(57)【要約】クラス２食物アレルゲンを有する食品を発酵させ、発酵食品組成物を製造する方法であり、クラス２食物アレルゲンを有する食品に、少なくともロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ以上、７２０ｕｎｉｔ以下である乳酸菌を添加し、前記食品を含む混合物のｐＨを４．０以上、８．５未満に調節しながら発酵する工程、および金属プロテアーゼによる酵素処理工程とを含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラス２食物アレルゲンを有する食品を発酵させ、発酵食品組成物を製造する方法であって、
クラス２食物アレルゲンを有する食品に、少なくともロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ以上、７２０ｕｎｉｔ以下である乳酸菌を添加し、前記食品を含む混合物のｐＨを４．０以上、８．５未満に調節しながら発酵する発酵工程、および
金属プロテアーゼによる酵素処理工程と、
を含む製造方法。
【請求項２】
前記酵素処理工程を、前記発酵工程前または前記発酵工程後に行なう請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記金属プロテアーゼが、エンド型金属プロテアーゼである請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記エンド型金属プロテアーゼが、糸状菌由来または細菌由来のエンド型金属プロテアーゼである請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記糸状菌がアスペルギルス属に属する菌、前記細菌がバチルス属に属する菌である請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
酵素処理時間が４時間以下である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
酵素処理における酵素添加量がクラス２食物アレルゲンを有する食品のタンパク質重量あたり１０Ｕ／ｇ以上、１２００Ｕ／ｇ以下である請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
前記乳酸菌がラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属およびエンテロコッカス属に属する乳酸菌からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上である請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
前記クラス２食物アレルゲンが、ＢｅｔＶ１および／またはＢｅｔＶ２のアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
前記クラス２食物アレルゲンを有する食品が大豆および／または大豆加工食品である請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１１】
アルギニン１ｍｇに対して請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法により得られた発酵食品組成物を５ｍｇ以上、１０００ｍｇ以下を添加しアルギニンの苦味を低減する方法。
【請求項１２】
アルギニン１ｍｇに対して請求項１〜１０のいずれかに記載の製造方法により得られた発酵食品組成物を５ｍｇ以上、１０００ｍｇ以下を含有している飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クラス２食物アレルゲンが低減した発酵食品組成物の製造方法、および安全で風味良好で体内への消化吸収性が優れた発酵食品組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
食品の安全性に対する関心が高まる中、食物アレルギー患者の増加あるいは多様化は大きな社会問題となっている。従来、食物アレルギーは、経口摂取した食品に含まれる特定のタンパク質によって感作が成立し、その後、食物を再度摂取した際に蕁麻疹、下痢等の症状を認めるものとされている。【０００３】
しかし、近年、花粉症やラテックスアレルギーに罹患している人において、果実や野菜、豆類を摂取した際、唇や喉等に痒みや腫れ等のアレルギー（クラス２食物アレルギー）を発症する人が増加している。例えば、ハンノキ花粉症に罹患している人が、大豆やモモ、リンゴ、トマト、キウイといった食品を摂取した後、クラス２食物アレルギーを発症し、受診する症例が増加している。さらに、クラス２食物アレルギーで受診する患者の多くは、自身がクラス２食物アレルギーであるという認識が無い場合が多く、重篤なアレルギー症状に至るという問題が起きている。クラス２食物アレルギーの原因としては、植物や果実等に含まれるクラス２食物アレルゲンが挙げられ、当該アレルゲンは花粉やラテックスのアレルゲンと高い相同性を有することから、花粉症に罹患している人の体内で花粉のアレルゲンと認識されてしまい、アレルギー症状を引き起こすことが判明している。【０００４】
一方、これまでに食物アレルギーに対する解決手段として、プロテアーゼまたは塩水を用いてアレルゲン低減化小麦粉を製造する方法（特許文献１）、乳酸菌由来のプロテアーゼを用いてアレルゲン低減米を製造する方法（特許文献２）、腸内細菌を用いて大豆胚軸を発酵し、大豆に含まれるアレルゲンを低減する方法（特許文献３）が開示されている。【０００５】
また、近年、健康に対する関心が高まっており、中でも、アルギニンは筋肉の増強、骨の強化、疲労回復効果、免疫機能の向上など様々な有用な効果を有することから、アルギニンを含む食品が多数開発されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１０−１０８６３６公報
【特許文献２】特開平１１−００９２０２公報
【特許文献３】特開２０１２−２２８２５２公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、例えば特許文献１または２に記載の方法は、プロテアーゼのみを使用するため、製造コストが膨大になるとともに、塩水等を食品に添加するため、得られた発酵物において苦味が生じてしまう問題が懸念される。【０００８】
本発明者らは、上記の先行文献における問題を解決するために、例えば、先行文献３に記載されている、クラス２食物アレルゲンを有する食品を乳酸菌発酵した際のクラス２食物アレルゲン低減について検討を行なった。しかしながら、クラス２食物アレルゲンを有する食品を乳酸菌発酵しただけでは、クラス２食物アレルゲンを十分に分解できず、食品自体の吸収性までは向上できないという問題を見出した。さらに、褥瘡や血流を改善する効果を有するアルギニンを食品に添加した場合、アルギニンが強力な苦味を有しているため、食品がアルギニンを微量に含んでいると、アルギニンに由来する苦味に影響されてしまい、好適に食することができないという問題を見出した。【０００９】
以上の問題等を鑑みて、本発明の目的は、クラス２食物アレルギーの原因タンパク質であるクラス２食物アレルゲンが効率よく低減され、風味が良好であり、アルギニンに由来する苦味が低減され、しかも体内への消化吸収性に優れた発酵食品組成物を製造する方法を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、アルギニンを添加した飲食品であっても、アルギニンに由来する苦味を効率よく低減できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、クラス２食物アレルゲンを有する食品に特定の範囲のロイシンアミノペプチダーゼ活性を有する乳酸菌を添加し、特定のｐＨ条件下で発酵させ、さらに金属プロテアーゼで酵素処理することで、食品中のクラス２食物アレルゲンが効率よく低減され、風味が良好であり、アルギニンに由来する苦味が低減され、しかも体内への消化吸収性に優れた発酵食品組成物を得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち、本発明が提供するのは以下の通りである。
（１）クラス２食物アレルゲンを有する食品を発酵させ、発酵食品組成物を製造する方法であって、
クラス２食物アレルゲンを有する食品に、少なくともロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ以上、７２０ｕｎｉｔ以下である乳酸菌を添加し、前記食品を含む混合物のｐＨを４．０以上、８．５未満に調節しながら発酵する発酵工程、および
金属プロテアーゼによる酵素処理工程と、
を含む製造方法。
（２）前記酵素処理工程を、前記発酵工程前または前記発酵工程後に行なう（１）記載の製造方法。
（３）前記金属プロテアーゼが、エンド型金属プロテアーゼである前記（１）または（２）に記載の製造方法。
（４）前記エンド型金属プロテアーゼが、糸状菌由来または細菌由来のエンド型金属プロテアーゼである前記（３）に記載の製造方法。
（５）前記糸状菌がアスペルギルス属に属する菌、前記細菌がバチルス属に属する菌である前記（４）に記載の製造方法。
（６）酵素処理時間が４時間以下である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）酵素処理における酵素添加量がクラス２食物アレルゲンを有する食品のタンパク質重量あたり１０Ｕ／ｇ以上、１２００Ｕ／ｇ以下である前記（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法。
（８）前記乳酸菌がラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属およびエンテロコッカス属に属する乳酸菌からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上である前記（１）〜（７）のいずれかに記載の製造方法。
（９）前記クラス２食物アレルゲンが、ＢｅｔＶ１および／またはＢｅｔＶ２のアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる前記（１）〜（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０）前記クラス２食物アレルゲンを有する食品が大豆および／または大豆加工食品である前記（１）〜（９）のいずれかに記載の製造方法。
（１１）アルギニン１ｍｇに対して前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の製造方法により得られた発酵食品組成物を５ｍｇ以上、１０００ｍｇ以下を添加しアルギニンの苦味を低減する方法。
（１２）アルギニン１ｍｇに対して前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の製造方法により得られた発酵食品組成物を５ｍｇ以上、１０００ｍｇ以下を含有している飲食品。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の製造方法は、ロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ以上、７２０ｕｎｉｔ以下である乳酸菌と金属プロテアーゼを用いることで、クラス２食物アレルゲンが効率よく低減し、体内への消化吸収性に優れた発酵食品組成物を提供することができる。また、金属プロテアーゼだけではなく乳酸菌も用いているため、風味が良好であり、金属プロテアーゼによる味の影響とアルギニンに由来する苦味が低減された発酵食品組成物を提供することができる。
さらに、本発明の製造方法により得られる発酵食品組成物は、クラス２食物アレルゲンが十分に低減されていることから、花粉症やラテックスアレルギーに罹患している人にとって、安全に摂取することができ、良好な風味を有し、アルギニンに由来する苦味が低減され、しかも体内への消化吸収性に優れているため、クラス２食物アレルゲンを有する食品の代替として使用可能である。
また、本発明では、前記発酵食品組成物を用いることで、アルギニンを添加した飲食品において、アルギニンに由来する苦味を効率よく低減させることができるため、様々な飲食品においてアルギニンを強化した機能性食品を提供することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例における本発明品１のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル染色並びにデンシトグラムの結果を示すグラフ（上図）及び比較品３のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル染色並びにデンシトグラムの結果を示すグラフ（下図）である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳述する。
本発明は、クラス２食物アレルゲンを有する食品を発酵させて発酵食品組成物を製造する方法に関する。
【００１５】
本発明でいうクラス２食物アレルゲンとは、花粉やラテックスに含まれるアレルゲンとアミノ酸配列の配列同一性が高いタンパク質を指し、主に植物や果実等に含まれる。特定のアレルゲンに対し配列同一性が２０％以上であれば、アレルギー症状を誘発する場合もあることから、本発明のクラス２食物アレルゲンとは、花粉やラテックスに含まれるアレルゲンとアミノ酸配列の配列同一性が２０％以上であるタンパク質を指す。
【００１６】
具体的には、以下のタンパク質が例示できる。シラカバ花粉の主要抗原である配列番号１に記載のＢｅｔＶ１のアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、好ましくは３０％以上、より好ましくは４０％以上、さらに好ましくは４７％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質、シラカバ花粉の主要抗原である配列番号２に記載のＢｅｔＶ２のアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは７４％以上の配列同一性を有するアミノ酸からなるタンパク質である。より具体的なクラス２食物アレルゲンとしては、ＢｅｔＶ１および／またはＢｅｔＶ２のアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性を有するＰＲ−１０ファミリータンパク質やプロフィリンファミリータンパク質が挙げられ、なかでもＰＲ−１０ファミリータンパク質であり、ＢｅｔＶ１のアミノ酸配列と４７％の配列同一性を有する、ダイズ由来のタンパク質である配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＧｌｙｍ４や、プロフィリンファミリータンパク質であり、ＢｅｔＶ２のアミノ酸配列と７４％の配列同一性を有する、ダイズ由来のタンパク質である配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＧｌｙｍ３が挙げられる。
【００１７】
尚、Ｇｌｙｍ４、またはＧｌｙｍ３のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するタンパク質、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をからなるタンパク質も本発明でいうクラス２食物アレルゲンに含まれる。
【００１８】
本発明でいうクラス２食物アレルゲンを有する食品とは、ヒトにおいて、クラス２食物アレルギーを引き起こす食品である。例えば、クラス２食物アレルギーを引き起こす食品として、リンゴ、モモ、イチゴ、ナシ、ビワ、サクランボ等のバラ科の食品、メロン、スイカ、キュウリ等のウリ科の食品、大豆、キウイ、オレンジ、ヤマイモ、マンゴー、アボカド、ヘーゼルナッツ（ハシバミ）、ニンジン、セロリ、ジャガイモ、トマト、ゴボウ、クルミ、アーモンド、ココナッツ、ピーナッツ、ライチ、タマネギ、米、小麦、マスタード、パプリカ、コリアンダー、トウガラシ、クミン等が挙げられる。なかでも、シラカバ花粉症に罹患している人の約半数が、クラス２食物アレルギーを発症することから、シラカバ花粉の主要抗原であるＢｅｔＶ１および／またはＢｅｔＶ２のアミノ酸配列と配列同一性が、少なくとも２０％以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質を多く含む食品であるリンゴ、モモ、イチゴ、ナシ、ビワ、サクランボ、メロン、スイカ、キュウリ、大豆、キウイ、オレンジ、ヤマイモ、マンゴー、アボカド、ヘーゼルナッツ（ハシバミ）、ニンジン、セロリ、ジャガイモ、トマト、ゴボウ、クルミ、アーモンド、ココナッツ、ピーナッツ、ライチ、マスタード、パプリカ、コリアンダー、トウガラシ等の食品が好ましい。特に、本発明のクラス２食物アレルゲンを有する食品としては、年間の消費量が多く、シラカバ花粉症に罹患している人が摂取した際、アナフィラキシーショック等、重篤なアレルギー症状を示すことが報告されている大豆、コムギ、それらの加工食品が好ましい。また、前記クラス２食物アレルゲンを有する食品は、単独または２種類以上の食品を組み合わせて使用してもよい。
【００１９】
さらに、本発明で使用するクラス２食物アレルゲンを有する食品は、上述で挙げられた野菜や果実等を水、熱水または食品に使用可能な有機溶媒等で抽出した抽出物、もしくは搾汁、磨砕、破砕または酵素等の処理した非濃縮物、濃縮物、希釈物または乾燥物等に加工して用いても良い。
【００２０】
また、本発明において、クラス２食物アレルゲンを有する食品に任意成分を適宜添加してもよい。前記任意成分としては、糖質、酵母エキス、肉エキス、ビタミン類、無機塩やペプチド類、アミノ酸類等が挙げられる。
【００２１】
前記アミノ酸類の中でも、褥瘡や血流を改善する効果を有するアルギニンを添加するのが好ましく、本発明の発酵食品組成物の製造方法を用いれば、アルギニン由来の苦味が低減された風味が良好な発酵食品組成物を得ることができる。
【００２２】
以下に本発明の製造方法を詳述する。
本発明の製造方法は、クラス２食物アレルゲンを有する食品に、少なくともロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ以上、７２０ｕｎｉｔ以下である乳酸菌を添加し、前記食品を含む混合物のｐＨを４．０以上、８．５未満に調節しながら発酵する発酵工程（以下、（ａ）工程ともいう）を含む。
【００２３】
本発明におけるロイシンアミノペプチダーゼ活性は、乳酸菌の湿菌体１ｇあたりの反応液とブランクとの５４０ｎｍにおける吸光度の差（５４０ｎｍにおける吸光度の差／湿菌体（ｇ））が１である場合を１ｕｎｉｔとして定義し、Ｍａｔｓｕｔａｎｉら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１１，３００，１９６７）の方法に準じて測定することができる。
前記ロイシンアミノペプチダーゼは、乳酸菌以外の微生物も有しており、前記微生物としては、例えば麹菌や枯草菌などが挙げられる。
【００２４】
本発明の製造方法に用いる乳酸菌は、特定のロイシンアミノペプチダーゼ活性を有する乳酸菌であり、ロイシンアミノペプチダーゼ活性としては７５ｕｎｉｔ以上であり、好ましくは７７ｕｎｉｔ以上、より好ましくは１６６ｕｎｉｔ以上、さらに好ましくは３６８ｕｎｉｔ以上である。またロイシンアミノペプチダーゼ活性の上限としては７２０ｕｎｉｔ以下であり、好ましくは７１９ｕｎｉｔ以下であり、より好ましくは５８９ｕｎｉｔ以下である。ロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ未満の乳酸菌であると、クラス２食物アレルゲンを低減しない、もしくはクラス２食物アレルゲンを低減するための発酵時間が長くなり好ましくない。また、乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼ活性が７２０ｕｎｉｔ以上の乳酸菌であると、得られた発酵食品組成物に苦味が発生する場合があり好ましくない。
【００２５】
また、本発明の製造方法に用いる乳酸菌は、ロイシンアミノペプチダーゼ活性が上記の範囲内にある乳酸菌であれば特に限定されないが、例えば、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ペディオコッカス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、バチルス属およびビフィドバクテリウム属に属する乳酸菌等が挙げられる。
より具体的な一例としては、
（１）ラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）Ｋ−４株（平成３年５月１５日付で工業技術院微生物工業技術研究所  特許寄託センターに微工研菌寄１２２４９号（ＦＥＲＭ  Ｐ−１２２４９）として寄託され、２０１６年９月１５日付でブダペスト条約の規定下で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ-ＩＰＯＤ）  〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に受領され（受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１２２４９）、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２４９として国際寄託に移管されている）、
（２）ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）  Ｒ０３７株（２０１０年２月１０日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）  〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−９００として国際寄託されている。）、
（３）ペディオコッカス・エスピー（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）３７９株（２０１３年１２月４日付でＮＰＭＤに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７７３として寄託され、２０１４年１１月１７日付でブダペスト条約の規定下で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７７３として国際寄託に移管されている）、
（４）ペディオコッカス・エスピー（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）３８０株（２０１３年１２月４日付でＮＰＭＤに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７７２として寄託され、２０１４年１１月１７日付でブダペスト条約の規定下で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７７２として国際寄託に移管されている）、
（５）ストレプトコッカス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）４６２株（２０１３年１２月４日付でＮＰＭＤに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１７７１として寄託され、２０１４年１１月１７日付でブダペスト条約の規定下で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７７１として国際寄託に移管されている）、
（６）ラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）２８株（２０１５年１０月３０日付でＮＰＭＤに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１５４として寄託され、２０１６年９月１５日付でブダペスト条約の規定下でＮＰＭＤに受領され（受領番号ＮＩＴＥ  ＡＢＰ−０２１５４）、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２１５４として国際寄託に移管されている）
などが挙げられる。
【００２６】
また、本発明の（ａ）の工程において、乳酸菌を添加する前に、予め、クラス２食物アレルゲンを有する食品を殺菌することができる。殺菌方法は、使用する食品の種類に応じて適当なものを選択すればよく、例えば、ＵＨＴ（超高温殺菌法）のような高温殺菌、レトルト殺菌、電磁波殺菌、高温真空殺菌、オゾン殺菌、電解水殺菌、間接過熱殺菌などが挙げられるが、特に限定はない。
【００２７】
また、本発明の（ａ）の工程における発酵の温度は、乳酸菌の生育に適した温度であれば、特に限定されないが、例えば、発酵の温度は１５〜４５℃であり、好ましくは２５〜４０℃、さらに好ましくは３０〜３７℃である。
【００２８】
また、本発明の（ａ）の工程におけるクラス２食物アレルゲンを有する食品に乳酸菌を添加し発酵させる際の前記食品を含む混合物のｐＨは４．０以上であり、好ましくは４．４以上であり、より好ましくは５．５以上である。また、本発明の（ａ）の工程における前記食品を含む混合物のｐＨの上限としては８．５未満であり、より好ましくは７．５以下であり、さらに好ましくは６．５以下である。前記食品を含む混合物のｐＨが４．０未満であるとロイシンアミノペプチダーゼ活性が弱まり所望の発酵食品組成物が得られない場合があり好ましくない。また、前記食品を含む混合物のｐＨが８．５以上であると、乳酸菌の増殖性が悪化し所望の発酵食品組成物が得られない場合があり好ましくない。
なお、前記食品を含む混合物とは、前記クラス２食物アレルゲンを有する食品および乳酸菌を混合した液状組成物をいう。前記クラス２食物アレルゲンを有する食品には、金属プロテアーゼによる酵素処理をされたものも含まれる。
【００２９】
本発明の（ａ）の工程におけるｐＨの調整は、発酵中における前記食品を含む混合物のｐＨが４．０以上、８．５未満になるように必要に応じて行えばよい。ｐＨを調節するにあたっては、食品に使用可能な化合物であれば、特に限定されないが、食品として摂取できる観点から、２価の金属化合物、水酸化ナトリウム、硫酸、アンモニア、クエン酸、乳酸等を用いることができ、これらの化合物を併用しても良い。食品に使用可能な２価の金属化合物としては、酢酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、リン酸三マグネシウム等のマグネシウム化合物、クエン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ピロリン酸二水素カルシウム、リン酸三カルシウム、ステアリン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム等のカルシウム化合物、グルコン酸亜鉛、硫酸亜鉛等の亜鉛化合物が挙げられる。ｐＨの調整方法は特に限定されないが、ｐＨ電極で前記食品を含む混合物中のｐＨを測定し、自動で供給する方法であっても良いし、発酵前に炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等の中性領域において不溶性の２価の金属化合物を予め添加しても良い。
【００３０】
本発明の（ａ）の工程における発酵時間としては、乳酸菌の種類および生育状況に応じて時間を設定すれば特に限定されないが、具体的には、１時間以上３６時間以下が好ましく、より好ましくは１時間以上２４時間以下、さらに好ましくは１時間以上１２時間以下である。発酵時間が１時間以上３６時間以下であると、得られる発酵食品組成物の風味が良くなる。
【００３１】
前記（ａ）の工程において、前記発酵時間で発酵を終了すればよいが、クラス２食物アレルゲンが発酵前よりも４０％以上低減するのに必要な発酵時間を設定してもよい。なお、発酵前の食品または発酵食品組成物中のクラス２食物アレルゲンの量は、後述の実施例に記載の方法により測定すればよい。
【００３２】
また、前記（ａ）工程において、クラス２食物アレルゲンの低減効率を向上させる観点から、クラス２食物アレルゲンを有する食品に２価の金属化合物を添加してもよい。前記２価の金属化合物としては、アルカリ土類金属、周期表１１族金属、周期表１２属金属のいずれかを含む化合物が挙げられるが、なかでも、通常食品として摂取できる観点から酢酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、リン酸三マグネシウム等のマグネシウム化合物、クエン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ピロリン酸二水素カルシウム、リン酸三カルシウム、ステアリン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム等のカルシウム化合物、グルコン酸亜鉛、硫酸亜鉛等の亜鉛化合物が好ましい。また、前記２価の金属化合物の代わりに、カルシウム、マグネシウムおよび亜鉛からなる群より選ばれる少なくとも１つ以上の金属化合物含有量の多い食品を添加してもよい。
【００３３】
本発明において、前記２価の金属化合物の添加量としては、原料であるクラス２食物アレルゲンを有する食品に対して好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。また、前記２価の金属化合物の添加量の上限としては好ましくは１ｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。なお、前記２価の金属化合物の添加量が１ｍｏｌ／Ｌより大きいと、２価の金属イオン特有の苦味、食感がざらつく等、風味が悪くなるため、好ましくない。
なお、前記２価の金属化合物の添加量を測定するための前記クラス２食物アレルゲンを有する食品の状態としては、前記食品を乳酸菌によって発酵させるために液状組成物としている状態をいう。
【００３４】
前記（ａ）工程終了後、乳酸菌を殺菌してもよい。
乳酸菌の殺菌方法としては、食品における常法を用いればよく、低温殺菌法、レトルト殺菌法、濾過滅菌法、高圧殺菌、マイクロ波殺菌法などが挙げられるが、特に限定はない。
【００３５】
さらに、本発明の製造方法は、金属プロテアーゼで酵素処理する工程（以下、（ｂ）工程ともいう）を含む。なお、本発明において、前記（ｂ）工程は、前記（ａ）工程の前または後のいずれかで行えばよい。
【００３６】
前記金属プロテアーゼとは、金属が触媒作用に関係しているプロテアーゼであり、例えば、エキソ型金属プロテアーゼやエンド型金属プロテアーゼが挙げられる。
エキソ型とは、タンパク質分子のアミノ酸配列末端からペプチド結合を加水分解して、タンパク質や高分子ペプチドを低分子のペプチドに分解するタイプをいい、基質となるタンパク質をＮ末端から切断するタイプとＣ末端から切断するタイプが存在する。
エンド型とは、タンパク質分子内部のペプチド結合を加水分解して、タンパク質や高分子ペプチドを低分子のペプチドに分解するタイプをいう。
【００３７】
前記エンド型金属プロテアーゼの例としては、糸状菌由来または細菌由来のエンド型金属プロテアーゼが挙げられる。
前記糸状菌としては、アスペルギルス属（Aspergillus）、クモノスカビ属（Rhizopus）などに属する菌などが挙げられる。
前記細菌としては、バチルス属（Bacillus）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）などに属する菌などが挙げられる。
前記エンド型金属プロテアーゼの具体例としては、天野エンザイム株式会社製「プロチンＳＤ−ＮＹ１０」、「サモアーゼＣ１００」「プロテアーゼＰ３ＳＤ」、「プロテアーゼＭＳＤ」、エイチビィアイ株式会社製「ヌクレイシン」、「オリエンターゼ」シリーズなどが挙げられる。
中でも、タンパク質の分解作用に加えて、得られる発酵食品組成物の風味が良好である観点から、天野エンザイム株式会社製「プロチンＳＤ−ＮＹ１０」、「サモアーゼＣ１００」「プロテアーゼＰ３ＳＤ」が好ましい。
前記エンド型金属プロテアーゼとしては、単独でもよいし、２種以上を併用してもよく、また、別のプロテアーゼと組み合わせてもよい。
【００３８】
前記金属プロテアーゼを用いた酵素処理における酵素添加量としては、消化吸収性を向上させる観点から、クラス２食物アレルゲンを有する食品中のタンパク質重量あたり、１０Ｕ／ｇ以上および１２００Ｕ／ｇ以下となるように調整することが好ましい。
前記酵素添加量の下限値は、２０Ｕ／ｇ以上、３０Ｕ／ｇ以上、４０Ｕ／ｇ以上、５０Ｕ／ｇ以上、６０Ｕ／ｇ以上、７０Ｕ／ｇ以上、８０Ｕ／ｇ以上、９０Ｕ／ｇ以上、１００Ｕ／ｇ以上、１１０Ｕ／ｇ以上、１２０Ｕ／ｇ以上、１３０Ｕ／ｇ以上、１４０Ｕ／ｇ以上、または１５０Ｕ／ｇ以上がより好ましい。また、前記酵素添加量の上限値は、１１００Ｕ／ｇ以下、１０００Ｕ／ｇ以下、９００Ｕ／ｇ以下、８００Ｕ／ｇ以下、７００Ｕ／ｇ以下、６００Ｕ／ｇ以下、５００Ｕ／ｇ以下、４００Ｕ／ｇ以下、３００Ｕ／ｇ以下、２９０Ｕ／ｇ以下、２８０Ｕ／ｇ以下、２７０Ｕ／ｇ以下、２６０Ｕ／ｇ以下、２５０Ｕ／ｇ以下、２４０Ｕ／ｇ以下、２３０Ｕ／ｇ以下、２２０Ｕ／ｇ以下、２１０Ｕ／ｇ以下、または２００Ｕ／ｇ以下がより好ましい。
なお、「Ｕ」は「ｕｎｉｔ」の略称である。前記Ｕ／ｇは、常法に基づいて測定すればよいし、市販品の金属プロテアーゼを使用する場合にはカタログに記載されているものから算出できる。
【００３９】
前記（ｂ）工程における前記酵素処理の時間および温度としては、原料であるクラス２食物アレルゲンを有する食品の種類、状態および酵素添加量によって一概に限定できない。例えば、酵素処理によるタンパク質の分解が進みすぎて食品本来の風味が損なわれない時間や温度を調整すればよい。具体的には、原料や酵素の種類や量に関係なく、得られる発酵食品組成物の風味を良好に保つ観点から、酵素処理時間は４時間以下であることが好ましく、３時間以下がより好ましく、前記酵素処理の時間の下限としては、酵素処理による効果を得る観点から、１０分以上、２０分以上、３０分以上、４０分以上、５０分以上、または１時間以上であることが好ましい。酵素処理温度は、用いる酵素によって一概に限定できないが、例えば、プロチンＳＤ−ＮＹ１０を用いる場合の酵素処理温度は、３０℃以上、４０℃以上、５０℃以上、または６０℃以上であることがより好ましく、酵素処理温度の上限は７０℃以下、特に６５℃以下であることが好ましい。なお、前記酵素処理温度が３０℃未満であると酵素活性が低下し、７０℃を超えると酵素活性が低下するだけでなく、酵素安定性も低下するため好ましくない。
【００４０】
本発明の製造方法として、前記（ａ）工程の前に、前記（ｂ）工程を行う場合、具体的には以下のような工程となる。
クラス２食物アレルゲンを有する食品を金属プロテアーゼで酵素処理する工程（（ｂ）工程）、
次いで、酵素処理したクラス２食物アレルゲンを有する食品に少なくともロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ以上、７２０ｕｎｉｔ以下である乳酸菌を添加し、該食品のｐＨを４．０以上、８．５未満に調節しながら発酵する工程（（ａ）工程）。
一方、前記（ａ）工程の後に、前記（ｂ）工程を行う場合、具体的には以下のような工程となる。
クラス２食物アレルゲンを有する食品に、少なくともロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ以上、７２０ｕｎｉｔ以下である乳酸菌を添加し、該食品のｐＨを４．０以上、８．５未満に調節しながら発酵する工程（（ａ）工程）、
次いで、前記工程で得られた乳酸菌発酵物を金属プロテアーゼで酵素処理する工程（（ｂ）工程）。
金属プロテアーゼの酵素処理は、基質特異的な酵素反応であるため、予めクラス２食物アレルゲンを有する食品を酵素処理しても所望の分解を行うことは可能であるが、効率よく発酵食品組成物を製造する観点から、前記（ａ）工程の後に前記（ｂ）工程を行うことができる。
【００４１】
前記（ｂ）工程後、酵素を失活させる処理を施してもよい。
酵素を失活させる方法としては、食品における常法を用いればよく、例えば、加熱する方法、加圧する方法、炭素数が１〜４のアルコールを用いる方法、超臨界二酸化炭素による方法、ｐＨを変化させる方法などの手法が挙げられるが、特に限定はない。
【００４２】
本発明の製造方法により得られた発酵食品組成物の回収は、発酵食品組成物をそのまま、もしくは、殺菌、均質化等、通常食品の用いられる処理を行った後、容器等に充填すればよいが、必要に応じて、遠心分離、圧搾、ろ過等による濃縮、凍結乾燥、スプレードライ等による乾燥等の処理を行なうことができる。また、特定の物質を低減、濃縮する目的でイオン交換膜等を用いた分離処理、溶剤を用いた抽出処理等を行っても良い。また、本発明の発酵食品組成物の製造方法は、同一の工場内で実施しても良いし、工程毎に異なる工場で実施しても良い。
【００４３】
さらに、本発明は、前記発酵食品組成物の製造方法より得られた発酵食品組成物に、アルギニンを添加する工程を含む、アルギニン強化発酵食品組成物を製造方法に関する。
アルギニンの添加量は、アルギニンが有する褥瘡や血流を改善する効果が得られる量であれば、特に限定されないが、良好な風味とアルギニンの機能性を発揮させる観点より、前記発酵食品組成物１００ｍｇに対してアルギニンを０．１ｍｇ以上、０．２ｍｇ以上、０．３ｍｇ以上、０．４ｍｇ以上、０．５ｍｇ以上、０．６ｍｇ以上、０．７ｍｇ以上、０．８ｍｇ以上、０．９ｍｇ以上、１ｍｇ以上、２．５ｍｇ以上、または５ｍｇ以上であり、また、２０ｍｇ以下、１９ｍｇ以下、１８ｍｇ以下、１７ｍｇ以下、１６ｍｇ以下、１５ｍｇ以下、１４ｍｇ以下、１３ｍｇ以下、１２ｍｇ以下、１１ｍｇ以下、または１０ｍｇ以下である範囲で添加することが好ましい。
【００４４】
また、本発明の製造方法より得られた発酵組成物は、原料食品と比べてクラス２食物アレルゲンの含有量が顕著に低減されており、しかも、乳酸菌による発酵で風味が良好なものとなっており、そのまま摂取することが可能であるが、必要に応じて、通常食品に用いられるその他原料を加えても良い。通常食品に用いられるその他原料としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、増粘剤、香料等を当業者の使用形態に応じて適宜混合することができ、前記その他原料の添加量は、当業者の製品形態に応じて設計することができる。
【００４５】
本発明の製造方法により得られる発酵食品組成物は、飲食品、機能性食品、医薬品、飼料等に用いることができる。
【００４６】
例えば、飲食品として日常的に摂取する場合、発酵食品組成物を含有する飲食品の形態には特に限定されず、パン類、ケーキ類、パイ類、クッキー類、ゼリー類、和菓子類、スナック菓子類、油菓子類、チョコレートおよびチョコレート菓子類、米菓類、ルウ類、ソール類、たれ類、トッピング類、氷菓類、麺類、ベーカリーミックス類、フライ食品類、加工肉製品類、豆腐・こんにゃくなどその他加工品、水産練り製品類、冷凍アントレ類、畜産冷凍食品、農産冷凍食品などの冷凍食品類、米飯類、ジャム類、チーズ、チーズフード、チーズ様食品、ガム類、キャンディー類、発酵乳類、缶詰類、飲料類などの一般的な飲食品の形態が挙げられる。また、機能性食品および医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えばカプセル剤、シロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、輸液、点鼻剤、点眼剤、座薬、貼付剤、噴霧剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容されるほかの製剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。また、飼料として用いる場合は、通常の配合飼料に使用される原料を動物の種類、発育ステージ、地域などの飼育環境に応じて適宜配合してもよい。かかる原料としては、例えば穀物類または加工穀物類（とうもろこし、マイロ、大麦、小麦、ライ麦、燕麦、キビ、小麦粉、小麦胚芽粉等）、糟糠類（ふすま、米糠、コーングルテンフィード等）、植物性油粕類（大豆油粕、ごま油粕、綿実油粕、落花生粕、ヒマワリ粕、サフラワー粕等）、動物性原料（脱脂粉乳、魚粉、肉骨粉等）、ミネラル類（炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、食塩、無水ケイ酸等）、ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸カルシウム、ニコチン酸アミド、葉酸等）、アミノ酸（グリシン、メチオニン等）、ビール酵母などの酵母類、無機物質の微粉末（結晶性セルロース、タルク、シリカ、白雲母、ゼオライト等）などが挙げられる。さらに、本発明の飼料に賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等の飼料用添加剤、所望によりその他の成分（例えば抗生物質や殺菌剤、駆虫剤、防腐剤等）を配合してもよい。飼料の形態は特に限定されるものではなく、例えば、粉末状、顆粒状、ペースト状、ペレット状、カプセル剤（ハードカプセル，ソフトカプセル）、錠剤等が挙げられる。飼料の給与対象となる動物は、特に限定されるものではないが、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の家畜類、ニワトリ（ブロイラー、採卵鶏の両方を含む）、七面鳥、合鴨等の家禽類、マウス、ラット、モルモット等の実験動物、イヌ、ネコ、鳥類、爬虫類、両生類などのペット等が挙げられる。
【００４７】
また、本発明の製造方法により得られる発酵食品組成物は、苦味などの異味をマスキングするのに使用することができる。
中でも、生理活性物質として有用である一方、強力な苦味を有するアルギニン１ｍｇに対して前記発酵食品組成物を５ｍｇ以上、１０００ｍｇ以下を添加することで、アルギニンの苦味を顕著に低減することができる。
前記発酵食品組成物の添加量の下限としては、アルギニンの苦味を低減する観点から、アルギニン１ｍｇに対して６ｍｇ以上、７ｍｇ以上、８ｍｇ以上、９ｍｇ以上、１０ｍｇ以上、１１ｍｇ以上、１２ｍｇ以上、１３ｍｇ以上、１４ｍｇ以上、１５ｍｇ以上、１６ｍｇ以上、１７ｍｇ以上、１８ｍｇ以上、１９ｍｇ以上、または２０ｍｇ以上が好ましい。また、前記添加量の上限としては、アルギニンの効果を十分に発現させる観点から、アルギニン１ｍｇに対して９００ｍｇ以下、８００ｍｇ以下、７００ｍｇ以下、６００ｍｇ以下、５００ｍｇ以下、４００ｍｇ以下、３００ｍｇ以下、２００以下、１５０ｍｇ以下、または１００ｍｇ以下が好ましい。
【００４８】
本発明のアルギニンの苦味の低減方法では、前記アルギニンと前記発酵食品組成物とは、例えば、予め混合していてもよいし、他のベースとなる飲食品にアルギニンまたは発酵食品組成物を別々に添加してもよい。
【００４９】
前記のアルギニンの苦味の低減方法を用いることで、様々な飲食品、特にアルギニンが有する苦味が強く感じられることでアルギニンを添加することが困難であった飲食品を、アルギニンを強化した機能性食品にすることを可能にする。
【実施例】
【００５０】
以下に、本発明を具体的に説明するために詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５１】
＜発酵豆乳の調製方法＞
市販の乾燥大豆を水洗し、９倍量の水に３時間浸漬した後、ミキサーでペースト状に粉砕、ガーゼでろ過し、豆乳を調製する。該豆乳にグルコース１％および炭酸カルシウム１．５％（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加し、９０℃、１５分の条件により滅菌した後、乳酸菌を接種し、３７℃で２４時間、攪拌しながら発酵させた。【００５２】
＜Ｇｌｙｍ４の低減率の算出方法＞
ＰＢＳ（１０ｍＭ  リン酸バッファー、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で１００倍希釈した発酵前または発酵後の豆乳を「９６ウェルＥＬＩＳＡプレート」（イワキ社製）に１００μＬ添加し、３７℃で３０分間静置し、プレートに固定した。発酵前または発酵後の豆乳を除去後、蒸留水で５倍希釈したブロッキング剤「ＢｌｏｃｋｉｎｇＯｎｅ」（商品名、ナカライテスク社製）を各ウェルに２００μＬ添加し、室温で１時間静置した。各ウェルを洗浄用バッファー「ＰＢＳＴ」（１０ｍＭ  リン酸バッファー、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４）で３回洗浄後、抗体希釈液「Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １」（商品名、東洋紡社製）で１０００倍希釈したＧｌｙｍ４に特異的なウサギ抗血清を各ウェルに５０μＬ添加し、３７℃で１時間静置した。
各ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄後、抗体希釈液「Ｃａｎ  Ｇｅｔ  Ｓｉｇｎａｌ（登録商標）  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２」（商品名、東洋紡社製）で１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を各ウェルに５０μＬ添加し、３７℃で１時間静置した。各ウェルをＰＢＳＴで５回洗浄後、「ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質  ＴＭＢキット」（商品名、ナカライテスク社製）を各ウェル１００μＬ添加し、室温で１５分静置後（発色反応）、１Ｍ硫酸を各ウェル１００μＬ添加（発色停止）し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた発酵前の豆乳と発酵後の豆乳の吸光度を用いて、Ｇｌｙｍ４の低減率を式（１）にて計算した。【００５３】
【数１】
2017057455.tif 000002
【００５４】
＜乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼ活性の算出方法＞
乳酸菌を１０ｍＬの滅菌済みＭＫ−１培地（０．５％酵母エキス、１％  ペプトン、１％  グルコースｐＨ６．８）で３７℃、２４時間培養し、遠心分離により菌体を集菌した。菌体を３０ｍＬの５０ｍＭ  リン酸バッファー（０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ−３ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ６．２）で洗浄後、再度遠心分離し、湿菌体を得た。該湿菌体重量を電子天秤（ザルトリウス社製）にて測定し、湿菌体の重量を測定した後、３０ｍＬの５０ｍＭ  リン酸バッファーに懸濁した菌体懸濁液をロイシンアミノペプチダーゼ活性測定に供した。菌体懸濁液０．１ｍＬに０．２ｍＭ  Ｌ−ロイシン−β−ナフチルアミド溶液（Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎ−β−ｎａｐｈｔｙｌａｍｉｄｅ／５０ｍＭ  リン酸バッファー）を２ｍＬ加え、３７℃で１時間酵素反応を行った。酵素反応液に、１ｍＬの０．２３Ｎ  ＨＣｌ／エタノール溶液を加え、酵素反応を停止させ、０．０６％ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒド／エタノール溶液を加え、３７℃、３０分間インキュベーション後、５４０ｎｍにおける吸光度を測定し、反応液の吸光度を測定した。また、ブランクは２ｍＬの０．２ｍＭ  Ｌ−ロイシン−β−ナフチルアミド溶液の代わりに、２ｍＬの５０ｍＭ  リン酸バッファーを用いて、前記操作を行い、吸光度を測定した。得られたブランクと反応液の５４０ｎｍにおける吸光度および湿菌体の重量を用いて、乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼ活性を式（２）にて計算した。【００５５】
【数２】
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【００５６】
＜乳酸菌の選抜方法＞
食品から分離した乳酸菌のうち、上記活性測定法を用いてロイシンアミノペプチダーゼ活性が５０ｕｎｉｔ以上の乳酸菌を選別した。【００５７】
＜発酵豆乳の官能評価＞
１０℃に調整した発酵豆乳を５名のパネラーに試飲してもらい、大豆臭と風味とを官能評価した。大豆臭の評価は、大豆臭を感じないものは「○」、大豆臭をやや感じる場合は「△」、大豆臭を感じる場合は「×」として評価した。風味の評価については、風味が良いものを「○」、風味があまり良くないものを「△」、風味が良くないものを「×」として評価した。【００５８】
＜タンパク質の分解の評価＞
クラス２食物アレルゲンを有する食品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、タンパク質染色を行なったゲルをデンシトメーター［Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＬＡＳ４０００（ＧＥヘルスケア社製）］で取り込み、イメージ解析ソフト（Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＴＬ（ＧＥヘルスケア社製）で解析した。各レーンのデンシトグラムより、レーン毎に総染色強度に対する各バンドの染色強度を算出し、分子量の大きい順に各バンドの染色強度を加算した値が５０％となる時の分子量を算出し、分子量の中央値とした。分子量の中央値は、全てのデータを並べたときの中央の値であるため、外れ値（例えば、分解されなかった高分子タンパク）の影響を受け難く、タンパク質の分解の程度を評価する上で適している。
なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、「Ｌａｅｍｍｌｉ法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５；１９７０）」により実施した。電気泳動用ゲル（１０〜２０％濃度のグラジエントゲル）は「ｅ−ＰＡＧＥＬ：Ｅ−Ｒ１０２０Ｌ（ＡＴＴＯ社製）」、タンパク質分子量マーカーは「プレシジョンＰＬＵＳプロテインスタンダード（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）」を使用し、その他の試薬はＬａｅｍｍｌｉ法に準じた。また、泳動終了後、「Ｂｉｏ-Ｓａｆｅクマシ―ステイン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）」によりタンパク質を染色した。【００５９】
（実施例１）＜乳酸菌のＧｌｙｍ４低減率＞
上記発酵豆乳の調製方法に記載の方法に準じて、乳酸菌、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブエスピー・ラクティスＫＬＡＢ−４株（以下、ＬＡＢ４株と記載）、ラクトバチルス・ヘルベティクスＫ−４株（以下、Ｋ４株と記載）およびペディオコッカス・アシディラクティシＲ０３７株（以下、Ｒ０３７株と記載）を用いて発酵豆乳を調製し、上記Ｇｌｙｍ４の低減率の算出方法に記載の方法に準じて、発酵豆乳のＧｌｙｍ４の低減率を算出した。その結果を表１に示す。
なお、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブエスピー・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ）ＫＬＡＢ−４株は、２００７年８月９日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）  〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−３９４として寄託され、２００８年９月２２日付でブダペスト条約の規定下で受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４として国際寄託に移管されている。【００６０】
【表１】
2017057455.tif 000004
【００６１】
表１より、発酵に用いた乳酸菌によりＧｌｙｍ４低減率が異なること見出した。【００６２】
（実施例２）＜実施例１で用いた乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼ活性＞
上記乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼ活性測定方法に記載の方法に準じて、ＬＡＢ４株、Ｋ４株、Ｒ０３７株のロイシンアミノペプチダーゼ活性を測定した。その結果を表２に示す。【００６３】
【表２】
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【００６４】
表２より、Ｇｌｙｍ４低減率が０％であったＬＡＢ４株のロイシンアミノペプチダーゼ活性は４８．２ｕｎｉｔであり、Ｇｌｙｍ４低減率が４０％のＫ４株のロイシンアミノペプチダーゼ活性は、７１８．６ｕｎｉｔ、Ｇｌｙｍ４低減率が８０％のＲ０３７株のロイシンアミノペプチダーゼ活性は３６８．３ｕｎｉｔであった。【００６５】
（実施例３）＜ロイシンアミノペプチダーゼ活性が５０ｎｕｉｔ以上を有する乳酸菌のスクリーニング＞
食品素材等から分離した乳酸菌２０株を対象に、上記乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼ活性測定方法に記載の方法に準じて、各乳酸菌のロイシンアミノペプチダーゼを測定し、ロイシンアミノペプチダーゼ活性が５０ｕｎｉｔ以上の菌株、ペディオコッカス・エスピー３８０株（以下、３８０株と記載）、ペディオコッカス・エスピー３７９株（以下、３７９株と記載）、ストレプトコッカス・エスピー４６２株（以下、４６２株と記載）、ラクトバチルス・ヘルベティクス２８株（以下、２８株と記載）を得た。これらの乳酸菌４株のロイシンアミノペプチダーゼ活性を表３に示す。【００６６】
【表３】
2017057455.tif 000006
【００６７】
（実施例４）＜実施例３にてスクリーニングした乳酸菌のＧｌｙｍ４低減率＞
上記発酵豆乳の調製方法に記載した方法に準じて、３８０株、３７９株、４６２株、２８株を用いて発酵豆乳を調製し、Ｇｌｙｍ４低減率を求めた。その結果を表４に示す。【００６８】
【表４】
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【００６９】
表４より、ロイシンアミノペプチダーゼ活性が７７．４ｕｎｉｔである３８０株のＧｌｙｍ４低減率は５０％であり、ロイシンアミノペプチダーゼ活性が１６６．１、５８８．６、５９３．３ｕｎｉｔである３７９株、４６２株、２８株のＧｌｙｍ４低減率はいずれも７０％であった。
したがって、実施例１から実施例４の結果より、ロイシンアミノペプチダーゼ活性が７５ｕｎｉｔ以上、７２０ｕｎｉｔ未満の乳酸菌であれば、４０％以上のＧｌｙｍ４低減率を有することを見出した。【００７０】
（実施例５）＜発酵時における食品のｐＨについての検討＞
市販の乾燥大豆より調製した豆乳に、グルコース１％、炭酸カルシウム０．２％（２０ｍｍｏｌ／Ｌ）になるよう添加し９０℃、１５分滅菌後、Ｒ０３７株を接種し、２５％水酸化ナトリウム溶液でｐＨをｐＨ５．５、ｐＨ６．５、ｐＨ７．５、またはｐＨ８．５に維持しながら３７℃で２４時間、攪拌発酵し、発酵豆乳を調製した。各制御ｐＨで調製した発酵豆乳中のＧｌｙｍ４を測定し、ｐＨ制御を行わない以外は同様に調整した発酵豆乳と比較した。その結果を表５に示す。【００７１】
【表５】
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【００７２】
表５より、ｐＨを４．５以上８．５未満とすることで、Ｇｌｙｍ４が低減しており、中でもｐＨ５．５からｐＨ７．５に維持した場合、Ｇｌｙｍ４低減率が８０％となるため、発酵工程において食品を含む混合物のｐＨを５．５からｐＨ７．５の間で調節するのが好ましいことを見出した。【００７３】
（実施例６）＜発酵時間の検討および官能評価＞
市販無調整豆乳に、グルコース１％および炭酸カルシウム０．６％（６０ｍｍｏｌ／Ｌ）を加え、９０℃、１５分間滅菌し、Ｒ０３７株を接種後、３７℃で８時間、１２時間、２４時間、３６時間、７２時間の各時間で攪拌発酵し、各々の発酵豆乳を調製した。
各発酵豆乳について、Ｇｌｙｍ４の低減率を算出した。また、各発酵豆乳および未発酵の豆乳について、上記、官能評価に記載の方法に準じて、臭いおよび味を３点法（×不良、△；普通、○；良好）で行った。Ｇｌｙｍ４の低減率および官能評価の結果を表６に示す。なお、Ｇｌｙｍ４の低減率が４０％以上であり、「臭い」および「味」の少なくとも１つが「○」であるものを合格品とした。【００７４】
【表６】
2017057455.tif 000009
【００７５】
表６より、市販無調製豆乳を８時間発酵することにより、Ｇｌｙｍ４の低減率は８０％となった。また、官能評価の結果、発酵時間が８時間から２４時間であると、発酵豆乳の臭いおよび味が両方ともまたはいずれかが良好であることを見出した。【００７６】
（実施例７）＜酵素のスクリーニングと酵素処理条件の検討＞
市販の大豆飲料（「まるごと大豆」、カゴメ社製、大豆固形分１４％）に、タンパク質１ｇあたり市販のプロテアーゼ（５種類）を、６０Ｕ／ｇ、３００Ｕ／ｇ、１２００Ｕ／ｇとなるように添加し、３０℃で１時間酵素処理した後、大豆タンパク質の分解の程度を評価した。また、酵素分解物の風味についてもパネラー５名により官能評価した。その結果を表７に示す。【００７７】
＜大豆タンパク質の分解の程度の評価＞
大豆タンパク質の分解の評価は、上記タンパク質の分解の評価に記載の方法に準じて行った。大豆液の分子量の中央値は３３ｋＤａであることから、酵素処理により分子量の中央値が１７ｋＤａ前後であれば、酵素処理が良好に行なわれ大豆タンパク質が分解されたと判断した。【００７８】
また、大豆タンパク質の分解の程度については、以下の基準で評価した。
「良好」：分子量の中央値が１７ｋＤａ以下  
「やや不良」：分子量の中央値が１８〜２８ｋＤａ  
「不良」：分子量の中央値が２９ｋＤａ以上  【００７９】
また、前記官能評価では、以下の基準で評価した。
「なし」：苦味を感じない（市販の大豆飲料と同等）  
「ややあり」：僅かに苦味を感じる    
「あり」：苦味を感じる  
「強い」：強い苦味を感じる  【００８０】
【表７】
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【００８１】
表７より、金属プロテアーゼであるプロチンＳＤ−ＮＹ１０、サモアーゼＣ１００、プロテアーゼＰ３ＳＤを用いた酵素処理により、大豆タンパク質の分解の程度が良好となりかつ酵素分解物の苦味もないことがわかる。
一方、金属プロテアーゼではない植物由来のシステインプロテアーゼであるパパインＷ−４０およびブロメラインＦを用いた場合、いずれもタンパク質の分解は良好であったものの、酵素分解物の苦味が強くなることがわかる。【００８２】
（実施例８）
次に、実施例７で良好な結果を示した３種類の金属プロテアーゼ（プロチンＳＤ−ＮＹ１０、サモアーゼＣ１００、プロテアーゼＰ３ＳＤ）を用いて、好適な酵素処理条件を検討した。
すなわち、市販の大豆飲料（「まるごと大豆」、カゴメ社製、大豆固形分１４％）に、前記３種類のうちいずれかの金属プロテアーゼを、３０Ｕ／ｇ、１００Ｕ／ｇ、３００Ｕ／ｇまたは６００Ｕ／ｇとなるように添加し、３０℃、４５℃、または６０℃で０．５時間、１時間、３時間または４時間酵素処理し、大豆タンパク質の分解の程度を上記と同じ基準でＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した。
また、風味についてもパネラー５名により実施例７と同じ基準で官能評価した。
これらの結果を表８に示す。【００８３】
【表８】
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【００８４】
表８より、金属プロテアーゼであるプロチンＳＤ−ＮＹ１０、サモアーゼＣ１００、プロテアーゼＰ３ＳＤを用い酵素処理する場合、酵素添加量および酵素処理温度により、大豆タンパク質の分解の程度ならびに風味は異なるが、処理時間を４時間以下、中でも１〜４時間の範囲で行うことが好適であることを見出した。また、前記の処理条件であれば、大豆タンパク質の分解の程度が良好となりかつ酵素分解物の苦味もないことがわかる。【００８５】
（実施例９）＜発酵食品組成物の製造方法１＞
実施例１〜８で得られた結果をもとに、大豆液を乳酸発酵し、次いで酵素処理を施すことで発酵食品組成物を作製するための条件を検討した。【００８６】
（本発明品１）
大豆飲料（「まるごと大豆」、カゴメ社製、大豆固形分１４％）に乳酸菌Ｒ０３７株を添加し、３７℃で乳酸発酵させ、ｐＨ５．０〜６．５となったことを確認した後８０℃、３０分加熱殺菌した。
次いで、得られた乳酸発酵物に、金属プロテアーゼであるプロチンＳＤ−ＮＹ１０を１００〜６００Ｕ／ｇタンパク質となるように添加し、６０℃で１〜３時間酵素処理した。
その後、９０℃２０分加熱処理して酵素を失活させて発酵食品組成物（発酵大豆液）を得た（本発明品１）。
本発明品１のＧｌｙｍ４低減率を評価したところ、Ｇｌｙｍ４低減率は８０％であったことから、本発明品１は、クラス２食物アレルゲンが低減した発酵食品組成物であることが分かった。また、官能評価の結果、本発明品１は苦味が無く風味良好であり、アルギニンを添加した本発明品１は、アルギニン由来の苦味が無かったことから、本発明品１はアルギニンに由来する苦味を低減することができる発酵食品組成物であることが分かった。さらに、本発明品１の分子量の中央値を算出した結果、未処理の大豆液（後述の比較品３）の分子量の中央値は３３ｋＤａであるのに対し、本発明品１の分子量の中央値は１５ｋＤａであったことから、本発明品１は消化吸収性に優れた発酵食品組成物であることが分かった。【００８７】
（本発明品２）
大豆液の乳酸発酵に用いる菌株を２８株に代えた以外は、全て本発明品１と同様にして発酵食品組成物を得た（本発明品２）。本発明品２についても、本発明品１と同様の評価をした結果、本発明品２は、苦味が無く風味良好であり、アルギニンを添加した本発明品２は、アルギニン由来の苦味が無かったことから、本発明品２はアルギニンに由来する苦味を低減することができる発酵食品組成物であることが分かった。さらに、本発明品２の分子量の中央値を算出した結果、本発明品２の分子量の中央値は１５ｋＤａであったことから、本発明品２は大豆タンパク質が分解された消化吸収性に優れた発酵食品組成物であることが分かった。【００８８】
（比較例１）
酵素処理を施していない以外は、実施例９と同様にして乳酸発酵物を得た（比較品１）。【００８９】
（比較例２）
乳酸発酵を行わずに、大豆液を酵素処理した以外は、実施例９と同様にして酵素処理物を得た（比較品２）。【００９０】
（比較例３）
未処理の大豆液をそのまま用いた（比較品３）。【００９１】
本発明品１〜２及び比較品１〜３のいずれかの１００ｇに対してアルギニンを１ｇ、５ｇおよび１０ｇとなるよう添加し、撹拌後、クエン酸でｐＨ７．０に調整し、アルギニン混合大豆液を調整した。それぞれの混合大豆液のアルギニンの苦味を、パネラー５名により官能評価した。
なお、前記官能評価では、以下の基準で評価した。
「○」：アルギニン添加による苦味を感じない    
「△」：アルギニン添加による苦味をやや感じる  
「×」：アルギニン添加による苦味を感じる    【００９２】
また、同時に、上記タンパク質の分解の評価に記載の方法に準じて本発明品１〜２及び比較品１〜３をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、大豆タンパク質の分子量の中央値を算出することで、大豆タンパク質の分解の程度を評価した。ここで、図１に本発明品１及び比較品３のＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル染色並びにデンシトグラムの結果を例示する。なお、図１において、デンシトグラムの横軸は分子量（ｋＤａ）、縦軸は染色強度（具体的は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質のバンドの濃さ）、各ピーク面積はバンドを示す。そして、バッググラウンドとなる染色強度を除き、各バンドのピーク面積を加算した値を総染色強度面積とする。そして、前記総染色強度面積を１００％としたときに、分子量の大きい方（小さい方からでも良い）のピーク面積から順に加算していき、総染色強度面積の５０％となる分子量を、分子量の中央値として算出した。図１より、本発明品１における総染色強度面積を１００％とした際に、各ピーク面積を順に加算して総染色強度面積の５０％となった際の分子量は１５ｋＤａであり、前記１５ｋＤａを本発明品１における分子量の中央値として算出した。また、比較品３も本発明品１と同様に、各ピーク面積を順に加算して総染色強度面積の５０％となる分子量を算出した結果、分子量は３３ｋＤａであり、前記３３ｋＤａを比較例３における分子量の中央値とした。本発明品２及び比較品１〜２についても、本発明品１及び比較品３と同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲル染色並びにデンシトグラムの結果を用いて、各分子量の中央値を算出した。
前記各製品（本発明品１〜２、比較品１〜３）における大豆タンパク質の分離試料の中央値と官能評価の結果を表９に示す。【００９３】
【表９】
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【００９４】
表９の結果より、乳酸発酵および酵素処理を施している本発明品１〜２は、アルギニンを添加されていても、アルギニンの苦味が低減されており、しかも、大豆タンパク質が分解されているため体内への消化吸収性にも優れることがわかる。
一方、酵素処理を施していない比較品１はアルギニンの苦味が低減されているものの、本発明品１〜２に比べると大豆タンパク質の分子量の中央値は大きいため、体内への消化吸収性には劣ることがわかる。
また、乳酸発酵を施していない比較品２は、大豆タンパク質の分子量の中央値は低いものの、アルギニンの苦味のマスキング効果が弱いことがわかる。
なお、乳酸発酵および酵素処理を施していない比較品３は、アルギニンの苦味のマスキング効果が弱く、大豆タンパク質の分子量の中央値も最も大きなものであった。
以上のことから、本発明で得られる発酵食品組成物には、アルギニンの苦味の低減効果があり、しかもタンパク質などの体内への消化吸収性に優れることがわかる。【００９５】
（実施例１０）＜発酵食品組成物の製造方法２＞
大豆液を酵素処理し、次いで乳酸発酵を施すことで発酵食品組成物を作製した。
具体的には、大豆飲料（「まるごと大豆」、カゴメ社製、大豆固形分１４％）にプロチンＳＤ−ＮＹ１０を１００〜６００Ｕ／ｇタンパク質となるように添加し、６０℃で１〜３時間酵素処理した。
その後、９０℃２０分加熱処理して酵素を失活させてから、Ｒ０３７株又は２８株を添加し、３７℃で乳酸発酵させ、ｐＨ５．０〜６．５となったことを確認した後８０℃、３０分加熱殺菌して発酵食品組成物（発酵大豆液）を得た（本発明品３、４）。
本発明品３、４は、前記本発明品１、２と同様に調べたところ、クラス２食物アレルゲンが低減し、風味が良好であり、アルギニンに由来する苦味が低減され、しかも体内への消化吸収性に優れた発酵食品組成物であることがわかった。
【受託番号】
【００９６】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１２２４９、ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４、ＮＩＴＥ  ＢＰ−９００、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７７３、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７７２、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１７７１、ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２１５４
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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