(57)【要約】  マイクロ流体デバイスは、電磁波を透過可能であり、かつ自家蛍光を有しない基板と、前記基板上に形成され、厚さ方向に複数の貫通孔が形成された壁部層を有するマイクロウェルアレイと、前記壁部層と離間した状態で前記基板と対向配置された蓋部材と、を備え、前記基板と前記壁部層に形成された前記貫通孔とでマイクロウェルが形成され、前記壁部層は、所定の波長の電磁波を吸収する有色成分を含有する材料から形成されている。
2017061600.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電磁波を透過可能であり、かつ自家蛍光を有しない基板と、
前記基板上に形成され、厚さ方向に複数の貫通孔が形成された壁部層を有するマイクロウェルアレイと、
前記壁部層と離間した状態で前記基板と対向配置された蓋部材と、
を備え、
前記基板と前記壁部層に形成された前記貫通孔とでマイクロウェルが形成され、
前記壁部層は、所定の波長の電磁波を吸収する有色成分を含有する材料から形成されている、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記有色成分は顔料であり、前記顔料の粒子径が前記マイクロウェルの最小寸法の５分の１以下である、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
請求項１または２に記載のマイクロ流体デバイスを用いた試料分析方法であって、
前記マイクロウェル内に試料を供給し、
封止液を用いて前記試料を前記マイクロウェル内に封入し、
前記マイクロウェル内に前記試料を封入した後に、前記マイクロ流体デバイスに電磁波を照射し、
前記電磁波が照射された前記マイクロウェルを前記基板側から観察する試料分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロウェルアレイを有するマイクロ流体デバイス、およびマイクロ流体デバイスを用いた試料分析方法に関する。
本願は、２０１５年１０月８日に日本に出願された特願２０１５−２００３６１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年、半導体回路の製造技術に用いられているエッチング技術やフォトリソグラフィ技術、または微細なプラスチックの成型方法を用いて形成された、種々の形態の微細な流路構造を有するマイクロウェルアレイが検討されている。これらのマイクロウェルアレイのウェルは、微小体積の流体中で種々の生化学的又は化学的反応をさせるための化学反応容器として用いられている。【０００３】
マイクロウェルアレイを有するマイクロ流体デバイスの製作のための材料としては、シリコーン、ガラス等の硬質の物質、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）等の種々の高分子樹脂やシリコーンゴム等の軟質の物質等が用いられている。例えば、特許文献１から３には、このようなマイクロ流体デバイスを、種々のマイクロチップ、バイオチップとして用いることが開示されている。【０００４】
ところで、近年、微少量の容積を有する微小空間内で酵素反応を行うことにより生体物質の検査を行う技術が注目されている。例えば、核酸の検出及び定量における新しいアプローチの一つとして、デジタルＰＣＲ技術が挙げられる。デジタルＰＣＲ技術とは、試薬と核酸との混合物を無数の微小液滴に分割してＰＣＲ増幅を行い、核酸を含んだ液滴からは蛍光等のシグナルが検出されるようにしておき、シグナルが検出された液滴を数えることにより定量を行う技術である。【０００５】
微小液滴の作製方法として、封止液で分断化することにより微小液滴を作製する方法や、基板上に形成した孔に試薬を入れ、続いて封止液を入れることにより微小液滴を作製する方法等が検討されている。【０００６】
生体分子から発せられる蛍光値を取得するための流体システム中で、流体システムに用いられる流体デバイスを構成する材料に顔料を添加して自家蛍光を低減させる方法が検討されている（例えば特許文献１から３を参照。）。これは、材料由来の自家蛍光がノイズとして検出されてしまうと、蛍光シグナルの検出に支障を来たすためである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】日本国特許第３５１０８８２号公報
【特許文献２】日本国特許第３３２６７０８号公報
【特許文献３】日本国特開平１１−２１１６５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献1に開示される技術をマイクロ流体デバイスに適用することには、いくつかの困難な点がある。
まず、マイクロウェルの大きさである。マイクロウェルは非常に微小であるため、マイクロウェルアレイを形成する際に顔料を添加すると、顔料の粒径によってはマイクロウェルのサイズと近くなり、マイクロウェルを精度良く形成できない可能性がある。
次に、ノイズとなる自家蛍光の発生源である。マイクロウェルに収容される液滴の体積は非常に小さいため、発せられる蛍光の値も非常に小さい。したがって、従来であればほとんど問題とならなかった微小な自家蛍光であっても、液滴の蛍光と同程度の蛍光値を有するノイズとなり、測定に影響を与える可能性がある。詳細は後述するが、このような自家蛍光の発生源は、マイクロウェルアレイを形成する材料に限られない。そのため、材料の自家蛍光を低減させるだけでは、完全に解決することは難しい。【０００９】
上記事情を踏まえ、本発明は、材料の自家蛍光を抑えつつ、マイクロウェルが精度良く形成されたマイクロ流体デバイスを提供することを目的とする。
本発明の他の目的は、微小な蛍光ノイズを好適に排除してマイクロウェルに収容された試料を分析することができる試料分析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第一態様に係るマイクロ流体デバイスは、電磁波を透過可能であり、かつ自家蛍光を有しない基板と、前記基板上に形成され、厚さ方向に複数の貫通孔が形成された壁部層を有するマイクロウェルアレイと、前記壁部層と離間した状態で前記基板と対向配置された蓋部材と、を備え、前記基板と前記壁部層に形成された前記貫通孔とでマイクロウェルが形成され、前記壁部層は、所定の波長の電磁波を吸収する有色成分を含有する材料から形成されている。【００１１】
上記第一態様において、前記有色成分は顔料であり、前記顔料の粒子径が前記マイクロウェルの最小寸法の５分の１以下であってもよい。【００１２】
本発明の第二態様に係る試料分析方法は、上記第一態様に係るマイクロ流体デバイスを用いた試料分析方法であって、前記マイクロウェル内に試料を供給し（試料供給工程）、封止液を用いて前記試料を前記マイクロウェル内に封入し（封入工程）、前記マイクロウェル内に前記試料を封入した後に、前記マイクロ流体デバイスに電磁波を照射し（電磁波照射工程）、前記電磁波が照射された前記マイクロウェルを前記基板側から観察する（試料観察工程）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の上記第一態様に係るマイクロウェルアレイによれば、材料の自家蛍光を抑えつつ、マイクロウェルが精度良く形成されたマイクロウェルアレイを提供することができる。
また、本発明の上記第二態様に係る試料分析方法によれば、微小な蛍光ノイズを好適に排除してマイクロウェルに収容された試料を分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す斜視図である。
【図２】図１のｂ−ｂ線における断面図である。
【図３】本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの使用時の状態を示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの使用時の状態を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスを用いた試料分析方法の効果を説明するための図である。
【図６】実施例１及び比較例１を用いたマイクロ流体デバイスの効果に関する実験結果を示す表である。
【図７】実施例１の顕微鏡画像である。
【図８】比較例１の顕微鏡画像である。
【図９】実施例１に用いた材料において、顔料の有無による蛍光強度の違いを示す表である。
【図１０】本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスの変形例を示す斜視図である。
【図１１Ａ】実施例２の明視野観察の結果である。
【図１１Ｂ】比較例２の明視野観察の結果である。
【図１２】実施例２の顕微鏡画像である。
【図１３】比較例２の顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一実施形態について、図１から図６を参照して説明する。本明細書において、各図面における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
【００１６】
図１は、本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１を示す斜視図である。図２は、図１のｂ−ｂ線における断面図である。マイクロ流体デバイス１は、図１および図２に示すように、基板１０と、蓋部材２０と、マイクロウェルアレイ３０とを備えている。蓋部材２０は、基板１０と対向配置されている。マイクロウェルアレイ３０は、基板１０と蓋部材２０との間に設けられている。
【００１７】
基板１０は、電磁波を透過可能である。ここで、電磁波としては、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線等が挙げられる。基板１０が電磁波を透過可能であることにより、マイクロ流体デバイス１に封入した試料に生じる蛍光、燐光等を基板１０側から観察することができる。
基板１０は、所定の波長範囲の電磁波のみを透過可能であってもよい。例えば、マイクロウェル内の試料について、可視光領域である３５０〜７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光を検出する場合には、少なくとも上記波長範囲の可視光を透過可能な基板を用いればよい。
【００１８】
基板１０を形成する材料としては、例えば、ガラス、樹脂等が挙げられる。樹脂基板としては、例えば、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、アクリル樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）等が挙げられる。これらの樹脂は各種添加剤を含んでいてもよく、複数の樹脂が混合されていてもよい。
【００１９】
後述する試料分析方法では蛍光や燐光を利用するため、基板１０としては、自家蛍光を実質的に有しない材料を用いる。ここで、「自家蛍光を実質的に有しない」とは、基板が、実験結果の検出に使用する波長の自家蛍光を全く有しないか、自家蛍光を有していても実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であることを意味する。例えば、検出対象の蛍光に比べて１／２以下、１／１０以下程度の自家蛍光であれば、実験結果の検出に影響を与えないほど微弱であるといえる。
【００２０】
基板１０の厚みは、適宜決定することが出来るが、例えば５ミリメートル（ｍｍ）以下が好ましく、２ｍｍ以下がより好ましく、１．６ｍｍ以下がさらに好ましい。
【００２１】
蓋部材２０は、板状またはシート状に形成された部材であり、厚さ方向に貫通する第一孔２１および第二孔２２を有する。第一孔２１および第二孔２２は、完成したマイクロ流体デバイス１において、マイクロウェルアレイ３０を含む内部空間Ｓと連通する。第一孔２１および第二孔２２は、それぞれ内部空間に流体を供給する入口および流体が排出される出口として機能する。
蓋部材２０を形成する材料や蓋部材２０の厚みについては、基板１０と同様とすることができる。
蓋部材２０の電磁波透過性については適宜設定できる。すなわち、後述する電磁波照射工程を蓋部材２０側から行わない場合は、蓋部材２０は電磁波を透過可能でなくてもよい。
【００２２】
マイクロウェルアレイ３０は、底部層３１と、壁部層３２と、複数のマイクロウェル３３とを有する。底部層３１は、基板１０上に設けられている。壁部層３２は、底部層３１上に形成されている。複数のマイクロウェル３３は、底部層３１と壁部層３２の厚さ方向に形成された複数の貫通孔３２ａとで構成されている。複数のマイクロウェル３３は、壁部層３２においてアレイ状に形成されている。基板１０と蓋部材２０との間の内部空間Ｓにおいて、マイクロウェルアレイ３０（壁部層３２）と蓋部材２０との間には隙間が存在する。この隙間は、複数のマイクロウェル３３、並びに第一孔２１および第二孔２２と連通する流路として機能する。
【００２３】
底部層３１は、マイクロウェル３３の底面を構成する。したがって、底面に親水性を付与したい場合は親水性材料で底部層３１を形成すればよい。また、底面に疎水性を付与したい場合は疎水性材料で底部層３１を形成すればよい。底部層３１は、底部層３１が電磁波を透過可能なように形成され、基板１０側からのマイクロウェル３３内の試料観察の妨げにならないようにすることが好ましい。また、底部層３１には、自家蛍光を実質的に有しない材料を用いることが好ましい。ここで、基板１０と底部層３１とが一体化されたものを単に基板と称することもできる。
【００２４】
なお、マイクロウェル３３の底面の特性が基板１０の特性で問題ない場合は、底部層３１を設けずに、基板１０上に直接壁部層３２が形成されてもよい。従って、その場合、基板１０の表面と壁部層３２の貫通孔３２ａとでマイクロウェル３３が構成される。
【００２５】
壁部層３２は、有色の材料で形成されており、厚さ方向に見た状態においてアレイ状に設けられた複数の貫通孔３２ａを有する。各貫通孔３２ａの内面は、各マイクロウェル３３の内壁面を構成する。
【００２６】
壁部層３２を形成する材料としては、樹脂に所定の波長の電磁波を吸収する有色成分を混合した材料が挙げられる。
樹脂材料としては、マイクロウェル３３に求める特性等を考慮して、樹脂の構成成分の分子が親水性基を有する親水性樹脂と、樹脂の構成成分の分子が疎水性基を有する疎水性樹脂とのいずれも用いることができる。
【００２７】
親水性基としては、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシル基、スルホン基、スルホニル基、アミノ基、アミド基、エーテル基、エステル基等が挙げられる。親水性樹脂の例としては、例えば、シロキサンポリマー；エポキシ樹脂；ポリエチレン樹脂；ポリエステル樹脂；ポリウレタン樹脂；ポリアクリルアミド樹脂；ポリビニルピロリドン樹脂；ポリアクリル酸共重合体等のアクリル樹脂；カチオン化ポリビニルアルコール、シラノール化ポリビニルアルコール、スルホン化ポリビニルアルコール等のポリビニルアルコール樹脂；ポリビニルアセタール樹脂；ポリビニルブチラール樹脂；ポリエチレンポリアミド樹脂；ポリアミドポリアミン樹脂；ヒドロキシメチルセルロース、メチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリエチレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド−ポリプロピレンオキサイド共重合体等のポリアルキレンオキサイド誘導体；無水マレイン酸共重合体；エチレン−酢酸ビニル共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、適宜選択して使用することができる。
疎水性樹脂の例としては、例えば、ノボラック樹脂；アクリル樹脂；メタクリル樹脂；スチレン樹脂；塩化ビニル樹脂；塩化ビニリデン樹脂；ポリオレフィン樹脂；ポリアミド樹脂；ポリイミド樹脂；ポリアセタール樹脂；ポリカーボネート樹脂；ポリフェニレンスルフィド樹脂；ポリスルフォン樹脂；フッ素樹脂；シリコーン樹脂；ユリヤ樹脂；メラミン樹脂；グアナミン樹脂；フェノール樹脂；セルロース樹脂；上記の樹脂の組み合わせ等の中から、ＪＩＳ  Ｒ３２５７−１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上である材料を適宜選択して使用することができる。すなわち、本明細書における疎水性とは、ＪＩＳ  Ｒ３２５７−１９９９に規定された静滴法に準じて測定した接触角が７０度以上であることを意味する。
【００２８】
親水性樹脂および疎水性樹脂のいずれも、熱可塑性樹脂であっても熱硬化性樹脂であってもよい。さらに、電子線やＵＶ光等の活性エネルギー線により硬化する樹脂であってもよく、エラストマーであってもよい。
樹脂材料としてフォトレジストを用いると、フォトリソグラフィにより壁部層３２に多数の微細な貫通孔を精度良く形成することができる。
フォトリソグラフィを用いる場合、使用するフォトレジストの種類の選択、塗布、露光（感光）、不要なフォトレジストの除去の方法には公知の手段を適宜選択することができる。
レジストを用いない場合は、例えば射出成型等により壁部層３２を形成することができる。
【００２９】
有色成分としては、有機質又は無機質の顔料が例示できる。具体的には、黒色顔料としては、カーボンブラック、アセチレンブラック、鉄黒等が挙げられる。黄色顔料としては、クロム黄、亜鉛黄、黄土、ハンザイエロー、パーマネントイエロー、ベンジンイエローが挙げられる。橙色顔料としては、オレンジレーキ、モリブデンオレンジ、ベンジンオレンジが挙げられる。赤色顔料としては、べんがら、カドミウムレッド、アンチモン朱、パーマネントレッド、リソールレッド、レーキレッド、ブリリアントスカーレット、チオインジゴレッドが挙げられる。青色顔料としては、群生、コバルトブルー、フタロシアニンブルー、フェロシアンブルー、インジゴが挙げられる。緑色顔料としては、クロムグリーン、ビリジアンナフトールグリーン、フタロシアニングリーン等が挙げられる。
【００３０】
また、壁部層３２を射出成型等で形成する場合、樹脂中に分散する顔料だけでなく、樹脂中に溶解する各種染料も有色成分として用いることが可能である。染料は各種染料法より例示できる。具体的には、直接染料、塩基性染料、カチオン染料、酸性染料、媒染染料、酸性媒染染料、硫化染料、建染染料、ナフトール染料、分散染料、反応染料などが挙げられる。特に、樹脂を染色する場合には、分散染料が選択されることが多い。
【００３１】
本明細書において、マイクロウェルとは、容積が１０ナノリットル（ｎＬ）以下のウェルを意味する。マイクロウェル３３の容積をこの程度に微小にすることにより、デジタルＰＣＲやインベーダー反応等の微小空間内で行う酵素反応を好適に行うことができる。デジタルＰＣＲにより、例えば遺伝子の変異検出等を行うことができる。
マイクロウェル３３の容積は、１フェムトリットル（ｆＬ）以上６ｎＬ以下が好ましく、１ｆＬ以上５ピコリットル（ｐＬ）以下がより好ましく、１ｆＬ以上３００ｆＬ以下が最も好ましい。このような範囲に容積を設定すると、後述する試料分析の際に、一つのマイクロウェル３３に、１から数個だけ生体分子又は担体を収容することが可能となる。
【００３２】
マイクロウェル３３の形状は、容積が上述した範囲内である限り特に制限はない。したがって、例えば、円筒形、複数の面により構成される多面体（例えば、直方体、六角柱、八角柱等）、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）等であってもよい。
さらに上述の形状を二つ以上組み合わせたような形状であってもよい。例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であってもよい。また、逆円錐形、逆角錐形の場合、円錐や角錐の底面が流路とマイクロウェル３３とを連通する開口部となる。この場合、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状を用いて、マイクロウェル３３の底部を平坦にしてもよい。他の例として、底部を開口部に向かって凸または凹となる曲面状に形成してもよい。
【００３３】
壁部層３２の厚さは、マイクロウェル３３の深さを規定する。マイクロウェルが円筒形の場合、生体分子を含む水性液体（試料）を封入する目的のためには、壁部層３２の厚さは、例えば１０ｎｍ以上１００μｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以上１０μｍ以下、更に好ましくは１μｍ以上１０μｍ以下の範囲内とすることができる。
マイクロウェル３３の各部寸法は、収容する水性液体の量や、生体分子を付着させたビーズ等の担体の大きさ等を考慮して、１つのマイクロウェルに１つ、もしくは数個の生体分子が収容されるように適宜決定すればよい。
【００３４】
マイクロウェルアレイ３０に設けるマイクロウェル３３の数や密度は適宜設定できる。
１ｃｍ２あたりのマイクロウェル３３の数は、例えば１万以上１０００万以下であり、好ましくは１０万以上５００万以下であり、更に好ましくは１０万以上１００万以下である。マイクロウェルの密度がこの範囲内であると、所定数のウェルに試料である水性液体を封入させる操作が容易である。また、実験結果を解析するためのウェルの観察も容易である。例えば、セルフリーＤＮＡの変異を測定する場合において、検出対象の変異の野生型に対する存在割合が０．０１％程度である場合、例えば、１００万〜２００万個程度のマイクロウェルを使用することが好適である。
図１では、複数のマイクロウェル３３が一列に並んだ一次元アレイの例を示している。しかしながら、上述のように多数のマイクロウェルを設ける場合、複数のマイクロウェルを二次元に配列した二次元アレイを用いてもよい。
【００３５】
有色成分として顔料を用いる場合、顔料の粒子径は、マイクロウェルの大きさに応じて所定の範囲に設定される。顔料の粒子径が、マイクロウェルの径方向寸法および深さ方向寸法のうち小さい方の寸法（以下、「最小寸法」と称する。）に対して５分の１以下であればマイクロウェルの形成精度に影響を及ぼさない。粒子径を最小寸法に対して１０分の１以下に設定するとさらに好ましい。例えば、最小寸法が１０ｎｍ〜１００μｍ程度であった場合、顔料の粒子径は１ｎｍ〜１０μｍ程度が好ましい。最小寸法が１００ｎｍ〜１０μｍであった場合、顔料の粒子径は、メーカーカタログ値等において１０ｎｍ〜１μｍ程度が好ましい。
【００３６】
顔料の粒子径を上述の範囲に設定することで、顔料がマイクロウェルに対して十分小さくなる。その結果、マイクロウェルを多数形成する際においても、顔料の粒子が妨げにならず、精度良く形成することができる。また、顔料の粒子間の着色されない領域をマイクロウェルに対して十分小さくすることにより、後述する自家蛍光抑制効果を好適に発揮させることができる。
【００３７】
マイクロウェルアレイの周囲には、平面視枠状の周縁部材３４が配置されている。マイクロ流体デバイス１の厚さ方向における周縁部材３４の寸法は、壁部層３２よりも大きい。周縁部材３４は、蓋部材２０を支持することにより蓋部材２０とマイクロウェルアレイとの間に隙間を確保し、流路を維持している。
周縁部材３４の材質等に特に制限はないが、例えばシリコーンゴムや、アクリル発泡体から形成される芯材フィルムの両面にアクリル系粘着剤が積層された両面粘着テープ等が挙げられる。
【００３８】
上記のように構成されたマイクロ流体デバイス１は、例えば以下の手順で製造することができる。
まず、基板１０を準備し、基板１０の面上に壁部層３２となる壁部用樹脂層を形成する。底部層３１を設ける場合は、壁部用樹脂層の形成前に底部層３１を形成する。底部層３１を設けない場合でも、必要に応じて基板１０の面上に基板１０と壁部用樹脂層との密着性を高めるアンカー層等を設けてもよい。
【００３９】
壁部樹脂層は、樹脂材料に有色成分を混合した材料から形成される。樹脂材料がレジストである場合、有色成分の含有率は、例えば０．５質量％（ｗｔ％）以上６０ｗｔ％以下とすることができる。含有率に関して、好ましくは５ｗｔ％以上５５ｗｔ％以下であり、更に２０ｗｔ％以上５０ｗｔ％以下がさらに好ましい。有色成分の含有率は、レジストに含まれる感光成分等の割合を考慮して所望するパターンが構築可能となるように、適宜設定することができる。また、有色成分が顔料である場合、形成するマイクロウェルに対して上述した所定の条件を満たすように顔料の粒子径を設定し、準備する。顔料と共に、分散剤が適宜添加されてもよい。
形成された壁部樹脂層は、含有する有色成分に基づいた色彩を有する。
【００４０】
次に、形成された壁部樹脂層に貫通孔３２ａを形成する。上述したように、フォトリソグラフィを用いると、貫通孔３２ａを簡便かつ精度よく形成することができる。壁部樹脂層を射出成型等により形成する場合は、壁部樹脂層の形成と貫通孔の形成とを同一のプロセスで行うことができる。この他、パターンマスクを用いたエッチング等によっても貫通孔３２ａの形成が可能である。
貫通孔３２ａが形成されると、壁部樹脂層が壁部層３２となり、マイクロウェルアレイ３０が完成する。
【００４１】
その後、マイクロウェルアレイ３０の周囲に周縁部材３４を配置してから蓋部材２０を周縁部材３４上に配置する。基板１０、周縁部材３４、および蓋部材２０を一体に接合すると、マイクロ流体デバイス１が完成する。
【００４２】
次に、本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１を用いた、本実施形態の試料分析方法について説明する。
本実施形態のマイクロウェルアレイ３０は、各マイクロウェル３３内に試料等の水性液体を封入することが非常に容易である。ここで、封入するとは、マイクロウェルアレイ３０の各マイクロウェル３３に水性液体を導入し、更に、各ウェルに導入された液体同士が互いに混合しない状態に隔離することを意味する。隔離する方法としては、例えば、ウェルに水性液体を導入した後、流路内に後述する封止液を充填すること等が挙げられる。本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１によれば、マイクロウェルの少なくとも９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上、例えば１００％に水性液体を容易に封入することができる。
【００４３】
本実施形態のマイクロウェルアレイは、例えば遺伝子の変異検出等において、封入した水性液体の温度を変化させた場合も、ウェル内に水性液体を好適に保持することができる。変化させる温度の範囲は、例えば０℃〜１００℃であり、好ましくは０℃〜８０℃であり、更に好ましくは２０℃〜７０℃である。ウェルに封入した水性溶液がこの範囲内であると、デジタルＰＣＲやインベーダー反応等の微小空間内で行う酵素反応を好適に行うことができる。
【００４４】
本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１を使用して分析する試料としては、例えば血液等の生体から採取した試料が挙げられる。また、試料分析により検出する検出対象は、ＰＣＲ産物等であってもよいし、人工的に合成された化合物等であってもよい。例えば、生体分子であるＤＮＡを検出対象とする場合、ウェルは、ＤＮＡが１分子入るような形状及び大きさを有していてもよい。
【００４５】
以下、蛍光顕微鏡を用いた蛍光観察をする場合を例にとり、試料分析方法の詳細について説明する。準備工程として、マイクロウェルに封入する試料を調製する。試料は、検出対象を含有する水性の液体であり、例えば、生体試料を鋳型とし、検出試薬としてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを含むＰＣＲ反応溶液等が挙げられる。調整においては、界面活性剤を添加して、試料をよりマイクロウェル内に入りやすくしてもよい。また、検出対象を特異的に認識するビーズを添加して、検出対象を捕捉させておいてもよい。
【００４６】
次に、シリンジ等を用いて、調整した試料を第一孔２１から内部空間Ｓに供給する（試料供給工程）。供給された試料１００は、図３に示すように、各マイクロウェル３３内および流路３５に充填される。内部空間Ｓ内の気体は、試料供給工程の前に予め抜いておく。この脱気操作は、内部空間Ｓにバッファを満たすことにより行ってもよい。
【００４７】
次に、試料をマイクロウェル３３に封入する封入工程を行う。封入工程の前に、試料内の検出対象に蛍光標識を付けておく。蛍光標識処理は、試料供給工程の前の、例えば試料の調整時に行ってもよいし、試料供給工程後に、蛍光標識を内部空間Ｓに導入して行ってもよい。
封入工程では、シリンジ等を用いて、封止液を第一孔２１から内部空間Ｓに供給する（試料供給工程）。供給された封止液１１０は流路内を流れ、図４に示すように、流路３５内に存在する試料１００と置換される。その結果、試料１００は、各マイクロウェル３３内のみに、互いに独立した状態で配置され、試料の封入が完了する。
【００４８】
本明細書において封止液とは、マイクロウェルアレイ３０の各マイクロウェル３３に導入された水性液体同士が互いに混合しない状態に隔離するために用いる液体を意味し、例えば、オイル類等が挙げられる。オイルとしては、例えばシグマ社製の商品名「ＦＣ４０」や、３Ｍ社製の商品名「ＨＦＥ−７５００」、ＰＣＲ反応等に用いられるミネラルオイル等を用いることができる。
封止液は、壁部層３２の材質に対する接触角が５度以上８０度以下であることが好ましい。封止液の接触角がこの範囲であると、各マイクロウェル３３に好適に試料を封入することができる。封止液の接触角は、例えば、ＪＩＳ  Ｒ３２５７−１９９９に規定された静滴法に準じて、水の代わりに封止液を用いて測定すればよい。
【００４９】
続いて、試料の蛍光観察が行われるが、その前に、マイクロ流体デバイスをサーマルサイクラーにかけて、ＰＣＲ反応やインベーダー反応等の酵素反応等を必要に応じて行ってもよい。
【００５０】
次に、封入工程後のマイクロ流体デバイス１を、基板１０を下側にして倒立型の蛍光顕微鏡にセットし、基板１０側から励起光（電磁波）を照射する（電磁波照射工程）。励起光の波長は使用している蛍光標識に応じて適宜設定される。
マイクロウェル３３内に蛍光標識された検出対象が封入されていると、そのマイクロウェルは励起光によって蛍光を発する。使用者は、基板１０側から顕微鏡で蛍光を発するウェルを観察する（試料観察工程）。検出対象が例えば一塩基多型（ＳＮＰ）の場合、蛍光を発するマイクロウェルの数を数えることで、ＳＮＰの発現頻度等を分析することができる。
【００５１】
本実施形態に係るマイクロ流体デバイス１では、マイクロウェルアレイの壁面を構成する壁部層３２が有色成分を含有する材料で形成されている。したがって、壁部層３２の樹脂材料が励起光に対して自家蛍光を有していても、発生した自家蛍光は有色成分により吸収されて打ち消され、自家蛍光が低減される。その結果、マイクロウェル３３の周囲における自家蛍光が好適に低減され、マイクロウェル３３の観察に妨げになることが好適に防止される。
【００５２】
また、有色成分の粒子径がマイクロウェル３３の最小寸法に対して所定の範囲とされている。そのため、マイクロウェル３３の形成精度に影響を与えることを抑えつつ、試料分析における自家蛍光の影響を低減することができる。
さらに、有色成分の粒子がマイクロウェル３３の内壁面を適度に粗面化する。その結果、試料とマイクロウェルとの接触面積が増加し、封入効率を向上させることができる。
【００５３】
さらに、壁部層３２の形成材料の中に、樹脂以外の自家蛍光を有する物質（例えば埃等）が入っていた場合でも、物質の周囲に有色成分が存在するため、励起光が物質まで到達しにくい。仮に励起光が物質まで少量到達した場合でも、発生した自家蛍光は有色成分により吸収されて打ち消され、試料分析に影響を与えにくい。
【００５４】
加えて、基板１０と壁部層３２との境界の位置を認識しやすいため、試料観察工程において、マイクロウェル３３の底面付近に顕微鏡のピントを合わせやすい。したがって、試料観察を簡便かつ好適に行うことができる。
【００５５】
さらに、壁部層３２が有色に形成されるため、壁部層３２の視認性が向上し、形成状況等を好適に確認することができる。したがって、マイクロ流体デバイス１の製造における品質管理や工程管理等の品質チェックが容易となる。
【００５６】
さらに、壁部層３２の色彩特性を利用した偽造防止も可能である。壁部層が透明である場合、外観だけでは所定の樹脂で作製されているか否かを判別することが出来ない。本実施形態のように、フェロシアンブルー等の有色成分を含有した材料から壁部層を作製した場合、一見して同様の色彩であっても、分光光度計により測定した吸収スペクトルにより、正当な製造者が製造した物と第三者による偽造品とを容易に判別することができる。
【００５７】
また、本実施形態に係る試料分析方法によれば、電磁波照射工程において電磁波をマイクロ流体デバイス１に照射し、電磁波が照射されたマイクロウェル３３内の試料を基板１０側から観察する。これにより以下の効果を奏する。
図５に示すように、マイクロ流体デバイス１の蓋部材２０上に自家蛍光を有する埃ｄが落下した場合、埃ｄは照射された励起光により蛍光を発する。マイクロウェル３３の分析においては、埃ｄのような小さなものが発する蛍光であっても、試料分析に支障を及ぼすノイズとなる可能性が十分にある。本実施形態に係る試料分析方法では、基板１０側からマイクロウェル３３を観察する。そのため、マイクロ流体デバイス１の平面視において壁部層３２と重なる位置に落下した埃ｄが蛍光を発しても、壁部層３２の有色成分により好適に打ち消される。また、基板１０側から励起光を照射した場合は、壁部層３２の有色成分により埃ｄに到達する励起光が減少するため、蛍光自体が発生しにくくなる。したがって、壁部層３２を形成する材料以外に起因する自家蛍光の影響をも好適に抑えて試料分析を行うことができる。
【００５８】
さらに、埃ｄ等の自家蛍光性異物が壁部層３２内に存在する場合でも、ほとんどの場合、自家蛍光性異物と基板１０との間には有色成分を含む壁部層３２の形成材料が存在する。このため、有色成分が自家蛍光の発生を抑制するとともに、発生した蛍光についても有色成分により吸収されて好適に打ち消される。自家蛍光性異物が繊維状である場合、有色成分が異物内に入り込み、より好適に自家蛍光を吸収する。
【００５９】
本実施形態において、使用する蛍光波長は、任意の波長で選択することが出来る。例えば可視光領域である３５０〜７００ｎｍの波長範囲にピークを有する蛍光を検出する場合、発生する蛍光の色として青、緑、黄、赤色などを選択し、検出したい生体分子ごとに結合する蛍光分子の色を異ならせておく。これにより、一度の検出で複数種の生体分子を検出することが可能となる。
ここで、有色成分として、黒色または青色の成分を用いると、広い波長範囲の電磁波を吸収できるため、汎用性が高く、好ましい。
【００６０】
また、有色成分の電磁波吸収特性は、使用する蛍光波長や、使用する励起光の波長、また、落下の可能性がある埃等の自家蛍光波長等に応じて適宜変更されてよい。また、壁部層は、所定の波長の電磁波を完全に吸収する必要は必ずしもなく、上述した自家蛍光の影響を試料分析に支障のない程度まで低減できればよい。「試料分析に支障のない程度」とは、少なくとも検出対象の蛍光強度の１／２以下であり、１／１０以下であるとさらに好ましい。
【００６１】
以上説明した本実施形態に係るマイクロ流体デバイスおよび試料分析方法について、効果を確認するための実施例および比較例を用いてさらに説明する。
（実施例１）
自家蛍光を有さない基板１０として、厚さ５００μｍのガラス基板を準備した。基板１０の一方の面にヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）を含む溶液を塗布して底部層３１を形成した。
壁部層３２の形成材料として、感光により硬化するネガ型のフォトレジストにフェロシアンブルーを３０ｗｔ％添加したものを用いた。形成材料を底部層３１上にスピンコートにより３μｍの厚さに塗布し、プリベークを行った後感光させた。次に現像処理を行い、不要なフォトレジストを除去して壁部層３２を形成した。
プリベークの条件および露光条件等は使用したフォトレジストに基づき適宜設定した。
以上により本実施形態に係るマイクロ流体デバイスと同等の層構造を有する実施例１の積層体を得た。
（実施例２）
自家蛍光を有さない基板１０として、厚さ５００μｍのガラス基板を準備した。基板１０の一方の面にヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）を含む溶液を塗布して底部層３１を形成した。
壁部層３２の形成材料として、感光により硬化するネガ型のフォトレジストにフェロシアンブルーを３０ｗｔ％添加したものを用いた。形成材料を底部層３１上にスピンコートにより３μｍの厚さに塗布し、プリベークを行った。その後、ドット状に微小孔（貫通孔）が形成されるように感光させた。次に現像処理を行い、不要なフォトレジストを除去した。このようにして微小孔を有する壁部層３２を形成した。
プリベークの条件および露光条件等は使用したフォトレジストに基づき適宜設定した。
以上により本実施形態に係るマイクロ流体デバイスと同等の層構造を有する実施例２の積層体を得た。
【００６２】
（比較例１）
実施例１と同一のガラス基板を基板として準備した。基板の一方の面に、無色透明で自家蛍光を有さない熱硬化樹脂（旭硝子社製  ＣＹＴＯＰ）をスピンコートにより３μｍの厚さに塗布し、ベークして硬化させることで壁部層を形成した。
以上により壁部層が有色成分を含まない比較例１の積層体を得た。
（比較例２）
実施例１と同一のガラス基板を基板として準備した。基板の一方の面に、無色透明で自家蛍光を有さない熱硬化樹脂（旭硝子社製  ＣＹＴＯＰ）をスピンコートにより３μｍの厚さに塗布し、ベークして硬化させた。その上にドライエッチング用のレジストを塗布し、ドット状に微小孔（貫通孔）が形成されるように感光させた。次に現像処理を行い不要なレジストを除去した。これによりＣＹＴＯＰ上にドライエッチング用のフォトレジストを形成した。このフォトレジストの上からドライエッチングを実施し、ＣＹＴＯＰから形成される壁部層を形成した。最後にＣＹＴＯＰ上のドライエッチング用のフォトレジストを除去し、壁部層に微小孔（貫通孔）を形成した。
以上により壁部層が有色成分を含まない比較例２の積層体を得た。
【００６３】
（実施例１および比較例１を用いた観察手順）
励起光として、３５０ｎｍ、４８０ｎｍ、および５９０ｎｍの３種類の波長の光を用いた。すべての励起光に対して自家蛍光を有するシートを実施例１および比較例１の壁部層３２に接触させて配置した。その後、基板１０側から各励起光を照射し、基板１０側に戻る蛍光の蛍光強度を計測した。
【００６４】
（結果）
実施例１および比較例１の測定結果を図６に示す。各励起光の波長に並べて蛍光波長を示している。
使用した各波長の励起光について同一条件で蛍光強度を測定した。その結果、実施例１では比較例１に対して、試料分析に支障のない１／７〜１／８０程度まで蛍光強度を低減できることが確認できた。
【００６５】
図７に、実施例１の顕微鏡画像を示す。画像における左下の一部領域において、比較のため壁部層３２が除去されている。この一部領域のみ自家蛍光シートの蛍光で明るく見えるが、他の部分は暗くなっており、壁部層３２が自家蛍光シートの蛍光の影響を好適に低減している。
図８に、比較例１の顕微鏡画像を示す。左下の帯状の部分において、図７同様、壁部層が除去されている。比較例１では、壁部層の有無に関係なく全体が明るく見えており、自家蛍光が強く影響していることが示された。
【００６６】
壁部層３２の材料として用いたフォトレジスト自体は、上述の波長の励起光に対して自家蛍光を有する。図９に、顔料の有無によるフォトレジストの蛍光強度の違いを示す。「顔料なし」のデータについては、フォトレジストの厚さおよび蛍光強度の測定条件を、実施例１と同一にして取得した。
図９に示すように、顔料を添加していない状態において、フォトレジストは強い自家蛍光を示した。これにより、使用する励起波長に対して自家蛍光を有する材料であっても、有色成分を含有させることで壁部層の材料として使用可能なことが示された。
【００６７】
（実施例２および比較例２を用いた観察手順）
励起光として、４８８ｎｍ波長の光を用いた。すべての励起光に対して自家蛍光を有するシートを実施例２および比較例２の壁部層３２に接触させて配置した。その後、基板１０側から各励起光を照射し、基板１０側に戻る蛍光の蛍光強度を計測した。
【００６８】
（結果）
実施例２および比較例２で使用した励起光について同一条件で蛍光強度を測定した。その結果、実施例２では比較例２に対して、微小孔部分（底面がガラスで透過）のみで蛍光が観察された。比較例２では、微小孔部分だけでなく壁部層がある部分でも蛍光が観察された。
【００６９】
実施例２および比較例２の明視野観察の結果を図１１Ａ及び１１Ｂに示す。実施例２では微小孔以外の部分に色がついており暗く見えた（微小孔部分は底がガラスのため透明である）。
【００７０】
図１２に、実施例２の顕微鏡画像を示す。画像におけるドット状に観察される領域において、壁部層３２が観察されなかった。微小孔の部分のみ明るく見えるが、他の部分は暗くなっており、壁部層３２が自家蛍光シートの蛍光の影響を好適に低減していることが確認できた。
図１３に、比較例２の顕微鏡画像を示す。図１１Ｂの明視野画像から分かるようにドット状の微小孔を有しているが、比較例２では、壁部層の有無に関係なく全体が明るく見えており、自家蛍光が強く影響していることが示された。
【００７１】
以上、実施形態および実施例を用いて本発明の一実施形態に係るマイクロ流体デバイスおよび試料分析方法について説明したが、本発明の技術範囲は上記実施形態および実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において構成要素の組み合わせを変えたり、各構成要素に種々の変更を加えたり、削除したりすることが可能である。
【００７２】
例えば、本実施形態に係る試料分析方法においては、上述したようにマイクロ流体デバイスの基板を下側にして配置した場合、基板上に埃等が落下する可能性が低いため好ましい。しかしながら、基板を上側に配置した状態で試料観察工程を行ってもよい。このようにしても、蓋部材２０に埃などの自家蛍光を有する異物が付着していた場合に自家蛍光の低減を行うことができる。
ただし、基板を上側に配置する場合、基板上に埃等が落下すると埃等の自家蛍光が試料観察に影響を及ぼす可能性があるため、試料観察工程の直前に基板上にエアを噴射する等の処理を行うのが好ましい。
【００７３】
また、本実施形態に係るマイクロ流体デバイスの変形例として、マイクロウェルを二次元アレイ状に配置したマイクロ流体デバイス１Ａを図１０に示す。マイクロ流体デバイス１と共通する構成については同一の符号を付して重複する説明を省略する。
【００７４】
マイクロ流体デバイス１Ａでは、マイクロウェル（不図示）が二次元アレイ状に配列された単位ウェルアレイ１３１がさらに二次元アレイ状に配列されてマイクロウェルアレイ１３０が構成されている。このようにすると、多数のマイクロウェルを高精度かつ高密度に配置することができる。
マイクロ流体デバイス１Ａの蓋部材２０Ａは、第二孔を有していない。そのかわりに、マイクロ流体デバイス１Ａの平面視における矩形形状の一辺に周縁部材３４を配置しないことにより、内部空間Ｓの周縁の一部を開放している。したがって、第一孔２１から導入した試料や封止液のうち過剰な部分は開放された周縁から排出される。マイクロ流体デバイスをこのように構成しても、同様の効果を奏する。
【００７５】
また、本実施形態に係る試料分析方法は、蛍光または燐光を用いた方法に限定されない。例えば、濁度等を用いた試料分析にも適用可能である。濁度を用いる場合、例えば４００〜１０００ｎｍ程度の波長の光を用いて測定することができ、これにもとづいて有色成分および壁部層の電磁波吸収特性を設定すればよい。
【符号の説明】
【００７６】
１、１Ａ  マイクロ流体デバイス
１０  基板
２０、２０Ａ  蓋部材
３０  マイクロウェルアレイ
３２  壁部層
３３  マイクロウェル
１００  試料
１１０  封止液
【図１】
2017061600.tif 000003
【図２】
2017061600.tif 000004
【図３】
2017061600.tif 000005
【図４】
2017061600.tif 000006
【図５】
2017061600.tif 000007
【図６】
2017061600.tif 000008
【図７】
2017061600.tif 000009
【図８】
2017061600.tif 000010
【図９】
2017061600.tif 000011
【図１０】
2017061600.tif 000012
【図１１Ａ】
2017061600.tif 000013
【図１１Ｂ】
2017061600.tif 000014
【図１２】
2017061600.tif 000015
【図１３】
2017061600.tif 000016
【国際調査報告】
2017061600.tif 000017
2017061600.tif 000018
2017061600.tif 000019
2017061600.tif 000020