(57)【要約】  ミコール酸部分及びアラビノガラクタンの一部が表面に露出している細菌ＣＷＳを作製することにより、それを用いて水中油型のエマルションを作製すれば、油粒子の表面に細菌ＣＷＳのアラビノガラクタンが突出・露出した新規な水中油型エマルションおよびその凍結乾燥製剤が作製できた。このエマルション製剤は、優れた安定性と共に、より優れた免疫賦活活性を示している。この結果、本発明のエマルション製剤を用いて、新たな癌の免疫療法剤を作製することが可能となった。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）、水、油、界面活性剤を含有する、下記条件を満たす水中油型エマルション製剤：
（ａ）レクチンに対する反応性を示す、
（ｂ）エマルション製剤のゼータ電位と、細菌の細胞壁骨格成分を含まない以外は同様にして作成されたビークル水中油型エマルションのゼータ電位の電位差が３〜１４ｍＶである。
【請求項２】
上記細菌が、ＣＷＳに脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、請求項１に記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項３】
上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、請求項１又は２に記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項４】
レクチンがコンカナバリンＡである、請求項１〜３のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項５】
上記電位差が４〜１２ｍＶである、請求項１〜４のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項６】
上記細菌が、ミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、請求項１〜５のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項７】
上記細菌がＢＣＧ菌である、請求項６に記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項８】
上記油がスクワラン、スクワレンまたはその混合物である、請求項１〜７のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項９】
上記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、請求項１〜８のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１０】
さらに抗酸化剤として、トコフェロール類、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）から選択される１以上の抗酸化剤を含有する、請求項１〜９のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１１】
上記抗酸化剤がジブチルヒドロキシトルエンである、請求項１０に記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１２】
さらに緩衝剤として、リン酸バッファーまたはクエン酸バッファーを含有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１３】
上記緩衝剤がクエン酸バッファーである、請求項１２に記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１４】
さらに単糖類、糖アルコール、多類糖、アミノ酸、タンパク質、ウレア、および無機塩からなる群から選択される一つ以上の賦形剤を含有する、請求項１〜１３のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１５】
上記賦形剤がマンニトール、スクロース又はトレハロースである、請求項１４記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１６】
上記賦形剤がマンニトールである、請求項１５に記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１７】
細菌がＢＣＧ菌であり、油がスクワレンまたはスクワランであり、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、さらに抗酸化剤としてジブチルヒドロキシトルエン、緩衝剤としてクエン酸バッファーを含有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の製剤。
【請求項１８】
細菌がＢＣＧ菌であり、油がスクワレンであり、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、緩衝剤としてクエン酸バッファーを含有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の製剤。
【請求項１９】
請求項１４〜１８のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤の凍結乾燥製剤。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載のエマルション製剤または凍結乾燥製剤を含有する、ヒトを含む哺乳動物のための医薬組成物。
【請求項２１】
癌の治療のための、請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
以下の工程を含む細菌ＣＷＳを含有する水中油型エマルション製剤の製造方法：
（ｉ）下記の条件を満たす細菌ＣＷＳ調製物を提供する、
ａ）細菌ＣＷＳ調製物中の全非構成アミノ酸含量が０．８重量％以下（０〜０．８重量％）である
ｂ）オーラミン染色によるＣＷＳ調製物の蛍光面積率が１０％以下（０〜１０％）である、
（ｉｉ）細菌ＣＷＳ調製物、油、並びに有機溶媒を含む混合液を攪拌して細菌ＣＷＳを分散させる、
（ｉｉｉ）有機溶媒を留去する、
（ｉｖ）有機溶媒留去後の細菌ＣＷＳに、界面活性剤を含む水溶液を加えて乳化する。
【請求項２３】
上記ＣＷＳ調製物の蛍光面積率が５％以下（０〜５％）である、請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
上記ＣＷＳ調製物の蛍光面積率が２％以下（０〜２％）である、請求項２２又は２３に記載の製造方法。
【請求項２５】
上記ＣＷＳ調製物（乾燥体）を生理食塩水中１ｍｇ／ｍＬに分散させた場合の、分散の６０分後のＯＤ値（６９０ｎｍ）が分散直後のＯＤ値と対比して０．４以上（０．４〜１．０）である、請求項２２〜２４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２６】
上記６０分後のＯＤ値（６９０ｎｍ）が分散直後のＯＤ値と対比して０．７以上（０．７〜１．０）である、請求項２２〜２５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２７】
上記細菌ＣＷＳ調製物が、さらに下記要件を満たす、請求項２２〜２６のいずれかに記載の製造方法：
細菌ＣＷＳ調製物の５〜２０重量倍のスクワレン、１．５〜７重量倍のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルＰＳ８０を用いて、１ｍｇＣＷＳ／ｍＬとなるように作製された水中油型エマルションのゼータ電位と、細菌ＣＷＳ調製物を用いない以外は同様にして作成されたビークル水中油型エマルションのゼータ電位の電位差が、３〜１４ｍＶである。
【請求項２８】
上記電位差が、４〜１２ｍＶである、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項２９】
上記細菌ＣＷＳ調製物が下記の条件を満たす、請求項２２〜２８のいずれかに記載の製造方法：
ＴＬＲ２と反応し、ＴＬＲ４と反応しない。
【請求項３０】
上記細菌ＣＷＳ調製物が、脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンの３層からなる、請求項２２〜２９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項３１】
上記細菌ＣＷＳ調製物が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択される細菌由来のものである、請求項２２〜３０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項３２】
上記細菌が、ミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、請求項３１に記載の製造方法。
【請求項３３】
上記細菌がＢＣＧ菌である、請求項３２に記載の製造方法。
【請求項３４】
請求項２２〜３３いずれかに記載の製造方法の工程（ｉｖ）において、さらに賦形剤を加えた上で乳化し、得られた水中油型エマルション製剤を凍結乾燥する工程を含む、細菌ＣＷＳ水中油型エマルションの凍結乾燥製剤の製造方法。
【請求項３５】
上記凍結乾燥製剤が請求項１９に記載の製剤である、請求項３４に記載の凍結乾燥製剤の製造方法。
【請求項３６】
下記を満たす細菌の細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）調製物：
ａ）ＣＷＳ調製物中の全非構成アミノ酸含量が０．８重量％以下（０〜０．８重量％）であり、かつ
ｂ）オーラミン染色によるＣＷＳ調製物の蛍光面積率が１０％以下（０〜１０％）である。
【請求項３７】
上記ＣＷＳ調製物の蛍光面積率が５％以下（０〜５％）である、請求項３６に記載のＣＷＳ調整物。
【請求項３８】
上記ＣＷＳ調製物の蛍光面積率が２％以下（０〜２％）である、請求項３７に記載のＣＷＳ調整物。
【請求項３９】
上記ＣＷＳ調製物（乾燥体）を生理食塩水中１ｍｇ／ｍＬに分散させた場合の、分散の６０分後のＯＤ値（６９０ｎｍ）が分散直後のＯＤ値と対比して０．４以上（０．４〜１．０）である、請求項３６〜３８のいずれかに記載のＣＷＳ調整物。
【請求項４０】
上記６０分後のＯＤ値（６９０ｎｍ）が分散直後のＯＤ値と対比して０．７以上（０．７〜１．０）である、請求項３９に記載のＣＷＳ調整物。
【請求項４１】
さらに以下の条件を満たす、請求項３６〜４０いずれかに記載の細菌ＣＷＳ調整物：
細菌ＣＷＳ調製物の５〜２０重量倍のスクワレン、１．５〜７重量倍のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルＰＳ８０を用いて、１ｍｇＣＷＳ／ｍＬとなるように作製した水中油型エマルションのゼータ電位と、細菌ＣＷＳ調製物を含まない以外は同様にして作成されたビークル水中油型エマルションのゼータ電位の電位差が３〜１４ｍＶである。
【請求項４２】
上記細菌ＣＷＳ調整物がレクチンに対して反応性を示すものである、請求項３６〜４１のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物。
【請求項４３】
上記レクチンが、コンカナバリンＡである、請求項４２に記載の細菌ＣＷＳ調製物。
【請求項４４】
ハロゲン系有機溶媒を含有しない、請求項３６〜４３のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物。
【請求項４５】
界面活性剤を含有しない、請求項３６〜４４のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物。
【請求項４６】
上記細菌ＣＷＳ調製物が、ＴＬＲ２に反応し、ＴＬＲ４に反応しない、請求項３６〜４５のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物。
【請求項４７】
上記細菌が、ＣＷＳに脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、請求項３６〜４６のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物。
【請求項４８】
上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、請求項３６〜４７のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物。
【請求項４９】
上記細菌が、ミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、請求項４８に記載の細菌ＣＷＳ調製物。
【請求項５０】
上記細菌が、ＢＣＧ菌又はノカルジア菌である、請求項４９に記載の細菌ＣＷＳ調製物。
【請求項５１】
上記細菌が、ＢＣＧ菌である、請求項５０に記載の細菌ＣＷＳ調製物。
【請求項５２】
請求項３６〜５１のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物を含有する医薬組成物。
【請求項５３】
上記医薬組成物がエマルション製剤又は懸濁液製剤である、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
上記懸濁液製剤が、水性懸濁液製剤である、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
癌の治療のための、請求項５２〜５４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５６】
ｉ）下記に特徴付けられる、細菌の精製菌体調製物を提供する工程：
ａ）ハロゲン系有機溶媒を含有しない、
ｂ）ＰＧＬの含有量が、精製菌体調製物全量の０．４重量％以下（０〜０．４重量％）である、
ｉｉ）精製菌体調製物を破砕処理する工程、
ｉｉｉ）精製菌体破砕物の酵素処理を行う工程、および
ｉｖ）酵素処理後、洗浄する工程
を含む、細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項５７】
精製菌体調製物のＰＧＬとグリセロールモノミコール酸エステル（ＧｒｏＭＭ）の残存量が各々原料菌体の元の含有量の１０重量％以下（０〜１０重量％）である、請求項５６に記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項５８】
精製菌体調製物がＴＬＲ４に反応せず、ＴＬＲ２に反応する、請求項５６または５７に記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項５９】
上記細菌が、ＣＷＳに脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、請求項５６〜５８のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項６０】
上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、請求項５６〜５９のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項６１】
上記細菌がミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、請求項６０に記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項６２】
上記細菌がＢＣＧ菌又はノカルジア菌である、請求項６１に記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項６３】
上記細菌がＢＣＧ菌である、請求項６２に記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項６４】
上記精製菌体調製物のＣＷＳ含量が３５〜４７重量％である、請求項５６〜６３のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項６５】
精製菌体調製物が、上記精製菌体調製物の水性懸濁液を、公称濾過精度が1〜３μｍのフィルターを用いて濾別した場合に、精製菌体調製物が濾取可能である、請求項５６〜６４のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項６６】
上記酵素処理の酵素が蛋白質分解酵素である、請求項５６〜６５のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項６７】
上記洗浄工程が、水又は水と親水性有機溶媒の混合溶媒で洗浄することを特徴とする、請求項５６〜６６のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項６８】
界面活性剤を使用しないことを特徴とする、請求項５６〜６７のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項６９】
ハロゲン系有機溶媒を使用しないことを特徴とする、請求項５６〜６８のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項７０】
実質的に細胞外付着成分を含まない、細菌の精製菌体調製物を提供する工程が、細菌の生菌あるいは死菌を、水と親水性有機溶媒の混合溶液中、還流下で加熱する工程を含む、請求項５６〜６９のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
【請求項７１】
下記に特徴付けられる、細菌の精製菌体調製物：
ａ）ハロゲン系有機溶媒を含有しない、
ｂ）ＰＧＬの含有量が、精製菌体調製物全量の０．４重量％以下（０〜０．４重量％）である。
【請求項７２】
ＰＧＬとグリセロールモノミコール酸エステル（ＧｒｏＭＭ）の残存量が各々原料菌体の元の含有量の１０重量％以下（０〜１０重量％）である、請求項７１に記載の細菌の精製菌体調製物。
【請求項７３】
ＴＬＲ４に反応せず、ＴＬＲ２に反応する、請求項７１〜７２いずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
【請求項７４】
上記細菌が、ＣＷＳに脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、請求項７１〜７３のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
【請求項７５】
上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、請求項７１〜７４いずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
【請求項７６】
上記細菌がミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、請求項７５に記載の細菌の精製菌体調製物。
【請求項７７】
上記細菌がＢＣＧ菌又はノカルジア菌である、請求項７６に記載の細菌の精製菌体調製物。
【請求項７８】
上記細菌がＢＣＧ菌である、請求項７６に記載の細菌の精製菌体調製物。
【請求項７９】
上記精製菌体調製物のＣＷＳ含量が３５〜４７重量％である、請求項７１〜７８のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
【請求項８０】
上記精製菌体調製物の水性懸濁液を、公称濾過精度が1〜３μｍのフィルターを用いて濾別した場合に、精製菌体調製物が濾取可能である、請求項７１〜７９のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
【請求項８１】
細菌の生菌あるいは死菌を、水と親水性有機溶媒の混合溶液中、還流下で加熱する工程を含む、細菌の精製菌体調製物の製造方法。
【請求項８２】
上記水と親水性有機溶媒の混合溶液中の水の含有量が１０〜４０重量％である、請求項８１に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
【請求項８３】
上記親水性有機溶媒として、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、アセトン、メチルエチルケトンから一つ以上が選択されることを特徴とする、請求項８１又は８２に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
【請求項８４】
上記親水性有機溶媒がメタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトンから一つ以上が選択されることを特徴とする、請求項８３に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
【請求項８５】
上記混合溶液から濾過処理にて精製菌体を分離することを特徴とする、請求項８１〜８４のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
【請求項８６】
上記濾過処理を、公称濾過精度が０．４５〜５μｍであるフィルターを用いて行う、請求項８５に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
【請求項８７】
上記濾過処理が、圧迫濾過であることを特徴とする、請求項８５または８６に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
【請求項８８】
上記精製菌体に存在する細胞外付着成分の含量を指標として精製の終点管理を行う、請求項８１〜８７のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
【請求項８９】
上記指標として、ＰＧＬ及び／又はＧｒｏＭＭの残存量をモニターすることを特徴とする、請求項８８に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
【請求項９０】
上記終点管理が、ＰＧＬの残存量をモニターして、精製菌体中の残存量重量が０．４重量％以下（０〜０．４重量％）であることを確認することを特徴とする、請求項８９記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
【請求項９１】
上記精製菌体調製物が、請求項７１〜８０のいずれかに記載の精製菌体調製物である、請求項８１〜９０のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞壁骨格成分（Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ：ＣＷＳ）を有効成分とするエマルション製剤、懸濁液製剤、とそれらの凍結乾燥製剤およびその製造に関するものである。特に、ＣＷＳが有するアラビノガラクタン等の糖鎖がエマルション製剤とその凍結乾燥製剤の油粒子表面に突出・露出し、レクチン（例えばコンカナバリンＡ）と反応し、免疫細胞に活性を示す製剤とその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細菌細胞壁骨格成分（細菌−ＣＷＳ）は、免疫賦活作用を有し、例えば動物モデルを用いた実験的腫瘍系、およびヒト癌の免疫療法において抗腫瘍活性を示すことが知られている。更に、上記の細菌細胞壁骨格成分を油成分中に分散、乳化させ、水中油型エマルション製剤として投与した場合、免疫賦活作用による抗腫瘍効果などが著しく高まることが知られている。【０００３】
例えばＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ菌（ＢＣＧ菌）の細胞壁骨格成分（以下、ＢＣＧ−ＣＷＳと略する場合がある）を含む水中油型エマルションを用いた癌免疫療法では、ヒトの癌治療において優れた成績が得られたことが報告されている(非特許文献１：日胸疾会誌１５（１１）７６９−７７４（１９７７）)。前記エマルションは、副作用に重大なものがなく高い安全性を有しているが、皮膚障害が回避できず、投与量の減量などが必要とされている（非特許文献２）。
また、ノカルジア・ルビア菌の細胞壁骨格成分（N−ＣＷＳ）の水中油型エマルションにおいても同様の臨床研究が報告されている。（非特許文献３：日外会誌，第８３回，第７号，１９８２，ｐ６３５−６４８、非特許文献４：肺癌，２８（３）：ｐ３５３〜３６，１９８８）【０００４】
前記水中油型エマルションは、細菌−ＣＷＳを油中に分散したペースト状の組成物に、界面活性剤を含む水を加えてエマルション化することにより調製することができる（国際公開パンフレット第２００４／０１２７５１号、国際公開パンフレット第２００５／１０２３６９号、特願２０１０−２７１３２２号公報）。しかし、一般に細菌−ＣＷＳを含有する水中油型エマルション製剤は不安定であり、現在、ＢＣＧ−ＣＷＳを用いる場合には臨床現場では、使用時に少量の水中油型エマルションを用時調製している。しかし、常に一定の製剤を手作業で調製することは難しく、また用時調製では事実上医薬品としての実用化は不可能である。【０００５】
そこで、水中油型エマルションを凍結乾燥して凍結乾燥製剤とし、使用時に分散溶媒を加えて水中油型エマルションを再調製させる方法が検討され、いくつかの凍結乾燥製剤に関する報告がなされた（特許文献１、２及び４）。【０００６】
細菌−ＣＷＳを含む凍結乾燥製剤を医薬品として供給するためには、安全性に優れ、生物活性を示し、保存安定性に優れた凍結乾燥製剤が求められる。しかしながら、これまで製剤及び原薬の形態、物理化学的性質等に関しての検討は十分ではなかった。製剤の安定性等については細菌―ＣＷＳの形態及び物理化学的性質が影響すると考えられるため、各種エマルション或いは懸濁液製剤の製造に適した細菌―ＣＷＳ及びその製造方法を見出し、それを用いた新規水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤の供給が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】再表００／００３７２４号公報
【特許文献２】再表２００４／０１２７５１号公報
【特許文献３】特開２００８−２１４２６６号公報
【特許文献４】再表２００５／１０２３６９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】日胸疾会誌１５（１１）７６９−７７４（１９７７）
【非特許文献２】日内会誌第６７巻第１２号１５００〜１５０５頁１９７８年
【非特許文献３】癌と化学療法、第１０巻第１号昭和５８年１月ｐ５３−６２：Ｎ−ＣＷＳ
【非特許文献４】肺癌，２８（３）：ｐ３５３〜３６，１９８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は高純度かつ各種エマルション、懸濁液製剤の製造に適した水への分散性に優れた細菌−ＣＷＳとその製造方法と、それを用いた保存安定性に優れた新規水中油型エマルション及び凍結乾燥製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、製剤の安定性等については細菌―ＣＷＳの形態及び物理化学的性質が影響すると考え、それらについて検討すると共に、細菌―ＣＷＳの形態及び物性が製剤の生物活性及び安定性等に大きく関与することを見出した。その結果、各種エマルション製剤の製造に適した細菌―ＣＷＳ及びその製造方法を見出し、さらに緩衝液や抗酸化剤にも工夫を加えた安定性に優れ、レクチン（例えばコンカナバリンＡ）と反応し、かつ免疫細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を有することを特徴とする新規水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤を見出すことができた。本発明の細菌―ＣＷＳを使用することにより、細菌―ＣＷＳが有する糖鎖が油粒子（油滴）表面に突出・露出し、レクチン（例えばコンカナバリンA）との反応性を有し免疫細胞に対して優れたｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を有し、皮膚障害を含め安全性及び保存安定性が改善された水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤を作製することができた。
本発明は、上記の知見をもとに、完成するに至ったものである。【００１１】
即ち本発明の要旨は以下の通りである。
［１］  細菌の細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）、水、油、界面活性剤を含有する、下記条件を満たす水中油型エマルション製剤：
（ａ）レクチンに対する反応性を示す、
（ｂ）エマルション製剤のゼータ電位と、細菌の細胞壁骨格成分を含まない以外は同様にして作成されたビークル水中油型エマルションのゼータ電位の電位差が３〜１４ｍＶである。
［２］  上記細菌が、ＣＷＳに脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、［１］に記載の水中油型エマルション製剤。
［３］  上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、［１］または［２］に記載の水中油型エマルション製剤。
［４］  レクチンがコンカナバリンＡである、［１］〜［３］のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
［５］  上記電位差が４〜１２ｍＶである、［１］〜［４］のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
［６］  上記細菌が、ミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、［１］〜［５］のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
［７］  上記細菌がＢＣＧ菌である、［６］に記載の水中油型エマルション製剤。
［８］  上記油がスクワラン、スクワレンまたはその混合物である、［１］〜［７］のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
［９］  上記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、［１］〜［８］のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
［１０］  さらに抗酸化剤として、トコフェロール類、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）から選択される１以上の抗酸化剤を含有する、［１］〜［９］のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
［１１］  上記抗酸化剤がジブチルヒドロキシトルエンである、［１０］に記載の水中油型エマルション製剤。
［１２］  さらに緩衝剤として、リン酸バッファーまたはクエン酸バッファーを含有する、［１］〜［１１］のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
［１３］  上記緩衝剤がクエン酸バッファーである、［１２］に記載の水中油型エマルション製剤。
［１４］  さらに単糖類、糖アルコール、多類糖、アミノ酸、タンパク質、ウレア、および無機塩からなる群から選択される一つ以上の賦形剤を含有する、［１］〜［１３］のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
［１５］  上記賦形剤がマンニトール、スクロースまたはトレハロースである、［１４］に記載の水中油型エマルション製剤。
［１６］  上記賦形剤がマンニトールである、［１５］に記載の水中油型エマルション製剤。
［１７］  細菌がＢＣＧ菌であり、油がスクワレンまたはスクワランであり、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、さらに抗酸化剤としてジブチルヒドロキシトルエン、緩衝剤としてクエン酸バッファーを含有する、［１］〜［１６］のいずれかに記載の製剤。
［１８］  細菌がＢＣＧ菌であり、油がスクワレンであり、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、緩衝剤としてクエン酸バッファーを含有する、［１］〜［１６］のいずれかに記載の製剤。
［１９］  ［１４］〜［１８］のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤の凍結乾燥製剤。
［２０］  ［１］〜［１９］のいずれかに記載のエマルション製剤または凍結乾燥製剤を含有する、ヒトを含む哺乳動物のための医薬組成物。
［２１］  癌の治療のための、［２０］記載の医薬組成物。
［２２］  以下の工程を含む細菌ＣＷＳを含有する水中油型エマルション製剤の製造方法：
（ｉ）下記の条件を満たす細菌ＣＷＳ調製物を提供する、
ａ）細菌ＣＷＳ調製物中の全非構成アミノ酸含量が０．８重量％以下（０〜０．８重量％）である
ｂ）オーラミン染色によるＣＷＳ調製物の蛍光面積率が１０％以下（０〜１０％）である、
（ｉｉ）細菌ＣＷＳ調製物、油、並びに有機溶媒を含む混合液を攪拌して細菌ＣＷＳを分散させる、
（ｉｉｉ）有機溶媒を留去する、
（ｉｖ）有機溶媒留去後の細菌ＣＷＳに、界面活性剤を含む水溶液を加えて乳化する。
［２３］  上記ＣＷＳ調製物の蛍光面積率が５％以下（０〜５％）である、［２２］に記載の製造方法。
［２４］  上記ＣＷＳ調製物の蛍光面積率が２％以下（０〜２％）である、［２２］または［２３］に記載の製造方法。
［２５］  上記ＣＷＳ調製物（乾燥体）を生理食塩水中１ｍｇ／ｍＬに分散させた場合の、分散の６０分後のＯＤ値（６９０ｎｍ）が分散直後のＯＤ値と対比して０．４以上（０．４〜１．０）である、［２２］〜［２４］のいずれかに記載の製造方法。
［２６］  上記６０分後のＯＤ値（６９０ｎｍ）が分散直後のＯＤ値と対比して０．７以上（０．７〜１．０）である、［２２］〜［２５］のいずれかに記載の製造方法。
［２７］  上記細菌ＣＷＳ調製物が、さらに下記要件を満たす、［２２］〜［２６］のいずれかに記載の製造方法：
細菌ＣＷＳ調製物の５〜２０重量倍のスクワレン、１．５〜７重量倍のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルＰＳ８０を用いて、１ｍｇＣＷＳ／ｍＬとなるように作製された水中油型エマルションのゼータ電位と、細菌ＣＷＳ調製物を用いない以外は同様にして作成されたビークル水中油型エマルションのゼータ電位の電位差が、３〜１４ｍＶである。
［２８］  上記電位差が、４〜１２ｍＶである、［２７］に記載の製造方法。
［２９］  上記細菌ＣＷＳ調製物が下記の条件を満たす、［２２］〜［２８］のいずれかに記載の製造方法：
ＴＬＲ２と反応し、ＴＬＲ４と反応しない。
［３０］  上記細菌ＣＷＳ調製物が、脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンの３層からなる、［２２］〜［２９］のいずれかに記載の製造方法。
［３１］  上記細菌ＣＷＳ調製物が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択される細菌由来のものである、［２２］〜［３０］のいずれかに記載の製造方法。
［３２］  上記細菌が、ミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、［３１］に記載の製造方法。
［３３］  上記細菌がＢＣＧ菌である、［３２］に記載の製造方法。
［３４］  ［２２］〜［３３］ののいずれかに記載の製造方法の工程（ｉｖ）において、さらに賦形剤を加えた上で乳化し、得られた水中油型エマルション製剤を凍結乾燥する工程を含む、細菌ＣＷＳ水中油型エマルションの凍結乾燥製剤の製造方法。
［３５］  上記凍結乾燥製剤が［１９］に記載の製剤である、［３４］に記載の凍結乾燥製剤の製造方法。
［３６］  下記を満たす細菌の細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）調製物：
ａ）ＣＷＳ調製物中の全非構成アミノ酸含量が０．８重量％以下（０〜０．８重量％）であり、かつ
ｂ）オーラミン染色によるＣＷＳ調製物の蛍光面積率が１０％以下（０〜１０％）である。
［３７］  上記ＣＷＳ調製物の蛍光面積率が５％以下（０〜５％）である、［３６］に記載のＣＷＳ調整物。
［３８］  上記ＣＷＳ調製物の蛍光面積率が２％以下（０〜２％）である、［３７］に記載のＣＷＳ調整物。
［３９］  上記ＣＷＳ調製物（乾燥体）を生理食塩水中１ｍｇ／ｍＬに分散させた場合の、分散の６０分後のＯＤ値（６９０ｎｍ）が分散直後のＯＤ値と対比して０．４以上（０．４〜１．０）である、［３６］〜［３８］のいずれかに記載のＣＷＳ調整物。
［４０］  上記６０分後のＯＤ値（６９０ｎｍ）が分散直後のＯＤ値と対比して０．７以上（０．７〜１．０）である、［３９］に記載のＣＷＳ調整物。
［４１］  さらに以下の条件を満たす、［３６］〜［４０］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調整物：
細菌ＣＷＳ調製物の１５重量倍のスクワレン、５重量倍のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルＰＳ８０を用いて、１ｍｇＣＷＳ／ｍＬとなるように作製した水中油型エマルションのゼータ電位と、細菌ＣＷＳ調製物を含まない以外は同様にして作成されたビークル水中油型エマルションのゼータ電位の電位差が３〜１４ｍＶである。
［４２］  上記細菌ＣＷＳ調整物がレクチンに対して反応性を示すものである、［３６］〜［４１］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物。
［４３］  上記レクチンが、コンカナバリンＡである、［４２］に記載の細菌ＣＷＳ調製物。
［４４］  ハロゲン系有機溶媒を含有しない、［３６］〜［４３］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物。
［４５］  界面活性剤を含有しない、［３６］〜［４４］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物。
［４６］  上記細菌ＣＷＳ調製物が、ＴＬＲ２に反応し、ＴＬＲ４に反応しない、［３６］〜［４５］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物。
［４７］  上記細菌が、ＣＷＳに脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、［３６］〜［４６］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物。
［４８］  上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、［３６］〜［４７］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物。
［４９］  上記細菌が、ミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、［４８］に記載の細菌ＣＷＳ調製物。
［５０］  上記細菌が、ＢＣＧ菌又はノカルジア菌である、［４９］に記載の細菌ＣＷＳ調製物。
［５１］  上記細菌が、ＢＣＧ菌である、［５０］に記載の細菌ＣＷＳ調製物。
［５２］  ［３６］〜［５１］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物を含有する医薬組成物。
［５３］  上記医薬組成物がエマルション製剤又は懸濁液製剤である、［５２］に記載の医薬組成物。
［５４］  上記懸濁液製剤が、水性懸濁液製剤である、［５３］に記載の医薬組成物。
［５５］  癌の治療のための、［５２］〜［５４］のいずれかに記載の医薬組成物。
［５６］  ｉ）下記に特徴付けられる、細菌の精製菌体調製物を提供する工程：
ａ）ハロゲン系有機溶媒を含有しない、
ｂ）ＰＧＬの含有量が、精製菌体調製物全量の０．４重量％以下（０〜０．４重量％）である、
ｉｉ）精製菌体調製物を破砕処理する工程、
ｉｉｉ）精製菌体破砕物の酵素処理を行う工程、および
ｉｖ）酵素処理後、洗浄する工程
を含む、細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［５７］  精製菌体調製物のＰＧＬとグリセロールモノミコール酸エステル（ＧｒｏＭＭ）の残存量が各々原料菌体の元の含有量の１０重量％以下（０〜１０重量％）である、［５６］に記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［５８］  精製菌体調製物がＴＬＲ４に反応せず、ＴＬＲ２に反応する、［５６］または［５７］に記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［５９］  上記細菌が、ＣＷＳに脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、［５６］〜［５８］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［６０］  上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、［５６］〜［５９］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［６１］  上記細菌がミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、［６０］に記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［６２］  上記細菌がＢＣＧ菌又はノカルジア菌である、［６１］に記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［６３］  上記細菌がＢＣＧ菌である、［６２］に記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［６４］  上記精製菌体調製物のＣＷＳ含量が３５〜４７重量％である、［５６］〜［６３］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［６５］  精製菌体調製物が、上記精製菌体調製物の水性懸濁液を、公称濾過精度が1〜３μｍのフィルターを用いて濾別した場合に、精製菌体調製物が濾取可能である、［５６］〜［６４］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［６６］  上記酵素処理の酵素が蛋白質分解酵素である、［５６］〜［６５］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［６７］  上記洗浄工程が、水又は水と親水性有機溶媒の混合溶媒で洗浄することを特徴とする、［５６］〜［６６］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［６８］  界面活性剤を使用しないことを特徴とする、［５６］〜［６７］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［６９］  ハロゲン系有機溶媒を使用しないことを特徴とする、［５６］〜［６８］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［７０］  実質的に細胞外付着成分を含まない、細菌の精製菌体調製物を提供する工程が、細菌の生菌あるいは死菌を、水と親水性有機溶媒の混合溶液中、還流下で加熱する工程を含む、［５６］〜［６９］のいずれかに記載の細菌ＣＷＳ調製物の製造方法。
［７１］  下記に特徴付けられる、細菌の精製菌体調製物：
ａ）ハロゲン系有機溶媒を含有しない、
ｂ）ＰＧＬの含有量が、精製菌体調製物全量の０．４重量％以下（０〜０．４重量％）である。
［７２］  ＰＧＬとグリセロールモノミコール酸エステル（ＧｒｏＭＭ）の残存量が各々原料菌体の元の含有量の１０重量％以下（０〜１０重量％）である、［７１］に記載の細菌の精製菌体調製物。
［７３］  ＴＬＲ４に反応せず、ＴＬＲ２に反応する、［７１］〜［７２］のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
［７４］  上記細菌が、ＣＷＳに脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、［７１］〜［７３］のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
［７５］  上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、［７１］〜［７４］のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
［７６］  上記細菌がミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、［７５］に記載の細菌の精製菌体調製物。
［７７］  上記細菌がＢＣＧ菌又はノカルジア菌である、［７６］に記載の細菌の精製菌体調製物。
［７８］  上記細菌がＢＣＧ菌である、［７６］に記載の細菌の精製菌体調製物。
［７９］  上記精製菌体調製物のＣＷＳ含量が３５〜４７重量％である、［７１］〜［７８］のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
［８０］  上記精製菌体調製物の水性懸濁液を、公称濾過精度が1〜３μｍのフィルターを用いて濾別した場合に、精製菌体調製物が濾取可能である、［７１］〜［７９］のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
［８１］  細菌の生菌あるいは死菌を、水と親水性有機溶媒の混合溶液中、還流下で加熱する工程を含む、細菌の精製菌体調製物の製造方法。
［８２］  上記水と親水性有機溶媒の混合溶液中の水の含有量が１０〜４０重量％である、［８１］に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
［８３］  上記親水性有機溶媒として、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、アセトン、メチルエチルケトンから一つ以上が選択されることを特徴とする、［８１］または［８２］に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
［８４］  上記親水性有機溶媒がメタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトンから一つ以上が選択されることを特徴とする、［８３］に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
［８５］  上記混合溶液から濾過処理にて精製菌体を分離することを特徴とする、［８１］〜［８４］のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
［８６］  上記濾過処理を、公称濾過精度が０．４５〜５μｍであるフィルターを用いて行う、［８５］に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
［８７］  上記濾過処理が、圧迫濾過であることを特徴とする、［８５］または［８６］に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
［８８］  上記精製菌体に存在する細胞外付着成分の含量を指標として精製の終点管理を行う、［８１］〜［８７］のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
［８９］  上記指標として、ＰＧＬ及び／又はＧｒｏＭＭの残存量をモニターすることを特徴とする、［８８］に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
［９０］  上記終点管理が、ＰＧＬの残存量をモニターして、精製菌体中の残存量重量が０．４重量％以下（０〜０．４重量％）であることを確認することを特徴とする、［８９記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
［９１］  上記精製菌体調製物が、［７１］〜［８０］のいずれかに記載の精製菌体調製物である、［８１］〜［９０］のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。【００１２】
なお、本願明細書および請求の範囲において、「細菌細胞骨格成分（ＣＷＳ）調製物」、「ＣＷＳ調製物」、「精製細菌調製物」等の用語を用いている。「調製物」は、細菌ＣＷＳや精製菌体成分のみを含有するのではなく、原料や製造工程に由来する種々の物質を含んでいても良い複合体を意味する。本願明細書においては特に断りのない限り、「細菌細胞骨格成分（ＣＷＳ）調製物」、「ＣＷＳ調製物」、「精製細菌調製物」と、「細菌細胞骨格成分」、「ＣＷＳ」、「精製細菌」はそれぞれ同じ物質を示すものとする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤は、糖鎖が油粒子の表面に突出・露出し、レクチンとの反応性及び免疫細胞に対して優れた活性を示し、保存安定性に優れている。それ故、本発明のエマルション及びその凍結乾燥製剤は、医薬品として癌免疫療法剤、花粉症、喘息等の免疫調節剤に使用可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】抗酸菌（結核菌）の細胞壁の基本構造を物質レベルでどのような形状になっているかを表した図（ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＳｐｅｃｔｒｕｍ，  ２（３），  １−１９（２０１４）のＦＩＧＵＲＥ  ６）である。細胞壁（細胞外付着成分を含む）に含まれる主な化合物が記載されている。更に、抗酸菌の細胞壁の成分の中で、有機溶媒で抽出される脂質が表されている。なお、細胞壁の成分の中で、ペプチドグリカン−アラビノガラクタン−ミコール酸の部分（細胞壁骨格）は有機溶媒等によって抽出できないことが記載されている。
【図２】本発明、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルションに対するローダミン標識コンカナバリンＡの結合、凝集反応の比較。ａ）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルション。ｂ）特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルション。（左：蛍光顕微鏡画像、右：微分干渉画像）
【図３】本発明のエマルション並びにエマルション中の油滴の模式図を示す。Ａは従来技術(例えば特許文献３）のエマルション中の油滴、Ｂ．本発明のエマルション中の油滴の模式図である。
【図４】各種オイル量（対ＢＣＧ−ＣＷＳ仕込み重量比３．８、６．０、７．５倍量）を用いて製造した異なる物性値（水への分散性）を有するＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションの粒度分布。ａ）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）のエマルション。ｂ）特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）のエマルション。
【図５】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）をそれぞれ用いて製造したエマルションの、マウスマクロファージ様細胞株（Ｒａｗ２６４．７細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＮＦ−α産生増強活性の比較。
【図６】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）をそれぞれ用いて製造したエマルションの、マウス未成熟樹状細胞株（ＢＣ−１細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１２産生増強活性の比較。
【図７】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）をそれぞれ用いて製造したエマルションの、ｈＴＬＲ２遺伝子導入ＨＥＫ細胞株（ヒト胎児由来腎臓細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏレポーター活性の比較。
【図８】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）の、ＢＣＧ−ＣＷＳオイルペーストのオイル量と、ｉｎｖｉｔｒｏ生物活性の相関性の比較（Ｒａｗ２６４．７細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＮＦ−α産生増強活性）。
【図９】ＢＣＧ−ＣＷＳオイルペーストの水中での模式図Ａ）は特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのオイルペースト。Ｂ）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのオイルペースト。２．水層、４．ＢＣＧ−ＣＷＳ、５．アラビノガラクタン特許文献３のオイルペーストではアラビノガラクタンが殆ど油滴表面に突出、露出していない。本発明のオイルペーストでは、アラビノガラクタンが多く油滴表面に突出、露出している。
【図１０】本発明ＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションの各種ｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性。ａ）ＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルションのＳＪＬ／Ｊマウスへの腹腔内投与時の血中ＩＦＮ―γ産生誘導効果。ｂ）ＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルションのＯＶＡ遺伝子導入Ｅ．Ｇ７細胞株担癌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）への腫瘍内投与時の腫瘍増殖抑制効果。
【図１１】各種抗酸化剤使用時における負荷条件下（６０℃、８日間保存）のビークルエマルションの保存安定性の比較。ａ）ｐＨ変動、ｂ）スクアレン含量変動、ｃ）オレイン酸含量変動。
【図１２】リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液の、加温負荷条件下（４０、６０℃）のＰＳ８０溶液に対するｐＨ変動。ａ）４０℃、ｂ）６０℃。
【図１３】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）の水中分散時におけるＯＤ相対値の変化。
【図１４】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳに関する物性の相違（水中の分散性、ｎ−ヘプタン中の粒度分布など）をＢＣＧ−ＣＷＳの表面形態の変化で説明したイメージ図である。（ａ）は分散状態、（ｂ）はミコール酸部分が通常の可逆的な疎水性相互作用、（ｃ）はミコール酸部分が不可逆的に強く凝集又は融合している形態を表している。
【図１５】各種水への分散性（物性値）を有するＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションによるＲａｗ２６４．７細胞株刺激時のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＮＦ−α産生量。
【図１６】ａ）特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの有機溶媒中加熱処理品のＯＤ相対値（分散性）の変化。ｂ）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの加熱及び界面活性剤処理品のＯＤ相対値（分散性）の変化。
【図１７】特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの再破砕品のＯＤ相対値（分散性）の変化。
【図１８】ウサギ抗ＢＣＧ死菌抗体に対する、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの結合反応性。
【図１９】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのオーラミン染色画像。（ａ）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ、（ｂ）特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ。（左：蛍光顕微鏡画像、右：微分干渉画像）
【図２０】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの（ａ）生理食塩水中、（ｂ）ｎ−ヘプタン中における粒度分布
【図２１】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）の、マウス未成熟樹状細胞株（ＢＣ−１細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１２産生増強活性。
【図２２】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）の、マウス樹状細胞株（ＪＡＷＳII細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１２産生増強活性。
【図２３】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）の、マウスマクロファージ様細胞株（Ｒａｗ２６４．７細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＮＦ−α産生増強活性。
【図２４】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）の、各種ｈＴＬＲ遺伝子導入ＨＥＫ細胞株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏレポーター活性。ａ)ｈＴＬＲ２、ｂ）ｈＴＬＲ４。
【図２５】精製菌体製造時の死菌体洗浄効率ａ）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いたＢＣＧ死菌体との比較による、本発明のＢＣＧ精製菌体の細胞外付着物残留量。ｂ）死菌体洗浄における本発明洗浄方法と公知法で洗浄した各菌体に含まれる細胞外付着成分の残留量をＴＬＣで示している。
【図２６】ＢＣＧ死菌、本発明の精製菌体に対するローダミン標識コンカナバリンＡの結合、凝集反応。ａ）ＢＣＧ死菌。ｂ）本発明の精製菌体。（左：蛍光顕微鏡画像、右：微分干渉画像）
【図２７−１】ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体とその破砕物の、各種ｈＴＬＲ遺伝子導入ＨＥＫ細胞株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏレポーター活性。ａ)ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体のｈＴＬＲ２レポーター活性。ｂ）本発明のＢＣＧ精製菌体とその破砕物のｈＴＬＲ２レポーター活性。
【図２７−２】ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体とその破砕物の、各種ｈＴＬＲ遺伝子導入ＨＥＫ細胞株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏレポーター活性。ｃ) ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体のｈＴＬＲ４レポーター活性。ｄ）本発明のＢＣＧ精製菌体とその破砕物のｈＴＬＲ４レポーター活性。
【図２８】ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体とその破砕物の、Ｒａｗ２６４．７細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＮＦ−α産生増強活性。ａ)ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体。ｂ）本発明のＢＣＧ精製菌体とその破砕物。
【図２９】ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体の、マウス樹状細胞株（ＪＡＷＳII細胞）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１２産生増強活性。
【図３０】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションの粒度分布
【図３１】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルション凍結乾燥製剤復水後のエマルションの粒度分布
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の第一の態様は、細菌−ＣＷＳを含有する水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤に関するものである。
本発明の「水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤」とは、本発明の細菌−ＣＷＳを用いて、例えば次のように製造できるものである。すなわち、(1)有機溶媒を用いて細菌−ＣＷＳ及びスクワレン、スクワラン等の油との混合油状物（オイルペースト）を調製し、(2)界面活性剤としてポリソルベート類等を配合し、(3) 前記（２)を水中で乳化し乳化液を得る。（４）乳化液を賦形剤としてマンニトール等を配合した緩衝液で希釈し、希釈液とし、均一性に富む水中油型エマルションを製造することができ、（５）当該水中油型エマルションを凍結乾燥させることによって凍結乾燥製剤を得ることができる。
一方、公知な方法（特許文献３）で製造したＢＣＧ−ＣＷＳを用いた場合、水中油型エマルション作製に最少必要な油量が多く、その凍結乾燥製剤の保存安定性が低くかつ、保存安定性の再現性が低いことが分かった。これらのことから、ＢＣＧ−ＣＷＳの形態及びその物性がエマルション及びその凍結乾燥製剤の保存安定性に大きく関与していることが分かった。
【００１６】
本発明の「細菌細胞壁骨格成分」とは、細菌由来の細胞壁骨格成分（Cell Wall Skeleton; ＣＷＳ）を含む任意の菌体由来成分を表し、細菌−ＣＷＳと略される。細菌−ＣＷＳとしては、例えばヒト型結核菌等のマイコバクテリウム属、乳酸菌等のラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、酵母等のサッカロマイセス属（Saccharomyces）の死菌等の、細菌の菌体そのもの、及びある程度単離された細胞壁骨格成分を挙げることができる。細菌としては、例えばグラム陽性棹菌のミコバクテリウム属細菌、ノカルジア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌などが挙げられる。「ミコバクテリウム属細菌」とは、具体的には、結核菌群細菌のMycobacterium tuberculosis（結核菌）、Mycobacterium bovis［ウシ型結核菌、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌；Bacillus Calmette−Guerin）を含む］、Mycobacterium  smegmatis(スメグマ菌)、（Mycobacterium africanum（アフリカ菌）、Mycobacterium microti（ネズミ型結核菌）があり、この他、Mycobacterium  leprae（ライ菌）、非結核性抗酸菌群であるMycobacterium kansasii、Mycobacterium avium、Mycobacterium phlei等が挙げることができる。「ラクトバシラス属細菌」とはカゼイ・シロタ菌（Casei strain Shirota）が挙げられる。中でも好ましいものとして、ミコバクテリウム属ウシ型結核菌の一種であるBCG菌およびノカルディア属細菌の一種であるノカルディア・ルブラを挙げることができる。
【００１７】
本発明の「細胞壁骨格（ＣＷＳ）」とは、図１に示す抗酸菌である結核菌の細胞壁から脂肪酸（ミコール酸）、糖鎖（アラビノガラクタン）及びペプチドグリカン以外の成分を除いた成分を示している。ＣＷＳは、抗酸菌菌体の破砕処理、核酸分解酵素処理、蛋白質分解酵素処理、溶媒洗浄などの精製工程を経て得られる、蛋白質、核酸及び脂肪酸等の可溶性成分を実質的に含まない不溶性残渣である（J. Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ.，  ５２，  ９５−１０１（１９７４））。
なお、前記のように、製造方法及び分析値が示され、純度あるいは不純物含量が明示されているＢＣＧ−ＣＷＳ（特許文献３）を製造し検討した結果、水に対する分散性が非常に悪く水中油型エマルションへの変換効率が低く、そのエマルション、懸濁液及び水中油型エマルションの凍結乾燥製剤の安定性が低い、或いは再現性が無いことが分かった。そこで、水への分散性を中心としてＢＣＧ−ＣＷＳの形態に着目しその物性改良を指標として、製造方法を変えることによって水に対する分散性に優れたＢＣＧ−ＣＷＳを得ることができた。
本発明の「脂肪酸」とは、例えばマイコバクテリウム属由来のミコール酸やノカルジア属の有する脂肪酸を挙げることができる。好ましくはミコール酸を挙げることができる。
本発明の「糖鎖」とはマイコバクテリウム属またはノカルジア属のＣＷＳなどに結合している糖鎖を言う。好ましくはアラビノガラクタンを挙げることができる。
【００１８】
前記公知法（特許文献３）で製造したＢＣＧ−ＣＷＳと上記水への分散性に優れた本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いてエマルションを作製し比較したところ、以下の
１）レクチン（コンカナバリンＡ）との反応性
２）ゼータ電位
３）水中油型エマルションへの変換効率と水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤の安定性
が明らかに異なることが分かった。
【００１９】
即ち、本発明の水中油型エマルションは、
１）レクチン（コンカナバリンＡ）との反応性：
レクチンに対し反応を示し凝集も確認されるが、公知ＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルションでは反応を示さない（図２）。
２）ゼータ電位：
ゼータ電位に関しては、ＢＣＧ−ＣＷＳに対して重量比１５倍量の油を用いた場合の水中油型エマルションでは強いゼータ電位（−１５．２ｍＶ）を示し、一方特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルションは、ＢＣＧ−ＣＷＳ非含有のビークルエマルション（−７．１ｍＶ）と同等のゼータ電位（―７．８ｍＶ）を示した。
【００２０】
３）水中油型エマルションへの変換効率（含有効率）：
エマルションの油量として、ＢＣＧ−ＣＷＳに対して重量比３．８倍量を用いた場合、高いエマルションへの変換率（９６％）を示し、一方で特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルションは低い変換率（５４％）であった（表５）。即ち、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを使用する場合、油量がＢＣＧ−ＣＷＳの３．８倍の場合には、エマルションを製造することができず、７倍以上の油量を用いた場合にのみ、エマルションが製造可能であることが示された。また、ＢＣＧ−ＣＷＳの６倍の油量で製造した場合も、本発明ＢＣＧ−ＣＷＳを用いた場合には９８％のエマルションへの変換が認められたが、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いた場合には７９％しか変換しなかった（表５）。この結果から、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションの作製には、７倍以上の油量が必須であることが示された。
【００２１】
しかも、ここで即ち６倍量の油量で作製した２つのエマルションの凍結乾燥製剤の安定性に大きな相違があった。特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いた製剤では、ＢＣＧ−ＣＷＳと油量の重量比がより大きい（７倍以上）にも関わらず、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いた製剤より、明らかに不安定であった。（凍結乾燥製剤復水後のエマルション内ＢＣＧ−ＣＷＳ含量測定によって算出した：４０℃、２週間保存後のＢＣＧ−ＣＷＳ減少量特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ製剤２０％、本発明ＢＣＧ−ＣＷＳ製剤約１％であった（表６）。
【００２２】
４）水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤の安定性：
エマルションの安定性は、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションと比較して本発明のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションの方が優れていた。例えば油量がＢＣＧ−ＣＷＳの重量比１５倍量の室温3日保存時のエマルションからの含有ＢＣＧ−ＣＷＳの減少量は、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションでは２４％減少し、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションの場合では７％の減少であった（表７）。
以上の結果を支持する事実として、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いた安定な水中油型エマルションの凍結乾燥製剤として特許文献３に明示されている凍結乾燥製剤では油量がＢＣＧ−ＣＷＳの重量比１８倍量のスクワランが用いられている。また、公知文献（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｈｅｒ．，  ２（３），  １６８−１７７（２００８）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｈｅｒ．，  ２（３），  １７８−１８７（２００８））では公知のＢＣＧ−ＣＷＳを用いた水中油型エマルションの凍結乾燥製剤として、２７倍量のスクワランが用いられている。
【００２３】
以上のように、変換効率（含有効率）、エマルションの安定性及び凍結乾燥製剤の保存安定性は、いずれも本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは公知ＢＣＧ−ＣＷＳに比して有意に優れており、より高いＢＣＧ−ＣＷＳの含有率を有する水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤の製造が可能になっている。
【００２４】
本発明の「保存安定性」とは、エマルションについては室温条件下、凍結乾燥製剤については４０℃条件下数日から２週間経過後のＣＷＳ含量等を評価し、含有率の減少が１０％以内であることを言う。エマルションに関しては好ましくは３日間で１０％以下の減量であり、エマルション凍結乾燥製剤に関しては好ましくは２％である。
【００２５】
本発明の「レクチンとの反応性」とは、レクチンとして例えばコンカナバリンＡと結合して凝集を起こすことをいう。レクチンとは特異的に糖鎖と結合する性質を有するタンパク質であり、もっぱら植物から分離されていた。コンカナバリンＡはナタ豆から得られた糖鎖結合性のタンパク質または糖タンパク質である。本発明の水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤がレクチンとの反応性を示すことは、エマルション中の油滴（油粒子）表面にアラビノガラクタンが突出・露出していることを示している。レクチンとしては、特に限定はないが、例えばローダミン標識コンカナバリンＡなどを使用することができる。
【００２６】
本発明の「ゼータ電位」とは、ゼータサイザーを用いて測定した水中油型エマルション中の油粒子表面の荷電状態を示すものである。本発明の水への分散性に優れたＢＣＧ−ＣＷＳで作成した水中油型エマルションの場合、ビークルエマルションのゼータ電位とのゼータ電位差は大きく（６〜９ｍＶ）、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いた水中油型エマルションの場合、ビークルエマルションのゼータ電位とのゼータ電位差はほとんど見られなかった（１ｍＶ以下）（表１０）。
【００２７】
更に、本発明ＢＣＧ−ＣＷＳを用いてＢＣＧ−ＣＷＳに対する油重量比を変えて作製したエマルションのビークルエマルションとのゼータ電位差を測定したところ、重量比７．５倍量、１５倍量、２２．５倍量の油を用いた場合、各々その電位差は９．２、７．２、５．４ｍＶを示した（表１１）。即ち、オイル量が多くなるにつれて油滴内部により多くのアラビノガラクタンが包埋される、即ち、アラビノガラクタンのエマルション油滴表面への露出量が減少していると考えられた。このことからも、レクチンとの反応性から示された結果と同様に、ゼータ電位からも、エマルションの油滴（油粒子）表面にアラビノガラクタンが突出・露出していることが示された。
このように、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルションとしては、ビークルエマルションとのゼータ電位差が３〜１４ｍVであり、好ましくは４〜１２ｍVを挙げることができる。特に好ましくは、４〜１１ｍVを挙げることができる。
なお、ＢＣＧ−ＣＷＳ及び油をそれぞれ蛍光化させたエマルションを観察したところ、蛍光が共局在しておりＢＣＧ−ＣＷＳがエマルション中の油粒子に封入されていることが確認されたが、ゼータ電位の相違及びレクチン（コンカナバリンＡ）との反応性を示すことは、エマルションの油粒子（油滴）の表面に糖鎖、即ちアラビノガラクタンが突出・露出した構造／形態を示している。即ち、本願の水中油型エマルションは、いままで知られているレクチンとの反応が陰性であることを特徴としている公知のエマルション（特許文献３）とは全く異なる新規な水中油型エマルションであることが確認できた（図３）。
【００２８】
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いた水中油型エマルションが特許文献３の水中油型エマルションと比較して、安定性が高くかつ、高い変換効率、即ち油滴に対するＢＣＧ−ＣＷＳ含量が高いエマルションが作成可能である理由として、油滴表面に糖鎖が突出・露出していること、即ち、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ自身が界面活性剤として機能している結果と考えられる。
【００２９】
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションの粒度分布についてはＢＣＧ−ＣＷＳに対し重量比７．５倍量の油を用いた本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの粒度分布を図４に示した。それらのメディアン径は本発明ＢＣＧ−ＣＷＳエマルションでは２．４μｍ、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションでは２．７μｍで、ほぼ同等のメディアン径を示した。また、本発明ＢＣＧ−ＣＷＳを用いた場合、油量が対ＢＣＧ−ＣＷＳ重量比３．８、６．０、７．５倍量で水中油型エマルションを作成した場合、いずれも同じメディアン径及び粒度分布波形を示した（図４ａ）。一方、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳで作成した水中油型エマルションの場合には、３．８、６．０倍量の油で作製すると、それらのメディアン径が大きくかつ粒度分布波形が２峰性、或いは３峰性を示した（図４ｂ）。尚、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルションは乳化条件、凍結乾燥条件によってメディアン径を２．５μｍ以下にすることが可能である。
【００３０】
これまで述べてきたように、細菌−ＣＷＳの水中油型エマルションの形態／構造、レクチンとの相互作用及び水中油型エマルション、水中油型エマルション凍結乾燥製剤の製造の容易さ、保存安定性、物理化学的性質は、用いる細菌−ＣＷＳの形態／構造等によって大きく左右されることが判明した。
【００３１】
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの生物活性については１）免疫細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性、２）リンパ節への移行性、３）動物実験ｉｎｖｉｖｏ活性等で優れた活性を示した。
１）免疫細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性：
ＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションのｉｎｖｉｔｒｏ活性については殆ど知られていないが、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ及び本発明のＢＣＧ−ＣＷＳから作製した水中油型エマルションを用いて汎用の免疫細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性について検討した。その結果、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳから作製したエマルションは予想外に有意な活性を示した。即ち、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルションに比べ、Ｒａｗ２６４．７細胞株では約１６倍、ＴＬＲ２遺伝子導入ＨＥＫ細胞株では約２２倍、ＢＣ−１細胞株では約６倍のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示した（図５、７、６）。
更に、エマルションを作製する前のＢＣＧ−ＣＷＳ、油及び界面活性剤からなるオイルペースト（混合油状物）でそのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を検討した。本発明のＢＣＧ−ＣＷＳから作製したオイルペーストは、Ｒａｗ２６４．７細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示すが、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳから作製したオイルペーストは殆どその活性を示さなかった。本発明のＢＣＧ−ＣＷＳオイルペーストではオイル量が増大するにつれてその活性が低下した（図８）。この現象は、オイル量が増大するに従ってアラビノガラクタンの油滴表面への露出量の減少と相関していると考えられた（図９）。
【００３２】
２）リンパ節への移行性： 
ＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションの皮内投与後のＢＣＧ−ＣＷＳの挙動については、モルモットを用いた実験が知られている。即ち、その挙動は、公知のＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルションでは皮内投与後３時間においてＢＣＧ−ＣＷＳの一部がリンパ節に移行することが報告されている。また、臨床効果に相当する薬効はリンパ節に移行したＢＣＧ−ＣＷＳが関与していることが示されている（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｈｅｒ．，  ２（３），  １６８−１７７（２００８）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｈｅｒ．，  ２（３），  １７８−１８７（２００８））。そこで、簡単な評価系（試験例２３）を構築しモルモットを用いて本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションについて皮内投与後のＢＣＧ−ＣＷＳのリンパ節への移行性について検討した。その結果、１時間後にいずれのＢＣＧ−ＣＷＳもリンパ節に移行していることが認められた。また、そのＢＣＧ−ＣＷＳのリンパ節への移行量は本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルションの方が、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳに比較して約２倍高いことが示された（表１２）。
【００３３】
３）ＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションの動物を用いた活性あるいは効力評価については多く報告されている。その活性本体についてはアジュバント活性であることから以下本願エマルションのアジュバント活性について検討した。マウスを用いたＩＦＮ―γの誘導については文献公知の方法で検討した（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，  ９９（７），  １４３５−１４４０（２００８））。投与ルートは腹腔内投与で、本願のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションは特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションより多くの血中ＩＦＮ−γを産生した（図１０ａ）。文献公知（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １１７，  ４７−５８（２００５））のＥ．Ｇ７−ＯＶＡ細胞担癌マウスモデルでの腫瘍増殖抑制効果の腫瘍内投与実験において本願のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションは特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションよりも強い腫瘍増殖抑制活性を示した（図１０ｂ）。公知のＭｅｔｈ−Ａ腫瘍細胞を用いた評価（Ｇａｎｎ，６９，６１９−６２６，１９７８）においても本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルションは、強く腫瘍の生着を抑制した（表１３）。
【００３４】
本発明の「水中油型エマルション」とは、前述の特許文献３に準じた方法を用いて製造できることがわかっている。すなわち、１）細菌−ＣＷＳ及び油を、分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合攪拌する工程；２）上記１）の有機溶媒を留去してオイルペースト（混合油状物）を作製する工程；３）細菌−ＣＷＳと油との混合油状物を界面活性剤存在下、水中で乳化する工程（乳化液）。４）緩衝剤、賦形剤等を含む水性溶媒で希釈する工程（希釈液）。細菌―ＣＷＳ濃度としては0.１〜４．０ｍｇ／ｍＬが可能である。
細菌−ＣＷＳ、油、界面活性剤、賦形剤、緩衝剤、必要に応じて抗酸化剤が処方される。
本発明の「乳化」とは、分離している２つの液体をエマルションにすることを乳化という。乳化する作用をもつ物質を乳化剤といい、界面活性剤が使用される。即ち、エマルションとは、水と油のように互いに溶解しない液相の一方が他の一方に微細な液滴として分散したものであり（Ｗ．Ｃｌａｙｔｏｎ，  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｂｌａｃｋｓｔｏｎｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９４３）、互いに溶解しない２つ以上の液相等からエマルションを形成する過程は乳化と称される（Ｐ．Ｂｅｃｈｅｒ，  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｉｃｅ，  Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９６５）。
本発明の「水中油型エマルション凍結乾燥製剤」とは、上記水中油型エマルションを通常の方法で凍結乾燥したものである。
【００３５】
本発明の「油」としては、公知文献（Immunology  第２７巻、第３１１〜３２９項（1974年））に記載されているような鉱物油、動植物油が挙げられる。鉱物油としては、例えば、流動パラフィン（ドレコール６ＶＲ、モレスコバイオレスＵ−６、モレスコバイオレスU−8等）、バイオール（Bayol  F)等が挙げられる。動植物油としては、例えば大豆油、シンセラン４、オレイン酸エチル、落花生油、椿油、ゴマ油、AD−65（落花生油とアラセルとアルミニウムモノステアレートの混合物）、テルペノイド誘導体としてスクワラン、スクワレン等が挙げられる。また、これら動植物油、鉱物油の中から選ばれる複数の油の混合物を挙げることができる。好ましいものとしては、スクワラン、スクワレン、あるいは例えば、大豆油、オレイン酸エチルもしくはオレイン酸などの植物油（またはそれに由来する油）とスクワラン、スクワレンとの混合物、例えば、ドレコール６VR、各種流動パラフィンなどの鉱物油とスクワラン、スクワレンの混合物が挙げられる。より好ましくは、スクワラン、スクワレン、ドレコール６ＶＲまたはそれらの混合物を挙げることができる。更により好ましくはスクワラン、スクワレンが挙げられる。
油の濃度は、具体的には、細菌−ＣＷＳに対し重量比にして、油が３〜３０倍量の組成が挙げられる。
【００３６】
乳化液の製造に使用するオイルペーストは、以下の１）及び２）：
１）細菌−ＣＷＳ及び油を、分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合攪拌する工程；
２）上記１）の有機溶媒を留去する工程；
により調製することができる。用いられる有機溶媒としては、ヘキサン、ヘプタン、トルエン等の炭化水素系溶媒、５〜２０％のエタノール等のアルコール系溶媒あるいはアセトン等のケトン系溶媒を含む上記炭化水素系溶媒が挙げられる。
【００３７】
本発明の「界面活性剤」とは、医薬品製剤に汎用される界面活性剤のことをいい、特に制限されるものではない。例えばリン脂質、非イオン性界面活性剤などを挙げることができる。リン脂質としては、ホスファチジルアミン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリンまたはレシチン等を挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質も使用することができる。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられる。当該ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、同モノパルミテート（ポリソルベート４０）、同モノステアレート（ポリソルベート６０）、または同モノオレート（ポリソルベー
ト８０）等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ２０）、同モノパルミネート（Ｓｐａｎ４０）、同モノステアレート（Ｓｐａｎ６０）、同モノオレート（Ｓｐａｎ８０）等を挙げることができる。  好ましい界面活性剤としては、卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０（ＨＣＯ−５０）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）を挙げることができる。より好ましくはポリソルベート８０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート類）が挙げられ、さらに好ましくは、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びその混合物が挙げられ、特に好ましい界面活性剤としてポリソルベート８０を挙げることができる。
【００３８】
界面活性剤の濃度は、水中油型エマルションにおいて０．０１〜５重量％の範囲が適当であり、０．０１〜３重量％が好ましく、より好ましくは０．０５〜２重量％を挙げることができる。これら界面活性剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。
【００３９】
本発明の「抗酸化剤」とは、自動酸化の連鎖反応を抑制するラジカル阻害機能、又は過酸化物を非ラジカル分解して不活性化する過酸化物分解機能を有する化合物を表し、医薬品製剤に使用できる抗酸化剤であれば特に制限されるものでは無い。具体的には、トコフェロール類、ジブチルヒドロキシトルエン（以下、ＢＨＴという），ブチルヒドロキシアニソール（以下、ＢＨＡという）、ノルジヒドログアヤレチン、没食子酸プロピル、ビタミンＣ（Ｖ．Ｃ．）及びその脂肪酸エステル（Ｖ．Ｃ．Ｅ．）又はソルビン酸等を例示することができる。抗酸化剤として、好ましくはＢＨＴ、α−トコフェロール（Ｖ．Ｅ．）、α−トコフェロールエステル誘導体（Ｖ．Ｅ．Ｅ．）を挙げることができる。特に好ましくはＢＨＴを挙げることができる。
【００４０】
本発明における、これらの抗酸化剤の配合量は、特に限定されるものではないが原薬の酸化分解を十分に防止するためには、組成物全体に対して０．０００１〜５重量％が好ましく、更に好ましくは０．０００１〜３重量％を挙げることができる。抗酸化剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。
【００４１】
抗酸化剤は、水中油型エマルションの製造工程における任意の工程で添加すればよいが、好ましくは、細菌−ＣＷＳと油の混合油状物（オイルペースト）製造時に加えることができる。α−トコフェロールが一般的に使用されているが、本発明の水中油型エマルションである乳化液及びその希釈液の更なる安定性の向上を目指して抗酸化剤について検討した。処方中酸化しやすいと考えられるポリソルベート８０及びスクワレンの安定性を、α−トコフェロールやＢＨＴなどの各種抗酸化剤を用いた水中油型エマルションのビークルについて検討した。その結果、図１１に示すように、ポリソルベート８０分解物（オレイン酸）の過酸化及びスクワレンの酸化の抑制はＢＨＴが最も優れており、それに伴うｐＨの変動も抑制していた。以上の結果から、α−トコフェロール、ビタミンＣ及びそのエステル体と比較してＢＨＴが抗酸化作用に最も優れていることを見出した。
【００４２】
本発明の「賦形剤」とは、上記エマルションのエマルションとしての安定性または凍結乾燥製剤としての安定性を維持・向上する目的で使用される成分である。本発明で使用可能な賦形剤としては、単糖類、糖アルコール、多糖類、アミノ酸、タンパク質、ウレア、または無機塩などが挙げられる。単糖類および二糖類としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース等が挙げられる。糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。多糖類としては、デキストラン、でんぷん、マルトデキストリン、セルロース、ポリビニルピロリドン、またはアルギン酸ナトリウム等が好ましいものとして挙げられる。アミノ酸としては、アラニン、グリシン、プロリン等の中性アミノ酸が好ましく、より好ましい中性アミノ酸としてはグリシンを挙げることができる。タンパク質としては、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン等が好ましいものとして挙げられる。無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。好ましい賦形剤としては、単糖類、または糖アルコールが挙げられ、特に好ましい賦形剤としてはマンニトールが挙げられる。
【００４３】
これら賦形剤は、１種類に限らず、適宜、数種類組み合わせて使用することができる。賦形剤の濃度は、水中油型エマルションにおいて０．１〜２０重量％の範囲が適当であり、より好ましくは０．１〜１０重量％を挙げることができる。賦形剤の好適な濃度は、賦形剤の種類によって異なるが、製造スケールや各含有成分の含有量に応じて、適宜調整することができる。アミノ酸の場合、例えばグリシンでは２．２５〜１１．２５重量％（３００〜１５００ｍＭ）、好ましくは６．７５重量％（９００ｍＭ）である。マンニトールの場合、水中油型エマルションにおける濃度は、好ましくは1〜10重量%、さらに好ましくは１〜8重量%、より好ましくは3〜6重量%を挙げることができる。マンニトールを賦形剤として用いることにより、等張と同程度の濃度で用いることができるので、より生体に負担の少ない安定な製剤を調製することができる。
【００４４】
前記賦形剤として挙げられた物質は、必要に応じて等張化剤として用いてもよい。これら賦形剤もしくは等張化剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。通常は、前記賦形剤が等張化剤を兼ねているが、前記賦形剤とは異なる物質を等張化剤として選択してもよい。等張化剤の濃度は、他の成分の含有量に応じて適宜設定されるが、通常０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１０重量％の範囲が適当である。
【００４５】
本発明の「緩衝剤」とは、本発明の水中油型エマルション（凍結乾燥製剤を水で再懸濁させることにより得られるエマルションを含む）のｐＨを一定に保つ目的で用いられる、緩衝剤を含む水溶液を表す。本発明で使用可能な緩衝剤としては特に制限されるものは無いが、医薬品製剤に使用される緩衝剤であれば好ましい。具体的には、グリシン、アラニン、アルギニン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ε−アミノカプロン酸、リジン、ロイシンなどのアミノ酸またはその塩酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩、ニコチン酸アミド、アミノ安息香酸などの両性電解質またはそのナトリウム塩などの塩、クエン酸、リン酸、乳酸、酢酸、ホウ酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、グリコール酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、サリチル酸、フタル酸、酒石酸などの有機酸のナトリウム塩、カリウム塩などの塩、上記弱酸の塩と、弱酸、塩酸、硫酸などの強酸との組み合わせ、トリス緩衝剤などが挙げられる。
【００４６】
例えば、リン酸緩緩衝液としては、５〜５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素二ナトリウムからなる緩衝液が挙げられ、通常はリン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素二ナトリウムの比率を１：２．３（重量比）で溶解し、適宜ｐＨを塩酸等の酸、又は水酸化ナトリウム等の塩基で微調整してもよい。トリス緩衝液としては、５〜５０ｍＭのトリス溶液からなる緩衝液が挙げられ、必要に応じて適宜例えばｐＨを０．１〜４Ｎの塩酸等で微調整することができる。クエン酸緩衝液としては、５〜５０ｍＭのクエン酸溶液からなる緩衝液が挙げられる。適宜ｐＨを０．０１〜４Ｎのクエン酸、塩酸あるいはクエン酸ナトリウム、水酸化ナトリウム等で微調整することができる。緩衝液として、好ましくはクエン酸緩衝液、リン酸緩衝液が挙げられ、特に好ましくはクエン酸緩衝液が挙げられる。
【００４７】
本発明の水中油型エマルション製剤は、緩衝剤によってｐＨ５．５〜８．５、好ましくはｐＨ６．０〜７．５に調整されることが好ましい。
【００４８】
本発明における、これらの緩衝剤の配合量は、十分な緩衝能を発揮するために十分な量であれば特に限定は無いが、好ましくは、５〜５０ｍＭである。
賦形剤としてアミノ酸などの緩衝作用を有する物質を用いる場合には、適宜緩衝剤の添加量を調整する。
なお、緩衝剤としてリン酸緩衝液が一般的に使用されているが、本発明の水中油型エマルションの場合には、処方成分の中で最も加水分解しやすいと考えられるポリソルベート８０の安定性を指標として検討した結果、図１２に示すように、リン酸緩衝液と比較してクエン酸緩衝液が明らかに安定性面及び緩衝能が優れていることが見出された。
【００４９】
本発明の凍結乾燥製剤を、水性溶媒で腹水（再懸濁）することによって、水中油型エマルション製剤を提供することができる。当該水中油型エマルション製剤もまた、本発明に含まれる。
本発明における凍結乾燥製剤を再懸濁するために使用される水性溶媒は、エマルション粒子の分散媒体となるものであり、注射用蒸留水、生理食塩水、または緩衝液等が挙げられるが、注射可能な水性溶媒であれば特に限定されない。ここで凍結乾燥製剤を再懸濁するために用いられる水性溶媒が生理食塩水や緩衝液などの無機塩を含む水性溶媒の場合、当該水性溶媒の組成については、再懸濁後の水中油型エマルション製剤の安定性等を考慮して、適宜選択すればよい。また、再懸濁後の水中油型エマルション製剤における無機塩（緩衝剤や賦形剤として添加された無機塩）の濃度は、ヒトに投与される場合に等張液となるように調整されることが好ましい。
【００５０】
また、本発明の凍結乾燥製剤を調製するための製造中間体である水中油型エマルション（乳化液、希釈液）も、本発明の範疇である。当該「水中油型エマルション」は、更に、賦形剤、緩衝剤等を含有することができる。すなわち当該水中油型エマルションは、好ましくはマンニトール等の賦形剤を含みかつ、更に緩衝剤を配合されてｐＨが５．５〜８．５に調整されている。
前述の水中油型エマルションを凍結乾燥することによって、凍結乾燥製剤を製造することができる。すなわち、本発明の凍結乾燥製剤は、水中油型エマルションを凍結乾燥し、最後に通常はバイアル内部を窒素置換し、打栓を行うことにより得ることができる。水中油型エマルションを凍結乾燥する際、凍結乾燥温度、および時間等は特に限定されない。
本発明のエマルション凍結乾燥製剤の製造にあたっては例えば０．０５〜４ｍＬ／バイアルまでの凍結乾燥が可能である。
【００５１】
本発明の水中油型エマルション製剤は、注射など非経口で投与される。投与形態は、治療・予防目的として皮下或いは皮内投与、また胸腔内投与等もできる。エマルション中の細菌−ＣＷＳの量は通常は０．０１〜２．０ｍｇ／ｍｌの濃度である。
【００５２】
本発明の凍結乾燥製剤は、適量の水性溶媒、例えば水、生理食塩水、緩衝液にて本発明水中油型エマルションに再懸濁して用いる。凍結乾燥製剤を再懸濁して生体に投与する場合の水中油型エマルションにおける各成分の濃度は、凍結乾燥前の、製造中間体としての水中油型エマルションにおける各成分の濃度と異なっていてもよい。水性溶媒の量は、投与濃度などによって変えることができる。
投与量、投与回数は対象とする疾患、患者の疾患、症状、年齢、体重、性別等によって異なり、例えば、成人に対して週１回もしくは４週１回の投与で１回あたり細菌−ＣＷＳ量として３〜２００μgの範囲、好ましくは５〜１２０μｇの範囲の投与を一例として挙げることができる。
【００５３】
本発明の凍結乾燥製剤及びこれを復水した水中油型エマルション製剤は、癌治療薬または予防薬、詳しくは免疫療法剤として有用である。対象となる癌の種類に特に限定はないが、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、子宮癌、乳癌、急性骨髄性白血病、舌癌、咽頭癌、卵巣癌、脳腫瘍等が挙げられる。ここで癌治療剤には、癌転移抑制剤としての態様も含まれる。また、各種の癌の免疫療法剤との併用剤としても用いることが可能である。更に、各種免疫疾患への治療薬あるいは予防薬として例えば下記のような疾患に単独、或いは併用剤として用いることが可能である。糖尿病（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，  ７（８）,  ｅ４１７５６（２０１２））、パーキンソン病（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，  ６（１）,  ｅ１６６１０（２０１１））、喘息などのアレルギー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２０３，  ２９２９−２９３７（２００６））、花粉症、感染症、自己免疫疾患、アトピー性皮膚炎などにも有用である。
【００５４】
なお、ＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションを用いた臨床報告の多くは、皮内投与による癌免疫療法剤としての評価に係るものである（日胸疾会誌１５（１１）７６９−７７４（１９７７））。それらの中には、臨床効果と共に安全性についても述べられており、安全性については皮膚障害を除いては大きな問題が無いと記されている。尚、皮膚障害の大小は投与量に依存していることが考えられている。
【００５５】
しかし、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルションでは、免疫細胞に対する強いｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性、動物実験ｉｎ  ｖｉｖｏにおける強いアジュバント効果、及び臨床効果に結びつくと考えられている皮内投与後のリンパ節への優れた移行性等のこれまでにない優れた特徴を有しており、投与量の減量等により皮膚障害を含め安全性が高くかつ保存安定性に優れた水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤が作製できている。
【００５６】
本発明の第２の態様は、「水への分散性に優れた細菌−ＣＷＳ」に関するものである。即ち、各種エマルション、懸濁液及びそれらの凍結乾燥製剤の製造に適した高純度の細菌―ＣＷＳに関するものである。
【００５７】
本発明の「高純度」とは、細菌―ＣＷＳに結合した蛋白質などの不純物が除かれた細菌―ＣＷＳであり、具体的には非構成アミノ酸及び不純蛋白質の含量が１．０％以下であり望ましくは０．８％以下であることを示している。また、界面活性剤を含まず、残留溶媒としてハロゲン系有機溶媒を含まないことも示している。
【００５８】
本発明の「全非構成アミノ酸」とは、細菌―ＣＷＳに含有されるペプチドグリカンの構成アミノ酸以外の不純物に由来するアミノ酸の総量のことをいう。不純物に由来する全非構成アミノ酸の含量としては、細菌―ＣＷＳ全組成の１．０％以下であることが望ましい。より好ましくは、０．８％以下であることを挙げることができる。
本発明の「不純蛋白質」とは、細菌―ＣＷＳに含有される不純物に由来する蛋白質の総量のことをいう。不純物に由来する蛋白質の含量としては、細菌―ＣＷＳ組成の１．０％以下であることが望ましい。より好ましくは、０．８％以下であることを挙げることができる。尚、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳに比して高い純度を有している。
【００５９】
本発明の「ハロゲン系有機溶媒及び界面活性剤を含有しない」とは、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等の細菌―ＣＷＳの製造の際に汎用されるハロゲン化炭化水素及びいずれの界面活性剤も含まないことをいう。このことは、本発明の製造工程でハロゲン系有機溶媒を使用しないことによって、ハロゲン系有機溶媒及び界面活性剤が細菌―ＣＷＳに残留しないことを表現するものである。
【００６０】
本発明の「水への分散性に優れた」とは、試験例５に基づいて、本発明の細菌―ＣＷＳを生理食塩水中に分散直後から６０分後までのＯＤ値（波長６９０nmにおける吸光度）の変化を測定し、直後を１とし、分散６０分後のＯＤ相対値（物性値）で分散性を評価し、そのＯＤ相対値（物性値）が６０分後に０．４以上であることを言う。好ましくは、分散６０分後のＯＤ相対値（物性値）が０．７以上であり、より好ましくは０．９以上であることが挙げられる（図１３）。しかし、特許文献３に従って製造したＢＣＧ−ＣＷＳ（特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ）では、分散の６０分後のＯＤ相対値（物性値）が０．２９に減少し、ＢＣＧ−ＣＷＳの沈降が認められた。
【００６１】
本発明の細菌―ＣＷＳ（ＢＣＧ−ＣＷＳ）では、上記６０分後ＯＤ相対値（物性値）で示されるように特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳとは物性が異なっている。特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳでは、その製造過程で界面活性剤の存在下での処理や高温処理により細菌―ＣＷＳのミコール酸同士の不可逆的な強い凝集、融合が起こり、ミコール酸部分の密度が高いラミネート構造を形成した形態を有していることから、水への分散性が低下していると考えられる。
【００６２】
また、本来天然型のＢＣＧ−ＣＷＳはミコール酸とアラビノガラクタンとペプチドグリカンからなり水中ではアラビノガラクタンが比較的自由に動くことが可能な界面活性剤様の構造を持ち、水中において安定な懸濁液として存在することが出来る。即ち、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは不可逆的なミコール酸同士の強い凝集、融合が抑制され、アラビノガラクタンが自由に動くことの出来る形態・構造であることが優れた水への分散性に寄与している。一方、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳではミコール酸同士の強い凝集、融合によって生じるラミネート型構造の内部にアラビノガラクタンが閉塞し界面活性剤様の機能が失われており水への分散性が大きく低下している（図１４）。
【００６３】
例えば、図１６ｂに示されるように、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いて、界面活性剤の非存在下ＢＣＧ−ＣＷＳ粉末の直接加熱或いは界面活性剤存在下水中で加熱すると、ＯＤ相対値（物性値）が減少し、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳと同程度のＯＤ相対値（物性値）となり、即ち分散性が悪化した。即ち、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは、加熱、界面活性剤の添加等によって容易にミコール酸部分の強い凝集、融合を起こし、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳへ変化して行くことが示され、加熱、界面活性剤処理等がＢＣＧ−ＣＷＳの強い凝集、融合を促進することが明らかになった。更に、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは、脂溶性有機溶媒中で加熱あるいは再破砕等を行っても、水への分散性に変化がないことから（図１６ａ、図１７）、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳに見られる強い凝集、融合は不可逆であることが分かった。このように、ＢＣＧ−ＣＷＳの分散性（ＯＤ相対値；物性値）を指標として、図１４（ａ）又は（ｂ）に示されるような本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは、製造過程の界面活性剤処理、加熱等によって図１４（ｃ）に示されるようなミコール酸部分が不可逆的に凝集、融合した形態を示す特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳと明らかに形態・表面構造等が異なっており、物として判別できることが示された。
【００６４】
本発明の「各種エマルションおよび凍結乾燥製剤の製造に適した細菌―ＣＷＳ」とは保存安定性が高い、水中油型エマルション、油中水型エマルション等のエマルションのみならず、水への分散性に優れていることから細菌―ＣＷＳの懸濁液など各種エマルション、水性懸濁液及びその凍結乾燥製剤の製造が効率及び収率よく製造が可能な細菌―ＣＷＳである。
更に、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳに関する１）抗体との反応、２）オーラミン染色、３）ゼータ電位等で多くの相違する知見が得られ、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの間には、ＢＣＧ−ＣＷＳの形態・表面構造の相違が顕著であることが示された。
１）抗体との反応；
図１８に示すように抗体との反応性が大きく異なっている。即ち、ウサギ抗ＢＣＧ死菌ＩｇＧ抗体との反応では、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは強い結合反応を示すが、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは結合反応を示さなかった。このように、抗ＢＣＧ抗体を用いて、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの形態・表面構造の相違を明らかに判別できることが分かった。
【００６５】
２）オーラミン染色；
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの形態・構造的相違は、図１９、表３、の（ａ）と（ｂ）で示されるオーラミン染色法の蛍光強度或いはその有無で評価することができる。オーラミン染色法は、細胞壁のミコール酸部分にオーラミンを付着させ染色する方法であるため、ミコール酸部分の密度が低下すると、洗浄処理で脱色され易くなる（顕微鏡  Ｖｏｌ．４８，Ｎｏ．１,  ５１−５６, （２０１３））。本法（試験例８）においても、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳではオーラミン染色法で染色されないが（図１９ａ）、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳでは染色され、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのミコール酸による強い凝集、融合が認められた（図１９ｂ）。また、蛍光面積率で定量比較したところ、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは０．１％以下であるのに対し、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは８０％以上を示した（表３）。即ち、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳはオーラミン染色陽性であるのに対し本発明のＢＣＧ−ＣＷＳはオーラミン染色陰性であった。
この様に、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは、オーラミン染色の蛍光面積率として１０％以下であり、好ましくは５％以下を挙げることができる。特に好ましくは、２％以下を挙げることができる。
更に、蛍光化コンカナバリンＡを用いて、本発明と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの結合強度を比較したところ、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの方がコンカナバリンAと明らかに強く結合し、凝集を示した（試験例９）。
【００６６】
３）ゼータ電位；
ゼータ電位について検討した結果、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを単純に水に分散した系でのゼータ電位を測定した場合には、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは凝集により測定できなかった。そこで、表面構造、形態に影響する可能性があるが、高圧破砕機を用いて粒度分布をそろえた上でゼータ電位を測定した。その結果、１０％イソプロパノール水中、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは―２２ｍＶを示し、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳはー３０ｍＶを示した（表４）。即ち、高圧破砕機による破砕後にも関わらず、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの表面構造が異なっていることが示された。
【００６７】
抗体との結合性の違いから、本発明及び特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ各々の表面構造の違いがあることが明らかとなり、オーラミン染色の相違によって特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳが不可逆的な強い凝集、融合によるラミネート構造を示していること、コンカナバリンＡとの結合性の相違から本願ＢＣＧ−ＣＷＳが特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳに比して表面にアラビノガラクタンが多く露出し特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳではアラビノガラクタンの露出が小さいことが示され、ゼータ電位の相違から、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの表面構造にはアラビノガラクタンに加えミコール酸部分が多く分布し、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの表面にはペプチドグリカンが多く露出していることが示された。即ち、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳはミコール酸部分同士が強く凝集、融合したラミネート構造であり、ミコール酸及びアラビノガラクタンの多くがラミネート内に閉塞された状態になっていることが明らかとなった。
【００６８】
これらの相違は、粒度分布測定においても相違が認められている。即ち、形態、構造的な相違によりn−ヘプタン溶媒中の粒度分布が本発明のＢＣＧ−ＣＷＳでは単一のピークを示すが特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳでは２峰性を示した（図２０）。
以上、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのミコール酸の凝集を主眼に置いた形態を模式図に示すと、図１４のように表わされる。本発明の「単一ピークの粒度分布」とは、細菌―ＣＷＳを生理食塩水又はｎ−ヘプタンに懸濁させた時のレーザー回折法で測定した時の粒度分布が単一なピークの粒度分布であることをいう。
【００６９】
以上、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは特許文献３のミコール酸同士の不可逆な強い凝集、融合に起因して多くの点で異なった挙動を示し、明確に異なる性質を有することが示された。その形態、構造的相違は本願のＢＣＧ−ＣＷＳでは強く凝集、融合していない図１４（ａ）又は（ｂ）を維持し、アラビノガラクタンが水中で比較的自由に動ける構造に対し特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは、ミコール酸部分が図１４（ｃ）に示すように不可逆的に強く凝集、融合しており、多くのアラビノガラクタンがミコール酸同士が強く凝集、融合したラミネート構造内に閉塞していると考えられる。
【００７０】
尚、ＢＣＧ−ＣＷＳ自身のゼータ電位の正確な評価が容易でないため、形態、表面構造に影響を与えないより緩和な条件でのゼータ電位に関する情報を得るべく、エマルション化した状態でゼータ電位に関して評価する方法について検討した。その結果、ＢＣＧ−ＣＷＳに対して重量比１５倍量の油、５倍のＰＳ８０を用いた系で物性値（水への分散性）の異なるＢＣＧ−ＣＷＳについてそれらのエマルションとビークルエマルションとのゼータ電位差を評価した。その結果、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳではそのゼータ電位差は４〜１０ｍＶであり、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳではそのゼータ電位差は１ｍＶ以下であった。以上、本発明ＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは本法のゼータ電位差測定により、容易に判別できた（試験例１５、表１０）。
更に、Ｒａｗ２６４．７細胞を用いたin vitro活性評価においても、上記ゼータ電位差との相関がみられた。ゼータ電位差が大きい本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションでは、ＴＮＦ―αの誘導量が約１０００ｐｇ／ｍＬ以上であるのに対し、電位差が殆どない特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションは約３００ｐｇ／ｍＬであった（図１５）。
即ち、この電位差の範囲（４〜１１ｍＶ）のＢＣＧ−ＣＷＳであれば、レクチンと反応し、免疫細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を有する安定な水中油型エマルションが製造できる本発明のＢＣＧ−ＣＷＳである。
水への分散性が優れている本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは水中油型エマルション、油中水型エマルションの製造に適すると共に、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳでは製造が困難なＢＣＧ−ＣＷＳ自身の懸濁液製剤の製造にも適したＢＣＧ−ＣＷＳである。
【００７１】
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳに関する上記ＢＣＧ−ＣＷＳの形態、表面構造の相違が、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの物性と生物活性に大きく影響していると考えられる。
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳと比較して免疫細胞に対するin vitro活性が高く、例えば、図２１に示されるようにマウス未成熟樹状細胞株（ＢＣ−１細胞）を用いたＩＬ−１２の誘導活性では、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳよりも約１２．５倍の高い活性を示した。また、図２２に示されるようにマウス樹状細胞株（ＪＡＷＳII細胞）を用いたＩＬ−１２の誘導活性では、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳよりも、約３．２倍高いＩＬ−１２の誘導活性を示した。
【００７２】
更に、図２３に示されるようにマウスマクロファージ様細胞株（ＲＡＷ２６４．７細胞）を用いたＴＮＦ−αの誘導活性では、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳよりも約２．８倍高いＴＮＦ−αの誘導活性を示した。
また、Ｔｏｌｌ−Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）に対するアゴニスト活性については、ＴＬＲ２についてはほぼ同等の活性を示し、ＴＬＲ４に対してはいずれも活性を示さなかった（図２４）
【００７３】
本発明の細菌―ＣＷＳは癌のみならずより広く各種免疫疾患に適用が可能である。細菌―ＣＷＳは生菌で起こりうる副作用を低減し代替となり得ることから、既に公知細菌―ＣＷＳにおいて各種癌に対する臨床研究が行われている。ただし、従来の製造方法は多段階かつ合理性の低い製造プロセスであることに加え、得られる細菌―ＣＷＳも形態、物性の問題から製剤化が難しく医薬品としての供給が困難であった。それに対して本発明の細菌―ＣＷＳは合理的、経済的な製造方法で高品質なものを安定に供給することができ、且つ各種製剤化も容易となったことから、医薬品としての有用性が高い細菌―ＣＷＳを初めて提供可能となった。
即ち、本発明の細菌―ＣＷＳを有効成分とする「医薬」とは、医薬（含動物薬）用途に使用される組成物のことを言い、例えば、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗感染症薬、免疫賦活剤（アジュバント）、免疫機能調節剤等の用途に使用される。
本発明の医薬の剤形としては、公知の各種の剤形を使用することができる。例えば、各種エマルション製剤又は懸濁液製剤を挙げることができる。本発明の各種エマルション製剤又は懸濁液製剤としては、医薬用途に使用される細菌―ＣＷＳのエマルションや水性懸濁液のことを言い、例えばエマルションとしては、水中油型（ｏ／ｗ）エマルション、油中水型（ｗ／ｏ）エマルション、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションなどが挙げられる。好ましくは水中油型エマルションを挙げることができる。例えば、公知の処方、製法で水中油型エマルションを製造した場合、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いることによって、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳと対比して、ＢＣＧ−ＣＷＳの含有率の高い水中油型エマルションが得られている。また、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション製剤は、コンカナバリンＡと反応しかつ免疫細胞に対し強いin ｖｉｔｒｏの活性を示す等、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いた水中油型エマルションとは異なったこれまでに無い特徴を持った水中油型エマルションを提供することができる。
更に、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは水への分散性に優れていることから、水への分散性の悪い特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳでは製造が困難なＢＣＧ−ＣＷＳの水性懸濁液の製造も必要に応じて可能である。例えば、膀胱癌の膀注療法への応用などが挙げることができる。また、腸管免疫に着目した錠剤あるいは腸溶剤のような経口固形剤としての応用を挙げることができる。
本発明の医薬組成物における細菌―ＣＷＳの含量は、注謝剤の場合は免疫応答を惹起するために、約１〜２００μｇ／回の範囲にあり、好適には約５〜１２０μｇ／回の範囲を挙げることができる。また、本発明の医薬組成物は、適切な手段で投与することができ、それらには、注射、胸腔内投与、経口投与、鼻腔内投与、膀胱内投与等が含まれるが投与量含めそれらに限定されるものではない。好適な態様のひとつとして、皮内、皮下、胸腔内への注射を挙げることができる。
なお、本発明の第二の態様の用語で特に言及されておらず、本発明の第一の態様と共通する用語は、第一の態様の用語と同じ意味を表す。
【００７４】
本発明の第三の態様は、水への分散性に優れた各種エマルション製剤及び懸濁液製剤の製造に適した物性を有する細菌―細胞壁骨格（細菌―ＣＷＳ）の製造方法に関するものである。
本発明の「精製菌体の破砕」とは、乾燥精製菌体を使用することも可能であるが、通常はウェット精製菌体を用い水或いは水と親水性有機溶媒との混合溶液に懸濁し破砕する。破砕する手段には特に限定はないが、高圧破砕機、ビーズミル、超音波照射装置、ホモミキサーなどの破砕機を用いることが挙げられ、好ましくは高圧破砕機を用いることが挙げられる。高圧破砕機を用いる場合、２０,０００〜４５,０００ｐｓｉ好ましくは３０,０００〜４５,０００ｐｓｉの圧力下に破砕することができ、その破砕物の粒度分布範囲は概ね０．１〜５．０μｍ、好ましくは０．１〜２．０μｍである。なお、破砕工程においては発熱が起こるため、ＣＷＳの発熱による形態変化を回避するため、処理温度を４〜６５℃の範囲で行うことが望ましい。より好ましくは４〜４５℃の範囲を挙げることができる。破砕物は、必要に応じて１，０００〜９，０００×ｇ、５〜３０分間、好ましくは３，０００〜８，０００×ｇ、５〜２０分間の遠心分離によって、破砕が不十分な細胞片や破砕されていない細胞が除去された均一な上清が得られる。破砕後の液又は沈殿物（デブリス）除去後の上清を直接１２，０００〜２０,０００×ｇ、好ましくは１６，０００〜２０,０００×ｇで遠心分離し、粗精製ＣＷＳが得られる。
本発明の「親水性有機溶媒」とは、水と混和する有機溶媒のことであり、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール、テトラヒドロフラン、アセトンであるが、１−プロパノール、ジオキサン、アセトニトリル、メチルエチルケトンを加えることができる。破砕処理、酵素処理、洗浄処理で用いる場合、好ましくは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフランなどを挙げることができ、より好ましくはイソプロパノールを挙げることができる。
水と親水性有機溶媒の混合溶液を用いる場合、親水性有機溶媒の含量としては、破砕処理においては０〜３０容量％であり、好ましくは５〜１５容量％を挙げることができ、酵素処理においては、０〜２０容量％であり、好ましくは０〜１０容量％を挙げることができる。洗浄処理においては、０〜３０容量％又は７０〜１００容量％であり、好ましくは０〜３０容量％を挙げることができる。
【００７５】
本発明の「精製処理」とは、細菌の精製菌体の破砕後の酵素処理、水、親水性有機溶媒又は水と親水性有機溶媒の混合溶液で洗浄することを言うが、酵素処理、洗浄の回数、順番はこの限りでない。酵素処理については核酸分解酵素と蛋白質分解酵素の連続処理があげられるが、本製造法においては精製度の高い菌体を用いることによって蛋白質分解酵素の短時間処理１回のみによって高純度かつ水への分散性に優れたＢＣＧ−ＣＷＳを製造できることが特徴の一つである。
核酸分解酵素及び処理方法は特に限定はなく当業者に周知の酵素、処理方法を適宜用いることができる。核酸分解酵素としてＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅを挙げることができる。好ましくは、ＤＮａｓｅを挙げることができる。具体的にはセラチア菌由来のエンドヌクレアーゼ（ベンゾナーゼ、Ｍｅｒｃｋ製）、ウシ膵臓由来２本鎖特異的エンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅＩ、Ｒｏｃｈｅ製）などが挙げられ、好ましくはベンゾナーゼを挙げることができる。
核酸分解酵素処理温度、時間の範囲は酵素の種類に応じて適宜選択することが可能であるが、処理温度の範囲は２０〜４０℃が挙げられ、好ましくは２０〜３０℃が挙げられる。
蛋白質分解酵素及び処理方法は特に限定はなく当業者に周知の酵素、処理方法を適宜用いることができる。具体的にはプロナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、パパイン、トリプシン、キモトリプシンなどを挙げることができる。好ましくは、プロナーゼ、パパインなどを挙げることができる。より好ましくはプロナーゼを挙げることができる。
蛋白質分解酵素処理温度、時間の範囲は酵素の種類に応じて適宜選択することが可能であるが、処理温度の範囲は、３０〜４５℃が挙げられ、好ましくは３０〜４０℃が挙げられる。
【００７６】
上記精製処理の特徴は、ＢＣＧ−ＣＷＳの不可逆的な強い凝集、融合に起因する形態、物性変化を回避することに留意したものであって、従来のＣＷＳの形態、物性変化に留意しない特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの製造方法とは大きく特徴が異なるものである。従来のＢＣＧ−ＣＷＳの製造法ではＢＣＧ菌体破砕後のプロセスが多段階であり（特許文献３、非特許文献２〜４）界面活性剤も使用されている（特許文献３、非特許文献４）。更に、脂溶性不純物などの細胞外付着成分のクロロホルム等疎水性有機溶媒を用いた除去プロセスがＢＣＧ−ＣＷＳ製造の最終工程及びその近辺で採用されている（特許文献３、非特許文献２〜４）。このように、従来のＢＣＧ−ＣＷＳの製造法では、破砕後も菌体に付着した多量の脂溶性不純物などが残存し、破砕後の酵素処理、洗浄などの各プロセスで目的とする不純物除去の効率が低下し且つ長時間の界面活性剤処理や加熱処理等が必要となる。そのことが、ミコール酸部分の不可逆的な強い凝集又は融合を引き起こす要因となっている。
本発明の製造方法では、上記従来のＢＣＧ−ＣＷＳの製造方法における形態、物性変化の問題を克服するため、細胞外付着成分を除去した精製菌体を原料に用いた。このことにより、製造プロセス全体が効率化され、特に形態変化や物性変化が懸念される破砕後の水、親水性有機溶媒又はそれらの混合溶液中での処理時間・回数・温度が最小化し、また界面活性剤、ハロゲン系有機溶媒を一切使用しない新規な製造法となっている。それにより、界面活性剤とハロゲン系有機溶媒を含まない、高純度且つ、水への分散性に優れた各種エマルション、懸濁液、及びその凍結乾燥製剤の製造に適した物性を有するＢＣＧ−ＣＷＳを高収率に製造することに成功した。
【００７７】
従来の細菌―ＣＷＳ製造方法は多段階かつ合理性の低い製造プロセスであることに加え、得られる細菌―ＣＷＳも形態、物性の問題から製剤化が難しく医薬品としての供給が困難であった。それに対して本発明の細菌―ＣＷＳは合理的、経済的な製造方法で高品質なものを安定に供給することができ、且つ各種製剤化も容易となったことから、医薬品としての有用性が高い細菌―ＣＷＳを初めて提供可能となった。
なお、本発明の第三の態様の用語で特に言及されておらず、本発明の第一及び第二の態様と共通する用語は、第一及び第二の態様の用語と同じ意味を表す。
【００７８】
本発明の第四の態様は、本発明の細菌―ＣＷＳ製造の中間体となる精製菌体とその製造方法に関するものである。
本発明の「細胞外付着成分」とは、抗酸菌の外脂質層に存在するか、あるいは内脂質層の細胞壁に付着する成分、例えば蛋白質等や遊離脂質、糖脂質、糖類、無機物等のことである（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ，  ２（３），  １−１９（２０１４）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ,  ３１（５），  １５６１−１５７２（１９９９））。細胞外付着成分として、例えば、抗酸菌の脂溶性物質としては、ＴＤＭ、ＴＭＭ（トレハロースモノミコレート）、ＧＭＭ（グルコースモノミコレート）などの糖脂質、ＰＩＭ（ホスファチジルイノシトールマンノシド）、ＰＤＩＭ、ＰＧＬ、ＧｒｏＭＭ、ワックスＤ成分などの脂溶性の細胞外付着成分を挙げることができる。また、水溶性物質としては、ＭＰＢ６４（ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｆｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍＲｍｏｆ  ０．６４ｉｎｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、ＭＤＰ１（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）等の蛋白質、ＬＭ（リポマンナン）、ＬＡＭ（リポアラビノマンナン）等の水溶性の細胞外付着成分や、残存する培養液成分などを挙げることができる
【００７９】
本発明の「精製菌体」とは、細胞外付着成分（菌体外成分）を除去した細菌菌体のことである。細胞外付着成分の除去率については特に限定はないが、できるだけ除かれたものが望ましい。例えば、クロロホルム／メタノール混合溶媒などの有機溶媒を用いて脂溶性の細胞外付着成分を除去した菌体（脱脂菌体）（特開２００６−３１２６０４）も可能であるが、水と親水性有機溶媒の混合溶液を用いて脂溶性の細胞外付着成分だけでなく水溶性の細胞外付着成分も除去した菌体が好適である。例えば、本発明のＢＣＧ精製菌体は細胞外付着成分が除去されていることから、精製菌体中のＢＣＧ−ＣＷＳ含量が向上しており、３５〜４７重量％の高含量であった。
【００８０】
一方、公知の有機溶媒による洗浄で脱脂菌体を製造する場合には、例えばＢＣＧ死菌を使用してＢＣＧ脱脂菌体を製造する場合には、２０〜３０重量％の減量しか見られないが、本発明の細胞外付着成分（菌体外成分）が除去されたＢＣＧ精製菌体の場合には、４０重量％前後の減量が認められた。即ち、精製菌体になれば、原料ＢＣＧ死菌から３０〜４５重量％の減量が認められ、より好ましくは３５〜４５重量％の減量が認められる。このことから、死菌からの減量の程度を指標とすれば、ＢＣＧ精製菌体は、単なるＢＣＧ脱脂菌体とは大きく減量の程度が異なっており、水を含む混合溶液を使用することから、脂質以外の蛋白質や糖類、無機物等の細胞外付着成分（菌体外成分）がほとんど除去された精製菌体になっている。
【００８１】
なお、これらの細胞外付着成分の中で、ＢＣＧ−ＣＷＳとの親和性が強く、除去効率の低い成分としてＰＧＬとＧｒｏＭＭが挙げられる。そのため、この２種の細胞外付着成分を、ＢＣＧ菌体から細胞外付着成分がどの程度除去できたかを示す指標として使用できることを見出した。図２５ａに示されるようにＢＣＧ死菌を使用した場合、その精製菌体に含有されるＰＧＬとＧｒｏＭＭの含量は各々原料のＢＣＧ死菌に含まれる含量の１０重量％以下になっていることをＴＬＣで確認した。次いで、ＰＧＬ含量についてＨＰＬＣによって含量測定したところ、その含量は乾燥精製菌体の０．４重量％以下であることが確認できた。従って、ＰＧＬ或いはＧｒｏＭＭを用いて洗浄の終点確認をすることによって細胞外付着成分（菌体外成分）がほとんど含まれていないＢＣＧ精製菌体を得ることができる。
【００８２】
本発明の「精製菌体に含有される細菌―ＣＷＳ含量」とは、精製菌体中の細菌―ＣＷＳの含有量を示すものであり、細菌―ＣＷＳの含有量は、細菌―ＣＷＳを構成している脂肪酸（例えばミコール酸）の量で評価する。精製菌体のアルカリ加水分解を行い、遊離してくる脂肪酸の存在量を標品との対比で評価した。
このように、本発明の細菌の精製菌体又はその破砕物では、細胞外付着成分が除去されていることから、脂肪酸（例えばミコール酸）部分及び糖鎖（例えばアラビノガラクタン）部分が細胞表面に露出した精製菌体であることが特徴であり、精製菌体特有の物性や生物活性を示している。また、それに基づき、物性や生物活性が大きく向上、改善された前述の精製菌体に由来する破砕物、細菌―ＣＷＳ、細菌―ＣＷＳエマルションの製造が可能となっている。
【００８３】
本発明の精製菌体やその破砕物を医薬組成物とする場合には、皮内、皮下への投与の場合、免疫応答を惹起するために、約１０〜５００μｇ／回の範囲の投与を行うことが好ましい。また、本発明の医薬組成物は、適切な手段で投与することができ、それらには、注射、胸腔内投与、経口投与、鼻腔内投与、膀胱内投与等が含まれるが、投与量を含めそれらに限定されない。好適な態様においては、皮内、皮下への注射を挙げることができる。本発明の精製菌体は細菌―ＣＷＳに記載と同様の適用が挙げられる。
【００８４】
精製菌体の製造方法で用いる細胞外付着成分の除去方法としては、特に限定はないが、例えば、細菌の菌体を水、有機溶媒又は水と有機溶媒の混合溶液のいずれかで洗浄、精製し菌体を回収する方法が挙げられる。用いる溶媒としては水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノールなどの低級アルコール、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、シクロヘキサン等の飽和炭化水素、ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素などのハロゲン化炭化水素、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル系、アセトニトリル、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチルなどを適宜組み合わせて使用することができる。好ましくは水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノールなどの低級アルコール、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の飽和炭化水素、トルエンなどの芳香族炭化水素、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、アセトン、メチルエチルケトンなどを適宜組み合わせて使用することができる。さらに好ましくは水とメタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトンなどの親水性有機溶媒との混合溶液が挙げられる。特に好ましくは水とテトラヒドロフランの混合溶液が挙げられる。好ましい水に対する親水性溶媒の比率は、洗浄効果が高く、濾過洗浄を可能にする１０〜４０重量％を挙げることができる。
【００８５】
菌体の回収方法としては遠心分離法や濾過法が挙げられるが、何ら限定されるものではない。好ましくは濾過法が挙げられる。洗浄、精製方法としては室温又は加温攪拌や加熱還流などが挙げられる。好ましくは加熱還流が挙げられる。
【００８６】
本発明の「濾過可能である」とは、洗浄液と菌体との分離処理において、遠心分離処理を使用することなく、一般的な濾過操作で容易に処理できることを言う。例えば、洗浄液と菌体を濾過して菌体を単離できることを言う。異物混入のリスクを考慮すると圧迫濾過が望ましい。従って、洗浄液を分離することが容易であり、分離した洗浄液をチェックして、洗浄の終点を容易に管理することが出来る。これまでの無処理のＢＣＧ死菌や公知（特開２００６−３１２６０４）のＢＣＧ脱脂菌体では、濾過操作が困難であり、洗浄液との分離には遠心分離が主体として用いられてきた。しかし、本発明のＢＣＧ精製菌体では、細胞外付着成分が除去されたことにより、原料のＢＣＧ死菌やＢＣＧ脱脂菌体とは物性が異なっており、一般的な濾過操作で容易に洗浄液との分離ができるようになった。一般的に結核菌やＢＣＧ菌等の抗酸菌は凝集しやすく、濾過が困難であるが、その凝集の原因として、細胞外付着成分とＭＤＰ１などの接着因子が関与していることが知られている（再表２０１０−００１８４１、日本細菌学雑誌６１（３）、３４５−３５２、２００６年）。本発明の精製菌体では、凝集の原因の一つである細胞付着成分が除去されており、その結果として濾過が容易になったと考えられる。
【００８７】
本発明の精製菌体の濾過性としては、例えば、公称濾過精度が３μｍ以上であるフィルターを濾過に使用した場合に、目詰まりすることなく濾過でき、キログラムスケールの湿菌を用いた場合でも１〜３時間以内で濾過が可能である。その結果、遠心分離などの分離処理を回避できることから、スケールアップも可能であり、処理時間も大きく短縮できるようになった。このように、本発明の精製菌体の濾過性は、ＢＣＧ死菌や公知のＢＣＧ脱脂菌体と大きく異なっている。
【００８８】
本発明の「フィルター」とは、濾紙、不織布、濾過布、メッシュシートなどの濾過に用いる分離膜のことを言う。本発明では、適宜必要に応じて、所望の公称濾過精度を持ったフィルターを使用することができるが、菌の濾過のためには公称濾過精度が０．４５〜５μｍのものが望ましい、好ましくは１〜３μｍのものを使用することが挙げられる。
本発明の「終点管理」とは、精製菌体中に存在する除去効率の低い脂溶性成分、例えばＰＧＬ及び／又はＧｒｏＭＭの溶出量、又はその存在の有無に関して確認を行なうことであり、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して確認することである。洗浄の終点としては、例えばＢＣＧ死菌を使用し、ＨＰＬＣでＰＧＬを評価する場合、精製菌体を疎水性有機溶媒を用いて不純物を抽出し、その抽出液及びＰＧＬ標準品をＨＰＬＣで分析する。精製菌体中のＰＧＬ含量が０．５重量％（対乾燥精製菌体重量）以下に低減していれば洗浄工程の終点とする。好ましくは０．４重量％（対乾燥精製菌体重量）以下に低減していることが挙げられる。
【００８９】
本発明のBCG精製菌体およびBCG死菌は共にＴＬＲ４にアゴニスト活性を示さず、ＴＬＲ２のみにアゴニスト活性を示す。更に、本発明の精製菌体は、抗酸菌（ＢＣＧ菌）の死菌と対比して、上記ＴＬＲ２においては約１．６倍の高活性を示し（図２７）、ＴＮＦ−α産生活性においても、約１．３〜１．４倍の高い活性を示し（図２８）、JAWSII細胞においては４倍の高い活性を示した（図２９）。
【００９０】
以上のように、本発明のBCG精製菌体は、原料のBCG死菌と対比しても高い免疫賦活活性を有することが示される。なお、細胞外付着成分には、ＴＤＭ等のように免疫賦活物質が存在する。本発明の精製菌体ではＴＤＭのような免疫賦活活性のある細胞外付着成分が除去されているにもかかわらず、それらを含有する死菌体よりも、本発明の精製菌体の免疫賦活活性が優れている。このように、本発明の精製菌体の免疫賦活活性が優れていることは予想外であり、その効果に基づき、本発明の精製菌体を用いて、副作用を回避した免疫賦活剤や抗がん剤が可能となり、本発明の精製菌体及びその破砕物を医薬用途に使用できることが示された。
【００９１】
例えば、ＢＣＧワクチンが花粉やダニのアレルギー抑制効果を示すことから（臨床検査  ５０（２）：２０３−２０８（２００６・２））、本発明の精製菌体を使用したワクチン等の免疫調節剤を用いて、副作用を回避した花粉やダニのアレルギー抑制剤が可能となった。
【００９２】
なお、本発明の第四の態様の用語で特に言及されておらず、本発明の第一〜第三の態様と共通する用語は、第一〜第三の態様の用語と同じ意味を表す。
【００９３】
本発明の第五の態様は、本発明の抗酸菌の精製菌体を用いる抗酸菌のミコール酸の製造方法に関するものである。
本発明の「アルカリ加水分解」とは、例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物を使用し、水溶液あるいはアルコール溶液として単独または混合して添加し、加水分解を行うことをいう。好ましいアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムを挙げることができる。より好ましくは、水酸化カリウムを挙げることができる。水溶液とアルコール溶液のアルカリ含量としては、適宜、目的に応じて選択することができ、例えば５〜１５％（重量／容量）を挙げることができる。
本発明の「中和、酸性化」とは、アルカリ加水分解終了後、例えば塩酸、硫酸などの無機酸の水溶液でアルカリ溶液を中和し、酸性化することをいう。
【００９４】
本発明の「液−液抽出」とは、無機酸の水溶液で中和、酸性化された溶液から疎水性有機溶媒で溶媒抽出及び抽出有機溶媒層の水洗、含アルコール水溶液洗浄等をいう。溶媒抽出に使用される有機溶媒としては、例えばｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、シクロヘキサン等の飽和炭化水素、例えばベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、例えば酢酸エチル等の酢酸エステル、例えばジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素などのハロゲン化炭化水素を挙げることができる。好ましい疎水性有機溶媒としては、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエンを挙げることができる。より好ましくはｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタンを挙げることができる。抽出有機溶媒層の洗浄に用いる含アルコール水溶液としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、イソプロパノール等と、水との混合溶液を挙げることができる。アルコールの比率としては１０〜９５容量％を挙げることができ、好ましくは７０〜９０容量％を挙げることができる。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例及び試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。【００９６】
実施例１：抗酸菌（ＢＣＧ菌）の精製菌体の製造
（１）出発原料（ＢＣＧ菌：Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  Ｔｏｋｙｏ  １７２（ＡＴＣＣ３５７３７））
上記ＢＣＧ菌をソートン培地中３７℃で初期定常期まで培地表面に菌膜として培養した。培養細胞を約３０分間８０℃に加熱することにより不活性化させ、遠心分離した。沈殿物として得られるＢＣＧ死菌を原料として、精製菌体を製造した。
（２）精製菌体製造
ａ）ＢＣＧ死菌体１．１９ｋｇ（ウェット、乾燥重量約２４０ｇ）を６６重量％テトラヒドロフラン水溶液５．７８ｋｇ中、窒素雰囲気下、加熱還流、加圧熱濾過し、次いで６０重量％テトラヒドロフラン水溶液で洗浄した。濾上物を６０重量％テトラヒドロフラン水溶液中、窒素雰囲気下、加熱還流、加圧熱濾過し、ＰＧＬ含量の減少を確認後、イソプロパノールで２回洗浄し濾上物４８０ｇ（ウェット）を得た。濾上物にイソプロパノール水溶液を添加し３回洗浄し精製菌体４７５．３ｇ（ウェット、乾燥重量約１５２ｇ）を得た。ＣＷＳ含量：４５．５％（ＨＰＬＣ）、テトラヒドロフラン含量：０．０４％（ガスクロマトグラフィー）、ＢＣＧ死菌体中のＰＧＬ量（全体の約２重量％）に対するＰＧＬ残存量：９．３％（ＨＰＬＣ）、乾燥精製菌体中のＰＧＬ含量０．３％【００９７】
ｂ）ＢＣＧ死菌体１．５２ｋｇ（ウェット、乾燥重量約３００ｇ）を８５容量％テトラヒドロフラン水溶液７．８Ｌ中、窒素雰囲気下、６０分間加熱還流後、加圧熱濾過し、７５容量％テトラヒドロフラン水溶液４５０ｍＬで洗浄した。この濾上物を７５容量％テトラヒドロフラン水溶液９Ｌ中、窒素雰囲気下、６０分間加熱還流後、加圧熱濾過し、７５容量％テトラヒドロフラン水溶液４５０ｍＬで洗浄した。さらに７５容量％テトラヒドロフラン水溶液２．０Ｌで２回洗浄し、次いでメタノール３．０Ｌとメタノール６．０Ｌで洗浄し、精製菌体５９７ｇ（ウェット、乾燥重量約２１０ｇ）を得た。ＣＷＳ含量：３７．５％（ＨＰＬＣ）、ＰＧＬ、ＧｒｏＭＭ残存量：ＢＣＧ死菌の含有量に対していずれも１０重量％以下（ＴＬＣ）。
ｃ）培養菌体を直接約６０分間６０重量％テトラヒドロフラン水溶液中で加熱処理することにより不活化させ、同時に上記精製処理を進めることによって精製菌体を得ることができた。【００９８】
試験例１：抗酸菌（ＢＣＧ菌）の精製菌体の精製度
本発明の精製菌体の精製度を確認するため、細胞外付着成分の残存量を以下の方法で評価した。
（１）ＰＧＬ残存量の測定（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による評価）
ＢＣＧ死菌体（乾燥体）及び精製菌体（乾燥体）約３０ｍｇを秤量し、それぞれにクロロホルム２ｍＬを正確に加え、超音波・攪拌機で十分に懸濁させた。精製水２ｍＬを加え、攪拌し、遠心分離した。クロロホルム層を０．２２μｍフィルターで濾過し、濾液を下記条件で分析した。その結果、ＰＧＬの残存量は、９．３％であった（実施例１（２）−ａ））。【００９９】
ＨＰＬＣ条件：カラム温度：４０℃、検出波長：２７５ｎｍ、流速：約１．０ｍＬ／分（ＰＧＬ保持時間約８分）、注入量：１０μＬ、測定時間：３５分、移動相：クロロホルム（エタノール含有）、メタノール（グラジエント）、カラム：ナカライテスク  Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５ＳＬ−II  ４．６Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ【０１００】
（２）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による評価
ＴＬＣによるＰＧＬ、ＧｒｏＭＭの残存量の測定を行った。実施例１のＢＣＧ死菌体（ウェット）及び精製菌体（ウェット）をそれぞれ約２０ｍｇ秤量し、脂溶性の高いＰＧＬとＧｒｏＭＭを溶出させるためトルエン１００μＬを加えた。攪拌・超音波照射後、２１，０４０×ｇ、５分間遠心分離し、上清の薄層クロマトグラフを行った。展開溶媒はクロロホルム／アセトン（１９：１、容積／容積）を使用し検出にはモリブデン酸アンモニウムセリウム溶液を用いた。その結果を図２５ａに示した。
図２５ａ）−（ａ）に示される呈色の強度から、ＢＣＧ精製菌体（実施例１（２）−ｂ））には、ＰＧＬの残存はほとんど認められず、ＧｒｏＭＭの残存が僅かに認められた。ＢＣＧ死菌体のＰＧＬ含量は約２％（試験例２―２）であり、また，ＢＣＧ死菌体のＧｒｏＭＭの含量は、図２５ａ）−（ｂ）に示されるように、ＰＧＬとほぼ同量であることが分かった。
そこで、ＢＣＧ精製菌体のＰＧＬとＧｒｏＭＭの残存量を算出することを行った。ＢＣＧ精製菌体中のＰＧＬとＧｒｏＭＭの含量は、図２５ａ）−（ａ）で示されている。一方、ＢＣＧ死菌体のＰＧＬとＧｒｏＭＭの含量は、図２５ａ）−（ｃ）で示されているので、これと比較すると、圧倒的にＢＣＧ精製菌体中のＰＧＬとＧｒｏＭＭの含量は低減している。
更に、定量のため、ＢＣＧ死菌体の洗浄液のＴＬＣ添加量を１／１０にした図２５ａ）−（ｂ）の結果と、図２５ａ）−（ａ）のＢＣＧ精製菌体の洗浄液の結果を対比した。その結果、ＢＣＧ精製菌体（図２５ａ）−（ａ））では、ＢＣＧ死菌体に含有されるＰＧＬ量とＧｒｏＭＭ量の１／１０量（図２５ａ−（ｂ））と比較すると、ＴＬＣの呈色の強度から、ＰＧＬの残存量が、図２５ａ）−（ｃ）の１／１０以下であることが分かった。更に、ＧｒｏＭＭの残存量は、図２５ａ）−（ｃ）の約１／１０以下になっていることが分かった。
以上のことから、本発明のＢＣＧ精製菌体のＰＧＬとＧｒｏＭＭの残存量は、原料のＢＣＧ死菌体の
それぞれの含量に対して１０重量％以下に低減していることを確認した。【０１０１】
試験例２−１：本発明の精製菌体中のＢＣＧ−ＣＷＳ含量測定
（１）方法
実施例１（２）−ａ）の精製菌体（乾燥体）を４ｍｇ秤量し、０．５Ｍ水酸化カリウム溶液１ｍＬ中６５℃、３時間加熱を行った。また、標品のＣＷＳを秤量して同様の操作を行い、それぞれの溶液中に遊離するミコール酸をＡＤＡＭ（９−Ａｎｔｈｒｙｌｄｉａｚｏｍｅｔｈａｎｅ、商標、フナコシ）試薬により蛍光標識し、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ条件：カラム温度：５０℃、励起波長：３６５ｎｍ、測定波長：４１２ｎｍ、流速：約１．０ｍＬ／分、注入量：１０μＬ、測定時間：６０分、移動相：メタノール、トルエン（グラジエント）、カラム：野村化学製 Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−３（３μｍ、４．６×１５０ｍｍ）【０１０２】
（２）結果
標品のＣＷＳと対比し、本発明の精製菌体には、含量４５．５％のＣＷＳを含むことが示された。尚、実施例５で得たＢＣＧ−ＣＷＳを実施例６と同様に再精製しＢＣＧ−ＣＷＳ標品とした。【０１０３】
試験例２−２：精製菌体中のＰＧＬの含量測定
（１）方法
試験例１（１）と同様にして、ＰＧＬ標品を用いて測定した。但し、実施例１（２）の６０容量％ＴＨＦ水溶液洗液からシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより単離精製したＰＧＬを標品とした。
（２）結果
その結果ＢＣＧ死菌体及び精製菌体中のＰＧＬ含量はそれぞれ２．０重量％、０．３重量％であった。【０１０４】
参考例１：本発明の水と親水性有機溶媒の混合溶液の洗浄効果
細胞外付着成分に対する本発明の水と親水性有機溶媒の混合溶液の洗浄効果を明らかにするため、特表２０１１−５００５４０に記載される菌体の洗浄液として良く用いられるクロロホルム／メタノール混合溶媒（１：１、容積／容積）の洗浄効果と本発明の洗浄効果を比較することを行った。
（１）洗浄方法
ａ）公知のクロロホルム／メタノール洗浄
上記公知文献（特表２０１１−５００５４０）に準じて、ＢＣＧ死菌体１０ｇ（ウェット、乾燥体約２ｇ）にクロロホルム／メタノール混合溶媒（１：１、容積／容積）５０ｍＬを加え、窒素雰囲気下、６０分間攪拌した。懸濁液を吸引濾過し、濾上物をクロロホルム／メタノール混合溶媒（１：１、容積／容積）１０ｍＬで共洗い洗浄した。この操作までの洗浄液を濃縮し抽出物３３４ｍｇを得た。
更に、洗浄後の死菌体にクロロホルム／メタノール混合溶媒（１：１、容積／容積）５０ｍＬを添加し、窒素雰囲気下、６０分間攪拌した。懸濁液を吸引濾過し、濾上物をクロロホルム／メタノール混合溶媒（１：１、容積／容積）１０ｍＬで共洗い洗浄し、再洗浄液を得た。【０１０５】
ｂ）本発明のテトラヒドロフラン水溶液洗浄
ＢＣＧ死菌体１０ｇ（ウェット、乾燥体約２ｇ）に９０容量％テトラヒドロフラン水５０ｍＬを加え、窒素雰囲気下、６０分間加熱還流した。吸引濾過により濾上物と濾液に分離し、７５容量％テトラヒドロフラン水１０ｍＬで共洗い洗浄し濾過した。この操作までの濾液を濃縮し抽出物４１５ｍｇを得た。
この濾上物に７５容量％テトラヒドロフラン水溶液５０ｍＬを添加し、窒素雰囲気下、６０分間加熱還流した。吸引濾過により濾上物と濾液に分離し、７５容量％テトラヒドロフラン水溶液１０ｍＬで共洗い洗浄し濾過し、再洗浄液を得た。
（２）洗浄効果の比較
抽出物量については、クロロホルム／メタノール混合溶媒（１：１、容積／容積）では３３４ｍｇの不純物除去量であったが、テトラヒドロフラン水溶液では４１５ｍｇであった。しかも、クロロホルム／メタノール混合溶媒では図２５ｂに示されるように２回目の洗浄でも明らかに多くの不純物が検出されている。このように、テトラヒドロフラン水溶液の洗浄効果が高いことが示された。【０１０６】
試験例３：抗酸菌（ＢＣＧ菌）精製菌体の糖結合性蛋白／レクチン（コンカナバリンＡ；ＣｏｎＡ）に対する結合活性の観察
ａ)評価サンプルの調製
加温減圧乾燥したＢＣＧ菌体（死菌）又は精製菌体をそれぞれホモジナイザーベッセルに５ｍｇ秤量し、生理食塩水約２ｍＬを加えた。ポッターホモジナイザーを用いて１，２００ｒｐｍで５分間ホモジナイズし、ＢＣＧ菌体（死菌）又は精製菌体の懸濁液とした。
ｂ）評価方法
上記懸濁液の評価サンプル５０μＬにローダミン標識コンカナバリンＡ溶液（ＣｏｎＡ−Ｒｈｏ、フナコシ）２μＬを添加し、穏やかに混合した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察した。
ｃ）観察結果
図２６に示すように、ＣｏｎＡの結合は、死菌の一部に見られたが、精製菌体の場合には、ほぼ全ての菌体にＣｏｎＡが結合することを確認した。死菌に比べ精製菌体の表面には、アラビノガラクタンを主とする糖鎖部分が顕著に露出していることが明らかになった。【０１０７】
試験例４：抗酸菌（ＢＣＧ菌）の精製菌体の生物活性評価
（１）ＴＮＦ−α産生量の測定
ａ）評価サンプルの調製
約４ｍｇのＢＣＧ菌体（死菌）、精製菌体及び精製菌体破砕物（乾燥体）に約１ｍＬの０．０１重量％ポリソルベート８０含有生理食塩水を加え、ポッターホモジナイザーで３，０００ｒｐｍ、５分間、室温で懸濁した。各懸濁液のＣＷＳ含量を測定し（試験例２と同様）、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で１０μｇＣＷＳ／ｍＬに調製し評価サンプルとした。
ｂ）測定方法
公知方法（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｈｅｒ．,  ５（３）,  １３０−１３５（２０１１））に準じて、ＲＡＷ２６４．７細胞（商標、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１）を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに５×１０＾４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。３７℃、５％ＣＯ２、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で５時間培養して接着させた後、評価サンプルを添加し、２０時間培養後、培養上清中のＴＮＦ−α濃度をサイトカインＥＬＩＳＡ法により測定した。
ｃ）測定結果
図２８ａに示されるように、本発明の精製菌体は、原料であるＢＣＧ菌体（死菌）より、約１．３倍の高いＴＮＦ−αの誘導活性を示した。
更に、本発明の精製菌体の破砕物も、図２８ｂに示されるように、本発明の精製菌体と同様の高いＴＮＦ−αの誘導活性を示した。【０１０８】
（２）ＴＬＲ２への生物活性評価
ａ）評価サンプルの調製
試験例４（１）−ａ）と同様にしてＢＣＧ菌体（死菌）、精製菌体及び精製菌体破砕物（乾燥体）を用いて１０μｇ／ｍＬの評価サンプルを調製した。
ｂ）測定方法
公知方法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．,  ９９（７）,  １４３５−１４４０（２００８））に準じて、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ｈＴＬＲ２細胞（商標、ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに５×１０＾４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。３７℃、５％ＣＯ２、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で２４時間培養して接着させた後、評価サンプルを添加し、２４時間培養後、培養上清をＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標、ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）と３７℃、６０分間反応させた後、マイクロプレートリーダーを用いて６５５ｎｍの吸光度を測定した。
ｃ）測定結果
図２７ａに示されるように、本発明の精製菌体は、原料であるＢＣＧ菌体（死菌）より、約１．６倍高いＴＬＲ２への活性を示した。
更に、本発明の精製菌体の破砕物も、図２７ｂに示されるように、本発明の精製菌体の約０．７倍のＴＬＲ２への活性を示した。【０１０９】
（３）ＴＬＲ４への生物活性評価
ａ）評価サンプルの調製
試験例４（１）−ａ）と同様にしてＢＣＧ菌体（死菌）、精製菌体及び精製菌体破砕物（乾燥体）を用いて１０μｇＣＷＳ／ｍＬの評価サンプルとした。また、対照検体のリポ多糖（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＬＰＳ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１：Ｂ４、ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で１ｎｇ／ｍＬに調製した。
ｂ）測定方法
公知方法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．,  ９９（７）,  １４３５−１４４０（２００８））に準じて、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ｈＴＬＲ４細胞（商標、ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに５×１０＾４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。３７℃、５％ＣＯ２、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で２４時間培養して接着させた後、評価サンプルを添加し、２４時間培養後、培養上清をＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標、ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）と３７℃、６０分間反応させた後、マイクロプレートリーダーを用いて６５５ｎｍの吸光度を測定した。
ｃ）測定結果
図２７ｃに示されるように、本発明の精製菌体は、原料であるＢＣＧ菌体（死菌）と同様にＴＬＲ４に対する活性を示さなかった。
なお、本発明の精製菌体の破砕物も、図２７ｄに示されるように、本発明の精製菌体と同様にＴＬＲ４に対する活性を示さなかった。【０１１０】
（４）ＩＬ−１２誘導活性の測定
ａ）評価サンプルの調製
試験例４（１）−ａ）と同様にしてＢＣＧ菌体（死菌）、精製菌体及び精製菌体破砕物（乾燥体）を用いて２００μｇＣＷＳ／ｍＬの評価サンプルを調製した。
ｂ）測定方法
マウス樹状細胞株（ＪＡＷＳII細胞）を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに５×１０＾４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。３７℃、５％ＣＯ２、２０％ＦＢＳ含有ＭＥＭα培地で４時間培養して接着させた後、評価サンプルを添加し、４４時間培養後、培養上清中のＩＬ−１２濃度をサイトカインＥＬＩＳＡ法により測定した。
ｃ）測定結果
図２９に示されるように、本発明の精製菌体は、ＢＣＧ菌体（死菌）よりも約４倍高いＩＬ−１２の誘導活性を示した。【０１１１】
実施例２：ノカルジア・ルビア菌の精製菌体の製造
ノカルジア・ルビア死菌体（ＪＣＭ２１５６株）５ｇ（ウェット）を順次６５重量％テトラヒドロフラン水溶液２５ｇ、６０重量％テトラヒドロフラン水溶液５０ｇで６０分間加熱還流後、９０重量％アセトン水溶液で洗浄、熱濾過し精製菌体０．７ｇ（乾燥）を得た。【０１１２】
実施例３：精製菌体の破砕物の製造
（１）原料
実施例１と同様にして製造したＢＣＧ精製菌体を使用した。
（２）破砕物の製造
上記ＢＣＧ精製菌体１．１ｇ（乾燥体）を１０容量％イソプロパノール水溶液４０ｇに懸濁し、電動ホモジナイザー（Ｏｍｎｉ  ＴＨ、Ｏｍｎｉ−ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で攪拌（２０，０００ｒｐｍ、６０℃、５分）した後、ＢＥＲＹＵ  ＭＩＮＩ（美粒）を用いて室温下、２０，０００ｐｓｉで破砕した。破砕液の一部を凍結乾燥機（ＡＬＰＨＡ  ２−４、ＭＡＲＴＩＮ  ＣＨＲＩＳＴ）を用いて凍結乾燥し、精製菌体破砕物の乾燥体５０ｍｇを得た。ＣＷＳ含量：３８．２％（ＨＰＬＣ）【０１１３】
実施例４：精製菌体からのミコール酸の製造
（１）ミコール酸の製造
精製菌体（乾燥体）１４０ｇを１０％（重量／容積）水酸化カリウム−５０容量％イソプロパノール水溶液１．４Ｌ中で２時間加熱還流後、冷却下で水１．４Ｌ加え、さらに６Ｍ塩酸で酸性化した。ｎ−ヘプタン２．１Ｌで２回抽出を行い、ｎ−ヘプタン層を水１．４Ｌで２回洗浄した後、９０容量％エタノール水溶液１．４Ｌで２回洗浄後、得られたｎ−ヘプタン層を減圧濃縮し、白色粉末のミコール酸１４．６ｇを得た。  
（２）ミコール酸の純度
上記ミコール酸の純度を確認するため、誘導体を作製しＨＰＬＣによる分析を行った。ミコール酸含量は９８％と高純度であった。
ＨＰＬＣの条件：誘導体化試薬：ＡＤＡＭ（商標、フナコシ）、カラム温度：５０℃、励起波長：３６５ｎｍ、測定波長：４１２ｎｍ、流速：約１．０ｍＬ／分、注入量：１０μＬ、測定時間：６０分、移動相：メタノール、トルエン（グラジエント）、カラム：野村化学製Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−３（３μｍ、４．６×１５０ｍｍ）【０１１４】
実施例５：ＢＣＧ菌のＣＷＳ（ＢＣＧ−ＣＷＳ）の製造
（１）原料
実施例１Ｇ精製菌体を使用した。
（２）ＣＷＳの製造
ａ）精製菌体の破砕
ＢＣＧ精製菌体２２３．６ｇ（ウェット、乾燥重量約７１．６ｇ）を１０容量％イソプロパノール水溶液に懸濁し、高圧ホモジナイザーＤｅＢＥＥ２０００（登録商標、ＢＥＥインターナショナル）を用いて３５ｋｐｓｉで破砕し、２５℃下に６８００×ｇで１０分間遠心分離した。次いで、上清を２５℃下に１８０００×ｇで６０分間遠心分離し、粗精製ＣＷＳを１７６．７ｇ（ウェット、乾燥重量約４０．６ｇ）を得た。
ＢＣＧ精製菌体２２４．６ｇ（ウェット、乾燥重量約７１．９ｇ）を同様に処理し粗精製ＣＷＳ１８７．２ｇ（ウェット、乾燥重量約４６．６ｇ）を得た。
ｂ）蛋白質分解酵素処理
粗精製ＣＷＳ２７１．２ｇ（ウェット、乾燥重量約６５ｇ）を、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液／イソプロパノール（９５：５、容積／容積、ｐＨ８．０）混合液３．２ｋｇに懸濁させた。プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２ｇを１０ｍＭトリス塩酸緩衝液／イソプロパノール（９５：５、容積／容積、ｐＨ８．０）混合液７８０ｇに溶かし、上記破砕品懸濁液に添加し、３７℃で４時間反応した。反応液を室温下に１８０００×ｇで６０分間遠心分離して沈殿物を得た。
ｃ）洗浄処理
上記沈殿物を１０倍重量の５容量％イソプロパノール水溶液に懸濁させ、室温下に遠心分離し、さらに２０容量％イソプロパノール水溶液に懸濁させ４０℃で３０分間攪拌した後、遠心分離して沈殿物を得た。更に、イソプロパノールに懸濁後、遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物を減圧乾燥し、白色粉末のＢＣＧ−ＣＷＳ３２．５ｇを得た。（死菌からのＣＷＳへの収率１８．８％；死菌から精製菌体への収率６１．２％、精製菌体からＣＷＳへの収率３０．８％）【０１１５】
（３）組成分析データ
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの組成の分析結果を表１に示す。なお比較のために、特許文献３に従って製造したＢＣＧ−ＣＷＳ（参考例２）組成の分析値と、特許文献３に記載されたＢＣＧ−ＣＷＳの文献値を併せて記載する。【０１１６】
【表１】
2018124132.tif 000003
【０１１７】
特許文献３に記載されたＢＣＧ−ＣＷＳ（文献値）と特許文献３に従って製造したＢＣＧ−ＣＷＳ（参考例２）の組成の分析値は、ほぼ同一であり、参考例２のＢＣＧ−ＣＷＳは、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを再現していることが示された。
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳでは、これら特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳと比較し、不純物に由来する全非構成アミノ酸の含量が１．０％以下であった。上記表１に示されるように、公知のＢＣＧ−ＣＷＳでは不純物に由来する全非構成アミノ酸の含量が１．０％以下になることはなかったが、本発明によって初めて１．０％を切る高純度のＢＣＧ−ＣＷＳを取得できるようになった。このように、公知のＢＣＧ−ＣＷＳの製造方法と比較して、本発明のより簡易なＢＣＧ−ＣＷＳの製造方法において、ＢＣＧ−ＣＷＳにおける純度の向上が得られたことは、細胞外付着成分の除去された精製菌体を使用したことがその大きな要因になっていると考えられる。【０１１８】
実施例６：本発明のＣＷＳ（ＢＣＧ−ＣＷＳ）の再精製
実施例５得たＢＣＧ−ＣＷＳ１００ｍｇを２０容量％イソプロパノール水溶液５ｍＬに懸濁させ、４０℃で３０分間攪拌した後、室温下で遠心分離して沈殿物を得た。これを繰り返して、再精製ＢＣＧ−ＣＷＳを９９．５ｍｇ得た。得られた再精製ＢＣＧ−ＣＷＳをＭｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（商標、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、蛋白質含量の定量を行った。以下の表２に示されるように、再度精製を行うことによってさらに不純物に由来する蛋白質含量が減少した。【０１１９】
【表２】
2018124132.tif 000004
【０１２０】
参考例２：公知法（特許文献３）に従ったＢＣＧ−ＣＷＳの製造
ａ）破砕処理
５７８ｇのＢＣＧ死菌（ウェット、乾燥重量約１１１ｇ）を３Ｌの水に懸濁し、ＭｉｎｉＤｅＢｅｅ（登録商標、ＢＥＥインターナショナル）を用いて３５ｋｐｓｉで破砕した。それらを２５℃下に６，７６０×ｇで１０分間遠心分離した。次いで、上清を２５℃下に１８，０００×ｇで６０分間遠心分離し沈殿を得た。
ｂ）核酸分解酵素処理と蛋白質分解酵素処理
上記沈殿に、ベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ．）を加え２５℃で１７時間反応した。遠心分離で沈殿を回収し１重量％トライトンＸ−１００水溶液で懸濁／遠心操作（沈殿回収）を５回繰り返し洗浄した後、プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて３７℃で１７時間反応した。２５℃下に１８０００×ｇで２０分間遠心分離して沈殿を集め、１重量％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００水溶液中に再懸濁させ、６０℃で２時間撹拌し、遠心分離して沈殿を得た。
ｃ）洗浄処理
遠心分離後の沈殿をエタノール、テトラヒドロフラン、クロロホルム／メタノール（２：１、容積／容積）、メタノールで順次洗浄した。残渣を乾燥し、乾燥ＢＣＧ−ＣＷＳ１４ｇを得た。（死菌からの収率１２．６％）
ｄ）組成分析データ
乾燥ＢＣＧ−ＣＷＳの組成は表１に示した。公知法（特許文献３）に従って製造されたＢＣＧ−ＣＷＳの組成は、表１に示されるように、文献値（特許文献３）とほぼ同一であることから、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを再現して製造できていることが確認できた。【０１２１】
試験例５：本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの水への分散性（ＯＤ相対値：物性値）
（１）測定サンプル
Ａ：本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（実施例５のサンプル）
Ｂ：特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（参考例２のサンプル）
（２）分散性の測定方法：
上記のＢＣＧ−ＣＷＳをそれぞれホモジナイザーベッセルに５ｍｇ秤量し、生理食塩水約２ｍＬを加えた。スリーワンモーターを用いて１，２００ｒｐｍで５分間ホモジナイズし懸濁液とした。この液を１ｍｇ／ｍＬに調製し、１．５ｍＬを３ｍＬ容プラスチックキュベットに添加した。分光光度計（Ｕ−５１００、日立ハイテクサイエンス）を用いて吸光度（６９０ｎｍ）を６０分間経時的に測定した。測定０分の吸光度を１とし、相対的な値（物性値）を算出した。【０１２２】
（３）結果：
測定結果を図１３に示す。本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）を生理食塩水中に分散させた時のＯＤ相対値（物性値）は、測定時間内（６０分間）において大きな変化が認められなかった。分散開始から６０分後でも、０．９８のＯＤ相対値（物性値）を示した。
一方、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）は、生理食塩水中に分散後、ＯＤ相対値（物性値）が速やかに低下を始め、６０分後に０．２２に低下し、ＢＣＧ−ＣＷＳの沈降が認められた。
尚、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ製造の小実験検討等の中でOD相対値（物性値）が０．９以上のＢＣＧ−ＣＷＳ以外に、０．７５、０．５８、０．４８を示すＢＣＧ−ＣＷＳも得られた。
以下、本発明ＢＣＧ−ＣＷＳのＯＤ相対値（物性値）が実施例５のサンプルを中心に０．９以上、０．７５、０．５８、０．４８の各サンプルについて各々Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄと表し参考例２のサンプルをＥと表す。【０１２３】
試験例６：本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの抗体反応性
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（実施例５）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（参考例２）の抗ＢＣＧ死菌抗体との結合性をサンドイッチ・ＥＬＩＳＡ法にて評価した。
（１）試剤
ウサギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｗｈｉｔｅ）抗ＢＣＧ死菌ＩｇＧ抗体を作製し、使用した。
（２）方法
ウサギ抗ＢＣＧ死菌ＩｇＧ抗体をＮｕｎｃ−ｉｍｍｕｎｏ  ｐｌａｔｅＩＩ（商標、Ｎｕｎｃ）に固層化した。上記のＢＣＧ−ＣＷＳとそれぞれ反応後、ビオチン標識した抗ＢＣＧ死菌抗体を添加し、室温で６０分間静置した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．）を添加し、室温で６０分間静置した。発色試薬（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｙｄｏｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ，  Ｒ＆Ｄ）を加え、室温で反応後、１Ｎ硫酸を加え反応を停止した。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（３）結果
測定結果を図１８に示す。本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは抗ＢＣＧ死菌抗体に反応性が高いが、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは抗ＢＣＧ死菌抗体に反応性が非常に低かった。抗ＢＣＧ抗体を１０００ｎｇ／ｍＬ使用した場合に、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは結合反応を示した（ＯＤ４５０値：０．３４）。また、上記抗ＢＣＧ死菌抗体を５００ｎｇ／ｍＬ使用した場合にも、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは結合反応を示した。しかし、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは、いずれの抗体添加量でも結合反応を示さなかった（ＯＤ４５０値：０．０１）。このように、抗ＢＣＧ死菌抗体を用いて、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのＣＷＳ表面構造が異なっていることが示された。
このように、抗体が認識するＢＣＧ−ＣＷＳの表面構造は、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの場合と、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの場合とでは大きく異なっていることを示している。【０１２４】
試験例７：本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの粒度分布
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの粒度分布を比較することを行った。
（１）方法
ポッター型ホモジナイザーを用いて生理食塩水、又は超音波発生装置を用いてｎ−ヘプタンに上記ＣＷＳをそれぞれ懸濁させ、粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ−２２００、島津製作所）を用いて粒度分布を評価した。
ａ）生理食塩水中での懸濁：
ＢＣＧ−ＣＷＳをホモジナイザーベッセルに約５ｍｇ秤量し、生理食塩水約２ｍＬを加えた。１，２００ｒｐｍで５分間ホモジナイズし懸濁液とした。
ｂ）ｎ−ヘプタン中での懸濁：
ＢＣＧ−ＣＷＳを試験管に約５ｍｇ秤量し、ｎ−ヘプタン約２ｍＬを加えた。超音波発生装置により懸濁させた。
（２）結果
粒度測定の結果を図２０に示す。本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは生理食塩水中では共に単一のピークの粒度分布を示した（図２０（ａ））。しかし、ｎ−ヘプタン中では０．１〜１００μｍの範囲において、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは単一の粒子径ピークを示し、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは２つの粒子径ピークを示した（図２０（ｂ））。本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは生理食塩水中とｎ−ヘプタン中での粒度分布挙動が大きく異なっていた。【０１２５】
試験例８：オーラミン染色法によるＣＷＳの形態評価
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの形態的な相違をオーラミン染色法により比較した。
（１）評価サンプル
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ：Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ 
特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ：Ｅ 
（サンプル名は試験例５に基づく）
（２）方法：
公知文献（顕微鏡，４８（１），  ５１−５６（２０１３））を参考に、ＢＣＧ−ＣＷＳ約５ｍｇにオーラミン水溶液（０．１５ｍｇ／ｍＬ）を５００μＬ加え、ホモジナイザーで分散後、遮光条件下、１０分間攪拌した。遠心分離（２１，０４０×ｇ、１０分間）し、残渣に水５００μＬを加えホモジナイザーで分散後、遠心分離し、残渣に０．５容量％ＨＣｌ・エタノール混液５００μＬを加え分散し、遠心分離した。前記操作を更に１回繰り返した。水５００μＬを加え分散後、遠心分離し、残渣に０．１重量％過マンガン酸カリウム水溶液５００μＬを加え分散させ、遠心分離した。残渣に水５００μＬを加え分散させ、遠心分離した。前記操作を更に１回繰り返した。沈殿にヘプタン／エタノール（９：１、容積／容積）混液１００μＬを加え分散させ、この懸濁液２μＬをスライドガラスに滴下・風乾した後、蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス、ＢＺ−Ｘ７１０）を用いて観察（４０倍拡大の視野、露光時間１／５秒）し、解析ソフト（ＢＺ−Ｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて試料総面積当たりの蛍光面積の比率を算出した。
（３）結果：
上記測定サンプルの観察写真を図１９（注１）に、蛍光面積率・判定の結果を表３に示す。オーラミン染色の結果、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）〜（Ｄ）では蛍光はほとんど観測されなかったが（蛍光面積の比率０．１％以下）、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）では、強い蛍光が観測され（蛍光面積の比率８９．４３％）、蛍光面積率１０％以下である（Ａ）〜（Ｄ）は陰性、１０％以上であった（Ｅ）は陽性と判定した。
上記オーラミン染色の結果から、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）〜（Ｄ）では、ミコール酸部分の密度が低く、強い凝集又は融合していないことが示された。一方、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｂ）では、ミコール酸部分の密度が高く、強く凝集又は融合していることが示された。更に、水への分散性（物性値）が０．４以上ではオーラミン染色が陰性を示すことが明らかとなった。
（注１：レーザー走査型共焦点顕微鏡（ＦＶ−１０００、オリンパス）の１００倍拡大の視野で観察）【０１２６】
【表３】
2018124132.tif 000005
【０１２７】
試験例９：本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３の水中におけるレクチン（コンカナバリンＡ）との反応性の比較
（１）評価サンプル
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（A）
特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（E）
（試験例５のサンプルを使用）
（２）方法
試験例５と同様にしてポッター型ホモジナイザーを用いて生理食塩水に上記（１）のＢＣＧ−ＣＷＳをそれぞれ懸濁させた。各評価サンプルの懸濁液５０μＬにローダミン標識コンカナバリンＡ溶液（フナコシ）２μＬを添加し、軽くピペッティングし、スライドグラスに適量滴下し、風乾させ共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察した。
（３）結果
蛍光化コンカナバリンＡを用いて、本発明と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの結合強度を比較したところ、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの方がコンカナバリンAと明らかに強く結合し、凝集を示した。【０１２８】
試験例１０：ＢＣＧ−ＣＷＳの懸濁液中のゼータ電位評価
（１）評価サンプル
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（A）
特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（E）
（試験例５のサンプルを使用）
（２）方法
上記（１）のＢＣＧ−ＣＷＳ５０ｍｇにイソプロパノール５ｍＬを添加し５分間超音波照射し分散させた後、５０ｍＬとなるように蒸留水を添加した（イソプロパノール終濃度、１０容量％）。高圧破砕機（ＢＥＲＹＵ−ＭＩＮＩ、美粒）を用いて、２０，０００ｐｓｉで破砕しサンプル分散液とした。各評価サンプル分散液５０μＬを１０容量％イソプロパノール水溶液２ｍＬに加え混合した後、ゼータサイザー（マルバーン、Ｎａｎｏ−ＺＳ）でゼータ電位を測定した。
（３）結果
表４に示すように、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは約―２２ｍＶのゼータ電位を示し、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは約―３０ｍＶのゼータ電位を示した。即ち、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの表面構造が異なっていることが示された。【０１２９】
【表４】
2018124132.tif 000006
【０１３０】
試験例１１（１）：本発明のＢＣＧ−ＣＷＳによるＴＮＦ−α産生量の測定
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの形態的な相違に基づく、生物活性（ＴＮＦ−αの産生量）への影響を比較した。
（１）評価サンプルの調製
約４ｍｇの本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ及び特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳに約２ｍＬの０．０１重量％ポリソルベート８０含有生理食塩水を加え、ポッター型ホモジナイザーで３，０００ｒｐｍ、５分間、室温で懸濁した。各懸濁液のＣＷＳ含量を測定し（試験例２と同様）、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で１０μｇＣＷＳ／ｍＬに調製し評価サンプルとした。
（２）測定方法
試験例４（１）と同様の方法に準じて測定した。
（３）測定結果
図２３に示されるように、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳより、約２．８倍の高いＴＮＦ−αの誘導活性を示した。【０１３１】
試験例１１（２）：ＢＣＧ−ＣＷＳのＴＬＲ２とＴＬＲ４に対する親和性の評価
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの形態的な相違に基づく、生物活性（ＴＬＲ２とＴＬＲ４）への影響を比較した。
（１）評価サンプルの調製
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ或いは、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いて、試験例４（２）、（３）と同様にして評価サンプルを調製した。また、対照検体のリポ多糖（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＬＰＳ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１：Ｂ４、ＩＮＶＩＶＯＧＥＮ）は１ｎｇ／ｍＬに調製した。
（２）測定方法
試験例４（２）、（３）の方法に準じて測定した。
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳは、いずれも図２４―a）に示すようにＴＬＲ２に反応するが、図２４―ｂ）に示すようにＴＬＲ４には反応しなかった。【０１３２】
試験例１１（３）：本発明のＢＣＧ−ＣＷＳによるＩＬ−１２産生量の測定
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの形態的な相違に基づく、生物活性（ＩＬ−１２の産生量）への影響を比較した。
（１）評価サンプルの調製
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ或いは、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いて、試験例４（４）と同様に実施した。但し、最終調製サンプル液は２０％ＦＢＳ含有ＭＥＭα培地で１００ｎｇＣＷＳ/ｍＬ（ＢＣ−１）、１００μｇＣＷＳ／ｍＬ（ＪＡＷＳII）とした。
（２）ＩＬ−１２の測定方法
ａ）マウス未成熟樹状細胞株（ＢＣ−１細胞）を用いた活性評価：
公知方法（Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．  ２００２  Ｊａｎ；７１（１）：１２５−３２）に準じて実施した。ＢＣ−１細胞を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに５×１０＾４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。３７℃、５％ＣＯ２、２０％ＦＢＳ含有ＭＥＭα培地で５時間培養して接着させた後、評価サンプルを添加し、２０時間培養後、培養上清中のＩＬ−１２濃度をサイトカインＥＬＩＳＡ法により測定した。
ｂ）マウス樹状細胞株（ＪＡＷＳII細胞）を用いた活性評価：
試験例４（４）の方法に準じて測定した。
（３）測定結果
ａ）ＢＣ−１細胞を用いた活性評価：
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは、図２１に示されるように特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳと比較すると、コントロール（生理食塩水）をベースラインとして、約１７倍のＩＬ−１２の誘導能を示した。
ｂ）ＪＡＷＳII細胞を用いた活性評価：
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは、図２２に示されるように特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳと比較すると、約３．２倍のＩＬ−１２誘導能を示した。【０１３３】
参考例３：特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの形態、物性の回復検討
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの間には、図１４（ａ）又は（ｂ）と図１４（ｃ）のような形態的相違が考えられている。そこで、図１４（ｃ）から図１４（ａ）又は（ｂ）に形態的、物性的な変換が可能か否かを検討した。【０１３４】
（１）：有機溶媒中の加熱による特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ形態、物性改善検討
上記特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ１０ｍｇをｎ−ヘプタン１ｍＬに懸濁し、９０℃、５又は１０時間加熱処理を行った。処理後懸濁液を室温下に１８，０００×ｇで６０分間遠心分離して沈殿物を得た。得られた沈殿物を減圧乾燥し、試験例７の方法にて濁度測定を行った。
その結果を図１６ａに示す。この結果に示されるように、有機溶媒中加熱を行っても特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳには、分散性の改善は認められなかった。【０１３５】
（２）再破砕処理による特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの形態、物性改善検討
特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ４１ｍｇを１０容量％イソプロパノール水溶液２０ｍＬに懸濁し、ＢＥＲＹＵ  ＭＩＮＩ（美粒）を用いて２０，０００ｐｓｉで再破砕処理を行った。破砕後懸濁液を室温下に１８，０００ｘｇで６０分間遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物を減圧乾燥し、試験例５の方法に準じて濁度測定（ＯＤ相対値測定）を行った。
その結果を図１７に示す。この結果に示されるように、再破砕処理においても特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳには、分散性の改善は認められなかった。
以上のことから、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのように、図１４（ｃ）のミコール酸部分が強く凝集又は融合した形態のＢＣＧ−ＣＷＳに変化すれば、図１４（ａ）又は（ｂ）の形態の本発明のＢＣＧ−ＣＷＳには戻らないことが明らかとなった。このことは、ＢＣＧ−ＣＷＳにおける図１４（ａ）又は（ｂ）から図１４（ｃ）への形態的な変化とそれに伴う物性的な変化は、不可逆であることを示している。【０１３６】
参考例４：本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの形態、物性に対する界面活性剤の影響
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの製造方法は、界面活性剤を使用しないことを特徴にしている。一方、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの製造方法では界面活性剤を使用している（参考例２）。そこで、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの形態、物性に対する界面活性剤の影響を明確にするため、下記のように本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを界面活性剤の非存在下ＢＣＧ−ＣＷＳ粉末の直接加熱或いは界面活性剤存在下水中で加熱してその物性変化を検討した。
ａ）評価サンプル
（１）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（A）
（２）特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（E）
（３）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（A）１０ｍｇをマイクロチューブに加えアルミ製ヒートブロックで１００℃、３時間加熱した。
その結果、図１６ｂサンプルＣの物性値は、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳと同等の挙動を示し、物性値０．９以上だったものが大きく低下した。
（４）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（A）３０ｍｇに１重量％トライトンＸ−１００水溶液２ｍＬを加えホモジナイザーで懸濁後、６０℃、６０分間攪拌した。遠心分離後上清を除いた。この操作をもう一度行った。次いでエタノール２ｍＬを加えホモジナイザーで懸濁し、遠心分離により上清を除いた。この操作をもう一度行った後減圧乾燥をした。
その結果、図１６ｂサンプルＤの物性値は、上記のサンプルＣと同じ挙動を示し、物性値が大きく低下した。
これらの挙動は、ＢＣＧ−ＣＷＳのミコール酸部分が不可逆的に強く凝集又は融合していることが示された。
（サンプル名は試験例５に基づく）【０１３７】
なお、上記の不可逆な形態的変化の理由としては、ＢＣＧ−ＣＷＳはミコール酸−アラビノガラクタン−ペプチドグリカンからなる超薄いフィルム状の３層構造を形成していると考えられている（ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＳｐｅｃｔｒｕｍ，  ２（３），  １−１９（２０１４）のＦＩＧＵＲＥ  ６）。従って、水中ではペプチドグリカン層を外側に向け、ミコール酸同士を内側に向けた状態（図１４（ｂ），（ｃ））を取ると考えられている（Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ７２（２），  １４９−１５６（２００８））。図１４（ｂ）のようなミコール酸同士の疎水性相互作用は分散操作等の物理的な処理により乖離する弱い結合であると考えられる。しかし、加熱、界面活性剤処理などを行うと、ミコール酸部分が不可逆的に強く凝集又は融合した図１４（ｃ）のような形態を形成すると考えられる
本発明では、図１４に示すようなミコール酸部分の不可逆な形態変化を解明することが出来たことから、その知見に基づいて、界面活性剤の使用や高温処理をすることなくＢＣＧ−ＣＷＳを製造し、水への分散性に優れた各種エマルション・懸濁液製剤の製造に適した物性を有する細菌−ＣＷＳの製造が初めて可能となった。【０１３８】
実施例７：ＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルションの製造
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳとの形態と物性の相違が、エマルションにどのような影響を及ぼすかを検討した。公知の水中油型エマルションの処方、製法（Ｐｒｏｃ．Ｊａｐａｎ  Ａｃａｄ．，  ７０，Ｓｅｒ．Ｂ，  ２０５−２０９（１９９４）、特開２０１０−２７１３２２）に準じて、上記２つのＢＣＧ−ＣＷＳを用いた水中油型エマルションを製造した。
（１）方法
ＢＣＧ−ＣＷＳ３６０ｍｇに、ｎ−ヘプタン／エタノール（９：１、容積／容積）溶液約３０ｍＬとスクアレン（岸本特殊肝油工業製）５．４ｇ（対ＢＣＧ−ＣＷＳ重量比１５倍）、ＢＨＴ（東京化成工業）１．５ｍｇを加え、攪拌した後超音波照射により室温で分散した。その後、乾燥窒素気流下６０℃に加熱し有機溶媒を留去した。ついで、０．０２重量％ポリソルベート８０水溶液１３５ｇを添加し、ホモミキサー（ラボ・リューション、ＰＲＩＭＩＸ社）を用いて６０℃、７，０００回転、５分間予備乳化を行った。更に、８．７３ｇの１０重量％ポリソルベート８０水溶液を添加し、６０℃、１２，０００回転、５分間本乳化を行い水中油型エマルション（乳化液Ａ）を得た。乳化液の粒度分布を、粒度分布計（ＳＡＬＤ−２２００、島津製作所）で測定した。乳化液の一部をサンプリングし、試験例２に準じてＢＣＧ−ＣＷＳ含量を測定した。
（２）結果
ＣＷＳ含量９１％（対仕込み重量パーセント、実濃度２．１８ｍｇＣＷＳ／ｍＬ）、スクワレン含量１００％（対仕込み重量パーセント、実濃度３６ｍｇ／ｍＬ）、メディアン系２．０μｍ、単一の粒度分布（図３０）の外観均一な水中油型エマルション製剤が得られた。【０１３９】
実施例８：凍結乾燥製剤の製造
（１）方法
実施例７と同様にして乳化を実施し水中油型エマルション乳化液を得た。乳化液に、等重量（５３．５ｇ）の６ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０／９０ｍｇ／ｍＬマンニトール／２０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）水溶液を添加混合し、ポリソルベート８０最終濃度を６ｍｇ／ｍＬ、マンニトール最終濃度４５ｍｇ／ｍＬの水中油型エマルション（希釈液）を得た。希釈液を凍結乾燥用バイアル（Φ１８．０×３３．０ｍｍ、ＣＳ、不二硝子）に１ｍＬずつ充填し、−８０℃ディープフリーザーで凍結した後、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＧＡＭＭＡ２−１６ＬＳＣｐｌｕｓ、ＭＡＲＴＩＮ  ＣＨＲＩＳＴ社製）を用いて行った。凍結乾燥再溶解液の粒度分布を、粒度分布計（ＳＡＬＤ−２２００、島津製作所）で測定した。再溶解液の一部をサンプリングし、試験例２に準じてＢＣＧ−ＣＷＳ含量を測定した。
（２）結果
凍結乾燥製剤を再溶解した結果、再溶解液中ＢＣＧ−ＣＷＳ含量９４％（対希釈液中含量、実濃度１．０８ｍｇＣＷＳ／ｍＬ）、スクワレン含量９３％（対希釈液中含量、実濃度１８．４ｍｇ／ｍＬ）、メディアン径２．３μｍ、単一ピークの粒度分布（図３１）の外観均一な水中油型エマルションが得られた。【０１４０】
実施例９：ＢＣＧ−ＣＷＳに対して油量を変えたエマルション及び凍結乾燥製剤の製造
以下、実施例７、８と同様にＢＣＧ−ＣＷＳに対する油の重量比を変えてエマルション製造を行った。但し、乳化機は実施例３と同様電動ホモジナイザーを用いて小スケールで実施した。尚、その時の乳化条件は以下の通りである。
（１）方法
ガラス試験管に１２ｍｇのＢＣＧ−ＣＷＳとスクワレン適量に対し、約２ｍＬの有機溶媒（ヘプタン或いはヘプタン／エタノール（９：１、容積／容積）混合溶媒）を添加し超音波照射により均一に懸濁した後、６０℃で窒素気流下乾固しオイルペーストを作成した。そこにＰＳ８０をスクワレンの１／３量ＰＳ８０含有の溶液を加え、乳化機で約１０，０００ｒｐｍ、６０℃、５分間乳化した乳化液を得た。そこに等容量のＤ（−）マンニトール／８ｍＭリン酸緩衝液溶液（ｐＨ７．０）を添加し希釈液を得た。
希釈液の粒度分布を測定した。希釈液の一部をサンプリングし、試験例２に準じてＢＣＧ−ＣＷＳ含量を測定した。尚、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳはサンプルＡ（試験例５の表記で示した）、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳサンプルＥを用いた（試験例５の表記で示した）。
（２）結果
結果、下記の表５と図４に示した結果を得た。【０１４１】
【表５】
2018124132.tif 000007
更に、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ及び、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ各々の６倍量のスクワレンを用いたエマルションについては、１ｍＬ／バイアルで凍結乾燥製剤を作成し、その安定性を比較した。その結果を表６で示した。【０１４２】
【表６】
2018124132.tif 000008
【０１４３】
試験例１２：エマルション（希釈液）の安定性評価
（１）評価サンプルの調製
実施例７に準じてエマルション希釈液を作製した。但し、それぞれのエマルション製剤中のスクワレンとＰＳ８０の製造時最終量（仕込み重量）はＢＣＧ−ＣＷＳ仕込み重量に対してそれぞれ１５倍、５倍になる様にし、緩衝液はクエン酸緩衝液を用いた。
・本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション希釈液
・特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション希釈液【０１４４】
（２）安定性評価
（１）で製造したエマルション希釈液を室温（２２〜２５℃）で３日保存し、サンプリング液中のＢＣＧ−ＣＷＳ含量を試験例２に準じて測定した。
（３）結果
表７に示す結果が得られた。本発明のＢＣＧ−ＣＷＳから作成したエマルション希釈液は特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳから作成したエマルション希釈液よりも安定であった。【０１４５】
【表７】
2018124132.tif 000009
【０１４６】
実施例１０：０．１ｍＬ、０．２ｍＬ低容量充填エマルション凍結乾燥製剤の製造
実施例７と同様にした製造した乳化液に、等重量（２８７．７ｇ）の６ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０／９０ｍｇ／ｍＬマンニトール／２０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ７．０）水溶液を混合し、ポリソルベート８０最終濃度を６ｍｇ／ｍＬ、マンニトール最終濃度４５ｍｇ／ｍＬの、５７５．４ｇの水中油型エマルション希釈液を得た。エマルション希釈液をピストンポンプ（ＤＩＧＩＳＰＥＮＳＥ３００９、ＩＶＥＫ社製）を用いて凍結乾燥用バイアル（Φ１８．０×３３．０ｍｍ、ＣＳ、不二硝子）に０．１ｍＬもしくは０．２ｍＬずつ充填し、−８０℃ディープフリーザー（ＭＤＦ−Ｕ７３Ｖ、ＳＡＮＹＯ社製）で凍結した後、凍結乾燥機（ＧＡＭＭＡ２−１６ＬＳＣｐｌｕｓ、ＭＡＲＴＩＮ  ＣＨＲＩＳＴ社製）で凍結乾燥を行って凍結乾燥製剤を得た。
（２）結果
凍結乾燥の結果、十分な形態を保った凍結乾燥ケーキの形成が確認された。また、下表８の通り、０．１、０．２ｍＬ／バイアル充填において、バイアル中のＢＣＧ−ＣＷＳ含量はそれぞれ、１０８μｇＣＷＳ／バイアル、２０３μｇＣＷＳ／バイアルであり、バイアル中のスクアレン含量は、それぞれ１．５８ｍｇスクアレン／バイアル、３．０２ｍｇスクアレン／バイアルであった。本発明のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションにより小容量充填の水中油型エマルション凍結乾燥製剤が製造できることが確認された。【０１４７】
【表８】
2018124132.tif 000010
【０１４８】
試験例１３：本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ及びそのエマルション製剤の表面形態（アラビノガラクタンの存在確認）
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳとそのエマルション製剤の場合、アラビノガラクタンがＣＷＳ表面、エマルション油粒子（油滴）表面に露出していることを、コンカナバリンＡの結合、凝集反応で確認した。
（１）評価サンプルの調製
ａ）ＢＣＧ−ＣＷＳ：
・本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ：試験例５の表記）
・特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（参考例２、Ｅ：試験例５の表記）
ｂ）エマルション希釈液：
（１）ａ）のＢＣＧ−ＣＷＳを用いて、実施例７に準じて、次のエマルション製剤を作製した。
但し、スクワレン量、ＳＰ８０量はＢＣＧ−ＣＷＳ仕込み重量比としてそれぞれ１５倍量、５倍量を用いた。また、クエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。
・本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション希釈液
・特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション希釈液【０１４９】
（２）評価方法
各評価サンプル５０μＬにローダミン標識コンカナバリンＡ溶液（フナコシ）２μＬを添加し、軽くピペッティングした後、共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察した。
（３）結果
図２に示される様に本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルション希釈液ではコンカナバリンＡ溶液によるローダミン呈色及び凝集反応が見られたが、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルション希釈液では殆ど呈色及び凝集反応が見られなかった。このことから、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルション希釈液では、油滴表面にアラビノガラクタンが露出しているが、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルション希釈液では、アラビノガラクタンが油粒子（油滴）中に包埋され、油滴表面にアラビノガラクタンが殆ど露出していないことが示された。【０１５０】
試験例１４：本発明のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションのゼータ電位の評価
（１）評価サンプルの調製
実施例７に準じて作製した、次のエマルション希釈液を使用した。但し、それぞれのエマルション製剤中のスクワレンとＰＳ８０の製造時最終量（仕込み重量）はＣＷＳ仕込み重量に対してそれぞれ１５倍、５倍になるようにして作製した。
・本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）を用いたエマルション希釈液
・特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）を用いたエマルション希釈液
・ビークルエマルション希釈液
（２）測定方法
試験例１０に準じてゼータ電位を測定した。
（３）結果
表９に示されるように、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション希釈液のゼータ電位はビークルエマルション希釈液とほぼ同等であったのに対し、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション希釈液は約２倍のマイナス電位を示した。従って、ゼータ電位差で本発明のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションを明らかに区別することができることが判明した。【０１５１】
【表９】
2018124132.tif 000011
【０１５２】
試験例１５：物性値の異なるＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションを用いた物性値とゼータ電位差の相関
（１）評価サンプルの調製
実施例７に準じて作製した、次のＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルション希釈液を使用した。但し、それぞれのＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルション中のスクアレンとＰＳ８０量はＢＣＧ−ＣＷＳ仕込み重量に対してそれぞれ１５倍、５倍になるようにして作製した。また、クエン酸緩衝液（ｐＨ７.0）を使用した。
・本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのサンプルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを用いて製造したエマルション希釈液
・特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのサンプルＥを用いて製造したエマルション希釈液
・ビークルエマルション希釈液
（２）測定方法
試験例１０に準じてゼータ電位を測定した。
（３）結果
得られたゼータ電位、各種ＢＣＧ−ＣＷＳエマルション希釈液から得られたゼータ電位をビークルエマルション希釈液から得られたゼータ電位の差を算出した値をゼータ電位差として評価した。その結果は、表１０に示す通りで、本発明ＢＣＧ−ＣＷＳのエマルション希釈液は、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルション希釈液に比して明らかにその電位差は大きかった。即ち、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルション希釈液の電位差は６〜９ｍＶが認められた。一方、特許文献３のエマルション希釈液ではその値は、１．０以下であった。【０１５３】
【表１０】
2018124132.tif 000012
【０１５４】
試験例１６：ＢＣＧ−ＣＷＳに対する油量とゼータ電位差の相関
（１）評価サンプルの調製
実施例７に準じて、対ＢＣＧ−ＣＷＳ重量比７．５、１５、２２．５倍量のスクワレンを用いて作成したＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルション希釈液、及びそれらのビークルエマルションを使用した。各々スクワレンの１／３重量のＰＳ８０量、クエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した。
（２）測定方法
試験例１０と同様にゼータ電位差を測定した。
（３）結果
結果を表１１に示した。油量の増大に相関して、ゼータ電位差が低下した。【０１５５】
【表１１】
2018124132.tif 000013
【０１５６】
試験例１７：製剤中におけるＢＣＧ−ＣＷＳとオイルの共局在の確認
製剤中のＢＣＧ−ＣＷＳの存在状態を確認する為に下記の評価を行った。
（１）評価法
公知文献（Ｉｎｆｅｃｔ.  Ｉｍｍｕｎ．，  ６８（１２），  ６８８３−６８９０（２０００））に準じてＦＩＴＣラベル化した本願ＢＣＧ−ＣＷＳ及びナイルレッドを溶解させたスクワレンを用い、実施例７に準じて水中油型エマルションを作製した。対ＢＣＧ−ＣＷＳ重量比にして１０倍量のスクワレン、その１／３量のＰＳ８０、リン酸緩衝液を用いた。得られたエマルション乳化液を蛍光顕微鏡で観察した。
（２）結果
ＢＣＧ−ＣＷＳ及びスクワレンの蛍光は共局在しており、エマルション乳化液の油滴内にＢＣＧ−ＣＷＳが存在していることが確認された。【０１５７】
試験例１８：各種抗酸化剤の効果の比較検証
ＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルション凍結乾燥製剤の安定性向上を目的として抗酸化剤の検討を実施した。
（１）評価サンプルの調製
実施例８に準じてエマルション凍結乾燥製剤を作製した。但し、それぞれのエマルション製剤中のスクワレンとＰＳ８０の製造時最終量（仕込み重量）はＢＣＧ−ＣＷＳ仕込み重量比にしてそれぞれ６倍、２倍になるようにして作製した。凍結乾燥製剤を再溶解した後、各抗酸化剤（ＡからＦ）を１０ｐｐｍ添加した液を使用した。
Ａ：未添加
Ｂ：ＤＬ−α−トコフェロール（Ｖ．Ｅ）
Ｃ：トコフェロール酢酸エステル（Ｖ．Ｅ  Ｅ）
Ｄ：アスコルビン酸（Ｖ．Ｃ）
Ｅ：６−Ｏ−ステアロイル−Ｌ−アスコルビン酸（Ｖ．Ｃ  Ｅ）
Ｆ：ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）
（２）評価方法
各評価サンプルを６０℃条件下静置保存し、試験開始時、２日経過後、４日経過後及び８日経過後の各時点でのｐＨ、スクアレン含量、ＰＳ８０分解の指標となるオレイン酸含量を測定した。【０１５８】
（３）結果
図１１に示されるように以下のことが明らかとなった。
ａ）ｐＨ：水溶性抗酸化剤のＶ．Ｃは抗酸化剤未添加の場合よりもｐＨが低下し、ＢＨＴを除くその他脂溶性抗酸化剤も未添加とほぼ同等の挙動であった。ＢＨＴは開始時のｐＨを唯一保持した。
ｂ）スクアレン含量：抗酸化剤未添加及びＢＨＴ以外の抗酸化剤において８日保存後のスクアレンの含量低下が認められ、ＢＨＴは開始時から変化が認められなかった。
ｃ）オレイン酸：ＰＳ８０は加水分解によりオレイン酸の含量が増加し、次にオレイン酸の過酸化反応のためオレイン酸含量が減少する傾向が認められＰＳ８０の分解指標となる。未添加、Ｖ．Ｃ及びＶ．Ｃ  Ｅは過酸化反応まで急激に進んだと思われオレイン酸含量は低下しており、Ｖ．Ｅ、Ｖ．Ｅ  Ｅは増加及び減少と反応が進んでいる。対してＢＨＴは緩やかな増加傾向が認められ、このことは加水分解後の過酸化反応を抑制していることを示している。
以上の結果から、各種抗酸化剤の中でＢＨＴが最も優れた抗酸化作用を示していることが示された。【０１５９】
試験例１９：緩衝剤の効果の比較検証
ＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルションの安定性向上を目的として緩衝剤を検討した。
本発明の製剤への効果の比較を実施するために、ＰＳ８０存在下、各種緩衝剤のｐＨ保持能力を比較した。
（１）評価サンプルの調製
ＰＳ８０を６ｍｇ／ｍＬとなる様に下記各種バッファーに添加し、ＰＳ８０溶液を得た。
Ａ：緩衝剤未添加
Ｂ：リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
Ｃ：クエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
（２）評価方法
各評価サンプルを４０℃、或いは６０℃条件下静置し、試験開始時からそれぞれ約６０、１５０日経過後までのｐＨを測定した。【０１６０】
（３）結果
図１２に示す様に、緩衝剤添加なしの溶液ではリン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤を添加した溶液に比べてｐＨ低下速度が速く、更にリン酸緩衝剤に比べてクエン酸緩衝剤のｐＨ保持能力が高かった。
以上の結果から、本製剤の処方条件において各種緩衝剤の中でも汎用されているリン酸緩衝剤よりもクエン酸緩衝剤がより高いｐＨ安定化能を示すことが明らかとなった。【０１６１】
試験例２０：本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルションによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性評価
（１）評価サンプルの調製
実施例７に準じて製造したエマルションを用いた。但し、ＢＣＧ−ＣＷＳ重量比にして１５倍量のスクアレンと５倍量のＰＳ８０と、クエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。
（２）評価方法
ａ）ＲＡＷ２６４．７細胞を用いたＴＮＦ−α活性評価：
試験例４（１）と同様に実施した。
ｂ）ＢＣ−１細胞を用いたＩＬ−１２活性評価：
試験例１１（３）と同様に実施した。
ｃ）ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ｈＴＬＲ２細胞を用いたｈＴＬＲ２のレポーター活性評価：
試験例４（２）の方法に準じて測定した。  
（３）結果
ａ）ＴＮＦ−α活性評価：
図５に示されるように、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション製剤は、ＴＮＦ−α誘導活性が特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション製剤よりも約１６倍高かった。
ｂ）ＩＬ−１２活性評価：
図６に示されるように、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション製剤は、ＩＬ−１２誘導活性が特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション製剤よりも約６倍高かった。
ｃ）ＴＬＲ２のレポーター活性評価：
図７に示されるように、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション製剤は、ｈＴＬＲ−２レポーター活性が特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルション製剤よりも約２２倍高かった。【０１６２】
試験例２１：ＢＣＧ−ＣＷＳのオイルペーストのオイル量とｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の相関
ＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性と使用油量との相関を見る一環としてその中間体であるオイルペーストを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性と油量との相関を検討した。
（１）評価サンプルの調製
ＢＣＧ−ＣＷＳにスクワレン（ＢＣＧ−ＣＷＳの８、１６、２４倍重量）とＰＳ８０（ＢＣＧ−ＣＷＳの１．５倍重量）を添加混合した後、ｎ−ヘキサンを添加し超音波照射を行いＢＣＧ−ＣＷＳ分散液を調製した。９６−ｗｅｌｌガラスマイクロプレートにそれらＢＣＧ−ＣＷＳ分散液を５０μｇ／ｗｅｌｌ添加し約２４時間２５℃で静置しｎ−ヘプタンを留去し、ＢＣＧ−ＣＷＳペーストを得た。
（２）測定方法（ＴＮＦ−α活性評価）：
試験例４（１）の方法に準じて測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞を上記のＢＣＧ−ＣＷＳペーストを含有する９６―ｗｅｌｌマイクロプレートに５×１０＾５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。３７℃、５％ＣＯ２、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で５時間培養して接着させた後、同種の新規培地で培地交換し更に２０時間培養後、培養上清中のＴＮＦ−α濃度をサイトカインＥＬＩＳＡ法により測定した。
（３）結果：
図８に示されるように、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）をスクワレンとＰＳ８０でペースト化すると、ペースト基剤の量の増加に従ってＴＮＦ−α産生量が低下した。一方で、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳはペースト化することにより、ＴＮＦ−αの産生が未処理群と同程度に減少した。これは、ペースト表面に露出してＲａｗ２６４．７細胞を刺激していたアラビノガラクタンが、ペーストの油成分が増えることにより閉塞、被覆されることを示している。【０１６３】
試験例２２：各種水への分散性（物性値）を有するＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションによるＲａｗ２６４．７細胞刺激時のＴＮＦ−α産生量比較
（１）サンプル
試験例５の各種ＢＣＧ−ＣＷＳを用いて、実施例７に準じて水中油型エマルションを作成した。但し、使用したＢＣＧ−ＣＷＳ重量比に対し、１５倍量のスクアレンと、５倍量のＰＳ８０とクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いた。
（２）方法
試験例４（１）の方法に準じて測定した。
（３）結果
図１５に示す様に本発明ＢＣＧ−ＣＷＳを用いたエマルションいずれもがＴＮＦ―αを約１０００ｐｇ／ｍＬ誘導したのに対し、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いた場合には約３００ｐｇ／ｍＬしか誘導されなかった。【０１６４】
試験例２３：製剤皮内投与時のＢＣＧ−ＣＷＳの体内挙動
公知のモルモット皮内投与後のＣＷＳ挙動の評価実験（Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｈｅｒ．，  ２（３），  １６８−１７７（２００８）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｈｅｒ．，  ２（３），  １７８−１８７（２００８））を参考に、（試験例１７に準じて製造した蛍光化ＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルションを調製し、蛍光強度を指標にしてリンパ節への移行性を評価する方法を確立した。その方法を用いて、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションを比較した。
（１）モルモット投与及び組織摘出法
試験例１７に準じて作製したラベル化ＢＣＧ−ＣＷＳの蛍光化エマルションをモルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ、雌、４週齢、ＳＬＣ）の背中皮内に約５０μｇ投与し、投与後１時間後の所属リンパ節（腋窩リンパ節）を採取した。摘出したリンパ節をホルマリン固定し、パラフィン切片を作成した。得られた切片を蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス、ＢＺ−Ｘ７１０）を用いて観察し、解析ソフト（ＢＺ−Ｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）を用いて算出した、リンパ節面積及び蛍光強度（輝度）からその比率（輝度／面積）を求めた。
（２）結果
表１２に示す結果の通り、いずれのＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションにおいても１時間後にＢＣＧ−ＣＷＳがリンパ節に移行しているのが確認された。その結果を表１２に示す。【０１６５】
【表１２】
2018124132.tif 000014
【０１６６】
試験例２４：マウス腹腔内製剤投与時の血中ＩＦＮ―γ産生誘導活性の比較
公知文献（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，  ９９（７），  １４３５−１４４０（２００８）
）に準じて本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫賦活活性を評価するために、マウス腹腔内製剤投与時の血中ＩＦＮγ産生誘導活性を評価した。
（１）評価サンプル
実施例７に準じて本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ或いは特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを含有した水中油エマルションを製造した。具体的には、４ｍｇのＢＣＧ−ＣＷＳ、ＢＣＧ−ＣＷＳ重量の２７倍重量のスクワラン、ＢＣＧ−ＣＷＳの１８倍重量のＰＳ８０を用いてオイルペーストを作成し、そこに４．５ｍＬの４５ｍｇ／ｍＬＤ（−）マンニトール／８ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、ポッターホモジナイザーで１，２００ｒｐｍ、６０℃、１２分間、乳化した。その後、４５ｍｇ／ｍＬＤ（−）マンニトール／８ｍＭリン酸で希釈し、１ｍｇＣＷＳ／ｍＬの投与用のエマルションとした。ビークルエマルションは、ＢＣＧ−ＣＷＳを使用せずに上記と同様の方法で製造した。【０１６７】
（２）評価方法
ｂ）約１週間馴化させたＳＪＬ／Ｊマウス（メス、６週齢）に対し、０、３、６日目に各エマルション３０μｇＣＷＳ／３０μＬを腹腔内投与した。最終投与から６時間後に採血し、血清中のＩＦＮγ量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（３）結果データ差し替え予定
図１０ａに示すように、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルション投与群の血清中ＩＦＮγ量は高い値を示したが、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルション投与群では低かった。本願のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルションは特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルションに比し、より強いＩＦＮγ産生誘導活性を示すことが示された。【０１６８】
試験例２５：Ｅ．Ｇ７−ＯＶＡ移植腫瘍マウスの抗腫瘍活性評価
（１）評価サンプル
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを用いて試験例２４（ＩＦＮ−γの系）と同様に評価用のエマルションを作成した。ビークルエマルションは、ＢＣＧ−ＣＷＳを使用せずに同様の方法で製造した。
（２）方法
約１週間馴化させたＣ５７ＢＬ／６マウス（６週齢、メス）にＯＶＡ発現Ｅ．Ｇ７細胞株（マウスリンパ腫由来細胞株）を１×１０＾６ｃｅｌｌｓ／５０μＬで皮内接種し、その後それぞれ１、４、７、１４日目に各評価用のエマルションをそれぞれ５０μｇＣＷＳ／５０μＬ／マウスとなるように腫瘍内投与した。細胞移植後２１日目に剖検し腫瘍重量を秤量した。【０１６９】
結果
図１０ｂに示した通りであり、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルションは特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳエマルションに比べ優れた効果を示している。【０１７０】
試験例２６：ＭｅｔｈＡ細胞移植マウスの抗腫瘍活性評価
（１）評価サンプル
実施例７に準じて本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ或いは特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳを含有した水中油エマルションを製造した。具体液には、１２ｍｇのＢＣＧ−ＣＷＳ、ＢＣＧ−ＣＷＳ重量の２７倍重量のスクワランからオイルペーストを作成し、そこにＢＣＧ−ＣＷＳの１８倍重量のＰＳ８０を含有した約４ｍＬの８ｍＭリン酸緩衝液を添加し、電動ホモジナイザーで乳化し乳化液を得た。その後、等容量の９０ｍｇ／ｍＬのＤ（−）マンニトール／８ｍＭリン酸緩衝液溶液を添加し、実施例７と同様にしてＢＣＧ−ＣＷＳ含有水中油エマルションを得た。ビークルエマルションは、ＢＣＧ−ＣＷＳを使用せずに上記と同様の方で製造した。
（２）評価方法
ａ）細胞調製
１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０倍地中でｉｎ ｖｉｔｒｏにて継代維持したＭｅｔｈＡ細胞株（同系繊維肉腫細胞株）を使用した。抗腫瘍活性評価に使用するため、ＭｅｔｈＡ細胞株をリン酸緩衝化生理食塩水で３度洗浄し、２×１０＾６ｃｅｌｌ／ｍＬとなるよう再懸濁した。
ｂ）細胞移植とエマルションの投与
約１週間馴化させたＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、６週齢、チャールスリバー）の背上部に（２）ａ）ＭｅｔｈＡ細胞株を１０＾５ｃｅｌｌ／５０μＬと上記の投与用液５０μｇＣＷＳ／５０μＬを混合し腹側腋窩皮内に移植した。移植後１８日後の腫瘍の生着率を評価した。
（３）結果
得られた結果を表１３に示した。本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルションは、ビークルエマルションに比べ、強く腫瘍の生着を阻止した。【０１７１】
【表１３】
2018124132.tif 000015
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
本発明の細菌ＣＷＳを含有する水中油型エマルション製剤及び凍結乾燥製剤は、油粒子表面にアラビノガラクタンが露出している新規な製剤であるため、レクチンとの反応性、保存安定性に優れ、更に免疫細胞に対して優れた活性を示している。それ故、本発明のエマルション製剤及びその凍結乾燥製剤は、医薬品として癌免疫療法剤、花粉症、喘息等の免疫調節剤に使用可能である。【０１７３】
本発明の細菌ＣＷＳは、細菌の細胞外付着成分が除去されて、菌体表面にミコール酸部分及びアラビノガラクタンの一部が露出した精製菌体を使用して、界面活性剤の使用や高温処理することなく、破砕処理、精製処理を行うことで作製されたＣＷＳである。そのため、不可逆的なミコール酸部分の強い凝集又は融合がほとんどなく、水への分散性が優れた高純度なＣＷＳとなっている。従って、本発明の細菌ＣＷＳは、それ自体でも優れた免疫賦活活性を有しており、医薬品として癌免疫療法剤、花粉症、喘息等の免疫調節剤に使用可能である。【０１７４】
また、本発明の細菌の精製菌体は、細菌の細胞外付着成分が除去されて、菌体表面にミコール酸部分及びアラビノガラクタンの一部が露出しており、精製度が高いものとなっている。従って、ＢＣＧ菌などのミコール酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含む細菌を用いて、ミコール酸やＢＣＧ−ＣＷＳなどの細菌ＣＷＳを、より簡便な製造プロセスで高純度且つ高収率に製造できるようになった。【０１７５】
これらの結果から、本発明の細菌ＣＷＳを活用して、各種の水中油型エマルション製剤や凍結乾燥製剤を使用することにより、製剤安定性が高く、生物活性に優れた癌の免疫療法剤、免疫賦活化剤等が提供できるようになった。
【符号の説明】
【０１７６】
１：エマルション、２．水層、３．油滴、４．細菌ＣＷＳ、５．アラビノガラクタン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年6月21日(2018.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）、水、油、界面活性剤を含有する、下記条件を満たす水中油型エマルション製剤：
（ａ）レクチンに対する反応性を示す、
（ｂ）エマルション製剤のゼータ電位がマイナスの値であり、細菌の細胞壁骨格成分を含まない以外は同様にして作成されたビークル水中油型エマルションのゼータ電位との電位差が３〜１４ｍＶである。
【請求項２】
上記細菌のＣＷＳが、脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、請求項１に記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項３】
上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、請求項１又は２に記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項４】
レクチンがコンカナバリンＡである、請求項１〜３のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項５】
上記電位差が４〜１２ｍＶである、請求項１〜４のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項６】
上記細菌が、ミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、請求項１〜５のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項７】
上記細菌がＢＣＧ菌である、請求項６に記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項８】
上記油がスクワラン、スクワレンまたはその混合物である、請求項１〜７のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項９】
上記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、請求項１〜８のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１０】
さらに抗酸化剤として、トコフェロール類、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）から選択される１以上の抗酸化剤を含有する、請求項１〜９のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１１】
上記抗酸化剤がジブチルヒドロキシトルエンである、請求項１０に記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１２】
さらに緩衝剤として、リン酸バッファーまたはクエン酸バッファーを含有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１３】
上記緩衝剤がクエン酸バッファーである、請求項１２に記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１４】
さらに単糖類、糖アルコール、多類糖、アミノ酸、タンパク質、ウレア、および無機塩からなる群から選択される一つ以上の賦形剤を含有する、請求項１〜１３のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１５】
上記賦形剤がマンニトール、スクロース又はトレハロースである、請求項１４記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１６】
上記賦形剤がマンニトールである、請求項１５に記載の水中油型エマルション製剤。
【請求項１７】
細菌がＢＣＧ菌であり、油がスクワレンまたはスクワランであり、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、さらに抗酸化剤としてジブチルヒドロキシトルエン、緩衝剤としてクエン酸バッファーを含有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の製剤。
【請求項１８】
細菌がＢＣＧ菌であり、油がスクワレンであり、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、緩衝剤としてクエン酸バッファーを含有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の製剤。
【請求項１９】
請求項１４〜１８のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤の凍結乾燥製剤。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれかに記載のエマルション製剤または凍結乾燥製剤を含有する、ヒトを含む哺乳動物のための医薬組成物。
【請求項２１】
癌の治療のための、請求項２０記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図１】抗酸菌（結核菌）の細胞壁の基本構造を物質レベルでどのような形状になっているかを表した図（ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＳｐｅｃｔｒｕｍ，  ２（３），  １−１９（２０１４）のＦＩＧＵＲＥ  ６）である。細胞壁（細胞外付着成分を含む）に含まれる主な化合物が記載されている。更に、抗酸菌の細胞壁の成分の中で、有機溶媒で抽出される脂質が表されている。なお、細胞壁の成分の中で、ペプチドグリカン−アラビノガラクタン−ミコール酸の部分（細胞壁骨格）は有機溶媒等によって抽出できないことが記載されている。
【図２】本発明、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルションに対するローダミン標識コンカナバリンＡの結合、凝集反応の比較。ａ）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルション。ｂ）特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルション。（左：蛍光顕微鏡画像、右：微分干渉画像）
【図３】本発明のエマルション並びにエマルション中の油滴の模式図を示す。Ａは従来技術(例えば特許文献３）のエマルション中の油滴、Ｂ．本発明のエマルション中の油滴の模式図である。
【図４】各種オイル量（対ＢＣＧ−ＣＷＳ仕込み重量比３．８、６．０、７．５倍量）を用いて製造した異なる物性値（水への分散性）を有するＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションの粒度分布。ａ）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）のエマルション。ｂ）特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）のエマルション。
【図５】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）をそれぞれ用いて製造したエマルションの、マウスマクロファージ様細胞株（Ｒａｗ２６４．７細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＮＦ−α産生増強活性の比較。
【図６】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）をそれぞれ用いて製造したエマルションの、マウス未成熟樹状細胞株（ＢＣ−１細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１２産生増強活性の比較。
【図７】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）をそれぞれ用いて製造したエマルションの、ｈＴＬＲ２遺伝子導入ＨＥＫ細胞株（ヒト胎児由来腎臓細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏレポーター活性の比較。
【図８】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）の、ＢＣＧ−ＣＷＳオイルペーストのオイル量と、ｉｎｖｉｔｒｏ生物活性の相関性の比較（Ｒａｗ２６４．７細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＮＦ−α産生増強活性）。
【図９】ＢＣＧ−ＣＷＳオイルペーストの水中での模式図Ａ）は特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのオイルペースト。Ｂ）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのオイルペースト。２．水層、４．ＢＣＧ−ＣＷＳ、５．アラビノガラクタン特許文献３のオイルペーストではアラビノガラクタンが殆ど油滴表面に突出、露出していない。本発明のオイルペーストでは、アラビノガラクタンが多く油滴表面に突出、露出している。
【図１０】本発明ＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションの各種ｉｎ  ｖｉｖｏ生物活性。ａ）ＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルションのＳＪＬ／Ｊマウスへの腹腔内投与時の血中ＩＦＮ―γ産生誘導効果。ｂ）ＢＣＧ−ＣＷＳ水中油型エマルションのＯＶＡ遺伝子導入Ｅ．Ｇ７細胞株担癌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）への腫瘍内投与時の腫瘍増殖抑制効果。
【図１１】各種抗酸化剤使用時における負荷条件下（６０℃、８日間保存）のビークルエマルションの保存安定性の比較。ａ）ｐＨ変動ｂ）オレイン酸含量変動。
【図１２】リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液の、加温負荷条件下（４０、６０℃）のＰＳ８０溶液に対するｐＨ変動。ａ）４０℃、ｂ）６０℃。
【図１３】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）の水中分散時におけるＯＤ相対値の変化。
【図１４】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳに関する物性の相違（水中の分散性、ｎ−ヘプタン中の粒度分布など）をＢＣＧ−ＣＷＳの表面形態の変化で説明したイメージ図である。（ａ）は分散状態、（ｂ）はミコール酸部分が通常の可逆的な疎水性相互作用、（ｃ）はミコール酸部分が不可逆的に強く凝集又は融合している形態を表している。
【図１５】各種水への分散性（物性値）を有するＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションによるＲａｗ２６４．７細胞株刺激時のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＮＦ−α産生量。
【図１６】ａ）特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの有機溶媒中加熱処理品のＯＤ相対値（分散性）の変化。ｂ）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの加熱及び界面活性剤処理品のＯＤ相対値（分散性）の変化。
【図１７】特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの再破砕品のＯＤ相対値（分散性）の変化。
【図１８】ウサギ抗ＢＣＧ死菌抗体に対する、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの結合反応性。
【図１９】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのオーラミン染色画像。（ａ）本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ、（ｂ）特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ。（左：蛍光顕微鏡画像、右：微分干渉画像）
【図２０】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳと特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳの（ａ）生理食塩水中、（ｂ）ｎ−ヘプタン中における粒度分布
【図２１】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）の、マウス未成熟樹状細胞株（ＢＣ−１細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１２産生増強活性。
【図２２】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）の、マウス樹状細胞株（ＪＡＷＳII細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１２産生増強活性。
【図２３】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）の、マウスマクロファージ様細胞株（Ｒａｗ２６４．７細胞株）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＮＦ−α産生増強活性。
【図２４】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ａ）と特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳ（Ｅ）の、各種ｈＴＬＲ遺伝子導入ＨＥＫ細胞株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏレポーター活性。ａ)ｈＴＬＲ２、ｂ）ｈＴＬＲ４。
【図２５】精製菌体製造時の死菌体洗浄効率ａ）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いたＢＣＧ死菌体との比較による、本発明のＢＣＧ精製菌体の細胞外付着物残留量。ｂ）死菌体洗浄における本発明洗浄方法と公知法で洗浄した各菌体に含まれる細胞外付着成分の残留量をＴＬＣで示している。
【図２６】ＢＣＧ死菌、本発明の精製菌体に対するローダミン標識コンカナバリンＡの結合、凝集反応。ａ）ＢＣＧ死菌。ｂ）本発明の精製菌体。（左：蛍光顕微鏡画像、右：微分干渉画像）
【図２７−１】ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体とその破砕物の、各種ｈＴＬＲ遺伝子導入ＨＥＫ細胞株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏレポーター活性。ａ)ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体のｈＴＬＲ２レポーター活性。ｂ）本発明のＢＣＧ精製菌体とその破砕物のｈＴＬＲ２レポーター活性。
【図２７−２】ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体とその破砕物の、各種ｈＴＬＲ遺伝子導入ＨＥＫ細胞株におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏレポーター活性。ｃ) ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体のｈＴＬＲ４レポーター活性。ｄ）本発明のＢＣＧ精製菌体とその破砕物のｈＴＬＲ４レポーター活性。
【図２８】ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体とその破砕物の、Ｒａｗ２６４．７細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＴＮＦ−α産生増強活性。ａ)ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体。ｂ）本発明のＢＣＧ精製菌体とその破砕物。
【図２９】ＢＣＧ菌体（死菌）と本発明のＢＣＧ精製菌体の、マウス樹状細胞株（ＪＡＷＳII細胞）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−１２産生増強活性。
【図３０】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルションの粒度分布
【図３１】本発明のＢＣＧ−ＣＷＳの水中油型エマルション凍結乾燥製剤復水後のエマルションの粒度分布
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
（２）評価方法
約１週間馴化させたＳＪＬ／Ｊマウス（メス、６週齢）に対し、０、３、６日目に各エマルション３０μｇＣＷＳ／３０μＬを腹腔内投与した。最終投与から６時間後に採血し、血清中のＩＦＮγ量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。
（３）結果
図１０ａに示すように、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルション投与群の血清中ＩＦＮγ量は高い値を示したが、特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルション投与群では低かった。本願のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルションは特許文献３のＢＣＧ−ＣＷＳのエマルションに比し、より強いＩＦＮγ産生誘導活性を示すことが示された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
【表１３】
2018124132.tif 000048
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
2018124132.tif 000049
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月3日(2018.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＣＧ−ＣＷＳ、水、油としてスクワラン、スクワレンまたはその混合物、界面活性剤としてポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する、下記条件を満たす水中油型エマルション製剤： 
（ａ）レクチンに対する反応性を示す、 
（ｂ）エマルション製剤のゼータ電位がマイナスの値であり、ＢＣＧ−ＣＷＳを含まない以外は同様にして作成されたビークル水中油型エマルションのゼータ電位との電位差が３〜１４ｍＶである。 
【請求項２】
上記ＢＣＧ−ＣＷＳが、脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、請求項１に記載の水中油型エマルション製剤。 
【請求項３】
レクチンがコンカナバリンＡである、請求項１又は２に記載の水中油型エマルション製剤。 
【請求項４】
上記電位差が４〜１２ｍＶである、請求項１〜３のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。 
【請求項５】
さらに抗酸化剤として、トコフェロール類、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）から選択される１以上の抗酸化剤を含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。 
【請求項６】
上記抗酸化剤がジブチルヒドロキシトルエンである、請求項５に記載の水中油型エマルション製剤。 
【請求項７】
さらに緩衝剤として、リン酸バッファーまたはクエン酸バッファーを含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。 
【請求項８】
上記緩衝剤がクエン酸バッファーである、請求項７に記載の水中油型エマルション製剤。 
【請求項９】
さらに単糖類、糖アルコール、多類糖、アミノ酸、タンパク質、ウレア、および無機塩からなる群から選択される一つ以上の賦形剤を含有する、請求項１〜８のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。 
【請求項１０】
上記賦形剤がマンニトール、スクロース又はトレハロースである、請求項９記載の水中油型エマルション製剤。 
【請求項１１】
上記賦形剤がマンニトールである、請求項１０に記載の水中油型エマルション製剤。 
【請求項１２】
油がスクワレンまたはスクワランであり、さらに抗酸化剤としてジブチルヒドロキシトルエン、緩衝剤としてクエン酸バッファーを含有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の製剤。 
【請求項１３】
油がスクワレンであり、緩衝剤としてクエン酸バッファーを含有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の製剤。 
【請求項１４】
請求項９〜１３のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤の凍結乾燥製剤。 
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載のエマルション製剤または凍結乾燥製剤を含有する、ヒトを含む哺乳動物のための医薬組成物。 
【請求項１６】
癌の治療のための、請求項１５記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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