(57)【要約】  未分化性を維持したまま増殖させる筋衛星細胞の培養用材料及びこれを用いた培養方法を提供することを目的とする。本発明は、ラミニンを含む筋衛星細胞培養用材料、およびこれを用いた筋衛星細胞の培養方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のラミニンを含む筋衛星細胞培養用材料。
【請求項２】
筋衛星細胞培養用培養基材または筋衛星細胞培養用培地である、請求項１記載の筋衛星細胞培養用材料。
【請求項３】
第１のラミニンがコーティングされている筋衛星細胞培養用培養基材である、請求項１または２記載の筋衛星細胞培養用材料。
【請求項４】
前記第１のラミニンが、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の筋衛星細胞培養用材料。
【請求項５】
前記第１のラミニンが、ヒトラミニンα２β１γ１、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１から成る群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の筋衛星細胞培養用材料。
【請求項６】
前記第１のラミニンが、ヒトラミニンα２β１γ１のＥ８フラグメントを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の筋衛星細胞培養用材料。
【請求項７】
筋衛星細胞と第１のラミニンとを接触させる接触工程を含む、筋衛星細胞の培養方法。
【請求項８】
第１のラミニンが、
ａ）培地に含まれている；
ｂ）培養基材中に含まれている；または
ｃ）培養基材にコーティングされている
ことを特徴とする、請求項７記載の筋衛星細胞の培養方法。
【請求項９】
培養基材が、ディッシュ、プレート、カバースリップ、マイクロキャリア、ゼラチンハイドロゲル、またはコラーゲンスポンジであることを特徴とする、請求項８記載の筋衛星細胞の培養方法。
【請求項１０】
前記接触工程において、請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養用材料を用いることを特徴とする、請求項７に記載の筋衛星細胞の培養方法。
【請求項１１】
さらに、筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程を含む、請求項７〜１０のいずれか一項記載の筋衛星細胞の培養方法。
【請求項１２】
前記第２のラミニンが、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１から成る群より選択される少なくとも１種のヒトラミニンを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の培養方法。
【請求項１３】
前記第２のラミニンが、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことを特徴とする、請求項１１または１２に記載の培養方法。
【請求項１４】
前記第２のラミニンが、筋衛星細胞の培養培地中に含まれていることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか一項記載の培養方法。
【請求項１５】
前記筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程が培養基材上に筋衛星細胞を播種する前に行われることを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか一項記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラミニンがコーティングされている筋衛星細胞培養用材料、これを用いた筋衛星細胞の培養方法および筋衛星細胞培養用キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋の組織幹細胞である筋衛星細胞は、筋繊維と基底膜との間隙に存在し、通常は細胞周期の静止期にとどまり未分化状態を維持している。しかし、ひとたび筋が損傷を受けると筋衛星細胞は活性化され、増殖と分化を経て筋組織を修復・再生する。加齢と共に筋衛星細胞の数及び機能が低下することが知られており、そのことにより筋繊維の損傷や萎縮に対して脆弱となった結果、筋量・筋力の低下へと繋がり、サルコペニアを発症すると考えられている（非特許文献１参照）。このような筋衛星細胞の機能不全による筋疾患や筋萎縮、または筋ジストロフィーなどの遺伝性筋疾患の新たな治療法として、局所に筋衛星細胞を移植して筋機能を再生することを目指した細胞移植治療の研究が注目されている。ｉＰＳ細胞から分化誘導する方法が試みられているが、安全性・品質を満たす筋衛星細胞は得られていない。一方、生体組織から得られる筋衛星細胞はわずかであり、移植治療に十分な量を確保するためには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して細胞数を増やさなくてはならない。現在、筋衛星細胞の培養には、培養ディッシュ上にコートする接着基質としてマトリゲル（商品名）が汎用されている（非特許文献２参照）。しかしマトリゲルは、マウスＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍由来の構成成分未知な蛋白質混合ゲルであるため、ヒト移植治療用の細胞の培養基質としては適さない。【０００３】
前述したように、静止期筋衛星細胞は筋繊維と基底膜に挟まれるように存在している。基底膜の主要構成蛋白質の一つにラミニンがある。ラミニンは、α、β、γ鎖の３つのサブユニットから構成されているヘテロ三量体蛋白質で、α、β、γ鎖の組合せによって１５種類のラミニンアイソフォームが同定されている。特にラミニンα鎖は組織特異的・発生段階特異的に発現していることが知られている。ラミニンの細胞接着活性を介する細胞表面レセプターはいくつか同定されているが、その主たるものはインテグリン（α６β１、α７β１、α６β４など）である。ラミニンは、各々サブユニット鎖の分子量がいずれも２００〜４００ｋＤと巨大で、それらを組換え蛋白質として発現・会合させヘテロ三量体蛋白質として精製することは容易ではない。【０００４】
そこで、ラミニンのインテグリン結合活性を保持した最小単位として組換えＥ８フラグメントが作成され、ゼノフリー条件での大量発現・精製が可能となっている。さらに、主たるラミニンアイソフォーム［ラミニン−１１１（α１β１γ１）、ラミニン−２１１（α２β１γ１）、ラミニン−３３２（α３β３γ２）、ラミニン−４１１（α４β１γ１）、ラミニン−５１１（α５β１γ１）］の組換えＥ８フラグメントが調製され、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞といった多能性幹細胞の未分化維持培養法において、ラミニン−５１１またはラミニン−３３２のＥ８フラグメントが効果的であることが見出されている（特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／０４３４０５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Grounds MD. Therapies for sarcopenia and regeneration of oldskeletal muscles: more a case of old tissue architecture than old stem cells.Bioarchitecture, 4, 81-87, 2014.
【非特許文献２】Grefte S, Vullinghs S, Kuijpers-Jagtman AM, Torensma R, Von den Hoff JW. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomed Mater, 7, 055004, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、筋衛星細胞の未分化性を維持したまま増殖する培養技術は、上述のとおりニーズが高いにも関わらず十分に確立されていなかった。そこで、本発明は、未分化性を維持したまま増殖させる筋衛星細胞の培養用材料及びこれを用いた培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の好ましい態様は以下の事項に関する。【０００９】
１．  第１のラミニンを含む筋衛星細胞培養用材料。【００１０】
２．  筋衛星細胞培養用培養基材または筋衛星細胞培養用培地である、上記１記載の筋衛星細胞培養用材料。【００１１】
３．  第１のラミニンがコーティングされている筋衛星細胞培養用培養基材である、上記１または２記載の筋衛星細胞培養用材料。【００１２】
４．  前記第１のラミニンが、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことを特徴とする上記１〜３のいずれかに記載の筋衛星細胞培養用材料。【００１３】
５．  前記第１のラミニンが、ヒトラミニンα２β１γ１、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１から成る群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンを含むことを特徴とする上記１〜４のいずれかに記載の筋衛星細胞培養用材料。【００１４】
６．  前記第１のラミニンが、ヒトラミニンα２β１γ１のＥ８フラグメントを含むことを特徴とする上記１〜５のいずれかに記載の筋衛星細胞培養用材料。【００１５】
７．  筋衛星細胞と第１のラミニンとを接触させる接触工程を含む、筋衛星細胞の培養方法。【００１６】
８．  第１のラミニンが、
ａ）培地に含まれている；
ｂ）培養基材中に含まれている；または
ｃ）培養基材にコーティングされている
ことを特徴とする、上記７記載の筋衛星細胞の培養方法。【００１７】
９．  培養基材が、ディッシュ、プレート、カバースリップ、マイクロキャリア、ゼラチンハイドロゲル、またはコラーゲンスポンジであることを特徴とする、上記８記載の筋衛星細胞の培養方法。【００１８】
１０．  前記接触工程において、上記１〜６のいずれかに記載の培養用材料を用いることを特徴とする、上記７に記載の筋衛星細胞の培養方法。【００１９】
１１．  さらに、筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程を含む、上記７〜１０のいずれか記載の筋衛星細胞の培養方法。【００２０】
１２．  前記第２のラミニンが、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１から成る群より選択される少なくとも１種のヒトラミニンを含むことを特徴とする、上記１１に記載の培養方法。【００２１】
１３．  前記第２のラミニンが、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことを特徴とする、上記１１または１２に記載の培養方法。【００２２】
１４．  ｉ）単離した筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる工程であって、該第２のラミニンがヒトラミニンα３β３γ２Ｅ８フラグメント、ヒトラミニンα４β１γ１Ｅ８フラグメント、およびヒトラミニンα５β１γ１Ｅ８フラグメントの混合物である工程、および
ｉｉ）該筋衛星細胞を第１のラミニンがコーティングされている培養基材上で培養する工程であって、該第１のラミニンがヒトラミニンα２β１γ１Ｅ８フラグメントである工程
を含むことを特徴とする、上記１１〜１３のいずれかに記載の筋衛星細胞の培養方法。【００２３】
１５．  前記第２のラミニンが、筋衛星細胞の培養培地中に含まれていることを特徴とする、上記１１〜１４のいずれか記載の培養方法。【００２４】
１６．  前記筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程が培養基材上に筋衛星細胞を播種する前に行われることを特徴とする、上記１１〜１５のいずれか記載の培養方法。【００２５】
１７．  さらに、
筋衛星細胞の増殖刺激物質と筋衛星細胞とを接触させる工程
を含むことを特徴とする、上記７〜１６のいずれか記載の培養方法。【００２６】
１８．  前記筋衛星細胞の増殖刺激物質が、筋衛星細胞の培養培地中に含まれていることを特徴とする、上記１７記載の培養方法。【００２７】
１９．  前記筋衛星細胞の増殖刺激物質が、ＪＡＫ阻害剤またはＳＴＡＴ阻害剤であることを特徴とする、上記１７または１８に記載の培養方法。【００２８】
２０．  前記筋衛星細胞が、ヒトまたはマウスの筋衛星細胞であることを特徴とする上記７〜１９のいずれか記載の培養方法。【００２９】
２１．  第１のラミニンを含む筋衛星細胞培養用キット。【００３０】
２２．  さらに、培養器、第２のラミニン、および筋衛星細胞細胞用の培地からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む、上記２１に記載の筋衛星細胞培養用キット。【００３１】
２３．  前記第１のラミニンがヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことを特徴とする、上記２１または２２に記載の筋衛星細胞培養用キット。【００３２】
２４．  前記第１のラミニンが、ヒトラミニンα２β１γ１、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１から成る群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンを含むことを特徴とする、上記２１〜２３のいずれかに記載の筋衛星細胞培養用キット。【００３３】
２５．  前記第１のラミニンがヒトラミニンα２β１γ１Ｅ８フラグメントであり、前記第２のラミニンがヒトラミニンα３β３γ２Ｅ８フラグメント、ヒトラミニンα４β１γ１Ｅ８フラグメントおよびヒトラミニンα５β１γ１Ｅ８フラグメントの混合物であることを特徴とする、上記２１〜２４のいずれかに記載の筋衛星細胞培養用キット。
【発明の効果】
【００３４】
本発明によると、筋衛星細胞の未分化性を維持したまま増殖させることができる筋衛星細胞培養用培養材料、および筋衛星細胞の未分化性を維持したまま増殖させる培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】例１のマウス骨格筋組織におけるラミニンα鎖の発現の解析結果を示す。
【図１Ｂ】図１Ａのラミニンα３、α４、α５鎖の染色像の拡大図を示す。
【図１Ｃ】筋再生後におけるマウス筋衛星細胞周囲のラミニンα鎖の発現の解析結果を示す。
【図２】例２におけるラミニンＥ８フラグメントを用いたマウス筋衛星細胞の細胞接着実験の結果を示す。
【図３Ａ】例３−１におけるラミニンＥ８フラグメントを用いたマウス筋衛星細胞の培養実験における概要図およびＰａｘ７陽性細胞率の相対値の算出結果を示す。
【図３Ｂ】例３−２における様々なラミニンＥ８フラグメントの組み合わせによるマウス筋衛星細胞の培養実験の結果を示す。
【図４】例４のヒト筋組織におけるラミニンα鎖の発現の解析結果を示す。
【図５】例５におけるラミニンＥ８フラグメントを用いたヒト筋衛星細胞の培養実験の結果を示す。
【図６】例６におけるマウス筋衛星細胞の前脛骨筋への移植実験の解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本実施形態の筋衛星細胞培養用材料（以下、単に「培養用材料」と記載することもある）は第１のラミニンを含む。ここで、第１のラミニンを「含む」とは、筋衛星細胞培養用材料と第１のラミニンとが接触していればよく、例えば、筋衛星細胞培養用材料にコーティングされていてもよいし、内包されていてもよいし、その両方であってもよい。第１のラミニンを含む培養用材料を用いて筋衛星細胞の培養を行うと、筋衛星細胞が培養用材料に対する十分な接着力を有し、かつ、未分化状態を維持したまま筋衛星細胞を増殖させることができる。筋衛星細胞培養用材料としては、筋衛星細胞培養用培養基材または筋衛星細胞培養用培地であることが好ましい。
【００３７】
（ラミニン）
ラミニンは、１５種類のアイソフォームを形成しうる、５種のα鎖、３種のβ鎖、および３種のγ鎖が特定されている。本明細書においては、例えば、α１鎖、β１鎖及びγ１鎖から構成されるラミニンを「ラミニンα１β１γ１」または「ラミニン１１１」と記載する。本実施形態においてラミニンは、全長であってもよいしその一部であってもよく、例えば、ラミニン１１１は、そのα１鎖、β１鎖及びγ１鎖のそれぞれが、互いに独立に、全長であってもよいしその一部であってもよい。
【００３８】
ラミニンのＥ８フラグメントは筋衛星細胞への接着活性が高いことから、本実施形態のラミニンは、少なくともＥ８フラグメントを含むことが好ましく、組換えタンパク質として精製しやすいことからＥ８フラグメントであることがより好ましく、実用化の観点からヒトラミニンのＥ８フラグメントであることがさらに好ましい。本明細書においては、ラミニンのＥ８フラグメントのことを単に「ラミニンＥ８」と記載することもあり、また、例えば、ラミニン１１１のＥ８フラグメントのことを「ラミニン１１１Ｅ８」とも記載する（他のラミニンのアイソフォームについても同様）。なお、単に「ラミニンＥ８」と記載したときは、ラミニンのアイソフォームは限定されず、いずれのアイソフォームのラミニンのＥ８フラグメントであってもよいものとする。
【００３９】
ラミニンのＥ８フラグメントは、マウスラミニンα１β１γ１（以下、「マウスラミニン１１１」とも記す。）をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar D., Timpl R., Thoenen H. The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3:1463-1468, 1984.、Goodman SL., Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105:589-598, 1987.）。例えば、ヒトラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１のＥ８フラグメント（マウスラミニン１１１Ｅ８）に相当するフラグメントの存在が推定されるが、これらを分離・同定したことは報告されていない。したがって、本発明に用いられるヒトラミニンのＥ８フラグメントは、対応するヒトラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン１１１Ｅ８と同様の細胞接着活性を有し、同様の構造を有し、同程度の分子量を有するヒトラミニンのフラグメントであればよい。
【００４０】
ラミニンのＥ８フラグメントの製造方法は特に限定されず、例えば、ラミニンの所望のアイソフォームの全長をエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し、目的のフラグメントを分取、精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量、品質の均一性、製造コスト等の観点から、組換えタンパク質として製造することが好ましい。
【００４１】
組換えヒトラミニン（全長またはその一部）は、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えヒトラミニン２１１Ｅ８の製造方法を例として以下説明する。組換えヒトラミニン２１１Ｅ８の製造方法としては、例えば、ヒトラミニン２１１Ｅ８のα鎖、β鎖およびγ鎖の各タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、得られた３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造できる。例えば、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.）に記載の方法に従って作製することができるが、これに限定されるものではない。例えばヒトラミニン２１１を構成するα２鎖、β１鎖、γ１鎖をそれぞれコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、表１に記載したアクセッション番号で公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。表１にラミニンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報の一例を記載する。第１のラミニンは、筋衛星細胞との接着性を有していればよく、例えば、これら特定のアミノ酸配列において、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたタンパク質であってもよい。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
本実施形態において、第１のラミニンは、動物のラミニンであることが好ましく、哺乳動物のラミニンであることがより好ましく、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、サルまたはヒトのラミニンであることがさらに好ましく、実用化の観点からヒトのラミニンであることが特に好ましい。
【００４４】
培養用材料中に含まれる第１のラミニンは、１種のみのラミニンでもよいし、２種以上のラミニンであってもよい。第１のラミニンとしては、特に限定されないが、ヒトラミニンを含むことが好ましく、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことがより好ましい。第１のラミニンのアイソフォームとしては、ヒトラミニンα２β１γ１、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１からなる群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンを含むことが好ましく、ヒトラミニンα２β１γ１を含むことがより好ましい。また、第１のラミニンとして、ヒトラミニンα２β１γ１Ｅ８、ヒトラミニンα３β３γ２Ｅ８、ヒトラミニンα４β１γ１Ｅ８およびヒトラミニンα５β１γ１Ｅ８からなる群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことが好ましく、ヒトラミニンのα２β１γ１のＥ８フラグメントを含むことがより好ましい。本実施形態の一態様として、第１のラミニンに含まれる全ラミニン中、ヒトラミニンα２β１γ１のＥ８フラグメントの割合が５０質量％以上であることが好ましく、７０質量％以上であることがより好ましく、９０質量％以上であることがさらに好ましく、１００質量％であってもよい。これら第１のラミニンを含む培養用材料を用いると、未分化の筋衛星細胞の割合が高い状態を維持して、細胞を培養することができる。
【００４５】
以下、本実施形態の培養用材料として、筋衛星細胞培養用培養基材および筋衛星細胞培養用培地について説明するが、筋衛星細胞培養用材料は、筋衛星細胞の培養に用いられる材料であればよく、特にこれらに限定されるものではない。
【００４６】
＜筋衛星細胞培養用培養基材＞
本実施形態の筋衛星細胞培養用培養基材（単に「培養基材」と記載することもある）は、第１のラミニンを含む。第１のラミニンは、培養基材にコーティングされていてもよいし、内包されていてもよく、第１のラミニンが培養基材に少なくともコーティングされている態様が好ましい。第１のラミニンが培養基材にコーティングされている場合、第１のラミニンが培養基材の一部または全部にコーティングされていてよく、好ましくは培養時に培地と接する面にコーティングされている。
【００４７】
本実施形態の培養基材は、培養器等の表面が第１のラミニンでコーティングされているのが好ましい。培養器としては、筋衛星細胞の培養に使用できるものであれば限定されず、例えば、シャーレ、フラスコ、ディッシュ、プレート、カバースリップ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、マイクロキャリア、ポリビニリデンフルオリド膜等のポリマー膜などが挙げられる。また、培養器の素材としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）等が挙げられる。
【００４８】
また、本実施形態の培養基材は、マイクロキャリア、ゼラチンハイドロゲル、コラーゲンスポンジなどの足場であってもよい。これら足場の形状は特に限定されず、例えば粒状であってもよいし、シート状であってもよい。足場として、市販品を用いてもよく、例えば、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製のＣｙｔｏｄｅｘ、和光純薬工業株式会社製のＭｅｄＧｅｌ等が挙げられる。本実施形態においては、これら足場に第１のラミニンがコーティングされていてもよいし、内包されていてもよいし、その両方であってもよい。
【００４９】
（筋衛星細胞培養用培養基材の製造方法）
本実施形態の培養基材の製造方法は、特に限定されないが、第１のラミニンを適当な溶媒、例えばＰＢＳ、生理食塩水、トリスヒドロキシメチルアミノメタンあるいは４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸で中性ｐＨとした生理的食塩水などで希釈し、この溶液を適当な培養器に添加して、例えば、約２℃〜約４０℃、好ましくは約２℃〜約３７℃で、約１時間〜約２４時間、好ましくは約１時間から約１５時間静置することにより、ラミニンが培養器表面にコーティングされた培養基材を得ることができる。培養器としては、筋衛星細胞の培養に使用できるものであれば限定されず、例えば、シャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、マイクロキャリア、ポリビニリデンフルオリド膜等のポリマー膜などが挙げられる。また、培養器の素材としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）等が挙げられる。
【００５０】
第１のラミニンのコーティング濃度は、特に限定されないが、約０．５μｇ／ｃｍ２〜約２５μｇ／ｃｍ２が好ましく、約０．８μｇ／ｃｍ２〜約１０μｇ／ｃｍ２がより好ましい。
【００５１】
第１のラミニンを培養器上にコーティングする際、コーティングは一度に行ってもよいし、２回以上行ってもよい。例えば、１種のアイソフォームのラミニンを培養基材上にコーティングした後、別のアイソフォームのラミニンをさらにその上にコーティングしてもよい。
【００５２】
本実施形態の培養基材は、ラミニン以外のヒト由来成分等がコーティングされていてもよい。例えば血清成分、細胞外マトリックス分子、成長因子、分化誘導因子、形態形成因子（モルフォゲン）などが挙げられる。また、合成高分子ゲル（合成ポリマー）などの非生物成分がコーティングされていてもよい。
【００５３】
本実施形態の培養基材は、ラミニンがコーティングされていることにより、従来用いられていたマトリゲルを用いずに未分化性を保持したまま筋衛星細胞を維持培養することが可能となる。さらに、異種由来の成分が排除されている培地を使用すれば、完全に異種由来の成分を含まない培養条件（ゼノフリー：Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ）で筋衛星細胞を培養することができ、例えば、ヒトラミニンでコーティングされた培養基材を用いてヒト筋衛星細胞を培養することにより、ヒトに対して免疫原性を発現する可能性が非常に低い、安全性の高いヒト筋衛星細胞を提供することができる。
【００５４】
また、本実施形態の培養基材は、ラミニンが内包されていてもよい。第１のラミニンの内包濃度は、特に限定されないが、例えば、ディッシュのコーティングの場合、約０．５μｇ／ｃｍ２〜約２５μｇ／ｃｍ２が好ましく、約０．８μｇ／ｃｍ２〜約１０μｇ／ｃｍ２がより好ましい。
【００５５】
＜筋衛星細胞培養用培地＞
本発明の培養用材料の一態様として、第１のラミニンを含む筋衛星細胞培養用培地であってもよい。筋衛星細胞培養用培地としては後述の筋衛星細胞の培養方法の説明中に記載の培地を用いてよい。また、筋衛星細胞培養用培地に含まれる第１のラミニンとしては、上記筋衛星細胞培養用培養基材に含まれる第１のラミニンと同様のものを用いることができる。
【００５６】
＜筋衛星細胞の培養方法＞
本実施形態は、筋衛星細胞の培養方法を提供する。本発明の筋衛星細胞の培養方法の一態様は、筋衛星細胞と第１のラミニンとを接触させる接触工程を含む。本発明の培養方法によると、筋衛星細胞の未分化性を維持したまま増殖させることができる。本発明の筋衛星細胞の培養方法においては、第１のラミニンが、ａ）培地に含まれている；ｂ）培養基材中に含まれている；またはｃ）培養基材にコーティングされていることにより、筋衛星細胞と第１のラミニンとが接触する態様が好ましく、ａ）、ｂ）、およびｃ）のうち少なくとも１つの態様を含めばよく、２つ以上の態様を含んでもよい。
【００５７】
本実施形態の筋衛星細胞の培養方法においては、上述の第１のラミニンを含む筋衛星細胞培養用培養基材および／または第１のラミニンを含む筋衛星細胞用培地を用いることが好ましく、少なくとも第１のラミニンを含む筋衛星細胞培養用培養基材を用いることがより好ましい。
【００５８】
（筋衛星細胞）
本実施形態の培養方法に用いる筋衛星細胞は、動物の筋衛星細胞であることが好ましく、哺乳動物の筋衛星細胞であることがより好ましく、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、サルまたはヒトの筋衛星細胞であることがさらに好ましく、ヒトまたはマウスの筋衛星細胞であることがさらに好ましく、ヒトの筋衛星細胞であることが特に好ましい。筋衛星細胞は、組織から分離した筋衛星細胞であることが好ましく、ヒトまたはマウス等の動物の組織からフローサイトメーター（ＦＡＣＳ(fluorescence activated cell sorting）)等を用いて分離してもよい。組織から筋衛星細胞を分離する方法は、例えば、Fukada S, Higuchi S, Segawa M et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp Cell Res 2004;296:245-255.を参照してもよい。別の態様として、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞から筋衛星細胞を作製してもよい。
【００５９】
（培地）
本実施形態の培養方法で使用する筋衛星細胞の未分化維持用の培地は、特に限定されないが、合成培地が好ましく、異種成分を含まない（ゼノフリー）合成培地が特に好ましい。市販または市販予定の合成培地としては、ｍＴｅＳＲ１（商品名、StemCell Technologies）、ＴｅＳＲ２（商品名、StemCell Technologies）、ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ（商品名、Invitrogen）、ｈＥＳＦ−ＧＲＯ（商品名、株式会社細胞科学研究所）等が挙げられる。このうちＴｅＳＲ２が異種成分を含まない培地である。本願の実施例においては、未分化培地として、ＤＭＥＭ  ｗｉｔｈ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、２０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、１％  Ｃｈｉｃｋ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  １００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、および５ｎｇ／ｍｌ  ｂａｓｉｃ−ＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製）の混合培地が用いられている。また、以下の文献（１）〜（５）に記載された培地も必要に応じて適宜改変を加えて用いられうる。
(1) Liu, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 346:131-139, 2006.
(2) Vallier, L. et al., J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005.
(3) Li, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 91:688-698, 2005.
(4) Yao, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6907-6912, 2006.
(5) Lu, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:5688-5693, 2006.
【００６０】
（培養方法）
筋衛星細胞の培養方法は、本実施形態の第１のラミニンを含む培養用材料（好ましくは第１のラミニンがコーティングされている培養基材）を用いればよく、細胞を維持または増幅し得る方法であれば特に限定されない。筋衛星細胞の播種密度は、特に限定されないが、約２．０×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜約２．０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２が好ましく、約５．０×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜約１．５×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２がより好ましく、約７．０×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜約１．２５×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２がさらに好ましい。培養温度としては、例えば、３０〜４０℃の範囲内、好ましくは３６〜３８℃の範囲内、より好ましくは３７℃を好適に例示することができる。また、細胞をより好適に維持または増幅する観点から、培地交換を適当な時期に行うことが好ましい。培地交換の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に制限されないが、例えば１〜５日間経過毎、好ましくは３日間経過毎としてもよい。培地交換においては、培地の全部を交換してもよいし、一部のみを交換してもよい。また、筋衛星細胞の培養においては必要により継代を行ってもよく、継代の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に制限されず、細胞の集団が大きくなってきたタイミングで適宜行うことができ、例えば、４〜１２日間経過毎、好ましくは６〜１０日間経過毎とすることができる。
【００６１】
また、筋衛星細胞の培養方法は、本実施形態の第１のラミニンが培地に含まれていれば、必ずしもラミニンがコーティングされている培養基材を用いる必要はない。培地に含められる第１のラミニンの使用量は、特に限定されないが、例えば、筋衛星細胞７．５×１０３個に対し、第１のラミニンを好ましくは０．１〜０．５μｇ、より好ましくは０．２〜０．４μｇとなるように混合してもよい。
【００６２】
筋衛星細胞の培養方法の一態様として、筋衛星細胞を本実施形態の培養基材を用いて培養する工程に加え、さらに、筋衛星細胞と、第１のラミニンとは別の第２のラミニンとを接触させる工程を含むことが好ましい。以下、
ｉ）筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程（以下、「工程（ｉ）」とも記載する）、および
ｉｉ）筋衛星細胞を、第１のラミニン含む培養基材を用いて培養する工程（以下、「工程（ｉｉ）」とも記載する）
として、説明する。
【００６３】
本実施形態の培養方法においては、少なくとも工程（ｉｉ）を含めばよいが、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）を含むことにより、工程（ｉｉ）のみを行う場合より未分化性を維持した筋衛星細胞の割合がさらに高い状態で筋衛星細胞を増殖させることができる。工程（ｉ）と工程（ｉｉ）を行う順序は限定されず、両工程を同時に行ってもよいし、工程（ｉ）を行った後工程（ｉｉ）を行ってもよいし、その逆であってもよく、工程（ｉ）と工程（ｉｉ）とを交互に繰り返し行ってもよい。
【００６４】
工程（ｉ）においては、筋衛星細胞と、第２のラミニンとを接触させる。第２のラミニンのアイソフォームは、１種であっても２種以上であってもよい。また、第２のラミニンは全長であってもその一部であってもよく、Ｅ８フラグメントを含むことが好ましい。なお、第１のラミニンと第２のラミニンのアイソフォームおよびサイズ等は互いに独立であり、その一部または全部が同一であっても異なっていてもよい。
【００６５】
第２のラミニンのアイソフォームとしては、特に限定されないが、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１からなる群より選択される少なくとも１種のヒトラミニンを含むことが好ましい。すなわち、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１からなる群より選択される１種であってもよいし、２種であってもよいし、３種すべてを含んでもよい。これらのうち、第２のラミニンがヒトラミニンα３β３γ２、α４β１γ１およびα５β１γ１の混合物を含むことが特に好ましい。第２のラミニンに含まれる全ラミニン中、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１の合計含有量が５０質量％以上であることが好ましく、７０質量％以上であることがより好ましく、９０質量％以上であることがさらに好ましく、１００質量％であってもよい。
【００６６】
第２のラミニンは、各ラミニンのＥ８フラグメントを含むことが好ましく、実用化の観点からヒトラミニンのＥ８フラグメントであることがさらに好ましい。第２のラミニンとして複数のラミニンを用いる場合、各ラミニンの混合比は特に限定されない。例えば、ヒトラミニン３３２Ｅ８、ヒトラミニン４１１Ｅ８及びヒトラミニン５１１Ｅ８を用いる場合、ヒトラミニン３３２Ｅ８の重量１００重量％に対し、ヒトラミニン４１１Ｅ８及びヒトラミニン５１１Ｅ８が、それぞれ独立に、５０〜２００重量％であるのが好ましく、７０〜１５０重量％であるのがより好ましく、８０〜１２０重量％であるのがさらに好ましく、各ラミニンがほぼ等重量であることが特に好ましい。第２のラミニンと筋衛星細胞とを接触させることにより、未分化筋衛星細胞の増殖をさらに促進することができる。この理由は定かではないが、本発明者らは、第２のラミニンと筋衛星細胞とが接触することにより、筋衛星細胞の周囲に第２のラミニンが付着して筋衛星細胞がコーティングされ、培養基材上の第１のラミニンと相互作用しやすくなるのではないかと推測している。
【００６７】
工程（ｉ）の一態様として、第２のラミニンが、筋衛星細胞の培養培地中に含まれていてもよい。すなわち、筋衛星細胞の培養培地中で、筋衛星細胞と第２のラミニンとが接触した状態となることが好ましい。培養培地中に、筋衛星細胞と第２のラミニンが加えられる順序および方法は特に限定されない。
【００６８】
本実施形態の培養方法の一態様として、工程（ｉ）の後工程（ｉｉ）を行う、すなわち、筋衛星細胞を培養基材上に播種する前に、筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程を行ってもよい。工程（ｉ）においては、例えば、第２のラミニンと、播種する筋衛星細胞の一部または全部とを、筋衛星細胞用の培地等の中に含ませてプレインキュベーションを行い、このプレインキュベーション後の筋衛星細胞を第１のラミニンがコーティングされている培養基材中に播種する方法が好適に挙げられる。プレインキュベーションは、好ましくは３６〜３８℃程度、より好ましくは約３７℃で、好ましくは１０分〜２時間程度、より好ましくは２０分〜１時間程度インキュベートする方法が挙げられる。あるいは、所定の温度、時間でプレインキュベーションすることなく、筋衛星細胞と第２のラミニンとを培地等の中で混合して、そのまま培養基材上に移してもよい。
【００６９】
工程（ｉ）の別の一態様として、培養基材上に筋衛星細胞と第２のラミニンとを別々に移してもよい。例えば、培養基材上に培地とともに筋衛星細胞を播種した後に第２のラミニンを培地中に加えてもよいし、第２のラミニンを含む培地を培養基材上に移した後、筋衛星細胞を播種してもよいし、培養基材上に培地を移した後、第２のラミニンと筋衛星細胞とを別々に加えてもよい。
【００７０】
工程（ｉ）における第２のラミニンの使用量は、特に限定されないが、例えば、筋衛星細胞７．５×１０３個に対し、第２のラミニンを好ましくは０．１〜０．５μｇ、より好ましくは０．２〜０．４μｇとなるように混合してもよい。また、工程（ｉ）においては、特に限定されないが、培地５０μｌに対し、筋衛星細胞が５．０×１０３〜１．０×１０４個程度になるように筋衛星細胞と第２のラミニンとを培地中で混合してプレインキュベーションする態様が好ましく挙げられる。
【００７１】
本実施形態の培養方法の好ましい一態様として、
ヒトラミニン３３２Ｅ８、ヒトラミニン４１１Ｅ８及びヒトラミニン５１１Ｅ８から選ばれる少なくとも一種と、筋衛星細胞とを接触させて、プレインキュベーションされた筋衛星細胞を調製する工程と、
該プレインキュベーションされた筋衛星細胞を、ヒトラミニン２１１Ｅ８がコーティングされた培養基材中に播種する工程と
を含む培養方法が挙げられる。
【００７２】
本実施形態の培養方法の一態様として、上記工程（ｉｉ）に加えて、または上記工程（ｉ）および工程（ｉｉ）に加えて、
筋衛星細胞と、筋衛星細胞の増殖刺激物質とを接触させる工程（以下、工程（ｉｉｉ）とも記載する）
を含むことが好ましい。
【００７３】
筋衛星細胞と増殖刺激物質とを接触させる方法は、特に限定されないが、増殖刺激物質が筋衛星細胞の培養用培地中に含まれることにより筋衛星細胞と接触することがより好ましい。
【００７４】
増殖刺激物質としては、特に限定されないが、例えばＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、代替血清が挙げられる。増殖刺激物質を用いると、筋衛星細胞の未分化性を高い割合で維持したまま筋衛星細胞の増殖率も向上させることができ好ましい。
【００７５】
本明細書において、「ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤」は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ相互作用の量および／または活性を、減少もしくは抑制することができる任意の化合物のことをいう。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤は、ＪＡＫ阻害剤またはＳＴＡＴ阻害剤であってもよい。ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ分子の量または活性をダウンレギュレートする。ＳＴＡＴ阻害剤は、ＳＴＡＴ分子の量または活性をダウンレギュレートする。これらのＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路への阻害は、ＪＡＫに対する直接的な結合、ＳＴＡＴに対する直接的な結合、またはＪＡＫもしくはＳＴＡＴをコードする遺伝子の発現を阻害することを含む様々な機構（例えばＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡｉ）、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路をダウンレギュレートするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等によって達成され得る。一般に、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤は、小分子化合物（例えば４‐（４’‐ヒドロキシフェニル）アミノ‐６，７‐ジメトキシキナゾリン）、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸であり得る。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤については、例えば非特許文献「Price FD, von Maltzahn J, Bentzinger CF, Dumont NA, Yin H, Chang NC, Wilson DH, Frenette J, Rudnicki MA. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat. Med., 20, 1174-81, 2014.」を参照することができる。具体的には、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤として、例えば、ＡＧ４９０、５，１５−ＤＰＰ、Ｓ３ｉ−２０１、ＷＰ−１０３４、Ｓｔａｔｔｉｃ、ルキソリチニブ、トファシチニブ、バリシチニブ等が挙げられる。
【００７６】
代替血清としては、例えば、Ultroser G Serum substitute（Pall社製）が挙げられる。
【００７７】
増殖刺激物質が筋衛星細胞の培養用培地に含まれる場合、その含有量は、特に限定されないが、０．５〜５０ｎＭであることが好ましい。増殖刺激物質がＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤の場合の培地中の含有量は、好ましくは１．０〜５×１０３ｎＭである。
【００７８】
なお、上記培養方法は筋衛星細胞の培養方法として記載したが、培養する細胞は筋衛星細胞以外の多能性幹細胞であってもよい。すなわち、多能性幹細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程、および多能性幹細胞を第１のラミニンでコーティングされている培養基材上で培養する工程を含む細胞の培養方法であってもよい。本発明において利用可能な多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）またはｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、特に、皮膚線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、胎児肺細胞由来ｉＰＳ細胞、包皮線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、もしくは心臓線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、腸管上皮幹細胞が挙げられる。また、ＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ＥＳ細胞と体細胞との融合細胞も用いられうる。本発明において好ましく利用可能な多能性幹細胞は、霊長類または齧歯類の細胞であり、より具体的にはヒト、マウス、またはラットの細胞のいずれかである。あるいは、ブタ、ウサギ、サルの多能性幹細胞も使用されうる。
【００７９】
＜キット＞
本発明は、一態様として、筋衛星細胞培養用のキット（以下、単に「キット」とも呼ぶ）を提供する。本実施形態のキットは第１のラミニンを含む。これに加えて、キットは、培養器、第２のラミニン、筋衛星細胞の未分化性を維持するための培養培地、該培養培地に添加する添加剤、細胞増殖刺激因子、取扱説明書、および他の付属品等を含んでもよい。これらのうち、本実施形態のキットは、第１のラミニンに加えて、培養器及び／又は第２のラミニンを含む態様が好ましい。
【００８０】
本キットに含まれる第１のラミニン、培養器、および第２のラミニンは、本明細書に記載のものが挙げられるが限定されない。培養培地の形態は、液体、固体、ゲル、粉末など任意のものでよく、解凍して、あるいは水に溶解して用いるものでもよい。培養培地は、１つの容器に全ての成分が含まれていても、成分ごとに複数の容器に分けられていてもよく、キットに含まれる培養培地の種類、数等に制限はない。また、培地は任意のサプリメントを加えて用いるものであってもよい。
【００８１】
本キットの一つの態様において、第１のラミニンとして、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことが好ましい。第１のラミニンのアイソフォームとしては、ヒトラミニンα２β１γ１、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１からなる群より選択される少なくとも一種のヒトラミニンを含むことが好ましく、ヒトラミニンα２β１γ１を含むことがより好ましい。さらに好ましくは、第１のラミニンがヒトラミニンα２β１γ１Ｅ８を含む。
【００８２】
本キットの一つの態様において、第２のラミニンとして、ヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことが好ましい。第２のラミニンのアイソフォームとしては、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１からなる群より選択される少なくとも１種のヒトラミニンを含むことが好ましく、ヒトラミニンα３β３γ２Ｅ８、ヒトラミニンα４β１γ１Ｅ８およびヒトラミニンα５β１γ１Ｅ８からなる群より選択される少なくとも１種のヒトラミニンのＥ８フラグメントを含むことがより好ましい。好適な例として、本キットの第２のラミニンは、ヒトラミニンα３β３γ２、ヒトラミニンα４β１γ１およびヒトラミニンα５β１γ１の混合物であってもよく、その混合比（重量比）は１：１：１であってもよい。
【００８３】
本キットの一つの態様において、第１のラミニンおよび第２のラミニンは適当な溶媒、例えばＰＢＳ、生理食塩水、トリスヒドロキシメチルアミノメタンあるいは４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸で中性ｐＨとした生理的食塩水などで希釈されていてもよい。
【００８４】
本キットの一つの態様において、培養器としては、筋衛星細胞の培養に使用できるものであれば限定されず、シャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、マイクロキャリア、ポリビニリデンフルオリド膜等のポリマー膜などが挙げられる。培養器の素材としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、ポリカーボネート、またはアクリル系ブロック共重合体（ＢＣＦ）等が挙げられる。
【００８５】
＜分化誘導＞
本実施形態の筋衛星細胞は、分化誘導を行って筋芽細胞、筋管細胞、筋繊維へ分化させることができる。分化誘導は、例えば、培養液をＤＭＥＭ  ｗｉｔｈ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、５％  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎおよび１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に変えて、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で培養することで行うことができる。分化誘導の方法は、例えば、非特許文献「ISOLATION AND GROWTH OF MOUSE PRIMARY MYOBLASTS Springer, M.L., T. Rando, and H.M. Blau (1997). Gene delivery to muscle. In Current Protocols in Human Genetics.」に記載の方法を参照してもよい。
【実施例】
【００８６】
以下、実施例を示して本実施形態を詳細に説明するが、本実施形態は以下の実施例に限定されるものではない。【００８７】
本発明者らは、筋衛星細胞の未分化維持培養方法を検討する前に、まず生体内での筋衛星細胞の周囲に存在するラミニンα鎖の発現を解析し、筋衛星細胞のニッチとしてどのラミニンα鎖が機能しているかを調べた。そのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現データに基づき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ラミニンＥ８フラグメントの種類の組合せ等、未分化を維持した状態での筋衛星細胞の培養条件を検討した。これら新規の培養方法を、マウスの筋衛星細胞とヒトの筋衛星細胞とを用いて検証した。以下、具体的に説明する。【００８８】
＜例１：マウス骨格筋組織でのラミニンα鎖の発現＞
（組織免疫蛍光化学染色）
まず、生体内での筋衛星細胞の周囲に存在するラミニンα鎖の発現を解析した。生後８週齢のマウスを安楽死させた後、前脛骨筋を取り出し、液体窒素で冷やしたイソペンタン（Ｗａｋｏ）で凍結させた。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ）を用いて、８μｍの厚みで凍結切片を作成し、乾燥させた後に４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで室温で１０分間固定した。Ｍ．Ｏ．Ｍ．  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて室温で１時間ブロッキンングした後、一次抗体としてラット抗ラミニンα鎖（α１−５）抗体、マウス抗Ｐａｘ７抗体（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ）を４℃で一晩反応させ、ＰＢＳで洗浄後、二次抗体としてマウス／ラットＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８／−Ａｌｅｘａ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で一時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて封入し、共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）により解析を行った。なお、「Ｐａｘ７」の発現は、静止期の未分化の筋衛星細胞の指標となる。【００８９】
結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。図１Ａ及び図１Ｂは、マウス筋組織（前脛骨筋）を用いて免疫蛍光化学染色により、ラミニンα鎖とＰａｘ７を検出した像である。図１Ａ中、「ＤＡＰＩ（4',6-diamino-2-phenylindole）」は、ＵＶ励起光下で青色蛍光を発し、細胞内の核の局在を示す。「ｍｅｒｇｅ」は、ラミニン、Ｐａｘ７及びＤＡＰＩの画像を電子情報的に融合した図である。左からラミニンα１、２、３、４、５鎖の各染色像である。筋繊維の辺縁に沿って基底膜由来のラミニンα２鎖の発現が確認された。さらに同じく筋線維辺縁と、特に筋衛星細胞（Ｐａｘ７陽性細胞）の周囲にラミニンα３、４、５鎖の発現がみられた（図１Ｂ）。ラミニンα１鎖の発現はみられなかった。【００９０】
図１Ｂは、図１Ａのラミニンα３、α４、α５鎖の染色像の拡大図を示している。筋衛星細胞の周囲にラミニンα３、α４、α５鎖が発現し局在していた。【００９１】
図１Ｃは、筋再生後、自己複製したと思われる筋衛星細胞の周囲に発現しているラミニンα鎖の解析結果を示している。マウス前脛骨筋にカルディオトキシンを注入し、筋再生を誘発し７日後の再生筋の凍結切片を作製した。上からラミニンα３、４、５鎖の免疫染色結果につき、共焦点レーザー顕微鏡によるｚ−ｓｔａｃｋ画像を解析したものである。自己複製したと思われる筋衛星細胞の周囲にα３、α４、α５鎖が筋衛星細胞を包み込むように強く発現・局在していた。なお、「マウス前脛骨筋にカルディオトキシンを注入し、筋再生を誘発する」方法は、下記文献（６）〜（８）を参照した。
(6) Biochemistry. 1975 Jul;14(13):2865-71. The complete covalent structure of a cardiotoxin from the venom of Naja nigricollis (African black-necked spitting cobra). Fryklund L, Eaker D.
(7) J Pharmacol Exp Ther. 1976 Mar;196(3):758-70. Mechanism of action of cobra cardiotoxin in the skeletal muscle. Lin Shiau SY, Huang MC, Lee CY.
(8) Biol Cell. 1988 62(2):171-82. Regeneration of muscles after cardiotoxin injury. I. Cytological aspects. Couteaux R, Mira JC, d’Albis A.【００９２】
＜例２：マウス筋衛星細胞のラミニンＥ８フラグメントへの接着効率の比較＞
（マウス筋衛星細胞の分離）
生後８週齢のマウスを安楽死させ、前肢と下肢の骨格筋組織を摘出し、ハサミで切り刻んだ後、０．１４％ＩＩ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）で３７℃の条件下で一時間処理した。その後、セルストレーナー１００μｍと４０μｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）で細胞を濾過し、抗体標識を行った。抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗ＣＤ４５抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗Ｓｃａ１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ビオチン化抗ＳＭ／Ｃ−２．６抗体を氷上で３０分間反応させた後、ストレプトアビジン−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を氷上で２０分間反応させた。抗体反応させた細胞はＨＢＳＳ（ＷＡＫＯ社製）に２０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）、１０％ＨＥＰＥＳ（ｇｉｇｃｏ社製）、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したものに懸濁し、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）を加えた。ＭｏＦｌｏ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）を用いて、ＣＤ３１陰性、ＣＤ４５陰性、Ｓｃａ１陰性、ＳＭ／Ｃ−２．６陽性の分画を筋衛星細胞としてソーティングした。この分離したマウス筋衛星細胞を用いて、下記の細胞接着実験を行った。【００９３】
（マウス筋衛星細胞の細胞接着実験）
９６ｗｅｌｌプレート（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）または図２に記載の各アイソフォームのラミニンＥ８フラグメント（１．５３μｇ／ｃｍ２）を４℃で一晩静置してコートした。細胞を播種する前に１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）ｗｉｔｈ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で室温で２時間以上ブロッキングし、０．１％ＢＳＡ／ＤＭＥＭ  ｗｉｔｈ  ＧｌｕｔａＭＡＸで２回洗浄をした。フローサイトメーターでソーティングした筋衛星細胞は０．１％ＢＳＡ／ＤＭＥＭ  ｗｉｔｈ  ＧｌｕｔａＭＡＸで２回洗浄した後、蛋白質（マトリゲルまたは図２に記載の各アイソフォームのラミニンＥ８）をコートした９６ｗｅｌｌプレートに播種し、３時間３７℃でインキュベーションした。その後、培養液を除き０．２％クリスタルバイオレット／２０％メタノールを加え１０分間固定・染色を行い、純水で２回洗浄した。風乾させた後、染色された細胞数を測定した。なお、本例及び以下の例で用いたラミニンは、ヒトラミニンの各アイソフォームである。【００９４】
マウス筋衛星細胞の細胞接着実験の結果を図２に示す。横軸は９６ｗｅｌｌプレートをコーティングしたタンパク質の種類を表し、縦軸はマトリゲルに接着した細胞数を１として、各ラミニンがコーティングされたプレートにおける接着した細胞の数の相対比を表す。図２中、横軸の「ＬＭ」は各ラミニンのアイソフォームのＥ８フラグメントを示し、例えば、「ＬＭ１１１」は、「ヒトラミニンα１β１γ１のＥ８フラグメント」を表す。図２のグラフ中、エラーバーは３個以上の独立した実験（ｎ≧３）における標準誤差を示す。スチューデントのt検定を行い、＊＊はマトリゲルの実験値に対してＰ＜０．０１であることを示す。既知の細胞外基質であり従来法で使われているマトリゲルと比較して、ラミニン（ＬＭ）３３２、４１１、５１１Ｅ８では同等以上の細胞接着活性がみられた。特にＬＭ５１１Ｅ８では細胞接着活性が有意に上昇した。【００９５】
＜例３−１：マウス筋衛星細胞のラミニンＥ８フラグメントを用いた培養の比較＞
コーティングは８ｗｅｌｌチャンバー（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ社製）に、それぞれ、マトリゲルまたは図３Ａに記載のヒトラミニン（ＬＭ）の各アイソフォームのＥ８フラグメント（１．０２μｇ／ｃｍ２）を４℃で一晩コートした。細胞を播種する前にＰＢＳで洗浄を行った。【００９６】
例２に記載の方法と同様にフローサイトメーターでソーティングしたマウス筋衛星細胞を調製し、細胞密度７．５×１０３個／ｃｍ２となるように、蛋白質（マトリゲルまたは図３Ａ記載のヒトラミニンのＥ８フラグメント）をコートした上記８ｗｅｌｌチャンバーに播種した。マトリゲルをコーティングしたチャンバーに筋衛星細胞を播種した試料（ｉ）、ラミニン（ＬＭ）５１１Ｅ８をコーティングしたチャンバーに筋衛星細胞を播種した試料（ｉｉ）（ＬＭ５１１Ｅ８）、ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８と、筋衛星細胞とのプレインキュベーション処理を行った後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたチャンバー上で培養した試料（ｉｉｉ）（ｐｒｅ３／４／５−ｏｎ２）を作製した。図３Ａ（ａ）に試料（ｉｉ）と試料（ｉｉｉ）の調製方法の概略を示す。試料（ｉｉｉ）については、播種する前に、ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８を混合比（重量）１：１：１で含む培養液（０．３μｇ／５０μｌ）に約７５００個の筋衛星細胞を懸濁し、３７℃の条件下で３０分間反応させたのち、蛋白質（ラミニン２１１Ｅ８）をコートした８ｗｅｌｌチャンバーに播種した。なお、プレインキュベーションに用いた培養液は下記の筋衛星細胞培養用の培養液である。【００９７】
筋衛星細胞培養用の培養液は、ＤＭＥＭ  ｗｉｔｈ  ＧｌｕｔａＭＡＸに２０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％  Ｃｈｉｃｋ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  １００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５ｎｇ／ｍｌ  ｂａｓｉｃ−ＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ）を添加したものを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で４〜６日培養を行った。培養３日目に培養液を交換し、４日目以降は毎日半量の培養液交換を行った。【００９８】
（細胞免疫蛍光化学染色）
４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて、上記により培養した各試料の細胞を室温で１０分間固定し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）／ＰＢＳで室温で１０分間透過処理をした。Ｐｏｗｅｒ  Ｂｌｏｃｋ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で１時間ブロッキンングした後、一次抗体としてマウス抗Ｐａｘ７抗体を４℃の条件下で一晩中反応させ、ＰＢＳで洗浄後、二次抗体としてマウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａ４８８を室温で一時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩを用いて封入し、オールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ−Ｘ７００（キーエンス）により解析を行った。【００９９】
結果を図３Ａ（ｂ）および（ｃ）に示す。図３Ａ（ｂ）および（ｃ）において、「ＬＭ５１１Ｅ８」は、ラミニン５１１Ｅ８をコーティングしたチャンバーに筋衛星細胞を播種した試料を表し、「ｐｒｅ３／４／５−ＬＭ２」は、ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８と、ヒト筋衛星細胞とのプレインキュベーション処理を行った後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した試料を表す。図３Ａ（ｂ）は例１と同様に行った免疫蛍光化学染色により検出した画像を示す。図３Ａ（ｃ）の上側のグラフにおける「Ｐａｘ７陽性細胞数／ＤＡＰＩの相対値」はＰａｘ７陽性細胞率であり、具体的には、Ｐａｘ７陽性細胞数を全細胞数（ＤＡＰＩ陽性細胞数）で割った数値を、マトリゲル上で培養した場合の該値を１として相対値として示したものである。図３Ａ（ｃ）の下側のグラフにおける「Ｐａｘ７陽性細胞数の相対値」は、Ｐａｘ７陽性の細胞数を、マトリゲル上で培養した場合の該値を１として相対値として示したものである。なお、図３Ａ（ｃ）のグラフ中、エラーバーは３個以上の独立した実験（ｎ≧３）における標準誤差を示す。スチューデントのt検定を行い、＊はマトリゲルの実験値に対してＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１であることを示す。Ｐａｘ７陽性細胞率は、マトリゲル上で培養した筋衛星細胞の試料と比べて、ＬＭ５１１Ｅ８上で培養した試料では有意に上昇し、ｐｒｅ３／４／５−ＬＭ２はさらに有意に上昇した。また、Ｐａｘ７陽性細胞数についても、ｐｒｅ３／４／５−ＬＭ２は、マトリゲル上で培養した試料より上昇した。【０１００】
＜例３−２：筋衛星細胞の培養条件の検討＞
培養基材であるディッシュ上をコーティングする第１のラミニンの種類、およびプレインキュベーションを行う場合の第２のラミニンの種類を、図３Ｂに示すとおりに変更して培養した試料について、例３−１と同様に培養してＰａｘ７陽性細胞率の相対値を算出し、培養条件をさらに詳細に検討した。図３Ｂ中の略号は下記のとおりである。なお、第２のラミニンは培養液５０μｌ中０．３μｇ添加し、第２のラミニン中複数のラミニンを含む場合は、各ラミニンを等重量ずつ、合計０．３μｇ／５０μｌになるようにした。特にプレインキュベーションについての記載がない試料は、第２のラミニンは用いずに筋衛星細胞を播種した試料であることを意味する。【０１０１】
ｍｔ：マトリゲルをコートしたディッシュ上で培養した（コントロール）
ｌｍ２：ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
ｌｍ３／４／５：ラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
ｌｍ５：ラミニン５１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
ｐｒｅｌｍ５−ｍｔ：ラミニン５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、マトリゲルをコートしたディッシュ上で培養した
ｐｒｅｌｍ５−ｌｍ２：ラミニン５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
ｐｒｅｌｍ５−ｌｍ５：ラミニン５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン５１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
ｐｒｅｌｍ４／５−ｍｔ：ラミニン４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、マトリゲルをコートしたディッシュ上で培養した
ｐｒｅｌｍ４／５−ｌｍ２：ラミニン４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
ｐｒｅｌｍ４／５−ｌｍ５：ラミニン４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン５１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した
ｐｒｅｌｍ３／４／５−ｍｔ：ラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、マトリゲルをコートしたディッシュ上で培養した
ｐｒｅｌｍ３／４／５−ｌｍ２：ラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養
ｌｍ３／４／５  ｏｎ  ｌｍ２：ラミニン２１１Ｅ８を１．０２μｇ／ｃｍ２でコートした上に、ラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８を重量比１:１:１で含む混合物を１．０２μｇ／ｃｍ２でさらにコートしたディッシュ上で、筋衛星細胞を培養した
ｓｏｌｕｔｉｏｎｌｍ３／４／５−ｌｍ２：ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上に筋衛星細胞を細胞密度７．５×１０３個／ｃｍ２となるように培養液とともに播種した後、培養液にラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８を等重量ずつ、合計０．３μｇ添加して培養した
ｐｒｅｌｍ３／４／５−ｌｍ５：ラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン５１１Ｅ８をコートした上で培養
ｐｒｅｌｍ２−Ｍｔ：ラミニン２１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、マトリゲルをコートしたディッシュ上で培養した
ｐｒｅｌｍ２−ｌｍ２：ラミニン２１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した【０１０２】
Ｐａｘ７陽性細胞率は、マトリゲル上で培養した筋衛星細胞の試料と比べて、ＬＭ５１１Ｅ８でコーティングされたディッシュ上で培養した試料において有意に上昇し、ｐｒｅｌｍ３／４／５−ｌｍ２、ｌｍ３／４／５  ｏｎ  ｌｍ２、ｓｏｌｕｔｉｏｎｌｍ３／４／５−ｌｍ２で特に有意に上昇した。このうち、ｐｒｅｌｍ３／４／５−ｌｍ２が最もＰａｘ７強陽性細胞率の平均値が高かった。【０１０３】
＜例４：ヒト筋組織でのラミニンα鎖の発現＞
（ヒト筋組織の免疫蛍光化学染色）
ヒト骨格筋組織においてもマウス骨格筋組織と同様にラミニンα鎖の発現解析を行った。前十字靭帯再建術の際に摘出した半腱様筋由来組織を取り出し、液体窒素で冷やしたイソペンタン（Wako）で凍結させた。クライオスタット（Leica）を用いて、８μmの厚みで凍結切片を作成し、乾燥させた後に４％パラホルムアルデヒド／PBSで室温で１０分間固定した。PowerBlock（BioGenex Laboratories）を用いて室温で１時間ブロッキンングした後、一次抗体としてマウス抗ラミニンα鎖（α１−５）抗体、マウス抗Pax7抗体（Developmental Studies Hybridoma Bank）を４℃で一晩反応させ、PBSで洗浄後、二次抗体としてマウス／ラットIgG-Alexa488／-Alexa594（Invitrogen）を室温で一時間反応させた。PBSで洗浄後、Mounting medium for fluorescence
with DAPI（Vector Laboratories）を用いて封入し、共焦点レーザー顕微鏡（Zeiss）により解析を行った。【０１０４】
図４は、ヒトの筋組織を用いて免疫蛍光化学染色によりラミニンとＰａｘ７を検出した像である。筋繊維に沿ってラミニンα２鎖の発現が確認された（図４（ａ））。さらに、筋衛星細胞の周囲にラミニンα３、α４、α５鎖の発現がみられた（図４（ｂ））。ラミニンα１鎖の発現は見られなかった。【０１０５】
＜例５：ヒト筋衛星細胞の培養＞
（ヒト筋衛星細胞の分離）
ヒト試料を用いた実験については、東京医科歯科大学医学部倫理審査委員会の承認を受けている。東京医科歯科大学附属病院整形外科での前十字靭帯再建術の際に摘出した半腱様筋由来組織をハサミで切り刻んだ後、０．１％ＩＩ型コラゲナーゼで３７℃の条件下で一時間処理した。その後、セルストレーナー１００μｍと４０μｍを通し細胞を濾過した後に抗体標識を行った。抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体、抗ＣＤ２３５ａ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗ＣＤ１１ｂ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗ＣＤ３４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗ＣＤ５６抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、抗インテグリンα７抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を氷上で３０分間反応させた。抗体反応させた細胞はＨＢＳＳに懸濁し、ＰＩを加えた。ＦＡＣＳはＭｏＦｌｏ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒを用いてＣＤ３１陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ２３５ａ陰性、ＣＤ１１陰性、ＣＤ３４陰性、ＣＤ５６陽性、インテグリンα７陽性の分画を筋衛星細胞としてソーティングした。このソーティングされたヒト筋衛星細胞を用いて下記の培養実験を行った。【０１０６】
（ラミニンＥ８フラグメントを用いたヒト筋衛星細胞の培養）
上述の方法によりフローサイトメーターを用いてソーティングしたヒト筋衛星細胞を、ラミニン３３２Ｅ８、４１１Ｅ８、５１１Ｅ８でプレインキュベーションした後、ラミニン２１１Ｅ８でコートしたディッシュ上で細胞を培養した（ｐｒｅ３／４／５−ｏｎ２）。培養液は、ＤＭＥＭ  ｗｉｔｈ  ＧｌｕｔａＭＡＸに２０％  ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、２５ｎｇ／ｍｌ  ｂａｓｉｃ−ＦＧＦを添加し５％ＣＯ２、３７℃の条件下で４〜６日培養を行った。培養３日目に培養液を交換し、４日目以降は毎日半量の培養液交換を行った。プレインキュベーション処理は、マウス筋衛星細胞の代わりにヒト筋衛星細胞を用いた以外は例３−１と同様の方法により行った。比較実験として、マトリゲルをコーティングしたディッシュ上でヒト筋衛星細胞を培養した。各培養サンプルについて、例３−１と同様の方法によりＰａｘ７陽性細胞率の相対値、Ｐａｘ７陽性細胞数の相対値を算出した。【０１０７】
結果を図５（ａ）および（ｂ）に示す。図５において、「ｐｒｅ３４５  ｏｎ２」は、ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８と、ヒト筋衛星細胞とのプレインキュベーション処理を行った後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した試料を意味し、「Ｍｔ」はマトリゲルをコートしたディッシュ上で培養した試料を意味する。図５（ａ）は例１と同様に行った免疫蛍光化学染色により検出した画像を示す。図５（ｂ）はＰａｘ７陽性細胞率の相対値、Ｐａｘ７陽性細胞数の相対値を示す。マトリゲルでディッシュをコーティングした場合と比べ、ｐｒｅ３４５  ｏｎ２のヒト筋衛星細胞は、Ｐａｘ７陽性細胞率およびＰａｘ７陽性細胞数共に上昇した。【０１０８】
＜例６：マウス筋衛星細胞の細胞移植実験＞
例２に記載の方法と同様にＣ５７ＢＬ／６−ＧＦＰトランスジェニックマウスからフローサイトメーターでソーティングしたマウス筋衛星細胞を調製し、細胞密度４．５×１０４個／ｃｍ２となるように、蛋白質（マトリゲルまたはヒトラミニンのＥ８フラグメント）をコートした６−ｗｅｌｌプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種した。（ｉ）マトリゲルをコーティングしたチャンバーに筋衛星細胞を播種した試料と、（ｉｉ）ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８と、筋衛星細胞とをプレインキュベーション処理を行った後、ヒトラミニンのＥ８フラグメントとしてラミニン２１１Ｅ８をコートしたチャンバー上で培養した試料（ｐｒｅ３／４／５−ｏｎ２）を作製した。プレインキュベーション処理を行った試料（ｉｉ）については、播種する前に、ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８を混合重量比１：１：１で含む溶液（０．３μｇ／５０μｌ）に細胞を懸濁し、３７℃の条件下で３０分間反応させたのち、蛋白質（ラミニン２１１Ｅ８）をコートした６−ｗｅｌｌプレートに播種した。【０１０９】
培養液は、ＤＭＥＭ  ｗｉｔｈ  ＧｌｕｔａＭＡＸに２０％  ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％  Ｃｈｉｃｋ  Ｅｍｂｒｙｏ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  １００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５ｎｇ／ｍｌ  ｂａｓｉｃ−ＦＧＦ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ）を添加したものを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で４〜６日培養を行った。培養３日目に培養液を交換し、４日目以降は毎日半量の培養液交換を行った。【０１１０】
培養した細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）で剥がし、２．０×１０５個／５０μｌに調整し骨格筋再生を促したＣ５７ＢＬ／６マウスの前脛骨筋に移植した。移植２週間後に移植をした前脛骨筋を取り出し、液体窒素で冷やしたイソペンタン（Ｗａｋｏ）で凍結させた。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ）を用いて、８μｍの厚みで凍結切片を作成し、乾燥させた後に４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで室温で１０分間固定した。Ｍ．Ｏ．Ｍ  ｋｉｔ（ＶＥＣＴＯＲ）を用いて室温で１時間ブロッキンングした後、一次抗体としてラット抗Ｌａｍｉｎｉｎα２鎖抗体を４℃で一晩反応させ、ＰＢＳで洗浄後、二次抗体としてラットＩｇＧ−Ａｌｅｘａ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を室温で一時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて封入し、共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）により解析を行った。【０１１１】
結果を図６に示す。図６において、「ｐｒｅ３／４／５  ｏｎ  ２」は、ラミニン３３２Ｅ８、ラミニン４１１Ｅ８、およびラミニン５１１Ｅ８と、ヒト筋衛星細胞とのプレインキュベーション処理を行った後、ラミニン２１１Ｅ８をコートしたディッシュ上で培養した試料（上記（ｉｉ）の試料）を意味する。図６（ａ）は、免疫蛍光化学染色によりラミニンα２、ＤＡＰＩおよびＧＦＰを検出した像であり、下段は上段それぞれの拡大図である。図６（ｂ）は、ＧＦＰ陽性筋繊維数の相対値を示し、図６（ｃ）は、ＧＦＰ陽性筋繊維率の相対値を示す。図６のグラフ中、エラーバーは３個以上の独立した実験（ｎ≧３）における標準誤差を示す。スチューデントのt検定を行い、マトリゲルの実験値に対して＊＊はＰ＜０．０１、＊＊＊はＰ＜０．００１であることを示す。マトリゲルでディッシュをコーティングした場合と比べ、ｐｒｅ３／４／５  ｏｎ２で培養した筋衛星細胞を移植した前脛骨筋では、ＧＦＰ陽性筋繊維数もＧＦＰ陽性筋繊維率も上昇した。これは、ｐｒｅ３／４／５  ｏｎ２で培養したＧＦＰ陽性筋衛星細胞の方が、マトリゲルでコーティングされたディッシュ上で培養した試料より高い割合で未分化が維持されているため、損傷組織への生着率が高く、結果的にＧＦＰ陽性筋繊維の増加につながっているからであると推察される。【０１１２】
この出願は、２０１５年１１月４日に出願された日本出願特願２０１５−２１６６０９を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明のラミニンがコーティングされている筋衛星細胞培養用培養基材を用いることにより、従来のマトリゲルを用いずに、ゼノフリーで、かつ未分化性を維持したまま筋衛星細胞を培養することができるため、損傷した筋への効率的な細胞移植再生治療等への利用が期待できる。
【図１Ａ】
2017078029.tif 000003
【図１Ｂ】
2017078029.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年4月17日(2017.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
ｉ）単離した筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる工程であって、該第２のラミニンがヒトラミニンα３β３γ２Ｅ８フラグメント、ヒトラミニンα４β１γ１Ｅ８フラグメント、およびヒトラミニンα５β１γ１Ｅ８フラグメントの混合物である工程、および
ｉｉ）該筋衛星細胞を第１のラミニンがコーティングされている培養基材上で培養する工程であって、該第１のラミニンがヒトラミニンα２β１γ１Ｅ８フラグメントである工程
を含むことを特徴とする、筋衛星細胞の培養方法。
【請求項１７】
前記第２のラミニンが、筋衛星細胞の培養培地中に含まれていることを特徴とする、請求項１６に記載の培養方法。
【請求項１８】
前記筋衛星細胞と第２のラミニンとを接触させる接触工程が培養基材上に筋衛星細胞を播種する前に行われることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の培養方法。
【請求項１９】
さらに、
筋衛星細胞の増殖刺激物質と筋衛星細胞とを接触させる工程
を含むことを特徴とする、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項２０】
前記筋衛星細胞が、ヒトまたはマウスの筋衛星細胞であることを特徴とする、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項２１】
請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の培養方法に用いる筋衛星細胞培養用キットであって、
第１のラミニン、培養器、第２のラミニン、および筋衛星細胞用の培地を含み、
前記第１のラミニンがヒトラミニンα２β１γ１Ｅ８フラグメントであり、
前記第２のラミニンがヒトラミニンα３β３γ２Ｅ８フラグメント、ヒトラミニンα４β１γ１Ｅ８フラグメントおよびヒトラミニンα５β１γ１Ｅ８フラグメントの混合物であることを特徴とする、筋衛星細胞培養用キット。
【国際調査報告】
2017078029.tif 000012
2017078029.tif 000013
2017078029.tif 000014
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