(57)【要約】  本発明の課題は、繊維性軟組織浸潤を抑制し、良好な軟骨再生をもたらす軟骨再生材料、並びに上記軟骨再生材料の製造方法を提供することである。本発明によれば、生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含む、軟骨再生材料であって、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に上記軟骨基質が存在する、上記軟骨再生材料が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含む、軟骨再生材料であって、前記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、前記多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に前記軟骨基質が存在する、前記軟骨再生材料。
【請求項２】
前記多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの２０％以上の領域に前記軟骨基質が存在する、請求項１に記載の軟骨再生材料。
【請求項３】
前記多孔質体の生体親和性高分子が、リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドである、請求項１又は２に記載の軟骨再生材料。
【請求項４】
前記多孔質体の生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンである、請求項１から３の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項５】
前記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、下記式１で示される、請求項４に記載の軟骨再生材料。
式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式１中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。
【請求項６】
前記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、請求項４又は５に記載の軟骨再生材料。
【請求項７】
前記多孔質体が、生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥することにより得られる、請求項１から６の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項８】
前記生体親和性高分子フィルムが、前記多孔質体の移植面の一部又は全部を移植部位から隔離するためのフィルムである、請求項１から７の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項９】
前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンである、請求項１から８の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項１０】
前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子が、下記式１で示される、請求項９に記載の軟骨再生材料。
式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式１中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。
【請求項１１】
前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子が、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、請求項９又は１０に記載の軟骨再生材料。
【請求項１２】
前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の架橋度が４〜１５である、請求項１から１１の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項１３】
前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の架橋度が４〜８である、請求項１から１２の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項１４】
前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の下記式４で示される分解速度が０．１〜２０質量％／時間である、請求項１から１３の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
式４：  分解速度 = （（Ｗ−Ｗｅ）―ｗｏ）／ｗｏ／Ｔ
式４において、Ｗは、コラゲナーゼによる分解及び凍結乾燥後に記録した試料の入ったチューブの質量を示し、Ｗｅは予め記録しておいたチューブの空質量を示し、ｗｏは試料の実際の添加量を示し、Ｔはコラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示す。
【請求項１５】
前記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の下記式４で示される分解速度が５〜１０質量％／時間である、請求項１から１４の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
式４：  分解速度 = （（Ｗ−Ｗｅ）―ｗｏ）／ｗｏ／Ｔ
式４において、Ｗは、コラゲナーゼによる分解及び凍結乾燥後に記録した試料の入ったチューブの質量を示し、Ｗｅは予め記録しておいたチューブの空質量を示し、ｗｏは試料の実際の添加量を示し、Ｔはコラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示す。
【請求項１６】
前記軟骨細胞が、関節軟骨由来軟骨細胞、耳介軟骨由来軟骨細胞、鼻軟骨由来軟骨細胞、iPS細胞由来軟骨細胞、ES細胞由来軟骨細胞、間葉系幹細胞由来軟骨細胞およびダイレクトリプログラミング法によって得られた軟骨細胞からなる群から選択される少なくとも一種の軟骨細胞である、請求項１から１５の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項１７】
前記多孔質体の関節腔面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に前記軟骨基質が存在する、請求項１から１６の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項１８】
生体親和性高分子のピンをさらに含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の軟骨再生材料。
【請求項１９】
生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥して多孔質体を得る工程Ａ、
前記工程Ａにおいて得られた多孔質体に軟骨細胞を播種して培養する工程Ｂ、及び
生体親和性高分子フィルムを提供する工程Ｃ、
を含む、請求項１から１７の何れか一項に記載の軟骨再生材料の製造方法。
【請求項２０】
前記工程Ａにおいて、生体親和性高分子を含む水溶液を攪拌した後に、凍結乾燥して多孔質体を得る、請求項１９に記載の軟骨再生材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体親和性高分子の多孔質体と生体親和性高分子フィルムとを含む軟骨再生材料、並びに上記軟骨再生材料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節骨軟骨欠損は自然再生が一般に困難であることから、細胞移植治療による再生医療が盛んに試みられている。具体的には、足場（Scaffold）を利用して、培養軟骨として細胞構造体の形で細胞を移植することが試みられている。【０００３】
特許文献１には、生分解性材料から構成される多孔質体であって所定の特性を有する多孔質体からなる細胞支持体が記載されている。特許文献１に記載の細胞支持体は、細胞を培養する担体として用いることができ、実施例においては、リコンビナントゼラチン又は天然ゼラチン素材からなる多孔質体を細胞支持体として用いることが記載されている。【０００４】
特許文献２には、主としてコラーゲンII型からなり、スポンジ様の開放性構造を有するマトリックス層および少なくとも一つの比較的不浸透性の閉鎖性構造を有するバリア層からなる多層膜が記載されている。特許文献２には、上記多層膜が、特に骨組織または軟骨組織の生体内再生のための使用に適していることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５３７号公報
【特許文献２】特表２００１−５１９２１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
関節骨軟骨欠損に対しては、細胞の懸濁液を注入する移植治療が知られているが、細胞を投与するだけでは欠損部位に細胞が生着せず、再生効果が十分ではない。また、上記の通り、足場（Scaffold）を利用して、培養軟骨として細胞構造体の形で細胞を移植することが多数試みられているが、実際のところ、培養軟骨の移植では、炎症の浸潤や血管浸潤により、培養軟骨が骨や繊維性軟組織になってしまうケースもあり、軟骨再生効果は必ずしも十分なものではなく、より高い軟骨再生効果を示す細胞構造体が求められている。【０００７】
特許文献１に記載の細胞支持体は、生分解性材料から構成され、所定の気孔率、所定の平均気孔サイズ、気孔間連通孔、及び所定の吸水率を有する多孔質体からなるものであり、骨再生材として有用であるが、軟骨再生能については不明である。
特許文献２から、II型コラーゲンが軟骨細胞の培養に有用であることは類推されるが、II型コラーゲンの関節内への移植は関節炎を誘発し（コラーゲン誘導性関節炎）、周辺の正常関節軟骨を傷害する原因となり得るため、II型コラーゲンを実際には使用することは好ましくない。また、特許文献２に記載されるようなバリア層を設けた場合でも、実際には、炎症の浸潤や血管浸潤を原因とする軟骨の骨化や繊維性軟組織浸潤を抑制することはできない。【０００８】
上記の通り、培養軟骨の移植では、炎症の浸潤や血管浸潤により、移植した培養軟骨部分が繊維性軟組織になってしまうことが課題である。
本発明は、繊維性軟組織浸潤を抑制し、良好な軟骨再生をもたらす軟骨再生材料を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、上記軟骨再生材料の製造方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含む、軟骨再生材料において、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に上記軟骨基質が存在する場合に、繊維性軟組織浸潤を抑制できるとともに良好な軟骨再生をもたらすことを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。【００１０】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含む、軟骨再生材料であって、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に上記軟骨基質が存在する、上記軟骨再生材料。
（２）上記多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの２０％以上の領域に上記軟骨基質が存在する、（１）に記載の軟骨再生材料。
（３）上記多孔質体の生体親和性高分子が、リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドである、（１）又は（２）に記載の軟骨再生材料。
（４）上記多孔質体の生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンである、（１）から（３）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（５）上記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、下記式１で示される、（４）に記載の軟骨再生材料。
式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式１中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。
（６）上記リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンが、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（４）又は（５）に記載の軟骨再生材料。
（７）上記多孔質体が、生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥することにより得られる、（１）から（６）の何れか一に記載の軟骨再生材料。【００１１】
（８）上記生体親和性高分子フィルムが、上記多孔質体の移植面の一部又は全部を移植部位から隔離するためのフィルムである、（１）から（７）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（９）上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンである、（１）から（８）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（１０）上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子が、下記式１で示される、（９）に記載の軟骨再生材料。
式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
式１中、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｍは２〜１０の整数であり、ｎは３〜１００の整数であり、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。
（１１）上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子が、
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
の何れかである、（９）又は（１０）に記載の軟骨再生材料。
（１２）上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の架橋度が４〜１５である、（１）から（１１）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（１３）上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の架橋度が４〜８である、（１）から（１２）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（１４）上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の下記式４で示される分解速度が０．１〜２０質量％／時間である、（１）から（１３）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
式４：  分解速度 = （（Ｗ−Ｗｅ）−ｗｏ）／ｗｏ／Ｔ
式４において、Ｗは、コラゲナーゼによる分解及び凍結乾燥後に記録した試料の入ったチューブの質量を示し、Ｗｅは予め記録しておいたチューブの空質量を示し、ｗｏは試料の実際の添加量を示し、Ｔはコラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示す。
（１５）上記生体親和性高分子フィルムの生体親和性高分子の下記式４で示される分解速度が５〜１０質量％／時間である、（１）から（１４）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
式４：  分解速度 = （（Ｗ−Ｗｅ）−ｗｏ）／ｗｏ／Ｔ
式４において、Ｗは、コラゲナーゼによる分解及び凍結乾燥後に記録した試料の入ったチューブの質量を示し、Ｗｅは予め記録しておいたチューブの空質量を示し、ｗｏは試料の実際の添加量を示し、Ｔはコラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示す。【００１２】
（１６）上記軟骨細胞が、関節軟骨由来軟骨細胞、耳介軟骨由来軟骨細胞、鼻軟骨由来軟骨細胞、iPS細胞由来軟骨細胞、ES細胞由来軟骨細胞、間葉系幹細胞由来軟骨細胞およびダイレクトリプログラミング法によって得られた軟骨細胞からなる群から選択される少なくとも一種の軟骨細胞である、（１）から（１５）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（１７）上記多孔質体の関節腔面の表面から150μmまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に上記軟骨基質が存在する、（１）から（１６）の何れか一に記載の軟骨再生材料。
（１８）生体親和性高分子のピンをさらに含む、（１）から（１７）の何れか一に記載の軟骨再生材料。【００１３】
（１９）生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥して多孔質体を得る工程Ａ、
上記工程Ａにおいて得られた多孔質体に軟骨細胞を播種して培養する工程Ｂ、及び
生体親和性高分子フィルムを提供する工程Ｃ、
を含む、（１）から（１７）の何れか一に記載の軟骨再生材料の製造方法。
（２０）上記工程Ａにおいて、生体親和性高分子を含む水溶液を攪拌した後に、凍結乾燥して多孔質体を得る、（１９）に記載の軟骨再生材料の製造方法。【００１４】
（２１）軟骨再生の治療において使用するための軟骨再生材料であって、生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含み、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に上記軟骨基質が存在する、上記軟骨再生材料。
（２２）生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含む、軟骨再生材料であって、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に上記軟骨基質が存在する、上記軟骨再生材料を、軟骨再生を必要とする患者に移植する工程を含む、軟骨再生方法。
（２３）軟骨再生材料の製造のための、生体親和性高分子の多孔質体と生体親和性高分子フィルムとの使用であって、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に上記軟骨基質が存在する、上記の使用。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の軟骨再生材料は、繊維性軟組織浸潤を抑制し、良好な軟骨再生をもたらし、細胞移植治療に有用である。本発明の軟骨再生材料の製造方法によれば、上記した繊維性軟組織浸潤を抑制し、良好な軟骨再生をもたらす本発明の軟骨再生材料を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、条件Ａの液温プロファイルを示す。
【図２】図２は、条件Ｂの液温プロファイルを示す。
【図３】図３は、条件Ｃの液温プロファイルを示す。
【図４】図４は、条件ＡＡの液温プロファイルを示す。
【図５】図５は、条件ＢＢの液温プロファイルを示す。
【図６】図６は、スポンジのみを移植（フィルムなし）した組織の染色の結果を示す。
【図７】図７は、スポンジ（細胞なし）とフィルムを移植した組織の染色の結果を示す。
【図８】図８は、移植面の軟骨基質充填割合が９０％の細胞培養スポンジとフィルムについて、移植前および移植した組織の染色の結果を示す。
【図９】図９は、移植面の軟骨基質充填割合が２０％又は３３％の細胞培養スポンジとフィルムについて、移植前および移植した組織の染色の結果を示す。
【図１０】図１０は、移植面の軟骨基質充填割合が２．９％又は５．４％の細胞培養スポンジとフィルムについて、移植前および移植した組織の染色の結果を示す。
【図１１】図１１は、移植面の軟骨基質充填割合が２０％の細胞培養スポンジをフィルムなしで又はフィルム有りで移植した組織の、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色の結果を示す。
【図１２】図１２は、移植面の軟骨基質充填割合が２０％の細胞培養スポンジをフィルムなしで又はフィルム有りで移植した組織の、サフラニンＯ染色の結果を示す。
【図１３】図１３は、移植面の軟骨基質充填割合が３３％の細胞培養スポンジとフィルム（架橋度６又は１３）を用いた、ウサギ膝関節軟骨欠損での長期移植試験（６ヶ月）の結果を示す。
【図１４】図１４は、フィルム（架橋度１３）のインビボでの分解を示す。
【図１５】図１５は、軟骨再生材料の分割移植についての、インビボでの検証の結果を示す。
【図１６】図１６は、軟骨再生材料の欠損部位への固定の検証の結果を示す。
【図１７】図１７は、ＣＢＥ３製ピンの作製を示す。
【図１８】図１８は、ＣＢＥ３製ピンによる軟骨再生材料の固定性を検証した結果を示す。
【図１９】図１９は、スポンジとフィルムの位置関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の軟骨再生材料は、生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含み、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に上記軟骨基質が存在するものである。
【００１８】
本発明の軟骨再生材料は、繊維性軟組織浸潤を抑制し、良好な軟骨再生をもたらすことから軟骨再生のために使用することができる。本発明の軟骨再生材料は、例えば、軟骨欠損部位に移植するための移植材料として使用することができる。
【００１９】
生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含み、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に上記軟骨基質が存在する本発明の軟骨再生材料が、上記の通り、繊維性軟組織浸潤を抑制し、良好な軟骨再生をもたらすことは、全く予想外な顕著な効果である。特許文献１においては、骨再生については記載されているが、軟骨再生については検討されていない。なお、骨再生と軟骨再生とは異なる現象であり、骨再生作用から軟骨再生作用を予想することはできない。また、特許文献２においても、多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に軟骨基質が存在するという本発明の特徴については記載も示唆もなく、特許文献２は、上記特徴により繊維性軟組織浸潤を抑制し、良好な軟骨再生をもたらすという効果を達成できることを何ら示唆するものではない。
【００２０】
本発明の軟骨再生材料においては、多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上（好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上）の領域に上記軟骨基質が存在する。上記した、多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの軟骨基質が存在する領域の割合のことを、本明細書中において、「軟骨基質充填割合」とも言う。上記の通り、移植面側の軟骨基質充填割合を１０％以上とすることによって、本発明の軟骨再生材料は、繊維性軟組織浸潤を抑制し、良好な軟骨再生をもたらすことが可能になる。なお、移植面側の軟骨基質充填割合の上限は特に限定されず、１００％でもよいし、１００％未満でもよい。
【００２１】
好ましくは、本発明の軟骨再生材料においては、多孔質体の関節腔面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上（より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、一層好ましくは５０％以上）の領域に軟骨基質が存在する。なお、関節腔面側の軟骨基質充填割合の上限は特に限定されず、１００％でもよいし、１００％未満でもよい。
【００２２】
多孔質体の移植面とは、生体内の欠損部に接する側の面（図１９のスポンジの場合は下面）を意味し、多孔質体の関節腔面とは、移植面の反対側の面（図１９のスポンジの場合は上面）を意味する。
【００２３】
軟骨基質充填割合の測定は、本明細書の実施例の「[１４]底面の軟骨基質充填割合が異なることの評価」に記載の方法に準じて行うことができる。即ち、多孔質体の切片を作製（ホルマリン固定、パラフィン包埋）し、サフラニンＯ染色することで断面を可視化して評価する。即ち、組織染色切片の移植面（底面）又は関節腔面（移植面の反対側の面）の表面から１５０μｍの厚さに着目し、サフラニンＯ染色で陽性となっている領域の面積を測定した。表面から１５０μｍの領域全体の面積に対する、サフラニンＯ染色陽性領域の面積の割合を求めることで１５０μｍ層中の軟骨基質充填割合を求めることができる。
以下、本発明の構成要素について説明する。
【００２４】
（１）生体親和性高分子の多孔質体
本発明で用いる多孔質体は、生体親和性高分子から構成される。
（１−１）生体親和性高分子
生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性高分子として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン及びＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性高分子としては、具体的には、リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、及びキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で表される、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。
【００２５】
リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドなどのポリペプチドの種類は、生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンは、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチン又は化学合成ゼラチンであり、より好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。
化学合成ペプチド又は化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチド又はゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護基としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、及び、アミノ基の保護基としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中、後記する（１−３）リコンビナントゼラチンの内容を当てはめることができる。
リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
【００２６】
本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０であることが好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性／非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して、有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」を意味する。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００２７】
本発明で用いる生体親和性高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、上記生体親和性高分子の親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用する。
【００２８】
本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、上記ポリペプチドのGrand average of hydropathicity（ＧＲＡＶＹ）値で表される親疎水性指標が、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがより好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』に記載の方法により得ることができる。
【００２９】
本発明で用いる生体親和性高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、上記生体親和性高分子の親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用する。
【００３０】
（１−２）架橋
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、本発明の軟骨再生材料を培地中で培養する際及び生体に移植した際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られている。本発明で使用する架橋方法は、好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。
【００３１】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いることができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋する高分子の具体例としては、リジン残基及びグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、およびヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００３２】
架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、一層好ましくは１００℃〜２５０℃であり、より一層好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００３３】
（１−３）リコンビナントゼラチン
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばＥＰ１０１４１７６号公報、ＵＳ特許６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号公報、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００３４】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然セラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００３５】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。
【００３６】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列は、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成及び配列において、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分構造においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸にはイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００３７】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満であることが好ましく、より好ましくは５％以上１０％未満である。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうちいずれか１つのアミノ酸、好ましくは２つ以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００３８】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列を一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で表わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列が好ましい。より好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列であり、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列の中では、ＥＲＧＤ配列が好ましい。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として間葉系幹細胞を用いた場合、軟骨分化において、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
【００３９】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個であることが好ましく、より好ましくは４〜３０個、さらに好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００４０】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤ配列（モチーフ）の割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、一層好ましくは少なくとも１．０％であり、より一層好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも６、更に好ましくは少なくとも８、一層好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは少なくとも６つ、より好ましくは少なくとも８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。
【００４１】
リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００４２】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式１：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは２〜１０の整数であり、好ましくは３〜５である。ｎは３〜１００の整数であり、１５〜７０が好ましく、５０〜６５がより好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。
【００４３】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、  式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００４４】
繰り返し単位には、天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは、天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は、好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。
【００４５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。
【００４６】
好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。
【００４７】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
である。
【００４８】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４９】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号公報、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００５０】
（１−４）生体親和性高分子の多孔質体の製造方法
生体親和性高分子の多孔質体の製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥することにより生体親和性高分子の多孔質体を得ることができる。生体親和性高分子の多孔質体の製造方法の一例としては、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下の温度で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の未凍結状態の溶液を凍結する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子の溶液を凍結乾燥する工程
を含む製造方法を挙げることができる。
【００５１】
生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、又は０．９℃以上でもよい。これにより製造された多孔質体は、より高い軟骨再生効果を達成できる。
【００５２】
工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材（好ましくは、テフロン（登録商標））を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却面から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
【００５３】
好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前〜１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。
【００５４】
好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒の融点−５℃以下であり、より好ましくは溶媒の融点−５℃以下かつ溶媒の融点−２０℃以上であり、更に好ましくは溶媒の融点−６℃以下かつ溶媒の融点−１６℃以上である。なお、「溶媒の融点」の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。
【００５５】
工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた未凍結状態の生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結するための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、更に好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。
【００５６】
工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子の溶液を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。
【００５７】
生体親和性高分子の多孔質体の形状及び大きさは特に限定されず、使用目的に応じて適当な形状及び大きさの多孔質体を使用することができる。形状としては、例えば、円柱、または直方体などを挙げることができるが、特に限定されず、患部である欠損部の形状に合わせた形状とすることができる。円柱の大きさとしては、直径が２ｍｍ〜２ｃｍであり、高さ（厚さ）が１ｍｍ〜２ｃｍであることが好ましい。直方体の大きさとしては、縦及び横の長さが２ｍｍ〜２ｃｍであり、高さ（厚さ）が１ｍｍ〜２ｃｍであることが好ましい。
生体親和性高分子の多孔質体の平均空孔サイズは、特に限定されないが、好ましくは、１０〜４００μｍであり、より好ましくは２０〜２００μｍであり、さらに好ましくは３０〜１００μｍであり、特に好ましくは４０〜９０μｍである。多孔質体の平均空孔サイズは、実施例「［８］リコンビナントペプチド多孔質体の空孔サイズの評価」に記載の方法に準じて測定することができる。
【００５８】
（２）軟骨細胞及び軟骨基質
本発明で用いる軟骨細胞は、細胞移植を行うことができ、軟骨再生能を発揮できる限り、任意の軟骨細胞を使用することができ、その種類は特に限定されない。また、使用する軟骨細胞は１種でもよいし、複数種の軟骨細胞を組合せて用いてもよい。また、使用する軟骨細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。軟骨細胞としては、関節軟骨由来軟骨細胞、耳介軟骨由来軟骨細胞、鼻軟骨由来軟骨細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）由来軟骨細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）由来軟骨細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来軟骨細胞およびダイレクトリプログラミング法によって得られた軟骨細胞からなる群から選択される少なくとも一種の軟骨細胞を使用することができる。ダイレクトリプログラミング法とは、皮膚から抽出した繊維芽細胞などの細胞などを軟骨細胞に直接変化させる手法である。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。
【００５９】
軟骨基質とは、軟骨細胞が産生する成分を意味し、主として細胞外基質である。軟骨基質は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、コンドロイチン硫酸、及びプロテオグリカンを主成分とし、場合によっては膠原線維及び弾性線維を含む。軟骨基質は、サフラニンＯ染色により存在を確認することができる。
【００６０】
生体親和性高分子の多孔質体に対する軟骨細胞の使用量は特に限定されないが、生体親和性高分子の多孔質体の体積当たりで、好ましくは１．０×１０5細胞／ｃｍ3〜１．０×１０8細胞／ｃｍ3であり、より好ましくは１．０×１０6細胞／ｃｍ3〜５．０×１０7細胞／ｃｍ3であり、さらに好ましくは２．０×１０6細胞／ｃｍ3〜１．０×１０7細胞／ｃｍ3である。下限を上記範囲とすることにより、移植用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する生体親和性高分子の多孔質体中の成分を細胞に供給できる。ここで、生体親和性高分子の多孔質体中の成分は特に制限されないが、後述する培地に含まれる成分が挙げられる。
【００６１】
（３）生体親和性高分子フィルム
本発明の軟骨再生材料は、生体親和性高分子の多孔質体とともに、生体親和性高分子フィルムを含む。即ち、本発明においては、軟骨細胞及び軟骨基質を含む生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを組み合わせて使用する。
生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとは、それぞれ別々にキットの形態で提供してもよいし、生体親和性高分子の多孔質体と生体親和性高分子フィルムとを一緒に貼り合せた形態で提供してもよい。好ましくは、生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとが、それぞれ別々であるキットの形態である。
生体親和性高分子の多孔質体と生体親和性高分子フィルムとをそれぞれ別々にキットの形態で提供する場合、使用者は、生体親和性高分子の多孔質体と生体親和性高分子フィルムとを一緒に貼り合せた後に移植することができる。あるいは、使用者は、生体親和性高分子フィルムを移植した後に、生体親和性高分子の多孔質体を移植してもよい。
【００６２】
生体親和性高分子フィルムは、生体親和性高分子の多孔質体の移植面の一部又は全部を移植部位から隔離するためのフィルムとして使用することが好ましい。例えば、生体親和性高分子フィルムを先ず移植部位に移植し、その後に、生体親和性高分子フィルムの上面（移植部位と接している面とは反対側の面）に、生体親和性高分子の多孔質体を移植することが好ましい。あるいは、生体親和性高分子の多孔質体と生体親和性高分子フィルムとを一緒に貼り合せた後に移植する場合には、生体親和性高分子フィルムが移植部位に直接接触するように移植することが好ましい。
【００６３】
生体親和性高分子フィルムを構成する生体親和性高分子の具体例及び好ましい範囲については、生体親和性高分子の多孔質体を構成する生体親和性高分子の場合と同様であり、具体的には、本明細書中の上記（１−１）生体親和性高分子、（１−２）架橋、及び（１−３）リコンビナントゼラチンに記載した通りである。なお、生体親和性高分子フィルムを構成する生体親和性高分子は、生体親和性高分子の多孔質体を構成する生体親和性高分子と同一でもよいし、異なるものでもよい。
【００６４】
生体親和性高分子フィルムの製造方法は特に限定されず、常法により実施できる。例えば、生体親和性高分子の水溶液を、プラスチックトレーに流し込み、低温下（例えば、冷蔵庫中など）で乾燥することにより生体親和性高分子フィルムを製造することができる。
【００６５】
生体親和性高分子フィルムは架橋することができる。架橋する場合、架橋度は特に限定されないが、一般的には、４〜１５であり、より好ましくは６〜１３であり、さらに好ましくは４〜８であり、特に好ましくは５〜７である。架橋度とは、１分子当たりの架橋数である。架橋度の測定は、実施例の[１０] 架橋度の測定方法に記載したＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法を用いて実施することができる。
【００６６】
生体親和性高分子フィルムの分解速度は、架橋度に応じて変動する。生体親和性高分子フィルムの分解速度は、後記する実施例の[１１] 分解速度の測定方法に記載した方法により測定及び評価することができる。
具体的には、予め質量を測定したチューブに試料（フィルム）５ｍｇを添加し、実際の添加量を記録する。放線菌由来のコラゲナーゼ２．５ｍｇを５０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させ、コラゲナーゼ溶液を得る。このコラゲナーゼ溶液１ｍｌを、試料を添加したチューブに加え、ボルテックスにて混合後、３７℃で所定の時間（＝Ｔ）振とうする。その後、チューブを１００００Ｇで１分間遠心し、上清をピペットで取り除く。さらに、超純水１ｍｌをチューブに加え、ボルテックス後、チューブを１００００Ｇで１分間遠心し、上清をピペットで取り除く。この操作をもう一度繰り返す。その後、試料を凍結乾燥し、試料の入ったチューブの質量を記録する。フィルムの分解速度は以下の式（式４）から算出する。
（式４）  分解速度 = （（Ｗ−Ｗｅ）―ｗｏ）／ｗｏ／Ｔ
式４において、Ｗは、凍結乾燥後に記録した、試料の入ったチューブの質量を示し、Ｗｅは予め記録しておいた、チューブの空質量を示す。ｗｏは、試料の実際の添加量を示す。Ｔは、コラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示す。
上記方法により測定した生体親和性高分子フィルムの分解速度は特に限定されないが、一般的には、０．１〜２０[質量％／時間]であり、好ましくは０．５〜２０[質量％／時間]であり、より好ましくは１〜１０[質量％／時間]であり、特に好ましくは５〜１０[質量％／時間]である。
【００６７】
（４）軟骨再生材料の製造方法
本発明はさらに、上記した本発明の軟骨再生材料の製造方法を提供する。
上記製造方法は、
生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥して多孔質体を得る工程Ａ、
上記工程Ａにおいて得られた多孔質体に軟骨細胞を播種して培養する工程Ｂ、及び
生体親和性高分子フィルムを提供する工程Ｃ、
を含む。
【００６８】
工程Ａは、本明細書中の上記「（１−４）生体親和性高分子の多孔質体の製造方法」に記載した通り実施することができる。工程Ａにおいては、好ましくは、生体親和性高分子を含む水溶液を攪拌した後に、凍結乾燥して多孔質体を得ることができる。
【００６９】
工程Ｂは、多孔質体に軟骨細胞を播種して培養する工程である。多孔質体への軟骨細胞の播種及び培養は、常法により行うことができる。
多孔質体に対する軟骨細胞の使用量、および培養時間を調節することにより、多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの軟骨基質が存在する領域の割合（移植面側の軟骨基質充填割合）、及び多孔質体の関節腔面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの軟骨基質が存在する領域の割合（関節腔面側の軟骨基質充填割合）を調節することができる。
【００７０】
工程Ｃは、生体親和性高分子フィルムを提供する工程である。本明細書中の上記「（３）生体親和性高分子フィルム」に記載した通り、生体親和性高分子フィルムを提供することができる。
【００７１】
（５）軟骨再生材料の使用方法
本発明の軟骨再生材料は、軟骨欠損の疾患部位に細胞移植の目的で使用することができる。軟骨欠損を伴う疾患としては、変形性関節症、骨軟骨欠損、離断性骨軟骨炎、外傷性軟骨損傷、骨関節炎、再発性多発軟骨炎、軟骨無形成症、椎間板損傷、椎間板ヘルニア等を挙げることができるが、特に限定されない。
移植方法としては、切開、注射、関節鏡、内視鏡等を使用した方法が挙げられる。本発明の軟骨再生材料は、細胞シート等の細胞移植物とは異なり、軟骨再生材料のサイズを小さくすることができるため、注射による移植といった低侵襲の移植方法が可能となる。
【００７２】
また、実施例の「[１９]軟骨基質あり（軟骨基質充填割合が十分な）スポンジの分割移植の有効性評価」に記載の通り、本発明の軟骨再生材料は、分割移植した場合でも軟骨再生が認められることが実証された。従って、軟骨細胞及び軟骨基質を含む多孔質体を一度分割してから、欠損部位に移植することも可能である。
【００７３】
さらに、実施例の「[２０]  欠損部位への固定が妥当であるかの検証」に記載の通り、本発明の軟骨再生材料は、移植後に欠損部位に軟骨再生材料をピンで固定することが可能である。ピンの素材は特に限定されないが、生体親和性高分子を使用することが好ましい。ピンを構成する生体親和性高分子の具体例及び好ましい範囲については、生体親和性高分子の多孔質体を構成する生体親和性高分子の場合と同様であり、具体的には、本明細書中の上記（１−１）生体親和性高分子、（１−２）架橋、及び（１−３）リコンビナントゼラチンに記載した通りである。なお、ピンを構成する生体親和性高分子は、生体親和性高分子の多孔質体を構成する生体親和性高分子と同一でもよいし、異なるものでもよい。
【００７４】
本発明の軟骨再生材料を移植する際の量は、疾患の状態などに応じて適宜選択することができるが、移植する細胞数としては、１．０×１０4ｃｅｌｌ／ｃｍ3〜２．０×１０7ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3が好ましく、２．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3〜５．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3がより好ましい。
本発明の軟骨再生材料の移植回数としては、１回だけ移植してもよいし、必要応じ２回以上の移植を行うこともできる。
【００７５】
（６）用途及び軟骨再生方法
本発明によれば、軟骨再生の治療において使用するための軟骨再生材料であって、生体親和性高分子の多孔質体と、生体親和性高分子フィルムとを含み、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に上記軟骨基質が存在する上記軟骨再生材料が提供される。各構成成分の好ましい範囲は本明細書中上記と同様である。
【００７６】
本発明によれば、上記した本発明の軟骨再生材料を、軟骨再生を必要とする患者に移植する工程を含む、軟骨再生方法が提供される。軟骨再生材料の各構成成分の好ましい範囲は、本明細書中の上記と同様である。
【００７７】
更に本発明によれば、軟骨再生材料の製造のための、生体親和性高分子の多孔質体と生体親和性高分子フィルムとの使用であって、上記多孔質体が軟骨細胞および軟骨基質を含有し、上記多孔質体の移植面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの１０％以上の領域に上記軟骨基質が存在する、上記の使用が提供される。生体親和性高分子の多孔質体と生体親和性高分子フィルムについての好ましい範囲は、本明細書中の上記と同様である。
【００７８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００７９】
［１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：  ＧＡＰ［（ＧＸＹ）63］3Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
また、本明細書における多孔質体とスポンジとは同義である。【００８０】
[２] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
[ＰＴＦＥ厚・円筒形容器]
底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製の円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのＰＴＦＥで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのＰＴＦＥで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをＰＴＦＥ厚・円筒形容器と呼称する。【００８１】
[アルミ硝子板・円筒形容器]
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。【００８２】
[温度差の小さい凍結工程、および乾燥工程]
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、およびアルミ硝子板・円筒形容器に、それぞれＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。
この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定は、以下に記載の通りである。【００８３】
条件Ａ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【００８４】
条件Ｂ：
アルミ硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【００８５】
条件Ｃ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量１０ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【００８６】
[３]各凍結工程での温度差測定
条件Ａ〜条件Ｃのそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の液面の液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図１〜図３の通りとなった。
この図１、図２、図３から、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃでは棚板温度−１０℃設定区間（−２０℃度に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温との温度差が２．５℃以下となっていた。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認できた。その後、温度は０℃付近で一定時間経過した。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後に０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっていた。従って、測定している温度は氷内部の固体温度であり、つまり液温ではない。【００８７】
以下に、条件Ａ、条件Ｂ、条件Ｃについて、非冷却面の液温が融点（０℃）になった時の温度差、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。なお、本明細書で言う「直前の温度差」とは、本イベントの１秒前〜２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も大きい温度差を表す。【００８８】
条件Ａ
非冷却面の液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．１℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．２℃
凝固熱発生直前の温度差：１．１℃【００８９】
条件Ｂ
非冷却面の液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．０℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．１℃
凝固熱発生直前の温度差：０．９℃【００９０】
条件Ｃ
非冷却面の液温が融点（０℃）になった時の温度差：１．８℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：１．１℃
凝固熱発生直前の温度差：２．１℃【００９１】
これらを以後、「温度差の小さい凍結工程・多孔質体」と呼称する。【００９２】
[４]１質量％エタノール含有溶液での、温度差の小さい凍結工程、および乾燥工程
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、およびアルミ硝子板・円筒形容器に、それぞれ１質量％（ｗ／ｗ）エタノール含有ＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。最終濃度１質量％のエタノール含有水溶液とすることで、融点は−０．４℃となる。エタノール／水濃度比における融点変化は文献「Pickering S.U.: A Study of the Properties of some Strong Solutions. J.Chem.Soc.London 63 (1893) 998-1027」から計算した。
この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定は、以下に記載の通りである。【００９３】
条件ＡＡ：
ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、エタノール最終濃度１質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がるまで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【００９４】
条件ＢＢ：
アルミ硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、エタノール最終濃度１質量％、水溶液量４ｍＬ。棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がるまで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。【００９５】
[１質量％エタノール含有溶液の、凍結工程での温度差測定]
条件ＡＡ及び条件ＢＢについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の液面の液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。尚、ここでは１質量％エタノールが溶媒となる為、溶媒融点は−０．４℃となる。エタノール／水濃度比における融点変化は文献「Pickering S.U.: A Study of the Properties of some Strong Solutions. J.Chem.Soc.London 63 (1893) 998-1027」から計算した。【００９６】
その結果、それぞれの温度とその温度差のプロファイルは図４及び図５の通りとなった。図４及び５から、条件ＡＡ及び条件ＢＢでは、棚板温度−１０℃設定区間において液温が融点である−０．４℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の温度差が２℃以下となっていた。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が−０．４℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認出来た。その後、温度は−０．４℃付近で一定時間経過した。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっていた。従って、測定している温度は氷内部の固体温度であり、つまり液温ではない。【００９７】
以下に、条件ＡＡ、条件ＢＢについて、非冷却面の液温が融点（−０．４℃）になった時の温度差、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差と、凝固熱発生直前の温度差を記載する。【００９８】
条件ＡＡ
非冷却面の液温が融点（−０．４℃）になった時の温度差：０．８℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．３℃
凝固熱発生直前の温度差：０．８℃【００９９】
条件ＢＢ
非冷却面の液温が融点（−０．４℃）になった時の温度差：１．３℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の温度差：０．０℃
凝固熱発生直前の温度差：１．３℃【０１００】
これらの結果、条件ＡＡ及び条件ＢＢにおいても、条件Ａ及び条件Ｂと同様に、「温度差の小さい凍結工程・多孔質体」として作製できることが分かった。【０１０１】
［５］リコンビナントペプチド薄層凍結多孔質体の作製
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。以後、この容器のことを円筒形容器と呼称する。【０１０２】
ＣＢＥ３水溶液を調製し、このＣＢＥ３水溶液を円筒形容器に流し込んだ。冷凍庫内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際、冷却棚板の温度、棚板と円筒形容器の間に挟む断熱板（硝子板）の厚さ、入れるＣＢＥ３水溶液の最終濃度、及び水溶液量は、以下に記載の通りである。棚板温度-４０℃、硝子板の厚さ２．２ｍｍ、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４．０％、水溶液量４ｍＬ。このようにして得た凍結ＣＢＥ３ブロックを凍結乾燥して、ＣＢＥ３多孔質体を得た、このようにして得た多孔質体を、以後、薄層凍結多孔質体と呼称する。【０１０３】
［６］攪拌によるリコンビナントペプチド多孔質体の作製
リコンビナントペプチドＣＢＥ３を用いて、攪拌法多孔質体を作製した。本例では、以下の組成で溶液を調製し、４℃にてホモジナイザー（AM-11、NIHONSEIKI製）で１７，０００ｒｐｍ、３０秒間攪拌し、アルミ製カップ容器に移して−８０℃で３時間急冷する。その後、凍結乾燥機にて３日間凍結乾燥を行い、多孔質体を得た。このようにして得た多孔質体を、以後、攪拌法多孔質体と呼称する。
組成：１０質量％多孔質体１０mＬ分（ＣＢＥ３：１０００ｍｇ、超純水：９８９５μＬ、１モル／Ｌ  ＨＣｌ：１０５μＬ）【０１０４】
［７］リコンビナントペプチド多孔質体の架橋
上記［２］及び［３］で得られた温度差の小さい凍結工程・多孔質体、上記［４］で得られたで温度差の小さいエタノール含有凍結工程・多孔質体、上記［５］で得られた薄層凍結多孔質体、及び上記［６］で得られた攪拌法多孔質体について、それぞれの多孔質体に、減圧下１６０℃で２０時間の熱架橋を施した。【０１０５】
［８］リコンビナントペプチド多孔質体の空孔サイズの評価
上記［７］で得られた各種の多孔質を、十分時間、生理食塩水で膨潤させた。その後、ミクロトームで凍結組織切片を作製し、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオシン）染色標本を作製した。標本から実スケール１．５ｍｍ大の断面像を用意し、個々の空孔面積を計測し、その後、上記面積を円換算した場合の円直径を算出し、空孔サイズとした。この空孔の２０か所以上の平均値を平均空孔サイズとした。その結果、上記［２］及び［３］由来の温度差の小さい凍結工程・多孔質体の平均空孔サイズは５９μｍ、上記［４］由来の温度差の小さいエタノール含有凍結工程・多孔質体は７２μｍ、上記［６］由来の攪拌法多孔質体は８２μｍ、上記［５］由来の薄層凍結多孔質体は４５μｍであった。【０１０６】
[９] リコンビナントペプチドフィルムの作製法
４質量％濃度のＣＢＥ３水溶液を調製し、このＣＢＥ３水溶液５．４ｍｌを、シリコン枠（８ｃｍ  ｘ  ３．５ｃｍ）を設置したプラスチックトレーに流し込んだ。このプラスチックトレーを冷蔵庫内に移し、水分が無くなるまで乾燥させることでリコンビナントペプチドのフィルムを得た。上記のリコンビナントペプチドのフィルムをプラスチックトレー／シリコン枠から取り出し、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は４８時間、７２時間）を施し、動物実験の試料を得た。【０１０７】
[１０] 架橋度の測定方法
上記［９］で作製したフィルムの架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。測定にはＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法を用いた。【０１０８】
＜サンプル調製＞
ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ3水溶液（１ｍＬ）及び１質量％ＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、混合物を３７℃で３時間振とうした。その後、３７質量％塩酸（１０ｍＬ）及び純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、サンプルとした。【０１０９】
＜ブランク調整＞
ガラスバイアルに、サンプル（約１０ｍｇ）、４質量％ＮａＨＣＯ3水溶液（１ｍＬ）及び１質量％ＴＮＢＳ水溶液（２ｍＬ）を添加し、直後に３７質量％塩酸（３ｍＬ）を加え、混合物を３７℃で３時間振とうした。その後、３７質量％塩酸（７ｍＬ）及び純水（５ｍＬ）を加えた後、混合物を３７℃で１６時間以上静置し、ブランクとした。
純水で１０倍希釈したサンプル、及び、ブランクの吸光度（３４５nm）を測定し、以下の（式２）及び（式３）から架橋度（１分子当たりの架橋数）を算出した。【０１１０】
（式２）  （Ａｓ−Ａｂ）／１４６００×Ｖ／ｗ
（式２）は、リコンビナントペプチド１ｇ当たりのリジン量（モル等量）を示す。
式２中、Ａｓはサンプル吸光度、Ａｂはブランク吸光度、Ｖは反応液量（ｇ）、ｗはリコンビナントペプチド質量（ｍｇ）を示す。
（式３）  １−（サンプル（式１）／未架橋リコンビナントペプチド（式１））×３４
（式３）は、１分子あたりの架橋数を示す。【０１１１】
その結果、上記［９］の４８時間架橋したフィルムは架橋度６であり、上記［６］の７２時間架橋したフィルムは架橋度１３であった。同様にして測定した上記［７］の多孔質体の架橋度は９であった。【０１１２】
[１１] 分解速度の測定方法
上記［９］で作製したフィルムの分解速度を評価した。
予め質量を測定したプラスチック製のチューブに、上記［９］で作製した試料５ｍｇを添加し、実際の添加量を記録した。
放線菌由来のコラゲナーゼ２．５ｍｇを５０ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させ、コラゲナーゼ溶液を得た。このコラゲナーゼ溶液１ｍｌを、試料を添加したチューブに加え、ボルテックスにて混合後、３７℃で５時間振とうさせた。その後、チューブを１００００Ｇで１分間遠心し、上清をピペットで取り除いた。さらに、超純水１ｍｌをチューブに加え、ボルテックスにて混合後、チューブを１００００Ｇで１分間遠心し、上清をピペットで取り除いた。この操作をもう一度繰り返した。その後、試料を凍結乾燥し、試料の入ったチューブの質量を記録した。【０１１３】
フィルムの分解速度は以下の式（式４）から算出した。
（式４）  分解速度 = （（Ｗ−Ｗｅ）―ｗｏ）／ｗｏ／Ｔ
式４において、Ｗは、凍結乾燥後に記録した、試料の入ったチューブの質量を示し、Ｗｅは予め記録しておいた、チューブの空質量を示す。ｗｏは、試料の実際の添加量を示す。Ｔは、コラゲナーゼ溶液中での振とう時間を示し、今回の試験では５時間である。【０１１４】
その結果、上記［９］のフィルムは、４８時間の架橋で分解速度６．９[質量％／時間]、７２時間の架橋で分解速度０．５［質量％／時間］であった。【０１１５】
[１２]  ウサギ軟骨細胞の採取方法
３〜４週齢の日本白色家兎をソムノペンチル静脈投与により屠殺し、大腿骨、脛骨（上腕骨）から軟骨組織を採取した。イソジン希釈液で消毒し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄し、０．２５質量％トリプシンを加え３７℃で約１時間反応させた後、３０００ユニット／ｍＬコラゲナーゼタイプＩＸ溶液で約３時間反応させ、消化物をセルストレーナーに通し、残渣を除去した。その後、培地を加え、コラゲナーゼを除去するため、遠心し、上清を除去してから培地を添加した。この工程でウサギ軟骨細胞を取得した。【０１１６】
なお、上記で使用している培地は、全て軟骨細胞培養用培地であり、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０体積％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、５０μｇ／ｍＬリン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウム、０．２５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンで構成された培地である。以後も培地と記載した場合は全てこれを使用している。【０１１７】
[１３]  軟骨基質充填割合の異なる、ウサギ軟骨細胞培養スポンジの作製
上記［６］で用意した攪拌法多孔質体（空孔サイズ８２μｍ）を直径５ｍｍ、厚さ２ｍｍに切り出し、その上に，上記［１２］で用意したウサギ軟骨細胞を５．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｃｍ3濃度で播種し、培養を実施した。それによって、軟骨基質ありスポンジを取得した。また、ここでウサギ軟骨細胞を播種しなかった物も用意しておき、それを軟骨基質なしスポンジとして用意した。なお、上記［７］及び［８］で用意した温度差の小さいエタノール含有凍結工程・多孔質体（空孔サイズ７２μｍ）を用いた場合も、以後の結果は同じ結果が得られたため、以下においては代表例として上記［６］由来の攪拌法多孔質体のデータを提示している。【０１１８】
[１４]  底面の軟骨基質充填割合が異なることの評価
上記［１３］で細胞を播種し培養した軟骨基質ありスポンジは、培養経過（３日、７日、１４日、２１日、２８日）とともに底面の軟骨基質充填割合の異なる軟骨基質ありスポンジを作ることができた。その底面の軟骨基質充填割合の測定は、軟骨基質ありスポンジの組織切片を作製（ホルマリン固定、パラフィン包埋）し、サフラニンＯ染色することで断面を可視化して評価した（図８〜図１０）。
特に、このようにして作製した組織染色切片の底面部分の１５０μｍの厚さの領域に着目し、この１５０μｍの厚さの領域について、軟骨基質が存在し、それ故サフラニンＯ染色で陽性となっている領域の面積を測定した。かつ、１５０μｍの厚さの領域全体の面積に対するサフラニンＯ染色陽性領域の面積の割合を求めることで「１５０μｍ層中の軟骨基質充填割合」とした。その結果、上記［１３］で作製した軟骨基質ありスポンジは、「１５０μｍ層中の軟骨基質充填割合」が２．９％、５．４％、２０％、３３％、９０％であった。【０１１９】
上記[１３]及び[１４]で作製した「１５０μｍ層中の軟骨基質充填割合」が２．９％、５．４％、２０％、３３％、９０％のスポンジ全てにおいて、関節腔面の表面から１５０μｍまでの厚さの領域のうちの３０％以上の領域に、軟骨基質が存在していた。【０１２０】
[１５] ウサギ軟骨欠損モデルの作製
日本白色家兎（北山ラベス、ＳＰＦ）２２週齢オスの膝関節部位に、直径５ｍｍ、深さ２ｍｍ程度の骨軟骨欠損を作製した。【０１２１】
[１６]ウサギ軟骨欠損モデルでのサンプル移植評価（１ヶ月）（軟骨基質充填割合の影響）
上記［１５］にて作製したウサギ軟骨欠損部位に、各種評価対象のサンプルを移植し、移植後１ヶ月の時点で剖検し、移植部位周辺の骨軟骨組織切片を作製した。組織はホルマリン固定を行った後、パラフィンで包埋し、移植物を含む組織切片を作製した。切片の染色は、ＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）、またはサフラニンＯ染色、あるいはサフラニンＯ及びファストグリーン染色を行った。【０１２２】
なお、ここでフィルムを用いている場合のフィルムとは、上記［９］で用意したフィルム（架橋度６と１３で同じ結果となったのでこの実施例では区別していない）を欠損の底面積大（直径５ｍｍ）に切り出したものを使用している。また、フィルムを使用する場合は、フィルムが移植面（下骨側）に存在する形で移植した。ウサギ骨軟骨欠損部位へ移植した際のスポンジとフィルムの位置関係について、図１９に図示した。【０１２３】
評価したサンプルとその結果を図６〜１２に示す。また、以下の基準で、軟骨再生、及び繊維性軟組織の浸潤抑制を評価した。評価の結果のまとめを表１に示す。【０１２４】
軟骨再生
Ａ：良好な軟骨再生が認められる。
Ｂ：一部でわずかな軟骨再生が認められる。
Ｃ：軟骨再生が認められない。【０１２５】
繊維性軟組織の浸潤抑制
Ａ：繊維性軟組織の浸潤抑制が認められる。
Ｂ：繊維性軟組織の浸潤抑制が若干認められる。
Ｃ：繊維性軟組織の浸潤抑制は認められない。
Ｄ：炎症浸潤を抑制することができず、繊維性軟組織の浸潤抑制は不良である。【０１２６】
【表１】
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【０１２７】
上記の結果から、「１５０μｍ層中の軟骨基質充填割合」が十分な場合（２０％、３３％、９０％）、かつフィルムを底面（移植面）に設置した場合に、良好な繊維性軟組織の浸潤抑制、及び良好な軟骨再生をもたらすことが分かった。【０１２８】
[１７]  ウサギ軟骨欠損モデルでのサンプル移植評価（長期６ヶ月）（フィルム架橋度の影響）
上記［１６］と同様にして、上記［１５］にて作製したウサギ軟骨欠損部位に、同一の軟骨基質充填割合（３３％）の軟骨基質ありスポンジ（上記［１３］及び［１４］）と、架橋度が異なるフィルム（上記［９］及び［１０］の架橋度６及び１３）を移植した。フィルムが移植面（下骨側）に存在するように移植した。移植後６ヶ月の時点で剖検し、移植部位周辺の骨軟骨組織切片を作製した。組織はホルマリン固定を行った後、パラフィンで包埋し、移植物を含む組織切片を作製した。切片染色はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）、またはサフラニンＯ染色、あるいはサフラニンＯ及びファストグリーン染色を行った。【０１２９】
なお、ここでフィルムを用いている場合のフィルムとは、上記［９］で用意したフィルムで二つの架橋度（上記［１０］で測定）のフィルム（架橋度６と１３）をそれぞれ欠損の底面積大（直径５ｍｍ）に切り出したものを使用した。【０１３０】
その結果を図１３に示す。図１３に示す通り、軟骨基質あり（軟骨基質充填割合３３％）スポンジと架橋度６フィルムを移植した場合でも、軟骨基質あり（軟骨基質充填割合３３％）スポンジと架橋度１３フィルムを移植した場合でも、ともに良好な繊維性軟組織の浸潤抑制（評価Ａ）と、十分に良好な軟骨再生（評価Ａ以上）を示した。さらに、架橋度６フィルムを用いた場合では、架橋度１３フィルムを用いた場合と比較して、より顕著に良好な軟骨再生（評価ＡＡ）が観察され、想定外に、架橋度６フィルムを用いた場合はさらに良い結果を生じることが明らかとなった。【０１３１】
[１８]  フィルムの生分解性
上記［９］、［１０］で作製した架橋度１３のフィルムを、上記［１５］で作製したウサギ軟骨欠損部位に留置し、１か月後と２か月後に剖検し、移植部位周辺の骨軟骨組織切片を作製した。組織はホルマリン固定を行った後、パラフィンで包埋し、移植物を含む組織切片を作製した。切片染色はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）を行った。
その結果を図１４に示す。図１４に示す通り、移植後１か月ではまだほとんど分解されていない架橋度１３のフィルムも、２か月後には明らかにフィルムの端から分解が進んでいることが明瞭に示された。このことから、使用しているフィルムは生分解性を有していることが証明された。【０１３２】
[１９]軟骨基質あり（軟骨基質充填割合が十分な）スポンジの分割移植の有効性評価
実際の医療現場においては関節鏡を使って移植治療することが可能であることがさらに望ましい。関節鏡で移植が可能であるためには、関節鏡ポータルを通過可能であることが必要である。そのためには、分割された移植物で骨軟骨欠損を満たした場合であっても、分割しない場合と同様な軟骨再生が認められることが重要である。これを評価する方法として、十分な軟骨基質充填割合を有する軟骨基質ありスポンジを、一度分割してから欠損部位に移植した場合に、分割部分で軟骨再生が認められるかを評価した。【０１３３】
上記［１３］及び［１４］で作製した軟骨基質ありスポンジ（軟骨基質充填割合９０％）を、図１５のように分割してから、上記［１５］で作製したウサギ軟骨欠損部位に、上記［９］及び［１０］で作製した架橋度１３のフィルムとともに移植した。移植はフィルムが移植面（下骨側）に存在するように行った。移植後１か月の時点で剖検し、移植部位周辺の骨軟骨組織切片を作製した。組織はホルマリン固定を行った後、パラフィンで包埋し、移植物を含む組織切片を作製した。切片染色はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）、またはサフラニンＯ染色、あるいはサフラニンＯ及びファストグリーン染色を行った。
なお、ここでフィルムを用いている場合のフィルムとは、上記［９］で用意した架橋度１３（上記［１０］で測定）のフィルムを、欠損の底面積大（直径５ｍｍ）に切り出したものを使用した。【０１３４】
その結果を図１５に示す。図１５に示す通り、分割した箇所でも良好な軟骨再生が認められた。この結果から、分割して移植した場合であっても、十分な軟骨基質充填割合とフィルムを有することで、十分な軟骨再生（評価Ａ）と十分な繊維性軟組織の浸潤抑制（評価Ａ）を示すことが分かった。これにより、関節鏡のポータルを通過させるために、一度分割してから移植を行っても有効性に影響がないことが確認された。【０１３５】
[２０]  欠損部位への固定が妥当であるかの検証
実際の医療現場においては、移植後に、移植物を欠損部位にピンで固定したいというニーズが生じることが多い。この固定が可能であるかは、移植物にピンで穴を空けた場合であっても、軟骨再生に重大な負の影響を及ぼさないことが必要である。このことを評価する方法として、十分な軟骨基質充填割合を有する軟骨基質ありスポンジを、骨軟骨欠損部位に留置したのちに、固定ピンにより貫通孔をあける検証を実施した。軟骨基質ありスポンジ及びフィルム、さらには欠損底面部の骨にまで貫く貫通孔をあけた場合であっても、軟骨再生に悪影響が出ないことを検証する。【０１３６】
上記［１３］及び［１４］で作製した軟骨基質ありスポンジ（軟骨基質充填割合９０％）と、上記［９］及び［１０］で作製した架橋度１３のフィルムを、上記［１５］で作製したウサギ軟骨欠損部位に移植し、その後に、直径０．８ｍｍあるいは直径１．５ｍｍのキルシュナー鋼線を用いて、スポンジ、フィルム及び下骨に至る貫通孔を空けた。その貫通孔が存在する状態のまま、１か月の時点で剖検し、移植部位周辺の骨軟骨組織切片を作製した。組織はホルマリン固定を行った後、パラフィンで包埋し、移植物を含む組織切片を作製した。切片染色はＨＥ染色（ヘマトキシリン・エオシン染色）、またはサフラニンＯ染色、あるいはサフラニンＯ及びファストグリーン染色を行った。【０１３７】
なお、ここでフィルムを用いている場合のフィルムとは、上記［９］で用意した架橋度１３（上記［１０］で測定）のフィルムを、欠損の底面積大（直径５ｍｍ）に切り出したものであり、フィルムが移植面（下骨側）に存在する形で設置されている。【０１３８】
その結果を図１６に示す。図１６に示す通り、直径０．８ｍｍ、直径１．５ｍｍの貫通孔をあけた場合であっても、１ヵ月後の軟骨再生（評価Ａ）、繊維性軟組織の浸潤抑制（評価Ａ）に影響はなく、良好な再生効果を示すことが明らかとなった。これにより、移植物を固定ピンで刺して固定することが可能であることが示された。【０１３９】
[２１]リコンビナントペプチドによるピン作製
上記［１９］のような固定を行う固定ピンとしては、骨に作った貫通孔に刺した後、抜け出てこない性能を有することが求められる。同時に、生体吸収性であることも求められる。既存製品では例えばポリ−Ｌ−乳酸で作製されているグランドフィックス（グンゼ社製）などを用いることが可能である。【０１４０】
さらに、上記［１］のＣＢＥ３を用いることでリコンビナントペプチド製のピンを作製することができた。上記［１］のＣＢＥ３を用い、１０質量％のＣＢＥ３水溶液を調製した。その後、図１７及び１８に示すテフロン（登録商標）製の鋳型に上記水溶液を流し込み、乾燥させた後に、減圧下１６０℃で２０時間の熱処理によって、熱架橋を施すことでＣＢＥ３製ピン（直径１ｍｍ、長さ５ｍｍ）を作製した。【０１４１】
一方、骨の代替物として、海綿骨試験材料を用意し、そこに直径０．８ｍｍのキルシュナー鋼線（K-wire）を用いて貫通孔を作製した。海綿骨試験材料にできた直系０．８ｍｍの孔に上記のCBE3製ピンを刺しこみ、水で十分膨潤させた。このCBE3製ピンは１日留置後でも抜けることなく形を維持しており、固定に使用できるピンであることが確認された（図１８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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