(57)【要約】  新規な生理機能を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の利用を提供する。本発明の一実施形態に係る多能性幹細胞の胚様体を形成させる方法は、多能性幹細胞を、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と共に培養する工程を包含し、上記分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいる。
2017073761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の胚様体を形成させる方法であって、
多能性幹細胞を、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と共に培養する工程を包含し、
当該分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいることを特徴とする、胚様体形成方法。
【請求項２】
上記分解物は、以下（Ａ）〜（Ｃ）のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の少なくとも１種類以上を含有しているものであることを特徴とする、請求項１に記載の胚様体形成方法：
（Ａ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ６とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（Ｂ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、Ｘ６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ７との間の化学結合、または、Ｘ１４とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（Ｃ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ１とＹ２との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（１）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−；
（２）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−Ｘ７−Ｘ８−Ｇ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｇ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｇ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｇ−；
（３）−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｇ−Ｙ４−Ｙ５−Ｇ−Ｙ６−Ｙ７−Ｇ−Ｙ８−Ｙ９−Ｇ−；
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ１〜Ｘ１４およびＹ１〜Ｙ９は、任意のアミノ酸である）。
【請求項３】
上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列は、上記トリプルヘリカルドメインのアミノ末端のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２に記載の胚様体形成方法。
【請求項４】
上記（１）〜（３）の何れかにて示されるアミノ酸配列における切断が、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのα１鎖内およびα２鎖内の少なくとも一方で行われていることを特徴とする、請求項２に記載の胚様体形成方法。
【請求項５】
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有している多能性幹細胞の胚様体形成用組成物であって、
当該分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいることを特徴とする、胚様体形成用組成物。
【請求項６】
上記分解物は、以下（Ａ）〜（Ｃ）のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の少なくとも１種類以上を含有しているものであることを特徴とする、請求項５に記載の胚様体形成用組成物：
（Ａ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ６とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（Ｂ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、Ｘ６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ７との間の化学結合、または、Ｘ１４とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（Ｃ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ１とＹ２との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（１）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−；
（２）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−Ｘ７−Ｘ８−Ｇ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｇ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｇ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｇ−；
（３）−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｇ−Ｙ４−Ｙ５−Ｇ−Ｙ６−Ｙ７−Ｇ−Ｙ８−Ｙ９−Ｇ−；
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ１〜Ｘ１４およびＹ１〜Ｙ９は、任意のアミノ酸である）。
【請求項７】
上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列は、上記トリプルヘリカルドメインのアミノ末端のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項６に記載の胚様体形成用組成物。
【請求項８】
上記（１）〜（３）の何れかにて示されるアミノ酸配列における切断が、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのα１鎖内およびα２鎖内の少なくとも一方で行われていることを特徴とする、請求項６に記載の胚様体形成用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多能性幹細胞の胚様体形成方法および多能性幹細胞の胚様体形成用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、真皮、靭帯、腱、骨および軟骨などを構成するタンパク質の１つであって、多細胞生物の細胞外マトリクスの主成分である。研究が進むにつれて、コラーゲンが様々な生理機能を有していることが明らかになり、現在も、コラーゲン分子の新たな生理機能を見出すための研究や、コラーゲン分子の新たな用途を見出すための研究が進められている。【０００３】
現在までの研究によって、１つのコラーゲン分子は３つのポリペプチド鎖によって構成されており、これら３つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成することによって、１つのコラーゲン分子が形成されていることが明らかになっている。【０００４】
螺旋構造を形成するための各ポリペプチド鎖内の領域は、トリプルヘリカルドメインと呼ばれ、当該トリプルヘリカルドメインは、特徴的なアミノ酸配列を有している。具体的に、トリプルヘリカルドメインは、「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ」にて示されるアミノ酸配列が繰り返し連続して出現するという特徴的なアミノ酸配列を有している。なお、上述した３つのアミノ酸からなるアミノ酸配列において、グリシン以外のアミノ酸、つまりＸおよびＹは、様々なアミノ酸であり得る。【０００５】
コラーゲン分子のアミノ末端および／またはカルボキシル末端（換言すれば、コラーゲン分子を構成している各ポリペプチド鎖のアミノ末端およびカルボキシル末端）には、コラーゲンの主たる抗原部位であるテロペプチドが存在する。当該テロペプチドは、コラーゲン分子を構成する各ポリペプチド鎖内において、上述したトリプルヘリカルドメインよりもアミノ末端側および／またはカルボキシル末端側に存在している。【０００６】
プロテアーゼなどの酵素を用いて処理することによりコラーゲン分子からテロペプチドを部分的に切除すると、コラーゲン分子の抗原性を低く抑えられることが知られている。このようなテロペプチドが部分的に切除されたコラーゲン分子をアテロコラーゲンと呼ぶ。【０００７】
現在までの研究によって、コラーゲン、アテロコラーゲン、および、プロテアーゼによるこれらの分解物、が様々な生理機能を有していることが明らかになり、当該生理機能に基づいたコラーゲン、アテロコラーゲン、および、プロテアーゼによるこれらの分解物の様々な用途が開発されている（例えば、特許文献１および２参照）。【０００８】
特許文献１では、コラーゲンまたはアテロコラーゲンをプロテアーゼ（例えば、ペプシンおよびアクチニダインなど）で処理した分解物を、止血用の医療用材料として用いる技術が開示されている。更に具体的に、特許文献１では、まず、キハダマグロの皮部に対してペプシン処理を施して、アテロコラーゲンを含有している水溶液を取得し、更に、当該水溶液に塩化ナトリウムを加えることによって、アテロコラーゲンを沈殿および回収している。なお、アテロコラーゲンを沈殿物として回収する際に、塩化ナトリウムは、上清と共に除去されることになる。そして、特許文献１では、沈殿物として回収されたアテロコラーゲンに対してアクチニダインによる分解処理を施して分解物を得、当該分解物を、止血用の医療用材料として用いている。【０００９】
一方、特許文献２では、コラーゲンまたはアテロコラーゲンをプロテアーゼで処理した分解物を、動脈硬化症および動脈硬化症に起因する疾患の予防または治療のための組成物として用いる技術が開示されている。更に具体的に、特許文献２では、ミネラルを除去した後のコラーゲンをプロテアーゼによって分解して得られるコラーゲンの分解物を、動脈硬化症および動脈硬化症に起因する疾患の予防または治療のための組成物として用いる技術が開示されている。【００１０】
上述したように、コラーゲンおよびアテロコラーゲンをプロテアーゼによって分解する場合には、塩濃度が低い条件下にて分解することが一般的である。そして、このような塩濃度が低い条件下におけるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物のアミノ酸配列は既に決定されており、そのアミノ酸配列は、非特許文献１などに開示されている。【００１１】
ところで、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）をin vitroで種々の細胞に分化誘導させる方法として、ＥＳ細胞の胚様体を形成させ、当該胚様体を目的の細胞へと分化誘導させる方法が広く用いられている（例えば、特許文献３、非特許文献３、非特許文献４および非特許文献５等）。ＥＳ細胞の胚様体を得る方法としては、ハンギングドロップ法（例えば、非特許文献６）や、超親水性処理培養皿を使用した培養方法（例えば、非特許文献４）が一般的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００４／０２０４７０号パンフレット（２００４年３月１１日公開）
【特許文献２】日本国公開特許公報「特開２００１−３１５８６号（２００１年２月６日公開）」
【特許文献３】日本国公開特許公報「特開２０１２−１３９２４６号（２０１２年７月２６日公開）」
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】S. Kunii et al., Journal of Biological Chemistry, Vol.285, No.23, pp.17465-17470, June4, 2010
【非特許文献２】K. Morimoto et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, Vol.68, pp.861-867, 2004
【非特許文献３】James A. Thomson, Joseph Itskovitz-Eldor, Sander S. Shapiro, Michelle A. Waknitz, Jennifer J. Swiergiel, Vivienne S. Marshall, Jeffrey M. Jones, Science 282, 1145-47 (1998)
【非特許文献４】T. Nakano, S. Ando, N. Takata, M. Kawada, K. Muguruma, K. Sekiguchi, K. Saito, S. Yonemura, M. Eiraku, Y. Sasai, Cell Stem Cell, 10, 771-785, (2012)
【非特許文献５】Joseph Itskovitz-Eldor, Maya Schuldiner, Dorit Karsenti, Amir Eden, OfraYanuka, Michal Amit, Hermona Soreq, Nissim Benvenisty, Molecular Medicine 6(2), 88-95, (2000)
【非特許文献６】Dang SM, Kyba M, Perlingeiro R, Daley GQ, Zandstra PW., Biotechnol Bioeng. 78, 442-53(2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したように、コラーゲン、アテロコラーゲン、および、これらの分解物の生理機能に関する研究が進んでいるが、これらの生理機能の全てが解明されているわけではない。【００１５】
これらが有する新たな生理機能を見出すことは、医療分野、食品分野、化粧品分野および基礎研究分野などの様々な分野の発展に大きく寄与できるものと考えられる。【００１６】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、新規な生理機能を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、特定の構造を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を、多能性幹細胞の胚様体を形成させる場合の足場材料として使用し得ることを見出した。そして、この新規知見に基づいて、本発明を完成するに至った。【００１８】
つまり、上記の課題を解決するために、本発明の一実施形態に係る胚様体形成方法は、多能性幹細胞の胚様体を形成させる方法であって、多能性幹細胞を、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と共に培養する工程を包含し、当該分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいることを特徴としている。【００１９】
本発明の一実施形態に係る胚様体形成方法では、上記分解物は、以下（Ａ）〜（Ｃ）のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の少なくとも１種類以上を含有しているものであり得る：
（Ａ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ６とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（Ｂ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、Ｘ６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ７との間の化学結合、または、Ｘ１４とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（Ｃ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ１とＹ２との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（１）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−；
（２）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−Ｘ７−Ｘ８−Ｇ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｇ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｇ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｇ−；
（３）−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｇ−Ｙ４−Ｙ５−Ｇ−Ｙ６−Ｙ７−Ｇ−Ｙ８−Ｙ９−Ｇ−；
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ１〜Ｘ１４およびＹ１〜Ｙ９は、任意のアミノ酸である）。【００２０】
本発明の一実施形態に係る胚様体形成方法では、上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列は、上記トリプルヘリカルドメインのアミノ末端のアミノ酸配列であることが好ましい。【００２１】
本発明の一実施形態に係る胚様体形成方法では、上記（１）〜（３）の何れかにて示されるアミノ酸配列における切断が、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのα１鎖内およびα２鎖内の少なくとも一方で行われていることが好ましい。【００２２】
本発明の一実施形態に係る胚様体形成用組成物は、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有している多能性幹細胞の胚様体形成用組成物であって、上記分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいることを特徴としている。【００２３】
本発明の一実施形態に係る胚様体形成用組成物では、上記分解物は、以下（Ａ）〜（Ｃ）のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の少なくとも１種類以上を含有しているものであり得る：
（Ａ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ６とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（Ｂ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、Ｘ６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ７との間の化学結合、または、Ｘ１４とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（Ｃ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ１とＹ２との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（１）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−；
（２）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−Ｘ７−Ｘ８−Ｇ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｇ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｇ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｇ−；
（３）−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｇ−Ｙ４−Ｙ５−Ｇ−Ｙ６−Ｙ７−Ｇ−Ｙ８−Ｙ９−Ｇ−；
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ１〜Ｘ１４およびＹ１〜Ｙ９は、任意のアミノ酸である）。【００２４】
本発明の一実施形態に係る胚様体形成用組成物では、上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列は、上記トリプルヘリカルドメインのアミノ末端のアミノ酸配列であることが好ましい。【００２５】
本発明の一実施形態に係る胚様体形成用組成物では、上記（１）〜（３）の何れかにて示されるアミノ酸配列における切断が、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのα１鎖内およびα２鎖内の少なくとも一方で行われていることが好ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、多能性幹細胞の胚様体を容易に形成させることができるという効果を奏する。また、本発明によれば、従来の胚様体形成方法と比較して、より短期間で胚様体を形成させることができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】位相差顕微鏡下で観察したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図である。なお、ＭＥＦはマウス胎児由来線維芽細胞（Murine Embryonic Fibroblasts）を、ＬＩＦは白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor）を意味する。また、（＋）は共存下での培養、（−）は非共存下での培養を示す。
【図２】位相差顕微鏡下で観察したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図である。
【図３】ＥＳ細胞の細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた結果を示す図であり、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて２日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｂ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて２日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて２日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図である。
【図４】位相差顕微鏡下で観察したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図である。
【図５】位相差顕微鏡下で観察したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図である。
【図６】ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件においてゼラチンコート培養皿において４日間培養したＧＦＰ遺伝子を内在したＥＳ細胞を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示したＥＳ細胞のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は、（ａ）に示したＥＳ細胞の各細胞の核をHoechst 33342染色し、蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｄ）は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。
【図７】ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件においてコラーゲン分解物ゲル培養皿においてＧＦＰ遺伝子を内在したＥＳ細胞を４日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察した胚様体の形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した胚様体のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は、（ａ）に示した胚様体の各細胞の核をHoechst 33342染色し、蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｄ）は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。
【図８】ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（−）の培養条件においてコラーゲン分解物ゲル培養皿においてＧＦＰ遺伝子を内在したＥＳ細胞を４日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察した胚様体の形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した胚様体のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は、（ａ）に示した胚様体の各細胞の核をHoechst 33342染色し、蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｄ）は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。
【図９】位相差顕微鏡下で観察したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ａ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、１日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎコート培養皿において、１日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、ｉＭａｔｒｉｘ５１１コート培養皿において、１日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図である。
【図１０】位相差顕微鏡下で観察したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ａ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、５日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎコート培養皿において、５日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、ｉＭａｔｒｉｘ５１１コート培養皿において、５日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図である。
【図１１】位相差顕微鏡下で観察したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ａ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、４日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿において、４日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図である。
【図１２】位相差顕微鏡下で観察したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ａ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、１２日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿において、１２日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図である。
【図１３】定量ＲＴ−ＰＣＲの結果から得られた発現量の最大値を１００として、各マーカーの相対発現量をレーダーチャート化したものを示す図であり、（ａ）は、コラーゲン分解物コート培養皿で形成したマウスＥＳ細胞の胚様体における各マーカーの相対発現量を示す図であり、（ｂ）は、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿で形成したマウスＥＳ細胞の胚様体における各マーカーの相対発現量を示す図であり、（ｃ）は、ゼラチンコート培養皿で形成したマウスＥＳ細胞の胚様体における各マーカーの相対発現量を示す図である。
【図１４】位相差顕微鏡下で観察したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、アテロコラーゲンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２７）において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｄ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ラット腱由来、配列番号２４と配列番号５との混合物）において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｅ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２６）において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図である。
【図１５】ＥＳ細胞の細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた結果を示す図であり、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｂ）は、アテロコラーゲンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２７）において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｄ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ラット腱由来、配列番号２４と配列番号５との混合物）において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｅ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２６）において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図である。
【図１６】ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件においてゼラチンコート培養皿においてＧＦＰ遺伝子を内在したＥＳ細胞を１日間培養した後に得られたコロニーを、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察した上記コロニーの形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した上記コロニーのＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は（ａ）および（ｂ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。
【図１７】ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件においてコラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２７）においてＧＦＰ遺伝子を内在したＥＳ細胞を１日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察した上記胚様体の形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した上記胚様体のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は（ａ）および（ｂ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。
【図１８】ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件においてコラーゲン分解物コート培養皿（ラット腱由来、配列番号２４と配列番号５との混合物）においてＧＦＰ遺伝子を内在したＥＳ細胞を１日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察した上記胚様体の形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した上記胚様体のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は（ａ）および（ｂ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。
【図１９】ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件においてコラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２６）においてＧＦＰ遺伝子を内在したＥＳ細胞を１日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察した上記胚様体の形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した上記胚様体のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は（ａ）および（ｂ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。
【図２０】位相差顕微鏡下で観察したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、アテロコラーゲンコート培養皿において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２７）において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｄ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ラット腱由来、配列番号２４と配列番号５との混合物）において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｅ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２６）において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図である。
【図２１】ＥＳ細胞の細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた結果を示す図であり、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｂ）は、アテロコラーゲンコート培養皿において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２７）において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｄ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ラット腱由来、配列番号２４と配列番号５との混合物）において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｅ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２６）において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００２９】
〔１．胚様体形成方法〕
本発明の一実施形態に係る胚様体形成方法（以下、「本実施形態の胚様体形成方法」ともいう。）は、多能性幹細胞の胚様体を形成させる方法であって、多能性幹細胞を、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と共に培養する培養工程を包含する構成である。
【００３０】
ここで、本明細書において、上記「多能性幹細胞」は、胎盤以外のすべての細胞に分化可能な分化多能性と、自己複製能とを有する細胞である。そのような多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（核移植ＥＳ細胞；ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、生体組織に由来する多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞（Multilineage-differentiating Stress Enduring cells））などを挙げることができるが、これらに限定されない。また、上記「多能性幹細胞」としては、例えば、ヒト、カニクイザルなどの霊長類、マウスなどに由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書において、上記「胚様体」は、多能性幹細胞から形成された球状の細胞塊であって、適切な分化誘導条件下で種々の細胞へ分化する能力を有しているものをいう。「胚様体」は、エンブリオイド・ボディー（Embryoid Body：EB）とも称される。本明細書における「胚様体」には、多能性幹細胞から胚様体が形成される途中の細胞の凝集体である「胚様体様細胞凝集体」も包含される。本明細書において、「胚様体」は、多能性マーカー（例えば、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ３／４（Octamer-binding transcription factor 3/4）、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ−３（stage-specific embryonic antigen-3）など）を発現していてもよく、また分化マーカー（例えば、ＳＯＸ１（SRY (sex determining region Y)-box 1）、ＳＯＸ７（SRY (sex determining region Y)-box 7）、ＳＯＸ１７（SRY (sex determining region Y)-box 17）、ＨＮＦ-３β（Hepatocyte Nuclear Factor 3β）／ＦｏｘＡ２（forkhead box protein A2）、ＧＡＴＡ４（GATA binding protein 4）、ＧＡＴＡ６（GATA binding protein 6）、Ｏｔｘ２（Orthodenticle homeobox 2）、ＣＸＣＲ４（Chemokine (C-X-C Motif) Receptor 4）、ＧＳＣ（goosecoid）など）を発現していてもよい。「胚様体」は、三胚葉（外胚葉、内胚葉、中胚葉）全てに分化できる能力を有していることが好ましい。三胚葉全てに分化できる能力を有している胚様体は、目的の細胞への分化誘導に好適に用いることができる。
【００３２】
また、「胚様体」の大きさは特に制限されないが、最長径が、５０〜１０００μｍであることが好ましく、１００〜５００μｍであることがより好ましい。「胚様体」の形は特に制限されないが、球形、略球形、楕円形、略楕円形等であることが好ましい。
【００３３】
本実施形態の胚様体形成方法によって胚様体が形成されたことは、肉眼または顕微鏡下で球状の細胞塊の存在を確認することによって確認することができる。本実施形態の胚様体形成方法によって得られた胚様体が種々の細胞へ分化する能力を有していることは、当該胚様体を、公知の適切な分化誘導条件（例えば、公知の、血液細胞への分化誘導条件、神経細胞への分化誘導条件など）で培養し、胚様体由来の細胞が目的の細胞へと分化したことを確認することによって、確認することができる。胚様体由来の細胞が目的の細胞へと分化したことは、分化した細胞の形態、遺伝子発現などを公知の手法を用いて確認することによって、確認することができる。
【００３４】
本実施形態の胚様体形成方法において、上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいる構成である。つまり、上記分解物は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの全体を含んでいてもよいし、トリプルヘリカルドメインの一部分を含んでいてもよい。「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」については、後段で詳細に説明する。
【００３５】
以下に、本実施形態の胚様体形成方法について詳細に説明する。
【００３６】
（１−１．培養工程）
培養工程は、多能性幹細胞を、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と共に培養する工程である。「多能性幹細胞を、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と共に培養する」とは、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が多能性幹細胞と接触可能に存在している環境中で多能性幹細胞を培養することを意味している。例えば、一実施形態において、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を用いて内面をコートした培養容器を用いて、多能性幹細胞を培養してもよい。また、他の実施形態において、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有しているゲル組成物上で多能性幹細胞を培養してもよい。コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、多能性幹細胞と当該多能性幹細胞を培養するための培養容器の内面との接触を妨げるように存在していることが好ましい。これにより、多能性幹細胞の胚様体を効率よく形成することができる。多能性幹細胞を培養するための培養容器は、細胞培養に通常用いられる容器を使用することができる。培養容器は、ディッシュ型のものであってもよく、プレート型、ボトル型のものであってもよい。
【００３７】
本実施形態の胚様体形成方法に使用するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の量は特に限定されない。
【００３８】
一実施形態において、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を用いて内面をコートした培養容器を用いて、多能性幹細胞を培養する場合は、２ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは３ｍｇ／ｍＬ〜１６ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬ、あるいは５ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは８ｍｇ／ｍＬ〜１６ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有している水溶液を調製し、当該分解物の水溶液を用いて、培養容器の内面をコートすることができる。培養容器の内面のコートは、多能性幹細胞の培養を開始する前に行えばよい。上記分解物の水溶液における上記分解物の濃度が２ｍｇ／ｍＬ以上であれば、胚様体を均一に形成することができる。また、上記分解物の水溶液における上記分解物の濃度が２０ｍｇ／ｍＬ以下であれば、再現性が良好となる。これに対して、上記分解物の水溶液における上記分解物の濃度が２ｍｇ／ｍＬ未満である場合は、胚様体の形成が不均一になる場合がある。また、上記分解物の水溶液における上記分解物の濃度が２０ｍｇ／ｍＬよりも高い場合は、粘性が高くなり再現性が不良となる場合がある。
【００３９】
他の実施形態において、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有しているゲル組成物上で多能性幹細胞を培養する場合は、最終濃度として、２ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が、ゲル組成物中に含有されていることが好ましく、５ｍｇ／ｍＬ〜１２ｍｇ／ｍＬまたは５ｍｇ／ｍＬ〜１１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が、ゲル組成物中に含有されていることがより好ましい。７ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬまたは８ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が、ゲル組成物中に含有されていることがよりさらに好ましい。ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として２ｍｇ／ｍＬ以上であれば、胚様体を均一に形成することができる。また、ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として１５ｍｇ／ｍＬ以下であれば、再現性が良好となる。これに対して、ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として２ｍｇ／ｍＬ未満である場合は、胚様体の形成が不均一になる場合がある。また、ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として１５ｍｇ／ｍＬよりも高い場合は、粘性が高くなり再現性が不良となる場合がある。
【００４０】
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有しているゲル組成物は、例えば、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を、濃縮培養液（例えば、５倍濃縮ＤＭＥＭなど）と再構成用緩衝液（５０ｍＭ  水酸化ナトリウム、２６０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）と混合し、この混合液を培養皿に添加して、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で３０分間程度静置することによって作製することができる。
【００４１】
培養工程において用いる培地は、多能性幹細胞の培地であれば特に制限されない。このような培地としては、使用する多能性幹細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、多能性幹細胞の増殖維持に用いられる公知の培養培地を用いることができる。このような培養培地は、基本培地に、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、ウシ胎児血清、グルタミン、ヌクレオシド、ＬＩＦなどを添加して調製することができる。
【００４２】
基本培地としては、従来公知の動物細胞用の培地を用いることができる。例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、α−ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などが挙げられる。これらの基本培地は、単独で使用されても、複数を混合して使用されてもよい。
【００４３】
基本培地には、血清が含有されていてもよいし、または含有されていなくてもよい。また、基本培地は、血清の代わりに人工血清代替物を含んでいてもよい。そのような人工血清代替物としては、例えば、KnockOut（登録商標）Serum Replacement（インビトロジェン製）を挙げることができる。
【００４４】
また、基本培地には、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor：ＬＩＦ)が含有されていてもよいし、または含有されていなくてもよい。ここで、ＬＩＦは、通常、マウスＥＳ細胞の未分化状態を維持するために培養培地に添加される。従って、マウスＥＳ細胞から胚様体を形成する場合は、通常は、ＬＩＦ非存在下において胚様体の形成が行われる。しかし、本実施形態の胚様体形成方法によれば、驚くべきことに、胚様体形成用培地としてＬＩＦを含有している培地を用いた場合であっても、ＬＩＦを含有していない培地を用いた場合と同様に、マウスＥＳ細胞から胚様体を形成することができる。
【００４５】
培養工程では、多能性幹細胞をフィーダー細胞と共培養させてもよく、フィーダー細胞が存在していなくてもよい。フィーダー細胞としては、多能性幹細胞の維持培養においてフィーダー細胞として通常用いられる細胞を使用することができる。例えば、マウス胎児由来線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast：ＭＥＦ）などを挙げることができる。フィーダー細胞を使用する場合は、多能性幹細胞の培養を開始する少なくとも１日前に、フィーダー細胞を播種しておくことが好ましい。
【００４６】
多能性幹細胞の播種密度は、特に限定されないが、培地１ｍｌあたり、１×１０３個〜１×１０６個であることが好ましく、２×１０３個〜５×１０５個であることがより好ましく、５×１０３個〜５×１０４個であることがさらに好ましい。一般に、播種数が極端に少ない場合は、細胞の生存率が低下しやすく、また胚様体を形成しにくくなる。一方、播種数が極端に多い場合は、不均一で大きな胚様体を形成しやすくなる。これらの場合、分化誘導する際に、再現性などの問題が生じやすい。播種密度は、多能性幹細胞の種類により適宜最適な密度を決めればよく、何ら限定されるものではない。
【００４７】
培養工程における培養条件としては、通常の細胞培養が行われる条件であればよい。培養温度は、例えば、３０℃〜４０℃、好ましくは３７℃である。培養は、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われ、ＣＯ２濃度は、例えば、２％〜５％、好ましくは５％である。培養期間は、どのような品質の胚様体を形成したいかに応じて適宜設定することができる。例えば、培養期間が長くなるほど、より大きい胚様体を形成することができる。培養期間は、使用する多能性幹細胞の種類により異なるが、短くとも１日間以上であることが好ましく、３日間以上であることがより好ましく、５日間以上であることがさらに好ましい。また、長くとも２０日間以下であることが好ましく、１５日間以下であることがより好ましく、１０日間以下であることがさらに好ましい。培養日数が短いと、胚様体のサイズが不均一で安定しにくい。一方、培養日数が長くなるに従い、胚様体の品質が低下しやすくなり、不均一な分化を起こしやすくなる。これら培養日数は、細胞の播種数により適宜最適な期間を決めればよく、何ら限定されるものではない。
【００４８】
従来のＥＳ細胞の胚様体を得る方法では、例えば、マウスのＥＳ細胞を用いた場合は、胚様体を得るまでに長期間（例えば、ハンギングドロップ法では、短くとも７日程度）を要する。これに対して、本実施形態の胚様体形成方法では、例えば、マウスのＥＳ細胞を用いた場合は、後述する実施例に示したとおり、培養開始後１日目には胚様体が形成される。
【００４９】
そして、従来のＥＳ細胞の胚様体を得る方法では、再現性が悪く、熟練を要していたが、本実施形態の胚様体形成方法では、一般的な細胞培養の手法によって、基本的な培養技術を有している研究者では容易に胚様体を形成することができる。
【００５０】
また、本実施形態の胚様体形成方法は、単なる胚様体のみならず、外胚葉、内胚葉および／または中胚葉に分化する能力を有する胚様体を形成することができるという点でも優れている。このような利点は本発明者らによって初めて見出されたものである。後述の実施例においても、本実施形態の胚様体形成方法によれば、これまでに観察されていないような胚様体が形成されることが示されている。また、実施例では、得られた胚様体が分化マーカーを発現することも示されている。
【００５１】
培養工程では、培養期間中に培地交換を行ってもよい。培地交換を行う場合は、毎日または２〜５日に一度、培地交換を行えばよい。適切な頻度で培地交換を行うことによって、良好な培養環境を保つことができる。従来のハンギングドロップ法、または超親水性処理培養皿では、通常、細胞に負担なく培地交換をすることができない。また、培地交換する間に細胞を吸引廃棄する危険性が高くなる。これに対して、本実施形態の胚様体形成方法では、細胞に負担をかけることなく培地交換をすることが可能である。また、培地交換の間に細胞を吸引廃棄する危険性が低い。
【００５２】
（１−２．その他の工程）
本実施形態の胚様体形成方法は、上述した培養工程以外の工程を更に包含していてもよい。例えば、形成された胚様体の質を確認する確認工程を更に包含していてもよい。ここで、上記「胚様体の質」とは、胚様体の未分化および／または分化の程度、胚様体の分化能、胚様体の大きさ（胚様体の直径）、胚様体の形が意図される。すなわち、当該確認工程は、胚様体の質を確認するために、例えば、胚様体の未分化および／または分化の程度を確認する工程であってもよく、胚様体の分化能を確認する工程であってもよく、胚様体の大きさ（例えば、直径）を確認する工程であってもよく、胚様体の形（例えば、球形）を確認する工程であってもよい。
【００５３】
胚様体の未分化および／または分化の程度は、例えば、胚様体における公知の分化マーカー、未分化マーカーなどの発現を遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで確認することによって確認することができる。
【００５４】
また、胚様体の分化能は、例えば、胚様体を公知の適切な分化誘導条件（例えば、公知の、血液細胞への分化誘導条件、神経細胞への分化誘導条件など）で培養し、胚様体由来の細胞が目的の細胞へと分化したことを確認することによって、確認することができる。
【００５５】
また、胚様体の大きさと形とは、例えば、胚様体の直径と形とを位相差顕微鏡下で測定することによって確認することができる。
【００５６】
上記確認工程は、上述した培養工程の途中で行ってもよく、培養工程後に行ってもよい。培養工程の途中で上記確認工程を行うことによって、培養期間を適切に調整することができる。
【００５７】
また、本実施形態の胚様体形成方法は、培養工程後に、胚様体を回収する回収工程を更に包含していてもよい。
【００５８】
以下に、本実施形態の胚様体形成方法において使用する「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」について詳細に説明する。
【００５９】
＜コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物＞
本実施形態の胚様体形成方法において、上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」（以下、単に「分解物」ともいう場合がある。）は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいる構成である。つまり、上記分解物は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの全体を含んでいてもよいし、トリプルヘリカルドメインの一部分を含んでいてもよい。
【００６０】
更に具体的には、上記分解物は、以下（Ａ）〜（Ｃ）のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の少なくとも１種類以上を含有しているものである：
（Ａ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ６とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（Ｂ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、Ｘ６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ７との間の化学結合、または、Ｘ１４とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（Ｃ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ１とＹ２との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（１）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−（配列番号１）；
（２）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−Ｘ７−Ｘ８−Ｇ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｇ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｇ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｇ−（配列番号１４）；
（３）−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｇ−Ｙ４−Ｙ５−Ｇ−Ｙ６−Ｙ７−Ｇ−Ｙ８−Ｙ９−Ｇ−（配列番号１３）；
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ１〜Ｘ１４およびＹ１〜Ｙ９は、任意のアミノ酸である）。
【００６１】
以下に、各構成について詳細に説明する。
【００６２】
分解物の材料になるコラーゲンおよびアテロコラーゲンは特に限定されず、周知のコラーゲンおよびアテロコラーゲンであればよい。
【００６３】
分解物の材料になるコラーゲンとしては、哺乳類（例えば、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒト、ラットまたはマウスなど）、鳥類（例えば、ニワトリなど）、または、魚類（例えば、サメ、コイ、ウナギ、マグロ（例えば、キハダマグロ）、ティラピア、タイ、サケなど）のコラーゲンを用いることができる。
【００６４】
更に具体的には、分解物の材料になるコラーゲンとしては、上記哺乳類または鳥類の真皮、腱、骨または筋膜などに由来するコラーゲン、あるいは、上記魚類の皮膚または鱗などに由来するコラーゲンを用いることができる。
【００６５】
分解物の材料になるアテロコラーゲンとしては、上記哺乳類、鳥類または魚類のコラーゲンをプロテアーゼ（例えば、ペプシンなど）によって処理して得られる、コラーゲン分子のアミノ末端および／またはカルボキシル末端からテロペプチドが部分的に除去されているアテロコラーゲンを用いることができる。
【００６６】
これらのなかでは、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヒトまたはラットのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを分解物の材料として好ましく用いることができ、ブタ、ウシまたはヒトのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを分解物の材料として更に好ましく用いることができる。
【００６７】
また、分解物の材料として魚類のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることにより、材料を簡便に、安全に、かつ大量に入手可能であり、ヒトに対してより安全なコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を実現することができる。
【００６８】
なお、分解物の材料として魚類のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いる場合には、サメ、コイ、ウナギ、マグロ（例えば、キハダマグロ）、ティラピア、タイまたはサケのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることが好ましく、マグロ、ティラピア、タイまたはサケのコラーゲンまたはアテロコラーゲンを用いることが更に好ましい。
【００６９】
分解物の材料としてアテロコラーゲンを用いる場合、熱による変性温度が、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上であるアテロコラーゲンを用いることが好ましい。例えば、分解物の材料として魚類のアテロコラーゲンを用いる場合、マグロ（例えば、キハダマグロ）、ティラピアまたはコイなどのアテロコラーゲンは熱変性温度が２５℃以上であるので、これらのアテロコラーゲンを用いることが好ましい。
【００７０】
上記構成であれば、分解物の変性温度を、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上に調節することができる。その結果、上記構成であれば、貯蔵時の安定性、利用時の安定性に優れた分解物を実現することができる。
【００７１】
分解物の材料になるコラーゲンおよびアテロコラーゲンは、周知の方法によって入手することができる。例えば、哺乳類、鳥類または魚類のコラーゲンに富んだ組織をｐＨ２〜４程度の酸性溶液に投入することによって、コラーゲンを溶出することができる。更に、当該溶出液にペプシンなどのプロテアーゼを添加して、コラーゲン分子のアミノ末端および／またはカルボキシル末端のテロペプチドを部分的に除去する。更に、当該溶出液に塩化ナトリウムなどの塩を加えることによって、アテロコラーゲンを沈殿させることができる。
【００７２】
上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」は、以下（Ａ）〜（Ｃ）のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の少なくとも１種類以上を含有しているものである：
（Ａ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ６とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（Ｂ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、Ｘ６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ７との間の化学結合、または、Ｘ１４とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（Ｃ）上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ１とＹ２との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物；
（１）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−；
（２）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−Ｘ７−Ｘ８−Ｇ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｇ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｇ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｇ−；
（３）−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｇ−Ｙ４−Ｙ５−Ｇ−Ｙ６−Ｙ７−Ｇ−Ｙ８−Ｙ９−Ｇ−；
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ１〜Ｘ１４およびＹ１〜Ｙ９は、任意のアミノ酸である）。
【００７３】
本明細書において「トリプルヘリカルドメイン」とは、「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ」（ＸおよびＹは任意のアミノ酸）にて示されるアミノ酸配列が、少なくとも３個以上、より好ましくは少なくとも８０個以上、より好ましくは少なくとも３００個以上、連続するアミノ酸配列を含むドメインであって、螺旋構造の形成に寄与するドメインを意図する。
【００７４】
本明細書において、上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の上記（１）〜（３）の何れか１つにて示されるアミノ酸配列内の任意の１箇所が切断された分解物であってもよい。上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインよりもＣ末端側の部分の全体を含んでいるものであってもよいし、または一部分を含んでいるものであってもよい。「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」がコラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインよりもＣ末端側の部分の一部分を含んでいる場合は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインよりもＣ末端側の部分を、３アミノ酸以上、５アミノ酸以上、１０アミノ酸以上含んでいてもよい。例えば、ニワトリＩ型コラーゲンのＣ末端配列の配列情報は、S. Kunii et al., Journal of Biological Chemistry, Vol.285, No.23, pp.17465-17470, June4, 2010に記載されている。
【００７５】
一実施形態において、上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」は、上記（Ａ）〜（Ｃ）のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の少なくとも１種類以上を含有するものであればよい。すなわち、上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」は、上記（Ａ）〜（Ｃ）のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の１種類を単独で含有するものであってもよく、上記（Ａ）〜（Ｃ）のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の内の１種類以上を組み合せて含有するものであってもよい。
【００７６】
トリプルヘリカルドメイン内で化学結合の切断が生じているポリペプチド鎖は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを構成する複数種類のポリペプチド鎖のうちの何れのポリペプチド鎖であってもよい。
【００７７】
例えば、化学結合の切断が生じているポリペプチド鎖は、α１鎖もしくはα２鎖のうちの何れであってもよい。
【００７８】
化学結合の切断が生じているポリペプチド鎖は、上述したポリペプチド鎖のなかではα１鎖またはα２鎖の少なくとも両方であることが好ましい。
【００７９】
化学結合の切断が生じているポリペプチド鎖は、上述したポリペプチド鎖のなかではα１鎖であることが更に好ましい。
【００８０】
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を酵素処理によって作製すれば、容易に特定のポリペプチド鎖のみで切断を生じさせることができる。
【００８１】
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、３つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成しているものであってもよい。あるいは、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、３つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成していないもの、または、３つのポリペプチド鎖が部分的に螺旋構造を形成していないものであってもよい。なお、３つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成しているか否かは、公知の方法（例えば、円偏光二色スペクトル）によって確認することができる。
【００８２】
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、基本的に３つのポリペプチド鎖を含んでいるが、３つのポリペプチド鎖のうちの１つのポリペプチド鎖にて化学結合の切断が生じていてもよいし、３つのポリペプチド鎖のうちの２つのポリペプチド鎖にて化学結合の切断が生じていてもよいし、３つのポリペプチド鎖の全てにて化学結合の切断が生じていてもよい。
【００８３】
３つのポリペプチド鎖が螺旋構造を形成している場合には、複数の螺旋構造体によって、網目状の会合体が形成されていてもよいし、線維状の会合体が形成されていてもよい。
【００８４】
本明細書において、網目状とは、水素結合または静電的相互作用、ファンデルワールス結合などによって分子が連なって立体的な網目をつくり、当該網目の間に隙間ができている構造を意図する。本明細書において、線維状とは、水素結合または静電的相互作用、ファンデルワールス結合などによって分子が連なって形成された略直線状の構造を意図する。また、本明細書において、会合体とは、同種の分子が共有結合によらないで２分子以上が相互作用して結合し、１つの構造単位となっているものを意図する。網目状または線維状の会合体が形成されているか否かは、電子顕微鏡にて観察することによって確認することができる。
【００８５】
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、架橋構造を有するものであってもよい。例えば、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖とが、螺旋構造と螺旋構造とが、または、ポリペプチド鎖と螺旋構造とが、架橋剤によって架橋されていてもよい。
【００８６】
上記架橋構造は、周知の架橋方法によって形成することができる。例えば、化学架橋する方法、熱処理により架橋する方法、紫外線など放射線照射により架橋する方法などが挙げられる。
【００８７】
化学架橋に用いる架橋剤としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩などの水溶性カルボジイミド化合物、エピクロロヒドリン、ビスエポキシジエチレングリコールなどのジエポキシ化合物、ＮａＢＨ４などが挙げられる。
【００８８】
架橋剤の濃度は、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物に対して、好ましくは１０−３〜１０質量％である。好ましくは、５〜４０℃にて、３〜４８時間、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と架橋剤とを接触させることにより、架橋構造を形成することができる。
【００８９】
紫外線により架橋する場合、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物に、例えば、室温にて、紫外線ランプなどにより紫外線を３〜４８時間程度照射することによって、架橋構造を形成することができる。
【００９０】
熱架橋する場合は、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を、減圧下にて、好ましくは１１０〜１６０℃程度の温度で、３〜４８時間程度加熱することによって、架橋構造を形成することができる。
【００９１】
架橋構造を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、耐コラゲナーゼ性、および、強度が向上しているという利点を有している。
【００９２】
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、必要に応じて、所望の化学修飾を施されていてもよい。化学修飾の種類としては、例えば、アシル化、ミリスチル化、ポリエチレングリコール修飾などを挙げることができる。
【００９３】
例えば、アシル化の一種であるサクシニル化を施した分解物は、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と無水コハク酸とを、リン酸緩衝液などの中性ｐＨの溶媒中で反応させて得ることができる。サクシニル化することにより、中性ｐＨの溶媒に対する分解物の溶解度を向上させることができる。
【００９４】
また、ポリエチレングリコール修飾を施した分解物は、塩化シアヌルで活性化したポリエチレングリコールと、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物とを反応させることにより、得ることができる。
【００９５】
上述したコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物では、上述したトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ６とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている；
（１）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−：
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ１〜Ｘ６は、任意のアミノ酸である）。
【００９６】
また、上述したコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物では、上述したトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、Ｘ６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ７との間の化学結合、または、Ｘ１４とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている；
（２）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−Ｘ７−Ｘ８−Ｇ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｇ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｇ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｇ−：
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ１〜Ｘ１４は、任意のアミノ酸である）。
【００９７】
また、上述したコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物では、上述したトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ１とＹ２との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている；
（３）−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｇ−Ｙ４−Ｙ５−Ｇ−Ｙ６−Ｙ７−Ｇ−Ｙ８−Ｙ９−Ｇ−（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｙ１〜Ｙ９は、任意のアミノ酸である）。
【００９８】
上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列のトリプルヘリカルドメイン内における位置は、特に限定されない。例えば、上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列は、トリプルヘリカルドメインの内部に存在していてもよいが、トリプルヘリカルドメインのアミノ末端に存在していることが好ましい（換言すれば、上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列の中の最もアミノ末端側に配置されている「Ｇ」が、トリプルヘリカルドメインの中の最もアミノ末端側に配置されている「Ｇ」と一致することが好ましい）。
【００９９】
上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列がトリプルヘリカルドメインの内部に存在している場合、当該（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列の具体的な位置は特に限定されない。当該（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列のアミノ末端側に、１個以上、５個以上、１０個以上、５０個以上、１００個以上、１５０個以上、２００個以上、２５０個以上または３００個以上の「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ」（ＸおよびＹは任意のアミノ酸）が連続するアミノ酸配列が存在していてもよい。また、当該（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、１個以上、５個以上、１０個以上、５０個以上、１００個以上、１５０個以上、２００個以上、２５０個以上または３００個以上の「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ」（ＸおよびＹは任意のアミノ酸）が連続するアミノ酸配列が存在していてもよい。
【０１００】
トリプルヘリカルドメイン内の当該（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列以外の部分（すなわち、上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列がトリプルヘリカルドメインの内部に存在している場合は、当該（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列のアミノ末端側および／またはカルボキシル末端側。上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列がトリプルヘリカルドメインのアミノ末端に存在している場合は、当該（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側）は切断されていなくてもよく、または１箇所以上が切断されていてもよい。
【０１０１】
上記Ｘ１〜Ｘ６の各々は、任意のアミノ酸であり得、アミノ酸の種類は特に限定されない。また、Ｘ１〜Ｘ６の各々は、少なくとも一部が同じ種類のアミノ酸であってもよいし、全てが異なる種類のアミノ酸であってもよい。
【０１０２】
例えば、Ｘ１〜Ｘ６の各々は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンのうちの何れであってもよい。
【０１０３】
更に具体的には、Ｘ１〜Ｘ６のうち、Ｘ１、Ｘ３およびＸ５が同じアミノ酸であり、その他が別のアミノ酸であってもよい。
【０１０４】
更に具体的には、Ｘ１〜Ｘ６のうち、Ｘ１、Ｘ３およびＸ５からなる群から選択される少なくとも１つがプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１０５】
更に具体的には、Ｘ１がプロリンであり、Ｘ２〜Ｘ６が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１０６】
更に具体的には、Ｘ１およびＸ３がプロリンであり、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ６が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１０７】
更に具体的には、Ｘ１、Ｘ３およびＸ５がプロリンであり、Ｘ２、Ｘ４およびＸ６が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１０８】
更に具体的には、Ｘ１、Ｘ３およびＸ５がプロリンであり、Ｘ２が側鎖に硫黄原子を含むアミノ酸（例えば、システインまたはメチオニン）または側鎖に水酸基を含むアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンまたはセリン）であり、Ｘ４およびＸ６が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１０９】
更に具体的には、Ｘ１、Ｘ３およびＸ５がプロリンであり、Ｘ２が側鎖に硫黄原子を含むアミノ酸（例えば、システインまたはメチオニン）であり、Ｘ４が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）または側鎖に水酸基を含むアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンまたはセリン）であり、Ｘ６が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１１０】
更に具体的には、Ｘ１、Ｘ３およびＸ５がプロリンであり、Ｘ２が側鎖に硫黄原子を含むアミノ酸（例えば、システインまたはメチオニン）であり、Ｘ４が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）または側鎖に水酸基を含むアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンまたはセリン）であり、Ｘ６が側鎖に塩基を含むアミノ酸（例えば、アルギニン、リシンまたはヒスチジン）であってもよい。
【０１１１】
更に具体的には、Ｘ１、Ｘ３およびＸ５がプロリンであり、Ｘ２がメチオニンであり、Ｘ４がアラニンまたはセリンであり、Ｘ６がアルギニンであってもよい。
【０１１２】
上記（２）にて示されるアミノ酸配列では、Ｘ１〜Ｘ６の各々は、上述したＸ１〜Ｘ６と同じ構成であり得る。Ｘ７〜Ｘ１４の具体的な構成について、以下に説明する。
【０１１３】
上記Ｘ７〜Ｘ１４の各々は、任意のアミノ酸であり得、アミノ酸の種類は特に限定されない。また、Ｘ７〜Ｘ１４の各々は、少なくとも一部が同じ種類のアミノ酸であってもよいし、全てが異なる種類のアミノ酸であってもよい。
【０１１４】
例えば、Ｘ７〜Ｘ１４の各々は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンのうちの何れであってもよい。
【０１１５】
更に具体的には、Ｘ７〜Ｘ１４のうち、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２およびＸ１３が同じアミノ酸であり、その他が別のアミノ酸であってもよい。
【０１１６】
更に具体的には、Ｘ７〜Ｘ１４のうち、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２およびＸ１３からなる群から選択される少なくとも１つがプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１１７】
更に具体的には、Ｘ７〜Ｘ１４のうち、Ｘ８がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１１８】
更に具体的には、Ｘ７〜Ｘ１４のうち、Ｘ８およびＸ９がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１１９】
更に具体的には、Ｘ７〜Ｘ１４のうち、Ｘ８、Ｘ９およびＸ１０がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１２０】
更に具体的には、Ｘ７〜Ｘ１４のうち、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０およびＸ１２がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１２１】
更に具体的には、Ｘ７〜Ｘ１４のうち、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２およびＸ１３がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１２２】
更に具体的には、Ｘ７〜Ｘ１４のうち、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２およびＸ１３がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、Ｘ７が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）であり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１２３】
更に具体的には、Ｘ７〜Ｘ１４のうち、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２およびＸ１３がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、Ｘ７およびＸ１１が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）であり、その他が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１２４】
更に具体的には、Ｘ７〜Ｘ１４のうち、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２およびＸ１３がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、Ｘ７およびＸ１１が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）であり、Ｘ１４が親水性でありかつ非解離性の側鎖を有するアミノ酸（セリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン）であってもよい。
【０１２５】
更に具体的には、Ｘ７〜Ｘ１４のうち、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１２およびＸ１３がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、Ｘ７がロイシンであり、Ｘ１１がアラニンであり、Ｘ１４がグルタミンであってもよい。
【０１２６】
上記（３）にて示されるアミノ酸配列は、トリプルヘリカルドメインのアミノ末端に位置している。つまり、Ｙ３とＹ４との間に位置しているＧは、トリプルヘリカルドメイン内の最もアミノ末端側に位置しているグリシンを示している。そして、Ｙ１、Ｙ２およびＹ３は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを構成する複数種類のポリペプチド鎖内において、トリプルヘリカルドメインよりもアミノ末端側に位置しているアミノ酸を示している。
【０１２７】
また、当該（３）にて示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、１個以上、５個以上、１０個以上、５０個以上、１００個以上、１５０個以上、２００個以上、２５０個以上または３００個以上の「Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ」（ＸおよびＹは任意のアミノ酸）が連続するアミノ酸配列が存在していてもよい。
【０１２８】
トリプルヘリカルドメイン内の当該（３）にて示されるアミノ酸配列以外の部分（すなわち、上記（３）にて示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側）は切断されていなくてもよく、または１箇所以上が切断されていてもよい。
【０１２９】
上記Ｙ１〜Ｙ９の各々は、任意のアミノ酸であり得、アミノ酸の種類は特に限定されない。また、Ｙ１〜Ｙ９の各々は、少なくとも一部が同じ種類のアミノ酸であってもよいし、全てが異なる種類のアミノ酸であってもよい。
【０１３０】
例えば、Ｙ１〜Ｙ９の各々は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンのうちの何れであってもよい。
【０１３１】
更に具体的には、Ｙ３がプロリンであり、Ｙ１およびＹ２が任意のアミノ酸であってもよい。
【０１３２】
更に具体的には、Ｙ３がプロリンであり、Ｙ１およびＹ２が脂肪族の側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンまたはイソロイシン）または側鎖に水酸基を含むアミノ酸（ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリシンまたはセリン）であってもよい。
【０１３３】
更に具体的には、Ｙ３がプロリンであり、Ｙ１がアラニンまたはセリンであり、Ｙ２がバリンであってもよい。
【０１３４】
このとき、Ｙ４〜Ｙ９の具体的な構成は、特に限定されないが、Ｙ４とＸ１とが同じアミノ酸であり、Ｙ５とＸ２とが同じアミノ酸であり、Ｙ６とＸ３とが同じアミノ酸であり、Ｙ７とＸ４とが同じアミノ酸であり、Ｙ８とＸ５とが同じアミノ酸であり、Ｙ９とＸ６とが同じアミノ酸であってもよい。
【０１３５】
従来のコラーゲン、および、アテロコラーゲンは、ヒトの体温に近い温度では溶け難い。一方、本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、ヒトの体温に近い温度でも液体状であり得る。
【０１３６】
また、本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、従来のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と比較して、ゲル化し始める濃度が高い。
【０１３７】
本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物には、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の上記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ６とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている。
【０１３８】
本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物には、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の上記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、Ｘ６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ７との間の化学結合、または、Ｘ１４とＧとの間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている。
【０１３９】
また、本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物には、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の上記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ１とＹ２との間の化学結合が切断された、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている。
【０１４０】
上記切断は、適宜所望の方法によって行うことができる。
【０１４１】
例えば、既に切断されている状態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを、化学合成法によって作製することが可能である。なお、化学合成法としては、一般的な周知の化学合成法を用いることが可能である。
【０１４２】
また、既に切断されている状態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンをコードするＤＮＡを周知のタンパク質発現ベクターに挿入する。そして、当該タンパク質発現ベクターを所望の宿主（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など）に導入した後、当該宿主内で、既に切断されている状態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンの発現を誘導する。これによって、既に切断されている状態のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを作製することも可能である。
【０１４３】
また、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ（例えば、システインプロテアーゼ））によって分解することによって上記切断を行うことも可能である。
【０１４４】
上記切断を行う方法の詳細については、後述する。
【０１４５】
（Ｉ．コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法）
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、
Ａ）コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、または、Ｘ６とＧとの間の化学結合を切断する、切断工程、または、
Ｂ）コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、Ｘ６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ７との間の化学結合、または、Ｘ１４とＧとの間の化学結合を切断する、切断工程、または、
Ｃ）コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ１とＹ２との間の化学結合を切断する、切断工程、を含む製造方法である：
（１）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−；
（２）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−Ｘ７−Ｘ８−Ｇ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｇ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｇ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｇ−；
（３）−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｇ−Ｙ４−Ｙ５−Ｇ−Ｙ６−Ｙ７−Ｇ−Ｙ８−Ｙ９−Ｇ−；
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ１〜Ｘ１４およびＹ１〜Ｙ９は、任意のアミノ酸である）。
【０１４６】
また、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、以下の切断工程を含む製造方法であってもよい。つまり、
Ｄ）コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（１）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、および、Ｘ６とＧとの間の化学結合から選択される何れか１つの化学結合を切断する、切断工程、または、
Ｅ）コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメイン内の下記（２）にて示されるアミノ酸配列の、Ｘ１とＸ２との間の化学結合、Ｘ２とＧとの間の化学結合、ＧとＸ３との間の化学結合、Ｘ４とＧとの間の化学結合、Ｘ６とＧとの間の化学結合、ＧとＸ７との間の化学結合、および、Ｘ１４とＧとの間の化学結合から選択される何れか１つの化学結合を切断する、切断工程、または、
Ｆ）コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインのアミノ末端の下記（３）にて示されるアミノ酸配列の、Ｙ１とＹ２との間の化学結合を切断する、切断工程：
（１）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−：
（２）−Ｇ−Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ−Ｘ５−Ｘ６−Ｇ−Ｘ７−Ｘ８−Ｇ−Ｘ９−Ｘ１０−Ｇ−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｇ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｇ−：
（３）−Ｙ１−Ｙ２−Ｙ３−Ｇ−Ｙ４−Ｙ５−Ｇ−Ｙ６−Ｙ７−Ｇ−Ｙ８−Ｙ９−Ｇ−：
（但し、Ｇは、グリシンであり、Ｘ１〜Ｘ１４およびＹ１〜Ｙ９は、任意のアミノ酸である）。
【０１４７】
以下に、各構成について詳細に説明する。なお、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物自体については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
【０１４８】
上記切断工程は、（１）〜（３）にて示されるアミノ酸配列の特定の箇所の化学結合を切断する工程であればよく、具体的な構成は特に限定されない。
【０１４９】
上記切断工程は、実際にトリプルヘリカルドメイン内の化学結合を切断して、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を作製する工程であってもよい（例えば、酵素法）。
【０１５０】
また、既にトリプルヘリカルドメイン内の化学結合が切断されているコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を作製する工程（例えば、化学合成法、組み換えタンパク質の発現）を本願における「切断工程」の概念に含めることもできる。
【０１５１】
以下に、上述した切断工程の詳細を説明する。
【０１５２】
（Ｉ−ｉ．酵素法に基づく切断工程）
酵素法に基づく切断工程を採用する場合には、例えば、以下のように切断工程を構成することができる。
【０１５３】
上記切断工程は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ（例えば、システインプロテアーゼ））によって分解することによって行うことが可能である。
【０１５４】
上記酵素としては特に限定されないが、例えば、システインプロテアーゼを用いることが好ましい。
【０１５５】
システインプロテアーゼとしては、塩基性アミノ酸量よりも酸性アミノ酸量の方が多いシステインプロテアーゼ、酸性領域の水素イオン濃度において活性であるシステインプロテアーゼを用いることが好ましい。
【０１５６】
このようなシステインプロテアーゼとしては、カテプシンＢ［ＥＣ  ３．４．２２．１］、パパイン［ＥＣ  ３．４．２２．２］、フィシン［ＥＣ  ３．４．２２．３］、アクチニダイン［ＥＣ  ３．４．２２．１４］、カテプシンＬ［ＥＣ  ３．４．２２．１５］、カテプシンＨ［ＥＣ  ３．４．２２．１６］、カテプシンＳ［ＥＣ  ３．４．２２．２７］、ブロメライン［ＥＣ  ３．４．２２．３２］、カテプシンＫ［ＥＣ  ３．４．２２．３８］、アロライン、カルシウム依存性プロテアーゼなどを挙げることが可能である。
【０１５７】
これらの中では、パパイン、フィシン、アクチニダイン、カテプシンＫ、アロラインまたはブロメラインを用いることが好ましく、パパイン、フィシン、アクチニダイン、カテプシンＫを用いることが更に好ましい。
【０１５８】
上述した酵素は、公知の方法によって入手することができる。例えば、化学合成による酵素の作製；細菌、真菌、各種動植物の細胞または組織からの酵素の抽出；遺伝子工学的手段による酵素の作製；などによって入手することができる。勿論、市販の酵素を用いることも可能である。
【０１５９】
コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ）によって分解することによって切断工程を行う場合には、例えば、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法にしたがって切断工程を行うことができる。以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法は、あくまでも切断工程の一例であって、本発明は、これら（ｉ）〜（ｉｉｉ）の方法に限定されない。
【０１６０】
なお、以下の（ｉ）および（ｉｉ）の方法は、（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列の特定の箇所の化学結合を切断するために用いられる方法の一例であり、以下の（ｉｉｉ）の方法は、（３）にて示されるアミノ酸配列の特定の箇所の化学結合を切断するために用いられる方法の一例である。
【０１６１】
（ｉ）高濃度の塩の存在下にて、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法。
【０１６２】
（ｉｉ）高濃度の塩と接触させた後の酵素と、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとを接触させる方法。
【０１６３】
（ｉｉｉ）低濃度の塩の存在下にて、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法。
【０１６４】
上述した（ｉ）の方法の具体例としては、例えば、高濃度の塩を含む水溶液中で、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法を挙げることができる。
【０１６５】
上述した（ｉｉ）の方法の具体例としては、例えば、高濃度の塩を含む水溶液と酵素とを予め接触させ、その後、当該酵素と、コラーゲンまたはアテロコラーゲンとを接触させる方法を挙げることができる。
【０１６６】
上述した（ｉｉｉ）の方法の具体例としては、例えば、低濃度の塩を含む水溶液中で、コラーゲンまたはアテロコラーゲンと、酵素とを接触させる方法を挙げることができる。
【０１６７】
上記水溶液の具体的な構成としては特に限定されないが、例えば、水を用いることが可能である。
【０１６８】
上記塩の具体的な構成としては特に限定されないが、塩化物を用いることが好ましい。塩化物としては、特に限定されないが、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＬｉＣｌまたはＭｇＣｌ２を用いることが可能である。
【０１６９】
上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は特に限定されないが、高いほど好ましいといえる。例えば、当該濃度は、２００ｍＭ以上であることが好ましく、５００ｍＭ以上であることがより好ましく、１０００ｍＭ以上であることがより好ましく、１５００ｍＭ以上であることがより好ましく、２０００ｍＭ以上であることが最も好ましい。
【０１７０】
上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度の上限値は、特に限定されないが、例えば２５００ｍＭであり得る。塩の濃度が２５００ｍＭよりも高くなると、タンパク質の多くが塩析してしまい、その結果、酵素によるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解効率が低下する傾向を示す。一方、塩の濃度が２５００ｍＭ以下であれば、酵素によるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの分解効率を高くすることができる。
【０１７１】
したがって、上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は、２００ｍＭ以上２５００ｍＭ以下であることが好ましく、５００ｍＭ以上２５００ｍＭ以下であることがより好ましく、１０００ｍＭ以上２５００ｍＭ以下であることがより好ましく、１５００ｍＭ以上２５００ｍＭ以下であることがより好ましく、２０００ｍＭ以上２５００ｍＭ以下であることが最も好ましい。
【０１７２】
上記高濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度が高いほど、酵素によるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの切断箇所の特異性を上げることができる。その結果、本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を、より均一で、かつ、生理活性が高いものにすることができる。
【０１７３】
上記低濃度の塩を含む水溶液における塩の濃度は特に限定されないが、低いほど好ましいといえる。例えば、当該濃度は、２００ｍＭよりも低いことが好ましく、１５０ｍＭ以下であることがより好ましく、１００ｍＭ以下であることがより好ましく、５０ｍＭ以下であることがより好ましく、略０ｍＭであることが最も好ましい。
【０１７４】
上記水溶液（例えば、水）に溶解させるコラーゲンまたはアテロコラーゲンの量は特に限定されないが、例えば、１０００重量部〜１００００重量部の水溶液に対して、１重量部のコラーゲンまたはアテロコラーゲンを溶解させることが好ましい。
【０１７５】
上記構成であれば、水溶液に対して酵素が加えられた場合、当該酵素とコラーゲンまたはアテロコラーゲンとを効率よく接触させることができる。そして、その結果、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ）によって効率よく分解することができる。
【０１７６】
上記水溶液に加える酵素の量は特に限定されないが、例えば、１００重量部のコラーゲンまたはアテロコラーゲンに対して、１０重量部〜２０重量部の酵素を加えることが好ましい。
【０１７７】
上記構成であれば、水溶液中の酵素の濃度が高いので、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素（例えば、プロテアーゼ）によって効率よく分解することができる。
【０１７８】
水溶液中でコラーゲンまたはアテロコラーゲンと酵素とを接触させるときの他の条件（例えば、水溶液のｐＨ、温度、接触時間など）も特に限定されず、適宜、設定することができるが以下の範囲であることが好ましい。
【０１７９】
１）水溶液のｐＨは、ｐＨ２．０〜７．０が好ましく、ｐＨ２．５〜６．５が更に好ましい。水溶液のｐＨを上述した範囲に保つために、水溶液に対して周知のバッファーを加えることが可能である。上記ｐＨであれば、水溶液中にコラーゲンまたはアテロコラーゲンを均一に溶解することができ、その結果、酵素反応を効率よく進めることができる。
【０１８０】
２）温度は特に限定されず、用いる酵素に応じて温度を選択すればよい。例えば、当該温度は、１５℃〜４０℃であることが好ましく、２０℃〜３５℃であることがより好ましい。
【０１８１】
３）接触時間は特に限定されず、酵素の量、および／または、コラーゲンまたはアテロコラーゲンの量に応じて接触時間を選択すればよい。例えば、当該時間は、１時間〜６０日間であることが好ましく、１日間〜７日間であることがより好ましく、３日間〜７日間であることが更に好ましい。
【０１８２】
なお、水溶液中でコラーゲンまたはアテロコラーゲンと酵素とを接触させた後、必要に応じて、ｐＨを再調整する工程、酵素を失活させる工程、および、不純物を除去する工程からなる群より選択される少なくとも１つの工程を経てもよい。
【０１８３】
また、上記不純物を除去する工程は、物質を分離するための一般的な方法によって行うことができる。上記不純物を除去する工程は、例えば、透析、塩析、ゲル濾過クロマトグラフィー、など電点沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、または、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどによって行うことができる。
【０１８４】
上述したように、切断工程は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを酵素によって分解することによって行うことが可能である。このとき、分解されるコラーゲンまたはアテロコラーゲンは、生体組織中に含有された状態のものであってもよい。つまり、切断工程は、生体組織と酵素とを接触させることによって行うことも可能である。
【０１８５】
生体組織としては、特に限定されず、その例として哺乳類または鳥類の真皮、腱、骨または筋膜、あるいは、魚類の皮膚または鱗を用いることができる。
【０１８６】
高い生理活性を維持し、かつ、多量にコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を得るという観点からは、生体組織として真皮を用いることが好ましい。
【０１８７】
生体組織として真皮を用いる場合、酸性条件下で真皮と酵素とを接触させることが好ましい。例えば、上記酸性条件としては、好ましくはｐＨ２．５〜６．５、更に好ましくはｐＨ２．５〜５．０、更に好ましくはｐＨ２．５〜４．０、最も好ましくはｐＨ２．５〜３．５である。
【０１８８】
より具体的に、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上記切断工程では、上記システインプロテアーゼと真皮とを接触させることによって、該真皮に含まれるコラーゲンと、上記システインプロテアーゼとを接触させることが好ましい。
【０１８９】
また、上記（１）または（２）にて示されるアミノ酸配列を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上記切断工程では、２００ｍＭ以上の濃度の塩の存在下にて、真皮と、システインプロテアーゼとを接触させることが好ましい。
【０１９０】
また、上記（１）、（２）または（３）にて示されるアミノ酸配列を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上記切断工程では、２００ｍＭ以上の濃度の塩と接触させた後のシステインプロテアーゼと、真皮とを接触させることが好ましい。
【０１９１】
また、上記（３）にて示されるアミノ酸配列を有するコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上記切断工程では、２００ｍＭよりも低い濃度の塩の存在下にて、真皮と、システインプロテアーゼとを接触させることが好ましい。
【０１９２】
（Ｉ−ｉｉ．化学合成法）
化学合成法に基づく切断工程を採用する場合には、例えば、以下のように切断工程を構成することができる。
【０１９３】
まず、周知のデータベースから、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを構成する各ポリペプチド鎖のアミノ酸配列の情報を入手する。なお、当該ポリペプチド鎖は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのタイプに応じて適宜選択すればよく、１種類のポリペプチド鎖であってもよく、複数の種類のポリペプチド鎖であってもよい。
【０１９４】
次いで、上記ポリペプチドの中から、切断されるべき化学結合を含むポリペプチド鎖および切断されるべき化学結合の位置を決定するとともに、当該化学結合が切断されたと想定したときの、所望のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を決定する。
【０１９５】
最後に、決定されたアミノ酸配列にしたがって、所望のポリペプチド鎖を周知の化学合成法によって合成する。
【０１９６】
以上のようにして、切断工程を実施することができる。
【０１９７】
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上述した切断工程以外の工程を含むことも可能である。
【０１９８】
例えば、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、所望のポリペプチド鎖を周知の化学合成法によって合成した後で、合成されたポリペプチド鎖を精製する工程を含んでいてもよい。なお、当該精製は、適宜、周知のカラムを用いて行えばよい。
【０１９９】
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、所望のポリペプチド鎖と、他のポリペプチド鎖とを混合する工程を含んでいてもよい。なお、他のポリペプチド鎖としては特に限定されず、同様に化学結合が切断されているポリペプチド鎖であってもよいし、化学結合が切断されていないポリペプチド鎖であってもよい。
【０２００】
（Ｉ−ｉｉｉ．組み換えタンパク質の発現に基づく切断工程）
組み換えタンパク質の発現に基づく切断工程を採用する場合には、例えば、以下のように切断工程を構成することができる。
【０２０１】
まず、周知のデータベースから、コラーゲンまたはアテロコラーゲンを構成する各ポリペプチド鎖のアミノ酸配列の情報を入手する。なお、当該ポリペプチド鎖は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのタイプに応じて適宜選択すればよく、１種類のポリペプチド鎖であってもよく、複数の種類のポリペプチド鎖であってもよい。
【０２０２】
次いで、上記ポリペプチドの中から、切断されるべき化学結合を含むポリペプチド鎖および切断されるべき化学結合の位置を決定するとともに、当該化学結合が切断されたと想定したときの、所望のポリペプチド鎖のアミノ酸配列およびＤＮＡ配列を決定する。
【０２０３】
次いで、所望のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡを周知のタンパク質発現ベクターに挿入する。そして、当該タンパク質発現ベクターを所望の宿主（例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞など）に導入した後、当該宿主内で、化学結合が切断された後のポリペプチド鎖を発現させる。
【０２０４】
以上のようにして、切断工程を実施することができる。
【０２０５】
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、上述した切断工程以外の工程を含むことも可能である。
【０２０６】
例えば、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、宿主内で、所望のポリペプチド鎖を発現させた後で、発現したポリペプチド鎖を精製する工程を含んでいてもよい。なお、当該精製は、適宜、周知のカラムを用いて行えばよい。
【０２０７】
コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の製造方法は、所望のポリペプチド鎖と、他のポリペプチド鎖とを混合する工程を含んでいてもよい。なお、他のポリペプチド鎖としては特に限定されず、同様に化学結合が切断されているポリペプチド鎖であってもよいし、化学結合が切断されていないポリペプチド鎖であってもよい。
【０２０８】
〔２．胚様体形成用組成物〕
本発明の一実施形態に係る胚様体形成用組成物（以下、「本実施形態の胚様体形成用組成物」ともいう。）は、多能性幹細胞の胚様体形成用組成物であって、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を主成分として含み、上記分解物は、上記コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの少なくとも一部分を含んでいるものである。つまり、上記分解物は、コラーゲンまたはアテロコラーゲンのトリプルヘリカルドメインの全体を含んでいてもよいし、トリプルヘリカルドメインの一部分を含んでいてもよい。上記「多能性幹細胞」、上記「胚様体」、および上記「コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物」については、上記「１．胚様体形成方法」の項で説明したとおりであるので、ここでは説明は省略する。
【０２０９】
本実施形態の胚様体形成用組成物中には、胚様体形成活性を有する主成分として、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が含まれている。本実施形態の胚様体形成用組成物中に含まれる、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物の量は特に限定されない。例えば、本実施形態の胚様体形成用組成物中に、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物が、０．１重量％以上含まれていてもよいが、その中でも５０重量％以上含まれていることが好ましく、更に９０重量％以上含まれていることがより好ましく、１００重量％含まれていることが最も好ましい。
【０２１０】
本実施形態の胚様体形成用組成物を用いて培養容器の内面をコートする場合は、本実施形態の胚様体形成用組成物を水等で希釈し、最終濃度として、２ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは３ｍｇ／ｍＬ〜１６ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬ、あるいは５ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは８ｍｇ／ｍＬ〜１６ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を含有している溶液を調製し、当該溶液を用いて、培養容器の内面をコートすることができる。上記溶液における上記分解物の濃度が２ｍｇ／ｍＬ以上であれば、胚様体を均一に形成することができる。また、上記溶液における上記分解物の濃度が２０ｍｇ／ｍＬ以下であれば、再現性が良好となる。これに対して、上記溶液における上記分解物の濃度が２ｍｇ／ｍＬ未満である場合は、胚様体の形成が不均一になる場合がある。また、上記溶液における上記分解物の濃度が２０ｍｇ／ｍＬよりも高い場合は、粘性が高くなり再現性が不良となる場合がある。
【０２１１】
また、本実施形態の胚様体形成用組成物には、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物以外の成分が添加されていてもよい。これらの成分としては特に限定されず、適宜、所望の成分を添加することができる。例えば、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を、濃縮培養液（例えば、５倍濃縮ＤＭＥＭなど）と再構成用緩衝液（５０ｍＭ  水酸化ナトリウム、２６０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）と混合して、ゲル化組成物としてもよい。この場合、コラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、ゲル化組成物中に最終濃度として、２〜１５ｍｇ／ｍＬ含まれていてもよく、５〜１５ｍｇ／ｍＬ含まれていてもよく、５〜１２ｍｇ／ｍＬ含まれていることが好ましく、７〜１０ｍｇ／ｍＬ含まれていることがより好ましい。ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として２ｍｇ／ｍＬ以上であれば、胚様体を均一に形成することができる。また、ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として１５ｍｇ／ｍＬ以下であれば、再現性が良好となる。これに対して、ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として２ｍｇ／ｍＬ未満である場合は、胚様体の形成が不均一になる場合がある。また、ゲル組成物中に含有されている上記分解物の濃度が、最終濃度として１５ｍｇ／ｍＬよりも高い場合は、粘性が高くなり再現性が不良となる場合がある。
【０２１２】
上述したとおり、本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物は、従来のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物と比較して、ゲル化し始める濃度が高い。それ故に、従来のコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物がゲル化する濃度と同じ濃度の本発明の一実施形態に用いるコラーゲンの分解物またはアテロコラーゲンの分解物を、常温にて安定して保存できる。それ故に、本実施形態の胚様体形成用組成物は、常温にて安定して保存できる。
【０２１３】
本実施形態の胚様体形成用組成物を用いれば、多能性幹細胞の胚様体を容易に形成させることができる。また、本実施形態の胚様体形成用組成物を用いれば、従来の胚様体形成方法と比較して、より短期間で胚様体を形成させることができる。
【０２１４】
本実施形態の胚様体形成用組成物は、由来動物、由来部位およびＮ末端（アミノ末端）切断部位に関わらず、上述した本実施形態の胚様体形成方法において使用することができる。
【０２１５】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。
【実施例】
【０２１６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。【０２１７】
＜１．ブタ由来のα１鎖の切断における、塩濃度の影響＞
塩化ナトリウムの濃度が０ｍＭ、２００ｍＭ、１０００ｍＭ、１５００ｍＭまたは２０００ｍＭである５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。【０２１８】
アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭ  ジチオスレイトールを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した（例えば、非特許文献２参照）。【０２１９】
次いで、塩を含む５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ブタ由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ブタ由来のＩ型コラーゲンを含む当該溶液と、を１０日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、ブタ由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。【０２２０】
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｉ型コラーゲンの分解物を分離した。【０２２１】
次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα１鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。【０２２２】
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。【０２２３】
表１に、塩濃度が０ｍＭ、２００ｍＭ、１０００ｍＭ、１５００ｍＭまたは２０００ｍＭの場合のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。【０２２４】
表１に示すように、塩濃度が異なると、α１鎖内の切断箇所が異なることが明らかになった。より具体的には、塩濃度が低いと（例えば、０ｍＭ）、トリプルヘリカルドメインの外側で切断が生じ、塩濃度が高いと（例えば、２００ｍＭ以上）、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。【０２２５】
塩濃度が高いときの切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所であった。【０２２６】
【表１】
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なお、塩濃度を変化させると、分解物中に含まれる、配列番号２にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号３にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、の比率が反応時間、反応ｐＨ、反応温度などの条件で異なった。分解物を大量に調製しようとすると、塩濃度が２０００ｍＭを超えるとＮａＣｌが不溶化した。分解物を大量に調製する場合、塩濃度の上限値を５００ｍＭまたは８００ｍＭに設定することが好ましいと考えられる。【０２２７】
＜２．ラットおよびニワトリ由来のα１鎖の切断における、塩濃度の影響＞
塩化ナトリウムの濃度が０ｍＭ、２０００ｍＭである５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。【０２２８】
アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭ  ジチオスレイトールを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。【０２２９】
次いで、塩を含む５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ラット尾部由来のＩ型コラーゲン、または、ニワトリ皮部由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ラット尾部由来のＩ型コラーゲン、または、ニワトリ皮部由来のＩ型コラーゲンと、を１０日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、アクチニダインとしては、上述した＜１＞の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、ラット尾部由来のＩ型コラーゲン、および、ニワトリ皮部由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。【０２３０】
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｉ型コラーゲンの分解物を分離した。【０２３１】
次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα１鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。【０２３２】
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。【０２３３】
表２に、塩濃度が０ｍＭおよび２０００ｍＭの場合のラット由来のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるラット由来のα１鎖の部分構造（塩濃度の欄が「−」であるデータを参照）を示す。【０２３４】
表３に、塩濃度が０ｍＭおよび２０００ｍＭの場合のニワトリ由来のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるニワトリ由来のα１鎖の部分構造（塩濃度の欄が「−」であるデータを参照）を示す。【０２３５】
表２および３に示すように、異なる種に由来するα１鎖であっても、塩濃度が低いと、（例えば、０ｍＭ）、トリプルヘリカルドメインの外側で切断が生じ、塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じやすいことが明らかになった。【０２３６】
塩濃度が高いときの切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所であった。【０２３７】
なお、塩濃度が２０００ｍＭの場合、分解物中に含まれる、配列番号２４にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号５にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、の比率が、反応時間、反応ｐＨ、反応温度などの条件で異なった。【０２３８】
【表２】
2017073761.tif 000004
【０２３９】
【表３】
2017073761.tif 000005
＜３．塩の種類に関する検討＞
塩が添加されていない溶液、ＭｇＣｌ２の濃度が５００ｍＭである水溶液、および、ＫＣｌの濃度が２００ｍＭである水溶液を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。【０２４０】
上記水溶液の各々に対し、アクチニダインと、ブタ由来のＩ型コラーゲンとを混合した後、１０日以上、２０℃にて反応させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、アクチニダインとしては、上述した＜１＞の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、ブタ由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。【０２４１】
上述した分解物の各々をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、α１鎖の分解物を分離した。【０２４２】
次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα１鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。【０２４３】
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。【０２４４】
表４に、塩濃度０ｍＭである水溶液を用いた場合、ＭｇＣｌ２の濃度が５００ｍＭである水溶液を用いた場合、および、ＫＣｌの濃度が２００ｍＭである水溶液を用いた場合のブタ由来のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるブタ由来のα１鎖の部分構造（塩濃度の欄が「−」であるデータを参照）を示す。【０２４５】
表４に示すように、異なる種類の塩であっても、塩濃度が低いと（例えば、０ｍＭ）、トリプルヘリカルドメインの外側で切断が生じ、塩濃度が高いと（例えば、２００ｍＭ  ＫＣｌ、５００ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。なお、２００ｍＭ  ＫＣｌと５００ｍＭ  ＭｇＣｌ２の場合、分解物中に含まれる、配列番号２にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号９にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、の比率が、反応時間、反応ｐＨ、反応温度などの条件で異なった。【０２４６】
異なる種類の塩を用いた場合の切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所であった。【０２４７】
【表４】
2017073761.tif 000006
＜４．システインプロテアーゼの種類に関する検討＞
本実施例では、システインプロテアーゼの一種であるカテプシンＫを用いて、高塩濃度条件下におけるα１鎖の切断箇所を検討した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。【０２４８】
塩化ナトリウムの濃度が２０００ｍＭである５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を準備した。なお、当該水溶液の溶媒としては、水を用いた。【０２４９】
カテプシンＫを活性化するため、１０ｍＭ  ジチオスレイトールを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、カテプシンＫを溶解し、４５分間、２５℃にて静置した。なお、カテプシンＫとしては、市販のものを利用した。【０２５０】
次いで、塩を含む５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ニワトリ由来のＩ型コラーゲン、または、ブタ由来のＩ型コラーゲンを溶解した。カテプシンＫを含む水溶液と、ニワトリ由来のＩ型コラーゲン、または、ブタ由来のＩ型コラーゲンを含む当該溶液と、を１０日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、ニワトリ由来のＩ型コラーゲン、および、ブタ由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。【０２５１】
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｉ型コラーゲンの分解物を分離した。【０２５２】
次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα１鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。【０２５３】
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。【０２５４】
表５に、ブタ由来のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるブタ由来のα１鎖の部分構造（塩濃度の欄が「−」であるデータを参照）を示す。【０２５５】
表５に示すように、システインプロテアーゼの一種であるカテプシンＫであっても、塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。【０２５６】
また、表５に示すように、システインプロテアーゼの一種であるカテプシンＫの場合には、複数種類の切断箇所が確認された。【０２５７】
なお、ニワトリ由来のＩ型コラーゲンの分解物の場合、ニワトリ由来のα１鎖の分解物は、下記配列番号１１および１２に対応するニワトリ由来のα１鎖の分解物と、下記配列番号１０におけるアミノ末端から数えて１０番目の「Ｓ」と１１番目の「Ｇ」との間の化学結合が切断されたものに対応するニワトリ由来のα１鎖の分解物と、が確認された。【０２５８】
【表５】
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＜５．ブタ由来のα１鎖の切断における、透析塩濃度の影響＞
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が２０００ｍＭである透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した（例えば、非特許文献２参照）。アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭ  ジチオスレイトールを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。【０２５９】
次いで、塩を含む５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ブタ由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ブタ由来のＩ型コラーゲンと、を３日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。また、ブタ由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。【０２６０】
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｉ型コラーゲンの分解物を分離した。【０２６１】
次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα１鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。【０２６２】
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。【０２６３】
表６に、透析塩濃度が２０００ｍＭの場合のブタ由来のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列、および、未分解であるブタ由来のα１鎖の部分構造（塩濃度の欄が「−」であるデータを参照）を示す。【０２６４】
表６に示すように、透析塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの外側あるいは内側で切断が生じることが明らかになった。なお、２０００ｍＭの場合、分解物中に含まれる、配列番号２６にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号２７にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号１５にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、の比率が、反応時間、反応ｐＨ、反応温度などの条件で異なった。【０２６５】
塩濃度が高いときの切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所が含まれていた。【０２６６】
【表６】
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＜６．ヒト由来のα１鎖の切断における、透析塩濃度の影響＞
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が２０００ｍＭである透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。なお、アクチニダインとしては、周知の方法にて精製したものを利用した（例えば、非特許文献２参照）。アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭ  ジチオスレイトールを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。【０２６７】
次いで、塩を含む５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）に対し、ヒト由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ヒト由来のＩ型コラーゲンと、を１０日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。また、ヒト由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。【０２６８】
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｉ型コラーゲンの分解物を分離した。【０２６９】
次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα１鎖の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。【０２７０】
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。【０２７１】
表７に示すように、透析塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの外側あるいは内側で切断が生じることが明らかになった。なお、２０００ｍＭの場合、分解物中に含まれる、配列番号２９にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号３０にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、配列番号１６にて示すアミノ酸配列のアミノ末端を有する分解物の量と、の比率が、反応時間、反応ｐＨ、反応温度などの条件で異なった。【０２７２】
塩濃度が高いときの切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所が含まれていた。【０２７３】
【表７】
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＜７．魚類由来のα１鎖の切断＞
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が２０００ｍＭである透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭ  ジチオスレイトールを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。【０２７４】
次いで、塩を含む５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、魚類（具体的には、キハダマグロ）由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、魚類由来のＩ型コラーゲンと、を３日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、アクチニダインとしては、上述した＜１＞の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、魚類由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。【０２７５】
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｉ型コラーゲンの分解物を分離した。【０２７６】
次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα１鎖（魚類由来のＩ型コラーゲン）の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。【０２７７】
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。【０２７８】
表８に、透析外液の塩濃度が２０００ｍＭの場合の、魚類由来のα１鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。なお、表８に示すように、α１鎖（魚類由来のＩ型コラーゲン）の分解物としては３種類検出され、これらの分解物の各々のアミノ末端のアミノ酸配列として、配列番号１８、配列番号１９および配列番号３１に示すアミノ酸配列を同定することに成功した。【０２７９】
【表８】
2017073761.tif 000010
＜８．ヒト由来のα２鎖の切断＞
＜４＞と同様にカテプシンＫを活性化するため、１０ｍＭ  ジチオスレイトールを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、カテプシンＫを溶解し、４５分間、２５℃にて静置した。【０２８０】
次いで、塩を含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対し、ヒト由来のＩ型コラーゲンを溶解した。カテプシンＫを含む水溶液と、ヒト由来のＩ型コラーゲンと、を１０日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、カテプシンＫとしては、上述した＜１＞の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、ヒト由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。【０２８１】
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｉ型コラーゲンの分解物を分離した。【０２８２】
次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα２鎖（ヒト由来のＩ型コラーゲン）の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。【０２８３】
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。【０２８４】
表９に、反応液の塩濃度が２００ｍＭの場合の、ヒト由来のα２鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。【０２８５】
【表９】
2017073761.tif 000011
＜９．ニワトリ由来のα２鎖の切断＞
透析チューブにアクチニダインを入れ、当該アクチニダインを、塩化ナトリウムの濃度が２０００ｍＭである透析外液に対して透析した。その後、透析外液を蒸留水に変えて透析を続けてアクチニダインを得た。アクチニダインを活性化するため、１０ｍＭ  ジチオスレイトールを含む５０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に対し、アクチニダインを溶解し、９０分間、２５℃にて静置した。【０２８６】
次いで、塩を含む５０ｍＭ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）に対し、ニワトリ由来のＩ型コラーゲンを溶解した。アクチニダインを含む水溶液と、ニワトリ由来のＩ型コラーゲンと、を７日間以上、２０℃にて接触させて、Ｉ型コラーゲンの分解物を作製した。なお、アクチニダインとしては、上述した＜１＞の実施例にて用いたものと同じものを用いた。また、ニワトリ由来のＩ型コラーゲンは、周知の方法に基づいて精製した（例えば、非特許文献２参照）。【０２８７】
上述した分解物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、Ｉ型コラーゲンの分解物を分離した。【０２８８】
次いで、Ｉ型コラーゲンの分解物を、常法によりＰＶＤＦ（Polyvinylidene Difluoride）膜へ転写した。そして、ＰＶＤＦ膜へ転写されたα２鎖（ニワトリ由来のＩ型コラーゲン）の分解物のアミノ末端のアミノ酸配列を、エドマン分解法によって決定した。【０２８９】
なお、実際のエドマン分析は、アプロサイエンス株式会社、または、近畿大学医学部分析機器共同研究室に依頼して、周知の方法にしたがって行った。【０２９０】
表１０に、透析外液の塩濃度が２０００ｍＭの場合の、ニワトリ由来のα２鎖の分解物のアミノ末端およびその近傍のアミノ酸配列を示す。【０２９１】
【表１０】
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表に示すように、異なる種に由来するα１鎖またはα２鎖であっても、塩濃度が高いと、トリプルヘリカルドメインの内側で切断が生じることが明らかになった。塩濃度が高いときの切断箇所は、本発明者が見出した新規な切断箇所であった。【０２９２】
＜１０．コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験１＞
（培養皿）
上述したコラーゲンの分解物（上述の透析塩濃度２０００ｍＭにおける、ブタ由来のコラーゲンの分解物、すなわち、配列番号２６および配列番号２７にて示されるアミノ酸配列（（１）、（２）および（３）にて示されるアミノ酸配列に相当）を有する分解物の混合物）と接触させた、市販の培養皿を試験に用いた。具体的には、３５ｍｍ培養皿に１０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの分解物の水溶液を６０μＬ添加して、培養皿に十分になじませて室温で５時間静置し、コラーゲン分解物コート培養皿とした。【０２９３】
また、１０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンの分解物の水溶液を、５倍濃縮したＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）と再構成用緩衝液（５０ｍＭ  水酸化ナトリウム、２６０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、２００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）とを混合し、この混合液を３５ｍｍ培養皿に２００μＬ添加して、培養皿に均一になるよう広げてコートして、３７℃のインキュベーター内で３０分間静置した。これを、コラーゲン分解物ゲル培養皿とした。【０２９４】
また、３５ｍｍ培養皿に０．１％ゼラチン溶液を１ｍＬ添加して、培養皿に十分になじませて室温で４時間静置した。４時間後にゼラチン溶液を除去して、ゼラチンコート培養皿とした。【０２９５】
（マウスＥＳ細胞）
山梨大学生命環境学部生命工学科  若山照彦教授から譲渡されたマウスＥＳ細胞を使用した。このマウスＥＳ細胞は、ＧＦＰ（green fluorescent protein）標識されており、ＧＦＰタンパク質をコードしている遺伝子が染色体中に挿入されているものである。【０２９６】
（フィーダー細胞の調製）
マイトマイシン処理したマウス胎児由来線維芽細胞（Murine Embryonic Fibroblasts：ＭＥＦ）（ＣＭＰＭＥＦＣＦ、ＤＳファーマバイオメディカル製）を１×１０５個／ｍＬに調製した。ゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿、コラーゲン分解物ゲル培養皿に、ＭＥＦをそれぞれ７×１０４個播種して、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて１日間培養した。【０２９７】
（胚様体の形成）
５００Ｕ／ｍＬの白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor：ＬＩＦ、商品番号１９９−１６０５１、和光純薬工業株式会社）および２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）（以下、「ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））」と称する。）を用いて、マウスＥＳ細胞２．５×１０４個／ｍＬを調製した。あらかじめＭＥＦを播種しておいたゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿、およびコラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスＥＳ細胞懸濁液２ｍＬをそれぞれ播種して、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養した（培養条件：ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋））。ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞を本実験のコントロールとした。なお、実施例において、「ＭＥＦ（＋）」はＭＥＦ共存下での培養、「ＭＥＦ（−）」はＭＥＦ非共存下での培養を示す。また、「ＬＩＦ（＋）」はＬＩＦ共存下での培養、「ＬＩＦ（−）」はＬＩＦ非共存下での培養を示す。【０２９８】
培養期間中は、毎日、新しいＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））と培地を交換した。【０２９９】
培養開始３日後に、位相差顕微鏡下でＥＳ細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図１に示す。図１中、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図である。【０３００】
ゼラチンコート培養皿において培養した場合、ＭＥＦはゼラチンコート培養皿の底面に接着して伸展していた。その間にＥＳ細胞がコロニーを形成していた。一般的なＥＳ細胞の培養所見と同じ形態であった（図１の（ａ））。【０３０１】
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、ＭＥＦはコラーゲン分解物コート培養皿の底面に接着していなかった。観察された細胞は浮遊した３次元細胞塊（胚様体）を形成しており、ゼラチンコート培養皿の一般的なＥＳ細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった（図１の（ｂ））。【０３０２】
コラーゲン分解物ゲル培養皿において培養した場合、ＭＥＦはコラーゲン分解物ゲル培養皿の底面に接着していた。観察された細胞はコラーゲン分解物ゲルに接着して３次元細胞塊（胚様体）を形成していた。ゼラチンコート培養皿の一般的なＥＳ細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった。コラーゲン分解物ゲルに接着している胚様体から細胞が伸展して別の胚様体に繋がっているようであった（図１の（ｃ））。【０３０３】
コラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞の形態は、ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞の形態とは全く異なっていた。ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞は、一般的なＥＳ細胞のコロニーを形成しただけであったが、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞は、ＬＩＦ添加にも関わらず、浮遊した胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてＥＳ細胞を培養することは、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。一方、コラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞は、これまでに観察されていないような胚様体が、ＬＩＦ存在下で形成された。具体的には、胚様体は、コラーゲン分解物ゲルに接着していることが示された。【０３０４】
同様の実験を、ＬＩＦを含まず且つ２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）（以下、「ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））」と称する。）を用いて行った。具体的には、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて、マウスＥＳ細胞２．５×１０４個／ｍＬを調製した。あらかじめＭＥＦを播種しておいたゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿、コラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスＥＳ細胞懸濁液２ｍＬをそれぞれ播種して、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養した（培養条件：ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（−））。ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞を本実験のコントロールとした。【０３０５】
培養期間中は、毎日、新しいＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））と培地を交換した。【０３０６】
培養開始３日後に、位相差顕微鏡下でＥＳ細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図２に示す。図２中、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図である。【０３０７】
ゼラチンコート培養皿において培養した場合、ＭＥＦはゼラチンコート培養皿の底面に接着して伸展していた。その間にＥＳ細胞がコロニーを形成していた。一般的なＥＳ細胞の培養所見と同じ形態であった（図２の（ａ））。【０３０８】
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、ＭＥＦはコラーゲン分解物コート培養皿の底面に接着していなかった。観察された細胞は浮遊した３次元細胞塊（胚様体）を形成しており、ゼラチンコート培養皿の一般的なＥＳ細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった（図２の（ｂ））。【０３０９】
コラーゲン分解物ゲル培養皿において培養した場合、ＭＥＦはコラーゲン分解物ゲル培養皿の底面に接着していた。観察された細胞はコラーゲン分解物ゲルに接着して３次元細胞塊（胚様体）を形成していた。ゼラチンコート培養皿の一般的なＥＳ細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった。コラーゲン分解物ゲルに接着している胚様体から細胞が伸展して別の胚様体に繋がっているようであった（図２の（ｃ））。【０３１０】
ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞の形態は、ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞の形態とは全く異なっていた。しかし、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞と比較して、形態学的な所見に明確な違いはなかった。ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞は、一般的なＥＳ細胞のコロニーを形成しただけであったが、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞は、ＬＩＦを添加していないにも関わらず、浮遊した胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてＥＳ細胞を培養することは、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。一方、コラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞は、これまでに観察されていないような胚様体が、ＬＩＦ非存在下で形成された。具体的には、胚様体は、コラーゲン分解物ゲルに接着していることが示された。【０３１１】
＜１１．コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験２＞
次に、ゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞の未分化能を調べるため、細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた。【０３１２】
５００Ｕ／ｍＬのＬＩＦおよび２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）（以下、「ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））」と称する。）を用いて、マウスＥＳ細胞２．５×１０４個／ｍＬを調製した。あらかじめＭＥＦを播種しておいたゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿、およびコラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスＥＳ細胞懸濁液２ｍＬをそれぞれ播種して、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養した（培養条件：ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋））。ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞を本実験のコントロールとした。培養期間中は、毎日、新しいＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））と培地を交換した。【０３１３】
２日間培養後に、細胞の培養上清を取り除き、滅菌ＰＢＳで洗浄した。引き続き、細胞を固定するために４％パラホルムアルデヒド溶液を細胞が浸るまで加え、室温で３０分間静置した。その後、滅菌蒸留水を細胞が浸るまで加えて洗浄する操作を２回繰り返した。洗浄液を取り除いた後、ＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ  ｄｏｕｂｌｅ-ｓｔａｉｎ  ｋｉｔ（商品コードＭＫ３００、タカラバイオ社製）付属のアルカリ性ホスファターゼ染色液を培養皿に２５０μＬ加えて３７℃で４５分間静置した。反応を停止させるため、染色液を取り除いて滅菌蒸留水で３回洗浄した。結果を図３に示す。【０３１４】
図３は、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件において２日間培養したＥＳ細胞の細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた結果を示す図であり、図３中、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて２日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性の有無を示す図であり、（ｂ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて２日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性の有無を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて２日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性の有無を示す図である。【０３１５】
コラーゲン分解物コート培養皿およびコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞から形成された胚様体は、ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞のコロニーと同様にアルカリ性ホスファターゼ活性陽性であることが示された（図３の（ａ）〜（ｃ））。一方、共培養しているＭＥＦはアルカリ性ホスファターゼ活性陰性であった。これらの結果は、コラーゲン分解物コート培養皿およびコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞から形成された胚様体が未分化能を維持していることを示している。【０３１６】
＜１２．コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験３＞
ＭＥＦを播種している培養皿の代わりに、ＭＥＦを播種していない培養皿を用いて、同様の実験を、ＬＩＦを含み且つ２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）（以下、「ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））」と称する。）を用いて行った。具体的には、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて、マウスＥＳ細胞２．５×１０４個／ｍＬを調製した。ＭＥＦを播種していないゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿、コラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスＥＳ細胞懸濁液２ｍＬをそれぞれ播種して、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養した（培養条件：ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（＋））。ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞を本実験のコントロールとした。【０３１７】
培養期間中は、毎日、新しいＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））と培地を交換した。【０３１８】
培養開始３日後に、位相差顕微鏡下でＥＳ細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図４に示す。図４中、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図である。【０３１９】
ゼラチンコート培養皿において培養した場合、ＥＳ細胞が単層に広がり、コロニー形成している細胞と単一で接着している細胞とを区別して観察した。細胞突起を示す形態を示す細胞も存在していた。一般的なＥＳ細胞のＭＥＦ共存下且つＬＩＦ存在下の培養所見（図１（ａ））と比べてコロニーの数が少なく大きさが小さく、それぞれの細胞が判別できる程度の細胞間接着であることが示された（図４の（ａ））。【０３２０】
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、観察されたＥＳ細胞は接着もしくは浮遊した３次元細胞塊（胚様体）を形成しており（図４の（ｂ））、ゼラチンコート培養皿の一般的なＥＳ細胞の培養所見（図４の（ａ））とはまったく異なる形態であった。どちらかと言えば、浮遊している胚様体の割合が多かった。【０３２１】
コラーゲン分解物ゲル培養皿において培養した場合、観察されたＥＳ細胞はコラーゲン分解物ゲルに接着もしくは浮遊した３次元細胞塊（胚様体）を形成していた。ゼラチンコート培養皿の一般的なＥＳ細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった。コラーゲン分解物ゲルに接着している胚様体の方が、浮遊している胚様体より比較的大きかった。（図４の（ｃ））。【０３２２】
ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞の形態は、ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞の形態とは全く異なっていた。しかし、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞と比較して、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞の形態は、大きさや形に多少の違いが観察されたが、明確な違いはなかった。ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（＋）の培養条件で、ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞は、一般的なＥＳ細胞のコロニーを形成するか、あるいは単一の接着細胞であった。特筆すべきは、ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（＋）の培養条件でコラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞は、ＭＥＦを共培養していないにも関わらず、胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてＥＳ細胞を培養することは、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。同様に、ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（＋）の培養条件でコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞は、これまでに観察されていないような胚様体が、ＭＥＦ非存在下で形成された。具体的には、ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（＋）の培養条件でコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞から形成された胚様体は、コラーゲン分解物ゲルに接着あるいは浮遊していることが示された。【０３２３】
＜１３．コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験４＞
ＭＥＦを播種している培養皿の代わりに、ＭＥＦを播種していない培養皿を用いて、同様の実験を、ＬＩＦを含まない２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）（以下、「ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））」と称する。）を用いて行った。具体的には、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて、マウスＥＳ細胞２．５×１０４個／ｍＬを調製した。ＭＥＦを播種していないゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿、コラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスＥＳ細胞懸濁液２ｍＬをそれぞれ播種して、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養した（培養条件：ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（−））。ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞を本実験のコントロールとした。【０３２４】
培養期間中は、毎日、新しいＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））と培地を交換した。【０３２５】
培養開始３日後に、位相差顕微鏡下でＥＳ細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図５に示す。図５中、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物ゲル培養皿において、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて３日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図である。【０３２６】
ゼラチンコート培養皿において培養した場合、ＥＳ細胞が単層に広がり、コロニー形成している細胞と単一で接着している細胞とを区別して観察した。細胞突起を示す形態を示す細胞も存在していた。一般的なＥＳ細胞のＭＥＦ共存下且つＬＩＦ存在下の培養所見（図１（ａ））と比べてコロニーの数が少なく大きさが小さく、それぞれの細胞が判別できる程度の細胞間接着であることが示された（図５の（ａ））。【０３２７】
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、観察されたＥＳ細胞は接着もしくは浮遊した３次元細胞塊（胚様体）を形成しており（図５の（ｂ））、ゼラチンコート培養皿の一般的なＥＳ細胞の培養所見（図５の（ａ））とはまったく異なる形態であった。どちらかと言えば、浮遊している胚様体の割合が多かった。【０３２８】
コラーゲン分解物ゲル培養皿において培養した場合、観察されたＥＳ細胞はコラーゲン分解物ゲルに接着もしくは浮遊した３次元細胞塊（胚様体）を形成していた。ゼラチンコート培養皿の一般的なＥＳ細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった。コラーゲン分解物ゲルに接着している胚様体の方が、浮遊している胚様体より比較的大きかった。（図５の（ｃ））。【０３２９】
ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞の形態は、ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞の形態とは全く異なっていた。しかし、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いてコラーゲン分解物コート培養皿（図１（ｂ））またはコラーゲン分解物ゲル培養皿（図１（ｃ））において培養したＥＳ細胞と比較して、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いてコラーゲン分解物コート培養皿またはコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞の形態は、大きさや形に多少の違いが観察されたが、明確な違いはなかった。ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（−）の培養条件で、ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞は、一般的なＥＳ細胞のコロニーを形成するか、あるいは単一の接着細胞であった。特筆すべきは、ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（−）の培養条件でコラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞は、ＭＥＦを共培養していないにも関わらず、胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてＥＳ細胞を培養することは、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。同様に、ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（−）の培養条件でコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞は、これまでに観察されていないような胚様体が、ＭＥＦ非存在下で形成された。具体的には、ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（−）の培養条件でコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養したＥＳ細胞から形成された胚様体は、コラーゲン分解物ゲルに接着あるいは浮遊していることが示された。【０３３０】
＜１４．コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験５＞
次に、得られた胚様体がＥＳ細胞のみから成るか否かをＧＦＰ発現ＥＳ細胞を培養して確認した。具体的には、５００Ｕ／ｍＬのＬＩＦおよび２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）（以下、「ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））」と称する。）を用いて、マウスＥＳ細胞２．５×１０４個／ｍＬを調製した。あらかじめＭＥＦを播種しておいたゼラチンコート培養皿、またはコラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスＥＳ細胞懸濁液２ｍＬをそれぞれ播種して、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４日間培養した（培養条件：ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋））。ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞を本実験のコントロールとした。【０３３１】
さらに、ＬＩＦを含まず２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）（以下、「ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））」と称する。）を用いて、マウスＥＳ細胞２．５×１０４個／ｍＬを調製した。あらかじめＭＥＦを播種しておいたコラーゲン分解物ゲル培養皿に、マウスＥＳ細胞懸濁液２ｍＬを播種して、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４日間培養した（培養条件：ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（−））。【０３３２】
４日間培養後に、それぞれの培養条件で培養して得られた細胞の核を、Cellstain（登録商標）-Hoechst 33342 solution（品番Ｈ３４２、株式会社  同仁化学研究所）を用いて染色した。【０３３３】
結果を図６〜図８に示す。図６は、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件において、ゼラチンコート培養皿において４日間培養したＥＳ細胞を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示したＥＳ細胞のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は、（ａ）に示したＥＳ細胞をHoechst 33342染色し、蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｄ）は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。また、図７は、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件においてコラーゲン分解物ゲル培養皿においてＥＳ細胞を４日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察した胚様体の形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した胚様体のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は、（ａ）に示した胚様体をHoechst 33342染色し、蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｄ）は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。また、図８は、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（−）の培養条件においてコラーゲン分解物ゲル培養皿においてＥＳ細胞を４日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察した胚様体の形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した胚様体のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は、（ａ）に示した胚様体をHoechst 33342染色し、蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｄ）は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。【０３３４】
その結果、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件においてゼラチンコート培養皿においてＥＳ細胞を培養した場合、ＧＦＰ陽性のＥＳ細胞が単層に広がり、コロニー形成することが確認できた（図６の（ａ）〜（ｄ））。【０３３５】
また、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））またはＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（−））を用いて、ＥＳ細胞をコラーゲン分解物ゲル培養皿において培養した場合、観察されたＧＦＰ陽性のＥＳ細胞は、コラーゲン分解物ゲルに接着した３次元細胞塊（胚様体）を形成していた。ゼラチンコート培養皿の一般的なＥＳ細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった。胚様体以外の細胞はＧＦＰ陰性であることから、胚様体以外の細胞はＭＥＦであると推察された（図７の（ａ）〜（ｄ）および図８の（ａ）〜（ｄ））。また、図８の（ａ）中の破線で囲った箇所は、コラーゲンと、細胞からの分泌物であると推察された。【０３３６】
以上の結果から、培養液中のＬＩＦの有無に関わらず、ＭＥＦ共存下においてコラーゲン分解物ゲル培養皿において形成された胚様体は、ＥＳ細胞由来であることが示された。【０３３７】
＜１５．コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験６＞
（ヒトｉＰＳ細胞）
京都大学  山中伸弥教授の研究室が樹立したヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ）を使用した。該ｉＰＳ細胞株は、染色体解析ですべての細胞が４６ＸＸで染色体異常は認められないものである。【０３３８】
（コラーゲン分解物コート培養皿の作製）
ブタ由来のコラーゲンの分解物を１０ｍｇ／ｍＬに調製し、６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５０μＬコートして３時間静置した。なお、コラーゲンの分解物としては上述したコラーゲンの分解物（塩濃度０ｍＭにおける、ブタ由来のコラーゲンの分解物のうち、配列番号２にて示されるアミノ酸配列（（３）にて示されるアミノ酸配列に相当）を有する分解物）を用いた。対照群１として、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）をＤ−ＰＢＳで１００倍に希釈したものを６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの１ウエルに１ｍＬを加え、１時間以上静置した。対照群２として、ｉＭａｔｒｉｘ５１１（株式会社ニッピ）を０．５μｇ／ｃｍ２になるようにコートした。【０３３９】
（ヒトｉＰＳ細胞の胚様体形成）
ヒトｉＰＳ細胞はｉＰＳ細胞専用のＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（コスモバイオ株式会社）を用いて１．０×１０５個に調整し、上記で作製した培養皿に播種した。培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて５日間行った。培養期間中は、毎日、新しいＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地と交換した。【０３４０】
培養開始１日後および５日後に、位相差顕微鏡下でｉＰＳ細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図９および図１０に示す。図９中、（ａ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、１日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎコート培養皿において、１日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、ｉＭａｔｒｉｘ５１１コート培養皿において、１日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図である。図１０中、（ａ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、５日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎコート培養皿において、５日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、ｉＭａｔｒｉｘ５１１コート培養皿において、５日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図である。【０３４１】
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、１日培養後ではｉＰＳ細胞が集まっている様子が観察された。また５日培養後では胚様体を形成していた（図９の（ａ）および図１０の（ａ））。【０３４２】
Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎコート培養皿において培養した場合、一般的なｉＰＳ細胞の培養所見と同じ形態であった。つまり、１日培養後ではｉＰＳ細胞は培養皿底面に個々に接着し、単層培養の細胞形態であった。５日培養後ではｉＰＳ細胞は過増殖状態となり、培養皿底面の全てに接着していることが示された（図９の（ｂ）および図１０の（ｂ））。【０３４３】
ｉＭａｔｒｉｘ５１１コート培養皿において培養した場合、ｉＰＳ細胞は培養皿の底面に接着していた。培養１日後および培養５日後の観察像は、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎコート培養皿の一般的なｉＰＳ細胞の培養所見と同様な形態であった。【０３４４】
コラーゲン分解物コート培養皿において培養したｉＰＳ細胞の形態は、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎコート培養皿またはｉＭａｔｒｉｘ５１１コート培養皿において培養したｉＰＳ細胞の形態とは全く異なっていた。Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎコート培養皿において培養したｉＰＳ細胞は、一般的なｉＰＳ細胞の増殖を示しただけであったが、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したｉＰＳ細胞は、ＬＩＦなどを添加しないにも関わらず、胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてｉＰＳ細胞を培養することは、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。【０３４５】
＜１６．コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験７＞
（塩基性線維芽細胞増殖因子を含まない培地でのｉＰＳ細胞の培養）
＜１５＞と同様の実験を、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含まない培地を用いて培養１２日目まで延長して胚様体の形態を観察した。すなわち、ヒトｉＰＳ細胞およびコラーゲン分解物としては、＜１５＞と同様のものを用いた。【０３４６】
（コラーゲン分解物コート培養皿の作製）
コラーゲン分解物を１０ｍｇ／ｍＬに調製し、６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに５０μＬコートして３時間静置した。対照群として、プラスチック表面を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマーで加工したＬｉｐｄｕｒｅ（日油株式会社）を用いた。ｉＰＳ細胞はＬｉｐｄｕｒｅ培養皿で培養すると、浮遊した胚様体を形成することが広く知られる。【０３４７】
（ヒトｉＰＳ細胞の胚様体形成）
ヒトｉＰＳ細胞はｉＰＳ細胞専用のＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（コスモバイオ株式会社）を用いて３．０×１０５個に調整し、上記で作製した培養皿に播種した。培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて１２日間行った。培養期間中は、培養４日目まで毎日、新しいＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地と半量交換した。培養５日目以降は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含まないｉＰＳ細胞専用培地であるｈｉＰＳ  ｍｅｄｉｕｍを用いて隔日に半量交換した。【０３４８】
培養開始４日後および１２日後に、位相差顕微鏡下でｉＰＳ細胞の形態を観察した。各細胞の４日後および１２日後の形態を、それぞれ図１１および図１２に示す。図１１中、（ａ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、４日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿において、４日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図である。図１２の（ａ）は、コラーゲン分解物コート培養皿において、１２日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図であり、図１２の（ｂ）は、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿において、１２日間培養したｉＰＳ細胞の形態を示す図である。【０３４９】
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、４日培養後ではｉＰＳ細胞が胚様体を形成する様子が観察された（図１１の（ａ））。さらにｂＦＧＦを含まない専用培地で１２日目まで培養した結果、胚様体が維持されていることが示された（図１２の（ａ））。【０３５０】
Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿において４日間培養した場合、一般的なｉＰＳ細胞の培養所見と同じく浮遊した胚様体が示された（図１１の（ｂ））。さらにｂＦＧＦを含まない専用培地で１２日目まで培養した結果、胚様体が巨大化していることが示された（図１２の（ｂ））。【０３５１】
コラーゲン分解物コート培養皿を用いたヒトｉＰＳ細胞の胚様体形成は、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿のヒトｉＰＳ細胞の胚様体形成と比べて、培養皿底面に接着していることから培地交換が容易であるという利点が明らかになった。Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿は培地交換する際に吸引による細胞の誤損出が起こりやすい。また、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿から回収した胚様体は、培地交換での遠心作業中に胚様体同士が接触して巨大化することが危惧された。一方、コラーゲン分解物コート培養皿では、そのような問題が起こりにくいことが分かった。さらに、ｂＦＧＦを含まない専用培地で培養してもコラーゲン分解物コート培養皿で形成したｉＰＳ細胞の胚様体は崩壊しないことが明らかになった。【０３５２】
コラーゲン分解物コート培養皿において培養したヒトｉＰＳ細胞の胚様体は、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿でのヒトｉＰＳ細胞と比較して、形態学的な所見に明確な違いは明確ではなかった。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてヒトｉＰＳ細胞の胚様体を培養することは、胚様体を維持させる新たな方法となりうることが示された。【０３５３】
＜１７．コラーゲンの分解物の胚様体の分化誘導に関する試験＞
次に、コラーゲンの分解物を用いて得られたマウスＥＳ細胞の胚様体を、分化誘導できることを確認した。具体的には、ＬＩＦを含まないＥＢ専用培地（ＤＭＥＭ培地に２０％ウシ胎児血清、１ｍＭ  ＭＥＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、１／１００希釈ＭＥＭ  Ｎｏｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｏｌｉｔｉｏｎ、１０μＭ  β−メルカプトエタノールを添加した培地）（以下、「ＥＢ培地」と称する）を用いて、マウスＥＳ細胞５．０×１０４個／ｗｅｌｌを調製した。次に、あらかじめ上記と同じ手法で調整した１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅのコラーゲン分解物コート培養皿、またはＬｉｐｉｄｕｒｅ培養皿を用意し、マウスＥＳ細胞懸濁液をそれぞれ播種した。ＥＢ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて１５日間培養した。培地は培養２日後以降、毎日、新しいＥＢ培地に交換した。ゼラチンコート培養皿において培養した播種前のＥＳ細胞を本実験のコントロールとした。【０３５４】
（マウスＥＳ細胞の胚様体からのＲＮＡの抽出）
１５日間培養後に、それぞれの培養条件で培養して得られたマウスＥＳ細胞の胚様体を遠心により集め、それぞれのＲＮＡを、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ精製用バッファーのＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＲＡ１（タカラバイオ株式会社）およびβ−メルカプトエタノールと混合し、さらに７０％エタノールを加えてよく混ぜた。得られた溶液をＲＮＡ精製用スピンカラムにて遠心してゲルに吸着させ、洗浄し、さらにＤＮａｓｅ処理してカラムから溶出させることで、各培養皿の胚様体のｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。【０３５５】
（マウスＥＳ細胞の胚様体からのＲＮＡのｃＤＮＡの調製）
常法により、タカラバイオ株式会社製のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）を用いて、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを合成した。反応後のｃＤＮＡ溶液は−２０℃もしくは−８０℃で次の実験まで保存した。【０３５６】
（マウスＥＳ細胞の胚様体のＲＮＡの解析）
分化に与えるコラーゲン分解物を用いた培養の影響を調べるため、以下の３つの分化マーカーのＲＮＡ発現量を調べた。中内胚葉、内胚葉および中胚葉への分化に関与するＧＡＴＡ４（ＧＡＴＡ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）、内胚葉系の肝細胞に特異的なＡＦＰ（αフェトプロテイン）、心筋前駆細胞に特異的なＮＫＸ２．５（ＮＫ−２  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｌａｔｅｄ，ｌｏｃｕｓ  ５）のプライマーを用いて、ＲＮＡ発現量を定量化した。上記で得られたｃＤＮＡを鋳型として、各プライマー、ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘなどの試薬と適量の超純水などとを混合し、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  （タカラバイオ株式会社）を用いて、常法により定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。【０３５７】
ＲＴ−ＰＣＲの結果から得られた発現量の最大値を１００として、各マーカーの相対発現量をレーダーチャート化したものを図１３に示す。コラーゲン分解物コート培養皿で形成したマウスＥＳ細胞の胚様体は、ＮＫＸ２．５の相対発現量が低いがＧＡＴＡ４とＡＦＰの相対発現量が高いことが明らかになった（図１３の（ａ））。Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿で形成した胚様体のＲＮＡ相対発現量は、コラーゲン分解物コート培養皿の胚様体のそれと同様であった（図１３の（ｂ））。一方、コントロールであるゼラチンコート培養皿のマウスＥＳ細胞では、逆に、ＮＫＸ２．５の相対発現量がＧＡＴＡ４およびＡＦＰより高いことが示された（図１３の（ｃ））。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿の胚様体は、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿の胚様体と同様にＥＳ細胞の分化に大きく影響することが明らかになった。ゼラチンコート培養皿の細胞の結果と正反対になることは、胚様体特有の分化誘導に適していることを示している。【０３５８】
ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞の分化誘導は胚様体を経ることが必須で、胚様体形成後に適切な分化誘導条件を満たすことが重要である。よって、コラーゲン分解物コート培養皿の胚様体も十分に分化誘導する能力を有していることが証明された。従来法のＬｉｐｉｄｕｒｅ培養皿の胚様体は浮遊しているので大きな凝集塊を形成しやすい。そのため、Ｌｉｐｉｄｕｒｅ培養皿でのＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の分化は、分化の質に大きく影響する。一方、コラーゲン分解物コート培養皿の胚様体は、分化の再現性および質を向上させることが可能となる。【０３５９】
＜１８．コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験８＞
（培養皿）
上述したコラーゲンの分解物（ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２７）、あるいはラット腱由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２４と配列番号５との混合物）、あるいはブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２６））と接触させた、市販の培養皿を試験に用いた。具体的には、３５ｍｍ培養皿にコラーゲン分解物の濃度（ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２７）は３．２ｍｇ／ｍＬから９．６ｍｇ／ｍＬ、ラット腱由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２４と配列番号５との混合物）は２.８ｍｇ／ｍＬから８.４ｍｇ／ｍＬ、ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２６）は３.３ｍｇ／ｍＬ）を変えて添加し、培養皿に十分になじませて室温で５時間静置し、コラーゲン分解物コート培養皿とした。【０３６０】
（マウスＥＳ細胞）
山梨大学生命環境学部生命工学科  若山照彦教授から譲渡されたマウスＥＳ細胞を使用した。このマウスＥＳ細胞は、ＧＦＰ（green fluorescent protein）標識されており、ＧＦＰタンパク質をコードしている遺伝子が染色体中に挿入されているものである。【０３６１】
（フィーダー細胞の調製）
マイトマイシン処理したマウス胎児由来線維芽細胞（Murine Embryonic Fibroblasts：ＭＥＦ）（ＣＭＰＭＥＦＣＦ、ＤＳファーマバイオメディカル製）を６．１×１０４個／ｍＬに調製した。ゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿（ブタ腱由来ペプシン可溶化Ｉ型コラーゲン、ＣＯＬ  １、旭テクノグラス社製）、コラーゲン分解物コート培養皿に、ＭＥＦをそれぞれ１．２×１０５個播種して、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ、日水製薬株式会社製）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて１日間培養した。【０３６２】
（胚様体の形成）
５００Ｕ／ｍＬの白血病抑制因子（Leukemia Inhibitory Factor：ＬＩＦ）および２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）（以下、「ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））」と称する。）を用いて、マウスＥＳ細胞２．５×１０５個／ｍＬを調製した。あらかじめＭＥＦを播種しておいたゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿に、マウスＥＳ細胞をそれぞれ５．０×１０４個／ｃｍ２播種して、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養した（培養条件：ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋））。ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したＥＳ細胞を本実験のコントロールとした。なお、実施例において、「ＭＥＦ（＋）」はＭＥＦ共存下での培養を示す。また、「ＬＩＦ（＋）」はＬＩＦ共存下での培養を示す。【０３６３】
培養開始１日後に、位相差顕微鏡下でＥＳ細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図１４に示す。図１４中、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、アテロコラーゲンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２７）において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｄ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ラット腱由来、配列番号２４と配列番号５との混合物）において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｅ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２６）において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図である。ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養した場合、ＭＥＦはゼラチンコート培養皿の底面に接着して伸展していた。その間にＥＳ細胞がコロニーを形成していた。一般的なＥＳ細胞の培養所見と同じ形態であった（図１４の（ａ）および（ｂ））。【０３６４】
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、ＥＳ細胞は３次元細胞塊（胚様体）を形成しており、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿の一般的なＥＳ細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった（図１４の（ｃ）〜（ｅ））。またＭＥＦはコラーゲン分解物コート培養皿の底面に接着していたが、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿のように底面全体に伸展せず、ＥＳ細胞の胚様体の底面で主にコラーゲンと接着していた。【０３６５】
コラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞の形態は、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したＥＳ細胞の形態とは全く異なっていた。ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したＥＳ細胞は、一般的なＥＳ細胞のコロニーを形成しただけであったが、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞は、接着した胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物の動物種（例えば、ブタ、ラット）、由来部位（例えば、皮部と腱）およびＮ末端切断部位（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２４、配列番号５）に関わらず、コラーゲン分解物コート培養皿においてＥＳ細胞を培養することは、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。【０３６６】
＜１９．コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験９＞
ゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞の未分化能を調べるため、細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた。【０３６７】
（培養皿）
上述したコラーゲンの分解物（ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２７）、あるいはラット腱由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２４と配列番号５との混合物）、あるいはブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２６））と接触させた、市販の培養皿を試験に用いた。具体的には、３５ｍｍ培養皿にコラーゲン分解物の濃度（ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２７）は３．２ｍｇ／ｍＬから９．６ｍｇ／ｍＬ、ラット腱由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２４と配列番号５との混合物）は２.８ｍｇ／ｍＬから８.４ｍｇ／ｍＬ、ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２６）は３.３ｍｇ／ｍＬ）を変えて添加し、培養皿に十分になじませて室温で５時間静置し、コラーゲン分解物コート培養皿とした。【０３６８】
（胚様体の形成）
５００Ｕ／ｍＬのＬＩＦおよび２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）（以下、「ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））」と称する。）を用いて、２．５×１０５個／ｍＬを調製した。あらかじめＭＥＦを播種しておいたゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿に、マウスＥＳ細胞をそれぞれ５．０×１０４個／ｃｍ２播種して、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養した（培養条件：ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋））。ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したＥＳ細胞を本実験のコントロールとした。【０３６９】
１日間培養後に、細胞の培養上清を取り除き、滅菌ＰＢＳで洗浄した。引き続き、細胞を固定するために４％パラホルムアルデヒド溶液を細胞が浸るまで加え、室温で３０分間静置した。その後、滅菌蒸留水を細胞が浸るまで加えて洗浄する操作を２回繰り返した。洗浄液を取り除いた後、ＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ  ｄｏｕｂｌｅ-ｓｔａｉｎ  ｋｉｔ（商品コードＭＫ３００、タカラバイオ社製）付属のアルカリ性ホスファターゼ染色液を培養皿に加えて３７℃で４５分間静置した。反応を停止させるため、染色液を取り除いて滅菌蒸留水で３回洗浄した。結果を図１５に示す。【０３７０】
図１５は、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件において１日間培養したＥＳ細胞の細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた結果を示す図であり、図１５中、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す図であり、（ｂ）は、アテロコラーゲンコート培養皿において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２７）において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す図であり、（ｄ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ラット腱由来、配列番号２４と配列番号５との混合物）において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す図であり、（ｅ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２６）において、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ染色の結果を示す図である。【０３７１】
コラーゲン分解物コート培養皿おいて培養したＥＳ細胞から形成された胚様体は、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したＥＳ細胞のコロニーと同様にアルカリ性ホスファターゼ活性陽性であることが示された（図１５の（ｃ）〜（ｅ））。一方、共培養しているＭＥＦはアルカリ性ホスファターゼ活性陰性であった。これらの結果は、コラーゲン分解物の動物種（例えば、ブタ、ラット）、由来部位（例えば、皮部と腱）およびＮ末端切断部位（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２４、配列番号５）に関わらず、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞から形成された胚様体が未分化能を維持していることを示している。【０３７２】
＜２０．コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験１０＞
次に、ＧＦＰ発現ＥＳ細胞を培養して得られた胚様体がＥＳ細胞のみから成るか否かを確認した。【０３７３】
（培養皿）
上述したコラーゲンの分解物（ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２７）、あるいはラット腱由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２４と配列番号５との混合物）、あるいはブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２６））と接触させた、市販の培養皿を試験に用いた。具体的には、３５ｍｍ培養皿にコラーゲン分解物の濃度（ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２７）は３．２ｍｇ／ｍＬから９．６ｍｇ／ｍＬ、ラット腱由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２４と配列番号５との混合物）は２.８ｍｇ／ｍＬから８.４ｍｇ／ｍＬ、ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２６）は３.３ｍｇ／ｍＬ）を変えて添加し、培養皿に十分になじませて室温で５時間静置し、コラーゲン分解物コート培養皿とした。【０３７４】
（胚様体の形成）
具体的には、５００Ｕ／ｍＬのＬＩＦおよび２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）（以下、「ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））」と称する。）を用いて、２．５×１０５個／ｍＬを調製した。あらかじめＭＥＦを播種しておいたゼラチンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿に、マウスＥＳ細胞をそれぞれ５．０×１０４個／ｃｍ２播種して、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養した（培養条件：ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋））。ゼラチンコート培養皿において培養したＥＳ細胞を本実験のコントロールとした。【０３７５】
結果を図１６〜図１９に示す。図１６は、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件において、ゼラチンコート培養皿においてＧＦＰ遺伝子を内在したＥＳ細胞を１日間培養した後に得られたコロニーを、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察した上記コロニーの形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した上記コロニーのＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は、（ａ）および（ｂ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。また、図１７は、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件においてコラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２７）においてＧＦＰ遺伝子を内在したＥＳ細胞を１日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察した上記胚様体の形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した上記胚様体のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は、（ａ）および（ｂ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。また、図１８は、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件においてコラーゲン分解物コート培養皿（ラット腱由来、配列番号２４と配列番号５との混合物）においてＧＦＰ遺伝子を内在したＥＳ細胞を１日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察した上記胚様体の形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した上記胚様体のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は、（ａ）および（ｂ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。また、図１９は、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件においてコラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２６）においてＧＦＰ遺伝子を内在したＥＳ細胞を１日間培養した後に得られた胚様体を、顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ａ）は、位相差顕微鏡下で観察した上記胚様体の形態を示す図であり、（ｂ）は、（ａ）に示した上記胚様体のＧＦＰの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す図であり、（ｃ）は、（ａ）および（ｂ）の画像を重ね合せた結果を示す図である。【０３７６】
その結果、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件においてゼラチンコート培養皿においてＥＳ細胞を培養した場合、ＧＦＰ陽性のＥＳ細胞が単層に広がり、コロニー形成することが確認できた（図１６の（ａ）〜（ｃ））。【０３７７】
また、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて、ＥＳ細胞をコラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、観察されたＧＦＰ陽性のＥＳ細胞は、コラーゲン分解物コートに接着した３次元細胞塊（胚様体）を形成していた。これは、ゼラチンコート培養皿の一般的なＥＳ細胞の培養所見とはまったく異なる形態であった。胚様体以外の細胞はＧＦＰ陰性であることから、胚様体以外の細胞はＭＥＦであると推察された（図１７の（ａ）〜（ｃ）、図１８の（ａ）〜（ｃ）および図１９の（ａ）〜（ｃ））。【０３７８】
以上の結果から、コラーゲン分解物の動物種（例えば、ブタ、ラット）、由来部位（例えば、皮部と腱）およびＮ末端切断部位（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２４、配列番号５）に関わらず、ＭＥＦ共存下においてコラーゲン分解物コート培養皿において形成された胚様体は、ＥＳ細胞由来であることが示された。【０３７９】
＜２１．コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験１１＞
（培養皿）
上述したコラーゲンの分解物（ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２７）、あるいはラット腱由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２４と配列番号５との混合物）、あるいはブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２６））と接触させた、市販の培養皿を試験に用いた。具体的には、３５ｍｍ培養皿にコラーゲン分解物の濃度（ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２７）は３．２ｍｇ／ｍＬから９．６ｍｇ／ｍＬ、ラット腱由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２４と配列番号５との混合物）は２.８ｍｇ／ｍＬから８.４ｍｇ／ｍＬ、ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２６）は３.３ｍｇ／ｍＬ）を変えて添加し、培養皿に十分になじませて室温で５時間静置し、コラーゲン分解物コート培養皿とした。【０３８０】
（胚様体の形成）
ＭＥＦを播種している培養皿の代わりに、ＭＥＦを播種していない培養皿を用いて、同様の実験を、ＬＩＦを含み且つ２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）（以下、「ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））」と称する。）を用いて行った。具体的には、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて、を用いて、マウスＥＳ細胞２．５×１０５個／ｍＬを調製した。ＭＥＦを播種していないゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿に、マウスＥＳ細胞をそれぞれ５．０×１０４個／ｃｍ２播種して、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養した（培養条件：ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（＋））。ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したＥＳ細胞を本実験のコントロールとした。なお、実施例において、「ＭＥＦ（−）」はＭＥＦ非共存下での培養を示す。また、「ＬＩＦ（＋）」はＬＩＦ共存下での培養を示す。【０３８１】
培養開始１日後に、位相差顕微鏡下でＥＳ細胞の形態を観察した。各細胞の形態を、図２０に示す。図２０中、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｂ）は、アテロコラーゲンコート培養皿において、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２７）において、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｄ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ラット腱由来、配列番号２４と配列番号５との混合物）において、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図であり、（ｅ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２６））において、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞の形態を示す図である。【０３８２】
ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養した場合、ＥＳ細胞が単層に広がり、単一で接着している細胞を観察した。細胞突起を示す形態を示す細胞も存在していた。一般的なＥＳ細胞のＭＥＦ共存下且つＬＩＦ存在下の培養所見（図１４の（ａ）および（ｂ））と比べてそれぞれの細胞が判別できる程度の典型的な細胞間接着であることが示された（図２０の（ａ）および（ｂ））。【０３８３】
コラーゲン分解物コート培養皿において培養した場合、観察されたＥＳ細胞は接着もしくは浮遊した３次元細胞塊（胚様体）を形成しており（図２０の（ｃ）〜（ｅ））、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿の一般的なＥＳ細胞の培養所見（図１４の（ａ）および（ｂ））とはまったく異なる形態であった。【０３８４】
ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いてコラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞の形態は、コラーゲン分解物の動物種（例えば、ブタ、ラット）、由来部位（例えば、皮部と腱）およびＮ末端切断部位（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２４、配列番号５）に関わらず、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したＥＳ細胞の形態とは全く異なっていた。しかし、ＭＥＦ共存下（ＭＥＦ（＋））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いてコラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞（図１４の（ｃ）〜（ｅ））と比較して、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いてコラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞（図２０の（ｃ）〜（ｅ））の形態は、大きさや形、接着、浮遊などに多少の違いが観察されたが、コラーゲン分解物の動物種（例えば、ブタ、ラット）、由来部位（例えば、皮部と腱）およびＮ末端切断部位（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２４、配列番号５）に関わらず、明確な違いはなかった。【０３８５】
ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（＋）の培養条件で、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したＥＳ細胞は、単一の接着細胞であった。特筆すべきは、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞は、コラーゲン分解物の動物種（例えば、ブタ、ラット）、由来部位（例えば、皮部と腱）およびＮ末端切断部位（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２４、配列番号５）に関わらず、ＭＥＦを共培養していない条件下でも、胚様体を形成した。つまり、コラーゲン分解物コート培養皿においてＥＳ細胞を培養することは、コラーゲン分解物の動物種（例えば、ブタ、ラット）、由来部位（例えば、皮部と腱）およびＮ末端切断部位（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２４、配列番号５）に関わらず、胚様体を形成させる新たな方法となりうることが示された。【０３８６】
＜２２．コラーゲンの分解物の胚様体形成能に関する試験１２＞
次に、ゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞の未分化能を調べるため、細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた。【０３８７】
（培養皿）
上述したコラーゲンの分解物（ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２７）、あるいはラット腱由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２４と配列番号５との混合物）、あるいはブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２６））と接触させた、市販の培養皿を試験に用いた。具体的には、３５ｍｍ培養皿にコラーゲン分解物の濃度（ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２７）は３．２ｍｇ／ｍＬから９．６ｍｇ／ｍＬ、ラット腱由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２４と配列番号５との混合物）は２.８ｍｇ／ｍＬから８.４ｍｇ／ｍＬ、ブタ皮部由来のＩ型コラーゲンの分解物（配列番号２６）は３.３ｍｇ／ｍＬ）を変えて添加し、培養皿に十分になじませて室温で５時間静置し、コラーゲン分解物コート培養皿とした。【０３８８】
（胚様体の形成）
５００Ｕ／ｍＬのＬＩＦおよび２０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（KnockOutＤＭＥＭ、サーモフィッシャーサイエンス製）（以下、「ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））」と称する。）を用いて、２．５×１０５個／ｍＬを調製した。ＭＥＦを播種していないゼラチンコート培養皿、アテロコラーゲンコート培養皿、コラーゲン分解物コート培養皿に、マウスＥＳ細胞をそれぞれ５．０×１０４個／ｃｍ２播種して、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて培養した。ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養したＥＳ細胞を本実験のコントロールとした。【０３８９】
１日間培養後に、細胞の培養上清を取り除き、滅菌ＰＢＳで洗浄した。引き続き、細胞を固定するために４％パラホルムアルデヒド溶液を細胞が浸るまで加え、室温で３０分間静置した。その後、滅菌蒸留水を細胞が浸るまで加えて洗浄する操作を２回繰り返した。洗浄液を取り除いた後、ＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔａｉｎ  ｋｉｔ（商品コードＭＫ３００、タカラバイオ社製）付属のアルカリ性ホスファターゼ染色液を培養皿に加えて３７℃で４５分間静置した。反応を停止させるため、染色液を取り除いて滅菌蒸留水で３回洗浄した。結果を図２１に示す。【０３９０】
図２１は、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））且つＬＩＦ（＋）の培養条件において１日間培養したＥＳ細胞の細胞内在性のアルカリ性ホスファターゼ活性を調べた結果を示す図であり、図２１中、（ａ）は、ゼラチンコート培養皿において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｂ）は、アテロコラーゲンコート培養皿において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｃ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２７）において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｄ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ラット腱由来、配列番号２４と配列番号５との混合物）において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図であり、（ｅ）は、コラーゲン分解物コート培養皿（ブタ皮部由来、配列番号２６）において、ＭＥＦ非共存下（ＭＥＦ（−））で、ＤＭＥＭ培地（ＬＩＦ（＋））を用いて１日間培養したＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性染色の結果を示す図である。【０３９１】
ＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（＋）の培養条件で、ゼラチンコート培養皿およびアテロコラーゲンコート培養皿において培養した単一のＥＳ細胞は、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件のＥＳ細胞のコロニー（図１５の（ａ）と（ｂ））と同様にアルカリ性ホスファターゼ活性陽性であることが示された（図２１の（ａ）と（ｂ））。コラーゲン分解物コート培養皿おいてＭＥＦ（−）且つＬＩＦ（＋）の培養条件で培養したＥＳ細胞から形成された接着および浮遊した胚様体は、ＭＥＦ（＋）且つＬＩＦ（＋）の培養条件の接着した胚様体（図１５の（ｃ）〜（ｅ））と同様にアルカリ性ホスファターゼ活性陽性であることが示された（図２１の（ｃ）〜（ｅ））。これらの結果は、ＭＥＦ非共存下でコラーゲン分解物コート培養皿において培養したＥＳ細胞から形成された胚様体もコラーゲン分解物の動物種（例えば、ブタ、ラット）、由来部位（例えば、皮部と腱）およびＮ末端切断部位（例えば、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２４、配列番号５）に関わらず、未分化能を維持していることを示している。【０３９２】
以上のことから、本実施例のコラーゲンの分解物は、マウスＥＳ細胞とヒトｉＰＳ細胞の胚様体形成能を有していることと、その後に必要とされる分化誘導に活用できることが明らかになった。本発明の一実施形態の方法によって得られた胚様体を適切な分化誘導培地で長期培養することにより、内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化させることで、さらに神経組織、骨・軟骨組織、脂肪組織、筋肉組織などの再建が期待される。
【産業上の利用可能性】
【０３９３】
本発明は、再生医療に関わる産業において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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