(57)【要約】  イソプレンと含酸素中性化合物とを含むイソプレン含有組成物と、希土類元素化合物と有機金属化合物とを含む重合触媒組成物とを用いて、イソプレンを重合させることを特徴とする、ポリイソプレンの製造方法であり、ここで、有機金属化合物の配合量がイソプレン含有組成物１００重量部に対して０．６〜３．０重量部である、ことを特徴とする、ポリイソプレンの製造方法。
2016174875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレンと含酸素中性化合物とを含むイソプレン含有組成物と、希土類元素化合物と有機金属化合物とを含む重合触媒組成物とを用いて、イソプレンを重合させることを特徴とする、ポリイソプレンの製造方法であり、
ここで、前記有機金属化合物の配合量が前記イソプレン含有組成物１００重量部に対して０．６〜３．０重量部である、
ことを特徴とする、ポリイソプレンの製造方法。
【請求項２】
前記含酸素中性化合物の配合量は、前記イソプレン含有組成物１００重量部に対して０．０５〜１．０重量部であることを特徴とする、請求項１に記載のポリイソプレンの製造方法。
【請求項３】
前記イソプレン含有組成物は、発酵法により調製されたことを特徴とする、請求項１又は２に記載のポリイソプレンの製造方法。
【請求項４】
前記含酸素中性化合物は、エーテル、エステル、ケトンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリイソプレンの製造方法。
【請求項５】
前記ポリイソプレンの数平均分子量（Ｍｎ）は、１００万以上であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリイソプレンの製造方法。
【請求項６】
前記ポリイソプレンの数平均分子量（Ｍｎ）は、１３０万以上であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリイソプレンの製造方法。
【請求項７】
前記ポリイソプレンの分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、２．５以下であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリイソプレンの製造方法。
【請求項８】
前記ポリイソプレンのシス−１、４−結合含量が、９８％以上であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリイソプレンの製造方法。
【請求項９】
前記希土類元素化合物が、金属−窒素結合（Ｍ−Ｎ結合）を有する、希土類元素含有化合物又は該希土類元素含有化合物とルイス塩基との反応物であり、
前記希土類元素含有化合物が、スカンジウム、イットリウム、又は原子番号５７〜７１の元素から構成されるランタノイド元素を含有する化合物であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリイソプレンの製造方法。
【請求項１０】
前記有機金属化合物が、
下記式（Ｓ２）
ＹＲ4aＲ5bＲ6c  ・・・（Ｓ２）
（式中、Ｙは、第１族、第２族、第１２族、及び第１３族からなる群から選択される金属元素であり；Ｒ4及びＲ5は、炭素数１〜１０の炭化水素基又は水素原子であり、同一であっても異なっていてもよく；Ｒ6は、炭素数１〜１０の炭化水素基であり；Ｒ6は上記Ｒ4又はＲ5と同一であっても異なっていてもよく；Ｙが第１族の金属元素である場合には、ａは１であり且つｂ及びｃは０であり、Ｙが第２族の金属元素及び第１２族の金属元素である場合には、ａ及びｂは１であり且つｃは０であり、Ｙが第１３族の金属元素である場合には、ａ、ｂ及びｃは１である）
又は下記式（Ｓ３）
ＡｌＲ7Ｒ8Ｒ9  ・・・（Ｓ３）
（式中、Ｒ7及びＲ8は、炭素数１〜１０の炭化水素基又は水素原子であり、同一であっても異なっていてもよく；Ｒ9は、炭素数１〜１０の炭化水素基であり；Ｒ9は上記Ｒ7又はＲ8と同一であっても異なっていてもよい）
で表される化合物であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリイソプレンの製造方法。
【請求項１１】
前記重合触媒組成物が、アルミノキサン化合物、ハロゲン化合物、イオン性化合物、アニオン性配位子となり得る化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリイソプレンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリイソプレンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タイヤ等のゴム製品には、優れた耐破壊特性、耐摩耗性、耐亀裂成長性等が要求されるため、その原料として優れた弾性を有するゴム成分を用いる必要がある。ゴム成分としては、ゴムノキから採取され、主として高い分子量を有するポリイソプレンからなる天然ゴムを用いることが知られている。【０００３】
近年、天然ゴムの需要はより一層高まる一方で、ゴムノキの資源の減少により、天然ゴムの価格が高騰している。そのため、ゴムノキ由来の天然ゴムのポリイソプレンと同等の特性を有するポリイソプレンを調製する研究が盛んに行われている。【０００４】
天然ゴムのポリイソプレンに代わるポリイソプレンとして、石油の蒸留等の化学的手法により調製される合成ポリイソプレンや、微生物を用いた手法により調製される発酵ポリイソプレン（特許文献１〜３参照）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１１−５０５８４１号公報
【特許文献２】特表２０１１−５１８５６４号公報
【特許文献３】特表２０１３−５１４３７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記従来の手法により調製されたイソプレンを用いるイソプレン含有組成物では、特に、イソプレンの重合を阻害する不純物が存在する場合等に、触媒活性が低下し、十分に高い分子量を有するポリイソプレンを製造することができない虞があった。【０００７】
そこで、本発明は、イソプレン以外にイソプレンの重合を阻害する不純物が存在する場合等であっても、その種類及び量をコントロールし、更にその上で重合触媒の種類及び量をコントロールすることによって、高度に精製したイソプレンを重合した場合と比較して高い分子量を有するポリイソプレンを製造することが可能なポリイソプレンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の要旨は以下の通りである。
本発明のポリイソプレンの製造方法は、イソプレンと含酸素中性化合物とを含むイソプレン含有組成物と、希土類元素化合物と有機金属化合物とを含む重合触媒組成物とを用いて、イソプレンを重合させることを特徴とする、ポリイソプレンの製造方法であり、
ここで、前記有機金属化合物の配合量が前記イソプレン含有組成物１００重量部に対して０．６〜３．０重量部である、ことを特徴とする。【０００９】
本発明のポリイソプレンの製造方法では、前記含酸素中性化合物の配合量は、前記イソプレン含有組成物１００重量部に対して０．０５〜１．０重量部であることが好ましい。
また、本発明のポリイソプレンの製造方法では、前記イソプレン含有組成物は、発酵法により調製されてよい。
更に、本発明のポリイソプレンの製造方法では、前記含酸素中性化合物は、エーテル、エステル、ケトンからなる群から選択されることが好ましい。
更に、本発明のポリイソプレンの製造方法では、前記ポリイソプレンの数平均分子量（Ｍｎ）は、１００万以上であることが好ましい。
更に、本発明のポリイソプレンの製造方法では、前記ポリイソプレンの数平均分子量（Ｍｎ）は、１３０万以上であることが好ましい。
更に、本発明のポリイソプレンの製造方法では、前記ポリイソプレンの分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、２．５以下であることが好ましい。
更に、本発明のポリイソプレンの製造方法では、前記ポリイソプレンのシス−１、４−結合含量が、９８％以上であることが好ましい。
更に、本発明のポリイソプレンの製造方法では、前記希土類元素化合物が、金属−窒素結合（Ｍ−Ｎ結合）を有する、希土類元素含有化合物又は該希土類元素含有化合物とルイス塩基との反応物であり、前記希土類元素含有化合物が、スカンジウム、イットリウム、又は原子番号５７〜７１の元素から構成されるランタノイド元素を含有する化合物であることが好ましい。
更に、本発明のポリイソプレンの製造方法では、前記有機金属化合物が、
下記式（Ｓ２）
ＹＲ4aＲ5bＲ6c  ・・・（Ｓ２）
（式中、Ｙは、第１族、第２族、第１２族、及び第１３族からなる群から選択される金属元素であり；Ｒ4及びＲ5は、炭素数１〜１０の炭化水素基又は水素原子であり、同一であっても異なっていてもよく；Ｒ6は、炭素数１〜１０の炭化水素基であり；Ｒ6は上記Ｒ4又はＲ5と同一であっても異なっていてもよく；Ｙが第１族の金属元素である場合には、ａは１であり且つｂ及びｃは０であり、Ｙが第２族の金属元素及び第１２族の金属元素である場合には、ａ及びｂは１であり且つｃは０であり、Ｙが第１３族の金属元素である場合には、ａ、ｂ及びｃは１である）
又は下記式（Ｓ３）
ＡｌＲ7Ｒ8Ｒ9  ・・・（Ｓ３）
（式中、Ｒ7及びＲ8は、炭素数１〜１０の炭化水素基又は水素原子であり、同一であっても異なっていてもよく；Ｒ9は、炭素数１〜１０の炭化水素基であり；Ｒ9は上記Ｒ7又はＲ8と同一であっても異なっていてもよい）
で表される化合物であることが好ましい。
更に、本発明のポリイソプレンの製造方法では、前記重合触媒組成物が、アルミノキサン化合物、ハロゲン化合物、イオン性化合物、アニオン性配位子となり得る化合物からなる群から選ばれる少なくとも１つの化合物を含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のポリイソプレンの製造方法によれば、比較的高い分子量を有するポリイソプレンを製造することができ、これにより、製造した合成ポリイソプレンの強度を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例において構築したｐＡＨ１６２−Ｐara−ｍｖａＥＳプラスミドについて示す図である。
【図２】（Ａ）ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃR−λａｔｔＲ組込み型ベクターについて示す図である。（Ｂ）実施例において構築したｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍR−λａｔｔＲ組込み型ベクターについて示す図である。
【図３】実施例において用いたｐＡＨ１６２−Ｐtac組込み型発現ベクターについて示す図である。
【図４】化学合成されたコドンを最適化したＫＤｙＩオペロンについて示す図である。
【図５】（Ａ）実施例において構築した、コドンを最適化したＫＤｙＩオペロンを保持するプラスミドｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐtac−ＫＤｙＩについて示す図である。（Ｂ）実施例において構築した、コドンを最適化したＫＤｙＩオペロンを保持するプラスミドｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐtac−ＫＤｙＩについて示す図である。
【図６】実施例において構築した、Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ由来のｍｖｋ遺伝子を保持する組込み型プラスミドｐＡＨ１６２−Ｐtac−ｍｖｋについて示す図である。
【図７】（Ａ）実施例において構築した、ゲノム改変物ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢphi80について示す図である。（Ｂ）実施例において構築した、ゲノム改変物ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢphi80について示す図である。（Ｃ）実施例において構築した、ゲノム改変物Δｃｒｔ：：ａｔｔＢphi80について示す図である。
【図８】（Ａ）実施例において構築した、ゲノム改変物Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐtac−ｍｖｋについて示す図である。（Ｂ）実施例において構築した、ゲノム改変物Δｃｒｔ：：Ｐtac−ｍｖｋについて示す図である。
【図９】（Ａ）実施例において構築した、ゲノム改変物ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐtac−ＫＤｙＩについて示す図である。（Ｂ）実施例において構築した、ゲノム改変物ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐtac−ＫＤｙＩについて示す図である。
【図１０】（Ａ）実施例において構築した、ゲノム改変物ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｐara−ｍｖａＥＳについて示す図である。（Ｂ）実施例において構築した、ゲノム改変物ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｐara−ｍｖａＥＳについて示す図である。
【図１１】実施例において用いたイソプレン回収装置の概要について示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（ポリイソプレンの製造方法）
以下、本発明のポリイソプレンの製造方法の実施形態について詳細に例示説明する。
本発明の一例のポリイソプレンの製造方法（以下、「一例の製造方法」ともいう）は、イソプレンと含酸素中性化合物とを含むイソプレン含有組成物と、希土類元素化合物と有機金属化合物とを含む重合触媒組成物とを用いて、イソプレンを重合させるものである。
【００１３】
−イソプレン含有組成物−
本発明の一例のポリイソプレンの製造方法において用いられるイソプレン含有組成物（以下、単に「イソプレン含有組成物」ともいう）は、イソプレンと含酸素中性化合物とを含む。
ここで、含酸素中性化合物は、イソプレンの重合に用いられる金属触媒の中心金属に配位すること等によって、触媒活性を向上させると考えられる。そして、このイソプレン含有組成物を用いるポリイソプレンの製造方法によれば、比較的高い分子量を有するポリイソプレンを製造することができる。
【００１４】
−−イソプレン−−
イソプレン含有組成物に含まれるイソプレンとしては、特に限定されることなく、化学的手法により得られたイソプレン（合成イソプレン）としてもよく、微生物を用いた手法により調製されるイソプレン（発酵イソプレン）としてもよい。
【００１５】
合成イソプレンは、通常、石油の分留においてＣ5留分として得ることができる。
発酵イソプレンは、例えば、後述の発酵法により得ることができ、この場合、発酵法による産物をそのままイソプレン含有組成物とすることができる。
【００１６】
合成イソプレン及び発酵イソプレンは、重合反応に用いられる前に、精製されることが好ましく、発酵イソプレンについてはその必要性が高い。
発酵イソプレンの精製方法としては、カラムクロマトグラフィー、蒸留等が挙げられ、特に、簡便性、経済性の観点から、カラムクロマトグラフィーが好ましい。
【００１７】
カラムクロマトグラフィーの場合、カラムの充填剤（固相）としては、活性アルミナ、シリカゲル、モレキュラーシーブ、還元銅等が挙げられ、特に、活性アルミナが好ましく、溶離液（液相）としては、炭化水素類が挙げられ、特に、ヘキサンが好ましい。
ここで、イソプレンに対する充填剤の重量割合としては、イソプレンの重合を阻害する不純物を十分に除去する観点から、０．１〜２．０が好ましく、０．５〜１．０が更に好ましい。精製時間としては、２〜８時間が好ましく、４〜６時間が更に好ましい。
【００１８】
−−含酸素中性化合物−−
含酸素中性化合物としては、エーテル、エステル、ケトン等が挙げられる。
エステルとしては、具体的には、酢酸エチル、酢酸メチル等が挙げられ、ケトンとしては、具体的には、メチルビニルケトン、メチルエチルケトン（２−ブタノン）、ジアセチル（２，３−ブタンジオン）、メチルイソブチルケトン等が挙げられる。特に、酢酸エチル、３−メチルフランが好ましい。
含酸素中性化合物として上記分類の化合物を選択すれば、比較的高い分子量を有するポリイソプレンを製造することができるという上記ポリイソプレンの製造方法の効果を高めることができる。
【００１９】
なお、イソプレン含有組成物は、上記のイソプレン及び含酸素中性化合物以外の成分も含んでもよい。
また、イソプレン含有組成物は、溶媒を含まないものを指し、例えば、上記のイソプレン及び含酸素中性化合物のみからなるものとしてもよい。
【００２０】
上記イソプレン含有組成物を用いるポリイソプレンの製造方法によれば、イソプレン以外に含酸素中性化合物が存在しながら、比較的高い分子量を有するポリイソプレンを製造することができる。これにより、製造した合成ポリイソプレンの強度を高めることができる。
【００２１】
ここで、イソプレン含有組成物は、イソプレンの重量が９８．５重量％以上であるイソプレン含有組成物である。上記割合は、本発明の効果を十分に得る観点から、９８．８重量％以上であることが好ましく、９９．０重量％以上であることが更に好ましい。
【００２２】
ここで、含酸素中性化合物の配合量は、比較的高い分子量を有するポリイソプレンを製造することができるという上記ポリイソプレンの製造方法の効果を十分に得る観点から、イソプレン１００重量部に対して０．０５重量部以上であることが好ましく、０．０７重量部以上であることが更に好ましく、０．１重量部以上であることが特に好ましい。また、含酸素中性化合物の配合量は、含酸素中性化合物が逆に触媒活性を低下させる虞を低減する観点から、１．０重量部以下であることが好ましく、０．７重量部以下であることが更に好ましく、０．５重量部以下であることが特に好ましい。
【００２３】
以下、前述の発酵イソプレンを生産するための発酵法について記載する。
発酵法では、イソプレン合成酵素（イソプレンシンターゼ）をコードする遺伝子を、宿主細胞に遺伝子導入することによって、宿主細胞の形質転換を行い、この形質転換体を培養して、イソプレンを生産させる。
そして、発酵法に従う一例の方法では、上記イソプレン合成酵素をコードする遺伝子以外に、イソプレン合成酵素の基質であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の合成に関与するメバロン酸（ＭＶＡ）経路、及び／又はメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関わる酵素群をコードする遺伝子も導入することによって、形質転換体を作製することが、イソプレンの生産量を増加させる観点から、好ましい。
更に、一例の方法では、更に、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換する能力を有するイソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼをコードする遺伝子も導入することによって、形質転換体を作製することが、イソプレンの生産量を増加させる観点から、好ましい。
【００２４】
発酵法において形質転換体中で発現される酵素は、宿主細胞の種と同種であってもよく、異種であってもよい。
本発明の一例として、宿主細胞としてパントエア・アナナティスを、イソプレン合成酵素としてムクナ由来のものを、メバロン酸経路に関与する酵素としてサッカロマイス・セレビシエ、エンテロコッカス・フェカリス、メタノセラ・パルディコラ由来のものを、イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼとしてサッカロマイス・セレビシエ由来のものを用いることが好ましい。この組み合わせによれば、イソプレンを高効率で生産することが可能となる。
【００２５】
［宿主］
一例の方法で用いられる宿主としては、イソプレン合成酵素（イソプレンシンターゼ）の基質であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の合成に関与するメバロン酸（ＭＶＡ）経路、及び／又はメチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に酵素群をコードする遺伝子を備えている限り、特に限定されることなく、あらゆる細胞が挙げられる。宿主としては、細菌又は真菌が好ましい。
【００２６】
細菌としては、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。
グラム陽性細菌としては、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属細菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌等が挙げられ、特に、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が好ましい。
ここで、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）等が挙げられ、特に、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｌｌｕｎａｅ）等が挙げられ、特に、コリネバクテリウム・グルタミカムが好ましい。
【００２７】
グラム陰性細菌としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属細菌、ビブリオ（Ｖｉｖｒｉｏ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられ、特に、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌が好ましい。
ここで、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、特に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）の株としては、当該技術分野において公知のものが挙げられ、例えば、ＤＨ５、ＪＭ１０９等が挙げられる。
パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・スチューアルティ（Ｐａｎｔｏｅａ  ｓｔｅｗａｒｔｉｉ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）等が挙げられ、特に、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）が好ましい。また、パントエア属細菌としては、欧州特許出願公開第０９５２２２１号明細書に開示される株も挙げられる。パントエア属細菌の代表的な株としては、例えば、欧州特許出願公開第０９５２２２１号明細書に開示される、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）、及びパントエア・アナナティスＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５）、及びパントエア・アナナティスＳＣ１７（０）株が挙げられる。パントエア・アナナティスＳＣ１７（０）は、２００５年９月２１日付でロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＶＫＰＭ），ＧＮＩＩ  Ｇｅｎｅｔｉｋａ）（Ｒｕｓｓｉａ，  １１７５４５  Ｍｏｓｃｏｗ，１  Ｄｏｒｏｚｈｎｙ  ｐｒｏｅｚｄ．１）に受託番号：ＶＫＰＭ  Ｂ−９２４６として寄託されている。
エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が挙げられ、特に、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｇｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）が好ましい。また、エンテロバクター属細菌としては、欧州特許出願公開第０９５２２２１号明細書に開示される株も挙げられる。エンテロバクター属細菌の代表的な株としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランスＡＴＣＣ１２２８７株、エンテロバクター・アエロゲネスＡＴＣＣ１３０４８株、エンテロバクター・アエロゲネスＮＢＲＣ１２０１０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００７  Ｍａｒ  ２７；９８（２）：３４０−３４８参照）、エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５）株等が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスＡＪ１１０６３７株は、２００７年８月２２日付で独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３４８として寄託され、２００８年３月１３日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５５の受領番号が付与されている。
【００２８】
真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属の微生物等が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物が好ましい。
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。
シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が好ましい。
ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が好ましい。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の微生物としては、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｔｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギフラキアム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）が挙げられ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）が好ましい。
【００２９】
宿主としては、上記細菌及び真菌の他に、例えば、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞等が挙げられる。
【００３０】
なお、上記宿主は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３１】
［イソプレン合成酵素（イソプレンシンターゼ）］
一例の方法で用いられるイソプレン合成酵素としては、葛（ｋｕｄｚｕ）（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ）由来イソプレン合成酵素（ＩｓｐＫ）、ポプラ由来イソプレン合成酵素、ムクナ（Ｍｕｃｕｎａ  ｐｒｕｒｉｅｎｓ）由来イソプレン合成酵素（ＩｓｐＭ）（ＵＳ２０１４０１１３３４４  Ａ１）、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ）由来イソプレン合成酵素、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）由来イソプレン合成酵素、フジ（Ｗｉｓｔｅｒｒｉａ）由来イソプレン合成酵素、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ）由来イソプレン合成酵素、茶ノ木（Ｍｅｌａｌｅｕｃａ  ａｌｔｅｒｎｉｆｌｏｒａ）由来イソプレン合成酵素等が挙げられる（例えば、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ６７  （４），１０２６−１０４０（２０１３）参照）。好ましい実施形態では、イソプレン合成酵素は、葛に由来してよく、別の好ましい実施形態では、イソプレン合成酵素は、ポプラに由来してよく、更に別の好ましい実施形態では、イソプレン合成酵素は、ムクナに由来してよい。
なお、上記イソプレン合成酵素は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３２】
［メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関わる酵素］
メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関わる酵素としては、例えば、メバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．１．３６；例１、Ｅｒｇ１２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９３５；例２、ＡＴ５Ｇ２７４５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０４１１）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＣ：２．７．４．２；例１、Ｅｒｇ８ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３９４７；例２、ＡＴ１Ｇ３１９１０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１８５１２４）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．３３；例１、Ｍｖｄ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１４４４１；例２、ＡＴ２Ｇ３８７００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８１４０４；例３、ＡＴ３Ｇ５４２５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６９９５）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．３．１．９；例１、Ｅｒｇ１０ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２９７；例２、ＡＴ５Ｇ４７７２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０３２０２８；例３、ＡＴ５Ｇ４８２３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６８６９４）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ：２．３．３．１０；例１、Ｅｒｇ１３ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５８０；例２、ＡＴ４Ｇ１１８２０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９２９１９；例３、ＭｖａＳ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３８）、ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．３４；例１、Ｈｍｇ２ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３５５５；例２、Ｈｍｇ１ｐ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１３６３６；例３、ＡＴ１Ｇ７６４９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７７７７５；例４、ＡＴ２Ｇ１７３７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１７９３２９、ＥＣ：１．１．１．８８、例、ＭｖａＡ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  Ｐ１３７０２）、アセチル−ＣｏＡ−Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ／ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡリダクターゼ（ＥＣ：２．３．１．９／１．１．１．３４、例、ＭｖａＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３９）等が挙げられる。
メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関わる酵素は、例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）等のメタノサルシナ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）等のメタノセラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ）属、コリネバクテリウム・ヴァリアビル（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｒｉａｂｉｌｅ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、メタノセタ・コンキリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ  ｃｏｎｃｉｌｉｉ）等のメタノセタ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａ）属、及びニトロソプミラス・マリチマス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ  ｍａｒｉｔｉｍｕｓ）等のニトロソプミラス（Ｎｉｔｒｏｓｏｐｕｍｉｌｕｓ）属に属する微生物由来の遺伝子から発現されるもの等が挙げられる。
なお、上記メバロン酸（ＭＶＡ）経路に関わる酵素は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
［メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関わる酵素］
メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関わる酵素としては、例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ピルビン酸塩とＤ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェートとから１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−ホスフェートを合成する）（ＥＣ：２．２．１．７、例１、Ｄｘｓ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４９５４；例２、ＡＴ３Ｇ２１５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６６６８６；例３、ＡＴ４Ｇ１５５６０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９３２９１；例４、ＡＴ５Ｇ１１３８０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１０７８５７０）、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＥＣ：１．１．１．２６７；例１、Ｄｘｒ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４７１５；例２、ＡＴ５Ｇ６２７９０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１９０６００）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＥＣ：２．７．７．６０；例１、ＩｓｐＤ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２７；例２、ＡＴ２Ｇ０２５００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６５２８６）、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＥＣ：２．７．１．１４８；例１、ＩｓｐＥ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１５７２６；例２、ＡＴ２Ｇ２６９３０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８０２６１）、２−Ｃ−メチル―Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロニリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．６．１．１２；例１、ＩｓｐＦ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７２２６；例２、ＡＴ１Ｇ６３９７０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６４８１９）、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−ニリン酸シンターゼ（ＥＣ：１．１７．７．１；例１、ＩｓｐＧ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７０１０；例２、ＡＴ５Ｇ６０６００、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿００１１１９４６７）、４−ヒドロキシ−３−メチル−２−ブテニル二リン酸レダクターゼ（ＥＣ：１．１７．１．２；例１、ＩｓｐＨ、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１４５７０；例２、ＡＴ４Ｇ３４３５０、ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿５６７９６５）等が挙げられる。
ＭＥＰ経路は原核微生物や植物に広く存在する事が知られており、これらの生物由来の酵素を利用することが可能である（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｍｅｖａｌｏｎａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ，  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６１，  １４０１−１４２６，  ２００４）。一例として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属の生物由来の遺伝子から発現されるもの等が挙げられる。
なお、上記メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路に関わる酵素は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３４】
［イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ］
イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼ（イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ）としては、例えば、Ｉｄｉ１ｐ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿０１５２０８）、ＡＴ３Ｇ０２７８０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１８６９２７）、ＡＴ５Ｇ１６４４０（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿１９７１４８）、及びＩｄｉ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＩＤ  ＮＰ＿４１７３６５）等が挙げられる。
【００３５】
本発明において用いられる発酵法では、上記酵素以外の酵素や、酵素以外のタンパク質も、必要に応じて用いることができる。
【００３６】
上記の酵素やタンパク質の機能を有する限り、上記の酵素やタンパク質のもののアミノ酸配列を有する上記の酵素やタンパク質に限定されることなく、上記の酵素やタンパク質の改変体も用いることができる。改変体としては、例えば、１個又は複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加等を有するものが挙げられる。
なお、「１個又は複数個」とは、置換、欠失、挿入、付加等に係るアミノ酸残基の種類や、そのアミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置により異なるが、１〜１０個を指し、好適には１〜５個、更に好適には１〜３個、更に特に好適には１〜２個を指す。
【００３７】
置換を有するものとしては、特に、保存的置換を有するものが挙げられる。
「保存的置換」とは、類似の性質を有するアミノ酸間での置換を指し、具体的には、芳香族アミノ酸の場合には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間での置換、疎水性アミノ酸の場合には、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間での置換、極性アミノ酸の場合には、Ｇｌｎ、Ａｓｎ間での置換、塩基性アミノ酸の場合には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間での置換、酸性アミノ酸の場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ間での置換、ヒドロキシル基を持つアミノ酸の場合には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ間での置換を指す。
保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、ＡｌａからＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及び、ＶａｌからＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。
【００３８】
上記の酵素やタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列（ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列）は、当該技術分野において公知である。
この塩基配列は、その塩基配列にコードされる酵素やタンパク質の機能を有する限り、上記の塩基配列そのものに限定されることなく、上記の塩基配列の変異体も用いることができる。
【００３９】
変異体は、天然おいて生じる変異により得られたものでもよく、人工的な変異（例えば、部位特異的変異導入）により得られたものでもよい。
【００４０】
塩基配列の変異体の本来の塩基配列に対する同一性は、８０％以上、好適には９０％以上、更に好適には９５％以上、更に特に好適には９７％以上である。
【００４１】
塩基配列の変異体は、元の塩基配列にコードされる酵素やタンパク質の機能を有する限り、当該技術分野において公知の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする、その塩基配列に相補的な塩基配列、及びその一部からなるプローブとすることもできる。
「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションが生じ、非特異的なハイブリダイゼーションが生じない条件を指す。この条件としては、例えば、高い配列同一性、例えば、８０％以上、好適には９０％以上、更に好適には９５％以上、更に特に好適には９７％以上の配列同一性を有するＤＮＡ同士はハイブリダイズするが、低い配列同一性、例えば、８０％未満の配列同一性を有するＤＮＡ同士はハイブリダイズしない条件や、サザンハイブリダイゼーション実験における洗浄操作の通常の条件である、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件、好適には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件、更に好適には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの条件で、１回、好適には２〜３回洗浄した場合に、ハイブリダイズを維持することができる条件等が挙げられる。
【００４２】
上記の酵素やタンパク質のアミノ酸をコードするコドンは、酵素やタンパク質の発現を行う宿主におけるコドンの使用頻度に応じて、変更することができ、これにより、上記の酵素やタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を変更することができる。
【００４３】
［遺伝子導入の方法］
一例の方法で用いられる遺伝子導入の方法としては、当該技術分野において公知の方法が挙げられる。
このような方法としては、例えば、酵素等の目的タンパク質をコードする遺伝子を有するプラスミドベクターを、塩化カルシウムで処理された菌体（コンピテントセル）を用いる手法やエレクトロポレーション法等により、宿主細胞に導入する方法、目的タンパク質をコードする遺伝子が導入されたファージベクターを菌体に感染させることによって菌の染色体中に導入する方法等が挙げられる。
【００４４】
本発明における遺伝子導入では、目的遺伝子の染色体上でのコピー数を増加させることによって、目的タンパク質の活性を強化することが好ましい。宿主となる微生物が本来保有していない酵素の遺伝子を導入する場合は、微生物は染色体上にその遺伝子を１コピー以上備えていることが好ましく、また、宿主となる微生物が保有している酵素の遺伝子を導入する場合は、微生物は染色体上にその遺伝子を複数コピー、望ましくは２コピー以上、更に望ましくは３コピー以上備えていることが好ましい。
本発明における遺伝子導入では、目的遺伝子の導入を、宿主細胞にその遺伝子を搭載しているプラスミドを導入することによっても、達成することができる。
ここで、コピー数の増加は、トランスポゾン、Ｍｕファージ等を利用して、宿主のゲノム上に目的遺伝子を転移させることによっても達成することができる。
【００４５】
ここで、ベクターとしては、特に限定されることなく、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。ベクターは、ＤＮＡベクターであってもＲＮＡベクターであってもよい。ベクターとしては、モノシストロニックベクター、バイシストロニックベクター、ポリシストロニックベクター等が挙げられる。
ベクターは、用いられる宿主に応じて適宜選択されてよく、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合には、ｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミド等が挙げられる。
【００４６】
ベクターの構築は、制限酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ライゲース等の酵素を適宜用いて、ＰＣＲ法、クロスオーバーＰＣＲ法、ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法、λ−Ｒｅｄ法等の遺伝子工学的手法を用いて行うことができる。
【００４７】
なお、前述の遺伝子導入に用いられるシステムは、常法により、下記の培養において目的遺伝子の発現を誘導することが可能となるように、構築することが好ましい。かかる誘導としては、例えば、ＩＰＴＧ誘導、アラビノース誘導等が挙げられる。ここで、ベクター中に用いられるプロモーターとしては、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等が挙げられる。
【００４８】
なお、本発明においては、イソプレン合成酵素を上述のベクターにより、パントエア・アナナティスの細胞質に導入し、更に、メバロン酸経路上流に関与する酵素を人工オペロンとして、メバロン酸経路下流に関与する酵素のうち、メバロン酸キナーゼは単独で、それ以外の酵素は人工オペロンとして染色体固定により、パントエア・アナナティスの染色体に固定することが好ましい。
【００４９】
以下、形質転換体の培養の詳細について記載する。
［培養方法］
形質転換体の培養方法としては、バッチ培養（回分培養）、流加培養（半回分培養）、連続培養（灌流培養）等が挙げられ、特に、イソプレンの工業的な生産を可能にする観点から、流加培養、連続培養が好ましい。
【００５０】
バッチ培養とは、１回の培養ごとに新たな培地を準備し、そこに形質転換体を加えることによって、培養を行い、ここで、培地等の追加は行わない方法である。バッチ培養では、形質転換体は、遅滞期、対数増殖期、定常期という増殖サイクルを辿り、イソプレンの生産量は、対数増殖期や定常期において高くなる。
【００５１】
流加培養とは、培地に形質転換体を加えて培養を行い、培養中に培地や培地の成分を適宜追加する方法である。流加培養では、細胞密度を調節することによって増殖速度を最適化したり、培地に蓄積した有害物質等を希釈することによってイソプレンの生産性を維持したりすることができる。
【００５２】
連続培養とは、一定の速度で培養槽に所定量の培地を連続的に供給しながら、同時に同量の培養液を抜き取る培養法である。連続培養では、培養環境を一定に維持することができる。より具体的には、この培養によれば、培養液中の形質転換体を主として対数増殖期に維持することができるため、イソプレンの生産性を維持しやすく、また、形質転換体の生育に悪影響を及ぼす可能性のある、代謝副産物及び死細胞の培地中での蓄積を防ぐことができる。
【００５３】
［培養条件］
培養条件としては、本発明のタンパク質の発現が可能な条件であれば、特に限定されず、標準的な細胞培養条件を用いることができる。
宿主細胞の性質に応じて、好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うこともできる。
培養温度としては、２０℃〜３７℃が好ましく、培養雰囲気としては、ＣＯ2濃度約６％〜約８４％であることが好ましく、ｐＨとしては、約５〜約９であることが好ましい。
【００５４】
［培地］
一例の方法で用いられる培地としては、天然培地、合成培地が挙げられ、少なくともイソプレン骨格を形成するための炭素源を含む培地であり、任意選択的に、窒素源、有機微量栄養源、無機物（ミネラル）等を含む培地としてよい。
炭素源としては、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、転化糖等の炭水化物；炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；脂質（オイル等）；脂肪酸；グリセリン脂肪酸エステル；ポリペプチド；再生可能な炭素源；酵母エキス；リン脂質；グリセロ脂質；グリセロール；アセテート等が挙げられる。
これらの炭素源は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００５５】
炭素源についての詳細を以下に記載する。
炭水化物のうちの単糖類としては、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）、アルドトリオース（グリセルアルデヒド）等のトリオース；ケトテトロース（エリトルロース）、アルドテトロース（エリトロース、トレオース）等のテトロース；ケトペントース（リブロース、キシルロース）、アルドペントース（リボース、アラビノース、キシロース、リキソース）、デオキシ糖（デオキシリボース）等のペントース；ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース）、デオキシ糖（フコース、フクロース、ラムノース）等のヘキソース；セドヘプツロース等のヘプトースが挙げられ、フルクトース、マンノース、ガラクトース、グルコース等のＣ６糖；キシロース、アラビノース等のＣ５糖の炭水化物が好ましい。
二糖類としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノース、セロビオース等が挙げられ、スクロース、ラクトースが好ましい。
オリゴ糖類としては、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース等の三糖類；アカルボース、スタキオース等の四糖類；フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、マンナンオリゴ糖（ＭＯＳ）等のその他のオリゴ糖類が挙げられる。
多糖類としては、グリコーゲン、デンプン（アミロース、アミロペクチン）、セルロース、デキストリン、グルカン（β１，３−グルカン）が挙げられ、デンプン、セルロースが好ましい。
転化糖としては、ショ糖を加水分解したものが挙げられる。
炭素数が１の化合物（Ｃ1化合物）としては、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等が挙げられる。
脂質としては、Ｃ4以上の飽和脂肪酸及び／又は不飽和脂肪酸を１以上含む物質が挙げられ、特に、室温で液体であるオイルが好ましい。
ここで、オイルとしては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁、油性微生物細胞、ナンキンハゼ等の植物性オイル、及び動物性オイルが挙げられる。
脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨ（「Ｒ」は炭化水素基を表す。）で表される化合物が挙げられ、不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸が挙げられる。ここで、不飽和脂肪酸は、「Ｒ」に少なくとも１の炭素−炭素二重結合を有する化合物であり、例えば、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミテライジン酸、アラキドン酸等が挙げられる。飽和脂肪酸は、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物であり、例えば、ドコサン酸、イコサン酸、オクタデカン酸、ヘキサデカン酸、テトラデカン酸、ドデカン酸等が挙げられる。脂肪酸としては、Ｃ2〜Ｃ22の脂肪酸が好ましく、特に、Ｃ12脂肪酸、Ｃ14脂肪酸、Ｃ16脂肪酸、Ｃ18脂肪酸、Ｃ20脂肪酸、Ｃ22脂肪酸が更に好ましい。
これら脂肪酸の塩、誘導体、誘導体の塩も挙げられる。塩としては、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩等が挙げられる。
グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等が挙げられる。
ポリペプチドとしては、微生物性ポリペプチド、植物性ポリペプチド等が挙げられ、ここで、微生物性ポリペプチドとしては、酵母又は細菌由来のポリペプチド等が挙げられ、植物性ポリペプチドとしては、大豆、コーン、キャノーラ、ジャトロファ、パーム、ピーナッツ、ヒマワリ、ココナッツ、マスタード、綿実、パーム核油、オリーブ、紅花、ゴマ、亜麻仁由来のポリペプチド等が挙げられる。
再生可能な炭素源としては、バイオマス炭素源が挙げられ、特に、その全部又は一部が加水分解されたバイオマス炭素源が好ましい。ここで、バイオマス炭素源としては、木、紙、及びパルプの廃材、葉状植物、果肉等のセルロース系基質；柄、穀粒、根、塊茎等の植物の一部分が挙げられる。バイオマス炭素源として用いられる植物としては、コーン、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケイト、コメ、アワ、大麦、キャッサバ、エンドウマメ等のマメ科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、タピオカ等が挙げられる。なお、バイオマス等の再生可能な炭素源を培地中に用いる際には、前処理を行うことが好ましく、前処理としては、酵素的前処理、化学的前処理、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５６】
例えば、炭素源としては、脂質、オイル、油脂、脂肪酸、グリセリン脂肪酸エステルとグルコース等の炭水化物との組み合わせが挙げられる。
また、炭素源としては、酵母エキス、又は酵母エキスと、グルコース等の他の炭素源との組み合わせが挙げられ、酵母エキスと、二酸化炭素やメタノール等のＣ1化合物との組み合わせが好ましい。
【００５７】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質又は酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。
無機物（ミネラル）としては、これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００５８】
一例の方法で用いられる培地としては、市販の標準培地が好ましい。
標準培地としては、特に限定されることなく、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロス、Ｙｅａｓｔ  ｍｅｄｉｕｍ（ＹＭ）ブロス等の既成培地が挙げられる。特定の宿主の培養に適した培地を適宜選択して用いることができる。
【００５９】
培養された形質転換体により生産されるイソプレンは、ガスとして発酵槽中に放出される。イソプレンガスは、集気装置に取り込み、冷却装置付きの蒸気トラップ等を用いた冷却により液化させることによって、液体のイソプレンとして回収することができる。このとき、イソプレンガスを、主としてイソプレンを吸着する吸着剤（例えば、疎水性シリカゲル等）に通し、その後、吸着時よりも圧力を下げることによって、イソプレンを主成分とするガスを回収することができる（国際公開第２０１４／１５６９９７号）。また、イソプレンガスは、水分を除去するために、冷却による水分の凝縮除去を行うことが好ましい。
イソプレン回収装置としては、例えば、後述の実施例に記載の装置が挙げられる。
以上、発酵法について記載した。
【００６０】
−重合触媒組成物−
以下、本発明の一例のポリイソプレンの製造方法において用いられる重合触媒組成物の一例について記載する。
この重合触媒組成物は、
・希土類元素化合物（以下、「（Ａ）成分」ともいう）と、
・有機金属化合物（以下、「（Ｂ）成分」ともいう）と
を含むことを必要とする。
ここで、この重合組成物は、更に、
・アルミノキサン化合物（以下、「（Ｃ）成分」ともいう）と、
・ハロゲン化合物（以下、「（Ｄ）成分」ともいう）と、
・イオン性化合物（以下、「（Ｅ）成分」ともいう）と
・アニオン性配位子となり得る化合物（以下、「（Ｆ）成分」ともいう）と
を含んでもよい。
【００６１】
−−希土類元素化合物（（Ａ）成分）−−
（Ａ）成分は、金属−窒素結合（Ｍ−Ｎ結合）を有する、希土類元素含有化合物又は該希土類元素含有化合物とルイス塩基との反応物とすることができる。
なお、希土類元素含有化合物としては、例えば、スカンジウム、イットリウム、又は原子番号５７〜７１の元素から構成されるランタノイド元素を含有する化合物等が挙げられる。ランタノイド元素とは、具体的には、ランタニウム、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミニウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウムである。
またなお、ルイス塩基としては、例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、ジメチルアニリン、トリメチルホスフィン、塩化リチウム、中性のオレフィン類、中性のジオレフィン類等が挙げられる。
【００６２】
ここで、希土類元素含有化合物又は該希土類元素含有化合物とルイス塩基との反応物は、希土類元素と炭素との結合を有しないことが好ましい。希土類元素含有化合物とルイス塩基との反応物が希土類元素−炭素結合を有さない場合、反応物が安定であり、取り扱いが容易である。
【００６３】
なお、上記（Ａ）成分は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６４】
ここで、（Ａ）成分は、式（Ｓ１）
Ｍ−（ＮＱ1）（ＮＱ2）（ＮＱ3）  ・・・（Ｓ１）
（式中、Ｍは、スカンジウム、イットリウム、ランタノイド元素からなる群から選択される少なくとも１種の元素を表し；ＮＱ1、ＮＱ2及びＮＱ3は、アミド基を表し、それぞれ同一であっても異なっていてもよく；３つのＭ−Ｎ結合を有する）
で表される化合物であることが好ましい。
【００６５】
上記構成によれば、（Ａ）成分を３つのＭ−Ｎ結合を有する化合物とすることができ、各結合が化学的に等価となり、化合物の構造が安定となるため、取り扱いが容易となる。また、上記構成とすれば、反応系における触媒活性を更に向上させることができる。そのため、反応時間を更に短くし、反応温度を更に高くすることができる。
ＮＱ1、ＮＱ2及びＮＱ3で表されるアミド基としては、例えば、ジメチルアミド基、ジエチルアミド基、ジイソプロピルアミド基等の脂肪族アミド基；フェニルアミド基、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアミド基、２，６−ジイソプロピルフェニルアミド基、２，６−ジネオベンチルフェニルアミド基、２−ｔｅｒｔ−ブチル−６−イソプロピルフェニルアミド基、２−ｔｅｒｔ−ブチル−６−ネオベンチルフェニルアミド基、２−イソプロピル−６−ネオベンチルフェニルアミド基、２，４，６−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルアミド基等のアリールアミド基；ビストリメチルシリルアミド基等のビストリアルキルシリルアミド基が挙げられ、特に、ビストリメチルシリルアミド基が好ましい。
上記アミド基は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６６】
−−有機金属化合物（（Ｂ）成分）−−
（Ｂ）成分は、式（Ｓ２）
ＹＲ4aＲ5bＲ6c  ・・・（Ｓ２）
（式中、Ｙは、第１族、第２族、第１２族、及び第１３族からなる群から選択される金属元素であり；Ｒ4及びＲ5は、炭素数１〜１０の炭化水素基又は水素原子であり、同一であっても異なっていてもよく；Ｒ6は、炭素数１〜１０の炭化水素基であり；Ｒ6は上記Ｒ4又はＲ5と同一であっても異なっていてもよく；Ｙが第１族の金属元素である場合には、ａは１であり且つｂ及びｃは０であり、Ｙが第２族の金属元素及び第１２族の金属元素である場合には、ａ及びｂは１であり且つｃは０であり、Ｙが第１３族の金属元素である場合には、ａ、ｂ及びｃは１である）
で表される化合物である。
【００６７】
（Ｂ）成分は、式（Ｓ３）
ＡｌＲ7Ｒ8Ｒ9  ・・・（Ｓ３）
（式中、Ｒ7及びＲ8は、炭素数１〜１０の炭化水素基又は水素原子であり、同一であっても異なっていてもよく；Ｒ9は、炭素数１〜１０の炭化水素基であり；Ｒ9は上記Ｒ7又はＲ8と同一であっても異なっていてもよい）
で表される有機アルミニウム化合物であることが好ましい。
上記有機アルミニウム化合物としては、例えば、トリメチルアルミニウム、トリエチルアルミニウム、トリ−ｎ−プロピルアルミニウム、トリイソプロピルアルミニウム、トリ−ｎ−ブチルアルミニウム、トリイソブチルアルミニウム、トリ−ｔ−ブチルアルミニウム、トリペンチルアルミニウム、トリヘキシルアルミニウム、トリシクロヘキシルアルミニウム、トリオクチルアルミニウム；水素化ジエチルアルミニウム、水素化ジ−ｎ−プロピルアルミニウム、水素化ジ−ｎ−ブチルアルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、水素化ジヘキシルアルミニウム、水素化ジイソヘキシルアルミニウム、水素化ジオクチルアルミニウム、水素化ジイソオクチルアルミニウム；エチルアルミニウムジハイドライド、ｎ−プロピルアルミニウムジハイドライド、イソブチルアルミニウムジハイドライド等が挙げられ、特に、トリエチルアルミニウム、トリイソブチルアルミニウム、水素化ジエチルアルミニウム、水素化ジイソブチルアルミニウムが好ましい。
上記有機アルミニウム化合物は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６８】
−−アルミノキサン化合物（（Ｃ）成分）−−
（Ｃ）成分は、有機アルミニウム化合物と縮合剤とを接触させることによって得られる化合物である。
（Ｃ）成分を用いることによって、重合反応系における触媒活性を更に向上させることができる。そのため、反応時間を更に短くし、反応温度を更に高くすることができる。
【００６９】
ここで、有機アルミニウム化合物としては、例えば、トリメチルアルミニウム、トリエチルアルミニウム、トリイソブチルアルミニウム等のトリアルキルアルミニウム、及びその混合物等が挙げられ、特に、トリメチルアルミニウム、トリメチルアルミニウムとトリイソブチルアルミニウムとの混合物が好ましい。
縮合剤としては、当技術分野において通常使用されるものが挙げられる。
【００７０】
（Ｃ）成分としては、例えば、式（Ｓ４）
−（Ａｌ（Ｒ10）Ｏ）n−  ・・・（Ｓ４）
（式中、Ｒ10は、炭素数１〜１０の炭化水素基であり、ここで、炭化水素基の一部はハロゲン及び／又はアルコキシ基で置換されてもよく；Ｒ10は、繰り返し単位間で同一であっても異なっていてもよく；ｎは５以上である）
で表されるアルミノキサンを挙げることができる。
【００７１】
上記アルミノキサンの分子構造は、直鎖状であっても環状であってもよい。また、ｎは１０以上であることが好ましい。更に、Ｒ10の炭化水素基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソブチル基等が挙げられ、特に、メチル基が好ましい。上記炭化水素基は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。Ｒの炭化水素基としては、メチル基とイソブチル基との組み合わせが好ましい。
【００７２】
（Ｃ）成分としては、ＴＭＡＯ、例えば、東ソー・ファインケム社製の製品名：ＴＭＡＯ−３４１が挙げられる。
また、（Ｃ）成分としては、ＭＭＡＯ、例えば、東ソー・ファインケム社製の製品名：ＭＭＡＯ−３Ａが挙げられる。
更に、（Ｃ）成分としては、ＰＭＡＯ、例えば、東ソー・ファインケム社製の製品名：ＴＭＡＯ−２１１も挙げられる。
【００７３】
これらのうち、触媒活性を向上させる効果を高める観点から、ＴＭＡＯ、ＭＭＡＯが好ましく、触媒活性を向上させる効果を更に高める観点から、ＴＭＡＯが、更に好ましい。
【００７４】
−−ハロゲン化合物（（Ｄ）成分）−−
（Ｄ）成分は、ルイス酸であるハロゲン含有化合物（以下、「（Ｄ−１）成分」ともいう）、金属ハロゲン化物とルイス塩基との錯化合物（以下、「（Ｄ−２）成分」ともいう）、及び活性ハロゲンを含む有機化合物（以下、「（Ｄ−３）成分」ともいう）からなる群から選択される少なくとも１種の化合物である。
【００７５】
これらの化合物は、（Ａ）成分、すなわち、Ｍ−Ｎ結合を有する、希土類元素含有化合物又は該希土類元素含有化合物とルイス塩基との反応物と反応して、カチオン性遷移金属化合物、ハロゲン化遷移金属化合物、及び／又は遷移金属中心において電子が不足した状態の遷移金属化合物を生成する。
（Ｄ）成分を用いることによって、ポリイソプレンのシス−１，４−結合含量を向上させることができる。
【００７６】
（Ｄ−１）成分としては、例えば、第３族、第４族、第５族、第６族、第８族、第１３族、第１４族又は第１５族の元素を含むハロゲン含有化合物等が挙げられ、特に、アルミニウムのハロゲン化物又は有機金属のハロゲン化物が好ましい。
ルイス酸であるハロゲン含有化合物としては、例えば、四塩化チタン、六塩化タングステン、トリ（ペンタフルオロフェニル）ボレート、メチルアルミニウムジブロマイド、メチルアルミニウムジクロライド、エチルアルミニウムジブロマイド、エチルアルミニウムジクロライド、ブチルアルミニウムジブロマイド、ブチルアルミニウムジクロライド、ジメチルアルミニウムブロマイド、ジメチルアルミニウムクロライド、ジエチルアルミニウムブロマイド、ジエチルアルミニウムクロライド、ジブチルアルミニウムブロマイド、ジブチルアルミニウムクロライド、メチルアルミニウムセスキブロマイド、メチルアルミニウムセスキクロライド、エチルアルミニウムセスキブロマイド、エチルアルミニウムセスキクロライド、アルミニウムトリブロマイド、トリ（ペンタフルオロフェニル）アルミニウム、ジブチル錫ジクロライド、四塩化錫、三塩化リン、五塩化リン、三塩化アンチモン、五塩化アンチモン等が挙げられ、特に、エチルアルミニウムジクロライド、エチルアルミニウムジブロマイド、ジエチルアルミニウムクロライド、ジエチルアルミニウムブロマイド、エチルアルミニウムセスキクロライド、エチルアルミニウムセスキブロマイドが好ましい。
ハロゲンとしては、塩素又は臭素が好ましい。
上記ルイス酸であるハロゲン含有化合物は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００７７】
（Ｄ−２）成分に用いられる金属ハロゲン化物としては、例えば、塩化ベリリウム、臭化ベリリウム、ヨウ化ベリリウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、塩化カドミウム、臭化カドミウム、ヨウ化カドミウム、塩化水銀、臭化水銀、ヨウ化水銀、塩化マンガン、臭化マンガン、ヨウ化マンガン、塩化レニウム、臭化レニウム、ヨウ化レニウム、塩化銅、ヨウ化銅、塩化銀、臭化銀、ヨウ化銀、塩化金、ヨウ化金、臭化金等が挙げられ、特に、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化バリウム、塩化亜鉛、塩化マンガン、塩化銅が好ましく、更に特に、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、塩化マンガン、塩化銅が好ましい。
（Ｄ−２）成分に用いられるルイス塩基としては、リン化合物、カルボニル化合物、窒素化合物、エーテル化合物、アルコールが好ましい。
例えば、リン酸トリブチル、リン酸トリ−２−エチルヘキシル、リン酸トリフェニル、リン酸トリクレジル、トリエチルホスフィン、トリブチルホスフィン、トリフェニルホスフィン、ジエチルホスフィノエタン、ジフェニルホスフィノエタン、アセチルアセトン、ベンゾイルアセトン、プロピオニトリルアセトン、バレリルアセトン、エチルアセチルアセトン、アセト酢酸メチル、アセト酢酸エチル、アセト酢酸フェニル、マロン酸ジメチル、マロン酸ジエチル、マロン酸ジフェニル、酢酸、オクタン酸、２−エチルヘキサン酸、オレイン酸、ステアリン酸、安息香酸、ナフテン酸、バーサチック酸（シェル化学社製の商品名、Ｃ10モノカルボン酸の異性体の混合物から構成される合成酸）、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジフェニルエーテル、２−エチルヘキシルアルコール、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、フェノール、ベンジルアルコール、１−デカノール、ラウリルアルコール等が挙げられ、特に、リン酸トリ−２−エチルヘキシル、リン酸トリクレジル、アセチルアセトン、２−エチルヘキサン酸、バーサチック酸、２−エチルヘキシルアルコール、１−デカノール、ラウリルアルコールが好ましい。
上記ルイス塩基のモル数は、上記金属ハロゲン化物１モル当たり、０．０１〜３０モル、好ましくは０．５〜１０モルの割合で反応させる。このルイス塩基との反応物を使用すると、ポリマー中に残存する金属を低減することができる。
【００７８】
（Ｄ−３）成分としては、例えば、ベンジルクロライド等が挙げられる。
【００７９】
−−イオン性化合物（（Ｅ）成分）−−
（Ｅ）成分は、非配位性アニオンとカチオンとからなるものである。
上記非配位性アニオンとしては、４価のホウ素アニオン、例えば、テトラフェニルボレート、テトラキス（モノフルオロフェニル）ボレート、テトラキス（ジフルオロフェニル）ボレート、テトラキス（トリフルオロフェニル）ボレート、テトラキス（テトラフルオロフェニル）ボレート、テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボレート、テトラキス（テトラフルオロメチルフェニル）ボレート、テトラ（トリル）ボレート、テトラ（キシリル）ボレート、（トリフェニル、ペンタフルオロフェニル）ボレート、［トリス（ペンタフルオロフェニル）、フェニル］ボレート、トリデカハイドライド−７，８−ジカルバウンデカボレート等が挙げられる。
上記非配位性アニオンは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
上記カチオンとしては、カルボニウムカチオン、オキソニウムカチオン、アンモニウムカチオン、ホスホニウムカチオン、シクロヘプタトリエニルカチオン、遷移金属を有するフェロセニウムカチオン等が挙げられる。ここで、カルボニウムカチオンとしては、トリフェニルカルボニウムカチオン、トリ（置換フェニル）カルボニウムカチオン等の三置換カルボニウムカチオン等が挙げられる。また、トリ（置換フェニル）カルボニルカチオンとしては、トリ（メチルフェニル）カルボニウムカチオン、トリ（ジメチルフェニル）カルボニウムカチオン等が挙げられる。
アンモニウムカチオンとしては、トリメチルアンモニウムカチオン、トリエチルアンモニウムカチオン、トリプロピルアンモニウムカチオン、トリブチルアンモニウムカチオン等のトリアルキルアンモニウムカチオン；Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリニウムカチオン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリニウムカチオン、Ｎ，Ｎ−２，４，６−ペンタメチルアニリニウムカチオン等のＮ，Ｎ−ジアルキルアニリニウムカチオン；ジイソプロピルアンモニウムカチオン、ジシクロヘキシルアンモニウムカチオン等のジアルキルアンモニウムカチオン等が挙げられる。
ホスホニウムカチオンとしては、トリフェニルホスホニウムカチオン、トリ（メチルフェニル）ホスホニウムカチオン、トリ（ジメチルフェニル）ホスホニウムカチオン等のトリアリールホスホニウムカチオン等が挙げられる。
上記カチオンは、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８０】
特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリニウムテトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボレート、トリフェニルカルボニウムテトラキス（ペンタフルオロフェニル）ボレート等が好ましい。
【００８１】
−−アニオン性配位子となり得る化合物（（Ｆ）成分）−−
（Ｆ）成分としては、例えば、式（Ｓ５）に示されるアニオン性三座配位子前駆体が挙げられる（Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ，２３，ｐ  ４７７８４７８７  （２００４）参照）。
【化１】
2016174875.tif 000003
・・・（Ｓ５）
（式中、Ｒは、アルキル基又はアリール基、Ｙは、水素、アルキル基、ハロゲン、シリル基からなる群から選択される少なくとも１つを示す。）
具体的には、ビス（２−ジフェニルホスフィノフェニル）アミン等のＰＮＰ配位子が挙げられる。
【００８２】
本発明のポリイソプレンの製造方法によれば、比較的高い分子量を有するポリイソプレンを製造することができるという本発明のイソプレン含有組成物の効果を得ることができる。
【００８３】
以下、本発明の一例のポリイソプレンの製造方法において用いられる重合触媒組成物の各成分間の重量割合について記載する。
【００８４】
（Ｂ）成分（有機金属化合物）の（Ａ）成分に対するモルにおける割合は、反応系における触媒活性を向上させる観点から、１〜５０であることが好ましい。
【００８５】
（Ｃ）成分（アルミノキサン）中のアルミニウムの、（Ａ）成分中の希土類元素に対するモルにおける割合は、反応系における触媒活性を向上させる観点から、１０〜１０００であることが好ましい。
【００８６】
（Ｄ）成分（ハロゲン化合物）の（Ａ）成分に対するモルにおける割合は、反応系における触媒活性を向上させる観点から、０．１〜５０であることが好ましい。
【００８７】
（Ｅ）成分（イオン性化合物）の（Ａ）成分に対するモルにおける割合は、反応系における触媒活性を向上させる観点から、０．１〜１０であることが好ましい。
【００８８】
ここで、本発明の一例のポリイソプレンの製造方法では、重合反応を十分に活性化する観点から、希土類元素化合物の配合量がイソプレン含有組成物１００重量部に対して０．０１８重量部以上であることが好ましく、０．０２重量部以上であることが更に好ましく、０．５５重量部以上であることが好ましく、０．６重量部以上であることが更に好ましく、０．６５重量部以上であることがより好ましく、０．７重量部以上であることが特に好ましい。また、逆に重合反応を不活性化する虞を低減する観点から、イソプレン含有組成物１００重量部に対して０．９５重量部以下であることが好ましく、０．９重量部以下であることが更に好ましく、０．８５重量部以下であることがより好ましく、０．８重量部以下であることが特に好ましい。
【００８９】
ここで、本発明の一例のポリイソプレンの製造方法では、重合反応を十分に活性化する観点から、有機金属化合物の配合量がイソプレン含有組成物１００重量部に対して０．６重量部以上であることを必要とし、０．９重量部以上であることが好ましく、１．１重量部以上であることが更に好ましい。
また、逆に重合反応を不活性化する虞を低減する観点から、有機金属化合物の配合量がイソプレン含有組成物１００重量部に対して３．０重量部以下であることを必要とし、１．６重量部以下であることが好ましく、１．５重量部以下であることが更に好ましい。
【００９０】
（ポリイソプレン）
本発明の一例のポリイソプレンの製造方法により製造されるポリイソプレン（以下、単に「ポリイソプレン」ともいう。）について記載する。
【００９１】
ポリイソプレンの数平均分子量（Ｍｎ）は、１００万以上であることが好ましく、１３０万以上であることが更に好ましい。
分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、２．５以下であることが好ましく、２．０以下であることが更に好ましい。
なお、数平均分子量（Ｍｎ）、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）は、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。
【００９２】
ポリイソプレンのシス−１、４−結合含量は、特に限定されることなく、９８％以上であることが好ましく、９９％以上であることが更に好ましい。より高い値であるほど、ポリイソプレンの伸長結晶性を高めることができ、ポリイソプレンの弾性を高めることができる。
ポリイソプレンのトランス−１，４−結合含量は、特に限定されることなく、２．０％以下であることが好ましく、１．０％以下であることが更に好ましい。より低い値であるほど、ポリイソプレンの伸長結晶性を高めることができ、ポリイソプレンの弾性を高めることができる。
ポリイソプレンの１，２−ビニル結合含量は、特に限定されることなく、２．０％以下であることが好ましく、１．０％以下であることが更に好ましい。より低い値であるほど、ポリイソプレンの伸長結晶性を高めることができ、ポリイソプレンの弾性を高めることができる。
ポリイソプレンの３，４−ビニル結合含量は、特に限定されることなく、２．０％以下であることが好ましく、１．０％以下であることが更に好ましい。より低い値であるほど、ポリイソプレンの伸長結晶性を高めることができ、ポリイソプレンの弾性を高めることができる。
【００９３】
（ゴム組成物）
ポリイソプレンを含むゴム組成物（以下、単に「ゴム組成物」ともいう。）について記載する。ここで、本発明のポリイソプレンは、ゴム組成物中でゴム成分とすることができる。
ゴム組成物は、上記ポリイソプレン以外のゴム成分も含んでよく、また、充填剤、老化防止剤、軟化剤、ステアリン酸、亜鉛華、加硫促進剤、加硫剤、オイル、硫黄等を更に含んでよい。
ゴム組成物は、当業者に周知の方法により製造することができる。
【００９４】
（タイヤ、ゴム製品）
ゴム組成物を用いて、タイヤを製造することができる。ここで、タイヤのあらゆる部材を、ゴム組成物を用いて製造されたものとすることができる。タイヤは、当業者に周知の方法により製造することができる。
また、ゴム組成物を用いて、履き物、ベルト、床材等のタイヤ以外のゴム製品も製造することができる。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。【００９６】
なお、以下の実施例では、宿主細胞としてパントエア・アナナティスを、イソプレン合成酵素としてムクナ由来のものを、メバロン酸経路に関与する酵素としてサッカロマイス・セレビシエ、エンテロコッカス・フェカリス、メタノセラ・パルディコラ由来のものを用いた。ここで、イソプレン合成酵素を発現用プラスミドにより、メバロン酸経路に関与する酵素を染色体固定により、宿主細胞に導入した。
（実施例１）
（１）イソプレン含有組成物の調製（発酵イソプレンの調製）【００９７】
（１−１）ＭＶＡ経路上流  染色体固定用プラスミドの作成
（１−１−１）アラビノース誘導型のエンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（Ｅ．  ｆａｅｃａｌｉｓ）由来メバロン酸経路上流遺伝子（ｍｖａＥＳ（Ｅ．  ｆａｅｃａｌｉｓ））発現用プラスミドｐＭＷ−Ｐara−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの構築
（１−１−１−１）ｍｖａＥＳ（Ｅ．  ｆａｅｃａｌｉｓ）遺伝子の化学的合成及びクローニング
エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（Ｅ．  ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のメバロン酸経路上流遺伝子（ｍｖａＥＳ（Ｅ．  ｆａｅｃａｌｉｓ））をコードするｍｖａＥＳ遺伝子の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ  ＡＦ２９００９２．１）、及びアミノ酸配列（ｍｖａＳ，  ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３８．１，  ｍｖａＥ，  ＧｅｎＰｅｐｔ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＩＤ  ＡＡＧ０２４３９．１）は公知である（Ｗｉｌｄｉｎｇ，ＥＩ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８２  （１５），  ４３１９−４３２７  （２０００）参照）。これらの情報に基づいて、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のコドン使用頻度に最適化されたｍｖａＥ遺伝子及びｍｖａＳ遺伝子を設計し、これらを、それぞれＥＦｍｖａＥ及びＥＦｍｖａＳと名付けた。ＥＦｍｖａＥの塩基配列を配列番号：１に、ＥＦｍｖａＳの塩基配列を配列番号：２に示す。化学合成により準備されたＥＦｍｖａＥ及びＥＦｍｖａＳのＤＮＡ配列を、常法により発現用プラスミドｐＵＣ５７（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）にクローニングし、得られたプラスミドを、それぞれ、ｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥ、ｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳと名付けた。ｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥの塩基配列を配列番号：３に、ｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳの塩基配列を配列番号：４に示す。【００９８】
（１−１−１−２）Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法に用いるプラスミドｐＭＷ−Ｐtrc−ｍｖａＥＳ−Ｔtrpの構築の準備
Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法に用いるためのプラスミドｐＭＷ−Ｐtrc−ｍｖａＥＳ−Ｔtrpを、下記の手順に従って構築した。
プラスミドｐＭＷ２１９（ニッポンジーン社製、品番：３１０−０２５７１）を、ＳｍａＩで消化処理し、この消化処理したプラスミドを精製した。得られたプラスミドをｐＭＷ２１９／ＳｍａＩと名付けた。
ｔｒｃプロモーター（Ｐtrc）領域の遺伝子を得るために、鋳型としてＰtrc領域を有するプラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂを、プライマーとして配列番号：５及び配列番号：６の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
ｍｖａＥ遺伝子部分を得るために、鋳型としてプラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＥを、プライマーとして配列番号：７及び配列番号：８の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
ｍｖａＳ遺伝子部分を得るために、鋳型としてプラスミドｐＵＣ５７−ＥＦｍｖａＳを、プライマーとして配列番号：８及び配列番号：９の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
ｔｒｐターミネーター（Ｔtrp）領域の遺伝子を得るために、鋳型としてＴtrp領域を有するプラスミドｐＳＴＶ−Ｐtac−Ｔtrpを、プライマーとして配列番号：１０と配列番号：１１の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲを行った。
上記４つのＰＣＲ反応においては、酵素としてＰｒｉｍｅ  Ｓｔａｒポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用い、反応溶液は、酵素の製造業者により提供される説明書に従って調製し、反応条件は、９８℃：１０秒、５５℃：５秒、７２℃：６０秒／ｋｂ、サイクル数：３０とした。その結果、Ｐtrc領域の遺伝子、ｍｖａＥ遺伝子、ｍｖａＳ遺伝子、Ｔtrp領域の遺伝子を含むＰＣＲ産物を取得した。【００９９】
（１−１−１−３）Ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ法に用いるプラスミドｐＭＷ−Ｐtrc−ｍｖａＥＳ−Ｔtrpの構築
続いて、鋳型として精製したＰtrcを含むＰＣＲ産物とｍｖａＥ遺伝子を含むＰＣＲ産物とを、プライマーとして配列番号：５及び配列番号：８からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。また、鋳型として精製したｍｖａＳ遺伝子を含むＰＣＲ産物とＴtrpを含むＰＣＲ産物を、プライマーとして配列番号：９及び配列番号：１２からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
その結果、Ｐtrc領域の遺伝子とｍｖａＥ遺伝子とを含むＰＣＲ産物、及びｍｖａＳ遺伝子とＴtrp領域の遺伝子とを含むＰＣＲ産物を取得した。
その後、Ｐtrc領域の遺伝子とｍｖａＥ遺伝子とを含むＰＣＲ産物、及びｍｖａＳ遺伝子とＴtrp領域の遺伝子とを含むＰＣＲ産物と、前述の消化処理したプラスミドｐＭＷ２１９／ＳｍａＩ  とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたプラスミドを、ｐＭＷ−Ｐtrc−ｍｖａＥＳ−Ｔtrpと名付けた。得られたｐＭＷ−Ｐtrc−ｍｖａＥＳ−Ｔtrpの配列を配列番号：１３に示す。【０１００】
（１−１−１−４）プラスミドｐＭＷ−Ｐara−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの構築
アラビノース誘導型メバロン酸経路上流遺伝子発現用プラスミドｐＭＷ−Ｐara−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐを、下記の手順に従って構築した。
鋳型として（１−１−３）で調製したプラスミドｐＭＷ−Ｐtrc−ｍｖａＥＳ−Ｔtrpを、プライマーとして配列番号：１４及び配列番号：１５の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
鋳型としてＰaraC領域の遺伝子、ａｒａＣ遺伝子、及びＰaraBAD領域の遺伝子を含む領域の遺伝子（以下、合わせて「Ｐara領域の遺伝子」ともいう）を含むプラスミドｐＫＤ４６（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ２０００，  ｖｏｌ．９７，  Ｎｏ．１２，  ｐ６６４０−６６４５参照）を、プライマーとして配列番号：１６及び配列番号：１７の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
その結果、ｐＭＷプラスミドとｍｖａＥＳ遺伝子とを含むＰＣＲ産物と、Ｐara領域の遺伝子を含むＰＣＲ産物とを取得した。精製したこれらのＰＣＲ産物同士を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて連結した。得られたアラビノース誘導型のＥ．  ｆａｅｃａｌｉｓ由来メバロン酸経路上流遺伝子（ｍｖａＥＳ（Ｅ．  ｆａｅｃａｌｉｓ））発現用プラスミドをｐＭＷ−Ｐara−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐと名付けた。ｐＭＷ−Ｐara−ｍｖａＥＳ−Ｔｔｒｐの塩基配列を配列番号：１８に示す。【０１０１】
（１−１−２）メバロン酸経路上流を保有する組込み型コンディショナル複製プラスミドの構築
メバロン酸経路の上流及び下流遺伝子を保有する組込み型プラスミドを構築するため、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃR−λａｔｔＲ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８；８：６３）を用いた。【０１０２】
ｐＭＷ−Ｐara−ｍｖａＥＳ−ＴｔｒｐのＫｐｎＩ−ＳａｌＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃR−λａｔｔＲのＳｐｈＩ−ＳａｌＩ認識部位中にクローニングした。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐａｒａプロモーター及びリプレッサー遺伝子ａｒａＣの制御下にあるＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ由来ｍｖａＥＳオペロンを保有するｐＡＨ１６２−Ｐara−ｍｖａＥＳプラスミドを構築した（図１）。【０１０３】
（１−２）ＭＶＡ経路下流  染色体固定用プラスミドの作成
（１−２−１）ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐｔａｃ−ＫＤｙＩ組込み型プラスミドの構築
ｔｅｔＡＲ遺伝子を含むｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃR−λａｔｔＲ組込み型ベクター（図２（Ａ））（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８；８：６３）のＡａｔＩＩ−ＡｐａＩフラグメントを、プライマーとして配列番号：１９（プライマー１１）及び配列番号：２０（プライマー１２）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、並びにｐＵＣ４Ｋプラスミド（Ｔａｙｌｏｒ  ＬＡ及びＲｏｓｅ  ＲＥ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６，３５８，１９８８）を鋳型として用いたＰＣＲで得られたＤＮＡフラグメントと置換した。その結果、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍR−λａｔｔＲが得られた（図２（Ｂ））。【０１０４】
Ｐtacプロモーターを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＴｃR−λａｔｔＲ組込み型ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ部位−ＳｐｈＩ部位に挿入した。その結果、組込み型発現ベクターｐＡＨ１６２−Ｐtacが構築された。クローニングされたプロモーターフラグメントを配列決定した。ｐＡＨ１６２−Ｐtacのマップを、図３に示す。【０１０５】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＰＭＫ、ＭＶＤ及びｙＩＤＩ遺伝子を保持するＤＮＡフラグメント（ＫＤｙＩオペロン）について、レアコドンを置換することによってコドンを最適化し、化学合成された上記コドンを最適化したＤＮＡプラグメントを、ＡＴＧ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｇｅｎｅ社（ロシア）より入手した（配列番号：２１）（図４）。組込み型ベクターｐＡＨ１６２−ＰtacのＳｐｈＩ部位−ＫｐｎＩ部位にサブクローニングした。得られたＰtac−ＫＤｙＩ発現カセットを保持するプラスミドｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐtac−ＫＤｙＩを、図５（Ａ）に示す。その後、ｔｅｔＡＲ遺伝子を保持するｐＡＨ１６２−Ｔｃ−Ｐtac−ＫＤｙＩのＮｏｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＡＨ１６２−λａｔｔＬ−ＫｍR−λａｔｔＲの対応フラグメントにより置換した。その結果、カナマイシン耐性遺伝子ｋａｎをマーカーとするｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐtac−ＫＤｙＩプラスミドを得た（図５（Ｂ））。【０１０６】
（１−２−２）ｐＡＨ１６２−Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）組込み型プラスミドの構築
標準的ＳＤ配列に連結された、メタノセラ・パルディコラ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａ  ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）株であるＳＡＮＡＥ（完全ゲノム配列については、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１１５３２を参照）由来の推定メバロン酸キナーゼ遺伝子（ｍｖｋ遺伝子）のコーディング部分を含む化学合成ＤＮＡフラグメント（配列番号：２２）を、上記組込み型発現ベクターｐＡＨ１６２−ＰtacのＰｓｔＩ部位−ＫｐｎＩ部位にクローニングし、ｐＡＨ１６２−Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）プラスミドを得た。
ｍｖｋ遺伝子を保持する組込み型プラスミドｐＡＨ１６２−Ｐtac−ｍｖｋのマップを、図６に示す。【０１０７】
（１−３）イソプレン生産菌の構築
（１−３−１）レシピエント株ＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢphi80  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢphi80  Δｃｒｔ：：Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）の構築
ａｔｔＬphi80及びａｔｔＲphi80に隣接した遺伝子ｋａｎ、並びに標的染色体部位に相同な４０ｂｐ配列を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存組込み（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９；１０：３４）、続いて、カナマイシン耐性マーカーの既報に従った除去（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０１１；３１８（１）：５５−６０）を含む２段階の手法を用いて、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢphi80及びΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢphi80染色体改変を、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）株に段階的に導入した。ＳＣ１７（０）は、Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５のλＲｅｄ耐性誘導体である（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９；１０：３４）；Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５の注釈付完全ゲノム配列は、ＰＲＪＤＡ１６２０７３又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ０１２０３２．１及びＡＰ０１２０３３．１として利用可能である。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８；８：６３）を鋳型として用いて、配列番号：２３（プライマー１３）と配列番号：２４（プライマー１４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、及び、配列番号：２５（プライマー１５）と配列番号：２６（プライマー１６）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、それぞれａｍｐＨ及びａｍｐＣ遺伝子中への組込みに使用されるＤＮＡフラグメントを生成した。配列番号：２７（プライマー１７）と配列番号：２８（プライマー１８）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチド、及び、配列番号：２９（プライマー１９）と配列番号：３０（プライマー２０）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、得られた染色体改変物のＰＣＲ検証に用いた。
並行して、（Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＡＪ１３３５５ゲノムの一部である、ｐＥＡ３２０メガプラスミド（３２０ｋｂ）上に位置する）ｃｒｔオペロンの代わりにｐｈｉ８０ファージのａｔｔＢ部位を保持するＰ．ａｎａｎａｔｉｓ  ＳＣ１７（０）の誘導体を構築した。この株を得るために、ゲノム中の標的部位に相同な４０ｂｐ領域に隣接したａｔｔＬphi80−ｋａｎ−ａｔｔＲphi80を保持するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントのλＲｅｄ依存組込みを、以前に記載された手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９；１０：３４）に従って行った。ａｔｔＬphi80−ｋａｎ−ａｔｔＲphi80によるｃｒｔオペロンの置換に用いられるＤＮＡフラグメントを、配列番号：３１（プライマー２１）と配列番号：３２（プライマー２２）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ反応で増幅した。ｐＭＷａｔｔｐｈｉプラスミド（Ｍｉｎａｅｖａ  ＮＩ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００８；８：６３）を、この反応で鋳型として用いた。得られた組込み体を、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬphi80−ｋａｎ−ａｔｔＲphi80と名付けた。配列番号：３３（プライマー２３）と配列番号：３４（プライマー２４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＬphi80−ｋａｎ−ａｔｔＲphi80．の染色体構造のＰＣＲ検証に用いた。構築株からのカナマイシン耐性マーカーの除去を、既報の手法に従いｐＡＨ１２９−ｃａｔヘルパープラスミドを用いて行った（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２０１１；３１８（１）：５５−６０）。配列番号：３３（プライマー２３）と配列番号：３４（プライマー２４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドを、得られたＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢphi80株のＰＣＲ検証に用いた。得られたΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢphi80、ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢphi80及びΔｃｒｔ：：ａｔｔＢphi80ゲノム改変物のマップをそれぞれ、図７（Ａ）、図７（Ｂ）、及び図７（Ｃ）に示す。【０１０８】
上記ｐＡＨ１６２−Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）プラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２０１１；３１８（１）：５５−６０）に従ってＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ａｔｔＢphi80のゲノムに組み込んだ。プラスミドの組込みを、配列番号：３１（プライマー２１）と配列番号：３３（プライマー２３）、配列番号：３２（プライマー２２）と配列番号：３４（プライマー２４）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応で確認した。その結果、ＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）株を得た。Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）改変物のマップを、図８（Ａ）に示す。
その後、ゲノムＤＮＡエレクトロポレーション手法（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９；１０：３４）を介したＳＣ１７（０）Δｃｒｔ：：ｐＡＨ１６２−Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）からＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢphi80  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢphi80への移入を行った。得られた株を、既報のｐＭＷ−ｉｎｔｘｉｓ−ｃａｔヘルパープラスミド（Ｋａｔａｓｈｋｉｎａ  ＪＩ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９；１０：３４）を用いてｐＡＨ１６２−Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）組込み型プラスミドのベクター部分を除去した。その結果、マーカー欠損株ＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ80  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ80  Δｃｒｔ：：Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）を得た。Δｃｒｔ：：Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）ゲノム改変物のマップを、図８（Ｂ）に示す。【０１０９】
（１−３−２）ＳＷＩＴＣＨ−Ｐａｒａ株の構築
ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐtac−ＫＤｙＩプラスミドを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２０１１；３１８（１）：５５−６０）に従って、ＳＣ１７（０）ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ80  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢφ80  Δｃｒｔ：：Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）／ｐＡＨ１２３−ｃａｔ株の染色体に組み込んだ。電気泳動後、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含むＬＢアガー上に細胞を撒いた。増殖したＫｍRクローンを、配列番号：２３（プライマー１３）と配列番号：２７（プライマー１７）、及び、配列番号：２３（プライマー１３）と配列番号：２９（プライマー１９）の塩基配列からなる合成オリゴヌクレオチドをプライマーとしたポリメラーゼ連鎖反応で試験した。ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢφ80又はｐＣ：：ａｔｔＢφ80ｍに組み込まれたｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐtac−ＫＤｙＩプラスミドを保持する株を選択した。ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐtac−ＫＤｙＩ及びΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐtac−ＫＤｙＩゲノム改変物のマップを、図９（Ａ）及び図９（Ｂ）に示す。【０１１０】
ｐＡＨ１６２−Ｐara−ｍｖａＥＳを、既報のプロトコル（Ａｎｄｒｅｅｖａ  ＩＧ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２０１１；３１８（１）：５５−６０）に従って、ｐＡＨ１２３−ｃａｔヘルパープラスミドを用いてＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐtac−ＫＤｙＩ  ΔａｍｐＨ：：ａｔｔＢphi80  Δｃｒｔ：：Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）及びＳＣ１７（０）  ΔａｍｐＣ：：ａｔｔＢphi80  ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｋｍ−Ｐtac−ＫＤｙＩ  Δｃｒｔ：：Ｐtac−ｍｖｋ（Ｍ．ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）レシピエント株の染色体中に挿入した。その結果、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐara−１及びＳＷＩＴＣＨ−Ｐara−２とそれぞれ名付けられた２セットの株を得た。ΔａｍｐＨ：：ｐＡＨ１６２−Ｐara−ｍｖａＥＳ及びΔａｍｐＣ：：ｐＡＨ１６２−Ｐara−ｍｖａＥＳゲノム改変物のマップを図１０（Ａ）及び図１０（Ｂ）に示す。【０１１１】
下記に従って、イソプレンシンターゼのプラスミドを導入した。
ＳＷＩＴＣＨ−Ｐara−１のコンピテントセルを常法に従い調整後、エレクトロポレーション法によりｐＳＴＶ２８−Ｐtac−ｉｓｐＳＭ（米国特許出願公開第２０１４−１１３３４４号明細書）を導入し、６０（ｍｇ／Ｌ）のクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに均一に塗布し、３７℃にて１８時間培養した。その後、得られたプレートから、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得した。このようにして得られた形質転換体をＰ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐara−１／ｐＳＴＶ２８−Ｐtac−ｉｓｐＳＭと命名した。【０１１２】
（１−４）イソプレン発酵によるイソプレンの製造
（１−４−１）Ｐ．ａｎａｎａｔｉｓイソプレン生産菌  ＳＷＩＴＣＨ−Ｐara−１／ｐＳＴＶ２８−Ｐtac−ｉｓｐＳＭの培養
イソプレン生産能を有する微生物として、ＳＷＩＴＣＨ−Ｐara−１／ｐＳＴＶ２８−Ｐtac−ｉｓｐＳＭを使用した。ＳＷＩＴＣＨ−Ｐara−１／ｐＳＴＶ２８−Ｐtac−ｉｓｐＳＭを、６０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに塗布し、３４℃にて１６時間培養を実施した。
下記表１に示すグルコース培地０．３Ｌを１Ｌ容積の発酵槽３基の各々に投入した後、充分に生育したプレート１枚分の菌体を接種し、培養を開始した。培養条件は、ｐＨ７．０（アンモニアガスにて制御）、３０℃、１５０ｍＬ／分の通気にて行い、培地中の酸素濃度が５％以上になるように撹拌制御を行った。なお、本実施例においては表１に示すグルコース培地は、Ａ区とＢ区を０．１５Ｌ調製し、１１５℃にて１０分間加熱滅菌を行った。放冷後、Ａ区とＢ区を混合し、クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を添加し、培地として使用した。【０１１３】
【表１】
2016174875.tif 000004
培地中に含まれるグルコースを全て消費したところで、４００ｍＬの培養液を５０Ｌ容積の発酵槽２基の各々に張り込んだ表２に示すグルコース培地２０Ｌに投入した。培養条件は、ｐＨ７．０（アンモニアガスにて制御）、３０℃、１０Ｌ／分の通気にて行い、培地中の酸素濃度が５％以上になるように撹拌制御を行った。なお、本実施例においては表２に示すグルコース培地は、Ａ区とＢ区を１０Ｌ調製し、１１５℃にて１０分間加熱滅菌を行った。放冷後、Ａ区とＢ区を混合し、クロラムフェニコール（６０ｍｇ／Ｌ）を添加し、培地として使用した。培養中は、培地中のグルコース濃度が１０ｇ／Ｌ以上になるよう５００ｇ／Ｌに調整したグルコースを連続的に添加した。【０１１４】
【表２】
2016174875.tif 000005
本実施例で使用したＳＷＩＴＣＨ−Ｐara−１／ｐＳＴＶ２８−Ｐtac−ｉｓｐＳＭは、メバロン酸経路上流遺伝子をアラビノース誘導型プロモーターにて発現させるため、Ｌ−アラビノース（和光純薬工業社製）の存在下でイソプレン生産量が顕著に向上する。本実施例においては、表２に示すグルコース培地に終濃度２０ｍＭとなるようＬ−アラビノースを添加することでイソプレン生産期へと誘導した。【０１１５】
発酵ガス中のイソプレン濃度を、マルチガスアナライザー（ＧＡＳＥＲＡ社製「Ｆ１０」）にて測定した。培養開始６時間目からイソプレンが検出され、３０時間目には発酵ガス中のイソプレン濃度は約８００ｐｐｍに達した。その後、培養終了する７６時間目まで、イソプレン濃度約８００ｐｐｍの発酵ガスをイソプレン回収装置に供給した。【０１１６】
（１−４−２）発酵ガスに含まれるイソプレンの回収
発酵ガスからのイソプレン回収には、図１１に示すイソプレン回収装置を使用した。第１の吸着塔１、第２の吸着塔２の両方に、疎水性シリカゲル（富士シリシア化学社製、Ｓ−６）の多孔質吸着剤層（図示せず）を設けた。多孔質吸着剤層は、予め濃度１．０体積％のイソプレンガスを吹き込むことにより、プレコートした状態にて実施に供した。
吸着工程では、発酵槽より生成した発酵ガスをフィードガス３として使用し、該フィードガス３を脱水処理及び脱有機物処理に付した後、フィードガス送気管１０及び１１（１０及び１１’）を介して第１の吸着塔１（又は第２の吸着塔２）に送気した。吸着時の条件は、温度２５℃、圧力１０１．３ｋＰａ、フィードガス線速度１．８ｃｍ／秒であった。吸着工程の後に大気に放出された排出ガス５中のイソプレン濃度は、マルチガスアナライザー（ＧＡＳＥＲＡ社製、Ｆ１０）にて測定した。
脱着工程では、窒素ガスをパージガス４として使用し、パージガス４をパージガス送気管１５及び１６（１５及び１６’）を介して第１の吸着塔１（又は第２の吸着塔２）に送気した。脱着時には、真空ポンプ６により吸着塔１、２内を３．３ｋＰａまで減圧した。また、パージガスの線速度は１．６ｃｍ／秒とした。冷却器７では、１０℃の冷却水を循環し、イソプレンを含有するガスを冷却した。そして、冷却されたガスを分離器８に通し、液体イソプレン９を回収した。
なお、イソプレン回収装置１００には、図１１に示すように、返送管１３及び排出管１４、１４’も設けた。
上記イソプレン回収装置１００を、吸着工程と脱着工程とを交互に切り替えながら運転した（各工程の実施回数：３００回、各工程の切り替え時間：１５分間）。
以上の操作により、合計１１１ｇのイソプレンを回収した。回収したイソプレン（イソプレン含有組成物）を重合反応の検討に用いた。【０１１７】
（２）イソプレン含有組成物の精製
前述の発酵法により調製したイソプレンを、カラムクロマトグラフィーにより、精製した。カラムの充填剤（固相）としては、活性アルミナ（関東化学社製、酸化アルミナ（活性）（粒状））、及びモレキュラーシーブス（関東化学社製、モレキュラーシーブス４Ａ）を用い、溶離液（液相）としては、ヘキサンを用いた。
精製条件の詳細を表３（後述）に示す。【０１１８】
（３）イソプレン含有組成物の分析
下記のポリイソプレンの製造に供されるイソプレンの品質を確認するため、前述の発酵法により調製したイソプレンをガスクロマトグラフィーにより分析した。
試料を、ガスクロマトグラフ用キャピラリーカラム（アジレントテクノロジー社製、ＨＰ−５ＭＳＵＩ（長さ：３０ｍ、内径：０．２５ｍｍ、膜厚：１μｍ））、及び、水素炎イオン化型検出器（ＦＩＤ）を備えたガスクロマトグラフ装置（アジレントテクノロジー社製、７８２０Ａ）を、カラム温度：３５℃で３分間ホールド後、２５℃／分で３００℃まで昇温、その後３００℃で１３分間保持；圧力：１９ｋＰａ；カラム流量：３ｍＬ／分；流入方法：スプリット  １００：１；カラムへの試料注入量：０．１μＬ；注入口温度：２５０℃；検出器温度：２３０℃の条件下で用いて、分析した。
本実施例では、特に、不純物の主成分である酢酸エチル及び３−メチルフランについて分析した。酢酸エチルと３−メチルフランとが共に検出された場合にはこれらの合計量を算出し、両者のいずれか一方が検出された場合にはそれぞれの量を算出した（表３参照）。
市販のイソプレン（比重０．６８１）を、冷却したメタノールで１０、１００、１０００、１００００、１０００００倍に希釈し、イソプレン標準試料用溶液を調整した。その後、水１ｍＬを入れたバイアルに各標準試料用溶液を、それぞれ１μＬ加えることによって、イソプレン標準試料とした。【０１１９】
（４）ポリイソプレンの製造
十分に乾燥させたステンレス製の２Ｌ反応器に、精製後のイソプレン３．５ｇを加えた。
一方、窒素雰囲気下のグローブボックス中で、ガラス製容器に、トリスビストリメチルシリルアミドガドリニウム（Ｇｄ［Ｎ（ＳｉＭｅ3）2］3）（（Ａ）成分）４０．０μｍｏＬ、トリブチルアルミニウム（（Ｂ）成分）２００μｍｏＬ、ビス（２−ジフェニルホスフィノフェニル）アミン（ＢＤＰＡ）４０．０μｍｏＬ、トルエン５ｇ、トリフェニルカルボニウムテトラキスペンタフルオロフェニルボレート（Ｐｈ3Ｃ+Ｂ-（Ｃ6Ｆ5）4）（（Ｅ）成分）４０．０μｍｏＬ、ｎ−ヘキサン３５ｇを加えて、重合触媒組成物とした。
その後、重合触媒組成物をグローブボックスから取り出し、イソプレンを含む２Ｌ反応器に加えた。この反応系を、５０℃で１２０分間維持し、イソプレンの重合反応を行った。その後、反応器に大量のメタノールを加えることによって、重合反応を停止させ、反応生成物を沈殿・分離し、更に５０℃で真空乾燥させて、重合体Ａを得た（収量：３．３ｇ）。【０１２０】
製造したポリスチレン換算の数平均分子量（Ｍｎ）及び分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を，ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）（ＧＰＣ装置：東ソー社製、ＨＬＣ−８２２０ＧＰＣ；カラム：東ソー社製、ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＨXL−２本；検出器：示差屈折率計（ＲＩ））により、単分散ポリスチレンを基準として、算出した。なお、測定温度は４０℃とし、溶出溶媒をＴＨＦとした。
製造したポリイソプレンを含むゴム組成物を調製し、該ゴム組成物を加硫することによって加硫済みゴムを得た。そして、この加硫済みゴムの試料について、ＪＩＳ  Ｋ  ６２５１に従って引張試験を行い、室温での引張破断強度（ＴＢ）を測定した。比較例１を１００として指数表示した。結果を表３に示す。従来例の評価結果を１００とした相対評価となる指数を算出した。評価結果を表３に示す。指数が大きいほど引張破断強度（ＴＢ）が高いことを示す。【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
（実施例２〜１１、比較例１〜４）
表３に示す条件とした点以外は実施例１と同様にポリイソプレンの製造を行った。【０１２３】
実施例１〜１１と、比較例１〜４とを比較することにより、有機金属化合物の配合量をイソプレン含有組成物１００重量部に対して０．６〜３．０重量部とすれば、比較的高い分子量を有するポリイソプレンを製造することができ、これにより、製造した合成ポリイソプレンの強度を高めることができるという本発明の所望の効果が得られることが示された。ここで、実施例１〜３、５〜１１と、実施例４とを比較することにより、含酸素中性化合物の配合量を、イソプレン含有組成物１００重量部に対して０．０５〜１．０重量部とすれば、上記本発明の効果が特に高いことが示された。
また、実施例１〜６、９〜１１と比較例４との比較結果と、実施例７、８と比較例１、２との比較結果とを比較することにより、上記本発明の効果は、特に、精製後に含酸素中性化合物が残存する発酵イソプレンを用いた場合に有利に得ることができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明のポリイソプレンの製造方法によれば、比較的高い分子量を有するポリイソプレンを製造することができ、これにより、製造した合成ポリイソプレンの強度を高めることができる。
【符号の説明】
【０１２５】
１                  第１の吸着塔
２                  第２の吸着塔
３                  イソプレンを含む発酵ガス（フィードガス）
４                  パージガス
５                  排気ガス
６                  真空ポンプ
７                  冷却器
８                  分離器
９                  回収イソプレン（液体イソプレン）
１０，１１，１１’  フィードガス送気管
１２，１２’        イソプレン含有パージガス送気管
１３                返送管
１４，１４’        排出管
１５，１６，１６’  パージガス送気管
１００              イソプレン回収装置
【寄託の表示】
【０１２６】
寄託機関の名称：ＶＫＰＭ  ロシア国立工業用微生物収集所
寄託機関のあて名：FGUP GosNII Genetika, 1 Dorozhny proezd, 1, Moscow 117545, Russian Federation
受託番号：VKPM B-9246  
寄託の日付：2005年9月21日
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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