(57)【要約】  本発明の目的は、異なる宿主間においてＤＮＡを移動させることのできる簡便で、且つハイスループットな方法を提供することである。  前記課題は、本発明の（Ａ）溶菌した枯草菌及びそれから放出されたベクターを含む溶菌液、並びに（Ｂ）ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質変性剤、ヌクレアーゼ、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される添加剤、を含むベクター含有液を用いて、酵母または大腸菌を形質転換することを特徴とする、酵母または大腸菌形質転換細胞の製造方法によって解決することができる。
2016163466.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）溶菌した枯草菌及びそれから放出されたベクターを含む溶菌液、並びに
（Ｂ）ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質変性剤、ヌクレアーゼ、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される添加剤、
を含むベクター含有液を用いて、酵母又は大腸菌を形質転換することを特徴とする、形質転換細胞の製造方法。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼ阻害剤が、アウリントリカルボン酸、界面活性剤、キレート剤、還元剤、バニジルヌクレオチド、過酸化水素、又は抗ヌクレアーゼ抗体である請求項１に記載の形質転換細胞の製造方法。
【請求項３】
前記タンパク質変性剤がタンパク質分解酵素又は界面活性剤である、請求項１又は２に記載の形質転換細胞の製造方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、又はＳ１ヌクレアーゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換細胞の製造方法。
【請求項５】
前記形質転換が、ベクター含有液及び酵母または大腸菌コンピテントセルとの混合、又はベクター含有液及び酵母または大腸菌の混合液へのエレクトロポレーションによって行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の形質転換細胞の製造方法。
【請求項６】
前記溶菌が、枯草菌培養液の静置、ファージの感染、界面活性剤の添加、又はそれらの２つ以上の組み合わせによって行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換細胞の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法によって得られる形質転換細胞。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法によって得られるライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換細胞の製造方法及びそれによって得られる形質転換細胞に関する。本発明によれば、簡便に形質転換細胞を製造することができる。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ組換え実験において、異なる宿主間においてＤＮＡを移動させる技術として、形質転換、ファージを経由する形質導入、及び接合伝達などの方法がある。
例えば、形質転換法を用いる場合、異なる宿主間で複製が可能なシャトルプラスミドベクターを用いて、第１の宿主中で複製されたＤＮＡをいったん回収し、そして精製してから用いる方法が汎用されている。しかしながら、この方法では、第１の宿主中のＤＮＡを回収し、精製する工程が必須であるために、多数の操作と時間が必要である。更に、ＤＮＡのサイズが大きい場合には、ＤＮＡの回収及び精製が非常に困難になることが知られており、目的のＤＮＡを完全に回収できないこともある。【０００３】
ＤＮＡを第２の宿主に移動する場合に、第１の宿主からＤＮＡを回収及び精製する必要がない手法としては、第１の宿主をプロトプラストにする方法がある。しかしながら、この方法では、プロトプラストにする操作が微妙な制御を必要とするため、誰にでも簡便に行える手法ではなく、一般的とは言えない（非特許文献１）。更に、２種の宿主を単純に混合するだけでＤＮＡを移動させることのできる接合伝達を利用する方法（非特許文献２）も知られているが、宿主域が非常に限定されるために扱いづらく、接合伝達に関与する多数の遺伝子を厳密に制御する必要もあり、一般的に汎用される方法ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２５３４６２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry）」（日本）２００１年、第６５巻、ｐ８２３−８２９
【非特許文献１】「マイクロバイオロジー・アンド・モリキュラー・バイオロジー・レビュー（Microbiology and Molecular Biology Reviews）」（米国）２００３年、ｐ２７７−３０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、異なる宿主間においてＤＮＡを移動させることのできる簡便で、且つハイスループットな方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、異なる宿主間においてＤＮＡを移動させることのできる簡便で、且つハイスループットな方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ベクターを含む枯草菌を溶菌させ、それに特定の酵素等を添加したベクター含有液を用い、酵母又は大腸菌を形質転換することによって、簡便に酵母形質転換細胞を得られることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（Ａ）溶菌した枯草菌及びそれから放出されたベクターを含む溶菌液、並びに（Ｂ）ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質変性剤、ヌクレアーゼ、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される添加剤、を含むベクター含有液を用いて、酵母又は大腸菌を形質転換することを特徴とする、形質転換細胞の製造方法、
［２］前記ヌクレアーゼ阻害剤が、アウリントリカルボン酸、還元剤、ドデシル硫酸ナトリウム、バニジルヌクレオチド、過酸化水素、又は抗ヌクレアーゼ抗体である［１］に記載の形質転換細胞の製造方法、
［３］前記タンパク質変性剤がタンパク質分解酵素又は界面活性剤である、［１］又は［２］に記載の形質転換細胞の製造方法、
［４］前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、又はＳ１ヌクレアーゼである、［１］〜［３］のいずれかに記載の形質転換細胞の製造方法、
［５］前記形質転換が、ベクター含有液及び酵母または大腸菌コンピテントセルとの混合、又はベクター含有液及び酵母または大腸菌の混合液へのエレクトロポレーションによって行われる、［１］〜［４］のいずれかに記載の形質転換細胞の製造方法、
［６］前記溶菌が、枯草菌培養液の静置、ファージの感染、界面活性剤の添加、又はそれらの２つ以上の組み合わせによって行われる、［１］〜［５］のいずれかに記載の形質転換細胞の製造方法、
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法によって得られる形質転換細胞、及び
［８］［１］〜［６］のいずれかに記載の製造方法によって得られるライブラリー、
に関する。
なお、本発明者らは、第１の宿主としてプロファージ溶原化大腸菌を用い、第２の宿主であるＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌又は高度好熱菌にベクターを移動させる方法を開発した（特許文献１）。しかしながら、本発明の方法と、特許文献１に記載の方法とは、構成が全く異なるものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の形質転換細胞の製造方法によれば、枯草菌からベクターＤＮＡの回収及び精製を行うことなしに、簡便に酵母又は大腸菌の形質転換細胞を得ることができる。また、本発明の形質転換細胞の製造方法によれば、ベクターＤＮＡの回収及び精製を行わないため、ベクターＤＮＡ、特に大きなサイズのベクターＤＮＡの回収及び精製における損失が無い。従って、大きなサイズのＤＮＡを、効率的に酵母又は大腸菌に導入することができる。
更に、本発明の形質転換細胞の製造方法によれば、多数のサンプルを一度に扱うことが可能であり、例えば酵母ライブラリー又は大腸菌ライブラリーを効率的に作製することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】添加剤を加えていない比較例１及び添加剤を加えた実施例１〜５の形質転換された酵母のコロニー数を示したグラフである。
【図２】枯草菌を静置（０ｈｒ、２ｈｒ、及び２４ｈｒ）することによって、枯草菌が溶菌することを示した写真である。
【図３】枯草菌を２時間（２ｈｒ）及び２４時間（２４ｈｒ）静置し、溶菌したベクター含有液を用いて、形質転換した酵母のコロニーを示した写真である。
【図４】エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（実施例１３）、ヌクレアーゼ阻害剤としてＥＤＴＡ（実施例１４）又はＥＧＴＡ（実施例１５）、タンパク質分解酵素として、ペプシン（実施例１６）、パパイン（実施例１７）、トリプシン（実施例１８）、又はエラスターゼ（実施例１９）を用いて酵母の形質転換を行ったコロニーの出現を示した写真である。
【図５】ヌクレアーゼ阻害剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用した場合の酵母のコロニー数の増加を示したグラフである。
【図６】エキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて酵母を形質転換した場合のコロニーの増加を示したグラフ及び写真である。
【図７】ヌクレアーゼ阻害剤として、Ｔｗｅｅｎ２０を用いて、酵母の形質転換を行ったコロニー数の増加を示したグラフである。
【図８】培地としてＬＢ培地、２ｘＹＴ培地、Ｓｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ、又はＳＯＢを用い、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた場合の酵母のコロニー数の変化を示したグラフである。
【図９】プラスミドとして、ｐＧＥＴＳ３０２（１５．５ｋｂｐ）、１８．２ｋｂｐのフラグメントが挿入されたｐＧＥＴＳ３０Ｘ（３３．７ｋｂｐ）、２９．２ｋｂｐのフラグメントが挿入されたｐＧＥＴＳ３０Ｘ（４４．７ｋｂｐ）、及び５０．１ｋｂｐのフラグメントが挿入されたｐＧＥＴＳ３０Ｘ（６５．６ｋｂｐ）を用い、ＥｘｏＩ、ＡＴＡ、及びプロテイナーゼＫを用いた場合の、酵母の形質転換の結果を示したグラフである。
【図１０】プラスミドとして、ｐＧＥＴＳ３０２（１５．５ｋｂｐ）、１８．２ｋｂｐのフラグメントが挿入されたｐＧＥＴＳ３０Ｘ（３３．７ｋｂｐ）、２９．２ｋｂｐのフラグメントが挿入されたｐＧＥＴＳ３０Ｘ（４４．７ｋｂｐ）、及び５０．１ｋｂｐのフラグメントが挿入されたｐＧＥＴＳ３０Ｘ（６５．６ｋｂｐ）を用い、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いた場合の、酵母の形質転換の結果を示したグラフである。
【図１１】形質転換される細胞として大腸菌を用いた場合の形質転換効率を示したグラフである。
【図１２】形質転換される細胞として大腸菌を用いた場合のベクターの大きさを検討したグラフである。
【図１３】形質転換される細胞として大腸菌を用いた場合の培地を検討したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
［１］形質転換細胞の製造方法
本発明の形質転換細胞の製造方法は、（Ａ）溶菌した枯草菌及びそれから放出されたベクターを含む溶菌液、並びに（Ｂ）ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質変性剤、ヌクレアーゼ、又はそれらの２つ以上の組み合わせ、を含むベクター液を用いて、酵母又は大腸菌を形質転換することを特徴とする。すなわち、溶菌液、並びにヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質変性剤、及びヌクレアーゼからなる群から選択される少なくとも１つの添加剤を含むベクター液を用いて酵母又は大腸菌を形質転換することを特徴とするものである。
本発明の形質転換細胞の製造方法は、酵母細胞又は大腸菌細胞の形質転換方法として用いることができる。
【００１１】
《枯草菌》
枯草菌（Bacillus subtilis：バシラス・サチリス）は、０．７−０．８ｘ２−３μｍの大きさの好気性のグラム陽性桿菌で、芽胞を形成する。本発明の形質転換細胞の製造方法に用いることのできる枯草菌は、ベクターＤＮＡを含む限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば１６８株、ＲＭ１２５株、又はそれらの誘導株を挙げることができる。１６８株、ＲＭ１２５株、又はそれらの誘導株は、振とう培養後の静置によって溶菌するため、本発明において好ましく、用いることができる。
枯草菌の培養に用いる培地は、特に限定されないが、例えばＬＢ培地、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ、２xＹＴ培地、ＳＯＢ培地、Antibiotic medium 3培地、Spizizen’s minimal medium（枯草菌用最少培地）、Schaeffer’s sporulation medium（枯草菌用胞子形成培地）を用いることができる。
【００１２】
（溶菌液）
本発明に使用する溶菌液は、枯草菌から放出されたベクターを含む限りにおいて、限定されるものではない。
枯草菌を溶菌させる方法は、特に限定されるものではないが、振とう培養後の静置、ファージによる溶菌、界面活性剤による溶菌を挙げることができる。
静置による溶菌は、例えば前記１６８株、ＲＭ１２５株、又はそれら由来の誘導株等を振とう培養した後に静置することによって、自己溶菌するものである。静置の時間は、ベクターＤＮＡが培地中に放出される限りにおいて特に限定されないが、下限は好ましくは１０分以上であり、より好ましくは３０分以上であり、更に好ましくは１時間であり、最も好ましくは２時間以上である。静置時間の上限は、ベクターＤＮＡが減少しない限りにおいて限定されないが、好ましくは７２時間以下であり、より好ましくは４８時間以下であり、更に好ましくは３６時間であり、最も好ましくは２４時間以下である。
バクテリオファージを用いた溶菌は、例えばＳＰ１０ファージ、φ１０５ファージ、又はφ２９ファージを枯草菌に感染させることによって行うことができる。例えば、ＳＰ１０ファージは、ＳＰβが欠損した枯草菌株（ＳＰβ−）を溶菌することができる。
バクテリオファージのＭＯＩ（multiplicity of infection）は、特に限定されないが、好ましくは０．１〜５０．０であり、より好ましくは０．５〜１０．０であり、更に好ましくは１．０〜５．０である。
界面活性剤による溶菌は、界面活性剤によって、枯草菌の細胞壁を破壊されることによって、溶菌するものである。溶菌に用いられる界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、又はＮ−ｌａｕｒｏｙｌ  ｓａｌｃｏｓｉｎｅを挙げることができる。界面活性剤の濃度は、特に限定されるものではなく、それぞれの界面活性剤について、適宜最適な濃度を決定することができる。
溶菌液は、そのまま形質転換に用いても、本発明を実施することができるが、例えば、遠心分離により、枯草菌の細胞のデブリスを除いたものを用いてもよい。更に、バッファー又は希釈液などにより、希釈したものを溶菌液として用いることもできる。また、エタノール沈殿により、ＤＮＡを濃縮したものを用いてもよい。
【００１３】
《ベクター》
枯草菌に含まれるベクターは、特に限定されるものではなく、例えばプラスミドベクター、ファージミドベクター、又はコスミドベクターを挙げることができるが、好ましくはプラスミドベクターであり、最も好ましくは枯草菌と酵母とのシャトルプラスミドベクターである。
枯草菌と酵母とのシャトルプラスミドベクターとしては、例えばｐＧＥＴＳ３０２、又はｐＧＥＴＳ３０Ｘを挙げることができる。
また、枯草菌と大腸菌のシャトルプラスミドベクターとしては、例えばｐＧＥＴＳ３０２、又はｐＧＥＴＳ３０Ｘ、またはｐＧＥＴＳＧＦＰまたはｐＧＥＴＳ１０９などを挙げることができる。ベクターに含まれる核酸も、ＤＮＡ組換え実験において、酵母又は大腸菌に導入される可能性のある核酸である限りにおいて、特に限定されるものではなく、様々な生物（動物、植物、又は微生物等）由来の核酸、又は合成された核酸を用いることができる。これらの核酸を含むベクターを用いて、酵母ライブラリー又は大腸菌ライブラリーを作製することもできる。
【００１４】
《添加剤》
前記溶菌液に添加される添加剤は、ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質変性剤、ヌクレアーゼ、又はそれらの２つ以上の組み合わせである。これらの添加剤を溶菌液に添加することにより、枯草菌からＤＮＡを回収及び精製することなく、効率よく酵母又は大腸菌を形質転換することができる。ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質変性剤、及びヌクレアーゼの組み合わせとしては、ヌクレアーゼ阻害剤及びタンパク質変性剤の組み合わせ、ヌクレアーゼ阻害剤及びヌクレアーゼの組み合わせ、タンパク質変性剤及びヌクレアーゼの組み合わせ、及びヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質変性剤、及びヌクレアーゼの組み合わせを挙げることができるが、特にはヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質変性剤、及びヌクレアーゼの組み合わせが好ましい。
【００１５】
《ベクター含有液の調製》
ベクター含有液は、前記溶菌した枯草菌及びそれから放出されたベクターを含む溶菌液並びに添加剤を含む。溶菌液は以下のように調製することができる。
枯草菌を、例えばテトラサイクリンを含む培地で培養する。培養時間は、用いる枯草菌の増殖スピードに応じて適宜決定することができ、特に限定されるものではないが、好ましくは６時間〜７２時間であり、より好ましくは８時間〜４８時間であり、更に好ましくは１０時間〜２４時間であり、最も好ましくは１２〜１６時間である。より具体的には、一晩（例えば１２時間）培養することにより、本発明の方法に用いる枯草菌を得ることができる。培養温度も限定されないが、３５〜４０℃で培養することが可能であり、好ましくは３６〜４０℃、より好ましくは３７〜４０℃、最も好ましくは３７℃である。
静置によって枯草菌を溶菌させる場合は、培養された枯草菌をそのまま静置する。静置時間は、前記の通り限定されるものではないが、好ましくは１０分〜７２時間であり、より好ましくは３０分〜４８時間であり、更に好ましくは１〜３６時間であり、最も好ましくは２〜２４時間である。前記の静置時間であることにより、充分なＤＮＡが放出され、且つＤＮＡが破壊されることが少ない。
ファージによって、枯草菌を溶菌させる場合は、例えばＳＰ１０ファージを枯草菌に感染させ、３３〜４０℃で１２〜３６時間培養する。
界面活性剤によって、枯草菌を溶菌させる場合は、例えば界面活性剤を枯草菌の培養液に添加し、静置又は撹拌することによって溶菌させることができる。
例えば、１６８株、ＲＭ１２５株、又はそれらの誘導株は、静置によって溶菌するが、ファージの感染、又は界面活性剤の添加を組み合わせて、溶菌させてもよい。
【００１６】
すなわち、前記溶菌液は、（１）枯草菌を培養する工程（以下、培養工程１と称することがある）及び（２）枯草菌を溶菌させる工程（以下、溶菌工程２と称することがある）によって得ることができる。また、溶菌液に前記添加剤を添加することによって、ベクター含有液を得ることができる。なお、タンパク質変性剤を添加する場合は、更に（３）タンパク質変性剤により溶菌液を処理する工程（以下、溶菌液処理工程３と称することがある）を行い、ベクター含有液を得ることができる。
本発明に用いるベクター含有液は、前記溶菌液に添加剤を含ませることによって、調製することができる。添加剤の添加のタイミングは、それぞれの添加剤の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えば以下のタイミングで添加剤を添加することができる。
ヌクレアーゼの添加のタイミングは、限定されるものではないが、前記培養工程１の前から溶菌工程２に添加することが好ましい。
ヌクレアーゼ阻害剤の添加のタイミングは、限定されるものではないが、前記培養工程１の前から前記溶菌工程２の前（培養工程１終了後）に添加することができる。特に、ヌクレアーゼを添加しない場合において、培養工程１の前、又は培養工程１中に添加することができる。一方、ヌクレアーゼを添加する場合は、ヌクレアーゼを添加した後にヌクレアーゼ阻害剤を添加することが好ましく、特には溶菌工程２の前（培養工程１終了後）が好ましい。
タンパク質変性剤の添加のタイミングは、限定されるものではないが、前記溶菌工程２の前から溶液処理工程３において添加することが好ましい。ヌクレアーゼを添加しない場合は、タンパク質変性剤は前記溶菌工程２の前から溶液処理工程３のいずれのタイミングで添加してもよい。ヌクレアーゼ及びタンパク質変性剤を添加する場合、タンパク質変性剤により、ヌクレアーゼが失活することがある。従って、ヌクレアーゼ及びタンパク質変性剤を添加する場合は、ヌクレアーゼを添加して作用させた後に、タンパク質変性剤を添加して作用させるのが好ましい。
また、ヌクレアーゼ阻害剤及びタンパク質変性剤は、溶菌工程２の前に同時に添加することもできる。ヌクレアーゼ阻害剤としてアウリントリカルボン酸を用い、タンパク質変性剤としてプロテイナーゼＫを用いた場合、溶菌工程２の前にアウリントリカルボン酸及びプロテイナーゼＫを添加し、３７℃で溶菌工程２及び溶菌液処理工程３を同時に行うこともできる。また、３７℃で溶菌工程２を行い、次いでプロテイナーゼＫの適温である６５℃で溶菌液処理工程３を行うこともできる。
【００１７】
培養工程１は、枯草菌を培養する工程であるが、前記の通り、３５〜４０℃（好ましくは３６〜４０℃、より好ましくは３７〜４０℃、最も好ましくは３７℃）で、６時間〜７２時間（好ましくは８時間〜４８時間、更に好ましくは１０時間〜２４時間であり、最も好ましくは１２〜１６時間）で培養することにより行うことができる。
前記溶菌工程２は、枯草菌を溶菌させる工程であるが、枯草菌培養液の静置、ファージの感染、界面活性剤の添加、又はそれらの２つ以上の組み合わせによって行うことができる。枯草菌培養液の静置は、５〜６５℃（好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは１５〜３７℃）で、１０分〜７２時間（より好ましくは３０分〜４８時間、更に好ましくは１〜３６時間、最も好ましくは２〜２４時間）静置することによって行うことができる。ファージの感染は、例えばＳＰ１０ファージを枯草菌にＭＯＩ０．１〜５０．０（より好ましくは０．５〜１０．０、更に好ましくは１．０〜５．０）で感染させ、３３〜４０℃で１２〜３６時間、置くことにより実施できる。更に、界面活性剤の添加は、界面活性剤を枯草菌の培養液に添加し、静置又は撹拌することによって実施することができる。
【００１８】
（ヌクレアーゼ）
本発明に用いるヌクレアーゼは、特に限定されるものではないが、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ又はＳ１ヌクレアーゼを挙げることができる。一方、非特異的に二本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮａｓｅＩ及び大腸菌エンドヌクレアーゼＩ）は、ベクターのＤＮＡを分解することがあるため、好ましくない。従って、本発明に用いるヌクレアーゼとしては、非特異的二本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ以外のヌクレアーゼ（すなわち、ヌクレアーゼ（非特異的二本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼを除く））が好ましい。ヌクレアーゼの添加量及び温度は、それぞれのヌクレアーゼに応じて、適宜決定することができる。すなわち、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではない。
従って、ヌクレアーゼの反応温度は、特に限定されるものではないが、好ましくは３０〜４０℃であり、より好ましくは３５〜３８℃である。
ヌクレアーゼの添加量は、前記の通り、限定されるものではないが、例えばエキソヌクレアーゼＩの添加量は、好ましくは０．１〜１０Ｕｎｉｔｓ／ｍＬであり、より好ましくは０．５〜３Ｕｎｉｔｓ／ｍＬである。
前記溶菌液中には、枯草菌のゲノムＤＮＡが存在している。これらの枯草菌のゲノムＤＮＡは、本発明に用いるベクターの酵母または大腸菌細胞への導入を阻害していることが考えられる。ヌクレアーゼを溶菌液に添加することにより、ゲノムＤＮＡの影響を抑制することができ、形質転換の効率が上昇すると考えられる。
【００１９】
（ヌクレアーゼ阻害剤）
本発明に用いるヌクレアーゼ阻害剤は、特に限定されるものではないが、アウリントリカルボン酸、界面活性剤、キレート剤、還元剤、ドデシル硫酸ナトリウム、バニジルヌクレオチド、過酸化水素、又は抗ヌクレアーゼ抗体を挙げることができる。ヌクレアーゼ阻害剤の添加量、及び温度は、それぞれのヌクレアーゼ阻害剤に応じて、適宜決定することができる。すなわち、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではない。
ヌクレアーゼ阻害剤の添加量は、前記の通り、限定されるものではないが、例えばアウリントリカルボン酸の添加量は、好ましくは０．０３〜３ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｍＬである。
前記溶菌液中には、枯草菌のヌクレアーゼが存在している。枯草菌のヌクレアーゼの中には、本発明に用いるベクターのＤＮＡを分解するヌクレアーゼ（特には、非特異的二本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ）も存在している。ヌクレアーゼ阻害剤を溶菌液に添加することにより、枯草菌のヌクレアーゼ（特には、非特異的二本鎖ＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ）の作用を抑制することができ、形質転換の効率が上昇すると考えられる。
【００２０】
前記界面活性剤は、特に限定されるものではないが、好ましくは非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤であり、より好ましくは非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤としては、限定されるものではないが、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｎｎ  ８０、Ｂｒｉｊ３５、又はＢｒｉｊ５８を挙げることができる。両性界面活性剤としては、限定されるものではないが、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ）、カプリン酸プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ）、ラウリルアミノプロピオン酸（ＬＡＰＡ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸（ＤＤＭＡＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ウンデカン酸（ＤＤＭＡＵ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）を挙げることができる。
界面活性剤の濃度は、当業者によって、それぞれの界面活性剤ごとに適宜決定することができる。すなわち、それぞれの界面活性剤により、本発明の効果が得られる最適な濃度範囲は異なるが、当業者であれば、本明細書の記載から界面活性剤の濃度を検討することにより、本発明の効果が得られる界面活性剤の最適濃度を決定することは、過度の負担無く実施することができる。例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の最適濃度は限定されるものではないが、好ましくは０．０１〜２重量％であり、より好ましくは０．０５〜１．５重量％である。また、Ｔｗｅｅｎ２０の最適濃度は、限定されるものではないが、好ましくは２〜５０重量％であり、より好ましくは３〜４０重量％であり、更に好ましくは１０〜３５重量％である。
更に、本発明において、界面活性剤は、ヌクレアーゼ阻害剤としての作用と、後述のタンパク質変性剤としての作用とを示すことができる。
【００２１】
前記キレート剤は、特に限定されるものではないが、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ジメルカプトプロパン・スルホン酸（ＤＭＰＳ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、アミノトリメチレン・ホスホン酸（ＡｒＰＡ）、クエン酸、又は酢酸、およびその薬学的に許容可能な塩を挙げることができる。
【００２２】
（タンパク質変性剤）
本発明に用いるタンパク質変性剤は、枯草菌の溶菌液に含まれる形質転換を阻害するタンパク質の作用を抑制する限りにおいて、特に限定されるものではないが、例えばタンパク質分解酵素、又は界面活性剤を挙げることができる。
タンパク質分解酵素も、特に限定されるものではないが、セリンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、又はシステインプロテアーゼを挙げることができる。より具体的には、プロテイナーゼＫ（セリンプロテアーゼ）、ペプシン（アスパラギン酸プロテアーゼ）、ブロメライン、キモパパイン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、フィシン、パパイン（システインプロテアーゼ）、ペプチダーゼ、プロテイナーゼＡ、トリプシン（セリンプロテアーゼ）、微生物プロテアーゼ、エラスターゼ、サブチリシン、カスパーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼ、エンテロペプチダーゼ、ヒドロラーゼを挙げることができる。タンパク質分解酵素の添加量、及び温度は、それぞれのタンパク質分解酵素に応じて、適宜決定することができる。すなわち、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではない。
タンパク質分解酵素の添加量は、前記の通り、限定されるものではないが、例えばプロテイナーゼＫの添加量は、好ましくは０．０５〜５００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬであり、より好ましくは２〜１０Ｕｎｉｔｓ／ｍＬである。プロテイナーゼＫの反応温度は、特に限定されるものではないが、好ましくは３０〜６５℃であり、より好ましくは４５〜６５℃であり、最も好ましくは、５０〜６５℃である。
界面活性剤も、特に限定されるものではないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＣＨＡＰＳ、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４、ＴｒｉｒｏｎＸ−１００、又はＴｗｅｅｎ２０を挙げることができる。界面活性剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤又は陽イオン性界面活性剤であり、より好ましくは非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤である。非イオン性界面活性剤としては、限定されるものではないが、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ４０、Ｔｗｅｎｎ  ８０、Ｂｒｉｊ３５、又はＢｒｉｊ５８を挙げることができる。両性界面活性剤としては、限定されるものではないが、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン（ＬＳＢ）、ラウリン酸アミドプロピルベタイン（ＬＰＢ）、コカミドプロピルベタイン（ＣＰＢ）、カプリン酸プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン（ＤＤＧｌｙ）、ラウリルアミノプロピオン酸（ＬＡＰＡ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ブチル酸（ＤＤＭＡＢ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアンモニオ）ウンデカン酸（ＤＤＭＡＵ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）を挙げることができる。界面活性剤の添加量及び温度は、それぞれの界面活性剤に応じて、適宜決定することができる。
【００２３】
《酵母》
酵母としては、本発明の技術分野において通常用いられている酵母を、制限なく用いることができる。すなわち、酵母細胞中にベクターＤＮＡを導入できる限りにおいて、限定されるものではない。例えば、ベクターＤＮＡの導入法として、エレクトロポレーションを用いる場合、電圧、印加時間、及パルスの回数等の条件を検討することによって、酵母の種類に制限されることなく、ベクターＤＮＡを導入することが可能である。従って、酵母の種類は限定されるものではないが、例えば、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae：サッカロマイセス・セレビシエ）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe：シゾサッカロマイセス・ポンベ）、カンジダ酵母（Candida albicans：カンジダ・アルビカンス）、アルカン資化酵母（Yarrowia lipolytica：ヤロウィア・リポリティカ）、メタノール資化酵母（Hansenula polymorpha：ハンセヌラ・ポリモルファ）、キラー酵母（Kluyveromyces lactis：クルイベロミセス・ラクティス）又はメタノール資化性酵母（Pichia pastoris：ピキア・パストリス）を挙げることができる。出芽酵母としては、例えばＹＰＨ４９９株、ＹＰＨ５００株、Ｗ３０３−１Ａ株、ＢＹ４７４１株、ＢＹ４７４２株、ＹＰＨ５０１株、ＳＦＹ５２株、又はＷ３０３−１Ｂ株、又はこれらの株由来の誘導株を用いることができる。
【００２４】
《大腸菌》
大腸菌としては、本発明の技術分野において通常用いられている大腸菌を、制限なく用いることができる。すなわち、大腸菌の細胞中にベクターＤＮＡを導入できる限りにおいて、限定されるものではない。従って、大腸菌の種類は限定されるものではないが、例えば、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＪＭ１０９、JＡ２２１、ＤＨ１、ＴＯＰ１０、又はＸＬ１-Ｂｌｕｅを挙げることができる。
【００２５】
《形質転換》
前記酵母細胞を形質転換する方法としては、化学的形質転換法及びエレクトロポレーション法を用いることができる。
本明細書において、酵母の化学的形質転換法は、酢酸リチウム存在下で酵母細胞を形質転換する酢酸リチウム法、浸透圧調整剤（ソルビトールやマンニトールなど）の存在下で、酵母細胞の細胞壁を、細胞壁溶解酵素を用いて取り除きスフェロプラスト（プロトプラスト）を作成し形質転換するプロトプラスト法（スフェロプラスト法）を含む。
例えば、酢酸リチウム法は、以下のように行うことができる。ＯＳＢバッファー（１ＭＬｉＡＣ；０．２ｍＬ、５０％ＰＥＧ３４００：０．８ｍＬ、４ＭＤＴＴ：２５μＬ）に一晩培養した酵母を懸濁する。前記ベクター含有液を添加し、４５分、４３．５℃でインキュベーションし、全量を平板培地に播き、培養する。
【００２６】
また、プロトプラスト法（スフェロプロスト法）は、例えば以下のように行うことができる。１Ｍソルビトール存在下でＺｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ（１０ｍｇ／ｍＬ）などの適当な細胞壁溶解酵素を用いて酵母の細胞壁を除去（プロトプラスト（スフェロプラスト）化し、ＳＴＣ（１Ｍ  ソルビトール、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）に懸濁後、前記ベクター含有液を添加し、１０分間室温で培養する。ＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）を静かに加え、室温で１０分放置した後、遠心して上清を取り除き、ＳＯＳ（１Ｍ  ソルビトール、０．６６ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．２５％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％  Ｂａｃｔｏ  ｐｅｐｔｏｎ）に穏やかに懸濁後、３０℃で３０分インキュベートし、全量を平板培地に播き、培養する。
本明細書において、化学的形質転換法に用いる酵母細胞をケミカルコンピテントセルと称することがある。
【００２７】
前記大腸菌を形質転換する方法としては、化学的形質転換法及びエレクトロポレーション法を用いることができる。
本明細書において、大腸菌の化学的形質転換法は、塩化カルシウムで処理した大腸菌（コンピテントセル）を用いて形質転換する塩化カルシウム法、塩化ルビジウムを用いて形質転換するハナハン法、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを用いて形質転換するミラー法を含む。
例えば、塩化カルシウム法は、以下のように行うことができる。ＬＢ培地で培養した大腸菌を集菌し、氷冷した塩化カルシウム溶液を加え懸濁する。更に遠心分離により大腸菌を集菌し、塩化カルシウム溶液に懸濁して、コンピテントセルを得る。コンピテントセルに前記ベクター含有液を添加し、４℃、３０分氷冷する。４２℃で４５秒間熱処理し、すぐに２分間氷冷する。８００μＬのＳＯＢ培地を加え、３７℃で１時間ほど培養する。それを選択培地に塗布して培養することによって、大腸菌の形質転換細胞を得ることができる。
【００２８】
前記酵母又は大腸菌のエレクトロポレーション法は、以下のように行うことができる。酵母又は大腸菌の懸濁液に前記ベクター含有液を適宜処理したものを添加し、電気パルスをかけることで酵母又は大腸菌の細胞膜に微小な穴を空け、ベクターＤＮＡが酵母細胞又は大腸菌の内部に取り込まれることで、形質転換することができる。本明細書において、エレクトロポレーションに用いる酵母細胞又は大腸菌細胞をエレクトロコンピテントセルと称することがある。
【００２９】
本発明の形質転換細胞の製造方法によって、枯草菌から放出されたベクターＤＮＡを含む酵母又は大腸菌の形質転換体を得ることができる。前記ベクターに含まれる核酸は、１種類でもよく、多種類の核酸が含まれていてもよい。多種類の核酸を含むベクターを含有する酵母の形質転換体は酵母ライブラリーとして用いることができる。また、大腸菌の形質転換体は、大腸菌ライブラリーとして用いることができる。本発明の製造方法によって得られた酵母形質転換細胞、又は大腸菌形質転換細胞は、クローン化されているＤＮＡを遺伝子資源としてより安定的に保存することができる。例えば、多種類のＤＮＡを含む微生物細胞より成るライブラリー等は、用いた細胞によっては維持管理が煩雑となる場合があるが、例えば、前記したような酵母ライブラリー又は大腸菌ライブラリーでは、構築後の維持・保存を非常に簡便かつ安定的に行うことができる。
【００３０】
［２］形質転換細胞
本発明の酵母形質転換細胞は、前記形質転換細胞の製造方法によって得られるものである。本発明の酵母形質転換細胞に含まれる「ベクター」、ベクターに含まれる「核酸」、及び「酵母」等は、前記「［１］形質転換細胞の製造方法」に記載のものを用いることができる。
また、本発明の酵母形質転換細胞は、酵母ライブラリーとして用いることができる。
本発明の大腸菌形質転換細胞は、前記形質転換細胞の製造方法によって得られるものである。本発明の大腸菌形質転換細胞に含まれる「ベクター」、ベクターに含まれる「核酸」、及び「大腸菌」等は、前記「［１］形質転換細胞の製造方法」に記載のものを用いることができる。
また、本発明の大腸菌形質転換細胞は、大腸菌ライブラリーとして用いることができる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００３２】
《実施例１》
本実施例では、エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、及びプロテイナーゼＫを用いて、酵母の形質転換を行った。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、ベクターｐＧＥＴＳ３０２を含む枯草菌ＲＭ１２５株を用いた。酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、ＹＰＨ４９９株を用い、リチウム陽イオン法に類似した方法でＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社のFrozen-EZ Yeast Transformation II Kitによってコンピテントセルを調製した。
テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地５ｍＬに、エキソヌクレアーゼ（ＥｘｏＩ；Ｔａｋａｒａ）５ｕｎｉｔｓ(最終濃度１Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ)を添加した。このＬＢ培地に、枯草菌を植菌し、３７℃で一晩培養した。ヌクレアーゼ阻害剤（アウリントリカルボン酸(ＡＴＡ)；０．３５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、２時間静置することによって、枯草菌を溶菌させた。得られた溶菌液に、プロテイナーゼＫ（最終濃度４Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を添加し、６５℃で１時間インキュベーションした。溶菌液２００μＬ、酵母のコンピテントセル５０μＬ、及びＴＦ溶液５００μＬ（ZYMO RESEARCH社のFrozen-EZ Yeast Transformation II KitのEZ 3 Solution）を混合し、３０℃で４５〜６０分、振とうした。１．２％のＳＤ  Ｌｅｕ−（ロイシン要求性Ｍｉｎｉｍａｌ  ＳＤ）アガーを加えプレートに播種し、酵母形質転換体を選択した。
３０℃で２日から４日培養し、コロニー数を測定した。結果を図１に示す。【００３３】
《実施例２》
本実施例では、エキソヌクレアーゼ、及びプロテイナーゼＫを用いて、酵母の形質転換を行った。
ヌクレアーゼ阻害剤を添加しなかったことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。結果を図１に示す。【００３４】
《実施例３》
本実施例では、ヌクレアーゼ阻害剤、及びプロテイナーゼＫを用いて、酵母の形質転換を行った。
エキソヌクレアーゼを添加しなかったことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。結果を図１に示す。【００３５】
《実施例４》
本実施例では、ヌクレアーゼ阻害剤を用いて、酵母の形質転換を行った。
エキソヌクレアーゼ及びプロテイナーゼＫを添加しなかったことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。結果を図１に示す。【００３６】
《実施例５》
本実施例では、プロテイナーゼＫを用いて、酵母の形質転換を行った。
エキソヌクレアーゼ及びヌクレアーゼ阻害剤を添加しなかったことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。結果を図１に示す。【００３７】
《比較例１》
本実施例では、エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、及びプロテイナーゼＫを用いずに、酵母の形質転換を行った。
エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、及びプロテイナーゼＫを添加しなかったことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。結果を図１に示す。【００３８】
図１に示すように、エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、及び／又はプロテイナーゼＫを添加することにより、酵母の形質転換効率が顕著に上昇した。【００３９】
《実施例６》
本実施例では、エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、及びプロテイナーゼＫを用いて、酵母の形質転換を行った。実施例１〜５では、枯草菌を試験管で培養したが、実施例６〜１０ではマルチウエル（イワキ社；MICROPLATE 12well）で培養した。枯草菌（Bacillus subtilis）は、ベクターｐＧＥＴＳ３０２、又はｐＧＥＴＳ３０Ｘを含む枯草菌ＲＭ１２５株を用いた。酵母（Saccharomyces cerevisiae）は、ＹＰＨ４９９株を用い、リチウム陽イオン法に類似した方法でZYMO RESEARCH社のFrozen-EZ Yeast Transformation II Kitによってコンピテントセルを調製した。
テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地３ｍＬを１２ウエルのマルチウエル分注し、エキソヌクレアーゼ（ＥｘｏＩ；Ｔａｋａｒａ）５ｕｎｉｔｓを添加（最終濃度１．６７Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）した。各ウエルに、枯草菌を植菌し、３７℃で一晩培養した。ヌクレアーゼ阻害剤（ＡＴＡ；０．３５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、２時間静置することによって、枯草菌を溶菌させた。得られた溶菌液に、プロテイナーゼＫ（最終濃度６．７Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を添加し、６５℃で１時間インキュベーションした。溶菌液２００μＬ、酵母のコンピテントセル５０μＬ、及びＴＦ溶液５００μＬを混合し、３０℃で４５〜６０分、振とうした。１．２％のＳＤ  Ｌｅｕ−（ロイシン要求性Ｍｉｎｉｍａｌ  ＳＤ）アガーを加えプレートに播種し、酵母形質転換体を選択した。
３０℃で２日から４日日培養し、コロニー数を測定した。結果を表１に示す。【００４０】
《実施例７》
本実施例では、エキソヌクレアーゼ、及びプロテイナーゼＫを用いて、酵母の形質転換を行った。
ヌクレアーゼ阻害剤を添加しなかったことを除いては、実施例６の操作を繰り返した。結果を表１に示す。【００４１】
《実施例８》
本実施例では、ヌクレアーゼ阻害剤、及びプロテイナーゼＫを用いて、酵母の形質転換を行った。
エキソヌクレアーゼを添加しなかったことを除いては、実施例６の操作を繰り返した。結果を表１に示す。【００４２】
《実施例９》
本実施例では、ヌクレアーゼ阻害剤を用いて、酵母の形質転換を行った。
エキソヌクレアーゼ及びプロテイナーゼＫを添加しなかったことを除いては、実施例６の操作を繰り返した。結果を表１に示す。【００４３】
《実施例１０》
本実施例では、プロテイナーゼＫを用いて、酵母の形質転換を行った。
エキソヌクレアーゼ及びヌクレアーゼ阻害剤を添加しなかったことを除いては、実施例６の操作を繰り返した。結果を表１に示す。【００４４】
《比較例２》
本実施例では、エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、及びプロテイナーゼＫを用いずに、酵母の形質転換を行った。
エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、及びプロテイナーゼＫを添加しなかったことを除いては、実施例６の操作を繰り返した。結果を表１に示す。【００４５】
【表１】
2016163466.tif 000003
【００４６】
表１に示すように、マルチウエル（イワキ社；MICROPLATE 12well）を用いるとコロニー数が増加した。また、実施例１〜５と同じように、エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤、及び／又はプロテイナーゼＫを添加することにより、酵母の形質転換効率が顕著に上昇した。【００４７】
《実施例１１》
本実施例では、枯草菌の培養後の静置を２時間又は２４時間行い、酵母の形質転換を行った。
酵母の静置を２時間及び２４時間としたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。結果を図２、図３に示す。
図２に示すように、２時間の静置で溶菌が進行し、２４時間では更に溶菌が進行していることがわかった。得られたコロニー数は、図３に示すように２時間で１００個、２４時間で１１７個であった。溶菌の時間は、２時間で、ほぼ充分であると考えられる。また、２４時間まで時間を延ばしても、溶菌液中のベクターは破壊されていないことがわかった。【００４８】
《実施例１２〜１９及び比較例３》
本実施例では、エキソヌクレアーゼとして、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ヌクレアーゼ阻害剤としてＥＤＴＡ又はＥＧＴＡ、タンパク質分解酵素として、ペプシン、パパイン、トリプシン、又はエラスターゼを用いて酵母の形質転換を行った。
実施例１２は、基本的に実施例６と同様の方法で行った。枯草菌（Bacillus subtilis）は、ベクターｐＧＥＴＳ３０２、又はｐＧＥＴＳ３０Ｘを含む枯草菌ＲＭ１２５株を用いた。酵母（Saccharomyces cerevisiae）は、ＢＹＣＲＴ−ＡＵＲ株を用い、一般的な酢酸リチウム法によってコンピテントセルを調製した。
テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地３ｍＬを１２ウエルのマルチウエル分注し、エキソヌクレアーゼ（ＥｘｏＩ；Ｔａｋａｒａ）５ｕｎｉｔｓ（最終濃度１．６７Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を添加した。各ウエルに、枯草菌を植菌し、３７℃で一晩培養した。ヌクレアーゼ阻害剤（ＡＴＡ；最終濃度０．３５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、２時間静置することによって、枯草菌を溶菌させた。得られた溶菌液に、プロテイナーゼＫ（最終濃度６．７Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を添加し、３７℃で１時間インキュベーションした。溶菌液５０μＬ、酵母のコンピテントセル１００μＬ、及び酢酸リチウム、ＰＥＧ3350溶液６００μＬ、キャリアＤＮＡ１０μＬを混合し、３０℃で３０分、振とう後ＤＭＳＯを７０μＬ加え、４２℃で１５分振とうした。その後集菌して滅菌水６００μＬに溶かした後１．２％のＳＤＬｅｕ−（ロイシン要求性Ｍｉｎｉｍａｌ  ＳＤ）アガーを加えプレートに播種し、酵母形質転換体を選択した。
実施例１３は、ＥｘｏＩの５ｕｎｉｓに代えて、ＥｘｏＩＩＩを５ｕｎｉｔｓ（最終濃度１．６７Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を用いたことを除いては、実施例１２の操作を繰り返した。
実施例１４は、ＡＴＡの０．３５ｍｇ／ｍＬに代えて、ＥＤＴＡ１ｍＭ（最終濃度）を用いたことを除いては、実施例１２の操作を繰り返した。
実施例１５は、ＡＴＡの０．３５ｍｇ／ｍＬに代えて、ＥＧＴＡ１ｍＭ（最終濃度）を用いたことを除いては、実施例１２の操作を繰り返した。
実施例１６は、プロテイナーゼＫに代えて、ペプシン（最終濃度６．７Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を用いたことを除いては、実施例１２の操作を繰り返した。
実施例１７は、プロテイナーゼＫに代えて、パパイン（最終濃度６．７Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）を用いたことを除いては、実施例１２の操作を繰り返した。
実施例１８は、プロテイナーゼＫに代えて、トリプシン（最終濃度０．０１％）を用いたことを除いては、実施例１２の操作を繰り返した。
実施例１９は、プロテイナーゼＫに代えて、エラスターゼ（最終濃度１２．５Ｕ／ｍＬ）を用いたことを除いては、実施例１２の操作を繰り返した。
比較例３は、ＥｘｏＩ、ＡＴＡ、及びプロテイナーゼＫを添加せずに、実施例１２の操作を繰り返した。
結果を図４及び表２に示す。【００４９】
【表２】
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実施例１２〜１９のエキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ阻害剤及びタンパク質分解酵素を用いた形質転換により、これらを用いなかった比較例よりもコロニー数が増加した。【００５０】
《実施例２０》
本実施例では、ヌクレアーゼ阻害剤として界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のみを使用して、酵母の形質転換を行った。
エキソヌクレアーゼを使用しないこと、タンパク質分解酵素を使用しないこと、及びヌクレアーゼ阻害剤（ＡＴＡ）に代えて、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いたことを除いては、実施例１２の操作を繰り返した。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度は、０．２５重量％、０．５重量％、１重量％で行った。図５に示すように、ＴｒｉｔｉｎＸ−１００を用いることにより、コロニー数の増加が見られた。【００５１】
《実施例２１》
本実施例では、エキソヌクレアーゼとしてエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）を使用し、ヌクレアーゼ阻害剤として界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を使用して、酵母の形質転換を行った。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の濃度は１重量％を用いた。
タンパク質分解酵素を使用しないこと、及びヌクレアーゼ阻害剤（ＡＴＡ）に代えて、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いたことを除いては、実施例１２の操作を繰り返した。図６に、比較例３、実施例１２、実施例２０とのコロニー数の比較を示す。ＥｘｏＩ及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いることにより、実施例２０と比較して、更に得られたコロニー数が増加した。【００５２】
《実施例２２》
本実施例では、界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ２０を用いて、酵母の形質転換を行った。
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を０．２５〜１重量％用いることに代えて、Ｔｗｅｅｎ２０を１〜３０重量％用いたことを除いては、実施例２０の操作を繰り返した。図７に示すように、Ｔｗｅｅｎ２０を添加することにより、得られるコロニー数が増加した。【００５３】
《実施例２３》
本実施例では、界面活性剤として、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０を用いて、酵母の形質転換を行った。
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いることに代えて、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０を１重量％用いたことを除いては、実施例２０の操作を繰り返した。表３に示すように、ＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０を添加することにより、得られるコロニー数が増加した。【００５４】
《実施例２４》
本実施例では、界面活性剤として、Ｔｗｅｎｎ８０を用いて、酵母の形質転換を行った。
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いることに代えて、Ｔｗｅｎｎ８０を10重量％用いたことを除いては、実施例２０の操作を繰り返した。表３に示すように、Ｔｗｅｎｎ８０を添加することにより、得られるコロニー数が増加した。【００５５】
《実施例２５》
本実施例では、界面活性剤として、両性界面活性剤であるＣＨＡＰＳを用いて、酵母の形質転換を行った。
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いることに代えて、ＣＨＡＰＳを１重量％用いたことを除いては、実施例２０の操作を繰り返した。表３に示すように、ＣＨＡＰＳを添加することにより、得られるコロニー数が増加した。【００５６】
【表３】
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【００５７】
《実施例２６》
本実施例では、培地としてＬＢ培地、２ｘＹＴ培地、Ｓｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ、又はＳＯＢを用い、界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて、酵母の形質転換を行った。
培地としてＬＢ培地（１００ｍＬあたり、Ｔｒｉｐｔｏｎ  １ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５ｇ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ）、２ｘＹＴ培地（１００ｍＬあたり、Ｔｒｉｐｔｏｎ  １．６ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １ｇ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ）、Ｓｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈ（１００ｍＬあたり、Ｔｒｉｐｔｏｎ  ３．２ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ２ｇ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ）、又はＳＯＢ（１００ｍＬあたり、Ｔｒｉｐｔｏｎ  ２ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５ｇ、ＮａＣｌ  ０．０５ｇ）を用いたことを除いては、実施例２０の操作を繰り返した。図８に示すように、Ｓｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈを用いた方法が得られるコロニー数が多かった。なお、同じ培地を用いた場合は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を添加することにより、比較例よりもコロニー数は増加した。【００５８】
《実施例２７》
本実施例では、ベクターＤＮＡの導入法として、エレクトロポレーションを用いて、酵母の形質転換を行った。
枯草菌（Bacillus subtilis）は、ｐＧＥＴＳ３０Ｘを含む枯草菌ＲＭ１２５株を用いた。酵母（Saccharomyces cerevisiae）は、ＢＹＣＲＴ−ＡＵＲ株を用いた。
テトラサイクリン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地３ｍＬに、枯草菌を植菌し、３７℃で一晩培養した。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１重量％添加し、２時間静置することによって、枯草菌を溶菌させた。得られた溶菌液をエタノール沈殿により脱塩処理した。
酵母のコンピテントセルは、１００ｍＬのＹＰＤＡに酵母を植菌して３０℃で４時間培養した。氷上に１５分静置し、遠心分離によって集菌した。２５ｍＬの氷冷滅菌水に懸濁し、更に遠心分離によって集菌した。得られた酵母を１Ｍソルビトールに懸濁し、遠心分離によって集菌した。同じ操作を３回繰り返し、コンピテントセルを得た。
エレクトロポレーションは、４０μＬのコンピテントセルに、５μＬの溶菌液を添加しパルスを印加した。すぐに５００μＬの１Ｍソルビトールを加え、ＳＤ  Ｌｅｕ−／１Ｍソルビトールのプレートに播種した。３０℃で３〜５日培養し、コロニー数を測定した。【００５９】
《比較例４》
本比較例では、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いないことを除いては、実施例２７の操作を繰り返した。
実施例２７及び比較例４の結果を表４に示す。
【表４】
2016163466.tif 000006
【００６０】
《実施例２８》
本実施例では、本発明の方法で用いるベクター（プラスミド）の大きさを検討した。プラスミドとして、ｐＧＥＴＳ３０２（１５．５ｋｂｐ）、１８．２ｋｂｐのフラグメントが挿入されたｐＧＥＴＳ３０Ｘ（３３．７ｋｂｐ）、２９．２ｋｂｐのフラグメントが挿入されたｐＧＥＴＳ３０Ｘ（４４．７ｋｂｐ）、及び５０．１ｋｂｐのフラグメントが挿入されたｐＧＥＴＳ３０Ｘ（６５．６ｋｂｐ）を用いて、酵母を形質転換した。
前記ｐＧＥＴＳ３０２（１５．５ｋｂｐ）、ｐＧＥＴＳ３０Ｘ（３３．７ｋｂｐ）、ｐＧＥＴＳ３０Ｘ（４４．７ｋｂｐ）、及びｐＧＥＴＳ３０Ｘ（６５．６ｋｂｐ）を用いたことを除いては、実施例６の操作を繰り返した。図９に示すように、本発明の方法により、６５．６ｋｂｐのプラスミドを用いて形質転換できることが分かった。【００６１】
《実施例２９》
本実施例では、ＴｒｉｔｏｎＸ１−１００を用いて、導入できるベクター（プラスミド）の大きさを検討した。プラスミドとして、実施例２８と同じプラスミドを用いた。
前記ｐＧＥＴＳ３０２（１５．５ｋｂｐ）、ｐＧＥＴＳ３０Ｘ（３３．７ｋｂｐ）、ｐＧＥＴＳ３０Ｘ（４４．７ｋｂｐ）、及びｐＧＥＴＳ３０Ｘ（６５．６ｋｂｐ）を用いたことを除いては、基本的に実施例２０の操作を繰り返した。図１０に示すように、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いることにより、実施例２８と比較しても、大きなプラスミドの形質転換効率が上昇した。【００６２】
《実施例３０》
本実施例では、形質転換される細胞として、大腸菌を用いた。
酵母に代えて、大腸菌（ＤＨ１０Ｂ）を用いたこと、及びプラスミドの導入方法として塩化カルシウム法を用いたことを除いては、実施例１２の操作を繰り返した。塩化カルシウム法は、以下のように行った。
ＬＢまたはＳＯＢ培地で培養した大腸菌を集菌し、氷冷した塩化カルシウム溶液を加え懸濁する。更に遠心分離により大腸菌を集菌し、塩化カルシウム溶液に懸濁して、コンピテントセルを作成した。コンピテントセルに前記ベクター含有液を添加し、４℃、３０分氷冷する。４２℃で４５秒間熱処理し、すぐに２分間氷冷する。８００μＬのＳＯＢ培地を加え、３７℃で４５分以上１時間程培養し、遠心して集菌後選択培地に塗布して培養することによって、大腸菌の形質転換細胞を得た。大腸菌のコンピテントセル２００μＬに対して、溶菌液を２００μＬ、１５０μＬ、１００μＬ、及び５０μＬ用いた。図１１に示すように、本発明の方法により大腸菌を形質転換することが可能であった。また、溶菌液が少ない方が、形質転換の効率が高かった。【００６３】
《実施例３１》
本実施例では、大腸菌を形質転換される細胞として用いた場合の導入できるベクター（プラスミド）の大きさを検討した。プラスミドとして、ｐＧＥＴＳ３０２（１５．５ｋｂｐ）、ｐＧＥＴＳ３０Ｘ（３３．７ｋｂｐ）、ｐＧＥＴＳ３０Ｘ（４４．７ｋｂｐ）を用いたことを除いては、実施例３０の操作を繰り返した。図１２に示すように、４４．７ｋｂｐのプラスミドを大腸菌に導入することが可能であった。【００６４】
《実施例３２》
本実施例では、培地としてＬＢ培地、及びＳｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈを用いて、大腸菌の形質転換を行った。
プラスミドとして、ｐＧＥＴＳ３０２（１５．５ｋｂｐ）、ｐＧＥＴＳ３０Ｘ（３３．７ｋｂｐ）、ｐＧＥＴＳ３０Ｘ（４４．７ｋｂｐ）を用いたこと、及び培地としてＬＢ培地、及びＳｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈを用いたことを除いては、実施例３０の操作を繰り返した。図１３に示すように、Ｓｕｐｅｒ  ｂｒｏｔｈを用いた方が形質転換の効率が高かった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の形質転換細胞の製造方法は、簡便かつ迅速に形質転換細胞を製造することができる。従って、ＤＮＡ組換え実験の分野において、酵母または大腸菌の形質転換細胞、酵母または大腸菌のライブラリーを、複雑な操作を必要とせずに、簡便に作製することが可能である。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年12月5日(2016.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）溶菌した枯草菌及びそれから放出されたベクターを含む溶菌液、並びに
（Ｂ）ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質変性剤、ヌクレアーゼ、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される添加剤、
を含むベクター含有液を用いて、酵母又は大腸菌を形質転換することを特徴とする、形質転換細胞の製造方法。
【請求項２】
前記ヌクレアーゼ阻害剤が、アウリントリカルボン酸、界面活性剤、キレート剤、還元剤、バニジルヌクレオチド、過酸化水素、又は抗ヌクレアーゼ抗体である請求項１に記載の形質転換細胞の製造方法。
【請求項３】
前記タンパク質変性剤がタンパク質分解酵素又は界面活性剤である、請求項１又は２に記載の形質転換細胞の製造方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、又はＳ１ヌクレアーゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の形質転換細胞の製造方法。
【請求項５】
前記形質転換が、ベクター含有液及び酵母または大腸菌コンピテントセルとの混合、又はベクター含有液及び酵母または大腸菌の混合液へのエレクトロポレーションによって行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の形質転換細胞の製造方法。
【請求項６】
前記溶菌が、枯草菌培養液の静置、ファージの感染、界面活性剤の添加、又はそれらの２つ以上の組み合わせによって行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の形質転換細胞の製造方法。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（Ａ）溶菌した枯草菌及びそれから放出されたベクターを含む溶菌液、並びに
（Ｂ）ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質変性剤、ヌクレアーゼ、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される添加剤、
を含むベクター含有液を用いて、酵母又は大腸菌を形質転換することを特徴とする、ライブラリーの製造方法。
【請求項１４】
前記ヌクレアーゼ阻害剤が、アウリントリカルボン酸、界面活性剤、キレート剤、還元剤、バニジルヌクレオチド、過酸化水素、又は抗ヌクレアーゼ抗体である請求項１３に記載のライブラリーの製造方法。
【請求項１５】
前記タンパク質変性剤がタンパク質分解酵素又は界面活性剤である、請求項１３又は１４に記載のライブラリーの製造方法。
【請求項１６】
前記ヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、マングビーンヌクレアーゼ、又はＳ１ヌクレアーゼである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のライブラリーの製造方法。
【請求項１７】
前記形質転換が、ベクター含有液及び酵母または大腸菌コンピテントセルとの混合、又はベクター含有液及び酵母または大腸菌の混合液へのエレクトロポレーションによって行われる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のライブラリーの製造方法。
【請求項１８】
前記溶菌が、枯草菌培養液の静置、ファージの感染、界面活性剤の添加、又はそれらの２つ以上の組み合わせによって行われる、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のライブラリーの製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
特許文献
［０００４］
特許文献１：特開２００５−２５３４６２号公報
非特許文献
［０００５］
非特許文献１：「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」（日本）２００１年、第６５巻、ｐ８２３−８２９
非特許文献２：「マイクロバイオロジー・アンド・モリキュラー・バイオロジー・レビュー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）」（米国）２００３年、ｐ２７７−３０１
発明の概要
発明が解決しようとする課題
［０００６］
本発明の目的は、異なる宿主間においてＤＮＡを移動させることのできる簡便で、且つハイスループットな方法を提供することである。
課題を解決するための手段
［０００７］
本発明者は、異なる宿主間においてＤＮＡを移動させることのできる簡便で、且つハイスループットな方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、ベクターを含む枯草菌を溶菌させ、それに特定の酵素等を添加したベクター含有液を用い、酵母又は大腸菌を形質転換することによって、簡便に酵母形質転換細胞を得られることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］（Ａ）溶菌した枯草菌及びそれから放出されたベクターを含む溶菌液、並びに（Ｂ）ヌクレアーゼ阻害剤、タンパク質変性剤、ヌクレアーゼ、及びそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される添加剤、を含むベクター含有液を用いて、酵母又は大腸菌を形質転換することを特徴とする、形質転換細胞の製造方法、
［２］前記ヌクレアーゼ阻害剤が、アウリントリカルボン酸、還元剤、ドデ
【国際調査報告】
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