(57)【要約】  本発明の目的は、新たな心不全を治療又は予防するための医薬組成物を提供することである。本発明の他の目的は、心不全を治療又は予防するための医薬組成物に用いることができるｓｉＲＮＡ及び該ｓｉＲＮＡを発現するベクターを提供することである。本発明により、心不全を治療又は予防するための医薬組成物であって、アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）のｍＲＡＮ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクター、及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。
2017078100.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心不全を治療又は予防するための医薬組成物であって、アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクター、及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物、
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡは、動物細胞に形質導入されると、細胞におけるアンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。
【請求項２】
前記ＤＮＡ配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列（ヘアピン配列）からなるヘアピン型ＲＮＡをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内ＲＮａｓｅであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡが形成される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記センス鎖配列が、下記の配列番号２〜配列番号８のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、請求項１又は２に記載の医薬組成物、
配列番号２：ＧＧＡＡＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＡＡＵＡ
配列番号３：ＧＡＧＡＧＵＵＣＡＵＵＵＡＣＣＵＡＡＡ
配列番号４：ＧＧＣＵＣＵＵＡＣＵＣＡＣＵＣＡＡＧＡ
配列番号５：ＧＧＣＡＵＵＧＵＧＡＧＣＧＡＧＧＵＧＡ
配列番号６：ＧＣＣＡＵＵＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＵＡ
配列番号７：ＧＵＵＵＣＣＧＣＣＵＧＧＡＡＣＣＵＧＡ
配列番号８：ＧＡＡＡＣＵＧＵＧＣＣＣＡＣＵＡＣＣＡ。
【請求項４】
前記ＤＮＡ配列が、下記の配列番号９〜配列番号１５のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物、
配列番号９：ＧＧＡＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＡＡＴＡ
配列番号１０：ＧＡＧＡＧＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＴＡＡＡ
配列番号１１：ＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＧＡ
配列番号１２：ＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＡ
配列番号１３：ＧＣＣＡＴＴＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＴＡ
配列番号１４：ＧＴＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡ
配列番号１５：ＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡ。
【請求項５】
前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、請求項１〜４のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターＡＡＶ６ベクターである請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
心不全を治療又は予防するための医薬組成物であって、アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡ、及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物、
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡは、動物細胞に形質導入されると、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。
【請求項９】
前記センス鎖配列が、下記の配列番号２〜配列番号８のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む請求項８に記載の医薬組成物、
配列番号２：ＧＧＡＡＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＡＡＵＡ
配列番号３：ＧＡＧＡＧＵＵＣＡＵＵＵＡＣＣＵＡＡＡ
配列番号４：ＧＧＣＵＣＵＵＡＣＵＣＡＣＵＣＡＡＧＡ
配列番号５：ＧＧＣＡＵＵＧＵＧＡＧＣＧＡＧＧＵＧＡ
配列番号６：ＧＣＣＡＵＵＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＵＡ
配列番号７：ＧＵＵＵＣＣＧＣＣＵＧＧＡＡＣＣＵＧＡ
配列番号８：ＧＡＡＡＣＵＧＵＧＣＣＣＡＣＵＡＣＣＡ。
【請求項１０】
アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターを含む、動物細胞でのアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤、
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡは、動物細胞（好ましくは、ヒト細胞）に形質導入されると、細胞におけるアンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列（ヘアピン配列）からなるヘアピン型ＲＮＡをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内ＲＮａｓｅであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡが形成される、請求項１０に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤。
【請求項１２】
前記センス鎖配列が、下記の配列番号２〜配列番号８のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、請求項１０又は１１に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤、
配列番号２：ＧＧＡＡＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＡＡＵＡ
配列番号３：ＧＡＧＡＧＵＵＣＡＵＵＵＡＣＣＵＡＡＡ
配列番号４：ＧＧＣＵＣＵＵＡＣＵＣＡＣＵＣＡＡＧＡ
配列番号５：ＧＧＣＡＵＵＧＵＧＡＧＣＧＡＧＧＵＧＡ
配列番号６：ＧＣＣＡＵＵＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＵＡ
配列番号７：ＧＵＵＵＣＣＧＣＣＵＧＧＡＡＣＣＵＧＡ
配列番号８：ＧＡＡＡＣＵＧＵＧＣＣＣＡＣＵＡＣＣＡ。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ配列が、下記の配列番号９〜配列番号１５のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、請求項１０又は１１に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤、
配列番号９：ＧＧＡＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＡＡＴＡ
配列番号１０：ＧＡＧＡＧＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＴＡＡＡ
配列番号１１：ＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＧＡ
配列番号１２：ＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＡ
配列番号１３：ＧＣＣＡＴＴＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＴＡ
配列番号１４：ＧＴＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡ
配列番号１５：ＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡ。
【請求項１４】
前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、請求項１０〜１３のいずれか一つに記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤。
【請求項１５】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである請求項１４に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤。
【請求項１６】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターＡＡＶ６ベクターである請求項１５に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤。
【請求項１７】
対象であるヒト由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２の発現を測定することにより、該対象が請求項１〜９のいずれか一つに記載の医薬組成物による心不全の治療又は予防が必要であるか否かを判定する方法。
【請求項１８】
前記血液が拡張型心筋症（ＤＣＭ）患者由来の血液である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記血液が拡張型心筋症患者の大動脈基部（Ａｏ）及び冠状静脈洞（ＣＳ）の血液である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
冠状静脈洞（ＣＳ）の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２の発現レベルが、大動脈基部（Ａｏ）の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、心不全の治療又は予防が必要であると判定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
冠状静脈洞（ＣＳ）の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２の発現レベルが、大動脈基部（Ａｏ）の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、請求項１〜８のいずれか一つに記載の医薬組成物を投与する対象と判定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜９のいずれか一つに記載の医薬組成物が投与された対象由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２の発現を測定することにより、該対象において心不全の治療効果が得られているか否かを判定する方法。
【請求項２３】
前記血液が対象の冠状静脈洞（ＣＳ）の血液である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれか一つに記載の医薬組成物の投与前後のアンジオポエチン様タンパク質２の発現を測定する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象であるヒト由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２の発現を測定することにより、該対象が心不全に罹患しているか心不全を発症するリスクがあるかを判定する方法。
【請求項２６】
前記血液が大動脈基部（Ａｏ）及び／又は冠状静脈洞（ＣＳ）の血液である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
冠状静脈洞（ＣＳ）の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２の発現レベルが、大動脈基部（Ａｏ）の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、心不全に罹患しているまたは心不全を発症するリスクがあると判定する、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な心不全を治療又は予防するための医薬組成物に関する。本発明は特には、アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の遺伝子を分子標的とすることにより、心不全を治療又は予防するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会の到来に伴い、心不全患者数は増加し、一旦罹患すると生活の質を落とすなど健康長寿社会実現への大きな阻害要因となっており、医学的にも社会的にも大きな問題となっている。また、重症化した心不全は、補助人工心臓（ＶＡＤ）や、ペースメーカー挿入による心臓再同期療法（ＣＲＴ）など、侵襲的な治療法以外に有効な治療法はない。【０００３】
心肥大は、高血圧のような負荷が増加する状態における適応応答であり、しばしば心不全へと進む。心不全は、主要な死亡原因となっており、患者は、世界中で２３百万人以上である。心不全は、心機能異常が原因の、周辺の酸素の供給と需要の不均衡と定義できる。心筋収縮能の減少は、駆出率が減少した心不全（ＨＦｒＥＦ）を引き起こす。一方、駆出率が維持された心不全（ＨＦｐＥＦ）においては、症状にもかかわらず伸縮率は正常に見え、心不全は異常な拡張機能により引き起こされると考えられる。収縮及び弛緩のいずれも主要なエネルギー消費プロセスであり、心筋エネルギー代謝の異常はＨＦｒＥＦ及びＨＦｐＥＦのいずれでも起こると考えられる。しかしながら、心機能と心筋エネルギー代謝が、心不全の進展の間にどのようにして低下するかは明らかでない。【０００４】
心肥大は、心筋細胞肥大による心臓の質量の増大と定義され、負荷の増大に対する適応応答であり、そして、心機能を維持するための手段である。高血圧などの病的刺激は、肥大から、心臓線維症や胎児心臓遺伝子プログラムの再発現を伴う状態である心不全への移行を促進する。これとは対照的に、運動は、保存された心筋構造及びエネルギー代謝に特徴づけられる生理的肥大を誘導し、心不全から心臓を保護する。２つのタイプの肥大の機構的な違いは、まだ明らかでない。【０００５】
心不全において、心機能維持に重要なＳＥＲＣＡ２のタンパク発現量が低下していることが報告されている。そのため、現在心不全に対する治療法として、ＳＥＲＣＡ２のタンパク量を心臓で増加させることを目的に、生体において心筋にデリバリーできる手段としてアデノ随伴ウイルス６（ＡＡＶ６）を用いたＡＡＶ６−ＳＥＲＣＡ２遺伝子治療の臨床治験が行われており、心機能回復及び生命予後において良好な結果が報告されてきている。【０００６】
アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ，Angiopoietin-like protein）は、血管新生因子であるアンジオポエチンに構造上類似する分泌型タンパク質で、これまでに７種類のＡＮＧＰＴＬが同定されている。ＡＮＧＰＴＬ２は血管細胞や単球細胞に作用することが分かっているが、この他にもＡＮＧＰＴＬ３やＡＮＧＰＴＬ４は脂質代謝、ＡＧＦ（Angiopoietin-like growth factor）／ＡＮＧＰＴＬ６はエネルギーや糖の代謝おいて重要な役割を果たすことなどが分かっている。このようなＡＮＧＰＴＬファミリーの多様な生理学的作用は、メタボリックシンドロームなどの生活習慣病やがんの新しい治療標的として注目されている。最近では、肥満やインスリン抵抗性が強い状態、糖尿病患者、動脈硬化症患者で、血中のＡＮＧＰＴＬ２濃度が高くなることが報告されている。【０００７】
ＡＮＧＰＴＬ２については、肥満、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、及び癌の進行と関連した慢性炎症におけるその役割を同定した研究は報告されている（例えば、特許文献１、非特許文献１−８）。しかしながら、今日まで、心臓におけるシグナル伝達因子、アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の機能は不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１１-９３８９６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kadomatsu, T., et al. Trends Endocrinol Metab 25, 245-254 (2014).
【非特許文献２】Tabata, M., et al. Cell Metab 10, 178-188 (2009).
【非特許文献３】Tazume, H., et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 32, 1400-1409 (2012).
【非特許文献４】Tian, Z., et al. J Mol Cell Cardiol 57, 1-12 (2013).
【非特許文献５】Horio, E., et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 34, 790-800 (2014).
【非特許文献６】Aoi, J., et al. Cancer Res 71, 7502-7512 (2011).
【非特許文献７】Endo, M., et al. Cancer Res 72, 1784-1794 (2012).
【非特許文献８】Odagiri, H., et al. Sci Signal 7, ra7 (2014).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、新たな心不全を治療又は予防するための医薬組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、心不全を治療又は予防するための医薬組成物に用いることができるｓｉＲＮＡ及び該ｓｉＲＮＡを発現するベクターを提供することである。
本発明の他の目的はまた、本発明の医薬組成物を適用する対象を選択するための方法及び本発明の医薬組成物の効果を確認するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、心筋細胞及び微小血管内皮細胞など、心臓組織においてアンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）が発現しており、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）負荷マウス心肥大モデルや、横行大動脈縮窄圧負荷（ＴＡＣ）マウス心肥大・心不全モデルにおいてその発現が有意に増強していること、そして、ヒト心不全患者においても健常心に比較しその発現が増強していることを発見し、病的心でＡＮＧＰＴＬ２が何らかの役割を果たしていることを見いだした。そして、遺伝子改変マウスを作成し解析した結果、ＡＮＧＰＴＬ２過剰発現マウスは、心機能低下を示し、さらに心不全発症に感受性を示すことを確認した。また逆に、ＡＮＧＰＴＬ２欠損マウスでは、心機能増強、及び心不全発症に抵抗性を示し、ＡＮＧＰＴＬ２は、心機能に対して抑制的に機能し、病的心肥大、心不全発症に促進的に作用することを確認した。【００１２】
そして、詳細なメカニズム解析の結果、ＡＮＧＰＴＬ２は、病的心肥大形成時に発現が増強し、ＡＫＴの分解を促進することで心機能維持に重要なＳＥＲＣＡ２タンパク量を減少させ、さらに心エネルギー代謝経路に対して抑制的に作用すること、逆に、ＡＮＧＰＴＬ２発現抑制により、ＡＫＴの安定化を介したＳＥＲＣＡ２タンパク量の増加、及び心エネルギー代謝経路活性化をもたらし、心不全発症に拮抗的に作用することを見いだした。【００１３】
さらに、ラット新生児心筋培養及びヒトｉＰＳ由来心筋細胞を用いて、ＡＮＧＰＴＬ２に対するｓｉＲＮＡが、心筋細胞においてＡＮＧＰＴＬ２のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現量を有意に低下させ、ＡＫＴ−ＳＥＲＣＡ２経路の活性化、心エネルギー代謝経路活性化をもたらすことを確認した。【００１４】
そして、以上のことより、本発明者らは、ＡＮＧＰＴＬ２に対するｓｉＲＮＡを用いたＡＮＧＰＴＬ２の作用抑制が心不全に対する新たな治療及び予防のための医薬組成物になることを見いだし、本発明を完成させた。【００１５】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］心不全を治療又は予防するための医薬組成物であって、アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチド（好ましくは、１９〜２７、さらに好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチド）のセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクター、及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物、
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡは、動物細胞（好ましくは、ヒト細胞）に形質導入されると、細胞におけるアンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。
［２］前記ＤＮＡ配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列（ヘアピン配列）からなるヘアピン型ＲＮＡをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内ＲＮａｓｅであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡが形成される、上記［１］に記載の医薬組成物。
［３］前記センス鎖配列が、下記の配列番号２〜配列番号８のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、上記［１］又は［２］に記載の医薬組成物、
配列番号２：ＧＧＡＡＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＡＡＵＡ
配列番号３：ＧＡＧＡＧＵＵＣＡＵＵＵＡＣＣＵＡＡＡ
配列番号４：ＧＧＣＵＣＵＵＡＣＵＣＡＣＵＣＡＡＧＡ
配列番号５：ＧＧＣＡＵＵＧＵＧＡＧＣＧＡＧＧＵＧＡ
配列番号６：ＧＣＣＡＵＵＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＵＡ
配列番号７：ＧＵＵＵＣＣＧＣＣＵＧＧＡＡＣＣＵＧＡ
配列番号８：ＧＡＡＡＣＵＧＵＧＣＣＣＡＣＵＡＣＣＡ。
［４］前記ＤＮＡ配列が、下記の配列番号９〜配列番号１５のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、上記［１］又は［２］に記載の医薬組成物、
配列番号９：ＧＧＡＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＡＡＴＡ
配列番号１０：ＧＡＧＡＧＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＴＡＡＡ
配列番号１１：ＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＧＡ
配列番号１２：ＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＡ
配列番号１３：ＧＣＣＡＴＴＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＴＡ
配列番号１４：ＧＴＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡ
配列番号１５：ＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡ。
［５］前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、上記［１］〜［４］のいずれか一つに記載の医薬組成物。
［６］前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである上記［５］に記載の医薬組成物。
［７］前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターＡＡＶ６ベクターである上記［６］に記載の医薬組成物。【００１６】
［８］心不全を治療又は予防するための医薬組成物であって、アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチド（好ましくは、１９〜２７、さらに好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチド）のセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡ、及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物、
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡは、動物細胞（好ましくは、ヒト細胞）に形質導入されると、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。
［９］前記センス鎖配列が、下記の配列番号２〜配列番号８のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む上記［８］に記載の医薬組成物、
配列番号２：ＧＧＡＡＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＡＡＵＡ
配列番号３：ＧＡＧＡＧＵＵＣＡＵＵＵＡＣＣＵＡＡＡ
配列番号４：ＧＧＣＵＣＵＵＡＣＵＣＡＣＵＣＡＡＧＡ
配列番号５：ＧＧＣＡＵＵＧＵＧＡＧＣＧＡＧＧＵＧＡ
配列番号６：ＧＣＣＡＵＵＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＵＡ
配列番号７：ＧＵＵＵＣＣＧＣＣＵＧＧＡＡＣＣＵＧＡ
配列番号８：ＧＡＡＡＣＵＧＵＧＣＣＣＡＣＵＡＣＣＡ。【００１７】
［１０］アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチド（好ましくは、１９〜２７、さらに好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチド）のセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターを含む、動物細胞（好ましくは、ヒト細胞）でのアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤、
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡは、動物細胞（好ましくは、ヒト細胞）に形質導入されると、細胞におけるアンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。
［１１］前記ＤＮＡ配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列（ヘアピン配列）からなるヘアピン型ＲＮＡをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内ＲＮａｓｅであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡが形成される、上記［１０］に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤。
［１２］前記センス鎖配列が、下記の配列番号２〜配列番号８のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、上記［１０］又は［１１］に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤、
配列番号２：ＧＧＡＡＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＡＡＵＡ
配列番号３：ＧＡＧＡＧＵＵＣＡＵＵＵＡＣＣＵＡＡＡ
配列番号４：ＧＧＣＵＣＵＵＡＣＵＣＡＣＵＣＡＡＧＡ
配列番号５：ＧＧＣＡＵＵＧＵＧＡＧＣＧＡＧＧＵＧＡ
配列番号６：ＧＣＣＡＵＵＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＵＡ
配列番号７：ＧＵＵＵＣＣＧＣＣＵＧＧＡＡＣＣＵＧＡ
配列番号８：ＧＡＡＡＣＵＧＵＧＣＣＣＡＣＵＡＣＣＡ。
［１３］前記ＤＮＡ配列が、下記の配列番号９〜配列番号１５のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、上記［１０］又は［１１］に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤、
配列番号９：ＧＧＡＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＡＡＴＡ
配列番号１０：ＧＡＧＡＧＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＴＡＡＡ
配列番号１１：ＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＧＡ
配列番号１２：ＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＡ
配列番号１３：ＧＣＣＡＴＴＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＴＡ
配列番号１４：ＧＴＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡ
配列番号１５：ＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡ。
［１４］前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、上記［１０］〜［１３］のいずれか一つに記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤。
［１５］前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである上記［１４］に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤。
［１６］前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターＡＡＶ６ベクターである上記［１５］に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤。【００１８】
［１７］対象である哺乳動物（好ましくはヒト）由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の発現を測定することにより、該対象が上記［１］〜［９］のいずれか一つに記載の医薬組成物による心不全の治療又は予防が必要であるか否かを判定する方法。
［１８］前記血液が拡張型心筋症（ＤＣＭ）患者由来の血液である上記［１７］に記載の方法。
［１９］前記血液が拡張型心筋症患者の大動脈基部（Ａｏ）及び冠状静脈洞（ＣＳ）の血液である上記［１８］に記載の方法。
［２０］冠状静脈洞（ＣＳ）の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の発現レベルが、大動脈基部（Ａｏ）の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、心不全の治療又は予防が必要であると判定する、上記［１９］に記載の方法。
［２１］冠状静脈洞（ＣＳ）の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の発現レベルが、大動脈基部（Ａｏ）の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、上記［１］〜［９］のいずれか一つに記載の医薬組成物を投与する対象と判定する方法。
［２２］上記［１］〜［９］のいずれか一つに記載の医薬組成物が投与された対象由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の発現を測定することにより、該対象において心不全の治療効果が得られているか否かを判定する方法。
［２３］前記血液が対象の冠状静脈洞（ＣＳ）の血液である上記［２２］に記載の方法。
［２４］上記［１］〜［９］のいずれか一つに記載の医薬組成物の投与前後のアンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の発現を測定する上記［２３］に記載の方法。【００１９】
［２５］心不全を治療又は予防するための方法において、治療又は予防が必要な対象（好ましくは、ヒト）に、アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチド（好ましくは、１９〜２７、さらに好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチド）のセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターを投与して、対象の心不全を治療又は予防するのに有効な量の前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡを発現生成させ、該ｓｉＲＮＡは、該ｓｉＲＮＡが発現生成した細胞内におけるアンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする方法。
［２６］前記ＤＮＡ配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列（ヘアピン配列）からなるヘアピン型ＲＮＡをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内ＲＮaseであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡが形成される、上記［２５］に記載の心不全を治療又は予防するための方法。
［２７］前記センス鎖配列が、下記の配列番号２〜配列番号８のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、上記［２５］又は［２６］に記載の心不全を治療又は予防するための方法、
配列番号２：ＧＧＡＡＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＡＡＵＡ
配列番号３：ＧＡＧＡＧＵＵＣＡＵＵＵＡＣＣＵＡＡＡ
配列番号４：ＧＧＣＵＣＵＵＡＣＵＣＡＣＵＣＡＡＧＡ
配列番号５：ＧＧＣＡＵＵＧＵＧＡＧＣＧＡＧＧＵＧＡ
配列番号６：ＧＣＣＡＵＵＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＵＡ
配列番号７：ＧＵＵＵＣＣＧＣＣＵＧＧＡＡＣＣＵＧＡ
配列番号８：ＧＡＡＡＣＵＧＵＧＣＣＣＡＣＵＡＣＣＡ。
［２８］前記ＤＮＡ配列が、下記の配列番号９〜配列番号１５のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、上記［２５］又は［２６］に記載の心不全を治療又は予防するための方法、
配列番号９：ＧＧＡＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＡＡＴＡ
配列番号１０：ＧＡＧＡＧＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＴＡＡＡ
配列番号１１：ＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＧＡ
配列番号１２：ＧＧＣＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＧＡ
配列番号１３：ＧＣＣＡＴＴＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＴＡ
配列番号１４：ＧＴＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＧＡ
配列番号１５：ＧＡＡＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＡ。
［２９］前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、上記［２５］〜［２８］のいずれか一つに記載の心不全を治療又は予防するための方法。
［３０］前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである上記［２９］に記載の心不全を治療又は予防するための方法。
［３１］前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターＡＡＶ６ベクターである上記［３０］に記載の心不全を治療又は予防するための方法。【００２０】
［３２］対象である哺乳動物（好ましくはヒト）由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の発現を測定することにより、該対象が心不全に罹患しているか心不全を発症するリスクがあるかを判定する方法。
［３３］前記血液が大動脈基部（Ａｏ）及び／又は冠状静脈洞（ＣＳ）の血液である上記［３２］に記載の方法。
［３４］冠状静脈洞（ＣＳ）の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の発現レベルが、大動脈基部（Ａｏ）の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、心不全に罹患しているまたは心不全を発症するリスクがあると判定する、上記［３３］に記載の方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、心筋細胞においてアンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制することができ、心不全の治療又は予防に有効な医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】左図は、野生型マウスのＴＡＣ処置６週間後の、心臓でのＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現を、ウェスタンブロットを用いて定量した結果である。Ｓｈａｍは、擬似コントロールマウスを表す。グラフは、各グループｎ＝５の平均である。右図は、アンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）で誘導した病的肥大のマウスモデルの心臓でのＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現を、誘導２週間後に、ウェスタンブロットを用いて定量した結果である。Ｖｅｈｉｃｌｅは、コントロールマウスを示す。グラフは、各グループｎ＝８の平均である。コントロールの値を１とした。データは、平均±ＳＥＭで表した。＊＊：ｐ＜０．０１である。
【図２】ＧＦＰ+心筋細胞及びＧＦＰ-心筋細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２の発現を確認した結果である。図２ａは、Ｍｙｈ６−ＥＧＦＰ ＴｇマウスからのＧＦＰ+心筋細胞及びＧＦＰ-非心筋筋細胞での、ＡＮＧＰＴＬ２及びＧＦＰをウェスタンブロットにより分析した結果である。Ｈｓｃ７０は、コントロールとして用いた。ＧＦＰ+の値を１とした。グラフは、各グループｎ＝３の平均である。図２ｂは、ＴＡＣ処置又は擬似コントロール処置（Ｓｈａｍ）の６週間後の、ＧＦＰ+及びＧＦＰ-細胞中のＡｎｇｐｔｌ２発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析した結果である。各グループｎ＝３の平均である。コントロールの値を１とした。図２ｃは、Ａｎｇ ＩＩ処置又はビークル処置の２週間後の、ＧＦＰ+及びＧＦＰ-細胞中のＡｎｇｐｔｌ２発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析した結果である。各グループｎ＝３の平均である。コントロールの値を１とした。データは、平均±ＳＥＭで表した。*：ｐ＜０．０５である。
【図３】図３ａは、８週齢及び１２週齢のαＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウス及び野生型同腹子の心収縮機能障害を確認した結果である。図３ａの上段は、Ｍ−モードの超音波検査の記録である。図３ａの中段は、小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）で染色した左心室切片の結果であり、心筋細胞の大きさを示している（スケールバー：５０μｍ）。図３ａの下段は、ＤＡＰＩで染色した左心室切片の結果であり、心筋細胞の大きさを示している（スケールバー：２００μｍ）。図３ｂは、８週齢、１２週齢及び１８週齢のαＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウス及び野生型同腹子（各群ｎ＝５−７）の、拡張期左室後壁の厚さ（ＬＶＰＷ；ｄ）、左心室拡張末期内径（ＬＶＩＤ；ｄ）、及びパーセント短縮率（％ＦＳ）の結果である。図３ｃは、１２週齢のαＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウス及び野生型同腹子（各群ｎ＝５−７）の心臓におけるＨＦ及び線維症と関連する遺伝子の相対的発現の結果である。野生型（ＷＴ）の値を１とした。データは、平均±ＳＥＭで表した。*：ｐ＜０．０５である。
【図４】αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２のＴｇ及び野生型対照マウスから単離した単一細胞を用いて心筋細胞の興奮収縮（ＥＣ）カップリングを評価した結果である。図４ａは、αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２のＴｇ（ｎ＝３１、Ｎ＝３）及び野生型対照マウス（ｎ＝４０、Ｎ＝３）から単離した心筋細胞の短縮率を、図４ｂは、１Ｈｚの刺激での平均Ｃａ2+移行を、図４ｃは、Ｃａ2+移行のピーク値を、図４ｄは、ピーク［Ｃａ2+］ｉに達する時間を、図４ｅは、αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２のＴｇ（ｎ＝５４、Ｎ＝３）及び野生型対照マウス（ｎ＝３５、Ｎ＝３）からの心筋細胞におけるＣａ2+移行減衰の時定数τを示している。図４ｆは、αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウス（ｎ＝５４，Ｎ＝３）及び野生型マウス（ｎ＝３５，Ｎ＝３）からの心筋細胞中の平均ＳＲ Ｃａ+値を示している。データは、平均±ＳＥＭで表した。*：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１である。Ｎは、独立した実験の回数である。
【図５】αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウス及び野生型マウスの、ＴＡＣ処置の３週間後の心臓組織切片を、Masson's Trichrome染色した結果である（スケールバー：１００μｍ）。
【図６】αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウス及び野生型マウスの、ＴＡＣ処置の３週間後の心臓組織における、心不全及び心臓線維症関連遺伝子の相対的発現を確認した結果である。各群ｎ＝６である。ＷＴの値を１とした。
【図７】αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウス（ｎ＝１３）及び野生型マウス（ｎ＝２８）のＴＡＣ処置後の生存率を示している。
【図８】１２週齢のＡｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウス及び野生型同腹子マウス（ＷＴ）の、心不全及び線維症関連遺伝子の相対発現を確認した結果である。ＷＴの値を１とした。
【図９】Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＯ及び同腹子マウス（ＷＴ）の心臓における種々のシグナル因子及びＳＥＲＣＡ２ａのイムノブロッティングの結果を定量的に示している。各群ｎ＝３−６である。対照の値を１とした。データは、平均±ＳＥＭで表した。*：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１である。
【図１０】αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇ及び同腹子マウス（ＷＴ）の心臓における種々のシグナル因子及びＳＥＲＣＡ２ａの免疫ブロッティングの結果を定量的に示している。各群ｎ＝３−６である。対照の値を１とした。データは、平均±ＳＥＭで表した。*：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１である。
【図１１】Ａｎｇｐｔｌ２又は対照のｓｉＲＮＡで形質転換したＮＲＣＭｓにおける、各因子の免疫ブロッティングの結果を定量的に示している。各群ｎ＝２−４である。対照の値を１とした。データは、平均±ＳＥＭで表した。*：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１である。
【図１２】Ａｄ−Ａｎｇｐｔｌ２又は対照Ａｄ−ＬａｃＺで形質転換したＮＲＣＭｓにおける、各因子の免疫ブロッティングの結果を定量的に示している。各群ｎ＝２−４である。対照の値を１とした。データは、平均±ＳＥＭで表した。*：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１である。
【図１３】運動負荷を行っていない対照マウス、トレッドミルランニングによる急性の訓練及び持続訓練を受けたマウス、の心臓からのＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の免疫ブロッティングの結果である。Ｈｓｃ７０を、泳動コントロールとして用いた。運動負荷を行っていない対照マウスの値を１とした。各群ｎ＝６−８である。
【図１４】ＦＬｕｃ−Ａｎｇｐｔｌ２−３’ＵＴＲ構築物のマウスＡｎｇｐｔｌ２ ３’ＵＴＲ上の、ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２２１、及びｍｉＲ−２２２の結合部位の予測である。ＦＬｕｃ−Ａｎｇｐｔｌ２−３’ＵＴＲ構築物を有し、対照のｐｃＤＮＡ３．１ベクター、或いはｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２０４又はｍｉＲ−１３５ａを発現するベクターで形質転換したＮＲＣＭｓの相対ルシフェラーゼ活性を示している。対照のｐｃＤＮＡ３．１ベクターで形質転換したＮＲＣＭｓの値を１とした。各群ｎ＝１０−１２である。データは、平均±ＳＥＭで表した。*：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１である。
【図１５】図１５ａの模式図は、ｍｉＲ−２２１／２２２結合部位を有する（上段）又は有しない（下段）ＦＬｕｃ−Ａｎｇｐｔｌ２−３’ＵＴＲ構築物を模式的に示した図である。図１５ａのグラフは、ＷＴ又は欠失したＦＬｕｃ−Ａｎｇｐｔｌ２−３’ＵＴＲ構築物を有し、対照ベクター或いはｍｉＲ−２２１又はｍｉＲ−２２２を発現するベクターで形質転換したＮＲＣＭｓの相対ルシフェラーゼ活性を示している。対照のｐｃＤＮＡ３．１ベクターで形質転換したＮＲＣＭｓの値を１とした。各群ｎ＝１０−１２である。図１５ｂは、持久運動トレーニング後の、対照及びｍｉＲ−２２１／２２２ＫＯマウスの心臓のＡＮＧＰＴＬ２のウェスタンブロット（左図）及び定量（右図）の結果を示した図である。Ｈｓｃ７０は、泳動コントロールである。運動負荷を行っていないｍｉＲ−２２１／２２２非ＫＯ対照マウスのレベルを１とした。データは、平均±ＳＥＭで表した。*：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１である。
【図１６】野生型マウスに、マウスＡｎｇｐｔｌ２のｓｈＲＮＡ（ＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ａ及び−Ｂ）を、１×１０10ｖｇ／マウス及び３×１０10ｖｇ／マウスで静脈内投与した２週間後の、ＡＮＧＰＴＬ２の免疫ブロティングの結果である。投与していないマウスの値を１とした。各群ｎ＝４である。
【図１７】図１６と同様に、図１７ａは、ｓｈＲＮＡ投与の２週間後の、ＰＧＣ−１α及びＰＰＡＲα転写物の測定結果であり、図１７ｂは、ｓｈＲＮＡ投与の２週間後の、ＡＫＴ及びＳＥＲＣＡ２ａタンパク質レベルの測定結果である。
【図１８】ウイルスなし（コントロール）、或いは、１×１０10 ｖｇ／マウス又は３×１０10 ｖｇ／マウスにてＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂを静脈内投与した４週間後の、ＴＡＣ誘導異常肥大心臓におけるＡＮＧＰＴＬ２の免疫ブロッティングの結果を示している。Ｈｓｃ７０を泳動コントロールとして用いた。データは、平均±ＳＥＭで表した。*：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１である。
【図１９】ウイルスなし（コントロール）、或いは、１×１０10 ｖｇ／マウス又は３×１０10 ｖｇ／マウスにてＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂを静脈内投与したマウス間の指標パラメーターの比較結果である。データは、平均±ＳＥＭで表した。*：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１である。
【図２０】対照、ＴＡＣ処置マウス、及びＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂ投与４週間のＴＡＣ処置マウスの、Ｍ−モード心臓エコー検査の記録、心臓の中央部の切片のＨＥ染色の結果（スケールバー：１ｍｍ）、及び全心臓の形状である。
【図２１】ＴＡＣ処置及びウイルス投与なし（コントロール）、或いは、ＴＡＣモデルに、３×１０10 ｖｇ／マウスにてＡＡＶ−ｓｈＳｃｒａｍｂｌｅ又はＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ａを静脈内投与したマウス間の指標パラメーターの比較結果である。各グループｎ＝１０。データは、平均±ＳＥＭで表した。＊＊：ｐ＜０．０１、+：ｐ＜０．００１である。
【図２２】ＡＮＧＰＴＬ２を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＮＧＰＴＬ２−Ｂ：ｓ２３８５４）又はコントロールｓｉＲＮＡで形質転換したヒトｉＰＳ由来心筋細胞における、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＫＴ及びＳＥＲＣＡ２Ａの発現を確認した結果である。図２２ａは、培地中のＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルを測定した結果である。各群ｎ＝４である。図２２ｂは、ＡＮＧＰＴＬ２、ＡＫＴ及びＳＥＲＣＡ２Ａのウェスタンブロットの結果（左図）、及びＡＫＴ及びＳＥＲＣＡ２Ａの相対タンパク質レベルである。実験は、少なくとも３回行った。Ｈｓｃ７０を泳動コントロールとして用いた。コントロールｓｉＲＮＡの値を１とした。図２２ｃは、エネルギー関連遺伝子、ＰＧＣ−１α及びＰＰＡＲαの発現の結果である。コントロールｓｉＲＮＡの値を１とした。データは、平均±ＳＥＭで表した。*：ｐ＜０．０５，＊＊：ｐ＜０．０１、＋：ｐ＜０．００１である。
【図２３】ＡＮＧＰＴＬ２を標的とする７種類のｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＮＧＰＴＬ２−Ａ〜Ｇ）又はコントロールｓｉＲＮＡで形質転換したヒトｉＰＳ由来心筋細胞における、培地中のＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルをウェスタンブロットにより検出した結果である。Ｈｓｃ７０を泳動コントロールとして用いた。
【図２４】実施例で用いたヒトＡＮＧＰＴＬ２を標的としたｓｉＲＮＡのそれぞれの配列のヒトＡＮＧＰＴＬ２配列上の位置を示している。線で囲った部分は、翻訳領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法及び材料とともに説明する。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等又は同様の任意の材料及び方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物及び特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
【００２４】
アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）は、肥満、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、及び癌の進行と関連した慢性炎症に関連することが報告されている。
ヒトＡＮＧＰＴＬ２遺伝子のｍＲＮＡ配列を配列番号１に示す。
本発明によれば、心筋細胞においてアンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現が抑制される。その結果、本発明は、心不全への移行を阻止又は遅延でき、心不全の治療又は予防のために有効である。
【００２５】
本発明によれば、哺乳動物（好ましくは、ヒト）のＡＮＧＰＴＬ２のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡを分解するのに有効なｓｉＲＮＡを、心筋細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２遺伝子の発現を抑制するために用いることによって特徴づけられる。ｓｉＲＮＡは、哺乳動物（好ましくは、ヒト）のＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡの部分配列と相同の配列をもつセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列を含む二本鎖ＲＮＡである。センス及びアンチセンスの各鎖を構成するヌクレオチド数は、約１８〜２９であり、好ましくは約１９〜２７、さらに好ましくは１９〜２５、より好ましくは１９〜２３である。細胞内に導入された、又は細胞内で形成された、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ-ヌクレアーゼ複合体（ＲＩＳＣ）の形成を誘導し、それによって哺乳動物（好ましくは、ヒト）のＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡが選択的に分解され、ＡＮＧＰＴＬ２の発現が阻止又は抑制される。
したがって、本発明のｓｉＲＮＡは、哺乳動物（好ましくはヒト）のＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡ配列からの連続する約１８〜２９ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含む。
本明細書中で使用する「選択的スプライス型ＲＮＡ」とは、転写によって形成されたｍＲＮＡ前駆体が成熟ｍＲＮＡにスプライシングされるときに、通常のスプライス部位と異なる部位での切断の結果生じるｍＲＮＡを意味する。
【００２６】
以下、ヒトのＡＮＧＰＴＬ２を代表例として説明するが、本発明の医薬組成物及び方法は哺乳動物の心不全の治療又は予防に用いることができる。
本発明の実施形態によれば、ヒトＡＮＧＰＴＬ２ ｍＲＮＡは、配列番号１に示される核酸配列によってコードされるＲＮＡ配列である。該ＲＮＡ配列は、配列番号１の核酸配列中のすべてのＴがＵに読み替えられた配列に相当する。このＲＮＡ又は該核酸配列から本発明に使用可能なｓｉＲＮＡ配列を決定することができる。本発明に使用するｓｉＲＮＡのための該ｍＲＮＡ上のターゲットサイトの選択は、公知の知識を用いて行うことができる。例えば、これに限定されないが、U. Tei K., et al. Nucleic Acids Research (2004) 32 (3): 936-948などの文献の記載を参考にすることができる。また、これに限定されないが、例えば、（ｉ）ＧＣ含量が約３０〜約７０％、好ましくは約５０％である、（ｉｉ）すべての塩基が均等であり、また、Ｇが連続していない、（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５'末端の塩基がＡ又はＵである、などの基準を参考にできる。なお、本発明の実施例においては、ＡＡに続く１９ヌクレオチドであり、ＡＡのあとにＧやＣが存在することを一つの基準としてターゲットサイトを選択したが、これに限定されるものではない。
【００２７】
本発明に使用するｓｉＲＮＡが具備すべき特徴は、該ｓｉＲＮＡを動物細胞（例えば、ヒト細胞）に形質導入した場合に、細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２遺伝子の発現を抑制し、ＡＮＧＰＴＬ２遺伝子のサイレンシング効果を生じることができる。本明細書で言う「ＡＮＧＰＴＬ２遺伝子の発現を抑制し、ＡＮＧＰＴＬ２遺伝子のサイレンシング効果を生じる」とは、「タンパク質レベルでのＡＮＧＰＴＬ２の減少を引き起こす効果を生じる」を意味する。従って、本発明で使用するｓｉＲＮＡは、タンパク質レベルでのＡＮＧＰＴＬ２の減少を引き起こす標的配列を含むことを特徴とする。
また、標的遺伝子であるＡＮＧＰＴＬ２遺伝子の発現を効率よく抑制すると同時に、無関係の遺伝子の発現に影響（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果）を及ぼすことのない高い選択性を有すること、及び、オリゴ核酸（ｓｉＲＮＡ）自体が望ましくない毒性、副作用を発現しないことが望ましい。このようなｓｉＲＮＡ配列は、公知知識に基づき、当業者が決定することができ、ｓｉＲＮＡ自体は、常法に従って作製して検討を行う（例えば、実際にｓｉＲＮＡを作製し、細胞に形質転換し、ＡＮＧＰＴＬ２遺伝子の発現抑制活性や細胞に対する毒性を確認することを含む）ことにより、当業者が取得することができる。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果がないことの確認は、これに限定されないが、例えば、候補ｓｉＲＮＡについて、予めジーンチップなどを利用して交差反応がないことにより確認できる。
【００２８】
本発明において用いることができるｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖配列は、これに限定されないが、例えば、好ましくは以下に示す配列番号２〜８の配列をあげることができる。
配列番号２：ＧＧＡＡＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＡＡＵＡ
配列番号３：ＧＡＧＡＧＵＵＣＡＵＵＵＡＣＣＵＡＡＡ
配列番号４：ＧＧＣＵＣＵＵＡＣＵＣＡＣＵＣＡＡＧＡ
配列番号５：ＧＧＣＡＵＵＧＵＧＡＧＣＧＡＧＧＵＧＡ
配列番号６：ＧＣＣＡＵＵＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＵＡ
配列番号７：ＧＵＵＵＣＣＧＣＣＵＧＧＡＡＣＣＵＧＡ
配列番号８：ＧＡＡＡＣＵＧＵＧＣＣＣＡＣＵＡＣＣＡ。
また、これらの配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列をセンス鎖配列とするｓｉＲＮＡも同様に、ＡＮＧＰＴＬ２遺伝子のサイレンシング効果を生じ、かつ、避けるべきｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を生じない限り用いることができる。これらの配列において任意の１つの塩基を置換・欠失又は付加することは常法に従って行うことができる。また、そのようにして作製した配列を用いて、本明細書の実施例に示された手法に準じて、それらの配列から作製したｓｉＲＮＡが本発明の目的の効果を生じるか否かを確認することができる。従って、上記配列において、１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列も本発明の効果を生じる限り本発明に含まれ、それらを含む医薬組成物及びそれを利用する方法も本発明に含まれる。
また、それらのセンス鎖配列を含むＲＮＡコードするＤＮＡ配列も本発明において用いることができ、本発明に含まれる。
【００２９】
さらに、本発明において用いることができるｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖配列は、上記した配列の何れかの配列の主要部分（例えば、上記配列中の連続する１２以上、好ましくは１５以上の配列）を含むようにして決定した、ＡＮＧＰＴＬ２のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチド、好ましくは１９〜２７、さらに好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチドの配列も含む。そのようにして決定した配列を用いて、本明細書の実施例に示された手法に準じて、それらの配列から作製したｓｉＲＮＡが本発明の目的の効果を生じるか否かを確認することができる。従って、上記した配列の何れかの配列の主要部分を含ようにして決定された配列も、それから作製したｓｉＲＮＡが本発明の効果を生じる限り本発明に含まれ、それらを含む医薬組成物及びそれを利用する方法も本発明に含まれる。
また、それらのセンス鎖配列を含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列も本発明において用いることができ、本発明に含まれる。
【００３０】
本発明で用いるｓｉＲＮＡは、センス鎖配列及び／又はアンチセンス鎖配列の末端にオーバーハングをもつことが好ましい。ｓｉＲＮＡのオーバーハングは、５’又は３’末端、好ましくはＲＮＡの３’末端にある。オーバーハングを構成するヌクレオチド数は、約１〜５ヌクレオチドであり、好ましくは約１〜４ヌクレオチド、さらに好ましくは約２〜３ヌクレオチド、より好ましくは２ヌクレオチドである。オーバーハングは、Ｔ又はＵもしくはＧであるのが好ましい。これに限定されないが、オーバーハングとして、ＴＴ、ＵＵ、ＵＧをもつｓｉＲＮＡが好ましい。
【００３１】
本発明で用いられるｓｉＲＮＡの例として、市販のものも用いることができる。例えば、Santa Cruz Biotech社（米国）により販売されているＡｎｇｐｔｌ２ ｓｉＲＮＡ（カタログ＃ sc-72351）、ORIGENE社（米国）により販売されているＡｎｇｐｔｌ２ ｓｉＲＮＡ（カタログ＃ SR415901）、Sigma-Aldrich社のＭｉｓｓｉｏｎ（登録商標）ｓｉＲＮＡライブラリーにあげられているＡｎｇｐｔｌ２のｓｉＲＮＡをあげることができる。
【００３２】
本発明で使用するｓｉＲＮＡは、単一のｓｉＲＮＡであってもよく、また、複数のｓｉＲＮＡの混合物（いわゆる、カクテル）であってもよい。上記した市販のＡｎｇｐｔｌ２ ｓｉＲＮＡは、いずれも、複数（３〜５種類）のｓｉＲＮＡの混合物である。
【００３３】
本発明のｓｉＲＮＡを生体内で使用するときには、ｓｉＲＮＡを直接患部に注入するか、又はｓｉＲＮＡの発現が可能なベクターを使用することができる。
ｓｉＲＮＡを直接患部に注入する場合には、それらをリポソーム、たとえばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン及びその他の正電荷リポソームと複合体形成して注入することができる。
本発明のｓｉＲＮＡの発現が可能なベクターを使用する場合は、例えば、ｓｉＲＮＡのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターが好ましく用いられる。
【００３４】
本発明のｓｉＲＮＡを得るために、ヘアピン型ＲＮＡを用いる又はヘアピン型ＲＮＡを細胞内で発現させることもできる。
本発明で使用可能なヘアピン型ＲＮＡは、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列を含むものであり、細胞内ＲＮａｓｅであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされてｓｉＲＮＡが形成されるＲＮＡである。
本発明のｓｉＲＮＡを生じるヘアピン型ＲＮＡをコードするヘアピン型ＤＮＡは、その３’末端には、転写停止シグナル配列として、或いはオーバーハングのために、１〜６個、好ましくは１〜５個のＴからなるポリＴ配列、例えば、４個又は５個のＴからなるＴＴＴＴ又はＴＴＴＴＴが連結される。ベクターＤＮＡから転写されたｓｉＲＮＡ前駆体としてのｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、そのアンチセンス鎖の３’末端に２〜４個のＵからなるオーバーハングを有することが望ましく、オーバーハングの存在によって、センスＲＮＡ及びアンチセンスＲＮＡはヌクレアーゼによる分解に対して安定性を増すことができる。ヒトには内在性のＤｉｃｅｒが１つ存在し、これが長鎖ｄｓＲＮＡや前駆体マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をそれぞれｓｉＲＮＡと成熟ｍｉＲＮＡに変換する役割をもつ。本発明における前記ループ配列の例（ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を示す）としては、例えば、ＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧ（配列番号１６）及びＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＴＡ（配列番号１７）をあげることができるが、これに限定されず公知のループ配列も使用できる。
【００３５】
本発明のｓｉＲＮＡを生じる（コードする）、別のＤＮＡの例はタンデム型ＤＮＡであり、これは前記センス鎖をコードするＤＮＡ配列と前記アンチセンス鎖をコードするＤＮＡ配列とを５'→３'方向に連続して含み、各鎖の５'末端にプロモーターが、また各鎖の３'末端にポリＴ配列がそれぞれ連結された配列からなり、細胞内で転写後、同時に生成したセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとがハイブリダイズしてｓｉＲＮＡを形成する。ポリＴ配列は、上記と同様に、転写停止シグナル配列としての１〜５個、特に４〜５個のＴからなることが好ましい。また、ヘアピン型と同様に、生成するｓｉＲＮＡは、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の３'末端に２〜４個のＵからなるオーバーハングを有していてもよい。
【００３６】
本発明のＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡは、化学的に又は組換え的に周知の方法で合成することができるが、ヌクレオチド数を考慮すると、慣用のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を使用して化学的に合成するのが容易である。また、ｓｉＲＮＡ関連の受託合成会社に合成を依頼して作製することも可能である。
【００３７】
本発明のＤＮＡ配列を有するＤＮＡは、ベクター中に組み込まれ、適当なプロモーターの調節下でＲＮＡに転写される。本発明で使用されるベクターには、プラスミド及びウイルスベクターが含まれる。
プロモーターとして、特に限定されないが、ｐｏｌＩＩＩプロモーター、たとえばヒトもしくはマウスＵ６プロモーター及びＨ１プロモーターを使用することができる。
ｓｉＲＮＡは、５’又は３’末端、好ましくはＲＮＡの３’末端にオーバーハングをもつことが好ましい。従って、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、オーバーハングを構成するようにした配列を含むことが好ましい。オーバーハングのヌクレオチド数は、約１〜５ヌクレオチドであり、好ましくは約１〜４ヌクレオチド、さらに好ましくは約２〜３ヌクレオチド、より好ましくは２ヌクレオチドである。また、コードされるｓｉＲＮＡのオーバーハングは、Ｕ又はＧであるのが好ましい。これに限定されないが、ｓｉＲＮＡのオーバーハングとして、ＵＵ、ＵＧをコードするＤＮＡ配列が好ましい。
【００３８】
プラスミドベクターは、公知の報告に基づいて調整できる。又は、市販のベクター系を用いて製造業社の手順書に従って作製することもできる。さらには、Ａｎｇｐｔｌ２に対するｓｉＲＮＡ２を発現するように設計されたベクターも市販されており、これらを制限なく用いることができる。例えば、Santa Cruz Biotech社（米国）により販売されているＡｎｇｐｔｌ２ ｓｈＲＮＡプラスミド（カタログ＃ sc-72351-SH）、ORIGENE社（米国）により販売されているＡｎｇｐｔｌ２ ｓｈＲＮＡを有するレトロウィルスプラスミド（カタログ＃ TG502578）をあげることができる。
【００３９】
本発明で使用するｓｈＲＮＡは、単一のｓｈＲＮＡであってもよく、また、複数のｓｈＲＮＡの混合物（いわゆる、カクテル）であってもよい。上記した市販のＡｎｇｐｔｌ２ ｓｈＲＮＡは、いずれも、複数（３〜５種類）の混合物である。また、本明細書の実施例では、２つのｓｈＲＮＡであるＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂ又はＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ａを別々に用いたが、それらを組み合わせて用いてもよい。
【００４０】
本発明で用いることができるプラスミドベクターは、一般に、本発明のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列及びプロモーターに加え、薬剤耐性遺伝子（たとえばピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子）、転写停止配列、ユニーク制限部位もしくはマルチプルクローニングサイト、複製開始点、シャイン−ダルガルノ配列などを含むことができる。
プラスミドベクターは、例えば、リポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン及びその他の正電荷リポソームから選択されるリポソームと複合体を形成しカプセル化された状態で患部に直接注入することができる。正電荷リポソームによる遺伝子導入では、ＤＮＡが細胞内にエンドサイトーシスされたのち、エンドソームと核膜との融合が起こり、ベクターが核へ移行する。
【００４１】
本発明で用いることができるウイルスベクターは、特に制限はないが、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター（白血病ウイルスベクターなど）、ヘルペスウイルスベクターなどをあげることができる。ウイルスベクターは、ヒトに使用する際に疾病を引き起こさないように例えば自己複製能を欠損したタイプのものが好ましい。例えば、アデノウイルスベクターの場合には、Ｅ１遺伝子及びＥ３遺伝子を欠失した自己複製能欠損型アデノウイルスベクターを使用することができる。ウイルスベクターの構築方法は、公知の方法に従い行うことができる。
本発明においては、心筋細胞においてＡＮＧＰＴＬ２遺伝子の発現を抑制することを目的としているので、心筋へのデリバリー選択性があるアデノ随伴ウイルスベクターが特に好ましく用いられる。アデノ随伴ウイルスベクターとしては、現在まで、Ｉ型からＸＩ型まで知られており、これらを制限なく用いることができるが、今後開発されるベクターも本発明の目的を達するかぎり制限なく用いることができる。好ましいベクターは、これに限定されないが、ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ＡＡＶ３，ＡＡＶ４，ＡＡＶ５，ＡＡＶ６，又はＡＡＶ９であり、特に好ましくはＡＡＶ６である。好適に用いられる各種アデノ随伴ウイルスベクターは市販されている。
【００４２】
ウイルスベクターを用いる場合は、患部にベクターを直接注入し細胞に感染させることによって細胞内に遺伝子導入することができる。特にアデノウイルスベクターは種々の細胞種に非常に高い効率で遺伝子導入可能であることが確認されており、また遺伝子治療のために実際に臨床応用されている。このベクターはまた、ゲノム中に組み込まれることがないため、その効果は一過的であり安全性も他のウイルスベクターと比べて高いと考えられる。
【００４３】
本発明の医薬組成物に含まれるｓｉＲＮＡの配列をコードするＤＮＡを含むウイルスベクターの投与量は、特に限定されないが、１．０Ｘ１０10〜１．０Ｘ１０15 、好ましくは５．０Ｘ１０10〜１．０Ｘ１０14 、より好ましくは１．０Ｘ１０11〜１Ｘ１０13 、さらに好ましくは１．４Ｘ１０11〜３Ｘ１０12 ｖｇ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎである。例えば、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を用いる場合の、特に好ましい投与量は、１．４Ｘ１０11〜３Ｘ１０12 ｖｇ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎである。ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを直接投与する場合の投与量は、特に制限されず、タンパク質レベルでのＡＮＧＰTＬ２の減少を引き起こす効果を生じる量が選択される。投与量は、治療有効量であり、また一定の時間的間隔で複数回投与することもできる。実際に用いる際は、患者の状態、年齢、性別、重篤度などに応じて専門医の判断により投与量が決定される。
【００４４】
本発明のベクターは、医薬上許容可能な担体、例えば、生理食塩水、緩衝液などとともに患者に投与される。医薬組成物にはさらに、安定化剤、保存剤、等張化剤などを含有させることができる。本発明の医薬組成物の投与方法については、特に制限はないが、局所投与又は非局所投与のいずれでも実施できるが、好ましくは局所投与である。局所投与の場合、気管支鏡等の内視鏡下、或いは外科手術にて患部を露出し、注射器等の手段で直接ベクターを投与することができる。非局所投与の場合、たとえば静脈内投与で行うことができる。投与形態としては、たとえばウイルスベクター、又はプラスミドとリポソームの複合体、を医薬上許容可能な担体に懸濁させた形態で投与される。
【００４５】
本発明はまた、哺乳類動物（好ましくは、ヒト）由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の発現量を測定することにより、対象が本発明の医薬組成物による心不全の治療又は予防に適するか否かを判定する方法である。
アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の発現は、常法に基づいて行うことができ、例えば、これに限定されないが、抗ＡＮＧＰＴＬ２抗体を用いて測定できる。抗体と用いた測定方法としては、これに限定されないが、例えば、イムノウェスタンブロティング、ＥＬＩＺＡ法をあげることができる。
【００４６】
血液が由来する哺乳動物としてはヒトが好ましく、本発明の医薬組成物による心不全の治療又は予防に適するか否かを判定するという目的より、心不全患者由来の血液が特に好ましい。
血液は、好ましくは心筋細胞から分泌されるタンパク質の量を鋭敏に反映する血液であり、心臓、特に左心室を循環した血液をあげることができる。これに限定されないが、特に好ましくは、大動脈基部（Ａｏ）及び冠状静脈洞（ＣＳ）由来の血液である。
【００４７】
本発明の方法においては、心臓組織内を循環した静脈、例えば、冠状静脈洞（ＣＳ）の血液中のＡＮＧＰＴＬ２の発現レベルが、心臓組織内を循環する直前の動脈、例えば、大動脈基部（Ａｏ）の血液中の発現レベルより高い場合に、血液が由来する対象が、本発明の医薬組成物による心不全の治療又は予防が必要であると判定することができる。
或いは、本発明の方法においては、心臓組織内を循環した静脈、例えば、冠状静脈洞（ＣＳ）の血液中のＡＮＧＰＴＬ２の発現レベルが、前もって定めた数値より高い場合に、血液が由来する対象が、本発明の医薬組成物による心不全の治療又は予防が必要であると判定することもできる。
本発明の方法においては、上記のようにして対象が本発明の医薬組成物による心不全の治療又は予防が必要であると判定した場合に、それらの対象は、本発明の医薬組成物を投与する対象であると判定する。
【００４８】
本発明の方法はまた、医薬品、例えば、本発明の医薬組成物が投与された対象由来の血液中のＡＮＧＰＴＬ２の発現を測定することにより、対象において心不全の治療又は予防効果が得られているか否かを判定する方法である。例えば、心臓組織内を循環した静脈、例えば、冠状静脈洞（ＣＳ）の血液中のＡＮＧＰＴＬ２の発現レベルが、本発明の医薬組成物の投与後において減少している場合は、医薬品の治療又は予防効果が得られていると判定することができる。
よって、本発明の方法は、心不全の治療又は予防のための医薬品の投与前後において、血液中のＡＮＧＰＴＬ２の濃度を測定することにより、医薬品の治療又は予防効果がでているかを判定する方法でもある。
【００４９】
本発明はまた、哺乳類動物（好ましくは、ヒト）由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の発現を測定することにより、対象が心不全に罹患している又は心不全を発症するリスクがあるか否かを判定する方法である。
アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）の発現を測定する方法は上記した通りである。
また、血液が由来する哺乳動物、対象とする血液を採取する部位、その他についても、上記の判定方法の記載がそのまま適用できる。  
【００５０】
本発明者らにより以下のことが見いだされ、本発明が新たな心不全の治療又は予防剤となることが示された。
１）ＡＮＧＰＴＬ２生産が、病的リモデリングを受けたマウスの心臓で活性化されており、また、潜在的なＤＣＭ患者の一部で潜在的に活性化されている。
２）病的刺激が、カルシニューリンＮＦＡＴシグナル伝達を介して心筋細胞のＡＮＧＰＴＬ２の生産を増加させる。
３）マウス心臓におけるＡＮＧＰＴＬ２活性（過剰発現）は、ＡＫＴ−ＳＥＲＣＡ２ａのシグナル伝達及び心筋のエネルギー代謝を乱すことにより、心不全（ＨＦ）への進行を加速させる。一方、Ａｎｇｐｔｌ２ノックアウトマウスは、増加したＡＫＴ−ＳＥＲＣＡ２ａシグナル伝達、増幅した心筋エネルギー代謝及びＡＴＰ生産、及び運動誘発性肥大に似た表現型である非病的な心筋肥大を示す。
４）運動トレーニング及び／又はｍｉＲ−２２１／２２２活性は、心臓のＡＮＧＰＴＬ２発現を減少させる。
５）Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスは、増加したＡＫＴ−ＳＥＲＣＡ２ａシグナル伝達、増幅した心筋エネルギー代謝及びＡＴＰ生産を示し、病的な心臓リモデリングから保護され、そして、ＫＯマウスの心臓の表現型は運動によって誘発されるものに似ている。
６）心臓の病的肥大状況でのＡＮＧＰＴＬ２の抑制が、マウスでは、ＡＫＴ−ＳＥＲＣＡ２ａのシグナル伝達を活性化し、心筋のエネルギー代謝を増強し、ＨＦへの移行をブロックする。
７）ＡＫＴ−ＳＥＲＣＡ２ａの活性化及び増強された心筋のエネルギー代謝が、ＡＮＧＰＴＬ２ノックダウンヒトｉＰＳ由来心筋細胞において起こる。
これらのことより、心臓ＡＮＧＰＴＬ２活性が、心臓リモデリングが病的になるかどうかを支配していると考えられることを示した。また、心臓病理学において、ＡＮＧＰＴＬ２の抑制が、運動による心臓保護効果を反復できることを示した。
【００５１】
カルシニューリンＮＦＡＴシグナル伝達は、病的な心臓肥大を促進する遺伝子の発現を増加させる。本発明者らは、カルシニューリンＮＦＡＴシグナル伝達が心筋Ａｎｇｐｔｌ２発現を増加させること、そして、ＡＮＧＰＴＬ２活性が病的心臓リモデリングを悪化させることを示した。興味深いことに、最近の論文では、心臓のｍｉＲ−２２２の発現が持久運動トレーニング後に増加すること、活性が成体心臓における生理学的な心筋細胞の成長に必要なこと、及びｍｉＲ−２２２の発現が（有害な）心臓のリモデリングから保護することを実証している。ｍｉＲ−２２１及びｍｉＲ−２２２は、同一の配列を標的とし、ｍｉＲ−２２１／２２２は、圧負荷で誘導した病的心臓リモデリングを改善することが報告されている（Peters, T.et al. Cardiovasc Res Suppl 103,S9-S46 (2014).）。
【００５２】
本発明者らの実験結果は、ＡＮＧＰＴＬ２が、ｍｉＲ−２２１／２２２ターゲットであること、そして、ＡＮＧＰＴＬ２の抑制が、ｍｉＲ−２２１／２２２が仲介する心臓保護の基礎となっていることを示唆している。循環ｍｉＲ−２２２レベルは、運動の後、健常人で上昇しており、ＡＮＧＰＴＬ２とｍｉＲ−２２１／２２２結合部位は、ヒトとマウスの間で完全に保存されており、このことは機能が保存されていることを示唆している。これらの知見は、ＡＮＧＰＴＬ２が肝細胞癌におけるｍｉＲ−２２１の直接のターゲットであるという観察と一致しており、また、ＡＮＧＰＴＬ２が慢性腎臓病におけるｍｉＲ−２２１の直接のターゲットであるという本発明者らの知見（Morinagaら、Kidney Int. 89: 327-341, 2016）とも一致する。
【００５３】
心臓肥大が進展するにつれ、キャピラリー数と心筋細胞の大きさとの間で不一致が発生し、これが心筋の低酸素症につながることが報告されている。まず、初期の適応段階で誘起される心臓の血管新生は当初は心臓機能を維持するが、不適応段階において不十分となる。これは、恐らく血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現の低下に起因する。従って、低下した心筋の酸素レベルが恐らくＨＦへの移行を制御している。抗ＶＥＧＦ療法は、腫瘍細胞におけるＶＥＧＦシグナル伝達を減衰させる代わりにＡＮＧＰＴＬ２発現を増加させると報告されている。ＡＮＧＰＴＬ２は、ＶＥＧＦのように、腫瘍微小環境で血管新生促進活性を有する。従って、増加したＡＮＧＰＴＬ２発現は、ＶＥＧＦの不足によって引き起こされる低酸素症に起因して、肥大心臓の中で発生する可能性がある。さらに、病的リモデリング環境で見られるＡＮＧＰＴＬ２の増加は、おそらく、減弱したＡＫＴ−ＳＥＲＣＡ２ａのシグナル伝達及び低下した心筋エネルギー代謝に起因した駆出率の減少により、心機能障害を悪化させる。最近の論文は、アップレギュレートしたＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡレベルが運動トレーニング後に見られ、このことは、心臓毛細血管化を示唆している。この環境は、老化関連の毛細血管及び血液供給不足の改善に関連する。持久運動トレーニング後にマウスでＡｎｇｐｔｌ２ ｍＲＮＡのレベルの減少が観察されたことは、運動がＡｎｇｐｔｌ２の転写を調節していることを示唆している。また、マウスの老化に伴い、心臓中でのＡＮＧＰＴＬ２産生の増加が観察された。したがって、適切な心筋酸素レベルの維持は、運動誘発性肥大の場合、ＡＮＧＰＴＬ２の発現をダウンレギュレートし、ＶＥＧＦによってキャピラリー数及び心筋細胞の大きさの正常な調節を可能にすることができる。
【００５４】
最近の論文によると、運動訓練を受けたマウスは、病的な心臓肥大、低下した収縮機能、及び肺うっ血から保護されること、及び、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達の活性化は、運動誘発性心臓保護のために必要であると示されている。以前の研究では、心筋細胞においてＡｋｔを過剰発現するＴｇマウスは、ＳＥＲＣＡ２ａの発現増加と関連する強化された左室機能を伴う心臓肥大を示した。ＡＫＴ−ＳＥＲＣＡ２ａの活性化による病的心臓リモデリングからの保護は、下記の実施例においてもＡｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスで観察された。このことは、ＡＮＧＰＴＬ２の抑制が運動誘発性心臓保護の根底にあることを示唆している。これらの知見はまた、アップレギュレートしたＡＮＧＰＴＬ２がＡＫＴ活性化に拮抗することを示唆している。下記の結果は、ＳＥＲＣＡ２ａは、心筋の収縮と弛緩で機能心筋細胞における細胞内のＣａ2+の恒常性を調節することによって、心臓の能力を維持するという考えを支持している。ＳＥＲＣＡ２ａの活性は、心臓の病態で変化しているので、通常のその活性を回復することが、心機能障害を管理するための戦略として提案されている。ＨＦ患者における遺伝子治療（ＡＡＶ１／ＳＥＲＣＡ２ａ）のＣＵＰＩＤフェーズ１試験は、このアプローチを支持しているが、フェーズ２ｂ試験は、プライマリーとセカンダリのエンドポイントを満たしていなかった。このことは、ＳＥＲＣＡ２ａの復元のみではＨＦを改善するのに十分ではないということを示唆している。
【００５５】
適切なＡＴＰ生産に必要な心筋のエネルギー代謝の最適化は、ＨＦｒＥＦとＨＦｐＥＦを治療するために重要であると考えられる。ＰＰＡＲα及びＰＧＣ−１αの転写物レベルは、病的肥大で減少しており、ミトコンドリア生合成を支配する遺伝子とβ−酸化はＰＰＡＲα及びＰＧＣ−１αによって制御されている。両因子のより高い存在量は、心臓細胞がエネルギー生成のための脂質酸化に依存することを可能とする。本発明者らは、心臓ＡＮＧＰＴＬ２の抑制が、ＰＰＡＲα及びＰＧＣ−１αのｍＲＮＡレベルを著しく増加させ、この出来事は、細胞内のＡＴＰ産生に関連していることを示した。他でも報告されているように、ＡＫＴシグナル伝達が、ＰＰＡＲα及びＰＧＣ−１αの転写物レベルを増加させるようである。まとめると、病的肥大との関連で、ＡＮＧＰＴＬ２の不活性化は心機能とエネルギー代謝を回復する可能性が示唆される。
【００５６】
興味深いことに、心臓でのＡＮＧＰＴＬ２生産は、調査したＤＣＭ患者のほぼ４０％で起こっていた。このことは、心機能不全がＡＮＧＰＴＬ２活性によって悪化すること、そして、これらの患者の一団は、治療的ＡＮＧＰＴＬ２抑制の候補となり得ることを示唆している。これらの知見はまた、ＤＣＭなどの疾患の基礎となるメカニズムが個体間で異なること、そして、これらの疾患の治療には個別化医療のアプローチが必要なことを示唆している。また、明らかに活性なＡＮＧＰＴＬ２の生産を伴うＤＣＭ患者は、他のＤＣＭ患者よりも高齢であった。機能不全は、老化心臓においてよく認められるものであり、ＡＮＧＰＴＬ２の発現は、老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）に関連付けられているので、心臓ＡＮＧＰＴＬ２の活性化は、加齢に関連した機能障害に関連しているかもしれない。
【００５７】
Ａｎｇｐｔｌ２のｓｈＲＮＡを発現するＡＡＶ６ベクターを静脈内注射されたマウスは、非投与のマウスに比べ、ＴＡＣにより誘発される心臓肥大に関し重症度が低かった。ｓｈＲＮＡのより高い投与量は、低い投与量に比べ、心機能障害に対してより効果的であった。このことは、ＡＡＶ６遺伝子導入の有効性は投与量に依存することを示唆している。本実施例で用いたＡＡＶ６の投与量は、適切であると報告されているものよりも低い。従って、本実施例で用いたよりもより高用量のＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂの投与は、より効果的に心臓を保護できるであろう。心臓へのＡＡＶ伝達に影響を与える他の要因、たとえば、心臓への優先的な血清型の選択、又は、静脈内注射以外のデリバリーアプローチを用いることが、将来の臨床応用のために有用である。前述のＣＵＰＩＤ遺伝子治療治験を解釈するに当たり、研究者は、予想よりも少ない効果は低い遺伝子導入に起因するかもしれないと述べている。これに対し、ＡＮＧＰＴＬ２をターゲットとする遺伝子治療は、大動脈根と冠状静脈洞のＡＮＧＰＴＬ２濃度を比較することにより、遺伝子導入効率を容易にモニターすることができるという利点を有する。
【００５８】
要約すると、本発明者らにより、病的な心臓刺激により誘発されたＡＮＧＰＴＬ２活性により適応から不適応な心臓リモデリングへの移行を加速すること、そして、ＡＮＧＰＴＬ２の抑制は、心機能や心筋のエネルギー代謝を回復させ、病的リモデリングの進行を阻止できることが示された。本発明により、運動の有益な心臓保護効果を再現することができ、本発明は、定期的な運動に参加することができないＨＦ患者にも適用することができるものである。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６０】
１．材料及び方法
（１）動物実験
全ての実験手順は、熊本大学の動物実験倫理審査委員会によって承認された手順で行った。すべての動物は通常の食餌を与え、自動制御照明（１２時間オン、１２時間オフ）で、２３℃で飼育した。下記の実験で用いた遺伝子改変マウスは以下のとおりである：Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌバックグランドのＡｎｇｐｔｌ２ノックアウトマウス（Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＯ）、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌバックグランドのａＰ２プロモーターによって誘導されたＡｎｇｐｔｌ２過剰発現トランスジェニックマウス（ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ２）、Ｃ５７ＢＬ／６ＪバックグランドのマウスαＭＨＣプロモーターで誘導されたＥＧＦＰ過剰発現Ｔｇマウス（αＭＨＣ−ＥＧＦＰ）、及びＦＶＢ／ＮバックグランドのケラチノサイトでＡｎｇｐｔｌ２を過剰発現しているＴｇマウス（Ｋ１４−Ａｎｇｐｔｌ２）。Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスは、ヘテロ接合のブリーダーによって維持した。ＫＫ−Ａｙ及びｄｂ／ｄｂマウスは、日本クレアから購入した。【００６１】
（２−１）αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２トランスジェニックマウスの作成
マウスＡｎｇｐｔｌ２をコードするｃＤＮＡを、αＭＨＣプロモーター発現ベクターにクローン化した。発現ベクターは、シンシナティ小児病院医療センターの心臓研究所のジェフリー・ロビンス博士から提供を受けた。Ｔｇの子孫を同定するために、以下のフォワード及びリバースプライマーを用いてゲノムＰＣＲを行った：フォワードプライマー（５’−ＡＣＴＴＣＴＡＣＡＴＧＡＧＡＴＣＡＴＴＣ−３’（配列番号１８））、リバースプライマー（５’−ＧＧＴＡＴＴＣＴＣＡＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＴＡ−３’（配列番号１９））。同質遺伝子系統を維持するために、マウスは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウスと交配することによりヘテロ接合体として増殖させた。Ｆ２又はＦ３世代の動物をすべての実験に用いた。【００６２】
（２−２）ｍｉＲ−２２１／２２２コンディショナルＫＯマウス
Ｃ５７ＢＬ／６ＮバックグランドのｍｉＲ−２２１／２２２コンディショナルＫＯマウスは、German Research Center for Environmental Health（ドイツ）から提供を受けた。同質遺伝子系統を維持するために、野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウスと交配させてヘテロ接合体として繁殖させた。【００６３】
（３）横行大動脈縮窄圧負荷（ＴＡＣ）により誘発した心肥大マウスモデルの作成
約１０週齢の雄マウス（２３−２５ｇ体重）にＴＡＣ手術を施して、圧負荷を与えた。簡単に言えば、マウスを、ペントバルビタールの腹腔内注射によって麻酔して、左開胸から大動脈弓にアクセスし、アーチ形の胸部大動脈を、２７ゲージ針を用いて締め付けて、完全な狭窄圧を作り出した。擬似マウスは、大動脈の結束をせずに同じ手順を行った。【００６４】
（４）アンジオテンシンＩＩ処置
アンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）は、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び１ｍＭの酢酸に溶解した。アンジオテンシンＩＩは、ミニ浸透圧ポンプを用いてマウスの背部皮下組織に連続的に２週間投与した（３ｍｇ／ｋｇ／日）。ビークル処置群は、ビークル（１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ 酢酸）を用いて同じ手順を行った。【００６５】
（５）心筋細胞と非心筋細胞の単離
心室はαＭＨＣ−ＥＧＦＰトランスジェニックマウスから回収し（一試料当たり３つの心臓）、組織を小片に刻んだ後、０．０７５％のコラゲナーゼ、０．１２％のトリプシン及び０．０２％のＤＮａｓｅで、４０分間、３７℃で消化した。細胞を回収し、再懸濁した後、１００μｍメッシュフィルターを通して５０ｍｌの遠心チューブに入れた。細胞は最終的に、０．５ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡ）に再懸濁し、ＧＦＰ陽性（心筋細胞）及びＧＦＰ陰性（非心筋細胞）に、セルソーターをＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ（Becton Dickinson社製、米国）を用いて単離した。【００６６】
（６）組織学的分析
マウス心臓組織試料は、２４時間、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。ブロックは、４μｍ厚の切片に切断し、空気乾燥し、脱パラフィンした。形態、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）、又はマッソントリクロームを評価するために、切片をヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。スライドをマウントし、ＢＩＯＲＥＶＯ ＢＺ−９０００顕微鏡（キーエンス、日本）を用いて観察した。アレクサＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４結合ＷＧＡ及びＤＡＰＩ（４’，６ジアミド−２−フェニルインドール）染色後に、心筋細胞の大きさの定量化を行った。各心室について、ＢＺ−Ｈ２Ａソフトウェア（ＫＥＹＥＮＣＥ、日本）を用いて１００の心筋細胞を測定した。測定は、中心の円形の心筋細胞核のレベルで、その長軸方向に対して垂直に切断された心筋細胞に限定した。線維化領域の定量化は、青色に染色された領域を可視化することにより行った。線維化領域は、全心室の領域で割った青色染色領域の和としてイメージＪソフトウェア（国立衛生研究所）を用いて計算した。【００６７】
（７）リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Qiagen社、米国）を用いて単離した。ＤＮａｓｅ処理ＲＮＡはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ試薬キット（タカラバイオ株式会社、日本）を用いて逆転写した。心臓組織は、マルチビーズｓｈｏｃｋｅｒ（登録商標）を使用して均質化した。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＳＹＢＥＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑTMＩＩ（タカラバイオ株式会社、日本）及び及びサーマルサイクラーダイスリアルタイムシステム（タカラバイオ株式会社、日本）を用いて行った。相対的な転写産物量は、マウス、ラット、及びヒト試料中の１８Ｓ ｒＲＮＡレベルに対して正規化した。以下の遺伝子のフォワード及びリバースオリゴヌクレオチドをＲＴ−ＰＣＲに用いた。
マウス：Ｒｐｓ１８，Ａｎｇｐｔｌ２，ＢＮＰ，Ｍｙｈ７，ＣＴＧＦ，Ｃｏｌ１，Ｃｏｌ３ａ，ＰＧＣ−１α，ＰＧＣ−１β，Ｎｒｆ１，Ｎｒｆ２，ＲＸＲα，ＰＰＡＲα，ＦＡＴＰ，ＣＤ３６，Ｆａｂｐ３，Ａｃｓｌ１，ＣＰＴ１α，ＣＴＰ１β，Ａｃａｄｓ，Ａｃａｄｍ，Ａｃｏｘ１，ＮＤ６，ＮＤ４，ａｓ９，Ｃｙｔ．ｂ，Ｃｙｔ．ｃ，Ｃｏｘ１，Ｃｏｘ２，Ｃｏｘ３，ＡＴＰａｓｅ６，ＡＴＰ５ａ１，ＡＴＰ５ｂ。
ラット：Ｒｐｓ１８，Ａｎｇｐｔｌ２，ＡＮＰ，ＢＮＰ，ＭＹＨ７，Ｓｅｒｃａ２ａ，ＰＧＣ−１α，ＰＰＡＲα。
ヒト：ＰＲＳ１８，ＡＮＧＰＴＬ２，ＰＧＣ−１α，ＰＰＡＲα。【００６８】
（８）心エコー検査
マウスは予め胸の毛を除去した。マウスは、１．５−２．５％のイソフルラン吸入により麻酔し、撮像中、専用の動物保持具上で仰臥位にて維持した。心臓及び呼吸速度を連続的にモニターしながら、体温を一定に維持した。経胸壁心エコー検査は、ＭＳ ４００リニアアレイトランスデューサ（１８−３８ ＭＨｚ）を使用して、小動物イメージングのための専用の高周波超音波システム（ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ ＶＥＶＯ ２１００、Fujifilm VisualSonics Inc, カナダ）を用いて行った。Ｍモード記録を心室中部レベルで行った。全ての画像は、専用ソフトウェア（ＶＥＶＯ ２１００バージョン１．４）を用いて分析した。左心室（ＬＶ）壁の厚さ（ＬＶＰＷ）と内部空洞拡張期（ＬＶＩＤ；ｄ）及び収縮期（ＬＶＩＤ；ｓ）における直径を測定した。パーセントＬＶ短縮率（％ＦＳ）をＭモードの測定値から算出した。すべての手順は、遺伝子型又は処置に関して、二重盲検条件下で行った。【００６９】
（９）成人の心筋細胞における細胞ショートニングとＣａ2+トランジェントの測定
心室心筋細胞を酵素的に単離した後、単一心筋細胞における細胞ショートニングとＣａ2+トランジェントを公知の情報（Shioya, T. J Physiol Sci 57, 327-335 (2007)、Katanosaka, Y., et al., Nat Commun 5, 3932 (2014)）に従って測定した。Ｃａ2+トランジェントを１０ｍＭのＩｎｄｏ−１ ＡＭを負荷した心筋細胞で記録した。単離した心筋細胞は、倒立顕微鏡のステージ上で、２０倍水浸対物レンズを用いて、二極刺激装置に接続された２つの白金電極インサートを使用して、１ Ｈｚで、電場中で刺激した。細胞ショートニングとＩｎｄｏ−１の蛍光シグナルは、高性能Ｅｖｏｌｖｅ ＥＭＣＣＤカメラ（Photometrics、米国）を使用して記録し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（バージョン７．７．１．０；Molecular Devices、米国）により分析した。実験は、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充したタイロード溶液で細胞を灌流して行った。【００７０】
（１０）ウェスタンブロット分析
マウスの心臓組織を、溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％のトリトンＸ−１００、５０ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＦ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ｍＭのＮａ3ＶＯ4、にプロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライテスク、日本）を加えたもの、ｐＨ７．５）中で、ｓｈｏｃｋｅｒ（登録商標）を用いてホモジナイズした。総タンパク質（２０μｇ）又は血清（０．１μｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜を、１：１０００倍希釈した抗ＰＤＫ１（＃３０６２）、抗Ｐ−ＰＤＫ１（Ｓ２４１）（＃３４３８Ｓ）、抗ＡＫＴ（＃９２７２Ｓ）、抗Ｐ−ＡＫＴ（ｓ４７３）（＃９２７１）、抗Ｐ−ＡＫＴ（Ｔ３０８）（＃４０５６）、抗ｍＴＯＲ（＃２９８３）、抗ｐ−ｍＴＯＲ（ｓ２４４８）（＃５５３６）、抗ｐ−ｍＴＯＲ（ｓ２４８１）（＃２９７４）、抗ｐ７０Ｓ６Ｋ（＃９２０２）、抗ｐ−ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）（＃９２０５Ｓ）、抗Ｅｒｋ（＃９１０２Ｓ）、抗ｐ−ＥＲＫ（Ｔ２０４／ｙ２０２）（＃９１０６Ｓ）、抗ＡＭＰＫ（＃２５３２Ｓ）、抗ｐ−ＡＭＰＫ（Ｔ１７２）（＃２５３５）（以上は、Cell Signaling Technology、米国）、又は抗Ｓｅｒｃａ２ａ（ａｂ３６２５；Abcam社、米国）と共に、４℃で、一晩インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、膜を、１：２０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体と共に６０分間室温でインキュベートした。Ａｎｇｐｔｌ２の免疫ブロッティングは、膜を、１：３０００倍希釈したビオチン化ヤギ抗Ａｎｇｐｔｌ２抗体と４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、膜を、１：６０００倍希釈したＨＲＰ結合ストレプトアビジンと室温で６０分間インキュベートした。内部コントロールとして、１：２０００倍希釈したマウス抗Ｈｓｃ７０（ＳＣ−７２９８；Santa Cruz Biotechnology、米国）抗体及び１：２０００倍希釈したＨＲＰ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を、それぞれ、第一及び二次抗体として使用した。ブロットを、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬とインキュベートし、発光イメージアナライザーＬＡＳ−４０００システム（富士フイルム、日本）を用いて可視化し、マルチゲージソフトウェア（富士フイルム、日本）を用いて定量化した。Ｈｓｃ７０は、正規化のために使用した。【００７１】
（１１）細胞内ＡＴＰの測定
心臓組織におけるＡＴＰレベルは、製造業者の説明書に従って、ＡＴＰアッセイキット（東洋インキ社製、日本）を用いて決定した。簡単に述べると、心臓組織片（１００ｍｇ）を１０ｍｌのホモジネート緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、０．２５Ｍのスクロース）中でホモジナイズし、１０分間、４℃で、１，０００×ｇで遠心分離した。上清を、氷上で、ホモジネート緩衝液で８倍に希釈した。混合物１００μｌを、１００μｌのＡＴＰ抽出液と混合し、発光をルミノメーターモデルＴＤ−２０／２０（Turner Designs、日本）で測定した。
ＮＲＣＭｓにおけるＡＴＰレベルは、同じキットを用いて測定した。簡単に述べると、細胞を形質導入した４８時間後に、ＮＲＣＭｓ（２×１０5細胞）をＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌのＰＢＳ中に懸濁した。細胞懸濁液は、９６ウェルプレートに入れ、ＡＴＰアッセイ溶液１００μｌを加えた。１分間振盪、次いで、室温で１０分間インキュベートした後、発光をＦＬＵＯＲＯＳＫＡＮ上昇マイクロプレートルミノメーター（Thermo Fisher Scientific Inc.、米国）を用いて測定し、次いで、Ａｓｃｅｎｔ・ｓｏｆｔｗａｒｅ・ｖｅｒｓｉｏｎ２．６を用いて分析した。【００７２】
（１２）ＮＲＣＭの培養
ＮＲＣＭｓを公知の報告（Yoshikawa, N., et al., Am J Physiol Endocrinol Metab 296, E1363-1373 (2009)）に従って調製した。簡単に述べると、１〜２日齢の新生仔ウィスターラットの心室を、０．０６％のトリプシン、０．０２５％のコラゲナーゼＩＩ、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ中で２０分間処理し、解離した。心筋細胞は、パーコール密度勾配手順によって別々に調製した。ＮＲＣＭｓを回収し、コラーゲン（タイプＩ）コートされた２４ウェル培養プレートに１×１０5細胞／ｃｍ2で播種した。細胞を、１０％のウシ胎児血清及び抗生物質を補充した１９９／ＤＭＥＭ培地（Life Technologies社、米国）中で、５％ＣＯ2で３７℃の加湿雰囲気中で増殖させた。２４時間後に、特に記載のない限り、種々の試薬又はアデノウイルス感染の処理に先だって培地を交換した。【００７３】
ＮＲＣＭｓにおけるＡＮＧＰＴＬ２ノックダウンの作成は、製造業者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉ ＭＡＸ試薬（Life technologies、米国）を使用して、ＮＲＣＭｓを、Ｍｉｓｓｉｏｎ ｓｉＲＮＡ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｎｅｇａｔｉｖｅコントロール（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ；Sigma-Aldrich社）、又は３つのＡｎｇｐｔｌ２を標的とした有効なＭｉｓｓｉｏｎ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｎｇｐｔｌ２−Ａ：ＳＡＳＩ＿Ｒｎ０１＿０００９３８０２：ＧＧＡＵＣＵＵＡＣＵＣＡＣＵＣＡＡＧＡＴＴ（配列番号２０）、ｓｉＡｎｇｐｔｌ２−Ｂ：ＳＡＳＩ＿Ｒｎ０１＿０００９３８００：ＧＡＧＡＧＵＡＣＡＵＵＵＡＣＣＵＣＡＡＴＴ（配列番号２１）、ｓｉＡｎｇｐｔｌ２−Ｃ：ＳＡＳＩ＿Ｒｎ０１＿０００９３７９９：ＣＣＡＧＡＡＡＧＣＧＡＧＵＡＣＵＡＵＡＴＴ（配列番号２２）、Sigma-Aldrich社）でトランスフェクトした。４８時間後に、細胞をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲのためにＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）（コスモバイオ、日本）で処理した、又は、細胞を回収してイムノブロット分析のための溶解緩衝液で溶解した。【００７４】
ＮＲＣＭｓでの活性ＮＦＡＴの過剰発現のために、製造業者の指示に従って、Ａｍａｘａ ｒａｔ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ−ｎｅｏｎａｔａｌ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ（登録商標）又はＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ（登録商標）（Lonza、米国）を用い、ネガティブコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１、又はDr. Takashi Minami（熊本大学生命資源研究・支援センター、日本）より提供された活性なマウスＮＦＡＴｃ３発現プラスミドとともにエレクトロポレートした。エレクトロポレーション後、細胞を播種し、２４時間培養した。【００７５】
Ａｎｇｐｔｌ２を発現する組換えアデノウイルス（ＡＤ−Ａｎｇｐｔｌ２）の生産は、タカラバイオ株式会社（日本）に依頼して行った。簡単に言うと、マウスＡｎｇｐｔｌ２ ｃＤＮＡは、ｐＡｘＣＡｗｔｉｔ２コスミドベクター（タカラバイオ株式会社、日本）のＳｍｉ Ｉ部位にクローニングし、２９３細胞にトランスフェクトした。ドミナントネガティブＡＫＴ（ＡＤ−ｄｎＡＫＴ）及びＬａｃＺ（ＡＤ−ＬａｃＺ）を発現する組換えアデノウイルスは、Dr. Tadashi Kadowaki（代謝病科、東京大学、日本）より提供を受けた。ＮＲＣＭｓは、ＭＯＩ ５０で播種した１時間後にアデノウイルスベクターに感染させた。次いで新しい培地と交換し、その後４８時間培養した。【００７６】
Ａｎｇ ＩＩ及びイソプロテレノール（ＩＳＯ；Sigma-Aldrich社）の処置は、ＮＲＣＭｓを、６時間及び１２時間、１００ｎＭのＡｎｇ ＩＩ又は１００ｎＭのＩＳＯで刺激した。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）処置は、ＮＲＣＭｓを、ＣｓＡで３０分間前処理し、次いで、Ａｎｇ ＩＩ及びＩＳＯで処置した。【００７７】
ＮＦＡＴの免疫細胞化学染色は、ＮＲＣＭｓを、無血清培地中で、１００ｎＭのＡｎｇ ＩＩの有無で、コラーゲンコートされたカバーガラス上に置いて行った。１２時間後、細胞を、ＰＢＳで軽く洗浄し、５分間、４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定し、そして、１５分間、０．４％のトリトンＸ−１００で処理して透過性とした。３％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳでブロックすることにより非特異的結合を最小化した。細胞を、１μｇ／ｍｌの、抗ＮＦＡＴＣ１ポリクローナル抗体（ｓｃ−７２９４、SantaCruz Biotechnology、米国）又は抗ＮＦＡＴＣ４ポリクローナル抗体（ａｂ６２６１３；Abcam、米国）とともにインキュベートし、次いで、アレクサＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８結合抗ウサギ抗体とインキュベートした。核は、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。画像は、蛍光顕微鏡（モデルＢＺ−９０００）を用いて取得した。【００７８】
（１３）持久運動トレーニング
１０週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウスは、動きの制限なしで、３０分間トレッドミル室（モデルＭＫ−６８０ＡＴ／０２Ｍ、室町株式会社、日本）で適応させた。マウスには、その後１５分間、ウォームアップのトレッドミル内ランニングをさせ（５メートル／分で５分間、１０メートル／分で５分間、及び１５メートル／分で５分間）、次いで、本当の持久運動トレーニングを開始した。急性の持久運動として、２０メートル／分で６０分間のトレッドミルランニングをマウスに開始した。慢性持久運動として、１５分間のウォームアップ及びそれに続く２０メートル／分での６０間のトレッドミルランニングを、１週間に５日、３週間マウスに繰り返した。最後のランニング運動の３時間後にマウスを安楽死させ、心臓組織を分析した。【００７９】
（１４）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
レポータープラスミド（Ｆｌｕｃ−Ａｎｇｐｔｌ２−３’ＵＴＲ）を構築するために、マウスＡｎｇｐｔｌ２の３’ＵＴＲをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってゲノムＤＮＡから増幅した後、ｐＧＬ３−プロモーターベクター（Promega、米国）中のホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）遺伝子の下流のＸｂａ Ｉ部位にクローニングした。Ａｎｇｐｔｌ２ ３’ＵＴＲからｍｉＲ−２２１／２２２結合部位を削除するために、以下のプライマーセットを設計した：５’−ＣＡＴＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＣＴＧＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧＧＧＡＧＧ−３’（配列番号２３）及び５’−ＡＧＡＡＣＡＴＧＡＧＡＡＡＴＧＣＴＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＣＡＧ−３’（配列番号２４）。Ａｎｇｐｔｌ２−３’ＵＴＲレポーターにおけるｍｉＲ−２２１／２２２結合部位の削除（Ｆｌｕｃ−Ａｎｇｐｔｌ２−３’ＵＴＲ−Δ２２１／２２２）は、製造元の手順に従い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ突然変異誘発基礎キット（タカラバイオ株式会社、日本）を用いて行った。ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２０４又はｍｉＲ−１３５ａの過剰発現ベクターは、ｐＢＡｐｏ−ＣＭＶ（タカラバイオ株式会社、日本）への完全長の成熟マイクロＲＮＡ配列を含む配列を挿入することによって構築した。ＮＲＣＭｓを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００試薬（Life technologies、米国）を使用して、ネガティブコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．１と、或いはマイクロＲＮＡをコードするプラスミド及びウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ）又はＦｌｕｃ−Ａｎｇｐｔｌ２−３’ＵＴＲかＦｌｕｃ−Ａｎｇｐｔｌ２−３’ＵＴＲ−Δ２２１／２２２のいずれかをコードするｐｈＲＬ−ＴＫベクター（Promega、米国）とともにトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、製造元の指示に従って、デュアル・グロ・ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega、米国）を用いて決定した。【００８０】
（１５）組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）処理
組換えＡＡＶ６ベクターの生産及び精製は、タカラバイオ株式会社（日本）に依頼して行った。簡単に説明すると、ｓｈＲＮＡ合成のために、マウスＡｎｇｐｔｌ２を標的とするｓｉＲＮＡをもつ一本鎖のオリゴヌクレオチド（ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ａ、ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂ）、及びコントロールとしてｓｈＳｃｒａｍｂｌｅ）と、その相補鎖を以下のように設計した。Ａ−ｔｏｐ：５’−ＣＴＡＧＡＧＡＧＡＧＴＡＣＡＴＴＴＡＣＣＴＣＡＡＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＧＧＴＡＡＡＴＧＴＡＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号２５）、及びＡ−ｂｏｔｔｏｍ：５’−ＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＴＡＣＡＴＴＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＴＡＴＴＧＡＧＧＴＡＡＡＴＧＴＡＣＴＣＴＣＴ−３’（配列番号２６）、Ｂ−ｔｏｐ：５’−ＣＴＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＧＡＧＴＡＣＴＡＴＡＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号２７）、及びＢ−ｂｏｔｔｏｍ：５’−ＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＧＡＧＴＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＴＡＴＡＴＡＧＴＡＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＧＧＣＴ−３’（配列番号２８）、Ｓｃｒａｍｂｌｅ−ｔｏｐ：５′−ＣＴＡＧＡＧＴＣＴＴＡＡＴＣＧＣＧＴＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧＧＣＣＴＴＡＴＡＣＧＣＧＡＴＴＡＡＧＡＣＴＴＴＴＴＴＡ−３′（配列番号３７）、及びＳｃｒａｍｂｌｅ−ｂｏｔｔｏｍ：５′−ＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＡＧＴＣＴＴＡＡＴＣＧＣＧＴＡＴＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＡＣＧＣＧＡＴＴＡＡＧＡＣＴ−３′（配列番号３８）。それぞれの配列における、マウスＡｎｇｐｔｌ２を標的とするセンス鎖配列又はアンチセンス鎖配列を下線で示した。なお、下線を付した配列の間の配列（ＴＡＧＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴＴＧ（配列番号１６）、及び、ＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＣＴＡ（配列番号１７））はループ配列である。
一本鎖オリゴ（ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ａ、ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂ、及びｓｈＳｃｒａｍｂｌｅ）をアニールし、ｐＡＡＶ−２ｘＵ６ベクター（タカラバイオ株式会社、日本）にクローニングした。組換えＡＡＶ６ベクターは、ＡＡＶｐｒｏヘルパーフリーシステム（タカラバイオ株式会社、日本）を用いて製造し、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって精製して、次いでＰＢＳに対して透析した。ゲノムコピー数は、ＡＡＶｐｒｏ滴定キット版（リアルタイムＰＣＲ用）バージョン２（タカラバイオ株式会社、日本）を用いて測定した。【００８１】
ＴＡＣ動物の分析のために、１０週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウスに対してＴＡＣ手術を行い、２週間後に、２％のイソフルランで麻酔し、静脈内に、組換えＡＡＶ６ベクターを１×１０10 ｖｇ又は３×１０10 ｖｇで注射した。心機能は、注射の前（ＴＡＣ処置の２週間後）、及び注射の２週間後、４週間又は５週間後に心エコー検査を用いて測定した。４週目又は５週目の心エコー検査の後、マウスを安楽死させ、心臓組織の、組織学的検査、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、及びイムノブロット分析を行った。いくつかの実験においては、１０週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌマウスにて、静脈内に、１×１０10 ｖｇ／マウス又は３×１０10 ｖｇ／マウスで組換えＡＡＶ６ベクターを注射した。注射の２週間後に、マウスを安楽死させ、心臓組織のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及びイムノブロット分析を行った。【００８２】
（１６）ヒトｉＰＳ由来心筋細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２ノックダウンの作成
ヒトｉＰＳ細胞株２５３Ｇ４又は８３６Ｂ３は多能性細胞である。両株の心筋細胞への分化誘導は、公知の報告（Tohyama, S., et al., Cell Stem Cell 12, 127-137 (2013). Uosaki, H., et al., PLoS One 6, e23657 (2011). Hemmi, N., et al. Stem Cells Transl Med 3, 1473-1483 (2014)）に従って行った。製造元の説明書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉ ＭＡＸ試薬（Life technologies、米国）を用いて、誘導した心筋細胞を、Ｍｉｓｓｉｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Sigma-Aldrich社、米国）、又はヒトＡＮＧＰＴＬ２を標的としたｓｉＲＮＡ（ｓｉＡＮＧＰＴＬ２−Ａ：ｓ２３８５５：ＧＧＡＡＣＡＵＵＧＡＣＧＧＣＧＡＡＵＡＴＴ（配列番号２９），ｓｉＡＮＧＰＴＬ２−Ｂ：ｓ２３８５４：ＧＡＧＡＧＵＵＣＡＵＵＵＡＣＣＵＡＡＡＴＴ（配列番号３０），ｓｉＡＮＧＰＴＬ２−Ｃ：ｓ２３８５３：ＧＧＣＵＣＵＵＡＣＵＣＡＣＵＣＡＡＧＡＴＴ（配列番号３１），ｓｉＡＮＧＰＴＬ２−Ｄ：ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００４２８０２：ＧＧＣＡＵＵＧＵＧＡＧＣＧＡＧＧＵＧＡＴＴ（配列番号３２），ｓｉＡＮＧＰＴＬ２−Ｅ：ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００４２８０３：ＧＣＣＡＵＵＡＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＵＡＴＴ（配列番号３３），ｓｉＡＮＧＰＴＬ２−Ｆ：ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００４２８０４：ＧＵＵＵＣＣＧＣＣＵＧＧＡＡＣＣＵＧＡＴＴ（配列番号３４），ｓｉＡＮＧＰＴＬ２−Ｇ：ＳＡＳＩ＿Ｈｓ０１＿０００４２８０６：ＧＡＡＡＣＵＧＵＧＣＣＣＡＣＵＡＣＣＡＴＴ（配列番号３５））でトランスフェクトした。ｓｉＡＮＧＰＴＬ２−Ａ，Ｂ，及びＣは、Life technologies から購入し、ｓｉＡＮＧＰＴＬ２−Ｄ，Ｅ，Ｆ，及びＧは、Sigma-Aldrich から購入した。それぞれの配列のヒトＡＮＧＰＴＬ２配列（配列番号１）上の位置を図２４に示す。トランスフェクションの１２時間後に、培地を交換し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。トランスフェクトされた細胞からの馴化培地中のＡＮＧＰＴＬ２濃度は、製造元の説明書に従って、ＡＮＧＰＴＬ２ ＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ、日本）を用いて概算した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲのためにＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）で細胞を処理、又はイムノブロット分析のために細胞を回収し、ＲＩＰＡ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１％のノニデットＰ−４０、１ｍＭのＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ７．５）で溶解した。【００８３】
（１７）ヒトでの試験
拡張型心筋症（ＤＣＭ）に罹った５８人の患者（４０人の男性と１８人の女性；平均年齢±ＳＥＭ、５４．７±１．７）が試験に登録された。２６人は、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）クラスＩに分類され、２７人はクラスＩＩに、５人はクラスＩＩＩであった。過去３ヶ月以内に急性ＨＦが発現した者又は腎機能障害［推定糸球体濾過率（ＥＧＦＲ）が３０ｍｌ／分／１．７３ｍ2未満］を持つ者は試験から除外した。すべての被験者に対し、冠動脈疾患の可能性を排除するために冠動脈造影を、そして、心筋炎又は特定の筋肉疾患を除外するために心内膜心筋生検を行った。ＤＣＭは、左心室の（ＬＶ）駆出率（ＥＦ）が５０％未満（コントラスト左室造影により明らかになる）であることと、５０％を越える冠動脈狭窄、心臓弁膜症、動脈性高血圧、及び公知の全身症状に起因する二次性心筋疾患が存在しない場合の拡張したＬＶ腔の両方が認められる場合と定義される。急性ウイルス性心筋炎又は家族性ＤＣＭの履歴をもつ患者はいなかった。免疫トリガーが原因でＤＣＭの進展を起こしていることを示す証拠をもつ患者もいなかった。患者は、心臓カテーテルのために大学病院へ紹介される前は安定した状態であった。書面によるインフォームドコンセントを心臓カテーテルの実施前に各患者から得た。試験は、名古屋大学大学院医学研究科のヒト倫理委員会によって承認され（プロトコル承認番号３５７−９、２０１５年３月１６日）、行われた。【００８４】
（１８）心臓カテーテル分析
すべての患者は、以前の報告（Okamoto, R., et al. Int Heart J 54, 202-206 (2013). Sakakibara, M., et al.Diabetes Res Clin Pract 92, 348-355 (2011).）のようにして左右心カテーテル診断を受けた。簡単に言うと、肺動脈楔入圧（ＰＣＷＰ）、及び心拍出量（ＣＯ）を、右内頸静脈を通して挿入したスワンガンツカテーテルを用いて測定した。心係数（ＣＩ）は以下の式により算出した：ＣＩ＝ＣＯ／体表面積（Ｌ／分／ｍ2）。右橈骨又は大腿動脈を介して、冠動脈造影と左心室造影も行った。６Ｆの液体で充たされたピグテールカテーテルを、ＬＶ圧を測定するために左心室に配置した。ＥＦは、area-length法を用いて、左心室造影により評価した。血清ＡＮＧＰＴＬ２の経心臓放出を調べるために、両心室カテーテル時に、大動脈基部（Ａｏ）からのＡＮＧＰＴＬ２と冠状静脈洞（ＣＳ）からのＡＮＧＰＴＬ２を同時に採取した。血清ＡＮＧＰＴＬ２レベルはヒトＡＮＧＰＴＬ２ ＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ、日本）を用いて測定した。【００８５】
（１９）ヒト患者の超音波心エコー分析
二次元心エコー検査は、報告（Okamoto, R., et al. Int Heart J 54, 202-206 (2013)）に従って、ＶＩＶＩＤ７システム（ＶｉＶｉｄ７、ＧＥヘルスケア、米国）を用いて行った。ＬＶエンド拡張期寸法（ＬＶＤｄ）、ＬＶ収縮末期寸法（ＬＶＤｓ）、及び左動脈寸法（ＬＡＤ）を測定した。パーセント短縮率（％ＦＳ）は、ＬＶＤｄ及びＬＶＤｓから計算した。ＬＶ質量指数（ＬＶＭＩ）は米国カルディオロジー協会により承認された式に従って、二次元の測定値から算出した。【００８６】
（２０）免疫組織学的解析
ヒト心臓組織サンプルは、うっ血性心不全（ＣＨＦ）患者及び非ＣＨＦ患者を含む患者からバイオプシーにより得た。全ての場合において、書面によるインフォームドコンセントを、関連する家族から入手した。試験はまた、熊本大学の倫理委員会によって承認された上で行った。ヒト心臓組織サンプルは、２４時間、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。ブロックは、４μｍ厚の切片に切断し、空気乾燥し、脱パラフィンした。免疫組織化学的分析のために、切片を、過ヨウ素酸で前処理して、内因性ペルオキシダーゼを阻害した。その後試験片は、ヒトＡＮＧＰＴＬ２のアミノ酸３８３−４００（ＳＦＲＬＥＰＥＳＥＹＹＫＬＲＬＧＲＹ（配列番号３６））に対応する合成ペプチドをウサギに免疫して産生した、ウサギポリクローナル抗ヒトＡＮＧＰＴＬ２抗体を１００倍に希釈したものとともに４℃にて一晩インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、試験片を、二次抗体としてペルオキシダーゼと結合したヤギ抗ウサギＩｇＧを５００倍希釈したものと共に、６０分間、室温でインキュベートした。次いで、試験片をヘマトキシリンで対比染色した。ネガティブコントロールとして、同じ手順を、一次抗体の代わりにアイソタイプコントロールＩｇＧ用いて行った。ペルオキシダーゼ活性は、３，３−ジアミノベンジジン溶液でインキュベーションすることによって可視化し、光学顕微鏡（モデルＢＺ−９０００）によって分析した。二重免疫蛍光染色は、ウサギポリクローナル抗ヒトＡＮＧＰＴＬ２抗体（１：１００）、ヤギポリクローナル抗ヒトαＭＨＣ（１：１００）、マウスモノクローナル抗ヒトＣＤ３１（１：１００）、及びヤギポリクローナル抗ヒトペリオスチン（１：１００）と共に用いた。アレクサＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８結合抗ウサギ又はアレクサＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４結合抗ヤギ／マウス抗体（１：２００）を二次抗体として用いた。ＰＢＳで洗浄後、蛍光画像を共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ４１０、Zeiss、ドイツ）によって取得した。【００８７】
（２１）統計解析
すべての値は、平均±ＳＥＭとして記載した。データは、不対の両側ｔ検定によって、変数の２群の比較で評価した。カプラン・マイヤーログランク検定をマウスの生存データを分析するために適用し、グラフパッドプリズムソフトウエア（バージョン５．０、グラフパッドソフトウェア）を用いて計算した。Ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意とみなされた。【００８８】
２．実験結果
（実施例１）マウスの病理学的心臓肥大におけるＡＮＧＰＴＬ２発現増加
心臓におけるＡＮＧＰＴＬ２機能を評価するために、ＴＡＣを用いた過酷な圧負荷により誘導したマウス心肥大モデルの心臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルを測定し、擬似コントロールマウスのレベルと比較した。野生株マウスを用い、ＴＡＣ又は擬似手術を行い、６週間後に、ウェスタンブロットによりタンパク質の発現を測定した。結果を図１の左図に示す。ＴＡＣマウスの心臓組織で観察されたＡＮＧＰＴＬ２のタンパク質レベルは、コントロールマウスに比べて高かった。【００８９】
また、ＴＡＣ処理をしたマウスは、左心室の拡張を伴う心肥大、短縮率（ＦＳ）の減少、胎児心臓遺伝子（例えば、心不全マーカーであるＡＮＰ、ＢＮＰ、及びＭｙｈ７など）と心臓線維化マーカー（ＣＴＧＦ、Ｃｏｌ１、及Ｃｏｌ３ａ１）の発現の増加、及び、左心室の拡張を伴う収縮機能障害によるＨＦｒＥＦの進展が観察された（データは示さず）。【００９０】
さらに、アンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ ＩＩ）で誘導した病的肥大のマウスモデルを用いて心臓のＡＮＧＰＴＬ２タンパク質のレベルを検討した。Ａｎｇ ＩＩ処理又はコントロールのビークル処置をした２週間後に、上記と同様にしてＡＮＧＰＴＬ２タンパク質のレベルを確認した。結果を図１の右図に示す。ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルは、コントロールに比べて、Ａｎｇ ＩＩで誘導した病的肥大において有意に増加していた。【００９１】
このＡｎｇ ＩＩ誘導モデルでは、マウスは、左心室の拡張を示さず、短縮率（ＦＳ）は維持されていたが、ＡＮＰ、ＢＮＰ、Ｍｙｈ７、ＣＴＧＦ、のＣｏｌ１、及びＣｏｌ３ａ１の発現増加を示した（データは示さず）。このことは、Ａｎｇ ＩＩ誘発性肥大が、ＨＦｐＥＦに関連した病的な心臓リモデリング事象であることを示唆している。【００９２】
次いで、心筋細胞特異的プロモーターαＭＨＣの制御下で増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現するトランスジェニックマウス（αＭＨＣ−ＥＧＦＰ Ｔｇマウス）から、心筋細胞と非心筋細胞をそれぞれ採取し、免疫ブロットを行った。結果を図２（ａ）に示す。ＡＮＧＰＴＬ２の発現は、ＧＦＰ陰性非心筋細胞よりもＧＦＰ陽性心筋細胞においてより豊富であった。さらに、ＴＡＣ処置又はＡｎｇ ＩＩ処置したマウスにおいて、ＲＴ−ＰＣＲ分析を行ったところ、図２（ｂ）及び（ｃ）に示されるように、ＴＡＣ及びＡｎｇ ＩＩ誘発性の肥大心の両方において、ＧＦＰ陽性心筋細胞でＡＮＧＰＴＬ２の発現が増加していた。このことは、病理学的リモデリングにおいて、ＡＮＧＰＴＬ２の発現の増加が心筋細胞で一次的に発生することを示唆している。【００９３】
（実施例２）心筋細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２の過剰発現マウスの心機能障害
心臓におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の増加が、病的リモデリングを促進するかどうかを検討した。検討のために、αＭＨＣプロモーターの制御下で心筋細胞にＡＮＧＰＴＬ２を過剰発現する４つのトランスジェニックマウス系統（αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウス）を作成した。全ての系統で出生時には正常であり、ＡＮＧＰＴＬ２のアップレギュレーションが心臓発生においてひどい混乱を引き起こさないことが示された。３つの系統（＃１−９、＃２−３、及び＃２−１４）は、ＴＡＣ誘発性の肥大に見られるのと同様の、心臓におけるＡＮＧＰＴＬ２発現増加を示した。これらの３つの系統を以下の実験に用いた。【００９４】
図３に示すように、野生型同腹子と比較すると、８週齢αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウスは、心収縮機能障害を示し、そして、１２週齢のトランスジェニックマウスは、短縮率の減少、及び心不全マーカーＡＮＰとＭｙｈ７及び線維症マーカーＣＴＧＦとのＣｏｌ１の発現増加を伴う心筋細胞肥大を示した。【００９５】
心機能障害は、心筋細胞における異常なＣａ2+輸送と関連づけられる。ＡＮＧＰＴＬ２を過剰発現する心筋細胞の興奮収縮（ＥＣ）カップリングを評価するために、αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２のＴｇ及び野生型対照マウスから単離した単一細胞にて、１ Ｈｚで電気刺激により誘発される収縮性及びＣａ2+移行を分析した。結果を図４に示す。短縮率は、対照に比べてＡＮＧＰＴＬ２を過剰発現する心筋細胞で著しく減少していた（図４ａ）。さらに、ＡＮＧＰＴＬ２を過剰発現する心筋細胞では、電気的に誘発されたＣａ2+移行の大きさは、野生型の６８％の値であった（図４ｂ及びｃ）。ピーク［Ｃａ2+］ｉに達する時間及びＣａ2+移行減衰の時定数は、ＡＮＧＰＴＬ２過剰発現心筋細胞で延びていた（図４ｂ、ｄ及びｅ）。更に、αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウスからの心筋細胞の筋小胞体（ＳＲ）中の Ｃａ2+値は、野生型マウスに比べて有意に低かった（図４ｆ）。全体として、これらの知見は、増加したＡＮＧＰＴＬ２の発現が、心筋細胞における収縮とのＣａ2+循環を損なうことを示している。【００９６】
ＴＡＣ処置の３週間後には、野生型マウスは、左心室拡張なしの心臓の適応肥大に発展したが、αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウスは、短縮率の高度の低下を伴う左心室の著しい拡張に発展し、それは、肺うっ血を伴うＨＦｒＥＦへと発展した（データは示さず）。組織学的分析及びマーカー分析によって推定される心臓線維症は、対照と比較してＡｎｇｐｔｌ２αＭＨＣ−Ｔｇマウスで有意に増加した。組織学的分析結果を図５に、マーカー分析結果を図６に示す。
ＴＡＣ処置の８週間後には、殆どのαＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウスは死亡したが、この時点では対照のマウスは殆ど死ななかった。結果を図７に示す。さらに、超音波心エコー検査の結果、短縮率によって推定されるように、野生型マウスは心臓の収縮機能を維持したが、一方、アンギオテンシンＩＩモデルで分析したαＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウスは減少した短縮率に起因する深刻な心臓の収縮機能障害を示した。心臓線維症及び、心不全及び線維症のマーカーの発現が、対照マウスと比較してαＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇで有意に増加していた。これらの知見は、心臓ＡＮＧＰＴＬ２の誤発現が、心臓の収縮を減少させることによって、ＨＦに導くことを示している。【００９７】
（実施例３）循環ＡＮＧＰＴＬ２による病的肥大又は心機能不全の促進
ＴＡＣ処理は循環しているＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルを上昇させるので、循環ＡＮＧＰＴＬ２が心機能不全の内分泌効果を持っているかどうかを検討した。本発明者らは以前、食餌誘導性肥満マウスは、脂肪組織におけるＡＮＧＰＴＬ２発現と、循環ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルを増加させることを報告している（Tabata M. et al. Cell Metab. 10, 178-188 (2009)）。そこで、２つの遺伝性肥満糖尿病マウスモデル（ｄｂ／ｄｂ及びＫＫ−Ａｙ）を用いて検討した。このモデルでは、対照に比べて、心臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルは同等であったのに対し、循環ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルは上昇していた。超音波心エコー検査の結果、非肥満の対照に対して、ｄｂ／ｄｂ又はＫＫ−Ａｙマウスでは、心臓肥大、心室拡張、又は心機能障害はなかった。いずれの肥満モデルでも、心臓におけるＡＮＰ、ＢＮＰ及びＭｙｈ７発現は対照に比較して変化がなかった。
さらに、野生型の対照に比べて循環ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルが上昇している、Ｋ１４プロモーターの制御下で皮膚にＡＮＧＰＴＬ２を過剰発現するトランスジェニックマウス（Ｋ１４−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウス）を用いて検討した。このＴｇマウスは、心臓のＡＮＧＰＴＬ２タンパクレベルは野生型と同等である。超音波心エコー検査及びＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、Ｔｇマウスと野生型対照の間で、心臓の表現型又は分子マーカーに差が無いことが判った。このことは、心臓リモデリングにおいて、循環ＡＮＧＰＴＬ２の内分泌影響がないことを示唆している。【００９８】
ａＰ２プロモーターの制御下でＡＮＧＰＴＬ２を過剰発現するトランスジェニックマウス（ａＰ２の−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウス）もまた、対照に比べ、循環ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルの増加を示す。ａＰ２／脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）が脂肪細胞及びマクロファージにおいて発現されていることは繰り返し報告されているが、免疫ブロッティングの結果、対照に比べ、ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウスの心臓部でＡＮＧＰＴＬ２の発現が有意に上昇していることを確認した。興味深いことに、８週齢のａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウスは対照に対し低下した短縮率を示し、１６週齢のＴｇマウスは低下した短縮率を伴う心肥大を示した。ＴＡＣ処置の３週間後に、野生型マウスは、左心室の拡張なしに適応心臓肥大が起こり、一方、ａＰ２の−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウスは、進行性の減少した短縮率を伴う左心室拡張を起こし、肺うっ血を伴うＨＦｒＥＦとなった。ａＰ２−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウスにおいて見られる血管周囲線維症の面積も、対照に比べ、有意に拡張していた。心不全マーカー及び線維症のマーカーの発現も観察された。これらの知見は、他の組織に由来する循環ＡＮＧＰＴＬ２よりも、心臓から局所的に由来するＡＮＧＰＴＬ２が病的な肥大又は心機能不全を促進することを示唆している。【００９９】
（実施例４）Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスでの慢性圧負荷下での心臓肥大からＨＦへの進展の検討
心臓でのＡＮＧＰＴＬ２欠損が病的リモデリングへと変化させるかどうかを評価するために、Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウス表現型を調べた。Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスは出生時には正常であり、肉眼における心臓表現型を示さなかった。対照と比較して、６週齢のＡｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスは心臓の収縮機能の増加を示し、１２週齢のＡｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスは増加した心臓の収縮機能を伴う心筋細胞肥大を呈した（データ示さず）。しかしながら、Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスの心臓においては、心不全マーカーの発現は相対的に減少していた（図８）が、一方、線維化マーカーは変化がなかった（図８）。このことは、ＴＡＣ処置なしでＡｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスで見られた心肥大が病的ではないであろうことを示唆している。【０１００】
ＴＡＣ処理後６週間までに、対照の野生型は、減少した短縮率を伴う左心室の拡張が進展し、それは、ＨＦｒＥＦへと進展した。Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスもまた、短縮率の減少を示したが、それは同腹子の対照よりも少ない程度であり、心室拡張せずに適応心臓肥大を維持した（データ示さず）。ＡＮＰ、ＢＮＰ、及びＭｙｈ７の発現が、対照マウスに比べてＡｎｇｐｔｌ２ ＫＯで有意に減少していたが、一方、線維症マーカーは同等であった（データは示さず）。これらの知見は、心臓でのＡＮＧＰＴＬ２欠損は、心臓の収縮性を増加させ、圧負荷下で、ＨＦへの進展に対する耐性を細胞に与えることを示唆している。Ａｎｇ ＩＩモデルでは、対照の同腹子に比べてＡｎｇｐｔｌ２ ＫＯでは、血管周囲線維症の領域の有意な減少及び、いくつかの心不全マーカー（ＡＮＰ及びＭｙｈ７、しかし、ＢＮＰではない）及び線維症マーカー（ＣＴＧＦ及びＣｏｌ１、しかし、Ｃｏｌ３ａ１ではない）の発現の有意な減少が観察された。このことは、心臓ＡＮＧＰＴＬ２欠損は、病的リモデリングに拮抗することを示唆している。【０１０１】
（実施例５）ＡＮＧＰＴＬ２欠損心臓細胞内のβ−脂肪酸酸化、ミトコンドリア生合成、及びＡＴＰ生産の増加
心機能は、一定の細胞内のＡＴＰ産生を必要とする。αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウスは、ＴＡＣ誘発性のＨＦに進展するので、αＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇの心筋エネルギー代謝を調節する遺伝子の発現を野生型対照と比較した。ＰＧＣ−１α及びＰＰＡＲα（β−酸化及びミトコンドリア生合成を制御する転写因子）の発現は、これらの活性及びＡＴＰ産生に関係する他の遺伝子の中で、野生株対照と比較して、１３週齢のαＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇにおいて有意に減少していた（データ示さず）。逆に、１３週齢のＡｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスにおけるエネルギー関連遺伝子の発現は、野生型対照よりも有意に大きかった（データ示さず）。さらに、ＰＧＣ−１α及びＰＰＡＲαの発現、ＣＤ３６（脂肪酸の受容体）の発現は、野生型対照マウスに比べて、６週齢Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＯで有意に増加していた（データ示さず）。また、ＰＰＡＲα及びＰＧＣ−１αの発現及び細胞内ＡＴＰ産生が、Ａｎｇｐｔｌ２ノックダウン（ＫＤ）プライマリーＮＲＣＭｓで有意に増加していたが、一方、ＰＰＡＲα（ＰＧＣ−１αではない）の発現及びＡＴＰ産生は、アデノウイルス発現ＡＮＧＰＴＬ２で形質転換したＮＲＣＭｓでは、有意に減少していた（データ示さず）。これらの知見は、心筋細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２抑制が、正常な心臓のエネルギー代謝を促進する遺伝子の発現を増加させることを示している。【０１０２】
（実施例６）心臓でのＡＫＴ−ＳＥＲＣＡ２ａのシグナル伝達のＡＮＧＰＴＬ２による不活性化
心臓の収縮とＡＮＧＰＴＬ２活性のリンク機構を同定するために、パスウェイスキャンアッセイを行い、ＡＫＴ及びその作用因子ｍＴＯＲとｐ７０Ｓ６Ｋを、心臓において活性化し、野生型対照マウスとＡｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスを比較した。免疫ブロッティングの結果を図９〜図１２に示す。同腹子対照マウスに比べてＡｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスの心臓でＡＫＴシグナル伝達は活性化していた（図９）。ＳＥＲＣＡ２ａのタンパク質レベルも同様の増加を示した（図９）。逆に、ＡＫＴシグナリングはαＭＨＣ−Ａｎｇｐｔｌ２ Ｔｇマウスの心臓で減衰しており（図１０）、相対的ＳＥＲＣＡ２ａレベルは、同様に有意に減少していた（図１０）。また、Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＤ ＮＲＣＭｓにおいて、ＡＫＴの活性化及び高いＳＥＲＣＡ２ａのタンパク質レベルが確認された（図１１）。このような増加したＳＥＲＣＡ２ａレベルは、ドミナントネガティブＡＫＴ（ｄｎＡＫＴ）の過剰発現により有意に減衰した（データ示さず）。逆に、ＡＫＴシグナル伝達は、ＡＮＧＰＴＬ２を過剰発現しているＮＲＣＭｓで著しく阻害されており（図１２）、そして、ＳＥＲＣＡ２ａのタンパク質レベルは比較的減少していた（図１２）。従って、ＡＮＧＰＴＬ２に続くＡＫＴ−ＳＥＲＣＡ２ａのシグナル伝達の活性化は、おそらく、心臓の収縮性を増加させる一方、ＡＮＧＰＴＬ２の過剰発現は反対の表現型を促進する。【０１０３】
（実施例７）心筋細胞でのＡｎｇｐｔｌ２ ｍＲＮＡレベルに対するカルシニューリンＮＦＡＴの活性化の影響
病的リモデリングのもとで心臓組織においてどのようにＡＮＧＰＴＬ２発現が上昇するかを検討するために、培養したＮＲＣＭｓを心臓肥大の促進因子で刺激した。アンギオテンシンＩＩ又はイソプロテレノール（ＩＳＯ）処理は、ＮＲＣＭｓでのＡｎｇｐｔｌ２ ｍＲＮＡレベルを有意に増加させた。アンギオテンシンＩＩとＩＳＯは共にＮＦＡＴの核移行を促進すると報告されており、ＮＦＡＴはまた、病的な心臓肥大の発展を引き起こす転写因子でもある。これらのことより、ＮＦＡＴの活性化が、心筋細胞におけるＡｎｇｐｔｌ２転写を増加させているかも知れないと示唆している。免疫細胞化学的分析の結果、Ａｎｇ ＩＩ処理後の核移行下で、ＮＦＡＴＣ１とＮＦＡＴＣ４が共に心筋細胞で発現しており、これらはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）によって阻害された。さらに、ＮＲＣＭｓでのＡｎｇ ＩＩ又はＩＳＯ依存的なＡＮＧＰＴＬ２アップレギュレーションは、ＣｓＡの処理によってブロックされた。Ａｎｇ ＩＩ処理はまた、ＮＲＣＭｓでのＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルを増加させたが、これはＣｓＡによりブロックされた。また、活性なＮＦＡＴ（ＣＡ−ＮＦＡＴ）の過剰発現は、ＮＲＣＭｓでＡｎｇｐｔｌ２ ｍＲＮＡレベルを上昇させた。このことは、カルシニューリンＮＦＡＴシグナル伝達が、心筋細胞でのＡＮＧＰＴＬ２の過剰発現を増加させていることを示唆している。【０１０４】
（実施例８）ＡＮＧＰＴＬ２の発現に対する持久運動トレーニングの影響
Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスで観察された心肥大は、運動によって誘発される肥大に似ている。したがって、運動訓練されたマウスと同様に、Ａｎｇｐｔｌ２ ＫＯマウスは、病的な心臓リモデリングに対して心臓保護を示した。このことは、ＡＮＧＰＴＬ２の欠損が、運動効果を再現することを示唆している。興味深いことに、運動負荷を行っていない対照マウスにおける結果と比較して、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルは、トレッドミルランニングによる急性の訓練を受けたマウスの心臓部で著しく減少しており、その減少したレベルは慢性訓練を受けたマウスの心臓で持続していた（図１３）。【０１０５】
疾患の原因メカニズムを評価するための、心血管疾患において、抑制マイクロＲＮＡとして機能することが報告されているマイクロＲＮＡをｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇデータベースを用いて検討した。ｍｉＲ−１３５ａ、ｍｉＲ−２０４、のｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２２１、及びｍｉＲ−２２２を含む５つの候補を同定した。データベースによると、これら全てがＡｎｇｐｔｌ２ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する。その中でも、心臓でのｍｉＲ−２２２の発現は、マウスにおいて運動トレーニング後に増加することが最近報告されている（Liu, X., et al. Cell Metab 21,584-595 (2015)）。インビトロでは、ＮＲＣＭｓにおけるｍｉＲ−２２２又はｍｉＲ−２２１の過剰発現は、Ａｎｇｐｔｌ２−３’ＵＴＲルシフェラーゼレポーター活性を有意に減衰させ（図１４）、効果は、ｍｉＲ−２２１／２２２結合配列の欠損でブロックされた（図１５ａ）。また、ｍｉＲ−２２１／２２２ ＫＯマウス及び対照のｍｉＲ−２２１／２２２Flox/yマウスに持久運動トレーニングをさせて、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルを測定した。対照のｍｉＲ−２２１／２２２Flox/yマウスでは、運動負荷マウスの心臓組織のＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルは、運動負荷を行っていないマウスのそれに比べて顕著に低かった。一方、ｍｉＲ−２２１／２２２ ＫＯマウスでは、運動負荷による心臓ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質レベルの減少は心臓では起こらなかった（図１５ｂ）。これらの知見は、ＡＮＧＰＴＬ２がｍｉＲ−２２１／２２２の直接のターゲットである可能性、及び持続運動がＡｎｇｐｔｌ２ ｍＲＮＡレベルでこれらのｍｉＲｓの抑制効果を高めていることを示唆している。【０１０６】
（実施例９）慢性圧負荷マウスのＨＦへの進展における、病的な肥大でのＡＮＧＰＴＬ２アップレギュレーションのブロッキングの効果
抗ＡＮＧＰＴＬ２試薬のインビボでの投与が病的心臓リモデリングを防ぐことができるか否かを検討した。心筋に選択的に形質導入することが報告されている組換えＡＡＶ６ベクターの全身デリバリーを用いた。Ａｎｇｐｔｌ２のｓｈＲＮＡを発現する組換えアデノ随伴ウイルス血清型６（ＡＡＶ６）ベクターを静脈内注射することにより、Ａｎｇｐｔｌ２のｓｈＲＮＡカセットをマウスの心臓にデリバリーした。これを行うために、マウスＡｎｇｐｔｌ２のｓｈＲＮＡを発現する２つの構築物（ＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ａ及び−Ｂ）を作製し、組換えＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ａ又はＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂを、１×１０10ｖｇ／マウス及び３×１０10ｖｇ／マウスで野生型マウスへ静脈内投与した。２週間後、ＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂを注射したマウスの心臓においてＡＮＧＰＴＬ２発現が有意に減少していたが、一方、ＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ａ構築物は、投与した濃度では効果がなかった（図１６）。ＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂを投与したマウスの心臓は、対照に比べて、ＰＧＣ−１α及びＰＰＡＲαの発現の上昇及びＡＫＴ−のＳＥＲＣＡ２ａシグナルデンタルの活性化が見られた（図１７）。【０１０７】
（実施例１０）ＴＡＣモデルを用いたＡＮＧＰＴＬ２アップレギュレーションのブロッキングの効果の確認（実験１）
次いで、処置後２週間で肥大が起こるＴＡＣモデルを用いて、インビボで、ＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂの静脈内注射がＡＮＧＰＴＬ２のアップレギュレーションを抑制するかを検討した。ＴＡＣ処置２週間後のＴＡＣ誘発性心機能障害をもつマウスを、３群に分け、その後、ウイルスなし（コントロール）、１×１０10 ｖｇ／マウス及び３×１０10 ｖｇ／マウスにてＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂを静脈内投与した。投与の２週間後から、２週間おきに、超音波心エコー検査により心機能を調べた。いずれのＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂの投与量でも、圧負荷での病的心臓リモデリングにおいてＡＮＧＰＴＬ２アップレギュレーションを抑制した（図１８）。対照マウスは減少した短縮率を伴う左心室拡張を示したが、一方、いずれの投与量のＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂが投与されたマウスにおいても、対照マウスに比べ、心機能障害を弱められており、左心室の拡張がブロックされていた（図１９及び図２０）。心臓重量／体重比は、対照と比較して、いずれの投与量のＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂが投与されたマウスにおいても減少していた。ＡＮＰ、ＢＮＰ及びＭｙｈ７の発現は対照心臓に対して有意に増加していたが、アップレギュレートされたＡＮＰ及びＭｙｈ７の発現は組換えＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂが投与されたマウスでブロックされていた（データ示さず）。【０１０８】
（実施例１１）ＴＡＣモデルを用いたＡＮＧＰＴＬ２アップレギュレーションのブロッキングの効果の確認（実験２）
実施例１０と同様にして、ＴＡＣモデルを用いて、インビボで、ＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂ又はＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ａの静脈内注射がＡＮＧＰＴＬ２のアップレギュレーションを抑制するかを検討した。但し、本実施例では、コントロールは、ＴＡＣモデルにＡＡＶ−ｓｈＳｃｒａｍｂｌｅを静脈内投与した。また、超音波心エコー検査による心機能の確認は、投与の２週間後及び５週間後に行った。
ＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂ投与は、ＡＡＶ−ｓｈＳｃｒａｍｂｌｅを投与したＴＡＣモデルと比較しても、実施例１０と同様に効果を示した。
ＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ａ投与の結果を図２１に示す。ＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ｂに加えＡＡＶ６−ｓｈＡｎｇｐｔｌ２−Ａ投与でも、対照マウスに比べ、心機能障害の改善が確認できた。【０１０９】
（実施例１２）ヒトｉＰＳ由来心筋細胞におけるＡＮＧＰＴＬ２の抑制効果
ヒト線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞から分化したヒト心筋細胞において、ＡＮＧＰＴＬ２の抑制が、ＡＫＴ−ＳＥＲＣＡ２ａのシグナル伝達を活性化し、そして、エネルギー代謝を高めるか否かを検討した。結果を図２２及び図２３に示す。ヒトＡＮＧＰＴＬ２を標的とするｓｉＲＮＡ（ＡＮＧＰＴＬ２のｓｉＲＮＡ）で形質転換した心筋細胞では、ＡＫＴ−ＳＥＲＣＡ２ａのシグナル伝達及びＰＧＣ−１α及びＰＰＡＲαの発現は活性化されたが、ＡＮＧＰＴＬ２の産生と分泌は抑制された。さらに、対照のヒトｉＰＳ由来心筋細胞に比べ、ＡＮＧＰＴＬ２のｓｉＲＮＡで形質転換した心筋細胞で、拍動数、（大きさや形状を含む）細胞特性、又は細胞死の頻度について変化はなかった。このことは、心臓毒性がないことを示唆している。図２３に示されるように、検討した７種類のヒトＡＮＧＰＴＬ２を標的とするｓｉＲＮＡにより、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質の発現が有意に減少した。【０１１０】
（実施例１３）ＨＦ患者における心臓ＡＮＧＰＴＬ２生産
病的心臓リモデリングにおいてＡＮＧＰＴＬ２が機能するかどうかを検討するために、慢性心不全と診断された患者又は心臓病に関連していない状況下で死亡した患者からのオートプシーで得られた心臓組織におけるＡＮＧＰＴＬ２タンパク質のレベルを調べた。免疫組織化学的分析の結果、ＨＦ患者において、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質が心筋細胞及び毛細血管内皮細胞で豊富に発現されていたが、心臓線維芽細胞ではそうではなかった。対照的に、対照個体では、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質は、心臓においてより低いレベルで発現されていた。【０１１１】
冠状静脈洞（ＣＳ）は、心臓から血液を排出している。従って、Ｃｓと大動脈根（Ａｏ）の間におけるＡＮＧＰＴＬ２濃度の差は、心臓組織からＡＮＧＰＴＬ２分泌を反映するであろう。心機能障害をもった患者においてこのような分泌が起こるか否かを検討した。非２次的及び非家族性のＤＣＭをもつ５８人の患者のＣｓとＡｏでＡＮＧＰＴＬ２濃度を比較した結果、２３人の心臓組織においてＡＮＧＰＴＬ２生産の有意な上昇（＞３５％増）が観察された。その２３人とこのパターンを示さなかった３５人の患者の間では、臨床指標によって推定される、心機能障害の重症度に差は認められなかった。心臓ＡＮＧＰＴＬ２分泌の増加の兆候を示した患者は、一般的に高齢であり、他の患者に比べ少し拡大したＬＶＤｄ径を示した。結果を下記の表１に示す。【０１１２】
【表１】
2017078100.tif 000003
【０１１３】
上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明は、心筋細胞においてアンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制するために有用であり、本発明は、心不全の治療又は予防のための医薬組成物として有用である。
【図１】
2017078100.tif 000004
【図２】
2017078100.tif 000005
【図３】
2017078100.tif 000006
【図４】
2017078100.tif 000007
【図５】
2017078100.tif 000008
【図６】
2017078100.tif 000009
【図７】
2017078100.tif 000010
【図８】
2017078100.tif 000011
【図９】
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【図１０】
2017078100.tif 000013
【図１１】
2017078100.tif 000014
【図１２】
2017078100.tif 000015
【図１３】
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【図１４】
2017078100.tif 000017
【図１５】
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【図１６】
2017078100.tif 000019
【図１７】
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【図１８】
2017078100.tif 000021
【図１９】
2017078100.tif 000022
【図２０】
2017078100.tif 000023
【図２１】
2017078100.tif 000024
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2017078100.tif 000027
【配列表】
2017078100000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年6月26日(2017.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心不全を治療又は予防するための医薬組成物であって、アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む哺乳動物の心筋細胞へのデリバリー選択性がある発現ベクター、及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物、
ここで、前記発現ベクターは、心筋細胞に形質導入されると、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡを生じ、心筋細胞におけるアンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。
【請求項２】
前記ＤＮＡ配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列（ヘアピン配列）からなるヘアピン型ＲＮＡをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内ＲＮａｓｅであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡが形成される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記センス鎖配列が、下記の配列番号２〜配列番号８のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、請求項１又は２に記載の医薬組成物、
2017078100.tif 000028
2017078100.tif 000029
【請求項４】
前記ＤＮＡ配列が、下記の配列番号９〜配列番号１５のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物、
2017078100.tif 000030
【請求項５】
前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、請求項１〜４のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである請求項５に記載の医薬組成物
【請求項７】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターＡＡＶ６ベクターである請求項６に記載の医薬組成物
【請求項８】
心不全を治療又は予防するための医薬組成物であって、アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡ、及び医薬上許容可能な担体を含む、哺乳動物の心筋を直接標的とすることを特徴とする医薬組成物、
ここで、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡは、哺乳動物の心筋細胞に形質導入されると、心筋細胞におけるアンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする
【請求項９】
前記センス鎖配列が、下記の配列番号２〜配列番号８のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む請求項８に記載の医薬組成物、
2017078100.tif 000031
【請求項１０】
アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む哺乳動物の心筋細胞へのデリバリー選択性がある発現ベクターを含む、心筋細胞でのアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤、
ここで、前記発現ベクターは、心筋細胞に形質導入されると、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡを生じ、心筋細胞におけるアンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列（ヘアピン配列）からなるヘアピン型ＲＮＡをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内ＲＮａｓｅであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡが形成される、請求項１０に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤。
【請求項１２】
前記センス鎖配列が、下記の配列番号２〜配列番号８のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、請求項１０又は１１に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤、
2017078100.tif 000032
【請求項１３】
前記ＤＮＡ配列が、下記の配列番号９〜配列番号１５のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、請求項１０又は１１に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤、
2017078100.tif 000033
【請求項１４】
前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、請求項１０〜１３のいずれか一つに記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤。
【請求項１５】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである請求項１４に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤。
【請求項１６】
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターＡＡＶ６ベクターである請求項１５に記載のアンジオポエチン様タンパク質２の発現抑制剤。
【請求項１７】
対象であるヒト由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２の発現を測定することにより、該対象が請求項１〜９のいずれか一つに記載の医薬組成物による心不全の治療又は予防が必要であるか否かを判定する方法。
【請求項１８】
前記血液が拡張型心筋症（ＤＣＭ）患者由来の血液である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記血液が拡張型心筋症患者の大動脈基部（Ａｏ）及び冠状静脈洞（ＣＳ）の血液である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
冠状静脈洞（ＣＳ）の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２の発現レベルが、大動脈基部（Ａｏ）の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、心不全の治療又は予防が必要であると判定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
冠状静脈洞（ＣＳ）の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２の発現レベルが、大動脈基部（Ａｏ）の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、請求項１〜９のいずれか一つに記載の医薬組成物を投与する対象と判定する方法。
【請求項２２】
請求項１〜９のいずれか一つに記載の医薬組成物が投与された対象由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２の発現を測定することにより、該対象において心不全の治療効果が得られているか否かを判定する方法。
【請求項２３】
前記血液が対象の冠状静脈洞（ＣＳ）の血液である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれか一つに記載の医薬組成物の投与前後のアンジオポエチン様タンパク質２の発現を測定する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（削除）
【請求項２６】
対象であるヒト由来の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２の発現を測定することにより、該対象が心不全に罹患しているか心不全を発症するリスクがあるかを判定する方法であって、前記血液が大動脈基部（Ａｏ）及び／又は冠状静脈洞（ＣＳ）の血液であることを特徴とする方法。
【請求項２７】
冠状静脈洞（ＣＳ）の血液中のアンジオポエチン様タンパク質２の発現レベルが、大動脈基部（Ａｏ）の血液中の発現レベルより高い場合に、該血液が由来する対象が、心不全に罹患しているまたは心不全を発症するリスクがあると判定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
心不全を治療又は予防するための医薬組成物であって、アンジオポエチン様タンパク質２（ＡＮＧＰＴＬ２）のｍＲＮＡ又はその選択的スプライス型ＲＮＡからの連続する１８〜２９ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含むＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクター、及び医薬上許容可能な担体を含む、哺乳動物の心筋に直接投与されることを特徴とする医薬組成物、
ここで、前記発現ベクターは、心筋細胞に形質導入されると、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列を含むｓｉＲＮＡを生じ、心筋細胞におけるアンジオポエチン様タンパク質２遺伝子の発現を抑制し、アンジオポエチン様タンパク質２遺伝子のサイレンシング効果を生じることを特徴とする。
【請求項２９】
前記ＤＮＡ配列が、前記センス鎖配列、前記アンチセンス鎖配列、及び前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列との間を共有結合によって結合する一本鎖ループ配列（ヘアピン配列）からなるヘアピン型ＲＮＡをコードする配列を含み、該ヘアピン配列が細胞内ＲＮａｓｅであるＤｉｃｅｒによってプロセシングされて、前記センス鎖配列と前記アンチセンス鎖配列からなるｓｉＲＮＡが形成される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記センス鎖配列が、下記の配列番号２〜配列番号８のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列である、請求項２８又は２９に記載の医薬組成物、
2017078100.tif 000034
【請求項３１】
前記ＤＮＡ配列が、下記の配列番号９〜配列番号１５のいずれか一つに示される塩基配列又は該配列において１つの塩基が置換・欠失又は付加された配列を含む、請求項２８又は２９に記載の医薬組成物、
2017078100.tif 000035
【請求項３２】
前記発現ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、請求項２８〜３１のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2017078100.tif 000036
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