(57)【要約】  新規で有効なDNA損傷改善用組成物を取得する。  配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する、DNA損傷改善用組成物を用いる。又は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する、DNA損傷改善用組成物を用いてもよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する、DNA損傷改善用組成物。
【請求項２】
美容用又は化粧用である、請求項1に記載のDNA損傷改善用組成物。
【請求項３】
配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する、紫外線損傷改善用組成物。
【請求項４】
配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する、DNA損傷改善用組成物。
【請求項５】
美容用又は化粧用である、請求項4に記載のDNA損傷改善用組成物。
【請求項６】
配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する、紫外線損傷改善用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNA損傷改善用組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線（UV）によってDNAが損傷を受けることが知られており、美容、化粧等の分野においてこれまでに数々の研究が報告されている。【０００３】
例えば、特許文献1の特許請求の範囲には、デラウエア種（Delaware）の果実の圧縮搾汁粕をセルラーゼ処理し、次いでポリガラクツロナーゼ処理した後に極性溶媒で抽出した抽出物を含有することを特徴とするDNA修復促進剤が記載されている。また特許文献2の特許請求の範囲には、ビフィドバクテリウム・ブレーベYIT12272を有効成分とし、ビフィドバクテリウム・ブレーベYIT12272を、1×103CFU以上を1日量として含有する経口用DNA損傷修復促進剤が記載されている。また特許文献3の特許請求の範囲には、D-プロリンと、その塩とからなる群から選択される1種類又は2種類以上の化合物を含むことを特徴とする、紫外線障害軽減組成物が記載されている。【０００４】
また特許文献4の特許請求の範囲には、オオウメガサソウ(Chimaphilaumbellata(L.)W.Barton)の葉の抽出物を有効成分とする紫外線防御剤が記載されている。また特許文献5の特許請求の範囲には、グミ科ヒッポファエ属沙棘(Hippophaerhamnoides L.)を粉砕し、極性溶媒で抽出を行った後セライト（登録商標）を加えてろ過して得られる極性溶媒抽出物を有効成分とし、紫外線曝露に起因する皮膚障害を抑制又は改善することを特徴とする抗皮膚障害剤が記載されている。また特許文献6の特許請求の範囲には、メシル酸ガベキサートを有効成分とし、紫外線暴露により誘発される皮膚障害の発症を軽減又は抑制する経口紫外線抵抗性向上剤が記載されている。【０００５】
一方で、本願発明者は、幹性化や癌治療にmiR-520d-5pが有効であることを報告している（特許文献7）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第5769448号明細書
【特許文献２】特許第5688376号明細書
【特許文献３】特許第5727364号明細書
【特許文献４】特許第5162145号明細書
【特許文献５】特許第4933768号明細書
【特許文献６】特許第5438369号明細書
【特許文献７】特許第5099571号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献1、2、4、及び5の技術は、抽出物や菌体のような任意の複数成分が効果に関与するものであるため、実用性及び利便性の点で改善の余地を有していた。また、特許文献3の技術は、特定の成分に関するものであるが、紫外線損傷の改善効果は十分とはいえなかった。また、特許文献6の技術は、紫外線抵抗性を上げることを目的としており、紫外線照射後のDNA損傷の改善には使用できない。また、特許文献7の技術は、幹性化や癌治療に関するものであり、DNA損傷を改善することは記載されていない。【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、新規で有効なDNA損傷改善用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、後述する実施例に記載の通り、紫外線照射による致命的なDNA損傷を受けた細胞をmiR-520d-5pで処理したところ、驚くべきことにDNA損傷が顕著に改善することを発見した。そして、この結果に基づき、本願発明を完成させた。【００１０】
即ち本発明によれば、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する、DNA損傷改善用組成物が提供される。【００１１】
また本発明によれば、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する、紫外線損傷改善用組成物が提供される。【００１２】
また本発明によれば、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する、DNA損傷改善用組成物が提供される。【００１３】
また本発明によれば、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する、紫外線損傷改善用組成物が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、DNA損傷又は紫外線損傷を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は、紫外線照射後の細胞の変化を表した図である。
【図２】図2は、紫外線照射後のフローサイトメトリーの結果を表した図である。
【図３】図3は、紫外線照射後のNHDF細胞のコラーゲン産生能を測定した結果を表した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、同様な内容については繰り返しの煩雑を避けるために、適宜説明を省略する。【００１７】
本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する、DNA損傷改善用組成物である。このDNA損傷改善用組成物は、後述する実施例で実証されているように、DNA損傷を改善することができる。このDNA損傷改善用組成物は、UVを受けて実質的に細胞死に至った細胞に対しても、DNA損傷のサルベージ効果を発揮し得る。【００１８】
このDNA損傷改善用組成物は、DNA損傷改善効果を高める観点からは、対象者が紫外線を受けた後に使用されることが好ましい。又は、このDNA損傷改善用組成物は、DNA損傷改善効果を高める観点からは、夜間に使用されることが好ましい。夜間は、日没から就寝前の間、又は18〜26時を含む。18〜26時は、18、19、20、21。22、23、24、25、又は26時であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。【００１９】
本発明の一実施形態において「配列番号1の塩基配列」は、miR-520d-5pの成熟miRNAの塩基配列（5'-CUACAAAGGGAAGCCCUUUC-3'）を含む。【００２０】
本発明の一実施形態において「改善用組成物」は、美容用の組成物であってもよい。また、美容用の組成物は化粧用に用いられる組成物を含む。また改善用組成物は、研究用、又は再生医療用の組成物であってもよい。また改善用組成物は、治療用の組成物であってもよい。また損傷改善用組成物は、損傷修復用組成物を含む。修復用組成物は修復促進用組成物を含む。【００２１】
またDNA損傷改善用組成物は、経皮吸収用組成物であってもよい。DNA損傷改善用組成物は、皮膚に塗布することで使用してもよい。DNA損傷改善用組成物の剤型は、例えば、クリーム剤、又は液剤あってもよい。【００２２】
本発明の一実施形態において「DNA損傷」は、例えば、DNA一本鎖の切断、DNA二本鎖の切断、DNA塩基の化学的変異を含む。DNA損傷は、例えば、物理的DNA損傷であってもよい。組成物によるDNA損傷の改善効果は、DNA損傷によって低下した細胞増殖が、組成物による処理によって増加したことによって評価してもよい。又は、市販のキット（例えば、OxiSelect（COSMO BIO co.,ltd.）、CometAssay Kit（Funakoshi Co., Ltd.））を使用することよって評価してもよい。【００２３】
本発明の一実施形態において「紫外線」は、波長が10〜400 nmの電磁波を含む。この波長は、例えば、10、50、100、200、250、280、300、315、350、又は400であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。美容促進の観点からは、近紫外線（200〜380nm）による損傷を改善することが好ましい。近紫外線は、UVA (315〜400nm)、UVB(280〜315nm)、UVC (280 nm未満) に分けることもできる。紫外線照射量は、例えば、0.01、0.1、0.5、1、5、15、20、25、又は30J/cm2であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。【００２４】
本発明の一実施形態において「美容」は、容姿を美しくすることを含む。美容は、例えば、UV照射により損傷を受けた肌に対して、整肌効果を発揮することを含む。【００２５】
本発明の一実施形態において「研究用」、又は「再生医療用」の改善用組成物は、例えば、研究又は再生医療で使用される材料（例えば、細胞、又は組織）に対する、紫外線、又はDNA損傷誘発性の物質に起因する材料の損傷、又は増殖抑制を改善するために使用されてもよい。これにより、研究用又は再生医療用材料を効率よく使用できる。【００２６】
本発明の一実施形態において「治療」は、患者の疾患、もしくは疾患に伴う1つ以上の症状の、症状改善効果あるいは予防効果を発揮しうることを含む。治療は、DNA損傷に伴う疾患の治療、老化性の皮膚科病変の治療、抗癌剤によるDNA損傷の治療を含む。本発明の一実施形態において「抗癌剤」は、例えば、DNA損傷誘発性の抗癌剤を含む。【００２７】
本発明の一実施形態において「対象者」は、健常人、被験者、又は患者を含む。対象者は、紫外線損傷を有する対象者、又は紫外線損傷改善もしくはDNA損傷改善を必要としている対象者を含む。対象者は、抗癌剤を投与後の対象者、又は投与予定の対象者であってもよい。対象者は、ヒト、又はヒトを除く哺乳類（例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット、ネズミ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、マーモセット、サル、又はチンパンジー等の1種以上）を含む。【００２８】
本発明の一実施形態において「組成物」は、例えば、美容剤、化粧料、薬用化粧料、治療薬、医薬部外品、又は外用薬を含む。この組成物は、有効成分と、美容学的又は薬理学的に許容される1つもしくはそれ以上の担体とを含む組成物であってもよい。組成物は、例えば、美白成分（例えば、アルブチン等）、保湿成分（例えば、ワセリン、ヒアルロン酸Na等）、又は美肌成分（例えば、ビタミンC等）を含有していてもよい。組成物は、例えば、有効成分と上記担体とを混合し、製剤学の技術分野において知られる任意の方法により製造できる。また担体の形状は特に限定されず、例えば、固体、半固体、又は液体であってもよい。組成物の使用量は特に限定されないが、例えば、1回あたり0.01〜10000mg/kg体重であってもよい。使用間隔は特に限定されないが、例えば、1〜30日に1〜3回投与してもよい。使用経路は、例えば、経皮、又は経口であってもよい。使用形態としては、例えば、クリーム剤、液剤、カプセル剤、錠剤、又は顆粒剤等であってもよい。使用量、使用間隔、使用方法は、対象者の年齢や体重、症状、対象部位等により、適宜選択してもよい。組成物は、in vitro又はin vivoで使用できる。組成物は、美容有効量、治療有効量、又は所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。組成物は、例えば、美容用容器又は化粧用容器内に含有されている組成物であってもよい。美容用容器又は化粧用容器は、例えば、チューブ、ポンプ式容器、広口ジャー容器、又は細口ボトル容器を含む。【００２９】
本発明の一実施形態において「ポリヌクレオチド」は、例えば、RNA鎖、又はそのRNA鎖をコードするDNA鎖であってもよい。このRNA鎖は、翻訳抑制性RNA分子であってもよい。翻訳抑制性RNA分子は、遺伝子から蛋白質への翻訳を抑制する作用を有するRNA分子を含む。翻訳抑制性RNA分子は、例えば、miRNA関連分子、又はRNAi分子を含む。翻訳抑制作用の確認は、リアルタイムRT-PCRによるRNA鎖発現量の定量によって行なうことができる。または、ノザンブロットによるRNA鎖発現量の解析や、ウェスタンブロットによる蛋白量の解析・表現型の観察等の方法でも行うことができる。また、特定の遺伝子に対する翻訳抑制性RNA分子を生成するプラスミドは、例えば、受託会社（例えば、タカラバイオ（株）等）から購入することができる。【００３０】
またポリヌクレオチドは、ヌクレオチドもしくは塩基、またはそれらの等価物が、複数結合した形態で構成されているものを含む。ポリヌクレオチドは、例えば、化学修飾を受けたポリヌクレオチド、塩を形成したポリヌクレオチド、溶媒和物を形成したポリヌクレオチド、化学物質結合性のポリヌクレオチドを含む概念である。化学修飾は、例えば、メチル化を含む。化学物質は、細胞取込促進物質（例えば、PEG又はその誘導体）、標識タグ（例えば、蛍光標識タグ等）、又はリンカー（例えば、ヌクレオチドドリンカー等）を含む。ヌクレオチドは、例えば、非化学修飾もしくは化学修飾のRNA塩基又はDNA塩基を含む概念である。等価物は、ヌクレオチドアナログを含む。ヌクレオチドアナログは、非天然のヌクレオチドを含む。「RNA鎖」は、非化学修飾もしくは化学修飾のRNA塩基、又はその等価物が2個以上連結した形態を含む。ポリヌクレオチドは、1本鎖又は2本鎖ポリヌクレオチドを含む。塩基配列は、例えば、A（アデニン）、G（グアニン）、C（シトシン）、T（チミン）によって表すことができる。また、TとU（ウラシル）は、用途に合わせて互いに読み替えてもよい。このように表された塩基配列中の塩基は、非化学修飾又は化学修飾のA、G、C、Tを含む。【００３１】
ポリヌクレオチドの塩基数は、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、又は500であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、DNA/RNA合成装置を用いて合成可能である。その他、DNA塩基又はRNA塩基合成の受託会社（例えば、インビトロジェン社やタカラバイオ社等）から購入することもできる。また、ベクターの合成も各メーカーに委託することができる。【００３２】
ポリヌクレオチドは、配列番号1の塩基配列を含んでいてもよい。この塩基配列は、miR-520d-5pの成熟miRNAを含む。またポリヌクレオチドは、配列番号2の塩基配列（5'-UCUCAAGCUGUGAGUCUACAAAGGGAAGCCCUUUCUGUUGUCUAAAAGAAAAGAAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGUUACGGUUUGAGA-3'）を含んでいてもよい。この塩基配列は、miR-520d-5pの全長配列を含む。またポリヌクレオチドは、配列番号3の塩基配列（5'-AAAGUGCUUCUCUUUGGUG-3'）を含んでいてもよい。この塩基配列は、配列番号1の塩基配列に相補的に結合してもよい。またポリヌクレオチドは、配列番号4の塩基配列（5'-UCUACAAAGGGAAGCCCUUUCUG -3'）を含んでいてもよい。この塩基配列は、ガイド鎖として機能してもよい。またポリヌクレオチドは、配列番号5の塩基配列（5'-AAAGUGCUUCUCUUUGGUGGGU-3'）を含んでいてもよい。この塩基配列は、パッセンジャー鎖として機能してもよい。【００３３】
本発明の一実施形態において「miRNA関連分子」は、例えば、miRNA、pri-miRNA、又はpre-miRNAを含む。miRNA関連分子は、標的RNA鎖の翻訳抑制に寄与することが知られている。また、miRNAは部分的にしか結合せずにミスマッチを含む不完全な相補鎖でも翻訳阻害を引きこすことが知られている。【００３４】
本発明の一実施形態において「RNAi分子」は、RNAi作用を有するRNA鎖であり、例えば、siRNA、shRNA、又はRNAi作用を有するsmall RNA等を挙げることができる。RNAi分子のデザインには、例えば、siDirect 2.0（Naito et al., BMC Bioinformatics. 2009 Nov 30;10:392.）等を使用できる。また、受託会社（例えば、タカラバイオ（株）等）に委託してもよい。【００３５】
本発明の一実施形態において「RNAi」は、siRNA、shRNA、短鎖もしくは長鎖の1もしくは2本鎖RNA、又はそれらの修飾物等の1つ以上によって、標的遺伝子もしくはmRNA等の機能が抑制、又はサイレンシングされる現象を含む。【００３６】
本発明の一実施形態において「siRNA」は、RNAiを誘導可能なRNA鎖を含む。一般的にsiRNAの2本鎖はガイド鎖とパッセンジャー鎖に分けることができ、ガイド鎖がRISCに取り込まれる。RISCに取り込まれたガイド鎖は、標的RNAを認識するために使われる。RNAi研究では主に人工的に作成したものが使用されるが、生体内において内在的に存在するものも知られている。RNA鎖は15塩基以上のRNAから構成されていてもよい。15塩基以上であれば、標的のポリヌクレオチドに対して精度よく結合できる可能性が高まる。また、RNA鎖は40塩基以下のRNAから構成されていてもよい。40塩基以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクがより低くなる。【００３７】
本発明の一実施形態において「shRNA」は、RNAiを誘導可能で、且つヘアピン状に折りたたまれた構造（ヘアピン様構造）を形成可能な1本鎖のRNA鎖を含む。典型的には、shRNAは細胞内でDicerによって切断され、siRNAが切り出される。このsiRNAによって標的RNAの切断が生じることが知られている。上記shRNAは35以上のヌクレオチドから構成されていてもよい。35以上であれば、shRNAに特有のへアピン様構造を精度よく形成できる可能性が高まる。また、上記shRNAは100塩基以下のRNAから構成されていてもよい。100塩基以下であれば、インターフェロン応答等の不利益な現象が生じるリスクが低くなる。但し、一般的にshRNAと構造および機能が類似しているpre-miRNAの多くが、100ヌクレオチド程度またはそれ以上の長さを有していることから、shRNAの長さは必ずしも100塩基以下でなくても、shRNAとして機能できると考えられる。【００３８】
本発明の一実施形態において「small RNA」とは、比較的小さいRNA鎖をいい、例えば、siRNA、shRNA、miRNA関連分子、アンチセンスRNA、1または2本鎖の低分子RNAなどを挙げることができる。【００３９】
翻訳抑制性RNA分子は、翻訳抑制効率を上昇させる観点からは、5'末端又は3'末端に1〜5塩基からなるオーバーハングを含んでいてもよい。この数は、例えば、5、4、3、2、または1塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また翻訳抑制性RNA分子が2本鎖のとき、各RNA鎖間にミスマッチRNAが存在していてもよい。その数は、例えば、1、2、3、4、5、又は10個以下であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。また翻訳抑制性RNA分子は、ヘアピンループを含んでいてもよい、ヘアピンループの塩基数は、例えば、10、8、6、5、4、又は3塩基であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。なお、各塩基配列の表記は、左側が5'末端、右側が3'末端である。【００４０】
翻訳抑制性RNA分子の長さは、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、又は500であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。この数は、DNA損傷の改善効果を高める観点からは、15以上、又は100以下が好ましい。【００４１】
本発明の一実施形態において、配列番号1〜5で示される塩基配列は、所望の効果を有する限り、（a）いずれかの塩基配列において、1又は複数個の塩基配列が欠失、置換、挿入、もしくは付加している塩基配列、及び（b）いずれかの塩基配列に対して、90％以上の相同性を有する塩基配列、からなる群から選ばれる1つ以上の塩基配列であってもよい。【００４２】
本発明の一実施形態において「複数個」は、例えば、10、8、6、5、4、3、又は2個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。DNA損傷改善効果を上昇させる観点からは、3個以下が好ましい。【００４３】
本発明の一実施形態において「90％以上」は、例えば、90、95、96、97、98、99、又は100％以上であってもよく、それらいずれか2つの値の範囲内であってもよい。上記「相同性」は、2つもしくは複数間の塩基配列において相同な塩基数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較する塩基配列群の塩基配列を整列させ、同一塩基の割合を最大にするために必要である場合は塩基配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、及びそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている(例えば、BLAST、GENETYX等)。相同性（％）は、Blastnのデフォルト設定によって測定された値で表してもよい。又は相同性（％）は、（相同な塩基数／比較元の塩基配列の塩基数）×100で表してもよい。【００４４】
本発明の一実施形態において「細胞」は、体細胞であってもよい。この体細胞は、例えば、皮膚細胞、又は線維芽細胞を含む。ポリヌクレオチドの細胞への導入は、例えば、ウイルスベクターを用いた感染導入、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、又はマイクロインジェクションなどを使用できる。また薬剤耐性やセルソーター等を利用して、導入された細胞のみを選択することができる。【００４５】
本発明の一実施形態において「ベクター」は、ウイルス（例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、又はHIV等）ベクター、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pBR322）、枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110）、酵母由来プラスミド（例、pSH19）、λファージなどのバクテリオファージ、psiCHECK-2、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo、pSUPER（OligoEngine社）、BLOCK-it Inducible H1 RNAi Entry Vector（インビトロジェン社）、pRNATin-H1.4/Lenti (GenScript, corp., NJ, USA)などを用いることができる。上記ベクターは、プロモーター、複製開始点、又は抗生物質耐性遺伝子など、DNA鎖の発現に必要な構成要素を含んでいてもよい。上記ベクターはいわゆる発現ベクターであってもよい。【００４６】
本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する、紫外線損傷改善用組成物である。この紫外線損傷改善用組成物は、後述する実施例で実証されているように、紫外線による細胞の損傷を改善することができる。この紫外線損傷改善用組成物は、UVを受けて実質的に細胞死に至った細胞に対しても、紫外線損傷のサルベージ効果を発揮し得る。【００４７】
本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する、DNA損傷改善用組成物である。このDNA損傷改善用組成物は、後述する実施例で実証されているように、DNA損傷を改善することができる。このDNA損傷改善用組成物は、UVを受けて実質的に細胞死に至った細胞に対しても、DNA損傷のサルベージ効果を発揮し得る。【００４８】
本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する、紫外線損傷改善用組成物である。この紫外線損傷改善用組成物は、後述する実施例で実証されているように、紫外線による細胞の損傷を改善することができる。この紫外線損傷改善用組成物は、UVを受けて実質的に細胞死に至った細胞に対しても、紫外線損傷のサルベージ効果を発揮し得る。【００４９】
本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する、美容剤又は化粧料である。本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する、美容剤又は化粧料である。これらの美容剤又は化粧料は、紫外線による細胞の損傷を改善することができる。【００５０】
本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する、組成物である。この組成物は、紫外線損傷を改善することができる。【００５１】
本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する組成物を対象者に投与する工程を含む、美容方法である。この方法によれば、DNA損傷を受けた対象者の細胞を改善することができる。本発明の一実施形態において「改善」は、損傷を受けた状態をもとの状態に近づける作用を含み、例えば、修復又は治療を含む。また、組成物を対象者に投与する工程は、組成物を対象者の皮膚に投与する工程を含んでいてもよい。また美容方法は、皮膚を洗浄する工程、又は皮膚を消毒する工程を含んでいてもよい。【００５２】
本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する組成物を対象者に投与する工程を含む、DNA損傷改善方法である。また本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する組成物を対象者に投与する工程を含む、紫外線損傷改善方法である。また本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する組成物を対象者に投与する工程を含む、DNA損傷改善方法である。また本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する組成物を対象者に投与する工程を含む、紫外線損傷改善方法である。また本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する組成物を対象者に投与する工程を含む、治療方法である。また本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する組成物を対象者に投与する工程を含む、治療方法である。投与する工程は、対象者の皮膚に塗布する工程を含んでいてもよい。また以上のいずれかの方法は、皮膚に組成物を投与する工程、皮膚を洗浄する工程、又は皮膚を消毒する工程を含んでいてもよい。また以上のいずれかの方法は、対象者に抗癌剤を投与する工程を含んでいてもよい。【００５３】
本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する組成物を研究又は再生医療用材料に接触させる工程を含む、DNA損傷改善方法、又は紫外線損傷改善方法である。また本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する組成物を研究又は再生医療用材料に接触させる工程を含む、DNA損傷改善方法、又は紫外線損傷改善方法である。【００５４】
本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドの、DNA損傷改善用組成物又は紫外線損傷改善用組成物の製造のための使用である。本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターの、DNA損傷改善用組成物又は紫外線損傷改善用組成物の製造のための使用である。【００５５】
本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する、コラーゲン産生促進用組成物である。本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する、コラーゲン産生促進用組成物である。これらのコラーゲン産生促進用組成物を用いれば、細胞又は組織のコラーゲン産生を促進することができる。【００５６】
本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドを含有する、紫外線によるコラーゲン産生減少の抑制用組成物である。本発明の一実施形態は、配列番号1の塩基配列、又はその塩基配列に対して1〜3個の塩基が欠失、置換、挿入、もしくは付加された塩基配列、を含むポリヌクレオチドをコードするベクターを含有する、紫外線によるコラーゲン産生減少の抑制用組成物である。これらのコラーゲン産生減少抑制用組成物を用いれば、紫外線損傷によるコラーゲン産生の減少を抑制することができる。本発明の一実施形態において「コラーゲン産生促進用組成物」又は「コラーゲン産生減少の抑制用組成物」は、細胞又は組織に適用されてもよい。細胞は、例えば、線維芽細胞であってもよい。組織は、例えば、皮膚であってもよい。細胞又は組織は、紫外線を受けた細胞又は組織であってもよい。【００５７】
本明細書において引用しているあらゆる刊行物、公報類（特許、又は特許出願）は、その全体を参照により援用する。【００５８】
本明細書において「又は」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。本明細書において「A〜B」は、A以上B以下を意味するものとする。【００５９】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。また、上記実施形態に記載の構成を組み合わせて採用することもできる。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６１】
＜実施例1＞
1.1 DNA損傷に対するサルベージ効果
図1は、UV照射後の細胞の変化を示した図ある。まず、10cm培養シャーレでNHDF細胞（ヒト皮膚線維芽細胞）を培養し、DNA傷害性の強いUV (302nm)照射を17分間（0.5 J/cm2）行った（図1の(1)）。NHDF細胞は、照射4分で十分に細胞死に至っていた。【００６２】
UV照射前、又はUV照射から3日後に、miR-520d-5pをレンチウィルス（pMIR-520d-5p/GFP）でNHDF細胞に感染導入した（図1の(2)）。miR-520d-5pの成熟miRNAの塩基配列を配列番号1に示す。また、UV照射後3日後に、スクランブル（コントロールの核酸）をNHDF細胞に導入した（図1の(2)）。NHDF細胞と、スクランブルを導入したNHDF細胞は、UV照射によって全て細胞死を維持した。また、UV照射前にmiR-520d-5pを導入したNHDF細胞も、細胞死を維持した。なお、細胞死の判定は、(i)長期の観察（2〜3か月で細胞が増殖しない）、(ii)MTTアッセイで増殖をしている細胞がない、(iii)アポトーシスキットでアポトーシスへ向かっている、(iv)フローサイトメトリーで増殖へ行く細胞が存在しないことを指標にした。【００６３】
約2週間後、UV照射後にmiR-520d-5pを導入したNHDF細胞を含むシャーレにおいて、GFP発現の弱いスフェロイドコロニーがいくつか出現していることが観察された（図1の(3)）。そのコロニーを6ウェルプレートに移し、培養した。1ヶ月以上経ったとき、各スフェロイドコロニーは線維芽細胞様細胞を生じさせた（図1の(4)）。スフェロイドコロニーと線維芽細胞様細胞の両方でGFP発現が観察された。継代のためのトリプシン処理によって、GFPを強発現した多数のスフェロイド細胞の出現が誘導された（図1の(5)）。細胞は、照射後平均75日で老化した。その結果、細胞は細胞死していた（図1の(6)）。この結果は、miR-520d-5pにより、UVによる致命的なDNA損傷がサルベージされたことを意味している。【００６４】
図1の最も左の写真は、UV照射前のNHDFの表現型である。左から2列目の写真（2週間以上経過）はGFPを発現した（下段）生存細胞の表現型（上段）である。左から3列目の写真（1ヶ月以上経過）はGFPを強発現した（下段）、成長したスフェロイドコロニーの代表的なものを示す。このとき、線維芽細胞様細胞がコロニーから産生していた（下段）。最も右の写真は、約80日（上段）までに成長した線維芽細胞様細胞を示している。GFPを発現している小円形細胞が、線維芽細胞様細胞の間に散在していた。なお、図中、Scramは、スクランブルを導入したことを意味する。520dは、miR-520d-5pを導入したことを意味する。【００６５】
1.2フローサイトメトリーの結果
図2は、紫外線照射後のフローサイトメトリーの結果を示した図である。最上段は、NHDF細胞のDNA量を示す。2段目は紫外線照射後にスクランブルを導入したNHDF細胞のDNA量、3段目は紫外線照射後にmiR-520d-5pを導入したNHDF細胞のDNA量、4段目は紫外線照射前にmiR-520d-5pを導入したNHDF細胞のDNA量を示す。4グループの各相の割合を、右側の点線の四角枠内に示した。紫外線照射後にスクランブルを導入したNHDF細胞と、紫外線照射前にmiR-520d-5pを導入したNHDF細胞は、UV照射による致命的なダメージを治癒できなかった。一方で、紫外線照射後にスクランブルを導入したNHDF細胞は、UV照射による致命的なダメージに耐えたことがわかる。また、紫外線照射後にスクランブルを導入したNHDF細胞は、S期（DNA合成期）が、紫外線照射後にスクランブルを導入したNHDF細胞に比べて1.5倍に増えていた。【００６６】
1.3 コラーゲン産生能の評価
図3は、UV照射を受けたNHDF細胞のコラーゲン産生能を測定した結果である。UVによるダメージからサルベージされたスフェロイド細胞集団は、非常に高いレベルのコラーゲン産生を維持した。老化した細胞はコラーゲン産生の増加傾向を示した。図中、PCはNHDFを意味する。Spheroidは、紫外線照射後にmiR-520d-5pを導入したNHDF細胞（33週）を意味する。**はP＜0.01を意味する。NCは死滅細胞を意味する。【００６７】
以上の結果、miR-520d-5pには、DNA損傷に対して改善効果があることが示された。【００６８】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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