(57)【要約】  エボラウィルスに効果的な抗体療法に有用な中和モノクローナル抗体が求められている。  本発明は、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループを認識し、エボラウィルスの生物活性を中和し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エボラウィルスの表面糖タンパク質（以下、ＧＰと略記する）の内部膜融合ループを認識し、エボラウィルスの生物活性を中和し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記ＧＰの内部膜融合ループを認識されるエボラウィルスが、ザイールエボラウィルス、スーダンエボラウィルス、ブンディブギョエボラウィルス、レストンエボラウィルスおよびタイフォレストエボラウィルスの全てのエボラウィルスである、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
前記認識されるＧＰの内部膜融合ループが、配列番号１のアミノ酸配列からなるもの、配列番号２のアミノ酸配列からなるもの、配列番号３のアミノ酸配列からなるもの、配列番号４のアミノ酸配列からなるもの、および配列番号５のアミノ酸配列からなるものの全てである、請求項２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
配列番号１２のアミノ酸配列；配列番号１２のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３のアミノ酸配列；配列番号１３のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１４のアミノ酸配列；配列番号１４のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１５のアミノ酸配列；配列番号１５のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６のアミノ酸配列；配列番号１６のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１７のアミノ酸配列；配列番号１７のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１７のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を有する重鎖可変領域を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
配列番号１２のアミノ酸配列；配列番号１２のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３のアミノ酸配列；配列番号１３のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１４のアミノ酸配列；配列番号１４のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１８のアミノ酸配列；配列番号１８のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９のアミノ酸配列；配列番号１９のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１９のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２０のアミノ酸配列；配列番号２０のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号２０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を有する重鎖可変領域を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
配列番号１２のアミノ酸配列；配列番号１２のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３のアミノ酸配列；配列番号１３のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１４のアミノ酸配列；配列番号１４のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する軽鎖可変領域と、
配列番号２１のアミノ酸配列；配列番号２１のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号２１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２のアミノ酸配列；配列番号２２のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号２２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２３のアミノ酸配列；配列番号２３のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号２３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を有する重鎖可変領域を含有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、および
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体から選ばれるいずれか１つの請求項４に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、および
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体から選ばれるいずれか１つの請求項５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２３のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、および
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体から選ばれるいずれか１つの請求項６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
配列番号１０のアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
配列番号１１のアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
配列番号１０のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含有する、請求項１０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１２】
キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１３】
抗体依存性細胞傷害活性を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の核酸分子を含むハイブリドーマ細胞または形質転換細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含んでなるエボラウィルス感染の診断試薬。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬。
【請求項１９】
エボラウィルス病の予防または治療薬である、請求項１８に記載の医薬。
【請求項２０】
請求項１６に記載のハイブリドーマまたは形質転換細胞を培地中に培養し、該培養上清中に抗体を生成蓄積させ、該抗体を採取し精製する工程を含む、前記請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体または該抗原結合断片の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エボラウィルスを認識するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィロウィルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）のウィルス、すなわちフィロウィルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）はヒトを含む霊長類に感染し、感染した霊長類において極めて高い致死率を伴う重篤な出血熱を引き起こす病原体である。フィロウィルスの集団感染は現時点においてアフリカに限定されているが、昨今の世界的な交通網の発達により将来的にアフリカ以外の地域において集団感染が勃発する可能性は否定できない。さらに、現時点においてフィロウィルス感染に対する有効な予防または治療薬は実用化されていない。
フィロウィルス科において、マールブルグウィルス属（Ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ）とエボラウィルス属（Ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）の２つの属のみが特定されている。さらに、エボラウィルス属において、ザイールエボラウィルス（Ｚａｉｒｅ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、スーダンエボラウィルス（Ｓｕｄａｎ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、タイフォレストエボラウィルス（Ｔａｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、ブンディブギョエボラウィルス（Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）およびレストンエボラウィルス（Ｒｅｓｔｏｎ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）の５つの種が特定されている。
エボラウィルス属のウィルス、すなわち、エボラウィルス（ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）の感染により引き起こされるエボラウィルス病（ＥＶＤ：Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）の平均致死率は、約５０％であり、過去の流行における致死率は、２５％〜９０％の範囲である。エボラウィルスへの感染からＥＶＤの発症までの潜伏期間は、２〜２１日である。ＥＶＤの初期症状は、疲労熱、筋痛、頭痛および咽喉痛である。その後、嘔吐、下痢、発疹、腎機能および肝機能障害、外出血などの症状が続く。【０００３】
近年、ＥＶＤの治療には、エボラウィルスの感染性を中和するモノクローナル抗体による受動免疫が効果的であることが、サルの感染モデルで明らかになった（非特許文献１および非特許文献２）。２０１４年の西アフリカでの流行の際には、感染者に対して、未承認薬ながら抗体療法が実施された。しかし、これまでに作出されたモノクローナル抗体は、５種類のエボラウィルスのうち、ザイールエボラウィルスによるＥＶＤの治療にしか効果が無い。
一方で、２０００年以降、５種類のエボラウィルスのうち、スーダンエボラウィルスおよびブンディブギョエボラウィルスによるＥＶＤも多発している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｒｚｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｅｂｏｌａ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（４）：ｅ３６１９２，２０１２．
【非特許文献２】Ｑｉｕ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ４（１３８）：１３８ｒａ８１，２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のような状況の下、エボラウィルスに対して効果的な抗体療法に有用な中和モノクローナル抗体が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、５種類全てのエボラウィルスの糖タンパク質ＧＰの内部膜融合ループを認識し、エボラウィルスの感染性を効率的に中和するモノクローナル抗体６Ｄ６を作出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
＜１＞
エボラウィルスの表面糖タンパク質（以下、ＧＰと略記する）の内部膜融合ループを認識し、エボラウィルスの生物活性を中和し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜２＞
前記ＧＰの内部膜融合ループを認識されるエボラウィルスが、ザイールエボラウィルス、スーダンエボラウィルス、ブンディブギョエボラウィルス、レストンエボラウィルスおよびタイフォレストエボラウィルスの全てのエボラウィルスである、前記＜１＞に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜３＞
前記認識されるＧＰの内部膜融合ループが、配列番号１のアミノ酸配列からなるもの、配列番号２のアミノ酸配列からなるもの、配列番号３のアミノ酸配列からなるもの、配列番号４のアミノ酸配列からなるもの、および配列番号５のアミノ酸配列からなるものの全てである、前記＜２＞に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜４＞
配列番号１２のアミノ酸配列；配列番号１２のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３のアミノ酸配列；配列番号１３のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１４のアミノ酸配列；配列番号１４のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１５のアミノ酸配列；配列番号１５のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６のアミノ酸配列；配列番号１６のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１７のアミノ酸配列；配列番号１７のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１７のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を有する重鎖可変領域を含有する、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜５＞
配列番号１２のアミノ酸配列；配列番号１２のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３のアミノ酸配列；配列番号１３のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１４のアミノ酸配列；配列番号１４のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１８のアミノ酸配列；配列番号１８のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９のアミノ酸配列；配列番号１９のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１９のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２０のアミノ酸配列；配列番号２０のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号２０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を有する重鎖可変領域を含有する、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜６＞
配列番号１２のアミノ酸配列；配列番号１２のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３のアミノ酸配列；配列番号１３のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１４のアミノ酸配列；配列番号１４のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する軽鎖可変領域と、
配列番号２１のアミノ酸配列；配列番号２１のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号２１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２のアミノ酸配列；配列番号２２のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号２２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２３のアミノ酸配列；配列番号２３のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号２３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を有する重鎖可変領域を含有する、前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜７＞
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、および
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体から選ばれるいずれか１つの前記＜４＞に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜８＞
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、および
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体から選ばれるいずれか１つの前記＜５＞に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜９＞
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２３のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有する
モノクローナル抗体、
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、および
配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、
配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体から選ばれるいずれか１つの前記＜６＞に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜１０＞
配列番号１０のアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
配列番号１１のアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含有する、前記＜１＞〜＜９＞のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜１１＞
配列番号１０のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含有する、前記＜１０＞に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜１２＞
キメラ抗体またはヒト化抗体である、前記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜１３＞
抗体依存性細胞傷害活性を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
＜１４＞
前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子。
＜１５＞
前記＜１４＞に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
＜１６＞
前記＜１４＞に記載の核酸分子を含むハイブリドーマ細胞または形質転換細胞。
＜１７＞
前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含んでなるエボラウィルス感染の診断試薬。
＜１８＞
前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬。
＜１９＞
エボラウィルス病の予防または治療薬である、前記＜１８＞に記載の医薬。
＜２０＞
＜１６＞に記載のハイブリドーマまたは形質転換細胞を培地中に培養し、該培養上清中に抗体を生成蓄積させ、該抗体を採取し精製する工程を含む、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項に記載の抗体または該抗原結合断片の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のモノクローナル抗体は、エボラウィルス病の原因となるエボラウィルスを認識し、その生物活性を喪失（中和）させることができる。好ましい態様において、本発明のモノクローナル抗体は、エボラウィルス病の症状の診断試薬、およびエボラウィルス病の予防または治療薬を含む医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例で作出したエボラウィルスの表面糖タンパク質（ＧＰ）を有するシュードタイプ水泡性口炎ウィルス（ＶＳＶ：Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）を示す図である。（Ａ）非増殖性シュードタイプＶＳＶ粒子、（Ｂ）増殖性シュードタイプＶＳＶ粒子。
【図２】マウスモノクローナル抗体６Ｄ６の交差中和活性を示すグラフである。
【図３】マウスモノクローナル抗体６Ｄ６の推定されるエピトープ（５１１〜５５６番目のアミノ酸配列（Ｒｅｓｔｏｎでは５１２〜５５７番目のアミノ酸配列）からなるＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｏｏｐ）を示す図である。（Ａ）矢印はＺａｉｒｅ  ＧＰエスケープミュータントに見られた変異部分を指す。（Ｂ）Ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｐｒｅ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｚａｉｒｅ  ＧＰ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｌｏｏｐの模式図（出典：Lee JE, et al., Nature. 2008, 454, 177-82.）（Ｃ）各エピトープのアミノ酸配列
【図４】マウスモノクローナル抗体６Ｄ６の可変領域を示す図である。（Ａ）軽鎖可変領域とＣＤＲ領域１〜３、（Ｂ）重鎖可変領域とＣＤＲ領域１〜３、（Ｃ）重鎖可変領域のＣＤＲ領域１〜３
【図５−１】マウスモノクローナル抗体６Ｄ６、６Ｄ６キメラ抗体、ＣＤＲ改変６Ｄ６キメラ抗体（Ｓｅｒ）およびＣＤＲ改変６Ｄ６キメラ抗体（Ａｌａ）の各種エボラウィルスに対する中和活性を示す。(a)シュードタイプ水泡性口炎ウィルス（ＶＳＶ：Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）をネガディブコントロールとして、（ｂ）ザイールエボラウィルス、(c)スーダンエボラウィルス、(d)タイフォレストエボラウィルス、（e）ブンディブギョエボラウィルスおよび(f)レストンエボラウィルスに対する中和活性を示す。各グラフとも、横軸に抗体濃度、縦軸に感染率（％）を示す。
【図５−２】（図５−１の続き）
【図６】２名の健常人末梢血から単離した末梢血単核球（Ｐｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）由来のエフェクター細胞懸濁液を用いて、抗ＤＮＰ抗体ＫＭ８８０４およびＫＭ８８０５の細胞傷害活性を測定した結果を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は細胞傷害活性（％）を表す。
【図７】２名の健常人末梢血から単離したＰＢＭＣ由来のエフェクター細胞懸濁液を用いて、抗エボラ抗体ＫＭ６２２２およびＫＭ６３６４の細胞傷害活性を測定した結果を示す。横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は細胞傷害活性（％）を表す。
【図８】ＡＤＣＣ活性６Ｄ６キメラ抗体のシュードタイプエボラウィルスに対する中和活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、2015年8月19日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願2015-161567号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１１】
１．本発明のモノクローナル抗体
本発明は、エボラウィルスの表面糖タンパク質ＧＰの内部膜融合ループ（ＩＦＬ：Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｏｏｐ）を認識し、エボラウィルスの生物活性を中和し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片（「本発明のモノクローナル抗体」という）である。典型的には、本発明のモノクローナル抗体は、エボラウィルスの表面ＧＰの内部膜融合ループに存在するエピトープに結合する。
【００１２】
「内部膜融合ループを認識する」とは、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループに存在するエピトープに結合すること、好ましくは、特異的に結合することを意味する。「特異的に結合する」とは、具体的には、エンザイム・イムノアッセイ等のイムノアッセイにより特異的な抗原抗体反応が検出可能であることを意味する。
【００１３】
「エボラウィルスの生物活性を中和し得る」とは、本発明のモノクローナル抗体がエボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループに結合することによってエボラウィルスの生物学的活性を阻害することを意味する。このような活性を、以下「中和活性」とも呼ぶ。「生物的活性を阻害する」とは、抗原（すなわち、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループ）に起因するエボラウィルスの生物活性を約５〜１００％、好ましくは１０〜１００％、より好ましくは２０〜１００％、より好ましくは３０〜１００％、より好ましくは４０〜１００％、より好ましくは５０〜１００％、より好ましくは６０〜１００％、より好ましくは７０〜１００％、さらに好ましくは８０〜１００％、低減させることをいう。
また「エボラウィルスの生物活性を中和し得る」とは、本発明の抗体のエボラウィルスに対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が、０．０１〜０．１０μｇ／ｍｌ、０．０３〜０．９０μｇ／ｍｌ、０．０５〜０．８０μｇ／ｍｌ、０．１０〜０．７０μｇ／ｍｌ、０．１０〜０．６９μｇ／ｍｌ、０．１０〜０．６８μｇ／ｍｌ、０．１０〜０．６７μｇ／ｍｌ、０．１０〜０．６６μｇ／ｍｌ、０．１０〜０．６５μｇ／ｍｌ、０．１０〜０．６４μｇ／ｍｌ、０．１０〜０．６３μｇ／ｍｌ、０．１０〜０．６２μｇ／ｍｌであることをいう。最も好ましくは中和活性ＩＣ５０が０．１２〜０.６２μｇ／ｍｌである。
【００１４】
生物活性は、例えば、ウィルスの感染性が挙げられる。ウィルスの感染性の測定方法は、後述の実施例に記載の通りである。
【００１５】
「抗体」は、４本のポリペプチド鎖、すなわち、２本の重鎖（Ｈ鎖）および２本の軽鎖（Ｌ鎖）であってジスルフィド結合によって相互接続されたものからなる免疫グロブリン分子を指す。各Ｈ鎖は、Ｈ鎖可変部領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」と称す場合がある）とＨ鎖不変部領域（Ｈ鎖不変部領域は３つのドメインからなり、それぞれ「ＣＨ１」、「ＣＨ２」、および「ＣＨ３」と称す場合がある（総称：ＣＨ））からなる。各Ｌ鎖は、Ｌ鎖可変部領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」と称す場合がある）とＬ鎖不変部領域（Ｌ鎖不変部領域は１つのドメインからなり、「ＣＬ」と称す場合がある）からなる。
特にＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、抗体の結合特異性に関与する点で重要である。抗体はＬＣＶＲ及びＨＣＶＲのアミノ酸残基を主に通じて標的抗原と相互作用するので、可変部領域内のアミノ酸配列は可変部領域の外にある配列よりも個々の抗体間の違いが大きい。更に、ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲにおいても、各種抗体間でより一定に保たれたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域と相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲは、それぞれ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、これらはＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列している。
ＣＤＲの定義およびその位置を決定する方法は複数報告されており、これらの何れも採用し得る。例えば、Ｋａｂａｔの定義（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）、またはＣｈｏｔｈｉａの定義（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７；１９６：９０１−９１７）を採用してもよい。また、場合によっては、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義の両方を考慮して決定しても良く、例えば、各々の定義によるＣＤＲの重複部分を、または、各々の定義によるＣＤＲの両方を含んだ部分をＣＤＲとすることもできる。そのような方法の具体例としては、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義の折衷案である、ＡｂＭの定義（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ．のＡｂＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いたＭａｒｔｉｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９；８６：９２６８−９２７２））を採用してもよい。
【００１６】
「モノクローナル抗体」は、単一の抗体産生細胞に由来する抗体分子である。本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、真核生物、原核生物またはファージの任意のクローンを含むが、それが産生される方法は限定されない。
「抗原結合性断片」は、全長抗体の一部であるが、全長抗体と同様に抗原へ結合性を有するものを指し、一般に、抗原結合領域または可変領域を含む部分のことである。ここで、本発明のモノクローナル抗体の抗原結合性断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、一本鎖抗体（Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｈ鎖Ｖ領域、及びＬ鎖Ｖ領域等）、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ（ｓｃＦｖ二量体）、ｄｓＦｖ（ジスルフィド安定化Ｖ領域）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）を少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。
尚、本明細書中、「モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片」を、簡略化のために、「モノクローナル抗体」ともいう。
【００１７】
「エピトープ」は、抗体またはその抗原結合性断片が認識する抗原の部位を指す。エピトープは、１またはそれ以上（例えば、１０以上、９以上、８以上、７以上、６以上、５以上、４以上、３以上、２以上、または１以上）のアミノ酸残基を含み、例えば、連続的アミノ酸、もしくはタンパク質の三次元フォールディングにより並置される非連続的アミノ酸の双方から形成され得る。本発明の抗体が認識するエピトープとしては、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループに存在するエピトープが好ましく、具体的にはＧＰ内部膜融合ループの１８番目に位置するＧｌｙを含むエピトープが挙げられる。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体でもよい。本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であっても同程度の中和活性を有するからである。また、本発明のモノクローナル抗体は、遺伝子組換え技術によって作製されるマウス抗体、ラット抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体いずれも含まれる。
「キメラ抗体」とは、Ｈ鎖およびＬ鎖の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）の配列がある哺乳動物種に由来し、定常領域（ＣＨおよびＣＬ）の配列が他の哺乳動物種に由来する抗体を意味する。可変領域の配列は、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種由来であることが好ましく、定常領域の配列は投与対象となる哺乳動物種由来であることが好ましい。キメラ抗体は、例えば、マウス−ヒトキメラ抗体である。
「ヒト化抗体」とは、可変領域に存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）以外のすべての領域（即ち、定常領域および可変領域中のＦＲ）の配列がヒト由来であり、ＣＤＲの配列のみが他の哺乳動物種由来である抗体を意味する。他の哺乳動物種としては、例えばマウス等の容易にハイブリドーマを作製することができる動物種が好ましい。
「ヒト抗体」は、本質的に、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全配列がヒト遺伝子から生じる抗体を意味する。
【００１９】
好ましい態様において、本発明のモノクローナル抗体は、５種類のエボラウィルス、すなわち、ザイールエボラウィルス（Ｚａｉｒｅ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、スーダンエボラウィルス（Ｓｕｄａｎ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、タイフォレストエボラウィルス（Ｔａｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）、ブンディブギョエボラウィルス（Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）およびレストンエボラウィルス（Ｒｅｓｔｏｎ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）の１種類以上（すなわち、１種、２種、３種、４種または５種）に対するモノクローナル抗体である。特に好ましい態様において、本発明のモノクローナル抗体は、５種類全てのエボラウィルスに対する交差性モノクローナル抗体である。
【００２０】
本発明のモノクローナル抗体が認識する内部膜融合ループが存在するＧＰは、エボラウィルスの糖タンパク質である。エボラウィルスは、マイナス鎖ＲＮＡウィルスであり、フィラメント状のウィルス粒子を形成している。このウィルス粒子は、宿主細胞由来の脂質二重膜であるエンベロープに包まれており、ＧＰを含む７種類の構造タンパク質を含む。構造タンパク質の一つであるＧＰは、エンベロープに存在する糖タンパク質であり、宿主細胞への吸着および侵入を担う。
ＧＰ以外の構造タンパク質は、ＮＰ、ＶＰ３５、ＶＰ４０、ＶＰ３０、ＶＰ２４およびＬである。ＶＰ４０は、マトリックスタンパク質であり、エンベロープの内側に存在し、エンベロープを裏打ちしている。ＶＰ２４は膜への親和性を持ち、マイナーマトリックスタンパク質であると考えられている。ＮＰ、ＶＰ３０およびＶＰ３５は、核タンパク質であり、Ｌは、ポリメラーゼタンパク質である。これらの核タンパク質およびポリメラーゼタンパク質は、ゲノムＲＮＡと結合し、らせん状のヌクレオカプシドを形成する。
【００２１】
ＧＰは、５種類のエボラウィルスでアミノ酸配列が特に異なる。ザイールエボラウィルス、スーダンエボラウィルス、ブンディブギョエボラウィルス、タイフォレストエボラウィルス、およびレストンエボラウィルスのＧＰのアミノ酸配列の情報は、ＧｅｎＢａｎｋのような公にアクセス可能な配列データベースにおいて、例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ２３１８７．１、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ２３０６９．１、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＿０１４３７３．１、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ２８００６．１、およびＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｕ２３１５２．１の配列を参照することによって入手することができる。
【００２２】
エボラウィルスのＧＰに存在する内部膜融合ループも、５種のエボラウィルスでそのアミノ酸配列が異なる。内部膜融合ループは、ザイールエボラウィルス、スーダンエボラウィルス、ブンディブギョエボラウィルス、タイフォレストエボラウィルス、およびレストンエボラウィルスでは、ＧＰのアミノ酸配列の５１１番目〜５５６番目の位置に存在し、レストンエボラウィルスでは、５１２番目〜５５７番目の位置に存在する。より具体的には、ザイールエボラウィルス、スーダンエボラウィルス、ブンディブギョエボラウィルス、タイフォレストエボラウィルス、およびレストンエボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に示す通りである。
【００２３】
好ましい態様において、本発明のモノクローナル抗体は、１種類以上（すなわち、１種、２種、３種、４種または５種）のエボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループを認識する。より具体的には、配列番号１のアミノ酸配列からなる内部膜融合ループ、配列番号２のアミノ酸配列からなるＧＰの内部膜融合ループ、配列番号３のアミノ酸配列からなるＧＰの内部膜融合ループ、配列番号４のアミノ酸配列からなるＧＰの内部膜融合ループ、および配列番号５のアミノ酸配列からなるＧＰの内部膜融合ループからなる群より選択される少なくとも１つ（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）のＧＰの内部膜融合ループを認識する。特に好ましい態様において、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号１のアミノ酸配列からなる内部膜融合ループ、配列番号２のアミノ酸配列からなるＧＰの内部膜融合ループ、配列番号３のアミノ酸配列からなるＧＰの内部膜融合ループ、配列番号４のアミノ酸配列からなるＧＰの内部膜融合ループ、および配列番号５のアミノ酸配列からなるＧＰの内部膜融合ループの全てを認識する。
また、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号１のアミノ酸配列において１８番目のＧｌｙがＬｙｓまたはＧｌｕに置換したアミノ酸からなる内部膜融合ループ、配列番号５において６番目のＴｙｒからＨｉｓへの置換、１１番目のＶａｌからＡｌａへの置換および１９番目のＬｅｕからＴｒｐへの置換を含むアミノ酸からなる内部膜融合ループ、および配列番号５において１８番目のＧｌｙからＧｌｕへの置換を含むアミノ酸からなる内部融合ループから選ばれる少なくとも１つのＧＰ内部膜融合ループを認識しない。
【００２４】
ある実施態様において、本発明のモノクローナル抗体は、抗体依存性細胞傷害活性を有していてもよい。このような抗体を、以下「ＡＤＣＣ活性抗体」と呼ぶ場合がある。ここで、抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ；  ＡＤＣＣ）とは、抗原に結合した抗体のＦｃ部位がナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球及び単核球（例えば末梢血単核球）などのエフェクター細胞のＦｃ受容体と結合することで、抗体依存的に誘導される細胞傷害活性である。したがって、この実施態様において、本発明のモノクローナル抗体は、抗原であるエボラウィルス（ザイールエボラウィルス、スーダンエボラウィルス、ブンディブギョエボラウィルス、タイフォレストエボラウィルス、およびレストンエボラウィルスのいずれか）に結合し、同抗体のＦｃ部位がナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球などのエフェクター細胞のＦｃ受容体と結合することで、抗体依存的に細胞傷害活性を誘導することができる。
【００２５】
好ましい態様において、本発明は、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループを認識し、エボラウィルスの生物活性を中和し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、配列番号１０のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３またはその変異ＣＤＲ１〜３を含む軽鎖可変領域と、配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３またはその変異ＣＤＲ１〜３を含む重鎖可変領域を含有する、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
モノクローナル抗体の可変部領域のアミノ酸配列は、大半の抗体−抗原相互作用を担っているため、特定の天然発生型の抗体を由来とする可変部領域配列またはＣＤＲ部分の配列を、異なる性質を持った異なる抗体由来の不変部領域またはフレームワーク配列に移植した状態で含有するような発現ベクターを構築すると、特定の天然発生型抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現させることができる。
そのために、もとの抗体のものと同様な結合特性を有するインタクト組換え抗体を作り直す際に、特定の抗体の配列全体を得る必要はない。その抗体の重鎖および軽鎖の可変部領域配列もしくはＣＤＲ部分の配列があれば、この目的にとって充分な場合もある。
【００２６】
配列番号１０のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域のＣＤＲ１〜３は、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４のアミノ酸配列からなる。
配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３は、Ｋａｂａｔの定義によるものでは、それぞれ、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７のアミノ酸配列からなる。
配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３は、ＡｂＭの定義によるものでは、それぞれ、配列番号１８、配列番号１９、および配列番号２０のアミノ酸配列からなる。
配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域のＣＤＲ１〜３は、Ｃｈｏｔｈｉａの定義によるものでは、それぞれ、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３のアミノ酸配列からなる。
【００２７】
好ましくは、本発明は、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループを認識し、エボラウィルスの生物活性を中和し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、以下のいずれかのものである。
【００２８】
（ａ）  配列番号１２のアミノ酸配列；配列番号１２のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３のアミノ酸配列；配列番号１３のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１４のアミノ酸配列；配列番号１４のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１５のアミノ酸配列；配列番号１５のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１５のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１６のアミノ酸配列；配列番号１６のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１６のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１７のアミノ酸配列；配列番号１７のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１７のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を有する重鎖可変領域を含有する、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【００２９】
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列；配列番号１２のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３のアミノ酸配列；配列番号１３のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１４のアミノ酸配列；配列番号１４のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する軽鎖可変領域と、
配列番号１８のアミノ酸配列；配列番号１８のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１８のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号１９のアミノ酸配列；配列番号１９のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１９のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２０のアミノ酸配列；配列番号２０のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号２０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を有する重鎖可変領域を含有する、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【００３０】
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列；配列番号１２のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１３のアミノ酸配列；配列番号１３のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および
配列番号１４のアミノ酸配列；配列番号１４のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号１４のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３
を有する軽鎖可変領域と、
配列番号２１のアミノ酸配列；配列番号２１のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号２１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、
配列番号２２のアミノ酸配列；配列番号２２のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号２２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および
配列番号２３のアミノ酸配列；配列番号２３のアミノ酸配列中の１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；および配列番号２３のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３
を有する重鎖可変領域を含有する、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【００３１】
本発明のいくつかの態様では、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域においてＣＤＲ以外のアミノ酸配列は特に限定されず、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列が他の抗体、特に、他種の抗体由来である、いわゆるＣＤＲ移植抗体も本発明の抗体に包含される。この内、ＣＤＲ以外のアミノ酸配列もヒト由来であるヒト化抗体が好ましいが、必要に応じてフレームワーク領域（ＦＲ）に１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するものでもよい。
【００３２】
本明細書において、「１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有する」とは、同一配列中の任意かつ１もしくは数個のアミノ酸配列中の位置において、１または数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。「１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加」における「１〜数個」は、例えば、５個、４個、３個、２個、または１個である。欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン；
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸；
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン；
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸；
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン；
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン；
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン。
【００３３】
本明細書において、「９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における「９０％以上」の範囲は、例えば、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上である。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Ａｌｔｚｓｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３（１９９０）参照）の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００３４】
好ましい態様において、本発明は、配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列の７番目のＣｙｓが他のアミノ酸残基に置換された重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体を提供する。ＣＤＲ配列に含まれるＣｙｓ残基は抗体の均一性、および安定性の観点から他のアミノ酸残基であることが好ましく、Ｃｙｓ残基から他のアミノ酸残基に置換することで、アミノ酸残基置換前の抗体の結合活性と同等の結合活性を有する抗体であれば、いずれのアミノ酸残基へ置換することもできる。他のアミノ酸残基として好ましくは、Ｓｅｒ、Ａｌａ等のアミノ酸残基が挙げられる。
より好ましい態様において、本発明は、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループを認識し、エボラウィルスの生物活性を中和し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、および配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体から選らばれるいずれか１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００３５】
別のより好ましい態様において、本発明は、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループを認識し、エボラウィルスの生物活性を中和し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、および配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号１８のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体から選ばれるいずれか１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００３６】
さらに別のより好ましい態様において、本発明は、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループを認識し、エボラウィルスの生物活性を中和し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２３のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体、および配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と、配列番号２１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号４１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域を含有するモノクローナル抗体から選らばれるいずれか１つのモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００３７】
いくつかの態様において、本発明は、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループを認識し、エボラウィルスの生物活性を中和し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、
配列番号１０のアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；配列番号１０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
配列番号１１のアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列中１〜数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の変異を有するアミノ酸配列；配列番号１１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含有するものを提供する。
【００３８】
好ましい態様において、本発明は、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループを認識し、エボラウィルスの生物活性を中和し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、
配列番号１０のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含有する、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００３９】
いくつかの態様において、本発明は、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループを認識し、エボラウィルスの生物活性を中和し得るモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、配列番号２４のアミノ酸配列からなる軽鎖と、配列番号２５のアミノ酸配列からなる重鎖を含有する、モノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００４０】
本発明の遺伝子組換え抗体は、遺伝子組換え技術によって作製される抗体であればいずれの方法で作製されたものであってもよく、目的の遺伝子組換え抗体をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞に導入する。その後、該抗体遺伝子発現細胞（または形質転換細胞ともいう）を培養し、培養上清から抗体を精製することで遺伝子組換え抗体を作製することができる。
ここで、マウス抗体、ラット抗体、キメラ抗体を作製する場合は、公知の遺伝子組換え技術によって構築できる。
ヒト化抗体を作製する場合は、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（ＦＲ）はヒト由来のものでＣＤＲはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する（いわゆるＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ移植））。次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト化抗体の一般的な作製法は、当分野において周知である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１−９１７（１９８７）；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：１００２９−１００３３（１９８９）；特表平４−５０２４０８号公報などを参照）。
【００４１】
ヒト化抗体を作製する際にフレームワーク素材として使用できるヒト抗体フレームワークのアミノ酸配列としては、軽鎖として配列番号３６および配列番号３７に示すアミノ酸配列、重鎖として配列番号３８および配列番号３９に示すアミノ酸配列が挙げられる。
【００４２】
ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９７７）１６，１３３−１４３；Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，（１９９８）２６，３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ，（１９９９）１０，６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ，Ｙ．，Ｍａｔｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）９７，７２２−７２７等を参照）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．，（２００２）４３（７），２３０１−８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，（２００２）１（２），１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，（２００２）１０９（３），４２７−４３１等を参照）により取得することができる。
【００４３】
２．本発明の単離された核酸分子
本発明は、本発明のモノクローナル抗体をコードする単離された核酸分子（「本発明の単離された核酸分子」という場合がある）を提供する。「核酸分子」は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて（例えば、本発明のモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に分離されて、配列決定される。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。
【００４４】
３．本発明の発現ベクター、および本発明の形質転換細胞
本発明は、本発明の単離された核酸分子を組込んだベクター（「本発明の発現ベクター」という）およびその発現ベクターが導入された形質転換細胞（「本発明の形質転換細胞」という）を提供する。
【００４５】
（１）本発明の発現ベクター
本発明の単離された核酸分子は、組換え宿主細胞でモノクローナル抗体を合成するために、発現ベクターへ挿入される。いくつかの態様では、本発明の単離された核酸分子として、２つの核酸分子を用いて、それぞれを異なる発現ベクターに挿入するか（例えば、第一の発現ベクターに重鎖、第二の発現ベクターに軽鎖）、あるいは、それらを同一の発現ベクターに挿入することができる。
発現ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウィルス等が挙げられる。
本発明の単離された核酸分子は、通常、適当なベクター中のプロモーターの下流に、発現可能なように連結される。
本発明の発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子があげられる。
【００４６】
（２）本発明の形質転換細胞
このようにして得られた、本発明の発現ベクターを、適当な宿主細胞中に導入することによって、形質転換細胞を作製することができる。宿主細胞としては、本発明の単離された核酸分子を発現できるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、細菌（大腸菌等）、放線菌、酵母、昆虫細胞（ＳＦ９等）、哺乳動物細胞（例えば、ヒトＨＥＫ２９３胎児腎由来細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫細胞など）が挙げられる。ＣＨＯ細胞としては、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＫＸＢ１１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ  ＃  １１６１９）、およびジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｒａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］およびα１，６−フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号）等を用いることができる。
発現ベクターの宿主細胞への導入方法およびこれによる形質転換方法は、一般的な各種方法によって行うことができる。発現ベクターの宿主細胞への導入方法としては、リン酸カルシウム法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４５７  （１９７３））、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））、エレクトロポレーション法（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１，８４１−８４５（１９８２））などがあげられる。このようにして、本発明の発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
【００４７】
４．本発明のモノクローナル抗体の作製方法
本発明のモノクローナル抗体の作製方法について説明する。
本発明のモノクローナル抗体の作製方法は、この方法に限定されないが、例えば、本発明のモノクローナル抗体は、本発明の形質転換細胞を、本発明のモノクローナル抗体の発現に適した条件下で培養し、培養上清などの培養物から、形質転換細胞で産生された本発明のモノクローナル抗体を精製することによって、作製することができる。いくつかの態様において、重鎖が１つの細胞で製造され、軽鎖が別の細胞で製造されるようにしてもよい。
【００４８】
本発明のモノクローナル抗体は、ウシ、ニワトリなどのトランスジェニック動物において製造することもできる。
また、本発明のモノクローナル抗体は、後述の本発明のハイブリドーマ細胞を、本発明のモノクローナル抗体の発現に適した条件下で培養し、培養上清などの培養物から、ハイブリドーマ細胞で産生された本発明のモノクローナル抗体を精製することによって、作製することができる。
抗原結合性断片は、全長抗体を適当なタンパク質分解酵素で処理する方法、遺伝子組換技術など、公知の方法で製造することができる。
本発明のモノクローナル抗体の精製は、塩析法、ゲルろ過法、イオン交換クロマト法、アフィニティークロマト法などの公知の精製手段を用いて行うことができる。
【００４９】
５．本発明のハイブリドーマ細胞の調製
本発明のハイブリドーマ細胞の調製（樹立）は、具体的には、以下のように行うことができるが、この方法に限定されるわけではない。
【００５０】
（１）抗原の調製
本発明のモノクローナル抗体を作製するために必要な抗原としては、（ｉ）後述の実施例に示したようなエボラウィルスＧＰを含むウィルス様粒子（ＶＬＰ）、（ｉｉ）エボラウィルスのＧＰを産生する細胞あるいはその細胞画分、またはエボラウィルスのＧＰをコードするＤＮＡにより形質転換された宿主細胞、すなわち、大腸菌などの原核性宿主細胞および昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核性宿主細胞中に、エボラウィルスのＧＰをコードするｃＤＮＡの全長または部分断片を公知の方法を用いて組み込み、そのままあるいは融合タンパク質として発現、精製されたタンパク質、（ｉｉｉ）ペプチド合成機を用いて合成されたエボラウィルスのＧＰなどを用いることができる。
免疫原として、２種以上（すなわち、２種、３種、４種または５種）のエボラウィルスのＧＰを用いるのが好ましい。
【００５１】
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウスまたはラットに、（１）に示した方法で作製された抗原を免疫して、その動物の脾、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、抗原を投与することにより行う。抗原の投与は、１回目の投与の後２〜３週間おきに３〜７回行う。各投与後５〜１０日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊  １９７６年〕などで調べる。免疫に用いた抗原細胞に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源として供する。脾細胞を骨髄腫細胞との融合に供するにあたって、抗原物質の最終投与後３〜４日目に、免疫したマウスまたはラットより脾臓を摘出し、脾細胞を採取する。脾臓を血清無添加の基礎培地（以下洗浄用培地という。）中で細断し、遠心分離して細胞を回収後、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ  ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球の除去を行い、洗浄用培地で洗浄した後に融合用脾細胞として提供する。
【００５２】
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８  −  アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）〔カレント・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・アンド・イムノロジィ−１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−１）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジィ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）６，５１１−５１９（１９７６）〕、ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４（ＳＰ−２）〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７６，２６９−２７０（１９７８）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）〔ジャーナル・オブ・イムノロジィ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１２３，１５４８−１５５０（１９７９）〕、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２５６，４９５−４９７（１９７５）〕などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔ＲＰＭＩ−１６４０培地にＬ−グルタミン（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５Ｍ）、ペニシリン  ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）を加えた培地（以下、ＲＰＭＩ−１６４０培地とする）に牛胎児血清（ＦＣＳ）を１０％加えた培地で継代し、融合当日５×１０７個以上の細胞数を確保する。
【００５３】
（４）細胞融合
（２）で免疫した抗体産生細胞と（３）で得られた骨髄腫細胞をＰＢＳでよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝２〜１０：１になるよう混合させる。細胞回収後、細胞をよくほぐし、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングリコール−１，５００（ＰＥＧ−１，５００）（５０％ＰＥＧ−１，５００（Ｗ／Ｖ），７５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）に溶解）０．２〜１ｍｌ／１０８抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎に２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地１〜２ｍｌを数回加え、全量が５０ｍｌになるまで洗浄する。細胞回収後、ゆるやかに細胞をほぐしながら、ＨＡＴ培地〔正常培地にヒポキサンチン（１０−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０−７Ｍ）を加えた培地〕１００ｍｌ中に懸濁する。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１５０μｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。培養後、培養上清の一部をとり、例えば（５）に述べる酵素免疫測定法あるいはＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇの略）などを用いて、１種以上（すなわち、１種、２種、３種、４種または５種）エボラウィルスのＧＰに特異的に反応する抗体を選択する。または、中和試験によって１種以上（すなわち、１種、２種、３種、４種または５種）のエボラウィルスまたはエボラウィルスのＧＰを纏ったシュードタイプウィルスに中和活性を示す抗体を選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し、安定して強い抗体価の認められたものから、エボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループを認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
したがって、これに関連する本発明の別の実施形態では、ハイブリドーマ細胞を培養し、得られる培養物から本発明のモノクローナル抗体を採取することを含む、本発明のモノクローナル抗体の製造方法が提供される。
【００５４】
６．本発明の医薬
本発明のモノクローナル抗体は、エボラウィルス病の予防または治療薬などの医薬として使用することができる。医薬として使用する場合には、エボラウィルス病の治療または予防が必要なヒトまたは動物種に対し、適合性を有するモノクローナル抗体が用いられる。医薬をヒトに使用する場合、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト抗体；ヒト化抗体；およびマウス−ヒトキメラ抗体などのキメラ抗体が好ましい。
「エボラウィルス病」は、エボラウィルスの感染により引き起こされる疾患である。エボラウィルス病は、エボラウィルスへの感染から潜伏期間を経て発症する。エボラウィルス病の初期症状は、疲労熱、筋痛、頭痛および咽喉痛である。その後、嘔吐、下痢、発疹、腎機能および肝機能障害、外出血などの症状が続く。
本発明のモノクローナル抗体を含有してなる予防または治療薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、対象、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して（例えば非経口的に）投与することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明のモノクローナル抗体またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、非経口投与に適する剤形として提供される。
【００５５】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。
このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、本発明のモノクローナル抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤（例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ））等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、本発明のモノクローナル抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
【００５６】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００５７】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。モノクローナル抗体の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ程度、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ程度、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇ程度の上記モノクローナル抗体が含有されていることが好ましい。
【００５８】
なお前記した各組成物は、上記モノクローナル抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
本発明のモノクローナル抗体を含有する医薬の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルート等によっても異なるが、例えば、成人のエボラウィルス病の予防または治療のために使用する場合には、本発明のモノクローナル抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与（例、皮下投与）および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
【００５９】
本発明のモノクローナル抗体は、エボラウィルスの予防または治療に有効な１種または複数の他の予防または治療薬と一緒に処方し、またはそのような他の予防または治療薬と同時又は逐次的に投与してもよい。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、本発明の抗体のエピトープと異なる他のエピトープに結合する１つまたは複数の他の抗エボラウィルス抗体とのカクテル製剤として、またはそのような他の抗体と同時又は逐次的に投与することができる。さらに、本発明の１つまたは複数の抗体は、前述の治療薬のうち２種またはそれ以上の種類を組み合わせて使用することができる。そのような組合せによる療法は、エスケープウィルスが出現する確立を大幅に抑えることが可能である。
本発明のモノクローナル抗体とのカクテル製剤として、または同時もしくは逐次的に併用投与することのできる他の抗エボラウィルス抗体の具体例としては、エボラウィルスに対するモノクローナル抗体である４２／３．７（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００３，１０６９−１０７４；  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２００７，  ２５（６），  ９９３−９）あるいはエボラウィルスに対するヒト‐マウスキメラモノクローナル抗体であるｃｈ１３３またはｃｈ２２６（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（４）：  ｅ３６１９２，２０１２）をあげることができる。また、これらの抗体の可変領域のアミノ酸配列をもとに作製したヒト型キメラ抗体やヒト化抗体も用いることができる。
これらの他の抗エボラウィルス抗体と本発明のモノクローナル抗体とを併用すること、またはカクテル製剤を用いることにより、エボラウィルスの予防または治療において相乗的にウィルス抑制効果が得られ得る。
【００６０】
本発明の医薬は、キットの形態で提供することもできる。当該キットは、本発明の医薬の他、他の活性成分、他の医薬、取扱説明書、容器等を含んでも良い。
また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体の予防または治療的有効量を、エボラウィルス病の予防または治療を必要とする対象に投与することを含む、エボラウィルス病の予防または治療方法を提供する。
【００６１】
７．本発明の診断試薬
本発明のモノクローナル抗体は、エボラウィルス病の診断用試薬または診断方法（「本発明の診断試薬」という）に有用である。診断用試薬または診断方法に用いる場合、本発明のモノクローナル抗体は、マウス由来の軽鎖および重鎖可変領域、およびマウス由来のγ１重鎖およびκ軽鎖定常領域を含む、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ２抗体であるのが好ましい。
【００６２】
エボラウィルスの検出は、具体的には、本発明のモノクローナル抗体を生体試料と反応させ、反応した抗体のシグナルを検出することにより行うことができる。抗体のシグナルは、生体試料中のエボラウィルス量の指標となる。
【００６３】
生体試料は、エボラウィルスが含まれている可能性がある生体試料であれば特に限定されず、例えば、全血、血清、血漿、リンパ球培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水、羊水、細胞もしくは臓器の抽出液などである。
生体試料を採取する対象は、エボラウィルスに感染する可能性がある対象であれば特に限定されず、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）が挙げられる。
【００６４】
本発明のモノクローナル抗体を用いたエボラウィルスの検出は、検体として対象から採取した生体試料と本発明のモノクローナル抗体とを抗原抗体反応によって結合させ、結合した抗体量に基づいて試料中の目的とする抗原量を測定することにより行う。抗原量の検出は、公知の免疫学的測定法に従って行えばよく、例えば、免疫沈降法、免疫凝集法、標識免疫測定法、免疫比懸濁法、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリー法などを用いることができる。標識免疫測定法では、抗体のシグナルは、標識抗体を用いて直接検出した標識量で表すほか、既知濃度あるいは既知抗体価の抗体を標準液として相対的に表してもよい。すなわち、標準液と検体を測定計により測定し、標準液の値を基準にして試料中の抗体シグナルを相対的に表すことができる。標識免疫測定法としては、例えばＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などが挙げられる。特に、ＥＬＩＳＡ法が簡便かつ高感度という点で好ましい。
【００６５】
さらに、得られた検出結果を指標としてエボラウィルス感染の有無を評価または診断することができる。例えば、生体試料からエボラウィルスが検出されたものをエボラウィルス感染陽性、検出されなかったものをエボラウィルス感染陰性とし、陽性の場合には、エボラウィルス病を発症している可能性があると判断し、エボラウィルス病の状態を評価することができる。
エボラウィルス病の状態とは、エボラウィルス病の罹患の有無またはその進行度を意味する。
【００６６】
本発明のモノクローナル抗体は、エボラウィルス病診断用キット（「本発明のキット」）の形態で提供することができる。本発明のキットは、エボラウィルス病の診断または治療に使用することができる。本発明のキットは本発明のモノクローナル抗体を含むが、そのほかに、標識物質、あるいは抗体またはその標識物を固定した固相化試薬などを含めることができる。抗体の標識物とは、酵素、放射性同位体、蛍光化合物、または化学発光化合物によって標識されたものを意味する。本発明のキットは、上記の構成要素の他、本発明のモノクローナル抗体を用いたエボラウィルスの検出を実施するための他の試薬、例えば標識物が酵素標識物の場合は、酵素基質（発色性基質等）、酵素基質溶解液、酵素反応停止液、あるいは検体用希釈液等を含んでいてもよい。
【００６７】
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって限定されない。【００６９】
実施例１：マウスモノクローナル抗体の作製
（１）免疫原の調製
ザイールおよびスーダンエボラウィルスのＧＰを含むウィルス様粒子（ＶＬＰ）を免疫原として作出した。
当該ＶＬＰは、より具体的には、次のように作出した。ザイールエボラウィルスまたは、スーダンエボラウィルスのＧＰ、ＶＰ４０およびＮＰの遺伝子をそれぞれ動物細胞用タンパク質発現ベクターｐＣＡＧＧＳに組み込んだプラスミドを構築し、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ を発現しているヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）に導入した。導入した細胞は、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで４８時間培養後、上清を回収し、３５００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行った。その上清を２５％ショ糖溶液をクッションに用いて、４℃、２８０００ｒｐｍで２時間超遠心分離を行い、上清を取り除き、ＰＢＳを加え再懸濁した。２４時間後、密度勾配を形成したショ糖溶液上にＶＬＰを含む再懸濁液を重層し、２８０００ｒｐｍ、４℃で２時間超遠心分離を行った。ＶＬＰを含むバンドが見える画分の溶液を回収し、ＰＢＳで希釈し再度４℃、２８０００ｒｐｍで２時間超遠心分離を行い、その後上清を取り除き少量のＰＢＳでＶＬＰを再懸濁した。２４時間後にＶＬＰを回収し、蛋白質濃度１ｍｇ／ｍｌに調整した。作出したＶＬＰは、表面にＧＰをもち、粒子の内側はＶＰ４０によって内張りされており、内部にＮＰを有する。【００７０】
（２）ハイブリドーマの作製
ラパマイシンを投与したマウスをザイールエボラウィルスのＶＬＰで３回、スーダンエボラウィルスのＶＬＰで１回免疫し、最後にザイールエボラウィルスのＶＬＰによる最終免疫３日後に脾臓を摘出し、骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）と融合させ、定法に従ってモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作出した。【００７１】
ハイブリドーマは、より具体的には、次のように作出した。５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス、１５週令に７５μｇ／ｋｇのラパマイシン（和光純薬社製）を、免疫開始１週間前から脾臓を摘出する日まで毎日腹腔内投与した。１００μｇのザイールエボラウィルスのＶＬＰを２，３週間間隔で３回、腹腔内投与し、３回目免疫の１週間後にそれぞれのマウスから血清を採取し、中和試験を行った。エボラウィルス種間交差中和活性が認められたマウス２匹に対し、３回目免疫の５週間後に１００μｇのスーダンエボラウィルスのＶＬＰを腹腔内投与して、１週間後に中和試験を行った。ザイールエボラウィルスに対して中和活性が高く、他のエボラウィルス種にも中和活性を示したマウス１匹を選び、４回目免疫の２週間後に１００μｇのザイールエボラウィルスのＶＬＰを腹腔内投与した。最終免疫の３日後にマウスから脾臓を取り出し、ＰＢＳ中で脾細胞を遊離させ、１７００ｒｐｍ、６分間遠心分離した。上清を除き、２５ｍｌのＰＢＳで３回、細胞を洗浄した。Ｐ３Ｕ１は１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養し、１３００ｒｐｍ、３分間遠心分離後、上清を除去し、２５ｍｌのＰＢＳで再懸濁した。細胞数が免疫脾臓細胞：骨髄腫細胞＝２〜５：１になるように免疫脾臓細胞にＰ３Ｕ１懸濁液を加え、１３００ｒｐｍ、５分間遠心分離後、上清を除去した。細胞をよくほぐし、３７℃でＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティック社製）１ｍｌを１分間かけて加え、静かに混ぜたのち１分間静置した。細胞懸濁液に３７℃で温めておいた２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ、ライフテクノロジーズ社製）１〜２ｍｌを数回加えた後、さらに全量が５０ｍｌになるまでゆっくり加えた。遠心分離を行い細胞回収後、ゆるやかに細胞をほぐしながら、ＨＡＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ、ライフテクノロジーズ社製）を加えた２０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地２５０ｍｌ中に懸濁した。この懸濁液を９６ウェルプレートに１５０μｌ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養した。その間２，３日ごとに培地半量を新しい培地に交換した。増殖したハイブリドーマの上清を用いて、スクリーニングを行い（下記記述）、すべてのエボラウィルス種を中和する抗体を選出し、限界希釈法によりクローニングを２回行った。その結果得られたマウスモノクローナル抗体６Ｄ６を産生するハイブリドーマは２０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で増殖させた後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地に馴化させて、培養した。【００７２】
（３）抗体スクリーニング
ハイブリドーマの培養上清を、エボラウィルスのＧＰを纏った非増殖性シュードタイプ水泡性口炎ウィルス（ＶＳＶ）（図１（Ａ））に対する中和活性を指標にスクリーニングし、すべてのエボラウィルス種を中和する抗体を得た。
すべてのエボラウィルス種を中和する抗体は、より具体的には、次のように選出した。ザイールエボラウィルスのＧＰをまとった非増殖性シュードタイプ水泡性口炎ウィルス（ＶＳＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ）（を９６ウェルプレートに６０μｌ／ウェルで分注した。そこに各ハイブリドーマの培養上清を６０μｌずつ加え、混合した。コントロールは、培養液（６０μｌ）を用いた。３０〜６０分後に９６ウェルプレートで前日から培養していたＶｅｒｏ  Ｅ６細胞にウィルス培養上清混合液を１００μｌずつ接種し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１８−２４時間培養した。培養後、ＧＦＰを指標にＩｎ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ２０００を用い、感染価を測定し、コントロールに比べ８０％以上中和しているウェルを選択した。選択されたウェルの細胞を培養し、培養上清を用いてスーダンエボラウィルス、ブンディブギョエボラウィルス、タイフォレストエボラウィルスまたはレストンエボラウィルスに対する中和試験を、ＶＳＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰに対する中和試験と同様の方法で行った。その結果、全ての種でコントロールに比べ８０％以上中和しているウェルを選出した。【００７３】
本シュードタイプＶＳＶシステムは、抗体の中和活性のスクリーニングに広く用いられている（Ｔａｋａｄａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１４７６４−９，１９９７）
約１５００クローンをスクリーニングした結果、既知の全てのエボラウィルスのＧＰに結合し、ウィルスの感染性を効率的に中和するマウスモノクローナル抗体（６Ｄ６）が得られた（図２）。【００７４】
（４）モノクローナル抗体の精製および中和活性の測定
プリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに６Ｄ６産生ハイブリドーマを５×１０6個／匹、腹腔内に投与した。７〜１０日後、腹部が肥大したマウスから腹水を採取し、３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離して血球成分を除いた。腹水から、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳ ＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）の添付説明書に従って，抗体を精製した。６Ｄ６抗体のアイソタイプは、ＭＯＵＳＥ  ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ  ＫＩＴ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ 社製）を用いて判定した結果、ＩｇＧ１、κ鎖であると同定された。
精製した抗体の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）をシュードタイプＶＳＶシステムおよびVero細胞を用いたウィルス感染性中和試験によって測定した。その結果、ザイールエボラウィルス、スーダンエボラウィルス、タイフォレストエボラウィルス、ブンディブギョエボラウィルスおよびレストンエボラウィルスに対するＩＣ５０は、それぞれ０.１２、０.１９、０.３３、０.２４および０.６２μｇ／ｍｌであった。【００７５】
実施例２：結合部位の確認
抗体存在下で、ザイールエボラウィルスのＧＰをもつ増殖性シュードタイプＶＳＶ（図１（Ｂ））を培養することによって、エスケープミュータントを選択し、ＧＰのアミノ酸配列を親株と比較した。
ザイールエボラウィルスのＧＰをもつ増殖性シュードタイプＶＳＶの作出、エスケープミュータントの選択、ＧＰのアミノ酸配列の比較は、具体的には、次のように行った。ＶＳＶの全ゲノムのうちＶＳＶのＧを削除したｐＡＴＸ―ＶＳＶｄｅｌｔａＧ＋ＭＣＳのＧ部分にザイールエボラウィルスのＧＰを組み込んだ発現プラスミドを作製した。このプラスミドとＶＳＶのＮ，Ｐ，ＭおよびＬ遺伝子が組み込まれた各プラスミドｐｂｌを同時にＴ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを恒常的に発現するシリアンハムスター腎細胞（ＢＨＫ−Ｔ７）細胞に、導入した。３日後に細胞変性効果（ＣＰＥ）が見られたウェルの細胞培養上清を回収した。回収された培養上清からウィルスのＲＮＡ抽出をＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の添付説明書に従って行った後、作出された増殖性シュードタイプＶＳＶの遺伝子に含まれるザイールエボラウィルスのＧＰの遺伝子およびアミノ酸配列（親株）を確認した。作出されたザイールエボラウィルスのＧＰをもつ増殖性シュードタイプＶＳＶをＶｅｒｏ  Ｅ６細胞に接種し、増殖させた。増殖させたザイールエボラウィルスのＧＰをもつ増殖性シュードタイプＶＳＶを分注し−８０℃でストックした。このザイールエボラウィルスのＧＰをもつ増殖性シュードタイプＶＳＶと６Ｄ６とを混和し１時間室温で反応させ、上清を除いたＶｅｒｏ  Ｅ６細胞に接種した。５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１時間吸着させた後、血清を含まない培地で１回洗浄し、６Ｄ６（１０μｇ/ｍｌ）及び０．８％寒天を含む培養液を重層した。５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４８時間培養後、形成されたプラークからウィルスを採取し、抽出したＲＮＡ抽出物を用いて、ＧＰ遺伝子の塩基配列を解読した。推定されるアミノ酸配列をエスケープミュータントと親株の間で比較した。変異アミノ酸を同定する事によって、６Ｄ６のエピトープを推定した。【００７６】
エスケープミュータントのＧＰ遺伝子にアミノ酸変異（５２８番目のグリシンがアルギニンまたはグルタミン酸に変異）を伴う塩基置換が認められ、ＧＰの立体構造上でそのアミノ酸はＧＰによる膜融合に必須な領域（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｏｏｐ：内部膜融合ループ）に位置していたことから、６Ｄ６のエピトープはＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｏｏｐ上に存在することが推定された（図３）。
ザイールエボラウィルス、スーダンエボラウィルス、ブンディブギョエボラウィルス、タイフォレストエボラウィルスおよびレストンエボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５に示す。また、ザイールエボラウィルスのエスケープ変異株［６クローンのうち５クローン］、ザイールエボラウィルスのエスケープ変異株［６クローンのうち１クローン］、レストンエボラウィルスのエスケープ変異株［６クローンのうち２クローン］およびレストンエボラウィルスのエスケープ変異株［６クローンのうち４クローン］の内部膜融合ループのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号６、配列番号７、配列番号８および配列番号９に示す。【００７７】
実施例３：マウスモノクローナル抗体６Ｄ６の遺伝子配列の決定
６Ｄ６の抗体全体および可変領域をコードする遺伝子配列をクローニングし、塩基配列を解読した。
遺伝子配列のクローニングおよび塩基配列の解読は、具体的には、次のように行った。６Ｄ６産生ハイブリドーマを１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で、５%ＣＯ２存在下、３７℃、３〜４日間培養した。５×１０6〜１×１０7個の細胞からＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付の使用説明書に従ってｍＲＮＡを抽出した。抗体可変領域遺伝子のｃＤＮＡを、Ｇｅｎｅ  Ｒａｃｅｒ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた5' -ＲＡＣＥ により合成した後ＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ・Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ-ＴＯＰＯ  クローニングベクター（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に挿入して、大腸菌に形質転換した。抗体定常領域遺伝子はＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて増幅し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に挿入し、大腸菌に形質転換した。３７℃で一晩培養後、増殖した各コロニーからプラスミドを抽出し、クローニングｋｉｔ中のＭ１３  ｆｏｗａｒｄプライマーおよびＭ１３  ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを用いて塩基配列を解読した。重鎖および軽鎖の抗体全体の遺伝子配列として可変領域と定常領域を連結した。【００７８】
抗体全体をコードする遺伝子、ならびにＶＨおよびＶＬ領域をコードする遺伝子配列から６Ｄ６の抗体全体および可変領域のアミノ酸配列を決定した。６Ｄ６の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２４および２５に示す。６Ｄ６のＶＬ領域およびＶＨ領域のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１０および１１に示す。
また、ＣＤＲのアミノ酸配列をＣＤＲの定義（http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid）に基づいて、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することで決定した。
その結果を図４に示す。また、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４に示す。Ｋａｂａｔの定義によるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７に示す。ＡｂＭの定義によるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０に示す。Ｃｈｏｔｈｉａの定義によるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３に示す。【００７９】
実施例４：６Ｄ６キメラ抗体の作製
（１）６Ｄ６キメラ抗体発現ベクターの構築
本発明で作製するキメラ抗体は、実施例１で取得されたマウスモノクローナル抗体６Ｄ６のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列に、国際公開第９７／１０３５４号に開示されているヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域およびヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をそれぞれ連結した６Ｄ６キメラ抗体、および該６Ｄ６キメラ抗体のＶＨ ＣＤＲ３に含まれるＣｙｓ残基をＡｌａ残基またはＳｅｒ残基に置換したキメラ抗体である（各ＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号４０、４１に示す）。【００８０】
初めに実施例１で得られたマウスモノクローナル抗体６Ｄ６のＶＨ、ＶＬ、およびＶＨのＣＤＲ３に含まれるＣｙｓ残基をＡｌａまたはＳｅｒに置換したアミノ酸配列をコードする各ＤＮＡ断片、国際公開第２０１０／１４３６９８号に記載されているＴｏｌ２トランスポゾンベクターの薬剤耐性遺伝子を、それぞれネオマイシン耐性遺伝子、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）耐性遺伝子に置換し、ヒト定常領域またはヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含むベクター（以下、トランスポゾンベクター）を用いて、６Ｄ６キメラ抗体発現ベクターを作製した。【００８１】
マウスモノクローナル抗体６Ｄ６のＶＬをコードするＤＮＡ断片が含まれるｐＣＲベクターを鋳型として、６Ｄ６Ｌ−Ｆ１および６Ｄ６Ｌ−Ｒ１（配列番号２６、２７）を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を鋳型として、６Ｄ６Ｌ−Ｆ２および６Ｄ６Ｌ−Ｒ２（配列番号２８、２９）を用いてＰＣＲを行うことにより、ＶＬをコードするＤＮＡ断片を増幅した。マウスモノクローナル抗体６Ｄ６のＶＨをコードするＤＮＡ断片は、全合成により作製した。【００８２】
６Ｄ６キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターは、ヒトκ鎖定常領域が挿入されたトランスポゾンベクターを制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）およびＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて消化し、トランスポゾンベクターの適切な位置にＶＬをコードするＤＮＡ断片を挿入することにより作製した。【００８３】
６Ｄ６キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターは、ヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域が挿入されたトランスポゾンベクターを制限酵素ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）およびＡｐａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて消化し、トランスポゾンベクターの適切な位置にＶＨをコードするＤＮＡ断片を挿入することにより作製した。【００８４】
６Ｄ６キメラ抗体のＶＨのＣＤＲ３に含まれるＣｙｓ残基をＡｌａに置換した抗体のＨ鎖発現ベクターは、６Ｄ６キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを鋳型として、６Ｄ６Ｈ−Ａｖｒ−Ｆおよび６Ｄ６Ｈ−Ｍｕｔ−Ａｌａ−Ｒ（配列番号３０、３１）、６Ｄ６Ｈ−Ｍｕｔ−Ａｌａ−Ｆおよび６Ｄ６Ｈ−Ａｐａ−Ｒ（配列番号３２、３３）を用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＡｖｒＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）およびＡｐａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて消化した６Ｄ６キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの適切な位置に挿入することにより作製した。【００８５】
６Ｄ６キメラ抗体のＶＨのＣＤＲ３に含まれるＣｙｓ残基をＳｅｒに置換した抗体のＨ鎖発現ベクターは、上述と同様にして各プライマー６Ｄ６Ｈ−Ａｖｒ−Ｆおよび６Ｄ６Ｈ−Ｍｕｔ−Ｓｅｒ−Ｒ（配列番号３０、３４）、６Ｄ６Ｈ−Ｍｕｔ−Ｓｅｒ−Ｆおよび６Ｄ６Ｈ−Ａｐａ−Ｒ（配列番号３５、３３）を用いて、６Ｄ６キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの適切な位置に挿入することにより作製した。【００８６】
（２）動物細胞を用いた６Ｄ６キメラ抗体の発現・精製
上記実施例４（１）で作製した６Ｄ６キメラ抗体の発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に一過性に導入し、該細胞をＥｘｐｉ２９３ＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて３〜６日間培養した後、培養上清を回収し、下記方法で６Ｄ６キメラ抗体の精製を行った。【００８７】
培養上清は、３０００  ｒｐｍ、４℃の条件で２０分間の遠心分離を行い、上清を回収した後、０．２μｍ孔径ＰＥＳ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて上清を濾過した。０．８  ｃｍ孔径カラムにＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）０．５ｍＬを充填し、精製水５ｍＬを添加し、０．１５Ｍ  クエン酸バッファー（ｐＨ３．５）５ｍＬおよび０．２Ｍ  ホウ酸ナトリウム−０．１５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、ホウ酸バッファーと記す）５ｍＬで平衡化を行った。【００８８】
次に、上記培養上清をカラムに通塔した後、ホウ酸バッファー５ｍＬ、０．１５Ｍ  クエン酸（ｐＨ  ５．０）５ｍＬで洗浄した。洗浄後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ  ３．５）２．２５ｍＬを用いて担体に吸着したタンパク質の溶出を行った。溶出画分は２５０μＬ、２ｍＬずつ、計２画分に分けて取得した。次に、得られた各画分の２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ２８０）を吸光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）で測定し、目的タンパク質が含まれている溶出画分を特定した。【００８９】
目的タンパク質溶出画分のバッファーを、ＮＡＰ−２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いてＤＰＢＳ（ｐＨ  ７．０）（Ｇｉｂｃｏ社製）に交換した。得られた抗体溶液は、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて滅菌濾過し４℃で保存した。
精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った結果、目的の約５０ｋＤａのＨ鎖、約２５ｋＤａのＬ鎖の各バンドが確認されたことから、６Ｄ６キメラ抗体、６Ｄ６キメラ抗体（Ａｌａ）および６Ｄ６キメラ抗体（Ｓｅｒ）の精製抗体が取得されたことが確認された。【００９０】
実施例５：６Ｄ６キメラ抗体の活性評価
実施例４で作製した６Ｄ６キメラ抗体およびＨ鎖ＣＤＲ３に含まれるＣｙｓ残基をＳｅｒまたはＡｌａに置換したキメラ抗体の結合活性を、ＶＬＰを抗原として用いたＥＬＩＳＡ法で測定した。その結果、いずれの６Ｄ６キメラ抗体も、全てのエボラウィルス種に対して、マウスモノクローナル抗体６Ｄ６と同等の結合活性を有する事を確認した。
また、中和活性を上述と同様にシュードタイプＶＳＶシステムおよびVero細胞を用いて測定した結果、いずれの６Ｄ６キメラ抗体も全てのエボラウィルス種に対して、マウスモノクローナル抗体６Ｄ６と同等の中和活性を有することを確認した（図５）。また各抗体とも、ザイール、スーダン、タイフォレストおよびブンディブギョエボラウィルスに対して、1μｇ/ｍＬの抗体濃度において、ほぼ完全に感染を抑制した。また、いずれの抗体も、抗体濃度１０μｇ/ｍＬでは、レストンエボラウィルスを含む５種類いずれのエボラウィルスによる感染も完全に抑制することが明らかになった。
以上の結果から、本発明の抗体は、既存の抗エボラウィルス抗体と比べて、既存のエボラウィルスの全てのウィルスに反応する広範なウィルススペクトルを示す高い感染抑制効果を有することが示唆された。【００９１】
実施例６：６Ｄ６キメラ抗体の膜型ＧＰ抗原発現細胞株に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性評価
膜型ＧＰ抗原発現細胞株に対する６Ｄ６キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を、以下に示す方法に従って測定した。
（１）  ＣＨＯ細胞株を用いた６Ｄ６キメラ抗体の安定発現・精製
実施例４で作製した６Ｄ６キメラ抗体のＨ鎖ＣＤＲ３に含まれるＣｙｓ残基をＳｅｒに置換した抗体の発現ベクターを、定法 [Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９９２） ]により動物細胞株へ導入し、６Ｄ６キメラ抗体を安定発現する形質転換株を取得した。ＣＨＯ細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株、およびα１，６−フコース転移酵素（ＦＵＴ８）遺伝子をノックアウトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞株（以下、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ−Ｋ１細胞株と表記する）を用い、得られた各形質転換株をＢａｌａｎＣＤＴＭＣＨＯ Ｇｒｏｗｔｈ Ａ培地、ＢａｌａｎＣＤＴＭ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ Ｉ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて１０〜１４日間培養した後に、実施例４（２）に記載の方法に従って培養上清を回収し、抗体を精製した。取得した抗体溶液は、バッファーを１０ ｍｍｏｌ／Ｌ グルタミン酸ナトリウム、２６２ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ−ソルビトール、０．０５ ｍｇ／ｍＬ ポリソルベート８０（ｐＨ ５．６）に交換した後、０．２２μｍ孔径Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて滅菌濾過し４℃で保存した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞株およびＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ−Ｋ１細胞株由来の各形質転換株より得た抗体を、それぞれＫＭ６２２２およびＫＭ６３６４と称す。【００９２】
（２）抗Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＮＰ）キメラ抗体の調製
６Ｄ６キメラ抗体のアイソタイプコントロール抗体として、抗ＤＮＰマウスモノクローナル抗体ｍＤＮＰ−１（ＶＬ Ｕ１６６８８、ＶＨ Ｕ１１６６８７）（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９６  Ｊｕｎｔｅｎ３３（９）ｔｅｎ７５９−６８）のヒト型キメラ抗体（以下、抗ＤＮＰキメラ抗体と表記する）を、実施例４と同様の方法により調製した。抗ＤＮＰキメラ抗体のＣＨＯ細胞株による安定発現および精製は、実施例６（１）に記載の方法に従って実施した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞株およびＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ−Ｋ１細胞株由来の各形質転換株より得た抗体を、それぞれＫＭ８８０４およびＫＭ８８０５と称す。【００９３】
（３）  ６Ｄ６キメラ抗体、抗ＤＮＰキメラ抗体のフコース含量測定
国際公開第２００２／３１１４０号に記載の方法に従い、６Ｄ６キメラ抗体ＫＭ６２２２およびＫＭ６３６４、抗ＤＮＰキメラ抗体ＫＭ８８０４およびＫＭ８８０５に存在するＮ結合複合型糖鎖のうち、フコースが結合していない糖鎖の割合を調べた。その結果を表１に示す。【００９４】
【表１】
2017030172.tif 000002
【００９５】
表１に示す結果から、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ−Ｋ１細胞で作製した６Ｄ６キメラ抗体ＫＭ６３６４および抗ＤＮＰキメラ抗体ＫＭ８８０５にはフコースが付加していないことが確認された。【００９６】
（４）  標的細胞懸濁液の調製
膜型ＧＰ抗原発現細胞株は、実施例１（１）に記載の方法に従い、ザイールエボラウィルスのＧＰ遺伝子を動物細胞用タンパク質発現ベクターｐＣＡＧＧＳに組み込んだプラスミドを、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎを発現しているヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）に導入することにより作製した。作製した膜型ＧＰ抗原発現細胞株を５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むフェノールレッド不含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）（以下、ＡＤＣＣ用培地と表記する）で洗浄し、同培地で至適の細胞密度に調製して標的細胞懸濁液とした。【００９７】
（５）  エフェクター細胞懸濁液の調製
以下に示した方法により、健常人２名の末梢血より末梢血単核球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）を分離し、エフェクター細胞懸濁液（ａ）、（ｂ）を調製した。ヘパリンナトリウム注（味の素社）を０．５ ｍＬ加えたシリンジを用いて、健常人２名から末梢血５０ ｍＬをそれぞれ採血した。採取した末梢血に同量の生理食塩水（大塚製薬社）を加えて希釈し、良く攪拌した。１５ ｍＬチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に４．５ ｍＬずつ分注したＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｌｅｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の上に、１０ ｍＬの希釈末梢血を静かに重層し、８４０ｇ、ブレーキオフ、室温の条件で２０分間遠心分離して、単核球層を分離した。得られた単核球画分を、ＡＤＣＣ用培地を用いて２回洗浄し、同培地により至適の細胞密度に調製して、エフェクター細胞懸濁液（ａ）、（ｂ）とした。【００９８】
（６）  ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ底プレート（ＦＡＬＣＯＮ社）の各ウェルに、各抗体を３０ μｇ／ｍＬから段階的に１０倍希釈した抗体溶液を５０ μＬずつ分注した後、次に実施例６（４）で調製した標的細胞懸濁液を２×１０４個／５０ μＬ／ウェルずつ分注し、最後に実施例６（５）で調製したエフェクター細胞懸濁液を２×１０５個／５０ μＬ／ウェルずつ分注し、全量を１５０ μＬとして、３７℃で４時間反応させた。本系でのエフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）の比は１０：１とした。ここで、調製した膜型ＧＰ抗原発現細胞株はＦＣＭ解析において、ＧＰ陽性画分が約５０％であったため、実質のＥ／Ｔ比が２０：１となるようにそれぞれの細胞懸濁液を分注した。反応後、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔｅｓｔ（和光純薬社）を用いて各培養上清の発色を測定した。細胞傷害活性は次式により求めた。
（式）
細胞傷害活性（％）＝ ｛（ [検体の吸光度] − [標的細胞自然遊離の吸光度] − [エフェクター細胞自然遊離の吸光度]）／ （ [標的細胞全遊離の吸光度] − [標的細胞自然遊離の吸光度] ）｝× １００
エフェクター細胞懸濁液（ａ）、（ｂ）を用いた場合の細胞傷害活性について、抗ＤＮＰ抗体ＫＭ８８０４およびＫＭ８８０５に対する結果を図６（ａ）および（ｂ）に、抗エボラ抗体ＫＭ６２２２およびＫＭ６３６４に対する結果を図７（ａ）および（ｂ）に示す。【００９９】
図６および７に示すように、アイソタイプコントロール抗体ＫＭ８８０４およびＫＭ８８０５が膜型ＧＰ発現細胞株に対する細胞傷害活性を誘導しない条件下において、ＫＭ６２２２およびＫＭ６３６４は膜型ＧＰ発現細胞株に対して抗体濃度依存的なＡＤＣＣ活性を示した。さらにＡＤＣＣ活性を増強した抗エボラ抗体であるＫＭ６３６４は膜型ＧＰ発現細胞株に対してＫＭ６２２２よりも高いＡＤＣＣ活性を有していた。【０１００】
実施例７：ＡＤＣＣ活性を増強した６Ｄ６キメラ抗体の中和活性評価
実施例６で得られた６Ｄ６キメラ抗体ＫＭ６２２２およびＡＤＣＣ活性を増強した６Ｄ６キメラ抗体ＫＭ６３６４を用いて、実施例１（４）と同様にシュードタイプＶＳＶシステムとＶｅｒｏ細胞を用いて中和活性を測定した。
結果を図８に示す。ＫＭ６３６４（図８Ｂ）は、ザイール型、スーダン型、ブンディブギョ型、タイフォレスト型及びレストン型の全ての種類のシュードタイプウィルスに対して、ＫＭ６２２２（図８Ａ）と同等の中和活性を有することが示された。また、ＫＭ６３６４の中和活性は、いずれの種類のシュードタイプウィルスに対してもＫＭ６２２２と同様に濃度依存的に増加した。
実施例５において６Ｄ６キメラ抗体ＫＭ６２２２がマウスモノクローナル抗体６Ｄ６と同等の中和活性を有することが示されているので、このことからＡＤＣＣ活性を増強した６Ｄ６キメラ抗体ＫＭ６３６４もマウスモノクローナル抗体６Ｄ６と同等の中和活性を有することが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明により、全ての種類のエボラウィルスによる感染症を効果的に治療・緩和することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１０２】
［配列番号１］ザイールエボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループのアミノ酸配列である。
［配列番号２］スーダンエボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループのアミノ酸配列である。
［配列番号３］ブンディブギョエボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループのアミノ酸配列である。
［配列番号４］タイフォレストエボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループのアミノ酸配列である。
［配列番号５］レストンエボラウィルスのＧＰの内部膜融合ループのアミノ酸配列である。
［配列番号６］ザイールエボラウィルスのエスケープ変異株［５／６］の内部膜融合ループのアミノ酸配列である。
［配列番号７］ザイールエボラウィルスのエスケープ変異株［１／６］の内部膜融合ループのアミノ酸配列である。
［配列番号８］レストンエボラウィルスのエスケープ変異株［２／６］の内部膜融合ループのアミノ酸配列である。
［配列番号９］レストンエボラウィルスのエスケープ変異株［４／６］の内部膜融合ループのアミノ酸配列である。
［配列番号１０］モノクローナル抗体６Ｄ６の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
［配列番号１１］モノクローナル抗体６Ｄ６の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
［配列番号１２］モノクローナル抗体６Ｄ６のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
［配列番号１３］モノクローナル抗体６Ｄ６のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
［配列番号１４］モノクローナル抗体６Ｄ６のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
［配列番号１５］モノクローナル抗体６Ｄ６の、Ｋａｂａｔの定義によるＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
［配列番号１６］モノクローナル抗体６Ｄ６の、Ｋａｂａｔの定義によるＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
［配列番号１７］モノクローナル抗体６Ｄ６の、Ｋａｂａｔの定義によるＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
［配列番号１８］モノクローナル抗体６Ｄ６の、ＡｂＭの定義によるＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
［配列番号１９］モノクローナル抗体６Ｄ６の、ＡｂＭの定義によるＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
［配列番号２０］モノクローナル抗体６Ｄ６の、ＡｂＭの定義によるＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
［配列番号２１］モノクローナル抗体６Ｄ６の、Ｃｈｏｔｈｉａの定義によるＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
［配列番号２２］モノクローナル抗体６Ｄ６の、Ｃｈｏｔｈｉａの定義によるＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
［配列番号２３］モノクローナル抗体６Ｄ６の、Ｃｈｏｔｈｉａの定義によるＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
［配列番号２４］モノクローナル抗体６Ｄ６の軽鎖のアミノ酸配列である。
［配列番号２５］モノクローナル抗体６Ｄ６の重鎖のアミノ酸配列である。
［配列番号２６］６Ｄ６Ｌ−Ｆ１プライマーの塩基配列
［配列番号２７］６Ｄ６Ｌ−Ｒ１プライマーの塩基配列
［配列番号２８］６Ｄ６Ｌ−Ｆ２プライマーの塩基配列
［配列番号２９］６Ｄ６Ｌ−Ｒ２プライマーの塩基配列
［配列番号３０］６Ｄ６Ｈ−Ａｖｒ−Ｆプライマーの塩基配列
［配列番号３１］６Ｄ６Ｈ−Ｍｕｔ−Ａｌａ−Ｒプライマーの塩基配列
［配列番号３２］６Ｄ６Ｈ−Ｍｕｔ−Ａｌａ−Ｆプライマーの塩基配列
［配列番号３３］６Ｄ６Ｈ−Ａｐａ−Ｒプライマーの塩基配列
［配列番号３４］６Ｄ６Ｈ−Ｍｕｔ−Ｓｅｒ−Ｒプライマーの塩基配列
［配列番号３５］６Ｄ６Ｈ−Ｍｕｔ−Ｓｅｒ−Ｆプライマーの塩基配列
［配列番号３６］ヒト化抗体を作成する際にフレームワーク素材として使用できるヒト抗体フレームワークのアミノ酸配列（軽鎖１）
［配列番号３７］ヒト化抗体を作成する際にフレームワーク素材として使用できるヒト抗体フレームワークのアミノ酸配列（軽鎖２）
［配列番号３８］ヒト化抗体を作成する際にフレームワーク素材として使用できるヒト抗体フレームワークのアミノ酸配列（重鎖１）
［配列番号３９］ヒト化抗体を作成する際にフレームワーク素材として使用できるヒト抗体フレームワークのアミノ酸配列（重鎖２）
［配列番号４０］Ｈ鎖ＣＤＲ３Ａｌａアミノ酸配列 
［配列番号４１］Ｈ鎖ＣＤＲ３Ｓｅｒアミノ酸配列
［配列番号４２］６Ｄ６キメラ抗体（ＣＤＲ３のＣｙｓをＳｅｒに置換）の重鎖可変領域のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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