(57)【要約】  本発明の課題は、核酸アナログ抗癌剤の漏出速度に優れるリポソームを含むリポソーム組成物およびその製造方法を提供することである。本発明によれば、（１）核酸アナログ抗癌剤を内包し、（２）リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質が、０．０１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％であり、（３）核酸アナログ抗癌剤／脂質比が２質量％〜１０質量％である、リポソームを含むリポソーム組成物およびその製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）核酸アナログ抗癌剤を内包し、（２）リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質が、０．０１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％であり、（３）核酸アナログ抗癌剤／脂質比が２質量％〜１０質量％である、リポソームを含むリポソーム組成物。
【請求項２】
核酸アナログ抗癌剤がゲムシタビンまたはその塩である、請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】
平均粒子径が１０ｎｍ〜１５０ｎｍである、請求項１または２に記載のリポソーム組成物。
【請求項４】
粒子径が２００ｎｍ以上であるリポソームが１質量％以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項５】
リポソームの内水相の浸透圧がリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項６】
（１）核酸アナログ抗癌剤を内包し、（２）リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質が、０．０１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％であり、（３）核酸アナログ抗癌剤／脂質比が２質量％〜１０質量％である、リポソームを含むリポソーム組成物の製造方法であって、（ａ）空のリポソームが分散した溶液と核酸アナログ抗癌剤溶液とを混合する工程、および
（ｂ）５５℃以上に加熱する工程を含む、リポソーム組成物の製造方法。
【請求項７】
（１）核酸アナログ抗癌剤を内包し、（２）リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質が、０．０１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％であり、（３）核酸アナログ抗癌剤／脂質比が２質量％〜１０質量％である、リポソームを含むリポソーム組成物の製造方法であって、
（ａ）空のリポソームが分散した溶液と核酸アナログ抗癌剤溶液とを混合する工程、および
（ｂ）５５℃以上に加熱する工程を含み、
前記（ａ）工程の前に、（ｃ）ｐＨ１〜５で核酸アナログ抗癌剤溶液を溶解させる工程を含み、前記（ｂ）工程が、ｐＨ５．０〜１３で５５℃以上に加熱する工程である、リポソーム組成物の製造方法。
【請求項８】
（ｂ）５５℃以上に加熱する工程の後に、
（ｄ）５分以上かけて４０℃に降温する工程を含む、請求項６または７に記載のリポソーム組成物の製造方法。
【請求項９】
さらに、（ｅ）リポソームの内水相の浸透圧をリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍に調整する工程を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のリポソーム組成物の製造方法。
【請求項１０】
空のリポソームを、エクストリュージョン処理をせずに作製する、請求項６〜９のいずれか一項に記載のリポソーム組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸アナログ抗癌剤を内包するリポソームを含むリポソーム組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗癌剤には下山分類によって分類されるように、癌細胞への攻撃が曝露時間に影響されない薬物と曝露時間に大きく影響される薬物がある（非特許文献１）。【０００３】
リポソーム製剤によって、薬剤を癌腫瘍に集積させ、長期間に渡って曝露させることが多く検討されている。リポソーム製剤とは、脂質膜からなるリポソーム中に薬物を内包した製剤である。
薬物を長期間に渡って癌腫瘍に暴露させるために、血液中でのリポソーム粒子からの薬物漏出速度を低くすることが好ましい。【０００４】
リポソーム中に薬物を内包させる方法として、特許文献１には、リポソームと薬物の混合液を恒温保持下でリポソームに分布させることにより、高い薬物封入率を達成したことが記載されている。【０００５】
また、リポソーム中に薬物を内包させる方法として、非特許文献２には、リポソーム内部に硫酸アンモニウム等を含有させてから薬物を封入させるリモートローディング法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】癌と化学療法、1976年、第3巻、1103-1110
【非特許文献２】Pharmaceutical Research, 2014, 31, 12583-2592
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２００２−５０９８６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
抗癌剤の中でも、例えば、ＤＮＡの合成を阻害する代謝拮抗剤は、ＤＮＡ合成期の一部の細胞だけを攻撃するため、曝露時間が短いと効果的な殺細胞性が得られない。そのような薬物において、投与後の体内代謝が速いと、腫瘍での充分な曝露時間を得ることができず、期待される薬効が得られない場合が多い。また、曝露時間を充分に得るために、希薄濃度の抗癌剤を点滴によって長時間曝露させる投与方法もあるが、患者が点滴時間中拘束されるなどＱＯＬ（Quality of life）を大きく損なう問題があった。
また、非特許文献２に記載されているリモートローディング法では、ゲムシタビンなどの薬物については封入率向上効果が得られない。
本発明は、核酸アナログ抗癌剤の漏出速度に優れるリポソームを含むリポソーム組成物およびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが鋭意検討した結果、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質が、０．０１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％であり、核酸アナログ抗癌剤／脂質比が２質量％〜１０質量％である、リポソームとすることにより、核酸アナログ抗癌剤の漏出速度に優れることを見出した。また、空のリポソームが分散した溶液と４０℃〜５０℃に保温した核酸アナログ抗癌剤溶液とを混合する工程、および、５５℃以上に加熱する工程を含むことにより、核酸アナログ抗癌剤の漏出速度に優れるリポソームを含むリポソーム組成物を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、下記を提供する。【００１１】
［１］（１）核酸アナログ抗癌剤を内包し、（２）リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質が、０．０１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％であり、（３）核酸アナログ抗癌剤／脂質比が２質量％〜１０質量％である、リポソームを含むリポソーム組成物。
［２］核酸アナログ抗癌剤がゲムシタビンまたはその塩である、［１］に記載のリポソーム組成物。
［３］平均粒子径が１０ｎｍ〜１５０ｎｍである、［１］または［２］に記載のリポソーム組成物。
［４］粒子径が２００ｎｍ以上であるリポソームが１質量％以下である、［１］〜［３］のいずれか一に記載のリポソーム組成物。
［５］リポソームの内水相の浸透圧がリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍である、［１］〜［４］のいずれか一に記載のリポソーム組成物。
［６］（１）核酸アナログ抗癌剤を内包し、（２）リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質が、０．０１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％であり、（３）核酸アナログ抗癌剤／脂質比が２質量％〜１０質量％である、リポソームを含むリポソーム組成物の製造方法であって、
（ａ）空のリポソームが分散した溶液と核酸アナログ抗癌剤溶液とを混合する工程、および
（ｂ）５５℃以上に加熱する工程を含む、リポソーム組成物の製造方法。
［７］  （１）核酸アナログ抗癌剤を内包し、（２）リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質が、０．０１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％であり、（３）核酸アナログ抗癌剤／脂質比が２質量％〜１０質量％である、リポソームを含むリポソーム組成物の製造方法であって、
（ａ）空のリポソームが分散した溶液と核酸アナログ抗癌剤溶液とを混合する工程、および
（ｂ）５５℃以上に加熱する工程を含み、
前記（ａ）工程の前に、（ｃ）ｐＨ１〜５で核酸アナログ抗癌剤溶液を溶解させる工程を含み、前記（ｂ）工程が、ｐＨ５．０〜１３で５５℃以上に加熱する工程である、リポソーム組成物の製造方法。
［８］（ｂ）５５℃以上に加熱する工程の後に、
（ｄ）５分以上かけて４０℃に降温する工程を含む、［６］または［７］に記載のリポソーム組成物の製造方法。
［９］さらに、（ｅ）リポソームの内水相の浸透圧をリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍に調整する工程を含む、［６］〜［８］のいずれか一に記載のリポソーム組成物の製造方法。
［１０］空のリポソームを、エクストリュージョン処理をせずに作製する、［６］〜［９］のいずれか一に記載のリポソーム組成物の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のリポソーム組成物に含まれるリポソームは、核酸アナログ抗癌剤の漏出速度に優れる。また、本発明のリポソーム組成物の製造方法により、核酸アナログ抗癌剤の漏出速度に優れるリポソームを含むリポソーム組成物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ゲムシタビンの血漿中での漏出率とインキュベーション時間との関係を示す図である。
【図２】粒径分布の測定の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
本発明において、特にことわらない限り、％は、質量百分率を意味する。
本明細書において組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００１５】
「核酸アナログ抗癌剤／脂質比」とは、リポソームに内包される核酸アナログ抗癌剤とリポソームを構成する脂質の質量比を意味する。
「空のリポソーム」とは、薬物を内包していないリポソームを意味する。
「漏出」とは、リポソームに内包された薬物が、リポソームを構成する脂質膜を通過して、リポソームの外部へ出ること（放出）を意味する。
「漏出速度」とは、単位時間あたりに、リポソームに内包された薬物が、リポソームを構成する脂質膜を通過して、リポソームの外部へ出る量を意味する。
投与前のリポソームの製造時および保管時は、リポソームに内包された状態を維持することが重要であり、漏出速度は低く抑えることが好ましい。一方、投与後の血液中では、薬物を癌腫瘍に暴露させるために、一定の速度で薬剤を漏出させることが好ましい。
「血中滞留性」とは、リポソーム組成物を投与した対象において、リポソームに封入された状態の薬物が血液中に存在する性質を意味する。
「リポソームの平均粒子径」とは、リポソーム組成物中に存在するリポソームの体積平均粒子径を意味する。本発明のリポソーム組成物中に含まれるリポソームの平均粒子径は動的光散乱法を用いて測定する。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、濃厚系粒子アナライザーＦＰＡＲ−１０００（大塚電子社製）、ナノトラックＵＰＡ（日機装社製）およびナノサイザー（マルバーン社製）等が挙げられる。
「対象」とは、その予防若しくは治療を必要とするヒト、マウス、サル、家畜等の哺乳動物であり、好ましくは、その予防若しくは治療を必要とするヒトである。
「腫瘍」としては、例えば、乳癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃（胃腺）癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌、腎細胞癌、非ホジキンリンパ腫および尿路上皮癌等が挙げられる。
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１７】
（リポソーム）
リポソームとは、脂質を用いた脂質二重膜で形成される閉鎖小胞体であり、その閉鎖小胞の空間内に水相（内水相）を有する。内水相には、水等が含まれる。リポソームは通常、閉鎖小胞外の水溶液（外水相）に分散した状態で存在する。リポソームはシングルラメラ（単層ラメラまたはユニラメラとも呼ばれ、二重層膜が一重の構造である。）であっても、多層ラメラ（マルチラメラとも呼ばれ、タマネギ状の形状の多数の二重層膜の構造である。個々の層は水様の層で仕切られている。）であってもよいが、本発明では、医薬用途での安全性および安定性の観点から、シングルラメラのリポソームであることが好ましい。
【００１８】
リポソームは、薬物を内包することのできるリポソームであれば、その形態は特に限定されない。「内包」とは、リポソームに対して薬物が内水相および膜自体に含まれる形態をとることを意味する。例えば、膜で形成された閉鎖空間内に薬物を封入する形態、膜自体に内包する形態等が挙げられ、これらの組合せでもよい。
【００１９】
リポソームの平均粒子径は、１０ｎｍ〜１５０ｎｍが好ましく、２０ｎｍ〜１１０ｎｍがより好ましく、３０ｎｍ〜９０ｎｍがさらに好ましい。
【００２０】
リポソームは球状またはそれに近い形態をとることが好ましい。
【００２１】
リポソームの脂質二重層を構成する成分は、脂質から選ばれる。脂質として、水溶性有機溶媒およびエステル系有機溶媒の混合溶媒に溶解するものを任意に使用することができる。脂質としては、例えば、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類、リゾリン脂質およびそれらの誘導体等が挙げられる。これらの成分は、単一種または複数種の成分から構成されてよい。
【００２２】
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）、ホスファジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン等の天然もしくは合成のリン脂質、またはこれらに水素添加したもの（例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ））等が挙げられる。これらのなかでも、水素添加大豆ホスファチジルコリン等の水素添加されたリン脂質またはスフィンゴミエリンが好ましく、水素添加大豆ホスファチジルコリンがより好ましい。なお、本発明において、「リン脂質」とはリン脂質に修飾を加えたリン脂質誘導体も包含する。
【００２３】
リン脂質以外の脂質としては、リン酸を含まない脂質が挙げられ、例えば、リン酸部分をその分子内に有しないグリセロ脂質、リン酸部分をその分子内に有しないスフィンゴ脂質等が挙げられる。なお、本発明において、「リン脂質以外の脂質」とはリン脂質以外の脂質に修飾を加えたリン脂質以外の脂質の誘導体も包含する。
【００２４】
脂質に塩基性官能基を有する化合物が結合した物質である場合、脂質はカチオン化脂質と呼ばれる。カチオン化脂質は、例えば、リポソームの膜を修飾することが可能となり、標的部位である細胞との接着性等を高めることができる。
【００２５】
コレステロール類としては、シクロペンタヒドロフェナントレンを基本骨格とし、その一部あるいはすべての炭素が水素化されているコレステロールおよびその誘導体を挙げることができる。例えば、コレステロールが挙げられる。平均粒子径を１００ｎｍ以下に微細化していくと脂質膜の曲率が高くなる。リポソームにおいて配列した膜のひずみも大きくなるため、水溶性薬物は更に漏出しやすくなる。漏出性を抑制する手段として、脂質による膜のひずみを埋める（膜安定化効果）ために、コレステロール等を添加することが有効である。
【００２６】
リポソームにおいて、コレステロール類の添加は、リポソームの膜のすきまを埋めること等により、リポソームの膜の流動性を下げることが期待される。一般には、リポソームにおいて、コレステロール類の量は、脂質成分の合計（総脂質）ｍｏｌ中、通常５０ｍｏｌ％程度までの量で含むことが望ましいとされている。しかし、内水相の浸透圧が高いリポソームにおいて、コレステロール類の量の最適な範囲は知られていなかった。
本発明に係るリポソームを構成する脂質の合計量に対するコレステロール類の含有率は１０ｍｏｌ％〜３５ｍｏｌ％が好ましく、１５ｍｏｌ％〜２５ｍｏｌ％がより好ましく、１７ｍｏｌ％〜２１ｍｏｌ％がさらに好ましい。リポソームの脂質成分の合計量に対するコレステロール類の含有率を１０ｍｏｌ％〜３５ｍｏｌ％とすることにより、優れた漏出速度と保管安定性とを両立できるリポソーム組成物を得ることができる。
【００２７】
リポソームには、上記の成分の他に、血中滞留性の改善のために親水性高分子等、膜構造の安定剤として脂肪酸またはジアセチルホスフェート等、抗酸化剤としてα−トコフェロール等を加えてもよい。本発明では、医薬用途において静脈注射用途での使用が認められていない分散助剤等の添加剤、例えば、界面活性剤等を用いないことが好ましい。
【００２８】
本発明に係るリポソームには、リン脂質、リン脂質以外の脂質、コレステロール類およびそれらの誘導体として、リン脂質、リン脂質以外の脂質またはコレステロール類を親水性高分子で修飾することが好ましい。
【００２９】
親水性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類、ポリプロピレングリコール類、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ポリビニルピロリドン、合成ポリアミノ酸等が挙げられる。上記の親水性高分子は、それぞれ単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。
これらの中でも、製剤の血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール類、ポリグリセリン類およびポリプロピレングリコール類が好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリグリセリン（ＰＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）がより好ましい。汎用性および血中滞留性の観点から、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がさらに好ましい。
【００３０】
ＰＥＧの分子量は、特に限定されないが、５００〜１０、０００ダルトンであり、好ましくは１、０００〜７、０００ダルトンであり、より好ましくは２、０００〜５、０００ダルトンである。
【００３１】
本発明に係るリポソームでは、リポソームに含まれる主たる脂質とともに、ＰＥＧによって修飾された脂質（ＰＥＧ修飾脂質）を用いることが好ましい。ＰＥＧ修飾脂質としては、例えば、１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）、１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ５０００（日本油脂社製）およびジステアロイルグリセロール−ＰＥＧ２０００（日本油脂社製）等の１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールが挙げられる。これらのＰＥＧ修飾脂質は、全脂質量に対して０．３〜５０質量％、好ましくは０．５〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％含有するように添加すればよい。
【００３２】
本発明に係るリポソームでは、水素添加大豆ホスファチジルコリン（リポソームに含まれる主たる脂質）、１、２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（主たる脂質と併用する脂質）、およびコレステロールの脂質の組合せが好ましい。
【００３３】
本発明に係るリポソームでは、アニオンポリマー（ポリアニオン）を含まないことが好ましい。
【００３４】
（リゾリン脂質）
リゾリン脂質とは、リン脂質の加水分解物であり、アシル基を１つ有するリン脂質を意味する。
リゾリン脂質としては、リゾホスファチジルコリン（リゾレシチン）、リゾホスファジルグリセロール、リゾホスファチジン酸、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、リゾスフィンゴミエリンおよび水素添加大豆リゾホスファチジルコリン等が挙げられる。
本発明において、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質は、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対して、０．０１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％であり、０．０５〜４ｍｏｌ％が好ましく、０．１〜３ｍｏｌ％がより好ましい。リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質をリポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対して、０．０１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％とすることにより、核酸アナログ抗癌剤の漏出速度を抑制することができる。
【００３５】
（核酸アナログ抗癌剤）
本発明に係るリポソームは、薬物として核酸アナログ抗癌剤を内包する。
核酸アナログ抗癌剤とは、プリン塩基やピリミジン塩基等の核酸の材料となる物質と類似した構造を持ち、ＤＮＡ鎖に組み込まれることで薬効を発揮する抗癌剤である。
核酸アナログ抗癌剤としては、例えば、ゲムシタビン、シタラビン、チオグアニン、エノシタビン、カペシタビン、ネララビン、デシタビン、クロファリビン、アザシチジン、フルダラビン、クラドリビンもしくは１−（２−デオキシ−２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）シトシンまたはそれらの塩などが挙げられる。
塩としては、通常知られているアミノ基などの塩基性基、ヒドロキシル基およびカルボキシル基などの酸性基における塩を挙げることができる。
塩基性基における塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸および硫酸などの鉱酸との塩；ギ酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、アスパラギン酸、トリクロロ酢酸およびトリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩；ならびにメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸との塩が挙げられる。
酸性基における塩としては、例えば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミンおよびＮ、Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などが挙げられる。
核酸アナログ抗癌剤としては、ゲムシタビンもしくは１−（２−デオキシ−２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）シトシンまたはそれらの塩が好ましく、ゲムシタビンまたはその塩がより好ましい。
【００３６】
（リポソームに内包された核酸アナログ抗癌剤）
本発明に係るリポソームに内包された薬物（核酸アナログ抗癌剤）は、リポソームの内水相に溶解状態で存在している。ここで、溶解状態とは、リポソームの体積に対して充填した薬物の量が、その内水相の組成液での薬物の飽和溶解度以下の場合、溶解状態で内包されたものとみなす。また、飽和溶解度以上においても、Ｃｒｙｏ−ＴＥＭで薬物結晶が観察されない、またはＸＲＤ測定で結晶格子に起因する回折パターンが観察されない場合、リポソームに内包された薬物の大部分が溶解し、溶解状態で内包されたものとみなす。この場合、脂質膜が作る物理化学的な環境による溶解促進、または一部薬物が脂質膜に取り込み等が起きていると推測する。また、リポソーム内部で固体物を形成させて、薬物を封入させる方法により内包したものは、水溶性の高い薬物であっても、本発明でいう溶解状態ではない。
溶解状態で内包される核酸アナログ抗癌剤としては、水に対して１ｍｇ／ｍｌ以上の溶解度を持つものが好ましく、１０ｍｇ／ｍｌ以上の溶解度を持つものがより好ましい。具体的には、ゲムシタビンが好ましい。
本発明に係るリポソームに内包された核酸アナログ抗癌剤の含有量は、リポソーム組成物に対して０．１〜２．０ｍｇ／ｍｌであることが好ましく、０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌであることがより好ましい。
【００３７】
（核酸アナログ抗癌剤／脂質比）
本発明に係るリポソームの核酸アナログ抗癌剤／脂質比は２質量％〜１０質量％であり、２．５質量％〜１０質量％が好ましく、３質量％〜１０質量％がより好ましい。核酸アナログ抗癌剤／脂質比を２質量％〜１０質量％とすることにより、漏出速度を好ましい範囲に制御しながら、脂質による高脂血症や脂肪肝を抑制することができる。なお、核酸アナログ抗癌剤／脂質比における脂質とは、リポソームを構成する脂質すべてを意味し、脂質にはリゾリン脂質も含まれる。
【００３８】
（リポソーム組成物）
本発明に係るリポソーム組成物は、核酸アナログ抗癌剤を内包するリポソームおよびそのリポソームを分散する水溶液を含むことができる。
【００３９】
本発明のリポソーム組成物は、商業生産に適したフィルター濾過適性およびＥＰＲ効果による腫瘍集積性の観点から、粒子径が２００ｎｍ以上のリポソームが１質量％以下であることが好ましく、０．５質量％以下であることがより好ましく、０．１質量％以下であることがさらに好ましい。
【００４０】
本発明のリポソーム組成物は、リポソームの内水相の浸透圧がリポソームの外水相の浸透圧に対して、好ましくは２倍〜８倍であり、より好ましくは２．５倍〜６倍であり、さらに好ましくは３倍〜５倍である。リポソームの内水相の浸透圧がリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍であるように設定することで、優れた薬物漏出速度と保管安定性とを両立することができる。
【００４１】
リポソーム組成物には、適宜、水性溶媒、添加剤等を加えることができる。リポソーム組成物は、投与経路に関連して、医薬的に許容される等張化剤、安定化剤、酸化防止剤、およびｐＨ調整剤の少なくとも一種を含んでもよい。
【００４２】
等張化剤としては、特に限定されないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素カリウムのような無機塩類、グリセロール、マンニトール、ソルビトールのようなポリオール類、グルコース、フルクトース、ラクトース、またはスクロースのような糖類が挙げられる。
【００４３】
安定化剤としては、特に限定されないが、例えば、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、またはスロースのような糖類が挙げられる。
【００４４】
酸化防止剤としては、特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、尿酸、トコフェロール同族体（例えば、ビタミンＥ、トコフェロールα、β、γ、δの４つの異性体）システイン、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等が挙げられる。安定化剤および酸化防止剤は、それぞれ単独でまたは２種以上組み合わせて使用することができる。
【００４５】
ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、クエン酸、酢酸、トリエタノールアミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ニ水素カリウム等が挙げられる。
【００４６】
リポソーム組成物は、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ＰＢＳ、塩化ナトリウム、糖類、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される添加物を含有してもよい。
【００４７】
特に、本発明に係るリポソーム組成物は、硫酸アンモニウム、Ｌ−ヒスチジン、精製白糖、水酸化ナトリウムまたは塩酸等を含有することが好ましい。
【００４８】
リポソーム組成物を充填する容器は、特に限定されないが、酸素透過性が低い材質であることが好ましい。例えば、プラスチック容器、ガラス容器、アルミニウム箔、アルミ蒸着フィルム、酸化アルミ蒸着フィルム、酸化珪素蒸着フィルム、ポリビニルアルコール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリ塩化ビニリデン、等をガスバリア層として有するラミネートフィルムによるバック等が挙げられ、必要に応じて、着色ガラス、アルミニウム箔やアルミ蒸着フィルム等を使用したバック等を採用することで遮光することもできる。
【００４９】
リポソーム組成物を充填する容器において、容器内の空間部に存在する酸素による酸化を防ぐために、容器空間部および薬液中のガスを窒素等の不活性ガスで置換することが好ましい。例えば、注射液を窒素バブリングし、容器への充填を窒素雰囲気下行うことが挙げられる。
【００５０】
リポソーム組成物の投与経路としては、非経口的投与が好ましい。例えば、点滴等の静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射および髄腔内注射を挙げることができる。投与方法としては、シリンジまたは点滴による投与が挙げられる。
【００５１】
リポソーム組成物に含まれる薬物の投与量および投与回数は、１日あたり、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で選ばれる。しかし、本発明のリポソーム組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００５２】
本発明のリポソーム組成物を有効に使用できる癌は、特に限定されないが、例えば、乳癌、子宮体癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、胃（胃腺）癌、非小細胞肺癌、膵臓癌、頭頚部扁平上皮癌、食道癌、膀胱癌、メラノーマ、大腸癌、腎細胞癌、非ホジキンリンパ腫および尿路上皮癌等が挙げられ、膵臓癌が好ましい。
【００５３】
（血液中での漏出速度）
本発明に係るリポソーム組成物において、薬物の血液中での漏出速度は１０質量％／２４ｈｒ〜７０質量％／２４ｈｒが好ましく、２０質量％／２４ｈｒ〜６０質量％／２４ｈｒがより好ましく、２０質量％／２４ｈｒ〜５０質量％／２４ｈｒがさらに好ましい。
【００５４】
血液中での漏出速度は、温度に依存するため、定温条件で測定することが好ましい。例えば、ヒトの場合、温度は特に限定されることはないが、体温（３５℃〜３８℃）の範囲内で測定することが好ましい。
【００５５】
リポソームに含まれる薬物が核酸アナログ抗癌剤である場合、血液中での漏出速度が１５質量％／２４ｈｒ未満であると、核酸アナログ抗癌剤として充分な体内での曝露時間を得ることができず、期待される薬効が得られない場合が多く、また、場合によっては核酸アナログ抗癌剤を含むリポソームが不要に長い時間体内に残留することで、皮膚等の本来分布しにくい組織に集積することで予想外の毒性が発現する場合がある。また、血液中での漏出速度が７０質量％／２４ｈｒより大きいと、単位時間あたりの曝露する薬物量が多くなるため、最高血中濃度が高くなることで毒性が大きくなる。また、漏出した薬物が腫瘍部以外の組織に分布することおよび速やかな代謝を受けることによって血中滞留性が低下するため、好ましくない。
【００５６】
血液中での漏出速度の測定方法は、特に限定されないが、対象となる哺乳動物、モデル系等に投与した後、哺乳動物またはモデル系から、血液または血漿等を単位時間毎に採取して、必要に応じて前処理等を行う。そして、目的の薬物を液体高速クロマトグラフ、マススペクトル等の方法によって測定することができる。
【００５７】
（リポソーム組成物の製造方法）
本発明のリポソーム組成物の製造方法は、（１）核酸アナログ抗癌剤を内包し、（２）リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質が、０．０１ｍｏｌ％〜５ｍｏｌ％であり、（３）核酸アナログ抗癌剤／脂質比が２質量％〜１０質量％である、リポソームを含むリポソーム組成物の製造方法であって、
（ａ）空のリポソームが分散した溶液と核酸アナログ抗癌剤溶液（好ましくは４０℃〜５０℃で保温した核酸アナログ抗癌剤溶液）とを混合する工程、および
（ｂ）５５℃以上に加熱する工程を含む製造方法である。
本発明のリポソーム組成物の製造方法は、
（ａ）空のリポソームが分散した溶液と核酸アナログ抗癌剤溶液（好ましくは４０℃〜５０℃で保温した核酸アナログ抗癌剤溶液）とを混合する工程の前に、
（ｆ）乾燥固化工程を経ずに、有機溶媒に溶解した脂質を乳化して空のリポソームを形成する乳化工程を含むことができる。
さらに、本発明のリポソーム組成物の製造方法は、
（ｅ）リポソームの内水相の浸透圧をリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍に調整する工程を含むことができる。
リポソーム組成物の製造方法は、必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる蒸発工程、無菌ろ過、無菌充填等の他の工程を含んでもよい。
【００５８】
（乳化工程）
乳化工程では、少なくとも１種の脂質が有機溶媒に溶解している油相と水相とを混合して脂質を含む水溶液を攪拌して乳化することができる。脂質が有機溶媒に溶解している油相および水相を混合し撹拌し、乳化することで、油相および水相がＯ／Ｗ型に乳化した乳化液が調製される。混合後、油相由来の有機溶媒の一部または全部を後述する蒸発工程によって除去することにより、リポソームが形成される。または、油相中の有機溶媒の一部または全部が撹拌・乳化の過程で蒸発して、リポソームが形成される。
【００５９】
撹拌する方法としては、粒子微細化のために、超音波または機械的せん断力が用いられる。また、粒子径の均一化のためには、一定の孔径のフィルターを通すエクストルーダー処理またはマイクロフルイザイザー処理を行うことができる。エクストルーダー等を用いれば、副次的に形成された多胞リポソームをばらして単胞リポソームにすることができる。本発明では、空のリポソームを、エクストリュージョン処理せずに次の工程に用いることが、製造工程の簡略化の観点から好ましい。
【００６０】
本発明では、撹拌の速度および時間を任意に選択することで、調製するリポソームの平均粒子径を制御することができる。安全性および安定性を有するリポソームを得る観点において、脂質を含む水溶液に周速２０ｍ／ｓｅｃ以上のせん断を与えることが好ましい。せん断としては、限定されないが、具体的には、周速２０ｍ／ｓｅｃ〜３５ｍ／ｓｅｃのせん断を与えることが好ましく、周速２３ｍ／ｓｅｃ〜３０ｍ／ｓｅｃのせん断を与えることがより好ましい。
【００６１】
乳化工程は、乳化する工程であれば限定されることはないが、好ましくは高せん断をかけ、有機溶剤を含む乳化工程で微粒子化する工程である。必要に応じて、乳化工程で用いた有機溶媒を蒸発させる（脱溶媒する）ことでリポソームを形成することができる。
【００６２】
リポソームを製造する際の乳化工程の液温は、適宜調整することが可能であるが、油相と水相との混合時の液温を使用する脂質の相転移温度以上とすることが好ましく、例えば、相転移温度が３５〜４０℃の脂質を使用する場合、３５℃〜７０℃とすることが好ましい。
【００６３】
（油相）
油相として用いられる有機溶媒として、水溶性有機溶媒およびエステル系有機溶媒の混合溶媒を用いる。本発明では、有機溶媒として、クロロホルム、塩化メチレン、ヘキサン、およびシクロヘキサン等の有機溶剤を実質的に用いないことが好ましく、これらの有機溶剤をまったく用いないことがより好ましい。
【００６４】
水溶性有機溶媒は、水と任意に混じりあう性質をもつ有機溶媒であることが好ましい。水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノールおよびｔ−ブタノール等のアルコール類、グリセリン、エチレングリコールおよびプロピレングリコール等のグリコール類、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類等が挙げられる。これらのなかでも、アルコール類が好ましい。アルコール類としては、エタノール、メタノール、２−プロパノールおよびｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、エタノール、２−プロパノールおよびｔ−ブタノールから選ばれる少なくとも１種であることがより好ましく、エタノールであることがさらに好ましい。
【００６５】
エステル系有機溶媒は、有機酸およびアルコールの反応から得られるエステルであることが好ましい。エステル系有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｔ−ブチルおよびプロピオン酸メチル等が挙げられ、酢酸エチル、酢酸イソプロピルおよびプロピオン酸メチルから選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、酢酸エチルであることがより好ましい。
【００６６】
水溶性有機溶媒およびエステル系有機溶媒の混合比率は、例えば、質量比で、９０：１０〜３０：７０とすることができ、好ましくは８０：２０〜４０：６０であり、より好ましくは８０：２０〜７０：３０である。水溶性有機溶媒およびエステル系有機溶媒の混合溶媒は、さらに水または緩衝液等の水性溶媒を含んでいてもよい。水性溶媒は、例えば、１〜３０質量％の範囲で加えることができる。混合溶媒のｐＨは、例えば、３〜１０とすることができ、４〜９であることが好ましい。エステル系有機溶媒にはこれら溶媒に可溶な各種薬剤等の生理活性物質等を含んでいてもよい。
【００６７】
水溶性有機溶媒としてエタノールを用い、エステル系有機溶媒として酢酸エチルを用いる場合、エタノールと酢酸エチルの混合比率は、例えば、質量比で、８０：２０〜７０：３０とすることができる。
【００６８】
脂質の濃度は、特に限定されず、適宜調整することが可能であるが、水溶性有機溶媒とエステル系有機溶媒の混合液を溶媒とする溶液として、４０ｇ／Ｌ〜２５０ｇ／Ｌとすることができ、１００ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌであることが好ましい。
【００６９】
（水相）
水相とは、外水相および内水相を意味する。
本発明における外水相とは、リポソームを分散する水溶液を意味する。例えば注射剤の場合においては、バイアル瓶またはプレフィルドシリンジ包装されて保管されたリポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。また、添付された分散用液またはその他溶解液により投与時に用時分散した液についても同様に、リポソームの分散液のリポソームの外側を占める溶液が外水相となる。
本発明における内水相とは、リポソームの脂質二重膜を隔てた閉鎖小胞内の水相を意味する。
リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液（外水相）としては、水（蒸留水、注射用水等）、生理食塩水、各種緩衝液または糖類の水溶液およびこれらの混合物（水性溶媒）が好ましく用いられる。緩衝液としては、有機系、無機系に限定されることはないが、体液に近い水素イオン濃度付近に緩衝作用を有する緩衝液が好適に用いられ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液およびグッドバッファー等があげられる。水相のｐＨは、例えば、５〜９とすることができ、７〜８であることが好ましい。リポソームを分散する水溶液（外水相）としては、リン酸緩衝液（例えば、ｐＨ＝７．４）を用いることが好ましい。リポソームの内水相は、リポソームを製造する際に、リポソームを分散する水溶液であってもよいし、新たに添加される、水、生理食塩水、各種緩衝液または糖類の水溶液およびこれらの混合物をあってもよい。外水相または内水相として用いる水は、不純物（埃、化学物質等）を含まないことが好ましい。
生理食塩水とは、人体と等張になるように調整された無機塩溶液を意味し、さらに緩衝機能を持っていてもよい。生理食塩水としては、塩化ナトリウムを０．９ｗ／ｖ％含有する食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（以下、ＰＢＳともいう）およびトリス緩衝生理食塩水等が挙げられる。
【００７０】
乳化工程を経て調製されたリポソームを含む水溶液は、リポソームに含まれなかった成分の除去、または濃度もしくは浸透圧の調整のために、遠心分離、限外ろ過、透析、ゲルろ過または凍結乾燥等の方法で後処理をしてもよい。
【００７１】
（エクストリュージョン処理）
得られたリポソームは、透析法、ろ過法またはエクストリュージョン処理等を用いて粒径を均一にすることができる。
エクストリュージョン処理とは、細孔を有するフィルターにリポソームを通過させることで、物理的なせん断力を施し、微粒化する工程を意味する。リポソームを通過させる際、リポソーム分散液およびフィルターを、リポソームを構成する膜の相転移温度以上の温度に保温することで、速やかに微粒化することができる。
本発明の製造方法では、商用生産への適性の観点から、製造適性（特に、目詰まり等）に難があり、高コストなエクストリュージョン処理をせずに、空のリポソームを、エクストリュージョン処理をせずに調製することが好ましい。
【００７２】
（核酸アナログ抗癌剤をリポソームに内包させる工程）
本発明のリポソーム組成物の製造方法では、（ａ）空のリポソームが分散した溶液と４０℃〜５０℃で保温した核酸アナログ抗癌剤溶液とを混合する工程、および（ｂ）５５℃以上に加熱する工程によって、核酸アナログ抗癌剤をリポソームに内包させることができる。
この工程により、漏出速度に優れるリポソームとなる。
【００７３】
本発明のリポソーム組成物の製造方法では、（ａ）空のリポソームが分散した溶液と核酸アナログ抗癌剤溶液（好ましくは４０℃〜５０℃で保温した核酸アナログ抗癌剤溶液）とを混合する工程の前に、（ｃ）ｐＨ１〜５で核酸アナログ抗癌剤溶液を溶解させる工程を含み、（ｂ）５５℃以上に加熱する工程が、ｐＨ５．０〜１３、好ましくはｐＨ６．０〜９．０、さらに好ましくはｐＨ６．５〜８．０で５５℃以上に加熱する工程であることが好ましい。
ｐＨ１〜５で溶解させることで、高い濃度で核酸アナログ抗癌剤を溶解させることができる。一方、ｐＨ１〜５の領域で核酸アナログ抗癌剤をリポソームに内包させると、リポソームの脂質が分解され易く、リゾリン脂質等が増加してしまう。また、核酸アナログ抗癌剤の類縁体も増加してしまう。そのため、核酸アナログ抗癌剤をリポソームに内包させる工程をｐＨ５．０〜１３、好ましくはｐＨ６．０〜９．０、さらに好ましくはｐＨ６．５〜８．０で行うことで、リゾリン脂質および核酸アナログ抗癌剤の類縁体の増加を抑制することができる。
【００７４】
本発明のリポソーム組成物の製造方法では、（ｂ）５５℃以上に加熱する工程の後に、（ｄ）５分以上かけて４０℃に降温する工程を含むことが好ましい。
降温する工程では、５分以上かけて４０℃まで降温する。１０分以上かけて４０℃まで降温することが好ましく、１５分以上かけて４０℃まで降温することがより好ましい。
５分以上かけて４０℃まで降温する工程を含むことにより、薬剤の血液中での漏出速度を抑制することができ、さらに血液中での漏出速度を一定に保つことが可能となる。降温速度を制御するだけで血液中での漏出速度が一定になることは当初想定していた以上の効果であった。ゆっくり降温することでリポソーム膜が均質になったためと推定される。
【００７５】
（浸透圧調整工程）
本発明のリポソーム組成物の製造方法では、（ｅ）リポソームの内水相の浸透圧をリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍に調整する工程を含むことが好ましい。
浸透圧を調整する工程では、リポソームの内水相の浸透圧をリポソームの外水相の浸透圧に対して２倍〜８倍に調整する。リポソームの内水相の浸透圧をリポソームの外水相の浸透圧に対して２．５倍〜６倍に調整することが好ましく、３倍〜５倍に調整することがより好ましい。
リポソームの内水相および外水相の浸透圧を調整することにより、漏出速度を制御することができる。浸透圧を調整する工程としては、特に限定されないが、透析等が挙げられる。本発明のリポソーム組成物の製造方法では、核酸アナログ抗癌剤をリポソームに内包させる工程および浸透圧を調整する工程を同時に行うことが、生産効率の観点から好ましい。
【００７６】
核酸アナログ抗癌剤をリポソームに内包させる工程の後に得られた液は、外水相と内水相の溶質が均一化されており、そのときの浸透圧を、完成するリポソーム組成物の内水相の浸透圧と定義できる。ただし、その後の外水相の透析による浸透圧調整工程において、加熱操作は脂質の相転移以下に抑える等により内水相の溶質が充分に保持されている場合に限る。また外水相の浸透圧は、最終的な透析工程に用いる透析液の浸透圧で定義できる。ただし、透析液にて充分に置換できた場合に限る。また、リポソーム組成物の完成液について、遠心分離または限外ろ過を利用し、外水相の溶質の組成濃度と内水相の溶質の組成濃度を定量し、その組成液の浸透圧を計測することでも、内水相および外水相の浸透圧を得ることができる。
【００７７】
浸透圧の計測は第十六改正日本薬局方記載の浸透圧測定法に従えばよい。具体的には水の凝固点（氷点）降下度測定により、オスモル濃度を求めることができる。また、水の凝固点降下度は溶質モル濃度で定義されるものであり、溶質モル濃度からもオスモル濃度を求めることができる。
【００７８】
外水相の浸透圧は、投与に際して重要な影響を生体に及ぼす。体液の浸透圧から大きく離れる場合は、各組織での水分の移動を原因とした溶血や痛みが発生する。したがって、外水相の浸透圧は、好ましくは２００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜４００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは２５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌであり、さらに好ましくは体液と等張である。
【００７９】
（蒸発工程）
リポソーム組成物の製造方法においては、必要に応じて蒸発工程を設けてもよい。蒸発工程では、乳化工程で得られたリポソームを含む水溶液から有機溶媒を蒸発させる。本発明において、蒸発工程とは、油相由来の有機溶媒の一部または全部を蒸発工程として強制的に除去する工程、および油相中の有機溶媒の一部または全部が撹拌・乳化の過程で自然に蒸発する工程の少なくとも一つを含む。
【００８０】
蒸発工程における有機溶剤を蒸発させる方法は、特に限定されないが、例えば、有機溶媒を加熱することにより蒸発させる工程、乳化後に静置または緩やかな撹拌を継続する工程、および真空脱気を行う工程の少なくとも一つを行えばよい。
有機溶剤を蒸発させる工程において、リポソームを含む水溶液に含まれる有機溶媒の濃度を、有機溶剤を蒸発させる工程の開始後から３０分以内に、１５質量％以下にすることが好ましい。
【００８１】
（無菌ろ過）
リポソーム組成物は、無菌ろ過を行うことが好ましい。ろ過の方法としては、中空糸膜、逆浸透膜またはメンブレンフィルター等を用いて、リポソームを含む水溶液から不要な物を除去することができる。本発明では、滅菌できる孔径をもつフィルター（好ましくは０．２μｍのろ過滅菌フィルター）によってろ過することが好ましい。
【００８２】
リポソームの変形による平均粒子径への影響を防ぐために、無菌ろ過工程および後述する無菌充填工程は、リポソームを構成する脂質の相転移温度以下で行うことが好ましい。例えば、脂質の相転移温度が５０℃付近である場合、０〜４０℃程度が好ましく、より具体的には５〜３０℃程度で製造されることが好ましい。
【００８３】
（無菌充填）
無菌ろ過の後に得られたリポソーム組成物は、医療用途として無菌充填することが好ましい。無菌充填の方法は公知のものが適用できる。容器に無菌的に充填することで医療用として好適なリポソーム組成物が調製できる。
【実施例】
【００８４】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかし、本発明は実施例に限定されるものではない。【００８５】
浸透圧は、溶質モル濃度から算出した。
平均粒子径および粒径分布は、試料をリン酸緩衝生理食塩水で３３倍質量に希釈し、ＦＰＡＲ−１０００ＡＳ（大塚電子社製）を用い、動的光散乱法で体積平均粒子径および粒子径の体積分布を測定した。【００８６】
リポソームに内包されるゲムシタビンは液体クロマトグラフィー／紫外可視吸光度検出により定量した。測定条件を以下に示す。
測定波長：２７２ｎｍ
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  ＡｔｌａｎｔｉｓＴ３φ、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：４０℃付近の一定温度
移動相ＡおよびＢはいずれも水／メタノール／トリフルオロ酢酸混液で、移動相の送液は移動相ＡおよびＢの混合比を変えて濃度勾配を制御した。
移動相Ａ：メタノール／水容積比率５／９５、トリフルオロ酢酸０．１％
移動相Ｂ：メタノール／水容積比率２５／７５、トリフルオロ酢酸０．１％
流量：毎分１．０ｍＬ
注入量：１０μＬ
サンプル注入時液温：２５℃付近の一定温度【００８７】
リポソームを構成する脂質は液体クロマトグラフィー／ＣＡＤ検出により定量した。測定条件を以下に示す。
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：４０℃付近の一定温度
移動相ＡおよびＢはいずれも７ｍＭ酢酸アンモニウムメタノール溶液を使用した。
流量：１．０ｍＬ
注入量：１０μＬ
サンプル注入時液温：２５℃付近の一定温度【００８８】
リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質は以下の方法により定量した。
１０ｍＬメスフラスコにＣ１７リゾフォスファチジルコリン１０ｍｇを秤取し、エタノールでメスアップし、これをさらに５０倍希釈して内部標準液とした。
リポソーム組成物２０μＬを秤取し、３８０μＬのエタノールを加えて２０倍希釈した。この溶液に４００μLの内部標準液を加えて混和させて測定用試料とし、液体クロマトグラフィー質量分析にて定量した。測定条件を以下に示す。
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：４０℃付近の一定温度
移動相：移動相ＡおよびＢの混合比率を変えて濃度勾配を制御した。
移動相Ａ：水／メタノール容積比率２０／８０
移動相Ｂ：メタノール
流量：毎分０．５ｍＬ
注入量：５μＬ
サンプル注入時液温：２５℃付近の一定温度【００８９】
（実施例１）
ａ）油相の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール及びＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１、２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（以下、ＤＳＰＥ−ＰＥＧともいう）を７６／１９／５のモル比となるようにそれぞれ１６．６ｇ、２．０ｇ、４．３ｇ取り、次いで有機溶媒（エタノール／酢酸エチル＝３／１）４０５ｍＬを加えて７０℃に加温し、脂質を溶解して油相とした。【００９０】
ｂ）水相の調製
４ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６１）を調製し、水相とした。【００９１】
ｃ）薬物未内包リポソームの調製
水相を７０℃に加温し、水相／油相＝８／３の容積比となるように油相を添加した後、回転かき混ぜ式乳化機（エム・テクニック社製）にて、周速２０ｍ／ｓ、１３０００ｒｐｍにて３０分間混合した。その後、相転位温度以上に加温しながら窒素を送気することで有機溶剤と水とを蒸発させ、乳化前の容積に対して約１／１０の体積になるまで濃縮し、薬物未内包リポソームを得た。このときの平均粒子径は６７．５ｎｍであった。【００９２】
ｄ）薬物内包リポソームの調製
薬物として、ゲムシタビン塩酸塩を用いた。ゲムシタビン塩酸塩はＴＥＶＡ社から購入した。
１）ＰＢＳ（１０×）の調製
塩化ナトリウム８１．６３ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物２９．０１ｇ、リン酸二水素ナトリウム二水和物２．２９ｇを注射用水９４８ｇで溶解し、ＰＢＳ（１０×）とした。
２）薬物ローディング液の調製
ゲムシタビン塩酸塩３．２６ｇ、ＰＢＳ１３．５９ｇ、日局注射用水１９．０５ｇ、８Ｍ水酸化ナトリウム０．６８ｍＬを混合し、７０℃で溶解させて薬物溶液とした。この薬物溶液１５．７ｍＬを４５℃で保温し、薬物未封入リポソーム１６．０ｍＬおよび８Ｍ水酸化ナトリウム０．３２ｍＬを加え、混合した。この液の浸透圧は１０３９ｍＯｓｍ／Ｌであり、これが完成するリポソームの内水相の浸透圧となる。次にこの液を７０℃で１０分間加熱した後４０℃まで３０分かけて冷却し、１０１６ｍＭスクロース／３７ｍＭヒスチジン溶液で希釈した。希釈後、一つにまとめ、薬物ローディング液とした。透析によるリポソーム組成物の完成透析液として２７５ｍＭスクロース／１０ｍＭヒスチジン水溶液を調製した。この液の溶質モル濃度より求めた浸透圧は２８５ｍＯｓｍ／Ｌであった。この透析液を用いて室温にて透析を行い、薬物ローディング液の外水相に存在する未封入のゲムシタビン塩酸塩と各溶質を除去し、透析液で外水相を置換した。以上の工程により、ゲムシタビン塩酸塩濃度０．５４ｍｇ／ｍＬ、平均粒子径７６．３ｎｍ、内水相浸透圧１０３９ｍＯｓｍ／Ｌ、外水相浸透圧２８５ｍＯｓｍ／Ｌ、内水相の外水相に対する浸透圧が３．６倍のゲムシタビン内包リポソーム組成物を得た。リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質は０．６２ｍｏｌ％であった。【００９３】
（実施例２）
薬物ローディングにおいて、４０℃まで５分以内に冷却した以外は実施例１同様にゲムシタビン内包リポソーム組成物を作製した。リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質は０．６５ｍｏｌ％であった。【００９４】
（試験例１）
血漿中の漏出率の測定
実施例１または２で得られたリポソーム組成物５０μＬをマウス血漿で２０倍希釈（体積）し、３７℃で２４時間インキュベートし、０、１、４、７、２４時間時点で１００μＬ採取した。続いて、限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ−０．５  １０ｋＤａ、ミリポア社製）を用い７４００×ｇ、３０分、４℃の条件で遠心ろ過を行った。回収したろ液に含まれるゲムシタビンを液体クロマトグラフィー／紫外可視吸光度検出にて定量し、漏出率を次の式により算出した。
式：漏出率（％）＝（インキュベーション単位時間後のろ液中のゲムシタビンの濃度）×２０÷リポソーム組成物に含まれるゲムシタビンの濃度×１００【００９５】
漏出率の結果を表１および図１に示す。
表１の「リポソーム組成物中の脂質の含有率」の脂質には、リゾリン脂質も含まれる。表１の「リゾリン脂質の含有率」は、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質の含有率を意味する。【００９６】
【表１】
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【００９７】
実施例１および２のリポソーム組成物は、いずれも漏出率が抑制され、良好な結果であるが、実施例１のリポソーム組成物がより良好な漏出率を示した（図１）。実施例１のリポソーム組成物が直線的な傾きで薬物が漏出されていくのに対し、実施例２のリポソーム組成物では４時間以内の初期漏出の傾きが大きい。これは、実施例２のリポソーム組成物中には、一部リポソーム膜の不均一な粒子が含まれており、これが初期段階でバーストしていることを示唆している。薬物の副作用を抑えるためには、一定速度で薬物が漏出されていくことが好ましく、実施例２のリポソーム組成物よりも実施例１のリポソーム組成物がより好ましい。【００９８】
（試験例２）
粒径分布の測定
実施例１または２で得られたリポソーム組成物をリン酸緩衝生理食塩水で３３倍質量に希釈し、ＦＰＡＲ−１０００ＡＳ（大塚電子社製）を用い、動的光散乱法で測定した。
結果を図２に示す。
実施例１および２のリポソーム組成物は、いずれも２００ｎｍ以上の粒子が検出されず、０．２μｍ濾過フィルターで処理可能なリポソーム組成物が得られた。【００９９】
（実施例３）
ａ）油相の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン、コレステロール及びＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１、２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩（以下、ＤＳＰＥ−ＰＥＧともいう）を７６／１９／５のモル比となるようにそれぞれ１６．６ｇ、２．０ｇ、４．３ｇ取り、次いで有機溶媒（エタノール／酢酸エチル＝３／１）４０６ｍＬを加えて７０℃に加温し、脂質を溶解して油相とした。【０１００】
ｂ）水相の調製
４ｍＭリン酸緩衝液を調製し、水相とした。【０１０１】
ｃ）薬物未内包リポソームの調製
水相を７０℃に加温し、水相／油相＝８／３の容積比となるように油相を添加した後、回転かき混ぜ式乳化機（エム・テクニック社製）にて、周速２０ｍ／ｓ、１３０００ｒｐｍにて３０分間混合した。その後、相転位温度以上に加温しながら窒素を送気することで有機溶剤と水とを蒸発させ、乳化前の容積に対して約１／１０の体積になるまで濃縮し、薬物未内包リポソームを得た。このときの平均粒子径は６７ｎｍであった。【０１０２】
ｄ）薬物内包リポソームの調製
薬物として、ゲムシタビン塩酸塩を用いた。ゲムシタビン塩酸塩はＴＥＶＡ社から購入した。
１）ＰＢＳ（１０×）の調製
塩化ナトリウム８２．０１ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物１４．４２ｇ、リン酸二水素ナトリウム二水和物２．３０ｇを注射用水１０６０．１ｇで溶解し、ＰＢＳ（１０×）とした。
２）薬物ローディング液の調製
ゲムシタビン塩酸塩０．０９７３ｇ、ＰＢＳ０．４２５ｇ、日局注射用水０．４６４ｇ、を混合し、４５℃〜７０℃で溶解させて薬物溶液とした。この薬物溶液を４５℃で保温し、薬物未封入リポソーム１．１ｍＬおよび８Ｍ水酸化ナトリウムを加え、ｐＨを５．０に調製した。次にこの液を７０℃で１０分間加熱した後４０℃まで３０分かけて冷却し、１０１６ｍＭスクロース／３７ｍＭヒスチジン溶液で希釈した。透析によるリポソーム組成物の完成透析液として２７５ｍＭスクロース／１０ｍＭヒスチジン水溶液を調製した。この液の溶質モル濃度より求めた浸透圧は２８５ｍＯｓｍ／Ｌであった。この透析液を用いて室温にて透析を行い、薬物ローディング液の外水相に存在する未封入のゲムシタビン塩酸塩と各溶質を除去し、透析液で外水相を置換した。以上の工程により、ゲムシタビン塩酸塩濃度０．６８ｍｇ／ｍＬ、リポソーム組成物中の脂質の含有率２．０ｗ／ｖ％のゲムシタビン内包リポソーム組成物を得た。リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質は１．０ｍｏｌ％であった。【０１０３】
（実施例４）
薬物ローディングにおいて、ｐＨを７．３に調製した以外は実施例３同様にゲムシタビン内包リポソーム組成物を作製した。ゲムシタビン塩酸塩濃度０．７９ｍｇ／ｍＬ、リポソーム組成物中の脂質の含有率２．０ｗ／ｖ％のゲムシタビン内包リポソーム組成物を得た。リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質は０．６ｍｏｌ％であった。【０１０４】
（実施例５）
薬物ローディングにおいて、ｐＨを９．４に調製した以外は実施例３同様にゲムシタビン内包リポソーム組成物を作製した。ゲムシタビン塩酸塩濃度０．６７ｍｇ／ｍＬ、リポソーム組成物中の脂質の含有率２．１ｗ／ｖ％のゲムシタビン内包リポソーム組成物を得た。リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質は２．２ｍｏｌ％であった。【０１０５】
（比較例１）
薬物ローディングにおいて、ｐＨを３．９に調製した以外は実施例３同様にゲムシタビン内包リポソーム組成物を作製した。ゲムシタビン塩酸塩濃度０．４２ｍｇ／ｍＬ、リポソーム組成物中の脂質の含有率２．３ｗ／ｖ％のゲムシタビン内包リポソーム組成物を得た。リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質以外のリン脂質の合計量に対する、リポソームを構成する脂質に含まれるリゾリン脂質は３．７ｍｏｌ％であった。【０１０６】
実施例３〜５及び比較例１について、ゲムシタビン／脂質比を表２に示す。【０１０７】
【表２】
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【０１０８】
薬物ローディングにおいて、５５℃以上に加熱する工程を、ｐＨ５．０〜１３、好ましくはｐＨ６．０〜９．０、さらに好ましくはｐＨ６．５〜８．０で実施することにより、良好なゲムシタビン／脂質比を示した。これはリゾリン脂質の生成が抑制され、優れた漏出速度を示したことを示唆している。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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