(57)【要約】本発明は、式（１）2017061150.tif 000025（式中、Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ１、Ｘ２又は１，４−ピペラジンジイル基であり；2017061150.tif 000026ｓは１又は２であり、Ｒ４は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎａ及びｎｂは独立して、０又は１であり、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、Ｙａ及びＹｂは独立して、エステル結合等を表し、Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、脂溶性ビタミン残基等を表す）で示される化合物を含む、体積メディアン径が１００ｎｍ以下であるＯ／Ｗ型エマルションを提供する。
2017061150.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
2017061150.tif 000023
（式中、Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ１、Ｘ２又は１，４−ピペラジンジイル基であり；
【化２】
2017061150.tif 000024
ｓは１又は２であり、
Ｒ４は炭素数１〜６のアルキル基を表し、
ｎａ及びｎｂは独立して、０又は１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又は尿素結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基又は炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基を表す）で示される化合物を含む、体積メディアン径が１００ｎｍ以下であるＯ／Ｗ型エマルション。
【請求項２】
体積メディアン径が３０〜５０ｎｍである、請求項１記載のＯ／Ｗ型エマルション。
【請求項３】
更に、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ脂質からなる群から選択される少なくとも１つを含有する、請求項１又は２記載のＯ／Ｗ型エマルション。
【請求項４】
難水溶性薬物が封入されている、請求項１〜３のいずれか１項記載のＯ／Ｗ型エマルション。
【請求項５】
難水溶性薬物が４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステル又はデキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステルである、請求項４記載のＯ／Ｗ型エマルション。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載のＯ／Ｗ型エマルションを含む、難水溶性薬物を細胞内へ送達するための担体。
【請求項７】
請求項４記載のＯ／Ｗ型エマルションを細胞へ接触させることを含む、難水溶性薬物を細胞内へ送達する方法。
【請求項８】
インビトロにおいてＯ／Ｗ型エマルションを細胞へ接触させる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
Ｏ／Ｗ型エマルションを生体内へ投与することにより、Ｏ／Ｗ型エマルションを細胞へ接触させる、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
式（１）の化合物を含む脂質のアルコール溶液と、ｐＨ３．０〜７．４、塩濃度０〜０．５Ｍの緩衝水溶液を混合することを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のＯ／Ｗ型エマルションの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞内の還元的環境に応答して崩壊するＯ／Ｗ型エマルション、およびその調製方法に関する。また、本発明は、難水溶性薬物を細胞内へ送達するための担体としての当該Ｏ／Ｗ型エマルションの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗悪性腫瘍薬、免疫抑制剤、抗生物質、抗真菌剤、抗高脂血症剤、抗炎症剤等の新薬候補物質の多くは難水溶性であり、十分な薬理活性を有しつつも、製剤化が困難であるため、開発途中でペンディングあるいはドロップアウトしてしまうことも少なくない。【０００３】
従来から、難水溶性薬物の医薬品への適用には、親水性界面活性剤やシクロデキストリンのような包接化合物による可溶化、植物油及びレシチンを用いた乳化といったような試みがなされているが、副作用を低減しつつ目的の薬効を得るためには、目的とする細胞や組織への集積性を高めるべく、平均粒子径の制御や細胞内での放出促進といった工夫がさらに必要である。【０００４】
平均粒子径を制御した可溶化剤の例としては、非特許文献１記載のポリマーミセルや非特許文献２および非特許文献３記載のリポソームがある。これらの文献には、平均粒子径を１００ｎｍ以下に制御することにより、脾臓からの排出を回避して血中滞留性を高めたり、腫瘍等の標的組織への集積性を高めたりすることが出来ることから、生体内への投与に有利であることが示されている。しかしながら、これらのミセルやリポソームについては、細胞内での薬物の放出効率の観点からは改善の余地がある。【０００５】
本発明者らは、細胞内で脂質膜構造体を崩壊させる性質を有する脂質を開発している（特許文献１、特許文献２）。当該脂質を含むリポソーム等の脂質構造体は、細胞内の還元環境下で容易に崩壊し、水溶性化合物である核酸を高い効率で放出することから、核酸を細胞内に効率的に送達するための優れた担体として用いることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０７３４８０号
【特許文献２】ＵＳ２０１４０３３５１５７
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nat Nanotechnol. 2011 Oct 23;6(12):815-23.Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size.Cabral H, Matsumoto Y, Mizuno K, Chen Q, Murakami M, Kimura M, Terada Y, Kano MR, Miyazono K, Uesaka M, Nishiyama N, Kataoka K.
【非特許文献２】Biochimica et Biophysica Acta, 1062 (1991) 142-148Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target.Aleksander L. Klibanov, Kazuo Maruyama, Anne Marie Beckerleg,Vladimir P. Torchilin and Leaf Huang
【非特許文献３】Biochimica et Biophysica Acta 1190 (1994) 99-107Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes.David C. Litzinger, Antoinette M.J. Buiting, Nico van Rooijen, and Leaf Huang
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、難水溶性薬物を細胞内へ効率的に送達するための担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、特許文献１および２に開示された脂質を含むリポソームに、核酸に換えて難水溶性薬物を封入し、細胞内へ導入しようと試みたが、難水溶性薬物を安定に封入した当該リポソームを作成することはできなかった。また、当該リポソームの粒子径を、生体内への投与に有利な１００ｎｍ以下に制御することも困難であった。そこで、本発明者らは更に試行錯誤を続けた結果、特許文献１及び２に開示された脂質を構成成分として用いて、Ｏ／Ｗ型エマルションを調製したところ、意外にも、当該Ｏ／Ｗ型エマルションは、リポソームとは異なって、内部に難水溶性薬物を安定に内封でき、細胞内の還元的環境に応答して効率的に薬物を放出することを見出した。更に、ある特定の条件で当該Ｏ／Ｗ型エマルションを調製することで、体積メディアン径を、生体内に投与した際に腫瘍などの組織深部への集積に有利な１００ｎｍ以下に制御できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
即ち、本発明は、以下の内容を包含する。
［１］式（１）【００１１】
【化１】
2017061150.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ１、Ｘ２又は１，４−ピペラジンジイル基であり；【００１３】
【化２】
2017061150.tif 000004
【００１４】
ｓは１又は２であり、
Ｒ４は炭素数１〜６のアルキル基を表し、
ｎａ及びｎｂは独立して、０又は１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又は尿素結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基又は炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基を表す）で示される化合物を構成成分として含む、体積メディアン径が１００ｎｍ以下であるＯ／Ｗ型エマルション。
［２］体積メディアン径が３０〜５０ｎｍである、［１］記載のＯ／Ｗ型エマルション。
［３］更に、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ脂質からなる群から選択される少なくとも１つを含有する、［１］又は［２］記載のＯ／Ｗ型エマルション。
［４］難水溶性薬物が封入されている、［１］〜［３］のいずれか記載のＯ／Ｗ型エマルション。
［５］難水溶性薬物が４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステル又はデキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステルである、［４］記載のＯ／Ｗ型エマルション。
［６］［１］〜［３］のいずれか記載のＯ／Ｗ型エマルションを含む、難水溶性薬物を細胞内へ送達するための担体。
［７］［４］記載のＯ／Ｗ型エマルションを細胞へ接触させることを含む、難水溶性薬物を細胞内へ送達する方法。
［８］インビトロにおいてＯ／Ｗ型エマルションを細胞へ接触させる、［７］記載の方法。
［９］Ｏ／Ｗ型エマルションを生体内へ投与することにより、Ｏ／Ｗ型エマルションを細胞へ接触させる、［７］記載の方法。
［１０］式（１）の化合物を含む脂質のアルコール溶液と、ｐＨ３．０〜７．４、塩濃度０〜０．５Ｍの緩衝水溶液を混合することを含む、［１］〜［４］のいずれか記載のＯ／Ｗ型エマルションの製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、難水溶性薬物を安定に内封することが出来る。難水溶性薬物を内封した、本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、細胞に取り込まれた後に、式（１）で示される化合物が細胞内の還元的環境により分解することで、Ｏ／Ｗ型エマルションが崩壊し、内封した難水溶性薬物が効率的に細胞内で放出される。従って、本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、難水溶性薬物の細胞内送達用の担体として有用である。また、本発明のＯ／Ｗ型エマルションは体積メディアン径が１００ｎｍ以下であることから、脾臓からの排出が回避されて血中滞留性が高く、腫瘍等の標的組織への集積性が高いので、生体内において、難水溶性薬物を標的組織へ送達するのに有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｂ−２、Ｂ−２−５、Ｏ−Ｃ３Ｍ、Ｂ−２−３、又はＴＳ−Ｐ４Ｃ２から調製される各種エマルションの体積基準粒子径分布を示す。
【図２】ＤＯＤＡＰ、又はＥＰＣから調製される各種粒子懸濁液の体積基準粒子径分布を示す。
【図３】Ｂ−２、コレステロールに加えＤＯＰＣまたはＤＯＰＥを含むエマルションの、調製時ｐＨが粒子径に与える影響を示す。
【図４】Ｂ−２、ＤＯＰＥ、及びコレステロールを含むエマルションの、調製時塩濃度が粒子径分布に与える影響を示す図である。
【図５】Ｂ−２、ＤＯＰＥ、及びコレステロールを含むエマルションの、調製時塩濃度と体積メディアン径の関係を示す図である。
【図６】Ｂ−２、Ｂ−２−５、Ｏ−Ｃ３Ｍ、Ｂ−２−３、又はＴＳ−Ｐ４Ｃ２から調製される各種エマルションの、還元条件下、および非還元環境下における薬剤放出を示す図である。
【図７】ＤＯＤＡＰ、又はＥＰＣから調製される各種粒子懸濁液の還元条件下、および非還元環境下における薬剤放出を示す図である。
【図８】Ｂ−２、Ｂ−２−５、ＥＰＣ、又はＤＯＤＡＰから調製される各種エマルション又は粒子懸濁液を静脈内注射した際の粒子（油滴）の主要臓器分布である。
【図９】図８に示す主要臓器分布を定量的に評価した図である。
【図１０】Ｂ−２から調製されるエマルションの腫瘍集積性に対する粒子径の影響を示す図である。
【図１１】Ｂ−２、Ｂ−２−５、ＤＯＤＡＰ、又はＥＰＣから調製される各種粒子（油滴）の腫瘍内分布を示す蛍光顕微鏡画像である。
【図１２】Ｂ−２、Ｂ−２−５、ＤＯＤＡＰ、又はＥＰＣから調製される各種粒子（油滴）の腫瘍内分布の不均一性を定量した図である。
【図１３】Ｂ−２、ＤＯＤＡＰ、又はＥＰＣから調製される各種粒子投与群と比較対照群の腫瘍体積増加率を示す図である。
【図１４】Ｌ−ＰＺ４Ｃ２から調製されるエマルションの、還元条件下（ＧＳＨ（＋））、および非還元環境下（ＧＳＨ（−））における薬剤放出を示す図である。
【図１５】４−メチルウンベリフェロンパルミチン酸エステルまたは４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステルとＢ−２から調製されるエマルションの脂質と薬剤の血中滞留性を比較した図である。
【図１６】４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステルとＢ−２から調製されるエマルションの血中の薬剤濃度と腫瘍での薬剤濃度を比較した図である。
【図１７】４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステルとＢ−２から調製されるエマルションの臓器分布を比較した図である。
【図１８】Ｂ−２とデキサメタゾンパルミチン酸エステルあるいはデキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステルからなるエマルションの薬剤の血中滞留性を比較した図である。
【図１９】Ｂ−２とデキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステルからなるエマルションの種々のＰＥＧ脂質濃度での血中滞留性を比較した図である。
【図２０】Ｂ−２とデキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステルからなるエマルションをマウスに投与した際の種々のｍＲＮＡの発現量を評価した図である。
【図２１】Ｂ−２とデキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステルからなるエマルションをマウスに投与した際の抗腫瘍効果を評価した図である。
【図２２】４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの分析結果の図である。
【図２３】デキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの分析結果の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明は、式（１）で表される化合物を含有するＯ／Ｗ型エマルションを提供するものである。
【００１９】
【化３】
2017061150.tif 000005
【００２０】
式（１）中、Ｘａ及びＸｂは独立して、以下に示すＸ１、Ｘ２又は１，４−ピペラジンジイル基である。
【００２１】
【化４】
2017061150.tif 000006
【００２２】
Ｘ１中のＲ４は炭素数１〜６のアルキル基を表し、直鎖状であっても分岐状であっても環状であっても良い。該アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜３である。炭素数１〜６のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔ−ペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、２−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２，２−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、シクロヘキシル基等を挙げることができる。Ｒ４は好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基又はイソプロピル基であり、最も好ましくはメチル基である。
【００２３】
Ｘ２中のｓは１又は２である。ｓが１のときＸ２はピロリジニウム基であり、ｓが２のときＸ２はピペリジニウム基である。ｓは好ましくは２である。尚、Ｘ２の結合の向きは制限されないが、好ましくは、Ｘ２中の窒素元素が、Ｒ１ａ及びＲ１ｂと結合する。
【００２４】
ＸａはＸｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＸａはＸｂと同一の基である。
【００２５】
ｎａ及びｎｂは独立して、０又は１であり、好ましくは１である。ｎａが１の場合、Ｒ３ａはＹａ及びＲ２ａを介してＸａと結合し、ｎａが０の場合にはＲ３ａ−Ｘａ―Ｒ１ａ―Ｓ−の構造を呈する。同様に、ｎｂが１の場合、Ｒ３ｂはＹｂ及びＲ２ｂを介してＸｂと結合し、ｎｂが０の場合にはＲ３ｂ−Ｘｂ―Ｒ１ｂ―Ｓ−の構造を呈する。
【００２６】
ｎａはｎｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ｎａはｎｂと同一である。
【００２７】
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、直鎖状であっても良く、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。炭素数１〜６のアルキレン基としては、具体的にはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基、テトラメチレン基、イソブチレン基、ペンタメチレン基、ネオペンチレン基等を挙げることができる。Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基又はテトラメチレン基であり、最も好ましくはエチレン基である。
【００２８】
Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一の基である。
【００２９】
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、直鎖状であっても良く、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖状である。炭素数１〜６のアルキレン基としては、Ｒ１ａ及びＲ１ｂの炭素数１〜６のアルキレン基の例として列挙したものを挙げることができる。
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基又はテトラメチレン基である。
Ｘａ及びＸｂがＸ１のとき、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、イソプロピレン基又はテトラメチレン基であり、最も好ましくはトリメチレン基である。
Ｘａ及びＸｂがＸ2のとき、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基であり、最も好ましくはエチレン基である。
Ｘａ及びＸｂが１，４−ピペラジンジイル基のとき、Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、好ましくはメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基であり、最も好ましくはエチレン基である。
【００３０】
Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一の基である。
【００３１】
Ｙａ及びＹｂは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、又はエーテル結合、尿素結合であり、好ましくはエステル結合、アミド結合、又はカーバメート結合であり、最も好ましくはエステル結合である。Ｙａ及びＹｂの結合の向きは制限されないが、Ｙａがエステル結合の場合、好ましくは、Ｒ３ａ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ２ａ−の構造を呈し、Ｙｂがエステル結合の場合、好ましくは、Ｒ３ｂ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ２ｂ−の構造を呈する。
【００３２】
ＹａはＹｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、ＹａはＹｂと同一の基である。
【００３３】
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基又は炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基を表し、好ましくは脂溶性ビタミン残基又は炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基である。
【００３４】
「ステロール残基」としては、Ｙａ又はＹｂとの結合に関与する反応性官能基（例、水酸基）を除いたステロール、又はステロール誘導体に由来する残基が挙げられるが、好ましくはステロール誘導体に由来する残基である。ステロール誘導体とは、例えば、ステロールの水酸基をジカルボン酸の一方のカルボン酸と反応させたステロールヘミエステル（この場合、もう一方のカルボン酸が反応性官能基となる）が挙げられる。ステロールには、例えばコレステロール、コレスタノール、スチグマステロール、β−シトステロール、ラノステロール、及びエルゴステロール等が挙げられるが、好ましくはコレステロール、又はコレスタノールである。ジカルボン酸としては、例えば、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、又はアジピン酸等が挙げられるが、好ましくはコハク酸、又はグルタル酸である。ステロール誘導体の具体例としては、コレステロールヘミコハク酸エステル、コレステロールヘミグルタル酸エステル等が挙げられる。
【００３５】
「脂溶性ビタミン残基」としては、Ｙａ又はＹｂとの結合に関与する反応性官能基（例、水酸基）を除いた脂溶性ビタミン、又は脂溶性ビタミン誘導体に由来する残基が挙げられるが、好ましくは脂溶性ビタミン誘導体に由来する残基である。脂溶性ビタミン誘導体とは、反応性官能基が水酸基である脂溶性ビタミンの水酸基をジカルボン酸の一方のカルボン酸と反応させた脂溶性ビタミンヘミエステル（この場合、もう一方のカルボン酸が反応性官能基となる）が挙げられる。脂溶性ビタミンとしては、例えばレチノイン酸、レチノール、レチナール、エルゴステロール、７−デヒドロコレステロール、カルシフェロール、コルカルシフェロール、ジヒドロエルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、トコフェロール、又はトコトリエノール等を挙げることができるが、好ましくは、レチノイン酸、又はトコフェロールであり、最も好ましくは、トコフェロールである。ジカルボン酸としては、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、及びアジピン酸等が挙げられるが、好ましくはコハク酸、及びグルタル酸である。脂溶性ビタミン誘導体の具体例としては、トコフェロールヘミコハク酸エステル、トコフェロールヘミグルタル酸エステル等が挙げられる。
【００３６】
炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基は、直鎖であっても、分岐を有していても良いが、好ましくは直鎖である。当該脂肪族炭化水素基は、飽和であっても不飽和であっても良い。不飽和炭化水素基の場合、当該脂肪族炭化水素基に含まれる不飽和結合の数は１〜６個、好ましくは１〜３個、最も好ましくは１〜２個である。不飽和結合には炭素−炭素二重結合及び三重結合が含まれるが、好ましくは二重結合である。当該脂肪族炭化水素基に含まれる炭素数は、好ましくは１３〜２１であり、最も好ましくは１３〜１７である。脂肪族炭化水素基には、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が含まれるが、好ましくはアルキル基又はアルケニル基である。炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基としては、例えば、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、ドデセニル基、トリコシル基、トリデセニル基、テトラデセニル基、ペンタデセニル基、ヘキサデセニル基、ヘプタデセニル基、オクタデセニル基、ノナデセニル基、イコセニル基、ヘンイコセニル基、ドコセニル基、トリコセニル基、トリデカジエニル基、テトラデカジエニル基、ペンタデカジエニル基、ヘキサデカジエニル基、ヘプタデカジエニル基、オクタデカジエニル基、ノナデカジエニル基、イコサジエニル基、ヘンイコサジエニル基、ドコサジエニル基、オクタデカトリエニル基、イコサトリエニル基、イコサテトラエニル基、イコサペンタエニル基、ドコサヘキサエニル基、メチルドデシル基、メチルトリデシル基、メチルテトラデシル基、メチルペンタデシル基、メチルヘプタデシル基、メチルオクタデシル基、メチルノナデシル基、メチルイコシル基、メチルヘンイコシル基、メチルドコシル基、エチルウンデシル基、エチルドデシル基、エチルトリデシル基、エチルテトラデシル基、エチルペンタデシル基、エチルヘプタデシル基、エチルオクタデシル基、エチルノナデシル基、エチルイコシル基、エチルヘンイコシル基、ヘキシルヘプチル基、ヘキシルノニル基、ヘプチルオクチル基、ヘプチルデシル基、オクチルノニル基、オクチルウンデシル基、ノニルデシル基、デシルウンデシル基、ウンデシルドデシル基、ヘキサメチルウンデシル基等を挙げることができる。直鎖のものとしては好ましくは、ドデシル基、トリデシル基、ペンタデシル基、ヘプタデシル基、ノナデシル基、ヘンイコシル基、ヘプタデセニル基、又はヘプタデカジエニル基であり、特に好ましくは、トリデシル基、ヘプタデシル基、ヘプタデセニル基、又はヘプタデカジエニル基である。分岐のものとしては好ましくは、メチルペンタデシル基、ヘキシルノニル基、ヘプチルデシル基、オクチルウンデシル基、又はヘキサメチルウンデシル基であり、特に好ましくは、メチルペンタデシル基、ヘキシルノニル基、又はヘプチルデシル基である。
【００３７】
一態様において、炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基は脂肪酸、脂肪族アルコール、又は脂肪族アミンに由来するものが用いられる。Ｒ３ａ（又はＲ３ｂ）が脂肪酸由来の場合、Ｙａ（又はＹｂ）はエステル結合、又はアミド結合であり、脂肪酸由来のカルボニル炭素はＹａ（又はＹｂ）に含まれる。例えば、リノール酸を用いた場合、Ｒ３ａ（又はＲ３ｂ）はヘプタデカジエニル基である。
【００３８】
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一であっても異なっていてもよいが、好ましくは、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一の基である。
【００３９】
一態様において、ＸａはＸｂと同一であり、ｎａはｎｂと同一であり、Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、Ｒ３ａはＲ３ｂと同一であり、ＹａはＹｂと同一である。
【００４０】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ１であり、
Ｒ４は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基を表す。
【００４１】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、Ｘ１であり、
Ｒ４は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基を表し、
ＸａはＸｂと同一であり、
Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、
Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
【００４２】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、Ｘ１であり、
Ｒ４はメチル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはエチレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはトリメチレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂは−ＣＯ−Ｏ−を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、炭素数１３〜１７のアルキル基又はアルケニル基を表す。
【００４３】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、Ｘ１であり、
Ｒ４はメチル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはエチレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはトリメチレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂは−ＣＯ−Ｏ−を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、炭素数１３〜１７のアルキル基又はアルケニル基を表し、
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
【００４４】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ１であり、
Ｒ４は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基）を表す。
【００４５】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、Ｘ１であり、
Ｒ４は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基）を表し、
ＸａはＸｂと同一であり、
Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、
Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
【００４６】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、Ｘ１であり、
Ｒ４はメチル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはエチレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはトリメチレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂは−ＣＯ−Ｏ−を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基）を表す。
【００４７】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、Ｘ１であり、
Ｒ４はメチル基を表し、ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂはエチレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂはトリメチレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂは−ＣＯ−Ｏ−を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基）を表し、
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
【００４８】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ２であり、
ｔは２であり、
ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基）、又は炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基（例、炭素数１２〜２３のアルキル基）を表す。
【００４９】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ２であり、
ｔは２であり、
ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基）、又は炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基（例、炭素数１２〜２３のアルキル基）を表し、
ＸａはＸｂと同一であり、
Ｒ１ａはＲ１ｂと同一であり、
Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
【００５０】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ２であり、
ｔは２であり、
ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、エチレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基）、又は炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基（例、炭素数１２〜２３のアルキル基）を表し、
ＸａはＸｂと同一であり、
Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
【００５１】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、１，４−ピペラジンジイル基であり、
ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
ＹａおよびＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは独立して、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基）又は炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基（例、炭素数１２〜２３（好ましくは、１３〜１７）のアルキル基又はアルケニル基を表す。
【００５２】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、１，４−ピペラジンジイル基であり、
ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは独立して、炭素数１〜６のアルキレン基を表し、
ＹａおよびＹｂはエステル結合を表し、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは独立して、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基）又は炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基（例、炭素数１２〜２３（好ましくは、１３〜１７）のアルキル基又はアルケニル基を表し、
Ｒ２ａはＲ２ｂと同一であり、
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
【００５３】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、１，４−ピペラジンジイル基であり、
ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、エチレン基を表し、
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、エチレン基を表し、
ＹａおよびＹｂは、−ＣＯ−Ｏ−を表し、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは独立して、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基）又は炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基（例、炭素数１２〜２３（好ましくは、１３〜１７）のアルキル基又はアルケニル基を表す。
【００５４】
一態様において、
Ｘａ及びＸｂは、１，４−ピペラジンジイル基であり、
ｎａ及びｎｂは１であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、エチレン基を表し、
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、エチレン基を表し、
ＹａおよびＹｂは、−ＣＯ−Ｏ−を表し、
Ｒ３ａおよびＲ３ｂは独立して、脂溶性ビタミン残基（例、レチノイン酸残基、トコフェロール残基、トコフェロールヘミコハク酸エステル由来の基）又は炭素数１２〜２３の脂肪族炭化水素基（例、炭素数１２〜２３（好ましくは、１３〜１７）のアルキル基又はアルケニル基を表し、
Ｒ３ａはＲ３ｂと同一である。
【００５５】
式（１）の化合物の具体例として、以下のＢ−２、Ｂ−２−２、Ｂ−２−３、Ｂ−２−４、Ｂ−２−５、ＴＳ−Ｃ４Ｅ、ＴＳ−Ｃ５Ｐ、ＴＳ−Ｐ２Ｃ１、ＴＳ−Ｐ３Ｃ１、ＴＳ−Ｐ４Ｃ１、ＴＳ−Ｐ４Ｃ２、ＴＳ−Ｐ４Ｃ３、ＴＳ−Ｐ４Ｃ４、ＴＧ−Ｃ３Ｍ、ＴＳａｍｉｄｅ−Ｃ３Ｍ、ＴＳ−ＰＺ４Ｃ２、Ｏ−Ｃ３Ｍ、Ｌ−ＰＺ４Ｃ２の化合物を挙げることができる。
【００５６】
【表１−１】
2017061150.tif 000007
【００５７】
【表１−２】
2017061150.tif 000008
【００５８】
【表１−３】
2017061150.tif 000009
【００５９】
【表１−４】
2017061150.tif 000010
【００６０】
式（１）で表される化合物のうち、Ｘａ及びＸｂが、Ｘ１又はＸ２の化合物は、ＷＯ２０１３／０７３４８０Ａ１又はＵＳ２０１４／０３３５１５７Ａ１に記載された方法により製造することが出来る。
【００６１】
式（１）で表される化合物のうち、Ｘａ及びＸｂが、１，４−ピペラジンジイル基である化合物の製造方法について説明する。
【００６２】
式（１）の化合物は、−Ｓ−Ｓ−（ジスルフィド）結合を有している。そのため、製造方法としては、Ｒ３ａ−（Ｙａ−Ｒ２ａ）ｎａ−Ｘａ−Ｒ１ａ−を有するＳＨ（チオール）化合物、及びＲ３ｂ−（Ｙｂ−Ｒ２ｂ）ｎｂ−Ｘｂ−Ｒ１ｂ−を有するＳＨ（チオール）化合物を製造後、これらを酸化（カップリング）することで−Ｓ−Ｓ−結合を含む本発明の化合物を得る方法、−Ｓ−Ｓ−結合を含む化合物から出発し、必要な部分を順次合成していき、最終的に本発明の化合物を得る方法等が挙げられる。好ましくは、後者の方法である。
【００６３】
後者の方法の具体例を以下に挙げるが、製造方法はこれらに限定されない。
【００６４】
出発化合物としては、−Ｓ−Ｓ−結合を含む両末端カルボン酸、両末端アミン、両末端イソシアネート、両末端アルコール、メタンスルホニル基などの脱離基を有する両末端アルコール、ｐ−ニトロフェニルカーボネート基などの脱離基を有する両末端カーボネートなどが挙げられる。
【００６５】
例えば、Ｘａ及びＸｂが１，４−ピペラジンジイル基であり、Ｒ１ａ及びＲ１ｂがエチレン基であり、ｎａ及びｎｂが１であり、Ｒ２ａ及びＲ２ｂがエチレン基であり、ＹａおよびＹｂが同一でＹ（エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、又はエーテル結合）であり、Ｒ３ａおよびＲ３ｂが同一でＲ３（ステロール残基、脂溶性ビタミン残基、又は炭素数１３〜２３の脂肪族炭化水素基）である化合物を製造する場合、−Ｓ−Ｓ−結合を含む化合物（Ｉ）中の両末端官能基を、４位にエチレン基を介して官能基を有するピペラジン誘導体（以下、「化合物（ＩＩ）」と称する）の１位の二級アミノ基と反応させた後、誘導体（ＩＩ）中の官能基とＲ３−Ｙを含む化合物（ＩＩＩ）中の官能基を反応させることにより、−Ｓ−Ｓ−結合、Ｒ１ａ及びＲ１ｂ、２つのピペラジン骨格、Ｒ２ａ及びＲ２ｂ、Ｙａ及びＹｂ、並びにＲ３ａ及びＲ３ｂを含む式（１）の化合物を得ることができる。
【００６６】
化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の反応には、触媒として、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムなどの塩基触媒を使用しても良く、無触媒で行っても良い。好ましくは、炭酸カリウム又は炭酸ナトリウムが触媒として用いられる。
【００６７】
触媒量としては、化合物（Ｉ）に対して０．１〜１００ｍｏｌ当量であり、好ましくは、０．１〜２０ｍｏｌ当量であり、より好ましくは０．１〜５ｍｏｌ当量である。化合物（ＩＩ）の仕込み量は、化合物（Ｉ）に対して、１〜５０ｍｏｌ当量であり、好ましくは１〜１０ｍｏｌ当量である。
【００６８】
化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒や水溶液であればよく、特に制限なく使用することができる。例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、トルエンなどが挙げられる。これらの中では、トルエン、クロロホルム、アセトニトリルが好ましい。
【００６９】
反応温度は、−２０〜１５０℃、好ましくは０〜８０℃であり、より好ましくは、２０〜５０℃である。反応時間は１〜４８時間、好ましくは２〜２４時間である。
【００７０】
化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の反応生成物（以下、反応生成物（Ｉ）と称する）と、化合物（ＩＩＩ）を反応させる場合には、化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の反応に使用した触媒のように、炭酸カリウムや炭酸ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ触媒を使用しても良く、ｐ−トルエンスルホン酸やメタンスルホン酸などの酸触媒、または無触媒で行ってもよい。
【００７１】
また、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、「ＤＣＣ」と称する）、ジイソプロピルカルボジイミド（以下、「ＤＩＣ」と称する）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＣ」と称する）などの縮合剤を使用して、反応生成物（Ｉ）と、化合物（ＩＩＩ）を直接反応させてもよく、または、化合物（ＩＩＩ）を、縮合剤を使用して、無水物などに変換した後、反応生成物（Ｉ）と反応させてもよい。
【００７２】
化合物（ＩＩＩ）の仕込み量は、反応生成物（Ｉ）に対して、1〜５０ｍｏｌ当量であり、好ましくは１〜１０ｍｏｌ当量である。
【００７３】
反応生成物（Ｉ）と化合物（ＩＩＩ）との反応に使用される触媒は、反応させる官能基同士によって、適宜選択してよい。
【００７４】
触媒量は、反応生成物（Ｉ）に対して０．０５〜１００ｍｏｌ当量であり、好ましくは、０．１〜２０ｍｏｌ当量であり、より好ましくは０．２〜５ｍｏｌ当量である。
【００７５】
反応生成物（Ｉ）と化合物（ＩＩＩ）の反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒や水溶液であればよく、特に制限なく使用することができる。例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、トルエンなどが挙げられる。これらの中ではクロロホルム、トルエンが好ましい。
【００７６】
反応温度は、０〜１５０℃、好ましくは０〜８０℃であり、より好ましくは、２０〜５０℃である。反応時間は１〜４８時間、好ましくは２〜２４時間である。
【００７７】
上記反応によって得られた反応物は、抽出精製、再結晶、吸着精製、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。
【００７８】
当業者であれば、適宜原料を選択し、本明細書の実施例の方法に準じて反応を行うことにより、所望の式（１）の化合物を製造することができる。
【００７９】
次に、本発明のＯ／Ｗ型エマルションについて説明する。
【００８０】
Ｏ／Ｗ型エマルションとは、油滴が水相に分散したエマルションをいう。油滴には不定型の層状構造物（層状の脂質二重膜）が含まれていてもよいく、含まれていなくてもよい。油滴が層状の脂質二重膜を含む場合、脂質二重膜と脂質二重膜の間に水相が存在していてもよい。本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、それを構成する油滴中に、式（１）の化合物を含む。
【００８１】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、式（１）の化合物以外に加えてそれ以外の脂質（例えば、リン脂質、ステロール、ＰＥＧ脂質、糖脂質、ペプチド脂質、式（１）の化合物以外のカチオン性脂質）を油滴中に含んでいてもよい。本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、油滴中に、式（１）の化合物に加えて、好ましくはＰＥＧ脂質、リン脂質、ステロールからなる群から選択される少なくとも１つの脂質を含み、より好ましくは、ＰＥＧ脂質を含む。一態様において、本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、油滴中に、式（１）の化合物に加えてＰＥＧ脂質を含み、加えて、リン脂質及びステロールからなる群から選択される少なくとも１つの脂質を含む、好ましい態様において、本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、油滴中に、式（１）の化合物に加えて、リン脂質、ＰＥＧ脂質及びステロールを含む。
【００８２】
ＰＥＧ脂質とは、ＰＥＧによる修飾を含む脂質を意味する。ＰＥＧ脂質は、本発明のＯ／Ｗ型エマルションの油滴中に含まれると、界面にＰＥＧ水和層を形成し、粒子間、および粒子とタンパク質間の凝集を防ぎ、調製中、および調製後の体積メディアン径を１００ｎｍ以下に安定に保つ。本発明のＯ／Ｗ型エマルションに用いるＰＥＧ脂質としては、上記のリン脂質にポリエチレングリコールが結合したＰＥＧリン脂質や、上記の炭素数８〜２４のアシル基が結合したジアシルグリセロールにポリエチレングリコールが結合したジアシルグリセロールＰＥＧが挙げられる。ＰＥＧ脂質を構成するポリエチレングリコールの分子量は特に限定されないが好ましくは２００〜１００００、より好ましくは２０００〜５０００である。本発明のＯ／Ｗ型エマルションに用いるＰＥＧ脂質は、好ましくは、アシル基が飽和型であるジアシルグリセロールＰＥＧであり、より好ましくはアシル基がミリストイル基又はステアロイル基であるジアシルグリセロールＰＥＧであり、さらに好ましくはミリストイル基と分子量２０００のポリエチレングリコールが結合したジアシルグリセロールＰＥＧ（ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００）又はステアロイル基と分子量２０００のポリエチレングリコールが結合したジアシルグリセロールＰＥＧ（ＤＳＧ−ＰＥＧ２０００）である。
【００８３】
リン脂質は、本発明のＯ／Ｗ型エマルションの油滴中に含まれると、その水／油界面を安定化し、血液中や培地中といったタンパク質存在下における安定性を与えたり、体積メディアン径を生体投与に適した１００ｎｍ以下まで安定に低下させたりする。リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ジセチルリン酸、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）、カルジオリピン等の天然あるいは合成のリン脂質；これらのリン脂質の部分もしくは完全水素添加物；これらのリン脂質の混合物である大豆レシチン、コーンレシチン、綿実油レシチン、卵黄レシチンなどの天然レシチン；および水素添加大豆レシチン、水素添加卵黄レシチンなどが挙げられる。これらのリン脂質を構成する炭化水素基は、１−位、２−位が同種もしくは異種どちらでも良く、炭素数８〜２４のアシル基で構成されている。炭素数８〜２４のアシル基としては、例えば、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキジン酸、ヘネイコサン酸、ベヘン酸、トリコサン酸、リグノセリン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸、ヘキサデカジエン酸、リノール酸、エイコサジエン酸、ドコサジエン酸、ヘキサデカトリエン酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、エイコサトリエン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、ドコサヘキサエン酸等の脂肪酸から水酸基を除いてなる残基が挙げられる。
【００８４】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションに用いるリン脂質は、好ましくは合成リン脂質であり、より好ましくはアシル基に不飽和結合を含む合成リン脂質であり、さらに好ましくはジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）であり、さらに好ましくはジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である。
【００８５】
ステロールは、本発明のＯ／Ｗ型エマルションの油滴中に含まれると、分子集合体としてのエマルションを構造的に安定化し、粒子径（体積メディアン径）を生体投与に適した１００ｎｍ以下まで安定に低下させる。本発明のＯ／Ｗ型エマルションに用いるステロールとしては、例えば、コレステロール、フィトステロール、ジヒドロコレステロール、ステアリン酸コレステリル、ノナン酸コレステリル、ヒドロキシステアリン酸コレステリル、オレイン酸ジヒドロコレステリル等が挙げられ、好ましくは、コレステロール、フィトステロール、ステアリン酸コレステリルであり、さらに好ましくはコレステロールである。
【００８６】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる脂質の含有量は、難水溶性薬物の細胞内への導入及び放出が可能な限り、特に限定されないが、通常、エマルション中の総脂質（但し、ＰＥＧ脂質を除く）濃度として０．５ｍＭ〜１０ｍＭであり、好ましくは、１ｍＭ〜８ｍＭである。
【００８７】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる式（１）の化合物の含有量は特に限定されないが、通常は、Ｏ／Ｗ型エマルションを後述の難水溶性薬物を細胞内へ送達するための担体として用いた場合に、細胞内へ難水溶性薬物を導入し、放出するのに十分な量の式（１）の化合物が本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる。例えば、油滴を構成する総脂質（但し、ＰＥＧ脂質を除く）の５〜１００モル％、好ましくは１０〜７０モル％、より好ましくは３０〜５０モル％である。
【００８８】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションがＰＥＧ脂質を含有する場合、その含有量は、本発明のＯ／Ｗ型エマルションによる難水溶性薬物の細胞内への導入及び放出が可能な限り、特に限定されない。本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる油滴を構成するＰＥＧ脂質以外の脂質の含有量の合計を１００モル当量とみなした場合、例えば、１モル当量以上、好ましくは３モル当量以上、より好ましくは５モル当量以上のＰＥＧ脂質が、追加的に本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる。ＰＥＧ脂質の含有量の上限値は、本発明のＯ／Ｗ型エマルションによる難水溶性薬物の細胞内への導入及び放出を妨げない限り、特に限定されないが、本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる油滴を構成するＰＥＧ脂質以外の脂質の含有量の合計を１００モル当量とみなした場合、本発明のＯ／Ｗ型エマルション中のＰＥＧ脂質の含有量は、例えば、２０モル当量以下、好ましくは、１８モル当量以下、より好ましくは、１５モル当量以下である。更なる局面において、本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる油滴を構成するＰＥＧ脂質以外の脂質の含有量の合計を１００モル当量とみなした場合、本発明のＯ／Ｗ型エマルション中のＰＥＧ脂質の含有量は、例えば、３０モル当量以下、好ましくは、２５モル当量以下、より好ましくは、２０モル当量以下である。従って、本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる油滴を構成するＰＥＧ脂質以外の脂質の含有量の合計を１００モル当量とみなした場合、例えば、１〜２０モル当量、好ましくは３〜１８モル当量、より好ましくは５〜１５モル当量のＰＥＧ脂質が、追加的に本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる。更なる局面において、本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる油滴を構成するＰＥＧ脂質以外の脂質の含有量の合計を１００モル当量とみなした場合、例えば、１〜３０モル当量、好ましくは３〜２５モル当量、より好ましくは５〜２０モル当量のＰＥＧ脂質が、追加的に本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる。
【００８９】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションがリン脂質を含有する場合、その含有量は、本発明のＯ／Ｗ型エマルションによる難水溶性薬物の細胞内への導入及び放出を妨げない限り、特に限定されないが、例えば、本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる油滴を構成する総脂質（但し、ＰＥＧ脂質を除く）の１０〜７０モル％、好ましくは２０〜６０モル％、より好ましくは３０〜５０モル％である。
【００９０】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションがステロールを含有する場合、その含有量は、本発明のＯ／Ｗ型エマルションによる難水溶性薬物の細胞内への導入及び放出を妨げない限り、特に限定されないが、例えば、本発明のＯ／Ｗ型エマルションに含まれる油滴を構成する総脂質（但し、ＰＥＧ脂質を除く）の１０〜５０モル％、好ましくは２０〜４０モル％である。
【００９１】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、それを構成する油滴中に、脂質以外の成分、例えば、界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、コール酸ナトリウム、オクチルグルコシド、Ｎ−Ｄ−グルコ−Ｎ−メチルアルカンアミド類等）、ポリエチレングリコール、蛋白質、難水溶性薬物（後述する）などをさらに含有してもよい。
【００９２】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、それを構成する水相中に、水に加えて、適切な緩衝剤（例、リン酸又はその塩、リンゴ酸又はその塩、炭酸又はその塩）、塩（例、NaCl、KCl）、水以外の親水性溶媒（例えば、アセトン１，２−ジメトキシエタン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル溶媒やメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールなどのアルコール溶媒；好ましくはアルコール溶媒；より好ましくはエタノールもしくはｔｅｒｔ−ブタノール）等を含有していてもよい。
【００９３】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションの体積メディアン径（本発明のＯ／Ｗ型エマルションを構成する油滴の体積メディアン径）は、１００ｎｍ以下、好ましくは７０ｎｍ以下、より好ましくは５０ｎｍ以下である。体積メディアン径を１００ｎｍ以下とすることにより、生体内に投与した際に、脾臓からの排出が回避されて血中滞留性が高くなり、また腫瘍等の組織深部への効率的な送達が可能となる。本発明のＯ／Ｗ型エマルションの体積メディアン径の下限値は、特に限定されないが、製造技術上の観点から、通常２０ｎｍ以上、好ましくは２５ｎｍ以上、より好ましくは３０ｎｍ以上である。本発明のＯ／Ｗ型エマルションの体積メディアン径は、通常２０〜１００ｎｍ、好ましくは２５〜７０ｎｍ、より好ましくは３０〜５０ｎｍである。
【００９４】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、式（１）の化合物及びその他の構成成分（脂質等）を適当な溶媒に溶解し、得られた脂質溶液を緩衝水溶液と混合し、水系に分散させることで調製することができる。脂質溶液と緩衝水溶液の混合方法については特に限定されないが、迅速に均一な乳化を達成可能な方法が好ましい。脂質溶液と緩衝水溶液の混合方法の例としては、マイクロ流路等を用いて連続的に混合を行う方法、ボルテックスミキサー等を用いた激しい撹拌により非連続的に混合を行う方法がある。ボルテックスミキサー等を用いた非連続的な方法で混合を行う場合、脂質溶液または緩衝水溶液の一方を撹拌しているところへ、他方を全量加えることで混合を行う。均一な乳化を達成するまでの混合時間は、短ければ短い程よく、例えば１０秒以内、好ましくは５秒以内、より好ましくは３秒以内である。
【００９５】
脂質溶液の調製に用いる溶媒としては、脂質を溶解し、且つ水と混和する溶媒であればよい。このような溶媒としては１，２−ジメトキシエタン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン等のエーテル溶媒；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールなどのアルコール溶媒等が挙げられる。好ましくはアルコール溶媒であり、より好ましくはエタノールもしくはｔｅｒｔ−ブタノールである。脂質溶液中の脂質濃度は、本発明のＯ／Ｗ型エマルションを調製し得る限り特に限定されないが、全脂質（但し、ＰＥＧ脂質を除く）の合計濃度として、例えば１〜１２．５ｍＭ、好ましくは２〜３ｍＭとなるように調整する。
【００９６】
緩衝水溶液のｐＨは、本発明のＯ／Ｗ型エマルションが調製可能であれば特に限定されないが、Ｏ／Ｗ型エマルションの体積メディアン径を安定的に１００ｎｍ以下に制御するためには、緩衝水溶液を弱酸性から中性、好ましくは弱酸性に調整することが好ましい。緩衝水溶液のｐＨは、例えば３．０〜７．４、好ましくは３．０〜５．０である。
【００９７】
緩衝水溶液の種類は還元性を示さない限り特に限定されないが、上述のｐＨ領域で緩衝作用を有するものが好ましい。例えば、炭酸、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、フタル酸、酢酸、リン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸又はグリシン緩衝水溶液等を挙げることができる。緩衝水溶液は、好ましくは、リンゴ酸緩衝水溶液である。これらの緩衝水溶液は、ＮａＯＨ、ＫＯＨ等のアルカリを用いて、適切なｐＨに調整することができる
【００９８】
緩衝水溶液中の緩衝剤の濃度は、適切な緩衝作用を有し、且つ脂質溶液／緩衝水溶液中で析出しない限り特に限定されないが、例えばリンゴ酸緩衝水溶液の場合、通常１〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜３０ｍＭである。
【００９９】
緩衝水溶液には、無機塩が溶解していてもよい。無機塩としては、特に限定されないが、例えば、アルカリ金属（Ｌｉ，Ｎａ，Ｋ等）やアルカリ土類金属（Ｃａ等）のハロゲン化物（塩化物等）や硫酸化物が包含される。無機塩は、好ましくは、ＮａＣｌ又はＫＣｌであり、より好ましくはＮａＣｌである。塩濃度が高いほど、Ｏ／Ｗ型エマルションの体積メディアン径が大きくなる傾向があるため、Ｏ／Ｗ型エマルションの体積メディアン径を安定的に１００ｎｍ以下に制御する観点から、塩濃度は、ハロゲンイオン濃度の合計として、好ましくは０〜０．５Ｍであり、より好ましくは０〜０．０８Ｍである。
【０１００】
緩衝水溶液と脂質溶液の混合体積比は、本発明のＯ／Ｗ型エマルションが調製可能であれば特に限定されないが、脂質溶液１００体積部に対して、緩衝水溶液を、通常２５〜４００体積部、好ましくは４２〜２３３体積部、より好ましくは６６〜１５０体積部、さらに好ましくは１００体積部、混合する。脂質溶液と緩衝水溶液の合計体積については限定されない。
【０１０１】
好適な態様において、式（１）の化合物を含む脂質のアルコール溶液と、ｐＨ３．０〜７．４、塩濃度０〜０．５Ｍの緩衝水溶液を混合することにより、乳化を行い、本発明のＯ／Ｗ型エマルションを得る。
【０１０２】
乳化により得られたＯ／Ｗ型エマルションの水相には、脂質溶液の溶媒が相当量含まれる可能性があるため、乳化が完了した後で、乳化産物を透析または限外濾過に付すことによりＯ／Ｗ型エマルションの水相を生体適合性緩衝水溶液へ置換してもよい。生体適合性緩衝液については生体に対し毒性を示さない緩衝液であれば限定されないが、例えばＰＢＳ等が用いられる。この際、透析や限外濾過処理に先立って、乳化産物に対して生体適合性緩衝液を加えてもよい。例えば乳化産物の３．２倍から４．０倍体積程度の生体適合性緩衝液を加えた後、透析や限外濾過処理を行う。緩衝液の置換処理は、乳化処理と連続して行うことが好ましく、乳化完了後、例えば３０分以内、好ましくは１０分以内、より好ましくは１分以内に透析又は限外濾過処理を開始する。脂質溶液に含まれる溶媒をできる限り除去するため、置換操作を２回以上行ってもよい。置換回数の上限については限定されない。
【０１０３】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、それを構成する油滴中に、任意の難水溶性薬物を安定に内封することが出来る。難水溶性薬物を内封した本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、細胞内に容易に取り込まれ、当該細胞内へ難水溶性薬物が効率的に導入される。一般に、担体を用いて細胞内へ難水溶性薬物を導入する場合、成功裏に細胞内へ難水溶性薬物が導入されたとしても、細胞内において担体中に難水溶性薬物が取り込まれたままの状態では、その薬物は薬効を十分に発揮することができない。しかしながら、本発明のＯ／Ｗ型エマルションの場合には、式（１）で示される化合物が細胞内の還元的環境により速やかに分解することで、Ｏ／Ｗ型エマルションが崩壊し、内封した難水溶性薬物が速やかに細胞内で放出され、その薬効を発揮することができる。従って、本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、難水溶性薬物の細胞内送達用の担体として有用である。
【０１０４】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションへの難水溶性薬物の内封は、上述したＯ／Ｗ型エマルションの調製において、難水溶性薬物を溶解した脂質溶液を用いて乳化を行うことにより達成することが出来る。本発明は、難水溶性薬物を内封した上記本発明のＯ／Ｗ型エマルションをも提供する。
【０１０５】
本発明において難水溶性薬物とは、化合物の疎水性を評価するために用いられる水／オクタノール分配係数ＬｏｇＰｏｗが４以上の薬物を意味する。このような難水溶性薬物の例としては、タクロリムス（ＬｏｇＰｏｗ：４．７９）、ウルソデオキシコール酸（ＬｏｇＰｏｗ：４．７６）、オキセサゼイン（ＬｏｇＰｏｗ：４．３８）、シンバスタチン（ＬｏｇＰｏｗ：４．７２）、エチニルエストラジオール（ＬｏｇＰｏｗ：４．１１）、クロトリマゾール（ＬｏｇＰｏｗ：４．９３）、ザルトプロフェン（ＬｏｇＰｏｗ：４．２５）、ベタメタゾン吉草酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：４．１４）、ペンタゾシン（ＬｏｇＰｏｗ：４．１５）、イオトロクス酸（ＬｏｇＰｏｗ：４．３２）、インドメタシン（ＬｏｇＰｏｗ：４．２５）、ケトコナゾール（ＬｏｇＰｏｗ：４．０４）、ダナゾール（４．９４）、ビホナゾール（ＬｏｇＰｏｗ：４．６９）、ベクロペタゾンプロピオン酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：４．０７）、メストラノール（ＬｏｇＰｏｗ：４．９４）、アセメタシン（ＬｏｇＰｏｗ：４．４９）、イプリフラボン（ＬｏｇＰｏｗ：４．２５）、カルベジロール（ＬｏｇＰｏｗ：４．０７）、ドンペリドン（ＬｏｇＰｏｗ：４．０５）、メフェナム酸（ＬｏｇＰｏｗ：４．８３）、イトラコナゾール（ＬｏｇＰｏｗ：５．００）、レセルピン（ＬｏｇＰｏｗ：４．４５）、クロルヘキシジン（ＬｏｇＰｏｗ：４．５８）、クリノフィブラート（ＬｏｇＰｏｗ：６．３３）、リボフラビン酪酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：６．２５）、シッカニン（ＬｏｇＰｏｗ：６．１０）、メキタジン（ＬｏｇＰｏｗ：５．２０）、エバスチン（ＬｏｇＰｏｗ：６．８１）、ベニジピン（ＬｏｇＰｏｗ：５．５６）、ベンズブロマロン（ＬｏｇＰｏｗ：６．６５）、エストラジオール安息香酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：５．１０）、ピモジド（ＬｏｇＰｏｗ：５．７６）、ミデカマイシン酢酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：５．５８）、トルナフタート（ＬｏｇＰｏｗ：５．１４）、メピチオスタン（ＬｏｇＰｏｗ：６．８９）、デキサメタゾンパルミチン酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：８．１３）、４-メチルウンベリフェロンパルミチン酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：７．９２）、エルゴカルシフェロール（ＬｏｇＰｏｗ：９．１５）、コレカルシフェロール（ＬｏｇＰｏｗ：９．０８）、トコフェロール（ＬｏｇＰｏｗ：１０．９６）、トコフェロール酢酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：１０．６９）、トコフェロールニコチン酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：１１．３３）、フィトナジオン（ＬｏｇＰｏｗ：１０．３１）、フルフェナジンエナント酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：７．２９）、メナテトレノン（ＬｏｇＰｏｗ：８．７９）、レチノール酢酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：７．１９）、クロラムフェニコールパルミチン酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：８．６９）、カンデサルタンシレキセチル（７．２１）、レチノールパルミチン酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：１４．３２）、ユビデカレノン（ＬｏｇＰｏｗ：１９．１２）、デキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：９．３７）、４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステル（ＬｏｇＰｏｗ：９．１６）などが挙げられる。
【０１０６】
更なる局面において、本出願は、デキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステル、及び４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステルをも提供する。当該化合物は、抗腫瘍剤等として有用である。当該化合物は、本発明において、難水溶性薬物として使用されたときに、コレステロールヘミコハク酸エステルの効果により、血中滞留性が高く、エステル化されていないデキサメタゾンや４−メチルウンベリフェロンと比較して、高い薬効が期待できる。以下に、デキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステル、及び４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステルの合成について具体例を挙げるが、製造方法はこれらに限定されない。
【０１０７】
デキサメタゾンや４−メチルウンベリフェロンの水酸基と、コレステロールヘミコハク酸エステルのカルボン酸を反応させることで所望の化合物が合成できる。この反応には、触媒として、炭酸カリウムや炭酸ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ触媒を使用しても良く、ｐ−トルエンスルホン酸やメタンスルホン酸などの酸触媒、または無触媒で行ってもよい。
【０１０８】
また、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、「ＤＣＣ」と称する）、ジイソプロピルカルボジイミド（以下、「ＤＩＣ」と称する）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下、「ＥＤＣ」と称する）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（以下、「ＤＭＡＰ」と称する場合がある）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（以下、「ＤＩＰＥＡ」と称する場合がある）などの縮合剤を使用してもよい。また、コレステロールヘミコハク酸エステルを、縮合剤を使用して無水物などに変換した後、デキサメタゾンや４−メチルウンベリフェロンの水酸基と反応させてもよい。
【０１０９】
コレステロールヘミコハク酸エステルの仕込み量は、水酸基を有する薬物に対して、1〜５０ｍｏｌ当量であり、好ましくは１〜１０ｍｏｌ当量である。
【０１１０】
触媒量は、反応生成物に対して０．０５〜１００ｍｏｌ当量であり、好ましくは、０．１〜２０ｍｏｌ当量であり、より好ましくは０．２〜５ｍｏｌ当量である。
【０１１１】
反応に使用する溶媒としては、反応を阻害しない溶媒であればよく、特に制限なく使用することができる。例えば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトニトリル、トルエン、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。これらの中ではクロロホルム、トルエン、ジメチルホルムアミドが好ましい。
【０１１２】
反応温度は、０〜１５０℃、好ましくは０〜８０℃であり、より好ましくは、２０〜５０℃である。反応時間は１〜４８時間、好ましくは２〜２４時間である。
【０１１３】
上記反応によって得られた反応物は、抽出精製、再結晶、吸着精製、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの一般的な精製法によって、適宜精製することができる。
【０１１４】
当業者であれば、適宜原料を選択し、本明細書の参考例の方法に準じて反応を行うことにより、所望の化合物を製造することができる。
【０１１５】
難水溶性薬物の疎水性が高い程、本発明のＯ／Ｗ型エマルションに内封されやすくなることが期待されることから、本発明に使用する難水溶性薬物のＬｏｇＰｏｗは高い程好ましく、好ましくは５以上、より好ましくは７以上、さらに好ましくは９以上である。但し、Ｏ／Ｗ型エマルションの調製において使用する脂質溶液の溶媒へ溶解できない薬物は、内封操作が困難となるおそれがある。従って、本発明に使用する難水溶性薬物と、脂質溶液の溶媒の組み合わせは、難水溶性薬物の溶解度（２５℃）が好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上となるものを用いる。
【０１１６】
好ましい態様において、難水溶性薬物として、細胞内に薬効発現のための作用点（標的分子）を有する薬物を使用する。
【０１１７】
尚、本発明のＯ／Ｗ型エマルションを構成する脂質や界面活性剤は、「難水溶性薬物」には包含されない。
【０１１８】
難水溶性薬物を内封した本発明のＯ／Ｗ型エマルションを、目的とする細胞へ接触させることにより、生体内及び／又は生体外において当該細胞内へ難水溶性薬物を導入し、放出させることができる。本発明は、このような、難水溶性薬物の細胞内への送達方法をも提供する。
【０１１９】
当該「細胞」の種類は、特に限定されず、原核生物及び真核生物の細胞を用いることができるが、好ましくは真核生物である。真核生物の種類も、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例えば、カエル等）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の脊椎動物、昆虫（蚕、蛾、ショウジョウバエ等）等の無脊椎動物、植物、微生物（例えば、酵母等）等が挙げられる。より好ましくは、本発明で対象とされる細胞は、動物もしくは植物細胞、さらに好ましくは哺乳動物細胞である。当該細胞は、癌細胞を含む培養細胞株であっても、個体や組織より単離された細胞、あるいは組織もしくは組織片の細胞であってもよい。また、細胞は接着細胞であっても、非接着細胞であってもよい。
【０１２０】
生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）において、難水溶性薬物を内封した本発明のＯ／Ｗ型エマルションと細胞とを接触させる工程を以下において具体的に説明する。
【０１２１】
細胞はＯ／Ｗ型エマルションとの接触の数日前に適当な培地に懸濁し、適切な条件で培養する。Ｏ／Ｗ型エマルションの接触時において、細胞は増殖期にあってもよいし、そうでなくてもよい。
【０１２２】
当該接触時の培養液は、血清含有培地であっても血清不含培地であってもよい。
【０１２３】
当該接触時の細胞密度は、特には限定されず、細胞の種類等を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常１×１０４〜１×１０７細胞／ｍＬの範囲である。
【０１２４】
このように調製された細胞に、上述の難水溶性薬物を内封した本発明のＯ／Ｗ型エマルションを添加する。該懸濁液の添加量は、特に限定されず、細胞数等を考慮して適宜設定することが可能である。細胞へ接触させる際のＯ／Ｗ型エマルションの濃度は、目的とする難水溶性薬物の細胞内への導入が達成可能な限り特には限定されないが、脂質濃度として、通常１〜１０ｎｍｏｌ／ｍＬ、好ましくは１０〜５０ｎｍｏｌ／ｍＬである。
【０１２５】
上述の懸濁液を細胞に添加した後、該細胞を培養する。培養時の温度、湿度、ＣＯ２濃度等は、細胞の種類を考慮して適宜設定する。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、通常、温度は約３７℃、湿度は約９５％、ＣＯ２濃度は約５％である。また、培養時間も用いる細胞の種類等の条件を考慮して適宜設定できるが、通常０．１〜２４時間の範囲であり、好ましくは０．２〜４時間の範囲であり、より好ましくは０．５〜２時間の範囲である。上記培養時間が短すぎると、難水溶性薬物が十分細胞内へ導入されず、培養時間が長すぎると、細胞が弱ることがある。
【０１２６】
上述の培養により、難水溶性薬物が細胞内へ導入されるが、好ましくは培地を新鮮な培地と交換するか、又は培地に新鮮な培地を添加して更に培養を続ける。細胞が哺乳動物由来の細胞である場合は、新鮮な培地は、血清又は栄養因子を含むことが好ましい。
【０１２７】
また、上述の通り、本発明のＯ／Ｗ型エマルションを用いることで、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）のみならず、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）においても難水溶性薬物を細胞内へ導入することが可能である。即ち、難水溶性薬物を内封した本発明のＯ／Ｗ型エマルションを対象へ投与することにより、該Ｏ／Ｗ型エマルションが標的細胞へ到達・接触し、生体内で該Ｏ／Ｗ型エマルションに内封された難水溶性薬物が細胞内へ導入される。該Ｏ／Ｗ型エマルションを投与可能な対象としては、特に限定されず、例えば、哺乳類（例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウシ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、ダチョウ等）、両生類（例えば、カエル等）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ等）等の脊椎動物、昆虫（例えば、蚕、蛾、ショウジョウバエ等）等の無脊椎動物、植物等を挙げることができる。本発明のＯ／Ｗ型エマルションの投与対象は、好ましくはヒト又は他の哺乳動物である。
【０１２８】
標的細胞の種類は特に限定されず、本発明のＯ／Ｗ型エマルションを用いることで、種々の組織（例えば、肝臓、腎臓、膵臓、肺、脾臓、心臓、血液、筋肉、骨、脳、胃、小腸、大腸、皮膚、脂肪組織等）中の細胞へ、難水溶性薬物を導入することが可能である。
【０１２９】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションは体積メディアン径を１００ｎｍ以下とすることにより、腫瘍等の組織深部への効率的な送達が可能なので、難水溶性薬物（例えば、難水溶性の抗腫瘍剤）を腫瘍組織（例、固形腫瘍組織）中の腫瘍細胞へ送達するのに有利である。
【０１３０】
また、式（１）の化合物としてＢ−２−５を含む本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、肝臓への集積性に優れているので、難水溶性薬物（例えば、難水溶性の肝臓疾患治療剤）を肝組織中の細胞（例、肝細胞）へ送達するのに有利である。
【０１３１】
難水溶性薬物を内封した本発明のＯ／Ｗ型エマルションの対象（例えば、脊椎動物、無脊椎動物など）への投与方法は、標的細胞へ該Ｏ／Ｗ型エマルションが到達・接触し、該Ｏ／Ｗ型エマルションに内封された難水溶性薬物を細胞内へ導入可能な方法であれば特に限定されず、難水溶性薬物の種類、標的細胞の種類や部位等を考慮して、自体公知の投与方法（例えば、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、スプレー等）等）を適宜選択することができる。該Ｏ／Ｗ型エマルションの投与量は、難水溶性薬物の細胞内への導入を達成可能な範囲であれば、特に限定されず、投与対象の種類、投与方法、難水溶性薬物の種類、標的細胞の種類や部位等を考慮して適宜選択することができる。
【０１３２】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションを、難水溶性薬物を細胞内へ送達するための担体として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。
【０１３３】
該担体が研究用試薬として提供される場合、当該本発明の担体は、本発明のＯ／Ｗ型エマルションをそのままで、あるいは例えば水もしくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば、水溶性溶媒（例えば、リンゴ酸緩衝液等）、有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯなど）もしくは水溶性溶媒と有機溶媒との混合液等）との懸濁液を用いて提供され得る。本発明の担体は適宜、自体公知の生理学的に許容し得る添加剤（例えば、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）を含むことが出来る。
【０１３４】
また、該担体が医薬として提供される場合、当該本発明の担体は、本発明のＯ／Ｗ型エマルションをそのままで用いて、あるいは医薬上許容される公知の添加剤（例えば、担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等）とともに用い、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって、経口剤（例えば、錠剤、カプセル剤等）あるいは非経口剤（例えば注射剤、スプレー剤等）として、好ましくは非経口剤（より好ましくは、注射剤）として製造することができる。
【０１３５】
ここで述べられた特許、特許出願明細書、科学文献を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【０１３６】
以下に本発明の実施例について更に詳細に説明するが、本発明は当該実施例に何ら限定されない。
【実施例】
【０１３７】
［実施例１］  微小Ｏ／Ｗ型エマルションの調製
カチオン性脂質としてＢ−２、Ｂ−２−５、Ｏ−Ｃ３Ｍ、Ｂ−２−３、ＴＳ−Ｐ４Ｃ２又はＬ−ＰＺ４Ｃ２を用い、カチオン性脂質：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＝３：４：３（モル比）からなる組成のＯ／Ｗ型エマルションを調製した。本調製においては、モデル薬物として４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎを１０モル％、ＰＥＧ脂質としてＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を１０モル％およびＤＳＧ−ＰＥＧ２０００を２．５モル％を用い、脂質濃度に換算して１．０ｍＭ相当のエマルションを調製した。【０１３８】
カチオン性脂質、ＤＯＰＥ、及びＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌの合計が１０００ｎｍｏｌとなるようエタノール溶液を調製し、さらにモデル薬物及びＰＥＧ脂質を上記の量加えた。エタノールで全量を４００μＬとした後、氷温で１５分静置した。同じく氷冷したリンゴ酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ３．０、３０ｍＭ  ＮａＣｌ）を４００μＬ、ボルッテクス下３秒以内に混合した。そこへ直ちにＰＢＳ（ニッスイ）を３２００μＬ添加した。混合物に対しＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ミリポア）を用いて限外濾過を行った。遠心条件として１０００ｇ、２５℃を用いた。１０分間の遠心の後３２００μＬのＰＢＳを加える操作を二度行った後、サンプルを濃縮し５００μＬ前後とした。質量が１０００ｍｇとなるようにＰＢＳで希釈し、脂質濃度に換算して１ｍＭのエマルションとした。【０１３９】
作製したエマルションの粒子径分布をゼータサイザーナノＺＳを用いた動的光散乱法により計測した。測定条件として、１ｍＭのエマルション４０μＬを２５℃で計測した。その結果全ての組成において体積メディアン径は１００ｎｍ以下であり、直鎖状頭部を用いた場合（即ち、式（I）のＸａ及びＸｂがＸ１の場合）、粒子径は５０ｎｍ以下であった。薬物回収率は８５％以上であった（図１、表２）。【０１４０】
【表２】
2017061150.tif 000011
【０１４１】
［比較例１］  従来型脂質ＤＯＤＡＰおよびＥＰＣを用いた調製
カチオン性脂質としてＤＯＤＡＰを用い、ＤＯＤＡＰ：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＝３:４:３（モル比）からなる組成の粒子を調製した。本調製においては、モデル薬物として４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎを１０モル％、ＰＥＧ脂質としてＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を１０モル％およびＤＳＧ−ＰＥＧ２０００を２．５モル％用い、脂質濃度に換算して１．０ｍＭ相当の粒子懸濁液を調製した。粒子の調製、粒子径分布の取得については実施例１に記載の方法に従った。【０１４２】
中性脂質としてＥＰＣを用い、ＥＰＣ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＝３：２からなる組成の粒子を調製した。本調製においてはモデル薬物として４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎを１０モル％、ＰＥＧ脂質としてＤＳＧ−ＰＥＧ２０００を２．５モル％用い、脂質濃度に換算して１．０ｍＭ相当の粒子懸濁液を調製した。【０１４３】
ＥＰＣ及びＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌを１０００ｎｍｏｌとなるよう混合し、さらにＰＥＧ脂質を加えた。脂質エタノール溶液と等量のクロロホルムを添加し、窒素通気下にて乾燥させた。乾燥後の脂質膜へＰＢＳを１ｍＬ加え１０分間静置の後、バスタイプソニケーターで３分間超音波処理を行い、粒子懸濁液とした。作製した粒子の粒子径分布を実施例１と同様に動的光散乱法により計測した。【０１４４】
その結果ＤＯＤＡＰの体積メディアン径は３４．８ｎｍ、ＰｄＩは０．４１８、モデル薬物回収率は７６．７％であった。ＥＰＣの体積メディアン径は４８．１ｎｍであったが、目視で凝集塊が認められた（図２、表３）。【０１４５】
【表３】
2017061150.tif 000012
【０１４６】
［実施例２］  Ｏ／Ｗ型エマルションに対するｐＨの影響
カチオン性脂質としてＢ−２を用い、カチオン性脂質：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＝３:４:３（モル比）またはカチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＝３：４：３（モル比）からなる組成のＯ／Ｗ型エマルションを調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を１５モル％用い、脂質濃度にして０．５ｍＭのエマルションを作製した。【０１４７】
Ｂ−２、ＤＯＰＥ及びＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌの合計が５００ｎｍｏｌになるようエタノール溶液を調製し、さらにＰＥＧ脂質を上記の量加えた。エタノールで全量を２００μＬとした後、氷温で１５分静置した。同じく氷冷したリンゴ酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ３．０−ｐＨ５．０）を２００μＬ、ボルッテクス下３秒以内に混合した。そこへ直ちにＰＢＳ（ニッスイ）を３６００μＬ添加した。混合物に対しＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ミリポア）を用いて限外濾過を行った。遠心条件として１０００Ｇ、２５℃を用いた。１０分間の遠心の後３２００μＬのＰＢＳを加える操作を二度行った後、サンプルを濃縮し５００μＬ前後とした。質量が１０００ｍｇとなるようにＰＢＳで希釈し０．５ｍＭのエマルション溶液とした。【０１４８】
作成したエマルション溶液の粒子径分布を実施例１と同様に動的光散乱により計測した。その結果ＤＯＰＣを用いた場合、体積メディアン径はｐＨに依らず４０ｎｍ付近を示した。ＤＯＰＥを用いた場合は体積メディアン径にｐＨ依存性が見られ、ｐＨ３．０で４０ｎｍ程度の最も小さな粒子となった。このため、微小粒子を作成するための条件としてｐＨ３．０が優れていた（図３、表４）。【０１４９】
【表４】
2017061150.tif 000013
【０１５０】
［実施例３］  Ｂ−２  Ｏ／Ｗ型エマルションに対する塩濃度の影響
カチオン性脂質としてＢ−２を用い、カチオン性脂質：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＝３:４:３（モル比）からなる組成のＯ／Ｗ型エマルションを調製した。本調製においては、ＰＥＧ脂質としてＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を１５モル％用い、脂質濃度にして０．５ｍＭのエマルションを作製した。【０１５１】
Ｂ−２、ＤＯＰＥ及びＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌの合計が５００ｎｍｏｌになるようエタノール溶液を調製し、さらにＰＥＧ脂質を上記の量加えた。エタノールで全量を２００μＬとした後、氷温で１５分静置した。同じく氷冷したリンゴ酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ３．０、０−１０００ｍＭ  ＮａＣｌ）を２００μＬ、ボルッテクス下３秒以内に混合した。そこへ直ちにＰＢＳ（ニッスイ）を３６００μＬ添加した。混合物に対しＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ミリポア）を用いて限外濾過を行った。遠心条件として１０００Ｇ、２５℃を用いた。１０分間の遠心の後３２００μＬのＰＢＳを加える操作を二度行った後、サンプルを濃縮し５００μＬ前後とした。質量が１０００ｍｇとなるようにＰＢＳで希釈し脂質濃度として０．５ｍＭのエマルションとした。作製したエマルションの粒子径分布を、実施例１と同様に動的光散乱により計測した。【０１５２】
その結果、体積メディアン径は６０ｍＭ以下のＮａＣｌ濃度において３０〜５０ｎｍとなることが示された。また５００ｍＭ以下の塩濃度では、体積メディアン径を１００ｎｍ以下に制御可能であることが示された（図４、図５）。【０１５３】
［実施例４］  薬物放出と還元応答性試験
カチオン性脂質としてＢ−２、Ｂ−２−５、Ｏ−Ｃ３Ｍ、Ｂ−２−３、ＴＳ−Ｐ４Ｃ２又はＬ−ＰＺ４Ｃ２を用い、カチオン性脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＝３：４：３（モル比）からなる組成のＯ／Ｗ型エマルションを調製した。本調製においてはＰＥＧ脂質としてＤＳＧ−ＰＥＧ２０００を９モル％用いた。また薬物モデル分子として４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎ  Ｐａｌｍｉｔａｔｅを３０モル％用い、粒子濃度による補正のために蛍光プローブＤｉＤを１モル％用いた。【０１５４】
カチオン性脂質、ＤＯＰＥ及びＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌの合計が１０００ｎｍｏｌになるようエタノール溶液を調製し、さらにＰＥＧ脂質、薬物モデル分子及び蛍光プローブを上記の量加えた。エタノールで全量を４００μＬとした後、３７℃で１５分静置した。同じく加温したリンゴ酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ３．０、３０ｍＭ  ＮａＣｌ）を４００μＬ、ボルッテクス下３秒以内に混合した。そこへ直ちにＰＢＳ（ニッスイ）を３２００μＬ添加した。混合物に対しＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（ミリポア）を用いて限外濾過を行った。遠心条件として１０００ｇ、２５℃を用いた。１０分間の遠心の後３２００μＬのＰＢＳを加える操作を二度行った後、サンプルを濃縮し５００μＬ前後とした。質量が１０００ｍｇとなるようにＰＢＳで希釈し脂質濃度として１ｍＭのエマルションとした。【０１５５】
作製したエマルションの内４００μＬを分子量カットオフ１０００の透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂ）に入れ、４０ｍＬのＰＢＳに対し３７℃にて透析した。この際、還元に対する応答性を調べるため１０ｍＭグルタチオンを含む４０ｍＬのＰＢＳに対しても同様に透析を行った。各タイムポイントにおいてにおいて透析チューブ内の溶液を３０μＬ回収した。回収サンプルはＰＢＳで３倍希釈した後、５μＬを３００μＬのホウ酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ１０．４）、１５０μＬのエタノール、及び５０μＬの１０％ＳＤＳと混合した（合計５０５μＬ）。６０℃で３０分浸透撹拌した後、溶液中の４ＭＵおよびＤｉＤ量を蛍光測定により定量した（４ＭＵ：Ｅｘ３８５、Ｅｍ４５０  ＤｉＤ：Ｅｘ６４５、Ｅｍ６６５）。４ＭＵの残存量をＤｉＤの残存量で除することにより粒子に対する薬物残存量とした。【０１５６】
その結果、非還元環境下において本Ｏ／Ｗ型エマルションは２４時間まで安定に薬物を保持する一方で、還元条件下では２４時間でほぼ完全な薬物の放出が認められた（図６、図１４）。このことから本Ｏ／Ｗ型エマルションは細胞内還元環境における薬物放出性を持つと考えられた。【０１５７】
［比較例２］  薬物放出と還元応答性試験（ＤＯＤＡＰ、ＥＰＣ）
従来型脂質としてＤＯＤＡＰ、又はＥＰＣを用い、従来型脂質：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ＝３：４：３（モル比）からなる組成の粒子懸濁液を調製した。本調製においてはＰＥＧ脂質としてＤＳＧ−ＰＥＧ２０００を９モル％用いた。また薬物モデル分子として４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎ  Ｐａｌｍｉｔａｔｅを３０モル％用い、粒子濃度による補正のために蛍光プローブＤｉＤを１モル％用いた。
粒子の調製及び薬物放出試験は実施例３に記載の方法で行った。
その結果、還元に対する応答性は認められず、薬物モデル物質はどの条件においても２４時間にわたってほぼ放出されなかった（図７）。【０１５８】
［試験例１］  Ｏ／Ｗ型エマルションの粒子の臓器集積性
カチオン性脂質としてＢ−２およびＢ−２−５を用いた。従来型脂質としてＤＯＤＡＰ及びＥＰＣを用いた。Ｏ／Ｗ型エマルション及び粒子懸濁液（ＤＯＤＡＰ、ＥＰＣ）の作製方法は実施例１および比較例１に記載の方法に従った。Ｏ／Ｗ型エマルション又は粒子懸濁液（ＤＯＤＡＰ、ＥＰＣ）を構成する油滴の体内動態を可視化するため、蛍光色素ＤｉＲを脂質の０．２モル％分加えた。粒子濃度は脂質濃度にして４ｍＭとなるよう調整した。【０１５９】
担がんマウスとして４Ｔ１細胞（マウス乳がん）を用いた。Ｂａｌｂ／ｃマウス（♀、４週齢）の右わき腹皮下へ１×１０６個の４Ｔ１細胞を移植した。移植から７日目に蛍光修飾粒子を含むＯ／Ｗ型エマルション又は粒子懸濁液（ＤＯＤＡＰ、ＥＰＣ）を２００μＬ（脂質８００ｎｍｏｌ）静脈内投与した。投与２４時間後、肝脱血を行った後脾臓、肝臓、腫瘍を回収し、ＩＶＩＳで画像を取得した。平均蛍光強度はＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて算出した。
その結果Ｂ−２−５は肝臓への集積が認められた。ＥＰＣは脾臓への集積が認められ、粗大な凝集塊の寄与が考えられる。Ｂ−２およびＤＯＤＡＰは腫瘍へ良好に移行することが示された（図８、９）。【０１６０】
［試験例２］  腫瘍集積性のＯ／Ｗ型エマルションの粒子径依存性
カチオン性脂質としてＢ−２を用いた。Ｏ／Ｗ型エマルションの調製は実施例３に従い行った。本調製においては、モデル薬物として４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎを１０モル％、ＰＥＧ脂質としてＤＭＧ−ＰＥＧ２０００を１０モル％およびＤＳＧ−ＰＥＧ２０００を２．５モル％を用い、脂質濃度に換算して４．０ｍＭ相当のエマルションを調製した。Ｏ／Ｗ型エマルション又は粒子懸濁液（ＤＯＤＡＰ、ＥＰＣ）を構成する油滴の体内動態を可視化するため、蛍光色素ＤｉＲを脂質の０．２モル％分加えた。粒子作製時の塩（ＮａＣｌ）濃度として３０ｍＭ、１５０ｍＭ、７５０ｍＭを選択し、それぞれ“Ｓｍａｌｌ”、 “Ｍｅｄｉｕｍ”、“Ｌａｒｇｅ”とした。粒子濃度は脂質濃度にして４ｍＭとなるよう調整した。【０１６１】
担がんマウスにおける臓器の分布性評価については試験例１と同様に行った。その結果、粒子径が小さくなるほど脾臓、肝臓への集積が低下した。一方で粒子径が小さくなるほど腫瘍への集積が増加し、最も集積性が高い粒子は“Ｓｍａｌｌ”であった。このことから微小なＯ／Ｗエマルションは腫瘍に対する薬物送達に適していることが示唆された（図１０）。【０１６２】
［試験例３］  腫瘍内粒子分布
カチオン性脂質としてＢ−２およびＢ−２−５を用いた。従来型脂質としてＤＯＤＡＰ及びＥＰＣを用いた。Ｏ／Ｗ型エマルション及び粒子懸濁液（ＤＯＤＡＰ、ＥＰＣ）は実施例１および比較例１に記載の方法に従い作製した。Ｏ／Ｗ型エマルション又は粒子懸濁液（ＤＯＤＡＰ、ＥＰＣ）を構成する油滴の体内動態を可視化するため、蛍光色素ＤｉＤを脂質の１．０％分加えた。粒子濃度は脂質濃度にして４ｍＭとなるよう調整した。【０１６３】
担がんマウスの作製と静脈内投与は試験例１と同様に行った。投与２４時間後、腫瘍を回収しマイクロスライサーで厚さ４００μｍの切片を作成した。ＤｉＤの蛍光を共焦点レーザースキャン顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ａ−１）にて取得した。画像は１０倍のレンズにて取得し、腫瘍全体にわたるラージイメージとして取得した。画像の定量はＩｍａｇｅＪにて行った。Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ（ＣＶ；画像内のムラの指標）は全ピクセル強度の分散をピクセル強度の平均値で除することで算出した。
その結果、Ｂ−２およびＤＯＤＡＰは画像のムラを表すＣＶ値が低いことが明らかとなった。これは粒子の微小化により腫瘍への浸透性が向上したためと考えられた（図１１、図１２）。【０１６４】
［試験例４］  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ｐａｌｍｉｔａｔｅ（ＤｅｘＰａｌ）搭載粒子の抗腫瘍効果
１．ＤｅｘＰａｌ搭載粒子の調製
カチオン性脂質としてＢ−２又はＤＯＤＡＰを用い、脂質のエタノール溶液として、５ｍＭカチオン性脂質  ６０μＬ、５ｍＭ  ＤＯＰＣ  ８０μＬ、５ｍＭ  Ｃｈｏｌ  ６０μＬ、１ｍＭ  ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００  １００μＬ、１ｍＭ  ＤＳＧ−ＰＥＧ２０００  ３０μＬ、及び１０ｍＭ  ＤｅｘＰａｌ  ３０μＬを５ｍＬチューブ内で混合し、エタノールを加えて４００μＬとした。中性脂質としてＥＰＣを用い、５ｍＭ  ＥＰＣ  １４０μＬ、５ｍＭ  Ｃｈｏｌ  ６０μＬ、１ｍＭ  ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００  １００μＬ、１ｍＭ  ＤＳＧ−ＰＥＧ２０００  ３０μＬ、及び１０ｍＭ  ＤｅｘＰａｌ  ３０μＬを５ｍＬチューブ内で混合し、エタノールを加えて４００μＬとした。本脂質エタノール溶液を氷上で１０分静置した。脂質エタノール溶液を撹拌しながら、氷冷２０ｍＭ  リンゴ酸緩衝液（ｐＨ  ３．０、３０ｍＭ  ＮａＣｌ）４００μＬを加え、数秒撹拌後、氷冷リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）２０００μＬを添加し数秒撹拌した。リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）１２００μＬを添加し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用い、以下の遠心条件（室温，１０００ｇ，３ｍｉｎ）で約５００μＬまで繰り返し限外濾過し濃縮した。リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）４０００μＬを添加し、同条件で再度約５００μＬまで限外濾過し濃縮した。この操作を再度繰り返した。リン酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）で１０００μＬまでメスアップし、１ｍＭ  ＤｅｘＰａｌ搭載粒子（油滴）を含むＯ／Ｗ型エマルション及び粒子懸濁液を得た。【０１６５】
２．ＤｅｘＰａｌ搭載粒子の粒子径、及び表面電位の測定
体積メディアン径並びに表面電位は、実施例１と同様に動的光散乱法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ；Ｍａｌｖｅｒｎ社）を用いて測定した。調製された各種粒子の体積メディアン径、表面電位を表５に示す。【０１６６】
【表５】
2017061150.tif 000014
【０１６７】
３．ＤｅｘＰａｌ搭載ＬＮＰのＤｅｘＰａｌ搭載率の測定
１ｍＭ  ＤｅｘＰａｌ搭載ＬＮＰ  ５０μＬをリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）５０μＬと混合し、うち５０μＬをＭｅＯＨ  ５０μＬと混合した。０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル  ４００μＬを添加し、高速液体クロマトグラフィーによりＤｅｘＰａｌを検出した（カラム：ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８、５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ（ジーエルサイエンス社）、移動相：ＭｅＯＨ：０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル＝７０：３０、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、検出器：２４０ｎｍ、注入量：２００μＬ）。ＤｅｘＰａｌの検量線として、０．５ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．１２５ｍＭ、０．０６２５ｍＭ、ＤｅｘＰａｌエタノール溶液５０μＬをＭｅＯＨ  ５０μＬと混合し、うち５０μＬをリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．４）５０μＬと混合した。０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル  ４００μＬを添加し、ＤｅｘＰａｌ搭載ＬＮＰと同様の方法でＤｅｘＰａｌを検出した。ピーク面積と濃度をプロットし、ＤｅｘＰａｌ搭載ＬＮＰ中のＤｅｘＰａｌ濃度、及び搭載率を算出した。各種ＤｅｘＰａｌ搭載ＬＮＰの搭載率を表６に示す。【０１６８】
【表６】
2017061150.tif 000015
【０１６９】
４．ＤｅｘＰａｌ搭載ＬＮＰのＥＧ７−ＯＶＡリンパ腫に対する抗腫瘍効果の検証
ＥＧ７−ＯＶＡ（ＯＶＡ発現ＥＬ４リンパ腫）をＣ５７ＢＬ／６Ｌ（６〜８週齢、♀）の右脇腹皮下に、８．０×１０５  ｃｅｌｌｓ移植し、１週間後に次の式に従い腫瘍体積を算出した：（長軸（ｍｍ３））×（短軸（ｍｍ３））２×０．５２）。腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３である担癌マウスをランダムにグループ分けした。その２４時間後、上記調製した、Ｂ−２、ＤＯＤＡＰ、又はＥＰＣを含むＤｅｘＰａｌ搭載ＬＮＰ、及び水溶性Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ製剤としてＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤｅｘＰｈｏｓ）を、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ換算で１ｍｇ／ｍＬとなるように尾静脈内投与した。その２４時間後、４８時間後に同様のＤｅｘＰａｌ搭載ＬＮＰ、及びＤｅｘＰｈｏｓを投与し、最終投与２４時間後に腫瘍体積を算出した。移植後１週間の腫瘍体積を１００％とした際の、最終投与の２４時間後における腫瘍体積の割合を図１３に示す。【０１７０】
［実施例５］  ４‐メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステル（４ＭＵ−ＣＨＥＭＳ）、デキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステル（Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳ）内封Ｏ／Ｗ型エマルションの作製
１．４ＭＵ−ＣＨＥＭＳ内封Ｏ／Ｗ型エマルションの作製
Ｂ−２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝３：４：３にＤＳＧ−ＰＥＧ２０００を９モル％、４ＭＵ−ＣＨＥＭＳを３０モル％加え、更に蛍光色素ＤｉＤを１モル％加え、実施例１と同様にエマルションを作製した。【０１７１】
２．Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳ内封Ｏ／Ｗ型エマルションの作製
脂質組成：Ｂ−２／ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／４／３、１０ｍｏｌ％  Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳ、１０ｍｏｌ％  ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００及び３ｍｏｌ％  ＤＳＧ−ＰＥＧ２０００にて、実施例１と同様な方法でエマルションを作製した。
作製した粒子の平均粒子径を実施例１と同様に測定した結果を表７に示す。【０１７２】
【表７】
2017061150.tif 000016
【０１７３】
［試験例５］  血中滞留性試験：４−メチルウンベリフェロンパルミチン酸エステル（４ＭＵ−Ｐａｌ）と４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステル（４ＭＵ−ＣＨＥＭＳ）の比較
Ｂ−２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ＝３：４：３の脂質混合物にＤＳＧ−ＰＥＧ２０００を９モル％、及び４ＭＵ−Ｐａｌを３０モル％加え、更に蛍光色素ＤｉＤを１モル％加え実施例１と同様な方法でエマルションを作製した。
Ｂ−２：ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：４ＭＵ−ＣＨＥＭＳ＝３：４：１．５：１．５の脂質混合物にＤＳＧ−ＰＥＧ２０００を１５モル％加え、さらに蛍光色素ＤｉＤを１モル％加え、実施例１と同様な方法でエマルションを作製した。
粒子懸濁液の濃度を脂質濃度（Ｂ−２＋ＤＯＰＣ＋Ｃｈｏｌ）で４ｍＭとした。ＩＣＲマウス♂４週齢に対し該懸濁液を尾静脈から２５０μＬを投与した。各タイムポイントで血液を２５μＬ回収し、ｐＨ１０．４ホウ酸バッファー２７５μＬ、エタノール１５０μＬ、１０％ＳＤＳ５０μＬと混合した。６０℃で３０分インキュベーションすることにより、４ＭＵ−Ｐａｌまたは４ＭＵ−ＣＨＥＭＳを加水分解した。生成する４-メチルウンベリフェロン、および粒子に修飾されたＤｉＤの蛍光をそれぞれプレートリーダで計測し、検量線から血中残存量を調べた結果を図１５に示す。４ＭＵ−ＣＨＥＭＳは４ＭＵ−Ｐａｌよりも長く血中を滞留した。【０１７４】
［試験例６］  血中滞留性試験：４ＭＵ−ＣＨＥＭＳの腫瘍と血中濃度の比較
Ｂ−２：ＤＯＰＣ：４ＭＵ−ＣＨＥＭＳ＝３：４：３の脂質混合物に、ＤＳＧ−ＰＥＧ２０００を２０モル％加え、粒子を作製した。粒子懸濁液の濃度を脂質濃度で８ｍＭとした。４Ｔ１細胞を皮下移植したＢａｌｂ／ｃマウス（♀４週齢、移植７日）に尾静脈から２００μＬ投与した。血中滞留性は試験例５と同様に調べた。腫瘍内濃度については、各タイムポイントで腫瘍を回収し、細断の後２５ｍｇを量り取った。ｐＨ１０．４ホウ酸バッファー３００μＬ、エタノール１５０μＬ、及び１０％ＳＤＳ５０μＬを加え、ホモジェナイズした。ホモジェネートを６０℃で３０分間インキュベーションした後、１４０００ｇで５分間遠心し上清の蛍光強度を調べ、検量線から存在量を見積もった。【０１７５】
比較対象として４−メチルウンベリフェロンとＤＳＧ−ＰＥＧ２０００からなるミセルを用いた。２％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ中でＤＳＧ−ＰＥＧ２０００を１．６ｍＭ、４ＭＵを２．４ｍＭとなるようミセルを調製した。投与、定量に関しては粒子と同様に行った。図１６に結果を示した。Ｂ−２と４ＭＵ−ＣＨＥＭＳからなるエマルションは４−メチルウンベリフェロンとＤＳＧ−ＰＥＧ２０００からなるミセルと比較して、長く血中を滞留し、腫瘍へ集積した。【０１７６】
［試験例７］  ４ＭＵ−ＣＨＥＭＳ内封エマルションの臓器分布
Ｂ−２：ＤＯＰＣ：４ＭＵ−ＣＨＥＭＳ＝３：４：３にＤＳＧ−ＰＥＧ２０００を２０モル％加え、蛍光色素ＤｉＤを１モル％加え、実施例１と同様にエマルションを調製した。粒子懸濁液を脂質濃度で８ｍＭとなるよう調整し、４Ｔ１細胞を皮下移植したＢａｌｂ／ｃマウス（♀４週齢）に尾静脈から２００μＬ投与した。ヘパリン／ＰＢＳで肝臓を脱血した後、肝臓、肺、心臓、腎臓、脾臓、腫瘍を取り出し、ＩＶＩＳによりＤｉＤの蛍光を取得した。また、各臓器に関する平均ピクセル強度を算出した。さらに、それぞれの腫瘍を細断し、２５ｍｇを量り取った。Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳでホモジェナイズした後遠心し、上清に含まれるＤｉＤの蛍光をプレートリーダーで取得した。結果を図１７に示した。Ｂ−２と４ＭＵ−ＣＨＥＭＳからなるエマルションは腫瘍に集積し、経時的に集積量が増大した。【０１７７】
［試験例８］  血中滞留性評価
１.デキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステル（Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳ）とＢ−２からなるエマルションの調製
脂質組成が３ｍＭ Ｂ−２／ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／４／３  ＋１０ｍｏｌ％Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳ＋１０ｍｏｌ％ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００  ＋１０ｍｏｌ％ＤＳＧ−ＰＥＧ２０００  （１０００  μＬ）の場合、以下のように脂質溶液を試験管内で混合した。【０１７８】
【表８】
2017061150.tif 000017
【０１７９】
溶媒を一度留去し、１００  μＬのＣＨＣｌ３で再溶解させた。Ｎ２ガスを吹き付け、試験管壁に脂質薄膜を形成させた。デシケーターで数時間真空処理後、２０ｍＭ  Ｍａｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｕｆｆｅｒ  （３０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ  ３．０）  １０００μＬを添加し、１０ｍｉｎ室温でインキュベートした。バス型ソニケーターで３０ｓｅｃ超音波処理後、プローブ型ソニケーターで５ｍｉｎ超音波処理した（出力：３０%）。４℃，１５０００ｇ，５ｍｉｎで遠心後、上清を回収した。３６ｍＭ  ＮａＯＨ／ＰＢＳを等量加えて中和を行なった。【０１８０】
２．Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳの定量
各粒子１００μＬを１．５ｍＬチューブへ移し、コンセントレーター（Ｈｅａｔ：Ｈｉｇｈ）で３０ｍｉｎ乾燥した。０．１％ＴＦＡ／Ｈｅｘａｎｅ：０．１％ＴＦＡ／ＥｔＯＨ＝９：１  １００μＬに溶解させ、ＨＰＬＣを用いてＤｅｘ−ＣＨＥＭＳのピーク面積を用いて回収率を算出した（ＨＰＬＣ条件…移動相：０．１％ＴＦＡ／Ｈｅｘａｎｅ：０．１％ＴＦＡ／ＥｔＯＨ＝９：１、カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ＳＬ−ＩＩ、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、分析時間：１０ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出波長：２４０ｎｍ、Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳのピーク：３．９０ｍｉｎ）。また、Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳの検量線として、０．５，０．２５，０．１２５，０．０６２５ｍＭ  Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳ  ｉｎ  ０．１％ＴＦＡ／Ｈｅｘａｎｅ：０．１％ＴＦＡ／ＥｔＯＨ：ＣＨＣｌ３＝８：１：１を用いた。【０１８１】
３．投与、血液回収
Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳとＢ−２からなるエマルションをＩＣＲマウス（４ｗ♂）に対して、２５μｇＤｅｘ−ＣＨＥＭＳ／ｍｏｕｓｅで投与した。２６Ｇ注射針を用いて、投与後１ｍｉｎ，１ｈｒ，６ｈｒ，２４ｈｒに尾静脈から４０μＬの血液を採取し、１μＬの５０００Ｕ／ｍＬヘパリンナトリウム入りＰＣＲチューブに素早く加え、タッピングにより混和後、氷上で保存した。【０１８２】
４．Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳの測定
４℃，１０００ｇ，１０ｍｉｎで遠心し血漿１６．５μＬを別の１．５ｍＬチューブへ移した。ＤＤＷで５０μＬとし、６２．５μＬのＣＨＣｌ３、１２５μＬの０．０４ｍＭ  ４−メチルウンベリフェロンパルミチン酸エステル（４ＭＵ−Ｐａｌ）  ｉｎ  ＭｅＯＨ（４ＭＵ−Ｐａｌを標準物質として使用した）を加えたのち、３０ｓｅｃボルテックスした。６２．５μＬのＣＨＣｌ３、６２．５μＬのＤＤＷを加えたのち、３０ｓｅｃボルテックスし、４℃，１５０００ｇ，５ｍｉｎで遠心した。下層のＣＨＣｌ３  １００μＬを別のチューブに回収し、溶媒を留去後、０．１％ＴＦＡ／Ｈｅｘａｎｅ：０．１％ＴＦＡ／ＥｔＯＨ＝９：１  １００μＬに溶解し、ＨＰＬＣを用いてＤｅｘ−ＣＨＥＭＳのピーク面積、及び４ＭＵ−Ｐａｌのピーク面積を算出した。また０．５，０．２５，０．１２５，０．０６２５ｎｍｏｌのＤｅｘ−ＣＨＥＭＳを同様の方法でＨＰＬＣを用いてピーク面積を算出し、検量線として用いた。
（ＨＰＬＣ条件：移動相：０．１％ＴＦＡ／Ｈｅｘａｎｅ：０．１％ＴＦＡ／ＥｔＯＨ＝９：１、カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ＳＬ−ＩＩ、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、分析時間：１０ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、検出波長：２４０ｎｍ（Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳ）又は２８０ｎｍ（４ＭＵ−Ｐａｌ）、Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳ：３．９０ｍｉｎ、４ＭＵ−Ｐａｌのピーク：３．２７ｍｉｎ）。【０１８３】
投与１分後を１００％とした場合の１時間後の血中残存率を算出した結果を図１８に示した。上記と同様にＢ−２とデキサメタゾンパルミチン酸エステル（Ｄｅｘ−Ｐａｌ）からなるエマルションを調製し、同様に評価したところ、Ｄｅｘ−Ｐａｌは１時間後には血中から消失したのに対し、Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳは滞留を続けていた。【０１８４】
［試験例９］  ＰＥＧ脂質の濃度の影響
Ｂ−２／ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／４／３＋１０ｍｏｌ％  ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００＋３〜９ｍｏｌ％  ＤＳＧ−ＰＥＧ２０００＋１０ｍｏｌ％  Ｄｅｘ―ＣＨＥＭＳの組成にて、実施例１と同様にエマルションを作製した。各ＰＥＧ量のエマルションをマウス尾静脈より投与し、１ｍｉｎ，１ｈｒ，６ｈｒ，及び２４ｈｒ後に血漿を回収、有機溶媒による抽出後、ＨＰＬＣによりＤｅｘ−ＣＨＥＭＳ濃度を算出した。結果を図１９に示す。ＤＳＧ−ＰＥＧ２０００の増量に伴い血中滞留性が向上し、ＤＳＧ−ＰＥＧ２０００  ６ｍｏｌ％と９ｍｏｌ％ではほぼ同等となった。【０１８５】
［試験例１０］  ｍＲＮＡ発現評価
１．エマルションの作製
Ｂ−２／ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ＝３／４／３＋１０ｍｏｌ％  ＤＭＧ−ＰＥＧ２０００＋６ｍｏｌ％  ＤＳＧ−ＰＥＧ２０００＋１０ｍｏｌ％  Ｄｅｘ―ＣＨＥＭＳの組成にて、実施例１と同様にエマルションを作製した。【０１８６】
２．腫瘍ｍＲＮＡ抽出
担癌マウスを頚椎脱臼により安楽死させ、解剖用ハサミを用いて腫瘍を摘出し、氷上のシャーレで皮膚を除去後細断した。約５０ｍｇの腫瘍をジルコニアビーズ入り自立型２ｍＬチューブへ入れ、液体窒素で急速凍結させた。全サンプルを摘出後、液体窒素から取り出し、５００μＬのＴＲＩｚｏｌを加えたのち、Ｍｉｃｒｏｓｍａｓｈを用いて破砕処理した（４８００ｒｐｍ，３０ｓｅｃ，２ｔｉｍｅｓ）。１００μＬのクロロホルムを加え。１ｍｉｎボルテックス後、５ｍｉｎ静置した。チューブを４℃、１２０００ｇ、１５ｍｉｎで遠心し、上清２００μＬを１．５ｍＬチューブへ移したのち、２５０μＬのイソプロパノールを添加した。１ｍｉｎボルテックス後、５ｍｉｎ静置し、４℃、１２０００ｇ、１５ｍｉｎで遠心後、上清を除いた。５００μＬの氷冷７０％エタノールを添加し、ペレットを舞い上がらせたのち、４℃、１２０００ｇ、１０ｍｉｎで遠心し、上清を除いた。この操作を再度行い、１００μＬのＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒでペレットを完全に溶解させた。２５０μＬのエタノール、５μＬの５Ｍ  ＮａＣｌを添加し、１ｍｉｎボルテックス後、５ｍｉｎ静置し、４℃、１２０００ｇ、１５ｍｉｎで遠心し、上清を除いた。５００μＬの氷冷７０％エタノールを添加し、ペレットを舞い上がらせたのち、４℃、１２０００ｇ、１０ｍｉｎで遠心し、上清を除いた。５００μＬのＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒでペレットを完全に溶解させ、吸光度により濃度を測定した。【０１８７】
３．逆転写反応
以下の組成で反応を行った。【０１８８】
【表９】
2017061150.tif 000018
【０１８９】
サーマルサイクラーの電源を入れ、プロトコルを開始し、蓋のプレインキュベートをおこなった（１０５℃）。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを０．２５μｇ／６μＬとなるようにＰＣＲ  ｔｕｂｅに入れ、６５℃，５ｍｉｎ→４℃，∞の条件で変性させた。
４×ＤＮ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  ｒｅｍｏｖｅｒ）を２μＬ加え、軽く撹拌し３７℃，５ｍｉｎ→４℃，∞の条件で反応させた。
５×ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩを２μＬ加え軽く撹拌し、３７℃，１５ｍｉｎ→５０℃，５ｍｉｎ→９８℃，５ｍｉｎ→４℃，∞の条件で反応させた。
別のＰＣＲ  ｔｕｂｅ内で１０倍希釈し、２４時間以内に使う場合は４℃、それ以外の場合には−２０℃で保存した。【０１９０】
４．定量的リアルタイムＰＣＲ
定量的リアルタイムＰＣＲは、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）  ＳＹＢＲ（登録商標）  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）、及びＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、３８４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔeを用いて行なった。１ｗｅｌｌあたり以下の組成となるように試薬を混合した。【０１９１】
【表１０】
2017061150.tif 000019
【０１９２】
測定は全てｄｕｐｌｉｃａｔｅで行なった。反応条件は以下のように行なった。ｄｄＣｔ法により解析を行なった。【０１９３】
【表１１】
2017061150.tif 000020
【０１９４】
Ｂ−２とＤｅｘ―ＣＨＥＭＳからなるエマルション、比較としてＰＢＳ、及び水溶性Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ製剤としてＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤｅｘＰｈｏｓ）、Ｂ−２とＤｅｘ―ＣＨＥＭＳからなるエマルションからＤｅｘ―ＣＨＥＭＳを除いたエマルションを投与し、ＰＢＳでの値を１として比較した。結果を図２０に示す。いずれの指標においてもＢ−２とＤｅｘ―ＣＨＥＭＳからなるエマルションが最も低い値を示した。【０１９５】
［試験例１１］  抗腫瘍効果
１．腫瘍移植
２日前に５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈで播種したＥＧ７−ＯＶＡを回収し、１０  ｍＬのＰＢＳで２回洗浄した。セルカウントをおこない、８．０×１０５ｃｅｌｌｓ／４０μＬとなるようにＰＢＳで懸濁した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（６〜８週齢、♀）の右脇腹へ、８．０×１０５ｃｅｌｌｓ／４０μＬで投与した。【０１９６】
２．ＤＣワクチン
１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／５００μＬ／ｗｅｌｌとなるように下記の方法で誘導した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）をｎｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｂｏｔｔｏｍ  １２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅへ播種した。【０１９７】
ＤＯＰＥ：Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ＝７：２（モル比）となるように試験管中で混合し、溶媒を留去した。等量の０．１２ｍｇ／ｍＬのプロタミン溶液と０．８ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡ溶液をボルテックスミキサーにかけながら混合し、プラスミドＤＮＡ／プロタミン粒子懸濁液を調製した（いずれも１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を溶媒とした）。脂質濃度が０．５５ｍＭとなるようにプラスミドＤＮＡ／プロタミン粒子懸濁液を試験管内に加え、室温で１０分間インキュベートした。バス型ソニケーターで超音波処理したのち、総脂質量の１０ｍｏｌ％となるようにＳＴＲ−ＫＡＬＡを混合することでＫＡＬＡ修飾プラスミドＤＮＡ含有ナノ粒子を調製した。【０１９８】
適切な濃度となるように、ＫＡＬＡ修飾プラスミドＤＮＡ含有ナノ粒子を添加した（Ｓｅｒｕｍ（−），ＧＭ−ＣＳＦ（＋））。２時間後にｍｅｄｉｕｍ（ｓｅｒｕｍ（＋））を添加した。その４時間後に各ｗｅｌｌからＢＭＤＣを回収しＰＢＳで２回洗浄後、セルカウントし適切な細胞濃度となるようにＰＢＳで希釈した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（６ｗ，♀）をジエチルエーテルで麻酔し、両足の裏から４０μＬのＢＭＤＣ懸濁液を皮下投与した。【０１９９】
３．Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳとＢ−２からなるエマルションの投与
試験例１で作製したＤｅｘ−ＣＨＥＭＳとＢ−２からなるエマルションをＤｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ換算で０．５ｍｇ／ｋｇに相当する量（２００μＬ）を尾静脈より投与した。
腫瘍体積は以下の式に従い算出した。
Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ（ｍｍ３）＝（ｍａｊｏｒ  ａｘｉｓ（ｍｍ））×（ｍｉｎｏｒ  ａｘｉｓ（ｍｍ））２×０．５２【０２００】
４．マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の誘導
滅菌シャーレにＲＰＭＩ−１６４０培地及びＰＢＳをそれぞれマウス１匹につき１０ｍＬ添加し、頚椎脱臼したＣ５７ＢＬ／６Ｊ、あるいはＢａｌｂ／ｃマウス（６〜１０週齢）より大腿骨および頚骨を摘出し、７０％エタノールで軽く消毒した後ＰＢＳに浸した。骨の両端を切断し、１ｍＬシリンジ（２６Ｇ針）により培地で骨髄細胞を押し出した。細胞懸濁液を４０μｍのセルストレイナーに通して５０ｍＬコニカルチューブに移した。遠心（４５０ｇ，４℃，５ｍｉｎ）後、上清を除去し、ＡＣＫ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  １ｍＬを添加、混合し、室温で５ｍｉｎ静置した。培地９ｍＬを添加後、遠心して上清を除去し、さらに培地１０ｍＬで２回洗浄した。次に、細胞を培地１０ｍＬに懸濁し、１０ｃｍ細胞培養ディッシュに添加し、３７℃，５％，ＣＯ２条件下で４時間以上培養した。軽くピペッティングして浮遊細胞のみを５０ｍＬコニカルチューブに回収し、遠心、上清除去後、培地１０ｍＬに懸濁してセルカウントした。１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように培地で懸濁し、ＧＭ−ＣＳＦ（終濃度１０ｎｇ／ｍＬ）を添加後、２４  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｍＬずつ播種し、３７℃，５％，ＣＯ２条件下で２日間培養した。２日後、４日後に細胞の凝集塊を残し、浮遊細胞を除去した後、新しいＧＭ−ＣＳＦ含有ＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍＬを添加した。ＧＭ−ＣＳＦ存在下で培養開始後６日目の浮遊及び弱付着細胞を未成熟樹状細胞として実験に用いた。
未処理（ｎｏｎ−ｔｒｅａｔ）、免疫付与のみした群(ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）、免疫付与せず試験例１で作製したＤｅｘ−ＣＨＥＭＳとＢ−２からなるエマルションを投与した群（Ｄeｘ−ＣＨＥＭＳ）、免疫付与したうえで試験例１で作製したＤｅｘ−ＣＨＥＭＳとＢ−２からなるエマルションを投与した群（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ＋Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳ）の比較を図２１に示した。免疫付与したうえで試験例１で作製したＤｅｘ−ＣＨＥＭＳとＢ−２からなるエマルションを投与した群（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ＋Ｄｅｘ−ＣＨＥＭＳ）が最も高い抗腫瘍効果を示した。【０２０１】
［参考例１］ＴＳ−ＰＺ４Ｃ２の合成
＜メシル化＞
ビス（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィド１５ｇ（東京化成工業社製）（９７ｍｍｏｌ）にアセトニトリル１４３ｍＬを加え、２０〜２５℃にて溶解させた。トリエチルアミン３３．３ｇ（関東化学社製）（３２８ｍｍｏｌ）を加えた後、攪拌しながら１０℃に冷却した。温度が２０℃以下になるように塩化メタンスルホニル３４．５ｇ（関東化学社製）（３００ｍｍｏｌ）を１時間かけて滴下した。滴下終了後、２０〜２５℃で３時間反応させた。ＴＬＣ分析（展開溶媒：クロロホルム、ヨウ素発色）により、ビス（２−ヒドロキシエチル）ジスルフィドのスポットが消失していることを確認し、反応を終了した。反応溶液にエタノール２９ｍＬを加え、反応を停止させた後に、ろ過にて不溶物をろ別除去した。ろ液に１０％重曹水１５０ｇを加え、５分攪拌した後、１０分間静置した。水層を除去後、さらに４回重曹水で抽出精製を行った。得られた有機層に硫酸マグネシウム４．５ｇを加えて、脱水を行った。ろ過にて不溶物をろ別除去した後、エバポレーターを用いてろ液の溶媒を留去し、褐色固体（以下、「ｄｉ−Ｍｓ体」と称する）を２９．４ｇ得た。【０２０２】
＜１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
得られた化合物ｄｉ−Ｍｓ体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの分析結果を以下に示す。
δ２．９５〜３．２０ｐｐｍ（ｍ、ＣＨ３−ＳＯ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、１０Ｈ）、δ４．４５〜４．５０ｐｐｍ（ｔ、ＣＨ３−ＳＯ２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、４Ｈ）【０２０３】
＜三級アミノ化＞
ｄｉ−Ｍｓ体１．２ｇ（４ｍｍｏｌ）にアセトニトリル３１ｍＬを加え、２０〜２５℃で溶解させた後、炭酸カリウム１．３ｇ（関東化学工業社製）（１０ｍｍｏｌ）を加えて、５分間攪拌した。その後、４−ピペラジンエタノール５．０ｇ（東京化成工業社製）（３９ｍｍｏｌ）を加え、２５〜３５℃で１３時間反応させた。ＴＬＣ分析（展開溶剤：クロロホルム／メタノール／２８％アンモニア水＝８０／２０／２（ｖ／ｖ／ｖ）、ヨウ素発色）により、ｄｉ−Ｍｓ体のスポットが消失していることを確認し、反応を終了した。ろ過にて不溶物をろ別除去した後、エバポレーターにてろ液の溶媒を留去した。得られた褐色液体をクロロホルム２５ｍＬに溶解させた後、蒸留水２５ｍＬを加え、５分攪拌した。攪拌後、１０分静置した後、水層を除去した。その後、さらに２回蒸留水で抽出精製を行った。得られた有機層に硫酸マグネシウム０．６ｇを加えて、脱水を行った。ろ過にて不溶物をろ別除去した後、エバポレーターを用いてろ液の溶媒を留去し、淡黄色の液体（以下、「ｄｉ−ＰＺ４Ｃ２体」と称する）を１．０ｇ得た。【０２０４】
＜１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
得られた化合物ｄｉ−ＰＺ４Ｃ２体の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの分析結果を以下に示す。
δ２．４０〜２．６６ｐｐｍ（ｍ、ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−、２０Ｈ）、δ２．６７〜２．７２ｐｐｍ（ｍ、−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、４Ｈ）、２．７４〜２．８５ｐｐｍ（ｍ、ＨＯ−ＣＨ２−、−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、６Ｈ）、３．６０〜３．６５ｐｐｍ（ｔ、ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−、４Ｈ）【０２０５】
＜アシル化＞
ｄｉ−ＰＺ４Ｃ２体３．０ｇ（８ｍｍｏｌ）とＤ−α−トコフェロールコハク酸エステル８．４ｇ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）（１６ｍｍｏｌ）をクロロホルム４５ｍＬに２０〜２５℃で溶解させた。その後、４−ジメチルアミノピリジン０．４ｇ（広栄化学工業社製）（３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ４．６ｇ（東京化成工業社製）（２４ｍｍｏｌ）を加え、３０℃で４時間反応させた。ＴＬＣ分析（展開溶剤：クロロホルム／メタノール＝９／１（ｖ／ｖ）、リン酸硫酸銅発色）により、Ｄ−α−トコフェロールコハク酸エステルのスポットが消失していることを確認し、反応を終了した。エバポレーターで反応溶媒を留去した後、ヘキサン２００ｍＬを加えた。その後、アセトニトリル１００ｍＬを加え、５分間攪拌した。１０分間静置した後、ヘキサン層を回収し、エバポレーターにて溶剤を留去し、淡黄色の液体１０．７ｇを得た。この液体９．０ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：クロロホルム／メタノール＝９９／１〜９８／２（ｖ／ｖ））し、目的物であるＴＳ−ＰＺ４Ｃ２を５．７ｇ得た。【０２０６】
＜１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
得られた化合物ＴＳ−ＰＺ４Ｃ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの分析結果を以下に示す。
δ０．８３〜０．８８ｐｐｍ（ｍ、（ＣＨ３）２ＣＨ−（ＣＨ２）３−（ＣＨ３）ＣＨ−（ＣＨ２）３−（ＣＨ３）ＣＨ−、２４Ｈ）、δ１．０３〜１．８２ｐｐｍ（ｍ、（ＣＨ３）２ＣＨ−（ＣＨ２）３−（ＣＨ３）ＣＨ−（ＣＨ２）３−（ＣＨ３）ＣＨ−（ＣＨ２）３−（ＣＨ３）Ｃ−、−Ｃ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ−Ｃ−Ｏ−、５２Ｈ）、δ１．９５〜２．０９ｐｐｍ（ｍ、Ａｒ−ＣＨ３、１８Ｈ）、δ２．４０〜２．６０ｐｐｍ（ｍ、−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−、−Ｃ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ−Ｃ−Ｏ−、２０Ｈ）、δ２．６１〜２．６８ｐｐｍ（ｍ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−、−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、８Ｈ）、δ２．７５〜２．８４ｐｐｍ（ｍ、Ａｒ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、８Ｈ）、δ２．９１〜２．９５ｐｐｍ（ｍ、Ａｒ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−、４Ｈ）、δ４．２１〜４．２５ｐｐｍ（ｔ、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−、４Ｈ）【０２０７】
［参考例２］  Ｌ−ＰＺ４Ｃ２の合成
＜アシル化＞
ｄｉ−ＰＺ４Ｃ２体２．５ｇ（７ｍｍｏｌ）とリノール酸３．７ｇ（日油社製）（１３ｍｍｏｌ）をクロロホルム２５ｍＬに２０〜２５℃で溶解させた。その後、４−ジメチルアミノピリジン０．３ｇ（３ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ３．８ｇ（２０ｍｍｏｌ）を加え、３０℃で４時間反応させた。ＴＬＣ分析（展開溶剤：クロロホルム／メタノール＝９／１（ｖ／ｖ）、リン酸硫酸銅発色）により、リノール酸のスポットが消失していることを確認し、反応を終了した。エバポレーターで反応溶媒を留去した後、ヘキサン５７ｍＬを加えた。その後、アセトニトリル２４ｍＬを加え、５分間攪拌した。１０分間静置した後、ヘキサン層を回収し、エバポレーターにて溶剤を留去し、淡黄色の液体４．９ｇを得た。この液体４．９ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：クロロホルム／メタノール＝９９／１〜９７／３（ｖ／ｖ））し、目的物であるＬ−ＰＺ４Ｃ２を３．１ｇ得た。【０２０８】
＜１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
得られた化合物Ｌ−ＰＺ４Ｃ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの分析結果を以下に示す。
δ０．８７〜０．９１ｐｐｍ（ｔ、（ＣＨ３−（ＣＨ２）３−ＣＨ２−、６Ｈ）、δ１．２５〜１．３８ｐｐｍ（ｍ、ＣＨ３−（ＣＨ２）３−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、２８Ｈ）、δ１．５８〜１．６３ｐｐｍ（ｍ、−（ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、４Ｈ）、δ２．００〜２．０７ｐｐｍ（ｍ、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、８Ｈ）、δ２．３０〜２．３２ｐｐｍ（ｔ、−（ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、４Ｈ）、δ２．５０〜２．７０ｐｐｍ（ｍ、−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−、−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−、２４Ｈ）、δ２．７５〜２．８４ｐｐｍ（ｍ、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、８Ｈ）、δ４．１８〜４．２１ｐｐｍ（ｔ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−、４Ｈ）、δ５．３０〜５．４１ｐｐｍ（ｍ、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、８Ｈ）【０２０９】
［実施例６］  Ｏ−ＰＺ４Ｃ２の合成
ｄｉ−ＰＺ４Ｃ２体０．８ｇ（２ｍｍｏｌ）とオレイン酸１．２ｇ（日油社製）（４ｍｍｏｌ）をクロロホルム８ｍＬに２０〜２５℃で溶解させた。その後、４−ジメチルアミノピリジン０．１ｇ（１ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ１．２ｇ（６ｍｍｏｌ）を加え、３０℃で３時間反応させた。ＴＬＣ分析（展開溶剤：クロロホルム／メタノール＝９／１（ｖ／ｖ）、リン酸硫酸銅発色）により、オレイン酸のスポットが消失していることを確認し、反応を終了した。エバポレーターで反応溶媒を留去した後、ヘキサン１２ｍＬを加えた。その後、アセトニトリル５ｍＬを加え、５分間攪拌した。１０分間静置した後、ヘキサン層を回収し、エバポレーターにて溶剤を留去し、淡黄色の液体１．８ｇを得た。この液体１．７ｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製（溶離液：クロロホルム／メタノール＝９９／１〜９７／３（ｖ／ｖ））し、目的物であるＯ−ＰＺ４Ｃ２を１．１ｇ得た。【０２１０】
＜１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）＞
得られた化合物Ｏ−ＰＺ４Ｃ２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの分析結果を以下に示す。
δ０．８６〜０．９０ｐｐｍ（ｔ、（ＣＨ３−（ＣＨ２）6−ＣＨ２−、６Ｈ）、δ１．２５〜１．３４ｐｐｍ（ｍ、ＣＨ３−（ＣＨ２）６−ＣＨ２−、−ＣＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、４０Ｈ）、δ１．５８〜１．６４ｐｐｍ（ｍ、−ＣＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、４Ｈ）、δ１．９９〜２．０３ｐｐｍ（ｍ、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、８Ｈ）、δ２．２８〜２．３２ｐｐｍ（ｍ、−ＣＨ２−（ＣＨ２）４−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、４Ｈ）、δ２．４５〜２．７０ｐｐｍ（ｍ、−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−、−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、２４Ｈ）、δ２．８０〜２．８５ｐｐｍ（ｍ、−Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、４Ｈ）、δ４．１８〜４．２１ｐｐｍ（ｔ、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ−、４Ｈ）、δ５．１３〜５．３８ｐｐｍ（ｍ、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、４Ｈ）【０２１１】
［参考例３］  ４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステル（４ＭＵ−ＣＨＥＭＳ）の合成
反応はアルゴン中で行った。ナスフラスコにコレステリルヘミサクシネート（ＣＨＥＭＳ）を２．４３ｇ，５ｍｍｏｌ、４−メチルウンベリフェロンを１．０６ｍｇ，６ｍｍｏｌ、無水ＤＭＦ  ２０ｍＬを加えた。さらにＮ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＤＭＡＰ）  ６１．１ｍｇ，０．５ｍｍｏｌを加えた後、Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＰＥＡ）  １．２２ｍＬ，７ｍｍｏｌ）、１−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣｌ）  １．１５ｇ，６ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）  で原料の消失を確認した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製、乾燥後、目的物である４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステルを得た。得られた４−メチルウンベリフェロンコレステロールヘミコハク酸エステルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの分析結果を図２２に、構造式を下に、それぞれ示す。【０２１２】
【化５】
2017061150.tif 000021
【０２１３】
［参考例４］  デキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステルの合成
反応はアルゴン中で行った。ナスフラスコにコレステリルヘミサクシネート（ＣＨＥＭＳ）を６０８．４ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ、デキサメタゾンを５８８．７ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ、無水ＤＭＦ  ２０ｍＬを加えた。さらにＮ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌ−４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ（ＤＭＡＰ）  １５．２ｍｇ，０．１２４ｍｍｏｌを加えた後、Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（ＤＩＰＥＡ）  ０．３０５ｍＬ，１．７５ｍｍｏｌ）、１−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣｌ）  ２８７．６ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で原料の消失を確認した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製、乾燥後、目的物であるデキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステルを得た。得られたデキサメタゾンコレステロールヘミコハク酸エステルの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの分析結果を図２３に、構造式を下に、それぞれ示す。【０２１４】
【化６】
2017061150.tif 000022
【産業上の利用可能性】
【０２１５】
本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、難水溶性薬物を安定に内封することが出来る。難水溶性薬物を内封した、本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、細胞に取り込まれた後に、式（I）で示される化合物が細胞内の還元的環境により分解することで、Ｏ／Ｗ型エマルションが崩壊し、内封した難水溶性薬物が効率的に細胞内で放出される。従って、本発明のＯ／Ｗ型エマルションは、難水溶性薬物の細胞内送達用の担体として有用である。また、本発明のＯ／Ｗ型エマルションは体積メディアン径が１００ｎｍ以下であることから、脾臓からの排出が回避されて血中滞留性が高く、腫瘍等の標的組織への集積性が高いので、生体内において、難水溶性薬物を標的組織へ送達するのに有利である。【０２１６】
本出願は、日本で出願された特願２０１５−２００１４８（出願日：２０１５年１０月８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2017061150.tif 000027
【図２】
2017061150.tif 000028
【図３】
2017061150.tif 000029
【図４】
2017061150.tif 000030
【図５】
2017061150.tif 000031
【図６】
2017061150.tif 000032
【図７】
2017061150.tif 000033
【図８】
2017061150.tif 000034
【図９】
2017061150.tif 000035
【図１０】
2017061150.tif 000036
【図１１】
2017061150.tif 000037
【図１２】
2017061150.tif 000038
【図１３】
2017061150.tif 000039
【図１４】
2017061150.tif 000040
【図１５】
2017061150.tif 000041
【図１６】
2017061150.tif 000042
【図１７】
2017061150.tif 000043
【図１８】
2017061150.tif 000044
【図１９】
2017061150.tif 000045
【図２０】
2017061150.tif 000046
【図２１】
2017061150.tif 000047
【図２２】
2017061150.tif 000048
【図２３】
2017061150.tif 000049
【国際調査報告】
2017061150.tif 000050
2017061150.tif 000051
2017061150.tif 000052
2017061150.tif 000053
2017061150.tif 000054
2017061150.tif 000055