(57)【要約】  本発明は、ＳＰＦＳにおいて、高感度で被測定物質量などを測定する方法、および当該方法に用いる測定用キットを提供する。  本発明の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法では、金属膜と、前記金属膜上に固定された第１の捕捉体と、を含む測定チップに検体を提供し、前記検体が含む前記被測定物質を前記第１の捕捉体に結合させる工程と、前記第１の捕捉体に結合した前記被測定物質に、蛍光物質により標識された第２の捕捉体を結合させる工程と、前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように光を照射するとともに、前記表面プラズモン共鳴に基づく局在場光にて励起された前記蛍光物質が発する蛍光を検出する工程と、を行う。このとき、第２の捕捉体一つ当たりに結合した前記蛍光物質の数を８〜２２とする。
2017057136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属膜と、前記金属膜上に固定され、被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第１の捕捉体と、を含む測定チップに検体を提供し、前記検体が含む前記被測定物質を前記第１の捕捉体に結合させる工程と、
前記第１の捕捉体に結合した前記被測定物質に、前記被測定物質の前記第１の捕捉体と結合する部位とは異なる部位に特異的に結合するための認識部位を有し、かつ蛍光物質により標識された第２の捕捉体を結合させる工程と、
前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように光を照射するとともに、前記表面プラズモン共鳴に基づく局在場光にて励起された前記蛍光物質が発する蛍光を検出する工程と、
を含む、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法であって、
前記第２の捕捉体一つ当たりに結合した前記蛍光物質の数が８〜２２である、
表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
【請求項２】
前記第２の捕捉体一つ当たりに結合した前記蛍光物質の数が１３〜１６である、請求項１に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
【請求項３】
前記蛍光物質が、ローダミン骨格を含む、
請求項１または２に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
【請求項４】
前記測定チップが、プリズムと、前記プリズムの一面に形成された前記金属膜と、前記第１の捕捉体と、を含む、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
【請求項５】
前記測定チップが、支持体と、前記支持体上に配置された、回折格子を含む前記金属膜と、前記第１の捕捉体と、を含む、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法。
【請求項６】
誘電体からなるプリズムと、前記プリズムの一面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定され、被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第１の捕捉体と、を有する測定チップ、および
前記被測定物質の前記第１の捕捉体と結合する部位とは異なる部位に特異的に結合するための認識部位を有し、かつ蛍光物質により標識された第２の捕捉体、
を含む、測定用キットであって、
前記第２の捕捉体一つ当たりに結合した前記蛍光物質の数が８〜２２である、
測定用キット。
【請求項７】
支持体と、前記支持体上に配置された回折格子を含む金属膜と、前記金属膜上に固定され、被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第１の捕捉体と、を含む測定チップ、および
前記被測定物質の前記第１の捕捉体と結合する部位とは異なる部位に特異的に結合するための認識部位を有し、かつ蛍光物質により標識された第２の捕捉体、
を含む、測定用キットであって、
前記第２の捕捉体一つ当たりに結合した前記蛍光物質の数が８〜２２である、
測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の被測定物質の量を測定する表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法、およびこれに用いる測定用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体中の物質測定のために、抗原抗体反応を用いた測定法が多く知られている。例えば、蛍光免疫測定法（以下、「ＦＩＡ」とも称する）では、被測定物質（抗原）に蛍光物質を含む標識物質を反応させる。その後、標識物質で標識された被測定物質に励起光を照射して、蛍光物質が発する蛍光を検出する。そして、検出された蛍光の強度などから、被測定物質の量を特定する。また、ＦＩＡの中でも、特に高感度に被測定物質の検出を行うことが可能な方法として、表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy、以下「ＳＰＦＳ」とも称する）が知られている（例えば特許文献１）。【０００３】
ＳＰＦＳでは、被測定物質に特異的に結合できる第１の捕捉体（例えば一次抗体）を金属膜上に固定して、被測定物質を捕捉するための反応場を形成する。この反応場に被測定物質を含む検体（例えば血液）を提供すると、第１の捕捉体に被測定物質が結合する。次いで、蛍光物質で標識された第２の捕捉体（例えば２次抗体）を反応場に提供すると、第１の捕捉体に結合している被測定物質に、第２の捕捉体が結合する。つまり、被測定物質が、間接的に蛍光物質で標識される。この状態で金属膜に励起光を照射すると、蛍光物質が、表面プラズモン共鳴（以下、「ＳＰＲ」とも称する）により増強された局在場光により励起され、蛍光を放出する。そして、蛍光物質が放出した蛍光を検出することで、被測定物質の量などを測定できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−８８２２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一般的なＦＩＡでは、標識物質１つ当たりに結合する蛍光物質の数（以下、「標識率」とも称する）が蛍光の検出感度に影響することが知られている。通常、標識率を高め過ぎると、バックグラウンドノイズが高まったり、濃度消光が生じやすくなり、蛍光の検出性が低下する。そのため、ＦＩＡでは、標識率を試薬メーカーが推奨する範囲内とすることが、蛍光の検出感度などの観点から好ましい。またこのような背景から、ＦＩＡの一種であるＳＰＦＳにおいても、第２の捕捉体１つ当たりに結合する蛍光物質の数を、試薬メーカーが推奨する範囲とするのが一般的である。【０００６】
近年、ＳＰＦＳには、より高い感度で、被測定物質の有無やその量を測定することが求められている。そこで、本発明は、ＳＰＦＳにおいて、高感度で被測定物質の量などを検出する方法、および当該方法に用いるための測定用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らが鋭意検討したところ、ＳＰＦＳでは、第２の捕捉体に、試薬メーカーが推奨する数より多く、具体的には８〜２２個の蛍光物質を結合させることで、検出される蛍光のシグナルが高くなること、一方でノイズは増大し難いことを見出した。つまり、蛍光物質の標識率を上記範囲とすることで、検出されるシグナル／ノイズ比を非常に高めることが可能となり、感度よく被測定物質を測定できることを見出し、本発明に至った。【０００８】
すなわち、本発明の一実施の形態に係る表面プラズモン励起増強蛍光分光測定方法は、金属膜と、前記金属膜上に固定され、被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第１の捕捉体と、を含む測定チップに検体を提供し、前記検体が含む前記被測定物質を前記第１の捕捉体に結合させる工程と、前記第１の捕捉体に結合した前記被測定物質に、前記被測定物質の前記第１の捕捉体と結合する部位とは異なる部位に特異的に結合するための認識部位を有し、かつ蛍光物質により標識された第２の捕捉体を結合させる工程と、前記金属膜に表面プラズモン共鳴が発生するように光を照射するとともに、前記表面プラズモン共鳴に基づく局在場光にて励起された前記蛍光物質が発する蛍光を検出する工程と、を含む。このとき、前記第２の捕捉体一つ当たりに結合した前記蛍光物質の数を８〜２２とする。【０００９】
また、本発明の一実施の形態に係る測定用キットは、誘電体からなるプリズムと、前記プリズムの一面上に配置された金属膜と、前記金属膜上に固定され、被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有する第１の捕捉体と、を有する測定チップ、および前記被測定物質の前記第１の捕捉体と結合する部位とは異なる部位に、特異的に結合するための認識部位を有し、かつ蛍光物質により標識された第２の捕捉体、を含む。そしてこのとき、前記第２の捕捉体一つ当たりに結合した前記蛍光物質の数を８〜２２とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の表面プラズモン共鳴測定方法もしくは測定用キットによれば、検出される蛍光のシグナル／ノイズ比を高めることができる。したがって、感度よく、被測定物質の有無や量を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＳＰＦＳ装置の構成を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明の実施の形態の測定方法を行う際の、ＳＰＦＳ装置の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【図３】図３は、回折格子を含む金属膜の斜視図である。
【図４】図４は、ＳＰＦＳにおける、第２の捕捉体一つ当たりに結合する蛍光物質の数（標識率）と、シグナル値、ノイズ値、及びシグナル／ノイズ比との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の一実施の形態を、以下、図面を参照して説明する。以下では、本実施の形態に用いる測定チップおよび装置について先に説明し、その後、当該装置や測定チップを用いた測定方法を説明する。
【００１３】
（測定チップおよび装置）
図１は、本発明の一実施の形態に用いるＳＰＦＳ装置１００の構成を示す模式図である。図１に示されるように、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、蛍光検出ユニット１２０、送液ユニット１３０、搬送ユニット１４０、および制御部１５０を有する。ＳＰＦＳ装置１００では、搬送ユニット１４０のチップホルダー１４２に測定チップ１０を装着した状態で、測定チップ１０の金属膜３０に表面プラズモン共鳴が発生するように励起光αを照射し、表面プラズモン共鳴に基づく局在場光を発生させる。そして、当該局在場光により、金属膜３０上に存在する蛍光物質を励起させ、蛍光物質が発する蛍光βを検出することで、検体中の被測定物質の有無や量を測定する。
【００１４】
測定チップ１０は、入射面２１、成膜面２２、および出射面２３を有するプリズム２０と、成膜面２２に形成された金属膜３０と、成膜面２２または金属膜３０上に配置された流路蓋４０とを有する。流路蓋４０は、金属膜３０と対向する面に流路溝を有し、成膜面２２や金属膜３０と、流路蓋４０とで囲まれた空間が、液体（例えば検体）を収容するための収容部４１となる。当該測定チップ１０は、通常、測定のたびに交換される。また、測定チップ１０は、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。
【００１５】
測定チップ１０が含むプリズム２０は、励起光αに対して透明な誘電体からなり、入射面２１、成膜面２２および出射面２３を有する。入射面２１は、励起光照射ユニット１１０からの励起光αをプリズム２０の内部に入射させるための面である。また、成膜面２２上には、金属膜３０が配置されており、プリズム２０の内部に入射した励起光αは、金属膜３０の裏面、より具体的にはプリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２）にて反射する。一方、出射面２３は、成膜面２２にて反射した反射光をプリズム２０の外部に出射させるための面である。
【００１６】
プリズム２０の形状は、特に限定されない。本実施の形態では、プリズム２０の形状は、台形を底面とする柱体である。台形の一方の底辺に対応する面が成膜面２２であり、一方の脚に対応する面が入射面２１であり、他方の脚に対応する面が出射面２３である。底面となる台形は、等脚台形であることが好ましい。これにより、入射面２１と出射面２３とが対称になり、励起光αのＳ波成分がプリズム２０内に滞留しにくくなる。
【００１７】
入射面２１は、励起光αが励起光照射ユニット１１０に戻らないように形成される。励起光αの光源がレーザーダイオード（以下「ＬＤ」ともいう）である場合、励起光αがＬＤに戻ると、ＬＤの励起状態が乱れてしまい、励起光αの波長や出力が変動してしまう。そこで、理想的な共鳴角または増強角を中心とする走査範囲において、励起光αが入射面２１に垂直に入射しないように、入射面２１の角度が設定される。ここで「共鳴角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、出射面２３から出射される反射光の光量が最小となるときの、入射角を意味する。また、「増強角」とは、金属膜３０に対する励起光αの入射角を走査した場合に、測定チップ１０の上方に放出される励起光αと同一波長の散乱光（以下「プラズモン散乱光」という）γの光量が最大となるときの、入射角を意味する。本実施の形態では、入射面２１と成膜面２２との角度および成膜面２２と出射面２３との角度は、いずれも約８０°である。
【００１８】
なお、測定チップ１０の設計により、共鳴角（およびその極近傍にある増強角）が概ね決まる。設計要素は、プリズム２０の屈折率や、金属膜３０の屈折率、金属膜３０の膜厚、金属膜３０の消衰係数、励起光αの波長などである。金属膜３０上に第１の捕捉体を介して捕捉された被測定物質によって共鳴角および増強角がシフトするが、その量は数度未満である。
【００１９】
プリズム２０は、複屈折特性を少なからず有する。プリズム２０の材料の例には、樹脂およびガラスが含まれる。プリズム２０の材料は、好ましくは、屈折率が１．４〜１．６であり、かつ複屈折が小さい樹脂である。
【００２０】
金属膜３０は、プリズム２０の成膜面２２上に配置されている。これにより、成膜面２２に全反射条件で入射した励起光αの光子と、金属膜３０中の自由電子との間で相互作用（ＳＰＲ）が生じ、金属膜３０の表面上に局在場光（一般に「エバネッセント光」または「近接場光」とも呼ばれる）が生じる。
【００２１】
金属膜３０の材料は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に限定されない。金属膜３０の材料の例には、金、銀、銅、アルミ、これらの合金が含まれる。金属膜３０の形成方法は、特に限定されない。金属膜３０の形成方法の例には、スパッタリング、蒸着、メッキが含まれる。金属膜３０の厚みは、特に限定されないが、３０〜７０ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００２２】
また、図１では図示しないが、本実施の形態では、金属膜３０のプリズム２０と対向しない面（金属膜３０の表面）に、第１の捕捉体が固定されている。第１の捕捉体は、検体中の被測定物質と特異的に結合するための認識部位を有する物質であり、当該第１の捕捉体は、収容部４１内に露出している。そして、収容部４１内に検体を提供した際に、第１の捕捉体と被測定物質とが接触することで、第１の捕捉体と被測定物質とが選択的に結合する。つまり、第１の捕捉体を介して、被測定物質を金属膜３０上に配置することができる。
【００２３】
金属膜３０上に固定されている第１の捕捉体の種類は、被測定物質に特異的に結合するための認識部位を有していれば特に制限されない。第１の捕捉体の例には、被測定物質に特異的な生体分子（例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、核酸アプタマーなど）、またはその断片などが含まれる。また、第１の捕捉体の金属膜３０への固定方法は特に限定されず、例えば物理吸着、化学結合（アミドカップリング、Ａｕとチオールとの反応、シランカップリング）などのいずれでもありうる。
【００２４】
また流路蓋４０は、流路溝を有し、流路溝の壁面および上面と、金属膜３０とによって、液体を収容するための空間（収容部４１）を形成可能な形状であれば、その形状は特に限定されない。また、流路蓋４０と金属膜３０との間に形成される収容部４１の形状や大きさも限定されない。収容部４１は、例えばウェルなど、液体を一時的に貯留するための空間であってもよいが、測定効率などの観点から、収容部４１が液体を流すための流路であることが好ましい。収容部４１が流路である場合、収容部４１の両端もしくは一方の端部は、流路蓋４０の上面に形成された不図示の注入口および排出口と接続されてもよい。
【００２５】
流路蓋４０は、金属膜３０上から放出される蛍光βおよびプラズモン散乱光γを外部に取り出す部分が、これらの光に対して透明な材料で形成されている。流路蓋４０は、全体が上記光に対して透明な材料で形成されていてもよく、一部が、上記光に対して不透明な材料で形成されていてもよい。蛍光βおよびプラズモン散乱光γに対して透明な材料の例には、樹脂が含まれる。また流路蓋４０は、例えば、両面テープや接着剤などによる接着や、レーザー溶着、超音波溶着、クランプ部材を用いた圧着などにより金属膜３０またはプリズム２０に接合されている。
【００２６】
次に、ＳＰＦＳ装置１００の測定チップ以外の構成要素について説明する。前述のとおり、ＳＰＦＳ装置１００は、励起光照射ユニット１１０、蛍光検出ユニット１２０、送液ユニット１３０、搬送ユニット１４０および制御部１５０を有する。
【００２７】
励起光照射ユニット１１０は、チップホルダー１４２に保持された測定チップ１０に励起光αを照射する。蛍光βまたはプラズモン散乱光γの測定時には、励起光照射ユニット１１０は、金属膜３０に対する入射角がＳＰＲを生じさせる角度となるように、金属膜３０に対するＰ波のみを入射面２１に向けて出射する。ここで「励起光」とは、蛍光物質を直接または間接的に励起させる光である。たとえば、励起光αは、プリズム２０を介して金属膜３０にＳＰＲが生じる角度で照射されたときに、蛍光物質を励起させる局在場光を金属膜３０の表面上に生じさせる光である。励起光照射ユニット１１０は、光源ユニット１１１、角度調整機構１１２および光源制御部１１３を含む。
【００２８】
光源ユニット１１１は、コリメートされ、かつ波長および光量が一定の励起光αを、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が略円形となるように出射する。光源ユニット１１１は、例えば、励起光αの光源、ビーム整形光学系、ＡＰＣ機構および温度調整機構（いずれも不図示）を含む。
【００２９】
光源の種類は、特に限定されず、一例として、レーザーダイオード（ＬＤ）が挙げられる。光源の他の例には、発光ダイオード、水銀灯、その他のレーザー光源が含まれる。光源から出射される光がビームでない場合は、光源から出射される光は、レンズや鏡、スリットなどによりビームに変換される。また、光源から出射される光が単色光でない場合は、光源から出射される光は、回折格子などにより単色光に変換される。さらに、光源から出射される光が直線偏光でない場合は、光源から出射される光は、偏光子などにより直線偏光の光に変換される。
【００３０】
ビーム整形光学系は、例えば、コリメーターやバンドパスフィルター、直線偏光フィルター、半波長板、スリット、ズーム手段などを含む。ビーム整形光学系は、これらのすべてを含んでいてもよいし、一部を含んでいてもよい。コリメーターは、光源から出射された励起光αをコリメートする。バンドパスフィルターは、光源から出射された励起光αを中心波長のみの狭帯域光にする。光源からの励起光αは、若干の波長分布幅を有しているためである。直線偏光フィルターは、光源から出射された励起光αを完全な直線偏光の光にする。半波長板は、金属膜３０にＰ波成分が入射するように励起光αの偏光方向を調整する。スリットおよびズーム手段は、金属膜３０裏面における照射スポットの形状が所定サイズの円形となるように、励起光αのビーム径や輪郭形状などを調整する。
【００３１】
ＡＰＣ機構は、光源の出力が一定となるように光源を制御する。より具体的には、ＡＰＣ機構は、励起光αから分岐させた光の光量を不図示のフォトダイオードなどで検出する。そして、ＡＰＣ機構は、回帰回路で投入エネルギーを制御することで、光源の出力を一定に制御する。
【００３２】
温度調整機構は、例えば、ヒーターやペルチェ素子などである。光源の出射光の波長およびエネルギーは、温度によって変動することがある。このため、温度調整機構で光源の温度を一定に保つことにより、光源の出射光の波長およびエネルギーを一定に制御する。
【００３３】
角度調整機構１１２は、金属膜３０（プリズム２０と金属膜３０との界面（成膜面２２））に対する励起光αの入射角を調整する。角度調整機構１１２は、プリズム２０を介して金属膜３０の所定の位置に向けて所定の入射角で励起光αを照射するために、励起光αの光軸とチップホルダー１４２とを相対的に回転させる。
【００３４】
たとえば、角度調整機構１１２は、光源ユニット１１１を励起光αの光軸と直交する軸（図１の紙面に対して垂直な軸）を中心として回動させる。このとき、入射角を走査しても金属膜３０上での照射スポットの位置がほとんど変化しないように、回転軸の位置を設定する。回転中心の位置を、入射角の走査範囲の両端における２つの励起光αの光軸の交点近傍（成膜面２２上の照射位置と入射面２１との間）に設定することで、照射位置のズレを極小化することができる。
【００３５】
前述のとおり、金属膜３０に対する励起光αの入射角のうち、プラズモン散乱光γの光量が最大となる角度が増強角である。励起光αの入射角を増強角またはその近傍の角度に設定することで、高強度の蛍光βを測定することが可能となる。測定チップ１０のプリズム２０の材料および形状、金属膜３０の膜厚、収容部４１内の液体の屈折率などにより、励起光αの基本的な入射条件が決まるが、収容部４１内の蛍光物質の種類および量、プリズム２０の形状誤差などにより、最適な入射条件はわずかに変動する。このため、測定ごとに最適な増強角を求めることが好ましい。
【００３６】
光源制御部１１３は、光源ユニット１１１に含まれる各種機器を制御して、光源ユニット１１１からの励起光αの出射を制御する。光源制御部１１３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００３７】
蛍光検出ユニット１２０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じた蛍光βを検出する。また、必要に応じて、蛍光検出ユニット１２０は、金属膜３０への励起光αの照射によって生じたプラズモン散乱光γも検出する。蛍光検出ユニット１２０は、受光ユニット１２１、位置切替え機構１２２およびセンサー制御部１２３を含む。
【００３８】
受光ユニット１２１は、測定チップ１０の金属膜３０の法線方向に配置される。受光ユニット１２１は、第１レンズ１２４、光学フィルター１２５、第２レンズ１２６および受光センサー１２７を含む。
【００３９】
第１レンズ１２４は、例えば、集光レンズであり、金属膜３０上から出射される光を集光する。第２レンズ１２６は、例えば、結像レンズであり、第１レンズ１２４で集光された光を受光センサー１２７の受光面に結像させる。両レンズの間の光路は、略平行な光路になっている。光学フィルター１２５は、両レンズの間に配置されている。
【００４０】
光学フィルター１２５は、蛍光成分のみを受光センサー１２７に導き、高いＳ（シグナル）／Ｎ（ノイズ）比で蛍光βを検出するために、励起光成分（プラズモン散乱光γ）を除去する。光学フィルター１２５の例には、励起光反射フィルター、短波長カットフィルターおよびバンドパスフィルターが含まれる。光学フィルター１２５は、例えば、所定の光成分を反射する多層膜を含むフィルター、または所定の光成分を吸収する色ガラスフィルターである。
【００４１】
受光センサー１２７は、蛍光βおよびプラズモン散乱光γを検出する。受光センサー１２７は、微小量の被測定物質からの微弱な蛍光βを検出することが可能な、高い感度を有する。受光センサー１２７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）などである。
【００４２】
位置切替え機構１２２は、光学フィルター１２５の位置を、受光ユニット１２１における光路上または光路外に切り替える。具体的には、受光センサー１２７が蛍光βを検出する時には、光学フィルター１２５を受光ユニット１２１の光路上に配置し、受光センサー１２７がプラズモン散乱光γを検出する時には、光学フィルター１２５を受光ユニット１２１の光路外に配置する。
【００４３】
センサー制御部１２３は、受光センサー１２７の出力値の検出や、検出した出力値による受光センサー１２７の感度の管理、適切な出力値を得るための受光センサー１２７の感度の変更、などを制御する。センサー制御部１２３は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００４４】
送液ユニット１３０は、チップホルダー１４２に保持された測定チップ１０の収容部４１内に、各種液体を供給する。本実施の形態では、例えば検体や、洗浄液、蛍光物質で標識された第２の捕捉体を含む標識液（以下、「標識液」とも称する）などを収容部４１に供給する。送液ユニット１３０は、液体チップ１３１、シリンジポンプ１３２および送液ポンプ駆動機構１３３を含む。
【００４５】
液体チップ１３１は、検体や洗浄液、標識液などの液体をそれぞれ収容するための容器である。液体チップ１３１としては、通常、複数の容器が液体の種類に応じて配置されるか、または複数の容器が一体化したチップが配置される。
【００４６】
送液ユニット１３０におけるシリンジポンプ１３２は、シリンジ１３４と、シリンジ１３４内を往復動作可能なプランジャー１３５とによって構成される。プランジャー１３５の往復運動によって、液体の吸引および排出が定量的に行われる。シリンジ１３４が交換可能であると、シリンジ１３４の洗浄が不要となる。このため、不純物の混入などを防止する観点から好ましい。シリンジ１３４が交換可能に構成されていない場合は、シリンジ１３４内を洗浄する構成をさらに付加することにより、シリンジ１３４を交換せずに使用することが可能となる。
【００４７】
送液ポンプ駆動機構１３３は、プランジャー１３５の駆動装置、およびシリンジポンプ１３２の移動装置を含む。シリンジポンプ１３２の駆動装置は、プランジャー１３５を往復運動させるための装置であり、例えば、ステッピングモーターを含む。ステッピングモーターを含む駆動装置は、シリンジポンプ１３２の送液量や送液速度を管理できるため、測定チップ１０の残液量を管理する観点から好ましい。シリンジポンプ１３２の移動装置は、例えば、シリンジポンプ１３２を、シリンジ１３４の軸方向（例えば垂直方向）と、軸方向を横断する方向（例えば水平方向）との二方向に自在に動かす。シリンジポンプ１３２の移動装置は、例えば、ロボットアーム、２軸ステージまたは上下動自在なターンテーブルによって構成される。
【００４８】
送液ユニット１３０は、液体チップ１３１より各種液体を吸引し、測定チップ１０の収容部４１内に供給する。このとき、プランジャー１３５を動かすことで、測定チップ１０の収容部４１内を液体が往復させることができ、収容部４１内の液体を攪拌できる。これにより、収容部４１内に提供された液体の濃度の均一化や、収容部４１内における反応（例えば抗原抗体反応）の促進などを実現することができる。このような操作を行う観点から、測定チップ１０の注入口は多層フィルムで保護されており、かつシリンジ１３４がこの多層フィルムを貫通した時に注入口を密閉できるように、測定チップ１０およびシリンジ１３４が構成されていることが好ましい。
【００４９】
収容部１内の液体は、再びシリンジポンプ１３２で吸引され、液体チップ１３１などに排出される。これらの動作の繰り返しにより、収容部４１内を洗浄したり、収容部４１内において、第１の捕捉体と被測定物質を反応させたり、被測定物質と蛍光物質で標識された第２の捕捉体とを反応させたりすることができる。
【００５０】
搬送ユニット１４０は、測定チップ１０を測定位置または送液位置に搬送し、固定する。ここで「測定位置」とは、励起光照射ユニット１１０が測定チップ１０に励起光αを照射し、それに伴い発生する蛍光βまたはプラズモン散乱光γを蛍光検出ユニット１２０が検出する位置である。また、「送液位置」とは、送液ユニット１３０が測定チップ１０の収容部４１内に液体を供給するか、または測定チップ１０の収容部４１内の液体を除去する位置である。搬送ユニット１４０は、搬送ステージ１４１およびチップホルダー１４２を含む。チップホルダー１４２は、搬送ステージ１４１に固定されており、測定チップ１０を着脱可能に保持する。チップホルダー１４２の形状は、測定チップ１０を保持することが可能であり、かつ励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げない形状である。たとえば、チップホルダー１４２には、励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γが通過するための開口が設けられている。搬送ステージ１４１は、チップホルダー１４２を一方向およびその逆方向に移動させる。搬送ステージ１４１も、励起光α、蛍光βおよびプラズモン散乱光γの光路を妨げない形状である。搬送ステージ１４１は、例えば、ステッピングモーターなどで駆動される。
【００５１】
制御部１５０は、角度調整機構１１２、光源制御部１１３、位置切替え機構１２２、センサー制御部１２３、送液ポンプ駆動機構１３３および搬送ステージ１４１を制御する。制御部１５０は、例えば、演算装置、制御装置、記憶装置、入力装置および出力装置を含む公知のコンピュータやマイコンなどによって構成される。
【００５２】
（測定方法）
次に、本実施の形態に係る測定方法を説明する。図２は、実施の形態の測定方法を行う際のＳＰＦＳ装置１００の動作手順の一例を示すフローチャートである。
【００５３】
まず、測定の準備をする（工程Ｓ１０）。具体的には、ＳＰＳＦ装置１００のチップホルダー１４２に前述の測定チップ１０を設置する。また、測定チップ１０の収容部４１内に保湿剤が存在する場合には、収容部４１内を洗浄して保湿剤を除去する。
【００５４】
次いで、測定チップ１０の金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する（工程Ｓ２０）。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を設置位置から測定位置に移動させる。この後、制御部１５０が、光源制御部１１３および角度調整部１１２を制御して、光源ユニット１１１から励起光αを金属膜３０（成膜面２２）の所定の位置に照射しながら、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を走査する。このとき、制御部１５０は、位置切替え機構１２２を制御して、光学フィルター１２５を受光ユニット１２１の光路外に移動させる。これとともに、制御部１５０は、センサー制御部１２３を制御して、受光センサー１２７でプラズモン散乱光γを検出する。制御部１５０は、励起光αの入射角とプラズモン散乱光γの強度との関係を含むデータを得る。そして、制御部１５０は、データを解析して、プラズモン散乱光γの強度が最大となる入射角（増強角）を決定する。最後に、制御部１５０は、角度調整部１１２を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に対する励起光αの入射角を増強角に設定する。
【００５５】
ここで、上記増強角は、プリズム２０の素材および形状、金属膜３０の厚み、収容部４１内の液体の屈折率などにより決まるが、収容部４１内の液体の種類および量、プリズム２０の形状誤差などの各種要因によりわずかに変動する。このため、測定を行うたびに増強角を決定することが好ましい。増強角は、０．１°程度のオーダーで決定される。
【００５６】
次いで、測定チップ１０の収容部４１に検体を提供し、測定チップ１０内の金属膜３０上に固定された第１の捕捉体に、検体中に含まれる被測定物質を特異的に結合させる（１次反応（工程Ｓ３０））。なお、被測定物質の結合後、収容部４１内には、緩衝液などを提供し、収容部４１内を洗浄して、遊離の被測定物質などを除去する。
【００５７】
ここで、本実施の形態で収容部４１に提供する検体および被測定物質の種類は特に限定されない。検体の例には、血液や血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液などの体液およびその希釈液が含まれる。またこれらの検体に含まれる被測定物質の例には、核酸（ＤＮＡやＲＮＡなど）、タンパク質（ポリペプチドやオリゴペプチドなど）、アミノ酸、糖質、脂質およびこれらの修飾分子が含まれる。
【００５８】
上記１次反応後、光学ブランク値を測定する（Ｓ４０）。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を設置位置から測定位置に移動させる。この後、制御部１５０が、光源制御部１１３を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に向けて光源ユニット１１１から、増強角で励起光αを出射させる。これと同時に、制御部１５０は、センサー制御部１２３を制御して、受光センサー１２７で光の光量を検出し、これをブランク値として記録する。
【００５９】
続いて、金属膜３０上の第１の捕捉体に結合した被測定物質に、蛍光物質で標識された第２の捕捉体を結合させる（２次反応（工程Ｓ５０））。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を測定位置から送液位置に移動させる。この後、制御部１５０は、送液ポンプ駆動機構１３３を制御して、液体チップ１３１中の第２の捕捉体を含む標識液を収容部４１内に提供する。ここで、第２の捕捉体は、被測定物質の、第１の捕捉体が特異的に結合する部位とは異なる部位に、特異的に結合する物質である。また、当該第２の捕捉体には、蛍光物質が結合している。したがって、標識液を収容部４１に提供すると、第１の捕捉体に結合している被測定物質に第２の捕捉体が特異的に結合し、被測定物質が、間接的に蛍光物質で標識される。なお、被測定物質を蛍光物質で標識後、収容部４１内には、緩衝液などを提供し、収容部４１内を洗浄して、遊離の第２の捕捉体などを除去する。
【００６０】
ここで、第２の捕捉体は、第１の捕捉体が被測定物質に特異的に結合する部位とは異なる部位に、特異的に結合する物質であればよく、被測定物質に特異的な生体分子（例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、核酸アプタマーなど）であってもよく、その断片などであってもよい。また、第２の捕捉体は、１分子からなるものであってもよく、２以上の分子が複合した複合体であってもよい。
【００６１】
また、第２の捕捉体に結合している蛍光物質は、金属膜表面に発生する局在場光によって励起され、蛍光を発する物質であれば、特に限定されず、公知の各種蛍光物質（例えばローダミン骨格を含む蛍光物質）でありうる。蛍光物質の具体例には、バイオティウム（Ｂｉｏｔｉｕｍ）社製の蛍光色素（例えばＣＦ  Ｄｙｅ（商品名）３５０、４０５Ｍ、５３２、５４３、５５５、５６８、５９４、６４２、６５０、６６７、６６３、６８１、６８０、７５５、７７０）などが含まれる。
【００６２】
また、第２の捕捉体１つ当たりに結合している蛍光物質の数は、８〜２２であり、好ましくは１３〜１６である。「第２の捕捉体１つ当たりに結合している蛍光物質の数」とは、収容部４１内に提供する、複数の第２の捕捉体に、それぞれ結合している蛍光物質の数の平均値である。したがって、収容部４１内に提供する標識液には、蛍光物質が８未満、もしくは２２超結合した第２の捕捉体が、一部含まれていてもよい。
【００６３】
ここで、第２の捕捉体１つ当たりに結合している蛍光物質の量は、第２の捕捉体に蛍光物質を結合させる際の第２の捕捉体と蛍光物質との仕込み比や、反応時間、反応時の温度により、調整可能であるが、反応時間や反応時の温度のみでは、蛍光物質の結合量を一定以上に増加させることは難しい。そこで、蛍光物質の結合量を多くする場合には、仕込み比で調整することが好ましい。また、収容部４１に提供する、第２の捕捉体１つ当たりに結合している蛍光物質の数（平均値）は、以下の方法により測定できる。吸光光度計により、蛍光物質が結合している第２の捕捉体について吸光度を測定し、第２の捕捉体の量及び蛍光物質の量をそれぞれ算出する。そして、第２の補足体の量に対する蛍光物質の量の比率を算出し、当該値を、蛍光物質の数とする。
【００６４】
次いで、収容部４１の底面（金属膜３０）上に、蛍光物質で標識された被測定物質が第１の捕捉体を介して配置された状態で、プリズム２０を通して励起光αを増強角で金属膜３０（成膜面２２）に照射する。そして、被測定物質を標識する蛍光物質からの蛍光値を測定する（測定工程（工程Ｓ６０））。具体的には、制御部１５０が、搬送ステージ１４１を制御して、測定チップ１０を送液位置から測定位置に移動させる。この後、制御部１５０は、光源制御部１１３を制御して、金属膜３０（成膜面２２）に向けて光源ユニット１１１から励起光αを出射させる。これと同時に、制御部１５０は、センサー制御部１２３を制御して、受光センサー１２７で蛍光βと同じ波長の光の光量を検出する。
【００６５】
最後に、被測定物質の存在または量を示すシグナル値を算出する（工程Ｓ７０）。蛍光値は、主として、被測定物質を標識する蛍光物質に由来する蛍光成分（シグナル値）と、光学ブランク値とを含む。したがって、制御部１５０は、工程Ｓ６０で得られた蛍光値から工程Ｓ４０で得られた光学ブランク値を引くことで、被測定物質の量に相関するシグナル値を算出することができる。そして、あらかじめ作成しておいた検量線により、被測定物質の量や濃度などに換算する。
【００６６】
（効果）
前述のように、一般的なＳＰＦＳでは、標識率を、蛍光試薬メーカーが推奨する範囲内（通常７以下）としている。これに対し、本実施の形態のように、標識率を８〜２２とすると、検出されるシグナル値が非常に高くなる。その一方で、検出されるノイズは、標識率が７以下である場合と比較して殆ど変化しない。したがって、ＳＰＦＳを行った場合、検出されるＳ（シグナル）／Ｎ（ノイズ）比を従来得られる値より、非常に高めることができ、感度よく被測定物質の量などを特定することが可能となる。
【００６７】
また、本実施の形態のＳＰＦＳでは、蛍光検出時に照射する励起光量を少なくしても、十分に高いシグナル値が得られる。一方、励起光量を少なくすることで、ノイズを全体的に低減することもできる。したがって、本実施の形態によれば、従来より少ない励起光量でＳＰＦＳを行うことも可能であり、その際、感度よく被測定物質の量などを特定することが可能となる。
【００６８】
また、本実施の形態によれば、反応場に提供する蛍光物質の量を少なくしても、十分に高いシグナル値が得られる。したがって、本実施の形態によれば少ない第２の捕捉体で、感度よく被測定物質の量などを特定することも可能であり、コストを抑制することができる。
【００６９】
なお、本実施の形態で使用する測定チップ１０と、蛍光物質で標識された第２の捕捉体と、を組み合わせて測定用キットとすることができる。当該測定用キットにおいて、蛍光物質で標識された第２の捕捉体は、粉体状であってもよく、液体状であってもよい。
【００７０】
［その他の実施の形態］
上述の実施の形態では、金属膜３０が形成されたプリズム２０を使用し、光子と表面プラズモンとを結合（カップリング）させるプリズムカップリング（ＰＣ）−ＳＰＦＳ（測定方法）および測定装置について説明した。しかし、本発明に係る測定方法および測定チップは、この形態に限定されない。図３は、回折格子を含む金属膜３０ａの斜視図である。本発明に係る測定方法および測定装置では、図３に示されるように、回折格子を含む金属膜３０ａを有する測定チップを使用してもよい。この場合も、光子と表面プラズモンとを結合させ、金属膜３０ａからプラズモン散乱光γを放出させることができる。この場合、プリズム２０は不要である。また、励起光照射ユニット１１０は、測定チップの金属膜３０ａ側に配置され、蛍光βの検出工程およびプラズモン散乱光γの検出工程では、回折格子に向けて励起光αを照射する。
【実施例】
【００７１】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例により限定されない。【００７２】
［実施例１］
（１）測定チップの準備
プリズムの一面上に金属膜が配置されているチップを準備した。そして、当該プリズムの金属膜に、第１の捕捉体（抗トロポニン抗体）を固定した。そして、金属膜上に流路蓋を載置し、測定チップとした。当該測定チップをＳＰＦＳ装置のチップホルダーに設置した。【００７３】
（２）１次反応
被測定物質であるトロポニンを含む検体を１５０μＬ（検体希釈液０．０５％  Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ  ｐＨ７．４、３％ＢＳＡ、被測定物質濃度１０〜１５ｎｇ／ｍＬ）を準備した。そして、当該検体を測定チップの収容部（流路）内に往復送液することで、流路内に固定された第１の捕捉体に検体中の被測定物質を特異的に反応（１次反応）させた。
次いで、流路内の検体を除去し、流路内を洗浄溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ  ｐＨ７．４）で洗浄した。その後、流路内に測定溶液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ、５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ  ｐＨ７．４）を入れ、波長６６０ｎｍの励起光をプリズム側から金属膜に増強角で照射した。そして、反応場から放出される光を検出し、光学ブランク値を得た。【００７４】
（３）蛍光物質で標識された第２の捕捉体の準備
第２の捕捉体（トロポニンの第一の補足体が結合する部位とは異なる部位に結合する抗トロポニン抗体）を１ｍｇ／ｍＬの濃度で含む溶液（１ｘＰＢＳ、ｐＨ７．４）１００μＬと、１Ｍ重炭酸ナトリウム１０μＬ（ｐＨ８．３）とを混合した。一方、ローダミン骨格を有する蛍光物質ＣＦ６６０Ｒ（バイオティウム社製）１μｍｏｌを脱水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２５０μＬに溶解した。その後、第２の捕捉体を含む溶液１１０μＬと、蛍光物質を含む溶液２．８μＬとを混合し、室温にて１時間反応させた。反応後、限外濾過により、未反応の蛍光物質を取り除いた。反応物の第２の補足体の濃度及び蛍光物質の濃度を吸光光度計にて確認し、蛍光物質の結合量を算出したところ、第２の捕捉体１つ当たり、蛍光物質が平均９．２個結合していた。なお、蛍光物質ＣＦ６６０Ｒ（バイオティウム社製）のメーカー推奨値は、４〜７である。【００７５】
（４）２次反応、及びシグナル値の算出
その後、上述のように作製した蛍光物質で標識された第２の捕捉体を含む標識液４０μＬ（標識抗体希釈液ＰＢＳ  ｐＨ７．４、１％ＢＳＡ、被測定物質濃度：４μｇ／ｍＬ）を流路内に往復送液し、流路内に第１の捕捉体を介して配置された被測定物質に、第２の捕捉体を結合（２次反応）させた。
２次反応の後、流路内の標識液を除去し、流路内を上記と同様の洗浄溶液で洗浄した。その後、光学ブランク値の測定と同様に、測定溶液を流路内に入れ、励起光を増強角で照射して、反応場から放出される蛍光強度を検出した。そして、蛍光の検出値から光学ブランク値を引き、当該値をシグナル値とした。【００７６】
［実施例２、３、および比較例１〜６］
第２の捕捉体と蛍光物質との反応当量比を変更し、第２の捕捉体に結合させる蛍光物質の平均個数を表１に示すように変更した以外は、実施例１と同様にシグナル値を算出した。なお、各シグナル値については、比較例１で得られたシグナル値を１００％とし、各実施例および比較例のシグナル値を、比較例１に対する相対強度（％）で評価した。当該相対強度を表１に示す。【００７７】
［参考例］
一方、各実施例及び比較例の際に生じるノイズや、シグナル／ノイズ比を確認するため、トロポニンを含む検体の代わりに、トロポニンを含まない緩衝液を送液した以外は実施例１〜３、及び比較例１〜６と同様に、光学ブランク値、及び蛍光強度を測定した。そして、検出された蛍光強度から光学ブランク値を引いた値をノイズ値とした。当該ノイズ値を表１に示す。また、比較例１に相当するノイズ値を１００％とし、各実施例および比較例に相当するノイズ値を、相対強度（％）で表した。これらの値も表１に示す。
その後、各実施例及び比較例で算出したシグナル値と、上記で算出したノイズ値との比（Ｓ／Ｎ比＝シグナル値強度／ノイズ値強度）を算出した。さらに比較例１のＳ／Ｎ比を１００％とし、各実施例及び比較例のＳ／Ｎ比を、相対強度（％）で表した。これらの値も表１に示す。【００７８】
【表１】
2017057136.tif 000003
【００７９】
［結果］
第２の捕捉体に結合する蛍光物質の数（標識率）と、シグナル値（相対値）、ノイズ値（相対値）、及びシグナル／ノイズ比（相対値）と、の関係を示すグラフを、図４に示す。上記表１および図４に示されるように、第２の捕捉体一つ当たりに結合する蛍光物質の数が８個未満である場合（比較例１〜５）、シグナル値の相対強度が２００％未満であるのに対し、蛍光物質の数が８〜２２個であると、上記シグナル値の相対強度が２００％を超える値を示した（実施例１〜３）。また、これらの実施例１〜３では、Ｓ／Ｎ比が１５０以上であり、比較例１と比較して高い値を示した。つまり、蛍光物質の数を上記範囲とすることで、高い感度で蛍光を検出（被測定物質量を測定）できることがわかる。一方、第２の捕捉体一つ当たりに結合する蛍光物質の量が２２個を超えると、シグナル値の相対強度が低くなり、比較例１と比較してＳ／Ｎ比も低くなった（比較例６）。第２の捕捉体に結合した蛍光物質どうしの距離が近くなったため、濃度消光が生じやすくなったと推察される。【００８０】
以上の結果から分かるとおり、本発明の実施の形態を採用することにより、感度よく、被測定物質の量を正確に測定することができる。【００８１】
本出願は、２０１５年９月２９日出願の特願２０１５−１９１３８０号に基づく優先権を主張する。これらの出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明に係る被測定物質の測定方法および測定キットによれば、被測定物質を高い感度で測定することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。
【符号の説明】
【００８３】
１０  測定チップ
２０  プリズム
２１  入射面
２２  成膜面
２３  出射面
３０  金属膜
４０  流路蓋
４１  収容部
１００  ＳＰＦＳ装置
１１０  励起光照射ユニット
１１１  光源ユニット
１１２  角度調整機構
１１３  光源制御部
１２０  蛍光検出ユニット
１２１  受光ユニット
１２２  位置切替え機構
１２３  センサー制御部
１２４  第１レンズ
１２５  光学フィルター
１２６  第２レンズ
１２７  受光センサー
１３０  送液ユニット
１３１  液体チップ
１３２  シリンジポンプ
１３３  送液ポンプ駆動機構
１３４  シリンジ
１３５  プランジャー
１４０  搬送ユニット
１４１  搬送ステージ
１４２  チップホルダー
１５０  制御部
α  励起光
β  蛍光
γ  プラズモン散乱光
【図１】
2017057136.tif 000004
【図２】
2017057136.tif 000005
【図３】
2017057136.tif 000006
【図４】
2017057136.tif 000007
【国際調査報告】
2017057136.tif 000008
2017057136.tif 000009
2017057136.tif 000010
2017057136.tif 000011