(57)【要約】  ステージＩＶの大腸癌の治療には、ＦＯＬＦＯＸ療法もしくはＦＯＬＦＩＲＩ療法のいずれかの全身化学療法が用いられる。しかし、どちらの療法が個々の患者にとって、効果的かを予見する方法はなかった。  大腸癌に対してＦＯＬＦＯＸ治療とＦＯＬＦＩＲＩ治療のうち、いずれの療法を選択するのが患者にとって有利であることを示すバイオマーカーであって、前記バイオマーカーは、ヒト染色体上の７ｐ１５．３、７ｑ３４、８ｑ２４．１、８ｑ２４．２、８ｑ２４．１−ｑ２４．２、９ｑ３４．３、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１、１３ｑ２２．１、１３ｑ３２．２−ｑ３２．３、１３ｑ３４、２０ｑ１２、２０ｑ１３．１３、２０ｑ１３．２、２０ｑ１３．３のうち、少なくとも１領域のコピー数の増加の有無であることを特徴とするバイオマーカーを用いることで、ＦＯＬＦＩＲＩ療法若しくはＦＯＬＦＯＸ療法を選択した方が有利になることを判断することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸癌に対してＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を行うに際し、患者にとってどちらが有利であるかを示すバイオマーカーであって、
前記バイオマーカーは、ヒト染色体上の７ｐ１５．３、７ｑ３４、８ｑ２４．１、８ｑ２４．２、８ｑ２４．１−ｑ２４．２、９ｑ３４．３、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１、１３ｑ２２．１、１３ｑ３２．２−ｑ３２．３、１３ｑ３４、２０ｑ１２、２０ｑ１３．１３、２０ｑ１３．２、２０ｑ１３．３のうち、少なくとも１領域のコピー数の増加の有無であることを特徴とするバイオマーカー。
【請求項２】
大腸癌に対してＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を行うに際し、患者にとってどちらが有利であるかを示すバイオマーカーであって、
前記バイオマーカーは、ヒト染色体上の７ｑ３４、８ｑ２４．１、８ｑ２４．２、８ｑ２４．１−ｑ２４．２、９ｑ３４．３、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１のうち、いずれかの領域のコピー数の増加の有無であることを特徴とするバイオマーカー。
【請求項３】
大腸癌に対してＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法のいずれかを選択する選択方法であって、
前記大腸癌の腫瘍組織検体のヒト染色体上の特定領域のコピー数の増加の有無を測定する工程と、
前記コピー数の増加の有無に基づいて前記ＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択する工程を含み、
前記ヒト染色体上の特定領域が、７ｐ１５．３、７ｑ３４、８ｑ２４．１、８ｑ２４．２、８ｑ２４．１−ｑ２４．２、９ｑ３４．３、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１、１３ｑ２２．１、１３ｑ３２．２−ｑ３２．３、１３ｑ３４、２０ｑ１２、２０ｑ１３．１３、２０ｑ１３．２、２０ｑ１３．３のうち、少なくとも１領域であることを特徴とする治療法の選択方法。
【請求項４】
前記ヒト染色体上の特定領域が、７ｑ３４、８ｑ２４．１、８ｑ２４．２、８ｑ２４．１−ｑ２４．２、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１のうち、少なくとも１領域であり、
前記ＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択する工程は、
前記特定領域のコピー数が増加している場合にＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択することを特徴とする請求項３に記載された治療法の選択方法。
【請求項５】
前記ヒト染色体上の特定領域が、９ｑ３４．３領域であり、
前記ＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択する工程は、
前記特定領域のコピー数が増加していない場合にＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択することを特徴とする請求項３に記載された治療法の選択方法。
【請求項６】
前記ヒト染色体上の特定領域が７ｐ１５．３と８ｑ２４．１であり、
前記ＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択する工程は、
前記７ｑ１５．３でコピー数の増加が認められ、前記８ｑ２４．１ではコピー数の増加が認められない場合にＦＯＬＦＯＸ療法を選択することを特徴とする請求項３に記載された治療法の選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸癌に対してＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法のいずれを選択するのが患者に対して有利であるかを示すバイオマーカーと、それを用いた療法の選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌研究会の大腸癌治療ガイドラインでは、大腸癌は、進行度を５つの段階（ステージ）で表される。ステージが進むに従い、癌の進行度は進む。このステージの判断は、大腸壁への侵入度、リンパ節への転移の有無、他の臓器への転移有無で判断される。ステージＩＶは最も進行した大腸癌で、他の臓器への転移が認められる段階である。このようなステージでは、外科的な切除は困難で専ら全身化学療法が施される。【０００３】
この進行・転移性結腸直腸癌に対する治療として、ファーストラインにＦＯＬＦＯＸ療法＋ベバシズマブ、あるいはＦＯＬＦＩＲＩ療法＋ベバシズマブが広く推奨されている。このうちベバシズマブ（ＢＥＶ）はＶＥＧＦ−Ａ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ：血管内皮増殖因子Ａ）に対するヒト化モノクローナル抗体として開発され、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ結合を阻害する薬剤である。腫瘍血管の血管内皮細胞は薬剤暴露によりＶＥＧＦＲ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：血管内皮細胞増殖因子受容体）シグナル伝達を遮断され、結果的に腫瘍血管は強力な血管新生阻害作用を受ける。【０００４】
ＢＥＶの有用性は切除不能・再発結腸直腸がんに対して確立しており、臨床の場に登場して数年経過している。ＢＥＶの薬理作用メカニズムは創薬の時点で明確であり、ＢＥＶを含めた血管新生阻害薬に対するバイオマーカー研究は精力的に早期の臨床開発段階から行われている。しかしながら臨床実地上有用な再現性があり、簡便で、測定値に施設間格差がなく、非侵襲的な、バイオマーカーは現時点では特定されていない。【０００５】
同様に、ＦＯＬＦＯＸ（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ）／ｌｅｖｏｆｏｌｉｎａｔｅ  ｃａｌｃｉｕｍ（Ｉ−ＬＶ）＋ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ（Ｌ−ＯＨＰ））療法およびＦＯＬＦＩＲＩ（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ）／ｌｅｖｏｆｏｌｉｎａｔｅ  ｃａｌｃｉｕｍ（Ｉ−ＬＶ）＋ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（ＣＰＴ−１１））療法両レジメンの効果予測因子についても、臨床実地上有用と証明されているバイオマーカーは現時点で特定されていない。【０００６】
ＤＮＡのコピー数を、発症した患者に対する最適な薬剤治療法の選択に利用可能なマーカーとしては、特許文献１（特開２０１１−１３５８３８号公報）が知られている。これは、著しい視力低下をきたす加齢黄斑変性症の発症及び進行を、高い精度及び確率で予測可能であり、加齢黄斑変性症の早期予防や、既に発症した患者に対する最適な薬剤治療法の選択に好適に利用可能な加齢黄斑変性症易罹患性判定用マーカーを提供するものである。【０００７】
大腸癌に対してＤＮＡのコピー数をマーカーとして用いた例として、特許文献２（特開２０１０−１６２０２９号公報）がある。ここでは、２つの非常に異なるタイプのアレイを組み合せて、癌およびトリソミーのようなさまざまな遺伝障害のマーカーとなり得る遺伝子のコピー数の変化を、高い解像度で迅速かつ正確に検出する方法を提供している。この方法では、対象となる疾患として、乳癌、肺癌、大腸癌、精巣癌、子宮内膜癌、または膀胱癌が上げられている。【０００８】
また、特許文献３（特表２００８−５２４９８６号公報）では、遺伝子のコピー数の変化を、乳癌、卵巣癌、胃癌、大腸癌、食道癌、間葉癌、膀胱癌または非小細胞肺癌の診断、予後、予測、予防および治療に利用する方法が開示されており、より具体的には、タキソール（商標）またはタキソテール（商標）などのタキサンまたはその他のタキサンに基づく誘導体を含む様々な治療計画に対する腫瘍性病変の応答予測を、遺伝子のコピー数の変化で行おうとするものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１１−１３５８３８号公報
【特許文献２】特開２０１０−１６２０２９号公報
【特許文献３】特表２００８−５２４９８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献３で開示されているように、癌の治療法に対する応答予測に遺伝子のコピー数の増加を用いる点については、すでに公開されている。しかし、より具体的に大腸癌に対するＦＯＬＦＯＸ療法およびＦＯＬＦＩＲＩ療法のどちらを選択するのが、個々の患者に対して有利かを判断するためのマーカーを開示するものではない。【００１１】
これらの療法は、一般的に交差耐性がないと考えられており、一方の薬物療法で効果が出ない場合は、他方の薬物療法を行うことができる。しかし、一方の薬物療法で効果が出なかった後に他方の薬物療法を行うのは、さらなる副作用に対する忍容性が要求される点と、治療コストの点からも患者にとっては、大きな負担となる。【００１２】
大腸癌の患者数は、日本国内だけでも１０万人を越えており、今後、ＦＯＬＦＯＸ療法およびＦＯＬＦＩＲＩ療法に対し、抗腫瘍薬の効果予測因子を特定し、治療対象の層別化を行うことは、医療経済面から有益である。また医療経済面だけでなく、患者にとっても無効な薬剤投与による有害事象の出現および無効な薬剤による無駄な治療期間の回避などの有益性をもたらす。したがって、ＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法のどちらがその患者にとって有利かを予見する必要性は高い。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、ヒト染色体上の特定領域のコピー数の増加の有無に基づいて、ＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を行うことがその患者に対しては有利であることを示すバイオマーカーおよび治療法の選択方法を提供するものである。【００１４】
より具体的に本発明に係るバイオマーカーは、
大腸癌に対してＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を行うに際し、患者にとってどちらが有利であるかを示すバイオマーカーであって、
前記バイオマーカーは、ヒト染色体上の７ｐ１５．３、７ｑ３４、８ｑ２４．１、８ｑ２４．２、８ｑ２４．１−ｑ２４．２、９ｑ３４．３、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１、１３ｑ２２．１、１３ｑ３２．２−ｑ３２．３、１３ｑ３４、２０ｑ１２、２０ｑ１３．１３、２０ｑ１３．２、２０ｑ１３．３のうち、少なくとも１領域のコピー数の増加の有無であることを特徴とする。【００１５】
また、大腸癌に対してＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を行うに際し、患者にとってどちらが有利であるかを示すバイオマーカーであって、
前記バイオマーカーは、ヒト染色体上の７ｑ３４、８ｑ２４．１、８ｑ２４．２、８ｑ２４．１−ｑ２４．２、９ｑ３４．３、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１のうち、いずれかの領域のコピー数の増加の有無であることを特徴とする。【００１６】
また、本発明に係る治療法の選択方法は、
大腸癌に対してＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法のいずれかを選択する選択方法であって、
前記大腸癌の腫瘍組織検体のヒト染色体上の特定領域のコピー数の増加の有無を測定する工程と、
前記コピー数の増加の有無に基づいて前記ＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択する工程を含み、
前記ヒト染色体上の特定領域が、７ｐ１５．３、７ｑ３４、８ｑ２４．１、８ｑ２４．２、８ｑ２４．１−ｑ２４．２、９ｑ３４．３、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１、１３ｑ２２．１、１３ｑ３２．２−ｑ３２．３、１３ｑ３４、２０ｑ１２、２０ｑ１３．１３、２０ｑ１３．２、２０ｑ１３．３のうち、少なくとも１領域であることを特徴とする。【００１７】
さらに、本発明に係る治療法の選択方法は、
前記ヒト染色体上の特定領域が、７ｑ３４、８ｑ２４．１、８ｑ２４．２、８ｑ２４．１−ｑ２４．２、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１のうち、少なくとも１領域であり、
前記ＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択する工程は、
前記特定領域のコピー数が増加している場合にＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択することを特徴とする。【００１８】
また、本発明の治療法の選択方法は、
前記ヒト染色体上の特定領域が、９ｑ３４．３領域であり、
前記ＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択する工程は、
前記特定領域のコピー数が増加していない場合にＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択することを特徴とする。【００１９】
また、本発明の治療法の選択方法は、
前記ヒト染色体上の特定領域が７ｐ１５．３と８ｑ２４．１であり、
前記ＦＯＬＦＯＸ療法またはＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択する工程は、
前記７ｑ１５．３でコピー数の増加が認められ、前記８ｑ２４．１ではコピー数の増加が認められない場合にＦＯＬＦＯＸ療法を選択することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２０】
本発明に係るバイオマーカーおよび治療法の選択方法によって、統計的な効果としてほぼ等しいとされているＦＯＬＦＯＸ療法およびＦＯＬＦＩＲＩ療法について、患者毎にいずれの療法の方が有利であるか否かを選択できる。したがって、患者にとっては、一方の療法を受けた後、他方の療法をやり直す必要がなくなるという効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】アジレント社ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ６．５Ｌｉｔｅソフトウェアによる染色体全領域とその領域にコードされている遺伝子のリストアップの例を示した図である。
【図２】７番、８番、１３番、２０番染色体で増幅領域があった箇所を示した図である。
【図３】７番染色体長腕３４（７ｑ３４）の領域におけるコピー数の増加の有無による生存率曲線を示すグラフである。
【図４】７番染色体長腕にある計４個の増幅領域についてコピー数の増加の有無による生存率曲線を示すグラフである。
【図５】１３番染色体長腕にある５個の増幅領域についてコピー数の増加の有無による生存率曲線を示すグラフである。
【図６】２０番染色体長腕にある４個の増幅領域についてコピー数の増加の有無による生存率曲線を示すグラフである。
【図７】７番、１３番、２０番にある増幅領域についてＥＴＳの結果を示すグラフである。
【図８】ＯＳ、ＥＴＳ両方に有意差を認めた７ｑ３４の領域について、（１）ＦＯＬＦＯＸ療法＋ベバシズマブのＦＯＬＦＯＸ群  ７５例、（２）ＦＯＬＦＩＲＩ療法＋ベバシズマブのＦＯＬＦＩＲＩ群７９例に分けて、それぞれ増幅有りの症例、無しの症例間におけるＯＳを（ｌｏｇ  ｒａｎｋ）検定して、計４群で比較した結果（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線）である。
【図９】１３番染色体での結果（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線）を示すグラフである。
【図１０】１３番染色体での結果（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線）を示すグラフである。
【図１１】２０番染色体での結果（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線）を示すグラフである。
【図１２】２０番染色体での結果（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線）を示すグラフである。
【図１３】７番染色体領域における全患者（１５４名）のコピー数増加（ＣＮＧ）あり、なし間のＯＳ、ＰＦＳにおける差およびＣＮＧあり（＋）、なし（−）の２群におけるＦＯＬＦＯＸ群、ＦＯＬＦＩＲＩ群間のＯＳ、ＰＦＳにおける差（ｐ値）を表す図である。
【図１４】８番染色体領域における全患者（１５４名）のコピー数増加（ＣＮＧ）あり、なし間のＯＳ、ＰＦＳにおける差およびＣＮＧあり（＋）、なし（−）の２群におけるＦＯＬＦＯＸ群、ＦＯＬＦＩＲＩ群間のＯＳ、ＰＦＳにおける差（ｐ値）を表す図である。
【図１５】１３番、２０番染色体領域における全患者（１５４名）のコピー数増加（ＣＮＧ）あり、なし間のＯＳ、ＰＦＳにおける差およびＣＮＧあり（＋）、なし（−）の２群におけるＦＯＬＦＯＸ群、ＦＯＬＦＩＲＩ群間のＯＳ、ＰＦＳにおける差（ｐ値）を表す図である。
【図１６】７ｐ１５．３の領域におけるＰＦＳのカプラン・マイヤー曲線を示すグラフである。
【図１７】８ｑ２４．１の領域におけるＯＳのカプラン・マイヤー曲線を示すグラフである。
【図１８】８ｑ２４．１の領域におけるＰＦＳのカプラン・マイヤー曲線を示すグラフである。
【図１９】７ｐ１５．３および８ｑ２４．１の領域におけるＣＮＧのステータスに基づいてグループ分けしたＰＦＳおよびＯＳのカプラン・マイヤー曲線を示すグラフである。
【図２０】７ｐ１５．３および８ｑ２４．１の領域におけるＣＮＧのステータスに基づいてグループ分けしたＰＦＳおよびＯＳのカプラン・マイヤー曲線を示すグラフである。
【図２１】７番、８番、１３番、２０番以外の染色体増幅領域における全患者（１５４名）、ＦＯＬＦＯＸ群（７５名）、ＦＯＬＦＩＲＩ群（７９名）のコピー数増加あり、なし間のＯＳ、ＰＦＳにおける差（ｐ値）を表す図である。
【図２２】９ｑ３４．３領域のＦＯＬＦＯＸ群、ＦＯＬＦＩＲＩ群におけるコピー数増加あり、なし間およびＣＮＧあり（＋）、なし（−）の２群におけるＦＯＬＦＯＸ群、ＦＯＬＦＩＲＩ群間のカプラー・マイヤ曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下に本発明に係るバイオマーカーおよび治療法の選択方法について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。
【００２３】
ステージＩＶで用いられる化学療法には、ＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法が使われている。ＦＯＬＦＯＸ療法とは、フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ））と、フォリン酸（ｌｅｖｏｆｏｌｉｎａｔｅ  ｃａｌｃｉｕｍ（Ｉ−ＬＶ））と、オキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ  （Ｌ−ＯＨＰ））の３剤を併用する治療法である。ＦＯＬＦＯＸ療法にはさらにベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＢＥＶ））を併用することを含めることもできる。
【００２４】
ＦＯＬＦＩＲＩ療法とは、フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ））と、フォリン酸（ｌｅｖｏｆｏｌｉｎａｔｅ  ｃａｌｃｉｕｍ（Ｉ−ＬＶ））と、イリノテカン塩酸塩（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（ＣＰＴ−１１））（以後単に「イリノテカン」と呼ぶ。）の３剤を併用する治療法である。ＦＯＬＦＩＲＩ療法にはさらにベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＢＥＶ））を併用することを含めることもできる。
【００２５】
したがって、ＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法との相違点は、オキサリプラチンとイリノテカンの違いである。しかし、個々の患者にとって、どちらの療法が適しているかを予見することは従来できなかった。以下の実施例が示すように、本発明では、各患者の腫瘍組織検体中の染色体において、ヒト染色体上の特定領域のコピー数の増加の有無を調べることで、どちらの療法を選択するのが有利になるのかを判断することができる。
【００２６】
なお、ここで「有利になる」とは、治療後の生存期間が長くなることが高い確率で期待できるという意味である。また、ここでヒト染色体上の特定領域のコピー数の増加の有無は、後述するＣＧＨ法、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法等の方法により測定することができる。
【実施例】
【００２７】
（実施例１）
以下の実施例に関して用いた対象症例は、切除不能・再発結腸／直腸がん初回化学療法例に該当し、２００８年９月から２０１２年１２月までに西日本がん研究機構（Ｗｅｓｔ  Ｊａｐａｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ）の「切除不能・再発結腸／直腸がん初回化学療法例に対する５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ（５−ＦＵ）／ｌｅｖｏｆｏｌｉｎａｔｅ  ｃａｌｃｉｕｍ（Ｉ−ＬＶ）＋ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ（Ｌ−ＯＨＰ）＋ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（ＢＥＶ）併用療法  対  ５ＦＵ／Ｉ−ＬＩ＋ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（ＣＰＴ−１１）＋ＢＥＶ併用療法のランダム化比較第ＩＩＩ相試験（ＷＪＯＧ４４０７Ｇ）」に登録され、かつＷＪＯＧ４４０７ＧＴＲに同意が得られた患者のデータである。【００２８】
検体は、治療前に得られた腫瘍組織検体から作成した病理スライド（ＦＦＰＥスライド）を使用した。腫瘍組織検体とは手術検体もしくは内視鏡下生検組織であり、スライドはパラフィン包埋、５ミクロンの切片での薄切を経て、スライドグラス上に固定し作成したものである。したがって、手術時に検体を採取する若しくは内視鏡によって生検組織を採取するのは、腫瘍組織検体を採取する工程といえる。なお、臨床試験登録以前に採取された検体も使用可能とした。【００２９】
腫瘍組織中のヒト染色体上の特定領域のコピー数変化は、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＣＧＨ）法を用いて測定した。ＣＧＨ法は、全染色体を対象にしてゲノムＤＮＡの過剰、欠失、増幅などのコピー数異常を短時間で検出する方法である。染色体コピー数変化の検出が可能であるため、従来の染色体分析法では詳細な解析が困難であった固形腫瘍のゲノム異常解析法として、現在、広く利用されている。【００３０】
染色体レベルの物理サイズで起きたコピー数の減少（ｌｏｓｓ）、増加（ｇａｉｎ）、増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を決定することができるが、本技術によりコピー数の変化を伴わない均衡型染色体転座を検出することは不可能である。例えば、転座のように染色体自体の数が変化しない場合等である。【００３１】
新しく同定された増幅領域に含まれるがん関連遺伝子は、遺伝子増幅に伴い発現量も増加していることが予想されることから、新規がん治療標的となる遺伝子探索を目的として、ＣＧＨ解析は頻繁に行われている。今回の研究では、パラフィン切片より抽出したゲノムＤＮＡを用い、市販の正常組織由来ＤＮＡと競合させることにより解析をおこなった。【００３２】
ＣＧＨ解析の手順は以下の通りである。
まず、ＦＦＰＥスライド検体からＤＮＡ抽出を行った。全部で１５４サンプルのＤＮＡ抽出を行った。【００３３】
次にがん部より抽出したＤＮＡの蛍光ラベルおよびハイブリダイゼーションの準備を行った。具体的には、癌部ＤＮＡはｃｙａｎｉｎｅ５（Ｃｙ５）、リファレンスＤＮＡ（正常組織由来ＤＮＡ）はｃｙａｎｉｎｅ３（Ｃｙ３）で蛍光ラベルした。【００３４】
ハイブリダイゼーションは以下のように行った。処理済みサンプル（Ｃｙ５ラベル化がん部ＤＮＡ＋Ｃｙ３ラベル化リファレンスＤＮＡ）１１０ｕｌのうち１００ｕｌをアジレント社ＣＧＨマイクロアレイ、４Ｘ４４Ｋに対応するガスケットスライドグラスにアプライした。次に、４Ｘ４４Ｋマイクロアレイスライドグラスにおけるプローブのコーティング面に触れるように、両スライドを重ね合わせたのち、チャンバーにセット（固定）した。回転式オーブンにて６５℃でハイブリダイゼーション反応を４０時間行った。【００３５】
実際の解析は以下の手順で行った。まず、２枚重ねになったガスケットおよびアレイスライドの間にピンセットを入れ、はがした。アレイスライドをアジレント社ＣＧＨ洗浄用バッファー１で満たされたガラス容器中のスライドラックに差し込んだ。その後室温で、５分放置した。【００３６】
次に、アジレント社ＣＧＨ洗浄用洗浄バッファー２で満たされた別のガラス容器中へ、アレイをスライドラックごと移した。その後３７℃で、１分放置した。【００３７】
次に、アレイを取り出し、スライドホルダーへセットした。そして、アジレント社オゾン除去フィルター付きスキャナーにセットしてスキャンを行った。【００３８】
ＰＣ（コンピュータ）上で、アジレント社スキャナコントロールソフトウェアを立ち上げ、アレイの画像を取り込んだ。【００３９】
次に、アジレント社Ｆｅａｔｕｒｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを用いて、さきに取り込んだ画像から、アレイ上にそれぞれのプローブが結合しているスポット（約４４，０００か所）についてＣｙ３、Ｃｙ５の蛍光強度を得た。Ｃｙ５／Ｃｙ３のｌｏｇ２比を算出して、各スポット（〇番染色体の〇ローカス）におけるヒト染色体上の特定領域のコピー数の増加の有無を見積もった。【００４０】
ヒト染色体上の特定領域のコピー数の増加の有無はａｂｅｒｒａｔｉｏｎという。何番染色体のどの領域にａｂｅｒｒａｔｉｏｎがあるかは、アジレント社ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ６．５Ｌｉｔｅソフトウェアをもちいて解析した。図１（ａ）（各染色体の全領域を図示したもの）と、図１（ｂ）（各染色体上の領域にコードされている遺伝子をリストアップした表）はこのソフトウェアがはじき出したものを例示したものである。このようなデータに基づいて、各症例の全染色体におけるａｂｅｒｒａｔｉｏｎを知ることができる。【００４１】
図１の表（図１（ｂ））については、サンプル名、染色体番号、ローカス、増幅か欠失、当該ローカスに含まれる遺伝子名などの情報が出力されている。本実施例では、全１５４検体のすべてにおいて、ａｂｅｒｒａｔｉｏｎを認めた染色体とそのローカスを記録した。今回は特に、Ｃｙ５／Ｃｙ３のｌｏｇ２比＞０．２５すなわち正常と比べて２０．２５＝１．１９倍以上増幅を認めたローカスのみを探索した。このように正常組織と比較してコピー数の増減を求めるのは、大腸癌の腫瘍組織検体のヒト染色体上の特定領域のコピー数の増加の有無を測定する工程といえる。【００４２】
なお、増幅が１．１９倍というように、整数倍にしないのは、正常細胞の混入や腫瘍細胞の不均一性など、ＤＮＡを収集した腫瘍組織における細胞の異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を想定しているからである。【００４３】
また、ほとんどのヒト遺伝子について、あらゆる組織における遺伝子コピー数の測定が簡便に行えるライフテクノロジーズ社「Ｔａｑｍａｎ（登録商標）  Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙ」を用いることもできる。【００４４】
今回（１）ＦＯＬＦＯＸ療法＋ベバシズマブ、（２）ＦＯＬＦＩＲＩ療法＋ベバシズマブ両併用療法の対象となった１５４名の大腸がん患者の治療前の手術検体、あるいはバイオプシー（内視鏡下生検組織）のパラフィン包埋切片から抽出したがん部ゲノムＤＮＡについて、アジレント社のキット「Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｏｌｉｇｏ  ＣＧＨ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ」を用いてＣＧＨ解析を行った。なお、各患者の観察期間は１６００日である。【００４５】
ヒト染色体上の特定領域のコピー数の増加のカットオフ値をｌｏｇ２比＞０．２５に設定し、もとの約１．２倍以上、つまり２．４コピー以上に増幅した領域を探した。すると、７番、８番、１３番、２０番染色体に増幅をもつ症例が集中していた。３０症例以上が増幅を示す領域を表１に示す。【００４６】
【表１】
2017051542.tif 000002
【００４７】
表１では、「Ｃｈｒ」は染色体番号、「ｌｏｃｕｓ」は遺伝子座を表す。これらの各領域についてコピー数の増加ありの症例（患者）、なしの症例（患者）の２群間でＰＦＳ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ：無増悪生存期間）およびＯＳ（Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ：全生存期間）のｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を行った。その結果、いずれの領域もＰＦＳに有意差を認めなかった。しかし、８番染色体を除くすべての領域でＯＳに有意差を認めた（ｐ＜０．０５）。このようなＯＳに有意差のあるヒト染色体上の特定領域は予後規定因子を含む可能性が示唆される。表１では、ＯＳに有意差のあるヒト染色体上の特定領域にアンダーラインを付した。【００４８】
図２は７番、８番、１３番、２０番染色体で増幅領域を示したものである。矢印の部分は増幅を示した領域を示しており、実際に増幅領域はこの部分を中心にしてある程度の幅をもつ。なお、７番、１３番、２０番の長腕の領域番号は引き出し線で示した。【００４９】
このうち７番染色体長腕３４（７ｑ３４）の領域における結果（生存率曲線）を図３に示す。図３（ａ）は、ＰＦＳの結果であり、図３（ｂ）はＯＳの結果である。図３（ａ）、（ｂ）共に、横軸は観察期間（日：目盛りは０日から１６００日）であり、縦軸は生存率（無単位：目盛りは０から１）である。また、四角印はこれらの領域で増幅あり（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ＋）であり、菱形印はこれらの領域で増幅無し（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−）である。この領域に増幅のある患者（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ＋）の方が増幅のない患者（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−）よりＯＳで有意に予後良好を示した。【００５０】
図４は７番染色体長腕にある計４個の増幅領域について示したものである。図４（ａ）は７ｑ１１．２１、図４（ｂ）は７ｑ１１．２２−２３、図４（ｃ）は７ｑ３４、図４（ｄ）は７ｑ３６．２の場合を示す。何れのグラフも横軸は観察期間（日：目盛りは０日から１６００日）であり、縦軸は生存率（無単位：目盛りは０から１）である。また、四角印はこれらの領域で増幅あり（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ＋）であり、菱形印はこれらの領域で増幅無し（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−）である。いずれも増幅のある患者の方が増幅のない患者と比べてＯＳで有意に予後良好であった。また、これらの領域は同一染色体の同じアーム（長腕）にあることから、増幅あり、なしのいずれかに割り当てられた患者の組み合わせが互いに近いので、似た曲線を示す。【００５１】
図５に１３番、図６に２０番染色体のＯＳの結果（生存率曲線）を示す。図５（ａ）は、１３ｑ１２．２、図５（ｂ）は１３ｑ１４．１１、図５（ｃ）は１３ｑ２２．１、図５（ｄ）は１３ｑ３２．２−ｑ３２．３、図５（ｅ）は１３ｑ３４の増幅領域を示す。また図６（ａ）は２０ｑ１２、図６（ｂ）は２０ｑ１３．１３、図６（ｃ）は２０ｑ１３．２、図６（ｄ）は２０ｑ１３．３の増幅領域を示す。【００５２】
何れのグラフも横軸は観察期間（日：目盛りは０日から１６００日）であり、縦軸は生存率（無単位：目盛りは０から１）である。また、四角印はこれらの領域で増幅あり（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ＋）であり、菱形印はこれらの領域で増幅無し（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−）である。これらの染色体における増幅領域も、いずれも増幅のある患者が予後良好で、さらに同じ染色体アーム上、つまり１３番長腕、２０番長腕においても類似した生存率曲線を示した。【００５３】
次にＥＴＳ（ｅａｒｌｙ  ｔｕｍｏｒ  ｓｈｒｉｎｋａｇｅ＝早期における腫瘍の縮み具合）の影響を検討した。登録時から８週時点における腫瘍の大きさ、つまり元の大きさと比較したパーセンテージについて、増幅ありの症例、なしの症例の２群間における平均値の差を各染色体領域で検定（ｔ−ｔｅｓｔ）した。結果を表２に示す。表２では、ＥＳＴの検定結果が５％未満になったヒト染色体上の特定領域にアンダーラインを付した。また、ＯＳに有意差のあるものにもアンダーラインを付した。ＥＴＳの結果を図７に示す。【００５４】
【表２】
2017051542.tif 000003
【００５５】
図７は、７番（図７（ａ））、１３番（図７（ｂ））、２０番（図７（ｃ））の各染色体におけるＥＴＳの結果を示す。それぞれ横軸方向には各染色体の増幅の有無（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎの±）およびＥＴＳに対するｐ値を示す。縦軸には腫瘍の登録時と比べた大きさの割合（％）を示す。なおｐ値が５％未満のものはｐ値の下に下線を引いてある。【００５６】
図７（ａ）に示すように７番染色体長腕では１か所（ｑ３４）でＥＴＳに有意差があった。また図７（ｂ）に示すように１３番長腕では５か所（ｑ１２．２、ｑ１４．１１、ｑ２２．１、ｑ３２．２−ｑ３２．３、ｑ３４）すべて、図７（ｃ）に示すように２０番では長腕にある４か所（ｑ１２、ｑ１３．１３、ｑ１３．２、ｑ１３．３）でＥＴＳに有意差があった（短腕３か所にはなかった）。つまり、全部で１０か所の領域でＥＴＳに有意差があった。ここで重要なのは、ヒト染色体上の特定領域のコピー数に増幅ありの症例で腫瘍の有意な縮小がみられたことである。これは増幅ありの症例でＯＳの予後が良かった結果（図３から図６の結果）と矛盾しない結果といえる。【００５７】
したがって、ＯＳのみならずＥＴＳでも有意差をみとめたこれら計１０か所の染色体領域は、多剤併用化学療法（１）ＦＯＬＦＯＸ療法＋ベバシズマブあるいは（２）ＦＯＬＦＩＲＩ療法＋ベバシズマブの効果予測因子を含む可能性が考えられる。【００５８】
すなわち、７番、１３番、２０番の上記１０箇所のうち、少なくとも１箇所の染色体領域にコピー数の増加が認められれば、ＦＯＬＦＯＸ療法若しくはＦＯＬＦＩＲＩ療法を行うことが患者に有利に働くことが分かる。つまり、ヒト染色体上の特定領域のコピー数の増加が、ＦＯＬＦＯＸ療法若しくはＦＯＬＦＩＲＩ療法を行うことが有利であることを示すマーカーとして利用できる。また、この時コピー数の増加とは、少なくとも正常組織の２．４コピー以上に増幅していれば足りる。【００５９】
以下、この（１）および（２）の２種の併用療法間で治療効果に差を示す領域の有無についての結果を示す。【００６０】
図８から図１２はＯＳ、ＥＴＳ両方に有意差を認めた１０個の領域（７ｑ３４、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１、１３ｑ２２．１、１３ｑ３２．２−ｑ３２．３、１３ｑ３４、２０ｑ１２、２０ｑ１３．１３、２０ｑ１３．２、２０ｑ１３．３）について、（１）ＦＯＬＦＯＸ療法＋ベバシズマブのＦＯＬＦＯＸ群７５例、（２）ＦＯＬＦＩＲＩ療法＋ベバシズマブのＦＯＬＦＩＲＩ群７９例に分けて、それぞれ増幅有りの症例、無しの症例間におけるＯＳを（ｌｏｇ  ｒａｎｋ）検定して、計４群で比較した結果（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒ曲線）である。図８から図１２において、ｐ値が５％（０．０５）未満になったものは下線を引いた。【００６１】
図８では、横軸が観察期間（日：目盛りは０日から１６００日）であり、縦軸は生存率（無単位０から１）である。「Ｘ＋」はＦＯＬＦＯＸ療法＋ベバシズマブでヒト染色体上の特定領域のコピー数の増幅があったもの、「Ｘ−」はＦＯＬＦＯＸ療法＋ベバシズマブで増幅がなかったものである。「Ｒ＋」はＦＯＬＦＩＲＩ療法＋ベバシズマブで増幅があったもの、「Ｒ−」はＦＯＬＦＩＲＩ療法＋ベバシズマブで増幅がなかったものである。
以後図９から図１２も同様である。【００６２】
図８を参照して、７番染色体ｑ３４では、ＦＯＬＦＩＲＩ群（Ｒ＋とＲ−）の方がＦＯＬＦＯＸ群（Ｘ＋とＸ−）よりも増幅有り、なしの症例間における効果の差が大きいことがわかる。Ｐ値でもＦＯＬＦＩＲＩ療法の場合０．０１２８となり、Ｒ＋とＲ−の間で有意差を示している（ｐ＝０．０１２８）。したがって、この領域にはｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎには影響しないが、ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎの感受性をあげる遺伝子を含む可能性がある。【００６３】
この領域（７ｑ３４）にコピー数の増幅を認める症例（３５例）に共通の（７ｑ３４に含まれる増幅した）遺伝子は、ＨＩＰＫ２，ＴＢＸＡＳ１，ＰＡＲＰ１２，ＪＨＤＭ１Ｄ，ＬＯＣ１００１３４２２９，ＳＬＣ３７Ａ３，ＲＡＢ１９，ＭＫＲＮ１である（後述の表３参照）。【００６４】
７ｑ３４の増幅の有無によりＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法のいずれかを選択することができるが、７ｑ３４に含まれる上記遺伝子のコピー数を測定することによってもＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法のいずれかを選択することができる可能性がある。【００６５】
図９および図１０には１３番染色体での結果を示す。図９および図１０で示されるように１３番染色体も同様に、ＦＯＬＦＩＲＩ群の方が増幅有り無しの差が大きかった。しかも増幅ありの場合、ＦＯＬＦＩＲＩ群がＦＯＬＦＯＸ群より感受性が高い傾向がみられる（ｐ＝０．２前後）。したがって、この領域にもｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎには影響しないが、ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎの感受性をあげる遺伝子を含む可能性がある。【００６６】
特に１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１、１３ｑ２２．１の３領域でｉｒｉｎｏｔｅｃａｎとｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎの差が顕著に示された。【００６７】
１３ｑ１２．２領域にコピー数の増幅を認める症例（７４例）に共通の（１３ｑ１２．２に含まれる増幅した）遺伝子は、ＵＳＰ１２、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２１Ｐ２８、ＳＮＯＲＤ１０２、ＳＮＯＲＡ２７、ＲＡＳＬ１１Ａ、ＧＴＦ３Ａ、ＭＴＩＦ３、ＬＮＸ２、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＧＳＸ１、ＰＤＸ１、ＡＴＰ５ＥＰ２、ＣＤＸ２、ＰＲＨＯＸＮＢ、ＦＬＴ３、ＬＯＣ１００２８８７３０、ＰＡＮ３、ＦＬＴ１、ＰＯＭＰ、ＳＬＣ４６Ａ３の２１遺伝子である（後述の表３参照）。【００６８】
また、１３ｑ１４．１１領域にコピー数の増幅を認める症例（６４例）に共通の（１３ｑ１４．１１に含まれる増幅した）遺伝子は、ＬＯＣ６４６９８２、ＦＯＸＯ１、ＭＩＲ３２０Ｄ１、ＭＲＰＳ３１、ＳＬＣ２５Ａ１５、ＳＵＧＴ１Ｌ１、ＭＩＲ６２１、ＥＬＦ１、ＷＢＰ４、ＫＢＴＢＤ６、ＫＢＴＢＤ７、ＭＴＲＦ１、ＮＡＡ１６、ＯＲ７Ｅ３７Ｐ、Ｃ１３ｏｒｆ１５、ＫＩＡＡ０５６４、ＤＧＫＨ、ＡＫＡＰ１１、ＴＮＦＳＦ１１、Ｃ１３ｏｒｆ３０、ＥＰＳＴＩ１、ＤＮＡＪＣ１５、ＥＮＯＸ１、ＣＣＤＣ１２２、Ｃ１３ｏｒｆ３１、ＬＯＣ１２１８３８、ＳＥＲＰ２の２７遺伝子である（後述の表３参照）。【００６９】
１３ｑ２２．１領域にコピー数の増幅を認める症例（６７例）に共通の（１３ｑ２２．１に含まれる増幅した）遺伝子はＰＩＦＢ１、ＫＬＦ５の２遺伝子である（後述の表３参照）。【００７０】
１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１、１３ｑ２２．１のコピー数の増幅の有無によりＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法のいずれかを選択することができるが、これら３領域に含まれる上記遺伝子のコピー数を測定することによってもＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法のいずれかを選択することができる可能性がある。【００７１】
図１１および図１２には、２０番染色体での結果を示す。図１１および図１２に示すように２０番染色体でも似た傾向はあるが、ＦＯＬＦＯＸ群も増幅あるなしの間で効果の異なる傾向が出ており（Ｘ＋ｖｓ．Ｘ−；ｐ＝０．０６−０．２）、これら４領域にはｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ、ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎのいずれかの感受性に特異的に影響を与える遺伝子を含む可能性は低い。【００７２】
以上より、両併用療法の効果を差別化するバイオマーカーとして７ｑ３４、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１、１３ｑ２２．１の４領域が挙げられ、表３に示すこれら４領域の増幅領域内に含まれる遺伝子もバイオマーカー候補となる可能性がある。【００７３】
【表３】
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【００７４】
大腸がん細胞株をもちいて表３に示すこれらの候補遺伝子の大量発現、あるいはｓｉＲＮＡによるノックダウンを行い、ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎおよびｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎの感受性の変化を測定すれば、効果予測因子（遺伝子）が見つかることが期待され、表３に示す遺伝子のコピー数（発現量）測定によって、個々の大腸癌の患者でｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂの併用薬としてどちらの療法が有利か予測可能となる。【００７５】
また、効果予測因子（遺伝子）を特定しなくても、７ｑ３４、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１、１３ｑ２２．１の４箇所のうち、少なくとも１つの領域において、コピー数の増幅があれば、ＦＯＬＦＩＲＩ療法を行うことがその患者にとって、治療効果の上がる療法であると予見することができる。【００７６】
特に１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１、１３ｑ２２．１の３領域は、ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎとｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎの差が顕著に示された。したがって、これらの３領域の少なくとも１つの領域のコピー数の増加を調べることで、高い確度でＦＯＬＦＩＲＩ療法を行うことがその患者にとって有利となるということが予見できる。【００７７】
また、ＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法との相違点は、オキサリプラチンとイリノテカンの違いであるので、７ｑ３４、１３ｑ１２．２、１３ｑ１４．１１、１３ｑ２２．１の４箇所のいずれかの領域のコピー数の増幅は、イリノテカンの治療効果を予見するマーカーとしても利用することができる。【００７８】
なお、ここで、コピー数の増加とは、少なくとも正常組織の２．４コピー以上に増幅していれば足りる。【００７９】
（実施例２）
次に実施例１でＷＪＯＧ４４０７ＧＲＴに同意を得られた患者の観察期間７０か月までをまとめた結果を示す。実施例１の場合より観察期間が長いので、より確度の高い結果が得られた。【００８０】
実施例１同様に、ヒト染色体上の特定領域のコピー数の増幅のカットオフ値をｌｏｇ２比＞０．２５に設定し、もとの約１．２倍以上、つまり２．４コピー以上に増幅した領域を探した。すると、７番、８番長腕、１３番、２０番染色体に増幅をもつ症例が集中していた。７番、８番、１３番、２０番染色体における増幅領域は図２に示した通りである。【００８１】
染色体バンドで区切ったこれらの各染色体領域における全患者（１５４名）、ＦＯＬＦＯＸ療法群（７５名）、ＦＯＬＦＩＲＩ療法群（７９名）のコピー数増加（ＣＮＧ：Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｇａｉｎ）あり、なし間のＯＳ、ＰＦＳにおける差（ｐ値）およびＣＮＧあり（＋）、なし（−）の２群におけるＦＯＬＦＯＸ療法群、ＦＯＬＦＩＲＩ療法群間のＯＳ、ＰＦＳにおける差（ｐ値）を表にしたものを、図１３（７番）、図１４（８番）、図１５（１３番、２０番）に示す。【００８２】
これらの各領域について全患者（１５４名）のうち、ヒト染色体上の特定領域のコピー数の増幅ありの症例（患者）、なしの症例（患者）の２群間でＰＦＳ（無増悪生存期間）およびＯＳ（全生存期間）のｌｏｇ−ｒａｎｋ検定を行うと、いずれの領域もＰＦＳに有意差を認めなかった。しかし、７ｑ、１３ｑ、２０番染色体の多くの領域でＯＳに有意差を認めた（図１３、１４、１５の「ｔｏｔａｌ（１５４）欄の「ＯＳ」欄参照）。つまり、ｐ値が０．０５より小さくなった（ｐ＜０．０５）。このようなＯＳに有意差のある遺伝子増幅領域は予後規定因子を含む可能性が示唆される。【００８３】
図１３を参照すると、７番染色体短腕７ｐのほとんどの領域におけるＣＮＧ（−）群で、ＰＦＳに準有意な差（ｐ＜０．１）が見られた。なかでも最もｐ値の小さい７ｐ１５．３の領域におけるＰＦＳのカプラン・マイヤー曲線を図１６に示す。【００８４】
図１６（ａ）は、ＦＯＬＦＯＸ療法に関して、増加あり（ＣＮＧ（＋））、なし（ＣＮＧ（−））についてのグラフである。図１６（ｂ）はＦＯＬＦＩＲＩ療法関して増加あり（ＣＮＧ（＋））、なし（ＣＮＧ（−））についてのグラフである。図１６（ｃ）は増加あり（ＣＮＧ（＋）に関して、ＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法についてのグラフである。また、図１６（ｄ）は増加なし（ＣＮＧ（−））に関して、ＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法についてのグラフである。【００８５】
全てのグラフに関して、横軸は観測期間（「Ｔｉｍｅ（ｍｏｎｔｈｓ）」と記載した。）であり、縦軸はＰＦＳについての生存確率（「ＰＦＳ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ」と記載した。）である。なお、各グラフ横軸は０から７０（か月）、縦軸は０から１までの目盛りが記載されている。【００８６】
図１６を参照すると、図１６（ｄ）においてｐ値が０．０５９と準有意差が見られた。すなわち、この領域に遺伝子の増幅のない患者では、ＦＯＬＦＯＸ療法よりＦＯＬＦＩＲＩ療法の方が高い治療効果を示したといえる。【００８７】
次に図１４を参照する。８番染色体長腕２４．１から２４．２（８ｑ２４．１−ｑ２４．２）にかけて、ＣＮＧ（＋）群におけるＰＦＳに有意差（ｐ＝０．０３７）または、準有意差（ｐ＝０．０５３）が見られた。８ｑ２４．１におけるＯＳのカプラン・マイヤー曲線を図１７に、ＰＦＳを図１８にそれぞれ示す。【００８８】
各図において、横軸が観察期間（Ｔｉｍｅ（ｍｏｎｔｈｓ）」と記載）であり、縦軸が生存確率（「ＯＳ若しくはＰＦＳ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ」と記載）であるのは図１６の場合と同じである。また、各図において、（ａ）は、ＦＯＬＦＯＸ療法に関して、増加あり（ＣＮＧ（＋））、なし（ＣＮＧ（−））についてのグラフであり、（ｂ）はＦＯＬＦＩＲＩ療法関して増加あり（ＣＮＧ（＋））、なし（ＣＮＧ（−））についてのグラフであり、（ｃ）は増加あり（ＣＮＧ（＋）に関して、ＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法についてのグラフであり、また（ｄ）は増加なし（ＣＮＧ（−））に関して、ＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法についてのグラフであるのも、図１６と同じである。なお、各グラフ横軸は０から７０（か月）、縦軸は０から１までの目盛りが記載されている。【００８９】
図１７（ａ）、図１７（ｂ）を参照して、ＦＯＬＦＯＸ療法群ではＣＮＧ（−）、ＦＯＬＦＩＲＩ療法群ではＣＮＧ（＋）でＯＳが有意に長かった（いずれのｐ値も０．０５より小さかった。）。さらに、ＣＮＧ（＋）群（図１７（ｃ）参照）では、ＦＯＬＦＩＲＩ療法群がＦＯＬＦＯＸ療法群よりも大きく予後良好であった（ｐ＝０．００４）。【００９０】
図１８を参照する。図１７の結果を反映して、ＰＦＳにおいてもＣＮＧ（＋）群（図１８（ｃ）参照）ではＦＯＬＦＩＲＩ療法群の方がＦＯＬＦＯＸ療法群よりも有意に治療効果が高かった（ｐ＝０．０３７）。【００９１】
７ｐ１５．３および８ｑ２４．１におけるＣＮＧのステータスに基づいてグループ分けした４群におけるＰＦＳおよびＯＳのカプラン・マイヤー曲線を図１９、図２０に示す。図１９（ａ）、図１９（ｂ）は、７ｐ１５．３および８ｑ２４．１のＣＮＧがともに増加あり（ＣＮＧ（＋））の場合である。図１９（ａ）はＰＦＳについて、図１９（ｂ）はＯＳについてのプロットである。【００９２】
図１９（ｃ）、図１９（ｄ）は、７ｐ１５．３のＣＮＧが増加あり（ＣＮＧ（＋））であり、８ｑ２４．１のＣＮＧが増加なし（ＣＮＧ（−））の場合である。図１９（ｃ）はＰＦＳについて、図１９（ｄ）はＯＳについてのプロットである。【００９３】
図２０（ａ）、図２０（ｂ）は、７ｐ１５．３のＣＮＧが増加なし（ＣＮＧ（−））であり、８ｑ２４．１のＣＮＧが増加あり（ＣＮＧ（＋））の場合である。図２０（ａ）はＰＦＳについて、図２０（ｂ）はＯＳについてのプロットである。【００９４】
図２０（ｃ）、図２０（ｄ）は、７ｐ１５．３および８ｑ２４．１のＣＮＧがともに増加なし（ＣＮＧ（−））の場合である。図２０（ｃ）はＰＦＳについて、図２０（ｄ）はＯＳについてのプロットである。【００９５】
また、それぞれのグラフで、横軸は観察期間（Ｔｉｍｅ（ｍｏｎｔｈｓ）」と記載）であり、縦軸は生存確率（「ＯＳ若しくはＰＦＳＰｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ」と記載）である。また、各グラフ横軸は０から７０（か月）、縦軸は０から１までの目盛りが記載されている。【００９６】
７ｐ１５．３でＣＮＧ（−）、８ｑ２４．１でＣＮＧ（＋）の場合（つまりＣＮＧ（−、＋）：図２０（ａ）、（ｂ）参照）、ＦＯＬＦＩＲＩ療法群で大きく治療効果の優位性が示された。【００９７】
ＣＮＧ（＋、＋）（図１９（ａ）、（ｂ））およびＣＮＧ（＋、−）（図１９（ｃ）、（ｄ））の場合は、ＯＳのカプラン・マイヤー曲線（図１９（ｂ）および（ｄ））より、それぞれＦＯＬＦＩＲＩ療法、ＦＯＬＦＯＸ療法の有利性が示唆された。【００９８】
つまり、図１９（ａ）、（ｂ）は、７ｐ１５．３および８ｑ２４．１のそれぞれの領域で共に遺伝子コピーの増加が認められれば、ＦＯＬＦＩＲＩ療法が有利との示唆である。また、図１９（ｃ）、（ｄ）は、７ｐ１５．３で遺伝子の増加があり、８ｑ２４．１で遺伝子の増加がなければ、ＦＯＬＦＯＸ療法が有利との示唆である。【００９９】
再び図１４を参照する。８ｑ２４．１から８ｑ２４．２領域にかけてＣＮＧ増加ありを認める症例のうち、ＮＳＭＭＣＥ２、ＴＲＢＩ、ＦＡＭ８４Ｂ、ＰＯＵ５Ｆ１Ｂ、ＬＯＣ７２７６７７、ＭＹＣ、ＰＶＴ１が最も頻繁にかつ共通してＣＮＧ増加ありを示す（コピー増加が認められる）遺伝子群であった。以上のことより、この領域にＦＯＬＦＩＲＩ療法の効果を引き上げる因子を含む可能性が示唆された。【０１００】
もし、ＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン）療法の感受性を引き上げる遺伝子Ａが見つかれば、個々の進行・転移性結腸直腸癌の患者について、遺伝子Ａのコピー数を測定することにより、増加が認められれば、ＦＯＬＦＩＲＩ療法とベバシズマブの併用治療を積極的に選択することができる。【０１０１】
また、図１３を参照して、７ｐ１５．３を含む７ｐ全領域には、ＦＯＬＦＯＸ療法の効果を引き上げる因子を含む可能性がある。【０１０２】
７番、８番、１３番、２０番以外の染色体増幅領域における全患者（１５４名）、ＦＯＬＦＯＸ療法群（７５名）、ＦＯＬＦＩＲＩ療法群（７９名）のコピー数増加あり、なし間のＯＳ、ＰＦＳにおける差（ｐ値）を図２１に示す。【０１０３】
このうち、特にＰＦＳに低いｐ値（０．１１）が認められた９ｑ３４．３領域のＦＯＬＦＯＸ療法群、ＦＯＬＦＩＲＩ療法群におけるコピー数増加あり、なし間およびＣＮＧあり（＋）、なし（−）の２群におけるＦＯＬＦＯＸ療法群、ＦＯＬＦＩＲＩ療法群間のカプラー・マイヤ曲線を図２２に示す。【０１０４】
図２２（ａ）は、ＦＯＬＦＯＸ療法に関して、増加あり（ＣＮＧ（＋））、なし（ＣＮＧ（−））についてのグラフである。図２２（ｂ）はＦＯＬＦＩＲＩ療法に関して増加あり（ＣＮＧ（＋））、なし（ＣＮＧ（−））についてのグラフである。図２２（ｃ）は増加あり（ＣＮＧ（＋）に関して、ＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法についてのグラフである。また、図２２（ｄ）は増加なし（ＣＮＧ（−））に関して、ＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法についてのグラフである。【０１０５】
全てのグラフに関して、横軸は観察期間（「Ｔｉｍｅ（ｍｏｎｔｈｓ）」と記載）であり、縦軸はＰＦＳの生存確率（「ＰＦＳＰｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ」と記載）である。また、各グラフ横軸は０から７０（か月）、縦軸は０から１までの目盛りが記載されている。【０１０６】
図２２（ｄ）を参照すると、全１５４症例中、この領域にコピー数増加のない１３７例でＦＯＬＦＩＲＩ療法の治療効果が有意に良好であった。【０１０７】
９ｑ３４．３領域にＣＮＧ増加ありを認める患者のうち、最も頻繁に共通してＣＮＧ増加ありを示す遺伝子群はＮＯＴＣＨ１、ＥＧＦＬ７、ＭＩＲ１２６、ＡＧＰＡＴ２、ＦＡＭ６９Ｂ、ＳＮＨＧ７であった。これらの中にＦＯＬＦＯＸ療法の治療効果を上げるか、またはＦＯＬＦＩＲＩ療法の治療効果を下げる因子が含まれる可能性がある。【０１０８】
もしそのような因子Ｂが見つかれば、個々の進行・移転性結腸直腸癌の患者について、遺伝子Ｂのコピー数を測定することで、遺伝子Ｂのコピー数の増加の見られない患者に対して、ベバシズマブの併用療法としてＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン）療法を優先的に選択することができる。もちろん、そのような遺伝子Ｂを特定していなくても、９ｑ３４．３領域のＣＮＧの増加がなければ、ベバシズマブの併用療法としてＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン療法）を優先的に選択することができる。【０１０９】
以上のことより両併用療法の効果を差別化するバイオマーカー候補として、８ｑ２４．１−ｑ２４．２、９ｑ３４．３の２か所の増幅領域内に含まれる遺伝子があげられ、８ｑ２４．１−ｑ２４．２、９ｑ３４．３の２か所の増幅領域のコピー数の増加の有無を調べることで、併用治療の選択をすることができる。【０１１０】
より具体的には、８ｑ２４．１−ｑ２４．２の増幅領域内で遺伝子の増幅がある場合は、ベバシズマブの併用としてＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択するのがよい。なお、８ｑ２４．１−ｑ２４．２の増加領域とは、８ｑ２４．１領域若しくは８ｑ２４．２領域だけで遺伝子のコピー数の増加があった場合を含む。また、９ｑ３４．３増幅領域内で遺伝子の増幅がない場合は、ベバシズマブの併用としてＦＯＬＦＩＲＩ療法を選択するのがよい。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明に係るバイオマーカーは、大腸癌の治療法としてＦＯＬＦＯＸ療法とＦＯＬＦＩＲＩ療法のどちらを選択するかを判断する際に好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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