(57)【要約】  本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸とリガンド部を含む核酸複合体であって、該アンチセンス鎖中の、17個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖が標的β2GPI mRNA配列と相補的であり、該センス鎖の3’末端または5’末端に、以下の式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)または式(V)であらわされるリガンド部を有する、前記核酸複合体等を提供する。2017010575.tif 000087
2017010575.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸とリガンド部を含む核酸複合体であって、
該アンチセンス鎖中の、17個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表4−1〜表4−16に記載された群から選択される標的β2GPI mRNA配列と相補的であり、
該センス鎖の3’末端または5’末端に、式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)または式(V)
【化１】
2017010575.tif 000082
（式中、
Xは、オリゴヌクレオチド-P(Z1)(Z2)-であり、ただし該オリゴヌクレオチドは該センス鎖であり、
Qは、存在しないか、または-T4-[Q4-P4]q4-であり、
Rは、以下に示す構造
【化２】
2017010575.tif 000083
であり、
Z1およびZ2は、それぞれ独立してOまたはSであり；
q1、q2、q3およびq4は、それぞれ独立して、0〜20の整数であり；
P1、P2、P3およびP4、ならびにT1、T2、T3およびT4は、それぞれ独立して、存在しないか、または-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-NH-CO-、-CO-O-もしくはCO-NH-であり、ただし、q1、q2、q3およびq4がそれぞれ2〜20の整数であるとき、それぞれのP1、P2、P3およびP4は、同一または異なっていてもよく、
Q1、Q2、Q3およびQ4は、それぞれ独立して、存在しないか、または置換もしくは無置換の炭素数1〜14のアルキレンであり、ただし、q1、q2、q3およびq4がそれぞれ2〜20の整数であるとき、それぞれのQ1、Q2、Q3およびQ4は、同一または異なっていてもよく、
L1、L2およびL3は、それぞれ独立して、糖リガンドである）であらわされるリガンド部を有する、核酸複合体。
【請求項２】
L1、L2およびL3の1つ以上が、以下に示す構造
【化３】
2017010575.tif 000084
(式中、Acはアセチル基をあらわす)
であらわされる糖リガンドである、請求項1記載の核酸複合体。
【請求項３】
L1、L2およびL3が同一である、請求項1または2記載の核酸複合体。
【請求項４】
T1、T2およびT3が同一であり、
q1、q2およびq3が同一であり、
Q1、Q2およびQ3が同一であり、かつ
P1、P2およびP3が同一である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項５】
Rが、
【化４】
2017010575.tif 000085
(式中、Acはアセチル基をあらわす)
である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項６】
R-Q-が、
【化５】
2017010575.tif 000086
(式中、Acはアセチル基をあらわし、Q4’は置換もしくは無置換の炭素数1〜14のアルキレンである)
である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項７】
二本鎖核酸のセンス鎖3’末端に、式(I)〜式(V)のいずれかであらわされるリガンド部を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項８】
二本鎖核酸のセンス鎖5’末端に、式(I)〜式(V)のいずれかであらわされるリガンド部を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項９】
二重鎖領域が11〜27個の塩基対を含む二重鎖領域であり、表4−1〜表4−16に記載された群から選択される標的β2GPI mRNA配列と相補的であるアンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドが、該標的β2GPI mRNA配列の3’末端から2番目のリボヌクレオチドと相補する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項１０】
センス鎖が、21〜25個のヌクレオチド鎖長であり、かつアンチセンス鎖が、21〜25個のヌクレオチド鎖長である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項１１】
センス鎖が、21〜25個のヌクレオチド鎖長であり、かつアンチセンス鎖が、21〜25個のヌクレオチド鎖長である二本鎖核酸が、19塩基対〜21塩基対の二重鎖領域を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項１２】
センス鎖の3’末端およびアンチセンス鎖の5’末端は、平滑末端を形成する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項１３】
二本鎖核酸が、2’-修飾ヌクレオチドを含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項１４】
二重鎖領域内のヌクレオチドの50〜100％が2’-修飾ヌクレオチドである、請求項13記載の核酸複合体。
【請求項１５】
2’-修飾ヌクレオチドが、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-F修飾ヌクレオチドまたは2’-H修飾ヌクレオチドである、請求項13または14記載の核酸複合体。
【請求項１６】
アンチセンス鎖が、表2-1〜2-18、表3-1〜3-18または表4-1〜4-16に記載されたアンチセンス鎖群から選択される配列を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項１７】
センス鎖が、表2-1〜2-18、表3-1〜3-18または表4-1〜4-16に記載されたセンス鎖群から選択される配列を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項１８】
表2-1〜2-18、表3-1〜3-18または表4-1〜4-16に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖から成る群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の核酸複合体。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか1項に記載の核酸複合体を含む、核酸複合体含有組成物。
【請求項２０】
請求項19記載の組成物を用いて二本鎖核酸を細胞内に導入することを含む、β2GPI遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項２１】
細胞が、哺乳動物の肝臓にある細胞である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
細胞内に導入する方法が、静脈内投与または皮下投与によって細胞内に導入する方法である、請求項20または21に記載の方法。
【請求項２３】
請求項19記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、β2GPI関連疾患の治療方法。
【請求項２４】
β2GPI関連疾患が、自己免疫疾患または血栓症である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
投与する方法が、静脈内投与または皮下投与である、請求項23または24記載の方法。
【請求項２６】
請求項19記載の組成物を含む、β2GPI関連疾患の治療に用いるための医薬。
【請求項２７】
β2GPI関連疾患が、自己免疫疾患または血栓症である、請求項26記載の医薬。
【請求項２８】
静脈内投与用または皮下投与用である、請求項26または27記載の医薬。
【請求項２９】
請求項19記載の組成物を含む、自己免疫疾患または血栓症の治療剤。
【請求項３０】
静脈内投与用または皮下投与用である、請求項29記載の自己免疫疾患または血栓症の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β2GPI遺伝子発現を抑制する核酸複合体、該複合体を含む組成物および該組成物を含む医薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
β2-Glycoprotein 1（β2GPI，別名：apolipoprotein H(apoH)）は326残基のアミノ酸から構成される可溶性の糖タンパク質であり、主に肝臓で産生される (インターナショナル  ジャーナル  オブ  クリニカル  アンド  ラボラトリー  リサーチ(International Journal of Clinical and Laboratory Research), 1992年, 第21巻, p256-263参照)。β2GPIは多彩な生理作用を有すると考えられており、血小板凝集反応、凝固・線溶反応、酸化LDLのマクロファージへの取り込みに関与していることが報告されている(非特許文献1）。【０００３】
疾患との関連について、β2GPIは抗リン脂質抗体症候群(APS)や全身性エリテマトーデス(SLE)といった自己免疫疾患において出現する抗リン脂質抗体の主要な対応抗原であることが知られている(非特許文献2)。抗β2GPI抗体は疾患の病態形成にも深く関与しており、β2GPIと抗β2GPI抗体によって形成される複合体は血管内皮細胞、単球、血小板、栄養芽細胞(trophoblast)といった様々な細胞の膜上受容体に活性化シグナルを発生させ、その結果、血栓症や妊娠異常といったAPSに特徴的な病態を引き起こし得ることが動物モデルを用いた研究ならびに臨床研究より明らかとなっている(非特許文献3）。β2GPIおよび抗β2GPI抗体からなる免疫複合体の形成を特異的に阻害することにより、前記疾患を予防あるいは治療できると期待できるが、β2GPIは血中に50-500μg/mLという比較的高濃度で存在しており、これら全てのβ2GPIを例えば一般的な抗体医薬によって阻害し続けることは容易ではない(非特許文献4）。【０００４】
一方、標的遺伝子の発現を抑制する方法として、例えばRNA干渉(RNA interference、以下、「RNAi」とよぶ)を利用した方法等が知られており、具体的には、線虫において標的とする遺伝子と同一の配列を有する二本鎖RNAを導入することにより、該標的遺伝子の発現が特異的に抑制される現象が報告されている(“ネイチャー(Nature)”, 1998年, 第391巻, 第6669号, p.806-811参照)。また、ショウジョウバエにおいて長い二本鎖RNAの代わりに、21〜23塩基の長さの二本鎖RNAを導入することによっても、標的遺伝子の発現が抑制されることが見出され、これはshort interfering RNA(siRNA)と名づけられている(国際公開第01/75164号参照)。【０００５】
RNAiについては、in  vivo試験においても多く検証されており、50塩基対以下のsiRNAを用いた胎児の動物での効果(米国特許出願公開第2002/132788号明細書参照)および成体マウスでの効果(国際公開第03/10180号参照)が報告されている。また、siRNAをマウス胎児に静脈内投与した場合に、腎臓、脾臓、肺、膵臓および肝臓の各臓器で特定の遺伝子の発現抑制効果が確認されている(“ネイチャー  ジェネティクス(Nature Genetics)”, 2002年, 第32巻, 第1号, p.107-108参照)。さらに、脳細胞においてもsiRNAを直接投与することで特定の遺伝子が発現抑制されることが報告されている(“ネイチャー  バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)”, 2002年, 第20巻, 第10号, p.1006-1010参照)。【０００６】
インビボにおける効果的な薬物(特に核酸類)の送達法の1つとして、標的化化合物と核酸類(特にsiRNA類)との核酸複合体(コンジュゲート)を用いることが報告されている。標的化化合物としては、細胞外に発現する受容体に結合可能なリガンドが挙げられる。その中でも、特に、肝細胞に極めて高発現しているアシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）に結合可能であるリガンドとしてN-アセチル-D-ガラクトサミン(GalNAc）等を利用した核酸複合体が複数報告されている。近年では、これらのリガンドとsiRNA類とを結合した核酸複合体が肝細胞に効率的に送達されることが報告されている(非特許文献5)。【０００７】
標的化化合物とsiRNA類の複合体は、例えば、特許文献1〜4等に記載されている。【０００８】
特許文献1および2には、例えば、以下に示す核酸複合体【０００９】
【化１】
2017010575.tif 000003
(式中、Acはアセチル基をあらわす。以下、同様)
が開示されている。
また、特許文献3には、例えば、以下に示す核酸複合体【００１０】
【化２】
2017010575.tif 000004
が開示されている。
さらに、特許文献4にも同様の核酸複合体が開示されている。【００１１】
そして、特許文献5および6には、ヒトのβ2GPI遺伝子をターゲットとするsiRNA配列の一部は開示されているが、該siRNA配列がヒトβ2GPI遺伝子の発現を抑制することは開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第2009/073809号
【特許文献２】国際公開第2013/075035号
【特許文献３】国際公開第2013/166121号
【特許文献４】国際公開第2011/104169号
【特許文献５】国際公開第2005/116204号
【特許文献６】国際公開第2008/043561号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】アナルズ  オブ  ニューヨーク  アカデミー  サイエンシズ(Annals of the New York Academy of Sciences), 2013年, 第1285巻, p44-58
【非特許文献２】ネイチャー  レビュー  リウマトロジー(Nature review rheumatology), 2011年, 第7巻, 第6号, p330-339
【非特許文献３】ザ  ニューイングランド  ジャーナル  オブ  メディシン(The NEW ENGLAND JOURNAL of MEDICINE), 2013年, 第368巻, 第11号, p1033-1044
【非特許文献４】ジャーナル  オブ  トロンボシス  アンド  ヘモスタシス(Journal of Thrombosis and Haemostasis), 2011年, 第9巻, 第7号, p1275-1284
【非特許文献５】ジャーナル  オブ  アメリカン  ケミカル  ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 2014年, 第136巻, p16958?16961
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、β2GPI遺伝子発現を抑制する核酸複合体、該複合体を含む組成物および該組成物を含む医薬等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下の(1)〜(30)に関する。
(1) センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸とリガンド部を含む核酸複合体であって、
該アンチセンス鎖中の、17個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表4-1〜表4-16に記載された群から選択される標的β2GPI mRNA配列と相補的であり、
該センス鎖の3’末端または5’末端に、式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)または式(V)
【化３】
2017010575.tif 000005
（式中、
Xは、オリゴヌクレオチド-P(Z1)(Z2)-であり、ただし該オリゴヌクレオチドは該センス鎖であり、
Qは、存在しないか、または-T4-[Q4-P4]q4-であり、
Rは、以下に示す構造
【化４】
2017010575.tif 000006
であり、
Z1およびZ2は、それぞれ独立してOまたはSであり；
q1、q2、q3およびq4は、それぞれ独立して、0〜20の整数であり；
P1、P2、P3およびP4、ならびにT1、T2、T3およびT4は、それぞれ独立して、存在しないか、または-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-NH-CO-、-CO-O-もしくはCO-NH-であり、ただし、q1、q2、q3およびq4がそれぞれ2〜20の整数であるとき、それぞれのP1、P2、P3およびP4は、同一または異なっていてもよく、
Q1、Q2、Q3およびQ4は、それぞれ独立して、存在しないか、または置換もしくは無置換の炭素数1〜14のアルキレンであり、ただし、q1、q2、q3およびq4がそれぞれ2〜20の整数であるとき、それぞれのQ1、Q2、Q3およびQ4は、同一または異なっていてもよく、
L1、L2およびL3は、それぞれ独立して、糖リガンドである）であらわされるリガンド部を有する、核酸複合体。
(2) L1、L2およびL3の1つ以上が、以下に示す構造
【化５】
2017010575.tif 000007
(式中、Acはアセチル基をあらわす)
であらわされる糖リガンドである、前記(1)記載の核酸複合体。
(3) L1、L2およびL3が同一である、前記(1)または(2)記載の核酸複合体。
(4) T1、T2およびT3が同一であり、
q1、q2およびq3が同一であり、
Q1、Q2およびQ3が同一であり、かつ
P1、P2およびP3が同一である、前記(1)〜(3)のいずれかに記載の核酸複合体。
(5) Rが、
【化６】
2017010575.tif 000008
(式中、Acはアセチル基をあらわす)
である、前記(1)〜(4)のいずれかに記載の核酸複合体。
(6) R-Q-が、
【化７】
2017010575.tif 000009
(式中、Acはアセチル基をあらわし、Q4’は置換もしくは無置換の炭素数1〜14のアルキレンである)
である、前記(1)〜(5)のいずれかに記載の核酸複合体。
(7) 二本鎖核酸のセンス鎖3’末端に、式(I)〜式(V)のいずれかであらわされるリガンド部を有する、前記(1)〜(6)のいずれかに記載の核酸複合体。
(8) 二本鎖核酸のセンス鎖5’末端に、式(I)〜式(V)のいずれかであらわされるリガンド部を有する、前記(1)〜(6)のいずれかに記載の核酸複合体。
(9) 二重鎖領域が11〜27個の塩基対を含む二重鎖領域であり、表4−1〜表4−16に記載された群から選択される標的β2GPI mRNA配列と相補的であるアンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドが、該標的β2GPI mRNA配列の3’末端から2番目のリボヌクレオチドと相補する、前記(1)〜(8)のいずれかに記載の核酸複合体。
(10) センス鎖が、21〜25個のヌクレオチド鎖長であり、かつアンチセンス鎖が、21〜25個のヌクレオチド鎖長である、前記(1)〜(9)のいずれかに記載の核酸複合体。
(11) センス鎖が、21〜25個のヌクレオチド鎖長であり、かつアンチセンス鎖が、21〜25個のヌクレオチド鎖長である二本鎖核酸が、19塩基対〜21塩基対の二重鎖領域を含む、前記(1)〜(10)のいずれかに記載の核酸複合体。
(12) センス鎖の3’末端およびアンチセンス鎖の5’末端は、平滑末端を形成する、前記(1)〜(9)のいずれかに記載の核酸複合体。
(13) 二本鎖核酸が、2’-修飾ヌクレオチドを含む、前記(1)〜(12)のいずれかに記載の核酸複合体。
(14) 二重鎖領域内のヌクレオチドの50〜100％が2’-修飾ヌクレオチドである、前記(13)記載の核酸複合体。
(15) 2’-修飾ヌクレオチドが、2’-O-メチル修飾ヌクレオチド、2’-F修飾ヌクレオチドまたは2’-H修飾ヌクレオチドである、前記(13)または(14)記載の核酸複合体。
(16) アンチセンス鎖が、表2-1〜2-18、表3-1〜3-18または表4-1〜4-16に記載されたアンチセンス鎖群から選択される配列を含む、前記(1)〜(15)のいずれかに記載の核酸複合体。
(17) センス鎖が、表2-1〜2-18、表3-1〜3-18または表4-1〜4-16に記載されたセンス鎖群から選択される配列を含む、前記(1)〜(15)のいずれかに記載の核酸複合体。
(18) 表2-1〜2-18、表3-1〜3-18または表4-1〜4-16に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖から成る群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列を含む、前記(1)〜(8)のいずれかに記載の核酸複合体。
(19) 前記(1)〜(18)のいずれかに記載の核酸複合体を含む、核酸複合体含有組成物。
(20) 前記(19)記載の組成物を用いて二本鎖核酸を細胞内に導入することを含む、β2GPI遺伝子の発現を抑制する方法。
(21) 細胞が、哺乳動物の肝臓にある細胞である、前記(20)記載の方法。
(22) 細胞内に導入する方法が、静脈内投与または皮下投与によって細胞内に導入する方法である、前記(20)または(21)に記載の方法。
(23) 前記(19)記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、β2GPI関連疾患の治療方法。
(24) β2GPI関連疾患が、自己免疫疾患または血栓症である、前記(23)記載の方法。
(25) 投与する方法が、静脈内投与または皮下投与である、前記(23)または(24)記載の方法。
(26) 前記(19)記載の組成物を含む、β2GPI関連疾患の治療に用いるための医薬。
(27) β2GPI関連疾患が、自己免疫疾患または血栓症である、前記(26)記載の医薬。
(28) 静脈内投与用または皮下投与用である、前記(26)または(27)記載の医薬。
(29) 前記(19)記載の組成物を含む、自己免疫疾患または血栓症の治療剤。
(30) 静脈内投与用または皮下投与用である、前記(29)記載の自己免疫疾患または血栓症の治療剤。
【発明の効果】
【００１６】
例えば本発明の核酸複合体を含む組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、β2GPI遺伝子発現を抑制し、β2GPI関連疾患を治療することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の核酸が標的とするβ2GPI遺伝子(β2GPIをコードする遺伝子)としては、Genbank Accession No.NM_000042として登録されているβ2GPI cDNA(配列番号３５４１)に対応する、β2GPIの完全長mRNAを産生する遺伝子が挙げられる。
【００１８】
本発明は、薬物としてのβ2GPI遺伝子の発現を低下または停止させる能力を有する二本鎖核酸とリガンド部を含む核酸複合体を提供する。
【００１９】
また、該複合体を含む核酸複合体含有組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、β2GPI遺伝子発現を抑制し、β2GPI関連疾患を治療する方法も提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、抗β2GPI抗体により媒介される障害を治療または予防するための方法も提供する。
【００２１】
本発明における核酸複合体は、二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端または5’末端に、式(I)、式(II)、式(III)、式(IV)または式(V)
【化８】
2017010575.tif 000010
（式中、
Xは、オリゴヌクレオチド-P(Z1)(Z2)-であり、ただし該オリゴヌクレオチドは該センス鎖であり、
Qは、存在しないか、または-T4-[Q4-P4]q4-であり、
Rは、以下に示す構造
【化９】
2017010575.tif 000011
であり、
Z1およびZ2は、それぞれ独立して、OまたはSであり；
q1、q2、q3およびq4は、それぞれ独立して、0〜20の整数であり；
P1、P2、P3およびP4、ならびにT1、T2、T3およびT4は、それぞれ独立して、存在しないか、または-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-NH-CO-、-CO-O-もしくはCO-NH-であり、ただし、q1、q2、q3およびq4がそれぞれ2〜20の整数であるとき、それぞれのP1、P2、P3およびP4は、同一または異なっていてもよく、
Q1、Q2、Q3およびQ4は、それぞれ独立して、存在しないか、または置換もしくは無置換の炭素数1〜14のアルキレンであり、ただし、q1、q2、q3およびq4がそれぞれ2〜20の整数であるとき、それぞれのQ1、Q2、Q3およびQ4は、同一または異なっていてもよく、
L1、L2およびL3は、それぞれ独立して、糖リガンドである）であらわされるリガンド部を有する核酸複合体である。
【００２２】
上記式(I)〜(V)中のXは、オリゴヌクレオチド-P(Z1)(Z2)-であり、該オリゴヌクレオチドは本発明の核酸複合体を構成する二本鎖核酸のセンス鎖をあらわす。
【００２３】
上記Z1およびZ2は、それぞれ独立して、OまたはSであり、Z1がOであり、かつZ2がSまたはOであることが好ましく、Z1とZ2が同時にOであることがより好ましい。
【００２４】
上記オリゴヌクレオチドを構成するセンス鎖は、後述するものが挙げられ、好ましいセンス鎖も後述と同様である。
【００２５】
上記式(I)〜(V)中のQは、存在しないか、または-T4-[Q4-P4]q4-であり、-T4-Q4-P4-であることが好ましく、-NH-CO-Q4-CO−（Q4は前記と同義）であることがより好ましい。
【００２６】
上記T4は、存在しないか、または-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-NH-CO-、-CO-O-もしくは-CO-NH-であり、-NH、-NH-CO−または-CO-NH-であることが好ましく、-NH-CO−であることがより好ましい。
【００２７】
上記Q４は、存在しないか、または置換もしくは無置換の炭素数1〜14のアルキレンであり、炭素数4〜14のアルキレンであることが好ましく、炭素数6〜12のアルキレンであることがより好ましく、炭素数8〜10のアルキレンであることがさらに好ましい。Q4が2つ以上存在する場合(上記式中のq4が2〜20の整数である場合)、それぞれのQ4は、同一または異なっていてもよい。
【００２８】
上記Q４’は、置換もしくは無置換の炭素数1〜14のアルキレンであり、炭素数4〜14のアルキレンであることが好ましく、炭素数6〜12のアルキレンであることがより好ましく、炭素数8〜10のアルキレンであることがさらに好ましい。
【００２９】
上記P4は、存在しないか、または-CO-、-NH-、-O-、-S-、-O-CO-、-NH-CO-、-CO-O-もしくは-CO-NH-であり、-CO-、-O-、-O-CO-、-NH-CO-、-CO-O-もしくは-CO-NH-であることが好ましく、-CO-、-O-、-NH-CO-もしくは-CO-NH-であることがより好ましい。なお、P4が2つ以上存在する場合(上記式中のq4が2〜20の整数である場合)、それぞれのQ4は、同一または異なっていてもよい。またP4が1つ存在する場合(上記式中のq4が1である場合)、P4は-CO-であることが好ましい。
【００３０】
上記q4は、0〜20の整数であり、0〜4であることが好ましく、1〜3であることがより好ましく、1〜2であることがさらに好ましい。また、上記式q4が2〜20の整数であるとき、それぞれのQ4およびP4は、同一または異なっていてもよい。
【００３１】
上記式(I)〜(V)中のRは、上記式(VI)であらわされる構造である。
【００３２】
上記式（VI）におけるq1、q2およびq3は、それぞれ独立して、0〜20の整数であり、q1、q2およびq3は、同一または異なって2〜4であることが好ましく、同一に2〜4であることがより好ましく、同一に3であることがさらに好ましい。
【００３３】
上記式(VI)中のQ1、Q2およびQ3は、それぞれ独立して、存在しないか、または置換もしくは無置換の炭素数1〜14のアルキレンであり、それぞれ独立して、炭素数1〜5のアルキレンであることが好ましく、炭素数2〜4のアルキレンであることがより好ましい。また、上記式(VI)中のq1、q2およびq3が2〜20の整数であるとき、それぞれのQ1、Q2およびQ3は、同一または異なっていてもよい。
【００３４】
上記式(I)〜(VI)中のQ1、Q2、Q3およびQ4の置換または無置換の炭素数1〜14のアルキレンにおけるアルキレン部分は、炭素数1〜14のアルキレンであればいずれであっても良い。炭素数1〜14のアルキレンとしては、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、ノニレン、デシレン、ウンデシレン、ドデシレン、トリデシレン、テトラデシレン等が挙げられる。
【００３５】
上記Q1、Q2、Q3およびQ4の定義において、置換または無置換の炭素数1〜14のアルキレンにおける置換基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル等のアルキル基、ヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基等の炭素数1〜4の直鎖状または分岐状のアルコキシ基、シアノ基、ならびにフルオロ基、クロロ基およびブロモ基等のハロゲン基等が挙げられる。
【００３６】
上記式(VI)中のL1、L2およびL3は、それぞれ独立して、糖リガンドである。
本発明において、糖リガンドとしては、標的細胞に発現している受容体に結合可能な糖類（単糖、二糖、三糖、多糖など）に由来する基を意味する。本発明においては、糖リガンドが、例えばグリコシド結合により結合する場合、糖リガンドを構成する糖類の結合に関与する水酸基を除いた部分が糖類に由来する基としての糖リガンドを意味する。また、例えばグリコシド結合により結合する場合、糖リガンドを構成する糖類の結合に関与する水酸基の水素原子を除いた部分が糖類に由来する基としての糖リガンドを意味する。
本発明においては、二本鎖核酸の標的細胞となる糖リガンドを選択すればよい。
単糖としては、例えばアロース、アルトース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、Ｄ−フシトール、Ｌ−フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、Ｄ−ガラクトサミニトール、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース−６−リン酸、グロース、グリセルアルデヒド、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース−６−リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロース、およびキシルロース等が挙げられる。
【００３７】
二糖、三糖、多糖としては、例えばアベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、２−デオキシリボース、２−デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース（ｅｖｅｍｉｔｒｏｓｅ）、フルクトオリゴ糖、ガルトオリゴ糖（ｇａｌｔｏ-ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β−マルトース、マルトリオース、マンナン−オリゴ糖、マンニノトリオース、メレチトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、ニゲロース、ノジリミシン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α，α−トレハロース、トラハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロース等が挙げられる。
【００３８】
糖類における各単糖は、Ｄ体またはＬ体であってもよく、Ｄ体とＬ体の任意割合による
混合物であってもよい。
糖類は、デオキシ糖（アルコールヒドロキシ基を水素原子に置換したもの）、アミノ糖（アルコールヒドロキシ基をアミノ基に置換したもの）、チオ糖（アルコールヒドロキシ基をチオールに置換したもの、またはＣ＝ＯをＣ＝Ｓに置換したもの、または環酸素を硫黄に置換したもの）、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖（環炭素を窒素に置換したもの）、イミノ糖（環酸素を窒素に置換したもの）、ホスファノ糖（環酸素をリンに置換したもの）、ホスファ糖（環炭素をリンに置換したもの）、Ｃ−置換単糖（非末端炭素原子における水素原子を炭素原子で置換したもの）、不飽和単糖、アルジトール（カルボニル基をＣＨＯＨ基で置換したもの）、アルドン酸（アルデヒド基をカルボキシ基に置換したもの）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸などを含んでいてもよい。
アミノ糖としては、糖類におけるアミノ単糖として、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン（ｋａｎｓｏｓａｍｉｎｅ）、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン（ｐｕｒｐｕｒｏｓａｍｉｎｅ）、ロドサミンなどが挙げられる。また、アミノ糖のアミノ基は、アセチル基などで置換されていてもよい。
シアル酸含有糖鎖としては、ＮｅｕＡｃを糖鎖非還元末端に含有する糖鎖が挙げられ、ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃを含有する糖鎖や、Ｎｅｕ５Ａｃα（２−６）Ｇａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃ等が挙げられる。
糖類における各単糖は、標的細胞に発現
している受容体に結合可能であることを限度として、置換基で置換されていてもよく、例えば、水酸基が置換されていてもよく、各単糖における水素原子がアジドおよび／または置換されていてもよいアリール基で１〜複数置換されていてもよい。
【００３９】
本発明の核酸複合体の糖リガンドとしては、標的とする各臓器に対応して標的細胞の表面に発現する受容体に結合する糖リガンドを選択することが好ましく、例えば標的細胞が肝細胞である場合、肝臓の細胞表面に発現する受容体に対する糖リガンドが好ましく、アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPR）に対する糖リガンドがより好ましい。
【００４０】
ASGPRに対する糖リガンドとしては、マンノースまたはN-アセチルガラクトサミンが好ましく、N-アセチルガラクトサミンがより好ましい。
ASGPRに対してより親和性の高い糖リガンドとして、例えばバイオオーガニック・メディシナル・ケミストリー(Bioorganic Medicinal Chemistry)、第17巻、7254-7264頁、2009年、およびジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー(Journal of American Chemical Society)、第134巻, 1978?1981頁、2012年等に記載の糖誘導体が知られており、これらを用いてもよい。
【００４１】
本発明の核酸複合体は、いずれかの窒素原子上の孤立電子対に、水素イオンが配位した場合に、製薬上許容し得る陰イオンと塩を形成していてもよい。
本発明において、製薬上許容し得る陰イオンとしては、例えば塩化物イオン、臭化物イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン等の無機イオン、酢酸イオン、シュウ酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、クエン酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン等の有機酸イオン等が挙げられる。
【００４２】
本発明の核酸複合体の製造法について説明する。なお、以下に示す製造法において、定義した基が該製造法の条件下で変化するかまたは該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法[例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第3版(Protective Groups in Organic Synthesis, third edition)、グリーン(T.W.Greene)著、John Wiley＆Sons Inc.(1999年)等に記載の方法]等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
【００４３】
製造方法1
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端に式(I)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-であるセンス鎖（オリゴヌクレオチドの3’末端が、式(I’)であらわされるセンス鎖）は、以下の方法にしたがって製造することができる。ここで、前記「Qの右末端の官能基が-CO-である」とは、式(I)中のQが-T4-[Q4-P4]q4-である場合において、q4が0であり、T4が-CO-であるか、またはq4が１以上であり、式(I)中の窒素原子に直接結合するQ中の−Q4-P−部分のP4が−CO−であることを示し、以下同様の意味を有する。
【００４４】
【化１０】
2017010575.tif 000012
(式中、P1はFmoc等の塩基により脱保護可能な保護基であり、DMTrはp,p’-ジメトキシトリチル基を表し、R’は、R基の各水酸基がアセチル基等の塩基で脱保護可能な保護基で保護された基を表し、Polymerは固相担体を表し、Q’は右末端の官能基が-CO-であるQを表す)
【００４５】
工程1
化合物(I-B)は、化合物(I-A)とp,p’-ジメトキシトリチルクロリドを、ピリジン等の溶媒中、必要に応じて共溶媒の存在下、0 ℃と100 ℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
共溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン、水等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
【００４６】
工程2
化合物(I-C)は、化合物(I-B)を、無溶媒でまたは溶媒中、1〜1000当量の2級アミン存在下、室温と200 ℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、1,2-ジメトキシエタン、ジオキサン、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、N,N-ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ピリジン、水等が挙げられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
2級アミンとしては、例えばジエチルアミン、ピペリジン等が挙げられる。
【００４７】
工程3
化合物(1-E)は、化合物(I-C)と化合物(I-D)を、無溶媒でまたは溶媒中、1〜30当量の塩基、縮合剤および必要に応じて0.01〜30当量の添加剤の存在下、室温と200 ℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程2で例示したものが挙げられる。
塩基としては、例えば炭酸セシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム  tert-ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、N-メチルモルホリン、ピリジン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)、N,N-ジメチル-4-アミノピリジン(DMAP)等が挙げられる。
縮合剤としては、例えば1,3-ジシクロヘキサンカルボジイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド・塩酸塩(EDC)、カルボニルジイミダゾール、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルホロホスファート、(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ)トリピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスファート、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート(HATU)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート(HBTU)、ヨウ化  2-クロロ-1-メチルピリジニウム等が挙げられる。
添加剤としては、例えば1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、4-ジメチルアミノピリジン(DMAP)等が挙げられる。
化合物(I-D)は、公知の方法(例えば、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958?16961頁、2014年参照)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【００４８】
工程4
化合物(I-F)は、化合物(I-E)とコハク酸無水物を、溶媒中、1〜30当量の塩基存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
【００４９】
溶媒としては、工程2で例示したものが挙げられる。
【００５０】
塩基としては、工程3で例示したものが挙げられる。
【００５１】
工程5
化合物(I-G)は、化合物(I-F)と末端がアミノ化された固相担体とを、無溶媒でまたは溶媒中、1〜30当量の塩基、縮合剤および必要に応じて0.01〜30当量の添加剤の存在下、室温と200℃の間の温度で、5分間〜100時間反応した後、無水酢酸/ピリジン溶液と室温と200℃の間の温度で5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程2で例示したものが挙げられる。
塩基、縮合剤および添加剤としては、それぞれ工程3で例示したものが挙げられる。
アミノ化された固相担体としては、例えば長鎖アルキルアミン細孔性ガラス(LCAA-CPG)等 が挙げられ、これらは市販品として得ることができる。
【００５２】
工程6
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端が、式(I)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体は、化合物(I-G)を用い、公知のオリゴヌクレオチド化学合成法で対応するヌクレオチド鎖を伸長した後に、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製を行うことで製造することができる。
【００５３】
公知のオリゴヌクレオチド化学合成法としては、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、CEM法 (ヌクレイック・アシッズ・リサーチ (Nucleic Acids Research), 第35巻, 3287頁、2007年参照)等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)により合成することができる。
【００５４】
固相からの脱離、脱保護は、オリゴヌクレオチド化学合成後、溶媒または無溶媒中、-80 ℃から200 ℃の間の温度で、10秒間から72時間塩基で処理することにより製造することができる。
【００５５】
塩基としては、例えばアンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ピペリジン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン(DBU)、炭酸カリウム等が挙げられる。
【００５６】
溶媒としては、水、メタノール、エタノール、THF等が挙げられる。
【００５７】
オリゴヌクレオチドの精製は、C18逆相カラムあるいは陰イオン交換カラム、好ましくは前述2つの手法を組み合わせにより可能である。精製後の核酸複合体純度は、90%以上、好ましくは95%以上とするのが望ましい。
【００５８】
上記工程3において、必要により、化合物(I-D)を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物(I-C)と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばQ’が-NH-CO-Q4’-CO-である場合(Q4’は置換または無置換の炭素数1〜14のアルキレンである)、工程3において、化合物(I-C)と、CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’は前記と同義)とを、工程3と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにR’-NH2(R’は前記と同義)と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’は前記と同義)およびR’-NH2(R’は前記と同義)は、公知の方法(例えば、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958?16961頁、2014年参照)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。ここで、Q4’において、置換または無置換の炭素数1〜14のアルキレンにおける置換基およびアルキレン部分は上記と同様である。
【００５９】
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端が、式(I)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-でないセンス鎖は、Qの構造に応じて、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。ここで、「Qの右末端の官能基が-CO-でないセンス鎖」とは、式(I)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-であるセンス鎖以外のものをいい、以下同様の意味をあらわす。
【００６０】
製造方法2
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端に式(II)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-であるセンス鎖（オリゴヌクレオチドの3’末端が、式(II’)であらわされるセンス鎖）は、以下の方法にしたがって製造することができる。
【００６１】
【化１１】
2017010575.tif 000013
(式中、 DMTr、R、R’、X、Q’、およびPolymerは前記と同義である。TBDMSはt-ブチルジメチルシリル基、Fmocは9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基を表す)
【００６２】
工程7
化合物(II-A)は、化合物(I-A)、t-ブチルジメチルシリルクロリドおよびジメチルアミノピリジンをN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)等の溶媒中、好ましくは２等量の塩基の存在下、0 ℃〜100 ℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
塩基としては、製造方法1の工程3で例示したものが挙げられる。
【００６３】
工程8
化合物(II-B)は、化合物(II-A)を用い、製造方法1の工程1と同様の条件にて製造することができる。
【００６４】
工程9
化合物(II-C)は、化合物(II-B)とフッ化n-テトラブチルアンモニウム(TBAF)を、溶媒中、室温と200 ℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程2で例示したものが挙げられる。
【００６５】
工程10
化合物(II-D)は、化合物(II-C)を用い、製造方法1の工程2と同様の条件にて製造することができる。
【００６６】
工程11
化合物(II-E)は、化合物(II-D)および化合物(I-D)を用い、製造方法1の工程3と同様の条件にて製造することができる。
【００６７】
工程12〜14
化合物(II’)は、化合物(II-E)を用い、製造方法1の工程4〜工程6と同様の条件にて製造することができる。
【００６８】
上記工程11において、必要により、化合物(I-D)を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物(II-C)と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばQ’が-NH-CO-Q4’-CO-である場合(Q4’は置換または無置換の炭素数1〜14のアルキレン)、工程11において、化合物(II-C)と、CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’は前記と同義)とを、工程11と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにR’-NH2(R’は前記と同義)と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’は前記と同義)およびR’-NH2(R’は前記と同義)は、公知の方法(例えば、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958−16961頁、2014年参照)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。ここで、Q4’において、置換または無置換の炭素数1〜14のアルキレンにおける置換基およびアルキレン部分は上記と同様である。
【００６９】
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端が、式(II)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-でないセンス鎖は、Qの構造に応じて、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらの組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【００７０】
製造方法3
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端に式(III)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-であるセンス鎖（オリゴヌクレオチドの3’末端が、式(III’)であらわされるセンス鎖）は、以下の方法にしたがって製造することができる。
【００７１】
【化１２】
2017010575.tif 000014
(式中、DMTr、Fmoc、R、R’、Q’、XおよびPolymerは前記と同義である。)
【００７２】
化合物(III’)は、化合物(III-A)を用い、製造方法1の工程1から工程6と同様の条件にて製造する事が出来る。なお、化合物(III-A)は市販品として得ることができる。
【００７３】
工程15
化合物(III-B)は、化合物(III-A)を用い、製造法1の工程1と同様の条件にて製造することができる。
化合物(III-A)は市販品として購入する事が出来る。
【００７４】
工程16
化合物(III-C)は、化合物(III-B)を用い、製造法1の工程2と同様の条件にて製造することができる。
【００７５】
工程17
化合物(III-E)は、化合物(III-C)を用い、製造法1の工程3と同様の条件にて製造することができる。
【００７６】
工程18〜20
化合物（III’）は、化合物（III-E）を用い、製造方法1の工程4〜工程6と同様の条件にて製造することができる。
【００７７】
上記工程17において、必要により、化合物(I-D)を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物(III-C)と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばQ’が-NH-CO-Q4’-CO-である場合(Q4’は置換または無置換の炭素数1〜14のアルキレン)、工程17において、化合物(III-C)と、CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’は前記と同義)とを、工程17と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにR’-NH2(R’は前記と同義)と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’は前記と同義)およびR’-NH2(R’は前記と同義)は、公知の方法(例えば、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958?16961頁、2014年参照)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。ここで、Q4’において、置換または無置換の炭素数1〜14のアルキレンにおける置換基およびアルキレン部分は上記と同様である。
【００７８】
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端が、式(III)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-でないセンス鎖は、Qの構造に応じて、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらの組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【００７９】
製造方法4
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端に式(IV)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-であるセンス鎖（オリゴヌクレオチドの3’末端が、式(IV’)であらわされるセンス鎖）は、以下の方法にしたがって製造することができる。
【００８０】
【化１３】
2017010575.tif 000015
(式中、DMTr、Fmoc、R’、Q’、XおよびPolymerは前記と同義である。)
【００８１】
化合物(IV’)は、化合物(IV-A)を用い、製造方法1の工程1から工程6と同様の条件にて製造する事が出来る。なお、化合物(IV-A)は市販品として得ることができる。
【００８２】
上記工程23において、必要により、化合物(I-D)を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物(IV-C)と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばQ’が-NH-CO-Q4’-CO-である場合(Q4’は置換または無置換の炭素数1〜14のアルキレンである)、工程23において、化合物(IV-C)と、CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’は前記と同義)とを、工程23と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにR’-NH2(R’は前記と同義)と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’は前記と同義)およびR’-NH2(R’は前記と同義)は、公知の方法(例えば、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958?16961頁、2014年参照)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。ここで、Q4’において、置換または無置換の炭素数1〜14のアルキレンにおける置換基およびアルキレン部分は上記と同様である。
【００８３】
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端が、式(IV)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-でないセンス鎖は、Qの構造に応じて、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらの組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【００８４】
製造方法5
オリゴヌクレオチドの3’末端が、式(V)であらわされるセンス鎖のうち、Qの右末端の官能基が-CO-であるセンス鎖（オリゴヌクレオチドの3’末端が、式(V’)であらわされるセンス鎖）は、以下の製造方法5にしたがって製造することができる。
【００８５】
【化１４】
2017010575.tif 000016
(式中、 DMTr、R’、X、Q’、TBDMS、FmocおよびPolymerは前記と同義である。)
【００８６】
化合物(V’)は、化合物(IV-A)を用い、製造方法2の工程1から工程7と同様の条件にて製造する事が出来る。なお、化合物(IV-A)は市販品として得ることができる。
【００８７】
上記工程31において、必要により、化合物(I-D)を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物(V-D)と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばQ’が-NH-CO-Q4’-CO-である場合(Q4’は置換または無置換の炭素数1〜14のアルキレンである)、工程31において、化合物(V-D)と、CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’は前記と同義)とを、工程31と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにR’-NH2(R’は前記と同義)と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、CH3CH2-O-CO-Q4’-CO-OH(Q4’は前記と同義)およびR’-NH2(R’は前記と同義)は、公知の方法(例えば、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958?16961頁、2014年参照)もしくはそれに準じた方法で得ることができる。ここで、Q4’において、置換または無置換の炭素数1〜14のアルキレンにおける置換基およびアルキレン部分は前記と同様である。
【００８８】
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3’末端が、式(V)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-でないセンス鎖は、Qの構造に応じて、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらの組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【００８９】
製造方法6
オリゴヌクレオチドの5’末端が、式(I)であらわされるセンス鎖のうち、Qの右末端の官能基が-CO-であるセンス鎖（オリゴヌクレオチドの5’末端が、式(I’’)であらわされるセンス鎖）は、以下の製造方法6にしたがって製造することができる。
【００９０】
【化１５】
2017010575.tif 000017
(式中、R、R’、Q’、DMTrおよびXは前記と同義である)
【００９１】
工程35
化合物(I-H)は、化合物(II-E)と2-シアノエチル−N, N, N’, N’-テトライソプロピルホスホジアミダイトを、無溶媒でまたは溶媒中、塩基および反応促進剤共存下、室温と200 ℃の間の温度で、5分間〜100時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、製造方法1の工程2で例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造方法1の工程3で例示したものが挙げられる。
反応促進剤としては、例えば、1H-テトラゾール、4,5-ジシアノイミダゾール、5-エチルチオテトラゾール、5-ベンジルチオテトラゾール等が挙げられ、市販品として購入できる。
【００９２】
工程36
オリゴヌクレオチドの5’末端が、式(I)であらわされるセンス鎖は、オリゴヌクレオチド鎖を伸長し、最後に化合物(I-H)を用い、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製を行うことにより、製造することができる。ここで、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製は、それぞれ製造方法1の工程6と同様にして製造できる。
【００９３】
さらに、製造方法1と同様に、二本鎖核酸を構成するセンス鎖の5’末端が、式(I)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-でないセンス鎖は、Qの構造に応じて、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらの組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【００９４】
製造方法7
オリゴヌクレオチドの5’末端が、式(II)であらわされるセンス鎖のうち、Qの右末端の官能基が-CO-であるセンス鎖（オリゴヌクレオチドの5’末端が、式(II’)であらわされるセンス鎖）は、製造方法6の工程35および36と同様の条件にて製造することができる。
【００９５】
【化１６】
2017010575.tif 000018
(式中、R、R’、Q’、DMTrおよびXは前記と同義である)
【００９６】
さらに、製造方法2と同様に、二本鎖核酸を構成するセンス鎖の5’末端が、式(II)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-でないセンス鎖は、Qの構造に応じて、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらの組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【００９７】
製造方法8
オリゴヌクレオチドの5’末端が、式(III)であらわされるセンス鎖のうち、Qの右末端の官能基が-CO-であるセンス鎖（オリゴヌクレオチドの5’末端が、式(III’)であらわされるセンス鎖）は、製造方法6の工程35および36と同様の条件にて製造することができる。
【００９８】
【化１７】
2017010575.tif 000019
(式中、R、R’、Q’、DMTrおよびXは前記と同義である)
【００９９】
製造方法3と同様に、二本鎖核酸を構成するセンス鎖の5’末端が、式(III)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-でないセンス鎖は、Qの構造に応じて、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらの組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０１００】
製造方法9
オリゴヌクレオチドの5’末端が、式(IV)であらわされるセンス鎖のうち、Qの右末端の官能基が-CO-であるセンス鎖（オリゴヌクレオチドの5’末端が、式(IV’)であらわされるセンス鎖）は、製造方法6の工程35および36と同様の条件にて製造することができる。
【０１０１】
【化１８】
2017010575.tif 000020
(式中、R、R’、Q’、DMTrおよびXは前記と同義である)
【０１０２】
製造方法4と同様に、二本鎖核酸を構成するセンス鎖の5’末端が、式(IV)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-でないセンス鎖は、Qの構造に応じて、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらの組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０１０３】
製造方法10
オリゴヌクレオチドの5’末端が、式(V)であらわされるセンス鎖のうち、Qの右末端の官能基が-CO-であるセンス鎖（オリゴヌクレオチドの5’末端が、式(V’)であらわされるセンス鎖）は、製造方法6の工程35および36と同様の条件にて製造することができる。
【０１０４】
【化１９】
2017010575.tif 000021
(式中、R、R’、Q’、DMTrおよびXは前記と同義である)
【０１０５】
製造方法5と同様に、二本鎖核酸を構成するセンス鎖の5’末端が、式(V)であらわされるリガンド部を有する核酸複合体のうち、Qの右末端の官能基が-CO-でないセンス鎖は、Qの構造に応じて、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらの組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０１０６】
製造方法11
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の3末端’または5’末端に式(I)〜(V)であらわされるリガンド部を有するセンス鎖と、二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖とを、水または適当な緩衝液にそれぞれ溶解し、混合することにより二本鎖核酸のセンス鎖3’あるいは5’末端が、式(I)であらわされる核酸複合体を得ることができる。
緩衝液としては、例えば酢酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、水等が挙げられ、これらを単独または混合して用いられる。
【０１０７】
センス鎖とアンチセンス鎖の混合比としては、センス鎖１当量に対してアンチセンス鎖が0.5〜2当量が好ましく、0.9〜1.1当量がより好ましく、0.95当量〜1.05当量がさらに好ましい。
センス鎖とアンチセンス鎖を混合後、適宜アニーリング処理を行ってもよい。アニーリング処理は、センス鎖とアンチセンス鎖の混合物を、好ましくは50〜100℃、より好ましくは60〜100℃、さらに好ましくは80〜100℃に加熱した後に、室温まで徐冷することにより行うことができる。
【０１０８】
アンチセンス鎖は、上記の公知オリゴヌクレオチド合成法に準じて得ることができる。
【０１０９】
本明細書における核酸複合体は、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の塩として得ることも可能である。
【０１１０】
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、アミノ酸付加塩としては、例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニン等の付加塩が挙げられる。
【０１１１】
本明細書の核酸複合体の塩を調製したい場合には、該複合体が所望の塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、該複合体を適当な溶媒に溶解または懸濁し、対応する酸または塩基を加え、単離・精製すればよい。また、該複合体塩を形成する対イオンを異なる対イオンに変換する際には、該複合体塩を適当な溶媒に溶解または懸濁した後、酸、塩基および／または塩(塩化ナトリウム、塩化アンモニウム等の無機塩等)を数当量〜大過剰量加えて単離、精製すればよい。
【０１１２】
本明細書の核酸複合体の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、全ての可能な異性体及びそれらの混合物も本発明に包含される。
【０１１３】
また、本明細書の核酸複合体は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもああり、これらの付加物も本発明に包含される。
【０１１４】
さらに、本発明の核酸複合体は、分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）（例えば、重水素等）で置換されたものも包含される。
【０１１５】
本発明の核酸複合体の具体例を表1に示す。ただし、本発明の核酸複合体は、これらに限定されるものではない。
【０１１６】
【表１】
2017010575.tif 000022
【０１１７】
【表２】
2017010575.tif 000023
【０１１８】
表1において、核酸複合体I〜Vにおけるオリゴヌクレオチド部分は、二本鎖核酸を構成するセンス鎖をあらわし、例えば、後述する表2-1〜表2-18、表3-１〜表3-18または表4-1〜4-16中のセンス鎖配列であらわされるセンス鎖が挙げられる。
【０１１９】
本発明において、β2GPI mRNAに対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸と称し、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸とも称する。
【０１２０】
本発明で用いられる核酸複合体を構成する二本鎖核酸は、哺乳動物細胞に導入された場合、β2GPI遺伝子の発現を低下または停止させる能力を有する二本鎖核酸であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸である。また、該センス鎖と該アンチセンス鎖とは少なくとも11個の塩基対を有し、該アンチセンス鎖中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個の、すなわち、17個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表4-1〜4-16に記載された群から選択される標的β2GPI mRNA配列と相補的である。
【０１２１】
本発明で用いられる核酸複合体を構成する二本鎖核酸としては、ヌクレオチドまたは該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなる分子であってもよく、例えばリボヌクレオチドの重合体であるRNA、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、RNAとDNAとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体が挙げられる。また、これらの核酸内にヌクレオチドと同等の機能を有する分子を少なくとも一つ含む誘導体も、本発明で用いられる薬物としての二本鎖核酸に含まれる。またウラシル（U）は、チミン（T）に一義的に読み替えることができる。
【０１２２】
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等が挙げられる。ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
【０１２３】
ヌクレオチドに修飾を施した分子としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等が挙げられる。
【０１２４】
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
【０１２５】
2’-修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’-OH基がH、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、BrおよびIからなる群(Rはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数1〜6のアルキルであり、R’はアルキレン、好ましくは炭素数1〜6のアルキレンである)から選択される置換基で置換されたヌクレオチドであり、より好ましくは2’-OH基がH、Fまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチドであり、さらに好ましくは2’-OH基がFまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチドである。また、2’-OH基が2-(methoxy)ethoxy基、3-aminopropoxy基、2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基、3-(N,N-dimethylamino)propoxy基、2-[2-(N,N-dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2-(methylamino)-2-oxoethoxy基、2-(N-methylcarbamoyl)etoxy 基および2-cyanoetoxy 基からなる群から選択される置換基で置換されたヌクレオチド等も挙げられる。
二本鎖核酸領域内のヌクレオチドに対して、2’-修飾ヌクレオチドは、50〜100％含まれることが好ましく、70〜100％含まれることがより好ましく、90〜100％含まれることがさらに好ましい。また、センス鎖のヌクレオチドに対して、2’-修飾ヌクレオチドは、20〜40％含まれることが好ましく、40〜60％含まれることがより好ましく、60％〜100％含まれることがさらに好ましい。また、アンチセンス鎖のヌクレオチドに対して、2’-O-メチル修飾ヌクレオチドは、0〜40％含まれることが好ましく、10〜20％含まれることがより好ましく、20〜40％含まれることがさらに好ましい。
【０１２６】
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられる。
【０１２７】
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基、ハロゲン等で置換されたもの、メチル基が水素、ヒドロキシメチル、炭素数2〜6のアルキル基等で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものが挙げられる。
【０１２８】
ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、ペプチド、蛋白質、糖、脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素等、別の化学物質を、直接またはリンカーを介して付加したものも挙げられ、具体的には、5’-ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6-FAM付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等が挙げられる。
ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
【０１２９】
本明細書において「相補」とは、2つの塩基間で塩基対合をし得る関係を意味し、例えば、アデニンとチミンまたはウラシルとの関係、並びにグアニンとシトシンとの関係のように緩やかな水素結合を介して、二重鎖領域全体として2重螺旋構造をとるものをいう。
【０１３０】
本明細書において「相補的」とは、2つのヌクレオチド配列が完全に相補する場合だけでなく、該ヌクレオチド配列間で0〜30％、0〜20％または0〜10％のミスマッチ塩基を有することができ、例えば、β2GPI mRNAに対して相補的なアンチセンス鎖は、該mRNAの部分塩基配列と完全に相補する塩基配列において、1つまたは複数の塩基の置換を含んでよいことを意味する。具体的には、アンチセンス鎖は、標的遺伝子の標的配列に対して1〜8個、好ましくは1〜6個、1〜4個、1〜3個、特に2個または1個のミスマッチ塩基を有していてもよい。例えば、アンチセンス鎖が21塩基長の場合には、標的遺伝子の標的配列に対して6個、5個、4個、3個、2個または1個のミスマッチ塩基を有してもよく、そのミスマッチの位置は、それぞれの配列の5’末端または3’末端であってもよい。
また、「相補的」とは、一方のヌクレオチド配列が、他方のヌクレオチド配列と完全に相補する塩基配列において、１つまたは複数の塩基が付加および／または欠失した配列である場合を包含する。例えば、β2GPI mRNAと本発明のアンチセンス鎖核酸とは、アンチセンス鎖における塩基の付加および／または欠失により、アンチセンス鎖および／または標的β2GPI mRNA領域に1個または2個のバルジ塩基を有してもよい。 
【０１３１】
本発明で用いられる薬物としての二本鎖核酸は、β2GPI mRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸および／または該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であれば、いずれのヌクレオチドまたはその誘導体から構成されていてもよい。本発明の二本鎖核酸は、標的β2GPI mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とが、少なくとも11個の塩基対の二重鎖を形成することができればいずれの長さでもよいが、二重鎖を形成できる配列の長さは、通常11〜35塩基であり、15〜30塩基が好ましく、17〜25塩基がより好ましく、17〜23塩基がさらに好ましく、19〜23塩基がよりさらに好ましい。
【０１３２】
本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖としては、標的β2GPI mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸が用いられるが、該核酸のうち1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が欠失、置換または付加したものを用いてもよい。
【０１３３】
β2GPIの発現を抑制する核酸としては、標的β2GPI mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であって、かつβ2GPIの発現を抑制する一本鎖核酸、もしくは標的β2GPI mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなり、かつβ2GPIの発現を抑制する二本鎖核酸が好適に用いられる。
【０１３４】
本発明において二本鎖核酸とは、二本のヌクレオチド鎖が対合し、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を有する核酸をいう。二重鎖領域とは、二本鎖核酸を構成するヌクレオチドまたはその誘導体が塩基対を構成して二重鎖を形成している部分をいう。二重鎖領域は、通常11〜27塩基対であり、15〜25塩基対が好ましく、15〜23塩基対がより好ましく、17〜21塩基対がさらに好ましい。
【０１３５】
二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸は、通常11〜30塩基からなるが、15〜29塩基からなることが好ましく、15〜27塩基からなることがより好ましく、15〜25塩基からなることがさらに好ましく、17〜23塩基からなることがよりさらに好ましい。
【０１３６】
本発明で用いられる薬物としての二本鎖核酸において、二重鎖領域に続く3’側または5’側に二重鎖を形成しない追加のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有する場合には、これを突出部(オーバーハング)と呼ぶ。突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの誘導体であってもよい。
【０１３７】
突出部を有する二本鎖核酸としては、少なくとも一方の鎖の3’末端または5’末端に1〜6塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、例えばdTdT(dTはデオキシチミジンを表す)またはUU(Uはウリジンを表す)からなる突出部を有するものが挙げられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、本発明において、アンチセンス鎖に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。なお、アンチセンス鎖は、二重鎖領域とそれに続く突出部とを含む、17個〜30個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド鎖において、表4-1〜4-16に記載された群から選択される標的β2GPI mRNA配列と十分に相補的である。さらに、本発明の二本鎖核酸としては、例えばDicer等のリボヌクレアーゼの作用により二本鎖核酸を生成する核酸分子(WO2005/089287)や、3’末端や5’末端の突出部を有さず平滑末端を形成する二本鎖核酸、センス鎖のみが突出した二本鎖核酸（US2012/0040459）等を用いることもできる。
【０１３８】
本発明で用いられる核酸複合体を構成する二本鎖核酸としては、標的遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列と同一の配列からなる核酸を用いてもよいが、該核酸の少なくとも一方の鎖の5’末端または3’末端が1〜4塩基削除された核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる二本鎖核酸を用いてもよい。
【０１３９】
本発明で用いられる核酸複合体を構成する二本鎖核酸は、RNA同士が二重鎖を形成した二本鎖RNA（dsRNA）、DNA同士が二重鎖を形成した二本鎖DNA（dsDNA）、またはRNAとDNAが二重鎖を形成したハイブリッド核酸であってもよい。あるいは、二本鎖のうちの一方もしくは両方の鎖がDNAとRNAとのキメラ核酸であってもよい。好ましくは二本鎖RNA（dsRNA）である。
【０１４０】
本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖の5’末端から2番目のヌクレオチドは、標的β2GPI mRNA配列の3’末端から2番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から2〜7番目のヌクレオチドが、標的β2GPI mRNA配列の3’末端から2〜7番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から2〜11番目のヌクレオチドが、標的β2GPI mRNA配列の3’末端から2〜11番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。また、本発明の核酸におけるアンチセンス鎖の5’末端から11番目のヌクレオチドが、標的β2GPI mRNA配列の3’末端から11番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から9〜13番目のヌクレオチドが、標的β2GPI mRNA配列の3’末端から9〜13番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンス鎖の5’末端から7〜15番目のヌクレオチドが、標的β2GPI mRNA配列の3’末端から7〜15番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。
【０１４１】
本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、例えば、Genbank  Accession  No.NM_000042として登録されているヒトβ2GPIの完全長mRNAのcDNA（センス鎖）の塩基配列（配列番号3541)に基づいて設計することができる。
【０１４２】
β2GPIの発現抑制活性を有する核酸としては、β2GPI mRNAに対して相補的な塩基配列を含む本発明のアンチセンス鎖核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む本発明のセンス鎖核酸とからなり、かつβ2GPIの発現抑制活性を有する二本鎖核酸が挙げられる。該二本鎖核酸を構成する一本鎖の核酸は、通常11〜30塩基からなるが、15〜29塩基からなることが好ましく、15〜27塩基からなることがより好ましく、15〜25塩基からなることがさらに好ましく、17〜23塩基からなることがよりさらに好ましく、19〜21塩基からなることが特に好ましい。該二本鎖核酸は通常15〜27塩基対、好ましくは15〜25塩基対、より好ましくは15〜23塩基対、さらに好ましくは15〜21塩基対からなる二重鎖領域を有している。
【０１４３】
二本鎖核酸は、β2GPI遺伝子配列内の標的配列と相互作用するように設計することができる。
【０１４４】
二本鎖核酸の1つの鎖の配列は、上記した標的部位配列に対して相補的である。二本鎖核酸は、本明細書に記述された方法を使用して、化学的に合成することができる。
【０１４５】
RNAは、酵素的または部分/全有機合成によって生成してもよく、また修飾されたリボヌクレオチドは、インビトロで酵素的または有機合成によって導入することができる。一つの態様において、それぞれの鎖は、化学的に調製される。RNA分子を化学的に合成する方法は、当該技術分野において公知である[ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucleic Acids Research）、1998年、第32巻、p.936-948参照 ]。一般に、二本鎖核酸は、固相オリゴヌクレオチド合成法を使用することによって合成することができる(たとえば、Usman et al.,米国特許第5,804,683号明細書;米国特許第5,831,071号明細書;米国特許第5,998,203号明細書;米国特許第6,117,657号明細書;米国特許第6,353,098号明細書;米国特許第6,362,323号明細書;米国特許第6,437,117号明細書;米国特許第6,469,158号明細書;Scaringe et al.,米国特許第6,111,086号明細書;米国特許第6,008,400号明細書;米国特許第6,111,086号明細書を参照)。
【０１４６】
一本鎖核酸は、固相ホスホロアミダイト法（ヌクレイック  アシッズ  リサーチ（Nucleic Acids Research)、1993年、第30巻、p.2435-2443参照)を使用して合成され、脱保護され、およびNAP-5カラム(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)上で脱塩される。オリゴマーは、15分工程のリニア勾配を使用するAmersham Source 15Qカラム-1.0cm。高さ.25 cm (Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)でのイオン交換高性能液体クロマトグラフィー(IE-HPLC)を使用して精製する。勾配は、90:10の緩衝液A:Bから52:48の緩衝液A:Bに変化し、緩衝液Aは100mmol/L Tris pH 8.5であり、および緩衝液Bは、100mmol/L Tris pH 8.5(1mol/LのNaCl)である。試料は、260nmにてモニターされ、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークは、収集され、プールされ、NAP-5カラムで脱塩され、および凍結乾燥される。
【０１４７】
各一本鎖核酸の純度は、Beckman PACE 5000(Beckman Coulter、Inc., Fullerton, Calif)でのキャピラリー電気泳動(CE)によって決定される。CEキャピラリーは、100μmの内径を有し、ssDNA 100R Gel(Beckman-Coulter)を含む。典型的には、約0.6nmoleのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注射して、444V/cmの電界において実行して、260nmにおけるUV吸光度によって検出される。変性トリス-ホウ酸-7mol/L-尿素泳動緩衝液は、Beckman-Coulterから購入する。以下に記述した実験に使用するための、CEによって評価すると少なくとも90%純粋である一本鎖核酸が得られる。化合物同一性は、製造業者の推奨プロトコルにしたがって、Voyager DE.TM.Biospectometryワークステーション(Applied Biosystems、Foster City,、Calif.)でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分光法によって検証される。一本鎖核酸の相対的な分子質量は、予想される分子質量の0.2%以内で得ることができる。
【０１４８】
一本鎖核酸は、100mmol/L 酢酸カリウム、30mmol/L HEPES、pH 7.5からなる緩衝液中に100μmol/L濃度にて再懸濁させる。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を同等のモル量で混合して、50μmol/L二本鎖核酸の最終溶液を得る。試料を95℃まで5分間加熱して、使用前に室温に冷却させる。二本鎖核酸は、-20℃にて保存する。一本鎖核酸は、凍結乾燥させるか、またはヌクレアーゼフリー水中に、-80℃で貯蔵する。
【０１４９】
本発明におけるセンス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含み、該アンチセンス鎖中の、17個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表4-1〜表4-16に記載された群から選択される標的β2GPI mRNA配列と相補的な二本鎖核酸として、表2-1〜2-18および表3-1〜3-18、ならびに後述する表4-1〜4-16に記載されたアンチセンス鎖から成る群から選択される配列を含む二本鎖核酸か、表2-1〜2-18および表3-1〜3-18、ならびに後述する表4-1〜4-16に記載されたセンス鎖から成る群から選択される配列を含む二本鎖核酸か、あるいは表2-1〜2-18および表3-1〜3-18、ならびに後述する表4-1〜4-16に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖から成る群から選択される１対のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列を含む二本鎖核酸を用いてよい。すなわち、本発明で用いられる核酸複合体を構成する二本鎖核酸の具体例は、表2-1〜2-18および表3-1〜3-18、ならびに後述する表4-1〜4-16中のセンス鎖およびアンチセンス鎖から成る二本鎖核酸である。なお、表3-1〜3-18中、N(M)は2’-O-メチル修飾RNA、N(F)は2’-フッ素修飾RNA、および＾はホスホロチオエートを示す。
【０１５０】
【表３】
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【０１５１】
【表４】
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【０１５２】
【表５】
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【０１５３】
【表６】
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【０１５４】
【表７】
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【０１５５】
【表８】
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【０１５６】
【表９】
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【０１５７】
【表１０】
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【０１５８】
【表１１】
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【０１５９】
【表１２】
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【０１６０】
【表１３】
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【０１６１】
【表１４】
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【０１６２】
【表１５】
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【０１６３】
【表１６】
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【０１６４】
【表１７】
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【０１６５】
【表１８】
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【０１６６】
【表１９】
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【０１６７】
【表２０】
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【０１６８】
【表２１】
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【０１６９】
【表２２】
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【０１７０】
【表２３】
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【０１７１】
【表２４】
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【０１７２】
【表２５】
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【０１７３】
【表２６】
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【０１７４】
【表２７】
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【０１７５】
【表２８】
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【０１７６】
【表２９】
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【０１７７】
【表３０】
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【０１７８】
【表３１】
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【０１７９】
【表３２】
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【０１８０】
【表３３】
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【０１８１】
【表３４】
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【０１８２】
【表３５】
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【０１８３】
【表３６】
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【０１８４】
【表３７】
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【０１８５】
【表３８】
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【０１８６】
本発明の組成物を、哺乳動物の細胞に投与することで、本発明の組成物中の二本鎖核酸を細胞内に導入することができる。
【０１８７】
インビボにおける本発明の核酸複合体の哺乳動物の細胞への導入方法は、インビボにおいて行うことのできる公知のトランスフェクションの手順に従って行えばよい。本発明の組成物を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、例えば血管、肝臓、肺、脾臓および/または腎臓へ送達され、送達臓器または部位の細胞内に本発明の組成物中の二本鎖核酸を導入することができる。
【０１８８】
送達臓器または部位の細胞内に本発明の組成物中の二本鎖核酸が導入されると、その細胞内のβ2GPI遺伝子の発現を低下させ、β2GPI関連疾患、例えば全身性エリテマトーデス(SLE)、抗リン脂質抗体症候群、末期腎不全患者における血液透析合併症および動脈硬化を治療あるいは予防することができる。投与対象は、哺乳動物であり、人であることが好ましい。
【０１８９】
また、本発明における脂質粒子含有組成物は、前記疾患の治療剤または予防剤に関するインビボの薬効評価モデルにおいて、β2GPI遺伝子を抑制することの有効性を検証するためのツールとして使用することもできる。インビボの薬効評価モデルとしては、ループスアンチコアグラント(LA)試験等が挙げられる。ここで、LAは、抗β2GPI抗体と同じく抗リン脂質抗体の一種であり、採血した血液のリン脂質依存性凝固反応をインビトロで阻害する活性を示す。LAは主にSLEやAPSといった疾患で出現し、抗β2GPI抗体と同様に血栓症や不育症の発症あるいは病態と相関することが数多く報告されている（“ブラッド(blood)”、2003年、第101巻、第5号、p1827-1832）。そして、抗β2GPI抗体は、β2GPIを介してリン脂質結合活性を獲得することから、β2GPI依存的なLA活性を発揮することも報告されている（“トロンボシスアンドヘモスタシス (Thrombosis and Haemostasis)”、1998、第79巻、第1号、p79-86）。さらに、このβ2GPI依存性LAは病態の発症率と強く相関することが報告されており(“ブラッド(blood)”、2004年、第104巻、第12号、p3598-3602）、血中β2GPIの発現抑制によってLA活性を解除できれば、β2GPI関連疾患に対する新規かつ有効な治療法を提供可能であると考えられる。臨床検査においてLAは、活性化部分トロンボプラスチン時間、カオリン凝固時間および／または希釈ラッセル蛇毒時間(dRVVT)を測定することで検出することができる。
【０１９０】
本発明の核酸複合体を、β2GPI関連疾患の治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、好ましくは静脈内投与、皮下投与または筋肉内投与をあげることができ、より好ましくは皮下投与が挙げられる。
【０１９１】
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば二本鎖核酸に換算した1日投与量が0.1μg〜1000 mgとなるように投与すればよく、1日投与量が1〜100 mgとなるように投与することが好ましい。
【実施例】
【０１９２】
次に、参考例、実施例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および試験例に限定されるものではない。なお、参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHzまたは400MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。また、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとは見かけ上幅広いシグナルであることを表す。【０１９３】
参考例1
【化２０】
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（式中、Fmoc、DMTrは前記と同義である）【０１９４】
工程１
(9H-フルオレン-9-イル)メチル((2R,3R)-1,3-ジヒドロキシブタン-2-イル)カルバマート (Chem-Impex International, Inc社製, 1.50 g, 4.58 mmol)をピリジン (20 mL)に溶解し、氷冷下、4,4’-ジメトキシトリチルクロライド (東京化成工業社製, 1.71 g, 5.04 mmol)を加えた後、室温にて2時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=90/10)で精製することにより、化合物2 (1.07 g, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 630 (M + H)+;【０１９５】
工程2
工程1で得られた化合物2 (1.07 g, 1.699 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてピペリジン (0.336 mL, 3.40 mmol)を加えて3時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、化合物3 (0.59 g, 収率85 %)を得た。
ESI-MS m/z: 408 (M + H)+;【０１９６】
工程3
工程2で得られた化合物3 (0.590 g, 1.45 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド (8 mL)に溶解し、12-エトキシ-12-オキソドデカン酸 (東京化成工業社製, 0.374 g, 1.45 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.632 mL, 3.62 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (和光純薬工業社製, 0.659 g, 1.74 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=90/10〜40/60)で精製し、化合物4 (0.430 g, 収率46%)を得た。
ESI-MS m/z: 648(M + H)+;  【０１９７】
工程4
工程3で得られた化合物4 (0.430 g, 0.664 mmol)をエタノール (5 mL)に溶解し、水酸化リチウム水溶液 (1.0 mL, 1.99 mol/L）を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去して化合物5の粗生成物 (0.420 g, 粗収率100％)を得た。
ESI-MS m/z: 618(M - H)-; 1H-NMR (CDCl3) δ:1.12 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.26-1.35 (m, 12H), 1.57-1.67 (m, 4H), 2.23 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.29 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.25 (dd, J = 9.6, 3.9 Hz, 1H), 3.37 (dd, J = 9.6, 4.7 Hz, 1H), 3.39-3.41 (m, 1H), 3.79 (s, 6H), 3.91-3.94 (m, 1H), 4.04-4.09 (m, 1H), 6.43 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 7.21-7.24 (m, 1H), 7.26-7.30 (m, 6H), 7.37-7.39 (m, 2H).【０１９８】
参考例2 
【化２１】
2017010575.tif 000061
（式中、Ac、DMTrは前記と同義であり、Poは固相担体であるLCAA-CPGをあらわす）【０１９９】
工程5
公知の方法[ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958?16961頁、2014年参照]で合成した化合物6 (0.119 g, 0.066 mmol)をTHF (2 mL)に溶解し、実施例1の工程4で得られた化合物5 (0.062 g, 0.100 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.116 mL, 0.663 mmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (0.050 g,  0.133 mmol)、およびN,N-ジメチルアミノピリジン (ナカライテスク社製, 8.1 mg, 0.133 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー(メタノール/クロロホルム)で精製し、化合物7 (0.035 g, 収率22%)を得た。
ESI-MS m/z: 1048(M + 2H)2+【０２００】
工程6
工程5で得られる化合物7 (0.135 g, 0.056 mmol)をジクロロメタン (2 mL)に溶解し、コハク酸無水物 (東京化成工業社製, 0.011 g, 0.113 mmol）、およびN,N-ジメチルアミノピリジン (0.021 g, 0.169 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去して化合物8 (0.110 g, 粗収率78%)の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1089(M + 2H)2+;
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 1.02 (d, J= 6.3 Hz, 3H), 1.15-1.25 (m, 12H), 1.39-1.55 (m, 22H), 1.77 (s, 9H), 1.88 (d, J = 7.9 Hz, 9H), 1.99 (s, 9H), 2.04 (t, J = 7.1 Hz, 6H), 2.10 (s, 9H), 2.11-2.15 (m, 2H), 2.28 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 2.37-2.42 (m, 2H), 2.49-2.53 (m, 2H), 2.83-2.95 (m, 2H), 2.99-3.08 (m, 12H), 3.31-3.45 (m, 6H), 3.48-3.58 (m, 12H), 3.67-3.75 (m, 2H), 3.73 (s, 6H), 3.83-3.92 (m, 3H), 3.97-4.06 (m, 9H), 4.10-4.18 (m, 1H), 4.49 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 4.97 (dd, J = 11.3, 3.4 Hz, 3H), 5.09-5.16 (m, 1H), 5.21 (d, J = 3.3 Hz, 3H), 6.84-6.91 (m, 4H), 6.99 (s, 1H), 7.12-7.40 (m, 9H), 7.71-7.89 (m, 10H).【０２０１】
工程7
工程6で得られた化合物8 (0.050 g, 0.014 mmol)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (0.011 g, 0.028 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン（0.098 mL, 0.056 mmol）をN,N-ジメチルホルムアミド(2 mL)に溶解し、固相担体であるLCAA-CPG (sigma-aldrich社製, 0.25 g, 0.014 mmol)を加え、室温にて終夜攪拌した。混合物をフリットに通して濾過し、ジクロロメタン、10%メタノールジクロロメタン溶液およびジエチルエーテルで洗浄した後、無水酢酸/ピリジン溶液と作用させる事で化合物9を得た（17.7 μmol/g, 収率30%）。なお、収率は1%トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン溶液を固相担持体に添加し、DMTr基に由来する吸収から計算できる固相担体への導入率より算出した。【０２０２】
試験例1  β2GPI mRNAのノックダウン活性の測定
96ウェルの培養プレートにヒト肝臓癌由来の細胞株であるHepG2細胞（ATCCより入手、ATCC番号：HB-8065）を、5,000細胞/80μL/ウェルとなるよう播種した。培地は、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むMEM培地(ライフテクノロジー社製、カタログ番号11095-098)を用いた。表4−1〜表4−16に記載の二本鎖核酸とRNAiMaxトランスフェクション試薬(ライフテクノロジー社製、カタログ番号:1401251)をOpti-MEM 培地(ライフテクノロジー社製、カタログ番号11058-021)で希釈して、二本鎖核酸の終濃度が100pmol/Lとなるように20μLのsiRNA/RNAiMax混合液を各々96ウェルの培養プレートに添加し、37℃、5% CO2条件下で24時間培養した。その後、細胞をPBS（Phosphate buffered saline）で洗浄し、各々のプレートからCells-to-Ctキット（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号:AM1728）を用いて製品に添付された説明書に記載された方法に従いcDNAを合成した。このcDNA 5μLをMicroAmpOptical 96ウェルプレート（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4326659）に加え、更に10μLのTaqMan Gene Expression Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4369016）、3μLのUltraPure Distilled Water（ライフテクノロジーズ社製、カタログ番号:10977-015）、1μLのhuman β2GPIプローブ、1μLのhuman GAPDHプローブを添加した。ABI7900 HTリアルタイムPCRシステムを用いて、human β2GPI遺伝子およびhuman GAPDH（D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）のリアルタイムPCRをおこなった。GAPDHは構成的発現遺伝子であり内部対照として測定し、β2GPI発現量を補正した。siRNAを添加せずにトランスフェクション試薬だけでHepG2細胞を処理した時のβ2GPImRNA量を1.0として、各siRNAを導入した時のβ2GPI mRNA相対発現量を算出した。本実験を3回おこない、β2GPI mRNA相対発現量の平均値を表4−1〜表4−16に示した。【０２０３】
【表３９】
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【０２０４】
【表４０】
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【０２０５】
【表４１】
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【０２０６】
【表４２】
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【０２０７】
【表４３】
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【０２０８】
【表４４】
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【０２０９】
【表４５】
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【０２１０】
【表４６】
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【０２１１】
【表４７】
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【０２１２】
【表４８】
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【０２１３】
【表４９】
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【０２１４】
【表５０】
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【０２１５】
【表５１】
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【０２１６】
【表５２】
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【０２１７】
【表５３】
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【０２１８】
【表５４】
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【０２１９】
更に、ノックダウン活性の高い二本鎖核酸を選抜するために、二本鎖核酸の終濃度を10pmol/Lに下げて上記と同じ実験系でβ2GPI遺伝子の相対発現量を算出した。その結果を表5に示す。【０２２０】
【表５５】
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【０２２１】
実施例1  β2GPI遺伝子を抑制する二本鎖核酸(siRNA)とリガンド部を含む核酸複合体の調製  【０２２２】
工程1
CH1179、CH0099、CH1180それぞれのアンチセンス鎖の3’末端にリガンド部を有する、β2GPI標的siRNAの合成（それぞれG-CH1179-s、G-CH0099-s、G-CH1180-sと呼ぶ）を、核酸合成装置(ウルトラ  ファースト  パラレル  シンセサイザー（Ultra Fast Parallel Syntheizer）、シグマ社製、以下UFPS)を用いて、0.2μmolスケールで行った。固相担体には、参考例2の工程7で得られた化合物9を用いた。DMT-2’-O-メチル-rA((tert-ブチル）フェノキシアセチル)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、DMT-2’-フルオロ-dA(ベンゾイル)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、DMT-2’-O-メチル-rG((tert-ブチル）フェノキシアセチル)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、DMT-2’-フルオロ-dG(イソブチリル)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、DMT-2’-O-メチル-rC((tert-ブチル）フェノキシアセチル)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、DMT-2’-フルオロ-dC(アセチル)アミダイト(SAFC-PROLIGO社)、DMT-2’-O-メチル-rUアミダイト(SAFC-PROLIGO社)、及びDMT-2’-フルオロ-dUアミダイト(SAFC-PROLIGO社)は0.1 mol/Lアセトニトリル溶液、化学的リン酸化試薬II(GlenResearch社)は0.06 mol/Lアセトニトリル溶液、硫化試薬II(GlenResearch社)は0.05 mol/Lアセトニトリル溶液、に調製して縮合反応に用いた。脱保護試薬としては、デブロッキング溶液-1（3%トリクロロ酢酸ジクロロメタン溶液、和光純薬工業株式会社）を用いた。ホスホロアミダイトのアクチベーターとして5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(SAFC-PROLIGO社)を用い、縮合時間は、各10分間とした。トリチルオフにて合成後、28%アンモニア溶液に浸し、55 ℃で4時間放置した。減圧下濃縮し、1-ブタノールを加えて反応を停止した。逆相液体クロマトグラフィー(資生堂, CAPSELL PAK C18, SG300, 6.0 mmx75 mm、5%アセトニトリル/0.1%酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:50%アセトニトリル/水によるグラジエント)を用いて精製し、目的のオリゴヌクレオチドを得た。結果を表6に示す。【０２２３】
【表５６】
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(表中、N (M)は2’-O-メチル修飾ＲＮＡを、N (F)は2’-フッ素修飾ＲＮＡを、^はホスホロチオエート修飾を、Xは表1中の核酸複合体Iにおけるリガンド部を、それぞれ示す。ここで、「表1中の核酸複合体Iにおけるリガンド部」とは、該核酸複合体Iを構成するオリゴヌクレオチド部分以外の部分構造を示す。）【０２２４】
工程2
得られた1本鎖のオリゴヌクレオチドは、混合緩衝液[100 mmol/L酢酸カリウム、30 mmol/L 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、HEPES)-KOH(pH 7.4)、2 mmol/L酢酸マグネシウム]に溶解し、濃度50 μmol/Lとした。センス鎖、アンチセンス鎖を各々等量混合し、80 ℃で10分間静置した。センス鎖配列は、それぞれ表3−2、3−18に記載されているCH1179、CH0099、CH1180のセンス鎖配列に示す通りである。徐々に温度を下げ、37 ℃で1時間静置し、2本鎖オリゴヌクレオチドを得た。最終的に得られた、CH1179、CH0099、CH1180それぞれの二本鎖核酸(siRNA)に、リガンド部が付加された核酸複合体を、G-CH1179、G-CH0099、G-CH1180と称する。【０２２５】
試験例2
核酸複合体のマウス初代肝細胞に対するin vitro活性
実施例1で得られた各核酸複合体につき、それぞれ以下の方法により、シーディーワン(CD-1)由来マウス初代肝細胞(ライフテクノロジー社製、カタログ番号MSCP10)に導入した。
最終濃度が10または3 nmol/Lとなるように、オプティメム(Opti-MEM、ギブコ(GIBCO)社、31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルの培養プレートに、20μLずつ分注した後、プライマリヘパトサイトゾウイングアンドプレーティングサプリメント(Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements ) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM3000)を含むウィリアムズイーメディウム(William’s E Medium) (ライフテクノロジー社製、カタログ番号A12176-01)に懸濁させたマウス初代肝細胞を、細胞数12500/80μL/ウェルとなるように播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、プライマリヘパトサイトメンテナンスサプリメント（Primary Hepatocyte Maintenance Supplements）(ライフテクノロジー社製、カタログ番号CM4000)を含むウィリアムズイーメディウムを添加した。また陰性対照の群として何も処理しない細胞を播種した。
各製剤を導入した細胞を37℃の5%CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、Cells-to-Ct Kit(アプライドバイオサイエンス(ABI)社、カタログ番号AM1728)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製とを行った。
得られたcDNAを鋳型とし、ユニバーサルプローブライブラリ(Universal Probe Library、ロシュ アプライドサイエンス(Roche Applied Science)社、04683633001)をプローブとして、ABI7900HT Fast(ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、β2GPI遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、β2GPIのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定した陰性対照におけるβ2GPIのmRNAの準定量値を1として、β2GPIのmRNAの準定量値から、β2GPIのmRNAの発現率を求めた。得られたβ2GPIのmRNAの発現率の結果を、IC50値として表7に示す。【０２２６】
【表５７】
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【０２２７】
表7から明らかなように、実施例1で得られた各核酸複合体は、マウス初代肝細胞に導入後のβ2GPI遺伝子のmRNAの発現を抑制した。【０２２８】
試験例3
核酸複合体のマウスにおけるin vivo活性
実施例1で得られた各核酸複合体につき、それぞれ以下の方法によりin vivo評価試験を実施した。なお、各核酸複合体は、試験に合わせてリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で希釈して用いた。マウス(Balb/c、日本クレアより入手)を馴化飼育後、各核酸複合体を3 mg/kg、20 mg/kgずつマウスに皮下注投与した。投与から3日後に肝臓を採取し液体窒素で凍結保存した。肝臓凍結サンプルをトリゾール(登録商標)アールエヌエーアイソレーションリージェンツ (ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)社製、カタログ番号15596026)およびアールエヌエーイージーミニキット(キアゲン(QIAGEN)社製、カタログ番号74106)を用い、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、全RNAの回収を行った。さらにトランスクリプターファーストストランドシーディーエヌエーシンセシスキット (ロシュ社(Roche社)製、カタログ番号04897030001)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。得られたcDNAを鋳型とし、タックマン(登録商標)ジーンエクスプレッションアッセイズプローブ(アプライドバイオシステムズ社製)をプローブとして、エービーアイ7900エイチティーファストABI7900HT Fast(ABI社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってPCR反応させることにより、β2GPI遺伝子および構成的発現遺伝子であるグリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、以下gapdhと表す)遺伝子をPCR反応させてmRNA増幅量をそれぞれ測定し、gapdhのmRNA増幅量を内部対照として、β2GPIのmRNAの準定量値を算出した。同様に測定したリン酸緩衝化生理食塩水投与群におけるβ2GPIのmRNAの準定量値を1として、β2GPIのmRNAの準定量値から、β2GPIのmRNAの発現率を求めた。得られたβ2GPIのmRNAの発現抑制率の結果を表8に示す。【０２２９】
【表５８】
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【０２３０】
表8から明らかなように、本発明の核酸複合体を、哺乳動物に投与して、生体内において、β2GPI遺伝子の発現を低下させ、β2GPI関連疾患を治療することができることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０２３１】
本発明の核酸複合体を、哺乳動物に投与して、生体内において、β2GPI遺伝子発現を抑制し、β2GPI関連疾患を治療することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０２３２】
配列番号１〜１１８０は、β2GPI遺伝子に対するsiRNAのセンス鎖RNA塩基配列を示す。
配列番号１１８１〜２３６０は、β2GPI遺伝子に対するsiRNAのアンチセンス鎖RNA塩基配列を示す。
配列番号２３６１〜３５４０は、標的となるβ2GPI遺伝子をDNA塩基配列で示す。
配列番号３５４１は、β2GPI遺伝子のcDNA塩基配列を示す。
配列番号４００１〜４７０２は、二本鎖核酸（ＢＨ０３３〜ＢＨ１１８０）のセンス鎖RNA塩基配列を示す。
配列番号４７０３〜５４０４は、二本鎖核酸（ＢＨ０３３〜ＢＨ１１８０）のアンチセンス鎖RNA塩基配列を示す。
配列番号５４０５〜６１０６は、二本鎖核酸（ＣＨ０３３〜ＣＨ１１８０）のセンス鎖RNA塩基配列を示す。
配列番号６１０７〜６８０８は、二本鎖核酸（ＣＨ０３３〜ＣＨ１１８０）のアンチセンス鎖RNA塩基配列を示す。
【配列表】
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【国際調査報告】
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