(57)【要約】  ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生成を抑え、高純度のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を、効率的に且つ低コストで安価に製造する新規な方法を提供することを課題とする。基質であるＬ−ピペコリン酸に、２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させてヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成させる方法であって、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素が以下の（１）及び（２）の特徴を有するヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法を提供する。（１）２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で、Ｌ−ピペコリン酸に作用して、Ｌ−ピペコリン酸の３位、４位及び／又は５位の炭素原子に水酸基を付加することができる。（２）Ｌ−プロリンに対する触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）が、Ｌ−ピペコリン酸に対する触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の７倍以下である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質であるＬ−ピペコリン酸に、２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させてヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成させる方法であって、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素が以下の（１）及び（２）の特徴を有するヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
（１）２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下、Ｌ−ピペコリン酸に作用して、Ｌ−ピペコリン酸の３位、４位及び／又は５位の炭素原子に水酸基を付加することができる。
（２）Ｌ−プロリンに対する触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）が、Ｌ−ピペコリン酸に対する触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の７倍以下である。
【請求項２】
Ｌ−リジン及び／又はＤＬ−リジンに、
（ｉ−１）Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素を反応させて、又は、
（ｉ−２）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素とアミノ酸ラセマーゼとを反応させて、
３，４，５，６−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸を生成させた後、
該３，４，５，６−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸に、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを作用させることにより基質のＬ−ピペコリン酸を生成させる工程を含む、
請求項１に記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
【請求項３】
Ｌ−リジンに、Ｌ−リジン ６−オキシダーゼ、Ｌ−リジン ６−デヒドロゲナーゼ及びＬ−リジン ６−アミノトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素を反応させて２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸を生成させた後、
該２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸に、ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼを作用させて基質のＬ−ピペコリン酸を生成させる工程を含む、
請求項１に記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
【請求項４】
Ｌ−リジンに、リジンシクロデアミナーゼを作用させて基質のＬ−ピペコリン酸を生成させる工程を含む、
請求項１に記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
【請求項５】
基質のＬ−ピペコリン酸に含まれているＬ−プロリンが１０％（ｗ／ｗ）以下である、請求項１〜４のいずれかに記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
【請求項６】
Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素が、さらに以下の（３）の特徴を有する、請求項１〜５のいずれかに記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
（３）Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物のヒドロキシ−Ｌ−プロリン生成活性が、該Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成活性を１００％とした場合の５５％以下である。
【請求項７】
Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素が、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含む、請求項１〜６のいずれかに記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法：
（Ａ）配列番号２、１２、１４、１６、１８、又は２０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｂ）配列番号２、１２、１４、１６、１８、又は２０で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、前記（１）及び（２）の特徴を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２、１２、１４、１６、１８、又は２０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記（１）及び（２）の特徴を有するタンパク質。
【請求項８】
Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞が、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡで形質転換された微生物若しくは細胞である、請求項１〜７のいずれかに記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
【請求項９】
Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡが、以下の（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示すＤＮＡを含むものである請求項８に記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法：
（Ｄ）配列番号１、１１、１３、１５、１７、又は１９で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号１、１１、１３、１５、１７、又は１９で表される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列を含み、前記（１）及び（２）の特徴を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｆ）配列番号１、１１、１３、１５、１７、又は１９で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、前記（１）及び（２）の特徴を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生物学的な方法により製造する方法に関し、具体的には、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生産する能力を有する酵素を用いて、Ｌ−ピペコリン酸からヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、医薬品を合成するための中間体等として有用な化合物である。例えば、（４Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の前駆体として（特許文献１）、（４Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸はＨＩＶプロテアーゼ阻害剤ｐａｌｉｎａｖｉｒの前駆体として（非特許文献１）、（５Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸及び（５Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は抗菌剤の前駆体として（特許文献２）、利用可能であることが知られている。【０００３】
ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、Ｌ−ピペコリン酸から生物学的な方法により製造できることが知られている。例えば、ミヤコグサ根粒菌メソリゾビウム・ロチ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）ＭＡＦＦ３０３０９９由来のＢＡＢ５２６０５タンパク質、アルファルファ根粒菌シノリゾビウム・メリロチ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１由来のＣＡＣ４７６８６タンパク質（以下「ＳｍＰＨ」と称することがある。）及びセグニリパラス・ルゴサス（Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓ ｒｕｇｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９７４由来のＥＦＶ１２５１７タンパク質のアノテーションよりも４８塩基（１６アミノ酸相当）上流から発現させたポリヌクレオチド（ｃｉｓ遺伝子）にコードされたタンパク質（以下「ＳｒｕＰＨ」と称することがある。）等が、Ｌ−ピペコリン酸を（５Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力を有することが報告されており（特許文献３）、これらの水酸化酵素を用いてＬ−ピペコリン酸をヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換することができる。【０００４】
しかしながら、これらの水酸化酵素はいずれも、Ｌ−プロリンを水酸化してヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する能力も有している。【０００５】
ここで、酵素・菌体等を用いて生物学的な方法により製造されたＬ−ピペコリン酸は、例えば、酵素・菌体の調製時に使用した培地等からの持ち込み成分としてＬ−プロリンが微量混入することがある。
また、純粋なＬ−ピペコリン酸を原料として、水酸化酵素を用いてヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造する場合、使用する水酸化酵素にＬ−プロリンが混入している場合がある。
さらに、原料であるＬ−ピペコリン酸、水酸化酵素のいずれにもＬ−プロリンが含まれていない場合であっても、水酸化酵素を発現する菌体を生育させながら反応させる場合は、その生育過程で菌体がＬ−プロリンを副生することも考えられる。【０００６】
Ｌ−プロリンは、Ｌ−ピペコリン酸と物理化学的性質が近いため、Ｌ−プロリンを完全に除去して、純粋なＬ−ピペコリン酸を得ることは難しい。
また、Ｌ−プロリンが混入したＬ−ピペコリン酸を原料として、前記の酵素を用いてＬ−ピペコリン酸をヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する場合、Ｌ−プロリンがヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換されるため、生成物はヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸とヒドロキシ−Ｌ−プロリンが混在したものになり、高純度のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を得ることが難しい。また、ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸と物理化学的性質が近いため、両者を分離することが難しい。【０００７】
したがって、ヒドロキシ−Ｌ−プロリンを除去して高純度のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を得るためには、何度も精製を繰り返したり高価な精製手段を用いたりする必要があるため精製の負荷が高く、時間的にもコスト的にも負担が大きいという問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１０−５１４７２０号公報
【特許文献２】特表２００４−５０５０８８号公報
【特許文献３】ＷＯ２０１３／１８７４３８
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Gillard et al.,The Journal of Organic Chemistry, 1996, Vol. 61, pp.2226
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のように、Ｌ−ピペコリン酸から生物学的な方法によりヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造する方法は知られているが、従来の方法は、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸だけでなくヒドロキシ−Ｌ−プロリンも生成してしまうため、高い純度が要求される医薬品の中間体等に使用するヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法としては満足できるものではなく、より効率的な製造方法が望まれている。
すなわち、本発明は、ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生成を抑え、高純度のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を、効率的に且つ低コストで安価に製造する新規な方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定のピペコリン酸水酸化酵素が、２−オキソグルタル酸依存的にＬ−ピペコリン酸をヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力（Ｌ−ピペコリン酸水酸化活性）を有し、かつ、Ｌ−プロリンをヒドロキシ−Ｌ−プロリンに変換する活性（Ｌ−プロリン水酸化活性）をほとんど持たないことを見出した。そして、これら特定の酵素をＬ−ピペコリン酸に作用させることにより、光学純度の高い、種々のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を高効率で得ることができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。【００１２】
すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］基質であるＬ−ピペコリン酸に、２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させてヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成させる方法であって、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素が以下の（１）及び（２）の特徴を有するヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
（１）２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で、Ｌ−ピペコリン酸に作用して、Ｌ−ピペコリン酸の３位、４位及び／又は５位の炭素原子に水酸基を付加することができる。
（２）Ｌ−プロリンに対する触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）が、Ｌ−ピペコリン酸に対する触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の７倍以下である。
［２］Ｌ−リジン及び／又はＤＬ−リジンに、
（ｉ−１）Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素を反応させて、又は、
（ｉ−２）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素とアミノ酸ラセマーゼとを反応させて、
３，４，５，６−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸を生成させた後、
該３，４，５，６−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸に、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを作用させることにより基質のＬ−ピペコリン酸を生成させる工程を含む、
［１］に記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
［３］Ｌ−リジンに、Ｌ−リジン ６−オキシダーゼ、Ｌ−リジン ６−デヒドロゲナーゼ及びＬ−リジン ６−アミノトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素を反応させて２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸を生成させた後、
該２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸に、ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼを作用させて基質のＬ−ピペコリン酸を生成させる工程を含む、
［１］に記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
［４］Ｌ−リジンに、リジンシクロデアミナーゼを作用させて基質のＬ−ピペコリン酸を生成させる工程を含む、
［１］に記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
［５］基質のＬ−ピペコリン酸に含まれているＬ−プロリンが１０％（ｗ／ｗ）以下である、［１］〜［４］のいずれかに記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
［６］Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素が、さらに以下の（３）の特徴を有する、［１］〜［５］のいずれかに記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
（３）Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物のヒドロキシ−Ｌ−プロリン生成活性が、該Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成活性を１００％とした場合の５５％以下である。
［７］Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素が、以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示すタンパク質を含む、［１］〜［６］のいずれかに記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法：
（Ａ）配列番号２、１２、１４、１６、１８又は２０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質；
（Ｂ）配列番号２、１２、１４、１６、１８又は２０で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、前記（１）及び（２）の特徴を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号２、１２、１４、１６、１８又は２０で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、前記（１）及び（２）の特徴を有するタンパク質。
［８］Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞が、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡで形質転換された微生物若しくは細胞である、［１］〜［７］のいずれかに記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法。
［９］Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡが、以下の（Ｄ）、（Ｅ）又は（Ｆ）に示すＤＮＡを含むものである［８］に記載のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法：
（Ｄ）配列番号１、１１、１３、１５、１７又は１９で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号１、１１、１３、１５、１７又は１９で表される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列を含み、前記（１）及び（２）の特徴を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｆ）配列番号１、１１、１３、１５、１７又は１９で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含み、前記（１）及び（２）の特徴を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、光学純度が高い、高純度のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を高効率で製造することができる。特に、本発明は、基質のＬ−ピペコリン酸にＬ−プロリンが含まれている場合であっても、高純度のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造することができる。
さらに、本発明は、ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの生成を抑えることができるので、医薬品の中間体等に使用できる高純度のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を、低コストで安価に製造することができるため、工業的に好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例３において、各Ｌ−ピペコリン酸濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）の逆数をｘ軸に、各Ｌ−ピペコリン酸濃度における各水酸化酵素量（ｍｇ）あたりのヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成活性（Ｕ／ｍｇ）の逆数をｙ軸にプロットした図である。
【図２】実施例４において、Ｌ−ピペコリン酸５位水酸化酵素について、Ｌ−プロリン及びＬ−ピペコリン酸に対する反応性を比較した図である。
【図３】実施例５において、（５Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の蓄積量の経時変化を示した図である。
【図４】実施例５において、（４Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の蓄積量の経時変化を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本明細書において、「Ｌ−ピペコリン酸水酸化活性」とは、Ｌ−ピペコリン酸の３位、４位及び／又は５位の炭素原子に水酸基を付加する能力を意味する。
「Ｌ−ピペコリン酸水酸化活性」を有するか否かは、例えば、Ｌ−ピペコリン酸を基質として含有し、さらに２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンを含有する反応系において、測定対象とする酵素をＬ−ピペコリン酸に対して作用させ、生成したヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の量を測定することにより確認することができる。
【００１６】
本明細書における「酵素」には、精製酵素（部分的に精製した酵素を含む。）や、通常の固定化技術を用いて担体に固定化したもの、例えば、ポリアクリルアミド、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等も含まれる。
本明細書において、「発現ベクター」とは、所望の機能を有するタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、所望の機能を有するタンパク質を前記宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子である。例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等が挙げられるが、これらに限定されず、好ましくはプラスミドである。
本明細書において、「形質転換体」とは、前記発現ベクター等により目的の遺伝子が導入され、所望の機能を有するタンパク質に関連する形質を表すことができるようになった微生物又は細胞を意味する。
【００１７】
本発明のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法は、２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で、基質であるＬ−ピペコリン酸に対して、以下の（１）及び（２）の特徴を有するＬ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させることを特徴とする。
（１）２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下、Ｌ−ピペコリン酸に作用して、Ｌ−ピペコリン酸の３位、４位及び／又は５位の炭素原子に水酸基を付加することができる。
（２）Ｌ−プロリンに対する触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）が、Ｌ−ピペコリン酸に対する触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の７倍以下である。
【００１８】
本発明で使用するＬ−ピペコリン酸水酸化酵素（以下、「本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素」と称することがある。）は、２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で、Ｌ−ピペコリン酸に作用して、Ｌ−ピペコリン酸の３位、４位及び／又は５位の炭素原子に水酸基を付加することができる酵素である。
【００１９】
２−オキソグルタル酸の量は、反応を阻害しない量であれば特に限定されないが、通常、反応系中においてＬ−ピペコリン酸と等モル又はそれ以上、好ましくは等モル〜１．２倍モルの範囲である。
２価の鉄イオンの量は、反応を阻害しない量であれば特に限定されないが、通常、反応系中においてＬ−ピペコリン酸１モルに対し０．０００１モル〜０．５モル、好ましくは０．００１モル〜０．１モルである。
２価の鉄イオンは、例えば、硫酸鉄、塩化鉄、クエン酸鉄等を反応系中に添加することにより、存在させることができる。
【００２０】
本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素は、好ましくは、配列番号２、１２、１４、１６、１８又は２０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むものである。
また、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素は、配列番号２、１２、１４、１６、１８又は２０で表されるアミノ酸配列のホモログであって上記（１）及び（２）の特徴を有するＬ−ピペコリン酸水酸化活性を有するタンパク質を含むものであってもよい。
【００２１】
そのような配列番号２、１２、１４、１６、１８又は２０で表されるアミノ酸配列のホモログとしては、配列番号２、１２、１４、１６、１８又は２０で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するものが挙げられる。置換、挿入又は付加の場合は、１又は数個のアミノ酸が保守的に置換、挿入又は付加された、保守的に変異されたものが好ましい。
ここで、「１又は数個のアミノ酸」とは、通常１個〜１００個、好ましくは１個〜５０個、より好ましくは１個〜２０個、さらに好ましくは１個〜１０個、特に好ましくは１個〜５個のアミノ酸である。
【００２２】
また、配列番号２、１２、１４、１６、１８又は２０で表されるアミノ酸配列のホモログとしては、配列番号２、１２、１４、１６、１８又は２０で表されるアミノ酸配列全長と７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するものが挙げられる。好ましくは、当該アミノ酸配列全長と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
本発明において、配列同一性とは、塩基配列またはアミノ酸配列において、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したヌクレオチドまたはアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J．Mol．Biol． 215 (1990) pp.403-410に記載されるNBLAST及びXBLASTプログラム中に組込まれている。より詳細には、塩基配列またはアミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラム（例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法は、当業者に周知の手法である。
【００２３】
配列番号２、１２、１４、１６、又は１８で表されるアミノ酸配列は、それぞれミクロモノスポラ・チョコリエンシス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｈｏｋｏｒｉｅｎｓｉｓ）、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）Ｎａｒａ  ｑｃ５ 株、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５４−１２５５株、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ）ＰＨ−１株、及びコルディア・チェジュドネンシス（Ｋｏｒｄｉａ  ｊｅｊｕｄｏｎｅｎｓｉｓ）株のゲノム情報に基づくものである。
【００２４】
本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素のうち、配列番号２、１８、又は２０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質や、配列番号２、１８、又は２０で表されるアミノ酸配列のホモログであってＬ−ピペコリン酸水酸化活性を有するタンパク質は、Ｌ−ピペコリン酸の５位の炭素原子を選択的に水酸化するので、高効率で（５Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成することができる。
【００２５】
本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素のうち、配列番号１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質や、配列番号１２、１４又は１６で表されるアミノ酸配列のホモログであってＬ−ピペコリン酸水酸化活性を有するタンパク質は、Ｌ−ピペコリン酸の４位の炭素原子を選択的に水酸化するので、高効率で（４Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成することができる。
【００２６】
本発明においては、１種又は２種以上のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素を使用することができる。
本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素は、ミクロモノスポラ・チョコリエンシス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｈｏｋｏｒｉｅｎｓｉｓ）、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）Ｎａｒａ  ｑｃ５ 株、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５４−１２５５株、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ）ＰＨ−１株、又はコルディア・チェジュドネンシス（Ｋｏｒｄｉａ  ｊｅｊｕｄｏｎｅｎｓｉｓ）株などから精製して得ることができる。
【００２７】
また、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）やハイブリダイゼーション等の公知の方法でクローン化し、それを適当な宿主で発現させることによって、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素を得ることもできる。
例えば、配列番号２、１２、１４、１６、１８又は２０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むＬ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡとしては、それぞれ、配列番号１、１１、１３、１５、１７又は１９で表される塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、配列番号１、１１、１３、１５、１７又は１９で表される塩基配列を含むＤＮＡのホモログであって、上記（１）及び（２）の特徴を有するＬ−ピペコリン酸水酸化活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
【００２８】
そのような配列番号１、１１、１３、１５、１７又は１９で表される塩基配列を含むＤＮＡのホモログとしては、配列番号１、１１、１３、１５、１７又は１９で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列を含むものが挙げられる。置換、挿入又は付加の場合は、１又は数個の塩基が保守的に置換、挿入又は付加された、保守的に変異されたものが好ましい。
ここで、「１又は数個の塩基」とは、通常１個〜３００個、好ましくは１個〜１５０個、より好ましくは１個〜６０個、さらに好ましくは１個〜３０個、より好ましくは１個〜１５個、特に好ましくは１個〜１０個、の塩基である。
【００２９】
なお、配列番号１、１１、１３、１５、又は１７で表される塩基配列は、それぞれ配列番号２、１２、１４、１６、又は１８で表されるアミノ酸配列をコードするミクロモノスポラ・チョコリエンシス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｈｏｋｏｒｉｅｎｓｉｓ）、コレトトリカム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）Ｎａｒａ  ｑｃ５ 株、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５４−１２５５株、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ）ＰＨ−１株、又はコルディア・チェジュドネンシス（Ｋｏｒｄｉａ  ｊｅｊｕｄｏｎｅｎｓｉｓ）株の遺伝子を大腸菌発現用にコドンを最適化した塩基配列である。このように形質転換対象の宿主に応じてコドンが最適化されたＤＮＡも当然に本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡに包含される。
【００３０】
また、配列番号１、１１、１３、１５、１７又は１９で表される塩基配列を含むＤＮＡのホモログとしては、配列番号１、１１、１３、１５、１７又は１９で表される塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡであってもよい。
【００３１】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、ストリンジェントな条件下、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。
ストリンジェントな条件としては、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法又はプラークハイブリダイゼーション法においては、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７ｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液の存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。該ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Ｃold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３２】
当業者であれば、配列番号１、１１、１３、１５、１７、又は１９で表される塩基配列を含むＤＮＡに、部位特異的変異導入法（Nucleic Acids Res.10,pp.6487(1982)、Methods in Enzymol.100,pp.448(1983)、Molecular Cloning、PCR A Practical Approach IRL Press pp.200(1991)）等を用いて、塩基の欠失、置換、挿入及び／又は付加を行い、所望の変異を導入することにより、配列番号１、１１、１３、１５、１７、又は１９で表される塩基配列を含むＤＮＡの変異体を得ることができる。
また、配列番号２、１２、１４、１６、１８又は２０で表されるアミノ酸配列又はその一部や、配列番号１、１１、１３、１５、１７又は１９で表される塩基配又はその一部を基に、例えば、ＤＮＡ Ｄａｔａｂａｎｋ ｏｆ ＪＡＰＡＮ（ＤＤＢＪ）等のデータベースに対してホモロジー検索を行って、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素のアミノ酸情報又はそれをコードするＤＮＡの塩基配列情報を手に入れることも可能である。
【００３３】
また、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素は、Ｌ−プロリンに対する触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）が、Ｌ−ピペコリン酸に対する触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の７倍以下、好ましくは２倍以下、より好ましくは１倍以下、さらに好ましくは０．５倍以下、特に好ましくは０．１倍以下である。そして最も好ましくは実質的にヒドロキシ−Ｌ−プロリン生成活性が０のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素である。本発明において「実質的にヒドロキシ−Ｌ−プロリン生成活性が０」とは、ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが１分子も生成しないことを意味するものではなく、ヒドロキシ−Ｌ−プロリンが検出できないか又は検出できても微量であって、当業者が技術常識に基づいて無視できる程度であることを意味する。
【００３４】
本発明の触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は、例えば、ミカエリス・メンテンの速度式を用いてｋｃａｔ／Ｋｍを算出する方法により求めることができる。ここで、ｋｃａｔは酵素１分子あたりの触媒効率を示し、Ｋｍは基質に対する酵素の親和性の指標である。
【００３５】
Ｋｍ及びｋｃａｔの具体的算出方法は以下のとおりである。まず、特定の基質濃度範囲で、各Ｌ−ピペコリン酸濃度における各水酸化酵素量（ｍｇ）あたりのヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成活性（Ｕ／ｍｇ）を測定する。ここで、１ユニット（Ｕ）は、１分間に１μｍｏｌのヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する能力を表す。続いて、実施した各Ｌ−ピペコリン酸濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）の逆数をｘ軸に、各Ｌ−ピペコリン酸濃度における各水酸化酵素量（ｍｇ）あたりのヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成活性（Ｕ／ｍｇ）の逆数をｙ軸にプロットする。それらの線形プロットにおいて、ｘ軸との切片の逆数に−１を掛けた数値がｋｍ（ｍｍｏｌ／Ｌ）を示し、ｙ軸との切片の逆数が最大速度であるＶｍａｘ（Ｕ／ｍｇ）を示すことが知られている。酵素１分子あたりの触媒能ｋｃａｔはＶｍａｘと酵素の分子量から算出できる。そうして得られたｋｃａｔとｋｍから、酵素の触媒能の指標となる触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を算出することができる。
【００３６】
触媒効率の算出に用いる酵素としては、当該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞を、有機溶媒や界面活性剤等による処理や物理的又は酵素的な処理により破壊したものから、酵素画分を粗精製物あるいは精製物として取り出したものを用いることができる。酵素活性の強さと反応時間は、反応時間に対して酵素活性が比例して増加する範囲で任意に設定することができる。
ミカエリス・メンテンの数式の詳細等に関しては、例えば「生化学実験法２１酵素反応速度論実験入門・学会出版センター」等に記述されている。
【００３７】
さらに、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素活性は、以下の方法で簡易的に評価することも可能である。
本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物をＬ−ピペコリン酸又はＬ−プロリンと反応させて、特定の基質濃度において、投入した細胞量（単位：ｇや濁度）又は総タンパク質量（単位：ｇ）あたりのヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成活性（Ｕ／ｇ）とヒドロキシ−Ｌ−プロリン生成活性（Ｕ／ｇ）を測定する。そして、特定の基質濃度におけるＬ−ピペコリン酸からヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を１００％として、同じ基質濃度におけるＬ−プロリンからヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する活性（相対値）を算出する。
本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素は、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物のヒドロキシ−Ｌ−プロリンを生成する活性が、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する活性を１００％した場合の通常５５％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３５％以下、特に好ましくは２０％以下、最も好ましくは０％である。
【００３８】
本発明で使用するＬ−ピペコリン酸水酸化酵素（以下、「本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素」と称することがある。）は、高位置選択性及び高立体選択性で、Ｌ−ピペコリン酸を水酸化することができるので、高効率で、光学純度の高いヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を得ることができる。
【００３９】
本発明のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法においては、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素を直接反応に使用してもよいが、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を反応に使用してもよい。
本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞は、内在的に前記生産能力を有する微生物若しくは細胞であってもよいし、育種により前記生産能力を付与した微生物若しくは細胞であってもよい。また、生きている微生物や細胞に限られず、生体としては死んでいるが酵素能力を有するものも含まれる。
また、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞の種類としては、「宿主微生物」又は「宿主細胞」として後述するものが挙げられる。
【００４０】
育種により前記生産能力を付与する手段としては、遺伝子組換え処理（形質転換）や変異処理等、公知の方法を採用することができる。形質転換の方法としては、目的とするＤＮＡを導入する方法、染色体上でプロモーター等の発現調節配列を改変して目的とするＤＮＡの発現を強化する方法等が挙げられる。
これらのうち、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡで形質転換された微生物若しくは細胞を用いることが好ましい。
【００４１】
例えば、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡを公知の発現ベクターに発現可能に挿入して、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素発現ベクターを構築し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換体を作製することができる。
また、該形質転換体は、宿主細胞の染色体に本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡを相同組み換え等の手法により発現可能に組み込むことによっても作製することができる。
【００４２】
形質転換体作製のための手順、宿主に適合した組換えベクターの構築及び宿主の培養方法は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術（例えば、前述のMolecular Cloningに記載の方法）に準じて行うことができる。
【００４３】
形質転換体の作製方法としては、例えば、宿主細胞中に安定に存在するプラスミドベクター、ファージベクター又はウイルスベクター中に、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素をコードするＤＮＡを導入し、構築された発現ベクターを該宿主細胞中に導入する、又は直接宿主ゲノム中に該ＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる方法が挙げられる。
このとき、宿主において、適当なプロモーターをＤＮＡの５'−側上流に連結させることが好ましく、さらに、ターミネーターを３'−側下流に連結させることがより好ましい。このようなプロモーター及びターミネーターとしては、宿主中で機能することが知られているプロモーター及びターミネーターであれば使用することができ、特に限定されない。例えば、「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」に記載されている、ベクター、プロモーター及びターミネーターを使用することができる。
【００４４】
形質転換の対象となる宿主微生物若しくは宿主細胞としては、宿主自体がＬ−ピペコリン酸の反応に悪影響を与えない限り特に限定されることはない。
宿主微生物としては、例えば、大腸菌（エシェリヒア属細菌）、バチルス属細菌、シュードモナス属細菌、コリネ型細菌、根粒菌、ラクトバチルス属細菌、ブレビバチルス属細菌、アナエロビオスピリラム属細菌、アクチノバチルス属細菌、放線菌等の原核生物、酵母、糸状菌等の菌類、植物、動物等の真核生物が挙げられる。中でも、好ましくは、大腸菌、酵母、コリネ型細菌であり、特に好ましくは大腸菌である。
【００４５】
宿主微生物としては、例えば以下に示すような微生物を挙げることができる。
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アナエロビオスピリラム（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、等に属する宿主ベクター系の確立されている細菌。
【００４６】
ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等に属する宿主ベクター系の確立されている放線菌。
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する宿主ベクター系の確立されている酵母。
【００４７】
ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する宿主ベクター系の確立されている菌類。
【００４８】
以下に、好ましい宿主微生物、該微生物における好ましい形質転換の手法、ベクター、プロモーター、ターミネーターを例示するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００４９】
エシェリヒア属、特にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、プラスミドベクターとしては、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミド等が挙げられ、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲ、Ｔ７ファージ等に由来するプロモーター等が挙げられる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーター等が挙げられる。これらのプロモーターのうち、発現効率を向上させる目的で、遺伝子発現を誘導可能なプロモーターを使用することもできる。例えば、上記ｌａｃプロモーターの場合には、ラクトースやイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等の誘導発現物質を添加することにより遺伝子発現を誘導することができる。
【００５０】
バチルス属においては、ベクターとしては、ｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミド等を挙げることができ、また、染色体に組み込むこともできる。プロモーター及びターミネーターとしては、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、α−アミラーゼ等の酵素遺伝子のプロモーターやターミネーター等が利用できる。
【００５１】
シュードモナス属においては、ベクターとしては、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）等で確立されている一般的な宿主ベクター系や、トルエン化合物の分解に関与するプラスミド、ＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０（Ｇｅｎｅ，２６，２７３−８２（１９８３））等を挙げることができる。
【００５２】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＡＪ４３（Ｇｅｎｅ ３９，２８１（１９８５））等のプラスミドベクターを挙げることができる。プロモーター及びターミネーターとしては、大腸菌で使用されている各種プロモーター及びターミネーターが利用可能である。
【００５３】
コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）においては、ベクターとしては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＢ１０１（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９６，１７５（１９８４））等のプラスミドベクターが挙げられる。
【００５４】
サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、特にサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、ベクターとしては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミド等が挙げられる。また、アルコール脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、酸性フォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、エノラーゼといった各種酵素遺伝子のプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００５５】
シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属においては、ベクターとしては、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６，８０（１９８６）に記載のシゾサッカロマイセス・ポンベ由来のプラスミドベクター等を挙げることができる。特に、ｐＡＵＲ２２４は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００５６】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリジー （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体への組み込みが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Ｔｒｅｎｄｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２８３−２８７（１９８９））。
【００５７】
また、宿主細胞としては、例えば、昆虫（例えば、蚕）等の動物（Ｎａｔｕｒｅ ３１５，５９２−５９４（１９８５））；菜種、トウモロコシ、ジャガイモ等の植物が挙げられる。また、大腸菌無細胞抽出液や小麦胚芽等の無細胞タンパク質も使用することができる。合成系を用いた系が確立されており、好適に利用できる。
また、前記したもの以外にも、様々な宿主・ベクター系が確立されており、それらを適宜使用することができる。
【００５８】
本明細書において、「Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞の処理物」とは、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞を培養し、当該生物若しくは細胞を、１）有機溶媒や界面活性剤等により処理したもの、２）凍結乾燥したもの、３）担体などに固定化したもの、４）物理的又は酵素的に破壊したもの、又は５）前述１）〜４）の処理物から酵素画分を粗精製物又は精製物として取り出したものを意味する。
【００５９】
有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等が挙げられる。
界面活性剤としては、例えば、非イオン性界面活性剤であるＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｂｒｉｊｉ ３５、Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｏｃｔｙｌ−β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、両イオン性界面活性剤である３−（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｅｐｒｏｐｙｌ） ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ（ＣＨＡＰＳ）、陰イオン性界面活性剤であるＳｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｐｈａｔｅ（ＳＤＳ）等が挙げられる。
【００６０】
担体等への固定化の具体例としては、該微生物若しくは細胞中の酵素画分をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル、イオン交換樹脂等に代表される担体に固定化する手法等が挙げられる。
物理的な破壊方法例としては、超音波処理や、フレンチプレスによる高圧処理、ホモジナイザー、ダイノミル等を用いた機械的摩砕処理等が挙げられる。
酵素的な破壊方法例としては、リゾチウム等の細胞壁溶解活性をもつ酵素によって処理する方法が挙げられる。
【００６１】
酵素精製の取出し方法としては通常の酵素の単離精製方法を用いることができる。例えば、前述の手法等により得られた抽出液から、遠心分離、限外濾過、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、各種樹脂を用いたクロマトグラフィー法（陰イオン交換クロマトグラフィー法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法）、そして等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用いることで精製物を得ることができる。
【００６２】
本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液としては、例えば、該微生物若しくは細胞と液体培地との懸濁液、該微生物若しくは細胞が分泌発現型微生物又は細胞である場合は該微生物若しくは細胞を遠心分離等で除去した上清やその濃縮物等が挙げられる。
【００６３】
本明細書において、「Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液」とは、１）微生物若しくは細胞の培養液、２）微生物若しくは細胞の培養液を有機溶媒や界面活性剤等により処理した培養液、３）微生物若しくは細胞の細胞膜を物理的に又は酵素的に破砕してある培養液を意味する。
有機溶媒、界面活性剤、物理的又は酵素的な破砕方法としては、前述に記載の資材や手法を用いることができる。
【００６４】
本発明のヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法は、２−オキソグルタル酸及び２価の鉄イオンの存在下で、基質であるＬ−ピペコリン酸に、前記Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液を作用させて、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成させることを特徴とする。
【００６５】
本発明においては、基質であるＬ−ピペコリン酸としては、純粋なＬ−ピペコリン酸を使用することができるが、Ｌ−プロリンを微量含むものであってもよい。Ｌ−プロリンの含有量は、通常１０％（ｗ／ｗ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｗ）以下、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｗ）以下である。
【００６６】
また、基質であるＬ−ピペコリン酸としては、市販のＬ−ピペコリン酸を使用することができるが、酵素・菌体等を用いて生物学的な方法により製造されたものを使用することもできる。生物学的な方法により製造されたＬ−ピペコリン酸には、例えば、酵素・菌体の調製時に使用した培地等からの持ち込み成分としてＬ−プロリンが混入する場合があるが、本発明においてはＬ−ピペコリン酸は上記含有量のＬ−プロリンが混入しているものでもよい。
【００６７】
Ｌ−ピペコリン酸を生物学的な方法により製造する方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
（ｉ）Ｌ−リジン及び／又はＤＬ−リジンに、
（ｉ−１）Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素を反応させて、又は
（ｉ−２）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素とアミノ酸ラセマーゼとを反応させて、
３，４，５，６−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸を生成させた後、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを作用させてＬ−ピペコリン酸を製造する。
【００６８】
（ｉｉ）Ｌ−リジンに、Ｌ−リジン ６−オキシダーゼ、Ｌ−リジン ６−デヒドロゲナーゼ及びＬ−リジン ６−アミノトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素を反応させて２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸を生成させた後、ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼと作用させてＬ−ピペコリン酸を製造する。
【００６９】
（ｉｉｉ）Ｌ−リジンに、リジンシクロデアミナーゼを作用させてＬ−ピペコリン酸を製造する。
【００７０】
本発明におけるＬ−ピペコリン酸を製造する第１の方法は、以下に示すとおりである。
（ｉ）Ｌ−リジン及び／又はＤＬ−リジンに、
（ｉ−１）Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素を反応させて、又は
（ｉ−２）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素とアミノ酸ラセマーゼとを反応させて、
３，４，５，６−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸を生成させた後、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼを作用させることを特徴とするＬ−ピペコリン酸の製造方法。
以下、スキームを例示して説明する。
【００７１】
【化１】
2017057730.tif 000002
【００７２】
スキーム（ｉ−１）は、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素とＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＭＡＡＤＨ）を使用する場合である。
【００７３】
まず、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる酵素により、化合物（ａ）（Ｌ−リジン）を化合物（ｂ）に変換する。化合物（ｂ）は、自発的に化合物（ｃ）（３，４，５，６−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸）に変換される。そして、化合物（ｃ）は、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＭＡＡＤＨ、別名ＤｐｋＡ）により、化合物（ｄ）（Ｌ−ピペコリン酸）に変換される。
【００７４】
ここで、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼとしては、Ｌ−リジンの２位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、J. Biochem., 2015, 157 (4), pp.201に記載されているタンパク質、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００７５】
Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼとしては、Ｌ−リジンの２位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Nature, 1966, 211, pp.854に記載されているタンパク質、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００７６】
Ｌ−アミノ酸トランスフェラーゼ（Ｌ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）としてはＬ−リジンの２位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Eur. J. Biochem., 1998, 254, pp.347に記載されているアミノ酸配列を含むタンパク質、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００７７】
Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼとしては、３，４，５，６−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸をＬ−ピペコリン酸に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、J. Biol. Chem. 2005, 280(49), pp.40875に記載されているＤｐｋＡ、又はＤｐｋＡと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００７８】
【化２】
2017057730.tif 000003
【００７９】
スキーム（ｉ−２）は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素、アミノ酸ラセマーゼ、及びＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＭＡＡＤＨ）を使用する場合である。
【００８０】
まず、アミノ酸ラセマーゼにより、化合物（ａ）（Ｌ−リジン）をＤ体の化合物（ａ'）（Ｄ−リジン）に変換し、これをＤ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる酵素により、化合物（ｂ）に変換する。化合物（ｂ）は、自発的に化合物（ｃ）に変換される。そして、化合物（ｃ）は、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＭＡＡＤＨ）により、化合物（ｄ）（Ｌ−ピペコリン酸）に変換される。
【００８１】
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとしては、Ｄ−リジンの２位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Biochemistry, 2005, 70, pp.40に記載されているアミノ酸配列を含むタンパク質、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００８２】
Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼは、Ｄ−リジンの２位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Microbiology, 2010, 156(Pt 1), pp.60及びProc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2009, 106, pp.906に記載されているＤａｕＡ、又はＤａｕＡと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００８３】
Ｄ−アミノ酸トランスフェラーゼ（Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）は、Ｄ−リジンの２位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Protein Eng, 1998, 11, pp.53に記載されているＤ−ＡＡＴ、又はＤ−ＡＡＴと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００８４】
アミノ酸ラセマーゼ（ＬｙｓＲ）としては、Ｌ−リジンをＤ−リジンに変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015, 99, pp.5045に記載されているＬｙｓＲ、又はＬｙｓＲと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００８５】
Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼとしては、３，４，５，６−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸をＬ−ピペコリン酸に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、J. Biol. Chem. 2005, 280(49), pp.40875に記載されているＤｐｋＡ、又はＤｐｋＡと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００８６】
スキーム（ｉ−１）及び（ｉ−２）の反応は、各酵素反応を別々に行ってもよいが、同一反応系で連続的に行うことが好ましい。
同一反応系で連続的に行う場合は、Ｌ−リジン、並びに各酵素をコードする遺伝子群で形質転換された細胞、該形質転換体の調製物及び／又は該形質転換体を培養して得られた培養液を含有する水性媒体中、あるいは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行うことが好ましい。
なお、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＭＡＡＤＨ）は、補酵素としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈが必要であるため、ＮＭＡＡＨの反応で生じるＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに再生する系を共存させることが好ましい。
再生方法としては、１）宿主微生物自体のＮＡＤ（Ｐ）+還元能を利用する方法、２）ＮＡＤ（Ｐ）+からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する能力を有する微生物やその調製物、又は、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素もしくは有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素（再生酵素類）を反応系内に添加する方法、３）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に利用可能な酵素である上記再生酵素類の遺伝子を本発明のＤＮＡとともに宿主に導入する方法等が挙げられる。
このうち、上記１）の再生方法においては、反応系にグルコース、エタノール、ギ酸などの化合物を添加することが好ましい。これにより、これらの化合物を宿主に代謝させ、その過程で生じるＮＡＤ（Ｐ）Ｈを反応に使用させることができる。
上記２）の再生方法においては、再生酵素類として、当該再生酵素類を含む微生物、該微生物菌体をアセトン処理したもの、凍結乾燥処理したもの、及び物理的又は酵素的に破砕したもの等の菌体調製物を用いてもよい。また、菌体調製物から該酵素画分を粗精製物あるいは精製物として取り出したものや、それらをポリアクリルアミドゲル又はカラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いてもよい。さらに、市販の酵素を用いてもよい。
上記２）及び３）の再生方法においては、補酵素還元能を発揮させるために、再生酵素の基質となる化合物を添加することが好ましい。例えば、グルコースデヒドロゲナーゼを利用する場合はグルコース、ギ酸デヒドロゲナーゼを利用する場合はギ酸、アルコールデヒドロゲナーゼを利用する場合はエタノール又はイソプロパノールなどを添加することが好ましい。
【００８７】
各反応を触媒する酵素を含む細胞は、本来的にこれらの酵素を有する微生物を用いてもよいが、各酵素をコードするＤＮＡで形質転換された細胞を用いることが好ましい。スキーム（ｉ−１）の場合は、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＬ−アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素及びＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＭＡＡＤＨ）をそれぞれコードするＤＮＡで形質転換された細胞を用いることが好ましい。また、スキーム（ｉ−２）の場合は、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ及びＤ−アミノ酸トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素、アミノ酸ラセマーゼ及びＮ−メチル−Ｌ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＭＡＡＤＨ）をそれぞれコードするＤＮＡで形質転換された細胞を用いることが好ましい。
【００８８】
また、これらのＤＮＡはそれぞれ染色体に組み込まれてもよいし、単一のベクター中にこれらのＤＮＡを導入して宿主を形質転換してもよいし、これらのＤＮＡをそれぞれ別個にベクターに導入した後に宿主を形質転換してもよい。
なお、微生物等の宿主細胞の形質転換方法、宿主の種類等は、前記したＬ−ピペコリン酸水酸化酵素の場合と同様である。
【００８９】
本発明のＬ−リジンからＬ−ピペコリン酸を製造する第２の方法は、以下に示すとおりである。
（ｉｉ）Ｌ−リジンに、Ｌ−リジン ６−オキシダーゼ、Ｌ−リジン ６−デヒドロゲナーゼ及びＬ−リジン ６−アミノトランスフェラーゼよりなる群から選ばれる１以上の酵素を反応させて、２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸を生成させた後、ピロリン−５−カルボン酸レダクターゼと作用させることを特徴とするＬ−ピペコリン酸の製造方法。
以下、スキームを例示して説明する。
【００９０】
【化３】
2017057730.tif 000004
【００９１】
まず、Ｌ−リジン ６−オキシダーゼ、Ｌ−リジン ６−デヒドロゲナーゼ及びＬ−リジン ６−トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素により、化合物（ａ）（Ｌ−リジン）を化合物（ｂ'）に変換する。化合物（ｂ'）は、自発的に化合物（ｃ'） （２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸）に変換される。そして、化合物（ｃ'）は、ピロリン−５−カルボン酸（Ｐ５ｃ）レダクターゼにより化合物（ｄ）（Ｌ−ピペコリン酸）に変換される。
【００９２】
Ｌ−リジン ６−オキシダーゼは、Ｌ−リジンの６位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Biochim. Biophys. Acta.,2006, 1764 pp.1577に記載されているＬｏｄＡ、又はＬｏｄＡと８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００９３】
Ｌ−リジン ６−デヒドロゲナーゼは、Ｌ−リジンの６位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、J. Biochem., 105, pp.1002-1008 (1989)に記載されているアミノ酸配列を含むタンパク質、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００９４】
Ｌ−リジン ６−トランスフェラーゼ（リジン−６−アミノトランスフェラーゼ）は、ヒドロキシ−Ｌ−リジンの６位のアミノ基をオキソ基に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、国際公開公報ＷＯ２００１／０４８２１６号に記載されているアミノ酸配列を含むタンパク質、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００９５】
ピロリン−５−カルボン酸（Ｐ５Ｃ）レダクターゼは、２，３，４，５−テトラヒドロピリジン−２−カルボン酸をＬ−ピペコリン酸に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、国際公開公報ＷＯ２００１／０４８２１６号に記載されているアミノ酸配列を含むタンパク質、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【００９６】
ピペコリン酸の製造方法（ｉｉ）の反応は、各酵素反応を別々に行ってもよいが、同一反応系で連続的に行うことが好ましい。特に、各反応を触媒する酵素を含む細胞をＬ−リジンと反応させることにより行うことが好ましい。各反応を触媒する酵素を含む細胞は、本来的にこれらの酵素を有する細胞を用いてもよいが、各酵素をコードするＤＮＡで形質転換された細胞を用いることが好ましく、具体的には、Ｌ−リジン ６−オキシダーゼ、Ｌ−リジン ６−デヒドロゲナーゼ及びＬ−リジン ６−トランスフェラーゼよりなる群から選ばれる少なくとも一種の酵素とピロリン−５−カルボン酸（Ｐ５Ｃ）レダクターゼをそれぞれコードするＤＮＡで形質転換された細胞を用いることが好ましい。
なお、微生物等の宿主細胞の形質転換方法、宿主の種類等は、前記したＬ−ピペコリン酸水酸化酵素の場合と同様である。
【００９７】
第２の方法（ｉｉ）を同一反応系で連続的に行う場合は、Ｌ−リジン、各酵素をコードする遺伝子群で形質転換された細胞、該形質転換体の調製物及び／又は該形質転換体を培養して得られた培養液を含有する水性媒体中、あるいは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行うことが好ましい。
【００９８】
本発明のＬ−リジンからＬ−ピペコリン酸を製造する第３の方法は以下に示すとおりである。
（ｉｉｉ）Ｌ−リジンに、リジンシクロデアミナーゼを作用させることを特徴とするＬ−ピペコリン酸の製造方法。
【００９９】
リジンシクロデアミナーゼは、Ｌ−リジンをＬ−ピペコリン酸に変換する反応を触媒しうるものであれば特に制限されないが、例えば、Biochimie 2007, 89, pp.591に記載されているアミノ酸配列を含むタンパク質、又は該アミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、該活性を保持するタンパク質が挙げられる。
【０１００】
リジンシクロデアミナーゼによる反応は、リジンシクロデアミナーゼを含む細胞をＬ−リジンと反応させることにより行うことが好ましい。リジンシクロデアミナーゼを含む微生物は本来的にこれらの酵素を有する細胞を用いてもよいが、リジンシクロデアミナーゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞を用いることが好ましい。
なお、微生物等の宿主細胞の形質転換方法、宿主の種類等は、前記したＬ−リジン水酸化酵素の場合と同様である。
【０１０１】
リジンシクロデアミナーゼによるＬ−リジンのＬ−ピペコリン酸への変換反応を行う場合は、Ｌ−リジン、リジンシクロデアミナーゼをコードするＤＮＡで形質転換された細胞、該形質転換体の調製物及び／又は該形質転換体を培養して得られた培養液を含有する水性媒体中、あるいは該水性媒体と有機溶媒との混合物中で行うことが好ましい。
【０１０２】
本発明においては、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液が、Ｌ−プロリンを含有していてもよい。この場合、Ｌ−プロリンの含有量は、１０％（ｗ／ｗ）以下、好ましくは１％（ｗ／ｗ）以下、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｗ）以下である。
【０１０３】
また、Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞が、培養液又は反応系中の成分を原料としてＬ−プロリンを生産する能力を有する微生物若しくは細胞であってもよい。
【０１０４】
また、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を製造する際は、溶媒を使用することができる。溶媒としては、特に限定されないが、水性溶媒中、又は水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒中で行うことが好ましい。
水性媒体としては、例えば、水又は緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が挙げられる。
また、水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒に用いる有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等、反応基質の溶解度が高いものを使用することができ、また、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン等、反応副産物の除去等に効果のあるものを使用することもできる。
【０１０５】
溶媒の量は、特に限定されないが、基質であるＬ−ピペコリン酸に対して、通常０．０１％ｗ／ｖ〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖである。
【０１０６】
反応系中における、基質であるＬ−ピペコリン酸の濃度は、通常０．０１％ｗ／ｖ〜９０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１％ｗ／ｖ〜３０％ｗ／ｖの範囲である。Ｌ−ピペコリン酸は、反応開始時に一括して反応系に添加してもよいが、酵素の基質阻害があった場合の影響を低減する、生成物の蓄積濃度を向上させる等の観点から、反応系に連続的又は間欠的に添加することが望ましい。
【０１０７】
２−オキソグルタル酸の量は、基質であるＬ−ピペコリン酸と等モル又はそれ以上、好ましくは等モル〜１．２倍モルの範囲で添加する。２−オキソグルタル酸は、反応開始時に一括して反応系添加してもよいが、酵素への阻害作用があった場合の影響を低減する、生成物の蓄積濃度を向上させる等の観点から、反応系に連続的又は間欠的に添加することが望ましい。
【０１０８】
また、２−オキソグルタル酸の代わりに、宿主が代謝可能なグルコース等の安価な化合物を反応系に添加し、宿主に代謝させ、その過程で生じる２−オキソグルタル酸を反応系に存在させてもよい。
【０１０９】
反応系中の２価の鉄イオンの濃度は、通常、Ｌ−ピペコリン酸１モルに対し０．０００１モル〜０．５モル、好ましくは０．００１モル〜０．１モルである。
【０１１０】
２価の鉄イオンは、通常、硫酸鉄、塩化鉄、クエン酸鉄等として、反応開始時に一括して反応系に添加することができるが、反応中に、添加した２価の鉄イオンが３価に酸化されたり、沈殿を形成して減少してしまったりした場合には、所望の濃度になるように追添加することも効果的である。
【０１１１】
また、本発明のＬ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液自体に既に所望の濃度の２価の鉄イオンが含まれている場合は、必ずしも鉄イオンを添加しなくてもよい。
【０１１２】
反応は、通常４℃〜６０℃、好ましくは１５℃〜４５℃、特に好ましくは２０℃〜４０℃の反応温度で、通常ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜８で行われる。反応時間は、通常１時間〜１５０時間程度である。
【０１１３】
Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素、該酵素を生産する能力を有する微生物若しくは細胞、該微生物若しくは細胞の処理物、及び／又は該微生物若しくは細胞を培養して得られた該酵素を含む培養液の量は、例えば、微生物若しくは細胞を用いる場合は、反応系中の微生物若しくは細胞の濃度が、湿菌体重で、通常、０．１％ｗ／ｖ〜５０％ｗ／ｖ、好ましくは１％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖである。また、該処理物や培養液を用いる場合には、酵素の比能力を求め、反応系中の微生物若しくは細胞の濃度が前記濃度になるように使用する。
【０１１４】
生成したヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、反応終了後、反応系中の菌体やタンパク質等を遠心分離、膜処理等により分離した後に、１−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等の有機溶媒による抽出；蒸留；イオン交換樹脂、シリカゲル等を用いたカラムクロマトグラフィー；等電点における晶析；一塩酸塩、二塩酸塩、カルシウム塩等による晶析等を適宜組み合わせることにより精製を行うことができる。
【実施例】
【０１１５】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【０１１６】
＜実施例１＞Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素遺伝子のクローニング
ミクロモノスポラ・チョコリエンシス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｈｏｋｏｒｉｅｎｓｉｓ）株由来のアスパルチルベータ水酸化酵素（ａｓｐａｒｔｙｌ ｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）としてアノテーションされているアミノ酸水酸化酵素ＭｃＰＨ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＷＰ＿０３０４８７０８９、配列番号２）をコードする遺伝子を、大腸菌発現用にコドン最適化された遺伝子配列（ｍｃｐｈ＿ＯＥ、配列番号１）として人工合成した。遺伝子はｐＪＥｘｐｒｅｓｓ４１１（ＤＮＡ２．０）に挿入されたプラスミドｐＪ４１１ＭｃＰＨとして構築された。【０１１７】
同様に、Ｌ−ピペコリン酸５位水酸化活性を示す酵素遺伝子４種のクローニングを実施した。
セグニリパラス・ルゴサス（Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓ ｒｕｇｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９７４ 株由来のＬ−ピペコリン酸 ｃｉｓ‐５−ヒドロキシラーゼＳｒｕＰＨ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＥＦＶ１２５１７、配列番号４）、カテヌリスポラ・アシジフィラ（Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａ ａｃｉｄｉｐｈｉｌａ）ＮＢＲＣ１０２１０８株由来のＬ−プロリン  ｃｉｓ−４−ヒドロキシラーゼＣａＰＨ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＷＰ＿０１２７８７６４０、配列番号６）、及びキセノラブダス・ドーセティエ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｄｏｕｃｅｔｉａｅ）ＦＲＭ１６株由来のＬ−プロリン  ｃｉｓ−４−ヒドロキシラーゼＸｄＰＨ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＣＤＧ１６６３９、配列番号８）をコードする、大腸菌発現用にコドン最適化された遺伝子配列であるｓｒｕｐｈ＿ＯＥ（配列番号３）、ｃａｐｈ＿ＯＥ（配列番号５）、及びｘｄｐｈ＿ＯＥ（配列番号７）を人工合成した。
それぞれｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４１１（ＤＮＡ２．０社製）に挿入されたプラスミドとして得られ、ｐＪ４１１ＳｒｕＰＨ、ｐＪ４１１ＣａＰＨ、及びｐＪ４１１ＸｄＰＨと命名した。【０１１８】
シノメゾビウム・メリロチ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１株由来のＬ−プロリン  ｃｉｓ−４−ヒドロキシラーゼＳｍＰＨ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＣＡＣ４７６８６、配列番号１０）をコードする、大腸菌発現用にコドン最適化された遺伝子配列であるｓｍｐｈ＿ＯＥ（配列番号９）を人工合成し、ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０１に挿入されたプラスミドｐＪ４０１ＳｍＰＨを作製した。ｓｍｐｈ＿ＯＥに対してはプライマーｓｍｐｈ＿ｆ（配列番号２１）とｓｍｐｈ＿ｒ（配列番号２２）を合成し、それらを用いてプラスミドＤＮＡを鋳型として常法に従ってＰＣＲ反応を行い、約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化したｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に常法に従ってライゲーションすることで、ｐＥＴ２４ＳｍＰＨを得た。
コルディア・チェジュドネンシス（Ｋｏｒｄｉａ  ｊｅｊｕｄｏｎｅｎｓｉｓ）株由来の推定上のタンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）としてアノテーションされているアミノ酸水酸化酵素ＫｊＰＨ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＷＰ＿０４６７５８３７２、配列番号１８）をコードする遺伝子を、大腸菌発現用にコドン最適化された遺伝子配列（ｋｊｐｈ＿ＯＥ、配列番号１７）として人工合成した。遺伝子はｐＪＥｘｐｒｅｓｓ４１１（ＤＮＡ２．０）に挿入されたプラスミドｐＪ４１１ＫｊＰＨとして構築された。【０１１９】
また、Ｌ−ピペコリン酸４位水酸化活性を示す酵素遺伝子３種のクローニングも実施した。
コレトトリカム・グロエオスポリオイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）Ｎａｒａ  ｑｃ５株由来のＬ−ピペコリン酸  ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシラーゼＣｇＰＨ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＥＬＡ３４４６０、配列番号１２）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５４−１２５５株由来のＬ−ピペコリン酸  ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシラーゼＰｃＰＨ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＸＰ＿００２５５８１７９、配列番号１４）、及びジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｚｅａｅ）ＰＨ−１株由来のＬ−ピペコリン酸  ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシラーゼＧｚＰＨ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ＸＰ＿３８３３８９、配列番号１６）の遺伝子をコードする大腸菌発現用にコドン最適化された遺伝子配列である、ｃｇｐｈ＿ＯＥ（配列番号１１）、ｐｃｐｈ＿ＯＥ（配列番号１３）、及びｇｚｐｈ＿ＯＥ（配列番号１５）を人工合成した。【０１２０】
表１に、遺伝子クローニングを実施した上記Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素について示した。【０１２１】
【表１】
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【０１２２】
＜実施例２＞Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素遺伝子発現菌体の取得
実施例１で得られた各プラスミドを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（インビトロジェン製）を常法に従い形質転換し、組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＭｃＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＳｒｕＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＣａＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＸｄＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２４ＳｍＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＣｇＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＰｃＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＧｚＰＨ、及びＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＫｊＰＨを得た。【０１２３】
導入した遺伝子を発現する菌体を得るために、各組換え大腸菌についてカナマイシン、及びｌａｃプロモーター誘導物質を含む液体ＬＢ培地を用いて、３０℃で約５時間培養し、その後さらに１８℃で約３０時間培養した後に集菌した。
得られた組換え大腸菌０．６ｍＬを遠心分離により集菌し、ｐＨが６である５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液０．５ｍＬに懸濁した。懸濁液を入れた容器を氷水中に浸して超音波破砕処理を行った後、１２，０００ｒｐｍの回転数で遠心分離した。得られた上清は、実施例３において、酵素液として用いた。【０１２４】
＜実施例３＞Ｌ−ピペコリン酸水酸化酵素のＬ−ピペコリン酸及びＬ−プロリンに対する触媒反応効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の確認
何種類かのＬ−ピペコリン酸水酸化酵素について、Ｌ−ピペコリン酸及びＬ−プロリンに対する触媒反応効率の確認を行った。
プラスチックチューブ内に、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜５０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−ピペコリン酸、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−オキソグルタル酸、１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−アスコルビン酸、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  硫酸鉄（II）、及び実施例２で得られた各酵素液を約２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度になるように添加し、得られた反応液０．２ｍＬを、３０℃で２５分間振とうさせた。その後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を０．０５ｍＬ添加して反応を停止させた。
Ｌ−プロリンを基質として用いた場合についても、上記Ｌ−ピペコリン酸の場合と同じ条件で反応を行った。【０１２５】
ついで、反応液を１−ｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−５−Ｌ−ａｌａｎｉｎａｍｉｄｅ（ＦＤＡＡ）（東京化成工業社製）を用いて、以下の方法により、各反応液中に含まれるヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸又はヒドロキシ−Ｌ−プロリンをＦＤＡＡ誘導体化した。【０１２６】
反応を停止させた反応液に、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムを０．０５ｍＬ添加して中和した。その溶液を１２，０００ｒｐｍの回転数で遠心分離して、得られた上清１５μＬに、１５μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を加えた後、さらに２０ｍｍｏｌ／ＬのＦＤＡＡアセトン溶液３０μＬを加え、４０℃で１時間保温した。その後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を１０μＬ加えて誘導体化反応を停止させ、メタノール８０μＬを加えて希釈し、それを１２，０００ｒｐｍの回転数で遠心分離して、得られた上清をＦＤＡＡ誘導体化液とした。【０１２７】
生成したヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸又はヒドロキシ−Ｌ−プロリンの量をＵＰＬＣ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ社製）により分析した。分析条件を表２〜表４に示す。
各酵素液が示した（５Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成活性又は（４Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成活性（Ｕ／ｍｇ）は、各水酸化酵素量（ｍｇ）当りのユニット（Ｕ）で定義した。ここでの１ユニットは、１分間に１μｍｏｌのヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する能力を表す。【０１２８】
【表２】
2017057730.tif 000006
【０１２９】
【表３】
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【０１３０】
【表４】
2017057730.tif 000008
【０１３１】
水酸化酵素量は以下のようにして定量した。
実施例２で得られた各酵素液を、注入する各レーン当りの総タンパク質量が５μｇずつになるように調製してポリアクリルアミド電気泳動を行った。得られた泳動図を画像解析ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｌａｂ３．０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて解析し、水酸化酵素の含有量を定量した。定量のための標準サンプルとしてＣａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用い、それを２００ｎｇ、４００ｎｇ及び６００ｎｇ供した際の各バンドのシグナル値を元に、目的の水酸化酵素のシグナル値から目的酵素の含有量を算出した。【０１３２】
酵素の触媒反応効率は、ミカエリス−メンテンの速度式に基づいて算出した。
まず、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で４点〜６点実施した各Ｌ−ピペコリン酸濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）の逆数をｘ軸に、各Ｌ−ピペコリン酸濃度における各水酸化酵素量（ｍｇ）あたりのヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成活性（Ｕ／ｍｇ）の逆数をｙ軸にプロットした（図１）。図１においては、ｘ軸との切片の逆数に−１を掛けた数値がｋｍ（ｍｍｏｌ／Ｌ）を示し、ｙ軸との切片の逆数が最大速度であるＶｍａｘ（Ｕ／ｍｇ）を示すことが知られている。
酵素１分子あたりの触媒能ｋｃａｔはＶｍａｘと酵素の分子量から算出できる。得られたｋｃａｔとｋｍから酵素の触媒能の指標となる触媒反応効率（ｋｃａｔ／ｋｍ）を算出した結果を表５に示す。【０１３３】
Ｌ−プロリンを基質として用いた場合、水酸化酵素ＣａＰＨを用いた反応液からは、多量のヒドロキシ−Ｌ−プロリンが検出された。また、水酸化酵素ＳｒｕＰＨ、ＸｄＰＨ、ＳｍＰＨ、及びＫｊＰＨの反応液からは、少量のヒドロキシ−Ｌ−プロリンが検出された。一方、水酸化酵素ＭｃＰＨの反応液からは、ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは検出されなかった。このことから、ＭｃＰＨは、プロリンへの反応性が極めて低い５−ヒドロキシピペコリン酸生成活性を持つ新規な酵素であると考えられる。この性質は公知の情報からは推測しがたいものである。【０１３４】
また、水酸化酵素ＣｇＰＨ、ＰｃＰＨ、ＧｚＰＨの反応液からも、ヒドロキシ−Ｌ−プロリンは検出されなかった。このことから、これらの水酸化酵素は、プロリンへの反応性が極めて低い４−ヒドロキシピペコリン酸生成活性を持つ新規な酵素であることが分かった。この性質は公知の情報からは推測しがたいものである。【０１３５】
【表５】
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【０１３６】
＜実施例４＞Ｌ−ピペコリン酸５位水酸化酵素の反応性の比較
Ｌ−ピペコリン酸５位水酸化酵素について、Ｌ−プロリンとＬ−ピペコリン酸に対する反応性の比較を行った。
プラスチックチューブ内に、１０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−ピペコリン酸又は１０ｍｍｏｌ／ＬのＬ−プロリン、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−オキソグルタル酸、１ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−アスコルビン酸、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ  硫酸鉄、及び実施例２で得られた各酵素液を約２ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度になるように添加し、得られた反応液０．２ｍＬを、３０℃で３０分間振とうした。生成したヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸及びヒドロキシ−Ｌ−プロリンの量を、実施例３と同様にしてＦＤＡＡ誘導体化法によって定量した。生成物の検出は、波長３４０ｎｍの吸収を指標にした。【０１３７】
反応液をＦＤＡＡ誘導体化した溶液をＬＣ分析したクロマトグラムを図２に示す。活性値は総タンパク質量当りの生成物量（Ｕ／ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）として評価し、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成活性を１００（％）とした場合の、ヒドロキシ−Ｌ−プロリン生成活性（相対活性）を表６に示す。【０１３８】
図２及び表６から明らかなように、水酸化酵素ＣａＰＨの反応液からは、多量のヒドロキシ−Ｌ−プロリンが検出された。また、水酸化酵素ＳｒｕＰＨ、ＸｄＰＨ及びＳｍＰＨの反応液からは、少量のヒドロキシ−Ｌ−プロリンが検出された。水酸化酵素ＭｃＰＨの反応液からはヒドロキシ−Ｌ−プロリンは検出されなかった。
このことからＭｃＰＨはプロリンへの反応性が極めて低く、且つ、高い５−ヒドロキシピペコリン酸生成活性を持つ新規な酵素であると考えられる。この性質は公知の情報からは推測しがたいものである。【０１３９】
また、水酸化酵素ＳｒｕＰＨ、ＸｄＰＨ及びＳｍＰＨは、プロリンへの反応性が低く、且つ、高い５−ヒドロキシピペコリン酸生成活性を持つ酵素であることが分かった。この性質は公知の情報からは推測しがたいものである。【０１４０】
【表６】
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【０１４１】
＜実施例５＞ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造
実施例２で得られた８種の組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＭｃＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＳｒｕＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＣａＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＸｄＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２４ＳｍＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＣｇＰＨ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＰｃＰＨ及びＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＪ４１１ＧｚＰＨを、カナマイシン硫酸塩（２５μｇ／ｍＬ）を含む種培養用Ｍ９液体培地（３３．９ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１５ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、２．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、５ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、１０ｇ／Ｌカザミノ酸、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸鉄、４ｇ／Ｌグルコース、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム）に接種し、３０℃で２４時間、２００ｒｐｍの条件で振とう培養した。【０１４２】
この培養液４０μＬをカナマイシン硫酸塩（２５μｇ／ｍＬ）とＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（メルク社）を含む本培養用Ｍ９液体培地（５０．９ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4、２２．５ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、３．８ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、７．５ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、１０ｇ／Ｌカザミノ酸、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸鉄、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−ピペコリン酸、１２．５ｇ／Ｌグリセロール）に添加した後、３０℃で１２０時間、２００ｒｐｍの条件で振とう培養した。【０１４３】
培養開始後４８時間、６４時間及び１２０時間において、培養液の遠心上清を回収して、分析用サンプルとし、ＬＣ分析及びＭＳ分析を行った。【０１４４】
分析用サンプルは、ＦＤＡＡ（東京化成工業社製）を用いて以下の方法によりＦＤＡＡ化した。
分析用サンプル液の遠心上清３μＬに、２７μＬの０．５ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ９）を加えた後、２０ｍｍｏｌ／ＬのＦＤＡＡアセトン溶液３０μＬを加え、４０℃で１時間保温した。その後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を１０μＬ加えて反応を停止させ、メタノール８０μＬを加えて希釈し、それを１２，０００ｒｐｍの回転数で遠心分離し、得られた上清をＦＤＡＡ化液とした。
得られたＦＤＡＡ化液を、表２に記載のＬＣ／ＭＳの条件で、ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸及びヒドロキシ−Ｌ−プロリンの量を分析した。得られた結果を図３及び図４に示す。【０１４５】
図３及び表７は、（５Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成酵素を用いた場合の生産性に関する結果である。図３は、（５Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の蓄積量の経時変化を示した図である。表７は、１２０時間後の各成分の蓄積量を確認した結果である。１２０時間の培養により、水酸化酵素ＳｒｕＰＨとＭｃＰＨはほとんどの基質を（５Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換できたことが分かる。【０１４６】
【表７】
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【０１４７】
実施例３においてプロリンへの反応性が確認された水酸化酵素ＳｒｕＰＨ、ＸｄＰＨ及びＳｍＰＨは、（４Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの蓄積が確認された。ＭｃＰＨは、（４Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの蓄積は確認されなかった。水酸化酵素ＣａＰＨについても（４Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの蓄積が確認されていないが、（５Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の蓄積量も少ないことから、これは、水酸化酵素ＣａＰＨの水酸化酵素としての能力が低いことに起因すると考えられる。【０１４８】
これらのことから、水酸化酵素ＭｃＰＨは、（５Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の高い生産能力があり、かつ精製時に除去が困難な（４Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン等の副生成物を蓄積させない特性を持つ、非常に実用的な水酸化酵素であると考えられる。【０１４９】
図４及び表８は、（４Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成酵素を用いた場合の生産性に関する結果である。図４は、（４Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の蓄積量の経時変化を示した図である。表８は、６４時間後の各成分の蓄積量を確認した結果である。６４時間の培養により、水酸化酵素ＣｇＰＨ、ＰｃＰＨ及びＧｚＰＨは大部分の基質を（４Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換できたことが分かる。また、（４Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンの蓄積は確認されなかった。【０１５０】
これらのことから、水酸化酵素ＣｇＰＨ、ＰｃＰＨ及びＧｚＰＨは、（４Ｓ）−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の高い生産能力があり、かつ精製時に除去が困難な（４Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン等の副生成物を蓄積させない特性を持つ、非常に実用的な水酸化酵素であると考えられる。【０１５１】
【表８】
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【０１５２】
＜実施例６＞変異導入による水酸化酵素ＭｃＰＨ遺伝子の改変
実施例１で得たプラスミドｐＪ４１１ＭｃＰＨを鋳型として、配列表の配列番号２３に示すプライマー（H4Q-f）と配列番号２４に示すプライマー（H4Q-r）を用いて、QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit （ストラタジーン社製）によりアミノ酸番号４番目のヒスチジンをグルタミンに置換した変異体（ＭｃＰＨｍ１）をコードするプラスミドを構築した。
前述と同様に、配列番号２５に示すプライマー（F5Y-f）と配列番号２６に示すプライマー（F5Y-r）を用いて５番目のフェニルアラニンをチロシンに（ＭｃＰＨｍ２）、配列番号２７に示すプライマー（C23A-f）と配列番号２８に示すプライマー（C23A-r）を用いて２３番目のシステインをアラニンに（ＭｃＰＨｍ３）、配列番号２９に示すプライマー（C44A-f）と配列番号３０に示すプライマー（C44A-r）を用いて４４番目のシステインをアラニンに（ＭｃＰＨｍ４）、配列番号３１に示すプライマー（L97R-f）と配列番号３２に示すプライマー（L97R-r）を用いて９７番目のロイシンをアルギニンに（ＭｃＰＨｍ５）、配列番号３３に示すプライマー（V98A-f）と配列番号３４に示すプライマー（V98A-r）を用いて９８番目のバリンをアラニンに（ＭｃＰＨｍ６）、配列番号３５に示すプライマー（D116G-f）と配列番号３６に示すプライマー（D116G-r）を用いて１１６番目のアスパラギン酸をグリシンに（ＭｃＰＨｍ７）、配列番号３７に示すプライマー（C137A-f）と配列番号３８に示すプライマー（C137A-r）を用いて１３７番目のシステインをアラニンに（ＭｃＰＨｍ８）、そして、配列番号３９に示すプライマー（D282E-f）と配列番号４０に示すプライマー（D282E-r）を用いて２８２番目のアスパラギン酸をグルタミン酸に（ＭｃＰＨｍ９）それぞれ置換するように設計したプラスミドを構築した。
得られた各プラスミドを用いて、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（インビトロジェン製）を常法に従い形質転換し、各変異体を発現する組換え大腸菌を取得した。得られた組換え大腸菌から、実施例２に記載の方法に従って酵素液を調製し、実施例４に記載の方法に従って、Ｌ−ピペコリン酸５位水酸化活性を評価した。活性値は総タンパク質量当りの生成物量（Ｕ／ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ）として評価し、変異を入れていない野生型酵素（ＭｃＰＨ）の５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成活性を１００（％）とした場合の、各変異体の活性値（相対活性）を表９に示した。【０１５３】
【表９】
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【０１５４】
さらに、活性向上に有効であったＭｃＰＨｍ２、ＭｃＰＨｍ３、そしてＭｃＰＨｍ９については、各変異箇所を組合せた効果を確認した。５番目のフェニルアラニンをチロシンに、２３番目のシステインをアラニンに置換した２重変異体（ＭｃＰＨｍ１０）を発現するプラスミド、さらに２８２番目のアスパラギン酸をグルタミン酸に置換した３重変異体を発現するプラスミドを構築した。そして、前述の方法に従って組換え大腸菌を作成し、酵素液を用いて５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生成活性を評価した。その結果を表１０に示した。３重変異体であるＭｃＰＨｍ１１（配列番号２０、同アミノ酸配列をコードする遺伝子を配列番号１９に示す）は、野生型より３倍以上も高い活性を示した。【０１５５】
【表１０】
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【０１５６】
ＭｃＰＨｍ１０とＭｃＰＨｍ１１に関しては、実施例４に記載の方法に準じて、基質としてＬ−プロリンを用いた場合の水酸化活性を確認した。その結果、いずれも実質的にプロリンへの活性が０であることを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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