(57)【要約】  胃癌の肝転移を予測する検査方法、検査キット、及び肝転移に選択的に作用する医薬のスクリーニング方法を提供する。胃癌肝転移で特異的に発現が変化しているＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２を指標とすることにより、術後の肝転移の予測や、分子標的治療薬をスクリーニングすることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃癌の胃切除術後の肝転移を予測するための検査方法であって、
対象から採取された患者血清、及び/又は胃切除術における胃癌組織におけるＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の少なくとも1つ以上の発現量を求め、
試料中のＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の少なくとも1つ以上の発現量に所定値と有意差が認められる場合には、肝転移のリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
【請求項２】
請求項１に記載の検査方法であって、
ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現量が、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現量を測定することを特徴とする検査方法。
【請求項３】
請求項２記載の検査方法であって、
ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２のｍＲＮＡ発現量の測定方法が定量的ＰＣＲ、又は次世代シーケンサーによるものであることを特徴とする検査方法。
【請求項４】
請求項１記載の検査方法であって、
ＭＦＳＤ４の発現量はＭＦＳＤ４遺伝子プロモーター領域のＤＮＡメチル化状態を解析することにより求めることを特徴とする検査方法。
【請求項５】
胃癌の胃切除術後の肝転移を診断又は予測するための検査キットであって、
ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、若しくはＥＴＮＫ２の発現量を測定するための定量的ＰＣＲ用のプライマー、抗ＳＹＴ７抗体、抗ＭＦＳＤ４抗体、若しくは抗ＥＴＮＫ２抗体、又はＭＦＳＤ４遺伝子プロモーター領域のメチル化検出試薬のいずれか１つ以上を含むことを特徴とする検査キット。
【請求項６】
胃癌の胃切除後の肝転移を治療するための分子標的治療薬をスクリーニングする方法であって、
ＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２の発現量の抑制、ＭＦＳＤ４の発現量の増加、又はＭＦＳＤ４遺伝子プロモーター領域のメチル化の少なくともいずれか１つを指標として物質をスクリーニングすることを特徴とする分子標的治療薬スクリーニング方法。
【請求項７】
ＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２の少なくともいずれか１つのｓｉＲＮＡを含む胃切除術後の肝転移を抑制するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌の予後診断マーカー及びこれを用いて検査する方法に関する。特に、胃癌の予後を左右する肝転移に進行するリスクの高い胃癌を検査する方法、検査キット、分子標的治療薬のスクリーニング方法、及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌は日本、中国、韓国などアジア、南米に多い癌である。日本での部位別癌死亡率を見ると、胃癌の死亡率は、年々減少しているものの男性では肺癌に次ぐ第２位、女性では大腸癌、肺癌に次ぎ、第３位の死亡率となっている（２０１２年統計による。）。癌検診の普及に伴って、早期発見が進み胃癌による死亡率は減少している。しかしながら、進行胃癌は依然として予後不良であり、胃癌罹患率の高い本邦において克服すべき重要な疾患である。【０００３】
胃癌の予後を大きく左右するのは再発転移である。現状では遠隔転移を有する胃癌は一括して扱われ、その治療方針も区別されていない。しかしながら、胃癌の再発転移形式には、腹膜播種転移、血行性転移、リンパ節転移という全く異なる３つの経路が存在する。【０００４】
原発巣から生じた遊離癌細胞が生着・増殖して転移巣を形成するには多段階の過程が必要であり、接着分子、タンパク分解酵素、増殖因子、血管新生因子、ケモカイン等多くの分子が関与していることが報告されている。胃癌においても再発転移の３つの経路は大きく異なることから、転移に関わる分子も異なり、転移した癌細胞の性質も大きく異なるものと考えられている。それにも関わらず、転移巣成立機序の異なる３つの経路を遠隔性転移として同等の治療が行われていることに転移癌の完全治癒の困難さの一因があると考えられている。【０００５】
再発胃癌や再発の恐れのある進行胃癌に対しては化学療法が行われる。現在標準レジメンとして用いられているのは、ＤＮＡ合成阻害を作用機序とするＳ−１の投与を基本とする治療法である。進行胃癌は、大規模コホート研究の結果、胃切除術後補助療法としてＳ−１内服を行うことにより治療の効果が認められ、術後のＳ−１内服が標準治療となっている。Ｓ−１は細胞増殖の盛んな癌一般に効果のある薬剤であり、転移する胃癌に特異的に作用するわけではない。実際にＳ−１単独療法が進行胃癌患者の生存期間を有意に延長した主因は、腹膜播種再発率の低下であり、肝転移をはじめとする血行性転移やリンパ節転移においては制御されているとは言い難い。【０００６】
胃癌の再発転移形式として血流にのって他の臓器に転移する血行性転移は、腹膜播種転移の次に多い。胃癌の場合には血行性転移の中でも肝臓に転移する肝転移が多い。再発に対してＳ−１内服がさほど有効ではなく、自覚症状が出にくい肝転移再発を早期に発見し、治療を行うことが胃癌の術後のフォローアップでは重要になってきている。【０００７】
近年、マイクロアレイや次世代シーケンサーなどによる網羅的な遺伝子解析法により、特異性の高い腫瘍マーカーの同定が行われている。胃癌に関しても再発を予測、検出する方法が開示されている（特許文献１〜３）。また、癌種を問わず肝転移のリスクの高いマーカーに関しては報告があるものの、胃癌に特異的な肝転移の予測を行うマーカーに関しては研究が進んではいない（特許文献４）。【０００８】
また、癌治療においては、副作用の軽減が可能な分子標的治療薬の開発が盛んになっている。分子標的治療薬とは、癌細胞等、病気の細胞の性質を分子レベルでとらえ、表面に発現しているタンパク質や遺伝子等を標的として効率よく作用するように作られた薬剤をいう。胃癌に対する分子標的治療薬はまだ数が少なく、ＨＥＲ２陽性胃癌に対するトラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）のみが国内承認を得ている状況である。さらに、米国では進行した胃癌にラムシルマブ（ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）が承認されている。【０００９】
また、進行胃癌に関しては、上述のように再発転移形式が違うものの異なる分子標的治療薬が開発されているわけではなく、特に肝転移を代表とする血行性転移に有効な分子標的治療薬が開発されているわけではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１３−１０２７１６号公報
【特許文献２】特表２００５−５１６２１５号公報
【特許文献３】国際公開２００５／０１０１８０号
【特許文献４】特開２００６−１１９０６４号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｕｇｉｔａ，Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，２００１年、Ｎｅｕｒｏｎ，Ｖｏｌ．３０，ｐｐ．４５９―４７３．
【非特許文献２】Ｍｅｎｄｅｚ，Ｊ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，２０１１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２８６、ｐｐ．２３９２８−２３９３７.
【非特許文献３】Ｔｉａｎ，Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，２００６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２８１、ｐｐ．２８４３８−２８４４９.
【非特許文献４】Ｋｅｒｒ，Ｎ．，  ｅｔ  ａｌ．，２０１０年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、Ｖｏｌ．４４（２）、ｐｐ．１６５−１７７.
【非特許文献５】Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ａ．，２０１２年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．１３（７），ｐｐ．４８４−４９２．
【非特許文献６】Ｔｏ，Ｋ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，２００２年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｖｏｌ．１０２（６），ｐｐ．６２３−６２８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述のように、再発、転移のリスクを評価するマーカーは開示されているものの胃癌の肝転移に特異的なマーカーについてはほとんど報告がない。また、精度がさほど高くないことからいまだ実用化されていない。そのため、精度高く再発リスクを評価することのできる肝転移に特異的なマーカーの同定が望まれている。肝転移に特異性の高いマーカーを見出すことができれば、より有効な個別化治療を提供することが可能となる。【００１３】
また、胃癌の分子標的治療薬として、現在我が国で承認されているトラスツズマブは進行、再発胃癌の約２０％程度を占めるＨＥＲ２陽性胃癌にのみ有効であるにすぎない。また、米国で進行胃癌の治療に承認されているラムシルマブは、予後延長効果がさほど大きいものとはいえない。そのため進行、再発胃癌に対する新たな分子標的治療薬の開発が望まれている。【００１４】
本発明は、胃癌の異なる再発転移形式に関わる遺伝子を明らかにし、予後予測を行い得る新規のマーカーを確立し、予後の悪い肝転移のリスクを検査する方法及び検査キットを提供することを課題とする。また、該マーカーを指標として分子標的医薬をスクリーニングする方法を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下に示す検査方法、キット、スクリーニング方法、及び医薬組成物に関する。
（１）胃癌の胃切除術後の肝転移を予測するための検査方法であって、対象から採取された患者血清、及び/又は胃切除術における胃癌組織におけるＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の少なくとも1つ以上の発現量を求め、試料中のＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の少なくとも1つ以上の発現量に所定値と有意差が認められる場合には、肝転移のリスクが高いと判定することを特徴とする検査方法。
（２）（１）に記載の検査方法であって、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現量が、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質発現量を測定することを特徴とする検査方法。
（３）（２）記載の検査方法であって、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２のｍＲＮＡ発現量の測定方法が定量的ＰＣＲ、又は次世代シーケンサーによるものであることを特徴とする検査方法。
（４）（１）記載の検査方法であって、ＭＦＳＤ４の発現量はＭＦＳＤ４遺伝子プロモーター領域のＤＮＡメチル化状態を解析することにより求めることを特徴とする検査方法。
（５）胃癌の胃切除術後の肝転移を診断又は予測するための検査キットであって、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、若しくはＥＴＮＫ２の発現量を測定するための定量的ＰＣＲ用のプライマー、抗ＳＹＴ７抗体、抗ＭＦＳＤ４抗体、若しくは抗ＥＴＮＫ２抗体、又はＭＦＳＤ４遺伝子プロモーター領域のメチル化検出試薬のいずれか１つ以上を含むことを特徴とする検査キット。
（６）胃癌の胃切除後の肝転移を治療するための分子標的治療薬をスクリーニングする方法であって、ＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２の発現量の抑制、ＭＦＳＤ４の発現量の増加、又はＭＦＳＤ４遺伝子プロモーター領域のメチル化の少なくともいずれか１つを指標として物質をスクリーニングすることを特徴とする分子標的治療薬スクリーニング方法。
（７）ＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２の少なくともいずれか１つのｓｉＲＮＡを含む胃切除術後の肝転移を抑制するための医薬組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、肝転移が起きる危険性を胃切除術後すぐに予測することができるため、その後の治療に活かすことができる。具体的には肝転移の危険性の高い患者群には、胃切除術後肝転移を視野に入れたフォローアップ計画をたて、治療を行うことが可能となる。さらに、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現量を指標として医薬をスクリーニングすることが可能となる。したがって、これら分子を標的とする胃癌肝転移再発を治療する医薬を開発することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現量と肝転移との相関を示す図。図１ＡはＳＹＴ７、図１ＢはＭＦＳＤ４、図１ＣはＥＴＮＫ２の発現量と肝転移との相関を示す。
【図２】胃癌患者２００症例の切除組織中のＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現量を平均値、及びプロット図で示す。
【図３】ＲＯＣ曲線による感度、特異度解析を示す図。
【図４】各遺伝子の高発現群、低発現群における肝転移再発率を示す図。
【図５】血清中の胃癌の進展度合いによるＳＹＴ７タンパク質量を示す図。
【図６】ヒト胃癌細胞株でのＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現と相関の見られる遺伝子を示す図。
【図７】ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現抑制による細胞の遊走能の変化を解析した図。
【図８】ＭＦＳＤ４の発現抑制による浸潤能の変化を解析した図。
【図９】ＭＦＳＤ４のメチル化異常を示す図。（Ａ）ＭＦＳＤ４のプロモーター領域の配列解析によるＣｐＧアイランドを示す図。（Ｂ）メチル化特異的ＰＣＲによる胃癌細胞株の解析結果を示す図。
【図１０】ＭＦＳＤ４のメチル化異常、及び脱メチル化による発現量の変化を示す図。（Ａ）プライマー位置を示す図。（Ｂ）各細胞での脱メチル化によるＭＦＳＤ４発現量の変化、及びメチル化の状態を示す図。
【図１１】血清試料中のＭＦＳＤ４のメチル化と胃癌の進展度合いとの相関を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明者は、胃切除術後の症例を経過に応じて分類し、胃癌原発巣組織から得られたｍＲＮＡを対象に次世代シーケンサーを用いた網羅的発現分析を行った。その結果、肝転移する胃癌ではＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２が特異的に高発現し、ＭＦＳＤ４の発現量が特異的に減少していることを明らかにした。これらの発現量が一定の値より高い、あるいは低い場合に肝転移を起こすリスクが高い症例であると診断可能である。
【００１９】
ＳＹＴ７はシナプトタグミン（Ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ、ＳＹＴ）ファミリーに属する膜タンパク質である。シナプス小胞上に存在するカルシウム・リン脂質結合分子として同定され、カルシウムセンサーとして機能することが示唆されている。ヒトでは１７種のアイソフォームの存在が報告され、主として脳組織に分布していることが報告されている。ＳＹＴ７も主として脳での発現が認められ、神経伝達物質のエクソサイトーシスに関与していることが報告されている（非特許文献１、２）。
【００２０】
ＥＴＮＫ２（Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ２）は、生体膜の主要なリン脂質であるホスファチジルエタノールアミンの合成経路の一つであるＣＤＰ−エタノールアミン経路で最初の合成ステップに関与する酵素である。肝臓や生殖器に多く発現しており、ノックアウトマウスの実験から胎盤のホメオスタシスに関与していることが示唆されている（非特許文献３）。
【００２１】
ＭＦＳＤ４（ｍａｊｏｒ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ４）は、神経組織での発現が報告されているが、その機能に関しては不明である（非特許文献４）。
【００２２】
これら３つのタンパク質は、いずれも胃での発現や癌、転移との関連は今まで報告されていない。また、早期に肝転移再発が認められた胃癌の症例において、ＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２の発現量が正常組織と比較して増加していることや、ＭＦＳＤ４の発現量が減少していることは、今までに報告がなく、本発明者によって初めて見出されたことである。
【００２３】
胃切除術後に切除胃癌組織の試料中のＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２のいずれかの発現量が有意に所定値と比較して差があれば、目視では確認できなくとも肝転移を起こしている潜在的肝転移の可能性や、将来的に肝転移を起こすリスクが高いことが予測される。したがって、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の少なくとも１つ以上の発現量を定量することによって、肝臓に転移するリスクを評価することができる。
【００２４】
また、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２は、胃の原発組織から分泌、あるいは崩壊した腫瘍から血液中に放出され、血液中を循環すると考えられる。したがって、胃癌組織だけではなく、血清を試料として血清中のＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現をＥＬＩＳＡ法等によって検出することにより、肝転移に移行するリスクを評価することができる。また、後述するＭＦＳＤ４のメチル化は、組織だけではなく血清試料から得たＤＮＡを解析することによっても検出することができる。
【００２５】
ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２は、ｍＲＮＡやタンパク質を定量することによって、その発現量を定量することができる。ｍＲＮＡやタンパク質は定量的に測定することができれば、どのような方法を用いてもよい。例えば、ｍＲＮＡは定量的ＰＣＲ、次世代シーケンサー、ノーザンブロッティング、遺伝子発現解析用ＤＮＡチップなどを用いて測定すればよい。特に、定量的ＰＣＲ法は短時間で測定できることから好ましい。定量的ＰＣＲ法は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ法、ＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＴ-ＰＣＲ法等、公知の方法を用いることができる。
【００２６】
タンパク質は抗ＳＹＴ７抗体、抗ＭＦＳＤ４抗体、抗ＥＴＮＫ２抗体を用いて測定すればよい。抗体はウサギ、ヤギ、マウス等の動物に抗原を免疫し定法により作成すればよい。また、タンパク質は、プロテインチップ、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロッティング等公知の方法によって定量することができる。ｍＲＮＡ、タンパク質を測定することにより、感度良くＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２発現量を定量し、肝転移のリスクを評価することができる。
【００２７】
さらに、ＭＦＳＤ４遺伝子のプロモーター領域はＣｐＧアイランドが存在し、ＤＮＡのメチル化によって発現が不活化されていることが明らかになった。したがって、ＭＦＳＤ４遺伝子の発現低下はプロモーター領域のメチル化の度合いを解析してもよい。ＤＮＡメチル化は、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、パイロシーケンス法、ＨＥＬＰアッセイ、Ｃｈｉｐ-ｏｎ-ｃｈｉｐアッセイ等、公知のアッセイ方法を用いることができる。
【００２８】
ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現量と肝転移再発との間に相関がみられたことから、これら遺伝子発現を定量可能なＰＣＲプライマーや、タンパク質を検出可能な抗体、あるいはＭＦＳＤ４遺伝子のプロモーター領域のメチル化の検出に必要な試薬を含むキットとすることにより、胃癌切除術後に肝転移再発の予後予測を行う検査キットとすることができる。これにより進行胃癌の術後をきめ細かくフォローすることができる。
【００２９】
ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２遺伝子の発現量を検査するキットとしては、各遺伝子の発現量を定量可能なＰＣＲプライマーセットの他に、定量に最適な酵素、試薬等を含んだ構成とすることができる。プライマーはＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２を定量的に測定することができれば、どのような配列を用いてもよい。また、発現量を正規化するために、ＧＡＰＤＨを増幅するプライマーのようなコントロールプライマーを含めてもよい。
【００３０】
また、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２タンパク質の発現量を検査するキットとしては、タンパク質を検出するための抗体、アプタマー等、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２タンパク質と結合する分子の他に、検出に必要な試薬を含む構成とすればよい。
【００３１】
さらに、ＭＦＳＤ４遺伝子のプロモーター領域のメチル化を検出するためには、公知のメチル化検出方法に必要な試薬を含む構成とすればよい。
【００３２】
胃癌肝転移群の患者において、ＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２が高発現していることから、これらの発現を抑制する化合物をスクリーニングすることによって、分子標的治療薬を選択することができる。また、ＭＦＳＤ４の発現は減少していることから、ＭＦＳＤ４の発現を増加する化合物をスクリーニングすることによって、分子標的治療薬を選択することができる。分子標的治療薬の候補は、低分子化合物、天然物等からなるライブラリーから選択すればよい。
【００３３】
例えば、胃癌肝転移より樹立された癌細胞株や胃癌細胞株のうちＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２が高発現している細胞株の培養液にライブラリー化合物を添加して細胞培養を行い、ＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２発現を抑制するものを選択すればよい。あるいは、ＭＦＳＤ４の発現量の低い細胞株の培養液にライブラリー化合物を添加して細胞培養を行い、ＭＦＳＤ４の発現が増加するものを選択すればよい。ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現量は、上述のようにｍＲＮＡやタンパク質を測定することによって定量することができるので、感度よく発現を抑制する物質を選択することができる。
【００３４】
また、本発明者は、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２をｓｉＲＮＡにより枯渇させると、細胞の遊走能に変化が生じることを見出した。発現亢進と肝転移に相関があるＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２に関してはｓｉＲＮＡで抑制することにより、肝転移の抑制を図ることができる。したがって、ＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２のｓｉＲＮＡを治療薬として使用できる可能性がある。
【００３５】
以下、データを踏まえて説明するが、本発明において、「ＳＹＴ７発現」、「ＭＦＳＤ４発現」、「ＥＴＮＫ２発現」とは、特に断りのない限り遺伝子及び／又はタンパク質の発現を指す。
【実施例１】
【００３６】
≪肝再発群に特異的に発現する遺伝子の解析（１）≫
これまでに名古屋大学医学部において胃切除術を行った進行胃癌症例を５年以上の長期無再発群、腹膜播種再発群、肝転移再発群、リンパ節再発群の４群に分け解析を行った。再発胃癌の２５％程度を占め、進行胃癌における胃切除術後のＳ−１内服が著効を奏さない肝転移再発に着目し、肝転移再発例の胃癌組織において正常組織（胃非癌部）と発現量の異なる遺伝子の検出を行うことにした。具体的には、ステージIII胃癌で治癒切除術が施行され、術後補助療法としてＳ−１内服を行った症例を経過に応じて群分けした。５年以上の長期無再発群、腹膜播種再発群、肝転移再発群、リンパ節再発群の４群に分けた。４例の肝転移再発群の患者の胃癌原発巣組織、胃非癌部、肝転移巣から得られたＲＮＡを対象にトランスクリプトーム解析による発現プロファイリングを行った。【００３７】
手術サンプルは、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、標準プロトコルに従いシーケンス用ライブラリーの調整を行った。【００３８】
次に、次世代シーケンサーＨｉｓｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、Ｐａｉｒｅｄ-Ｅｎｄシーケンシングを行い、トランスクリプトーム解析を行った。読み取り塩基長は１００塩基／リード、参考取得リード数は１億リードペア（２億リード）／レーン、参考取得データ量は２０Ｇｂ／レーンでデータの取得を行った。【００３９】
解析はＨｉＳｅｑ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、指定参照配列へのマッピング処理を行い、ＦＰＫＭ（Fragments per kilobase of exon per million mapped sequence reads）値に基づく遺伝子ごとの発現量を算出し、検体間比較テーブルを作成することにより行った。【００４０】
肝転移再発群の４例の胃非癌部、胃原発巣、肝転移巣における５７７５１分子の発現量をトランスクリプトーム解析により網羅的に解析した。胃非癌部と胃原発巣で遺伝子発現量に有意な差が認められ、胃原発巣と肝転移巣の間では発現に有意な差が認められない遺伝子を抽出した。【００４１】
表１は、肝転移再発が認められた群で、胃非癌部、胃原発巣、肝転移巣のシグナルを求め、肝転移巣と胃原発巣、胃非癌部と胃原発巣間のシグナル強度比（ｌｏｇ２比）を算出してまとめたものである。胃非癌部と胃原発巣で遺伝子発現量に有意な差が認められ、胃原発巣と肝転移巣の間では発現に有意な差が認められない遺伝子としてＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４が抽出された。【００４２】
【表１】
2016181979.tif 000003
【００４３】
表１に示すように、ＳＹＴ７（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤアクセッション番号：ＮＭ＿００１２５２０６５．１）の発現が肝転移再発群において有意に増加していることが認められた。ＳＹＴ７は、胃原発巣では胃非癌部に対して２１倍以上の発現亢進が認められた。また、ＭＦＳＤ４（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤアクセッション番号：ＮＭ＿１８１６４４．４）の発現が肝転移再発群で有意に減少していることが認められた。ＭＦＳＤ４は、胃原発巣では胃非癌部に対して約２０分の１に発現量が低下していることが認められた。【００４４】
さらに、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４ともに、肝転移巣と胃原発巣との間では発現量に有意な差は認められなかった。胃原発巣と肝転移巣において発現に差が認められないということは、これら遺伝子の発現異常が胃原発巣から転移する以前に起こっている変化であることが示唆される。したがって、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４の遺伝子発現は、内視鏡での生検あるいは癌の切除術を行った段階で肝転移を起こすリスクの高い症例を選別するマーカーとして用いることができる。
【実施例２】
【００４５】
≪肝再発群に特異的に発現する遺伝子の解析（２）≫
上述の５年以上の長期無再発群、腹膜播種再発群、肝転移再発群、リンパ節再発群の４群に分けた患者の胃癌原発巣組織から得られたＲＮＡを対象にトランスクリプトーム解析による発現プロファイリングを行った。各群４例のＲＮＡについて５７７５１分子の発現量を網羅的に解析した。４群間比較を行い、肝転移再発群において、他の３群と比較して発現量に有意な差が認められる分子の検出を行った。その結果、３１遺伝子が有意に肝転移再発群において発現増加していることが明らかとなった。その中から、癌組織での発現がこれまでに報告されておらず、遺伝子の機能が報告されている解析可能な遺伝子を選択した。【００４６】
表２に示すように、肝転移再発群ではＥＴＮＫ２（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＩＤアクセッション番号：ＮＭ＿００１２９７７６０．１）遺伝子の発現量が、長期無再発群に対して有意に増強していることが認められる。肝転移再発した症例では無再発群と比較して、ＥＴＮＫ２は約５．３倍の発現増強が認められた。これに対し、他の転移形式である腹膜播種再発群、リンパ節再発群ではＥＴＮＫ２の有意な発現の増強は認められなかった。したがって、ＥＴＮＫ２遺伝子発現量及びタンパク質発現量は胃癌肝転移のバイオマーカーとして機能する。【００４７】
【表２】
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【実施例３】
【００４８】
≪臨床検体でのＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現量≫
臨床検体を用い定量的ＰＣＲ法によって、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２のｍＲＮＡ発現の解析を行った。解析した検体は、胃切除時にすでに肝転移が認められた９症例、胃切除時には肝転移が認められなかったが、術後２年以内の早期に肝転移再発した１２症例、いずれにも該当しない５７症例の計７８検体である。【００４９】
ＰＣＲプライマーは下記の配列を用い、ＡＢＩ  ＳＴＥＰＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ-Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９５℃１０分加熱後、９５℃５秒、６０℃６０秒で４０サイクルのＰＣＲ条件で増幅を行い解析した。【００５０】
プライマー配列
ＳＹＴ７  ：Ｆｏｒｗａｒｄ  ＧＣＧＣＡＧＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＴＡ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＴＣＴＧＡＧＡＣＧＧＡＧＧＡＡＣＧＴＧ（配列番号２）
ＭＦＳＤ４：Ｆｏｒｗａｒｄ  ＣＡＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡＡＧＧＡ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＡＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＡＴＧＧＡＡＣＡＧ（配列番号４）
ＥＴＮＫ２：Ｆｏｒｗａｒｄ  ＴＧＡＡＧＡＡＣＧＡＧＡＴＣＡＡＣＣＣＣ（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＧＡＣＡＡＡＡＣＡＣＣＡＣＡＧＧＧＧＡＣ（配列番号６）【００５１】
図１ＡはＳＹＴ７のｍＲＮＡの発現量を、図１ＢはＭＦＳＤ４のｍＲＮＡ発現量を、図１ＣはＥＴＮＫ２のｍＲＮＡ発現量を夫々ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量で正規化した値を、胃切除時にすでに肝転移が認められた症例、胃切除時には肝転移が認められなかったが、術後２年以内の早期に肝転移再発した症例、肝転移以外の症例の各群で箱ひげ図（最小値、第１四分点、中央値、第３四分点、最大値）で表したものである。【００５２】
肝転移再発が認められた症例、すなわち胃切除時にすでに肝転移が認められた症例、胃切除時には肝転移が認められなかったが、術後２年以内の早期に肝転移再発した症例では、有意にＳＹＴ７及びＥＴＮＫ２の発現レベルの増加が、ＭＦＳＤ４では有意に発現レベルの低下が認められた。【００５３】
患者によるばらつきはあるものの、肝転移が認められた群のＳＹＴ７及びＥＴＮＫ２の発現量は、肝転移以外の群に対して有意に高値であった。また、ＭＦＳＤ４の発現は肝転移以外の群では、肝転移再発が認められた群に比べ有意に高値であった。【００５４】
至適カットオフ値の設定はさらに多検体での検証が望まれるが、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２発現量を測定することにより肝転移再発する胃癌のリスク予測を可能とする。例えば、ＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２発現を肝転移のマーカーとする場合には、図１Ａ、ｌＣに示すように、肝転移が認められなかった患者群のうち、同時性肝転移、術後２年以内肝転移、いずれの肝転移群の中央値を超える患者は２５％以下であることから、肝転移群の症例の各中央値を基準として肝転移再発する胃癌のリスクを予測することができる。ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の測定方法や測定する試料によってもカットオフ値は異なることが予測されることがら、適宜カットオフ値を求めて、肝転移再発リスクの高い患者群を選択しフォローすることが望ましい。
【実施例４】
【００５５】
症例数を増やし、上記と同様に定量的ＰＣＲ法により解析を行った。２００症例の胃癌患者の切除組織中の各遺伝子の発現量を解析した。ステージＩＩ/ＩＩＩでは、後の肝転移再発の有無で、肝再発（−）、肝再発（+）に分け、ステージＩＶでは遠隔転移を有する中でも、肝転移の有無で分けて解析を行っている。図２の左側に平均値を、右側にプロット図を示している。【００５６】
ＳＹＴ７の胃癌組織中発現量は、治癒切除術後に肝転移再発した症例（Ｓｔａｇｅ  ＩＩ／ＩＩＩ、肝再発（＋））、遠隔転移を有する中でも、肝転移を有した症例（Ｓｔａｇｅ  ＩＶ肝転移（＋））で有意に高値であった。逆に、将来もしくは現在の肝転移を有しない症例においては、正常胃組織と発現量に差を認めず、胃癌肝転移の存在及び予測に高い特異性を有していると考えられる。ＭＦＳＤ４の胃癌組織中発現量は、肝転移あるいは将来の肝転移再発を認めた症例でより高度に抑制されていた。ＥＴＮＫ２の胃癌組織中発現量は、遠隔転移を有する中でも、肝転移を有した症例（Ｓｔａｇｅ  ＩＶ肝転移（＋））で有意に高値であった。逆に、それ以外の胃癌症例においては、正常胃組織と発現量に差を認めず、胃癌肝転移の存在に高い特異性を有していると考えられる。【００５７】
上記２００症例の胃癌患者での各ｍＲＮＡ発現量についてＲＯＣ曲線解析を行った。図３に示すように、胃癌原発巣でのＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２のｍＲＮＡ発現度は、いずれも肝転移あるいは術後２年以内の肝転移に対して高い相関性を示した。【００５８】
各遺伝子のＲＯＣ曲線解析で得られたカットオフ値を用いて、９３例のステージＩＩ／ＩＩＩ胃癌患者、すなわち治癒切除されたものの再発の危険性の高い病期のステージの患者群でその後の再発経過を調べた。図４に示すように、胃癌原発巣のＳＹＴ７発現亢進例、ＭＦＳＤ４発現抑制例、ＥＴＮＫ２発現亢進例では夫々有意に治癒切除術後の肝転移再発が多く、多変量解析においても胃癌肝転移の独立危険因子であった。
【実施例５】
【００５９】
胃切除組織試料だけではなく、血液試料を用いて肝転移を予測することができれば、術前、術後にも血液試料によって診断を行うことができることから、患者にとってメリットが大きい。そこで、患者血清を用いてＳＹＴ７の発現量に変化が見られるか解析を行った。【００６０】
患者血清中のＳＹＴ７量をＥＬＩＳＡキット（ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ  ＶＩＩ  （ＳＹＴ７）、Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ社製）を用いて測定した。健常患者１６例、ステージＩ胃癌患者１０例、ステージＩＩ胃癌患者９例、ステージＩＩＩ胃癌患者１０例、ステージＩＶ胃癌患者３９例を対象とした。結果を図５に示す。【００６１】
図５に示すように、胃癌の病期にしたがって段階的な血清ＳＹＴ７の上昇を認めた。よって、血清ＳＹＴ７値は、胃癌の進展度合いの診断および転移再発予測バイオマーカーとなりうる。【００６２】
他のマーカーについても、胃切除組織だけではなく、血液試料を用い、タンパク質発現量を測定することによって、肝転移再発を予測することができるものと考えられる。
【実施例６】
【００６３】
≪主要癌関連遺伝子の発現との相関≫
ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２が肝転移再発と相関があることが認められたので、次にこれら遺伝子と主要癌関連遺伝子発現量を網羅的に調べ、どのような遺伝子の発現量と相関があるか解析を行った。解析には１０種のヒト胃癌細胞株、ＡＧＳ（ＡＴＣＣより入手）、ＭＫＮ１（理研細胞バンクより入手）、ＭＫＮ７４（理研細胞バンクより入手）、Ｎ８７（ＡＴＣＣより入手）、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（ＡＴＣＣより入手）、ＭＫＮ４５（理研細胞バンクより入手）、ＮＵＧＣ２（名古屋大学で樹立）、ＮＵＧＣ３（名古屋大学で樹立）、ＮＵＧＣ４（名古屋大学で樹立）、ＳＣ−６−ＪＣＫ（東北大学より入手）及び非腫瘍性腺上皮細胞株ＦＨｓ７４（ＡＴＣＣより入手）を用いた。【００６４】
解析はＨｕｍａｎ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｏ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（ＥＭＴ）  ＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、８４種類の主要な癌関連遺伝子との発現の相関を解析した。結果を図６に示す。【００６５】
ＳＹＴ７の発現量は、上皮間葉移行（ＥＭＴ）関連分子であるＴＧＦＢ３の発現と有意な正の相関関係を認めた。逆に、ＥＭＴで抑制されているＣＡＶ２、ＲＧＳ２とは逆相関関係を認めた。【００６６】
ＭＦＳＤ４の発現量は、癌の転移・進展に深く関与するＥＭＴ関連分子であるＢＭＰ２の発現と有意な逆相関関係を、逆に、ＥＭＴで抑制されているＮＵＤＴ１３、ＯＣＬＮとは正の相関関係を認めた。【００６７】
ＥＴＮＫ２発現量は、ＡＨＮＡＫ、ＩＴＧＡＶ、ＦＮ１、ＭＭＰ３、ＴＧＦＢ１、ＥＧＦＲと有意な正の相関関係を示した。ＡＨＮＡＫ、ＩＴＧＡＶはＥＭＴ促進因子、ＦＮ１、ＭＭＰ３は細胞外基質タンパク質、ＴＧＦＢ１、ＥＧＦＲは細胞増殖因子として知られている。これらの結果は、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現が他の主要な癌関連遺伝子と協調的関係にあることを示している。
【実施例７】
【００６８】
≪ｓｉＲＮＡを用いたノックダウン解析≫
肝転移再発と相関の見られるＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現を調節することによって、肝転移再発を抑制できるか解析を行った。ｓｉＲＮＡを用いて、胃癌細胞株の遊走能、浸潤能に変化が生じるか解析を行った。【００６９】
ＳＹＴ８、ＳＹＴ１３の高発現胃癌細胞株であるＭＫＮ１を用いて、各遺伝子の選択的発現阻害（ノックダウン）実験を行い、胃癌細胞の遊走能を評価した。【００７０】
Ａｃｃｅｌｌ  ｓｉＲＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社製）を用いてＭＫＮ１細胞に各４０ｎＭのｓｉＲＮＡを導入し、７２時間無血清ＤＭＥＭ培地で培養後、遊走能の評価を行った。ＳＹＴ７  ｓｉＲＮＡ、ＭＦＳＤ４  ｓｉＲＮＡ、ＥＴＮＫ２  ｓｉＲＮＡ、コントロールｓｉＲＮＡ（Ａｃｃｅｌｌ  Ｇｒｅｅｎ  Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）はいずれもＤｈａｒｍａｃｏｎ社より得た。【００７１】
ｓｉＲＮＡ導入後７２ｈ時間無血清培地で培養し、創傷治癒アッセイ（Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）により細胞の遊走能の評価を行った。ＭＫＮ１細胞は２×１０４になるように、１２ウェルプレートにｉｂｉｄｉ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ  ｍｅｔｈｏｄ（ｉｂｉｄ社製）を予め定めた幅でｗｏｕｎｄ  ｇａｐを形成して播種し、無血清培地で培養した。播種２４時間後にインサートを除去し、６時間ごとに２００μｍ間隔でｗｏｕｎｄ幅を測定した。測定は、４０倍の倍率の顕微鏡を用い、各ウェル１０か所を測定して平均及び標準偏差を求めた。【００７２】
顕微鏡画像及びｗｏｕｎｄ幅の経時的変化を図７に示す。図７中＊印で示したのは、ｓｉＲＮＡ導入処理を行っていないコントロールに比べ有意差があることを示す。ＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２のノックダウンにより、胃癌細胞株ＭＫＮ１の遊走能が有意に減少し、ＭＦＳＤ４のノックダウンにより有意に亢進することが明らかとなった。【００７３】
次に、ＭＦＳＤ４発現阻害による細胞の浸潤能について解析を行った。細胞の浸潤能は、ｓｉＲＮＡ導入後７２ｈ時間無血清培地で培養した細胞をマトリゲル浸潤アッセイ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）により評価した。ＢｉｏＣｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ（ＢＤ  Ｓｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、プロトコルにしたがってアッセイを行った。具体的には、ｓｉＲＮＡを導入したＭＫＮ１細胞を１ウェルあたり各々２．５×１０４になるように播種し、無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養後、膜底面の細胞を固定し、ディフクイック（シスメックス社製）で染色して顕微鏡下で観察し細胞数を数えた。顕微鏡観察は２００倍の倍率で行い、ランダムに選択した５つの視野の平均と標準偏差を求めた。【００７４】
顕微鏡画像を図８左に、浸潤能を有する細胞数を図８右に示す。ＭＦＳＤ４の発現を阻害すると、胃癌細胞は有意に浸潤能の抑制を示すことが明らかとなった。なお、図８右グラフ中の＊印は各サンプル間で有意差があったことを示す。【００７５】
これらの結果によってＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、及びＥＴＮＫ２は胃癌細胞の遊走能、浸潤能に関与しており、ＳＹＴ７及び／又はＥＴＮＫ２を阻害することで肝転移再発を抑制できる可能性が示唆された。したがって、ＳＹＴ７及び／又はＥＴＮＫ２のｓｉＲＭＡは医薬組成物の有効成分として機能し得る。また、ＭＦＳＤ４に関しては、その発現を回復させることができれば、肝転移再発を抑制することができると考えられる。
【実施例８】
【００７６】
≪ＤＮＡメチル化異常の検出≫
癌細胞での遺伝子の発現低下は多くの場合ＤＮＡのメチル化異常に起因することが報告されている（非特許文献５、６）。ＤＮＡのＣｐＧ配列のＣの位置にメチル基が付加されるのがＤＮＡのメチル化である。遺伝子のプロモーター部位に存在するＣｐＧアイランドがメチル化されることによって、遺伝子の不活化が生じることにより遺伝子発現の低下が生じている。ＭＦＳＤ４遺伝子発現の胃癌肝転移再発群での低下がＤＮＡメチル化によるかを解析した。【００７７】
図９ＡにＭＦＳＤ４遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドを示す。ＭＦＳＤ４の上流の配列（ＮＣ＿０００００１．１１  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＧＲＣｈ３８．ｐ２）の解析を行った。図中、細いラインで示しているのは、ＭＦＳＤ４のプロモーター領域である。メチル化を受け得るＣｐＧ配列を細いライン上に縦線で示している。通常の確率で計算した数値よりも大きく乖離した頻度で集まっている部分がＣｐＧアイランドある。図中、太いラインで示した領域はＣｐＧアイランドの定義に該当する配列中にＧＣが５５％以上含まれる領域である。【００７８】
ＭＦＳＤ４のプロモーター領域を解析した結果、ＣｐＧアイランドが１３１１ヌクレオチドにわたって存在することが明らかとなった。次にメチル化特異的ＰＣＲ法によって、１２種の胃癌細胞株、ＡＧＳ、ＧＣＩＹ（理研細胞バンクより入手）、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＭＫＮ１、ＭＫＮ２８（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）、ＭＫＮ４５、ＭＫＮ７４、Ｎ８７、ＮＵＧＣ２、ＮＵＧＣ３、ＮＵＧＣ４、ＳＣ−６−ＪＣＫ及び非腫瘍性腺上皮細胞株ＦＨｓ７４のメチル化状態をメチル化特異的ＰＣＲ法で解析した。【００７９】
細胞からＤＮＡを抽出し、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）をプロトコル通りに用いてバイサルファイト処理を行った。ＰＣＲプライマーは下記の配列を用い、ＭＦＳＤ４の上流の配列の解析を行った。図９（Ａ）に示すようにＰＣＲプライマーは転写開始部位より上流のＣｐＧアイランド中に設定している。ポリメラーゼはＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、Ｖｅｒｉｔｉ（登録商標）  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって、９５℃１０分加熱後、９５℃５秒、６０℃６０秒で４０サイクルのＰＣＲ条件で増幅を行い解析した。【００８０】
ＭＦＳＤ４、メチル化検出プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＧＧＴＴＴＴＣＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＣＧ（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＧＣＣＴＣＴＡＣＧＡＣＧＡＡＴＡＡＡＣ（配列番号８）【００８１】
１２種の胃癌細胞株および非腫瘍性腺上皮細胞株ＦＨｓ７４のうち、ＡＧＳ、ＭＫＮ２８、ＮＵＧＣ３、ＳＣ−６−ＪＣＫでＭＦＳＤ４遺伝子のプロモーター領域のメチル化が認められた（図９（Ｂ））。非腫瘍性腺上皮細胞株ＦＨｓ７４のＭＦＳＤ４  ｍＲＮＡ発現量を１．０とすると、ＡＧＳ、ＭＫＮ２８、ＮＵＧＣ３、ＳＣ−６−ＪＣＫのＭＦＳＤ４の発現量は、夫々０．６５、０．２５、０．０９、０．０６であった。これらＭＦＳＤ４遺伝子のプロモーター領域のメチル化が認められた胃癌細胞株では、ＭＦＳＤ４発現レベルが非腫瘍性腺上皮細胞株ＦＨｓ７４と比較して高度に抑制されており、プロモーター領域のメチル化と遺伝子発現の抑制との相関が認められた。【００８２】
プロモーター領域のメチル化をさらに詳細に解析するためにプライマーを変えてバイサルファイトシーケンス法により解析を行った。プライマーの位置の概略を図１０（Ａ）に示す。図９（Ａ）で示すプライマーの位置よりも、より上流に設定している。用いたプライマー配列は下記のとおりである。【００８３】
ＭＦＳＤ４、メチル化検出プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＧＴＡＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴＴＧＧＧＴＡＧ（配列番号９）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＣＡＡＡＡＡＴＣＡＣＣＴＴＣＡＡＴＣＴＣＴＡＡＡ（配列番号１０）【００８４】
図１０（Ｂ）に示す１１種の細胞、胃癌細胞株であるＡＧＳ、ＭＫＮ１、ＭＫＮ７４、Ｎ８７、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ、ＭＫＮ４５、ＮＵＧＣ２、ＮＵＧＣ３、ＮＵＧＣ４、ＳＣ−６−ＪＣＫ及び非腫瘍性腺上皮細胞株ＦＨｓ７４で解析を行ったところ、ＡＧＳ、Ｎ８７、ＭＫＮ４５、ＮＵＧＣ３，ＳＣ−６−ＪＣＫの５つの細胞株でＤＮＡメチル化を認めた（図１０（Ｂ）Ｂｏｘ、Ｂｏｘ上段；Ｍ＝メチル化あり、Ｕ＝メチル化なしを示す。）。いずれの細胞においても、ＭＦＳＤ４領域のコピー数異常は認められなかった（Ｂｏｘ下段）。一方で、胃癌細胞の５０％でＤＮＡメチル化が認められた。【００８５】
各細胞は１０μＭの５−ａｚａ−ｄＣ（シグマアルドリッチ社）を添加した培地で９６時間細胞を培養し、脱メチル化処理を行って、ＭＦＳＤ４の発現量を解析した。黒いＢａｒは通常の細胞、白いＢａｒは５−ａｚａ−ｄＣによる脱メチル化処理を施した細胞株での結果である（図１０（Ｂ）グラフ）。コントロールであるＦＨｓ７４細胞株より高度に発現量が抑制されていた細胞株では高頻度にＤＮＡメチル化を伴っており、それらの発現は脱メチル化処理で回復した。これらの結果から、ＭＦＳＤ４の発現抑制はＤＮＡメチル化を主たる調節因子としていることが明らかである。【００８６】
胃癌細胞株での解析は、胃癌組織内でも生じていると考えられることから、発現量の低下が認められるＭＦＳＤ４については、胃癌組織中のＭＦＳＤ４プロモーター領域のメチル化を解析することによって、肝転移のリスクを検査してもよい。【００８７】
≪臨床検体でのＭＦＳＤ４メチル化の検出≫
メチル化の有無を患者血液試料を用いて解析できれば、肝転移再発を予測する際に非常にメリットになる。そこで、患者血清を用いてＭＦＳＤ４発現量の解析を行った。患者血清からＤＮＡを抽出し、バイサルファイト処理を行い、定量的メチル化特異的ＰＣＲ法により解析した。メチル化を定量するためには、以下のプライマーを用いた。【００８８】
定量的ＰＣＲ法プライマー
Ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＴＡＴＴＧＴＴＴＡＴＴＣＧＴＣＧＴＡＧＡＧＧＣ（配列番号１１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＴＡＡＣＧＣＡＡＡＣＴＡＡＣＧＡＡＣＴＣＧ（配列番号１２）
ｐｒｏｂｅ：ＡＡＡＣＣＣＣＧＣＣＣＴＴＡＡＡＣＣＣＧＡ（配列番号１３）【００８９】
患者血清から抽出したＤＮＡに定量的プライマーとプローブを合わせて混合しＰＣＲ反応を行うことにより特異的にＭＦＳＤ４のメチル化を検出した。ＰＣＲ反応はＡＢＩ  ＳＴＥＰＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９５℃１０分加熱後、９５℃５秒、６０℃６０秒で４０サイクルのＰＣＲ条件で増幅を行い解析した。【００９０】
図１１は、健常患者１０例、ステージＩ胃癌患者６例、ステージＩＩ／ＩＩＩ胃癌患者で１０例、ステージＩＶ胃癌患者で１２例の解析結果を示す。健常患者、ステージＩ胃癌患者では、ＭＦＳＤ４の血清中メチル化は検出されなかった。一方、ステージＩＩ／ＩＩＩ胃癌患者では１０例中２例で検出（２０％）、ステージＩＶ胃癌患者では１２例中５例で血清試料中でメチル化が検出された。したがって。血清中のＭＦＳＤ４  ＤＮＡメチル化は、胃癌の進展度合いの診断バイオマーカーとしても機能し得る。【００９１】
上述のように、胃癌組織中、あるいは血液試料中のＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２のｍＲＮＡ発現を解析することにより精密に予後予測を行うことが可能である。また、抗ＳＹＴ７抗体、抗ＥＴＮＫ２抗体、抗ＭＦＳＤ４を用いてＥＬＩＳＡ等によって検出することも可能である。【００９２】
また、肝転移再発群において遺伝子発現が減少しているＭＦＳＤ４の場合は、プロモーター領域のＤＮＡメチル化を解析してもよい。一般的に発現量の減少する遺伝子、タンパク質をマーカーとすることは精度の点で問題が生じる場合もあるが、ＤＮＡのメチル化を検出することにより、感度よく検出が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、手術時に得られる試料中のＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現量を、肝転移のリスクを予測するマーカーとして用い検査することができる。その結果、より細かい治療方針のもとに患者の治療を行うことが可能となる。さらに、ＳＹＴ７、ＭＦＳＤ４、ＥＴＮＫ２の発現量を指標として用いてスクリーニングを行うことにより、胃癌肝転移に選択的に作用する医薬の開発を行うことが可能となる。特に、ＳＹＴ７、ＥＴＮＫ２のｓｉＲＮＡは医薬組成物としても機能し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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