(57)【要約】  変異糸状菌を効率よく作製する方法の提供。宿主糸状菌に部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼと一本鎖ＤＮＡとを導入し、該宿主のゲノムＤＮＡにおける該部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼによる切断部位の上流領域及び下流領域を、相同組換えによって該一本鎖ＤＮＡで置換することを含む、変異糸状菌の製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主糸状菌に部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼと一本鎖ＤＮＡとを導入し、該宿主のゲノムＤＮＡにおける該部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼによる切断部位の上流領域及び下流領域を、相同組換えによって該一本鎖ＤＮＡで置換することを含む、変異糸状菌の製造方法。
【請求項２】
前記一本鎖ＤＮＡの長さが１０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記一本鎖ＤＮＡが、前記宿主のゲノムＤＮＡにおける切断部位の上流領域及び下流領域と相同な領域をそれぞれ含む２つのＤＮＡ配列を含有する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記２つのＤＮＡ配列の長さがそれぞれ５ｂｐ以上である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記一本鎖ＤＮＡが、前記宿主のゲノムＤＮＡに挿入すべき配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記挿入すべき配列の長さが１ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼがＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１又はＺＦＮ技術に基づく人工ＤＮＡヌクレアーゼである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記糸状菌が接合菌門に属する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記糸状菌がリゾプス属菌である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記リゾプス属菌がＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅである、請求項９記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異糸状菌の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、部位特異的ヌクレアーゼ（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いたゲノム編集技術が報告されている。ゲノム編集は、ゲノム上の標的遺伝子のＤＮＡ二重鎖を特異的に切断し、切断したＤＮＡの修復の過程でヌクレオチドの欠失や挿入、置換を誘導したり、外来ポリヌクレオチドを挿入するなどして、ゲノムを部位特異的に改変する技術である。このような技術は、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）−Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１、Ｈｏｍｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｃｏｍｐａｃｔ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ＴＡＬＥＮなどとして知られている。部位特異的ヌクレアーゼを用いたゲノム編集により、ゲノムＤＮＡ上の標的部位の相同組換え効率を向上させることができ、本来相同組換え能が低い生物でも、相同組換えを起こすことが可能であることが報告されている（非特許文献１）。【０００３】
ゲノム編集技術は、従来改変が比較的難しかった哺乳動物細胞の遺伝子の相同組換え効率を向上させた。非特許文献２には、ＴＡＬＥＮ技術を用いてゲノムに導入した一本鎖ＤＮＡによりヒト標的ゲノム領域の一塩基を改変することで、一塩基多型を研究する手法が報告されている。非特許文献３には、ＴＡＬＥＮ技術を用いてマウス胚細胞のゲノムに一本鎖ＤＮＡを導入することで遺伝子改変する手法が報告されている。しかし、この方法では、１〜数塩基から、長くとも３００ｂｐ未満のゲノム領域を置換又は欠失したことしか報告されていない。非特許文献４には、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術を用いてラット胚細胞のゲノムに一本鎖ＤＮＡを導入することで遺伝子改変する手法が報告され、最大で約８３０ｂｐのＤＮＡを挿入したこと、さらに長鎖のゲノム領域の挿入や置換を行う際には、二つの一本鎖ＤＮＡを必要とすることが記載されている。しかしながら、この方法でも、１つの遺伝子領域そのものをゲノムに挿入したり、既存のゲノム大領域を別の遺伝子領域と入れ換えたりすることはなお困難である。【０００４】
リゾプス菌等の糸状菌は、有機酸などの有用物質の微生物学的生産に利用することができる有用微生物である。有用物質生産により適した糸状菌変異株を遺伝子組換え技術によって開発することが望まれる。【０００５】
糸状菌であるニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）は、組換え研究に多く用いられる生物の一つである。しかし、ニューロスポラ・クラッサ野生型株の相同組換え率は非常に低く、これを相同組換え法により遺伝子改変することは容易ではない。【０００６】
リゾプス属菌での相同組換えもまた容易ではない。リゾプス属菌では、細胞に導入したＤＮＡ断片が相同組換えによりゲノムＤＮＡに組み込まれる確率がまれである。またリゾプス属菌では、導入したＤＮＡ断片が自発的に環化したり、複製起点なしでも増幅したりするため、遺伝子マーカーを用いた遺伝子組換え株の選抜が困難である。さらに、リゾプス属菌の遺伝学的背景は未だ十分に研究されていない。したがって従来、リゾプス属菌変異株の開発には技術的な困難さが伴っていた。これまで、リゾプス属菌ゲノムへの遺伝子導入には、アグロバクテリウム法（非特許文献５）、細胞に導入するＤＮＡの末端を修飾する方法（非特許文献６）などの、相同配列部分へのターゲィングによる方法が試みられている。しかしこれらの方法は効率的でない。一方、リゾプス属菌の遺伝子破壊株は、一例しか報告がない（非特許文献７）。【０００７】
（非特許文献１）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３３９（６１２１）：８２３−８２６
（非特許文献２）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ，２０１５，１６：２１１２８−２１１３７
（非特許文献３）ＰＮＡＳ，  ２０１３，  １１０（１０）：３７８２−８７
（非特許文献４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０１６，２０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１０４３１
（非特許文献５）Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００４，２７１（４）：４９９−５１０
（非特許文献６）Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００５，２７４（４）：３７３−３８３
（非特許文献７）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２０１０，７７（３）：５８７−６０４
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、宿主糸状菌に部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼと一本鎖ＤＮＡとを導入し、該宿主のゲノムＤＮＡにおける該部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼによる切断部位の上流領域及び下流領域を、相同組換えによって該一本鎖ＤＮＡで置換することを含む、変異糸状菌の製造方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【０００９】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、およびその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【００１０】
本明細書において、別途限定がない限り、遺伝子又はＤＮＡに関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子又はＤＮＡの転写方向の上流及び下流をいう。
【００１１】
本明細書において、遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【００１２】
「ゲノム編集」とは、ゲノム上の標的遺伝子座のＤＮＡ二重鎖を、部位特異的人工ＤＮＡヌクレアーゼを用いて特異的に切断し、切断したＤＮＡの修復の過程でヌクレオチドの欠失や挿入、置換を誘導したり、外来ポリヌクレオチドを挿入するなどして、ゲノムを標的部位特異的に改変する技術である。このようなゲノム編集技術は、主に使用する部位特異的人工ＤＮＡヌクレアーゼにちなんでＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）−Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１、Ｈｏｍｉｎｇ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｃｏｍｐａｃｔ  ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ＴＡＬＥＮなどとして知られている（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１４，１５：３２１−３３４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，３９：ｅ８２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，３４：ｅ１４９、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１３，４：１７６２）。これらの技術に基づくゲノム編集のためのキットは市販されており、例えばＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ社、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社などから購入することができる。
【００１３】
本発明者は、部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼを用いたゲノム編集技術を糸状菌に応用することによって、従来よりも効率よく変異糸状菌を作製することに成功した。しかしながら、その組換え率は未だ十分とはいえず、特に１つの遺伝子領域全体の欠失や置換など、ゲノムの大領域の改変は困難であった。
【００１４】
本発明者は、糸状菌のゲノム編集による相同組換え技術についてさらなる研究を行った結果、部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼと共に細胞に導入するドナーＤＮＡとして一本鎖ＤＮＡを用いることで、相同組換え率が向上し、さらにゲノムの長鎖領域を改変することができることを見出した。
【００１５】
したがって、本発明は、変異糸状菌の製造方法を提供する。当該方法は、上記ゲノム編集技術に基づいて、宿主糸状菌に部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼと一本鎖ＤＮＡとを導入し、該宿主のゲノムＤＮＡにおける該部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼによる切断部位の上流領域及び下流領域を、相同組換えによって該一本鎖ＤＮＡで置換することを含む。
【００１６】
本発明によれば、ゲノムの長鎖領域が改変された変異糸状菌を効率よく製造することができる。本発明により得られた変異糸状菌は、宿主に対して異種遺伝子を導入して得られた組換え糸状菌であってもよく、宿主に対して同種遺伝子が導入された変異糸状菌であってもよく、又は宿主の遺伝子に対する欠失変異を有する変異糸状菌であってもよい。
【００１７】
本発明において、宿主糸状菌としては、例えば、接合菌門、子嚢菌門、担子菌門、及びツボカビ門に属する菌が挙げられる。接合菌門に属する菌としては、例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属などが挙げられる。子嚢菌門に属する菌としては、例えば、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ属、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ属、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ属、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属などが挙げられる。担子菌門に属する菌としては、例えば、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ属、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ属、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ属、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ属、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ｐｈｌｅｂｉａ属、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ属、Ｔｒａｍｅｔｅｓ属などが挙げられる。ツボカビ門に属する菌としては、例えば、Ｃｈｙｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｎｏｗａｋｏｖｓｋｉｅｌｌａ属、Ｏｌｐｉｄｉｕｍ属、Ａｌｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｏｅｌｏｍｏｍｙｃｅｓ属、Ｍｏｎｏｂｌｅｐｈａｒｉｓ属などが挙げられる。このうち、接合菌門又は子嚢菌門に属する菌が好ましく、接合菌門に属する菌がより好ましく、リゾプス属菌がさらに好ましい。リゾプス属菌としては、例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ａｒｒｈｉｚｕｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｔｏｎｋｉｎｅｎｓｉｓ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒなどが挙げられ、このうち、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ及びＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅが好ましく、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒがより好ましい。
【００１８】
本発明で用いられる部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼは、切断すべきゲノムＤＮＡ部位を特異的に認識して、切断するＤＮＡヌクレアーゼである。好ましくは、本発明で用いられる部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼは、上述したゲノム編集技術で用いられる部位特異的人工ＤＮＡヌクレアーゼであり、より好ましくは、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１、又はＺＦＮ技術で用いられる部位特異的人工ＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）、Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅ又はＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｃｐｆ１  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＺＦＮ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）が挙げられる。ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮは、切断すべきゲノムＤＮＡ部位の近傍に特異的に結合する標的認識領域と、ＤＮＡヌクレアーゼとの複合体であり、これによって、切断すべきゲノムＤＮＡ部位を特異的に認識して、切断することを可能にする。一方、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９技術では、ＤＮＡヌクレアーゼであるＣａｓ９と、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡのヘアピン構造を模倣したｇｕｉｄｅＲＮＡを用いることで、ＤＮＡ切断を誘導する。また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１技術では、ＤＮＡヌクレアーゼであるＣｐｆ１と、ｃｒＲＮＡを模倣したｇｕｉｄｅＲＮＡを用いることで、ＤＮＡ切断を誘導する。その際、Ｃａｓ９やＣｐｆ１によるＤＮＡ切断の特異性はｇｕｉｄｅＲＮＡで規定され、標的部位での切断を可能にする。当業者であれば、切断すべきゲノムＤＮＡ部位及びその周辺のＤＮＡ配列を取得し、それに合わせた標的認識領域を有する人工ＤＮＡヌクレアーゼ又はｇｕｉｄｅＲＮＡを設計することができる。
【００１９】
宿主に上記部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼを導入する場合、該ヌクレアーゼポリリボヌクレオチドや該ヌクレアーゼポリペプチドを宿主細胞に直接導入してもよいが、該ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入し、該細胞内で該ヌクレアーゼを発現させることが好ましい。
【００２０】
部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する場合、好ましくは、該ＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが宿主細胞に導入される。発現ベクターは、宿主細胞内で安定に保持され増殖が可能なものであれば特に限定されず、当業者が適宜選択することができる。例えば、リゾプス属菌に適した発現ベクターとしては、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１８／２１９、ｐＰＴＲ１／２（ＴａＫａＲａ）、ｐＲＩ９０９／９１０（ＴａＫａＲａ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１−３３１，１９８５）、ｐＡＢ４−１（ｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１−７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５−３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７−４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７−４５１，１９９０）等が挙げられる。
【００２１】
宿主細胞内での部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼの効率的な発現のために、該部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞内で働くプロモーターと作動可能に連結されていることが好ましい。使用するプロモーターの種類は、宿主細胞に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、リゾプス属菌で働くプロモーターの例としては、ｌｄｈＡプロモーター（米国特許第６２６８１８９号）、ｐｇｋ１プロモーター（国際公開第２００１／７３０８３号）、ｐｇｋ２プロモーター（国際公開第２００１／７２９６７号）、ｐｄｃＡプロモーター及びａｍｙＡプロモーター（Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，１８６：４１−５０）、ｔｅｆ及び１８ＳｒＲＮＡプロモーター（米国特許出願公開第２０１０／１１２６５１号）、ならびにａｄｈ１プロモーター（特願２０１５−１５５７５９）が挙げられる。
【００２２】
上記部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼを用いる場合、宿主内で外来エキソヌクレアーゼを発現させることにより、部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼによる標的ＤＮＡの破壊等が促進される（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１３，３：１２５３，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０１２５３、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２，９：９７３−９７５）。したがって、好ましい実施形態において、宿主細胞に、部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼ又はそれをコードするポリヌクレオチドとともに、エキソヌクレアーゼ、又はそれをコードするポリヌクレオチドが導入され、該宿主細胞でそれらが共発現される。エキソヌクレアーゼとしては、糸状菌に由来するエキソヌクレアーゼであれば特に限定されないが、好ましくはリゾプス属菌由来エキソヌクレアーゼ、より好ましくはエキソヌクレアーゼ１又はエキソヌクレアーゼ２に属するものが挙げられ、さらに好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ由来のエキソヌクレアーゼが挙げられる。
【００２３】
好ましくは、該エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが宿主細胞に導入され、部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼと共発現する。好ましくは、該エキソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは発現ベクター上でプロモーターと作動可能に連結されている。使用され得る発現ベクター及びプロモーターの種類は、上記ＤＮＡヌクレアーゼの場合と同様である。
【００２４】
本発明で用いられる一本鎖ＤＮＡは、宿主糸状菌のゲノムＤＮＡに対する供与体ＤＮＡとして使用される。本明細書において、「供与体ＤＮＡ」とは、相同組換えにより宿主のゲノムＤＮＡを改変するために用いられるＤＮＡ断片をいう。供与体ＤＮＡは、宿主のゲノムＤＮＡと相同な２つのＤＮＡ配列（それぞれ上流相同配列及び下流相同配列とも称する）を含有する一本鎖ＤＮＡである。該上流相同配列及び下流相同配列は、それぞれ、該宿主のゲノムＤＮＡにおける上記部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼで切断される部位の上流領域及び下流領域と相同な領域を含む。該部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼによる切断部位は、該上流相同配列及び下流相同配列の間に位置していてもよく、あるいは該切断部位の一部および全部が、該上流相同配列及び下流相同配列のいずれかに含まれていてもよい。さらに、該供与体ＤＮＡは、該上流相同配列及び下流相同配列の間に、宿主糸状菌のゲノムＤＮＡに挿入すべき挿入配列を有していてもよい。該挿入配列は、特に限定されず、任意の遺伝子領域の配列、例えば該遺伝子のコード領域、プロモーター等の制御領域、イントロン、およびその他非コード領域を含んでいてもよく、さらに、薬剤耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。好ましくは、該挿入配列中において、該遺伝子のコード領域は制御領域と作動可能に連結されている。
【００２５】
供与体ＤＮＡである該一本鎖ＤＮＡは、宿主に導入された後、その上流相同配列及び下流相同配列によって該宿主のゲノムＤＮＡにおける切断部位の上流領域及び下流領域との間で相同組換えを起こし、該上流領域から下流領域までの配列と置き換わる。したがって、該一本鎖ＤＮＡにおける挿入配列の有無によって、相同組換え後の宿主のゲノムＤＮＡに、部位特異的に配列の置換、挿入又は欠失が起こる。より詳細には、該一本鎖ＤＮＡが挿入配列を含む場合、宿主のゲノムＤＮＡに挿入配列が置換又は挿入される。あるいは、該一本鎖ＤＮＡが実質的に上流相同配列及び下流相同配列のみを有し、挿入配列を含まない場合、宿主のゲノムＤＮＡの欠失をもたらす。
【００２６】
供与体ＤＮＡは、上流相同配列及び下流相同配列、ならびに必要に応じて宿主に導入したい挿入配列をコードするＤＮＡを調製して、これらを連結することによって構築することができる。当業者であれば、宿主ゲノムの該切断部位周辺、もしくは一本鎖ＤＮＡと置換したい標的領域のＤＮＡ配列を取得し、それに基づいて上流相同配列及び下流相同配列のＤＮＡを設計することができる。該挿入配列をコードするＤＮＡは、１種類の遺伝子領域のＤＮＡであってもよいが、２種類以上の遺伝子領域を含むＤＮＡであってもよい。例えば、挿入配列は、宿主に導入したい遺伝子をコードするＤＮＡ断片と、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子をコードするＤＮＡ断片からなるものであってもよい。好適な例においては、上流相同配列のＤＮＡ断片、挿入配列をコードするＤＮＡ断片、及び下流相同配列のＤＮＡ断片を定法に従って各々構築した後、それらを順に連結させて供与体ＤＮＡを得る。
【００２７】
供与体ＤＮＡは、最初に二本鎖ＤＮＡとして構築され、その後一本鎖ＤＮＡへと変性されてもよい。例えば、クローニングなどにより上流相同配列、下流相同配列、及び挿入配列を含む二本鎖ＤＮＡプラスミドを構築し、それを鋳型にしてＰＣＲを行い、二本鎖ＤＮＡ断片を得る。これらプラスミドまたは二本鎖ＤＮＡに対して、ソニケーション、熱変性後の急冷、ＮａＯＨなどの強アルカリ処理などに供することで、一本鎖ＤＮＡへと変性させることができる。
【００２８】
あるいは、供与体ＤＮＡは、最初から一本鎖ＤＮＡとして構築されてもよい。一本鎖ＤＮＡは、化学合成（株式会社医学生物学研究所などから購入可能）、ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ＰＣＲなどにより調製することができる。さらに、Ｍ１３などのＦｆファージ又はＦｏｒｉを持つｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどのプラスミド、及びｆ因子を持つＪＭ１０９などの大腸菌を用いることでも、一本鎖ＤＮＡを調製することができる。さらなる一本鎖ＤＮＡの調製法として、片方のプライマーをビオチン化してＰＣＲし、ＰＣＲ産物をストレプトアビジンビーズにより回収した後、該ＰＣＲ産物を解離させてビオチン化されていない方の一本鎖ＤＮＡを溶出させる方法、片方のプライマーをリン酸化してＰＣＲし、Ｌａｍｄａエキソヌクレアーゼを用いて処理する方法などを挙げることができる。
【００２９】
一本鎖ＤＮＡの好ましい調製法としては、Ｆｆファージとｆ因子を持つ大腸菌とを用いる方法、ビオチン化プライマーを用いる方法、及びリン酸化プライマーを用いる方法が挙げられる。このうち、リン酸化プライマーを用いる方法がより好ましい。
【００３０】
該一本鎖ＤＮＡにおいて、上流相同配列及び下流相同配列の長さは、好ましくは、それぞれ５ｂｐ以上、１０ｂｐ以上、１５ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、２５ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、３５ｂｐ以上、４０ｂｐ以上、４５ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２５０ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、７５０ｂｐ以上、又は１０００ｂｐ以上である。また、該一本鎖ＤＮＡが、該上流及び下流相同配列の間に挿入配列を有する場合、該挿入配列の鎖長は、１ｂｐ以上であればよいが、好ましくは０．３ｋｂ以上、より好ましくは１ｋｂｐ以上、さらにより好ましくは３ｋｂｐ以上であり、かつ好ましくは５０ｋｂｐ以下、より好ましくは２０ｋｂｐ以下、さらに好ましくは１０ｋｂｐ以下、さらに好ましくは９ｋｂｐ以下、さらに好ましくは５ｋｂｐ以下、である。あるいは、該挿入配列の鎖長は、好ましくは、１ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、０．３ｋｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、又は３ｋｂｐ以上５０ｋｂｐ以下であり、より好ましくは１ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、０．３ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、又は３ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下であり、さらに好ましくは、１ｂｐ以上１０ｋｂｐ以下、０．３ｋｂｐ以上１０ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以上１０ｋｂｐ以下、又は３ｋｂｐ以上１０ｋｂｐ以下であり、さらに好ましくは、１ｂｐ以上９ｋｂｐ以下、０．３ｋｂｐ以上９ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以上９ｋｂｐ以下、又は３ｋｂｐ以上９ｋｂｐ以下であり、さらに好ましくは、１ｂｐ以上５ｋｂｐ以下、０．３ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下、又は３ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下である。
【００３１】
したがって、本発明で用いられる該一本鎖ＤＮＡの鎖長は、好ましくは１０ｂｐ以上、より好ましくは２０ｂｐ以上、さらに好ましくは３０ｂｐ以上、さらに好ましくは４０ｂｐ以上、さらに好ましくは５０ｂｐ以上、さらに好ましくは６０ｂｐ以上、さらに好ましくは７０ｂｐ以上、さらに好ましくは８０ｂｐ以上、さらに好ましくは９０ｂｐ以上、さらに好ましくは１００ｂｐ以上、さらに好ましくは２００ｂｐ以上、さらに好ましくは５００ｂｐ以上、さらに好ましくは１０００ｂｐ以上、さらに好ましくは１５００ｂｐ以上、さらに好ましくは２０００ｂｐ以上であって、かつ好ましくは５０ｋｂｐ以下、より好ましくは２０ｋｂｐ以下、さらに好ましくは１２ｋｂｐ以下、さらに好ましくは１１ｋｂｐ以下である。
【００３２】
あるいは、本発明で用いられる上記一本鎖ＤＮＡの鎖長は、好ましくは、１０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、１０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、１０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、１０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、２０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、２０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、２０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、２０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、３０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、３０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、３０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、３０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、４０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、４０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、４０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、４０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、５０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、５０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、５０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、５０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、６０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、６０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、６０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、６０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、７０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、７０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、７０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、７０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、８０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、８０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、８０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、８０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、９０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、９０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、９０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、９０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、１００ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、１００ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、１００ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、１００ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、２００ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、２００ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、２００ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、２００ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、５００ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、５００ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、５００ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、５００ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、１０００ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、１０００ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、１０００ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、１０００ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、１５００ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、１５００ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、１５００ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、１５００ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、２０００ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、２０００ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、２０００ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、又は２０００ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下である。
【００３３】
該部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクター、及び一本鎖ＤＮＡは、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などを用いて宿主細胞に導入することができる。
【００３４】
導入された一本鎖ＤＮＡにより目的の相同組換えが生じた組換え細胞は、本来有する遺伝子の欠失、導入された遺伝子の発現、マーカー遺伝子の発現などに基づいて選択することができる。
【００３５】
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００３６】
〔１〕宿主糸状菌に部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼと一本鎖ＤＮＡとを導入し、該宿主のゲノムＤＮＡにおける該部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼによる切断部位の上流領域及び下流領域を、相同組換えによって該一本鎖ＤＮＡで置換することを含む、変異糸状菌の製造方法。
【００３７】
〔２〕好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡの長さが、
１０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、１０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、１０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、１０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、２０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、２０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、２０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、２０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、３０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、３０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、３０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、３０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、４０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、４０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、４０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、４０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、５０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、５０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、５０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、５０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、６０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、６０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、６０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、６０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、７０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、７０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、７０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、７０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、８０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、８０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、８０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、８０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、９０ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、９０ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、９０ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、９０ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、１００ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、１００ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、１００ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、１００ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、２００ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、２００ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、２００ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、２００ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、５００ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、５００ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、５００ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、５００ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、１０００ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、１０００ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、１０００ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、１０００ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、１５００ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、１５００ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、１５００ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、１５００ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下、２０００ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、２０００ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、２０００ｂｐ以上１２ｋｂｐ以下、又は２０００ｂｐ以上１１ｋｂｐ以下である、
〔１〕記載の方法。
【００３８】
〔３〕好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡが、前記宿主のゲノムＤＮＡにおける切断部位の上流領域及び下流領域と相同な領域をそれぞれ含む２つのＤＮＡ配列を含有する、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
【００３９】
〔４〕好ましくは、前記２つのＤＮＡ配列の長さが、それぞれ、５ｂｐ以上、１０ｂｐ以上、１５ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、２５ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、３５ｂｐ以上、４０ｂｐ以上、４５ｂｐ以上、５０ｂｐ以上、１００ｂｐ以上、２５０ｂｐ以上、５００ｂｐ以上、７５０ｂｐ以上、又は１０００ｂｐ以上である、〔３〕記載の方法。
【００４０】
〔５〕好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡが、前記宿主のゲノムＤＮＡに挿入すべき挿入配列を含む、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
【００４１】
〔６〕前記挿入配列の長さが、
好ましくは１ｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、０．３ｋｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以上５０ｋｂｐ以下、又は３ｋｂｐ以上５０ｋｂｐ以下であり、
より好ましくは１ｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、０．３ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下、又は３ｋｂｐ以上２０ｋｂｐ以下であり、
さらに好ましくは１ｂｐ以上１０ｋｂｐ以下、０．３ｋｂｐ以上１０ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以上１０ｋｂｐ以下、又は３ｋｂｐ以上１０ｋｂｐ以下であり、
さらに好ましくは１ｂｐ以上９ｋｂｐ以下、０．３ｋｂｐ以上９ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以上９ｋｂｐ以下、又は３ｋｂｐ以上９ｋｂｐ以下であり、
さらに好ましくは１ｂｐ以上５ｋｂｐ以下、０．３ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下、１ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下、又は３ｋｂｐ以上５ｋｂｐ以下である、
〔５〕記載の方法。
【００４２】
〔７〕好ましくは、前記一本鎖ＤＮＡが、前記宿主のゲノムＤＮＡに挿入すべき挿入配列を含まない、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
【００４３】
〔８〕前記部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼが、
好ましくは、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１又はＺＦＮ技術に基づく人工ＤＮＡヌクレアーゼであり、
より好ましくはＴＡＬＥＮである、
〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の方法。
【００４４】
〔９〕前記糸状菌が、
好ましくは、接合菌門、子嚢菌門、又は担子菌門に属する菌であり、
より好ましくは、接合菌門、又は子嚢菌門に属する菌であり、
さらにより好ましくは接合菌門に属する菌である、
〔１〕〜〔８〕のいずれか１項記載の方法。
【００４５】
〔１０〕好ましくは、前記接合菌門に属する菌がリゾプス属菌である、〔９〕記載の方法。
【００４６】
〔１１〕好ましくは、前記リゾプス属菌がＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅである、〔１０〕記載の方法。
【００４７】
〔１２〕好ましくは、前記部位特異的ＤＮＡヌクレアーゼと一本鎖ＤＮＡの導入とともに、前記宿主糸状菌において外来エキソヌクレアーゼを発現させることをさらに含む、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項記載の方法。
【００４８】
〔１３〕前記外来エキソヌクレアーゼが、
好ましくは、糸状菌に由来するエキソヌクレアーゼであり、
より好ましくはリゾプス属菌由来エキソヌクレアーゼであり、
さらに好ましくは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ又はＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ由来のエキソヌクレアーゼである、
〔１２〕記載の方法。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００５０】
本実施例で用いたＰＣＲプライマーを表１〜６に示す。【００５１】
【表１】
2017135317.tif 000002
【００５２】
【表２】
2017135317.tif 000003
【００５３】
【表３】
2017135317.tif 000004
【００５４】
【表４】
2017135317.tif 000005
【００５５】
【表５】
2017135317.tif 000006
【００５６】
【表６】
2017135317.tif 000007
【００５７】
実施例１  変異リゾプス属菌の作製
（１）トリプトファン栄養要求性株の作製
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ  ＪＣＭ（Ｊａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／理研）５５５７株（以降、５５５７株と表記）、又は５５５７株由来のトリプトファン栄養要求性株を、相同組換え体の親株として用いた。トリプトファン栄養要求性株は、５５５７株へのイオンビーム照射による変異導入株の中から選抜し取得した。イオンビーム照射は、独立行政法人日本原子力研究開発機構・高崎量子応用研究所のイオン照射施設（ＴＩＡＲＡ）において行った。照射は、ＡＶＦサイクロトロンを用いて１２Ｃ５＋を加速し、２２０ＭｅＶのエネルギーで１００〜１２５０Ｇｒａｙ照射した。照射した菌体より胞子を回収し、その中から、ｔｒｐＣ遺伝子領域に１塩基欠損変異を有し、トリプトファン栄養要求性を示すＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ  ０２Ｔ６株を取得した。以降の実施例では、リゾプス属菌相同組換え体作製のための親株として５５５７株又は０２Ｔ６株を用いた。【００５８】
（２）プラスミドベクター作製
５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーｏＪＫ１６２（配列番号１０）及びｏＪＫ１６３（配列番号１１）を用いたＰＣＲにてｔｒｐＣ遺伝子のＤＮＡ断片を合成した。次に、プラスミドｐＵＣ１８を鋳型に、プライマーｏＪＫ１６４（配列番号１２）及びｏＪＫ１６５（配列番号１３）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結しプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣを作製した。【００５９】
次いで、５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型に、ａｄｈ１のプロモーター断片とターミネーター断片を、それぞれプライマーｏＪＫ２０２（配列番号１４）及びｏＪＫ２０４（配列番号１５）、ならびにｏＪＫ２０５（配列番号１６）及びｏＪＫ２１６（配列番号１７）を用いたＰＣＲにて増幅した。次に、上記で構築したプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣを鋳型に、プライマーｏＪＫ２１０（配列番号１８）及びｏＪＫ２１１（配列番号１９）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の３断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結してプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを作製した。得られたプラスミドには、ｔｒｐＣ遺伝子領域の下流にａｄｈ１プロモーター及びターミネーターが順に配置されている。【００６０】
さらに、ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈから、ｔｒｐＣ遺伝子領域を除いたプラスミドベクターを作製した。すなわち、上記で構築したｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｔｒｐＣ−ｌｏｓｔ−Ｆ（配列番号２０）及びｔｒｐＣ−ｌｏｓｔ−Ｒ（配列番号２１）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。本断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、プラスミドｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを作製した。【００６１】
（３）ｐｄｃ１、ｐｄｃ２及びｔｒｐＣ遺伝子破壊用ＴＡＬＥＮの作製
ｐｄｃ１、ｐｄｃ２又はｔｒｐＣ遺伝子座を標的として、ＴＡＬＥＮを作製した。ＴＡＬＥＮの作製は、ｐｄｃ１遺伝子座を標的とするものはＴｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社に、ｐｄｃ２又はｔｒｐＣ遺伝子座を標的とするものはＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に依頼し、Ｃｕｓｔｏｍ  ＸＴＮ  ＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社が提供するＴＡＬＥＮの商品名）又はＧｅｎｅＡｒｔ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＴＡＬｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が提供するＴＡＬＥＮの商品名）を得た。これらキットは、それぞれの標的遺伝子に対し、Ｌｅｆｔ−ＴＡＬＥＮ及びＲｉｇｈｔ−ＴＡＬＥＮの２つのポリヌクレオチドを含む。ｐｄｃ１遺伝子（配列番号１）を標的とするキットは、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１（配列番号２）及びＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１（配列番号３）を含み、これらはそれぞれ、ｐｄｃ１遺伝子のセンス鎖中の５’−ＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＡＡＡＡＴＣＧ−３’（配列番号９６）及びアンチセンス鎖中の５’−ＴＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＡＧＡＣＧＧ−３’（配列番号９７）の配列を標的とするＴＡＬＥＮをコードする。また、ｐｄｃ２遺伝子（配列番号４）を標的とするキットは、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ２（配列番号５）及びＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ２（配列番号６）を含み、これらはそれぞれ、ｐｄｃ２遺伝子のセンス鎖中の５’−ＴＧＧＴＧＴＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＴＡＴ−３’（配列番号９８）及びアンチセンス鎖中の５’−ＴＧＣＣＧＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣ−３’（配列番号９９）の配列を標的とするＴＡＬＥＮをコードする。また、ｔｒｐＣ遺伝子（配列番号７）を標的とするキットは、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｔｒｐＣ（配列番号８）及びＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｔｒｐＣ（配列番号９）を含み、これらはそれぞれ、ｔｒｐＣ遺伝子のセンス鎖中の５’−ＴＧＣＣＡＡＧＧＣＧＣＣＡＡＴＧＴＡＧ−３’（配列番号１００）及びアンチセンス鎖中の５’−ＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＴ−３’（配列番号１０１）の配列を標的とするＴＡＬＥＮをコードする。【００６２】
ｐｄｃ１遺伝子用のＬｅｆｔＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを、上記（２）で作製したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ用発現ベクターｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈに挿入し、ａｄｈ１プロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−Ｒ（配列番号２２）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号２３）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１を鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−ＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号２４）及びＴＡＬＥＮ−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号２５）を用いたＰＣＲにてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１断片を増幅した。上記２断片には、１５塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１を含むプラスミドｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１を得た。【００６３】
同様に、ｐｄｃ１遺伝子用のＬｅｆｔＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドから、上記（２）で作製したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ用発現ベクターｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを用い、ａｄｈ１プロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−Ｒ（配列番号２２）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号２３）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１を鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−ＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号２４）及びＴＡＬＥＮ−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号２５）を用いたＰＣＲにてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１断片を増幅し、ベクター断片と連結してＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１を含むプラスミドｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１−２を得た。【００６４】
ｐｄｃ１遺伝子用のＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドは、上記（２）で作製したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ用発現ベクターｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを用い、ａｄｈ１プロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−Ｒ（配列番号２２）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号２３）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１を鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−ＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号２４）及びＴＡＬＥＮ−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号２５）を用いたＰＣＲにてＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１断片を増幅し、ベクター断片と連結してＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１を含むプラスミドｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１を得た。【００６５】
ｐｄｃ２遺伝子用のＬｅｆｔＴＡＬＥＮ及びＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドは、上記（２）で作製したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ用発現ベクターｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを用い、ａｄｈ１プロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−Ｒ（配列番号２２）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号２３）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ２又はＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ２を鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−ＬｉｆｅＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号２６）及びＬｉｆｅＴＡＬＥＮ−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号２７）を用いたＰＣＲにてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ２又はＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ２断片を増幅し、ベクター断片と連結して、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ２又はＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ２を含むプラスミドｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ２又はｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ２を得た。【００６６】
同様に、ｔｒｐＣ遺伝子用のＬｅｆｔ及びＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドは、上記（２）で作製したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ用発現ベクターｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを用い、ａｄｈ１プロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−Ｒ（配列番号２２）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号２３）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｔｒｐＣ又はＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｔｒｐＣを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−ＬｉｆｅＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号２６）及びＬｉｆｅＴＡＬＥＮ−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号２７）を用いたＰＣＲにてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｔｒｐＣ又はＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｔｒｐＣ断片を増幅し、ベクター断片と連結して、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｔｒｐＣ又はＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｔｒｐＣを含むプラスミドｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｔｒｐＣ又はｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｔｒｐＣを得た。【００６７】
（４）エキソヌクレアーゼ発現ベクターの作製
プラスミドｐＵＣ１８（タカラバイオ）を鋳型に、プライマーｐＰＴＲ１−ｓａｌ１−Ｆ（配列番号２８）及びｐＰＴＲ１−ｓａｌ１−Ｒ（配列番号２９）を用いたＰＣＲにてｐＵＣ１８ベクター断片を増幅した。また、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＮＲＢＣ５３８４株（以下、５３８４株と表記）の精製ゲノム溶液を鋳型に、プライマーｓａｌ１−ｌｄｈｐｒｏ−Ｆ３（配列番号３０）及びｌｄｈｐｒｏ−Ｒ（配列番号３１）を用いてｌｄｈプロモーター断片を、プライマーｌｄｈｐｒｏ−ｅｘｏ１−Ｆ２（配列番号３２）及びｅｘｏ１−ｐｄｃｔｅｒ−Ｒ２（配列番号３３）を用いてエキソヌクレアーゼ遺伝子断片を、及びプライマーｐｄｃＴｅｒ−Ｆ（配列番号３４）及びｐｄｃＴｅｒ−ｓａｌ１−Ｒ（配列番号３５）を用いてｐｄｃターミネーター断片を、それぞれ増幅した。増幅した上記４断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、プラスミドｐｌｄｈ−ｅｘｏ１を作製した。
また、５３８４株の精製ゲノム溶液を鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−ｅｘｏ１−Ｆ（配列番号３６）及びｅｘｏ１−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号３７）を用いてエキソヌクレアーゼ遺伝子断片を、ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーａｄｈｐｒｏ−Ｒ（配列番号２２）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号２３）を用いたＰＣＲにてベクター断片を、それぞれ増幅した。増幅した上記２断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、プラスミドｐａｄｈ−ｅｘｏ１を作製した。【００６８】
（５）各遺伝子座を標的とするｔｒｐＣ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ用プラスミドの作製
ｐｄｃ１遺伝子座に対してｐｄｃ１遺伝子ＯＲＦを除き、ｔｒｐＣ遺伝子領域をｋｎｏｃｋ−ｉｎするための、プラスミドｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ１）を作製した。すなわち、ｐＵＣ１８を鋳型にプライマーｐＵＣ１８−Ｐａｅ１−Ｆ３（配列番号３８）及びｐＵＣ１８−Ｈｉｎｄ３−Ｒ３（配列番号３９）にて増幅したｐＵＣ１８ベクター断片と、５５５７株のゲノムを鋳型にプライマーＰＤＣ１−ｕｐｓｔｒ−Ｆ（配列番号４０）及びＰＤＣ１−ｕｐｓｔｒ−Ｒ（配列番号４１）にて増幅したｐｄｃ１遺伝子のプロモーター部位断片と、５５５７株のゲノムを鋳型にプライマーｔｒｐＣｐｒｏ−Ｒ（配列番号４２）及びｔｒｐＣｔｅｒ−Ｆ（配列番号４３）にて増幅したｔｒｐＣ遺伝子領域断片と、５５５７株のゲノムを鋳型にプライマーＰＤＣ１−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｆ（配列番号４４）及びＰＤＣ１−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｒ（配列番号４５）にて増幅したｐｄｃ１遺伝子のターミネーター部位断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、ｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ１）を構築した。【００６９】
同様に、ｐｄｃ２遺伝子座にて、ｐｄｃ２遺伝子ＯＲＦを除き、ｔｒｐＣ遺伝子領域をｋｎｏｃｋ−ｉｎするための、プラスミドｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ２）を作製した。すなわち、ｐＵＣ１８を鋳型にプライマーｐＵＣ１８−Ｐａｅ１−Ｆ３（配列番号３８）及びｐＵＣ１８−Ｈｉｎｄ３−Ｒ３（配列番号３９）にて増幅したｐＵＣ１８ベクター断片と、５５５７株のゲノムを鋳型にプライマーＰＤＣ２−ｕｐｓｔｒ−Ｆ（配列番号４６）及びＰＤＣ２−ｕｐｓｔｒ−Ｒ（配列番号４７）にて増幅したｐｄｃ２遺伝子のプロモーター部位断片と、５５５７株のゲノムを鋳型にプライマーｔｒｐＣｐｒｏ−Ｒ（配列番号４２）及びｔｒｐＣｔｅｒ−Ｆ（配列番号４３）にて増幅したｔｒｐＣ遺伝子領域断片と、５５５７株のゲノムを鋳型にプライマーＰＤＣ２−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｆ（配列番号４８）及びＰＤＣ２−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｒ（配列番号４９）にて増幅したｐｄｃ２遺伝子のターミネーター部位断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、ｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ２）を構築した。【００７０】
続いて、ｔｒｐＣ遺伝子座にて、開始コドンから５００ｂｐ欠損したｔｒｐＣ遺伝子（配列番号７）をｔｒｐＣ遺伝子領域にｋｎｏｃｋ−ｉｎすることで、ｔｒｐＣ遺伝子破壊を行うための、プラスミドｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｔｒｐＣ）を作製した。すなわち、ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型にプライマーｔｒｐＣ−ｉｎａｃｔｉｖｅ−Ｆ（配列番号５０）及びｔｒｐＣ−ｉｎａｃｔｉｖｅ−Ｒ（配列番号５１）にて増幅した断片の両端をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、ｔｒｐＣ遺伝子配列が開始コドンから５００ｂｐ欠損したｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｔｒｐＣ）を構築した。【００７１】
（６）ｐｄｃ１遺伝子座を標的とする、（ｔｒｐＣ＋ＦＴ１）ｋｎｏｃｋ−ｉｎ用プラスミドの作製
プラスミドｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ１）のｔｒｐＣ配列の５’側にａｄｈ１プロモーター及びＦＴ１遺伝子を導入したプラスミドである、ｐ（ｔｒｐＣ＋ＦＴ１）−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ１）を作製した。すなわち、ｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ１）を鋳型にプライマーｔｒｐＣｐｒｏ−Ｒ（配列番号４２）及びｐｄｃ１ｔｅｒ−Ｆ（配列番号５２）にて増幅したベクター断片と、ＦＴ１プラスミド（ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈのａｄｈ１プロモーターの下流側にＦＴ１遺伝子（配列番号１０２）を導入したプラスミド）を鋳型にプライマーｔｒｐＣ−ａｄｈ１ｐｒｏ−Ｆ（配列番号５３）及びＦＴ１−ｐｄｃ１Ｔｅｒ−Ｒ（配列番号５４）にて増幅したａｄｈ１プロモーターとＦＴ１遺伝子を含む断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、ｐ（ｔｒｐＣ＋ＦＴ１）−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ１）を構築した。【００７２】
（７）ｐｄｃ１遺伝子座を標的とする、（ｔｒｐＣ＋ＰＹＣ）ｋｎｏｃｋ−ｉｎ用プラスミドの作製
（６）と同様に、ｐ（ｔｒｐＣ＋ＰＹＣ）−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ１）を作製した。すなわち、ｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ１）を鋳型にプライマーｔｒｐＣｐｒｏ−Ｒ（配列番号４２）及びｐｄｃ１ｔｅｒ−Ｆ（配列番号５２）にて増幅したベクター断片と、ＰＹＣプラスミド（ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈのａｄｈ１プロモーターの下流側にＰＹＣ遺伝子（配列番号１０３）を導入したプラスミド）を鋳型にプライマーｔｒｐＣ−ａｄｈ１ｐｒｏ−Ｆ（配列番号５３）及びＰＹＣ−ｐｄｃ１Ｔｅｒ−Ｒ（配列番号５５）にて増幅したａｄｈ１プロモーターとＰＹＣ遺伝子を含む断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、ｐ（ｔｒｐＣ＋ＰＹＣ）−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ１）を構築した。【００７３】
（８）二本鎖ＤＮＡの調製
表７のＮｏ．１に従い、二本鎖ＤＮＡを調製した。すなわち、プラスミドｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ１）を鋳型にプライマーＰＤＣ１−ｕｐｓｔｒ−Ｆ２（配列番号５６）及びＰＤＣ１−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｒ２（配列番号５７）を用いてＤＮＡ断片を増幅し、鋳型をＤｐｎ１（ＴＯＹＯＢＯ）処理にて分解した。続いて生成物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理、及びエタノール沈殿処理して精製し、精製物を適量のＤＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶解し、ｐｄｃ１遺伝子破壊用の二本鎖ＤＮＡ溶液を得た。【００７４】
（９）一本鎖ＤＮＡの調製
表７のＮｏ．２〜Ｎｏ．２０に従い、一本鎖ＤＮＡを調製した。すなわち、表７の各条件のテンプレートを鋳型に、プライマー１及びプライマー２を用いて、表７の挿入長の長さを有するＤＮＡ断片を増幅し、鋳型をＤｐｎ１（ＴＯＹＯＢＯ）処理にて分解した。続いて生成物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理、及びエタノール沈殿処理して精製した。精製物を、さらにＬａｍｂｄａ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて処理した後、上記と同様に精製し、一本鎖ＤＮＡを得た。Ｌａｍｂｄａ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理は、３７℃、オーバーナイトで行った。【００７５】
【表７】
2017135317.tif 000008
【００７６】
（１０）パーティクルガンによる遺伝子導入
上記（８）又は（９）で作製した一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡ（表７のＮｏ．１〜２０）を、上記（３）で作製したＬｅｆｔＴＡＬＥＮ発現ベクター及びＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ発現ベクター、ならびに上記（４）で作製したエキソヌクレアーゼ発現ベクターと混合し、ＤＮＡ溶液を調製した。
ＴＡＬＥＮ発現ベクターは、Ｎｏ．１とＮｏ．２にはｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１及びｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１を、Ｎｏ．３〜１８にはｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１−２及びｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１を、Ｎｏ．１９にはｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ２及びｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ２を、Ｎｏ．２０にはｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｔｒｐＣ及びｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｔｒｐＣを用いた。エキソヌクレアーゼ発現ベクターは、Ｎｏ．１とＮｏ．２にはｐｌｄｈ−ｅｘｏ１を、それ以外には、ｐａｄｈ−ｅｘｏ１を用いた。Ｎｏ．１とＮｏ．２の条件においてのみ、遺伝子導入プラスミドを制限酵素処理した。すなわち、ｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１、ｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１−２及びｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ１は制限酵素ＳｃａＩで、プラスミドｐｌｄｈ−ｅｘｏ１は制限酵素Ｐｓｔ１で処理した。ＤＮＡ溶液におけるＬｅｆｔＴＡＬＥＮ発現ベクター、ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ発現ベクター、エキソヌクレアーゼ発現ベクター、及び一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの濃度比は、Ｎｏ．１とＮｏ．２ではおよそ２：４：２：１、Ｎｏ．３〜２０ではおよそ１：１：１：２とした。
調製したＤＮＡ溶液（約１〜３μｇ／μＬ）１０μＬを金粒子溶液（６０ｍｇ／ｍＬ、ＩＮＢＩＯ  ＧＯＬＤ社、粒子径１μｍ）１００μＬに加え混合した。さらに０．１Ｍスペルミジンを４０μＬ加え、ボルテックスでよく攪拌した。２．５ＭのＣａＣｌ２を１００μＬ加え、ボルテックスで１分間攪拌した後、６０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿に７０％ＥｔＯＨを２００μＬ加え、３０秒間ボルテックスで攪拌した後、６０００ｒｐｍで３０秒間遠心し、上清を除いた。得られた沈殿を１００μＬの１００％ＥｔＯＨで再懸濁した。【００７７】
上記（１）で取得した０２Ｔ６株又は５５５７株の胞子に対し、上記のＤＮＡ−金粒子溶液を用い、ＧＤＳ−８０（ネッパジーン社のパーティクルガン）にて遺伝子導入を行った。Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１９の条件では０２Ｔ６株を用い、遺伝子導入後の胞子は、無機寒天培地（２０ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．６ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、０．２５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．０９ｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、１５ｇ／Ｌ寒天）上で、３０℃にて１週間ほど静置培養した。Ｎｏ．２０の条件では５５５７株の胞子を用い、遺伝子導入後の胞子は、ＰＤＢ培地（３９ｇ／ＬＰＤＢ）上で、３０℃にて１週間ほど静置培養した。【００７８】
（１１）ｐｄｃ１遺伝子欠損株の選択（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１８）
上記（１０）で培養した菌体から胞子を回収し、ｐＨ３に調製した無機寒天培地（２０ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．６ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、０．２５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．０９ｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、１５ｇ／Ｌ寒天）で単離した。生育した菌株の菌糸を爪楊枝にて一部かき取り、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に懸濁し、９５℃で１０分間インキュベートした。その後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で適宜希釈し、コロニーＰＣＲ用のゲノムテンプレート溶液とした。コロニーＰＣＲは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーｐｄｃ１−ｕｐ２（配列番号５８）とｔｒｐＣ（ｄ）−１（配列番号５９）、及びＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。上記プライマーでコロニーＰＣＲを行った場合、ｐｄｃ１遺伝子座にｔｒｐＣ遺伝子断片又はｔｒｐＣ遺伝子とその他の遺伝子断片のｋｎｏｃｋ−ｉｎが起こっていれば、適切な長さのＤＮＡ断片が増幅する。コロニーＰＣＲによりＤＮＡ増幅断片が得られた菌株を、Ｋｎｏｃｋ−ｉｎ株（ｐｄｃ１遺伝子欠損株）とした。【００７９】
（１２）ｐｄｃ２遺伝子欠損株の選択（Ｎｏ．１９）
上記（１０）で培養した菌体から胞子を回収し、ｐＨ３に調製した無機寒天培地（２０ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．６ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、０．２５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．０９ｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、１５ｇ／Ｌ寒天）で単離した。生育した菌株の菌糸を爪楊枝にて一部かき取り、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に懸濁し、９５℃で１０分間インキュベートした。その後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で適宜希釈し、コロニーＰＣＲ用のゲノムテンプレート溶液とした。コロニーＰＣＲは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーｐｄｃ２−ｄｏｗｎ１（配列番号６０）とｔｒｐＣ（ｄ）−７（配列番号６１）、及びＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。上記プライマーでコロニーＰＣＲを行った場合、ｐｄｃ２遺伝子座にｔｒｐＣ遺伝子断片のｋｎｏｃｋ−ｉｎが起こっていれば、適切な長さのＤＮＡ断片が増幅する。コロニーＰＣＲによりＤＮＡ増幅断片が得られた菌株を、Ｋｎｏｃｋ−ｉｎ株（ｐｄｃ２遺伝子欠損株）とした。【００８０】
（１３）ｔｒｐＣ遺伝子欠損株の選択（Ｎｏ．２０）
上記（１０）で培養した菌体から胞子を回収し、ｐＨ６に調製した５−ＦＡＡ培地（１０ｇ／Ｌグルコース、３．３６ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、０．０３ｇ／Ｌ  トリプトファン、５ｇ／Ｌ  ５−フルオロアントラニル酸、１５ｇ／Ｌ寒天）で培養した。生育した菌株は、５−ＦＡＡ培地に植え継いだ。生育した菌株の菌糸を爪楊枝にて一部かき取り、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に懸濁し、９５℃で１０分間インキュベートした。その後、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で適宜希釈し、コロニーＰＣＲ用のゲノムテンプレート溶液とした。コロニーＰＣＲは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーｐｄｃ１−ｄｏｗｎ３（配列番号６２）とｔｒｐＣ（ｄ）−５（配列番号６３）、及びＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。上記プライマーでコロニーＰＣＲを行った場合、ｔｒｐＣ遺伝子座に、５００ｂｐ欠損したｔｒｐＣ遺伝子断片のｋｎｏｃｋ−ｉｎが起こっていれば、増幅ＤＮＡ断片のバンド位置がシフトする。コロニーＰＣＲによりＤＮＡ増幅断片のバンドがシフトした菌株を、Ｋｎｏｃｋ−ｉｎ株（ｔｒｐＣ遺伝子欠損株）とした。【００８１】
（１４）組換え効率の比較
（ａ）一本鎖ＤＮＡ  対  二本鎖ＤＮＡ
供与体ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合と一本鎖ＤＮＡの場合（表７のＮｏ．１及びＮｏ．２）の間で、相同組換え効率の比較を行った。結果を表８に示す。二本鎖ＤＮＡを用いた場合、長鎖配列が導入された相同組換え株を取得することはできなかったが、一本鎖ＤＮＡを用いることで、長鎖配列が導入された相同組換え株の取得に成功した。さらに、供与体ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡの場合、最長で約８．８ｋｂｐの長鎖配列を導入した相同組換え株の取得に成功した（表７のＮｏ．２〜４）。【００８２】
【表８】
2017135317.tif 000009
【００８３】
（ｂ）宿主ゲノムＤＮＡに対する相同領域の長さ
一本鎖ＤＮＡにおける宿主ゲノムＤＮＡとの相同領域の鎖長が組換え効率に与える影響を検討した（表７のＮｏ．２、８、及び９）。結果を表９に示す。【００８４】
【表９】
2017135317.tif 000010
【００８５】
（１５）ｐｄｃ３遺伝子欠損株の取得
（ａ）プラスミドベクターの作製
上記（２）で構築したｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈのａｄｈ１プロモーターをｃｉｐＣプロモーターに変更したプラスミドベクターを作製した。すなわち、該ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈを鋳型にプライマーａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号２３）及びｔｒｐＣｔｅｒ−Ｒ（配列番号１０４）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅し、また５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーｔｒｐＣｔｅｒ−ｃｉｃＣｐｒｏ−Ｆ（配列番号１０５）及びｃｉｐＣｐｒｏ−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号１０６）を用いたＰＣＲにてｃｉｐＣプロモーター領域断片を増幅した。以上の２断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結してプラスミドｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−ＰｃｉｐＣ−Ｔａｄｈを作製した。【００８６】
続いて、上記で構築したｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−ＰｃｉｐＣ−ＴａｄｈからｔｒｐＣ遺伝子領域を除いたプラスミドベクターを作製した。すなわち、該ｐＵＣ１８−ｔｒｐＣ−ＰｃｉｐＣ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｔｒｐＣ−ｌｏｓｔ−Ｆ２（配列番号１０７）及びｔｒｐＣ−ｌｏｓｔ−Ｒ２（配列番号１０８）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。本断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、プラスミドｐＵＣ１８−ＰｃｉｐＣ−Ｔａｄｈを作製した。【００８７】
（ｂ）ｐｄｃ３遺伝子破壊用ＴＡＬＥＮの作製
ｐｄｃ３遺伝子座を標的として、ＴＡＬＥＮを作製した。ＴＡＬＥＮの作製は、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に依頼し、ＧｅｎｅＡｒｔ  ＰｅｒｆｅｃｔＭａｔｃｈ  ＴＡＬｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が提供するＴＡＬＥＮの商品名）を得た。このキットは、標的遺伝子に対するＬｅｆｔ−ＴＡＬＥＮ及びＲｉｇｈｔ−ＴＡＬＥＮの２つのポリヌクレオチドを含む。ｐｄｃ３遺伝子（配列番号１４３）を標的とするキットは、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３（配列番号１４４）及びＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３（配列番号１４５）を含み、これらはそれぞれ、ｐｄｃ３遺伝子のセンス鎖中の５’−ＣＣＧＧＡＡＴＣＧＡＣＡＣＧＡＴＴＴＴ−３’（配列番号１４６）及びアンチセンス鎖中の５’−ＣＧＴＡＡＣＴＴＡＣＣＡＴＡＴＴＧＴＡ−３’（配列番号１４７）の配列を標的とするＴＡＬＥＮをコードする。【００８８】
ｐｄｃ３遺伝子用のＬｅｆｔＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを、上記（１５）（ａ）で作製したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ用発現ベクターｐＵＣ１８−ＰｃｉｐＣ−Ｔａｄｈに挿入し、ｃｉｐＣプロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８−ＰｃｉｐＣ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｃｉｐＣｐｒｏ−Ｒ（配列番号１０９）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号２３）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３を鋳型に、プライマーｃｉｐＣｐｒｏ−ＬｉｆｅＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号１１０）及びＬｉｆｅＴＡＬＥＮ−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号２７）を用いたＰＣＲにてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３断片を増幅した。上記２断片には、１５塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３を含むプラスミドｐｃｉｐＣ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３を得た。【００８９】
同様に、ｐｄｃ３遺伝子用のＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを、上記（１５）（ａ）で作製したＲ．ｄｅｌｅｍａｒ用発現ベクターｐＵＣ１８−ＰｃｉｐＣ−Ｔａｄｈに挿入し、ｃｉｐＣプロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８−ＰｃｉｐＣ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｃｉｐＣｐｒｏ−Ｒ（配列番号１０９）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号２３）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３を鋳型に、プライマーｃｉｐＣｐｒｏ−ＬｉｆｅＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号１１０）及びＬｉｆｅＴＡＬＥＮ−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ（配列番号２７）を用いたＰＣＲにてＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３断片を増幅した。上記２断片には、１５塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３を含むプラスミドｐｃｉｐＣ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３を得た。【００９０】
（ｃ）エキソヌクレアーゼ発現ベクターの作製
上記（４）で作製したプラスミドｐｌｄｈ−ｅｘｏ１を鋳型に、プライマーｃｉｐＣｐｒｏ−ｅｘｏ１−Ｆ（配列番号１１１）及びｅｘｏ１−ａｄｈｔｅｒ−Ｒ２（配列番号１４２）を用いたＰＣＲにてエキソヌクレアーゼ遺伝子断片を、上記（１５）（ａ）で作製したプラスミドｐＵＣ１８−ＰｃｉｐＣ−Ｔａｄｈを鋳型に、プライマーｃｉｐＣｐｒｏ−Ｒ（配列番号１０９）及びａｄｈｔｅｒ−Ｆ（配列番号２３）を用いたＰＣＲにてベクター断片を、それぞれ増幅した。上記２断片には、１５塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、プラスミドｐｃｉｐＣ−ｅｘｏ１を得た。【００９１】
（ｄ）ｐｄｃ３遺伝子座を標的とするｔｒｐＣ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ用プラスミドの作製
ｐｄｃ３遺伝子座に対してｐｄｃ３遺伝子ＯＲＦを除去し、ｔｒｐＣ遺伝子領域をｋｎｏｃｋ−ｉｎするための、プラスミドｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ３）を作製した。すなわち、ｐＵＣ１８を鋳型にプライマーｐＵＣ１８−Ｐａｅ１−Ｆ３（配列番号３８）及びｐＵＣ１８−Ｈｉｎｄ３−Ｒ３（配列番号３９）にて増幅したｐＵＣ１８ベクター断片と、５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーｐｄｃ３−ｕｐｓｔｒ−Ｆ（配列番号１１２）及びｐｄｃ３−ｕｐｓｔｒ−Ｒ２（配列番号１１３）にて増幅したｐｄｃ３遺伝子プロモーター断片と、５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーｐｄｃ３−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｆ２（配列番号１１４）及びｐｄｃ３−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｒ（配列番号１１５）にて増幅したｐｄｃ３遺伝子ターミネーター断片を増幅した。以上３断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、ｐｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ３）を作製した。【００９２】
続いて、ｐｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ３）を鋳型にプライマーｐｄｃ３−ｕｐｓｔｒ−Ｒ（配列番号１１６）及びｐｄｃ３−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｆ（配列番号１１７）にて増幅したＤＮＡ断片と、５５５７株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーｔｒｐＣｐｒｏ−Ｒ（配列番号４２）及びｔｒｐＣｔｅｒ−Ｆ（配列番号４３）にて増幅したｔｒｐＣ遺伝子領域断片を増幅した。以上２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、ｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ３）を作製した。【００９３】
（ｅ）一本鎖ＤＮＡの調製
ＰＣＲの鋳型としてプラスミドｐｔｒｐＣ−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｐｄｃ３）を、プライマーとしてｐｄｃ３−ｕｐｓｔｒ−Ｆ２（配列番号１１８）及びｐｄｃ３−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｒ２−Ｐ（配列番号１１９、５’側はリン酸化されている）を用いた以外は、上記（９）と同様の手順で一本鎖ＤＮＡを得た。【００９４】
（ｆ）パーティクルガンによる遺伝子導入
上記（１０）と同様の手順で、一本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡ−金粒子溶液を調製し、これを用いて０２Ｔ６株の胞子に対して遺伝子導入し、得られた胞子を培養した。一本鎖ＤＮＡには、上記（１５）（ｅ）で作製した一本鎖ＤＮＡを用いた。ＴＡＬＥＮ発現ベクターには、上記（１５）（ｂ）で作製したｐｃｉｐＣ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３及びｐｃｉｐＣ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３を用いた。エキソヌクレアーゼ発現ベクターには上記（１５）（ｃ）で作製したｐｃｉｐＣ−ｅｘｏ１を用いた。ＤＮＡ溶液におけるｐｃｉｐＣ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３、ｐｃｉｐＣ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｐｄｃ３、ｐｃｉｐＣ−ｅｘｏ１、及び一本鎖ＤＮＡの濃度比は、およそ１：１：１：２とした。【００９５】
（ｇ）ｐｄｃ３遺伝子欠損株の選択
上記（１１）と同様の手順で、上記（１５）（ｆ）で培養した菌体から胞子を回収し、菌株の単離及びゲノムテンプレート溶液の調製を行った。次いでこれを鋳型としたコロニーＰＣＲによりｐｄｃ３遺伝子座にｔｒｐＣ遺伝子領域断片がｋｎｏｃｋ−ｉｎされたｐｄｃ３遺伝子欠損株を選択した。コロニーＰＣＲは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーｐｄｃ３−ｕｐ（配列番号１２０）とｔｒｐＣ（ｄ）−１（配列番号５９）、及びＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。上記プライマーでコロニーＰＣＲを行った場合、ｐｄｃ３遺伝子座にｔｒｐＣ遺伝子領域断片のｋｎｏｃｋ−ｉｎが起こっていれば、適切な長さのＤＮＡ断片が増幅する。コロニーＰＣＲによりＤＮＡ増幅断片が得られた菌株を、Ｋｎｏｃｋ−ｉｎ株（ｐｄｃ３遺伝子欠損株）とした。【００９６】
（ｈ）ｐｄｃ３遺伝子座での相同組換え効率
得られたｐｄｃ３遺伝子欠損株について相同組換え効率を調べた（表１０）。【００９７】
【表１０】
2017135317.tif 000011
【００９８】
実施例２  変異リゾプス属菌（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）の作製
（１）アデニン栄養要求性株の作製
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＮＲＢＣ５３８４株（以下、５３８４株と表記）を相同組換え体の親株として用いた。アデニン栄養要求性株は、５３８４株の胞子へのＵＶ照射による変異導入株の中から選抜し取得した。ＵＶ照射は、殺菌ランプＧＬ１５（日立アプライアンス）を用いて、１分間照射した。照射した胞子を回収し、その中から、ａｄｅ１遺伝子領域に変異を有し、アデニン栄養要求性を示すＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＡＭ００２株を取得した。以降の実施例では、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ相同組換え体作製のための親株としてＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＡＭ００２株を用いた。【００９９】
（２）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ用プラスミドベクターの作製
５３８４株のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーｐＵＣ１８−ａｄｈ１ｐｒｏ−Ｆ（配列番号１２１）及びａｄｈ１ｐｒｏ−ｐＵＣ１８−Ｒ（配列番号１２２）を用いたＰＣＲにてａｄｈ１のプロモーター断片を増幅した。次に、ｐＵＣ１８を鋳型に、プライマーｐＵＣ１８−Ｐａｅ１−Ｆ３（配列番号３８）及びｐＵＣ１８−Ｈｉｎｄ３−Ｒ３（配列番号３９）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。以上の２断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結してプラスミドｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ（ＲＯ）を作製した。【０１００】
続いて、５３８４株のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーａｄｈ１ｐｒｏ−ａｄｈ１ｔｅｒ−Ｆ（配列番号１２３）及びａｄｈ１ｔｅｒ−ｐＵＣ１８−Ｒ（配列番号１２４）を用いたＰＣＲにてａｄｈ１のターミネーター断片を増幅した。さらに、ｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ（ＲＯ）を鋳型に、プライマーｐＵＣ１８−Ｐａｅ１−Ｆ３（配列番号３８）及びａｄｈ１ｐｒｏ−ａｄｈ１ｔｅｒ−Ｒ（配列番号１２５）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片増幅した。以上の２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結してプラスミドｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈ（ＲＯ）を作製した。【０１０１】
（３）ｌｄｈＡ遺伝子破壊用ＴＡＬＥＮの作製
ｌｄｈＡ遺伝子座を標的として、ＴＡＬＥＮを作製した。ＴＡＬＥＮの作製は、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に依頼し、ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＴＡＬｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が提供するＴＡＬＥＮの商品名）を得た。このキットは、標的遺伝子に対するＬｅｆｔ−ＴＡＬＥＮ及びＲｉｇｈｔ−ＴＡＬＥＮの２つのポリヌクレオチドを含む。ｌｄｈＡ遺伝子（配列番号１４８）を標的とするキットは、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡ（配列番号１４９）及びＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡ（配列番号１５０）を含み、これらはそれぞれ、ｌｄｈＡ遺伝子のセンス鎖中の５’−ＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＡＴＡ−３’（配列番号１５１）及びアンチセンス鎖中の５’−ＴＣＣＴＣＴＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＣＴＣ−３’（配列番号１５２）の配列を標的とするＴＡＬＥＮをコードする。【０１０２】
ｌｄｈＡ遺伝子用のＬｅｆｔＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを、上記（２）で作製したＲ．ｏｒｙｚａｅ用発現ベクターｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈ（ＲＯ）に挿入し、ａｄｈ１プロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈ（ＲＯ）を鋳型に、プライマーａｄｈ１ｐｒｏ（ｏ）−Ｒ（配列番号１２６）及びａｄｈ１ｔｅｒ（ｏ）−Ｆ（配列番号１２７）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡを鋳型に、プライマーａｄｈ１ｐｒｏ（ｏ）−ＬｉｆｅＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号１２８）及びＬｉｆｅＴＡＬＥＮ−ａｄｈ１ｔｅｒ（ｏ）−Ｒ（配列番号１２９）を用いたＰＣＲにてＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡ断片を増幅した。上記２断片には、１５塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡを含むプラスミドｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡ（ＲＯ）を得た。【０１０３】
同様に、ｌｄｈＡ遺伝子用のＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮをコードするポリヌクレオチドを、ｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈ（ＲＯ）に挿入し、ａｄｈ１プロモーターとａｄｈ１ターミネーターの制御下でＴＡＬＥＮを発現するベクターを作製した。すなわち、ｐＵＣ１８−Ｐａｄｈ−Ｔａｄｈ（ＲＯ）を鋳型に、プライマーａｄｈ１ｐｒｏ（ｏ）−Ｒ（配列番号１２６）及びａｄｈ１ｔｅｒ（ｏ）−Ｆ（配列番号１２７）を用いたＰＣＲにてベクター断片を増幅した。続いてＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡを鋳型に、プライマーａｄｈ１ｐｒｏ（ｏ）−ＬｉｆｅＴＡＬＥＮ−Ｆ（配列番号１２８）及びＬｉｆｅＴＡＬＥＮ−ａｄｈ１ｔｅｒ（ｏ）−Ｒ（配列番号１２９）を用いたＰＣＲにてＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡ断片を増幅した。上記２断片には、１５塩基ずつオーバーラップする領域が存在する。これら２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡを含むプラスミドｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡ（ＲＯ）を得た。【０１０４】
（４）ｌｄｈＡ遺伝子座を標的とする ａｄｅ１  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ用プラスミドの作製
ｌｄｈＡ遺伝子座に対してｌｄｈＡ遺伝子ＯＲＦの一部を除去し、ａｄｅ１遺伝子領域をｋｎｏｃｋ−ｉｎするための、プラスミドｐａｄｅ１−ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｌｄｈＡ）を作製した。すなわち、ｐＵＣ１８を鋳型にプライマーｐＵＣ１８−Ｐａｅ１−Ｆ３（配列番号３８）及びｐＵＣ１８−Ｈｉｎｄ３−Ｒ３（配列番号３９）にて増幅したｐＵＣ１８ベクター断片と、５３８４株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーｌｄｈＡ−ｕｐｓｔｒ−Ｆ（配列番号１３０）及びｌｄｈＡ−ｕｐｓｔｒ−Ｒ２（配列番号１３１）にて増幅した、ｌｄｈＡ遺伝子の一部を含むｌｄｈＡ遺伝子プロモーター部位断片と、５３８４株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーｌｄｈＡ−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｆ２（配列番号１３２）及びｌｄｈＡ−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｒ（配列番号１３３）にて増幅したｌｄｈＡ遺伝子ターミネーター部位断片を増幅した。以上３断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、ｐｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｌｄｈＡ）を作製した。【０１０５】
続いて、ｐｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｌｄｈＡ）を鋳型にプライマーｌｄｈＡ−ｕｐｓｔｒ−Ｒ（配列番号１３４）及びｌｄｈＡ−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｆ（配列番号１３５）にて増幅したＤＮＡ断片と、５３８４株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーａｄｅ１ｐｒｏ−Ｒ（配列番号１３６）及びａｄｅ１ｔｅｒ−Ｆ（配列番号１３７）にて増幅したａｄｅ１遺伝子領域断片を増幅した。以上２断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて連結し、ｐａｄｅ１  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｌｄｈＡ）を作製した。【０１０６】
（５）二本鎖ＤＮＡの調製
プラスミドｐａｄｅ１  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ（ｌｄｈＡ）を鋳型にプライマーｌｄｈＡ−ｕｐｓｔｒ−Ｆ２（配列番号１３８）及びｌｄｈＡ−ｄｏｗｎｓｔｒ−Ｒ２−Ｐ（配列番号１３９、５’側はリン酸化されている）を用いてＤＮＡ断片を増幅し、鋳型をＤｐｎ１（ＴＯＹＯＢＯ）処理にて分解した。続いて生成物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理、及びエタノール沈殿処理して精製し、精製物を適量のＤＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒに溶解し、ｌｄｈＡ遺伝子破壊用の二本鎖ＤＮＡ溶液を得た。【０１０７】
（６）一本鎖ＤＮＡの調製
次いで、上記（５）で得た二本鎖ＤＮＡを、Ｌａｍｂｄａ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて処理した後、上記と同様に精製し、一本鎖ＤＮＡを得た。Ｌａｍｂｄａ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ処理は、３７℃、オーバーナイトで行った。【０１０８】
（７）パーティクルガンによる遺伝子導入
実施例１の（１０）と同様の手順で、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡ−金粒子溶液を調製し、これを用いてＡＭ００２株の胞子に対して遺伝子導入し、得られた胞子を培養した。一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡには、上記（５）又は（６）で作製した一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡを用いた。ＴＡＬＥＮ発現ベクターには、上記（３）で作製したｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡ（ＲＯ）及びｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡ（ＲＯ）を用いた。エキソヌクレアーゼ発現ベクターには、実施例１（４）で作製したｐｌｄｈ−ｅｘｏ１を用いた。ＤＮＡ溶液におけるｐａｄｈ−ＬｅｆｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡ（ＲＯ）、ｐａｄｈ−ＲｉｇｈｔＴＡＬＥＮ−ｌｄｈＡ（ＲＯ）、ｐｌｄｈ−ｅｘｏ１、及び一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの濃度比は、およそ１：１：１：２とした。【０１０９】
（８）ｌｄｈＡ遺伝子欠損株の選択
上記（７）で培養した菌体から胞子を回収し、実施例１の（１１）と同様の手順で、菌株の単離及びゲノムテンプレート溶液の調製を行った。次いでこれを鋳型としたコロニーＰＣＲによりｌｄｈＡ遺伝子座にａｄｅ１遺伝子領域断片がｋｎｏｃｋ−ｉｎされたｌｄｈＡ遺伝子欠損株を選択した。コロニーＰＣＲは、上記ゲノムテンプレート溶液、プライマーｌｄｈＡ−ｕｐ（配列番号１４０）とａｄｅ１−１５（配列番号１４１）、及びＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて行った。上記プライマーでコロニーＰＣＲを行った場合、ｌｄｈＡ遺伝子座にａｄｅ１遺伝子領域断片のｋｎｏｃｋ−ｉｎが起こっていれば、適切な長さのＤＮＡ断片が増幅する。コロニーＰＣＲによりＤＮＡ増幅断片が得られた菌株を、Ｋｎｏｃｋ−ｉｎ株（ｌｄｈＡ遺伝子欠損株）とした。【０１１０】
（９）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅでの相同組換え効率の比較
（ａ）一本鎖ＤＮＡ  対  二本鎖ＤＮＡ
供与体ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合と一本鎖ＤＮＡの場合の間で、相同組換え効率の比較を行った。結果を表１１に示す。二本鎖ＤＮＡを用いた場合、長鎖配列が導入された相同組換え株を取得することはできなかったが、一本鎖ＤＮＡを用いることで、長鎖配列が導入された相同組換え株の取得に成功した。【０１１１】
【表１１】
2017135317.tif 000012
【配列表】
2017135317000001.app
【国際調査報告】
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