(57)【要約】  加水分解反応を触媒する、酵素タンパク質とは異なる新たな分子を提供する。  本発明の触媒性ペプチドは、加水分解反応を触媒するペプチドであり、下記（Ａ１）〜（Ａ４）からなる群から選択された少なくとも一つのペプチドからなることを特徴とする。（Ａ１）Ｔｏｂ/ＢＴＧタンパク質における、ＢｏｘＡと、その上流領域および下流領域の少なくとも一方の領域とからなるペプチド（Ａ２）前記（Ａ１）の部分領域からなるペプチド（Ａ３）前記（Ａ１）または前記（Ａ２）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド（Ａ４）前記（Ａ１）または前記（Ａ２）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ１）〜（Ｃ４）からなる群から選択された少なくとも一つのペプチドからなることを特徴とする加水分解反応を触媒する触媒性ペプチド。
（Ａ１）Ｔｏｂ/ＢＴＧタンパク質における、ＢｏｘＡと、その上流領域および下流領域の少なくとも一方の領域とからなるペプチド
（Ａ２）前記（Ａ１）の部分領域からなるペプチド
（Ａ３）前記（Ａ１）または前記（Ａ２）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド
（Ａ４）前記（Ａ１）または前記（Ａ２）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド
（Ｂ１）Ｔｏｂ/ＢＴＧタンパク質における、ＢｏｘＢからなるペプチド
（Ｂ２）前記（Ｂ１）の部分領域からなるペプチド
（Ｂ３）前記（Ｂ１）または前記（Ｂ２）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド
（Ｂ４）前記（Ｂ１）または前記（Ｂ２）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド
（Ｃ１）Ｔｏｂ/ＢＴＧタンパク質における、Ｃ末端領域または中間領域からなるペプチド
（Ｃ２）前記（Ｃ１）の部分領域からなるペプチド
（Ｃ３）前記（Ｃ１）または前記（Ｃ２）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド
（Ｃ４）前記（Ｃ１）または前記（Ｃ２）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド
【請求項２】
前記ペプチドのアミノ酸残基数が、５〜２２の範囲である、請求項１記載の触媒性ペプチド。
【請求項３】
前記（Ａ１）において、ＢｏｘＡのアミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸配列であり、
配列番号１において、
Xaa1が、Y,FまたはH、
Xaa2が、PまたはS、
Xaa3が、EまたはD、
Xaa4が、KまたはC、
Xaa5が、Y,L,CまたはS、
Xaa6が、SまたはQ、
Xaa7が、GまたはA、
Xaa8が、FまたはY、
Xaa9が、VまたはI、
Xaa10が、HまたはR、
Xaa11が、IまたはVである、請求項１記載の触媒性ペプチド。
【請求項４】
前記（Ａ１）が、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１から３のいずれか一項に記載の触媒性ペプチド。
【請求項５】
前記（Ａ２）が、配列番号３〜１４、および４４〜４８のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１から４のいずれか一項に記載の触媒性ペプチド。
【請求項６】
前記（Ａ３）が、配列番号１５〜２６、５０および５３のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１から５のいずれか一項に記載の触媒性ペプチド。
【請求項７】
前記（Ａ３）が、配列番号２７〜３１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドであり、
配列番号２７において、Xaaは、W、L、V、NまたはDであり、
配列番号２８において、Xaaは、K、V、T、YまたはMであり、
配列番号２９において、Xaaは、T、E、P、WまたはKであり、
配列番号３０において、Xaaは、H、V、W、Y、R、L、P、M、E、A、D、Q、N、KまたはGであり、
配列番号３１において、Xaaは、T、Q、V、KまたはEである、請求項１から６のいずれか一項に記載の触媒性ペプチド。
【請求項８】
前記（Ｂ１）において、ＢｏｘＢのアミノ酸配列が、配列番号３２のアミノ酸配列であり、
配列番号３２において、
Xaa1が、VまたはL、
Xaa2が、Q、E、SまたはK、
Xaa3が、DまたはE、
Xaa4が、LまたはM、
Xaa5が、SまたはT、
Xaa6が、V、LまたはI、
Xaa7が、VまたはI、
Xaa8が、F、YまたはC、
Xaa9が、EまたはR、
Xaa10が、SまたはC、
Xaa11が、YまたはC、
Xaa12が、QまたはR、
Xaa13が、IまたはYである、請求項１から７のいずれか一項に記載の触媒性ペプチド。
【請求項９】
前記（Ｂ１）が、配列番号３３〜３５のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の触媒性ペプチド。
【請求項１０】
前記（Ｂ２）が、配列番号３６〜３８のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１から９のいずれか一項に記載の触媒性ペプチド。
【請求項１１】
前記（Ｃ１）が、配列番号３９から４１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の触媒性ペプチド。
【請求項１２】
前記（Ｃ３）が、配列番号４２または４３のアミノ配列からなるペプチド配列である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の触媒性ペプチド。
【請求項１３】
触媒性分子を含み、
前記触媒性分子が、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の触媒性ペプチドであることを特徴とする触媒性ペプチド試薬。
【請求項１４】
さらに、前記触媒性ペプチドとは異なる分子を含み、前記分子が、前記触媒性ペプチドに連結されている、請求項１３記載の触媒性ペプチド試薬。
【請求項１５】
前記異なる分子が、ターゲットに対する結合分子である、請求項１４記載の触媒性ペプチド試薬。
【請求項１６】
前記結合物質が、タンパク質またはペプチドである、請求項１５記載の触媒性ペプチド試薬。
【請求項１７】
基質を、請求項１から１２のいずれか一項に記載の触媒性ペプチドで処理する工程を含み、前記基質が、タンパク質またはペプチドであることを特徴とする、タンパク質またはペプチドの分解方法。
【請求項１８】
前記基質が、酵素タンパク質である、請求項１７記載の分解方法。
【請求項１９】
前記基質が、アミロイドベータタンパク質もしくはそのフラグメントペプチド、プリオンタンパク質もしくはそのフラグメントペプチド、ｈＭＭＰ７もしくはそのフラグメントペプチド、ＳＯＤ１もしくはそのフラグメントペプチド、Ｔａｕタンパク質もしくはそのフラグメントペプチド、または、クリスタリンまたはそのフラグメントペプチドである、請求項１７記載の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加水分解活性を示す新規ペプチドおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学的手法によるタンパク質の分解には、一般的に、加水分解反応を触媒する酵素タンパク質が使用されている。しかしながら、酵素タンパク質は、例えば、水、温度、酸性等の条件によって安定性に影響を受けやすく、変性し易いことが知られている。このため、酵素タンパク質のような反応を触媒する新たな分子の提供が望まれている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、本発明は、加水分解反応を触媒する、酵素タンパク質とは異なる新たな分子の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の触媒性ペプチドは、加水分解反応を触媒するペプチドであり、下記（Ａ１）〜（Ｃ４）からなる群から選択された少なくとも一つのペプチドからなることを特徴とする。
（Ａ１）Ｔｏｂ/ＢＴＧタンパク質における、ＢｏｘＡと、その上流領域および下流領域の少なくとも一方の領域とからなるペプチド
（Ａ２）前記（Ａ１）の部分領域からなるペプチド
（Ａ３）前記（Ａ１）または前記（Ａ２）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド
（Ａ４）前記（Ａ１）または前記（Ａ２）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド
（Ｂ１）Ｔｏｂ/ＢＴＧタンパク質における、ＢｏｘＢからなるペプチド
（Ｂ２）前記（Ｂ１）の部分領域からなるペプチド
（Ｂ３）前記（Ｂ１）または前記（Ｂ２）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド
（Ｂ４）前記（Ｂ１）または前記（Ｂ２）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド
（Ｃ１）Ｔｏｂ/ＢＴＧタンパク質における、Ｃ末端領域または中間領域からなるペプチド
（Ｃ２）前記（Ｃ１）の部分領域からなるペプチド
（Ｃ３）前記（Ｃ１）または前記（Ｃ２）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド
（Ｃ４）前記（Ｃ１）または前記（Ｃ２）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチド【０００５】
本発明の触媒性ペプチド試薬は、触媒性分子を含み、前記触媒性分子が、前記本発明の触媒性ペプチドであることを特徴とする。【０００６】
本発明の分解方法は、タンパク質またはペプチドの分解方法であって、基質を、前記本発明の触媒性ペプチドで処理する工程を含み、前記基質が、タンパク質またはペプチドであることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の触媒性ペプチドによれば、加水分解反応を触媒できる。本発明の触媒性ペプチドは、酵素タンパク質とは異なり、分子量の小さなペプチドであることから、前記タンパク質とは異なる新たな触媒分子として、加水分解反応に適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、触媒性ペプチドの加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図２】図２は、触媒性ペプチドの加水分解活性を示すクロマトグラムと、分解で得られたフラグメント配列である。
【図３】図３は、触媒性ペプチドの加水分解活性に対するｐＨの影響を示すクロマトグラムである。
【図４】図４は、触媒性ペプチドのＳＯＤ１に対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図５】図５は、触媒性ペプチドによる分解で得られたフラグメントの配列を示す。
【図６】図６は、触媒性ペプチドの加水分解活性に対する緩衝液の影響を示すクロマトグラムである。
【図７】図７は、触媒性ペプチドの加水分解活性に対する緩衝液濃度の影響を示すクロマトグラムである。
【図８】図８は、触媒性ペプチドの至適ｐＨを示すクロマトグラムである。
【図９】図９は、触媒性ペプチドの加水分解活性に対する金属の影響を確認したクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、触媒性ペプチドの加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図１１】図１１は、触媒性ペプチドの加水分解活性を示すクロマトグラムと、分解で得られたフラグメント配列である。
【図１２】図１２は、触媒性ペプチドの加水分解活性に対する緩衝液の影響を確認したクロマトグラムである。
【図１３】図１３は、触媒性ペプチドによる分解で得られたフラグメントを示す。
【図１４】図１４は、触媒性ペプチドによる分解で得られたフラグメントを示す。
【図１５】図１５は、各種触媒性ペプチドの加水分解活性の有無を示す表である。
【図１６】図１６は、プロテアーゼ阻害剤による、触媒性ペプチドの自己消化の阻害を示すクロマトグラムである。
【図１７】図１７は、触媒性ペプチドの加水分解活性に対する有機溶媒の影響を確認したクロマトグラムである。
【図１８】図１８は、触媒性ペプチドの加水分解活性に対するアルブミンの影響を確認したクロマトグラムである。
【図１９】図１９は、プロテアーゼ阻害剤による、触媒性ペプチドの自己消化の阻害を示すクロマトグラムである。
【図２０】図２０は、触媒性ペプチドの至適濃度を示すグラフである。
【図２１】図２１は、触媒性ペプチドの加水分解活性を示すクロマトグラムと、分解で得られたフラグメントのアミノ酸配列である。
【図２２】図２２は、各種プロテアーゼ阻害剤による、触媒性ペプチドの自己消化の阻害を示すクロマトグラムである。
【図２３】図２３は、触媒性ペプチドの加水分解活性を示すグラフである。
【図２４】図２４は、触媒性ペプチドの固体Aβ1-42に対する加水分解活性を示すクロマトグラムと、分解で得られたフラグメントである。
【図２５】図２５は、触媒性ペプチドの可溶性Aβ1-42に対する加水分解活性を示すクロマトグラムと、切断箇所である。
【図２６】図２６は、触媒性ペプチドの自己消化を示すクロマトグラムと、分解で得られたフラグメントのアミノ酸配列である。
【図２７】図２７は、触媒性ペプチドの自己消化を示すクロマトグラムと、分解で得られたフラグメントのアミノ酸配列である。
【図２８】図２８は、触媒性ペプチドのAβ11-29に対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図２９】図２９は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図３０】図３０は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図３１】図３１は、基質濃度と反応速度との関係を示すグラフである。
【図３２】図３２は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図３３】図３３は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図３４】図３４は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図３５】図３５は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図３６】図３６は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図３７】図３７は、触媒性ペプチドの自己消化を示すクロマトグラムである。
【図３８】図３８は、プロテアーゼ阻害剤による、触媒性ペプチドの自己消化の阻害を示すクロマトグラムである。
【図３９】図３９は、触媒性ペプチドによるAβの切断点を示す図である。
【図４０】図４０は、触媒性ペプチドのAβに対する分子間相互作用を示すグラフである。
【図４１】図４１は、触媒性ペプチドのＮＭＲの結果である。
【図４２】図４２は、触媒性ペプチドの推定構造を示す概略図である。
【図４３】図４３は、触媒性ペプチドのＴａｕに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図４４】図４４は、触媒性ペプチドのＴａｕに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図４５】図４５は、触媒性ペプチドのＴａｕに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図４６】図４６は、触媒性ペプチドによるＴａｕの切断点を示す図である。
【図４７】図４７は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図４８】図４８は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図４９】図４９は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図５０】図５０は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図５１】図５１は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図５２】図５２は、反応液組成を示す。
【図５３】図５３は、触媒性ペプチドの自己消化を示すクロマトグラムである。
【図５４】図５４は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図５５】図５５は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図５６】図５６は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図５７】図５７は、プロテアーゼ阻害剤による、触媒性ペプチドの自己消化の阻害を示すクロマトグラムである。
【図５８】図５８は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図５９】図５９は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図６０】図６０は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図６１】図６１は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図６２】図６２は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図６３】図６３は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図６４】図６４は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図６５】図６５は、触媒性ペプチドのクリスタリンに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図６６】図６６は、触媒性ペプチドのクリスタリンに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図６７】図６７は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図６８】図６８は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図６９】図６９は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図７０】図７０は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【図７１】図６７は、触媒性ペプチドの自己消化を示すクロマトグラムである。
【図７２】図７２は、触媒性ペプチドのAβに対する加水分解活性を示すクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜触媒性ペプチド＞
本発明の触媒性ペプチドは、前述のように、前記（Ａ１）〜（Ｃ４）からなる群から選択された少なくとも一つのペプチドからなることを特徴とする、加水分解反応を触媒するペプチドである。
【００１０】
本発明者らは鋭意研究の結果、Ｔｏｂ/ＢＴＧタンパク質における機能不明な領域のペプチ
ドが、加水分解反応を触媒する加水分解活性を有することを見出した。本発明の触媒性ペプチドは、短鎖の小さな分子であり、例えば、酵素タンパク質よりも、水、温度、酸等に対する安定性が高く、変性が起こり難い。このため本発明の触媒性ペプチドは、例えば、酵素タンパク質よりも扱いやすく、酵素タンパク質に代わって、様々な用途に応用することが可能である。
【００１１】
本発明の触媒性ペプチドの長さは、アミノ酸残基数の下限が、例えば、５、７、９であり、その上限が、例えば、２２、１８、１７であり、その範囲が、例えば、５〜２２、５〜１８、５〜１７である。
【００１２】
本発明の触媒性ペプチドとして、まず、前記（Ａ１）〜（Ａ４）のペプチドについて説明する。
【００１３】
前記（Ａ１）のペプチドは、Ｔｏｂ/ＢＴＧタンパク質における、ＢｏｘＡと、その上流領域および下流領域の少なくとも一方の領域とからなるペプチドである。前記（Ａ１）ペプチドは、例えば、ＢｏｘＡとその上流領域とからなるペプチドでもよいし、ＢｏｘＡとその下流領域とからなるペプチドでもよいし、前記上流領域とＢｏｘＡと前記下流領域とからなるペプチドでもよい。
【００１４】
前記（Ａ１）ペプチドにおいて、ＢｏｘＡのアミノ酸配列は、特に制限されず、例えば、配列番号１のアミノ酸配列があげられる。配列番号１において、例えば、Xaa1が、Y,FまたはH、Xaa2が、PまたはS、Xaa3が、EまたはD、Xaa4が、KまたはC、Xaa5が、Y,L,CまたはS、Xaa6が、SまたはQ、Xaa7が、GまたはA、Xaa8が、FまたはY、Xaa9が、VまたはI、Xaa10が、HまたはR、Xaa11が、IまたはVである。
BoxA：  配列番号１
HW[Xaa1][Xaa2][Xaa3][Xaa4]P[Xaa5]KG[Xaa6][Xaa7][Xaa8]RC[Xaa9][Xaa10][Xaa11]
【００１５】
前記配列番号１のＢｏｘＡとしては、具体例として、以下の配列があげられる。
【表１】
2017119511.tif 000003
【００１６】
前記（Ａ１）ペプチドにおいて、前記上流領域の長さは、アミノ酸残基数の下限が、例えば、１、２であり、その上限が、例えば、１０、８、６、４であり、その範囲が、例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４である。また、前記（Ａ１）ペプチドにおいて、前記下流領域の長さは、アミノ酸残基数の下限が、例えば、１、２であり、その上限が、例えば、１０、８、６、４であり、その範囲が、例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４である。
【００１７】
前記（Ａ１）ペプチドの長さは、アミノ酸残基数の下限が、例えば、１８、２０であり、その上限が、例えば、３０、２６、２２であり、その範囲が、例えば、１８〜３０、１８〜２６、１８〜２２である。
【００１８】
前記（Ａ１）ペプチドの具体例としては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドJALがあげられる。前記JALの配列において、下線部が、配列番号３のＢｏｘＡに該当する。なお、配列番号２において、下線部の配列は、例えば、配列番号４４〜４８のいずれかの配列に置換されてもよい。
JAL（Tob1）：配列番号２    KYEGHWYPEKPYKGSGFRCIHI
【００１９】
前記（Ａ２）のペプチドは、前記（Ａ１）の部分領域からなるペプチドである。前記（Ａ２）ペプチドの長さは、アミノ酸残基数の下限が、例えば、５、７、９であり、その上限が、例えば、１８、１７、１６であり、その範囲が、例えば、５〜１８、５〜１７、５〜１６である。
【００２０】
前記（Ａ２）ペプチドの具体例としては、例えば、配列番号１のペプチドからなるBoxAがあげられる。
【００２１】
また、前記（Ａ２）ペプチドの具体例としては、例えば、配列番号３〜１４からなる群から選択された少なくとも一つのアミノ酸配列からなるペプチドがあげられる。配列番号３は、BoxAであり、配列番号４および１０〜１４は、それぞれ、前記（Ａ１）ペプチドである配列番号２のJAL（Tob1）の部分領域からなるペプチドであり、中でも、配列番号４および１１〜１４は、配列番号３のBoxA（TOB1）の部分領域からなるペプチドである。また、配列番号５〜９は、それぞれ、配列番号１および３のBoxAの部分領域からなるペプチドである。
【００２２】
【表２】
2017119511.tif 000004
【００２３】
前記（Ａ３）のペプチドは、前記（Ａ１）または前記（Ａ２）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチドである。前記（Ａ３）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜５個、１〜３個、１個または２個である。
【００２４】
前記（Ａ３）のペプチドは、具体例として、例えば、配列番号１５〜２６ならびに配列番号５０および５３のアミノ酸配列からなるペプチドがあげられる。
【表３】
2017119511.tif 000005
【００２５】
前記（Ａ３）のペプチドは、具体例として、例えば、配列番号２７〜３１のアミノ酸配列からなるペプチドがあげられる。配列番号２７において、Xaaは、W、L、V、NまたはDであり、配列番号２８において、Xaaは、K、V、T、YまたはMであり、配列番号２９において、Xaaは、T、E、P、WまたはKであり、配列番号３０において、Xaaは、H、V、W、Y、R、L、P、M、E、A、D、Q、N、KまたはGであり、配列番号３１において、Xaaは、T、Q、V、KまたはEである。
【表４】
2017119511.tif 000006
【００２６】
前記（Ａ４）のペプチドは、前記（Ａ１）または前記（Ａ２）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチドである。前記同一性は、例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。同一性は、例えば、比較する配列同士を適切にアライメントしたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。同一性は、例えば、配列におけるギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される。前記アライメントは、例えば、任意のアルゴリズムの利用により行うことができ、具体的に、ＢＬＡＳＴ（Basic  local  alignment  search  tool)、ＢＬＡＳＴ−２、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｓａｌｉｎ等の相同性検索ソフトウエアが使用できる。同一性の算出は、例えば、前述のような公知の相同性検索プログラムを用いて算出でき、具体例は、例えば、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）において、デフォルトのパラメーターを用いることによって算出できる。同一性については、以下、同様である。
【００２７】
本発明の触媒性ペプチドとして、つぎに、前記（Ｂ１）〜（Ｂ４）のペプチドについて説明する。
【００２８】
前記（Ｂ１）のペプチドは、Ｔｏｂ/ＢＴＧタンパク質における、ＢｏｘＢからなるペプチドである。
【００２９】
前記（Ｂ１）ペプチドにおいて、ＢｏｘＢのアミノ酸配列は、特に制限されず、例えば、配列番号３２のアミノ酸配列があげられる。配列番号３２において、例えば、Xaa1が、VまたはL、Xaa2が、Q、E、SまたはK、Xaa3が、DまたはE、Xaa4が、LまたはM、Xaa5が、SまたはT、Xaa6が、V、LまたはI、Xaa7が、VまたはI、Xaa8が、F、YまたはC、Xaa9が、EまたはR、Xaa10が、SまたはC、Xaa11が、YまたはC、Xaa12が、QまたはR、Xaa13が、IまたはYである。
BoxB：  配列番号３２
[Xaa1]P[Xaa2][Xaa3][Xaa4][Xaa5][Xaa6]W[Xaa7]DP[Xaa8][Xaa9]V[Xaa10][Xaa11][Xaa12][Xaa13]GE
【００３０】
前記（Ｂ１）の配列番号３２のＢｏｘＢは、具体例として、例えば、配列番号３３〜３５のアミノ酸配列からなるペプチドがあげられる。
【表５】
2017119511.tif 000007
【００３１】
前記（Ｂ２）のペプチドは、前記（Ｂ１）の部分領域からなるペプチドである。前記（Ｂ２）ペプチドの長さは、アミノ酸残基数の下限が、例えば、５、７、９であり、その上限が、例えば、１９、１８、１７であり、その範囲が、例えば、５〜１９、５〜１８、５〜１７である。
【００３２】
前記（Ｂ２）のペプチドは、具体例として、例えば、配列番号３６〜３８のアミノ酸配列からなるペプチドがあげられる。
【表６】
2017119511.tif 000008
【００３３】
前記（Ｂ３）のペプチドは、前記（Ｂ１）または前記（Ｂ２）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチドである。前記（Ｂ３）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜５個、１〜３個、１個または２個である。
【００３４】
前記（Ｂ４）のペプチドは、前記（Ｂ１）または前記（Ｂ２）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチドである。前記同一性は、例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【００３５】
本発明の触媒性ペプチドとして、つぎに、前記（Ｃ１）〜（Ｃ４）のペプチドについて説明する。
【００３６】
前記（Ｃ１）のペプチドは、Ｔｏｂ/ＢＴＧタンパク質における、Ｃ末端領域または中間領域からなるペプチドである。
【００３７】
前記（Ｃ１）のペプチドは、具体例として、例えば、配列番号３９〜４１のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドがあげられる。
【表７】
2017119511.tif 000009
【００３８】
前記（Ｃ２）のペプチドは、前記（Ｃ１）の部分領域からなるペプチドである。前記（Ｃ２）ペプチドの長さは、アミノ酸残基数の下限が、例えば、５、７、９であり、その上限が、例えば、２３、１５、１３であり、その範囲が、例えば、５〜２３、５〜１５、５〜１３である。
【００３９】
前記（Ｃ３）のペプチドは、前記（Ｃ１）または前記（Ｃ２）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチドである。前記（Ｃ３）において、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸残基の個数は、特に制限されず、例えば、１〜５個、１〜３個、１個または２個である。
【００４０】
前記（Ｃ３）のペプチドは、具体例として、例えば、配列番号４２または４３のアミノ酸配列からなるペプチドがあげられる。
【表８】
2017119511.tif 000010
【００４１】
前記（Ｃ４）のペプチドは、前記（Ｃ１）または前記（Ｃ２）のアミノ酸配列に対して、８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、加水分解活性を有するペプチドである。前記同一性は、例えば、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【００４２】
本発明の触媒性ペプチドによれば、例えば、基質としてタンパク質またはペプチドを加水分解できる。前記基質は、特に制限されず、例えば、アミロイドベータ（Ａβ）タンパク質またはそのフラグメントペプチド、プリオンタンパク質またはそのフラグメントペプチド、ｈＭＭＰ７（ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ７）またはそのフラグメントペプチド、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）またはそのフラグメントペプチド、Ｔａｕ  ＭＢＤ等のＴａｕタンパク質またはそのフラグメントペプチド、αＡ−クリスタリン等のクリスタリンまたはそのフラグメントペプチド等があげられる。
【００４３】
本発明の触媒性ペプチドは、例えば、凝集性タンパク質またはそのフラグメントペプチドの加水分解にも利用できる。アミロイドベータタンパク質、プリオンタンパク質やＳＯＤ１は、凝集することによって、それぞれ、アルツハイマー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）や筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の原因になっていることが報告されている。しかし、これらの凝集タンパク質を分解できるタンパク質酵素は、報告されていない。一方、本発明の触媒性ペプチドによれば、例えば、凝集したアミロイドベータタンパク質やプリオンタンパク質、さらにＳＯＤ１等を分解することもできる。このため、本発明の触媒性ペプチドは、例えば、凝集性タンパク質が原因となるアルツハイマーやクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、さらに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経疾患の治療薬としても有用であるといえる。
【００４４】
本発明の触媒性ペプチドは、例えば、さらに自己消化の特性を有してもよい。この場合、前述のような治療薬（医薬）として生体に投与した場合、例えば、触媒機能を発揮しつつ、徐々に分解されるため、安全性に優れる。
【００４５】
＜触媒性ペプチド試薬＞
本発明の触媒性ペプチド試薬は、前述のように、触媒性分子を含み、前記触媒性分子が前記本発明の触媒性ペプチドであることを特徴とする。本発明は、触媒性分子として、前記本発明の触媒性ペプチドを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。
【００４６】
本発明の触媒性ペプチド試薬は、例えば、さらに、前記触媒性ペプチドとは異なる分子を含み、前記分子が、前記触媒性ペプチドに連結されてもよい。前記分子は、例えば、分解目的のターゲットに対する結合分子である。前記結合物質は、例えば、タンパク質またはペプチドであり、具体例として、リガンド等があげられる。本発明の触媒性ペプチド試薬において、例えば、前記ターゲットに結合する結合分子を前記触媒性ペプチドに連結させておくことが好ましい。このような形態によれば、例えば、本発明の触媒性ペプチド試薬が前記結合分子により前記ターゲットに結合し、前記触媒性ペプチド試薬における前記触媒性ペプチドによって、前記ターゲットを分解できる。
【００４７】
＜分解方法＞
本発明の分解方法は、前述のように、基質を、前記本発明の触媒性ペプチドで処理する工程を含み、前記基質が、タンパク質またはペプチドであることを特徴とする、タンパク質またはペプチドの分解方法である。本発明は、前記触媒性ペプチドを使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は何ら制限されない。前記基質としては、例えば、前述のようなターゲットがあげられる。
【００４８】
前記処理工程における条件は、特に制限されず、反応温度は、例えば、室温〜３７℃、反応ｐＨは、例えば、６．５〜８である。また、前記処理工程において、例えば、アルブミンを共存させてもよい。前記基質は、特に制限されず、前述の記載が援用できる。
【実施例】
【００４９】
［実施例１］
（１）加水分解活性の確認
合成ペプチドＪＡＬが、ｈＭＭＰ７（ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ７）のプロドメイン由来合成ペプチドに対して加水分解活性を有することを確認した。【００５０】
加水分解ペプチドとして下記ＪＡＬを使用し、基質として、ｈＭＭＰ７  ４２−５０またはｈＭＭＰ７  ２６−５０を使用した。
JAL（Tob1）：  KYEGHWYPEKPYKGSGFRCIHI
hMMP7  42-50：  FYLYDSETK
hMMP7  26-50：  GMSELQWEQAQDYLKRFYLYDSETK【００５１】
まず、緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．５、終濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌ）に、ＪＡＬ（終濃度０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）およびｈＭＭＰ７のフラグメントペプチド（終濃度０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ）を入れ、この反応液を、３７℃で１４日間または１６日間インキュベートした。その後、前記反応液について、ＨＰＬＣにより、ＪＡＬおよびｈＭＭＰ７のフラグメントペプチドのピークを確認した。ＨＰＬＣは、以下の条件により行った。
カラム：SHISEIDO  CAPCELL  PAK  C18  MGII（4.6mm  ID．×150mm）
温度：40℃
波長：220nm
濃度勾配：0.1%  TFA含有0−70%  CH3CN、15分
検出器：Photodiode-array【００５２】
そして、ＨＰＬＣにおいて、２０μＬずつピークを分取し、マススペクトロメトリー（ABI  QSTAR  Elite  system社）（以下、ＭＳ）により、フラグメントの同定を行った。ＭＳは、フローインジェクション法を用い、以下の条件により行った。
MS：positive  ion  mode
Ion  spray電圧：3500  -  5500Ｖ
Ion  source温度：140  -  400℃
溶媒：0.1%  HCOOH含有70%  CH3CN【００５３】
なお、以下の実験において、特に述べない限り、同様の条件により、加水分解活性の測定を行った。【００５４】
この結果を、図１および図２に示す。図１は、反応開始後０日および１４日後のＨＰＬＣの結果である。図１に示すように、ｈＭＭＰ７  ４２−５０およびｈＭＭＰ７  ２６−５０のピークが減少していることから、ＪＡＬが、ｈＭＭＰ７  ４２−５０およびｈＭＭＰ７  ２６−５０に対して活性があることが明らかとなった。また、ＪＡＬ自身のピークが低くなっていることから、自己消化を起こしていると考えられる。図２は、反応開始から１６日後のＭＳによるフラグメント同定の結果であり、分解で得られたフラグメント配列を示す。図２に示すように、前記基質は、複数の部位で切断されていた。【００５５】
（２）至適pHの検討
加水分解ペプチドとしてＪＡＬを使用し、基質としてｈＭＭＰ７  １−４２を使用して、活性の至適ｐＨを検討した。反応液のｐＨを、ｐＨ３．５−８．０の範囲で、０．５刻みのｐＨとなるように調整し、反応液を５日間インキュベートした以外は、前記（１）と同様にして測定を行った。ｐＨの調整は、ｐＨ３．５−６．０の範囲では酢酸緩衝液を使用し、ｐＨ６．５−８．０の範囲ではＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用し、いずれも終濃度１５０ｍｍｏｌ／Ｌとした。この結果、ｐＨ３．５−６．０において活性があった（図３）。また、ｐＨ６．５−８．０では、反応開始後０日目の結果との間に差はみられなかった。
hMMP7  1-42：MRLTVLCAVCLLPGSLALPLPQEAGGMSELQWEQAQDYLKRF（配列番号４９）【００５６】
［実施例２］
（１）加水分解活性の確認
ＪＡＬが、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）由来のフラグメントペプチドに対して加水分解活性を有することを確認した。【００５７】
加水分解ペプチドとして前記ＪＡＬを使用し、基質として、下記ＳＯＤ１  ２−３８、ＳＯＤ１  １２−３８、ＳＯＤ１  ５３−７０、ＳＯＤ１  １１５−１５４またはＳＯＤ１  ２−１２を使用し、反応液のｐＨは６．５または７．５とし、反応のインキュベート時間は０日、３日間、４日間とした以外は、前記実施例１(１)と同様にして、加水分解活性の測定を行った。
SOD1  2-38：  ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKG
SOD1  12-38：  DGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKG
SOD1  53-70：  DNTAGCTSAGPHFNPLSR
SOD1  115-154：  GRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ
SOD1  2-12：  ATKAVCVLKGD【００５８】
この結果を、図４および図５に示す。図４は、反応開始後０日および３日後もしくは４日後のＨＰＬＣの結果である。図４に示すように、ＳＯＤ１  ２−３８、ＳＯＤ１  １２−３８、ＳＯＤ１  ５３−７０、ＳＯＤ１  ２−１２に対して、ＪＡＬの活性が確認された。特に、ＳＯＤ１  ５３−７０、ＳＯＤ１  ２−３８に対して活性が強かった。一方、ＳＯＤ１  １１５−１５４に対しては活性がみられなかった。図５は、ＭＳによるフラグメント同定の結果である。図５に示すように、ＪＡＬにより、ＳＯＤ１  ２−３８、およびＳＯＤ１  ２−１２において、矢印に示す複数の部位が切断されていた。また、ＳＯＤ１  ２−３８由来フラグメントペプチド断片において、Ｃｙｓ残基同士によるＳ−Ｓ結合もみられた。【００５９】
（２）緩衝液（反応液）の検討
加水分解ペプチドとしてＪＡＬを使用し、基質としてＳＯＤ１  ２−３８を使用して、反応液に使用する緩衝液を検討した。緩衝液として、Ｔｒｉｓ緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．５、終濃度１００ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ａｓｓａｙ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｃａ２＋、５μｍｏｌ／Ｌ  Ｚｎ２＋、０．０６％  Ｂｒｉｊｉ３５、および０．０２％  ＮａＮ３）を使用し、インキュベート時間は０日、１日間、３日間とした以外は、前記（１）と同様にして測定を行った。また、コントロールとして、前記緩衝液に代えて、生理食塩水（０．９ｗ／ｖ％）を使用した。この結果、Ａｓｓａｙ緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液と比較してＪＡＬによる切断が早くみられた（図６）。また、生理食塩水では活性はみられなかった。よって、緩衝液を使用することが、ＪＡＬの加水分解活性に必要であると考えられる。また、生理食塩水は、例えば、使用時までのＪＡＬの保存に適していると考えられる。【００６０】
（３）濃度の検討
続いて、Ｔｒｉｓ緩衝液の濃度を変えて、インキュベート時間は０日、１日間、４日間とした以外は、前記（２）と同様にして測定を行った。この結果、ＭｉｌｌｉＱ水のみ（０ｍｍｏｌ／Ｌ）では活性はなく、Ｔｒｉｓ緩衝液では濃度に依存せずに活性がみられた（図７）。【００６１】
（４）至適ｐＨの検討
次に、加水分解ペプチドとしてＪＡＬを使用し、基質としてＳＯＤ１  ２−３８を使用して、活性の至適ｐＨを検討した。反応液のｐＨを、ｐＨ６．５−８．０の範囲で、０．５刻みのｐＨとなるように調整し、インキュベート時間は０日、１日間とした以外は、前記（１）と同様にして測定を行った。この結果、いずれのｐＨでも活性がみられ、各ｐＨ間の差はみられなかった（図８）。このことから、体内で使用した際における局所でのｐＨ変動による影響はないと考えられる。【００６２】
（５）金属要求性の検討
さらに、加水分解ペプチドとしてＪＡＬを使用し、基質としてＳＯＤ１  ２−３８を使用して、活性の金属要求性を検討した。反応液に添加する金属イオンは、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、これらの組合せとした。各反応液において、金属イオンの濃度は、Ｃａ２＋は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ、その他の金属イオンは、５μｍｏｌ／Ｌとした。そして、反応液中に金属イオンを添加・未添加とし、インキュベート時間は０日、１日間とした以外は、前記（１）と同様にして各反応液について測定を行った。この結果、金属の有無にかかわらず活性があり、金属イオン（Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃａ２＋）の有無による差はみられなかった（図９）。【００６３】
［実施例３］
ＪＡＬの変異体が、加水分解活性を有することを確認した。【００６４】
（１）ＳＯＤ１  ２−３８およびＳＯＤ１  ２−１２に対する活性
加水分解ペプチドとしてＪＡＬの変異体である下記ＪＡＬ７−２２、ＪＡＬ１４−２２、ＪＡＬ１−２２  Ｃ１９Ｍ、またはＪＡＬ７−２２  Ｃ１９Ｍを使用し、基質として前記ＳＯＤ１  ２−３８  およびＳＯＤ１  ２−１２  を使用した以外は、前記実施例１（１）と同様にして、加水分解活性の測定を行った。ＪＡＬ１−２２  Ｃ１９ＭおよびＪＡＬ７−２２  Ｃ１９Ｍは、ＪＡＬに含まれるＣｙｓ残基が、反応中にＳ−Ｓ結合を形成し、フラグメント解析を困難にすることから、ＪＡＬ１−２２およびＪＡＬ７−２２のＣｙｓ残基をＭｅｔに置換したものである。この結果、ＪＡＬ７−２２、ＪＡＬ１−２２  Ｃ１９Ｍ、およびＪＡＬ７−２２  Ｃ１９Ｍにおいて、活性がみられた（図１０）。
JAL7-22：  YPEKPYKGSGFRCIHI
JAL14-22：  GSGFRCIHI
JAL1-22  C19M：  KYEGHWYPEKPYKGSGFRMIHI
JAL7-22  C19M：  YPEKPYKGSGFRMIHI【００６５】
（２）Ａβ１−２０に対する活性
加水分解ペプチドとしてＪＡＬを使用し、基質として下記Ａβ１−２０を使用した以外は、前記（１）と同様にして活性の測定を行った。この結果、ＪＡＬは、Ａβ１−２０に対して活性を有していた（図１１）。
Aβ1-20：配列  DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF【００６６】
（３）緩衝液（反応液）の検討
加水分解ペプチドとしてＪＡＬを使用し、基質としてＡβ１−２０を使用して、緩衝液の検討を行った。緩衝液としてＰＢＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液を使用し、インキュベート時間は０日、３日間、５日間とした以外は、前記（２）と同様にして測定を行った。この結果、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）およびＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．５）では活性がみられた（図１２）。一方、リン酸緩衝液では活性がみられなかった。このことから、ＰＢＳおよびＴｒｉｓ緩衝液を緩衝液として使用することで、ＪＡＬの活性が十分に得られることが示された。以降の実験では、体内投与に適していることから、ＰＢＳを用いて測定を行った。【００６７】
（４）Ｔｏｂ／ＢＴＧの活性の検討
加水分解ペプチドとしてＪＡＬ（Ｔｏｂ１）  ７−２２ＣＭ、ＪＡＬ（Ｔｏｂ１）７−２２、Ｔｏｂ２  ７−２２、ＢＴＧ１  ７−２２、ＢＴＧ２  ７−２２、ＢＴＧ３  ７−２２またはＢＴＧ４  ７−２２を使用し、基質としてＡβ１−２０またはＡβ１１−２９を使用した以外は、前記（１）と同様にして、活性の測定を行った。また、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、和光純薬社製、終濃度０．０２５％）を添加し、活性の変化を測定した。
JAL(Tob1)  7-22CM：  YPEKPYKGSGFRMIHI
Tob2  7-22：  YPEKPLKGSGFRCVHI
BTG1  7-22：  FPEKPCKGSGYRCIRI
BTG2  7-22：  FPEKPSKGSGYRCIRI
BTG3  7-22：  YPEKPSKGQAYRCIRV
BTG4  7-22：  HSDCPSKGQAFRCIRI【００６８】
この結果を図１３に示す。図１３において、１−１９、１−１８等は、分解で得られたフラグメントの領域を示す。各変異体において、Ａβ１−２０およびＡβ１１−２９に対する活性がみられた。また、クロマトグラムの比較の結果、ＨＳＡを添加することにより、活性が増強された。【００６９】
（５）ＰｒＰ（ヒトプリオンタンパク質）由来フラグメントペプチドに対する活性
次に、基質として、下記ＰｒＰ  １７５−１８９を使用して、各ペプチドの活性の測定を行った。また、加水分解ペプチドとしてＴｏｂ２  ７−２２またはＢＴＧ３  ７−２２を使用した測定において、ＨＳＡにさらにＣｕ２＋を加えることによる活性の変化を測定した。加水分解活性の測定は、前記（１）と同様にして行った。これらの結果、Ｔｏｂ２、ＢＴＧ１、ＢＴＧ３、ＢＴＧ４は、ＰｒＰ  １７５−１８９に対する活性がみられた。また、Ｔｏｂ２  ７−２２およびＢＴＧ３  ７−２２は、Ｃｕ２＋を入れても、活性を有していた（図１４）。Ｃｕ２＋を加えた反応系においては、ＰｒＰ  １７５−１８９由来のフラグメント断片のペプチドによるS-S結合も見られた。
PrP  175-189：  FVHDCVNITIKQHTV【００７０】
（６）Aβペプチドに対する活性
次に、加水分解ペプチドとして、各種のＪＡＬの変異体を使用し、基質として、Ａβ１−２０または下記Ａβ１１−２９を使用した以外、前記（１）と同様にして、活性の測定を行った（図１５）。この結果、ＪＡＬ（Ｔｏｂ１）  ７−２２  Ｃ１９Ｍ、ＪＡＬ（Ｔｏｂ１）  １２−１８、ＪＡＬ（Ｔｏｂ１）  １２−１８  Ｓ１５Ａ、ＪＡＬ（Ｔｏｂ１）  １４−１８は、Ａβ１−２０に対して活性を有していた。そして、ＪＡＬ（Ｔｏｂ１）  ７−２２  Ｙ７Ａ  Ｃ１９Ｍ  Ｉ２２Ａ、ＪＡＬ（Ｔｏｂ１）９−２０  Ｃ１９Ｍ、ＪＡＬ（Ｔｏｂ１）１２−２２  Ｃ１９Ｍ  Ｉ２２Ａ、ＪＡＬ（Ｔｏｂ１）１２−２０  Ｃ１９Ｍ、ＪＡＬ（Ｔｏｂ１）１２−２０  Ｙ１２Ａ  Ｃ１９Ｍは、Ａβ１１−２９に対して活性を有していた。
Aβ11-29：  EVHHQKLVFFAEDVGSNKG【００７１】
（７）阻害剤による自己消化への影響
次に、加水分解ペプチドとして各種のＪＡＬの変異体を使用し、自己消化のメカニズムを検討した。各種のＪＡＬの変異体の反応液に、プロテアーゼ阻害剤（商品名Ｒｏｃｈｅ  ｃＯｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ社製）を加えて、反応した。前記プロテアーゼ阻害剤は、１錠を１ｍＬ  ＭｉｌｌｉＱ水に溶かした後、５０μＬを添加した。加水分解活性の測定は、前記（１）と同様にして行った。この結果、測定した全てのペプチドにおいて、自己消化への阻害がかかった（図１６）。【００７２】
［実施例４］
ＪＡＬの加水分解活性について、反応条件を検討した。【００７３】
（１）有機溶媒の影響
加水分解ペプチドとしてＪＡＬ１−２２  Ｃ１９Ｍを使用し、基質としてＡβ１−１９を使用して、有機溶媒の影響を検討した。反応液中に、それぞれの終濃度が１０％となるように、ＤＭＳＯ、ＣＨ３ＯＨ、またはＣＨ３ＣＮを加え、インキュベート時間は０日、３日間、５日間とした以外は、前記実施例１（１）と同様にして、活性の測定を行った。この結果、反応液中にＤＭＳＯを加えても、ＪＡＬ１−２２  Ｃ１９Ｍの活性がみられた（図１７）。一方、ＣＨ３ＯＨおよびＣＨ３ＣＮを加えると活性がみられなかった。このことから、難溶解性のペプチドは、ＤＭＳＯで溶解させて使用することにより、ＪＡＬの分解活性への影響を与えることなく使用可能であることが示された。以下の実験において、難溶解性のペプチドは、ＤＭＳＯで溶解させて使用した。【００７４】
（２）アルブミンの影響
加水分解ペプチドとしてＪＡＬ７−２２  Ｃ１９Ｍを使用し、基質としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、和光純薬社製、終濃度０．０２５％）またはＨＳＡ（和光純薬、終濃度０．０２５％）を使用した以外、前記（１）と同様にして、活性の測定を行った。この結果、ＨＳＡ、ＢＳＡともに、ＪＡＬによる切断はみられなかった（図１８）。一方、ＨＳＡ、ＢＳＡともに、これらを反応液中に加えることにより、ＪＡＬ  ７−２２  Ｃ１９Ｍの自己消化が増加していた。このことから、ＨＳＡおよびＢＳＡを加えることにより、ＪＡＬ  ７−２２  Ｃ１９Ｍの活性が強まったと考えられる。また、体内には血清アルブミンが存在することから、体内での使用にも適していると考えられる。以降の実験において、ＨＳＡを反応液に入れて、ＪＡＬの加水分解活性を測定した。【００７５】
（３）阻害剤による自己消化への影響
加水分解ペプチドとしてＪＡＬ７−２２  Ｃ１９Ｍを使用し、自己消化のメカニズムを検討した。ＪＡＬ７−２２  Ｃ１９Ｍの反応液に、ＨＳＡを加え、さらに、プロテアーゼ阻害剤（商品名Ｒｏｃｈｅ  ｃＯｍｐｌｅｔｅ）、Ｅ６４、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、ＡＥＢＳＦ、ＥＤＴＡ（０．４ｍｍｏｌ／Ｌ）、またはＰｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａを加えた以外、前記（１）と同様にして、活性の測定を行った。この結果、Ｒｏｃｈｅ  ｃＯｍｐｌｅｔｅおよびＡＥＢＳＦを加えたサンプルにおいて、自己消化のフラグメントが消失していた（図１９）。【００７６】
（４）至適濃度の検討
加水分解ペプチドとしてＪＡＬ７−２２  Ｃ１９Ｍを使用し、基質としてＡβ１−１９を使用して、加水分解ペプチドの基質に対する至適濃度を検討した。インキュベート時間は０日、３日間、５日間とした以外は、前記（１）と同様にして、活性の測定を行った。この結果を図２０に示す。図２０において、各日数における各バーは、左から、加水分解ペプチドの濃度０、０．０５、０．１、０．２、０．４、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の結果を示す。図２０に示すように、基質（Ａβ１−１９）とペプチドの割合が、１：１（ペプチド終濃度：０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ）の条件下と、１：４（ペプチド終濃度：０．２ｍｍｏｌ／Ｌ）の条件下において、基質が減少し（上図）、消化物（Ａβ１−１８）（下図）が増加していた。このことから、これらの濃度比において、ＪＡＬ７−２２の活性が強いことがわかった。また、ペプチドの濃度が高いと、ＪＡＬ７−２２の活性が落ちていた。
Aβ1-19：  DAEFRHDSGYEVHHQKLVF【００７７】
（５）Ａβの各種フラグメントに対する活性
加水分解ペプチドとしてＪＡＬ１２−２０  Ｃ１９Ｍを使用し、基質としてＡβ１１−２９を使用した以外は、前記（１）と同様にして、活性の測定を行った。この結果、Ａβ１１−２９に対して、強い活性がみられた（図２１）。【００７８】
（６）プロテアーゼの種類の検討
加水分解ペプチドとしてＪＡＬ１２−２０  Ｃ１９Ｍを使用し、基質としてＡβ１１−２９を使用して、自己消化のメカニズムを検討した。ＪＡＬ１２−２０  Ｃ１９Ｍの反応液に、プロテアーゼ阻害剤（商品名Ｒｏｃｈｅ  ｃＯｍｐｌｅｔｅまたはＡＥＢＳＦ）を加え、インキュベート時間を０日、１日間として反応させた以外、前記（１）と同様にして活性の測定を行った。この結果、セリンプロテアーゼインヒビターであるＡＥＢＳＦにより、自己消化への阻害がかかった（図２２）。このことから、ＪＡＬは、セリンプロテアーゼ様ペプチドである可能性が考えられる。【００７９】
［実施例５］
ＪＡＬの変異体が、Ａβに対して加水分解活性を有することを確認した。【００８０】
（１）Ａβに対する活性の検討
ＪＡＬ１４−１８(配列：GSGFR)において、JALと同様の活性が確認できたことから（実施例３（６））、ＪＡＬ１４−１８とその変異体を合成し、加水分解ペプチドとして使用して、活性の測定を行った。基質としてＡβ１−２０（上図）またはＡβ１１−２９（下図）を使用した。活性の測定は、前記実施例１（１）と同様にして行った。この結果、GSGFR、GSGVR、GSGYR、DSGFRは、Ａβ１−２０に対して活性が強く、GSGHR、GSGQRは、Ａβ１１−２９に対して活性が強かった（図２３）。これらの結果より、アミノ酸１残基の違いで基質特異性が変化することが判明した。【００８１】
（２）固体（不溶性）Ａβ１−４２に対する活性の検討
加水分解ペプチドとしてＪＡＬ１２−２０  Ｃ１９Ｍを使用し、基質として合成した固体（不溶性）のＡβ  １−４２を使用し、インキュベート時間を０日、７日間とした以外、前記（１）と同様にして活性の測定を行った。この結果、ＪＡＬ１２−２０  Ｃ１９Ｍにより、不溶性固体であるＡβ１−４２の切断がみられた（図２４）。この結果から、生体内において不溶性凝集体として存在するＡβ１−４２についても、分解が可能であると推測される。【００８２】
（３）可溶性Ａβに対する活性の検討
加水分解ペプチドとしてＪＡＬ１２−２０  Ｃ１９Ｍを使用し、基質として、購入したＡβ１−４２（ペプチド研究所製）を使用した以外は、前記（１）と同様にして、活性の測定を行った。この結果、ＪＡＬ１２−２０  Ｃ１９ＭによるＡβ１−４２の切断がみられた（図２５）。【００８３】
［実施例６］
（１）ＢｏｘＢの自己消化
ＢｏｘＢにおいて、自己消化を確認した。加水分解ペプチドとしてＢｏｘＢのＢＴＧ１  ８−２０またはＢｏｘＢのＴｏｂ１  ８−２０を使用し、ＨＳＡを加えて、インキュベート時間は、０日、５日間とした以外は、前記実施例（１）と同様にして活性の測定を行った。この結果、自己消化を示すフラグメントがみられた（図２６）。【００８４】
（２）Ｔｏｂ１の中間領域由来フラグメントペプチドの自己消化
加水分解ペプチドとしてＴｏｂ１  １９８−２２１またはＴｏｂ１  ２２１−２３６を使用し、インキュベート時間は、０日、５日間とした以外は、前記（１）と同様にして活性の測定を行った。この結果、Ｔｏｂ１  ２２１−２３６において自己消化を示すフラグメントがみられた（図２７）。【００８５】
（３）Ａβに対する活性の検討
加水分解ペプチドとしてＴｏｂ１  １９８−２２１、Ｔｏｂ１  ２２１−２３６、ＢｏｘＢのＴｏｂ１  ８−２０またはＢｏｘＢのＢＴＧ１  ８−２０を使用し、基質としてＡβ  １１−２９を使用した以外は、前記（１）と同様にして、活性の測定を行った。この結果、Ｔｏｂ１  ２２１−２３６、ＢｏｘＢのＢＴＧ１  ８−２０において活性がみられた（図２８）。【００８６】
［実施例７］
ＪＡＬの変異体である前記ＪＡＬ１−２２  Ｃ１９Ｍの部分配列ＪＡＬ−ＴＡ９について、各性質の検討および構造解析を行った。
JAL1-22  C19M：  KYEGHWYPEKPYKGSGFRMIHI
JAL-TA9：  PYKGSGFRMI（配列番号５０）【００８７】
基質として、可溶性粉末のＡβ４２（標品、ペプチド研究所製）、その断片ペプチドであるＡβ１−２０、Ａβ１１−２９、可溶性Ａβ２８−４２を使用した。活性の測定は、下記反応液組成１の反応液を使用し、前記反応液を３７℃で所定時間インキュベートした後、前記反応液１０μＬをＨＰＬＣに供した以外は、前記実施例１（１）と同様にして行った。ＭＳ分析の場合は、前記反応液２０μＬをＨＰＬＣに供し、ピークを分取してから、ＭＳ分析を行った。【００８８】
Aβ1-42：  DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
Aβ1-20：  DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF
Aβ11-29：  EVHHQKLVFFAEDVGSNKG
Aβ28-42：  KGAIIGLMVGGVVIA【００８９】
【表９】
2017119511.tif 000011
【００９０】
固体基質として、Ａβ４２の結晶を使用した。活性の測定は、前記反応液組成２の反応液を使用し、前記反応液を３７℃で所定時間インキュベートした後、前記反応液１０μＬをＨＰＬＣに供した以外は、前記実施例１（１）と同様にして行った。ＭＳ分析の場合は、前記反応液１００μＬをＨＰＬＣに供し、ピークを分取してから、ＭＳ分析を行った。【００９１】
（１）Ａβ由来のフラグメント（Ａβ−Ｆ）
（１−１）Ａβ−Ｆに対するＪＡＬ−ＴＡ９の活性
これらの結果を、図２９に示す。図２９は、前記反応液のＨＰＬＣの結果であり、左側が、反応０時間の結果であり、右側が、反応一晩後の結果である。図２９に示すように、ＪＡＬ−ＴＡ９は、いずれのＡβ−Ｆをも分解しており、これらに活性を示すことが明らかとなった。【００９２】
（１-２）Ａβ−Ｆに対する切断点の同定
これらの結果を、図３０に示す。図３０は、所定時間反応後のＭＳによるフラグメント同定の結果であり、分解で得られたフラグメント配列を示す。図３０において、「Ｊ」は、ＪＡＬ−ＴＡ９に由来するフラグメントを示し、「Ａ」は、Ａβ−Ｆに由来するフラグメントを示す。図３０に示すように、いずれのＡβ−Ｆも、複数の部位で切断されていた。特に、Ａβについて、凝集の核であると報告されている中間領域に対して、強い切断活性を示した。【００９３】
（２）Ａβ１−２０およびＡβ１１−２９に対する反応速度
反応液におけるＡβ−Ｆ濃度を、０．０５、０．２、０．４ｍｍｏｌ／Ｌとし、反応時間を０、１時間とし、ＨＰＬＣを行った。そして、Ａβ−Ｆのピークの減少率から、Ｋｍ値を求めた。これらの結果を、図３１に示す。図３１は、基質濃度と反応速度との関係を示すグラフである。この結果、Ａβ１１−２９は、Ａβ１−２０に比べて、ＪＡＬ-ＴＡ９に対する親和性が高いことがわかった。【００９４】
（３）Ａβ４２
（３−１）Ａβ４２に対するＪＡＬ−ＴＡ９の活性
Ａβ４２として、前記標品と前記固体とを使用した。これらの結果を、図３２に示す。図３２は、前記反応液のＨＰＬＣの結果であり、左側が、固体Ａβ４２の結果であり、右側が、標品Ａβ４２の結果である。図３２に示すように、ＪＡＬ−ＴＡ９は、いずれのＡβ４２をも分解しており、これらに活性を示すことが明らかとなった。【００９５】
（３-２）Ａβ４２に対する切断点の同定
これらの結果を、図３３〜３６に示す。図３３および３４は、固体Ａβ４２の結果であり、図３５および３６は、可溶性の標品Ａβ４２の結果である。図３３〜３６において、「Ｊ」は、ＪＡＬ−ＴＡ９に由来するフラグメントを示し、「Ａ」は、Ａβ４２に由来するフラグメントを示す。図３３は、固体Ａβ４２の所定時間反応後のＭＳによるフラグメント同定の結果であり、図３４は、ＭＳによるフラグメントＡ５、Ａ７、Ａ８の同定結果である。図３５は、可溶性の標品Ａβ４２の所定時間反応後のＭＳによるフラグメント同定の結果であり、図３６は、ＭＳによるフラグメントＡ１、Ａ４の同定結果である。【００９６】
可溶性の標品Ａβ４２は、反応３日の段階で新たなピークが現れ、図３５および図３６に示すように、反応７日において、複数の部位で切断されていた。そして、その切断点を確認したところ、特に、Ａβについて、凝集の核であると報告されている中間領域に対して、強い切断活性を示した。また、同様に、図３３および図３４に示すように、固体Ａβ４２についても、活性が見られた。【００９７】
（４）ＪＡＬ−ＴＡ９の自己消化
（４−１）自己消化の確認
ＪＡＬ−ＴＡ９について、基質を無添加した以外は、同様にして反応を行い、自己消化を確認した。この結果を図３７に示す。図３７に示すように、ＪＡＬ−ＴＡ９は自己消化が確認された。【００９８】
（４−２）阻害剤による自己消化への影響
ＪＡＬ−ＴＡ９について、阻害剤による自己消化への影響を確認した。前記反応液に、プロテアーゼ阻害剤を終濃度０ｍｍｏｌ／Ｌまたは６ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加した以外は、同様にして活性を測定した。なお、プロテアーゼ阻害剤は、前記実施例４（６）において、ＪＡＬ１２−２２  Ｃ１９Ｍの自己消化への阻害を示したセリンブロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦを使用した。この結果を図３８に示す。図３８において、右のグラフは、セリンプロテアーゼを添加した反応液のＭＳの結果である。図３８に示すように、ＡＥＢＳＦを添加することによって、自己消化への阻害がかかった。この結果から、ＪＡＬ−ＴＡ９は、セリンプロテアーゼ様ペプチドと考えられる。【００９９】
前記（１）〜（４）の結果に基づいて、Ａβ４２およびＡβ由来フラグメントにおける切断点を、図３９に示す。図３９に示すように、Ａβ４２における中間領域に対して、強い切断活性を示したことがわかる。【０１００】
（５）Ａβ４２およびＡβ−Ｆに対するＪＡＬ−ＴＡ９の分子間相互作用
Ａβ４２およびＡβ−Ｆに対するＪＡＬ−ＴＡ９の分子間相互作用を、ＡＦＦＩＮＸ  ＱＮμ（商品名、ｉｎｉｔｉｕｎ社製）を用いて、そのプロトコルにしたがって、確認した。これらの結果を、図４０のグラフに示す。図４０において、Ｘは、白金電極にＪＡＬ−ＴＡ９を固定化していない場合の結果であり、Ｙは、白金電極にＪＡＬ−ＴＡ９を固定化した場合の結果である。図４０に示すように、ＪＡＬ-ＴＡ９は、Ａβ１１−２９およびＡβ４２に対して、強い相互作用を示し、これは、切断の活性と相関していた。【０１０１】
（６）ＪＡＬ−ＴＡ９の構造解析
ＪＡＬ−ＴＡ９についてＮＭＲを行った。その結果を図４１に示す。また、図４２に、ＪＡＬ−ＴＡ９の立体構造と活性部位とを示す。ＪＡＬ−ＴＡ９は、Ｌｙｓ  ＨεとＭｅｔ  Ｈγ、および、Ｓｅｒ  ＨβとＡｒｇ  Ｈδが、空間的に近い位置になることより、非常にコンパクトで、セリンプロテアーゼ様の立体構造を取っていると推測される。また、ＪＡＬ−ＴＡ９は、水酸基（Ｓｅｒ）を中心とし、二つのアミノ基（Ｇｌｙ）によりOxyanion  Holeが形成されており、セリンプロテアーゼ様活性に必要な塩基性アミノ酸、水酸基、Ｃ末端のカルボニル基が、立体的に近い位置に存在すると推測される。このような低分子のＪＡＬ−ＴＡ９は、Ａβのオリゴマーに対して、内部に侵入し、内部から加水分解活性により分解していくと解される。なお、本発明は、この推測には限定されない。【０１０２】
［実施例８］
ＪＡＬ−ＴＡ９による、アルツハイマーの原因物質の１つであるＴａｕタンパク質の分解を確認した。【０１０３】
（１）活性
基質として、Ｔａｕ  ＭＢＤ（微小管結合ドメイン）由来のフラグメント（Ｔａｕ  ＭＢＤ１−３０）を使用した。活性の測定は、下記反応液組成３の反応液を使用し、前記反応液を３７℃で所定時間インキュベートした後、前記反応液１０μＬをＨＰＬＣに供した以外は、前記実施例１（１）と同様にして行った。ＭＳ分析の場合は、前記反応液２０μＬをＨＰＬＣに供し、ピークを分取してから、ＭＳ分析を行った。
Tau  MBD  1-30：  GSKDNIKHVPGGGSVQIVYKPVDLSKVTSK（配列番号５１）【０１０４】
【表１０】
2017119511.tif 000012
【０１０５】
これらの結果を、図４３に示す。図４３は、前記反応液のＨＰＬＣの結果であり、左側が、反応０時間の結果であり、右側が、反応一晩後の結果である。図４３に示すように、ＪＡＬ−ＴＡ９は、Ｔａｕ  ＭＢＤ  １−３０を分解しており、活性を示すことが明らかとなった。【０１０６】
（２）切断点の同定
図４４および図４５に、１日および５日反応後のＭＳによるフラグメント同定の結果であり、分解で得られたフラグメント配列を示す。図４４および図４５において、上図は、ＪＡＬ−ＴＡ９とＴａｕ  ＭＢＤ  １−３０とを反応させた結果であり、下図は、前記反応液において、ＪＡＬ−ＴＡ９無添加の結果である。【０１０７】
図４４（反応１日）の下図に示すように、Ｔａｕ  ＭＢＤ  １−３０は、ＪＡＬ−ＴＡ９無添加の様態で、分解が確認された。そして、図４４の上図に示すように、ＪＡＬ−ＴＡ９とＴａｕ  ＭＢＤ  １−３０とを反応させることによって、下図と同様のＴａｕ  ＭＢＤ  １−３０の分解断片（９、１１）とＪＡＬ−ＴＡ９の自己消化断片（１〜５、７、８、１２、１３）の他に、ＪＡＬ−ＴＡ９により切断されたＴａｕ  ＭＢＤ  １−３０の断片（図において下線で示す６、１０）が得られた。さらに、図４５（反応５日）に示すように、ＪＡＬ−ＴＡ９とＴａｕ  ＭＢＤ  １−３０とを反応させることによって、下図と同様のＴａｕ  ＭＢＤ  １−３０の分解断片（１２、１３）とＪＡＬ−ＴＡ９の自己消化断片（１〜６、９，１０、１４−１６）の他に、ＪＡＬ−ＴＡ９により切断されたＴａｕ  ＭＢＤ  １−３０の断片（図において下線で示す４，７，８，１１，１３、１４）が得られた。【０１０８】
これらの結果に基づいて、Ｔａｕ  ＭＢＤ  １−３０における切断点を、図４６に示す。【０１０９】
［実施例９］
ＪＡＬ−ＴＡ９のキメラペプチドを合成し、Ａβに対する活性を確認した。【０１１０】
（１）Ａβ１１−２９
Ａβ結合部位であるａ−ＡＣペプチドをＪＡＬ−ＴＡ９のＮ末端に結合したキメラペプチドを合成した。基質として、Ａβ４２の断片ペプチドであるＡβ１１−２９を使用した。活性の測定は、下記反応液組成の反応液を使用し、前記反応液を３７℃で所定時間インキュベートした後、前記反応液１０μＬをＨＰＬＣに供した以外は、前記実施例１（１）と同様にして行った。ＭＳ分析の場合は、反応６日後の前記反応液２０μＬをＨＰＬＣに供し、ピークを分取してから、ＭＳ分析を行った。
キメラペプチド（Aβ  binding  site  AAJAL-TA9）
FVIFLDVKHFSPEDLTVK-AA-YKGSGFRMI（配列番号５２）【０１１１】
【表１１】
2017119511.tif 000013
【０１１２】
これらの結果を、図４７に示す。図４７は、前記反応液のＨＰＬＣの結果であり、左側が、基質添加の結果であり、右側が、基質添未添加の結果である。図４７に示すように、前記キメラペプチドは、Ａβ１１−２９を分解しており、活性を示すことが明らかとなった。【０１１３】
図４８は、６日反応後のＭＳによるフラグメント同定の結果であり、分解で得られたフラグメント配列を示す。【０１１４】
（２）Ａβ４２
基質として、Ａβ４２を使用した。活性の測定は、下記反応液組成の反応液を使用し、前記反応液を３７℃で所定時間インキュベートした後、前記反応液１０μＬをＨＰＬＣに供した以外は、前記実施例１（１）と同様にして行った。ＭＳ分析の場合は、反応７日後の前記反応液２０μＬをＨＰＬＣに供し、ピークを分取してから、ＭＳ分析を行った。【０１１５】
【表１２】
2017119511.tif 000014
【０１１６】
これらの結果を、図４９に示す。図４９は、前記反応液のＨＰＬＣの結果であり、左列が、基質単独の結果であり、真ん中の列が、キメラペプチド単独の結果であり、右列が、基質とキメラペプチドを反応させた結果である。図４９に示すように、前記キメラペプチドは、反応１日目から、Ａβ４２１１−２９を分解しており、活性を示すことが明らかとなった。【０１１７】
図５０および５１は、７日反応後のＭＳによるフラグメント同定の結果であり、分解で得られたフラグメント配列を示す。図５０において、下線の配列が、キメラペプチドにより切断されたＡβ４２の断片である。図５０に、キメラペプチドによるＡβ４２の切断点をあわせて示す。【０１１８】
［実施例１０］
ＢｏｘＡのＢＴＧ３（配列番号４７：HWYPEKPSKGQAYRCIRV）の部分配列の変異体であるＡＮＡ−ＴＡ９について、加水分解活性を確認した。以下、前記ＢＴＧ３をＢＴＧ／ＡＮＡともいう。また、使用する反応液組成を図５２に示す。
ANA-TA9：  SKGQAYRMI（配列番号５３）【０１１９】
（１）自己消化
図５２の反応液Ｉを３７℃で所定時間インキュベートして、ＡＮＡ−ＴＡ９の自己消化をＨＰＬＣにより確認した。この結果を図５３に示す。図５３に示すように、ＡＮＡ-ＴＡ９は、自己消化を示した。図５３に、自己消化で検出された断片の配列を合わせて示す。【０１２０】
（２）Ａβ−Ｆｓの切断
前記実施例７に示したＡβ−Ｆｓに対する活性を確認した。反応液組成は、図５２の反応液IIを使用した。この結果を図５４に示す。図５４において、一段目は、反応０時間、二段目は、反応１日、三段目は、反応５日の結果を示す。図５４に示すように、ＡＮＡ−ＴＡ９は、いずれのＡβ−Ｆｓをも切断できた。図５４において、下線の配列が、ＡＮＡ−ＴＡ９により切断されたＡβ−Ｆｓの断片である。【０１２１】
（３）Ａβ４２の切断
前記実施例７に示した標品Ａβ４２に対する活性を確認した。反応液組成は、図５２の反応液IIIを使用した。この結果を図５５および図５６に示す。図５５および図５６に示すように、ＡＮＡ−ＴＡ９は、Ａβ４２を切断できた。図５５において、下線の配列が、ＡＮＡ−ＴＡ９により切断されたＡβ４２の断片である。【０１２２】
（４）プロテアーゼ阻害剤による影響
図５７に示す反応液IVを使用して、プロテアーゼ阻害剤によるＡＮＡ−ＴＡ９の自己消化への影響を確認した。図５７に、ＪＡＬ-ＴＡ９の結果もあわせて示す。図５７において、各反応系は、上段が反応０時間の結果であり、下段が６時間の結果である。図５７に示すように、ＡＮＡ−ＴＡ９およびＪＡＬ−ＴＡ９は、それぞれ、プロテアーゼ阻害剤により自己消化が抑制された。【０１２３】
［実施例１１］
ＡＮＡ−ＴＡ９の自己消化で現れるＡＮＡ−ＹＡ４（ＹＲＭＩともいう）について、加水分解活性を確認した。
ANA-SA4：  YRMI（配列番号５４）【０１２４】
（１）Ａβ１−２０の切断
図５２の反応液Vを３７℃で所定時間インキュベートして、ＡＮＡ−ＹＡ４（ＹＲＭＩ）の自己消化と、ＡＮＡ−ＹＡ４によるＡβ１−２０の切断を確認した。この結果を図５８に示す。図５８に示すように、ＡＮＡ-ＳＡ４は、自己消化し、また、Ａβ１−２０を分解した。【０１２５】
図５９に反応１日におけるＭＳの結果を示す。図５９において、下線の配列が、ＡＮＡ−ＹＡ４により切断されたＡβ１−２０の断片である。【０１２６】
（２）Ａβ１１−２９Ａβ−Ｆの切断
図５２の反応液Vを３７℃で所定時間インキュベートして、ＡＮＡ−ＹＡ４（ＹＲＭＩ）の自己消化と、ＡＮＡ−ＹＡ４によるＡβ１１−２９の切断を確認した。この結果を図６０に示す。図６０に示すように、ＡＮＡ-ＳＡ４は、自己消化し、また、Ａβ１１−２９を分解した。図６０において、下線の配列が、ＡＮＡ−ＹＡ４により切断されたＡβ１１−２９の断片である。【０１２７】
図６１に反応１日におけるＭＳの結果を示す。図６１において、下線の配列が、ＡＮＡ−ＹＡ４により切断されたＡβ１１−２９の断片である。また、図６１に、ＡＮＡ−ＹＡ４によるＡβ１１−２９の切断点を示す。【０１２８】
［実施例１２］
ＡＮＡ−ＴＡ９の自己消化で現れるＡＮＡ−ＳＡ５について、加水分解活性を確認した。
ANA-SA5：  SKGQA（配列番号５５）【０１２９】
図５２の反応液VIを３７℃で所定時間インキュベートして、ＡＮＡ−ＳＡ５によるＡβ１−２０、Ａβ１１−２９の切断を確認した。この結果を図６２に示す。図６２に示すように、ＡＮＡ-ＳＡ４は、Ａβ１−２０を分解し、反応１日でピークは４９．６％に減少し、５日でほぼ消滅した。そして、図６３に示すように、反応５日において、１２種類のＡβ１−２０の断片が検出された。また、図６２に示すように、ＡＮＡ-ＳＡ４は、Ａβ１１−２９を分解し、反応１日でピークは７２％に減少し、５日でほぼ消滅した。そして、図６４に示すように、反応５日において、１３種類のＡβ１１−２９の断片が検出された。図６３および図６４には、ＡＮＡ−ＳＡ５によるＡβ−Ｆｓの切断点をあわせて示す。【０１３０】
［実施例１３］
αＡ−クリスタリンは、シャペロン様活性を有し、レンズの透明性を維持している。そして、αＡ−クリスタリンの７１−８８のペプチドは、アミロイドβの凝集を抑制すること、このペプチド自身も凝集して、アミロイド線維を形成すると報告されている。そこで、実施例７のＪＡＬ−ＴＡ９について、αＡ−クリスタリンの分解活性を確認した。【０１３１】
基質として、αＡ−クリスタリンの７１−８８の下記配列のフラグメントペプチド（摂南大学にて合成）を使用した。活性の測定は、下記反応液組成の反応液を使用し、前記反応液を３７℃で所定時間インキュベートした後、前記反応液１０μＬをＨＰＬＣに供した以外は、前記実施例１（１）と同様にして行った。ＭＳ分析の場合は、前記反応液２０μＬをＨＰＬＣに供し、ピークを分取してから、ＭＳ分析を行った。
αＡ−クリスタリン：FVIFLDVKHFSPEDLTVK（配列番号５６）【０１３２】
【表１３】
2017119511.tif 000015
【０１３３】
これらの結果を、図６５に示す。図６５に示すように、ＪＡＬ−ＴＡ９は、自己消化し、また、反応１日からαＡ−クリスタリンを分解できた。また、図６６に示すように、ＪＡＬ−ＴＡ９により切断されたαＡ−クリスタリンの断片が検出された。図６６において、下線の配列が、ＪＡＬ−ＴＡ９により切断されたαＡ−クリスタリンの断片である。また、図６５に、αＡ−クリスタリンの切断点をあわせて示す。【０１３４】
［実施例１４］
ＪＡＬ−ＴＡ９は、Ｔｏｂ１のＢｏｘＡドメイン由来である。そこで、Ｔｏｂ１のＢｏｘＢドメイン（配列番号３４）の由来であるペプチド（Ｔｏｂ１  ＢｏｘＢ  ８−２０：WIDPFEVSYQIGE）について、活性の測定を行った。基質として、前記実施例７と同様のＡβ１−２０、Ａβ１１−２９を使用した。活性の測定は、下記反応液組成の反応液を使用した以外は、前記実施例７と同様にして行った。【０１３５】
【表１４】
2017119511.tif 000016
【０１３６】
（１）Ａβ−Ｆに対する活性
これらの結果を、図６６に示す。図６６は、前記反応液のＨＰＬＣの結果である。図６６に示すように、Ｔｏｂ１  ＢｏｘＢ  ８−２０は、ＢｏｘＡ由来のペプチドと同様に、Ａβ−Ｆを分解し、これらに活性を示すことが明らかとなった。【０１３７】
（２）Ａβ−Ｆに対する切断点の同定
これらの結果を、図６７および６８に示す。図６７および６８は、ＭＳによるフラグメント同定の結果であり、分解で得られたフラグメント配列を示す。各図において、下線部の配列が、Ａβ−Ｆに由来するフラグメントを示す。図６７および６８に示すように、いずれのＡβ−Ｆも、複数の部位で切断されていた。【０１３８】
［実施例１５］
ＪＡＬ  １２−１７（ＹＫＧＳＧＦ）および１２−１６（ＹＫＧＳＧ）について、自己消化およびＡβ−Ｆに対する活性を確認した。活性の測定は、下記反応液組成の反応液を使用した以外は、前記実施例７と同様にして行った。基質として、前記実施例７と同様のＡβ１１−２９を使用した。自己消化は、基質を未添加とした以外は、同様に反応を行った。【０１３９】
【表１５】
2017119511.tif 000017
【０１４０】
これらの結果を、図６９および７０に示す。両図は、前記反応液のＨＰＬＣの結果である。両図に示すように、ＪＡＬ  １２−１７およびＪＡＬ  １２−１６は、いずれも自己消化とＡβ−Ｆの分解が確認された。また、【０１４１】
図７１に、反応３日後における、ＭＳによるフラグメント同定の結果として、分解で得られたフラグメント配列を示す。図７１は、自己消化の結果であり、図７２は、Ａβ−Ｆの分解の結果である。図７１の上図に示すように、ＪＡＬ  １２−１６では、ＪＡＬ  １２−１４（Ｐ２）の増加が見られ、図７１の下図に示すように、ＪＡＬ  １２−１７では、ＪＡＬ  １３−１７（Ｐ５）の増加が見られた。【０１４２】
図７２に、ＭＳによるフラグメント同定の結果として、分解で得られたフラグメント配列を示す。図７２において、下線部の配列が、Ａβ−Ｆに由来するフラグメントを示す。図７２に示すように、ＪＡＬ  １２−１７およびＪＡＬ  １２−１６のいずれにおいても、Ａβ−Ｆに対する切断点は同じであった。【０１４３】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。【０１４４】
この出願は、２０１６年１月６日に出願された米国特許仮出願ＵＳ６２／２７５，５９９、および２０１６年３月３０日に出願された日本出願特願２０１６−０６８４９６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明の触媒性ペプチドによれば、加水分解反応を触媒できる。本発明の触媒性ペプチドは、酵素タンパク質とは異なり、分子量の小さなペプチドであることから、前記タンパク質とは異なる新たな触媒分子として、加水分解反応に適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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