(57)【要約】  本発明は、肝細胞、肝前駆細胞、胆管上皮細胞、肝類洞内皮前駆細胞、肝類洞内皮細胞、肝星前駆細胞、肝星細胞及び肝細胞組織モデル、並びにそれらの調製方法に関する。本発明はまた、肝前駆細胞、肝類洞内皮前駆細胞、又は肝星前駆細胞を含む細胞画分に関する。本発明はまた、上記細胞、肝細胞組織モデル若しくは細胞画分を含む医薬組成物又はキットに関する。本発明はまた、肝疾患治療剤のスクリーニング方法、薬剤の肝毒性の評価方法、感染性疾患モデルの肝細胞及びその調製方法、感染性疾患モデル組織及びその調製方法、並びに、感染性治療剤のスクリーニング方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝前駆細胞を含む細胞画分から、ＣＰＭ陽性の表現型を指標として肝前駆細胞を分取する工程を含む、肝前駆細胞の調製方法。
【請求項２】
胚体内胚葉細胞又は肝内胚葉細胞を分化誘導して肝前駆細胞を含む前記細胞画分を調製する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多能性幹細胞を分化誘導して前記胚体内胚葉細胞又は前記肝内胚葉細胞を調製する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で調製され得、ＣＰＭ陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝細胞又は胆管上皮細胞への分化能を有する、肝前駆細胞。
【請求項６】
凍結保存し、解凍した後における前記肝前駆細胞の増殖能が、凍結保存前における肝前駆細胞の増殖能と比較して低下しない、請求項５に記載の肝前駆細胞。
【請求項７】
全細胞に対して９０％以上の肝前駆細胞を含む細胞画分であって、前記肝前駆細胞はＣＰＭ陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝細胞又は胆管上皮細胞への分化能を有する、細胞画分。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の肝前駆細胞を肝細胞へと分化誘導する工程を含む、肝細胞の調製方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法で調製され得る、増殖能を有する肝細胞。
【請求項１０】
請求項５又は６に記載の肝前駆細胞を胆管上皮細胞へと分化誘導する工程を含む、胆管上皮細胞の調製方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法で調製され得る、増殖能を有する胆管上皮細胞。
【請求項１２】
肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分から、ＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を指標として肝類洞内皮前駆細胞を分取する工程を含む、肝類洞内皮前駆細胞の調製方法。
【請求項１３】
中胚葉細胞を分化誘導して肝類洞内皮前駆細胞を含む前記細胞画分を調製する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
多能性幹細胞を分化誘導して前記中胚葉細胞を調製する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法で調製され得、ＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝類洞内皮細胞への分化能を有する、肝類洞内皮前駆細胞。
【請求項１７】
全細胞に対して９０％以上の肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分であって、前記肝類洞内皮前駆細胞はＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝類洞内皮細胞への分化能を有する、細胞画分。
【請求項１８】
（１）ＴＧＦ−β阻害剤を用いて請求項１６に記載の肝類洞内皮前駆細胞を分化誘導して、肝類洞内皮細胞を含む細胞画分を調製する工程、及び
（２）肝類洞内皮細胞を含む前記細胞画分からＣＤ３１陽性およびＦｃγＲ ＩＩ陽性の表現型を指標として肝類洞内皮細胞を分取する工程
を含む、肝類洞内皮細胞の調製方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法で調製され得、ＣＤ３１陽性およびＦｃγＲ ＩＩ陽性の表現型を有し、増殖能を有する、肝類洞内皮細胞。
【請求項２０】
肝星前駆細胞を含む細胞画分からＡＬＣＡＭ陽性の表現型を指標として肝星前駆細胞を分取する工程を含む、肝星前駆細胞の調製方法。
【請求項２１】
多能性幹細胞を分化誘導して肝星前駆細胞を含む前記細胞画分を調製する工程をさらに含む、肝星前駆細胞の調製方法。
【請求項２２】
前記多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法で調製され得、ＡＬＣＡＭ陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝星細胞への分化能を有する、肝星前駆細胞。
【請求項２４】
全細胞に対して９０％以上の肝星前駆細胞を含む細胞画分であって、前記肝星前駆細胞はＡＬＣＡＭ陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝星細胞への分化能を有する、細胞画分。
【請求項２５】
Ｒｏｃｋ阻害剤を用いて、肝星前駆細胞を肝星細胞へと分化誘導する工程を含む、肝星細胞の調製方法。
【請求項２６】
前記肝星前駆細胞が、請求項２３に記載の肝星前駆細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の方法で調製され得、増殖能を有する、肝星細胞。
【請求項２８】
請求項５若しくは６に記載の肝前駆細胞、又は請求項７に記載の細胞画分を、肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞から成る群から選択される少なくとも１つの肝非実質細胞と共培養する工程を含む、肝細胞組織モデルの調製方法。
【請求項２９】
前記肝類洞内皮細胞が、請求項１９に記載の肝類洞内皮細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記肝星細胞が、請求項２７に記載の肝星細胞である、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
肝細胞と、肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞から成る群から選択される少なくとも１つの肝非実質細胞とを含み、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法で調製され得る、肝細胞組織モデル。
【請求項３２】
請求項５又は６に記載の肝前駆細胞、請求項７に記載の細胞画分、請求項９に記載の肝細胞、請求項１１に記載の胆管上皮細胞、請求項１６に記載の肝類洞内皮前駆細胞、請求項１７に記載の細胞画分、請求項１９に記載の肝類洞内皮細胞、請求項２３に記載の肝星前駆細胞、請求項２４に記載の細胞画分、請求項２７に記載の肝星細胞、或いは請求項３１に記載の肝細胞組織モデルを含む、医薬組成物。
【請求項３３】
請求項９に記載の肝細胞又は請求項３１に記載の肝細胞組織モデルに肝疾患治療剤の候補品を投与することを含む、肝疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項３４】
請求項９に記載の肝細胞又は請求項３１に記載の肝細胞組織モデルに薬剤を投与することを含む、薬剤の肝毒性の評価方法。
【請求項３５】
（１）請求項５若しくは６に記載の肝前駆細胞、又は請求項７に記載の細胞画分中の肝前駆細胞に病原体を感染させる工程、
（２）病原体を感染した前記肝前駆細胞を分化誘導して病原体感染疾患モデルの肝細胞を調製すること
を含む、感染性疾患モデルの肝細胞の調製方法。
【請求項３６】
請求項９に記載の肝細胞に病原体を感染させる工程を含む、感染性疾患モデルの肝細胞の調製方法。
【請求項３７】
前記病原体が、肝炎ウィルス又はマラリア原虫である、請求項３５又は３６に記載の調製方法。
【請求項３８】
請求項３５〜３７に記載の方法によって調製され得る、感染性疾患モデルの肝細胞。
【請求項３９】
（１）請求項５又は６に記載の肝前駆細胞、又は請求項７に記載の細胞画分中の肝前駆細胞に病原体を感染させる工程、
（２）病原体を感染した前記肝前駆細胞を、肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞から成る群から選択される少なくとも１つの肝非実質細胞と共培養する工程
を含む、感染性疾患モデル組織の調製方法。
【請求項４０】
前記病原体が、肝炎ウィルス又はマラリア原虫である、請求項３９に記載の調製方法。
【請求項４１】
請求項３９又は４０に記載の方法によって調製され得る、感染性疾患モデル組織。
【請求項４２】
請求項３８に記載の感染性疾患モデルの肝細胞又は請求項４１に記載の感染性疾患モデル組織に感染性肝疾患治療剤の候補品を投与することを含む、感染性肝疾患治療剤のスクリーニング方法。
【請求項４３】
請求項５又は６に記載の肝前駆細胞、請求項７に記載の細胞画分、請求項９に記載の肝細胞、請求項１１に記載の胆管上皮細胞、請求項１６に記載の肝類洞内皮前駆細胞、請求項１７に記載の細胞画分、請求項１９に記載の肝類洞内皮細胞、請求項２３に記載の肝星前駆細胞、請求項２４に記載の細胞画分、請求項２７に記載の肝星細胞、或いは請求項３１に記載の肝細胞組織モデルを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞、肝前駆細胞、胆管上皮細胞、肝類洞内皮前駆細胞、肝類洞内皮細胞、肝星前駆細胞、肝星細胞及び肝細胞組織モデル、並びにそれらの調製方法に関する。本発明はまた、肝前駆細胞、肝類洞内皮前駆細胞、又は肝星前駆細胞を含む細胞画分に関する。本発明はまた、上記細胞、肝細胞組織モデル若しくは細胞画分を含む医薬組成物又はキットに関する。本発明はまた、肝疾患治療剤のスクリーニング方法、薬剤の肝毒性の評価方法、感染性肝疾患モデルの肝細胞及びその調製方法、感染性肝疾患モデル組織及びその調製方法、並びに、感染性肝疾患治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓は代謝、解毒、血清タンパク質の合成など多種多様な機能を担っており、生体の恒常性維持に必須の臓器である。肝臓の実質細胞である肝細胞は、こうした多彩な肝機能を担う。特に、シトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素群など多数の代謝酵素を発現するため、肝細胞は薬物の毒性試験等の創薬研究に利用されている。【０００３】
また、重度の肝臓疾患（劇症肝炎、肝硬変、肝癌など）などに対する根本治療は、肝臓移植しかないが、ドナー不足や免疫抑制療法を生涯行う必要性などの問題点があり、肝移植に代わる新しい治療法の開発が望まれている。その中の一つとして、細胞移植療法がある。【０００４】
しかしながら、生体肝臓から分離した肝細胞は培養により急速に代謝酵素活性を失う。また、ヒト生体からヒト肝細胞を大量に供給することは困難である。【０００５】
近年、ヒト胚性幹細胞（Embryonic Stem Cell：ＥＳ細胞）および人工多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem cell：ｉＰＳ細胞）を含むヒト多能性幹細胞は、新たな肝細胞供給源として期待が高まっている。多能性幹細胞から肝細胞を誘導する試みが多数報告されている(非特許文献１〜３)。【０００６】
また、肝細胞は、肝臓の毛細血管系である類洞を構成する肝類洞内皮細胞(Liver Sinusoidal Endothelial Cell：ＬＳＥＣ)や周皮細胞である肝星細胞（Hepatic Stellate Cell：ＨＳＣ)と密接して存在している。これら肝非実質細胞は、肝細胞と相互作用することで肝臓の発生及び分化にも大きく寄与することが知られている。【０００７】
近年の幹細胞を活用した分化誘導研究では、単一の機能細胞の誘導だけでなく細胞同士の相互作用に着目した組織再生に注目が集まっている。生体における多くの器官は、単一の細胞から構成されるのではなく、異なる細胞同士が液性因子や細胞接着等の相互作用を介し、発生分化する。幹細胞から誘導された異なる細胞同士を共培養で立体構築することにより、機能的な細胞や組織の再生に成功した例が報告されている（非特許文献４及び５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ogawa et al., Development 2013, 140 (15), 3285-3296
【非特許文献２】Si-Tayeb et al., Hepatology 2010, 51 (1), 297-305
【非特許文献３】Takayama et al., J Hepatol. 2012, 57 (3), 628-36
【非特許文献４】Wang et al., Sci Rep., 2015, 5, 9232
【非特許文献５】Taguchi et al., Cell Stem Cell, 2014, 14 (1), 53-67
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来知られているヒト多能性幹細胞からヒト肝細胞を誘導する方法は、多段階の分化誘導を経る必要があり、均一で大量の肝細胞を短期間で調製することは困難である。さらに、当該方法によって得られるヒト肝細胞において、薬剤代謝に関わる酵素であるＣＹＰの発現量が生体の肝細胞と比べて低く、生体肝細胞と同等の生理機能を有する肝細胞の誘導には至っていないのが現状である。【００１０】
また、肝発生時の細胞間相互作用をインビトロで忠実に再現することで、機能的な肝細胞や肝組織を誘導することが可能になると考えられる。しかし、肝発生時に肝細胞と相互作用する非実質細胞を、ヒト生体から安定的かつ大量に得ることは困難である。【００１１】
したがって本発明は、均一で高機能の肝細胞、肝非実質細胞及びそれらの前駆細胞を高純度で効率よく調製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、肝前駆細胞を含む細胞画分から、カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）陽性の表現型を指標として肝前駆細胞を選択的に分取できること、そして得られた肝前駆細胞を分化誘導することで均一で高機能の肝細胞を調製できることを見出した。【００１３】
また本発明者らは、肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分から、ＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を指標として、均一で高機能の肝類洞内皮前駆細胞を選択的に分取できること、得られた肝類洞内皮前駆細胞を分化誘導することで、均一で高機能の肝類洞内皮細胞を調製できることを見出した。【００１４】
また本発明者らは、肝星前駆細胞を含む細胞画分から、活性化白血球細胞接着分子（activated-leukocyte cell adhesion molecule：ＡＬＣＡＭ）陽性の表現型を指標として、均一で高機能の肝星前駆細胞を選択的に分取できることを見出した。【００１５】
また本発明者らは、Rhoキナーゼ（Rho-associated protein kinase：ＲＯＣＫ）阻害剤を用いて、肝星前駆細胞を肝星細胞へと分化誘導することができることを見出した。【００１６】
また本発明者らは、上記で得られた肝前駆細胞を肝非実質細胞と共培養することで、肝前駆細胞から肝細胞への分化を促進できることを見出した。【００１７】
さらに本発明者らは、上記で得られた肝前駆細胞及び肝細胞から感染性肝疾患モデルの肝細胞を調製できることを見出した。【００１８】
すなわち本発明は、以下の態様を有する。
［１］
肝前駆細胞を含む細胞画分から、ＣＰＭ陽性の表現型を指標として肝前駆細胞を分取する工程を含む、肝前駆細胞の調製方法。
［２］
胚体内胚葉細胞又は肝内胚葉細胞を分化誘導して肝前駆細胞を含む前記細胞画分を調製する工程をさらに含む、［１］に記載の方法。
［３］
多能性幹細胞を分化誘導して前記胚体内胚葉細胞又は前記肝内胚葉細胞を調製する工程をさらに含む、［１］に記載の方法。
［４］
前記多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、［２］又は［３］に記載の方法。
［５］
［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法で調製され得、ＣＰＭ陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝細胞又は胆管上皮細胞への分化能を有する、肝前駆細胞。
［６］
凍結保存し、解凍した後における前記肝前駆細胞の増殖能が、凍結保存前における肝前駆細胞の増殖能と比較して低下しない、［５］に記載の肝前駆細胞。
［７］
全細胞に対して９０％以上の肝前駆細胞を含む細胞画分であって、前記肝前駆細胞はＣＰＭ陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝細胞又は胆管上皮細胞への分化能を有する、細胞画分。
［８］
［５］又は［６］に記載の肝前駆細胞を肝細胞へと分化誘導する工程を含む、肝細胞の調製方法。
［９］
［８］に記載の方法で調製され得る、増殖能を有する肝細胞。
［１０］
［５］又は［６］に記載の肝前駆細胞を胆管上皮細胞へと分化誘導する工程を含む、胆管上皮細胞の調製方法。
［１１］
［１０］に記載の方法で調製され得る、増殖能を有する胆管上皮細胞。
［１２］
肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分から、ＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を指標として肝類洞内皮前駆細胞を分取する工程を含む、肝類洞内皮前駆細胞の調製方法。
［１３］
中胚葉細胞を分化誘導して肝類洞内皮前駆細胞を含む前記細胞画分を調製する工程をさらに含む、［１２］に記載の方法。
［１４］
多能性幹細胞を分化誘導して前記中胚葉細胞を調製する工程をさらに含む、［１３］に記載の方法。
［１５］
前記多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、［１４］に記載の方法。
［１６］
［１２］〜［１５］のいずれか１つに記載の方法で調製され得、ＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝類洞内皮細胞への分化能を有する、肝類洞内皮前駆細胞。
［１７］
全細胞に対して９０％以上の肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分であって、前記肝類洞内皮前駆細胞はＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝類洞内皮細胞への分化能を有する、細胞画分。
［１８］
（１）ＴＧＦ−β阻害剤を用いて［１６］に記載の肝類洞内皮前駆細胞を分化誘導して、肝類洞内皮細胞を含む細胞画分を調製する工程、及び
（２）肝類洞内皮細胞を含む前記細胞画分からＣＤ３１陽性およびＦｃγＲ ＩＩ陽性の表現型を指標として肝類洞内皮細胞を分取する工程
を含む、肝類洞内皮細胞の調製方法。
［１９］
［１８］に記載の方法で調製され得、ＣＤ３１陽性およびＦｃγＲ ＩＩ陽性の表現型を有し、増殖能を有する、肝類洞内皮細胞。
［２０］
肝星前駆細胞を含む細胞画分からＡＬＣＡＭ陽性の表現型を指標として肝星前駆細胞を分取する工程を含む、肝星前駆細胞の調製方法。
［２１］
多能性幹細胞を分化誘導して肝星前駆細胞を含む前記細胞画分を調製する工程をさらに含む、肝星前駆細胞の調製方法。
［２２］
前記多能性幹細胞がヒトｉＰＳ細胞である、［２１］に記載の方法。
［２３］
［２０］〜［２２］のいずれか１つに記載の方法で調製され得、ＡＬＣＡＭ陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝星細胞への分化能を有する、肝星前駆細胞。
［２４］
全細胞に対して９０％以上の肝星前駆細胞を含む細胞画分であって、前記肝星前駆細胞はＡＬＣＡＭ陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝星細胞への分化能を有する、細胞画分。
［２５］
Ｒｏｃｋ阻害剤を用いて、肝星前駆細胞を肝星細胞へと分化誘導する工程を含む、肝星細胞の調製方法。
［２６］
前記肝星前駆細胞が、［２３］に記載の肝星前駆細胞である、［２５］に記載の方法。
［２７］
［２５］又は［２６］に記載の方法で調製され得、増殖能を有する、肝星細胞。
［２８］
［５］又は［６］に記載の肝前駆細胞を、肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞から成る群から選択される少なくとも１つの肝非実質細胞と共培養する工程を含む、肝細胞組織モデルの調製方法。
［２９］
前記肝類洞内皮細胞が、［１９］に記載の肝類洞内皮細胞である、［２８］に記載の方法。
［３０］
前記肝星細胞が、［２７］に記載の肝星細胞である、［２８］又は［２９］に記載の方法。
［３１］
肝細胞と、肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞から成る群から選択される少なくとも１つの肝非実質細胞とを含み、［２８］〜［３０］のいずれか１つに記載の方法で調製され得る、肝細胞組織モデル。
［３２］
［５］又は［６］に記載の肝前駆細胞、［７］に記載の細胞画分、［９］に記載の肝細胞、［１１］に記載の胆管上皮細胞、［１６］に記載の肝類洞内皮前駆細胞、［１７］に記載の細胞画分、［１９］に記載の肝類洞内皮細胞、［２３］に記載の肝星前駆細胞、［２４］に記載の細胞画分、［２７］に記載の肝星細胞、或いは［３１］に記載の肝細胞組織モデルを含む、医薬組成物。
［３３］
［９］に記載の肝細胞又は［３１］に記載の肝細胞組織モデルに肝疾患治療剤の候補品を投与することを含む、肝疾患治療剤のスクリーニング方法。
［３４］
［９］に記載の肝細胞又は［３１］に記載の肝細胞組織モデルに薬剤を投与することを含む、薬剤の肝毒性の評価方法。
［３５］
（１）［５］若しくは［６］に記載の肝前駆細胞、又は［７］に記載の細胞画分中の肝前駆細胞に病原体を感染させる工程、
（２）病原体を感染した前記肝前駆細胞を分化誘導して病原体感染疾患モデルの肝細胞を調製すること
を含む、感染性疾患モデルの肝細胞の調製方法。
［３６］
［９］に記載の肝細胞に病原体を感染させる工程を含む、感染性疾患モデルの肝細胞の調製方法。
［３７］
前記病原体が、肝炎ウィルス又はマラリア原虫である、［３５］又は［３６］に記載の調製方法。
［３８］
［３５］〜［３７］に記載の方法によって調製され得る、感染性疾患モデルの肝細胞。
［３９］
（１）［５］又は［６］に記載の肝前駆細胞、又は［７］に記載の細胞画分中の肝前駆細胞に病原体を感染させる工程、
（２）病原体を感染した前記肝前駆細胞を、肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞から成る群から選択される少なくとも１つの肝非実質細胞と共培養する工程
を含む、感染性疾患モデル組織の調製方法。
［４０］
前記病原体が、肝炎ウィルス又はマラリア原虫である、［３９］に記載の調製方法。
［４１］
［３９］又は［４０］に記載の方法によって調製され得る、感染性疾患モデル組織。
［４２］
［３８］に記載の感染性疾患モデルの肝細胞又は［４１］に記載の感染性疾患モデル組織に感染性肝疾患治療剤の候補品を投与することを含む、感染性肝疾患治療剤のスクリーニング方法。
［４３］
［５］又は［６］に記載の肝前駆細胞、［７］に記載の細胞画分、［９］に記載の肝細胞、［１１］に記載の胆管上皮細胞、［１６］に記載の肝類洞内皮前駆細胞、［１７］に記載の細胞画分、［１９］に記載の肝類洞内皮細胞、［２３］に記載の肝星前駆細胞、［２４］に記載の細胞画分、［２７］に記載の肝星細胞、或いは［３１］に記載の肝細胞組織モデルを含む、キット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、均一で高機能の肝細胞、肝非実質細胞及びそれらの前駆細胞を高純度で効率よく調製することが可能である。得られた肝細胞は、例えば創薬スクリーニングに利用可能である。また、得られた肝細胞、肝非実質細胞及びそれらの前駆細胞は、例えば細胞療法への使用が可能である。また、得られた肝細胞、肝非実質細胞及びそれらの前駆細胞は、疾患モデルの作製に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ヒトｉＰＳ細胞から肝細胞へと分化誘導させた際のＣＰＭ陽性細胞画分の変遷を経時的に示したフローサイトメトリー解析の結果を示す。図中の「ｉＰＳＣｓ」は、ヒトｉＰＳ細胞を示す。図中の「ＤＥ」は、胚体内胚葉細胞を含む細胞群を示す。図中の「ＳＨ」は、肝内胚葉細胞を含む細胞群を示す。図中の「ＩＨ」は、肝前駆細胞を含む細胞群を示す。図中の「ＭＨ」は、成熟肝細胞を含む細胞群を示す。図中のパーセンテージは、細胞群中のＣＰＭ陽性細胞の割合を示す。
【図２】図２は、肝前駆細胞を含む細胞群（ＩＨ）から、ＣＰＭ陽性を指標として細胞を分離した場合におけるフローサイトメトリー解析の結果を示す。当該細胞分離により、９７．７％の肝前駆細胞を分取できた。
【図３】図３は、ＣＰＭ陽性細胞の免疫細胞化学染色の結果を示す。
【図４】図４は、ＣＰＭ陽性細胞とＣＰＭ陰性細胞における肝前駆細胞マーカーの発現量の比較結果を示す。*ｐ＜０．０５，**ｐ＜０．０１，***ｐ＜０．００１。８回の実験の平均±ＳＥＭとして結果を表示する。
【図５】図５は、ＣＰＭ陽性細胞の増殖能（上）、及びＣＰＭ陽性細胞の複数回の継代後における相対細胞数（下）を示す。エラーバーは、４つの独立した実験の平均±ＳＥＭを示す。
【図６】図６は、分化誘導前の肝前駆細胞と分化誘導して得られた肝細胞について、明視野顕微鏡による観察、免疫細胞化学染色によるアルブミンの染色及びＰＡＳ染色によるグリコーゲンの蓄積の観察を行った結果を示す。
【図７】図７は、ＣＰＭ陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒトiPS細胞由来肝細胞（iPSC Heps）と、ＣＰＭ陽性を指標として分取された肝前駆細胞を分化誘導して得られた、ヒトiPS細胞由来肝細胞（CPM+ Heps）における、ＣＹＰ４５０のｍＲＮＡの発現レベルの比較結果を示す。６回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして結果を表示する。*ｐ＜０．０５，**ｐ＜０．０１，***ｐ＜０．００１。
【図８】図８は、ＣＰＭ陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒトiPS細胞由来肝細胞（iPSC Heps）とＣＰＭ陽性を指標として分取された肝前駆細胞を分化誘導して得られた、ヒトiPS細胞由来肝細胞（CPM+ Heps）における、ＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡの発現レベルの比較結果を示す。少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして結果を表示する。*ｐ＜０．０５，**ｐ＜０．０１，***ｐ＜０．００１。Ｒｉｆはリファンピシンを示す。
【図９】図９は、ＣＰＭ陽性を指標として分取された肝前駆細胞と、当該肝前駆細胞から分化誘導されたヒト胆管上皮細胞における、ＡＦＰのｍＲＮＡ発現を定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した結果を示す。ＬＰＣｓは発明の方法で調製された肝前駆細胞のことであり、Ｃｈｏｌは当該肝前駆細胞から分化誘導されたヒト胆管上皮細胞のことである。４回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして結果を表示する。**ｐ＜０．０１
【図１０】図１０は、ＣＰＭ陽性を指標として分取された肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒト胆管上皮細胞と、ＣＰＭ陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒト胆管上皮細胞における、胆管上皮細胞特異的マーカーのｍＲＮＡ発現を定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した結果を示す。図中の「CPM+ Cholangiocytes」はＣＰＭ陽性を指標として分取された肝前駆細胞を分化誘導して得られた肝前駆細胞のことであり、図中の「iPSC Cholangiocytes」はＣＰＭ陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒト胆管上皮細胞のことである。４回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして結果を表示する。ＮＤ：検出されず、**ｐ＜０．０１，***ｐ＜０．００１。
【図１１】図１１は、ヒトｉＰＳ細胞（iPSC）、ヒト中胚葉細胞(Meso)、ヒト肝類洞内皮前駆細胞(LSEC pro) （細胞分離前）における、マーカー分子の遺伝子発現量を示す。ｎ＝３，３，５、**ｐ＜０．０１，***ｐ＜０．００１。
【図１２】図１２は、ヒト中胚葉細胞を分化誘導して得られたヒト肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞群のフローサイトメトリー解析の結果を示す。ＦＬＫ１+細胞分画（左）に、ＣＤ３１+ＣＤ３４+/-細胞（右）が存在する。
【図１３】図１３は、ヒト中胚葉細胞を分化誘導して得られたヒト肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞群（pre-sorted）、pre-sorted群から分離されたＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞（ＣＤ３４+）、ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４-細胞（ＣＤ３４-）における、ヒト肝類洞内皮前駆細胞のマーカー分子（ＳＴＡＢ２及びＬＹＶＥ１）の発現量を示す。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ。*ｐ＜０．０５，***ｐ＜０．００１。
【図１４】図１４は、ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+のヒト肝類洞内皮前駆細胞の位相差顕微鏡像を示す。スケールバー：１００μｍ
【図１５】図１５は、ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+のヒト肝類洞内皮前駆細胞の増殖（左）、および継代培養後の結果（右）を示す。ｎ＝３。平均±ＳＥＭ。
【図１６】図１６は、５継代後のＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞における肝類洞内皮前駆細胞マーカー分子の発現量を示す。Ｐ０：０継代、Ｐ５：５継代。ｎ＝３。平均±ＳＥＭ。ＮＳ：有意差なし。
【図１７】図１７は、凍結保存後のＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞の免疫細胞化学染色像を示す。青：核、赤：ＣＤ３１。スケールバー、１００μｍ。
【図１８】図１８は、ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+のヒト肝類洞内皮前駆細胞と当該前駆細胞から誘導されたヒト肝類洞内皮細胞における、肝類洞内皮細胞マーカーの発現量を示す。図中の「pre」は、ヒト肝類洞内皮前駆細胞を示す。図中の「＋Ａ８３−０１」は、ヒト肝類洞内皮細胞を示す。図中の「Ｆ８」は、ファクターVIIIを示す。ｎ＝３、平均±ＳＥＭ。
【図１９】図１９は、ヒト肝類洞内皮前駆細胞から誘導されたヒト肝類洞内皮細胞を含む細胞画分のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図２０】図２０は、ＣＤ３１陽性、ＦｃＲγＩＩ陽性細胞の位相差顕微鏡像を示す。スケールバー、１００μｍ。
【図２１】図２１は、ＣＤ３１+ＦｃＲγＩＩ-細胞及びＣＤ３１+ＦｃＲγＩＩ+細胞におけるヒト肝類洞内皮細胞マーカー分子の発現解析を示す。ヒト臍帯血静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をコントロールとして用いた。ｎ＝３。平均±ＳＥＭ。ＮＤ：検出されず。*ｐ＜０．０５，**ｐ＜０．０１，***ｐ＜０．００１。
【図２２】図２２は、ヒトｉＰＳ細胞由来のＣＤ３１陽性ＦｃＲγＩＩ陽性の肝類洞内皮細胞（ｉＰＳ−ＬＳＥＣ）のアセチル化ＬＤＬ（Ａｃ−ＬＤＬ）及びヒアルロン酸（ＨＡ）の取り込み能を示す免疫細胞化学染色像である。コントロールとしてＨＵＶＥＣを用いた。青：核、赤：アセチル化ＬＤＬ、緑：ヒアルロン酸  スケールバー、１００μｍ。
【図２３】図２３は、ヒトｉＰＳ細胞由来のＣＤ３１陽性ＦｃＲγＩＩ陽性の肝類洞内皮細胞（ｉＰＳ−ＬＳＥＣ）のアセチル化ＬＤＬ（Ａｃ−ＬＤＬ）及びヒアルロン酸（ＨＡ）の取り込み細胞の割合を示す。コントロールとしてＨＵＶＥＣを用いた。ｎ＝３。平均±ＳＥＭ。ＮＳ：有意差なし。ＮＤ：検出されず。
【図２４】図２４は、ヒトｉＰＳ細胞由来のＣＤ３１陽性ＦｃＲγＩＩ陽性の肝類洞内皮細胞の免疫細胞化学染色像を示す。青：核、赤：ファクターVIII（Ｆ８）
【図２５】図２５は、ヒトｉＰＳ細胞由来のＣＤ３１陽性ＦｃＲγＩＩ陽性の肝類洞内皮細胞の細胞内タンパク質（ファクターVIII：Ｆ８）のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図２６】図２６は、ヒトｉＰＳ細胞由来中胚葉細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図２７】図２７は、ヒトｉＰＳ細胞由来中胚葉細胞の分離前（before）、ＡＬＣＡＭ陽性細胞（ALCAM+）とＡＬＣＡＭ陰性細胞（ALCAM-）における、肝星前駆細胞マーカー分子の発現量を示す。ｎ＝３。平均±ＳＥＭ。
【図２８】図２８は、ヒトｉＰＳ細胞由来ヒト肝星細胞（iPS-HSC）における肝星細胞マーカー分子の発現解析結果を示す。ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMSC）をコントロールとして用いた。ｎ＝３。平均±ＳＥＭ。
【図２９】図２９は、ヒトｉＰＳ細胞由来ヒト肝星細胞（iPS-HSC）及びヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMSC）のフローサイトメトリー解析の結果を示す。細胞内のビタミンＡを自家蛍光検出した。
【図３０】図３０は、ビタミンＡ添加後のヒトｉＰＳ細胞由来ヒト肝星細胞（iPS-HSC）及びヒト骨髄由来間葉系幹細胞（hMSC）の位相差顕微鏡像を示す。スケールバー  １００μｍ
【図３１】図３１は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝類洞内皮細胞とヒトｉＰＳ細胞由来肝星細胞をフィーダー細胞としてヒトｉＰＳ細胞由来ＣＰＭ+肝前駆細胞と共培養したときの、肝前駆細胞マーカーの発現（LSEC HSC）を示す。コントロールとしてＨＵＶＥＣとｈＭＳＣをフィーダー細胞として用いた（HUVEC hMSC）。ｎ＝１
【図３２】図３２は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝類洞内皮細胞とマウス由来非実質細胞とを共培養した際の肝細胞分化に関わる遺伝子の発現解析結果を示す。左側バーは、ｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞の単独培養の結果を示し、右側バーは、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス由来非実質細胞とを共培養した結果を示す。
【図３３】図３３は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス非実質細胞とを平面培養した際の肝細胞分化に関わる遺伝子の発現解析結果を示す。図中の「ｉＰＳ肝細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞を単独培養したものを示す。図中の「＋肝類洞内皮細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス肝類洞内皮細胞とを共培養したものを示す。図中の「＋星細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス星細胞とを共培養したものを示す。図中の「＋中皮細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス中皮細胞とを共培養したものを示す。ｎ＝３。平均±ＳＥＭ。*ｐ＜０．０５，***ｐ＜０．００１。
【図３４】図３４は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス非実質細胞との三次元共培養の２日目における明視野像を示す。図中の「ｉＰＳ肝細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞を単独培養したものを示す。図中の「＋肝類洞内皮細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス肝類洞内皮細胞とを共培養したものを示す。図中の「＋星細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス星細胞とを共培養したものを示す。図中の「＋中皮細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス中皮細胞とを共培養したものを示す。(スケールバー:50μm)
【図３５】図３５は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス非実質細胞とを三次元培養した際の肝細胞分化に関わる遺伝子の発現解析結果を示す。図中の「ｉＰＳ肝細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞を単独培養したものを示す。図中の「＋肝類洞内皮細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス肝類洞内皮細胞とを共培養したものを示す。図中の「＋星細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス星細胞とを共培養したものを示す。図中の「＋中皮細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス中皮細胞とを共培養したものを示す。ｎ＝３。平均±ＳＥＭ。***Ｐ＜０．００５，*Ｐ＜０．０５
【図３６】図３６は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス非実質細胞とを平面培養、及び三次元培養した際のアルブミンの発現解析結果を示す。図中の「ｉＰＳ肝細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞を単独培養したものを示す。図中の「＋肝類洞内皮細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス肝類洞内皮細胞とを共培養したものを示す。図中の「＋星細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス星細胞とを共培養したものを示す。図中の「＋中皮細胞」は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス中皮細胞とを共培養したものを示す。（左側バー：平面培養４日目、中央バー：三次元培養２日目、右側バー：三次元培養４日目)
【図３７】図３７は、ヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とマウス非実質細胞とを平面培養（二次元培養）、及び三次元培養した際の肝機能マーカーの発現解析結果を示す。図中の「２Ｄ」は、平面培養の結果を示し、図中の「３Ｄ」は三次元培養の結果を示す。
【図３８】図３８は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）を感染させた肝前駆細胞（Ｈｅｐ−ｐｒｏ）及びそれから分化誘導した肝細胞（Ｈｅｐ）の培養上清中におけるＨＢｓ抗原の定量結果を示す。
【図３９】図３９は、ＨＢＶを感染させた肝前駆細胞（Ｈｅｐ−ｐｒｏ）及びそれから分化誘導した肝細胞（Ｈｅｐ）の培養上清中におけるＨＢｓ抗原量を示す。
【図４０】図４０は、HBV、HCV、マラリア感染に関与する分子の肝細胞での発現解析結果を示す。図中の「iPSCs-Hep」は、ＣＰＭ陽性を指標とした濃縮を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒトiPS細胞由来肝細胞を示す。図中の「CPM+-Hep」は、ＣＰＭ陽性を指標として濃縮された肝前駆細胞を分化誘導して得られた、ヒトiPS細胞由来肝細胞を示す。ｎ＝６，３。平均±ＳＥＭ。**Ｐ＜０．０１，***Ｐ＜０．００１，ＮＳ：有意差なし。
【図４１】図４１は、マウス肝前駆細胞（ＬＰＣ）、マウス成熟肝細胞（Ｈｅｐ）及びマウス胆管上皮細胞（Ｃｈｏｌ）におけるＣＰＭの発現解析結果を示す。少なくとも４回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして結果を表示する。***ｐ＜０．００１
【図４２】図４２は、胎齢１２．５日マウス胎仔肝臓のフローサイトメトリー解析の結果を示す。ＣＤ４５-ＦＬＫ１+細胞画分（左）にＣＤ３１+ＣＤ３４+/-細胞が存在する。
【図４３】図４３は、マウスＣＤ４５-ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４-細胞（ＣＤ３４-）とマウスＣＤ４５-ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞（ＣＤ３４+）における、肝類洞内皮前駆細胞マーカー分子の発現解析結果を示す。ｎ＝３。平均±ＳＥＭ。*ｐ＜０．０５，**ｐ＜０．０１，***ｐ＜０．００１。
【図４４】図４４は、マウスＣＤ４５-ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞（肝類洞内皮前駆細胞）の増殖能を示す。ｎ＝１
【図４５】図４５は、Ａ８３−０１添加５日後のマウスＣＤ４５-ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞における、肝類洞内皮細胞マーカー分子の発現解析結果を示す。添加前（Ｄａｙ０）の遺伝子発現量をコントロールとした。ｎ＝３。平均±ＳＥＭ。*ｐ＜０．０５，**ｐ＜０．０１
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書において「肝細胞」とは、胆汁の産生や各種物質の代謝などの肝臓としての主要な機能を担っている肝実質細胞のことである。肝細胞は、薬物代謝酵素ＣＹＰを発現している。また肝細胞は、アルブミン産生能及びグリコーゲン貯蔵能を有する。
【００２２】
本明細書において「肝非実質細胞」とは、肝臓を構成する、肝実質細胞（肝細胞）以外の他の細胞群のことであり、肝類洞内皮細胞、肝星細胞、中皮細胞、胆管上皮細胞、ピット細胞、クッパー細胞などが含まれる。
【００２３】
本明細書において「多能性幹細胞」とは、自己複製能と多分化能を有する細胞であり、生体を構成するあらゆる細胞を形成する能力を備える細胞をいう。「自己複製能」とは、１つの細胞から自分と同じ未分化な細胞を作る能力のことをいう。「分化能」とは、細胞が分化する能力をいう。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ＥＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell）、精子幹細胞（germline stem cell：ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell：ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：ｉＰＳ細胞）などが含まれるが、これらに限定されない。多能性幹細胞の由来は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類及び両生類のいずれでもよく、特に限定されない。哺乳動物は、霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレットなどを含む。
【００２４】
本明細書において「胚体内胚葉細胞」とは、食道、胃、小腸および大腸を含む全腸管、並びに肺、肝臓、胸腺、副甲状腺、甲状腺、胆嚢、および膵臓などの腸管に由来する器官の形成をつかさどる胚葉の細胞である。また本明細書において「肝内胚葉細胞」とは、胚体内胚葉細胞から分化した細胞であり、肝前駆細胞への分化能を有する細胞のことである。本明細書において「胚体内胚葉細胞」及び「肝前駆細胞」は、生体に存在するもののみならず、多能性幹細胞から分化して得られたものも含む。
【００２５】
本明細書において「中胚葉細胞」とは、中皮、筋肉、骨格、皮膚真皮、結合組織、心臓・血管（血管内皮も含む）、血液（血液細胞も含む）、リンパ管、脾臓、腎臓、尿管、性腺（精巣、子宮、性腺上皮）などの形成をつかさどる胚葉の細胞である。本明細書において「中胚葉細胞」は、生体に存在するもののみならず、多能性幹細胞から分化して得られたものも含む。
【００２６】
本明細書において「肝前駆細胞」とは、自己複製能を有し、かつ肝細胞又は胆管上皮細胞への分化能を有する、胚体内胚葉細胞由来の細胞のことである。本明細書において「肝前駆細胞」は、生体に存在するもののみならず、多能性幹細胞から分化して得られたものも含む。
【００２７】
本明細書において「肝類洞内皮前駆細胞」とは、自己複製能を有し、かつ肝類洞内皮細胞への分化能を有する、中胚葉細胞由来の細胞のことである。本明細書において「肝類洞内皮前駆細胞」は、生体に存在するもののみならず、多能性幹細胞から分化して得られたものも含む。
【００２８】
本明細書において「肝星前駆細胞」とは、自己複製能を有し、かつ肝星細胞への分化能を有する、中胚葉細胞由来の細胞のことである。本明細書において「肝星前駆細胞」は、生体に存在するもののみならず、多能性幹細胞から分化して得られたものも含む。
【００２９】
本明細書において「増殖能」とは、細胞の増殖する能力をいう。本明細書では格別に言及しない場合、増殖の状態は、定常状態での増殖の可能性を指す。ここで、「定常状態」とは、生体での通常の条件であって、生体の恒常性が維持されている状態をいう。そのような状態は、当業者であれば、容易に決定することができる。たとえば、細胞密度解析により、細胞密度がほぼ一定で変化しないこと、または細胞増殖マーカーの発現が認められないことなどによって確認することができる。本明細書において「増殖能が高い」とは、定常状態で増殖能を有することをいう。
【００３０】
本明細書において「細胞画分」とは、分取、単離又は濃縮したい細胞を一定量含む細胞群のことをいう。当該細胞画分は、分取、単離又は濃縮したい細胞以外の他の細胞、及び／又は、１つ以上の化学物質が含んでも良い。細胞画分の形態は特に限定されず、例えば細胞を含む液体であってもよく、当該液体が凍結されたものでもよい。
【００３１】
本発明の一態様は、肝前駆細胞を含む細胞画分から、ＣＰＭ陽性の表現型を指標として肝前駆細胞を分取する工程を含む、肝前駆細胞の調製方法に関する。以下で「本発明の肝前駆細胞の調製方法」とも呼ぶ。
【００３２】
「本発明の肝前駆細胞の調製方法」において使用される「肝前駆細胞を含む細胞画分」は、特に限定されないが、肝前駆細胞へと分化する任意の細胞を原料として調製されてもよい。例えば、胚体内胚葉細胞又は肝内胚葉細胞を分化誘導して調製されてもよい。また当該細胞画分は、生体から抽出して調製されてもよい。例えば、動物の胎仔の肝臓から調製されてもよい。本発明の肝前駆細胞の調製方法の一実施形態において、当該調製方法は、肝前駆細胞を含む細胞画分を調製する工程をさらに含む。
【００３３】
「本発明の肝前駆細胞の調製方法」において使用される「肝前駆細胞を含む細胞画分」が、胚体内胚葉細胞又は肝内胚葉細胞を分化誘導して調製される場合、当該胚体内胚葉細胞又は肝内胚葉細胞は、生体から抽出して調製されたものであってもよく、多能性幹細胞を分化誘導して調製されたものでもよい。多能性幹細胞を分化誘導して調製される場合、使用される多能性幹細胞は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物の多能性幹細胞であり、より好ましくは、霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ又はフェレットの多能性幹細胞であり、さらに好ましくはヒトの多能性幹細胞であり、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。
【００３４】
多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞及び肝内胚葉細胞を経由して肝前駆細胞に至る分化誘導は、公知の方法を用いればよく、特に限定されない。例えば非特許文献２（Si-Tayeb et al., Hepatology 2010, 51(1), 297-305）に記載されているように、ヒトｉＰＳ細胞からヒト肝前駆細胞を分化誘導する手順と同様にして行われても良い。
【００３５】
カルボキシペプチダーゼＭ（ＣＰＭ）とは、カルボキシペプチダーゼファミリーのひとつである。ＣＰＭは細胞膜表面に発現し、ペプチドやタンパク質のＣ末端からアルギニン及びリジン残基を切断する。驚くべきことに、ＣＰＭは肝前駆細胞特異的マーカー分子であることが明らかとなった。ＣＰＭは、肝前駆細胞では高発現しているが、分化前の多能性幹細胞や、分化後の肝細胞や胆管上皮細胞においては発現していない。従来、肝前駆細胞特有のマーカーとして、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＨＮＦ４ａが知られている。しかし、これらは細胞内因子であり、当該マーカーを指標とした場合には細胞を破壊せずに肝前駆細胞を回収することはできない。一方、ＣＰＭは膜タンパク質であるため、これを指標として肝前駆細胞を破壊せずに回収可能である。
【００３６】
ＣＰＭ陽性の表現型を指標として肝前駆細胞を分取する工程は、特に限定されないが、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）(Fluorescence Activated Cell Sorting)又は磁気細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）(Magnetic Cell Sorting)により行われても良い。
【００３７】
「本発明の肝前駆細胞の調製方法」の一実施形態において、当該調製方法は、分取された肝前駆細胞を増殖させる工程をさらに含んでもよい。当該増殖工程における細胞培養の条件は、肝前駆細胞の増殖を阻害しない限り特に限定されない。
【００３８】
本発明の一態様は、肝前駆細胞を含む細胞画分から、ＣＰＭ陽性の表現型を指標として肝前駆細胞を分取する工程を含む、肝前駆細胞の単離方法に関する。また、本発明の一態様は、肝前駆細胞を含む細胞画分から、ＣＰＭ陽性の表現型を指標として肝前駆細胞を分取する工程を含む、肝前駆細胞の濃縮方法に関する。
【００３９】
本発明の一態様は、本発明の肝前駆細胞の調製方法によって調製され得、ＣＰＭ陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝細胞又は胆管上皮細胞への分化能を有する、肝前駆細胞に関する。以下で「本発明の肝前駆細胞」とも呼ぶ。
【００４０】
「本発明の肝前駆細胞」は、凍結保存することができる。凍結後、解凍した後における本発明の肝前駆細胞の増殖能は、凍結保存前における本発明の肝前駆細胞の増殖能と比較して低下しない。「本発明の肝前駆細胞」は、例えば、−８０℃で、３か月以上、６か月以上、９か月以上、又は１２か月以上保存することが可能である。本発明の肝前駆細胞の高い増殖能及び凍結保存性により、肝前駆細胞を必要に応じて解凍して培養することが可能である。
【００４１】
「本発明の肝前駆細胞」は、継代培養することができる。
【００４２】
「本発明の肝前駆細胞」は、肝前駆細胞のマーカーとして知られているα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＨＮＦ４ａ、ＡＦＰ、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ１α、ＰＲＯＸ１、ＴＢＸ３、ＣＤ１３、ＥｐＣＡＭ及びＨＨＥＸを発現する。
【００４３】
本発明の一態様は、全細胞に対して９０％以上の肝前駆細胞を含む細胞画分であって、前記肝前駆細胞はＣＰＭ陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝細胞又は胆管上皮細胞への分化能を有する、細胞画分に関する。以下で「本発明の肝前駆細胞を含む細胞画分」とも呼ぶ。
【００４４】
「本発明の肝前駆細胞を含む細胞画分」には、当該画分中の全細胞に対して、肝前駆細胞が９０％以上含まれ、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上含まれる。「本発明の肝前駆細胞を含む細胞画分」には、本発明の肝前駆細胞の濃縮画分や、当該濃縮画分を培養することで得られる細胞群も含まれる。
【００４５】
「本発明の肝前駆細胞を含む細胞画分」は、特に限定されないが、例えば、上記の本発明の肝前駆細胞の調製方法に従って調製され得る。
【００４６】
本発明の一態様は、本発明の肝前駆細胞を肝細胞へと分化誘導する工程を含む、肝細胞の調製方法に関する。以下で「本発明の肝細胞の調製方法」とも呼ぶ。
【００４７】
「本発明の肝細胞の調製方法」の一実施形態は、（１）肝前駆細胞を含む細胞画分から、ＣＰＭ陽性の表現型を指標として肝前駆細胞を分取する工程、及び（２）分取された前記肝前駆細胞を肝細胞へと分化誘導する工程を含む、肝細胞の調製方法に関する。
【００４８】
肝前駆細胞から肝細胞への分化誘導は、公知の方法を用いればよく、特に限定されない。例えば、非特許文献２（Si-Tayeb et al., Hepatology 2010, 51 (1), 297-305）に記載されているように、インターロイキン６(interleukin-6：IL-6)ファミリーサイトカインとして知られるオンコスタチンＭを用いて、ヒト肝前駆細胞を含む培地を処理することにより行われても良い。
【００４９】
「本発明の肝細胞の調製方法」の一実施形態において、当該調製方法は、分化誘導して得られた肝細胞を増殖させる工程をさらに含んでもよい。当該増殖工程における細胞培養の条件は、肝細胞の増殖を阻害しない限り特に限定されない。
【００５０】
本発明の一態様は、本発明の肝細胞の調製方法で調製され得る、増殖能を有する肝細胞に関する。以下で「本発明の肝細胞」とも呼ぶ。
【００５１】
「本発明の肝細胞」は、薬物代謝酵素ＣＹＰ（例えば、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ｃ８）を高レベルで発現する。例えば、肝前駆細胞を含む細胞画分からＣＰＭ陽性の表現型を指標として分取された肝前駆細胞を分化誘導して調製された本発明の肝細胞は、ＣＰＭ陽性の表現型を指標とした肝前駆細胞の分取を行わずに、前記細胞画分と同一組成の細胞画分に分化誘導工程を施して調製された肝細胞と比較して、ＣＹＰ３Ａ４を少なくとも２倍以上発現し得る。
【００５２】
「本発明の肝細胞」は、分化誘導前の肝前駆細胞と比較して、高いアルブミン産生能及びグリコーゲン蓄積能を有する。好ましくは、肝前駆細胞を含む細胞画分からＣＰＭ陽性の表現型を指標として分取された肝前駆細胞を分化誘導して調製された本発明の肝細胞は、ＣＰＭ陽性の表現型を指標とした肝前駆細胞の分取を行わずに、前記細胞画分と同一組成の細胞画分に分化誘導工程を施して調製された肝細胞と比較して、高いアルブミン産生能及びグリコーゲン蓄積能を有する。
【００５３】
本発明の一態様は、「本発明の肝細胞」を含む、細胞画分に関する。好ましくは、当該細胞画分は、全細胞に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の「本発明の肝細胞」を含む。
【００５４】
本発明の一態様は、本発明の肝前駆細胞を胆管上皮細胞へと分化誘導する工程を含む、胆管上皮細胞の調製方法に関する。以下で「本発明の胆管上皮細胞の調製方法」とも呼ぶ。
【００５５】
「本発明の胆管上皮細胞の調製方法」の一実施形態は、（１）肝前駆細胞を含む細胞画分から、ＣＰＭ陽性の表現型を指標として肝前駆細胞を分取する工程、及び（２）分取された前記肝前駆細胞を胆管上皮細胞へと分化誘導する工程を含む、胆管上皮細胞の調製方法に関する。
【００５６】
「本発明の胆管上皮細胞の調製方法」において、本発明の肝前駆細胞から胆管上皮細胞への分化誘導は、公知の方法を用いればよく、特に限定されない。例えば、Tanimizu et al., Mol Biol Cell, 2007, 18(4), 1472-1479またはYanagida et al., PloS ONE 8, e67541に記載された三次元ゲル培養法によって行われても良い。
【００５７】
「本発明の胆管上皮細胞の調製方法」の一実施形態において、当該調製方法は、分化誘導して得られた胆管上皮細胞を増殖させる工程をさらに含んでもよい。当該増殖工程における細胞培養の条件は、胆管上皮細胞の増殖を阻害しない限り特に限定されない。
【００５８】
本発明の一態様は、本発明の胆管上皮細胞の調製方法で調製され得る、増殖能を有する胆管上皮細胞に関する。以下で「本発明の胆管上皮細胞」とも呼ぶ。
【００５９】
「本発明の胆管上皮細胞」は、胆管上皮細胞のマーカーとして知られているＣＫ７、ＣＦＴＲ、ＡＱＰ１、ＴＧＲ５、ＳＯＸ９及びＨＮＦ６を発現する。
【００６０】
本発明の一態様は、「本発明の胆管上皮細胞」を含む、細胞画分に関する。好ましくは、当該細胞画分は、全細胞に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の「本発明の胆管上皮細胞」を含む。
【００６１】
発明の一態様は、肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分から、ＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を指標として肝類洞内皮前駆細胞を分取する工程を含む、肝類洞内皮前駆細胞の調製方法に関する。以下で「本発明の肝類洞内皮前駆細胞の調製方法」とも呼ぶ。
【００６２】
「本発明の肝類洞内皮前駆細胞の調製方法」において使用される「肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分」は、特に限定されないが、肝類洞内皮前駆細胞へと分化する任意の細胞を原料として調製されてもよい。例えば、中胚葉細胞を分化誘導して調製されてもよい。また例えば、造血系幹細胞を分化誘導して調製されてもよい。また当該細胞画分は、生体から抽出して調製されてもよい。例えば、動物の胎仔の肝臓から調製されてもよい。本発明の肝類洞内皮前駆細胞の調製方法の一実施形態において、当該調製方法は、肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分を調製する工程をさらに含む。
【００６３】
「本発明の肝類洞内皮前駆細胞の調製方法」において使用される「肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分」が、中胚葉細胞を分化誘導して調製される場合、当該中胚葉細胞は、生体から抽出して調製されたものであってもよく、多能性幹細胞を分化誘導して調製されたものでもよい。多能性幹細胞から中胚葉細胞への分化は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、胚様体（Embryo body；EB）を経由する方法であってもよい。また例えば、Kattman S J, et al., Cell Stem Cell, 2011, 8, 228-40に記載された方法に従って行われてもよい。多能性幹細胞としては、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物の多能性幹細胞であり、より好ましくは、霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ又はフェレットの多能性幹細胞であり、さらに好ましくはヒトの多能性幹細胞であり、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。
【００６４】
中胚葉細胞の肝類洞内皮前駆細胞への分化誘導は、公知の方法を用いればよく、特に限定されない。例えば、Kattman S J, et al., Cell Stem Cell, 2011, 8, 228-40に記載された方法に従って行われてもよい。
【００６５】
「本発明の肝類洞内皮前駆細胞の調製方法」の一実施形態は、（１）中胚葉細胞を分化誘導して肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分を調製する工程、（２）ＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を指標として肝類洞内皮前駆細胞を分取する工程を含む、肝類洞内皮前駆細胞の調製方法に関する。
【００６６】
ＦＬＫ１、ＣＤ３４、ＣＤ３１は、血管内皮細胞マーカーとして知られている。驚くべきことに、ＦＬＫ１、ＣＤ３４及びＣＤ３１の組み合わせが、肝類洞内皮前駆細胞の特異的マーカーとなることが明らかとなった。
【００６７】
ＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を指標として肝類洞内皮前駆細胞を分取する工程は、特に限定されないが、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）(Fluorescence Activated Cell Sorting)又は磁気細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）(Magnetic Cell Sorting)により行われても良い。
【００６８】
「本発明の肝類洞内皮前駆細胞の調製方法」の一実施形態において、当該調製方法は、分取された肝類洞内皮前駆細胞を増殖させる工程をさらに含んでもよい。当該増殖工程における細胞培養の条件は、肝類洞内皮前駆細胞の増殖を阻害しない限り特に限定されない。
【００６９】
本発明の一態様は、肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分から、ＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を指標として肝類洞内皮前駆細胞を分取する工程を含む、肝類洞内皮前駆細胞の単離方法に関する。また、本発明の一態様は、肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分から、ＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を指標として肝類洞内皮前駆細胞を分取する工程を含む、肝類洞内皮前駆細胞の濃縮方法に関する。
【００７０】
発明の一態様は、本発明の肝類洞内皮前駆細胞の調製方法で調製され得、ＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝類洞内皮細胞への分化能を有する、肝類洞内皮前駆細胞に関する。以下で「本発明の肝類洞内皮前駆細胞」とも呼ぶ。
【００７１】
「本発明の肝類洞内皮前駆細胞」は、凍結保存することができる。凍結後、解凍した後における本発明の肝類洞内皮前駆細胞の増殖能は、凍結保存前における本発明の肝類洞内皮前駆細胞の増殖能と比較して低下しない。「本発明の肝類洞内皮前駆細胞」は、例えば、−８０℃で、３か月以上、６か月以上、９か月以上、又は１２か月以上保存することが可能である。本発明の肝類洞内皮前駆細胞の優れた増殖能及び凍結保存性により、肝類洞内皮前駆細胞を必要に応じて適宜大量培養することが可能である。
【００７２】
「本発明の肝類洞内皮前駆細胞」は、継代培養することができる。
【００７３】
本発明の一態様は、全細胞に対して９０％以上の肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分であって、前記肝類洞内皮前駆細胞はＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝類洞内皮細胞への分化能を有する、細胞画分に関する。以下で「本発明の肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分」とも呼ぶ。
【００７４】
「本発明の肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分」には、当該画分中の全細胞に対して、肝類洞内皮前駆細胞が９０％以上含まれ、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上含まれる。「本発明の肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分」には、本発明の肝類洞内皮前駆細胞の濃縮画分や、当該濃縮画分を培養することで得られる細胞群も含まれる。
【００７５】
「本発明の肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分」は、特に限定されないが、例えば、上記の「本発明の肝類洞内皮前駆細胞の調製方法」に従って調製され得る。
【００７６】
発明の一態様は、（１）ＴＧＦ−β阻害剤を用いて、本発明の肝類洞内皮前駆細胞を分化誘導して肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分を調製する工程、（２）肝類洞内皮細胞を含む前記細胞画分からＣＤ３１陽性およびＦｃγＲ ＩＩ陽性の表現型を指標として肝類洞内皮細胞を分取する工程、を含む、肝類洞内皮細胞の調製方法に関する。以下で「本発明の肝類洞内皮細胞の調製方法」とも呼ぶ。
【００７７】
「本発明の肝類洞内皮細胞の調製方法」の一実施形態は、（１）肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分から、ＦＬＫ１陽性、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３１陽性の表現型を指標として肝類洞内皮前駆細胞を分取する工程、（２）ＴＧＦ−β阻害剤を用いて、本発明の肝類洞内皮前駆細胞を分化誘導して肝類洞内皮前駆細胞を調製する工程、（３）肝類洞内皮細胞を含む前記細胞画分からＣＤ３１陽性およびＦｃγＲ ＩＩ陽性の表現型を指標として肝類洞内皮細胞を分取する工程を含む、肝類洞内皮細胞の調製方法に関する。
【００７８】
本明細書において「ＴＧＦ−β阻害剤」とは、トランスフォーミング増殖因子であるＴＧＦ−βの機能またはシグナル伝達を阻害するための薬剤のことであり、低分子化合物、抗体、またはアンチセンス化合物などの形態のものであってもよい。本発明の肝類洞内皮細胞の調製方法において使用されるＴＧＦ−β阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、Ａ８３−０１（３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾロ−１−カルボチオアミド）、Ｉ６１６４５１（３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノニル））−１Ｈ−ピラゾール）、ＬＤＮ１９３１８９（４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリン）、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＳＢ−５０５１２４（２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物）、ＳＤ−２０８（２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）プテリジン−４−イル）ピリジン−４−イル−アミン）、ＳＢ−５２５３３４（６−［２−（１，１−ジメチルエチル）−５−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］キノキサリン）、ＬＹ−３６４９４７（４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン）、ＬＹ２１５７２９９（４−［２−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−５，６−ジヒドロ−４Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ］ピラゾール−３−イル］−キノリン−６−カルボン酸アミド）、Ｄ４４７６（４−［４−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾル−２−イル］ベンズアミド）などが挙げられる。好ましくは、Ａ８３−０１である。
【００７９】
ＣＤ３１陽性およびＦｃγＲ ＩＩ陽性の表現型を指標として肝類洞内皮細胞を分取する工程は、特に限定されないが、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）(Fluorescence Activated Cell Sorting)又は磁気細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）(Magnetic Cell Sorting)により行われても良い。
【００８０】
「本発明の肝類洞内皮細胞の調製方法」の一実施形態において、当該調製方法は、分化誘導して得られた肝類洞内皮細胞を増殖させる工程をさらに含んでもよい。当該増殖工程における細胞培養の条件は、肝類洞内皮細胞の増殖を阻害しない限り特に限定されない。
【００８１】
発明の一態様は、「本発明の肝類洞内皮細胞の調製方法」で調製され得、ＣＤ３１陽性およびＦｃγＲ ＩＩ陽性の表現型を有し、増殖能を有する、肝類洞内皮細胞に関する。以下で「本発明の肝類洞内皮細胞」とも呼ぶ。
【００８２】
本発明の肝類洞内皮細胞はまた、肝類洞内皮細胞のマーカーとして知られているＳｔａｂ２、Ｌｙｖｅ１及びファクターVIIIを発現する。
【００８３】
「本発明の肝類洞内皮細胞」は、血管内皮細胞に特徴的な機能であるアセチル化ＬＤＬの取り込み能を有する。また、本発明の肝類洞内皮細胞は、肝類洞内皮細胞に特徴的な機能であるヒアルロン酸の取り込み能を有する。また、「本発明の肝類洞内皮細胞」は、血管網形成能を有する。
【００８４】
ファクターVIIIの欠損又は活性低下は、血友病の原因とされる。例えば、本発明の肝類洞内皮細胞を血友病患者へ移植することによって血友病を処置し得る。
【００８５】
本発明の一態様は、「本発明の肝類洞内皮細胞」を含む細胞画分に関する。好ましくは、当該細胞画分は、全細胞に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の「本発明の肝類洞内皮細胞」を含む。
【００８６】
本発明の一態様は、全細胞に対して９０％以上の肝類洞内皮細胞を含む細胞画分であって、前記肝類洞内皮細胞はＣＤ３１陽性およびＦｃγＲ ＩＩ陽性の表現型を有し、増殖能をする、細胞画分に関する。当該細胞画分は、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の前記肝類洞内皮細胞を含む。
【００８７】
発明の一態様は、肝星前駆細胞を含む細胞画分からＡＬＣＡＭ陽性の表現型を指標として肝星前駆細胞を分取する工程を含む、肝星前駆細胞の調製方法に関する。以下で「本発明の肝星前駆細胞の調製方法」とも呼ぶ。
【００８８】
「本発明の肝星前駆細胞の調製方法」において使用される「肝星前駆細胞を含む細胞画分」は、特に限定されないが、肝星前駆細胞へと分化する任意の細胞を原料として調製されてもよい。例えば、肝星前駆細胞を含む中胚葉細胞集団から調製されてもよい。また例えば、間葉系幹細胞（Mesenchymal Stem Cells：MSC）を分化誘導して調製されてもよい。また当該細胞画分は、生体から抽出して調製されてもよい。例えば、動物の胎仔の肝臓から調製されてもよい。本発明の肝星前駆細胞の調製方法の一実施形態において、当該調製方法は、肝前駆細胞を含む細胞画分を調製する工程をさらに含む。
【００８９】
「本発明の肝星前駆細胞の調製方法」において使用される「肝星前駆細胞を含む細胞画分」が、中胚葉細胞から調製される場合、当該中胚葉細胞は、生体から抽出して調製されてもよいし、多能性幹細胞から分化誘導して調製されてもよい。多能性幹細胞から中胚葉細胞への分化は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、胚様体（Embryo body；EB）を経由する方法であってもよい。また例えば、Kattman S J, et al., Cell Stem Cell, 2011, 8, 228-40に記載された方法に従って行われてもよい。多能性幹細胞は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物の多能性幹細胞であり、より好ましくは、霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ又はフェレットの多能性幹細胞であり、さらに好ましくはヒトの多能性幹細胞であり、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。
【００９０】
活性化白血球細胞接着分子（Activated-Leukocyte Cell Adhesion Molecule：ＡＬＣＡＭ）は、横中隔間充織の間葉系細胞のマーカーとして知られている。驚くべきことに、ＡＬＣＡＭが肝星前駆細胞の特異的マーカーであることが明らかとなった。
【００９１】
ＡＬＣＡＭ陽性の表現型を指標として肝星前駆細胞を分取する工程は、特に限定されないが、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）(Fluorescence Activated Cell Sorting)又は磁気細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）(Magnetic Cell Sorting)により行われても良い。
【００９２】
「本発明の肝星前駆細胞の調製方法」の一実施形態において、当該調製方法は、分取された肝星前駆細胞を増殖させる工程をさらに含んでもよい。当該増殖工程における細胞培養の条件は、肝星前駆細胞の増殖を阻害しない限り特に限定されない。
【００９３】
本発明の一態様は、肝星前駆細胞を含む細胞画分からＡＬＣＡＭ陽性の表現型を指標として肝星前駆細胞を分取する工程を含む、肝星前駆細胞の単離方法に関する。また、本発明の一態様は、肝星前駆細胞を含む細胞画分からＡＬＣＡＭ陽性の表現型を指標として肝星前駆細胞を分取する工程を含む、肝星前駆細胞の濃縮方法に関する。
【００９４】
発明の一態様は、本発明の肝星前駆細胞の調製方法で調製され得、ＡＬＣＡＭ陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝星細胞への分化能を有する、肝星前駆細胞に関する。以下で「本発明の肝星前駆細胞」とも呼ぶ。
【００９５】
「本発明の肝星前駆細胞」は、凍結保存することができる。凍結後、解凍した後における本発明の肝星前駆細胞の増殖能は、凍結保存前における本発明の肝星前駆細胞の増殖能と比較して低下しない。「本発明の肝星前駆細胞」は、例えば、−８０℃で、３か月以上、６か月以上、９か月以上、又は１２か月以上保存することが可能である。本発明の肝星前駆細胞の優れた増殖能及び凍結保存性により、肝星前駆細胞を必要に応じて適宜大量培養することが可能である。
【００９６】
発明の一態様は、全細胞に対して９０％以上の肝星前駆細胞を含む細胞画分であって、前記肝星前駆細胞はＡＬＣＡＭ陽性の表現型を有し、増殖能を有し、肝星細胞への分化能を有する、細胞画分に関する。以下で「本発明の肝星前駆細胞を含む細胞画分」とも呼ぶ。
【００９７】
「本発明の肝星前駆細胞を含む細胞画分」には、当該画分中の全細胞に対して、肝星前駆細胞が９０％以上含まれ、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上含まれる。「本発明の肝星前駆細胞を含む細胞画分」には、本発明の肝星前駆細胞の濃縮画分や、当該濃縮画分を培養することで得られる細胞群も含まれる。
【００９８】
「本発明の肝星前駆細胞を含む細胞画分」は、特に限定されないが、例えば、上記の「本発明の肝星前駆細胞の調製方法」に従って調製され得る。
【００９９】
発明の一態様は、Ｒｏｃｋ阻害剤を用いて、肝星前駆細胞を肝星細胞へと分化誘導する工程を含む、肝星細胞の調製方法に関する。以下で「本発明の肝星細胞の調製方法」とも呼ぶ。
【０１００】
Ｒｈｏキナーゼ（Rho-associated protein kinase：Ｒｏｃｋ）は、低分子量ＧＴＰ結合蛋白Ｒｈｏの標的蛋白質として同定されたセリン−スレオニン蛋白リン酸化酵素であり、平滑筋収縮や細胞の形態変化など様々な生理機能に関与していることが知られている。本明細書において「Ｒｏｃｋ阻害剤」とは、Ｒｏｃｋの機能を阻害するための薬剤のことであり、低分子化合物、抗体、またはアンチセンス化合物などの形態のものであってもよい。本発明の肝星細胞の調製方法において使用されるＲｏｃｋ阻害剤としては、特に限定されないが、例えば、Ｙ２７６３２（（Ｒ）−（＋）−トランス−Ｎ−（４−ピリジル）−４−（１−アミノエチル）−シクロヘキサンカルボキサミド）、ファスジル（Fasudil）（ヘキサヒドロ−１−（５−イソキノリンスルホニル）−１Ｈ−１，４−ジアゼピン）、Ｈ−１１５２（（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スフホニル］−ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−ジアゼピン）などが挙げられる。好ましくは、Ｙ２７６３２である。
【０１０１】
「本発明の肝星細胞の調製方法」において使用される肝星前駆細胞は、特に限定されないが、肝星前駆細胞へと分化する任意の細胞を原料として調製されてもよい。例えば、肝星前駆細胞を含む中胚葉細胞集団から調製されてもよい。また例えば、上記した「本発明の肝星前駆細胞の調製方法」に従って調製されてもよい。また当該肝星前駆細胞は、生体から抽出して調製されてもよい。本発明の肝星細胞の調製方法の一実施形態において、当該調製方法は、肝星前駆細胞を調製する工程をさらに含む。
【０１０２】
本発明の肝星細胞の調製方法の一実施形態は、（１）肝星前駆細胞を含む細胞画分からＡＬＣＡＭ陽性の表現型を指標として肝星前駆細胞を分取する工程、及び（２）Ｒｏｃｋ阻害剤を用いて、肝星前駆細胞を肝星細胞へと分化誘導する工程を含む、肝星細胞の調製方法に関する。また本発明の肝星細胞の調製方法の別の実施形態において、使用される肝星前駆細胞は、「本発明の肝星前駆細胞」である。
【０１０３】
本発明の肝星細胞の調製方法の一実施形態において、当該調製方法は、分化誘導して得られた肝星細胞を増殖させる工程をさらに含んでもよい。当該増殖工程における細胞培養の条件は、肝星細胞の増殖を阻害しない限り特に限定されない。
【０１０４】
本発明の一態様は、本発明の肝星細胞の調製方法で調製され得、増殖能を有する、肝星細胞に関する。以下で「本発明の肝星細胞」とも呼ぶ。
【０１０５】
本発明の一態様は、「本発明の肝星細胞」を含む細胞画分に関する。好ましくは、当該細胞画分は、全細胞に対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の「本発明の肝星細胞」を含む。
【０１０６】
本発明の一態様は、本発明の肝前駆細胞を、肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞から成る群から選択される少なくとも１つの肝非実質細胞と共培養する工程を含む、肝細胞組織モデルの調製方法に関する。以下で「本発明の肝細胞組織モデルの調製方法」とも呼ぶ。
【０１０７】
「本発明の肝細胞組織モデルの調製方法」で使用される肝類洞内皮細胞は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類及び両生類のいずれの肝類洞内皮細胞でもよく、特に限定されない。好ましくは哺乳動物の肝類洞内皮細胞であり、より好ましくは、霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ又はフェレットの肝類洞内皮細胞であり、特に好ましくはヒトの肝類洞内皮細胞である。当該肝類洞内皮細胞は、本発明の肝類洞内皮細胞であってもよい。また当該肝類洞内皮細胞は、肝類洞内皮細胞へと分化する任意の細胞を原料として調製されてもよい。例えば、多能性幹細胞、中胚葉細胞又は肝類洞内皮細胞を分化誘導して調製されてもよい。また当該肝類洞内皮細胞は、生体から抽出して調製されてもよい。例えば、動物の胎仔の肝臓から調製されてもよい。当該肝類洞内皮細胞は、「本発明の肝類洞内皮細胞の調製方法」に従って調製されてもよい。
【０１０８】
「本発明の肝細胞組織モデルの調製方法」で使用される肝星細胞は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類のいずれの肝星細胞でもよく、特に限定されない。好ましくは哺乳動物の肝星細胞であり、より好ましくは、霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ又はフェレットの肝星細胞であり、特に好ましくはヒトの肝星細胞である。ここで、当該肝星細胞は、本発明の肝星細胞であってもよい。また当該肝星細胞は、肝星細胞へと分化する任意の細胞を原料として調製されてもよい。例えば、多能性幹細胞、中胚葉細胞又は肝星前駆細胞を分化誘導して調製されてもよい。また当該細胞画分は、生体から抽出して調製されてもよい。例えば、動物の胎仔の肝臓から調製されてもよい。当該肝星細胞は、「本発明の肝星細胞の調製方法」に従って調製されてもよい。
【０１０９】
「本発明の肝細胞組織モデルの調製方法」で使用される肝中皮細胞は、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類のいずれの肝中皮細胞でもよく、特に限定されない。好ましくは哺乳動物の肝中皮細胞であり、好ましくは、霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ又はフェレットの肝中皮細胞である。また当該肝中皮細胞は、肝中皮細胞へと分化する任意の細胞を原料として調製されてもよい。例えば、多能性幹細胞を分化誘導して調製されてもよい。また当該肝中皮細胞は、生体から抽出して調製されてもよい。例えば、動物の胎仔の肝臓から調製されてもよい。
【０１１０】
「本発明の肝細胞組織モデルの調製方法」において、共培養する工程における条件は、肝前駆細胞の分化誘導を促進するものである限り特に限定されないが、例えば、二次元培養（平面培養）、又は三次元培養される。好ましくは三次元培養される。
【０１１１】
本発明の一態様は、肝細胞と、肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞から成る群から選択される少なくとも１つの肝非実質細胞とを含み、「本発明の肝細胞組織モデルの調製方法」で調製され得る肝細胞組織モデルに関する。以下で「本発明の肝細胞組織モデル」とも呼ぶ。
【０１１２】
本発明の一態様は、本発明の肝前駆細胞、本発明の肝前駆細胞を含む細胞画分、本発明の肝細胞、本発明の胆管上皮細胞、本発明の肝類洞内皮前駆細胞、本発明の肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分、本発明の肝類洞内皮細胞、本発明の肝星前駆細胞、本発明の肝星前駆細胞を含む細胞画分、本発明の肝星細胞、或いは本発明の肝細胞組織モデルを含む、医薬組成物に関する。以下で「本発明の医薬組成物」とも呼ぶ。
【０１１３】
「本発明の医薬組成物」は、薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝剤、賦形剤又はこれらの組み合わせをさらに含んでも良い。
【０１１４】
「本発明の医薬組成物」の一実施形態において、当該医薬組成物は、細胞移植治療用材料若しくは細胞移植治療用組成物、又は再生医療用材料若しくは再生医療用組成物である。
【０１１５】
本発明の医薬組成物の投与部位は特に限定されないが、例えば、肝臓内、脾臓内、門脈内、腸管膜内、腹腔内、腎臓被膜下、リンパ節であってもよい。
【０１１６】
本発明の一態様は、本発明の肝細胞又は本発明の肝細胞組織モデルに肝疾患治療剤の候補品を投与することを含む、肝疾患治療剤のスクリーニング方法に関する。以下で「本発明の肝疾患治療剤のスクリーニング方法」とも呼ぶ。
【０１１７】
「本発明の肝疾患治療剤のスクリーニング方法」における肝疾患としては、特に限定されないが、例えば、フェニルケトン尿症および他のアミノ酸血症、血友病および他の凝固因子欠損症、家族性高コレステロール血症および他の脂質代謝障害、尿素回路障害、糖原病、ガラクトーゼ血症、果糖血症、チロシン血症、タンパク質・糖質代謝欠損症、有機酸尿、ミトコンドリア病、ペルオキシソーム・リソソーム異常、タンパク質合成異常、肝細胞トランスポーター欠損、グリコシル化異常、肝炎、肝硬変、先天性代謝異常、急性肝不全、急性肝感染症、急性化学毒性、慢性肝不全、胆管炎、胆汁性肝硬変症、アラギル症候群、α−１−アンチトリプシン欠損症、自己免疫性肝炎、胆道閉鎖症、肝癌、肝嚢胞性疾患、脂肪肝、ガラクトーゼ血症、胆石、ジルベール症候群、血色素症、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、および他の肝炎ウィルス感染症、ポルフィリン症、原発性硬化性胆管炎、ライ症侯群、類肉腫症、チロシン血症、１型糖原病、あるいはウィルソン病が挙げられる。
【０１１８】
本発明の一態様は、「本発明の肝細胞」又は「本発明の肝細胞組織モデル」に薬剤を投与することを含む、薬剤の肝毒性の評価方法に関する。以下で「本発明の薬剤の肝毒性の評価方法」とも呼ぶ。
【０１１９】
「本発明の薬剤の肝毒性の評価方法」は、特に限定されないが、例えば、ＣＹＰ（例えば、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ｃ８）の阻害活性を調べることを含む。
【０１２０】
本発明の一態様は、（１）「本発明の肝前駆細胞」、又は「本発明の肝前駆細胞を含む細胞画分」中の肝臓前駆細胞に病原体を感染させる工程、（２）病原体を感染した前記肝前駆細胞を分化誘導して感染性疾患モデルの肝細胞を調製することを含む、感染性肝疾患モデルの肝細胞の調製方法に関する。また、本発明の一態様は、本発明の肝細胞に病原体を感染させる工程を含む、感染性疾患モデルの肝細胞の調製方法に関する。以下でこれらの調製方法を「本発明の感染性疾患モデルの肝細胞の調製方法」とも呼ぶ。
【０１２１】
「本発明の感染性疾患モデルの肝細胞の調製方法」において使用される病原体としては、特に限定されないが、例えば、肝炎ウィルス（例えば、Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウィルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウィルス（ＨＥＶ）、Ｆ型肝炎ウィルス（ＨＦＶ）、Ｇ型肝炎ウィルス（ＨＧＶ）、ＴＴ型肝炎ウィルス（ＨＴＴＶ））、マラリア原虫などが挙げられる。
【０１２２】
「本発明の感染性疾患モデルの肝細胞の調製方法」において、「感染性疾患」とは、感染する病原体に依存するが、例えば肝炎（例えば例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、Ｆ型肝炎、Ｇ型肝炎、ＴＴ型肝炎）及びマラリアが挙げられる。
【０１２３】
本発明の一態様は、本発明の感染性疾患モデルの肝細胞の調製方法によって調製され得る、感染性疾患モデルの肝細胞に関する。以下で「本発明の感染性疾患モデルの肝細胞」とも呼ぶ。
【０１２４】
本発明の一態様は、（１）本発明の肝前駆細胞に病原体を感染させる工程、（２）病原体を感染した前記肝前駆細胞を、肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞から成る群から選択される少なくとも１つの肝非実質細胞と共培養する工程を含む、感染性疾患モデル組織の調製方法に関する。以下で「本発明の感染性疾患モデル組織の調製方法」とも呼ぶ。
【０１２５】
「本発明の感染性肝疾患モデル組織の調製方法」で使用される肝類洞内皮細胞、肝星細胞及び肝中皮細胞は特に限定されず、「本発明の肝細胞組織モデルの調製方法」において挙げられたものと同様でよい。
【０１２６】
「本発明の感染性疾患モデル組織の調製方法」で使用される病原体、及び対象となる疾患は特に限定されず、「本発明の感染性疾患モデルの肝細胞」において挙げられたものと同様でよい。
【０１２７】
本発明の一態様は、本発明の感染性疾患モデル組織の調製方法によって調製され得る、感染性疾患モデル組織に関する。以下で「本発明の感染性疾患モデル組織」とも呼ぶ。
【０１２８】
本発明の一態様は、「本発明の感染性疾患モデルの肝細胞」又は「本発明の感染性疾患モデル組織」へ、感染性肝疾患治療剤の候補品を投与することを含む、感染性肝疾患治療剤のスクリーニング方法に関する。
【０１２９】
本発明の一態様は、本発明の肝前駆細胞、本発明の肝前駆細胞を含む細胞画分、本発明の肝細胞、本発明の胆管上皮細胞、本発明の肝類洞内皮前駆細胞、本発明の肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞画分、本発明の肝類洞内皮細胞、本発明の肝星前駆細胞、本発明の肝星前駆細胞を含む細胞画分、本発明の肝星細胞、或いは本発明の肝細胞組織モデルを含む、キットに関する。以下で「本発明のキット」とも呼ぶ。
【０１３０】
本発明のキットは、特に限定されないが、例えば、本発明の肝細胞、本発明の胆管上皮細胞、発明の肝類洞内皮細胞本発明の肝星細胞又は本発明の肝細胞組織モデルの調製のために、本発明の医薬組成物の調製のために、本発明の肝疾患治療剤のスクリーニング方法のために、本発明の薬剤の肝毒性の評価方法のために、本発明の感染性疾患モデルの肝細胞の調製のために、本発明の感染性疾患モデル組織の調製のために、或いは、感染性肝疾患治療剤のスクリーニング方法のために使用されてもよい。本発明のキットは、当該キットの使用説明書を含んでも良い。
【実施例】
【０１３１】
以下に示す実施例を参照して本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲は、以下の実施例によって限定されるものでないことは言うまでもない。【０１３２】
＜細胞質タンパク質のフローサイトメトリー解析＞
Cytofix/Cytoperm Fixtation/permeabi1ization kit（BD Biosciences）を用いて細胞を固定および透過処理し、細胞質タンパク質を抗原抗体法により標識した。その後、MoF1o XDP セルソーター ((Beckman Coulter, Inc) を用いてフローサイトメトリー解析を行った。【０１３３】
＜定量ＲＴ−ＰＣＲ＞
TRIzol reagent(Life Technologies)もしくはNucleoSpin RNA XS (MACHEREY-NAGAL, Duren, Germany)を用いてＲＮＡを抽出した。残存しているゲノムＤＮＡを、DNaseI (Life Techno1ogies)を用いて消化後、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara bio, Shiga, Japan)を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。定量ＲＴ−ＰＣＲは、SYBR Premix EX TaqII(Takara bio, Shiga, Japan)を用いて行い、データはβ−アクチンを標準化コントロールとしてｄｄＣｔ法に従って算出した。【０１３４】
定量ＲＴ−ＰＣＲで使用されたプライマーは以下の通りである。
【表１】
2016148216.tif 000002
【０１３５】
＜免疫細胞化学染色＞
培養細胞を１０％ホルマリン溶液(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)で１０分間固定後、0.2% Triton-X100(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)で１５分間浸透化処理した。５％スキムミルク溶液(BD Biosciences)でブロッキング後、一次抗体を４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄後、蛍光標識された二次抗体を室温で２時間反応させ、Hoechst33342（Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, US）で対比染色した。【０１３６】
＜自動磁気細胞分離装置による細胞の分離＞
実施例４（２）の肝類洞内皮前駆細胞の分離、実施例５（１）の肝類洞内皮細胞の分離、及び実施例６の肝星前駆細胞の分離を以下の通り行った。
０．０５％のトリプシン／０．５ｍＭのＥＤＴＡ、若しくはＡｃｃｕｍａｘ（Innovative Cell Technologies, Inc.)を用いて解離し、０．０３％ＢＳＡ−ＰＢＳで懸濁した。調製した細胞を、FcR block reagent（Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Germany）で２０分間ブロッキングした後、各細胞に特異的な抗原を認識する一次抗体で、３０分間標識した。細胞を洗浄後、必要に応じて抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（Miltenyi Biotech）、抗ＰＥマイクロビーズ（Miltenyi Biotech）で２０分間標識し、autoMACS Pro セパレーター（Mi1tenyi Biotech）で目的の細胞を濃縮した。その後、MoF1o XDP セルソーター（Beckman Coulter, Inc）を用いて分離した。【０１３７】
本実施例で使用した一次抗体、二次抗体及びマイクロビーズを以下に示す。
【表２】
2016148216.tif 000003
【０１３８】
実施例１
（１）ヒト肝前駆細胞の調製
ヒトｉＰＳ細胞（４５４Ｅ２株、RIKEN Cell Bank）を、非特許文献２（Si-Tayeb et al., Hepatology 2010, 51(1), 297-305）に記載された以下の手順により、ヒト肝前駆細胞へと分化誘導した。Ｂ２７及び１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含むＲＰＭＩ培地中で、ヒトｉＰＳ細胞を５％ＣＯ2、周囲酸素環境下で５日間培養した。その後、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を添加したＲＰＭＩ／Ｂ２７培地中で４％Ｏ2／５％ＣＯ2環境下で５日間培養した。その後、２０ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加したＲＰＭＩ／Ｂ２７培地中で１０日間以上４％Ｏ2／５％ＣＯ2環境下で培養することでヒト肝前駆細胞を含む細胞群を得た。当該細胞群から、MoFlo XDP セルソーター (Beckman Coulter)を用いて、ＣＰＭ陽性細胞であるヒト肝前駆細胞と、ＣＰＭ陰性の細胞とを分離した。当該分離は、autoMACS Pro セパレーター (Miltenyi Biotech)を用いても同様に行うことができた。【０１３９】
図１は、ヒトｉＰＳ細胞から肝細胞へと分化誘導させた際のＣＰＭ陽性細胞画分の変遷を経時的に示したフローサイトメトリー解析の結果を示す。図２は、肝前駆細胞を含む細胞群（ＩＨ）から、ＣＰＭ陽性を指標として細胞を分離した場合におけるフローサイトメトリー解析の結果を示す。上記分化誘導手順に従った場合、ＣＰＭ陽性細胞含有量が最大で約４０％の細胞画分が得られた。当該細胞画分からＣＰＭ陽性細胞のみを分離することで、ＣＰＭ陽性細胞含有量が９７．７％である濃縮された細胞画分が得られた。一方、ＣＰＭ陽性細胞の分離を行わずに成熟肝細胞まで分化誘導した場合には、ＣＰＭ陽性細胞の含有量が減少した。これは、ＣＰＭが肝前駆細胞における特異的細胞表面マーカーであることを示す。図３は、単離されたＣＰＭ陽性細胞の免疫細胞化学染色の結果を示す。肝前駆細胞マーカーとして知られるＡＦＰ及びＨＮＦ４αの発現が観察された。【０１４０】
図４は、定量ＲＴ−ＰＣＲで得られたＣＰＭ陽性細胞とＣＰＭ陰性細胞における細胞マーカーの発現量の比較結果を示す。ＣＰＭ陽性細胞は、肝前駆細胞マーカーとして知られるＡＦＰ、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ１α、ＰＲＯＸ１、ＴＢＸ３、ＣＤ１３、ＥｐＣＡＭ及びＨＨＥＸをＣＭＰ陰性細胞と比較して有意に発現していた。一方、胆管細胞のマーカーとして知られるＣＤ１３３の発現量は、ＣＰＭ陰性細胞と比較してＣＰＭ陽性細胞において有意に低かった。【０１４１】
（２）ヒト肝前駆細胞の増殖
１０％ ＦＢＳ(JRH Biosciences)、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン、ＩＴＳ、Ｎ−２サプリメント、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、Ｌ−グルタミン(Life Technologies)、アスコルビン酸 (1 mM)、ニコチンアミド (10 mM)、Ｎ−アセチル−システイン (0.2 mM) (Sigma-Aldrich)、デキサメタゾン(1ｘ10-7M)、ＨＧＦ (20 ng/ml)、ＥＧＦ (10 ng/ml) (PeproTech)、 Ｙ−２７６３２(5 μM) (Wako) 及びＡ８３−０１(2.5 μM) (Tocris) を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２（Sigma-Aldrich）中で、マイトマイシンＣで処理したＭＥＦフィーダー細胞（２．０ｘ１０4細胞／ｃｍ2）上にて、上記で分取されたＣＰＭ陽性細胞を培養した。【０１４２】
ＭＥＦフィーダー細胞上で培養することでＣＰＭ陽性細胞はコロニーを形成した。一方、ＣＰＭ陰性細胞を同様の条件で培養した場合、そのようなコロニーを形成しなかった。ＣＰＭ陽性細胞は、細胞播種後７日目でコンフルエントとなった（図５）。当該細胞は、インビトロで継代培養することができ、５回の継代で１０００倍以上に細胞増殖した（図５）。また、当該細胞を６か月間凍結保存した後、解凍した場合においても、凍結保存前の肝前駆細胞の性質を維持していた。【０１４３】
実施例２
（１）ヒト肝前駆細胞からヒト肝細胞への分化誘導
非特許文献２に記載された通りに、実施例１（２）で増殖させてコンフルエントに達したＣＰＭ陽性細胞を、HCM Single Quots (EGFを除く)及びオンコスタチンＭ (20 ng/ml) (PeproTech)を添加した肝細胞基本培地（Hepatocyte Basal Medium） (Lonza) 中で５〜１０日間、インキュベートすることで、ヒト肝細胞への分化誘導を行った。【０１４４】
（２）アルブミン産生及びグリコーゲン蓄積
分化誘導前の肝前駆細胞と分化誘導して得られた肝細胞について、明視野顕微鏡による観察、免疫細胞化学染色によるアルブミンの染色、及びＰＡＳ染色によるグリコーゲンの蓄積を観察した結果を示す（図６）。ＰＡＳ染色は、コールドシッフ試薬（Cold Schiff's Reagent）（Wako Pure Chemical Industires, Ltd.）を用いて、標準的なプロトコルにしたがって行われた。分化誘導前の肝前駆細胞と比較して分化誘導して得られた肝細胞において、アルブミンの高い産生及びグリコーゲンの高い蓄積が確認された。【０１４５】
（３）ＣＹＰ４５０発現
上記（１）で得られたヒト肝細胞と、従来法である非特許文献２（Si-Tayeb et al., Hepatology 2010, 51 (1), 297-305）に記載された手順でヒトｉＰＳ細胞から誘導されたヒト肝細胞（すなわち、ＣＰＭ陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒトiPS細胞由来肝細胞）とにおけるＣＹＰ４５０のｍＲＮＡ発現を定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。結果を図７及び８に示す。上記（１）で得られたヒト肝細胞は、従来法で調製されたヒト肝細胞と比較して、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ１８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ２Ｃ８の高い発現を示した。また、リファンピシンを添加することで、ＣＹＰ３Ａ４の発現がさらに増大することが分かった。本発明の方法で調製されたヒト肝細胞は、その特性において、ＣＰＭ陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒトiPS細胞由来肝細胞と区別される。【０１４６】
実施例３
（１）ヒト肝前駆細胞からヒト胆管上皮細胞への分化誘導
Tanimizu et al., Mol Biol Cell, 2007, 18(4), 1472-1479、及びYanagida et al., PloS ONE 8, e67541に記載された三次元ゲル培養法を少し修正して、ヒト胆管上皮細胞への分化誘導を行った。実施例１（２）に従って、ＣＰＭ陽性細胞を増殖させた後、細胞を回収し、増殖因子削減マトリゲル（growth factor reduced Matrigel）(Corning)とコラーゲンタイプＩ（Nitta Gelatin）との２：３混合物からなるゲル中で１ｘ１０5細胞／５０μｌの密度で再懸濁した。細胞懸濁液をその後２４ウェルプレート（Corning）へ添加し、固体化するまで３７℃で２時間インキュベートした。その後、細胞をＲ−スポンジン−１（40 ng/ml）及びＷＮＴ−３ａ(40 ng/ml) (PeproTech)の存在下、７日間培養することで、ヒト胆管上皮細胞へと分化誘導した。ヒト胆管上皮細胞は、シストを形成した。【０１４７】
（２）細胞マーカーの発現
得られたヒト胆管上皮細胞において、肝前駆細胞マーカーであるＡＦＰの発現量は低下した（図９）。一方、胆管上皮細胞特異的マーカーの発現が確認された（図１０）。ＣＰＭ陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒト胆管上皮細胞と、上記（１）で調製されたヒト胆管上皮細胞とにおける胆管上皮細胞マーカーのｍＲＮＡ発現を定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した（図１０）。上記（１）で得られたヒト胆管上皮細胞は、ＣＰＭ陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒト胆管上皮細胞と比較して、胆管上皮細胞マーカーであるＣＫ７、ＣＦＴＲ、ＡＱＰ１、ＴＧＲ５、ＳＯＸ９及びＨＮＦ６の高い発現を示した。【０１４８】
実施例４
ヒト肝類洞内皮前駆細胞の調製
（１）ヒトｉＰＳ細胞からヒト中胚葉細胞への分化誘導
ヒトｉＰＳ細胞（４５４Ｅ２株、RIKEN Cell Bank）を、マイトマイシンＣ処理したマウス胎仔線維芽細胞 (ＭＥＦ：Mouse Embryo Fibroblast、）をフィーダーとして培養した。なお、MEFは、胎仔マウス（ICRマウス、日本エスエルシー株式会社）から調製した。分化誘導開始前に、ヒトｉＰＳ細胞をゼラチンコートディッシュに再播種し、３０分間インキュベートすることでＭＥＦを取り除いた。ヒトｉＰＳ細胞から中胚葉へ分化誘導するため、Ultra-Low Attachment plate (Corning) 上で胚葉体形成培養を行った。胚葉体形成培養を、Stempro-34 SFM (Life Technologies) を基本培地として、誘導開始０日から１日に１０μＭのＹ２７６３２（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）、２ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Life Technologies）を加え、誘導開始１日〜４日に５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Pepro Tech, New Jersey, US）、５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Life Technologies社）、３０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Life Technologies社）を加え、誘導開始４日から６日に１０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Pepro Tech）、５．４μＭのＳＢ４３１５４２（Tocris, Bristol, UK）、０．５μＭのドルソモルフィン（Tocris）を加えることで行った。６日間培養して中胚葉細胞へと分化誘導した。【０１４９】
（２）ヒト中胚葉細胞からヒト肝類洞内皮前駆細胞への分化誘導
（１）で得られた胚葉体をあらかじめゼラチンコートしたプレートに移し、ＥＧＭ−２（Lonza, Basel, Switzerland）に５０ｎｇ／ｍ１のＶＥＧＦを添加した内皮細胞培地で７日間培養した。ＣＤ３１陽性、ＦＬＫ１陽性及びＣＤ３４陽性のヒト肝類洞内皮前駆細胞を、MoFlo XDP cell sorter (Beckman Coulter, Inc)で分離した。すべての分化誘導を５％ＣＯ2、４％Ｏ2環境下で行った。【０１５０】
（３）各分化段階におけるマーカー分子の発現解析
ヒトｉＰＳ細胞、上記（１）で誘導されたヒト中胚葉細胞、上記（２）で誘導されたヒト肝類洞内皮前駆細胞（細胞分離前）における、マーカー分子の遺伝子発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。結果を図１１に示す。未分化マーカーであるＯＣＴ４は、ｉＰＳ細胞において高く発現し、分化の進行とともに減少した。中胚葉マーカーであるＭＥＳＰ１は、中胚葉細胞の分化ステージで最も高い発現を示した。ＣＤ３１やＶＥ−カドヘリン（ＶＥ−Ｃａｄ）といった血管内皮細胞マーカー分子は、肝類洞内皮前駆細胞のステージで高発現した。さらに、ＳＴＡＢ２やＬＹＶＥ１といった肝類洞内皮前駆細胞マーカー分子も肝類洞内皮前駆細胞のステージで高発現した（図１１）。以上の結果から、誘導された細胞中には肝類洞内皮前駆細胞の特徴を有する細胞が含まれることが示唆された。【０１５１】
（４）各分化段階におけるマーカー分子の発現解析
ヒト中胚葉から分化誘導されたヒト肝類洞内皮前駆細胞を含む細胞群（pre-sorted）、pre-sorted群から分離されたＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞（ＣＤ３４+）、ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４-細胞（ＣＤ３４-）における、ヒト肝類洞内皮前駆細胞のマーカー分子（ＳＴＡＢ２及びＬＹＶＥ１）の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。結果を図１３に示す。ＣＤ３４+細胞群は、ＣＤ３４-細胞群と比較して、ＳＴＡＢ２やＬＹＶＥ１といった肝類洞内皮前駆細胞マーカー分子を高発現していた。当該結果から、ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+の表現型の組み合わせが、ヒト肝類洞内皮前駆細胞を分取するためのマーカーとして利用できることが明らかとなった。【０１５２】
（５）ヒト肝類洞内皮前駆細胞の増殖能
上記実施例４（２）で分取したＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞を、フィブロネクチンコートしたプレートに15,000 細胞/cm2で播種し、内皮細胞培地で培養した。ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞は、内皮細胞様の形態を維持し(図１４)、高い増殖能を有しており（図１５上）、数回の継代培養も可能であった(図１５下)。なお細胞数は、０．０５％トリプシン／０．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて細胞を解離し、血球計算盤を用いて算出した。また、定量ＲＴ−ＰＣＲ解析により、この細胞は５継代後も肝類洞内皮前駆細胞マーカー分子の発現を維持した(図１６）。さらに、長期凍結保存が可能であり、３０日間の凍結保存後もＣＤ３１を均一に発現した（図１７）。【０１５３】
実施例５
（１）ヒト肝類洞内皮細胞の調製
上記実施例４（２）で分取されたヒト肝類洞内皮前駆細胞を、２０，０００細胞／ｃｍ2の密度でフィブロネクチンコートしたプレートに再播種し、ＥＧＭ−２（Lonza, Basel, Switzerland）に５０ｎｇ／ｍ１のＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β阻害剤である１．５μＭのＡ８３−０１（Tocris）を添加したヒト肝類洞内皮細胞誘導培地で１４日間培養することで、ヒト肝類洞内皮細胞を含む細胞画分を得た。すべての分化誘導を５％ＣＯ2、４％Ｏ2環境下で行った。高効率に成熟した肝類洞内皮細胞を誘導するため、当該細胞画分からその後、MoFlo XDP セルソーター（Beckman Coulter, Inc）を用いて、ＣＤ３１陽性、ＦｃＲγＩＩ陽性細胞を分離した。【０１５４】
（２）マーカー分子の発現解析
上記実施例４（２）で分取されたヒト肝類洞内皮前駆細胞と上記実施例５（１）で調製されたヒト肝類洞内皮細胞（分取前）における、肝類洞内皮細胞マーカーの発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。結果を図１８に示す。ＴＧＦ−β阻害剤の添加により、肝類洞内皮細胞マーカーであるＳＴＡＢ２、ＦｃＲγＩＩＢ及びＦ８の発現が細胞中で促進された。【０１５５】
（３）ヒト肝類洞内皮細胞の特性
実施例５（１）で分取されたＣＤ３１陽性ＦｃＲγＩＩ陽性の肝類洞内皮細胞は、内皮細胞様形態を呈した（図２０）。また、ＣＤ３１陽性ＦｃＲγＩＩ陽性細胞は、ＣＤ３１陽性ＦｃＲγＩＩ陰性細胞やＨＵＶＥＣと比較して、ＳＴＡＢ２、ＦｃＲγＩＩＢ、血液凝固第VIII因子（ファクターVIII）を高発現していた（図２１）。【０１５６】
（４）アセチル化ＬＤＬ及びヒアルロン酸の取り込み能
ＣＤ３１陽性ＦｃＲγＩＩ陽性の肝類洞内皮細胞を含む培養培地に 5μg/mlのＤｉＩ−Ａｃ−ＬＤＬ(AlfaAesar, Massachusetts, US)もしくは 25μg/mlのフルオレセインアミン標識されたヒアルロン酸ナトリウム（ＦＡＨＡ−Ｌ１）（PG Research, Tokyo, Japan)を添加し、３０℃で４時間インキュベートした。４時間後、ＰＢＳで洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で対比染色した。結果を図２２及び２３に示す。肝類洞内皮細胞におけるアセチル化ＬＤＬの取り込み能はＨＵＶＥＣと比べて同等程度であったのに対し、ＳＴＡＢ２を介して行われるヒアルロン酸の取り込みは、肝類洞内皮細胞のみで確認された。【０１５７】
（５）ファクターVIIIの発現
免疫細胞化学染色およびフローサイトメトリー解析（図２４及び２５）により、ファクターVIIIのタンパク質レベルでの発現が認められた。【０１５８】
実施例６
ヒト肝星前駆細胞の調製
実施例４（１）に記載された手順と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞からヒト中胚葉細胞を分化誘導した。当該中胚葉細胞集団に含まれるヒト肝星前駆細胞を、ＡＬＣＡＭ陽性を指標として、MoFlo XDP セルソーター（Beckman Coulter, Inc）でＡＬＣＡＭ陽性細胞（ヒト肝星前駆細胞）とＡＬＣＡＭ陰性細胞に分離した。ヒトｉＰＳ細胞由来中胚葉細胞の分離前、ＡＬＣＡＭ陽性細胞及びＡＬＣＡＭ陰性細胞における、肝星前駆細胞マーカー分子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。結果を図２７に示す。ＡＬＣＡＭ陽性細胞はＡＬＣＡＭ陰性細胞と比較して、ＨＧＦ、ＣＹＧＢ、ＮＧＦＲ、デスミン（ＤＥＳ）といった肝星前駆細胞特異的マーカー分子を高発現していた。【０１５９】
実施例７
（１）ヒト肝星細胞の調製
セルマトリックス  ＴｙｐｅＩ−Ｃ（Nitta Gelatin, Osaka, Japan）をコートしたプレートに、実施例６で調製されたヒト肝星前駆細胞を１５，０００細胞／ｃｍ2の密度で播種し、ＭＳＣＧＭ(Lonza）に、Ｒｏｃｋ阻害剤である１０μＭのＹ２７６３２を添加した肝星細胞誘導培地で５日間培養することで分化誘導し、ヒト肝星細胞を得た。分化誘導は５％ＣＯ2、２０％Ｏ2の環境下で行った。【０１６０】
（２）マーカー分子の発現解析
上記実施例７（１）で調製されたヒトｉＰＳ細胞由来肝星細胞における肝星細胞マーカー分子の発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。結果を図２８に示す。ヒトｉＰＳ細胞由来肝星細胞は、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ)と比較して肝星細胞に特異的に発現するＨＧＦ、ＮＧＦＲ、ＣＹＧＢ、ＬＲＡＴを高発現した。【０１６１】
（３）ビタミンＡの取り込み能
肝星細胞は、細胞内にピタミンＡを取り込み、貯蔵することが知られている。そこで、ビタミンＡを培地中に添加し、取り込み能を解析した。ヒトｉＰＳ細胞由来肝星細胞の培養系にビタミン A (レチノイド(Sigma-Aldrich Corporation，St. Louis，US))を10μMで添加した。0.05%トリプシン／0.5mM EDTAを用いて細胞を解離し、CantoII (BD Biosciences）用い、フローサイトメトリーによって細胞内のビタミンＡの自家蛍光を検出した。ｈＭＳＣをコントロールとして用いた。ヒトｉＰＳ細胞由来肝星細胞のみにおいて自家蛍光が検出され、細胞内にピタミンＡを取り込んでいることが確認された（図２９）。【０１６２】
また、位相差顕微鏡像から、ｈＭＳＣと比較して、上記実施例７（１）で調製されたヒトｉＰＳ細胞由来肝星細胞では細胞内に脂肪滴が確認された（図３０）。【０１６３】
実施例８
ヒト肝細胞組織モデルの調製（ヒト肝非実質細胞とヒト肝前駆細胞との共培養）
実施例５で調製したヒト肝類洞内皮細胞、及び実施例７で調製したヒト肝星細胞を、セルマトリックスＴｙｐｅＩ−Ｃ（Nitta Ge1atin, Osaka, Japan）でコートしたプレートにコンフルエントになるように播種し、フィーダーを作製した。翌日フィーダー細胞をマイトマイシンＣ処理した。フィーダー細胞のコントロールとして、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ，Lonza社から入手）とヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ，Lonza社から入手）を用いた。これらのフィーダー細胞に実施例１で調製した肝前駆細胞を播種し、１０日間共培養した。【０１６４】
ＨＵＶＥＣおよびｈＭＳＣをフィーダー細胞として用いた場合と比較して、ヒトｉＰＳ細胞由来肝類洞内皮細胞及び肝星細胞をフィーダー細胞に用いた場合は肝前駆細胞マーカーおよび肝細胞マーカーであるＨＮＦ４α、ＡＦＰ及びＡＬＢの発現が増強された（図３１）。よって、樹立したヒトｉＰＳ細胞由来肝類洞内皮細胞および肝星細胞は、肝前駆細胞の増殖・分化能を支持することが示唆された。【０１６５】
実施例９
ヒト肝細胞組織モデルの調製（マウス肝非実質細胞とヒト肝前駆細胞との共培養）
（１）マウス胎仔肝の消化・溶血処理
胎齢14.5日のマウス胎仔（C57BL/6マウス、日本エスエルシー株式会社）から、小型バサミとピンセットを用いて外科的に肝臓を摘出した。摘出した肝組織を小型バサミにより細切した。肝組織を10〜20 mlのLPM（Thermo Fisher Scientific） に移し、37℃の温浴にて5分間静置した。その後、Liver Digest Medium（Thermo Fisher Scientific）に液交換し、37℃の温浴にて5分間攪拌した。その後、ディスポーザブルピペットを用いてピペッティングにより機械的に肝組織を消化した。1800 rpm、3分間の遠心分離を行い上清除去後、10% FBSを添加したDMEMで懸濁した。70 μmセルストレイナーに細胞懸濁液を通し、1800 rpm、3分間の遠心分離を行い上清除去後、得られた細胞を5 mlの塩化アンモニウム溶液に懸濁し、4℃、6分間反応させ、溶血処理を行った。10% FBSを添加したDMEMを添加し、70 μmセルストレイナーに通し、1800 rpm、3分間遠心分離を行い上清除去後、細胞を回収した。【０１６６】
（２）マウス胎仔肝非実質細胞の分離
溶血処理を行った細胞を1% BSA/PBSで懸濁し、マウスFcR（抗体（1:100希釈）を添加し4℃、15分間ブロッキングを行った。次に一次抗体（1:100希釈）を 30分間反応させた。一次抗体はビオチン標識あるいはFITC標識されたStab2抗体、ビオチン標識されたMsln抗体、APC標識されたp75NTR抗体を用いた。一次抗体を1% BSA/PBSで除去後、同様に二次抗体（1:100希釈）を20分間反応させた。二次抗体はSA-APC抗体あるいはSA-PE抗体を用いた。二次抗体を1% BSA/PBS で除去後、MACS Running Buffer（Miltenyi Biotec K.K.）で20倍に希釈された磁気ビーズ（Miltenyi Biotec K.K.)を10分間反応させた。その後auto MACS （Miltenyi Biotec K.K.）を用いて磁気細胞分離を行った。単細胞分離を行う場合はさらにMoflo（Beckman Coulter）を用いて分離を行った。【０１６７】
（３）マウス胎仔肝非実質細胞の培養
分離したマウス胎仔肝非実質細胞は、コラーゲンTypeＩC（Nitta Gelatin）及びコラーゲンTypeＩA（Nitta Gelatin）上のプレートに2% B27（Life Technology）、50 ng/ml rhVEGF（Peprotech）、10 μg/ml Y27632（Wako）、 0.5 μM A83-01（Tocris） を添加したEGM+MSC（1:1、LONZA）にて 37℃、5% CO2 、湿度 95% 条件下にて培養を行った。【０１６８】
（４）マウス肝類洞内皮細胞の培養
コラーゲンTypeＩC（Nitta Gelatin）及びコラーゲンTypeＩA（Nitta Gelatin）上のプレートに播種した。培地は50 ng/ml rhVEGF（Peprotech）、10 μg/ml Y27632（Wako）、0.5μM A83-01（Tocris）が添加されたEGM（LONZA）を用いた。37℃、5% CO2 、湿度95% 条件下にて培養を行った。【０１６９】
（５）マウス肝星細胞の培養
コラーゲンTypeＩC（Nitta Gelatin）及びコラーゲンTypeＩA（Nitta Gelatin）上のプレートに播種した。培地は2% B27（Life Technology）、50 ng/ml rhVEGF（Peprotech）、10 μg/ml Y27632（Wako）、 0.5 μM A83-01（Tocris） を添加したEGM+MSC（1:1、LONZA）を用いた。37℃、5% CO2 、湿度95% 条件下にて培養を行った。【０１７０】
（６）マウス肝中皮細胞の培養
コラーゲンTypeIV（Nitta Gelatin）及びコラーゲンTypeＩA（Nitta Gelatin）上のプレートに播種した。培地は10% FBS、50 nmol/L mercaptoethanol、10 ng/ml oncostatin M (0SM)（Peprotech）、10 ng/ml bFGF（Peprotech）が添加されたαMEMを用いた。37℃、5% CO2、湿度95% 条件下にて培養を行った。培地交換は1日おきに行った。【０１７１】
（７）共培養（平面培養）
コラーゲン1ゲル（Nitta Gelatin）を48-wellプレート1 wellあたり200 μl添加し30分間、インキュベーター内でゲル化させた。当該ゲルに上記実施例９（３）のマウス由来非実質細胞を播種し、培養後、これをフィーダー細胞として、実施例１で調製された肝前駆細胞と共に、肝前駆細胞が維持・増殖可能な維持培地及び肝前駆細胞を成熟肝細胞へ誘導する分化培地中で共培養した。なお、維持培地として、実施例１（２）において肝前駆細胞の培養に用いたＤＭＥＭ−Ｆ１２培地を使用した。分化培地として、20 ng/ml rhOSM（Peprotech）、1% ITS premix（Life Technology）、0.5 μM デキサメタゾン、0.5 μM A83-01（Tocris）を添加した HCM SingleQuots Kit（LONZA、rhEGFのみ非添加）を用いた。また、肝前駆細胞を上記維持培地及び分化培地中で単独培養した。【０１７２】
肝細胞分化に関わる遺伝子の発現を、定量ＲＴ−ＰＣＲで解析した（図３２）。具体的には、肝細胞の分泌タンパク質であるALB、薬剤代謝に関わる酵素であるCYP3A4、胆汁酸の排泄に関与するABCトランスポーターのABCB11（Bile Salt Export Pump）の発現量を比較した。各種肝細胞マーカーは、維持培地で培養した場合、その発現量に変化は無かったが、分化培地で培養した場合には、発現上昇が確認され、さらに非実質細胞との共培養において最も高い発現量を示した。【０１７３】
また、上記実施例９（４）〜（６）の肝類洞内皮細胞、肝星細胞、肝中皮細胞と、上記実施例１のヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞の共培養系を作製し、各細胞の肝成熟化に与える影響について検証した。上記非実質細胞をコラーゲンゲル上に播種し、２日間培養後、これらをフィーダー細胞として、ｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞と共培養した。肝細胞への成熟化を評価するために、定量ＲＴ−ＰＣＲにより遺伝子発現解析を行った。結果を図３３に示す。肝前駆細胞から肝細胞への分化を制御する転写因子であるＨＮＦ４ＡとＣＥＢＰＡの発現量は、ｉＰＳ肝細胞単独培養と比較し、肝星細胞、肝中皮細胞との共培養下において増加した。したがって、肝星細胞と肝中皮細胞は肝細胞分化を促進する役割を有することが示唆された。肝細胞の分化マーカーの一つであるアルブミン（ＡＬＢ）は、肝星細胞との共培養下において単独培養と比較し１．８倍の発現量を示した。また、肝機能の一つであるアンモニア代謝に関わる酵素ＣＰＳ１の発現は、肝星細胞や肝中皮細胞との共培養条件下において上昇し、肝星細胞との共培養条件下においては単独培養と比較し３．８倍の発現量となった。【０１７４】
（８）共培養（三次元培養（スフェロイド培養））
96-well-EZsphere（IWAKI）に5×104 cells/wellの密度で培養した。上記実施例９（４）〜（６）の肝類洞内皮細胞（3×104 cells/well）、肝星細胞（3×104 cells/well）又は肝中皮細胞（3×103 cells/well）を、上記実施例１のヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞と同時に播種した。上記の分化培地を使用し、培養二日目に半量培地交換した。37℃、5% CO2、湿度95%条件下にて培養を行った。三次元培養した場合において、スフェロイド形成が認められた。マーカーの発現解析結果を図３５に示す。ＨＮＦ４ＡとＣＥＢＰＡの発現量は、肝星細胞と共培養を行った際に特に上昇することが示された。また、アルブミン発現量における平面培養と三次元培養との違いを示す結果を図３６に示す。平面培養４日目、三次元培養２日目、三次元培養４日目において比較すると、三次元培養の条件下において、効率的に成熟化が促進されたことが示された。【０１７５】
上記実施例９（３）のマウス非実質細胞と上記実施例１のヒトｉＰＳ細胞由来肝前駆細胞とを平面培養及び三次元培養した際の肝細胞分化に関わる遺伝子の発現解析結果を図３７に示す。肝機能マーカーは、三次元培養系で高く発現した。【０１７６】
実施例１０
ヒトＢ型肝炎疾患モデルの肝細胞の調製
実施例１（１）で調製されたヒト肝前駆細胞及び実施例２（２）で調製されたヒト肝細胞にＨＢＶを感染させた。ＨＢＶ感染後１６日目で培養上清および細胞を回収した。【０１７７】
培養上清中のＨＢｓＡｇの定量結果を図３８に示す。ＨＢＶを感染させた肝前駆細胞及び肝細胞のいずれの培養上清中においても、ＨＢｓ抗原が認められた。特に肝細胞においてＨＢｓ抗原は高値であった。【０１７８】
ＨＢＶを感染させた肝前駆細胞及び肝細胞におけるＨＢＶのＤＮＡの定量結果を図３９に示す。肝前駆細胞及び肝細胞においてＨＢＶのＤＮＡが認められた。特に肝細胞において高値であった。【０１７９】
実施例１１
病原体の感染に必要な物質の産生の分析
実施例２（１）で調製されたヒト肝細胞（以下で「CPM+-Hep」とも呼ぶ）と、実施例１（１）でｉＰＳ細胞から肝前駆細胞へと分化誘導後、ＣＰＭ陽性を指標として肝前駆細胞を分取する工程を経ずに、実施例２（１）と同様の手順で分化誘導をして調製された肝細胞（以下で「iPSCs-Hep」とも呼ぶ）とにおいて、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス及びマラリア原虫が細胞に感染するために必要とされる物質が産生されているか否かを定量ＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。結果を図４０に示す。【０１８０】
試験したいずれの肝細胞も、ＨＢＶ感染に必要とされる分子（ＣＤ８１）、ＨＣＶ感染に必要とされる分子（ＣＤ８１、ＣＬＤＮ１、ＯＣＬＮ）、ＨＢＶ感染に必要とされる分子（ＣＤ８１、ＳＣＡＲＢ）の発現をしていた。その発現量は、iPSCs-Hepと比較して CPM+-Hepの方が高かった。この結果は、ＣＰＭ陽性を指標として分取された肝前駆細胞を分化誘導して得られた、ヒトiPS細胞由来肝細胞本願発明の肝細胞を用いた方が、ＣＰＭ陽性を指標とした分取を行わずに肝前駆細胞を分化誘導して得られたヒトiPS細胞由来肝細胞と比較して、感染性疾患モデルの作製に好適に使用し得ることを示している。【０１８１】
実施例１２
マウス胎仔肝細胞の分析（マウス肝前駆細胞）
胎齢 12.5 日マウス胎仔（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の肝臓を回収した。当該肝臓を細断し、 Liver Digestion Medium (Life Technologies, California, US)で 15分間消化した。消化した胎仔マウス肝臓細胞を、 40μmセルストレイナー (BD bioscience, New Jersey, US)に通し、単一細胞懸濁液を得た。この細胞をＦｃブロック試薬でブロッキングし、ＰＥ標識抗ＣＰＭ抗体及びＦＩＴＣ標識抗ＤＬＫ１抗体とインキュベートした。ＰＥ及びＦＩＴＣ標識抗アイソタイプコントロールをネガティブコントロールとして用いた。ＣＰＭ陽性（ＣＰＭ＋）及びＣＰＭ陰性（ＣＰＭ−）細胞をMoFlo XDP セルソーター（Beckman Coulter, Inc, California, US）で単離した。【０１８２】
回収されたＣＰＭ陽性細胞（肝前駆細胞）と、マウス成熟肝細胞と、マウス胆管上皮細胞におけるＣＰＭの発現解析を定量ＲＴ−ＰＣＲにより行った。結果を図４１に示す。肝前駆細胞において、ＣＰＭは肝前駆細胞に特異的であり、肝細胞及び胆管上皮細胞においてほとんど発現していなかった。【０１８３】
実施例１３
マウス胎仔肝細胞の分析（マウス肝類洞内皮前駆細胞）
胎齢１２．５日マウス胎仔（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の肝臓を回収した。当該肝臓を細断し、Liver Digestion Medium (Life Technologies, California, US)で 10分間消化した。消化した胎仔マウス肝臓細胞を溶血後、 70μmセルストレイナー (BD bioscience, New Jersey, US)に通した。この細胞をＦｃＲブロック試薬で２０分間ブロッキングした後、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３１抗体 (BD Biosciences)、ＰＥ標識抗Ｆ１ｋ１抗体 (eBioscience, SanDiego, USA)、ビオチン標識抗ＣＤ３４抗体(eBioscience)、ＢＶ３９５標識抗ＣＤ４５抗体(BD bioscience)で３０分間標識した。細胞を洗浄後、ストレプトアビジンＡＰＣ (BD Biosciences) と抗ＦＩＴＣマイクロビーズ仰（Miltenyi Biotech)で ２０分間標識した。ＣＤ３１+細胞をautoMACS Pro セパレーター（Miltenyi Biotech）で濃縮後、MoFlo XDP セルソーター（Beckman Coulter, Inc, California, US）を用いてＣＤ４５-ＣＤ３１+Ｆ１ｋ１+ＣＤ３４+/-細胞を単離した。【０１８４】
これまでに、マウス胎仔肝臓における肝類洞内皮前駆細胞は Flk1、CD31、CD34といった血管内皮細胞マーカー分子を発現することが報告されている。フローサイトメトリー解析により、胎齢１２．５日のマウス肝臓には、ＣＤ４５-Ｆｌｋ１+ＣＤ３１+の血管内皮細胞が存在し、その分画中にＣＤ４５-Ｆ１ｋ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+/-のサブポピュレーションが存在することが明らかとなった(図４２)。これらをセノレソーターによって分取し、遺伝子発現解析を行ったところ、ＣＤ４５-ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞はＣＤ４５-ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４-細胞と比較して、Ｓｔａｂ２やＦｌｔ４、Ｌｙｖｅ１といった肝類洞内皮前駆細胞特異的マーカー遺伝子を高発現していた(図４３)。【０１８５】
また、上記で分取したＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞を、フィブロネクチンコートしたプレートに15,000 細胞/cm2で播種し、内皮細胞培地で培養した。培養７日目で約３倍に増殖した（図４４）。なお細胞数は、０．０５％トリプシン／０．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて細胞を解離し、血球計算盤を用いて算出した。【０１８６】
また、ＦＬＫ１+ＣＤ３１+ＣＤ３４+細胞の培養系に、ＴＧＦ−β阻害剤であるＡ８３−０１（Tocris）することで、Ｓｔａｂ２やＦ８、Ｌｙｖｅ１といった成熟肝類洞内皮細胞マーカー遺伝子の発現が有意に誘導された（図４５）。
【産業上の利用可能性】
【０１８７】
本発明の方法により、均一で高機能の肝細胞、肝非実質細胞及びそれらの前駆細胞を効率よく調製することが可能である。得られた肝細胞は、例えば創薬スクリーニングに利用可能である。また、得られた肝細胞、肝非実質細胞及びそれらの前駆細胞は、例えば細胞療法への使用が可能である。また、得られた肝細胞、肝非実質細胞及びそれらの前駆細胞は、疾患モデルの作製に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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