(57)【要約】  固相担体への非特異吸着を低減でき、脂質二重膜を有する小胞を選択的かつ効率よく分離できる方法を提供すること。  脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程を含み、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかを、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行うことを特徴とする、脂質二重膜を有する小胞の分離方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、
前記複合体を洗浄する洗浄工程を含み、
前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかを、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行うことを特徴とする、
脂質二重膜を有する小胞の分離方法。
【請求項２】
前記複合体形成工程を、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行う、請求項１に記載の分離方法。
【請求項３】
前記生体試料が、体液又は細胞培養上清である、請求項１又は２に記載の分離方法。
【請求項４】
前記生体試料が、体液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分離方法。
【請求項５】
前記複合体形成工程に用いられる複合体形成反応液が、無機塩を含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分離方法。
【請求項６】
前記無機塩が、アルカリ金属ハロゲン化物である、請求項５に記載の分離方法。
【請求項７】
前記複合体形成工程における複合体形成反応の反応温度が、２〜４２℃の範囲内である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分離方法。
【請求項８】
前記リガンドが、小胞の表面に存在する表面抗原を認識する抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の分離方法。
【請求項９】
前記小胞が、エクソソームである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の分離方法。
【請求項１０】
前記固相担体が、磁性粒子である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の分離方法。
【請求項１１】
前記洗浄工程が、前記磁性粒子を磁力により集めて磁性粒子と液相とを分離する集磁工程、及び該集磁工程で分離された磁性粒子を洗浄液中に分散させる分散工程を含む、請求項１０に記載の分離方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離方法の後に、
さらに小胞中の核酸を検出する核酸検出工程を含むことを特徴とする、
小胞中の核酸の検出方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離方法の後に、
さらに小胞の内側及び表面の少なくとも一方に存在するタンパク質を検出するタンパク質検出工程を含むことを特徴とする、
小胞由来のタンパク質の検出方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の分離方法の後に、
さらに前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定するシグナル測定工程を含むことを特徴とする、
小胞由来のシグナル測定方法。
【請求項１５】
被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための方法であって、
被検者由来の生体試料を用いて、請求項１４に記載のシグナル測定方法により前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程を含むことを特徴とする、
疾患の判定方法。
【請求項１６】
疾患治療薬の薬効評価方法であって、
疾患治療薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料を用いて、請求項１４に記載のシグナル測定方法により、前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程を含むことを特徴とする、
疾患治療薬の薬効評価方法。
【請求項１７】
脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体と、
無機塩又は有機塩を含み該無機塩又は有機塩の含有量が、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有する液状組成物を備えることを特徴とする、
キット。
【請求項１８】
疾患の判定用又は疾患治療薬の薬効評価用である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程とを含む、脂質二重膜を有する小胞の分離方法に使用される、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかに添加するための液状組成物であって、
０．１５Ｍ以上の塩濃度を有することを特徴とする、
液状組成物。
【請求項２０】
不溶性担体を用いて脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料から脂質二重膜を有する小胞を分離する方法に使用される、前記小胞と前記不溶性担体との複合体を形成させるための検体希釈液であって、
０．１５Ｍ以上の塩濃度を有することを特徴とする、
検体希釈液。
【請求項２１】
無機塩を含有する、請求項２０に記載の検体希釈液。
【請求項２２】
前記無機塩が、アルカリ金属ハロゲン化物である、請求項２１に記載の検体希釈液。
【請求項２３】
不溶性担体を用いて脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料から脂質二重膜を有する小胞を分離する方法であって、
０．１５Ｍ以上の塩濃度を有する検体希釈液を用いることを特徴とする、
脂質二重膜を有する小胞の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、薬効評価方法、キット、液状組成物及び検体希釈液に関する。より詳細には、エクソソームなどの脂質二重膜を有する小胞の分離方法、該方法を利用した核酸又はタンパク質の検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、疾患判定又は薬効評価用キット、上記分離方法に用いる液状組成物、及び検体希釈液に関する。
【背景技術】
【０００２】
小胞は脂質二重膜に包まれた構造を有するものであり、斯様な小胞のうち、生体内の体液中に存在する小胞顆粒としてエクソソームが知られている。エクソソームの表面には、一般的な細胞表面と同様に、種々の膜タンパク質が存在することが知られており、その一方で、エクソソームの内部には、サイトカイン等各種タンパク質以外にもｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれることも分かってきた。【０００３】
また、免疫系の細胞や各種癌細胞等の種々の細胞からエクソソームが分泌されることが知られており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役としてのエクソソームの機能、エクソソームと生理現象や癌等の疾患との関連性が注目され、これについて検討が進められている。例えば、腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭの抗体を用いた場合に、卵巣癌患者の循環血中からエクソソームが分離され、エクソソーム由来のｍｉＲＮＡ発現量と卵巣癌の進行との間に関連性があることが既に報告されている（非特許文献１）。【０００４】
また、エクソソーム上に発現する４回膜貫通型の膜タンパク質として、テトラスパニンファミリーに属するＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１があり、非特許文献２には、メラノーマ患者の血漿中のエクソソーム量が健常者のものと比べて高く、これがＣＤ６３に対する抗体や腫瘍関連マーカーのＣａｖｅｏｌｉｎ−１に対する抗体で検出・定量化できることが報告されている。また、遠心分離後の血漿サンプルに、抗ＣＤ６３抗体や種々の膜タンパク質に対する抗体等を組み合わせて反応させることで、癌患者におけるエクソソームに由来するシグナルを定量して解析することが行われている（特許文献１）。【０００５】
上記のように、血清、血漿、血液などの臨床検体からエクソソームを特異的に捕捉し、エクソソームに含まれるタンパク質やｍｉＲＮＡを新たなバイオマーカーとして疾患の早期診断や再発の発見に利用する試みがされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０６５９６８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄ．Ｄ．Ｔａｙｌｏｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１０，１３−２１（２００８）
【非特許文献２】Ｍ．Ｌｏｇｏｚｚｉ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．，４，１−１０（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記臨床検体は、アルブミンおよびグロブリン等の高濃度のタンパク質を含んでいるため、臨床検体から分離したエクソソームを疾患の判定に用いる際に、固相担体や反応容器内壁に対する非特異吸着に起因して、抗原抗体反応などの特異反応が検体成分により阻害をうけることや陰性と判定されるべき検体が誤って陽性と判定される（以下、偽陽性）ことが大きな問題となる。この問題は臨床検体が血清や血漿の場合に特に顕著となる。
この偽陽性を減少させるために、反応中に界面活性剤を添加する、或いは固相担体にタンパク質やポリマーをオーバーコートするなどの手法が用いられてきたが、これまでの手法だけでは非特異吸着に起因する偽陽性を減少させるには限界があった。偽陽性を減少させることは、エクソソームをはじめとする小胞を利用した疾患の判定や疾患治療薬の薬効評価において、ますます重要な課題となってくる。
また、エクソソームの分離に先立ち、抗原抗体反応を阻害しうる検体成分を取り除き、エクソソームを濃縮するなどの前処理をすることが提案されており、斯様な前処理法として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法による単離法、超遠心機を用いた単離法等が一般的に行われているが、このような前処理を行っても非特異吸着を十分に低減することは困難であり、また手間がかかるという問題があった。
本発明が解決しようとする課題は、固相担体への非特異吸着を低減でき、脂質二重膜を有する小胞を選択的かつ効率よく分離できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを混合して複合体形成反応液を形成して、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、上記複合体形成工程で形成された小胞と固相担体との複合体に洗浄液を加えて洗浄工程液を形成し、前記複合体を洗浄する洗浄工程を含む、脂質二重膜を有する小胞の分離方法において、（以下、複合体形成反応液および洗浄工程液を総称して、「反応液」と言う。）前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかを、反応液中の塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行うことにより、固相担体への非特異吸着を低減でき、脂質二重膜を有する小胞を選択的かつ効率よく分離できることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、以下の＜１＞〜＜２３＞を提供するものである。【００１１】
＜１＞  脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程を含み、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかを、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行うことを特徴とする、脂質二重膜を有する小胞の分離方法。
＜２＞  前記複合体形成工程を、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行う、＜１＞に記載の分離方法。
＜３＞  前記生体試料が、体液又は細胞培養上清である、＜１＞又は＜２＞に記載の分離方法。
＜４＞  前記生体試料が、体液である、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の分離方法。
＜５＞  前記複合体形成工程に用いられる複合体形成反応液が、無機塩を含有する、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の分離方法。
＜６＞  前記無機塩が、アルカリ金属ハロゲン化物である、＜５＞に記載の分離方法。
＜７＞  前記複合体形成工程における複合体形成反応の反応温度が、２〜４２℃の範囲内である、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の分離方法。
＜８＞  前記リガンドが、小胞の表面に存在する表面抗原を認識する抗体である、＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の分離方法。
＜９＞  前記小胞が、エクソソームである、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の分離方法。
＜１０＞  前記固相担体が、磁性粒子である、＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の分離方法。
＜１１＞  前記洗浄工程が、前記磁性粒子を磁力により集めて磁性粒子と液相とを分離する集磁工程、及び該集磁工程で分離された磁性粒子を洗浄液中に分散させる分散工程を含む、＜１０＞に記載の分離方法。【００１２】
＜１２＞  ＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の分離方法の後に、さらに小胞中の核酸を検出する核酸検出工程を含むことを特徴とする、小胞中の核酸の検出方法。
＜１３＞  ＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の分離方法の後に、さらに小胞の内側及び表面の少なくとも一方に存在するタンパク質を検出するタンパク質検出工程を含むことを特徴とする、小胞由来のタンパク質の検出方法。
＜１４＞  ＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の分離方法の後に、さらに前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定するシグナル測定工程を含むことを特徴とする、小胞由来のシグナル測定方法。
＜１５＞  被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための方法であって、被検者由来の生体試料を用いて、＜１４＞に記載のシグナル測定方法により前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程を含むことを特徴とする、疾患の判定方法。
＜１６＞  疾患治療薬の薬効評価方法であって、疾患治療薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料を用いて、＜１４＞に記載のシグナル測定方法により、前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程を含むことを特徴とする、疾患治療薬の薬効評価方法。【００１３】
＜１７＞  脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体と、無機塩又は有機塩を含み該無機塩又は有機塩の含有量が、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有する液状組成物を備えることを特徴とする、キット。
＜１８＞  疾患の判定用又は疾患治療薬の薬効評価用である、＜１７＞に記載のキット。【００１４】
＜１９＞  脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程とを含む、脂質二重膜を有する小胞の分離方法に使用される、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかに添加するための液状組成物であって、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有することを特徴とする、液状組成物。【００１５】
＜２０＞  不溶性担体を用いて脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料から脂質二重膜を有する小胞を分離する方法に使用される、前記小胞と前記不溶性担体との複合体を形成させるための検体希釈液であって、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有することを特徴とする、検体希釈液。
＜２１＞  無機塩を含有する、＜２０＞に記載の検体希釈液。
＜２２＞  前記無機塩が、アルカリ金属ハロゲン化物である、＜２１＞に記載の検体希釈液。【００１６】
＜２３＞  不溶性担体を用いて脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料から脂質二重膜を有する小胞を分離する方法であって、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有する検体希釈液を用いることを特徴とする、脂質二重膜を有する小胞の分離方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の脂質二重膜を有する小胞の分離方法によれば、固相担体への非特異吸着を低減でき、脂質二重膜を有する小胞を選択的かつ効率よく分離できる。
したがって、本発明によれば小胞中の核酸、小胞由来のタンパク質、小胞由来のシグナルを、簡便且つ正確に検出・測定できる。また、本発明の疾患の判定方法、薬効評価方法は、偽陽性になりにくい。また、本発明のキット、液状組成物、検体希釈液を用いることにより、固相担体への非特異吸着を低減でき、脂質二重膜を有する小胞を選択的かつ効率よく分離できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】塩濃度を０．１５〜０．３５Ｍとすることによる非特異吸着低減作用を示す図である（臨床検体：血清）。
【図１−２】塩濃度を０．１５〜０．３５Ｍとすることによる非特異吸着低減作用を示す図である（臨床検体：クエン酸血漿）。
【図２−１】反応温度２５℃における塩濃度を０．１５〜０．３５Ｍとすることによる反応性向上作用を示す図である（臨床検体：血清）。
【図２−２】反応温度４℃における塩濃度を０．２５Ｍとすることによる反応性向上作用を示す図である（臨床検体：血清）。
【図３】種々の臨床検体を用いた場合の非特異吸着低減作用を確認した図である。
【図４】種々の臨床検体を用いた場合の反応性向上作用を確認した図である。
【図５−１】固相担体として抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子を用いた場合の反応性向上作用を確認した図である。
【図５−２】固相担体として抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を用いた場合の反応性向上作用を確認した図である。
【図５−３】固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合の反応性向上作用を確認した図である。
【図６】固相担体として抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を用いてヒト健常者血清と反応させた場合の小胞中の核酸の検出結果を示す図である。
【図７−１】ヒト健常者血清に由来する小胞中の核酸の検出結果を示す図である。
【図７−２】ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞中の核酸の検出結果を示す図である。
【図８−１】ヒト健常者血清に由来する小胞表面のタンパクの検出結果を示す図である。
【図８−２】ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞表面のタンパクの検出結果を示す図である。
【図９−１】ヒト健常者血清に由来する小胞表面のネイティブフォームの立体構造を維持したタンパクの検出結果を示す図である。
【図９−２】ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞表面のネイティブフォームの立体構造を維持したタンパクの検出結果を示す図である。
【図９−３】ヒト結腸がんＨＴ２９細胞より調製したエクソソーム含有培養上清をヒト健常者血清に添加した、擬似的な疾患由来生体試料から、小胞表面のタンパクをネイティブフォームの立体構造を維持したまま検出した結果を示す図である。
【図９−４】ヒト結腸がんＨＴ２９細胞より調製したエクソソーム含有培養上清をヒト健常者ヘパリン血漿に添加した、擬似的な疾患由来生体試料から、小胞表面のタンパクをネイティブフォームの立体構造を維持したまま検出した結果を示す図である。
【図１０−１】ヒト結腸がんＨＴ２９細胞より調製したエクソソーム含有培養上清をヒト健常者血清に添加した、擬似的な疾患由来生体試料から、小胞表面のタンパクを検出した結果を示す図である。
【図１０−２】ヒト結腸がんＨＴ２９細胞より調製したエクソソーム含有培養上清をヒト健常者ヘパリン血漿に添加した、擬似的な疾患由来生体試料から、小胞表面のタンパクを検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
〔脂質二重膜を有する小胞の分離方法〕
本発明の脂質二重膜を有する小胞の分離方法は、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、小胞と固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、複合体を洗浄する洗浄工程を含み、複合体形成工程及び洗浄工程の少なくともいずれかを、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行うことを特徴とするものである。ここで、本明細書において塩濃度とは、無機塩および有機塩の合計である塩濃度であり、好ましくは無機塩の塩濃度であり、さらに好ましくは１価の無機塩の塩濃度であり、特に好ましくはアルカリ金属ハロゲン化物の濃度であり、最も好ましくは塩化ナトリウムの濃度である。反応液の塩濃度は、反応液中の塩の終濃度ともいう。
【００２０】
（複合体形成工程）
複合体形成工程は、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを混合して複合体形成反応液を形成して、小胞と固相担体との複合体を形成させる工程である。複合体形成反応液を形成することにより、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とが接触する。上記接触により、リガンドに小胞が捕捉され、小胞と固相担体との複合体が形成される。なお、複合体形成工程の反応系には、上記固相担体に結合したリガンド以外に、脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドも共存していてもよい。
【００２１】
上記生体試料は脂質二重膜を有する小胞を含むものであれば特に限定されるものではなく、例えば、体液、菌体液、細胞培養の培地、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体が挙げられる。この中でも、体液、細胞培養上清が好ましく、体液がより好ましい。体液としては、全血、血清、血漿、血液成分、各種血球、血餅、血小板等の血液組成成分の他、尿、精液、母乳、汗、間質液、間質性リンパ液、骨髄液、組織液、唾液、胃液、関節液、胸水、胆汁、腹水、羊水等が挙げられ、好ましくは血液組成成分である。本発明の分離方法は、斯様な臨床検体を生体試料として用いた場合であっても、固相担体への非特異吸着が低く、捕捉反応の反応性が高いため、本発明の分離方法によれば、広範な種類の生体試料から選択的かつ効率よく小胞を分離できる。例えば、生体試料として血漿を用いた場合でも非特異吸着が起こりにくく、血清を用いた場合でも捕捉反応の反応性が高い。
なお、血液組成成分は、クエン酸、ヘパリン、ＥＤＴＡ等の抗凝固剤で処理されたものでもよい。
【００２２】
上記生体試料は、バッファー組成物で希釈するなどして予め前処理したものを用いてもよいが、生体から摂取したものをそのまま用いることもできる。すなわち、本発明の分離方法によれば、ＰＥＧ沈殿法、超遠心機等を用いた単離法等による前処理を行わず簡便に選択的な分離をすることも可能である。
【００２３】
また、上記脂質二重膜を有する小胞としては、細胞、細胞から細胞外に放出されるエクソソームのような小胞、エンベロープを有するウイルス等が挙げられるが、本発明の分離方法は、小胞がエクソソームである場合に特に好ましく用いられる。
また、小胞の表面に存在する表面抗原は、小胞の表面に存在する物質で抗原性のあるものであれば特に限定されない。エクソソームの表面抗原を例に挙げると、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類；ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ等の抗原提示関連タンパク質；インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＥｐＣＡＭなどの接着分子；ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＧＦ−βなどのサイトカイン／サイトカイン受容体、酵素類等が挙げられる。これらの中でも、エクソソーム表面に存在する抗原タンパク質が好ましい。
【００２４】
生体試料の使用量（濃度）は、好ましくは０．００１〜１００％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１〜５０％（ｗ／ｖ）である。
【００２５】
また、本発明の分離方法に用いる固相担体は、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合したものであれば特に限定されない。
リガンドとしては、小胞の表面に存在する表面抗原を認識する抗体が好ましく、エクソソームの表面に存在する表面抗原を認識する抗体がより好ましい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
上記モノクローナル抗体は、特に限定されるものではなく、公知の方法、例えば、Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ  ａｓ  ａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（２００４），８９８−９０７に記載された方法に従って調製したものでよい。また、エクソソームの表面抗原ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類を認識するモノクローナル抗体は、国際公開第２０１３／０９９９２５号等を参照して作製できる。
なお、上記抗体のクラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭが挙げられるが、ＩｇＧが好ましい。また、これらを低分子化したフラグメントを用いてもよい。例えば、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ等が挙げられる。
【００２６】
上記リガンドを結合させる固相担体の材質としては、例えば、ポリスチレン類、ポリエチレン類、ポリプロピレン類、ポリエステル類、ポリ（メタ）アクリロニトリル類、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ（メタ）アクリル酸エステル類、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物；ガラス；金属；磁性体；磁性体を含む樹脂組成物；これらの組み合わせ等が挙げられる。
また、固相担体の形状は特に限定されるものではなく、例えば、トレイ状、球状、粒子状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等が挙げられる。
本発明においては、固液分離や洗浄の容易性の観点から、磁性粒子が好ましい。
【００２７】
上記磁性粒子としては、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属；コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる磁性体からなる微粒子；これら磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が挙げられる。樹脂としては、疎水性重合体、親水性重合体などが挙げられる。
中でも、磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が好ましく、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面にポリマー層が形成されたものがより好ましい。例えば、特開２００８−３２４１１号公報に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層が形成され、当該第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。
【００２８】
ここで、超常磁性微粒子としては、粒子径２０ｎｍ以下（好ましくは粒子径５〜２０ｎｍ）の酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＸＦｅ2Ｏ4（Ｘは、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ0.5Ｆｅ0.5等である。）で表現されるフェライト、Ｆｅ3Ｏ4で表現されるマグネタイト、γ−Ｆｅ2Ｏ3が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない点で、γ−Ｆｅ2Ｏ3及びＦｅ3Ｏ4のいずれか一方を含むことが好ましい。
【００２９】
また、上記疎水性の第１ポリマー層を形成するためのモノマーは、単官能モノマー、多官能モノマーに大別される。ここで、単官能モノマーとは反応性基を１個有するモノマーであり、多官能モノマーとは反応性基を２個以上有するモノマーである。
単官能モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル系モノマー；メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレート等のエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル系モノマーを例示することができる。
多官能モノマーとしては、例えば、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレート等の多官能（メタ）アクリレート；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィンの他、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。
【００３０】
また、上記第２ポリマー層を形成するためのモノマーは、粒子表面への官能基導入を主目的とするものであり、グリシジル基含有モノマーを含むものが好ましい。グリシジル基含有モノマーの含有量としては、第２ポリマー層を形成するための全モノマー中、２０質量％以上が好ましい。ここで、グリシジル基含有モノマーとしては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル等が挙げられる。
【００３１】
第２ポリマー層のグリシジル基を化学修飾することにより導入される極性基としては、リガンドと反応可能な官能基であることが好ましく、酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含むものがより好ましい。中でも、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基、活性エステル基がより好ましい。特に、磁性粒子の第２ポリマー層が前記極性基及び２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する場合、リガンドとの結合性が良好となる。
また、磁性粒子等の固相担体は、その表面にビオチン類結合部位を有する物質が固定されていてもよい。ビオチン類結合部位を有する物質としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、及びそれらの誘導体から選ばれる１種又は２種以上の化合物等が挙げられる。さらに、この場合、固相担体は、ビオチン類結合部位を有する物質を介してビオチン類を結合した抗体等が結合されていてもよい。固相担体の表面へのビオチン類結合部位を有する物質の固定は、日本国特許第４７１６０３４号公報に記載された方法等の公知の方法により行えばよい。
【００３２】
リガンドを固相担体に結合する方法としては、物理的吸着法や、共有結合法、イオン結合法といった化学的に結合する方法などが用いられる。物理的吸着法としては、固相担体にリガンドを直接固定する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定する方法などが挙げられる。化学的に結合させる方法としては、固相担体表面に導入した、リガンドと反応可能な官能基を利用して、固相担体上に直接結合する方法、固相担体とリガンドとの間にスペーサー分子（カルボジイミド化合物など）を化学結合で導入してから結合する方法、アルブミンなどの他のタンパク質にリガンドを結合させた後、そのタンパク質を固相担体に化学結合する方法などが挙げられる。
【００３３】
また、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体は、市販品を用いてもよい。例えば、Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ９  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ６３  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）（いずれもＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＣＤ９  Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ、ＣＤ６３  Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ、ＣＤ８１  Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ（いずれもＳＢＩ社製）等が挙げられる。
【００３４】
また、上記リガンドが結合した固相担体の使用量は、生体試料に対し、好ましくは０．００００１〜０．１質量倍、より好ましくは０．０００１〜０．０１質量倍である。
【００３５】
複合体形成工程における複合体形成反応液には、上記各成分の他に、必要に応じて、界面活性剤；アルブミン等のタンパク質；核酸；ショ糖等の糖類等を添加することもできる。
界面活性剤は、非特異吸着の低減の観点、小胞へのダメージを抑える上で効果的であり、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤がさらに好ましい。また、界面活性剤は、芳香族基を分子中に含まない界面活性剤が好ましい。
芳香族基を分子中に含まない界面活性剤としては、例えば、高級アルコールエチレンオキサイド付加物、脂肪酸エチレンオキサイド付加物、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物、高級アルキルアミンエチレンオキサイド付加物、脂肪酸アミドエチレンオキサイド付加物、油脂のエチレンオキサイド付加物、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物等が挙げられる。これらの中でも、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物が好ましい。具体的には、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール等が挙げられる。
界面活性剤の使用量は、複合体形成反応液の全量に対して、好ましくは０．００５〜１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１５〜３．５％（ｗ／ｖ）である。
【００３６】
また、複合体形成工程における反応温度は、好ましくは２〜４２℃の範囲内であり、より好ましくは３〜４０℃の範囲内、特に好ましくは４〜３７℃の範囲内である。本発明の分離方法における複合体形成工程は常温又は常温付近でも反応が選択的かつ効率よく進行するため、非常に簡便である。また、反応時間は、通常、１分間〜４８時間であるが、好ましくは５分間〜２４時間、より好ましくは１０分間〜１０時間、特に好ましくは１０分間〜５時間である。
【００３７】
複合体形成工程において、系中のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５〜１０の範囲、より好ましくはｐＨ６〜８の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【００３８】
（洗浄工程）
洗浄工程は、上記複合体形成工程で形成された小胞と固相担体との複合体に洗浄液を加えて洗浄工程液を形成し、上記複合体を洗浄する工程である。これによって、未反応の成分や未反応の標識物質等が除去される。複合体形成工程における複合体を含む系をそのまま洗浄してもよい。
【００３９】
上記洗浄工程は、通常、固相担体の形状により２種類に分けられる。磁性粒子のように固相担体が粒子状である場合には、例えば洗浄液中に磁性粒子を分散させて洗浄する方法が挙げられ、一方、固相担体がマイクロプレートのような形態である場合には、その表面に洗浄液を接触させて洗浄する方法が挙げられる。いずれの態様であっても、本発明においては、洗浄液として、界面活性剤を含む洗浄液を使用することが好ましい。界面活性剤としては、上記複合体形成工程で使用してもよいものと同様のものが好ましい。
【００４０】
また、固相担体が磁性粒子の場合、洗浄工程としては、磁性粒子を磁力により集めて磁性粒子と液相とを分離する集磁工程、及び該集磁工程で分離された磁性粒子を洗浄液中に分散させる分散工程とを含むことが好ましい。これによって、未反応の物質や生体試料中の夾雑物を磁性粒子表面からさらに効率よく洗浄・分離除去できる。
具体的には、反応容器に磁場を作用させ、磁性粒子を反応容器壁に付着させて集めた後、反応上清を除去し、さらに必要に応じて洗浄液を加え、同様に磁場を作用させた後上清を除去する操作を繰り返すことにより行えばよい。洗浄液としては、上記複合体形成工程で挙げた界面活性剤と緩衝液を含む洗浄液が好ましい。
【００４１】
（反応液の塩濃度）
本発明の分離方法では、複合体形成工程及び洗浄工程の少なくともいずれかを、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行うことが好ましい。すなわち、複合体形成反応液の塩濃度および洗浄工程液の塩濃度の少なくともいずれかを、０．１５〜２Ｍの環境下で行うことが好ましい。さらに、捕捉反応の反応性の観点から、複合体形成工程を、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行うのが好ましい。反応液の塩濃度は、複合体形成工程の全体もしくは一部、または洗浄工程の全体もしくは一部において０．１５〜２Ｍの範囲であればよい。
反応液の塩濃度は、より好ましくは０．２Ｍ以上、さらに好ましくは０．２５Ｍ以上であり、また、より好ましくは１Ｍ以下、さらに好ましくは０．５Ｍ以下、特に好ましくは０．４５Ｍ以下、最も好ましくは０．３５Ｍ以下である。
【００４２】
反応液に含まれる無機塩としては、アルカリ金属ハロゲン化物；炭酸塩、重炭酸塩等の無機酸の塩が挙げられ、アルカリ金属ハロゲン化物が好ましく、アルカリ金属塩化物がより好ましい。無機塩としては、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム等が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの中でも、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムが好ましく、塩化ナトリウム、塩化カリウムがより好ましく、塩化ナトリウムが特に好ましい。
【００４３】
反応液に含まれる有機塩としては、有機酸の塩が好ましく、有機酸のアルカリ金属塩がより好ましく、カルボン酸のアルカリ金属塩が更に好ましく、カルボン酸のナトリウム塩が特に好ましい。有機塩としては、具体的には、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、乳酸ナトリウム等が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４４】
反応液の塩濃度が０．１５Ｍ未満の場合及び２Ｍよりも高い場合には、非特異吸着の増大や捕捉反応の反応性の低下が生じる場合があり、また、小胞内外の浸透圧差によって、小胞が破壊される場合もある。
【００４５】
（解離工程）
本発明の分離方法は、洗浄工程後、捕捉された小胞をリガンドから解離する解離工程を有していてもよい。
リガンドが特定の抗体である場合に抗原・抗体反応による特異的な結合を解離される条件としては、アフィニティークロマトグラフィー等で種々のものが知られている（例えば、"Ａｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  ｍｅｔｈｏｄｓ"  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ参照）。上記解離工程はこれに準じて行えばよい。即ち、本発明で使用される解離液としては、塩酸、硫酸、プロピオン酸、酢酸、グリシン／塩酸バッファー等の酸性溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、アンモニア水溶液、ジエチルアミン等のアルカリ性溶液；３Ｍ塩化ナトリウム水溶液、４．５Ｍ塩化マグネシウム水溶液等の高イオン強度溶液；ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤含有溶液；ジオキサン、エチレングリコール等の極性を下げる物質を含有する緩衝液；トリクロロ酢酸、チオシアン酸などのカオトロピックイオンの他、尿素、塩酸グアニジン等を含有する緩衝液が挙げられる。
【００４６】
〔核酸の検出方法及びタンパク質の検出方法〕
本発明の小胞中の核酸の検出方法は、上記分離方法の後に、さらに小胞中の核酸を検出する核酸検出工程を含むものである。
また、本発明の小胞由来のタンパク質の検出方法は、上記分離方法の後に、さらに小胞の内側及び表面の少なくとも一方に存在するタンパク質を検出するタンパク質検出工程を含むものである。
これら検出方法は、上記分離方法を行う以外は常法にしたがっておこなえばよい。上記脂質二重膜を有する小胞がエクソソームである場合、回収されたエクソソームから核酸やタンパク質を、ＰＣＲ法、電気泳動法、ウェスタンブロッティング法、免疫化学的方法、フローサイトメトリー等の公知の方法に従って検出すればよい。これらの中でも、簡便に感度よく検出でき、且つネイティブフォームの立体構造を維持できる点からは、フローサイトメトリーが好ましい。また、核酸としては、ｍｉＲＮＡやｍＲＮＡ等が挙げられる。
特に、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、本発明の核酸の検出方法によれば、エクソソーム由来の核酸（ｍｉＲＮＡ等）を検出し、それを解析することによって、生理現象や各種疾患の判定が可能になる。
【００４７】
〔シグナル測定方法〕
本発明の小胞由来のシグナル測定方法は、上記分離方法の後に、さらに前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定するシグナル測定工程を含むものである。
上記シグナル強度の測定は免疫測定法により行えばよく、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素イムノメトリックアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、イムノブロット法、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー等が挙げられる。これらの中でも、簡便に感度よく検出でき、且つネイティブフォームの立体構造を維持できる点からは、フローサイトメトリーが好ましい。また、簡便に感度よく抗体を検出できる点からは、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。ＥＬＩＳＡ法としては、競合法、サンドイッチ法などが挙げられる。また、検出感度の面から発光免疫測定法も好ましい。発光免疫測定法は、例えば、富士レビオ社製クラスIIIシリーズ等の市販の発光基質を反応させて、Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ＧｌｏＭａｘ等の発光測定機を用いて、発光免疫測定法におけるシグナル強度である発光強度を測定することにより行うことができる。
ここで、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用する場合の分離方法の一例を示す。まず、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドを固相担体に結合した後、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料を接触させて複合体を形成させ、その後洗浄する。そこに、モノクローナル抗体又はその抗体断片や疾患特異的膜タンパク質抗体又はその抗体断片を修飾した標識抗体を添加して、さらなる複合体を形成させる。そして、形成された複合体中の標識量を検出することにより、生体試料に含まれる小胞に由来するシグナル量や、生体試料に含まれる疾患特異的小胞量を測定することができる。
【００４８】
〔疾患の判定方法〕
本発明の被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための方法は、被検者由来の生体試料を用いて、上記シグナル測定方法により前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程（以下、工程（Ｉ）ともいう）を含むことを特徴とするものである。
そして、工程（Ｉ）で測定されたシグナル強度と、対照者由来の生体試料のシグナル強度とを対比して、被検者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合に、被検者が疾患を発症していると判定すればよい（以下、工程（ＩＩ）ともいう）。
本発明の疾患の判定方法で判定可能な疾患としては、癌疾患（大腸癌、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌、腎癌、皮膚癌など）、炎症系疾患（リウマチ、変形性関節症、腎症、膵炎、肝炎、アレルギーなど）、アルツハイマー等の神経変性疾患、脳疾患、免疫不全に関連する疾患、不妊、うつ病、自閉症等の精神疾患、パーキンソン病等の難治療性疾患、自己免疫性疾患、循環器疾患、血液疾患、消化器疾患、老化に伴う疾患、感染症等が例示される。これらの中でも、癌疾患、免疫系疾患の判定に有用であり、特に癌疾患の判定に特に有用である。
また、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の免疫活性の指標に応用すれば、癌ワクチンの癌疾患に対する効果判定にも応用できる。
【００４９】
工程（Ｉ）は、上記シグナル測定方法で測定を行うこと以外は常法にしたがって行えばよい。
また、工程（ＩＩ）は、工程（Ｉ）で測定されたシグナル強度について、対照者由来の生体試料のシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、被検者由来の生体試料のシグナルが対照者におけるシグナルと比べて強い場合に、疾患を発症している可能性が高いと判断される。なお、本発明において、対照者とは、疾患を発症していない被検者と同年代・同性の者の平均をいい、対照者におけるシグナル強度は被検者におけるシグナル強度と共に測定してもよく、別途予め測定した値から得られた統計値を用いてもよい。
【００５０】
〔疾患治療薬の薬効評価方法〕
本発明の疾患治療薬の薬効評価方法は、疾患治療薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料を用いて、上記シグナル測定方法により、複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程（以下、工程（Ａ）ともいう）を含むことを特徴とするものである。
そして、疾患治療薬の投与後の被検者由来の生体試料における複合体由来のシグナル強度が、疾患治療薬の投与前の被検者由来の生体試料における複合体由来のシグナル強度より弱いと認められる場合に、疾患治療薬が薬効を示している可能性が高いと判定すればよい（以下、工程（Ｂ）ともいう）。
上記疾患治療薬としては、上記判定方法で判定可能な疾患を治療する薬物が挙げられる。好適な具体例は、抗癌剤、抗免疫系疾患薬である。
【００５１】
工程（Ａ）は、上記シグナル測定方法で測定を行うこと以外は常法にしたがって行えばよい。
また、工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で測定されたシグナル強度について、疾患治療薬の投与前の生体試料におけるシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、疾患治療薬の投与後の生体試料におけるシグナル量が投与前の生体試料におけるシグナル量と比べて少ない場合に、該薬が疾患を抑える効果を有している可能性が高いと判断される。
特に、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、疾患治療薬の投与の前後での血中エクソソームの変化（存在量の増減だけに加え、膜タンパク質の量の変動を含む）を測定することにより、患者における薬効を評価することが可能になると考えられる。また、例えば、癌細胞に特異的な膜タンパク質に対するリガンドとエクソソームの表面抗原に対するリガンドとを組み合わせれば、癌診断の特異性の向上や癌種の特定などが期待でき、より癌疾患に特異的な診断薬の開発が可能となると考えられる。
【００５２】
〔キット〕
本発明のキットは、脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体と、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有する液状組成物とを備えることを特徴とするものである。斯かるキットは、上記分離方法、上記疾患の判定、上記疾患治療薬の薬効評価に有用である。
固相担体、液状組成物に含まれる無機塩又は有機塩としては、上記分離方法で用いるものと同様のものが挙げられる。
上記液状組成物中の塩濃度は、好ましくは０．３Ｍ以上、より好ましくは０．４Ｍ以上、更に好ましくは０．５Ｍ以上であり、また、好ましくは４Ｍ以下、より好ましくは２Ｍ以下、更に好ましくは１Ｍ以下、更に好ましくは０．９Ｍ以下、特に好ましくは０．７Ｍ以下である。
また、液状組成物は、上記分離方法と同様の界面活性剤を含んでいてもよい。また、液状組成物のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５〜１０の範囲、より好ましくはｐＨ６〜８の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えば、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【００５３】
〔液状組成物、検体希釈液〕
本発明の液状組成物は、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程とを含む、脂質二重膜を有する小胞の分離方法に使用される、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかに添加するための液状組成物であって、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有する。  また、本発明の検体希釈液は、不溶性担体を用いて脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料から脂質二重膜を有する小胞を分離する方法に使用される、前記小胞と前記不溶性担体との複合体を形成させるための検体希釈液であって、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有することを特徴とするものである。
[実施例]
【００５４】
以下、具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら具体例に限定されるものではない。
【００５５】
（バッファー類の調製）
表１に示す比較反応バッファー１および反応バッファー１〜５を準備した。
反応バッファー：トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ（組成は、１，３７０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，  ２６．８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ，  ２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ；Ｓｉｇｍａ社製１０×ＴＢＳを水で１０倍希釈したもの。ｐH7.4。以下同じ。））に、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（ｇｉｂｃｏ社製  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、以下同じ）を０．０３％（ｗ／ｖ）になるように添加し、更に、必要に応じて塩化ナトリウム（Ｗａｋｏ社製、試薬特級）を表１に示す濃度になるように添加したもの。
【００５６】
【表１】
2016186215.tif 000002
【００５７】
コントロールバッファーとして、以下のバッファーを準備した。
コントロールバッファー：ＴＢＳに、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールを濃度が０．０３％（ｗ／ｖ）になるように添加したもの。ｐH7.4。
【００５８】
（検体の調製）
検体１（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）：コントロールバッファーに、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液（低分子の塩は濃縮されていない。以下同じ。）を２０倍希釈となるように添加したもの。
検体２（Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）。
検体３（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を２０倍希釈となるように添加したもの。
検体４（Ｐｌａｓｍａ）：プールクエン酸血漿（コージンバイオ社製）。
検体５（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ）：プールクエン酸血漿（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を２０倍希釈となるように添加したもの。
検体６（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）：試験例１で作製したコントロールバッファーに、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体７（Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）。
検体８（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体９（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）：試験例１で作製したコントロールバッファーに、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体１０（Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）。
検体１１（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体１２（Ｐｌａｓｍａ（Ｈｅｐａｒｉｎ））：プールヘパリン血漿（コージンバイオ社製）。
検体１３（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｐｌａｓｍａ（Ｈｅｐａｒｉｎ））：プールヘパリン血漿（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体１４（Ｐｌａｓｍａ（ＥＤＴＡ））：プールＥＤＴＡ血漿（コージンバイオ社製）。
検体１５（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｐｌａｓｍａ（ＥＤＴＡ））：プールＥＤＴＡ血漿（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体１６（Ｐｌａｓｍａ（Ｃｉｔｒａｔｅ））：プールクエン酸血漿（コージンバイオ社製）。
検体１７（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｐｌａｓｍａ（Ｃｉｔｒａｔｅ））：プールクエン酸血漿（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体１８（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１０倍希釈となるように添加したもの。
検体１９（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｐｌａｓｍａ（Ｈｅｐａｒｉｎ））：プールヘパリン血漿（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１０倍希釈となるように添加したもの。
【００５９】
（抗体結合粒子の調製）
陰性対照粒子：抗マウスＩｇＧ抗体（ＪＳＲライフサイエンス社製、以下同じ）を磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、以下同じ。）に結合させたもの。陰性対象粒子は、エクソソームと反応しない。
抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子：ＣＤ９抗体（アブカム社製  ａｂ２２１５、以下同じ）を磁性粒子に結合させたもの。
抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子：ＣＤ６３抗体（ＪＳＲライフサイエンス社製）を磁性粒子に結合させたもの。
抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子：抗ＣＤ８１抗体（Ｃｌｏｎｅ  Ｍ３８、Ａｂｎｏｖａ  ＭＡＢ６４３５）を磁性粒子に結合させたもの。
抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子：抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＪＳＲライフサイエンス社製）を磁性粒子に結合させたもの。
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ抗体結合磁性粒子：抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子と抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を１：１：１：１で混合したもの。
【００６０】
（試験例１）
９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、陰性対照粒子０．０１２５ｍｇを加え、各ウェルに、コントロールバッファー、検体１〜５を２５μＬ、１ウェルあたりに１種ずつ添加した。比較反応バッファー１を、反応液の塩濃度が０．０７Ｍになるように加え、２５℃で２０分反応させた（ｐＨ：７．４）。また、比較反応バッファー１に代えて反応バッファー１〜５をそれぞれ使用し、同様の反応を行った。
【００６１】
本明細書におけるすべての試験例において、各反応バッファーを用いたときの、反応液の塩濃度は以下の通りである。
【００６２】
反応バッファー        反応液の塩濃度
――――――――――――――――――――
比較反応バッファー１    ０．０７Ｍ
反応バッファー１        ０．１５Ｍ
反応バッファー２        ０．２Ｍ
反応バッファー３        ０．２５Ｍ
反応バッファー４        ０．３Ｍ
反応バッファー５        ０．３５Ｍ
――――――――――――――――――――
【００６３】
次に、洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ。以下同じ。）を用いて反応後の陰性対照粒子を洗浄し、ＢＳＡを１質量％含むＴＢＳで希釈したアルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰ）標識抗ＣＤ８１抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、２５℃で２０分反応させた。上記と同様の洗浄バッファーで洗浄した後、発光基質（富士レビオ社製クラスIIIシリーズ  ルミパルス基質液）を５０μＬ添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ＧｌｏＭａｘ）を用いて発光強度を測定した。結果を図１−１、図１−２に示す。
図１−１、図１−２に示すとおり、反応液の塩濃度が０．０７Ｍの場合は、検体成分の非特異吸着に起因すると考えられるバックグラウンドシグナルが検出されたが、反応液の塩濃度が０．１５〜０．３５Ｍの場合には非特異吸着が低減され、バックグラウンドシグナルが減少していた。
【００６４】
（試験例２−１）
この抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子と、エクソソームを含む臨床検体と、比較反応バッファー１または反応バッファー１〜５のいずれかを混合し、洗浄後、試験例１と同様にＥＬＩＳＡにより捕捉されたエクソソームを検出することで、比較反応バッファー１または反応バッファー１〜５を用いた場合の反応性を評価した。
【００６５】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加え、各チューブに、検体６〜８を１チューブあたりに１種ずつ添加した（検体６：０．１ｍＬ、検体７：０．１ｍＬ、検体８：０．１ｍＬ）。比較反応バッファー１を、反応液の塩濃度が０．０７Ｍになるように加え、２５℃で５時間反応させた（ｐＨ：７．４）。また、比較反応バッファー１に代えて反応バッファー１〜５をそれぞれ使用し、同様の反応を行った。
次に、Ｗａｓｈｉｎｇ／Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＪＳＲライフサイエンス社製）０．５ｍＬで洗浄した後、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、０．０１２５ｍｇ／ｗｅｌｌとなるように分注した。試験例１と同様にして、洗浄バッファーによる洗浄、ＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行った後、発光強度を測定した。結果を図２−１に示す。
図２−１に示すとおり、反応液の塩濃度が０．１５〜０．３５Ｍの場合は、血清中での捕捉反応の反応性が向上することがわかった。
【００６６】
（試験例２−２）
捕捉反応の反応条件を２５℃２０分から４℃５時間に変更して、試験例２−１と同様の試験を行った。
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加え、各チューブに、検体６〜８を各０．１ｍＬ、１チューブあたりに１種ずつ添加した。比較反応バッファー１を、反応液の塩濃度が０．０７Ｍになるように加え、４℃で５時間反応させた（ｐＨ：７．４）。また、比較反応バッファー１に代えて反応バッファー３を使用し、同様の反応を行った。
次に、洗浄バッファー０．５ｍＬで洗浄した後、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、０．０１２５ｍｇ／ｗｅｌｌとなるように分注した。試験例１と同様にして、洗浄バッファーによる洗浄、ＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行った後、発光強度を測定した。結果を図２−２に示す。なお、図２−２には反応温度２５℃で行った試験結果もあわせて示す。
試験例２−２の結果（図２−２）から、反応液の塩濃度が０．２５Ｍの場合は、反応温度が４℃、２５℃のいずれであっても、血清中での捕捉反応の反応性が良好となることがわかった。
【００６７】
（試験例３）
反応バッファー３の非特異吸着低減作用を、検体を変更して確認した。
【００６８】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、陰性対照粒子０．１ｍｇを加え、各チューブに検体９〜１７を０．１ｍＬ、１チューブあたりに１種ずつ添加した。比較反応バッファー１を、反応液の塩濃度が０．０７Ｍになるように加え、２５℃で５時間反応させた（ｐＨ：７．４）。また、比較反応バッファー１に代えて反応バッファー３を等量使用し、同様の反応を行った。
次に、洗浄バッファー０．５ｍＬで洗浄した後、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、０．０１２５ｍｇ／ｗｅｌｌとなるように分注した。試験例１と同様にして、洗浄バッファーによる洗浄、ＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行った後、発光強度を測定した。
図３に示すとおり、反応液の塩濃度が０．２５Ｍの場合は、検体の種類によらずバックグラウンドシグナルが少なかった。
【００６９】
（試験例４）
反応バッファー３の反応性向上作用を、検体を変更して確認した。具体的手順を以下に示す。
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加え、各チューブに、検体９〜１３を０．１ｍＬ、１チューブあたりに１種ずつ添加した。比較反応バッファー１を、塩濃度が０．０７Ｍになるように加え、２５℃で５時間反応させた（ｐＨ：７．４）。また、比較反応バッファー１に代えて反応バッファー３を使用し、同様の反応を行った。
次に、洗浄バッファー０．５ｍＬで洗浄した後、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、０．０１２５ｍｇ／ｗｅｌｌとなるように分注した。試験例１と同様にして、洗浄バッファーによる洗浄、ＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行った後、発光強度を測定した。結果を図４に示す。
図４に示すとおり、塩濃度が０．２５Ｍの場合は、検体の種類によらず捕捉反応の反応性が高かった。
【００７０】
（試験例５）
抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子、抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子、抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子に変更し、検体として検体１０〜１３を用いた以外は試験例４と同様にして、反応バッファー３の反応性向上作用の検討を行った。結果を図５−１（抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子）、図５−２（抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子）、図５−３（抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子）に示す。
【００７１】
（試験例６  小胞中の核酸の検出）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を１２本用意し、チューブ１〜１２とナンバリングした。チューブ１〜４に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇずつ、チューブ５〜８に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．５ｍｇずつ、チューブ９〜１２に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を１ｍｇずつ、それぞれ加えた。
次いで、チューブ１〜１２に、反応バッファー３を、反応液の塩濃度が０．２５Ｍになるように加え、更に検体１０を１ｍＬずつ加えた。チューブ１，５，９については２５℃で１時間、チューブ２，６，１０については２５℃で５時間、チューブ３，７，１１については２５℃で２４時間、チューブ４，８，１２については４℃で２４時間反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー０．５ｍＬで３回洗浄し、この懸濁液を、上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に０．５ｍＬ分注した。集磁ラックを用いて、抗体結合磁性粒子を集磁後、上清を０．４ｍＬ抜き取り、残った抗体結合粒子液０．１ｍＬからｍｉｃｒｏＲＮＡを回収し定量した。結果を図６に示す。
なお、ｍｉｃｒｏＲＮＡの回収にはＥｘｏＣａｐTM Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ社製、＃ＭＥＸ−Ｅ）を用いた。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ−２１）の定量には、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製、＃４３６６５９７）、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（ライフテクノロジーズ社製、＃１８６９４８３８４）、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ，  ｎｏ  ＵＮＧ（ライフテクノロジーズ社製、＃４４４００４０）を用い、操作については推奨プロトコールに従った。
【００７２】
図６に示すとおり、反応液の塩濃度０．２５Ｍ環境下で反応させることによって、ヒト健常者血清に由来する小胞中の核酸を検出できた。さらに検出された核酸量は、抗体結合粒子量、温度、時間に依存して上昇した。
【００７３】
（試験例７  小胞中の核酸の検出）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を８本用意し、チューブ１３〜２０とナンバリングした。チューブ１３〜１４に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を１ｍｇずつ、チューブ１５〜１６に、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子を１ｍｇずつ、チューブ１７〜１８に、抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を１ｍｇずつ、チューブ１９〜２０に、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ抗体結合磁性粒子（抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子と抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を１：１：１：１で混合したもの）を１ｍｇずつ、それぞれ加えた。
次いで、チューブ１３〜２０に、反応バッファー３を、反応液の塩濃度が０．２５Ｍになるように添加した。奇数番号のチューブに試験例３で示した検体１０を、偶数番号のチューブに試験例３で示した検体１２を、それぞれ０．３ｍＬずつ加え、２５℃で２４時間反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー０．５ｍＬで３回洗浄し、この懸濁液を、上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に０．５ｍＬ分注した。集磁ラックを用いて、抗体結合磁性粒子を集磁後、上清を０．４ｍＬ抜き取り、残った抗体結合粒子液０．１ｍＬからｍｉｃｒｏＲＮＡを回収し定量した。結果を図７−１、図７−２に示す。
なお、ｍｉｃｒｏＲＮＡの回収にはｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（５０）（ＱＩＡＧＥＮ社製、＃２１７１８４）を用いた。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ−２１）の定量は、試験例６の場合と同様に行った。
【００７４】
また、比較対象として、エクソソームを回収する標準的な方法である超遠心分離法を利用して小胞中の核酸の検出を行った。すなわち、検体１０、１２それぞれ１１ｍＬずつについて、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」とも言う。）を１１ｍＬ加え、懸濁した。再度、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００ｒｐｍ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを０．１１ｍＬ加え、懸濁した。懸濁液のうち３μＬをｍｉｃｒｏＲＮＡの回収、定量に用いた。結果を図７−１、図７−２に示す。
なお、ｍｉｃｒｏＲＮＡの回収、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ−２１）の定量は、上記と同様にして行った。
【００７５】
図７−１に示すとおり、反応液の塩濃度０．２５Ｍ環境下で反応させることによって、ヒト健常者血清に由来する小胞中の核酸を、超遠心分離法と同等レベルで検出できることが確認された。
図７−２に示すとおり、ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞中の核酸は、超遠心分離法を利用した場合では検出できなかった。ヒト健常者ヘパリン血漿は一般的にＰＣＲ阻害を起こす物質を含むと考えられており、超遠心分離法により回収したサンプルではＰＣＲを阻害する物質が残存するためと考えられる。これに対し、反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で反応させた場合にはヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞中の核酸を検出できた。
これらの結果から、反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で小胞と粒子を反応させることによって、血清、血漿といった検体の種類を問わず小胞中の核酸を検出できた。
【００７６】
（試験例８  小胞表面のタンパクの検出）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を１０本用意し、チューブ２１〜３０とナンバリングした。各チューブに、以下のように磁性粒子０．２ｍｇずつを加えた。
【００７７】
チューブ番号        磁性粒子
――――――――――――――――――――――――――――――
２１〜２２      抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子
２３〜２４      抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子
２５〜２６      抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子
２７〜２８      抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子
２９〜３０      Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ抗体結合磁性粒子
――――――――――――――――――――――――――――――
【００７８】
次いで、チューブ２１〜３０に、反応バッファー３を、反応液の塩濃度が０．２５Ｍになるように添加した。奇数番号のチューブに試験例３で示した検体１０を、偶数番号のチューブに試験例３で示した検体１２を、それぞれ１．０ｍＬずつ加え、２５℃で３時間反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー０．５ｍＬで３回洗浄し、この懸濁液を、上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に０．５ｍＬ分注した。
次いで集磁して洗浄液を廃棄後、抗体結合磁性粒子を１×サンプルバッファー２０μＬで懸濁し、９５℃で５分間静置処理した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファーにて洗浄した。
試験例８と同様にして、一次抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行い、発光基質を反応させ、発光測定器にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図８−１、図８−２に示す。
【００７９】
また、比較対象として、エクソソームを回収する標準的な方法である超遠心分離法を利用して小胞表面のタンパクの検出を行った。すなわち、検体１０、１２それぞれ１１ｍＬずつについて、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを１１ｍＬ加え、懸濁した。再度、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを０．１１ｍＬ加え、懸濁した。懸濁液のうち１０μＬに４×サンプルバッファー５μＬ、ＰＢＳ５μＬを添加し、９５℃で５分間静置処理した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファーにて洗浄した。
試験例８と同様にして、一次抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行い、発光基質を反応させ、発光測定器にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図８−１、図８−２に示す。
【００８０】
図８−１、図８−２に示すとおり、反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で小胞と粒子を反応させることによって、ヒト健常者血清、ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞表面のタンパクを、超遠心分離法と同等レベルで検出できることが確認された。また、抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合には、小胞表面タンパクは検出されなかった。ＥｐＣＡＭタンパク質は健常者の血液中にはほとんど存在せず、癌などの疾患によりその血中濃度が上昇すると考えられている。反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で小胞と粒子を反応させることによって、非特異反応を抑制することができた。
【００８１】
（試験例９−１  小胞表面のネイティブフォームの立体構造を維持したタンパクの検出（１））
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を８本用意し、チューブ３１〜３８とナンバリングした。各チューブに、以下のように磁性粒子０．１ｍｇずつを加えた。
【００８２】
チューブ番号          磁性粒子
――――――――――――――――――――――――――――――――
３１，３２      抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子
３３，３４      抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子
３５，３６      抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子
３７，３８      抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子
――――――――――――――――――――――――――――――――
【００８３】
反応バッファー３を、反応液の塩濃度が０．２５Ｍになるようにチューブ３１〜３８に添加した。
次いで、チューブ３１，３３，３５，３７には試験例３で示した検体１０を０．３ｍＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。また、チューブ３２，３４，３６，３８には試験例３で示した検体１２を０．３ｍＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー０．２５ｍＬで２回洗浄し、集磁後、上清を取り除き、リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに懸濁した。
上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を４０本用意し、チューブ３９〜７８とナンバリングした。チューブ３１〜３８の懸濁液を、次のようにして０．１ｍＬずつ分注した。
チューブ３１の懸濁液を、チューブ３９〜４３へ。
チューブ３２の懸濁液を、チューブ４４〜４８へ。
チューブ３３の懸濁液を、チューブ４９〜５３へ。
チューブ３４の懸濁液を、チューブ５４〜５８へ。
チューブ３５の懸濁液を、チューブ５９〜６３へ。
チューブ３６の懸濁液を、チューブ６４〜６８へ。
チューブ３７の懸濁液を、チューブ６９〜７３へ。
チューブ３８の懸濁液を、チューブ７４〜７８へ。
【００８４】
次いで、各チューブに、以下のように抗体をそれぞれ５μＬずつ添加した。
【００８５】
チューブ番号                                  抗体
――――――――――――――――――――――――――――――――――
３９，４４，４９，５４，５９，６４，６９，７４    ＰＥ抗マウスＩｇＧ
４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５    ＰＥ抗ＣＤ９
４１，４６，５１，５６，６１，６６，７１，７６    ＰＥ抗ＣＤ６３
４２，４７，５２，５７，６２，６７，７２，７７    ＰＥ抗ＣＤ８１
４３，４８，５３，５８，６３，６８，７３，７８    ＰＥ抗ＥｐＣＡＭ
――――――――――――――――――――――――――――――――――
【００８６】
ここで、
ＰＥ抗マウスＩｇＧ：フィコエリスリン（以下、ＰＥ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＯＮＹ社製）
ＰＥ抗ＣＤ９：ＰＥ標識抗ＣＤ９抗体（ＳＯＮＹ社製）
ＰＥ抗ＣＤ６３：ＰＥ標識抗ＣＤ６３抗体（ＳＯＮＹ社製）
ＰＥ抗ＣＤ８１：ＰＥ標識抗ＣＤ８１抗体（ＳＯＮＹ社製）
ＰＥ抗ＥｐＣＡＭ：ＰＥ標識抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＳＯＮＹ社製）
【００８７】
その後、チューブ３９〜７８を、２５℃、１０００ｒｐｍの条件で、１時間懸濁した。
次に、反応後の各粒子をリン酸緩衝生理食塩水０．５ｍＬで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＢＤ社製、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６）を用いて、各サンプルの蛍光シグナルを確認した。結果を図９−１、図９−２に示す。
【００８８】
図９−１、図９−２に示すとおり、反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で小胞と粒子を反応させることによって、ヒト健常者血清、ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞表面のＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が検出できた。
また、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子、抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を用いた場合において、発癌により発現すると考えられているＥｐＣＡＭを抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出したピークが、コントロールとした抗マウスＩｇＧ抗体と比較してピークシフトしていなかった。健常者の検体からは検出されないものと考えられる。
さらに、固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合には、抗マウスＩｇＧ抗体で検出されたピークと抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出されたピークはさほど変わらなかった。すなわち、固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合に、健常者の検体よりエクソソームは得られなかった。非特異吸着が低いものと考えられる。
また、解析に用いたサンプルにはタンパク質の立体構造を変化させる熱、薬剤等の処理をしておらず、小胞表面に存在するネイティブフォームのＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が検出できたものと考えられる。
【００８９】
（試験例９−２  小胞表面のネイティブフォームの立体構造を維持したタンパクの検出（２））
試験に先立ち、以下に示す検体１８、１９を用意した。
【００９０】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を８本用意し、チューブ７９〜８６とナンバリングした。チューブ７９，８０に抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ、チューブ８１，８２に抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ、チューブ８３，８４に抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ、チューブ８５，８６に抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加えた。反応バッファー３を、反応液の塩濃度が０．２５Ｍになるようにチューブ７９〜８６に添加した。
次いで、チューブ７９，８１，８３，８５には検体１８を０．３ｍＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。また、チューブ８０，８２，８４，８６には検体１９を０．３ｍＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー０．２５ｍＬで２回洗浄し、集磁後、上清を取り除き、リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに懸濁した。
上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を４０本用意し、チューブ８７〜１２６とナンバリングした。チューブ７９〜８６の懸濁液を、次のようにして０．１ｍＬずつ分注した。
チューブ７９の懸濁液を、チューブ８７〜９１へ。
チューブ８０の懸濁液を、チューブ９２〜９６へ。
チューブ８１の懸濁液を、チューブ９７〜１０１へ。
チューブ８２の懸濁液を、チューブ１０２〜１０６へ。
チューブ８３の懸濁液を、チューブ１０７〜１１１へ。
チューブ８４の懸濁液を、チューブ１１２〜１１６へ。
チューブ８５の懸濁液を、チューブ１１７〜１２１へ。
チューブ８６の懸濁液を、チューブ１２２〜１２６へ。
【００９１】
次いで、各チューブに、以下のように抗体をそれぞれ５μＬずつ添加した。
【００９２】
チューブ番号                              抗体
――――――――――――――――――――――――――――――――
87, 92, 97, 102, 107, 112, 117, 122       ＰＥ抗マウスＩｇＧ
88, 93, 98, 103, 108, 113, 118, 123       ＰＥ抗ＣＤ９
89, 94, 99, 104, 109, 114, 119, 124       ＰＥ抗ＣＤ６３
90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125      ＰＥ抗ＣＤ８１
91, 96, 101, 106, 111, 116, 121, 126      ＰＥ抗ＥｐＣＡＭ
――――――――――――――――――――――――――――――――
【００９３】
その後、チューブ８７〜１２６を、２５℃、１０００ｒｐｍの条件で、１時間懸濁した。
次に、反応後の各粒子をリン酸緩衝生理食塩水０．５ｍＬで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＢＤ社製、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６）を用いて、各サンプルの蛍光シグナルを確認した。結果を図９−３、図９−４に示す。
【００９４】
図９−３、図９−４に示すとおり、反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で小胞と粒子を反応させることによって、ヒト健常者血清、ヒト健常者ヘパリン血漿、ヒト結腸がんＨＴ２９細胞に由来する小胞表面に存在するＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が検出できた。
また発癌により発現すると考えられているＥｐＣＡＭを抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出したピークについて、コントロールとした抗マウスＩｇＧ抗体と比較してピークシフトが観察された。サンプルに健常者検体のみを用いている図９−１、図９−２ではこのピークシフトは確認されなかったことから、本発明を利用して疾患を判定できると考えられる。
さらに、固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合には、抗マウスＩｇＧ抗体で検出されたピークと抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出されたピークはさほど変わらなかった。すなわち、固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合に、健常者の検体よりエクソソームは得られなかった。非特異吸着が低いものと考えられる。
また、解析に用いたサンプルにはタンパク質の立体構造を変化させる熱、薬剤等の処理をしておらず、小胞表面に存在するネイティブフォームのＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が検出できたものと考えられる。
【００９５】
（試験例１０）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を２０本用意し、チューブ１２７〜１４６とナンバリングした。各チューブに、以下のように磁性粒子０．２ｍｇずつを加えた。
【００９６】
チューブ番号            磁性粒子
―――――――――――――――――――――――――――――
１２７〜１３０      抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子
１３１〜１３４      抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子
１３５〜１３８      抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子
１３９〜１４２      抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子
１４３〜１４６      Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ抗体結合磁性粒子
―――――――――――――――――――――――――――――
【００９７】
次いで、チューブ１２７〜１４６に、反応バッファー３を、反応液の塩濃度が０．２５Ｍになるように添加した。各チューブに、以下のように検体をそれぞれ０．１ｍＬずつ加え、２５℃で２４時間反応させた。
【００９８】
チューブ番号                検体
――――――――――――――――――――――――――――――
１２７，１３１，１３５，１３９，１４３    検体１０
１２８，１３２，１３６，１４０，１４４    検体１８
１２９，１３３，１３７，１４１，１４５    検体１２
１３０，１３４，１３８，１４２，１４６    検体１９
――――――――――――――――――――――――――――――
【００９９】
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー０．５ｍＬで３回洗浄し、この懸濁液を、上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に０．５ｍＬ分注した。
次いで集磁して洗浄液を廃棄後、抗体結合磁性粒子を１×サンプルバッファー２０μＬで懸濁し、９５℃で５分間静置処理した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファーにて洗浄した。
試験例８と同様にして、一次抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行い、発光基質を反応させ、発光測定器にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図１０−１、図１０−２に示す。
【０１００】
また、比較対象として、エクソソームを回収する標準的な方法である超遠心分離法を利用して小胞表面のタンパクの検出を行った。すなわち、検体１０、１２、１８、１９それぞれ１１ｍＬずつについて、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを１１ｍＬ加え、懸濁した。再度、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを０．１１ｍＬ加え、懸濁した。懸濁液のうち１μＬに４×サンプルバッファー５μＬ、ＰＢＳ１４μＬを添加し、９５℃で５分間静置処理した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファーにて洗浄した。
試験例８と同様にして、一次抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行い、発光基質を反応させ、発光測定器にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図１０−１、図１０−２に示す。
【０１０１】
図１０−１、図１０−２に示すとおり、反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で小胞と粒子を反応させることによって、ヒト健常者血清、ヒト健常者ヘパリン血漿、ヒト結腸がんＨＴ２９細胞に由来する小胞表面のタンパクを、超遠心分離法と同等レベルもしくはそれ以上で検出できた。また、抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いて検出した場合に、ヒト健常者血清、ヘパリン血漿ではバンドが検出されず、これらにヒト結腸がんＨＴ２９細胞の培養上清を添加した場合にはバンドが検出された。本発明を利用して疾患を判定できると考えられる。
【０１０２】
〔脂質二重膜を有する小胞の分離方法（第１の分離方法）〕
本発明の第１の分離方法は、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、小胞と固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、複合体を洗浄する洗浄工程を含み、複合体形成工程及び洗浄工程の少なくともいずれかを、終濃度０．１５〜２Ｍの無機塩又は有機塩の存在下で行うことを特徴とするものである。ここで、本明細書において終濃度（最終濃度）とは、生体試料由来の無機塩（通常０．１４Ｍ程度）や有機塩を含まない無機塩、有機塩の濃度であり、複合体形成工程、洗浄工程の際における人為的に存在させた系内の無機塩又は有機塩の最終濃度をいう。無機塩又は有機塩の終濃度は、粉状、粒状等の固形物や検体希釈液等の液状組成物によるいずれの方法においても調整することが可能である。また、終濃度の測定は、公知の各種の測定方法や測定機器等を用いて行えばよい。
【０１０３】
（複合体形成工程）
複合体形成工程は、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、小胞と固相担体との複合体を形成させる工程である。上記接触により、リガンドに小胞が捕捉され、小胞と固相担体との複合体が形成される。なお、複合体形成工程の反応系には、上記固相担体に結合したリガンド以外に、脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドも共存していてもよい。
【０１０４】
上記生体試料は脂質二重膜を有する小胞を含むものであれば特に限定されるものではなく、例えば、体液、菌体液、細胞培養の培地、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体が挙げられる。この中でも、体液、細胞培養上清が好ましく、体液がより好ましい。体液としては、全血、血清、血漿、血液成分、各種血球、血餅、血小板等の血液組成成分の他、尿、精液、母乳、汗、間質液、間質性リンパ液、骨髄液、組織液、唾液、胃液、関節液、胸水、胆汁、腹水、羊水等が挙げられ、好ましくは血液組成成分である。本発明の第１の分離方法は、斯様な臨床検体を生体試料として用いた場合であっても、固相担体への非特異吸着が低く、捕捉反応の反応性が高いため、本発明の第１の分離方法によれば、広範な種類の生体試料から選択的かつ効率よく小胞を分離できる。例えば、生体試料として血漿を用いた場合でも非特異吸着が起こりにくく、血清を用いた場合でも捕捉反応の反応性が高い。
なお、血液組成成分は、クエン酸、ヘパリン、ＥＤＴＡ等の抗凝固剤で処理されたものでもよい。
【０１０５】
上記生体試料は、終濃度が０．１５〜２Ｍとなる量の無機塩又は有機塩を含むバッファー組成物に添加しておくなどして予め前処理したものを用いてもよいが、生体から摂取したものをそのまま用いることもできる。すなわち、本発明の第１の分離方法によれば、ＰＥＧ沈殿法、超遠心機等を用いた単離法等による前処理を行わず簡便に選択的な分離をすることも可能である。
【０１０６】
また、上記脂質二重膜を有する小胞としては、細胞、細胞から細胞外に放出されるエクソソームのような小胞が挙げられるが、本発明の第１の分離方法は、小胞がエクソソームである場合に特に好ましく用いられる。
また、小胞の表面に存在する表面抗原は、小胞の表面に存在する物質で抗原性のあるものであれば特に限定されない。エクソソームの表面抗原を例に挙げると、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類；ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ等の抗原提示関連タンパク質；インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＥｐＣＡＭなどの接着分子；ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＧＦ−βなどのサイトカイン／サイトカイン受容体、酵素類等が挙げられる。これらの中でも、エクソソーム表面に存在する抗原タンパク質が好ましい。
【０１０７】
また、本発明の第１の分離方法に用いる固相担体は、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合したものであれば特に限定されない。
リガンドとしては、小胞の表面に存在する表面抗原を認識する抗体が好ましく、エクソソームの表面に存在する表面抗原を認識する抗体がより好ましい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
上記モノクローナル抗体は、特に限定されるものではなく、公知の方法、例えば、Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ  ａｓ  ａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（２００４），８９８−９０７に記載された方法に従って調製したものでよい。また、エクソソームの表面抗原ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類を認識するモノクローナル抗体は、国際公開第２０１３／０９９９２５号等を参照して作製できる。
なお、上記抗体のクラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭが挙げられるが、ＩｇＧが好ましい。また、これらを低分子化したフラグメントを用いてもよい。例えば、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ等が挙げられる。
【０１０８】
上記リガンドを結合させる固相担体の材質としては、例えば、ポリスチレン類、ポリエチレン類、ポリプロピレン類、ポリエステル類、ポリ（メタ）アクリロニトリル類、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ（メタ）アクリル酸エステル類、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物；ガラス；金属；磁性体；磁性体を含む樹脂組成物；これらの組み合わせ等が挙げられる。
また、固相担体の形状は特に限定されるものではなく、例えば、トレイ状、球状、粒子状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等が挙げられる。
本発明においては、固液分離や洗浄の容易性の観点から、磁性粒子が好ましい。
【０１０９】
上記磁性粒子としては、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ3Ｏ4）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ2Ｏ3）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属；コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる磁性体微粒子；これら磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が挙げられる。樹脂としては、疎水性重合体、親水性重合体などが挙げられる。
中でも、磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が好ましく、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面にポリマー層が形成されたものがより好ましい。例えば、特開２００８−３２４１１号公報に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層が形成され、当該第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。
【０１１０】
ここで、超常磁性微粒子としては、粒子径２０ｎｍ以下（好ましくは粒子径５〜２０ｎｍ）の酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＸＦｅ2Ｏ4（Ｘ＝Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ0.5Ｆｅ0.5等）で表現されるフェライト、Ｆｅ3Ｏ4で表現されるマグネタイト、γ−Ｆｅ2Ｏ3が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない点で、γ−Ｆｅ2Ｏ3及びＦｅ3Ｏ4のいずれか一方を含むことが好ましい。
【０１１１】
また、上記疎水性の第１ポリマー層を形成するためのモノマーは、単官能性モノマー、架橋性モノマーに大別される。
上記単官能性モノマーとして、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル系モノマー；メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレート等のエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル系モノマーを例示することができる。また、上記架橋性モノマーとして、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレート等の多官能性（メタ）アクリレート；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィンの他、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。
【０１１２】
また、上記第２ポリマー層を形成するためのモノマーは、粒子表面への官能基導入を主目的とするものであり、グリシジル基含有モノマーを含むものである。グリシジル基含有モノマーの含有量としては、第２ポリマー層を形成するためのモノマー中、２０質量％以上が好ましい。ここで、グリシジル基を含む共重合性モノマーとしては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル等が挙げられる。
【０１１３】
第２ポリマー層のグリシジル基を化学修飾することにより導入される極性基としては、リガンドと反応可能な官能基であることが好ましく、酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含むものがより好ましい。中でも、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基、活性エステル基がより好ましい。特に、磁性粒子の第２ポリマー層が前記極性基及び２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する場合、リガンドとの結合性が良好となる。
また、磁性粒子等の固相担体は、その表面にビオチン類結合部位を有する物質が固定されていてもよい。ビオチン類結合部位を有する物質としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、及びそれらの誘導体から選ばれる１種又は２種以上の化合物等が挙げられる。さらに、この場合、固相担体は、ビオチン類結合部位を有する物質を介してビオチン類を結合した抗体等が結合されていてもよい。固相担体の表面へのビオチン類結合部位を有する物質の固定は、日本国特許第４７１６０３４号公報に記載された方法等の公知の方法により行えばよい。
【０１１４】
リガンドを固相担体に結合する方法としては、物理的吸着法や、共有結合法、イオン結合法といった化学的に結合する方法などが用いられる。物理的吸着法としては、固相担体にリガンドを直接固定する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定する方法などが挙げられる。化学的に結合させる方法としては、固相担体表面に導入した、リガンドと反応可能な官能基を利用して、固相担体上に直接結合する方法、固相担体とリガンドとの間にスペーサー分子（カルボジイミド化合物など）を化学結合で導入してから結合する方法、アルブミンなどの他のタンパク質にリガンドを結合させた後、そのタンパク質を固相担体に化学結合する方法などが挙げられる。
【０１１５】
また、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体は、市販品を用いてもよい。例えば、Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ９  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ６３  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）（いずれもＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＣＤ９  Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ、ＣＤ６３  Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ、ＣＤ８１  Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ（いずれもＳＢＩ社製）等が挙げられる。
【０１１６】
また、上記リガンドが結合した固相担体の使用量は、生体試料に対し、好ましくは０．００００１〜０．１質量倍、より好ましくは０．０００１〜０．０１質量倍である。
【０１１７】
複合体形成工程は、上記各成分の他に、必要に応じて、界面活性剤；アルブミン等のタンパク質；核酸；ショ糖等の糖類等を用いて行ってもよい。
これらの中では、非特異吸着の低減の観点、小胞へのダメージを抑える観点から、界面活性剤が好ましく、非イオン性界面活性剤がより好ましく、ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤が特に好ましい。また、界面活性剤は、芳香族基を分子中に含まないものが好ましい。
例えば、高級アルコールエチレンオキサイド付加物、脂肪酸エチレンオキサイド付加物、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物、高級アルキルアミンエチレンオキサイド付加物、脂肪酸アミドエチレンオキサイド付加物、油脂のエチレンオキサイド付加物、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物等が挙げられる。これらの中でも、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物が好ましい。具体的には、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール等が挙げられる。
界面活性剤の使用量は、終濃度で、好ましくは０．００５〜１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１５〜３．５％（ｗ／ｖ）である。
【０１１８】
また、複合体形成工程における反応温度は、好ましくは２〜４２℃の範囲内であり、より好ましくは１５〜４０℃の範囲内、特に好ましくは２０〜３７℃の範囲内である。本発明の第１の分離方法における複合体形成工程は常温又は常温付近でも反応が選択的かつ効率よく進行するため、非常に簡便である。また、反応時間は、通常、１分間〜４８時間であるが、好ましくは５分間〜２４時間、より好ましくは１０分間〜１０時間、特に好ましくは１０分間〜５時間である。
【０１１９】
複合体形成工程において、系中のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５〜１０の範囲、より好ましくはｐＨ６〜８の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えば、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【０１２０】
（洗浄工程）
洗浄工程は、上記複合体形成工程で形成された小胞と固相担体との複合体を洗浄する工程である。これによって、未反応の成分や未反応の標識物質等が除去される。複合体形成工程における複合体を含む系をそのまま洗浄してもよい。
【０１２１】
上記洗浄工程は、通常、固相担体の形状により２種類に分けられる。磁性粒子のように固相担体が粒子状である場合には、例えば洗浄液中に磁性粒子を分散させて洗浄する方法が挙げられ、一方、固相担体がマイクロプレートのような形態である場合には、その表面に洗浄液を接触させて洗浄する方法が挙げられる。いずれの態様であっても、本発明においては、洗浄液として、界面活性剤を含む洗浄液を使用することが好ましい。界面活性剤としては、上記複合体形成工程で使用してもよいものと同様のものが好ましい。
【０１２２】
また、固相担体が磁性粒子の場合、洗浄工程としては、磁性粒子を磁力により集めて磁性粒子と液相とを分離する集磁工程、及び該集磁工程で分離された磁性粒子を洗浄液中に分散させる分散工程とを含むことが好ましい。これによって、未反応の物質や生体試料中の夾雑物を磁性粒子表面からさらに効率よく洗浄・分離除去できる。
具体的には、反応容器に磁場を作用させ、磁性粒子を反応容器壁に付着させて集めた後、反応上清を除去し、さらに必要に応じて洗浄液を加え、同様に磁場を作用させた後上清を除去する操作を繰り返すことにより行えばよい。洗浄液としては、上記複合体形成工程で挙げた界面活性剤と緩衝液を含む洗浄液が好ましい。
【０１２３】
（無機塩又は有機塩）
本発明の第１の分離方法は、複合体形成工程及び洗浄工程の少なくともいずれかを、終濃度０．１５〜２Ｍの無機塩又は有機塩の存在下で行うものであるが、捕捉反応の反応性の観点から、複合体形成工程を、終濃度０．１５〜２Ｍの無機塩又は有機塩の存在下で行うのが好ましい。また、無機塩、有機塩の中では、本発明の所望の効果を高める観点から、無機塩が好ましい。
【０１２４】
上記無機塩としては、アルカリ金属ハロゲン化物；炭酸塩、重炭酸塩等の無機酸の塩が挙げられ、アルカリ金属ハロゲン化物が好ましく、アルカリ金属塩化物がより好ましい。無機塩としては、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム等が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの中でも、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムが好ましく、塩化ナトリウム、塩化カリウムがより好ましく、塩化ナトリウムが特に好ましい。
【０１２５】
上記有機塩としては、有機酸の塩が好ましく、有機酸のアルカリ金属塩がより好ましく、カルボン酸のアルカリ金属塩が更に好ましく、カルボン酸のナトリウム塩が特に好ましい。有機塩としては、具体的には、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、乳酸ナトリウム等が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１２６】
また、系内の無機塩又は有機塩の終濃度は、０．１５〜２Ｍである。本明細書で規定する終濃度が０．１５Ｍ未満の場合及び２Ｍよりも高い場合は、非特異吸着の増大や捕捉反応の反応性の低下が生じることがあり、また、小胞内外の浸透圧差によって、小胞が破壊されることも懸念される。終濃度は、好ましくは０．１７５Ｍ以上、より好ましくは０．２Ｍ以上、特に好ましくは０．２５Ｍ以上であり、また、好ましくは１Ｍ以下、より好ましくは０．５Ｍ以下、更に好ましくは０．４５Ｍ以下、特に好ましくは０．３５Ｍ以下である。
【０１２７】
（解離工程）
本発明の分離方法は、洗浄工程後、捕捉された小胞をリガンドから解離する解離工程を有していてもよい。
リガンドが特定の抗体である場合に抗原・抗体反応による特異的な結合を解離される条件としては、アフィニティークロマトグラフィー等で種々のものが知られている（例えば、"Ａｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  ｍｅｔｈｏｄｓ" Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ参照）。上記解離工程はこれに準じて行えばよい。即ち、本発明で使用される解離液としては、塩酸、硫酸、プロピオン酸、酢酸、グリシン／塩酸バッファー等の酸性溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、アンモニア水溶液、ジエチルアミン等のアルカリ性溶液；３Ｍ塩化ナトリウム水溶液、４．５Ｍ塩化マグネシウム水溶液等の高イオン強度溶液；ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤含有溶液；ジオキサン、エチレングリコール等の極性を下げる物質を含有する緩衝液；トリクロロ酢酸、チオシアン酸などのカオトロピックイオンの他、尿素、塩酸グアニジン等を含有する緩衝液が挙げられる。
【０１２８】
〔核酸の検出方法及びタンパク質の検出方法〕
本発明の小胞中の核酸の検出方法は、上記第１の分離方法の後に、さらに小胞中の核酸を検出する核酸検出工程を含むものである。
また、本発明の小胞由来のタンパク質の検出方法は、上記第１の分離方法の後に、さらに小胞の内側及び表面の少なくとも一方に存在するタンパク質を検出するタンパク質検出工程を含むものである。
これら検出方法は、上記第１の分離方法を行う以外は常法にしたがっておこなえばよい。上記脂質二重膜を有する小胞がエクソソームである場合、回収されたエクソソームから核酸やタンパク質を、ＰＣＲ法、電気泳動法、ウェスタンブロッティング法、免疫化学的方法、フローサイトメトリー等の公知の方法に従って検出すればよい。これらの中でも、簡便に感度よく検出でき、且つネイティブフォームの立体構造を維持できる点からは、フローサイトメトリーが好ましい。また、核酸としては、ｍｉＲＮＡやｍＲＮＡ等が挙げられる。
特に、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、本発明の核酸の検出方法によれば、エクソソーム由来の核酸（ｍｉＲＮＡ等）を検出し、それを解析することによって、生理現象や各種疾患の判定が可能になる。
【０１２９】
〔シグナル測定方法〕
本発明の小胞由来のシグナル測定方法は、上記第１の分離方法の後に、さらに前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定するシグナル測定工程を含むものである。
上記シグナル強度の測定は免疫測定法により行えばよく、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素イムノメトリックアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、イムノブロット法、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー等が挙げられる。これらの中でも、簡便に感度よく検出でき、且つネイティブフォームの立体構造を維持できる点からは、フローサイトメトリーが好ましい。また、簡便に感度よく抗体を検出できる点からは、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。ＥＬＩＳＡ法としては、競合法、サンドイッチ法などが挙げられる。
ここで、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用する場合の分離方法の一例を示す。まず、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドを固相担体に結合した後、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料を接触させて複合体を形成させ、その後洗浄する。そこに、モノクローナル抗体又はその抗体断片や疾患特異的膜タンパク質抗体又はその抗体断片を修飾した標識抗体を添加して、さらなる複合体を形成させる。そして、形成された複合体中の標識量を検出することにより、生体試料に含まれる小胞に由来するシグナル量や、生体試料に含まれる疾患特異的小胞量を測定することができる。
【０１３０】
〔疾患の判定方法〕
本発明の被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための方法は、被検者由来の生体試料を用いて、上記シグナル測定方法により前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程（以下、工程（Ｉ）ともいう）を含むことを特徴とするものである。
そして、工程（Ｉ）で測定されたシグナル強度と、対照者由来の生体試料のシグナル強度とを対比して、被検者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合に、被検者が疾患を発症していると判定すればよい（以下、工程（ＩＩ）ともいう）。
本発明の疾患の判定方法で判定可能な疾患としては、癌疾患（大腸癌、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌、腎癌、皮膚癌など）、炎症系疾患（リウマチ、変形性関節症、腎症、膵炎、肝炎、アレルギーなど）、アルツハイマー等の神経変性疾患、脳疾患、免疫不全に関連する疾患、不妊、うつ病、自閉症等の精神疾患、パーキンソン病等の難治療性疾患、自己免疫性疾患、循環器疾患、血液疾患、消化器疾患、老化に伴う疾患、感染症等が例示される。これらの中でも、癌疾患、免疫系疾患の判定に有用であり、特に癌疾患の判定に特に有用である。
また、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の免疫活性の指標に応用すれば、癌ワクチンの癌疾患に対する効果判定にも応用できる。
【０１３１】
工程（Ｉ）は、上記シグナル測定方法で測定を行うこと以外は常法にしたがって行えばよい。
また、工程（ＩＩ）は、工程（Ｉ）で測定されたシグナル強度について、対照者由来の生体試料のシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、被検者由来の生体試料のシグナルが対照者におけるシグナルと比べて強い場合に、疾患を発症している可能性が高いと判断される。なお、本発明において、対照者とは、疾患を発症していない被検者と同年代・同性の者の平均をいい、対照者におけるシグナル強度は被検者におけるシグナル強度と共に測定してもよく、別途予め測定した値から得られた統計値を用いてもよい。
【０１３２】
〔疾患治療薬の薬効評価方法〕
本発明の疾患治療薬の薬効評価方法は、疾患治療薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料を用いて、上記シグナル測定方法により、複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程（以下、工程（Ａ）ともいう）を含むことを特徴とするものである。
そして、疾患治療薬の投与後の被検者由来の生体試料における複合体由来のシグナル強度が、疾患治療薬の投与前の被検者由来の生体試料における複合体由来のシグナル強度より弱いと認められる場合に、疾患治療薬が薬効を示している可能性が高いと判定すればよい（以下、工程（Ｂ）ともいう）。
上記疾患治療薬としては、上記判定方法で判定可能な疾患を治療する薬物が挙げられる。好適な具体例は、抗癌剤、抗免疫系疾患薬である。
【０１３３】
工程（Ａ）は、上記シグナル測定方法で測定を行うこと以外は常法にしたがって行えばよい。
また、工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で測定されたシグナル強度について、疾患治療薬の投与前の生体試料におけるシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、疾患治療薬の投与後の生体試料におけるシグナル量が投与前の生体試料におけるシグナル量と比べて少ない場合に、該薬が疾患を抑える効果を有している可能性が高いと判断される。
特に、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、疾患治療薬の投与の前後での血中エクソソームの変化（存在量の増減だけに加え、膜タンパク質の量の変動を含む）を測定することにより、患者における薬効を評価することが可能になると考えられる。また、例えば、癌細胞に特異的な膜タンパク質に対するリガンドとエクソソームの表面抗原に対するリガンドとを組み合わせれば、癌診断の特異性の向上や癌種の特定などが期待でき、より癌疾患に特異的な診断薬の開発が可能となると考えられる。
【０１３４】
〔キット〕
本発明のキットは、脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体と、無機塩又は有機塩を含み該無機塩又は有機塩の含有量が系内の終濃度を０．１５〜２Ｍに調整できる量である液状組成物とを備えることを特徴とするものである。斯かるキットは、上記第１の分離方法、上記疾患の判定、上記疾患治療薬の薬効評価に有用である。
固相担体、液状組成物に含まれる無機塩又は有機塩としては、上記第１の分離方法で用いるものと同様のものが挙げられる。
上記終濃度は、好ましくは０．１７５Ｍ以上、より好ましくは０．２Ｍ以上、特に好ましくは０．２５Ｍ以上であり、また、好ましくは１Ｍ以下、より好ましくは０．５Ｍ以下、更に好ましくは０．４５Ｍ以下、特に好ましくは０．３５Ｍ以下である。
具体的には、液状組成物中における無機塩又は有機塩の含有量は、好ましくは０．３Ｍ以上、より好ましくは０．４Ｍ以上、更に好ましくは０．５Ｍ以上であり、また、好ましくは４Ｍ以下、より好ましくは２Ｍ以下、更に好ましくは１Ｍ以下、更に好ましくは０．９Ｍ以下、特に好ましくは０．７Ｍ以下である。
また、液状組成物は、上記第１の分離方法と同様の界面活性剤を含んでいてもよい。また、液状組成物のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５〜１０の範囲、より好ましくはｐＨ６〜８の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えば、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【０１３５】
〔液状組成物、検体希釈液及び第２の分離方法〕
本発明の液状組成物は、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程とを含む、脂質二重膜を有する小胞の分離方法に使用される、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかに添加するための液状組成物であって、無機塩又は有機塩を含み、該無機塩又は有機塩の含有量が、系内の終濃度を０．１５〜２Ｍに調整できる量であることを特徴とするものである。
また、本発明の検体希釈液は、不溶性担体を用いて脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料から脂質二重膜を有する小胞を分離する方法に使用される、前記小胞と前記不溶性担体との複合体を形成させるための検体希釈液であって、無機塩又は有機塩を含み、該無機塩又は有機塩の含有量が、系内の終濃度を０．１５〜２Ｍに調整できる量であることを特徴とするものである。
また、本発明の第２の分離方法は、不溶性担体を用いて脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料から脂質二重膜を有する小胞を分離する方法であって、無機塩又は有機塩を含み、該無機塩又は有機塩の含有量が、系内の終濃度を０．１５〜２Ｍに調整できる量である検体希釈液を系内に添加することを特徴とするものである。
本発明の液状組成物及び検体希釈液の組成、ｐＨは、上記本発明のキットが備える液状組成物と同様である。また、本発明の検体希釈液は、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体以外の不溶性担体（例えば、ゲル濾過担体やフィルター等）を用いた小胞分離に用いてもよい。したがって、本発明の検体希釈液は、種々の担体を用いた小胞分離に利用することができる。
[実施例]
【０１３６】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１３７】
（試験例１）
エクソソームとは反応しない抗マウスＩｇＧ抗体を磁性粒子に結合させた陰性対照粒子と、エクソソームを含む臨床検体と、反応バッファーとを混合し、洗浄後、エクソソームの膜上に発現しているＣＤ８１を認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡにより陰性対照粒子に非特異吸着したエクソソームを検出することで、反応バッファーの非特異吸着低減作用を確認した。具体的手順を以下に示す。
【０１３８】
まず、参考例１及び実施例１〜５の反応バッファーとして、以下の反応バッファーを準備した。
参考例１及び実施例１〜５の反応バッファー：トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ（Ｓｉｇｍａ社製１０×ＴＢＳを１０倍希釈、以下同じ））に、非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（ｇｉｂｃｏ社製  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、以下同じ）を濃度が０．０３％（ｗ／ｖ）になるように添加し、更に、無機塩として塩化ナトリウム（Ｗａｋｏ社製、試薬特級）を表２に示す濃度になるように添加したもの
【０１３９】
【表２】
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【０１４０】
次に、コントロールバッファーとして、以下のバッファーを準備した。
コントロールバッファー：ＴＢＳに、非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールを濃度が０．０３％（ｗ／ｖ）になるように添加したもの
また、検体１〜５として、以下の検体を準備した。
検体１（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）：コントロールバッファーに、スパイクとしてＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を２０倍希釈となるように添加したもの
検体２（Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）
検体３（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）に、スパイクとしてＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を２０倍希釈となるように添加したもの
検体４（Ｐｌａｓｍａ）：プールクエン酸血漿（コージンバイオ社製）
検体５（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ）：プールクエン酸血漿（コージンバイオ社製）に、スパイクとしてＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を２０倍希釈となるように添加したもの
次に、陰性対照粒子として、抗マウスＩｇＧ抗体（ＪＳＲライフサイエンス社製、以下同じ）を磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、以下同じ）に結合させたものを準備した。
【０１４１】
次いで、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、陰性対照粒子０．０１２５ｍｇを加え、各ウェルに、コントロールバッファー、検体１〜５を２５μＬ、１ウェルあたりに１種ずつ添加した。参考例１の反応バッファーを、塩化ナトリウムの終濃度が０．０７Ｍになるように加え、２５℃で２０分反応させた（ｐＨ：７．４）。また、参考例１の反応バッファーに代えて実施例１〜５の反応バッファーをそれぞれ等量使用し、同様の反応を行った（実施例１：終濃度０．１５Ｍ、実施例２：終濃度０．２Ｍ、実施例３：終濃度０．２５Ｍ、実施例４：終濃度０．３Ｍ、実施例５：終濃度０．３５Ｍ（実施例１〜５：ｐＨ７．４））。
次に、洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）を用いて反応後の陰性対照粒子を洗浄し、ＢＳＡを１質量％含むＴＢＳで希釈したアルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰ）標識抗ＣＤ８１抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、２５℃で２０分反応させた。上記と同様の洗浄バッファーで洗浄した後、発光基質（富士レビオ社製クラスIIIシリーズ  ルミパルス基質液）を５０μＬ添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ＧｌｏＭａｘ）を用いて発光強度を測定した。結果を図１−１、図１−２に示す。
図１−１、図１−２に示すとおり、塩化ナトリウムの終濃度が０．０７Ｍの場合（参考例１）は、検体成分の非特異吸着に起因すると考えられるバックグラウンドシグナルが検出されたが、塩化ナトリウムの終濃度が０．１５〜０．３５Ｍの場合（実施例１〜５）には非特異吸着が低減され、バックグラウンドシグナルが減少していた。
【０１４２】
（試験例２−１）
抗ＣＤ９抗体（アブカム社製  ａｂ２２１５、以下同じ）を磁性粒子に結合させたもの（以下、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子ともいう）を準備し、この抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子と、エクソソームを含む臨床検体と、参考例１及び実施例１〜５の各反応バッファーとを混合し、洗浄後、試験例１と同様にＥＬＩＳＡにより捕捉されたエクソソームを検出することで、参考例１及び実施例１〜５の各反応バッファーを用いた場合の反応性を評価した。具体的手順を以下に示す。
まず、検体６〜８として、以下の検体を準備した。
検体６（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）：試験例１で作製したコントロールバッファーに、スパイクとしてＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの
検体７（Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）
検体８（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）に、スパイクとしてＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの
【０１４３】
次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加え、各チューブに、検体６〜８を１チューブあたりに１種ずつ添加した（検体６：０．１ｍＬ、検体７：０．１ｍＬ、検体８：０．１ｍＬ）。参考例１の反応バッファーを、塩化ナトリウムの終濃度が０．０７Ｍになるように加え、２５℃で５時間反応させた（ｐＨ：７．４）。また、参考例１の反応バッファーに代えて実施例１〜５の反応バッファーをそれぞれ等量使用し、同様の反応を行った（実施例１：終濃度０．１５Ｍ、実施例２：終濃度０．２Ｍ、実施例３：終濃度０．２５Ｍ、実施例４：終濃度０．３Ｍ、実施例５：終濃度０．３５Ｍ（実施例１〜５：ｐＨ７．４））。
次に、Ｗａｓｈｉｎｇ／Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＪＳＲライフサイエンス社製）０．５ｍＬで洗浄した後、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、０．０１２５ｍｇ／ｗｅｌｌとなるように分注した。これに、ＢＳＡを１質量％含むＴＢＳで希釈したＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、２５℃で２０分反応させた。洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）を用いて反応後の粒子を洗浄し、発光基質（富士レビオ社製クラスIIIシリーズ  ルミパルス基質液）を５０μＬ添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ＧｌｏＭａｘ）を用いて発光強度を測定した。結果を図２−１に示す。
図２−１に示すとおり、塩化ナトリウムの終濃度が０．１５〜０．３５Ｍの場合（実施例１〜５）は、血清中での捕捉反応の反応性が向上することがわかった。
【０１４４】
（試験例２−２）
捕捉反応の反応温度を２５℃から４℃に変更して、試験例２−１と同様の試験を行った。具体的手順を以下に示す。
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加え、各チューブに、検体６〜８を１チューブあたりに１種ずつ添加した（検体６：０．１ｍＬ、検体７：０．１ｍＬ、検体８：０．１ｍＬ）。参考例１の反応バッファーを、塩化ナトリウムの終濃度が０．０７Ｍになるように加え、４℃で５時間反応させた（ｐＨ：７．４）。また、参考例１の反応バッファーに代えて実施例３の反応バッファーを等量使用し、同様の反応を行った（実施例３：終濃度０．２５Ｍ（ｐＨ：７．４））。
次に、洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）０．５ｍＬで洗浄した後、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、０．０１２５ｍｇ／ｗｅｌｌとなるように分注した。これに、ＢＳＡを１質量％含むＴＢＳで希釈したＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、２５℃で２０分反応させた。洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）を用いて反応後の粒子を洗浄し、発光基質（富士レビオ社製クラスIIIシリーズ  ルミパルス基質液）を５０μＬ添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ＧｌｏＭａｘ）を用いて発光強度を測定した。結果を図２−２に示す。なお、図２−２には反応温度２５℃で行った試験結果もあわせて示す。
試験例２−２の結果（図２−２）から、塩化ナトリウムの終濃度が０．２５Ｍの場合（実施例３）は、反応温度が４℃、２５℃のいずれであっても、血清中での捕捉反応の反応性が良好となることがわかった。
【０１４５】
（試験例３）
実施例３の反応バッファーの非特異吸着低減作用を、検体を変更して確認した。具体的手順を以下に示す。
まず、検体９〜１７として、以下の検体を準備した。
検体９（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）：試験例１で作製したコントロールバッファーに、スパイクとしてＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの
検体１０（Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）
検体１１（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）に、スパイクとしてＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの
検体１２（Ｐｌａｓｍａ（Ｈｅｐａｒｉｎ））：プールヘパリン血漿（コージンバイオ社製）
検体１３（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｐｌａｓｍａ（Ｈｅｐａｒｉｎ））：プールヘパリン血漿（コージンバイオ社製）に、スパイクとしてＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの
検体１４（Ｐｌａｓｍａ（ＥＤＴＡ））：プールＥＤＴＡ血漿（コージンバイオ社製）
検体１５（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｐｌａｓｍａ（ＥＤＴＡ））：プールＥＤＴＡ血漿（コージンバイオ社製）に、スパイクとしてＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの
検体１６（Ｐｌａｓｍａ（Ｃｉｔｒａｔｅ））：プールクエン酸血漿（コージンバイオ社製）
検体１７（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｐｌａｓｍａ（Ｃｉｔｒａｔｅ））：プールクエン酸血漿（コージンバイオ社製）に、スパイクとしてＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの
【０１４６】
次いで、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、試験例１で作製した陰性対照粒子０．１ｍｇを加え、各チューブに検体９〜１７を０．１ｍＬ、１チューブあたりに１種ずつ添加した。参考例１の反応バッファーを、塩化ナトリウムの終濃度が０．０７Ｍになるように加え、２５℃で５時間反応させた（ｐＨ：７．４）。また、参考例１の反応バッファーに代えて実施例３の反応バッファーを等量使用し、同様の反応を行った（実施例３：終濃度０．２５Ｍ（ｐＨ：７．４））。
次に、洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）０．５ｍＬで洗浄した後、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、０．０１２５ｍｇ／ｗｅｌｌとなるように分注した。これに、ＢＳＡを１質量％含むＴＢＳで希釈したＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、２５℃で２０分反応させた。洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）を用いて反応後の粒子を洗浄し、発光基質（富士レビオ社製クラスIIIシリーズ  ルミパルス基質液）を５０μＬ添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ＧｌｏＭａｘ）を用いて発光強度を測定した。
図３に示すとおり、塩化ナトリウムの終濃度が０．２５Ｍの場合（実施例３）は、検体の種類によらずバックグラウンドシグナルが少なかった。
【０１４７】
（試験例４）
実施例３の反応バッファーの反応性向上作用を、検体を変更して確認した。具体的手順を以下に示す。
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加え、各チューブに、試験例３で示した検体９〜１３を０．１ｍＬ、１チューブあたりに１種ずつ添加した。参考例１の反応バッファーを、塩化ナトリウムの終濃度が０．０７Ｍになるように加え、２５℃で５時間反応させた（ｐＨ：７．４）。また、参考例１の反応バッファーに代えて実施例３の反応バッファーを等量使用し、同様の反応を行った（実施例３：終濃度０．２５Ｍ（ｐＨ：７．４））。
次に、洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）０．５ｍＬで洗浄した後、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、０．０１２５ｍｇ／ｗｅｌｌとなるように分注した。これに、ＢＳＡを１質量％含むＴＢＳで希釈したＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、２５℃で２０分反応させた。洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）を用いて反応後の粒子を洗浄し、発光基質（富士レビオ社製クラスIIIシリーズ  ルミパルス基質液）を５０μＬ添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ＧｌｏＭａｘ）を用いて発光強度を測定した。結果を図４に示す。
図４に示すとおり、塩化ナトリウムの終濃度が０．２５Ｍの場合（実施例３）は、検体の種類によらず捕捉反応の反応性が高かった。
【０１４８】
（試験例５）
抗ＣＤ６３抗体（ＪＳＲライフサイエンス社製）を磁性粒子に結合させたもの（以下、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子という）、抗ＣＤ８１抗体（Ｃｌｏｎｅ  Ｍ３８、Ａｂｎｏｖａ  ＭＡＢ６４３５）を磁性粒子に結合させたもの（以下、抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子という）、抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＪＳＲライフサイエンス社製）を磁性粒子に結合させたもの（以下、抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子という）を、それぞれ準備した。
抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子、抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子、抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子に変更し、検体として試験例３で示した検体１０〜１３を用いた以外は試験例４と同様にして、実施例３の反応バッファーの反応性向上作用の検討を行った。結果を図５−１（抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子）、図５−２（抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子）、図５−３（抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子）に示す。
【０１４９】
（試験例６  小胞中の核酸の検出）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を１２本用意し、チューブ１〜１２とナンバリングした。チューブ１〜４に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇずつ、チューブ５〜８に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．５ｍｇずつ、チューブ９〜１２に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を１ｍｇずつ、それぞれ加えた。
次いで、チューブ１〜１２に、実施例３の反応バッファーを、塩化ナトリウムの終濃度が０．２５Ｍになるように１ｍＬずつ加え、更に試験例３で示した検体１０を１ｍＬずつ加えた。チューブ１，５，９については２５℃で１時間、チューブ２，６，１０については２５℃で５時間、チューブ３，７，１１については２５℃で２４時間、チューブ４，８，１２については４℃で２４時間反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）０．５ｍＬで３回洗浄し、この懸濁液を、上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に０．５ｍＬ分注した。集磁ラックを用いて、抗体結合磁性粒子を集磁後、上清を０．４ｍＬ抜き取り、残った抗体結合粒子液０．１ｍＬからｍｉｃｒｏＲＮＡを回収し定量した。結果を図６に示す。
なお、ｍｉｃｒｏＲＮＡの回収にはＥｘｏＣａｐTM Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ社製、＃ＭＥＸ−Ｅ）を用いた。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ−２１）の定量には、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製、＃４３６６５９７）、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（ライフテクノロジーズ社製、＃１８６９４８３８４）、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ，  ｎｏ  ＵＮＧ（ライフテクノロジーズ社製、＃４４４００４０）を用い、操作については推奨プロトコールに従った。
【０１５０】
図６に示すとおり、終濃度０．２５Ｍの塩化ナトリウム存在下で反応させることによって、ヒト健常者血清に由来する小胞中の核酸を検出できた。さらに検出された核酸量は、抗体結合粒子量、温度、時間に依存して上昇することが確認された。
【０１５１】
（試験例７  小胞中の核酸の検出）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を８本用意し、チューブ１３〜２０とナンバリングした。チューブ１３〜１４に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を１ｍｇずつ、チューブ１５〜１６に、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子を１ｍｇずつ、チューブ１７〜１８に、抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を１ｍｇずつ、チューブ１９〜２０に、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ抗体結合磁性粒子（抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子と抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を１：１：１：１で混合したもの）を１ｍｇずつ、それぞれ加えた。
次いで、チューブ１３〜２０に、実施例３の反応バッファーを、塩化ナトリウムの終濃度が０．２５Ｍになるように０．３ｍＬずつ添加した。奇数番号のチューブに試験例３で示した検体１０を、偶数番号のチューブに試験例３で示した検体１２を、それぞれ０．３ｍＬずつ加え、２５℃で２４時間反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）０．５ｍＬで３回洗浄し、この懸濁液を、上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に０．５ｍＬ分注した。集磁ラックを用いて、抗体結合磁性粒子を集磁後、上清を０．４ｍＬ抜き取り、残った抗体結合粒子液０．１ｍＬからｍｉｃｒｏＲＮＡを回収し定量した。結果を図７−１、図７−２に示す。
なお、ｍｉｃｒｏＲＮＡの回収にはｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（５０）（ＱＩＡＧＥＮ社製、＃２１７１８４）を用いた。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ−２１）の定量には、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製、＃４３６６５９７）、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（ライフテクノロジーズ社製、＃１８６９４８３８４）、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ，  ｎｏ  ＵＮＧ（ライフテクノロジーズ社製、＃４４４００４０）を用い、操作については推奨プロトコールに従った。
【０１５２】
また、比較対象として、エクソソームを回収する標準的な方法である超遠心分離法を利用して小胞中の核酸の検出を行った。すなわち、試験例３で示した検体１０、１２それぞれ１１ｍＬずつについて、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを１１ｍＬ加え、懸濁した。再度、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００ｒｐｍ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを０．１１ｍＬ加え、懸濁した。懸濁液のうち３μＬをｍｉｃｒｏＲＮＡの回収、定量に用いた。結果を図７−１、図７−２に示す。
なお、ｍｉｃｒｏＲＮＡの回収、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ−２１）の定量は、上記と同様にして行った。
【０１５３】
図７−１に示すとおり、終濃度０．２５Ｍの塩化ナトリウム存在下で反応させることによって、ヒト健常者血清に由来する小胞中の核酸を、超遠心分離法と同等レベルで検出できることが確認された。
図７−２に示すとおり、ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞中の核酸は、超遠心分離法を利用した場合では検出できなかった。ヒト健常者ヘパリン血漿は一般的にＰＣＲ阻害を起こす物質を含むと考えられており、超遠心分離法により回収したサンプルではＰＣＲを阻害する物質が残存するためと考えられる。これに対し、終濃度０．２５Ｍの塩化ナトリウム存在下で反応させた場合にはヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞中の核酸を検出できた。
これらの結果から、終濃度０．２５Ｍの塩化ナトリウム存在下で小胞と粒子を反応させることによって、血清、血漿といった検体の種類を問わず小胞中の核酸を検出できることがわかった。
【０１５４】
（試験例８  小胞表面のタンパクの検出）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を１０本用意し、チューブ２１〜３０とナンバリングした。チューブ２１〜２２に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．２ｍｇずつ、チューブ２３〜２４に、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子を０．２ｍｇずつ、チューブ２５〜２６に、抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を０．２ｍｇずつ、チューブ２７〜２８に、抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を０．２ｍｇずつ、チューブ２９〜３０に、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ抗体結合磁性粒子（抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子と抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を１：１：１：１で混合したもの）を０．２ｍｇずつ、それぞれ加えた。
次いで、チューブ２１〜３０に、実施例３の反応バッファーを、塩化ナトリウムの終濃度が０．２５Ｍになるように１．０ｍＬずつ添加した。奇数番号のチューブに試験例３で示した検体１０を、偶数番号のチューブに試験例３で示した検体１２を、それぞれ１．０ｍＬずつ加え、２５℃で３時間反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）０．５ｍＬで３回洗浄し、この懸濁液を、上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に０．５ｍＬ分注した。
次いで集磁して洗浄液を廃棄後、抗体結合磁性粒子を１×サンプルバッファー２０μＬで懸濁し、９５℃で５分間静置処理した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄した。
一次抗体として抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体を、標識抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｕｓｅ  ＴｒｕｅＢｌｏｔ  ＵＬＴＲＡ：  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  １８−８８１７−３３）を、それぞれ２５℃で１時間反応させ、これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄した後、発光基質を反応させ、発光測定器（ＬＡＳ−３０００，ＦＵＪＩＦＩＬＭ）にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図８−１、図８−２に示す。
【０１５５】
また、比較対象として、エクソソームを回収する標準的な方法である超遠心分離法を利用して小胞表面のタンパクの検出を行った。すなわち、試験例３で示した検体１０、１２それぞれ１１ｍＬずつについて、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを１１ｍＬ加え、懸濁した。再度、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを０．１１ｍＬ加え、懸濁した。懸濁液のうち１０μＬに４×サンプルバッファー５μＬ、ＰＢＳ５μＬを添加し、９５℃で５分間静置処理した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄した。
一次抗体として抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体を、標識抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｕｓｅ  ＴｒｕｅＢｌｏｔ  ＵＬＴＲＡ：  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  １８−８８１７−３３）を、それぞれ２５℃で１時間反応させ、これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄した後、発光基質を反応させ、発光測定器（ＬＡＳ−３０００，ＦＵＪＩＦＩＬＭ）にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図８−１、図８−２に示す。
【０１５６】
図８−１、図８−２に示すとおり、終濃度０．２５Ｍの塩化ナトリウム存在下で小胞と粒子を反応させることによって、ヒト健常者血清、ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞表面のタンパクを、超遠心分離法と同等レベルで検出できることが確認された。また、抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合には、小胞表面タンパクは検出されなかった。ＥｐＣＡＭタンパク質は健常者の血液中にはほとんど存在せず、癌などの疾患によりその血中濃度が上昇すると考えられている。終濃度０．２５Ｍの塩化ナトリウム存在下で小胞と粒子を反応させることによって、非特異反応を抑制できていることが確認された。
【０１５７】
（試験例９−１  小胞表面のネイティブフォームの立体構造を維持したタンパクの検出（１））
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を８本用意し、チューブ３１〜３８とナンバリングした。チューブ３１，３２に抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ、チューブ３３，３４に抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ、チューブ３５，３６に抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ、チューブ３７，３８に抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加えた。実施例３の反応バッファーを、塩化ナトリウムの終濃度が０．２５Ｍになるようにチューブ３１〜３８に０．３ｍＬずつ添加した。
次いで、チューブ３１，３３，３５，３７には試験例３で示した検体１０を０．３ｍＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。また、チューブ３２，３４，３６，３８には試験例３で示した検体１２を０．３ｍＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）０．２５ｍＬで２回洗浄し、集磁後、上清を取り除き、リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに懸濁した。
上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を４０本用意し、チューブ３９〜７８とナンバリングした。チューブ３１より、チューブ３９〜４３へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ３２より、チューブ４４〜４８へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ３３より、チューブ４９〜５３へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ３４より、チューブ５４〜５８へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ３５より、チューブ５９〜６３へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ３６より、チューブ６４〜６８へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ３７より、チューブ６９〜７３へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ３８より、チューブ７４〜７８へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。
次いで、チューブ３９，４４，４９，５４，５９，６４，６９，７４には、コントロールとして、フィコエリスリン（以下、ＰＥ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＯＮＹ社製）を、チューブ４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５には、ＰＥ標識抗ＣＤ９抗体（ＳＯＮＹ社製）を、チューブ４１，４６，５１，５６，６１，６６，７１，７６には、ＰＥ標識抗ＣＤ６３抗体（ＳＯＮＹ社製）を、チューブ４２，４７，５２，５７，６２，６７，７２，７７には、ＰＥ標識抗ＣＤ８１抗体（ＳＯＮＹ社製）を、チューブ４３，４８，５３，５８，６３，６８，７３，７８には、ＰＥ標識抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＳＯＮＹ社製）を、それぞれ５μＬずつ添加した。その後、チューブ３９〜７８を、２５℃、１０００ｒｐｍの条件で、１時間懸濁した。
次に、反応後の各粒子をリン酸緩衝生理食塩水０．５ｍＬで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＢＤ社製、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６）を用いて、各サンプルの蛍光シグナルを確認した。結果を図９−１、図９−２に示す。
【０１５８】
図９−１、図９−２に示すとおり、終濃度０．２５Ｍの塩化ナトリウム存在下で小胞と粒子を反応させることによって、ヒト健常者血清、ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞表面のＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が検出できることが確認された。
また、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子、抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を用いた場合において、発癌により発現すると考えられているＥｐＣＡＭを抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出したピークが、コントロールとした抗マウスＩｇＧ抗体と比較してピークシフトしておらず、健常者の検体からは検出されないものと考えられる。
さらに、固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合には、抗マウスＩｇＧ抗体で検出されたピークと抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出されたピークはさほど変わらなかった。すなわち、固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合に、健常者の検体よりエクソソームは得られておらず、非特異吸着が低いものと考えられる。
また、解析に用いたサンプルにはタンパク質の立体構造を変化させる熱、薬剤等の処理をしておらず、小胞表面に存在するネイティブフォームのＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が検出できたものと考えられる。
【０１５９】
（試験例９−２  小胞表面のネイティブフォームの立体構造を維持したタンパクの検出（２））
試験に先立ち、以下に示す検体１８、１９を用意した。
検体１８（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）に、スパイクとしてＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１０倍希釈となるように添加したもの
検体１９（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｐｌａｓｍａ（Ｈｅｐａｒｉｎ））：プールヘパリン血漿（コージンバイオ社製）に、スパイクとしてＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１０倍希釈となるように添加したもの
【０１６０】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を８本用意し、チューブ７９〜８６とナンバリングした。チューブ７９，８０に抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ、チューブ８１，８２に抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ、チューブ８３，８４に抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ、チューブ８５，８６に抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加えた。実施例３の反応バッファーを、塩化ナトリウムの終濃度が０．２５Ｍになるようにチューブ７９〜８６に０．３ｍＬずつ添加した。
次いで、チューブ７９，８１，８３，８５には検体１８を０．３ｍＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。また、チューブ８０，８２，８４，８６には検体１９を０．３ｍＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）０．２５ｍＬで２回洗浄し、集磁後、上清を取り除き、リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに懸濁した。
上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を４０本用意し、チューブ８７〜１２６とナンバリングした。チューブ７９より、チューブ８７〜９１へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ８０より、チューブ９２〜９６へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ８１より、チューブ９７〜１０１へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ８２より、チューブ１０２〜１０６へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ８３より、チューブ１０７〜１１１へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ８４より、チューブ１１２〜１１６へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ８５より、チューブ１１７〜１２１へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。チューブ８６より、チューブ１２２〜１２６へ、懸濁液を０．１ｍＬずつ分注した。
次いで、チューブ８７，９２，９７，１０２，１０７，１１２，１１７，１２２には、コントロールとしてＰＥ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＯＮＹ社製）を、チューブ８８，９３，９８，１０３，１０８，１１３，１１８，１２３には、ＰＥ標識抗ＣＤ９抗体（ＳＯＮＹ社製）を、チューブ８９，９４，９９，１０４，１０９，１１４，１１９，１２４には、ＰＥ標識抗ＣＤ６３抗体（ＳＯＮＹ社製）を、チューブ９０，９５，１００，１０５，１１０，１１５，１２０，１２５には、ＰＥ標識抗ＣＤ８１抗体（ＳＯＮＹ社製）を、チューブ９１，９６，１０１，１０６，１１１，１１６，１２１，１２６には、ＰＥ標識抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＳＯＮＹ社製）を、それぞれ５μＬずつ添加した。その後、チューブ８７〜１２６を、２５℃、１０００ｒｐｍの条件で、１時間懸濁した。
次に、反応後の各粒子をリン酸緩衝生理食塩水０．５ｍＬで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＢＤ社製、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６）を用いて、各サンプルの蛍光シグナルを確認した。結果を図９−３、図９−４に示す。
【０１６１】
図９−３、図９−４に示すとおり、終濃度０．２５Ｍの塩化ナトリウム存在下で小胞と粒子を反応させることによって、ヒト健常者血清、ヒト健常者ヘパリン血漿、ヒト結腸がんＨＴ２９細胞に由来する小胞表面に存在するＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が検出できることが確認された。
また発癌により発現すると考えられているＥｐＣＡＭを抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出したピークについて、コントロールとした抗マウスＩｇＧ抗体と比較してピークシフトが確認できた。サンプルに健常者検体のみを用いている図９−１、図９−２ではこのピークシフトは確認されなかったことから、本発明を利用して疾患を判定できることがわかった。
さらに、固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合には、抗マウスＩｇＧ抗体で検出されたピークと抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出されたピークはさほど変わらなかった。すなわち、固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合に、健常者の検体よりエクソソームは得られておらず、非特異吸着が低いものと考えられる。
また、解析に用いたサンプルにはタンパク質の立体構造を変化させる熱、薬剤等の処理をしておらず、小胞表面に存在するネイティブフォームのＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が検出できたものと考えられる。
【０１６２】
（試験例１０）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を２０本用意し、チューブ１２７〜１４６とナンバリングした。チューブ１２７〜１３０に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．２ｍｇずつ、チューブ１３１〜１３４に、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子を０．２ｍｇずつ、チューブ１３５〜１３８に、抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を０．２ｍｇずつ、チューブ１３９〜１４２に、抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を０．２ｍｇずつ、チューブ１４３〜１４６に、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ抗体結合磁性粒子（抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子と抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を１：１：１：１で混合したもの）を０．２ｍｇずつ、それぞれ加えた。
次いで、チューブ１２７〜１４６に、実施例３の反応バッファーを、塩化ナトリウムの終濃度が０．２５Ｍになるように０．１ｍＬずつ添加した。チューブ１２７，１３１，１３５，１３９，１４３に試験例３で示した検体１０を、チューブ１２８，１３２，１３６，１４０，１４４に試験例９−２で示した検体１８を、チューブ１２９，１３３，１３７，１４１，１４５に試験例３で示した検体１２を、チューブ１３０，１３４，１３８，１４２，１４６に試験例９−２で示した検体１９を、それぞれ０．１ｍＬずつ加え、２５℃で２４時間反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ）０．５ｍＬで３回洗浄し、この懸濁液を、上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に０．５ｍＬ分注した。
次いで集磁して洗浄液を廃棄後、抗体結合磁性粒子を１×サンプルバッファー２０μＬで懸濁し、９５℃で５分間静置処理した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄した。
一次抗体として抗ＣＤ９抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ａｌｉｘ抗体を、標識抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｕｓｅ  ＴｒｕｅＢｌｏｔ  ＵＬＴＲＡ：  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  １８−８８１７−３３）を、それぞれ２５℃で１時間反応させ、これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄した後、発光基質を反応させ、発光測定器（ＬＡＳ−３０００，ＦＵＪＩＦＩＬＭ）にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図１０−１、図１０−２に示す。
【０１６３】
また、比較対象として、エクソソームを回収する標準的な方法である超遠心分離法を利用して小胞表面のタンパクの検出を行った。すなわち、検体１０、１２、１８、１９それぞれ１１ｍＬずつについて、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを１１ｍＬ加え、懸濁した。再度、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを０．１１ｍＬ加え、懸濁した。懸濁液のうち１μＬに４×サンプルバッファー５μＬ、ＰＢＳ１４μＬを添加し、９５℃で５分間静置処理した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄した。
一次抗体として抗ＣＤ９抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体、抗Ａｌｉｘ抗体を、標識抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｍｏｕｓｅ  ＴｒｕｅＢｌｏｔ  ＵＬＴＲＡ：  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  １８−８８１７−３３）を、それぞれ２５℃で１時間反応させ、これを洗浄バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて洗浄した後、発光基質を反応させ、発光測定器（ＬＡＳ−３０００，ＦＵＪＩＦＩＬＭ）にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図１０−１、図１０−２に示す。
【０１６４】
図１０−１、図１０−２に示すとおり、終濃度０．２５Ｍの塩化ナトリウム存在下で小胞と粒子を反応させることによって、ヒト健常者血清、ヒト健常者ヘパリン血漿、ヒト結腸がんＨＴ２９細胞に由来する小胞表面のタンパクを、超遠心分離法と同等レベルもしくはそれ以上で検出できることが確認された。また、抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いて検出した場合に、ヒト健常者血清、ヘパリン血漿ではバンドが検出されず、これらにヒト結腸がんＨＴ２９細胞の培養上清を添加した場合にはバンドが検出されることから、本発明を利用して疾患を判定できることがわかった。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年3月23日(2017.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、分離方法、検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、薬効評価方法、キット、液状組成物及び検体希釈液に関する。より詳細には、エクソソームなどの脂質二重膜を有する小胞の分離方法、該方法を利用した核酸又はタンパク質の検出方法、シグナル測定方法、疾患の判定方法、疾患治療薬の薬効評価方法、疾患判定又は薬効評価用キット、上記分離方法に用いる液状組成物、及び検体希釈液に関する。
【背景技術】
【０００２】  小胞は脂質二重膜に包まれた構造を有するものであり、斯様な小胞のうち、生体内の体液中に存在する小胞顆粒としてエクソソームが知られている。エクソソームの表面には、一般的な細胞表面と同様に、種々の膜タンパク質が存在することが知られており、その一方で、エクソソームの内部には、サイトカイン等各種タンパク質以外にもｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれることも分かってきた。【０００３】  また、免疫系の細胞や各種癌細胞等の種々の細胞からエクソソームが分泌されることが知られており、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役としてのエクソソームの機能、エクソソームと生理現象や癌等の疾患との関連性が注目され、これについて検討が進められている。例えば、腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭの抗体を用いた場合に、卵巣癌患者の循環血中からエクソソームが分離され、エクソソーム由来のｍｉＲＮＡ発現量と卵巣癌の進行との間に関連性があることが既に報告されている（非特許文献１）。【０００４】  また、エクソソーム上に発現する４回膜貫通型の膜タンパク質として、テトラスパニンファミリーに属するＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１があり、非特許文献２には、メラノーマ患者の血漿中のエクソソーム量が健常者のものと比べて高く、これがＣＤ６３に対する抗体や腫瘍関連マーカーのＣａｖｅｏｌｉｎ−１に対する抗体で検出・定量化できることが報告されている。また、遠心分離後の血漿サンプルに、抗ＣＤ６３抗体や種々の膜タンパク質に対する抗体等を組み合わせて反応させることで、癌患者におけるエクソソームに由来するシグナルを定量して解析することが行われている（特許文献１）。【０００５】  上記のように、血清、血漿、血液などの臨床検体からエクソソームを特異的に捕捉し、エクソソームに含まれるタンパク質やｍｉＲＮＡを新たなバイオマーカーとして疾患の早期診断や再発の発見に利用する試みがされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０６５９６８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｄ．Ｄ．Ｔａｙｌｏｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，１１０，１３−２１（２００８）
【非特許文献２】Ｍ．Ｌｏｇｏｚｚｉ．，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．，４，１−１０（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  しかしながら、上記臨床検体は、アルブミンおよびグロブリン等の高濃度のタンパク質を含んでいるため、臨床検体から分離したエクソソームを疾患の判定に用いる際に、固相担体や反応容器内壁に対する非特異吸着に起因して、抗原抗体反応などの特異反応が検体成分により阻害をうけることや陰性と判定されるべき検体が誤って陽性と判定される（以下、偽陽性）ことが大きな問題となる。この問題は臨床検体が血清や血漿の場合に特に顕著となる。
この偽陽性を減少させるために、反応中に界面活性剤を添加する、或いは固相担体にタンパク質やポリマーをオーバーコートするなどの手法が用いられてきたが、これまでの手法だけでは非特異吸着に起因する偽陽性を減少させるには限界があった。偽陽性を減少させることは、エクソソームをはじめとする小胞を利用した疾患の判定や疾患治療薬の薬効評価において、ますます重要な課題となってくる。
また、エクソソームの分離に先立ち、抗原抗体反応を阻害しうる検体成分を取り除き、エクソソームを濃縮するなどの前処理をすることが提案されており、斯様な前処理法として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法による単離法、超遠心機を用いた単離法等が一般的に行われているが、このような前処理を行っても非特異吸着を十分に低減することは困難であり、また手間がかかるという問題があった。
本発明が解決しようとする課題は、固相担体への非特異吸着を低減でき、脂質二重膜を有する小胞を選択的かつ効率よく分離できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】  そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを混合して複合体形成反応液を形成して、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、上記複合体形成工程で形成された小胞と固相担体との複合体に洗浄液を加えて洗浄工程液を形成し、前記複合体を洗浄する洗浄工程を含む、脂質二重膜を有する小胞の分離方法において、（以下、複合体形成反応液および洗浄工程液を総称して、「反応液」と言う。）前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかを、反応液中の塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行うことにより、固相担体への非特異吸着を低減でき、脂質二重膜を有する小胞を選択的かつ効率よく分離できることを見出し、本発明を完成した。【００１０】  すなわち、本発明は、以下の＜１＞〜＜２３＞を提供するものである。【００１１】  ＜１＞  脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程を含み、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかを、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行うことを特徴とする、脂質二重膜を有する小胞の分離方法。
＜２＞  前記複合体形成工程を、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行う、＜１＞に記載の分離方法。
＜３＞  前記生体試料が、体液又は細胞培養上清である、＜１＞又は＜２＞に記載の分離方法。
＜４＞  前記生体試料が、体液である、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の分離方法。
＜５＞  前記複合体形成工程に用いられる複合体形成反応液が、無機塩を含有する、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の分離方法。
＜６＞  前記無機塩が、アルカリ金属ハロゲン化物である、＜５＞に記載の分離方法。
＜７＞  前記複合体形成工程における複合体形成反応の反応温度が、２〜４２℃の範囲内である、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の分離方法。
＜８＞  前記リガンドが、小胞の表面に存在する表面抗原を認識する抗体である、＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の分離方法。
＜９＞  前記小胞が、エクソソームである、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の分離方法。
＜１０＞  前記固相担体が、磁性粒子である、＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の分離方法。
＜１１＞  前記洗浄工程が、前記磁性粒子を磁力により集めて磁性粒子と液相とを分離する集磁工程、及び該集磁工程で分離された磁性粒子を洗浄液中に分散させる分散工程を含む、＜１０＞に記載の分離方法。【００１２】  ＜１２＞  ＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の分離方法の後に、さらに小胞中の核酸を検出する核酸検出工程を含むことを特徴とする、小胞中の核酸の検出方法。
＜１３＞  ＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の分離方法の後に、さらに小胞の内側及び表面の少なくとも一方に存在するタンパク質を検出するタンパク質検出工程を含むことを特徴とする、小胞由来のタンパク質の検出方法。
＜１４＞  ＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の分離方法の後に、さらに前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定するシグナル測定工程を含むことを特徴とする、小胞由来のシグナル測定方法。
＜１５＞  被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための方法であって、被検者由来の生体試料を用いて、＜１４＞に記載のシグナル測定方法により前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程を含むことを特徴とする、疾患の判定方法。
＜１６＞  疾患治療薬の薬効評価方法であって、疾患治療薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料を用いて、＜１４＞に記載のシグナル測定方法により、前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程を含むことを特徴とする、疾患治療薬の薬効評価方法。【００１３】  ＜１７＞  脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体と、無機塩又は有機塩を含み該無機塩又は有機塩の含有量が、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有する液状組成物を備えることを特徴とする、キット。
＜１８＞  疾患の判定用又は疾患治療薬の薬効評価用である、＜１７＞に記載のキット。【００１４】  ＜１９＞  脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程とを含む、脂質二重膜を有する小胞の分離方法に使用される、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかに添加するための液状組成物であって、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有することを特徴とする、液状組成物。【００１５】  ＜２０＞  不溶性担体を用いて脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料から脂質二重膜を有する小胞を分離する方法に使用される、前記小胞と前記不溶性担体との複合体を形成させるための検体希釈液であって、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有することを特徴とする、検体希釈液。
＜２１＞  無機塩を含有する、＜２０＞に記載の検体希釈液。
＜２２＞  前記無機塩が、アルカリ金属ハロゲン化物である、＜２１＞に記載の検体希釈液。【００１６】  ＜２３＞  不溶性担体を用いて脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料から脂質二重膜を有する小胞を分離する方法であって、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有する検体希釈液を用いることを特徴とする、脂質二重膜を有する小胞の分離方法。
【発明の効果】
【００１７】  本発明の脂質二重膜を有する小胞の分離方法によれば、固相担体への非特異吸着を低減でき、脂質二重膜を有する小胞を選択的かつ効率よく分離できる。
したがって、本発明によれば小胞中の核酸、小胞由来のタンパク質、小胞由来のシグナルを、簡便且つ正確に検出・測定できる。また、本発明の疾患の判定方法、薬効評価方法は、偽陽性になりにくい。また、本発明のキット、液状組成物、検体希釈液を用いることにより、固相担体への非特異吸着を低減でき、脂質二重膜を有する小胞を選択的かつ効率よく分離できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】塩濃度を０．１５〜０．３５Ｍとすることによる非特異吸着低減作用を示す図である（臨床検体：血清）。
【図１−２】塩濃度を０．１５〜０．３５Ｍとすることによる非特異吸着低減作用を示す図である（臨床検体：クエン酸血漿）。
【図２−１】反応温度２５℃における塩濃度を０．１５〜０．３５Ｍとすることによる反応性向上作用を示す図である（臨床検体：血清）。
【図２−２】反応温度４℃における塩濃度を０．２５Ｍとすることによる反応性向上作用を示す図である（臨床検体：血清）。
【図３】種々の臨床検体を用いた場合の非特異吸着低減作用を確認した図である。
【図４】種々の臨床検体を用いた場合の反応性向上作用を確認した図である。
【図５−１】固相担体として抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子を用いた場合の反応性向上作用を確認した図である。
【図５−２】固相担体として抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を用いた場合の反応性向上作用を確認した図である。
【図５−３】固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合の反応性向上作用を確認した図である。
【図６】固相担体として抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を用いてヒト健常者血清と反応させた場合の小胞中の核酸の検出結果を示す図である。
【図７−１】ヒト健常者血清に由来する小胞中の核酸の検出結果を示す図である。
【図７−２】ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞中の核酸の検出結果を示す図である。
【図８−１】ヒト健常者血清に由来する小胞表面のタンパクの検出結果を示す図である。
【図８−２】ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞表面のタンパクの検出結果を示す図である。
【図９−１】ヒト健常者血清に由来する小胞表面のネイティブフォームの立体構造を維持したタンパクの検出結果を示す図である。
【図９−２】ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞表面のネイティブフォームの立体構造を維持したタンパクの検出結果を示す図である。
【図９−３】ヒト結腸がんＨＴ２９細胞より調製したエクソソーム含有培養上清をヒト健常者血清に添加した、擬似的な疾患由来生体試料から、小胞表面のタンパクをネイティブフォームの立体構造を維持したまま検出した結果を示す図である。
【図９−４】ヒト結腸がんＨＴ２９細胞より調製したエクソソーム含有培養上清をヒト健常者ヘパリン血漿に添加した、擬似的な疾患由来生体試料から、小胞表面のタンパクをネイティブフォームの立体構造を維持したまま検出した結果を示す図である。
【図１０−１】ヒト結腸がんＨＴ２９細胞より調製したエクソソーム含有培養上清をヒト健常者血清に添加した、擬似的な疾患由来生体試料から、小胞表面のタンパクを検出した結果を示す図である。
【図１０−２】ヒト結腸がんＨＴ２９細胞より調製したエクソソーム含有培養上清をヒト健常者ヘパリン血漿に添加した、擬似的な疾患由来生体試料から、小胞表面のタンパクを検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】〔脂質二重膜を有する小胞の分離方法〕
本発明の脂質二重膜を有する小胞の分離方法は、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、小胞と固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、複合体を洗浄する洗浄工程を含み、複合体形成工程及び洗浄工程の少なくともいずれかを、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行うことを特徴とするものである。ここで、本明細書において塩濃度とは、無機塩および有機塩の合計である塩濃度であり、好ましくは無機塩の塩濃度であり、さらに好ましくは１価の無機塩の塩濃度であり、特に好ましくはアルカリ金属ハロゲン化物の濃度であり、最も好ましくは塩化ナトリウムの濃度である。反応液の塩濃度は、反応液中の塩の終濃度ともいう。
【００２０】（複合体形成工程）
複合体形成工程は、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを混合して複合体形成反応液を形成して、小胞と固相担体との複合体を形成させる工程である。複合体形成反応液を形成することにより、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とが接触する。上記接触により、リガンドに小胞が捕捉され、小胞と固相担体との複合体が形成される。なお、複合体形成工程の反応系には、上記固相担体に結合したリガンド以外に、脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドも共存していてもよい。
【００２１】  上記生体試料は脂質二重膜を有する小胞を含むものであれば特に限定されるものではなく、例えば、体液、菌体液、細胞培養の培地、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体が挙げられる。この中でも、体液、細胞培養上清が好ましく、体液がより好ましい。体液としては、全血、血清、血漿、血液成分、各種血球、血餅、血小板等の血液組成成分の他、尿、精液、母乳、汗、間質液、間質性リンパ液、骨髄液、組織液、唾液、胃液、関節液、胸水、胆汁、腹水、羊水等が挙げられ、好ましくは血液組成成分である。本発明の分離方法は、斯様な臨床検体を生体試料として用いた場合であっても、固相担体への非特異吸着が低く、捕捉反応の反応性が高いため、本発明の分離方法によれば、広範な種類の生体試料から選択的かつ効率よく小胞を分離できる。例えば、生体試料として血漿を用いた場合でも非特異吸着が起こりにくく、血清を用いた場合でも捕捉反応の反応性が高い。
なお、血液組成成分は、クエン酸、ヘパリン、ＥＤＴＡ等の抗凝固剤で処理されたものでもよい。
【００２２】  上記生体試料は、バッファー組成物で希釈するなどして予め前処理したものを用いてもよいが、生体から摂取したものをそのまま用いることもできる。すなわち、本発明の分離方法によれば、ＰＥＧ沈殿法、超遠心機等を用いた単離法等による前処理を行わず簡便に選択的な分離をすることも可能である。
【００２３】  また、上記脂質二重膜を有する小胞としては、細胞、細胞から細胞外に放出されるエクソソームのような小胞、エンベロープを有するウイルス等が挙げられるが、本発明の分離方法は、小胞がエクソソームである場合に特に好ましく用いられる。
また、小胞の表面に存在する表面抗原は、小胞の表面に存在する物質で抗原性のあるものであれば特に限定されない。エクソソームの表面抗原を例に挙げると、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類；ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ等の抗原提示関連タンパク質；インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＥｐＣＡＭなどの接着分子；ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＧＦ−βなどのサイトカイン／サイトカイン受容体、酵素類等が挙げられる。これらの中でも、エクソソーム表面に存在する抗原タンパク質が好ましい。
【００２４】  生体試料の使用量（濃度）は、好ましくは０．００１〜１００％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１〜５０％（ｗ／ｖ）である。
【００２５】  また、本発明の分離方法に用いる固相担体は、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合したものであれば特に限定されない。
リガンドとしては、小胞の表面に存在する表面抗原を認識する抗体が好ましく、エクソソームの表面に存在する表面抗原を認識する抗体がより好ましい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。
上記モノクローナル抗体は、特に限定されるものではなく、公知の方法、例えば、Ｋ．Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ  ａｓ  ａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１４（２００４），８９８−９０７に記載された方法に従って調製したものでよい。また、エクソソームの表面抗原ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１等のテトラスパニン類を認識するモノクローナル抗体は、国際公開第２０１３／０９９９２５号等を参照して作製できる。
なお、上記抗体のクラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭが挙げられるが、ＩｇＧが好ましい。また、これらを低分子化したフラグメントを用いてもよい。例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等が挙げられる。
【００２６】  上記リガンドを結合させる固相担体の材質としては、例えば、ポリスチレン類、ポリエチレン類、ポリプロピレン類、ポリエステル類、ポリ（メタ）アクリロニトリル類、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ（メタ）アクリル酸エステル類、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物；ガラス；金属；磁性体；磁性体を含む樹脂組成物；これらの組み合わせ等が挙げられる。
また、固相担体の形状は特に限定されるものではなく、例えば、トレイ状、球状、粒子状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等が挙げられる。
本発明においては、固液分離や洗浄の容易性の観点から、磁性粒子が好ましい。
【００２７】  上記磁性粒子としては、例えば、四三酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）、三二酸化鉄（γ−Ｆｅ２Ｏ３）、各種フェライト、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属；コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金からなる磁性体からなる微粒子；これら磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が挙げられる。樹脂としては、疎水性重合体、親水性重合体などが挙げられる。
中でも、磁性体を樹脂中に含む磁性粒子が好ましく、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面にポリマー層が形成されたものがより好ましい。例えば、特開２００８−３２４１１号公報に記載の、超常磁性微粒子を含む母粒子の表面に、疎水性の第１ポリマー層が形成され、当該第１ポリマー層上に、少なくとも表面にグリシジル基を有する第２ポリマー層が形成され、当該グリシジル基を化学修飾することにより極性基が導入された磁性粒子が挙げられる。
【００２８】  ここで、超常磁性微粒子としては、粒子径２０ｎｍ以下（好ましくは粒子径５〜２０ｎｍ）の酸化鉄系の微粒子が代表的であり、ＸＦｅ２Ｏ４（Ｘは、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｍｇ、Ｃｕ、Ｌｉ０．５Ｆｅ０．５等である。）で表現されるフェライト、Ｆｅ３Ｏ４で表現されるマグネタイト、γ−Ｆｅ２Ｏ３が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ない点で、γ−Ｆｅ２Ｏ３及びＦｅ３Ｏ４のいずれか一方を含むことが好ましい。
【００２９】  また、上記疎水性の第１ポリマー層を形成するためのモノマーは、単官能モノマー、多官能モノマーに大別される。ここで、単官能モノマーとは反応性基を１個有するモノマーであり、多官能モノマーとは反応性基を２個以上有するモノマーである。
単官能モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル系モノマー；メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレート等のエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステル系モノマーを例示することができる。
多官能モノマーとしては、例えば、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレート等の多官能（メタ）アクリレート；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィンの他、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。
【００３０】  また、上記第２ポリマー層を形成するためのモノマーは、粒子表面への官能基導入を主目的とするものであり、グリシジル基含有モノマーを含むものが好ましい。グリシジル基含有モノマーの含有量としては、第２ポリマー層を形成するための全モノマー中、２０質量％以上が好ましい。ここで、グリシジル基含有モノマーとしては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル等が挙げられる。
【００３１】  第２ポリマー層のグリシジル基を化学修飾することにより導入される極性基としては、リガンドと反応可能な官能基であることが好ましく、酸素原子、窒素原子及び硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも１種の原子を１個以上含むものがより好ましい。中でも、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基、活性エステル基がより好ましい。特に、磁性粒子の第２ポリマー層が前記極性基及び２，３−ジヒドロキシプロピル基を有する場合、リガンドとの結合性が良好となる。
また、磁性粒子等の固相担体は、その表面にビオチン類結合部位を有する物質が固定されていてもよい。ビオチン類結合部位を有する物質としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、タマビジン、及びそれらの誘導体から選ばれる１種又は２種以上の化合物等が挙げられる。さらに、この場合、固相担体は、ビオチン類結合部位を有する物質を介してビオチン類を結合した抗体等が結合されていてもよい。固相担体の表面へのビオチン類結合部位を有する物質の固定は、日本国特許第４７１６０３４号公報に記載された方法等の公知の方法により行えばよい。
【００３２】  リガンドを固相担体に結合する方法としては、物理的吸着法や、共有結合法、イオン結合法といった化学的に結合する方法などが用いられる。物理的吸着法としては、固相担体にリガンドを直接固定する方法、アルブミンなどの他のタンパク質に化学的に結合させてから吸着させて固定する方法などが挙げられる。化学的に結合させる方法としては、固相担体表面に導入した、リガンドと反応可能な官能基を利用して、固相担体上に直接結合する方法、固相担体とリガンドとの間にスペーサー分子（カルボジイミド化合物など）を化学結合で導入してから結合する方法、アルブミンなどの他のタンパク質にリガンドを結合させた後、そのタンパク質を固相担体に化学結合する方法などが挙げられる。
【００３３】  また、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体は、市販品を用いてもよい。例えば、Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ９  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）、Ｅｘｏｓｏｍｅ−Ｈｕｍａｎ  ＣＤ６３  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ／Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ）（いずれもＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＣＤ９  Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ、ＣＤ６３  Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ、ＣＤ８１  Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｋｉｔ（いずれもＳＢＩ社製）等が挙げられる。
【００３４】  また、上記リガンドが結合した固相担体の使用量は、生体試料に対し、好ましくは０．００００１〜０．１質量倍、より好ましくは０．０００１〜０．０１質量倍である。
【００３５】  複合体形成工程における複合体形成反応液には、上記各成分の他に、必要に応じて、界面活性剤；アルブミン等のタンパク質；核酸；ショ糖等の糖類等を添加することもできる。
界面活性剤は、非特異吸着の低減の観点、小胞へのダメージを抑える上で効果的であり、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリエチレングリコール型非イオン性界面活性剤がさらに好ましい。また、界面活性剤は、芳香族基を分子中に含まない界面活性剤が好ましい。
芳香族基を分子中に含まない界面活性剤としては、例えば、高級アルコールエチレンオキサイド付加物、脂肪酸エチレンオキサイド付加物、多価アルコール脂肪酸エステルエチレンオキサイド付加物、高級アルキルアミンエチレンオキサイド付加物、脂肪酸アミドエチレンオキサイド付加物、油脂のエチレンオキサイド付加物、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物等が挙げられる。これらの中でも、ポリアルキレングリコールエチレンオキサイド付加物が好ましい。具体的には、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール等が挙げられる。
界面活性剤の使用量は、複合体形成反応液の全量に対して、好ましくは０．００５〜１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．０１５〜３．５％（ｗ／ｖ）である。
【００３６】  また、複合体形成工程における反応温度は、好ましくは２〜４２℃の範囲内であり、より好ましくは３〜４０℃の範囲内、特に好ましくは４〜３７℃の範囲内である。本発明の分離方法における複合体形成工程は常温又は常温付近でも反応が選択的かつ効率よく進行するため、非常に簡便である。また、反応時間は、通常、１分間〜４８時間であるが、好ましくは５分間〜２４時間、より好ましくは１０分間〜１０時間、特に好ましくは１０分間〜５時間である。
【００３７】  複合体形成工程において、系中のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５〜１０の範囲、より好ましくはｐＨ６〜８の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【００３８】（洗浄工程）
洗浄工程は、上記複合体形成工程で形成された小胞と固相担体との複合体に洗浄液を加えて洗浄工程液を形成し、上記複合体を洗浄する工程である。これによって、未反応の成分や未反応の標識物質等が除去される。複合体形成工程における複合体を含む系をそのまま洗浄してもよい。
【００３９】  上記洗浄工程は、通常、固相担体の形状により２種類に分けられる。磁性粒子のように固相担体が粒子状である場合には、例えば洗浄液中に磁性粒子を分散させて洗浄する方法が挙げられ、一方、固相担体がマイクロプレートのような形態である場合には、その表面に洗浄液を接触させて洗浄する方法が挙げられる。いずれの態様であっても、本発明においては、洗浄液として、界面活性剤を含む洗浄液を使用することが好ましい。界面活性剤としては、上記複合体形成工程で使用してもよいものと同様のものが好ましい。
【００４０】  また、固相担体が磁性粒子の場合、洗浄工程としては、磁性粒子を磁力により集めて磁性粒子と液相とを分離する集磁工程、及び該集磁工程で分離された磁性粒子を洗浄液中に分散させる分散工程とを含むことが好ましい。これによって、未反応の物質や生体試料中の夾雑物を磁性粒子表面からさらに効率よく洗浄・分離除去できる。
具体的には、反応容器に磁場を作用させ、磁性粒子を反応容器壁に付着させて集めた後、反応上清を除去し、さらに必要に応じて洗浄液を加え、同様に磁場を作用させた後上清を除去する操作を繰り返すことにより行えばよい。洗浄液としては、上記複合体形成工程で挙げた界面活性剤と緩衝液を含む洗浄液が好ましい。
【００４１】（反応液の塩濃度）
本発明の分離方法では、複合体形成工程及び洗浄工程の少なくともいずれかを、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行うことが好ましい。すなわち、複合体形成反応液の塩濃度および洗浄工程液の塩濃度の少なくともいずれかを、０．１５〜２Ｍの環境下で行うことが好ましい。さらに、捕捉反応の反応性の観点から、複合体形成工程を、塩濃度０．１５〜２Ｍの環境下で行うのが好ましい。反応液の塩濃度は、複合体形成工程の全体もしくは一部、または洗浄工程の全体もしくは一部において０．１５〜２Ｍの範囲であればよい。
反応液の塩濃度は、より好ましくは０．２Ｍ以上、さらに好ましくは０．２５Ｍ以上であり、また、より好ましくは１Ｍ以下、さらに好ましくは０．５Ｍ以下、特に好ましくは０．４５Ｍ以下、最も好ましくは０．３５Ｍ以下である。
【００４２】  反応液に含まれる無機塩としては、アルカリ金属ハロゲン化物；炭酸塩、重炭酸塩等の無機酸の塩が挙げられ、アルカリ金属ハロゲン化物が好ましく、アルカリ金属塩化物がより好ましい。無機塩としては、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム等が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。これらの中でも、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムが好ましく、塩化ナトリウム、塩化カリウムがより好ましく、塩化ナトリウムが特に好ましい。
【００４３】  反応液に含まれる有機塩としては、有機酸の塩が好ましく、有機酸のアルカリ金属塩がより好ましく、カルボン酸のアルカリ金属塩が更に好ましく、カルボン酸のナトリウム塩が特に好ましい。有機塩としては、具体的には、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、乳酸ナトリウム等が挙げられ、これらのうち１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４４】  反応液の塩濃度が０．１５Ｍ未満の場合及び２Ｍよりも高い場合には、非特異吸着の増大や捕捉反応の反応性の低下が生じる場合があり、また、小胞内外の浸透圧差によって、小胞が破壊される場合もある。
【００４５】（解離工程）
本発明の分離方法は、洗浄工程後、捕捉された小胞をリガンドから解離する解離工程を有していてもよい。
リガンドが特定の抗体である場合に抗原・抗体反応による特異的な結合を解離される条件としては、アフィニティークロマトグラフィー等で種々のものが知られている（例えば、”Ａｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  ｍｅｔｈｏｄｓ”  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ参照）。上記解離工程はこれに準じて行えばよい。即ち、本発明で使用される解離液としては、塩酸、硫酸、プロピオン酸、酢酸、グリシン／塩酸バッファー等の酸性溶液；水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、アンモニア水溶液、ジエチルアミン等のアルカリ性溶液；３Ｍ塩化ナトリウム水溶液、４．５Ｍ塩化マグネシウム水溶液等の高イオン強度溶液；ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤含有溶液；ジオキサン、エチレングリコール等の極性を下げる物質を含有する緩衝液；トリクロロ酢酸、チオシアン酸などのカオトロピックイオンの他、尿素、塩酸グアニジン等を含有する緩衝液が挙げられる。
【００４６】〔核酸の検出方法及びタンパク質の検出方法〕
本発明の小胞中の核酸の検出方法は、上記分離方法の後に、さらに小胞中の核酸を検出する核酸検出工程を含むものである。
また、本発明の小胞由来のタンパク質の検出方法は、上記分離方法の後に、さらに小胞の内側及び表面の少なくとも一方に存在するタンパク質を検出するタンパク質検出工程を含むものである。
これら検出方法は、上記分離方法を行う以外は常法にしたがっておこなえばよい。上記脂質二重膜を有する小胞がエクソソームである場合、回収されたエクソソームから核酸やタンパク質を、ＰＣＲ法、電気泳動法、ウェスタンブロッティング法、免疫化学的方法、フローサイトメトリー等の公知の方法に従って検出すればよい。これらの中でも、簡便に感度よく検出でき、且つネイティブフォームの立体構造を維持できる点からは、フローサイトメトリーが好ましい。また、核酸としては、ｍｉＲＮＡやｍＲＮＡ等が挙げられる。
特に、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、本発明の核酸の検出方法によれば、エクソソーム由来の核酸（ｍｉＲＮＡ等）を検出し、それを解析することによって、生理現象や各種疾患の判定が可能になる。
【００４７】〔シグナル測定方法〕
本発明の小胞由来のシグナル測定方法は、上記分離方法の後に、さらに前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定するシグナル測定工程を含むものである。
上記シグナル強度の測定は免疫測定法により行えばよく、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素イムノメトリックアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、イムノブロット法、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー等が挙げられる。これらの中でも、簡便に感度よく検出でき、且つネイティブフォームの立体構造を維持できる点からは、フローサイトメトリーが好ましい。また、簡便に感度よく抗体を検出できる点からは、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。ＥＬＩＳＡ法としては、競合法、サンドイッチ法などが挙げられる。また、検出感度の面から発光免疫測定法も好ましい。発光免疫測定法は、例えば、富士レビオ社製クラスＩＩＩシリーズ等の市販の発光基質を反応させて、Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ＧｌｏＭａｘ等の発光測定機を用いて、発光免疫測定法におけるシグナル強度である発光強度を測定することにより行うことができる。
ここで、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用する場合の分離方法の一例を示す。まず、小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドを固相担体に結合した後、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料を接触させて複合体を形成させ、その後洗浄する。そこに、モノクローナル抗体又はその抗体断片や疾患特異的膜タンパク質抗体又はその抗体断片を修飾した標識抗体を添加して、さらなる複合体を形成させる。そして、形成された複合体中の標識量を検出することにより、生体試料に含まれる小胞に由来するシグナル量や、生体試料に含まれる疾患特異的小胞量を測定することができる。
【００４８】〔疾患の判定方法〕
本発明の被検者が疾患を発症しているか否かを判定するための方法は、被検者由来の生体試料を用いて、上記シグナル測定方法により前記複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程（以下、工程（Ｉ）ともいう）を含むことを特徴とするものである。
そして、工程（Ｉ）で測定されたシグナル強度と、対照者由来の生体試料のシグナル強度とを対比して、被検者におけるシグナル強度が対照者におけるシグナル強度より強いと認められる場合に、被検者が疾患を発症していると判定すればよい（以下、工程（ＩＩ）ともいう）。
本発明の疾患の判定方法で判定可能な疾患としては、癌疾患（大腸癌、乳癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、食道癌、肝癌、肺癌、腎癌、皮膚癌など）、炎症系疾患（リウマチ、変形性関節症、腎症、膵炎、肝炎、アレルギーなど）、アルツハイマー等の神経変性疾患、脳疾患、免疫不全に関連する疾患、不妊、うつ病、自閉症等の精神疾患、パーキンソン病等の難治療性疾患、自己免疫性疾患、循環器疾患、血液疾患、消化器疾患、老化に伴う疾患、感染症等が例示される。これらの中でも、癌疾患、免疫系疾患の判定に有用であり、特に癌疾患の判定に特に有用である。
また、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の免疫活性の指標に応用すれば、癌ワクチンの癌疾患に対する効果判定にも応用できる。
【００４９】  工程（Ｉ）は、上記シグナル測定方法で測定を行うこと以外は常法にしたがって行えばよい。
また、工程（ＩＩ）は、工程（Ｉ）で測定されたシグナル強度について、対照者由来の生体試料のシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、被検者由来の生体試料のシグナルが対照者におけるシグナルと比べて強い場合に、疾患を発症している可能性が高いと判断される。なお、本発明において、対照者とは、疾患を発症していない被検者と同年代・同性の者の平均をいい、対照者におけるシグナル強度は被検者におけるシグナル強度と共に測定してもよく、別途予め測定した値から得られた統計値を用いてもよい。
【００５０】〔疾患治療薬の薬効評価方法〕
本発明の疾患治療薬の薬効評価方法は、疾患治療薬の投与前及び投与後の被検者由来の生体試料を用いて、上記シグナル測定方法により、複合体を形成した小胞由来のシグナル強度を測定する工程（以下、工程（Ａ）ともいう）を含むことを特徴とするものである。
そして、疾患治療薬の投与後の被検者由来の生体試料における複合体由来のシグナル強度が、疾患治療薬の投与前の被検者由来の生体試料における複合体由来のシグナル強度より弱いと認められる場合に、疾患治療薬が薬効を示している可能性が高いと判定すればよい（以下、工程（Ｂ）ともいう）。
上記疾患治療薬としては、上記判定方法で判定可能な疾患を治療する薬物が挙げられる。好適な具体例は、抗癌剤、抗免疫系疾患薬である。
【００５１】  工程（Ａ）は、上記シグナル測定方法で測定を行うこと以外は常法にしたがって行えばよい。
また、工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で測定されたシグナル強度について、疾患治療薬の投与前の生体試料におけるシグナルに基づいて統計学的な解析を行って比較を行う。解析方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を用いることができる。また、その後の判定は、例えば、疾患治療薬の投与後の生体試料におけるシグナル量が投与前の生体試料におけるシグナル量と比べて少ない場合に、該薬が疾患を抑える効果を有している可能性が高いと判断される。
特に、エクソソームは、種々の細胞、例えば免疫系の細胞や各種癌細胞から分泌されることから、疾患治療薬の投与の前後での血中エクソソームの変化（存在量の増減だけに加え、膜タンパク質の量の変動を含む）を測定することにより、患者における薬効を評価することが可能になると考えられる。また、例えば、癌細胞に特異的な膜タンパク質に対するリガンドとエクソソームの表面抗原に対するリガンドとを組み合わせれば、癌診断の特異性の向上や癌種の特定などが期待でき、より癌疾患に特異的な診断薬の開発が可能となると考えられる。
【００５２】〔キット〕
本発明のキットは、脂質二重膜を有する小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体と、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有する液状組成物とを備えることを特徴とするものである。斯かるキットは、上記分離方法、上記疾患の判定、上記疾患治療薬の薬効評価に有用である。
固相担体、液状組成物に含まれる無機塩又は有機塩としては、上記分離方法で用いるものと同様のものが挙げられる。
上記液状組成物中の塩濃度は、好ましくは０．３Ｍ以上、より好ましくは０．４Ｍ以上、更に好ましくは０．５Ｍ以上であり、また、好ましくは４Ｍ以下、より好ましくは２Ｍ以下、更に好ましくは１Ｍ以下、更に好ましくは０．９Ｍ以下、特に好ましくは０．７Ｍ以下である。
また、液状組成物は、上記分離方法と同様の界面活性剤を含んでいてもよい。また、液状組成物のｐＨは特に限定されないが、好ましくはｐＨ５〜１０の範囲、より好ましくはｐＨ６〜８の範囲である。目的のｐＨを維持するために、通常、緩衝液が用いられ、例えば、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。
【００５３】〔液状組成物、検体希釈液〕
本発明の液状組成物は、脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料と、前記小胞の表面に存在する表面抗原を認識するリガンドが結合した固相担体とを接触させ、前記小胞と前記固相担体との複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体を洗浄する洗浄工程とを含む、脂質二重膜を有する小胞の分離方法に使用される、前記複合体形成工程及び前記洗浄工程の少なくともいずれかに添加するための液状組成物であって、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有する。  また、本発明の検体希釈液は、不溶性担体を用いて脂質二重膜を有する小胞を含む生体試料から脂質二重膜を有する小胞を分離する方法に使用される、前記小胞と前記不溶性担体との複合体を形成させるための検体希釈液であって、０．１５Ｍ以上の塩濃度を有することを特徴とするものである。
【実施例】
【００５４】  以下、具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら具体例に限定されるものではない。【００５５】（バッファー類の調製）
表１に示す比較反応バッファー１および反応バッファー１〜５を準備した。
反応バッファー：トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ（組成は、１，３７０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，  ２６．８ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ，  ２５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ；Ｓｉｇｍａ社製１０×ＴＢＳを水で１０倍希釈したもの。ｐＨ７．４。以下同じ。））に、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（ｇｉｂｃｏ社製  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、以下同じ）を０．０３％（ｗ／ｖ）になるように添加し、更に、必要に応じて塩化ナトリウム（Ｗａｋｏ社製、試薬特級）を表１に示す濃度になるように添加したもの。【００５６】
【表１】
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【００５７】  コントロールバッファーとして、以下のバッファーを準備した。
コントロールバッファー：ＴＢＳに、非イオン性界面活性剤であるポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールを濃度が０．０３％（ｗ／ｖ）になるように添加したもの。ｐＨ７．４。【００５８】（検体の調製）
検体１（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）：コントロールバッファーに、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液（低分子の塩は濃縮されていない。以下同じ。）を２０倍希釈となるように添加したもの。
検体２（Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）。
検体３（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を２０倍希釈となるように添加したもの。
検体４（Ｐｌａｓｍａ）：プールクエン酸血漿（コージンバイオ社製）。
検体５（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ）：プールクエン酸血漿（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を２０倍希釈となるように添加したもの。
検体６（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）：試験例１で作製したコントロールバッファーに、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体７（Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）。
検体８（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｉｎ  Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体９（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ）：試験例１で作製したコントロールバッファーに、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体１０（Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）。
検体１１（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体１２（Ｐｌａｓｍａ（Ｈｅｐａｒｉｎ））：プールヘパリン血漿（コージンバイオ社製）。
検体１３（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｐｌａｓｍａ（Ｈｅｐａｒｉｎ））：プールヘパリン血漿（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体１４（Ｐｌａｓｍａ（ＥＤＴＡ））：プールＥＤＴＡ血漿（コージンバイオ社製）。
検体１５（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｐｌａｓｍａ（ＥＤＴＡ））：プールＥＤＴＡ血漿（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体１６（Ｐｌａｓｍａ（Ｃｉｔｒａｔｅ））：プールクエン酸血漿（コージンバイオ社製）。
検体１７（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｐｌａｓｍａ（Ｃｉｔｒａｔｅ））：プールクエン酸血漿（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１００倍希釈となるように添加したもの。
検体１８（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｓｅｒｕｍ）：プール血清（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１０倍希釈となるように添加したもの。
検体１９（ＨＴ２９  ｓｕｐ．  ｓｐｉｋｅ  Ｐｌａｓｍａ（Ｈｅｐａｒｉｎ））：プールヘパリン血漿（コージンバイオ社製）に、ＨＴ２９細胞培養上清１００倍濃縮液を１０倍希釈となるように添加したもの。【００５９】（抗体結合粒子の調製）
陰性対照粒子：抗マウスＩｇＧ抗体（ＪＳＲライフサイエンス社製、以下同じ）を磁性粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ、以下同じ。）に結合させたもの。陰性対象粒子は、エクソソームと反応しない。
抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子：ＣＤ９抗体（アブカム社製  ａｂ２２１５、以下同じ）を磁性粒子に結合させたもの。
抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子：ＣＤ６３抗体（ＪＳＲライフサイエンス社製）を磁性粒子に結合させたもの。
抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子：抗ＣＤ８１抗体（Ｃｌｏｎｅ  Ｍ３８、Ａｂｎｏｖａ  ＭＡＢ６４３５）を磁性粒子に結合させたもの。
抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子：抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＪＳＲライフサイエンス社製）を磁性粒子に結合させたもの。
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ抗体結合磁性粒子：抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子と抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を１：１：１：１で混合したもの。【００６０】（試験例１）
９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、陰性対照粒子０．０１２５ｍｇを加え、各ウェルに、コントロールバッファー、検体１〜５を２５μＬ、１ウェルあたりに１種ずつ添加した。比較反応バッファー１を、反応液の塩濃度が０．０７Ｍになるように加え、２５℃で２０分反応させた（ｐＨ：７．４）。また、比較反応バッファー１に代えて反応バッファー１〜５をそれぞれ使用し、同様の反応を行った。【００６１】本明細書におけるすべての試験例において、各反応バッファーを用いたときの、反応液の塩濃度は以下の通りである。【００６２】  反応バッファー        反応液の塩濃度
――――――――――――――――――――
比較反応バッファー１      ０．０７Ｍ
反応バッファー１          ０．１５Ｍ
反応バッファー２          ０．２Ｍ
反応バッファー３          ０．２５Ｍ
反応バッファー４          ０．３Ｍ
反応バッファー５          ０．３５Ｍ
――――――――――――――――――――【００６３】  次に、洗浄バッファー（Ｔｗｅｅｎ２０を０．１質量％含むＴＢＳ。以下同じ。）を用いて反応後の陰性対照粒子を洗浄し、ＢＳＡを１質量％含むＴＢＳで希釈したアルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰ）標識抗ＣＤ８１抗体（０．１μｇ／ｍＬ）を５０μＬ添加し、２５℃で２０分反応させた。上記と同様の洗浄バッファーで洗浄した後、発光基質（富士レビオ社製クラスＩＩＩシリーズ  ルミパルス基質液）を５０μＬ添加し、５分後に発光測定機（Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ＧｌｏＭａｘ）を用いて発光強度を測定した。結果を図１−１、図１−２に示す。
図１−１、図１−２に示すとおり、反応液の塩濃度が０．０７Ｍの場合は、検体成分の非特異吸着に起因すると考えられるバックグラウンドシグナルが検出されたが、反応液の塩濃度が０．１５〜０．３５Ｍの場合には非特異吸着が低減され、バックグラウンドシグナルが減少していた。【００６４】（試験例２−１）
この抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子と、エクソソームを含む臨床検体と、比較反応バッファー１または反応バッファー１〜５のいずれかを混合し、洗浄後、試験例１と同様にＥＬＩＳＡにより捕捉されたエクソソームを検出することで、比較反応バッファー１または反応バッファー１〜５を用いた場合の反応性を評価した。【００６５】  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加え、各チューブに、検体６〜８を１チューブあたりに１種ずつ添加した（検体６：０．１ｍＬ、検体７：０．１ｍＬ、検体８：０．１ｍＬ）。比較反応バッファー１を、反応液の塩濃度が０．０７Ｍになるように加え、２５℃で５時間反応させた（ｐＨ：７．４）。また、比較反応バッファー１に代えて反応バッファー１〜５をそれぞれ使用し、同様の反応を行った。
次に、Ｗａｓｈｉｎｇ／Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＪＳＲライフサイエンス社製）０．５ｍＬで洗浄した後、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、０．０１２５ｍｇ／ｗｅｌｌとなるように分注した。試験例１と同様にして、洗浄バッファーによる洗浄、ＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行った後、発光強度を測定した。結果を図２−１に示す。
図２−１に示すとおり、反応液の塩濃度が０．１５〜０．３５Ｍの場合は、血清中での捕捉反応の反応性が向上することがわかった。【００６６】（試験例２−２）
捕捉反応の反応条件を２５℃２０分から４℃５時間に変更して、試験例２−１と同様の試験を行った。
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加え、各チューブに、検体６〜８を各０．１ｍＬ、１チューブあたりに１種ずつ添加した。比較反応バッファー１を、反応液の塩濃度が０．０７Ｍになるように加え、４℃で５時間反応させた（ｐＨ：７．４）。また、比較反応バッファー１に代えて反応バッファー３を使用し、同様の反応を行った。
次に、洗浄バッファー０．５ｍＬで洗浄した後、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、０．０１２５ｍｇ／ｗｅｌｌとなるように分注した。試験例１と同様にして、洗浄バッファーによる洗浄、ＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行った後、発光強度を測定した。結果を図２−２に示す。なお、図２−２には反応温度２５℃で行った試験結果もあわせて示す。
試験例２−２の結果（図２−２）から、反応液の塩濃度が０．２５Ｍの場合は、反応温度が４℃、２５℃のいずれであっても、血清中での捕捉反応の反応性が良好となることがわかった。【００６７】（試験例３）
反応バッファー３の非特異吸着低減作用を、検体を変更して確認した。【００６８】  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、陰性対照粒子０．１ｍｇを加え、各チューブに検体９〜１７を０．１ｍＬ、１チューブあたりに１種ずつ添加した。比較反応バッファー１を、反応液の塩濃度が０．０７Ｍになるように加え、２５℃で５時間反応させた（ｐＨ：７．４）。また、比較反応バッファー１に代えて反応バッファー３を等量使用し、同様の反応を行った。
次に、洗浄バッファー０．５ｍＬで洗浄した後、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、０．０１２５ｍｇ／ｗｅｌｌとなるように分注した。試験例１と同様にして、洗浄バッファーによる洗浄、ＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行った後、発光強度を測定した。
図３に示すとおり、反応液の塩濃度が０．２５Ｍの場合は、検体の種類によらずバックグラウンドシグナルが少なかった。【００６９】（試験例４）
反応バッファー３の反応性向上作用を、検体を変更して確認した。具体的手順を以下に示す。
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加え、各チューブに、検体９〜１３を０．１ｍＬ、１チューブあたりに１種ずつ添加した。比較反応バッファー１を、塩濃度が０．０７Ｍになるように加え、２５℃で５時間反応させた（ｐＨ：７．４）。また、比較反応バッファー１に代えて反応バッファー３を使用し、同様の反応を行った。
次に、洗浄バッファー０．５ｍＬで洗浄した後、９６ウェル白色プレート（コーニング社製  ＃２３７１１００７）に、０．０１２５ｍｇ／ｗｅｌｌとなるように分注した。試験例１と同様にして、洗浄バッファーによる洗浄、ＡＬＰ標識抗ＣＤ８１抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行った後、発光強度を測定した。結果を図４に示す。
図４に示すとおり、塩濃度が０．２５Ｍの場合は、検体の種類によらず捕捉反応の反応性が高かった。【００７０】（試験例５）
抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子、抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子、抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子に変更し、検体として検体１０〜１３を用いた以外は試験例４と同様にして、反応バッファー３の反応性向上作用の検討を行った。結果を図５−１（抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子）、図５−２（抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子）、図５−３（抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子）に示す。【００７１】（試験例６  小胞中の核酸の検出）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を１２本用意し、チューブ１〜１２とナンバリングした。チューブ１〜４に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇずつ、チューブ５〜８に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．５ｍｇずつ、チューブ９〜１２に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を１ｍｇずつ、それぞれ加えた。
次いで、チューブ１〜１２に、反応バッファー３を、反応液の塩濃度が０．２５Ｍになるように加え、更に検体１０を１ｍＬずつ加えた。チューブ１，５，９については２５℃で１時間、チューブ２，６，１０については２５℃で５時間、チューブ３，７，１１については２５℃で２４時間、チューブ４，８，１２については４℃で２４時間反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー０．５ｍＬで３回洗浄し、この懸濁液を、上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に０．５ｍＬ分注した。集磁ラックを用いて、抗体結合磁性粒子を集磁後、上清を０．４ｍＬ抜き取り、残った抗体結合粒子液０．１ｍＬからｍｉｃｒｏＲＮＡを回収し定量した。結果を図６に示す。
なお、ｍｉｃｒｏＲＮＡの回収にはＥｘｏＣａｐＴＭ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ社製、＃ＭＥＸ−Ｅ）を用いた。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ−２１）の定量には、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ社製、＃４３６６５９７）、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（ライフテクノロジーズ社製、＃１８６９４８３８４）、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ＩＩ，  ｎｏ  ＵＮＧ（ライフテクノロジーズ社製、＃４４４００４０）を用い、操作については推奨プロトコールに従った。【００７２】  図６に示すとおり、反応液の塩濃度０．２５Ｍ環境下で反応させることによって、ヒト健常者血清に由来する小胞中の核酸を検出できた。さらに検出された核酸量は、抗体結合粒子量、温度、時間に依存して上昇した。【００７３】（試験例７  小胞中の核酸の検出）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を８本用意し、チューブ１３〜２０とナンバリングした。チューブ１３〜１４に、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を１ｍｇずつ、チューブ１５〜１６に、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子を１ｍｇずつ、チューブ１７〜１８に、抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を１ｍｇずつ、チューブ１９〜２０に、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ抗体結合磁性粒子（抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子と抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子と抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を１：１：１：１で混合したもの）を１ｍｇずつ、それぞれ加えた。
次いで、チューブ１３〜２０に、反応バッファー３を、反応液の塩濃度が０．２５Ｍになるように添加した。奇数番号のチューブに試験例３で示した検体１０を、偶数番号のチューブに試験例３で示した検体１２を、それぞれ０．３ｍＬずつ加え、２５℃で２４時間反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー０．５ｍＬで３回洗浄し、この懸濁液を、上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に０．５ｍＬ分注した。集磁ラックを用いて、抗体結合磁性粒子を集磁後、上清を０．４ｍＬ抜き取り、残った抗体結合粒子液０．１ｍＬからｍｉｃｒｏＲＮＡを回収し定量した。結果を図７−１、図７−２に示す。
なお、ｍｉｃｒｏＲＮＡの回収にはｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（５０）（ＱＩＡＧＥＮ社製、＃２１７１８４）を用いた。また、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ−２１）の定量は、試験例６の場合と同様に行った。【００７４】  また、比較対象として、エクソソームを回収する標準的な方法である超遠心分離法を利用して小胞中の核酸の検出を行った。すなわち、検体１０、１２それぞれ１１ｍＬずつについて、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」とも言う。）を１１ｍＬ加え、懸濁した。再度、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００ｒｐｍ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを０．１１ｍＬ加え、懸濁した。懸濁液のうち３μＬをｍｉｃｒｏＲＮＡの回収、定量に用いた。結果を図７−１、図７−２に示す。
なお、ｍｉｃｒｏＲＮＡの回収、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲ−２１）の定量は、上記と同様にして行った。【００７５】  図７−１に示すとおり、反応液の塩濃度０．２５Ｍ環境下で反応させることによって、ヒト健常者血清に由来する小胞中の核酸を、超遠心分離法と同等レベルで検出できることが確認された。
図７−２に示すとおり、ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞中の核酸は、超遠心分離法を利用した場合では検出できなかった。ヒト健常者ヘパリン血漿は一般的にＰＣＲ阻害を起こす物質を含むと考えられており、超遠心分離法により回収したサンプルではＰＣＲを阻害する物質が残存するためと考えられる。これに対し、反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で反応させた場合にはヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞中の核酸を検出できた。
これらの結果から、反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で小胞と粒子を反応させることによって、血清、血漿といった検体の種類を問わず小胞中の核酸を検出できた。【００７６】（試験例８  小胞表面のタンパクの検出）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を１０本用意し、チューブ２１〜３０とナンバリングした。各チューブに、以下のように磁性粒子０．２ｍｇずつを加えた。【００７７】チューブ番号        磁性粒子
――――――――――――――――――――――――――――――
２１〜２２      抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子
２３〜２４      抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子
２５〜２６      抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子
２７〜２８      抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子
２９〜３０      Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ抗体結合磁性粒子
――――――――――――――――――――――――――――――【００７８】  次いで、チューブ２１〜３０に、反応バッファー３を、反応液の塩濃度が０．２５Ｍになるように添加した。奇数番号のチューブに試験例３で示した検体１０を、偶数番号のチューブに試験例３で示した検体１２を、それぞれ１．０ｍＬずつ加え、２５℃で３時間反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー０．５ｍＬで３回洗浄し、この懸濁液を、上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に０．５ｍＬ分注した。
次いで集磁して洗浄液を廃棄後、抗体結合磁性粒子を１×サンプルバッファー２０μＬで懸濁し、９５℃で５分間静置処理した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファーにて洗浄した。
試験例８と同様にして、一次抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行い、発光基質を反応させ、発光測定器にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図８−１、図８−２に示す。【００７９】  また、比較対象として、エクソソームを回収する標準的な方法である超遠心分離法を利用して小胞表面のタンパクの検出を行った。すなわち、検体１０、１２それぞれ１１ｍＬずつについて、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを１１ｍＬ加え、懸濁した。再度、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを０．１１ｍＬ加え、懸濁した。懸濁液のうち１０μＬに４×サンプルバッファー５μＬ、ＰＢＳ５μＬを添加し、９５℃で５分間静置処理した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファーにて洗浄した。
試験例８と同様にして、一次抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行い、発光基質を反応させ、発光測定器にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図８−１、図８−２に示す。【００８０】  図８−１、図８−２に示すとおり、反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で小胞と粒子を反応させることによって、ヒト健常者血清、ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞表面のタンパクを、超遠心分離法と同等レベルで検出できることが確認された。また、抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合には、小胞表面タンパクは検出されなかった。ＥｐＣＡＭタンパク質は健常者の血液中にはほとんど存在せず、癌などの疾患によりその血中濃度が上昇すると考えられている。反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で小胞と粒子を反応させることによって、非特異反応を抑制することができた。【００８１】（試験例９−１  小胞表面のネイティブフォームの立体構造を維持したタンパクの検出（１））
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を８本用意し、チューブ３１〜３８とナンバリングした。各チューブに、以下のように磁性粒子０．１ｍｇずつを加えた。【００８２】チューブ番号          磁性粒子
――――――――――――――――――――――――――――――――
３１，３２        抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子
３３，３４        抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子
３５，３６        抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子
３７，３８        抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子
――――――――――――――――――――――――――――――――【００８３】  反応バッファー３を、反応液の塩濃度が０．２５Ｍになるようにチューブ３１〜３８に添加した。
次いで、チューブ３１，３３，３５，３７には試験例３で示した検体１０を０．３ｍＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。また、チューブ３２，３４，３６，３８には試験例３で示した検体１２を０．３ｍＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー０．２５ｍＬで２回洗浄し、集磁後、上清を取り除き、リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに懸濁した。
上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を４０本用意し、チューブ３９〜７８とナンバリングした。チューブ３１〜３８の懸濁液を、次のようにして０．１ｍＬずつ分注した。
チューブ３１の懸濁液を、チューブ３９〜４３へ。
チューブ３２の懸濁液を、チューブ４４〜４８へ。
チューブ３３の懸濁液を、チューブ４９〜５３へ。
チューブ３４の懸濁液を、チューブ５４〜５８へ。
チューブ３５の懸濁液を、チューブ５９〜６３へ。
チューブ３６の懸濁液を、チューブ６４〜６８へ。
チューブ３７の懸濁液を、チューブ６９〜７３へ。
チューブ３８の懸濁液を、チューブ７４〜７８へ。【００８４】  次いで、各チューブに、以下のように抗体をそれぞれ５μＬずつ添加した。【００８５】          チューブ番号                                    抗体
――――――――――――――――――――――――――――――――――
３９，４４，４９，５４，５９，６４，６９，７４      ＰＥ抗マウスＩｇＧ
４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５      ＰＥ抗ＣＤ９
４１，４６，５１，５６，６１，６６，７１，７６      ＰＥ抗ＣＤ６３
４２，４７，５２，５７，６２，６７，７２，７７      ＰＥ抗ＣＤ８１
４３，４８，５３，５８，６３，６８，７３，７８      ＰＥ抗ＥｐＣＡＭ
――――――――――――――――――――――――――――――――――【００８６】ここで、
ＰＥ抗マウスＩｇＧ：フィコエリスリン（以下、ＰＥ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＯＮＹ社製）
ＰＥ抗ＣＤ９：ＰＥ標識抗ＣＤ９抗体（ＳＯＮＹ社製）
ＰＥ抗ＣＤ６３：ＰＥ標識抗ＣＤ６３抗体（ＳＯＮＹ社製）
ＰＥ抗ＣＤ８１：ＰＥ標識抗ＣＤ８１抗体（ＳＯＮＹ社製）
ＰＥ抗ＥｐＣＡＭ：ＰＥ標識抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＳＯＮＹ社製）【００８７】  その後、チューブ３９〜７８を、２５℃、１０００ｒｐｍの条件で、１時間懸濁した。
次に、反応後の各粒子をリン酸緩衝生理食塩水０．５ｍＬで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＢＤ社製、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６）を用いて、各サンプルの蛍光シグナルを確認した。結果を図９−１、図９−２に示す。【００８８】  図９−１、図９−２に示すとおり、反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で小胞と粒子を反応させることによって、ヒト健常者血清、ヒト健常者ヘパリン血漿に由来する小胞表面のＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が検出できた。
また、抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子、抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子、抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を用いた場合において、発癌により発現すると考えられているＥｐＣＡＭを抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出したピークが、コントロールとした抗マウスＩｇＧ抗体と比較してピークシフトしていなかった。健常者の検体からは検出されないものと考えられる。
さらに、固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合には、抗マウスＩｇＧ抗体で検出されたピークと抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出されたピークはさほど変わらなかった。すなわち、固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合に、健常者の検体よりエクソソームは得られなかった。非特異吸着が低いものと考えられる。
また、解析に用いたサンプルにはタンパク質の立体構造を変化させる熱、薬剤等の処理をしておらず、小胞表面に存在するネイティブフォームのＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が検出できたものと考えられる。【００８９】（試験例９−２  小胞表面のネイティブフォームの立体構造を維持したタンパクの検出（２））
試験に先立ち、以下に示す検体１８、１９を用意した。【００９０】  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を８本用意し、チューブ７９〜８６とナンバリングした。チューブ７９，８０に抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ、チューブ８１，８２に抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ、チューブ８３，８４に抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ、チューブ８５，８６に抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を０．１ｍｇ加えた。反応バッファー３を、反応液の塩濃度が０．２５Ｍになるようにチューブ７９〜８６に添加した。
次いで、チューブ７９，８１，８３，８５には検体１８を０．３ｍＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。また、チューブ８０，８２，８４，８６には検体１９を０．３ｍＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。
次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー０．２５ｍＬで２回洗浄し、集磁後、上清を取り除き、リン酸緩衝生理食塩水１ｍＬに懸濁した。
上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を４０本用意し、チューブ８７〜１２６とナンバリングした。チューブ７９〜８６の懸濁液を、次のようにして０．１ｍＬずつ分注した。
チューブ７９の懸濁液を、チューブ８７〜９１へ。
チューブ８０の懸濁液を、チューブ９２〜９６へ。
チューブ８１の懸濁液を、チューブ９７〜１０１へ。
チューブ８２の懸濁液を、チューブ１０２〜１０６へ。
チューブ８３の懸濁液を、チューブ１０７〜１１１へ。
チューブ８４の懸濁液を、チューブ１１２〜１１６へ。
チューブ８５の懸濁液を、チューブ１１７〜１２１へ。
チューブ８６の懸濁液を、チューブ１２２〜１２６へ。【００９１】  次いで、各チューブに、以下のように抗体をそれぞれ５μＬずつ添加した。【００９２】          チューブ番号                                    抗体
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８７，９２，９７，１０２，１０７，１１２，１１７，１２２    ＰＥ抗マウスＩｇＧ
８８，９３，９８，１０３，１０８，１１３，１１８，１２３    ＰＥ抗ＣＤ９
８９，９４，９９，１０４，１０９，１１４，１１９，１２４    ＰＥ抗ＣＤ６３
９０，９５，１００，１０５，１１０，１１５，１２０，１２５  ＰＥ抗ＣＤ８１
９１，９６，１０１，１０６，１１１，１１６，１２１，１２６  ＰＥ抗ＥｐＣＡＭ
――――――――――――――――――――――――――――――――【００９３】  その後、チューブ８７〜１２６を、２５℃、１０００ｒｐｍの条件で、１時間懸濁した。
次に、反応後の各粒子をリン酸緩衝生理食塩水０．５ｍＬで２回洗浄した後、フローサイトメーター（ＢＤ社製、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６）を用いて、各サンプルの蛍光シグナルを確認した。結果を図９−３、図９−４に示す。【００９４】  図９−３、図９−４に示すとおり、反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で小胞と粒子を反応させることによって、ヒト健常者血清、ヒト健常者ヘパリン血漿、ヒト結腸がんＨＴ２９細胞に由来する小胞表面に存在するＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が検出できた。
また発癌により発現すると考えられているＥｐＣＡＭを抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出したピークについて、コントロールとした抗マウス１９Ｇ抗体と比較してピークシフトが観察された。サンプルに健常者検体のみを用いている図９−１、図９−２ではこのピークシフトは確認されなかったことから、本発明を利用して疾患を判定できると考えられる。
さらに、固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合には、抗マウス１９Ｇ抗体で検出されたピークと抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体で検出されたピークはさほど変わらなかった。すなわち、固相担体として抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子を用いた場合に、健常者の検体よりエクソソームは得られなかった。非特異吸着が低いものと考えられる。
また、解析に用いたサンプルにはタンパク質の立体構造を変化させる熱、薬剤等の処理をしておらず、小胞表面に存在するネイティブフォームのＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１が検出できたものと考えられる。【００９５】（試験例１０）
Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）を２０本用意し、チューブ１２７〜１４６とナンバリングした。各チューブに、以下のように磁性粒子０．２ｍｇずつを加えた。【００９６】チューブ番号            磁性粒子
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１２７〜１３０      抗ＣＤ９抗体結合磁性粒子
１３１〜１３４      抗ＣＤ６３抗体結合磁性粒子
１３５〜１３８      抗ＣＤ８１抗体結合磁性粒子
１３９〜１４２      抗ＥｐＣＡＭ抗体結合磁性粒子
１４３〜１４６      Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ抗体結合磁性粒子
―――――――――――――――――――――――――――――【００９７】  次いで、チューブ１２７〜１４６に、反応バッファー３を、反応液の塩濃度が０．２５Ｍになるように添加した。各チューブに、以下のように検体をそれぞれ０．１ｍＬずつ加え、２５℃で２４時間反応させた。【００９８】            チューブ番号                      検体
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１２７，１３１，１３５，１３９，１４３      検体１０
１２８，１３２，１３６，１４０，１４４      検体１８
１２９，１３３，１３７，１４１，１４５      検体１２
１３０，１３４，１３８，１４２，１４６      検体１９
――――――――――――――――――――――――――――――【００９９】  次に、反応後の各粒子を洗浄バッファー０．５ｍＬで３回洗浄し、この懸濁液を、上記とは別の新しいＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ  ２ｍＬ（エッペンドルフ社製、＃００３０１０８１３２）に０．５ｍＬ分注した。
次いで集磁して洗浄液を廃棄後、抗体結合磁性粒子を１×サンプルバッファー２０μＬで懸濁し、９５℃で５分間静置処理した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファーにて洗浄した。
試験例８と同様にして、一次抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行い、発光基質を反応させ、発光測定器にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図１０−１、図１０−２に示す。【０１００】  また、比較対象として、エクソソームを回収する標準的な方法である超遠心分離法を利用して小胞表面のタンパクの検出を行った。すなわち、検体１０、１２、１８、１９それぞれ１１ｍＬずつについて、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを１１ｍＬ加え、懸濁した。再度、超遠心分離機（ベックマン社製  Ｏｐｔｉｍａ  ＸＥ−９０）を用い、１００，０００×ｇ、４℃で７０分間遠心した。上清を抜き取り、沈殿にＰＢＳを０．１１ｍＬ加え、懸濁した。懸濁液のうち１μＬに４×サンプルバッファー５μＬ、ＰＢＳ１４μＬを添加し、９５℃で５分間静置処理した。各サンプルを全量（２０μＬ）アプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写後、ブロッキングバッファー（１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ及び０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ）にて３７℃で２時間振とうした。これを洗浄バッファーにて洗浄した。
試験例８と同様にして、一次抗体との反応、洗浄バッファーによる洗浄を行い、発光基質を反応させ、発光測定器にてウェスタンブロット像を確認した。結果を図１０−１、図１０−２に示す。【０１０１】  図１０−１、図１０−２に示すとおり、反応液の塩濃度０．２５Ｍの環境下で小胞と粒子を反応させることによって、ヒト健常者血清、ヒト健常者ヘパリン血漿、ヒト結腸がんＨＴ２９細胞に由来する小胞表面のタンパクを、超遠心分離法と同等レベルもしくはそれ以上で検出できた。また、抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いて検出した場合に、ヒト健常者血清、ヘパリン血漿ではバンドが検出されず、これらにヒト結腸がんＨＴ２９細胞の培養上清を添加した場合にはバンドが検出された。本発明を利用して疾患を判定できると考えられる。
【国際調査報告】
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