(57)【要約】本発明は、水性媒体に対するカルシウム塩の分散性や保存安定性が向上し、さらにはカルシウム塩のフィラグリン産生促進作用が高まったカルシウム塩組成物を提供することを目的とする。本発明は、水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩と、アニオン性分散剤とを含む、カルシウム塩組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩と、アニオン性分散剤とを含む、カルシウム塩組成物。
【請求項２】
さらに水性媒体を含む、請求項１記載のカルシウム塩組成物。
【請求項３】
前記カルシウム塩と分散剤との重量比が１：０．５〜１：１００である、請求項１又は２記載のカルシウム塩組成物。
【請求項４】
前記カルシウム塩がカルシウムの有機塩又は無機塩である、請求項１〜３のいずれか１項記載のカルシウム塩組成物。
【請求項５】
前記カルシウムの有機塩が、グリセロリン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クエン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、ミリスチン酸カルシウム、及び５’−リボヌクレオチドカルシウムからなる群から少なくとも一つ選ばれる、請求項４記載のカルシウム塩組成物。
【請求項６】
前記カルシウムの無機塩が、リン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム、ピロリン酸二水素カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸二水素カルシウム、ケイ酸カルシウム、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、硫酸カルシウム、及びアパタイトからなる群から少なくとも一つ選ばれる、請求項４記載のカルシウム塩組成物。
【請求項７】
前記アニオン性分散剤が、アスコルビン酸、トラネキサム酸、水溶性高分子及びリン酸塩誘導体からなる群から少なくとも一つ選ばれる請求項１〜６のいずれか１項記載のカルシウム塩組成物。
【請求項８】
前記水溶性高分子が、アラビアガム、トラガカントガム、ガラクタンガム、グァーガム、カラギーナン、キサンタンガム、脱アシル化ジェランガム、マルトース、トレハロース、キチン、キトサン、カンテン、デンプン、デキストラン、シクロデキストリン、サクシノグルカン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン、ヒアルロン酸及びその塩、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルデンプン、メチルセルロース、プルラン、ペクチン、ニトロセルロース、エチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、セルロース硫酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶性セルロース、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ポリビニルメチルエーテル、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合高分子、アクリル系高分子、ポリエチレンイミン、カチオン化グァーガム、及びカチオン化セルロースからなる群から少なくとも一つ選ばれる、請求項７記載のカルシウム塩組成物。
【請求項９】
前記リン酸塩誘導体が、リン酸塩、リン酸水素塩、ポリリン酸塩、メタリン酸塩、リン酸−Ｌ−アスコルビン酸塩、アデノシン−リン酸塩、ジアルキルリン酸塩、モノアルキルリン酸塩、ジポリオキシエチレンリン酸塩、モノポリオキシエチレンリン酸塩、及びフィチン酸塩からなる群から少なくとも一つ選ばれる、請求項７記載のカルシウム塩組成物。
【請求項１０】
前記アニオン性分散剤を少なくとも２種含む、請求項１〜９のいずれか１項記載のカルシウム塩組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載のカルシウム塩組成物、あるいは水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩を含む、フィラグリン産生促進剤。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項記載のカルシウム塩組成物、あるいは水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩を含む、抗老化剤。
【請求項１３】
乾式粉砕にて粉砕した、水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩を含む、フィラグリン産生促進剤。
【請求項１４】
水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩と、アニオン性分散剤とを、一緒に乾式粉砕したカルシウム塩組成物を含む、フィラグリン産生促進剤。
【請求項１５】
前記カルシウム塩と、水性媒体とを含む、請求項１３に記載のフィラグリン産生促進剤。
【請求項１６】
前記カルシウム塩組成物と、水性媒体とを含む、請求項１４に記載のフィラグリン産生促進剤。
【請求項１７】
水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩を乾式粉砕する工程を含む、フィラグリン産生促進剤の製造方法。
【請求項１８】
前記の乾式粉砕する工程後、さらに水性媒体に分散させる工程を含む、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩と、アニオン性分散剤とを、一緒に乾式粉砕する工程を含む、フィラグリン産生促進剤の製造方法。
【請求項２０】
前記の乾式粉砕する工程後、さらに水性媒体に分散させる工程を含む、請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載のカルシウム塩組成物、あるいは水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩を使用する、フィラグリン産生促進方法。
【請求項２２】
前記カルシウム塩に前記アニオン性分散剤を２種以上混合させることを特徴とする、カルシウム塩の粒子径の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルシウム塩の分散性及び保存安定性に優れたカルシウム塩組成物、ならびにそのフィラグリン産生促進剤及び抗老化剤としての用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の構成成分であるフィラグリンは、皮膚バリア機能に関与し、アレルゲン、毒素、及び感染性生物などの侵入を防ぐという皮膚機能に関わる重要なタンパク質であると考えられ、近年、アトピー性皮膚炎をはじめとするアレルギー疾患の発症リスクと関連することが明らかにされてきている（非特許文献１参照）。
また、天然保湿因子（Natural Moisturizing Factors；ＮＭＦ）の主成分であるアミノ酸やウロカニン酸などは、フィラグリンが角質層内で分解されて産生されるものである。このフィラグリンは、角質層直下の顆粒層に存在する表皮角化細胞でプロフィラグリンとして蓄積され、脱リン酸、加水分解を経てフィラグリンへと分解され、角質層に移行して、角質細胞の内部構築に関与することが知られている（非特許文献２参照）。
これらのことから、表皮角質細胞のフィラグリン産生を高めることは、ヒト皮膚の角質層内の水分環境を本質的に改善し、皮膚の保湿性ホメオスタシスを維持すること、さらにはアトピー疾患等の慢性的な皮膚疾患の改善を促すことが期待される。【０００３】
従来、プロフィラグリン産生促進作用又はフィラグリン産生促進作用を有するものとして、カンゾウ抽出物（特許文献１参照）、米麹の加温加圧処理物（特許文献２参照）、及び医薬スクリーニング化合物（特許文献３参照）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−３６３０５４号公報
【特許文献２】特開２０１４−２４０３６１号公報
【特許文献３】特開２０１４−２２４１０９号公報
【特許文献４】特開２０１２−７７０４４号公報
【特許文献５】特許第３８２７２５９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】京府医大誌、１１９、８７７（２０１０）
【非特許文献２】ファルマシア、５０、９７３（２０１４）
【非特許文献３】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，８１，３３ｓ（１９８３）
【非特許文献４】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１０６，２５４（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、安全性の高い材料の中から抗老化作用や美白作用を有する有効成分を見出し、それを配合した医薬品、医薬部外品、及び化粧品を提供することを目的に鋭意研究を進めてきた。【０００７】
ところで、カルシウムイオンは、濃度依存的にヒト皮膚角化細胞の増殖や分化能を変化させることが知られている（非特許文献３及び非特許文献４参照）。このカルシウムイオンの特異的な作用を利用して、化粧品、医薬品、及び医薬部外品において、ヒト皮膚角化細胞のターンオーバーの改善（特許文献４）、及び表皮角質化促進剤として皮膚バリアの向上（特許文献５）にカルシウム塩を使用することが提案されている。【０００８】
しかしながら、実際に化粧用や医療用にカルシウムイオンの使用を考慮した場合、所定の濃度になるようにカルシウムイオンを適量皮膚に塗布することは、乾燥や液だれの問題から難しい。また、皮脂や汗によるカルシウムイオンの流れ落ちも問題となっている。
さらに、カルシウムイオンは、２価のイオンであるため、化粧品などに配合される増粘剤や有効成分などとキレートを形成し易く、そのため、安定に配合させることが難しい場合もある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意研究の結果、水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩が媒体中で分散していると良好なフィラグリン産生促進作用を発揮すること、また、水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩とアニオン性分散剤とを含むカルシウム塩組成物が、水性媒体に対するカルシウム塩の分散性を向上させ、さらにはそのフィラグリン産生促進作用を高めることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明は、
(1)  水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩と、アニオン性分散剤とを含む、カルシウム塩組成物；
(2)  さらに水性媒体を含む、上記(1)に記載のカルシウム塩組成物；
(3)  前記カルシウム塩と分散剤との重量比が１：０．５〜１：１００である、上記(1)又は(2)記載のカルシウム塩組成物；
(4)  前記カルシウム塩がカルシウムの有機塩又は無機塩である、上記(1)〜(3)のいずれか１項記載のカルシウム塩組成物；
(5)  前記カルシウムの有機塩が、グリセロリン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クエン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、ミリスチン酸カルシウム、及び５’−リボヌクレオチドカルシウムからなる群から少なくとも一つ選ばれる、上記(4)記載のカルシウム塩組成物；
(6)  前記カルシウムの無機塩が、リン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム、ピロリン酸二水素カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸二水素カルシウム、ケイ酸カルシウム、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、硫酸カルシウム、及びアパタイトからなる群から少なくとも一つ選ばれる、上記(4)記載のカルシウム塩組成物；
(7)  前記アニオン性分散剤が、アスコルビン酸、トラネキサム酸、水溶性高分子及びリン酸塩誘導体からなる群から少なくとも一つ選ばれる上記(1)〜(6)のいずれか１項記載のカルシウム塩組成物；
(8)  前記水溶性高分子が、アラビアガム、トラガカントガム、ガラクタンガム、グァーガム、カラギーナン、キサンタンガム、脱アシル化ジェランガム、マルトース、トレハロース、キチン、キトサン、カンテン、デンプン、デキストラン、シクロデキストリン、サクシノグルカン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン、ヒアルロン酸及びその塩、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルデンプン、メチルセルロース、プルラン、ペクチン、ニトロセルロース、エチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、セルロース硫酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶性セルロース、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ポリビニルメチルエーテル、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合高分子、アクリル系高分子、ポリエチレンイミン、カチオン化グァーガム、及びカチオン化セルロースからなる群から少なくとも一つ選ばれる、上記(7)記載のカルシウム塩組成物；
(9)  前記リン酸塩誘導体が、リン酸塩、リン酸水素塩、ポリリン酸塩、メタリン酸塩、リン酸−Ｌ−アスコルビン酸塩、アデノシン−リン酸塩、ジアルキルリン酸塩、モノアルキルリン酸塩、ジポリオキシエチレンリン酸塩、モノポリオキシエチレンリン酸塩、及びフィチン酸塩からなる群から少なくとも一つ選ばれる、上記(7)記載のカルシウム塩組成物；
(10)  前記アニオン性分散剤を少なくとも２種含む、上記(1)〜(9)のいずれか１項記載のカルシウム塩組成物。
(11)  上記(1)〜(10)のいずれか１項記載のカルシウム塩組成物、あるいは水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩を含む、フィラグリン産生促進剤；
(12)  上記(1)〜(10)のいずれか１項記載のカルシウム塩組成物、あるいは水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩を含む、抗老化剤；
(13)  乾式粉砕にて粉砕した、水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩を含む、フィラグリン産生促進剤；
(14)  水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩と、アニオン性分散剤とを、一緒に乾式粉砕したカルシウム塩組成物を含む、フィラグリン産生促進剤；
(15)  前記カルシウム塩と、水性媒体とを含む、上記(13)記載のフィラグリン産生促進剤；
(16)  前記カルシウム塩組成物と、水性媒体とを含む、上記(14)記載のフィラグリン産生促進剤；
(17)  水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩を乾式粉砕する工程を含む、フィラグリン産生促進剤の製造方法；
(18)  前記の乾式粉砕する工程後、さらに水性媒体に分散させる工程を含む、上記(17)記載の製造方法；
(19)  水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩と、アニオン性分散剤とを、一緒に乾式粉砕する工程を含む、フィラグリン産生促進剤の製造方法；
(20)  前記の乾式粉砕する工程後、さらに水性媒体に分散させる工程を含む、上記(19)記載の製造方法；
(21)  上記(1)〜(10)のいずれか１項記載のカルシウム塩組成物、あるいは水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩を使用する、フィラグリン産生促進方法；
に関する。
(22)  前記カルシウム塩に前記アニオン性分散剤を２種以上混合させることを特徴とする、カルシウム塩の粒子径の制御方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩は、フィラグリンの産生を促進させ、優れた抗老化作用と安全性を併せ持つ抗老化剤としての効果を奏することができる。
また、本発明によれば、媒体に対するカルシウム塩の分散性や保存安定性に優れたカルシウム塩組成物を得ることができる。かかるカルシウム塩組成物は、カルシウム塩のフィラグリン産生促進作用を向上させて、優れた抗老化作用と安全性を併せ持つ抗老化剤としての効果を奏することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例６のＤＬＳの散乱強度別粒子径分布を示す図である。
【図２】実施例６のＤＬＳの個数別粒子径分布を示す図である。
【図３】比較試験例７の蛍光顕微鏡画像を示す図である。
【図４】比較試験例８の蛍光顕微鏡画像を示す図である。
【図５】比較試験例９の蛍光顕微鏡画像を示す図である。
【図６】比較試験例１０の蛍光顕微鏡画像を示す図である。
【図７】試験例２０の蛍光顕微鏡画像を示す図である。
【図８】試験例２１ならびに比較試験例１１及び１２のドットブロットの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩とは、当該水性媒体に対する２０℃の溶解度が、塩化カルシウムよりも低いカルシウム塩をいう。
ここで、水性媒体に対する２０℃の溶解度とは、化学便覧（改定ＩＩＩ版、丸善株式会社、１９９１年、東京）に規定されるように、カルシウム塩を水性媒体に２０℃で飽和させ、得られた飽和溶液１００ｇ中に溶解しているカルシウム塩の量（ｇ）を意味する。例えば、水性媒体が水である場合、２０℃での純水中の塩化カルシウムの溶解度は４２．７であるので、水に対して不溶又は難溶なカルシウム塩とは、水に対する２０℃の溶解度が４２．７未満であるカルシウム塩をいう。
【００１４】
本発明の水性媒体とは、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）若しくは親水性媒体、又はこれらから選択される２以上の媒体の混合物をいう。
また、上記親水性媒体は、医薬品や化粧品の分野で慣用されるものであれば、特に制限されず、水との相溶性に優れる常温で液状のものであれば特に制限されない。例えば、アルコールが好ましく、具体的には、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、及びｎ−ブタノールなどの１価低級アルコール；１，３−ブチレングリコール、エチレングリコール、及びプロピレングリコールなどの２価アルコール；ポリエチレングリコール、ジプロピレングリコール、及びポリプロピレングリコールなどのポリアルキレングリコール；グリセリン、ジグリセリン、トリメチロールプロパン、ペンタエリスリトール、及びソルビトールなどの多価アルコールが例示される。これらの中でも、エタノール又はグリセリンが特に好ましい。これらは、単独で使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
上記水性媒体の中で、カルシウム塩が良好に分散することから、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水及びエタノールの混合物並びに水及びグリセリンの混合物が好ましく、水並びに水及びグリセリンの混合物がより好ましく、水が最も好ましい。
【００１５】
前記水性媒体は、水又はＰＢＳと親水性媒体との混合物である場合、例えば、親水性媒体１００重量部に対して、水又はＰＢＳを０．５重量部〜１００重量部、好ましくは３０重量部〜１００重量部、より好ましくは８０重量部〜１００重量部含有する。
【００１６】
本発明において、水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩は、カルシウム塩の水などの媒体中での分散性や保存安定性が良好になり、またフィラグリンの産生を促進させる点で、乾式粉砕にて粉砕されるのが好ましい。
【００１７】
本発明において、水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩は、水などの媒体中での分散性や保存安定性が良好になり、またフィラグリンの産生を促進させる点で、数十ｎｍから数百ｎｍの粒子径を有するのが好ましく、例えば、ＤＬＳによって測定される散乱強度平均粒子径が５０ｎｍ〜３００ｎｍ、特に１００ｎｍ〜３００ｎｍであるのが好ましい。
また、前記水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩は、水などの媒体中での分散性や保存安定性が良好になり、またフィラグリンの産生を促進させる点で、水などの媒体中で負に帯電した粒子として分散しているのが好ましく、例えば、ゼータ電位が−６０ｍＶ〜−３０ｍＶであるのが好ましい。
【００１８】
本発明のカルシウム塩組成物は、前記水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩及びアニオン性分散剤を含む。
本発明のフィラグリン産生促進剤は、前記水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩を含み、好ましくはさらにアニオン性分散剤を含む。
【００１９】
本発明のカルシウム塩組成物は、前記カルシウム塩及びアニオン性分散剤に加えて、さらに前記で定義された水性媒体を含んでもよい。この水性媒体の種類及び量は、得られたカルシウム塩組成物中でカルシウム塩が分散している限り、特に制限されない。
【００２０】
本発明のカルシウム塩組成物中におけるカルシウム塩と分散剤との重量比は、媒体に対してカルシウム塩が分散可能な条件であれ特に制限されないが、好ましくは１：０．５〜１：１００、より好ましくは１：４〜１：１００又は１：１〜１：２０、さらに好ましくは１：５〜１：２０である。特に、カルシウム塩組成物中におけるカルシウム塩の粒子径が小さくなることから、分散剤の量を増やすことが好ましいが、最大量は、重量比でカルシウム塩１に対し分散剤が例えば１００である。
【００２１】
本発明のカルシウム塩は、水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩であれば特に制限されず、例えば、カルシウムの有機塩又は無機塩のいずれであってもよい。
上記のカルシウムの有機塩として、グリセロリン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クエン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、ミリスチン酸カルシウム、及び５’−リボヌクレオチドカルシウムが例示され、グリセロリン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム、５’−リボヌクレオチドカルシウムが好ましく、グリセロリン酸カルシウムがより好ましい。
また、上記カルシウムの無機塩として、リン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム、ピロリン酸二水素カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸二水素カルシウム、ケイ酸カルシウム、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、硫酸カルシウム、及びアパタイトが例示され、リン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸二水素カルシウム、アパタイト、ケイ酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウムが好ましく、リン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸二水素カルシウム、アパタイト、ケイ酸カルシウム、炭酸カルシウムがより好ましく、リン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム、リン酸三カルシウム、リン酸二水素カルシウム、アパタイトがさらにより好ましく、リン酸三カルシウムが最も好ましい。
【００２２】
本発明のアニオン性分散剤は、アスコルビン酸（例えば、Ｌ−アスコルビン酸）、トラネキサム酸、水溶性高分子、及びリン酸塩誘導体が例示され、水溶性高分子及びリン酸塩誘導体が好ましい。
【００２３】
前記水溶性高分子として、アラビアガム、トラガカントガム、ガラクタンガム、グァーガム、カラギーナン（例えば、κ−カラギーナン）、キサンタンガム、脱アシル化ジェランガム、マルトース、トレハロース、キチン、キトサン、カンテン、デンプン、デキストラン、シクロデキストリン（例えば、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、及び分枝シクロデキストリン）、サクシノグルカン、コラーゲン、カゼイン、アルブミン、ゼラチン、ヒアルロン酸及びその塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム）、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルデンプン、メチルセルロース、プルラン、ペクチン、ニトロセルロース、エチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、セルロース硫酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶性セルロース、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ポリビニルメチルエーテル、カルボキシビニルポリマー、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合高分子、アクリル系高分子（例えば、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチルアクリレート、ポリアクリアミド）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、カチオン化グァーガム、及びカチオン化セルロースが例示され、脱アシル化ジェランガム、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、コラーゲン、ヒアルロン酸ナトリウム、κ−カラギーナン、マルトース、トレハロースが好ましく、脱アシル化ジェランガム、コラーゲン、ヒアルロン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、κ−カラギーナンがより好ましく、コラーゲン、ヒアルロン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウムが特に好ましい。
【００２４】
前記リン酸塩誘導体として、リン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム）、リン酸水素塩（例えば、リン酸水素ナトリウム）、ポリリン酸塩（例えば、ポリリン酸ナトリウム）、メタリン酸塩、リン酸−Ｌ−アスコルビン酸塩（例えば、リン酸−Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム及びリン酸−Ｌ−アスコルビン酸マグネシウム）、アデノシン−リン酸塩（例えば、アデノシン−リン酸ナトリウム）、ジアルキルリン酸塩、モノアルキルリン酸塩、ジポリオキシエチレンリン酸塩、モノポリオキシエチレンリン酸塩、及びフィチン酸塩（例えば、フィチン酸ナトリウム）が例示され、アデノシン−リン酸ナトリウム、フィチン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、リン酸−Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、リン酸−Ｌ−アスコルビン酸マグネシウムが好ましく、ポリリン酸ナトリウム、リン酸−Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、リン酸−Ｌ−アスコルビン酸マグネシウムがより好ましく、ポリリン酸ナトリウムが最も好ましい。
【００２５】
本発明において、アニオン性分散剤は単独で使用しても、２種類以上を併用してもよいが、粒子径が１００ｎｍ以下のカルシウム塩粒子が得られる点から、２種類以上、特に２種類のアニオン性分散剤を併用するのが好ましい。例えば、リン酸塩誘導体の中から２種類の誘導体を併用するのが好ましく、ポリリン酸ナトリウムとリン酸−Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムの併用が特に好ましい。
【００２６】
上記の中でも、カルシウム塩と分散剤との特に好ましい組み合わせは、実施例に記載のカルシウム塩と分散剤の組み合わせである。例えば、表１に示した組み合わせである。
【００２７】
【表１】
2016199927.tif 000002
【００２８】
本発明のカルシウム塩組成物は、慣用の方法で製造され得るが、カルシウム塩の水などの媒体中での分散性や保存安定性が良好になり、またフィラグリンの産生を促進させる点で、カルシウム塩を乾式粉砕にて粉砕してから製造され、さらに好ましくは、カルシウム塩を乾式粉砕にて粉砕してから、アニオン性分散剤と混合して製造され、最も好ましくは、カルシウム塩及びアニオン性分散剤を、一緒に乾式粉砕にて粉砕して製造される。
また、カルシウム塩及びアニオン性分散剤を、乾式粉砕にて粉砕してから、さらに水性媒体に分散させて、本発明のカルシウム塩組成物を得てもよい。
【００２９】
前記の乾式粉砕の条件としては、カルシウム塩及びアニオン性分散剤を小片に粉砕できる条件であれば特に制限されないが、乳鉢、ボールミル、ホモジナイザーなどの粉砕機を用いることが望ましい。また、粉砕時間や処理圧などは、粉砕されるカルシウム塩及び分散剤の硬さに応じて、適度調整される。
得られる組成物中のカルシウム塩の分散性や保存安定性が良好になり、またフィラグリンの産生を促進させる点で、ボールミル（例えば、Ｒｅｔｓｃｈ製、ＭＭ２００）を用いて、周波数２５Ｈｚ、処理時間９０分で、又はボールミル（例えば、Ｆｒｉｔｓｃｈ製、遊星ボールミルＰ−６）を用いて、５００ｒｐｍで、乾式粉砕を行うのが好ましい。
【００３０】
本発明において、前記カルシウム塩に前記アニオン性分散剤を２種以上混合させることで、前記カルシウム塩の粒子径を制御することができる。この混合は慣用の手法で行い得るが、前述の乾式粉砕で行うのが好ましい。
例えば、上記方法により、粒子径が１００ｎｍ以下のカルシウム塩粒子が得られる。
【００３１】
本発明のカルシウム塩組成物あるいは水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩は、皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、及び蕁麻疹などのアレルギー性皮膚疾患の予防及び／又は治療用医薬、フィラグリン産生促進剤、抗老化剤、又は美白剤などとして、例えば、医薬品、医薬部外品、又は化粧品として使用することができる。
【００３２】
本発明のカルシウム塩組成物は、本発明の効果を損なわない限り、任意の活性成分、例えば、他の抗老化作用や美白作用を有する成分を添加してもよい。
【００３３】
本発明のカルシウム塩組成物は、本発明の効果を損なわない限り、賦形剤、甘味料、酸味料、増粘剤、香料、色素、乳化剤及びその他、医薬品、医薬部外品、化粧品に通常配合され得る成分を含有することができる。例えば、そのような成分として、グリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコール、流動パラフィン、スクワラン、高級脂肪酸、高級アルコールなどの油分、クエン酸、乳酸などの有機酸類、苛性ソーダ、トリエタノールアミンなどのアルカリ類、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、粉末、顔料、染料、防腐防黴剤、樹脂、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、キレート剤、増粘剤、保湿剤、アルコール、水、香料などが例示される。
【００３４】
本発明では、皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、及び蕁麻疹などのアレルギー性皮膚疾患などの予防及び／又は治療のため、抗老化又は美白のため、あるいはフィラグリン産生促進のため、患者などの対象者に、本発明のカルシウム塩組成物あるいは水性媒体に対して不溶又は難溶なカルシウム塩を適切な有効量で投与することができる。有効量や摂取期間は、対象者の年齢、症状に応じて任意に定めることができる。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。なお、実施例に用いた装置、細胞、及び培地は以下の通りである。
・ボールミル；Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＭＭ２００
・ボールミル；Ｆｒｉｔｓｃｈ社製、遊星ボールミルＰ−６
・動的光散乱装置（ＤＬＳ）；Ｍａｌｖｅｒｎ社製、ゼータサイザーナノＺＳ
・遠心分離機；ＫＵＢＯＴＡ社製、テーブルトップ遠心機４０００
・オートクレーブ；ＴＯＭＹ社製、ＥＳ−２１５
・インキュベータ；パナソニック社製、ＫＭ−ＣＣ１７ＲＵ２
・蛍光顕微鏡；ＫＥＹＥＮＣＥ社製、ＢＩＯＲＥＶＯ  ＢＺ−９０００
・培地；クラボウ社製、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２
・細胞；クラボウ社製、ＮＨＥＫ（ＡＤ）【００３６】
１．カルシウム塩組成物の調製
(1)  調製例１（分散性試験）
表２に従って各カルシウム塩及び分散剤を秤量し、一緒にボールミル（Ｒｅｔｓｃｈ社製、ＭＭ２００）にて乾式粉砕・混合処理（２５Ｈｚ，９０分間）に付し、実施例１〜３０のカルシウム塩組成物を得た。なお、実施例２７〜３０は分散剤を２種類加えて三成分系とした。【００３７】
【表２】
2016199927.tif 000003
【００３８】
(2)  調製例２（分散性試験、粉砕時間依存性）
リン酸三カルシウム／リン酸―Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム（＝１／９（ｗｔ／ｗｔ））混合粉末（３．０ｇ）を秤量し、ボールミル（Ｆｒｉｔｓｃｈ社製、遊星ボールミルＰ−６）にて乾式粉砕・混合処理（５００ｒｐｍ）に付した。その際、０．５、１．０、３．０、５．０、７．０時間後に粉砕を止め、２００ｍｇずつサンプリングした。【００３９】
(3)  調製例３
分散剤を混合することなく、リン酸三カルシウムのみを５００ｍｇ秤量して、ボールミルにて乾式粉砕・混合処理（２５Ｈｚ，９０分間）に付し、調製例３のカルシウム塩粉末を得た。【００４０】
２．分散試験（Ａ）
(1)  分散試験（水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））
調製例１にて得られたいくつかのカルシウム塩組成物を、それぞれ、カルシウム塩の濃度が１．０ｍｇ／２ｍＬになるように、分散媒〔水又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）〕に分散させ、分散液を調製した。得られた分散液を、その調製から１時間、室温にて静置させ、観察した。沈降物が目視で確認されない分散液を“○”、沈降物が目視で確認された分散液を“×”と評価した。結果を表３に示した。【００４１】
【表３】
2016199927.tif 000004
【００４２】
(2)  粒子径及びゼータ電位測定
調製例１にて得られたいくつかのカルシウム塩組成物を、それぞれ、カルシウム塩の濃度が１．０ｍｇ／２ｍＬになるように水に分散させた。得られた分散液を、ＤＬＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製、ゼータサイザーナノＺＳ）を用いた粒子径及びゼータ電位の測定に付した。良好にフィッティング解析できたものに関しては、その結果を表４に示した。また、実施例６については、そのＤＬＳの散乱強度別粒子径分布及び個数別粒子径分布をそれぞれ図１及び２に示した。これら粒子径及びゼータ電位の結果より、分散液中のカルシウム塩は、数十ｎｍから数百ｎｍの粒子径を有するカルシウム塩微粒子であることが示され、かつゼータ電位の解析から負に帯電した粒子が水中で分散していることが明らかになった。また、実施例１９と２０の比較により、粉砕・混合時における分散剤の量を増やすことにより、カルシウム塩の微粒子の粒子径は小さくなることが示された。さらに、実施例６及び７と２７〜３０の結果を比べると、分散剤単独のものより、二種類の分散剤を混合することによって、カルシウム塩微粒子の粒子径は小さくなることが判明した。
実施例３及び５は、それら自体が多分散な多糖類を分散剤に用いており、本試験における粒子径のフィッティング解析には適していなかった。【００４３】
【表４】
2016199927.tif 000005
【００４４】
(3)  粒子径の粉砕・混合時間依存性
調製例２にてサンプリングしたカルシウム塩組成物を、それぞれ、カルシウム塩の濃度が１．０ｍｇ／２ｍＬになるように水に分散させた。得られた分散液を、ＤＬＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社製、ゼータサイザーナノＺＳ）を用いた粒子径の測定に付した。結果を表５に示した。
粉砕・混合時間が７．０時間までにおいては、粉砕・混合時間が長くなるほど、粒子径が一定値に収束する傾向が見られた。【００４５】
【表５】
2016199927.tif 000006
【００４６】
上記のように、散乱強度平均粒子径が５０ｎｍ〜３００ｎｍであると本発明のカルシウム塩の分散性が良好である。
また、ゼータ電位に関しては、−６０ｍＶ〜−３０ｍＶであると本発明のカルシウム塩の分散性が良好である。【００４７】
表３〜５から、水に不溶又は難溶な種々のカルシウム塩を分散剤と混合させて得られたカルシウム塩組成物の分散性は良好であることが示された。【００４８】
３．分散試験（Ｂ）（分散性：分散方法依存性）
表６に従い、分散剤を９ｍｇ／２ｍＬの濃度で分散媒に溶解させて、水溶液又はＰＢＳ溶液を得た。得られた水溶液又はＰＢＳ溶液に、それぞれ、調製例３のカルシウム塩（リン酸三カルシウム）の粉末を、カルシウム塩の濃度が１ｍｇ／２ｍＬの濃度になるように、分散させて、試験例１〜４の分散液を調製した。
また、表６に従い、リン酸三カルシウム５０ｍｇ及び分散剤４５０ｍｇをそれぞれ秤量し、一緒にボールミルにて乾式粉砕・混合処理（２５Ｈｚ，９０分間）に付し、カルシウム塩組成物を得た。得られたカルシウム塩組成物を、カルシウム塩の濃度が１ｍｇ／２ｍＬになるように、分散媒に分散させて、試験例５〜８の分散液を調製した。
得られた分散液を、その調製から室温にて１時間静置させ、観察した。その結果、カルシウム塩と分散剤とを一緒にボールミルにて乾式粉砕処理した試験例５〜８の方が、リン酸三カルシウムのみをボールミルにて乾式粉砕処理した試験例１〜４と比較して、より分散性に優れていた。【００４９】
【表６】
2016199927.tif 000007
【００５０】
４．分散試験（Ｃ）（水／各種アルコール混合分散媒に対する分散試験）
表７に示す実施例のカルシウム塩組成物を、カルシウム塩の濃度が１．０ｍｇ／２ｍＬになるように、水／各種アルコール混合分散媒に分散させ、分散液を調製した。得られた分散液を、その調製から１時間、室温にて静置させ、観察した。沈降物が目視で確認されない分散液を“○”、沈降物が目視で確認された分散液を“×”と評価した。結果を表７に示した。【００５１】
【表７】
2016199927.tif 000008
【００５２】
５．分散試験（Ｄ）（限外ろ過試験）
実施例７にて得られたカルシウム塩組成物を、２５ｍｇ／５ｍＬになるように水に分散させ、得られた分散液を、限外ろ過フィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  ３Ｋ）を用いて、遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ社製、テーブルトップ遠心機４０００、３０００ｒｐｍ、１時間）により約１ｍＬに濃縮した。得られた上澄みに蒸留水４ｍＬを加えて混液を得、それをろ液と共にＤＬＳ測定に付した。結果を表８に示した。表８から、上澄みにカルシウム塩組成物に由来する微粒子が確認された。これは、カルシウム塩組成物を濃縮、精製すること、また、他の分散媒によって分散媒を置換することも可能であることを意味している。【００５３】
【表８】
2016199927.tif 000009
【００５４】
６．分散試験（Ｅ）（カルシウム塩の濃度依存性）
実施例６及び７にて得られたカルシウム塩組成物を、表９に示した濃度になるように、水に分散させた。得られた分散液を、その調製から１時間、室温にて静置後、観察した。沈降物が目視で確認されない分散液を“○”、沈降物が目視で確認された分散液を“×”と評価した。結果を表９に示した。表９の結果からも、カルシウム塩と分散剤とを一緒にボールミルにて乾式粉砕処理した実施例６及び７のカルシウム塩組成物は、リン酸三カルシウムのみをボールミルにて乾式粉砕処理した試験例２と比較して、高濃度（１．０〜３.０ｍｇ／ｍＬ）にてリン酸三カルシウムをより良好に分散できることが示された。【００５５】
【表９】
2016199927.tif 000010
【００５６】
７．分散試験（Ｆ）（分散液の保存安定性）
実施例３、６及び７にて得られたカルシウム塩組成物を２５ｍｇ／５ｍＬになるように水に分散させ、得られた分散液を４５℃恒温槽における安定性試験に付した。安定性の評価は、目視、及び実施例６、７に関してはＤＬＳを用いて実施した。沈降物が目視では確認されない分散液を“○”、沈降物が目視で確認された分散液を“×”と評価した。結果を表１０に示した。本発明のカルシウム塩分散液は、９週間経過後でも良好な保存安定性を示した。
【表１０】
2016199927.tif 000011
【００５７】
８．フィラグリン産生試験（Ａ）
(1)  カルシウム塩添加培地の調製
各種カルシウム塩をカルシウムイオン濃度換算０．８９Ｍになるように水に分散させた後、得られた分散液をオートクレーブ（１２０℃，２０分間）で滅菌することにより、各種カルシウム塩ストック分散液を調製した。
そして、表１１に従い、各種カルシウム塩ストック水分散液を、所定のカルシウムイオン換算添加濃度になるように、ピペッティングしながら、培地（クラボウ社製、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２）に添加し、カルシウム塩添加培地を調製した。なお、本試験では、ボールミル（２５Ｈｚ，９０分間）にて乾式粉砕・混合処理に付したカルシウム塩を使用した。【００５８】
(2)  フィラグリン産生試験
前記のカルシウム塩添加培地の調製に使用したのと同じ培地を加えた２４ウェル培養プレート上に、ヒト皮膚角化細胞（クラボウ社製，ＮＨＥＫ）を細胞密度が３，８００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように播種した後、３日間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。その後、培地を前記で調製したカルシウム塩添加培地に交換し、一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。
カルシウム塩によるフィラグリン産生の有無は、Anti-Filaggrin/FLG, Rabbit-Poly, Alexa Fluor 488（ＢＩＳ社製、以下「Anti-FLG」とも記載）による蛍光免疫染色法にて調べた。また、比染色としてＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミヂノ−２−フェニルインドール二塩酸、Ｗａｋｏ社製）を用いて、核を染色した。
すなわち、上述の一晩インキュベートした細胞を、ＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド溶液（Ｗａｋｏ社製）で固定化した。固定化した細胞を、０．１％トリトン−Ｘ１００にて透過処理し、次いで、Anti-FLGのＰＢＳ溶液（×５０）にて一晩４℃にてインキュベートした後、１００ｎＭ  ＤＡＰＩのＰＢＳ溶液にて染色した。なお、細胞は各操作後にＰＢＳにて洗浄された。
フィラグリンの相対的な産生量を求めるために、上述の染色した細胞の蛍光顕微鏡画像を撮影した。その画像の輝度をPhotoshop CS3を用いて数値化し、得られた数値を細胞数で割ることにより規格化した（輝度／細胞数；Ｌｃｅｌｌ）。また、カルシウム塩水分散液を培地に添加していない比較試験例２のＬｃｅｌｌと比較した、各種カルシウム塩添加による輝度の増加率も算出した。結果を表１１に示した。【００５９】
【表１１】
2016199927.tif 000012
【００６０】
表１１に示すとおり、いずれのカルシウム塩の添加によっても、Anti-FLGに由来する蛍光の輝度の増加は確認された。蛍光免疫染色法による蛍光顕微鏡の輝度は相対的なフィラグリンの産生量を反映しているので、この試験から、カルシウム塩がヒト皮膚角化細胞のフィラグリンの産生を促進することが示された。
特にリン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム、及びリン酸三カルシウムは、塩化カルシウムと比較して相対的にフィラグリンの産生量が高く、かつ低濃度のカルシウム塩においても良好にフィラグリンの産生を促すことが明らかとなった。【００６１】
前記のリン酸水素カルシウム、ピロリン酸カルシウム、及びリン酸三カルシウムは、水に対して溶解性が低く、培地中においても目視上、ほとんど溶解していなかった。それにもかかわらず、これらカルシウム塩がフィラグリンの産生を促す理由として、局所的に細胞に接触・作用していることが推察される。
つまり、これらのカルシウム塩は、培地中に溶解したカルシウムイオンとして細胞に作用するのではなく、カルシウム塩そのものとして作用して、細胞のフィラグリンの産生を向上させたことが推察される。【００６２】
９．フィラグリン産生試験（Ｂ）
フィラグリン産生試験（Ａ）では、水に不溶又は難溶なカルシウム塩がフィラグリン産生を促進することが示された。そこで、カルシウム塩と分散剤を含むカルシウム塩組成物を用いて、フィラグリンの産生試験を実施した。【００６３】
(1)  カルシウム塩添加培地の調製
実施例６のカルシウム塩組成物（リン酸三カルシウム／ポリリン酸ナトリウム）又は塩化カルシウムをカルシウムイオン濃度換算０．０８９Ｍ（９２ｍｇ／ｍＬ）になるように水に分散させた後、オートクレーブ（１２０℃、２０分間）で滅菌することにより、カルシウム塩ストック分散液を調製した。
そして、表１２に従い、カルシウム塩ストック水分散液を、所定のカルシウムイオン換算添加濃度になるように、ピペッティングしながら、フィラグリン産生試験（Ａ）で使用したのと同じ培地に添加し、カルシウム塩添加培地を調製した。【００６４】
(2)  フィラグリン産生試験
フィラグリン産生試験（Ａ）で使用したのと同じ培地を加えた２４ウェル培養プレート上に、ヒト皮膚角化細胞（クラボウ社製，ＮＨＥＫ）を細胞密度が３，８００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように播種した後、３日間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。その後、培地を、前記で調製したカルシウム塩添加培地に交換し、１日又は２日インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。これらのインキュベートした細胞を、それぞれ、前述のフィラグリン産生試験（Ａ）と同様に、染色して、Ｌｃｅｌｌ及び輝度増加率を算出した。結果は表１２に示した。【００６５】
【表１２】
2016199927.tif 000013
【００６６】
水に分散可能な実施例６〔リン酸三カルシウム／ポリリン酸ナトリウム：１／９（ｗｔ／ｗｔ）〕を用いて、フィラグリンの産生試験を実施した。その結果、試験例１３及び１４と同様に、カルシウム塩組成物を培地に添加することにより、フィラグリンの産生を促進することが示された。蛍光顕微鏡の輝度は相対的なフィラグリンの量を反映しているため、その輝度の数値の大きさ自体はそれほど意味を持たないが、比較試験例と比較して、本発明のカルシウム塩組成物では明確に良好にフィラグリンの産生を促進することが示された。【００６７】
１０．フィラグリン産生試験（Ｃ）
フィラグリン試験（Ｂ）では、カルシウム塩組成物の有効性を示した。本発明のカルシウム塩組成物は、カルシウム成分及び分散剤成分を含む。そこで、各種構成成分がフィラグリン産生に与える影響を調べるためにフィラグリン産生試験を実施した。用いたカルシウム塩組成物は、実施例２８にて粉砕したものを使用した。【００６８】
(1)  試験培地の調製
実施例２８のカルシウム塩組成物をカルシウムイオン濃度換算１９．３ｍＭ（実施例２８組成物；２０ｍｇ／ｍL）になるように水に分散させ、また、塩化カルシウム水溶液（２.１５ｍｇ／ｍＬ）、リン酸−Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム水溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）、ポリリン酸ナトリウム水溶液（１６ｍｇ／ｍＬ）を調製した。その後、それらを滅菌フィルター（０．２５μｍ）にて滅菌することにより、試験用ストック水分散液を調製した。
そして、表１３に従い、試験用ストック水分散液を、所定の各成分の添加濃度になるように、ピペッティングしながら、フィラグリン産生試験（Ａ）で使用したのと同じ培地に添加し、試験培地を調製した。【００６９】
【表１３】
2016199927.tif 000014
【００７０】
(2)  フィラグリン産生試験
フィラグリン産生試験（Ａ）で使用したのと同じ培地を加えた２４ウェル培養プレート上に、ヒト皮膚角化細胞（クラボウ社製，ＮＨＥＫ）を細胞密度が３，８００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように播種した後、３日間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。その後、培地を、前記で調製したカルシウム塩添加培地に交換し、２日インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。これらのインキュベートした細胞を、それぞれ、前述のフィラグリン産生試験（Ａ）と同様に、染色して、顕微鏡観察を行った。【００７１】
結果を図３〜７に示す。その結果、無添加の培地（比較試験例７）及び各成成分からなる試験培地（比較試験例８〜１０）と比較して、実施例２８のカルシウム塩組成物を添加した試験培地（試験例２０）において、最も明瞭にフィラグリンに由来する緑の発光を確認することができた。このことから、カルシウム塩組成物は良好にフィラグリンを産生することが示された。【００７２】
１０．フィラグリン産生試験（Ｄ）
フィラグリン試験（Ａ）〜（Ｃ）では、カルシウム塩組成物もしくは不溶性のカルシウム塩がフィラグリンを産生することの蛍光免疫染色法を用いて有効性を示した。しかしながら、蛍光免疫染色法はディッシュに接着した一部の細胞のみを観察する手法であり、定量的であるとは言い難い。そこで、フィラグリンの産生試験をドットプロットにて実施した。ドットプロットはディッシュに接着したすべての細胞を回収し、メンブレンに転写後、免疫染色をする半定量的な手法である。用いたカルシウム塩組成物は、実施例２８にて粉砕したものを使用した。【００７３】
(1)  カルシウム塩試験培地の調製
実施例２８のカルシウム塩組成物（試験例２１）及び塩化カルシウム（比較試験例１２）をカルシウムイオン濃度換算０．３９ｍＭになるように培地（クラボウ社製、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２）に添加し、カルシウム塩添加培地をそれぞれ調製した。また、無添加の培地（比較試験例１１）も準備した。その後、それら培地を滅菌フィルター（０．２５μｍ）にて滅菌することにより、試験用培地を調製した。【００７４】
(2)  フィラグリン産生試験
フィラグリン産生試験（Ａ）で使用したのと同じ培地を加えた２４ウェル培養プレート上に、ヒト皮膚角化細胞（クラボウ社製，ＮＨＥＫ）を細胞密度が３０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈ（Φ１００ｘ２１ｍｍ）なるように播種した後、１日間培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。その後、培地を、前記で調製したカルシウム塩添加培地に交換し、２日インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２）。
その後、ＰＢＳにて洗浄後、トリプシン／ＥＤＴＡ（クラボウ社製）にて細胞を剥離後、トリプシン中和液（クラボウ社製）にて、トリプシンを中和し、遠心分離にて細胞を回収した。回収した細胞をＰＢＳにて置換後、遠心分離にて上澄みを除去後、細胞ペレットを作製した。得られた細胞ペレットをウレアバッファにて細胞を融解し、遠心分離にて上澄みを分取した。得られた上澄み中に含まれる総タンパク質量をＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を用いて見積もった。結果を表１４に示す。【００７５】
【表１４】
2016199927.tif 000015
【００７６】
得られたタンパク質溶液をメンブレン（ＰＶＤＦ，ミリポア社製、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、０．４５μｍ）に転写した後、ブロッキング後、１次抗体（Ａｎｔｉ−Ｆｉｌａｇｒｉｎ（ＡＫＨ１）（Ｍｏｕｓｅ）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ、ナカライ社製）にて４℃、一晩インキュベートした。その後、ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ブロッキング後、二次抗体（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｇｏａｔ，  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ，  Ｄａｋｏ社製）１時間震盪させた。その後、ＰＢＳ−Ｔにて洗浄後、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥヘルスケア社製）にて処理した。画像処理は、Ｃ−ＤｉＧｉｔ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）にて行った。結果を図８に示す。【００７７】
図８より試験例２１は比較試験例１１及び１２と比較して、フィラグリンタンパク質に由来する発光が強く確認された。表１４より、試験例２１、比較試験例１１及び１２の総タンパク質量が同程度の量であることからも、本発明のカルシウム組成物はフィラグリンを産生することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明のカルシウム塩組成物は、カルシウム塩のフィラグリン産生促進作用を向上させるので、フィラグリン産生促進剤として有用である。また、そのため、本発明のカルシウム塩組成物は、皮膚バリア機能を高め、アレルゲン、毒素、及び感染性生物などの侵入を防ぎ、皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、及び蕁麻疹などのアレルギー性皮膚疾患の治療及び／又は予防に有用である。
さらに、本発明のカルシウム塩組成物は、カルシウム塩によるフィラグリンの産生を促進させることにより、天然保湿因子の主成分であるアミノ酸量を増大させるなどして、皮膚における、シワ形成、弾力性低下、肌荒れ、及び保湿機能の低下といった、皮膚の老化症状を予防、治療、及び／又は改善する抗老化剤としても有用である。
さらに、本発明のカルシウム塩組成物は、美白剤としても有用である。
【図１】
2016199927.tif 000016
【図２】
2016199927.tif 000017
【図３】
2016199927.tif 000018
【図４】
2016199927.tif 000019
【図５】
2016199927.tif 000020
【図６】
2016199927.tif 000021
【図７】
2016199927.tif 000022
【図８】
2016199927.tif 000023
【国際調査報告】
2016199927.tif 000024
2016199927.tif 000025
2016199927.tif 000026
2016199927.tif 000027
2016199927.tif 000028
2016199927.tif 000029