(57)【要約】  本発明は、対象の皮膚の標的領域における白癬菌の有無を簡便に検出できる方法及びキットを提供することを目的とし、かかる目的を達成するために、対象の皮膚の標的領域における白癬菌の有無を検出するための方法であって、（ａ）極性表面を有する第１の支持体と、前記極性表面に付着した前記標的領域由来の剥離物質とを含んでなる第１の試薬、及び、第２の支持体と、前記第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを含んでなる第２の試薬を準備する工程、（ｂ）工程（ａ）の後、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で、前記第１の試薬における前記剥離物質と前記第２の試薬における前記基質とを接触させる工程、並びに、（ｃ）工程（ｂ）の後、前記第２の試薬における前記基質の分解の有無を検出する工程を含んでなる、前記方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の皮膚の標的領域における白癬菌の有無を検出するための方法であって、
（ａ）極性表面を有する第１の支持体と、前記極性表面に付着した前記標的領域由来の剥離物質とを含んでなる第１の試薬、及び、第２の支持体と、前記第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを含んでなる第２の試薬を準備する工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で、前記第１の試薬における前記剥離物質と前記第２の試薬における前記基質とを接触させる工程、並びに、
（ｃ）工程（ｂ）の後、前記第２の試薬における前記基質の分解の有無を検出する工程
を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記極性表面が、ニトロ基、スルホ基、硫酸基、リン酸基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、第２級アミノ基及び第３級アミノ基からなる群より選択される１種又は２種以上の極性基を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の支持体がニトロセルロース膜である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基質がカゼインである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）で準備される前記第２の試薬の前記基質に標識物質が結合しており、工程（ｃ）において、前記標識物質の有無を指標として、前記第２の試薬における前記基質の分解の有無を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）において、前記第２の試薬に残存する前記基質に標識物質を結合させ、前記標識物質の有無を指標として、前記第２の試薬における前記基質の分解の有無を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対象の皮膚の標的領域における白癬菌の有無を検出するためのキットであって、
極性表面を有する第１の支持体、及び
第２の支持体と、前記第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを含んでなる試薬
を含んでなる、前記キット。
【請求項８】
前記極性表面が、ニトロ基、スルホ基、硫酸基、リン酸基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、第２級アミノ基及び第３級アミノ基からなる群より選択される１種又は２種以上の極性基を有する、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記第１の支持体がニトロセルロース膜である、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
前記基質がカゼインである、請求項７に記載のキット。
【請求項１１】
前記第２の試薬における前記基質に標識物質が結合している、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、白癬菌を検出するための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
白癬は、白癬菌（皮膚糸状菌）によって生じる感染症である。白癬菌は、ケラチンを基質とするタンパク質分解酵素（ケラチナーゼ）を分泌し、ケラチンを分解して栄養源としながら増殖する。したがって、白癬菌は、ケラチンが多く存在する部位、例えば、皮膚の表面を覆う角層、角層が変化して形成される爪、毛等に感染しやすい。白癬は、白癬菌が感染する部位に応じて、足白癬（いわゆる水虫）、股部白癬（いわゆるインキンタムシ）、頭部白癬（いわゆるシラクモ）、爪白癬、手白癬、体部白癬（いわゆるゼニタムシ）、顔面白癬等と呼ばれる。【０００３】
白癬とその他の皮膚疾患とは治療方法が異なるが、白癬と同様の症状を呈する皮膚疾患（例えば、湿疹、皮膚炎、汗疱）が数多く存在するため、症状に基づいて、白癬とその他の皮膚疾患とを明確に区別して診断することは難しい。【０００４】
このため、白癬の診断には、対象の皮膚から鱗屑をピンセット等で採取し、苛性カリ（ＫＯＨ）で溶解した後、顕微鏡で観察するＫＯＨ直接検鏡法が一般的に採用されている。しかしながら、ＫＯＨ直接検鏡法は、検体の採取、白癬菌の有無の判別等が難しいため、相当の熟練を必要とする。採取した鱗屑を培養した後、白癬菌の有無を確認する方法も存在するが、結果が得られるまでに相当の時間がかかる。【０００５】
その他、白癬の診断に使用可能な方法として、白癬菌（皮膚糸状菌）抗原に対する抗体を使用して白癬菌を検出する方法（特許文献１及び２）、非イオン性界面活性剤又は両イオン性界面活性剤を含有する処理液で試料から皮膚糸状菌成分を抽出して皮膚糸状菌を検出する方法（特許文献３）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１５９５９３号公報
【特許文献２】特開２００４−２５８０２４号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／１１９４３１号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、対象の皮膚の標的領域における白癬菌の有無を簡便に検出できる方法及びキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、
（Ａ）極性表面を有する第１の支持体（例えば、ニトロセルロース膜）を対象の皮膚の標的領域に接触させた後、標的領域から剥離すると、標的領域由来の剥離物質（標的領域から剥離された物質）が第１の支持体の極性表面に付着すること、
（Ｂ）標的領域に白癬菌が存在する場合には、第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質にケラチナーゼが含まれること、
（Ｃ）第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質には、ケラチナーゼとともに様々な夾雑物が付着しているにも関わらず、第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質と、第２の支持体（例えば、スライドグラス又はニトロセルロース膜）の表面に結合したケラチナーゼの基質（例えば、カゼイン）とを、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で接触させると、標的領域由来の剥離物質に含まれるケラチナーゼにより、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質が分解されること、
（Ｄ）第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質に予め標識物質（例えば、蛍光色素）を結合させておくことにより、あるいは、第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質と、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とをケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で接触させた後、第２の支持体の表面に残存するケラチナーゼの基質に標識物質（例えば、金コロイド）を結合させることにより、標識物質の有無を指標として、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質の分解の有無を検出できること（すなわち、第２の支持体の表面のうち、標識物質が存在する部分は、ケラチナーゼの基質が分解されなかった部分であると判別でき、第２の支持体の表面のうち、標識物質が存在しない部分は、ケラチナーゼの基質が分解された部分であると判別できること）、
（Ｅ）標的領域に白癬菌が存在しない場合には、第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質と、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で接触させても、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質が分解されないので、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質の分解の有無を指標として、対象の皮膚の標的領域における白癬菌の有無を検出できること（すなわち、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質が分解された場合には、標的領域に白癬菌が存在すると判別でき、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質が分解されなかった場合には、標的領域に白癬菌が存在しないと判別できること）等を見出し、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
［１］対象の皮膚の標的領域における白癬菌の有無を検出するための方法であって、
（ａ）極性表面を有する第１の支持体と、前記極性表面に付着した前記標的領域由来の剥離物質とを含んでなる第１の試薬、及び、第２の支持体と、前記第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを含んでなる第２の試薬を準備する工程、
（ｂ）工程（ａ）の後、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で、前記第１の試薬における前記剥離物質と前記第２の試薬における前記基質とを接触させる工程、並びに、
（ｃ）工程（ｂ）の後、前記第２の試薬における前記基質の分解の有無を検出する工程
を含んでなる、前記方法。
［２］前記極性表面が、ニトロ基、スルホ基、硫酸基、リン酸基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、第２級アミノ基及び第３級アミノ基からなる群より選択される１種又は２種以上の極性基を有する、前記［１］に記載の方法。
［３］前記第１の支持体がニトロセルロース膜である、前記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記基質がカゼインである、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］工程（ａ）で準備される前記第２の試薬の前記基質に標識物質が結合しており、工程（ｃ）において、前記標識物質の有無を指標として、前記第２の試薬における前記基質の分解の有無を検出する、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］工程（ｃ）において、前記第２の試薬に残存する前記基質に標識物質を結合させ、前記標識物質の有無を指標として、前記第２の試薬における前記基質の分解の有無を検出する、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［７］対象の皮膚の標的領域における白癬菌の有無を検出するためのキットであって、
極性表面を有する第１の支持体、及び
第２の支持体と、前記第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを含んでなる試薬
を含んでなる、前記キット。
［８］前記極性表面が、ニトロ基、スルホ基、硫酸基、リン酸基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、第２級アミノ基及び第３級アミノ基からなる群より選択される１種又は２種以上の極性基を有する、前記［７］に記載のキット。
［９］前記第１の支持体がニトロセルロース膜である、前記［７］又は［８］に記載のキット。
［１０］前記基質がカゼインである、前記［７］〜［９］のいずれかに記載のキット。
［１１］前記第２の試薬における前記基質に標識物質が結合している、前記［７］〜［１０］のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、対象の皮膚の標的領域における白癬菌の有無を簡便に検出できる方法及びキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、試験例１における蛍光観察装置での観察結果を示す図である。
【図２】図２は、試験例２における蛍光観察装置での観察結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例１における顕微鏡での観察結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例１における蛍光観察装置での観察結果（２値化した観察画像）を示す図である。
【図５】図５は、実施例２における顕微鏡での観察結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例２における蛍光観察装置での観察結果（２値化した観察画像）を示す図である。
【図７】図７は、試験例３における金コロイド染色結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の方法及びキットについて説明する。
本発明の方法及びキットは、対象の皮膚の標的領域における白癬菌の有無を検出するための方法及びキットである。
【００１３】
「対象」は、白癬菌が寄生し得る動物である限り特に限定されない。白癬菌が寄生し得る動物としては、例えば、ヒト又はその他の哺乳類（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ等）、ニワトリ、インコ等の鳥類等が挙げられる。
【００１４】
「皮膚」は、白癬菌が寄生し得る限り特に限定されない。皮膚としては、例えば、足、股、頭、手、顔、その他の体部等の皮膚が挙げられる。なお、「皮膚」には、爪も包含される。
【００１５】
「標的領域」は、対象の皮膚のうち、白癬菌の感染が疑われる領域である。標的領域は、例えば、鱗屑が生じている領域である。
【００１６】
「白癬菌」は、白癬の原因となる皮膚糸状菌である。白癬菌の形態は特に限定されず、例えば、胞子、菌糸、分生子等の菌体断片の形態であってもよい。白癬菌としては、例えば、白癬菌属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、小胞子菌属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、表皮菌属（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）、その有性世代（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）等が挙げられる。ヒト好性白癬菌としては、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ等が挙げられる。イヌ、ネコ等の動物好性白癬菌としては、例えば、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｇａｌｌｉｎａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ等が挙げられる。白癬の原因となる代表的な白癬菌は、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｔｏｎｓｕｒａｎｓ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ  ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ等であり、これらを検出対象とすることが好ましい。
【００１７】
本発明の方法は、極性表面を有する第１の支持体と、極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質とを含んでなる第１の試薬、及び、第２の支持体と、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを含んでなる第２の試薬を準備する工程を、工程（ａ）として含む。
【００１８】
第１の試薬は、第１の支持体の極性表面を標的領域に接触させた後、標的領域から剥離することにより得られた試薬であり、極性表面を有する第１の支持体と、極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質とを含んでなる。第１の支持体の極性表面を標的領域に接触させる際、第１の支持体の極性表面を予め水等の極性溶媒で湿らせておくことが好ましい。これにより、標的領域に存在する物質のうち、第１の支持体の極性表面に親和性を有する物質が付着しやすくなる。第１の支持体の極性表面を標的領域に接触させる時間は特に限定されないが、通常１〜１５分、好ましくは５〜１０分である。
【００１９】
第１の支持体は、極性表面を有する。極性表面は、極性基を有する表面である。表面に極性基が存在することにより、当該表面には極性が付与される。極性基は、極性を有する官能基である。官能基の極性は、当該官能基の分極により生じ得る。官能基の分極は、例えば、当該官能基に含まれる原子間の電気陰性度の差、当該官能基に含まれる原子と当該官能基が結合する原子（例えば、炭素原子）との間の電気陰性度の差、これらの組み合わせ等により生じる。極性基は、非イオン性基であってもよいし、カチオン性基、アニオン性基等のイオン性基であってもよい。極性基としては、例えば、ニトロ基、スルホ基、硫酸基、リン酸基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、第２級アミノ基（例えばメチルアミノ基）、第３級アミノ基（例えばジメチルアミノ基）等が挙げられ、極性表面は、これらの中から選択された１種又は２種以上の極性基を有することができる。塩を形成可能な極性基は、塩を形成していてもよい。例えば、アミノ基、第２級アミノ基、第３級アミノ基等のカチオン性基は、ハロゲン陰イオン、硫酸陰イオン、スルホン酸陰イオン、リン酸陰イオン、カルボン酸陰イオン等の陰イオンと結合して塩を形成していてもよく、スルホ基、硫酸基、リン酸基、水酸基、カルボキシル基等のアニオン性基は、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のアルカリ金属イオンと結合して塩を形成していてもよい。
【００２０】
第１の支持体の形状、サイズ等は、特に限定されず、標的領域の形状、サイズ等に応じて適宜調整することができる。第１の支持体の形状は、例えば、膜である。第１の支持体のサイズは、例えば、極性表面が標的領域と略同じ又はそれよりも大きくなるように調整することができる。第１の支持体の材料は、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で固体状態を維持可能である限り特に限定されない。第１の支持体の表面に極性を付与する極性基は、第１の支持体の材料が元来有する官能基であってもよいし、第１の支持体の材料に人為的に導入された官能基であってもよい。第１の支持体は、複数の部材の複合体（例えば、複数の層の積層体）であってもよい。第１の支持体が複数の部材の複合体である実施形態としては、例えば、第１の支持体が、極性表面を有する第１の部材と、第１の部材の極性表面が露出するように第１の部材を支持する第２の部材との複合体である実施形態が挙げられる。
【００２１】
第１の支持体は、可撓性を有することが好ましい。第１の支持体が可撓性を有する場合、第１の支持体の形状を標的領域の形状に沿って変形させることができるので、第１の支持体の極性表面を標的領域に接触させる作業が容易となる。
【００２２】
第１の支持体は、液体透過性を有することが好ましい。第１の支持体が液体透過性を有する実施形態としては、例えば、第１の支持体が液体透過孔（例えば、直径０．２〜０．４５μｍの貫通孔）を有する実施形態が挙げられる。第１の支持体が液体透過性を有する場合、第１の試薬における標的領域由来の剥離物質と第２の試薬におけるケラチナーゼの基質とを接触させた後、第１の支持体を通じて、第１の試薬と第２の試薬との接触面に所望の液体を供給することができる。第１の試薬と第２の試薬との接触面に供給される液体としては、例えば、ケラチナーゼの酵素反応が進行するように、第１の試薬と第２の試薬との接触面の条件（例えば、ｐＨ）を調整するための液体が挙げられる。ｐＨを調整するための液体としては、例えば、ｐＨ緩衝液が挙げられ、ｐＨ緩衝液としては、例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスＥＤＴＡ緩衝液、重炭酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。
【００２３】
第１の支持体は、ニトロセルロース膜であることが好ましい。第１の支持体がニトロセルロース膜である場合、第１の支持体は、極性基であるニトロ基を表面に有するとともに、可撓性及び液体透過性を有する。
【００２４】
その他、適当な基材（例えば、水不溶性基材）の表面に極性基を導入して得られる表面修飾基材を、第１の支持体として使用してもよい。基材としては、例えば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ポリビニリデンフルオライド膜、セルロースアセテート等のセルロースエステル膜、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル膜、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等のポリオレフィン系樹脂膜等が挙げられる。基材への極性基の導入は常法に従って行うことができる。
【００２５】
第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質は、第１の支持体の極性表面を標的領域に接触させた後、標的領域から剥離した際に、第１の支持体の極性表面とともに標的領域から剥離された物質である。第１の支持体の極性表面を標的領域に接触させた後、標的領域から剥離すると、第１の支持体の極性表面には、標的領域に存在する物質のうち、第１の支持体の極性表面に親和性を有する物質が非特異的に付着する。標的領域に存在し得る物質のうち、第１の支持体の極性表面に親和性を有する物質としては、ケラチナーゼ、その他のタンパク質、脂質等が挙げられる。したがって、標的領域にケラチナーゼが存在する場合、第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質には、ケラチナーゼとともに様々な夾雑物が含まれる。
【００２６】
第２の試薬は、第２の支持体と、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを含んでなる。
【００２７】
第２の支持体の形状、サイズ等は、特に限定されず、第１の支持体の形状、サイズ等に応じて適宜調整することができる。第２の支持体の形状は、例えば、平板、膜等である。第２の支持体のサイズは、例えば、ケラチナーゼの基質を結合させる表面が、標的領域由来の剥離物質が付着した第１の支持体の極性表面と略同じ又はそれよりも大きくなるように調整することができる。第２の支持体の材料は、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で固体状態を維持可能である限り特に限定されない。第２の支持体の材料としては、例えば、プラスチック、金属、ガラス、セラミックス等の水不溶性の材料が挙げられる。第２の支持体としては、例えば、スライドグラス、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ポリビニリデンフルオライド膜、セルロースアセテート等のセルロースエステル膜、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル膜、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等のポリオレフィン系樹脂膜等を使用することができる。第２の支持体としては、極性表面を有する支持体（例えば、ニトロセルロース膜）を使用することが好ましい。これにより、極性表面が有する正電荷とケラチナーゼの基質が有する負電荷との間の静電相互作用、及び、極性表面が有する負電荷とケラチナーゼの基質が有する正電荷との間の静電相互作用を利用して、第２の支持体の極性表面にケラチナーゼの基質を吸着させることができる。但し、極性表面を有する支持体と、極性表面に付着したケラチナーゼの基質との結合には、静電相互作用以外に、疎水性相互作用等が関与してもよい。第２の支持体の極性表面に関する説明は、第１の支持体の極性表面に関する説明と同様である。極性表面を有する支持体の具体例は、第１の支持体の具体例と同様である。ケラチナーゼの基質が有する負電荷としては、例えば、カルボキシル基の分極又はイオン化により生じる負電荷が挙げられ、ケラチナーゼの基質が有する正電荷としては、例えば、アミノ基の分極又はイオン化により生じる正電荷が挙げられる。静電相互作用には、イオン間相互作用、双極子間相互作用、イオン−双極子間相互作用等が含まれる。イオン間相互作用は、ケラチナーゼの基質が有するイオン化した官能基と、第２の支持体が有するイオン化した官能基との間で生じ得る。双極子間相互作用は、ケラチナーゼの基質が有する分極した官能基（双極子モーメントを有する官能基）と、第２の支持体が有する分極した官能基（双極子モーメントを有する官能基）との間で生じ得る。イオン−双極子間相互作用は、ケラチナーゼの基質が有する分極した官能基（双極子モーメントを有する官能基）と、第２の支持体が有するイオン化した官能基との間で、又は、ケラチナーゼの基質が有するイオン化した官能基と、第２の支持体が有する分極した官能基（双極子モーメントを有する官能基）との間で生じ得る。
【００２８】
第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質は、ケラチナーゼにより分解され得る限り特に限定されず、例えば、カゼイン、ケラチン、ゼラチン、コラーゲン等が挙げられる。第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質は、好ましくはカゼインである。
【００２９】
ケラチナーゼの基質が結合した第２の支持体の表面は、平面であってもよいし、曲面であってもよいが、好ましくは平面である。ケラチナーゼの基質が結合した第２の支持体の表面が平面である場合、第１の試薬における標的領域由来の剥離物質と第２の試薬におけるケラチナーゼの基質とを接触させやすい。
【００３０】
第２の支持体の表面に対するケラチナーゼの基質の結合様式は、特に限定されない。例えば、第２の支持体の表面に適当なコーティング処理を施すことにより、第２の支持体のコーティング処理表面に、ケラチナーゼの基質を吸着させることができる。コーティング処理に使用されるコーティング剤としては、例えば、シラン、シリコーン、リジン、シリカゲル、アルミナ、ポリアミド樹脂等が挙げられる。
【００３１】
その他の結合様式としては、例えば、ストレプトアビジン又はアビジンとビオチンとの特異的相互作用、疎水性相互作用、磁性相互作用、極性相互作用、共有結合（例えば、アミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合等）の形成、架橋剤による架橋等が挙げられる。これらの結合様式が可能となるように、公知の技術を用いて、支持体表面又は基質に適当な化学修飾を施すことができる。
【００３２】
ストレプトアビジン又はアビジンとビオチンとの特異的相互作用以外にも、マルトース結合タンパク質／マルトース、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルやコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ＡＴＰ結合タンパク質／ＡＴＰ、核酸／相補的核酸、受容体タンパク質／リガンド、酵素／基質、抗体／抗原、ＩｇＧ／プロテインＡ等の特異的相互作用を利用することができる。
【００３３】
アビジン又はストレプトアビジンとビオチンとの相互作用を利用する場合には、例えば、ビオチンを導入した基質を、アビジン又はストレプトアビジンでコーティングされた支持体に結合させることができる。
【００３４】
共有結合の形成を利用する場合には、基質又は支持体の官能基を利用して共有結合を形成させることができる。共有結合を形成し得る官能基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基、水酸基等が挙げられる。例えば、支持体の表面にカルボキシル基が存在する場合には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等のカルボジイミド類でカルボキシル基を活性化させた後、基質が有するアミノ基と反応させることにより、支持体と基質とをアミド結合させることができる。また、支持体の表面にアミノ基が存在する場合には、無水コハク酸等の環状酸無水物を用いてアミノ基をカルボキシル基に変換した後、基質に存在するアミノ基と反応させることにより、支持体と基質とをアミド結合させることができる。
【００３５】
架橋剤による架橋を利用する場合には、支持体及び基質が有する官能基と反応し得る種々の架橋剤を使用することができる。架橋剤としては、例えば、二官能性試薬、三官能性試薬等の多官能性試薬が挙げられる。多官能性試薬としては、例えば、Ｎ−スクシンイミジル（４−イオードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、ジマレイミド、ジチオ−ビス−ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、６−ヒドラジノニコチミド（ＨＹＮＩＣ）等が挙げられる。
【００３６】
第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質には、標識物質が結合していることが好ましい。第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質に標識物質が結合している場合、標識物質の有無を指標として、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質がケラチナーゼにより分解されたか否かを検出することができる。すなわち、第２の支持体の表面のうち、標識物質が存在する部分は、ケラチナーゼの基質が分解されなかった部分であると判別することができ、第２の支持体の表面のうち、標識物質が存在しない部分は、ケラチナーゼの基質が分解された部分であると判別することができる。標識物質としては、例えば、蛍光色素（例えば、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類等）、放射性物質（例えば、１３Ｃ、３Ｈ等）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、着色粒子（例えば、金属コロイド粒子、着色ラテックス等）等が挙げられる。但し、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質に予め標識物質を結合させておく必要はない。例えば、第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質と、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とをケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で接触させた後、第２の支持体の表面に残存するケラチナーゼの基質に標識物質を結合させてもよい。
【００３７】
本発明の方法は、工程（ａ）の後、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で、第１の試薬における標的領域由来の剥離物質と第２の試薬におけるケラチナーゼの基質とを接触させる工程を、工程（ｂ）として含む。
【００３８】
工程（ｂ）において、標的領域由来の剥離物質が付着した第１の支持体の極性表面とケラチナーゼの基質が結合した第２の支持体の表面とを接触させることにより、第１の試薬における標的領域由来の剥離物質と第２の試薬におけるケラチナーゼの基質とを接触させることができる。
【００３９】
第１の試薬における標的領域由来の剥離物質と第２の試薬におけるケラチナーゼの基質との接触は、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で行われる。ケラチナーゼの酵素反応の進行に関与する条件としては、例えば、温度、ｐＨ等が挙げられる。ケラチナーゼの酵素反応が進行する温度は、通常３０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃である。ケラチナーゼの酵素反応が進行するｐＨは、通常６〜１１、好ましくは８〜１０である。
【００４０】
温度の調整は、第１の試薬における標的領域由来の剥離物質と第２の試薬におけるケラチナーゼの基質とを接触させた状態で、第１の試薬及び第２の試薬を、ケラチナーゼの酵素反応が進行する温度環境下に維持することにより行うことができる。温度の調整は、例えば、市販のインキュベータを使用して行うことができる。
【００４１】
ｐＨの調整は、ｐＨ緩衝液を使用して行うことができる。ｐＨ緩衝液としては、例えば、例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスＥＤＴＡ緩衝液、重炭酸緩衝液、ホウ酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。ｐＨ緩衝液のｐＨは、ケラチナーゼの酵素反応が進行するｐＨと同様、通常６〜１１、好ましくは８〜１０である。ｐＨ緩衝液は、第１の試薬における標的領域由来の剥離物質と第２の試薬におけるケラチナーゼの基質とを接触させる前に、標的領域由来の剥離物質が付着した第１の支持体の極性表面、及び／又は、ケラチナーゼの基質が結合した第２の支持体の表面に加えることができる。また、第１の支持体が液体透過性を有する場合、第１の試薬における標的領域由来の剥離物質と第２の試薬におけるケラチナーゼの基質と接触させた後、第１の支持体を通じて、第１の試薬と第２の試薬との接触面にｐＨ緩衝液を供給することができる。
【００４２】
ケラチナーゼを活性化するために、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を使用することができる。ＥＤＴＡは、ｐＨ緩衝液に含有させて（例えば、トリスＥＤＴＡ緩衝液として）使用してもよいし、ｐＨ緩衝液とは別のＥＤＴＡ溶液として使用してもよい。ＥＤＴＡは、例えば、０．０１〜１Ｍの濃度で使用することができる。ＥＤＴＡの希釈溶媒としては、例えば、水、トリス緩衝液等を使用することができる。ＥＤＴＡは、第１の試薬における標的領域由来の剥離物質と第２の試薬におけるケラチナーゼの基質と接触させる前に、標的領域由来の剥離物質が付着した第１の支持体の極性表面、及び／又は、ケラチナーゼの基質が結合した第２の支持体の表面に加えることができる。また、第１の支持体が液体透過性を有する場合、第１の試薬における標的領域由来の剥離物質と第２の試薬におけるケラチナーゼの基質と接触させた後、第１の支持体を通じて、第１の試薬と第２の試薬との接触面にＥＤＴＡを供給することができる。
【００４３】
第１の試薬における標的領域由来の剥離物質と第２の試薬におけるケラチナーゼの基質とを、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で接触させる時間は、通常１〜６時間、好ましくは１〜２時間である。
【００４４】
本発明の方法は、工程（ｂ）の後、第２の試薬におけるケラチナーゼの基質の分解の有無を検出する工程を、工程（ｃ）として含む。
【００４５】
標的領域に白癬菌が存在する場合には、第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質にケラチナーゼが含まれるので、第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質と第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で接触させると、第２の支持体の表面に結合していたケラチナーゼの基質は分解される。なお、第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質には、ケラチナーゼとともに様々な夾雑物が付着しているが、第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質と第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で接触させると、標的領域由来の剥離物質に含まれるケラチナーゼにより、第２の支持体の表面に結合していたケラチナーゼの基質は分解される。一方、標的領域に白癬菌が存在しない場合には、第１の支持体の極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質と、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で接触させても、第２の支持体の表面に結合していたケラチナーゼの基質は分解されない。したがって、第２の支持体の表面に結合していたケラチナーゼの基質の分解の有無を指標として、対象の皮膚の標的領域における白癬菌の有無を検出することができる。すなわち、第２の支持体の表面に結合していたケラチナーゼの基質が分解された場合には、標的領域に白癬菌が存在すると判別することができ、第２の支持体の表面に結合していたケラチナーゼの基質が分解されなかった場合には、標的領域に白癬菌が存在しないと判別することができる。標的領域における白癬菌の有無の検出は、対象における白癬の診断に有用である。すなわち、本発明の方法は、対象における白癬の診断を補助する方法として使用することができる。
【００４６】
第２の試薬におけるケラチナーゼの基質の分解の有無は、第２の支持体の表面におけるケラチナーゼの基質の有無を指標として検出することができる。すなわち、第１の試薬と接触させる前にケラチナーゼの基質が結合していた第２の支持体の表面のうち、第１の試薬と接触させた後もケラチナーゼの基質が残存する部分は、ケラチナーゼの基質が分解されなかった部分であると判別することができ、第１の試薬と接触させる前にケラチナーゼの基質が結合していた第２の支持体の表面のうち、第１の試薬と接触させた後にケラチナーゼの基質が消失した部分は、ケラチナーゼの基質が分解された部分であると判別することができる。なお、ケラチナーゼによる分解以外の要因に起因して、第２の支持体の表面から、ケラチナーゼの基質が消失する可能性がある。例えば、第２の支持体の表面に対するケラチナーゼの基質の結合力が不十分である場合、そのような可能性がある。しかしながら、ケラチナーゼによる分解に起因してケラチナーゼの基質が消失した部分は、その面積、形状、連続性等に基づいて、その他の要因に起因してケラチナーゼの基質が消失した部分と明確に区別可能である。例えば、ケラチナーゼによる分解以外の要因に起因してケラチナーゼの基質が消失した部分では、残存するケラチナーゼの基質が点在し、ケラチナーゼの基質の消失が不連続に生じ得る。これに対して、ケラチナーゼによる分解に起因してケラチナーゼの基質が消失した部分では、残存するケラチナーゼの基質が点在せず、ケラチナーゼの基質の消失が連続して生じ得る。
【００４７】
第２の支持体の表面におけるケラチナーゼの基質の有無を検出する際、第１の試薬と第２の試薬との接触状態を解除した後（すなわち、第１の試薬と第２の試薬とを分離した後）、第２の支持体の表面を洗浄することが好ましい。これにより、ケラチナーゼの基質の分解により生じた分解物が第２の支持体の表面から除去されるので、第２の支持体の表面におけるケラチナーゼの基質の有無を検出しやすくなる。洗浄には、例えば、水等を使用することができる。
【００４８】
第２の支持体の表面におけるケラチナーゼの基質の有無を検出する際、対照との比較を行うことが好ましい。対照は、第１の試薬の代わりに、極性表面に標的領域由来の剥離物質が付着していない（すなわち、標的領域と接触させていない）第１の支持体を使用した点を除いて本発明の方法と同様の工程を行った後の、第２の支持体の表面におけるケラチナーゼの基質の有無である。標的領域由来の剥離物質が付着していない（すなわち、標的領域と接触させていない）第１の支持体の極性表面と、ケラチナーゼの基質が結合した第２の支持体の表面とを、ケラチナーゼの酵素反応が進行する条件下で接触させた後の、第２の支持体の表面におけるケラチナーゼの基質の有無を対照とすることにより、第１の試薬と接触させる前にケラチナーゼの基質が結合していた第２の支持体の表面のうち、第１の試薬と接触させた後にケラチナーゼの基質が消失した部分が、ケラチナーゼによる分解に起因して生じたのか、あるいは、その他の要因に起因して生じたのかを判別することができる。したがって、第２の支持体の表面におけるケラチナーゼの基質の有無を指標として、第２の試薬におけるケラチナーゼの基質の分解の有無を精度よく検出することができる。
【００４９】
第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質に予め標識物質が結合している場合、工程（ｃ）において、標識物質の有無を指標として、第２の支持体の表面におけるケラチナーゼの基質の分解の有無を検出することができる。すなわち、第１の試薬と接触させる前にケラチナーゼの基質が結合していた第２の支持体の表面のうち、標識物質が存在する部分は、ケラチナーゼの基質が分解されなかった部分であると判別することができ、第１の試薬と接触させる前にケラチナーゼの基質が結合していた第２の支持体の表面のうち、標識物質が存在しない部分は、ケラチナーゼの基質が分解された部分であると判別することができる。標識物質の有無の検出は、常法に従って行うことができる。但し、第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質に予め標識物質を結合させておく必要はない。例えば、工程（ｃ）において、第２の試薬に残存するケラチナーゼの基質に標識物質を結合させ、標識物質の有無を指標として、第２の試薬におけるケラチナーゼの基質の分解の有無を検出してもよい。この実施形態でも上記と同様、標識物質が存在する部分は、ケラチナーゼの基質が分解されなかった部分であると判別することができ、標識物質が存在しない部分は、ケラチナーゼの基質が分解された部分であると判別することができる。第２の試薬に残存するケラチナーゼの基質に標識物質を結合させ、標識物質の有無を指標として、第２の試薬におけるケラチナーゼの基質の分解の有無を検出する方法としては、例えば、以下で説明する標識化抗体又はタンパク質染色法を使用した方法が挙げられる。
【００５０】
工程（ｃ）において、ケラチナーゼの基質を認識する標識化抗体を使用して、第２の支持体の表面におけるケラチナーゼの基質の分解の有無を検出することができる。すなわち、第１の試薬と接触させる前にケラチナーゼの基質が結合していた第２の支持体の表面のうち、標識化抗体が結合した部分は、ケラチナーゼの基質が分解されなかった部分であると判別することができ、標識化抗体が結合しなかった部分は、ケラチナーゼの基質が分解された部分であると判別することができる。標識化抗体の結合の有無は、抗体を標識化する標識物質の有無を指標して検出することができる。標識物質の有無の検出は、常法に従って行うことができる。
【００５１】
工程（ｃ）において、タンパク質染色法を使用して、第２の支持体の表面におけるケラチナーゼの基質の分解の有無を検出することができる。すなわち、第１の試薬と接触させる前にケラチナーゼの基質が結合していた第２の支持体の表面のうち、タンパク質染色法で染色された部分は、ケラチナーゼの基質が分解されなかった部分であると判別することができ、タンパク質染色法で染色されなかった部分は、ケラチナーゼの基質が分解された部分であると判別することができる。タンパク質染色法としては、例えば、クマシーブリリアントブルー染色法、銀染色法、金コロイド染色法、蛍光染色法（例えば、ＢｉｏＲａｄ社製Ｓｙｐｒｏ  Ｒｕｂｂｙ）等が挙げられ、常法に従って行うことができる。タンパク質染色法によれば、ケラチナーゼの基質の分解の有無を肉眼により簡便に検出することができ、特殊な装置は必要とされない。
【００５２】
本発明のキットは、極性表面を有する第１の支持体、及び、第２の支持体と第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを含んでなる試薬を含んでなる。
【００５３】
本発明のキットにおける第１の支持体は、本発明の方法における第１の試薬を調製するために使用される。すなわち、第１の支持体の極性表面を標的領域に接触させた後、標的領域から剥離することにより、極性表面を有する第１の支持体と、極性表面に付着した標的領域由来の剥離物質とを含んでなる第１の試薬を調製することができる。本発明のキットにおける、第２の支持体と第２の支持体の表面に結合したケラチナーゼの基質とを含んでなる試薬は、本発明の方法における第２の試薬に相当する。
【００５４】
本発明のキットは、第１の支持体を使用して第１の試薬を調製した後、本発明の方法を実施するために使用することができる。本発明の方法に関する本明細書中の記載は、本発明のキットにも適用される。
【実施例】
【００５５】
以下、試験例及び実施例に基づいて、本発明について説明する。試験例及び実施例では、別段規定する場合を除き、以下の試薬を使用した。
（１）タンパク質標識キット
タンパク質標識キットとして、株式会社同仁化学研究所製のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｋｉｔ−ＮＨ２（製品コード：ＬＫ０１）を使用した。本キットは、アミノ基を有するタンパク質を、フルオレセインで標識するためのキットである。本キット付属のＮＨ２−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎは、その分子内に活性エステル基を有するため、アミノ基を有するタンパク質と混合すると安定な共有結合を形成する。【００５６】
（２）ケラチナーゼの基質タンパク質
ケラチナーゼの基質タンパク質として、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ製のヒト表皮由来ケラチン（Ｋｅｒａｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）（製品番号：０２５３−１ＭＧ）、和光純薬工業株式会社製のゼラチン、及び、ナカライテスク株式会社製のカゼイン（商品コード：０７３１９−８２）を使用した。
ケラチン、ゼラチン及びカゼインを、それぞれ、タンパク質標識キットで蛍光標識した後、０．１％ケラチン溶液（溶媒：蒸留水）、０．１％ゼラチン溶液（溶媒：蒸留水）及び０．１％カゼイン溶液（溶媒：０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５））を調製した。０．１％ケラチン溶液、０．１％ゼラチン溶液及び０．１％カゼイン溶液を蒸留水で１０倍希釈し、０．０１％ケラチン溶液、０．０１％ゼラチン溶液及び０．０１％カゼイン溶液を調製した。なお、「％」は、質量パーセント濃度を表す。【００５７】
（３）ケラチナーゼ
ケラチナーゼとして、コスモ・バイオ株式会社から購入したＫｅｒａｔｉｎａｓｅ  Ｐｕｒｅ  １００  （５００Ｕ）（商品コード：ＰＢＬ０１．１．０１）を使用した。
ケラチナーゼ１００ｍｇを、塩化カリウム７４０ｍｇを含有する１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍＬに加えた。得られた溶液を蒸留水で１０倍希釈して、０．０１％ケラチナーゼ溶液を調製した。なお、「％」は、質量パーセント濃度を表す。【００５８】
（４）スライドグラス
スライドグラスとして、武藤化学株式会社製のＮｅｗシランＩＩ（シランコーティングされたスライドグラス）を使用した。【００５９】
（５）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
ＥＤＴＡとして、株式会社同仁化学研究所製のＥＤＴＡ（商品名２ＮＡ（ＥＤＴＡ・２Ｎａ））を使用した。ＥＤＴＡ（０．５Ｍ，ｐＨ８）を蒸留水で１０倍希釈し、ＥＤＴＡ溶液を調製した。【００６０】
〔試験例１〕
スライドグラス３枚に、それぞれ、０．０１％ケラチン溶液、０．０１％ゼラチン溶液及び０．０１％カゼイン溶液を２００μＬずつ滴下し、薄く広げ、室温で３０分間放置した。その後、蒸留水で３回洗浄し、室温で乾燥させた。これにより、ケラチンでコーティングされたスライドグラス、ゼラチンでコーティングされたスライドグラス及びカゼインでコーティングされたスライドグラスを得た。【００６１】
縦１０ｍｍ×横１０ｍｍのニトロセルロースメンブレン（ＢｉｏＲａｄ社製のサポート付ニトロセルロースメンブレン、ポアサイズ０．２μｍ）上に、直径８ｍｍの円形の濾紙を乗せ、０．０１％ケラチナーゼ溶液１０μＬを濾紙に滴下し、１０分間放置した後、濾紙を取り除いた。これにより、表面の一部にケラチナーゼが付着したニトロセルロースメンブレンを得た。以下、ニトロセルロースメンブレンの表面のうち、ケラチナーゼが付着した部分を「ケラチナーゼ付着領域」という。【００６２】
ケラチンでコーティングされたスライドグラス、ゼラチンでコーティングされたスライドグラス及びカゼインでコーティングされたスライドグラスに、それぞれ、ケラチナーゼが付着したニトロセルロースメンブレンを載置し、ケラチン、ゼラチン又はカゼインでコーティングされたスライドグラスの表面と、ケラチナーゼが付着したニトロセルロースメンブレンの表面とを接触させた。スライドグラスにニトロセルロースメンブレンを載置して形成された構造体を、以下、「接触構造体」という。【００６３】
接触構造体のニトロセルロースメンブレン上（ケラチナーゼが付着した表面と反対側の表面上）に、ニトロセルロースメンブレンと略同じ大きさの濾紙を乗せ、ＥＤＴＡ溶液５０μＬを濾紙に滴下した。なお、ＥＤＴＡ溶液は、接触構造体の接触面におけるｐＨを、ケラチナーゼの酵素反応の至適ｐＨに調整することができる。【００６４】
ＥＤＴＡ溶液滴下後の接触構造体を湿潤箱（モイストチャンバー）に入れて遮光し、約３７℃で１時間、インキュベーションした。インキュベーションには、市販のインキュベータ（株式会社三商製の小型インキュベータＳＩＢ−３５）を使用した。なお、接触構造体が乾燥しないように、湿潤箱には湿らせた紙を入れておいた。【００６５】
インキュベーション後、接触構造体をスライドグラスとニトロセルロースメンブレンとに分離し、ニトロセルロースメンブレンと接触させたスライドグラスの表面を蒸留水で洗浄し、蛍光観察装置（スーパーＬＥＤビューワー，ＳＰＶ−２２０，Ｇｅｌｌｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で観察した。なお、理論上は、基質タンパク質でコーティングされたスライドグラスの表面のうち、ケラチナーゼと接触しなかった部分（ニトロセルロースメンブレンと接触しなかった部分及びニトロセルロースメンブレンと接触したがケラチナーゼ付着領域と接触しなかった部分）は、基質タンパク質が分解されないため、蛍光が観察される一方、ケラチナーゼと接触した部分（ニトロセルロースメンブレンのケラチナーゼ付着領域と接触した部分）は、基質タンパク質が分解されるため、蛍光が観察されないはずである。【００６６】
観察結果を図１に示す。図１に示すように、ケラチンでコーティングされたスライドグラスでは、その表面のうち、ケラチナーゼと接触しなかった部分でも、ケラチナーゼと接触した部分でも、蛍光がほとんど観察されなかった。これは、ケラチナーゼと接触しかなった部分のケラチンが、スライドグラスの表面を蒸留水で洗浄する際にスライドグラスの表面から除去されたことに起因すると考えられる。また、図１に示すように、ゼラチンでコーティングされたスライドグラスでは、その表面のうち、ケラチナーゼと接触しなかった部分の大部分で蛍光が観察され、ケラチナーゼと接触した部分で蛍光が観察されなかったが、ケラチナーゼと接触しなかった部分の一部で蛍光が観察されなかった。これは、ケラチナーゼと接触しかなった部分の一部のゼラチンが、スライドグラスの表面を蒸留水で洗浄する際にスライドグラスの表面から除去されたことに起因すると考えられる。これに対して、カゼインでコーティングされたスライドグラスの観察結果は、最も理論上の現象と近かった。すなわち、カゼインでコーティングされたスライドグラスの表面のうち、ケラチナーゼと接触しなかった部分では、蛍光が均一に観察され、ケラチナーゼと接触した部分では、蛍光が観察されなかった。そして、蛍光が観察された部分と、蛍光が観察されなかった部分との境界線は、カゼインでコーティングされたスライドグラスにおいて最も明瞭であった。したがって、以下の試験例及び実施例では、スライドグラスにコーティングする基質タンパク質として、カゼインを使用した。【００６７】
〔試験例２〕
縦１０ｍｍ×横１０ｍｍのニトロセルロースメンブレン（ＢｉｏＲａｄ社製のサポート付ニトロセルロースメンブレン、ポアサイズ０．２μｍ）を３枚用意した。【００６８】
縦２５ｍｍ×横２５ｍｍのメディカルテープ（優肌絆）に縦８ｍｍ×横８ｍｍの濾紙を貼付し、濾紙の上にニトロセルロースメンブレンを貼付して、皮膚貼付用メンブレンを作製した。２枚のニトロセルロースメンブレンを使用して、２枚の皮膚貼付用メンブレンを作製した。【００６９】
生理食塩水を滴下して湿らせた２枚の皮膚貼付用メンブレンを、ヒトの健常皮膚に１０分間貼付した後、剥離した。【００７０】
剥離後、２枚の皮膚貼付用メンブレンのうち、１枚は、０．０１％ケラチナーゼ溶液を滴下せず、そのまま、サンプルＡとして使用した。残りの１枚の皮膚貼付用メンブレンは、ニトロセルロースメンブレン上に直径８ｍｍの円形の濾紙を乗せ、０．０１％ケラチナーゼ溶液１０μＬを濾紙に滴下し、１０分間放置した後、濾紙を取り除き、サンプルＢとして使用した。以下、ニトロセルロースメンブレンの表面のうち、ケラチナーゼが付着した部分を「ケラチナーゼ付着領域」という。【００７１】
皮膚に貼付していないニトロセルロースメンブレン１枚は、ニトロセルロースメンブレン上に直径８ｍｍの円形の濾紙を乗せ、０．０１％ケラチナーゼ溶液１０μＬを濾紙に滴下し、１０分間放置した後、濾紙を取り除き、サンプルＣとして使用した。以下、ニトロセルロースメンブレンの表面のうち、ケラチナーゼが付着した部分を「ケラチナーゼ付着領域」という。【００７２】
サンプルＡ〜Ｃに、ＥＤＴＡ溶液を５０μＬずつ滴下した後、サンプルＡ〜Ｃを、カゼインでコーティングされたスライドグラスに載置し、カゼインでコーティングされたスライドグラスの表面と、ニトロセルロースメンブレンの表面（サンプルＡに関しては、皮膚に貼付された表面（但し、０．０１％ケラチナーゼ溶液は滴下されていない）であり、サンプルＢに関しては、皮膚に貼付された後、０．０１％ケラチナーゼ溶液が滴下された表面であり、サンプルＣに関しては、０．０１％ケラチナーゼ溶液が滴下された表面（但し、皮膚に貼付されていない）である）とを接触させた。スライドグラスにニトロセルロースメンブレンを載置して形成された構造体を、以下、「接触構造体」という。【００７３】
接触構造体を湿潤箱（モイストチャンバー）に入れて遮光し、約３７℃で１時間、インキュベーションした。インキュベーションには、市販のインキュベータ（株式会社三商製の小型インキュベータＳＩＢ−３５）を使用した。なお、接触構造体が乾燥しないように、湿潤箱には湿らせた紙を入れておいた。【００７４】
インキュベーション後、接触構造体をスライドグラスとニトロセルロースメンブレンとに分離し、ニトロセルロースメンブレンと接触させたスライドグラスの表面を蒸留水で洗浄し、蛍光観察装置（スーパーＬＥＤビューワー，ＳＰＶ−２２０，Ｇｅｌｌｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で観察した。【００７５】
観察結果を図２に示す。図２中、（Ａ）はサンプルＡと接触させたスライドグラスの観察結果、（Ｂ）はサンプルＢと接触させたスライドグラスの観察結果、（Ｃ）はサンプルＣと接触させたスライドグラスの観察結果を示す。【００７６】
図２に示すように、サンプルＡと接触させたスライドグラスの表面のうち、サンプルＡと接触させた部分でも蛍光が観察された。また、図２に示すように、サンプルＢ及びサンプルＣと接触させたスライドグラスの表面のうち、サンプルＢ及びサンプルＣのケラチナーゼ付着領域と接触させた部分（すなわち、ケラチナーゼと接触させた部分）では蛍光が観察されなかった。但し、サンプルＢよりもサンプルＣの方が、蛍光が観察された部分と蛍光が観察されなかった部分との境界線が明瞭であった。サンプルＢ及びサンプルＣと接触したスライドグラスの表面において同様に、ケラチナーゼと接触させた部分で蛍光が観察されなかったことは、ニトロセルロースメンブレンの表面に皮膚由来の夾雑物が存在しても、ケラチナーゼは、ニトロセルロースメンブレンの表面に十分に吸着可能であること、並びに、ケラチナーゼの酵素反応は、皮膚由来の夾雑物がケラチナーゼとともにニトロセルロースメンブレンに吸着された状態でも進行可能であることを示す。【００７７】
〔試験例３〕
（１）試薬
以下の試薬を準備した。
・１０％カゼイン溶液
ナカライテスク株式会社製のカゼイン（商品コード：０７３１９−８２）を使用して、１０％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）を０．１％含有する１０％カゼイン溶液を調製した。なお、「％」は、質量パーセント濃度を表す。【００７８】
・１０ｍｇ／ｍＬケラチナーゼ溶液
ケラチナーゼとして、コスモ・バイオ株式会社から購入したＫｅｒａｔｉｎａｓｅ  Ｐｕｒｅ  １００  （５００Ｕ）（商品コード：ＰＢＬ０１．１．０１）を使用した。
ケラチナーゼ１００ｍｇを、塩化カリウム７４０ｍｇを含有する１．０Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍＬに加えて、１０ｍｇ／ｍＬケラチナーゼ溶液を調製した。【００７９】
・検出用基材
検出用基材として、ニトロセルロースメンブレン（ＢｉｏＲａｄ社製のサポート付ニトロセルロースメンブレン、ポアサイズ０．２μｍ）を使用した。【００８０】
・サンプリング用基材
サンプリング用基材として、ニトロセルロースメンブレン（ＢｉｏＲａｄ社製のサポート付ニトロセルロースメンブレン、ポアサイズ０．２μｍ）を使用した。【００８１】
・金コロイド
金コロイドとして、フナコシ株式会社から購入したＰＲＯＴＯＧＯＬＤ  Ｋｉｔを使用した。【００８２】
・Ｔ−ＰＢＳ
Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）を０．３％含有するＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）を調製した。【００８３】
（２）検出用基材のカゼインコーティング
検出用基材を１０％カゼイン溶液に浸漬し、４℃のクールインキュベータに入れ、振盪させながら一晩インキュベーションした。インキュベーション後、検出用基材を蒸留水で３回洗浄し、完全に乾燥させた。こうして、カゼインでコーティングされた検出用基材を得た。【００８４】
（３）サンプリング用基材へのケラチナーゼの付着
蒸留水を使用して、１０ｍｇ／ｍＬケラチナーゼ溶液を１０００倍に希釈した。丸く切り取った濾紙片を希釈したケラチナーゼ溶液に浸漬し、ケラチナーゼ溶液を含浸させた濾紙片をサンプリング用基材の表面に載置し、室温で１０分間放置した。放置後、サンプリング用基材から濾紙片を取り除き、サンプリング用基材を乾燥させた。こうして、表面の一部にケラチナーゼが付着したサンプリング用基材を得た。以下、サンプリング用基材の表面のうち、ケラチナーゼが付着した部分を「ケラチナーゼ付着領域」という。【００８５】
（４）検出用基材とサンプリング用基材との接触
プラスチック容器内に載置した２枚程度の濾紙に、希釈したエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を適量染み渡らせた後、濾紙の上に、カゼインでコーティングされた検出用基材を載置した。カゼインでコーティングされた検出用基材の上に、ケラチナーゼが付着したサンプリング用基材を載置し、カゼインでコーティングされた検出用基材の表面と、ケラチナーゼが付着したサンプリング用基材の表面とを接触させた。検出用基材の上にサンプリング用基材を載置して形成された構造体を、以下、「接触構造体」という。接触構造体を収容するプラスチック容器を、約３７℃で一晩、インキュベーションした。インキュベーションには、市販のインキュベータ（株式会社三商製の小型インキュベータＳＩＢ−３５）を使用した。【００８６】
（５）金コロイド染色
インキュベーション後、接触構造体を検出用基材とサンプリング用基材とに分離し、検出用基材の表面を蒸留水で１回洗浄した。洗浄後、検出用基材をＴ−ＰＢＳに３７℃の温度条件下、３０分間程度浸漬し、検出基材の表面をブロッキングした。ブロッキング後、検出用基材の表面を２０℃（室温）の温度条件下、Ｔ−ＰＢＳで５分間×３回洗浄し、次いで、蒸留水で１分間×３回洗浄した。洗浄後、検出用基材を金コロイドに振盪させながら２〜４時間以上浸漬した。浸漬後、検出用基材の表面を蒸留水で２分間×５回洗浄し、乾燥させた。【００８７】
金コロイド染色結果を図７に示す。図７に示すように、カゼインでコーティングされた検出用基材の表面のうち、ケラチナーゼと接触しなかった部分（サンプリング用基材のケラチナーゼ付着領域と接触しなかった部分）は、カゼインが分解されなかったため、金コロイドにより赤色に染色された一方、ケラチナーゼと接触した部分（サンプリング用基材のケラチナーゼ付着領域と接触した部分）は、カゼインが分解されたため、金コロイドによる染色濃度が低下した。なお、図７に示すように、金コロイドによる染色濃度が低下した部分は、サンプリング用基材のケラチナーゼ付着領域に対応する形状、すなわち、サンプリング用基材へケラチナーゼを付着させるために使用した丸く切り取った濾紙片に対応する形状を有していた。【００８８】
〔実施例１〕
縦２５ｍｍ×横２５ｍｍのメディカルテープ（優肌絆）に縦８ｍｍ×横８ｍｍの濾紙を貼付し、濾紙の上に縦１０ｍｍ×横１０ｍｍのニトロセルロースメンブレン（ＢｉｏＲａｄ社製のサポート付ニトロセルロースメンブレン、ポアサイズ０．２μｍ）を貼付して、皮膚貼付用ニトロセルロースメンブレンを作製した。【００８９】
生理食塩水を滴下して表面を湿らせた皮膚貼付用ニトロセルロースメンブレンを、足白癬のある対象者（白癬菌の活性が高い５６歳の女性）の足白癬病変部位（鱗屑のある部位）に１０分間貼付した後、剥離した。【００９０】
皮膚貼付用ニトロセルロースメンブレンを貼付した部位と同じ部位から鱗屑をピンセットで採取し、採取した鱗屑を顕微鏡で観察し（観察倍率：１００倍）、白癬菌の有無を確認した。顕微鏡観察の結果を図３に示す。図３に示すように、視野全体に白癬菌が観察された。なお、図３において、糸状の物体が白癬菌である。【００９１】
剥離後の皮膚貼付用ニトロセルロースメンブレンの表面に、ＥＤＴＡ溶液５０μＬを滴下した後、カゼインでコーティングされたスライドグラスに載置し、スライドグラスのカゼインコーティング表面と、ニトロセルロースメンブレンの表面（皮膚に貼付した表面）とを接触させた。スライドグラスにニトロセルロースメンブレンを載置して形成された構造体を、以下、「接触構造体」という。【００９２】
接触構造体を湿潤箱（モイストチャンバー）に入れて遮光し、約３７℃で１時間、インキュベーションした。インキュベーションには、市販のインキュベータ（コスモ・バイオ株式会社製の小型インキュベータＳＩＢ−３５）を使用した。なお、接触構造体が乾燥しないように、湿潤箱には湿らせた紙を入れておいた。【００９３】
インキュベーション後、接触構造体をスライドグラスとニトロセルロースメンブレンとに分離し、ニトロセルロースメンブレンと接触させたスライドグラスの表面を蒸留水で洗浄し、蛍光観察装置（スーパーＬＥＤビューワー，ＳＰＶ−２２０，Ｇｅｌｌｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で観察した。蛍光の有無を判別しやすいように、観察画像を２値化した。２値化では、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ）を使用して、ある一定の明るさ以上のシグナルを白、それ未満のシグナルを黒に変換した。２値化処理前の画像において、蛍光が観察されなかった部分が最も明瞭に見える値をｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（１３１）とした。なお、画像処理においてシグナルの明るさ（輝度）は２５６階調（０〜２５５、０はシグナル無し、２５５は最大の明るさ＝白）で表され、「１３１」はその中の１３２番目の明るさであることを意味する。【００９４】
２値化した観察画像を図４に示す。
図４において、白色の部分は、蛍光が観察された部分、すなわち、カゼインが残存する部分であり、黒色の部分は、蛍光が観察されなかった部分、すなわち、カゼインが消失した部分である。図４に示すように、ニトロセルロースメンブレンと接触させた後のスライドグラスの表面には、その面積、形状、連続性等に基づいて、その他の部分と明確に区別可能な部分（図４中、矢印で示す部分）が存在した。この部分には、残存するカゼインが点在せず、カゼインの消失が連続して生じていた。この状態は、群棲して存在する白癬菌の状態（図３参照）と合致することから、ケラチナーゼによる分解に起因してカゼインが消失した部分であると判定した。【００９５】
図４は、ニトロセルロースメンブレンの表面（皮膚に貼付した表面）にケラチナーゼが付着しており、このケラチナーゼにより、スライドグラスの表面にコーティングされたカゼインが分解されたことを示す。したがって、スライドグラスの表面にコーティングされたカゼインの分解の有無を指標として、ニトロセルロースメンブレンの表面（皮膚に貼付した表面）におけるケラチナーゼの付着の有無を検出することができる。また、後述する実施例２の結果を参照すると、ニトロセルロースメンブレンの表面（皮膚に貼付した表面）におけるケラチナーゼの付着の有無は、ニトロセルロースメンブレンを貼付した皮膚領域における白癬菌の有無と指標となる。【００９６】
〔実施例２〕
縦２５ｍｍ×横２５ｍｍのメディカルテープ（優肌絆）に縦８ｍｍ×横８ｍｍの濾紙を貼付し、濾紙の上に縦１０ｍｍ×横１０ｍのニトロセルロースメンブレン（ＢｉｏＲａｄ社製のサポート付ニトロセルロースメンブレン、ポアサイズ０．２μｍ）を貼付して、皮膚貼付用ニトロセルロースメンブレンを作製した。【００９７】
生理食塩水を滴下して表面を湿らせた皮膚貼付用ニトロセルロースメンブレンを、足白癬のある対象者（白癬菌の活性が低い５８歳の女性）の足白癬病変部位（鱗屑のある部位）に１０分間貼付した後、剥離した。【００９８】
皮膚貼付用ニトロセルロースメンブレンを貼付した部位と同じ部位から鱗屑をピンセットで採取し、採取した鱗屑を顕微鏡で観察し（観察倍率：１００倍）、白癬菌の有無を確認した。顕微鏡観察の結果を図５に示す。図５に示すように、白癬菌はほとんど観察されなかった。なお、図５中、丸で囲んだ部分に存在する糸状の物体が白癬菌である。【００９９】
剥離後の皮膚貼付用ニトロセルロースメンブレンの表面に、ＥＤＴＡ溶液５０μＬを滴下した後、カゼインでコーティングされたスライドグラスに載置し、スライドグラスのカゼインコーティング表面と、ニトロセルロースメンブレンの表面（皮膚に貼付した表面）とを接触させた。スライドグラスにニトロセルロースメンブレンを載置して形成された構造体を、以下、「接触構造体」という。【０１００】
接触構造体を湿潤箱（モイストチャンバー）に入れて遮光し、約３７℃で１時間、インキュベーションした。インキュベーションには、市販のインキュベータ（株式会社三商製の小型インキュベータＳＩＢ−３５）を使用した。なお、接触構造体が乾燥しないように、湿潤箱には湿らせた紙を入れておいた。【０１０１】
インキュベーション後、接触構造体をスライドグラスとニトロセルロースメンブレンとに分離し、ニトロセルロースメンブレンと接触させたスライドグラスの表面を蒸留水で洗浄し、蛍光観察装置（スーパーＬＥＤビューワー，ＳＰＶ−２２０，Ｇｅｌｌｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で観察した。蛍光の有無を判別しやすいように、観察画像を２値化した。２値化は、実施例１と同様に行った。【０１０２】
２値化した観察画像を図６に示す。なお、図６中、四角で示す部分は、スライドグラスの表面のうち、ニトロセルロースメンブレンと接触した部分である。
図６において、白色の部分は、蛍光が観察された部分、すなわち、カゼインが残存する部分であり、黒色の部分は、蛍光が観察されなかった部分、すなわち、カゼインが消失した部分である。図６に示すように、ニトロセルロースメンブレンと接触させた後のスライドグラスの表面には、その面積、形状、連続性等に基づいて、その他の部分と明確に区別可能な部分は存在しなかったことから、ケラチナーゼによる分解に起因してカゼインが消失した部分は存在しないと判定した。【０１０３】
図６は、ニトロセルロースメンブレンの表面（皮膚に貼付した表面）にケラチナーゼが付着しておらず、スライドグラスの表面にコーティングされたカゼインが分解されなかったことを示す。したがって、スライドグラスの表面にコーティングされたカゼインの分解の有無を指標として、ニトロセルロースメンブレンの表面（皮膚に貼付した表面）におけるケラチナーゼの付着の有無を検出することができる。また、上述した実施例１の結果を参照すると、ニトロセルロースメンブレンの表面（皮膚に貼付した表面）におけるケラチナーゼの付着の有無は、ニトロセルロースメンブレンを貼付した皮膚領域における白癬菌の有無と指標となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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