(57)【要約】本発明は、新規生物発光酵素の提供に関する。また、本発明の一実施の形態は、下記(ｉ)〜(iii)に記載のアミノ酸配列を含み、かつ、カイアシ類ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである；（ｉ）配列番号１又は１２に示されるアミノ酸配列、（ii）配列番号１又は１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは、欠失しているアミノ酸配列、又は、（iii）配列番号１又は１２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(ｉ)〜(ｉｉｉ)に記載のアミノ酸配列を含み、かつ、カイアシ類ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド；
(ｉ)配列番号１又は１２に示されるアミノ酸配列、
(ｉｉ)配列番号１又は１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは、欠失しているアミノ酸配列、又は、
(ｉｉｉ)配列番号１又は１２に示されるアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、
配列番号１又は１２に示されるアミノ酸配列が、配列番号２〜１１、１３〜１８に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸が発現可能に挿入された発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターであって、
前記核酸がコードするポリペプチドが、他のタンパク質との融合タンパク質として発現されるように、前記核酸と前記タンパク質をコードする核酸とが連結されたものであることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項６】
請求項３に記載の核酸が発現可能に導入された形質転換細胞。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のポリペプチドからなることを特徴とするレポータータンパク質であって、レポーター分析法に用いるためのレポータータンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載のレポータータンパク質と共に、標的タンパク質又は標的タンパク質を認識するペプチドを含む融合タンパク質を含む発酵性融合タンパク質。
【請求項９】
レポータータンパク質のC末端側には膜局在シグナル(MLS)が結合されており、標的ポリペプチドが両者の間に挿入されていることを特徴とする、請求項８に記載の発光性融合タンパク質。
【請求項１０】
前記挿入された標的ポリペプチドが、蛍光タンパク質又はルシフェラーゼであることを特徴とする、請求項９に記載の発光性融合タンパク質。
【請求項１１】
前記挿入された標的ポリペプチドが、細胞膜の形態を変化させるポリペプチド又は当該ポリペプチドが認識するアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、請求項１０に記載の発光性融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載の発光性融合タンパク質をコードするレポーター遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の発現ベクターが導入された形質転換細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、外部刺激に応じた細胞内での標的遺伝子の発現の位置、発現時期又は発現量を解析するためのレポーター分析法。
【請求項１５】
前記分析法が、レポータージーンアッセイ法又はツーハイブリットアッセイ法である、請求項１４に記載の分析法。
【請求項１６】
リガンド結合性のタンパク質のリガンド活性を測定するための生物発光プローブであって、
N末端側及びC末端側に２分割された請求項７に記載のレポータータンパク質と共に、リガンド結合性の標的タンパク質及び標的タンパク質にリガンドが結合した場合の立体構造変化を認識するポリペプチドを含む融合タンパク質からなる生物発光プローブ。
【請求項１７】
リガンド結合性のタンパク質のリガンド活性を測定するための発現ベクターであって、請求項１６に記載の生物発光プローブをコードする核酸が、当該核酸を細胞内で発現可能とする制御配列の制御下にあることを特徴とする、発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターが導入された形質転換細胞。
【請求項１９】
前記形質転換細胞が、幹細胞である請求項１８に記載の形質転換細胞。
【請求項２０】
請求項１６に記載の発現ベクターを用いることを特徴とする、被検細胞内におけるリガンド結合性のタンパク質のリガンド活性の検出方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の発現ベクターを用いて被検細胞内におけるリガンド結合性のタンパク質のリガンド活性を観察することを特徴とする、生物発光イメージング法。
【請求項２２】
リガンドを検出する融合タンパク質であって、
前記リガンドが結合する結合部位を有するタンパク質ＡとＢの間に位置する、請求項１又は２に記載のポリペプチドを有し、
前記タンパク質ＡとＢが前記リガンドを結合した場合に起こる分子歪みにより、前記ポリペプチドがルシフェラーゼ活性を可変することを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項２２に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現ベクターを含んでいることを特徴とする形質転換細胞。
【請求項２５】
被験試料中のリガンドを検出する方法であって、
前記被験試料と、請求項２３に記載の融合タンパク質とを接触させる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規人工生物発光酵素群に関する。
【背景技術】
【０００２】
発光生物が放つ発光に対する好奇心は紀元前３世紀の記録にも記されているほど古いテーマである。ところが、実際の生物発光の化学的な原理が明らかになったのは20世紀に入ってからである(非特許文献１)。
生物発光の実用的利用は、発光生物からの発光酵素の遺伝子クローニングが成功したことから急速に用途を拡大してきた。最近20年の生物発光研究の歴史を辿ってみるとまず自然界から生物発光酵素を樹立し、遺伝子組み換え技術により当該発光酵素を発光プローブ化する。さらに発光プローブを生体イメージングや診断装置に応用する方向で研究が進行されてきた。この三者は生物発光の三本柱として当該分野を支えてきた。
生物発光は、低バックグラウンド、高い信号雑音比(S/N)、信号の広いダイナミックレンジ、および生体イメージングにおける適合といった特徴的な生化学分析の利点を提供する(非特許文献２)。生物発光は、生物発光酵素と発光生物から得られたCa2+感受性エクオリンのような「発光タンパク質」によって生成される。多くの研究者は、視覚的表示として生化学分析への応用を容易にするため、優れた光学特性と機能性を持つ新規の生物発光酵素を作成することに打ち込んできた(非特許文献３、４)。
竹中らによる一連の研究により、北海道の南の深海から動物発光プランクトンを採集し様々な天然発光酵素が樹立された。最初2008年に2種の発光酵素(非特許文献５)、2012年に11種の発光酵素(非特許文献６及び特許文献１)、さらに2013年に12種の発光酵素が樹立できた(非特許文献１０)。これらの天然発光酵素の樹立により、データベース上copepoda発光酵素の数は25種類にのぼった。
より高輝度で安定的に発光する生物発光反応系を創出することは、発光研究者の長年の夢であった。
本発明者らは近年、北海道の南の深海から採集された動物プランクトン試料からのカイアシ類生物発光酵素(13種類)や他の既存の生物発光酵素(２種)の多重配列アラインメントから高い頻度のアミノ酸を抽出することで一連の人工生物発光酵素(Artificial Luciferases: ALucs)を樹立した(非特許文献４、７及び特許文献２)。またその最適発光反応に資する基質や反応溶液に関する周辺技術研究を行った(特許文献３、４)。カイアシ類生物発光酵素は、一般的に、互いに高い相同性を共有し、深海エビからのOplophorus生物発光酵素(OLucs)に系統学的に近いことが知られている(図１参照)。
本発明者らが樹立したALucsのうちの一つであるALuc30について、当該タンパク質を構成する全アミノ酸を独自の超二次構造コード(SSCs)解析をしたところ、その配列内に、Ca2 +結合タンパク質(カルモジュリンやエクオリン)が共通して持つ典型的な「EFハンド」に類似したヘリックス-ループ-へリックス構造が存在することが明らかになった(非特許文献７)(図２及び図３参照)。カチオン依存的に生物発光を放つ生物発光酵素が、以前から報告されている：例えば、甲虫生物発光酵素は、様々な二価のカオチンと置換することができる補因子としてのMg2 +が必要である(非特許文献８)。また、OLucがいくつかの多価カオチンにより発光輝度が阻害されることが以前から報告されていたが、そのメカニズムは不明である(非特許文献９)。 
このような先行研究は、生物発光酵素が発光活性に反応溶液添加物、特に陽イオンの種類・濃度に強く依存していることを示唆するものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−２４９６１９号公報
【特許文献２】特開２０１４−１００１３７号公報
【特許文献３】国際公開公報第２０１５／０５６７６２号パンフレット
【特許文献４】特開２０１４−０８５３１１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Shimomura, O., Bioluminescence. 2006, Singapore: World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd.
【非特許文献２】Ozawa, T., H. Yoshimura, and S.B. Kim, Advances in Fluorescence and Bioluminescence Imaging. Anal. Chem., 2013. 85(2): p. 590-609.
【非特許文献３】Loening, A.M., A. Dragulescu-Andrasi, and S.S. Gambhir, A red-shifted Renilla luciferase for transient reporter-gene expression. Nat. Methods, 2010. 7(1): p. 5-6.
【非特許文献４】Kim, S.B., M. Torimura, and H. Tao, Creation of artificial luciferases for bioassays. Bioconjugate Chem., 2013. 24: p. 2067-2075.
【非特許文献５】Takenaka, Y., et al., Two forms of secreted and thermostable luciferases from the marine copepod crustacean, Metridia pacifica. Gene, 2008. 425(1-2): p. 28-35.
【非特許文献６】Takenaka, Y., et al., Evolution of Bioluminescence in Marine Planktonic Copepods. Mol. Biol. Evol., 2012. 29(6): p. 1669-1681.
【非特許文献７】Kim, S.B. and H. Izumi, Functional artificial luciferases as an optical readout for bioassays. Biochem. Biophys. Res. Comm., 2014. 448(4): p. 418-423.
【非特許文献８】Wang, Y., et al., Quantum Yields and Quantitative Spectra of Firefly Bioluminescence with Various Bivalent Metal Ions. Photochemistry and Photobiology, 2011. 87(4): p. 846-852.
【非特許文献９】Inouye, S. and S. Sasaki, Overexpression, purification and characterization of the catalytic component of Oplophorus luciferase in the deep-sea shrimp, Oplophorus gracilirostris. Protein Expression and Purification, 2007. 56(2): p. 261-268.
【非特許文献１０】Yasuhiro, T eat al., Computational analysis and functional expression of ancestral copepod luciferase. Gene. 2013 Oct 10;528(2):201-205
【非特許文献１１】Kim, S.B., M. Sato, and H. Tao, Molecular Tension-Indexed Bioluminescent Probe for Determining Protein-Protein Interactions. Bioconjugate Chem., 2009. 20(12): p. 2324-2330.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
「小分子量でも発光輝度のバリエーションがあり高安定性を示す生物発光酵素系」を創成することは、関連研究者の長年の夢であった。しかしながら既存の生物発光酵素は分子量がカイアシ類発光酵素の中では比較的に大きく、各種バイオアッセイで要求する発光輝度の多様性と安定性が乏しかった。生物発光酵素は発光標識として使われるため、小分子であればあるほどホスト分子に立体障害を引き起こす可能性は低くなる。一般的に小分子タンパク質はより高い発現量を期待できる。さらに従来より発光輝度と安定性にバリエーションを持たせれば、バイオアッセイや生物発光イメージング(BLI)の多様なニーズに答えられる。一般的に高輝度発光酵素は発光安定性が悪く、低輝度発光酵素は発光安定性が良いことから、この二者の組み合わせは経時変化による多様な分子イベントの観察に有利である。例えば、デュアルアッセイの構築ができる。デュアルアッセイ系では２つの発光酵素が共存するため、アッセイ中に１つの発光酵素活性を抑制する工程が必ず入る。そのため、安定性の高い発光酵素と低い発光酵素を組合せる手法は有効である。このように、本発明は、既存の生物発光酵素と比較して分子量の小さい発光酵素、又は、発光輝度若しくは安定性の異なる発光酵素の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
今まで挑戦されてない新たな人工タンパク質創出技術を駆使することにより、今までの常識を覆す斬新な人工生物発光酵素(ALuc)群の新規樹立ができると考えた。まず、(１)ALuc群を最初に樹立した2013年ころに比べて、発光プランクトン(copepoda)由来の天然発光酵素がさらに多く発見され、拡充されたデータベースができている。(２)ALucの中にCa2+のような陽イオンに結合するEFハンドという特殊なアミノ酸配列が存在していると見られており、その配列は発光活性に重要な役割を担っていることが分かった。(３)発光プランクトン(copepoda)由来の天然発光酵素には配列の長さがまちまちであり、最短の配列でも弱発光を示す例があることから、従来のALucより大幅に短い配列のALuc群が創製できると考えた。
本発明では、まず上の３要素を全部取り入れることで、従来より短くEFハンドを保存しつつ、高い発光輝度を示すALuc群を新規樹立した。これらに40番台と50番台のALuc群(ALuc41-51)の名前を付与し、本発明を完成した。また、既存のALucの骨格を基に、ALuc40番代のアミノ酸配列を参考にして、新規人工生物発光酵素群(ALuc51―ALuc57)を開発した。
すなわち、本発明は以下の通りである；
〔１〕下記(ｉ)〜(iii)に記載のアミノ酸配列を含み、かつ、カイアシ類ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチド；
(ｉ)配列番号１又は１２に示されるアミノ酸配列、
(ii)配列番号１又は１２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、付加、若しくは、欠失しているアミノ酸配列、又は、
(iii)配列番号１又は１２に示されるアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
〔２〕上記〔１〕に記載のポリペプチドであって、
配列番号１又は１２に示されるアミノ酸配列が、配列番号２〜１１、１３〜１８に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であることを特徴とするポリペプチド。
〔３〕上記〔１〕又は〔２〕に記載のポリペプチドをコードする核酸。
〔４〕上記〔３〕に記載の核酸が発現可能に挿入された発現ベクター。
〔５〕上記〔４〕に記載の発現ベクターであって、
前記核酸がコードするポリペプチドが、他のタンパク質との融合タンパク質として発現されるように、前記核酸と前記タンパク質をコードする核酸とが連結されたものであることを特徴とする、発現ベクター。
〔６〕上記〔３〕に記載の核酸が発現可能に導入された形質転換細胞。
〔７〕上記〔１〕又は〔２〕に記載のポリペプチドからなることを特徴とするレポータータンパク質であって、レポーター分析法に用いるためのレポータータンパク質。
〔８〕上記〔７〕に記載のレポータータンパク質と共に、標的タンパク質又は標的タンパク質を認識するペプチドを含む融合タンパク質を含む発酵性融合タンパク質。
〔９〕レポータータンパク質のC末端側には膜局在シグナル(MLS)が結合されており、標的ポリペプチドが両者の間に挿入されていることを特徴とする、〔８〕に記載の発光性融合タンパク質。
〔１０〕前記挿入された標的ポリペプチドが、蛍光タンパク質又はルシフェラーゼであることを特徴とする、〔９〕に記載の発光性融合タンパク質。
〔１１〕前記挿入された標的ポリペプチドが、細胞膜の形態を変化させるポリペプチド又は当該ポリペプチドが認識するアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを特徴とする、〔１０〕に記載の発光性融合タンパク質。
〔１２〕上記〔９〕〜〔１１〕のいずれか一項に記載の発光性融合タンパク質をコードするレポーター遺伝子を含む発現ベクター。
〔１３〕上記〔１２〕に記載の発現ベクターが導入された形質転換細胞。
〔１４〕上記〔１３〕に記載の形質転換細胞を用いることを特徴とする、外部刺激に応じた細胞内での標的遺伝子の発現の位置、発現時期又は発現量を解析するためのレポーター分析法。
〔１５〕前記分析法が、レポータージーンアッセイ法又はツーハイブリットアッセイ法である、上記〔１４〕に記載の分析法。
〔１６〕リガンド結合性のタンパク質のリガンド活性を測定するための生物発光プローブであって、
N末端側及びC末端側に２分割された請求項７に記載のレポータータンパク質と共に、リガンド結合性の標的タンパク質及び標的タンパク質にリガンドが結合した場合の立体構造変化を認識するポリペプチドを含む融合タンパク質からなる生物発光プローブ。
〔１７〕
リガンド結合性のタンパク質のリガンド活性を測定するための発現ベクターであって、上記〔１６〕に記載の生物発光プローブをコードする核酸が、当該核酸を細胞内で発現可能とする制御配列の制御下にあることを特徴とする、発現ベクター。
〔１８〕上記〔１７〕に記載の発現ベクターが導入された形質転換細胞。
〔１９〕前記形質転換細胞が、幹細胞である上記〔１８〕に記載の形質転換細胞。
〔２０〕上記〔１６〕に記載の発現ベクターを用いることを特徴とする、被検細胞内におけるリガンド結合性のタンパク質のリガンド活性の検出方法。
〔２１〕上記〔１６〕に記載の発現ベクターを用いて被検細胞内におけるリガンド結合性のタンパク質のリガンド活性を観察することを特徴とする、生物発光イメージング法。
〔２２〕リガンドを検出する融合タンパク質であって、
前記リガンドが結合する結合部位を有するタンパク質ＡとＢの間に位置する、上記〔１〕又は〔２〕に記載のポリペプチドを有し、
前記タンパク質ＡとＢが前記リガンドを結合した場合に起こる分子歪みにより、前記ポリペプチドがルシフェラーゼ活性が可変することを特徴とする融合タンパク質。
〔２３〕上記〔２２〕に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔２４〕上記〔２３〕に記載の発現ベクターを含んでいることを特徴とする形質転換細胞。
〔２５〕被験試料中のリガンドを検出する方法であって、
前記被験試料と、請求項２３に記載の融合タンパク質とを接触させる工程を含む、方法。
また、本発明は、以下の態様も包含する。
〔２−１〕
人工生物発光酵素用反応バッファーであって、下記(１)及び(２)を含み、人工生物発光の発光輝度を上昇させる作用を有する生物発光用反応バッファー；
（１）Tris-バッファー及び／又はHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）Mg(II)、Ca(II)、Cr(II)からなる群より選択される金属カチオン。
〔２−２〕
人工生物発光酵素用反応バッファーであって、下記(１)及び(２)を含み、人工生物発光の発光輝度を抑制する作用を有する生物発光用反応バッファー；
（１）Tris-バッファー及び／又はHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）Mn(II)、Co(II)、Cu(II)、Zn(II)、Cd(II)、Pb(II)、Al(III)、Fe(III)、Mo(IV)からなる群より選択される金属カチオン。
〔２−３〕
人工生物発光酵素用反応バッファーであって、下記(１)及び(２)を含み、人工生物発光の発光安定性を向上させる作用を有する生物発光用反応バッファー；
（１）Tris-バッファー及び／又はHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）Co(II)。
〔２−４〕
人工生物発光酵素用反応バッファーであって、下記(１)及び(２)を含み、人工生物発光のＳ／Ｎ比を改善する作用を有する生物発光用反応バッファー；
（１）Tris-バッファー及び／又はHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）Co(II)、Mn(II)、Cu(II)からなる群より選択される金属カチオン。
〔２−５〕
人工生物発光酵素用反応バッファーであって、下記(１)及び(２)を含み、人工生物発光の発光輝度を上昇させる作用を有する生物発光用反応バッファー；
（１）Tris-バッファー及び／又はHBSSバッファーを含む基本バッファー、
（２）ビタミンＣ。
〔２−６〕
人工生物発光酵素用反応バッファーであって、pHが7〜10であることを特徴とするバッファー。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、新たな分子設計手法に基づき、天然発光酵素と比較して高い発光輝度を有するALuc群を新規に樹立した。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、海洋生物発光酵素、発光タンパク質、および他のCa2+結合タンパク質の系統樹を示す。PDBアクセッション番号、開発者、またはプロバイダーは、括弧内に示されている。略語：NonoLucはOplophorus(発光エビ)生物発光酵素の変異体(OLuc)、ALucsは人工生物発光酵素、MpLuc1はMetridia pacifica生物発光酵素１、MLucはMetridia longa生物発光酵素、CBPはRenilla muelleriからのセレンテラジン結合タンパク質、CLucはCypridina(ウミホタル)生物発光酵素、RLuc8.6-535はRenilla(ウミシイタケ)生物発光酵素8.6-535を示す。
【図２】図２は、ALuc30の推定超二次構造の詳細図を示す。図２(Ａ)は複数の配列のアラインメントおよびALucsの超二次構造コード(SSC)を示す。h、s、およびのbの文字はそれぞれ以下を意味する：h) α−ヘリックス型、s) β−シート型、およびb)不確定残基。推定上α−ヘリックスは、灰色のバーで示され、H1-H9の番号が付されている。ピンクの影は連続した相同性の領域を示している。EFハンド様領域(ヘリックス-ループ-ヘリックス構造)の主要なアミノ酸は、黄色と矢印で強調表示され、セレンテラジン結合タンパク質(CBP)のものと比較されている。赤の矢印はALucsの分泌過程におけるALucsの推定切断部位を示している。  図２(Ｂ)は、ALuc変異体の相対的な光強度を示す。ALuc25のEF-ハンド様領域の推定コア部位を変異させ、その結果として生じた光強度を、本来のALuc25およびその他従来の生物発光酵素と比較した。対応する変異部位は次の通りであった：ALuc25m1、E150Y、A182Y。 ALuc25m2、E150W、A182W。 ALuc25m3、E150Y。ALuc25m4、E150W。
【図３】図３(Ａ)は、ALucsとCa2 +結合タンパク質配列の多重アラインメントを示す。シーケンスにおいて、SSCコードの「h」と「s」はそれぞれ、ヘリックスおよびシート構造を意味する。アライメントはALucsのへリックス-ループ-へリックス構造の相関関係、およびCa2+結合タンパク質の既知のEFハンドを強調している。シーケンス番号と灰色のバーはそれぞれ、ALucsのアミノ酸番号及び螺旋領域を示している。 EFハンドのアミノ酸配列は非常に可変であるが、アライメントにおいて赤色系列で示されたように同じSSCコードを共有する。挿入図ａはALucs、発光タンパク質、および他のCa2+結合タンパク質の系統樹を示す。EFハンド領域の情報は以下の参考文献から得られた：(1) Gifford et al. Biochemical Journal 2007, 405, 199; (2) Titushin et al. Photochemical & Photobiological Sciences 2008, 7, 189; (3) Oishi et al. FEBS Letters 1992, 307, 272)。ALucsはセレンテラジン結合タンパク質(CBP)と比較的高い均一性を有している。
【図４】図４は、ALucsのプロトン主導型光学特性を示す。図４(Ａ)は、擬似カラーで撮像された天然型CTZとALucsの光強度のプロトン依存型上昇(n=3;標準偏差)を示す。画像は三回反復結果の一つである。図４(Ｂ)は、天然型CTZの化学構造を示す。図４(Ｃ)は、ALucsの光強度のプロトン依存型上昇(n=3；標準偏差)を示す。最大の光強度は、より高いpH領域で確認された。図４(Ｄ)は、pH9におけるALucsと海洋生物発光酵素の相対的な光安定性(n=3；標準偏差)を示す。パーセンテージはnCTZ注射20分後比の持続的な光強度を示している。
【図５】図５(Ａ)は、生物発光酵素の光安定性を示す。パーセンテージは、初期強度と比較して、20分後に残った光強度を示す。図５(Ｂ)は、トリス塩酸緩衝液中の一価および二価の金属カチオンに応じたALuc16の相対光強度を示す。
【図６】図６は、ALuc16の金属カチオン主導型光強度を示す。図６(Ａ)は、100μg/mL中の金属カチオンによるALuc16の相対光強度(三回反復で決定)を示す。光強度は、ALuc16量(ng)及び積分時間(秒)で正規化した。挿入図ａは、表示カチオンによる代表的な光学像を示している。挿入図ｂは、光強度のMg(II)濃度依存性を示す(n=3；標準偏差)。アスタリスクは、上昇した光強度を強調している。  図６(Ｂ)は、光スペクトルのカチオン主導型分散を示す。強度分散は、基質注射後60分間、5分毎にモニターされた。長期安定性は、100μg/mLのCa(II)で測定された。I600は、全強度を超える600nmより長い光強度比を意味する。
【図７】図７は、Pb(II)または基質単独(Ctrl)によるALuc16活性の用量反応曲線を示す。ALuc16活性はPb(II)の濃度を上昇させることによって阻害される。挿入図は、LAS-4000(富士フィルム)で撮影された光学像を示している。検出限界は0.4 μg/mLのあたりに見られる。
【図８】図８は、ALuc16による光強度のカチオン駆動型の長期安定性を示す。図８(Ａ)は、さまざまな濃度のCa(II)と生物発光強度の時間経過を示す。強度分散を基質注射後60分間、10分毎にモニターした。挿入図は100μg/mLのCa(II)とMg(II)との間の相対的な光安定性を示す。光学イメージは、Ca(II)のさまざまな濃度での長時間光強度を示す。全体的な強度範囲は、相対強度の分散を強調するために時間によって調整した。相対発光ユニット(RLU)のスケールはインディケーターで示した。図８(Ｂ)は、さまざまな濃度のMg(II)と絶対光強度の時間的経過(n=3；標準偏差)を示す。0分での初期光強度は濃度依存的に上昇している。
【図９】図９は、カチオン-ALuc構造の相関関係を示す円偏光二色性(CD)スペクトルを示す。Pb(II)及びAl(III)に応答し、ALuc16の構造が変性される。Al_10、Al_20、Al_50、およびAl_100はそれぞれ10、20、50、および100μg/mLのAl(III)を意味する。 Pb_1は1μg/mLのPb(II)を示す。
【図１０】図１０(Ａ)は、哺乳類細胞中の分子歪みプローブの基本的な作用機構を示す。分子歪みプローブ中のタンパク質ＡとＢは、リガンドに反応して近づく。タンパク質はALucを挟んで分子ひずみによってくっつく。分子ひずみは劇的に生物発光を促進する。図１０(Ｂ)は、分子歪みに反応する生物発光鋳型候補のcDNAコンストラクト概要図を示す。歪みプローブv1とv2は、タンパク質ＡとＢのどちらを目的とするかで異なる。略：TPv1とv2は、Tension Prove v1とv2；Kzはkozak sequenceを示す。図１０(Ｃ)は、リガンド刺激前後の16種類のテンプレート候補の光強度の変動(n=3)を示す。灰色と黒色のバーはそれぞれTPv1とv2を示している。X軸の「＋」と「−」はそれぞれ、ラパマイシンの有無を表す。赤色のバーは、「TPv2.4」と名付けられた分子歪みプローブにおける生物発光の劇的な上昇を示している。挿入図ａは、ラパマイシン刺激前後のTPｖ2.4の生物発光スペクトラを示している。最高光強度は530 nmで確認された。略：TPv1.1はTension Probe Version 1.1を示し、TPv2.1はTension probe version 2.1を示す。
【図１１】図１１は、分子歪みプローブをエンコードするcDNAコンストラクト概要図を示す。TPv0.1と0.2は、それぞれ、TPv2.4のFKBP欠損とFRB欠損である。略：Kzはkozak配列、ER LBDはヒトエストロゲン受容体のリガンド結合ドメイン(205-555 aa)、SH2はν-SrcのSH2ドメイン、RLuc8はウミシイタケルシフェラーゼ(RLuc)の８変異位置相違体(8-mutation-bearing variant)を示す。
【図１２】図１２(Ａ)は、ラパマイシンの濃度変化に依存したTPv2.4の発光輝度の変化(n=4)を示す。挿入図ａはタンパク質量(μg)、輝度積算時間(sec)、発光エリア(mm2)より補正したものである。図１２(Ｂ)は、ラパマイシン刺激前後におけるネガティヴコントロールプローブ(TPv0.1やTPv0.2)とTPv2.4の相対的な発光輝度(n=3)を示す。挿入図ａは分子歪みプローブの分子結合モデルを示す。10-6 Mラパマイシンより刺激を受けると、TPv0.1やTPv0.2プローブは分子歪みがALuc23にかからない。一方、TPv2.4の場合は歪みがかかるようになっている。TPv0.1とTPv0.2との間では、同じ細部に導入された場合、分子間結合が起こりうる。挿入図ｂはその発光イメージを示す。図１２(Ｃ)は、PTv2.4ライセットのタンパク質量を示すウェスタンブロット分析。ライセットは電気泳動され、抗FKBP(abcam)と抗β-actin抗体(Sigma)でブロットした。両方は共に45 kD近傍で発光輝度を示した。
【図１３】図１３(Ａ)は、ALuc30の超二次立体構造予測を示す。挿入図ａは、ALucのＣ末端を示している。ALucのC末端は、FKBPのN-末端配列と高い相同性を持っている。図１３(Ｂ)は、ラパマイシン有り無しの条件でTPv3シリーズの発光輝度(n=4)を示す。TPv3シリーズテンプレートは、TPv2シリーズに比べて、FRBとFKBP の間にあるALuc23のＣ末端が短い特徴を共有する。発光イメージ図の白ドットボクスは極めて低いバックグラウンド発光を示す。それぞれの長さは括弧の中に示している。星印は、他に比べて極めて低いバックグラウンド発光を示している。挿入図ａは、その実際の発光輝度を示す。
【図１４】図１４(Ａ)は、コンビネーション生物発光プローブの作動原理を示す模式図を示す。FRBとFKBPの結合が、上段も下段のプローブもその内部歪みをもたらす。下段のプローブの短いALuc23の欠陥は、傍にあるFKBPのＮ末端により相補される。図１４(Ｂ)は、コンビネーション生物発光プローブのcDNAコンストラクトの概要図。ここでALuc23のアミノ酸を浮き彫りにしている。ALuc23の3’末端の数ベースを削ることでバックグラウンド輝度を弱めると共に、プローブの当初の目的である相補概念を実現する。そのアミノ酸配列は、削ったALuc23のＣ末端をハイライトしている。
【図１５】図１５は、分子歪みセンサ(TPv2.4)の基質選択性を示す。図１５(Ａ)は、ラパマイシンに対してTPv2.4の絶対発光強度(n=3)を示す。バーグラフの上のある数字は、ラパマイシン(10-6 M)有り無し時の発光輝度の倍数を表す。上と下の挿入図は、それぞれ生物発光イメージと天然セレンテラジンの化学構造を示す。白バーは天然セレンテラジン共存下での実験を示す。図１５(Ｂ)は、基質添加後の生物発光の経時変化(n=3)。その生物発光酵素を5分ごとにモニターし相対的な発光輝度としてパーセント(％)で表示している。
【図１６】図１６(Ａ)は、マイクロスライド上の生きたCOS-7細胞のラパマイシン依存的な発光輝度。TPv2.4はラパマイシン依存的に生物発光を放つ。挿入図ａは、光学スライドのイメージのプロファイルを示す。図１６(Ｂ)は、様々なリガンドに対するTPv4.1とTPv4.2の相対的な発光輝度(n=3)を示す。挿入図はTPv4.1とTPv4.2の分子構造を描いている。略語：ER LBDとはヒト女性ホルモン受容体のリガンド結合ドメイン、SH2とはv-SrcのSrcホモロジードメイン、RLuc8とはウミシイタケルシフェラーゼの８つの変位が導入されている変異体、E2とは17β-estradiol、OHTとは4-hydroxytamoxifen。
【図１７】図１７は、公知のソフト(WebLogo display)を用いて、天然の発光プランクトン由来の発光酵素群から頻度の高いアミノ酸を抽出した結果を示す。文字の大きさは頻度の多さを意味する。
【図１８−１】図１８−１は、新規開発した人工生物発光酵素群のアミノ酸配列の整列を示す。CLUSTAL 2.1により整列を行った。
【図１８−２】図１８−２は、新規合成した人工生物発光酵素の相対的な遺伝系統図を示す。新規合成された人工生物発光酵素の配列を基に相互間の遺伝的相関性を調べた。公開ソフトのCLUSTAL 2.1より検索した。
【図１９】図１９は、新規人工生物発光酵素(GLuc、RLuc8.6-535、ALuc16、ALuc30、ALuc41-48)の相対的な発光輝度を示す(n=5)。
【図２０】図２０は、新規人工生物発光酵素(GLuc、RLuc8.6-535、ALuc41-51)の相対的な発光輝度(n=3)を示す。
【図２１】図２１(Ａ)は、分子歪みセンサーの作動原理。図２１(Ｂ)は、分子歪みセンサーのラパマイシン依存的な発光輝度変化。
【図２２】図２２は、分子歪みセンサーの金属イオン感受性を示す。白バーと黒バーはそれぞれラパマイシン無し有りの条件を示す。図２２(Ａ)は、金属イオン有無による分子歪みセンサーの発光輝度の絶対値。分子歪みセンサー1μgあたり、１秒間積算した発光輝度を示すため、単位はRLU/sec/μgとなる。図２２(Ｂ)は、金属イオン有無による分子歪みセンサーの発光輝度の相対値。即ち、金属イオン無しの時の発光輝度(１)に比べ金属イオン有りの時の相対的な発光輝度を示す。
【図２３】図２３は、金属イオン濃度に対し分子歪みセンサーの発光輝度安定性を示す。図２３(Ａ)は、Ca2+の濃度変化による発光輝度の経時変化(基質添加後１分以内)を示す。Ca2+濃度の増加により全体的な発光輝度が減少するが、S/N比は良くなる。図２３(Ｂ)は、Co2+の濃度変化による発光輝度の経時変化(基質添加後１分以内)を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)群について
（１−１）カイアシ類ルシフェラーゼについて：
発光性の海洋動物としては、Metridia okhotensis、Pleuromamma abdominalis、Lucicutia ovaliformis、Heterorhabdus tanneri、Heterostylites major、Gaussia princeps、Renilla reniformis(ウミシイタケ)、Metridia pacifica、Lucicutia grandis、Lucicutia bicormuta、Pleuromamma xiphias、Pleuromamma scutullata、Haloptilus pseudooxycephalus、Candacia longimana、Candacia columbiae、Candacia bipinnata、Calanus jashnovi、Neocalanus cristatus、Neocalanus flemingeri、Neocalanus plumchrus、Scaphocalanus magnus、Spinocalanus spinipes、Euchaeta marina、Undeuchaeta plumose、Undeuchaeta major、Xanthocalanus kurilensis、Scaphocalanus magnus  Gaidius variabilis、Euchirella amoena、Cypridina (ウミホタル；CLuc)、オベリン(Obelin)、アクアリン(aqualine)、Oplophorus由来の海洋生物が生物発光酵素(ルシフェラーゼ)を産生していることが知られている。
【００１０】
本発明において、「カイアシ類ルシフェラーゼ」というとき、これら「発光性の海洋動物」のうち、カイアシ類と呼ばれる発光性プランクトンとして生活する微小な甲殻類が産生する発光酵素(ルシフェラーゼ)を指す。具体的には、MoLuc1、MoLuc2、PaLuc1、PaLuc2、LoLuc、HtLuc1、HtLuc2、HmLuc1、HmLuc2、ガウシアルシフェラーゼ(GLuc)、ウミシイタケルシフェラーゼ(RLuc)、カイアシルシフェラーゼ(MLuc、MpLuc1、MpLuc2)、ウミホタルルシフェラーゼ(CLuc)などが含まれる。「カイアシ類ルシフェラーゼ」は、基質特異性としては、「セレンテラジン」を特異的に酸化させる。一般的に深海環境、即ち、至適pH約7.5〜8、至適温度約4〜10℃で発光反応を触媒する酵素的特性を有しているが、この範囲以外の条件でも広く発光を触媒する。以下、本発明で「カイアシ類ルシフェラーゼ」というとき、既知のカイアシ類に由来するルシフェラーゼと共通した酵素活性上及び構造上の特徴を有するルシフェラーゼをいう。具体的には、至適pH約5〜8、至適温度約4〜25℃を有し、「セレンテラジン」を基質として発光反応を触媒する酵素活性を有するルシフェラーゼであって、構造的には２つの酵素活性ドメインを有し、N末端に分泌シグナルを有し、分子量が20kD程度(18kD−28kD)で他の発光酵素と比較して最も小さい分子量を有するルシフェラーゼであることを意味する。「カイアシ類ルシフェラーゼ」間では、アミノ酸配列上の相同性も約50％以上有り、親水性・疎水性パターンや酵素活性領域の位置などアミノ酸配列上の構成も類似しており、他の海洋生物由来のルシフェラーゼと比較すれば、発光強度の高いルシフェラーゼであるといえる。
【００１１】
本明細書において、「セレンテラジン」とは、天然型のセレンテラジン(Native CTZ)に限定されるものではなく、天然型のセレンテラジンの各種誘導体も包含する。すなわち、「セレンテラジン」は、「セレンテラジン類」と換言することもできる。セレンテラジンの具体例として、天然型のセレンテラジン(Native CTZ)、セレンテラジンip(CTZ ip)、セレンテラジンi(CTZ i)、セレンテラジンhcp(CTZ hcp)、セレンテラジン400A(CTZ 400A)、セレンテラジンfcp(CTZ fcp)、セレンテラジンcp(CTZ cp)、セレンテラジンf(CTZ f)、セレンテラジンh(CTZ h)、セレンテラジンn(CTZ n)などが例示される。
【００１２】
（１−２）本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)群について
本発明の新規な人工ルシフェラーゼ(ALuc)は、これらの「カイアシ類ルシフェラーゼ」群のアミノ酸配列をもとに創製されているので、前記基質特異性や至適pHなど「カイアシ類ルシフェラーゼ」の基本的な酵素としての特性は保持しており、さらに発光強度、長波長の発光、発光の安定性などの発光特性において、顕著に優れた特性を獲得した画期的な人工ルシフェラーゼである。
【００１３】
本発明における典型的な人工ルシフェラーゼ(ALuc)は、配列番号１又は配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。なお、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドには、例えば、ALuc41(配列番号２)、ALuc43(配列番号３)、ALuc44(配列番号４)、ALuc45(配列番号５)、ALuc46(配列番号６)、ALuc47(配列番号７)、ALuc48(配列番号８)、ALuc49(配列番号９)、ALuc50(配列番号１０)、ALuc51(配列番号１１)などが含まれる。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドには、ALuc42(配列番号１３)、ALuc52(配列番号１４)、ALuc53(配列番号１５)、ALuc55(配列番号１６)、ALuc56(配列番号１７)、ALuc57(配列番号１８)などが含まれる。
すなわち、本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)の一実施の形態としては、以下の(ｉ)〜(iii)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、カイアシルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、と表現することもできる。
(ｉ)配列番号２〜１１、１３〜１８のいずれかに示されたアミノ酸配列、
(ii)配列番号２〜１１、１３〜１８のいずれかに示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、
なお、本明細書において「１もしくは数個のアミノ酸」というとき、「数個」は、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個を表す。
(iii)配列番号２〜１１、１３〜１８のいずれかに示されたアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
ここで、例えば、95％以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.5%以上の同一性を有するアミノ酸配列であればさらに好ましい。
【００１４】
また、本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)のアミノ酸配列はいずれも図１で表されるような共通の基本骨格を有する。これらの基本骨格を有する限り、他の位置のアミノ酸は任意のアミノ酸であっても同等の高性能のカイアシルシフェラーゼ活性を有する。したがって、本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)は、以下の(iv)〜又は(vi)に記載のアミノ酸配列を含み、カイアシルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、と表現することもできる。
(iv)配列番号１又は配列番号１２に示されたアミノ酸配列、
(ｖ)配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、1-29位、又は195-199位の少なくともいずれかの領域において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列、又は
(vi)配列番号１２に示されたアミノ酸配列のうち、1-29位、又は214-218位の少なくともいずれかの領域において、１もしくは数個のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
【００１５】
ここで、配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち、N末端側の1-20位までのアミノ酸は分泌シグナル(secretion peptide；SP)であり、また、C末側の192-196位のペプチドはGlycineリッチなリンカー様のペプチド(通称、GSリンカーという)であるため、いずれの領域の一部又は全部のアミノ酸が欠損しても良い。同様に、配列番号１２に示されたアミノ酸配列のうち、N末端側の1-20位までのアミノ酸は分泌シグナル(secretion peptide；SP)であり、また、C末側の211-215位のペプチドはGlycineリッチなリンカー様のペプチド(通称、GSリンカーという)であるため、いずれの領域の一部又は全部のアミノ酸が欠損しても良い。分泌シグナルに関しては、例えば、カイアシ類発光酵素であるMetridia pacifica luciferase 1(MpLuc1)の場合は1-18位、pleuromamma luciferaseの場合は1-19位のアミノ酸に該当し、何れも欠損してもよいことが分かっている。
【００１６】
また、配列番号１又は配列番号１２に示されたアミノ酸配列のうち、20-29位を、機能性アミノ酸配列(例えば、抗原認識部位、アフィニティカラム認識部位、局在シグナルなど。)に置換しても、人工発行酵素の機能は著しく阻害されない。従って、当該領域の一部又は全部のアミノ酸が欠損しても良い。
【００１７】
配列番号１又は配列番号１２に示されたアミノ酸配列のうち、小文字で表されるアミノ酸について、以下に詳細に説明する。
またこの際、個々のアミノ酸の性質においては以下の表１を基にして親水性、疎水性、中性などを決定した。
【表１】
2017057752.tif 000002
【００１８】
配列番号１の中にあらわされるアミノ酸のうち、20、31、33、40、45、46、63、67、89、90、104、132、167、183、186位のアミノ酸はどのようなアミノ酸であっても良く、また欠損しても良い。好ましくは、20位がP又はH、31位はD又はG、33位はV又はE、40位はG又はD、45位はR又はL、46位はD又は欠損、63位はK又はL、67位はI又はK、89位はI又はD、90位はK又はW、104位はH又はE、132位はD又はE、167位はK又はL、183位はK又はA、186位はD又はA又はGである。
【００１９】
また、同11、13、37、41、51、69、95、120、121、124、125、154、157、160、164、191位のアミノ酸は疎水性アミノ酸(例えば、V、F、A、L)であって、好ましくは、11位はV又はI、13位はL又はF、41位はV又はL、51位はA又はG、70位はI又はL、95位はM又はV、96位はY又はW、120位はP又はA、121位はI又はV、124位はA又はI、125位はP又はL、154位はL又はW、157位はL又はW、160位はV又はL、164位はA又はL、191位はL又はAである。
【００２０】
19、21-27、35、42、43、52、74、88、110、111、172、184位は親水性アミノ酸(例えば、Q、K、D、R、H、E、T)であって、好ましくは、19位はK又はN、21-27位はHHHHHHH又はTEDEDED、35位はN又はK、42位はV又はL、43位はN又はT、52位はD又はR、74位はK又はQ、88位はK又はH、110位はK又はE、111位はD又はE、172位はD又はS、184位はE又はQである。
【００２１】
同38、39、50、134、176、185、187、192位は中性アミノ酸であって、好ましくは、38位はA又はT、39位はI又はT、50位はS又はV、134位はT又はA、176位はS又はG、185位はV又はQ、187位はT 、N、Y、F又はW、192位はA又はGである。
【００２２】
配列番号１２の中にあらわされるアミノ酸のうち、20、31、33、40、45、46、51-69、82、86、108、109、123、151、186、202、205位のアミノ酸はどのようなアミノ酸であっても良く、また欠損しても良い。好ましくは、20位がP又はH、31位はD又はG、33位はV又はE、40位はG又はD、45位はR又はL、46位はD又は欠損、51-69位はEDMNVISRDTDVDANRADR又は欠損、82位はK又はL、86位はI又はK、108位はI又はD、109位はK又はW、123位はH又はE、151位はD又はE、186位はK又はL、202位はK又はA、205位はD又はA又はGである。
【００２３】
また、同11、13、37、41、70、88、114、125、139、140、143、144、173、176、179、183、210位のアミノ酸は疎水性アミノ酸(例えば、V、F、A、L)であって、好ましくは、11位はV又はI、13位はL又はF、41位はV又はL、70位はA又はG、89位はI又はL、114位はM又はV、125位はY又はW、139位はP又はA、140位はI又はV、143位はA又はI、144位はP又はL、173位はL又はW、176位はL又はW、179位はV又はL、183位はA又はL、210位はL又はAである。
【００２４】
19、21-27、35、42、43、71、93、107、129、130、191、203位は親水性アミノ酸(例えば、Q、K、D、R、H、E、T)であって、好ましくは、19位はK又はN、21-27位はHHHHHHH又はTEDEDED、35位はN又はK、42位はV又はL、43位はN又はT、71位はD又はR、93位はK又はQ、107位はK又はH、129位はK又はE、130位はD又はE、191位はD又はS、203位はE又はQである。
【００２５】
同38、39、50、153、195、204、206、211位は中性アミノ酸であって、好ましくは、38位はA又はT、39位はI又はT、50位はS又はV、153位はT又はA、195位はS又はG、204位はV又はQ、206位はT 、N、Y、F又はW、211位はA又はGである。
【００２６】
本発明の人工ルシフェラーゼのまた別の態様においては、抗体認識部位(epitope配列)を内部に有する。「抗体認識部位」もしくは「epitope配列」は、「抗原サイト」と換言することができる。
【００２７】
具体的には、抗体認識部位(epitope配列)を内部に有する人工ルシフェラーゼは、配列番号１又は配列番号１２中20-31位の領域が抗体認識部位(epitope配列)を含む。抗体認識部位(epitope配列)の好ましい例としては、His-tag(HHHHHH)(配列番号１９)、FLAG-tag(DYKDDDDK)(配列番号２０)、Myc-tag(EQKLISEEDL)(配列番号２１)、HA-tag(YPYDVPDYA)(配列番号２２)、V5-tag(GKPIPNPLLGLDST)(配列番号２３)、T7-tag(MASMTGGQQMG)(配列番号２４)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２８】
His-tagを内部に有する人工ルシフェラーゼの一例においては、配列番号１又は配列番号１２中20-31位のアミノ酸が全てH(His x 8配列)である。
【００２９】
FLAG-tagを内部に有する人工ルシフェラーゼの一例においては、配列番号１又は配列番号１２中20-31位のアミノ酸がDYKDDDDK(FLAG-tag配列、配列番号２０)である。
【００３０】
c-Myc-tagを内部に有する人工ルシフェラーゼの一例においては、配列番号１又は配列番号１２中20-31位の領域の配列がEQKLISEEDL(Myc-tag配列、配列番号２１)である。
【００３１】
HA-tagを内部に有する人工ルシフェラーゼの一例においては配列番号１又は配列番号１２中20-31位のアミノ酸がYPYDVPDYA(HA-tag配列、配列番号２２)である。
なお、配列番号１のアミノ酸配列及び配列番号１２のアミノ酸配列は、一実施の形態において、下記のように表すことができる。
配列番号１：
MMGIKVLFALyCyALVQAzxzzzzzzzDIVxVxGzFynnxyzzDxxFTInyzRGKLPGKKLPxEVLxEyEANAzKAGCTRGCLICLSzxxCTAKyKKWLPGRCxSyEGDzzTGQGGIGEyyVDyyEIPGFKxLnPMEQFIAQVDLCADCTTGCyKGyANyKCSyLLxKWLPzRCAnFADKIQxznxnIKGynGS
(上記アミノ酸配列中、ｘは任意のアミノ酸を示し、ｙは疎水性アミノ酸を示し、ｚは親水性アミノ酸を示し、ｎは中性アミノ酸を示す。)
配列番号２：
MMGIKVLFALyCyALVQAzxzzzzzzzDIVxVxGzFynnxyzzDxxFTInxxxxxxxxxxxxxxxxxxxyzRGKLPGKKLPxEVLxEyEANAzKAGCTRGCLICLSzxxCTAKyKKWLPGRCxSyEGDzzTGQGGIGEyyVDyyEIPGFKxLnPMEQFIAQVDLCADCTTGCyKGyANyKCSyLLxKWLPzRCAnFADKIQxznxnIKGynGS
(上記アミノ酸配列中、ｘは任意のアミノ酸を示し、ｙは疎水性アミノ酸を示し、ｚは親水性アミノ酸を示し、ｎは中性アミノ酸を示す。)
【００３２】
２．本発明の人工ルシフェラーゼの樹立のためのストラテジー
本発明では、(１)既開発の人工生物発光酵素(ALuc)群とは遺伝的相関性が低く、(２)より小分子量であり、(３)よりバリエーションのある輝度や発光安定性を示す人工生物発光酵素を樹立することを課題としている。
しかし、この課題は、ポイント変異導入法(site-directed mutagenesis)など何れの従来法でも対応が困難な課題である。本発明者が最近開発した従来ALucシリーズにおいても上記課題解決にはならない。なぜなら従来ALucシリーズは整列した配列から頻度の高いアミノ酸を抽出するストラテジーだったので、組み合わせによりどうしても最も長いアミノ酸配列になってしまうため、上記課題を解決できない。
従って、本発明では、この課題を解決するために、ALuc樹立の原点に戻り最初から設計しなおすことにより「小さくて強い発光酵素群」を樹立する研究を行った。
前述したように、従来のALuc特許出願以後(特開２０１４−１００１３７)、さらにデータベースが蓄積され、今日データベースには天然のカイアシ類発光酵素は27種類にのぼる(国立研究開発法人産業技術総合研究所（AIST）より２５種類、他機関より２種類)。この新しいデータプールの配列情報から頻度の高いアミノ酸を抽出しつつ、頻度の低いアミノ酸は果敢に欠損させるストラテジーで新規ALuc配列を樹立した。このためにはWebLogoのような専用のソフトを用いることが好ましい(図１７参照)。頻度の高いアミノ酸をつなげ合せることで、従来の何れの発光酵素配列とは全く異なる新たな配列群を創成した。
さらに、分子量を減らすために、本発明者が初めて見出した以下のことを行った。
まず、WebLogoのような専用のソフトを用いて頻度の高いアミノ酸をを抽出すると、抽出した配列の中に頻度の低いアミノ酸はブランクで現れる(図１７参照)。本発明者は、このように、纏まった頻度を示さない領域を、酵素活性に特に影響しない部位と断定し排除すると共に頻度の高いところだけをつなげ合せることで、従来のALuc群よりも遥かに短い配列を持つ一連のALucを新規樹立した。この配列をさらに折畳むと上下配列間には反復性が見られ、この上下配列間の相同性を高める調整を行った。
さらに、配列の中には典型的なEFハンド様構造が４ヵ所存在しており(図３)、これらEFハンド様構造に変異を入れると失活することから、ALucの発光特性に深く関わっている部位であることを、初めて明らかにした。従って今発明で新規樹立した40番代と50番代のALuc群においては、このEFハンド様構造を保存に配慮しつつ一連のALuc群を創製できた。このように、本発明により提供される新規の人工発光酵素は、上述のような新規のアプローチにより達成されたものである。
【００３３】
以下、「３．本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)の酵素活性」、「４．本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)の機能向上について」、「５．本発明ルシフェラーゼ(ALuc)の「レポーター分析法」への応用」、「６．バイオアッセイ用バッファー」、「７．本発明の人工ルシフェラーゼが対象とするバイオアッセイ」、「８．本発明の人工ルシフェラーゼを使用する試験において用いる測定方法、測定装置」、「９．バイオアッセイの対象被検物質」について特開２０１４−１００１３７号公報、国際公開第２０１４／０６５０４７号パンフレットの開示内容を参照又は引用して説明する。なお、上記文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
【００３４】
３．本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)の酵素活性
（３−１）酵素活性の確認方法
ALucの酵素活性は、まず、公知の遺伝子導入用脂質試薬を用いて、ALucをコードする発現ベクターをアフリカ猿由来のCOS-7細胞に導入し、比較のために変異を含まない従来のGLucを持つ発現ベクターも、同法で細胞に導入する。ベクターを導入してから一定時間(10〜20時間、例えば16時間)が経過した後、既知の細胞溶解試薬を使って細胞溶解液を作製する。
【００３５】
その後、細胞溶解液とセレンテラジンを含む既知の基質溶液とを混合して発色強度や発光の経時安定性などを測定する。
【００３６】
発光強度は、従来の発光分光光度計を用い、周知の基質添加後に測定する方法で特定の波長での強度を計測すればよく、毎分計測することで発光の経時的変化からその安定性が評価できる。長波長側へのシフトを測定するには、全波長スキャンする。
【００３７】
（３−２）本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)の酵素活性の特徴
本発明における典型的な人工ルシフェラーゼ(ALuc)は、ALuc41(配列番号２)、ALuc43(配列番号３)、ALuc44(配列番号４)、ALuc45(配列番号５)、ALuc46(配列番号６)、ALuc47(配列番号７)、ALuc48(配列番号８)、ALuc49(配列番号９)、ALuc50(配列番号１０)、ALuc51(配列番号１１)である。
【００３８】
従来のカイアシ類ルシフェラーゼで観察される共通の酵素活性の特徴として、
（１）一過性の強い光を示す特徴があり発光安定性が乏しい点、
（２）N末端に分泌シグナルを有する点、
（３）発光酵素の大きさが他の発光酵素より小さい点、
を挙げることができる。
（４）共通して青色(480nm)を出す点があった。
【００３９】
本発明のALucシリーズは、いずれも(２)と(３)の特徴はそのまま保持している。また、 (１)の発光安定性については、従来のカイアシ類ルシフェラーゼと比較して格段に高い。特に、Aluc45は、既存のALucと比較しても極めて安定性の高い発光シグナルを示した。
生物発光酵素の二大性質として発光輝度と安定性を取り上げられる。前述したように、一部の新規ALucにおいては従来に比べて発光輝度と発光安定性の両方が改善されており、一般的に輝度が良くなると安定性が悪くなり、安定性が良くなると輝度が悪くなるという常識を覆すものであった。
【００４０】
以上のように、本発明によって従来のカイアシ類ルシフェラーゼの良い点を保持したまま共通の問題点を克服した、極めて有望な人工発光群であることが確認できた。
さらに、本発明により提供されるALucは、一実施の形態において、既存のALucと比較してもより小さい分子量のものである。生物発光酵素は発光標識として使われるため、小分子であることは下記のようなメリットを有する。すなわち、小分子であればあるほどホスト分子に立体障害を引き起こす可能性は低くなる。また、小分子タンパク質はより高い発現量を期待できる。さらに、タンパク質ミスフォルディングのリスクが低くなりフォールディング後、発光機能発揮が速いとされる。このようにより小分子であるALucは、例えば上記の点で優れている。
【００４１】
４．本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)の機能向上について
本発明の人工ルシフェラーゼ(ALuc)の用途については、典型的には、従来の生物発光プローブにおける発光酵素の要素として用いることの他に、きわめて高輝度な安定的な発光シグナルを発するため生体内の各種の蛍光イメージング用レポーター遺伝子の代替として用いることなどが挙げられる。いずれにしても、主要な用途は、ヒトをはじめ哺乳動物の生体内で、又は試験管内の哺乳動物細胞で用いる場合である。
【００４２】
このため、他の機能向上のための改変としては、各アミノ酸に対応するコドンを各宿主生物種に適したコドンに変更して発現しやすいコドンにする改変、ならびに間接的な機能向上のために発現プロモーターの性能を改良することが有効である。さらに、本人工生物発光酵素(ALuc)のN末端やC末端に機能性ペプチドをつけることによって様々な付加機能が期待できる。例えば、N末端やC末端に細胞膜局在化シグナル(membrane localization signal；MLS)をつけることによってALuc本体を細胞膜に局在させることができる。この場合、ALuc由来のN末側の分泌シグナル(1-20位又はその１部配列)はあってもなくてもよいが、当該分泌シグナルが存在することで小胞体を経由するため、ALucを含む融合タンパク質に対してもフォールディング効率を上げられる場合がある。なお、本発明において、特に明記していない場合でも、シグナルペプチドを含め２種類以上のペプチドを結合する場合には、適宜周知のリンカーを用いてその長さ、読み枠などを調節している。ALucが細胞膜に局在することによって外部からの基質や酸素の供給が円滑になり、ALucを基盤とした発光プローブ(例、発光カプセル)の場合には、外部の信号に速やかに反応できる利点がある。本発明においても必要に応じて適宜採用する。このような機能向上用の改変ストラテジーについて、以下に具体的に示すがこれらの手法に限定されない。
【００４３】
５．本発明ルシフェラーゼ(ALuc)の「レポーター分析法」への応用
（５−１）本発明の「レポーター分析法」について
本発明のALuc及びその遺伝子は、各種「レポーター分析法」における「レポータータンパク質」又は「レポーター遺伝子」として好適に用いることができる。
【００４４】
本発明で「レポータータンパク質」又は「レポーター遺伝子」というとき、外部刺激に応じた細胞内での標的タンパク質又は標的遺伝子の挙動を調べるために用いる発光標識を意味する。また、本発明において「レポーター分析法」というとき、外部刺激に応じて細胞内における標的タンパク質又は標的遺伝子の挙動を、本発明のALuc及びその遺伝子を「レポータータンパク質」又は「レポーター遺伝子」として用いることで、ALucによる発光の有無もしくは発光量、発光時期又はその発光位置に置き換えて観察する分析法であり、具体的には、標的遺伝子の発現位置、発現時期、又は発現量を、レポータータンパク質のALucの発光位置、発光時期、又は発光量として定性的又は定量的に測定する方法であるということもできる。
【００４５】
具体的には、レポータータンパク質を、標的タンパク質のN末端やC末端に融合して融合蛋白として用いられる場合が典型的であるが、N末端とC末端に２分割したレポータータンパク質と標的タンパク質とが直接又は他のペプチド配列を介して融合される場合もある。レポーター遺伝子の典型的な使い方としては、標的遺伝子の5’や3’末端に繋ぎキメラ遺伝子を作ることによって発現後の標的タンパク質の挙動を調べるために用いられる。同様にレポーター遺伝子を２分割しそれぞれ標的遺伝子の5’末端と3’末端、もしくは標的遺伝子の中に挿入して使うこともできる。
【００４６】
本発明のレポータータンパク質は、上記ALucの定義を用いて、以下のように記載することができる。
【００４７】
下記の(ｉ)〜(vii)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含み、かつカイアシ類ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドからなるレポータータンパク質；
(ｉ)配列番号２〜１１、１３〜１８のいずれかに示されたアミノ酸配列、
(ii)配列番号２〜１１、１３〜１８のいずれかに示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、
なお、ここで数個とは、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個を表す。
(iii)配列番号２〜１１、１３〜１８のいずれかに示されたアミノ酸配列と90％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
(iv)配列番号１に示されたアミノ酸配列、
(ｖ)配列番号１に示されたアミノ酸配列のうち1-29位、又は195-199位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列、
(vi)配列番号１２示されたアミノ酸配列、
(vii)配列番号１２に示されたアミノ酸配列のうち、1-29位、又は214-218位の少なくともいずれかの領域において、１個以上のアミノ酸が欠損しているアミノ酸配列。
【００４８】
本発明のレポータータンパク質は、生体内などin vivo条件下で用いる場合には、上記(ｉ)〜(ix)に示されたアミノ酸配列をコードする核酸からなる「レポーター遺伝子」を、標的遺伝子に繋いでベクターなどに組み込み、ターゲットとなる細胞内に導入される。
【００４９】
以下、本発明の「レポーター分析法」を、NiuらによりNiu，G.，Chen，X. Y. Theranostics，2 2012 413.において示された３つの分類である“basic”、“inducible”及び“activatable”の３種類に分けて、本発明のALucのそれぞれの分析法への適用について具体的に説明する。ここで、“basic”法とは、もっとも単純なレポーター分析系であって、各種の被検タンパク質に対して単にALucを繋いで標識しただけのレポーター分析系であるともいえる。典型的なものとしては、抗体に繋げた生物発光酵素融合タンパク質(即ち、生物発光酵素標識抗体)があげられる。“inducible”法は、“basic”法と比較してレポーターの発現がプロモーターによって制御されている点が異なる。典型的には、生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)法の他、いわゆるレポータージーンアッセイやツーハイブリットアッセイ(刺激に依存してレポーターを発現する)があげられる。また、“activatable”法は、レポーター自体がリガンド刺激に能動的に反応して発光することを利用するレポーター分析法であり、典型的には、一分子型生物発光プローブ、発光カプセルがあげられ、他にprotein complentation assay(PCA)，protein splicing assay(PSA)などに適用できる。
【００５０】
（５−２）“basic”法について
本発明のALucをレポータータンパク質として「basic法」に適用する場合、ALucを単純に標的タンパク質に繋げた融合タンパク質を作ればよい。この際に非制御型プロモーターで発現する点が他のレポーター分析法とは異なる。
【００５１】
なお、本明細書において「融合タンパク質」とは、(ｉ)ALucであるレポータータンパク質と標的タンパク質又は標的タンパク質を認識するペプチドとを含む融合タンパク質をコードする遺伝子から一体として発現させたもの、(ii)ALucであるレポータータンパク質及び標的タンパク質又は標的タンパク質を認識するペプチドを別々に発現させ、これを化学反応により連結させたものなどを包含する。別々に発現させたタンパク質等を化学反応により連結させる手段としては、例えば、クロスリンカーによる連結、アビジン‐ビオチンの結合能を利用した連結、アミノ酸残基の化学反応性を利用した結合などが例示される。
【００５２】
典型的な抗体と結合させた生物発光融合タンパク質の場合について説明すると、抗体の単鎖可変領域フラグメント(scFv)のcDNAの上流や下流にALucの遺伝子を繋げたキメラDNAを作成し、適当な発現ベクターに挿入することで完成できる。
【００５３】
（５−３）“inducible”法について
生物発光酵素をレポータータンパク質として「inducible法」に適用することは、組換えDNA技術によって組換えタンパク質が作製される際の遺伝子発現の時期及び発現量の解析のために従来から用いられており、特に外部刺激に応答した発現時期及び発現量変化を示す指標として広く用いられている。「inducible法」に含まれる分析システムとしては、レポータージーンアッセイ(reporter gene assay)、Yeast Two-hybrid assay、Mammalian Two-hybrid assay、protein splicing assay(PSA)、protein complementation assay(PCA)、circular permutation assay、bioluminescence resonance energy transfer assay(BRET)等があるが、これらの分析システムに必須のレポーター遺伝子として本発明のALucを用いることで、アッセイの計測性能を飛躍的に向上できる。
【００５４】
以下、典型的な「inducible法」分析システムである、レポータージーンアッセイ、及びツーハイブリッド・アッセイについて詳細に説明する。
【００５５】
（ｉ）レポータージーンアッセイ
レポータージーンアッセイ法は、外部刺激による転写因子の活性化及び遺伝子の発現調節の解析手段として繁用されているが、典型的には核内受容体を介したシグナル伝達を攪乱する内分泌攪乱物質(環境ホルモン)の検出に用いられている。核内受容体を介したシグナル伝達に関連した標的遺伝子(例えば、ホルモン応答性遺伝子)の発現は、リガンドと受容体の複合体が当該遺伝子の転写調節するシス領域(ホルモン応答配列；hormone response element)に結合することで引き起こされる。この各種ホルモン応答性遺伝子のシス領域の下流にルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を組み込んだプラスミドを細胞内に導入し、リガンドとなり得るホルモン分子又は内分泌攪乱物質量を生物発光量などで検出するアッセイ法である。
【００５６】
その際の宿主細胞としては、一般的な遺伝子組換えに用いられる哺乳動物細胞のCOS細胞、CHO-K1細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、NIH3T3細胞などが好ましく用いられるが、酵母細胞、大腸菌など細菌細胞、昆虫細胞などでも良いが、主要な用途としては、ヒトをはじめ哺乳動物の生体内で、又はインビトロの哺乳動物細胞内で用いる場合が多い。
【００５７】
レポータージーンアッセイ法において、従来から広く用いられていたホタルルシフェラーゼの場合、[１]分子量が大きくて発現までに時間がかかるので、宿主細胞に大きな負担をかけることになり、[２]発光強度が低いため、十分ルシフェラーゼ(レポーター)量が蓄積するまでに、通常刺激後1〜2日の時間を待つ必要がある、という欠点があったが、本発明のALucをレポータータンパク質として選択することでこれらの問題点が解消される。とりわけ、本発明のAlucは、ホタルルシフェラーゼ等と比較して、高い発光強度を維持しつつ、かつ、従来のALuc(例えば、Aluc30など)と比較してさらに分子量が小さい点において優れている。
【００５８】
本発明のALucをレポータータンパク質として使用すれば、レポーターの発光強度が極めて高いため、刺激後にごく短時間で測定ができる利点がある。そのため、従来のレポータータンパク質より大幅に計測時間を短縮でき、かつ経時的な発光の安定性も高いことから、遺伝子導入効率の悪い細胞株においても発光測定ができる。
【００５９】
具体的に、本発明のALucをこれらのレポータージーンアッセイに適用するためには、上流に特殊なプロモーターを搭載している既知の真核細胞発現ベクターに当該発光酵素を繋いで、真核細胞に導入し、一定時間が過ぎた後、信号(刺激)有り無しの条件で測定に用いればよい(Takenaka，Y.，Yamaguchi，A.，Tsuruoka，N.，et al. Molecular Biology and Evolution，29 2012 1669.)。当該ALucを搭載できる、レポータージーンアッセイ用の発現ベクターとしては、公知のpTransLucentベクターを利用し、既知の方法を使って簡単に搭載させることができる。
【００６０】
（ii）ツー・ハイブリッド法
ツー・ハイブリッド法(Two-hybrid法)はタンパク質間の相互作用を調べる手法の１つであり、1989年に酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いたyeast two-hybrid(Y2H)システムがまず構築された。転写活性化因子であるGAL4タンパク質のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)と転写活性化ドメインが分離可能であることを利用して、GAL4 DBDと任意のタンパク質Ａ(bait)を融合タンパク質として発現させ、同時に細胞内で発現させた転写活性化ドメイン(TA)と融合タンパク質としたタンパク質Ｂ(prey)と相互作用をするかどうかを判定できる。前記タンパク質ＡとＢが結合する場合にはDBDとTAが近接してDNA結合ドメイン(DBD)が、「UASG」塩基配列に結合するのでその下流に連結したレポーター遺伝子発現を促すことになる。レポーター遺伝子がルシフェラーゼであれば、その特異的な基質存在下で生物発光をモニターすれば、Ａ,Ｂ両タンパク質の親和性が測定でき、タンパク質Ａ(bait)と相互作用をするタンパク質、ペプチドのスクリーニングができる。その際のタンパク質Ｂ(prey)は発現ライブラリーによって提供させることもできる。
【００６１】
宿主細胞としては、酵母細胞に限らず、大腸菌など細菌類や、哺乳動物細胞、昆虫細胞も用いられる。その際、酵母由来の転写活性化因子であるGAL4 DBD以外に、大腸菌由来のリプレッサータンパク質の「LexA」等を用いることもできる。これらをコードするDNAと、リガンド応答性転写調節因子のリガンド結合領域などbaitタンパク質(即ち、前記の任意のタンパク質Ａ)をコードするDNAとを連結し、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に連結する。一方、「転写活性化因子の転写活性化領域」としては、例えば、GAL4の転写活性化領域、大腸菌由来のB42酸性転写活性化領域、ヘルペス単純ウイルスVP16の転写活性化領域等を用いることができる。これら転写活性化領域をコードするDNAと、preyタンパク質(即ち、前記の任意のタンパク質Ｂ)をコードするDNAとを連結し、宿主細胞内で機能可能なプロモーターの下流に連結する。
【００６２】
具体的には、転写調節因子GAL4のDNA結合領域をコードするDNAを有し、出芽酵母を宿主細胞において利用可能なベクターとして、プラスミドpGBT9(Clontech社製)等をあげることができ、GAL4の転写活性化領域をコードするDNAを有し、出芽酵母において利用可能なベクターとして、プラスミドpGAD424(Clontech社製)等をあげることができる。また、GAL4のDNA結合領域をコードするDNAを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、pM(Clontech社製)、pBIND(Promega社製)等をあげることができ、単純ヘルペスウィルスVP16の転写活性化領域をコードするDNAを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、pVP16(Clontech社製)、pACT(Promega社製)等をあげることができる。また、LexAのDNA結合領域をコードするDNAを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、pLexA(Clontech社製)等をあげることができ、B42をコードするDNAを有し、哺乳類動物細胞において利用可能なベクターとして、pB42AD(Clontech社製)等をあげることができる。
【００６３】
その際、例えば、本発明のALuc遺伝子を、GAL4が結合する領域(「UASG」)などの下流にレポーター遺伝子として挿入したベクターを構築すればよく、哺乳動物宿主の場合であれば、市販のpG5Lucベクター(Promega)やpFR-Lucベクター(Stratagene)を利用し、当該ベクターに搭載されているホタルルシフェラーゼの代わりに周知の方法で簡単に本発明のルシフェラーゼ(ALuc)を搭載して使用することができる。また、市販のpG5CATベクター(Clontech)のChloramphenicol acetyltransferase(CAT)の代わりに用いることもできる。
【００６４】
（５−４）“activatable”法について
生物発光酵素を“activatable”法のレポータータンパク質として搭載する分析システムも、従来から本発明者らが「生物酵素発光プローブ」技術として研究開発し、発展させてきた。以下、典型的な“activatable”法の例として、本発明のALucの「生物酵素発光プローブ」への適用例、及びそれを用いた「細胞内イメージング法」について述べるが、それに先立ち、まず、本発明ではじめて開発した「発光性融合タンパク質(発光カプセル)」について述べる。その他、本発明のALucは、“activatable”法に含まれるprotein complentation assay(PCA)、protein splicing assay (PSA)におけるレポータータンパク質として好適に適用できる。
【００６５】
（ｉ）発光性融合タンパク質(発光カプセル)の製造
本発明のALucのC末端側に膜局在シグナル(MLS)を結合することで、ALuc本体を細胞膜に局在させることができるが、このように細胞膜に局在する分子設計を行うことによって、基質と酸素の供給が円滑になるため、極めて高輝度で安定的な生物発光可視化が可能になる。その際、ALuc本体とシグナルペプチドをコードする核酸の間に任意のポリペプチドやタンパク質の遺伝子をカーゴ(貨物という)として挿入することが可能である。こうすることによってカーゴとなるタンパク質を細胞膜表面に効率的に運ぶことができ、しかも運ばれた場所が光るように仕掛けたことになる。典型的な例としては、各タンパク質の繋ぎ目に、細胞死に応答するDEVD配列やIETD配列を入れ込んだ場合では、細胞死の際caspase-3やcaspase-8の活性を信号として能動的に応答し、可視化するシステムとして働く。本発明者はこの構造の発光性融合タンパク質を「発光カプセル」と名付けた。
【００６６】
この発光カプセルは、従来の発光プローブと比較し、極めて高輝度で安定な発光特質を示し、細胞膜を透過できない検体に対しても応答する利点を持つ。この発光カプセルは「発光酵素本体のC末端」に「膜局在シグナル(MLS)」をつけた構造を基本骨格とする。このままで、又は本発明の発光酵素をタンデムに繋いで発光量を増強した場合でも、細胞死を誘発する化合物など細胞表面の形態変化を引き起こす化合物の作用を、細胞膜表面の形態変化として可視化できるから、観察が容易になる。好ましくは、発光酵素本体のC末端とMLSとの間に、細胞膜表面の形態変化を引き起こすポリペプチドもしくはその一部認識配列、具体的には、例えば、G-protein coupled receptor(GPCR)やc-Srcなどの全長もしくは一部認識配列を挿入することが可能である。また、発光酵素本体のC末端とMLSとの間に細胞死を誘発するポリペプチド、もしくはその認識配列を貨物として挿入することで、細胞死の可視化が可能である。より具体的には、各種caspaseやプロテアーゼ(セリンプロティアーゼ、システインプロティアーゼなど)、消化酵素(トリプシン、アミラーゼなど)によって認識されるペプチド配列(通常20アミノ酸以下、好ましくは10アミノ酸以下)、例えば、「DEVD」(配列番号２５)又は「IETD」(配列番号２６)を含むアミノ酸配列を貨物として挿入した場合、Caspase-3活性による細胞死の可視化が可能である。さらに発光酵素本体とMLSとの間に蛍光タンパク質もしくは他の発光酵素を貨物としてつなげることによって、本発明の発光酵素をタンデムで繋いだ場合と同様に、細胞膜表面での光発生量が強力となるため、より細胞膜の形態観察が容易となり、細胞膜を透過できないリガンドに対しても応答するため、幅広い刺激物に対するスクリーニングが可能である。
【００６７】
即ち本発明の発光カプセルは、本発明のALucのC末端側と膜局在シグナル(MLS)との間に、細胞膜表面で発現させたい任意のタンパク質又はポリペプチドが挿入された発光性融合タンパク質であり、典型的には、
（ａ）本発明のALucのC末端側と膜局在シグナル(MLS)との間に、蛍光タンパク質又はルシフェラーゼが挿入された発光性融合タンパク質(なお、ルシフェラーゼとしては本発明の他のALucであってもよい)、
（ｂ）本発明のALucのC末端側と膜局在シグナル(MLS)との間に、細胞膜の形態を変化させるポリペプチド又は当該ポリペプチドが認識する20アミノ酸以下の、好ましくは10アミノ酸以下のポリペプチドが挿入された発光性融合タンパク質。ここで、特に、細胞膜の形態を変化させるポリペプチドとして、細胞死を誘発するポリペプチドが好ましく、Caspase及びその認識配列である「DEVD」又は「IETD」を含む20アミノ酸以下のポリペプチドが特に好ましい。
【００６８】
（ii）発光プローブへの応用
また、本発明のALucを、本発明者らが既に特許出願している発明に係る一分子型発光プローブ(Kim，S. B.，Awais，M.，Sato，M.，et al. Anal. Chem.，79 2007 1874.、Kim，S. B.，Otani，Y.，Umezawa，Y.，et al. Anal. Chem.，79 2007 4820.、Kim，S. B.，Sato，M.，Tao，H. Bioconjugate Chem.，19 2008 2480.、Kim，S. B.，Sato，M.，Tao，H. Anal. Chem.，81 2009 67.、米国特許第8124424号明細書、米国特許第8043827号明細書、米国公開番号US-2009-0269781(A1)、国際公開WO2008/084869)、又は二分子型発光プローブ(Kim，S. B.，Kanno，A.，Ozawa，T.，et al. ACS Chem. Biol.，2 2007 484.、Kim，S. B.，Ozawa，T.，Watanabe，S.，et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，101 2004 11542.)に組み込むことによって、リガンドの有無、リガンドの活性強度を高輝度で観測できる。当該プローブの構成要素として、[１]２つに分割された当該発光酵素(ＮとＣ末側断片)の近傍に、[２]標的リガンドに応答するリガンド結合タンパク質と、[３]リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質を繋げた形態で高性能の発光プローブを構成できる。この発光プローブ中、前記リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを前記認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された前記酵素断片が相補して酵素活性を変化させることができる。この時、当該分割酵素の高輝度と安定性のため、検出限界の向上と信頼性の高い計測が可能となる。
【００６９】
本発明において、「一分子型発光プローブ」というとき、可視化イメージングするために用いられる全構成要素を単一融合分子内に集積したことを特徴とする、公知の生物発光プローブの一つである(米国特許第8124424号明細書、米国特許第8043827号明細書)。例えば、本発明のALucを２分割したNとC末側断片を、リガンド結合タンパク質及びリガンド結合タンパク質の認識タンパク質を基本構成要素として含む融合タンパク質である。同様に「二分子型発光プローブ」というときは、本発明のALucのN末側断片とC末側断片を、リガンド結合タンパク質を含む融合タンパク質、及び認識タンパク質を含む融合タンパク質内にそれぞれ存在させたタイプの生物発光プローブを指す。
【００７０】
これらの生物発光プローブにおいて、本発明のALucを用いる場合には、N末側断片とC末側断片とに２分割する必要があるが、その分割位置は、公知のALucにおける切断位置に相当する位置を適用することができる。
【００７１】
本発明の高輝度発光酵素を一分子型発光プローブとして用いる際の具体的な手法は、(米国特許第8124424号明細書、米国特許第8043827号明細書、米国公開番号US-2009-0269781(A1)、国際公開WO2008/084869)に詳細に記載された手法に従う。具体的には、本発明のルシフェラーゼ(ALuc)を２分割し、リガンド結合性のタンパク質及び当該タンパク質にリガンドが結合した場合の立体構造変化を認識するペプチド配列とを直線上に結合させた発光プローブをコードするキメラDNAを設計する。一般には、そのキメラDNAを発現させたい細胞に適したベクター内にサブクローンし、当該ベクターを細胞内に導入して、細胞内で発現させるが、キメラDNAの上流に制御配列を繋いで細胞内に直接導入することもできる。ここで、対象の細胞としては、ヒトを含めた哺乳動物由来の細胞が好ましく、生体内に存在する状態の細胞であっても、細胞本来の機能を維持した状態の培養細胞であってもよい。酵母細胞、昆虫細胞の他、大腸菌などの原核細胞であってもよい。ベクターの具体的な種類も特に限定されず、発現に用いる宿主中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。細胞内への導入法としては、マイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法等の公知のトランスフェクション法を用いることができる。あるいは脂質による細胞内導入法(BioPORTER(Gene Therapy Systems社)、Chariot(Active Motif社)等)を採用することもできる。
【００７２】
本発明の高輝度発光酵素を用いた生物発光プローブは、キメラDNAとして細胞内に導入された後に細胞内で融合タンパク質として発現されるため、当該形質転換細胞に対してリガンド刺激を行った後、当該細胞からの発光量の変化を測定することによって、リガンドの性質、活性の程度等を評価することができる。
【００７３】
本発明の高輝度ルシフェラーゼ(ALuc)を生物発光プローブ内に構成する際、当該ALucと共に搭載できる「リガンド結合タンパク質」としては、そのリガンド結合部位にリガンドが結合するタンパク質が意図される。リガンド結合タンパク質は、例えば、リガンドが結合することによって立体構造が変化するか、リン酸化を起こすか、タンパク質間相互作用を促すものであり得る。このようなリガンド結合タンパク質としては、例えば、ホルモン、化学物質又は信号伝達タンパク質をリガンドとする核内受容体(NR)、サイトカイン受容体、あるいは各種タンパク質キナーゼが用いられる。リガンド結合タンパク質は、対象とするリガンドによって適宜選択される。リガンド結合タンパク質に結合するリガンドとしては、リガンド結合タンパク質に結合するものであれば特に限定されず、細胞外から細胞内に取り込まれる細胞外リガンドであってもよく、細胞外からの刺激により細胞内で産生される細胞内リガンドであってもよい。例えば、受容体タンパク質(例えば核内受容体、Ｇタンパク質結合型受容体等)に対するアゴニスト又はアンタゴニストであり得る。また、細胞内の情報伝達に関与するタンパク質に特異的に結合するサイトカイン、ケモカイン、インシュリン等の信号伝達タンパク質、細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー、リン酸化アミノ酸残基、Ｇタンパク質結合型受容体リガンド等であり得る。
【００７４】
例えば、リガンドとして細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー等を対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、各セカンドメッセンジャーの結合ドメインを使用することができる。セカンドメッセンジャーとは、ホルモン、神経伝達物質等の細胞外情報伝達物質が細胞膜に存在する受容体と結合することによって、細胞内で新たに生成される別種の細胞内情報伝達物質を意図している。このセカンドメッセンジャーとして、例えば、cGMP、AMP、PIP、PIP2、PIP3、イノシトール３リン酸(IP3：inositol triphosphate)、IP4、Ca2+、diacylglycerol、arachidonic achid等が挙げられる。例えば、セカンドメッセンジャーのCa2+に対しては、リガンド結合タンパク質としてカルモジュリン(CaM)を用いることができる。
また、本発明の酵素を一分子型生物発光プローブとして用いる方法として、特願２００９−２００４１３や特願２０１０−０１８７５９に記載される融合タンパク質として使用することもできる。
【００７５】
（iii）細胞内イメージング
また、当該ALucをコードする遺伝子を用いることで、様々な細胞株に安定的に導入できる。一例として、胚内未分化細胞、ES細胞や新型万能細胞(iPS)に当該ALucを安定的に導入できる。前記細胞そのものは、光らないため内部で起こる分子現象、組織特異性を探索するのは大変困難であった。この困難を克服するために、まず、体細胞に当該ALucを含む分子プローブを導入してから胚を作成し、様々な臓器組織に分化させる。すると、各臓器ごとに起こる特異的な分子現象を高感度に計測できる。
【００７６】
その際には、山中らの手法に従う(Okita，K.，Ichisaka，T.，Yamanaka，S. Nature，448 2007 313.)。
【００７７】
また、本ALucに適選のシグナルペプチドを繋げることによって、各細胞小器官の高輝度イメージングに使用できる。例えば、GAP-43由来の「MLCCMRRTKQV配列」(配列番号２７)をALucのＮ又はＣ末に付けることによって、細胞膜に局在化できる。また、細胞質局在のために「GRKKRRQRRR配列」(配列番号２８)を付ける。また、小胞体(ER)と細胞核に局在化させるためには、それぞれ「KDEL」(配列番号２９)と「DPKKKRKV配列」(配列番号３０)を繋げることによって可能となる。他に、HIS-tag(HHHHHH) (配列番号１９)、FLAG-tag(DYKDDDDK)(配列番号２０)、Myc-tag(EQKLISEEDL)(配列番号２１)、HA-tag(YPYDVPDYA)(配列番号２２)、V5-tag(GKPIPNPLLGLDST)(配列番号２３)、T7-tag(MASMTGGQQMG)(配列番号２４)などの抗原サイトをつけることによって、非細胞系における免疫染色、分離精製に利用できる。その際には、周知の免疫染色法、immunocytochemistry等の手法が適用できる。
【００７８】
なお、本発明のように人工生物発光酵素(ALuc)が新規樹立されても、最適発光反応場を提供するためには、発光反応溶液の最適化がもう一つの課題である。生物発光には、発光酵素、基質、酸素(O2)、反応溶液(コファクタ―含む)の４つ要素により起こる酸化反応である。従って、ALucに最適発光反応場を提供するにはこの４つの要素を好適に制御する必要がある。この４つの構成要素の中で、基質は合成研究により優れた基質を開発できる。酸素は発光反応の場で特に加えなくても良い。その他の制御可能な要素として「発光酵素と反応溶液」の最適化は、生物発光の高輝度性と発光安定性を達成するためには重要である。
反応溶液が重要な理由として、「最適発光反応場」を構成するからである。反応場の中で各構成要素が発光に寄与する。しかしながら反応溶液の重要性にも関わらず、反応溶液の構成因子は多様で添加物の数が多いため、ある発光反応系における最適な反応系を創出することは難しい。構成因子には、バッファー種(Tris, phosphateなど)、イオン(カチオンとアニオン)、水素濃度(pH)、界面活性剤、抗酸化剤、安定剤、糖質など、多様であるため、これら全てにおける最適組成を作りあげることは極めて困難な課題である。
この最適発光反応溶液を構成するために、添加カチオンの種類(図５，６、２２)、カチオンの濃度(図７)、輝度の経時変化(図８、２３)、基質の種類(類似体)(図１５)などを調べ、新規ALuc群に最適な発光溶液組成の検討を行った。当該検討により見出された発光溶液組成について以下に記載する。
【００７９】
６．バイオアッセイ用バッファー
（６−１）基本となるバッファー成分−１(HBSSバッファー)
本発明のALucに使用されるバッファーとしては、HBSSバッファー(Hanks' Balanced Salt Solution)を基本組成物として用いることができる。その調製手法は、公知のプロトコール(例えば、国立研究開発法人医薬基盤・健康栄養研究所のホームページhttp://cellbank.nibio.go.jp/legacy/sheet/att00011.htm)に従い、以下のように調製することができる。
まず、以下の４種類の溶液をあらかじめ調製し，混合して利用する。
溶液１    1.4％ NaHCO3 溶液 
溶液２    NaCl 80.0g，KCl 4.0g，MgSO4・7H2O 2.0g，Na2HPO4・2H2O 0.6g，glucose 10.0g，KH2PO4 0.6gを水800mlに溶かした溶液。
溶液３    CaCl2 1.4gを水100mlに溶解した溶液。
溶液４    Phenol red 0.4gを秤量し，少量の水でペースト状にし，ついで水を加えて150mlとする。
水酸化ナトリウム溶液(N/20)でpHを7.0に調整し全量を200mlとする。
使用する際には、87.5mlの滅菌水に溶液１を2.5ml、溶液２を8ml、溶液３を1ml、溶液４を1ml、それぞれ加えたものを使用する。Phenol redを使わない場合には、溶液４の混合を省略できる。
【００８０】
（６−２）基本となるバッファー成分−２(Tris−バッファー)
トリスバッファーそのものは従来から広く使われているバッファー成分(ここでいうトリスはトリスヒドロキシメチルアミノメタンの略称であり、一般的な組成はトリス塩10mMにHClでpHを調整したもので、添加剤としてEDTA 1mMを入れる場合もある)であり、生体適合性が高い理由で、さまざまなバイオ研究で用いられている。しかし、トリスバッファーが生物発光反応に与える影響に関する研究は今まで十分されてなかった。
本発明のALucにおいては、トリスバッファーが生物発光に好適に使えるものであり、細胞溶解(Lysis)用にもアッセイ用にも用いられる基礎バッファー成分として用いることができる。
【００８１】
（６−３）本発明におけるバッファー組成
上記基本的なバッファー成分のHBSSバッファー及びTris−バッファーを組み合わせて用いることができるが、その際両者を容量(v/v)％で20〜50：50〜20、好ましくは40〜60：60〜40、最も好ましくは、60：40で配合する。
界面活性剤としては、NP-40及びTW80、さらにSDSを組み合わせて用いるが、その際、NP-40：TW80：SDSを容量(v/v)％で1：0.1〜1：0〜0.5、好ましくは、1〜2：0.5〜2：0.1〜1、最も好ましくは、1：1：0.1の比で配合する。
界面活性剤のTW80を他の界面活性剤と組み合わせて含有させるが、その際の濃度が1〜10(v/v)％、好ましくは5〜10(v/v)％範囲で配合する。
ポリオールとしては、ポリエチレングリコール(PEG)及び糖成分(スクロース，グルコース)を組み合わせるが、PEG400が0.01〜10(v/v)％範囲、糖成分(スクロース，グルコース)は0〜20mg/mL範囲で配合するが、好ましくはそれぞれPEG400が0.1〜10(v/v)％範囲、糖成分(スクロース，グルコース)は2〜10mg/mL範囲で配合する。
重金属として、(Fe(III)，Cu(II)，Mo(VI)やZn(II))を単独又は組み合わせて含有させるが、その際の濃度が0.01〜1PPM範囲で、好ましくは1PPM配合する。
ハロゲンイオン(Br-やI)を単独又は組み合わせて含有させるが、その際の濃度が1〜100mM、好ましくは50〜100mMの範囲で配合する。
その他、発光安定性を向上させるためにビタミンＣなどの還元剤を適宜配合すると、さらによい。
【００８２】
７．本発明の人工ルシフェラーゼが対象とするバイオアッセイ
本発明のALucが適用できるバイオアッセイとしては、たとえば、以下に挙げる公知の方法を挙げることができる。しかしながら、本発明のALucが適用可能なバイオアッセイは、以下に限定されない。
(１)レポータージーンアッセイ(reporter-gene assay)、(２)ツーハイブリットアッセイ(two-hybrid assay)、(３)酵素結合免疫吸着法(enzyme-linked immunosorbent assay)、(４)放射免疫アッセイ(ラジオイムノアッセイ、RIA)、(５)蛍光タンパク質間蛍光共鳴エネルギー転移を利用したフレット法(FRET)、(５)タンパク質断片相補法(protein complementation assay(PCA))、(６)一分子型生物発光プローブ(integrated-molecule-format bioluminescent probe；又は簡単にsingle-chain probe)、(７)円順列置換プローブ、(８)分子歪みセンサー(molecular tension-indexed bioluminescent probe)、(９)多重認識型生物発光プローブ(multiple recognition-type bioluminescent probe)、(１０)マルチカラー生物発光イメージングプローブセット。
【００８３】
８．本発明の人工ルシフェラーゼを使用する試験において用いる測定方法、測定装置
発光活性の測定は、通常の生物発光アッセイ用の装置と操作法に準じて実施すればよく、特に制限なく従来のプロトコールが適用できる。
生物発光強度を測定するためには、ルミノメーター(例、MiniLumat LB 9506 (Berthold); GloMax 20/20n (Promega))が一般的に利用されてきた。プレート上で培養された細胞にライセートバッファーをかけることによって細胞溶解液を作り、基質と混合した後の発光値を即時に測定する。
96穴プレート上に培養された細胞を対象にリガンド活性を計測する場合には、既製の生物発光プレートリーダー(例、Mithras LB 940 (Berthold); SH-9000(Corona))を用いることができる。リガンド共存下で、発現されたプローブによる生物発光は、前記プレートリーダーに付いている自動基質溶液インジェクターを用いることによって瞬時に基質導入・発光測定ができる。
【００８４】
９．バイオアッセイの対象被検物質
これらのバイオアッセイの対象となる被検物質には、例えば、有機または無機の化合物(特に低分子量の化合物)、生物活性を持つタンパク質、ペプチド等が含まれる。これらの物質は、機能や構造が既知のものであっても未知のものであってもよい。また、「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、目的物質を効率的に特定するための被検物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である(例えば、米国特許第6,004,617号；5,985,365号を参照)。さらには、市販のライブラリー(例えば、米国ComGenex社製、ロシアAsinex社製、米国Tripos, Inc.社製、ロシアChemStar, Ltd社製、米国3D Pharmaceuticals社製、Martek Biosciences社製などのライブラリー)を使用することもできる。また、コンビナトリアルケミカルライブラリーを、本プローブを発現する細胞の集団に適用することによって、いわゆる「ハイスループットスクリーニング」を実施することもできる。
【００８５】
１０．本発明で用いる用語、概念について
本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III(組換えDNA技術)」、東京化学同人 (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987)などに記載の方法、あるいはそこで引用された文献記載の方法、またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種タンパク質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース(URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等)から入手することができる。
また、本明細書内に記載する特許文献及び非特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。【００８７】
（実施例１）
＜実験＞ALucsのEFハンド様領域
本発明者らは最近、動物プランクトン試料からのカイアシ類ルシフェラーゼ配列のアラインメントで頻度の高いアミノ酸を繋ぎ合わせることで一連の人工ルシフェラーゼ(ALuc)を作成した(非特許文献４、７)。図２(Ａ)におけるALuc30の分子構造は、アミノ酸配列のテンプレートに基づいたモデリングによって事前に予想された(非特許文献７及びIzumi, H., et al., Data Mining of Supersecondary Structure Homology between Light Chains of Immunogloblins and MHC Molecules: Absence of the Common Conformational Fragment in the Human IgM Rheumatoid Factor. Journal of Chemical Information and Modeling, 2013. 53(3): p. 584-591.)。今回のテンプレートに基づいたモデリング(TBM)アプローチの詳細な手順は以前に実証されている。
簡単に言えば、本発明者らは公共のデータベースから入手可能な既存の海洋ルシフェラーゼの既知の結晶学的情報を再調査した。データベース内の構造が入手可能なルシフェラーゼ中、ALucsが、Renilla muelleri由来のセレンテラジン結合タンパク質(CBP)(PDB id: 2hpsと2hq8)と最も高い配列相同性を共有することを見つけた(16.7%)。そこで、ALucsの分子構造テンプレートにCBPを選択した。CBPの配列を、超二次構造コード(SSC)の視点からALuc30の配列と整列させた。アライメントでは、CBP内すべての共通アミノ酸は、最初ALuc30のものと置換した。最終的に、ALuc30の分子構造は、Polak-Ribiereアルゴリズムに基づく分子力学法(MM)により最適化された。
本発明者らは、典型的なCa2+結合タンパク質を伴うALucsの多重配列アライメントをClustalW 2.1(SFI)を使用して行った。アライメントは、ヘリックス-ループ-ヘリックス構造を示すSSCパターンを繰り返す、特異的な推定EF様モチーフを明らかにした(図２、３)。【００８８】
重要なアミノ酸を確認するためのALuc25のポイント変異導入
ALuc25変異体をコードするpcDNA3.1プラスミドを、PCRおよび適当なプライマーを用いて「QuikChange」と呼ばれる部位特異的突然変異誘発技術によって作製した(図２(Ｂ))(Sawano, A. and A. Miyawaki, Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis. Nucleic Acids Res. , 2000. 28(16): p. e78.)。変異体はALuc25m1(変異部位：E150Y、A182Y)、m2(変異部位：E150W、A182W)、m3(変異部位：E150Y)とm4(変異部位：E150W)と命名された。参考文献に従って、GLucとRLuc8.6-535をコードする同じpcDNA3.1プラスミドが準備された。プラスミドの一部は一時的にリポフェクション試薬のTransIT-LT1(Mirus)を用いてCOS-7細胞にトランスフェクトされた。トランスフェクション16時間後、細胞は溶解バッファー(Promega)で溶解され、溶解液の一部(10 μL)はオプティカルボトムの96穴プレートに移された。特定の基質(ネイティブセレンテラジン; nCTZ)をプレートへ同時注入した後、直ちに、光強度をイメージアナライザー(LAS-4000、富士フィルム)を用いて評価した。【００８９】
＜結果と考察＞
ALucsのEFハンド様構造はALuc活性のために極めて重要な部位である。
ClustalW 2.1(SFI)を使用して、典型的なCa2+結合タンパク質でALucsの多重配列アラインメントを行った(図３)。ALucsの結合タンパク質は天然ルシフェラーゼとCa2+に対しての配列相同性は乏しかったが、SSC配列のアラインメントは、へリックス-ループ-へリックス構造を示すユニークな繰り返しSSCパターンを明らかにし(図２(Ａ)、３)、それはセレンテラジン結合タンパク質(CBP)のような既知のCa2+結合タンパク質のEFハンド構造に対応する部位に現れた(Petri, E.T., et al., Structure of the EF-hand domain of polycystin-2 suggests a mechanism for Ca2+-dependent regulation of polycystin-2 channel activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2010. 107(20): p. 9176-9181)。構造は、非Ca2+結合タンパク質の中ではまれである。
提案されたEFハンド様構造におけるアミノ酸(E150Y、A182Y、E150W、及びA182W)の点突然変異はALuc25の光強度を完全に破壊した(図２(Ｂ))。これらの結果は、EFハンド様構造がALuc活性の構造中心であることを示唆した。
この研究では異なるALucsからの結果を検討するが、我々は、それら間の逐次類似性を考慮し、ALucsの共通の光学的特徴であると予想した(図１、２(Ａ))。例えば、ALuc30と34間の唯一の違いは、アミノ酸20〜27(下線)でのエピトープ配列である。【００９０】
（実施例２）
＜実験＞ALucsのプロトン依存光強度
ALucsのプロトン駆動型の光強度は、プロトンと生物発光の関係の解明を助けるために算出された(図４)。アフリカミドリザル腎臓由来COS-7細胞を96穴プレートで培養し、Gluc、RLuc8.6-535、ALuc23、またはALuc34をコードするpcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen)をトランスフェクトした。細胞は培養され、図２(Ｂ)と同様の方法で溶解された。次に、プレート中の溶解物の10μLは同時に、pH 4〜9のユニバーサル緩衝液のアリコートとネイティブセレンテラジン(nCTZ)原液(図４(Ｂ))を混合して調製された基質溶液40μL(基質最終濃度：0.1mg/ml)と混合された。基質注入後直ちに、プレートは、イメージアナライザー(LAS-4000、富士フィルム)に移され、相対光強度は30秒間積算された。強度の経時変化は、20分間、5分毎に評価された(図４(Ｄ))。【００９１】
＜結果と考察＞低プロトン濃度がALucsの光強度を高める
ALuc活性の最小カチオン(H +)駆動機能を解明するために、プロトン濃度(pH)による光強度を測定した(図４)。低いpH領域、例えばpH4および5(酸性条件)では、光強度はバックグラウンドレベルまで抑制された。これとは対照的に、ALuc23とALuc34の光強度は、pH6に比べてpH7で約5倍まで大幅に上昇した(図４(Ｃ))。GLucとRLuc8.6-535が低い光安定性を示し、20分後に初期強度の30%未満を保持するようなpH9において、20分後でもALucsは、初期光強度の51〜53%を維持した(図４(Ｄ))。
ALucsの対応する特徴は、レンテラジン類似体共存下で観察した(図４(Ａ))。最大光強度はpH9で得られ、基質注入から20分後でさえ、強度は初期強度の41%(ALuc23)と60%(ALuc34)であった(図４(Ａ))。【００９２】
このALuc活性のpH駆動による上昇は、例えばOplophorus(エビ)ルシフェラーゼ(OLuc)、Gaussia(カイアシ類)ルシフェラーゼ(GLuc)、Cypridina(ウミホタル)ルシフェラーゼ(CLuc)とPeriphylla(クロカムリクラゲ)ルシフェラーゼ(PLuc)のような他の海洋ルシフェラーゼのものより非常に独特である。他の海洋ルシフェラーゼの最大光強度は通常、約pH7.5で確認され、pH8よりも高いpHですぐに減少し、約pH9において強度を殆ど失う(非特許文献１及びInouye, S. and S. Sasaki, Overexpression, purification and characterization of the catalytic component of Oplophorus luciferase in the deep-sea shrimp, Oplophorus gracilirostris. Protein Expression and Purification, 2007. 56(2): p. 261-268.；Ruecker, O., et al., Gaussia-luciferase as a sensitive reporter gene for monitoring promoter activity in the nucleus of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Molecular Genetics and Genomics, 2008. 280(2): p. 153-162.)。【００９３】
nCTZのヒドロキシル基のpKa値は、水溶液相(水相)で約7.6であることから(Ohmiya, Y. and T. Hirano, Shining the light: The mechanism of the bioluminescence reaction of calcium-binding photoproteins. Chemistry & Biology, 1996. 3(5): p. 337-347.)、nCTZは約pH9で脱プロトン化されたアニオン形態であると考えられている(図４)。pH9でのALucsの最高光強度は、他のルシフェラーゼと比較して、ALucsがアニオン性nCTZおよびその類似体を順応させるための光学プラットフォームを提供することを強く示唆している(図４(Ｂ))。【００９４】
（実施例３）
＜実験＞ALucsの金属カチオン駆動型光強度
金属カチオン駆動の光学特性はALuc16を用いて推定された(図６)。ALuc16の金属カチオンを含まない試料は、予め以下のように調製した：我々は最初にPCRを用いてC末端にStrep-IIタグを持つALuc16のDNAコンストラクトを生成した。次いで、コンストラクトをpOPTHMベクター(切断可能なN末端His6-MBPタグを持つ)にクローニングし、0.3mM IPTG誘導で、細菌株Shuffle T7 Express(New England Biolabs)で発現させた。細胞は再懸濁され、氷冷溶解緩衝液(50mM Tris-HCl pH8.0、500mM KCl、5mMイミダゾール、0.2mg/mL HEWL、1 EDTA-freeプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Roche Diagnostics社製))で超音波処理された。溶解物は18000rpmで40分間遠心分離され、その後上清は5 mL HisTrap HPカラム(GE Healthcare)に通された。AKTA精製システム(GE Healthcare)は、カラムを洗浄し、ALuc16融合タンパク質を溶出するために以下のように使用した：カラムを100mLの洗浄緩衝液(20mM Tris-HCl pH8.0、50mMリン酸カリウムpH8.0、100mM NaCl、15mM イミダゾール pH8.0)で洗浄し、80mL以上のイミダゾール勾配(15〜300mM)(an imidazole gradient over 80mL)で溶出した。溶出された試料は、4℃で24時間金属カチオンを含まないTris-HCl緩衝液(0.05M、pH8.2)に対して透析され、最終的に1mg/mlの濃度に希釈された。【００９５】
精製されたALuc16ストックは、実験の前に、さらに金属カチオンを含まないTris-HCl緩衝液(0.05M、pH8.2)で2μg/mLになるように500倍希釈された。次いで、45μLの混合液は、図６(Ａ)の実験の為に、96穴オプティカルボトムプレート(Nunc)中の5μLのさまざまな濃度の金属カチオン(Ca(II)、Mg(II)、Mn(II)、Co(II)、Ni(II)、Cu(II)、Zn(II)、Cd(II)、Pb(II)、Al(III)、Fe(III)、Mo(IV)もしくはCr(VI))と混合された(Solution A)。一方、nCTZ(Promega)を持つ対応する基質溶液は、カチオンを含まないTris-HCl緩衝液で100倍に希釈された(Solution B)。50 μLのSolution Bは同時に多チャンネルマイクロピペット(Gilson)で、96穴プレート内のSolution Aに注入された。マイクロプレートは直ちに冷却電荷結合素子(CCD)カメラを装備したイメージアナライザー(LAS-4000、富士フィルム)に移され、光強度を同時に高精度モードで評価された。測定は３回行った(n = 3)。光学像はマルチゲージV3.2(富士フィルム)を用いて分析された。
対応する生物発光スペクトル(図６(B))はまた、図６(Ａ)のものと同様の方法を用いて測定された。 200μL PCRチューブ中で、50μLのALuc16と金属カチオン(Ca(II)、Fe(III)、Ni(II)、Zn(II)、Mg(II)もしくはCr(VI)；濃度100μg/mL)の金属カチオンを含まないTris-HCl緩衝液中での混合物(Solution A)は、さらに10 μLのnCTZ溶液と混合された(Solution B)。チューブは直ちに精密分光光度計(AB-1850、ATTO)(図６(Ｂ))のチャンバーに移され、結果として生じるスペクトルは、30秒積算で採取された。
ALuc活性の詳細な用量反応曲線は、さまざまな濃度のPb(II)とネガティブコントロールとしての基質単体を用いて決定された(図７)。実験は、図６と同様の方法で行われた。挿入図は、LAS-4000(富士フィルム)で撮影された光学像を示している。【００９６】
試薬
図６中の標準的な金属カチオンは、和光純薬から購入した。対アニオンは塩化物である。 ALuc16、23、25、30および34をエンコードするpcDNA3.1(+)プラスミドは、我々の以前の研究からのものである(非特許文献４、７)。Renilla reinformisルシフェラーゼ8.6-535(RLuc8.6-535)とGaussia princepesルシフェラーゼ(GLuc)をエンコードするプラスミドは、Eurofins Genomics社によりカスタム合成され、pcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen)にサブクローニングされた。リポフェクション試薬(TransIT-LT1)は、Mirus社から購入した。天然型セレンテラジン(nCTZ)は商用RLucアッセイキット(E2820、Promega社)から入手した(Nishihara, R., et al., Bioluminescent coelenterazine derivatives with imidazopyrazinone C-6 extended substitution. Chem. Commun., 2014. 51: p.391-394.)。ユニバーサル緩衝液(クエン酸、ホウ酸、KH2PO4)のための材料は和光純薬から入手したが、トリズマ塩基塩は、金属カチオンを含まないTris-HCl緩衝液を調製するために、Sigma-Aldrichから購入して使用した。我々の試薬で起こりうる金属カチオンの混入は簡単に、事前に誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)によって推定され、その結果、カチオンの濃度は全て1μg/mL未満であり、多価金属カチオンの濃度は0.1μg/mL未満であることが分かった(表２)。【００９７】
【表２】
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【００９８】
＜結果と考察＞  金属カチオンはALucsの光強度を支配する
ALuc16の金属カチオン駆動型光強度を調べた(図６)。例えば、Li+、Na+、K+やNH4+のような一価カチオンは、ALuc16の光強度に少し影響を及ぼした(図５(Ｂ))。一価カチオン駆動型機能と同様の結論が先にOLucで報告されている(非特許文献９)。対照的に、多価カチオンが大幅にALuc16の光強度を支配することが分かった(図６)。二価カチオンの中でもCa(II)およびMg(II)は、その他のMg(II)、Co(II)、Cu(II)、Zn(II)、及びPb(II)のような二価カチオンが金属カチオンを含まないTris-HCl緩衝液(pH8.2、0.05M)中でALuc16活性を抑制するのに対し、1.5倍までALuc16活性を高める(非特許文献９、Inouye, S. and Y. Sahara, Identification of two catalytic domains in a luciferase secreted by the copepod Gaussia princeps. Biochem. Biophys. Res. Comm., 2008. 365(1): p. 96-101.)。OLucとGLucにおけるCu(II)およびZn(II)の対応する抑制効果は、以前に報告されている。多価カチオンのうち、Cr(VI)もALuc16の光強度を約２倍に高めた。全体的な光強度順位は降順で以下のように示される：Cr(VI)、Mg(II)、Ca(II)>Ni(II)>Mo(IV)、Cd(II)、Fe(III)、Zn(II) >Mn(II)やその他(Co(II)、Cu(II)、及びPb(II))。
EFハンド構造を結合するための最適な二価カチオンの半径は、Mg(II)(0.81オングストローム)およびCa(II)(1.06オングストローム)の半径の間にあることが決定されている(Snyder, E.E., B.W. Buoscio, and J.J. Falke, Calcium(Ii) Site Specificity - Effect of Size and Charge on Metal-Ion Binding to an Ef-Hand-Like Site. Biochemistry, 1990. 29(16): p. 3937-3943；Ozawa, T., K. Sasaki, and Y. Umezawa, Metal ion selectivity for formation of the calmodulin-metal-target peptide ternary complex studied by surface plasmon resonance spectroscopy. Biochimica Et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1999. 1434(2): p. 211-220.)。EFハンドとその変異体は、Ca2+のほかに多価カチオンとの幅広い相互結合親和性を有することが知られている(Rowe, L., M. Ensor, and S. Daunert, EF-hand Ca2+-binding bioluminescent proteins: Effects of mutations and alternative divalent cations - art. no. 64490T. Genetically Engineered and Optical Probes for Biomedical Applications IV, 2007. 6449: p. T4490-T4490.；Falke, J.J., et al., Quantitating and Engineering the Ion Specificity of an Ef-Hand-Like Ca2+ Binding-Site. Biochemistry, 1991. 30(35): p. 8690-8697.；Gifford, J.L., M.P. Walsh, and H.J. Vogel, Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs. Biochemical Journal, 2007. 405: p. 199-221.)。半径範囲を考慮すると、試験された金属カチオンのほとんどは潜在的にEFハンド構造に結合する。当面のカチオン駆動型のALuc16活性の特徴は以下のように説明することができる：(ｉ)カチオンであるCa(II)とMg(II)は、直接ALuc16のEFハンド様構造を結合し、光強度を変調する、(ii)多価カチオンは、酵素反応で活性化エネルギー(Ea)を減らす結果、nCTZの遷移状態におけるアミドアニオンを安定化させることができる、または(iii)上記の効果は相乗的にALuc活性の上昇に寄与する。相乗効果は、Cr(VI)によるALuc16の光強度上昇を考慮すると、多価カチオンとが妥当である。
現在までに、多価カチオンとルシフェラーゼ活性との相関関係は十分には検討されていない。いくつかの研究ではこの問題を扱っているが、作用メカニズムは不明なままである。 Rodionovaらは、Ca(II)、Mn(II)、およびMg(II)がシベリア発光ミミズFridericia heliotaから得られたFridericiaルシフェラーゼの活性を上昇させることを報告した(Rodionova, N.S. and V.N. Petushkov, Effect of different salts and detergents on luciferin-luciferase luminescence of the enchytraeid Fridericia heliota. Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology, 2006. 83(2): p. 123-128.)。しかし、Mn(II)によるブースト効果は、このALuc16では観察されなかった。OLucにおける結果は、以前にInouyeらによって報告された、彼らはいくつかの多価カチオン(Ca(II)、Mg(II)、Cu(II)、Zn(II)及びCd(II))のOLucへの影響を評価した。そこでは、一価カチオンはOLucの光強度にほとんど影響を与えなかったが、対照的に、Cu(II)、Zn(II)及びCd(II)は光強度を阻害した。
Pb(II)の阻害効果は、さらに長期の濃度範囲(図７)で調べた。用量応答曲線は、ALuc16活性がPb(II)の濃度を上昇させることによって迅速に阻害されることを示す。ネガティブコントロールとしての溶媒(Tris-HCl、pH8.2)によっては阻害されなかった。線形範囲は1-100μg/mLの間であった。光強度は、Pb(II)で1μg/mLまで素早く減衰した(図７)。この結果は、カラム精製されたALucが多価金属カチオンへの特異的な金属カチオン選択性と感度を示す新規な光センサーであることを示している。【００９９】
金属カチオンは、生物発光スペクトルにほとんど影響を及ぼさない
本発明者らはさらに、生物発光スペクトルにおける金属カチオンの寄与を調べた。我々が、生物発光スペクトルの金属カチオン駆動型分散を調べたところ(図６(Ｂ))、図６に示された効果的な金属カチオンが選択された、すなわち、Ca(II)、Fe(III)、Ni(II)、Zn(II)、Mg(II)又はCr(VI)。しかし、我々の推測とは対照的に、金属カチオンでスペクトルのシフトはほとんど見られなかった。例えば、Ca(II)およびNi(II)は、スペクトルのたった2 nmのブルーシフトおよび4nmのレッドシフトを誘導した。スペクトルにおける金属カチオンの無視していい程度の影響は、多価カチオンがALucsの発光の化学反応においてnCTZの中間体の電気的状態を調節しないことを示唆している。【０１００】
（実施例４）
＜実験＞
光強度の長期安定性は、図６(Ａ)のものと同じ方法を用いて推定した(図８(Ａ))。マイクロプレートは、LAS-4000のチャンバー内に配置し、光強度は基質の注射後、60分間、5分毎に観察した。
＜結果と考察＞  Ca(II)はALuc活性の長期安定性に寄与する
ルシフェラーゼの長期安定性は、バイオアッセイで生物発光マーカーのための重要な決定要因である。そのためALuc活性へのブースト効果から、我々は、カチオン駆動の長期安定性のためにCa(II)、Mg(II)とCr(VI)を選択した(図８)。対照的な効果はCa(II)とMg(II)の効果の比較で見出された。Ca(II)およびMg(II)の両方が光強度を高めるが、唯一Ca(II)は、濃度依存的に生物発光強度を延長した(図８(Ａ))。Ca(II)はnCTZ注射後13分間、初期光強度の60％を維持し、さらに60分後でも光強度の4％を保持した(図８(Ａ)、光学像)。対照的に、Mg(II)濃度は依存的にALuc活性を上昇させるが、めったに長期的な安定性に影響を与えない(図８(Ａ)及び図９(Ｂ))。
長期安定性は、Ca(II)がALuc16の構造的堅牢性を変化させることを示唆している。そこで我々は、Ca(II)がALuc16のEFハンド様構造を結合し、ALucsの光強度の長期化をサポートしていることを推測している。【０１０１】
金属カチオン混合ALuc16の円偏光二色性(CD)測定
円偏光二色性(CD)測定は、さらにALuc16活性のカチオン駆動の劣化を推論するために行われた(図９)。試料はPb(II)又はAl(III)とカラム精製と透析されたALuc16が様々な濃度で混合されたものを調製し、調製後、CD分光計(JASCO、日本)を用いて測定された。
222nmレベルでのCDスペクトルのモル楕円率すなわちα-ヘリックス部の変化がAl(III)濃度の上昇によって徐々に減少する。同様の特徴は、Pb(II)でも観察された。1μg/mL以上のPb(II)レベルで、基礎ノイズスペクトルを示した。全ての結果は、Pb(II)及びAl(III)等の金属カチオンがALuc16の三次構造を破壊し、分解に至ることを示唆している。【０１０２】
（実施例５）分子歪みセンサー
プラスミドの設計
本発明者らはPPIsを感知することが可能な分子歪みセンサーとして、それらの可能性を評価するためにデザインされた２３種類の異なる分子をエンコードするDNAコンストラクト群(series)を作製した(表３)。TPv1とTPv2シリーズのプローブの基礎的な分子コンストラクトは、N末端からそれらのタンパク質成分の番号順に異なる。cDNAコンストラクトの概略図は図１０(Ｂ)と図１１に示してある。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のテンプレートとして、以下のコンポーネントをエンコードするcDNAは、対応するプロバイダーから入手した：ウミシイタケルシフェラーゼ８(RLuc8)はGambhir教授より譲渡していただいた；ALucs16、23、24、30は我々の以前の研究から得られた(非特許文献４、７)；ヒトFKBP(12kD、Genebank access number: AAP36774.1)とFRB(11kD、PDB access number: 1AUE_A)は公開されているデータベース(NCBI)の配列情報に基づいて、Europins Genomics(東京)によって注文合成された；ヒトエストロゲン受容体(ER LBD、305-550 AA)のリガンド結合ドメインとSH2ドメインであるν-Srcは我々の以前の研究から得られた(非特許文献１１)。
【表３】
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表３に示されたコンポーネントをエンコードするcDNA断片の一群は、特異的な制限サイトを導入するために対応するプライマーを用いてPCRによって作製された。特異的な制限サイトとは、5’末端と3’末端がそれぞれHindIII/BamHI、BamHI/KpnI、もしくはKpnI/XhoIである。プローブコンポーネントにつながるリンカーは、プローブ内の分子内歪み(intramolecular tension)を効率的に開発するために最小限にされた。cDNA断片は、対応する制限酵素(NEB)によって切断され、ライゲーションキット(Takara Bio)でライゲートされ、最終的に、pcDNA3.1(+)哺乳類発現ベクター(Invitrogen)へHindIIIとXhoIサイトを用いてサブクローニングされた。プローブは、分子デザイン(表３)に基づいて５つのグループ(TPv0、TPv1、TPｖ2、TPｖ3とTPｖ4群)に分けられた。
TPv1とTPv2シリーズのプローブをエンコードするcDNAコンストラクトは、5’末端からの断片の順番が異なっている(図１０(Ｂ))。TPv3シリーズプローブをエンコードするコンストラクトは、それらがALuc23をエンコードするcDNAセグメントを短縮型C末端に持つということでその他と比較して、特徴づけられる。TPv4シリーズプローブをエンコードするコンストラクトが一般的に使用されている現存のプローブデザインとその他のPPIモデルとを調査するために設計されたのに対して、TPv0シリーズプローブをエンコードするコンストラクトはネガティブコントロールを確認するために設計された。
全てのコンストラクトのDNA配列は、DNA配列シーケンサー(GenomeLab GeXP, Beckman Coulter)により確認された。【０１０３】
分子TPsのための光学分子デザインの進化
１６種類の分子デザインは、効率的な分子TPsを設計するために調べられた(図１０(Ｃ))。
アフリカミドリサル肝臓由来のCOS-7細胞は、10%  牛胎児血清(FBS; Gibco)と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含んだDulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)を用いて、96穴プレート(Nunc)で37℃の細胞培養器(5% CO2；Sanyo)中で培養された。プレート上の細胞は、TPv1やTPv2シリーズプローブをエンコードするベクターの一つであるpcDNA3.1(+)の溶液(0.2μg/well)とリポフェクション試薬(TransIT-LT1；Mirus)を用いて、図１０(Ｃ)で明記されているように一過性トランスフェクションされ、先の実験に進む前に、5% CO2条件下で37℃、16時間培養された。
プレートの細胞は、コントロール(0.1%エタノールを培養培地に溶かしたもの)もしくは10-6Mラパマイシンで4時間刺激され、その後、溶解試薬(Promega)で溶解された。溶解液の一部(10μL)は、新しい96穴オプティカルボトムプレート(Thermo Scientific)に移され、同時に、マルチチャンネルピペット(Gilson)でnative coeloenterazine(nCTZ)を含むアッセイ溶液(Promega)10μLと混合された。プレートは直ちに冷却CCDカメラ(-25℃)が装備されたイメージアナライザー(LAS-4000；FujiFilm)のチャンバーにセットされた。光強度は、イメージ取得ソフト(Image Reader V2.0)で計測され、特定イメージ分析ソフト(Multi Gauge v3.1)で分析された。
発光強度は、相対的な発光輝度(RLU)の倍数発光輝度、すなわち、RUL ratio(+/-)で表現される。RLU(+)とRLU(-)はそれぞれ、ラパマイシン有と無の状態で培養後の1μgの細胞溶解物の発光強度である；RLUは、イメージアナライザーで作製した光子数の増幅値である。
相対光スペクトラは、ラパマイシンの存在状態もしくは不在状態で測定された(図１０C, inset a)。TPv2.4によって発現したCOS-7細胞は、10-5Mラパマイシンで4時間刺激され、溶解試薬で溶解された。溶解液5μLは、nCTZを含む35μLのアッセイ試薬(Promega)と200μLマイクロチューブ中で混合された。相対光スペクトラは、ワンショットで全光をキャプチャー出来る冷却電化結合素子(CCD)カメラを装備した高精度分校即光計(AB-1850; ATTO)で30秒積分された。【０１０４】
タンパク質間相互作用(PPIs)による分子歪み下の蛍光はそれらの光強度を強める
分子間PPIsによって誘導される発光分子歪みの可視化の為に、一連の生物発光プローブがデザインされた(図１０(Ｃ))。
16個のデザインされた候補プローブのいくつかは、光強度の有意な強化、もしくは抑制をラパマイシンに対して示した：TPv1.3やTPv1.7が10-6 Mラパマイシンに反応して光強度が1/3に抑制されたのに対して、TPv2はvehicle(1%エタノールを含む培養培地)単体と比較して10-6 Mラパマイシン存在下で、生物発光強度の6.7倍の増加を示した。TPv2.7とTPv2.8は、同じリガンドによる刺激に対して約2倍強い生物発光という結果だった。
相対光強度は、TPv2.4を持つCOS-7細胞において、vehicle(0.1%エタノール)もしくは10-6Mラパマイシンによる刺激で得られた。スペクトラの光強度は、ラパマイシンによって大いに強化され、最大光強度(λmax)は約530nmで確認された。すべての発光の約13%は高い組織透過性を示し、通常「光学窓」と呼ばれる赤色と近赤外線領域の600nmよりも長波長に存在した(図１０(Ｃ), inset a)。【０１０５】
分泌タンパク質(SP)包埋型と欠損型プローブは典型的なリガンド感受性を示す
カイアシ類ルシフェラーゼが、N末端領域の変化の多い領域とそのそばにある２回繰り返しの鏡像様触媒型ドメインによって成り立つことは多重整列によって以前から予測されていた(非特許文献７Inouye, S. and Y. Sahara, Identification of two catalytic domains in a luciferase secreted by the copepod Gaussia princeps. Biochem. Biophys. Res. Comm., 2008. 365(1): p. 96-101.、)。変化の多いドメインはN末端で独特な分泌タンパク質(SP)を成す(非特許文献６)。
16個の分子デザインのSP包埋型とSP欠損型プローブのリガンド感受性を比較することは興味深い(図１０(Ｃ))。(ｉ)SPを持つ分子デザインは全て、光強度を上昇させることに失敗した、(ii)SP包埋型のプローブ(TPv1.1、TPv1.3、TPv1.7とTPv2.1)においてのみ、有意な光強度の減衰が確認された。
TPsにおけるSPsの役割はいまだにはっきりしないが、これらの結果は、SPsがプローブ内部において天然の可動性リンカーとして働いていることを示唆しており、したがって、FKBP-FRB相互作用によって強まった分子内歪みを弱めるのであろう。リンカーの最短長がルシフェラーゼを挟んだ分子内歪みを効率的に誘導するためのプローブドメインの間に適していたというリンカーの長さの観点で以前に議論された(Kim, S.B., M. Sato, and H. Tao, Molecular Tension-Indexed Bioluminescent Probe for Determining Protein-Protein Interactions. Bioconjugate Chem., 2009. 20(12): p. 2324-2330)。
これらすべての結果は以下のことを示す。(ｉ)ルシフェラーゼは光学的変異が些細であるにも関わらず、タンパク質―タンパク質相互作用によって誘導された分子内歪みに反応したそれらの酵素的活性を調節する内因性の特質をもっているであろう。(ii)分子内歪みへのプローブの感受性は、ルシフェラーゼの可動領域を含む分子デザインと可動性リンカーの長さによって支配される。【０１０６】
（実施例６）
TPv2.4のリガンド依存的な発光輝度の増加
TPv2.4の発光輝度のリガンド依存性を調べるために、ラパマイシン濃度を変えながらTPv2.4の発光輝度を測定した(図１２(Ａ))。まず、TPv2.4を発現するCOS-7細胞を以下の要領で準備した。まず、細胞をエタノール0.1%水溶液(コントロール)または10-9から10-4M範囲のラパマイシン刺激を4時間行った。その後、細胞はライシスバッファー(プロメガ)より溶解し、細胞溶解液の一部分(10μL)を96穴プレートの各ウェルに移動した。マイクロプレート上の溶解液に天然セレンテラジン入りのアッセイ溶液(50uL)を同時に加えた。マイクロプレートは即時にイメージアナライザーの暗箱に移しその発光輝度を測定した。得られた発光輝度(相対的発光ユニット；RLU)はタンパク質量(μg)、積算時間(sec)、発光エリア(mm2)で標準化した。従って、ユニットはRLU/μg/s/mm2である。【０１０７】
TPv2.4の発光輝度はラパマイシン定量・依存的に増加した
TPv2.4の発光輝度のリガンド依存性を、ラパマイシン濃度を変えながら測定した(図１２)。0.1％エタノール水溶液(コントロール)に対してバックグラウンド発光を示した反面、ラパマイシン刺激に対して徐々に発光輝度を増し、10-5Mあたりで最大値を示した。一方、ラパマイシン濃度が10-4Mになるとむしろ発光輝度がバックグラウンドレベルまで下がった。このような弱い発光輝度は、恐らく過度なラパマイシン濃度により細胞が死んだ可能性がある。【０１０８】
TPv2.4の分子歪み―発光輝度相関性を証明するためのネガティブコントロール
本発明者らは、さらにラパマイシンにより増加した発光輝度が、リガンド刺激を受けた分子プローブの分子内歪みだけによる現象であるかどうかを検証した。例えば、リガンドに依存した分子間の結合による可能性もありうる(図１１、１２(Ｂ))。
予測しなかった分子間の結合による可能性を排除する検証をするために、我々はTPv0.1とTPv0.2を作りあげた。このプローブには、TP2.4の構造にそれぞれFKBPかFRBが欠損している。このような分子プローブをコードするコンストラクトをpcDNA3.1(+)にサブクローンしその配列の信頼性をDNAシーケンサーにより検証した。
COS-7細胞を96穴マイクロプレートに培養し、各ウェルの細胞に(ｉ) TPv0.1, (ii) TPv0.2, (iii) TPv0.1 plus TPv0.2または (iv) TPv2.4をコードするpcDNA3.1 (+)ベクターを導入した。その細胞をCO2インキュベーターで16時間培養した後、ラパマイシンで４時間刺激した。その細胞を溶解し一定量のライセット(20μL)を96穴マイクロプレート(光検出用プレート)に移した。最後にマイクロプレートの各ライセットに定量の天然セレンテラジン入りのアッセイバッファー(50μL)を同時に加え発光輝度をイメージアナライジャーで各発光輝度を測定した。
TPv2.4の発現量を検証するためにウェスタンブロット実験を行った(図１２(Ｃ))。COS-7細胞にTPv2.4を一過性発現された後、10-6Mラパマイシンで４時間刺激した。その後一定量のサンプルバッファーで溶解した。そのライセットを電気泳動しニトロセルロース紙に移した。その後、各タンパク質をラビット抗FKBP抗体やマウス抗β-アクチン抗体で染めた。その後、それぞれの２次抗体処理をし、最終的にはホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP) 基質溶液 (Immunostar, Wako)で発光させた。【０１０９】
リガンドにより結合したFRBとFKBP間の相互作用、それからその相互作用による分子内歪みのみによりTPv2.4の発光輝度が増加された
(ｉ) TPv0.1 alone, (ii) TPv0.2 aloneまたは(iii) TPv0.1とTPv0.2両方発現する細胞に対して10-6Mラパマイシン刺激を加えても発光輝度が上がらなかった。一方、TPv2.4を発現する細胞の場合、同じ刺激に対して5.4倍発光輝度が増加した(図１２(Ｂ))。
TPv2.4の見かけ上の発現レベルをウェスタンブロット分析により検証した(図１２(Ｃ))。その結果、抗FKBP抗体と抗β-アクチン抗体は45kD近傍で特定的なタンパク質バンドを示した。その分子量の大きさは、TPv2.4とβ-アクチンの予測分子量と一致する。このバンドの濃さはラパマイシン刺激前後で大きい差はなかった。
このネガティブコントロール実験結果は以下のことを示す：(ｉ)ラパマイシンより誘導されたFRBとFKBP間の相互作用は分子歪みを誘発し、ALucの発光輝度を増加する唯一なファクターであった、(ii)分子間タンパク質―タンパク質相互作用はALucの発光輝度を増加させなかった、(iii)10-6MのラパマイシンそのものはALuc活性を増加または阻害できない、(iv)ウェスタンブロット結果は、TPv2.4が確かに発現されており、その発現量がラパマイシン刺激により大きく偏ることはない。【０１１０】
（実施例７）
タンパク質―タンパク質間相互作用を可視化するためのコンビナショナルプローブの開発
前述したTPv2.4の成功を基に、分子歪みセンサーの利点とタンパク質断片相補アッセイの利点を融合したコンビナショナルプローブの開発を行った(図１３、１４)。
本発明者はTPv2.4の中で、ALuc23のＣ末端配列がFRBPのＮ末端と高い相同性を示す点に注目した(図１３(Ａ)、挿入図ａ)。この情報を基に、TPv2.4の中のALuc23のＣ末端にあるアミノ酸配列を幾つか削った形態の発光プローブを開発し、TPv3.1、TPv3.2、TPv3.3 と名付けた(表３、図１４(Ｂ))。この作業は全長ALuc23のDNAを、3’末端を削ったALuc23のDNAに代える作業より得られた。
上述したTPv3シリーズのプローブ(即ち、TPv2.4、TPv3.1、TPv3.2、TPv3.3)の何れかを発現するCOS-7細胞を96穴透明底プレートに他の実験と同様の方法で培養した(図１３(Ｂ))。この細部にコントロール(0.1％エタノール)か10-6Mのラパマイシンで４時間刺激し、その後細胞ライセットを作りそこから出る発光強度を上述したイメージアナライザーで測定した。
コンビナショナルプローブは改善されたシグナル対バックグラウンド(S/B)比を示した：上述したように、分子歪みセンサーとタンパク質相補アッセイの両特徴を併せ持つ一連のコンビナショナルプローブを作成した(図１３)。
ALuc23のC末端のアミノ酸を順次に削ったことで、プローブ発光輝度も順次に弱くなった(図１３(Ｂ))。最大のS/B比を示したTPv3.3は最も短いALuc23(18-198 AA)を含有しているものであった。このように改善されたS/B比はラパマイシンより強くなった発光輝度よりは、バックグラウンド輝度が大幅に減たことで得られた。実際にコントロール(0.1％エタノール)刺激により出たTPv3.3の発光輝度は、バックグラウンドとさほど差がなかった(図１３(Ｂ)、挿入図ａ、点線)。この結果は、(１)まず分子歪みセンサーの利点とタンパク質断片相補アッセイの利点を融合したコンビナショナルプローブが実際に作れることを実証している。また、(２)一定の最適化プロセスを経ることにより、分子歪みセンサーとタンパク質相補アッセイが持つ一般的な利点を考えた場合、コンビナショナルプローブがより強い発光輝度とＳ/Ｎ比を得ることもできると思われる。【０１１１】
（実施例８）
TPv2.4の輝度と経時変化の基質依存性
TPv2.4の輝度と経時変化の基質依存性を、ラパマイシン有り無しの条件で測定した(図１５)。
COS-7細胞を96穴プレートに培養し、細胞にTP2.4をコードするpcDNA3.1(+)ベクターを一過性導入した。その後２日間培養した。ラパマイシン10-6Mで4時間刺激した後、各ウェルの細胞を細胞溶解バッファー(50μl)で20分間溶かした。その後、定量のライセット(10μL)を96穴透明ボトムプレートに移した。別途、約10種類のセレンテラジン類似体(基質、25μg)を25μLエタノールに溶かした。その溶液をさらにアッセイバッファー(Promega)で10倍希釈し最終濃度0.1μg/μLの溶液を作り上げた。これを基質溶液と名付けた。マルチピペットを用いて、この基質溶液50μLをプレート上のライセット溶液に一斉に導入し、直ちにイメージ分析機(LAS-4000, FujiFilm)に移して5分刻みで30秒積算時間モードで光測定を行った。
本研究で測定したセレンテラジン類似体は、Promokine社の「セレンテラジンサンプラーキット」から9種類であった。即ち、native coelenterazine (nCTZ), coelenterazine h (CTZ h), coelenterazine f (CTZ f), coelenterazine i (CTZ i), coelenterazine n (CTZ n), coelenterazine cp (CTZ-cp), coelenterazine hcp (CTZ hcp), coelenterazine fcp (CTZ fcp), coelenterazine ip (CTZ ip)。【０１１２】
TPv2.4は強い発光輝度のためには、nCTZ, CTZ h and CTZ fを好む
TPv2.4の基質選択性と経時変化特性を様々なセレンテラジン類似体を持って調べた(図１５)。
TPv2.4のための最も強い生物発光強度は、nCTZ, CTZ h and CTZ fの場合に観察された(図１５(Ａ))。例えば、その絶対発光輝度は、CTZ iの場合に比べて４から５倍強かった。一方、基質の中でもCTZs hcp, fcp, and ip類は、発光輝度が弱くバックグラウンドに近い発光輝度を示した。より精密な分析のために「化学構造−輝度相関性」を調べたところ、発光輝度はセレンテラジンのC-2位置にある側鎖のサイズに依存していることが分かった。即ち、この位置の側鎖のサイズは、CTZ n, CTZ i, CTZ f, CTZ hの順で小さくなるが、輝度においては大体この順で強くなる。CTZ cp, CTZ hcp, CTZ fcp, CTZ ipの弱い発光輝度は、セレンテラジンC-8位置の側鎖により説明できる。本発明者の人工生物発光酵素(ALuc)の基質依存性に関する以前研究からも同様の結果を得ている(非特許文献７)。この先行研究でも発光輝度はCTZ n, CTZ i, CTZ f, CTZ hの順で上がっていた。
天然のセレンテラジンより長い発光輝度持続性は、CTZ n, CTZ iを用いた場合に観察できた(図１５(Ｂ))。CTZ iの発光半減期は基質導入から約15分ころである。一方、CTZ nの場合は、基質導入から20分が経っても初期発光輝度の６割程度温存していた。
分子歪みセンサー(TP)が示す上記結果は以下のように解析できる。(１)基質の発光輝度と安定性は基本的にC-2、C-6、C-8番側鎖における官能基のサイズ効果により支配される。(２)セレンテラジン類似体のC-2は発光輝度と持続性を決める最も重要なサイトである。(３)セレンテラジンのC-8位置は、基質が分子歪みセンサー(TP)を認識するために保存されているところであり、どのようなC-8位置の変化も、基質の分子歪みセンサー(TP)認識を妨げる。【０１１３】
（実施例９）
TPv2.4を持つCOS-7細胞の生細胞イメージング
多チャンネルマイクロスライド(μ-slide VI0.4, ibidi)にTPv2.4を発現する生きたCOS-7細胞の生物発光イメージングを行った。まずCOS-7細胞を６チャンネルマイクロスライドに培養し、細胞にTPv2.4をコードするpcDNA3.1(+)ベクターを一過性導入し、2日間培養した。その細胞の左と右の３つのチャンネルにはそれぞれコントロール(0.1％エタノール)か10-6Mのラパマイシン刺激を４時間行った。その後、スライド内の培養液を基質(ネイティブセレンテラジン)が含有しているHBSSバッファーに交換した。その後、直ちにスライドをイメージ分析装置のチャンバー内に移して5分刻みで30秒積算モードで発光イメージを測定した。【０１１４】
本プローブの概念を汎用性を調べるために他のタンパク質―タンパク質間結合モデルへの適用
TPv2.4をさらに改変することにより、当該概念が他のタンパク質―タンパク質間結合モデルに一般的に適用できるかどうかを試した(図１６(Ｂ))。
TPv2.4内のFRBとFKBPをコードするDNAをそれぞれER LBDとSH2ドメインに交替してTPv4.1に名づけた。リン酸化されたER LBDとSH2ドメイン間の結合は、哺乳類細胞内のERの典型的なノンゲノミックシグナル機構を代表する。別途、TPv2.4にあるALuc23 (18-212 AA)のcDNAをRLuc8のcDNAに代えた物をTPv4.2と名付けた(表３、図１１、１６(Ｂ))。生物発光輝度は上述したように基質としてnCTZを用いたイメージ分析により測定した【０１１５】
TPv2.4は生細胞におけるリガンド依存的な生物発光増加を誘発する
小動物モデルにおける生物発光イメージングは医学・薬学分野で魅力的なテーマである。本発光プローブの生体応用可能性を、TPv2.4を発現する生きたCOS-7細胞を用いて試した(図１６(Ａ))。
10-6Mのラパマイシンで刺激した右の3チャンネルだけが、コントロール(0.1% ethanol)刺激の左3チャンネルに比べて約6倍の強い発光を示した。このモデル研究で示す高いS/B比結果は、TPv2.4を発現する生きた哺乳類細胞を生きた動物の特定臓器に移植し、そこでラパマイシン活性を生物発光強度で確認できることを意味する。【０１１６】
分子歪みセンサの基礎概念は他のタンパク質―タンパク質結合モデルにも一般的に適用できる
この分子歪みセンサーの概念の汎用性を以下のタンパク質―タンパク質結合モデル(PPI)で試した：即ち(ｉ) TPv4.1 (ER LBD-ALuc23-SH2)では、17β-estradiol (E2)がER LBDとSH2との結合を促進する;(ii) TPv4.2 (FRB-RLuc8-FKBP)の中ではラパマイシンがFRBとFKBPの結合を促進する。【０１１７】
（実施例１０）
新規人工生物発光酵素の作製及び発光活性評価
新規人工生物発光酵素群を樹立するために、公知のWebLogo Displayソフト(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)を用いて、天然の生物発光酵素群のアミノ酸配列から頻度の高いアミノ酸を抽出した(図１７)。その結果、アミノ酸配列中の一部の配列を欠損させた場合であっても、発光を可能とする酵素群を見出した。頻度の高いアミノ酸が浮き彫りになり、この配列を繋ぎ合わせることによりALuc41からALuc51番に至る発光酵素群を開発した。また、既存のALucの骨格に、ALuc41番代のアミノ酸配列を参考にした新規人工生物発光酵素群(ALuc51―ALuc57)を開発した。その具体的な配列は図１８−１で示した。図１８−２は、今回新規合成した人工生物発光酵素群の相対的な遺伝系統図を示す。この相対的な遺伝系統図は、CLUSTALW 2.1により計算した。
96穴マイクロプレートを用いてアフリカミドリサル腎臓由来のCOS-7細胞を培養した。COS-7細胞を培養プレートの底面面積の９割を占めるまで増殖させ、図１９と図２０で示したように、各発光酵素をコードするpcDNA 3.1(+) vector(Invitrogen)をそれぞれlipofection試薬(TransIT-LT1, Mirus)より一過性導入した。その後、１日程度さらに培養した。培養後、細胞溶解剤(Lysis buffer, Promega)を用いて細胞溶解液を作り、各ウェルからそれぞれ細胞溶解液を5μLずつ取って計測用の96穴マイクロプレートに移した。マルチチャンネルピペットを用いて、天然のセレンテラジンが含有されているアッセイバッファー(50μL)を各ウェルに同時に添加した。アッセイバッファーを添加後直ちにイメージアナライザー(LAS-4000, FujiFilm)の暗箱に入れて、CCDカメラより発光イメージを測定した(図１９、２０)。
その結果、何れの新規人工生物発光酵素も従来の天然型ルシフェラーゼ等と比較して高い発光活性を持つことが分かった。とりわけALuc45、ALuc49、ALuc50などは、従来のALuc(例えば、Aluc16、ALuc30)と比較してもさらに強い発光輝度を示すことが確認できた。一方で、ALuc41、ALuc46、ALuc47などは従来のALuc(例えば、Aluc16、ALuc30)と比較して、相対的に低い発光輝度を示した。【０１１８】
（実施例１１）
生物発光プローブの金属陽イオン効果
生物発光プローブの金属イオン効果を、精製した生物発光プローブを用いて調べた(図２１、２２)。
まずこの実験のために、N末端とC末端にFRBとFKBPというラパマイシン結合タンパク質を配置しその間に人工生物発光酵素(ALuc23)を挿入した独特な分子プローブを開発した(図２１)。本プローブは、ラパマイシン有りの条件でFRBとFKBP間の分子内タンパク質―タンパク質間相互作用が起こり、そのためFRBとFKBPの間にあるALuc23に分子歪みがかかる。その結果、発光輝度が強くなる。
分子歪みセンサーをコードするpOPTHMベクターを大腸菌に導入し、融合タンパク質を発現させた(図２１)。その後、融合タンパク質をHisタグアフィニティ―カラムで精製し純粋な分子歪みセンサーを抽出した。この純粋な分子歪みセンサーのリガンド感受性を確認するために、ラパマイシン有り無しの条件で分子歪みセンサーの発光輝度を調べた。その結果、ラパマイシン有りの条件でより明るく発光した(図２１(Ｂ))。
さらに、本分子歪みセンサーの金属イオン効果を測定するために、ラパマイシン有り無しの条件、および様々な金属イオン添加による発光輝度の変化を測定した(図２２、２３)。
この実験のために、精製した分子歪みセンサーの濃度をTris-HClバッファー(pH8.2)に希釈することで0.1mg/mLになるように合わせた。この分子歪みセンサーにラパマイシンを加え最終濃度が10-5Mになるように調整した。その後、金属イオン入りのTris-HClバッファー(pH8.2)より希釈することで、0.01mg/mLの分子歪みセンサー溶液を調整した。この際、加えた金属イオンの最終濃度は10μg/mLであった。この溶液を96穴マイクロプレートに移し、マイクロインジェクターより基質溶液を添加しながら、金属イオンの有り無しの違いによる発光輝度を測定した。
同様の手法で、異なる金属イオン濃度に依存した発光プローブの発光安定性を調べた(図２３)。前記同様にマイクロインジェクターより基質溶液を添加した後、1分間の発光輝度の変化を測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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