(57)【要約】【課題】  簡便な方法でビフィズス菌の生菌数を増大・維持させながら、乳酸菌とビフィズス菌を含む発酵乳を製造することを目的とする。【解決手段】  原料乳と、乳酸菌と、ビフィズス菌と、を混合する第１工程と、原料乳を発酵させる第２工程と、を順次行う発酵乳の製造方法であって、上記第２工程が終了する前に、原料乳にラクターゼを添加する工程（ラクターゼ添加工程）を有し、前記第１工程の前、前記第１工程と略同時又は前記第１工程の後から選択される１つ以上のタイミングで、前記ラクターゼ添加工程を行うことを特徴とする発酵乳の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
原料乳と、乳酸菌と、ビフィズス菌と、を混合する第１工程と、
原料乳を発酵させる第２工程と、
を順次行う発酵乳の製造方法であって、
上記第２工程が終了する前に、原料乳にラクターゼを添加する工程（ラクターゼ添加工程）を行うことを特徴とする発酵乳の製造方法。
【請求項２】
前記第１工程の前、前記第１工程と略同時又は前記第１工程の後から選択される１つ以上のタイミングで、前記ラクターゼ添加工程を行うことを特徴とする請求項１に記載の発酵乳の製造方法。
【請求項３】
前記ラクターゼによって、前記原料乳に含まれる乳糖を徐々に分解することを特徴とする請求項１又は２に記載の発酵乳の製造方法。
【請求項４】
前記原料乳に加える前記ラクターゼの終濃度が１．３ｕｎｉｔ／ｇ以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の発酵乳の製造方法。
【請求項５】
乳糖の分解によって生成したグルコース及びガラクトースを前記乳酸菌又は前記ビフィズス菌に資化させることを特徴とする請求項３に記載の発酵乳の製造方法。
【請求項６】
前記乳糖が、前記ラクターゼによって分解され、且つ、当該分解と並行して前記乳酸菌又は前記ビフィズス菌の少なくとも一方に資化されることを特徴とする請求項３又は５に記載の発酵乳の製造方法。
【請求項７】
前記ラクターゼが前記第２工程中に徐々に失活していくことを特徴とする請求項１に記載の発酵乳の製造方法。
【請求項８】
乳酸菌と、ビフィズス菌と、ラクターゼと、を含有する発酵乳であって、
当該ラクターゼが中性ラクターゼであり、発酵乳中において失活した状態で存在し、乳糖が２．０質量％以下であることを特徴とする発酵乳。
【請求項９】
前記乳糖が０．５質量％以下であることを特徴とする請求項８に記載の発酵乳。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌と、ビフィズス菌と、を使用した発酵乳の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸内菌叢を構成する乳酸菌やビフィズス菌は、腸内で有益な作用を奏することが知られている。しかし、乳酸菌やビフィズス菌の増殖速度は、腸内菌叢を構成する他の細菌に比べて遅い。そこで、腸内で乳酸菌やビフィズス菌を選択的に増殖させる発明が提案されている（例えば、特許文献１参照）。特にビフィズス菌は増殖速度が遅く、ビフィズス菌を特異的に増殖させる発明も提案されている（例えば、特許文献２参照）。【０００３】
腸内菌叢を構成する乳酸菌やビフィズス菌の割合を増やす方法として、生きた状態の乳酸菌やビフィズス菌を含む発酵乳を摂取することも考えられる。しかしながら、ビフィズス菌は乳酸菌に比べて酸素に弱く、増殖速度も遅いことから、乳酸菌とビフィズス菌を含む発酵乳を製造する場合において、ビフィズス菌を増殖させることは難しい。ビフィズス菌の種類によっては、乳酸菌との共存下において、ほとんど増殖せず死滅するものも存在する。そこで、乳酸菌とビフィズス菌を含む発酵乳を製造する場合、ビフィズス菌の添加量を多くするか、特許文献２に記載のガラクトオリゴ糖を添加する必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２７２２１１０号
【特許文献２】特開２００９−１８９３７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、乳酸菌とビフィズス菌を含む発酵乳を製造するために、ビフィズス菌の添加量を多くする場合、事前に大量のビフィズス菌を培養する必要が生じることと、原料乳に大量のビフィズス菌を添加する必要が生じることから、製造コストが増大する問題があった。特許文献２に記載のガラクトオリゴ糖を得るには、別途の工程が必要になるため、製造コストが増大する問題があった。【０００６】
本発明は、簡便な方法でビフィズス菌の生菌数を増大・維持させながら、乳酸菌とビフィズス菌を含む発酵乳を製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、以下の技術的構成を有することにより、本発明の課題を解決した。【０００８】
（１）原料乳と、乳酸菌と、ビフィズス菌と、を混合する第１工程と、原料乳を発酵させる第２工程と、を順次行う発酵乳の製造方法であって、上記第２工程が終了する前に、原料乳にラクターゼを添加する工程（ラクターゼ添加工程）を行うことを特徴とする発酵乳の製造方法。
（２）前記第１工程の前、前記第１工程と略同時又は前記第１工程の後から選択される１つ以上のタイミングで、前記ラクターゼ添加工程を行うことを特徴とする前記（１）に記載の発酵乳の製造方法。
（３）前記ラクターゼによって、前記原料乳に含まれる乳糖を徐々に分解することを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の発酵乳の製造方法。
（４）前記原料乳に加える前記ラクターゼの終濃度が１．３ｕｎｉｔ／ｇ以上であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の発酵乳の製造方法。
（５）乳糖の分解によって生成したグルコース及びガラクトースを前記乳酸菌又は前記ビフィズス菌に資化させることを特徴とする前記（３）に記載の発酵乳の製造方法。
（６）前記乳糖が、前記ラクターゼによって分解され、且つ、当該分解と並行して前記乳酸菌又は前記ビフィズス菌の少なくとも一方に資化されることを特徴とする前記（３）又は（５）に記載の発酵乳の製造方法。
（７）前記ラクターゼが前記第２工程中に徐々に失活していくことを特徴とする前記（１）に記載の発酵乳の製造方法。
（８）乳酸菌と、ビフィズス菌と、ラクターゼと、を含有する発酵乳であって、当該ラクターゼが中性ラクターゼであり、発酵乳中において失活した状態で存在し、乳糖が２．０質量％以下であることを特徴とする発酵乳。
（９）前記乳糖が０．５質量％以下であることを特徴とする前記（８）に記載の発酵乳。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、簡便な方法でビフィズス菌の生菌数を増大・維持させながら、乳酸菌とビフィズス菌を含む発酵乳を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明によって、発酵途中におけるｐＨが高くなる傾向が認められることを示す図である（発酵終了時のｐＨは本発明の実施有無によって変わらない）。
【図２】ラクターゼ終濃度によって、ビフィズス菌数の増加割合が異なることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、原料乳と、乳酸菌と、ビフィズス菌と、を混合する第１工程と、
原料乳を発酵させる第２工程と、
を順次行う発酵乳の製造方法であって、
上記第２工程が終了する前に、原料乳にラクターゼを添加する工程（ラクターゼ添加工程）を行うことを特徴とする発酵乳の製造方法である。
第２工程が終了する前に、ラクターゼ添加工程を行うことで、原料乳に含まれる乳糖を酵素反応によってグルコースとガラクトースに分解することが可能になる。ラクターゼ添加工程によって、原料乳に含まれる乳糖量が減少し、グルコース量とガラクトース量が増大する結果、発酵乳におけるビフィズス菌の生菌数が増大する。第２工程が終了とは、発酵工程が終了と同義である。
当該効果は、原料乳にグルコース及び／又はガラクトースを添加しただけでは得られない。発酵乳におけるビフィズス菌の生菌数を増大させるには、ラクターゼを添加することによって、原料乳に含まれる乳糖量を減少させた上で、グルコース量及びガラクトース量を増大させることが重要である。
【００１２】
第１工程は、原料乳と、乳酸菌と、ビフィズス菌と、を混合するものであればよく、加える順序は制限されない。原料乳を主にする場合、原料乳に乳酸菌と、ビフィズス菌と、を加えればよい。
原料乳と、乳酸菌と、ビフィズス菌と、を混合する方法は特に限定されない。原料乳中に、乳酸菌とビフィズス菌が略均一に分布するようにわずかな時間だけ混合させる程度でもよい。略均一に分布させた後は、原料乳を満たした容器の底面に、乳酸菌とビフィズス菌が分布した状態であってもよい。
ビフィズス菌は酸素耐性が高くないため、混合する時間は短くすることが好ましい。混合速度を遅くすると、原料乳中の溶存酸素量を低くすることができるため好ましい。原料乳の温度を高くすると溶存酸素量を低くすることが可能である。また、撹拌時に泡立てないように注意することも重要である。また、溶存酸素低減、除去の為に脱気操作や窒素などの不活性ガスによる曝気操作も効果的である。
【００１３】
第２工程は、原料乳を、乳酸菌とビフィズス菌で発酵させる工程である。
第２工程における発酵温度は、乳酸菌及びビフィズス菌が生育する温度であればよい。
使用する乳酸菌及びビフィズス菌によって発酵温度は異なるが、２０℃〜５０℃の範囲にすることが好ましく、２５℃〜４５℃にすることがより好ましい。
下限値未満であると、発酵が遅延しやすくなり、経済性に優れた発酵乳を得にくくなるおそれがある。
上限値超であると、乳酸菌及びビフィズス菌、又はビフィズス菌の死滅の問題がある。
【００１４】
第２工程における発酵時間は、使用する乳酸菌及びビフィズス菌の種類並びにその発酵温度によるが、１時間〜４８時間の範囲にすることが好ましい。発酵が進むにつれて、原料乳のｐＨが低下するので、これを指標にすることもできる。
下限値未満であると発酵が十分に進行せず、所望の発酵乳を得にくくなるおそれがある。
上限値超であると製造コストの増加や出来上がった発酵乳の品質が悪化するおそれがある。
【００１５】
ラクターゼ添加工程は、第１工程の前、第１工程と略同時又は第１工程の後から選択される１つ以上のタイミングで、行うことが好ましい。２以上のタイミングで行うことも可能である。ラクターゼ添加工程後に、原料乳に含まれる乳糖の分解が行われることになる（ラクターゼ反応）。
【００１６】
簡便性の点とビフィズス菌の増殖効果を得る点からは、第１工程の前又は第１工程と略同時にラクターゼ添加工程を行うことが好ましい。乳糖の分解によって生成したグルコース及びガラクトースを前記乳酸菌又は前記ビフィズス菌に資化させることが可能になる。
第１工程の前又は第１工程と略同時にラクターゼを添加することによって、発酵途中における乳酸菌の生育が抑えられ、ビフィズス菌の増殖効果が高められる。ラクターゼを添加した場合に、発酵途中において乳酸菌の生育が抑えられることは、原料乳のｐＨが下がりにくくなることから確認することができる。
【００１７】
ビフィズス菌の増殖効果をさらに高める点からは、第１工程と略同時にラクターゼ添加工程を行うことがより好ましい。発酵が進むにつれて、前記原料乳に含まれる乳糖の分解速度を緩やかにすることが可能となる結果、ビフィズス菌と乳酸菌の共存化において、ビフィズス菌が資化しやすい環境を整えることができ、ビフィズス菌の増殖効果を高めることができる。
前記ラクターゼとして中性ラクターゼを使用することが好ましい。発酵乳を製造する場合に中性ラクターゼを使用すると、発酵の進行に伴うｐＨ低下によって徐々に中性ラクターゼが失活する。すなわち、中性ラクターゼによる原料乳に含まれる乳糖の分解速度は、発酵の進行に伴い、漸減することになる。このような中性ラクターゼの作用は、乳酸菌とビフィズス菌の共存化において、ビフィズス菌が原料乳中の糖類を資化させやすくなる環境を提供することができ、発酵乳中のビフィズス菌数を増大させるものである。
【００１８】
本発明において、略同時とは、使用する乳酸菌及びビフィズス菌の生育速度によって変化する相対的なものであって、使用する乳酸菌又はビフィズス菌の少なくとも一方が誘導期に該当することを意味する。ビフィズス菌の増殖効果を増大させるには、使用する乳酸菌及びビフィズス菌のいずれもが誘導期に該当する時期にラクターゼ添加工程を行うことが好ましい。
【００１９】
原料乳に対するラクターゼ反応の温度は０℃〜５５℃であることが好ましく、５〜５０℃であることがより好ましい。
ラクターゼ反応の温度が下限値未満であると乳糖の分解が不足しやすくなるおそれがある。これを解消するには、ラクターゼの反応時間を長くする必要が生じるため、発酵乳を効率的に製造することが難しい。
ラクターゼ反応の温度が上限値超であると、ラクターゼが失活しやすくなり、乳糖の分解が不十分な状態になるおそれがある。乳酸菌とビフィズス菌の共存化において、ビフィズス菌を増大させにくくなる。
【００２０】
原料乳に対するラクターゼ反応の時間は０．５時間〜４８時間であることが好ましく、１時間〜４０時間であることがより好ましい。ラクターゼとして中性ラクターゼを使用する場合、第２工程において、原料乳のｐＨ低下に伴い徐々に中性ラクターゼが失活するため、そのラクターゼ反応の時間は第２工程よりも短いものになる。
ラクターゼ反応の時間が下限値未満であると、乳糖の分解が不足しやすくなるおそれがある。
ラクターゼ反応の時間が上限値超であると、製造コストの増加の問題がある。
【００２１】
原料乳に対するラクターゼ反応のｐＨは２．０〜１０．０であることが好ましく、ｐＨ２．５〜９．０であることがより好ましく、ｐＨ３．０〜８．０であることが特に好ましい。中性ラクターゼを使用する場合におけるラクターゼ反応のｐＨは、５．０〜８．０であることが好ましい。酸性ラクターゼを使用する場合におけるラクターゼ反応のｐＨは、３．０〜７．０であることが好ましい。
下限値未満、もしくは上限値以上であると、ラクターゼが失活しやすくなり、乳糖の分解が不十分な状態になるおそれがある。
発酵が進むにつれて、原料乳のｐＨが低下する。ラクターゼが中性ラクターゼである場合、原料乳のｐＨの低下に伴い、失活する。
【００２２】
本発明に係る発酵乳は、乳酸菌と、ビフィズス菌と、ラクターゼと、を含有する発酵乳であって、当該乳酸菌の数が１ｍＬあたり１×１０の４乗〜１×１０の１０乗個の範囲にあり、当該ビフィズス菌の数が１ｍＬあたり１×１０の４乗〜１×１０の１２乗個の範囲にあることを特徴とする。
上述した発酵乳の製造方法を経ることによって、発酵乳に含まれる乳酸菌の数及びビフィズス菌の数を上記の範囲にすることができる。当該発酵乳に含まれる乳酸菌及びビフィズス菌の数は生菌数を意味する。
【００２３】
発酵乳中に含まれるラクターゼの少なくとも一部は、中性ラクターゼであることが好ましい。当該中性ラクターゼは、発酵乳中において失活した状態で存在することが好ましい。
中性ラクターゼが失活した場合においても、そのタンパク質構造は維持されている。したがって、発酵乳自体又は発酵乳を濃縮したものについて電気泳動を行うことで、発酵乳中に中性ラクターゼが存在するか確認することができる。電気泳動を行った後、得られた特定のバンドからアミノ酸配列を推定することも可能である。当該中性ラクターゼの配列はその由来によって異なるが、既知であるため、電気泳動結果及びそのアミノ酸配列から、ラクターゼの存在を確認することが可能である。同様に、発酵乳自体又は発酵乳を濃縮したものについて電気泳動を行うことで、発酵乳中に酸性ラクターゼが存在するか確認することも可能である。アミノ酸配列の推定も同様である。
発酵乳中に含まれるラクターゼが失活していることは、後述するラクターゼの活性測定方法を行うことで確認することができる。
【００２４】
発酵乳のｐＨは５．５以下にあることが好ましく、ｐＨ５．０以下であることがより好ましい。発酵乳のｐＨの下限値は、３．０以上であることが好ましく、３．５以上であることがより好ましい。
発酵乳のｐＨが上限値超であると凝乳が不十分となる問題がある。発酵乳のｐＨが低すぎると酸味が強くなりすぎ、味のバランスを損ないやすくなる。
【００２５】
発酵乳の乳糖分解率は、５０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることがさらに好ましい。上限値は限定されないが、例えば１００％である。乳糖分解率は、発酵前の乳糖量を発酵後の乳糖量で除した値に１００を乗じた値で示される。乳糖分解率は、乳糖量の減少量であるので、ラクターゼによる乳糖分解量と、乳酸菌及びビフィズス菌による乳糖の資化量の合計である。ラクターゼ添加工程を経ない発酵乳（乳酸菌及びビフィズス菌を含む）の乳糖分解率は、使用する原料乳、菌株及び発酵条件等によるが、最大４０％であり、発酵が良好に進んだ場合、およそ３０〜４０％になる。
ラクターゼ添加工程を第１工程の前又は第１工程と略同時に行うことで、ラクターゼによる発酵乳の乳糖分解率を高めることができる。
乳糖分解率が下限値未満であると、乳酸菌とビフィズス菌を含む発酵乳において、ビフィズス菌が十分に増殖しないおそれがある。
【００２６】
ラクターゼ添加工程を経た発酵乳に含まれる乳糖量は、２．０質量％以下であることが好ましく、１．０質量％以下であることが好ましく、０．５質量％以下であることがさらに好ましい。下限値は限定されないが、例えば、０質量％である。ラクターゼ添加工程を経ない発酵乳に含まれる乳糖量は、使用する原料乳、菌株及び発酵条件等によるが、最低３．０質量％である。したがって、発酵乳に含まれる乳糖量を測定することにより、ラクターゼ添加工程を行ったか否かを推定することができる。
発酵乳に含まれる乳糖量が上限値超であると、乳酸菌とビフィズス菌を含む発酵乳において、ビフィズス菌が十分に増殖しないおそれがある。
【００２７】
ラクターゼ添加工程を経た発酵乳に含まれるグルコース量は、０．５％以上であることが好ましく、１．０％以上であることがより好ましく、２．０％以上であることがさらに好ましい。発酵乳に含まれるグルコース量を上記以上含めることによって、乳酸菌とビフィズス菌が共存する状態であっても、ビフィズス菌がグルコースを資化しやすい環境を整えることができる。
ラクターゼ添加工程を経ない発酵乳（乳酸菌及びビフィズス菌を含む）に含まれるグルコース量は、発酵が良好に進んだ場合、ほとんどゼロである。グルコースは乳酸菌が資化してしまい、ビフィズス菌は資化することができずに増殖が制限されてしまう。
【００２８】
ラクターゼ添加工程を経た発酵乳に含まれるガラクトース量は、１．０％以上であることが好ましく、１．５％以上であることがより好ましく、２．０％以上であることがさらに好ましい。発酵乳に含まれるガラクトース量を上記以上含めることによって、乳酸菌とビフィズス菌が共存する状態であっても、ビフィズス菌がグルコースを資化しやすい環境を整えることができる。
ラクターゼ添加工程を経ない発酵乳（乳酸菌及びビフィズス菌を含む）に含まれるガラクトース量は、発酵が良好に進んだ場合、１．０％未満である。ガラクトースは乳酸菌が資化しやすい状況にあるため、ビフィズス菌は資化しにくく、増殖が制限されてしまう。
【００２９】
以下、本発明に係る発酵乳を構成する材料について説明する。
【００３０】
＜原料乳＞
原料乳としては、乳糖を含有するものであればよく、例えば、牛乳、羊乳もしくは山羊乳等の獣乳、母乳又はこれらを乾燥させた粉乳等を単独又は混合したものを使用することができる。本発明においては、これらにさらに乳糖及び水を加えたものも原料乳である。
発酵乳を１００質量％としたときの原料乳は９０質量％以上であることが好ましく、９５質量％以上であることが好ましく、９８質量％以上であることがさらに好ましい。
【００３１】
本発明においては、発酵が完了するまでの乳を原料乳といい、発酵が完了した後の乳を発酵乳という。
【００３２】
原料乳の殺菌方法は、原料乳及び後述するその他の成分に存在する微生物を殺菌できる条件であればよく、その殺菌方法は限定されない。殺菌方法としては、超高温で短時間（数秒間）行う方法、高温で比較的短時間（数分）行う方法、低温（数十度）で長時間（数分〜数十分）行う方法等が挙げられる。
【００３３】
＜乳酸菌＞
乳酸菌としては、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物を例示できる。
例えば、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられる。これらの乳酸菌は単独で使用しても良いし、２以上を組み合わせて使用しても良い。
なお、上記の乳酸菌のうち、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）及びストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を使用したものが狭義のヨーグルトである。
【００３４】
原料乳への乳酸菌の添加量は、１ｍＬあたり１×１０の４乗〜１×１０の１０乗個であることが好ましい。
下限値未満であると発酵速度低下の問題がある。
上限値超であると製造コストの増加の問題がある。
【００３５】
＜ビフィズス菌＞
ビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物を例示できる。
例えば、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム・エスエスピー・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ｓｓｐ．  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス・エスエスピー・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）である。これらのビフィズス菌は単独で使用しても良いし、２以上を組み合わせて使用しても良い。
このうち、ビフィドバクテリウム・アニマリス・エスエスピー・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ  ｓｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）のＢＢ−１２株（クリスチャンハンセン社製）は耐酸性を有することから好ましい。また、当該ＢＢ−１２株は酸素耐性もある程度有することから、発酵乳の製造において使用しやすい。
【００３６】
原料乳へのビフィズス菌の添加量は、１ｍＬあたり１×１０の４乗〜１×１０の１２乗個であることが好ましい。
下限値未満であると菌数不足の問題がある。
上限値超であると製造コスト増加の問題がある。
【００３７】
原料乳に添加するビフィズス菌数と乳酸菌数の比率は、０．０１〜１０００００の範囲内にあることが好ましく、０．１〜１００００の範囲内にあることがより好ましく、１〜１０００の範囲にあることがさらに好ましい。
下限値未満であると、発酵後のビフィズス菌数が増えにくくなる恐れがある。
上限値超であると、発酵後のビフィズス菌数は増えるものの、製造コストが増大する傾向にあり、好ましくない。
【００３８】
＜ラクターゼ＞
ラクターゼは、乳糖をガラクトースとグルコースに分解する作用を有する。ラクターゼは、β−ガラクトシダーゼと呼ばれることもある。ラクターゼは細菌由来のものと酵母由来のものとカビ由来のものがある。ラクターゼとしては、中性に至適ｐＨがある中性ラクターゼ、酸性に至適ｐＨがある酸性ラクターゼを使用することができる。
ラクターゼは単独で使用しても良いし、２以上を組み合わせて使用しても良い。中性ラクターゼを単独又は２以上、酸性ラクターゼを単独又は２以上使用することも可能である。
【００３９】
中性ラクターゼとしては、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来のラクターゼ又はクルイベロマイセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロマイセス・マーキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のラクターゼが好ましい。クルイベロミセス由来のラクターゼは，クルイベロミセスの菌そのもののほか，クルイベロミセス・ラクチスから派生したラクターゼが含まれる。活性の至適ｐＨとして６.０〜７.５かつ失活ｐＨ５．５〜４.０があげられる。発酵乳のｐＨは５．０以下であるため、中性ラクターゼを使用する場合、発酵乳に含まれる中性ラクターゼは失活した状態である。
【００４０】
酸性ラクターゼ（β−ガラクトシダーゼ）としては、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のラクターゼ、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）由来のラクターゼ、またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のラクターゼが好ましい。
【００４１】
ラクターゼの添加量は原料乳に加える終濃度として、０．１〜１００ｕｎｉｔ／ｇの範囲にするのが好ましく、０．５〜５０ｕｎｉｔ／ｇとするのがより好ましい。１．３〜４０ｕｎｉｔ／ｇとすることがさらに好ましく、１．５〜３０ｕｎｉｔ／ｇとすることが特に好ましい。本発明においては、「ｕｎｉｔ」を「Ｕ」と略す場合がある。
下限値未満では十分な乳糖分解が得られず、ビフィズス菌を増大させる効果が得られにくくなる。
上限値超では乳糖分解が急速に進むため、ビフィズス菌を増大させる効果が得られにくくなる。
【００４２】
＜その他＞
原料乳又は発酵乳に乳糖以外のグルコース及びガラクトース等の糖類、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を添加することもできる。
これらの材料を添加する場合、事前に殺菌処理を行ってから添加しても良いし、原料乳に添加後に殺菌処理を行っても良い。
【００４３】
以下、本発明を実施例を用いて説明するが、本発明はこれに制限されるものではない。
以下の実施例において、ラクターゼは、断りの無い場合には合同酒精社製のＧＯＤＯ−ＹＮＬ２（中性ラクターゼ）を用いた。ビフィズス菌は、断りのない場合にはクリスチャンハンセン社製のＢＢ１２株を用いた。
【００４４】
＜評価方法＞
（中性ラクターゼ活性の測定方法）
中性ラクターゼ活性は、ＦＣＣ、第４版、１９９６年７月１日、第８０１〜８０２頁／ラクターゼ（中性）（β-ガラクトシダーゼ）活性で、公表されたものを用いて測定した。
【００４５】
（酸性ラクターゼ活性の測定方法）
酸性ラクターゼ活性は、ＦＣＣ、第４版、１９９６年７月１日、第８０２〜８０３頁／ラクターゼ（酸性）（β-ガラクトシダーゼ）活性で、公表されたものを用いて測定した。
【００４６】
（乳酸菌数の測定方法）
乳酸菌数の測定は、発酵前の原料乳と、調製した発酵乳を生理食塩水で適宜希釈した０．１ｍＬを、栄研化学社製ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地‘栄研’で混釈して３７℃で２日間の培養後の菌数を測定した。
【００４７】
（ビフィズス菌数の測定方法）
ビフィズス菌数の測定は、発酵前の原料乳と、調製した発酵乳を生理食塩水で適宜希釈した０．１ｍＬを、栄研化学社製ＴＯＳプロピオン酸寒天培地で混釈して３７℃で２日間の嫌気培養後の菌数を測定した。
【００４８】
（糖分析方法）
乳サンプル（原料乳に各種材料を添加したもの又は後述する発酵乳）２００μＬに２０％スルホサリチル酸を５０μＬ、純水を８００μＬ加えた後、２００００ｇで１０分間の遠心を行った。この上清に対してＨＰＬＣ分析（Ｗａｔｅｒｓ社製、Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５）を行った。分析カラムはＣＡＲＢＯＳｅｐ  ＣＨＯ−６２０  ＣＡ（トランスジェノミック社製）を用い、カラム温度８５℃、純水を移動相に毎分０．５ｍＬの流量で、示差屈折検出器にて実施した。
【００４９】
［実施例１］
市販のスキムミルク（森永乳業社製）を２質量部、市販の牛乳（明治乳業社製）を９８質量部で混合、溶解して１００℃で５分の殺菌処理を行った。原料乳を４０℃まで冷却し、０．１質量部のラクターゼ（終濃度５Ｕ／ｇ）を添加して、撹拌せずに４０℃で２０分間ラクターゼ反応を行った後、１００℃で５分のラクターゼ失活処理をした。得られた原料乳を４３℃まで冷却し、乳酸菌（ＹＦ−Ｌ８１２株：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのミクスチャー、クリスチャンハンセン社製）０．１ｍｇ／原料乳１ｍＬとビフィズス菌０．０５ｍｇ／原料乳１ｍＬをそれぞれ添加して４３℃で４時間発酵させ、実施例１の発酵乳を得た（ラクターゼ前処理）。
【００５０】
［比較例１］
実施例１と同時に、以下のようにしてラクターゼ処理を行わない発酵乳を得た。
市販のスキムミルク（森永乳業社製）を２質量部、市販の牛乳（明治乳業社製）を９８質量部で混合、溶解して１００℃で５分の殺菌処理を行った。殺菌処理後に原料乳を４３℃まで冷却し、乳酸菌とビフィズス菌を実施例１と同様に添加して４３℃で４時間発酵させ、比較例１の発酵乳を得た。
【００５１】
＜評価＞ＹＦ−Ｌ８１２株とラクターゼ前処理添加乳におけるＢＢ−１２株の増殖効果
表１に示したように、ラクターゼ処理を行った実施例１において、発酵中にＢＢ−１２株が良好な増殖を示した。発酵終了時点での実施例１と比較例１との差はおよそ３９％（（実施例のビフィズス菌数の増加割合−その実施例と同時に行った比較例のビフィズス菌数の増加割合）であった。発酵後のｐＨに実施例１と比較例１で差は見られず、発酵乳の製造に影響は見られなかった。図１に示したように、実施例１（図１の実線）は比較例１（図１の破線）に比べ、発酵途中におけるｐＨは高くなる傾向が認められた。表４に示したように、発酵後の乳酸菌数はラクターゼ処理を行った実施例１が良好な増殖を示した。
表１中の発酵前とは、各種材料を混合した直後に測定した値を意味する。他の表でも同様である。
表２に示したように、実施例１における発酵後の乳糖分解率は７２％であった。比較例１のグルコース量及びガラクトース量はほとんど存在しないのに対し、実施例１の発酵乳に含まれるグルコース量及びガラクトース量が増大した。２糖である乳糖よりも単糖であるグルコース又はガラクトースの方が資化しやすいと考えられるため、実施例１の発酵乳の方がビフィズス菌が成長しやすい状態にあると示唆された。
【００５２】
【表１】
2016186151.tif 000003
【００５３】
【表２】
2016186151.tif 000004
【００５４】
［実施例２］
市販のスキムミルク（森永乳業社製）を２質量部、市販の牛乳（明治乳業社製）を９８質量部で混合、溶解して１００℃で５分の殺菌処理を行った。殺菌処理後に原料乳を４３℃まで冷却し、０．０５質量部（終濃度２．５Ｕ／ｇ）のラクターゼと乳酸菌（ＹＦ−Ｌ８１２株）０．１ｍｇ／料乳１ｍＬとビフィズス菌０．０５ｍｇ／原料乳１ｍＬを添加して４３℃で４時間発酵させ、実施例２の発酵乳を得た（ラクターゼ同時添加）。
【００５５】
［比較例２］
実施例２と同時に、比較例１と同様にしてラクターゼ処理を行わない比較例２の発酵乳を得た。
【００５６】
表３に示したように、ラクターゼ処理を行った実施例２において、発酵中にＢＢ−１２株が良好な増殖を示した。発酵終了時点での実施例２と比較例２との差はおよそ１５８％であった。発酵後のｐＨと乳酸菌数に実施例２と比較例２で差は見られず、発酵乳の製造に影響は見られなかった。
図示していないが、実施例２及び比較例２においても実施例１及び比較例１と同様に、発酵途中におけるｐＨが高くなる傾向が認められた。
実施例２の発酵乳のラクターゼ活性は認められなかったため、当該発酵乳に含まれる中性ラクターゼは失活していることが示唆された。
表４に示したように、発酵後の乳糖分解率は９１％であった。第１工程と略同時にラクターゼ添加工程を行うことで、第２工程において、ラクターゼによる乳糖分解が進むものと考えられる。
【００５７】
【表３】
2016186151.tif 000005
【００５８】
【表４】
2016186151.tif 000006
【００５９】
［実施例３］
常法に従いアスペルギルス・オリゼー  ＲＩＢ４０を４％マルトエキス（オリエンタル酵母社製）寒天培地に生育させた。ツァペックドックスブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）を１００ｍＬ含む５００ｍＬ容三角フラスコに、生育した菌糸先端部分の５ｍｍ角を植菌し、３０℃で７日間培養した培養上清を酸性ラクターゼの粗酵素として取得した。粗酵素液は、８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加して沈殿を回収し、得られた沈殿を１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁し、同緩衝液で透析した試料をカビ由来の酸性ラクターゼとして用いた。
実施例２で使用したラクターゼの代わりに上記のカビ由来の酸性ラクターゼを用いた以外、実施例２と同様にして、実施例３の発酵乳を得た。
【００６０】
［実施例４］
実施例２で使用したラクターゼの代わりにバチルス・サーキュランス由来の中性ラクターゼ（アマノエンザイム社製  ラクトレスＬ３）を用いた以外、実施例２と同様にして、実施例４の発酵乳を得た。
【００６１】
［比較例３］
実施例３及び４と同時に、比較例１と同様にしてラクターゼ処理を行わない発酵乳を得た。
【００６２】
表５に示したように、カビ由来のラクターゼ処理した実施例３、ならびにバチルス・サーキュランス由来の中性ラクターゼ処理した実施例４においても発酵中にＢＢ−１２株が良好な増殖を示した。発酵終了時点でのラクターゼ未処理の比較例３との差は実施例３でおよそ９７％、実施例４で１４４％であった。
実施例３の発酵乳の酸性ラクターゼ活性を認めた。実施例４の発酵乳の中性ラクターゼ活性は認められなかったため、当該発酵乳に含まれる中性ラクターゼは失活していることが示唆された。
【００６３】
【表５】
2016186151.tif 000007
【００６４】
［実施例５］
実施例１で使用した乳酸菌（ＹＦ−Ｌ８１２株）の代わりに乳酸菌（ＹＣ−３８０株：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのミクスチャー、クリスチャンハンセン社製）を用いた以外、実施例１と同様にして、実施例５の発酵乳を得た。
【００６５】
［比較例４］
実施例５と同時に、使用した乳酸菌（ＹＦ−Ｌ８１２株）の代わりに乳酸菌（ＹＣ−３８０株：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのミクスチャー、クリスチャンハンセン社製）を用いた以外、比較例１と同様にしてラクターゼ処理を行わない発酵乳を得た。
【００６６】
表６に示したように、ラクターゼ処理を行った実施例５が発酵中にＢＢ−１２株が良好な増殖を示した。発酵終了時点での比較例４との差はおよそ３９％であった。
実施例５の発酵乳のラクターゼ活性は認められなかったため、当該発酵乳に含まれる中性ラクターゼは失活していることが示唆された。
比較例４のグルコース量及びガラクトース量はほとんど存在しないのに対し、実施例５の発酵乳に含まれるグルコース量及びガラクトース量が増大した。２糖である乳糖よりも単糖であるグルコース又はガラクトースの方が資化しやすいと考えられるため、実施例５の発酵乳の方がビフィズス菌が成長しやすい状態にあると示唆された。
【００６７】
【表６】
2016186151.tif 000008
【００６８】
【表７】
2016186151.tif 000009
【００６９】
［実施例６］
実施例２で使用した乳酸菌（ＹＦ−Ｌ８１２株）の代わりに乳酸菌（ＹＣ−３８０株）を用いた以外、実施例２と同様にして、実施例６の発酵乳を得た。
【００７０】
［比較例５］
実施例６と同時に、比較例４と同様にしてラクターゼ処理を行わない発酵乳を得た。
【００７１】
表８に示したように、ラクターゼ処理を行ったサンプルの方が発酵中にＢＢ−１２株が良好な増殖を示した。発酵終了時点でのラクターゼ未処理との差はおよそ４６５％であった。
実施例６の発酵乳のラクターゼ活性は認められなかったため、当該発酵乳に含まれる中性ラクターゼは失活していることが示唆された。
比較例５のグルコース量及びガラクトース量はほとんど存在しないのに対し、実施例６の発酵乳に含まれるグルコース量及びガラクトース量が増大した。２糖である乳糖よりも単糖であるグルコース又はガラクトースの方が資化しやすいと考えられるため、実施例６の発酵乳の方がビフィズス菌が成長しやすい状態にあると示唆された。
【００７２】
【表８】
2016186151.tif 000010
【００７３】
【表９】
2016186151.tif 000011
【００７４】
［実施例７］
ラクターゼの終濃度を０．５Ｕ／ｇから１０Ｕ／ｇに段階的に調整した以外、実施例６と同様にして、実施例７の発酵乳を得た。
【００７５】
［比較例６］
実施例７と同時に、比較例４と同様にしてラクターゼ処理を行わない発酵乳を得た。
【００７６】
表１０に示したように、ラクターゼ処理を行ったサンプルの方が発酵中にＢＢ−１２株が良好な増殖を示した。発酵終了時点でのラクターゼ未処理との差はおよそ３２％から６４２％であった。
得られた結果を図２に示した。図２に示したように、ビフィズス菌数の増加割合についての比較例との差は、ラクターゼの終濃度が０．５Ｕ／ｇ以上１．０Ｕ／ｇ以下である場合、ラクターゼを添加しなかった比較例に比べわずかに改善した程度であった。ラクターゼの終濃度が１．０Ｕ／ｇ以上５Ｕ／ｇ以下である場合、ラクターゼの添加濃度に依存して、ほぼ直線的に増大する結果が得られた。ラクターゼの終濃度が５Ｕ／ｇ超であると、添加濃度に依存した効果は確認できず、ラクターゼの終濃度が５Ｕ／ｇのものとほぼ同程度の効果であった。
実施例７の全ての発酵乳のラクターゼ活性は認められなかったため、当該発酵乳に含まれる中性ラクターゼは失活していることが示唆された。
【００７７】
【表１０】
2016186151.tif 000012
【００７８】
［実施例８］
ビフィズス菌をＢＢ−１２株の代わりにＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ    ＪＣＭ  １１９２に変更した以外、実施例６と同様にして、実施例８の発酵乳を得た。
【００７９】
［比較例７］
実施例８と同時に、比較例４と同様にしてラクターゼ処理を行わない発酵乳を得た。
【００８０】
表１１に示したように、ラクターゼ処理を行ったサンプルの方が発酵中にＪＣＭ  １１９２株が良好な増殖を示した。発酵終了時点でのラクターゼ未処理との差はおよそ４６％であった。
実施例８の発酵乳のラクターゼ活性は認められなかったため、当該発酵乳に含まれる中性ラクターゼは失活していることが示唆された。
【００８１】
【表１１】
2016186151.tif 000013
【００８２】
［実施例９］
ビフィズス菌をＢＢ−１２株の代わりにＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ  ＪＣＭ  １２１７に変更した以外、実施例６と同様にして、実施例８の発酵乳を得た。
【００８３】
［比較例８］
実施例９と同時に、比較例４と同様にしてラクターゼ処理を行わない発酵乳を得た。
【００８４】
表１２に示したように、ラクターゼ処理を行った実施例９が発酵中にＪＣＭ  １１９２株の減少が抑制された。発酵終了時点でのラクターゼ未処理との差はおよそ４％であった。
実施例９の発酵乳のラクターゼ活性は認められなかったため、当該発酵乳に含まれる中性ラクターゼは失活していることが示唆された。
【００８５】
【表１２】
2016186151.tif 000014
【００８６】
［参考例１］
原料乳中にグルコースもしくはガラクトースをそれぞれ１質量％、およびその両方を第１工程で添加した以外、比較例４と同様にしてラクターゼ処理を行わない発酵乳を得た。
【００８７】
［比較例９］
参考例１と同時に、比較例４と同様にしてラクターゼ処理を行わない発酵乳を得た。
【００８８】
表１３に示したように、糖を添加して発酵を行った参考例１は、発酵中にＢＢ−１２株が良好な増殖を示さず、比較例９とほぼ同様の傾向を示した。
【００８９】
【表１３】
2016186151.tif 000015
【００９０】
［実施例１０］
ラクターゼの終濃度を１．３Ｕ／ｇ、１．５Ｕ／ｇのより低濃度域で段階的に調整した以外、実施例６と同様にして、実施例１０の発酵乳を得た。
【００９１】
［比較例１０］
実施例１０と同時に、比較例４と同様にしてラクターゼ処理を行わない発酵乳を得た。
【００９２】
表１４に示したように、ラクターゼ処理を行ったサンプルの方が発酵中にＢＢ−１２株が良好な増殖を示した。発酵終了時点でのラクターゼ未処理との差はおよそ９７％から１０７％であった。この差の数値とラクターゼ終濃度の数値を図２に当てはめると、曲線の近似した位置にプロットすることができる。実施例１０は、実施例７に比べ発酵前のビフィズス菌数が多かったことから、栄養源が枯渇しやすく、ｐＨも下がりやすい状況であったことから、ビフィズス菌数が十分に増加する前に発酵が終了したことが考えられるところ、ラクターゼの終濃度が１．３Ｕ／ｇ及び１．５Ｕ／ｇであれば、ラクターゼの添加濃度に依存してビフィズス菌数が増大することが示唆された。
実施例１０の全ての発酵乳のラクターゼ活性は認められなかったため、当該発酵乳に含まれる中性ラクターゼは失活していることが示唆された。
【００９３】
【表１４】
2016186151.tif 000016
【００９４】
以上のことから、乳酸菌とビフィズス菌を含む発酵乳においてビフィズス菌の増殖効果を得るには、単にグルコースやガラクトースの量を調整するだけでは不十分であり、ラクターゼ添加によって乳糖量が減少し、且つ、グルコース量及びガラクトース量を増大させることが重要であることが示された。特に、乳酸菌とビフィズス菌を含む発酵乳においてビフィズス菌の増殖効果を更に増大させるには、ラクターゼ添加工程を第１工程と略同時にするのが良いことが示された。
乳酸菌とビフィズス菌を含む発酵乳において、ビフィズス菌が死滅する傾向にある場合であっても、ラクターゼ添加工程を設けることによって、ビフィズス菌の生菌数を維持させることができることが示された。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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