(57)【要約】本発明は、界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物を含有する酸化剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物を含有する酸化剤。
【請求項２】
前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である請求項１に記載の酸化剤。
【請求項３】
前記超原子価ヨウ素化合物がデス・マーチン試薬、又は２−ヨードキシ安息香酸である請求項１又は２に記載の酸化剤。
【請求項４】
前記ミセルの粒子径が５０ｎｍ以下である請求項１〜３のいずれか一項に記載の酸化剤。
【請求項５】
界面活性剤によりミセル封入化された超原子価ヨウ素化合物の製造方法であって、
（ａ）前記超原子価ヨウ素化合物と、アセトニトリルと、界面活性剤と、溶媒とを混合し、４℃以上２５℃未満の温度で液色が透明から黄色を呈するまで振盪撹拌する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）後、さらに２５℃以上３０℃以下の温度で振盪撹拌する工程と、
を備え、
前記超原子価ヨウ素化合物はヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である製造方法。
【請求項６】
前記超原子価ヨウ素化合物の濃度が２０ｍｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下である請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の酸化剤と、
ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
を備える酸化反応試薬。
【請求項８】
請求項７に記載の酸化反応試薬を用いて、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法。
【請求項９】
標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化するためのキットであって、
ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物と、
界面活性剤と、
アセトニトリルと、
ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
を備えるキット。
【請求項１０】
二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出するためのキットであって、
ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物と、
界面活性剤と、
アセトニトリルと、
ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
バイサルファイトと、
前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーセットと、
を備えるキット。
【請求項１１】
二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する方法であって、
（Ａ）ヒドロキシメチルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料と、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の酸化剤と、
ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
を混合し、ヒドロキシメチルシトシンを酸化し、ホルミルシトシンに変換する工程と、
（Ｂ）前記変換されたホルミルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をバイサルファイトにより処理し、ホルミルシトシンをウラシルに変換する工程と、
（Ｃ）前記変換されたウラシルを有する二本鎖ポリヌクレオチドに、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーを添加し、増幅する工程と、
（Ｄ）酸化剤を添加せずに工程（Ａ）〜（Ｃ）を行った二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をコントロールとして比較し、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する工程と、
を備える検出方法。
【請求項１２】
界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンジアセテートを含有することを特徴とする酸化剤。
【請求項１３】
界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンジアセテートの製造方法であって、
（ａ）ヨードベンゼンジアセテートと、アセトニトリルと、界面活性剤と、溶媒とを混合し、４℃以上２５℃未満の温度で液色が透明から黄色を呈するまで振盪撹拌する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）後、さらに２５℃以上３０℃以下の温度で振盪撹拌する工程と、
を備える製造方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の酸化剤と、
ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
を備える酸化反応試薬。
【請求項１５】
請求項１４に記載の酸化反応試薬を用いて、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法。
【請求項１６】
標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化するためのキットであって、
ヨードベンゼンジアセテートと、
界面活性剤と、
アセトニトリルと、
ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
を備えるキット。
【請求項１７】
二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出するためのキットであって、
ヨードベンゼンジアセテートと、
界面活性剤と、
アセトニトリルと、
ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
バイサルファイトと、
前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーセットと、
を備えるキット。
【請求項１８】
二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する方法であって、
（Ａ）ヒドロキシメチルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料と、
請求項１２に記載の酸化剤と、
ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、
ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、
を混合し、ヒドロキシメチルシトシンを酸化し、ホルミルシトシンに変換する工程と、
（Ｂ）前記変換されたホルミルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をバイサルファイトにより処理し、ホルミルシトシンをウラシルに変換する工程と、
（Ｃ）前記変換されたウラシルを有する二本鎖ポリヌクレオチドに、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーを添加し、増幅する工程と、
（Ｄ）酸化剤を添加せずに工程（Ａ）〜（Ｃ）を行った二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をコントロールとして比較し、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する工程と、
を備える検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化剤とその使用に関する。
本願は、２０１５年７月３０日に、日本に出願された特願２０１５−１５０８４６に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシ基を酸化する方法は、有機化学の基本反応の一つであり、これまでに多くの酸化反応試薬が開発されてきた。中でも、有機溶媒中で定量的にヒドロキシ基を酸化する方法は、遷移金属酸化試薬、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ペルヨージナン化合物等の超原子価要素試薬などが開発されてきた。しかし、水系溶媒中では、強い酸又はアルカリ条件を必要とすることや、水分子から発生するヒドロキシラジカル種などによる副反応で、反応制御が難しい傾向がある。また、水溶性生体高分子であるタンパク質やＤＮＡは、電子豊富な官能基を有し、巨大分子ゆえの反応点近傍の立体障害など、基質としては最も難しい部類に属する。水系溶媒で多種類の官能基が混在する巨大分子のヒドロキシ基を温和な条件で酸化することは、今までできなかった標識や機能化など多くの可能性に道を開くことにつながる。例えば、エピゲノム分野で注目を浴びているヒドロキシメチルシトシンは、酸化及び還元的脱アミノ化反応でウラシルに変換できるので、温和且つ定量的酸化反応が開発できれば、一塩基レベルでその位置情報を取得し、幹細胞や再生医学研究への大きな寄与が期待できる。【０００３】
特許文献１には、過ルテニウム酸塩酸化剤を使用した、試料ヌクレオチド配列中の５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）などの修飾シトシン残基を同定する方法が開示されている。過ルテニウム酸塩酸化剤は、弱塩基性、室温の温和な条件で第１級アルコールをアルデヒドに、第２級アルコールをケトンに酸化できる。【０００４】
また、遷移金属酸化剤以外の温和な酸化方法として、ＴＥＭＰＯと呼ばれるニトロキシラジカルを用いた酸化方法がある。中でも、東北大学大学院薬学研究科の岩渕らによって開発されたＡＺＡＤＯＬ（登録商標）（２−ヒドロキシ−２−アザアダマンタン）は、ＴＥＭＰＯよりも高活性なＮ−ヒドロキシである（例えば、特許文献２参照）。ＡＺＡＤＯＬ（登録商標）は、ニトロキシラジカルであるＡＺＡＤＯ（２−アザアダマンタン−Ｎ−オキシル）よりも安定で且つＡＺＡＤＯよりも水への溶解性が高いという利点を有する。
一般的に、次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）又はヨードベンゼンジアセテート（（Ｄｉａｃｅｔｏｘｙｉｏｄｏ）ｂｅｎｚｅｎｅ；ＢＡＩＢ）を共酸化剤として用いる。水系溶媒中において、ＮａＯＣｌ又はＢＡＩＢによりＡＺＡＤＯＬ（登録商標）が酸化され、活性種であるオキソアンモニウム塩となることで、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を特異的に酸化することができる。ＮａＯＣｌは親水性であり、ＢＡＩＢは疎水性であり、物性は相反する。また、ＮａＯＣｌを共酸化剤として用いて、セルロースのヒドロキシ基を均一系で酸化した報告例がある（例えば、非特許文献１、２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１４−５２１３２９号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／１４５３２３号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｓｕｇｕｙｕｋｉ  Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，“Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ  Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｓ ｆｒｏｍ  ＴＥＭＰＯ−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ”，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ７，Ｎｕｍｂｅｒ６，ｐｐ．１６８７−１６９０，Ｊｕｎｅ  ２００６．
【非特許文献２】Ｔｓｕｇｕｙｕｋｉ  Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，“Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｎａｎｏｆｉｂｅｒｓ  Ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  ＴＥＭＰＯ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ”，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ８，Ｎｕｍｂｅｒ８，ｐｐ．２４８５−２４９１，Ａｐｒｉｌ  １０，  ２００７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載されている過ルテニウム酸塩酸化剤は、３価の酸化剤として働き、二酸化ルテニウムへと還元される。また、反応の自触媒性を有し、この自触媒性は反応で生成した不溶性の二酸化ルテニウム粒子の表面に過ルテニウム酸塩酸化剤が吸着して活性化されるためであると考えられている。しかしながら、水が存在すると二酸化ルテニウム粒子の表面に過ルテニウム酸塩酸化剤よりも優先的に吸着してしまうため、自触媒性を妨害するという課題がある。よって、水を吸着除去するために乾燥剤が必要であり、生体内環境を反映した水系溶媒中で酸化反応を行うことが難しい。【０００８】
また、ＡＺＡＤＯＬ（登録商標）とＮａＯＣｌ又はＢＡＩＢを使用した酸化反応では、共酸化剤としてＮａＯＣｌを用いる場合には、ＮａＯＣｌから発生するラジカルで、酸化反応に弱い基質は分解してしまうため、使用する基質が制限される。また、共酸化剤としてＢＡＩＢを用いる場合には、疎水性が高く、生体内環境を反映した水系溶媒中で酸化反応を行うことが難しい。【０００９】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物を含有する酸化剤。
［２］前記界面活性剤が、陰イオン界面活性剤である［１］に記載の酸化剤。
［３］前記超原子価ヨウ素化合物がデス・マーチン試薬、又は２−ヨードキシ安息香酸である［１］又は［２］に記載の酸化剤。
［４］前記ミセルの粒子径が５０ｎｍ以下である［１］〜［３］のいずれか一つに記載の酸化剤。【００１１】
［５］界面活性剤によりミセル封入化された超原子価ヨウ素化合物の製造方法であって、
（ａ）前記超原子価ヨウ素化合物と、アセトニトリルと、界面活性剤と、溶媒とを混合し、４℃以上２５℃未満の温度で液色が透明から黄色を呈するまで振盪撹拌する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）後、さらに２５℃以上３０℃以下の温度で振盪撹拌する工程と、
を備え、
前記超原子価ヨウ素化合物はヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である製造方法。
［６］前記超原子価ヨウ素化合物の濃度が２０ｍｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下である［５］に記載の製造方法。【００１２】
［７］［１］〜［４］のいずれか一つに記載の酸化剤と、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を備える酸化反応試薬。
［８］［７］に記載の酸化反応試薬を用いて、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法。【００１３】
［９］標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化するためのキットであって、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物と、界面活性剤と、アセトニトリルと、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を備えるキット。
［１０］二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出するためのキットであって、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物と、界面活性剤と、アセトニトリルと、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、バイサルファイトと、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーセットと、を備えるキット。【００１４】
［１１］二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する方法であって、
（Ａ）ヒドロキシメチルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料と、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の酸化剤と、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を混合し、ヒドロキシメチルシトシンを酸化し、ホルミルシトシンに変換する工程と、
（Ｂ）前記変換されたホルミルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をバイサルファイトにより処理し、ホルミルシトシンをウラシルに変換する工程と、
（Ｃ）前記変換されたウラシルを有する二本鎖ポリヌクレオチドに、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーを添加し、増幅する工程と、
（Ｄ）酸化剤を添加せずに工程（Ａ）〜（Ｃ）を行った二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をコントロールとして比較し、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する工程と、を備える検出方法。【００１５】
［１２］界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンジアセテートを含有することを特徴とする酸化剤。
［１３］界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンジアセテートの製造方法であって、
（ａ）ヨードベンゼンジアセテートと、アセトニトリルと、界面活性剤と、溶媒とを混合し、４℃以上２５℃未満の温度で液色が透明から黄色を呈するまで振盪撹拌する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）後、さらに２５℃以上３０℃以下の温度で振盪撹拌する工程と、を備える製造方法。【００１６】
［１４］［１２］に記載の酸化剤と、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を備える酸化反応試薬。
［１５］［１４］に記載の酸化反応試薬を用いて、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法。【００１７】
［１６］標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化するためのキットであって、ヨードベンゼンジアセテートと、界面活性剤と、アセトニトリルと、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を備えるキット。
［１７］二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出するためのキットであって、ヨードベンゼンジアセテートと、界面活性剤と、アセトニトリルと、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、バイサルファイトと、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーセットと、を備えるキット。【００１８】
［１８］二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する方法であって、
（Ａ）ヒドロキシメチルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料と、［１２］に記載の酸化剤と、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を混合し、ヒドロキシメチルシトシンを酸化し、ホルミルシトシンに変換する工程と、
（Ｂ）前記変換されたホルミルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をバイサルファイトにより処理し、ホルミルシトシンをウラシルに変換する工程と、
（Ｃ）前記変換されたウラシルを有する二本鎖ポリヌクレオチドに、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーを添加し、増幅する工程と、
（Ｄ）酸化剤を添加せずに工程（Ａ）〜（Ｃ）を行った二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をコントロールとして比較し、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する工程と、を備える検出方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化することができる。また、本発明によれば、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを容易に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本実施形態におけるミセル封入化されたＢＡＩＢを含有する酸化剤及びＡＺＡＤＯＬ（登録商標）を用いたヒドロキシメチルシトシンの酸化反応を示した模式図である。
【図２】本実施形態における二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンとメチルシトシンについて、酸化反応及びバイサルファイト処理前後での変化を比較した図である。
【図３】本実施形態における二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンとメチルシトシンについて、酸化反応及びバイサルファイト処理前後での変化を比較した図である。
【図４】実施例１における基質ＤＮＡのＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによる測定結果を示したグラフである。
【図５Ａ】実施例２における基質ＤＮＡ中のヒドロキシメチルシトシン及びメチルシトシンの位置と、酸化反応及びバイサルファイト処理による基質ＤＮＡ中のシトシン及びヒドロキシメチルシトシンからウラシルへの変換を示した模式図である。
【図５Ｂ】実施例２における基質ＤＮＡの酸化反応の時間の違いによるヒドロキシメチルシトシンからウラシルへ変換する割合の変化を示した模式図である。
【図６】実施例２における基質ＤＮＡの酸化反応の時間の違いによるメチル化（又はヒドロキシメチル化）シトシンの割合の変化を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。
なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
【００２２】
＜＜酸化剤＞＞
一実施形態において、本発明は、界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物を含有する酸化剤を提供する。
【００２３】
本実施形態によれば、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物を水系溶媒中で酸化剤として使用することができる。また、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物をミセル封入化することにより、基質と隔離することができ、基質分解などの副反応を防ぐことができる。
【００２４】
本明細書中において、「界面活性剤」とは、界面(物質の境の面）に作用して、性質を変化させる物質を意味し、構造としては、１つの分子の中に、水になじみやすい「親水性」と、油になじみやすい「親油性」の２つの部分を有する。本実施形態において、使用する界面活性剤としては、イオン性界面活性剤が好ましく、陰イオン界面活性剤（アニオン界面活性剤）がより好ましい。
本明細書中において、「陰イオン界面活性剤」とは、水に溶かした際にイオン化して、親水基（構造的に水になじむ部分）がマイナスに解離するものを意味し、構造としては、親水基としてカルボン酸、スルホン酸、又はリン酸構造等を有し、カルボン酸型（Ｒ−ＣＯＯ−Ｍ＋）、分枝鎖型又は直鎖型アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（Ｒ−Ｃ６Ｈ４−ＳＯ３−Ｎａ＋）、スルホン酸型（Ｒ−ＳＯ３−Ｎａ＋）、硫酸エステル型（Ｒ−Ｏ−ＳＯ３−Ｎａ＋）及びリン酸エステル型（Ｒ−Ｏ−ＰＯ（ＯＨ）ＯＭ＋）等である。具体的には、コール酸ナトリウム水和物、デオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム塩、タウロデオキシコール酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ドデシル硫酸リチウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ；ＳＤＳ）、ドデシルホスホコリン（ｄｏｄｅｃｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ；ＤＰＣ）等が挙げられる。この中でも、安価で、且つ、コンパクトなミセルを作製可能であるという観点から、ＳＤＳ又はＤＰＣが特に好ましい。
【００２５】
本明細書中において、「酸化」とは、水溶性生体高分子等の対象とする物質が電子を失う化学反応を意味し、具体的には、対象とする物質に酸素が化合する反応、又は、対象とする物質が水素を奪われる反応などが挙げられる。
本明細書においては、「酸化剤」とは、酸素原子を転移される化合物、又は、酸化還元反応で電子を得る物質を意味し、水溶性生体高分子等の対象とする物質中のヒドロキシル基をホルミル基又はケトン基に酸化するものである。
【００２６】
＜超原子価ヨウ素化合物＞
一般に、超原子価ヨウ素化合物とは原子価殻に８つ以上の電子を持つヨウ素を含有する化合物である。
本実施形態における超原子価ヨウ素化合物は、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性であり、下記一般式（１）で表される化合物（以下、「化合物（１）」と略記する場合がある。）、又は下記一般式（２）で表される化合物（以下、「化合物（２）」と略記する場合がある。）である。
【００２７】
【化１】
2017018408.tif 000002
【００２８】
［Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ２１、及びＲ２４で表される基］
一般式（１）及び一般式（２）中、Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ２１、及びＲ２４は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、アミノ基、ホルミル基、カルボキシル基、スルホ基、Ｃ１-１２アルキル基、Ｃ３-１２シクロアルキル基、（Ｃ１-１２アルキル）オキシ基（Ｃ１-１２アルコキシ基）、（Ｃ３-１２シクロアルキル）オキシ基、（Ｃ１-１２アルキル）チオ基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）チオ基、（Ｃ１-１２アルキル）アミノ基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）アミノ基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ基、ジ（Ｃ３−６シクロアルキル）アミノ基、Ｃ１-１２アルキルカルボニル基、Ｃ３-１２シクロアルキルカルボニル基、（Ｃ１-１２アルキル）オキシカルボニル基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）オキシカルボニル基、（Ｃ１-１２アルキル）チオカルボニル基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）チオカルボニル基、（Ｃ１-１２アルキル）アミノカルボニル基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）アミノカルボニル基、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル基、ジ（Ｃ３−６シクロアルキル）アミノカルボニル基、（Ｃ１-１２アルキル）カルボニルオキシ基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）カルボニルオキシ基、（Ｃ１-１２アルキル）カルボニルチオ基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）カルボニルチオ基、（Ｃ１-１２アルキル）カルボニルアミノ基、（Ｃ３-１２シクロアルキル）カルボニルアミノ基、ジ（Ｃ１-１２アルキルカルボニル）アミノ基、ジ（Ｃ３-１２シクロアルキルカルボニル）アミノ基、Ｃ１−６ハロアルキル基、Ｃ３−６ハロシクロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ３−６シクロアルケニル基、Ｃ２−６ハロアルケニル基、Ｃ３−６ハロシクロアルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ２−６ハロアルキニル基、Ｒａで置換されていてもよいベンジル基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルオキシ基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルチオ基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルアミノ基、Ｒａで置換されていてもよいジベンジルアミノ基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルチオカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルアミノカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいジベンジルアミノカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルカルボニルオキシ基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルカルボニルチオ基、Ｒａで置換されていてもよいベンジルカルボニルアミノ基、Ｒａで置換されていてもよいジ（ベンジルカルボニル）アミノ基、Ｒａで置換されていてもよいアリール基、Ｒａで置換されていてもよいアリールオキシ基、Ｒａで置換されていてもよいアリールチオ基、Ｒａで置換されていてもよいアリールアミノ基、Ｒａで置換されていてもよいジアリールアミノ基、Ｒａで置換されていてもよいアリールカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいアリールオキシカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいアリールチオカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいアリールアミノカルボニル基、Ｒａで置換されていてもよいジアリールアミノカルボニル基、Ｒａで置換されて��てもよいアリールカルボニルオキシ基、Ｒａで置換されていてもよいアリールカルボニルチオ基、Ｒａで置換されていてもよいアリールカルボニルアミノ基、Ｒａで置換されていてもよいジ（アリールカルボニル）アミノ基、又はＲａで置換されていてもよいベンゼンスルホニルオキシ基である。Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は互いに同一であってもよく、互いに異なっていてもよい。
【００２９】
ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられる。なお、本明細書における「ハロ」（ｈａｌｏ）の表記もこれらのハロゲン原子を表す。
【００３０】
本明細書におけるＣａ〜Ｃｂアルキルとは、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖の炭化水素基を表す。
Ｃａ〜Ｃｂアルキルとしては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、１−エチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、１，２−ジメチルプロピル基、２，２−ジメチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、１−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００３１】
本明細書におけるＣａ〜Ｃｂハロアルキルとは、炭素原子に結合した水素原子が、ハロゲン原子によって任意に置換された、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖の炭化水素基を表す。このとき、２個以上のハロゲン原子によって置換されている場合、それらのハロゲン原子は互いに同一でも、または互いに異なっていてもよい。
Ｃａ〜Ｃｂハロアルキルとしては、例えば、フルオロメチル基、クロロメチル基、ブロモメチル基、ヨードメチル基、ジフルオロメチル基、クロロフルオロメチル基、ジクロロメチル基、ブロモフルオロメチル基、トリフルオロメチル基、クロロジフルオロメチル基、ジクロロフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ブロモジフルオロメチル基、ブロモクロロフルオロメチル基、ジブロモフルオロメチル基、２−フルオロエチル基、２−クロロエチル基、２−ブロモエチル基、２，２−ジフルオロエチル基、２−クロロ−２−フルオロエチル基、２，２−ジクロロエチル基、２−ブロモ−２−フルオロエチル基、２，２，２−トリフルオロエチル基、２−クロロ−２,２−ジフルオロエチル基、２，２−ジクロロ−２−フルオロエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、２−ブロモ−２,２−ジフルオロエチル基、２−ブロモ−２−クロロ−２−フルオロエチル基、２−ブロモ−２，２−ジクロロエチル基、１，１，２，２−テトラフルオロエチル基、ペンタフルオロエチル基、１−クロロ−１,２，２，２−テトラフルオロエチル基、２−クロロ−１，１，２，２−テトラフルオロエチル基、１，２−ジクロロ−１，２，２−トリフルオロエチル基、２−ブロモ−１，１，２，２−テトラフルオロエチル基、２−フルオロプロピル基、２−クロロプロピル基、２−ブロモプロピル基、２−クロロ−２−フルオロプロピル基、２，３−ジクロロプロピル基、２−ブロモ−３−フルオロプロピル基、３−ブロモ−２−クロロプロピル基、２，３−ジブロモプロピル基、３，３，３−トリフルオロプロピル基、３−ブロモ−３，３−ジフルオロプロピル基、２，２，３，３−テトラフルオロプロピル基、２−クロロ−３，３，３−トリフルオロプロピル基、２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル基、１，１，２，３，３，３−ヘキサフルオロプロピル基、ヘプタフルオロプロピル基、２，３−ジクロロ−１，１，２，３，３−ペンタフルオロプロピル基、２−フルオロ−１−メチルエチル基、２−クロロ−１−メチルエチル基、２−ブロモ−１−メチルエチル基、２，２，２−トリフルオロ−１−（トリフルオロメチル）エチル基、１，２，２，２−テトラフルオロ−１−（トリフルオロメチル）エチル基、２，２，３，３，４，４−ヘキサフルオロブチル基、２，２，３，４，４，４−ヘキサフルオロブチル基、２，２，３，３，４，４，４−ヘプタフルオロブチル基、１，１，２，２，３，３，４，４−オクタフルオロブチル基、ノナフルオロブチル基、４−クロロ−１，１，２，２，３，３，４，４−オクタフルオロブチル基、２−フルオロ−２−メチルプロピル基、２−クロロ−１，１−ジメチルエチル基、２−ブロモ−１，１−ジメチルエチル基、５−クロロ−２，２，３，４，４，５，５−ヘプタフルオロペンチル基、トリデカフルオロヘキシル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００３２】
本明細書におけるＣａ〜Ｃｂシクロアルキルとは、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる環状の炭化水素基を表し、３員環から６員環までの単環または複合環構造を形成することが出来る。また、各々の環は指定の炭素原子数の範囲でアルキル基によって任意に置換されていてもよい。
Ｃａ〜Ｃｂシクロアルキルとしては、例えば、シクロプロピル基、１−メチルシクロプロピル基、２−メチルシクロプロピル基、２，２−ジメチルシクロプロピル基、２，２，３，３−テトラメチルシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、２−メチルシクロペンチル基、３−メチルシクロペンチル基、シクロヘキシル基、２−メチルシクロヘキシル基、３−メチルシクロヘキシル基、４−メチルシクロヘキシル基、ビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−イル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００３３】
本明細書におけるＣａ〜Ｃｂハロシクロアルキルとは、炭素原子に結合した水素原子が、ハロゲン原子によって任意に置換された、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる環状の炭化水素基を表し、３員環から６員環までの単環または複合環構造を形成することが出来る。また、各々の環は指定の炭素原子数の範囲でアルキル基によって任意に置換されていてもよく、ハロゲン原子による置換は環構造部分であっても、側鎖部分であっても、或いはそれらの両方であってもよく、さらに、２個以上のハロゲン原子によって置換されている場合、それらのハロゲン原子は互いに同一でも、または互いに異なっていてもよい。
Ｃａ〜Ｃｂハロシクロアルキルとしては、例えば、２，２−ジフルオロシクロプロピル基、２，２−ジクロロシクロプロピル基、２，２−ジブロモシクロプロピル基、２，２−ジフルオロ-1-メチルシクロプロピル基、２，２−ジクロロ−１−メチルシクロプロピル基、２，２−ジブロモ-1-メチルシクロプロピル基、２，２，３，３−テトラフルオロシクロブチル基、２−（トリフルオロメチル）シクロヘキシル基、３−（トリフルオロメチル）シクロヘキシル基、４−（トリフルオロメチル）シクロヘキシル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００３４】
本明細書におけるＣａ〜Ｃｂアルケニルとは、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖で、且つ、分子内に１個または２個以上の二重結合を有する不飽和炭化水素基を表す。
Ｃａ〜Ｃｂアルケニルとしては、例えば、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−メチルエテニル基、２−ブテニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、２−ペンテニル基、２−メチル−２−ブテニル基、３−メチル−２−ブテニル基、２−エチル−２−プロペニル基、１，１−ジメチル−２−プロペニル基、２−ヘキセニル基、２−メチル−２−ペンテニル基、２，４−ジメチル−２，６−ヘプタジエニル基、３，７−ジメチル−２，６−オクタジエニル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００３５】
本明細書におけるＣａ〜Ｃｂハロアルケニルとは、炭素原子に結合した水素原子が、ハロゲン原子によって任意に置換された、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖で、且つ、分子内に１個または２個以上の二重結合を有する不飽和炭化水素基を表す。このとき、２個以上のハロゲン原子によって置換されている場合、それらのハロゲン原子は互いに同一でも、または互いに異なっていてもよい。
Ｃａ〜Ｃｂハロアルケニルとしては、例えば、２，２−ジクロロビニル基、２−フルオロ−２−プロペニル基、２−クロロ−２−プロペニル基、３−クロロ−２−プロペニル基、２−ブロモ−２−プロペニル基、３−ブロモ−２−プロペニル基、３，３−ジフルオロ−２−プロペニル基、２，３−ジクロロ−２−プロペニル基、３，３−ジクロロ-2-プロペニル基、２，３−ジブロモ−２−プロペニル基、２，３，３−トリフルオロ−２−プロペニル基、２，３，３−トリクロロ−２−プロペニル基、１−（トリフルオロメチル）エテニル基、３−クロロ−２−ブテニル基、３−ブロモ−２−ブテニル基、４，４−ジフルオロ−３−ブテニル基、３，４，４−トリフルオロ−３−ブテニル基、３−クロロ−４，４，４−トリフルオロ−２−ブテニル基、３−ブロモ−２−メチル−２−プロペニル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００３６】
本明細書におけるＣａ〜Ｃｂアルキニルの表記は、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖で、且つ、分子内に１個または２個以上の三重結合を有する不飽和炭化水素基を表す。
Ｃａ〜Ｃｂアルキニルとしては、例えば、エチニル基、１−プロピニル基、２−プロピニル基、２−ブチニル基、１−メチル−２−プロピニル基、２−ペンチニル基、１−メチル−２−ブチニル基、１，１−ジメチル−２−プロピニル基、２−ヘキシニル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００３７】
本明細書におけるＣａ〜Ｃｂハロアルキニルとは、炭素原子に結合した水素原子が、ハロゲン原子によって任意に置換された、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖で、且つ、分子内に１個または２個以上の三重結合を有する不飽和炭化水素基を表す。このとき、２個以上のハロゲン原子によって置換されている場合、それらのハロゲン原子は互いに同一でも、または互いに異なっていても良い。
Ｃａ〜Ｃｂハロアルキニルとしては、例えば、２−クロロエチニル基、２−ブロモエチニル基、２−ヨードエチニル基、３−クロロ−２−プロピニル基、３−ブロモ−２−プロピニル基、３−ヨード−２−プロピニル基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００３８】
（Ｒａで表される基）
Ｒａは、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６ハロアルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルキルスルフェニルＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６ハロアルコキシ基、Ｃ１−６アルキルスルフェニル基、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ１−６ハロアルキルスルフェニル基、Ｃ１−６ハロアルキルスルフィニル基、Ｃ１−６ハロアルキルスルホニル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６ハロアルケニル基、Ｃ２−６アルケニルオキシ基、Ｃ２−６ハロアルケニルオキシ基、Ｃ２−６アルケニルスルフェニル基、Ｃ２−６アルケニルスルフィニル基、Ｃ２−６アルケニルスルホニル基、Ｃ２−６ハロアルケニルスルフェニル基、Ｃ２−６ハロアルケニルスルフィニル基、Ｃ２−６ハロアルケニルスルホニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ２−６ハロアルキニル基、Ｃ２−６アルキニルオキシ基、Ｃ２−６ハロアルキニルオキシ基、Ｃ２−６アルキニルスルフェニル基、Ｃ２−６アルキニルスルフィニル基、Ｃ２−６アルキニルスルホニル基、Ｃ２−６ハロアルキニルスルフェニル基、Ｃ２−６ハロアルキニルスルフィニル基、Ｃ２−６ハロアルキニルスルホニル基、−ＮＯ２、−ＣＮ、ホルミル基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＳＣＮ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、Ｃ１−６ハロアルキルカルボニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニルオキシ基、フェニル基、Ｃ１−６アルキルアミノ基、又はジＣ１−６アルキルアミノ基である。置換するＲａの数は１〜５個であり、Ｒａが２個以上の場合は、それぞれの置換基は同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００３９】
Ｒａで置換されていてもよいアリール基としては、例えば、フェニル基、ｏ−メチルフェニル基、ｍ−メチルフェニル基、ｐ−メチルフェニル基、ｏ−クロルフェニル基、ｍ−クロルフェニル基、ｐ−クロルフェニル基、ｏ−フルオロフェニル基、ｐ−フルオロフェニル基、ｏ−メトキシフェニル基、ｐ−メトキシフェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ｐ−シアノフェニル基、α−ナフチル基、β−ナフチル基、ｏ−ビフェニリル基、ｍ−ビフェニリル基、ｐ−ビフェニリル基、１−アントリル基、２−アントリル基、９−アントリル基、１−フェナントリル基、２−フェナントリル基、３−フェナントリル基、４−フェナントリル基、９−フェナントリル基、２−チエニル基、３−チエニル基、２−フリル基、３−フリル基、２−ピラニル基、３−ピラニル基、４−ピラニル基、２−ベンゾフラニル基、３−ベンゾフラニル基、４−ベンゾフラニル基、５−ベンゾフラニル基、６−ベンゾフラニル基、７−ベンゾフラニル基、１−イソベンゾフラニル基、４−イソベンゾフラニル基、５−イソベンゾフラニル基、２−ベンゾチエニル基、３−ベンゾチエニル基、４−ベンゾチエニル基、５−ベンゾチエニル基、６−ベンゾチエニル基、７−ベンゾチエニル基、１−イソベンゾチエニル基、４−イソベンゾチエニル基、５−イソベンゾチエニル基、２−クロメニル基、３−クロメニル基、４−クロメニル基、５−クロメニル基、６−クロメニル基、７−クロメニル基、８−クロメニル基、１−ピロリル基、２−ピロリル基、３−ピロリル基、１−イミダゾリル基、２−イミダゾリル基、４−イミダゾリル基、１−ピラゾリル基、３−ピラゾリル基、４−ピラゾリル基、２−チアゾリル基、４−チアゾリル基、５−チアゾリル基、３−イソチアゾリル基、４−イソチアゾリル基、５−イソチアゾリル基、２−オキサゾリル基、４−オキサゾリル基、５−オキサゾリル基、３−イソオキサゾリル基、４−イソオキサゾリル基、５−イソオキサゾリル基、２−ピリジル基、３−ピリジル基、４−ピリジル基、２−ピラジニル基、２−ピリミジニル基、４−ピリミジニル基、５−ピリミジニル基、３−ピリダジニル基、４−ピリダジニル基、１−インドリジニル基、２−インドリジニル基、３−インドリジニル基、５−インドリジニル基、６−インドリジニル基、７−インドリジニル基、８−インドリジニル基、１−イソインドリル基、４−イソインドリル基、５−イソインドリル基、１−インドリル基、２−インドリル基、３−インドリル基、４−インドリル基、５−インドリル基、６−インドリル基、７−インドリル基、１−インダゾリル基、２−インダゾリル基、３−インダゾリル基、４−インダゾリル基、５−インダゾリル基、６−インダゾリル基、７−インダゾリル基、１−プリニル基、２−プリニル基、３−プリニル基、６−プリニル基、７−プリニル基、８−プリニル基、２−キノリル基、３−キノリル基、４−キノリル基、５−キノリル基、６−キノリル基、７−キノリル基、８−キノリル基、１−イソキノリル基、３−イソキノリル基、４−イソキノリル基、５−イソキノリル基、６−イソキノリル基、７−イソキノリル基、８−イソキノリル基、１−フタラジニル基、５−フタラジニル基、６−フタラジニル基、２−ナフ��リジニル基、３−ナフチリジニル基、４−ナフチリジニル基、２−キノキサリニル基、５−キノキサリニル基、６−キノキサリニル基、２−キナゾリニル基、４−キナゾリニル基、５−キナゾリニル基、６−キナゾリニル基、７−キナゾリニル基、８−キナゾリニル基、３−シンノリニル基、４−シンノリニル基、５−シンノリニル基、６−シンノリニル基、７−シンノリニル基、８−シンノリニル基、２−プテニジニル基、４−プテニジニル基、６−プテニジニル基、７−プテニジニル基及び３−フラザニル基等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４０】
Ｒａで置換されていてもよいベンジル基としては、例えば、ベンジル基、ｏ−メチルベンジル基、ｍ−メチルベンジル基、ｐ−メチルベンジル基、ｏ−クロルベンジル基、ｍ−クロルベンジル基、ｐ−クロルベンジル基、ｏ−フルオロベンジル基、ｐ−フルオロベンジル基、ｏ−メトキシベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｐ−ニトロベンジル基、ｐ−シアノベンジル基等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４１】
Ｒａで置換されていてもよいベンゼンスルホニルオキシ基としては、例えば、ベンゼンスルホニルオキシ基、ｏ−トルエンスルホニルオキシ基、ｍ−トルエンスルホニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニル基、ｏ−クロルベンゼンスルホニルオキシ基、ｍ−クロルベンゼンスルホニルオキシ基、ｐ−クロルベンゼンスルホニルオキシ基、ｏ−フルオロベンゼンスルホニルオキシ基、ｐ−フルオロベンゼンスルホニルオキシ基、ｏ−メトキシベンゼンスルホニルオキシ基、ｐ−メトキシベンゼンスルホニルオキシ基、ｐ−ニトロベンゼンスルホニルオキシ基、ｐ−シアノベンゼンスルホニルオキシ基等が挙げられ、これらに限定されない。
【００４２】
中でも、Ｒ１１及びＲ２１は水素原子であることが好ましい。
また、中でも、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、及びＲ２４は、フッ素原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であることが好ましい。
Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６は、合成しやすいことから同一であることが好ましい。
【００４３】
［Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２２、及びＲ２３で表される基］
一般式（１）及び一般式（２）中、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ２２、及びＲ２３は、それぞれ独立に、Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６で例示された基と同様の基が挙げられる。本実施形態において、Ｒ１２及びＲ１３、又はＲ２２及びＲ２３は互いに結合して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、Ｃ１−１０アルキレン基、又はこれらの組み合わせを形成していてもよい。
【００４４】
本明細書におけるＣａ〜Ｃｂアルキレンとは、炭素原子数がａ〜ｂ個よりなる直鎖または分岐鎖で、且つ、分子内に１個または２個以上の二重結合を有する不飽和炭化水素基を表す。
Ｃａ〜Ｃｂアルキレンとしては、例えば、メチレン基、エチレン基、ｎ−プロピレン基、ｎ−ブチレン基、ｎ−ペンチレン基、ｎ−へキシレン基、ｎ−ヘプチレン基、ｎ−オクチレン基、ｎ−ノニレン基、ｎ−デシレン基等の直鎖状のアルキレン基、ジメチルメチレン基、２−メチルプロピレン基、２−メチルへキシレン基、テトラメチルエチレン基等の分岐鎖状のアルキレン基等が具体例として挙げられ、各々の指定の炭素原子数の範囲で選択される。
【００４５】
Ｒ１２及びＲ１３、又はＲ２２及びＲ２３が互いに結合している場合、中でも、−ＣＯＯ−、又はジメチルメチレンオキシ基を形成していることが好ましい。
Ｒ１２及びＲ１３、又はＲ２２及びＲ２３が結合していない場合、中でも、Ｒ１２及びＲ２２は、水素原子であることが好ましく、Ｒ１３及びＲ２３はフッ素原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であることが好ましい。
【００４６】
［Ｘ２１］
一般式（２）中、Ｘ２１は酸素原子、又は硫黄原子である。中でも、Ｘ２１は酸素原子であることが好ましい。
【００４７】
［ｎ１１、ｎ１２、ｎ１３、ｎ２１、ｎ２２、及びｎ２３］
一般式（１）中、ｎ１１はＲ１１の個数を示し、且つ１〜５のいずれかの整数である。ｎ１１が２以上のときＲ１１は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
一般式（１）中、ｎ１２はＲ１２の個数を示し、且つ０〜４のいずれかの整数である。ｎ１２が２以上のときＲ１２は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
一般式（２）中、ｎ２１はＲ２１の個数を示し、且つ１〜５のいずれかの整数である。ｎ２１が２以上のときＲ２１は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
一般式（２）中、ｎ２２はＲ２２の個数を示し、且つ０〜４のいずれかの整数である。ｎ２２が２以上のときＲ２２は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
ｎ１１とｎ１２との和は５であり、ｎ２１とｎ２２との和は５である。
ｎ１３及びｎ２３は０又は１である。
【００４８】
化合物（１）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（１−１）で表される化合物（以下、「化合物（１−１）」と略記することがある。）、又は下記一般式（１−２）で表される化合物（以下、「化合物（１−２））と略記することがある。）等が挙げられる。
なお、これら化合物は、好ましい化合物（１）の一例に過ぎず、好ましい化合物（１）はこれらに限定されない。
【００４９】
また、化合物（２）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（２−１）で表される化合物（以下、「化合物（２−１）」と略記することがある。）、又は下記一般式（２−２）で表される化合物（以下、「化合物（２−２））と略記することがある。）等が挙げられる。
なお、これら化合物は、好ましい化合物（２）の一例に過ぎず、好ましい化合物（２）はこれらに限定されない。
【００５０】
【化２】
2017018408.tif 000003
【００５１】
（式中、Ｒ１１、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ２３、Ｒ２４、ｎ１１、ｎ１３、及びｎ２３は、いずれも上記と同じである。また、Ｙ１１及びＹ２１は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、Ｃ１−１０アルキレン基、又はこれらの組み合わせである。）
【００５２】
［Ｙ１１及びＹ２１］
一般式（１−２）及び一般式（２−２）中、Ｙ１１及びＹ２１は−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、Ｃ１−１０アルキレン基、又はこれらの組み合わせである。中でも、Ｙ１１及びＹ２１は−ＣＯＯ−、又はジメチルメチレンオキシ基であることが好ましい。
【００５３】
化合物（１−１）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ１１が水素原子、又はＣ１-１２アルキル基であり、Ｒ１３がハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であり、Ｒ１４がハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であるもの等が挙げられる。
化合物（１−１）でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ１１が水素原子、又はメチル基であり、Ｒ１３がフッ素原子、ヒドロキシ基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、又はフェニル基であり、Ｒ１４がフッ素原子、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、又はｐ−トルエンスルホニルオキシ基であるもの等が挙げられる。
【００５４】
化合物（１−２）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６がハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であり、Ｙ１１が−ＣＯＯ−、又はジメチルメチレンオキシ基であるもの等が挙げられる。
化合物（１−２）でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６がメチルカルボニルオキシ基、又はトリフルオロメチルカルボニルオキシ基フェニル基であり、Ｙ１１が−ＣＯＯ−であるもの等が挙げられる。
【００５５】
化合物（２−１）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ２３及びＲ２３がハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であるもの等が挙げられる。
化合物（２−１）でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ２３及びＲ２３がフッ素原子、ヒドロキシ基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、又はフェニル基であるもの等が挙げられる。
【００５６】
化合物（２−２）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ２４がフッ素原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、メチルカルボニルオキシ基、トリフルオロメチルカルボニルオキシ基、ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、又はフェニル基であり、Ｙ１１が−ＣＯＯ−、又はジメチルメチレンオキシ基であるもの等が挙げられる。
化合物（２−２）でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ２４がヒドロキシ基、又はメチルカルボニルオキシ基であり、Ｙ１１が−ＣＯＯ−であるもの等が挙げられる。
【００５７】
化合物（１）のうち、化合物（１−１）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（１−１−１）で表される化合物（以下、「化合物（１−１−１）」と略記することがある）、下記一般式（１−１−２）で表される化合物（以下、「化合物（１−１−２）」と略記することがある）、下記一般式（１−１−３）で表される化合物（以下、「化合物（１−１−３）」と略記することがある）、下記一般式（１−１−４）で表される化合物（以下、「化合物（１−１−４）」と略記することがある）、及び下記一般式（１−１−５）で表される化合物（以下、「化合物（１−１−５）」と略記することがある）等が挙げられる。
化合物（１）のうち、化合物（１−２）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（１−２−１）で表される化合物（以下、「化合物（１−２−１）」と略記することがある）、及び下記一般式（１−２−２）で表される化合物（以下、「化合物（１−２−２）」と略記することがある）等が挙げられる。
なお、これら化合物は、好ましい化合物（１）の一例に過ぎず、好ましい化合物（１）はこれらに限定されない。
【００５８】
化合物（２）のうち、化合物（２−１）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（２−１−１）で表される化合物（以下、「化合物（２−１−１）」と略記することがある）等が挙げられる。
化合物（２）のうち、化合物（２−２）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（２−２−１）で表される化合物（以下、「化合物（２−２−１）」と略記することがある）等が挙げられる。
なお、これら化合物は、好ましい化合物（２）の一例に過ぎず、好ましい化合物（２）はこれらに限定されない。
【００５９】
【化３】
2017018408.tif 000004
【００６０】
【化４】
2017018408.tif 000005
【００６１】
式中、Ａｃとはアセチル基（メチルカルボニル基）であり、Ｔｓとはトシル基（ｐ−トルエンスルホニル基）である。
化合物（１−１−２）は、ヨードベンゼンジアセテート（Ｂｉｓ（ａｃｅｔｏｘｙ）ｉｏｄｏ  ｂｅｎｚｅｎｅ；ＢＡＩＢ）と呼ばれる化合物であり、化合物（１−２−２）はデス・マーチン試薬と呼ばれる化合物であり、化合物（２−１−１）はヨードシルベンゼンと呼ばれる化合物であり、化合物（２−２−１）は２−ヨードキシ安息香酸と呼ばれる化合物である。
【００６２】
＜超原子価ヨウ素化合物の製造方法＞
化合物（１）及び化合物（２）は公知化合物であるため、市販のものを用いてもよく、合成したものを用いてもよい。
化合物（１）及び化合物（２）は、例えば、ヨードベンゼンを基本構造として有する化合物を原料として公知の反応を用いて、製造できる。より具体的には以下のとおりである。
【００６３】
化合物（１）のうち、化合物（１−１−２）（ＢＡＩＢ）は、例えば、ヨードベンゼンと過酢酸と酢酸とを反応させて、化合物（１−１−２）（ＢＡＩＢ）を得る工程を備える製造方法により、製造できる。
また、化合物（１）のうち、化合物（１−２−２）（デス・マーチン試薬）は、ヨード安息香酸とペルオキシ一硫酸カリウムとを反応させて、２−ヨードキシ安息香酸を得る工程と、前記２−ヨードキシ安息香酸と無水酢酸とを、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸を用いて反応させて、化合物（１−２−２）（デス・マーチン試薬）を得る工程と、を備える製造方法により、製造できる。
【００６４】
化合物（２）のうち、化合物（２−１−１）（ヨードシルベンゼン）は、例えば、化合物（１−１−２）（ＢＡＩＢ）を加水分解し、化合物（２−１−１）（ヨードシルベンゼン）を得る工程を備える製造方法により、製造できる。
また、化合物（２）のうち、化合物（２−２−１）（２−ヨードキシ安息香酸）は、ヨード安息香酸とペルオキシ一硫酸カリウムとを反応させて、２−ヨードキシ安息香酸を得る工程を備える製造方法により、製造できる。
【００６５】
反応終了後は、公知の手法によって、必要に応じて後処理を行い、各化合物を取り出せばよい。すなわち、適宜必要に応じて、ろ過、洗浄、抽出、ｐＨ調整、脱水、濃縮等の後処理操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて行い、濃縮、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー等により、各化合物を取り出せばよい。また、取り出した各化合物は、さらに必要に応じて、結晶化、再沈殿、カラムクロマトグラフィー、抽出、溶媒による結晶の撹拌洗浄等の操作をいずれか単独で、又は２種以上組み合わせて１回以上行うことで、精製してもよい。
【００６６】
各化合物は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、質量分析法（ＭＳ）、赤外分光法（ＩＲ）等、公知の手法で構造を確認できる。
【００６７】
化合物（１）及び化合物（２）の製造方法は上記に限定されず、その他公知の方法を用いて、所望の構造を有する化合物（１）及び化合物（２）を製造すればよい。
【００６８】
＜ミセル＞
図１は、ミセル封入化されたＢＡＩＢを含有する酸化剤及びＡＺＡＤＯＬ（登録商標）を用いたヒドロキシメチルシトシンの酸化反応を示した模式図である。図１から、ＢＡＩＢ等の前記超原子価ヨウ素化合物（化合物（１））は、界面活性剤によりミセル封入化されることで、水溶性を有し、さらに、基質である二本鎖ポリヌクレオチドから隔離されて、基質の分解を抑制することができる。
【００６９】
また、本実施形態における化合物（１）又は化合物（２）が封入されたミセルの粒子径は、５０ｎｍ以下であり、１０ｎｍ以上４０ｎｍ以下であることが好ましく、１０ｎｍ以上３０ｎｍであることがより好ましい。
前記ミセルの粒子径が上記下限値以上であることにより、化合物（１）又は化合物（２）を封入することができる。また、前記ミセルの粒子径が上記上限値以下であることにより、基質である二本鎖ポリヌクレオチドは約３００〜４００ｂｐの場合、約１０万であって、分子量の差が大きいため、前記二本鎖ポリヌクレオチドは前記ミセル内に入り込めず、化合物（１）又は化合物（２）による酸化的攻撃を防ぐことができる。また、触媒の分子量が約２００（例えば、ＡＺＡＤＯＬ（登録商標）は分子量１５３）であるため、前記ミセル内に取り込まれて、再酸化されて、基質である二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンのヒドロキシ基をを選択的に酸化することができる。
前記ミセルの粒子径は、動的光散乱装置、又は透過型電子顕微鏡により測定することができる。
【００７０】
＜＜酸化剤の製造方法＞＞
一実施形態において、本発明は、界面活性剤によりミセル封入化された超原子価ヨウ素化合物の製造方法であって、
（ａ）前記超原子価ヨウ素化合物と、アセトニトリルと、界面活性剤と、溶媒とを混合し、４℃以上２５℃未満の温度で液色が透明から黄色を呈するまで振盪撹拌する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）後、さらに２５℃以上３０℃以下の温度で振盪撹拌する工程と、
を備え、
前記超原子価ヨウ素化合物はヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である製造方法を提供する。
【００７１】
本実施形態によれば、界面活性剤によりミセル封入化されたヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物（化合物（１）又は化合物（２））を容易に作製することができる。
【００７２】
以下に、酸化剤の製造方法について、詳細に説明する。
まず、反応容器において、アセトニトリルと界面活性剤溶液とを混合（好ましくは、体積比でアセトニトリル：界面活性剤溶液＝１：９）し、これに、化合物（１）又は化合物（２）を添加することが好ましい。好ましくは、４℃以上２５℃未満、より好ましくは、４℃以上１０℃以下の温度で液色が透明から黄色を呈するまで振盪撹拌する（工程（ａ））。この反応は、発熱反応であり、２５℃未満であれば、沸点の低いアセトニトリルが揮発することが防げるため、反応容器の周りに氷水等をはって、４℃以上２５℃未満に温度管理することが好ましい。
【００７３】
有機配位子であるアセトニトリルは、化合物（１）又は化合物（２）と錯体を形成し、化合物（１）又は化合物（２）のミセル可溶化に寄与すると考えられている。また、酸化剤中のアセトニトリルの濃度は、５〜１０％が好ましく、８〜１０％がより好ましく、１０％が特に好ましい。１０％以下の場合、界面活性剤により形成されたミセルが壊れることはない。
【００７４】
酸化剤中の界面活性剤の濃度は、２％以上５％以下であることが好ましい。２％以上の場合、化合物（１）又は化合物（２）をミセル封入することができ、５％以下の場合、コストに見合わった使用量とすることができる。
【００７５】
酸化剤中の化合物（１）又は化合物（２）の濃度は、２０ｍｇ／ｍＬ以上３０ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。２０ｍｇ／ｍＬ以上の場合、酸化力を担保することができ、また、３０ｍｇ／ｍＬ以下の場合、濃度に見合った酸化力を得ることができる。
【００７６】
界面活性剤溶液に用いる溶媒としては、反応を阻害せず、そのまま水溶性生体高分子の酸化反応に用いることができるものであれば特に限定はなく、例えば、水などが挙げられる。界面活性剤溶液の量が少なすぎると、反応中に沸点の低いアセトニトリルが揮発してしまうので、化合物（１）又は化合物（２）、アセトニトリル、及び界面活性剤の濃度を上述した濃度に保てる範囲内の量を使用すればよい。
【００７７】
振盪撹拌するための装置としては、特に限定はなく、超音波攪拌機、超音波分散機等が挙げられる。
【００７８】
液色が透明から黄色を呈することが、化合物（１）又は化合物（２）の酸化活性のインジケータであり、化合物（１）又は化合物（２）とアセトニトリルが錯体を形成したサインである。そのため、液色が透明から黄色を呈した後に、温度を上げて、２５℃以上３０℃以下の温度で振盪撹拌することで、化合物（１）又は化合物（２）を完全に溶解させ、化合物（１）又は化合物（２）のミセル可溶化を促進する（工程（ｂ））。
【００７９】
本実施形態において、製造された酸化剤は、凍結保存することも可能であるが、使用する直前に製造し、製造当日に使い切ることが好ましい。これは、経時的に酸化活性が失われてしまうためである。酸化活性の指標は、液色が黄色を呈していることであり、黄色が退色していれば、失活していると判断することができる。
【００８０】
＜＜酸化反応試薬＞＞
一実施形態において、本発明は、上述の酸化剤と、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を備える酸化反応試薬を提供する。
【００８１】
本実施形態によれば、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化可能な試薬を得ることができる。
【００８２】
本実施形態の酸化反応試薬は、上述の酸化剤を備える。使用可能な界面活性剤、酸化剤の製造方法等は上述のとおりである。
【００８３】
＜触媒＞
さらに、本実施形態の酸化反応試薬は、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒を備える。
【００８４】
本実施形態において、触媒である「ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物」は、下記一般式（３）で表されるＮ−ヒドロキシ化合物である。
【００８５】
【化５】
2017018408.tif 000006
【００８６】
［Ｒ３１で表される基］
一般式（３）中、Ｒ３１は、上述の［Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６で表される基］で例示された基と同様の基が挙げられる。中でも、Ｒ３１は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１-３アルキル基、又はＣ１-３アルコキシ基であることが好ましい。
【００８７】
［Ｒ３２及びＲ３３で表される基］
一般式（３）中、Ｒ３２及びＲ３３は、それぞれ独立に上述の［Ｒ１１、Ｒ１４、Ｒ１５、及びＲ１６で表される基］で例示された基と同様の基が挙げられる。また、Ｒ３２及びＲ３３は、互いに結合してメチレン基を形成していてもよい。
【００８８】
［ｎ３１］
一般式（３）中、ｎ３１はＲ３１の個数を示し、且つ１〜８のいずれかの整数である。ｎ３１が２以上のときＲ１１は互いに同一であってもよく異なっていてもよい。
【００８９】
化合物（３）で好ましいものとしては、例えば、下記一般式（３−１）で表される化合物（以下、「化合物（１−１）」と略記することがある。）等が挙げられる。
なお、これら化合物は、好ましい化合物（３）の一例に過ぎず、好ましい化合物（３）はこれらに限定されない。
【００９０】
【化６】
2017018408.tif 000007
【００９１】
（式中、Ｒ３１は、上記と同じである。Ｒ３１は、互いに同一でもあってもよく、異なっていてもよい。）
【００９２】
化合物（３−１）で好ましいものとしては、例えば、Ｒ３１が水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、Ｃ１-３アルキル基、又はＣ１-３アルコキシ基であるもの等が挙げられる。
化合物（３−１）でより好ましいものとしては、例えば、Ｒ３１が水素原子、フッ素原子、ヒドロキシ基、メチル基、又はメトキシ基であるもの等が挙げられる。
【００９３】
化合物（３）のうち、化合物（３−１）で好ましいものとしては、例えば、Ｎ−ヒドロキシ−１−フルオロ−２−アザアダマンタン （１−Ｆ−ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−フルオロ−２−アザアダマンタン （５−Ｆ−ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−フルオロ−１−メチル−２−アザアダマンタン （５−Ｆ−１−Ｍｅ−ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシ−５，７−ジフルオロ−１−メチル−２−アザアダマンタン （５，７−Ｆ２−１−Ｍｅ−ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシ−１−メチル−２−アザアダマンタン（１−Ｍｅ−ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシ−１−メチル−５-ヒドロキシ−２−アザアダマンタン （１−Ｍｅ−５−ＯＨ−ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−メトキシ−１−メチル−２−アザアダマンタン （５−ＭｅＯ−１−Ｍｅ−ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ヒドロキシ−２−アザアダマンタン（５−ＯＨ−ＡＺＡＤＯＨ）、Ｎ−ヒドロキシ−９−アザビシクロ［３．３．１］ノナン （ＡＢＮＯＨ）、２−ヒドロキシ−２−アザアダマンタン（ＡＺＡＤＯＬ（登録商標））等が挙げられる。
なお、これら化合物は、好ましい化合物（３）の一例に過ぎず、好ましい化合物（３）はこれらに限定されない。
中でも、化合物（３）は、ＡＺＡＤＯＬ（登録商標）であることが好ましい。
【００９４】
［触媒の製造方法］
本明細書において、触媒として用いる化合物（３）は、「Ｙ．Ｉｗａｂｕｃｈｉ，  Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２０１３，６１，１１９７．」、及び国際公開第２００６／００１３８７号に記載の方法で製造することができる。また、ＡＺＡＤＯＬ（登録商標）については、合成せずに市販品を用いることもできる。
【００９５】
［触媒の濃度］
反応試薬中において、触媒は、１ｍｇ／ｍＬ以上２ｍｇ／ｍＬ以下の濃度であることが好ましく、２ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。
【００９６】
［触媒の基質］
本実施形態では、各種のヒドロキシ基を有する化合物を基質として、触媒として化合物（３）及び上述の酸化剤の存在下、温和な条件で酸化反応を行うことができる。
また、従来、ＴＥＭＰＯなどの触媒では酸化反応を行うことが難しかった、立体的に込み合った構造のヒドロキシ基を有する化合物についても酸化反応を行うことができる。
本実施形態において、酸化されるアルコール化合物としては、特に制限されるものではなく、各種のヒドロキシ基を有する化合物が挙げられる。これらヒドロキシ基を有する化合物としては、中でも、タンパク質又は核酸等が好ましい。
【００９７】
＜溶媒＞
さらに、本実施形態の酸化反応試薬は、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒を備える。ｐＨ６．０以上７．０未満である場合、酸化反応をスムーズに進めることができる。ｐＨ６．０以上７．０未満が好ましく、ｐＨ６．６以上６．８以下がさらに好ましい。溶媒としては、上記ｐＨの範囲内に調製されたものであれば、特に限定はない。例えば、リン酸緩衝液が挙げられる。反応試薬中での濃度が、０．８Ｍ程度であることが好ましい。
【００９８】
反応試薬中のｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒とミセル封入化された化合物（１）又は化合物（２）と触媒との体積比は、２：２：１であることが好ましい。溶媒がこの割合よりも増えると、酸化反応性が下がるためである。
【００９９】
＜＜標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法＞＞
一実施形態において、本発明は、上述の酸化反応試薬を用いて、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法を提供する。
【０１００】
本実施形態によれば、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化することができる。
【０１０１】
本発明及び本明細書において、「水溶性生体高分子」とは、水系溶媒中に溶解可能な生体内に存在する高分子の有機化合物を意味し、例えば、タンパク質や核酸が挙げられる。
【０１０２】
図１は、ミセル封入化されたＢＡＩＢを含有する酸化剤及びＡＺＡＤＯＬ（登録商標）を用いたヒドロキシメチルシトシンの酸化反応を示した模式図である。上述の酸化反応試薬を用いて、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法について、図１を用いながら、以下に詳細を説明する。
【０１０３】
まず、標的である水溶性生体高分子を含む溶液と、上述の酸化反応試薬を混合し、静置する。本実施形態における酸化反応は、温和な条件で実施できることが特徴であり、反応温度としては、４℃以上４０℃以下で行うことができ、４℃以上２５℃以下で行うことが好ましい。４℃以上である場合、試薬や緩衝液の塩の沈殿を防ぐことができ、２５℃以下である場合、反応速度を保ちながら基質分解などの副反応を防ぐことができる。また、反応時間は、標的である水溶性生体高分子の大きさや量によって変化するが、３０分以上４時間以内が好ましい。
【０１０４】
標的である水溶性生体高分子と酸化反応試薬との混合液中において、ミセル封入化されたＢＡＩＢは、ＡＺＡＤＯＬ（登録商標）のヒドロキシ基を選択的に酸化する。酸化されたＡＺＡＤＯＬ（登録商標）は、ＡＺＡＤＯを経て活性種であるオキソアンモニウム塩となる。このオキソアンモニウム塩は、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する。
【０１０５】
よって、標的である水溶性生体高分子を含む溶液と、上述の酸化反応試薬を混合し、温和な条件で反応させることにより、ヒドロキシ基がホルミル基又はケトン基に酸化された標的である水溶性生体高分子を得ることができる。
【０１０６】
＜＜標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化するためのキット＞＞
一実施形態において、本発明は、標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化するためのキットであって、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物（化合物（１）又は化合物（２））と、界面活性剤と、アセトニトリルと、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を備えるキットを提供する。
【０１０７】
本実施形態のキットによれば、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化することができる。
【０１０８】
本実施形態において、化合物（１）又は化合物（２）、及び触媒は粉末状であることが好ましい。上述の通り、ミセル封入化された化合物（１）又は化合物（２）を含有する酸化剤は、使用直前に製造することが好ましい。
また、触媒については、水に溶けにくい性質を有しているため、アセトニトリルと触媒とを体積比１：１で混合し、溶媒に溶解するとよい。触媒は、５ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で調製し、反応溶液中において、終濃度が１ｍｇ／ｍＬ以上２ｍｇ／ｍＬ以下となるように混合すればよい。
【０１０９】
界面活性剤は、５％程度の濃度の液体であることが好ましい。ミセル封入化された化合物（１）又は化合物（２）の製造時に、終濃度が２％以上５％以下となるように使用すればよい。
【０１１０】
アセトニトリルは、１００％程度の濃度の液体であることが好ましい。ミセル封入化されたＢＡＩＢの製造時に、終濃度が１０％程度となるように使用すればよい。
【０１１１】
ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒は、２Ｍ程度の濃度の液体であることが好ましい。反応溶液中において、０．８Ｍ程度の濃度となるように使用すればよい。
【０１１２】
標的である水溶性生体高分子については、上述の通り、例えば、タンパク質や核酸が挙げられ、ＤＮＡを使用する場合には、反応溶液中において、５ｐＭ以上１０ｐＭ以下の濃度となるように調製することが好ましい。
【０１１３】
＜＜二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出するためのキット＞＞
一実施形態において、本発明は、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出するためのキットであって、ヨードベンゼンを基本構造に有し、疎水性である超原子価ヨウ素化合物（化合物（１）又は化合物（２））と、界面活性剤と、アセトニトリルと、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、バイサルファイトと、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーセットと、を備えるキットを提供する。
【０１１４】
本実施形態のキットによれば、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを容易に検出することができる。
【０１１５】
本実施形態において、化合物（１）又は化合物（２）、界面活性剤、アセトニトリル、触媒、及び溶媒については、上述のとおりである。
【０１１６】
本明細書において、「バイサルファイト」とは、亜硫酸水素塩を意味し、二本鎖ポリヌクレオチド中のシトシン塩基をウラシル塩基に置換するためのものである。
図２は、バイサルファイトによりシトシン塩基がウラシル塩基に変換する反応工程を示した図である。また、ヒドロキシメチルシトシンについても、ヒドロキシ基がホルミル基に酸化されることで、バイサルファイトによりウラシルに変換することが知られている。
【０１１７】
本実施形態のキットは、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーセットを備える。前記プライマーセットの塩基配列については、標的となる二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域により、適宜設計することができる。
【０１１８】
本実施形態のキットは、１つまたは複数の対照細胞及び核酸のうち少なくともいずれかを含んでいてもよい。例えば、対照核酸には、ある動物の本質的にすべての細胞においてアクセス可能である（例えば、ハウスキーピング遺伝子配列またはそのプロモーター）か、またはある動物のほとんどの細胞においてアクセス不能であるかのいずれかである遺伝子配列を含むものが含まれる。
【０１１９】
本実施形態のキットは、そのような遺伝子配列を増幅するためのプライマーの１つまたは複数のセットを（遺伝子配列または細胞がキットに実際に含まれるか否かにかかわらず）含んでいてもよい。
本実施形態のキットは、ＤＮＡ修飾剤、細胞透過処理剤及び細胞崩壊剤のうち少なくともいずれか、並びに対照ＤＮＡ領域を増幅するための１つまたは複数のプライマーセットを含んでいてもよい。
例えば、前記ＤＮＡ修飾剤が制限酵素である場合において、１つのＤＮＡ領域当たりに、制限酵素の潜在的な切断部位を少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つなど）含むＤＮＡ領域の一部分を増幅するための（例えば、修飾されていないコピーの数を計算するために有用な）第１のプライマーセット、及び、潜在的な切断部位を含まないＤＮＡ領域の一部分を増幅するための（例えば、コピーの総数を計算するために有用な）少なくとも第２のプライマーセットからなる少なくとも２つのプライマーセットを含めることができる。
【０１２０】
本実施形態のキットは、以下のもののうち１つまたは複数を含んでいてもよい。
（ｉ）細胞膜の透過処理剤または崩壊剤；
（ｉｉ）制限酵素、ＤＮアーゼ又は他のＤＮＡ修飾剤；
（ｉｉｉ）修飾剤による更なる修飾を防止することのできる「停止」用溶液；
（ｉｖ）核酸の抽出及び精製のうち少なくともいずれかを行うための材料（例えば、ゲノムＤＮＡの精製のため、及び「停止」用溶液の成分などの非ＤＮＡ成分の除去のうち少なくともいずれかを行うためのスピンカラム）；
（ｖｉ）ＤＮＡのＰＣＲ又はｑＰＣＲ増幅のための試薬、（さらに、任意で、テンプレート及びポリメラーゼのうち少なくともいずれかの他にＰＣＲ又はｑＰＣＲのために必要なすべての成分を含む１つの混合物）
【０１２１】
＜＜二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する方法＞＞
一実施形態において、本発明は、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する方法であって、
（Ａ）ヒドロキシメチルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料と、上述の酸化剤と、ヘテロ原子として窒素を１つ有し、該窒素にヒドロキシ基が結合している脂環式複素環を有する化合物である触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を混合し、ヒドロキシメチルシトシンを酸化し、ホルミルシトシンに変換する工程と、
（Ｂ）前記変換されたホルミルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をバイサルファイトにより処理し、ホルミルシトシンをウラシルに変換する工程と、
（Ｃ）前記変換されたウラシルを有する二本鎖ポリヌクレオチドに、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーを添加し、増幅する工程と、
（Ｄ）酸化剤を添加せずに工程（Ａ）〜（Ｃ）を行った二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をコントロールとして比較し、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出する工程と、を備える検出方法を提供する。
【０１２２】
本実施形態によれば、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを容易に検出することができる。
【０１２３】
本実施形態の検出方法について、以下に詳細を説明する。
まず、ヒドロキシメチルシトシンを有する二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料と、ミセル封入化されたＢＡＩＢを含有する酸化剤と、触媒と、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒と、を混合する（工程Ａ）。上述の＜酸化反応試薬＞と同様に、ｐＨ６．０以上７．０未満である溶媒とミセル封入化された化合物（１）又は化合物（２）と触媒との体積比は、２：２：１であることが好ましい。
また、上述の＜標的である水溶性生体高分子のヒドロキシ基を選択的に酸化する方法＞と同様に、室温で行うことが好ましい。また、反応時間についても、標的である水溶性生体高分子の大きさや量によって変化するが、３０分以上４時間以内が好ましい。
図３は、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンとメチルシトシンについて、酸化反応及びバイサルファイト処理前後での変化を比較した図である。
反応溶液中において、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシン（２）は酸化されて、ホルミルシトシン（３）に変換する（工程Ａ）。一方、メチルシトシン（１）は、酸化反応及びバイサルファイト処理後においても変化せずメチルシトシンのままである。
ホルミルシトシン（３）に変換後、酸化剤を除去する工程を行うことが好ましい。具体的には、有機溶剤などにより二本鎖ポリヌクレオチドを抽出し、スピンカラムなどを用いて精製する方法が挙げられる。
【０１２４】
次に、反応溶液にバイサルファイト処理を行う。反応条件は、８０℃以上１００℃未満の温度で３０分以上１時間以下行うことが好ましい。反応溶液中において、二本鎖ポリヌクレオチド中のホルミルシトシン（３）は、スルホン化され、さらに、加水的な脱アミノ反応により、スルホン化ウラシルに変換する。続いて、アルカリ処理でスルホン基を除去され、ウラシル（４）に変換する（工程Ｂ）。
【０１２５】
続いて、バイサルファイト処理を行った二本鎖ポリヌクレオチドに、前記二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを含む領域を増幅するためのフォワード及びリバースプライマーを添加し、ＰＣＲ又はｑＰＣＲ等により増幅する（工程Ｃ）。
ＰＣＲ又はｑＰＣＲの条件については、二本鎖ポリヌクレオチドの長さや配列特性に応じて、公知の方法に従って当業者が決定できる。
【０１２６】
続いて、酸化剤を添加せずに工程（Ａ）〜（Ｃ）を行った二本鎖ポリヌクレオチドを含有する試料をコントロールとして、サンガーシークエンス法により、塩基配列を比較する（工程Ｄ）。コントロールと比較することにより、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを検出することができる。
【０１２７】
ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）は遺伝子発現のｏｎ又はｏｆｆに関与すると考えられており、その存在量は細胞の種類に拠り大きく異なる。また、最も多量に存在するのは中枢神経系であることが知られている。また、マウス海馬及び小脳では５ｈｍＣ含有量は加齢とともに増加することが知られている。よって、５ｈｍＣの検出は、エピジェネティクス分野において注目されている。
本明細書中において、「エピジェネティクス」とは、ＤＮＡの配列変化によらない遺伝子発現を制御及び伝達するシステム、並びにその学術分野を意味し、細胞分裂を通して娘細胞に受け継がれるという遺伝的な特徴を持ちながらも、ＤＮＡ塩基配列の変化（突然変異）とは独立した機構である。このような制御は、化学的に安定した修飾である一方、食事、大気汚染、喫煙、酸化ストレスへの暴露などの環境要因によって動的に変化する。つまり、エピジェネティクスは、遺伝子と環境要因の架け橋となる機構であると考えられる。
したがって、５ｈｍＣを検出することにより、病気の発症の有無や症状の程度に差、又は、幹細胞及び再生医学研究などへの大きな寄与が期待できる。
【０１２８】
以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の構成等も含まれる。
【実施例】
【０１２９】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１３０】
［実施例１］
１−１．酸化剤の調製
５％ＳＤＳ水溶液（０．９ｍＬ）と、１００％アセトニトリル（０．１ｍＬ）の混合溶液に粉末ＢＡＩＢ（Ｗａｋｏ社製）（２０ｍｇ）を添加し、氷を浮かべた超音波攪拌機にて、１０分前後振盪撹拌した。液色が黄色を呈したら、超音波攪拌機内の氷を除去し、室温でさらに振盪撹拌して完全溶解させ、ミセル封入化されたＢＡＩＢを含む酸化剤を得た。酸化剤中には、４．５％ＳＤＳ、１０％アセトニトリル、２０ｍｇ／ｍＬ  ＢＡＩＢが含有していた。
また、ＢＡＩＢが封入されたミセルを、動的光散乱装置を用いて測定したところ、粒子径が約１８ｎｍであり、透過型電子顕微鏡を用いて測定したところ、粒子径が約２６ｎｍであった。【０１３１】
１−２．触媒の調製
１００％アセトニトリル（０．２５ｍＬ）、水（０．２５ｍＬ）の混合溶液に、粉末ＡＺＡＤＯＬ（Ｗａｋｏ社製）（５ｍｇ）を添加し、超音波攪拌機にて、１０分前後振盪撹拌し、触媒溶液を得た。触媒溶液中には、５０％アセトニトリル、１０ｍｇ／ｍＬ  ＡＺＡＤＯＬが含有していた。【０１３２】
１−３．基質ＤＮＡ中のヒドロキシルメチルシトシンの酸化反応
基質として使用した１０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ（ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ社製）の塩基配列を表１に示した。基質ＤＮＡはそれぞれ、緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した。【０１３３】
【表１】
2017018408.tif 000008
【０１３４】
各基質ＤＮＡ（０．６ｎｍｏｌ）が溶解された試料溶液（１μＬ）、２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）（２４μＬ）、２０ｍｇ／ｍＬ  ＢＡＩＢ（２４μＬ）及び１０ｍｇ／ｍＬ  ＡＺＡＤＯＬ（１２μＬ）をＰＣＲ用チューブに添加し、混合した後、氷により低温に保持した槽において、３０分静置して、酸化反応を行った。酸化反応を停止するために、アニリン（１２０μＬ）を添加し、ボルテックスにかけた。卓上遠心分離機にて遠心分離後、上層にある褐色の有機層を除去し、トルエン（１２０μＬ）を添加して、残留酸化剤を除去する工程を３回繰り返した。また、コントロールとして、酸化剤を加えないものも用意した。【０１３５】
１−４．バイサルファイト処理
抽出された基質ＤＮＡを含有する溶液に１０Ｍ  バイサルファイト（１２０μＬ）を添加し、９０℃で１時間保持した。続いて、ＯＤＳ−ＨＰＬＣによりＤＮＡを精製した。０．２Ｍ  ＮａＯＨ（１０μＬ）を添加し、３７℃で３０分間静置して、脱スルホン酸処理を行った。得られた基質ＤＮＡを含有する溶液をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ（ＪＥＯＬ社製  ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＰ）を用いて分析した。結果を図４に示した。【０１３６】
図４において、Ａ，Ｃ，Ｅは酸化反応を行ったものであり、５’末端が酸化され、カルボキシル基に変換している。また、Ｂ，Ｄ，Ｆはコントロールとして酸化反応を行わなかったものである。
図４のＡとＢを比較すると、酸化反応を行ったものでは、５’末端から数えて６番目に位置するヒドロキシメチルシトシンがウラシルに変換したが、コントロールでは、メチルスルホン酸シトシンであり、ウラシルに変換していなかった。
また、図４のＡとＣを比較すると、マススペクトルのピーク値は同一であった。
さらに、図４のＥとＦから、メチルシトシンについては、酸化反応による影響は見られなかった。【０１３７】
以上から、ミセル封入化されたＢＡＩＢ及びＡＺＡＤＯＬを用いることで、ヒドロキシメチルシトシンが酸化されることが確かめられた。また、酸化反応を行ったものと行わなかったものを比較することで、ヒドロキシメチルシトシンの位置を同定できることが明らかとなった。【０１３８】
［実施例２］
２−１．酸化剤の調製
実施例１の１−１．と同様の方法により調製した。
２−２．触媒の調製
実施例１の１−２．と同様の方法により調製した。【０１３９】
２−３．基質ＤＮＡ中のヒドロキシルメチルシトシンの酸化反応
基質として１００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ（ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ社製）を使用した。塩基配列は、センス鎖を配列番号５に、アンチセンス鎖を配列番号６示した。図５Ａは、基質である１００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ中のヒドロキシメチルシトシン及びメチルシトシンの位置と、酸化反応及びバイサルファイト処理による基質ＤＮＡ中のシトシン及びヒドロキシメチルシトシンからウラシルへの変換を示した模式図である。
基質ＤＮＡ（０．１ｎｍｏｌ）が溶解された試料溶液（０．５μＬ）、２Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）（２０μＬ）、２０ｍｇ／ｍＬ  ＢＡＩＢ（２０μＬ）及び１０ｍｇ／ｍＬ  ＡＺＡＤＯＬ（１０μＬ）をＰＣＲ用チューブに添加し、混合した後、氷により低温に保持した槽において、３０分、１時間、４時間、１２時間と時間をふって、酸化反応を行った。酸化反応を停止するために、アニリン（１００μＬ）を添加し、ボルテックスにかけた。卓上遠心分離機にて遠心分離後、上層にある褐色の有機層を除去し、トルエン（１００μＬ）を添加して、基質ＤＮＡを抽出する工程を３回繰り返した。また、コントロールとして、酸化反応を行わないものも用意した。【０１４０】
２−４．バイサルファイト処理
抽出された基質ＤＮＡを含有する溶液に１０Ｍ  バイサルファイト（１００μＬ）を添加し、９０℃で１時間保持した。続いて、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＺＹＭＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて、精製した。【０１４１】
２−５．基質ＤＮＡの増幅
精製された基質ＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。酵素としては、Ｔａｑポリメラーゼを使用し、プライマーの塩基配列は表２を示した。【０１４２】
【表２】
2017018408.tif 000009
【０１４３】
増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、精製した。【０１４４】
２−６．サンガーシークエンス法によるヒドロキシルメチルシトシンの検出
精製されたＰＣＲ産物をベクターに挿入し、サンガーシークエンス法により、塩基配列を同定した。結果を図５Ｂ及び図６に示した。【０１４５】
図５Ｂ及び図６から、ヒドロキシメチルシトシンがウラシルへ変換した割合は、酸化反応時間に比例していることが明らかとなった。また、２つのヒドロキシメチルシトシンを含む１００ｂｐの基質ＤＮＡでは、４時間以上酸化反応を行うことで、基質ＤＮＡ中の約８６％のヒドロキシメチルシトシンがウラシルへ変換されることが明らかとなった。【０１４６】
以上の結果から、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化できることが明らかとなった。また、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを容易に検出できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明によれば、生体内環境を反映した水系溶媒中において、温和な条件で水溶性生体高分子中のヒドロキシ基を選択的に酸化することができる。また、本発明によれば、二本鎖ポリヌクレオチド中のヒドロキシメチルシトシンを容易に検出することができる。
【符号の説明】
【０１４８】
１…メチルシトシン（５ｍＣ）、２…ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、３…ホルミルシトシン（５ｆＣ）、４…ウラシル
【図１】
2017018408.tif 000010
【図２】
2017018408.tif 000011
【図３】
2017018408.tif 000012
【図４】
2017018408.tif 000013
【図５Ａ】
2017018408.tif 000014
【図５Ｂ】
2017018408.tif 000015
【図６】
2017018408.tif 000016
【配列表】
2017018408000001.app
【国際調査報告】
2017018408.tif 000017
2017018408.tif 000018
2017018408.tif 000019
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