(57)【要約】【課題】ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導能活性を有する生薬またはエキスを有効成分とする医薬又は組成物の提供を目的とする。【解決手段】甘草、縮砂、何首烏、黄耆、葛根、山椒、赤芍、大黄、釣藤鉤、苦参、炮附子、麻黄、防已、良姜およびそれらのエキスは、BDNF遺伝子発現誘導活性を有し、それらを単独、混合、他の生薬を配合した漢方方剤は、うつ病やアルツハイマー病などの精神疾患や神経変性疾患による脳機能低下の改善に有用である。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
甘草、縮砂、何首烏、黄耆、葛根、山椒、赤芍、大黄、釣藤鉤、苦参、炮附子、麻黄、防已、良姜又はそれらのエキスから選ばれる一つ以上を有効成分として含有することを特徴とする脳由来神経栄養因子の発現誘導剤。
【請求項２】
何首烏、山椒、赤芍、釣藤鉤、良姜、大黄、麻黄又はそれらのエキスから選ばれる一つ以上を有効成分として含有することを特徴とする脳由来神経栄養因子の発現誘導剤。
【請求項３】
有効成分として人参又はそのエキスが追加された請求項１又は２記載の脳由来神経栄養因子の発現誘導剤。
【請求項４】
甘草、縮砂、何首烏、黄耆、葛根、山椒、赤芍、大黄、釣藤鉤、苦参、炮附子、麻黄、防已、良姜又はそれらのエキスから選ばれる一つ以上を有効成分として含有することを特徴とする脳由来神経栄養因子の発現を誘導する組成物。
【請求項５】
何首烏、山椒、赤芍、釣藤鉤、良姜、大黄、麻黄又はそれらのエキスから選ばれる一つ以上を有効成分として含有することを特徴とする脳由来神経栄養因子の発現を誘導する組成物。
【請求項６】
有効成分として人参又はそのエキスが追加された請求項４又は５記載の脳由来神経栄養因子の発現を誘導する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳由来神経栄養因子の発現を誘導する活性を有する生薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
我が国では、高齢化社会の影響により認知症などの神経系の疾患急増が問題視されている。
このような疾患による脳機能の低下は、患者本人の生活の質の重大な低下を招き、また介護に関わる家族の負担も増えるため、これら疾患の治療薬開発だけでなく、予防の観点からの研究開発は、精神衛生や社会福祉を考える上で非常に重要な取り組みである。
特に予防においては、日常的な服用が可能な薬剤の開発が求められる。
そこで注目されるのが、生薬に代表される伝統医薬品である。
これら伝統医薬品は、長年の使用実績から安全性の面で克服すべきハードルが低い一方、科学的根拠に乏しいものも少なくなく、特に中枢神経系への効果については未解明な部分が多い。
また、数多く存在する生薬の中から、脳機能低下の予防効果を有するものを検索することは、時間・労力・コストの面で非常に困難であるものの、例えば、生薬の人参、乾姜及び山椒の漢方方剤である大建中湯のマウスにおける記憶・学習増強効果（非特許文献１）、杏仁、麻黄、桂枝、人参、当帰、センキュウ、乾姜、甘草及び石膏からなる神経栄養因子合成促進剤（特許文献１）、薬用ニンジンのアルコール抽出物中の神経細胞賦活物質（特許文献２）などが報告されている。【０００３】
【特許文献１】日本国特開平７−２５７７７号公報
【特許文献２】日本国特開平６−３１６５２７号公報
【非特許文献１】J Nat Med(2006) 60:64-67
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor、以下、ＢＤＮＦと称する）は、１１９個のアミノ酸からなるポリベプチドの二量体として存在し、神経栄養因子ファミリーに属するタンパク質の１つであり、その生理作用は、脳・神経系において、神経細胞の生存や神経ネットワーク形成、さらには記憶の固定化などの高次脳機能発現といった多岐にわたる。
また、様々な神経変性疾患や精神疾患においてＢＤＮＦ発現量の減少が認められており、ＢＤＮＦの発現を誘導する薬物、あるいはそれを含む組成物は、神経変性疾患や精神疾患により低下した脳機能を改善することが期待されている。
一方、長年の使用実績から安全性が確保されており、日本薬局方にも収載されている生薬のエキスにＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性を持つものがどの程度存在するかが未知数である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記した状況下、発明者らは、ＢＤＮＦ遺伝子発現変化をホタルの発光酵素ルシフェラーゼによる発光の強弱により計測可能な遺伝子改変マウス由来の大脳皮質神経細胞初代培養系を用いる測定系を開発し、この測定系により、神経細胞に作用してＢＤＮＦ遺伝子発現を誘導する生薬エキスを簡便・迅速にスクリーニングすることに成功し、本発明を完成させるに至った。【０００６】
本発明に使用される生薬は、甘草、縮砂、何首烏、黄耆、葛根、山椒、赤芍、大黄、釣藤鉤、苦参、炮附子、麻黄、防已及び良姜であり、個々の生薬については以下のとおりである。【０００７】
甘草（カンゾウ）：マメ科カンゾウ属ウラルカンゾウ（Glycyrrhiza uralensis）又はスペインカンゾウ（Glycyrrhiza glabra Linne）の根及びストロン、ときには周皮を除いたもの（皮去りカンゾウ）である。【０００８】
縮砂（シュクシャ）：ショウガ科アモムム属アモムム・キサンティオデス（Amomum xanthioides）の種子の塊である。【０００９】
何首烏（カシュウ）：タデ科タデ属ツルドクダミ（Polygonum multiflorum）の塊根である。【００１０】
黄耆（オウギ）：マメ科ゲンゲ属キバナオウギ（Astragalus membranaceus）又はナイモウオウギ（Astragalus mongholicus）の根である。【００１１】
葛根（カッコン）：マメ科クズ属クズ（Pueraria lobata Ohwi）の周皮を除いた根である。【００１２】
山椒（サンショウ）：ミカン科サンショウ属サンショウ（Zanthoxylum piperitum）の成熟果実の果皮で、 種子をできるだけ取り除いたものである。【００１３】
赤芍（セキシャク）：ボタン科ボタン属シャクヤク（Paeonia lactiflora）の根であって、外皮をつけたままのものである。【００１４】
大黄（ダイオウ）：タデ科ダイオウ属ダイオウ（Rheum palmatum）、タングートダイオウ（Rheum tanguticum）、ヤクヨウダイオウ（Rheum officinale）、チョウセンダイオウ（Rheum coreanum）又はそれらの種間雑種の根茎である。【００１５】
釣藤鉤（チョウトウコウ）：アカネ科カギカズラ属カギカズラ（Uncaria rhynchophylla）、トウカギカズラ（Uncaria sinensis Haviland）又はUncaria macrophylla Wallichの茎枝の一部をつけた棘である。【００１６】
苦参（クジン）：マメ科クララ属クララ（Sophora flavescens）の根である。【００１７】
炮附子（ホウブシ）：キンポウゲ科トリカブト属ハナトリカブト（Aconitum carmichaeli）又はオクトリカブト (Aconitum japonicum)の塊根をニガリ液に数日浸し、加熱処理したものである。【００１８】
麻黄（マオウ）：マオウ科マオウ属シナマオウ（Ephedra sinica）、アイマオウ（Ephedra intermedia）又はキダチマオウ（Ephedra equisetina）の地上茎である。【００１９】
防已（ボウイ）：ツヅラフジ科ツヅラフジ属オオツヅラフジ（Sinomenium acutum）のつる性の茎及び根茎である。【００２０】
良姜（リョウキョウ）：ショウガ科ハナミョウガ属リョウキョウ（Alpinia officinarum）の根茎である。【００２１】
本発明には、上記した生薬の抽出物（以下、「エキス」称する）を用いることもできる。
エキスの製造方法としては、生薬を、例えば、水（温水、熱湯など）によって抽出するか、又は有機溶媒を用いて抽出する。
有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノールなどのアルコール類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコールなどのグリコール類、アセトニトリルなどを用いることができ、これらの有機溶媒を単独、又は適宜組み合わせ、一定の比率で混合して用いることができる。
好ましくは、メタノール、エタノール、水、ブチレングリコール、含水アルコール又はアセトニトリル−水混合溶媒などが好ましい。【００２２】
水抽出又は有機溶媒抽出の方法としては、通常の生薬抽出に用いられる方法を用いることができ、例えば、生薬１重量部に対し、水及び／又は有機溶媒５〜３００重量部を用いて、攪拌しながら、その沸点以下の温度で加熱還流することが望ましい。
抽出工程は、通常は５分〜７日間、好ましくは１０分〜２４時間実施すればよい。【００２３】
抽出工程終了後、濾過又は遠心分離などの適当な方法により、水及び／又は有機溶媒抽出液から、不溶物を分離して粗エキスを得ることができる。
常法による熱水エキス又は有機溶媒エキスの他に、粗エキスを各種有機溶媒又は吸着剤などにより、更に処理した精製エキスも、本発明に用いることができる。
これらの粗エキス及び各種の精製処理を終えた精製エキスは、抽出したままの溶液、溶媒を濃縮したもの、溶媒を留去し乾燥したもの、凍結乾燥したもの、さらに乾燥した固形物を粉砕し粉末等にしたもののいずれであってもよい。【００２４】
本発明に使用される甘草、縮砂、何首烏、黄耆、葛根、山椒、赤芍、大黄、釣藤鉤、苦参、炮附子、麻黄、防已、良姜及びそれらのエキスは、各々単独で使用してもよく、組み合わせて処方として使用してもよい。
単独での使用は、何首烏、山椒、赤芍、釣藤鉤または良姜が好ましく、特に山椒が好ましい。
処方には、人参など他の生薬を加えた処方としてもよい。
例えば、人参エキスを加えた処方として、後述する試験例４の山椒エキス＋人参エキス、防已エキス＋人参エキス、釣藤鈎エキス＋人参エキスなどが挙げられ、また、大建中湯に用いられる、人参、山椒および乾姜の組み合わせなどが例として挙げられる。【００２５】
上記の単味エキス及びエキスを組み合わせた処方物は、錠剤，散剤、顆粒剤、カプセル剤などに製剤化して経口的に投与してもよい。【００２６】
経口剤は、必要に応じて結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤などを加え錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤を常法により製造することができる。
また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、安定化剤などを添加することができる。【００２７】
エキス等の投与量は、疾患、症状、年齢、併用される治療的措置などにより異なるが、経口剤としてヒトに投与する場合は、抽出物として０.１〜１００ｍｇ／ｋｇを１日１回〜数回に分けて投与すればよい。【００２８】
エキス等を、該エキス等含有した飲食品または飲食品用組成物にすることもできる。
ここで、「飲食品」とは、飲食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定された特定保健用食品や栄養機能食品などの保健機能食品をも含むものであり、更にサプリメント、飼料、食品添加物等も本発明の飲食品に包含される。【００２９】
エキス等を飲食品または飲食品用組成物に使用するには、そのまま、又は種々の栄養成分とともに加工肉、果汁、牛乳、豆乳などの飲食品の原料に混ぜて飲食品または飲食品用組成物を製造することができる。
また、エキス等を健康食品、栄養補助食品などとして使用する場合、例えば慣用の手段を用いて、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、シロップ剤などの形態に調製することができる。【００３０】
上記の飲食品または飲食品用組成物におけるエキス等の配合量は、添加形態及び投与形態によっても異なり広い範囲から選択できるが、通常、０.０１〜１０重量％配合するのが望ましい。
【発明の効果】
【００３１】
甘草、縮砂、何首烏、黄耆、葛根、山椒、赤芍、大黄、釣藤鉤、苦参、炮附子、麻黄、防已、良姜及びそれらのエキスは、ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性を有し、それらを単独、混合、他の生薬を配合した漢方方剤は、軽度認知障害（ＭＣＩ）や認知症などの疾患による脳機能の低下の改善や予防、うつ病やアルツハイマー病などの精神疾患や神経変性疾患による脳機能の改善に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】スクリーニングの概要を示す図である。
【図２】内在性ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性を示す図である。ＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現量をハウスキーピング遺伝子の１つであるグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡ発現量で補正し、生薬エキス添加前（０時間）のＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現量に対する変化を誘導倍率として示した。
【図３】図２と同様に内在性ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性を示す図である。
【図４】生薬の組み合わせでの内在性ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性を示す図である。
【図５】大建中湯エキスでのＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明を試験例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
試験例で使用した生薬エキスは、生薬を純水で５０分間煎じ、ろ過後、凍結乾燥したエキス粉末をＭｉｌｌｉＱ水に溶解させたものである（１０ｍｇ／ｍＬ）。
【００３４】
試験例１
＜ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導能活性＞
ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性は、ＢＤＮＦ遺伝子発現変化を発光強度により計測可能な遺伝子改変マウス（ＢＤＮＦ−Ｌｕｃマウス）を用いて検討した。
胎生１６.５日齢のＢＤＮＦ−Ｌｕｃマウスの大脳皮質を単離後、酵素処理し、得られた細胞を９６ウェル培養プレート上で１３日間培養した。
培養後、生薬エキスを終濃度が０.５ｍｇ／ｍＬとなるように培養液中に添加し、再び培養を行った。
実験対照群としては、溶媒であるＭｉｌｌｉＱ水のみを添加した。ＭｉｌｌｉＱ水又は生薬エキスの添加後、６時間、２４時間、４８時間後にルシフェラーゼ活性測定キット（プロメガ社）を用いて各ウェルの発光を測定した。各時間におけるＭｉｌｌｉＱ水添加時のルシフェラーゼ活性を基準として、生薬エキスのルシフェラーゼ活性の誘導倍率を算出した。
生薬エキスのルシフェラーゼ活性の誘導倍率を表１に示す。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
表１の結果から、ルシフェラーゼ活性の誘導倍率が１０倍以上となったものは、カシュウ（何首烏）、サンショウ（山椒）、セキシャク（赤芍）、チョウトウコウ（釣藤鉤）、ボウイ（防已）、及びリョウキョウ（良姜）であった。
そのうち、カシュウ、サンショウ、チョウトウコウは１５倍を超えていた。
最大は、チョウトウコウの２１．２９培である。
また、５倍〜１０倍の値を示したものはダイオウ（大黄）、マオウ（麻黄）及びニンジン（人参）であった。
【００３７】
試験例２
＜内在性ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性＞
内在性ＢＤＮＦ遺伝子（大脳皮質神経細胞で実際に発現しているＢＤＮＦ遺伝子）発現誘導活性は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によりＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現量の変化を測定することで検討した。
胎生１７日齢のラットの大脳皮質を単離後、酵素処理し、得られた細胞を６ウェル培養プレート上で１３日間培養した。
培養後、各生薬エキスを終濃度が０.５ｍｇ／ｍＬとなるように培養液中に添加し、再び培養を行った。
実験対照群としては、溶媒であるＭｉｌｌｉＱ水のみを添加した。
各生薬エキスの添加後、０時間、０.５時間、１時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間後にＲＮＡ抽出キット（キアゲン社）を用いて細胞からＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン社）を用いて逆転写反応を行った。
逆転写反応後に得られたＤＮＡ産物及びＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、各生薬エキス添加後のＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現量の変化を解析した。
結果を図２に示す。
図２に示したグラフから、コントロール（溶媒）に比較して人参エキス、サンショウエキス、釣藤鉤エキスのいずれも高い内在性ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性を示した。
特に釣藤鉤エキスは、高い値を示した。
【００３８】
試験例３
何首烏エキス、大黄エキス、麻黄エキス、良姜エキス、防已エキスを使用し、試験例２と同様な方法で、内在性ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性を検討した。結果を図３に示した。
図３のグラフから、いずれも高い内在性ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性を示し、特に大黄エキス、麻黄エキス及び良姜エキスが高い値を示した。
【００３９】
試験例４
人参エキスに山椒エキス、防已エキス、または釣藤鉤エキスを混合した場合の内在性ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性は、ＲＴ−ｑＰＣＲ法によりＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現量の変化を測定することで検討した。
胎生１７日齢のラットの大脳皮質を単離後、酵素処理し、得られた細胞を６ウェル培養プレート上で１３日間培養した。
培養後、各生薬エキスを終濃度が０.５ｍｇ／ｍＬとなるように培養液中に添加し、再び培養を行った。
人参エキスと山椒エキス、および人参エキスと防已エキスの組み合わせの場合は添加３時間後、人参エキスと釣藤鉤エキスの組み合わせの場合は添加２４時間後にＲＮＡ抽出キット（キアゲン社）を用いて細胞からＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン社）を用いて逆転写反応を行った。
逆転写反応後に得られたＤＮＡ産物およびＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて、各生薬エキス添加後のＢＤＮＦ ｍＲＮＡ発現量の変化を解析した。
結果を図４に示した。
図４に示したグラフから、各生薬単独よりも人参エキスと組み合せた方が高い誘導活性を示すことが明らかになった。
【００４０】
試験例５
＜大建中湯エキスのＢＤＮＦ遺伝子発現誘導能活性＞
ＢＤＮＦ遺伝子発現誘導活性は、ＢＤＮＦ遺伝子発現変化を発光強度により計測可能な遺伝子改変マウス（ＢＤＮＦ−Ｌｕｃマウス）を用いて検討した。
胎生１６.５日齢のＢＤＮＦ−Ｌｕｃマウスの大脳皮質を単離後、酵素処理し、得られた細胞を９６ウェル培養プレート上で１３日間培養した。
培養後、大建中湯エキスを終濃度が０.５ｍｇ／ｍＬとなるように培養液中に添加し、再び培養を行った。
大建中湯エキスの添加後、６時間、２４時間後にルシフェラーゼ活性測定キット（プロメガ社）を用いて各ウェルの発光を測定した。
結果を図５に示した。
図５に示したグラフから、大建中湯即ち人参、山椒、及び乾姜の組み合せにおいても高い活性を示すことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
甘草、縮砂、何首烏、黄耆、葛根、山椒、赤芍、大黄、釣藤鉤、苦参、炮附子、麻黄、防已、良姜及びそれらのエキスは、BDNF遺伝子発現誘導活性を有し、それらを単独、混合、他の生薬を配合した漢方方剤は、認知症などの疾患による脳機能の低下の改善や予防、うつ病やアルツハイマー病などの精神疾患や神経変性疾患による脳機能の低下の改善に有用である。
また、甘草、縮砂、何首烏、黄耆、葛根、山椒、赤芍、大黄、釣藤鉤、苦参、炮附子、麻黄、防已及び／又は良姜のエキスは、単独、混合又は他の生薬を配合して、認知症などの疾患による脳機能の低下の改善や予防、うつ病やアルツハイマー病などの精神疾患や神経変性疾患による脳機能の低下を改善する食品又は飲料とすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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