(57)【要約】本発明は、分化状態が未知の幹細胞あるいは幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞とし、該被検細胞の培養上清における所定の指標物質の存在量に基づいて該被検細胞の分化状態を評価する方法である。前記指標物質は、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、アスパラギン酸、アルギニン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸、リボン酸、キヌレニン、シスタチオニン、トレオン酸、ピルビン酸、プトレシン、アスコルビン酸、リボフラビン、セリン、システイン、オロト酸、及びクエン酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物である。本発明の一形態では２種以上の指標物質の存在量に基づいて分化状態の評価が行われる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化状態が未知の幹細胞あるいは幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞の分化状態を評価する方法であって、
被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップ、及び前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞の分化状態を評価するステップを有し、
前記指標物質が、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、アスパラギン酸、アルギニン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸、リボン酸、キヌレニン、シスタチオニン、トレオン酸、ピルビン酸、プトレシン、アスコルビン酸、リボフラビン、セリン、システイン、オロト酸、及びクエン酸から成る群から選択される２種以上であり、
２種以上の指標物質の存在量に基づいて前記分化状態の評価が行われる、細胞分化状態の評価方法。
【請求項２】
分化状態が既知である対照細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップをさらに有し、
前記２種以上の指標物質のそれぞれについて、前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、前記分化状態の評価が行われる、請求項１に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項３】
前記２種以上の指標物質のそれぞれについて、前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比が予め定めた閾値以上であるか否か又は閾値以下であるか否かに基づいて、前記分化状態の評価が行われる、請求項２に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項４】
前記対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用する、請求項２または３に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項５】
前記分化状態の評価において、分化状態であるか未分化状態であるかを評価するとともに、分化状態であると評価された被検細胞の分化の方向が内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれであるかを評価することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項６】
前記２種以上の指標物質のそれぞれについて、前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量の培養時間に伴う変化を解析することにより、前記評価が行われる、請求項５に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項７】
前記２種以上の指標物質の存在量を多変量解析することにより、前記評価が行われる、請求項５または６に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項８】
前記２種以上の指標物質として、キヌレニン、２−アミノアジピン酸、オルニチン、及びデオキシシチジンからなる群から選択される２種以上を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項９】
前記２種以上の指標物質として、キヌレニン、２−アミノアジピン酸、オルニチン、デオキシシチジン、トリプトファン、シスタチオニン、ヒポキサンチン、及びウリジンからなる群から選択される２種以上を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１０】
前記２種以上の指標物質が、代謝経路の前後関係にある前駆物質と代謝生成物とを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１１】
前記前駆物質がトリプトファンであり、前記代謝生成物がキヌレニンである、請求項１０に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１２】
前記前駆物質がオルニチンであり、前記代謝生成物がプトレシンである、請求項１０に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１３】
前記前駆物質がアルギニンであり、前記代謝生成物がオルニチンである、請求項１０に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１４】
前記被検細胞の培養上清における前記前駆物質の存在量と前記代謝生成物との比に基づいて前記評価が行われる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１５】
分化状態が未知の幹細胞あるいは幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞として、該被検細胞の分化状態を評価する方法であって、
被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップ、及び前記指標物質の存在量に基づいて前記被検細胞の分化状態を評価するステップを有し、
前記指標物質が、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、アスパラギン酸、アルギニン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸、及びリボン酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物であることを特徴とする細胞分化状態の評価方法。
【請求項１６】
前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量と、分化状態が既知である対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞の分化状態を評価することを特徴とする請求項１５に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１７】
前記対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用し、アルギニン、トリプトファン、及び４−アミノ安息香酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物の、前記対照細胞の培養上清における存在量に対する前記被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以上である場合に、前記被検細胞が分化状態であると判定することを特徴とする請求項１６に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１８】
前記対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用し、オルニチン、アラニン、アスパラギン酸、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物の、前記対照細胞の培養上清における存在量に対する前記被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以下である場合に、前記被検細胞が分化状態であると判定することを特徴とする請求項１６に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１９】
前記幹細胞が多能性幹細胞であることを特徴とする請求項１〜１８のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法による被検細胞の分化状態の評価結果に基づいて、前記被検細胞を選別する工程を含む、細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の分化状態を評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の分化状態を評価するためには、免疫染色を利用した方法（例えば特許文献１を参照）やマーカー遺伝子の発現レベルを定量する方法（例えば特許文献２を参照）が広く用いられている。【０００３】
免疫染色を利用した方法では、まず評価対象とする細胞、例えば多能性幹細胞をパラホルムアルデヒド等で固定化した上で抗原−抗体反応を行う。ここで、多能性幹細胞が未分化状態であるか否かを判定するための抗体としては、ＳＳＥＡ−４やＴＲＡ１−６０が広く用いられている（例えば特許文献１を参照）。続いて、前記抗体に結合する二次抗体を細胞に添加し、その後、予め前記二次抗体に付与しておいた蛍光標識等を検出する。これにより、細胞上に前記抗体に対する抗原が存在するか否か、すなわち該細胞が未分化状態であるか否かを評価することができる。【０００４】
また、マーカー遺伝子の発現レベルの定量による方法では、例えば多能性幹細胞からｍＲＮＡを抽出し、これを逆転写酵素によってｃＤＮＡに変換した後、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）によってマーカー遺伝子を増幅する。このとき、多能性幹細胞の未分化性を評価するためのマーカー遺伝子としては、ＮＡＮＯＧやＰＯＵ５Ｆ１（ＯＣＴ３／４）が広く用いられる（例えば非特許文献１を参照）。このＰＣＲ産物を電気泳動やリアルタイムＰＣＲ装置で検出することにより前記細胞におけるマーカー遺伝子の発現量を確認し、その結果から該細胞が未分化状態であるか否かを評価する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2004-313184号公報
【特許文献２】特開2006-042663号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）, 2007, 第25巻, pp.803-816
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記従来の評価方法では、いずれも細胞に対して侵襲的な処理を行う必要がある。そのため、分化状態の評価を行った後に、該評価に供した細胞を別の目的に利用すること、例えば再生医療用の細胞源とすることができなかった。また、同一サンプル（すなわち同一培養皿中の細胞）について、時間経過に伴う変化を評価することは不可能であり、分化状態の経時的な変化を評価するためには複数の培養皿で並行して培養を行う等、煩雑な作業が必要であった。【０００８】
本発明は、上記の点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、細胞の分化状態を非侵襲的に評価する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、細胞の分化状態によって培養上清中の特定の指標物質の存在量が異なることを見出し、本発明に至った。【００１０】
本発明に係る細胞分化状態の評価方法では、分化状態が未知の幹細胞あるいは幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞とし、該被検細胞の培養上清における所定の指標物質の存在量に基づいて該被検細胞の分化状態を評価する。すなわち、本発明に係る細胞分化状態の評価方法は、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量を測定するステップ、及び指標物質の存在量に基づいて被検細胞の分化状態を評価するステップを有する。【００１１】
前記指標物質は、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、アスパラギン酸、アルギニン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸、リボン酸、キヌレニン、シスタチオニン、トレオン酸、ピルビン酸、プトレシン、アスコルビン酸、リボフラビン、セリン、システイン、オロト酸、及びクエン酸から成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物である。【００１２】
上記本発明に係る細胞分化状態の評価方法は、例えば、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、分化状態が既知である対照細胞の培養上清における指標物質の存在量とを比較することにより、被検細胞の分化状態を評価できる。【００１３】
例えば、アルギニン、トリプトファン、４−アミノ安息香酸等の指標物質は、分化細胞の培養上清における存在量が未分化細胞の培養上清における存在量よりも大きくなる傾向がある。そのため、対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用する場合、アルギニン、トリプトファン、及び４−アミノ安息香酸等の指標物質の、対照細胞の培養上清における存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は分化状態であると判定できる。【００１４】
例えば、オルニチン、アラニン、アスパラギン酸、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸等の指標物質は、分化細胞の培養上清における存在量が未分化細胞の培養上清における存在量よりも小さくなる傾向がある。そのため、対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用する場合、オルニチン、アラニン、アスパラギン酸、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸等の指標物質の、対照細胞の培養上清における存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定できる。【００１５】
本発明の一形態では、２種以上の上記指標物質の存在量に基づいて分化状態の評価が行われる。例えば、２種以上の指標物質のそれぞれについて、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、対照細胞の培養上清における指標物質の存在量とを比較することにより、分化状態の評価が行われる。２種以上の指標物質のそれぞれについて、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、対照細胞の培養上清における指標物質の存在量との比を求め、これらの比が予め定めた閾値以上であるか否かに基づいて、分化状態の評価を行ってもよい。対象細胞としては、例えば未分化であることが明らかな細胞が用いられる。【００１６】
２種以上の指標物質として、例えば、代謝経路の前後関係にある前駆物質と代謝生成物とを選択でき、被検細胞の培養上清における前駆物質の存在量と代謝生成物との比に基づいて分化状態を評価できる。前駆物質と代謝生成物の組み合わせの例として、トリプトファンとキヌレニンの組み合わせ、オルニチンとプトレシンの組み合わせ、アルギニンとオルニチンの組み合わせ等が挙げられる。【００１７】
２種以上の指標物質として、例えば、キヌレニン、２−アミノアジピン酸、オルニチン及びデオキシシチジンを含む組み合わせを採用できる。２種以上の指標物質には、さらに、トリプトファン、シスタチオニン、ヒポキサンチン、及びウリジンが含まれていてもよい。【００１８】
２種以上の指標物質の存在量に基づいて分化状態の評価を行うことにより、被検細胞の分化状態をより高精度に評価できる。また、２種以上の指標物質の存在量に基づいて分化状態の評価を行うことにより、被検細胞が分化状態であるか未分化状態であるかの評価に加えて、分化状態であると評価された被検細胞の分化の方向が内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれであるかを評価することもできる。【００１９】
例えば、被検細胞の培養上清における、キヌレニン、２−アミノアジピン酸、及びデオキシシチジンから成る群から選択される２種以上の指標物質の存在量の培養時間に伴う変化を解析することにより、被検細胞が分化状態であるか未分化状態であるかを評価するとともに、分化状態であると評価された被検細胞の分化の方向が内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれであるかを評価できる。【００２０】
被検細胞の培養上清における、キヌレニン、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、トリプトファン、シスタチオニン、ヒポキサンチン、及びウリジンから成る群から選択される２種以上の指標物質の存在量を多変量解析することにより、被検細胞が分化状態であるか未分化状態であるかを評価するとともに、分化状態であると評価された被検細胞の分化の方向が内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれであるかを評価できる。【００２１】
本発明に係る細胞分化状態の評価方法は、前記幹細胞がＥＳ細胞（Embryonic Stem cells、胚性幹細胞）やｉＰＳ細胞（Induced Pluripotent Stem cells、人工多能性幹細胞）等の多能性幹細胞であってもよい。【００２２】
本発明に係る細胞分化状態の評価方法で用いる前記培養上清中の前記指標物質の存在量は、どのような方法を用いて求めてもよく、代表的な方法として液体クロマトグラフィー分析法、質量分析法を挙げることができる。
【発明の効果】
【００２３】
上記本発明に係る細胞分化状態の評価方法によれば、従来のように細胞を破壊する必要がなく、非侵襲的に細胞の分化状態を評価することができる。これにより、分化状態の評価後に、被検細胞を再生医療用の細胞源等として利用することが可能となる。また、分化状態の経時的な変化を評価する場合にも、従来のように複数の培養皿で並行して培養を行うといった煩雑な作業を行う必要がなく、同一培養皿中の細胞を対象として容易に時間経過に伴う分化状態の変化を評価することが可能となる。また、培養上清中の２種以上の指標物質の存在量に基づく評価により被検細胞の分化状態をより高精度に評価できる。２種以上の指標物質の存在量に基づく評価により、被検細胞が分化状態であるか未分化状態であるかの評価に加えて、分化状態であると評価された被検細胞の分化の方向性を評価することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】本発明の一実施例における細胞分化状態の評価方法を説明する模式図（その１）。
【図１Ｂ】本発明の一実施例における細胞分化状態の評価方法を説明する模式図（その２）。
【図２Ａ】実施例において培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた各物質の存在量の経時変化を示すグラフ（その１）。
【図２Ｂ】実施例において培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた各物質の存在量の経時変化を示すグラフ（その２）。
【図２Ｃ】実施例において培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた各物質の存在量の経時変化を示すグラフ（その３）。
【図２Ｄ】実施例において培養上清のＬＣ−ＭＳ分析により求められた各物質の存在量の経時変化を示すグラフ（その４）。
【図３Ａ】実施例において培養上清のＧＣ−ＭＳ分析により求められた各物質の存在量の経時変化を示すグラフ（その１）。
【図３Ｂ】実施例において培養上清のＧＣ−ＭＳ分析により求められた各物質の存在量の経時変化を示すグラフ（その２）。
【図４Ａ】実施例において、培養２日目〜４日目のサンプルにおける各物質の存在量の主成分分析結果を示すグラフ（その１）。
【図４Ｂ】実施例において、培養２日目〜４日目のサンプルにおける各物質の存在量の主成分分析結果を示すグラフ（その２）。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明に係る細胞分化状態の評価方法は、被検細胞の培養上清におけるバイオマーカー（指標物質）の存在量に基づいて該被検細胞の分化状態を評価するものである。
【００２６】
前記被検細胞としては幹細胞、典型的にはＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を用いることができる。また前記幹細胞より分化誘導を行った細胞も被検細胞として用いることができる。分化状態が未知の幹細胞が被検細胞である場合、本発明の評価方法により、分化状態であるか未分化状態であるかを判定できる。幹細胞より分化誘導を行った細胞が被検細胞である場合、本発明の評価方法により、未分化状態の細胞が混在しているか否かを判定できる。
【００２７】
被検細胞の培養に用いる培地としては、幹細胞の培養に一般的に使用される培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２や、該ＤＭＥＭ／Ｆ１２を主成分とする培地（例えばｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲ−Ｅ８等）を用いることができる。表１にＤＭＥＭ／Ｆ１２の構成成分を示す。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
前記バイオマーカーとしては、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、グルタミン酸、トリプトファン、アスパラギン、アラニン、シスチン、ヒポキサンチン、ウリジン、アスパラギン酸、アルギニン、２−ヒドロキシ酪酸、２−ヒドロキシイソ吉草酸、３−ヒドロキシイソ吉草酸、尿素、４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ安息香酸、リボン酸、キヌレニン、シスタチオニン、トレオン酸、ピルビン酸、プトレシン、アスコルビン酸、リボフラビン、セリン、システイン、オロト酸、及びクエン酸等が挙げられる。
【００３０】
未分化状態の細胞の培養上清と、分化状態の細胞の培養上清では、これらのバイオマーカーの存在量が異なる。そのため、培養上清におけるこれらのバイマーカーの存在量を測定することにより、細胞が分化状態であるか未分化状態であるかを判定できる。分化状態が既知である対照細胞の培養上清におけるバイオマーカーの存在量を測定し、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、対照細胞の培養上清における指標物質の存在量とを比較することにより、分化状態を評価してもよい。
【００３１】
対照細胞は、分化状態が既知であれば未分化細胞でも分化細胞でもよい。分化細胞は分化の進行度合いや分化の方向性の相違等に起因して培養上清におけるバイオマーカーの存在量が変動する場合があるため、未分化細胞を対照細胞とすることが好ましい。被検細胞の培養上清におけるバイオマーカーの存在量と、対照細胞の培養上清におけるバイオマーカーの存在量との比較は、例えば両者の比を求めることにより行われる。この比が所定の閾値（１よりも大きい閾値）以上である場合、あるいは所定の閾値（１よりも小さい閾値）以下である場合に、細胞が分化状態にあると判定することができる。被検細胞の培養上清におけるバイオマーカーの存在量と、対照細胞の培養上清におけるバイオマーカーの存在量との比が所定の閾値と同一の場合は未分化状態であると判定し、閾値を超える場合あるいは閾値未満の場合に、細胞が分化状態にあると判定してもよい。なお、幹細胞より分化誘導を行った細胞が被検細胞である場合、「未分化状態」とは、分化状態の細胞に未分化状態の細胞が混在している場合を含んでいてもよい。
【００３２】
本発明に係る細胞分化状態の評価方法の好ましい形態では、被検細胞の培養上清における２種以上のバイオマーカーの存在量に基づいて該被検細胞の分化状態を評価する。２種以上のバイオマーカーを組み合わせることにより、分化状態をより高精度で評価できる。また、２種以上のバイオマーカーを組み合わせることにより、細胞の分化状態だけでなく、分化状態にある細胞が内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれに分化するか、つまり、分化の方向性を評価することができる。
【００３３】
２種以上のバイオマーカーは、上記のバイオマーカーから任意に選択できる。上記バイオマーカーの中でも、分化の方向性を評価する上で有用なバイオマーカーとして、キヌレニン、２−アミノアジピン酸、オルニチン、デオキシシチジン、トリプトファン、シスタチオニン、ヒポキサンチン、及びウリジンが挙げられる。これらの中の２種以上のバイオマーカー存在量に基づいて評価を行うことが好ましい。
【００３４】
２種以上のバイオマーカーの存在量に基づく分化状態の評価方法としては、被検細胞の培養上清におけるそれぞれのバイオマーカーの存在量の培養時間に伴う変化を解析する方法、２種以上のバイオマーカーの存在量を多変量解析する方法、２種の指標物質の存在量の比を求める方法等が挙げられる。これらの手法を組み合わせて評価を行ってもよい。２種のバイオマーカーの存在量に基づく判定は、例えば、第一のバイオマーカーの存在量（あるいは指標値）を横軸、第二のバイオマーカーの存在量（あるいは指標値）を縦軸として、プロットすることにより行ってもよい。３種以上のバイオマーカーの存在量に基づく評価を行う場合は、多変量解析が有用である。
【００３５】
２種類のバイオマーカーとして、代謝経路の前後関係にある代謝生成物とその前駆物質の組み合わせが挙げられる。代謝生成物と前駆物質の比に基づいて評価を行うことにより、分化の方向性の評価精度が向上する。代謝経路の前駆物質は、代謝生成物に対する代謝物に限定されず、代謝経路の２つ以上前の物質でもよい。前駆物質と代謝生成物の組み合わせとしては、例えばトリプトファンとキヌレニンの組み合わせ、オルニチンとプトレシンの組み合わせ、アルギニンとオルニチンの組み合わせ等が挙げられる。なお、代謝経路の種類は特に限定されず、前駆物質と代謝生成物の組み合わせも上記に限定されない。
【００３６】
代謝生成物と前駆物質との比を求める場合、被検細胞の培養上清における代謝生成物と前駆物質との比に基づいて評価を行ってもよく、対照細胞の培養上清における代謝生成物の存在量と前駆物質の存在量の比と、被検細胞の培養上清における代謝生成物の存在量と前駆物質の存在量の比とを対比してもよい。また、対照細胞の培養上清における代謝生成物の存在量と被検細胞の培養上清における代謝生成物の存在量の比、及び対照細胞の培養上清における前駆物質の存在量と被検細胞の培養上清における前駆物質の存在量の比を求め、これらを対比することにより評価を行ってもよい。
【００３７】
培養上清における前記バイオマーカーの存在量を測定する方法としては、質量分析法による定量分析、特に液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）や、ガスクロマトグラフ質量分析装置（ＧＣ−ＭＳ）を用いた定量分析を好適に利用することができるが、これに限定されるものではない。例えば、培養上清に所定の前処理を施した試料を溶離液とともに液体クロマトグラフィー（ＬＣ）装置のカラムに流し、カラムにより分離されて溶出する成分を、紫外可視分光検出器や赤外分光検出器等の検出器で検出した結果から、試料中に含まれる前記バイオマーカーの存在量を求めるようにしてもよい。また、前記各バイオマーカーを特異的に発色又は発光させる試薬等を培養上清に添加し、該発色又は発光の強度に基づいてバイオマーカーの存在量を求めるようにしてもよい。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の方法による細胞の分化状態評価の一実施例について説明する。図１Ａ及び図１Ｂは本実施例による細胞分化状態の評価方法の実施手順を示す模式図である。【００３９】
本実施例では、ヒトｉＰＳ細胞株ＰＦＸ#９を使用した。また、ヒトｉＰＳ細胞株に分化誘導刺激を与えたものを被検細胞とし、ヒトｉＰＳ細胞株に分化誘導刺激を与えなかったもの（即ち、未分化状態を維持したもの）を対照細胞とした。以下、本実施例における細胞培養から培養上清の分析までの手順について説明する。【００４０】
［対照細胞の培養及び培養上清の回収］
ビトロネクチン−Ｎ（Vitronectin-N、Life Technologies社）コートが施された３枚の培養皿（直径60 mm）に前記ＰＦＸ#９株を植え継いで培養を行った（図１Ａでは簡略化のため培養皿１枚のみを示している）。培地としてはｍＴｅＳＲ１（modified Tenneille Serum Replacer 1、STEMCELL Technologies社）又はＴｅＳＲ−Ｅ８（Tenneille Serum Replacer E8、STEMCELL Technologies社）を使用し、毎日培地の交換を行った。ｍＴｅＳＲ１の構成成分を表２に、ＴｅＳＲ−Ｅ８の構成成分を表３に示す。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を０日目として６日間培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用サンプルとした。【００４１】
【表２】
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【００４２】
【表３】
2017068801.tif 000005
【００４３】
［内胚葉分化細胞の培養及び培養上清の回収］
ビトロネクチン−Ｎコートが施された３枚の培養皿（直径60 mm）に前記ＰＦＸ#９株を植え継いで培養を行った（図１Ａでは簡略化のため培養皿１枚のみを示している）。培地としてはｍＴｅＳＲ１又はＴｅＳＲ−Ｅ８を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。継代を行った日を０日目とし、１日目にアクチビン−Ａ（Activin-A、PeproTech社）、Ｗｎｔ３ａ（Wingless-type MMTV integration site family, member 3A、PeproTech社）、ＢＭＰ−４（Bone Morphogenetic Proteins-4、PeproTech社）をそれぞれ終濃度100 ng/mL、40 ng/mL、0.5 ng/mLとなるよう添加した培地に交換した。２日目以降はアクチビン−ＡとＢＭＰ−４をそれぞれ終濃度100 ng/mL、0.5 ng/mLとなるよう添加した培地に交換することにより内胚葉分化誘導刺激を行った。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を０日目として６日間培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用サンプルとした。【００４４】
［中胚葉分化細胞の培養及び培養上清の回収］
ビトロネクチン−Ｎコートが施された３枚の培養皿（直径60 mm）に前記ＰＦＸ#９株を植え継いで培養を行った（図１Ｂでは簡略化のため培養皿１枚のみを示している）。培地としてはｍＴｅＳＲ１又はＴｅＳＲ−Ｅ８を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。継代を行った日を０日目とし、１日目以降はＢＭＰ−４を終濃度40 ng/mLとなるよう添加した培地に交換することにより中胚葉分化誘導刺激を行った。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を０日目として６日間培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用サンプルとした。【００４５】
［外胚葉分化細胞の培養及び培養上清の回収］
ビトロネクチン−Ｎコートが施された３枚の培養皿（直径60 mm）に前記ＰＦＸ#９株を植え継いで培養を行った（図１Ｂでは簡略化のため培養皿１枚のみを示している）。培地としてはｍＴｅＳＲ１又はＴｅＳＲ−Ｅ８を使用し、毎日培地の交換を行ってコンフルエントに達するまで培養を継続した。継代を行った日を０日目とし、１日目以降はＳＢ４３１５４２ (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide、和光純薬工業株式会社）及びＮｏｇｇｉｎ（PeproTech社）をそれぞれ終濃度10 μM、500 ng/mLとなるよう添加した培地に交換することにより外胚葉分化誘導刺激を行った。細胞の植え継ぎ（継代）を行った日を０日目として６日間培養を継続し、各日の培地交換時に培養皿から回収した培養上清を質量分析用サンプルとした。【００４６】
［ＬＣ−ＭＳによる分析］
前記サンプル100 μLに、内部標準物質として0.5 mMイソプロピルリンゴ酸水溶液を20 μL添加し、混合した後、アセトニトリルを200 μL添加して除蛋白を行った。その後、サンプルを遠心分離（15,000 rpm、室温、15分間）して上清を回収し、超純水（Milli-Q（登録商標）水、メルク株式会社）で10倍希釈してＬＣ−ＭＳ分析に供した。ＬＣ−ＭＳ分析では、島津製作所製の「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳメソッドパッケージ  細胞培養プロファイリング」（以下「ＭＰ」と略す）に収録された分析条件に従った。ＭＰは培地に含まれる化合物及び細胞から分泌される代謝物をＬＣ−ＭＳで分析するための分析条件パラメータが集約されたものである。化合物の同定は、ＭＰに登録されている標準品の保持時間とサンプル中の化合物の保持時間との差が±0.3分以内であること、定量イオン、確認イオンの両ピークが検出されていること、強度値が1000以上であることを基準に行った。また、化合物の定量は、サンプル中の各化合物に特徴的なイオン（定量イオン）についてマスクロマトグラムの面積を算出する方法により実施した。【００４７】
［ＧＣ−ＭＳによる分析］
前記サンプル100 μLに、内部標準物質として0.5 mg/mLイソプロピルリンゴ酸水溶液を10 μL添加し、混合した後、アセトニトリルを200 μL添加して除蛋白を行った。その後、サンプルを遠心分離（15,000 rpm、室温、15分間）して上清100 μLを回収し、減圧乾燥を行った。各サンプルをメトキシアミン塩酸塩を含むピリジン溶液中でインキュベートすることにより、サンプル中の化合物のメトキシム化を行った。更に、各サンプルにＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド）を添加してサンプル中の化合物をトリメチルシリル化（誘導体化）した。そして、これらの誘導体化処理を施したサンプルをＧＣ−ＭＳによる分析に供した。【００４８】
ＧＣ−ＭＳ分析では、島津製作所製の「Smart Metabolites Database」（以下「ＤＢ」と略す）を使用した。該ＤＢは上述した誘導体化処理と同様の処理を施した種々の標準品をＧＣ−ＭＳで分析したデータが集約されたものである。化合物の同定は、前記ＤＢで設定された保持指標（保持時間を相対化した数値）とサンプル中の誘導体化化合物の保持指標との差が±5以内であるか否か、及び前記データベースで設定された定量イオン及び確認イオンの両者がサンプル中の誘導体化化合物について検出されているか否かを指標に行った。一方、化合物の定量は、前記データベースで設定された条件に従い、サンプル中の各誘導体化化合物に特徴的なイオンについてマスクロマトグラムの面積を算出する方法により実施した。【００４９】
［データ解析］
培養１日目から６日目に回収された培養上清について、上記のＬＣ−ＭＳ分析及びＧＣ−ＭＳ分析により求められた各化合物の定量値（面積値）を、前記内部標準物質の定量値（面積値）で除した値（面積比）を算出し、これを培養上清中における各化合物の存在量の指標値とした。未分化維持細胞（対照細胞）、内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞、及び外胚葉分化細胞のそれぞれについて同定された化合物の存在量の指標値を、横軸を培養日数、縦軸を該指標値とする座標系にプロットした。また、培養の経過に伴う存在量の指標値の変化が対照細胞と明確に異なる化合物を選別した。具体的には培養３日目から６日目の間で上記対照細胞における指標値の平均値をＡ、被検細胞における指標値の平均値をＢとしたときに、Ａ／Ｂ、又はＢ／Ａが1.5以上となる化合物を選別した。【００５０】
また、培養の初期段階での細胞の状態を評価するための有効な化合物を選定するために、多変量解析を行った。具体的には、培養２日目〜４日目のサンプルについて、上記で算出した指標値を多変量解析ソフトウェア（R version 3.1.2）に入力し、主成分分析を行った。その結果に基づき、未分化維持細胞と内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞、外胚葉分化細胞を区別できる化合物の組み合わせを選別した。【００５１】
[ 結果 ]
以上により、対照細胞の培養液上清中と分化誘導刺激を行った被検細胞の培養上清中とで、培養の経過に伴う存在量の指標値の変化が明確に異なる化合物を以下の表４〜２４に示す。なお、これらの表において、数値に網掛を付けたサンプルは対照細胞の指標値から変化有りと判定されたサンプルを示す。【００５２】
【表４】
2017068801.tif 000006
表４から、キヌレニン（Kynurenine）は、分化誘導によって被検細胞の培養上清中の存在量が対照細胞の培養上清中の存在量よりも減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のキヌレニンの存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００５３】
【表５】
2017068801.tif 000007
表５から、オルニチン（Ornithine）は、分化誘導によって被検細胞の上清中の存在量が対照細胞と比較して減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のオルニチンの存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００５４】
【表６】
2017068801.tif 000008
表６から、２-アミノアジピン酸（2-Aminoadipic acid）は、内胚葉及び中胚葉に分化誘導された被検細胞では、上清中の存在量が対照細胞と比較して減少することが分かった。一方、外胚葉に分化誘導された被検細胞では、上清中の存在量は培養３日目〜６日目のいずれにおいても対照細胞と比較して増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中の２-アミノアジピン酸の存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は内胚葉又は中胚葉に向かって分化すると判定することができ、閾値以上であるときは、被検細胞が外胚葉に向かって分化すると判定することができる。【００５５】
【表７】
2017068801.tif 000009
表７から、デオキシシチジン（Deoxycytidine）は、内胚葉に分化誘導された被検細胞では、上清中の存在量が対照細胞と比較して減少することが分かった。一方、中胚葉に分化誘導された被検細胞及び外胚葉に分化誘導された被検細胞の一部では、上清中の存在量は対照細胞と比較して増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のデオキシシチジンの存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は内胚葉に向かって分化すると判定することができ、閾値以上であるときは、被検細胞が中胚葉又は外胚葉に向かって分化すると判定することができる。【００５６】
【表８】
2017068801.tif 000010
表８から、グルタミン酸（Glutamic acid）は、内胚葉に分化誘導された被検細胞の上清中の存在量が対照細胞と比較して増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のグルタミン酸の存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は内胚葉に向かって分化すると判定することができる。【００５７】
【表９】
2017068801.tif 000011
表９から、トリプトファン（Tryptophan）は、分化誘導によって、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清におけるトリプトファンの存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００５８】
【表１０】
2017068801.tif 000012
表１０から、シスタチオニン（Cystathionine）は分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して概ね減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清におけるシスタチオニンの存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００５９】
【表１１】
2017068801.tif 000013
表１１から、アラニン（Alanine）は分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して概ね減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清におけるアラニンの存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００６０】
【表１２】
2017068801.tif 000014
表１２から、シスチン（Cystine）は、内胚葉及び外胚葉に分化誘導された被検細胞では、上清中の存在量が対照細胞と比較して概ね減少することが分かった。一方、中胚葉に分化誘導された被検細胞では、上清中の存在量は対照細胞と比較して概ね増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のシスチンの存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は内胚葉又は外胚葉に向かって分化すると判定することができ、閾値以上であるときは、被検細胞が中胚葉に向かって分化すると判定することができる。【００６１】
【表１３】
2017068801.tif 000015
表１３から、ヒポキサンチン（Hypoxanthine）は、中胚葉及び外胚葉に分化誘導された被検細胞では、培養５日目までは上清中の存在量が対照細胞と比較して概ね増加することが分かった。従って、ヒポキサンチンについては、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、培養開始から５日目までの間に対照細胞の培養上清中のヒポキサンチンの存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は中胚葉又は外胚葉に向かって分化すると判定することができる。【００６２】
【表１４】
2017068801.tif 000016
表１４から、ウリジン（Uridine）は、分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して増加することがわかった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のウリジンの存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００６３】
【表１５】
2017068801.tif 000017
表１５から、アスパラギン酸（Aspartic acid）は分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清におけるアスパラギン酸の存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００６４】
【表１６】
2017068801.tif 000018
表１６から、アルギニン（Arginine）は分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して概ね増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清におけるアルギニンの存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００６５】
【表１７】
2017068801.tif 000019
表１７から、２−ヒドロキシ酪酸（2-Hydroxybutyric acid）は分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清における２−ヒドロキシ酪酸の存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００６６】
【表１８】
2017068801.tif 000020
表１８から、２−ヒドロキシイソ吉草酸（2-Hydroxyisovaleric acid）は、分化誘導によって被検細胞の上清中の存在量が対照細胞と比較して概ね減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中の２−ヒドロキシイソ吉草酸の存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００６７】
【表１９】
2017068801.tif 000021
表１９から、３−ヒドロキシイソ吉草酸（3-Hydroxyisovaleric acid）は分化誘導により、内胚葉及び外胚葉に分化誘導された被検細胞の一部を除いて、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清における３−ヒドロキシイソ吉草酸の存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００６８】
【表２０】
2017068801.tif 000022
表２０から、尿素（Urea）は分化誘導により、外胚葉に分化誘導された被検細胞の一部を除いて、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して減少することが分かった。対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清における尿素の存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００６９】
【表２１】
2017068801.tif 000023
表２１から、４−ヒドロキシ安息香酸（4-Hydroxybenzoic acid）は分化誘導により、内胚葉に分化誘導された被検細胞の一部、外胚葉に分化誘導された被検細胞の一部を除いて、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清における４−ヒドロキシ安息香酸の存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００７０】
【表２２】
2017068801.tif 000024
表２２から、４−アミノ安息香酸（4-Aminobenzoic acid）は分化誘導により、被検細胞の上清中の存在量が対照細胞の上清中の存在量と比較して増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清における４−アミノ安息香酸の存在量に対する被検細胞の培養上清における存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以上である場合に、被検細胞は分化状態であると判定することができる。【００７１】
【表２３】
2017068801.tif 000025
表２３から、リボン酸（Ribonic acid）は、中胚葉に分化誘導された被検細胞では、上清中の存在量が対照細胞と比較して減少することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のリボン酸の存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は中胚葉に向かって分化すると判定することができる。【００７２】
【表２４】
2017068801.tif 000026
表２４から、クエン酸（Citric acid）は、中胚葉に分化誘導された被検細胞及び内胚葉に分化誘導された被検細胞の一部において、分化誘導によって被検細胞の上清中の存在量が対照細胞と比較して増加することが分かった。従って、対照細胞に未分化細胞を用いた場合、対照細胞の培養上清中のクエン酸の存在量に対する被検細胞の培養上清中の存在量の比（被検細胞／対照細胞）が予め定めた閾値以下である場合に、被検細胞は内胚葉又は中胚葉に向かって分化すると判定することができる。【００７３】
ｍＴｅＳＲ１株、ＴｅＳＲ−Ｅ８株の培養１日目〜６日目の培養上清における前記バイオマーカーの存在量の変化を図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、３Ａ及び３Ｂに示す。なお、図２Ａ〜図２ＤはＬＣ−ＭＳ分析による結果であり、図３Ａ及び図３ＢはＧＣ−ＭＳ分析による結果である。これらの図から明らかなように、培養開始直後は被検細胞と対照細胞とで前記バイオマーカーの存在量に違いはないが、多くのバイオマーカーについて、時間が経過するにつれて被検細胞と対照細胞の間でその存在量の差が広がっていくことが確認された。対照細胞と被検細胞との間で存在量の違いが最大となる時期が培養細胞の種類やバイオマーカーの種類によって異なることが確認された。さらに、被検細胞の分化状態（内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞、外胚葉分化細胞）によって、バイオマーカーの存在量に違いがあることも確認された。【００７４】
例えば、キヌレニンは、被検細胞よりも対照細胞の方が培養時間の経過とともに培養上清中の存在量が大きく増加する。２-アミノアジピン酸は、内胚葉分化細胞及び中胚葉分化細胞では、培養上清中の存在量はほとんど変化しないが、対照細胞及び外胚葉分化細胞において培養上清中の存在量に変化（増加）が見られ、特に外胚葉分化細胞において大きな変化が見られる。デオキシシチジンは、播種後、全ての細胞において培養上清中の存在量の変化（増加）が見られるが、内胚葉に分化誘導刺激を行った細胞では、培養上清中の存在量が培養時間の経過とともに大きく減少する。従って、このような、培養上清中の存在量の変化に関するバイオマーカー毎の特徴を利用することにより、被検細胞が分化状態にあるか非分化状態にあるかの判定とともに、分化状態にあると判定された被検細胞の分化の方向性（内胚葉、中胚葉、外胚葉）を評価することができる。１種のバイオマーカーのみに基づく評価では、内胚葉分化、中胚葉分化及び外胚葉分化の全てについて評価を行うことは困難であるが、２種以上のバイオマーカーの存在量に基づいて判定を行えば、分化の方向性をより正確に評価できる。【００７５】
ｍＴｅＳＲ１株の培養２日目〜４日目の培養上清におけるキヌレニン、２−アミノアジピン酸、オルニチン、デオキシシチジン、トリプトファン、シスタチオニン、ヒポキサンチン、及びウリジンの存在量を主成分分析した結果を図４Ａに示す。この図から、培養３日目で未分化状態（対照細胞）と内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞及び外胚葉分化細胞をそれぞれ明確に区別することができることが分かった。【００７６】
また、ＴｅＳＲ−Ｅ８株の培養２日目〜４日目の培養上清における前記バイオマーカーの存在量を主成分分析した結果を図４Ｂに示す。この図から、培養４日目で未分化状態（対照細胞）と内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞及び外胚葉分化細胞をそれぞれ明確に区別することができることが分かった。【００７７】
すなわち、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、培養上清における２種類以上のバイオマーカーの存在量を指標とすることにより、被検細胞が分化状態にあるか非分化状態にあるかの判定とともに、被検細胞の分化の方向性（内胚葉、中胚葉、外胚葉）を評価できることが分かった。【００７８】
［他の試験方法との対比］
培養上清におけるバイオマーカーの存在量の分析と他の試験方法による分析との整合を確認するために、細胞破壊的検査による分析を行った。【００７９】
上記の「対象細胞の培養」、「内胚葉分化細胞の培養」、「中胚葉分化細胞の培養」、及び「外胚葉分化細胞の培養」と同様に、培地としてｍＴｅＳＲ１又はＴｅＳＲ−Ｅ８を使用して、細胞の培養及び分化誘導刺激を行い、継代を行った日を０日目として、４日後及び７日後に細胞を採取した。【００８０】
TaqMan HPSC Scorecard Panel （アプライドバイオシステムズ社）により、採取した細胞のｍＲＮＡを抽出して９６種類の遺伝子発現レベルを定量ＰＣＲにより評価し、その結果を基に各胚葉系への分化度合のスコアを算出した。ｍＴｅＳＲ１株の解析スコアを表２５、ＴｅＳＲ−Ｅ８株の解析スコアを表２６に示す。これらの表において、数値に網掛を付けたサンプルは解析スコアが０．５以上であり、特定の方向に細胞が分化していることを示している。【００８１】
【表２５】
2017068801.tif 000027
【００８２】
【表２６】
2017068801.tif 000028
【００８３】
表２５及び表２６の結果から、「対象細胞の培養」（分化誘導刺激なし）では特定方向への分化はみられず、「内胚葉分化細胞の培養」（アクチビン−Ａ、Ｗｎｔ３ａ、及びＢＭＰ−４による分化誘導刺激）では内胚葉分化が進行しており、「中胚葉分化細胞の培養」（ＢＭＰ−４による分化誘導刺激）では中胚葉分化が進行しており、「外胚葉分化細胞の培養」（Ｂ４３１５４２及びＮｏｇｇｉｎによる分化誘導刺激）では外胚葉分化が進行していることが分かる。【００８４】
これらの結果から、培養上清におけるバイオマーカーの存在量を指標とする評価手法は、従来の細胞破壊的な手法を再現可能であり、同一培養皿中の細胞を対象として時間経過に伴う分化状態の変化を評価することが可能な優れた手法であるといえる。【００８５】
［代謝経路の前後関係にある化合物の比に基づくデータ解析］
培養１日目から６日目に回収された培養上清について、ＬＣ−ＭＳ分析により求められた各化合物の存在量の指標値を算出した。対照細胞（未分化維持細胞）、被検細胞（内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞、及び外胚葉分化細胞）のそれぞれの培養上清のキヌレニン（Kynurenine）、トリプトファン（Tryptophan）、オルニチン（Ornithine）、アルギニン（Arginine）及びプトレシン（Putrescine）の指標値から、被検細胞における指標値の平均値Ｂを対照細胞における指標値の平均値Ａで除した値Ａ／Ｂを算出した。【００８６】
（キヌレニン／トリプトファン）
代謝生成物としてのキヌレニンのＡ／Ｂの値とともに、キヌレニンのＡ／Ｂを、キヌレニン経路の前駆物質であるトリプトファンのＡ／Ｂで除した値を表２７及び表２８に示す。【００８７】
【表２７】
2017068801.tif 000029
【００８８】
【表２８】
2017068801.tif 000030
【００８９】
表４に示したように、キヌレニンは分化誘導によって被検細胞の培養上清中の存在量（Ｂ）が対照細胞の培養上清中の存在量（Ａ）よりも減少し、単独でも被検細胞が分化状態であるか否かを判定できる（前述のように、表の値が１から離れるほど対照細胞からの変化が大きいことを表している）。一方、表２７（ｍＴｅＳＲ１）及び表２８（ＴｅＳＲ−Ｅ８）に示すように、キヌレニンとその前駆物質であるトリプトファンの比は、キヌレニン単独の場合よりも対照細胞との差が大きく、培養日数の経過とともにその傾向が顕著となることが分かる。【００９０】
これらの結果を、細胞破壊的な手法による評価結果である表２５，２６と比べると、被検細胞の培養上清中の存在量を評価する方法では、分化誘導刺激開始後の経過日数が少ない段階で、対象細胞と被検細胞との間に有意な差が表れていることが分かる。また、キヌレニンを単独で指標とするよりも、キヌレニンとトリプトファンの比を用いた場合には、対照細胞との差がより顕著となる傾向があることから、被検細胞の分化状態をより高精度に評価できることが分かる。【００９１】
（オルニチン／アルギニン）
代謝生成物としてのオルニチンのＡ／Ｂの値とともに、オルニチンのＡ／Ｂを、オルニチン回路（尿素回路）の前駆物質であるアルギニンのＡ／Ｂで除した値を表２９及び表３０に示す。【００９２】
【表２９】
2017068801.tif 000031
【００９３】
【表３０】
2017068801.tif 000032
【００９４】
表５に示したように、オルニチンは分化誘導によって被検細胞の培養上清中の存在量（Ｂ）が対照細胞の培養上清中の存在量（Ａ）よりも減少し、単独でも被検細胞が分化状態であるか否かを判定できる。一方、表２９（ｍＴｅＳＲ１）及び表３０（ＴｅＳＲ−Ｅ８）に示すように、内胚葉分化細胞及び中胚葉分化細胞については、オルニチンとその前駆物質であるアルギニンの比は、オルニチン単独の場合よりも対照細胞との差が大きく、培養日数の経過とともにその傾向が顕著となることが分かる。これらの結果から、オルニチンを単独で指標とするよりも、オルニチンとアルギニンの比を用いることにより、被検細胞の分化状態をより高精度に評価できることが分かる。【００９５】
（プトレシン／オルニチン）
代謝生成物としてのプトレシンのＡ／Ｂの値とともに、プトレシンのＡ／Ｂを、アルギニン／プロリン代謝の前駆物質であるオルニチンのＡ／Ｂで除した値を表３１に示す。【００９６】
【表３１】
2017068801.tif 000033
【００９７】
ｍＴｅＳＲ１培地を用いた場合、プトレシンは、分化誘導によって被検細胞の培養上清中の存在量（Ｂ）が対照細胞の培養上清中の存在量（Ａ）よりも増加する傾向がみられ、特に内胚葉分化細胞及び外胚葉分化細胞については、培養日数の経過とともにその傾向が顕著となることから、プトレシン単独で被検細胞が分化状態であるか否かを判定できる。中内胚葉分化細胞については、プトレシン単独では明確な傾向がみられなかった。これに対して、プトレシンとその前駆物質であるオルニチンの比を用いることにより、培養日数の経過とともに対照細胞との差が大きくなっており、中胚葉分化細胞に関しても分化状態であることを判定できる。内胚葉分化細胞及び外胚葉分化細胞については、プトレシン単独よりも、プトレシンとその前駆物質であるオルニチンの比を用いる方が対照細胞との差が大きく、被検細胞の分化状態をより高精度に評価できることが分かる。
【図１Ａ】
2017068801.tif 000034
【図１Ｂ】
2017068801.tif 000035
【図２Ａ】
2017068801.tif 000036
【図２Ｂ】
2017068801.tif 000037
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2017068801.tif 000039
【図３Ａ】
2017068801.tif 000040
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2017068801.tif 000043
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月19日(2018.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の一形態では、２種以上の上記指標物質の存在量に基づいて分化状態の評価が行われる。例えば、２種以上の指標物質のそれぞれについて、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、対照細胞の培養上清における指標物質の存在量とを比較することにより、分化状態の評価が行われる。２種以上の指標物質のそれぞれについて、被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、対照細胞の培養上清における指標物質の存在量との比を求め、これらの比が予め定めた閾値以上であるか否かに基づいて、分化状態の評価を行ってもよい。対照細胞としては、例えば未分化であることが明らかな細胞が用いられる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
上記の「対照細胞の培養」、「内胚葉分化細胞の培養」、「中胚葉分化細胞の培養」、及び「外胚葉分化細胞の培養」と同様に、培地としてｍＴｅＳＲ１又はＴｅＳＲ−Ｅ８を使用して、細胞の培養及び分化誘導刺激を行い、継代を行った日を０日目として、４日後及び７日後に細胞を採取した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
表２５及び表２６の結果から、「対照細胞の培養」（分化誘導刺激なし）では特定方向への分化はみられず、「内胚葉分化細胞の培養」（アクチビン−Ａ、Ｗｎｔ３ａ、及びＢＭＰ−４による分化誘導刺激）では内胚葉分化が進行しており、「中胚葉分化細胞の培養」（ＢＭＰ−４による分化誘導刺激）では中胚葉分化が進行しており、「外胚葉分化細胞の培養」（Ｂ４３１５４２及びＮｏｇｇｉｎによる分化誘導刺激）では外胚葉分化が進行していることが分かる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
［代謝経路の前後関係にある化合物の比に基づくデータ解析］
培養１日目から６日目に回収された培養上清について、ＬＣ−ＭＳ分析により求められた各化合物の存在量の指標値を算出した。対照細胞（未分化維持細胞）、被検細胞（内胚葉分化細胞、中胚葉分化細胞、及び外胚葉分化細胞）のそれぞれの培養上清のキヌレニン（Kynurenine）、トリプトファン（Tryptophan）、オルニチン（Ornithine）、アルギニン（Arginine）及びプトレシン（Putrescine）の指標値から、被検細胞における指標値の平均値Ｂを対照細胞における指標値の平均値Ａで除した値Ｂ／Ａを算出した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
（キヌレニン／トリプトファン）
代謝生成物としてのキヌレニンのＢ／Ａの値とともに、キヌレニンのＢ／Ａを、キヌレニン経路の前駆物質であるトリプトファンのＢ／Ａで除した値を表２７及び表２８に示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
これらの結果を、細胞破壊的な手法による評価結果である表２５，２６と比べると、被検細胞の培養上清中の存在量を評価する方法では、分化誘導刺激開始後の経過日数が少ない段階で、対照細胞と被検細胞との間に有意な差が表れていることが分かる。また、キヌレニンを単独で指標とするよりも、キヌレニンとトリプトファンの比を用いた場合には、対照細胞との差がより顕著となる傾向があることから、被検細胞の分化状態をより高精度に評価できることが分かる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
（オルニチン／アルギニン）
代謝生成物としてのオルニチンのＢ／Ａの値とともに、オルニチンのＢ／Ａを、オルニチン回路（尿素回路）の前駆物質であるアルギニンのＢ／Ａで除した値を表２９及び表３０に示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
（プトレシン／オルニチン）
代謝生成物としてのプトレシンのＢ／Ａの値とともに、プトレシンのＢ／Ａを、アルギニン／プロリン代謝の前駆物質であるオルニチンのＢ／Ａで除した値を表３１に示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
ｍＴｅＳＲ１培地を用いた場合、プトレシンは、分化誘導によって被検細胞の培養上清中の存在量（Ｂ）が対照細胞の培養上清中の存在量（Ａ）よりも増加する傾向がみられ、特に内胚葉分化細胞及び外胚葉分化細胞については、培養日数の経過とともにその傾向が顕著となることから、プトレシン単独で被検細胞が分化状態であるか否かを判定できる。中胚葉分化細胞については、プトレシン単独では明確な傾向がみられなかった。これに対して、プトレシンとその前駆物質であるオルニチンの比を用いることにより、培養日数の経過とともに対照細胞との差が大きくなっており、中胚葉分化細胞に関しても分化状態であることを判定できる。内胚葉分化細胞及び外胚葉分化細胞については、プトレシン単独よりも、プトレシンとその前駆物質であるオルニチンの比を用いる方が対照細胞との差が大きく、被検細胞の分化状態をより高精度に評価できることが分かる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分化状態の評価方法であって、
分化状態が未知の幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞とし、分化状態が既知である多能性幹細胞を対照細胞として、
前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞の分化状態を評価し、
前記指標物質が、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、トリプトファン、アラニン、ヒポキサンチン、ウリジン、アルギニン、キヌレニン、シスタチオニン、及びプトレシンから成る群から選択される２種以上である、細胞分化状態の評価方法。
【請求項２】
前記２種以上の指標物質のそれぞれについて、前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比が予め定めた閾値以上であるか否か又は閾値以下であるか否かに基づいて、前記分化状態の評価が行われる、請求項１に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項３】
前記対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用する、請求項１または２に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項４】
前記分化状態の評価において、分化状態であるか未分化状態であるかを評価するとともに、分化状態であると評価された被検細胞の分化の方向が内胚葉、中胚葉、及び外胚葉のいずれであるかを評価することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項５】
前記２種以上の指標物質のそれぞれについて、前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量の培養時間に伴う変化を解析することにより、前記評価が行われる、請求項４に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項６】
前記２種以上の指標物質の存在量を多変量解析することにより、前記評価が行われる、請求項４または５に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項７】
前記２種以上の指標物質として、キヌレニン、２−アミノアジピン酸、オルニチン、及びデオキシシチジンからなる群から選択される２種以上を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項８】
前記２種以上の指標物質として、キヌレニン、２−アミノアジピン酸、オルニチン、デオキシシチジン、トリプトファン、シスタチオニン、ヒポキサンチン、及びウリジンからなる群から選択される２種以上を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項９】
前記２種以上の指標物質のうちの１つが、２−アミノアジピン酸である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１０】
前記２種以上の指標物質が、代謝経路の前後関係にある前駆物質と代謝生成物とを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１１】
前記前駆物質がトリプトファンであり、前記代謝生成物がキヌレニンである、請求項１０に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１２】
前記前駆物質がオルニチンであり、前記代謝生成物がプトレシンである、請求項１０に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１３】
前記前駆物質がアルギニンであり、前記代謝生成物がオルニチンである、請求項１０に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１４】
前記被検細胞の培養上清における前記前駆物質の存在量と前記代謝生成物の存在量との比に基づいて前記評価が行われる、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１５】
細胞分化状態の評価方法であって、
分化状態が未知の幹細胞あるいは多能性幹細胞より分化誘導を行った細胞を被検細胞とし、分化状態が既知である多能性幹細胞を対照細胞として、
前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記被検細胞の培養上清における前記指標物質の存在量とを比較することにより、前記被検細胞の分化状態を評価し、
前記指標物質が、オルニチン、２−アミノアジピン酸、デオキシシチジン、トリプトファン、アラニン、ヒポキサンチン、ウリジン、及びアルギニンから成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物であることを特徴とする細胞分化状態の評価方法。
【請求項１６】
前記指標物質のそれぞれについて、前記被検細胞の培養上清における指標物質の存在量と、前記対照細胞の培養上清における前記指標物質の存在量との比が予め定めた閾値以上であるか否か又は閾値以下であるか否かに基づいて、前記分化状態の評価が行われる、請求項１５に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１７】
前記対照細胞として未分化であることが明らかな細胞を使用する、請求項１６に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１８】
前記指標物質のうち、アルギニン及びトリプトファンから成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物の、前記対照細胞の培養上清における存在量に対する前記被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以下である場合に、前記分化状態が未知の幹細胞は未分化状態である、又は前記幹細胞より分化誘導を行った細胞には未分化状態の細胞が混在していると判定することを特徴とする請求項１７に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項１９】
前記指標物質のうち、オルニチン及びアラニンから成る群から選ばれる少なくとも一つの化合物の、前記対照細胞の培養上清における存在量に対する前記被検細胞の培養上清における存在量の比が予め定めた閾値以上である場合に、前記分化状態が未知の幹細胞は未分化状態である、又は前記幹細胞より分化誘導を行った細胞には未分化状態の細胞が混在していると判定することを特徴とする請求項１７に記載の細胞分化状態の評価方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法による被検細胞の分化状態の評価結果に基づいて、前記被検細胞を選別する工程を含む、細胞の培養方法。
【国際調査報告】
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