(57)【要約】  本発明は、近赤外有機色素および式（Ｉ）表されるカリックスアレーン誘導体を含有する組成物を提供する（式（Ｉ）中、ｎは、４〜８の整数を示し、ｎ個のＲ１は、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基を示し、Ｍ＋は、１価のカチオンを示す。）。2016152954.tif 000020
2016152954.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
近赤外有機色素、および
式（Ｉ）：
【化１】
2016152954.tif 000015
（式（Ｉ）中、
ｎは、４〜８の整数を示し、
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基を示し、
Ｍ＋は、１価のカチオンを示す。）
で表されるカリックスアレーン誘導体
を含有する組成物。
【請求項２】
Ｍ＋が、アルカリ金属イオンである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｍ＋が、ナトリウムイオンである請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ｎが４であり、４個のＲ１が、それぞれ独立に、Ｃ４−１１アルキル基である請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ｎが６であり、６個のＲ１が、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基である請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ｎが８であり、８個のＲ１が、それぞれ独立に、Ｃ５アルキル基である請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
近赤外有機色素が、インドシアニングリーン、ローダミン８００、オキサジン７５０、ＩＲ７８０、ＩＲ８１３およびＩＲ１０４８からなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
近赤外有機色素が、抗体と結合したものである請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
式（Ｉ）で表されるカリックスアレーン誘導体の量が、近赤外有機色素１モルに対して、１０〜１０，０００モルである請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
式（Ｉ）：
【化２】
2016152954.tif 000016
（式（Ｉ）中、
ｎは、４〜８の整数を示し、
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基を示し、
Ｍ＋は、１価のカチオンを示す。）
で表されるカリックスアレーン誘導体を含有する、水中における近赤外有機色素の発光強度増強剤。
【請求項１１】
式（Ｉ）：
【化３】
2016152954.tif 000017
（式（Ｉ）中、
ｎは、４〜８の整数を示し、
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基を示し、
Ｍ＋は、１価のカチオンを示す。）
で表されるカリックスアレーン誘導体を含有する、水中における近赤外有機色素の安定化剤。
【請求項１２】
式（Ｉ）：
【化４】
2016152954.tif 000018
（式（Ｉ）中、
ｎは、４〜８の整数を示し、
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基を示し、
Ｍ＋は、１価のカチオンを示す。）
で表されるカリックスアレーン誘導体を使用して水中における近赤外有機色素の発光強度を向上させる方法。
【請求項１３】
式（Ｉ）：
【化５】
2016152954.tif 000019
（式（Ｉ）中、
ｎは、４〜８の整数を示し、
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基を示し、
Ｍ＋は、１価のカチオンを示す。）
で表されるカリックスアレーン誘導体を使用して水中における近赤外有機色素の安定性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水中における近赤外有機色素の発光強度および安定性を向上させるために有用なカリックスアレーン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体を非侵襲でイメージングする方法として、Ｘ線ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴが一般的であるが、近年、簡便且つ高感度な非侵襲イメージング法として近赤外蛍光イメージングが注目されている。近赤外領域の光（７００〜１，５００ｎｍ）は生体透過性に優れているため、近赤外蛍光イメージングは、血管撮像等の外科手術ナビゲーションツールとして、臨床応用が進みつつある。【０００３】
近赤外蛍光イメージングでは、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）等の近赤外有機色素が蛍光プローブとして用いられる。しかし、近赤外有機色素は共役系が長く、その疎水性が高いため、水への溶解性（安定性）が低く、且つ有機溶媒中での発光強度に比べて水中での発光強度が低下する傾向がある。【０００４】
上記のような近赤外有機色素の欠点を克服するため、様々な技術が提案されている。例えば、特許文献１には、ゼラチン誘導体およびインドシアニングリーンを有する複合体が記載されている。また、特許文献２には、インドシアニングリーンおよび正帯電部位を有する脂質を有する粒子が記載されている。また、特許文献３には、インドシアニングリーン等の光吸収化合物に結合したリポソーム膜構成物質を含み、且つリポソーム内に薬剤を含むリポソーム複合体が記載されている。また、特許文献４には、ＰＥＧ−アルキルブロックコポリマーおよび近赤外線蛍光色素を含むナノ粒子製剤が記載されている。また、特許文献５には、荷電された高分子電解質および反対に荷電された親水性の光学的蛍光剤の共凝集体を含む超微粒子マトリックスが記載されている。【０００５】
しかし、特許文献１〜３に記載されているようなゼラチン誘導体、正帯電部位を有する脂質、リポソーム膜構成物質等は製造コストが高いという問題がある。また、特許文献４および５に記載されているようなナノ粒子製剤、超微粒子マトリックス等は、製造に手間がかかるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−６７２９５号公報
【特許文献２】国際公開２０１３／１２５２３７号
【特許文献３】国際公開２０１３／０５１７３２号
【特許文献４】特表２０１０−５３９１３８号公報
【特許文献５】特表２００９−５０７０９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、水中における近赤外有機色素の発光強度および安定性を向上させることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者が、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねた結果、スルホナート基（−ＳＯ３−基）および特定の炭素数のアルキル基を有するカリックスアレーン誘導体を用いれば、水中における近赤外有機色素の発光強度および安定性を向上させ得ることを見出した。この知見に基づく本発明は以下の通りである。【０００９】
［１］  近赤外有機色素、および
式（Ｉ）：【００１０】
【化１】
2016152954.tif 000003
【００１１】
（式（Ｉ）中、
ｎは、４〜８の整数を示し、
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基を示し、
Ｍ＋は、１価のカチオンを示す。）
で表されるカリックスアレーン誘導体
を含有する組成物。
［２］  Ｍ＋が、アルカリ金属イオンである前記［１］に記載の組成物。
［３］  Ｍ＋が、ナトリウムイオンである前記［１］に記載の組成物。
［４］  ｎが４であり、４個のＲ１が、それぞれ独立に、Ｃ４−１１アルキル基である前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の組成物。
［５］  ｎが６であり、６個のＲ１が、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基である前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の組成物。
［６］  ｎが８であり、８個のＲ１が、それぞれ独立に、Ｃ５アルキル基である前記［１］〜［３］のいずれか一つに記載の組成物。
［７］  近赤外有機色素が、インドシアニングリーン、ローダミン８００、オキサジン７５０、ＩＲ７８０、ＩＲ８１３およびＩＲ１０４８からなる群から選ばれる少なくとも一つである前記［１］〜［６］のいずれか一つに記載の組成物。
［８］  近赤外有機色素が、抗体と結合したものである前記［１］〜［７］のいずれか一つに記載の組成物。
［９］  式（Ｉ）で表されるカリックスアレーン誘導体の量が、近赤外有機色素１モルに対して、１０〜１０，０００モルである前記［１］〜［８］のいずれか一つに記載の組成物。
［１０］式（Ｉ）：【００１２】
【化２】
2016152954.tif 000004
【００１３】
（式（Ｉ）中、
ｎは、４〜８の整数を示し、
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基を示し、
Ｍ＋は、１価のカチオンを示す。）
で表されるカリックスアレーン誘導体を含有する、水中における近赤外有機色素の発光強度増強剤。
［１１］式（Ｉ）：【００１４】
【化３】
2016152954.tif 000005
【００１５】
（式（Ｉ）中、
ｎは、４〜８の整数を示し、
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基を示し、
Ｍ＋は、１価のカチオンを示す。）
で表されるカリックスアレーン誘導体を含有する、水中における近赤外有機色素の安定化剤。
［１２］  式（Ｉ）：【００１６】
【化４】
2016152954.tif 000006
【００１７】
（式（Ｉ）中、
ｎは、４〜８の整数を示し、
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基を示し、
Ｍ＋は、１価のカチオンを示す。）
で表されるカリックスアレーン誘導体を使用して水中における近赤外有機色素の発光強度を向上させる方法。
［１３］  式（Ｉ）：【００１８】
【化５】
2016152954.tif 000007
【００１９】
（式（Ｉ）中、
ｎは、４〜８の整数を示し、
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基を示し、
Ｍ＋は、１価のカチオンを示す。）
で表されるカリックスアレーン誘導体を使用して水中における近赤外有機色素の安定性を向上させる方法。
［１４］  水中における近赤外有機色素の発光強度および安定性を向上させるために用いられる、式（Ｉ）：【００２０】
【化６】
2016152954.tif 000008
【００２１】
（式（Ｉ）中、
ｎは、４〜８の整数を示し、
ｎ個のＲ１は、それぞれ独立に、Ｃ４−１２アルキル基を示し、
Ｍ＋は、１価のカチオンを示す。）
で表されるカリックスアレーン誘導体。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、水中における近赤外有機色素の蛍光強度および安定性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】試験例１で測定したインドシアニングリーンのリン酸緩衝生理食塩水溶液の蛍光スペクトルである。
【図２】試験例２で測定したインドシアニングリーンのリン酸緩衝生理食塩水溶液の蛍光スペクトルである。
【図３】試験例３で測定したインドシアニングリーンのリン酸緩衝生理食塩水溶液の蛍光スペクトルである。
【図４】試験例４で測定したローダミン８００のリン酸緩衝生理食塩水溶液の蛍光スペクトルである。
【図５】試験例５で測定したオキサジン７５０のリン酸緩衝生理食塩水溶液の蛍光スペクトルである。
【図６】試験例６で測定したＩＲ７８０のリン酸緩衝生理食塩水溶液の蛍光スペクトルである。
【図７】試験例７で測定したＩＲ８１３のリン酸緩衝生理食塩水溶液の蛍光スペクトルである。
【図８】試験例８で測定した測定したＩＲ１０４８のリン酸緩衝生理食塩水溶液の蛍光スペクトルである。
【図９】試験例９で測定した、インドシアニングリーンのリン酸緩衝生理食塩水溶液を調製してからの時間と蛍光強度との関係を示すグラフである。
【図１０】試験例９で測定した、調製してから１ヶ月後のインドシアニングリーンのリン酸緩衝生理食塩水溶液の蛍光スペクトルである。
【図１１】試験例１０で測定した、インドシアニングリーン−抗ＨＥＲ２抗体およびカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を用いた乳がん細胞の近赤外蛍光イメージングの画像である。
【図１２】試験例１０で測定した、インドシアニングリーン−抗ＨＥＲ２抗体を用いた乳がん細胞の近赤外蛍光イメージングの画像である。
【図１３】試験例１１で測定した、インドシアニングリーンおよびカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を用いたマウス肝臓の近赤外蛍光イメージングの画像である。
【図１４】試験例１１で測定した、インドシアニングリーンを用いたマウス肝臓の近赤外蛍光イメージングの画像である。
【図１５】試験例１２で測定した、インドシアニングリーンおよびカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を用いたマウスリンパ節の近赤外蛍光イメージングの画像である。
【図１６】試験例１２で測定した、インドシアニングリーンを用いたマウスリンパ節の近赤外蛍光イメージングの画像である。
【図１７】試験例１３で測定した、インドシアニングリーン−抗ＨＥＲ２抗体よびカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を用いた乳がん腫瘍の近赤外蛍光イメージングの画像である（（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ、投与直後（０時間）、投与４０時間後、投与６９時間後の画像である）。
【図１８】試験例１３で測定した、インドシアニングリーン−抗ＨＥＲ２抗体よびカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を用いた乳がん腫瘍の近赤外蛍光イメージングの画像である（（Ａ）〜（Ｃ）は、それぞれ、投与直後（０時間）、投与４０時間後、投与６９時間後の画像である）。
【図１９】試験例１４で測定した、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加したＨｅＬａ細胞およびカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加していないＨｅＬａ細胞（コントロール）の細胞生存率を示すグラフである。
【図２０】試験例１５で測定した、スルホン化カリックス［４］アレーンのナトリウム塩Ｓ４のリン酸緩衝生理食塩水溶液中での粒径を示すグラフである。
【図２１】試験例１５で測定した、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６のリン酸緩衝生理食塩水溶液中での粒径を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、水中における近赤外有機色素の蛍光強度および安定性を向上させるために、上記式（Ｉ）で表されるカリックスアレーン誘導体（以下「カリックスアレーン誘導体（Ｉ）」と略称することがある。）を使用することを特徴とする。そのため本発明は、（ｉ）近赤外有機色素およびカリックスアレーン誘導体（Ｉ）を含有する組成物；（ｉｉ）カリックスアレーン誘導体（Ｉ）を含有する、水中における近赤外有機色素の発光強度増強剤；（ｉｉｉ）カリックスアレーン誘導体（Ｉ）を含有する、水中における近赤外有機色素の安定化剤；（ｉｖ）カリックスアレーン誘導体（Ｉ）を使用して水中における近赤外有機色素の蛍光強度を向上させる方法；および（ｖ）カリックスアレーン誘導体（Ｉ）を使用して水中における近赤外有機色素の安定性を向上させる方法；を提供する。
【００２５】
本発明は、好ましくは、（ｉ）近赤外有機色素およびカリックスアレーン誘導体（Ｉ）を含有する組成物；（ｉｉ−ｉｉｉ）カリックスアレーン誘導体（Ｉ）を含有する、水中における近赤外有機色素の発光強度および安定性の増強剤；および（ｉｖ−ｖ）カリックスアレーン誘導体（Ｉ）を使用して水中における近赤外有機色素の蛍光強度および安定性を向上させる方法；を提供する。
【００２６】
本発明において近赤外有機色素とは、光を吸収して、近赤外領域の光（７００〜１，５００ｎｍ）を発光する有機化合物を意味する。近赤外有機色素としては、例えば、下記式で表されるインドシアニングリーン、ローダミン８００、オキサジン７５０、ＩＲ７８０、ＩＲ８１３、ＩＲ１０４８等が挙げられる。これらの中でインドシアニングリーンが好ましい。
【００２７】
【化７】
2016152954.tif 000009
【００２８】
【化８】
2016152954.tif 000010
【００２９】
【化９】
2016152954.tif 000011
【００３０】
【化１０】
2016152954.tif 000012
【００３１】
近赤外有機色素は、抗体と結合したものであってもよい。抗体としては、モノクロナール抗体が好ましい。モノクロナール抗体としては、ヒト化抗体、ヒト抗体が好ましい。ヒト化抗体としては、例えば、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、ハーセプチン（登録商標））、抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ）、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体（ＡＭＧ４７９）、抗ＣＤ２２抗体（エプラツズマブ）、抗ＥＧＦＲ抗体（マツズマブ）等が挙げられる。ヒト抗体としては、例えば、抗ＨＧＦ抗体（ＡＭＧ１０２）、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体（シクスシマブ）、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体（ダロツズマブ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体（デノスマブ）、抗ＥＧＦＲ抗体（マニツズマブ）等が挙げられる。抗体と結合した近赤外有機色素は、公知の方法、例えば、BioconjugateChem., 2009, 20(11), p 2177. に記載の方法によって製造することができる。近赤外有機色素と抗体との結合は、公知のリンカーを使用してもよい。そのため、上述の「抗体と結合した近赤外有機色素」には、リンカーを介して抗体と結合した近赤外有機色素が含まれる。
【００３２】
本発明で使用するカリックスアレーン誘導体（Ｉ）は、ハロゲン化アルキルを用いて、スルホン化カリックス［ｎ］アレーン（ｎは４〜８の整数を示す）のフェノール性水酸基をアルキル化することによって製造することができる。ハロゲン化アルキルを用いるアルキル化は周知の合成法であり、当業者であれば、合成条件を適宜設定して容易に行うことができる。また、スルホン化カリックス［ｎ］アレーンは市販されており、容易に入手することができる。このようにカリックスアレーン誘導体（Ｉ）は、従来技術で使用されている物（例えば、特許文献１で使用されているゼラチン誘導体等）に比べて大量合成が容易であり、安価に製造することができる。また、カリックスアレーン誘導体（Ｉ）は、下記試験例で示されるように、細胞毒性を有さないという利点を有する。
【００３３】
下記試験例で示されるように、近赤外有機色素の水溶液にカリックスアレーン誘導体（Ｉ）の出発原料であるスルホン化カリックス［ｎ］アレーンのナトリウム塩を添加すると、かえって発光強度が低下する。しかし、驚くべきことに、スルホン化カリックス［ｎ］アレーンをアルキル化したカリックスアレーン誘導体（Ｉ）を近赤外有機色素の水溶液に添加すると、水中での近赤外有機色素の安定性および発光強度が顕著に向上する。
【００３４】
カリックスアレーン誘導体（Ｉ）は、親水性の−ＳＯ３−基および疎水性の基Ｒ１（即ち、Ｃ４−１２アルキル基）を有する両親媒性化合物であり、水中では、親水性の−ＳＯ３−基を外側にし、疎水性のＣ４−１２アルキル基を内側にしたミセルを形成すると考えられる。形成したカリックスアレーン誘導体（Ｉ）のミセルの内側には疎水的な環境が形成され、この内側に近赤外有機色素が取り込まれることによって、近赤外有機色素の安定性および発光強度の向上が達成されると推定される。但し、本発明はこのような推定に限定されない。
【００３５】
式（Ｉ）中のｎは４〜８の整数を示す。ｎは、好ましくは４、６または８であり、より好ましくは４または６であり、さらに好ましくは４である。
【００３６】
式（Ｉ）中のＲ１はＣ４−１２アルキル基を示す。ｎ個のＲ１は、同じものでも、異なるものでもよく、好ましくは、同じものである。アルキル基は、直鎖状でも、分枝鎖状でもよく、好ましくは直鎖状である。Ｃ４−１２アルキル基としては、例えば、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル等が挙げられる。
【００３７】
式（Ｉ）中のＭ＋は、アルカリ金属イオン、アンモニウムイオン等の１価のカチオンを示す。Ｍ＋は、好ましくはアルカリ金属イオン、より好ましくはナトリウムイオンである。
【００３８】
ｎが４であるカリックスアレーン誘導体（Ｉ）において、４個のＲ１は、それぞれ独立に、好ましくはＣ４−１１アルキル基、より好ましくは直鎖のＣ４−１１アルキル基、さらに好ましくは直鎖のＣ４−９アルキル基である。前記Ｃ４−１１アルキル基およびＣ４−９アルキル基の具体例としては、それぞれ、前記Ｃ４−１２アルキル基の具体例の中で炭素数が４〜１１であるもの、および炭素数が４〜９であるものが挙げられる。前記カリックスアレーン誘導体（Ｉ）において、４個のＲ１は同じものであることが好ましい。前記カリックスアレーン誘導体（Ｉ）において、Ｍは、好ましくはアルカリ金属イオン、より好ましくはナトリウムイオンである。
【００３９】
ｎが６であるカリックスアレーン誘導体（Ｉ）において、６個のＲ１は、それぞれ独立に、好ましくはＣ４−１２アルキル基、より好ましくは直鎖のＣ４−１２アルキル基、さらに好ましくは直鎖のＣ６−１１アルキル基である。前記Ｃ４−１１アルキル基およびＣ４−９アルキル基の具体例としては、それぞれ、前記Ｃ４−１２アルキル基の具体例の中で炭素数が４〜１１であるもの、および炭素数が４〜９であるものが挙げられる。前記カリックスアレーン誘導体（Ｉ）において、６個のＲ１は同じものであることが好ましい。前記カリックスアレーン誘導体（Ｉ）において、Ｍは、好ましくはアルカリ金属イオン、より好ましくはナトリウムイオンである。
【００４０】
ｎが８であるカリックスアレーン誘導体（Ｉ）において、８個のＲ１は、それぞれ独立に、好ましくはＣ５アルキル基である。前記カリックスアレーン誘導体（Ｉ）において、８個のＲ１は、より好ましくはｎ−ペンチルである。前記カリックスアレーン誘導体（Ｉ）において、Ｍは、好ましくはアルカリ金属イオン、より好ましくはナトリウムイオンである。
【００４１】
水中における近赤外有機色素の安定化および発光強度の向上の観点から、カリックスアレーン誘導体（Ｉ）の量は、近赤外有機色素１モルに対して、好ましくは１０〜１０，０００モル、より好ましくは１００〜１０，０００モル、さらに好ましくは５００〜５，０００モル、特に好ましくは１，０００〜３，０００モルである。
【実施例】
【００４２】
以下、製造例および試験例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の製造例および試験例によって制限を受けるものではなく、上記・下記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。【００４３】
製造例１：カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６の製造【００４４】
【化１１】
2016152954.tif 000013
【００４５】
５０ｍＬの三角フラスコに、スルホン化カリックス［４］アレーン（即ち、テトラスルホ（テトラヒドロキシ）カリックス［４］アレーン、東京化成工業社製）１ｇを秤り取り、蒸留水４ｍＬに溶かし、水酸化ナトリウム０．５ｇを加えた。得られた溶液に、ジメチルスルホキシド２０ｍＬを加え、撹拌した。得られた溶液に、臭化ヘキシル（ｎ−Ｃ６Ｈ１３Ｂｒ）４ｇを加え、５０〜６０℃で２４時間反応させた。反応終了後、ろ過し、ろ液にエタノールを加えて、生成物を沈殿させた。遠心分離機（１５，０００ｇ）により生成物を分離し、蒸留水１０ｍＬに溶解させた。これに再びエタノールを加えて生成物を沈殿させた。この操作をさらに２回繰り返して、精製を行った。得られた精製物を真空乾燥して、上記式で表されるカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を得た。得られたＳ４−６を、乳鉢にて粉砕し、得られた粉末を保存した。【００４６】
製造例２：カリックスアレーン誘導体Ｓｎ−ｍの製造【００４７】
【化１２】
2016152954.tif 000014
【００４８】
出発原料としてスルホン化カリックス［４］アレーン、スルホン化カリックス［６］アレーンまたはスルホン化カリックス［８］アレーン（即ち、テトラスルホ（テトラヒドロキシ）カリックス［４］アレーン、ヘキサスルホ（ヘキサヒドロキシ）カリックス［４］アレーン、またはオクタスルホ（オクタヒドロキシ）カリックス［８］アレーン）を使用し、製造例１と同様にして、上記式で表されるカリックスアレーン誘導体Ｓｎ−ｍを製造した（ｎおよびｍは整数を示す。）。なお、前記Ｓｎ−ｍにおいて、ｎは、式（Ｉ）中のｎ（即ち、繰返し単位の数）に対応し、ｍは、式（Ｉ）中のＲ１の炭素数に対応する。また、製造例１および２のいずれにおいても、直鎖の臭化アルキルを使用し、Ｒ１として直鎖アルキル基を導入した。【００４９】
試験例１：カリックスアレーン誘導体Ｓ４−ｍによるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の蛍光強度向上の観察
ＩＣＧ（Sigma-Aldrich 社製）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（色素濃度：１μＭ、３ｍＬ）に、スルホン化カリックス［４］アレーンのナトリウム塩Ｓ４またはカリックスアレーン誘導体Ｓ４−ｍ（ｍは整数を示す。）（１０ｍｇ）を添加し、蛍光スペクトルを測定した。同様に、スルホン化カリックス［４］アレーンのナトリウム塩Ｓ４等を添加していないＩＣＧのＰＢＳ溶液の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルは、励起波長７４０ｎｍおよび室温の条件で日本分光社製ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００を用いて測定した。結果を図１に示す。【００５０】
図１に示されるように、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−４〜Ｓ４−１１を添加したＰＢＳ溶液では、これらを添加しないＰＢＳ溶液に比べて、ＩＣＧの蛍光強度が向上した。一方、スルホン化カリックス［４］アレーンのナトリウム塩Ｓ４または短鎖アルキル基（プロピル基）を導入したカリックスアレーン誘導体Ｓ４−３を添加したＰＢＳ溶液では、これらを添加しないＰＢＳ溶液に比べて、ＩＣＧの蛍光強度が低下した。【００５１】
試験例２：カリックスアレーン誘導体Ｓ６−ｍによるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の蛍光強度向上の観察
ＩＣＧ（Sigma-Aldrich 社製）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（色素濃度：１μＭ、３ｍＬ）に、スルホン化カリックス［６］アレーンのナトリウム塩Ｓ６またはカリックスアレーン誘導体Ｓ６−ｍ（ｍは整数を示す。）（１０ｍｇ）を添加し、蛍光スペクトルを測定した。同様に、スルホン化カリックス［６］アレーンのナトリウム塩Ｓ６等を添加していないＩＣＧのＰＢＳ溶液の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルは、励起波長７４０ｎｍおよび室温の条件で日本分光社製ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００を用いて測定した。結果を図２に示す。【００５２】
図２に示されるように、カリックスアレーン誘導体Ｓ６−４〜Ｓ６−１２を添加したＰＢＳ溶液では、これらを添加しないＰＢＳ溶液に比べて、ＩＣＧの蛍光強度が向上した。一方、スルホン化カリックス［６］アレーンのナトリウム塩Ｓ６または短鎖アルキル基（プロピル基）を導入したカリックスアレーン誘導体Ｓ６−３を添加したＰＢＳ溶液では、これらを添加しないＰＢＳ溶液に比べて、ＩＣＧの蛍光強度が低下した。【００５３】
試験例３：カリックスアレーン誘導体Ｓ８−ｍによるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の蛍光強度向上の観察
ＩＣＧ（Sigma-Aldrich 社製）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（色素濃度：１μＭ、３ｍＬ）に、スルホン化カリックス［８］アレーンのナトリウム塩Ｓ８またはカリックスアレーン誘導体Ｓ８−ｍ（ｍは整数を示す。）（１０ｍｇ）を添加し、蛍光スペクトルを測定した。同様に、スルホン化カリックス［８］アレーンのナトリウム塩Ｓ８等を添加していないＩＣＧのＰＢＳ溶液の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルは、励起波長７４０ｎｍおよび室温の条件で日本分光社製ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００を用いて測定した。結果を図３に示す。【００５４】
図３に示されるように、カリックスアレーン誘導体Ｓ８−５を添加したＰＢＳ溶液では、これを添加しないＰＢＳ溶液に比べて、ＩＣＧの蛍光強度が向上した。一方、スルホン化カリックス［８］アレーンのナトリウム塩Ｓ８または短鎖アルキル基（プロピル基）を導入したカリックスアレーン誘導体Ｓ８−３を添加したＰＢＳ溶液では、これらを添加しないＰＢＳ溶液に比べて、ＩＣＧの蛍光強度が低下した。【００５５】
試験例４：カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６によるローダミン８００の蛍光強度向上の観察
ローダミン８００（和光純薬工業社製）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（色素濃度：１μＭ、３ｍＬ）に、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６（１０ｍｇ）を添加し、蛍光スペクトルを測定した。同様に、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加していないローダミン８００のＰＢＳ溶液の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルは、励起波長６４０ｎｍおよび室温の条件で日本分光社製ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００を用いて測定した。結果を図４に示す。【００５６】
図４に示されるように、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加したＰＢＳ溶液では、これを添加しないＰＢＳ溶液に比べて、ローダミン８００の蛍光強度が向上した。【００５７】
試験例５：カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６によるオキサジン７５０の蛍光強度向上の観察
オキサジン７５０（エキシトン社製）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（色素濃度：１μＭ、３ｍＬ）に、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６（１０ｍｇ）を添加し、蛍光スペクトルを測定した。同様に、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加していないオキサジン７５０のＰＢＳ溶液の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルは、励起波長６４０ｎｍおよび室温の条件で日本分光社製ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００を用いて測定した。結果を図５に示す。【００５８】
図５に示されるように、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加したＰＢＳ溶液では、これを添加しないＰＢＳ溶液に比べて、オキサジン７５０の蛍光強度が向上した。【００５９】
試験例６：カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６によるＩＲ７８０の蛍光強度向上の観察
ＩＲ７８０（シグマアルドリッチ社製）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（色素濃度：１μＭ、３ｍＬ）に、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６（１０ｍｇ）を添加し、蛍光スペクトルを測定した。同様に、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加していないＩＲ７８０のＰＢＳ溶液の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルは、励起波長７４０ｎｍおよび室温の条件で日本分光社製ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００を用いて測定した。結果を図６に示す。【００６０】
図６に示されるように、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加したＰＢＳ溶液では、これを添加しないＰＢＳ溶液に比べて、ＩＲ７８０の蛍光強度が向上した。【００６１】
試験例７：カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６によるＩＲ８１３の蛍光強度向上の観察
ＩＲ８１３（シグマアルドリッチ社製）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（色素濃度：１μＭ、３ｍＬ）に、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６（１０ｍｇ）を添加し、蛍光スペクトルを測定した。同様に、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加していないＩＲ８１３のＰＢＳ溶液の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルは、励起波長７４０ｎｍおよび室温の条件で日本分光社製ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００を用いて測定した。結果を図７に示す。【００６２】
図７に示されるように、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加したＰＢＳ溶液では、これを添加しないＰＢＳ溶液に比べて、ＩＲ８１３の蛍光強度が向上した。【００６３】
試験例８：カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６によるＩＲ１０４８の蛍光強度向上の観察
ＩＲ１０４８（シグマアルドリッチ社製）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（色素濃度：１μＭ、３ｍＬ、１０体積％のジメチルスルホキシドを含む）に、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６（１０ｍｇ）を添加し、蛍光スペクトルを測定した。同様に、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加していないＩＲ１０４８のＰＢＳ溶液の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルは、励起波長９６０ｎｍおよび室温の条件で（株）堀場製作所製ＮａｎｏＬｏｇを用いて測定した。結果を図８に示す。【００６４】
図８に示されるように、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加したＰＢＳ溶液では、これを添加しないＰＢＳ溶液に比べて、ＩＲ１０４８の蛍光強度が向上した。【００６５】
試験例９：カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６によるインドシアニングリーン（ＩＣＧ）の安定性向上の観察
ＩＣＧ（Sigma-Aldrich 社製）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（色素濃度：１μＭ、３ｍＬ）に、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６（１０ｍｇ）を添加し、蛍光スペクトルを測定した。同様に、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加していないＩＣＧのＰＢＳ溶液の蛍光スペクトルを測定した。なお、蛍光スペクトルは、励起波長７４０ｎｍおよび室温の条件で日本分光社製ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−８２００を用いて測定した。ＩＣＧのＰＢＳ溶液を調製してからの時間と蛍光強度との関係を示すグラフを図９に、ＰＢＳ溶液を調製してから１ヶ月後の蛍光スペクトルを図１０に示す。【００６６】
図９に示されるように、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を添加したＰＢＳ溶液では、ＰＢＳ溶液の調製から６日後でも蛍光強度が高いままであり、図１０に示されるように、ＰＢＳ溶液の調製から１ヶ月後でも蛍光スペクトルが観察された。一方、Ｓ４−６を添加していないＰＢＳ溶液では、ＰＢＳ溶液の調製から２日程度で蛍光が消失した。【００６７】
試験例１０：インドシアニングリーン（ＩＣＧ）−抗ＨＥＲ２抗体を用いた乳がん細胞（ＫＰＬ−４）の近赤外蛍光イメージング
まず、抗ＨＥＲ２抗体（ハーセプチン（登録商標）、中外製薬社製）を結合したＩＣＧ（ＩＣＧ−抗ＨＥＲ２抗体）を、Bioconjugate Chem., 2009, 20(11), p 2177. に記載の方法によって製造した。
次いで、得られたＩＣＧ−抗ＨＥＲ２抗体を用いて、ＨＥＲ２陽性ヒト乳がん細胞（ＫＰＬ−４、川崎医大）の細胞表面にあるＨＥＲ２受容体の近赤外蛍光イメージングを行った。画像は、励起波長７６０ｎｍおよび蛍光波長８３０ｎｍの条件でキーエンス社製の蛍光顕微鏡を用いて取得した。ＩＣＧ−抗ＨＥＲ２抗体溶液（色素濃度：１μＭ、１００μＬ）にカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６（１ｍｇ）を加えたときの画像を図１１に、Ｓ４−６を加えていないときの画像を図１２に示す。【００６８】
図１１および図１２の対比から明らかなように、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を用いることによって、蛍光画像の強度が顕著に改善される。【００６９】
試験例１１：インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を用いたマウス肝臓の近赤外蛍光イメージング
ヌードマウスの尾静脈から、ＩＣＧおよびカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６の溶液（色素濃度：１μＭ、Ｓ４−６濃度：１２５μＭ、０．１ｍＬ）またはＩＣＧ溶液（色素濃度：１μＭ、０．１ｍＬ）を投与し、肝臓の近赤外蛍光イメージングを行った。画像は、励起波長７６０ｎｍ、蛍光波長８３０ｎｍおよび露光時間３０秒の条件で Bruker 社製イメージング装置 MS FX PRO を用いて取得した。Ｓ４−６を用いたときの画像を図１３に、Ｓ４−６を用いていないときの画像を図１４に示す。【００７０】
カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を用いたときの画像（図１３）は、Ｓ４−６を用いないときの画像（図１４）に比べて、肝臓部分の蛍光強度が２〜３倍高かった。【００７１】
試験例１２：インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を用いたマウスリンパ節の近赤外蛍光イメージング
ヌードマウスの左足表面からＩＣＧおよびカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６の溶液（色素濃度：１μＭ、Ｓ４−６濃度：１２５μＭ、０．１ｍＬ）またはＩＣＧ溶液（色素濃度：１μＭ、０．１ｍＬ）を投与し、下肢リンパ節の近赤外蛍光イメージングを行った。画像は、励起波長７８５ｎｍおよび蛍光波長８００ｎｍ以上の条件で Andor 社製Si EM カメラを用いて取得した。Ｓ４−６を用いたときの画像を図１５に、Ｓ４−６を用いていないときの画像を図１６に示す。【００７２】
カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を用いた場合には、ＩＣＧの蛍光強度が高いため、リンパ節が造影できた（図１５）。しかし、Ｓ４−６を用いない場合には、リンパ節を造影できなかった（図１６）。【００７３】
試験例１３：インドシアニングリーン（ＩＣＧ）−抗ＨＥＲ２抗体を用いた乳がん腫瘍の近赤外蛍光イメージング
抗ＨＥＲ２抗体（ハーセプチン（登録商標）、中外製薬社製）を結合したＩＣＧを用いて、ＨＥＲ２陽性ヒト乳がん細胞（ＫＰＬ−４、川崎医大製）を移植したヌードマウスの乳がん腫瘍の近赤外蛍光イメージングを行った。ＩＣＧ−抗ＨＥＲ２抗体およびカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６の溶液（色素濃度：１μＭ、Ｓ４−６濃度：１２５μＭ、０．１ｍＬ）またはＩＣＧ−抗ＨＥＲ２抗体の溶液（色素濃度：１μＭ、０．１ｍＬ）は、尾静脈から投与した。画像は、励起波長７６０ｎｍ、蛍光波長８３０ｎｍ、および露光時間６０秒の条件で Bruker 社製イメージング装置 MS FX PRO を用いて取得した。Ｓ４−６を用いたときの画像を図１７に、Ｓ４−６を用いていないときの画像を図１８に示す。【００７４】
カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６を用いたときの画像（図１７）は、Ｓ４−６を用いないときの画像（図１８）に比べて、乳がん腫瘍の蛍光強度が２〜３倍高かった。【００７５】
試験例１４：カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６の細胞毒性の評価
カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（Ｓ４−６濃度：１ｍＭ）をＨｅＬａ細胞に所定の濃度（１０μＭ、５０μＭまたは１００μＭ）になるように添加し、添加２４時間後にInvitrogen 社製セルカウンターで細胞生存率を測定した。同様に、Ｓ４−６を添加しないコントロールの細胞生存率を測定した。結果を図１９に示す。【００７６】
図１９に示されるように、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６は１００μＭ以下の濃度では細胞毒性を示さなかった。【００７７】
試験例１５：スルホン化カリックス［４］アレーンのナトリウム塩Ｓ４およびカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中の粒径測定
ＰＢＳ（３ｍＬ）に、スルホン化カリックス［４］アレーンのナトリウム塩Ｓ４またはカリックスアレーン誘導体Ｓ４−６（１０ｍｇ）を溶かし、光路長１ｃｍのセルを用いたMalvern 社製 Nano-ZS によって、それらの粒子径を測定した。それらの結果を図２０および図２１に示す。【００７８】
図２１に示されるように、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６の粒径は１０ｎｍ以下であり、リポソームのような大きな構造を持っていなかった。この結果から、カリックスアレーン誘導体Ｓ４−６のミセル形成が示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によれば、水中における近赤外有機色素の蛍光強度および安定性を向上させることができる。そのため、本発明は近赤外蛍光イメージング等に利用することができる。【００８０】
本願は、日本で出願された特願２０１５−０６３３２６号を基礎としており、その内容は本願明細書に全て包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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