(57)【要約】  高い中和活性を保持し、局所での薬効を発現しつつ全身暴露による全身性の副作用を低減した、優れた抗ヒトＮＧＦ抗体フラグメント、及び、該抗体フラグメントを用いた、術後疼痛の治療手段の提供。  配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント：
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）（ａ）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの翻訳後修飾により生じた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項２】
配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項３】
翻訳後修飾が重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である、請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項４】
配列番号５のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項５】
請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、発現ベクター：
（ａ）請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクター；及び
（ｂ）請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、請求項７に記載の宿主細胞：
（ａ）請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）請求項１に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法で生産できる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項１１】
請求項１〜４及び１０のいずれか１項に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１２】
術後疼痛の治療用局所医薬組成物である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
請求項２に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、請求項４に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
術後疼痛の治療用局所医薬組成物である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
術後疼痛の治療用局所医薬組成物の製造のための、請求項１〜４及び１０のいずれか１項に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの使用。
【請求項１６】
術後疼痛の治療のための、請求項１〜４及び１０のいずれか１項に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの局所投与による使用。
【請求項１７】
術後疼痛の治療に局所投与での使用をするための、請求項１〜４及び１０のいずれか１項に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
【請求項１８】
請求項１〜４及び１０のいずれか１項に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの有効量を対象の局所に投与することを含む、術後疼痛の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントに関する。本発明はまた、当該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、当該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、当該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法に関する。本発明はさらに当該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを含む医薬組成物、及び、当該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを用いて術後疼痛を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経成長因子（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＮＧＦ）は、神経栄養因子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）と総称される液性因子の一つであり、生体内においてニューロンの発生、分化、機能維持において重要な役割を担っている。ＮＧＦの受容体としては、高親和性のｔｒｋＡ（ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｋｉｎａｓｅ Ａ）と低親和性のｐ７５ＮＴＲ（ｐ７５  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が知られている。このうちｐ７５ＮＴＲは全ての神経栄養因子と結合し、ニューロンの発生過程においてアポトーシスに関与していることが報告されているが、その役割は未だ十分に解明されていない。一方、ＮＧＦとｔｒｋＡのノックアウトマウスの間では同様のフェノタイプが認められることが知られており（非特許文献１）、ＮＧＦの生理作用は主にｔｒｋＡを介して発現すると考えられている。【０００３】
ＮＧＦをラットに投与すると痛みが誘発されることが報告され（非特許文献２）、さらにヒトへＮＧＦを静脈内投与すると全身性の筋肉痛を生じること、またＮＧＦの局所投与により全身性の痛みだけでなく、投与した部位に痛覚過敏及び異痛症が誘発されると報告されている（非特許文献３）。動物においてＮＧＦの発現量はラットの術後疼痛モデルなど筋肉（非特許文献４）及び皮膚（非特許文献５）組織の切開時等の組織障害により上昇することが知られている。ヒト疼痛病態においては、変形性関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＯＡ）の関節軟骨でＮＧＦ及びｔｒｋＡの発現が亢進していることや（非特許文献６）、帝王切開時の切開部滲出液中でＮＧＦレベルが上昇していること（非特許文献７）、リウマチ性関節炎（非特許文献８）や間質性膀胱炎（非特許文献９）の患者でＮＧＦレベルが上昇していることが実証されている。【０００４】
これまでに種々の疼痛動物モデルにおいてＮＧＦシグナルを阻害すると疼痛が抑制されることが報告されている（非特許文献１０、特許文献１〜３）。【０００５】
現在までに報告されているヒトＮＧＦに対する抗体としては、完全ヒト型抗ヒトＮＧＦ抗体であるＲＥＧＮ４７５（特許文献２）、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−ＰＥＧ（特許文献３）、Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ（特許文献４）、及びＭＥＤＩ−５７８（特許文献５）、ヒト化抗ヒトＮＧＦ抗体であるＴａｎｅｚｕｍａｂ（特許文献６）及びＰＧ１１０（特許文献７）が報告されている。その中でも臨床においてＴａｎｅｚｕｍａｂの静脈内投与に加えて、皮下投与で変形性関節症に伴う関節痛、慢性腰痛、間質性膀胱炎に伴う膀胱痛などの疼痛に対して幅広い鎮痛効果を示すことが報告されている（非特許文献１１〜１３）。【０００６】
医薬品において副作用は多くの医薬品で報告されており、それは抗ＮＧＦ抗体においても例外ではない。抗ＮＧＦ抗体のヒトへの投与により発現した有害事象として、Ｔａｎｅｚｕｍａｂの臨床試験においては頭痛、上気道感染症、感覚異常等が報告され（非特許文献１１）、Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂの臨床試験においては知覚障害、頭痛、鼻咽頭炎等が報告され（非特許文献１４）、さらにはＲＥＧＮ４７５の臨床試験では関節痛、知覚過敏、筋肉痛、末梢浮腫、及び関節腫脹等が報告されている（非特許文献１５）。【０００７】
一般に、医薬品が作用する標的組織以外の組織に暴露された場合、それらの組織においては人体にとって好ましくない副作用が生じる。【０００８】
一般に、医薬品を標的組織に直接投与して、その部位での組織濃度を高め、全身循環血を介した標的以外の組織の暴露を低減することにより、副作用を回避する局所投与剤が開発されている。【０００９】
多くの抗体医薬品は静脈などの血管内への投与に加えて、皮下あるいは筋肉内といった部位へ投与するものも多く存在する。これらは皮下あるいは筋肉内へ投与されたのち、リンパ管を介して速やかに血中に移行する。多くの抗体医薬品は血中に移行した後に血流循環を介して標的組織に運ばれて薬理作用を発揮する。また、多くの抗体医薬品の分布は血液が高く、血中から標的組織への移行性（組織／血液濃度比）は低い。そのため多くの抗体医薬品が標的組織の作用濃度を維持するためには、高い血中濃度の維持が必要である（非特許文献１６）。さらに、多くの抗体医薬品は数日から１カ月程度の血中半減期を有し、長期間の血中濃度持続を示すことにより、長時間薬理作用が維持される。従って、通常の抗体医薬品を皮下あるいは筋肉内という局所部位に投与したとしても、抗体医薬品の多くは血液中に残存して全身循環することにより全身性の薬効及び副作用が発現する。【００１０】
抗体医薬品等のバイオ医薬品において二量体化等の多量体化は安定で均質な品質の担保をする上で大きな課題となる。【００１１】
Ｆａｂ’の二量体化体のＦ（ａｂ’）２はＦａｂ’とは体内動態が異なることが知られている（非特許文献１７，１８）。【００１２】
Ｆａｂ’の二量体化体のＦ（ａｂ’）２に対する自然抗体は抗体の消失を引き起こすことが報告されている（非特許文献１９）。このような抗原−抗体反応は薬剤の体内動態に影響して消失を早める他、アナフィラキシー反応等のリスクも生じる。このように、Ｆ（ａｂ’）２にはいくつかのリスクがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１８３０３２号
【特許文献２】国際公開第２００９／０２３５４０号
【特許文献３】国際公開第２０１３／０２２０８３号
【特許文献４】国際公開第２００５／０１９２６６号
【特許文献５】国際公開第２００６／０７７４４１号
【特許文献６】国際公開第２００４／０５８１８４号
【特許文献７】米国特許第８４３５５２３号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】「レビューズ  イン  ザ  ニューロサイエンシズ（Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９７、Ｖｏｌ．８、ｐ．１３−２７
【非特許文献２】「ザ  ジャーナル  オブ  ニューロサイエンス（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９９３、Ｖｏｌ．１３、ｐ．２１３６−２１４８
【非特許文献３】「アナルズ  オブ  ニューロロジー（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）」、１９９４、Ｖｏｌ．３６、ｐ．２４４−２４６
【非特許文献４】「アネスシージオロジー（Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ）」、２００９、Ｖｏｌ．１１０、ｐ．１４０−１４９
【非特許文献５】「ペイン（Ｐａｉｎ）」、２００５、Ｖｏｌ．１１７、ｐ．６８−７６
【非特許文献６】「リューマトロジー（Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）」、２００２、Ｖｏｌ．４１、ｐ．１４１３−１４１８
【非特許文献７】「ザ  ジャーナル  オブ  ペイン（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｉｎ）」、２００８、Ｖｏｌ．９、ｐ．６５０−６５７
【非特許文献８】「クリニカル  アンド  エクスペリメンタル  リューマトロジー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）」、１９９７、Ｖｏｌ．１５、ｐ．４３３−４３８
【非特許文献９】「ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  ウロロジー（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ）」、１９９７、Ｖｏｌ．７９、ｐ．５７２−５７７
【非特許文献１０】「トレンズ  イン  ファーマコロジカル  サイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、２００６、Ｖｏｌ．２７、ｐ．８５−９１
【非特許文献１１】「ザ  ニュー  イングランド  ジャーナル  オブ  メディシン（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２０１０、Ｖｏｌ．３６３、ｐ．１５２１−１５３１
【非特許文献１２】「ザ  ジャーナル  オブ  ウロロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ）」、２０１１、Ｖｏｌ．１８５、ｐ．１７１６−１７２１
【非特許文献１３】「ペイン（Ｐａｉｎ）」、２０１１、Ｖｏｌ．１５２、ｐ．２２４８−２２５８
【非特許文献１４】「ペイン（Ｐａｉｎ）」、２０１３、Ｖｏｌ．１５４、ｐ．１９１０−１９１９
【非特許文献１５】「ペイン（Ｐａｉｎ）」、２０１４、Ｖｏｌ．１５５、ｐ．１２４５−１２５２
【非特許文献１６】「バイオアナリシス（Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ）」、２０１３、Ｖｏｌ．５、ｐ．２００３−２０１４
【非特許文献１７】「ザ  ジャーナル  オブ  ファーマコロジー  アンド  エクスペリメンタル  セラピューティクス（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、１９９７、Ｖｏｌ．２８１、ｐ．１−８
【非特許文献１８】「キャンサー  リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９８６、Ｖｏｌ．４６、ｐ．３９６９−３９７８
【非特許文献１９】「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  イミュノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、１９９５、Ｖｏｌ．２５、ｐ．３１２８−３１３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、高い中和活性を保持し、局所での薬効を発現しつつ全身暴露による全身性の副作用を低減した、優れた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、医学上又は産業上有用な物質・方法として以下の発明を含むものである。【００１７】
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
（１）以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント：
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）（ａ）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの翻訳後修飾により生じた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
（２）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
（３）翻訳後修飾が重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化である、上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
（４）配列番号５のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
（５）上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含む、ポリヌクレオチド。
（６）以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、発現ベクター：
（ａ）上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクター；及び
（ｂ）上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（７）上記（６）に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（８）以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、上記（７）に記載の宿主細胞：
（ａ）上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）上記（１）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターとで形質転換された宿主細胞。
（９）上記（８）に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法。
（１０）上記（９）に記載の方法で生産できる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
（１１）上記（１）〜（４）及び（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（１２）術後疼痛の治療用局所医薬組成物である、上記（１１）に記載の医薬組成物。
（１３）上記（２）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、上記（４）に記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（１４）術後疼痛の治療用局所医薬組成物である、上記（１３）に記載の医薬組成物。
（１５）術後疼痛の治療用局所医薬組成物の製造のための、上記（１）〜（４）及び（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの使用。
（１６）術後疼痛の治療のための、上記（１）〜（４）及び（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの局所投与による使用。
（１７）術後疼痛の治療に局所投与での使用をするための、上記（１）〜（４）及び（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
（１８）上記（１）〜（４）及び（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの有効量を対象の局所に投与することを含む、術後疼痛の治療方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＮＧＦが病態形成に関与する術後疼痛の治療に有用である。このような本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、その中和活性及び局所滞留性が高くかつ血中からの消失が早いという優れた体内動態により、投与量の低減ならびに薬効持続の延長を示し、かつ全身暴露による全身性の副作用が低減された、臨床適用において薬効、安全性共に非常に優れた改善を示すことが期待されるものである。本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＮＧＦが関与する術後疼痛の治療において大きく貢献するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に、本発明について詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００２０】
本発明者らは、抗ヒトＮＧＦ抗体又はその抗原結合フラグメントの作製において相当の創意検討を重ねた結果、高い中和活性を保持しつつ、局所での薬効を発現しつつ全身暴露による全身性の副作用を低減した、優れた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを作製することに成功した。
【００２１】
抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２万〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００２２】
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）とよばれている。可変領域よりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３あるいはＣＬと表される。
【００２３】
抗体の抗原決定部位はＶＨ及びＶＬによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。重鎖と軽鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
【００２４】
抗体の重鎖定常領域のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間にある領域はヒンジ領域とよばれ、この領域は、プロリン残基を多く含み、２本の重鎖をつなぐ複数の鎖間Ｓ−Ｓ結合を含む。例えば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の各ヒンジ領域には、重鎖間のＳ−Ｓ結合を構成している、それぞれ、２個、４個、１１個、２個のシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、パパインやペプシン等のタンパク質分解酵素に対する感受性が高い領域である。抗体をパパインで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ−Ｓ結合よりもＮ末端側の位置で重鎖が切断され、２個のＦａｂフラグメントと１個のＦｃフラグメントに分解される。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される。抗体をペプシンで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ−Ｓ結合よりもＣ末端側の位置で重鎖が切断され、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが生成される。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ−Ｓ結合で結合した二量体構造のフラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成され、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ−Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメントは、いずれも可変領域を含み、抗原結合活性を有する。
【００２５】
本発明者らが作製に成功した本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、以下の特徴を有するＦａｂフラグメントである：
配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
【００２６】
具体的には、本発明者らは、完全ヒト型抗ヒトＮＧＦ抗体１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’フラグメント（特許文献３；同文献中で１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’とも称する）を改変し、各種生物学的活性試験及び物性試験を用いた抗体のスクリーニングによって、安定でかつ高い中和活性及び局所滞留性を保持する抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントとして、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを同定することに成功した。
【００２７】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、本願明細書に開示される配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、その重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを合成し、適当な発現ベクターに連結する。次いで、当該発現ベクターを培養細胞中に導入する。最後にこの培養細胞を培養して培養上清からモノクローナルＦａｂフラグメントを得ることができる。
【００２８】
本発明のＦａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明のＦａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、当該重鎖フラグメント及び軽鎖のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、国際公開第９０／０７８６１号に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
【００２９】
１つの実施形態において、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３０】
本発明のＦａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明のＦａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドの作製につづく、当該ポリヌクレオチドの発現ベクターへの導入、発現ベクターの培養細胞への導入、培養細胞の培養、Ｆａｂフラグメントの精製等については、当該分野で公知の種々の方法を使用して行うことができる。
【００３１】
使用される発現ベクターとしては、例えば、ＧＳベクターｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）が挙げられるが、本発明のＦａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明のＦａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。
【００３２】
上記の発現ベクターは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等により、培養細胞中に導入される。
【００３３】
発現ベクターを導入する培養細胞としては、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、２９３細胞等の培養細胞が使用でき、これを常法により培養すればよい。
【００３４】
上記培養後、培養上清中に蓄積されたＦａｂフラグメントは、各種カラムクロマトグラフィーにより精製することができ、例えば、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ等によるカラムクロマトグラフィーを使用することができる。
【００３５】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの例としては、後記実施例に記載されるｈ１ｆ．６抗体が挙げられる。
【００３６】
抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等が挙げられ、種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、２００８、Ｖｏｌ．９７、ｐ．２４２６−２４４７）。
【００３７】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントには、翻訳後修飾により生じた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントも含まれ得る。翻訳後修飾により生じ得る本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの例としては、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化した抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントが挙げられる。このようなＮ末端のピログルタミル化による翻訳後修飾は、抗体の活性に影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００６、Ｖｏｌ．３４８、ｐ．２４−３９）。
【００３８】
例えば、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントには、以下の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントも含まれる：
配列番号５のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
【００３９】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＮＧＦに結合する。得られた抗ヒトＮＧＦ抗体ＦａｂフラグメントのヒトＮＧＦに対する結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡやＦＡＣＳ等の方法がある。例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒトＮＧＦをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、これに対してＦａｂフラグメントを添加して反応させた後、ビオチン等で標識した抗Ｋａｐｐａ抗体等の二次抗体及びアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジンを反応させた後、その活性を検出する試薬（例えば、アルカリフォスファターゼ標識の場合、化学発光アルカリフォスファターゼ基質）等を用いた活性測定により、二次抗体の結合を同定する。また、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＮＧＦに加え、他の動物由来のＮＧＦ（例えば、マウスＮＧＦ）にも結合でき、これらのタンパク質に対する結合活性を測定してもよい。
【００４０】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒトＮＧＦに対する中和活性を有している。本明細書中で使用される場合、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの「中和活性」とは、ヒトＮＧＦへの結合によりヒトＮＧＦを介してもたらされる任意の生物活性を阻害する活性を意味し、ヒトＮＧＦの１つ又は複数の生物活性を指標に評価することができる。このような中和活性としては、例えば、ヒトＮＧＦとその受容体であるヒトｔｒｋＡとの結合阻害活性が挙げられ、後記実施例に記載されるような方法を用いることによって評価することができる。
【００４１】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの効果をより詳細に評価するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでの試験を用いることもできる。例えば、後記実施例に記載のように、ラット足裏切開術後痛モデルを用いる鎮痛効果試験等を用いて、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントのｉｎ  ｖｉｖｏでの薬効を評価することができる。また、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントをラットの大腿筋へ局所投与した後にその組織ホモジネートを用いたＮＧＦとの結合活性評価試験や、ＮＧＦとその受容体であるｔｒｋＡとの結合阻害活性評価試験を行うことにより組織中の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの薬理活性を確認することもできる。さらに、血漿中及び組織中の薬物濃度評価試験を行うことによりＦａｂフラグメントの局所曝露量の維持及び全身血中曝露量の低減を評価することもできる。
【００４２】
その他、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの各種安定性（例えば、熱安定性、長期保存安定性、高濃度安定性）を評価する方法としては、例えばサイズ排除クロマトグラフィーによる保存中の凝集体形成の測定を利用する方法が挙げられる。
【００４３】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、必要に応じて精製された後、常法に従って製剤化され、術後疼痛の治療に用いることができる。
【００４４】
「術後疼痛」とは、切創、穿刺、切開、裂傷、又は個体の組織内の創傷などの外部の外傷に起因する又はそれから生じる疼痛をいう（侵襲性又は非侵襲性にかかわらず、すべての外科的処置に起因するものが含まれる）。本明細書中で使用する術後疼痛には、外部からの物理的な外傷を伴わずに起こる（外傷に起因しない、又は外傷により派生したものではない）疼痛は含まれない。術後疼痛は内部又は外部（末梢が含まれる）の疼痛であり、創傷、切創、外傷、裂傷又は切開は、偶発的（外傷創傷の場合）または意図的（手術時の切開の場合）に起こり得る。疼痛は疼痛スコア及び当分野で周知の他の方法を用いて客観的及び主観的に評価することができる。本明細書中で使用する術後疼痛にはアロディニア（すなわち、通常は非侵害である刺激に対する応答の増加）及び痛覚異常過敏（すなわち、通常は侵害性又は不快な刺激に対する応答の増加）が含まれ、これらは熱的又は機械的な性質である場合がある。疼痛は、熱感受性、機械的刺激に対する感受性及び／又は安静時疼痛によって特徴づけられる。術後疼痛には、機械的刺激に対して誘導された疼痛及び安静時疼痛が含まれる。
【００４５】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、術後疼痛の治療剤として用いることができる。この治療剤の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤、デポ剤等の非経口剤を挙げることができ、標的組織局所への筋肉内注射、皮下注射等により投与することが好ましい。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。
【００４６】
上記製剤化に当たっての本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
【００４７】
また、本発明は、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを含む医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体や添加剤を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体や添加剤の種類は特に限定されず、当業者に周知の担体や添加剤を用いることができる。本発明は、術後疼痛の治療に使用するための本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント、及び、術後疼痛の治療用医薬組成物の製造のための本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの使用にも関する。本発明は、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの有効量を対象の局所に投与することを含む、術後疼痛の治療方法にも関する。なお、「対象」とは、その治療を必要とするヒト又はその他のほ乳動物であり、ある態様としては、その治療を必要とするヒトである。本発明の治療方法における抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの有効量は、上記製剤化にあたってのＦａｂフラグメントの添加量と同様の量であってよい。また、本発明の局所医薬組成物は、治療が望まれる部位、又はその領域に隣接した部位、特に外科手術時の切開組織等の標的組織、あるいはその近傍に投与、使用される医薬組成物を意味する。例えば、上記に記載した通り、標的組織局所への筋肉内注射、皮下注射等により投与することができる。また、標的組織局所に本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントが一定時間、好ましくは、７２時間であり、さらに好ましくは２４時間滞留することを含む。
【００４８】
本発明の医薬組成物には、複数種の本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを含み得る。例えば、翻訳後修飾を受けていない抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント及び翻訳後修飾により生じた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物には、以下の（ａ）及び（ｂ）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを含有する医薬組成物も含まれる。
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）（ａ）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの翻訳後修飾により生じた抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
【００５０】
１つの実施形態において、本発明の医薬組成物には、以下の（ａ）及び（ｂ）の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを含有する医薬組成物も含まれる。
（ａ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）配列番号５のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメント。
【００５１】
本発明はまた、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド（以下、纏めて「本発明のポリヌクレオチド」とも称する）、並びにそれらのいずれか又は両方を含む発現ベクター（以下、「本発明の発現ベクター」とも称する）に関する。
【００５２】
本発明の発現ベクターは、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。使用される発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等が挙げられ、例えば、ＧＳベクターｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）を使用することができる。１つの実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。別の実施形態において、本発明の発現ベクターは、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターである。
【００５３】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。細菌中で本発明のＦａｂフラグメントあるいはその重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、宿主がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母中での発現用プロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、バチルス属菌での発現用プロモーターとしては、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
【００５４】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域及び複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞又は昆虫細胞を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントをコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
【００５５】
本発明はまた、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換され得るものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞（ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、２９３細胞等）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）など）が例示される。形質転換自体は、公知の方法により行われ得る。
【００５６】
本発明の宿主細胞としては、以下の（ａ）及び（ｂ）が挙げられる：
（ａ）本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、該抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００５７】
本発明はまた、本発明の宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を含む、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法に関する。好ましくは、該方法で使用される宿主細胞としては、前記本発明の宿主細胞（ａ）及び（ｂ）が挙げられる。
【００５８】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの生産において、形質転換された宿主細胞は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類等）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）を含んでいてもよい。
【００５９】
宿主細胞の培養自体は、公知の方法により行われる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９５５、Ｖｏｌ．１２２、ｐ．５０１−５０４）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９５９、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６−３９７）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、１９６７、Ｖｏｌ．１９９、ｐ．５１９−５２４）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１９５０、Ｖｏｌ．７３、ｐ．１−８）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５、Ｖｏｌ．８２、ｐ．８４０４−８４０８）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば、上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｏｌ．Ｃｏｌ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｖｏｌ．３、Ａ２．２）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８０、Ｖｏｌ．７７、ｐ．４５０４−４５０８）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【００６０】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程に加えて、さらには、該宿主細胞から抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを回収、好ましくは単離、精製することができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００６１】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントには、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを生産する方法で生産できる抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントも含まれる。
【００６２】
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供する。しかし、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００６３】
市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。【００６４】
（実施例１：抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの作製）
１−１５（Ｎ５２Ｄ）−Ｆａｂ’フラグメント（特許文献３）の重鎖をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを鋳型として、ＶＨからヒンジ領域の遺伝子断片３種（配列番号１、配列番号２及び配列番号３）を各々増幅できるように設計したプライマーを用い、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ社、Ｆ−５３０Ｌ）を用いて当該３種の遺伝子断片を増幅した。増幅した領域の５’側にはＨｉｎｄＩＩＩが、３’側にはＥｃｏＲＩが含まれている。このようにして得た重鎖遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ（ともにＮＥＢ社）で消化し、発現ベクターであるｐＥＥ６．４に挿入した。【００６５】
これらの発現プラスミドを常法により大腸菌に導入して形質転換クローンを得、それからＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ａ１４６０）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。一方、軽鎖遺伝子は、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖遺伝子と同じ塩基配列（配列番号４）であり、それによりコードされるアミノ酸配列は配列番号８である。この軽鎖遺伝子断片を含むｐＥＥ１２．４を使用した。【００６６】
抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖遺伝子断片が挿入されたＧＳベクター（ｐＥＥ６．４）、及び抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖遺伝子断片が挿入されたＧＳベクター（ｐＥＥ１２．４）を、制限酵素であるＮｏｔＩとＰｖｕＩ（ともにＮＥＢ社）を用いそれぞれ切断した。その後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社、６０２３）を用いてライゲーションを行い、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖及び軽鎖の両遺伝子断片が挿入されたＧＳベクターを構築した。得られたプラスミドＤＮＡを鋳型としてシークエンス反応を行い、クローニングされている重鎖をＶＨからヒンジ領域まで、軽鎖をＶＬからＣＬ領域までの塩基配列を確認した。３種類の重鎖の当該ＶＨからヒンジ領域の塩基配列を配列番号１、配列番号２及び配列番号３に示した。また、それによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５、配列番号６及び配列番号７に示した。３種類の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは配列番号１の重鎖と配列番号４の軽鎖、配列番号２の重鎖と配列番号４の軽鎖及び配列番号３の重鎖と配列番号４の軽鎖を組み合わせて作製し、それぞれをｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体とした。【００６７】
当該ＧＳベクターを用いて、一過性発現及び恒常的発現の２種類の方法で抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを発現させた。一過性発現については、ＣＤ−ＣＨＯ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養されたＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）に対し、当該ＧＳベクターをＭａｘＣｙｔｅエレクトロポレーション装置（ＭａｘＣｙｔｅ社）によりトランスフェクトし、７日間培養した。その培養上清からＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥヘルスケア社、１７−５４５８−０２）を用いて、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを精製した。恒常的発現については、エレクトロポレーション法を用いて制限酵素であるＰｖｕＩで切断した当該ＧＳベクターをＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞にトランスフェクトすることにより抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを発現させた。その培養上清からＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔを用いて、抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントを精製し、サイズ排除クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて確認した。なお、精製したｈ１ｆ．６抗体の翻訳後修飾を確認するため質量分析を行った結果、その大部分においてＮ末端のピログルタミル化と考えられるピークが生じていた。【００６８】
（実施例２：各抗ヒトＮＧＦ抗体ＦａｂフラグメントのヒトＮＧＦ機能阻害活性評価）
作製した各抗ヒトＮＧＦ抗体ＦａｂフラグメントのヒトＮＧＦ機能阻害活性評価を行うため、ヒトＮＧＦとその受容体ｔｒｋＡの結合阻害を指標としたヒトＮＧＦ−ｔｒｋＡ拮抗ＥＬＩＳＡを行った。ヒトｔｒｋＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１７５−ＴＫ−０５０）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色９６プレート（Ｎｕｎｃ社、４３６１１０）に１ウェルあたり５０μＬ添加し、４℃で一晩プレートをインキュベートすることで固相化した。逆遠心によりヒトｔｒｋＡ固相液を除去し、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社、３７５３２）を１ウェルあたり２００μＬ添加した。プレートを室温にて３０分間インキュベートした後、逆遠心によりＢｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳを除去した。０．１％ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを用いて約２０００００ｎｇ／ｍＬから約２ｎｇ／ｍＬの間で７から１１段階に希釈した精製抗体サンプルを、それぞれ７００ｎｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＮＧＦと等量ずつ混合し、室温にて３０分間インキュベートしたサンプルを１ウェルあたり１００μＬ添加した。尚、ここで用いたビオチン化ヒトＮＧＦは、ヒトＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、２５６−ＧＦ−１００／ＣＦ）をＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社、２１３２９）を使用してビオチン化したものを用いた。ヒトＮＧＦのビオチン化は、２５０μＬの０．４ｍｇ／ｍＬ  ヒトＮＧＦ溶液に対して、１．２５μＬの５ｍＭ  ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ溶液を添加し、氷上、遮光条件で２時間反応させた後、マニュアルに従ってＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  ３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＦＣ５００３２４）を２回用いて、反応液をＰＢＳ溶液として回収することにより行った。コントロールとして０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを準備した。室温にて３０分間インキュベートした後、プレートを洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ））で３回洗浄し、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキングワン（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液で１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ社、２１３２４）を１ウェルあたり１００μＬ添加した。室温にて３０分間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、０．１ｍＭ塩化マグネシウム含有２ｍＭトリス（ｐＨ９．８）緩衝液で５倍希釈したアルカリフォスファターゼ基質（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＡＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ／Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，  ４５０ｎｍ；ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社、ＡＰＵ４−０１００−０１）を１ウェルあたり１００μＬ加えた。室温にて３０分間インキュベートし、そのシグナル値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。【００６９】
１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’フラグメント、ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体の試験を２試行実施した。各抗体のヒトＮＧＦ−ｔｒｋＡ結合阻害率を算出するにあたり、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳの測定値を０％とし、各抗体における最大濃度の測定値を１００％と設定した。算出されたヒトＮＧＦ−ｔｒｋＡ結合阻害率を解析し、３パラメータロジスティック又は４パラメータロジスティック曲線回帰により抗体のＩＣ５０値を算出した。２試行のＩＣ５０値を幾何平均した結果、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’フラグメント、ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体のヒトＮＧＦ−ｔｒｋＡ結合阻害ＩＣ５０値はそれぞれ０．３０μｇ／ｍＬ、０．３２μｇ／ｍＬ、０．３０μｇ／ｍＬ、０．２８μｇ／ｍＬであり、これらのヒトＮＧＦ−ｔｒｋＡ結合阻害能はほぼ同等であった。【００７０】
（実施例３：各抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの５０℃、１４日間保存による二量体形成評価）
１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’フラグメント、ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体の各溶液をｐＨ５，６，７の緩衝液（ｐＨ５，６は２０ｍＭ  クエン酸・１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７はＰＢＳ）に置換し、１０ｍｇ／ｍＬに調整して５０℃、１４日間保存し、安定性を評価した。【００７１】
５０℃、１４日間保存する前後のサンプル中の二量体の形成はＬＣ１１００（アジレントテクノロジー社）を用い、カラムとしてＴＳＫ  ｇｅｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｗ３０００（ＴＯＳＯＨ社、２ｍｍＩＤ×３００ｍｍ）サイズ排除クロマトグラフィーを用いて評価した。移動相として０．１Ｍリン酸水素二ナトリウム、０．２Ｍ  Ｌ（＋）アルギニン酸塩に塩酸を加えてｐＨ６．８に調整した溶液を用い、流速を０．０７５ｍＬ／分、温度２５℃で使用し、検出波長２８０ｎｍ、リファレンス波長３６０ｎｍで測定した。測定は各２回実施して二量体形成率を算術平均し、保存後の二量体形成率から保存前の二量体形成率を引くことで二量体増加率を算出した。結果、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’フラグメントの二量体増加率はｐＨ５，６，７の条件下でそれぞれ５．４％、１７．０％、１８．２％であり、いずれのｐＨにおいても顕著な二量体の形成を認めた。一方でｈ１ｆ．６抗体の二量体増加率はｐＨ５，６，７の条件下でそれぞれ０．１％、０．３％、０．５％、ｈ１ｆ．７抗体の二量体増加率はｐＨ５，６，７の条件下でそれぞれ０．１％、０．３％、０．４％、ｈ１ｆ．８抗体の二量体増加率はｐＨ５，６，７の条件下でそれぞれ０．１％、０．５％、０．７％、であった。ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体は１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’フラグメントに比べて二量体の増加率が顕著に低く、安定であることが示された。【００７２】
（実施例４：各抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの５０℃、１４日間保存によるヒトＮＧＦ機能阻害活性安定性評価）
ｐＨ６において５０℃、１４日間保存した１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’フラグメント、ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、及びｈ１ｆ．８抗体の保存後のヒトＮＧＦ−ｔｒｋＡ結合阻害活性の変化を実施例２に記載のヒトＮＧＦ−ｔｒｋＡ拮抗ＥＬＩＳＡを用いて評価した。２試行のＩＣ５０値を幾何平均した結果、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’フラグメント、ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体の５０℃、１４日間保存後のヒトＮＧＦ−ｔｒｋＡ結合阻害ＩＣ５０値はそれぞれ０．４７μｇ／ｍＬ、０．３８μｇ／ｍＬ、０．５６μｇ／ｍＬ、０．４７μｇ／ｍＬであった。各抗体の５０℃、１４日間保存後の保存前に対するＩＣ５０増加率はそれぞれ５９％、２１％、８７％、６８％であった。【００７３】
以上より、ｈ１ｆ．６抗体、ｈ１ｆ．７抗体、ｈ１ｆ．８抗体が５０℃、１４日間の保存において１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’フラグメントで起こる二量体増加を顕著に減少させた。ｈ１ｆ．６抗体は保存中の活性減弱も少なく、高い安定性を持つ抗ＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントであることを見出した。【００７４】
（実施例５：ＥＬＩＳＡによる抗ヒトＮＧＦ抗体のヒトＮＧＦ結合評価）
ｈ１ｆ．６抗体の抗原結合活性を測定するために、ＥＬＩＳＡを使用した。ここではヒトＮＧＦに対する結合能を評価するために、ヒトＮＧＦを固相化したプレートを用いて試験した。この際、比較対照として先行抗体Ｔａｎｅｚｕｍａｂを用いた。【００７５】
ヒトＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、２５６−ＧＦ−１００／ＣＦ）をＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色９６プレート（Ｎｕｎｃ社、４３６１１０）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩プレートをインキュベートすることで固相化した。逆遠心によりヒトＮＧＦ固相液を除去し、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社、３７５３２）を１ウェルあたり２００μＬ添加し、室温にて３０分間プレートをインキュベートした。その後逆遠心によりＢｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳを除去し、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて、精製抗体サンプルを１０００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで１１段階に希釈し、１ウェルあたり１００μＬ添加して、室温にて３０分間プレートをインキュベートした。コントロールとして０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを準備した。プレートを洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキングワン（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液で１０００倍に希釈したビオチン化抗ヒトＫａｐｐａ軽鎖抗体（ＩＢＬ社、１７２４９）を１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄し、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキングワン溶液で１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ社、２１３２４）を１ウェルあたり１００μＬ添加し、プレートを室温にて０．５時間インキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄し、０．１ｍＭ塩化マグネシウム含有２ｍＭトリス（ｐＨ９．８）緩衝液で５倍希釈したアルカリフォスファターゼ基質（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＡＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ／Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，  ４５０ｎｍ；ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社、ＡＰＵ４−０１００−０１）を１ウェルあたり１００μＬ加えた。室温にて３０分間インキュベートし、そのシグナル値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。【００７６】
各抗体の試験をデュプリケートで行い、算術平均を算出した。各抗体のヒトＮＧＦ結合率を算出するにあたり、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳの測定値を０％とし、各抗体における最大濃度の測定値を１００％と設定した。算出されたヒトＮＧＦ結合率を解析し、３パラメータロジスティック曲線回帰により抗体のＥＣ５０値を算出した。ｈ１ｆ．６抗体については２試行のＥＣ５０値を幾何平均した結果、ｈ１ｆ．６抗体のＥＣ５０値は７３．０ｎｇ／ｍＬであったのに対し、ＴａｎｅｚｕｍａｂのＥＣ５０値は１４６ｎｇ／ｍＬであった。【００７７】
（実施例６：抗ヒトＮＧＦ抗体のヒトＮＧＦ機能阻害活性評価）
ｈ１ｆ．６抗体のヒトＮＧＦ機能阻害活性を測定するために、実施例２で用いたＮＧＦ−ｔｒｋＡ結合阻害を評価する拮抗ＥＬＩＳＡを使用した。この際、比較対照として先行抗体Ｔａｎｅｚｕｍａｂを用いた。【００７８】
ｈ１ｆ．６抗体は４試行、Ｔａｎｅｚｕｍａｂは３試行実施し、算出したＩＣ５０値の幾何平均を算出した。結果、ｈ１ｆ．６抗体のヒトＮＧＦ−ｔｒｋＡ結合阻害ＩＣ５０値は０．３１μｇ／ｍＬであったのに対し、ＴａｎｅｚｕｍａｂのヒトＮＧＦ−ｔｒｋＡ結合阻害ＩＣ５０値は０．８６μｇ／ｍＬであった。【００７９】
（実施例７：組織中の抗体の局所滞留性、ヒトＮＧＦ結合活性及びヒトＮＧＦ機能阻害活性の評価）
ｈ１ｆ．６抗体を局所投与した後、抗体の局所滞留を評価するため、投与組織における抗体濃度を評価した。正常ラットに各ｎ＝４でｈ１ｆ．６抗体を０．３及び３ｍｇ／ｋｇで大腿筋内に局所投与し、投与６時間後の大腿筋中の抗体濃度をＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）アッセイにより測定した。局所投与は抗体をＰＢＳを溶媒として０．２ｍＬ／ｋｇの投与容量で大腿筋内に注射することで行った。【００８０】
採取した大腿筋組織は２．５倍量の組織ホモジネート液（１０ｍＭ  トリス、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ，Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ社）、ｐＨ８．０）を添加し、大腿筋ホモジネートを作製した。ＥＣＬアッセイでの測定にはベロシミューンマウスにヒトＮＧＦを免疫して得られた１−１５抗体（特許文献３）をマウスに免疫して取得した２種類の抗１−１５抗体であるＡＮＡ−ＩＢＬ−１３Ａとビオチン化ＡＮＡ−ＩＢＬ−５２Ａを用いた。尚、ここで用いたビオチン化ＡＮＡ−ＩＢＬ−５２Ａは、ＡＮＡ−ＩＢＬ−５２ＡをＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学、ＬＫ０３）を用いて、テクニカルマニュアルに従いビオチン化したものを用いた。【００８１】
ＥＣＬアッセイの方法を以下に示す。抗１−１５抗体であるＡＮＡ−ＩＢＬ−１３ＡをＴＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｌ１５ＸＡ−６）に１ウェルあたり２５μＬ添加した。室温で１時間プレートをインキュベートすることで、ＡＮＡ−ＩＢＬ−１３Ａを固相化した。逆遠心によりＡＮＡ−ＩＢＬ−１３Ａ固相液を除去し、プレートを洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄し、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社、３７５３２）を１ウェルあたり１５０μＬ添加した。室温で1時間インキュベートした後、逆遠心によりＢｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳを除去し、プレートを洗浄液で３回洗浄し、大腿筋ホモジネートは希釈液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳ）で１００倍に希釈し、さらに希釈が必要なサンプルについては、抗体未投与の大腿筋ホモジネートを１％含む希釈液を用いて検量線の範囲内になるように希釈して、１ウェルあたり２５μＬ添加した。大腿筋ホモジネートの検量線作成用に、希釈液を用いて１００００ｎｇ／ｍＬから０．５１ｎｇ／ｍＬまで１０段階に希釈したｈ１ｆ．６抗体を、抗体未投与の大腿筋ホモジネート１％を含む希釈液を用いて１００倍希釈したサンプルを準備した。コントロールとして、抗体未投与の大腿筋ホモジネート１％を含む希釈液を準備した。室温にて１時間インキュベートした後、逆遠心により溶液を除去し、プレートを洗浄液で３回洗浄し、希釈液を用いて３００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン化ＡＮＡ−ＩＢＬ−５２Ａを１ウェルあたり２５μＬ添加した。室温にて1時間インキュベートした後、逆遠心により溶液を除去し、プレートを洗浄液で３回洗浄し、希釈液を用いて１０００ｎｇ／ｍＬに希釈したＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ  ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｒ３２ＡＤ−１）を２５μＬ添加した。室温にて1時間インキュベートした後、逆遠心により溶液を除去し、プレートを洗浄液で３回洗浄した。超純水（ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）、メルク社）で２倍に希釈したＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（４ｘ）ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｒ９２ＴＣ−２）を１５０μＬ添加し、その電気化学発光をＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）で測定した。【００８２】
抗体濃度を算出するにあたり、検量線を作成した。回帰式は４パラメータロジスティック曲線回帰にて解析を行った。検量線から、各ポイントにおける大腿筋中の抗体濃度を算出した。各個体をデュプリケートで行い、濃度の算術平均を求めた。【００８３】
ｈ１ｆ．６抗体を０．３及び３ｍｇ/ｋｇ大腿筋内へ局所投与して、投与６時間後の大腿筋中濃度を測定した結果、ｈ１ｆ．６抗体の０．３及び３ｍｇ/ｋｇ投与群ではそれぞれ２．６６μｇ／ｍＬ及び６７．９μｇ／ｍＬであった。【００８４】
次に、大腿筋中でのヒトＮＧＦ結合活性を有するｈ１ｆ．６抗体量を測定するため、ヒトＮＧＦ結合ＥＬＩＳＡを使用した。
ヒトＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、２５６−ＧＦ／ＣＦ）をＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色３８４プレート（Ｎｕｎｃ社、４６０３７２）に１ウェルあたり２０μＬ添加し、４℃で一晩プレートをインキュベートして固相化した。逆遠心によりヒトＮＧＦ固相液を除去し、ブロッキングワン（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液を１ウェルあたり８０μＬ添加し、室温にて１時間プレートをインキュベートした。プレートを洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳで１０倍に希釈したブロッキングワンを用いて０．３ｍｇ／ｋｇ投与群は１０倍、３ｍｇ／ｋｇ投与群は１００倍に大腿筋ホモジネートを希釈し、１ウェルあたり２０μＬ添加した。
また、０．３ｍｇ／ｋｇ投与群及び３ｍｇ／ｋｇ投与群の大腿筋ホモジネートの検量線作成用に、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳで１０倍に希釈したブロッキングワンに抗体未投与の大腿筋ホモジネート１０％及び１％を加えた希釈液で、それぞれｈ１ｆ．６抗体を３０００ｎｇ／ｍＬから０．０３ｎｇ／ｍＬまで１１段階に希釈し、１ウェルあたり２０μＬ添加した。【００８５】
室温にて１時間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳで１０倍に希釈したブロッキングワンを用いて、ビオチン化抗ヒトＫａｐｐａ軽鎖抗体（ＩＢＬ社、１７２４９）を２５００倍希釈し、１ウェルあたり２０μＬ添加した。室温にて１時間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳで１０倍希釈したブロッキングワンを用いて、高感度ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ社、２１１３０）を８０００倍希釈し、１ウェルあたり２０μＬ添加して室温にて１時間プレートをインキュベートした。プレートを洗浄液で３回洗浄し、化学発光基質（ＢＭ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＯＤ）；Ｒｏｃｈｅ社、１１５８２９５０００１）を１ウェルあたり２０μＬ加え、そのシグナル値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。試験はデュプリケートで行い、ヒトＮＧＦ結合活性を有する抗体量を算出するために検量線を作成した。回帰式は４パラメータロジスティック曲線回帰により、検量線から各ポイントにおけるヒトＮＧＦ結合活性を有する抗体量を算出した。０．３及び３ｍｇ／ｋｇ投与群に関してそれぞれ３５倍及び３５０倍することで大腿筋中でのヒトＮＧＦ結合活性を有するｈ１ｆ．６抗体量を求め、算術平均を算出した。【００８６】
その結果、０．３ｍｇ／ｋｇ投与群でヒトＮＧＦ結合活性を有するｈ１ｆ．６抗体は２．１２μｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｋｇ投与群では７７．９μｇ／ｍＬであった。【００８７】
よって、上記の大腿筋中のｈ１ｆ．６抗体濃度及びヒトＮＧＦ結合活性を有するｈ１ｆ．６抗体量の結果から、大腿筋中に存在する抗体のほぼ全てが、ヒトＮＧＦ結合活性を有することが示された。【００８８】
そこで次に、大腿筋中のヒトＮＧＦ機能阻害活性評価を行うため、ヒトＮＧＦとその受容体ｔｒｋＡの結合阻害を指標としたヒトＮＧＦ−ｔｒｋＡ拮抗ＥＬＩＳＡを行った。
ヒトｔｒｋＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、１７５−ＴＫ−０５０）をＰＢＳで２０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色３８４プレートに１ウェルあたり２０μＬ添加し、４℃で一晩インキュベートすることで固相化した。逆遠心によりヒトｔｒｋＡ固相液を除去し、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳを１ウェルあたり８０μＬ添加し、室温にて３０分間プレートをインキュベートした。プレートを洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄し、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳを除去した。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて０．３ｍｇ／ｋｇ投与群は５倍、３ｍｇ／ｋｇ投与群は５０倍に希釈したラット大腿筋ホモジネートを、それぞれ０．４μｇ／ｍＬのビオチン化ヒトＮＧＦと等量ずつ混合し、室温にて３０分間インキュベートしたサンプルを１ウェルあたり２０μＬ添加した。尚、ラット大腿筋ホモジネートは採取した大腿筋組織を２．５倍量の組織ホモジネート液で作製しているため、０．３及び３ｍｇ／ｋｇ投与群はもとの大腿筋組織濃度のそれぞれ３５倍及び３５０倍希釈した溶液を用いて評価している。
ここで用いたビオチン化ヒトＮＧＦは、ヒトＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、２５６−ＧＦ−１００／ＣＦ）をＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社、２１３２９）を使用してビオチン化したものを用いた。ヒトＮＧＦのビオチン化は、１ｍＬの０．４ ｍｇ／ｍＬ  ヒトＮＧＦ溶液に対して、５μＬの５ｍＭ  ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｂｉｏｔｉｎ溶液を添加した。氷上、遮光条件で２時間反応させた後、マニュアルに従ってＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ  ３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＦＣ５００３２４）を２回用いて、反応液をＰＢＳ溶液として回収することにより行った。
コントロールとして０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳと、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて希釈したｈ１ｆ.６抗体  １０μｇ／ｍＬを準備した。０．３ｍｇ／ｋｇ投与群及び３ｍｇ／ｋｇ投与群のコントロールサンプルは０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳに抗体未投与の大腿筋ホモジネートを１０％及び１％加えた希釈液を用いてそれぞれ調製した。室温にて３０分間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳで２０倍に希釈したブロッキングワン溶液で１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ社、２１３２４）を１ウェルあたり２０μＬ添加した。室温にて３０分間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、１０ｍＭ塩化マグネシウム含有２００ｍＭトリス（ｐＨ９．８）緩衝液を１０倍希釈した溶液と１：１で混和したアルカリフォスファターゼ基質（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＡＰ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ／Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  Ｓｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，  ４５０ｎｍ；ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社、ＡＰＵ４−０１００−０１）を１ウェルあたり２０μＬ加えた。室温にて３０分間インキュベートし、そのシグナル値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。
各濃度におけるヒトＮＧＦ機能阻害活性を算出するにあたり、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したサンプルの測定値を０％とし、１０μｇ／ｍＬの測定値を１００％と設定した。試験はデュプリケート（コントロールは４或いは８ウェル）で行い、算術平均を算出した。【００８９】
その結果、０．３ｍｇ／ｋｇ投与群では、大腿筋内抗体濃度の３５倍薄い条件においても２１．２％の阻害活性を示した。また、３ｍｇ／ｋｇ投与群では、大腿筋内抗体濃度の３５０倍薄い条件において５９．９％の阻害活性を示した。すなわち、ｈ１ｆ．６抗体を０．３及び３ｍｇ／ｋｇ投与した群の大腿筋組織中では、ヒトＮＧＦとその受容体ｔｒｋＡの結合を阻害することによるヒトＮＧＦ機能阻害活性を有することを確認できた。【００９０】
以上から、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントであるｈ１ｆ．６抗体は局所に投与することで標的組織での抗体濃度及びヒトＮＧＦ結合活性を保つことにより、ヒトＮＧＦとその受容体の結合を阻害することが明らかとなった。本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントであるｈ１ｆ．６抗体は、より少ない局所投与量で標的組織の局所薬効を発現する優れた医薬品になり得る可能性が高いことが期待される。【００９１】
（実施例８：ラット足裏切開術後痛モデルにおける鎮痛効果評価）
臨床における術後疼痛を反映するとされるラット足裏切開術後痛モデル(Ｐａｉｎ、２００５、Ｖｏｌ．１１７、ｐ．６８−７６)を用いて、ｈ１ｆ．６抗体を術部に局所投与した際の術後痛に対する鎮痛効果を評価した。特許文献３には、完全ヒト型抗ヒトＮＧＦ抗体１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧが静脈内投与の全身投与によって本モデルでの鎮痛効果を有することが示されている。本試験では、ｈ１ｆ．６抗体の局所投与による術後痛に対する鎮痛効果を評価するにあたり、比較対照として１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧの局所投与及び全身投与を用いた。【００９２】
具体的には、手術群は各群１０匹、非手術群は５匹とし、非手術群、溶媒（２０ｍＭ  Ｃｉｔｒａｔｅ，１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ６）群、ｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、及び１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群の計５群を設定した。足裏局所投与は約２ｍｇ小片のＳｐｏｎｇｅｌ（登録商標）シート（アステラス製薬）に３０ｍｇ／ｍＬ抗体溶液３０μＬを浸透膨潤させたものを切開した足底の筋部に埋め込むことで行った。また、溶媒群及び１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群においては溶媒を浸透膨潤させたＳｐｏｎｇｅｌシートを埋め込んだ。本評価ではイソフルラン麻酔下において左後肢足裏を踵先端から約５ｍｍ部分を起点として約１０ｍｍつま先方向へ直線的に切開し、露出した足底筋を縦方向に切開後、筋の位置を戻し、Ｓｐｏｎｇｅｌシートを埋め込んでナイロン糸で２か所マットレス縫合した。手術終了２４時間、４８時間、７２時間後の疼痛閾値を測定した。疼痛閾値は、Ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｌａｎｔａｒ  ａｅｓｔｈｅｓｉｏｍｅｔｅｒ（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ社）を用いて、ラットの足裏への加圧に対する逃避行動を示す圧力を測定した。【００９３】
疼痛閾値として各群の個体の回避行動を起こした圧力閾値の３回の算術平均を算出し、非手術群の疼痛閾値を１００％、溶媒群の疼痛閾値を０％として各薬剤群の疼痛閾値の改善率を算出した。結果、術後２４時間後のｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群の疼痛閾値改善率は、それぞれ３４％、４９％、４６％であり、各薬剤投与群の疼痛閾値はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定においていずれも溶媒群に対してｐ＜０．０５の有意な改善作用を認めた。また、術後４８時間後のｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群の疼痛閾値改善率は、それぞれ３８％、３１％、３４％であり、各薬剤投与群の疼痛閾値はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定においていずれも溶媒群に対してｐ＜０．０５の有意な改善作用を認め、術後７２時間後のｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群の疼痛閾値改善率は、それぞれ２６％、３３％、２８％であり、各薬剤投与群の疼痛閾値はＳｔｕｄｅｎｔ−ｔ検定においていずれも溶媒群に対してｐ＜０．０５の有意な改善作用を認めた。この際、術後２４時間後、４８時間後、７２時間後のいずれにおいてもＴｕｋｅｙ多重比較検定においてｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群の３群の間で疼痛閾値にｐ＜０．０５の有意な差は見られず、これら３群間で観察された鎮痛薬効は術後２４時間後、４８時間後、７２時間後のいずれにおいても薬理学的に同等であることが判明した。【００９４】
（実施例９：局所投与による血漿中及び組織中の薬物濃度評価）
実施例８での評価の際の各抗体の足底筋中及び血漿中の濃度を評価するために、実施例８と同様の方法でラットに各ｎ＝３でｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群を設定し、２４時間後の足底筋中及び血漿中の抗体濃度をＥＣＬアッセイにより測定した。足裏局所投与は実施例８と同じく約２ｍｇ小片のＳｐｏｎｇｅｌ（登録商標）シート（アステラス製薬）に３０ｍｇ／ｍＬ抗体溶液３０μＬを浸透膨潤させたものを切開した足底の筋部に埋め込み縫合することで行った。【００９５】
足底筋中の抗体濃度は、採取した足底筋を９倍量の足裏組織ホモジネート液（１０ｍＭ  トリス、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｃＯｍｐｌｅｔｅ，  Ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ社）、ｐＨ８．０）でホモジネートしたサンプル中濃度を測定し、その濃度を１０倍した値を用いた。ＥＣＬアッセイでの測定には２種類の抗１−１５抗体であるＡＮＡ−ＩＢＬ−１３Ａとビオチン化ＡＮＡ−ＩＢＬ−５２Ａを用いた。尚、ここで用いたビオチン化ＡＮＡ−ＩＢＬ−５２Ａは、ＡＮＡ−ＩＢＬ−５２ＡをＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学、ＬＫ０３）を用いて、テクニカルマニュアルに従いビオチン化したものを用いた。【００９６】
ＥＣＬアッセイの方法を以下に示す。ＡＮＡ−ＩＢＬ−１３ＡをＴＢＳで５０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｌ１５ＸＡ−３）に１ウェルあたり２５μＬ添加した。室温で１時間プレートをインキュベートすることで、ＡＮＡ−ＩＢＬ−１３Ａを固相化した。逆遠心によりＡＮＡ−ＩＢＬ−１３Ａ固相液を除去し、洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）でプレートを３回洗浄し、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ社、３７５３２）を１ウェルあたり１５０μＬ添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした後、逆遠心によりＢｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳを除去した。プレートを洗浄液で３回洗浄し、血漿サンプル及び足底筋ホモジネートを希釈液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ＴＢＳ）で１０倍に希釈し、１ウェルあたり２５μＬ添加した。血漿サンプルの検量線作成用に、抗体未投与の血漿１０％を含む希釈液を用いて、３３３ｎｇ／ｍＬから０．０１７ｎｇ／ｍＬまで１０段階に希釈したｈ１ｆ．６抗体及び１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを準備し、コントロールとして、抗体未投与の血漿１０％を含む希釈液を準備した。足底筋ホモジネートの検量線作成用に、抗体未投与の足底筋ホモジネート１０％を含む希釈液を用いて、３３３ｎｇ／ｍＬから０．０１７ｎｇ／ｍＬまで１０段階に希釈したｈ１ｆ．６抗体及び１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを準備した。コントロールとして、抗体未投与の足底筋ホモジネート１０％を含む希釈液を準備した。室温にて１時間プレートをインキュベートした後、逆遠心により溶液を除去した。プレートを洗浄液で３回洗浄し、希釈液を用いて１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン化ＡＮＡ−ＩＢＬ−５２Ａを１ウェルあたり２５μＬ添加して、プレートを室温にて１時間インキュベートした。逆遠心により溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄し、希釈液を用いて５００倍に希釈したＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ  ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｒ３２ＡＤ−１）を２５μＬ添加した。プレートを室温にて１時間インキュベートした後、逆遠心により溶液を除去し、プレートを洗浄液で３回洗浄した。超純水（ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）、メルク社）で２倍に希釈したＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（４ｘ）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｒ９２ＴＣ−１）を１５０μＬ添加し、その電気化学発光をＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）で測定した。【００９７】
抗体濃度を算出するにあたり、検量線を作成した。回帰式は４パラメータロジスティックもしくは５パラメータロジスティック曲線回帰により解析を行った。検量線から、各ポイントにおける血漿中及び足底筋中の抗体濃度を算出した。各試験をトリプリケートで行い、算出した濃度の算術平均を求めた。本試験でのｈ１ｆ．６抗体の定量限界は血漿中濃度が０．２ｎｇ／ｍＬ、足底筋中濃度が２ｎｇ／ｍＬであり、完全ヒト型抗ＮＧＦ抗体１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧの定量限界は血漿中濃度が０．５ｎｇ／ｍＬ、足底筋中濃度が２ｎｇ／ｍＬであった。【００９８】
ｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群のそれぞれにおける投与２４時間後の足底筋中濃度を測定した結果、それぞれ１３２ｎｇ／ｍＬ、４６．２ｎｇ／ｍＬ、２４．１ｎｇ／ｍＬであった。ｈ１ｆ．６抗体を足裏内投与した群の足底筋中濃度が最も高かった。一方、投与２４時間後の血漿中濃度はそれぞれ０．２３０ｎｇ／ｍＬ未満（３例中１例は０．２３０ｎｇ／ｍＬ、２例は０．２ｎｇ／ｍＬ未満）、６５．１ｎｇ／ｍＬ、３９６ｎｇ／ｍＬであり、ｈ１ｆ．６抗体を足裏内投与した群の血漿中濃度が最も低かった。【００９９】
各抗体の足底筋中濃度及び血漿中濃度を基に、ｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群のそれぞれについて投与２４時間後の足底筋中／血漿中の濃度比を算出した。その際、定量限界未満であったｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した個体の投与２４時間後の血漿中濃度は定量限界の０．２ｎｇ／ｍＬとした。【０１００】
ｈ１ｆ．６抗体を９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを９００μｇ足裏局所投与した群、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧを１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群のそれぞれにおける投与２４時間後の足底筋中／血漿中の濃度比はそれぞれ６２８、０．７１、０．０６１であった。１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧは足裏内投与を行うことで静脈内投与に比して足底筋中／血漿中の濃度比が１０倍以上高かった。足裏への局所投与群の比較では、ｈ１ｆ．６抗体は１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧと比較して、足底筋中／血漿中の濃度比が８００倍以上であった。【０１０１】
以上から、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントであるｈ１ｆ．６抗体の局所投与は目的の局所での薬剤濃度を保ちつつ全身血流中の抗体濃度を低減できることが示され、さらに完全ヒト型抗ヒトＮＧＦ抗体１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’−１０ｋＰＥＧに比して極めて有効に局所での薬剤濃度を保ちつつ全身血流中の薬剤濃度を低減することが示された。よって、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは局所での薬効を発現しつつ全身性の副作用を低減する優れた医薬品になり得る可能性が高いことが期待される。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、術後疼痛の治療に有用であることが期待される。本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントは、局所での薬効を発現しつつ全身性の血中暴露に基づく副作用を低減した優れた薬剤であるという点で特に有用であることが期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０１０３】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１で示される塩基配列は、ｈ１ｆ．６抗体の重鎖フラグメントの塩基配列であり、配列表の配列番号５で示されるアミノ酸配列は、配列番号１によりコードされる重鎖フラグメントのアミノ酸配列である。配列表の配列番号２で示される塩基配列は、ｈ１ｆ．７抗体の重鎖フラグメントの塩基配列であり、配列表の配列番号６で示されるアミノ酸配列は、配列番号２によりコードされる重鎖フラグメントのアミノ酸配列である。配列表の配列番号３で示される塩基配列は、ｈ１ｆ．８抗体の重鎖フラグメントの塩基配列であり、配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号３によりコードされる重鎖フラグメントのアミノ酸配列である。配列表の配列番号４で示される塩基配列は、１−１５（Ｎ５２Ｄ−Ａ）−Ｆａｂ’フラグメントの軽鎖の塩基配列であり、配列表の配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号４によりコードされる軽鎖のアミノ酸配列である。配列表の配列番号９で示される塩基配列は、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖可変領域の塩基配列であり、配列表の配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、配列番号９によりコードされる重鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列表の配列番号１１で示される塩基配列は、本発明の抗ヒトＮＧＦ抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖可変領域の塩基配列であり、配列表の配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、配列番号１１によりコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【配列表】
2016190263000001.app
【国際調査報告】
2016190263.tif 000002
2016190263.tif 000003
2016190263.tif 000004
2016190263.tif 000005