(57)【要約】  下記一般式（１）及び下記一般式（２）のいずれかで表される化合物からなるＣＬＥＣ−２拮抗剤である。〔一般式（１）〕2017119417.tif 000044（ただし、前記一般式（１）中、ＭはＨ２及び第２〜１２族元素のいずれかを表し、Ｒ１はビニル基及び１−ヒドロキシエチル基のいずれかを表し、Ｘは第１族元素を表す。）〔一般式（２）〕2017119417.tif 000045（ただし、前記一般式（２）中、ＭはＨ２及び第２〜１２族元素のいずれかを表し、Ｒ２はフェニル基、スルホフェニル基、カルボキシフェニル基及び１−メチルピリジニウム−４−イル基のいずれかを表す。）
2017119417.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）及び下記一般式（２）のいずれかで表される化合物からなることを特徴とするＣＬＥＣ−２拮抗剤。
〔一般式（１）〕
【化１】
2017119417.tif 000034
（ただし、前記一般式（１）中、ＭはＨ２及び第２〜１２族元素のいずれかを表し、Ｒ１はビニル基及び１−ヒドロキシエチル基のいずれかを表し、Ｘは第１族元素を表す。）
〔一般式（２）〕
【化２】
2017119417.tif 000035
（ただし、前記一般式（２）中、ＭはＨ２及び第２〜１２族元素のいずれかを表し、Ｒ２はフェニル基、スルホフェニル基、カルボキシフェニル基及び１−メチルピリジニウム−４−イル基のいずれかを表す。）
【請求項２】
前記一般式（１）で表される化合物が、下記一般式（１−Ａ）及び下記一般式（１−Ｂ）のいずれかで表される化合物である請求項１に記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤。
〔一般式（１−Ａ）〕
【化３】
2017119417.tif 000036
（ただし、前記一般式（１−Ａ）中、ＭはＨ２、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＰｄのいずれかを表し、Ｘは第１族元素を表す。）
〔一般式（１−Ｂ）〕
【化４】
2017119417.tif 000037
（ただし、前記一般式（１−Ｂ）中、ＭはＨ２、Ｃｏ、Ｚｎ及びＣｕのいずれかを表す。）
【請求項３】
前記一般式（１−Ｂ）で表される化合物が、下記構造式Ｂ４で表される化合物である請求項２に記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤。
〔構造式Ｂ４〕
【化５】
2017119417.tif 000038
【請求項４】
前記一般式（２）で表される化合物が、下記構造式Ｃ１で表される化合物である請求項１から３のいずれかに記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤。
〔構造式Ｃ１〕
【化６】
2017119417.tif 000039
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤からなることを特徴とする血小板凝集抑制剤。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤からなることを特徴とする抗血栓薬。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤からなることを特徴とする抗転移薬。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤からなることを特徴とする抗関節炎薬。
【請求項９】
下記一般式（１−Ａ）及び下記一般式（１−Ｂ）のいずれかで表されることを特徴とする化合物。
〔一般式（１−Ａ）〕
【化７】
2017119417.tif 000040
（ただし、前記一般式（１−Ａ）中、ＭはＣｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＰｄのいずれかを表し、Ｘは第１族元素を表す。）
〔一般式（１−Ｂ）〕
【化８】
2017119417.tif 000041
（ただし、前記一般式（１−Ｂ）中、ＭはＣｏ、Ｚｎ及びＣｕのいずれかを表す。）
【請求項１０】
プロトポルフィリンの塩及び金属酢酸塩を、ジメチルスルホキシド及び酢酸のいずれかと、水との存在下、７０℃〜９５℃で１時間〜３０時間反応させて下記一般式（１−Ａ）で表される化合物を得る工程を含むことを特徴とする化合物の製造方法。
〔一般式（１−Ａ）〕
【化９】
2017119417.tif 000042
（ただし、前記一般式（１−Ａ）中、ＭはＣｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＰｄのいずれかを表し、Ｘは第１族元素を表す。）
【請求項１１】
ヘマトポルフィリン及び金属酢酸塩を、メタノール及び酢酸のいずれかの存在下、１５℃〜３０℃で５時間〜３０時間反応させて下記一般式（１−Ｂ）で表される化合物を得る工程を含むことを特徴とする化合物の製造方法。
〔一般式（１−Ｂ）〕
【化１０】
2017119417.tif 000043
（ただし、前記一般式（１−Ｂ）中、ＭはＣｏ、Ｚｎ及びＣｕのいずれかを表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板活性化受容体ＣＬＥＣ−２の機能を特異的に抑制可能なＣＬＥＣ−２拮抗剤、血小板凝集抑制剤、抗血栓薬、抗転移薬、及び抗関節炎薬、並びにポルフィリン骨格を有する化合物、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞、脳梗塞などの動脈血栓症は、血小板が中心的な役割を果たす。抗血小板薬は、世界で約２兆円の市場規模があるが、出血の副作用が問題となっている。大規模コホート調査によると、出血のリスクがベネフィットを上回るため、現在、１次予防のための抗血小板薬の使用は推奨されていない。したがって、出血の副作用が少ない抗血小板薬が望まれている。【０００３】
癌による死亡の９割程度は、転移に起因するものであり、次に多いのが癌関連血栓症である。しかし、転移を抑制する薬剤はこれまでに報告されてない。一方、ヘパリンやワーファリンを癌患者に投与して、癌関連血栓症を予防する試みがなされてきたが、特に化学療法後など、出血の副作用が発生するという問題がある。【０００４】
一方、血小板活性化受容体ＣＬＥＣ−２は、本発明者らが見出したものであり、血小板を活性化する蛇毒であるロドサイチンの受容体として、血小板上に同定された（例えば、非特許文献１参照）。本発明者らは、ＣＬＥＣ−２の生体内リガンドが、ある種の癌細胞に発現する膜蛋白ポドプラニンであることを見出した（例えば、非特許文献２参照）。【０００５】
ＣＬＥＣ−２の機能を欠損させたマウスとして、ＣＬＥＣ−２欠損骨髄キメラマウス、及び抗ポドプラニン抗体を注射することによりＣＬＥＣ−２を欠損させたマウスにおいて、血栓形成が抑制されるが、出血時間の有意な延長はないことを本発明者らは示した（例えば、非特許文献３〜５参照）。また、抗ポドプラニン抗体が、マウス肺転移モデルにおいて癌の肺転移を抑制することを本発明者らは報告した（例えば、非特許文献６参照）。【０００６】
したがって、ＣＬＥＣ−２をターゲットとした薬剤は、出血の副作用の少ない抗血栓、抗血小板薬、及び抗転移薬となり得ることが期待される。しかしながら、ＣＬＥＣ−２をターゲットとした薬剤は同定されておらず、また、出血の副作用が少ない血小板凝集抑制剤、及び癌の転移を抑制する抗転移薬、並びにそれらの候補化合物について研究開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７（２）：５４２−５４９
【非特許文献２】ＪＢＣ，２００７；２８２（３６）：２５９９３−２６００１
【非特許文献３】Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１４（１６）：３４６４−３４７２
【非特許文献４】ＪＢＣ，２０１０；２８５（３２）：２４４９４−２４５０７
【非特許文献５】Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．，２０１３；３３（５）：９２６−９３４
【非特許文献６】Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．２００８；  ９９（１）：５４−６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、血小板活性化受容体ＣＬＥＣ−２の機能を特異的に抑制可能なＣＬＥＣ−２拮抗剤、血小板凝集抑制剤、抗血栓薬、抗転移薬、及び抗関節炎薬、並びに金属イオンにポルフィリン骨格を有する配位子が配位した化合物、及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記一般式（１）及び下記一般式（２）のいずれかで表される化合物からなることを特徴とするＣＬＥＣ−２拮抗剤である。
〔一般式（１）〕
【化１】
2017119417.tif 000003
（ただし、前記一般式（１）中、ＭはＨ２及び第２〜１２族元素のいずれかを表し、Ｒ１はビニル基及び１−ヒドロキシエチル基のいずれかを表し、Ｘは第１族元素を表す。）
〔一般式（２）〕
【化２】
2017119417.tif 000004
（ただし、前記一般式（２）中、ＭはＨ２及び第２〜１２族元素のいずれかを表し、Ｒ２はフェニル基、スルホフェニル基、カルボキシフェニル基及び１−メチルピリジニウム−４−イル基のいずれかを表す。）
＜２＞  前記一般式（１）で表される化合物が、下記一般式（１−Ａ）及び下記一般式（１−Ｂ）のいずれかで表される化合物である前記＜１＞に記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤である。
〔一般式（１−Ａ）〕
【化３】
2017119417.tif 000005
（ただし、前記一般式（１−Ａ）中、ＭはＨ２、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＰｄのいずれかを表し、Ｘは第１族元素を表す。）
〔一般式（１−Ｂ）〕
【化４】
2017119417.tif 000006
（ただし、前記一般式（１−Ｂ）中、ＭはＨ２、Ｃｏ、Ｚｎ及びＣｕのいずれかを表す。）
＜３＞  前記一般式（１−Ｂ）で表される化合物が、下記構造式Ｂ４で表される化合物である前記＜２＞に記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤である。
〔構造式Ｂ４〕
【化５】
2017119417.tif 000007
＜４＞  前記一般式（２）で表される化合物が、下記構造式Ｃ１で表される化合物である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤である。
〔構造式Ｃ１〕
【化６】
2017119417.tif 000008
＜５＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤からなることを特徴とする血小板凝集抑制剤である。
＜６＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤からなることを特徴とする抗血栓薬である。
＜７＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤からなることを特徴とする抗転移薬である。
＜８＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤からなることを特徴とする抗関節炎薬である。
＜９＞  下記一般式（１−Ａ）及び下記一般式（１−Ｂ）のいずれかで表されることを特徴とする化合物である。
〔一般式（１−Ａ）〕
【化７】
2017119417.tif 000009
（ただし、前記一般式（１−Ａ）中、ＭはＣｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＰｄのいずれかを表し、Ｘは第１族元素を表す。）
〔一般式（１−Ｂ）〕
【化８】
2017119417.tif 000010
（ただし、前記一般式（１−Ｂ）中、ＭはＣｏ、Ｚｎ及びＣｕのいずれかを表す。）
＜１０＞  プロトポルフィリンの塩及び金属酢酸塩を、ジメチルスルホキシド及び酢酸のいずれかと、水との存在下、７０℃〜９５℃で１時間〜３０時間反応させて下記一般式（１−Ａ）で表される化合物を得る工程を含むことを特徴とする化合物の製造方法である。
〔一般式（１−Ａ）〕
【化９】
2017119417.tif 000011
（ただし、前記一般式（１−Ａ）中、ＭはＣｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＰｄのいずれかを表し、Ｘは第１族元素を表す。）
＜１１＞  ヘマトポルフィリン及び金属酢酸塩を、メタノール及び酢酸のいずれかの存在下、１５℃〜３０℃で５時間〜３０時間反応させて下記一般式（１−Ｂ）で表される化合物を得る工程を含むことを特徴とする化合物の製造方法である。
〔一般式（１−Ｂ）〕
【化１０】
2017119417.tif 000012
（ただし、前記一般式（１−Ｂ）中、ＭはＣｏ、Ｚｎ及びＣｕのいずれかを表す。）
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、血小板活性化受容体ＣＬＥＣ−２の機能を特異的に抑制可能なＣＬＥＣ−２拮抗剤、血小板凝集抑制剤、抗血栓薬、抗転移薬、及び抗関節炎薬、並びに金属イオンにポルフィリン骨格を有する配位子が配位した化合物、及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１における一次スクリーニングのフロー、及び結果を説明する図である。
【図２】図２は、実施例１における二次スクリーニングの結果を説明する図である。
【図３】図３は、実施例１におけるプロトポルフィリンＩＸ（Ｈ２−ＰＰ）のフローサイトメーターによる評価結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例２のプロトポルフィリン亜鉛錯体（Ｚｎ−ＰＰ）のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を示す図である。
【図５】図５は、実施例２のプロトポルフィリン亜鉛錯体（Ｚｎ−ＰＰ）の１Ｈ−ＮＭＲによる測定結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例２におけるプロトポルフィリン亜鉛錯体（Ｚｎ−ＰＰ）のフローサイトメーターによる評価結果を示す図である。
【図７】図７は、実施例３のプロトポルフィリンニッケル錯体（Ｎｉ−ＰＰ）のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を示す図である。
【図８】図８は、実施例３におけるプロトポルフィリンニッケル錯体（Ｎｉ−ＰＰ）のフローサイトメーターによる評価結果を示す図である。
【図９】図９は、実施例４のプロトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＰＰ）のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例４におけるプロトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＰＰ）のフローサイトメーターによる評価結果を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例５のプロトポルフィリンパラジウム錯体（Ｐｄ−ＰＰ）のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を示す図である。
【図１２】図１２は、実施例５におけるプロトポルフィリンパラジウム錯体（Ｐｄ−ＰＰ）のフローサイトメーターによる評価結果を示す図である。
【図１３】図１３は、実施例６におけるヘマトポルフィリン（Ｈ２−ＨＰ）のフローサイトメーターによる評価結果を示す図である。
【図１４】図１４は、実施例７のヘマトポルフィリン亜鉛錯体（Ｚｎ−ＨＰ）のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を示す図である。
【図１５】図１５は、実施例７のヘマトポルフィリン亜鉛錯体（Ｚｎ−ＨＰ）の１Ｈ−ＮＭＲによる測定結果を示す図である。
【図１６】図１６は、実施例７におけるヘマトポルフィリン亜鉛錯体（Ｚｎ−ＨＰ）のフローサイトメーターによる評価結果を示す図である。
【図１７】図１７は、実施例８のヘマトポルフィリン銅錯体（Ｃｕ−ＨＰ）のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を示す図である。
【図１８】図１８は、実施例８におけるヘマトポルフィリン銅錯体（Ｃｕ−ＨＰ）のフローサイトメーターによる評価結果を示す図である。
【図１９】図１９は、実施例９のヘマトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＨＰ）のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を示す図である。
【図２０】図２０は、実施例９におけるヘマトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＨＰ）のフローサイトメーターによる評価結果を示す図である。
【図２１】図２１は、実施例１０における５，１０，１５，２０−テトラキス（ｐ−スルホフェニル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン（ＴＰＰＳ）のフローサイトメーターによる評価結果を示す図である。
【図２２】図２２は、実施例１１におけるα，β，γ，δ−テトラキス（１−メチルピリジニウム−４−イル）ポルフィリンのｐ−トルエンスルホナート（ＴＭＰｙＰ４ＯＴｓ）のフローサイトメーターによる評価結果を示す図である。
【図２３】図２３は、ヒト血小板凝集に対する血小板凝集抑制効果の評価結果を示す図である。
【図２４】図２４は、マウス血小板凝集に対する血小板凝集抑制効果の評価結果を示す図である。
【図２５】図２５は、マウス肺転移モデルの化合物投与（ＤＭＳＯ、又はＣｏ−ＨＰ）開始から１４日目の肺の様子を示す写真である。
【図２６】図２６は、マウス肺転移モデルの化合物投与（ＤＭＳＯ、又はＣｏ−ＨＰ）開始から１４日目の肺の重量を示す図である。
【図２７】図２７は、マウスｉｎ  ｖｉｖｏ塩化鉄血栓形成モデルを用いた血管閉塞時間延長効果を示す図である。
【図２８】図２８は、マウスｉｎ  ｖｉｖｏにおける出血時間への影響を示す図である。
【図２９】図２９は、野生型マウス、及びＣＬＥＣ−２欠損骨髄キメラマウスをレシピエントマウスとするＫ／ＢｘＮマウス血清移入関節炎モデルにおけるリウマチ様関節炎の炎症の程度を示す図である。
【図３０】図３０は、野生型マウスをレシピエントマウスとするＫ／ＢｘＮマウス血清移入関節炎モデルにおけるリウマチ様関節炎に対するＣｏ−ＨＰ投与による影響を示す図である。
【図３１】図３１は、ヒトリンパ管上皮細胞（ＬＥＣ）の血小板接着を視覚化した写真である。
【図３２】図３２は、ヒトリンパ管上皮細胞（ＬＥＣ）の血小板接着面積を定量化したグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（ＣＬＥＣ−２拮抗剤）
本発明のＣＬＥＣ−２拮抗剤は、下記一般式（１）及び下記一般式（２）のいずれかで表される、ポルフィリン骨格を有する化合物からなる。
前記ＣＬＥＣ−２拮抗剤は、血小板活性化受容体であるＣＬＥＣ−２の機能を抑制する作用を有する薬剤である。前記ＣＬＥＣ−２拮抗剤は、ＣＬＥＣ−２の生体内のリガンドであるポドプラニンと、ＣＬＥＣ−２との結合を抑制する作用を有することが好ましい。
【００１３】
−ＣＬＥＣ−２−
前記ＣＬＥＣ−２は、正式名：Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２であり、血小板を活性化する蛇毒であるロドサイチンの受容体として同定された（Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０７（２）：５４２−５４９）。ヒトでは、ほぼ血小板にのみ特異的に発現することが知られている。
一方、前記ＣＬＥＣ−２の生体内リガンドであるポドプラニンは、シアル酸に富む膜糖タンパク質であり、扁平上皮癌、悪性中皮腫などに発現し、その発現量が多いほど予後不良になることが知られていた。また、血小板凝集活性、癌の転移促進活性を有することが知られ、血小板に受容体が存在することが予測されていたが、血小板受容体が前記ＣＬＥＣ−２であることが同定されるまで約２０年間を要した。
前記ＣＬＥＣ−２が、ポドプラニンにより活性化されると、血小板凝集が促進され、血栓形成が促進される。
これに対して、本発明のＣＬＥＣ−２拮抗剤は、ＣＬＥＣ−２に特異的に結合又はポドプラニンと競合することによりＣＬＥＣ−２の機能を抑制する拮抗剤として機能する。
【００１４】
＜＜一般式（１）で表される化合物＞＞
〔一般式（１）〕
【化１１】
2017119417.tif 000013
（ただし、前記一般式（１）中、ＭはＨ２及び第２〜１２族元素のいずれかを表し、Ｒ１はビニル基及び１−ヒドロキシエチル基のいずれかを表し、Ｘは第１族元素を表す。）
【００１５】
前記一般式（１）中、Ｍは、Ｈ２及び第２〜１２族元素のいずれかであり、Ｈ２、第８族元素、第９族元素、第１０族元素、第１１族元素、第１２族元素が好ましく、Ｈ２、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｃｕ、Ｚｎがより好ましい。
なお、第２族元素等は、国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の新しい表記法に基づくものであり、前記第２〜１２族元素は、旧ＩＵＰＡＣ表記の第ＩＩＡ族〜第ＶＩＩＩＡ族、第ＩＢ族及び第ＩＩＢ族にそれぞれ対応する。
【００１６】
前記一般式（１）中、Ｘは、第１族元素であり、Ｈ、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋが好ましく、Ｈ、Ｎａがより好ましい。
【００１７】
前記一般式（１）で表される化合物としては、下記一般式（１−Ａ）表される化合物、及び下記一般式（１−Ｂ）で表される化合物のいずれかであることが好ましい。
【００１８】
＜＜＜一般式（１−Ａ）で表される化合物＞＞＞
下記一般式（１−Ａ）表される化合物は、前記一般式（１）中、Ｒ１がビニル基である、プロトポルフィリン骨格を有する化合物である。
〔一般式（１−Ａ）〕
【化１２】
2017119417.tif 000014
（ただし、前記一般式（１−Ａ）中、ＭはＨ２、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＰｄのいずれかを表し、Ｘは第１族元素を表す。）
【００１９】
前記一般式（１−Ａ）表される化合物としては、例えば、下記構造式Ａ１で表されるプロトポルフィリンＩＸ、下記構造式Ａ２で表されるプロトポルフィリン亜鉛錯体、下記構造式Ａ３で表されるプロトポルフィリンニッケル錯体、下記構造式Ａ４で表されるプロトポルフィリンコバルト錯体、下記構造式Ａ５で表されるプロトポルフィリンパラジウム錯体などが挙げられる。これらの中でも、下記構造式Ａ１で表されるプロトポルフィリンＩＸ、下記構造式Ａ２で表されるプロトポルフィリン亜鉛錯体、下記構造式Ａ４で表されるプロトポルフィリンコバルト錯体が好ましく、下記構造式Ａ１で表されるプロトポルフィリンＩＸがより好ましい。
【化１３】
2017119417.tif 000015
【００２０】
＜＜＜一般式（１−Ｂ）で表される化合物＞＞＞
下記一般式（１−Ｂ）で表される化合物は、前記一般式（１）中、Ｒ１が１−ヒドロキシエチル基であり、ＸがＨ（水素）である、ヘマトポルフィリン骨格を有する化合物である。
〔一般式（１−Ｂ）〕
【化１４】
2017119417.tif 000016
（ただし、前記一般式（１−Ｂ）中、ＭはＨ２、Ｃｏ、Ｚｎ及びＣｕのいずれかを表す。）
【００２１】
前記一般式（１−Ｂ）表される化合物は、具体的には、下記構造式Ｂ１で表されるヘマトポルフィリン、下記構造式Ｂ２で表されるヘマトポルフィリン亜鉛錯体、下記構造式Ｂ３で表されるヘマトポルフィリン銅錯体、及び下記構造式Ｂ４で表されるヘマトポルフィリンコバルト錯体である。これらの中でも、下記構造式Ｂ１で表されるヘマトポルフィリン、下記構造式Ｂ３で表されるヘマトポルフィリン銅錯体、及び下記構造式Ｂ４で表されるヘマトポルフィリンコバルト錯体が好ましく、ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する活性が特に高い点で、下記構造式Ｂ４で表されるヘマトポルフィリンコバルト錯体がより好ましい。
【化１５】
2017119417.tif 000017
【００２２】
＜＜一般式（２）で表される化合物＞＞
〔一般式（２）〕
【化１６】
2017119417.tif 000018
（ただし、前記一般式（２）中、ＭはＨ２及び第２〜１２族元素のいずれかを表し、Ｒ２はフェニル基、スルホフェニル基、カルボキシフェニル基及び１−メチルピリジニウム−４−イル基のいずれかを表す。）
【００２３】
前記一般式（２）中、Ｍは、Ｈ２及び第２〜１２族元素のいずれかであり、Ｈ２、第８族元素、第９族元素、第１０族元素、第１１族元素、第１２族元素が好ましく、Ｈ２、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｐｄ、Ｃｕ、Ｚｎがより好ましい。
【００２４】
前記一般式（２）で表される化合物としては、例えば、下記構造式Ｃ１で表される、５，１０，１５，２０−テトラキス（ｐ−スルホフェニル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン（「ＴＰＰＳ」と称することがある。）、下記構造式Ｃ２で表される、α，β，γ，δ−テトラキス（１−メチルピリジニウム−４−イル）ポルフィリン（「ＴＭＰｙＰ」と称することがある。）のｐ−トルエンスルホナート（「ＴＭＰｙＰ４ＯＴｓ」と称することがある。）、テトラフェニルポルフィリン（「ＴＰＰ」と称することがある。）、５，１０，１５，２０−テトラキス（ｐ−カルボキシフェニル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン（「ＴＰＰＣ」と称することがある。）などが挙げられる。これらの中でも、下記構造式Ｃ１で表されるＴＰＰＳが好ましい。
【００２５】
〔構造式Ｃ１〕
【化１７】
2017119417.tif 000019
【００２６】
〔構造式Ｃ２〕
【化１８】
2017119417.tif 000020
【００２７】
（血小板凝集抑制剤及び抗血栓薬）
本発明の血小板凝集抑制剤は、本発明の前記ＣＬＥＣ−２拮抗剤からなる。前記血小板凝集抑制剤は、血小板の凝集を抑制する作用を有する薬剤である。
本発明の抗血栓薬は、本発明の前記ＣＬＥＣ−２拮抗剤からなる。前記抗血栓薬は、血栓の形成を抑制し、血管閉塞を予防する作用を有する薬剤である。
前記血小板凝集抑制剤及び前記抗血栓薬は、血小板活性化受容体であるＣＬＥＣ−２の機能抑制を介して作用することが好ましく、ＣＬＥＣ−２の生体内のリガンドであるポドプラニンと、ＣＬＥＣ−２との結合を抑制する作用を有することがより好ましい。
【００２８】
（抗転移薬）
本発明の抗転移薬は、本発明の前記ＣＬＥＣ−２拮抗剤からなる。前記抗転移薬は、がん細胞の転移を抑制する作用を有する薬剤である。
前記抗転移薬は、血小板活性化受容体であるＣＬＥＣ−２の機能抑制を介して作用することが好ましく、ＣＬＥＣ−２の生体内のリガンドであるポドプラニンと、ＣＬＥＣ−２との結合を抑制する作用を有することがより好ましい。
【００２９】
（抗関節炎薬）
本発明の抗関節炎薬は、本発明の前記ＣＬＥＣ−２拮抗剤からなる。前記抗関節炎薬は、関節の炎症を抑制する作用を有する薬剤であり、例えば、抗リウマチ薬などが挙げられる。
前記抗関節炎薬は、血小板活性化受容体であるＣＬＥＣ−２の機能抑制を介して作用することが好ましく、ＣＬＥＣ−２の生体内のリガンドであるポドプラニンと、ＣＬＥＣ−２との結合を抑制する作用を有することがより好ましい。
【００３０】
（製剤）
前記製剤としては、本発明のＣＬＥＣ−２拮抗剤、血小板凝集抑制剤、抗血栓薬、抗転移薬、及び抗関節炎薬の少なくともいずれかを含み、更に必要に応じて薬理学的に許容可能な担体などのその他の成分を含む。
前記ＣＬＥＣ−２拮抗剤、血小板凝集抑制剤、抗血栓薬、抗転移薬、及び抗関節炎薬の少なくともいずれかとしては、前記一般式（１）及び前記一般式（２）のいずれかで表される化合物であってもよく、前記化合物の薬理学的に許容可能な、塩、溶媒和物及びプロドラッグの少なくともいずれかであってもよい。
【００３１】
前記製剤は、デキストリン、シクロデキストリンなどの薬理学的に許容可能な担体、助剤を用いて、常法に従い、液状、粉末状、顆粒状、錠剤状などの任意の剤形に製剤化して提供することができ、他の組成物（例えば、点眼薬、経口医薬品など）に配合して使用できる他、軟膏剤、外用液剤、貼付剤などとして使用することができる。
前記助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味剤、矯臭剤などを用いることができる。
【００３２】
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記安定剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記矯味剤乃至矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００３３】
前記製剤を投与する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて各薬剤に適した投与経路、投与タイミング、投与量、投与スケジュール等の投与条件を適宜選択することができる。
前記投与経路としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、静脈内投与、経皮投与、経口投与が好ましい。
【００３４】
前記製剤の投与量としては、特に制限はなく、処置を必要とする対象の疾患状態、体重等の要因に応じて適宜選択することができるが、一日当たり、１ｍｇ〜１，０００ｍｇが好ましく、１０ｍｇ〜２００ｍｇがより好ましい。
【００３５】
（化合物）
本発明の化合物は、下記一般式（１−Ａ）及び下記一般式（１−Ｂ）のいずれかで表される、ポルフィリン骨格を有する化合物である。
前記一般式（１−Ａ）で表されるプロトポルフィリン骨格を有する化合物は、本発明の前記一般式（１−Ａ）で表される化合物の製造方法により好適に製造することができる。
前記一般式（１−Ｂ）で表されるヘマトポルフィリン骨格を有する化合物は、本発明の前記一般式（１−Ｂ）で表される化合物の製造方法により好適に製造することができる。
【００３６】
〔一般式（１−Ａ）〕
【化１９】
2017119417.tif 000021
（ただし、前記一般式（１−Ａ）中、ＭはＣｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＰｄのいずれかを表し、Ｘは第１族元素を表す。）
【００３７】
〔一般式（１−Ｂ）〕
【化２０】
2017119417.tif 000022
（ただし、前記一般式（１−Ｂ）中、ＭはＣｏ、Ｚｎ及びＣｕのいずれかを表す。）
【００３８】
（化合物の製造方法）
＜一般式（１−Ａ）で表される化合物の製造方法＞
本発明の化合物の製造方法は、前記一般式（１−Ａ）で表される化合物の製造方法であって、プロトポルフィリンの塩及び金属酢酸塩を、ジメチルスルホキシド及び酢酸のいずれかと、水との存在下、７０℃〜９５℃で１時間〜３０時間反応させて下記一般式（１−Ａ）で表される化合物を得る工程を含み、更に必要に応じて精製工程などのその他の工程を含む。
前記プロトポルフィリンの塩としては、前記一般式（１−Ａ）で表される化合物のＭがＨ２である化合物の塩であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記構造式Ａ１で表されるプロトポルフィリンＩＸなどが挙げられる。
ここで、前記金属酢酸塩における金属は、前記一般式（１−Ａ）中、Ｍで表されるＣｏ、Ｚｎ、Ｎｉ及びＰｄのいずれかである。
【００３９】
前記一般式（１−Ａ）で表される化合物が、下記構造式Ａ２で表されるプロトポルフィリン亜鉛錯体である場合、プロトポルフィリンの塩及び酢酸亜鉛を、ジメチルスルホキシドと水との存在下で反応させることが好ましく、反応温度としては７０℃〜９０℃（例えば、８０℃）が好ましく、反応時間としては１時間〜１０時間（例えば、２時間）が好ましい。
【００４０】
前記一般式（１−Ａ）で表される化合物が、下記構造式Ａ３で表されるプロトポルフィリンニッケル錯体である場合、プロトポルフィリンの塩及び酢酸ニッケルを、ジメチルスルホキシドと水との存在下で反応させることが好ましく、反応温度としては７０℃〜９０℃（例えば、８０℃）が好ましく、反応時間としては５時間〜２０時間（例えば、８時間）が好ましい。
【００４１】
前記一般式（１−Ａ）で表される化合物が、下記構造式Ａ４で表されるプロトポルフィリンコバルト錯体である場合、プロトポルフィリンの塩及び酢酸コバルト（ＩＩ）を、酢酸と水との存在下で反応させることが好ましく、反応温度としては８０℃〜９５℃（例えば、９０℃）が好ましく、反応時間としては１２時間〜３０時間（例えば、２４時間）が好ましい。
【００４２】
前記一般式（１−Ａ）で表される化合物が、下記構造式Ａ５で表されるプロトポルフィリンパラジウム鉛錯体である場合、プロトポルフィリンの塩及び酢酸パラジウム（ＩＩ）を、酢酸と水との存在下で反応させることが好ましく、反応温度としては８０℃〜９５℃（例えば、９０℃）が好ましく、反応時間としては１２時間〜３０時間（例えば、２４時間）が好ましい。
【化２１】
2017119417.tif 000023
【００４３】
＜一般式（１−Ｂ）で表される化合物の製造方法＞
本発明の化合物の製造方法は、前記一般式（１−Ｂ）で表される化合物の製造方法であって、ヘマトポルフィリン及び金属酢酸塩を、メタノール及び酢酸のいずれかの存在下、１５℃〜３０℃で５時間〜３０時間反応させて下記一般式（１−Ｂ）で表される化合物を得る工程を含み、更に必要に応じて精製工程などのその他の工程を含む。
前記ヘマトポルフィリンは、下記構造式Ｂ１で表される化合物である。
ここで、前記金属酢酸塩における金属は、前記一般式（１−Ｂ）中、Ｍで表されるＣｏ、Ｚｎ及びＣｕのいずれかである。
【００４４】
前記一般式（１−Ｂ）で表される化合物が、下記構造式Ｂ２で表されるヘマトポルフィリン亜鉛錯体である場合、ヘマトポルフィリン及び酢酸亜鉛を、メタノールの存在下で反応させることが好ましく、反応温度としては１５℃〜３０℃（例えば、２５℃）が好ましく、反応時間としては５時間〜２０時間（例えば、８時間）が好ましい。
【００４５】
前記一般式（１−Ｂ）で表される化合物が、下記構造式Ｂ３で表されるヘマトポルフィリン銅錯体である場合、ヘマトポルフィリン及び酢酸銅（ＩＩ）を、酢酸の存在下で反応させることが好ましく、反応温度としては１５℃〜３０℃（例えば、２５℃）が好ましく、反応時間としては１２時間〜３０時間（例えば、２４時間）が好ましい。
【００４６】
前記一般式（１−Ｂ）で表される化合物が、下記構造式Ｂ４で表されるヘマトポルフィリンコバルト錯体である場合、ヘマトポルフィリン及び酢酸コバルト（ＩＩ）を、酢酸の存在下で反応させることが好ましく、反応温度としては１５℃〜３０℃（例えば、２５℃）が好ましく、反応時間としては１２時間〜３０時間（例えば、２４時間）が好ましい。
【化２２】
2017119417.tif 000024
【実施例】
【００４７】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限されるものではない。【００４８】
（実施例１：プロトポルフィリンＩＸ）
＜ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の探索（一次スクリーニング）＞
理化学研究所ケミカルバイオロジー研究基盤施設の天然物を中心とした１５，０００種類の低分子化合物ライブラリーを用い、下記の方法により、ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の一次スクリーニングを行った。
リコンビナントＣＬＥＣ−２とリコンビナントポドプラニンとの結合を検出可能なＥＬＩＳＡ検出系を構築し、ＥＬＩＳＡ検出系を用いた測定によって一次スクリーニングを行った。【００４９】
−リコンビナントＣＬＥＣ−２の調製−
リコンビナントＣＬＥＣ−２として、文献「ＪＢＣ，２００７；２８２（３６）：２５９９３−２６００１」に記載の方法にしたがって、ヒトＣＬＥＣ−２−ｒＦｃ２を調製した。【００５０】
−リコンビナントポドプラニンの調製−
リコンビナントポドプラニンとして、文献「ＪＢＣ，２００７；２８２（３６）：２５９９３−２６００１」に記載の方法にしたがって、ヒトポドプラニン−ｈＦｃ２−Ｂｉｏｔｉｎを調製した。【００５１】
−ＥＬＩＳＡ検出系による測定−
９６ウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）２ＨＢ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に固相蛋白液（１μｇ／１００ｍＬのヒトＣＬＥＣ−２−ｒＦｃ２を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）１００μＬを滴下し、プレートシールをして、４℃にて８時間〜２４時間反応させた。固相蛋白液を除去後、洗浄液（０．０５体積％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ、ｐＨ７．２）４００μＬで１回洗浄した。次いで、ブロック剤（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋ、Ｓｃｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１５０μＬを加え、正確に５分間放置した。ブロック剤を除去後、洗浄液４００μＬで２回洗浄した。【００５２】
得られたリコンビナントＣＬＥＣ−２をコートしたＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに、前記低分子化合物ライブラリーの各化合物の溶液（１０μｇ／ｍＬ）１００μＬを滴下し、前記溶液を除去後、洗浄液４００μＬで３回洗浄した。次いで、検出蛋白液（１μｇ／１００ｍＬのヒトポドプラニン−ｈＦｃ２−Ｂｉｏｔｉｎを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）１００μＬを滴下して、室温（２５℃）にて１時間反応させた。検出蛋白液を除去後、洗浄液４００μＬで３回洗浄した。検出試薬（ｓｔｒｅｐｔｏＡｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＣＡ社製）１００μＬを滴下して１時間反応させた。検出試薬を除去後、洗浄液４００μＬで３回洗浄した。次いで、ＴＢＭ液（Ｔ０４４０、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を１００μＬ滴下し、暗室にて３分間〜５分間反応させた後、反応停止液（０．５ＭのＨＣｌ）を５０μＬ加え、マイクロプレートリーダー（装置名：マルチラベルカウンター、ＡＲＶ０ｍｘ−Ｕ１  １４２０−０５０Ｊ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて４５０ｎｍでの吸光度を測定した。【００５３】
なお、陰性コントロールとして、各化合物の溶液、及び検出蛋白液に代えて、それぞれＰＢＳを用いた。また、陽性コントロールとして、各化合物の溶液に代えてＰＢＳを用いた。
各化合物の吸光度から、下記式１により、結合抑制率を算出した。結合抑制率が４０％以上の化合物を、ＣＬＥＣ−２に対する結合活性を有する化合物と判断した。
〔式１〕
結合抑制率（％）＝１００−（各化合物の吸光度―陰性コントロールの吸光度）／（陽性コントロールの吸光度−陰性コントロールの吸光度）【００５４】
図１に、実施例１における一次スクリーニングのフロー、及び結果を説明する図を示す。陽性コントロールにおいては、ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合に由来する波長４５０ｎｍのシグナルが観察される。これに対して、図１に示す通り、ＣＬＥＣ−２に結合する化合物Ａを投与した場合、ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合が抑制され、前記陽性コントロールで観察されたシグナルが低減される。一方、ＣＬＥＣ−２に結合しない（又は、ポドプラニンとの結合を抑制しない）化合物Ｂを投与した場合、ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合が抑制されないため、前記陽性コントロールで観察されたシグナルは変化しない。【００５５】
以上の通り、リコンビナントＣＬＥＣ−２とリコンビナントポドプラニンとの結合に対して、前記低分子化合物ライブラリーの各化合物がその結合を抑制するか否かを指標として、ＣＬＥＣ−２に結合する低分子化合物リガンドを探索した。その結果、ポルフィリン骨格を有する化合物であるプロトポルフィリンＩＸ（「Ｈ２−ＰＰ」と称することがある。）を含む、６４種類の化合物が得られた。【００５６】
＜ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の評価（二次スクリーニング）＞
一次スクリーニングにおいて得られた６４種類の化合物について、次いで、ＣＬＥＣ−２発現培養細胞を用いたフローサイトメーターによって二次スクリーニングを行った。【００５７】
−ＣＬＥＣ−２発現培養細胞の調製−
ＣＬＥＣ−２発現培養細胞として、文献「Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００３；７７（７）：４０７０−４０８０」に記載の方法にしたがって、ヒトＣＬＥＣ−２発現２９３ＴＲＥｘ細胞を調製した。
なお、この細胞は、Ｔｅｔ  ｏｎシステムにより、ドキシサイクリン添加でＣＬＥＣ−２を発現する細胞であり、フローサイトメーターによる測定の２４時間前に、終濃度１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを添加することによってＣＬＥＣ−２の発現を誘導した。【００５８】
−ヒトポドプラニン−ヒトＦｃ２の調製−
リコンビナントポドプラニンとして、文献「ＪＢＣ，２００７；２８２（３６）：２５９９３−２６００１」に記載の方法にしたがって、ヒトポドプラニン−ヒトＦｃ２を調製した。【００５９】
−ＣＬＥＣ−２発現培養細胞を用いたフローサイトメーターによる測定−
ヒトＣＬＥＣ−２発現２９３ＴＲＥｘ細胞２．５×１０５細胞を含むＰＢＳ５０μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに加えた。２０μｇ／ｍＬの各化合物を終濃度５μｇ／ｍＬとなるように前記マイクロチューブに加えて４℃で３０分間静置した。次いで、５μｇ／ｍＬとなるようにヒトポドプラニン−ヒトＦｃ２又はヒトＦｃ２を添加して（ただし、検出モードＦＬ１で自家蛍光が出る化合物に関しては、ビオチン標識したヒトポドプラニン−ヒトＦｃ２又はビオチン標識したヒトＦｃ２を添加して）４℃で３０分間静置した。更に、１ｍＬのＰＢＳを加えて洗浄し、余分な化合物やリコンビナント蛋白質を除き、０．１ｍＬのＰＢＳを加えて再懸濁した。その後、抗ヒトＩｇＧ抗体−ＦＩＴＣを添加して（ただし、検出モードＦＬ１で自家蛍光が出る化合物に関しては、ＡＰＣラベルａｖｉｄｉｎを添加して）４℃で２０分間静置した。得られた試料に３００μＬのＰＢＳを加えてフローサイトメーター（装置名：ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ（登録商標）Ｃ６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）の検出モードＦＬ１で解析した（ただし、検出モードＦＬ１で自家蛍光が出る化合物に関しては、検出モードＦＬ４で解析した）。
なお、陰性コントロールとして、各化合物の溶液に代えて１μＬのＤＭＳＯを添加した試料を用いた。また、別の陰性コントロールとして、ヒトポドプラニン−ヒトＦｃ２に代えてヒトＦｃ２を添加した試料を用いた。陽性コントロールとして、各化合物の溶液に代えて終濃度５０ｎＭのロドサイチンを添加した試料を用いた。【００６０】
図２に、実施例１における二次スクリーニングの結果を説明する図を示す。化合物非存在下では（図２の左パネル参照）、陰性コントロールであるヒトＦｃ２をヒトポドプラニン−ヒトＦｃ２に置換することにより、ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合に由来するピークシフトが観察される。一方、ＣＬＥＣ−２に結合する化合物を投与した場合（図２の右パネル参照）、ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合が完全に抑制されると、ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合に由来するピークシフトが全く観察されず、陰性コントロールに由来するピークに完全に重なるピークが観察される。また、ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合が部分的に抑制された場合（図示せず）、抑制の程度に依存して、陰性コントロールに由来するピークと、ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合に由来するピークとの間のピークが観察される。【００６１】
下記式２により、結合抑制率を算出した。結合抑制率が４０％以上の化合物を、ＣＬＥＣ−２に対する結合活性を有する化合物と判断した。
〔式２〕
結合抑制率（％）＝１００−１００×（Ｔ−Ｎ）／（Ｐ−Ｎ）
ただし、前記式中、Ｐ、Ｎ、及びＴは以下の通りである。
Ｐ：化合物の陽性コントロール（ヒトポドプラニン−ヒトＦｃ２、ＤＭＳＯ）に由来するｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）
Ｎ：結合の陰性コントロール（ヒトＦｃ２、ＤＭＳＯ）に由来するＭＦＩ
Ｔ：化合物を投与した場合に由来するＭＦＩ【００６２】
以上の通り、ＣＬＥＣ−２発現細胞とリコンビナントポドプラニンとの結合に対して、一次スクリーニングにて同定した各化合物がその結合を抑制するか否か（結合抑制率４０％以上）を指標として、ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物を探索した。
その結果、ポルフィリン骨格を有する化合物であるプロトポルフィリンＩＸ（Ｈ２−ＰＰ）が得られた。実施例１におけるプロトポルフィリンＩＸ（Ｈ２−ＰＰ）のフローサイトメーターによる評価結果を図３に示す。プロトポルフィリンＩＸの結合抑制率は、８６．２％であった。【００６３】
以下の実施例２〜５及び７〜９に示す通り、実施例１の二次スクリーニングにおいて得られたプロトポルフィリンＩＸを最適化するため、プロトポルフィリンＩＸの類似物質として、プロトポルフィリン金属錯体及びヘマトポルフィリン金属錯体を製造した。
また、以下の実施例２〜１１では、評価対象の化合物として、実施例２〜１１のプロトポルフィリンＩＸの類似物質を用いた以外は、実施例１の二次スクリーニングと同様にしてＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の評価及び最適化を行った。【００６４】
（実施例２：プロトポルフィリン亜鉛錯体）
＜プロトポルフィリン亜鉛錯体（Ｚｎ−ＰＰ）の合成及び同定＞
プロトポルフィリン  二ナトリウム塩（東京化成工業株式会社製、１００ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２０ｍＬ、蒸留水５ｍＬを加えて溶解したところに酢酸亜鉛（３９０ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）加え、８０℃で２時間加熱撹拌した。その後、室温（２５℃）まで冷却し、エタノールを加えて結晶化させ、得られた沈殿を蒸留水で洗浄し、収率９８％で紫色沈殿（１０９ｍｇ）を得た。
得られた化合物の同定を、１Ｈ−ＮＭＲ、紫外線−可視光吸収スペクトル（ＵＶ−ｖｉｓスペクトル）、及び蛍光スペクトルにより行った結果、プロトポルフィリン亜鉛錯体が得られたことが分かった。反応式を下記反応式（１）に示す。実施例２のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を図４に示す。また、実施例２の１Ｈ−ＮＭＲによる測定結果を図５に示す。
なお、ＵＶ−ｖｉｓスペクトル測定には、ＵＶ−１８００（株式会社島津製作所製）、蛍光スペクトル測定には、ＦＰ−６３００（日本分光株式会社製）を用い、図中、ＵＶ−ｖｉｓスペクトルを実線で示し、蛍光スペクトルを破線で示した。１Ｈ−ＮＭＲ測定には、ＡＶＡＮＣＥ  ４００（Ｂｒｕｋｅｒ社製）を用い、重ＤＭＳＯ中で測定を行った。【００６５】
〔反応式（１）〕
【化２３】
2017119417.tif 000025
（ただし、前記反応式（１）中、Ｚｎ（ＯＡｃ）２は酢酸亜鉛を表し、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを表す。）【００６６】
＜ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合抑制評価＞
実施例１の二次スクリーニングにおいて、評価対象の化合物として、終濃度５μｇ／ｍＬのプロトポルフィリン亜鉛錯体を用いた以外は、実施例１の二次スクリーニングと同様にしてＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の評価を行った。プロトポルフィリン亜鉛錯体のフローサイトメーターによる評価結果を図６に示す。プロトポルフィリン亜鉛錯体の結合抑制率は、７１．２％であった。【００６７】
（実施例３：プロトポルフィリンニッケル錯体）
＜プロトポルフィリンニッケル錯体（Ｎｉ−ＰＰ）の合成及び同定＞
プロトポルフィリン  二ナトリウム塩（東京化成工業株式会社製、１００ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）にＤＭＳＯ  ２０ｍＬ、蒸留水５ｍＬを加え溶解したところに酢酸ニッケル（６１０ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）加え、８０℃で８時間加熱撹拌した。その後、室温（２５℃）まで冷却し、メタノールを加えて結晶化させ、得られた沈殿を蒸留水で洗浄した。この沈殿を酢酸−蒸留水で再結晶を行うことにより収率６５％で深紫色沈殿（７１ｍｇ）を得た。
得られた化合物の同定を、ＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルにより行った結果、プロトポルフィリンニッケル錯体が得られたことが分かった。反応式を下記反応式（２）に示す。実施例３のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を図７に示す。【００６８】
〔反応式（２）〕
【化２４】
2017119417.tif 000026
（ただし、前記反応式（２）中、Ｎｉ（ＯＡｃ）２は酢酸ニッケルを表し、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドを表す。）【００６９】
＜ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合抑制評価＞
実施例１の二次スクリーニングにおいて、評価対象の化合物として、終濃度５μｇ／ｍＬのプロトポルフィリンニッケル錯体を用いた以外は、実施例１の二次スクリーニングと同様にしてＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の評価を行った。プロトポルフィリンニッケル錯体のフローサイトメーターによる評価結果を図８に示す。プロトポルフィリンニッケル錯体の結合抑制率は、５０．４％であった。【００７０】
（実施例４：プロトポルフィリンコバルト錯体）
＜プロトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＰＰ）の合成及び同定＞
プロトポルフィリン  二ナトリウム塩（東京化成工業株式会社製、１００ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌ）に酢酸２０ｍＬを加え溶解したところに酢酸コバルト（ＩＩ）４水和物（４１０ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）加え、９０℃で２４時間加熱撹拌した。その後、室温（２５℃）まで冷却した後、蒸留水１５０ｍＬに反応混合物を加えて約４℃に冷却することにより収率９３％で深紫色沈殿（１０２ｍｇ）を得た。
得られた化合物の同定を、ＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルにより行った結果、プロトポルフィリンコバルト錯体が得られたことが分かった。反応式を下記反応式（３）に示す。実施例４のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を図９に示す。【００７１】
〔反応式（３）〕
【化２５】
2017119417.tif 000027
（ただし、前記反応式（３）中、Ｃｏ（ＯＡｃ）２は酢酸コバルト（ＩＩ）を表す。）【００７２】
＜ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合抑制評価＞
実施例１の二次スクリーニングにおいて、評価対象の化合物として、終濃度５μｇ／ｍＬのプロトポルフィリンコバルト錯体を用いた以外は、実施例１の二次スクリーニングと同様にしてＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の評価を行った。プロトポルフィリンコバルト錯体のフローサイトメーターによる評価結果を図１０に示す。プロトポルフィリンコバルト錯体の結合抑制率は、７９．４％であった。【００７３】
（実施例５：プロトポルフィリンパラジウム錯体）
＜プロトポルフィリンパラジウム錯体（Ｐｄ−ＰＰ）の合成及び同定＞
プロトポルフィリン  二ナトリウム塩（東京化成工業株式会社製、５０ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）に酢酸１０ｍＬを加え溶解したところに酢酸パラジウム（ＩＩ）（９２ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）加え、９０℃で２４時間加熱撹拌した。その後、室温（２５℃）まで冷却した後、蒸留水５０ｍＬに反応混合物を加えて結晶化させ、得られた沈殿をＤＭＳＯ−メタノール及びＤＭＳＯ−蒸留水で再結晶を行うことで定量的収率にて深紫色沈殿（６５ｍｇ）を得た。
得られた化合物の同定を、ＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルにより行った結果、プロトポルフィリンパラジウム錯体が得られたことが分かった。反応式を下記反応式（４）に示す。実施例５のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を図１１に示す。【００７４】
〔反応式（４）〕
【化２６】
2017119417.tif 000028
（ただし、前記反応式（４）中、Ｐｄ（ＯＡｃ）２は酢酸パラジウム（ＩＩ）を表す。）【００７５】
＜ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合抑制評価＞
実施例１の二次スクリーニングにおいて、評価対象の化合物として、終濃度５μｇ／ｍＬのプロトポルフィリンパラジウム錯体を用いた以外は、実施例１の二次スクリーニングと同様にしてＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の評価を行った。プロトポルフィリンパラジウム錯体のフローサイトメーターによる評価結果を図１２に示す。プロトポルフィリンパラジウム錯体の結合抑制率は、６６．７％であった。【００７６】
（実施例６：ヘマトポルフィリン）
＜ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合抑制評価＞
実施例１の二次スクリーニングにおいて、評価対象の化合物として、終濃度５μｇ／ｍＬのヘマトポルフィリン（和光純薬工業株式会社製）を用いた以外は、実施例１の二次スクリーニングと同様にしてＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の評価を行った。ヘマトポルフィリンのフローサイトメーターによる評価結果を図１３に示す。ヘマトポルフィリンの結合抑制率は、９０．２％であった。【００７７】
（実施例７：ヘマトポルフィリン亜鉛錯体）
＜ヘマトポルフィリン亜鉛錯体（Ｚｎ−ＨＰ）の合成及び同定＞
ヘマトポルフィリン（和光純薬工業株式会社製、１００ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）にメタノール２０ｍＬを加え溶解したところに飽和酢酸亜鉛メタノール溶液２ｍＬを加え、室温（２５℃）で一晩（８時間）撹拌した。その後、蒸留水５０ｍＬに反応混合物を加えて約４℃に冷却することで定量的収率にて紫色沈殿（１１６ｍｇ）を得た。
得られた化合物の同定を、１Ｈ−ＮＭＲ、ＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルにより行った結果、ヘマトポルフィリン亜鉛錯体が得られたことが分かった。反応式を下記反応式（５）に示す。実施例７のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を図１４に示す。また、合成例１の１Ｈ−ＮＭＲによる測定結果を図１５に示す。【００７８】
〔反応式（５）〕
【化２７】
2017119417.tif 000029
（ただし、前記反応式（５）中、Ｚｎ（ＯＡｃ）２は酢酸亜鉛を表し、ＭｅＯＨはメタノールを表す。）【００７９】
＜ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合抑制評価＞
実施例１の二次スクリーニングにおいて、評価対象の化合物として、終濃度５μｇ／ｍＬのヘマトポルフィリン亜鉛錯体を用いた以外は、実施例１の二次スクリーニングと同様にしてＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の評価を行った。ヘマトポルフィリン亜鉛錯体のフローサイトメーターによる評価結果を図１６に示す。ヘマトポルフィリン亜鉛錯体の結合抑制率は、８１．３％であった。【００８０】
（実施例８：ヘマトポルフィリン銅錯体）
＜ヘマトポルフィリン銅錯体（Ｃｕ−ＨＰ）の合成及び同定＞
ヘマトポルフィリン（和光純薬工業株式会社製、１００ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）に酢酸２０ｍＬを加え溶解したところに酢酸銅（ＩＩ）（３００ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）加え、室温（２５℃）で２４時間撹拌した。その後、蒸留水１５０ｍＬに反応混合物を加えて約４℃に冷却することで定量的収率にて紫色沈殿（１６２ｍｇ）を得た。
得られた化合物の同定を、ＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルにより行った結果、ヘマトポルフィリン銅錯体が得られたことが分かった。反応式を下記反応式（６）に示す。実施例８のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を図１７に示す。【００８１】
〔反応式（６）〕
【化２８】
2017119417.tif 000030
（ただし、前記反応式（６）中、Ｃｕ（ＯＡｃ）２は酢酸銅（ＩＩ）を表す。）【００８２】
＜ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合抑制評価＞
実施例１の二次スクリーニングにおいて、評価対象の化合物として、終濃度５μｇ／ｍＬのヘマトポルフィリン銅錯体を用いた以外は、実施例１の二次スクリーニングと同様にしてＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の評価を行った。ヘマトポルフィリン銅錯体のフローサイトメーターによる評価結果を図１８に示す。ヘマトポルフィリン銅錯体の結合抑制率は、８４．０％であった。【００８３】
（実施例９：ヘマトポルフィリンコバルト錯体）
＜ヘマトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＨＰ）の合成及び同定＞
ヘマトポルフィリン（和光純薬工業株式会社製、１００ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）に酢酸２０ｍＬを加え溶解したところに酢酸コバルト（ＩＩ）４水和物（４１０ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）加え、室温（２５℃）で２４時間撹拌した。その後、酢酸エチルと蒸留水を加えて抽出操作を行ったところ、沈殿が生じたため、ろ取し、有機相は硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を減圧留去した。残渣成分と抽出操作で得た沈殿と同一成分であることがＴＬＣによって確認できたため、併せてメタノール−トルエンにより再結晶を行うことにより収率５０％で深紫色沈殿（５５ｍｇ）を得た。
得られた化合物の同定を、ＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルにより行った結果、ヘマトポルフィリンコバルト錯体が得られたことが分かった。反応式を下記反応式（７）に示す。実施例９のＵＶ−ｖｉｓスペクトル、及び蛍光スペクトルによる測定結果を図１９に示す。【００８４】
〔反応式（７）〕
【化２９】
2017119417.tif 000031
（ただし、前記反応式（７）中、Ｃｏ（ＯＡｃ）２は酢酸コバルト（ＩＩ）を表す。）【００８５】
＜ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合抑制評価＞
実施例１の二次スクリーニングにおいて、評価対象の化合物として、終濃度５μｇ／ｍＬのヘマトポルフィリンコバルト錯体を用いた以外は、実施例１の二次スクリーニングと同様にしてＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の評価を行った。ヘマトポルフィリンコバルト錯体のフローサイトメーターによる評価結果を図２０に示す。ヘマトポルフィリンコバルト錯体の結合抑制率は、１０１．１％であった。【００８６】
（実施例１０：５，１０，１５，２０−テトラキス（ｐ−スルホフェニル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン）
＜ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合抑制評価＞
実施例１の二次スクリーニングにおいて、評価対象の化合物として、終濃度５μｇ／ｍＬのプロトポルフィリンＩＸに代えて、下記構造式Ｃ１で表される、５，１０，１５，２０−テトラキス（ｐ−スルホフェニル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン（東京化成工業株式会社製、「ＴＰＰＳ」と称することがある。）を用いた以外は、実施例１の二次スクリーニングと同様にしてＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の評価を行った。ＴＰＰＳのフローサイトメーターによる評価結果を図２１に示す。ＴＰＰＳの結合抑制率は、８９．８％であった。【００８７】
〔構造式Ｃ１〕
【化３０】
2017119417.tif 000032
【００８８】
（実施例１１：α，β，γ，δ−テトラキス（１−メチルピリジニウム−４−イル）ポルフィリンのｐ−トルエンスルホナート）
＜ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合抑制評価＞
実施例１の二次スクリーニングにおいて、評価対象の化合物として、終濃度５μｇ／ｍＬのプロトポルフィリンＩＸに代えて、下記構造式Ｃ２で表される、α，β，γ，δ−テトラキス（１−メチルピリジニウム−４−イル）ポルフィリン（「ＴＭＰｙＰ」と称することがある。）のｐ−トルエンスルホナート（東京化成工業株式会社製、「ＴＭＰｙＰ４ＯＴｓ」と称することがある。）を用いた以外は、実施例１の二次スクリーニングと同様にしてＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制する化合物の評価を行った。ＴＭＰｙＰ４ＯＴｓのフローサイトメーターによる評価結果を図２２に示す。ＴＭＰｙＰ４ＯＴｓの結合抑制率は、５４．４％であった。【００８９】
〔構造式Ｃ２〕
【化３１】
2017119417.tif 000033
【００９０】
実施例２〜１１の結果、評価したプロトポルフィリンＩＸの類似物質の全てが、４０％以上の結合抑制活性を示し、ＣＬＥＣ−２とポドプラニンとの結合を抑制することが分かった。中でも、Ｃｏ−ＨＰの結合抑制活性が高く、実施例１の二次スクリーニングの評価系（化合物を終濃度５μｇ／ｍＬで用いた場合）において、ほぼ完全に結合を抑制することが分かった。【００９１】
＜ヒト血小板凝集に対する血小板凝集抑制効果の評価＞
ヒト由来の血小板（ＰＬＴ：２０×１０４／μＬ）を用い、ロドサイチン、コラーゲン、又はトロンビンにより血小板凝集を惹起した際の、プロトポルフィリンＩＸ（Ｈ２−ＰＰ）及びヘマトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＨＰ）による血小板凝集抑制効果を、文献「Ｂｌｏｏｄ  ２００３：１０２（４）：１３６７−１３７３」に記載の方法にしたがって評価した。【００９２】
ヒト血小板凝集に対する血小板凝集抑制効果の評価結果を、図２３に示す。
その結果、１．０μｇ／ｍＬ（１．５μＭ）のＨ２−ＰＰ又はＣｏ−ＨＰ投与により、ロドサイチン惹起血小板凝集が特異的に抑制され、特に、Ｃｏ−ＨＰ投与によりほぼ完全に抑制されることが分かった。【００９３】
＜マウス血小板凝集に対する血小板凝集抑制効果の評価＞
マウス由来の血小板（ＰＬＴ：２０×１０４／μＬ）を用い、ロドサイチン、コラーゲン、又はトロンビンにより血小板凝集を惹起した際の、プロトポルフィリンＩＸ（Ｈ２−ＰＰ）及びヘマトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＨＰ）による血小板凝集抑制効果を、文献「Ｂｌｏｏｄ  ２００３：１０２（４）：１３６７−１３７３」に記載の方法にしたがって評価した。【００９４】
マウス血小板凝集に対する血小板凝集抑制効果の評価結果を、図２４に示す。
その結果、１．０μｇ／ｍＬ（１．５μＭ）のＨ２−ＰＰ又はＣｏ−ＨＰ投与により、ロドサイチン惹起血小板凝集が抑制され、特に、１．０μｇ／ｍＬ（１．５μＭ）のＣｏ−ＨＰ投与が最もロドサイチン惹起血小板凝集を抑制することが分かった。【００９５】
＜マウス肺転移モデルを用いた転移抑制効果の評価＞
高転移性を示し、ポドプラニンを発現する細胞株であるメラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０細胞を移植したマウス肺転移モデルを用いて、ヘマトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＨＰ）による転移抑制効果を下記の方法により評価した。【００９６】
Ｃ５７ＢＬ／６系統マウス（８週齢、雄、日本チャールズ・リバー株式会社より購入、各群ｎ＝５）に対し、０日目にＢ１６Ｆ１０−ＧＦＰ細胞（アンチキャンサージャパン株式会社製）１×１０６細胞／個体を尾静脈より経静脈的に投与した。０日目に同時に、１質量％ＤＭＳＯ、１００μｇ／ｍＬのＣｏ−ＨＰを眼窩より２００μＬ投与することにより化合物投与を行った（１匹あたり２０μｇ、循環血液量２ｍＬとして、１０μｇ／ｍＬ）。以後、２日ごとの２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目及び１２日目に化合物投与を行い、１４日目にマウスから肺を摘出して肺重量を測定した。【００９７】
マウス肺転移モデルの化合物投与（ＤＭＳＯ、又はＣｏ−ＨＰ）開始から１４日目の肺の様子を示す写真を、図２５に示す。また、マウス肺転移モデルの化合物投与（ＤＭＳＯ、又はＣｏ−ＨＰ）開始から１４日目の肺の重量を示すグラフを、図２６に示す。
その結果、メラノーマ細胞株Ｂ１６Ｆ１０細胞の移植により、肺に腫瘍ができ（図２５、左パネル参照）、肺重量が増加するのに対し、Ｃｏ−ＨＰでは、腫瘍の発生が抑制され（図２５、右パネル参照）、また肺重量の増加も抑制された（図２６、ｐ＝０．０１４４；Ｄｕｎｎ多重比較検定）。【００９８】
＜マウスｉｎ  ｖｉｖｏ塩化鉄血栓形成モデルを用いた血管閉塞時間延長効果の評価＞
塩化鉄により血栓を形成させた、血栓形成モデルマウスを用いて、ヘマトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＨＰ）による血管閉塞時間延長効果を下記の方法により評価した。【００９９】
Ｃ５７ＢＬ／６系統マウス（８週齢、雄、日本チャールズ・リバー株式会社より購入、各群ｎ＝３）に３質量％セボフルラン（丸石製薬株式会社製）をプラスチックボックスに０．５Ｌ／分間で気化させ、マウスをボックス内に入れて麻酔を導入した。実験が終了するまでこの麻酔条件下で麻酔状態を維持した。１質量％ＤＭＳＯ、又は１００μｇ／ｍＬのＣｏ−ＨＰを眼窩より２００μＬ投与することにより化合物投与を行った（１匹あたり２０μｇ、循環血液量２ｍＬとして、１０μｇ／ｍＬ）。次いで、四肢をビニールテープで固定し、左大腿動脈を露出させた後、先細ピンセットを用いて他の組織から左大腿動脈を剥離し、パラフィルムを挟んで組織液の浸潤を防止した。レーザー血流計（装置名：ＡＬＦ２１ＲＤ、株式会社アドバンス製）を用い、血流６０ｍＬ／分間／１００ｇ以上を目安として血流量の最も高い位置を探してセンサーを固定し、２分間〜３分間血流を測定することにより、障害（塩化鉄投与による血栓形成刺激）前の安定した各パラメータを測定した。
１０質量％塩化鉄の水溶液を浸漬させたろ紙を、露出させた左大腿動脈の上に載せることにより、血栓の形成を惹起した。血栓が形成され、血管が閉塞する基準として、血流５ｍＬ／分間／１００ｇ以下が１分間以上継続した時点まで、レーザー血流計による測定を続けた。なお、血管閉塞時間は、塩化鉄投与から、血流５ｍＬ／分間／１００ｇ以下が１分間以上継続した際の、閉塞開始時刻までに要した時間とした。【０１００】
マウスｉｎ  ｖｉｖｏ塩化鉄血栓形成モデルを用いた血管閉塞時間延長効果を、図２７に示す。
その結果、ＤＭＳＯを投与した対照と比較して、Ｃｏ−ＨＰ投与により、顕著に血管閉塞時間が延長することが分かった。【０１０１】
＜マウスｉｎ  ｖｉｖｏにおける出血時間への影響の評価＞
一般的な抗血栓薬の副作用として、血液が固まりにくくなる作用（出血傾向）があり、出血のリスクがあることが知られている。そこで、ヘマトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＨＰ）の投与が、出血してから止血するまでの時間（出血時間）に与える影響を下記の方法により評価した。【０１０２】
Ｃ５７ＢＬ／６系統マウス（８週齢、雄、日本チャールズ・リバー株式会社、各群ｎ＝８）に３質量％セボフルラン（丸石製薬株式会社製）をプラスチックボックスに０．５Ｌ／分間で気化させ、マウスをボックス内に入れて麻酔を導入した。実験が終了するまでこの麻酔条件下で麻酔状態を維持した。１質量％ＤＭＳＯ、又は１００μｇ／ｍＬのＣｏ−ＨＰを眼窩より２００μＬ投与することにより化合物投与を行った（１匹あたり２０μｇ、循環血液量２ｍＬとして、１０μｇ／ｍＬ）。１０分間後に、マウス尾部を先端より２ｍｍカミソリで切断し、断端を３７℃の生理食塩水に浸し、出血時間を記録した。
なお、止血の基準を、３０秒間以上再出血が起こらないこととし、出血時間は、尾部切断から、止血の開始時刻までに要した時間とした。【０１０３】
マウスｉｎ  ｖｉｖｏにおける出血時間への影響を、図２８に示す。
その結果、Ｃｏ−ＨＰ投与群における出血時間（平均±標準偏差：２１２．０±８６．４秒間）は、ＤＭＳＯを投与した対照の出血時間（１５２．０±５２．６秒間）に対して、統計的有意差が観察されず、したがって、出血の副作用が少ない抗血栓薬などとして有用であることが分かった。【０１０４】
＜Ｋ／ＢｘＮマウス血清移入関節炎モデルを用いた関節炎への影響の評価＞
ＣＬＥＣ−２欠損骨髄キメラマウスに、関節炎抑制作用があることを本発明者らは新たに見出した。そこで、ヘマトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＨＰ）の投与が、リウマチ様関節炎に与える影響を下記の方法により評価した。【０１０５】
関節炎誘発性Ｋ／ＢｘＮマウス血清（山梨大学にて繁殖の上、血清を採取）１００μＬ／Ｂｏｄｙを、処置当日（Ｄａｙ０）と処置後２日目（Ｄａｙ２）に、レシピエントマウスへと腹腔投与した（図２９〜３０中、黒矢頭）。前記レシピエントマウスとして、野生型骨髄キメラマウス（野生型マウス胎仔肝臓を放射線照射した野生型マウスに移植した１５週齢の骨髄キメラＣ５７ＢＬ／６雄マウス、図２９、ｎ＝５；野生型マウスはＣ５７ＢＬ／６系統マウス、８週齢、雄、日本チャールズ・リバー株式会社より購入した。）、又はＣＬＥＣ−２欠損骨髄キメラマウス（血小板特異的ＣＬＥＣ−２欠損マウス胎仔肝臓を移植した１５週齢の骨髄キメラＣ５７ＢＬ／６雄マウス、図２９、ｎ＝５；野生型マウスはＣ５７ＢＬ／６系統マウス、８週齢、雄、日本チャールズ・リバー株式会社より購入した。）を用いた。
更に、野生型マウスにおいて、２００μｇ／ｍＬのＣｏ−ＨＰを１００μＬ／Ｂｏｄｙで、Ｄａｙ０、２、４、及び６に眼窩静脈叢より投与した（図３０、Ｃｏ−ＨＰ投与群ｎ＝５）。一方、対照としてＰＢＳを同様に投与した（図３０、対照群ｎ＝６）。
処置後１０日目（Ｄａｙ１０）まで１日１回、前足の厚み、前足首の厚み、踵の厚み、後足の厚みをデジタルノギスにて測定した。各個体において、これらの測定値の合計を関節炎の程度の指標とした。結果を平均値±標準偏差で示し、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより有意差検定を行った。【０１０６】
野生型マウス（ＷＴ）、及びＣＬＥＣ−２欠損骨髄キメラマウス（ＣＬＥＣ−２  ＫＯ）をレシピエントマウスとするＫ／ＢｘＮマウス血清移入関節炎モデルにおけるリウマチ様関節炎の炎症の程度を、図２９に示す。また、野生型マウスをレシピエントマウスとするＫ／ＢｘＮマウス血清移入関節炎モデルにおけるリウマチ様関節炎に対するＣｏ−ＨＰ投与による影響を、図３０に示す。
図２９の結果から、野生型マウスに比べて、ＣＬＥＣ−２欠損骨髄キメラマウスにおいてリウマチ様関節炎の炎症の程度は有意に抑制された。したがって、リウマチ様関節炎にＣＬＥＣ−２が関与することが示唆された。
図３０の結果から、Ｃｏ−ＨＰ投与によって、リウマチ様関節炎の炎症の程度は有意に抑制された。おそらく、関節内滑膜細胞上に発現しているポドプラニンと血小板ＣＬＥＣ−２の結合で血小板が活性化され、炎症が促進される可能性があるのではないかと考えられる。
これらの結果から、Ｃｏ−ＨＰを始めとするＣＬＥＣ−２拮抗剤は、抗リウマチ薬などの抗関節炎薬として使用できる可能性が示唆された。【０１０７】
＜リンパ管内皮上の血栓形成への影響の評価＞
血管内皮上のみならず、リンパ管内皮上でも血栓が形成されることが知られている。そこで、リンパ管内皮上で形成された血栓に対する、ヘマトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＨＰ）の投与による影響を、下記の方法により評価した。【０１０８】
ヒトリンパ管上皮細胞（ＬＥＣ）をパラレルプレートフローチャンバー（ｉｂｉｄｉ  μ−スライドＶＩ０．１、ｉｂｉＴｒｅａｔ、ｉｂｉｄｉ社製）上で単層状に培養し、１質量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する内皮細胞成長培地（商品名：;ＥＧＭ−２、Ｌｏｎｚａ社製）を用いてＬＥＣのブロッキングを２時間行った。
健康なボランティアからのヒト全血を、１００ｎｇ／ｍＬアルガトロバン（商品名：ノバスタン、田辺三菱製薬株式会社製）、及び５Ｕ／ｍＬヘパリン（商品名：ヘパリンＮａ注、持田製薬株式会社製）を用いて採取した。血液を５μＭの３−ジヘキシルオキシカルボシアニンヨウ化物（ＤｉＯＣ６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、及び化合物（Ｃｏ−ＨＰ）又は対照溶媒（ＤＭＳＯ）を含有する内皮細胞成長培地で１０分間の前処理を行った。得られた血液サンプルを４００ｓ−１のせん断速度で１０分間、前記パラレルプレートフローチャンバーに灌流した。蛍光ビデオ顕微鏡を用いて、血小板接着を視覚化し、灌流開始から、１、３、５、７、及び１０分間経過後に静止画を撮影した。１０分間経過後の静止画を、血小板接着面積を画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｊ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて定量した。【０１０９】
ヒトリンパ管上皮細胞（ＬＥＣ）の血小板接着を視覚化した写真、及び血小板接着面積を定量化したグラフを、それぞれ図３１及び図３２に示す。
その結果、ヘマトポルフィリンコバルト錯体（Ｃｏ−ＨＰ）の投与により、リンパ管内皮上での血栓形成が著しく抑制されることが示唆された。【０１１０】
悪性腫瘍手術においてリンパ節郭清を施行後、リンパ浮腫が生じることがある。日本における上肢リンパ浮腫患者が５万人、下肢リンパ浮腫患者が７万人となっており、この数は年々増加している。リンパ浮腫が慢性化すると、象皮化、線維化と進み、感染を繰り返したり、ＱＯＬが著しく低い状態となる。リンパ浮腫の治療の一つとして、リンパ管静脈吻合術を行い、リンパ管内のリンパ液を静脈に灌流させるという治療法がある。これは有効な治療法であるが、長期の開存率は４０％しかない。吻合部が閉塞してしまう原因の一つに吻合部での血栓形成がある。おそらく、血液がリンパ管内に逆流する際、血小板ＣＬＥＣ−２とリンパ管内皮のポドプラニンが結合して血栓が形成されるものと考えられる。ＣＬＥＣ−２とポドプラニンの結合を抑制することができれば、リンパ管血管吻合術後の閉塞をある程度予防できると考える。
本実験の結果から、リンパ管内皮上での血栓形成がＣｏ−ＨＰで著しく抑制されることが明らかとなった。このことは、Ｃｏ−ＨＰを始めとするＣＬＥＣ−２拮抗剤がリンパ管血管吻合部などの血管以外の部位においても、抗血栓薬として使用できることを示唆する。
【図１】
2017119417.tif 000046
【図２】
2017119417.tif 000047
【図３】
2017119417.tif 000048
【図４】
2017119417.tif 000049
【図５】
2017119417.tif 000050
【図６】
2017119417.tif 000051
【図７】
2017119417.tif 000052
【図８】
2017119417.tif 000053
【図９】
2017119417.tif 000054
【図１０】
2017119417.tif 000055
【図１１】
2017119417.tif 000056
【図１２】
2017119417.tif 000057
【図１３】
2017119417.tif 000058
【図１４】
2017119417.tif 000059
【図１５】
2017119417.tif 000060
【図１６】
2017119417.tif 000061
【図１７】
2017119417.tif 000062
【図１８】
2017119417.tif 000063
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
2017119417.tif 000070
【図２６】
2017119417.tif 000071
【図２７】
2017119417.tif 000072
【図２８】
2017119417.tif 000073
【図２９】
2017119417.tif 000074
【図３０】
2017119417.tif 000075
【図３１】
2017119417.tif 000076
【図３２】
2017119417.tif 000077
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月27日(2017.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
下記構造式Ｂ４で表される化合物からなることを特徴とするＣＬＥＣ−２拮抗剤。
〔構造式Ｂ４〕
【化１】
2017119417.tif 000078
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
請求項３に記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤からなることを特徴とする血小板凝集抑制剤。
【請求項６】
請求項３に記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤からなることを特徴とする抗血栓薬。
【請求項７】
請求項３に記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤からなることを特徴とする抗転移薬。
【請求項８】
請求項３に記載のＣＬＥＣ−２拮抗剤からなることを特徴とする抗関節炎薬。
【国際調査報告】
2017119417.tif 000079
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