(57)【要約】  本発明は、藻類バイオマスを利用して有機酸を生産する方法を提供することを課題とする。本発明は、ユーグレナを窒素欠乏条件下で好気的に培養する窒素欠乏培養工程、または炭素源を含む培地を用いて好気的に培養する従属栄養培養工程のいずれかと、窒素欠乏培養工程で得られた培養産物を嫌気条件下でインキュベートする嫌気培養工程を含む方法により、ユーグレナを用いてコハク酸などの有機酸を生産することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーグレナを、窒素欠乏条件下で好気的に培養する窒素欠乏培養工程、および窒素欠乏培養工程で得られた培養産物を嫌気条件下でインキュベートする嫌気培養工程を含む、ユーグレナを用いた有機酸の生産方法。
【請求項２】
窒素欠乏培養工程を３日間以上行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ユーグレナを、炭素源を含む培地を用いて好気的に培養する従属栄養培養工程、および従属栄養培養工程で得られた培養産物を嫌気条件下でインキュベートする嫌気培養工程を含む、ユーグレナを用いた有機酸の生産方法。
【請求項４】
嫌気培養工程の培養産物から有機酸を含有する培養液を取り出す工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
嫌気培養工程の前に、窒素欠乏培養工程または従属栄養培養工程の培養産物に含まれるユーグレナ細胞体を濃縮する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ユーグレナが野生型ユーグレナである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
有機酸がコハク酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユーグレナを用いてポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）の原料などとして有用なコハク酸に代表される有機酸を生産する方法、およびその方法で得られるユーグレナの培養産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の石油系プラスチックに替わる新たなプラスチック素材として、バイオマスを原料とするバイオマスプラスチック、および自然界において微生物の作用により分解される生分解性プラスチックの研究開発が近年進められている。バイオマスプラスチックと生分解性プラスチックの双方の性質を有する生分解性バイオマスプラスチックとしては、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、澱粉樹脂、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、およびポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）等が知られている。【０００３】
ＰＢＳは、コハク酸と１，４−ブタンジオールから縮合反応によって合成され、有用性の高い生分解性バイオマスプラスチックとして知られている。原料のコハク酸は、従来石油を原料として合成されているが、最近では、トウモロコシやサトウキビなどに由来する糖質を用い、従属栄養細菌の発酵による生産なども行われている。しかし、食料系植物を原料とすると、食料および飼料用需要との競合が生じ、安定供給面での問題を伴う。そのため、既存の食料生産と競合しないバイオマスを原料としてコハク酸を生産することが好ましい。【０００４】
当該バイオマスとしては、近年では藻類が注目されている。中でもユーグレナ（ミドリムシ）は、光合成により様々な化合物を生産する能力を有し、燃料生産にも利用できることが知られている。例えば特許文献１には、バイオ燃料の原料となるワックスエステルを高含有するユーグレナの生産方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−１５３７３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまで種々の藻類について研究が行われているにもかかわらず、コハク酸などの有機酸を多量に産生する藻類の種類および培養条件などは未だ見出されていない。本発明は、藻類によりコハク酸などの有機酸を生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、種々の藻類を検討した結果、ユーグレナを窒素欠乏条件下で、あるいは有機または無機炭素源を含む培地を用いて従属栄養条件下で培養した後に、嫌気条件下でインキュベートすることにより、有機酸を多く含む培養産物が得られることを見出した。本発明の要旨は以下のとおりである。
（１）ユーグレナを、窒素欠乏条件下で好気的に培養する窒素欠乏培養工程、および窒素欠乏培養工程で得られた培養産物を嫌気条件下でインキュベートする嫌気培養工程を含む、ユーグレナを用いた有機酸の生産方法。
（２）窒素欠乏培養工程を３日間以上行う、（１）に記載の方法。
（３）ユーグレナを、炭素源を含む培地を用いて好気的に培養する従属栄養培養工程、および従属栄養培養工程で得られた培養産物を嫌気条件下でインキュベートする嫌気培養工程を含む、ユーグレナを用いた有機酸の生産方法。
（４）嫌気培養工程の培養産物から有機酸を含有する培養液を取り出す工程をさらに含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）嫌気培養工程の前に、窒素欠乏培養工程または従属栄養培養工程の培養産物に含まれるユーグレナ細胞体を濃縮する工程をさらに含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）ユーグレナが野生型ユーグレナである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）有機酸がコハク酸である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）ユーグレナが産生した有機酸を１００ｍｇ／Ｌ以上の濃度で含有する、ユーグレナを培養して得られる培養産物。
（９）有機酸がコハク酸である、（８）に記載の培養産物
（１０）ユーグレナを培養した後に得られる培養液である、（８）または（９）に記載の培養産物。
（１１）ユーグレナを、窒素欠乏条件下で３日間以上好気的に培養する窒素欠乏培養工程、および窒素欠乏培養工程で得られた培養産物を嫌気条件下でインキュベートする嫌気培養工程を含む方法によりユーグレナを培養して得られる、（８）〜（１０）のいずれかに記載の培養産物。
（１２）ユーグレナを、炭素源を含む培地を用いて好気的に培養する従属栄養培養工程、および従属栄養培養工程で得られた培養産物を嫌気条件下でインキュベートする嫌気培養工程を含む方法によりユーグレナを培養して得られる、（８）〜（１０）のいずれかに記載の培養産物。
（１３）前記ユーグレナが野生型である、（８）〜（１２）のいずれかに記載の培養産物。
（１４）ユーグレナを、窒素欠乏条件下で３日間以上好気的に培養する窒素欠乏培養工程、窒素欠乏培養工程で得られた培養産物を嫌気条件下でインキュベートする嫌気培養工程、および嫌気培養工程で得られた培養産物からユーグレナ細胞体を採取する工程を含む方法により得られる、ユーグレナ細胞体。
（１５）ユーグレナを、炭素源を含む培地を用いて好気的に培養する従属栄養培養工程、および従属栄養培養工程で得られた培養産物を嫌気条件下でインキュベートする嫌気培養工程、および嫌気培養工程で得られた培養産物からユーグレナ細胞体を採取する工程を含む方法により得られる、ユーグレナ細胞体。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、藻類バイオマスであるユーグレナを利用してＰＢＳなどの原料として有用なコハク酸に代表される有機酸を生産することが可能となる。また、有機酸の生産と同時に、有用なユーグレナ細胞体も得ることができる。【０００９】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１５−０９５９９３号の明細書、特許請求の範囲および図面に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の方法は、ユーグレナを、窒素欠乏条件下で好気的に培養する窒素欠乏培養工程、または炭素源を含む培地を用いて好気的に培養する従属栄養培養工程のいずれかと、当該工程で得られた培養産物を嫌気条件下でインキュベートする嫌気培養工程とを含むことを特徴とする。目的化合物であるコハク酸などの有機酸は、嫌気培養工程で得られる培養産物中に含まれる。なお、本明細書において「培養産物」とは、ユーグレナを培養して得られる全ての産物を包含する概念である。より具体的には、ユーグレナを培養槽に入れた培養液中で培養した場合には、ユーグレナ細胞体およびユーグレナが産生した物質を含む培養液の全て、すなわち培養槽の内容物全てを包含する概念である。
【００１１】
ユーグレナ（Euglena、和名：ミドリムシ）はユーグレナ属に属する微生物の総称である。ユーグレナは、運動性を有する藻類であり、その大多数は、鞭毛運動をする動物的性質と、葉緑体を有し光合成を行う植物的性質の両方を兼ね備えることが知られている。ユーグレナの具体例としては、Euglena acus、Euglena caudata、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena oxyuris、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridis、Euglena vermiformisなどが挙げられる。これらのうち、本発明の方法では、従来広く研究に利用されているユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）を好適に用いることができる。
【００１２】
ユーグレナは、遺伝子組み換えを行っていない野生型ユーグレナを用いると、培養に際して自然界との遺伝子交雑などに配慮する必要がないため、屋外でも培養することができ、培養にかかるコストを抑制することができるため好ましい。しかしながら、これに限られるものではなく、コハク酸などの有機酸を多く産生するよう遺伝子組み換えを行ったユーグレナを用いてもよい。
【００１３】
（窒素欠乏培養工程および従属栄養培養工程）
窒素欠乏培養工程では、窒素欠乏条件下で、例えば窒素欠乏培地を用いて、ユーグレナを好気的に培養する。窒素欠乏条件下で培養すると、当初はユーグレナ細胞体中に蓄積された窒素源が利用されるが、それを全て資化してしまった後は、ユーグレナは窒素欠乏状態に陥る。ユーグレナはそのストレスに応じてコハク酸などの有機酸を産生し細胞体内に蓄積するものと考えられる。窒素欠乏培養期間は３日間以上であり、特に４日間以上、とりわけ５日間以上、さらに６日間以上とすると、有機酸をより多く蓄積すると考えられるため好ましい。
【００１４】
ユーグレナの窒素欠乏培地を用いた好気的培養の条件は、従来のユーグレナの培養法において知られたものを用いることができる。培養温度は、通常２０〜３４℃の範囲内とするのが効率的な生育のために好ましい。また、培地には空気をバブリングすることが好ましく、特にユーグレナはＣＯ２を資化するため、１〜５％のＣＯ２を含む空気を培地中にバブリングすることがより好ましい。好気的培養は光照射下（明条件下）で行うことが好ましく、明暗サイクル、特に概日リズムに準じた明暗サイクル条件下（例えば１２時間明暗サイクル）で行うことがより好ましい。明条件下における光強度は、３０〜２００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１の範囲とすることが好ましい。培地のｐＨは３〜８の範囲とすることが好ましい。
【００１５】
ユーグレナの培養には、例えばＣｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地（ＣＭ培地）、Ｈｕｔｎｅｒ培地、およびＫｏｒｅｎ−Ｈｕｔｎｅｒ培地、ＡＹ培地などの公知の培地の一部組成を変更した改変培地を用いることができる。培地の改変には、窒素欠乏条件とするための窒素源の除去が含まれる。例えば、ＣＭ培地であれば、組成からリン酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４）を除外することにより窒素欠乏条件とすることができる。なお、窒素欠乏条件とは、培地中の窒素濃度がＮ原子換算で０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以下、特に０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以下である状態を意味する。
【００１６】
ユーグレナの培養に用いる培地の改変には、ユーグレナの増殖を促進する栄養源、あるいは有機酸の生合成原料となるような炭素源の追加も含まれ得る。ユーグレナの培養は、炭素源が追加された培地を用いて、完全従属栄養条件下で、あるいは光合成と培地に追加された炭素源を併用可能な条件下（本明細書において、このような光合成を併用する条件も従属栄養条件の概念に包含されるものとする）で行ってもよい。従属栄養条件下でユーグレナの培養を行うことにより、独立栄養条件下で培養を行った場合と比較して、有機酸をより多く蓄積するようになる。上述した窒素欠乏培養工程は、従属栄養条件下で培養を行う従属栄養培養工程に置き換えることができる。従属栄養培養工程は、培地から窒素源が除去されていない、窒素充足条件下で行ってもよい。従属栄養培養工程は、異なる構成の培地を用いる以外は、窒素欠乏培養工程と同様に実施することができる。
【００１７】
培地に追加する炭素源としては、例えば、グルコースやフルクトースなどの糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸やリンゴ酸などのカルボン酸や、グルタミン酸などのアミノ酸といった有機酸またはその塩等、および炭酸水素ナトリウムなどの無機炭素化合物が挙げられる。例えば、培地中にエタノールを０．５〜１．０容量％加えると、ユーグレナの生育促進につながる。なお、炭素源以外の栄養源として、塩化カリウムや塩化マグネシウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩を培地に加えてもよい。培地に追加する炭素源としては、糖類および有機酸が好ましく、なかでもグルコースならびに酢酸およびその塩が特に好ましい。培地に追加する炭素源は、培地の他の成分とのバランスの観点から、１〜２００ｍＭ、特に１〜１００ｍＭ、とりわけ１〜２０ｍＭの範囲の濃度で添加することが好ましい。
【００１８】
窒素欠乏培養工程または従属栄養培養工程に用いるユーグレナは、予め通常の窒素欠乏ではない培地を用いて前培養されているものを用いる。好ましくは１日以上、特に２日以上、とりわけ３日以上前培養したユーグレナが分散した培養液を採取して遠心分離し、必要に応じて脱イオン水で洗浄した後、培地に加えるなどして、窒素欠乏条件下または従属栄養条件下に置く。培養工程の開始時におけるユーグレナ細胞体の濃度は１０〜２０ｇ／Ｌ、培養工程の完了時におけるユーグレナ細胞体の濃度は２０〜５０ｇ／Ｌとすると、ユーグレナの生育効率、さらには有機酸の産生効率の面から好ましい。
【００１９】
なお、本明細書において、ユーグレナ細胞体の重量は、特に言及しない場合には乾燥重量を意味する。ユーグレナ細胞体の乾燥重量は、ユーグレナが分散した培養液の所定量をサンプリングし、遠心分離、洗浄および凍結乾燥などの工程を経て水分を除去した後のユーグレナ細胞体を測定して得られる重量である。従って、ｇ／Ｌの単位で表されるユーグレナ細胞体の濃度とは、培養液１リットルあたりに含まれるユーグレナ細胞体の乾燥重量を意味する。
【００２０】
（嫌気培養工程）
嫌気培養工程では、上記の窒素欠乏培養工程または従属栄養培養工程で得られた培養産物を嫌気条件下でインキュベートする。嫌気条件下のインキュベートは、好ましくは暗条件で行われる。ここで、「暗条件」とは、具体的には、光強度が１μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１以下の弱光条件または光のない暗黒条件をいう。
【００２１】
「嫌気培養」とは、嫌気発酵ともいえる工程であり、ユーグレナが嫌気条件下でエネルギーを獲得するために、嫌気呼吸により有機物を酸化して、コハク酸などの有機酸と二酸化炭素を生産する異化代謝を意味する。また、「嫌気条件」とは、ユーグレナが好気呼吸を行うことができる最低酸素量を下回る、実質的に酸素が存在しない条件であり、酸素濃度が、通常では１％以下、好ましくは０．５％以下、特に０．２％以下、さらに完全に無酸素（酸素量が検出限界以下）の条件を意味する。ユーグレナは、好気かつ窒素欠乏条件下または従属栄養条件下で培養すると細胞内にコハク酸などの有機酸を蓄積するが、それをさらに嫌気かつ暗条件で培養すると、コハク酸などの有機酸の生合成がさらに促進され、また有機酸を細胞外に放出するようになると考えられる。嫌気条件は、培養槽内の気相中における酸素濃度を上記範囲内に調整することで達成できる。例えば、気相中の気体を、窒素やアルゴンなどの不活性ガスで置換することにより達成することができる。
【００２２】
嫌気培養に付される培養産物は、遠心分離した後に上清を廃棄し、沈殿したユーグレナ細胞体を少量の新たな培地に分散させるなどして、予めユーグレナ細胞体を濃縮すると、ユーグレナ細胞体が培養液中に有機酸を放出しやすくなり、嫌気培養工程後の培養液における有機酸含有量が高くなるため好ましい。濃縮は、培養産物の容量に対する、嫌気培養工程に付されるユーグレナ細胞体分散液の容量が１／１０以下、特に１／２０以下、とりわけ１／５０以下、さらに１／７５以下となるように行うと、嫌気培養工程後の培養液における有機酸含有量がより高くなるため好ましい。なお、濃縮のための方法は遠心分離に限られるものではなく、他の公知の方法、例えばフィルター濾過により分散質を集積するなどの方法で行ってもよい。
【００２３】
嫌気培養工程における培地は、上記の窒素欠乏培養工程および従属栄養培養工程と同様のものを用いてもよく、あるいはユーグレナの増殖を促進するような栄養源を有しない緩衝液を用いてもよい。培養に用いることができる緩衝液としては、ＨＥＰＥＳバッファ、Ｔｒｉｓバッファ、ＰＢＳバッファ、ＭＯＰＳバッファ、ＭＥＳバッファなどが挙げられる。その他、嫌気培養工程における培養条件は、空気バブリングを行わない以外は上記の窒素欠乏培養工程および従属栄養培養工程と同様にしてもよいが、振盪培養とすると、嫌気培養工程後の培養液における有機酸含有量がより高くなるため好ましい。
【００２４】
嫌気培養は、少なくとも１日以上行うことが好ましく、２日以上、特に３日以上行うことがより好ましい。嫌気培養に付すことで、ユーグレナはコハク酸などの有機酸を培養液中に放出する。嫌気培養後の培養液中には、培養終了直後の非濃縮状態で１００ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは２００ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは３００ｍｇ／Ｌ以上のコハク酸が含まれる。嫌気培養後の培養液中のコハク酸含有量は、培養条件を最適化することにより、８００ｍｇ／Ｌ以上、１０００ｍｇ／Ｌ以上、さらには１５００ｍｇ／Ｌ以上とすることも可能である。従って、嫌気培養後の培養液中には、培養終了直後の非濃縮状態で、１００ｍｇ／Ｌ以上、２００ｍｇ／Ｌ以上、３００ｍｇ／Ｌ以上、８００ｍｇ／Ｌ以上、１０００ｍｇ／Ｌ以上、または１５００ｍｇ／Ｌ以上の有機酸が含まれ得る。なお、産生される有機酸（特にコハク酸）は抗菌作用を有するため、特定の細菌等が増殖することを防ぐことができる。
【００２５】
嫌気培養後の培養液中の有機酸含有量は、培養産物を遠心分離して採取した上清を乾燥させて得られたサンプルを、例えばＨＰＬＣなどにより分析することにより求めることができる。嫌気培養後のユーグレナ細胞体の乾燥重量に対する、上清に含まれる有機酸の重量比率は０．５重量％以上であることが好ましく、特に１重量％以上、さらに１．５重量％以上であることがより好ましい。
【００２６】
嫌気培養後の培養液中に含まれる有機酸は、コハク酸以外に、例えばクエン酸、リンゴ酸および乳酸などが挙げられる。クエン酸以外の有機酸の含有量は、コハク酸に比較して極めて少なくなることが多い。嫌気培養後の培養液中に含まれるリンゴ酸および乳酸の量は、それぞれ、コハク酸含有量の１／５以下、特に１／６以下、とりわけ１／７、さらに１／１０以下であってもよい。リンゴ酸および乳酸の量が少ないことは、有用性がより高いコハク酸の分離精製の観点から好ましい。また、嫌気培養後の培養液中には、その他の下記のような有用な化合物が含まれ得る：３−ヒドロキシプロピオン酸、マロン酸、プロピオン酸、セリン、アセトイン、アスパラギン酸、フマル酸、３−ヒドロキシブチロラクトン、トレオニン、アラビニトール、フルフラール、グルタミン酸、イタコン酸、レブリン酸、プロリン、キシリトール、キシロン酸、アコニット酸、クエン酸、２，５−フランジカルボン酸、グルカル酸、リジン、レボグルコサン、ソルビトール。それらの含有量は、コハク酸含有量の１／５以下、特に１／６以下、とりわけ１／７、さらに１／１０以下であってもよい。
【００２７】
嫌気培養後の培養産物には、培養液中のみならず、ユーグレナ細胞体にも有機酸が含まれる。ユーグレナ細胞体中に含まれる有機酸は、水または有機溶媒で抽出することにより取り出すことができる。その際、超音波破砕装置などにより機械的な力を加えるか、あるいはリゾチームなどの酵素を添加するなどして細胞膜を破壊してもよい。なお、ユーグレナ細胞体中にも、有機酸のみならず、上記に述べたような有用な化合物が含まれ得る。
【００２８】
嫌気培養後に得られた有機酸を含有する培養産物からは、従来公知の方法により高純度の有機酸を精製することが可能である。例えば、培養産物を遠心分離して採取した上清を乾燥させて得られた生成物は、イオン交換樹脂などで脱塩し、結晶化やカラムクロマトグラフィなどの手法により、高純度のコハク酸へと精製することができる。
【００２９】
嫌気培養後に得られた培養産物中のユーグレナ細胞体は、含有される有機酸のみならず、細胞体それ自体も有用性を有する。ユーグレナ細胞体は、数多くのビタミン、ミネラル、アミノ酸、不飽和脂肪酸などを含有することが知られており、食品もしくは栄養補助食品または飼料として有用である。また、本発明の方法で嫌気培養後に得られるユーグレナ細胞体では、嫌気培養の間に細胞体に含有される糖質が減少しているため、本発明の方法によれば、従来よりも高付加価値である低糖質のユーグレナ細胞体を提供することが可能となる。従って、本発明は別の側面において、上記に述べた窒素欠乏培養工程または従属栄養培養工程と嫌気培養工程とを含み、さらに嫌気培養工程で得られた培養産物から遠心分離などによりユーグレナ細胞体を採取する工程を含む方法により得られたユーグレナ細胞体にも関する。
【００３０】
また、上述のとおり、本発明の方法において嫌気培養工程後の培養液中には、培養終了直後の非濃縮状態で１００ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは２００ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは３００ｍｇ／Ｌ以上の有機酸が含まれる。より好ましくは、嫌気培養工程後の培養液中には、培養終了直後の非濃縮状態で１００ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは２００ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは３００ｍｇ／Ｌ以上のコハク酸が含まれる。従って、本発明はさらに別の側面において、ユーグレナが産生した有機酸（コハク酸）を１００ｍｇ／Ｌ以上の濃度で含有する、ユーグレナを培養して得られる培養産物、特に培養液に関する。ユーグレナを含む他の藻類を培養した後の培養液であって、このような多量の有機酸を含むものはこれまで知られていない。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００３２】
１．試験手順
（１）ユーグレナの培養（窒素充足または欠乏条件下）
野生型Euglena gracilis（ユーグレナ社より取得、窒素充足下の通常の培養環境で１〜２週間程度の前培養を行ったもの）は、初期ユーグレナ細胞体濃度を１０〜２０ｇ／Ｌとし、表１に示す組成を有する改変Ｃｒａｍｅｒ−Ｍｙｅｒｓ培地（改変ＣＭ培地、ｐＨ３．５）を用いて、２５℃、１２時間明暗サイクルで、１％のＣＯ２を含む空気をバブリングしながらインキュベーター中で好気的に静置培養した。光強度は５０〜１００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１とした。培養は１Ｌの培養容器を用いて行った。なお、培養を窒素欠乏下で行う場合は、改変ＣＭ培地の組成から窒素源である（ＮＨ４）２ＨＰＯ４を除外した。【００３３】
【表１】
2016181902.tif 000002
【００３４】
（２）嫌気培養
上記（１）で得られた培養液を所定量採取して遠心分離（５０００ｒｐｍ×５分）し、上清を捨てた。得られたユーグレナ細胞体を１０ｍＬの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨバッファ（ｐＨ７．８）に懸濁し、２０ｍＬ容量のバイアル瓶に移した。バイアル瓶にはゴム栓をして注射針を２本刺し、その片方から窒素ガスを１時間導入した。なお、その間、バイアル瓶は３０℃の光照射環境下に置かれた。１時間後に注射針を取り除き、アルミホイルで遮光したバイアル瓶を２５℃のインキュベーターに入れ、振盪培養を行った。３日後または６日後に開栓し、内容物を１５ｍＬチューブに移してすぐに遠心分離した（１０，０００ｒｐｍ×２分）。得られた上清は、他のチューブに移し、凍結乾燥させた。【００３５】
嫌気培養前のユーグレナ細胞体の乾燥重量は、別途、上記（１）で得られた培養液を５０ｍＬ分採取してチューブに入れ、遠心分離後に上清を捨て、さらに細胞体を滅菌水で２回洗浄することにより塩を取り除き、１日以上マイナス８０℃で凍結乾燥したものの重量を測定することにより算出した。【００３６】
（３）有機酸定量
ブロモチモールブルーを用いたポストラベル法により分析を行った。上記（２）で得られた上清の凍結乾燥物を、濾過済みの１００μＬの３ｍＭ過塩素酸水溶液に溶解させ、フォトダイオードアレイ検出器および２本のカラム（ＲＳｐａｋ  ＫＣ−８１１、昭和電工社製）を備えた高速液体クロマトグラフ（ＬＣ−２０００Ｐｌｕｓ、日本分光社製）により分析した。０．２ｍＭブロモチモールブルー溶液（１５ｍＭリン酸ナトリウムバッファ中）を用いて有機酸を定量し、波長４４５ｎｍでピークを検出した。カラム温度は６０℃とし、３ｍＭ過塩素酸水溶液および０．２ｍＭブロモチモールブルー溶液の流速はそれぞれ１．０ｍＬ／分および１．５ｍＬ／分とした。【００３７】
２．試験結果
（１）試験１
窒素充足下、または窒素欠乏下で１１日間培養して得られた培養液８００ｍＬを遠心分離して得られたユーグレナ細胞体を１０ｍＬのバッファに懸濁し、３日間嫌気培養した。嫌気培養後の培養液に含まれていた有機酸の量を表２に示す。窒素充足下で培養したユーグレナを嫌気培養に付しても、得られた上清中にはコハク酸はほとんど含まれておらず、嫌気培養前の細胞体の乾燥重量に対するコハク酸の量は０．０８重量％に過ぎなかった。一方、窒素欠乏下で１１日間培養してユーグレナを嫌気培養に付したところ、得られた上清中には多量のコハク酸が含まれており、その量は嫌気培養前の細胞体の乾燥重量に対して１.９重量％であり、窒素充足下で培養したサンプルにおけるコハク酸量の２０倍以上（嫌気培養前の細胞体の乾燥重量基準）にも及んだ。なお、クエン酸はＨＰＬＣチャートにおけるピークが他の成分と重なったため定量ができなかったが、チャートからコハク酸と同程度の量のクエン酸が産生されていることが推察された。【００３８】
【表２】
2016181902.tif 000003
【００３９】
（２）試験２
窒素欠乏下で１１日間または１４日間培養して得られた培養液８００ｍＬを遠心分離して得られたユーグレナ細胞体を１０ｍＬのバッファに懸濁し、３日間嫌気培養した。嫌気培養後の培養液に含まれていた有機酸の量を表３に示す。いずれの培養日数の場合においても、得られた上清中には多量のコハク酸が含まれており、その量は嫌気培養前の細胞体の乾燥重量に対してそれぞれ７．５重量％および３．１重量％であった。【００４０】
【表３】
2016181902.tif 000004
【００４１】
（３）試験３
窒素欠乏下で１４日間培養して得られた培養液８００ｍＬを遠心分離して得られたユーグレナ細胞体を１０ｍＬのバッファに懸濁し、６日間嫌気培養した。嫌気培養後の培養液に含まれていた有機酸の量を表４に示す。試験２の結果と比較すると、嫌気培養の日数を３日間から６日間としてもコハク酸の含有量に大きな変化はみられなかった。嫌気培養前の細胞体の乾燥重量に対するコハク酸の含有量は４．８重量％であった。なお、試験１〜３の結果におけるコハク酸含有量のバラつきは、培養容器のインキュベーター中の位置およびそれに伴う光の照射程度等の相違に起因したものと推察された。【００４２】
【表４】
2016181902.tif 000005
【００４３】
（４）試験４
窒素充足下、１０ｍＭの酢酸ナトリウムを加えたＣＭ培地、あるいは対照として添加物を加えないＣＭ培地を用いて、１４日間培養して得られた培養液２０〜１００ｍＬを遠心分離し、得られたユーグレナ細胞体を１０ｍＬのバッファに懸濁し、３日間嫌気培養した。なお、窒素充足下での培養は、光強度を２００μｍｏｌ ｍ−２ｓ−１に設定して行った。嫌気培養前の細胞体の乾燥重量に対するコハク酸の含有量は、対照で１．１重量％、培地に酢酸ナトリウムを添加した場合で１．５重量％であった。なお、他の試験例と比較してコハク酸生産量が少ないのは、用いたユーグレナ細胞体の量が少なかったためと考えられる。
【表５】
2016181902.tif 000006
【００４４】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【国際調査報告】
2016181902.tif 000007
2016181902.tif 000008
2016181902.tif 000009
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