(57)【要約】  本発明の課題は、低酸素状態のみならず様々な誘因による血管バリアー破綻に対して作用する神経系血管バリアーの破綻抑制剤及び神経系疾患治療剤を提供することである。解決手段として、（ａ）ベイシジン（basigin）遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；（ｂ）ベイシジンの生理活性を消失又は減退する機能性核酸；（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；のいずれかを有効成分とする神経系血管バリアーの破綻抑制剤又は神経系疾患治療剤を調整する。神経系疾患としては、脳神経系疾患又は網膜神経系疾患が好ましい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分とする神経系血管バリアーの破綻抑制剤。
（ａ）ベイシジン（basigin）遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；
（ｂ）ベイシジンの活性を消失又は減退する機能性核酸；
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；
【請求項２】
ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸がｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載の神経系血管バリアー破綻抑制剤。
【請求項３】
ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸が、配列番号１に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号２に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡ、又は、配列番号３に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号４に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項２記載の神経系血管バリアー破綻抑制剤。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分とする神経系血管バリアーの破綻に起因する神経系疾患治療剤。
（ａ）ベイシジン（basigin）遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；
（ｂ）ベイシジンの活性を消失又は減退する機能性核酸；
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；
【請求項５】
神経系疾患が、脳神経系疾患又は網膜神経系疾患であることを特徴とする請求項４記載の神経系疾患治療剤。
【請求項６】
神経系疾患が、脳浮腫又は網膜浮腫であることを特徴とする請求項５記載の神経系疾患治療剤。
【請求項７】
ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸がｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項４〜６のいずれか記載の神経系疾患治療剤。
【請求項８】
ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸が、配列番号１に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号２に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡ、又は、配列番号３に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号４に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項７記載の神経系疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は低酸素状態のみならず様々な誘因による神経系血管バリアー破綻に対して作用する神経系血管バリアー破綻抑制剤及び神経系疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
成体の神経組織（脳、網膜、脊髄など）では、血液と神経組織の間に血管バリアー（血液脳関門、血液網膜関門など）が形成され、神経細胞が正常に機能できる至適組織微小環境が維持されており、組織特異的に分化した血管系が有するバリアー機能により他組織から区画化されている。成体神経組織の血管バリアー機能は個体発生過程において誘導されるが、いったん誘導された血管バリアー機能も常に一定の状態にあるわけではなく、成体は血管バリアー機能を増強したり減弱させたりすることにより、神経細胞が正常に機能するための至適微小環境を維持している。一方、虚血性脳疾患などの難治性神経系疾患においては、血管バリアー機能が破綻し組織微小環境の撹乱が生じることが、病態を悪化させる大きな要因として働いている。したがって、血管バリアー機能の調節因子は、それら難治性疾患の病態悪化を妨げるための新規治療法開発の標的となることが期待される。【０００３】
神経系血管バリアー機能の本体は、血管の内皮細胞間に形成されるタイトジャンクション（tight junction：以下、ＴＪ）網に依存することから、ＴＪ構成分子を研究することが、血管バリアー調節機構の解明に向けた戦略の中心となっている。ＴＪ構成分子としては、occludin、claudin（２７メンバーからなるファミリーを形成）、junctional adhesion molecule A (ＪＡＭ−Ａ)などが特定されているが、生理的状態の神経系血管内皮細胞の細胞膜に発現・局在しているクローディン−５（claudin-5：claudin family membersの一つ）が血管バリアー機能に必須であることが報告されている（非特許文献１参照）。また、本発明者らは、１）難治性神経系疾患の血管内皮細胞の細胞膜からのクローディン−５の消失、２）血管バリアー機能の破綻、３）病態悪化、というカスケードを報告した（非特許文献２参照）。しかしながら、血管バリアー機能の制御機構については、いまだ多くが不明のままである。【０００４】
神経系血管バリアーの破綻は、神経毒性分子の組織内侵入を許すとともに、血漿成分の浸出による組織浮腫を惹起する。浮腫が一定期間を超えて持続すると神経系組織に不可逆的な障害が加わる。現在の医療では、血管バリアー破綻による脳浮腫に対しては、グリセオールの静脈内投与により血漿膠質浸透圧を上げ、組織間質液を血管内に移動させる治療が主流となっている。副腎皮質ステロイド投与も浮腫に有効との考えもあるが、その浮腫軽減機構は明らかではなく、副作用も多く併発することから治療適応は狭い。【０００５】
また、難治性神経疾患において血管バリアーを破綻させる種々の誘因が知られているが、本発明者らは、誘因として組織低酸素状態に焦点を当てた解析を行い、ＡＤＡＭ１２及びＡＤＡＭ１７を血管バリアー破綻の責任因子として特定し、それらを標的とした治療薬の有用性を示した（特許文献１、非特許文献３参照）。ＡＤＡＭ１２及びＡＤＡＭ１７を標的とした治療薬は、主として低酸素状態を誘因とした血管バリアー破綻に対して有用である。【０００６】
一方、多くの神経系疾患における血管バリアー破綻には低酸素状態が誘因として働くものの、実際には、低酸素状態以外の種々の誘因が混在して血管バリアー破綻に関与している。そのため、ＡＤＡＭ１２及び／又はＡＤＡＭ１７を標的とした治療薬は神経系疾患の病態改善に寄与するが、血管バリアー破綻の抑制が完全ではない可能性が残る。そこで、低酸素状態のみならず様々な誘因による血管バリアー破綻に対して作用する神経系疾患治療薬が求められていた。【０００７】
ところで、ベイシジンは細胞膜に局在するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質であり、ＥＭＭＰＲＩＮ（extracellular matrix metalloproteinase inducer）、ＣＤ１４７（cluster of differentiation 147）、ＨＴ７、ＯＸ−４７とも称されている。かかるベイシジンをターゲットとするｓｉＲＮＡがＭＭＰ−９を減少させること、及び、ベイシジンをターゲットとする抗体が、肝細胞がんと共培養したヒト繊維芽細胞におけるＭＭＰ−２を増減させること（特許文献２参照）や、ベイシジン抗体が、がんや炎症性疾患の診断、治療に用いることができること（特許文献３、４参照）や、ベイシジン抗体が、血管新生に関与する悪性疾患の診断又は治療に用いることができること（特許文献５、６参照）が報告されているが、ベイシジンと血管バリアー破綻との関係は示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１７４８３４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１３／１５０５１８号パンフレット
【特許文献３】特開平６−２２５７６３号公報
【特許文献４】中国特許出願公開第１０４０８６６５４号明細書
【特許文献５】特表２０１２−５０６３６９号公報
【特許文献６】特表２００７−５３０５３８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nitta T, et al. J. Cell Biol.(2003) 161:653-660
【非特許文献２】Koto T, et al. Am. J. Pathol.(2007) 170:1389-1397
【非特許文献３】Cui D, et al. Sci. Rep. 5:12796(2015) doi:10.1038/srep12796
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、低酸素状態のみならず様々な誘因による血管バリアー破綻に対して作用する神経系血管バリアーの破綻抑制剤及び神経系疾患治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、多くの神経系疾患において血管バリアー破綻の誘因として存在する組織低酸素状態に焦点をあてた解析を行い、血管内皮細胞に発現しているＡＤＡＭ１２とＡＤＡＭ１７が低酸素刺激による血管バリアー破綻の責任因子として特定し、それらを標的とした治療薬の有用性を示した。しかし、低酸素状態以外にも血管バリアー破綻の誘因は存在し、多くの神経系疾患においては、それらの誘因が混在して血管バリアー破綻を来たすと考えられる。ＡＤＡＭ１２とＡＤＡＭ１７は、主として低酸素状態を誘因とした血管バリアー破綻に関与する因子であることから、もしも様々な誘因による血管バリアー破綻に共通した責任因子を特定できれば、多くの神経系疾患に適応可能なより汎用性の高い新規治療法の確立が期待されると考え研究を進めた。そして、低酸素状態と共に炎症などの誘因による血管バリアー破綻に共通する責任因子としてベイシジン（ｂａｓｉｇｉｎ）に着目した。ベイシジンが報告されて約３０年間が経過する（当初はＨＴ７として報告；[Risau W, et al. EMBO(1986) J. 5, 3179-3183）。多くの研究者によるベイシジンの解析にも拘わらず、その血管バリアーにおける機能は不明のままである。これまでの解析は全て、「血管バリアー形成内皮細胞に特異的に発現している分子」は「血管バリアー機能を誘導し維持するために働く分子」との視点に立ったものであった。そこで、本発明者らは、発想を逆転し、「血管バリアー形成内皮細胞に特異的に発現している分子」は「必要な時に血管バリアーを開くために働く分子」ではないかとの仮説を立て、本発明の研究計画の着想に至り解析を進めた。その結果、神経系血管内皮細胞に発現するベイシジンは、種々の誘因による血管バリアー破綻に共通した責任因子であること、神経系疾患における治療標的として有用であることが明らかとなり、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、以下に示すとおりのものである。
［１］以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分とする神経系血管バリアーの破綻抑制剤。
（ａ）ベイシジン（basigin）遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；
（ｂ）ベイシジンの活性を消失又は減退する機能性核酸；
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；
［２］ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸がｓｉＲＮＡであることを特徴とする上記［１］記載の神経系血管バリアーの破綻抑制剤。
［３］ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸が、配列番号１に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号２に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡ、又は、配列番号３に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号４に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡであることを特徴とする上記［２］記載の神経系血管バリアーの破綻抑制剤。
［４］以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分とする神経系血管バリアーの破綻に起因する神経系疾患治療剤。
（ａ）ベイシジン（basigin）遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；
（ｂ）ベイシジンの活性を消失又は減退する機能性核酸；
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；
［５］神経系疾患が、脳神経系疾患又は網膜神経系疾患であることを特徴とする上記［４］記載の神経系疾患治療剤。
［６］神経系疾患が、脳浮腫又は網膜浮腫であることを特徴とする上記［５］記載の神経系疾患治療剤。
［７］ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸がｓｉＲＮＡであることを特徴とする上記［４］〜［６］のいずれか記載の神経系疾患治療剤。
［８］ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸が、配列番号１に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号２に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡ、又は、配列番号３に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号４に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡであることを特徴とする上記［７］記載の神経系疾患治療剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、低酸素状態のみならず様々な誘因による血管バリアー破綻に対して作用する神経系血管バリアーの破綻抑制剤及び神経系疾患治療剤を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】マウス脳血管内皮細胞株（ｂＥＮＤ．３細胞）を培養し、ベイシジン（以下、「ＢＳＧ」ともいう）ｓｉＲＮＡ＃１、ＢＳＧｓｉＲＮＡ＃２、Ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｅ  ｓｉＲＮＡを導入後、さらにＴＮＦ−α、ＶＥＧＦを添加してから６時間培養後、又は低酸素処理直後におけるクローディン−５の発現と局在を免疫染色により調べた結果を示す図である。
【図２】図１におけるクローディン−５タンパク質の発現を定量化した結果を示す図である。
【図３】経皮内電気抵抗値（ＴＥＥＲ）を測定する方法の概念図である。
【図４】ＴＮＦ−α又はＶＥＧＦを添加してから３、６、９時間培養後における、細胞単層の経皮内電気抵抗値（ＴＥＥＲ）を測定した結果を示す図である。
【図５】参考例において、マウス脳血管内皮細胞株（ｂＥＮＤ．３細胞）を培養し、ＡＤＡＭ１２ｓｉＲＮＡ、ＡＤＡＭ１７ｓｉＲＮＡ、Ｎｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｅ  ｓｉＲＮＡを導入後、さらにＴＮＦ−α、ＶＥＧＦを添加してから６時間培養後、又は低酸素処理後のクローディン−５タンパク質の発現を定量化した結果を示す図である。
【図６】実施例２において、正常マウス及びストレプトゾトシン投与マウスに、ＢＳＧｓｉＲＮＡ＃１又は２、及びＮｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｅ  ｓｉＲＮＡを硝子体内に注射し、トレーサーを投与後にトレーサーの漏出を共焦点顕微鏡にて観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明における神経系疾患治療剤としては、（ａ）ベイシジン（basigin）遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；（ｂ）ベイシジンの活性を消失又は減退する機能性核酸；（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；のいずれかを有効成分とする神経系血管バリアーの破綻抑制剤（以下、「本発明の神経系血管バリアーの破綻抑制剤」という場合がある）や、上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分とする神経系血管バリアーの破綻に起因する神経系疾患治療剤（以下、「本発明の神経系疾患治療剤」という場合がある）であれば特に制限されず、クローディン−５の消失を抑制すると共に、神経系血管バリアー機能の破綻を抑制することや、副作用が少なく効果的に神経系血管バリアーの破綻に起因する神経系疾患治療をすることができる。
【００１６】
また、本発明の神経系血管バリアーの破綻抑制剤の別の態様としては、（ａ）ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；（ｂ）ベイシジンの活性を消失又は減退する機能性核酸；（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；のいずれかを対象に投与することを特徴とする神経系血管バリアーの破綻抑制方法や、神経系血管バリアーの破綻抑制剤として使用するための、（ａ）ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；（ｂ）ベイシジンの生理活性を消失又は減退する機能性核酸；（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；のいずれかや、（ａ）ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；（ｂ）ベイシジンの生理活性を消失又は減退する機能性核酸；（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；のいずれかの、神経系血管バリアーの破綻抑制剤の調製における使用を挙げることができる。
【００１７】
さらに、本発明の神経系疾患治療剤の別の態様としては、（ａ）ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；（ｂ）ベイシジンの活性を消失又は減退する機能性核酸；（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；のいずれかを対象に投与することを特徴とする神経系血管バリアーの破綻に起因する神経系疾患治療方法や、神経系血管バリアーの破綻に起因する神経系疾患治療剤として使用するための、（ａ）ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；（ｂ）ベイシジンの生理活性を消失又は減退する機能性核酸；（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；のいずれかや、（ａ）ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；（ｂ）ベイシジンの生理活性を消失又は減退する機能性核酸；（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；のいずれかの、神経系血管バリアーの破綻に起因する神経系疾患治療剤の調製における使用を挙げることができる。
【００１８】
ベイシジンは、細胞膜に局在するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する糖タンパク質であり、ＥＭＭＰＲＩＮ（extracellular matrix metalloproteinase inducer）、ＣＤ１４７（cluster of differentiation 147）、ＨＴ７、ＯＸ−４７とも称されている。
【００１９】
本発明において、ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸としては、ベイシジン遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイムを挙げることができ、ベイシジン遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを好適に挙げることができる。また、本発明において、ベイシジンの活性を消失又は減退する機能性核酸としては、ベイシジンが血管バリアーを開く機能を消失又は減退するアプタマーを挙げることができる。上記機能性核酸はベイシジン遺伝子の配列情報に基づいて設計することができ、例えば以下の文献に記載の方法で設計することができる（Wadhwa, R, et al. Reviews in Mutat. Res. (2004) 567:71-84, Wadhwa, R. et al. Current Opinions in Molecular Therapeutics. (2004) 6:367-372, Wadhwa, R. et al. EMBO (2003) 4:595-601）。また、かかる機能性核酸は公知の合成による方法及び遺伝子組換え技術を用いる方法により作製することができる。
【００２０】
上記ベイシジン遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとは、ベイシジン遺伝子のｍＲＮＡに相同なヌクレオチドのセンス鎖配列と、その相補的なアンチセンス鎖配列とからなり、ベイシジン遺伝子の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡを意味する。二本鎖ＲＮＡの長さは、好ましくは１７〜２７塩基対、より好ましくは１８〜２０塩基対である。ベイシジン遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡとしては、具体的には、配列番号１に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号２に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡ、又は配列番号３に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号４に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡを好適に挙げることができる。また、それぞれの鎖の３’側には、オーバーハング配列、好ましくはチミン、グアニン、シトシン、アデニンのいずれかから選択される２塩基をもたせることにより、ベイシジン遺伝子の発現抑制作用を増強することもできる。
【００２１】
上記機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクターとしては、上記機能性核酸を発現可能なベクターであれば特に制限されないが、たとえば機能性核酸がｓｉＲＮＡの場合には、ベイシジンの特定ヌクレオチドのセンス鎖配列−リンカー−その相補的なアンチセンス鎖配列からなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットをプロモーターの下流に挿入することにより作製することができる。かかる機能性核酸発現ベクター作製に用いるベクターは、市販品を含め公知のものを用いることができるが、哺乳動物に導入する場合にはウイルスベクターであることが好ましい。ウイルスベクターとしては、例えば、マウス白血病レトロウイルスベクターや、アデノ随伴ウイルスベクターや、アデノウイルスベクターや、リポソームなどを具体的に挙げることができるが、ＨＩＶレンチウイルスベクターは、非分裂細胞にも効率よく長期発現が可能であるという特徴を有する点で好ましい。また、これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００２２】
前記神経系血管バリアーの破綻に起因する神経系疾患としては、好ましくは血管バリアー機能が破綻して組織微小環境の攪乱が生じることによる疾患を挙げることができ、より好ましくは脳浮腫、脳梗塞、血管性認知症、虚血性脳疾患などの脳神経系疾患、又は網膜浮腫などの網膜神経系疾患を挙げることができ、特に好ましくは脳浮腫又は網膜浮腫を挙げることができる。なお、神経系血管とは、神経系組織の血管であり、神経系組織以外の組織における血管は含まれない。
【００２３】
前記神経系血管バリアーとは、血液と神経系の組織液との物質交換を制限する機構を意味し、血液と脳の組織液との物質交換を制限する血液脳関門や、血液と網膜の組織液との物質交換を制限する血液網膜関門を好適に挙げることができる。
【００２４】
本発明において、血管バリアーの破綻とは、血液と神経系の組織液との物質交換を制限する機構が機能しないことを意味する。かかる血管バリアーの破綻により、神経毒性分子の組織内侵入や血漿成分の浸出などの血管バリアー機能の障害が生じることとなる。
【００２５】
本発明の神経系血管バリアーの破綻抑制剤又は神経系疾患治療剤は、ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸、ベイシジンの活性を消失又は減退する機能性核酸や、かかる機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクターを有効成分としていればよく、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤などの製剤化のために通常使用され薬学的に許容される添加物を含んでいてもよい。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤などの固形製剤であってもよいが、優れた神経系疾患治療効果を得る観点からは、溶液剤、乳剤、懸濁剤などの液剤とすることが好ましい。
【００２６】
本発明の神経系血管バリアーの破綻抑制剤の投与方法としては所望の神経系血管バリアーの破綻抑制効果が得られる限り特に制限されず、また、本発明の神経系疾患治療剤の投与方法としては、所望の神経系疾患治療効果が得られる限り特に制限されず、所貴いずれの投与方法も静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与などを挙げることができ、特に網膜神経系疾患においては、硝子体内投与を挙げることができる。また、本発明の神経系血管バリアーの破綻抑制剤又は神経系疾患治療剤の投与量は特に制限されず、被検者や被検動物の体調、病状、体重、年齢、性別などによって適宜調整することができる。投与量としては、例えば１日あたり、０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１μｇ〜１０ｇ／ｋｇ体重、さらに好ましくは１μｇ〜１ｇ／ｋｇ体重を挙げることができ、本発明の神経系血管バリアーの破綻抑制剤を他の神経系血管バリアーの破綻抑制剤と併用してもよく、また、本発明の神経系疾患治療剤を他の神経系疾患治療剤と併用してもよい。本発明の神経系血管バリアーの破綻抑制剤又は神経系疾患治療剤の投与回数や投与期間なども特に制限されず、１日あたりの投与量を１日１回又は数回に分けて投与することもできる。また投与対象の細胞、組織の由来や生体は特に制限されず、好ましくは哺乳類であり、例えばヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスターなどを例示することができ、中でもヒトを例示することができる。
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
[マウス脳血管内皮細胞株の単層培養を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ系解析]
本発明者らはこれまでに、上述のように１）難治性神経系疾患の血管内皮細胞の細胞膜からのクローディン−５の消失、２）血管バリアー機能の破綻、３）病態悪化、というカスケードを明らかにして報告した。そこで、１次スクリーニングとして、対象因子の発現を特異的に抑制するｓｉＲＮＡを作製し、種々の刺激（低酸素、サイトカインなど）によるマウス脳血管内皮細胞株（ｂＥＮＤ．３細胞）の細胞膜からのクローディン−５消失に共通した阻害効果を示すｓｉＲＮＡを、血管バリアー破綻に対する治療薬候補とした。そのなかでベイシジンに対するｓｉＲＮＡを候補とし、かかる候補ｓｉＲＮＡの血管バリアー破綻に対する治療薬としての有用性について、以下に示す方法でｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を用いた機能的解析を行った。【００２９】
ベイシジンに対するｓｉＲＮＡ（ベイシジン特異的ｓｉＲＮＡ（ＢＳＧｓｉＲＮＡ））として、以下の表１に示すＢＳＧｓｉＲＮＡ＃１（センス鎖配列：配列番号５、アンチセンス鎖配列：配列番号６）、ＢＳＧｓｉＲＮＡ＃２（センス鎖配列：配列番号７、アンチセンス鎖配列：配列番号８）の２種類、及びＮｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｅ  ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡ：カタログ番号４３９０８４３）をThermo Fisher Scientific社から購入した。なお、配列番号５〜１２中、小文字で表される塩基配列はオーバーハング配列を表す。【００３０】
マウス脳血管内皮細胞株（ｂＥＮＤ．３細胞：ＡＴＣＣより購入）をそれぞれ４ディッシュ用意し、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）入りのＤＭＥＭ培地（シグマ・アルドリッチ社製）を用いて、３７℃、９５％エアー、５％ＣＯ2条件下で培養した。コンフェルトになってからさらに５．５日後に上記各ｓｉＲＮＡを終濃度が１０ｎＭとなるように導入した。導入３６時間後に、４ディッシュのうち１ディッシュはＶＥＧＦを、１ディッシュはＴＮＦ−αを５０ｎｇ／ｍｌとなるように加え、１ディッシュは添加無しとし、正常酸素状態でそれぞれさらに３時間、６時間、９時間培養した。また、４ディッシュのうち残りの１ディッシュはｓｉＲＮＡ導入３６時間後に、３０分間ほど１％低酸素状態とした。【００３１】
【表１】
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【００３２】
ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦを添加してから６時間培養後、又は低酸素処理直後におけるクローディン−５の発現と局在を、１次抗体としてRabbit anti-mouse claudin-5（Thermo Fisher Scientific社製）、２次抗体としてAlexaFluor（登録商標） 488 Goat anti-Rabbit IgG抗体（Thermo Fisher Scientific社製）を用いた免疫染色により調べた結果を図１に示す。また、図１におけるクローディン−５タンパク質の発現を上記非特許文献３に記載の方法に準じて定量化した結果を図２に示す。具体的には、１検体あたり、３視野を無作為に選出して写真を撮影し、１枚の写真につき３本のラインを引き、細胞膜との交点におけるクローディン−５の蛍光強度を測定し、平均値を算出した。同様に１群あたり３検体ずつ測定を行い、平均値を比較した。【００３３】
さらに、血管バリアーの機能的指標として、ＴＮＦ−α又はＶＥＧＦを添加して３、６、９時間培養後における、細胞単層の経皮内電気抵抗値（ＴＥＥＲ）を上記非特許文献２に記載の方法に従って図３に示すように測定した結果を図４に示す。【００３４】
（結果）
図１、２に示すように、ｓｉＲＮＡ無し若しくはＮｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｅ  ｓｉＲＮＡを導入した場合には、ＶＥＧＦ添加、ＴＮＦ−α添加、低酸素状態の全ての病的刺激によってｂＥＮＤ．３細胞の細胞膜からのクローディン−５消失現象が観察された。一方、ＢＳＧｓｉＲＮＡ＃１又は２をｂＥＮＤ．３細胞に導入してベイシジンの発現を阻害したところ、ＶＥＧＦ添加、ＴＮＦ−α添加、低酸素状態のいずれもｂＥＮＤ．３細胞の細胞膜からのクローディン−５消失現象が抑制された。さらに、図４に示すように、ＶＥＧＦ添加、ＴＮＦ−α添加におけるｂＥＮＤ．３細胞単層のＴＥＥＲを経時的に測定したところ、ＢＳＧｓｉＲＮＡ＃１又は２は、ＶＥＧＦ添加、ＴＮＦ−α添加によるＴＥＥＲ低下を抑制することが明らかとなった。したがって、ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸は、低酸素状態のみならずＶＥＧＦやＴＮＦ−αなどの様々な誘因による血管バリアー破綻に対して作用することが明らかとなった。【００３５】
［参考例］
上記ＢＳＧｓｉＲＮＡ＃１又は２の代わりに以下の表２に示すＡＤＡＭ１２ｓｉＲＮＡ（センス鎖配列：配列番号９、アンチセンス鎖配列：配列番号１０）、ＡＤＡＭ１７ｓｉＲＮＡ（センス鎖配列：配列番号１１、アンチセンス鎖配列：配列番号１２）の２種類を用いて、上記と同様にｂＥＮＤ．３細胞の細胞膜からのクローディン−５消失現象を調べた。結果を図５に示す。【００３６】
【表２】
2017073232.tif 000004
【００３７】
図５に示すように、低酸素処理による細胞膜からのクローディン−５消失現象は、ＡＤＡＭ１２ｓｉＲＮＡ又はＡＤＡＭ１７ｓｉＲＮＡによって抑制されるが、ＶＥＧＦ添加、ＴＮＦ−α添加による細胞膜からのクローディン−５消失現象は、ＡＤＡＭ１２ｓｉＲＮＡ又はＡＤＡＭ１７ｓｉＲＮＡによって抑制されないことが確認された。したがって、ＡＤＡＭ１２又はＡＤＡＭ１７は、あくまで低酸素状態を誘因とした血管バリアー破綻に関与する因子であるに過ぎないことが明らかとなった。
【実施例２】
【００３８】
［マウスの網膜組織を用いたｉｎ  ｖｉｖｏ系解析］
ＶＥＧＦやＴＮＦ−αなどの病的刺激は異なる細胞内シグナル伝達系を介して働くことから、ベイシジンは、異なる細胞内シグナル伝達系に共通した下流において血管バリアー機能を調節する因子（バリアーを開く因子）であると解釈される。したがって、ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸は、種々の誘因が混在して血管バリアー破綻が起こる神経系疾患に対する有用な治療標的をなることが示唆される。そこで、ベイシジンの治療標的としての有用性について、以下に示す方法でマウスを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ系を用いた機能的解析を行った。なお、網膜は、個体発生の過程で中枢神経系が出芽する形で形成される組織であり、脳と同様に中枢神経系の一部である。網膜の血管系は、長軸方向に全長に渡って２次元的に観察・評価することが可能であるため、本研究では、中枢神経系の代表として網膜を解析材料として用いた。【００３９】
７週齢のＣ５７Ｂ６／Ｎマウスを４時間絶食し、血糖と体重を測定した。次に、１５０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（Streptozotocin：クエン酸緩衝液に溶解）を腹腔内注射した。さらにストレプトゾトシン注射から４日後に４時間絶食し、血糖と体重を測定し、血糖値が２５０ｍｇ／ｄｌ以上のマウスを血液網膜関門破綻モデルマウスとした。【００４０】
正常マウス（クエン酸緩衝液を腹腔内注射したＣ５７Ｂ６／Ｎマウス）と上記で得られた血液網膜関門破綻モデルマウスの硝子体内に、ＢＳＧｓｉＲＮＡ＃１又は２、又はＮｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｅ  ｓｉＲＮＡを注射（１０ｎＭを１μｌ）した。硝子体への注射から３日後（ストレプトゾトシン投与から７日後）に各々のマウスに、トレーサーとして蛍光色素を心臓内投与した後、網膜伸展標本を作製し、注入したトレーサーの漏出を共焦点顕微鏡にて観察することで網膜血管の透過性（血液網膜関門機能の指標）を評価した。トレーサーとしては、Tetramethylrhodamine-conjugated lysine fixable dextran（10kDa;Thermo Fisher Scientific社製）及びHoechst stain H33252（534Da;Thermo Fisher Scientific社製）の２つの蛍光色素を用いた。結果を図６に示す。【００４１】
図６に示すように、ｓｉＲＮＡ注射なし（−）又はＮｏｎ−ｓｉｌｅｎｃｅ  ｓｉＲＮＡを注射した場合のストレプトゾトシン投与血液網膜関門破綻モデルマウスは、血管内投与した色素の網膜血管からの漏出亢進が認められた（図６の下段左枠）。一方、その血液網膜関門破綻モデルマウスの硝子体内にＢＳＧｓｉＲＮＡ＃１又は２を投与した場合には、網膜血管からの色素漏出は、正常マウスの網膜血管と同程度の透過性まで抑制された（図６の下段右枠）。これらの結果は、種々の誘因が混在して血管バリアー破綻を来している神経系疾患において、血管バリアー機能を回復させるための治療標的としてベイシジンが有用であること、換言すれば、ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸を用いれば、血管バリアー機能を回復させて神経系疾患を治療できることが可能であることを示している。【００４２】
これらの結果より、本発明によって、いまだ有効な治療法がない難治性神経系疾患において、浮腫改善のみならず神経毒性分子の組織内侵入の阻害も含め、病態悪化のカスケードを人為的に制御し、病態の改善につながる治療を行うことが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
神経系血管バリアーの破綻に起因する脳浮腫、網膜浮腫、虚血性脳疾患などの神経系疾患に対する新規治療薬として利用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2017073232000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年2月8日(2017.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分とする神経系血管バリアーの機能回復剤。
（ａ）ベイシジン（ｂａｓｉｇｉｎ）遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；
（ｂ）ベイシジンの活性を消失又は減退する機能性核酸；
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；
【請求項２】
ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸がｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載の神経系血管バリアーの機能回復剤。
【請求項３】
ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸が、配列番号１に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号２に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡ、又は、配列番号３に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号４に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項２記載の神経系血管バリアーの機能回復剤。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかを有効成分とする神経系血管バリアーの破綻を来している神経系疾患の治療剤。
（ａ）ベイシジン（ｂａｓｉｇｉｎ）遺伝子の発現を抑制する機能性核酸；
（ｂ）ベイシジンの活性を消失又は減退する機能性核酸；
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）の機能性核酸をコードするＤＮＡを含む該機能性核酸発現ベクター；
【請求項５】
神経系疾患が、脳神経系疾患又は網膜神経系疾患であることを特徴とする請求項４記載の神経系疾患の治療剤。
【請求項６】
神経系疾患が、脳浮腫又は網膜浮腫であることを特徴とする請求項５記載の神経系疾患の治療剤。
【請求項７】
ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸がｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項４〜６のいずれか記載の神経系疾患の治療剤。
【請求項８】
ベイシジン遺伝子の発現を抑制する機能性核酸が、配列番号１に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号２に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡ、又は、配列番号３に示すヌクレオチドのセンス鎖配列と配列番号４に示すその相補的なアンチセンス鎖配列から構成されるｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項７記載の神経系疾患の治療剤。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
技術分野
［０００１］
本発明は低酸素状態のみならず様々な誘因による神経系血管バリアー破綻に対して作用する神経系血管バリアー破綻抑制剤及び神経系疾患治療剤に関する。
背景技術
［０００２］
成体の神経組織（脳、網膜、脊髄など）では、血液と神経組織の間に血管バリアー（血液脳関門、血液網膜関門など）が形成され、神経細胞が正常に機能できる至適組織微小環境が維持されており、組織特異的に分化した血管系が有するバリアー機能により他組織から区画化されている。成体神経組織の血管バリアー機能は個体発生過程において誘導されるが、いったん誘導された血管バリアー機能も常に一定の状態にあるわけではなく、成体は血管バリアー機能を増強したり減弱させたりすることにより、神経細胞が正常に機能するための至適微小環境を維持している。一方、虚血性脳疾患などの難治性神経系疾患においては、血管バリアー機能が破綻し組織微小環境の撹乱が生じることが、病態を悪化させる大きな要因として働いている。したがって、血管バリアー機能の調節因子は、それら難治性疾患の病態悪化を妨げるための新規治療法開発の標的となることが期待される。
［０００３］
神経系血管バリアー機能の本体は、血管の内皮細胞間に形成されるタイトジャンクション（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ：以下、ＴＪ）網に依存することから、ＴＪ構成分子を研究することが、血管バリアー調節機構の解明に向けた戦略の中心となっている。ＴＪ構成分子としては、ｏｃｃｌｕｄｉｎ、ｃｌａｕｄｉｎ（２７メンバーからなるファミリーを形成）、ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ａ（ＪＡＭ−Ａ）などが特定されているが、生理的状態の神経系血管内皮細胞の細胞膜に発現・局在しているクローディン−５（ｃｌａｕｄｉｎ−５：ｃｌａｕｄｉｎ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ
【国際調査報告】
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