(57)【要約】  本発明の目的は、核酸が消化管の上皮細胞間隙経路を介して効率的に吸収される新たな経腸投与用組成物を提供することである。  タイトジャンクション結合性ペプチドと脂溶性物質を結合させた核酸とを併用することによって、消化管の上皮細胞間隙を介する核酸の吸収性を格段に向上させ得る。
2017094745.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タイトジャンクション結合性ペプチド、及び脂溶性物質が結合している核酸を含有することを特徴とする、経腸投与用組成物。
【請求項２】
タイトジャンクション結合性ペプチドが、以下の(1)〜(18)のいずれかのペプチドを含む、請求項１に記載の経腸投与用組成物：
(1)配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
(2)配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(3)配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(4)配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
(5)配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(6)配列番号２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(7)配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
(8)配列番号３に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(9)配列番号３に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(10)配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
(11)配列番号４に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(12)配列番号４に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(13)配列番号５に示すアミノ酸配列において、７位のセリン残基の側鎖の水酸基と１４位のイソロイシン残基のカルボキシル基とがエステル結合によって環状構造を形成しており、且つ１位のロイシン残基のアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合しているペプチド、
(14)配列番号５に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、７位のアミノ酸残基の側鎖の水酸基とＣ末端のアミノ酸残基のカルボキシル基とがエステル結合によって環状構造を形成しており、且つＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合しており、前記(13)に示すペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
(15)配列番号５に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、７位のアミノ酸残基の側鎖の水酸基とＣ末端のアミノ酸残基のカルボキシル基とがエステル結合によって環状構造を形成しており、且つＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合しており、前記(13)に示すペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
(16)配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
(17)配列番号６に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(18)配列番号６に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
【請求項３】
前記核酸が、siRNA又はDNA/RNA2本鎖ヘテロ核酸である、請求項１又は２に記載の経腸投与用組成物。
【請求項４】
前記脂溶性物質が核酸に対して共有結合で直接結合している、請求項１〜３のいずれかに記載の経腸投与用組成物。
【請求項５】
前記脂溶性物質が、脂溶性ビタミン又はコレステロールである、請求項１〜４のいずれかに記載の経腸投与用組成物。
【請求項６】
前記脂溶性物質が、ビタミンＥである、請求項１〜５のいずれかに記載の経腸投与用組成物。
【請求項７】
経口投与によって投与される、請求項１〜６のいずれかに記載の経腸投与用組成物。
【請求項８】
タイトジャンクション結合性ペプチド、及び脂溶性物質が結合している核酸を含有する組成物の、経腸投与製剤の製造のための使用。
【請求項９】
前記経腸投与製剤が、経口投与によって投与される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
核酸の投与が必要とされる患者に、タイトジャンクション結合性ペプチド、及び脂溶性物質が結合している核酸を含有する組成物を経腸投与する工程を含む、核酸を消化管で吸収させる方法。
【請求項１１】
前記経腸投与が、経口投与である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸が消化管の上皮細胞間隙経路を介して効率的に吸収される経腸投与用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己投与が可能で最も服薬順守が高い剤形は経口剤（経腸投与製剤）であり、近年使用されている全医薬品の三分の二を占めている。経口送達技術は、次世代医薬品として有望な核酸医薬を中心とする近未来医療への移行のボトルネックとなっており、核酸医薬の経口投与が可能になれば、革新的であり、医療技術の進歩に多大なる貢献をもたらすことが期待される。【０００３】
従来、核酸分子の消化管からの吸収を改善する技術として、例えば、特許文献１には、脂溶性ビタミンやコレステロールを結合した核酸分子を、中鎖不飽和脂肪酸や長鎖不飽和脂肪酸等と共に脂質微粒子製剤として製剤化することによって、大腸からの吸収を改善できることが報告されている。しかしながら、特許文献１の技術では、中鎖不飽和脂肪酸や長鎖不飽和脂肪酸等を微粒子化するために比較的多量の乳化剤が必要とされ、また小腸内では微粒子の物理的安定性を維持することが難しく作用も安定しないことがある。また、特許文献２には、標的遺伝子の発現を抑制する核酸に脂溶性ビタミンやコレステロールを結合させ、これを内因性カイロミクロンの産生が誘導されている条件で脊椎動物に投与することによって、肝臓に対する選択的送達が可能になることが報告されている。しかしながら、特許文献２の技術では、小腸における吸収が低く、更に内因性カイロミクロンの産生を誘導するために脂質の投与が必要とされ、特許文献１の場合と同様に脂質を乳化させるために比較的多量の乳化剤が必要になる。また、小腸における核酸の吸収を高める技術として、非特許文献１には、カプリン酸ナトリウムを使用することによりアンチセンス核酸の経腸吸収を向上できることが報告されている。しかしながら、非特許文献１では、用量が核酸２５０〜１０００ｍｇ／Ｋｇ及びカプリン酸ナトリウム２５０ｍｇ／Ｋｇになっており、双方ともに非実用的レベルである。また、非特許文献１のように高用量のカプリン酸ナトリウムを使用すると、細胞間隙経路の透過性のみならず細胞内経路の透過性も高める上に、粘膜障害性や局所刺激性も懸念される。このように、経口投与によって核酸の消化管における吸収を向上させる製剤技術については、更なる改善が望まれている。【０００４】
一方、消化器官の粘膜上皮細胞層は、隣接二細胞間の接着に関与しているクローディン（Claudin）や隣接三細胞間の接着に関与しているアンギュリン（Angulin）と呼ばれる膜タンパク質等によって隣接する腸管上皮細胞間が緊密結合したタイトジャンクションを形成しており、当該タイトジャンクション機能を制御することによって、ペプチド性薬物や多糖類の消化管における吸収を向上させる技術が報告されている。例えば、非特許文献２及び特許文献３には、クローディン等に結合するタイトジャンクション結合性ペプチドが、ペプチド性薬物や多糖類の細胞間隙経路からの腸管吸収を向上させ得ることが報告されている。しかしながら、タイトジャンクションの制御によって、経口投与された核酸の消化管吸収性を高める革新的な製剤技術については、未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Therapy-Nucleic Acids (2014) 3, e211
【非特許文献２】Biomaterials 33 (2012) 3464-3474
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第2012/23291号
【特許文献２】国際公開第2009/69313号
【特許文献３】国際公開第2009/5000号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、核酸が消化管の上皮細胞間隙経路を介して効率的に吸収される新たな経腸投与用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、核酸に脂溶性物質を結合させ、これをタイトジャンクション結合性ペプチドと組み合わせて使用することによって、当該核酸とタイトジャンクション結合性ペプチドが非共有結合で結合した状態になると共に、タイトジャンクション結合性ペプチドがクローディンやアンギュリンに結合し、消化管の上皮細胞間隙を介する核酸の吸収性を格段に向上させ得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  タイトジャンクション結合性ペプチド、及び脂溶性物質が結合している核酸を含有することを特徴とする、経腸投与用組成物。
項２．  タイトジャンクション結合性ペプチドが、以下の(1)〜(18)のいずれかのペプチドを含む、項１に記載の経腸投与用組成物：
(1)配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
(2)配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(3)配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(4)配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
(5)配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(6)配列番号２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(7)配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
(8)配列番号３に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(9)配列番号３に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(10)配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
(11)配列番号４に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(12)配列番号４に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(13)配列番号５に示すアミノ酸配列において、７位のセリン残基の側鎖の水酸基と１４位のイソロイシン残基のカルボキシル基とがエステル結合によって環状構造を形成しており、且つ１位のロイシン残基のアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合しているペプチド、
(14)配列番号５に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、７位のアミノ酸残基の側鎖の水酸基とＣ末端のアミノ酸残基のカルボキシル基とがエステル結合によって環状構造を形成しており、且つＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合しており、前記(13)に示すペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
(15)配列番号５に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、７位のアミノ酸残基の側鎖の水酸基とＣ末端のアミノ酸残基のカルボキシル基とがエステル結合によって環状構造を形成しており、且つＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合しており、前記(13)に示すペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
(16)配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチド、
(17)配列番号６に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド、
(18)配列番号６に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
項３．  前記核酸が、siRNA又はDNA/RNA2本鎖ヘテロ核酸である、項１又は２に記載の経腸投与用組成物。
項４．  前記脂溶性物質が核酸に対して共有結合で直接結合している、項１〜３のいずれかに記載の経腸投与用組成物。
項５．  前記脂溶性物質が、脂溶性ビタミン又はコレステロールである、項１〜４のいずれかに記載の経腸投与用組成物。
項６．  前記脂溶性物質が、ビタミンＥである、項１〜５のいずれかに記載の経腸投与用組成物。
項７．  経口投与によって投与される、項１〜６のいずれかに記載の経腸投与用組成物。
項８．  タイトジャンクション結合性ペプチド、及び脂溶性物質が結合している核酸を含有する組成物の、経腸投与製剤の製造のための使用。
項９．  前記経腸投与製剤が、経口投与によって投与される、項８に記載の使用。
項１０．  核酸の投与が必要とされる患者に、タイトジャンクション結合性ペプチド、及び脂溶性物質が結合している核酸を含有する組成物を経腸投与する工程を含む、核酸を消化管で吸収させる方法。
項１１．  前記経腸投与が、経口投与である、項１０に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、比較的多量の脂質や乳化剤を使用せずに、腸管上皮非透過性である核酸に対して小腸を含めた消化管における細胞間隙経路を介した吸収を高めることができるので、核酸の経口投与を実現する革新的な製剤技術が提供される。【００１１】
また、本発明で使用されるタイトジャンクション結合性ペプチドは、局所障害作用を認めず、プロテアーゼ耐性の水溶性低分子タンパク質であり、溶解に界面活性剤等の乳化剤を必要としないので、本発明によれば、高い安全性をもって消化管における核酸の吸収性の向上が図られる。【００１２】
従来技術では、核酸は、患者組織への直接投与や静脈内注射等の侵襲的投与でしか体内の標的部位に送達できなかったが、本発明によれば、経口投与という非侵襲的投与であり、且つ自己投与が可能な製剤として提供することができるので、核酸医薬の分野において、革新的な技術進歩をもたらし、更には医療従事者及び患者の負担を軽減することができる。【００１３】
本発明において、消化管における核酸の吸収性を向上させる作用機序については、限定的な解釈を望むものではないが、以下のように類推される。タイトジャンクション結合性ペプチドと脂溶性物質が結合した核酸が共存すると、両者が水素結合や疎水結合等の非共有結合により結合した複合体になる。消化管内で当該複合体に含まれるタイトジャンクション結合性ペプチドがタイトジャンクションを構成している膜タンパク質に特異的に結合して細胞間隙経路の透過性を高めると共に、脂溶性物質が結合した核酸が、複合体から遊離し、透過性が亢進した細胞間隙経路を介して効率的に吸収される。消化管の細胞間隙経路を介して吸収された核酸は、脂溶性物質を介して、血中やリンパ球中のリポタンパク質と結合し、当該タンパク質が分布する臓器に選択的に送達され、核酸の機能が発揮される。核酸に結合させる脂溶性物質の種類を適宜選択することにより、核酸の送達部位を制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１において、αトコフェロールが結合しているsiRNA（Toc-siRNA）とタイトジャンクション結合性ペプチド（C-CPE 194、m19、Ib）を併用して、マウス小腸においてループアッセイを行い、肝移行したToc-siRNAを蛍光観察した結果を示す図である。
【図２】実施例２において、αトコフェロールが結合しているDNA/RNA2本鎖ヘテロ核酸（Toc-HDO）とタイトジャンクション結合性ペプチド（m19）を併用して、マウス小腸においてループアッセイを行い、肝移行したToc-siRNAを蛍光観察した結果を示す図である。
【図３】実施例３において、siRNA又はToc-siRNAとタイトジャンクション結合性ペプチド（m19）を併用して、マウス小腸においてループアッセイを行い、肝移行したsiRNA又はToc-siRNAを蛍光観察した結果を示す図である。
【図４】実施例４において、タイトジャンクション結合性ペプチド（C-CPE 194)と核酸（HDO、Toc-HDO）の結合性をゲルシフトアッセイにより評価した結果を示す図である。
【図５】実施例５において、HDO又はToc-HDOとタイトジャンクション結合性ペプチド（m19）を併用して、マウス小腸においてループアッセイを行い、肝臓におけるターゲット遺伝子（ApoB遺伝子）の発現量を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．経腸投与用組成物
本発明の経腸投与用組成物は、タイトジャンクション結合性ペプチド、及び脂溶性物質が結合している核酸を含有することを特徴とする。以下、本発明の経腸投与用組成物について詳述する。
【００１６】
タイトジャンクション結合性ペプチド
本発明で使用されるタイトジャンクション結合性ペプチドとは、消化器官の粘膜上皮細胞層において、上皮細胞間が緊密結合しているタイトジャンクションの形成に関与している膜タンパク質に結合し、消化管における細胞間隙経路を介した吸収を高めるペプチドである。
【００１７】
タイトジャンクションは、隣接二細胞間の接着に関与しているクローディン、隣接三細胞間の接着に関与しているアンギュリン等の膜タンパク質によって形成されていることが知られており、本発明で使用されるタイトジャンクション結合性ペプチドは、これらの膜タンパク質のいずれに結合するものであってもよい。
【００１８】
また、クローディンについては、従来、２７種の分子が同定されており、その内、クローディン−１、−２、−３、−４、−５、及び−８が消化器官におけるタイトジャンクションの形成に関与していることが知られている。また、アンギュリンについては、従来、３種の分子が同定されており、その内、アンギュリン−１、及び−３が消化器官におけるタイトジャンクションの形成に関与していることが知られている。そのため、本発明で使用されるタイトジャンクション結合性ペプチドは、クローディン−１、−２、−３、−４、−５、−８、アンギュリン−１、−３の内の少なくとも１種の膜タンパク質に結合できるものであればよい。より一層効果的に消化管における核酸の吸収性を向上させるという観点から、本発明で使用されるタイトジャンクション結合性ペプチドとして、好ましくは、クローディン−１及び／又はクローディン−４に結合するペプチドが挙げられる。
【００１９】
タイトジャンクション結合性ペプチドについては従来報告されており、本発明では、従来公知のタイトジャンクション結合性ペプチドを使用してもよく、また将来新たに開発されるタイトジャンクション結合性ペプチドを使用することもできる。
【００２０】
例えば、クローディン−４に結合するタイトジャンクション結合性ペプチドとしては、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfiringens）が産生するエンテロトキシン（CPE）のC末断片（C-CPE）及びその変異体が知られている（Biomaterials 33 (2012) 3464-3474；国際公開第2009/5000号参照）。また、例えば、クローディン−１に結合するタイトジャンクション結合性ペプチドとしては、合成ペプチドであるC1C2（Mol. Pharm. 9 (2012) 1785-1794.参照）、及びシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）RtIB026が産生するMA206（J Am Chem Soc. 135 (2013) 18949-56.）が知られている。また、例えば、アンギュリン−１に結合するタイトジャンクション結合性ペプチドとしては、イオタ毒素のbinding component（Ib）が知られている（Infect Immun 79 (2011)4353-60.参照）。
【００２１】
C-CPEとは、具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドである。また、C-CPEの変異体としては、具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるC-CPE 194、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるM19等が挙げられる。
【００２２】
また、本発明では、下記(i)及び(ii)に示すペプチド（C-CPEの変異体）、下記(iii)及び(iv)に示すペプチド（C-CPE 194の変異体）、下記(v)及び(vi)に示すペプチド（M19の変異体として）を、タイトジャンクション結合性ペプチドとして使用することもできる。
(i)配列番号１に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
(ii)配列番号１に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
(iii)配列番号２に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
(iv)配列番号２に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
(v)配列番号３に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
(vi)配列番号３に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
【００２３】
前記(i)、(iii)、及び(v)のペプチドにおいて、導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の改変のみ（例えば置換のみ）を含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(i)、(iii)、及び(v)のペプチドにおいて、導入される置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は数個であればよく、例えば１〜１８個又は１〜１２個、好ましくは１〜１０個、１〜８個、１〜５個、又は１〜４個、更に好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
【００２４】
また、前記(ii)、(iv)、及び(vi)のペプチドにおいて、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列に対する配列同一性は、８５％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。
【００２５】
ここで、前記(ii)、(iv)、及び(vi)のペプチドにおいて、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列に対する配列同一性とは、配列番号１〜３に示す各アミノ酸配列と比較して算出される配列同一性である。また、「配列同一性」とは、ＢＬＡＳＴ  ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２  ｂｉｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ  Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，ｐ２４７−２５０，１９９９）により得られるアミノ酸配列の同一性の値を示す。パラメーターは、Ｇａｐ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｃｏｓｔ  ｖａｌｕｅ：１に設定すればよい。
【００２６】
また、前記(i)〜(vi)のペプチドにおいてアミノ酸置換が導入されている場合、導入されるアミノ酸置換の態様として保存的置換が挙げられる。即ち、前記(i)〜(vi)のペプチドにおける置換としては、例えば、置換前のアミノ酸が非極性アミノ酸であれば他の非極性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が非荷電性アミノ酸であれば他の非荷電性アミノ酸への置換、置換前のアミノ酸が酸性アミノ酸であれば他の酸性アミノ酸への置換、及び置換前のアミノ酸が塩基性アミノ酸であれば他の塩基性アミノ酸への置換が挙げられる。
【００２７】
前記(i)及び(ii)のペプチドにおいて、「配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有する」とは、クローディン−４に対する結合能が配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等であり、脂溶性の修飾基が結合している核酸に対して、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等の消化管吸収性を付与できることを意味する。また、前記(iii)〜(vi)のペプチドについても、同様である。
【００２８】
また、C1C2とは、具体的には、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明では、下記(vii)及び(viii)に示すペプチド（C1C2の変異体）を、タイトジャンクション結合性ペプチドとして使用することもできる。
(vii)配列番号４に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
(viii)配列番号４に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
【００２９】
前記(vii)のペプチドにおいて、導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の改変のみ（例えば置換のみ）を含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(vii)のペプチドにおいて、導入される置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は数個であればよく、例えば１〜４個、好ましくは１〜３個、更に好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個が挙げられる。
【００３０】
また、前記(viii)のペプチドにおいて、配列番号４に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、８５％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。なお、前記(vii)のペプチドにおける配列同一性の算出方法については前記の通りである。
【００３１】
また、前記(vii)及び(viii)のペプチドにおいてアミノ酸置換が導入されている場合、導入されるアミノ酸置換の態様として保存的置換が挙げられ、その具体的態様については前記の通りである。
【００３２】
前記(vii)及び(viii)のペプチドにおいて、「配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有する」とは、クローディン−１に対する結合能が配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等であり、脂溶性の修飾基が結合している核酸に対して、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等の消化管吸収性を付与できることを意味する。
【００３３】
また、MA206とは、具体的には、配列番号５に示すアミノ酸配列において、７位のセリン残基の側鎖の水酸基と１４位（Ｃ末端）のイソロイシン残基のカルボキシル基とがエステル結合によって環状構造を形成しており、且つ１位（Ｎ末端）のロイシン残基のアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合した構造を有し、下記一般式（１）に示す構造を有するリポ環状デプシペプチドである。
【００３４】
【化１】
2017094745.tif 000003
【００３５】
本発明では、下記(ix)及び(x)に示すペプチド（MA206の変異体）を、タイトジャンクション結合性ペプチドとして使用することもできる。
(ix)配列番号５に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、７位のアミノ酸残基の側鎖の水酸基とＣ末端のアミノ酸残基のカルボキシル基とがエステル結合によって環状構造を形成しており、且つＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合しており、MA206と同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
(x)配列番号５に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、７位のアミノ酸残基の側鎖の水酸基とＣ末端のアミノ酸残基のカルボキシル基とがエステル結合によって環状構造を形成しており、且つＮ末端のアミノ酸残基のアミノ基に３−ヒドロキシデカノイル基がアミド結合しており、MA206と同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
【００３６】
前記(ix)のペプチドにおいて、導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の改変のみ（例えば置換のみ）を含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(ix)のペプチドにおいて、導入される置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は数個であればよく、例えば１又は２個、好ましくは１個が挙げられる。
【００３７】
また、前記(x)のペプチドにおいて、配列番号５に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、８５％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。なお、前記(x)のペプチドにおける配列同一性の算出方法については前記の通りである。
【００３８】
また、前記(x)及び(xi)のペプチドにおいてアミノ酸置換が導入されている場合、導入されるアミノ酸置換の態様として保存的置換が挙げられ、その具体的態様については前記の通りである。
【００３９】
前記(x)及び(xi)のペプチドにおいて、「MA206と同等のタイトジャンクション結合能を有する」とは、クローディン−１に対する結合能がMA206と同等であり、脂溶性の修飾基が結合している核酸に対して、MA206と同等の消化管吸収性を付与できることを意味する。
【００４０】
また、Ibとは、具体的には、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドである。本発明では、下記(xii)及び(xiii)に示すペプチド（Ibの変異体）を、タイトジャンクション結合性ペプチドとして使用することもできる。
(xii)配列番号６に示すアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されてなり、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
(xiii)配列番号６に示すアミノ酸配列に対する配列同一性が８５％以上であり、且つ、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有するペプチド。
【００４１】
前記(xii)のペプチドにおいて、導入されるアミノ酸の改変は、置換、付加、挿入、及び欠失の中から１種類の改変のみ（例えば置換のみ）を含むものであってもよく、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。前記(xii)のペプチドにおいて、導入される置換、付加、挿入又は欠失されるアミノ酸は、１個又は数個であればよく、例えば１〜２１個又は１〜１５個、好ましくは１〜１０個、１〜８個、１〜５個、又は１〜４個、更に好ましくは１〜３個、特に好ましくは１又は２個或いは１個が挙げられる。
【００４２】
また、前記(xiii)のペプチドにおいて、配列番号６に示すアミノ酸配列に対する配列同一性は、８５％以上であればよいが、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上が挙げられる。なお、前記(xiii)のペプチドにおける配列同一性の算出方法については前記の通りである。
【００４３】
また、前記(xii)及び(xiii)のペプチドにおいてアミノ酸置換が導入されている場合、導入されるアミノ酸置換の態様として保存的置換が挙げられ、その具体的態様については前記の通りである。
【００４４】
前記(xii)及び(xiii)のペプチドにおいて、「配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等のタイトジャンクション結合能を有する」とは、アンギュリン−１に対する結合能が配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等であり、脂溶性の修飾基が結合している核酸に対して、配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドと同等の消化管吸収性を付与できることを意味する。
【００４５】
また、タイトジャンクション結合性ペプチドは、前記C-CPE、C1C2、MA206、Ib、及びこれらの変異体のＮ末端側又はＣ末端側に、ポリペプチドの発現の向上、精製の容易性の付与等のために、他の機能を有するポリペプチド、ペプチドタグ等が付加されているものであってもよい。このような目的で、本発明のポリペプチドのＮ末端側及び／又はＣ末端側に付加されるアミノ酸の数については、特に制限されないが、例えば１〜１００個、好ましくは１〜５０個、更に好ましくは１〜３０個が挙げられる。
【００４６】
これらのタイトジャンクション結合性ペプチドの中でも、より一層効果的に消化管における核酸の吸収性を向上させるという観点から、好ましくは、C-CPE、C-CPE 194、M19、及びこれらの変異体、更に好ましくはC-CPE 194、M19、及びこれらの変異体、特に好ましくはC-CPE 194及びM19が挙げられる。また、これらのタイトジャンクション結合性ペプチドは、１種単独で使用してもよく、２種以上組み合わせて使用してもよい。
【００４７】
タイトジャンクション結合性ペプチドは、公知の遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法等を用いて製造することができる。
【００４８】
脂溶性物質が結合している核酸
本発明の経腸投与用組成物では、標的遺伝子の発現を抑制又は増強させる核酸（即ち、核酸医薬）に、脂溶性物質を結合させて使用する。
【００４９】
本発明で使用される核酸としては、標的遺伝子の発現を抑制又は増強でき、所望の薬理活性を発揮できるものであればよい。また、核酸に結合させる脂溶性物質として、ビタミンＥ又はコレステロールを使用する場合であれば、消化管から吸収された核酸を肝臓に集積させることができるので、肝疾患の治療目的で、肝臓で発現している遺伝子を標的とする核酸を使用することが好ましい。
【００５０】
本発明で使用される核酸としては、標的遺伝子の発現を抑制又は増強できることを限度として特に制限されず、DNA又はRNAのいずれであってもよく、また１本鎖又は２本鎖のいずれであってもよい。本発明で使用される核酸として、具体的には、siRNA（センス鎖とアンチセンス鎖を含む二本鎖RNA）、DNA/RNA2本鎖ヘテロ核酸（標的mRNAに結合するアンチセンスgapmerとこれと相補的なcRNAを含む二本鎖核酸；Nature Communications, Volume 6, id. 7969 (2015)及び国際公開第2013/089283号）、shRNA、アンチセンスDNA、アンチセンスRNA、アンタゴミア、核酸アプタマー、リボザイム、DNAデコイ、プラスミド等の核酸が挙げられる。これらの中でも、消化管における吸収性をより一層向上させるという観点から、好ましくはsiRNA及びDNA/RNA2本鎖ヘテロ核酸が挙げられる。
【００５１】
本発明で使用される核酸は、生体内で分解されにくいように各種の改変が施されていてもよい。例えば、核酸がRNAを含む場合であれば、RNaseに対する耐性を備えさせるために、RNAを構成しているリボヌクレオチドに対してメチル化やチオリン酸化等の処理が施されていてもよい。
【００５２】
本発明で使用される核酸において、構成するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの数については、特に制限されず、使用する核酸の種類に応じて適宜設定されるが、例えば、8〜100程度、好ましくは10〜50程度、更に好ましくは12〜30程度が挙げられる。
【００５３】
また、標的遺伝子の発現を抑制又は増強する核酸は、標的遺伝子の塩基配列、その転写因子が結合し得る部分の塩基配列等の情報に基づいて公知の手法により設計することができる。例えば、siRNAの場合であれば特開2005-168485号公報等、DNA/RNA2本鎖ヘテロ核酸の場合であればNature Communications, Volume 6, id. 7969 (2015)、国際公開第2013/089283号等；核酸アプタマーの場合であればNature, 1990, 346(6287):818-22等；リボザイムの場合であればFEBS Lett, 1988, 239, 285.、タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059等の記載に基づいて、各塩基配列を設計することができる。また、標的遺伝子の発現を抑制又は増強する核酸は、公知の合成手法や遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。
【００５４】
また、本発明で使用される核酸は、脂溶性物質が結合している状態で使用される。このように疎水性物質が結合した核酸を使用することにより、当該核酸がタイトジャンクション結合性ペプチドと物理的に結合することができ、その結果、タイトジャンクション結合性ペプチドを利用した消化管の細胞間隙を介する核酸の透過性を格段に向上させることが可能になる。また、核酸に結合させた脂溶性物質は、消化管から吸収された後に、血中やリンパ球中のリポタンパク質等のタンパク質と結合して、当該タンパク質が分布する臓器に送達されるので、核酸を選択的に送達する役割も果たす。
【００５５】
核酸に結合させる脂溶性物質としては、疎水性を示す基を有し、薬学的に許容されることを限度として特に制限されず、核酸を送達させるべき部位に応じて適宜選定すればよいが、例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン；コレステロール、グリセリド、糖脂質、脂肪酸等の脂質；アシルカルニチン、アシルＣｏＡ等の中間代謝物等が挙げられる。これらの脂溶性物質は、１種単独で使用してもよく、また2種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中でも、好ましくは脂溶性ビタミン、脂質、更に好ましくはビタミンＥ、コレステロールが挙げられる。特に、ビタミンＥ及び／又はコレステロールを使用する場合であれば、核酸を肝臓に選択的に送達させることが可能になる。
【００５６】
核酸に結合させる脂溶性物質としてビタミンＥを使用する場合、その種類については、特に制限されないが、例えば、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、δ−トコトリエール、及びこれらのエステル誘導体（例えば、酢酸エステル、コハク酸エステル等）が挙げられる。これらのビタミンＥは、ｄ体、ｌ体、又はｄｌ体のいずれであってもよい。これらのビタミンＥの中でも、好ましくはα−トコフェロールが挙げられる。
【００５７】
核酸と脂溶性物質との結合は、核酸と脂溶性物質が共有結合、イオン結合、水素結合等によって直接結合している状態であってもよく、また、他の物質（リンカー）を介して結合された状態であってもよい。核酸と脂溶性物質との結合を安定化させるという観点から、好ましくは核酸と脂溶性物質が共有結合により直接結合していることが望ましい。
【００５８】
核酸と脂溶性物質とを直接的に共有結合させる方法については、特に制限されないが、例えば、脂溶性物質が、ビタミンＥ、ビタミンＡ、コレステロール等の水酸基を有している脂溶性物質の場合であれば、当該水酸基と核酸の５'末端側に存在するヌクレオチドのリン酸残基とをリン酸エステル結合によって結合させればよい。例えば、α−トコフェロールを核酸の５'末端側に存在するヌクレオチドのリン酸残基とリン酸エステル結合によって結合させた場合、以下の一般式（２）に示す構造式になる。
【００５９】
【化２】
2017094745.tif 000004
【００６０】
このように、水酸基を有している脂溶性物質と核酸とをリン酸エステル結合によって結合させる方法は、Tetrahedron Letters 33; 2729-2732. 1992等の記載に基づいて行うことができる。
【００６１】
また、核酸と脂溶性物質とをイオン結合や水素結合等によって結合させる方法については、特に制限されないが、例えば、正電荷を有する物質（例えば、アルギニン残基を含むペプチド等）を脂溶性物質に結合させ、当該物質の正電荷と、核酸が有する負電荷とのイオン結合や水素結合を利用して結合させる方法が挙げられる。なお、正電荷を有する物質としてアルギニン残基を含むペプチドを使用する場合、当該ペプチドにおけるアルギニン残基の数としては、核酸とのより安定的な結合を得る観点から、通常２以上、好ましくは３以上、更に好ましくは４以上が挙げられる。
【００６２】
また、核酸と脂溶性物質とを他の物質（リンカー）を介して結合させる方法については、特に制限されないが、例えば、脂溶性物質が、ビタミンＥ、ビタミンＡ、コレステロール等の水酸基を有している脂溶性物質の場合であれば、当該水酸基と反応する官能基と、核酸が有する水酸基又はリン酸残基と反応する官能基とを有する２官能性のリンカー分子を用いて、核酸と脂溶性物質とを連結させればよい。
【００６３】
タイトジャンクション結合ペプチドと核酸の比率及び含有量
本発明の経腸投与用組成物において、タイトジャンクション結合性ペプチドと、脂溶物質が結合している核酸との比率については、特に制限されないが、たとえば、タイトジャンクション結合性ペプチド１分子当たり、脂溶物質が結合している核酸が1〜200分子、好ましくは1〜100分子、更に好ましくは1〜10分子となる比率が挙げられる。
【００６４】
本発明の経腸投与用組成物において、タイトジャンクション結合性ペプチド、及び脂溶物質が結合している核酸の含有量については、前述する比率や後述する用量を充足するように適宜設定すればよい。
【００６５】
製剤形態
本発明の経腸投与用組成物の製剤形態については、特に制限されず、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、坐剤等の固形製剤；液剤、注射剤等の液状製剤等が挙げられる。
【００６６】
本発明の経腸投与用組成物は、前述する成分の他に、各種の製剤形態に調製するために必要とされる基剤や添加剤が含まれていてもよい。
【００６７】
このような基剤や添加剤の種類については、薬学的に許容されることを限度として特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水等の水性基剤；乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤；ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースカルシウム、アルファー化デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、カルボキシメチルスターチ等の崩壊剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンガム等の結合剤；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート等の乳化剤；動物油脂、炭化水素類、ロウ類、シリコーン油等の油脂類；ｐＨ調整剤；緩衝剤等が挙げられる。
【００６８】
また、本発明の経腸投与用組成物を錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤等の製剤形態にする場合には、腸溶性コーティング剤で被覆され、腸溶性が付与されていることが望ましい。腸溶性コーティング剤としては、胃内のｐＨでは不溶性であるが、腸内のｐＨでは少なくとも部分的に可溶性を示す腸溶性ポリマーであればよい。このような腸溶性コーティング剤としては、具体的には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース等の腸溶性セルロース誘導体；メタクリル酸・メタクリル酸メチル共重合体、メタクリル酸・アクリル酸エチル共重合体、アクリル酸メチル・メタクリル酸メチル・メタクリル酸コポリマー等の腸溶性アクリル酸共重合体等が挙げられる。これらの腸溶性コーティング剤は、１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００６９】
更に、本発明の経腸投与用組成物は、核酸が標的細胞内に移行され易いように、必要に応じて核酸導入補助剤が含まれていてもよい。核酸導入補助剤としては、具体的には、リポフェクタミン、オリゴフェクタミン、ＲＮＡｉフェクト、リポソーム、ポリアミン、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム、デンドリマー等が挙げられる。
【００７０】
用法・用量
本発明の経腸投与用組成物は、核酸の投与が必要とされる患者に対して、核酸を投与するのに使用される。具体的には、例えば、本発明の経腸投与用組成物は、特定の遺伝子の発現を抑制又は増強することにより、改善又は治癒が見込まれる疾患の治療目的で使用することができる。特に、本発明の経腸投与用組成物では、核酸に結合させる脂溶性物質の種類を選定することにより、疾患部位に対して選択的に核酸を送達させることができるので、疾患の治療効果を高めることができる。例えば、核酸に結合させる脂溶性物質として、ビタミンＥ又はコレステロールを使用する場合であれば、消化管から吸収された核酸を肝臓に集積させることができ、肝疾患の治療目的で好適に使用できる。
【００７１】
本発明の経腸投与用組成物の投与態様については、腸において前記核酸が吸収される態様であることを限度として、特に制限されないが、例えば、内服による経口投与、坐剤、肛門から挿入又は注入による腸内投与が挙げられる。これらの中でも、経口投与は、患者自身で容易に行うことができ、負担も軽いので、本発明の経腸投与用組成物の投与態様として好適である。
【００７２】
本発明の経腸投与用組成物の用量については、患者の疾患の種類や程度、患者の年齢、使用する核酸の種類等に応じて、治療有効量に適宜設定すればよいが、例えば、核酸（結合している脂溶性物質を除く核酸自体の重量）の重量換算で0.001〜50 mg/kg-体重となる量を1日当たり１〜３回に分けて投与すればよい。
【００７３】
２．経腸投与製剤の製造のための使用、及び核酸を消化管で吸収させる方法
本発明は、更に、タイトジャンクション結合性ペプチド、及び脂溶性物質が結合している核酸を含有する組成物の、経腸投与製剤の製造のための使用を提供する。また、本発明は、核酸の投与が必要とされる患者に、タイトジャンクション結合性ペプチド、及び脂溶性物質が結合している核酸を含有する組成物を経腸投与する工程を含む、核酸を消化管で吸収させる方法を提供する。当該使用及び方法における具体的内容については、前記「１．経口投与用組成物」の欄に記載した通りである。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定して解釈されるものではない。【００７５】
以下の実施例で使用した各試験材料は、以下の通りである。なお、実施例１〜３で使用したsiRNA、Toc-siRNA、HDO、及びToc-HDOについては、各種蛍光物質で予め標識しておいた。
siRNA
以下のセンス鎖及びアンチセンス鎖からなるマウスアポリポプロテインＢ（ApoB）mRNAに対するsiRNA。
センス鎖：5'-GuCAuCACACuGAAuACCAAUGCugG*A-3'
アンチセンス鎖：5'-ucc*A*gc*AUUGGuAuUCAGUGuGAuGAc*A*C-3'
前記センス鎖及びアンチセンス鎖において、小文字は2'-O-methyl化されたRNAを示す。＊は、チオリン酸結合を示す。【００７６】
Toc-siRNA
前記siRNAのアンチセンス鎖の５'末端のリン酸残基が、α−トコフェロールの水酸基とリン酸エステル結合で共有結合している、α−トコフェロール結合siRNA。
Toc-siRNAにおけるα−トコフェロールとアンチセンス鎖との結合構造は、前記一般式（２）に示す構造である。【００７７】
HDO
以下のDNA/LNA gapmer及びcRNAからなるマウスアポリポプロテインＢ（ApoB）mRNAに対するDNA/RNA2本鎖ヘテロ核酸。
DNA/LNA gapmer：5'-G*C*a*t*t*g*g*t*a*t*T*C*A-3'
前記DNA/LNA gapmerにおいて、小文字はDNA、大文字はLNA（CはLNAメチルシトシンを示す）を示す。＊は、チオリン酸結合を示す。
cRNA：5'-u*g*a*AUACCAAU*g*c-3'
前記cRNAにおいて、大文字はRNA、小文字は2'-O-methyl化されたRNAを示す。＊は、チオリン酸結合を示す。【００７８】
Toc-HDO
前記DNA/RNA2本鎖ヘテロ核酸のcRNAの５'末端のリン酸残基が、α−トコフェロールの水酸基とリン酸エステル結合で共有結合している、α−トコフェロール結合ヘテロ核酸。
Toc-HDOにおけるα−トコフェロールとcRNAとの結合構造は、前記一般式（１）に示す構造である。【００７９】
C-CPE 194
配列番号２に示すアミノ酸配列からなるC-CPE 194のＮ末端側に、Hisタグが付加されているペプチドであり、配列番号７に示すアミノ酸配列からなるペプチド。【００８０】
m19
配列番号３に示すアミノ酸配列からなるm19のＮ末端側に、Hisタグが付加されているペプチドであり、配列番号８に示すアミノ酸配列からなるペプチド。【００８１】
Ib
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチド。【００８２】
実施例１：タイトジャンクション結合性ペプチドによるToc-siRNAの経腸吸収促進活性の評価
小腸投与されたToc-siRNAのタイトジャンクション結合性ペプチド（C-CPE 194、m19、Ib)による経粘膜吸収促進活性を評価するために、以下の実験を行った。【００８３】
１．実験方法
マウス小腸においてループアッセイ（loop assay）を行った。先ず、小腸に蛍光標識したToc-siRNAと各種タイトジャンクション結合性ペプチドの混合液を投与し、4時間後のマウス肝臓を回収した。次いで、回収した肝臓の組織切片を作製し、肝移行したToc-siRNAを蛍光観察した。具体的な実験手法については、以下の通りである。【００８４】
（投与薬液の調製）
Toc-siRNA（10 mg/kg）とタイトジャンクション結合性ペプチド（C-CPE 194：200 μg/mL、m19：50 μg/mL、Ib：50 μg/mL）をpH 6.5のリン酸緩衝液（PBS；20 mM Na2HPO4、47 mM KH2PO4、100mM NaCl）に溶解させ、総容量100 μLに調整した。なお、対照実験にはToc-siRNAのみをPBSに溶解したものを用いた。【００８５】
（マウスin situ loop 法）
実験開始前の12時間、水のみを自由に与えて絶食させたマウス（雄Slc:ICR、日本エスエルシー株式会社）にミルクを0.3 mL×3回（30分間隔）経口投与した。ミルク最終投与から20分後、5 mg/mlペントバルビタールナトリウム溶液（Sigma-Aldrich）を250 μL/30g腹腔内に投与した。ペントバルビタールナトリウム溶液の投与5-10分後に、麻酔下において開腹し、37℃の生理食塩水（大塚製薬）にて腸内を洗浄した。絹糸により腸管を2カ所結紮し、約5 cmの腸管ループを作製した。【００８６】
次いで、作製した腸管ループ内に前記薬液（100 μL）を投与し、腹部を縫合した後、滅菌ガーゼとラップで保護し静置した。4時間後、4℃の生理食塩水にて脱血還流を行い、マウスを犠牲にした後、肝臓の一部を切り出して4％パラホルムアルデヒド（和光）にて固定した。翌日、パラホルムアルデヒド液を30％スクロース溶液（和光）に置換した。翌日、肝臓組織をスクロース液から取り出し、OCTコンパウンド（サクラファインテックジャパン）にて包埋した。クリオスタット（ライカ）にて肝組織切片を作製し、Alexsa488-Phalloidin（Life Technologies）、及びDAPI（sigma）にて組織染色を行った。染色を施した肝組織切片を蛍光顕微鏡にて観察し、肝移行したToc-siRNAを蛍光観察した（Red: Cy3（Toc-siRNA）, Blue:TO-PRO3（核染色）, Green: Alexa488-Phalloidin (アクチン染色)）。【００８７】
２．実験結果
得られた結果を図１に示す。この結果から、タイトジャンクション結合性ペプチド（C-CPE 194、m19、Ib)と共にToc-siRNAを投与した場合には、Toc-siRNAを単独で投与した場合に比べて、肝臓内に送達されたToc-siRNA量が格段に高まっていることが確認された。即ち、本実験結果から、タイトジャンクション結合性ペプチドによって、脂溶性物質を結合させたsiRNAの小腸吸収が促進されることが明らかとなった。【００８８】
実施例２：タイトジャンクション結合性ペプチドによるToc-HDOの経腸吸収促進活性の評価【００８９】
小腸投与されたToc-HDOのタイトジャンクション結合性ペプチド（m19)による経粘膜吸収促進活性を評価するために、以下の実験を行った。【００９０】
１．実験方法
マウス小腸においてループアッセイ（loop assay）を行った。先ず、小腸に蛍光標識したToc-HDOと各種タイトジャンクション結合性ペプチドの混合液を投与し、3時間後のマウス肝臓を回収した。次いで、回収した肝臓の組織切片を作製し、肝移行したToc-HDOを蛍光観察した。具体的な実験手法については、以下の通りである。【００９１】
（投与薬液の調製）
Toc-HDO（5 mg/kg）とm19（100 μg/mL）をpH 6.5のリン酸緩衝液（PBS ; 20 mM Na2HPO4, 47 mM KH2PO4, 100mM NaCl）に溶解させ総容量100 μLに調整した。なお、対照実験にはToc-HDOのみをPBSに溶解したものを用いた。【００９２】
（マウスin situ loop 法）
前記実施例１と同様の方法で、マウスから約5 cmの腸管ループを作製した。次いで、作製した腸管ループ内に前記薬液（100 μL）を投与し、腹部を縫合した後、滅菌ガーゼとラップで保護し静置した。3時間後、4℃の生理食塩水にて脱血還流を行い、それ以降は、前記実施例１と同様の方法で、肝組織切片を作成し、組織染色を行った（Red: Alexa568（Toc-HDO）, Blue: DAPI（核染色）, Green: Alexa488-Phalloidin (アクチン染色)）。【００９３】
２．実験結果
得られた結果を図２に示す。この結果から、タイトジャンクション結合性ペプチド（m19)と共にToc-HDOを投与した場合には、Toc-HDOを単独で投与した場合に比べて、肝臓内に送達されたToc-HDO量が格段に高まっていることが確認された。即ち、本実験結果から、タイトジャンクション結合性ペプチドによって、脂溶性物質を結合させたDNA/RNA２本鎖ヘテロ核酸の小腸吸収が促進されることが明らかとなった。【００９４】
実施例３：タイトジャンクション結合性ペプチドによるsiRNA及びToc-siRNAの経腸吸収促進活性の評価【００９５】
小腸投与されたsiRNA及びToc-siRNAのタイトジャンクション結合性ペプチド（m19)による経粘膜吸収促進活性を評価し、トコフェロールによる小腸吸収促進への影響を検証するために、以下の実験を行った。【００９６】
１．実験方法
マウス小腸においてループアッセイ（loop assay）を行った。先ず、小腸に蛍光標識したsiRNA及びToc-siRNAとｍ19の混合液を投与し、4時間後のマウス肝臓を回収した。次いで、回収した肝臓の組織切片を作製し、肝移行したsiRNA及びToc-siRNAを蛍光観察した。具体的な実験手法については、以下の通りである。【００９７】
（投与薬液の調製）
siRNA又はToc-siRNA（340 μM）とm19（50 μg/mL）をpH 6.5のリン酸緩衝液（PBS ; 20 mM Na2HPO4, 47 mM KH2PO4, 100mM NaCl）に溶解させ総容量100 μLに調整した。【００９８】
（マウスin situ loop 法）
前記実施例２と同様の方法で、腸管ループの作製、薬液（100 μL）の投与、肝組織切片の作製、及び組織染色を行った（Red: Cy3（siRNA, Toc-siRNA）, Blue: TO-PRO3（核染色）, Green: Alexa488-Phalloidin (アクチン染色)）。【００９９】
２．実験結果
得られた結果を図３に示す。この結果から、m19とToc-siRNAを投与した場合には、m19とsiRNAを場合に比べて、肝臓内への送達量が格段に高まっていることが確認された。即ち、本実験結果から、タイトジャンクション結合性ペプチドと共に、脂溶性物質を結合させた核酸を投与することにより、当該核酸の小腸吸収が促進されることが明らかとなった。【０１００】
実施例４：タイトジャンクション結合性ペプチドとHDO (HDO、Toc-HDO)の結合性解析
タイトジャンクション結合性ペプチド（C-CPE 194)と核酸（HDO、Toc-HDO）の結合性を解析するために、以下の実験を行った。【０１０１】
１．実験方法
タイトジャンクション結合性ペプチド（C-CPE 194)と核酸（HDO、Toc-HDO）の結合性をゲルシフトアッセイにより評価した。具体的な実験手法は以下の通りである。【０１０２】
HDOを、PBS又はC-CPE 194（1000 pmol）を含むPBSに添加して混合し、室温で30分間インキュベートし、混合液を得た。また、別途、Toc-HDOを、C-CPE 194（0, 100, 300, 600, 1000 pmol）を含むPBSに添加して混合し、室温で30分間インキュベートし、混合液を得た。得られた各混合液を15%ポリアクリルアミド非変性ゲルにアプライし、電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色した。【０１０３】
２．実験結果
得られた結果を図４に示す。HDOとC-CPE 194を含む混合液では、HDOを単独で含む液と同じ部位に、HDOに由来するバンドが確認された。一方、Toc-HDOとC-CPE 194を含む混合液では、C-CPE 194の濃度依存的にHDO単体サイズのバンドが消失した。即ち、本結果から、C-CPE 194はToc-HDOに対して高い結合性を示すことが明らかとなった。【０１０４】
実施例５：タイトジャンクション結合性ペプチド（m19）を用いて小腸から吸収されたToc-HDOの肝臓でのターゲット遺伝子に対する遺伝子抑制効果の評価
タイトジャンクション結合性ペプチド（m19）を用いて小腸から吸収されたToc-HDOの肝臓でのApoB遺伝子発現抑制効果を評価するため、以下の実験を行った。【０１０５】
１．実験方法
マウス小腸においてループアッセイ（loop assay）を行った。先ず、小腸にToc-HDOとタイトジャンクション結合性ペプチド(m19)の混合液を2回投与し（3時間間隔）、6日後のマウス肝臓を回収した。次いで、回収した肝臓の組織切片からtotal RNAを回収し、cDNAを作製した。次いで、Toc-HDOのターゲット遺伝子であるApoB遺伝子の発現をリアルタイムPCR(q PCR)により測定した。具体的な実験手法については、以下の通りである。【０１０６】
（投与薬液の調製）
Toc-HDO（10 mg/kg）とタイトジャンクション結合性ペプチド（m19：100 μg/mL）をpH 6.5のリン酸緩衝液（PBS；20 mM Na2HPO4、47 mM KH2PO4、100mM NaCl）に溶解させ、総容量400 μLに調整した。なお、対照実験には、Toc-HDOの代わりにHDOを使用したものを用いた。【０１０７】
（マウスin situ loop 法）
前記実施例１と同様の方法で、マウスから約5 cmの腸管ループを作製した。次いで、作製した腸管ループ内に、3時間間隔で2回に分けて前記薬液を合計400 μL投与し、腸管及び腹部を縫合した。6日間飼育した後、4℃の生理食塩水にて脱血還流を行い、マウスを犠牲にした後、肝臓の一部を切り出し、ISOGEN（ニッポンジーン株式会社）を用いてホモジナイズした。その後、全RNAを回収した後、TaqMan Universal cDNA master (サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)にてcDNAを作製した。作製したcDNAよりApoB遺伝子の発現をTaqMan Universal PCR master mix (サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)および目的遺伝子に対応するFAM標識プライマー（TaqMan(R) Gene Expression Assays、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社)を用いて、リアルタイムPCR解析システム(DNA Engine Opticon 2, バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社 )にて測定した。なお、ApoB遺伝子の発現量は、ハウスキーピング遺伝子であるGAPDH遺伝子の発現量で補正を行った。【０１０８】
２．実験結果
得られた結果を図５に示す。HDOとm19を含む薬液（HDO/m19）を投与した場合には、コントロールに比べて、ApoB遺伝子の発現抑制効果は認められなかった。これに対して、Toc-HDOとm19を含む薬液（Toc-HDO/m19）を投与した場合には、コントロール、及びHDOとm19を含む薬液を投与した場合に比べて、有意にApoB遺伝子の発現を抑制できていた。即ち、本結果から、タイトジャンクション結合性ペプチドと、脂溶性物質が結合している核酸とを併用することによって、消化管における核酸の吸収性を格段に向上できることが明らかとなった。【０１０９】
実施例１〜５の結果に基づく考察
実施例１〜５の結果を踏まえると、タイトジャンクション結合性ペプチドは、脂溶性物質が結合している核酸と結合することにより、当該核酸の小腸における吸収性を高めていると推測される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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