遺伝子およびSyncytin遺伝子の発現量がControlよりも増加した「分化培養２日目より前に分化培地Bでの培養を開始した場合」の「分化培養２日目より前」の時期は、「培養物中にGCM1 mRNAを発現する細胞が出現する前」の時期に相当することが示唆された。【００７０】
実施例９：ヒトＥＳ細胞から分化した合胞体栄養膜細胞の製造
実施例１で作製されたＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞を、実施例２の（１）に記載の方法に倣って、維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付した。
ＭＥＦ除去操作を行ったＧＣＭ１−ＧＦＰノックインヒトＥＳ細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％  ＣＯ２条件下で維持培養した。その際の培地には、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y−27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、上記培地を、基礎分化培地Ｂ（１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、及び３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、レチノイン酸（RAR agonist） を１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、もしくは１０００ｎＭとなるように添加した分化培地；または、基礎分化培地ＢにＤＭＳＯを０．０１％の濃度になるように添加した分化培地に交換し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の培地への交換を行った。
分化培地を用いた培養の５日目に、細胞をPBS（Invitrogen）にて２回洗浄した後、４％  パラホルムアルデヒド（Wako）を用いて１５分間固定を実施した。前記細胞を０．３％  トライトンＸ−１００（Wako）を添加したＰＢＳを用いて５分間膜透過処理したのち、細胞をPBSにて３回洗浄した。次いで、前記細胞を３％  ＢＳＡにより１時間乃至２時間ブロッキングした後、５μｇ／ｍｌ  chicken anti-GFP antibody（Abcam）、２μｇ／ｍｌ  goat anti-chicken IgG antibody Alexa 488（Life technologies）および１μｇ／ｍｌ  Hoechst 33342 (同仁化学)を用いて免疫染色した。得られた染色試料について、全自動イメージアナライザーArrayscan（Thermo Scientific）を用いてＧＦＰ陽性細胞の割合を定量した。上記の細胞培養からＧＦＰ陽性細胞の測定までを３回反復して実施した。結果を図８に示す。ＧＦＰ陽性細胞の割合の標準誤差をエラーバーで示す。
１ｎＭまたは１０ｎＭのレチノイン酸が添加された分化培地を用いた場合は、レチノイン酸が添加されていない分化培地を用いた場合（Control）と比べて、ＧＦＰ陽性細胞の割合が１０％前後増加した。一方、１００ｎＭ以上のレチノイン酸が添加された分化培地を用いた場合は、Controlと比べてＧＦＰ陽性細胞の割合が１０％以上減少した。【００７１】
実施例１０：ヒトＥＳ細胞から分化した合胞体栄養膜細胞の製造
ＫｈＥＳ−１細胞を、実施例２の（１）に記載の方法に倣って、維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付した。
ＭＥＦ除去操作を行ったＫｈＥＳ−１細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％  ＣＯ２条件下で維持培養した。その際の培地には、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y−27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin及び１００μｇ／ｍｌ  streptomycinが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（以下、基礎培地Ｃと記す。）；基礎培地Ｃに１ｎＭもしくは１０００ｎＭ  レチノイン酸が添加された培地；基礎培地Ｃに１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４が添加された分化培地；基礎培地Ｃに１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４及び１ｎＭレチノイン酸が添加された分化培地；または、基礎培地Ｃに１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４及び１０００ｎＭレチノイン酸が添加された分化培地に置換し（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日後に、同じ組成の培地への交換を行い、更に２日間培養した。
day 0から５日目に、RNeasy Micro Kit（QIAGEN）を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAを、SuperScript III（Invitrogen）を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe（Applied biosystems）およびTaqMan Fast advanced master mix（Applied biosystems）を用いたリアルタイムPCRにより、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子であるSyncytin遺伝子の発現量を調べた。上記各培養で得られた細胞について、Syncytin遺伝子およびハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。Syncytin遺伝子のｍＲＮＡ量をＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量で除して得られる値を、Syncytin遺伝子の相対発現量として示した。結果を図９に示す。図９のＡには、ＢＭＰ４が添加されていない培地を用いた場合の結果を示し、図９のＢには、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４が添加された分化培地を用いた場合の結果を示す。
ＢＭＰ４非存在下では、１０００ｎＭのレチノイン酸が添加された培地を用いた場合に、レチノイン酸が添加されていない培地を用いた場合と比べて、Syncytin遺伝子の相対発現量がわずかに増加した（図９Ａ）。一方、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４ 存在下では、レチノイン酸が添加されていない培地を用いた場合と比べて、１ｎＭのレチノイン酸が添加された分化培地を用いた場合にはSyncytin遺伝子の相対発現量が増加し、１０００ｎＭのレチノイン酸が添加された分化培地を用いた場合にはSyncytin遺伝子の相対発現量が減少した（図９Ｂ）。【００７２】
実施例１１：  ヒトＥＳ細胞から分化した栄養膜細胞及び合胞体栄養膜細胞の製造とこれらを用いる細胞層透過性試験
ヒトＥＳ細胞を実施例２の（１）に記載の方法に倣って、維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付す。
ＭＥＦ除去操作を行ったヒトＥＳ細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレートに播種し、３７℃、２％ＣＯ２条件下で維持培養する。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y-27632を添加した培地を用いる。
維持培養開始から２日後に、上記培地を、基礎分化培地Ｂ（１０％  FBS、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４ 、および３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）  および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地に置換して（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で1日間乃至２日間培養し、上記ヒトＥＳ細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得る。得られる培養物について、必要に応じて、Cytokeratin7をコードするmRNAを発現し、SyncytinをコードするmRNAを発現していない細胞の存在を確認する。
上記培養で得られた細胞をセルカルチャーインサート（Corning、Cat.3470、メンブレン孔サイズ０．４μｍ）上で、３７℃、５％  ＣＯ２条件下に１日間乃至４日間培養する。培地には、基礎分化培地Ｂ（１０％  FBS、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４ 、および３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）  および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地を用いる。day 0から３日目以降は、PD 173074を含まないこと以外は上記と同じ組成の分化培地を用いる。必要に応じて、上記ヒトＥＳ細胞から分化した合胞体栄養膜細胞の出現を確認する。
「Poulsen, M. et al. Toxicology in Vitro 2009, 23, 1380-1386」等に記載の胎盤透過性試験方法を参考に被験物質の透過性試験を行う。
上記セルカルチャーインサート上に形成された細胞層の電気抵抗値（Ω）をMillicell ERS-2（Millipore）を用いて測定し、得られた測定値から細胞を播種していないブランクの電気抵抗値を引きメンブレンフィルターの面積（ｃｍ２）を掛けた値である経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ、Ω・ｃｍ２）を求める。ＴＥＥＲ値が３５以上となるタイトジャンクションを形成した細胞層を透過性試験に用いる。
インサート内およびマルチプルウェルプレート内の培地をHanks’ Balanced Salt Solution（ＨＢＳＳ）（no phenol red、ライフテクノロジーズ）に置換し、３７℃  ５％  ＣＯ２条件下で３０分間乃至４５分間インキュベートする。インサート内（アピカル側）の培地を被験物質を含んだＨＢＳＳに置換し、７０ｒｐｍで攪拌しながら３７℃、０％乃至５％  ＣＯ２条件下で培養する。３０分、６０分、９０分および１２０分後にマルチプルウェルプレート内から培地１００μｌを採取し、同量のＨＢＳＳを添加する。マルチプルウェルプレート内の培地中の被験物質を蛍光プレートリーダー（PerkinElmer）やＬＣ−ＭＳ等を用いて定量することによって、上記細胞層における被験物質の透過性を評価する。【００７３】
実施例１２：  ヒトｉＰＳ細胞から分化した栄養膜細胞及び合胞体栄養膜細胞の製造
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（京都大学ｉＰＳ研究所より入手）を、実施例２の（１）に記載の方法に倣って、維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付す。
ＭＥＦ除去操作を行ったヒトｉＰＳ細胞の塊を。TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％  ＣＯ2条件下で維持培養する。その際の培地には、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y−27632を添加した培地を用いる。
維持培養開始から２日後に、上記培地を、基礎培地Ｂ（１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）もしくは１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）のいずれかが添加された分化培地；または、０．１μＭ  S26948、０．１μＭ  CGP 7930、１０ｎＭ  SR 11237および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）からなる群より選ばれる２種以上が添加された分化培地に置換して（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で1日間乃至２日間培養し、上記ヒトｉＰＳ細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得る。得られる培養物について、必要に応じて、Cytokeratin7をコードするmRNAを発現し、SyncytinをコードするmRNAを発現していない細胞の存在を確認する。
上記分化培地を用いたday 0からの培養を継続し、上記ヒトｉＰＳ細胞から分化した合胞体栄養膜細胞を含む培養物を得る。day 0から３日目以降は、PD 173074を含まないこと以外は上記と同じ組成の分化培地を用いる。【００７４】
実施例１３：  ヒトＥＳ細胞から分化した栄養膜細胞及び合胞体栄養膜細胞の製造とこれらを用いた細胞層透過性試験
ＫｈＥＳ−１細胞を実施例２の（１）に記載の方法に倣って、維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付した。
ＭＥＦ除去操作を行ったＫｈＥＳ−１細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１枚あたり１．５×１０5細胞となるように１０ｍｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした１００ｍｍセルカルチャーディッシュ（BD Falcon）に播種し、３７℃、２％ＣＯ２条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、上記培地を、２０μＭ  Y-27632を添加した基礎分化培地Ｂ（１０％  FBS、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４ 、および３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）  および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地に置換して（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で２日間培養し、ＫｈＥＳ−１細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得た。
上記培養で得られた細胞を、セルカルチャーディッシュに接着したままで、PBSで２回洗浄した後、２ｍｇ／ｍｌ  collagenaseＩＶ（Invitrogen）及び２０μｇ／ｍｌ  DNaseI（Roche）が添加されたＰＢＳを当該ディッシュに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で５分間インキュベートした。前記ディッシュにTrypLE Express（Life Technologies）をさらに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で５分間インキュベートした。前記ディッシュに、１０％  ＦＢＳ（コーニング）、２ｍＭ  L-glutamine、及び１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin（Penicillin‐Streptomycin Mixed Solution、ナカライテスク）が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を添加した後、ピペッティングにより細胞を剥離して、細胞を含む培地を回収し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行った。遠心分離された前記培養物から上清を除去した後、沈殿に基礎分化培地Ｂ（１０％  FBS、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４ 、および３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）  、１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）、２μM   Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK（Promega）、１０ｎｇ／ｍｌ  HGF（Ｒ＆Ｄ）および、１０μM  SB203580（p38 MAPK inhibitor、Abcam）を添加した分化培地（以下、基礎分化培地Cと記す。）を添加して細胞を懸濁した後、得られた細胞懸濁液を０．１％ゼラチン（Sigma-Aldrich）でコートしたセルカルチャーインサート（Corning、Cat.3470、メンブレン孔サイズ０．４μｍ）上に播種し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。培地には、基礎分化培地C培地を用いた。前記セルカルチャーインサートへの播種の1日後に、SB203580を含まないこと以外は上記と同じ組成の分化培地に置換し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。
セルカルチャーインサートへの播種の2日後に、上記セルカルチャーインサート上に形成された細胞層の電気抵抗値（Ω）をMillicell ERS-2（Millipore）を用いて測定し、得られた測定値から細胞を播種していないブランクの電気抵抗値を引きメンブレンフィルターの面積（ｃｍ２）を掛けた値である経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ、Ω・ｃｍ２）を求めた。ＴＥＥＲ値が２５０以上となるタイトジャンクションを形成した細胞層を透過性試験に用いた。
インサート内およびマルチプルウェルプレート内の培地をHanks’ Balanced Salt Solution（ＨＢＳＳ）（no phenol red、ライフテクノロジーズ）に置換し、３７℃  ５％  ＣＯ２条件下で３０分間乃至４５分間インキュベートした。インサート内（アピカル側）の培地を被験物質を含んだＨＢＳＳに置換し、３００ｒｐｍで攪拌しながら３７℃条件下で培養した。
被験物質の添加１２０分後に、マルチプルウェルプレート内から透過した被験物質を含むＨＢＳＳ１００μｌを採取し、同量のＨＢＳＳを添加した。マルチプルウェルプレート内の培地中の被験物質をＬＣ−ＭＳを用いて定量することによって、上記細胞層における被験物質の透過性を評価した。各被験物質の透過量を、アンチピリンの透過量で除して得られる値をin vitro相対的透過量として表４に示した。満期胎盤を用いた胎盤潅流法による透過性試験から得られた各被験物質の相対的透過量を、「Li, H. et al. Arch. Toxicol. 2013, 87, 1661-1669」より抜粋し、ex vivo相対的透過量（文献値）として表４に示した。【００７５】
【表４】
2016186078.tif 000005
各被験物質のin vitro相対的透過量とex vivo相対的透過量との相関性を調べた。結果を図１０に示す。各被験物質の、in vitro相対的透過量とex vivo相対的透過量との相関係数の２乗が０．９４８と高い相関を示した（図１０）。
この結果から、本発明製造方法により製造した細胞を用いることによって、胎盤細胞における被験物質の細胞層透過性を検定可能であることが示された。【００７６】
実施例１４：  ヒトｉＰＳ細胞から分化した合胞体栄養膜細胞の製造
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株（京都大学ｉＰＳ研究所より入手）を、実施例２の（１）に記載の方法に倣って、維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付した。
（１）本発明製造例
本発明の製造例として、ＭＥＦ除去操作を行ったヒトｉＰＳ細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％  ＣＯ2条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y−27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、上記培地を、２０μＭ  Y−27632を添加した基礎培地Ｂ（１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地に置換し（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日目後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行った。
（２）比較製造例
比較例として、MEF除去操作を行った２０１Ｂ７細胞の塊を、１０００μｌフィルターチップ（日本ジェネティクス）を用いて１０回乃至２０回ピペッティングを行うことにより数十個の細胞からなる細胞塊とし、得られた細胞塊を１ウェルあたり約１．５×１０３細胞乃至約４×１０３細胞相当となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％ＣＯ２条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、 1μＭ  A83-01および０．１μＭ  PD 173074を添加した分化培地（非特許文献2に記載）への培地交換を行って（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日後に、同じ組成の分化培地への培地交換を行った。
（３）対照（未分化維持培養）
分化を誘導しない対照として、MEF除去操作を行った２０１Ｂ７細胞の塊を、１０００μｌフィルターチップ（日本ジェネティクス）を用いて１０回乃至２０回ピペッティングを行うことにより数十個の細胞からなる細胞塊とし、得られた細胞塊を１ウェルあたり約１．５×１０３細胞乃至約４×１０３細胞相当となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％ＣＯ２条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、ＭＥＦ−ＣＭに４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加した培地への培地交換を行って（この時をday 0とする。）、その後３日間培養し、同じ組成の培地への培地交換を行って更に２日間培養した。培養は３７℃、２％  ＣＯ２条件下で行った。
（４）遺伝子発現解析
day 0から６日目（day 6）に、RNeasy Micro Kit（QIAGEN）を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。得られたtotal RNAを、SuperScript III（Invitrogen）を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe（Applied biosystems）およびTaqMan Fast advanced master mix（Applied biosystems）を用いたリアルタイムＰＣＲにより、合胞体栄養膜細胞のマーカー遺伝子として知られるSyncytin遺伝子の発現量を調べた。上記各培養で得られた細胞について、Syncytin遺伝子のｍＲＮＡ発現量およびハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。Syncytin遺伝子のｍＲＮＡ量をＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量で除して得られる値をSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量の補正値とし、比較製造例（（２）に記載）で得られた細胞におけるSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を１として、本発明製造例（（１）に記載）または対照（（３）に記載）で得られた細胞におけるSyncytin遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を相対発現量として示した。結果を図１１に示す。図１１において、対照（未分化維持培養）の細胞における相対発現量を白棒グラフで、比較例の細胞における相対発現量を灰色棒グラフで、本発明製造例の細胞における相対発現量を黒棒グラフで示す。本発明製造例で得られた細胞では、比較製造例で得られた細胞と比べて、Syncytin遺伝子の相対発現量が約３．７倍増加していた（図１１）。
この結果から、本発明製造方法により、ヒトｉＰＳ細胞から、合胞体栄養膜細胞を高効率に製造可能であることが示された。【００７７】
実施例１５：  ヒトｉＰＳ細胞から分化した栄養膜細胞及び合胞体栄養膜細胞の製造とこれらを用いた細胞層透過性試験
ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７株を実施例２の（１）に記載の方法に倣って、維持培養した後、ＭＥＦ除去操作に付した。
ＭＥＦ除去操作を行った２０１Ｂ７細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１枚あたり１．５×１０5細胞となるように１０ｍｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした１００ｍｍセルカルチャーディッシュ（BD Falcon）に播種し、３７℃、２％ＣＯ２条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y-27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、上記培地を、２０μＭ  Y-27632を添加した基礎分化培地Ｂ（１０％  FBS、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４ 、および３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）  および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地に置換して（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で２日間培養し、２０１Ｂ７細胞から分化した栄養膜細胞を含む培養物を得た。
上記培養で得られた細胞を、セルカルチャーディッシュに接着したままで、PBSで２回洗浄した後、２ｍｇ／ｍｌ  collagenaseＩＶ（Invitrogen）及び２０μｇ／ｍｌ  DNaseI（Roche）が添加されたＰＢＳを当該ディッシュに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で５分間インキュベートした。前記ディッシュにTrypLE Express（Life Technologies）をさらに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で５分間インキュベートした。前記ディッシュに１０％  ＦＢＳ（コーニング）、２ｍＭ  L-glutamine、及び１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin（Penicillin‐Streptomycin Mixed Solution、ナカライテスク）が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を添加した後、ピペッティングにより細胞を剥離して、細胞を含む培地を回収し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分間）を行った。遠心分離された前記培養物から上清を除去した後、沈殿に基礎分化培地Ｂ（１０％  FBS、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４ 、および３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）  、１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）、２μM   Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK（Promega）、１０ｎｇ／ｍｌ  HGF（Ｒ＆Ｄ）および、１０μM  SB203580（p38 MAPK inhibitor、Abcam）を添加した分化培地（以下、基礎分化培地Cと記す。）を添加して細胞を懸濁した後、、得られた細胞懸濁液を０．１％ゼラチン（Sigma-Aldrich）でコートしたセルカルチャーインサート（Corning、Cat.3470、メンブレン孔サイズ０．４μｍ）上に播種し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。培地には、基礎分化培地Cを用いた。前記セルカルチャーインサートへの播種の１日後に、培地を、SB203580を含まないこと以外は上記と同じ組成の分化培地に置換し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。
セルカルチャーインサートへの播種の４日後に、上記セルカルチャーインサート上に形成された細胞層の電気抵抗値（Ω）をMillicell ERS-2（Millipore）を用いて測定し、得られた測定値から細胞を播種していないブランクの電気抵抗値を引きメンブレンフィルターの面積（ｃｍ２）を掛けた値である経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ、Ω・ｃｍ２）を求めた。ＴＥＥＲ値が２５０以上となるタイトジャンクションを形成した細胞層を透過性試験に用いた。
インサート内およびマルチプルウェルプレート内の培地をHanks’ Balanced Salt Solution（ＨＢＳＳ）（no phenol red、ライフテクノロジーズ）に置換し、３７℃  ５％  ＣＯ２条件下で３０分間乃至４５分間インキュベートした。インサート内（アピカル側）の培地を被験物質を含んだＨＢＳＳに置換し、３００ｒｐｍで攪拌しながら３７℃条件下で培養した。
被験物質の添加１２０分後にマルチプルウェルプレート内から被験物質を含んだＨＢＳＳ１００μｌを採取し、同量のＨＢＳＳを添加した。マルチプルウェルプレート内の培地中の被験物質をＬＣ−ＭＳを用いて定量することによって、上記細胞層における被験物質の透過性を評価した。各被験物質の透過量を、アンチピリンの透過量で除して得られる値をin vitro相対的透過量として表５に示した。満期胎盤を用いた胎盤潅流法による透過性試験から得られた各被験物質の相対的透過量を、「Li, H. et al. Arch. Toxicol. 2013, 87, 1661-1669」より抜粋し、ex vivo相対的透過量（文献値）として表５に示した。【００７８】
【表５】
2016186078.tif 000006
各被験物質のin vitro相対的透過量とex vivo相対的透過量との相関性を調べた。結果を図１２に示す。各被験物質のin vitro相対的透過量とex vivo相対的透過量との相関係数の２乗が０．８４２と高い相関を示した（図１２）。
この結果から、本発明製造方法によりヒトiPS細胞から製造した細胞を用いることによって、胎盤細胞における被験物質の細胞層透過性を検定可能であることが示された。【００７９】
実施例１６：  ヒトES細胞から製造した合胞体栄養膜細胞およびヒト絨毛癌細胞株の経上皮抵抗
（１）ヒトES細胞を用いた合胞体栄養膜細胞の製造と経上皮抵抗測定
ＫｈＥＳ−１細胞を実施例１３に記載の方法に倣って、栄養膜細胞へと分化させ、セルカルチャーインサート上に再播種し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で２日間培養した。同条件で６ウェルの培養を行った。
セルカルチャーインサートへの播種の2日後に、上記セルカルチャーインサート上に形成された細胞層の電気抵抗値（Ω）をMillicell ERS-2（Millipore）を用いて測定し、得られた測定値から細胞を播種していないブランクの電気抵抗値を引きメンブレンフィルターの面積（ｃｍ２）を掛けた値である経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ、Ω・ｃｍ２）を求めた。結果を図１３Ａに示す。図１３Ａにおいて、TEER値の標準偏差をエラーバーで示す。ヒトES細胞由来合胞体栄養膜細胞は、４５３と高い抵抗値を示した。
（２）ヒト絨毛癌細胞株の培養と経上皮抵抗測定
ヒト絨毛癌細胞株BeWo細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より入手）を、１００ｍｍセルカルチャーディッシュ上に播種し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。同条件で６ウェルの培養を行った。その際の培地には、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma-Aldrich）に、１０％  ＦＢＳ（コーニング）、２ｍＭ  L-glutamine、および１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ  streptomycin（Penicillin‐Streptomycin Mixed Solution、ナカライテスク）が添加された培地（以下、BeWo培地と記す。）を用いた。
前記BeWo細胞を、セルカルチャーディッシュに接着したままで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、Invitrogen）で２回洗浄した後、０．２５％トリプシン-EDTA溶液（ナカライテスク）を当該ディッシュに添加し、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で２分間インキュベートした。前記ディッシュにBeWo培地を添加した後、ピペッティングにより細胞を剥離して、細胞を含む培地を回収し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、３分間）を行った。遠心分離された前記培養物から上清を除去した後、沈殿に、BeWo培地を添加して懸濁した。得られた細胞を、１ウェルあたり２．５×１０４細胞となるように２００μｌの培地に懸濁して、コラーゲンI（Cellmatrix type I-C、新田ゼラチン）でコートしたセルカルチャーインサート上に播種し、３７℃、５％ ＣＯ２条件下で培養した。２日ごとにBeWo培地への培地交換を行った。
セルカルチャーインサートへの播種から１４日目に、上記セルカルチャーインサート上に形成された細胞層の電気抵抗値（Ω）をMillicell ERS-2（Millipore）を用いて測定し、得られた測定値から細胞を播種していないブランクの電気抵抗値を引きメンブレンフィルターの面積（ｃｍ２）を掛けた値である経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ、Ω・ｃｍ２）を求めた。結果を図１３Ｂに示す。図１３Ｂにおいて、TEER値の標準偏差をエラーバーで示す。BeWo細胞のTEER値は２５であり、ヒトES細胞から製造した細胞と比べ低い抵抗値であった。【００８０】
実施例１７：  ヒトES細胞から製造した合胞体栄養膜細胞およびヒト絨毛癌細胞株でのトランスポーター発現
（１）ヒトＥＳ細胞を用いた合胞体栄養膜細胞の製造
ＭＥＦ除去操作を行ったヒトＥＳ細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％  ＣＯ2条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y−27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、上記培地を、基礎培地Ｂ（１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地に置換し（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行った。分化培地を用いた培養の４日目（day 4）に、細胞をＰＢＳにて２回洗浄した後、４％  パラホルムアルデヒドを用いて１５分間固定した。
（２）ヒト絨毛癌細胞株の培養
ヒト絨毛癌細胞株BeWo細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より入手）を、９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）上に播種し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。その際の培地には、BeWo培地を用いた。播種後１日目に、細胞をＰＢＳにて２回洗浄した後、４％  パラホルムアルデヒドを用いて１５分間固定した。
（３）細胞観察
（１）および（２）で固定した細胞を３％  ＢＳＡにより１時間乃至２時間ブロッキングした後、４μｇ／ｍｌ  mouse anti-Mdr1 antibody（Santa Cruz Biotechnology）, ２μｇ／ｍｌ  donky anti-mouse IgG antibody Alexa 488（Life technologies）および１μｇ／ｍｌ  Hoechst 33342 (同仁化学)を用いて免疫染色した。得られた染色試料の免疫染色像を蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１４に示す。
ＢｅＷｏ細胞では、ヒト合胞体栄養膜細胞に発現することが知られている薬物排出トランスポーターＭｄｒ１遺伝子が発現したことを示す緑色蛍光が認められなかった（図１４Ａ）。一方、ヒトＥＳ細胞由来合胞体栄養膜細胞では、８割程度の細胞が緑色蛍光を示した（図１４Ｂ）。【００８１】
実施例１８：  ヒトES細胞から製造した合胞体栄養膜細胞およびヒト絨毛癌細胞株でのトランスポーター発現
（１）ヒトＥＳ細胞を用いた合胞体栄養膜細胞の製造
ＭＥＦ除去操作を行ったヒトＥＳ細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり１．５×１０３細胞となるように１５０μｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした９６穴培養プレート（エッジプレート、Nunc）に播種し、３７℃、２％  ＣＯ2条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y−27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、上記培地を、基礎培地Ｂ（１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地に置換し（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行い、更に２日間培養した。day 5に、RNeasy Micro Kit（QIAGEN）を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。
（２）ヒト絨毛癌細胞株の培養
ヒト絨毛癌細胞株BeWo細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より入手）を、１００ｍｍセルカルチャーディッシュ上に播種し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。その際の培地には、BeWo培地を用いた。播種後３日目に、RNeasy Micro Kit（QIAGEN）を用いて、細胞からtotal RNAを抽出した。
（３）遺伝子発現解析
（１）および（２）で得られたtotal RNA、並びにHuman Placenta Total RNA（タカラバイオ）を、SuperScript III（Invitrogen）を用いて逆転写し、得られたDNAを鋳型としてTaqMan probe（Applied biosystems）およびTaqMan Fast advanced master mix（Applied biosystems）を用いたリアルタイムPCRにより、薬物排出トランスポーターであるBCRP遺伝子の発現量を調べた。上記各培養で得られた細胞について、BCRP遺伝子およびハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲにより測定した。BCRP遺伝子のｍＲＮＡ量をＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量で除して得られる値を、BCRP遺伝子ｍＲＮＡ量の補正値とし、Human Placenta Total RNAにおけるBCRP遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を１として、ヒトＥＳ細胞由来合胞体栄養膜細胞またはBeWo細胞におけるBCRP遺伝子ｍＲＮＡ量補正値を相対発現量として示した。結果を図１５に示す。図１５において、ＢｅＷｏ細胞の相対発現量を白色棒グラフで、ヒトＥＳ細胞由来合胞体栄養膜細胞の相対発現量を灰色棒グラフで、Human Placenta Total RNAの相対発現量を黒棒グラフで示す。
ＢｅＷｏ細胞ではBCRP遺伝子ｍＲＮＡ発現量が、Human Placenta Total RNAにおけるBCRP遺伝子ｍＲＮＡ発現量の約０．２５倍であった。一方、本発明製造例で得られた細胞ではBCRP遺伝子ｍＲＮＡ発現量が、Human Placenta Total RNAにおけるBCRP遺伝子ｍＲＮＡ発現量の約１．０６倍であった。【００８２】
実施例１９：  ヒトES細胞から製造した合胞体栄養膜細胞およびヒト絨毛癌細胞株での薬物排出トランスポーター機能解析
（１）ヒトＥＳ細胞を用いた合胞体栄養膜細胞の製造
ＭＥＦ除去操作を行ったヒトＥＳ細胞の塊を、TrypLE Express（Life Technologies）を用いて単一細胞に分散し、得られた細胞を１ウェルあたり２．５×１０４細胞となるように１．５ｍｌの培地に懸濁して、２０倍希釈したマトリゲル（Growth Factor Reduced、BD Biosciences）でコートした６穴培養プレート（BD Falcon）に播種し、３７℃、２％  ＣＯ2条件下で維持培養した。維持培養には、ＭＥＦ−ＣＭに、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ及び２０μＭ  Y−27632を添加した培地を用いた。
維持培養開始から２日後に、上記培地を、２０μＭ  Y−27632を添加した基礎培地Ｂ（１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  L-glutamine、１００Ｕ／ｍｌ  penicillin、１００μｇ／ｍｌ streptomycin、１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、３００ｎＭ  PD 173074が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）に、０．１μＭ  S26948（PPARγ agonist）、０．１μＭ  CGP 7930（GABABR positive allosteric modulator）、１０ｎＭ  SR 11237（RXR agonist）および１ｎＭ  レチノイン酸（RAR agonist）を添加した分化培地に置換し（この時をday 0とする。）、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。前記培地置換の３日後に、PD 173074を含まないこと以外は同じ組成の分化培地への交換を行い、更に２日間培養した。
（２）ヒト絨毛癌細胞株の培養
ヒト絨毛癌細胞株BeWo細胞（ヒューマンサイエンス振興財団より入手）を、６穴培養プレート（BD Falcon）上に播種し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で培養した。その際の培地には、BeWo培地を用いた。
（３）トランスポーター基質の取込み実験
（１）および（２）で得られた細胞を、ＰＢＳにて１回洗浄した後、０．１％  ＤＭＳＯ（Sigma-Aldrich）または１００μＭ  ベラパミル（ＭＤＲ１阻害剤、Sigma-Aldrich）が添加されたＨＢＳＳ（ライフテクノロジーズ）を添加し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下でインキュベートした。各条件につき３ウェルずつを用いて培養した。３０分後、１μＭ  カルセインＡＭ（ＭＤＲ１基質、同仁化学）をさらに添加した以外は同じ組成のＨＢＳＳに置換し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下でインキュベートした。６０分後、氷冷したＰＢＳにて１回洗浄した後、０．２％  トライトンＸ−１００（Wako）を含む０．２Ｎ  ＮａＯＨ（ナカライテスク）を添加し、３７℃、５％  ＣＯ２条件下で一晩インキュベートし、細胞溶解液を得た。
（４）トランスポーター機能の解析
（３）で得た細胞溶解液に含まれるカルセインの蛍光強度を、蛍光プレートリーダーにより調べた。（３）で得た細胞溶解液のタンパク濃度を、BCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific）により調べた。上記細胞溶解液のカルセイン蛍光強度の値を当該細胞溶解液のタンパク濃度で除して得られる値を、カルセイン蛍光強度の補正値とし、ＤＭＳＯ添加条件でのカルセイン蛍光強度の補正値を１として、ヒトＥＳ細胞由来合胞体栄養膜細胞またはBeWo細胞におけるカルセイン蛍光強度の補正値を相対値として示した。結果を図１６に示す。相対値の標準偏差をエラーバーで示す。ＤＭＳＯ添加例の蛍光強度相対値に対して統計的に有意に差がある蛍光強度相対値にアスタリスクを付す（***はP値０．００１未満を意味する）。ＢｅＷｏ細胞では、ＤＭＳＯ添加例と比べて、ベラパミル添加例で蛍光強度相対値が約１．５倍増加したが有意な変化ではなかった（図１６Ａ）。ヒトＥＳ細胞由来合胞体栄養膜細胞では、ＤＭＳＯ添加例と比べて、ベラパミル添加例で蛍光強度相対値が約２．７倍有意に増加した（図１６Ｂ）。
非蛍光性のカルセインＡＭは細胞の膜を容易に透過し、細胞質で細胞内エステラーゼにより膜不透過で緑色蛍光を示すカルセインへと加水分解される。カルセインはＭＤＲ１基質であり、ＭＤＲ１により細胞外へと排出されている。ＭＤＲ１阻害剤であるベラパミルによって細胞内カルセイン濃度が増加することは、細胞膜上に機能的なＭＤＲ１が発現していることを意味することから、実施例１７からヒト絨毛癌細胞株と比べて、ヒトＥＳ細胞由来合胞体栄養膜細胞が機能的なトランスポーターをより多く持つことが示唆された。
実施例１４から１７の結果から、本発明製造法によりヒトＥＳ細胞から製造した細胞を用いることによって、ヒト絨毛癌細胞株と比べて、被験物質の胎盤細胞層透過性をより精緻に検定可能であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明製造方法によれば、ヒト細胞由来の人工合胞体栄養膜細胞及びその前駆細胞をin vitroで高効率に製造することが可能となる。本発明製造方法によって製造された人工合胞体栄養膜細胞及びその前駆細胞は、化学物質等の毒性または薬効の評価や病態解析などに利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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