(57)【要約】本発明は、腫瘍細胞の転移性能獲得又はアポトーシス抵抗性獲得といった悪性化を抑制するための抑制剤及び抗腫瘍剤を提供する。本発明は、Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、腫瘍細胞の転移性能獲得又はアポトーシス抵抗性獲得を抑制又は阻害する、腫瘍細胞の悪性化抑制剤；ヒト以外の動物の腫瘍細胞の悪性化を抑制する方法であって、Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害することにより、腫瘍細胞の転移性能獲得又はアポトーシス抵抗性獲得を抑制又は阻害する、腫瘍細胞の悪性化抑制方法；Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、前立腺がんの治療に用いられる、抗腫瘍剤；並びに、Ｚｉｃ５遺伝子の発現量からなる、腫瘍細胞の悪性度マーカーである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、腫瘍細胞の転移性能獲得又はアポトーシス抵抗性獲得を抑制又は阻害する、腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
【請求項２】
前記Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、Ｚｉｃ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである、請求項１に記載の腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
【請求項３】
前記Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、Ｚｉｃ５タンパク質とＥ−カドヘリンをコードする遺伝子のプロモーター配列との相互作用を阻害する物質、Ｚｉｃ５タンパク質の核内局在を阻害する物質、又はＺｉｃ５タンパク質を分解する物質である、請求項１に記載の腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
【請求項４】
前記腫瘍細胞が、メラノーマ細胞又は前立腺がん細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
【請求項５】
前記腫瘍細胞が、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
【請求項６】
ヒト以外の動物の腫瘍細胞の悪性化を抑制する方法であって、
Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害することにより、腫瘍細胞の転移性能獲得又はアポトーシス抵抗性獲得を抑制又は阻害する、腫瘍細胞の悪性化抑制方法。
【請求項７】
Ｚｉｃ５遺伝子の機能の抑制又は阻害を、ＲＮＡ干渉により、Ｚｉｃ５遺伝子の発現を阻害することにより行う、請求項６に記載の腫瘍細胞の悪性化抑制方法。
【請求項８】
Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、メラノーマの治療に用いられる、抗腫瘍剤。
【請求項９】
ＢＲＡＦ阻害剤耐性を有するメラノーマ、又はＢＲＡＦ阻害剤への治療適性のないメラノーマの治療に用いられる、請求項８に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１０】
Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、前立腺がんの治療に用いられる、抗腫瘍剤。
【請求項１１】
前記Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、Ｚｉｃ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項１２】
Ｚｉｃ５遺伝子の発現量からなる、腫瘍細胞の悪性度マーカー。
【請求項１３】
被検腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量をマーカーとし、
被検腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量が多いほど、悪性度が高いと評価する、腫瘍細胞の悪性度の評価方法。
【請求項１４】
前記被検腫瘍細胞が原発性腫瘍細胞であり、前記被検腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量が、所定の閾値以上である場合に、前記被検腫瘍細胞が転移性能又はアポトーシス抵抗性を獲得したリスクが高いと評価する、請求項１３に記載の腫瘍細胞の悪性度の評価方法。
【請求項１５】
Ｚｉｃ５遺伝子の発現量からなり、メラノーマ又は前立腺がんを検出する、腫瘍マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞の転移性能獲得又はアポトーシス抵抗性獲得といった悪性化を抑制するための抑制剤及び抗腫瘍剤に関する。
本願は、２０１５年５月１日に、日本に出願された特願２０１５−９３９８０号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
悪性黒色腫（メラノーマ）は、メラニン産生細胞であるメラノサイトががん化した悪性腫瘍である。早期発見により治癒が可能であるが、遠隔性転移を起こした症例における５年生存率は約１０％と低く、有効な治療法が確立されていない（例えば、非特許文献１及び２参照。）。また、症例の約６０〜７０％以上でＢＲＡＦＶ６００Ｅ遺伝子変異が確認されている。ＢＲＡＦ（ＭＡＰＫ経路のＭＡＰＫＫＫ）が下流のＭＥＫ（ＭＡＰＫ経路のＭＡＰＫＫ）をリン酸化して活性化し、活性化されたＭＥＫによりさらに下流のＥＲＫ（ＭＡＰＫ経路のＭＡＰＫ）がリン酸化されて活性化することにより、増殖、生存、浸潤、転移に関わる多くのタンパク質が活性化される（例えば、非特許文献３参照。）。ＢＲＡＦＶ６００Ｅの変異によりＢＲＡＦが恒常的かつ強力に活性化していることが、メラノーマの原因の１つであり、現在では、変異型ＢＲＡＦに対する選択的な阻害剤（ＰＬＸ４０３２、ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ）を用いた臨床試験が行われ、高い奏効率が確認されている。しかし、ＢＲＡＦ遺伝子のスプライシングバリアントの発現や、間質細胞から分泌される肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の発現など、様々な機構により、ＢＲＡＦ阻害剤に対する薬剤耐性が生じ、その効果は限定的であることが報告されている（例えば、非特許文献４〜６参照。）。【０００３】
上皮性のがんが転移能を獲得する原因の１つとして、上皮間葉形質転換（Epithelial Mesenchymal Transition；ＥＭＴ）が知られている。ＥＭＴは、上皮系の細胞が間葉系細胞の形質を獲得する現象であり、ＥＭＴを生じると、上皮細胞間接着分子であるＥ−カドヘリンの発現量が減少することが知られている。また、ＥＭＴは、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｔｗｉｓｔなどの転写因子によって制御されていることが明らかになっており、これらの因子がＥ−カドヘリンなどの発現を制御し、ＥＭＴを引き起こすことが知られている（例えば、非特許文献７参照。）。【０００４】
メラノーマにおいても、転移のある症例で多くのＥＭＴ関連遺伝子の発現が変化しており、ＥＭＴプログラムの亢進が転移の原因の一つであることが示唆されている（例えば、非特許文献８参照。）。また、ＢＲＡＦ変異をもつメラノーマにおいて、ＢＲＡＦの恒常的活性化によりＺｅｂ１、Ｔｗｉｓｔ１などの転写因子が発現誘導され、これらの因子によるＥ−カドヘリンの発現抑制が生じ、メラノーマの増悪が引き起こされるというＥＭＴ様の現象が確認されている（例えば、非特許文献９参照。）。Ｅ−カドヘリンの発現レベルは多くのメラノーマにおいて低下しており、Ｅ−カドヘリンの発現が低下している症例において再発率が有意に上昇することが報告されている（例えば、非特許文献１０参照。）。これらの知見から、Ｅ−カドヘリンの発現低下とメラノーマの増悪との関連が示唆されている。【０００５】
一方で、ＥＭＴはがんだけでなく、初期胚発生時にも必須の現象であり、原腸陥入や神経冠細胞の分化に関与している。神経冠細胞は、背側神経管の一部でＥＭＴを起こし、上皮組織から乖離することで移動能を獲得し、末梢神経系、グリア細胞、衛星細胞、メラノサイト、象牙芽細胞、頭蓋顔面軟骨などに分化する。神経冠細胞のＥＭＴにおいても、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｔｗｉｓｔなどの転写因子によりＥ−カドヘリンの発現低下が引き起こされている（例えば、非特許文献７及び１１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Aamdal et al., European Journal of Cancer，2011，vol.47，Suppl 3，p.S336-S337.
【非特許文献２】Blank et al. , Cancer Immunology, Immunotherapy, 2011, vol.60, p.1359-1371.
【非特許文献３】Cangol et al., FEBS Journal, 2009，vol.277(1), p.2-27.
【非特許文献４】Poulikakos et al., Nature，2011，vol.480, p.387-390.
【非特許文献５】Price et al., Journal of Clinical Oncology  2011，vol.29(19)，p.2675-2682.
【非特許文献６】Villanueva et al., Cancer Research, 2011, vol.71, p.7137.
【非特許文献７】Thiery et al.，Cell，2009，vol.139, p.871-890.
【非特許文献８】Alonso et al., Cancer Research, 2007，vol.67(7), p.3450-3460.
【非特許文献９】Caramel et al., Cancer Cell，2013，vol.24, p.466-480.
【非特許文献１０】Andersen et al., Modern Pathology，2004，vol.17, p.990-997.
【非特許文献１１】Acloque et al., Journal of Clinical Investigation，2009，vol.119，  p.1438-1449.
【非特許文献１２】Satow et al.，Gastroenterology，2012，vol.142(3)，p.572-581.
【非特許文献１３】Kanemaru et al.，Nature Communications，2012，vol.3，p.963.
【非特許文献１４】Arozarena et al., Cancer Cell，2011，vol.19，p.45-57.
【非特許文献１５】Sanz-Moreno et al., Cancer Cell, 2011, vol.20, p.229-245.
【非特許文献１６】Hirano et al.，Biochemical Pharmacology，2013，vol.86(10)，p.1419-1429.
【非特許文献１７】Ishigro et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004，vol.324, p.302-307．
【非特許文献１８】Dennis et al., Genome Biology，2003，vol.4(5)，p.P3.
【非特許文献１９】Hess et al., Cancer Research, 2005，vol.65，p.9851-9860.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、腫瘍細胞の転移性能獲得又はアポトーシス抵抗性獲得といった悪性化を抑制するための抑制剤及び抗腫瘍剤を提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究した結果、腫瘍細胞においてＺｉｃ５（Zic family member 5 (odd-paired homolog, Drosophila)）遺伝子の発現を抑制することにより、Ｅ−カドヘリンの発現量低下が抑制されること、Ｚｉｃ５タンパク質がＥ−カドヘリンの転写因子として機能することを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤、腫瘍細胞の悪性化抑制方法、抗腫瘍剤、腫瘍細胞の悪性度マーカー、腫瘍細胞の悪性度の評価方法、及び腫瘍マーカーは、下記［１］〜［１５］である。
［１］  Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、腫瘍細胞の転移性能獲得又はアポトーシス抵抗性獲得を抑制又は阻害する、腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
［２］  前記Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、Ｚｉｃ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである、前記［１］の腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
［３］  前記Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、Ｚｉｃ５タンパク質とＥ−カドヘリンをコードする遺伝子のプロモーター配列との相互作用を阻害する物質、Ｚｉｃ５タンパク質の核内局在を阻害する物質、又はＺｉｃ５タンパク質を分解する物質である、前記［１］の腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
［４］  前記腫瘍細胞が、メラノーマ細胞又は前立腺がん細胞である、前記［１］〜［３］のいずれかの腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
［５］  前記腫瘍細胞が、ＢＲＡＦ阻害剤耐性を有する、前記［１］〜［４］のいずれかの腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
［６］  ヒト以外の動物の腫瘍細胞の悪性化を抑制する方法であって、
Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害することにより、腫瘍細胞の転移性能獲得又はアポトーシス抵抗性獲得を抑制又は阻害する、腫瘍細胞の悪性化抑制方法。
［７］  Ｚｉｃ５遺伝子の機能の抑制又は阻害を、ＲＮＡ干渉により、Ｚｉｃ５遺伝子の発現を阻害することにより行う、前記［６］の腫瘍細胞の悪性化抑制方法。
［８］  Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、メラノーマの治療に用いられる、抗腫瘍剤。
［９］  ＢＲＡＦ阻害剤耐性を有するメラノーマ、又はＢＲＡＦ阻害剤への治療適性のないメラノーマの治療に用いられる、前記［８］の抗腫瘍剤。
［１０］  Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、前立腺がんの治療に用いられる、抗腫瘍剤。
［１１］  前記Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質が、Ｚｉｃ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡである、前記［８］〜［１０］のいずれかの抗腫瘍剤。
［１２］  Ｚｉｃ５遺伝子の発現量からなる、腫瘍細胞の悪性度マーカー。
［１３］  被検腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量をマーカーとし、
被検腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量が多いほど、悪性度が高いと評価する、腫瘍細胞の悪性度の評価方法。
［１４］  前記被検腫瘍細胞が原発性腫瘍細胞であり、前記被検腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量が、所定の閾値以上である場合に、前記被検腫瘍細胞が転移性能又はアポトーシス抵抗性を獲得したリスクが高いと評価する、前記［１３］の腫瘍細胞の悪性度の評価方法。
［１５］  Ｚｉｃ５遺伝子の発現量からなり、メラノーマ又は前立腺がんを検出する、腫瘍マーカー。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤及び抗腫瘍剤は、腫瘍細胞におけるＥ−カドヘリンの発現量低下を抑制し、転移性能獲得又はアポトーシス抵抗性獲得といった悪性化を抑制することができる。本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤等は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を有する腫瘍細胞や、ＢＲＡＦ阻害剤ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂに対する薬剤耐性を獲得した腫瘍細胞に対しても悪性化抑制作用及び抗腫瘍作用を有することから、腫瘍治療に非常に有効な新規薬剤である。
また、腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量は、腫瘍細胞の悪性度マーカーとして有用であり、よって本発明に係る腫瘍細胞の悪性度の評価方法は、転移性腫瘍の早期発見や、薬剤耐性獲得のリスク評価に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、各細胞のＧＡＰＤＨを内部標準としたＺｉｃ５遺伝子の発現量の定量結果を示した図である。
【図２】実施例１において、ヒトメラノーマ臨床検体を、抗ＺＩＣ５抗体を用いて免疫組織染色した染色像である。
【図３】実施例１において、図３の染色像について、染色強度に基づいてＺｉｃ５遺伝子の発現量をスコア化した結果を示した図である。
【図４】実施例２において、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株のウェスタンブロット像である。
【図５】実施例２において、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株のＧＡＰＤＨを内部標準としたＣＤＨ１遺伝子（Ｅ−カドヘリンをコードする遺伝子）のｍＲＮＡの相対発現量の測定結果を示した図である。
【図６】実施例２において、ＲＮＡ干渉によるＺｉｃ５遺伝子発現を抑制した場合の、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株のＧＡＰＤＨを内部標準としたＣＤＨ１遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量の測定結果を示した図である。
【図７】実施例２において、ｓｉＺＩＣ５＃１、ｓｉＺＩＣ５＃２、ｓｉＮｅｇ＃１、又はｓｉＮｅｇ＃２を導入したＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞とＡ３７５細胞のＧＡＰＤＨを内部標準としたＺｉｃ５遺伝子及びＣＤＨ１遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量の測定結果を示した図である。
【図８】実施例３において、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株の、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイの移動細胞数の計数結果（上段）と、ウェスタンブロット像（下段）である。
【図９】実施例３において、ｓｉＺＩＣ５＃１、ｓｉＺＩＣ５＃２、ｓｉＮｅｇ＃１、又はｓｉＮｅｇ＃２を導入したＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞とＡ３７５細胞の、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイの移動細胞数の計数結果（上段）と、ウェスタンブロット像（下段）である。
【図１０】実施例３において、ｓｉＺＩＣ５＃１、ｓｉＺＩＣ５＃２、ｓｉＮｅｇ＃１、又はｓｉＮｅｇ＃２を導入したＡ３７５細胞の、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ アッセイの浸潤細胞数の計数結果を示した図である。
【図１１】実施例３において、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株の、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）処理下又は未処理下の、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイの移動細胞数の計数結果を示した図である。
【図１２】実施例３において、ｓｉＺＩＣ５＃１、ｓｉＺＩＣ５＃２、ｓｉＮｅｇ＃１、又はｓｉＮｅｇ＃２を導入したＡ３７５細胞とＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞の細胞数を経時的に測定した結果を示した図である。
【図１３】実施例３において、ＭＴＴアッセイによってＺｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株の生存細胞の相対数の測定結果を示した図である。
【図１４】実施例３において、各細胞のｓｕｂＧ１期にある細胞の割合（％）を示した図である。
【図１５】実施例４において、各細胞を皮下移植されたヌードマウスの腫瘍組織の大きさ（Ａ）及び重量（Ｂ）の経時的変化を示した図である。
【図１６】実施例４において、ｓｈＮｅｇ株、ｓｈＺｉｃ５−１株又はｓｈＺｉｃ５−２株を注入したヌードマウスにおける肺転移能を測定した結果を示した図である。
【図１７】実施例５において、ＥＭＳＡにおいて用いた３種のプローブの塩基配列のアラインメント図である。
【図１８】実施例５において、ＥＭＳＡの電気泳動したゲルをＨＲＰ標識ストレプトアビジンで染色した染色像である。
【図１９】実施例５において、クロマチン免疫沈降法において、マウスＩｇＧ又は抗ＨＡ抗体で沈降させたＤＮＡの相対量の測定結果を示した図である。
【図２０】実施例５において、ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示した図である。
【図２１】実施例５において、変異導入前のＥ−カドヘリンプロモーター領域（ｐＣＤＨ１）と一塩基置換変異を導入した変異体ＧＢＳｍｕｔ及びＭ５ｍｕｔの塩基配列のアラインメント図である。
【図２２】実施例５において、変異導入前のｐＣＤＨ１と、変異体ＧＢＳｍｕｔ及びＭ５ｍｕｔとのルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示した図である。
【図２３】実施例６において、ｓｉＺＩＣ５又はｓｉＮｅｇを導入したＡ３７５細胞及びＨＴ１４４細胞におけるＰＤＧＦＤ遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量の測定結果を示した図である。
【図２４】実施例６において、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株のＰＤＧＦＤ遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量の測定結果を示した図である。
【図２５】実施例６において、ｓｉＰＤＧＦＤ＃１、ｓｉＰＤＧＦＤ＃２、又はｓｉＮｅｇ＃１を導入したＡ３７５細胞の細胞数を経時的に測定した結果を示した図である。
【図２６】実施例６において、ｓｉＺＩＣ５又はｓｉＮｅｇを導入したＡ３７５細胞及びＨＴ１４４細胞におけるＩＴＧＡ６遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量の測定結果を示した図である。
【図２７】実施例６において、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株のＩＴＧＡ６遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量の測定結果を示した図である。
【図２８】実施例６において、ラットＩｇＧ又は抗ＩＴＧＡ６抗体で処理したＡ３７５細胞の相対細胞数の測定結果を示した図である。
【図２９】実施例６において、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株の細胞に、ｓｉＰＤＧＦＤ＃１又はｓｉＮｅｇ＃１を導入した細胞のＴｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイの相対移動細胞数の測定結果を示した図である。
【図３０】実施例７において、ＰＬＸ４０３２処理後又はＤＭＳＯ処理のＺｉｃ５遺伝子安定発現株及びＦｌａｇ安定発現株の相対細胞数の測定結果を示した図である。
【図３１】実施例７において、ＢＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ４０３２処理後又はＤＭＳＯ処理のＺｉｃ５遺伝子安定発現株及びＦｌａｇ安定発現株のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）の測定結果を示した図である。
【図３２】実施例７において、ｓｉＮｅｇ、ｓｉＺＩＣ５、ｓｉＰＤＧＦＤ、又はｓｉＩＴＧＡ６を導入したＡ３７５細胞のＰＬＸ４０３２処理後又はＤＭＳＯ処理におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）の測定結果を示した図である。
【図３３】実施例７において、ｓｉＮｅｇ、ｓｉＺＩＣ５、ｓｉＰＤＧＦＤ、又はｓｉＩＴＧＡ６を導入したＡ３７５細胞をＰＬＸ４０３２処理後又はＤＭＳＯ処理における相対細胞数の測定結果を示した図である。
【図３４】実施例７において、ラットＩｇＧ又は抗ＩＴＧＡ６抗体で処理したＡ３７５細胞のＰＬＸ４０３２処理後又はＤＭＳＯ処理におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）の測定結果を示した図である。
【図３５】実施例７において、ｓｉＮｅｇ又はｓｉＰＤＧＦＤを導入したＺｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株（左図）、及びラットＩｇＧ又は抗ＩＴＧＡ６抗体で処理したＺｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株（右図）の、ＰＬＸ４０３２処理におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）の測定結果を示した図である。
【図３６】実施例７において、ｓｉＮｅｇ又はｓｉＺＩＣ５を導入したＡ３７５細胞のＭＥＫ阻害剤ＵＯ１２６処理後、若しくはオキサリプラチン処理後又はＤＭＳＯ処理における、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）の測定結果を示した図である。
【図３７】実施例８において、５種類のＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ耐性株（ｖｅｍＲ−１〜５）とＡ３７５細胞を、各濃度のＰＬＸ４０３２で４８時間処理した後の相対細胞数の測定結果を示した図である。
【図３８】実施例８において、ＰＬＸ４０３２処理後又はＤＭＳＯ処理した後のｖｅｍＲ−１〜５細胞及びＡ３７５細胞のウェスタンブロット像である。
【図３９】実施例８において、ｓｉＮｅｇ、ｓｉＺＩＣ５、又はｓｉＰＤＧＦＤを導入したｖｅｍＲ−１〜５細胞及びＡ３７５細胞の相対細胞数の測定結果を示した図である。
【図４０】実施例９において、３種類のＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ耐性株（ｖｅｍＲ−１〜３）とＨＴ１４４細胞を、各濃度のＰＬＸ４０３２で４８時間処理した後の相対細胞数の測定結果を示した図である。
【図４１】実施例９において、ＰＬＸ４０３２処理後又はＤＭＳＯ処理した後のｖｅｍＲ−１〜３細胞及びＨＴ１４４細胞のウェスタンブロット像である。
【図４２】実施例９において、ｓｉＮｅｇ、ｓｉＺＩＣ５、ｓｉＰＤＧＦＤ、又はｓｉＩＴＧＡ６を導入したｖｅｍＲ−１〜３細胞及びＨＴ１４４細胞の相対細胞数の測定結果を示した図である。
【図４３】実施例１０において、ヒト前立腺がん臨床検体を、抗ＺＩＣ５抗体を用いて免疫組織染色した染色像を、染色強度に基づいてＺｉｃ５遺伝子の発現量をスコア化した結果を示した図である。
【図４４】実施例１０において、ｓｉＺＩＣ５＃１、ｓｉＺＩＣ５＃２、ｓｉＮｅｇ＃１、又はｓｉＮｅｇ＃２を導入したＤＵ１４５細胞の相対細胞数の測定結果を示した図である。
【図４５】実施例１０において、ｓｉＺＩＣ５＃１又はｓｉＮｅｇ＃１を導入したＤＵ１４５細胞又はＰＣ細胞におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）の測定結果を示した図である。
【図４６】実施例１０において、ｓｉＺＩＣ５＃１又はｓｉＮｅｇ＃１を導入したＤＵ１４５細胞におけるＺｉｃ５遺伝子、ＰＤＧＦＤ遺伝子、及びＩＴＧＡ６遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量の測定結果を示した図である。
【図４７】実施例１０において、ｓｉＰＤＧＦＤ＃１、ｓｉＰＤＧＦＤ＃２、又はｓｉＩＴＧＡ６＃１を導入したＤＵ１４５細胞の相対細胞数の測定結果を示した図である。
【図４８】実施例１０において、ｓｉＰＤＧＦＤ＃１、ｓｉＰＤＧＦＤ＃２、又はｓｉＩＴＧＡ６＃１を導入した後、ｄｏｃｅｔａｘｅｌ処理後又はＤＭＳＯ処理したＤＵ１４５細胞におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）の測定結果を示した図である。
【図４９】実施例１１において、ｓｉＰＤＧＦＤ又はｓｉＮｅｇを導入したＡ３７５細胞のウェスタンブロット像である。
【図５０】実施例１１において、ｈＰＤＧＦＤ過剰発現株とｐｃＤＮＡ株のウェスタンブロット像である。
【図５１】実施例１１において、ＦＡＫ阻害剤処理後のＡ３７５細胞のウェスタンブロット像である。
【図５２】実施例１１において、ＳＴＡＴ３阻害剤処理後のＡ３７５細胞のウェスタンブロット像である。
【図５３】実施例１１において、ＩＬ−６処理後のＡ３７５細胞のウェスタンブロット像である。
【図５４】実施例１２において、ｓｉＮｅｇ＃１、ｓｉＮｅｇ＃２、ｓｉＺＩＣ５＃１、又はｓｉＰＤＧＦＤ＃１を導入したｖｅｍＲ−３細胞のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）の測定結果を示した図である。
【図５５】実施例１２において、ｓｉＺＩＣ５＃１又はｓｉＰＤＧＦＤ＃１を導入し、さらにＢＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ４０３２処理したｖｅｍＲ−３細胞のウェスタンブロット像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明及び本願明細書において、「腫瘍細胞の悪性化」は、腫瘍細胞が、転移性能を獲得したり、アポトーシス抵抗性等の薬剤耐性を獲得する現象を意味する。
【００１３】
本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤は、Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質を有効成分とし、腫瘍細胞の転移性能獲得又はアポトーシス抵抗性獲得を抑制又は阻害することを特徴とする。Ｚｉｃ５遺伝子がコードするＺｉｃ５タンパク質は、Ｅ−カドヘリンをコードする遺伝子（ＣＤＨ１遺伝子）のプロモーター領域中の配列ＧＧＧＣＧＧＴに結合することにより、Ｅ−カドヘリンの発現を制御する。Ｚｉｃ５遺伝子の発現量が多くなるほど、Ｅ−カドヘリンの発現が抑制され、ＥＭＴが生じ、転移性能やアポトーシス抵抗性を獲得しやすくなる。逆に、Ｚｉｃ５遺伝子の発現を抑制することにより、Ｅ−カドヘリンの発現量の低下が抑制され、ＥＭＴが生じにくくなる。このため、本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤を腫瘍細胞内に導入することによって、ＥＭＴを抑制し、悪性化を抑制できる。Ｚｉｃ５タンパク質がＣＤＨ１遺伝子の転写因子としての機能を有することは、本願発明者らによって初めて見出された知見である。なお、Ｚｉｃ５タンパクは、Ｅ−カドヘリン以外のタンパク質をコードする遺伝子の転写因子としても機能する可能性があり、当該タンパク質の発現を制御することによっても腫瘍細胞の悪性化が抑制されている可能性がある。
【００１４】
Ｚｉｃ５遺伝子の機能の抑制又は阻害は、Ｚｉｃ５遺伝子の発現を阻害することによって達成できる。すなわち、本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤の有効成分であるＺｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質としては、ＲＮＡ干渉等により、Ｚｉｃ５遺伝子の発現自体を抑制させる作用を有する物質が挙げられる。当該物質としては、例えば、Ｚｉｃ５遺伝子のｃＤＮＡの部分領域（ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）標的領域）のセンス鎖とアンチセンス鎖からなる二本鎖構造を有するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ）が挙げられる。また、標的である腫瘍細胞内において、ｓｉＲＮＡ等を生産させることができるＲＮＡｉ誘導ベクターであってもよい。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＲＮＡｉ誘導ベクターの作製は、標的とするＺｉｃ５遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列情報から、常法により設計し製造することができる。また、ＲＮＡｉ誘導ベクターは、市販の各種ＲＮＡｉベクターの塩基配列に、ＲＮＡｉ標的領域の塩基配列を挿入することによって作製することもできる。
【００１５】
本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤の有効成分としては、Ｚｉｃ５タンパク質に直接又は間接的に結合することによって、Ｚｉｃ５タンパク質がＣＤＨ１遺伝子のプロモーター配列に結合することを抑制又は阻害する物質であってもよい。当該物質としては、特に限定されるものではなく、核酸、ペプチド、タンパク質、低分子化合物のいずれであってもよい。
【００１６】
Ｚｉｃ５タンパク質に結合してＺｉｃ５タンパク質とＣＤＨ１遺伝子のプロモーター配列との相互作用を阻害する核酸としては、例えば、ＣＤＨ１遺伝子のプロモーター配列中のＺｉｃ５タンパク質との結合領域（ＧＧＧＣＧＧＴ）と同一又は相同性の高い塩基配列を有する核酸分子（いわゆる、デコイ核酸）が挙げられる。デコイ核酸としては、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい、また、１本鎖核酸であってもよく、２本鎖核酸であってもよい。生体内での安定性に優れることから、デコイ核酸としては、２本鎖ＤＮＡが好ましい。
【００１７】
Ｚｉｃ５タンパク質に結合してＺｉｃ５タンパク質とＣＤＨ１遺伝子のプロモーター配列との相互作用を阻害するタンパク質としては、例えば、抗ＺＩＣ５抗体が挙げられる。当該抗体としては、モノクローナル抗体でもよく、ポリクローナル抗体でもよい。また、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の人工的に合成された抗体であってもよい。これらの抗体は、常法により製造することができる。
【００１８】
また、本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤の有効成分としては、Ｚｉｃ５タンパク質の核内局在を阻害する物質であってもよい。Ｚｉｃ５タンパク質の核内局在が阻害されると、Ｚｉｃ５タンパク質はＣＤＨ１遺伝子のプロモーター配列と結合できず、ＣＤＨ１遺伝子の転写因子としての機能が阻害される。Ｚｉｃ５タンパク質の核内局在を阻害する物質としては、Ｚｉｃ５タンパク質の核内への移行を阻害する物質であってもよく、核外への排出を促進する物質であってもよい。核内移行を阻害する物質としては、例えば、Ｚｉｃ５タンパク質と、Ｚｉｃ５タンパク質の核内移行シグナルを被覆するように結合する物質が挙げられる。当該物質としては、タンパク質やペプチドであってもよく、低分子化合物であってもよい。
【００１９】
本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤の有効成分としては、Ｚｉｃ５タンパク質を分解する物質であってもよい。Ｚｉｃ５タンパク質自体が分解されることにより、その機能は阻害される。Ｚｉｃ５タンパク質を分解する物質としては、Ｚｉｃ５タンパク質を直接分解する分解酵素であってもよく、タンパク質分解酵素の基質になるようにポリユビキチン等の各種標識を行う物質であってもよい。
【００２０】
本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤は、経口投与、静注、鼻腔又は口腔への直接投与、経皮投与等の各種投与形態に適した剤型に、常法により製剤化できる。当該剤型としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、チュアブル剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、注射剤、含嗽剤、噴霧剤、貼付剤、軟膏剤等が挙げられる。
【００２１】
本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤は、有効成分であるＺｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質に加えて、各種添加剤を含有していてもよい。当該添加剤としては、賦形剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等が挙げられる。これらの添加剤としては、薬学上許容される物質であって、医薬の製剤化に使用されているものの中から適宜選択して使用することができる。
【００２２】
本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤をヒトやヒト以外の動物に投与し、Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害することにより、腫瘍細胞の転移性能獲得又はアポトーシス抵抗性獲得を抑制又は阻害し、これらの動物の腫瘍細胞の悪性化を抑制することができる。当該動物としては、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の哺乳動物や、ニワトリ、ウズラ、カモ等の鳥類等が挙げられる。
【００２３】
本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤は、様々な腫瘍細胞に対して悪性化を抑制できる。標的とされる腫瘍細胞は、転移性がん由来の腫瘍細胞であってもよいが、悪性化抑制効果が充分に発揮できることから、原発性がん由来の腫瘍細胞であることが好ましい。
【００２４】
本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤により標的とされる腫瘍細胞の種類は特に限定されるものではなく、皮膚がん、前立腺がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、副腎がん、胃がん、大腸がん、腎臓がん、子宮頸がん、子宮体がん、卵巣がん、膀胱がん、脂肪肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、黄紋筋肉腫、滑膜肉腫、悪性末梢神経腫瘍、骨肉腫、軟骨肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫等の細胞が挙げられる。本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤が治療剤として用いられる腫瘍細胞としては、元々Ｅ−カドヘリンの発現量の多い上皮性細胞に由来する腫瘍細胞であることが好ましく、Ｚｉｃ５遺伝子の発現量も多いことから皮膚がん細胞又は前立腺がん細胞が好ましく、メラノーマ細胞又は前立腺がん細胞がより好ましい。特に、本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤は、ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ等のＢＲＡＦ阻害剤に対する耐性を有する腫瘍細胞やＢＲＡＦ阻害剤への治療適性のない（すなわち、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を有さない）腫瘍細胞に対しても悪性化抑制作用を奏することから、これらの腫瘍細胞を有する腫瘍の治療に好適に用いられる。
【００２５】
メラノーマ等の皮膚がんや前立腺がんにおいては、Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害することにより、悪性化が抑制できるだけではなく、腫瘍細胞の増殖も抑制できる。このため、Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質は、メラノーマ等の皮膚がんや前立腺がんの治療に用いられる抗腫瘍剤の有効成分として用いることもできる。当該Ｚｉｃ５遺伝子の機能を抑制又は阻害する物質としては、本発明に係る腫瘍細胞の悪性化抑制剤の有効成分と同様のものが使用できる。特に、本発明に係る抗腫瘍剤は、従来、有効な治療剤がなかったＢＲＡＦ阻害剤耐性を有するメラノーマや、ＢＲＡＦ阻害剤への治療適性のないメラノーマに対し、非常に有効な治療剤である。
【００２６】
Ｚｉｃ５遺伝子の発現量が多い腫瘍細胞ほど、Ｅ−カドヘリンの発現が抑制され、ＥＭＴが生じ、悪性化しやすくなる。逆に、Ｚｉｃ５遺伝子の発現量が少ない腫瘍細胞ほど、Ｅ−カドヘリンの発現量が低下せず、ＥＭＴが生じ難く、悪性化し難い。このため、腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量は、悪性度マーカーとして有用である。すなわち、被検腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量をマーカーとし、Ｚｉｃ５遺伝子の発現量に基づいて、当該被検腫瘍細胞の悪性度を評価することができる。
【００２７】
例えば、被検腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量が多いほど、悪性度が高いと評価することができる。逆に、被検腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量が少ないほど、悪性度が低いと評価することができる。また、被検腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量を、予め設定された閾値と比較し、当該被検腫瘍細胞の悪性度を評価してもよい。Ｚｉｃ５遺伝子の発現量が、予め設定された閾値よりも多い場合には被検腫瘍細胞の悪性度は高いと評価し、予め設定された閾値よりも少ない場合には被検腫瘍細胞の悪性度は低いと評価する。例えば、被検腫瘍細胞が原発性腫瘍細胞であり、当該被検腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量が、所定の閾値以上である場合に、当該被検腫瘍細胞が転移性能又はアポトーシス抵抗性を獲得したリスクが高いと評価することができる。
【００２８】
当該閾値は、Ｚｉｃ５遺伝子の発現量の測定方法の種類等を考慮して、また必要な予備検査等を行うことにより、適宜設定することができる。例えば、その他の検査方法の結果から、悪性化していないことが確認されている腫瘍細胞や非腫瘍細胞の細胞群（非悪性化群）のＺｉｃ５遺伝子の発現量の測定値と、転移性能又はアポトーシス抵抗性を獲得していることが確認されている腫瘍細胞の細胞群（悪性化群）のＺｉｃ５遺伝子の発現量の測定値とを比較することにより、両群を識別するための閾値を適宜設定することができる。
【００２９】
被検腫瘍細胞のＺｉｃ５遺伝子の発現量は、ｍＲＮＡレベルで測定してもよく、タンパク質レベルで測定してもよい。Ｚｉｃ５遺伝子の発現量の測定方法としては、細胞中の標的タンパク質量又は標的のｍＲＮＡ量を定量的又は半定量的に測定可能な方法であれば特に限定されるものではなく、検体中のｍＲＮＡやタンパク質の検出に用いられる公知の方法の中から、適宜選択して用いることができる。各方法は常法により行うことができる。
【００３０】
Ｚｉｃ５遺伝子のｍＲＮＡ量は、Ｚｉｃ５遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るプローブを用いたハイブリダイゼーション法により検出してもよく、Ｚｉｃ５遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るプライマーとポリメラーゼとを用いた核酸増幅反応を利用した方法により検出してもよい。その他、市販されている検出用キット等を利用することもできる。例えば、被検腫瘍細胞から抽出した総ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行うことによりｃＤＮＡを合成した後、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等を行い、得られた増幅産物量を測定することによって、Ｚｉｃ５遺伝子のｍＲＮＡ量を定量できる。増幅産物量は、ゲルやキャピラリー電気泳動等で特異的に分離した後、それを検出することにより定量的に測定することができる。また、ＰＣＲに代えてリアルタイムＰＣＲ等の半定量的ＰＣＲを行うことにより、Ｚｉｃ５遺伝子のｍＲＮＡの検出と同時にその定量を簡便に行うことができる。
【００３１】
Ｚｉｃ５タンパク質量は、Ｚｉｃ５タンパク質と特異的に結合する抗体（抗ＺＩＣ５抗体）を用いて測定することができる。例えば、抗ＺＩＣ５抗体を一次抗体とした免疫染色を行い、染色の有無や染色強度に基づいて、被検腫瘍細胞中におけるＺｉｃ５の発現の有無や発現強度を調べる。当該免疫染色は、酵素標識した抗体を用いる酵素抗体染色法であってもよく、蛍光標識した抗体を用いる蛍光抗体染色法であってもよい。また、被検腫瘍細胞のＺｉｃ５タンパク質量は、被検腫瘍細胞から調製された細胞抽出液中のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ等により分離させた後、ウェスタンブロット法等により定量的に測定することができる。
【００３２】
メラノーマ細胞や前立腺がん細胞は、がん化する前の細胞に比べてＺｉｃ５遺伝子の発現量が多い。このため、Ｚｉｃ５遺伝子の発現量は、メラノーマ又は前立腺がんを検出することを特徴とする腫瘍マーカーとしても有用である。例えば、Ｚｉｃ５遺伝子の発現量が、予め設定された閾値よりも多い場合には被検細胞はメラノーマ細胞又は前立腺がん細胞であると評価し、予め設定された閾値よりも少ない場合には被検細胞はがん化していない細胞であると評価する。例えば、その他の検査方法の結果から、がん化していないことが確認されている細胞の細胞群（正常細胞群）のＺｉｃ５遺伝子の発現量の測定値と、メラノーマ細胞であることが確認されている細胞の細胞群（メラノーマ細胞群）のＺｉｃ５遺伝子の発現量の測定値とを比較することにより、両群を識別するための閾値を適宜設定することができる。
【実施例】
【００３３】
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお、動物実験は、学校法人東京薬科大学において、倫理委員会の承認の下、動物実験の研究ガイドラインを遵守して行われた。【００３４】
＜細胞培養＞
以下の実施例において、使用した細胞の培養は以下の通りにして行った。
メラノーマ細胞株である４種類の細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞、Ｃｏｌｏ８２９細胞、ＨＴ１４４細胞、及びＡ３７５細胞）、及び前立腺がん細胞株であるＤＵ１４５細胞は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）より分譲されたものを用いた。前立腺がん細胞株であるＰＣ３細胞は、ＪＣＲＢ細胞バンク（独立行政法人医薬基盤研究所）より分譲されたものを用いた。ＨＥＫ２９３細胞とＨｅＬａ細胞は、非特許文献１２に記載のものを用いた。これらの細胞は、３７℃、５％ＣＯ２存在下、１０％ウシ胎児血清を含有させたＲＰＭＩ １６４０培地（インビトロジェン社製）中で培養した。【００３５】
［実施例１］
がん細胞の悪性化と個体発生時に重要な役割を果たすＥＭＴの共通性に着目し、神経冠の発生に関与する遺伝子群に対するヒト型ｓｉＲＮＡライブラリーを作製し、ＲＮＡ干渉法を利用して、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を有するメラノーマ細胞株におけるＥ−カドヘリンの発現抑制作用を有する遺伝子を探索した。【００３６】
＜ＲＮＡ干渉による、Ｅ−カドヘリン発現量に対する影響の測定＞
まず、神経冠細胞の形成・分化に必須であり、かつ、がん細胞における詳細な分子機構が解明されていない遺伝子を２６個選別し、各遺伝子についてそれぞれＲＮＡ干渉を行い、Ｅ−カドヘリンの発現量に対する影響を調べた。具体的には、各遺伝子に対して２種類のｓｉＲＮＡ（キアゲン社製）をそれぞれ導入した細胞のＥ−カドヘリンを、蛍光免疫染色法により検出し、その発現量を定量した。この結果、２６個の遺伝子のうち、Ｚｉｃ５、ＢＭＰＥＲ、ＴＥＳ、ＳＵＬＦ１、ＳＵＬＦ２、及びＳＯＸ１０の６個の遺伝子が、ｓｉＲＮＡ導入により発現を抑制した細胞において、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞及びＣｏｌｏ８２９細胞の両方において、Ｅ−カドヘリンの発現量が、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞に比べて１．５倍以上に上昇した。【００３７】
＜ウェスタンブロット法によるＺｉｃ５遺伝子の発現確認＞
メラノーマ及びメラノサイトにおけるＺｉｃ５遺伝子の発現量をタンパク質レベルで確認するため、メラノーマ細胞株であるＡ３７５細胞、ＨＴ１４４細胞、ＣＯＬＯ８２９細胞、及びＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞、並びにヒト正常メラノサイト（ＮＨＭ）におけるＺｉｃ５遺伝子の発現量を、ウェスタンブロット法によって調べた。ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を内部コントロールとして使用した。ウェスタンブロット法は、抗ＺＩＣ５抗体（Ａｖｉｖａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ社製）及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いて、カネマルらの方法（非特許文献１３参照。）に準じて行った。【００３８】
各細胞のＧＡＰＤＨを内部標準としたＺｉｃ５タンパク質の発現量の定量結果を図１に示す。図１中、下段が各細胞のウェスタンブロットの結果であり、上段がウェスタンブロットで検出された各バンドの染色強度に基づいて算出されたＺｉｃ５タンパク質の発現量（相対値）である。その結果、Ｚｉｃ５遺伝子の発現量は、ヒト正常メラノサイトに比べて、全てのメラノーマ細胞株において高いことが確認できた。【００３９】
＜ヒトメラノーマ組織切片のＺＩＣ５染色＞
また、ヒトメラノーマの患者組織切片であって、良性母斑（Ｂｅｎｉｇｎ  ｎｅｖｕｓ）の組織切片１８枚、がん組織部位（Ｍｅｌａｎｏｍａ）の組織切片５６枚、及び転移部位（Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）の組織切片２６枚が含まれている組織マイクロアレイ（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ社から購入）に対して、抗ＺＩＣ５抗体（Ａｖｉｖａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ社製）を用いて免疫組織染色を行い、ヒトメラノーマ臨床検体におけるＺｉｃ５タンパク質の発現を調べた。免疫染色像を、図２の上段に示す。この結果、良性母斑に比べて、がん組織部位や転移部位では、Ｚｉｃ５遺伝子の発現レベルが有意に亢進していることがわかった。【００４０】
また、各組織切片の染色像を、染色強度に基づいて４段階（０〜３）にスコア化した。各スコアの染色強度を図２下段に示し、各スコアの結果を図３に示す。図３の左図は、良性母斑、がん組織部位、及び転移部位の染色像のＺｉｃ５発現量スコアであり、図３の右図は、ステージごとのＺｉｃ５発現量スコアである。この結果、Ｚｉｃ５遺伝子の発現は、メラノーマのステージが進行するほど高くなる傾向がみられた。【００４１】
これらの結果から、スクリーニングにより得た候補遺伝子Ｚｉｃ５は、Ｅ−カドヘリンの発現を制御し、メラノーマの進行に関与する可能性が示唆された。【００４２】
［実施例２］
メラノーマ細胞におけるＺｉｃ５遺伝子の役割を解明するため、メラノーマ細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を用いて、Ｚｉｃ５遺伝子安定過剰発現株を作製し、転移関連遺伝子について調べた。【００４３】
＜Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株の作製＞
まず、ヒトＺｉｃ５遺伝子のＯＲＦのｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、得られた増幅産物を発現用プラスミドベクターｐＦｌａｇ−ＣＭＶ−４（Ｓｉｇｍａ社製）にサブクローニングし、Ｆｌａｇ標識されたＺＩＣ５（Ｆｌａｇ−ＺＩＣ５）を発現するための発現ベクター（Ｆｌａｇ−ＺＩＣ５発現ベクター）を調製した。得られたＦｌａｇ−ＺＩＣ５発現ベクターを、リポフェクタミン試薬「リポフェクタミン２０００」（インビトロジェン社製）を用い、製品添付のプロトコールに従ってＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後の細胞を薄く播き、８００μｇ／ｍＬのＧ４１８（インビトロジェン社製）を含有する培地中で１０日間培養し、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株を選抜した。
対照として、Ｆｌａｇ−ＺＩＣ５発現ベクターに代えてＦｌａｇペプチドのみを発現させる空ベクター（ｐＦｌａｇ−ＣＭＶ−４）を用いた以外は同様にしてトランスフェクション及びＧ４１８選抜を行い、Ｆｌａｇ安定発現株を得た。【００４４】
Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株（コントロール細胞）の細胞の形態を、顕微鏡観察により調べたところ、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株は、コントロール細胞と比較して樹状突起の数が減少していることが観察された（図示せず。）。【００４５】
＜ウェスタンブロット法によるＥ−カドヘリン発現量の測定＞
Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株のＥ−カドヘリンのタンパク質量を、ＧＡＰＤＨを内部標準としたウェスタンブロット法により測定した。ウェスタンブロット法は、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）、抗Ｅ−カドヘリン抗体（ＢＤバイオサイエンス社製）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いて、カネマルらの方法（非特許文献１３参照。）に準じて行った。測定は、２回の独立した試行により行った。【００４６】
各抗体により染色されたバンドを図４に示す。上段（「Ｆｌａｇ」）が抗Ｆｌａｇ抗体で染色されたバンドであり、中段（「Ｅ−ｃａｄ」）が抗Ｅ−カドヘリン抗体で染色されたバンドであり、下段（「ＧＡＰＤＨ」）が抗ＧＡＰＤＨ抗体で染色されたバンドである。Ｆｌａｇ−ＺＩＣ５が発現しているＺｉｃ５遺伝子安定発現株（図中、「Ｆｌａｇ−ＺＩＣ５」）では、コントロール細胞（図中、「ｐＦｌａｇ」）に比べて顕著にＥ−カドヘリンの発現が抑制されていた。【００４７】
＜ｑＲＴ−ＰＣＲによるＥ−カドヘリン量の測定＞
Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株のＣＤＨ１遺伝子（Ｅ−カドヘリンをコードする遺伝子）のｍＲＮＡ量を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量を内部標準とした。測定は、２回の独立した試行により行った。
まず、各細胞の総ＲＮＡを回収し、これを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。総ＲＮＡの回収には市販のキット「ReliaPrep RNA Cell Miniprep System」（プロメガ社製）を用い、逆転写反応には市販のキット「High Capacity cDNA Reverse Transcription kit」（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、それぞれ製品添付のプロトコールに従って行った。
次いで、得られたｃＤＮＡを鋳型とし、リアルタイムＰＣＲを行った。リアルタイムＰＣＲは、市販のキット「THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix」（東洋紡社製）とサーマルサイクラー「CFX96」（バイオ・ラッド社製）を用いて行った。使用したプライマーを表１に示す。【００４８】
【表１】
2016178374.tif 000002
【００４９】
各細胞のＣＤＨ１遺伝子のｍＲＮＡ量は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量によりノーマライズした。Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株のＣＤＨ１遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量の平均値（ｎ＝３）を図５に示す。この結果、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株では、Ｅ−カドヘリンの発現が減少することが示された。【００５０】
＜Ｚｉｃ５遺伝子発現抑制のＥ−カドヘリン発現量への影響＞
Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株のＺｉｃ５遺伝子をＲＮＡ干渉により抑制した場合のＣＤＨ１遺伝子のｍＲＮＡ量を、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株に対して、表２に記載のｓｉＺＩＣ５＃２又はネガティブコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＮｅｇ＃１）を実施例１と同様にして導入した。ｓｉＲＮＡ導入後の細胞のＣＤＨ１遺伝子のｍＲＮＡ量を、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量を内部標準とし、前記と同様にしてｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。【００５１】
【表２】
2016178374.tif 000003
【００５２】
各細胞のＣＤＨ１遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量の平均値（ｎ＝３）を図６に示す。この結果、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株におけるＥ−カドヘリンの発現減少は、ＲＮＡ干渉によるＺｉｃ５遺伝子発現抑制により回復することが示された。【００５３】
＜内在性のＺＩＣ５の機能＞
内在性のＺＩＣ５の役割を明らかにするため、メラノーマ細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞とＡ３７５細胞を用いて、ＲＮＡ干渉によるＺｉｃ５遺伝子の発現抑制の影響を検討した。
各細胞に対して、表２に記載のｓｉＺＩＣ５＃１、ｓｉＺＩＣ５＃２、ｓｉＮｅｇ＃１、又はｓｉＮｅｇ＃２を実施例１と同様にして導入した。ｓｉＲＮＡ導入後の細胞のＺｉｃ５遺伝子、ＣＤＨ１遺伝子、ＴＹＲＰ１遺伝子、ＴＹＲ遺伝子、及びＭＭＰ２遺伝子のｍＲＮＡ量を、ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量を内部標準とし、前記と同様にしてｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。なお、Ｚｉｃ５遺伝子のｍＲＮＡ量の定量には、表３に記載のプライマーを使用した。  【００５４】
【表３】
2016178374.tif 000004
【００５５】
ｓｉＺＩＣ５＃２又はｓｉＮｅｇ＃２を導入した細胞の透過光画像を比較したところ、Ｚｉｃ５遺伝子の発現抑制により、Ａ３７５細胞の形態変化が観察された（図示せず。）。
また、各細胞のＺｉｃ５遺伝子、ＣＤＨ１遺伝子、ＴＹＲＰ１遺伝子、ＴＹＲ遺伝子、及びＭＭＰ２遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量の平均値（ｎ＝３）を調べた（図示せず。）。各細胞のＺｉｃ５遺伝子及びＣＤＨ１遺伝子の測定結果を図７に示す。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞とＡ３７５細胞のいずれにおいても、ｓｉＺＩＣ５＃１又はｓｉＺＩＣ５＃２を導入した細胞ではＺｉｃ５遺伝子のｍＲＮＡの相対発現量は顕著に減少していることが確認された。また、ｓｉＺＩＣ５＃１又はｓｉＺＩＣ５＃２を導入した細胞では、ＣＤＨ１遺伝子、ＴＹＲＰ１遺伝子、及びＴＹＲ遺伝子の発現上昇とＭＭＰ２遺伝子の発現低下が引き起こされていた。これらの結果から、Ｚｉｃ５遺伝子は、メラノーマ細胞において、Ｅ−カドヘリンの抑制、細胞の脱分化の促進、細胞外基質分解酵素（ＭＭＰ２）の発現亢進を引き起こす因子であると考えられた。【００５６】
［実施例３］
ＺＩＣ５により引き起こされたＥ−カドヘリンの発現低下、脱分化、細胞外基質分解酵素 （ＭＭＰ２）の発現亢進は、いずれも転移性メラノーマの特徴である。従って、次に、ＺＩＣ５がメラノーマ細胞の悪性形質である、運動能、浸潤能、増殖能に与える影響について検討を行った。【００５７】
＜スクラッチアッセイ＞
運動能を調べるため、無血清条件下でのスクラッチアッセイを行った。
具体的には、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株を培養し、コンフルエントの細胞を黄色チップの先端で削った（スクラッチ）後、無血清培地中で培養した。スクラッチから２４時間経過後の細胞では、Ｆｌａｇ安定発現株細胞と比較し、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株では、移動細胞数が増加していた（図示せず。）。【００５８】
＜Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイ＞
運動能を調べるため、血清入り条件下におけるＴｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイを行った。
具体的には、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株を、孔径８μｍのインサート（ＢＤバイオサイエンス社製）を入れた２４ウェルプレートにまき、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養し、移動した細胞数を計数した。計数結果を図８（上段）に示す。この結果、Ｆｌａｇ安定発現株に比べて、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株では、移動細胞数が有意に増加していた。【００５９】
メラノーマの運動性の亢進に重要な因子として、Ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ２（ＭＬＣ２）が知られている。ＭＬＣ２はリン酸化を受け活性化し、アクトミオシン収縮を促進することによって細胞運動を促進していることが知られている（非特許文献１４及び１５参照。）。そこで、各細胞のリン酸化ＭＬＣ２（ｐｐＭＬＣ２）、ＭＬＣ２、及びＧＡＰＤＨのタンパク質量を、ウェスタンブロット法により測定した。ウェスタンブロット法は、抗ｐｐＭＬＣ２抗体、抗ＭＬＣ２抗体、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（いずれもＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いて、カネマルらの方法（非特許文献１３参照。）に準じて行った。【００６０】
各細胞のウェスタンブロットの結果を図８の下段に示す。この結果、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株では、Ｆｌａｇ安定発現株に比べてＭＬＣ２のリン酸化が亢進していることが明らかになった。【００６１】
内在性のＺｉｃ５遺伝子をｓｉＲＮＡにより発現抑制した際のメラノーマ細胞の運動能について、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイを行い検証した。具体的には、メラノーマ細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞とＡ３７５細胞に、表２に記載のｓｉＺＩＣ５＃１、ｓｉＺＩＣ５＃２、ｓｉＮｅｇ＃１、又はｓｉＮｅｇ＃２を実施例１と同様にして導入した。各ｓｉＲＮＡを導入した細胞に対して、前記と同様にしてＴｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ アッセイを行い、移動した細胞数を計数した。計数結果を図９（上段）に示す。この結果、両細胞とも、Ｚｉｃ５遺伝子の発現抑制により細胞移動率の減少が観察された。また、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞にｓｉＲＮＡを導入した細胞について、ｐｐＭＬＣ２、ＭＬＣ２、及びＧＡＰＤＨのタンパク質量を、ウェスタンブロット法により測定した。ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞のウェスタンブロットの結果を図９の下段に示す。この結果、Ｚｉｃ５遺伝子の発現抑制によりｐｐＭＬＣ２の減少も確認された。【００６２】
＜Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ アッセイ＞
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｉｎｖａｓｉｏｎ アッセイを、６０μＬ（２．５ｍｇ／ｍＬ）のＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ（ＢＤバイオサイエンス社製）が添加された細胞培養インサートを用いて、ヒラノらの方法（非特許文献１６）の方法に準じて行った。マトリゲルに浸潤した細胞数を計数した。計数結果を図１０に示す。この結果、Ｚｉｃ５遺伝子の発現抑制による細胞浸潤率の低下が観察された。【００６３】
＜ＭＬＣ２リン酸化抑制下におけるＴｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイ＞
ＭＬＣ２リン酸化抑制の細胞移動性に対する影響を調べた。具体的には、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株に対して、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）処理をした状態又は未処理の状態で、前記の通りＴｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイを行い、移動した細胞数を計数した。計数結果を図１１に示す。この結果、Ｚｉｃ５遺伝子の過剰発現による移動細胞の増加は、ＲＯＣＫ阻害剤処理によるＭＬＣ２リン酸化の抑制によって部分的に抑制できた。【００６４】
また、各細胞のｐｐＭＬＣ２、ＭＬＣ２、及びＧＡＰＤＨのタンパク質を、前記と同様にしてウェスタンブロット法により測定した。この結果、ＲＯＣＫ阻害剤未処理のＺｉｃ５遺伝子安定発現株で検出されたｐｐＭＬＣ２のバンドが、ＲＯＣＫ阻害剤処理のＺｉｃ５遺伝子安定発現株ではほとんど検出されず、ＲＯＣＫ阻害剤処理により、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株で亢進していたＭＬＣ２のリン酸化は、ＲＯＣＫ阻害剤処理により抑制されていた（図示せず。）。
これらの結果から、ＺＩＣ５はメラノーマ細胞の運動能を促進する因子であり、その一因としてＭＬＣ２のリン酸化の亢進があることが明らかになった。【００６５】
＜細胞増殖アッセイ＞
細胞増殖アッセイを行い、Ｚｉｃ５遺伝子の細胞増殖に対する影響について検討した。
細胞増殖アッセイは、ウェルあたり１，０００〜２，０００個の細胞となるように９６ウェルプレートにまいたＡ３７５細胞及びＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞に、表２に記載のｓｉＺＩＣ５＃１、ｓｉＺＩＣ５＃２、ｓｉＮｅｇ＃１、又はｓｉＮｅｇ＃２を実施例１と同様にして導入した。各ｓｉＲＮＡを導入した細胞の細胞数を、経時的に測定した。細胞数の計数は、細胞核をヘキスト３３３４２（同仁化学研究所製）染色し、各ウェルの総細胞数をＩＮ Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００（ＧＥヘルスケア社製）により計数した。各細胞の細胞数の平均値（ｎ＝３）を図１２に示す。この結果、Ａ３７５細胞及びＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞のいずれにおいても、ＺＩＣ５＃１又はｓｉＺＩＣ５＃２を導入した細胞では、細胞の増殖が鈍く、Ｚｉｃ５遺伝子の発現抑制によりメラノーマ細胞の増殖率が低下することが明らかになった。また、同じ傾向が、Ｃｏｌｏ８２９細胞とＨＴ１４４細胞においても観察された（図示せず。）。【００６６】
また、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株を９日間培養し、経時的にＭＴＴアッセイを行い、生存している細胞の相対数を測定した。測定結果を図１３に示す。図中、「△」は、細胞がコンフルエントになった時点を示す。この結果、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株では、細胞密度が高くなっても増え続ける現象が観察された。【００６７】
＜細胞周期解析＞
Ｚｉｃ５遺伝子が、細胞周期に与える影響について、Ａ３７５細胞に表２に記載のｓｉＺＩＣ５＃２又はｓｉＮｅｇ＃２を実施例１と同様にして導入した細胞に対して、細胞周期解析を行うことにより調べた。
細胞周期解析は、まず、２４時間無血清培地で培養した後、１０％ＦＢＳ含有培地で２４時間培養した。次いで、細胞を固定してＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ）染色した後、フローサイトメトリー解析（ＳＨ８００，ソニー社製）を行った。得られたデータは、解析ソフトウェアＦｌｏｗＪｏ（トミーデジタルバイオロジー社製）により解析した。この結果、Ｚｉｃ５遺伝子の発現が抑制された細胞では、ｓｕｂＧ１期の細胞が増大していた。ｓｉＺＩＣ５＃１又はｓｉＮｅｇ＃１を導入した細胞でも同様の結果が得られた。ｓｕｂＧ１期の細胞数の割合（％）を図１４に示す。統計学的差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。【００６８】
これらの結果から、Ｚｉｃ５遺伝子はメラノーマ細胞の増殖に促進的に働く因子であることが明らかになった。【００６９】
［実施例４］
ここまでの結果より、Ｚｉｃ５遺伝子がメラノーマ細胞の細胞増殖、移動能、浸潤能を促進することが確認されたため、生体内におけるメラノーマの増殖・転移について検討を行った。【００７０】
＜ｓｈＺｉｃ５株及びｓｈＮｅｇ株の作製＞
転移能の高いＡ３７５細胞に、Ｚｉｃ５遺伝子に対するｓｈＲＮＡ導入プラスミドを安定的に組み込んだｓｈＺｉｃ５株、ネガティブコントロールｓｈＲＮＡ導入プラスミドを組み込んだネガティブコントロール株（ｓｈＮｅｇ株）を作製した。
ｓｈＮｅｇ株は、Ａ３７５細胞に、ｓｈＲＮＡ発現用ベクターであるｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−ＺｓＧｒｅｅｎ（クロンテック社製）を導入し、ｓｈＺｉｃ５−１株又はｓｈＺｉｃ５−２株は、ｐＳＩＲＥＮ−ＲｅｔｒｏＱ−ＺｓＧｒｅｅｎに下記表４に記載の塩基配列を標的とするＺｉｃ５用ｓｈＲＮＡを組み込んだものを導入した。ｓｈＲＮＡの導入は、プラスミドの導入と同様にして行った。ｓｈＲＮＡを導入した細胞を限界希釈後、ＧＦＰ陽性クローンを単離し、安定発現株とした。【００７１】
【表４】
2016178374.tif 000005
【００７２】
＜生体内におけるＺｉｃ５遺伝子の発現抑制とヒトメラノーマ細胞の増殖及び転移＞
１０，０００，０００個のｓｈＮｅｇ株、ｓｈＺｉｃ５−１株又はｓｈＺｉｃ５−２株を０．１ｍＬのＰＢＳで懸濁した細胞懸濁液を、５週齢のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウス（クレア社から購入）の皮下に注射した。皮下注射後、３〜４日ごとに、形成された腫瘍組織の大きさ（Ｖ）を下記式に基づいて計測した。式中、「Ａ」は腫瘍組織の最大径であり、「Ｂ」は腫瘍組織の最小径である。
Ｖ ＝ １／２（Ａ×Ｂ２）【００７３】
測定結果を図１５に示す。図１５（Ａ）は計測された腫瘍組織の大きさＶの結果であり、図１５（Ｂ）は移植から３４日目の腫瘍組織の重量である。統計学的差異は、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）により求めた。この結果、ｓｈＺｉｃ５−１株又はｓｈＺｉｃ５−２株を移植した場合には、生体内腫瘍組織がほとんど大きくならず、顕著な腫瘍増殖率の抑制が確認された。また、摘出した腫瘍の重さを測定した結果、ｓｈＮｅｇ株と比較してｓｈＺｉｃ５−１株及びｓｈＺｉｃ５−２株において、腫瘍重量が著しく低下していることが明らかとなった。すなわち、Ｚｉｃ５遺伝子の発現を抑制することにより、生体内においても腫瘍の増殖が抑制されることがわかった。【００７４】
＜肺転移能の測定＞
ｓｈＮｅｇ株、ｓｈＺｉｃ５−１株又はｓｈＺｉｃ５−２株を、６週齢のＢａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウス（クレア社から購入）の尾静脈に注射して移植し、移植から２．５か月目に、肺転移能を調べた。具体的には、肺に形成された結節の数を測定した。さらに、マウス肺におけるヒトメラノーマ細胞の浸潤度を定量するため、マウス肺組織中のヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。なお、ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定し、マウスＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量によってノーマライズした。【００７５】
測定結果を図１６に示す。図１６（Ａ）は、肺に形成された結節の数を測定した結果であり、図１６（Ｂ）は、これらの肺における、マウスＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量によってノーマライズされたヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量の測定結果を示す。統計学的差異は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ’ｓ Ｕ−ｔｅｓｔにより求めた。この結果、肺における腫瘍形成数は、ｓｈＺｉｃ５−１株又はｓｈＺｉｃ５−２株を移植したマウスにおいて著しく減少していた。また、マウス肺に含まれるヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡ量は、ｓｈＮｅｇ株と比較し、ｓｈＺｉｃ５−１株又はｓｈＺｉｃ５−２株を注入したマウスで有意な減少が見られた。これらの結果から、ＺＩＣ５は、メラノーマ細胞の転移を促進する因子であることが示唆された。【００７６】
［実施例５］
ＺＩＣ５はＣ２Ｈ２タイプのジンクフィンガードメインを持つＺｉｃ ｆａｍｉｌｙに属しており、このファミリーにはＺｉｃ１−５が存在している。Ｚｉｃ１−３は転写因子としての機能やターゲット遺伝子が報告されているが、Ｚｉｃ４とＺｉｃ５については転写因子としての機能やターゲット遺伝子に関しての報告がない。しかし、マウスＺｉｃ５ジンクフィンガードメイン（Ｚｉｃ５ ＺＦ）は、他のＺｉｃと同様にＧｌｉ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＧＢＳ）やいくつかのＧＢＳ変異導入配列に結合する能力があることが示されている（非特許文献１７参照。）。【００７７】
ＺＩＣ５により発現変動する遺伝子のプロモーター領域について検討したところ、Ｅ−カドヘリンのプロモーター領域にマウスＺｉｃ５ ＺＦが結合する配列ＧＧＧＣＧＧＴが存在していた。そこで、ＺＩＣ５がＥ−カドヘリンプロモーターに結合し、転写調節する可能性について、ゲルシフトアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ、ＥＭＳＡ）により検証した。【００７８】
図１７に、ＥＭＳＡに用いたオリゴヌクレオチドプローブの塩基配列のアラインメント図を示す。図中、四角で囲まれた領域が推定ジンクフィンガードメイン結合配列である。また、図中、「Ｍ５」は、ＧＢＳに一塩基置換変異をいれたもの、「ｐＣＤＨ１」はヒトＣＤＨ１遺伝子のプロモーター領域（Ｅ−カドヘリンプロモーター）、である。【００７９】
＜ＥＭＳＡ＞
具体的には、まず、ヒトＺＩＣ５のジンクフィンガードメインを、下記表５に記載の塩基配列からなるフォワードプライマー及びリバースプライマーによってＰＣＲ増幅し、ｐＧＥＸ−６Ｐ（アマシャム・ファルマシア社製）にサブクローニングし、ＧＳＴと融合したＺＩＣ５  ＺＦ（ＧＳＴ−ＺＩＣ５  ＺＦ）発現用ベクターを調製した。当該ＧＳＴ−ＺＩＣ５  ＺＦを大腸菌ＢＬ２１株に導入し、発現させたＧＳＴ−ＺＩＣ５  ＺＦをグルタチオンセファロースビーズ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。【００８０】
【表５】
2016178374.tif 000006
【００８１】
精製したＧＳＴ−ＺＩＣ５  ＺＦを、図１７に記載の塩基配列からなり、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドからなる３種のプローブ（北海道システムサイエンス社製）（配列番号１５〜１７）とそれぞれ結合バッファー（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、７ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇ／ｍＬ ウシ血清アルブミン、９０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１５０ｎｇ  ｐｏｌｙ（ｄＩ−ｄＣ））中でインキュベートし、形成された複合体を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（泳動バッファー：０．５×ＴＢＥバッファー（ｐＨ８））により分離した。分離した複合体は、ＨＲＰ（西洋ワサビパーオキシダーゼ）標識したストレプトアビジンで検出した。電気泳動したゲルをＨＲＰ標識ストレプトアビジンで染色して検出したバンドパターンを図１８に示した。【００８２】
図１８に示すように、ヒトＺｉｃ５  ＺＦは、マウスＺｉｃ５  ＺＦと同様にＧＢＳには結合するが変異を導入したＭ５には結合しないことが明らかになった。さらに、予想Ｚｉｃ５ ＺＦ結合配列を含むＥ−カドヘリンプロモーター配列との結合も確認できた。この結果、ヒトＺｉｃ５  ＺＦも、マウスＺｉｃ５  ＺＦと同様の特性があり、Ｅ−カドヘリンプロモーター領域中の配列に結合し得ることが明らかになった。【００８３】
＜クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）法＞
次に、細胞内でヒトＺｉｃ５（全長）がＥ−カドヘリンプロモーター領域に結合することを確認するため、ＣｈＩＰ法を行った。
具体的には、ＨｅＬａ細胞にＨＡタグ標識Ｚｉｃ５（Ｚｉｃ５−ＨＡ）を強制発現させた後、１％ホルムアルデヒド溶液にて４℃、３時間処理して細胞を固定させた後、グリシンを終濃度１２５ｍＭとなるように添加して１０分間置き、反応を終了させた。次いで、当該細胞を２％ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄した後に、ライシスバッファー（５ｍＭ ＰＩＰＥＳ（ｐＨ８．０）、８５ｍＭ ＫＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０）で可溶化し、得られたライセートにＭＮａｓｅ（タカラ社製）を添加して３０分間、３７℃で処理した。ＭＮａｓｅ処理後のライセートを１０，０００ｒｐｍで４℃、１０分間遠心分離処理し、上清を回収した。
当該上清をＣｈＩＰ希釈用バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ８）、１６７ｍＭ  ＮａＣｌ、１．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で希釈した後、マウスＩｇＧ又は抗ＨＡ抗体（シグマ社製）を添加し、４℃で一晩、免疫沈降を行った。形成された免疫複合体をプロテインＡ／Ｇビーズで回収し、ＲＩＰＡバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２％  ＳＤＳ、０．２％  デオキシコール酸ナトリウム）とＬｉＣｌバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５Ｍ  ＬｉＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．５％  ＮＰ−４０、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム）で洗浄した。得られたタンパク質−ＤＮＡ複合体は、６５℃で４時間加熱処理して逆クロスリンクし、次いでプロテイナーゼＫ処理した後、ＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）によりＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡサンプルは、表６に記載のプライマーを用いてＰＣＲ増幅して定量した。ネガティブコントロールは、Ｅ−カドヘリンと同染色体上で下流に存在する領域とした。【００８４】
【表６】
2016178374.tif 000007
【００８５】
定量結果を図１９（左図）に、各ＤＮＡの電気泳動図を図１９（右図）に、それぞれ示す。この結果、Ｚｉｃ５−ＨＡを強制発現させた細胞に対して抗ＨＡ抗体で免疫沈降を行ったサンプルでのみ、Ｅ−カドヘリンプロモーター領域の共沈が確認できた。Ｅ−カドヘリンと同染色体上で下流に存在するネガティブコントロール領域のＤＮＡは検出されなかったことから、Ｚｉｃ５−ＨＡとＥ−カドヘリンプロモーター領域の共沈の特異性が確認できた。【００８６】
＜ルシフェラーゼレポーターアッセイ＞
実際にＺＩＣ５がＥ−カドヘリンプロモーターの活性を制御するかを調べるために、Ｅ−カドヘリンプロモーター下にルシフェラーゼを繋いだプラスミドを作製し、ルシフェラーゼアッセイを行った。
具体的には、まず、下記表７に記載のｐＣＤＨ１フォワードプライマーとｐＣＤＨ１リバースプライマーとを用いてＣＤＨ１プロモーター領域をＰＣＲ増幅し、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）のＸｈｏＩ−ＮｃｏＩ領域にサブクローニングして、ルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ｐＣＤＨ１−Ｌｕｃ）を作製した。また、インターナルコントロールとして、Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅのｐｈＲＬ−ＴＫプラスミド（プロメガ社製）を用いた。【００８７】
ＨＥＫ２９３細胞に、ｐＣＤＨ１−ＬｕｃとｐｈＲＬ−ＴＫを、リポフェクタミン２０００（インビトロジェン社製）を用いてトランジェントに発現させた。ルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いて測定した。統計学的差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。測定結果（ｎ＝３）を図２０に示す。この結果、Ｅ−カドヘリンプロモーターの活性はＺｉｃ５強制発現下では低下することが示された。【００８８】
ＺＩＣ５によるＥ−カドヘリンプロモーター活性の抑制が図１７で示した予想ＺＩＣ５結合配列を介して行われているのかを検証するために、Ｅ−カドヘリンプロモーターの予想Ｚｉｃ５結合配列中に一塩基置換変異を導入し、ルシフェラーゼアッセイを行った。図２１に、導入した一塩基置換変異の塩基配列を示す。変異体ＧＢＳ−ｍｕｔはＺｉｃ５ ＺＦが結合することが確認されている変異体であり、変異体Ｍ５−ｍｕｔはＺｉｃ５ ＺＦが結合しないことが確認されている変異体である。レポーターコンストラクトに、図２１に示す一塩基置換変異を導入した変異体ＧＢＳｍｕｔ及びＭ５ｍｕｔを、表７に記載のプライマーを用いて作製した。【００８９】
【表７】
2016178374.tif 000008
【００９０】
作製した変異体を用いて、前記と同様にしてルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。測定結果（ｎ＝３）を図２２に示す。この結果、ＺＩＣ５の強制発現によりＧＢＳ−ｍｕｔを導入したプロモーターの活性は抑制されたが、Ｍ５−ｍｕｔを導入したプロモーターの活性は抑制されなかった。以上の結果より、ＺＩＣ５はＥ−カドヘリンプロモーター上のＧＧＧＣＧＧＴ配列を認識して結合し、そのプロモーター活性を抑制することが明らかとなった。【００９１】
［実施例６］
以上の結果より、ＺＩＣ５がＥ−カドヘリンの発現を調節する転写因子として機能することが明らかになったが、Ｅ−カドヘリンの発現制御だけではＺＩＣ５によるメラノーマの形質変化を説明できない。そこで、ＺＩＣ５による遺伝子発現変化を網羅的に調べるために、マイクロアレイ解析を行った。【００９２】
＜マイクロアレイ解析＞
Ａ３７５細胞又はＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞に、表２に記載のｓｉＺＩＣ５又はｓｉＮｅｇを実施例１と同様にして導入した。ｓｉＲＮＡ導入から４８時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した。各サンプルのトータルＲＮＡ１μｇを用いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）に対して、製品添付のプロトコールに従ってマイクロアレイを行った。定量のノーマライズは、アレイデータから得られたＲＮＡ発現量に従って行った。ヒートマップ可視化はＭｅｖ（ＭｕｌｔｉＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｖｉｅｗｅｒ）を用いて行った。経路解析は、ＤＡＶＩＤ（非特許文献１８）を用いて行った。【００９３】
Ａ３７５細胞及びＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞においてＺｉｃ５を発現抑制した際に、どちらの細胞においても１．５倍以上発現上昇する遺伝子は９１３個、半分以下に発現低下する遺伝子は３０２個同定された。これらの変動遺伝子が関連する現象について調べるため、 経路解析を行ったところ、Ｇｌｉｏｍａ、Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ、Ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎに関連する遺伝子が多く含まれていることが分かった（図示せず。）。【００９４】
＜Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ関連因子との関係の解析＞
Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎにおいて活性化されるＦｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ（ＦＡＫ）のリン酸化はメラノーマの悪性度と関連づけられているため（非特許文献１９参照。）、ＺＩＣ５によるＦＡＫの変化を検証した。さらに、Ｚｉｃ５発現抑制による変動遺伝子の中でＦｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎに関連する遺伝子の中から、ＩＴＧＡ６（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ，  ａｌｐｈａ  ６）とＰＤＧＦＤ（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｄ）に着目し、細胞内における変化を調べた。具体的には、ｓｉＺＩＣ５又はｓｉＮｅｇを導入したＡ３７５細胞について、ウェスタンブロットにより、リン酸化ＦＡＫ（ｐＦＡＫ）、総ＦＡＫ（ＦＡＫ）、ＩＴＧＡ６、ｐｒｏ−ＰＤＧＦＤ、及びβ−アクチンの量を調べた。ウェスタンブロットは、抗ｐＦＡＫ抗体（Ｓｉｇｎａｌｗａｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ社製）、抗ＦＡＫ抗体（Ａｃｒｉｓ社製）、抗β−アクチン抗体（シグマ社製）、抗ＩＴＧＡ６抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）、及び抗ＰＤＧＦＤ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を用いた以外は前記と同様にして行った。この結果、Ｚｉｃ５発現抑制細胞においては、ＦＡＫのリン酸化が著しく減少していることが明らかになった。また、ＩＴＧＡ６とｐｒｏ−ＰＤＧＦＤの発現量も減少している傾向が観察された（図示せず。）。【００９５】
Ａ３７５細胞及びＨＴ１４４細胞に、表２に記載のｓｉＺＩＣ５又はｓｉＮｅｇを実施例１と同様にして導入した場合のＰＤＧＦＤ遺伝子の発現量を、表１０に示すプライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより調べた。各細胞のＰＤＧＦＤ遺伝子のｍＲＮＡ量は、ＡＣＴＢ（β−アクチン）遺伝子のｍＲＮＡ量によりノーマライズした。ＰＤＧＦＤ遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量（ｓｉＮｅｇを導入した細胞の発現量を１とする。）（ｎ＝３）を算出した結果を図２３に示す。統計学的差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、ＰＤＧＦＤの遺伝子発現は、Ｚｉｃ５遺伝子発現抑制により著しく減少した。【００９６】
また、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株の細胞におけるＰＤＧＦＤ遺伝子の発現量を同様にして調べた。ＰＤＧＦＤ遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量（ｓｉＮｅｇ＃１を導入した細胞の発現量を１とする。）（ｎ＝３）を算出した結果を図２４に示す。統計学的差異は、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）により求めた。この結果、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株におけるＰＤＧＦＤ遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量は、Ｆｌａｇ安定発現株と比較して高く、Ｚｉｃ５遺伝子過剰発現により、ＰＤＧＦＤの遺伝子発現が亢進することが確認された。【００９７】
また、Ａ３７５細胞及びＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞に、表１に記載のｓｉＮｅｇ＃１と、表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤ＃１及びｓｉＰＤＧＦＤ＃２とを実施例１と同様にして導入し、ＰＤＧＦＤ遺伝子の発現抑制の影響を調べた。この結果、いずれの細胞においても、ｓｉＰＤＧＦＤ＃１又はｓｉＰＤＧＦＤ＃２を導入した細胞では形態が変化していた（図示せず。）。すなわち、メラノーマ細胞株におけるＰＤＧＦＤの発現抑制は細胞の形態変化を誘発することがわかった。【００９８】
【表８】
2016178374.tif 000009
【００９９】
また、ｓｉＲＮＡ導入後の各細胞の細胞数を経時的に計数し、ｓｉＲＮＡ導入後１日目の細胞数を１とした相対細胞数を算出し、増殖性を調べた。この結果、ｓｉＰＤＧＦＧＤを導入した細胞では、ｓｉＺｉｃ５を導入した細胞と同様に、細胞増殖が抑制されており、メラノーマ細胞株におけるＰＤＧＦＤ遺伝子の発現抑制により、細胞増殖が抑制されることがわかった（図示せず。）。ＰＤＧＦＤ遺伝子の発現抑制による細胞増殖の抑制は、Ｃｏｌｏ８２９細胞及びＨＴ１４４細胞においても観察された（図示せず。）。さらに、Ａ３７５細胞については、各細胞の細胞周期を調べた。各細胞のＧ１期、Ｓ期、及びＧ２Ｍ期にある細胞の割合の平均値（ＳＤ）（％）を表９に示す。統計学的差異は、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、Ａ３７５細胞では、ＰＤＧＦＤ遺伝子の発現抑制により、Ｓ期とＧ２Ｍ期の細胞の割合が減少していた。【０１００】
【表９】
2016178374.tif 000010
【０１０１】
また、ｓｉＰＤＧＦＤ＃１、ｓｉＰＤＧＦＤ＃２、又はｓｉＮｅｇ＃１を導入したＡ３７５細胞について、細胞数を継時的に計数した。各細胞の、ｓｉＮｅｇ＃１を導入した細胞数を１とした相対細胞数を図２５に示す。統計学的差異は、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、Ａ３７５細胞では、ＰＤＧＦＤ遺伝子の発現抑制により、細胞増殖率の低下が引き起こされた。【０１０２】
Ａ３７５細胞及びＨＴ１４４細胞に、表２に記載のｓｉＺＩＣ５又はｓｉＮｅｇを実施例１と同様にして導入した場合のＩＴＧＡ６遺伝子の発現量を、表１０に示すプライマーを用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより調べた。各細胞のＩＴＧＡ６遺伝子のｍＲＮＡ量は、ＡＣＴＢ（β−アクチン）遺伝子のｍＲＮＡ量によりノーマライズした。ＩＴＧＡ６遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量（ｓｉＮｅｇを導入した細胞の発現量を１とする。）（ｎ＝３）を算出した結果を図２６に示す。統計学的差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、ＩＴＧＡ６の遺伝子発現は、Ｚｉｃ５遺伝子発現抑制により著しく減少した。【０１０３】
また、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株の細胞におけるＩＴＧＡ６遺伝子の発現量を同様にして調べた。ＩＴＧＡ６遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量（ｓｉＮｅｇ＃１を導入した細胞の発現量を１とする。）（ｎ＝３）を算出した結果を図２７に示す。この結果、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株におけるＩＴＧＡ６遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量は、Ｆｌａｇ安定発現株と比較して高く、Ｚｉｃ５遺伝子過剰発現により、ＩＴＧＡ６の遺伝子発現が亢進することが確認された。【０１０４】
また、Ａ３７５細胞にラットＩｇＧ又は抗ＩＴＧＡ６抗体の抗体溶液（２０μｇ／ｍＬ）で７２時間処理した後の細胞数を計数した。ラットＩｇＧで処理した細胞の細胞数を１とした相対細胞数（ｎ＝３）の結果を図２８に示す。統計学的差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、抗ＩＴＧＡ６抗体によりＩＴＧＡ６を中和した細胞では、細胞増殖の低下が引き起こされた。また、ｓｉＩＴＧＡ６の導入によりＩＴＧＡ６遺伝子の発現を抑制した細胞でも、細胞増殖の低下が引き起こされた（図示せず）。一方で、ＩＴＧＡ６遺伝子の発現抑制は、細胞移動率にはさほど影響は観察されなかった（図示せず）。【０１０５】
また、ヒトＩＴＧＡ６遺伝子のｃＤＮＡをプラスミドｐｃＤＮＡに組み込んだｈＩＴＧＡ６発現用ベクターをトランスフェクションし、Ｇ４１８処理により選抜したｈＩＴＧＡ６過剰発現株と、空ベクターであるｐｃＤＮＡをトランスフェクションし、Ｇ４１８処理により選抜したｐｃＤＮＡ株（ネガティブコントロール）に対して、表２に記載のｓｉＺＩＣ５又はｓｉＮｅｇを実施例１と同様にして導入した場合の細胞数を計数した。この結果、ｈＩＴＧＡ６過剰発現株では、ｓｉＺＩＣ５導入による細胞数の低下を部分的に回復することが示された（図示せず。）。【０１０６】
また、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株の細胞に、表１に記載のｓｉＮｅｇ＃１と表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤ＃１を実施例１と同様にして導入した細胞について、実施例２と同様にしてＴｒａｎｓｗｅｌｌ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎアッセイを行い、移動細胞数を計数した。移動細胞数は、総生存細胞数でノーマライズした。各細胞の、ｓｉＮｅｇ＃１を導入した細胞の移動細胞数を１とした相対細胞数（ｎ＝３）を図２９に示す。統計学的差異は、ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、ｓｉＰＤＧＦＤ＃１を導入した細胞では、Ｚｉｃ５遺伝子の過剰発現による細胞移動数の増加が完全に抑制されていた。この結果から、ＺＩＣ５は、ＰＤＧＦＤの発現を介して細胞移動を制御していることが示唆された。【０１０７】
また、表１に記載のｓｉＮｅｇ＃１、表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤ＃１、ｓｉＰＤＧＦＤ＃２、ｓｉＩＴＧＡ６＃１を実施例１と同様にして導入した細胞に対して、ｐＦＡＫ、総ＦＡＫ、及びβ−アクチンの量をウェスタンブロットにより調べた。この結果、ＰＤＧＦＤやＩＴＧＡ６の発現抑制は、Ｚｉｃ５の発現抑制と同様にＦＡＫのリン酸化を低下させたことから、Ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎへの関与が確認できた（図示せず。）。【０１０８】
【表１０】
2016178374.tif 000011
【０１０９】
［実施例７］
ＺＩＣ５が、ＢＲＡＦ阻害剤（ＰＬＸ４０３２, ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社製）に対する感受性に変化を与えるかについて、検証を行った。【０１１０】
具体的には、まず、ＳＫ−ＭＥＬ−２８細胞を用いて、前記と同様にしてＺｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株（コントロール細胞）を製造した。
Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株に対して、それぞれ、ＰＬＸ４０３２を終濃度１０μＭで４８時間処理し、処理後の細胞数を計数した。なお、ＰＬＸ４０３２はＤＭＳＯに溶解させた溶液として用い、等量のＤＭＳＯを添加したもの（ＤＭＳＯ処理）をコントロールとした。Ｆｌａｇ安定発現株をＰＬＸ４０３２処理した細胞（図中、「ＰＬＸ４０３２」欄が「＋」、以下の実施例において同様）又はＤＭＳＯ処理した細胞（図中、「ＰＬＸ４０３２」欄が「−」、以下の実施例において同様）の細胞数を１とした相対細胞数（ｎ＝３）の結果を図３０に示す。統計学的差異は、ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、ＰＬＸ４０３２処理による細胞数の低下は、Ｚｉｃ５遺伝子安定発現株では緩和された。また、これらの細胞について、ＰＬＸ４０３２処理後のアポトーシス細胞の割合をＦＩＴＣ標識Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＭＢＬ社製）を用いて検出した。各細胞におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖで染色された細胞）の割合（％）（ｎ＝３）の結果を図３１に示す。この結果、ＰＬＸ４０３２処理によるアポトーシスの誘導は、Ｚｉｃ５遺伝子過剰発現により有意に減少することが示された。【０１１１】
なお、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合は、次のようにして測定した。まず、各細胞にＦＩＴＣ標識Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＭＢＬ社製）とヘキスト３３３４２を添加して４０分間インキュベートした。次いで、インキュベート後の細胞の染色状態を、イメージングサイトメーター「ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００」（ＧＥヘルスケア社製）のＤＡＰＩフィルターとＦＩＴＣフィルターを使用して解析した。ＤＡＰＩ染色された全細胞（ＤＡＰＩポジティブ細胞）に対するＡｎｎｅｘｉｎ Ｖで染色された細胞（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞）の割合（％）は、ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ３．７（ＧＥヘルスケア社製）により決定した。統計学的差異は、ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。【０１１２】
次に、内在性のＺＩＣ５、及び下流因子であるＰＤＧＦＤ及びＩＴＧＡ６の発現抑制が、ＰＬＸ４０３２による細胞増殖の低下やアポトーシスの誘導に及ぼす影響について検討した。まず、Ａ３７５細胞に、表１に記載のｓｉＮｅｇ、ｓｉＺＩＣ５、表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤ、又はｓｉＩＴＧＡ６を実施例１と同様にして導入した後、ＤＭＳＯ又はＰＬＸ４０３２溶液（５μＭにＤＭＳＯに溶解させた溶液）で４８時間処理した。次いで、処理後の細胞にＦＩＴＣ標識Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＭＢＬ社製）とヘキスト３３３４２を添加して４０分間インキュベートした。インキュベート後の各細胞におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）（ｎ＝３）の結果を図３２に示し、ｓｉＮｅｇを導入した細胞の細胞数を１とした相対細胞数（ｎ＝３）の結果を図３３に示す。なお、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合の統計学的差異は、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、ＰＬＸ４０３２によるアポトーシスの誘導は、Ｚｉｃ５、ＰＤＧＦＤ、ＩＴＧＡ６の発現抑制により相乗的に亢進されること、及びＰＬＸ４０３２処理による細胞数の減少は、Ｚｉｃ５、ＰＤＧＦＤ、ＩＴＧＡ６の発現抑制により促進されること、が明らかになった。Ｃｏｌｏ８２９細胞においても、同様の結果が得られた（図示せず。）。【０１１３】
また、Ａ３７５細胞を、ラットＩｇＧ又は抗ＩＴＧＡ６抗体の抗体溶液（２０μｇ／ｍＬ）と共に、ＤＭＳＯ又はＰＬＸ４０３２溶液（１０μＭに溶解させた溶液）で４８時間処理した。処理後の各細胞におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）（ｎ＝３）の結果を図３４に示す。統計学的差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）により求めた。この結果、抗ＩＴＧＡ６抗体によりＩＴＧＡ６を中和した細胞において、ＰＬＸ４０３２と相乗的にアポトーシスを誘導できることが明らかになった。また、ｓｉＺＩＣ５及びｓｉＰＤＧＦＤをそれぞれ導入した細胞においても、ＰＬＸ４０３２と相乗的にアポトーシスを誘導できた（図示せず。）。【０１１４】
また、実施例６で作製したＺｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株に、表１に記載のｓｉＮｅｇ又は表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤを実施例１と同様にして導入した細胞と、ラットＩｇＧ又は抗ＩＴＧＡ６抗体の抗体溶液（２０μｇ／ｍＬ）を添加した細胞を、それぞれＰＬＸ４０３２溶液（５μＭにＤＭＳＯに溶解させた溶液）で４８時間処理した。これらの細胞のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）（ｎ＝３）の結果を図３５に示す。統計学的差異は、ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、Ｚｉｃ５遺伝子の過剰発現によるアポトーシスの抑制作用は、ＰＤＧＦＤを発現抑制することによって完全になくなること（図３５（左図）、ＩＴＧＡ６の中和抗体処理により部分的になくなること（図３５（右図）が明らかになった。【０１１５】
また、Ａ３７５細胞に、表２に記載のｓｉＮｅｇ又はｓｉＺＩＣ５を実施例１と同様にして導入した後、ＤＭＳＯ、ＵＯ１２６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）溶液（１０μＭにＤＭＳＯに溶解させた溶液）、又はオキサリプラチン（シグマアルドリッチ社製）溶液（２０μＭにＤＭＳＯに溶解させた溶液）で４８時間処理した。処理後の各細胞におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）（ｎ＝３）の結果を図３６に示す。統計学的差異は、ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、Ｚｉｃ５によるアポトーシスの抑制作用は、ＭＥＫ阻害剤であるＵＯ１２６や白金製剤であるオキサリプラチンで処理した細胞でも、ＰＬＸ４０３２処理の場合と同様の結果が得られた。【０１１６】
また、Ａ３７５細胞に、表１に記載のｓｉＮｅｇ、ｓｉＺＩＣ５、表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤ、ｓｉＩＴＧＡ６を実施例１と同様にして導入した後、ＤＭＳＯ又はＰＬＸ４０３２溶液（５μＭに溶解させた溶液）で２４時間処理した後における、リン酸化Ｓｔａｔ３（ｐＳｔａｔ３）、総Ｓｔａｔ３（Ｓｔａｔ３）、及びβ−アクチンの量をウェスタンブロットにより調べた。この結果、ＰＬＸ４０３２処理の有無にかかわらず、ＺＩＣ５又はＩＴＧＡ６のノックダウンによってＳｔａｔ３のリン酸化が抑制されたが、ＰＤＧＦＤがノックダウンされた細胞では、ＰＬＸ４０３２処理の場合のみＳｔａｔ３のリン酸化が抑制された（図示せず。）。【０１１７】
実施例６で作製したＺｉｃ５遺伝子安定発現株とＦｌａｇ安定発現株を、ＤＭＳＯ、又はＳｔａｔ３阻害剤ＷＰ１０６６（サンタクルズ社製）溶液（１０μＭに溶解させた溶液）で２４時間処理したところ、Ｚｉｃ５によるアポトーシスの抑制作用は、Ｓｔａｔ３阻害剤処理により完全に抑制された（図示せず。）。【０１１８】
これらの結果から、ＺＩＣ５は、下流因子ＰＤＧＦＤやＩＴＧＡ６によるＳｔａｔ３の活性化を介して、メラノーマ細胞のアポトーシスを抑制し、薬剤耐性に寄与すると考えられ、これらの分子の抑制が治療効果の向上につながることが期待できる。【０１１９】
［実施例８］
次に、生じてしまったＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ耐性株に対して、Ｚｉｃ５遺伝子及び下流因子ＰＤＧＦＤ、ＩＴＧＡ６が治療標的になる可能性を検討した。【０１２０】
まず、Ａ３７５細胞を用いてＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ耐性株を５種類（ｖｅｍＲ−１〜５）作製した。各細胞株を、Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ（ＰＬＸ４０３２）０、２、又は４μＭで４８時間処理した後の細胞数を計数し、ＰＬＸ４０３２未処理（ＰＬＸ４０３２濃度が０μＭ）の場合の細胞数を１とする相対細胞数を算出した。結果を図３７に示す。ｖｅｍＲ−１〜５では、Ａ３７５細胞よりも、ＰＬＸ４０３２処理による細胞の減少幅が小さく、Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ耐性を有することが確認された。【０１２１】
ｖｅｍＲ−１〜５細胞及びＡ３７５細胞に対して、ＤＭＳＯ又はＰＬＸ４０３２溶液（５μＭに溶解させた溶液）で４８時間処理した後における、リン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）（ｐＡＫＴ）、総ＡＫＴ（ＡＫＴ）、リン酸化ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／２０４）（ｐＥＲＫ）、総ＥＲＫ１／２（ＥＲＫ）、及びβ−アクチンの量をウェスタンブロットにより調べた。ウェスタンブロットは、抗ｐＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、抗ＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、抗ｐＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、抗ＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、及び抗β−アクチン抗体（シグマ社製）を用いた以外は前記と同様にして行った。結果を図３８に示す。この結果、ｖｅｍＲ−１〜５細胞では、ＥＲＫの再活性化が観察された。【０１２２】
ｖｅｍＲ−１〜５細胞及びＡ３７５細胞に対して、表１に記載のｓｉＮｅｇ、ｓｉＺＩＣ５、又は表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤを実施例１と同様にして導入した。ｓｉＲＮＡ導入から３日後の各細胞の細胞数を計数し、Ａ３７５細胞にｓｉＮｅｇを導入した細胞の細胞数を１とした場合の相対細胞数（ｎ＝３）を算出した。統計学的差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。結果を図３９に示す。いずれの細胞においても、ｓｉＲＮＡ導入によりＺＩＣ５又はＰＤＧＦＤの発現を抑制すると、細胞数が減少し、増殖率が低下した。【０１２３】
［実施例９］
ＨＴ１４４細胞を用いて、同様にしてＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ耐性株を３種類（ｖｅｍＲ−１〜３）作製した。各細胞株を、Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ（ＰＬＸ４０３２）０、４、又は８μＭで４８時間処理した後の細胞数を計数し、ＰＬＸ４０３２未処理（ＰＬＸ４０３２濃度が０μＭ）の場合の細胞数を１とする相対細胞数を算出した。結果を図４０に示す。【０１２４】
ｖｅｍＲ−１〜３細胞及びＨＴ１４４細胞に対して、ＤＭＳＯ又はＰＬＸ４０３２溶液（５μＭにＤＭＳＯに溶解させた溶液）で４８時間処理した後における、ｐＡＫＴ、ＡＫＴ、ｐＥＲＫ、ＥＲＫ、及びβ−アクチンの量を実施例８と同様にしてウェスタンブロットにより調べた。結果を図４１に示す。この結果、ｖｅｍＲ−１〜３細胞では、ＡＫＴとＥＲＫの両方の再活性化が観察された。【０１２５】
ｖｅｍＲ−１〜３細胞及びＨＴ１４４細胞に対して、表１に記載のｓｉＮｅｇ、ｓｉＺＩＣ５、表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤ、ｓｉＩＴＧＡ６を実施例１と同様にして導入した。ｓｉＲＮＡ導入から３日後の各細胞の細胞数を計数し、ＨＴ１４４細胞にｓｉＮｅｇを導入した細胞の細胞数を１とした場合の相対細胞数（ｎ＝３）を算出した。統計学的差異は、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）により求めた。結果を図４２に示す。いずれの細胞においても、ｓｉＲＮＡ導入によりＺＩＣ５、ＰＤＧＦＤ、又はＩＴＧＡ６の発現を抑制すると、細胞数が減少し、増殖率が低下した。【０１２６】
実施例８及び実施例９の結果から、メラノーマ治療において生じてしまったＢＲＡＦ阻害剤耐性細胞に対しても、Ｚｉｃ５、ＰＤＧＦＤ、ＩＴＧＡ６の抑制が治療に有効であることが示唆された。【０１２７】
［実施例１０］
＜ヒト前立腺がんにおけるＺｉｃ５遺伝子の発現＞
データベース検索により、Ｚｉｃ５遺伝子の発現が転移性前立腺がんにおいて亢進していることが示唆されていた(ＧＤＳ２５４６)。そのため、ヒト前立腺がんの臨床組織におけるＺｉｃ５遺伝子の発現について、免疫組織染色法により検討した。具体的には、ヒト前立腺がんの組織切片７３枚、非前立腺がんの組織切片７枚（いずれも、ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ社から購入）に対して、抗ＺＩＣ５抗体（Ａｖｉｖａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ社製）を用いて免疫組織染色を行った。各臨床組織切片の抗Ｚｉｃ５抗体による染色像を、染色強度に基づいて４段階（０〜３）にスコア化した。図４３に、非がん切片とがん切片のスコア（左図）、グリーソン分類によるグレード３、４、又は５の切片のスコア（中図）、グレード２又は３の切片のスコア（右図）を示す。統計学的差異は、非がん切片とがん切片のスコアはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ‘ｓ  Ｕ−ｔｅｓｔにより、グリーソン分類及びグレードにより分類した切片のスコアはＦｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔにより、それぞれ求めた。この結果、非がん部とがん部ではその発現に有意な差が見られなかったが、グレードの進行した前立腺がんにおいてＺｉｃ５遺伝子の発現が亢進していることが示唆された。【０１２８】
＜ヒト前立腺がんにおけるＺｉｃ５遺伝子の発現抑制の影響＞
ヒト前立腺がん細胞株ＤＵ１４５細胞を用いてＺｉｃ５発現抑制の影響を調べた。
まず、ＤＵ１４５細胞に、表２に記載のｓｉＺＩＣ５＃１、ｓｉＺＩＣ５＃２、ｓｉＮｅｇ＃１、又はｓｉＮｅｇ＃２を実施例１と同様にして導入し、導入後０、２、又は３日後の細胞数を計数した。各細胞の相対細胞数（導入後０日目（導入前）の細胞の細胞数を１とする。）（ｎ＝３）を算出した結果を図４４に示す。統計学的差異は、ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、ＤＵ１４５細胞では、ｓｉＲＮＡ導入によるＺｉｃ５遺伝子発現抑制により、細胞増殖率が低下することが明らかになった。【０１２９】
ＤＵ１４５細胞又はＰＣ細胞に、表２に記載のｓｉＺＩＣ５＃１又はｓｉＮｅｇ＃１を実施例１と同様にして導入し、導入後の細胞について実施例７と同様にしてＦＩＴＣ標識Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＭＢＬ社製）を用いて染色し、各細胞におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）（ｎ＝３）を算出した。統計学的差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。結果を図４５に示す。この結果、ｓｉＺＩＣ５＃１導入細胞ではＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合が増大しており、Ｚｉｃ５遺伝子発現抑制によりアポトーシスが誘導されることも明らかになった。【０１３０】
ＤＵ１４５細胞に、表２に記載のｓｉＺＩＣ５＃１又はｓｉＮｅｇ＃１を実施例１と同様にして導入し、導入後の各細胞のＺｉｃ５遺伝子、ＰＤＧＦＤ遺伝子、及びＩＴＧＡ６遺伝子のｍＲＮＡ発現量を、実施例６と同様にしてｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより調べた。各細胞のＺｉｃ５遺伝子等のｍＲＮＡ発現量は、ＡＣＴＢ（β−アクチン）遺伝子のｍＲＮＡ発現量によりノーマライズした。各遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現量（ｓｉＮｅｇ＃１を導入した細胞の発現量を１とする。）（ｎ＝３）を算出した結果を図４６に示す。統計学的差異は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、ＰＤＧＦＤ遺伝子及びＩＴＧＡ６の遺伝子発現は、Ｚｉｃ５遺伝子発現抑制により著しく減少した。【０１３１】
ＤＵ１４５細胞に、表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤ＃１、ｓｉＰＤＧＦＤ＃２、又はｓｉＩＴＧＡ６＃１を実施例１と同様にして導入し、導入後０、２、又は３日後の細胞数を計数した。各細胞の相対細胞数（導入後０日目（導入前）の細胞の細胞数を１とする。）（ｎ＝３）を算出した結果を図４７に示す。統計学的差異は、ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、ＤＵ１４５細胞の細胞増殖率は、ｓｉＲＮＡ導入によるＰＤＧＦＤ遺伝子発現抑制によって低下したが、ＩＴＧＡ６遺伝子発現抑制によってはほとんど影響しなかった。【０１３２】
さらに、ＤＵ１４５細胞に、表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤ＃１、ｓｉＰＤＧＦＤ＃２、又はｓｉＩＴＧＡ６＃１を実施例１と同様にして導入した後、ＤＭＳＯ、又はｄｏｃｅｔａｘｅｌ（シグマアルドリッチ社製）溶液（５ｎＭに溶解させた溶液）で２４時間処理した。処理後の各細胞におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）（ｎ＝３）の結果を図４８に示す。統計学的差異は、ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｅａｎｓ  ｔｅｓｔ（＊＊＊：Ｐ＜０．００１、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊：Ｐ＜０．０５）により求めた。この結果、Ｚｉｃ５及びＰＤＧＦＤのノックダウンでは、ｄｏｃｅｔａｘｅｌにより誘導されるアポトーシスが顕著に増大していた。ＩＴＧＡ６のノックダウンでは、さほどの影響は観察されなかった。【０１３３】
これらの結果から、前立腺がん細胞において、Ｚｉｃ５遺伝子の下流でＰＤＧＦＤ遺伝子やＩＴＧＡ６遺伝子の発現が制御されていること、ＰＤＧＦＤ遺伝子の発現抑制は細胞増殖率を低下させること、Ｚｉｃ５遺伝子及びＰＤＧＦＤ遺伝子の発現抑制は、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌによるアポトーシス誘導を亢進すること、が明らかになった。これらのことから、Ｚｉｃ５遺伝子及びＰＤＧＦＤ遺伝子の抑制は、前立腺がんの治療に対しても有効であることが示唆された。【０１３４】
［実施例１１］
ＰＤＨＦＤ遺伝子の発現やその下流のシグナル因子であるＦＡＫ及びＳＴＡＴ３等の活性が、Ｚｉｃ５遺伝子の発現に与える影響を調べた。【０１３５】
＜ＰＤＧＦＤ遺伝子の発現抑制のＺｉｃ５遺伝子に対する影響＞
Ａ３７５細胞に、表１に記載のｓｉＮｅｇと表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤを実施例１と同様にして導入してＲＮＡ干渉を行い、得られた細胞ついて、ＰＤＧＦＤ遺伝子とＺｉｃ５遺伝子の発現量を、ＧＡＰＤＨを内部標準としたウェスタンブロット法により測定した。ウェスタンブロット法は、抗ＺＩＣ５抗体（Ａｖｉｖａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ社製）、抗ＰＤＧＦＤ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いて、カネマルらの方法（非特許文献１３参照。）に準じて行った。【０１３６】
各抗体により染色されたバンドを図４９に示す。上段（「ＺＩＣ５」）が抗ＺＩＣ５抗体で染色されたバンドであり、中段（「ｐｒｏ−ＰＤＧＦＤ」）が抗ＰＤＧＦＤ抗体で染色されたバンドであり、下段（「ＧＡＰＤＨ」）が抗ＧＡＰＤＨ抗体で染色されたバンドである。ｓｉＰＤＧＦＤ導入によりｐｒｏ−ＰＤＧＦＤの発現が抑制された細胞では、ＺＩＣ５の発現も抑制されていた。【０１３７】
＜ＰＤＧＦＤ遺伝子の過剰発現のＺｉｃ５遺伝子に対する影響＞
ヒトＰＤＧＦＤ遺伝子のｃＤＮＡをプラスミドｐｃＤＮＡに組み込んだｈＰＤＧＦＤ発現用ベクターをトランスフェクションし、Ｇ４１８処理により選抜したｈＰＤＧＦＤ過剰発現株と、空ベクターであるｐｃＤＮＡをトランスフェクションし、Ｇ４１８処理により選抜したｐｃＤＮＡ株（ネガティブコントロール）について、ウェスタンブロットにより、リン酸化ＦＡＫ（ｐＦＡＫ）、リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐＳＴＡＴ３）、総ＳＴＡＴ３（ＳＴＡＴ３）、ＺＩＣ５、ｐｒｏ−ＰＤＧＦＤ、及びβ−アクチンの量を調べた。ウェスタンブロットは、抗ｐＦＡＫ抗体（Ｓｉｇｎａｌｗａｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ社製）、抗ｐＳＴＡＴ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ＳＴＡＴ３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗ＺＩＣ５抗体（Ａｖｉｖａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ社製）、抗ＰＤＧＦＤ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）、及び抗β−アクチン抗体（シグマ社製）を用いた以外は前記と同様にして行った。【０１３８】
各抗体により染色されたバンドを図５０に示す。この結果、ｈＰＤＧＦＤ過剰発現株においては、ｐｒｏ−ＰＤＧＦＤのみならずＺＩＣ５の発現も著しく亢進していることが明らかになった。【０１３９】
＜ＦＡＫ阻害剤処理のＺｉｃ５遺伝子に対する影響＞
Ａ３７５細胞を、ＦＡＫ阻害剤Ｉ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）濃度が０、１、２．５、又は５μＭである培地中で２４時間処理した後、ウェスタンブロットにより、ＺＩＣ５、ｐｒｏ−ＰＤＧＦＤ、ｐＥＲＫ、及びβ−アクチンの量を調べた。ウェスタンブロットは、抗ＺＩＣ５抗体（Ａｖｉｖａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ社製）、抗ＰＤＧＦＤ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）、抗ｐＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、及び抗β−アクチン抗体（シグマ社製）を用いた以外は前記と同様にして行った。【０１４０】
各抗体により染色されたバンドを図５１に示す。この結果、ＦＡＫ阻害剤処理により、ｐＥＲＫ量には変化が見られなかったが、ＺＩＣ５とｐｒｏ−ＰＤＧＦＤは、ＦＡＫ阻害剤の濃度依存的に発現量の低下が確認された。【０１４１】
＜Ｓｔａｔ３阻害剤処理のＺｉｃ５遺伝子に対する影響＞
Ａ３７５細胞を、Ｓｔａｔ３阻害剤ＷＰ１０６６（サンタクルズ社製）濃度が０、１、１．５、２、２．５、３、又は４μＭである培地中で２４時間処理した後、ウェスタンブロットにより、ＺＩＣ５、ｐｒｏ−ＰＤＧＦＤ、ｐＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ３、及びＧＡＰＤＨの量を調べた。ウェスタンブロットは、抗ＺＩＣ５抗体（Ａｖｉｖａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ社製）、抗ＰＤＧＦＤ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）、抗ｐＳＴＡＴ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ＳＴＡＴ３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた以外は前記と同様にして行った。【０１４２】
各抗体により染色されたバンドを図５２に示す。この結果、Ｓｔａｔ３阻害剤処理により、ＳＴＡＴ３量は変化せず、ｐＳＴＡＴ３量は、Ｓｔａｔ３阻害剤の濃度依存的に発現量の低下が確認された。さらに、ｐｒｏ−ＰＤＧＦＤ量とＺＩＣ５量も、ｐＳＴＡＴ３と同様に、Ｓｔａｔ３阻害剤の濃度依存的に発現量が低下した。【０１４３】
＜ＩＬ−６処理のＺｉｃ５遺伝子に対する影響＞
Ａ３７５細胞を、インターロイキン−６（ＩＬ−６）（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）濃度が０、１０、又は２０ｎｇ／ｍＬである培地中で２４時間処理した後、ウェスタンブロットにより、ＺＩＣ５、ｐｒｏ−ＰＤＧＦＤ、ｐＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ３、及びＧＡＰＤＨの量を調べた。ウェスタンブロットは、抗ＺＩＣ５抗体（Ａｖｉｖａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ社製）、抗ｐＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、抗ｐＳＴＡＴ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、ＳＴＡＴ３抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた以外は前記と同様にして行った。【０１４４】
各抗体により染色されたバンドを図５３に示す。この結果、ＩＬ−６処理により、ＳＴＡＴ３量及びｐＥＲＫ量は変化せず、ｐＳＴＡＴ３量は、ＩＬ−６の濃度依存的に発現量の増大が確認された。さらに、ＺＩＣ５量も、ｐＳＴＡＴ３と同様に、ＩＬ−６の濃度依存的に発現量が増大した。【０１４５】
これらの結果から、ＺＩＣ５により正に制御されるＰＤＧＦＤ、ＦＡＫ、ＳＴＡＴ３のシグナルは、ＺＩＣ５の発現を正に制御していることが示唆され、これらの因子が、ポジティブフィードバックループを形成していることが示唆された。【０１４６】
［実施例１２］
実施例８で作製したＶｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ耐性株（ｖｅｍＲ−３細胞）について、ＺＩＣ５及びＰＤＧＦＤの発現抑制の影響を調べた。【０１４７】
＜ＺＩＣ５及びＰＤＧＦＤの発現抑制のアポトーシスへの影響＞
ｖｅｍＲ−３細胞に、表１に記載のｓｉＮｅｇ＃１、ｓｉＮｅｇ＃２、表２に記載のｓｉＺＩＣ５＃１、又は表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤ＃１を、それぞれ実施例１と同様にして導入してＲＮＡ干渉を行い、得られた細胞ついて、実施例７と同様にしてアポトーシス細胞の割合をＦＩＴＣ標識Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ（ＭＢＬ社製）を用いて検出した。各細胞におけるＡｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合（％）（ｎ＝３）の結果を図５４に示す。この結果、ｓｉＺＩＣ５＃１を導入した細胞とｓｉＰＤＧＦＤ＃１を導入した細胞の両方とも、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖポジティブ細胞の割合が顕著に増大しており、ｖｅｍＲ−３細胞では、ＺＩＣ５の発現を抑制したり、ＰＤＧＦＤの発現を抑制することによってアポトーシスが誘導されることがわかった。【０１４８】
＜ＺＩＣ５及びＰＤＧＦＤの発現抑制とＥＲＫの活性化への影響＞
ｖｅｍＲ−３細胞に、表１に記載のｓｉＮｅｇ＃１、ｓｉＮｅｇ＃２、表２に記載のｓｉＺＩＣ５＃１、又は表８に記載のｓｉＰＤＧＦＤ＃１を、それぞれ実施例１と同様にして導入してＲＮＡ干渉を行い、得られた細胞ついて、実施例７と同様にしてＢＲＡＦ阻害剤ＰＬＸ４０３２処理又はＤＭＳＯ処理を行った後に、ウェスタンブロット法によりｐＥＲＫの量を調べた。ウェスタンブロット法は、抗ＺＩＣ５抗体（Ａｖｉｖａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ社製）、抗ＰＤＧＦＤ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）、抗ｐＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、抗ＥＲＫ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）、及び抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いて、カネマルらの方法（非特許文献１３参照。）に準じて行った。【０１４９】
各抗体により染色されたバンドを図５５に示す。図中、「ＰＬＸ４０３２処理」が、「＋」はＰＬＸ４０３２処理を行った細胞の結果を、「−」はＤＭＳＯ処理を行った細胞の結果を、それぞれ示す。また、「ｓｉＺＩＣ５」が、「＋」はｓｉＺＩＣ５＃１を導入した細胞の結果を、「−」はｓｉＮｅｇ＃１を導入した細胞の結果をそれぞれ示す。「ｓｉＰＤＧＦＤ」が、「＋」はｓｉＰＤＧＦＤ＃１を導入した細胞の結果を、「−」はｓｉＮｅｇ＃２を導入した細胞の結果をそれぞれ示す。ｖｅｍＲ−３細胞では、ＰＬＸ４０３２処理によるＥＲＫの不活性化（ｐＥＲＫ量の減少）は引き起こされなかったが、ＺＩＣ５の発現を抑制したり、ＰＤＧＦＤの発現を抑制すると、ｐＥＲＫ量が低下した。【０１５０】
これらの結果から、ＺＩＣ５／ＰＤＧＦＤが形成するポジティブフィードバックシグナルが、Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ耐性株におけるＭＥＫ／ＥＲＫシグナルの異常活性化に寄与していると考えられた。
【図１】
2016178374.tif 000012
【図２】
2016178374.tif 000013
【図３】
2016178374.tif 000014
【図４】
2016178374.tif 000015
【図５】
2016178374.tif 000016
【図６】
2016178374.tif 000017
【図７】
2016178374.tif 000018
【図８】
2016178374.tif 000019
【図９】
2016178374.tif 000020
【図１０】
2016178374.tif 000021
【図１１】
2016178374.tif 000022
【図１２】
2016178374.tif 000023
【図１３】
2016178374.tif 000024
【図１４】
2016178374.tif 000025
【図１５】
2016178374.tif 000026
【図１６】
2016178374.tif 000027
【図１７】
2016178374.tif 000028
【図１８】
2016178374.tif 000029
【図１９】
2016178374.tif 000030
【図２０】
2016178374.tif 000031
【図２１】
2016178374.tif 000032
【図２２】
2016178374.tif 000033
【図２３】
2016178374.tif 000034
【図２４】
2016178374.tif 000035
【図２５】
2016178374.tif 000036
【図２６】
2016178374.tif 000037
【図２７】
2016178374.tif 000038
【図２８】
2016178374.tif 000039
【図２９】
2016178374.tif 000040
【図３０】
2016178374.tif 000041
【図３１】
2016178374.tif 000042
【図３２】
2016178374.tif 000043
【図３３】
2016178374.tif 000044
【図３４】
2016178374.tif 000045
【図３５】
2016178374.tif 000046
【図３６】
2016178374.tif 000047
【図３７】
2016178374.tif 000048
【図３８】
2016178374.tif 000049
【図３９】
2016178374.tif 000050
【図４０】
2016178374.tif 000051
【図４１】
2016178374.tif 000052
【図４２】
2016178374.tif 000053
【図４３】
2016178374.tif 000054
【図４４】
2016178374.tif 000055
【図４５】
2016178374.tif 000056
【図４６】
2016178374.tif 000057
【図４７】
2016178374.tif 000058
【図４８】
2016178374.tif 000059
【図４９】
2016178374.tif 000060
【図５０】
2016178374.tif 000061
【図５１】
2016178374.tif 000062
【図５２】
2016178374.tif 000063
【図５３】
2016178374.tif 000064
【図５４】
2016178374.tif 000065
【図５５】
2016178374.tif 000066
【配列表】
2016178374000001.app
【国際調査報告】
2016178374.tif 000067
2016178374.tif 000068
2016178374.tif 000069
2016178374.tif 000070