(57)【要約】開示されているのは、一般式（１）：2016178426.tif 000018（式中、Ｘ及びＹは、同一又は異なって、アミノ酸残基を示す。ｎは、２〜６の整数を示す。ｐは、０〜４の整数を示し、ｑは、０〜４の整数を示す。ただし、ｐ＋ｑは、４の整数を超えないものとする。ｐが２〜４の整数を示す場合、（Ｘ）ｐで示されるアミノ酸残基を構成する２〜４個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。ｑが２〜４の整数を示す場合、（Ｙ）ｑで示されるアミノ酸残基を構成する２〜４個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。）で表されるチロシンペプチド、又は該チロシンペプチドと高分子とから構成される複合体であって、該高分子には１個以上のチロシンペプチドが結合している、複合体を含有する抗氷核活性剤、該抗氷核活性剤及び水を含有する不凍性液体、該複合体を含む霜害防除用コーティング液、該抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む生物材料の抗氷核活性を向上させる方法、並びに該抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む生物材料の保存方法である。
2016178426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）：
【化１】
2016178426.tif 000017
（式中、Ｘ及びＹは、同一又は異なって、アミノ酸残基を示す。
ｎは、２〜６の整数を示す。
ｐは、０〜４の整数を示し、
ｑは、０〜４の整数を示す。
ただし、ｐ＋ｑは、４の整数を超えないものとする。
ｐが２〜４の整数を示す場合、（Ｘ）ｐで示されるアミノ酸残基を構成する２〜４個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。
ｑが２〜４の整数を示す場合、（Ｙ）ｑで示されるアミノ酸残基を構成する２〜４個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。）
で表されるチロシンペプチド、又は
該チロシンペプチドと高分子とから構成される複合体であって、該高分子には１個以上のチロシンペプチドが結合している、複合体
を含有する抗氷核活性剤。
【請求項２】
ｎが２〜４の整数を示す、請求項１に記載の抗氷核活性剤。
【請求項３】
ｎが２又は３を示し、ｐが０又１を示し、かつｑが０又は１を示す、請求項１又は２に記載の抗氷核活性剤。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤、及び水を含有する不凍性液体。
【請求項５】
請求項１に記載の複合体を含む霜害防除用コーティング液。
【請求項６】
請求項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む、生物材料の抗氷核活性を向上させる方法。
【請求項７】
請求項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む、生物材料の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗氷核活性剤、不凍性液体及び霜害防除用コーティング液に関する。さらに、本発明は、生物材料の抗氷核活性を向上させる方法、及び生物材料の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水の中には異物が入っていることから、その異物が氷の核となり、水は０℃で凝固する。このような異物は、氷核活性物質と言われており、代表的な氷核活性物質としては、シュードモナス属の細菌、ヨウ化銀等が知られている。一方、純水は、異物が存在しないことから、氷の核が生成できず、凝固点（０℃）よりも低い、例えば−３９℃の温度まで冷却しても、凝固（固体化）しないことがある。このような現象は、一般に「過冷却現象」と言われている。【０００３】
このような過冷却現象を促進する抗氷核活性剤（過冷却促進剤）が、これまでに幾つか報告されており、抗氷核活性剤は、氷点下であっても凍らない水を作ることができる。その結果、凍結による膨張が起こらなくなるため、植物又は動物の細胞が破壊されずに保存でき、一旦凍った場合でも、微小な氷核ができ、微小な氷結晶形成が生じることから、食品、生体材料（臓器保存）等の分野での応用が期待されている。【０００４】
例えば、香辛料の成分であるオイゲノール（非特許文献１参照）等の低分子化合物；バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)由来の多糖（非特許文献２参照）等の高分子化合物が抗氷核活性を示すことが報告されている。【０００５】
しかしながら、これらの抗氷核活性剤は、氷核活性物質であるシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)等の細菌に対して抗氷核活性を示すものの、ヨウ化銀に対して抗氷核活性は低く、また、これらの抗氷核活性剤は、安全性の問題から、食品、生体材料分野等での利用が困難となっていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】H.Kawahara et al, J. Antibact. Antifung. Agents, 1996, Vol. 24, pp.95-100
【非特許文献２】Y.Yamashita et al, Biosci. Biotech. Biochem., 2002, Vol. 66, pp.948-954
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、氷核活性物質に対して幅広く抗氷核活性作用を示し、食品、生物材料、環境等の分野への応用が可能である抗氷核活性剤、不凍性液体及び霜害防除用コーティング液を提供することを目的とする。さらに、本発明は、生物材料の抗氷核活性を向上させる方法、及び生物材料の保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、チロシンペプチド及びチロシンペプチドと高分子とから構成される複合体が、上記目的を達成できることを見出した。これらの知見に基づいてさらに研究した結果、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、下記の抗氷核活性剤、不凍性液、霜害防除用コーティング液等を提供することにある。【００１０】
項１．
一般式（１）：【００１１】
【化１】
2016178426.tif 000003
（式中、Ｘ及びＹは、同一又は異なって、アミノ酸残基を示す。
ｎは、２〜６の整数を示す。
ｐは、０〜４の整数を示し、
ｑは、０〜４の整数を示す。
ただし、ｐ＋ｑは、４の整数を超えないものとする。
ｐが２〜４の整数を示す場合、（Ｘ）ｐで示されるアミノ酸残基を構成する２〜４個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。
ｑが２〜４の整数を示す場合、（Ｙ）ｑで示されるアミノ酸残基を構成する２〜４個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。）
で表されるチロシンペプチド、又は
該チロシンペプチドと高分子とから構成される複合体であって、該高分子には１個以上のチロシンペプチドが結合している、複合体
を含有する抗氷核活性剤。
項２．
ｎが２〜４の整数を示す、項１に記載の抗氷核活性剤。
項３．
ｎが２又は３を示し、ｐが０又１を示し、かつｑが０又は１を示す、項１又は２に記載の抗氷核活性剤。
項４．
項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤、及び水を含有する不凍性液体。
項５．
前記抗氷核活性剤を０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ含有する、項４に記載の不凍性液体。
項６．
項１に記載の複合体を含む霜害防除用コーティング液。
項７．
項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む、生物材料の抗氷核活性を向上させる方法。
項８．
項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を食品に接触させる工程を含む、食品の抗氷核活性を向上させる方法。
項９．
項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む、生物材料の保存方法。
項１０．
項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を食品に接触させる工程を含む、食品の保存方法。
項１１．
項１に記載のチロシンペプチド又は複合体の抗氷核活性剤としての使用。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、氷核活性物質に対して幅広く抗氷核活性作用を示し、食品、生物材料、環境等の分野への応用が可能である抗氷核活性剤、不凍性液体及び霜害防除用コーティング液を提供できる。また、本発明の抗氷核活性剤を利用することで、食品、生物材料等の長期低温保存が可能となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、Ｖａｌｉの小滴凍結法についての写真である。
【図２】図２は、チロシンの重合度の影響を示した図である（実施例１〜４及び比較例１）。
【図３】図３は、チロシン３量体の濃度の影響を示した図である（実施例２及び５〜１０）。
【図４】図４は、アミノ酸３量体及びアミノ酸１量体の抗氷核活性を示した図である（実施例２及び比較例２〜８）。
【図５】図５は、氷核活性物質の種類の影響を示した図である。
【図６】図６は、解凍後の豆腐の状態（写真）と豆腐の破断荷重（Ｎ）とを示した図である（実施例１及び比較例９）。
【図７】図７は、豆腐を１ヶ月間冷凍保存し、その後、緩慢解凍又は急速解凍させた豆腐のＳＥＭ写真（１００倍）である（実施例１、２及び比較例９）。
【図８】図８は、凍結時の豆腐の状態を示したＳＥＭ写真（１００倍）である（実施例２及び比較例９）。
【図９】図９は、豆腐の温度と冷却時間との関係（冷却曲線）を示した図である（実施例１、２及び比較例９）。
【図１０】図１０は、X線光電子分光分析の結果を示した図である。上から、P4VP-GGGYYY (Mw:36000, 46000, 54000), GGGYYY, ピラニア処理のみを示す。
【図１１】図１１は、水中における、アミノ酸３量体、及びアミノ酸６量体と高分子との複合体の抗氷核活性を示した図である（比較例１０、実施例２及び１１）。
【図１２】図１２は、ガラス表面における、高分子、及びアミノ酸３量体又は６量体と高分子との複合体の抗氷核活性を示した図である（比較例１１、実施例１２及び１３）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．抗氷核活性剤
本発明の抗氷核活性剤は、チロシンペプチド、又は該チロシンペプチドと高分子とから構成される複合体であって、該高分子には１個以上のチロシンペプチドが結合している、複合体を含有する抗氷核活性剤である。なお、本明細書中において、「含有する」又は「含む」なる表現については、「含有する」、「含む」、「実質的にのみからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
【００１５】
チロシンペプチド
チロシンペプチドとは、チロシン−チロシン（Tyr-Tyr）構造を有する化合物であればよく、チロシンの２量体以上の化合物を意味している。このようなチロシンペプチドとしては、具体的に、下記一般式（１）：
【００１６】
【化２】
2016178426.tif 000004
【００１７】
（式中、Ｘ、Ｙ、ｎ、ｐ及びｑは、前記と同じ。）
で表される化合物が挙げられる。
【００１８】
上記[Tyr]とは、チロシン残基
([H2N-CH(-CH2C6H4-4-OH)-COOH]、
[H2N-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO]、
[HN-CH(-CH2C6H4-4-OH)-COOH]、又は
[HN-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO])を意味し、該チロシン残基におけるチロシンとしては、Ｌ−チロシン又はＤ−チロシンが挙げられる。好ましいチロシンとしては、天然型アミノ酸であるＬ−チロシンである。
【００１９】
ｎは、２〜６の整数を示し、好ましいｎとしては２〜５の整数であり、より好ましくは２〜４の整数であり、特に好ましくは２又は３である。
【００２０】
ｎが２である[Tyr]２とは、[Tyr−Tyr]の構造、即ち、
[H2N-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-COOH]、
[H2N-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO]、
[HN-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-COOH]、又は
[HN-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO] の構造を意味している。
【００２１】
ｎが３である[Tyr]３とは、[Tyr−Tyr−Tyr]の構造、即ち、
[H2N-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-COOH]
[H2N-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO]
[HN-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-COOH]、又は
[HN-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO]の構造を意味している。
【００２２】
ｎが４である[Tyr]４とは、[Tyr−Tyr−Tyr−Tyr]の構造、即ち、
[H2N-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-COOH]、
[H2N-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO]、
[HN-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-COOH]、又は
[HN-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO]の構造を意味している。
【００２３】
ｎが５である[Tyr]５とは、[Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr]の構造、即ち、
[H2N-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-COOH]、
[H2N-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO]、
[HN-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-COOH]、又は
[HN-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO]の構造を意味している。
【００２４】
ｎが６である[Tyr]６とは、[Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr]の構造、即ち、
[H2N-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-CO-NH-CH(-CH2C6H4-4-OH)-COOH]の構造を意味している。
【００２５】
ｐは、０〜４の整数を示し、ｑは、０〜４の整数を示し、ただし、ｐ＋ｑは、４を超えないものとする。ｐが２〜４の整数を示す場合、（Ｘ）ｐで示されるアミノ酸残基を構成する２〜４個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。ｑが２〜４の整数の場合、（Ｙ）ｑで示されるアミノ酸残基を構成する２〜４個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。
【００２６】
（Ｘ）ｐで示されるアミノ酸残基について、ｐが１である場合のアミノ酸残基とは、アミノ酸のＣ末端から水酸基（ＯＨ）を除いた基（H2N-CHR-CO）を意味する。ここでRは、アミノ酸の側鎖部分を意味する。ｐが２〜４の整数である場合のアミノ酸残基とは、アミノ酸のＣ末端から水酸基（ＯＨ）を除いた基（H2N-CHR-CO）、又は、アミノ酸のＣ末端から水酸基（ＯＨ）及びＮ末端から水素原子を除いた基（HN-CHR-CO）を意味する。
【００２７】
具体的に、ｐが２である（Ｘ）２−とは、（Ｘ−Ｘ）−の構造、即ち、（アミノ酸残基−アミノ酸残基）−の構造を有していることを意味し、例えば、ＸがSer（セリン）である場合、（Ser−Ser）−とは、[H2N-CH(-CH2OH)-CO-NH-CH(-CH2OH)-CO]-を意味している。
【００２８】
ｐが３である（Ｘ）３−とは、（Ｘ−Ｘ−Ｘ）−の構造を有していることを意味する。例えば、ＸがSer（セリン）である場合、（Ser−Ser−Ser）−とは、[H2N-CH(-CH2OH)-CO-NH-CH(-CH2OH)-CO-NH-CH(-CH2OH)-CO]-を意味している。
【００２９】
ｐが４である（Ｘ）４−とは、（Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ）−の構造を有していることを意味している。例えば、ＸがSer（セリン）である場合、（Ser−Ser−Ser−Ser）−とは、[H2N-CH(-CH2OH)-CO-NH-CH(-CH2OH)-CO-NH-CH(-CH2OH)-CO-NH-CH(-CH2OH)-CO]-を意味している。
【００３０】
（Ｙ）ｑで示されるアミノ酸残基について、ｑが１である場合のアミノ酸残基とは、アミノ酸のＮ末端から水素原子（Ｈ）を除いた基（HN-CHR-COOH）を意味する。ここでRは、アミノ酸の側鎖部分を意味する。ｑが２〜４である場合のアミノ酸残基とは、アミノ酸のＮ末端から水素原子（Ｈ）を除いた基（HN-CHR-COOH）、又は、アミノ酸のＣ末端から水酸基（ＯＨ）及びＮ末端から水素原子を除いた基（HN-CHR-CO）を意味する。
【００３１】
具体的に、ｑが２である−（Ｙ）２とは、−（Ｙ−Ｙ）の構造、即ち、−（アミノ酸残基−アミノ酸残基）の構造を有していることを意味し、例えば、ＹがThr（トレオニン）である場合、−（Thr−Thr）とは、-[HN-CH(-CH(CH3)OH)-CO-NH-CH(-CH(CH3)OH)-COOH]を意味している。
【００３２】
ｑが３である−（Ｙ）３とは、−（Ｙ−Ｙ−Ｙ）の構造を有していることを意味する。例えば、ＹがThr（トレオニン）である場合、−（Thr−Thr−Thr）とは、-[HN-CH(-CH(CH3)OH)-CO-HN-CH(-CH(CH3)OH)-CO-NH-CH(-CH(CH3)OH)-COOH]を意味している。
【００３３】
ｑが４である−（Ｙ）４とは、−（Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｙ）の構造を有していることを意味する。例えば、ＹがThr（トレオニン）である場合、−（Thr−Thr−Thr−Thr）とは、-[HN-CH(-CH(CH3)OH)-CO-HN-CH(-CH(CH3)OH)-CO-HN-CH(-CH(CH3)OH)-CO-NH-CH(-CH(CH3)OH)-COOH]を意味している。
【００３４】
「アミノ酸残基」におけるアミノ酸としては、天然型アミノ酸、又は非天然型アミノ酸が挙げられる。すなわち、アミノ酸残基におけるアミノ酸としては、Ｌ−アミノ酸であってもよく、Ｄ−アミノ酸であってもよく、又はこれらの混合物でもよい。また、アミノ酸の種類としては、アミノ基とカルボキシル基とを有する化合物であれば特に限定されない。例えば、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、及びδ−アミノ酸が挙げられ、天然型アミノ酸であるα−アミノ酸が好ましく、アミノ酸側鎖中に水酸基を有するα−アミノ酸がより好ましい。
【００３５】
天然型アミノ酸としては、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン及びＬ−プロリンが挙げられる。中でも好ましい天然型アミノ酸としては、アミノ酸側鎖中に水酸基を有する化合物、例えば、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン及びＬ−チロシンであり、より好ましくはＬ−チロシンである。
【００３６】
非天然型アミノ酸としては、天然型タンパク質を構成する上記天然型アミノ酸２０種類以外の全てのアミノ酸を意味する。具体的には、（１）天然型アミノ酸中の原子を他の物質で置換した非天然型アミノ酸、（２）天然型アミノ酸の側鎖の光学異性体又は位置異性体、（３）天然型アミノ酸の側鎖に置換基を導入した非天然型アミノ酸、（４）天然型アミノ酸の側鎖を置換して疎水性、反応性、荷電状態、分子の大きさ、水素結合能等を変化させた非天然型アミノ酸等が挙げられる。
【００３７】
本明細書におけるチロシンペプチド又はアミノ酸は、チロシンペプチド又はアミノ酸の主鎖又は側鎖が化学的修飾、生物学的（酵素的）修飾等を受けたチロシンペプチド誘導体又はアミノ酸誘導体であってもよい。修飾の例としては、例えば、アルキル化、アシル化（より具体的には、アセチル化等）、水酸基化、エステル化、ハロゲン化、アミノ化、アミド化等の官能基導入（変換）等を挙げることができるが、これらに限定されることはない。具体的なチロシンペプチドの誘導体については後述する。
【００３８】
本明細書におけるアミノ酸の略号による表示は、IUPAC-IUBの規定（IUPAC-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)）、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。また、アミノ酸等に関し光学異性体が有り得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
【００３９】
本明細書において、本明細書に挙げる種々のアミノ酸配列中に存在する「アミノ酸」は、公知の三文字又は一文字略語によって特定される（表１参照）。
【００４０】
【表１】
2016178426.tif 000005
【００４１】
本明細書において、Tyr−Tyrとは、上述したとおり、チロシン同士が縮合して、一つのチロシンのカルボン酸部位ともう一つのチロシンのアミノ酸部位がペプチド結合を有している化合物[H2N-CH(-CH2C6H4)-CO-NH-CH(-CH2C6H4)-COOH]である。
【００４２】
上記チロシンの２量体（以下、「チロシン２量体」ということもある）とは、上記Tyr−Tyrで示されるアミノ酸配列からなるペプチドだけでなく、Tyr−Tyrの両末端又は片方の末端に、さらにアミノ酸残基が結合している化合物であってもよく、本明細書において、チロシン２量体、及びチロシン２量体とアミノ酸残基とが結合している化合物を含めて、チロシン２量体化合物という。
【００４３】
チロシン２量体化合物としては、例えば、一般式（２）：
【００４４】
【化３】
2016178426.tif 000006
【００４５】
（式中、Ｘ及びＹは、同一又は異なって、アミノ酸残基を示す。
ｐは、０〜４の整数を示し、
ｑは、０〜４の整数を示す。
ただし、ｐ＋ｑは、４を超えないものとする。
ｐが２〜４の場合、（Ｘ）ｐで示されるアミノ酸残基を構成する２〜４個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。
ｑが２〜４の場合、（Ｙ）ｑで示されるアミノ酸残基を構成する２〜４個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。）で表される化合物が挙げられる。
【００４６】
具体的にチロシン２量体化合物としては、例えば、
Tyr−Tyr、
Ser−Tyr−Tyr、
Tyr−Tyr−Ser、
Ser−Tyr−Tyr−Ser、
Phe−Tyr−Tyr、
Tyr−Tyr−Phe、
Phe−Tyr−Tyr−Phe、
Thr−Tyr−Tyr、
Tyr−Tyr−Thr、
Thr−Tyr−Tyr−Thr、
Phe−Ser−Tyr−Tyr、
Ser−Tyr−Tyr−Phe、
Tyr−Tyr−Ser−Phe、
Tyr−Tyr−Ser−Tyr−Tyr、
Phe−Ser−Tyr−Tyr−Ser−Phe等が挙げられる。中でも、好ましいチロシン２量体化合物としては、Tyr−Tyr、及びチロシン２量体と水酸基を有するアミノ酸残基とが結合したチロシン２量体化合物であり、より好ましくは、Tyr−Tyr、Ser−Tyr−Tyr、Tyr−Tyr−Ser、Thr−Tyr−Tyr、及びTyr−Tyr−Thrである。
【００４７】
チロシンペプチドとしては、上記チロシン２量体化合物だけでなく、チロシン３量体化合物、チロシン４量体化合物、チロシン５量体化合物、及びチロシン６量体化合物が挙げられる。
【００４８】
チロシン３量体化合物としては、Tyr−Tyr−Tyrだけでなく、Tyr−Tyr−Tyrの両末端又は片方の末端に、さらにアミノ酸残基が結合している化合物であってもよく、本明細書において、チロシン３量体化合物は、チロシン３量体、及びチロシン３量体とアミノ酸残基とが結合している化合物を含んでいる。
【００４９】
チロシン３量体化合物としては、例えば、一般式（３）：
【００５０】
【化４】
2016178426.tif 000007
【００５１】
（式中、Ｘ及びＹは、同一又は異なって、アミノ酸残基を示す。
ｐは、０〜３の整数を示し、
ｑは、０〜３の整数を示す。
ただし、ｐ＋ｑは、３を超えないものとする。
ｐが２又は３の場合、（Ｘ）ｐで示されるアミノ酸残基を構成する２又は３個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。
ｑが２又は３の場合、（Ｙ）ｑで示されるアミノ酸残基を構成する２又は３個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。）で表される化合物が挙げられる。
【００５２】
具体的にチロシン３量体化合物としては、例えば、
Tyr−Tyr−Tyr、
Ser−Tyr−Tyr−Tyr、
Tyr−Tyr−Tyr−Ser、
Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Ser、
Phe−Tyr−Tyr−Tyr、
Tyr−Tyr−Tyr−Phe、
Phe−Tyr−Tyr−Tyr−Phe、
Thr−Tyr−Tyr−Tyr、
Tyr−Tyr−Tyr−Thr、
Thr−Tyr−Tyr−Tyr−Thr、
Phe−Ser−Tyr−Tyr−Tyr、
Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Phe、
Tyr−Tyr−Tyr−Ser−Phe、
Phe−Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Ser−Phe等が挙げられる。中でも、好ましいチロシン３量体化合物としては、Tyr−Tyr−Tyr、及びチロシン３量体と水酸基を有するアミノ酸残基とが結合したチロシン３量体化合物であり、より好ましくは、Tyr−Tyr−Tyrである。
【００５３】
チロシン４量体化合物としては、Tyr−Tyr−Tyr−Tyrだけでなく、Tyr−Tyr−Tyr−Tyrの両末端又は片方の末端に、さらにアミノ酸残基が結合している化合物であってもよく、本明細書において、チロシン４量体化合物は、チロシン４量体、及びチロシン４量体とアミノ酸残基とが結合している化合物を含んでいる。
【００５４】
チロシン４量体化合物としては、例えば、一般式（４）：
【００５５】
【化５】
2016178426.tif 000008
【００５６】
（式中、Ｘ及びＹは、同一又は異なって、アミノ酸残基を示す。
ｐは、０〜２の整数を示し、
ｑは、０〜２の整数を示す。
ただし、ｐ＋ｑは、２を超えないものとする。
ｐが２の場合、（Ｘ）ｐで示されるアミノ酸残基を構成する２個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。
ｑが２の場合、（Ｙ）ｑで示されるアミノ酸残基を構成する２個のアミノ酸残基は同一又は異なっていてもよい。）で表される化合物が挙げられる。
【００５７】
具体的にチロシン４量体化合物としては、例えば、
Tyr−Tyr−Tyr−Tyr、
Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr、
Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Ser、
Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Ser、
Phe−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr、
Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Phe、
Phe−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Phe、
Thr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr、
Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Thr、
Thr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Thr、
Phe−Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr、
Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Phe、
Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Ser−Phe、
Phe−Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Ser−Phe等が挙げられる。中でも、好ましいチロシン４量体化合物としては、Tyr−Tyr−Tyr−Tyrである。
【００５８】
チロシン５量体化合物としては、Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyrだけでなく、Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyrの両末端又は片方の末端に、さらにアミノ酸残基が結合している化合物であってもよく、本明細書において、チロシン５量体化合物は、チロシン５量体、及びチロシン５量体とアミノ酸残基とが結合している化合物を含んでいる。
【００５９】
チロシン５量体化合物としては、例えば、一般式（５）：
【００６０】
【化６】
2016178426.tif 000009
【００６１】
（式中、Ｘ及びＹは、同一又は異なって、アミノ酸残基を示す。
ｐは、０〜１の整数を示し、
ｑは、０〜１の整数を示す。
ただし、ｐ＋ｑは、１を超えないものとする。）で表される化合物が挙げられる。
【００６２】
具体的にチロシン５量体化合物としては、例えば、
Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr、
Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr、
Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Ser、
Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Ser、
Phe−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr、
Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Phe、
Phe−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Phe、
Thr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr、
Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Thr、
Thr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Thr、
Phe−Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr、
Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Phe、
Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Ser−Phe、
Phe−Ser−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Ser−Phe等が挙げられる。中でも、好ましいチロシン５量体化合物としては、Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyrである。
【００６３】
チロシン６量体化合物としては、Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyr−Tyrで示される化合物である。
【００６４】
これらの中でも、チロシンペプチドとしては、好ましくはｎが２〜４を示すチロシンペプチドであり、より好ましくはｎが２又は３を示すチロシンペプチドであり、さらに好ましくはｎが２又は３を示し、ｐが０又１を示し、かつｑが０又は１を示すチロシンペプチドであり、特に好ましくはｎが３を示し、ｐが０を示し、かつｑが０を示すチロシンペプチド（チロシン３量体、Tyr-Tyr-Tyr）である。
【００６５】
なお、本明細書において、チロシンペプチドとしては、上記チロシン２量体化合物、チロシン３量体化合物、チロシン４量体化合物、チロシン５量体化合物、及びチロシン６量体化合物だけでなく、これら化合物と類似の化学構造を有する化合物（上述したチロシンペプチド誘導体）も包含されている。チロシンペプチド誘導体としては、例えば、チロシンペプチドの水素原子（例えば、アミノ基の水素原子；チロシン側鎖の水酸基の水素原子）が、アルキル化、アシル化（より具体的には、アセチル化等）、エステル化、ハロゲン化、アミド化等の官能基化された化合物；チロシンペプチドの水酸基の位置が異なる位置異性体（ｍ−チロシン、ｏ−チロシン）等が挙げられる。中でも、チロシンペプチド誘導体としては、チロシンペプチドの水素原子が、炭素数１〜６等のアルキル基に置き換わった化合物；チロシンペプチドの水素原子が、炭素数３〜８等のシクロアルキル基に置き換わった化合物；及びチロシンペプチドの水素原子が、アリール基に置き換わった化合物が好ましい。
【００６６】
「アルキル基」としては、特に制限はなく、例えば、炭素数１〜６の直鎖状アルキル基又は炭素数３〜６の分岐鎖状アルキル基が挙げられる。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、２−メチルブチル基、１−メチルブチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基、１−エチルブチル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１−エチル−２−メチルプロピル基等が挙げられる。該アルキル基としては、好ましくは炭素数１〜６の直鎖状アルキル基であり、より好ましくはメチル基、エチル基、及びｎ−ブチル基である。該アルキル基は、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、シアノ基、ニトロ基、シクロアルキル基（例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等）、アリール基（例えば、フェニル基、ナフチル基等）等の置換基を１〜６個有していてもよい。
【００６７】
なお、本明細書において、「ｎ−」はnormal、「ｓ−」はsecondary (sec−)、及びはtertiary (tert−)を意味する。
【００６８】
「シクロアルキル基」としては、特に制限はなく、例えば、炭素数３〜８のシクロアルキル基が挙げられ、具体的には、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。該シクロアルキル基としては、好ましくは炭素数３〜７シクロアルキル基であり、より好ましくは炭素数５〜７シクロアルキル基であり、特に好ましくはシクロヘキシル基である。該シクロアルキル基は、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、シアノ基、ニトロ基、アルキル基（例えば、炭素数１〜６のアルキル基）、アリール基（例えば、フェニル基、ナフチル基等）等の置換基を１〜６個有していてもよい。
【００６９】
「アリール基」としては、特に制限はなく、例えば、単環式又は二環式以上のアリール基が挙げられ、具体的には、フェニル基、ナフチル基、アンスラニル基、フェナンスリル基等が挙げられる。アリール基としては、好ましくは単環式又は二環式のアリール基であり、より好ましくはフェニル基である。該アリール基は、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、シアノ基、ニトロ基、アルキル基（例えば、炭素数１〜６のアルキル基）、シクロアルキル基（例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等）、アリール基（例えば、フェニル基、ナフチル基等）等の置換基を１〜６個有していてもよい。
【００７０】
チロシンペプチドは、１種単独で使用することができ、又は２種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００７１】
チロシンペプチドは、市販品を使用することができ、市販品がない場合は、公知の製造方法に従い製造することができる。例えば、チロシンのアミノ基（−ＮＨ２）をジメチルアミノ基（−ＮＭｅ２）に変換した化合物は、アデニンとメチル化剤（例えば、ヨウ化メチル等）とを反応させることにより製造することができる。
【００７２】
チロシンペプチドと高分子とから構成される複合体
本発明における複合体は、チロシンペプチドと高分子とから構成され、該高分子には１個以上のチロシンペプチドが結合している。チロシンペプチドが結合する位置は、高分子の主鎖、側鎖、及び末端のいずれであってもよい。
【００７３】
高分子としては、チロシンペプチドが結合できるものであれば制限はなく、中でもペプチドが結合できる基、例えば、カルボキシル基、アミノ基などを有する化合物が好適に使用できる。高分子としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブタジエン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエステル、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリアルキレングリコール、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリウレタン、ポリスルフォン、ポリアミン、ポリウレア、ポリイミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ４ビニルピリジン、セルロース、アミロース、アミロペクチンなどが挙げられる。中でも、好ましくは、ポリ４ビニルピリジン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸などである。
【００７４】
高分子の平均分子量は特に制限はなく、例えば、1,000〜100,000の範囲が挙げられる。ここでの平均分子量とは、数平均分子量又は重量平均分子量のいずれであってもよく、これらの平均分子量はゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)等により測定できる。
【００７５】
チロシンペプチドと高分子とは、適宜、公知の方法を利用して結合させることができる。例えば、最初に４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）(ACVA)のような重合開始剤をチロシンペプチドに結合させた後にラジカル重合により高分子を合成することができる。また、適当な架橋剤を介してチロシンペプチドと高分子とを結合させることもできる。そのような架橋剤としては、チロシンペプチドと高分子とを結合できる少なくとも２価の架橋剤であれば特に限定されない。高分子が、カルボキシル基又はアミノ基を有する場合は、ペプチド結合を形成させることで高分子とチロシンペプチドとを結合させることができる。
【００７６】
高分子に結合させるチロシンペプチドは上記チロシンペプチドである限り制限はなく、中でも、Ｘ及びＹのいずれか一方が３又は４残基（すなわち、ｐ、ｑが３又は４）であり、これを介して高分子に結合しているものが好ましい。これは、Ｘ及びＹがスペーサーとして機能することで、チロシン部分が抗氷核活性能を奏し易くなると推測されるからである。この場合のＸ及びＹとしては特に制限はなく、グリシンであることが好ましい。
【００７７】
高分子の分子内に２個以上のチロシンペプチドが結合している場合のチロシンペプチドは、１種単独又は２種以上の組み合わせのいずれであってもよい。また、複合体は、１種単独で使用することができ、又は２種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００７８】
以下の記載では、特に断りがない限り本発明の抗氷核活性剤は固体であるものとして説明するが、本発明の抗氷核活性剤は固体に限定されない。すなわち、本発明の抗氷核活性剤は、液体及び固体のいずれの形態も含むものとする。例えば、本発明の抗氷核活性剤が固体である場合、生物材料（例えば、食品（例えば、食用等の魚介類；野菜等の植物；牛肉、豚肉、鶏肉等の食用肉；豆腐、ヨーグルト等のタンパク質変性した加工品；飲料）、生体材料（例えば、植物又は動物の細胞（組織）；人間又は動物の血液；人間又は動物の臓器或いはその一部））に対して固体を接触させることで、該生物材料の水分で溶解し、抗氷核活性剤として利用することができる。また、本発明の抗氷核活性剤が液体である場合、上記生物材料に対して液体を接触（例えば、噴霧又は滴下）させることで、該生物材料の抗氷核活性剤として利用することができる。
【００７９】
本発明の抗氷核活性剤は、さらにその他の成分を含有することができる。その他の成分としては、特に限定はなく、例えば、公知の抗氷核活性剤（例えば、特開２０１０−１２１０５２号公報に記載の抗氷核活性剤）、水、エタノール等が挙げられる。
【００８０】
本発明の抗氷核活性剤を製剤化する場合、その剤形としては、特に限定はなく、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、クリーム、軟膏等の剤形が挙げられる。
【００８１】
２．不凍性液体
本発明の不凍性液体は、上記チロシンペプチド又は該チロシンペプチドと高分子とから構成される複合体（抗氷核活性剤）、及び水を含有している。不凍性液体とは、氷の凝固点（０℃）において凍らない液体を意味する。
【００８２】
チロシンペプチド又は複合体（抗氷核活性剤）の含有量としては、特に限定はなく、通常、不凍性液体中に、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲である。また、チロシンペプチドの含有量としては、特に限定はなく、通常、不凍性液体中に、０．００１〜１００ｍＭの範囲であり、好ましくは０．１〜１０ｍＭの範囲である。
【００８３】
なお、水は、純水であってもよく、又は、水道水であってもよい。水中には、氷核活性物質が含有していてもよい。
【００８４】
氷核活性物質としては、特に限定はなく、例えば、シュードモナス属細菌、ヨウ化銀、フルオレン−９−オン、フェナジン、メタアルデヒト等が挙げられる。中でも、好ましい氷核活性物質は、シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、及びヨウ化銀である。
【００８５】
氷核活性物質は、抗氷核活性組成物中に１種単独で含まれていてもよく、又は２種以上含まれていてもよい。
【００８６】
氷核活性物質の含有量としては、特に限定はなく、通常、不凍性液体中に、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００８７】
不凍性液体中の抗氷核活性剤と氷核活性物質との配合割合は、重量比で、通常、１：１０〜１：２００であり、好ましくは１：１０〜１：１００であり、より好ましくは１：１０〜１：２０である。
【００８８】
本発明の不凍性液体中に、生物材料（例えば、食品（食用等の魚介類；野菜等の植物；牛肉、豚肉、鶏肉等の食用肉；豆腐、ヨーグルト等のタンパク質変性した加工品；飲料）、生体材料（植物又は動物の細胞（組織）；人間又は動物の臓器或いはその一部））を浸漬し、又は本発明の不凍性液体を、上記生物材料に噴霧又は滴下し、次いで冷却することにより、通常０℃以下、特に約０℃〜−１５℃の温度範囲で生物材料が凍結（破壊）せずに、又は一旦凍った場合でも、微小な氷核ができ、微小な氷結晶形成が生じることから、長期低温保存が可能である。
【００８９】
３．生物材料の抗氷核活性を向上させる方法
本発明の生物材料の抗氷核活性を向上させる方法は、上記抗氷核活性剤（過冷却促進剤）又は不凍性液体を生物材料に接触させる工程を含んでいる。
【００９０】
生物材料は、上記１及び２で説明した生物材料と同じである。
【００９１】
接触とは、上記抗氷核活性剤（過冷却促進剤）が固体である場合、この固体を生物材料に接触させる（例えば、均一に振りかける）ことで、該生物材料の水分で溶解し、抗氷核活性を示す。また、上記抗氷核活性剤（過冷却促進剤）が液体である場合又は不凍性液体を使用する場合、上記生物材料に対して液体を接触（例えば、噴霧又は滴下）させることで、該生物材料の抗氷核活性剤として利用することができる。
【００９２】
４．食品の抗氷核活性を向上させる方法
本発明の食品の抗氷核活性を向上させる方法は、上記抗氷核活性剤（過冷却促進剤）又は不凍性液体を食品に接触させる工程を含んでいる。
【００９３】
食品は、上記１及び２で説明した食品と同じである。接触とは、上記３で説明したとおりである。
【００９４】
５．生物材料の保存方法
本発明の生物材料の保存方法は、上記抗氷核活性剤（過冷却促進剤）又は不凍性液体を生物材料に接触させる工程を含んでいる。
【００９５】
生物材料は、上記１及び２で説明した生物材料と同じである。接触とは、上記３で説明したとおりである。
【００９６】
６．食品の保存方法
本発明の食品の保存方法は、上記抗氷核活性剤（過冷却促進剤）又は不凍性液体を食品に接触させる工程を含んでいる。
【００９７】
食品は、上記１及び２で説明した食品と同じである。接触とは、上記３で説明したとおりである。
【００９８】
７．用途
本発明の抗氷核活性剤（過冷却促進剤）又は不凍性液体は、食品、飲料等の品質保持剤（食品保存剤、飲料保存剤）等の食品分野；細胞保存剤、血液保存剤、臓器保存剤等の医療分野；化粧品分野；霜害防除剤、霜付着阻害剤、塗料等の環境分野等に広く適用することができる。
【００９９】
本発明の抗氷核活性剤は溶液に添加し、不凍性液体として使用することができる。この不凍性液体は、食品保存液、飲料保存液、細胞保存液、臓器保存液、霜害防除液、霜付着阻害液等として使用できる。
【０１００】
また、チロシンペプチドと高分子とから構成される複合体（過冷却促進剤）は、高分子部分を利用してガラス、金属、樹脂等の対象物に吸着固化させることができるため、霜害防除及び霜付着阻害を目的としたコーティング液の成分として特に有効である。
【０１０１】
品質保持剤（食品保存剤及び飲料保存剤）
本発明の品質保持剤（食品保存剤（食品保存液）、飲料保存剤（飲料保存液））が使用できる食品又は飲料としては、特に限定はなく、例えば、野菜、魚、肉（鶏肉、豚肉、牛肉等）等の生鮮食品；ジュース等の飲料；豆腐、高野豆腐等の加工食品等が挙げられる。
【０１０２】
本発明の品質保持剤を使用することで食品又は飲料の保存が可能であり、これら食品又は飲料を輸出入、輸送等する際、凍結保存から過冷却保存へと変換することが可能であることから、電力エネルギー等の削減が可能となる。
【０１０３】
細胞保存剤（細胞保存液）
本発明の細胞保存剤（細胞保存液）が使用できる細胞としては、植物、動物等の細胞であれば特に限定はなく、例えば、ヒト細胞、精子、卵子等が挙げられる。
【０１０４】
本発明の細胞保存剤（細胞保存液）を使用することで細胞が破壊されずに保存が可能となる。
【０１０５】
血液保存剤（血液保存液）
本発明の血液保存剤（血液保存液）が使用できる血液は、ヒト及び動物（ヒトを除く）の血液であれば特に限定はなく、例えば、全血、血漿、血清等が挙げられる。さらに、本発明の血液保存剤（血液保存液）は、血液成分である白血球、赤血球、血漿、血小板等にも使用できる。
【０１０６】
臓器保存剤（臓器保存液）
本発明の臓器保存剤（臓器保存液）が使用できる臓器としては、ヒト及び動物（ヒトを除く）の臓器又はその一部であれば特に限定はない。
【０１０７】
本発明の臓器保存剤（臓器保存液）を、臓器移植時に取り出した臓器の保存液；臓器の長期保管する際の保存液等に利用することができる。
【０１０８】
霜害防除剤（霜害防除液）
本発明の霜害防除剤（霜害防除液）は、コンピューター、車のエンジン等の冷却液；冷凍庫等の着霜防止剤；車窓ガラスの曇り防止剤；トンネル結露防止剤等に利用することもできる。
【０１０９】
本発明の抗氷核活性剤又は不凍性液体は、塗料等に混ぜて使用することができる。本発明の抗氷核活性剤を含有する塗料を用いて被覆（コーティング）された金属、樹脂等の対象物は、霜害を防除又は霜の付着を防止することができる。
【実施例】
【０１１０】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【０１１１】
＜測定機器＞
製造例において、MALDI-TOF-MAは、KRATOS  AXIMA−CFR（株式会社島津製作所製）により測定した。【０１１２】
＜原料及び試薬＞
・Fmoc-Tyr(tBu)-Alko-PEG Resin：N-α-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-O-(t-butyl)-L-tyrosine p-methoxybenzyl alcohol polyethyleneglycol resin（渡辺化学工業株式会社製）【０１１３】
【化７】
2016178426.tif 000010
【０１１４】
・Fmoc-Tyr(tBu)-OH：N-α-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-O-(t-butyl)-L-tyrosine（渡辺化学工業株式会社製）【０１１５】
【化８】
2016178426.tif 000011
【０１１６】
・DMSO：ジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社製）
・DMF：ジメチルホルムアミド（和光純薬工業株式会社製）
・PPD：ピペリジン（和光純薬工業株式会社製）
・NMM：N-メチルモルホリン（和光純薬工業株式会社製）
・DMT-MM：4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium Chloride 
・n-Hydrate（和光純薬工業株式会社製）
・TFA：トリフルオロ酢酸（和光純薬工業株式会社製）【０１１７】
製造例１（チロシン２量体）
Fmoc-Tyr(tBu)-Alko-PEG Resin 0.917 g (0.220 mmol)を25% DMSO/DMF溶液で30分間膨潤させた。その後、多量のDMFで1分間該樹脂を置換した後、DMFを除去する工程（以下、「置換する工程」という）を3回繰り返し、次いで、20% PPD/DMF溶液でFmoc-Tyr(tBu)-Alko-PEG Resin のFmoc基を除去した。その後、得られたTyr(tBu)-Alko-PEG Resinを DMFで1分間3回置換する工程、及びメタノールで1分間3回置換する工程を順次行った。【０１１８】
次いで、得られたTyr(tBu)-Alko-PEG Resinを25% DMSO/DMF溶液で30分間膨潤させた。その後、Tyr(tBu)-Alko-PEG ResinをDMFで1分間3回置換する工程を行い、さらに、該樹脂に、Fmoc-Tyr(tBu)-OH (3.0 eq)、NMM (3.0 eq)、及びDMT-MM (3.0 eq)を加えて120分間縮合反応を行った。トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム法（TNBS法）で、縮合反応の完了を確認後、DMFで1分間3回、及びメタノールで1分間3回置換する工程を順次行った後、Fmoc-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Alko-PEG Resinを得た。【０１１９】
得られたFmoc-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Alko-PEG Resinに、TFA 9.5 mL及び超純水（Milli-Q(商標)超純水製造装置、メルク株式会社製）0.5 mLを加え、脱保護反応及び脱樹脂反応を行った。得られた反応溶液にジエチルエーテル50 mLを加え、チロシン２量体及び樹脂の混合物（沈殿物）を得た。この沈殿物をろ別後、多量のTFAをろ過物に加え溶解したチロシン２量体を回収し、減圧濃縮を行った。濃縮後、残渣に水を加えて可溶部のみを回収し、チロシン２量体を水−アセトニトリルグラジエントHPLC（東ソー株式会社製、検出器UV(UV-8020)、ポンプ(DP-8020)、オートサンプラー(AS-8071)、カラム(YMC Protein-RP 250 mm×4.6 mm)）で分取し透析を行った。透析後、凍結乾燥し目的物であるチロシン２量体を得た。この化合物は、HPLCによりシングルピークであることを確認した。
チロシン２量体：
MALDI-TOF-MA：[M+H]+=508.267、[M+Na]+=530.306【０１２０】
製造例２（チロシン３量体）
上記製造例１で得られたFmoc-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Alko-PEG Resinに対して、上記製造例１で記載した方法を繰り返し、Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Alko-PEG ResinとFmoc-Tyr(tBu)-OH (3.0 eq)とを縮合反応させて、Fmoc-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Alko-PEG Resinを得た。その後、製造例１と同様の精製方法に従い、目的物であるチロシン３量体を得た。この化合物は、HPLCによりシングルピークであることを確認した。
チロシン３量体：
MALDI-TOF-MA：[M+H]+=508.267、[M+Na]+=530.306、[M+K]+=546.244【０１２１】
製造例３（チロシン４量体）
上記製造例２で得られたFmoc-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Alko-PEG Resinに対して、上記製造例１で記載した方法を繰り返し、Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Alko-PEG ResinとFmoc-Tyr(tBu)-OH (3.0 eq)とを縮合反応させて、Fmoc-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Alko-PEG Resinを得た。その後、製造例１と同様の精製方法に従い、目的物であるチロシン４量体（配列番号１）を得た。この化合物は、HPLCによりシングルピークであることを確認した。
チロシン４量体：
MALDI-TOF-MA：[M+H]+=671.257、[M+Na]+=693.713、[M+K]+=709.701【０１２２】
製造例４（チロシン５量体）
上記製造例３で得られたFmoc-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Alko-PEG Resinに対して、上記製造例１で記載した方法を繰り返し、Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Alko-PEG ResinとFmoc-Tyr(tBu)-OH (3.0 eq)とを縮合反応させて、Fmoc-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Alko-PEG Resinを得た。その後、製造例１と同様の精製方法に従い、目的物であるチロシン５量体（配列番号２）を得た。この化合物は、HPLCによりシングルピークであることを確認した。
チロシン５量体：
MALDI-TOF-MA：[M+H]+=834.893、[M+Na]+=857.210、[M+K]+=872.909【０１２３】
実施例１
上記製造例１で得られたチロシン２量体（Tyr−Tyr）を濃度が２．０ｍＭとなるように超純水（Milli-Q(商標)超純水製造装置、メルク株式会社製）で溶解させて水溶液を調製した。【０１２４】
実施例２〜４
チロシン２量体を表２に記載の抗氷核活性剤（製造例２〜４に記載のチロシンペプチド）に代えた以外は実施例１と同様の方法で、それぞれの水溶液を製造した。【０１２５】
比較例１
チロシン２量体をチロシン１量体（Tyr、和光純薬工業株式会社製）に代えた以外は実施例１と同様の方法で、それぞれの水溶液を製造した。【０１２６】
試験例１．抗氷核活性能（過冷却促進能）の評価
下記表２に記載のチロシンペプチドを含有する抗氷核活性剤（実施例１〜４）及びチロシン１量体（比較例１）に関して、下記の方法によって抗氷核活性能（過冷却促進能）を評価した。【０１２７】
ヨウ化銀の濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように、超純水にヨウ化銀を溶解させた水溶液を９００μＬ用意した。【０１２８】
それぞれの評価用サンプルは、実施例１〜４及び比較例１の水溶液１００μＬとヨウ化銀を溶解させた水溶液９００μＬとを混合することによって調製した。また、ブランクサンプルは、超純水１００μＬとヨウ化銀を溶解させた水溶液９００μＬとを混合することによって調製した。【０１２９】
抗氷核活性能（過冷却促進能）は、Ｖａｌｉの小滴凍結法によって測定した。詳しくは、Ｖａｌｉの小滴凍結法（図１）に従い、コールドプレート冷却装置（COOLACE CCA-1000, 東京理化器械社製）の銅版の上にアルミニウムのフィルムを置き、アセトン及びクロロホルム（アセトン：クロロホルム＝１：２の溶液）で希釈したシリコンオイル懸濁液をコーティングし、その表面に各評価用サンプル及びブランクサンプルを１０μＬずつ３０箇所に滴下し、毎分１．０℃の速度で温度を低下させて、３０個の小滴の５０％が凍結する温度をＴ50とする。【０１３０】
各サンプルの上記小滴凍結時の温度をＳａｍｐｌｅＴ50とし、ブランクサンプルの上記小滴凍結時の温度をＢｌａｎｋＴ50とする。そして、抗氷核活性値ΔＴ50（℃）は、下記式によって求めた。
式：ΔＴ50（℃）＝ＢｌａｎｋＴ50−ＳａｍｐｌｅＴ50【０１３１】
実施例１〜４及び比較例１の抗氷核活性剤について評価した結果を下記表２及び図２に示した。なお、結果の値は、３回の試験結果の平均値である。【０１３２】
【表２】
2016178426.tif 000012
【０１３３】
＜結果＞
実施例１〜４の抗氷核活性剤の全てが、抗氷核活性値が０よりも高く、抗氷核活性を示すことがわかった。【０１３４】
一方、比較例１のチロシン１量体は、抗氷核活性を示さなかった。【０１３５】
実施例１〜４の抗氷核活性剤のうち、チロシン３量体（実施例２）は、抗氷核活性値が一番高く、最も優れた抗氷核活性能を示した。そこで、次に、チロシン３量体の濃度の影響を下記試験例２で調べた。【０１３６】
実施例５〜１０
チロシン３量体の濃度が０．１ｍＭ（実施例５）、０．２ｍＭ（実施例６）、０．５ｍＭ（実施例７）、１．０ｍＭ（実施例８）、５．０ｍＭ（実施例９）、及び１０．０ｍＭ（実施例１０）となるように超純水で溶解させて水溶液を調製した。【０１３７】
試験例２．チロシン３量体の濃度の影響
チロシン３量体を含有する抗氷核活性剤について、その濃度が抗氷核活性に与える影響を調べた。【０１３８】
ヨウ化銀濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように、超純水にヨウ化銀を溶解させた水溶液を９００μＬ用意した。【０１３９】
それぞれの評価用サンプルは、実施例２及び５〜１０の水溶液１００μＬとヨウ化銀を溶解させた水溶液９００μＬを混合することによって調製した。また、ブランクサンプルは、超純水１００μＬとヨウ化銀を溶解させた水溶液を混合することによって調製した。【０１４０】
抗氷核活性能（過冷却促進能）は、上記試験例１に示したＶａｌｉの小滴凍結法によって測定した。実施例２及び５〜１０の抗氷核活性剤について評価した結果を下記表３及び図３に示した。なお、結果の値は、３回の試験結果の平均値である。【０１４１】
【表３】
2016178426.tif 000013
【０１４２】
＜結果＞
チロシン３量体は、その濃度が０．１ｍＭ〜１０．０ｍＭの範囲（実施例２及び５〜１０）において、全て抗氷核活性能を有することが分かった。中でも、チロシン３量体の濃度が２．０ｍＭ（１．０ｍｇ／ｍＬ）（実施例２）の場合に、最も優れた抗氷核活性値（１０．１℃）を示した。【０１４３】
試験例３．チロシン３量体以外のアミノ酸１量体又はアミノ酸３量体の抗氷核活性試験
チロシン３量体以外のアミノ酸３量体、及びアミノ酸１量体の抗氷核活性能を調べた。【０１４４】
チロシン３量体を、フェニルアラニン３量体（Phe−Phe−Phe、フナコシ株式会社製、比較例３）、セリン３量体（Ser−Ser−Ser、フナコシ株式会社製、比較例５）又はトレオニン３量体（Thr−Thr−Thr、フナコシ株式会社製、比較例７）に代えた以外は、試験例１と同様の方法で、抗氷核活性試験を行った。【０１４５】
チロシン３量体を、チロシン１量体（Tyr、和光純薬工業株式会社製、比較例２）、フェニルアラニン１量体（Phe、和光純薬工業株式会社製、比較例４）、セリン１量体（Ser、和光純薬工業株式会社製、比較例６）又はトレオニン１量体（Thr、和光純薬工業株式会社製、比較例８）に代えた以外は、試験例１と同様の方法で抗氷核活性試験を行った。【０１４６】
その結果を下記表４及び図４に示した。なお、結果の値は、３回の試験結果の平均値である。【０１４７】
【表４】
2016178426.tif 000014
【０１４８】
＜結果＞
チロシン３量体（実施例２）は、チロシン１量体（比較例２）に比べて、抗氷核活性値が著しく向上した。【０１４９】
一方、チロシン３量体以外の、フェニルアラニン３量体（比較例３）、セリン３量体（比較例５）及びトレオニン３量体（比較例７）は、それぞれの１量体（比較例４、６及び８）に比べて、抗氷核活性値は向上しなかった。【０１５０】
試験例４．氷核活性物質の種類の影響
氷核活性物質であるヨウ化銀を、シュードモナス細菌であるシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)に代えた以外は試験例１と同様の方法で、実施例１の評価用サンプルを調製した。上記試験例１と同様の試験方法で、抗氷核活性能（過冷却促進能）を測定した結果、チロシン３量体を含有する抗氷核活性剤は、ヨウ化銀以外に、シュードモナス・フルオレッセンスに対しても、抗氷核活性能（１．９℃）を示した。その結果を図５に示した。なお、結果の値は、３回の試験結果の平均値である。【０１５１】
試験例５．生物材料（牛レバー）に対する抗氷核活性試験
牛レバー（縦１ｍｍ×横１ｍｍ×高さ１ｍｍ）の上に、実施例２（チロシン３量体）の抗氷核活性剤の水溶液を超純水で１０倍希釈した水溶液（終濃度０．２ｍＭ）を１０μＬ滴下した。ブランクサンプルとしては超純水を使用した。【０１５２】
抗氷核活性能（過冷却促進能）は、上記試験例１に示したＶａｌｉの小滴凍結法と同様の方法で測定した。なお、結果の値は、３回の試験結果の平均値である。【０１５３】
その結果、実施例２（チロシン３量体）の抗氷核活性剤の抗氷核活性値は、０．６℃であり、実施例２のチロシン３量体は、抗氷核活性を有していた。【０１５４】
試験例６．生物材料（豆腐）に対する抗氷核活性試験
６−１．凍結解凍後の豆腐の状態及び豆腐の破断荷重
絹ごし豆腐（縦１．５ｍｍ×横１．５ｍｍ×高さ１．５ｍｍ）を、比較例９（水、ブランク）、及び実施例１（チロシン２量体）の溶液に、それぞれ一晩浸漬した。その後、豆腐を溶液から取り出し、水気を拭き取った後、ラップ（プラスチックラップ）で包んだ。そして、ラップで包まれた豆腐を、液体窒素に浸漬して急速凍結させた。その後、凍結された豆腐を、緩慢解凍（２５℃加温）、又は急速解凍（６０℃加温）させた。解凍後の豆腐の鬆（す）の状態（写真）と豆腐の破断荷重（Ｎ）を図６に示した。豆腐の破断荷重（Ｎ）は、クリープメーター(RE2-33005C、株式会社山電製）で測定した。【０１５５】
＜結果＞
図６の結果から、実施例１の豆腐の破断荷重は、比較例９の豆腐の破断荷重に比べて、緩慢解凍及び急速解凍のいずれの場合も低く、このことは豆腐に鬆（す）が入っていないことを示している。したがって、実施例１のチロシン２量体は、抗氷核活性を有していることが分かった。【０１５６】
６−２．１ヶ月冷凍保存後の豆腐の観察
上述の急速凍結した豆腐（実施例１、２及び比較例９）を１ヶ月間、−２０℃で冷凍保存した。その後、凍結された豆腐を、緩慢解凍（２５℃加温）、又は急速解凍（６０℃加温させた。解凍後の豆腐の状態（ＳＥＭ写真）を図７に示した。ＳＥＭ写真は、以下、ＳＥＭ（走査型顕微鏡）（株式会社日立製作所、Ｓ−３０００Ｎ）を用いて撮影したものである。なお、ＳＥＭ写真の白いバーは、１００μｍを示している。【０１５７】
＜結果＞
図７の写真のとおり、実施例１（チロシン２量体）及び実施例２（チロシン３量体）の溶液に浸漬させた豆腐は、比較例９（ブランク）の溶液に浸漬させた豆腐に比べて、緩慢解凍又は急速解凍のいずれの場合においても、豆腐に鬆（す）が入らず、豆腐の組織が密な状態を保っていた。【０１５８】
６−３．凍結時の豆腐の観察
比較例９（ブランク）、及び実施例２（チロシン３量体）の溶液にそれぞれ一晩浸漬した絹ごし豆腐（縦１．５ｍｍ×横１．５ｍｍ×高さ１．５ｍｍ）を、−２０℃で緩慢凍結、又は液体窒素で急速凍結した後の、凍結時の豆腐の状態（ＳＥＭ写真）を図８に示した。なお、ＳＥＭ写真の白いバーは、１００μｍを示している。【０１５９】
＜結果＞
実施例２（チロシン３量体）の溶液で浸漬させた豆腐は、比較例９（ブランク）の溶液に浸漬させた豆腐に比べて、緩慢凍結又は急速凍結のいずれの場合においても、豆腐に鬆（す）が入らず、凍結時の組織の状態が密な状態を維持していた。【０１６０】
試験例７．豆腐の冷却曲線
比較例９（ブランク）、実施例１（チロシン２量体）及び実施例２（チロシン３量体）の溶液にそれぞれ一晩浸漬した絹ごし豆腐（縦１．５ｍｍ×横１．５ｍｍ×高さ１．５ｍｍ）を冷却した。【０１６１】
豆腐に熱電対温度計（HORIBA製）を差し込み、−２０℃の冷凍庫内で、２０秒ごと温度を測定し、温度（℃）と冷却時間（秒）との関係を冷却曲線（図９）とした。また、豆腐が凍結をし始めた温度（凍結開始温度）、豆腐が完全に凍った温度、及び豆腐が完全に凍るまでの時間を下記表５及び図９に示した。【０１６２】
【表５】
2016178426.tif 000015
【０１６３】
＜結果＞
本発明のチロシン２量体及びチロシン３量体を含む豆腐は、抗氷核活性剤を含まない豆腐（比較例９）に比べて、凍結し始めた温度、及び完全に凍る温度が低く、また、完全に凍るまでの時間も長くなった。この結果は、本発明のチロシン２量体及びチロシン３量体が、豆腐に対して抗氷核活性能を有することを示している。【０１６４】
製造例５（P4VP (ポリ４−ビニルピリジン)-GGGYYY）
カラムにFmoc-Tyr(tBu)-Alko-PEG Resin 0.200 mmol (0.870 g)を入れた。そのカラムに反応溶媒であるDMFを加え、1分間撹拌した。これを3回繰り返した。次にメタノールをカラムに加え、1分間撹拌し洗浄した。これを3回繰り返した。次に25% DMSO/DMFをカラムに加え、30分間撹拌し膨潤させた。30分後、DMFで1分間撹拌し、これを3回繰り返した後、20% ピペリジン/DMFをカラムに加え、30分間撹拌し、Fmoc基の脱保護反応を行った。30分後、DMFとメタノールとで洗浄を行った。TNBS 20%、PBS 40%、及びNaHCO3 40%の混合溶液に少量の試料を入れ呈色を確認し、それを脱保護の完了を示すものとした。【０１６５】
次に25% DMSO/DMFで30分間膨潤させた後、DMFで洗浄した。Fmoc-Tyr(tBu)-OH 0.600 mmol (0.276 g)、DMT-MM 3.00 g、NMM 0.060 mL、及びDMFをカラムに加えて、2時間縮合した。縮合後、DMFとメタノールとで洗浄を行った。また、先のFmoc基の脱保護の確認と同様に、混合溶液に少量の試料を加え、呈色しないことを確認し、それを縮合の完了を示すものとした。【０１６６】
この手順を繰り返し、Fmoc-Gly-OH 0.600 mmol (0.178 g)(渡辺化学工業株式会社製)を用いて目的のペプチドH-GGGYYY-Alko-PEG-Resinを合成した。【０１６７】
合成したH-GGGYYY-Alko-PEG-Resinに、重合の開始剤であるACVA 0.600 mmol (0.168 g)(和光純薬工業株式会社製)を同様の手順で3時間縮合した。縮合後、DMFとメタノールとで洗浄した後、DCMで膨潤させ、減圧乾燥させた。開始剤を縮合させたACVA-GGGYYY-Alko-PEG-ResinをDMFに加えて、ペプチド量を1等量とし、モノマー ４−ビニルピリジン(4-VP)(和光純薬工業株式会社製)を必要量加え、重合時間を変えて、窒素雰囲気下、70℃のウォーターバス中で重合させた。重合後、カラムに移し替え、DMFとメタノールとで洗浄した後、減圧乾燥させた。【０１６８】
次に、精製水0.5 mL及びTFA 9.5 mLの混合溶液をアイスバス中で10分間撹拌した。その混合溶液をアイスバスから取り出し、合成したハイブリッドポリマーに加え、サンプル管内で100分間撹拌した。攪拌後ジエチルエーテルを加えてアイスバス中で10分間撹拌し、結晶化させた。沈殿を吸引濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。沈殿を10%酢酸に溶解し透析を行った。透析膜内に白色の沈殿が見られたら、その溶液をナスフラスコへ移し凍結乾燥を行い目的物を得た。【０１６９】
製造例６（P4VP-YYY）
H-GGGYYY-Alko-PEG-Resinに代えて、H-YYY-Alko-PEG-Resinを使用した以外は製造例５と同様の方法でP4VP-YYYを合成した。【０１７０】
製造例７（P4VP）
ACVAを反応溶媒DMFに溶解させ、ACVA 1等量に対してモノマー4-VPを必要量加えて窒素雰囲気下、70℃で重合させた。水を加えることで析出した沈殿物を吸引濾過しながら洗い、10%酢酸に溶解し、透析を行った。透析膜内に白色の沈殿が見られたら、その溶液をナスフラスコへ移し凍結乾燥を行い目的物を得た。【０１７１】
以下の表６に得られた製造例５〜７で得られた化合物の分子量を示す。なお、特に断りがない限り、以後の試験例には表６に記載の化合物を使用した。【０１７２】
【表６】
2016178426.tif 000016
Mn：数平均分子量
Mw：重量平均分子量【０１７３】
試験例８．ガラスへの複合体吸着固定化
直径13 mmのカバーガラスを、濃硫酸：30%過酸化水素＝7 : 3で混合したピラニア溶液に2時間浸漬し、カバーガラス表面の有機物を除去した。次に、カバーガラスを超純水、メタノールそれぞれで洗浄した。その後、ウェルプレートに入れ、終夜減圧乾燥させた。【０１７４】
カバーガラス表面に吸着固定化させる試料P4VP-GGGYYY (Mw:36000, 46000, 54000)を10%酢酸に溶解させ、1 mmol/Lの濃度にした。その溶液を減圧乾燥させていたカバーガラス1枚にウェルプレート上で500μL滴下し、終夜浸漬した。1日後、溶液を吸い取り、ウェルプレート内を超純水で3回ずつ洗浄した。その後、再度減圧乾燥を行った。【０１７５】
吸着固定化の確認のため、カバーガラスの表面をX光電子分光分析装置(株式会社島津製作所、ESCA-3400HSE)によって解析した。また、ブランクサンプルとして、ピラニア処理のみを行なったカバーガラス、P4VP-GGGYYYに代えてGGGYYYを10%酢酸に溶解させた溶液に浸漬させたカバーガラスの2種類を用いた。その結果を図１０に示した。【０１７６】
＜結果＞
図１０の結果から、炭素(C1s)について、ピラニア処理及びペプチドのみと比べてP4VP-GGGYYYの方が大きいピークが出ていた。窒素(N1s)について、ピラニア処理及びペプチドのみはピークが検出できないが、P4VP-GGGYYYはピークが出ていた。したがって、ガラス表面に複合体を固定化できていることが分かった。【０１７７】
実施例１１、比較例１０
P4VP-GGGYYY（実施例１１）、グリシン３量体(GGG)（比較例１０）の濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように超純水で溶解させて水溶液を調製した。【０１７８】
試験例９．水溶液中での複合体の抗氷核活性試験
水溶液中での複合体の抗氷核活性能を調べた。【０１７９】
ヨウ化銀濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように、超純水にヨウ化銀を溶解させた水溶液を９００μＬ用意した。【０１８０】
それぞれの評価用サンプルは、実施例２、１１及び比較例１０の水溶液１００μＬとヨウ化銀を溶解させた水溶液９００μＬとを混合することによって調製した。また、ブランクサンプルは、超純水１００μＬとヨウ化銀を溶解させた水溶液９００μＬとを混合することによって調製した。【０１８１】
抗氷核活性能（過冷却促進能）は、上記試験例１に示したＶａｌｉの小滴凍結法によって測定した。実施例２、１１及び比較例１０の抗氷核活性剤について評価した結果を図１１に示した。なお、結果の値は、３回の試験結果の平均値である。【０１８２】
＜結果＞
P4VP-GGGYYYが水溶液中において抗氷核活性能を示すことが分かった。【０１８３】
実施例１２、比較例１１
P4VP-GGGYYYに代えて、P4VP-YYY（実施例１２）、P4VP（比較例１１）を使用した以外は試験例８と同様の方法でこれらをカバーガラスの表面に固定化した。【０１８４】
試験例１０．ガラス表面での複合体の抗氷核活性試験
P4VP（比較例１１）、P4VP-YYY（実施例１２）、又はP4VP-GGGYYY（実施例１３）がガラス表面に固定化された直径１３ｍｍのカバーガラスをコールドプレート冷却装置上に敷いたアルミ箔の上に４枚置いた。１．０ｍｇ／ｍＬのヨウ化銀水溶液をピペットマンで１００μＬ取り、カバーガラス１枚に３滴ずつ、合計で１２滴滴下した。２Ａの電流で徐々に温度を下げ、１２滴全てに霜が見られた温度をサンプルの凝固点とした。また、ピラニア処理のみを行なったカバーガラスをブランクとして用いた。サンプルとブランクとの凝固点の差を抗氷核活性値とした。結果を図１２に示した。なお、結果の値は、３回の試験結果の平均値である。【０１８５】
＜結果＞
P4VP-GGGYYYが最も抗氷核活性能が高かった。このことから、ガラス表面からペプチドが長く伸びている方が活性が高くなることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明の抗氷核活性剤は、食品、飲料等の品質保持剤等の食品分野；細胞保存剤、血液保存剤、臓器保存剤等の医療分野；化粧品分野；霜害防除剤、霜付着阻害剤、塗料等の環境分野等に広く適用することができる。
【図１】
2016178426.tif 000019
【図２】
2016178426.tif 000020
【図３】
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【図４】
2016178426.tif 000022
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2016178426.tif 000028
【図１１】
2016178426.tif 000029
【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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