(57)【要約】  本発明は、脳内のAβ沈着とタウ沈着を単一分子によって同時に削減することができるワクチンの提供を目的とする。  本発明は、アミロイドβをコードするDNA、免疫グロブリンFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAを含む組み換えベクターを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドβをコードするDNA、免疫グロブリンFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAを含む組み換えベクター。
【請求項２】
アミロイドβをコードするDNAが、アミロイドβの繰り返し配列をコードするDNAである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
タウをコードするDNAが、タウの繰り返し配列をコードするDNAである、請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
アミロイドβがAβ1-42である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み換えベクターを含む、アルツハイマー病の予防又は治療用DNAワクチン。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み換えベクターを含む、脳内Aβ及び脳内タウを削減するためのDNAワクチン。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み換えベクターを含む、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤。
【請求項８】
アミロイドβ、免疫グロブリンFc配列及びタウのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項９】
アミロイドβが、アミロイドβの繰り返し配列である、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
タウが、タウの繰り返し配列である、請求項８又は９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
アミロイドβがAβ1-42である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み換えベクターから発現されるポリペプチド。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、アルツハイマー病の予防又は治療用ワクチン。
【請求項１４】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、脳内Aβ及び脳内タウを削減するためのワクチン。
【請求項１５】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドβ及びタウに対するDNAワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、前頭葉連合野、側頭葉、海馬領域において中等度から高度の脳萎縮が肉眼的に認められる疾患であり、その主要顕微鏡所見としては老人斑（アミロイドβ（Aβ）沈着）、神経原線維変化(過リン酸化タウの沈着)、神経細胞脱落の３つが観察される。
アミロイドの蓄積は、タウ沈着や神経細胞の変化に先行することが数多く報告され、非認知症老人やダウン症の剖検脳でも観察されている。近年、アミロイドの沈着がこの病態の最上流に位置し、アミロイドの蓄積を防止できるならば、その後に起きる事象、すなわち、神経細胞内のタウの蓄積、神経細胞の脱落などをある程度防ぐことができるとする「アミロイド仮説」が受け入れられるようになった。
しかしながら、病理学的検索からは抗免疫療法はAβ沈着を効果的に削減するが、タウ沈着を削減する効果は極めて弱いことが報告されている（非特許文献１：Boche, D. et al., Acta Neuropathol 120, 13-20）。
現在、Aβに対するDNAワクチンは知られているが（特許文献１：国際公開第2010/110408号）、Aβ沈着とタウ沈着を単一分子によって同時に削減することができるDNAワクチンは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第2010/110408号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Boche, D. et al., Acta Neuropathol 120, 13-20
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、脳内のAβ沈着とタウ沈着を単一分子（単一コンストラクト（構築物））によって同時に削減することができるワクチンを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、アミロイドβをコードするDNA、免疫グロブリンFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAを含む組み換えベクターを用いることにより、脳内のAβ沈着とタウ沈着を単一分子によって同時に削減することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。【０００７】
（１）アミロイドβをコードするDNA、免疫グロブリンFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAを含む組み換えベクター。
（２）アミロイドβをコードするDNAが、アミロイドβの繰り返し配列をコードするDNAである、上記（１）に記載のベクター。
（３）タウをコードするDNAが、タウの繰り返し配列をコードするDNAである、上記（１）又は（２）に記載のベクター。
（４）アミロイドβがAβ1-42である、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のベクター。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の組み換えベクターを含む、アルツハイマー病の予防又は治療用DNAワクチン。
（６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の組み換えベクターを含む、脳内Aβ及び脳内タウを削減するためのDNAワクチン。
（７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の組み換えベクターを含む、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤。
（８）アミロイドβ、免疫グロブリンFc配列及びタウのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（９）アミロイドβが、アミロイドβの繰り返し配列である、上記（８）に記載のポリペプチド。
（１０）タウが、タウの繰り返し配列である、上記（８）又は（９）に記載のポリペプチド。
（１１）アミロイドβがAβ1-42である、上記（８）〜（１０）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１２）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の組み換えベクターから発現されるポリペプチド。
（１３）上記（８）〜（１２）のいずれかに記載のポリペプチドを含む、アルツハイマー病の予防又は治療用ワクチン。
（１４）上記（８）〜（１２）のいずれかに記載のポリペプチドを含む、脳内Aβ及び脳内タウを削減するためのワクチン。
（１５）上記（８）〜（１２）のいずれかに記載のポリペプチドを含む、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、脳内のAβ沈着とタウ沈着を単一分子によって同時に削減することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】YM7555の構造の模式図である。
【図２】本発明の組み換えベクターによるタンパク質発現をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す図である。
【図３】本発明の組み換えベクターによるタンパク質発現をELISAにより測定した結果を示す図である。
【図４】YM7555の免疫と採血のスケジュールを示す図である。
【図５】Tgマウスにおける抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導結果を示す図である。
【図６】野生型マウスにおける抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導結果を示す図である。
【図７】本発明による脳内Aβ及び脳内タウの削減効果を示す図である。
【図８】YM7555Pの構造の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【００１１】
１．概要
現在、AβをコードするDNAを含むコンストラクト及びこれを含有するDNAワクチンは知られているが（特許文献１：国際公開第2010/110408号）、Aβとタウの両者をコードするDNAを含むDNAワクチン、特にAβの繰り返し配列とタウの繰り返し配列をコードするDNAを含むDNAワクチンは知られていない。これは、Aβの繰り返し配列とタウの繰り返し配列とを組み合わせると、発現後のポリペプチドにおいて各配列部分が立体構造的に互いに干渉しあい、Aβ又はタウに対する抗体を誘導できない可能性を当業者が予測することが要因の一つとして挙げられる。また、仮に当業者がAβをコードするDNA及びタウをコードするDNAの両者を含むコンストラクトを作製しようとしても、このようなコンストラクトの作製は技術的に容易ではないことが、これまで作製されていない要因の一つとして考えられる。具体的には、AβをコードするDNA及びタウをコードするDNAはそれぞれ疎水性が高く、またその繰り返し配列をコードするDNAはその繰り返し配列を有するために、通常知られているクローニング方法を用いた場合には、自己会合（セルフライゲーション）による高次構造を形成しやすく、ベクターへのライゲーションやコンストラクト同士の連結反応が進みにくい。そのため、当業者は、通常の方法を用いた場合には、AβをコードするDNA及びタウをコードするDNAの両者を含むコンストラクトを作製することは技術的に困難であった。  
また、仮にそのようなコンストラクトを作製できたとしても、実際に生体内においてAβ及びタウを含むポリペプチドを単一分子として発現し、そのポリペプチドにより免疫系を刺激し、Aβ、タウ及びその関連物質に対する抗体の産生を誘導し、さらにはそれらの抗体によって脳内Aβ及びタウを同時に削減できるDNAワクチンを作製することは極めて困難であった。
そして、当業者がAβとタウを生体内で発現させることを考えたとしても、AβをコードするDNAを含む組み換えベクターとタウをコードするDNAを含む組み換えベクターという二種類の分子を併用投与することを想起するのが一般的である。
これに対し、本発明者は、脳内のAβ沈着とタウ沈着を単一分子によって同時に削減することができるDNAワクチンはアルツハイマー病の治療又は予防に有用であると考え、鋭意研究を行った結果、本明細書の実施例に記載された独自の手法を用いることにより、AβをコードするDNA、免疫グロブリンFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAを含む組み換えベクターをDNAワクチンとして用いることにより、脳内のAβ沈着とタウ沈着を単一分子によって同時に削減することに成功し、本発明を完成するに至った。
特に、本発明の組み換えベクターは、その構成要素の相乗効果により、生体内で強い神経毒性を示すリン酸化タウを削減することができるため、アルツハイマー病の治療又は予防に極めて有効である。
本発明において「同時」とは、必ずしも時間的に同時ということを意味するのではなく、同じ部位（細胞集団）において両方ともということを意味する。
【００１２】
２．組み換えベクター、ポリペプチド
（１）アミロイドβ（Aβ）
アミロイドβ（Aβ）は、β-及びγ-セクレターゼの働きにより前駆体タンパク質(APP: amyloid β protein precursor)から切り出される40-43アミノ酸からなるポリペプチドである。
本発明に用いられる「Aβ」は、天然のAβのアミノ酸配列における連続した15アミノ酸以上、好ましくは連続した20アミノ酸以上を含むポリペプチドであり、より好ましくはAβのN末端側の１〜42番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Aβ1-42）である。
AβをコードするDNAの塩基配列は、所定のデータベースから入手可能である。ヒトAβをコードするDNAの塩基配列としては、例えばGenbankアクセッション番号NC_000021.7、マウスをコードするDNAの塩基配列としては、アクセッション番号NC_000082.5に記載された塩基配列を利用することができる。
【００１３】
本発明においては、AβをコードするDNAを鋳型とし、所望の領域を増幅させるためのプライマーを用いてPCRを行うことにより、様々な領域の塩基配列を含むDNAを調製することができる。このようなDNAとしては、例えば、γセクレターゼにより切断される43のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド（「Aβ1-43」という）をコードするDNA、AβのN末端側の１〜２０番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド（「Aβ1-20」という）をコードするDNA、AβのN末端側の１〜40番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド（「Aβ1-40」という）をコードするDNA、AβのN末端側の１〜42番のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド（「Aβ1-42」という）をコードするDNAが挙げられるが、好ましくはAβ1-42をコードするDNAである。
また、本発明において、アミロイドβ（Aβ）、免疫グロブリンFc配列及びタウのアミノ酸配列を含むポリペプチド（以下「本発明のポリペプチド」とも称する）において使用されるAβとしては、Aβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42が挙げられるが、好ましくはAβ1-42である。
ヒトAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２、４、６、８に示し、マウスAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42はそれぞれ配列番号１０、１２、１４、１６に示す。また、ヒトAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42をコードするDNAの塩基配列はそれぞれ配列番号１、３、５、７に示し、マウスAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42をコードするDNAの塩基配列はそれぞれ配列番号９、１１、１３、１５に示す。
ヒト又はマウスのAβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42をコードするDNAは、ヒト又はマウスのAβ1-43をコードするDNAからPCRを用いて調製することができる。
【００１４】
また、本発明の組み換えベクターにおいては、上記ヒト又はマウスのAβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42をコードするDNAのほか、以下のDNAも、本発明において使用することができる。
配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号７に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号９に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１３に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【００１５】
ヒトAβ1-43、ヒトAβ1-20、ヒトAβ1-40、ヒトAβ1-42、マウスAβ1-43、マウスAβ1-20、マウスAβ1-40、マウスAβ1-42は、それぞれ固有のAβ活性を有する。従って、例えば、配列番号１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNAから発現するタンパク質は、ヒトAβ1-43と同等のAβ活性を有していればよい。他の配列番号に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Aβ活性を有するタンパク質をコードするDNAから発現するタンパク質についても同様である。
【００１６】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0．5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual(4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）等を参照することができる。
【００１７】
本発明の組み換えベクターにおいて、AβをコードするDNAとしては、配列番号１、３、５又は７に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性（同一性）を有し、かつ、ヒトAβ活性を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。また、配列番号９、１１、１３又は１５に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、マウスAβ活性を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
【００１８】
本発明のポリペプチドにおいて、Aβとしては、配列番号２、４、６、８又は３５に示すアミノ酸配列と70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性（同一性）を有し、かつ、ヒトAβ活性を有するポリペプチドを用いることができる。そのようなAβとしては、好ましくは配列番号８又は３５に示すアミノ酸配列と85%以上の相同性を有し、かつヒトAβ活性を有するポリペプチドであり、より好ましくは配列番号８又は３５に示すアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつヒトAβ活性を有するポリペプチドである。また、本発明のポリペプチドにおいて、Aβとしては、配列番号１０、１２、１４又は１６に示すアミノ酸配列と70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、マウスAβ活性を有するポリペプチドを用いることができる。そのようなAβとしては、好ましくは配列番号１６に示すアミノ酸配列と85%以上の相同性を有し、かつマウスAβ活性を有するポリペプチドであり、より好ましくは配列番号１６に示すアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつマウスAβ活性を有するポリペプチドである。
【００１９】
本発明のポリペプチドにおいて、Aβには、配列番号２、４、６、８又は３５に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号２、４、６、８又は３５に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつヒトAβ活性を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号２、４、６、８又は３５に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
(i) 配列番号２、４、６、８又は３５に示すアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２、４、６、８又は３５に示すアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２、４、６、８又は３５に示すアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００２０】
本発明のポリペプチドにおいて、Aβには、配列番号１０、１２、１４又は１６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号１０、１２、１４又は１６に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつマウスAβ活性を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号１０、１２、１４又は１６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
(i) 配列番号１０、１２、１４又は１６に示すアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号１０、１２、１４又は１６に示すアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号１０、１２、１４又は１６に示すアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００２１】
本発明においてAβ活性とは、Aβが被験者（ヒト、マウス等）の脳において生成、蓄積及び／又は凝集し、Aβ沈着（老人斑）を形成する活性を意味する。Aβ活性は、免疫組織染色、ELISA等の免疫学的手法により測定することができる。例えば、免疫組織染色の場合は、評価対象となるタンパク質を被験動物（マウス等）の脳で発現させ、発現させた組織の切片において抗Aβ抗体を用いた免疫染色を行い、Aβの生成、蓄積、凝集及び／又は沈着等を検出することにより測定することができる。
【００２２】
また、「Aβ活性を有する」とは、配列番号２、４、６、８若しくは３５、又は配列番号１０、１２、１４若しくは１６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのAβ活性を100としたときと比較して、10%以上、20％以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、好ましくは90%以上の活性を有することを意味する。
【００２３】
上記の変異を有するポリペプチドを調製するためにポリヌクレオチドに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual(4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons（1987-1997））、Kunkel（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kramer and Fritz（1987）Method. Enzymol. 154: 350-67、Kunkel（1988）Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
【００２４】
本発明において、AβをコードするDNAは、Aβの繰り返し配列をコードするDNAであってもよい。Aβの繰り返し配列をコードするDNAを含むベクターは、複数のAβ又はこれら複数のAβを含むポリペプチドを発現することができる。また、本発明のポリペプチドにおいて、AβはAβの繰り返し配列であってもよい。複数のAβ又はこれら複数のAβを含むポリペプチドは、細胞外でAβのオリゴマーを形成する。このオリゴマーは、免疫系を刺激し、Aβオリゴマーに対する抗体を誘導する。これにより、Aβモノマーよりも神経毒性が強いAβオリゴマーを削減することが期待できる。
本発明は、Aβの繰り返し配列又はこれをコードするDNAを含むことにより、より高い脳内Aβ削減効果を示すことができる。また、本発明ではAβの繰り返し配列又はこれをコードするDNAを有することにより、神経毒性や高いアミロイド凝集性を示す多様な分子（pEAβ3-42、ABri、ADan等）に対する抗体をも誘導することができる。
Aβの繰り返し回数の範囲は、Aβが折りたたみ構造を形成することにより、Aβモノマーよりも抗原性が向上する範囲であれば限定されるものでないが、その範囲としては、2〜4回が好ましく、3〜4回がより好ましく、4回がさらに好ましい。
【００２５】
（２）タウ
本発明の組み換えベクターは、タウをコードするDNAを含む。また、本発明のポリペプチドは、タウのアミノ酸配列を含む。
タウは、神経軸索などに存在する分子量約５万のタンパク質であり、微小管の安定性に寄与するタンパク質である。
本発明において、タウはヒト由来のタウ（ヒトタウ（human tau））及びマウス由来のタウ（マウスタウ（mouse tau））のいずれでもよいが、好ましくはヒトタウである。また、タウには６種類アイソフォーム（0N3R、1N3R、0N3R、2N3R、1N4R、2N4R）が存在するが、本発明におけるタウはいずれかのアイソフォームに限定されるものではない。
タウをコードするDNAの塩基配列は、所定のデータベースから入手可能である。ヒトタウをコードするDNAの塩基配列としては、例えば、タウのアイソフォーム2N4RをコードするDNAの塩基配列（Genbankアクセッション番号NM_005910.5）を利用することができるが、これに限定されない。ヒトタウ（2N4R、全長）をコードするDNAの塩基配列は配列番号１７に示し、アミノ酸配列は、配列番号１８に示す。
本発明においては、タウをコードするDNAを鋳型とし、所望の領域を増幅させるためのプライマーを用いてPCRを行うことにより、様々な領域の塩基配列を含むDNAを調製することができる。このようなDNAとしては、例えば、タウの全長のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する６アミノ酸残基以上、８アミノ酸残基以上、１０アミノ酸残基以上、２０アミノ酸残基以上、２０アミノ酸残基以上、３０アミノ酸残基以上のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む／からなるポリペプチド（部分ポリペプチド）をコードするDNAが挙げられる。部分ポリペプチドをコードするDNAとしては、より具体的には、タウのN末端側の295から305番のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド（「tau295-305」という）をコードするDNA、タウのN末端側の379から408番のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド（「tau379-408」という）をコードするDNAが挙げられる。
ヒトtau295-305をコードするDNA、ヒトtau379-408をコードするDNAの塩基配列は、ぞれぞれ配列番号１９、２１に示す。また、ヒトtau295-305及びヒトtau379-408のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２０、２２に示す。
【００２６】
また、本発明におけるタウをコードするDNAとしては、上記ヒトタウをコードするDNAのほか、以下のDNAも使用することができる。
配列番号１７に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、タウ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号１９に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、タウ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号２１に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、タウ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【００２７】
ヒトタウ、ヒトtau295-305、ヒトtau379-408は、それぞれ固有のタウ活性を有する。従って、例えば、配列番号１７に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、タウ活性を有するタンパク質をコードするDNAから発現するタンパク質は、ヒトタウと同等のタウ活性を有していればよい。他の配列番号に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、タウ活性を有するタンパク質をコードするDNAから発現するタンパク質についても同様である。
「ストリンジェントな条件」については上記と同様である。
【００２８】
本発明の組み換えベクターにおいて、タウをコードするDNAとしては、配列番号１７、１９又は２１に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性（同一性）を有し、かつ、ヒトタウの活性を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
【００２９】
本発明のポリペプチドにおいて、タウとしては、配列番号１８、２０、２２又は２４に示すアミノ酸配列と70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性（同一性）を有し、かつ、ヒトタウの活性を有するポリペプチドを用いることができる。そのようなタウとしては、好ましくは配列番号１８、２０又は２２に示すアミノ酸配列と85%以上の相同性を有し、かつヒトタウの活性を有するポリペプチドであり、より好ましくは配列番号１８、２０、２２又は２４に示すアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつヒトタウの活性を有するポリペプチドである。
【００３０】
本発明のポリペプチドにおいて、タウには、配列番号１８、２０、２２又は２４に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号１８、２０、２２又は２４に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつヒトタウの活性を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号１８、２０、２２又は２４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
(i) 配列番号１８、２０、２２又は２４に示すアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号１８、２０、２２又は２４に示すアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号１８、２０、２２又は２４に示すアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００３１】
本発明においてタウの活性とは、タウが被験者（ヒト、マウス等）の脳において生成、蓄積及び／又は凝集する活性を意味する。タウの活性は、免疫組織染色、ELISA等の免疫学的手法により測定することができる。例えば、免疫組織染色の場合は、評価対象となるタンパク質を被験動物（マウス等）の脳で発現させ、発現させた組織の切片において抗タウ抗体を用いた免疫染色を行い、タウの生成、蓄積、凝集及び／又は沈着等を検出することにより測定することができる。
【００３２】
また、「ヒトタウの活性を有する」とは、配列番号１８、２０、２２又は２４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドのヒトタウの活性を100としたときと比較して、10%以上、20％以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、好ましくは90%以上の活性を有することを意味する。
変異を有するポリペプチドを調製する方法については上記の通りである。
【００３３】
本発明において、タウをコードするDNAは、タウの繰り返し配列をコードするDNAであってもよい。また、本発明のポリペプチドにおいて、タウはタウの繰り返し配列であってもよい。タウの繰り返し配列をコードするDNAを含むベクターは、複数のタウ又はこれら複数のタウを含むポリペプチドを発現することができる。タウの繰り返し配列をコードするDNAとしては、例えばヒトtau295-305又はヒトtau379-408の繰り返し配列をコードするDNAが挙げられる。また、タウの繰り返し配列のアミノ酸配列としては、例えばヒトtau295-305又はヒトtau379-408の繰り返し配列のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
タウの繰り返し回数の範囲は、タウが折りたたみ構造を形成することにより、タウのモノマーよりも抗原性が向上する範囲であれば限定されるものでないが、その範囲としては、2〜4回が好ましく、3〜4回がより好ましく、4回がさらに好ましい。
また、リン酸化されたタウは、微小管結合能を喪失し、互いに結合して凝集体を形成する。本発明の組み換えベクター及びポリペプチドは、その構成要素の相乗効果により、結果として生体内で強い神経毒性を示すリン酸化タウを削減することができるため、アルツハイマー病の治療又は予防に極めて有効である。
【００３４】
（３）免疫グロブリンFc（IgFc）配列
本発明の組み換えベクターは、免疫グロブリンFc（IgFc）配列をコードするDNAを含む。また、本発明のポリペプチドは、IgFc配列のアミノ酸配列を含む。IgFc配列をコードする遺伝子を生体に導入することにより、Aβ及びタウを含むポリペプチドの細胞内での転写翻訳を促進することができ、さらに細胞外放出を促進し、Aβ及びタウに対する免疫応答をより強く刺激することができる。
本発明に使用されるIgFc配列としては、ヒトIgFc配列及びマウスIgFc配列が挙げられる。ヒトIgFc配列をコードするDNAの塩基配列としては、Genbankアクセッション番号BC014258、マウスIgFc配列をコードするDNAの塩基配列としては、アクセッション番号XM_484178.3に記載された塩基配列を利用することができる。
【００３５】
本発明に用いられるヒト及びマウスIgFc配列をコードするDNAの塩基配列、並びにヒト及びマウスIgFc配列のアミノ酸配列の配列番号をそれぞれ以下に示す。
ヒトIgFc配列をコードするDNAの塩基配列：配列番号２５
ヒトIgFc配列のアミノ酸配列：配列番号２６
マウスIgFc配列をコードするDNAの塩基配列：配列番号２７
マウスIgFc配列のアミノ酸配列：配列番号２８
【００３６】
配列番号２５及び２７で示される塩基配列には、本来のIgFc配列に含まれるシステイン残基をセリン残基に置換するための変異が導入されている。これはジスルフィド結合の形成を回避することを意図したものである。
【００３７】
また、本発明に用いられるヒト及びマウスIgFc配列をコードするDNAとしては、以下のDNAも使用することができる。
配列番号２５に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒトIgFc活性を有するタンパク質をコードするDNA。
配列番号２７に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、マウスIgFc活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【００３８】
本発明において、IgFc活性とは、IgFc配列を含むポリペプチドの細胞内産生及び細胞外への放出を促進する活性を意味する。例えば、あるタンパク質のIgFc活性は、IgFcと目的のポリペプチドとの融合タンパク質を培養細胞内で発現させ、培養細胞内又は培養上清中に存在する当該ポリペプチドの増加量を定量することにより、測定することができる。当該ポリペプチドの定量は、ELISA、EIA等の免疫学的手法を用いて行うことができる。
【００３９】
本発明の組み換えベクターにおいて、IgFc配列をコードするDNAとしては、配列番号２５に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、ヒトIgFc活性を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。また、配列番号２７に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、マウスIgFc活性を有するタンパク質をコードするDNAを用いることができる。
IgFc活性についての説明は上記と同様である。
【００４０】
本発明のポリペプチドにおいて、IgFc配列としては、配列番号２６に示すアミノ酸配列と70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性（同一性）を有し、かつ、ヒトIgFc活性を有するポリペプチドを用いることができる。そのようなIgFc配列としては、好ましくは配列番号２６に示すアミノ酸配列と85%以上の相同性を有し、かつヒトIgFc活性を有するポリペプチドであり、より好ましくは配列番号２６に示すアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつヒトIgFc活性を有するポリペプチドである。また、本発明のポリペプチドにおいて、IgFc配列としては、配列番号２８に示すアミノ酸配列と70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ、マウスIgFc活性を有するポリペプチドを用いることができる。そのようなIgFc配列としては、好ましくは配列番号２８に示すアミノ酸配列と85%以上の相同性を有し、かつマウスIgFc活性を有するポリペプチドであり、より好ましくは配列番号２８に示すアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつマウスIgFc活性を有するポリペプチドである。
【００４１】
本発明のポリペプチドにおいて、IgFc配列には、配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号２６に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつヒトIgFc活性を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号２６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
(i) 配列番号２６に示すアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２６に示すアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２６に示すアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００４２】
本発明のポリペプチドにおいて、IgFc配列には配列番号２８に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、配列番号２８に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつマウスIgFc活性を有するポリペプチドが含まれる。
上記配列番号２８に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
(i) 配列番号２８に示すアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２８に示すアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２８に示すアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００４３】
別の態様において、本発明の組み換えベクターは、アミロイドβをコードするDNA、免疫グロブリンFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAを含むポリヌクレオチドを含むものである。
このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド（YM7555PをコードするDNA）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の組み換えベクターにおいては、配列番号３０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドのほか、以下のポリヌクレオチドも使用することができる。
配列番号３０に示す塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗Aβ抗体及び／又は抗タウ抗体を誘導する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
配列番号３０に示す塩基配列と50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上（好ましくは90%以上）の相同性（同一性）を有し、かつ、抗Aβ抗体及び／又は抗タウ抗体を誘導する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００４４】
本発明において、「抗Aβ抗体及び／又は抗タウ抗体を誘導する活性」とは、被験者である哺乳動物（マウス、ヒト等）の生体内（in vivo）において抗Aβ抗体及び／又は抗タウ抗体を誘導する活性を意味する。この活性は、免疫組織染色、ウエスタンブロッティング、ELISA等の免疫学的手法により測定することができる。例えば、本発明のポリペプチド又はこれを発現する組み換えベクターを哺乳動物に投与後、採血し、血液中の抗Aβ抗体及び／又は抗タウ抗体の抗体価をELISAで測定することにより、当該活性を測定することができる。
また、「抗Aβ抗体及び／又は抗タウ抗体を誘導する活性を有する」とは、配列番号３１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を100としたときと比較して、10%以上、20％以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、好ましくは90%以上の活性を有することを意味する。
「ストリンジェントな条件」については上記と同様である。
【００４５】
本発明のポリペプチドとしては、例えば、配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（YM7555P）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明のポリペプチドとしては、配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドのほか、以下のポリペプチドも使用することができる。
配列番号３１に示すアミノ酸配列と、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上又は99％以上（好ましくは90%以上）の相同性（同一性）を有し、かつ、抗Aβ抗体及び／又は抗タウ抗体を誘導する活性を有するポリペプチド。
配列番号３１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗Aβ抗体及び／又は抗タウ抗体を誘導する活性を有するポリペプチド。
【００４６】
上記配列番号３１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
(i) 配列番号３１に示すアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号３１に示すアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号３１に示すアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００４７】
（４）組み換えベクターの作製
本発明の組み換えベクターは、AβをコードするDNA、免疫グロブリンFc（IgFc）配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAを含むものである。
Aβ、タウ又はIgFc配列をコードするDNAの由来は、DNAワクチンの投与の対象となる動物と同種の動物由来でも異種の動物由来であってもよいが、同種の動物由来のAβ、タウ又はIgFc配列をコードするDNAを用いることが好ましい。
AβをコードするDNA、IgFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAは、それぞれすでにクローニングされている。したがって、本発明のベクターに含まれるDNAは、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、遺伝子工学的手法として一般的に用いられているDNA合成装置を用いた核酸合成法を使用することができる。また、鋳型となるDNA配列を単離又は合成した後に、それぞれのDNAに特異的なプライマーを設計し、PCR装置を用いてその遺伝子配列を増幅するPCR法、又はクローニングベクターを用いた遺伝子増幅法を用いることができる。さらには、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１８、１９、２１、２５又は２７で表される塩基配列からなるDNA、又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。上記方法は、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual(4th edition)」（Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012)）等に従い、当業者ならば容易に行うことができる。得られたPCR産物の精製には公知の方法を用いることができる。
【００４８】
組換えベクターの作製は、通常の遺伝子工学的手法を採用することができる。
例えば、目的のAβをコードするDNA、タウをコードするDNA及びIgFc配列をコードするDNAの試料をPCR等により調製する。PCRは、KODポリメラーゼまたはその他のα型DNAポリメラーゼを用いる通常の方法によって実施することができる。増幅した目的断片は制限酵素で消化した後、pCR（登録商標）-Blunt II-TOPO（登録商標） vector (Invitrogen)などのプラスミドベクターの制限酵素部位またはマルチクローニング部位に挿入する。得られたPCR産物のヌクレオチド配列をシークエンサーで確認し、正しい配列を含むプラスミドを選択する。DNA試料は、電気泳動的に単一のプラスミドとして確認できることが好ましい。
【００４９】
本発明の組換えベクターに含まれるプロモーターとして、アクチンプロモーター、EF1プロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーターなどを使用することができる。これらのプロモーターは、適当なプラスミドに連結することができる。
「ストリンジェントな条件」は前記と同様である。「プロモーター活性を有する」とは、構造タンパク質または非構造タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を有することを意味する。
【００５０】
本発明のベクターは、上記Aβ、タウ及びIgFc配列が発現できるように機能しうる形態で含まれている。すなわち、適切な調節エレメントの制御下に、導入される遺伝子（DNA）の発現を可能にする様式で、そのベクター中に導入遺伝子が挿入されている。AβをコードするDNA、IgFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAは、それぞれ同一ベクターの別の部分に挿入されていてもよく、タンデムに連続して挿入されていてもよい。ここで、調節エレメントとしては、例えばプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、などを意味する。
【００５１】
本発明のベクターは、AβをコードするDNA、IgFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAを挿入した領域以外の位置に他の外来遺伝子を保持してもよい。このような外来遺伝子としては、例えば、ベクターをモニターするためのマーカー遺伝子、あるいはサイトカインおよびホルモンのような免疫系調節遺伝子、シグナル配列（リーダー配列）であってもよく、特に限定されるものではない。
【００５２】
本発明の組み換えベクターとしては、例えば、
(i) CMVプロモーター下流にAβ1-42をコードするDNA、IgFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAを含むpVAX1、
(ii) CMVプロモーター下流にAβ1-42の繰り返し配列をコードするDNA、IgFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAを含むpVAX1、
(iii) CMVプロモーター下流にAβ1-42をコードするDNA、IgFc配列をコードするDNA及びタウの繰り返し配列をコードするDNAを含むpVAX1、並びに
(iv) CMVプロモーター下流にAβ1-42の繰り返し配列をコードするDNA、IgFc配列をコードするDNA及びタウの繰り返し配列をコードするDNAを含むpVAX1
が挙げられる。
ここで、「タウ」としては、例えば、ヒトタウ（全長）、ヒトtau295-305、ヒトtau379-408が挙げられるが、好ましくはヒトtau379-408である。
【００５３】
CMVプロモーター下流にAβ1-42をコードするDNA、IgFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAを含むpVAX1は、CMVプロモーターとAβ1-42をコードするDNAとの間にIg leader（IgL）配列を含み、IgFc配列をコードするDNAとタウをコードするDNAとの間にスペーサー配列（「リンカー」とも称する）を含むことが好ましい。さらに、前記pVAX1は、CMVプロモーター、Ig leader配列、Aβ1-42をコードするDNA、IgFc配列をコードするDNA、スペーサー配列、タウをコードするDNAをこの順に含むことがより好ましい。
【００５４】
CMVプロモーター下流にAβ1-42の繰り返し配列をコードするDNA、IgFc配列をコードするDNA及びタウの繰り返し配列をコードするDNAを含むpVAXは、CMVプロモーターとAβ1-42の繰り返し配列をコードするDNAとの間にIg leader（IgL）配列を含み、Aβ1-42の繰り返し配列をコードするDNAにおける各「Aβ1-42をコードするDNA」間、IgFc配列をコードするDNAとタウの繰り返し配列をコードするDNAとの間、及びタウの繰り返し配列をコードするDNAにおける各「タウをコードするDNA」間にスペーサー配列を含むことが好ましい。さらに、前記pVAX1は、CMVプロモーター、Ig leader配列、Aβ1-42の繰り返し配列をコードするDNA、IgFc配列をコードするDNA、スペーサー配列、タウの繰り返し配列をコードするDNAをこの順に含むことがより好ましい（図１）。
上記組み換えベクターは、マウス又はヒト由来のDNAを有することができるが、マウス由来のDNAを有するベクターは前臨床試験又は試薬に用いることができ、ヒト由来のDNAを有するベクターは医薬組成物又は試薬に用いることができる。
なお、上記と同様の手法に基づいて、Aβ1-42をコードするDNAを含まず、Ig leader（IgL）配列、タウをコードするDNA、及びIgFc配列をコードするDNAを含むベクターを作製することができる。このようなベクターとしては、例えば、IgL-タウx1-huFc (Ig leader（IgL）配列、タウを１回コードするDNA、及びIgFc配列をコードするDNA）、IgL-Tau x4-huFc（Ig leader（IgL）配列、タウの４回繰り返し配列をコードするDNA、及びIgFc配列をコードするDNA。本明細書において「タウx4-IgFc」とも称する）を含むベクターが挙げられる。
【００５５】
（５）ポリペプチドの作製
本発明のポリペプチドは、アミロイドβ、免疫グロブリンFc配列及びタウのアミノ酸配列を含むものである。
本発明のポリペプチドは、公知の手法を用いて作製することができるが、具体的には以下の通りである。
（i）発現ベクターの作製
本発明のポリペプチドを発現するベクターは、発現させる宿主細胞に保持されるものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、バクテリオファージ等が挙げられる。プラスミドDNAとしては、例えば、pCR（登録商標）-Blunt II-TOPO（登録商標） vector (Invitrogen)などのプラスミドベクターが挙げられるが、これに限定されない。
本発明のポリペプチドを発現するベクターとしては、上記「（４）組み換えベクターの作製」に準じて作製された組み換えベクターを用いることができる。すなわち、本発明のポリペプチドは、アミロイドβをコードするDNA、免疫グロブリンFc配列をコードするDNA及びタウをコードするDNAを含む組み換えベクターから発現されるポリペプチドであってもよい。
（ii）形質転換
本発明のポリペプチドを産生する宿主としては、例えば、哺乳動物細胞、ビフィズス菌、乳酸菌、大腸菌等の細菌類、昆虫細胞、酵母、カビ等を挙げることができるがこれらに限定されない。
宿主への組換えDNAの導入は、公知の方法により行うことができる。上記のベクターを宿主に導入する方法として、例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、電気穿孔法、カチオン性脂質法等を挙げることができる。
また、DNAが導入されたことの確認は、選択マーカー遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ブラストシジン耐性遺伝子等）を用いて行われる。
（iii）ポリペプチドの産生
本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその変異体を含む上記形質転換体を培養し、その培養物からポリペプチドを採取することにより得ることができる。
「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
プロモーターとして誘導型転写プロモーターを用いた発現ベクターを導入した組換え体を培養する場合は、必要に応じて誘導剤を培地に添加してもよい。誘導剤にIPTGを用いる場合のIPTGの添加量は、0.1〜1.0 mMであり、培養開始後2〜12時間後に添加し、添加後さらに1〜12時間追加培養する。
培養後、本発明のポリペプチドが菌体内又は細胞内に蓄積される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより、目的のポリペプチドを採取する。本発明のポリペプチドが菌体外又は細胞外に産生される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、硫安沈殿操作等により前記培養液中からポリペプチドを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製する。
上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスL-細胞、HeLa細胞、CHO細胞、出芽酵母、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されないものであってもよい。
（iv）ペプチド合成
本発明のポリペプチドは化学合成により得ることができる。ペプチド合成は、既知の方法により、合成装置を用いてことができる。また、本発明のポリペプチドは、ペプチド合成受託会社にペプチド合成を依頼し、購入することによって得ることもできる。
【００５６】
３．ワクチン（組み換えベクターを含むDNAワクチン及びポリペプチドを含むワクチン）並びに抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤
本発明は、上記組み換えベクターを含む、アルツハイマー病の予防又は治療用DNAワクチン(医薬組成物）を提供する。また別の態様において、本発明は、上記ベクターを含む、脳内Aβ及び脳内タウを削減するためのDNAワクチンを提供する。
DNAワクチンは、ベクター（プラスミドやウイルス）に目的のタンパク質をコードするDNAを組み込んで生体に投与し、当該ベクターを取り込んだ生体において目的のタンパク質を発現させて免疫系を刺激し、そのタンパク質に対する抗体を誘導するというものである。DNAワクチンは、投与後長時間体内に止まり、コードされたタンパク質を緩徐に作り続けるため、過剰な免疫反応を避けることができる。また、DNAワクチンは、遺伝子工学的手法により改良も可能である。
また、本発明は、アミロイドβ、免疫グロブリンFc配列及びタウのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含有するワクチン(医薬組成物）を提供する。また別の態様において、本発明は、前記ポリペプチドを含む、脳内Aβ及び脳内タウを削減するためのワクチンを提供する。
【００５７】
本発明において、「治療」とは、疾患の発症後に本発明のワクチンを被験者に接触させる（例えば、投与する）ことにより、接触させない場合に比べて、当該疾患の症状を軽減することを意味し、必ずしも疾患の症状を完全に抑制することを意味するものではない。疾患の発症とは、疾患の症状が身体に現れることを意味する。
本発明において、「予防」とは、疾患の発症前に本発明のワクチンを被験者に接触させる（例えば、投与する）ことにより、接触させない場合に比べて、疾患の発症後の症状を軽減することを意味し、必ずしも発症を完全に抑制することを意味するものではない。
本発明において、「削減」とは、脳内に存在するAβ及び／又はタウの量を減少させることをいい、脳内Aβ及び／又は脳内タウの蓄積量、凝集量、脳への沈着量を減少させることを含む。また、上記ベクターを含む本発明のDNAワクチンは、脳内Aβ及び／又は脳内タウの増加を抑制するためのワクチンとして使用することもできる。
【００５８】
別の態様において、本発明は、上記ベクター又はポリペプチドを含む、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤を提供する。
【００５９】
近年、神経毒性を示すAβにも様々な亜種があることが明らかになりつつある。最もよく分析されているAβオリゴマーにも2分子、3分子又は4分子が凝集した低分子型と12分子以上の高分子型に大別できる。また、翻訳後修飾によりN末が欠損してピロル化したpEAβ3-42にも強い神経毒性があることが示されている（Saido et al., Neurosci Lett, 215, 173-176, 1996、Schlenzig et al., Biochemistry, 48, 7072-7078, 2009）。さらに、アミノ酸配列はAβと全く異なるものの、高いアミロイド凝集性を示すABri（Ghiso et al., Brain Pathol, 16, 71-79, 2006）やADanといった分子もアルツハイマー病の発病に関係していることを示唆する所見も得られつつある。
本発明の組み換えベクター及びポリペプチドは、神経毒性や高いアミロイド凝集性を示す多様な分子（pEAβ3-42、ABri、ADan等）に対する抗体をも誘導することができる。
【００６０】
pEAβ3-42は、Aβ1-42のN末がgulutaminyl cyclase (QC)によって切断され、翻訳後修飾(ピロル化)された分子である。pEAβ3-42は、神経毒性が強く、この分子自体凝集性が高い。また、修飾を受けていないAβの凝集性を高める作用も有し、アルツハイマー病における病変形成の主役の一つである。
ABriは、家族性英国型認知症の原因分子であり、ADanは、家族性デンマーク型認知症の原因分子である。ABri及びADanは、前駆タンパク質のストップコドン部分に生じた遺伝子変異により、前駆タンパク質から長い分子として切り出されることにより生じる分子である。ABri及びADanは、アミロイド(アミロイドとは小分子が凝集して沈着する現象の総称)凝集性が高く、疾患進行の中心分子であり、アルツハイマー病変形成にも何らかの役割を果たしていると考えられている。
【００６１】
本発明のベクターを、DNAワクチン又は抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤として使用する場合は、被験者の標的部位への直接投与するか、あるいは、被験者由来細胞又は遺伝子導入用の他の細胞にベクターを感染させ、その細胞を標的部位に注入する間接投与のいずれかにより、遺伝子を導入することができる。また同様に、本発明のポリペプチドをDNAワクチン又は抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤として使用する場合は、当該ポリペプチドを被験者の標的部位に直接投与することができる。
【００６２】
また、本発明のベクター又はポリペプチドをリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。本発明のベクター又はポリペプチドを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等から全身投与する。脳等に局所投与することもできる。
【００６３】
リポソーム構造を形成するための脂質としては、リン脂質、コレステロール類や窒素脂質等が用いられるが、一般に、リン脂質が好適であり、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天然リン脂質、あるいはこれらを定法に従って水素添加したものが挙げられる。また、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン等の合成リン脂質を用いることができる。
【００６４】
リポソームの製造方法は、DNA又はポリペプチドが保持されるものであれば特に限定されるものではなく、慣用の方法、例えば、逆相蒸発法、エーテル注入法、界面活性剤法等を用いて製造できる。
これらのリン脂質を含む脂質類は単独で用いることができるが，２種以上を併用することも可能である。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基をもつ原子団を分子内に有するものを用いることにより、電気的に陰性のDNAの結合率を増加させることもできる。これらリポソーム形成時の主要リン脂質の他に一般にリポソーム形成用添加剤として知られるコレステロール類、ステアリルアミン、α−トコフェロール等の添加剤を用いることもできる。このようにして得られるリポソームには、患部の細胞又は目的とする組織の細胞内への取り込みを促進するために、膜融合促進物質、例えばポリエチレングルコール等を添加することができる。
【００６５】
本発明のワクチン並びに抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤等は、常法にしたがって製剤化することができ、医薬的に許容されるキャリアを含むものであってもよい。このようなキャリアは添加物であってもよく、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
【００６６】
上記添加物は、本発明のワクチン並びに抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製されたベクターを溶剤(例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等)に溶解し、これにTween80、Tween20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥用賦形剤としては、例えばマンニトール、ブドウ糖、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール等の糖類、トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン等のデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース、アラビアゴム、トラガカントゴム等のゴム、ゼラチン、コラーゲン等などが挙げられる。
【００６７】
本発明のワクチン並びに抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤等の投与対象（被験者）としては哺乳動物が挙げられる。ここで、哺乳動物には、例えばヒトのほか、サルなどの非ヒト霊長類、マウスおよびラットなどのげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、およびイヌなどその他の全ての哺乳動物が含まれ、より好ましくはヒトである。投与対象となる動物（被験者）は、例えばアルツハイマー病に罹患した個体、アルツハイマー病であることが予想される個体、Aβの沈着が亢進している個体、タウ沈着が亢進している個体、神経細胞が脱落した個体などである。また、投与対象（被験者）は、アルツハイマー病の治療及び／又は予防、脳内Aβ及び脳内タウの削減、及び／又は抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導を必要とする被験者（患者）であってもよい。
【００６８】
本発明のワクチン並びに抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤等の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。ワクチンの有効投与量は、疾患の徴候又は状態を軽減するワクチンの量である。このようなワクチンの治療効果及び毒性は、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順、例えばED50(集団の50％において治療的に有効な用量)、あるいはLD50(集団の50％に対して致死的である用量)によって決定することができる。また、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤の有効投与量は、患者から採取した生体試料（血液、細胞、組織等を含む）において検出可能なレベルの抗Aβ抗体及び／又は抗タウ抗体を誘導することができる誘導剤の量である。抗Aβ抗体及び／又は抗タウ抗体の検出は、ELISA、免疫染色等の免疫学的手法により行うことができる。当業者は、ワクチン並びに抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤について適切な投与量を決定することが可能である。
【００６９】
投与経路は適切に選択することができ、例えば経皮、鼻腔内、経気管支、筋内、腹腔内、静脈内、及び皮下の経路を含むが、これらの投与経路に限定されるものではない。特に筋肉内投与、皮下投与などが好ましい。接種部位は、１箇所でも又は複数箇所でもよい。
治療効果と毒性効果との間の用量比は治療係数であり、ED50／LD50として表され得る。
本発明のワクチン又は抗Aβ抗体誘導剤の投与量は、ヒトに対して投与する場合、１回あたり約1μg〜1000μg、好ましくは約10〜500μg、より好ましくは約50〜250μgである。投与回数は、1回、又は副作用が臨床上許容される範囲内である限り複数回可能である。
【００７０】
これまでに、アルツハイマー病に対するワクチンの開発ではAβに対する抗体とTh2活性に着目した研究が行われている。したがって、予めワクチンとしての抗体価または細胞性免疫活性を測定しておくことが好ましい。
例えば、細胞性免疫活性は生体よりリンパ球を分離・培養し、3H−チミジンの取り込みを測定することにより評価できる。
また、Th2活性は、末梢血より血漿を分離し、ELISAにより抗体価を測定することにより評価できる。
【００７１】
本発明のワクチンを投与対象の動物に投与すると、Aβ及び／又はタウに対する免疫反応が誘導される。すなわち、前記Aβ1-43、Aβ1-20、Aβ1-40、Aβ1-42及びタウのアミノ酸配列にはエピトープが存在するため、本発明のワクチンが投与された場合には抗体産生が誘導される。
【００７２】
Aβ及びタウに対する免疫反応は、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の産生量を測定することにより検出することができる。抗体の産生量の測定は、通常の免疫学的手法、例えばELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)により測定することができる。また、ワクチンの治療効果は、脳組織内のAβ及びタウの量やAβ沈着(老人斑)の減少などにより確認することができる。脳組織内のAβ及びタウの量や沈着の様子は、免疫組織化学等により観察することが可能である。
【００７３】
４．アルツハイマー病の治療及び予防方法、脳内Aβ及び脳内タウを削減する方法、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体を誘導する方法
本発明の組み換えベクター、ポリペプチド及びワクチンは、アルツハイマー病の治療又は予防方法、脳内Aβ及び／又は脳内タウを削減する方法、抗Aβ抗体及び／又は抗タウ抗体を誘導する方法に使用することができる。すなわち、本発明は、本発明の組み換えベクター又はポリペプチドを被験者に投与することを含む、アルツハイマー病の治療又は予防方法、脳内Aβ及び／又は脳内タウを削減する方法、抗Aβ抗体及び／又は抗タウ抗体を誘導する方法を提供する。
本発明の方法における、「治療」、「予防」及び「削減」の説明、並びに投与方法、製剤化方法、剤形、投与対象（被験者）、投与量、投与経路などの説明は、上記「３．」に記載したものと同様である。
【００７４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７５】
１．IgL配列、Aβ、IgFc配列及びタウのそれぞれをコードするDNAを含む組み換えベクター（プラスミド）の構築
（１）IgL配列及びIgFc配列をそれぞれコードするDNAの増幅及びクローニング
Immunoglobulin κleader（以下「IgL」）配列、及びImmunoglobulin Fc (以下「Fc」又は「IgFc」) 配列をコードするDNAをクローニングするため、ヒト末梢血由来mRNAを材料とし、ReverTra Ace-α- (TOYOBO, Tokyo, Japan) を用いてcDNAを合成した。各配列をコードする塩基配列の5'末端又は3'末端を含み、且つ適切な制限酵素サイト (IgL: Bam HI又はXho I、IgFc: Kpn I又はNot I) を付加したプライマーを設計し、KOD-plus- (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて、ヒトIgL配列（配列番号３２）及びヒトIgFc配列をコードするDNA（を含むDNA）を増幅した。本来のヒトIgFc配列には、5'末端近傍に3箇所のシステイン残基をコードするコドンが含まれるが、S-S結合を回避するため、プライマーデザイン時にセリン残基をコードする塩基に変更（TGT→TCT又はTGC→TCC）し、増幅産物を得た。【００７６】
（２）AβをコードするDNAの増幅及びクローニング
アミロイドβ1-42（以下「Aβ」又は「Aβ1-42」）をコードするDNAは、オリゴヌクレオチド合成により作製した。但し、全長（126 bp）をカバーする配列の合成は困難であるため、先ず、Aβをコードする塩基配列の5'末端又は3'末端を含み、部分的に相補的（Aβ配列の中央部24 bp）な2本のオリゴヌクレオチドを合成した。各末端には適切な制限酵素サイト（Xho I、Kpn I）を付加した。これらをアニーリング後、ポリメラーゼ反応により完全な2本鎖を作製した。
Aβ1-42の４回繰り返し配列（以下「Aβx4」ともいう）をコードするDNA（配列番号３４）のコンストラクトは、4個のAβ1-42を3個のリンカー配列(GGTGGCGGTGGCTCG：配列番号２９)で連結することにより作製した。先ず、「Aβ1-42+リンカー配列+Aβ1-6」及び「Aβ37-42+リンカー配列+ Aβ1-42」という2種類のコンストラクトを、PCR増幅により作製した。次に、両コンストラクトを混合してテンプレートとし、Aβ1-42の塩基配列の5’側に制限酵素サイトXho Iを付加したセンスプライマー及びAβ1-42の3’側に制限酵素サイトKpn Iを付加したアンチセンスプライマーを用いてPCR増幅を行った。増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、ラダー状に現れたバンドのうち、Aβx4の分子量に合致する約560 bpのバンドを切り出して精製した。【００７７】
（３）tauをコードするDNAの増幅及びクローニング
tau379-408（以下「tau」又は「tau379-408」）をコードするDNAは、オリゴヌクレオチド合成によりセンス鎖とアンチセンス鎖を作製し、アニーリングにより2本鎖を作製した。
tauの４回繰り返し配列（以下「taux4」）をコードするDNA（配列番号２３）のコンストラクトは、4個のtauを3個のリンカー配列(GGTGGCGGTGGCTCG：配列番号２９)で連結することにより作製した。先ず、「tau379-408+リンカー配列+tau1-3」及び「tau406-408+リンカー配列+tau379-408」という2種類のコンストラクトを、PCR増幅により作製した。次に、両コンストラクトを混合してテンプレートとし、tau379-408の塩基配列の5’側に制限酵素サイトSal Iを付加したセンスプライマーならびにtau379-408の3’側に停止コドン及び制限酵素サイトNot Iを付加したアンチセンスプライマーを用いてPCR増幅を行った。増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、ラダー状に現れたバンドのうち、(tau379-408)x4の分子量に合致する約420 bpのバンドを切り出して精製した。【００７８】
（１）（２）（３）より得られた各産物をクローニングベクター (Zero Blunt TOPO PCR Kit for Sequencing, Invitrogen, Tokyo, Japan) に挿入し、シークエンス解析により目的の配列を有するクローンを選定した。【００７９】
２．IgL、Aβx4、IgFc、taux4をコードする4つのDNAコンストラクトの連結
IgL配列、Aβx4、IgFc配列及びtaux4をコードするDNAの発現ベクターへの挿入
IgL配列、(Aβ1-42)x4及びIgFc配列をコードするDNAは、各DNAに予め付加した制限酵素サイトを利用してクローニングベクターから切り出し、アガロースゲルより精製した (MinElute Gel Extraction Kit, Qiagen, Tokyo, Japan)。先ず、IgL、Aβx4、IgFcの3コンストラクトをLigation High (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて連結した。Aβx4の自主会合による連結効率の低さとそれによる連結産物の少なさを補うため、この産物をテンプレートとして、IgL配列増幅時に用いたのと同一のセンスプライマー（制限酵素サイトBamH I及びIgL配列の5’末端を含むプライマー）及びIgFc配列増幅時に用いたのと同一のアンチセンスプライマー（制限酵素サイトSal I及びIgFc配列の3’末端を含むプライマー）を使用し、IgL-Aβx4-IgFc連結配列のPCR増幅を行った。pTargetベクターは、TAクローニングサイトを利用せず、このサイトの上流及び下流にそれぞれ存在するBamH I、Sal Iの2箇所の制限酵素サイトで切断し、IgL-Aβx4-IgFc連結配列と同一の突出末端を作製した。それぞれをアガロースゲル電気泳動し、精製 (MinElute Gel Extraction Kit) 後ライゲーション(Ligation High) して、pTarget/IgL-Aβx4-IgFcを作製した。シークエンス解析により、正しい配列が得られていることを確認した。
次に、pTarget/IgL-Aβx4-IgFcのインサート直下にあるSal I、Not Iの2箇所の制限酵素サイトを切断し、taux4コンストラクトと同一の突出末端を作製した。Ligation Highを用いてtaux4を組み込み、pTargetベクター内でIgL-Aβx4-IgFc-taux4の連結配列を完成させた（pTarget/IgL-Aβx4-IgFc-taux4）。【００８０】
３．IgL-Aβx4-IgFc-taux4をコードするDNAの発現ベクターへの挿入
IgL-Aβx4-IgFc-taux4連結配列は、5’末端側のBamH I及び3’末端側のNot I制限酵素サイトで切断し、pTargetベクターより切り出した。pVAX1ベクター (Life Technologies Japan, Tokyo, Japan) は、クローニングサイトをインサートと同一のBamH I及びNot Iで切断した。両者をそれぞれアガロースゲル電気泳動後に精製してライゲーション (Ligation High) し、pVAX1/IgL-Aβx4-IgFc-taux4プラスミドを完成させた。大腸菌に大量産生させると共に、最終シークエンス解析により正しい配列が得られていることを確認した。
このようにして、Aβ、IgFc配列及びタウをコードするDNAを含む組み換えベクターの例として、pVAX1/ IgL-Aβx4-IgFc-taux4（以下「YM7555」とも称する）を得た。得られたpVAX1/ IgL-Aβx4-IgFc-taux4のインサートの塩基配列を、配列番号３０に示す。また、IgL- Aβx4-IgFc- taux4の発現産物（ポリペプチド）（YM7555P）のアミノ酸配列を配列番号３１に示す。YM7555PにおけるIgL配列、Aβx4及びtaux4のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３３、３５及び２４に示す。IgL-Aβx4-IgFc-taux4の構造の模式図を図１に示す。【００８１】
上記のAβ1-42の４回繰り返し配列（「Aβx4」又は「(Aβ1-42)x4」と表記）をコードするDNA及びタウの４回繰り返し配列（「taux4」又は「(tau379-408)x4」と表記）をコードするDNAは、疎水性が高く、繰り返し配列を有するため、通常知られているクローニング方法を用いた場合には、自己会合（セルフライゲーション）による高次構造を形成しやすく、ベクターへのライゲーションやコンストラクト同士の連結反応が進みにくいという問題点があった。
そこで、このような問題点を克服するため、本実施例では、下記の(a) 大過剰インサート法、(b) 増幅結合法、(c) 100コロニー法など、本発明者が開発した独自の方法を組み合わせて本発明の組み換えベクターを完成させた。
(a) 大過剰インサート法
通常のライゲーション法ではベクターとインサートとは1:1から1:10の比で混合するが、本実施例ではベクターとインサートとを1:10から1:1000の比で混合した。そして、本実施例のライゲーションでは、1:10から1:1000の比のうち最も適切な混合比を採用した。また、自己会合を防止するために、試料はライゲーションの直前に95℃で5分間加熱した。
(b) 増幅結合法
コンストラクトの両端に適切な制限酵素部位を付加し、最終産物の5'末端及び3'末端の塩基配列を有するプライマーを用いて、PCRにおいて当該コンストラクトの増幅及びライゲーションを同時に行った。
(c) 100コロニー法
上記の繰り返し配列を有するインサートは自己会合及び変異が起こりやすいため、100個のクローンのコロニーをピックアップして保存した。その後、プラスミドを12-24個のコロニーから精製し、適切な塩基配列を含むプラスミドを有するクローンが得られるまで、シークエンスを行った。【００８２】
４．組み換えペプチド等
Aβ1-42合成ペプチドは、株式会社ペプチド研究所から購入した。
組み換えベクターpVAX1/IgL-(Aβ1-42)x4-huIgFc-huIL-4（YM3711）（国際公開第2010/110408号）の発現産物（YM3711P）及びYM7555の発現産物（YM7555P）は、YM3711及びYM7555をそれぞれトランスフェクトしたFreeStyle（商標） 293-F細胞（Invitrogen）の無血清培養上清から精製した。具体的には、YM3711及びYM7555をそれぞれトランスフェクトした細胞を培養し始めて４日後に培養上清を得て、濾過した。YM3711P及びYM7555PはIgFcを有するため、これらの産物はHiTrap Protein G column (GE Healthcare)を用いてさらに精製した。溶出液を回収し、抗Aβモノクローナル抗体である6E10を用いて溶出液が強力なAβ免疫反応性を有することをO.D.280nmで確認した。
組み換えタウタンパク質は和光純薬工業株式会社から購入した。【００８３】
５．培養細胞におけるタンパク質発現確認
YM7555が目的のタンパク質を誘導することを確認するため、HEK293細胞にYM7555プラスミドをトランスフェクトし、培養上清中に分泌されたタンパク質（YM7555P）の特性を、抗Aβ抗体、又は抗タウ抗体を用いたWestern blottingにより解析した。また、市販のAβ測定サンドイッチELISAキットを用い、YM7555Pの定量解析を行った。
その結果を図2及び図3に示す。Western blottingでは、YM7555の発現産物（YM7555P）は、期待通り、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の両抗体で検出された（図2A及び図2B）。また、単量体の推定分子量は約60 kDaであるが、YM7555Pは発現後に二量体から多量体を形成しやすく、120 kDaのバンドが多く出現した。抗Aβ抗体で検出されたYM3711の発現産物（YM3711P）（単量体約60 kDa）、(Aβ1-42)x4-IgFc産物（Aβx4-Fc）（単量体約40 kDa）も同様の特性を示したことから（図2B）、この現象は繰り返し構造が複合体を形成しやすいために生じたものと推測された。タウx4-IgFc(タウx4-Fc)の発現産物（単量体約40kDa）は抗タウ抗体でのみ検出され（図2A）、検索した全ての産物が抗体特異的に検出されていることが確認された。また、分子量が約60 kDaより小さな分子は検出されなかったことから、Aβ1-42分子とタウ分子が別々に形成されることはなく、Aβ1-42-タウ分子複合体が単一分子として発現し、細胞外に放出されていることが示された。【００８４】
タウ379-408配列を認識する市販のサンドイッチELISAキットがないため、各産物の定量はAβ定量用ELISAキットを用いて行った。その結果、Aβのアミノ酸配列を含むYM3711P、YM7555P、Aβx4-Fc産物のいずれも十分量の発現が認められた（図3）。非常に高発現のYM3711Pに比べるとYM7555Pの発現量は相対的に低かったが、この現象は、タウx4配列の翻訳部分の疎水性が高く、細胞に負担がかかることや、可溶性タンパク質として培養上清に分泌しにくくなるために生じたものと推測された。【００８５】
すなわち、この実験により、本願発明の組み換えベクターからAβ及びタウの両者を含むポリペプチドが単一分子として発現することが示された。
YM7555Pの構造の模式図を図8に示す。【００８６】
６．Tgマウスにおける抗Aβ1-42抗体及び抗タウ抗体の誘導
ニュージーランド白ウサギ、又は3種類の家族性アルツハイマー病関連変異遺伝子を導入した3xTgマウス(B6;129-Psen1tm1Mpm Tg(APPSwe,tauP301L)1Lfa/Mmjax）に対し、YM7555を定期的に筋注して経時採血し、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体価の変動をELISAにより測定した。3xTgマウスでは最終投与2週後に屠殺して脳を採取し、本発明による治療効果を、病理・免疫組織化学的解析及び脳抽出液中のタンパク質量をELISAで測定することにより評価した。【００８７】
まず、3x Tgマウスにおける抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の力価を測定した。
YM7555免疫と採血のスケジュールを図4に示す。モデルマウス（Tg）と野生型マウス（Wild type）からYM7555の免疫前に採血し（S0, 丸印）、0週、2週、4週、6週にYM7555を免疫した（黒菱型）。初回免疫後2週ごとに採血し、抗体価を測定した（白丸印、S1, S2, S3, S4）。
その結果を図5に示す。3匹のTgマウスにおける抗Aβ抗体の誘導結果（力価の変化）をぞれぞれ図5A-Cに示し、同マウスの抗タウ抗体の誘導結果をそれぞれ図5D-Fに示す。両抗体ともに初回免疫から4-8週で上昇し始め、12週で最高値を示した。そのOD値は当初の値の約10倍に上昇した。図5において、◆印は16倍希釈血漿、■印は32倍希釈血漿を用いた結果を示す。図5CにおけるS2血漿での抗体価の一時的低下は検索エラーと考えられる。図5において、「S0」は免疫前採血を示し、「S1」は２週間後、「S2」は4週間後、「S3」は6週間後、「S4」は8週間後の採血を示す。また、「S3f」は、6週間後の採血が最終採血であることを示す。【００８８】
この結果から、本発明の組み換えベクターから発現した単一分子のポリペプチドにより、生体内（in vivo）において、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体が高力価で同時に誘導されることが示された。
すなわち、本発明の組み換えベクターは、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の誘導剤として有用であることが示された。【００８９】
７．野生型マウスにおける抗Aβ1-42抗体及び抗タウ抗体の誘導
Tgマウスの代わりに野生型マウスを用いて、上記「６．」と同様の試験を行った。
その結果、抗Aβ抗体及び抗タウ抗体の上昇の程度はTgマウスとほぼ同等であった。
結果を図6に示す。3匹の野生型マウスにおける抗Aβ抗体の誘導結果（力価の変化）をぞれぞれ図6A-Cに示し、同マウスの抗タウ抗体の誘導結果をそれぞれ図6D-Fに示す。【００９０】
８．TgマウスにおけるAβ沈着及びタウ沈着の削減
本発明の組み換えベクターが目的通りAβ沈着とタウ沈着を削減するかを確認するため、3xTg マウスにYM7555を定期的に投与し、大脳皮質（前頭葉皮質）でのAβとタウをサンドイッチELISAで定量した。より具体的には、3xTgマウスへのYM7555の最終投与から2週後に当該マウスを屠殺して脳を採取し、脳抽出液中における、(A)Aβ（Aβ1-42）、(B)トータルタウ（Total tau）及び(C)リン酸化タウ（pTau）の各タンパク質量をELISAで測定した。
結果を図7に示す。図7において、「un Tx」はYM7555未投与Tgマウスにおける各タンパク質量を示し、「YM7555 Tx」はYM7555が投与されたTgマウスにおける各タンパク質量を示す。
図7に示すように、(A)Aβ（Aβ1-42）、(B)トータルタウ（Total tau）及び(C)リン酸化タウ（pTau）の各タンパク質量は、いずれもYM7555投与群で明らかに低下していた。特に、強い神経毒性を示すリン酸化タウ(C)がYM7555投与群で全く検出されなかったことは予測できない効果であった。
この結果から、本発明の組み換えベクターは脳内Aβ及び脳内タウを削減するためのDNAワクチンとして有用であることが示された。
また、アルツハイマー病の原因物質と考えられている脳内Aβ及び脳内タウを削減でき、特に、強い毒性を示すリン酸化タウを削減できたことから、本願発明の組み換えベクターは、アルツハイマー病の予防用又は治療用DNAワクチンとして極めて有用であることが示された。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号１９：合成DNA
配列番号２０：合成ペプチド
配列番号２１：合成DNA
配列番号２２：合成ペプチド
配列番号２３：合成DNA
配列番号２４：合成ペプチド
配列番号２９：合成DNA
配列番号３０：合成DNA
配列番号３１：合成ペプチド
配列番号３４：合成DNA
配列番号３５：合成ペプチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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