(57)【要約】  本発明は、ドラッグデリバリーシステム用標的型シェルに関する。本発明は、チオールとハロゲン化アルキルの反応性を利用して、シロール含有カルボシランデンドリマーと、標的認識部位を含む標識タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）とを含み、生体高分子その他の分子を内包することができ、標的細胞中に前記生体高分子等を選択的に送達することができる、ドラッグデリバリーシステム用標的型シェルを提供することを目的とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される凝集性分子からなるドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料と標的配列提示部とを有し、分子量２０万以下のタンパク質、核酸、疎水性分子からなる群から選ばれるいずれかの分子を内包し得る、ドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
【化１】
2017094792.tif 000027
【請求項２】
水性溶媒中で前記ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料が凝集して形成され、５０〜５００ｎｍの直径を有する、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
【請求項３】
前記標的配列提示部は、標的組織に送達されるための標的認識部位を有するタンパク質又はペプチドで構成されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
【請求項４】
前記ペプチドは、前記標的組織に発現されている、表面抗原、受容体、ゲート、トランスポーター及びチャンネルからなる群から選ばれるいずれかの標的タンパク質と特異的に結合し、前記標的タンパク質と前記ペプチドの結合体が細胞内へのエンドサイトーシスを促進するものであることを特徴とする、請求項３に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
【請求項５】
前記ペプチドは、配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれるいずれかに記載の配列を有するものであることを特徴とする、請求項３に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
DMPGTVLPGG（配列表の配列番号１）
VPTDTDYSGG（配列表の配列番号２）
DMPGTVLPGG GGGSEGEWQ QQQHQWAKQE（配列表の配列番号３）
【請求項６】
前記ペプチドは、配列表の配列番号４〜６からなる群から選ばれるいずれかに記載の配列を有するものであることを特徴とする、請求項３に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号４）
MASMTGGQQMGR VPTDTDYSGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF NDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNDKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号５）
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG GGGSEGEWQQQQHQWAKQE MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGTC ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号６）
【請求項７】
前記標的組織は、炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞を含む組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞で構成される組織、及び腫瘍細胞で構成された組織からなる群から選ばれるいずれかの組織であることを特徴とする、請求項３に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
【請求項８】
前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（II）〜（V）からなる群から選ばれるいずれかの構造を有する分子で表されるものであることを特徴とする請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル：
式中、TSPPは、標的配列提示部を有する蛍光タンパク質を表す。
【化２】
2017094792.tif 000028
【化３】
2017094792.tif 000029
【化４】
2017094792.tif 000030
【化５】
2017094792.tif 000031
【請求項９】
前記蛍光タンパク質は、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項７に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達システムに使用可能な、カルボシランデンドリマーを用いた薬物送達システム用標的型シェルに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、抗体、ペプチドアプタマー、核酸等の生体高分子が、次世代医薬品として注目を集めている。こうした生体高分子は、製造工程における品質管理、製剤の保存、及び投与方法その他の点で、従来の低分子化合物を有効成分とする医薬品とは大きく異なっている。【０００３】
一般に、医薬製剤を投与する場合、治療を要する疾病と薬剤の性質にもよるが、標的部位にどれだけの有効成分を送達できるかが奏効率に影響する。例えば、生体高分子であるタンパク質や抗体を有効成分とする場合には、投与時の剤形によって、これらに対する抗体が生成されて有効性が低下し、それによって奏効率（治療効果）も下がるといった問題が生じることも知られている。【０００４】
このため、こうした医薬製剤を標的部位に適切に送達する手段として、様々な薬剤送達システム（ＤＤＳ：ドラッグデリバリーシステム）が、盛んに開発されている。ＤＤＳに使用する担体としては、例えば、リポソーム、ミセル、合成樹脂粒子等を挙げることができる。また、こうした担体を使用した製剤としては、例えば、標的部位に局在する分子と特異的に結合するリガンドをリポソーム等に結合させたもの（特許文献１、及び２参照）、リポソームや合成樹脂粒子等の表面にＮ−アセチルグルコサミンその他の糖を露出させたもの（特許文献３及び４参照）、及びミセルに抗体を結合させたもの（特許文献５参照）などが報告されている。【０００５】
また、ミセル構造となるデンドリマーを利用した担体についても、開発が進められつつある（特許文献６、７及び８参照）。デンドリマーとは、ギリシャ語の「ｄｅｎｄｒａ」（樹木）を語源とする、規則正しく分岐した樹状高分子化合物の総称である。デンドリマーは数分子が会合すると球状となり、その内部にナノメートルスケールの空間が形成される。このため、この空間に様々な官能基が現れるように分子を組み込むことや会合度を数10〜数100に上げる事もでき、設計の自由度が高い。こうしたことから、現在、ナノテクノロジーの分野においては、様々な新規デンドリマーの開発が盛んに行われている。【０００６】
これまでに、ウイルスや細菌への感染によって生じる疾患を予防及び／又は治療するために、デンドリマーを利用したＤＤＳ担体の開発が行われてきている（特許文献９参照）。【０００７】
一方、ＡＩＥ（aggregation-induced emission；非発光性化合物が互いに凝集し合うことで、特定の波長の光を照射することによって、高効率発光を惹起する現象）効果を有するシロール基を含有するデンドリマー（以下、本明細書においては、「カルボシランデンドリマー」という。）は、通常、ミセルを形成すると凝集体の形成がなされたことと等価となり蛍光発光することが知られている（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００５／０１１６３２
【特許文献２】ＷＯ２００５／０１１６３３
【特許文献３】特開２００７−    １９２３
【特許文献４】特開２００９−  ４６４１３
【特許文献５】特開２０１４−  ７３９７５
【特許文献６】特開２００１−２０６８８５
【特許文献７】特開２００５−１２００６８
【特許文献８】特開２００７−２３８８６０
【特許文献９】特許第５６２９８８８号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Chem Commun (Camb). 2009 Aug 7;(29):4332-53. doi: 10.1039/b904665h. Epub 2009 May 13
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、ＤＤＳ用の担体の研究は精力的に行われてはいるものの、生体高分子を有効成分とする薬剤を、その特性を損なうことなく、効率的に標的とする部位へ送達することは非常に難しい。【００１１】
経口投与の場合には、胃酸という強酸で担体が分解されないようにしない限り、有効成分である生体高分子は腸には到達し得ず、吸収もされない。また、静脈投与（静脈注射、以下、集合的に「静注」ということがある。）の場合には、血流中に一時に高濃度の薬剤を投与することはできるが、上記のような胃酸による分解とは別の問題があり、標的部位に有効濃度で送達させることは、以下のような理由から難しい。すなわち、血中の薬剤濃度は、尿中への排出、肝臓での代謝、種々の組織への蓄積等により時間と共に急速に低下すること、また、標的性が無いまま血中に留まることもあるからである。【００１２】
また、標的部位に送達する薬剤の量を増やす、重篤な副作用が発生する場合もある。例えば、パーキンソン病の治療薬であるレボドパは、血液脳関門の通過量が非常に少ないため、奏効率が上がらない。そして、レボドパの投与量を増やすと、標的部位である脳以外にもレボドパの分解酵素があるため、重篤な副作用が現れて、それ以上治療が続けられなくなるということが実際に起こっている。一方、少量の薬剤を１日に何度も投与することは、患者や医療従事者への負荷が大きくなるという問題につながる。【００１３】
生体高分子用の担体は、分子量の大きな有効成分をその内部に取り込むことができるという特性に加えて、それ自身が生体との適合性の高いものでなければならない。生体適合性が低いと、生体側で種々の反応が起こり、担体の投与自体が生体に対して悪影響を与えることになるからである。さらに、標的部位に送達されるまでは安定した構造を保ち、標的部位に送達されたときに、有効成分である生体高分子を速やかに放出できるものでなければならない。【００１４】
以上のように、生体高分子用の担体には種々の要件を満たすことが求められる。しかし、これまで、こうした特性・性質を有する担体は実用化されておらず、こうした特性・性質を有する担体に対する強い社会的要請があった。【００１５】
最近ではexosomeなどの天然のナノ粒子及び細胞（例えば、赤血球）の持つ標的性や生体適合性をＤＤＳに利用する研究が盛んであるが薬剤の内包技術が完成しておらず、実用化には至っていない。【００１６】
このため、有効成分となり得る生体高分子を内包させ、標的組織に送達することができ、送達後に、その組織において内包された生体高分子を適切に放出することができる生体適合性の高い担体に対する強い社会的要請があった。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、チオールとハロゲン化アルキルの反応性を利用して、シロール含有カルボシランデンドリマーと、標識タンパク質とを（例えば、緑色蛍光タンパク質）を水性溶媒中、又は前記水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒中で混合したところ、前記デンドリマーとタンパク質との複合体である凝集性分子が形成されることを初めて見出した。ここで、前記水性溶媒は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水その他の溶質を含む。【００１８】
また、本発明の発明者等は、さらに、上記のようなタンパク質をデンドリマーに担持させると、上記凝集性分子中のタンパク質が外側に向いた状態でのリポソーム(以下、「ベジクル」ということがある。) 又はミセル形成を誘導することを見出した。さらに、上記タンパク質、上記カルボシランデンドリマー、及びモデル薬剤を水性溶媒中で混合したところ、上記モデル薬剤を内包したミセルが形成されることも見出した。こうしたモデル薬剤としては、例えば、色素、レクチン、抗体等が挙げられる。【００１９】
加えて、本発明の発明者らは、蛍光タンパク質を担持させたシロール含有デンドリマーが生理食塩水中で発光すること、及びその発光現象が、シロールと蛍光タンパク質との間における共鳴エネルギー移動（FRET）によるものであることをも見出した。
さらに、蛍光タンパク質を担持させたシロール含有カルボシランデンドリマーによって形成されるミセルの内径は、およそ50nm〜500nm程度であること、及びこのような内径を有するミセルには、その内部に生体高分子を含む種々の薬剤を内包させることが可能であることをも見出した。【００２０】
また、生体は、一般的に、エンドサイトーシスによって、上記のようなミセルが細胞内に取り込んで破壊することが知られている。本発明の発明者等は、標的組織結合配列を組み込むことにより、標的組織に対して特異的な送達が可能となることを見出した。【００２１】
本発明は、以上のような状況の下で完成されたものであり、種々の分子量の化合物や生体高分子を取り込むことができ、生体内で安定性が高く、かつ、標的組織への有効成分の送達を可能とする、ドラッグデリバリーシステム用標的型シェルを提供することを目的とする。【００２２】
本発明は、以下の態様を含むものである。本発明の一の実施態様においては、本発明は、下記式（Ｉ）で表される凝集性分子からなるドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料と標的配列提示部とを有し、分子量２０万以下のタンパク質、核酸、疎水性分子からなる群から選ばれるいずれかの分子を内包し得る、ドラッグデリバリーシステム用標的型シェルである。【００２３】
【化１】
2017094792.tif 000002
【００２４】
上記のシェルは、水性溶媒中で前記ドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料が凝集して形成され、５０〜５００ｎｍの直径を有することが好ましい。特に、抗がん剤のドラッグデリバリーにおいて癌細胞周辺の新生血管へのEnhanced Permeability and Retention Effect に最適なサイズにもなっているからである。【００２５】
また、前記標的配列提示部は、標的組織に送達されるための標的認識部位を有するタンパク質又はペプチドで構成されていることが好ましい。そして、前記ペプチドは、前記標的組織に発現されている、表面抗原、受容体、ゲート、トランスポーター及びチャンネルからなる群から選ばれるいずれかの標的タンパク質と特異的に結合し、前記標的タンパク質と前記ペプチドの結合体が細胞内へのエンドサイトーシスを促進するものであることが好ましい。【００２６】
具体的には、前記ペプチドは、配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれるいずれかに記載の配列を有するものであることが好ましい。
DMPGTVLPGG（配列表の配列番号１）
VPTDTDYSGG（配列表の配列番号２）
DMPGTVLPGG GGGSEGEWQ QQQHQWAKQE（配列表の配列番号３）【００２７】
前記ペプチドは、配列表の配列番号４〜６からなる群から選ばれるいずれかに記載の配列を有するものであることが好ましい。【００２８】
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号４）【００２９】
MASMTGGQQMGR VPTDTDYSGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF NDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNDKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号５）【００３０】
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG GGGSEGEWQQQQHQWAKQE MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGTC ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号６）【００３１】
ここで、前記標的組織は、炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞を含む組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞で構成される組織、及び腫瘍細胞で構成された組織からなる群から選ばれるいずれかの組織であることが好ましい。【００３２】
ここで、前記炎症を起こしている正常組織としては、自己免疫疾患として顕著な特徴を有する組織等を挙げることができる。また、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞を含む組織としては、SNP解析により病態と一塩基置換等遺伝子変異との関連が明らかな組織等を挙げることができる。好ましくない遺伝子発現の見られる細胞としては、前述の好ましくない遺伝子発現の見られる組織由来の細胞等を挙げることができる。さらに、腫瘍細胞で構成された組織としては、乳癌組織、肺癌組織、肝癌組織、子宮頸癌組織等を挙げることができる。以上のような標的認識部位としては、配列表の配列番号１〜３を挙げることができ、標的提示部としては、配列表の配列番号７〜１１に示すアミノ酸配列を挙げることができる。【００３３】
また、前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（II）〜（V）からなる群から選ばれるいずれかの構造を有する分子で表されるものであることが好ましく、下記式中、TSPPは標的配列提示部を有する蛍光タンパク質である。【００３４】
【化２】
2017094792.tif 000003
【００３５】
【化３】
2017094792.tif 000004
【００３６】
【化４】
2017094792.tif 000005
【００３７】
【化５】
2017094792.tif 000006
【００３８】
ここで、前記蛍光タンパク質は、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることが好ましい。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、薬剤等を送達し得る担体の製造に必要な特性を備えた、ドラッグデリバリーシステム用標的型シェルを作製することができる。そして、ドラッグデリバリーシステム用標的型シェルに、生体高分子を含む種々の薬剤を内胞させ、標的組織に送達させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、一般的なカルボシランデンドリマーの基本的な形態を示す模式図である。
【図２】図２は、ジメチルシランからの、ジメチルダンベル（１）６-Brの合成スキームを示した図である。
【図３】図３は、作製したミセルの粒径の分布を示すグラフである。
【００４１】
【図４】図４は、作製したミセルを走査型顕微鏡（ＳＥＭ）で観察したときの、典型的な電子顕微鏡写真である。
【図５】図５は、ＧＦＰと式（Ｘ）に示すシロールデンドリマーとの複合体（以下、「GFP-シロールデンドリマー複合体」という。）、ＧＦＰのみ、または、式（Ｘ）に示すシロールデンドリマーのみでインキュベートして得られた産物の発光特性を調べた結果を示す図である。
【００４２】
【図６】図６は、薬剤モデルの存在下で作製したミセルの粒径の分布を調べた結果を示す図である
【図７】図７は、DiIを内包させたGFP-シロールデンドリマー複合体からなるミセルを370nmで励起したときの発光特性を調べた結果を示す図である。
【００４３】
【図８】図８は、Alexa594で標識したＷＧＡを内包させたGFP-シロールデンドリマー複合体からなるミセルを370nmで励起したときの発光特性を調べた結果を示す図である。
【００４４】
【図９】図９は、アニーリング温度を変えてインバースＰＣＲを行った後の、ＰＣＲ産物の電気泳動像である。
【図１０】図１０は、標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質会合駆動型ミセルの蛍光スペクトルを測定した結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＭＣＦ−７の標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質会合駆動型ミセルの粒径分布図である。
【００４５】
【図１２】図１２は、低温低真空走査型電子顕微鏡を用いて、形成された粒子がミセルなのか、ベジクルなのかを判定するために観察したときの電子顕微鏡像である。図中、白い円及び白い矢印で示した構造物は、塩の結晶であると考えられる。また、黒の円及び黒の矢印で示した構造物は、ベジクル様物質と思われる。
【００４６】
【図１３】図１３は、標的型タンパク質及び標的型タンパク質を含むミセルのMCF細胞への取込みを示すグラフである。(A)は、HepG2標的タイプ１型タンパク質(-)(-)及びMCF7標的タイプ１型タンパク質(-)(-)の取り込みを示す。(B)は、HepG2標的タイプ１型タンパク質(+)(+)及びMCF7標的タイプ１型タンパク質(+)(+)の取り込みを示す。(C)は、HepG2標的タイプ１型ミセル(-)(-)及びMCF7標的タイプ１型ミセル(-)(-)の取り込みを示す。(D)は、HepG2標的タイプ１型タンパク質(+)(+)及びMCF7標的タイプ１型タンパク質(+)(+)の取り込みを示す。
【００４７】
【図１４】図１４は、A549細胞と本発明のミセルとが接触した後、24時間後におけるミセルの取込みの相違を示すFACSによる分析結果である。(A)はミセルなし、(B)及び(C)は未標的型ミセルを使用した場合、(D)及び(E)は標的型ミセルを使用した場合の結果である。
【図１５】図１５は、MCF7細胞と本発明のミセルとが接触した後、24時間後におけるミセルの取込みの相違を示すFACSによる分析結果である。(A)はミセルなし、(B)及び(C)は未標的型ミセルを使用した場合、(D)及び(E)は標的型ミセルを使用した場合の結果である。
【００４８】
【図１６】図１６は、未標的型ミセルの濃度依存的変化及び経時変化を示す図である。(A)は、未標的型（NSS25）の結果を、また、(B)は未標的型（NSS26）の結果をそれぞれ示す。
【図１７】図１７は、標的タイプ１型ミセルの濃度依存的変化及び経時変化を示す図である。
【図１８】図１８は、未標的型ミセル及び標的型ミセルの経時変化を示すグラフである。(A)は未標的型（NSS25）、(B)は未標的型（NSS26）、(C)は標的タイプ１型ミセルの結果をそれぞれ示す。
【００４９】
【図１９】図１９は、シェルを構成するタンパク質をゲル電気泳動した時の結果を示す電気泳動像である。(A)は染色前、(B)はクマシーブリリアントブルー（CBB）で染色した結果を示す。
【００５０】
【図２０Ａ】図２０Ａは、コラーゲンコートディッシュで培養した標的細胞中への未標的型ミセルの取り込みを示す蛍光顕微鏡像である。上段は取込み実験の開始後３時間、下段は24時間の蛍光顕微鏡像である。
【００５１】
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ポリ-d-リジンコートディッシュ又はコラーゲンコートディッシュ中で、ミセルなしで細胞を培養したときの状態を示す光学顕微鏡像である。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、コラーゲンコートディッシュで培養した標的細胞中への標的タイプ１型ミセルの取り込みを示す蛍光顕微鏡像である。上段は取込み実験の開始後３時間、下段は24時間の蛍光顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。本発明は、上述した通りの下記式（Ｉ）で表される凝集性分子からなるドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料と標的配列提示部とを有し、分子量２０万以下のタンパク質、核酸、疎水性分子からなる群から選ばれるいずれかの分子を内包し得る、ドラッグデリバリーシステム用標的型シェルである。
【００５３】
【化６】
2017094792.tif 000007
【００５４】
本発明で使用するカルボシランデンドリマー（以下、「シロールデンドリマー」ということがある。）は、以下の構造を有する化合物であることが、凝集性及び後述する標的配列提示部の双方の性質を備えるようにすることができることから、さらに好ましい。
【００５５】
一般的なカルボシランデンドリマーの構造を、図１のＡ〜Ｃに示す。図１のＡに示す化合物はファン(0)3と呼ばれるものであり、この化合物は、円で囲んだベンゼン環をコアとしている。図１のＢに示す化合物は、ダンベル(1)6と呼ばれるものであり、図１のＡに示す２分子のファン(0)3分子が、コアに代えて、２つのメチル基がついたケイ素（Me-Si-Me）で結合されている。図１のＣに示す化合物は、ボール(1)6と呼ばれる化合物であり、ダンベルのMe-Si-Meのメチル基に代えて、ファン(0)3のコアが外れた分子が結合し、球状となっている。
本発明のカルボシランデンドリマーは図２に示す手順（スキーム１）で合成することができる。
【００５６】
本発明のカルボシランデンドリマーの構造は、従来のカルボシランデンドリマーとは全く相違しており、分子の末端に結合している臭素原子の１つが標的配列提示部との結合に関与する。ここで、標的配列提示部は、配列表の配列番号１〜３に示す標的認識部位を有するタンパク質であることが、上記デンドリマーで形成されるＤＤＳ用薬剤の特異的な送達を可能にする上で好ましい。
【００５７】
そして、上記標的配列を構成するタンパク質は、唯一の反応性チオール基を有するものであり、前記チオール基はフォールディングされたタンパク質の外側、すなわちタンパク質表面に位置していることが好ましい。
【００５８】
チオール基は、上記デンドリマー中に存在するハロゲン原子と反応し、タンパク質とデンドリマーとを結合させる役割を担うため、フォールディングされたタンパク質の内側に位置していても、結合に関与できないからである。ここで、「チオール基を有するタンパク質」には、元々チオール基を有しているタンパク質のほか、遺伝子工学的手法等を用いて新たにチオール基を導入したもの、及びシステインを含むタンパク質のシステインが還元されて、チオール基となったもの等が含まれる。
【００５９】
タンパク質中のチオール基の存在位置は特に限定されないが、タンパク質上の特定の領域にチオール基が存在することが好ましい場合もある。さらに、シェルの発光特性の制御が可能になる場合がある。なお、「システインを含むタンパク質」に含まれるシステインは、既存の任意のアミノ酸との置換による方法、所望の位置への挿入による方法その他の遺伝子工学的手法等により、所望の位置に導入されたものであってもよい。タンパク質の所望のアミノ酸の位置にシステイン残基を導入することは、部位特異的突然変異導入法その他の公知の遺伝子工学的手法を使用することにより、当業者であれば容易に実施することができる。
【００６０】
上記の標的配列提示部を構成するタンパク質は、会合する性質（以下、「会合性」ということがある。）を有するものであればよく、特に限定されないが、緑色蛍光タンパク質（以下、下記のような緑色以外の蛍光を発する蛍光タンパク質を集合的に「ＧＦＰ」ということがある。）及びその変異体を含む蛍光タンパク質を使用することが好ましい。こうした蛍光タンパク質が結合した上記カルボシランデンドリマーは、タンパク質が会合すると強い蛍光を発し、会合状態を容易に検出できるからである。
【００６１】
本発明において使用することができるＧＦＰとしては、例えば、配列表の配列番号７に示すＧＦＰ、配列番号８に示すＧＦＰ、配列表の配列番号９に示すＢＦＰ（青色蛍光タンパク質)、配列表の配列番号１０に示すＹＦＰ等のほか、クロンテック社から市販されているＣＦＰやＲＦＰその他のＧＦＰ誘導体を挙げることができる。これら以外にも、配列表の配列番号５に示すイソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質なども使用することができるが、配列表の配列番号７に示すＧＦＰが、蛍光の強さ及び扱いやすさから好適に使用することができる。さらには、MBL社より市販のアザミグリーンやその他の色変異体も好適に使用可能であることは、構造上の特性から想定できる。
【００６２】
また、こうしたＧＦＰは、公知の方法（例えば、Biochim. Biophys. Acta 1679 (2004) 222-229; Biochem. Biophys. Res. Commun. 330 (2005) 454-460等を参照されたい）を用いて産生してもよく、こうしたタンパク質の産生を受託生産する企業に依頼して作製したものを使用してもよい。
【００６３】
シロールその他のＡＩＥ効果を惹起する官能基を含む分子をデンドリマーの骨格として用い、標的配列提示部を蛍光タンパク質等の会合性タンパク質で構成された本発明の凝集性担体を作製し、これを用いてミセルを形成させると、シロール基が凝集した部分からも蛍光が生じ、蛍光タンパク質−シロール間で蛍光共鳴エネルギー移動（FRET：Fluorescence resonance energy transfer）が生じて、強い蛍光となる。そして、ミセルが崩壊するとFRETは消失する。
【００６４】
このため、本発明の凝集性担体と標的配列提示部とを用いて作製したミセルを、薬剤送達のための担体として用いると、上記担体（ミセル）の生体内における状態を、FRETの変化を指標としてモニターすることができる。さらに、このようなモニターが可能となることによって、こうした担体の存在位置および存在状態を追跡することができる。
【００６５】
蛍光タンパク質とシロールデンドリマーとの間でFRETを生じさせるには、標的配列提示部を構成する蛍光タンパク質のどの位置が、上記シロールデンドリマーに固定されるかが重要になってくる。デンドリマーと結合する上記蛍光タンパク質上の位置は、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる。上記標的配列提示部を構成する蛍光タンパク質としてＧＦＰを用いる場合には、Ｎ末端領域、Ｃ末端領域、Ｎ末端領域又はＣ末端領域のいずれかに隣接するループ領域と、デンドリマーとが結合することが望ましく、これらの領域中にチオール基を有するシステインなどのアミノ酸が存在していることが好ましい。
【００６６】
ここで、「Ｎ末端領域」での結合は、Ｎ末端近傍に存在する10アミノ酸程度のコア部分から突出した部分と上記シロールデンドリマーとが結合した場合をいう。Ｃ末端領域との結合も同様に、Ｃ末端領域に存在する10アミノ酸程度のコア部分から突出した部分と、上記シロールデンドリマーとが結合した場合をいう。
【００６７】
本発明のシロールデンドリマーに担持されるハロゲン基の位置は、特に限定されないが、上記シロールデンドリマーの側鎖に存在することが好ましい。より好ましくは、上記式（Ｉ）に示すように、側鎖の末端（シロール基から最も遠い位置）に存在することがさらに好ましい。
【００６８】
上述したように、本発明の方法に使用されるシロールデンドリマーは、上記式（Ｉ）で示す化合物であることが好ましい。この化合物は、例えば、後述するスキーム２に示すように、シロールコア２（1,1-ジアリール-2,3,4,5-テトラフェニルシロール）を、公知の中間体18を経て、1,2-ジフェニルアセチレンから合成することができる。
【００６９】
次いで、触媒としてH2PtCl6・6H2Oを使用して、トリクロロシランで２のヒドロシル化を行い、アリールマグネシウムブロマイドを用いたグリニャール反応によって、シロールコアデンドリマー３を得ることができる。得られたデンドリマー３をジクロロヘキシルボランで処理し、その後アルカリ溶液中にて過酸化水素で加水分解し、ヘキサヒドロキシ誘導体４を得る。次いで、ヘキサヒドロキシ誘導体のO-メシル化を行なうことにより、臭素アニオンと置換し５を得ることができる（Tetrahedron Lett., 2007 48:4365-4368）。
【００７０】
【化７】
2017094792.tif 000008
【００７１】
前記標的配列提示部を構成する標的認識部位を有するタンパク質は、会合をする性質を有するものであればよく、特に限定されない。しかし、前記タンパク質は、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることが好ましい。
【００７２】
入手が容易であり、また、蛍光タンパク質自体の蛍光強度が大きいことから、FRETによって強い蛍光が生じるためである。ここで、前記青色蛍光タンパク質は、ブルー又はシアンの蛍光を呈するものがいずれも含まれる。
【００７３】
本発明の凝集性分子は、チオール基を有する上述したタンパク質（標的配列提示部）と、側鎖にハロゲン基を有するデンドリマー化合物（式（Ｉ））とを混合し、インキュベートして、タンパク質のチオール基とデンドリマー化合物のハロゲン基とを反応させ、デンドリマー化合物にタンパク質を結合させる。このとき、タンパク質は、DTTなどの還元剤で予め処理をして、-SH基が酸化されていない状態にしておくことが望ましい。この反応で、１分子のＧＦＰが組み込まれた場合の反応を、スキーム２に示す。
【００７４】
【化８】
2017094792.tif 000009
【００７５】
例えば、上記のスキーム２に示す反応は、適当な溶媒（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、生理食塩水など水溶性溶媒）中で行うことができる。この場合の反応条件は、使用するタンパク質によって異なるが、反応温度は、使用するタンパク質の変性温度を下回ってさえいればよく、例えば、0〜50℃、好ましくは30℃〜45℃、より好ましくは37℃程度とすることができる。GFPを用いると、42℃までは、温度依存的に反応性を向上させることができることから、GFPを使用することがＤＤＳ用凝集性担体材料を作製する上では好適である。
【００７６】
また、反応時間は、反応温度によっても異なるが、例えば、1時間〜24時間、好ましくは、10時間〜19時間、より好ましくは、15時間〜18時間程度とすることが好ましい。この程度の反応時間とすることにより、使用したチオール基を有するタンパク質が上記シロールデンドリマーに結合するとともに、リポソーム又はミセルが形成されるからである。
【００７７】
すなわち、タンパク質−デンドリマー複合体が形成されるにつれて、タンパク質（親水性部分）を水溶性溶媒側に、デンドリマーのコアの部分（疎水性部分）を疎水性部分同士で会合する様な構造を有するようにしたリポソーム又はミセルが形成される。すなわち、上記のような会合性のタンパク質をデンドリマーの側鎖に結合させることにより、タンパク質の会合が駆動力となってリポソーム又はミセルが形成されていくものと考えられる。
【００７８】
ここで、上記シロールデンドリマーには、少なくとも１個以上のタンパク質が、側鎖末端のハロゲン原子と置換されて結合する。このため、上記の反応で得られるドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料は、上述した化学式（II）〜（V）で表される結合体の混合物として得られることになる。
【００７９】
チオール基を有するタンパク質が蛍光タンパク質である場合には、こうしたタンパク質とデンドリマーとの混合比（モル比）は、タンパク質を１として、デンドリマーが例えば、１〜２０とすることができ、好ましくは、１：５〜１：15、より好ましくは、１：10程度である。ただし、この比率は濃度に依存して最適な値が変動する。
【００８０】
また、上記の反応を行なう際には、標的配列提示部であるタンパク質に、標的認識部位となるアミノ酸配列を組み込んでおくことが、後述するＤＤＳでの効率のよい送達を実現する上で好ましい。こうした標的認識部位の組み込みは、インバースPCRによって簡便に行うことが好ましい。こうして作製された変異体をコードしたプラスミドを大腸菌に組み込んで発現させれば容易に変異体タンパク質を得る事ができ、ＤＤＳ用凝集性分子を得ることができるからである。
【００８１】
上記のような標的認識部位を標的配列提示部であるタンパク質に組み込んでおくことにより、前記炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる組織、腫瘍細胞で構成された組織等に、特異的に、本発明のドラッグデリバリーシステム用標的型シェルに内包された所望の薬剤を、活性を維持したまま送達することができる。
【００８２】
上記のような構造を有するドラッグデリバリーシステム用標的型シェルを作製し、これに所望の薬剤を内胞させることにより、薬剤の有効性を維持しつつ、標的組織に対して特異的にこうした薬剤を送達することができる。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は、あくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）ＤＤＳ用凝集性分子及びミセルの作製
本実施例においては、標的提示部作製用のタンパク質として下記の通りのGFPを、また、デンドリマーとしてシロールデンドリマーを用いた。
（１）ＤＤＳ用凝集性分子の作製
本実施例において、ハロゲン基を有するデンドリマーとして、下記の化学式（Ｘ）に示す化合物（以下、「ジメチルダンベル（１）６−Br」ということがある。）を使用し、チオール基を有するタンパク質として、GFP（緑色蛍光タンパク質）（配列番号７）を用いた。【００８４】
【化９】
2017094792.tif 000010
【００８５】
ここで使用したGFP（配列表の配列番号７）は、既に発明者らが報告した方法に従って（Biochim. Biophys. Acta 1679 (2004) 222-229; Biochem. Biophys. Res. Commun. 330 (2005) 454-460を参照されたい）、配列番号７に示すGFPのアミノ酸配列のＣ末端領域の251番目のアミノ酸をシステインに置換するとともに、元々存在していたシステイン（48番目及び70番目）をセリン及びバリンにそれぞれ置換した。【００８６】
まず、20μＭ濃度のGFP溶液（PBS中）に、最終濃度１mMとなるようにDTTを加え、10分間室温で処理し、GFP表面に存在するシステインの還元を行った。システインを還元した、400〜450μLの20μMのGFP溶液（PBS中）に、最終濃度10倍モル等量になるように、200μMの上記式(VI)に示すシロールデンドリマー溶液（DMSO溶媒）を10μL加えてボルテックスで混合した。【００８７】
混合後、37℃で静置した状態で、終夜インキュベートし、GFPと上記シロールデンドリマーとを結合させ、引き続き、ミセルを形成させた。このときのインキュベート時間は、約16〜18時間であった。得られたミセルを含む溶液中のミセルの粒子の特性を、動的光散乱法（DLS; Dynamic light scattering）により測定した。結果を表１に示す。【００８８】
【表１】
2017094792.tif 000011
【００８９】
また、上記反応液を、25℃にてZETASIZER NANO-S（マルバーン社製）を用いて、レーザー光の波長を532 nmとして、粒径を測定した。結果を図３に示す。図３（Ａ）はGFPのみでインキュベートし、得られた産物の粒径分布を調べた結果である。図３（Ｂ）は式（VI）のシロールデンドリマーのみでインキュベートし、得られた産物の粒径分布を調べた結果である。図３（Ｃ）はGFPと式（VI）のシロールデンドリマーとを混合してインキュベートし、得られた産物の粒径分布を調べた結果である。横軸は得られた産物の粒径を、縦軸は横軸に示すサイズの産物の全体に占める％を表す。【００９０】
GFPと上記シロールデンドリマーとをインキュベートした場合（上記表１中、「GFP-Silole only」と表示。）には、得られたミセルの粒径はおよそ150nmであった。これに対し、GFPのみをインキュベートした場合に観察された粒径はおよそ4nm、上記シロールデンドリマーのみでインキュベートした場合に観察された粒径はおよそ650nmであった。上記シロールデンドリマーのみでインキュベートした場合に観察された粒径がこのように大きくなったのは、おそらく、シロールデンドリマー同士で凝集し、大きな凝集体が形成されたためと考えられた。【００９１】
次に、得られたミセルの粒子を走査型電子顕微鏡（SEM; Scanning Electron Microscope）で観察したところ、粒子径がおよそ100〜500nmの多数の粒子と、粒子径が500nm程度の少数の粒子とが確認された（図４参照）。【００９２】
以上の結果から、本発明のＤＤＳ用凝集性担体を用いて形成されたミセルの粒子径は、およそ100〜500nmであり、およそ100〜200nm程度の粒子径のものが多いことが明らかになった。また、SEMを用いた電顕微鏡写真の像から、球状のミセル構造を形成していることも確認された。【００９３】
（２）蛍光共鳴エネルギー移動の確認
本実施例において使用したシロールデンドリマーは、疎水性のシロールのコア部分が凝集すると発光する（ＡＩＥ効果を発揮する）性質を有しているため、ミセル構造をとった場合にも発光することが確認されていた。そこで、シロールデンドリマーにＧＦＰを結合させたGFP-シロールデンドリマーからなるミセルを作製した場合に、シロールとＧＦＰとの間において蛍光共鳴エネルギー移動（FRET：Fluorescence resonance energy transfer）が生じるがどうかを検討した。【００９４】
発光特性の実験は、上記の反応液から、未反応の蛍光タンパク質及びデンドリマー（遊離している分子）を除去した後に行った（図５参照）。シロールデンドリマーのみでインキュベートした産物は370nmの波長で励起し（白抜きの四角：□）、ＧＦＰのみでインキュベートした産物は488nmの波長で励起し（白抜きの三角：△）、ＧＦＰおよびシロールデンドリマーを用いてインキュベートした産物（本発明のミセル）は370nmの波長で励起し（黒丸：●）、各々の発光波長の特性を調べた。GFP-シロールデンドリマー複合体からなるミセル（ＧＦＰおよび式（Ｘ）のシロールデンドリマーでインキュベートして得られた産物）は、シロールからＧＦＰへのFRETによる発光が、510nm付近に観察された。【００９５】
図５に示すように、シロールデンドリマーの発光のピークは480nm付近で観察された。また、ＧＦＰとシロールデンドリマーとの結合体の発光では、シャープなピークは認められず、510nm付近でもっとも高い値を示した。これに対し、ＧＦＰの発光は、510nm付近にシャープなピークとして観察され、これは上記シロールデンドリマーからＧＦＰへのFRETによるものと考えられた。また、ミセルが崩壊したときに、FRETに起因すると考えられるＧＦＰの発光も消失した。【００９６】
すなわち、ＡＩＥ効果を有するデンドリマーと、蛍光タンパク質等の会合性のタンパク質とを結合させた分子（GFP-シロールデンドリマー複合体）を作製し、こうした分子を用いてミセルを形成させると、ミセルの状態でもデンドリマーと蛍光タンパク質との間でFRETが生じること、ミセルの崩壊によってFRETも消失した。
以上から、本発明のミセルをＤＤＳ用凝集性担体として使用すると、送達された組織・器官を確認できることが示された。また、標的組織・器官に送達されたミセルが崩壊した後であっても、蛍光タンパク質の蛍光を追跡することはでき、これによって、蛍光タンパク質が送達された細胞内の環境等を感知することもできる。【００９７】
（３）GFP−シロールデンドリマー複合体からなるミセルへの薬剤等の内包実験
次に、本発明のミセルを用いて、薬剤等を内包するミセルが作製できるか否かを確認した。本実施例では、モデル薬剤として、DiI（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl indocarbocyanine perchlorate、Promokine PK-CA707-60010, PromoCell GmbH製）、Oil orange SS（東京化成工業（株）製、T0553）、ヤギ抗マウスIgG（abcam社製、ab6708）-Alexa610（Molecular Probes社製、A30050）およびＷＧＡ（Wheat Germ Agglutinin：小麦胚芽レクチン、Molecular Probes社製）（WGA-Alexa Fluoro (登録商標) 594 conjugate、W11262）を用いた。【００９８】
システインを還元した20μMのＧＦＰに、最終濃度10倍モル等量になるように、200μMの上記式（Ｘ）に示すシロールデンドリマー（DMSO溶媒）を10μL加え、さらに、DiI（最終濃度；1μＭ、蛍光色素）、Oil orange SS（最終濃度；20μＭ、蛍光色素）、ヤギ抗マウスIgG-Alexa610（最終濃度；0.1μＭ）及びＷＧＡ（最終濃度；2μＭ）のいずれかを加えてボルテックスで混合し、37℃で静置して終夜インキュベートした（約16〜18時間）。【００９９】
各モデル薬剤を加えた試料中で、各薬剤を内包するミセルが形成されているか否か、及びミセルが形成されている場合には、それらのミセルの粒子径を、上述した動的光散乱法により測定した。結果を表２に示す。ここで、薬剤モデルとしては、DiI、Oil orange SS、及びヤギ抗マウスIgG-Alexa 610を使用した。【０１００】
図６のＡ〜Ｃに、上記のモデル薬剤を用いた場合の粒径の分布を示す。図６のＡはDiIの存在下、図６のＢはOil orange SSの存在下、図６のＣはヤギ抗マウスIgG-Alexa 610の存在下で、各々、ミセルを作製した場合の粒径分布である。横軸は得られたミセルの粒径を、縦軸は各横軸に示すサイズのミセルの全体に占める％を表す。DiIを加えた場合のミセルの粒径はおよそ95nm、Oil orange SSを加えた場合もおよそ95nm、IgG-Alexa610を加えた場合はおよそ180nmであった。【０１０１】
【表２】
2017094792.tif 000012
【０１０２】
蛍光色素であるDiIを内包するミセルの発光特性を調べた結果を、図７に示す。図７のＢは、図７のＡの500nm付近のスペクトルを拡大した図である。横軸は波長（nm）を、縦軸は相対的蛍光強度(a. u.)を表す。まず、DiIを内包するミセルを作製し、該ミセルをＰＢＳで３回洗浄した試料、その後、この反応溶液を0.45μmの孔径のフィルターでろ過して遊離色素を除いた試料、及び0.45μmのフィルターに代えて0.22μmのフィルターでろ過して遊離色素を除いた試料をそれぞれ調製し、これらの試料の蛍光を測定した。【０１０３】
図７のＡ及びＢに示すように、370nmの波長で励起した場合には、480nm波長付近に肩ピークが確認され、シロールの発光によるものと考えられた。510nm付近のピークはシロールからＧＦＰへのFRETによるものを考えられ、570nm付近のピークはシロールからDiIへのFRETに起因するものと考えられた。以上の結果から、DiIがミセル内に封入されていることが確認された。【０１０４】
次に、Alexa594で標識したＷＧＡを内包させたミセルの発光特性を調べた（図８のＡ及びＢ参照）。図８のＡは、Alexa594標識ＷＧＡを添加したときの反応液をそのまま測定した結果である。また、図８のＢは、限外濾過スピンカラム（Millipore社製）を用いて、反応液から未反応タンパク質等（Alexa594で標識したＷＧＡ、シロールデンドリマー、ＧＦＰ等その他のミセルに取り込まれなかったもの）を除去した後、測定を行った結果である。図８中、実線はGFP-シロールデンドリマー複合体とＷＧＡを混合処理して得られた産物の蛍光特性を示し、破線はＧＦＰとＷＧＡを混合処理して得られた産物の蛍光特性を示す。【０１０５】
図中、実線は、GFP−シロールデンドリマー複合体からなるミセルにAlexa594標識ＷＧＡを内包させたもの、また、破線は、ＧＦＰとAlexa594標識ＷＧＡを混合したものを内包させたものを、それぞれ測定した結果を示す（励起波長はいずれも370nm）。【０１０６】
限外濾過スピンカラム処理を行っていない反応液をそのまま測定した結果を示す図８のＡには、シロールデンドリマーからの蛍光が480nm付近に、ＧＦＰからの蛍光が510nm付近に、また、ＷＧＡからの蛍光が610nm付近にそれぞれ検出された。これに対し、図８のＢに示されるように、限外濾過スピンカラム処理を行うとフリーのシロールデンドリマー、ＧＦＰおよびＷＧＡが除去され（破線）るため、これらからの発光はほとんど検出でされなかった。以上より、作製されたミセルにAlexa594標識ＷＧＡが内包されていることが確認できた。【０１０７】
（実施例２）標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質の調製
本願発明のミセルとＣ末端で結合し、かつ、癌細胞の表面に発現する受容体と結合する標的ペプチドとＮ末端で結合する、標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質を以下のように調製した。【０１０８】
（１）インバースＰＣＲ
（１−１）ペプチド配列の選定
選定した標的結合部位に組み込んだペプチドのアミノ酸配列を下記表３に記載した。MCF7-1は、下記表３に示す配列を含む、ヒト乳腺癌由来細胞であるMCF7であり（以下、「標的タイプ１型」ということがある。）、MCF-2は、下記表３に示す配列を含むMCF-1の変異体（以下、「標的タイプ２型」ということがある。）である。また、MCF7-1＋αスタンドは、下記表３に示すように、上記のMCF7-1にαへリックス構造の短いペプチド（以下、「αスタンド」という。）をつないだ構造を有するMCF7-1の別の変異体である（以下、「タイプ１強化型」ということがある。）。【０１０９】
【表３】
2017094792.tif 000013
【０１１０】
（１−２）プライマーの作成
表３に示された上記ペプチド配列についてインバースＰＣＲを行なうためのプライマーを下記表４に記載した。これらプライマーは、配列表の配列番号１及び３については上記ペプチド配列のDMとPGTVLPの間から、配列番号２については上記ペプチド配列のVPとTDTDYSGGの間から伸長反応が開始するように設計した。これはインバースPCRが最適に行われることを鑑みている。【０１１１】
【表４】
2017094792.tif 000014
【０１１２】
（１−３）インバースＰＣＲ用テンプレートプラスミドの調製
インバースPCR用テンプレートプラスミドは、以下の論文に記載の方法で調製した。
「Protease-sensitive signaling by chemically engineered intramolecular fluorescent resonance energy transfer mutants of green fluorescent protein. - Miho Suzuki, et al. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression
Volume 1679, Issue 3, 17 September 2004, Pages 222-229」【０１１３】
（１−３−１）GFPuv5変異体のプラスミド構築
GFPuv5は、pGFPgcn4から以下のようにして得た。まず、I167T突然変異＋フォワードプライマー 5’CATTGAAGATGGCTCCGTTCAA（配列番号１８）及びリバースプライマー5’TTGTGGCGAGTTTTGAAGTTAG（配列番号１９）を用いたインバースＰＣＲを用いて遺伝子マニピュレーション用の同義の突然変異を生じさせたPCR産物を得て、引き続きこのPCR産物を環化処理して作製された。以上のようにして得られたコンストラクトを、pGFPgcn5と命名した。【０１１４】
その後、GFPuv5のcDNAをpET21a（Novagen社製）にクローニングしてタンパクを発現させた。ここで発現したタンパク質を精製し、GFPuv5tagと命名した。そのコード領域を、プライマー5’CTCGACCAT[ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGT]CGCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA（配列番号２０）（GFPuv5シリーズのＮ末端向きのT7遺伝子の10タンパク質用の最初の11アミノ酸のエピトープタグに接着する、接着するタグは［  ］で示した）、及びGFPuv5シリーズのＣ末端にHisタグを提供する、5’TGACGTGAATTCATTA[GTGATGGTGATGGTGATG]TTTGTAGAGCTCATCCATGC（配列番号２１）（Hisタグを[  ]で示す）を用いて増幅させた。【０１１５】
配列番号1〜３に示した塩基配列のDNAをpET21aに挿入し、NdeI及びEcoRIで消化した。このpGFPgcnプラスミドを遺伝子マニュピレーションに使用し、pET21aプラスミドをT7プロモーターの制御下でのタンパク質発現に使用した。GFPuv5の遺伝子及びその突然変異体の遺伝子の塩基配列を、ＤＮＡシーケンシングにより確認した(ABI PRISM 3100 Genetic Analyser社製)。実験中に、さらに３つの同義の突然変異が発見された(Ser-30のagtがagcに、His-78のcatがcacに、Gln-183のcaaがcagに、それぞれ変異している)。【０１１６】
それらの突然変異は蛍光タンパク質にとっては有害ではないため、これらの突然変異を含んだまま実験を継続した。精製されたGFPuv5tagの蛍光強度は、GFPuv4tagの約1.9倍であった。その後、48位又は70位のいずれかのシステイン残基を、pGFPgcn5を用いたインバースＰＣＲによってランダム化されたアミノ酸で置換した。【０１１７】
オリゴヌクレオチドである、5’CTTAAATTTATTNNKACTGGAAAAC（配列番号２２）及び5’GGTAAGTTTTCCGTATGTTG（配列番号２３）をシステイン48の突然変異に使用し、5’GTGTTCAANNKTTTTCCCGTTATCCG（配列番号２４）及び5’CATACGTCAGAGTAGTGACAAG（配列番号２５）をシステイン70の突然変異に使用した。大腸菌BL21(DE3)の培養物を、得られたプラスミドで形質転換し、昼光励起の下で、強い蛍光についてスクリーニングを行ない、寒天培地上で選択した。48では、幾つかの強い蛍光を発する変異体が得られた(Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, 及びTyr置換)。しかし、70位のアミノ酸を置換した突然変異体では、C70Vシステイン変異体のみが適切な蛍光を与えた。【０１１８】
強い蛍光強度を有する二重システイン突然変異GFPuv5を作製するために、一重突然変異を有するプラスミドをNcoI及びEcoRIで消化し、それぞれの領域に再度ライゲーションした。選択は一重突然変異体で行った。UV5C0 tag (C48S/C70V) が全ての組換体の中で最も高い蛍光強度を示した。
次に、システインを6位及び229位にそれぞれインバースPCRによって導入した。この導入には、C48S突然変異を有するプラスミドと、以下のプライマーのセットをそれぞれの突然変異に使用した。【０１１９】
Glu置換用：5’TGTCTTTTCACTGGAGTTGTCCC（配列番号２６）及び5’TTCTCCTTTACTCATTTTTTC（配列番号２７）
Ile置換用：5’TGCACACATGGCATGGATGAGCTC（配列番号２８）及び5’CCCAGCAGCAGTTACAAACTC（配列番号２９）
トリプシン標的配列(Gln-Gly-Arg)からなる３つのプロテアーゼタグは、種々のスペーサー配列を有し（スペーサーなし、Thrスペーサー又はGly-Thrスペーサー）、必要なシステインがHis-231とAsp-234との間で置換されている。このコンストラクトを、puvC48Stagと得られたプラスミド（テンプレート）と、下記表５に示すプライマーとを用いて得た。【０１２０】
【表５】
2017094792.tif 000015
【０１２１】
（１−３−２）GFPuv5tag突然変異体の精製
全てのプラスミドで大腸菌BL 21(DE3)を形質転換した。アンピシリン(50μg/ml)及びIPTG (0.5mM)を添加したＬＢ培地(38mL)に、定常期の終夜培養した大腸菌(12ml)を播種し、37℃で８時間インキュベートした。2,500 x gで20分間遠心して細胞を集め、10mLのPBSに再懸濁した。細胞のペレットを、50mMトリス及び8M尿素を含む10mLの溶解バッファー（pH 8.0）中で、15分間、室温にて溶解させ、ボルテックスした。1,200 x gで15分間遠心し、上清をPBS中に懸濁したNi2+-NTA 樹脂(Qiagen Co. Ltd.製)と混合した。この樹脂を、PBS及び20mMのイミダゾールで順番に洗浄した後に、結合したGFPuv5tag突然変異体を250mMのイミダゾール溶液で溶出させた。【０１２２】
バッファー交換のために、溶出物を10倍希釈したＰＢＳで平衡化したPD-10ゲル電気泳動濾過カラム(Amersham Bioscience Co. Ltd.製)にアプライした。溶出されたGFPuv5tag突然変異体タンパク質を集め、それらの濃度をクマジータンパクアッセイ試薬(Pierce社製)で定量した。精製されたGFPuv5tag突然変異体を、15％ SDS-PAGEによって分析した。
インバースＰＣＲ用テンプレートプラスミドの塩基配列を配列番号２６に示した。【０１２３】
（１−４）ＰＣＲの条件
下記表６に示す反応液を調製し、下記表７の条件でインバースＰＣＲを行った。【０１２４】
【表６】
2017094792.tif 000016
【０１２５】
【表７】
2017094792.tif 000017
【０１２６】
（１−５）電気泳動による確認
上記ＰＣＲ反応液の一部をとって、0.8％ PAGE、電圧100 V、印圧時間30分間のゲル電気泳動を行い、各サンプル中で増幅されたペプチドを確認した。泳動結果を図９に示す。【０１２７】
（２）非依存的Ａ配列の除去及びPCR産物の精製
下記表８の反応液を調製し、120℃で30分間反応させ、上記PCRによって生じた非依存的Ａ配列を除去した。その後、QIAquick（登録商標） PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を使用して、キットに添付の説明書に従って上記PCR産物を精製した。【０１２８】
【表８】
2017094792.tif 000018
【０１２９】
（３）ライゲーション反応
引き続き、下記表９に示す反応液を調製し、16℃で３時間以上反応させて、後述する大腸菌ＤＨ５αの形質転換用環状プラスミドを作製した。変異体に応じて、25℃、37℃等を使い分けた。【０１３０】
【表９】
2017094792.tif 000019
【０１３１】
（４）大腸菌ＤＨ５αの形質転換
大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（BioDynamics Laboratory社製）10μlを使用直前に氷上で融解させ、コンピテントセル溶液を調製した。このコンピテントセル溶液にライゲーション反応液を1μL加え、氷上で30分間放置した。その後、42℃で30秒間インキュベートした後に、氷上で2分間冷却した。ここに、SOC（東洋紡（株）製）培地を90μL加え、37℃で1時間シェーカー上において反応させた。その後、アンピシリン含有LB選択培地（東洋紡（株）製）に播種し、37℃で一晩静置した。【０１３２】
（５）コロニーＰＣＲ
上記形質転換で得られたコロニーからコロニーＰＣＲを行い、想定されるインサートを確認した。
（５−１）ＰＣＲ用反応液溶液の調製
下記表１０のコロニーＰＣＲ用反応液を調製した。【０１３３】
【表１０】
2017094792.tif 000020
【０１３４】
上記コロニーＰＣＲ用反応液をＰＣＲ用チューブに入れ、上記アンピシリン含有ＬＢ培地で増殖した大腸菌を採取し、これを加えた。ＰＣＲは下記の表１１に示すプログラムで行った。【０１３５】
【表１１】
2017094792.tif 000021
【０１３６】
（５−２）電気泳動
上記ＰＣＲ反応液の1.2％アガロースゲルで印加電圧100 V、時間30分間の電気泳動を行い、増幅が確認できたコロニーを、ＬＢ液体培地（東洋紡（株）製）が入った培養ボトルに移植し、37℃でインキュベートした。【０１３７】
（６）プラスミドの精製
上記ＬＢ液体培地で培養した大腸菌中の上記プラスミドを、Wizard Plus SV Minipreps. DNA Purification System（プロメガ（株）製）を用い、製品に添付された説明書に従って精製した。その後、精製したプラスミドの配列をユーロフィンジェノミクス（株）に依頼して解析した。【０１３８】
（７）大腸菌BL21(DE3）の形質転換
大腸菌BL21(DE3）コンピテントセル（BioDynamics Laboratory社製）10μLを使用直前に氷上で融解させ、コンピテントセル溶液を調製した。このコンピテントセル溶液に、上記シーケンスにより目的とする配列が入っていることが確認できたプラスミド液1μlを加え、氷上で30分間放置した。【０１３９】
その後、42℃で30秒間インキュベート後、氷上で２分間冷却した。ここに、ＳＯＣ（東洋紡（株）製）培地を90μL加え、37℃で１時間シェーカー上において反応させた。その後、アンピシリン含有LB選択培地に播種し、37℃で一晩静置した。翌日、形質転換されて緑色の蛍光を発しているコロニーを取り、アンピシリン含有ＬＢ液体培地１mlが入った培養ボトルに入れ、37℃で一晩静置して前培養を行った。【０１４０】
（８）標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質の精製
（８−１）コロニーの培養
50mLチューブにアンピシリン含有ＬＢ液体培地４mLを入れ、ここに上記前培養液290μLを加えたものを試料として４本用意し、28℃で４時間シェーカー上で培養した。その後、100mMのIPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を43μL加え、28℃で一晩シェーカー上で培養した。【０１４１】
（８−２）タンパク質の回収
翌日、上記の４本のチューブの培養液を１本のチューブに集約した。内容物を移した３本のチューブを、それぞれ１ｍlのＰＢＳ（-）バッファー（和光純薬工業（株）製）で洗浄し、この洗浄液もまとめたチューブに加えた。以上のように培養物を集約したチューブを、室温にて、5,000rpm（遠心機名：KUBOTA3740、ローター番号KUBOTA AF2018、久保田商事（株）製）で５分間遠心した。【０１４２】
その後、(i)上清を捨て、沈殿したペレットに、ＰＢＳ（-）バッファーを３ml加えて、(ii)よく攪拌した後、5,000 rpmで５分間遠心した。上記の(i)と(ii)とを２回繰り返した。沈殿したペレットに、B-PER Lysis Buffer（Reagent社製）を４mL加え、蓋を締めて室温にて一晩シェーカーで攪拌した。【０１４３】
（８−３）His-tagによる精製
Ni-NTA Agarose（QlAGEN社製）を15mLチューブに２mLとり、(i)1,000rpmで１分間遠心し、(ii)上清を捨てて、１×ＰＢＳバッファーを1mL加えてよく攪拌した。上記(i)と(ii)とを３回繰り返し、Ni-NTA樹脂を調製した。【０１４４】
上記B-PER Lysis Buffer溶液が入ったチューブを、12,000rpmで10分間、室温にて遠心した後、上清を15mLのファルコンチューブに移した。ここに、よく撹拌した上記Ni-NTA樹脂400μLを加え、回転シェーカーで10分間、室温にて攪拌した。その後、1,000rpmで１分間、室温にて遠心し、上清を捨てた。ここに、(iii)１×ＰＢＳバッファーを４mL加えてよく攪拌し、(iv)1,000rpmで１分間、室温にて遠心し、上清を捨てた。(iii)と(iv)とを２回繰り返した。【０１４５】
その後、(v)20ｍMのイミダゾール（和光純薬工業（株）製）を４mL加えてよく攪拌し、(vi)1,000rpmで１分間、室温にて遠心し、上清を捨てた。(v)と(vi)とを２回繰り返した。ここに、250ｍMのイミダゾールを500μL加え、回転シェーカーで10分間、室温にて攪拌した。その後、1,000rpmで１分間遠心し、緑色蛍光を発している上清を、新しい15mLのファルコンチューブに入れ、次のゲルろ過用タンパク質精製溶液とした。【０１４６】
（８−４）ゲルろ過による精製
上記タンパク質精製溶液中のイミダゾールとPBSバッファーとを置換し、精製して目的の標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質を得た。以上の操作では、GEヘルスケア・ジャパン株式会社のNAP5カラムを使用し、製品に添付の説明書に従って精製を行った。【０１４７】
（９）標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質の選択
上記精製作業で得られた標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質濃度の吸光度（280nm）、及び発色団濃度（形成能）の吸光度（488nm）を常法に従って計測し、A488/A280の値が1.5を超えたものを、目的の標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質として選択した。結果を表１２に示した。【０１４８】
【表１２】
2017094792.tif 000022
【０１４９】
（実施例３）標的ペプチド配列結合シェル（蛍光タンパク質会合駆動型ミセル）の作製
タンパク質としてＧＦＰに代えて、実施例２で調製した標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質を用いて、実施例１と同様にして、標的ペプチド配列が結合したミセル（蛍光タンパク質会合駆動型ミセル）を作成した。【０１５０】
（１）発光特性
上記作製した標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質会合駆動型ミセルの発光特性を、実施例１と同様にして測定した（図１０参照）。図１０の凡例中、反応物は、シロールデンドリマーと標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質が結合した複合体を、未反応物は、それらが結合していない状態のものを示し、各数値は励起光の波長（nm）を示す。標的ペプチド配列結合ミセルでも、実施例１と同様に、510nm付近に発光のピークが観察された。【０１５１】
（２）粒子特性
上記標的ペプチド配列結合リポソーム又はミセルの粒子特性を、実施例１と同様に動的光散乱法により測定した（図１１参照）。図１１中、横軸は得られたミセルの粒径を、縦軸は各横軸に示すサイズのミセルの全体に占める％を表す。その結果、実施例１と同様に、およそ100nm〜200nmの粒子径を有する粒子が確認された。
以上から、標的ペプチド配列を有する蛍光タンパク質結合ミセルも、標的配列を有しないそれと同等のミセルを形成することが示された。さらに、実施例１で得られたミセルも、本実施例で得られたミセルのいずれもが、蛍光タンパク質の会合によって形成される、蛍光タンパク質会合駆動型ミセルであると推定された。【０１５２】
（実施例４）ＤＤＳミセル・リポソーム（ベジクル）形態判定実験
（１）基本リポソーム又はミセルの作製
リポソーム又はミセルを以下のようにして作製した。まず、GFP含有溶液を、10K アミコンフィルタ（Amicon社製）を用いて、14,000 ｘ gで15分間遠心して濃縮し、1 x PBSを加えて99μLにメスアップした。20μMのGFP含有溶液を使用して、50μM/50μLのミセルを作製するために、137.5μLのGFPを濃縮した。【０１５３】
次いで、この溶液に1μLの100 mMのDTTを加え、室温にて10分間インキュベーションした。インキュベートした溶液の全量をNICKカラム（GEヘルスケアジャパン社製）にアプライし、365μLの1 x PBSを加えた。さらに、380μLの1 ｘ PBSを加えて、ほぼ全量を回収した。【０１５４】
次いで、回収した溶液中に含まれるGFPに対して、7.78mMのTPS（2，3，4，5−テトラフェニル−1，1−ジメチルシロール）を、モル比で1:10になるように3.53μL加え、37℃にて終夜、溶液中の分子を凝集させた。
次いで、終夜で凝集させた約380μLの溶液全量を100 Kアミコンフィルタに入れ、14,000 x gで10分間遠心して濃縮し、約30μLをカラム上液として取った。ここに100μLの1 x PBSを加えて14,000 x gで10分間遠心して洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返し、洗浄液約300μLを集めた。【０１５５】
14,000 x gで10分間の遠心後、カラムを逆さまにして卓上遠心機にてカラムの上液を回収した。空になったカラムに適量の1 x PBSを加え、目的としていた体積の1.2倍となるように1 x PBSでメスアップした。４℃にて１日置いて平衡化し、20倍に希釈して粒度を測定した。また、蛍光測定は島津:RF5300-PCを用いて、励起波長370nm、測定波長488nmとし、80倍希釈のサンプルを測定した（レンジは3 x 5）。【０１５６】
また、100 Kアミコンフィルタに入れて14,000 x gで10分間遠心した後の溶液のうち、約350μLをカラム下液とした。上記の洗浄液を合わせて650μLとし、20倍に希釈して、粒度を測定した。また、蛍光測定は、励起波長370nm、測定波長488nmとし、25倍希釈のサンプルを測定した（レンジは3 x 5）。ここで得られた未標的型リポソーム又はミセルを、NSS25及びNSS26と命名した。【０１５７】
（２）電子顕微鏡による判定結果
低温低真空走査型電子顕微鏡（（株）日立ハイテクノロジーズ製、カタログ番号  S-3400N）を用いて、リポソーム又はミセルの判別を行ったところ、概ね観察された分子はリポソーム（ベジクル）であった。液体窒素雰囲気下で切片の観察を行なった。【０１５８】
この電子顕微鏡では、入射電子ビームの反射電子像をBSE像として、また虹電子像をSE像として得た。また、X線による元素分析も同時に行った。BSE像を図１２(A)〜(C)に示した。低解像度の走査型電子顕微鏡画像では主にベジクル型様分子が多く観察された。その一部に元素分析を行ったところケイ素が検出された分子もあった（図１２参照）。【０１５９】
（実施例５）リポソーム（ベジクル）或はミセルの濃度依存的安定性試験
（１）試料ミセル（標的結合部位を有するミセル）の作製
50μM x 50μL分の試料ミセルを、以下のようにして作製した。基本ミセルとして、上記実施例（X1）で作製した未標的型ミセル（NSS25及びNSS26）を、それぞれ16.1μM及び31.6μM使用した。標的認識部位としてMCF7の配列を含む標的型ミセル（配列表の配列番号12及び13）を11.3μM使用した。【０１６０】
上記の各リポソーム又はミセルを含むミセル溶液を、それぞれAmicon 10Kフィルタに入れ、14,000 x g で15分間遠心し、上清をそれぞれ回収した。各ミセル溶液を1 x PBSで99μLにメスアップし、1 mMのDTTを1μL加えて10分間室温にて静置した。
ついで、各リポソーム又はミセル溶液をNICKカラムで処理し、得られた各処理液にTPSを3.21μL加え、37℃で終夜置いた。【０１６１】
（２）リポソーム（ベジクル）或はミセルの濃度依存性の確認
上記（１）のようにして得た各ミセル溶液を、それぞれ380μLずつAmicon 100Kフィルタに入れ、14,000 x g で10分間遠心した。約350μLがフィルタを抜けて落ちるため、これを下液、フィルタ上に残った約30μLを上液とした。【０１６２】
上液をそのまま残し、ここに100μLの 1 x PBSを加えて、14,000 x g で10分間遠心し、フィルタを抜けた約100μLの溶液を回収した。この操作を３回繰り返して、得られた溶液を下液と合わせ、20倍希釈して基本ミセルと同様にDLS（粒度分布）を測定した。【０１６３】
上液を含むフィルタを卓上遠心機（久保田商事（株）製）にかけて、２〜３分間遠心して回収した。ついで、空になったフィルタに適量の1 x PBSを加えて10分間静置した。その後、このフィルタを逆さまにして卓上遠心機にかけて2〜3分間遠心し、フィルタ内の溶液を回収し、1 x PBSを加えて60μLにメスアップし、50μM/50μLの原液（1x）とした。【０１６４】
この原液を1 x PBSで5倍、10倍、及び50倍希釈し、平衡化するために室温にて1日置いた。その後、基本ミセルの場合と同様にして、粒度測定及び蛍光測定を行った。臨界ミセル濃度以上で作成されたミセルは、1ヶ月後でも安定に存在する可能性があることが示された。【０１６５】
（実施例６）ＤＤＳミセルの構成タンパク質物性確認試験
（１）タンパク質の精製
上記のミセルの構成タンパク質の物性を確認するために、Ni NTA Super flow（Qiagen社製）を用いて上記構成タンパク質を以下の手順で精製した。【０１６６】
（１−１）タンパク質の凝集分子からの溶出
まず、基本ミセル（50μM/50μL）を50μL取って50mLのファルコンチューブ（ファルコン社製）に入れ、20mMのイミダゾールで洗浄し、その後、250mMのイミダゾールを加えた。回転シェーカーで終夜反応させ、ミセルからタンパク質を溶出させた。このファルコンチューブをそのまま遠心機（久保田商事（株）製）にセットして、12,000rpmで10分間遠心し、得られた上清を15mLのファルコンチューブに移した。【０１６７】
（１−２）Ni NTA樹脂スラリーの調製
上記のようにファルコンチューブを遠心している間に、Ni NTA樹脂（Ni NTA Super flow中に含まれている）の準備を行なった。まず、Ni NTAアガロースを2.5mL取り、防腐剤を除去した。次いで、Ni NTAアガロースゲルを含むこの溶液を、よく振って均一に混合し、15mLのファルコンチューブに移した。【０１６８】
その後、卓上遠心機にて、1,000rpmで１分間遠心してゲルを沈殿させ、上清をピペットで除き、1 x PBSを1mL加えて振り混ぜ、ボルテックスした。この操作を３回繰り返した。３回目の遠心後に上清をピペットで除き、スラリーとした。使用する分以外は、４℃にて保存した。【０１６９】
（１−３）各タンパク質の精製
15mLのファルコンチューブ中の上記の構成タンパク質溶液中に、上記スラリーがチューブの内壁につかないように注意しながら、400μLを滴下した。その後、回転シェーカーにセットして最速にメモリを合わせて10分間反応させた。【０１７０】
ついで、回転シェーカーからチューブを外し、動物細胞用遠心機（タイテック（株）製）にて1,000prmで１分間遠心し、上清を捨てた。チューブの底に残っているペレットに1 x PBSを４mL加えてボルテックスし、上記遠心機を用いて1,000rpmで１分間遠心した。この操作を２回繰り返した。【０１７１】
得られたペレットに20 mMのイミダゾールを4 mL加えてボルテックスし、上記遠心機を用いて1,000 rpmで1分間遠心した。この操作を2回繰り返した。次いで、得られたペレットに250 mMのイミダゾールを500μL加え、回転シェーカーにセットして最速にメモリを合わせて10分間反応させた。ついで、回転シェーカーからチューブを外し、上記動物細胞用遠心機にて1,000 rpmで1分間遠心し、上記の新しい15 mLのファルコンチューブに移した。【０１７２】
古いチューブに残ったペレットに250mMのイミダゾールを再度加え、回転シェーカーにセットして最速にメモリを合わせて５分間反応させた。ついで、回転シェーカーからチューブを外し、上記動物細胞用遠心機にて1,000rpmで１分間遠心し、上清をとって先ほどの上清と合わせた。この操作を５回繰り返した。【０１７３】
（１−４）ゲル電気泳動
以上のようにして精製した各タンパク質（GFP）についてゲル電気泳動を以下のようにして行った。
まず、5μMの各タンパク質を含む溶液を約10μLずつ準備し、1.5mLの蓋付きチューブに入れた。分子量マーカー（ラダー）として、Precision Protein Standards Prestained Broad Range（BioRad社製）も10μLを取って、同様に1.5mLチューブに入れた。下記表１３に示す組成のランニングゲル（12％）及び表１４に示す組成のスタッキングゲル（4％）を調製した。【０１７４】
【表１３】
2017094792.tif 000023
【０１７５】
【表１４】
2017094792.tif 000024
【０１７６】
各精製タンパク質溶液及び分子量マーカーをアプライし、200V、20mAで60分、泳動させ、その後、さらに75分泳動させた。また、以下の表１５に示す組成を有する泳動バッファーを使用した。【０１７７】
【表１５】
2017094792.tif 000025
【０１７８】
結果を図19に示す。ゲル電気泳動結果から、標的タイプ２型（MCF7-2）は、カルボシランデンドリマーで構成される籠状の構造がタイトになっているため、蛍光強度は強いが標的性が低いことが明らかになった。また、タイプ１強化型（MCF7-1＋αスタンド）では、上記の籠状の構造が緩く、標的性は高いが蛍光が弱いことが明らかになった。以上から、籠状構造の締まり方と、標的認識部位の構造とが重要であることが示された。【０１７９】
（実施例７）ＤＤＳリポソーム又はミセルへの薬剤内包実験
内包させる薬剤として、Orange OTを使用した。80μMのGFP含有溶液を使用し、7.78mMのTPSを10.28μL炭化した以外は、上記基本ミセルの作製工程と同じ手順でミセル溶液を調製した。ついで、Orenge OT（8mMのOrange OTのストック溶液）を、GFPに対して、モル比（終濃度）で1:1となるよう1μL加えた。次いで、DiI282（400μMのDiI282のストック溶液）を、GFPに対して、モル比（終濃度）で20:1になるよう加え、37℃にて終夜で取り込ませた。【０１８０】
次いで、カラムの上液を、目的としていた体積の1.2倍となるように1ｘPBSでメスアップした後に、PVDFフィルタ（孔径0.45μm又は0.22μm）に通す点を除いて、基本ミセルの作製と同じ手順で処理して回収し、同じ希釈倍率で、粒度及び蛍光測定を行った。
上液については、基本リポソーム又はミセルの作製と同じ手順で処理し、同じ希釈倍率で、粒度及び蛍光測定を行った。薬剤の内包は疎水性、親水性物質ともに可能と思われるがミセル形成条件の最適化が各々必要であると考えられた。【０１８１】
（実施例８）ＤＤＳリポソーム又はミセルの細胞取込み実験
（１）実験方法
コンフレントになっているMCS7細胞を、0.25％のtrypsin溶液にて剥がし、細胞懸濁液（1 x 109個/mL）を調製した。この細胞懸濁液を、3mLずつ、５枚のコラーゲンコードディッシュ（MatTek社製）又はポリ-d-リジンディッシュ（MatTek社製）に播種した。【０１８２】
細胞がウェルの底面に付着した後に、各ウェルから培地をピペットで除き、適当量のDMEM(+)を加えて付着細胞は剥がさないように洗浄する操作を３回繰り返した。【０１８３】
３時間及び24時間観察用のコラーゲンコートディッシュの各ウェルに、450μLのDMEM(+)を加えた。次いで、陰性対照のウェルに、1 x PBSを50μL加えた。7.3μLのタイプ１強化型のストック溶液に42.7μLの1 x PBSを加えて50μLとしたサンプル１を、ディッシュ２枚の各ウェルに加えた。また、8.4μLの未標的型のストック溶液に41.6μLの1 x PBSを加えたサンプル２を別の２枚のディッシュに加えた。【０１８４】
ポリ-d-リジンディッシュの陰性対照のウェルにも、1 x PBSを50μL加えた。また、24時間観察用の1枚のディッシュに、8.1μLの未標的型（NSS26）のストック溶液に41.9μLの1 x PBSを加えたサンプル2を加えた。直後に写真撮影を行ない、37℃にて5％CO2の存在下にて、３時間又は24時間の培養を行なった。培養終了後に、1mLのDMEM(+)を加えて細胞を洗浄した。この操作を３回繰り返した。【０１８５】
（２）共焦点顕微鏡FV-100（Olympus社製  FV 1000D）による観察結果
DAPIについては405nmのレーザーで励起し、460nmの発光を観察して、デンドリマーの部分を観察した。また、GFP部分は515〜520nmの発光を観察した。観察結果を図２０Ａ〜２０Ｃに示す。３時間の結果（図２０Ｃ上段）と24時間の観察結果（図２０Ｃ下段）とを比較したところ、24時間でも、標的性を持たせたミセルの方が、標的細胞に正しく取り込まれているように思われた（図１６〜１８参照）。【０１８６】
（３）解析方法
解析ソフトにはImage Jを用いた。それぞれのエリアの蛍光強度を数値化し、ミセルの蛍光強度と蛍光タンパク質の蛍光強度の比率より、ミセルの崩壊、蛍光タンパク質の残存を確認するに至った。【０１８７】
FACSに計測に関して解析用ソフトウェアとしてFlowJoを使用した。解析に当たっては、細胞のみのデータを使用し、自家蛍光している細胞集団を選択した。また、全てのデータから自家蛍光している細胞集団を差し引いた。結果を図１３〜１５に示した。図中に示した数字は、自家蛍光を差し引いた残りの細胞数/全測定細胞数である。下記の表１６に、自家蛍光の細胞集団を５通り判定しその平均を示した。【０１８８】
【表１６】
2017094792.tif 000026
【０１８９】
以上より、細胞のコンディションが良ければ標的化されること、及び、長時間の細胞へのミセルの接触は未標的ミセルも一般的なエンドサイトーシスにて大量に取り込まれることが示された。ただし、標的化型のミセルの方が非標的化型のものよりも速く取込まれる可能性がある。また、取り込まれたミセルは細胞内で壊れ得ると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０１９０】
本願発明は、医薬製剤分野、特に薬剤送達の分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１９１】
配列番号１：ＧＦＰに組み込む標的認識配列ペプチド（MCF7-1）
配列番号２：ＧＦＰに組み込む標的認識配列ペプチド（MCF7-2）
配列番号３：ＧＦＰに組み込む標的認識配列ペプチド（MCF7-1＋αスタンド）
配列番号４：MCF7-1を組み込んだＧＦＰ
配列番号５：MCF7-2を組み込んだＧＦＰ
配列番号６：MCF7-1＋αスタンドを組み込んだＧＦＰ
配列番号７：ＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号８：ＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号９：ＢＦＰのアミノ酸配列
配列番号１０：ＹＦＰのアミノ酸配列
配列番号１１：イソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２：ＭＣＦ７−１の増幅用フォワードプライマー
配列番号１３：ＭＣＦ７−１の増幅用リバースプライマー
配列番号１４：ＭＣＦ７−２増幅用フォワードプライマー
配列番号１５：ＭＣＦ７−２増幅用リバースプライマー
配列番号１６：MCF7-1＋αスタンド増幅用フォワードプライマー
配列番号１７：MCF7-1＋αスタンド増幅用リバースプライマー
配列番号１８：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１９：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号２０：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２１：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号２２：オリゴヌクレオチド
配列番号２３：オリゴヌクレオチド
配列番号２４：オリゴヌクレオチド
配列番号２５：オリゴヌクレオチド
配列番号２６：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２７：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号２８：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号２９：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号３０：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号３１：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号３２：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号３３：インバースＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号３４：インバースＰＣＲ用フォワードプライマー
【図１】
2017094792.tif 000032
【図２】
2017094792.tif 000033
【図３】
2017094792.tif 000034
【図４】
2017094792.tif 000035
【図５】
2017094792.tif 000036
【図６】
2017094792.tif 000037
【図７】
2017094792.tif 000038
【図８】
2017094792.tif 000039
【図９】
2017094792.tif 000040
【図１０】
2017094792.tif 000041
【図１１】
2017094792.tif 000042
【図１２】
2017094792.tif 000043
【図１３】
2017094792.tif 000044
【図１４】
2017094792.tif 000045
【図１５】
2017094792.tif 000046
【図１６】
2017094792.tif 000047
【図１７】
2017094792.tif 000048
【図１８】
2017094792.tif 000049
【図１９】
2017094792.tif 000050
【図２０Ａ】
2017094792.tif 000051
【図２０Ｂ】
2017094792.tif 000052
【図２０Ｃ】
2017094792.tif 000053
【配列表】
2017094792000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月29日(2017.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される凝集性分子を有し、分子量２０万以下のタンパク質、核酸、疎水性分子からなる群から選ばれるいずれかの分子を内包し得る、ドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
【化１】
2017094792.tif 000054
（式中、Ｙは、臭素原子、又はイオウ原子と前記イオウ原子を介して結合される標的配列提示部を表す。ここで、前記標的配列提示部は、標的組織に送達されるための標的認識部位を有するタンパク質又はペプチドで構成されており、標的タンパク質と前記標的認識部位との結合体が細胞内へのエンドサイトーシスを促進する。なお、Ｙがすべて同時に臭素原子となることはない。）
【請求項２】
水性溶媒中で前記凝集性分子が凝集して形成され、５０〜５００ｎｍの直径を有する、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
前記ペプチドは、前記標的組織に発現されている、表面抗原、受容体、ゲート、トランスポーター及びチャンネルからなる群から選ばれるいずれかの標的タンパク質と特異的に結合し、前記標的タンパク質と前記ペプチドの結合体が細胞内へのエンドサイトーシスを促進するものであることを特徴とする、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
【請求項５】
前記ペプチドは、配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれるいずれかに記載の配列を有するものであることを特徴とする、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
2017094792.tif 000055
【請求項６】
前記ペプチドは、配列表の配列番号４〜６からなる群から選ばれるいずれかに記載の配列を有するものであることを特徴とする、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
2017094792.tif 000056
【請求項７】
前記標的組織は、炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞を含む組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞で構成される組織、及び腫瘍細胞で構成された組織からなる群から選ばれるいずれかの組織であることを特徴とする、請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
【請求項８】
前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（ＩＩ）〜（Ｖ）からなる群から選ばれるいずれかの構造を有する分子で表されるものであることを特徴とする請求項１に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル：
式中、ＴＳＰＰは、標的認識部位を有する蛍光タンパク質を表す。
【化２】
2017094792.tif 000057
【化３】
2017094792.tif 000058
【化４】
2017094792.tif 000059
【化５】
2017094792.tif 000060
【請求項９】
前記蛍光タンパク質は、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項８に記載のドラッグデリバリーシステム用標的型シェル。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
［００１９］
加えて、本発明の発明者らは、蛍光タンパク質を担持させたシロール含有デンドリマーが生理食塩水中で発光すること、及びその発光現象が、シロールと蛍光タンパク質との間における共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によるものであることをも見出した。
さらに、蛍光タンパク質を担持させたシロール含有カルボシランデンドリマーによって形成されるミセルの内径は、およそ５０ｎｍ〜５００ｎｍ程度であること、及びこのような内径を有するミセルには、その内部に生体高分子を含む種々の薬剤を内包させることが可能であることをも見出した。
［００２０］
また、生体は、一般的に、エンドサイトーシスによって、上記のようなミセルが細胞内に取り込んで破壊することが知られている。本発明の発明者等は、標的組織結合配列を組み込むことにより、標的組織に対して特異的な送達が可能となることを見出した。
［００２１］
本発明は、以上のような状況の下で完成されたものであり、種々の分子量の化合物や生体高分子を取り込むことができ、生体内で安定性が高く、かつ、標的組織への有効成分の送達を可能とする、ドラッグデリバリーシステム用標的型シェルを提供することを目的とする。
［００２２］
本発明は、以下の態様を含むものである。本発明の一の実施態様においては、本発明は、下記式（Ｉ）で表される凝集性分子を有し、分子量２０万以下のタンパク質、核酸、疎水性分子からなる群から選ばれるいずれかの分子を内包し得る、ドラッグデリバリーシステム用標的型シェルである。
［００２３］
［化１］
2017094792.tif 000061
（式中、Ｙは、臭素原子、又はイオウ原子と前記イオウ原子を介して結合される標的配列提示部を表す。ここで、前記標的配列提示部は、標的組織に送達されるための標的認識部位を有するタンパク質又はペプチドで構成されており、標的タンパク質と前記標的認識部位との結合体が細胞内へのエンドサイトーシスを促進する。なお、Ｙがすべて同時に臭素原子となることはない。）
［００２４］
上記のシェルは、水性溶媒中で前記凝集性分子が凝集して形成され、５０〜５００ｎｍの直径を有することが好ま
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
2017094792.tif 000062
［００３１］
ここで、前記標的組織は、炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞を含む組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞で構成される組織、及び腫瘍細胞で構成された組織からなる群から選ばれるいずれかの組織であることが好ましい。
［００３２］
ここで、前記炎症を起こしている正常組織としては、自己免疫疾患として顕著な特徴を有する組織等を挙げることができる。また、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞を含む組織としては、ＳＮＰ解析により病態と一塩基置換等遺伝子変異との関連が明らかな組織等を挙げることができる。好ましくない遺伝子発現の見られる細胞としては、前述の好ましくない遺伝子発現の見られる組織由来の細胞等を挙げることができる。さらに、腫瘍細胞で構成された組織としては、乳癌組織、肺癌組織、肝癌組織、子宮頸癌組織等を挙げることができる。以上のような標的認識部位としては、配列表の配列番号１〜３を挙げることができ、標的提示部としては、配列表の配列番号７〜１１に示すアミノ酸配列を挙げることができる。
［００３３］
また、前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（ＩＩ）〜（Ｖ）からなる群から選ばれるいずれかの構造を有する分子で表されるものであることが好ましく、下記式中、ＴＳＰＰは標的認識部位を有する蛍光タンパク質である。
［００３４］
［化２］
2017094792.tif 000063
［００３５］
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
開始後３時間、下段は２４時間の蛍光顕微鏡像である。
［００５１］
［図２０Ｂ］図２０Ｂは、ポリ−ｄ−リジンコートディッシュ又はコラーゲンコートディッシュ中で、ミセルなしで細胞を培養したときの状態を示す光学顕微鏡像である。
［図２０Ｃ］図２０Ｃは、コラーゲンコートディッシュで培養した標的細胞中への標的タイプ１型ミセルの取り込みを示す蛍光顕微鏡像である。上段は取込み実験の開始後３時間、下段は２４時間の蛍光顕微鏡像である。
発明を実施するための形態
［００５２］
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。本発明は、上述した通りの下記式（Ｉ）で表される凝集性分子を有し、分子量２０万以下のタンパク質、核酸、疎水性分子からなる群から選ばれるいずれかの分子を内包し得る、ドラッグデリバリーシステム用標的型シェルである。
［００５３］
［化６］
2017094792.tif 000064
（式中、Ｙは、臭素原子、又はイオウ原子と前記イオウ原子を介して結合される標的配列提示部を表す。ここで、前記標的配列提示部は、標的組織に送達されるための標的認識部位を有するタンパク質又はペプチドで構成されており、標的タンパク質と前記標的認識部位との結合体が細胞内へのエンドサイトーシスを促進する。なお、Ｙがすべて同時に臭素原子となることはない。）
［００５４］
本発明で使用するカルボシランデンドリマー（以下、「シロールデンドリマー」ということがある。）は、以下の構造を有する化合物であることが、凝集性及び後述する標的配列提示部の双方の性質を備えるようにすることができることから、さらに好ましい。
［００５５］
一般的なカルボシランデンドリマーの構造を、図１のＡ〜Ｃに示す。図１のＡに示す化合物はファン（０）３と呼ばれるものであり、この化合物は、円で囲んだベンゼン環をコアとしている。図１のＢに示す化合物は、ダンベル（１）６と呼ばれるものであり、図１のＡに示す２分子のファン（０）３分子が、コアに代えて、２つのメチル基がついたケイ素（Ｍｅ−Ｓｉ−Ｍｅ）で結合されている。図１のＣに示す化合物は、ボール（１）６と呼ばれる化合物であり、ダンベルのＭｅ−
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
容易に実施することができる。
［００６０］
上記の標的配列提示部を構成するタンパク質は、会合する性質（以下、「会合性」ということがある。）を有するものであればよく、特に限定されないが、緑色蛍光タンパク質（以下、下記のような緑色以外の蛍光を発する蛍光タンパク質を集合的に「ＧＦＰ」ということがある。）及びその変異体を含む蛍光タンパク質を使用することが好ましい。こうした蛍光タンパク質が結合した上記カルボシランデンドリマーは、タンパク質が会合すると強い蛍光を発し、会合状態を容易に検出できるからである。
［００６１］
本発明において使用することができるＧＦＰとしては、例えば、配列表の配列番号７に示すＧＦＰ、配列番号８に示すＧＦＰ、配列表の配列番号９に示すＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、配列表の配列番号１０に示すＹＦＰ等のほか、クロンテック社から市販されているＣＦＰやＲＦＰその他のＧＦＰ誘導体を挙げることができる。これら以外にも、配列表の配列番号５に示すイソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質なども使用することができるが、配列表の配列番号７に示すＧＦＰが、蛍光の強さ及び扱いやすさから好適に使用することができる。さらには、ＭＢＬ社より市販のアザミグリーンやその他の色変異体も好適に使用可能であることは、構造上の特性から想定できる。
［００６２］
また、こうしたＧＦＰは、公知の方法（例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１６７９（２００４）２２２−２２９；  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３０（２００５）４５４−４６０等を参照されたい）を用いて産生してもよく、こうしたタンパク質の産生を受託生産する企業に依頼して作製したものを使用してもよい。
［００６３］
シロールその他のＡＩＥ効果を惹起する官能基を含む分子をデンドリマーの骨格として用い、標的配列提示部を蛍光タンパク質等の会合性タンパク質で構成した凝集性分子を作製し、これを用いてミセルを形成させると、シロール基が凝集した部分からも蛍光が生じ、蛍光タンパク質−シロール間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）が生じて、強い蛍光となる。そして、ミセルが崩壊するとＦＲＥＴは消失する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
［００６４］
このため、上述した凝集性分子を用いて作製したミセルを、薬剤送達のための担体として用いると、上記担体（ミセル）の生体内における状態を、ＦＲＥＴの変化を指標としてモニターすることができる。さらに、このようなモニターが可能となることによって、こうした担体の存在位置および存在状態を追跡することができる。
［００６５］
蛍光タンパク質とシロールデンドリマーとの間でＦＲＥＴを生じさせるには、標的配列提示部を構成する蛍光タンパク質のどの位置が、上記シロールデンドリマーに固定されるかが重要になってくる。デンドリマーと結合する上記蛍光タンパク質上の位置は、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる。上記標的配列提示部を構成する蛍光タンパク質としてＧＦＰを用いる場合には、Ｎ末端領域、Ｃ末端領域、Ｎ末端領域又はＣ末端領域のいずれかに隣接するループ領域と、デンドリマーとが結合することが望ましく、これらの領域中にチオール基を有するシステインなどのアミノ酸が存在していることが好ましい。
［００６６］
ここで、「Ｎ末端領域」での結合は、Ｎ末端近傍に存在する１０アミノ酸程度のコア部分から突出した部分と上記シロールデンドリマーとが結合した場合をいう。Ｃ末端領域との結合も同様に、Ｃ末端領域に存在する１０アミノ酸程度のコア部分から突出した部分と、上記シロールデンドリマーとが結合した場合をいう。
［００６７］
本発明のシロールデンドリマーに担持されるハロゲン基の位置は、特に限定されないが、上記シロールデンドリマーの側鎖に存在することが好ましい。より好ましくは、下記式（ＶＩ）に示すように、側鎖の末端（シロール基から最も遠い位置）に存在することがさらに好ましい。
［００６８］
上述したように、本発明の方法に使用されるシロールデンドリマーは、下記式（ＶＩ）で示す化合物であることが好ましい。この化合物は、例えば、後述するスキーム２に示すように、シロールコア２（１，１−ジアリール−２，３，４，５−テトラフェニルシロール）を、公知の中間体１８を経て、１，２−ジフェニルアセチレンから合成することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
［００６９］
次いで、触媒としてＨ２ＰｔＣｌ６・６Ｈ２Ｏを使用して、トリクロロシランで２のヒドロシル化を行い、アリールマグネシウムブロマイドを用いたグリニャール反応によって、シロールコアデンドリマー３を得ることができる。得られたデンドリマー３をジクロロヘキシルボランで処理し、その後アルカリ溶液中にて過酸化水素で加水分解し、ヘキサヒドロキシ誘導体４を得る。次いで、ヘキサヒドロキシ誘導体のＯ−メシル化を行なうことにより、臭素アニオンと置換し５を得ることができる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２００７  ４８：４３６５−４３６８）。
［００７０］
［化７］
2017094792.tif 000065
［００７１］
前記標的配列提示部を構成する標的認識部位を有するタンパク質は、会合をする性質を有するものであればよく、特に限定されない。しかし、前記タンパク質は、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることが好ましい。
［００７２］
入手が容易であり、また、蛍光タンパク質自体の蛍光強度が大きいことから、ＦＲＥＴによって強い蛍光が生じるためである。ここで、前記青色蛍光タンパク質は、ブルー又はシアンの蛍光を呈するものがいずれも含まれる。
［００７３］
本発明で利用する凝集性分子は、チオール基を有する上述したタンパク質（標的配列提示部）と、側鎖にハロゲン基を有するデンドリマー化合物（式（ＶＩ））とを混合し、インキュベートして、タンパク質のチオール基とデンドリマー化合物のハロゲン基とを反応させ、デンドリマー化合物にタンパク質を結合させる。このとき、タンパク質は、ＤＴＴなどの還元剤で予め処理をして、−ＳＨ基が酸化されていない状態にしておくことが望ましい。この反応で、１分子のＧＦＰが組み込まれた場合の反応を、スキーム２に示す。
［００７４］
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
［化８］
2017094792.tif 000066
［００７５］
例えば、上記のスキーム２に示す反応は、適当な溶媒（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水など水溶性溶媒）中で行うことができる。この場合の反応条件は、使用するタンパク質によって異なるが、反応温度は、使用するタンパク質の変性温度を下回ってさえいればよく、例えば、０〜５０℃、好ましくは３０℃〜４５℃、より好ましくは３７℃程度とすることができる。ＧＦＰを用いると、４２℃までは、温度依存的に反応性を向上させることができることから、ＧＦＰを使用することがＤＤＳ用凝集性分子を作製する上では好適である。
［００７６］
また、反応時間は、反応温度によっても異なるが、例えば、１時間〜２４時間、好ましくは、１０時間〜１９時間、より好ましくは、１５時間〜１８時間程度とすることが好ましい。この程度の反応時間とすることにより、使用したチオール基を有するタンパク質が上記シロールデンドリマーに結合するとともに、リポソーム又はミセルが形成されるからである。
［００７７］
すなわち、タンパク質−デンドリマー複合体が形成されるにつれて、タンパク質（親水性部分）を水溶性溶媒側に、デンドリマーのコアの部分（疎水性部分）を疎水性部分同士で会合する様な構造を有するようにしたリポソーム又はミセルが形成される。すなわち、上記のような会合性のタンパク質をデンドリマーの側鎖に結合させることにより、タンパク質の会合が駆動力となってリポソーム又はミセルが形成されていくものと考えられる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
［００７８］
ここで、上記シロールデンドリマーには、少なくとも１個以上のタンパク質が、側鎖末端のハロゲン原子と置換されて結合する。このため、上記の反応で得られるドラッグデリバリーシステム用標的型シェルは、上述した化学式（ＩＩ）〜（Ｖ）で表される結合体の混合物として得られることになる。
［００７９］
チオール基を有するタンパク質が蛍光タンパク質である場合には、こうしたタンパク質とデンドリマーとの混合比（モル比）は、タンパク質を１として、デンドリマーが例えば、１〜２０とすることができ、好ましくは、１：５〜１：１５、より好ましくは、１：１０程度である。ただし、この比率は濃度に依存して最適な値が変動する。
［００８０］
また、上記の反応を行なう際には、標的配列提示部であるタンパク質に、標的認識部位となるアミノ酸配列を組み込んでおくことが、後述するＤＤＳでの効率のよい送達を実現する上で好ましい。こうした標的認識部位の組み込みは、インバースＰＣＲによって簡便に行うことが好ましい。こうして作製された変異体をコードしたプラスミドを大腸菌に組み込んで発現させれば容易に変異体タンパク質を得る事ができ、ＤＤＳ用凝集性分子を得ることができるからである。
［００８１］
上記のような標的認識部位を標的配列提示部であるタンパク質に組み込んでおくことにより、前記炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる組織、腫瘍細胞で構成された組織等に、特異的に、本発明のドラッグデリバリーシステム用標的型シェルに内包された所望の薬剤を、活性を維持したまま送達することができる。
［００８２］
上記のような構造を有するドラッグデリバリーシステム用標的型シェルを作製し、これに所望の薬剤を内胞させることにより、薬剤の有効性を維持しつつ、標的組織に対して特異的にこうした薬剤を送達することができる。
実施例
［００８３］
以下の実施例は、あくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
（実施例１）ＤＤＳ用凝集性分子及びミセルの作製
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
）により測定した。結果を表１に示す。
［００８８］
［表１］
2017094792.tif 000067
［００８９］
また、上記反応液を、２５℃にてＺＥＴＡＳＩＺＥＲ  ＮＡＮＯ−Ｓ（マルバーン社製）を用いて、レーザー光の波長を５３２ｎｍとして、粒径を測定した。結果を図３に示す。図３（Ａ）はＧＦＰのみでインキュベートし、得られた産物の粒径分布を調べた結果である。図３（Ｂ）は式（ＶＩ）のシロールデンドリマーのみでインキュベートし、得られた産物の粒径分布を調べた結果である。図３（Ｃ）はＧＦＰと式（ＶＩ）のシロールデンドリマーとを混合してインキュベートし、得られた産物の粒径分布を調べた結果である。横軸は得られた産物の粒径を、縦軸は横軸に示すサイズの産物の全体に占める％を表す。
［００９０］
ＧＦＰと上記シロールデンドリマーとをインキュベートした場合（上記表１中、「ＧＦＰ−Ｓｉｌｏｌｅ  ｏｎｌｙ」と表示。）には、得られたミセルの粒径はおよそ１５０ｎｍであった。これに対し、ＧＦＰのみをインキュベートした場合に観察された粒径はおよそ４ｎｍ、上記シロールデンドリマーのみでインキュベートした場合に観察された粒径はおよそ６５０ｎｍであった。上記シロールデンドリマーのみでインキュベートした場合に観察された粒径がこのように大きくなったのは、おそらく、シロールデンドリマー同士で凝集し、大きな凝集体が形成されたためと考えられた。
［００９１］
次に、得られたミセルの粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）で観察したところ、粒子径がおよそ１００〜５００ｎｍの多数の粒子と、粒子径が５００ｎｍ程度の少数の粒子とが確認された（図４参照）。
［００９２］
以上の結果から、上述したＤＤＳ用凝集性分子を用いて形成されたミセル
【国際調査報告】
2017094792.tif 000068
2017094792.tif 000069
2017094792.tif 000070
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