(57)【要約】  食道癌患者の腫瘍が食道類基底細胞癌か他の食道癌かを容易かつ正確に鑑別する方法を開発し、提供する。  被験者及び健常者又は健常者群から採取された試料中の食道類基底細胞癌マーカーの発現レベルを測定して、得られた測定値に基づいて、被験者が食道類基底細胞癌に罹患している可能性が高いと判定する食道類基底細胞癌の罹患鑑別を補助する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
食道類基底細胞癌の罹患鑑別を補助する方法であって、
被験者及び健常者又は健常者群から採取された試料において配列番号１４１〜１４５で示す塩基配列をそれぞれ含む5種の遺伝子の単位量あたりの発現レベルを測定してその測定値を得る測定工程、
前記測定工程で得られた測定値に基づいて、
被験者及び健常者又は健常者群の測定値から各遺伝子の発現比を算出し、その発現比の合算値を得る、又は
被験者及び健常者群においてそれぞれの前記測定工程で測定した全遺伝子の測定値から平均測定値を算出する
算出工程、
前記算出工程で得られた値に基づいて、
合算値がROC曲線から導かれる所定のカットオフ値を超える場合、又は
健常者群の平均測定値に対する被験者の平均測定値が統計学的に有意に大きい場合、その被験者は食道類基底細胞癌に罹患している可能性が高いと判定する判定工程
を含む前記方法。
【請求項２】
前記配列番号１４１〜１４５で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号７１〜７５で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記配列番号７１〜７５で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号１〜５で示す塩基配列からなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記測定工程において、配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子の単位量あたりに含まれる発現量をさらに測定する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号７６〜７８で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記配列番号７６〜７８で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号６〜８で示す塩基配列からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記測定工程において、配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子の単位量あたりに含まれる発現量をさらに測定する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号７９〜８３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記配列番号７９〜８３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号９〜１３で示す塩基配列からなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定工程において、配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子の単位量あたりに含まれる発現量をさらに測定する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号８４〜１４０で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記配列番号８４〜１４０で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号１４〜７０で示す塩基配列からなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子の単位量あたりの発現レベルは、該遺伝子のmRNA若しくはそのヌクレオチド断片、又は該遺伝子がコードするタンパク質又はそのペプチド断片の単位量あたりの絶対量又は相対量として測定される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記判定工程において健常者群の平均測定値に対する被験者の平均測定値が２倍以上である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号１４１〜１４５で示す塩基配列をそれぞれ含む5種の遺伝子群からなる食道類基底細胞癌マーカー。
【請求項１６】
前記5種の遺伝子がそれぞれ配列番号７１〜７５で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項１５に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
【請求項１７】
前記配列番号７１〜７５で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号１〜５で示す塩基配列からなる、請求項１６に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
【請求項１８】
配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子をさらに含む遺伝子群からなる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
【請求項１９】
前記配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号７６〜７８で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項１８に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
【請求項２０】
前記配列番号７６〜７８で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号６〜８で示す塩基配列からなる、請求項１９に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
【請求項２１】
配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子をさらに含む遺伝子群からなる、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
【請求項２２】
前記配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号７９〜８３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項２１に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
【請求項２３】
前記配列番号７９〜８３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号９〜１３で示す塩基配列からなる、請求項２２に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
【請求項２４】
配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子をさらに含む遺伝子群からなる、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
【請求項２５】
前記配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号８４〜１４０で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項２４に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
【請求項２６】
前記配列番号８４〜１４０で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号１４〜７０で示す塩基配列からなる、請求項２５に記載の食道類基底細胞癌マーカー。
【請求項２７】
配列番号１４１〜１４５で示す塩基配列からなるプローブ群を含む食道類基底細胞癌検出用試薬。
【請求項２８】
配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含む、請求項２７に記載の食道類基底細胞癌検出用試薬。
【請求項２９】
配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含む、請求項２７又は２８に記載の食道類基底細胞癌検出用試薬。
【請求項３０】
配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の食道類基底細胞癌検出用試薬。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の食道類基底細胞癌検出用試薬を含む食道類基底細胞癌検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食道類基底細胞癌マーカー、及びそれを用いた食道類基底細胞癌罹患鑑別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
類基底細胞癌（Basaloid squamous cell carcinoma: BSC）は、Wainら(非特許文献１)によって最初に報告された咽頭喉頭領域の腫瘍であり、咽頭喉頭領域以外にも、食道、肺、肛門、子宮頸部、陰茎、膀胱などでの発生が報告されている。【０００３】
食道類基底細胞癌（Basaloid squamous cell carcinoma of the esophagus：以下、本明細書では、しばしば「BSCE」と略称する）は、食道癌のうち食道扁平上皮癌と食道腺癌を除いた特殊組織型食道癌に分類される比較的稀な癌であり、食道癌全体に占める割合は、日本では1.0％〜8.7％（非特許文献２〜１１）、海外では0.4％〜11.3％と言われている(非特許文献１２〜２０)。BSCEの組織学的特徴は、中心壊死を伴う充実性胞巣、篩状偽房状、導管様配列、腺様小嚢胞様胞巣、硝子様物質の沈着、扁平上皮癌部分の併存等が指摘されているが、組織型が多様であるため、一般的には鑑別診断が困難である。特に腺様嚢胞癌、小細胞癌、低分化型扁平上皮癌、腺扁平上皮癌との正確な鑑別を要する。また、術前内視鏡的生検でのBSCE診断は、非常に困難といわれており、正診率は0〜10％に過ぎない。これまでにも、免疫染色（非特許文献３、６、１０、１２、１４、１５）やPCR（非特許文献２１又は２２）によるBSCE診断の報告がなされてきたが、いずれも特異性を示せていない。【０００４】
BSCEの予後に関しては、まだ一定の見解が得られていないが、食道扁平上皮癌よりも増殖能や細胞学的悪性度が高いといわれており、進行癌では予後不良という報告もなされている(非特許文献２３)。予後改善には、手術、放射線化学療法に加えて、新たな集学的治療法の確立が必要と考えられるが、その疾患の希少性及び術前診断の困難さから、特徴的な治療法の選択ができず、通常型扁平上皮癌に準じて行われているのが現状である。【０００５】
したがって、BSCEの術前診断精度の向上が不可欠であるが、既存の方法ではこの問題を解決できず、精度の高いBSCE診断法の確立が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wain S.L., et al., 1986, Hum Pathol 17:1158-66
【非特許文献２】Takubo K., et al., 1991, Acta Pathologica Japonica 41:59-64
【非特許文献３】Abe K., et al., 1996, American Journal of Surgical Pathology 20:453-461
【非特許文献４】Koide N., et al., 1997, Surgery Today 27:685-691
【非特許文献５】Kawahara K., et al., 2001, Report of a case. Surgery Today 31:655-659
【非特許文献６】Ohashi K., et al., 2003, Pathology Research and Practice 199:713-721
【非特許文献７】Yoshioka S., et al., 2004, Japanese Journal of Gastroenterological Surgery 37:290-295
【非特許文献８】Kobayashi Y., et al., 2009, Diseases of the Esophagus 22:231-238
【非特許文献９】Saito S., et al., 2009, Esophagus 6:177-181
【非特許文献１０】Imamhasan A., et al., 2012, Human Pathology 43:2012-2023
【非特許文献１１】Tachimori Y., et al., 2008, Esophagus 12:130-157
【非特許文献１２】Sarbia M., et al., 1997, Cancer 79:1871-1878
【非特許文献１３】Zhang X. H., et al., 1998, World Journal of Gastroenterology 4:397-403
【非特許文献１４】Cho K.J., et al., 2000, Histopathology 36:331-340
【非特許文献１５】Huang Z., et al., 2001, Chinese medical journal 114:1084-1088
【非特許文献１６】Lam K.Y., et al., 2001, Journal of Pathology 195:435-442
【非特許文献１７】Klaase J.M., et al., 2003, Annals of Surgical Oncology 10:261-267
【非特許文献１８】Li T.J., et al., 2004, Archives of Pathology and Laboratory Medicine 128:1124-1130
【非特許文献１９】Chen S.B., et al., 2012, Journal of Cancer Research and Clinical Oncology 138:1165-1171
【非特許文献２０】Zhang B.H., et al., 2013, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 14:1889-1894
【非特許文献２１】Sarbia M., et al., 1999, American Journal of Pathology 155:1027-1032
【非特許文献２２】Bellizzi A.M., et al., 2009, American Journal of Surgical Pathology 33:1608-1614
【非特許文献２３】Arai T., et al., 2011, Esophagus 8:169-177
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、食道癌患者の腫瘍がBSCEか他の食道癌かを容易かつ正確に鑑別する方法を開発し、提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために複数の食道癌患者から摘出された癌組織及び正常組織に対して網羅的遺伝子発現解析技術を用いて遺伝子発現プロファイルを取得し、BSCEとそれ以外の食道癌及び正常部位との間で発現レベルに大きく差がある70種類の遺伝子群を見出した。そして、被験者及び健常者の試料中におけるこれらの遺伝子の発現レベルを測定することによって、BSCEとその他の食道癌を容易かつ正確に鑑別できる方法を開発した。本発明は、当該知見に基づくものであって、以下を提供する。【０００９】
（１）食道類基底細胞癌の罹患鑑別を補助する方法であって、被験者及び健常者又は健常者群から採取された試料において配列番号１４１〜１４５で示す塩基配列をそれぞれ含む5種の遺伝子の単位量あたりの発現レベルを測定してその測定値を得る測定工程、前記測定工程で得られた測定値に基づいて、被験者及び健常者又は健常者群の測定値から各遺伝子の発現比を算出し、その発現比の合算値を得る、又は被験者及び健常者群においてそれぞれの前記測定工程で測定した全遺伝子の測定値から平均測定値を算出する算出工程、前記算出工程で得られた値に基づいて、合算値がROC曲線から導かれる所定のカットオフ値を超える場合、又は健常者群の平均測定値に対する被験者の平均測定値が統計学的に有意に大きい場合、その被験者は食道類基底細胞癌に罹患している可能性が高いと判定する判定工程を含む前記方法。
（２）前記配列番号１４１〜１４５で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号７１〜７５で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、（１）に記載の方法。
（３）前記配列番号７１〜７５で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号１〜５で示す塩基配列からなる、（２）に記載の方法。
（４）前記測定工程において、配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子の単位量あたりに含まれる発現量をさらに測定する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号７６〜７８で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、（４）に記載の方法。
（６）前記配列番号７６〜７８で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号６〜８で示す塩基配列からなる、（５）に記載の方法。
（７）前記測定工程において、配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子の単位量あたりに含まれる発現量をさらに測定する、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号７９〜８３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、（７）に記載の方法。
（９）前記配列番号７９〜８３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号９〜１３で示す塩基配列からなる、（８）に記載の方法。
（１０）前記測定工程において、配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子の単位量あたりに含まれる発現量をさらに測定する、（１）〜（９）のいずれかに記載の方法。【００１０】
（１１）前記配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号８４〜１４０で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、（１０）に記載の方法。
（１２）前記配列番号８４〜１４０で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号１４〜７０で示す塩基配列からなる、（１１）に記載の方法。
（１３）前記遺伝子の単位量あたりの発現レベルは、該遺伝子のmRNA若しくはそのヌクレオチド断片、又は該遺伝子がコードするタンパク質又はそのペプチド断片の単位量あたりの絶対量又は相対量として測定される、（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）前記判定工程において健常者群の平均測定値に対する被験者の平均測定値が２倍以上である、（１）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）配列番号１４１〜１４５で示す塩基配列をそれぞれ含む5種の遺伝子群からなるBSCEマーカー。
（１６）前記5種の遺伝子がそれぞれ配列番号７１〜７５で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、（１５）に記載のBSCEマーカー。
（１７）前記配列番号７１〜７５で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号１〜５で示す塩基配列からなる、（１６）に記載のBSCEマーカー。
（１８）配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子をさらに含む遺伝子群からなる、（１５）〜（１７）のいずれかに記載のBSCEマーカー。
（１９）前記配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号７６〜７８で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、（１８）に記載のBSCEマーカー。
（２０）前記配列番号７６〜７８で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号６〜８で示す塩基配列からなる、（１９）に記載のBSCEマーカー。【００１１】
（２１）配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子をさらに含む遺伝子群からなる、（１５）〜（２０）のいずれかに記載のBSCEマーカー。
（２２）前記配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号７９〜８３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、（２１）に記載のBSCEマーカー。
（２３）前記配列番号７９〜８３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号９〜１３で示す塩基配列からなる、（２２）に記載のBSCEマーカー。
（２４）配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列をそれぞれ含む一以上の遺伝子をさらに含む遺伝子群からなる、（１５）〜（２３）のいずれかに記載のBSCEマーカー。
（２５）前記配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ配列番号８４〜１４０で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、（２４）に記載のBSCEマーカー。
（２６）前記配列番号８４〜１４０で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子がそれぞれ配列番号１４〜７０で示す塩基配列からなる、（２５）に記載のBSCEマーカー。
（２７）配列番号１４１〜１４５で示す塩基配列からなるプローブ群を含むBSCE検出用試薬。
（２８）配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含む、（２７）に記載のBSCE検出用試薬。
（２９）配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含む、（２７）又は（２８）に記載のBSCE検出用試薬。
（３０）配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含む、（２７）〜（２９）のいずれかに記載のBSCE検出用試薬。
（３１）（２７）〜（３０）のいずれかに記載のBSCE検出用試薬を含むBSCE検出用キット。【００１２】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-024129号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のBSCEマーカーを用いたBSCE罹患鑑別方法によれば、食道癌患者の腫瘍がBSCEか他の食道癌かを正確に鑑別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の70種のBSCE鑑別遺伝子群（BSCEマーカー）の発現プロファイルに基づいたクラスタ分析により分類された結果を示す図である。上段の樹形図（デンドログラム）は、70種のBSCEマーカーの遺伝子発現パターンを基に、非類似度係数に基づいて作成されたものであり、中段のバーは、各検体の癌の種類（正常組織を含む）の区別を示す。また、下段の図は遺伝子発現パターンを示す図（以下「ヒートマップ図」という。）である。
【図２−１】（A）70種のBSCEマーカーにおけるROC曲線を示す。縦軸は「感度」、横軸は「１−特異度」の値を示す（以下、ROC曲線を示す図において同様とする）。（B）70遺伝子のBSCEマーカーを用いたときの感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は前記70種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値（70遺伝子発現スコア）を示す。
【図２−２】（C）各検体における70遺伝子発現スコアが小さい順に検体を並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び70遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上二段のバーのうち「癌種」で示す上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す下のバーはBSCEと非BSCEの区別を示す（色のついているものがBSCEであることを示す）。
【図２−３】（D）実施例１で得た57検体の手術検体の70遺伝子発現スコアと312検体の生検検体の70遺伝子発現スコアを合わせて作成したROC曲線である。（E）前記70種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と312検体の生検検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「70遺伝子発現スコア」を示す。
【図２−４】（F）312検体の生検検体と57検体の手術検体と合わせて、70遺伝子発現スコアの小さい順に検体を並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び70遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上三段のバーのうち「癌種」で示す１番目のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す２番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「生検;手術」で示す３番目のバーは手術検体と生検検体の区別を示す。
【図２−５】（G）57検体の手術検体の70遺伝子発現スコアと20検体のFFPE組織検体の70遺伝子発現スコアを合わせて作成したROC曲線である。（H）前記70種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「70遺伝子発現スコア」を示す。
【図２−６】（I）さらに、20検体のFFPE組織検体と57検体の手術検体を合わせて、再度70遺伝子発現スコアの小さい順に検体を並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び70遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上四段のバーのうち「癌種」で示す一番上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「福島医大の診断」で示す２番目のバーはFFPE組織検体を福島県立医科大学において病理診断した結果の癌の種類の区別を、「Basaloid」で示す３番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「FFPE;手術」で示す一番下のバーは手術検体とFFPE組織検体の区別を示す。
【図２−７】（J）手術検体、生検検体、及びFFPE組織検体の全てを合わせたときのBSCEマーカーの70遺伝子発現スコアによる群散布図である。図中、星印の付いた横線は、平均値を示す（以下の図において同様とする）。
【図２−８】（K）検体の種類ごとに分けて作成した群散布図である。
【図３−１】（A）表１においてNo.R-1〜R-5で示す5種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体の5遺伝子発現スコア（5種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値）から作成したROC曲線である。（B）前記5種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「前記5種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値（5遺伝子発現スコア）」を示す。
【図３−２】（C）No.R-1〜R-5で示す5種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体の5遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（D）前記5種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と312検体の生検検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「5遺伝子発現スコア」を示す。
【図３−３】（E）No.R-1〜R-5で示す5種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体の5遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（F）前記5種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「5遺伝子発現スコア」を示す。
【図３−４】（G）No.R-1〜R-5で示す5種のBSCEマーカーの5遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体を5遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び5遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上二段のバーのうち「癌種」で示す上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す下のバーはBSCE又は非BSCEの区別を示す（色のついているものがBSCEであることを示す）。
【図３−５】（H）No.R-1〜R-5で示す5種のBSCEマーカーの5遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体を5遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び5遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上三段のバーのうち「癌種」で示す１番目のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す２番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「生検;手術」で示す３番目のバーは手術検体と生検検体の区別を示す。
【図３−６】（I）No.R-1〜R-5で示す5種のBSCEマーカーの5遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体を5遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び5遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上四段のバーのうち「癌種」で示す一番上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「福島医大の診断」で示す２番目のバーはFFPE組織検体を福島県立医科大学において病理診断した結果の癌の種類の区別を、「Basaloid」で示す３番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「FFPE;手術」で示す一番下のバーは手術検体とFFPE組織検体の区別を示す。
【図３−７】（J）手術検体、生検検体、及びFFPE組織検体の全てを合わせたときのNo.R-1〜R-5で示す5種のBSCEマーカーの5遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象としたときの群散布図である。
【図３−８】（K）検体の種類ごとに分けて作成した群散布図である。
【図４−１】（A）表１においてNo.R-1〜R-8で示す8種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体の8遺伝子発現スコア（8種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値）から作成したROC曲線である。（B）前記8種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「前記8種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値（8遺伝子発現スコア）」を示す。
【図４−２】（C）No.R-1〜R-8で示す8種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体の8遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（D）前記8種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と312検体の生検検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「8遺伝子発現スコア」を示す。
【図４−３】（E）No.R-1〜R-8で示す8種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体の8遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（F）前記8種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「8遺伝子発現スコア」を示す。
【図４−４】（G）No.R-1〜R-8で示す8種のBSCEマーカーの8遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体を8遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び8遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上二段のバーのうち「癌種」で示す上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す下のバーはBSCE又は非BSCEの区別を示す（色のついているものがBSCEであることを示す）。
【図４−５】（H）No.R-1〜R-8で示す8種のBSCEマーカーの8遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体を8遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び8遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上三段のバーのうち「癌種」で示す１番目のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す２番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「生検;手術」で示す３番目のバーは手術検体と生検検体の区別を示す。
【図４−６】（I）No.R-1〜R-8で示す8種のBSCEマーカーの8遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体を8遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び8遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上四段のバーのうち「癌種」で示す一番上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「福島医大の診断」で示す２番目のバーはFFPE組織検体を福島県立医科大学において病理診断した結果の癌の種類の区別を、「Basaloid」で示す３番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「FFPE;手術」で示す一番下のバーは手術検体とFFPE組織検体の区別を示す。
【図４−７】（J）手術検体、生検検体、及びFFPE組織検体の全てを合わせたときのNo.R-1〜R-8で示す8種のBSCEマーカーの8遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象としたときの群散布図である。
【図４−８】（K）検体の種類ごとに分けて作成した群散布図である。
【図５−１】（A）表１においてNo.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-13で示す10種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体の10遺伝子発現スコア（No.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-13で示す10種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値）から作成したROC曲線である。（B）前記10種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「前記10種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値（10遺伝子発現スコア）」を示す。
【図５−２】（C）No.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-13で示す10種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体の10遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（D）前記10種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と312検体の生検検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「10遺伝子発現スコア」を示す。
【図５−３】（E）No.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-13で示す10種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体の10遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（F）前記10種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「10遺伝子発現スコア」を示す。
【図５−４】（G）No.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-13で示す10種のBSCEマーカーの10遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体を10遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び10遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上二段のバーのうち「癌種」で示す上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す下のバーはBSCE又は非BSCEの区別を示す（色のついているものがBSCEであることを示す）。
【図５−５】（H）No.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-13で示す10種のBSCEマーカーの10遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体を10遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び10遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上三段のバーのうち「癌種」で示す１番目のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す２番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「生検;手術」で示す３番目のバーは手術検体と生検検体の区別を示す。
【図５−６】（I）No.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-13で示す10種のBSCEマーカーの10遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体検体を10遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び10遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上四段のバーのうち「癌種」で示す一番上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「福島医大の診断」で示す２番目のバーはFFPE組織検体を福島県立医科大学において病理診断した結果の癌の種類の区別を、「Basaloid」で示す３番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「FFPE;手術」で示す一番下のバーは手術検体とFFPE組織検体の区別を示す。
【図５−７】（J）手術検体、生検検体、及びFFPE組織検体の全てを合わせたときのNo.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-13で示す10種のBSCEマーカーの10遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象としたときの群散布図である。
【図５−８】（K）検体の種類ごとに分けて作成した群散布図である。
【図６−１】（A）表１においてNo.R-1〜R-13で示す13種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体の13遺伝子発現スコア（13種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値）から作成したROC曲線である。（B）前記13種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「前記13種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値（13遺伝子発現スコア）」を示す。
【図６−２】（C）No.R-1〜R-13で示す13種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体の13遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（D）前記13種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と312検体の生検検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「13遺伝子発現スコア」を示す。
【図６−３】（E）No.R-1〜R-13で示す13種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体の13遺伝子発現スコアと20検体のFFPE組織検体の13遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（F）前記13種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「13遺伝子発現スコア」を示す。
【図６−４】（G）No.R-1〜R-13で示す13種のBSCEマーカーのスコア値について、実施例１で得た57検体の手術検体を13遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び13遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上二段のバーのうち「癌種」で示す上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す下のバーはBSCE又は非BSCEの区別を示す（色のついているものがBSCEであることを示す）。
【図６−５】（H）No.R-1〜R-13で示す13種のBSCEマーカーの13遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体を13遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び13遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上三段のバーのうち「癌種」で示す１番目のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す２番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「生検;手術」で示す３番目のバーは手術検体と生検検体の区別を示す。
【図６−６】（I）No.R-1〜R-13で示す13種のBSCEマーカーの13遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体を13遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び13遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上四段のバーのうち「癌種」で示す一番上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「福島医大の診断」で示す２番目のバーはFFPE組織検体を福島県立医科大学において病理診断した結果の癌の種類の区別を、「Basaloid」で示す３番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「FFPE;手術」で示す一番下のバーは手術検体とFFPE組織検体の区別を示す。
【図６−７】（J）手術検体、生検検体、及びFFPE組織検体の全てを合わせたときのNo.R-1〜R-13で示す13種のBSCEマーカーの13遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象としたときの群散布図である。
【図６−８】（K）検体の種類ごとに分けて作成した群散布図である。
【図７−１】（A）表１においてNo.R-1〜R-5及びNo.R-14〜R-15で示す7種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体の7遺伝子発現スコア（7種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値）から作成したROC曲線である。（B）前記7種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「前記7種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値（7遺伝子発現スコア）」を示す。
【図７−２】（C）No.R-1〜R-5及びNo.R-14〜R-15で示す7種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体の7遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（D）前記7種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と312検体の生検検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「7遺伝子発現スコア」を示す。
【図７−３】（E）No.R-1〜R-5及びNo.R-14〜R-15で示す7種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体の7遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（F）7種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「7遺伝子発現スコア」を示す。
【図７−４】（G）No.R-1〜R-5及びNo.R-14〜R-15で示す7種のBSCEマーカーの7遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体を7遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び7遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上二段のバーのうち「癌種」で示す上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す下のバーはBSCE又は非BSCEの区別を示す（色のついているものがBSCEであることを示す）。
【図７−５】（H）No.R-1〜R-5及びNo.R-14〜R-15で示す7種のBSCEマーカーのスコア値について、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体を7遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び7遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上三段のバーのうち「癌種」で示す１番目のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す２番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「生検;手術」で示す３番目のバーは手術検体と生検検体の区別を示す。
【図７−６】（I）No.R-1〜R-5及びNo.R-14〜R-15で示す7種のBSCEマーカーの7遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体を7遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び7遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上四段のバーのうち「癌種」で示す一番上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「福島医大の診断」で示す２番目のバーはFFPE組織検体を福島県立医科大学において病理診断した結果の癌の種類の区別を、「Basaloid」で示す３番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「FFPE;手術」で示す一番下のバーは手術検体とFFPE組織検体の区別を示す。
【図７−７】（J）手術検体、生検検体、及びFFPE組織検体の全てを合わせたときのNo.R-1〜R-5及びNo.R-14〜R-15で示す7種のBSCEマーカーの7遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象としたときの群散布図である。
【図７−８】（K）検体の種類ごとに分けて作成した群散布図である。
【図８−１】（A）表１においてNo.R-1〜R-8及びNo.R-14〜R-15で示す10種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体の10’遺伝子発現スコア（No.R-1〜R-8及びNo.R-14〜R-15で示す10種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値）から作成したROC曲線である。（B）前記10種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「前記10種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値（10’遺伝子発現スコア）」を示す。
【図８−２】（C）No.R-1〜R-8及びNo.R-14〜R-15で示す10種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体の10’遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（D）前記10種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と312検体の生検検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「10’遺伝子発現スコア」を示す。
【図８−３】（E）No.R-1〜R-8及びNo.R-14〜R-15で示す10種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体の10’遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（F）10種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「10’遺伝子発現スコア」を示す。
【図８−４】（G）No.R-1〜R-8及びNo.R-14〜R-15で示す10種のBSCEマーカーの10’遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体を10’遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上二段のバーのうち「癌種」で示す上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す下のバーはBSCE又は非BSCEの区別を示す（色のついているものがBSCEであることを示す）。
【図８−５】（H）No.R-1〜R-8及びNo.R-14〜R-15で示す10種のBSCEマーカーの10’遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体を10’遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）（中段）及び10’遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上三段のバーのうち「癌種」で示す１番目のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す２番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「生検;手術」で示す３番目のバーは手術検体と生検検体の区別を示す。
【図８−６】（I）No.R-1〜R-8及びNo.R-14〜R-15で示す10種のBSCEマーカーの10’遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体を10’遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び10’遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上四段のバーのうち「癌種」で示す一番上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「福島医大の診断」で示す２番目のバーはFFPE組織検体を福島県立医科大学において病理診断した結果の癌の種類の区別を、「Basaloid」で示す３番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「FFPE;手術」で示す一番下のバーは手術検体とFFPE組織検体の区別を示す。
【図８−７】（J）手術検体、生検検体、及びFFPE組織検体の全てを合わせたときのNo.R-1〜R-8及びNo.R-14〜R-15で示す10種のBSCEマーカーの10’遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象としたときの群散布図である。
【図８−８】（K）検体の種類ごとに分けて作成した群散布図である。
【図９−１】（A）表１においてNo.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-15で示す12種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体の12遺伝子発現スコア（12種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値）から作成したROC曲線である。（B）前記12種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「前記12種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値（12遺伝子発現スコア）」を示す。
【図９−２】（C）No.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-15で示す12種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体の12遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（D）前記12種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と312検体の生検検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「12遺伝子発現スコア」を示す。
【図９−３】（E）No.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-15で示す12種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体の12遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（F）前記12種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「12遺伝子発現スコア」を示す。
【図９−４】（G）No.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-15で示す12種のBSCEマーカーの12遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体を12遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上二段のバーのうち「癌種」で示す上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す下のバーはBSCE又は非BSCEの区別を示す（色のついているものがBSCEであることを示す）。
【図９−５】（H）No.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-15で示す12種のBSCEマーカーの12遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体を12遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上三段のバーのうち「癌種」で示す１番目のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す２番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「生検;手術」で示す３番目のバーは手術検体と生検検体の区別を示す。
【図９−６】（I）No.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-15で示す12種のBSCEマーカーの12遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体を12遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び12遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上四段のバーのうち「癌種」で示す一番上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「福島医大の診断」で示す２番目のバーはFFPE組織検体を福島県立医科大学において病理診断した結果の癌の種類の区別を、「Basaloid」で示す３番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「FFPE;手術」で示す一番下のバーは手術検体とFFPE組織検体の区別を示す。
【図９−７】（J）手術検体、生検検体、及びFFPE組織検体の全てを合わせたときのNo.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-15で示す12種のBSCEマーカーの12遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象としたときの群散布図である。
【図９−８】（K）検体の種類ごとに分けて作成した群散布図である。
【図１０−１】（A）表１においてNo.R-1〜R-15で示す15種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体の15遺伝子発現スコア（15種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値）から作成したROC曲線である。（B）前記15種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「前記15種のBSCEマーカーの対数変換相対的発現比の合算値（15遺伝子発現スコア）」を示す。
【図１０−２】（C）No.R-1〜R-15で示す15種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体の15遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（D）前記15種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と312検体の生検検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「15遺伝子発現スコア」を示す。
【図１０−３】（E）No.R-1〜R-15で示す15種のBSCEマーカーに関して、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体の15遺伝子発現スコアから作成したROC曲線である。（F）前記15種のBSCEマーカーを用いたときの57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体における感度特異度曲線である。縦軸は「感度」又は「特異度」、横軸は「15遺伝子発現スコア」を示す。
【図１０−４】（G）No.R-1〜R-15で示す15種のBSCEマーカーの15遺伝子発現スコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体を15遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上二段のバーのうち「癌種」で示す上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す下のバーはBSCE又は非BSCEの区別を示す（色のついているものがBSCEであることを示す）。
【図１０−５】（H）No.R-1〜R-15で示す15種のBSCEマーカーのスコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と312検体の生検検体の15遺伝子発現スコアを小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び15遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上三段のバーのうち「癌種」で示す１番目のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「Basaloid」で示す２番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「生検;手術」で示す３番目のバーは手術検体と生検検体の区別を示す。
【図１０−６】（I）No.R-1〜R-15で示す15種のBSCEマーカーのスコアについて、実施例１で得た57検体の手術検体と20検体のFFPE組織検体を15遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直したときのヒートマップ図（中段）及び15遺伝子発現スコアの値をプロットしたグラフ（下段）である。図中の縦線はカットオフ値を示す。また、上四段のバーのうち「癌種」で示す一番上のバーは癌の種類（正常組織を含む）の区別を、「福島医大の診断」で示す２番目のバーはFFPE組織検体を福島県立医科大学において病理診断した結果の癌の種類の区別を、「Basaloid」で示す３番目のバーはBSCEと非BSCEの区別（色のついているものがBSCEであることを示す）を、「FFPE;手術」で示す一番下のバーは手術検体とFFPE組織検体の区別を示す。
【図１０−７】（J）手術検体、生検検体、及びFFPE組織検体の全てを合わせたときのNo.R-1〜R-15で示す15種のBSCEマーカーの15遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象としたときの群散布図である。
【図１０−８】（K）検体の種類ごとに分けて作成した群散布図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．食道類基底細胞癌マーカー
１−１．概要
本発明の第１の態様は食道類基底細胞癌マーカー（BSCEマーカー）である。本発明のBSCEマーカーは、少なくとも5種の遺伝子群からなり、被験者及び健常者又は健常者群の試料中におけるその発現レベルを測定することでBSCEの罹患の有無、又は罹患している食道癌がBSCEか、それ以外の他の食道癌かを正確に鑑別することができる。
【００１６】
１−２．定義
「食道」とは、輪状軟骨の下端から胃に移行するまでの長さ20〜25ｃｍの管状の臓器で、頚部食道、胸部食道、腹部食道の3領域から形成されている。
【００１７】
「食道癌」は、食道の粘膜から発生する悪性腫瘍であり、扁平上皮癌（食道扁平上皮癌）や腺癌（食道腺癌）の主要な食道癌の他、食道類基底細胞癌（BSCE）のような特殊組織型食道癌が知られている。
【００１８】
「食道扁平上皮癌」は、食道本来の粘膜である扁平上皮から発生する食道癌である。充実性の胞巣を形成し、重層扁平上皮への分化を示す。角化又は層状分化傾向を示し、多くの場合、細胞間橋が認められる。食道扁平上皮癌は、頚部食道又は胸部食道での発生頻度が高く、日本での食道癌の約90%を占めている。
【００１９】
「食道腺癌」は、腺細胞中で発生する食道癌で、腹部食道の胃付近で発生することが多い。腺細胞は、食道内壁において粘液分泌に働く食道腺を形成している。欧米諸国では、Barrett食道を背景に発生するBarrett食道腺癌の発生頻度が高く、食道癌の半数以上を占めている。
【００２０】
「食道類基底細胞癌（BSCE）」は、前述のように特殊組織型食道癌に分類される比較的稀な食道癌である。当該癌細胞は、食道に発生する基底細胞に類似した特徴を有し、小型の細胞が、充実胞巣又は索状に増殖し、ときに不規則な腺様、小嚢胞様構造を形成することを特徴とする。さらに、胞巣内外に硝子様（基底膜様）物質の沈着が認められる。また一部の癌では導管様分化を伴うものもある。上皮内には食道扁平上皮癌を有することが多く、浸潤部でも食道扁平上皮癌を伴うことがある。
【００２１】
本明細書において「食道類基底細胞癌マーカー（BSCEマーカー）」とは、BSCEの罹患の有無の鑑別、又はBSCEと他の主要な食道癌、すなわち食道扁平上皮癌及び食道腺癌との鑑別をすることのできるバイオマーカーをいう。
【００２２】
本明細書において「鑑別」とは、食道癌罹患歴のある被験者がBSCEに罹患しているか否か若しくは罹患していたか否か、又は食道癌患者がBSCEとBSCE以外の他の主要な食道癌のいずれに罹患しているか、を判別することをいう。
【００２３】
１−３．構成
本態様のBSCEマーカーは、BSCE鑑別遺伝子群で構成される。本明細書において「BSCE鑑別遺伝子群」とは、配列番号１４１〜１４５で示す塩基配列をそれぞれ含む少なくとも5種の遺伝子（COL9A2遺伝子、FGF3遺伝子、NPTX2遺伝子、COL9A3遺伝子、及びCOL9A1遺伝子）からなる。すなわち、この5種の遺伝子が本態様のBSCEマーカーの必須BSCE鑑別遺伝子群となる。前記5種の遺伝子は、それぞれが表１においてNo.R-1〜R-5に相当し、配列番号７１〜７５で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。具体的には、それぞれが配列番号１〜５で示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。なお、BSCEマーカーを構成する個々の遺伝子を本明細書では「BSCE鑑別遺伝子」と表記する。
【００２４】
【表１】
2017138627.tif 000002
【００２５】
2017138627.tif 000003
【００２６】
2017138627.tif 000004
【００２７】
表中、「gene name」はBSCE鑑別遺伝子名を、「symbol」はBSCE鑑別遺伝子の略称を、「ID」はBSCE鑑別遺伝子のアクセッションナンバーを示す。また配列番号においてAはBSCE鑑別遺伝子の全長塩基配列を、Bはその遺伝子がコードするタンパク質の全長アミノ酸配列を、Cはプローブに用いた塩基配列を示す。
【００２８】
本態様のBSCEマーカーは、前記必須BSCE鑑別遺伝子群に加えて、選択BSCE鑑別遺伝子を含むことができる。本明細書において「選択BSCE鑑別遺伝子」とは、表１に記載のBSCE鑑別遺伝子群に属する必須BSCE鑑別遺伝子以外の遺伝子をいう。選択BSCE鑑別遺伝子が複数の場合、本明細書では、しばしば「選択BSCE鑑別遺伝子群」と表記する。
【００２９】
本態様のBSCEマーカーは、前記必須BSCE鑑別遺伝子群に加えて、選択BSCE鑑別遺伝子として、さらに配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列をそれぞれ含む3種の遺伝子（PPP1R1B遺伝子、TTYH1遺伝子、及びABTB2遺伝子）を一以上含むことができる。前記配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列を含む遺伝子はそれぞれ表１においてNo.R-6〜R-8に相当し、配列番号７６〜７８で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。例えば、それぞれ配列番号６〜８で示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
【００３０】
本態様のBSCEマーカーは、前記必須BSCE鑑別遺伝子群に加えて、選択BSCE鑑別遺伝子として、さらに配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列をそれぞれ含む5種の遺伝子（TTLL4遺伝子、PTPN5遺伝子、ETV6遺伝子、IL17RD遺伝子、及びCCDC8遺伝子）を一以上含むことができる。前記配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ表１においてNo.R-9〜R-13に相当し、配列番号７９〜８３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。例えば、それぞれ配列番号９〜１３で示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。また、このとき選択BSCE鑑別遺伝子である上述の配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列をそれぞれ含む遺伝子、好ましくは配列番号７６〜７８で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、より好ましくは配列番号６〜８で示す塩基配列からなる遺伝子をさらに一以上含んでいてもよい。
【００３１】
本態様のBSCEマーカーは、前記必須BSCE鑑別遺伝子群に加えて、選択BSCE鑑別遺伝子として、さらに配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列をそれぞれ含む遺伝子を一以上含むことができる。前記配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列を含む遺伝子がそれぞれ表１においてNo.R-14〜R-70に相当し、配列番号８４〜１４０で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であることが好ましい。例えば、それぞれ配列番号１４〜７０で示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。また、このとき選択BSCE鑑別遺伝子である上述の配列番号１４６〜１５３で示す塩基配列をそれぞれ含む遺伝子、好ましくは配列番号７６〜８３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子、より好ましくは配列番号６〜１３で示す塩基配列からなる遺伝子をさらに一以上含んでいてもよい。
【００３２】
したがって、本態様のBSCEマーカーは、5種以上70種以下のBSCE鑑別遺伝子群で構成される。通常、本態様のBSCEマーカーは、構成する遺伝子の種類が多いほどBSCE罹患鑑別方法における鑑別精度が高くなる。
【００３３】
本明細書においてBSCEマーカーは、原則的にはDNA（cDNA）で示す塩基配列からなる遺伝子であるが、その遺伝子の発現時に転写産物として生じ、RNA配列からなるmRNA、遺伝子の翻訳産物として生じるアミノ酸配列からなるタンパク質、及びそれらの部分断片もマーカーである遺伝子の発現を反映するため間接的にBSCEマーカーとなり得る。
【００３４】
また、BSCEマーカーを構成するBSCE鑑別遺伝子は、上述の遺伝子の塩基配列と70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上の塩基同一性を有するヌクレオチド、上述の遺伝子の塩基配列において1個又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド、及び前記遺伝子の部分塩基配列に相補的な塩基配列からなるヌクレオチド断片とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸で酵素活性を保持するヌクレオチドも含まれる。このようなヌクレオチドの具体的な例として、同一アミノ酸配列をコードする縮重コドンを含むヌクレオチド、各遺伝子の各種変異体（バリアント）や点突然変異遺伝子等の変異遺伝子、及びチンパンジー等の他種生物のオルソログ遺伝子が挙げられる。なお、本明細書において「塩基同一性」とは、二つの塩基配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両塩基配列の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、表１に記載の遺伝子の全塩基数に対する比較するヌクレオチドの塩基配列中の同一塩基数の割合（％）をいう。「複数個のヌクレオチド」とは、2〜30個、2〜14個、2〜10個、2〜8個、2〜6個、2〜5個、2〜4個、又は2〜3個のヌクレオチドをいう。また、「ストリンジェントな条件」とは、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。一般に、低塩濃度で、かつ高温であるほど高ストリンジェントな条件となる。低ストリンジェントな条件とは、例えば、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、1×SSC、0.1％ SDS、37℃程度で洗浄する条件であり、より厳しくは0.5×SSC、0.1％ SDS、42℃〜50℃程度で洗浄する条件である。さらに厳しい高ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば50℃〜70℃、55℃〜68℃、又は65℃〜68℃で、0.1×SSC及び0.1% SDSで洗浄する条件である。一般に高ストリンジェントな条件が好ましい。前記SSC、SDS及びに温度の組み合わせは、例示に過ぎない。当業者は、前記SSC、SDS及びに温度に加えて、プローブ濃度、プローブ塩基長、ハイブリダイゼーション時間等のその他の条件を適宜組み合わせてハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定することもできる。
【００３５】
２．食道類基底細胞癌罹患鑑別方法
２−１．概要
本発明の第２の態様は、被験者の食道類基底細胞癌（BSCE）の罹患鑑別を補助する方法である。本発明のBSCE罹患鑑別方法は、被験者及び健常者又は健常者群から採取された試料中に含まれる第１態様に記載のBSCEマーカーの発現プロファイルを得て、該発現プロファイルに基づいて該被験者における食道癌が食道類基底細胞癌であるか又はそれ以外の食道癌であるかの鑑別を補助する方法である。「BSCEマーカーの発現プロファイル」とは、BSCEマーカーを構成する各BSCE鑑別遺伝子の発現レベルに関する情報をいう。本明細書では、特に複数のBSCE鑑別遺伝子の発現レベルに関する情報から構築される遺伝子発現パターンをいう。一般に、取得する遺伝子の発現プロファイルが多いほど精度の高い鑑別が可能となる。
【００３６】
２−２．方法
本発明のBSCE罹患鑑別方法は、測定工程、算出工程、及び判定工程を必須の工程として含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
【００３７】
２−２−１．測定工程
「測定工程」とは、被験者及び健常者又は健常者群から採取された試料において第１態様のBSCEマーカーの単位量あたりの発現レベルを測定してその測定値を得る工程である。
【００３８】
本明細書において「被験者」とは、試料を提供し、検査に供されるヒト個体をいう。被験者は、食道癌罹患歴のある個体又は食道癌罹患の疑いのある個体のいずれであってもよい。ここでいう「食道癌罹患歴のある個体」とは、現在食道癌に罹患している患者、及び過去食道癌に罹患した食道癌既往歴者を含む。BSCEは病理組織学的に食道扁平上皮癌と区別が困難であることから、病理組織学的に食道扁平上皮癌の疑いがあると診断された患者又は食道扁平上皮癌既往歴者は、被験者として好適である。
【００３９】
本明細書において「健常者」とは、健常状態にあるヒトをいう。ただし、本明細書では健常ヒト細胞も広義の健常者に含むものとする。したがって、個体レベルのみならず、例えば、食道癌の患者から採取した組織のうちの正常部分のように、細胞レベルで健常状態にあれば健常者と称することとする。
【００４０】
本明細書において「健常状態」とは、本明細書では、少なくとも食道癌に罹患していない健全な状態を意味する。つまり、本明細書の健常者とは、食道癌に罹患していないヒト個体(ヒト細胞を含む)、好ましくはいずれの疾患や異常も有さない健康なヒト個体(ヒト細胞を含む)である。本態様で用いる健常者は、性別、年齢、身長、体重等の身体的条件や、人数は特に制限はしないが、被験体と同性で、また年齢、身長、及び体重等の身体的条件が同一又は近似であることが好ましい。なお、本明細書では複数の健常者からなる集団を「健常者群」と称する。
【００４１】
本明細書において「試料」とは、前記被験者又は健常者若しくは健常者群から採取され、本態様のBSCE罹患鑑別方法に供されるものであって、例えば、組織、細胞、体液又は腹腔洗浄液が該当する。ここでいう「組織」及び「細胞」は、被験者又は健常者のいずれの部位由来でもよいが、好ましくは生検により採取された、又は手術により切除された検体、より具体的には食道組織又は食道細胞である。特に好ましくは生検により採取された食道癌細胞又は食道癌罹患の疑いのある食道組織又は食道細胞である。なお、これらの組織又は細胞は、ホルマリン固定後パラフィンに包埋されたもの（FFPE：Formalin-Fixed Paraffin Embedded)でもよい。また、ここでいう「体液」とは、被験者又は健常者から採取された液体状の生体試料をいう。例えば、血液（血清、血漿及び間質液を含む）、髄液（脳脊髄液）、尿、リンパ液、消化液、腹水、胸水、神経根周囲液、各組織若しくは細胞の抽出液等が挙げられる。好ましくは血液である。
【００４２】
試料の採取は、組織又は細胞であれば、生検又は手術による外科的摘出により入手すればよい。また、体液であれば、当該分野の公知の方法に基づいて行なえばよい。例えば、血液やリンパ液であれば公知の採血方法に従えばよい。本態様のBSCE罹患鑑別方法において必要となる試料の量は、特に限定するものではない。組織又は細胞であれば少なくとも10μg、好ましくは少なくとも0.1mgあれば望ましいが、生検材料でも構わない。また血液、又はリンパ液のような体液であれば、少なくとも0.1mL、好ましくは少なくとも1mL、より好ましくは少なくとも10mLの容量があればよい。試料は、第１態様のBSCEマーカーを測定可能なように、必要に応じて調製、処理することができる。例えば、試料が組織又は細胞であれば、ホモジナイズ処理や細胞溶解処理、遠心や濾過による夾雑物除去、プロテアーゼインヒビターの添加等が挙げられる。これらの処理の詳細についてはGreen & Sambrook, Molecular Cloning, 2012, Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pressに詳しく記載されており、参考にすればよい。
【００４３】
本明細書において「単位量」とは、任意に定められる試料の量をいう。例えば、容量（μL、mLで表される）や重量（μg、mg、gで表される）が該当する。単位量は特に特定しないが、一連のBSCE罹患鑑別方法で測定される単位量は一定である。したがって、本工程で測定に供される被験者と健常者由来の試料の単位量は常に同一となる。単位量は、BSCE罹患鑑別方法を新たに行う度に変更することもできるが、各BSCE罹患鑑別方法の単位量を一定にしておけば、他の条件が同一であれば健常者又は健常者群の測定値に関しては以前に測定した測定値を再利用でき、BSCE罹患鑑別方法毎に測定する必要がなくなるので便利である。
【００４４】
本明細書において「遺伝子の発現レベル」とは、BSCE鑑別遺伝子の発現量（転写産物量）、発現強度又は発現頻度をいう。ここでいう遺伝子の発現レベルは、BSCE鑑別遺伝子の野生型遺伝子の発現レベルに限らず、点突然変異遺伝子等の変異遺伝子の発現レベルも含み得る。また、BSCE鑑別遺伝子の発現を示す転写産物には、スプライスバリアントのような異型転写産物（バリアント）及びそれらの断片も含み得る。変異遺伝子、転写産物、又はその断片に基づく情報であっても本発明における遺伝子の発現プロファイルの構築が可能だからである。遺伝子の発現レベルは、BSCEマーカーを構成するBSCE鑑別遺伝子群の転写産物、すなわちmRNA量、又はその翻訳産物であるタンパク質量若しくは活性等の測定により測定値として得ることができる。
【００４５】
本明細書において「測定値」とは、遺伝子発現レベルの測定方法によって得られた値である。測定値は、試料中のmRNA量やタンパク質量をng（ナノグラム）やμg（マイクログラム）等の容量で表した絶対値であってもよいし、また対照値に対する吸光度や標識分子による蛍光強度等で表した相対値であってもよい。さらにタンパク質の活性の場合、比活性であってもよい。
【００４６】
以下、各BSCE鑑別遺伝子の転写産物又は翻訳産物の測定方法について具体的に説明をする。
【００４７】
（１）転写産物の測定
BSCE鑑別遺伝子の転写産物の測定は、mRNA量の測定であっても、またmRNAから逆転写されて得られたcDNA量の測定であってもよい。一般に遺伝子の転写産物の測定には、上記の遺伝子の塩基配列の全部又は一部を含むヌクレオチドをプライマー又はプローブに用いて、遺伝子の発現レベルを絶対値又は相対値として測定する方法が採用される。
【００４８】
本態様のプライマー又はプローブは、通常、DNA、RNA等の天然核酸で構成される。安定性が高く、合成が容易で低廉なDNAは特に好ましい。また、必要に応じて天然核酸と化学修飾核酸や擬似核酸を組み合わせることもできる。化学修飾核酸や擬似核酸には、例えば、PNA(Peptide Nucleic Acid)、LNA(Locked Nucleic Acid;登録商標)、メチルホスホネート型DNA、ホスホロチオエート型DNA、2'-O-メチル型RNA等が挙げられる。また、プライマー及びプローブは、蛍光物質及び／又はクエンチャー物質、又は放射性同位元素（例えば、32P、33P、35S）等の標識物質、あるいはビオチン若しくは（ストレプト）アビジン、又は磁気ビーズ等の修飾物質を用いて標識又は修飾してもよい。標識物質は、限定されず、市販のものを用いることができる。例えば、蛍光物質であればFITC、Texas、Cy3、Cy5、Cy7、Cyanine3、Cyanine5、Cyanine7、FAM、HEX、VIC、フルオレサミン及びその誘導体、及びローダミン及びその誘導体等を用いることができる。クエンチャー物質であれば、AMRA、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、又はBHQ-3等を用いることができる。プライマー及びプローブにおける標識物質の標識位置は、その修飾物質の特性や、使用目的に応じて適宜定めればよい。一般的には、5’又は3’末端部に修飾されることが多い。また、一つのプライマー及びプローブ分子が一以上の標識物質で標識されていても構わない。これらの物質のヌクレオチドへの標識は公知の方法で行うことができる。
【００４９】
プライマー又はプローブとして用いるヌクレオチドは、上記BSCEマーカーを構成する各遺伝子のセンス鎖、又はアンチセンス鎖からなるヌクレオチドのいずれであってもよい。
【００５０】
プライマー又はプローブの塩基長は特に限定しない。プローブの場合、後述するハイブリダイゼーション法に使用するのであれば、少なくとも10塩基長以上からBSCE鑑別遺伝子全長、好ましくは15塩基長以上からBSCE鑑別遺伝子全長、より好ましくは30塩基長以上からBSCE鑑別遺伝子全長、さらに好ましくは50塩基長以上からBSCE鑑別遺伝子全長であり、マイクロアレイに使用するのであれば、10〜200塩基長、好ましくは20〜150塩基長、より好ましくは30〜100塩基長である。一般にプローブは長いほどハイブリダイゼーション効率が上昇し、感度は高くなる。一方、プローブは短いほど感度は低くなるが、逆に特異性が上昇する。プローブの具体的な例として、表１のCにおいて配列番号１４１〜２１０で示す塩基配列からなる80塩基のヌクレオチドが挙げられる。一方、プライマーの場合、フォワードプライマー及びリバースプライマーのそれぞれが10〜50bp、好ましくは15〜30bpあればよい。
【００５１】
上記したプライマー又はプローブの調製は当業者に既知であり、例えば、前述のGreen & Sambrook, Molecular Cloning（2012）に記載された方法に準じて調製することができる。また、核酸合成受託メーカーに配列情報を提供し、委託製造することも可能である。
【００５２】
BSCE鑑別遺伝子の転写産物の測定は、公知の核酸定量方法であればよく、特に限定はしない。例えば、ハイブリダイゼーション法、又は核酸増幅法が挙げられる。
【００５３】
「ハイブリダイゼーション法」とは、検出すべき標的核酸の塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列を有する核酸断片をプローブとして用い、その核酸と該プローブ間の塩基対合を利用して、標的核酸若しくはその断片を検出、定量する方法である。本態様で標的核酸は、BSCEマーカーを構成する各BSCE鑑別遺伝子のmRNA若しくはcDNA、又はその断片が該当する。一般にハイブリダイゼーション法は、非特異的にハイブリダイズする目的外の核酸を排除するためストリンジェントな条件で行うことが好ましい。前述の低塩濃度かつ高温下の高ストリンジェントな条件はより好ましい。ハイブリダイゼーション法には、検出手段の異なるいくつかの方法が知られているが、例えば、ノザンブロット法（ノザンハイブリダイゼーション法）、マイクロアレイ法、表面プラズモン共鳴法又は水晶振動子マイクロバランス法が好適である。
【００５４】
「ノザンブロット法」は、遺伝子の発現を解析する最も一般的な方法で、試料より調製した全RNA又はmRNAを変性条件下でアガロースゲル若しくはポリアクリルアミドゲル等による電気泳動によって分離し、フィルターに転写（ブロッティング）した後に、標的RNAに特異的な塩基配列を有するプローブを用いて、標的核酸を検出する方法である。プローブを蛍光色素や放射性同位元素のような適当なマーカーで標識することで、例えば、ケミルミ（化学発光）撮影解析装置（例えば、ライトキャプチャー；アトー社）、シンチレーションカウンター、イメージングアナライザー（例えば、FUJIFILM社：BASシリーズ）等の測定装置を用いて標的核酸を定量することも可能である。ノザンブロット法は、当該分野において周知著名な技術であり、例えば、前述のGreen, M.R. and Sambrook, J.（2012）を参照すればよい。
【００５５】
「マイクロアレイ法」は、基板上に標的核酸の塩基配列の全部若しくは一部に相補的な核酸断片をプローブとして小スポット状に高密度で配置、固相化したマイクロアレイ又はマイクロチップに標的核酸を含む試料を反応させて、基盤スポットにハイブリダイズした核酸を蛍光等によって検出、定量する方法である。標的核酸は、mRNAのようなRNA、又はcDNAのようなDNAのいずれであってもよい。検出、定量には、標的核酸等のハイブリダイゼーションに基づく蛍光等をマイクロプレートリーダーやスキャナにより検出、測定することによって達成できる。測定した蛍光強度により、mRNA量若しくはcDNA量又はレファレンスmRNA（参照mRNA）に対するそれらの存在比を決定することができる。マイクロアレイ法も当該分野において周知の技術である。例えば、DNAマイクロアレイ法（DNAマイクロアレイと最新PCR法（2000年）村松正明、那波宏之監修、秀潤社）等を参照すればよい。
【００５６】
「表面プラズモン共鳴（SPR：Surface Plasmon Resonance）法」とは、金属薄膜へ照射したレーザー光の入射角度を変化させると特定の入射角度（共鳴角）において反射光強度が著しく減衰するという表面プラズモン共鳴現象を利用して、金属薄膜表面上の吸着物を極めて高感度に検出、定量する方法である。本発明においては、例えば、金属薄膜表面に標的核酸の塩基配列に相補的な配列を有するプローブを固定化し、その他の金属薄膜表面部分をブロッキング処理した後、被験体又は健常体若しくは健常体群から採取された試料を金属薄膜表面に流通させることによって標的核酸とプローブの塩基対合を形成させて、サンプル流通前後の測定値の差異から標的核酸を検出、定量することができる。表面プラズモン共鳴法による検出、定量は、例えば、Biacore社で市販されるSPRセンサを利用して行なうことができる。本技術は、当該分野において周知である。例えば、永田和弘、及び半田宏, 生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法, シュプリンガー・フェアラーク東京, 東京, 2000を参照すればよい。
【００５７】
「水晶振動子マイクロバランス（QCM: Quarts Crystal Microbalance）法」とは、水晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着するとその質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用して、共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に捕らえる質量測定法である。本方法による検出、定量も、SPR法と同様に市販のQCMセンサを利用して、例えば、電極表面に固定した標的核酸の塩基配列に相補的な配列を有するプローブと被験体又は健常体若しくは健常体群から採取された試料中の標的核酸との塩基対合によって標的核酸を検出、定量することができる。本技術は、当該分野において周知であり、例えば、Christopher J. et al., 2005, Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review,105:1103-1169や森泉豊榮，中本高道，(1997) センサ工学，昭晃堂を参照すればよい。
【００５８】
「核酸増幅法」とは、フォワード／リバースプライマーを用いて、標的核酸の特定の領域を核酸ポリメラーゼによって増幅させる方法をいう。例えば、PCR法（RT-PCR法を含む）、NASBA法、ICAN法、LAMP（登録商標）法（RT-LAMP法を含む）が挙げられる。好ましくはPCR法である。核酸増幅法を用いた遺伝子の転写産物の測定方法には、リアルタイムRT-PCR法のような定量的核酸増幅法が使用される。リアルタイムRT-PCR法には、さらに、SYBR（登録商標）Green等を用いるインターカレーター法、Taqman（登録商標）プローブ法、デジタルPCR法、及びサイクリングプローブ法が知られているが、いずれの方法であってもよい。これらはいずれも公知の方法であり、当該技術分野における適当なプロトコルにも記載されているので、それらを参照すればよい。
【００５９】
リアルタイムRT-PCR法で遺伝子の転写産物を定量する方法について、以下で一例を挙げて簡単に説明をする。リアルタイムRT-PCR法は、試料中のmRNAから逆転写反応によって調製されたcDNAを鋳型として、PCRの増幅産物が特異的に蛍光標識される反応系で、増幅産物に由来する蛍光強度を検出する機能の備わった温度サイクラー装置を用いてPCRを行う核酸定量方法である。反応中の標的核酸の増幅産物量をリアルタイムでモニタリングして、その結果をコンピュータで回帰分析する。増幅産物を標識する方法としては、蛍光標識したプローブを用いる方法（例えば、TaqMan（登録商標）PCR法）と、2本鎖DNAに特異的に結合する試薬を用いるインターカレーター方法とがある。TaqMan（登録商標）PCR法は、5’末端部がクエンチャー物質で、また3’末端部が蛍光色素で修飾されたプローブを用いる。通常は、5’末端部のクエンチャー物質が3’末端部の蛍光色素を抑制しているが、PCRが行われるとTaqポリメラーゼのもつ5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により当該プローブが分解され、それによってクエンチャー物質の抑制が解除されるため蛍光を発するようになる。その蛍光量は、増幅産物の量を反映する。増幅産物が検出限界に到達するときのサイクル数（CT）と初期鋳型量とは逆相関の関係にあることから、リアルタイム測定法ではCTを測定することによって初期鋳型量を定量している。数段階の既知量の鋳型を用いてCTを測定し、検量線を作製すれば、未知試料の初期鋳型量の絶対値を算出することができる。RT-PCRで使用する逆転写酵素は、例えば、M-MLV RTase、ExScript RTase（TaKaRa社）、Super Script II RT（Thermo Fisher Scientific社）等を使用することができる。
【００６０】
リアルタイムPCRの反応条件は、一般に、公知のPCR法を基礎として、増幅する核酸断片の塩基長及び鋳型用核酸の量、並びに使用するプライマーの塩基長及びTm値、使用する核酸ポリメラーゼの至適反応温度及び至適pH等により変動するため、これらの条件に応じて適宜定めればよい。一例として、通常、変性反応を94〜95℃で5秒〜5分間、アニーリング反応を50〜70℃で10秒〜1分間、伸長反応を68〜72℃で30秒〜3分間行い、これを１サイクルとして15〜40サイクルほど繰り返して伸長反応を行うことができる。前記メーカー市販のキットを使用する場合には、原則としてキットに添付のプロトコルに従って行えばよい。
【００６１】
リアルタイムPCRで用いられる核酸ポリメラーゼは、DNAポリメラーゼ、特に熱耐性DNAポリメラーゼである。このような核酸ポリメラーゼは、様々な種類のものが市販されており、それらを利用することもできる。例えば、前記Applied Biosystems TaqMan MicroRNA Assays Kit（Thermo Fisher Scientific社）に添付のTaq DNAポリメラーゼが挙げられる。特にこのような市販のキットには、添付のDNAポリメラーゼの活性に最適化されたバッファ等が添付されているので有用である。
【００６２】
（２）翻訳産物の測定
BSCE鑑別遺伝子の翻訳産物の測定は、BSCE鑑別遺伝子がコードするタンパク質（ペプチド）量の測定であってもよいし、そのタンパク質が有する活性の測定であってもよい。
【００６３】
（２−１）タンパク質量の測定
一般にタンパク質量の測定には、そのタンパク質のアミノ酸配列、特に特異性の高い特徴的なアミノ酸配列を認識して、結合する結合子を用いる方法が採用される。そのような結合子には、例えば、抗体若しくはその抗体フラグメント又は核酸アプタマーが挙げられる。
【００６４】
（抗体）
本工程で使用する抗体又はその断片は、BSCE鑑別遺伝子がコードするタンパク質（BSCRマーカータンパク質）の一部をエピトープとして認識し、抗原抗体反応によってそれに特異的に結合することで、BSCEマーカータンパク質を検出することができる。ここでいう「一部」とは、5〜15個、好ましくは5〜10個、より好ましくは6〜10個の連続するアミノ酸からなる領域をいう。
【００６５】
本工程で使用する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は組換え抗体のいずれであってもよい。より特異的な検出を可能にするためには、モノクローナル抗体又は組換え抗体が好ましい。抗体のグロブリンタイプは、特に限定されるものではなく、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、IgYのいずれであってもよいが、IgG及びIgMが好ましい。また、本態様の抗体の由来生物種は、特に限定はしない。哺乳動物及び鳥を含めたあらゆる動物由来とすることができる。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ニワトリ、又はヒトなどが挙げられる。
【００６６】
本明細書において前記「組換え抗体」とは、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体及び合成抗体をいう。
【００６７】
「キメラ抗体」とは、ある抗体において、軽鎖及び重鎖の定常領域（C領域：Constant region）を他の抗体の軽鎖及び重鎖のC領域で置換した抗体である。例えば、マウス抗ヒトモノクローナル抗体において、その軽鎖及び重鎖のC領域を適当なヒト抗体のC領域と置換した抗体が該当する。つまり、この場合、CDRを包含する可変領域（V領域：Variable region）はマウス抗体由来であり、C領域はヒト抗体由来となる。
【００６８】
「ヒト化抗体」とは、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、標的抗原に対するヒト以外の哺乳動物由来の抗体中のCDRとヒト抗体のCDRとを置換したモザイク抗体である。例えば、マウス抗ヒトFBXO32抗体の各CDR領域（CDR１〜CDR3）をコードするDNA配列を、適当なヒト抗体由来の対応する各CDRをコードするDNA配列と置換した組換え抗体遺伝子を調製し、それを発現させることによって得られる抗体が該当する。
【００６９】
「合成抗体」とは、化学的方法又は組換えDNA法を用いることによって合成した抗体をいう。例えば、適当な長さと配列を有するリンカーペプチド等を介して、特定の抗体の一以上のVL及び一以上のVHを人工的に連結させた一量体ポリペプチド分子、又はその多量体ポリペプチドが該当する。このようなポリペプチドの具体例としては、一本鎖Fv（scFv ：single chain Fragment oｆ variable region）（Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL参照）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ(tetrabody)等が挙げられる。免疫グロブリン分子において、VL及びVHは、通常別々のポリペプチド鎖（軽鎖と重鎖）上に位置する。一本鎖Fvは、これら2つのポリペプチド鎖上のV領域を十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、1本のポリペプチド鎖に包含した構造を有する合成抗体断片である。一本鎖Fv内において両V領域は、互いに自己集合して1つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。一本鎖Fvは、それをコードする組換えDNAを、公知技術を用いてファージゲノムに組み込み、発現させることで得ることができる。ダイアボディは、一本鎖Fvの二量体構造を基礎とした構造を有する分子である(Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448)。トリアボディ、及びテトラボディは、ダイアボディと同様に一本鎖Fv構造を基本としたその三量体、及び四量体構造を有する。それぞれ、三価、及び四価の抗体断片であり、多重特異性抗体であってもよい。
【００７０】
本工程で使用する抗体は、BSCEマーカータンパク質との解離定数が、10-8M以下、好ましくは10-9M以下、より好ましくは10-10M以下の高い親和性を有することが好ましい。上記解離定数は、当該分野で公知の技術を用いて測定することができる。例えば、BIAcoreシステム（GE Healthcare社）により速度評価キットソフトウェアを用いて測定してもよい。
【００７１】
本工程で使用する本態様のポリクローナル抗体は、適当な動物にBSCEマーカータンパク質を免疫する当該分野で公知の方法により得ることができる。また、モノクローナル抗体も当該分野の慣用技術である公知の方法により得ることができる。例えば、BSCEマーカータンパク質又はそのペプチド断片でマウス等を免疫した後、免疫された動物から抗体産生細胞を採取する。その抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして標的抗原として用いたBSCEマーカータンパク質等に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定すればよい。
【００７２】
「抗体フラグメント」とは、前述の抗体の抗原結合活性を有するペプチド断片であって、例えば、Fab、F(ab’)2、Fv等が挙げられる。
【００７３】
本工程で使用する抗体又はその抗体フラグメントは、修飾されていてもよい。ここでいう「修飾」とは、抗体検出に必要な標識、又は抗原特異的結合活性化に必要な機能上の修飾を含む。標識には、例えば、前述の蛍光物質、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる標識が挙げられる。また、修飾には、標的抗原であるBSCEマーカータンパク質に対する親和性を調整するため行われる抗体のグリコシル化等が挙げられる。具体的には、例えば、抗体のフレームワーク領域（FR：Framework region）において、グリコシル化部位を構成するアミノ酸残基に、置換を導入してグリコシル化部位を除去し、それによって、その部位のグリコシル化を喪失させる改変等がある。
【００７４】
（核酸アプタマー）
「核酸アプタマー」とは、核酸で構成されるアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸分子の二次構造、さらに三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合し、標的物質の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を持つリガンド分子をいう。核酸アプタマーを構成するヌクレオチドは、通常は天然核酸であるRNA及び／又はDNAであるが、転写又は複製可能な非天然型ヌクレオチドを含んでいてもよい。好適には、RNAのみで構成されるRNAアプタマー、又はDNAのみで構成されるDNAアプタマーである。
【００７５】
本工程で使用する核酸アプタマーは、BSCEマーカータンパク質を標的分子として、当該分野で公知の方法により作製することができる。例えば、SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法を用いた試験管内選別法が挙げられる。SELEX法とは、例えば、RNAアプタマーを分離する場合であれば、「ランダム配列領域とその両端にプライマー結合領域を有する多数のRNA分子によって構成されるRNAプールから標的分子であるBSCEマーカータンパク質に結合したRNA分子を選択する。回収したRNA分子をRT-PCR反応によって増幅した後、得られたcDNA分子を鋳型として転写を行い、選択されたRNA分子の増幅産物を得て、それを次のラウンドのRNAプールにする。」という一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対して、より結合力の強いRNA分子を選択する方法である。一方、SELEX法で、DNAアプタマーを分離する場合には、「ランダム配列領域とその両端にプライマー結合領域を有する多数のDNA分子によって構成されるDNAプールから標的分子であるBSCEマーカータンパク質に結合したDNA分子を選択する。選択したDNA分子をPCR反応によって増幅し、それを次のラウンドのDNAプールにする」という一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対して、より結合力の強いDNA分子を選択する方法である。ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。一般的にランダム配列領域は、20〜80塩基、プライマー結合領域は、それぞれ15〜40塩基の範囲が好ましい。標的分子への特異性を高めるためには、予め標的分子に類似する分子とRNAプール又はRNAプールとを混合し、標的分子と結合しなかったRNA分子又はDNA分子からなるプールを用いればよい。以上の方法によって最終的に得られた核酸分子を本態様の核酸アプタマーとして利用する。なお、SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, U.S.A.92: 11509-11513）に準じて行えばよい。
【００７６】
本工程で使用する核酸アプタマーは、蛍光物質等の標識物質を用いて標識することもできる。標識物質の種類は、標的分子への結合能を阻害しない範囲において、上述した標識物質のいずれを使用してもよい。また、食道類基底細胞癌鑑別用試薬が前述のプローブの場合の時と同様に、核酸アプタマーを固相担体上に固定した状態で提供することもできる。核酸アプタマーを固定する固相担体の素材は限定しない。例えば、前述した基板と同様の素材を使用することができる。
【００７７】
（２−２）タンパク質活性の測定
タンパク質活性の測定には、そのタンパク質が有する活性に応じた測定方法が採用される。例えば、リガンドと受容体、又は転写因子とDNAのようなペプチド−タンパク質、低分子化合物−タンパク質、又はタンパク質−核酸のように、BSCEマーカータンパク質が他の物質と結合して機能する場合であれば、BSCEマーカータンパク質の結合活性を測定すればよい。結合活性を測定する具体例としては、上述の表面プラズモン共鳴法や水晶振動子マイクロバランス法を利用して測定する方法が挙げられる。例えば、BSCEマーカータンパク質が転写因子の場合、その標的DNA配列を金属薄膜表面に標的核酸の塩基配列に固定化し、BSCEマーカータンパク質を含み得る被験体又は健常体若しくは健常体群から採取された試料を金属薄膜表面に流通させてBSCEマーカータンパク質と標的DNA配列の結合量を検出することによってBSCEマーカータンパク質の活性を測定することができる。また、BSCEマーカータンパク質が酵素として機能する場合であれば、基質を添加してその触媒活性を測定すればよい。
【００７８】
２−２−２．算出工程
「算出工程」とは、前記測定工程で得られた測定値に基づいて、特定の値を算出する工程である。本工程は、合算値算出工程と平均測定値算出工程の2つの独立した工程を含み、いずれか一方、又は両方を選択することができる。
【００７９】
（ａ）合算値算出工程
合算値算出工程では、前記測定工程で得られた測定値に基づいてBSCEマーカーを構成する各BSCE鑑別遺伝子の発現比を算出し、その合算値を得る。ここでいう「遺伝子の発現比」とは、BSCEマーカーを構成する一の遺伝子において、測定工程で得た被験者及び健常者又は健常者群の測定値から算出される比率をいう。発現比は、すべての検体について共通のサンプル（以下「共通リファレンス」という。）に対する相対比として算出される。発現比を算出する際の共通リファレンスは、共通であればどのようなものでも構わない。例えば、特定の細胞株でもよく、複数の細胞株を混合したものでもよい。また、健常者でもよい。その場合、健常者は一人であってもよいが、複数からなる健常者群が好ましい。
【００８０】
発現比の算出は、具体的には、例えば、BSCEマーカーにおいて必須BSCE鑑別遺伝子群の一つであるCOL9A2遺伝子の被験者の測定値をA1、共通リファレンスの測定値をB1とした場合、COL9A2遺伝子の発現比はA1/B1で表される。同様に、FGF3遺伝子の被験者の測定値をA2、共通リファレンスの測定値をB2とした場合、FGF3遺伝子の発現比はA2/B2で表される。また、NTPX2遺伝子の被験者の測定値をA3、共通リファレンスの測定値をB3とした場合、NTPX2遺伝子の発現比はA3/B3で表され、COL9A3遺伝子の被験者の測定値をA4、共通リファレンスの測定値をB4とした場合、COL9A3遺伝子の発現比はA4/B4で表され、そしてCOL9A1遺伝子の被験者の測定値をA5、共通リファレンスの測定値をB5とした場合、COL9A1遺伝子の発現比はA5/B5で表される。このとき本工程で得られる発現比の合算値は、A1/B1＋A2/B2＋A3/B3＋A4/B4＋A5/B5で表される。被験者と共通リファレンスの発現比を算出する場合には、予め共通リファレンスに含まれる各検体の平均測定値を算出し、その平均測定値と被験者の測定値から発現比を算出すればよい。例えば、共通リファレンスに含まれる各検体がBa、Bb、Bc、及びBdからなる場合、COL9A2遺伝子のそれぞれの測定値をBa1、Bb1、Bc1、及びBd1で表すと、COL9A2遺伝子の発現比は4A1/(Ba1+Bb1+Bc1+Bd1)で表される。BSCEマーカーが必須BSCE鑑別遺伝子群に加えて選択BSCE鑑別遺伝子を含む場合、その選択BSCE鑑別遺伝子の前記発現比も算出され、合算される。なお、各BSCE鑑別遺伝子の発現比はB/Aで表すこともできる。
【００８１】
（ｂ）平均測定値算出工程
平均測定値算出工程では、前記測定工程で得られた測定値に基づいて被験者及び健常者群のそれぞれにおいて、BSCEマーカーを構成するBSCE鑑別遺伝子群から平均測定値を算出する。また、ここでは健常者群を構成するそれぞれの健常者において、BSCEマーカーを構成するBSCE鑑別遺伝子群から平均測定値を算出する。平均測定値は、例えば、BSCEマーカーが必須BSCE鑑別遺伝子群を含む7種のBSCE鑑別遺伝子で構成される場合、各BSCE鑑別遺伝子の測定値の総和を種類数である7で除することで算出できる。平均測定値算出工程では、原則として平均測定値を算出するが、必要に応じて、被験者及び健常者群のそれぞれの測定値の総和、すなわちBSCEマーカーを構成するBSCE鑑別遺伝子群の種類数で除する前の値を算出することもできる。
【００８２】
２−２−３．判定工程
「判定工程」とは、前記算出工程で得られた値に基づいて、被験者におけるBSCEの罹患を判定する工程である。本工程は、前記算出工程における2つの工程、すなわち合算値算出工程と平均測定値算出工程のそれぞれで得られた値に基づいて異なる方法で判定を行う。
【００８３】
（ａ）合算値算出工程で得られた値に基づく場合
算出工程で合算値算出工程を行った場合、得られた合算値がROC曲線から導かれる所定のカットオフ値(cutoff value)を超えたときには、その被験者はBSCEに罹患している可能性が高いと判定する。
【００８４】
「ROC曲線(Receiver Operatorating Characteristic curve、受信者動作特性曲線)」は、縦軸を真陽性率（TPF: True Position Fraction）、すなわち感度、横軸を偽陽性率（FPF: False Position Fraction）、すなわち（１−特異度）とし、検査結果のどの値を所見ありと判断するかの閾値、つまりカットオフポイント(cutoff point)を媒介変数として変化させてプロットしていくことで作成される。特異度とは、陰性者を正確に陰性と判断する率である。
【００８５】
作成したROC曲線から、どのカットオフポイントをカットオフ値として採用するかは、疾患の重症度や検査の位置づけ、その他種々の条件より決定すればよい。通常、カットオフポイントを偽陽性率の低い点に採ると、健常者で陽性となる者は減るものの、逆に有疾患者を多数除いてしまう結果、感度が低くなる。反対に感度を高めると健常者における偽陽性率が高くなってしまう。一般に感度、特異度をともに高める（1に近づくようする）ためには、カットオフ値がROC曲線上で点(0,1)に最も近い点を与える値に設定すればよい。なお、生検のような侵襲の大きな検査の前にスクリーニング検査としてその検査を実施するような状況では、取りこぼしを少なくするために、感度が高めになるようにカットオフ値を設定すればよい。
【００８６】
（ｂ）平均測定値算出工程で得られた値に基づく場合
算出工程で平均測定値算出工程を行った場合、得られた健常者群又はBSCE以外の食道癌患者群の平均測定値に対する被験者の平均測定値が統計学的に有意に大きい場合、その被験者は食道類基底細胞癌に罹患している可能性が高いと判定する。
【００８７】
本明細書において、「統計学的に有意」とは、被験者と健常者群又はBSCE以外の食道癌患者群の測定値の差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。例えば、得られた値の危険率（有意水準）が小さい場合、具体的には5％より小さい場合（p<0.05）、1％より小さい場合（p<0.01）、又は0.1％より小さい場合（p<0.001）が挙げられる。ここで示す「p（値）」は、統計学的検定において、統計量が仮定した分布の中で、仮定が偶然正しくなる確率を示す。したがって「p」が小さいほど、仮定が真に近いことを意味する。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントt検定法、共変量分散分析等を用いることができる。
【００８８】
本明細書では、健常者群又はBSCE以外の食道癌患者群の平均測定値と被験者の平均測定値との比較において、統計学的に有意に差がある場合、その被験体はBSCEに罹患していると判定する。例えば、健常者群又はBSCE以外の食道癌患者群の平均測定値に対する被験者の平均測定値が1.5倍以上、2.0倍以上、3.0倍以上、4倍以上、5倍以上、又は6倍以上の場合、通常は統計学的な有意差があるとみなすことができる。
【００８９】
２−３．効果
本態様のBSCE罹患鑑別方法によれば、生検や手術により摘出した検体を調べることで、その検体を提供した被験者がBSCEか、又はその他の食道癌かを正確に鑑別することができる。正診率の高い本態様のBSCE罹患鑑別方法によって、BSCEであると確定診断をすることが可能となり、通常型食道扁平上皮癌とは違う病態であると認識し、再発リスクや治療法の判断を考慮し、対応できる利点がある。
【００９０】
また、BSCEの確実な診断と、それに伴う症例集積が進むことで、希少疾患であるBSCEのさらなる病態を把握し、最適な治療法を導き出すことが可能となる。さらに、一般的に予後不良であるBSCEの生命予後の改善に寄与できる。
【００９１】
従来、BSCEは、病理学的診断に基づいて判断されていたが、診断結果を判断する医師の差や病院間の差が存在していた。しかし、本態様のBSCE罹患鑑別方法によれば、BSCE診断を補助する客観的なデータを提供することができる。
【００９２】
３．食道類基底細胞癌検出用試薬
３−１．概要
本発明の第３の態様は、食道類基底細胞癌（BSCE）検出用試薬である。本態様のBSCE検出用試薬は、例えば食道癌に罹患している被験者由来の試料に適用することで、その被験者の食道癌が食道類基底細胞癌であるか、その他の食道癌であるかを鑑別することができる。
【００９３】
３−１−１．構成
本態様のBSCE検出用試薬は、BSCEマーカーを構成するBSCE鑑別遺伝子の転写産物、すなわちmRNA又はcDNAを検出するためのプローブ又はプライマーセット、又はBSCEマーカータンパク質を検出するための抗体又は核酸アプタマーからなる。これらの具体的な構成については、第２態様の測定工程に記載している。例えば、BSCEマーカーを構成する5種の必須BSCE鑑別遺伝子群の転写産物を検出する場合、BSCE検出用試薬は、配列番号１４１〜１４５で示す塩基配列からなるプローブ群（相補配列を含む）を含むことができる。また、この場合、BSCE検出用試薬は、配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列からなる一以上のプローブをさらに含むことができる。より好ましくは、配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列からなる一以上のプローブを、またさらに好ましくは１５４〜２１０で示す塩基配列からなる一以上のプローブを含んでいてもよい。
【００９４】
本態様のBSCE検出用試薬が上記のようなプローブの場合、BSCE鑑別用試薬は、各プローブを基板上に固定したDNAマイクロアレイ又はDNAマイクロチップの状態で提供することもできる。各プローブを固定する基板の素材は、限定はしないが、ガラス板、石英板、シリコンウェハー等が通常使用される。基板の大きさは、例えば、3.5mm×5.5mm、18mm×18mm、22mm×75mmなどが挙げられるが、これはプローブのスポット数やそのスポットの大きさなどに応じて様々に設定することができる。プローブは、1スポットあたり通常0.1μg〜0.5μgのヌクレオチドが用いられる。ヌクレオチドの固定化方法には、ヌクレオチドの荷電を利用してポリリジン、ポリ-L-リジン、ポリエチレンイミン、ポリアルキルアミン等のポリ陽イオンで表面処理した固相担体に静電結合させる方法や、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基などの官能基を導入した固相表面に、アミノ基、アルデヒド基、SH基、ビオチンなどの官能基を導入したヌクレオチドを共有結合により結合させる方法が挙げられる。
【００９５】
また、本態様のBSCE検出用試薬がBSCEマーカータンパク質を特定期に認識する抗体又はそのフラグメントの場合、BSCE鑑別用試薬は、固相担体上に固定化された状態で提供することができる。固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。固定化は、固相担体と抗体又はそのフラグメントとを物理的吸着法、化学的結合法又はこれらの併用等の公知の方法に従って結合させることにより行うことができる。
【００９６】
３−２．効果
本態様のBSCE検出用試薬を用いて、食道癌罹患歴のある被験者又は食道癌罹患の疑いのある被験者に適用することで、食道癌罹患歴のある被験者がBSCEに罹患しているか否か若しくは罹患していたか否か、又はBSCEとBSCE以外の他の主要な食道癌のどちらに罹患しているか、また食道癌罹患の疑いのある被験者がBSCEに罹患しているか否かを客観的かつ正確に判定することができる。特に、従来の病理診断では鑑別することが困難であったBSCEと食道扁平上皮癌との区別も、本態様のBSCE検出用試薬を用いることで容易に鑑別することが可能となる。
【００９７】
４．食道類基底細胞癌検出キット
４−１．概要
本発明の第４の態様は食道類基底細胞癌（BSCE)検出キットである。本発明のBSCE検出キットは、第３態様のBSCE検出用試薬を必須の構成要素として含む。
【００９８】
４−２．構成
本発明のBSCE検出キットを構成する第３態様のBSCE検出用試薬の構成は、特に限定されず、プローブ、プライマーセット、抗体、核酸アプタマーのいずれであってもよい。それぞれは、少なくともBSCEマーカーを構成する5種の必須BSCE鑑別遺伝子群の転写産物又は翻訳産物を検出できればよいが、好ましくは配列番号１４６〜１４８で示す塩基配列を含む3種の選択BSCE鑑別遺伝子の一以上、より好ましくは配列番号１４９〜１５３で示す塩基配列を含む5種の選択BSCE鑑別遺伝子の一以上、さらに好ましくは配列番号１５４〜２１０で示す塩基配列を含む57種の選択BSCE鑑別遺伝子の一以上を検出できればよい。また、プローブ、プライマーセット、抗体、核酸アプタマー等を組み合わせて包含することもできる。
【００９９】
本発明のBSCE検出キットは、第３態様のBSCE検出用試薬に加えた、BSCEマーカーの検出に必要な他の試薬、例えば、バッファや二次抗体、検出及び結果鑑別に用いる説明書を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１００】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、この実施例は単なる一例示に過ぎず、本発明は実施例に記載の範囲に限定されるものではない。【０１０１】
＜実施例１＞
（目的）
BSCEマーカーを構成するBSCE鑑別遺伝子を特定する。
（方法と結果）【０１０２】
１．生体試料
１−１．対象
2008年１月から2015年7月の間に、福島県立医科大学臓器再生外科学講座において、本研究に対する同意が得られた食道癌患者のうち、手術及び内視鏡的生検で生体試料の採取が可能であった患者98名を対象とした。【０１０３】
１−２．生体試料の採取方法
（１）手術検体に関しては、癌摘出直後、病変部分及び病変部から5cm以上離れた正常部分から約7×7mm大の検体を試料として採取した後、凍結用チューブに入れ、液体窒素で凍結させた。残りの癌標本は、ホルマリン固定後、パラフィン包埋（FFPE：Formalin-Fixed Paraffin Embedded)切片を作製し、後述する病理学的診断を行った。手術検体数は、BSCEと診断された7サンプルを含む57サンプルである。【０１０４】
（２）生検検体に関しては、上部消化管内視鏡検査時に生検鉗子（OLYMPUS FB-230K）を用いて、病変部分及び正常部分から、約3×3mm大の検体を試料として採取した後、凍結用チューブに入れ、液体窒素で凍結させた。また、凍結用検体採取部位からできるだけ近接した病変部分から再度検体を採取し、ホルマリン固定後、FFPE切片を作製し、後述する病理学的診断を行った。【０１０５】
１−３．ホルマリン固定パラフィン包埋組織の入手
検証用のサンプルとして、USbiomax社から「食道類基底細胞癌」として販売されていたFFPE組織20検体を購入した。【０１０６】
１−４．病理学的診断
上記「１-２．生体試料の採取方法」で作製したFFPE切片の組織（FFPE組織）、又は「１-３．ホルマリン固定パラフィン包理組織の入手」で購入したFFPE組織から病理切片を作製した。病理切片をH.E（Hematoxylin and Eosin）染色し、二人の病理医により独立に組織学的診断を行った。病理学的診断は、Wainらの示した病理学的基準を用いて行い、かつ、Imamhasanら（Imamhasan A., et al., 2012, Human Pathology 43:2012-2023）らが示した病理学的形態の6パターンを参照とした。当該６パターンは、次のA〜Fに示す通りである。【０１０７】
（A）中心壊死を伴う充実性胞巣（solid nest with comedo-type necrosis）
（B）篩状偽房状（Cribriform pattern and pseudoacini formation）
（C）導管様配列（ductal differentiation）
（D）腺様小嚢胞様胞巣（small nests with a microcystic and/or trabecular pattern）
（E）硝子様物質の沈着（hyaline-like material deposition）
（F）扁平上皮癌部分の併存（coexistence of invasive SCC component）
各症例の診断は、上記A〜Fの所見の発現割合も検討し、総合的に診断した。なお、本実施例では、検体の大部分が扁平上皮癌成分であっても、一部に食道類基底細胞癌成分が混在している検体は、食道類基底細胞癌と認定した。【０１０８】
病理画像は、HSオールインワン蛍光顕微鏡BZ-9000（KEYENCE, Osaka, Japan）を用いて撮影した。画像処理はIllustrator(Adobe System Inc., CA, USA)を用いて行った。【０１０９】
１−５．検体の分類
上記手術検体を対象としてBSCEとその他の食道癌を区別するマーカー遺伝子を抽出した。具体的には次の通りである。【０１１０】
98名の患者のうち、手術検体のみを採取した患者が18名、生検検体のみを採取した患者が68名、手術検体と生検検体の両方を採取した患者が12名であった。病理組織学的検討により、98名の患者のうちBSCEと診断された患者は、7名のみであった。1個人から複数個の検体（手術検体、生検検体）を採取し、遺伝子発現解析を行った。採取した検体から十分な量のRNAが得られ、網羅的遺伝子発現解析が可能であった検体は、合計で369検体であり、その内訳は、手術57検体、生検312検体であった。手術検体の内訳は、正常食道上皮26検体、食道扁平上皮癌23検体、食道類基底細胞癌（BSCE）7検体、食道内分泌細胞癌1検体であった。生検検体の内訳は、正常食道上皮229検体、扁平上皮癌51検体、BSCE 8検体、内分泌細胞癌1検体、腺癌21検体、上皮内腫瘍2検体であった。【０１１１】
手術を行ったBSCEの臨床病理学的特徴を表２に示す。男性（M）5例及び女性（F）1例で、平均年齢は62.6歳（55〜68歳）であった。術前生検においてBSCEと診断されていた患者は3例（3/6、50%）であった。腫瘍径は、平均で28.6mm（12mm〜45mm）、腫瘍の存在部位は、全例が胸部中部食道であった。UICC第7版でのTNM Stage分類では、I期が4例、II期が1例、III期が1例であった。I期の1例が術後58カ月で原病死、III期の1例が術後19カ月で原病死、II期の1例で術後再発を認めるも生存中、I期の3例が無再発生存中（観察期間7〜60ケ月）である。【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
２．DNAマイクロアレイの作製
マイクロアレイ用合成DNAを用いてDNAマイクロアレイを作製した。polyA＋RNA（mRNA）を対象としたDNAマイクロアレイ（以下「システム１」という。）は、ヒト由来の転写産物に対応する31797種類の合成DNA（80 mers）をスライドガラス上にアレイ化して作製した。また、全RNAを対象としたDNAマイクロアレイ（以下「システム２」という）は、ヒト由来の転写産物に対応する14400種類の合成DNA（80 mers）をスライドガラスにアレイ化して作製した。DNAマイクロアレイの作製方法は、Schena M., et al., 1995, Science, 270:467-470に記載の作製方法を参照した。具体的には、超微量分注装置（マイクロダイアグノスティク社製）を用いて、同社推奨のプロトコルに従ってヒト遺伝子断片ライブラリー（マイクロダイアグノスティック社製）をスライドガラス（松波硝子工業社製、HAコートスライドガラス）にプリントして作製した。このDNAマイクロアレイを気相恒温器内にて80℃で1時間静置し、さらにUVクロスリンカー（Hoefer社製、UVC500）を用いて120mJの紫外線を照射した。DNAマイクロアレイの後処理は、特許第4190899号に記載の方法に従った。【０１１４】
３．標識cDNAの調製
３−１．凍結組織からの全RNA抽出
前記「１−２．生体試料の採取方法」で採取し、液体窒素で凍結させた試料から、ISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて、添付のプロトコルに従い、全RNAを抽出した。【０１１５】
３−２．FFPEからの全RNA抽出
前記「１−３．ホルマリン固定パラフィン包埋組織の入手」で購入したFFPE組織から、ISOGEN PB Kit（ニッポンジーン社製）を用いて、添付のプロトコルに従って全RNAを抽出した。【０１１６】
３−３．polyA＋RNA精製
125 μg以上の全RNAが取得できたサンプルについては、引き続き、MicroPoly(A)purist kit（Ambion社製）を用い、添付のプロトコルに従ってpolyA＋RNAを精製した。【０１１７】
３−４．標識cDNAの調製
調製したpolyA＋RNA又は全RNAを鋳型として逆転写反応により検体標識cDNAを調製した。具体的には、2.0μgの前記polyA＋RNA又は5.0μgの前記全RNA、SuperScript II（登録商標）逆転写酵素（Thermo Fisher Scientific社製）及びCyanine5 -deoxyuridinetriphosphate（Cyanine 5-dUTP）（Perkin Elmer社製）を用いて、核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）により調製した。【０１１８】
対照用polyA＋RNA又は全RNAとして、ヒト共通レファレンス（マイクロダイアグノスティック社製）を使用した。ヒト共通レファレンスは、22種のヒト由来の細胞株（A431細胞、A549細胞、AKI細胞、HBL-100細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、HL60細胞、IMR-32細胞、Jurkat細胞、K562細胞、KP4細胞、MKN7細胞、NK-92細胞、Raji細胞、RD細胞、Saos-2細胞、SK-N-MC細胞、SW-13細胞、T24細胞、U251細胞、U937細胞及びY79細胞）のそれぞれから調製されたpolyA＋RNA又は全RNAを等量混合したものである。【０１１９】
ヒト共通レファレンスを鋳型とする対照標識cDNAは、色素標識デオキシヌクレオチドにCyanine3-deoxyuridinetriphosphate（Cyanine 3-dUTP）（Perkin Elmer社製）を用いた以外は、前記検体標識cDNAと同様に調製した。標識cDNAの具体的な調製方法については、各社推奨のプロトコルにそれぞれ従った。【０１２０】
前記検体標識cDNA及び対照標識cDNAを同一試験管内で混合して混合標識cDNAとした後、Micropure EZ（メルクミリポア社製）及びMicrocon YM30（登録商標）（メルクミリポア社製）を用いて精製した。具体的な精製方法については同社推奨のプロトコルに従った。【０１２１】
精製後の混合標識cDNAに対して核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）に付属のハイブリダイゼーションバッファー及び純水を用いて15μL又は７μLに調製し、標識cDNA溶液とした。【０１２２】
４．ハイブリダイゼーション
前記標識cDNA溶液を99℃で5分間加熱して熱変性させ、標識プローブを調製した。標識プローブを「１．DNAマイクロアレイの作製」で作製したDNAマイクロアレイ上に滴下し、ハイブリダイゼーションカセット（マイクロダイアグノスティック社製）に格納した。該ハイブリダイゼーションカセットを気相恒温器（三洋電機バイオメディカ社製）に入れ、42℃で20時間静置した状態で保温した。【０１２３】
ハイブリダイゼーションカセットからDNAマイクロアレイを取り出し、核酸標識・ハイブリダイゼーション試薬（マイクロダイアグノスティック社製）付属のハイブリダイゼーション洗浄溶液を用い、同社推奨のプロトコルに従ってDNAマイクロアレイを洗浄した。【０１２４】
５．食道類基底細胞癌鑑別用マーカーの選出
５−１．遺伝子発現レベルの測定
各遺伝子の発現レベルは、前記「４．ハイブリダイゼーション」においてDNAマイクロアレイ上に固定されたオリゴDNAと結合した標識プローブの蛍光強度に基づいて測定した。洗浄後のDNAマイクロアレイ上の蛍光をスキャナGenePix4000B（Axon Instrument社製）を用いて測定した後、スキャナに付属の解析ソフトウェアGenePixPro（Axon Instrument社製）を用いて光学的に評価し、蛍光強度の相対値を数値化した。具体的には、DNAマイクロアレイ上に固定されたオリゴDNAスポットにおける検体標識cDNA由来の蛍光強度（Cyanine 5蛍光強度）と対照標識cDNA由来の蛍光強度（Cyanine 3蛍光強度）をスポット毎に測定し、各スポットにおけるCyanine5/Cyanine3蛍光強度比（対数変換相対的発現比：log2比）を算出することで、スポット間の遺伝子発現レベルの補正（スケーリング）を行った。また、DNAマイクロアレイ上のスポット以外の場所における蛍光強度からバックグラウンドを算出し、ノイズとして各スポットの蛍光強度比から控除した。【０１２５】
５−２．BSCEとその他の食道癌を区別するためのマーカーとなる遺伝子群の抽出
BSCEと病理診断された7検体を含む手術57検体から、DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイルを取得した。その中から、DNAマイクロアレイのシステム１及びシステム２に共通して搭載されている14400遺伝子を抽出した。次に、食道類基底細胞癌と病理診断された7検体中2検体以上で、蛍光強度が検出限界以下であった遺伝子を除外した。続いて、57検体中少なくとも1検体以上で、対数変換相対的発現比が1以上又は−1以下の条件を満たす遺伝子群を抽出した。さらに、各遺伝子について全検体の対数変換相対的発現比の平均値を算出し、少なくとも1検体以上で、当該平均値との差が1以上又は−1以下の値を有する遺伝子群を抽出した（7379遺伝子）。当該遺伝子群の対数変換相対的発現比の値をもとに、二次元方向でクラスタ分析を行った。【０１２６】
「クラスタ分析」とは、遺伝子発現パターンの類似した遺伝子どうし又はサンプルどうしをグルーピングする統計的手法である。データ間の類似度（例えば、ユークリッド距離等）を定義し、その類似度を用いることにより、遺伝子発現パターンの類似したサンプルどうしをグループ化することができる。階層的クラスタ分析は、解析用ソフトウェア「Expression View Pro」（マイクロダイアグノスティック社）、「GeneMaths XT」（インフォコム社）、「GeneSpring」（アジレント・テクノロジー社）又は「treeview」（スタンフォード大学）、MicroArray Data Analysis tool（フィルジェン社）等を用いても行うことができる。予めBSCEとその他の食道癌を判定するための判別分析モデルを構築しておき、該判別分析モデルに被験者から得られた遺伝子の発現プロファイルに関するデータを入力し、BSCE罹患の有無の判別を行うことができる。例えば、食道癌既往歴者において、判明したBSCE群とその他の食道癌群の2つのクラスタからなる判別分析モデルに、食道癌に罹患した新たな被験者に由来する遺伝子の発現データを加えて、クラスタ分析を行うことにより、その新たな被験者がBSCEとその他の食道癌のいずれの群に入るかで判別することができる。また、例えば、判別分析から判別式を得て、蛍光強度とBSCE罹患を関連付け、判別式にデジタル数値化した被験者の発現シグナルのパターンを代入することにより、BSCE罹患の有無の判別を行うこともできる。【０１２７】
結果を図１に示す。クラスタ分析により、57検体は、BSCE 7検体中6検体で形成されるクラスタ（以下「BSCEクラスタ」という）、主として扁平上皮癌検体で形成されるクラスタ（以下「扁平上皮癌クラスタ」という）、及び主として正常検体を含むクラスタ（以下「正常検体クラスタ」という）に分類された。なお、内分泌細胞癌は、1検体のみであり、クラスタに分かれているとは言えない。【０１２８】
前記BSCEクラスタに含まれる食道類基底細胞癌6検体（以下「BSCE検体群」とする）の対数変換相対的発現比の平均測定値を算出し、その値が1以上になる遺伝子群を抽出した。次に、残りの検体の中からBSCEクラスタに含まれないBSCE 1検体を除いた残り50検体（以下「非BSCE検体群」とする）のうち、少なくとも26検体以上で蛍光強度が検出限界以下の遺伝子群を除いた。非BSCE検体群の対数変換相対的発現比の標準偏差を算出し、その値が0.5未満になる遺伝子群を抽出した。次に、BSCE検体群の対数変換相対的発現比の平均値が非BSCE検体群の対数変換相対的発現比の平均値より１以上大きい遺伝子群を抽出した。さらに、BSCE検体群と非BSCE検体群の間でt検定による二群比較を行い、P値が0.01未満になる遺伝子群を抽出した。その結果として得られた、表１に示す70種の遺伝子を本発明のBSCEマーカーを構成する「BSCE鑑別遺伝子群」として特定した。【０１２９】
70種全てのBSCE鑑別遺伝子群をBSCEマーカーとして用いて、BSCEマーカーがBSCEを鑑別可能かについて、ROC曲線を作成して検証した。その結果を図２（A）に示す。手術検体では曲線の面積、すなわちArea Under the Curve（以下「AUC」という）が1.0000となった。また、BSCEマーカー（70遺伝子）を用いて、感度特異度曲線を作成して検証した。手術検体において、カットオフ値を感度と特異度が交わる点である17.2912に設定したときに、図２（B）に示すように感度（＝特異度）が1.0000となった。これらの結果は、本発明のBSCEマーカーを用いることによって、BSCEを高精度に鑑別可能であること示している。【０１３０】
次に、各検体におけるBSCEマーカー（70遺伝子群）の対数変換相対的発現比の合算値（以下「70遺伝子発現スコア」とする）を算出し、70種のBSCE鑑別遺伝子を70遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直した。結果を図２（C）に示す。この結果も、BSCEマーカーを用いて図中の境界線で示すカットオフ値を設定することによってBSCEを高精度に鑑別できることが立証された。【０１３１】
＜実施例２＞
（目的）
生検検体を用いたときのBSCEマーカーによるBSCE鑑別有効性の検証をする。【０１３２】
（方法と結果）
検体（57検体）の70遺伝子発現スコアと生検検体の70遺伝子発現スコアを合わせてROC曲線を作成して検証した。生検検体の70遺伝子発現スコアは、実施例１で採取した生検312検体からDNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイルを取得し、対数変換相対的発現比に変換した後に、BSCEマーカー（70遺伝子群）のデータを抽出して70種全てのBSCE鑑別遺伝子群について70遺伝子発現スコアを算出した。その結果、図２（D）に示すようにAUCが0.9927となった。また、BSCEマーカー（70遺伝子群）を用いて、手術検体（57検体）と生検検体（312検体）を合わせて感度特異度曲線を作成して検証した結果、図２（E）に示すように、カットオフ値を33.1368に設定した場合、感度が0.9333、特異度が0.9915となった。これらの結果から、本発明のBSCEマーカーを用いることで、生検検体のBSCEを高精度に鑑別できることが示された。【０１３３】
さらに、生検検体（312検体）と手術検体（57検体）と合わせて再度、70遺伝子発現スコアの小さい順に並べ直した。その結果、図２（F）に示すように、BSCEマーカーを用いれば、生検検体と手術検体を合わせた場合であっても図中の境界線で示すカットオフ値を設定することによってBSCEを高精度に鑑別できることが立証された。【０１３４】
なお、生検検体を用いた検証では、100％の感度及び特異度で判別できていない。しかし、生検検体の場合、病理組織学的検査に供した検体と遺伝子発現解析に供した検体は、同一部位の組織を2分割したものではなく、部位が隣接しているだけで互いに異なる。BSCEは、扁平上皮癌部分で覆われている場合や、同一病変内に併存する場合が多いため、病理組織学的検査でBSCEと診断された患者由来の検体でも、その生検検体の中にBSCEの成分が含まれない場合や、その逆の場合もあり得る。しかし、本発明のBSCE罹患鑑別方法が生検検体に適用できないわけではない。実際、手術検体の病理学的診断で腫瘍の大部分は扁平上皮癌であるが約10％程度にBSCEが存在すると診断された患者において、術前の生検検体（3検体）では、2検体がBSCEと、残りの1検体が扁平上皮癌という診断がなされていた。さらにそれらの近傍の部位を当該70遺伝子発現スコアで検証したところ、前者の1検体と後者の1検体がBSCEであるという判定になった。【０１３５】
＜実施例３＞
（目的）
FFPE組織を用いたときのBSCEマーカーによるBSCE鑑別有効性の検証をする。【０１３６】
（方法と結果）
BSCEマーカー検証用のFFPE組織検体として、USbiomax社から購入した前述のFFPE組織20検体を用いた。全FFPE組織を改めて病理学的に診断したところ、13検体が食道類基底細胞癌、2検体が扁平上皮癌、そして5検体が内分泌細胞癌であることが明らかとなった。【０１３７】
これらのFFPE組織検体からDNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイルを取得し、対数変換相対的発現比に変換した後に、BSCEマーカー（70遺伝子群）のデータを抽出して70遺伝子発現スコアを算出した。BSCEマーカー（70遺伝子群）を用いてFFPE組織検体のBSCEを鑑別可能かについて、手術検体（57検体）とFFPE組織検体（20検体）を合わせてROC曲線を作成して検証した。その結果、図２（G）に示すようにAUCが0.9930となった。また、BSCEマーカー（70遺伝子群）を用いて、手術検体（57検体）とFFPE組織検体（20検体）を合わせて感度特異度曲線を作成して検証した結果、図２（H）に示すように、カットオフ値を34.7723に設定した場合、感度が0.9000、特異度が0.9825となった。これらの結果から、本発明のBSCEマーカーを用いることで、FFPE組織検体のBSCEを高精度に鑑別できることが示された。【０１３８】
さらに、FFPE組織検体（20検体）と手術検体（57検体）を合わせて、再度70遺伝子発現スコアの小さい順に並べ直した。その結果、図２（I）に示すように、BSCEマーカーを用いれば、FFPE組織検体と手術検体を合わせた場合であっても図中の境界線で示すカットオフ値を設定することによってBSCEを高精度に鑑別できることが立証された。【０１３９】
＜実施例４＞
（目的）
手術検体、生検検体、及びFFPE検体を用いた群散布図によるBSCE鑑別有効性の検証をする。【０１４０】
（方法と結果）
手術検体、生検検体、及びFFPE組織検体の全てを合わせて、BSCEマーカー（70遺伝子群）の70遺伝子発現スコアによる群散布図を作成した。その結果、図２（J）に示すように、非BSCE検体群の平均値は8.970であり、BSCE検体群の平均値は70.549であった。両者間には統計的に有意差（P＝1.43×10-9）が存在した。【０１４１】
次に、検体の種類ごとに分けて上記と同様に群散布図を作成した。結果を図２（K）に示す。手術検体では、非BSCE検体群の平均値は6.808であり、BSCE検体群の平均値は108.715であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0004）が存在した。生検検体を対象とした場合、非BSCE検体群の平均値は8.878であり、BSCE検体群の平均値は72.764であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0012）が存在した。FFPE組織検体を対象とした場合、非BSCE検体群の平均値は28.389であり、BSCE検体群の平均値は48.635であった。また、両者間には統計的に有意差（P＝0.0003）が存在した。【０１４２】
以上の結果から、BSCEマーカーの発現レベルを測定することによって、BSCEを高精度に鑑別できることが立証された。【０１４３】
＜実施例５＞
（目的）
BSCEマーカーにおける必須BSCE鑑別遺伝子群を選択する。【０１４４】
（方法と結果）
実施例１で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、ｔ検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。その結果、表１のNo.R-1〜R-5で示す5種のBSCE鑑別遺伝子群で、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。【０１４５】
DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現プロファイルを取得し、対数変換相対的発現比に変換した後に、上記必須BSCE鑑別遺伝子群を構成する5種のBSCE鑑別遺伝子の遺伝子発現データを抽出して合算値（以下「5遺伝子発現スコア」とする）を算出し、その合算値、すなわち5遺伝子発現スコア値を用いてROC曲線を作成した。その結果、図３（A）に示すようにAUCが手術検体のみでは1.0000に、また図３（C）に示すように手術検体と生検検体では0.9533に、そして図３（E）に示すように手術検体とFFPE組織検体では0.9737となった。【０１４６】
次に、感度特異度曲線を作成し検証した結果、図３（B）に示すように手術検体のみではカットオフ値を2.7064に設定した場合、感度及び特異度はともに1.0000となった。また、図３（D）に示すように、手術検体と生検検体ではカットオフ値を4.1997に設定した場合、感度が0.9333、特異度が0.9718となった。さらに、図３（F）に示すように手術検体とFFPE組織検体ではカットオフ値を6.3559に設定した場合、感度が0.9500、特異度が0.9123となった。【０１４７】
続いて、上記5種のBSCE鑑別遺伝子の5遺伝子発現スコアを用いて、手術検体のみ（図３（G））、手術検体と生検検体（図３（H））、及び手術検体とFFPE組織検体（図３（I））についてその5遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直した。その結果、一定のカットオフ値を設定することで、いずれの検体であってもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別できることが明らかとなった。【０１４８】
さらに、上記5種のBSCE鑑別遺伝子の5遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象として群散布図を作成した。結果を図３（J）に示す。非BSCE検体群の平均値は1.052であり、BSCE検体群の平均値は10.496であった。両者間には統計的に有意差（P＝1.61×10-11）が存在した。【０１４９】
続いて、検体の種類ごとに分けて群散布図を作成した。結果を図３（K）に示す。手術検体では非BSCE検体群の平均値は−0.967であり、BSCE検体群の平均値は13.200であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0003）が存在した。生検検体では非BSCE検体群の平均値は1.240であり、BSCE検体群の平均値は9.801であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0048）が存在した。FFPE組織検体を対象とした場合、非BSCE検体群の平均値は7.320であり、BSCE検体群の平均値は9.468であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0265）が存在した。【０１５０】
以上の結果から、表１においてNo.R-1〜R-5で示す5種のBSCE鑑別遺伝子群で構成されるBSCEマーカーであってもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが示された。そこで、この5種のBSCE鑑別遺伝子群を必須BSCE鑑別遺伝子群とした。【０１５１】
＜実施例６＞
（目的）
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。［１］【０１５２】
（方法と結果）
実施例１で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、ｔ検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。その結果、前記必須BSCE鑑別遺伝子群に加えて、さらに表１のNo.R-6〜R-8で示す3種の選択BSCE鑑別遺伝子を含む8種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。【０１５３】
基本操作は、実施例５に準じた。8種のBSCE鑑別遺伝子の遺伝子発現データを抽出して合算値（以下「8遺伝子発現スコア」とする）を算出し、その合算値、すなわち8遺伝子発現スコアからROC曲線を作成した結果、図４（A）に示すようにAUCが手術検体のみでは1.0000に、また図４（C）に示すように手術検体と生検検体では0.9364に、そして図４（E）に示すように手術検体とFFPE組織検体では0.9693となった。【０１５４】
次に、感度特異度曲線を作成し検証した結果、図４（B）に示すように手術検体のみではカットオフ値を2.3660に設定した場合、感度及び特異度はともに1.0000となった。また、図４（D）に示すように、手術検体と生検検体ではカットオフ値を6.0307に設定した場合、感度が0.9333、特異度が0.9746となった。さらに、図４（F）に示すように手術検体とFFPE組織検体ではカットオフ値を9.6492に設定した場合、感度が0.9000、特異度が0.9123となった。【０１５５】
続いて、上記8種のBSCE鑑別遺伝子の8遺伝子発現スコアを用いて、手術検体のみ（図４（G））、手術検体と生検検体（図４（H））、及び手術検体とFFPE組織検体（図４（I））についてその8遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直した結果、一定のカットオフ値を設定することで、いずれの検体であってもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別できることが明らかとなった。【０１５６】
さらに、上記8種のBSCE鑑別遺伝子の8遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象として群散布図を作成した結果、図４（J）に示すように非BSCE検体群の平均値は2.050であり、BSCE検体群の平均値は14.273であった。両者間には統計的に有意差（P＝1.23×10-10）が存在した。【０１５７】
続いて、検体の種類ごとに分けて群散布図を作成した結果を図４（K）に示す。手術検体では非BSCE検体群の平均値は−0.623であり、BSCE検体群の平均値は18.805であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0008）が存在した。生検検体では非BSCE検体群の平均値は2.294であり、BSCE検体群の平均値は12.767であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0049）が存在した。FFPE組織検体を対象とした場合、非BSCE検体群の平均値は10.538であり、BSCE検体群の平均値は12.758であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0690）が存在した。【０１５８】
以上の結果から、表１においてNo.R-1〜R-8で示す8種のBSCE鑑別遺伝子群で構成されるBSCEマーカーもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが示された。【０１５９】
＜実施例７＞
（目的）
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。［２］【０１６０】
（方法と結果）
実施例１で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、ｔ検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。その結果、前記必須BSCE鑑別遺伝子群に加えて、さらに表１のNo.R-9〜R-13で示す5種の選択BSCE鑑別遺伝子を含む10種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。【０１６１】
基本操作は、実施例５に準じた。前記10種のBSCE鑑別遺伝子の遺伝子発現データを抽出して合算値（以下「10遺伝子発現スコア」とする）を算出し、その合算値、すなわち10遺伝子発現スコアからROC曲線を作成した結果、図５（A）に示すようにAUCが手術検体のみでは1.0000に、また図５（C）に示すように手術検体と生検検体では0.9714に、そして図５（E）に示すように手術検体とFFPE組織検体では0.9930となった。【０１６２】
次に、感度特異度曲線を作成し検証した結果、図５（B）に示すように手術検体のみではカットオフ値を2.2155に設定した場合、感度及び特異度はともに1.0000となった。また、図５（D）に示すように、手術検体と生検検体ではカットオフ値を6.6384に設定した場合、感度が0.9333、特異度が0.9915となった。さらに、図５（F）に示すように手術検体とFFPE組織検体ではカットオフ値を6.5719に設定した場合、感度が0.9500、特異度が0.9825となった。【０１６３】
続いて、上記10種のBSCE鑑別遺伝子の10遺伝子発現スコアを用いて、手術検体のみ（図５（G））、手術検体と生検検体（図５（H））、及び手術検体とFFPE組織検体（図５（I））についてその10遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直した結果、一定のカットオフ値を設定することで、いずれの検体であってもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別できることが明らかとなった。【０１６４】
さらに、上記10種のBSCE鑑別遺伝子の10遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象として群散布図を作成した結果、図５（J）に示すように非BSCE検体群の平均値は0.311であり、BSCE群の平均値は13.584であった。両者間には統計的に有意差（P＝1.63×10-10）が存在した。【０１６５】
続いて、検体の種類ごとに分けて群散布図を作成した結果を図５（K）に示す。手術検体では非BSCE検体群の平均値は−1.814であり、BSCE検体群の平均値は19.965であった。両者間には統計的に有意差（P＝9.87×10-5）が存在した。生検検体では非BSCE検体群の平均値は0.551であり、BSCE検体群の平均値は14.208であった。両者間には統計的に有意差（P＝2.52×10-3）が存在した。FFPE組織検体を対象とした場合、非BSCE群の平均値は5.063であり、BSCE検体群の平均値は9.764であった。両者間には統計的に有意差（P＝9.27×10-4）が存在した。【０１６６】
以上の結果から、表１においてNo.R-1〜R-5、及びNo.R-9〜R-13で示す10種のBSCE鑑別遺伝子群で構成されるBSCEマーカーもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが示された。【０１６７】
＜実施例８＞
（目的）
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。［３］【０１６８】
（方法と結果）
実施例５〜７で検証した、必須BSCE鑑別遺伝子群を含む表１のNo.R-1〜R-13で示す13種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。【０１６９】
基本操作は、実施例５に準じた。前記13種のBSCE鑑別遺伝子の遺伝子発現データを抽出して合算値（以下「13遺伝子発現スコア」とする）を算出し、その合算値、すなわち13遺伝子発現スコアからROC曲線を作成した結果、図６（A）に示すようにAUCが手術検体のみでは1.0000に、また図６（C）に示すように手術検体と生検検体では0.9482に、そして図６（E）に示すように手術検体とFFPE組織検体では0.9877となった。【０１７０】
感度特異度曲線も図６（B）に示すように手術検体のみではカットオフ値を2.7974に設定した場合、感度及び特異度はともに1.0000となった。また、図６（D）に示すように、手術検体と生検検体ではカットオフ値を8.5372に設定した場合、感度が0.9333、特異度が0.9915となった。さらに、図６（F）に示すように手術検体とFFPE組織検体ではカットオフ値を9.3096に設定した場合、感度が0.9500、特異度が0.9649となった。【０１７１】
続いて、上記13種のBSCE鑑別遺伝子の13遺伝子発現スコア）を用いて、手術検体のみ（図６（G））、手術検体と生検検体（図６（H））、及び手術検体とFFPE組織検体（図６（I））についてその13遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直した結果、一定のカットオフ値を設定することで、いずれの検体であってもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別できることが明らかとなった。【０１７２】
さらに、上記13種のBSCE鑑別遺伝子の13遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象として群散布図を作成した結果、図６（J）に示すように非BSCE検体群の平均値は1.309であり、BSCE群の平均値は17.360であった。両者間には統計的に有意差（P＝3.94×10-10）が存在した。【０１７３】
続いて、検体の種類ごとに分けて群散布図を作成した結果を図６（K）に示す。手術検体では非BSCE検体群の平均値は−1.471であり、BSCE検体群の平均値は25.570であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0003）が存在した。生検検体では非BSCE検体群の平均値は1.605であり、BSCE検体群の平均値は17.174であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0029）が存在した。FFPE組織検体を対象とした場合、非BSCE検体群の平均値は8.281であり、BSCE検体群の平均値は13.055であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0035）が存在した。【０１７４】
以上の結果から、表１においてNo.R-1〜R-13で示す13種のBSCE鑑別遺伝子群で構成されるBSCEマーカーもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが示された。【０１７５】
＜実施例９＞
（目的）
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。［４］【０１７６】
（方法と結果）
実施例１で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、ｔ検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。その結果、前記必須BSCE鑑別遺伝子群に加えて、さらに表１のNo.R-14及びR-15示す2種の選択BSCE鑑別遺伝子を含む7種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。【０１７７】
基本操作は、実施例５に準じた。前記7種のBSCE鑑別遺伝子の遺伝子発現データを抽出して合算値（以下「7遺伝子発現スコア」とする）を算出し、その合算値、すなわち7遺伝子発現スコア値からROC曲線を作成した結果、図７（A）に示すようにAUCが手術検体のみでは1.0000に、また図７（C）に示すように手術検体と生検検体では0.9648に、そして図７（E）に示すように手術検体とFFPE組織検体では0.9904となった。【０１７８】
次に、感度特異度曲線を作成し検証した結果、図７（B）に示すように手術検体のみではカットオフ値を1.1138に設定した場合、感度及び特異度はともに1.0000となった。また、図７（D）に示すように、手術検体と生検検体ではカットオフ値を4.2419に設定した場合、感度が0.9333、特異度が0.9746となった。さらに、図７（F）に示すように手術検体とFFPE組織検体ではカットオフ値を8.2572に設定した場合、感度が0.9000、特異度が1.0000となった。【０１７９】
続いて、上記7種のBSCE鑑別遺伝子の7遺伝子発現スコアを用いて、手術検体のみ（図７（G））、手術検体と生検検体（図７（H））、及び手術検体とFFPE組織検体（図７（I））についてその7遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直した結果、一定のカットオフ値を設定することで、いずれの検体であってもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別できることが明らかとなった。【０１８０】
さらに、上記7種のBSCE鑑別遺伝子の7遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象として群散布図を作成した結果、図７（J）に示すように非BSCE検体群の平均値は0.256であり、BSCE検体群の平均値は12.531であった。両者間には統計的に有意差（P＝1.28×10-11）が存在した。【０１８１】
続いて、検体の種類ごとに分けて群散布図を作成した結果を図７（K）に示す。手術検体では非BSCE検体群の平均値は−2.845であり、BSCE検体群の平均値は15.358であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0003）が存在した。生検検体では非BSCE検体群の平均値は0.617であり、BSCE検体群の平均値は12.544であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0037）が存在した。FFPE組織検体を対象とした場合、非BSCE群の平均値は6.748であり、BSCE検体群の平均値は11.001であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0010）が存在した。【０１８２】
以上の結果から、表１においてNo.R-1〜R-5、及びNo.R-14〜R-15で示す7種のBSCE鑑別遺伝子群で構成されるBSCEマーカーもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが示された。【０１８３】
＜実施例１０＞
（目的）
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。［５］【０１８４】
（方法と結果）
実施例１で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、ｔ検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。実施例６で示した表１のNo.1-〜R-8で示す8種のBSCE鑑別遺伝子群に加えて、さらに表１のNo.R-14及びR-15で示す2種の選択BSCE鑑別遺伝子を含む10種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。【０１８５】
基本操作は、実施例５に準じた。前記10種のBSCE鑑別遺伝子の遺伝子発現データを抽出して合算値（以下「10’遺伝子発現スコア」とする）を算出し、その合算値、すなわち10’遺伝子発現スコア値からROC曲線を作成した結果、図８（A）に示すようにAUCが手術検体のみでは1.0000に、また図８（C）に示すように手術検体と生検検体では0.9437に、そして図８（E）に示すように手術検体とFFPE組織検体では0.9851となった。【０１８６】
次に、感度特異度曲線を作成し検証した結果、図８（B）に示すように手術検体のみではカットオフ値を0.7590に設定した場合、感度及び特異度はともに1.0000となった。また、図８（D）に示すように、手術検体と生検検体ではカットオフ値を6.1962に設定した場合、感度が0.9333、特異度が0.9774となった。さらに、図８（F）に示すように手術検体とFFPE組織検体ではカットオフ値を10.2696に設定した場合、感度が0.9000、特異度が0.9474となった。【０１８７】
続いて、上記10種のBSCE鑑別遺伝子の10’遺伝子発現スコアを用いて、手術検体のみ（図８（G））、手術検体と生検検体（図８（H））、及び手術検体とFFPE組織検体（図８（I））についてその10’遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直した結果、一定のカットオフ値を設定することで、いずれの検体であってもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別できることが明らかとなった。【０１８８】
さらに、上記10種のBSCE鑑別遺伝子の10’遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象として群散布図を作成した結果、図８（J）に示すように非BSCE検体群の平均値は1.254であり、BSCE検体群の平均値は16.308であった。両者間には統計的に有意差（P＝6.69×10-11）が存在した。【０１８９】
続いて、検体の種類ごとに分けて群散布図を作成した結果を図８（K）に示す。手術検体では非BSCE検体群の平均値は−2.502であり、BSCE検体群の平均値は20.963であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0007）が存在した。生検検体では非BSCE検体群の平均値は1.671であり、BSCE検体群の平均値は15.510であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0040）が存在した。FFPE組織検体を対象とした場合、非BSCE群の平均値は9.966であり、BSCE検体群の平均値は14.292であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0039）が存在した。【０１９０】
以上の結果から、表１においてNo.R-1〜R-8、及びNo.R-14〜R-15で示す10種のBSCE鑑別遺伝子群で構成されるBSCEマーカーもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが示された。【０１９１】
＜実施例１１＞
（目的）
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。［６］【０１９２】
（方法と結果）
実施例１で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、ｔ検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。実施例７で示した表１のNo.R-1〜R-5及びNo.R-9〜R-13で示す10種のBSCE鑑別遺伝子群に加えて、さらに表１のNo.R-14及びR-15で示す2種の選択BSCE鑑別遺伝子を含む12種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。【０１９３】
基本操作は、実施例５に準じた。前記12種のBSCE鑑別遺伝子の遺伝子発現データを抽出して合算値（以下「12遺伝子発現スコア」とする）を算出し、その合算値、すなわち12遺伝子発現スコア値からROC曲線を作成した結果、図９（A）に示すようにAUCが手術検体のみでは1.0000に、また図９（C）に示すように手術検体と生検検体では0.9772に、そして図９（E）に示すように手術検体とFFPE組織検体では0.9974となった。【０１９４】
次に、感度特異度曲線を作成し検証した結果、図９（B）に示すように手術検体のみではカットオフ値を1.4000に設定した場合、感度及び特異度はともに1.0000となった。また、図９（D）に示すように、手術検体と生検検体ではカットオフ値を6.6782に設定した場合、感度が0.9333、特異度が0.9915となった。さらに、図９（F）に示すように手術検体とFFPE組織検体ではカットオフ値を6.7474に設定した場合、感度が0.9500、特異度が1.0000となった。【０１９５】
続いて、上記12種のBSCE鑑別遺伝子の12遺伝子発現スコアを用いて、手術検体のみ（図９（G））、手術検体と生検検体（図９（H））、及び手術検体とFFPE組織検体（図９（I））についてその12遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直した結果、一定のカットオフ値を設定することで、いずれの検体であってもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別できることが明らかとなった。【０１９６】
さらに、上記12種のBSCE鑑別遺伝子の12遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象として群散布図を作成した結果、図９（J）に示すように非BSCE検体群の平均値は−0.485であり、BSCE検体群の平均値は15.619であった。両者間には統計的に有意差（P＝9.03×10-11）が存在した。【０１９７】
続いて、検体の種類ごとに分けて群散布図を作成した結果を図９（K）に示す。手術検体では非BSCE検体群の平均値は−3.692であり、BSCE検体群の平均値は22.123であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0001）が存在した。生検検体では非BSCE検体群の平均値は−0.072であり、BSCE検体群の平均値は16.950であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0024）が存在した。FFPE組織検体を対象とした場合、非BSCE群の平均値は4.490であり、BSCE検体群の平均値は11.297であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0001）が存在した。【０１９８】
以上の結果から、表１においてNo.R-1〜R-5、No.R-9〜R-13、及びNo.R-14〜R-15で示す12種のBSCE鑑別遺伝子群で構成されるBSCEマーカーもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが示された。
＜実施例１２＞
（目的）
BSCEマーカーにおけるBSCE鑑別遺伝子群の絞り込みを行う。［７］【０１９９】
（方法と結果）
実施例１で特定した70種のBSCE鑑別遺伝子を用いて、BSCE検体群と非BSCE検体群の間の平均値の差、標準偏差、ｔ検定によるP値、BSCE検体群のスコア値及びクラスタ分析により形成したクラスタを考慮して優先順位付けをした。実施例７で示した表１のNo.R-1〜R-13で示す13種のBSCE鑑別遺伝子群に加えて、さらに表１のNo.R-14及びR-15で示す2種の選択BSCE鑑別遺伝子を含む15種のBSCE鑑別遺伝子群でも、BSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが明らかとなった。【０２００】
基本操作は、実施例５に準じた。前記15種のBSCE鑑別遺伝子の遺伝子発現データを抽出して合算値（以下「15遺伝子発現スコア」とする）を算出し、その合算値、すなわち15遺伝子発現スコアからROC曲線を作成した結果、図１０（A）に示すようにAUCが手術検体のみでは1.0000に、また図１０（C）に示すように手術検体と生検検体では0.9556に、そして図１０（E）に示すように手術検体とFFPE組織検体では0.9939となった。【０２０１】
次に、感度特異度曲線を作成し検証した結果、図１０（B）に示すように手術検体のみではカットオフ値を1.0559に設定した場合、感度及び特異度はともに1.0000となった。また、図１０（D）に示すように、手術検体と生検検体ではカットオフ値を8.8317に設定した場合、感度が0.9333、特異度が0.9915となった。さらに、図１０（F）に示すように手術検体とFFPE組織検体ではカットオフ値を9.2942に設定した場合、感度が0.9500、特異度が0.9825となった。【０２０２】
続いて、上記15種のBSCE鑑別遺伝子の15遺伝子発現スコアを用いて、手術検体のみ（図１０（G））、手術検体と生検検体（図１０（H））、及び手術検体とFFPE組織検体（図１０（I））についてその15遺伝子発現スコアが小さい順に並べ直した結果、一定のカットオフ値を設定することで、いずれの検体であってもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別できることが明らかとなった。【０２０３】
さらに、上記15種のBSCE鑑別遺伝子の15遺伝子発現スコアを用いて、解析済みの全検体を対象として群散布図を作成した結果、図１０（J）に示すように非BSCE検体群の平均値は0.513であり、BSCE検体群の平均値は19.396であった。両者間には統計的に有意差（P＝2.11×10-10）が存在した。【０２０４】
続いて、検体の種類ごとに分けて群散布図を作成した結果を図１０（K）に示す。手術検体では非BSCE検体群の平均値は−3.349であり、BSCE検体群の平均値は27.728であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0003）が存在した。生検検体では非BSCE検体群の平均値は0.982であり、BSCE検体群の平均値は19.917であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0028）が存在した。FFPE組織検体を対象とした場合、非BSCE群の平均値は7.708であり、BSCE検体群の平均値は14.588であった。両者間には統計的に有意差（P＝0.0003）が存在した。【０２０５】
以上の結果から、表１においてNo.R-1〜R-13、及びNo.R-14〜R-15で示す15種のBSCE鑑別遺伝子群で構成されるBSCEマーカーもBSCE検体群と非BSCE検体群を鑑別し得ることが示された。 【０２０６】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図３−７】
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【図３−８】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図５−８】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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