(57)【要約】  本発明は、新規なＤＮＡ検出方法およびそのための装置を提供するためになされた。すなわち、蛍光標識プローブとＤＮＡインターカレーターと検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液をオイルに加えてドロップレットを作製する工程と、前記ドロップレットに対してＰＣＲを行う工程と、前記蛍光標識プローブからの蛍光と、ＤＮＡインターカレーターからの蛍光と、を測定する工程と、を含み、前記ＤＮＡ溶液は、１つのドロップレットに含まれる前記検出対象のＤＮＡが１を超えない濃度である、ＤＮＡ検出方法とする。また、それぞれ各工程を行う、ドロップレット作製部と、サーマルサイクラー部と、蛍光検出部とを備えたＤＮＡ検出装置とする。
2018008083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光標識プローブとＤＮＡインターカレーターと検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液をオイルに加えてドロップレットを作製する工程と、
前記ドロップレットに対してＰＣＲを行う工程と、
前記蛍光標識プローブからの蛍光と、ＤＮＡインターカレーターからの蛍光と、を測定する工程と、
を含み、前記ＤＮＡ溶液は、１つのドロップレットに含まれる前記検出対象のＤＮＡが１を超えない濃度である、ＤＮＡ検出方法。
【請求項２】
前記蛍光の両方を測定後、少なくともいずれかの蛍光が検出されないドロップレットを、前記検出対象のＤＮＡを含まないドロップレットと判定する工程を含む、請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項３】
前記蛍光標識プローブが、蛍光色素とそのクエンチャーを有する、請求項１または２に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項４】
前記蛍光標識プローブからの蛍光と、前記ＤＮＡインターカレーターからの蛍光が、同時に検出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項５】
前記蛍光標識プローブからの蛍光が、前記ＤＮＡインターカレーターからの蛍光より先に検出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項６】
前記蛍光標識プローブからの蛍光が前記ＤＮＡインターカレーターからの蛍光よりも短波長である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項７】
前記オイルがフッ素系オイル、シリコーン系オイル、または炭化水素系オイルを含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項８】
蛍光標識プローブとＤＮＡインターカレーターと検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液をオイルに加えてドロップレットを作製するためのドロップレット作製部と、
前記ドロップレットに対してＰＣＲを行うためのサーマルサイクラー部と、
前記蛍光標識プローブからの蛍光と、ＤＮＡインターカレーターからの蛍光と、を測定する蛍光検出部と、を備え、
前記ＤＮＡ溶液は、１つのドロップレットに含まれる前記検出対象のＤＮＡが１を超えない濃度である、ＤＮＡ検出装置。
【請求項９】
検出対象のＤＮＡを含むドロップレットの数および検出対象のＤＮＡを含まないドロップレットの数を表示するモニターを備える、請求項８に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項１０】
前記蛍光標識プローブが、蛍光色素とそのクエンチャーを有する、請求項８または請求項９に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項１１】
前記蛍光標識プローブからの蛍光と、前記ＤＮＡインターカレーターからの蛍光が、同時に検出されるように構成されている、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項１２】
前記蛍光標識プローブからの蛍光が、前記ＤＮＡインターカレーターからの蛍光より先に検出されるように構成されている、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項１３】
前記蛍光標識プローブの蛍光が前記ＤＮＡインターカレーターの蛍光よりも短波長である請求項８〜１２のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項１４】
前記オイルがフッ素系オイル、シリコーン系オイル、または炭化水素系オイルを含有する、請求項８〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項１５】
ＤＮＡ検出装置に、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出方法を行わせるためのプログラム。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ検出装置は、請求項８〜１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ検出装置である、請求項１５に記載のプログラム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
がんや感染症の診断においては、検体中に微量にしか含まれないがん関連遺伝子およびウイルス由来遺伝子の定量や、対象とするがん関連遺伝子の総量に比べて微量な変異の検出が求められている。これまでこのような遺伝子検査ではＰＣＲ（特許文献１−３）やリアルタイムＰＣＲ（非特許文献１）が用いられていたが、近年、検体の微量化や早期診断のため、従来以上に高感度な遺伝子検査において、再現性よく、かつ定量的に測定できる方法が望まれている。【０００２】
ドロップレットデジタルＰＣＲ（特許文献４）は、限界希釈したサンプルを用いて絶対的に定量することで、従来の遺伝子検査において対象遺伝子が微量なときに測定再現性が低下するという課題を解決する方法として開発された。ドロップレットデジタルＰＣＲの実験手順を次に示す。まず、ドロップレットデジタルＰＣＲでは１ドロップレットに１つか０の対象遺伝子が入るように検体を限界希釈する。次に、限界希釈した検体にＰＣＲに必要となるＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、蛍光標識プローブを加え、オイル中にＰＣＲ反応液のドロップレットを作製する。ドロップレット作製後、ＰＣＲにより対象遺伝子を増幅する。ＰＣＲ後に各ドロップレットの蛍光強度を測定し、閾値を超える蛍光強度をもつドロップレットの数をカウントすることにより、対象遺伝子を定量する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第４６８３１９５号
【特許文献２】米国特許第４６８３２０２号
【特許文献３】米国特許第４８００１５９号
【特許文献４】特表２０１３−５２１７６４
【非特許文献１】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１０，ｐｐ９８６−９９４，１９９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、新規なＤＮＡ検出方法およびそのための装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施態様は、蛍光標識プローブとＤＮＡインターカレーターと検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液をオイルに加えてドロップレットを作製する工程と、前記ドロップレットに対してＰＣＲを行う工程と、前記蛍光標識プローブからの蛍光と、ＤＮＡインターカレーターからの蛍光と、を測定する工程と、を含み、前記ＤＮＡ溶液は、１つのドロップレットに含まれる前記検出対象のＤＮＡが１を超えない濃度である、ＤＮＡ検出方法である。このＤＮＡ検出方法において、前記蛍光の両方を測定後、少なくともいずれかの蛍光が検出されないドロップレットを、前記検出対象のＤＮＡを含まないドロップレットと判定する工程を含んでもよい。また、前記蛍光標識プローブが、蛍光色素とそのクエンチャーを有してもよい。また、前記蛍光標識プローブからの蛍光と、前記ＤＮＡインターカレーターからの蛍光が、同時に検出されてもよく、前記蛍光標識プローブからの蛍光が、前記ＤＮＡインターカレーターからの蛍光より先に検出されてもよい。また、前記蛍光標識プローブからの蛍光が前記ＤＮＡインターカレーターからの蛍光よりも短波長であってもよい。また、前記オイルがフッ素系オイル、シリコーン系オイル、または炭化水素系オイルを含有してもよい。【０００６】
本発明の他の一実施態様は、蛍光標識プローブとＤＮＡインターカレーターと検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液をオイルに加えてドロップレットを作製するためのドロップレット作製部と、前記ドロップレットに対してＰＣＲを行うためのサーマルサイクラー部と、前記蛍光標識プローブからの蛍光と、ＤＮＡインターカレーターからの蛍光と、を測定する蛍光検出部と、を備え、前記ＤＮＡ溶液は、１つのドロップレットに含まれる前記検出対象のＤＮＡが１を超えない濃度である、ＤＮＡ検出装置である。このＤＮＡ検出装置は、検出対象のＤＮＡを含むドロップレットの数および検出対象のＤＮＡを含まないドロップレットの数を表示するモニターを備えてもよい。また、前記蛍光標識プローブが、蛍光色素とそのクエンチャーを有してもよい。また、前記蛍光標識プローブからの蛍光と、前記ＤＮＡインターカレーターからの蛍光が、同時に検出されるように構成されていても、前記蛍光標識プローブからの蛍光が、前記ＤＮＡインターカレーターからの蛍光より先に検出されるように構成されていてもよい。また、前記蛍光標識プローブの蛍光が前記ＤＮＡインターカレーターの蛍光よりも短波長であってもよい。また、前記オイルがフッ素系オイル、シリコーン系オイル、または炭化水素系オイルを含有してもよい。【０００７】
本発明のさらなる一実施態様は、ＤＮＡ検出装置に、上記いずれかに記載のＤＮＡ検出方法を行わせるためのプログラムである。このＤＮＡ検出装置は、上記いずれかのＤＮＡ検出装置であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の一実施態様における、ＤＮＡ検出方法の各工程をあらわす模式図である。
【図２】本発明の一実施態様において、ドロップレットとその蛍光の組み合わせを示す図である。
【図３】本発明の一実施態様において、ドロップレットの蛍光強度を測定する方法を示す図である。
【図４】本発明の一実施態様における、ＤＮＡ検出方法を行うための装置とその装置で用いるカートリッジを示す模式図である。
【図５】本発明の一実施態様において、図４の装置とカートリッジを用いたＤＮＡ検出方法を示すフローである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
（１）ＤＮＡ検出方法
本発明に係るＤＮＡ検出方法は、蛍光標識プローブとＤＮＡインターカレーターと検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液をオイルに加えてドロップレットを作製する工程と、ドロップレットに対してＰＣＲを行う工程と、蛍光標識プローブからの蛍光と、ＤＮＡインターカレーターからの蛍光と、を測定する工程と、を含む。以下、実施例を挙げて、具体的に発明の内容を説明するが、本発明は本実施例に限定されない。
【００１０】
図１に本発明の一実施態様における、ＤＮＡ検出方法の各工程を示した。まず、検出対象のＤＮＡ１０２を含む検体に、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー１０７、それぞれ異なる蛍光で標識された複数の異なる配列を認識する蛍光標識プローブ１０３、１０４、ＤＮＡインターカレーター１０８、デオキシリボヌクレオチド類、緩衝液を加え、ＰＣＲ反応液１０１とする。
【００１１】
検体は特に限定されないが、検出対象のＤＮＡを含む試料であればよく、動植物の体液や組織、細胞、排泄物などの生体試料や、土壌サンプルなど真菌や細菌などが含まれる試料が例示できる。体液としては血液、唾液、髄液などが例示できる。組織としては、外科手術や生検法によって得られた疾患の患部（例えば、乳房や肝臓などのがん組織）が例示できる。細胞としては、生検法によって採取した疾患の患部付近の細胞や、血液中を循環する血中循環腫瘍細胞などが例示できる。これらの検体は、生体や環境などから採取後、ホモジネートしたものや懸濁液に添加したもの、あるいは溶解液で溶解させたものでもよいが、それらに含まれる核酸を精製したものであることが好ましい。
【００１２】
蛍光標識プローブ１０３、１０４は、それぞれ５’および３’末端に蛍光色素１０５と蛍光色素１０５のクエンチャー１０６をもつ。蛍光標識プローブ１０３、１０４はＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブのようなテンプレートＤＮＡにアニールした後、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により加水分解されて蛍光色素とクエンチャーが離れて蛍光を発するものでもよいし、モレキュラービーコンのような通常ステムループ構造を形成し、テンプレートＤＮＡにアニールして蛍光色素とクエンチャーが離れて蛍光を発するものでもよい。蛍光標識プローブ１０３、１０４の濃度は特に限定されないが、プライマー１０７と同程度であって、０．０１μＭから１μＭとすることが好ましい。
【００１３】
蛍光標識プローブ１０３、１０４の蛍光色素１０５とクエンチャー１０６の組み合わせは、一般的にリアルタイムＰＣＲに用いられている組み合わせであれば特に限定されず、蛍光色素１０５がＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５など、クエンチャー１０６がＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３などが例示できる。
【００１４】
蛍光標識プローブ１０３、１０４が認識する配列は、全く異なる種類のＤＮＡであってもよく、１塩基だけ異なる配列を有するＤＮＡであってもよい。例えば、遺伝子であれば、異なる遺伝子のものであってもよいし、同じ遺伝子の野生型と変異型であってもよい。例えば、肺がんの遺伝子検査を行う場合であれば、分子標的薬の効果を予測するため、ＡＬＫ融合遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子変異の有無を判定する。その時、ＡＬＫ融合遺伝子とＥＧＦＲ遺伝子の各々を認識する配列であってもよいし、ＥＧＦＲのＬ８５８Ｒ変異型とその野生型を認識する配列であってもよい。
【００１５】
ＤＮＡインターカレーター１０８はＰＣＲ反応において２本鎖ＤＮＡと結合することによって蛍光強度が増加し、ＤＮＡの検出に用いることのできるインターカレーターであれば適用できる。具体的には、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＩやＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ（登録商標）  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ  Ｏｒａｎｇｅ、ＳＹＴＯ  Ｒｅｄ、ＰＯＰＯ（登録商標）−１、ＢＯＢＯ（登録商標）−１、ＹＯＹＯ（登録商標）−１、ＴＯＴＯ（登録商標）−１、ＪＯＪＯ（登録商標）−１、ＰＯＰＯ−３、ＬＯＬＯ（登録商標）−１、ＢＯＢＯ−３、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＰＯ−Ｐｒｏ（登録商標）−１、ＹＯ−Ｐｒｏ（登録商標）−１、ＴＯ−Ｐｒｏ（登録商標）−１、ＪＯ−Ｐｒｏ（登録商標）−１、ＰＯ−Ｐｒｏ−３、ＹＯ−Ｐｒｏ−３、ＴＯ−Ｐｒｏ−３、ＴＯ−Ｐｒｏ−５、エチジウムブロマイドなどを使用可能である。通常、ＤＮＡ検出にＤＮＡインターカレーターを用いる場合、過剰量を添加して蛍光強度を高くし、精度を向上させるが、本発明ではＤＮＡインターカレーターはＤＮＡの増幅の有無が判断できればよく、定量性を必要としないため、ＤＮＡインターカレーターの濃度は、プライマー１０７と同程度もしくはそれよりも薄くてもよい。具体的には、０．００１μＭから１μＭとすることが好ましい。また、ＤＮＡインターカレーターはＰＣＲ反応液だけでなく、ドロップレットの作製に用いるオイルに混合してもよい。
【００１６】
次に、ＰＣＲ反応液１０１、オイルと界面活性剤の混合溶液１１０を用いてドロップレット１０９を作製する。このとき、１ドロップレットに１つか０の検出対象のＤＮＡ１１１、１１２を含むように検体の希釈倍率を調整する。ドロップレットの大きさは特に限定されないが、１０μｍから１００μｍが好ましい。例えばドロップレットの大きさを平均２０μｍと仮定すると、１ドロップレットあたりの平均体積は４ｐｌとなる。４ｐｌのドロップレット１つにつき３．２ｐｇのゲノム１つが入るようにすると、最終濃度が８００ｎｇ／μｌになるように検体を希釈することになるが、実際はこの濃度で作製するとドロップレット１つにつき複数個のゲノムが入ってしまう確率が高いため、ＤＮＡの最終濃度は前述した値の１０分の１である８０ｎｇ／μｌ以下が好ましく、下限値は１０００分の１である０．８ｎｇ／μｌ以上が好ましく、１００分の１である８ｎｇ／μｌ程度がより好ましい。
ドロップレットの作製方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、マイクロ流路中でオイルと界面活性剤、ＰＣＲ反応液を混ぜてドロップレットを作製する方法、ＰＣＲ反応液を多孔質膜を通してオイルと界面活性剤の層へ添加してドロップレットを作製する方法、チューブ内でオイルと界面活性剤、ＰＣＲ反応液を混ぜてボルテックスミキサーによる攪拌により作製する方法などが挙げられる。
【００１７】
オイルはドロップレットを構成するＰＣＲ反応液に不溶性もしくは難溶性である化学的に不活性な物質であり、また、ＰＣＲのような高温での温度変化に対して安定である物質が好ましく、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイルなどが使用可能である。フッ素系オイルとしては、例えばＰｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎやＨｙｄｒｏｆｌｕｏｒｏｅｔｈｅｒなどが挙げられる。フッ素系オイルは、炭素鎖が長いほうが揮発性が低いので好ましい。また、フッ素系オイルは比重が１．７超であり、ＰＣＲ反応液の溶媒である水の比重１に比べて重いため、作製したドロップレットはオイルに浮く。シリコーン系オイルとしては、例えばＰｏｌｙｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅやＴｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘｙｓｉｌｉｃａｔｅなどが挙げられる。シリコーン系オイルはフッ素系オイルと異なり、比重が０．９８程度でＰＣＲ反応液の溶媒である水の比重に近く、作製したドロップレットはオイル中に均一に分散する。炭化水素系オイルとしては、例えばミネラルオイルや流動パラフィン、ヘキサデカンなどが挙げられる。炭化水素系オイルは比重が０．８４程度でＰＣＲ反応液の溶媒である水の比重よりも軽いため、作製したドロップレットはオイルに沈む。
【００１８】
界面活性剤の種類は特に限定されないが、Ｔｗｅｅｎ  ２０、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｓｐａｎ８０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などが適用可能である。
【００１９】
作製したドロップレットに対し、サーマルサイクラーでＰＣＲを行い、ドロップレット内で検出対象のＤＮＡを増幅させる。反応終了後、各ドロップレットの蛍光強度を測定する。
【００２０】
図２に、想定されるドロップレットとその蛍光の組み合わせに関する例を示す。ドロップレット２０１から２０５までの５種類について、図２ＡにはＰＣＲ前のドロップレットの状態を、図２ＢにはＰＣＲ後のドロップレットの状態を示している。図２ＡのＰＣＲ前の状態ではドロップレット内に含まれるＤＮＡのみを表示しており、蛍光標識プローブやＤＮＡインターカレーターについては省略している。ドロップレット２０１は検出対象のＤＮＡ２０６を含み、ドロップレット２０２と２０３は検出対象以外のＤＮＡ２０７を含み、ドロップレット２０４と２０５はＤＮＡを含まない。図２Ｂに示すように、ドロップレット２０２および２０４は検出対象のＤＮＡ２０６を含まないため、蛍光標識プローブ２０８も分解されず、ＤＮＡインターカレーター２０９もインターカレートせず、蛍光は検出されない。ドロップレット２０１では検出対象のＤＮＡ２０６を含むため、そのＤＮＡの増幅に伴って蛍光標識プローブが分解されて蛍光色素２１０とクエンチャー２１１が離れ、また、ＤＮＡインターカレーター２１２が増幅したＤＮＡにインターカレートし、蛍光標識プローブおよびＤＮＡインターカレーターの蛍光が検出される。ドロップレット２０３および２０５は検出対象のＤＮＡ２０６を含まないが、検体由来の成分により蛍光標識プローブが分解、もしくは蛍光プローブの蛍光色素２１０とクエンチャー２１１が解離し、蛍光標識プローブの蛍光色素２１０が蛍光を発する場合を示している。しかし、ドロップレット２０３および２０５はＤＮＡが増幅していないため、ＤＮＡインターカレーター２０９は蛍光を発しない。したがって、蛍光標識プローブとＤＮＡインターカレーターの両方の蛍光が検出されるドロップレットの数をカウントすることにより検出対象のＤＮＡ２０６の数が測定でき、どちらか一方または両方の蛍光が検出されないドロップレットの数をカウントすることにより、検出対象のＤＮＡ２０６を含まないドロップレットの数を測定できる。このように、本発明によると、実際に増幅したＤＮＡを、異なるメカニズムの二つの方法で検出しているため、両方が偽陽性になる確率が著しく低下し、測定再現性および測定精度を向上させることができる。
【００２１】
なお、検出対象のＤＮＡ２０６が複数種類ある場合は、ＤＮＡの種類ごとに異なる蛍光色素で標識した蛍光標識プローブを使用することによって、蛍光標識プローブの蛍光色素の種類から、ドロップレットに含まれるＤＮＡの種類を判定することができる。
【００２２】
図３に、各ドロップレットの蛍光強度を測定する方法の一例を示す。図３Ａには、マイクロ流路を用いてドロップレットの蛍光強度を測定する方法を示す。ドロップレット３０１がマイクロ流路中を矢印の方向に流れている。ドロップレット３０２の位置までドロップレットが流れると、レーザー３０３により励起光がドロップレットに照射される。レーザー３０３によりドロップレットに含まれる蛍光物質が励起され、発する蛍光を蛍光フィルター３０４を通してフォトマルチプルメーター３０５で検出する。レーザー３０３、蛍光フィルター３０４、フォトマルチプルメーター３０５で構成される蛍光検出器は、蛍光標識プローブとＤＮＡインターカレーターの検出ごとに別々に設けてもよいし、図３に示すように１つのレーザーの励起光で励起して３つのバンドパスフィルターでそれぞれの蛍光を同時に検出するように構成してもよい。
【００２３】
図３Ｂは、平面上にドロップレットを配置し、ドロップレットの蛍光強度を測定する方法を示す図である。ステージ３１１上にドロップレットを含む溶液を添加する。このとき、オイルが炭化水素系オイルであればドロップレットは溶液中で沈み、ステージ３１１上で動かないため、ドロップレットの位置を特定でき、数も数えられる。しかし、フッ素系オイルではドロップレットは溶液中で浮き、シリコーン系オイルでは溶液中に分散するため、ステージ上で動かないようにして蛍光を検出するには、例えば、ドロップレットの直径と同等または直径より薄いガラス板に挟まれた空間にドロップレットを含む溶液を添加するなどの処理が必要になる。このようにドロップレットを配置した後、レーザー３０６によってレンズ３０７、３０８を通して励起光をドロップレットに照射すると、ドロップレットに含まれる蛍光物質が励起され、蛍光を発する。蛍光物質から放射された蛍光は蛍光フィルター３１２により励起光の波長をカットした後に、ＣＣＤカメラ３１３で撮影する。蛍光フィルター３１２は励起光の波長をカットするロングパスフィルターでもよいし、蛍光標識プローブとＤＮＡインターカレーターごとに異なるバンドパスフィルターでもよい。
【００２４】
蛍光標識プローブの蛍光色素とＤＮＡインターカレーターの波長の組み合わせは、検出の順番によって望ましい波長が異なる。なぜなら、ＤＮＡインターカレーターの強度はＤＮＡ増幅の有無を判定できればよく、定量性を必要としないが、蛍光標識プローブの蛍光色素は正確に強度を測定する必要があるため、ＤＮＡインターカレーターの測定により蛍光標識プローブの蛍光色素が退色するなど影響を受けない条件が好ましい。従って、蛍光標識プローブの蛍光測定をＤＮＡインターカレーターよりも先に行う場合や、蛍光標識プローブとＤＮＡインターカレーターを１つのレーザーの励起光で励起して、２つのバンドパスフィルターでそれぞれの蛍光を同時に検出する場合であれば、ＤＮＡインターカレーターの蛍光色素の波長は、特に問題にならない。しかし、ＤＮＡインターカレーターの蛍光測定を蛍光標識プローブよりも先に行うのであれば、蛍光標識プローブの蛍光色素をＤＮＡインターカレーターの波長より短波長側のものを選んだほうが、ＤＮＡインターカレーターの測定により蛍光標識プローブの蛍光色素が退色する可能性が低くなるので好ましい。
（２）ＤＮＡ検出装置
本発明の一実施態様におけるＤＮＡ検出装置は、蛍光標識プローブとＤＮＡインターカレーターと検出対象のＤＮＡを含有するＤＮＡ溶液をオイルに加えてドロップレットを作製するためのドロップレット作製部と、ドロップレットに対してＰＣＲを行うためのサーマルサイクラー部と、蛍光標識プローブからの蛍光と、ＤＮＡインターカレーターからの蛍光と、を測定する蛍光検出部と、を備える。以下、実施例を挙げて、具体的に発明の内容を説明するが、本発明は本実施例に限定されない。
【００２５】
図４は、本発明の方法を行うための装置とその装置で用いるカートリッジの一例を示す図である。図４Ａに示すように、ドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置４２１はドロップレット作製部４０１、サーマルサイクラー４０２、ドロップレット検出部４０３、モニター４０４から構成される。ドロップレット作製部４０１は、図４Ｂに示すドロップレット作製用カートリッジ４０５をセットして用いる。ドロップレット作製用カートリッジ４０５は、オイル供給口４１５、ＰＣＲ反応液導入口４１６、ドロップレット排出口４１７を有する。ドロップレット検出装置４０３は、図４Ｃに示すドロップレット検出用カートリッジ４０７をセットして用いる。ドロップレット検出用カートリッジ４０７は、オイル供給口４１８、ドロップレット導入口４１９、廃液排出口４２０を有する。ドロップ作製用カートリッジのオイル供給口４１５はドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置４２１と流体的に接続され、ポンプ４０９によってオイル４１３が供給される。ドロップ作製用カートリッジのＰＣＲ反応液導入口４１６はドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置４２１と流体的に接続され、ポンプ４０８によって窒素ガスや空気などのガスまたはオイル４１２が供給される。ドロップ作製用カートリッジのドロップレット排出口４１７はドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置４２１と流体的に接続され、サーマルサイクラー４０２にセットしたマイクロチューブ４０６へとつながっている。ドロップレット検出用カートリッジ４０７のオイル供給口４１８はドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置４２１と流体的に接続され、ポンプ４１０によってオイル４１３が供給される。ドロップレット検出用カートリッジ４０７のドロップレット導入口４１９はドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置４２１と流体的に接続され、サーマルサイクラー４０２にセットしたマイクロチューブ４０６へとつながっている。ドロップレット検出用カートリッジ４０７の廃液排出口４２０は、ドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置４２１と流体的に接続され、ポンプ４１１によって廃液溜め４１４にドロップレット検出用カートリッジ４０７内の廃液が排出される。ポンプは、ペリスタポンプであっても、シリンジポンプであっても、ダイアフラムポンプであってもよい。モニター４０４は、測定結果やメッセージを表示するための表示部であり、ユーザが操作を入力する入力部でもある。
【００２６】
図５は、図４の装置とカートリッジを用いた測定の方法の一例を示す図である。生体試料に含まれるＤＮＡを精製したものを検体とし、この検体をＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、蛍光標識プローブ、ＤＮＡインターカレーター、デオキシリボヌクレオチド類、ｐＨ緩衝液を含むＰＣＲ反応液に添加する（Ｓ５０１）。蛍光標識プローブはＤＮＡポリメラーゼにより加水分解されて蛍光を発するＴａｑＭａｎプローブを用いた場合を示す。ドロップレット作製用カートリッジ４０５のＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応液導入口４１６に添加する（Ｓ５０２）。ドロップレット作製用カートリッジ４０５をドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置４２１のドロップレット作製部４０１にセットする。オイル供給口４１５からオイル４１３を、ＰＣＲ反応液導入口４１６からオイル４１２を添加する（Ｓ５０３）。ドロップレット作製用カートリッジ４０５内のオイルとＰＣＲ反応液の流路が交わる部位において、ドロップレットが生成する。生成したドロップレットは、ドロップレット排出口４１７から排出され、サーマルサイクラー内にあらかじめ設置しておいたマイクロチューブ４０６に貯蔵される（Ｓ５０４）。マイクロチューブ４０６の蓋を閉め、サーマルサイクラーの温度制御によりＰＣＲを行う（Ｓ５０５）。反応サイクルが進むと、ＤＮＡが増幅するとともに、蛍光標識プローブが分解されて、蛍光強度が高くなる。一方、合成したＤＮＡは２本鎖を形成し、ＤＮＡインターカレーターがこの２本鎖ＤＮＡにインターカレートして蛍光を発する。反応終了後、ドロップレット検出部４０３にあらかじめ設置しておいたドロップレット検出用カートリッジのドロップレット導入口４１９からドロップレットを、オイル供給口４１５からオイル４１３を添加する（Ｓ５０６）。ドロップレット検出部において、蛍光標識プローブとＤＮＡインターカレーターの蛍光強度を測定する（Ｓ５０７）。ＤＮＡインターカレーターの蛍光強度が閾値以下のドロップレットを空と判定する（Ｓ５０８）。閾値は、例えば、ＤＮＡインターカレーターの蛍光強度の最大値の１０分の１とすることができるが、これに限定されない。蛍光標識プローブの蛍光強度とＤＮＡインターカレーターの蛍光強度の両方が高いドロップレットを、検出対象のＤＮＡを含むドロップレットとし、どちらか一方または両方の蛍光が検出されないドロップレットを空のドロップレットとし、検出対象のＤＮＡを含むドロップレットの数と検出対象のＤＮＡを含まないドロップレットの数をモニターに表示する（Ｓ５０９）。
（３）プログラム
本発明の一実施態様は、ＤＮＡ検出装置に、ＤＮＡ検出方法を行わせるためのプログラムである。ここでＤＮＡ検出装置は、（２）で詳述した装置を用い、ＤＮＡ検出方法として、（１）で詳述した方法を実行する。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明によって、新規なＤＮＡ検出方法およびそのための装置を提供できるようになった。
【符号の説明】
【００２８】
１０１  ＰＣＲ反応液
１０２  ＤＮＡ
１０３、１０４  蛍光標識プローブ
１０５  蛍光色素
１０６  クエンチャー
１０７  プライマー
１０８  ＤＮＡインターカレーター
１０９  ドロップレット
１１０  オイルと界面活性剤の混合溶液
１１１  検出対象のＤＮＡ（Ａ）
１１２  検出対象のＤＮＡ（Ｂ）
１１３  検出対象以外のＤＮＡ
２０１〜２０５  ドロップレット
２０６  検出対象のＤＮＡ
２０７  検出対象以外のＤＮＡ
２０８  蛍光標識プローブ
２０９  ＤＮＡインターカレーター
２１０  蛍光色素
２１１  クエンチャー
２１２  ＤＮＡインターカレーター
３０１、３１２  ドロップレット
３０３  レーザー
３０４  蛍光フィルター
３０５  フォトマルチプルメーター
３０６  レーザー
３０７、３０８  レンズ
３０９  ドロップレット
３１０  ドロップレット
３１１  ステージ
３１２  蛍光フィルター
３１３  フォトマルチプルメーター
４０１  ドロップレット作製部
４０２  サーマルサイクラー
４０３  ドロップレット検出部
４０４  モニター
４０５  ドロップレット作製用カートリッジ
４０６  マイクロチューブ
４０７  ドロップレット検出用カートリッジ
４０８〜４１１  バルブ
４１２  オイル
４１３  オイル
４１４  廃液溜め
４１５  オイル供給口
４１６  ＰＣＲ反応液導入口
４１７  ドロップレット排出口
４１８  オイル供給口
４１９  ドロップレット導入口
４２０  廃液排出口
４２１  ドロップレットデジタルＰＣＲ測定装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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