(57)【要約】  本発明は、還元型グルタチオンの安定かつ加工しやすい結晶およびその製造方法を提供する。本発明によれば、還元型グルタチオンの金属塩のアモルファスを疎水性有機溶媒に懸濁した後、得られた懸濁液に水を添加することにより還元型グルタチオンの金属塩の結晶を析出させることにより、還元型グルタチオンの金属塩の結晶を製造する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元型グルタチオンの金属塩の結晶。
【請求項２】
還元型グルタチオンの金属塩の結晶が、還元型グルタチオンと、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムからなる群より選ばれる金属との塩の結晶である請求項１記載の還元型グルタチオンの金属塩の結晶。
【請求項３】
還元型グルタチオンの金属塩の結晶が、還元型グルタチオンとナトリウムとの塩（以下、「還元型グルタチオン・ナトリウム塩」という）の結晶（以下、「還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶」という）である請求項１記載の還元型グルタチオンの金属塩の結晶。
【請求項４】
還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶が、還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶である、請求項３記載の結晶。
【請求項５】
粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、１９．９０°±０．２０°、２５．５８°±０．２０°および２６．８８°±０．２０°にピークを有することを特徴とする請求項４記載の結晶。
【請求項６】
粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、さらに２０．１６°±０．２０°、２４．６８°±０．２０°、２６．３０°±０．２０°、２７．６８°±０．２０°および３３．２０±０．２０°にピークを有することを特徴とする請求項５記載の結晶。
【請求項７】
粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、さらに１７．９０°±０．２０°、２０．８６°±０．２０°、２２．１０°±０．２０°および２５．３０°±０．２０°にピークを有することを特徴とする請求項６記載の結晶。
【請求項８】
粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、さらに６．４２±０．２０°、１８．９０±０．２０°および２９．３０±０．２０°にピークを有することを特徴とする請求項７記載の結晶。
【請求項９】
単結晶Ｘ線構造解析において、−１７３℃で測定した場合、次の概略的単位胞パラメーター：ａ＝２７．８８１Å；ｂ＝１０．８１８Å；ｃ＝４．８８１Å；α＝９０°；β＝９０°；γ＝９０°；Ｖ＝１４７２．２Å３；Ｚ＝４；を有し、かつ空間群がＰ２１２１２１（＃１９）；である、請求項４〜８のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項１０】
還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶が、還元型グルタチオン・ナトリウム塩の無水結晶である、請求項３記載の結晶。
【請求項１１】
粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、２５．９２°±０．２０°、２０．２８°±０．２０°および２７．２８°±０．２０°にピークを有することを特徴とする請求項１０記載の結晶。
【請求項１２】
粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、さらに２０．５２°±０．２０°、２５．０２°±０．２０°、２１．２６°±０．２０°、２６．６６°±０．２０°および２８．０８±０．２０°にピークを有することを特徴とする請求項１１記載の結晶。
【請求項１３】
粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、さらに２２．４８°±０．２０°、３３．５６°±０．２０°、１９．７０°±０．２０°および１８．３２°±０．２０°にピークを有することを特徴とする請求項１２記載の結晶。
【請求項１４】
粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、さらに１９．２６±０．２０°、２８．７４±０．２０°および２９．６４±０．２０°にピークを有することを特徴とする請求項１３記載の結晶。
【請求項１５】
還元型グルタチオンの金属塩のアモルファスを疎水性有機溶媒に懸濁した後、得られた懸濁液に水を添加することにより還元型グルタチオンの金属塩の結晶を析出させる工程を含む還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
【請求項１６】
疎水性有機溶媒が、ヘキサン又はトルエンである請求項１５記載の還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
【請求項１７】
還元型グルタチオンの金属塩のアモルファスを疎水性有機溶媒に懸濁した後、得られた懸濁液にメタノール又はエタノールの水溶液を添加することにより還元型グルタチオンの金属塩の結晶を析出させる工程を含む還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
【請求項１８】
金属の水酸化物水溶液に還元型グルタチオンのフリー体を溶解させてｐＨを５．０〜８．０に調整し、還元型グルタチオンの金属塩の水溶液を取得した後、得られた水溶液を濃縮し、次に当該濃縮水溶液に対して０．１〜３倍量のＣ１〜Ｃ６のアルコールを該濃縮水溶液に少量ずつ徐々に添加し、その後還元型グルタチオンの金属塩の結晶を種晶として添加して還元型グルタチオンの金属塩の結晶を析出させる工程を含む還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
【請求項１９】
還元型グルタチオンの金属塩の結晶が、還元型グルタチオンと、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムからなる群より選ばれる金属との塩の一水和物結晶である請求項１５、１７又は１８記載の還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
【請求項２０】
還元型グルタチオンの金属塩の結晶が、還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶である請求項１５、１７または１８記載の還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
【請求項２１】
Ｃ１〜Ｃ６のアルコールが、メタノールまたはエタノールである請求項１８記載の還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
【請求項２２】
還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶を、８０℃以上で、３時間以上乾燥させることを特徴とする、還元型グルタチオン・ナトリウム塩の無水結晶の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば健康食品、医薬品、化粧品等の製品、原料または中間体等として有用である還元型グルタチオンの結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
還元型グルタチオン（γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−シスチニル−グリシン）は、生物に広く存在する物質であり、補酵素として作用するほか、肝臓において解毒作用を有することが知られている。よって還元型グルタチオンは医薬品、健康食品および化粧品等の製品、原料または中間体として広く用いられている。【０００３】
上記した製品、原料及び中間体に用いられる還元型グルタチオンの形態は、その取り扱いの良さから粉末であることが好ましい。しかしながら、凍結乾燥やスプレードライ等の一般的な乾燥粉末の製造法で得られる還元型グルタチオンの非結晶体（アモルファス）は、吸湿性が高くまた流動性も十分ではないため加工に適していない。【０００４】
還元型グルタチオンの結晶としては、そのフリー体の結晶は知られている（特許文献１）が、当該フリー体の結晶は溶解度が低いため液体製剤に不向きであり、また酸性であるため加工の際には注意が必要である。よって、保存安定性が良く加工しやすい形態の還元型グルタチオン結晶が求められていた。【０００５】
還元型グルタチオンがジスルフィド結合で連結した酸化型グルタチオン（グルタチオンの二量体）のフリー体の一水和物（特許文献２）、及び六水和物（特許文献３）は知られているが、還元型グルタチオンの水和物結晶及び塩結晶は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／０４７７９２号
【特許文献２】国際公開第２００３／０３５６７４号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１３２７２４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、例えば健康食品、医薬品、化粧品等の製品、原料または中間体等として有用な還元型グルタチオンの金属塩結晶を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の（１）〜（２２）に関する。
（１）還元型グルタチオンの金属塩の結晶。
（２）還元型グルタチオンの金属塩の結晶が、還元型グルタチオンと、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムからなる群より選ばれる金属との塩の結晶である上記（１）記載の還元型グルタチオンの金属塩の結晶。
（３）還元型グルタチオンの金属塩の結晶が、還元型グルタチオンとナトリウムとの塩（以下、「還元型グルタチオン・ナトリウム塩」という）の結晶（以下、「還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶」という）である上記（１）記載の還元型グルタチオンの金属塩の結晶。
（４）還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶が、還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶である、上記（３）記載の結晶。
（５）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、１９．９０°±０．２０°、２５．５８°±０．２０°および２６．８８°±０．２０°にピークを有することを特徴とする上記（４）記載の結晶。
（６）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、さらに２０．１６°±０．２０°、２４．６８°±０．２０°、２６．３０°±０．２０°、２７．６８°±０．２０°および３３．２０±０．２０°にピークを有することを特徴とする上記（５）記載の結晶。
（７）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、さらに１７．９０°±０．２０°、２０．８６°±０．２０°、２２．１０°±０．２０°および２５．３０°±０．２０°にピークを有することを特徴とする上記（６）記載の結晶。
（８）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、さらに６．４２±０．２０°、１８．９０±０．２０°および２９．３０±０．２０°にピークを有することを特徴とする上記（７）記載の結晶。
（９）単結晶Ｘ線構造解析において、−１７３℃で測定した場合、次の概略的単位胞パラメーター：ａ＝２７．８８１Å；ｂ＝１０．８１８Å；ｃ＝４．８８１Å；α＝９０°；β＝９０°；γ＝９０°；Ｖ＝１４７２．２Å３；Ｚ＝４；を有し、かつ空間群がＰ２１２１２１（＃１９）；である、上記（４）〜（８）のいずれか１に記載の結晶。
（１０）還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶が、還元型グルタチオン・ナトリウム塩の無水結晶である、上記（３）記載の結晶。
（１１）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、２５．９２°±０．２０°、２０．２８°±０．２０°および２７．２８°±０．２０°にピークを有することを特徴とする上記（１０）記載の結晶。
（１２）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、さらに２０．５２°±０．２０°、２５．０２°±０．２０°、２１．２６°±０．２０°、２６．６６°±０．２０°および２８．０８±０．２０°にピークを有することを特徴とする上記（１１）記載の結晶。
（１３）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、さらに２２．４８°±０．２０°、３３．５６°±０．２０°、１９．７０°±０．２０°および１８．３２°±０．２０°にピークを有することを特徴とする上記（１２）記載の結晶。
（１４）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）が、さらに１９．２６±０．２０°、２８．７４±０．２０°および２９．６４±０．２０°にピークを有することを特徴とする上記（１３）記載の結晶。
（１５）還元型グルタチオンの金属塩のアモルファスを疎水性有機溶媒に懸濁した後、得られた懸濁液に水を添加することにより還元型グルタチオンの金属塩の結晶を析出させる工程を含む還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
（１６）疎水性有機溶媒が、ヘキサン又はトルエンである上記（１５）記載の還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
（１７）還元型グルタチオンの金属塩のアモルファスを疎水性有機溶媒に懸濁した後、得られた懸濁液にメタノール又はエタノールの水溶液を添加することにより還元型グルタチオンの金属塩の結晶を析出させる工程を含む還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
（１８）金属の水酸化物水溶液に還元型グルタチオンのフリー体を溶解させてｐＨを５．０〜８．０に調整し、還元型グルタチオンの金属塩の水溶液を取得した後、得られた水溶液を濃縮し、次に当該濃縮水溶液に対して０．１〜３倍量のＣ１〜Ｃ６のアルコールを該濃縮水溶液に少量ずつ徐々に添加し、その後還元型グルタチオンの金属塩の結晶を種晶として添加して還元型グルタチオンの金属塩の結晶を析出させる工程を含む還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
（１９）還元型グルタチオンの金属塩の結晶が、還元型グルタチオンと、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムからなる群より選ばれる金属との塩の一水和物結晶である上記（１５）、（１７）又は（１８）記載の還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
（２０）還元型グルタチオンの金属塩の結晶が、還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶である上記（１５）、（１７）又は（１８）記載の還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
（２１）Ｃ１〜Ｃ６のアルコールが、メタノールまたはエタノールである上記（１８）記載の還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法。
（２２）還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶を、８０℃以上で、３時間以上乾燥させることを特徴とする、還元型グルタチオン・ナトリウム塩の無水結晶の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、例えば健康食品、医薬品、化粧品等の製品、原料または中間体等として有用である還元型グルタチオンの金属塩の結晶が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶の粉末Ｘ線回折のピークパターンを示す図である。グラフの縦軸は強度（単位ｃｐｓ）、横軸は回折角（２θ）（単位°）である。
【図２】図２は、還元型グルタチオン・ナトリウム塩の無水結晶の粉末Ｘ線回折のピークパターンを示す図である。グラフの縦軸は強度（単位ｃｐｓ）、横軸は回折角（２θ）（単位°）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．本発明の還元型グルタチオンの金属塩の結晶
本発明の還元型グルタチオンの金属塩の結晶は、無水結晶であっても水和物結晶であってもよい。好ましくは水和物結晶をあげることができ、より好ましくは一水和物結晶をあげることができる。一水和物結晶は保存安定性に優れるためである。
【００１２】
また、本発明の還元型グルタチオンの金属塩の結晶は、α晶およびβ晶などの結晶多形を含む結晶であってもよい。なかでも、α晶が好ましい。結晶としては総還元型グルタチオンの金属塩結晶に占めるα晶の比率が、９５％以上が好ましく、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．５％以上、最も好ましくは９９．９％以上である結晶をあげることができる。
【００１３】
本発明の還元型グルタチオンの金属塩の結晶は、還元型グルタチオンといずれかの金属との塩の結晶であれば金属には制限はない。金属としてはアルカリ金属及びアルカリ土類金属に属する金属が好ましく、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムからなる群より選ばれる金属がより好ましく、ナトリウムがさらに好ましい。
【００１４】
本発明の還元型グルタチオンの金属塩の結晶は、グルタチオンに対して、金属イオンが等価となる分子数を含む結晶をあげることができる。より具体的には、グルタチオンイオン価数に対して、金属イオン価数が、通常は０．５〜２、好ましくは０．８〜１．２、より好ましくは１．０をあげることができる。
【００１５】
また、本発明の還元型グルタチオンの金属塩の結晶としては、そのｐＨが通常は５．０〜８．０、より好ましくは５．５〜７．５、さらに好ましくは６．０〜７．０の結晶をあげることができる。
【００１６】
本発明の還元型グルタチオンとナトリウムとの塩（以下、「還元型グルタチオン・ナトリウム塩」という）の結晶（以下、「還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶」という）が一水和物結晶である場合、より具体的には、Ｘ線源としてＣｕＫαを用いた粉末Ｘ線回折を実施した際、その回折角（２θ）が、１９．９０°±０．２０°、２５．５８°±０．２０°および２６．８８°±０．２０°にピークを有する。
【００１７】
好ましくは２θが、さらに２０．１６°±０．２０°、２４．６８°±０．２０°、２６．３０°±０．２０°、２７．６８°±０．２０°および３３．２０±０．２０°にピークを有する。
【００１８】
より好ましくは（２θ）が、さらに１７．９０°±０．２０°、２０．８６°±０．２０°、２２．１０°±０．２０°および２５．３０°±０．２０°にピークを有する。
【００１９】
さらに好ましくは２θが、さらに６．４２±０．２０°、１８．９０±０．２０°および２９．３０±０．２０°にピークを有する。
【００２０】
もっとも好ましくは表１に示す値で規定される結晶であり、かつ図１で示される回折パターンを有する結晶である。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
粉末Ｘ線回折を行う際に用いる分析装置、および測定条件としては、分析装置は株式会社リガク社製の試料水平型多目的Ｘ線回折装置ＵｌｔｉｍａＩＶ、測定条件は、Ｘ線源に銅ターゲット封入管を用いて、単色化しないＸ線を試料に照射し、エネルギー分解型検出器を用いてＣｕＫα線（波長１．５４１Å）由来の回折Ｘ線を検出する条件をあげることができる。
【００２３】
さらに具体的な本発明の還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶は、単結晶Ｘ線構造解析において、−１７３℃で測定した場合、次の概略的単位胞パラメーター：ａ＝２７．８８１Å；ｂ＝１０．８１８Å；ｃ＝４．８８１Å；α＝９０°；β＝９０°；γ＝９０°；Ｖ＝１４７２．２Å３；Ｚ＝４；を有し、かつ空間群がＰ２１２１２１（＃１９）；であることが好ましい。
【００２４】
より好ましくは、単結晶Ｘ線構造解析において、−１７３℃で測定した場合、表２に示す値で規定される結晶である。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
本発明の還元型グルタチオンの金属塩の結晶構造を決定する方法としては、単結晶Ｘ線回折装置による構造解析（ＳＸＲＤ）を挙げることができる。還元型グルタチオンの金属塩の単結晶を回折計に取り付け、室温の大気中あるいは所定の温度の不活性ガス気流中で、所定の波長のＸ線を用いて、回折画像を測定する。回折画像から算出された面指数と回折強度の組から、直接法による構造決定と最小二乗法による構造精密化［Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ａ６４，１１２（２００８）］を行い、単結晶構造が得られる。単結晶Ｘ線回折装置としては、例えば、アジレント・テクノロジー社製の単結晶Ｘ線構造解析装置ＳｕｐｅｒＮｏｖａを使用することができる。
【００２７】
また、本発明の還元型グルタチオンの金属塩の結晶が無水結晶である場合、より具体的には、Ｘ線源としてＣｕＫαを用いた上述の粉末Ｘ線回折を実施した際、その回折角（２θ）が、２５．９２°±０．２０°、２０．２８°±０．２０°および２７．２８°±０．２０°にピークを有する。
【００２８】
好ましくは、回折角（２θ）が、さらに２０．５２°±０．２０°、２５．０２°±０．２０°、２１．２６°±０．２０°、２６．６６°±０．２０°および２８．０８±０．２０°にピークを有する。
【００２９】
より好ましくは、回折角（２θ）が、さらに２２．４８°±０．２０°、３３．５６°±０．２０°、１９．７０°±０．２０°および１８．３２°±０．２０°にピークを有する。
【００３０】
さらに好ましくは、回折角（２θ）が、さらに１９．２６±０．２０°、２８．７４±０．２０°および２９．６４±０．２０°にピークを有する。
【００３１】
もっとも好ましくは表３に示す値で規定される還元型グルタチオン・ナトリウム塩の無水結晶であり、かつ図２で示される回折パターンを有する結晶である。
【００３２】
【表３】
2016159317.tif 000005
【００３３】
２．本発明の還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造方法
［還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶の製造方法］
（１）結晶転移による製造方法
本発明の製造方法としては、還元型グルタチオンと金属との塩のアモルファスを疎水性有機溶媒に懸濁した後、得られた懸濁液に水を添加することにより還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶を析出させる工程を含む還元型グルタチオンの該金属塩の一水和物結晶の製造方法をあげることができる。
【００３４】
または、還元型グルタチオンと金属との塩のアモルファスを疎水性有機溶媒に懸濁した後、得られた懸濁液にメタノール又はエタノールの水溶液を添加することにより還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶を析出させる工程を含む還元型グルタチオンの該金属塩の一水和物結晶の製造方法をあげることができる。
【００３５】
還元型グルタチオンと金属との塩のアモルファスは、還元型グルタチオンのフリー体に等モルの金属の水酸化物と水とを加え中和した後、液体窒素を用いて急速凍結しつつ、乾燥させることにより取得できる。
【００３６】
還元型グルタチオンのフリー体は、アモルファスであっても結晶であってもよい。結晶は協和発酵バイオ株式会社から購入することもできる。アモルファスは、発酵法（国際公開第２００８／１２６７８４号）又は酵素法［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６６，２３３（２００４）、および日本国特開昭６０−１０５４９９号公報など］で得られる還元型グルタチオンを公知の方法で精製した後、凍結乾燥又はスプレードライ等の方法で乾燥することで得ることができる。
【００３７】
金属の水酸化物は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物が好ましく、特にナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムからなる群より選ばれる金属の水酸化物が好ましい。金属の水酸化物として最も好ましくは、水酸化ナトリウムをあげることができる。
【００３８】
還元型グルタチオンに金属の水酸化物と水とを加えて通常は１〜１２日間、好ましくは５〜１０日間、より好ましくは７日間攪拌して完全溶解させた後、液体窒素で急速に冷却し、市販の凍結乾燥機を用いて乾燥することで還元型グルタチオンと金属との塩のアモルファスを取得することができる。
【００３９】
還元型グルタチオンの金属塩のアモルファスを疎水性有機溶媒に分散し、懸濁させ、得られた懸濁液に水を添加することで、還元型グルタチオンの金属塩をアモルファスから結晶に転移させることができる。
【００４０】
疎水性有機溶媒としては、例えば、ヘキサンおよびトルエン等をあげることができる。該疎水性有機溶媒１ｍｌあたり、通常５〜１００ｍｇ、好ましくは１０〜８０ｍｇ、より好ましくは２０〜５０ｍｇの還元型グルタチオンの金属塩のアモルファスを分散させる。
【００４１】
還元型グルタチオンの金属塩溶液に添加する水の量は、多すぎるとアモルファスに水滴が供給され液状化してしまう。そのため水の添加量としては、例えば、疎水性有機溶媒１ｍｌに対して通常１〜２０μｌ、好ましくは２〜１５μｌ、より好ましくは２〜１２μｌ、特に好ましくは５〜１０μｌをあげることができる。
【００４２】
水を添加後、攪拌することにより還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶を取得することができる。得られる還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶として好ましくは、還元型グルタチオンとナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムからなる群より選ばれる金属との塩の一水和物結晶であり、より好ましくは還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶である。当該結晶は、減圧乾燥等により乾燥することができる。
【００４３】
また、上記において水の代わりにメタノール又はエタノールの水溶液を添加することによっても、還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶を取得することができる。
メタノール又はエタノールの水溶液の添加量としては、例えば、疎水性有機溶媒１ｍｌあたり８０％のメタノール又はエタノール水溶液として１０〜６０μｌをあげることができる。また、メタノールおよびエタノールのヘキサン等の疎水性有機溶媒との親和性および上記した疎水性有機溶媒に対する水の添加量を考慮すれば、８０％のメタノール又はエタノール水溶液の１０〜６０μｌに対応する濃度のアルコール溶液とその添加量であれば、還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶を取得することができる。
【００４４】
（２）種晶を用いた結晶の製造方法
上記（１）で取得される還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶を種晶として用いることにより、工業的な規模でも還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶を製造できる。
【００４５】
金属の水酸化物水溶液に、還元型グルタチオンのフリー体を溶解させてｐＨを５．０〜８．０に調整して還元型グルタチオンの金属塩水溶液を取得した後、当該水溶液を例えばフィルター等でろ過してから濃縮する。
【００４６】
濃縮水溶液を一旦冷却してから、Ｃ１〜Ｃ６のアルコールを徐々に添加して攪拌後、還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶を種晶として添加する。
【００４７】
析出した結晶を熟成させた後、再び冷却してから還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶を分離する。分離した結晶を乾燥することで還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶を取得することができる。
【００４８】
得られる還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶として好ましくは、還元型グルタチオンとナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムからなる群より選ばれる金属との塩の一水和物結晶であり、より好ましくは還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶である。
【００４９】
金属の水酸化物としては、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物が好ましく、特にナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムからなる群より選ばれる金属の水酸化物が好ましい。金属の水酸化物として最も好ましくは、水酸化ナトリウムをあげることができる。
【００５０】
金属の水酸化物水溶液に、還元型グルタチオンのフリー体を溶解させて通常はｐＨを５．０〜８．０、好ましくは５．５〜７．５、より好ましくは６．０〜７．０に調整し、還元型グルタチオンの金属塩の水溶液を取得する。還元型グルタチオンの金属塩の水溶液は、通常４００〜９００ｇ／Ｌ、好ましくは５００〜８５０ｇ／Ｌ、より好ましくは６００〜８００ｇ／Ｌになるまで減圧濃縮する。
【００５１】
濃縮水溶液は、通常１０〜３０℃、好ましくは１５〜２８℃、より好ましくは２０〜２５℃に冷却してからＣ１〜Ｃ６のアルコール、好ましくは濃縮水溶液の０．１〜３倍量、好ましくは０．５〜２倍量、より好ましくは当該濃縮水溶液とほぼ等量のメタノールまたはエタノールを、少量ずつ徐々に添加する。メタノールまたはエタノールを添加する速度は、例えば当該濃縮水溶液が１００ｍｌである場合、１．０〜２．０ｍｌ／ｍｉｎをあげることができる。
【００５２】
種晶として添加する還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶の量は、濃縮水溶液に含まれる還元型グルタチオンの量（フリー体換算）に対し、例えば、０．１〜５％、好ましくは０．２〜３％、より好ましくは０．３〜２％をあげることができる。
【００５３】
種晶を添加後、室温〜８０℃の間の任意の温度におくことにより、析出してくる結晶を熟成させることができる。加温は例えば２０℃／時間の割合で行うことが好ましい。
【００５４】
熟成時間は任意でよく、好ましくは３０分間〜２０時間、より好ましくは１時間〜１５時間をあげることができる。
【００５５】
加温熟成した場合は、冷却した後、当該冷却温度で結晶を熟成させることが好ましい。冷却は、例えば５℃／時間の割合で行うことができ、熟成温度としては１５℃〜室温、より好ましくは２０〜２５℃をあげることができる。
【００５６】
熟成時間は任意でよく、好ましくは３０分間〜５時間、より好ましくは１時間〜３時間をあげることができる。
【００５７】
熟成後、結晶をろ過または遠心分離することで結晶分離し、その後結晶を乾燥、例えば減圧乾燥することにより還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶を取得することができる。
【００５８】
［還元型グルタチオンの金属塩の無水結晶の製造方法］
上記で取得された還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶について、従来公知の任意の方法、例えば、減圧乾燥、真空乾燥、流動層乾燥、通風乾燥等により乾燥させることで白色の還元型グルタチオンの金属塩の無水結晶が得られる。好ましくは、還元型グルタチオンの金属塩の一水和物結晶を８０℃以上で、３時間以上乾燥させる方法を挙げることができる。具体的には、例えば還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶を１０５℃下で２０時間通風乾燥することにより、還元型グルタチオン・ナトリウム塩の無水結晶が得られる。
【実施例】
【００５９】
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］
結晶転移による還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造１【００６０】
（１）還元型グルタチオンの金属塩のアモルファスの製造
還元型グルタチオンのフリー体の結晶（協和発酵バイオ株式会社製）０．５ｇに、超純水５０ｍＬおよび２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液８１３μＬを加え、還元型グルタチオンを完全に溶解させた。液体窒素中に溶解液が入った容器を入れ、該溶液を急速凍結した後、凍結乾燥機中で３日以上減圧乾燥させることで、還元型グルタチオン・ナトリウム塩のアモルファスを取得した。【００６１】
（２）還元型グルタチオンの金属塩結晶への転移
上記（１）で取得した還元型グルタチオン・ナトリウム塩のアモルファス５０ｍｇをヘキサン１．０ｍＬに分散させた後、水を５μＬ添加し７日間攪拌した。析出した結晶をヌッチェろ過で分離し、その後減圧乾燥することで還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶を取得した。【００６２】
［実施例２］
結晶転移による還元型グルタチオンの金属塩の結晶の製造２【００６３】
実施例１（１）と同じ方法で取得した還元型グルタチオンのナトリウム塩のアモルファス２５０ｍｇをヘキサン５ｍＬに分散させた後、８０％エタノール水溶液５５μＬを添加し７日間攪拌した。析出した結晶をヌッチェろ過で分離し、その後減圧乾燥することで還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶を取得した。【００６４】
（試験例１）
粉末Ｘ線回折分析
実施例１および２で取得された還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶を、粉末Ｘ線回折分析に供した。
分析条件および実施例１で取得した結晶の測定結果は以下のとおりである。
分析装置：リガク電機社製  試料水平型多目的Ｘ線回折装置ＵｌｔｉｍａＩＶ
測定条件：Ｘ線源はＣｕＫα、測定波長１．５４１Å、モノクロメーターを使用した単色化は未実施のＫα線を使用【００６５】
【表４】
2016159317.tif 000006
【００６６】
また、粉末Ｘ線回折分析のチャート図を、図１に示した。
実施例２で取得した結晶も上記と同様の方法で分析し、図１のチャート図と実施例２で取得した結晶のチャート図とを比較したところ、両者はよく一致した。よって、実施例２で取得された結晶は、実施例１で取得された結晶と同一の結晶形であることが確認された。【００６７】
（試験例２）
水分含量の測定
実施例１で取得された結晶を以下の条件の熱分析に供した。
測定装置：エスエスアイナノテクノロジーズ社（現：日立ハイテクノロジーズ社）製熱分析装置ＴＧ／ＤＴＡ  ６２００型
測定条件：５０℃から１７０℃まで速度２℃／ｈで昇温した時の重量変化量から水分含量を算出
昇温開始から分解（１７０℃付近）までに約５％の重量減少が確認された。還元型グルタチオン・ナトリウム塩の理論水分値から、実施例１で取得された結晶は一水和物結晶であると考えられた。【００６８】
（試験例３）
吸湿性試験
実施例１（１）で取得した還元型グルタチオン・ナトリウム塩のアモルファスと、実施例１で最終的に取得した還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶の吸湿性を、以下の条件下で比較した。
保管条件：４０℃、相対湿度７５％（飽和食塩水で調整）
測定条件：サンプル約０．３ｇを精密天秤によって評量後、プラスチック容器に充填し、上記条件にて保管後、再度サンプルを評量して重量変化率を算出した
結果は以下のとおりであった。なお、試験開始時のそれぞれの重量を１００％として各経過時間のサンプルの重量を測定した。表５中、−は測定しなかったことを示す。【００６９】
【表５】
2016159317.tif 000007
【００７０】
アモルファスと比較して、結晶は吸湿しにくく保存安定性に優れていることが確認された。【００７１】
［実施例３］
還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶の製造
フリー体のグルタチオン結晶（ＫＯＪＩＮ．Ｃｏ．Ｌｔｄより購入）３１０ｇを水に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨを６．０に調整し、１０００ｍＬとした。得られた水溶液のうち２５０ｍＬを次の工程に供した。
当該２５０ｍＬの水溶液を濃縮して１００ｍＬとした濃縮液を２５℃に維持しつつ、１００％−メタノールを１１０ｍＬを１時間かけて滴下した後、実施例１で得られた結晶を種結晶として０．７５ｇ添加し、結晶を起晶させた。結晶スラリーを７０℃で１時間、２５℃で１２時間熟成させた後に当該結晶を濾取し、２５℃で通風乾燥させることにより、３５．７ｇの還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶を得た。【００７２】
（試験例４）
粉末Ｘ線回折分析
実施例３で取得された還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶を、粉末Ｘ線回折分析に供した。
分析条件および実施例３で取得した結晶の測定結果は以下のとおりである。
分析装置：リガク電機社製  試料水平型多目的Ｘ線回折装置ＵｌｔｉｍａＩＶ
測定条件：Ｘ線源はＣｕＫα、測定波長１．５４１Å、モノクロメーターを使用した単色化は未実施のＫα線を使用
図１のチャート図と実施例１で取得した結晶のチャート図とを比較したところ、両者はよく一致した。よって、実施例１で取得された結晶は、実施例１で取得された結晶と同一の結晶形であることが確認された。【００７３】
（試験例５）
単結晶Ｘ線構造解析
結晶の構造を決定するために、実施例３で取得された還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶に対し、測定装置（アジレント・テクノロジー社製単結晶Ｘ線構造解析装置ＳｕｐｅｒＮｏｖａ）を用いて単結晶Ｘ線回折（ＳＸＲＤ）を実施した。まず、還元型グルタチオンの金属塩の単結晶を回折計に取り付け、室温の大気中あるいは所定の温度の不活性ガス気流中で、所定の波長のＸ線を用いて、回折画像を測定した。次に、回折画像から算出された面指数と回折強度の組から、直接法による構造決定と最小二乗法による構造精密化［Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ａ６４，１１２（２００８）］を行い、単結晶構造を得た。その結果を表６にまとめる。
上記測定の結果、当該結晶が確かに還元型グルタチオン・ナトリウム塩の結晶であり、単位格子内に水分子を有する一水和物であることが確認された。また、フラック  パラメーター（Ｆｌａｃｋ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）［Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ａ３９，８７６．（１９８３）］は−０．１２（１１）とほぼ０となることから、解析結果の絶対構造に矛盾がないことを確認した。【００７４】
【表６】
2016159317.tif 000008
【００７５】
［実施例４］
還元型グルタチオン・ナトリウム塩の無水結晶の製造
実施例３で取得された還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶５．０ｇを１０５℃下で２０時間通風乾燥することにより、４．６ｇの白色結晶が得られた。
（試験例６）
水分含量の測定
実施例４で取得された結晶を以下の条件で測定した。
測定装置：平沼産業社製自動水分測定装置ＡＱＶ―２２００
当該結晶に含まれる水分量をカールフィッシャー法により測定した結果、１．３重量％であり、理論水分量との比較から、当該還元型グルタチオン・ナトリウム塩結晶は、還元型グルタチオン・ナトリウム塩の無水結晶であることがわかった。
（試験例７）
粉末Ｘ線回折分析
実施例４で取得された還元型グルタチオン・ナトリウム塩の無水結晶を、上述の試験例４と同様の手順で粉末Ｘ線回折分析に供した。その結果を表７に示す。また、粉末Ｘ線回折分析のチャート図を、図２に示した。【００７６】
【表７】
2016159317.tif 000009
【００７７】
表７に示す通り、実施例４で取得された結晶の粉末Ｘ線回折結果は、実施例１で得られた還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶と比較して、回折角が僅かに異なっていた。本結果は、乾燥の過程で還元型グルタチオン・ナトリウム塩の一水和物結晶から、分子の位置や配座に大きな変化を伴うことなく水分子が脱離し、結晶格子の僅かな収縮を伴って各回折ピークの強度が変化したことによると考えられた。同様の変化は参考文献（Ｃｒｙｓｔ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｅｓ．Ｖｏｌ．１６，ｐ１５４３，２０１６）中にも確認することができる。【００７８】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１５年３月３１日付で出願された日本特許出願（特願２０１５−０７４０８４）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明により、例えば健康食品、医薬品、化粧品等の製品、原料または中間体等として有用である還元型グルタチオンの結晶が提供される。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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