(57)【要約】  モノグリセリンジカプリル酸エステル及び／又はジグリセリンジカプリル酸エステルを有効成分として含むバイオフィルム形成抑制剤は、微生物を殺菌することなく、バイオフィルムの形成を抑制することができるバイオフィルム形成抑制剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
モノグリセリンジカプリル酸エステル及び／又はジグリセリンジカプリル酸エステルを有効成分として含むことを特徴とするバイオフィルム形成抑制剤。
【請求項２】
請求項１に記載のバイオフィルム形成抑制剤を含有することを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物。
【請求項３】
モノグリセリンジカプリル酸エステル及び／又はジグリセリンジカプリル酸エステルを用いることを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物によるバイオフィルムの形成を抑制するために用いるバイオフィルム形成抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオフィルムとは、細菌やカビ等の微生物が固体や液体の表面に付着することによって形成される微生物集合体であり、様々な環境に存在する。このバイオフィルムと呼ばれる微生物集合体は、日常生活の分野、食品産業の分野及び医療の分野等、各分野において深く関与して多くの問題を引き起こしている。例えば、日常生活の分野においては、台所、浴室、トイレ等の排水口に存在するヌメリもバイオフィルムであり、悪臭の要因となることが指摘されている。食品産業の分野においては、各種配管や各種製造設備等に微生物が付着してバイオフィルムを形成し、微生物汚染の要因になることが指摘されている。医療の分野に関しては、カテーテル内部やコンタクトレンズ、義歯等にバイオフィルムが形成され、感染症を引き起こす要因となることが指摘されている。【０００３】
特に、義歯の汚れは義歯性口内炎だけでなく口角炎などを引き起こすことも指摘され、更に、バイオフィルムの形成（デンチャープラークの堆積）が助長され、ますます口腔内環境が悪化することも指摘されている。そして、このバイオフィルムには高頻度でカンジダ菌が検出されることが報告されている。【０００４】
一般にバイオフィルムは、一度形成されると薬剤の浸透率低下や熱耐性を有するようになり、薬剤処理や加熱処理による除去が難しいとされる。最も効果的な手法としては、ブラッシング等による物理的除去とされているが、細部への物理的除去は困難とされ、問題視されているのが現状である。他のバイオフィルムの除去方法として、一般的な殺菌剤を用いる方法、バイオフィルム溶解物質を用いる方法、或いはこれらを併用する方法が提案されている。しかし、殺菌剤を多用した場合、或いは、高濃度の殺菌剤を使用した場合、薬剤耐性菌の出現や、殺菌効果による口腔内の菌環境の変化による菌交代症の発症、副作用の発現など、人体に対して様々な影響を与える可能性がある。従って、バイオフィルムを形成する微生物を殺菌するのではなく、バイオフィルムの形成そのものを抑制することが効果的であるといえる。【０００５】
バイオフィルムの形成そのものを抑制する従来技術としては、モノグリセリンモノカプリル酸エステルを含む炭素数７〜１４の飽和脂肪酸残基を有するモノグリセリンモノ脂肪酸エステル、ジグリセリンモノラウリン酸エステルを有効成分とする、カンジダ菌によるバイオフィルムの形成を抑制するためのバイオフィルム抑制剤（特許文献１）が開示されている。しかし、特許文献１の表２から、グリセリルジラウレート（モノグリセリンジ脂肪酸エステル）は、グリセリルモノラウレート（モノグリセリンモノ脂肪酸エステル）と比較してバイオフィルム抑制力が低いこと、即ち、モノグリセリン脂肪酸エステルを構成する脂肪酸が２分子の場合は好ましくないことが知られている。さらには、特許文献１の表２から、ジグリセリルモノカプリレート（ジグリセリンモノカプリル酸エステル）のバイオフィルム抑制力が低いこと、即ちジグリセリン脂肪酸エステルを構成する脂肪酸としてカプリル酸は好ましくないことが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３‐２３１００２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、微生物を殺菌することなく、バイオフィルムの形成を抑制することができるバイオフィルム形成抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決する為に鋭意研究を重ねた結果、モノグリセリンジカプリル酸エステル及び／又はジグリセリンジカプリル酸エステルが上記課題を解決することを見出した。本発明者は、これらの知見に基づき更に研究を重ね、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記の構成を包含する。
［１］モノグリセリンジカプリル酸エステル及び／又はジグリセリンジカプリル酸エステルを有効成分として含むことを特徴とするバイオフィルム形成抑制剤。
［２］上記［１］に記載のバイオフィルム形成抑制剤を含有することを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物。
［３］モノグリセリンジカプリル酸エステル及び／又はジグリセリンジカプリル酸エステルを用いることを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する方法。
［４］微生物とモノグリセリンジカプリル酸エステル及び／又はジグリセリンジカプリル酸エステルとを接触させることを特徴とするバイオフィルム形成を抑制する方法。
［５］バイオフィルム形成を抑制するために使用するモノグリセリンジカプリル酸エステル及び／又はジグリセリンジカプリル酸エステル。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、カンジダ菌を殺菌することなく、カンジダ菌に由来するバイオフィルムの形成を抑制することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤の有効成分であるモノグリセリンジカプリル酸エステルは、１分子のモノグリセリンと２分子のカプリル酸とがエステル結合したものである。
【００１１】
モノグリセリンジカプリル酸エステルは、モノグリセリンジカプリル酸エステルを含む混合物であってもよく、例えば、モノグリセリンとカプリル酸とのエステル化物、或いはモノグリセリン又はモノグリセリンモノカプリル酸エステルとモノグリセリントリカプリル酸エステルとのエステル交換された生成物が挙げられる。これらは、通常はモノグリセリンジカプリル酸エステルの他に、モノグリセリンモノカプリル酸エステル、モノグリセリントリカプリル酸エステル、モノグリセリン、カプリル酸等を含む混合物であってよい。
【００１２】
モノグリセリンジカプリル酸エステルを含む混合物としては、好ましくは、エステル中のジエステル含量が４０重量％以上であり、より好ましくはジエステル含量が７０重量％以上である。
【００１３】
モノグリセリンジカプリル酸エステルの製造方法に特に制限はなく、公知方法又は自体公知の方法により製造することができるが、一般的にはモノグリセリンとカプリル酸とのエステル化反応によって製造することができる。
【００１４】
モノグリセリンジカプリル酸エステルの原料として用いられるカプリル酸としては、食用可能な動植物油脂を起源とするものであれば特に制限はないが、純度が５０％以上のものが好ましい。純度が５０％未満であると、本発明のバイオフィルム形成抑制効果が十分に発揮されない虞がある。なお、カプリル酸は化学合成によって得られるカプリル酸であってもよい。
【００１５】
モノグリセリンジカプリル酸エステルのエステル化反応による製造方法は以下の通り例示される。例えば、撹拌機、加熱用ジャケット、邪魔板等を備えた通常の反応容器に、モノグリセリンとカプリル酸とを１．０：０．７５〜１．０：２．１のモル比で仕込み、通常触媒としてアルカリ（例えば水酸化ナトリウム等）を加えて撹拌混合し、窒素ガス雰囲気下でエステル化反応により生成する水を系外に除去しながら、所定温度で加熱する。反応温度は通常、約１８０〜２６０℃の範囲、好ましくは約２００〜２５０℃の範囲である。また、反応圧力条件は常圧下又は減圧下で、反応時間は約０．５〜１５時間、好ましくは約１〜３時間である。反応の終点は、通常反応混合物の酸価を測定し、約３以下を目安に決められる。得られる反応液は、未反応のカプリル酸、未反応のモノグリセリン、モノグリセリンモノカプリル酸エステル、モノグリセリンジカプリル酸エステル、モノグリセリントリカプリル酸エステル等を含む混合物である。これを本発明で使用してもよい。
【００１６】
エステル化反応終了後、所望により反応混合物中に残存する触媒を中和してもよい。その際、エステル化反応の温度が２００℃以上の場合は、液温を１８０〜２００℃に冷却してから中和処理を行うのが好ましい。中和後、好ましい実施態様として、得られた反応混合物中から未反応のモノグリセリン及びトリグリセライドを可及的に除去することにより得ることができる。前記未反応のグリセリン及びトリグリセライドを除去する方法としては、例えば減圧蒸留、分子蒸留、カラムクロマトグラフィー又は液液抽出等の自体公知の方法が挙げられる。グリセリン及びトリグリセライド除去後、所望により脱色、脱臭等の処理を行ってよい。
【００１７】
モノグリセリンジカプリル酸エステルは、市販されているものを用いることができ、例えば、サンファットＧＤＣ−Ｓ（商品名；太陽化学社製  ジエステル含量７５％）等が挙げられる。
【００１８】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤の有効成分であるジグリセリンジカプリル酸エステルは、１分子のジグリセリンと２分子のカプリル酸とがエステル結合したものである。
【００１９】
ジグリセリンジカプリル酸エステルは、ジグリセリンジカプリル酸エステルを含む混合物であってもよく、例えば、ジグリセリンとカプリル酸とのエステル化物が挙げられる。これらは、通常、ジグリセリンジカプリル酸エステルの他に、ジグリセリンモノカプリル酸エステル、ジグリセリントリカプリル酸エステル、ジグリセリンテトラカプリル酸エステル、ジグリセリン、カプリル酸等を含む混合物である。
【００２０】
ジグリセリンジカプリル酸エステルを含む混合物としては、好ましくは、エステル中のジエステル含量が２０％以上であり、より好ましくはジエステル含量が３５％以上である。
【００２１】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤の原料として用いられるジグリセリンとしては、通常グリセリンに、好ましくは少量の酸又はアルカリを触媒として添加し、窒素又は二酸化炭素等の任意の不活性ガス雰囲気下で、例えば約１８０℃以上の温度で加熱し、重縮合反応させて得られるグリセリンの平均重合度が約１．５〜２．４、好ましくは平均重合度が約２．０のジグリセリン混合物が挙げられる。また、ジグリセリンはグリシドール又はエピクロルヒドリン等を原料として得られるものであっても良い。反応終了後、必要であれば中和、脱塩、脱色等の処理を行ってよい。
【００２２】
本発明においては、上記ジグリセリン混合物を、例えば蒸留又はカラムクロマトグラフィー等を用いる公知方法又は自体公知の方法を用いて精製し、グリセリン２分子からなるジグリセリンを約５０質量％以上、好ましくは約８５質量％以上に高濃度化した高純度ジグリセリンが、好ましく用いられる。
【００２３】
ジグリセリンジカプリル酸エステルの原料として用いられるカプリル酸としては、食用可能な動植物油脂を起源とするものであれば特に制限はないが、純度が５０％以上のものが好ましい。純度が５０％未満であると、本発明のバイオフィルム形成抑制効果が十分に発揮されない虞がある。なお、カプリル酸は、化学合成で得られるものであってもよい。
【００２４】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤の有効成分であるジグリセリンジカプリル酸エステルのエステル化反応による製造方法を例示すれば以下の通りである。例えば、攪拌機、加熱用のジャケット又は邪魔板等を備えた通常の反応容器に、ジグリセリンとカプリル酸を約１．０：０．７〜１．０：２．５、のモル比で仕込み、通常触媒として水酸化ナトリウムを加えて攪拌混合し、窒素ガス雰囲気下で、エステル化反応により生成する水を系外に除去しながら、所定温度で加熱する。前記所定温度は通常、約１８０〜２６０℃の範囲、好ましくは約２００〜２５０℃の範囲である。また、反応における圧力条件は減圧下又は常圧下で、反応時間は約０．５〜１５時間、好ましくは約１〜３時間である。反応の終点は、通常反応混合物の酸価を測定し、酸価約３以下を目安とするのが好ましい。得られた反応液は、未反応のカプリル酸、未反応のジグリセリン、ジグリセリンモノカプリル酸エステル、ジグリセリンジカプリル酸エステル、ジグリセリントリカプリル酸エステル及びジグリセリンテトラカプリル酸エステル等を含む混合物である。この混合物を本発明で使用してもよい。
【００２５】
エステル化反応終了後、所望により反応混合物中に残存する触媒を中和してもよい。その際、エステル化反応の温度が約２００℃以上の場合は、液温を約１８０〜２００℃に冷却してから中和処理を行うのが好ましい。中和後、得られた反応混合物を、所望により冷却して、約１００〜１８０℃、好ましくは約１３０〜１５０℃に保ち、好ましくは約０．５時間以上、更に好ましくは約１〜１０時間放置するのが好ましい。未反応のジグリセリンが下層に分離した場合はそれを除去するのが好ましい。
【００２６】
上記処理により得られたジグリセリンジカプリル酸エステルは、ジエステル体の含有量が通常約２０％以上４０％未満のものであるが、所望により、該ジグリセリンジカプリル酸エステルを、例えば流下薄膜式分子蒸留装置又は遠心式分子蒸留装置等を用いて分子蒸留するか、又はカラムクロマトグラフィーもしくは液液抽出等自体公知の方法を用いて精製することにより、全体に対してジエステル体を約５０％以上、好ましくは約７０％以上含むジグリセリンジカプリル酸エステルを得ることもできる。また所望により、蒸留後脱色、脱臭等の処理を行ってよい。
【００２７】
ジグリセリンジカプリル酸エステルは、市販されているものを用いることができ、例えば、ポエムＦＢ‐２８（商品名；理研ビタミン社製  ジエステル含量３８％）が挙げられる。
【００２８】
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、有害微生物、特にカンジダ菌に由来するバイオフィルムの形成抑制に有効である。対象となるカンジダ菌は特に制限はなく、カンジダ属に属する真菌全般を指し、具体的には例えば、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラシロシス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイなどが挙げられる。
【００２９】
バイオフィルム形成抑制剤を含有するバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物も本発明の形態の１つである。
【００３０】
バイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物としては、本発明のバイオフィルム形成抑制剤であるモノグリセリンジカプリル酸エステル及び／又はジグリセリンジカプリル酸エステルを含有する、例えば、練歯磨、液状歯磨、泡状歯磨等の歯磨剤、入歯安定剤、歯肉マッサージクリーム、局所塗布剤、洗口剤、マウスウォッシュ、口中清涼剤、タブレット、口腔用ウエットティッシュ、口腔湿潤用ジェル剤等が挙げられる。
バイオフィルム形成抑制剤を含有するバイオフィルム形成を抑制する食品も本発明の形態の１つである。バイオフィルム形成を抑制する食品としては、本発明のバイオフィルム形成抑制剤であるモノグリセリンジカプリル酸エステル及び／又はジグリセリンジカプリル酸エステルを含有する、例えば、トローチ剤、チューインガム、フィルム状食品等が挙げられる。これらはデンチャープラークの堆積等を防止することができる。
この他、バイオフィルム形成抑制剤を含有するバイオフィルム形成を抑制する化粧品、医薬部外品、医薬品等も本発明の形態に包含される。
【００３１】
上記したバイオフィルム形成を抑制する口腔用組成物、食品、化粧品、医薬部外品、医薬品等に含まれるバイオフィルム形成抑制剤の配合量は、有効成分であるモノグリセリンジカプリル酸エステル及び／又はジグリセリンジカプリル酸エステルとして、好ましくは０．０００１〜５．０質量％であり、より好ましくは０．０００５〜１．０質量％である。０．０００１質量％未満であるとバイオフィルム形成抑制効果が不十分である場合があり、５．０質量％を超えると風味に悪影響を与える場合がある。
【００３２】
以下に本発明を実施例で説明するが、これは本発明を単に説明するだけのものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００３３】
＜本発明品及び参考例品＞
［本発明品］
本発明品として、下記に示す本発明品１、２、３及び４を用いた。
本発明品１：モノグリセリンジカプリル酸エステル（商品名：サンファットＧＤＣ−Ｓ；太陽化学社製）
本発明品２：ジグリセリンジカプリル酸エステル（下記方法で作製したもの）
本発明品３：ジグリセリンジカプリル酸エステル（下記方法で作製したもの）
本発明品４：本発明品１及び２の混合品（本発明品１及び２を質量比１：１で混合したもの）
［参考例品］
参考例品として、下記に示す参考例品１及び２を用いた。
参考例品１：モノグリセリンジラウリン酸エステル（商品名：α，α'-ジラウリン（試薬）；東京化成工業社製  純度９６％以上）
参考例品２：ケトコナゾール（商品名：Ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ；ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）【００３４】
［本発明品２の作製］
先ず、攪拌機、温度計、ガス吹込管及び水分離器を取り付けた反応釜にグリセリン２０ｋｇを仕込み、触媒として水酸化ナトリウム２０ｗ／ｖ％水溶液１００ｍＬを加え、窒素ガス気流中２５０℃で４時間グリセリン縮合反応を行った。得られた反応生成物を約９０℃まで冷却し、リン酸約２０ｇを添加して中和した後ろ過し、ろ液を１６０℃、２５０Ｐａの条件下で減圧蒸留してグリセリンを除き、続いて２００℃、２０Ｐａの高真空条件下で真空蒸留してグリセリン３％、ジグリセリン９２％、トリグリセリン５％を含む留分（ジグリセリン混合物）約３．０ｋｇを得た。次に、留分に対して１質量％の活性炭を加え、減圧下にて脱色処理した後ろ過した。得られたジグリセリンは、水酸基価が約１３５９、平均重合度が約２．０であり、ジグリセリンの含有量は９８質量％であった。
次に、撹拌機、温度計、ガス吹込管及び水分離器を取り付けた５００ｍＬの四つ口フラスコに、上記方法で得たジグリセリン１７６．６ｇ（約１．０６モル）及びカプリル酸（商品名：ＮＡＡ−８２；日油社製）１２３．４ｇ（約０．８６モル）を仕込み、触媒として水酸化ナトリウム１０ｗ／ｖ％水溶液１．５ｍＬを加え、常圧下、窒素ガス気流中、２００℃で１時間エステル化反応した後、更に温度を２３０℃に上げ、酸価１．０以下となるまで約２時間エステル化反応を行った。得られた反応混合物を冷却して本発明品２約２７０ｇを得た。【００３５】
［本発明品３の作製］
上記方法で得られた本発明品２（１００ｇ）にヘキサン１００ｇを加え、分液ロートにて混和した。その後、２０質量％含水メタノール５０ｇを加えて混和し、下相（水相）を分取して水相部１を得た。次いで、残った上相に２０質量％含水メタノール５０ｇを加えて混和し、下相を分取して水相部２を得た。この作業を更に５回繰り返し、水相部３〜７を得、水相部４〜７を１つにまとめた。得られた水相部４〜７（合計２３０ｇ）にヘキサン７０ｇを加えて混和し、分取した下相からロータリーエバポレーターを用いて溶媒を減圧留去し、本発明品３を約１４ｇ得た。【００３６】
本発明品１、２及び３に含まれるモノエステル、ジエステル及びトリエステルの各形態のエステル含量をまとめたものを表１に示す。なお、各形態のエステル含量の測定方法は、下記方法で行った。【００３７】
［各形態のエステル含量測定法］
ＨＰＬＣを用いてエステル組成分析を行い、定量は絶対検量線法により行った。即ち、データ処理装置によってクロマトグラム上に記録された被検試料の各形態のエステル体に相当するピーク面積を測定し、順相系カラムクロマトグラフィーにより精製したモノグリセリンモノステアリン酸エステル、ジグリセリンモノステアリン酸エステル、又はトリグリセリンモノステアリン酸エステルを標準試料として作成した検量線から、被検試料の各形態のエステル含量を求めた。ＨＰＬＣ分析条件を以下に示した。【００３８】
［ＨＰＬＣ分析条件］
装置          島津高速液体クロマトグラフ
ポンプ（型式：ＬＣ−１０Ａ；島津製作所社製）
カラムオーブン（型式：ＣＴＯ−１０Ａ；島津製作所社製）
データ処理装置（型式：Ｃ−Ｒ７Ａ；島津製作所社製）
カラム        ＧＰＣカラム（型式：ＳＨＯＤＥＸ  ＫＦ−８０２；昭和電工社製）
２本連結
移動相        ＴＨＦ
流量          １．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出器        ＲＩ検出器（型式：ＲＩＤ−６Ａ；島津製作所社製）
カラム温度    ４０℃
検液注入量    １５μＬ（ｉｎ  ＴＨＦ）【００３９】
【表１】
2016152273.tif 000002
【００４０】
＜バイオフィルム形成抑制効果の評価＞
本発明品１、２、３、４、参考例品１、２のそれぞれを用いて、供試菌（カンジダ・アルビカンス  ＮＢＲＣ  １５９４株）に由来するバイオフィルムの形成抑制効果の評価を行った。【００４１】
（１）供試菌液の調整
１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌したポテトデキストロース寒天培地（ＤＩＦＣＯ社製）を滅菌済みシャーレにて加えて固化し、寒天平板を作製した。凍結保存品の供試菌をこの寒天平板に塗抹して、３０℃にて２日間培養した。２％グルコース含有酵母ニトロゲンベース（ＤＩＦＣＯ社製）を１０倍希釈し、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌した培地２０ｍｌをバッフル付き三角フラスコに分注し、上記寒天培地で培養した供試菌を一白金耳取り植菌した。その後、３０℃、１５０ｒｐｍにて２４時間攪拌培養し、前培養液とした。次いで、遠心分離（４７００ｒｐｍ、１０分、２０℃）をおこない集菌した。集菌した菌を生理食塩水２０ｍｌを用いて洗浄し、再び遠心分離（４７００ｒｐｍ、１０分、２０℃）をおこない集菌した。集菌した菌をサブローブドウ糖培地（ペプトン１．０質量％、ブドウ糖４．０質量％を含み、１規定の塩酸を用いてｐＨ５．７に調整した液体培地。以下、「ＳＧ培地」という。）１０ｍｌに加え、再懸濁した。この再懸濁液をＳＧ培地で２０倍希釈したものを供試菌液として用いた。供試菌液中の菌数は、３．２×１０６個／ｍｌであった。【００４２】
（２）バイオフィルム形成方法
本発明品１、２、３、４、参考例品１、２を被験試料とし、各被験試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解して被験試料液とし、該被験試料液２μＬ、供試菌液１９８μＬを、９６穴マイクロプレート（商品名：ＴＣプレート９６ｗｅｌｌ（Ｃｅｌｌ＋）；ザルスタット社製）の各ウェル（穴）に加えた。なお、被験試料液中の被験試料濃度は、供試菌液と加えた際の濃度、即ち各ウェル中の被験試料の濃度がそれぞれ５ｐｐｍ、２５ｐｐｍ、５０ｐｐｍ、１００ｐｐｍとなるように調製した。その後、被験試料液及び供試菌液を加えた９６穴マイクロプレートを３０℃、２日間の静置培養を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。
また、コントロール（被験試料無添加）として、被験試料液２μＬと供試菌液１９８μＬをウェルに加えるのに替えて、被験試料を用いずにＤＭＳＯ２μＬと供試菌液１９８μＬをウェルに加える以外は同様の操作を行って各ウェル中にバイオフィルムを形成した。【００４３】
（３）形成させたバイオフィルムの定量方法
静置培養終了後、各ウェルの被験試料液及び培養液等の液部を除去し、各ウェルの付着物（菌体、分泌物及び沈着物等）をバイオフィルムとし、各ウェルに０．０１質量％のクリスタルバイオレット水溶液（商品名：Ｂｅｃｔｏｎ；Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）５０μＬを添加し、バイオフィルムを染色した。次いで、各ウェルから添加したクリスタルバイオレット液を除き、２００μＬの蒸留水で２回洗浄後、エタノール２００μＬを加えて各ウェルからバイオフィルムを染色していたクリスタルバイオレットを溶出させることにより、マイクロプレートに固着したバイオフィルムを定量した。定量方法としては、マイクロプレートリーダー（型式：ＳＨ−９０００Ｌａｂ；ＣＯＲＯＮＡ ＥＬＥＣＴＲＩＣ社製）を用いて、各ウェルの６００ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．６００）を測定した。【００４４】
（４）バイオフィルム形成抑制効果の評価方法
コントロールのウェルに形成したバイオフィルムの６００ｎｍにおける吸光度を基準吸光度とし、その数値の時にバイオフィルム形成率１００％とした。それぞれの被験試料の吸光度と基準吸光度と対比してバイオフィルム形成率を計算し、各被験試料のバイオフィルム形成率を縦軸、被試験試料の濃度を横軸とした対数近似曲線グラフを作成した。
上記対数近似曲線のグラフを用い、各ウェルの吸光度が、基準吸光度の５０％に相当するバイオフィルム形成率、すなわちバイオフィルム形成率５０％となる各試被験試料の濃度（以下、「５０％阻害濃度」という。）を算出した。
被験試料のバイオフィルム形成抑制効果の判定は、各被検試料について算出された５０％阻害濃度を参考例品２（ケトコナゾール：陽性対照とする）の５０％阻害濃度と比較し、被験試料の５０％阻害濃度が２０ｐｐｍ以下の場合にバイオフィルム形成の抑制に優れているとし、被験試料の５０％阻害濃度が２０ｐｐｍを超える場合にバイオフィルム形成の抑制に劣ると判定した。得られた結果を表２に示す。【００４５】
【表２】
2016152273.tif 000003
【００４６】
＜バイオフィルム形成抑制に用いた被験試料の静菌効果の評価＞
１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌したＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ寒天培地（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｍｌを５０℃まで冷却した。そこに、それぞれの被験試料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した被験試料液を１００μＬを添加し、撹拌して均一になるように混合した後に滅菌済みシャーレに加えて平板培地を作製した。なお、該平板培地中の各被験試料の濃度は、１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、３００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍとなるようにした。次いで凍結保存品の供試菌（カンジダ・アルビカンス（ＮＢＲＣ １５９４株））を各平板培地に一白金耳塗抹して、３０℃にて１日間培養した。
培養終了後の各平板培地上の菌増殖状況を目視にて確認した。平板培地上に塗抹線に沿って発育が認められなかったものは、その被験試料の濃度で静菌性があると判断した。結果を表３に示す。【００４７】
【表３】
2016152273.tif 000004
【００４８】
表２及び３の結果より、本発明品１、２、３及び４は、バイオフィルム形成抑制効果の評価が、いずれも５０％阻害濃度が２０ｐｐｍ以下でありバイオフィルム形成抑制効果に優れていた。また、静菌性の評価は、１０００ｐｐｍ添加区でも菌の発育がみられ、静菌効果を有していなかった。即ち、本発明品１、２、３及び４は、菌を殺菌することがなかった。
一方、参考例品１、２は、バイオフィルム形成抑制効果の評価が、いずれも５０％阻害濃度が２０ｐｐｍを超えるものでありバイオフィルム形成抑制効果に劣っていた。また、静菌性の評価は、参考例品１は、１０００ｐｐｍ添加区でも菌の発育がみられ、静菌効果を有していなかった。即ち、参考例品１は、菌を殺菌することがなかった。参考例品２は、１００ｐｐｍ添加区で菌の生育が認められず、静菌性を有していた。【００４９】
＜製造例１：タブレットの製造＞
下記表４の配合により、各成分を均一に混合し水を加えて混練りした後、乾燥させて単発式打錠機にて本発明品１を含有するタブレットを製造した。【００５０】
【表４】
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【００５１】
＜製造例２：フィルム状食品の製造＞
下記表５の配合により、各成分を均一に混合し水を加えて混練りした後プラスチックフィルムに展延し乾燥させ、本発明品１を含有するフィルム状食品を製造した。【００５２】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、バイオフィルム形成抑制剤として食品及び化粧品産業の分野並びに医療の分野等、各分野において利用することができる。
【国際調査報告】
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