(57)【要約】本発明は、（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有することを特徴とするタンパク質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３１位、２１１位及び３１８位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３１位、２１１位及び３１８位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３６９位、１４４９位及び１５５６位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３６９位、１４４９位及び１５５６位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
以下の（ｇ）〜（ｊ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｇ）配列番号３又は４で表される塩基配列、
（ｈ）配列番号３又は４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列、
（ｉ）配列番号３又は４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、
（ｊ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡと、を備えるタンパク質−ＲＮＡ複合体。
【請求項４】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、
前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＹＧ（Ｙは、シトシン又はチミンのピリミジン）からなるＰＡＭ配列を有し、
前記タンパク質は、請求項１に記載のタンパク質であり、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。
【請求項５】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、
前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する工程と、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、修飾された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＹＧ（Ｙは、シトシン又はチミンのピリミジン）からなるＰＡＭ配列を有し、
前記タンパク質は、請求項１に記載のタンパク質であり、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。
【請求項６】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において選択的且つ部位特異的に修飾するための方法であって、
細胞内に、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂ及びガイドＲＮＡをインジェクションする工程と、
細胞に青色の光を照射し、前記タンパク質Ａ及び前記タンパク質Ｂを結合し、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を回復する工程と、
前記タンパク質Ａ及び前記タンパク質Ｂの結合体が、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する工程と、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、修飾された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＹＧ（Ｙは、シトシン又はチミンのピリミジン）からなるＰＡＭ配列を有し、
前記タンパク質Ａは、Ｃ末端に光スイッチタンパク質ａが結合した融合タンパク質であって、以下の（ｋ）〜（ｍ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質を含み、且つ、前記タンパク質Ｂと結合することでＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であり、
（ｋ）配列番号５で表されるアミノ酸配列、
（ｌ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｍ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
前記タンパク質Ｂは、Ｎ末端に光スイッチタンパク質ｂが結合した融合タンパク質であって、以下の（ｎ）〜（ｐ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質を含み、且つ、前記タンパク質Ａと結合することでＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であり、
（ｎ）配列番号６で表されるアミノ酸配列、
（ｏ）配列番号６で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５２６位、６０６位及び７１３位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｐ）配列番号６で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５２６位、６０６位及び７１３位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法を用いて、標的遺伝子のノックアウト細胞を作製する方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法を用いて、標的遺伝子のノックイン細胞を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変されたＦｎＣａｓ９タンパク質及びその使用に関する。
本願は、２０１５年７月１４日に、日本に出願された特願２０１５−１４０７６１号、及び２０１６年２月１０日に、米国に仮出願された米国特許第６２／２９３，３３３号明細書に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子と共に、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成することが知られている。ＣＲＩＳＰＲは、ファージまたはプラスミドＤＮＡに起因することが多く、大きさの類似するスペーサーと呼ばれる独特の可変ＤＮＡ配列が間に入った、２４〜４８ｂｐの短い保存された反復配列からなる。また、リピート及びスペーサー配列の近傍には、Ｃａｓタンパク質ファミリーをコードする遺伝子群が存在する。【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおいて、外来性のＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質ファミリーによって３０ｂｐ程度の断片に切断され、ＣＲＩＳＰＲに挿入される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ１及びＣａｓ２タンパク質は、外来性ＤＮＡのｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）と呼ばれる塩基配列を認識して、その上流を切り取って、宿主のＣＲＩＳＰＲ配列に挿入し、これが細菌の免疫記憶となる。免疫記憶を含むＣＲＩＳＰＲ配列が転写されて生成したＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡと呼ぶ。）は、一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）と対合し、Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ９タンパク質に取り込まれる。Ｃａｓ９に取り込まれたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡはＲＮａｓｅＩＩＩにより切断され、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡｓ：ｃｒＲＮＡｓ）となり、Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体はｃｒＲＮＡと相補的な外来侵入性ＤＮＡに結合し、ＤＮＡを切断する酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）であるＣａｓ９タンパク質が、外来侵入性ＤＮＡを切断することよって、外から侵入したＤＮＡの機能を抑制及び排除する。【０００４】
Ｃａｓ９タンパク質は外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断する。ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によってさまざまであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）では「ＮＧＧ」の３塩基を認識する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は２つのＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」(Ｎは任意の塩基を表す。)の５〜６塩基をＰＡＭ配列として認識する。ＰＡＭ配列の上流の何ｂｐのところを切断するかも細菌種によって異なるが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを含め大部分のＣａｓ９オルソログはＰＡＭ配列の３塩基上流を切断する。【０００５】
近年、細菌でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを、ゲノム編集に応用する技術が盛んに開発されている。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを融合させて、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラ（以下、ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ：ｇＲＮＡ）と呼ぶ。）として発現させ、活用している。これによりｎｕｃｌｅａｓｅ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＲＧＮ）を呼び込み、目的の部位でゲノムＤＮＡを切断する。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムには、ｔｙｐｅＩ、ＩＩ、ＩＩＩがあるが、ゲノム編集で用いるのはもっぱらｔｙｐｅＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり、ｔｙｐｅＩＩではＲＧＮとしてＣａｓ９タンパク質が用いられている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質はＮＧＧという３つの塩基をＰＡＭ配列として認識するため、グアニンが２つ並んだ配列がありさえすればその上流を切断できる。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いた方法は、目的のＤＮＡ配列と相同な短いｇＲＮＡを合成するだけでよく、単一のタンパク質であるＣａｓ９タンパク質を用いてゲノム編集ができる。そのため、従来用いられていたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）やトランス活性化因子様作動体（ＴＡＬＥＮ）のようにＤＮＡ配列ごとに異なる大きなタンパク質を合成する必要がなく、簡便かつ迅速にゲノム編集を行うことができる。【０００６】
特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。
特許文献２には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。さらに、特許文献２には、Ｃａｓ９タンパク質のＤ３１Ａ又はＮ８９１Ａ変異体が、一方のＤＮＡ鎖のみにｎｉｃｋを入れるＤＮＡ切断酵素であるｎｉｃｋａｓｅとして機能することが開示されている。さらに、ＤＮＡ切断後の修復メカニズムで挿入欠失などの変異を起こしやすい非相同末端結合の発生率は少ないままで、野生型Ｃａｓ９タンパク質と同程度の相同組み換え効率を有することが示されている。
非特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９を使用したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであって、２つのＣａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体と、該Ｄ１０Ａ変異体と複合体を形成する１対の標的特異的ガイドＲＮＡを利用するダブルニッカーゼシステムが開示されている。各Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体及び標的特異的ガイドＲＮＡの複合体は、ガイドＲＮＡと相補するＤＮＡ鎖に１つだけニックを作る。一対のガイドＲＮＡは約２０塩基程度ずれており、標的ＤＮＡの反対鎖に位置する標的配列のみを認識する。各Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体及び標的特異的ガイドＲＮＡの複合体によって作られた２つのニックはＤＮＡ二本鎖切断（ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ：ＤＳＢ）を模倣する状態になり、一対のガイドＲＮＡを利用することで高レベルの効率を維持しつつ、Ｃａｓ９タンパク質媒介型遺伝子編集の特異性を改善できることが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０９３６６１号
【特許文献２】特表２０１５−５１０７７８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ran, F. A., et al., “Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity”, Cell, vol.154, p1380-1389, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１に開示されているＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質は、認識可能なＰＡＭ配列が「ＮＧＧ」の３塩基であり、特許文献２に開示されているＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質では、認識可能なＰＡＭ配列が「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」の５〜６塩基である。よって、ともに認識可能なＰＡＭ配列に制限があるため、編集可能な標的配列が制限される。
また、非特許文献１に開示されているダブルニッカーゼシステムでは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質を使用しており、認識可能なＰＡＭ配列が標的配列内のセンス鎖及びアンチセンス鎖に１か所ずつ計２か所必要となるため、さらに編集可能な標的配列が制限される。【００１０】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ち、さらにエンドヌクレアーゼ活性を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を提供する。また、前記Ｃａｓ９タンパク質を利用した簡便且つ迅速で標的配列に部位特異的なゲノム編集技術を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３１位、２１１位及び３１８位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３１位、２１１位及び３１８位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３６９位、１４４９位及び１５５６位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３６９位、１４４９位及び１５５６位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。【００１２】
［２］以下の（ｇ）〜（ｊ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
（ｇ）配列番号３又は４で表される塩基配列、
（ｈ）配列番号３又は４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列、
（ｉ）配列番号３又は４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、
（ｊ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。【００１３】
［３］［１］に記載のタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡと、を備えるタンパク質−ＲＮＡ複合体。【００１４】
［４］標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、
前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＹＧ（Ｙは、シトシン又はチミンのピリミジン）からなるＰＡＭ配列を有し、
前記タンパク質は、［１］に記載のタンパク質であり、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。【００１５】
［５］標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、
前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する工程と、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、修飾された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＹＧ（Ｙは、シトシン又はチミンのピリミジン）からなるＰＡＭ配列を有し、
前記タンパク質は、［１］に記載のタンパク質であり、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。【００１６】
［６］標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において選択的且つ部位特異的に修飾するための方法であって、
細胞内に、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂ及びガイドＲＮＡをインジェクションする工程と、
細胞に青色の光を照射し、前記タンパク質Ａ及び前記タンパク質Ｂを結合し、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を回復する工程と、
前記タンパク質Ａ及び前記タンパク質Ｂの結合体が、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する工程と、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、修飾された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＹＧ（Ｙは、シトシン又はチミンのピリミジン）からなるＰＡＭ配列を有し、
前記タンパク質Ａは、Ｃ末端に光スイッチタンパク質ａが結合した融合タンパク質であって、以下の（ｋ）〜（ｍ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質を含み、且つ、前記タンパク質Ｂと結合することでＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であり、
（ｋ）配列番号５で表されるアミノ酸配列、
（ｌ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｍ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
前記タンパク質Ｂは、Ｎ末端に光スイッチタンパク質ｂが結合した融合タンパク質であって、以下の（ｎ）〜（ｐ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質を含み、且つ、前記タンパク質Ａと結合することでＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であり、
（ｎ）配列番号６で表されるアミノ酸配列、
（ｏ）配列番号６で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５２６位、６０６位及び７１３位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｐ）配列番号６で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５２６位、６０６位及び７１３位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法。【００１７】
［７］［６］に記載の方法を用いて、標的遺伝子のノックアウト細胞を作製する方法。
［８］［６］に記載の方法を用いて、標的遺伝子のノックイン細胞を作製する方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ち、さらにエンドヌクレアーゼ活性を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を得ることができる。また、前記Ｃａｓ９タンパク質を利用した簡便且つ迅速で標的配列に部位特異的なゲノム編集技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】種の異なる細菌において、認識可能なＰＡＭ配列を示す図である。
【図１Ｂ】種の異なる細菌において、認識可能なＰＡＭ配列を示す表である。
【図２Ａ】Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９タンパク質（ＦｎＣａｓ９タンパク質）、ガイドＲＮＡ及び標的二本鎖ポリヌクレオチドの四者複合体の結晶構造解析の結果を示す図である。
【図２Ｂ】Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９タンパク質（ＦｎＣａｓ９タンパク質）、ガイドＲＮＡ及び標的二本鎖ポリヌクレオチドの四者複合体の結晶構造解析の結果を示す図２Ａの拡大図である。
【図３】野生型ＦｎＣａｓ９タンパク質中、及び本実施形態におけるＣａｓ９タンパク質中のＰＡＭ配列認識部位と標的二本鎖ポリヌクレオチドとの相互作用又は非相互作用の一例を模式的に表す図である。
【図４Ａ】野生型ＦｎＣａｓ９タンパク質中の１４４９番目のグルタミン酸とＰＡＭ配列と相補的な配列中の２番目のシトシンとの相互作用を示すモデル図である。
【図４Ｂ】本実施形態におけるＣａｓ９タンパク質の一例として１４４９番目のヒスチジンと相補的な配列中の２番目のシトシンとの相互作用を示すモデル図である。
【図５Ａ】野生型ＦｎＣａｓ９タンパク質中の１５５６番目のアルギニンとＰＡＭ配列中の２番目のグアニンとの相互作用を示すモデル図である。
【図５Ｂ】本実施形態におけるＣａｓ９タンパク質の一例として１５５６番目のアラニンとＰＡＭ配列中の２番目のグアニンとの非相互作用を示すモデル図である。
【図６Ａ】野生型ＦｎＣａｓ９タンパク質中の１３６９番のグルタミン酸とＰＡＭ配列と相補的な配列中の１番目のアデニンと２番目のシトシンの間にあるリン酸基との非相互作用を示すモデル図である。
【図６Ｂ】本実施形態におけるＣａｓ９タンパク質の一例として１３６９番のアルギニンとＰＡＭ配列と相補的な配列中の１番目のアデニンと２番目のシトシンの間にあるリン酸基との相互作用を示すモデル図である。
【図７】本実施形態におけるＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質−ガイドＲＮＡ複合体による標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断する様子を表す模式図である。
【図８】本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に修飾するための方法の工程を示す図である。
【図９】本実施形態における標的遺伝子上の塩基配列の切断とそれに引き続く標的遺伝子の修復を説明した図である。
【図１０Ａ】実施例１におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表した画像である。
【図１０Ｂ】実施例１におけるＤＮＡ切断活性測定試験のアガロースゲル電気泳動の結果を表した画像である。
【図１１Ａ】実施例２における各種Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡをインジェクションした胚の発生率を示したグラフである。
【図１１Ｂ】実施例２におけるＦｎＣａｓ９及び長さの異なるガイドＲＮＡをインジェクションした胚盤胞の形態を示した画像である。
【図１２】実施例２における各種Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡをインジェクションした胚盤胞におけるノックアウト効率を示したグラフである。
【図１３】実施例３における野生型ＦｎＣａｓ９又は変異型ＦｎＣａｓ９、及びガイドＲＮＡをインジェクションした胚盤胞におけるノックアウト効率を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。
なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
【００２１】
＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞
一実施形態において、本発明は、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質を提供する。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３１位、２１１位及び３１８位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３１位、２１１位及び３１８位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３６９位、１４４９位及び１５５６位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３６９位、１４４９位及び１５５６位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【００２２】
本実施形態のタンパク質は、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ち、さらにエンドヌクレアーゼ活性を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質である。本実施形態のタンパク質によれば、簡便且つ迅速で標的配列に部位特異的なゲノム編集技術を提供することができる。
【００２３】
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを意味し、互換的に使用される。また、１つ若しくは複数のアミノ酸が、天然に存在する対応アミノ酸の化学的類似体、又は修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーを意味する。
【００２４】
本明細書中において、「配列」とは、任意の長さのヌクレオチド配列を意味しており、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、線状、環状、又は分岐状であり、一本鎖又は二本鎖である。
本明細書中において、「ＰＡＭ配列」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中に存在し、Ｃａｓ９タンパク質により認識可能な配列を意味し、ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によって異なる。本実施形態のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質により認識可能な配列は、「５’−ＹＧ−３’」で表すことができる。
【００２５】
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」とは、線状又は環状配座であり、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるものではない。また、天然ヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチエート骨格）を包含する。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は、同一の塩基対合特異性を有し、例えば、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
【００２６】
本明細書中において、「ガイドＲＮＡ」とは、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡのヘアピン構造を模倣したものであり、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。さらに、標的二本鎖ポリヌクレオチドと非相補的な塩基配列からなり、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
【００２７】
本発明者らは、ＰＡＭ認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を得るために、Ｃａｓ９のオルソログを調べ、オルソログの中で最もＰＡＭ認識の制限が緩いＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のＣａｓ９タンパク質に着目した。
本明細書において、「オルソログ」とは、共通の祖先遺伝子から種分岐に伴って派生した遺伝子間の対応関係、もしくは、そのような対応関係にある遺伝子群を意味する。
図１Ａは、種の異なる細菌において、認識可能なＰＡＭ配列を示した図であり、図１Ｂは種の異なる細菌において、認識可能なＰＡＭ配列を示した表である。Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ９タンパク質（ＦｎＣａｓ９タンパク質）は５’−ＮＧＲ−３’という３つの塩基をＰＡＭ配列として認識すればよく、ＰＡＭ配列による制限が他の種のＣａｓ９タンパク質と比較して緩いことがわかる。
なお、本明細書において、「Ｎ」は、アデニン、シトシン、チミン及びグアニンからなる群から選択された任意の１塩基を意味し、「Ａ」はアデニン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｔ」はチミン、「Ｒ」はプリン骨格を有する塩基（アデニン又はグアニン）、「Ｙ」はピリミジン骨格を有する塩基（シトシン又はチミン）を意味する。
【００２８】
続いて、ＦｎＣａｓ９タンパク質、ガイドＲＮＡ及び標的二本鎖ポリヌクレオチドの三者複合体について、結晶構造解析を行い、ＰＡＭ配列認識部位の構造を得た。図２Ａ及び図２Ｂは、ＦｎＣａｓ９タンパク質、ガイドＲＮＡ及び標的二本鎖ポリヌクレオチドの四者複合体の結晶構造解析の結果を示す図である。ＰＡＭ配列として「５’−ＴＧＧ−３’」をガイドＲＮＡと非相補的な塩基配列に含む鎖を有する標的二本鎖ポリヌクレオチドを用いた。図２Ｂから、ＰＡＭ配列認識部位において、ＦｎＣａｓ９タンパク質中の１５８５番目のアルギニン（Ａｒｇ１５８５）とＰＡＭ配列中の２番目のグアニンとが水素結合を形成しており、さらに、ＦｎＣａｓ９タンパク質中の１５５６番目のアルギニン（Ａｒｇ１５５６）とＰＡＭ配列中の３番目のグアニンとが水素結合を形成していることが明らかとなった。
また、図３の左側は、野生型ＦｎＣａｓ９タンパク質中のＰＡＭ配列認識部位と標的二本鎖ポリヌクレオチドとの相互作用を模式的に表した図である。また、図４Ａ、図５Ａ、及び図６Ａは、野生型ＦｎＣａｓ９タンパク質中のＰＡＭ配列認識部位の各アミノ酸と標的二本鎖ポリヌクレオチドとの相互作用を拡大して示すモデル図である。標的二本鎖ポリヌクレオチド内のガイドＲＮＡと相補的な塩基配列を含む鎖において、ＰＡＭ配列と相補的な配列である「３’−ＮＣＣ−５’」では、野生型ＦｎＣａｓ９タンパク質中の１２４１番目のアルギニンと１４４９番目のグルタミン酸と、ＰＡＭ配列と相補的な配列中の２番目のシトシンとが、水分子を介した水素結合を形成していることが明らかとなった（図３左側及び図４Ａ参照。）。
そこで、上述した野生型ＦｎＣａｓ９タンパク質中のＰＡＭ配列認識部位の改変を試み、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ち、さらにエンドヌクレアーゼ活性を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を発明するに至った。
【００２９】
本発明のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質は、具体的には、下記（ａ）又は（ｄ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質である。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列。
【００３０】
配列番号１は、ＦｎＣａｓ９タンパク質中のＰＡＭ配列認識部位の配列（１２３８番目のメチオニンから１６２９番目のアスパラギンまでの３９１残基）であって、ＰＡＭ配列の認識が広範化されるように点変異を施したアミノ酸配列である。
配列番号２は、ＦｎＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列であって、ＰＡＭ配列の認識が広範化されるように点変異を施したアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号２のアミノ酸番号１４４９位（配列番号１のアミノ酸番号２１１位）のアスパラギン酸をシトシンと水素結合し得る側鎖を有するアミノ酸に改変することで、標的二本鎖ポリヌクレオチド内のＰＡＭ配列と相補的な配列おける２番目のシトシン（３’−Ｎ『Ｃ』Ｃ−５’）と直接水素結合するため、結合力を強めることができる。「ヌクレオチドと水素結合し得る側鎖を有するアミノ酸」としては、例えば、アスパラギン、グルタミン及びヒスチジンが挙げられ、この中で、ヒスチジンが好ましい。
さらに、配列番号２のアミノ酸番号１５５６位（配列番号１のアミノ酸番号３１８位）のアルギニンを分子構造の小さいアミノ酸に改変することで、ＰＡＭ配列中の３番目のグアニン（５’−ＮＧ『Ｇ』−３’）との水素結合がなくなるため、ＰＡＭ配列の認識が広範化することができる。「分子構造の小さいアミノ酸」としては、例えば、アラニン、グリシン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、トレオニン、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸が挙げられ、この中で、アラニンが好ましい。
さらに、配列番号２のアミノ酸番号１３６９位（配列番号１のアミノ酸番号１３１位）のグルタミン酸を塩基性アミノ酸又は任意の核酸のうち、プリン骨格を有する塩基（アデニン又はグアニン）中のリン酸基と水素結合し得るアミノ酸に改変することで、標的二本鎖ポリヌクレオチド内のＰＡＭ配列と相補的な配列おける１番目の任意の核酸（３’−『Ｎ』ＣＣ−５’）のうち、プリン骨格を有する塩基（アデニン又はグアニン）中のリン酸基との結合力を強めることができる。「塩基性アミノ酸」としては、例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられる。また、「任意の核酸のうち、プリン骨格を有する塩基（アデニン又はグアニン）中のリン酸基と水素結合し得るアミノ酸」としては、例えば、アスパラギン、グルタミン、チロシンが挙げられる。これらの中で、アルギニンが好ましい。
【００３２】
本発明のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質は、前記（ａ）又は（ｄ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質として、下記（ｂ）若しくは（ｃ）、又は、（ｅ）若しくは（ｆ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質を含有する。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３１位、２１１位及び３１８位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３１位、２１１位及び３１８位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３６９位、１４４９位及び１５５６位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１３６９位、１４４９位及び１５５６位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【００３３】
前記（ａ）又は（ｄ）のタンパク質と機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
また、ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、１〜１５個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００３４】
本明細書において、「エンドヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の途中を切断する酵素を意味する。よって、本実施形態のＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質は、ガイドＲＮＡにより誘導され、ＤＮＡ鎖の途中を切断する酵素活性を有する。
【００３５】
本実施形態のタンパク質は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であれば、上記（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもかまわない。
【００３６】
図３の右側は、本実施形態におけるＣａｓ９タンパク質中のＰＡＭ配列認識部位と標的二本鎖ポリヌクレオチドとの相互作用の一例を模式的に表した図である。また、図４Ｂ、図５Ｂ、及び図６Ｂは本実施形態のＣａｓ９タンパク質の一例として改変されたＰＡＭ配列認識部位の各アミノ酸と標的二本鎖ポリヌクレオチドとの相互作用又は非相互作用を拡大して示したモデル図である。
図３の右側、並びに図４Ｂ、図５Ｂ、及び図６Ｂに示すように、ＦｎＣａｓ９タンパク質全長の１３６９番目のグルタミン酸をアルギニンに、１４４９番目のアスパラギン酸をヒスチジンに、１５５６番目のアルギニンをアラニンに改変している。改変されたＦｎＣａｓ９タンパク質の１３６９番目のアルギニンが標的二本鎖ポリヌクレオチド内のＰＡＭ配列と相補的な配列おける１番目のプリン骨格を有する塩基（アデニン又はグアニン）（３’−『Ｒ』ＣＣ−５’）中のリン酸基との結合力を強めている（図３の右側、及び図６Ｂ参照。）。また、改変されたＦｎＣａｓ９タンパク質の１４４９番目のヒスチジンが標的二本鎖ポリヌクレオチド内のＰＡＭ配列と相補的な配列おける２番目のシトシン（３’−Ｒ『Ｃ』Ｃ−５’）と水素結合することで（図３の右側、及び図４Ｂ参照）、改変されたＦｎＣａｓ９タンパク質の１５８５番目のアルギニンとＰＡＭ配列中の２番目のグアニン（５’−Ｙ『Ｇ』Ｇ−３’）との相互作用を補強している。さらに、改変されたＦｎＣａｓ９タンパク質の１５５６番目のアミノ酸をアラニンにすることで、ＰＡＭ配列中の３番目のグアニン（５’−ＹＧ『Ｇ』−３’）との相互作用がなくなるため（図３の右側、及び図５Ｂ参照。）、認識可能なＰＡＭ配列が「５’−ＹＧ−３’」となり、広範化することができる。
【００３７】
本実施形態におけるＰＡＭ認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質は、例えば次のような方法により作成することができる。まず、前記ＰＡＭ認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含むベクターを用いて、宿主を形質転換する。続いて、当該宿主を培養して前記タンパク質を発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、前記タンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現した前記タンパク質を適宜の方法により精製することにより、ＰＡＭ認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質が得られる。
宿主としては、特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物が挙げられる。
【００３８】
＜タンパク質をコードする遺伝子＞
一実施形態において、本発明は、以下の（ｇ）〜（ｊ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
（ｇ）配列番号３又は４で表される塩基配列、
（ｈ）配列番号３又は４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠損、置換又は付加されている塩基配列、
（ｉ）配列番号３又は４で表される塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、
（ｊ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００３９】
本実施形態の遺伝子によれば、発現ベクターに挿入し宿主に形質転換することで、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ち、さらにエンドヌクレアーゼ活性を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を得ることができる。
【００４０】
配列番号３は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。また、配列番号４は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００４１】
ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよい塩基の数としては、１〜３０個が好ましく、１〜１５個がより好ましく、１〜１０個が特に好ましく、１〜５個が最も好ましい。
【００４２】
本明細書において、「ストリンジェンとな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００４３】
＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質−ガイドＲＮＡ複合体＞
一実施形態において、本発明は、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡと、を備えるタンパク質−ＲＮＡ複合体を提供する。
【００４４】
本実施形態のタンパク質−ＲＮＡ複合体によれば、ＰＡＭ配列が広範化され、簡便且つ迅速で標的配列に対し部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの編集をすることができる。
【００４５】
前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは、iｎ  ｖｉｔｒｏ及びiｎ  ｖｉｖｏにおいて、温和な条件で混合することで、タンパク質−ＲＮＡ複合体を形成することができる。温和な条件とは、タンパク質が分解又は変性しない程度の温度及びｐＨを示しており、温度は４℃以上４０℃以下が好ましく、ｐＨは４以上１０以下が好ましい。
また、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡを混合し、インキュベートする時間は、０．５時間以上１時間以下が好ましい。前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡによる複合体は、安定しており、室温で数時間静置しても安定性を保つことができる。
【００４６】
＜ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステム＞
一実施形態において、本発明は、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質をコードする遺伝子を含む第１のベクターと、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ）配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡを含む第２のベクターと、を備えるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを提供する。
【００４７】
本実施形態のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムによれば、ＰＡＭ配列が広範化され、簡便且つ迅速で標的配列に対し部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの編集をすることができる。
【００４８】
上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質をコードする遺伝子は、上述の＜タンパク質をコードする遺伝子＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
【００４９】
ガイドＲＮＡは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２２塩基以上２４塩基以下までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものを適宜設計すればよい。さらに、標的二本鎖ポリヌクレオチドと非相補的な塩基配列からなり、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。  
【００５０】
本実施形態のベクターは、発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウィルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
【００５１】
上述の発現ベクターにおいて、前記Ｃａｓ９タンパク質、及び前記ガイドＲＮＡ発現用プロモーターとしては特に限定されず、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター等の動物細胞における発現用のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ＲＥＦ（ｒｕｂｂｅｒ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）プロモーター等の植物細胞における発現用のプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等の昆虫細胞における発現用のプロモーター等を使用することができる。これらプロモーターは、前記Ｃａｓ９タンパク質、及び前記ガイドＲＮＡ、又は前記Ｃａｓ９タンパク質、及び前記ガイドＲＮＡを発現する細胞の種類に応じて、適宜選択することができる。
【００５２】
上述の発現ベクターは、さらに、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
【００５３】
＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞
［第１実施形態］
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＹＧ（Ｙは、シトシン又はチミンのピリミジン）からなるＰＡＭ配列を有し、
前記タンパク質は、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質であり、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。
【００５４】
本実施形態の方法によれば、ＰＡＭ配列が広範化されたＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼを用いることで、簡便であって迅速、且つ標的配列に対し部位特異的に標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断することができる。
【００５５】
本実施形態において、標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＹＧ（Ｙは、シトシン又はチミンのピリミジン）からなるＰＡＭ配列を有するものであればよく、特別な限定はない。
本実施形態において、タンパク質及びガイドＲＮＡについては、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたとおりである。
【００５６】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法について、以下に詳細を説明する。
まず、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡを温和な条件で混合し、インキュベートする。温和な条件とは、上述のとおりである。インキュベートする時間は、０．５時間以上１時間以下が好ましい。前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡによる複合体は、安定しており、室温で数時間静置しても安定性を保つことができる。
【００５７】
次に、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド上において、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは複合体を形成する。前記タンパク質は、「５’−ＹＧ−３’」からなるＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する。図７は、本実施形態におけるＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質−ガイドＲＮＡ複合体による標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断する様子を表す模式図である。前記Ｃａｓ９タンパク質がＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列を起点として、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの二重らせん構造が引き剥され、前記ガイドＲＮＡ中の前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列とアニーリングすることで、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの二重らせん構造が部分的にほぐれる。このとき、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位、及びＰＡＭ配列と相補的な配列の３塩基上流に位置する切断部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドのリン酸ジエステル結合を切断し、平滑末端を作出する。
【００５８】
［第２実施形態］
本実施形態において、インキュベート工程の前に、さらに、上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを用いて、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、ガイドＲＮＡとを発現させる発現工程を備えていてもよい。
【００５９】
本実施形態の発現工程において、まず、上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを用いて、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを発現させる。発現させる具体的な方法としては、Ｃａｓ９タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、及びガイドＲＮＡを含む発現ベクターそれぞれを用いて、宿主を形質転換する。続いて、当該宿主を培養してＣａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡを発現させる。培地の組成、培養の温度、時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、融合タンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現したＣａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡを適宜の方法により精製することにより、Ｃａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡが得られる。
【００６０】
＜標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法＞
［第１実施形態］
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、タンパク質と、ガイドＲＮＡとを混合し、インキュベートする工程と、前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する工程と、前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、修飾された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＹＧ（Ｙは、シトシン又はチミンのピリミジン）からなるＰＡＭ配列を有し、
前記タンパク質は、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質であり、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。
【００６１】
本実施形態の方法によれば、ＰＡＭ配列が広範化されたＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼを用いることで、簡便であって迅速、且つ標的配列に対し部位特異的に標的二本鎖ポリヌクレオチドを修飾することができる。
【００６２】
本実施形態において、標的二本鎖ポリヌクレオチド、タンパク質及びガイドＲＮＡについては、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞、及び＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞において示されたとおりである。
【００６３】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法について、以下に詳細を説明する。標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するまでの工程は上述の＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞に示された工程と同様である。続いて、前記ガイドＲＮＡと前記二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、目的に応じた修飾が施された標的二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。
【００６４】
本明細書中において、「修飾」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列が変化することを意味する。例えば、標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断、切断後の外因性配列の挿入（物理的挿入又は相同指向修復を介する複製による挿入）による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化、切断後の非相同末端連結（ＮＨＥＪ：切断により生じたＤＮＡ末端どうしが再び結合すること）による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化等が挙げられる。
本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾により、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの変異の導入、又は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの機能を破壊することができる。
【００６５】
［第２実施形態］
本実施形態において、インキュベート工程の前に、さらに、上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを用いて、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、ガイドＲＮＡとを発現させる発現工程を備えていてもよい。
【００６６】
本実施形態の発現工程において、まず、上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを用いて、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを発現させる。発現させる具体的な方法としては、上述の＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞の［第２実施形態］において例示された方法と同様である。
【００６７】
＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に修飾するための方法＞
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に修飾するための方法であって、
上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを細胞に導入し、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示されたタンパク質と、ガイドＲＮＡとを発現させる発現工程と、
前記タンパク質が、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する工程と、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、修飾された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＹＧ（Ｙは、シトシン又はチミンのピリミジン）からなるＰＡＭ配列を有し、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。
【００６８】
本実施形態の発現工程において、まず、上述のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムを用いて、細胞内において、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡを発現させる。
【００６９】
本実施形態の方法の適用対象となる細胞の由来となる生物としては、例えば、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫等が挙げられる。前記動物としては、特別な限定はなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられ、これらに限定されない。
また、細胞の由来となる生物の種類は、所望の標的二本鎖ポリヌクレオチドの種類、目的等により任意に選択することができる。
【００７０】
本実施形態の方法の適用対象となる動物由来の細胞としては、例えば、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離されたガン細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７１】
生体を構成する体細胞としては、例えば、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳、神経組織等の任意の組織から採取される細胞等が挙げられ、これらに限定されない。体細胞として、より具体的には、例えば、線維芽細胞、骨髄細胞、免疫細胞（例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、マクロファージ、単球、等）、赤血球、血小板、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、肝細胞、膵島細胞（例えば、α細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞等）、軟骨細胞、卵丘細胞、グリア細胞、神経細胞（ニューロン）、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心筋細胞、食道細胞、筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞、骨格筋細胞等）、メラニン細胞、単核細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７２】
幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、ガン幹細胞、毛包幹細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７３】
がん細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。がん細胞の由来となるがんとしては、例えば、乳がん（例えば、浸潤性乳管がん、非浸潤性乳管がん、炎症性乳がん等）、前立腺がん（例えば、ホルモン依存性前立腺がん、ホルモン非依存性前立腺がん等）、膵がん（例えば、膵管がん等）、胃がん（例えば、乳頭腺がん、粘液性腺がん、腺扁平上皮がん等）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性中皮腫等）、結腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、直腸がん（例えば、消化管間質腫瘍等）、大腸がん（例えば、家族性大腸がん、遺伝性非ポリポーシス大腸がん、消化管間質腫瘍等）、小腸がん（例えば、非ホジキンリンパ腫、消化管間質腫瘍等）、食道がん、十二指腸がん、舌がん、咽頭がん（例えば、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん等）、頭頚部がん、唾液腺がん、脳腫瘍（例えば、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫等）、神経鞘腫、肝臓がん（例えば、原発性肝がん、肝外胆管がん等）、腎臓がん（例えば、腎細胞がん、腎盂と尿管の移行上皮がん等）、胆嚢がん、胆管がん、膵臓がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、卵巣がん（例、上皮性卵巣がん、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣性胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍等）、膀胱がん、尿道がん、皮膚がん（例えば、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞がん等）、血管腫、悪性リンパ腫（例えば、細網肉腫、リンパ肉腫、ホジキン病等）、メラノーマ（悪性黒色腫）、甲状腺がん（例えば、甲状腺髄様ガン等）、副甲状腺がん、鼻腔がん、副鼻腔がん、骨腫瘍（例えば、骨肉腫、ユーイング腫瘍、子宮肉腫、軟部組織肉腫等）、転移性髄芽腫、血管線維腫、隆起性皮膚線維肉腫、網膜肉腫、陰茎癌、精巣腫瘍、小児固形がん（例えば、ウィルムス腫瘍、小児腎腫瘍等）、カポジ肉腫、ＡＩＤＳに起因するカポジ肉腫、上顎洞腫瘍、線維性組織球腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、慢性骨髄増殖性疾患、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病等）等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７４】
細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株としては、例えば、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸がん細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ−３３Ａ、ＨＴ−２９、ＡＥ−１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ、Ｖｅｒｏ等が挙げられ、これらに限定されない。
【００７５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓベクターシステムの細胞への導入方法としては、使用する生細胞に適した方法で行うことができ、エレクトロポレーション法、ヒートショック法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、ウイルスを用いた方法や、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ６  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）などの市販のトランスフェクション試薬を用いた方法などを挙げることができる。
【００７６】
続く、平滑末端作出工程、及び修飾工程については、上述の＜標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法＞の［第１実施形態］に示された方法と同様である。
本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾により、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの変異の導入、又は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの機能が破壊された細胞を得ることができる。
【００７７】
＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において選択的且つ部位特異的に修飾するための方法＞
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において選択的且つ部位特異的に修飾するための方法であって、
細胞内に、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂ及びガイドＲＮＡをインジェクションする工程と、
細胞に青色の光を照射し、前記タンパク質Ａ及び前記タンパク質Ｂを結合し、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を回復する工程と、
前記タンパク質Ａ及び前記タンパク質Ｂの結合体が、ＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する工程と、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、修飾された前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを得る工程と、を備え、
前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＹＧ（Ｙは、シトシン又はチミンのピリミジン）からなるＰＡＭ配列を有し、
前記タンパク質Ａは、Ｃ末端に光スイッチタンパク質ａが結合した融合タンパク質であって、以下の（ｋ）〜（ｍ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質を含み、且つ、前記タンパク質Ｂと結合することでＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であり、
（ｋ）配列番号５で表されるアミノ酸配列、
（ｌ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｍ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
前記タンパク質Ｂは、Ｎ末端に光スイッチタンパク質ｂが結合した融合タンパク質であって、以下の（ｎ）〜（ｐ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなるタンパク質を含み、且つ、前記タンパク質Ａと結合することでＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であり、
（ｎ）配列番号６で表されるアミノ酸配列、
（ｏ）配列番号６で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５２６位、６０６位及び７１３位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｐ）配列番号６で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５２６位、６０６位及び７１３位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
前記ガイドＲＮＡは、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中の前記ＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものである方法を提供する。
【００７８】
本実施形態の方法によれば、細胞内において、ＰＡＭ配列が広範化されたＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼを用いることで、簡便であって迅速、且つ標的配列に対し部位特異的に標的二本鎖ポリヌクレオチドを修飾することができる。
【００７９】
本実施形態のＰＡＭ認識が広範化されたＣａｓタンパク質は、ＰＡＭの広範化によってターゲットの選出の制限は緩和されたものの、ＰＡＭによる特異性が減少したことによるＯｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果の上昇が危惧される。よって、本発明者らは、Ｃａｓタンパク質を二分割し、Ｃａｓタンパク質のＮ末端側のアミノ酸残基からなるタンパク質のＣ末端に光スイッチタンパク質を結合した融合タンパク質、及びＣａｓタンパク質のＣ末端側のアミノ酸残基からなるタンパク質のＮ末端に光スイッチタンパク質を結合した融合タンパク質を使用することで、Ｃａｓ９の活性をコントロールすることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００８０】
本明細書において、「光スイッチタンパク質」とは、東京大学大学院総合文化研究科の佐藤守俊准教授らの研究グループにより開発された（Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６，６２５６（２０１５）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ７２５６）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）が有する小さな光受容体のヴィヴィッド（Ｖｉｖｉｄ）に対して多角的にプロテインエンジニアリングを施したタンパク質の対を意味する。光スイッチタンパク質の対は、暗所では単量体として存在し、青い光を受容するとヘテロ二量体を形成する。光による単量体と二量体の変換を利用して、さまざまな光活性化型のツールを設計及び開発することができる。光スイッチタンパク質ａのアミノ酸配列は、配列番号７に、光スイッチタンパク質ｂのアミノ酸配列は、配列番号８に示した。
【００８１】
本実施形態の方法の適用対象となる細胞としては、上述の＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に修飾するための方法＞において例示されたものと同様のものが挙げられる。
また、細胞の由来となる生物としては、例えば、原核生物、酵母、動物、植物、昆虫等が挙げられる。前記動物としては、特別な限定はなく、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等が挙げられ、これらに限定されない。
また、細胞の由来となる生物の種類は、所望の標的二本鎖ポリヌクレオチドの種類、目的等により任意に選択することができる。
【００８２】
［タンパク質Ａ］
本実施形態のタンパク質Ａは、具体的には、Ｃ末端に光スイッチタンパク質ａが結合した融合タンパク質であって、下記（ｋ）又は（ｎ）のアミノ酸配列からなるタンパク質を含み、且つ、前記タンパク質Ｂと結合することでＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質である。
（ｋ）配列番号５で表されるアミノ酸配列。
【００８３】
配列番号５は、配列番号２のアミノ酸番号１位から８２９位までのＮ末端側の８２９残基のアミノ酸配列である。
【００８４】
また、光スイッチタンパク質ａはＧｌｙ−Ｓｅｒの２塩基が８回繰り返される合計１６アミノ酸残基からなる柔軟なリンカーを介してタンパク質Ａに結合していることが好ましい。
【００８５】
本実施形態のタンパク質Ａは、具体的には、Ｃ末端に光スイッチタンパク質ａが結合した融合タンパク質であって、前記（ｋ）のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質として、下記（ｌ）又は（ｍ）のアミノ酸配列からなるタンパク質を含有する。
（ｌ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｍ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【００８６】
前記（ｋ）のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
また、ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、１〜１５個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００８７】
［タンパク質Ｂ］
本実施形態のタンパク質Ｂは、具体的には、Ｎ末端に光スイッチタンパク質ｂが結合した融合タンパク質であって、下記（ｎ）のアミノ酸配列からなるタンパク質を含み、且つ、前記タンパク質Ａと結合することでＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質である。
（ｎ）配列番号６で表されるアミノ酸配列。
【００８８】
配列番号６は、配列番号２のアミノ酸番号８４４位から１６２９位までのＣ末端側の７８６残基のアミノ酸配列である。
【００８９】
また、光スイッチタンパク質ｂは、前記タンパク質Ａと同様に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒの２塩基が８回繰り返される合計１６アミノ酸残基からなる柔軟なリンカーを介してタンパク質Ｂに結合していることが好ましい。
【００９０】
本実施形態のタンパク質Ｂは、具体的には、Ｎ末端に光スイッチタンパク質ｂが結合した融合タンパク質であって、前記（ｎ）のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質として、下記（ｏ）又は（ｐ）のアミノ酸配列からなるタンパク質を含有する。
（ｏ）配列番号６で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５２６位、６０６位及び７１３位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｐ）配列番号６で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号５２６位、６０６位及び７１３位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【００９１】
前記（ｎ）のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
また、ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、１〜１５個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００９２】
本実施形態において、前記タンパク質Ａは、Ｃ末端に光スイッチタンパク質ａが結合した融合タンパク質であって、且つ前記タンパク質Ｂと結合することでＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であれば、上記（ｋ）〜（ｍ）のいずれか一つのアミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもかまわない。
また、前記タンパク質Ｂについても同様に、Ｎ末端に光スイッチタンパク質ｂが結合した融合タンパク質であって、且つ前記タンパク質Ａと結合することでＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有するタンパク質であれば、上記（ｎ）〜（ｐ）のいずれか一つのアミノ酸配列のみからなるタンパク質であってもかまわない。
【００９３】
前記タンパク質Ａ及び前記タンパク質Ｂは、上述の＜ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質＞において示した方法により作成することができる。
【００９４】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に修飾するための方法について、以下に詳細を説明する。図８は、本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に修飾するための方法の工程を示す図である。
まず、細胞内に、前記タンパク質Ａ、前記タンパク質Ｂ及び前記ガイドＲＮＡをインジェクションする。前記タンパク質Ａ、前記タンパク質Ｂ及び前記ガイドＲＮＡの混合物をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）溶液等のバッファーに懸濁して用いることが好ましい。
インジェクション方法は、使用する細胞に応じて、公知の方法に従って当業者が決定できる。
【００９５】
次に、細胞に波長４５０ｎｍ以上４９５ｎｍ以下の青色の光を照射する。これにより、前記タンパク質Ａ内の光スイッチタンパク質ａと、前記タンパク質Ｂ内の光スイッチタンパク質ｂとが結合し、Ｃａｓ９タンパク質が再構築されて、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を回復することができる（スイッチオンの状態）。
また、光照射を止めると、前記タンパク質Ａ内の光スイッチタンパク質ａ及び前記タンパク質Ｂ内の光スイッチタンパク質ｂは結合力を失う。このため、前記タンパク質Ａ及び前記タンパク質Ｂは離れ離れになり、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を消失する（スイッチオフの状態）。
よって、光照射の時間を制御することで、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性の持続時間を非常に短く制御できるため、オフターゲットの問題（標的部位以外でも二本鎖ポリヌクレオチドの切断と塩基配列の改変が起こってしまう問題）を低減でき、狙ったタイミングや狙った時間でのみＣａｓ９タンパク質による標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断を行うことができる。
その他詳細な条件等については、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１５）  『Ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｏｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ』  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３２４５」に記載の方法を参考にして実施することができる。
【００９６】
続いて、上述の＜標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法＞と同様に、前記ガイドＲＮＡと前記二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、目的に応じた修飾が施された標的二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。
【００９７】
＜標的遺伝子のノックアウト細胞を作製する方法＞
一実施形態において、本発明は、上述の標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に修飾するための方法を用いて、標的遺伝子のノックアウト細胞を作製する方法を提供する。
【００９８】
本実施形態の方法によれば、標的遺伝子の機能が破壊（ノックアウト）された細胞を容易に作製することができる。
【００９９】
本実施形態において、標的遺伝子のノックアウト細胞の作製手順は、上述の＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に修飾するための方法＞に記載のとおりである。図９は、本実施形態における標的遺伝子上の塩基配列の切断とそれに引き続く標的遺伝子の修復を説明した図である。切断された標的遺伝子は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が起こる前に、ＤＮＡ末端に塩基の欠失や挿入が起こる。よって、ＮＨＥＪによって修復された標的遺伝子では、切断部位に位置する遺伝子の機能が破壊される（ノックアウト）。遺伝子がノックアウトされたことの検証は、ＰＣＲ及び配列をシークエンスすることなどによって確かめることができる。
【０１００】
＜標的遺伝子のノックイン細胞を作製する方法＞
一実施形態において、本発明は、上述の標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に修飾するための方法を用いて、標的遺伝子のノックイン細胞を作製する方法を提供する。
【０１０１】
本実施形態の方法によれば、標的遺伝子の機能が置換（ノックイン）された細胞を容易に作製することができる。
【０１０２】
本実施形態において、標的遺伝子のノックアウト細胞の作製手順は、上述の＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを細胞内において部位特異的に修飾するための方法＞に記載のとおりである。図９は、本実施形態における標的遺伝子上の塩基配列の切断とそれに引き続く標的遺伝子の修復を説明した図である。標的遺伝子の切断部位と相同性の高い配列を有する、Ｃａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡの細胞内への導入と同時に、又は該導入の前後のタイミングで、ドナーＤＮＡと呼ばれるＤＮＡを細胞に入れることで、ゲノムの切断部位とドナーＤＮＡとの間で相同組換え（ＨＲ）が起こる。ＨＲによって修復された標的遺伝子では、もともとの遺伝子の塩基配列がドナーＤＮＡの塩基配列で置き換えられる（ノックイン）。遺伝子がノックインされたことの検証は、ＰＣＲ及び配列をシークエンスすることなどによって確かめることができる。
【０１０３】
＜遺伝子治療＞
一実施形態において、本発明は、ゲノム編集を実行し、遺伝子を治療するための方法及び組成物を提供する。以前に知られている標的化された遺伝子組換えの方法と対照的に、本実施形態の方法は、実行が、効率的かつ安価であり、そして任意の細胞または生物に適応可能である。細胞又は生物の二本鎖核酸の任意のセグメントは、本実施形態の遺伝子治療方法により改変することができる。本実施形態の遺伝子治療方法は、全ての細胞に内在性である相同組換えプロセス及び非相同組換えプロセスの両方を利用する。
【０１０４】
本明細書において、「ゲノム編集」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムやＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）等の技術により標的化された遺伝子組換えまたは標的化された変異を実行することにより、特異的な遺伝子破壊やレポーター遺伝子のノックイン等を行う新しい遺伝子改変技術を意味する。
【０１０５】
また、一実施形態において、本発明は、標的化されたＤＮＡ挿入又は標的化されたＤＮＡ欠失を行う遺伝子治療方法を提供する。この遺伝子治療方法は、ドナーＤＮＡを含む核酸構築物を用いて、細胞を形質転換する工程を包含する。標的遺伝子切断後のＤＮＡ挿入およびＤＮＡ欠失に関するスキームについては、公知の方法に従って当業者が決定できる。
【０１０６】
また、一実施形態において、本発明は、体細胞及び生殖細胞の両方で利用され、特定の遺伝子座で遺伝子操作を行う遺伝子治療方法を提供する。
【０１０７】
また、一実施形態において、本発明は、体細胞において遺伝子を壊すための遺伝子治療方法を提供する。ここで、遺伝子は、細胞又は生物に対して有害な産物を過剰発現し、細胞又は生物に対して有害な産物を発現する。このような遺伝子は、疾患において生じる１つ以上の細胞型において過剰発現され得る。本実施形態の遺伝子治療方法による、前記過剰発現した遺伝子の破壊は、前記過剰発現した遺伝子に起因する疾患を被る個体に、より良い健康をもたらすることができる。すなわち、細胞のほんの小さな割合の遺伝子の破壊が働き、発現レベルを減少し、治療効果を生じさせる。
【０１０８】
また、一実施形態において、本発明は、生殖細胞において遺伝子を壊すための遺伝子治療方法を提供する。特定の遺伝子が破壊された細胞は、特定の遺伝子の機能を有さない生物を作製するために活用することができる。前記遺伝子が破壊された細胞において、遺伝子は完全にノックアウトさせることができる。この特定の細胞における機能の欠損は、治療効果を有し得る。
【０１０９】
また、一実施形態において、本発明は、遺伝子産物をコードするドナーＤＮＡの挿入する遺伝子治療方法を提供する。この遺伝子産物は、構成的に発現された場合、治療効果を有する。例えば、膵細胞の個体群において、活性プロモーター及びインシュリン遺伝子をコードするドナーＤＮＡの挿入を引き起こすために、前記ドナーＤＮＡを、糖尿病を被る個体に挿入する方法が挙げられる。次いで、外因性ＤＮＡを含む膵細胞の前記個体群は、インシュリンを生成し、糖尿病患者を治療することができる。
さらに、前記ドナーＤＮＡは作物に挿入され、薬剤的関連遺伝子産物を生成させることができる。タンパク質産物の遺伝子（例えば、インシュリン、リパーゼまたはヘモグロビン）は、制御エレメント（構成的活性プロモーター、または誘導性プロモーター）と一緒に植物に挿入され、植物中で大量の医薬品を生成することができる。次いで、このようなタンパク質産物は、植物から単離することができる。
トランスジェニック植物又はトランスジェニック動物は、核酸移入技術（ＭｃＣｒｅａｔｈ，Ｋ．Ｊ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：１０６６−１０６９；Ｐｏｌｅｊａｅｖａ，Ｉ．Ａ．ら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８６−９０）を用いる方法で作製することができる。組織型特異的ベクター又は細胞型特異的ベクターは、選択した細胞内でのみ遺伝子発現を提供するために利用することができる。
【０１１０】
また、上記の方法を生殖細胞に用いた場合、標的遺伝子にドナーＤＮＡを挿入させて、後の全ての細胞分裂により、設計された遺伝的変更を有する細胞を生成することができる。
【０１１１】
本実施形態の遺伝子治療方法の適用対象としては、例えば、任意の生物、培養細胞、培養組織、培養核（培養細胞、培養組織、又は培養核インタクトには、生物を再生するために使用可能な細胞、組織又は核を含む）、配偶子（例えば、発達の様々な段階の卵又は精子）等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態の遺伝子治療方法の適用対象となる細胞の由来としては、任意の生物（昆虫、真菌、げっ歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、及び他の農業上重要な動物、並びに他の哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ及びヒトが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）等が挙げられ、これらに限定されない。
【０１１２】
さらに、本実施形態の遺伝子治療方法は、植物において使用することができる。本実施形態の遺伝子治療方法の適用対象となる植物としては、特別な限定はなく、任意の様々な植物種（例えば、単子葉植物又は双子葉植物等）において適用することができる。
【０１１３】
以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の構成等も含まれる。
【実施例】
【０１１４】
以下、実施例及び比較例等を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。【０１１５】
［実施例１］
１．野生型及び変異型ＦｎＣａｓ９の調製
（１）コンストラクトの設計
遺伝子合成によりコドンが最適化されたＦｎＣａｓ９遺伝子（野生型ＦｎＣａｓ９の塩基配列：配列番号９、Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１４４９Ｈ／Ｒ１５５６Ａ変異型ＦｎＣａｓ９の塩基配列：配列番号１０）をそれぞれ、ｐＥ−ＳＵＭＯ  ｖｅｃｔｏｒ（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ）に組み込んだ。さらに、ＳＵＭＯタグとＦｎｃａｓ９遺伝子の間にＴＥＶ認識配列を付加した。完成したコンストラクトから発現するＣａｓ９のＮ末端には６残基のヒスチジンが連続し（Ｈｉｓタグ）、続いてＳＵＭＯタグ、ＴＥＶプロテアーゼ認識サイトが付加される設計になっている。
なお、野生型ＦｎＣａｓ９の塩基配列については、Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ研究室がヒトのコドンに最適化して人工合成した塩基配列を使用した。【０１１６】
（２）大腸菌での発現
作成したベクターを大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｒｏｓｅｔｔａ２ （ＤＥ３）株へ形質転換した。その後、２０μｇ／ｍｌカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地培養した。ＯＤ＝０．８になるまで培養した時点で、発現誘導剤としてイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）（終濃度１ｍＭ）を添加し、３７℃で４時間培養した。培養後、大腸菌を遠心（５，０００ｇ、１０分）により回収した。【０１１７】
（３）野生型及び変異型ＦｎＣａｓ９の精製
（２）で回収した菌体を緩衝液Ａで懸濁し、超音波破砕した。遠心（２５，０００ｇ，３０分）により上清を回収し、緩衝液Ｃで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂 （ＱＩＡＧＥＮ）と混合し、１時間穏やかに転倒混和した。素通り画分を回収した後、４カラム容量の緩衝液Ｃ、さらに２カラム容量の高塩濃度緩衝液Ｄで洗浄を行った。【０１１８】
次いで、再度２カラム容量の緩衝液Ｃで洗浄した後、５カラム容量の高イミダゾール濃度緩衝液Ｂで目的タンパク質を溶出した。溶出したタンパク質にＴＥＶプロテアーゼを添加し、緩衝液Ｃを用いて４℃で一晩透析し、タグの除去を行った。透析後、ＨｉｓタグおよびＴＥＶプロテアーゼを目的タンパク質と分離するために、再び緩衝液Ｃで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂と混合し、素通り画分を回収した。引き続いて、３カラム容量の緩衝液Ｃにてカラム洗浄を行い、洗浄液を回収した。【０１１９】
次いで、粗精製したサンプルのＮａＣｌ濃度が１５０ｍＭになるように希釈した後、緩衝液Ｅ（０Ｍ  ＮａＣｌ）９２．５％、緩衝液Ｆ（２Ｍ  ＮａＣｌ）７．５％で平衡化したＭｏｎｏＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にサンプルをチャージした。次いで、５カラム容量分の緩衝液Ｅ（０Ｍ  ＮａＣｌ）９２．５％及び緩衝液Ｆ（２Ｍ  ＮａＣｌ）７．５％の混合溶液で洗浄を行った後、緩衝液Ｆを７．５％から５０％へ（ＮａＣｌ濃度は１５０ｍＭから１Ｍへ）直線勾配をかけて目的タンパク質を溶出した。次いで、溶出したサンプルを緩衝液Ｇで平衡化したＨｉｌｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にサンプルを通し、１カラム容量分の緩衝液Ｇで目的タンパク質を溶出した。【０１２０】
緩衝液Ａ〜Ｇの組成について、表１に示す。表１中、「２−ＭＥ」は、２−メルカプトエタノール  （２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を意味し、「ＤＴＴ」は、ジチオトレイトール （ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を意味し、「ＰＭＳＦ」は、フッ化フェニルメチルスルホニル（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を意味する。【０１２１】
【表１】
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【０１２２】
２．ガイドＲＮＡの調製
目的のガイドＲＮＡ配列（配列番号１１）が挿入されたベクターの作製を行った。ガイドＲＮＡ配列の上流にＴ７プロモーター配列を付加し、線状化したｐＵＣ１１９ベクター（ＴａＫａＲａ）に組み込んだ。作製したベクターを元に、ＰＣＲを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の鋳型ＤＮＡを作製した。この鋳型ＤＮＡを用いて、３７℃、４時間、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。転写産物を含む反応液に等量のフェノールクロロホルムを加えて混合した後、２０℃にて遠心（１０，０００ｇ、２分）し、上清を回収した。上清に１／１０量の３Ｍ  酢酸ナトリウムおよび２．５倍量の１００％エタノールを添加し、４℃にて遠心（１０，０００ｇ、３分）し、転写産物を沈殿させた。上清を廃棄して７０％エタノールを添加し、４℃にて遠心（１０，０００ｇ、３分）し再び上清を廃棄した。沈殿を風乾後、ＴＢＥ緩衝液に再懸濁し、７Ｍ  Ｕｒｅａ変性１０％ＰＡＧＥにより精製した。目的ＲＮＡの分子量に位置するバンドを切り出し、Ｅｌｕｔｒａｐ電気溶出システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＲＮＡを抽出した。その後、抽出したＲＮＡをＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通し、緩衝液を緩衝液Ｈ（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ８．０）、１５０ｍＭ  
ＮａＣｌ）に交換した。【０１２３】
３．プラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
ＤＮＡ切断活性測定試験に用いるために、標的ＤＮＡ配列およびＰＡＭ配列が挿入されたベクターの作製を行った。標的ＤＮＡ配列にＰＡＭ配列１〜７をそれぞれ付加し、線状化したｐＵＣ１１９ベクターに組み込んだ。標的配列及びＰＡＭ配列１〜４を表２に示す。【０１２４】
【表２】
2017010543.tif 000003
【０１２５】
作製したベクターを用いて、大腸菌Ｍａｃｈ１株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換し、２０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃にて培養した。
培養後、菌体を遠心（８，０００ｇ、１分）により回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。
精製した７種類のＰＡＭ配列が付加した標的プラスミドＤＮＡを用いて切断実験を行った。プラスミドＤＮＡは、制限酵素ＢａｍＨＩにより１本に線状化した。この線状化ＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列を野生型、又は変異型のＦｎＣａｓ９が切断すると、約１，０００ｂｐと約２，０００ｂｐの切断産物ができる。３７℃にて１時間反応させた。反応溶液の組成は表３に示す。【０１２６】
【表３】
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【０１２７】
反応後のサンプルについて、１％濃度のアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、切断産物のバンドを確認した。結果を図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。図１０Ｂにおいて、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」とは基質を示し、「Ｐｒｏｄｕｃｔ」とは切断産物を示す。【０１２８】
図１０Ａから、野生型ＦｎＣａｓ９では、ＰＡＭ配列がＴＧＡ及びＴＧＧのみ認識し、標的プラスミドＤＮＡが切断されたのに対し、変異型ＦｎＣａｓ９では、全てのＰＡＭ配列を認識し、標的プラスミドＤＮＡが切断された。
また、図１０Ｂから、野生型ＦｎＣａｓ９では、全てのＰＡＭ配列を認識し、標的プラスミドＤＮＡが切断されたの対し、変異型ＦｎＣａｓ９では、ＰＡＭ配列がＴＧＧ及びＣＧＧのみ認識し、標的プラスミドＤＮＡが切断された。
よって、野生型のＦｎＣａｓ９ではＰＡＭ配列「ＮＧＲ」を認識するのに対し、変異型のＦｎＣａｓ９ではＰＡＭ配列「ＹＧ」を認識することが確かめられた。【０１２９】
以上から、変異型のＦｎＣａｓ９ではＰＡＭ配列が広範化されており、簡便且つ迅速に標的配列に対し部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断を行えることが明らかとなった。【０１３０】
［実施例２］
１．変異型ＦｎＣａｓ９の調製
実施例１と同様の方法で変異型ＦｎＣａｓ９を調製した。コントロールとして、ＳｐＣａｓ９（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）を、比較例としてＣｊＣａｓ９（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９）を使用した。【０１３１】
２．ガイドＲＮＡの調製
マウスＴｅｔ１遺伝子（Ｅｘ４）を標的遺伝子としてガイドＲＮＡを２０ｍｅｒ、２２ｍｅｒ、２４ｍｅｒの長さでそれぞれ調製した。調製方法は実施例１と同様にして行った。ガイドＲＮＡの塩基配列を表４に示す。【０１３２】
【表４】
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【０１３３】
３．マウスＴｅｔ１遺伝子（Ｅｘ４）ノックアウト試験
（１）インジェクション
調製した各種Ｃａｓ９及び長さの異なるガイドＲＮＡをそれぞれ組み合わせて、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ８．０）に希釈した溶液を調製し、マウス受精卵にインジェクションした。【０１３４】
（２）マウス受精卵の発生率及び胚盤胞の形態の確認
インジェクションから４日後の胚盤胞について発生率を確認した。結果を図１１Ａに示す。胚の発生に対する毒性はなく、発生率も良かった。また、図１１ＢはＦｎＣａｓ９及び長さの異なるガイドＲＮＡをインジェクションした胚盤胞の形態を示した画像である。いずれの胚盤胞においても、正常な形態であった。【０１３５】
（３）マウスＴｅｔ１遺伝子のノックアウト効率の確認
インジェクションから４日後の胚盤胞を回収し、マウスＴｅｔ１遺伝子のノックアウト効率を、以下の方法を用いて算出した。まず、細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、各種Ｃａｓ９によるノックアウトが行われた領域を含む部分を下記表５に示す配列のプライマーを用いたＰＣＲにより、増幅させた。次いで、制限酵素による切断を行い、ＰＣＲ産物の切断パターンからノックアウトの成否を判断し、ノックアウト効率を算出した。各種Ｃａｓ９によるノックアウトが成功していた場合、配列が変更され、制限酵素によるＰＣＲ産物の切断が起こらない。その一方でノックアウトが行われなかった場合、制限酵素がＰＣＲ産物を切断する。こうしたＰＣＲ産物の切断パターンから、ノックアウトの成否を判断した。結果を図１２に示す。コントロールであるＳｐＣａｓ９及びガイドＲＮＡとしてＴｅｔ１−２０ｍｅｒをインジェクションした胚盤胞でのマウスＴｅｔ１遺伝子の２つのアレルがノックアウトされた効率を１００％とした。
また、図１２において、「１  ａｌｌｅｌｅ  ＫＯ」とは、マウスＴｅｔ１遺伝子の１つのアレルのノックアウト効率を示し、「２  ａｌｌｅｌｅ  ＫＯ」とは、マウスＴｅｔ１遺伝子の２つのアレルのノックアウト効率を示す。【０１３６】
【表５】
2017010543.tif 000006
【０１３７】
図１２から、変異型ＦｎＣａｓ９及び長さの異なるガイドＲＮＡをマウス受精卵にインジェクションすることにより、マウスＴｅｔ１遺伝子をノックアウトすることができた。また、ガイドＲＮＡの長さは２２塩基であるとき、効率が良いことが明らかとなった。【０１３８】
［実施例３］
１．野生型及び変異型のＦｎＣａｓ９の調製
実施例１と同様の方法で野生型及び変異型のＦｎＣａｓ９を調製した。【０１３９】
２．ガイドＲＮＡの調製
マウスＴｅｔ１遺伝子（Ｅｘ４）を標的遺伝子として、表６に示す塩基配列を有するガイドＲＮＡを調製した。調製方法は実施例１と同様にして行った。【０１４０】
【表６】
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【０１４１】
３．マウスＴｅｔ１遺伝子（Ｅｘ４）ノックアウト試験
（１）インジェクション
調製した野生型のＦｎＣａｓ９、又は変異型ＦｎＣａｓ９、及び各種ガイドＲＮＡをそれぞれ組み合わせて、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ８．０）に希釈した溶液を調製し、マウス受精卵にインジェクションした。【０１４２】
（２）マウス受精卵の発生率及び胚盤胞の形態の確認
インジェクションから４日後の胚盤胞について発生率を確認した。胚の発生に対する毒性はなく、発生率も良かった。また、いずれの胚盤胞においても、正常な形態であった。【０１４３】
（３）マウスＴｅｔ１遺伝子のノックアウト効率の確認
インジェクションから４日後の胚盤胞を回収し、マウスＴｅｔ１遺伝子のノックアウト効率は、実施例２の（３）と同様の方法を用いて算出した。結果を図１３に示す。野生型のＦｎＣａｓ９及びガイドＲＮＡをインジェクションした胚盤胞でのマウスＴｅｔ１遺伝子がノックアウトされた効率を１００％とした。このとき、ノックアウトされたのが、マウスＴｅｔ１遺伝子の１つのアレルであっても、２つのアレルであっても、ノックアウトされたものとしてカウントし、ノックアウト効率を算出した。
また、図１３において、棒グラフ上部に記載の数字は、「遺伝子がノックアウトされた胚盤胞の個数／インジェクションを行った受精卵の個数」を示し、棒グラフ上部に記載の括弧内の数字は、「２つのアレルがノックアウトされた胚盤胞の個数／１つのアレルがノックアウトされた胚盤胞の個数」を示す。【０１４４】
図１３から、野生型のＦｎＣａｓ９では、ＰＡＭ配列がＴＧＡ、又はＴＧＧである場合、マウスＴｅｔ１遺伝子をノックアウトすることができた。
一方、変異型のＦｎＣａｓ９では、ノックアウト効率に差はあるが、全てのＰＡＭ配列において、マウスＴｅｔ１遺伝子をノックアウトすることができた。
また、変異型のＦｎＣａｓ９では、ＰＡＭ配列がＴＧＡである場合、マウスＴｅｔ１遺伝子の２つのアレルがノックアウトされ、その他のＰＡＭ配列である場合、マウスＴｅｔ１遺伝子の１つのアレルがノックアウトされた。【０１４５】
以上のことから、変異型ＦｎＣａｓ９タンパク質ではＰＡＭ配列の認識が広範化されており、変異型ＦｎＣａｓ９タンパク質を用いることで、標的遺伝子の機能が破壊（ノックアウト）された細胞を容易に作製できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１４６】
本発明によれば、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ち、さらにエンドヌクレアーゼ活性を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を得ることができる。また、前記Ｃａｓ９タンパク質を利用した簡便且つ迅速で標的配列に部位特異的なゲノム編集技術を提供することができる。
【図１Ａ】
2017010543.tif 000008
【図１Ｂ】
2017010543.tif 000009
【図２Ａ】
2017010543.tif 000010
【図２Ｂ】
2017010543.tif 000011
【図３】
2017010543.tif 000012
【図４Ａ】
2017010543.tif 000013
【図４Ｂ】
2017010543.tif 000014
【図５Ａ】
2017010543.tif 000015
【図５Ｂ】
2017010543.tif 000016
【図６Ａ】
2017010543.tif 000017
【図６Ｂ】
2017010543.tif 000018
【図７】
2017010543.tif 000019
【図８】
2017010543.tif 000020
【図９】
2017010543.tif 000021
【図１０Ａ】
2017010543.tif 000022
【図１０Ｂ】
2017010543.tif 000023
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
2017010543.tif 000027
【配列表】
2017010543000001.app
【国際調査報告】
2017010543.tif 000028
2017010543.tif 000029
2017010543.tif 000030
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