(57)【要約】  耐アルカリ性が高い多孔質シリカ、およびこれを用いたクロマトグラフィ担体を提供する。  リン酸化物成分とジルコニウム酸化物成分とを含む多孔質シリカであって、多孔質シリカの単位比表面積当たりのリン原子の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜２５μｍｏｌ／ｍ２であり、多孔質シリカの単位比表面積当たりのジルコニウム原子の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜１５μｍｏｌ／ｍ２である、多孔質シリカである。また、この多孔質シリカに固定されたリガンドを含む、クロマトグラフィ担体である。
2016163480.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸化物成分とジルコニウム酸化物成分とを含む多孔質シリカであって、
多孔質シリカの単位比表面積当たりのリン原子の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜２５μｍｏｌ／ｍ２であり、多孔質シリカの単位比表面積当たりのジルコニウム原子の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜１５μｍｏｌ／ｍ２である、多孔質シリカ。
【請求項２】
請求項１に記載の多孔質シリカからなる、クロマトグラフィ担体用の多孔質シリカ。
【請求項３】
多孔質シリカを充填したカラムを用いた分子量４５３の標準ポリスチレンの測定により検出されたピークから以下の計算式で求められる理論段数が２０００段以上である、請求項２に記載の多孔質シリカ。
Ｎ＝５．５４×［ｔ／Ｗ０．５］２
ここで、Ｎは理論段数、ｔは成分の保持時間、Ｗ０．５はピーク高さの５０％位置におけるピーク幅である。
【請求項４】
請求項１に記載の多孔質シリカ、および前記多孔質シリカに固定されたリガンドを含む、クロマトグラフィ担体。
【請求項５】
アフィニティクロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体であって、前記リガンドがプロテインＡを含む、請求項４に記載のクロマトグラフィ担体。
【請求項６】
前記プロテインＡの固定化量が９．５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上である、請求項５に記載のクロマトグラフィ担体。
【請求項７】
動的結合容量が３５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上である、請求項５または６に記載のクロマトグラフィ担体。
【請求項８】
前記リガンドがスルホン酸又またはカルボキシル基を含む、陽イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体、前記リガンドがアミンを含む、陰イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体、前記リガンドがアルキル基を含む、逆相クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体、または、前記リガンドがジオール基を含む、サイズ排除クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体である、請求項４に記載のクロマトグラフィ担体。
【請求項９】
リン酸化物前駆体およびジルコニウム酸化物前駆体を任意の順でまたは同時に多孔質シリカに付着させ、次いで焼成する、多孔質シリカの製造方法。
【請求項１０】
得られる多孔質シリカの単位比表面積当たりのリン原子の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜２５μｍｏｌ／ｍ２であり、多孔質シリカの単位比表面積当たりのジルコニウム原子の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜１５μｍｏｌ／ｍ２である、請求項９に記載の多孔質シリカの製造方法。
【請求項１１】
前記リン酸化物前駆体を多孔質シリカに付着させ、次いで前記ジルコニウム酸化物前駆体を多孔質シリカに付着させる、請求項９または１０に記載の多孔質シリカの製造方法。
【請求項１２】
前記リン酸化物前駆体が、オキシ塩化リン、ホスホリルエタノールアミン、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二化ナトリウム、トリアルキルホスフィン、トリフェニルホスフィン、トリアルキルホスフィンオキシド、トリフェニルホスフィンオキシド、リン酸エステル、ポリリン酸もしくはその塩、オルトリン酸もしくはその塩、または五酸化二リンである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の多孔質シリカの製造方法。
【請求項１３】
前記ジルコニウム酸化物前駆体が、塩化ジルコニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＩＩ）、オキシ塩化ジルコニウム、テトラアルコキシジルコニウム、またはジアルコキシジルコニウムジクロリドである、請求項９〜１２いずれか１項に記載の多孔質シリカの製造方法。
【請求項１４】
前記リン酸化物前駆体および前記ジルコニウム酸化物前駆体を乾式法で多孔質シリカに付着させる、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の多孔質シリカの製造方法。
【請求項１５】
前記焼成の温度が３００℃〜５００℃である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の多孔質シリカの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質シリカ、クロマトグラフィ担体、および多孔質シリカの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多孔質シリカは、液体クロマトグラフィ用充填材、固定化酵素用担体、形状選択性触媒、各種イオンの吸着・分離用材料、塗料用艶消材、化粧品原料等に用いることができる。
多孔質シリカの用途に応じて、多孔質シリカがアルカリ環境下で用いられる場合には、多孔質シリカに耐アルカリ性を付与したものを用いることが望まれる。【０００３】
近年、アフィニティクロマトグラフィを用いて、特定のタンパク質を高精度に精製又は除去することが、医薬分野および医療分野において重要視されている。例えば、特定の機能を有する薬品を精製する場合には、特定のタンパク質を高精度に精製することが必要とされる。【０００４】
アフィニティクロマトグラフィでは、リガンドとして特異的な結合性を有するプロテインＡが広く利用されている。プロテインＡは、グラム陽性球菌である真正細菌のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するタンパク質であり、様々な動物由来のＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合する性質を有し、ＩｇＧ精製に広く利用されている。プロテインＡを不溶性担体に固定化させ、この不溶性担体を用いたアフィニティクロマトグラフィによりＩｇＧを特異的に分離精製する手法が広く知られている。【０００５】
アフィニティクロマトグラフィに用いられるアフィニティ担体においては、一般に、リンカーと称される構造を不溶性担体とリガンドの間に介在させ、リンカーの一端を担体に結合させ、且つリンカーの他端をリガンドに結合させることにより、リガンドを不溶性担体に固定化している（特許文献１）。
アフィニティクロマトグラフィでは、担体をアルカリ洗浄することがあるため、担体の耐アルカリ性が重要になる。【０００６】
多孔質シリカに耐アルカリ性を付与する一方法としては、特許文献２および特許文献３に開示される。
特許文献２には、シリカゲルにジルコニウム成分を担持させる耐アルカリ性に優れたシリカゲルの製造方法が提案されている。
特許文献３には、ジルコニアがコートされたコントロールドポアガラスにプロテインＡが固定された分離剤が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０６２１０５号
【特許文献２】特許第２７４０８１０号公報
【特許文献３】国際公開第２０１４／０６７６０５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献２および３では、多孔質シリカをジルコニアで処理して耐アルカリ性を付与しているが、処理後の多孔質シリカの細孔形状については検討されていない。また、多孔質シリカの耐アルカリ性をさらに高めることが望まれる。
一方、多孔質シリカをクロマトグラフィ担体として用いる場合、ジルコニアの処理前後で多孔質シリカの細孔形状を維持して、処理後の多孔質シリカの理論段数を高めることが望まれる。【０００９】
本発明の目的は、耐アルカリ性が高い多孔質シリカ、およびこれを用いたクロマトグラフィ担体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の各発明である。
［１］リン酸化物成分とジルコニウム酸化物成分とを含む多孔質シリカであって、多孔質シリカの単位比表面積当たりのリン原子の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜２５μｍｏｌ／ｍ２であり、多孔質シリカの単位比表面積当たりのジルコニウム原子の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜１５μｍｏｌ／ｍ２である、多孔質シリカ。
［２］前記［１］に記載の多孔質シリカからなる、クロマトグラフィ担体用の多孔質シリカ。
［３］多孔質シリカを充填したカラムを用いた分子量４５３の標準ポリスチレンの測定により検出されたピークから以下の計算式で求められる理論段数が２０００段以上である、［２］に記載の多孔質シリカ。
Ｎ＝５．５４×［ｔ／Ｗ０．５］２
ここで、Ｎは理論段数、ｔは成分の保持時間、Ｗ０．５はピーク高さの５０％位置におけるピーク幅である。【００１１】
［４］前記［１］に記載の多孔質シリカ、および前記多孔質シリカに固定されたリガンドを含む、クロマトグラフィ担体。
［５］アフィニティクロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体であって、前記リガンドがプロテインＡを含む、［４］に記載のクロマトグラフィ担体。
［６］前記プロテインＡの固定化量が９．５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上である［５］に記載のクロマトグラフィ担体。
［７］動的結合容量が３５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上である、［４］または［５］に記載のクロマトグラフィ担体。
［８］前記リガンドがスルホン酸又またはカルボキシル基を含む、陽イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体、前記リガンドがアミンを含む、陰イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体、前記リガンドがアルキル基を含む、逆相クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体、または、前記リガンドがジオール基を含む、サイズ排除クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体である、［４］に記載のクロマトグラフィ担体。【００１２】
［９］リン酸化物前駆体およびジルコニウム酸化物前駆体を任意の順でまたは同時に多孔質シリカに付着させ、次いで焼成する、多孔質シリカの製造方法。
［１０］得られる多孔質シリカの単位比表面積当たりのリン原子の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜２５μｍｏｌ／ｍ２であり、多孔質シリカの単位比表面積当たりのジルコニウム原子の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜１５μｍｏｌ／ｍ２である、［９］に記載の多孔質シリカの製造方法。
［１１］前記リン酸化物前駆体を多孔質シリカに付着させ、次いで前記ジルコニウム酸化物前駆体を多孔質シリカに付着させる、［９］または［１０］に記載の多孔質シリカの製造方法。
［１２］前記リン酸化物前駆体が、オキシ塩化リン、ホスホリルエタノールアミン、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二化ナトリウム、トリアルキルホスフィン、トリフェニルホスフィン、トリアルキルホスフィンオキシド、トリフェニルホスフィンオキシド、リン酸エステル、ポリリン酸もしくはその塩、オルトリン酸もしくはその塩、または五酸化二リンである、［９］〜［１１］のいずれかに記載の多孔質シリカの製造方法。
［１３］前記ジルコニウム酸化物前駆体が、塩化ジルコニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＩＩ）、オキシ塩化ジルコニウム、テトラアルコキシジルコニウム、またはジアルコキシジルコニウムジクロリドである、［９］〜［１２］のいずれかに記載の多孔質シリカの製造方法。
［１４］前記リン酸化物前駆体および前記ジルコニウム酸化物前駆体を乾式法で多孔質シリカに付着させる、［９］〜［１３］のいずれかに記載の多孔質シリカの製造方法。
［１５］前記焼成の温度が３００℃〜５００℃である、［１０］〜［１４］のいずれかに記載の多孔質シリカの製造方法。【００１３】
さらに本発明は、以下の発明である。
［１６］前記［４］に記載のクロマトグラフィ担体を用いてクロマトグラフィを行う方法。
［１７］前記［４］に記載のクロマトグラフィ担体を用いてタンパク質を精製するタンパク質の製造方法。
［１８］前記タンパク質がＩｇＧである［１７］記載のタンパク質の製造方法。
［１９］プロテインＡを固定化したアフィニティクロマトグラフィ担体であって、動的結合容量が３５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上であり、かつ、室温で５００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液に２０時間浸漬し、浸漬前の動的結合容量に対する浸漬後の動的結合容量の割合が６０％以上であるアフィニティクロマトグラフィ担体。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、耐アルカリ性の高い多孔質シリカ、およびこれを用いたクロマトグラフィ担体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ポリスチレン分子量に対する理論段数の関係を表わすグラフである。
【図２】図２は、各例の相対Ｓｉ溶出量を表わすグラフである。
【図３】図３は、リン酸化物前駆体量に対する相対Ｓｉ溶出量の関係を表わすグラフである。
【図４】図４は、ジルコニア酸化物前駆体量に対する相対Ｓｉ溶出量の関係を表わすグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について説明するが、以下の説明における例示によって本発明は限定されない。
本発明の多孔質シリカは、リン酸化物成分とジルコニウム酸化物成分とを含む多孔質シリカであって、多孔質シリカの単位比表面積当たりのリン原子の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜２５μｍｏｌ／ｍ２であり、多孔質シリカの単位比表面積当たりのジルコニウム原子の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜１５μｍｏｌ／ｍ２であることを特徴とする。以下、この本発明の多孔質シリカを「多孔質シリカ（Ａ）」とも記す。
本発明によれば、耐アルカリ性の高い多孔質シリカを提供することができる。また、この多孔質シリカ（Ａ）を用いて、耐アルカリ性の高いクロマトグラフィ担体を提供することができる。
さらに、この多孔質シリカ（Ａ）を用いることで、クロマトグラフィ担体の理論段数を高くすることができる。
耐アルカリ性が高いとともに、理論段数が高いクロマトグラフィ担体を用いることで、アルカリ性においても高分離能を有するクロマトグラフィ担体を提供することができる。また、クロマトグラフィ担体をアルカリ洗浄する場合に、繰り返し使用によって、理論段数が低下することを防止することができる。
【００１７】
多孔質シリカ（Ａ）に含まれるジルコニウム酸化物の少なくとも一部は、Ｓｉ−Ｏ−Ｚｒで表される結合でシリカと結合していると考えられる。以下、多孔質シリカ（Ａ）に含まれるジルコニウム酸化物成分を「Ｚｒ成分」とも記す。また、本発明において、ジルコニウム酸化物前駆体は、焼成等により酸化物となるジルコニウム化合物である。以下、「ジルコニウム酸化物前駆体」を「前駆体Ｚｒ」とも記す。
同様に、多孔質シリカに含まれるリン酸化物の少なくとも一部は、Ｓｉ−Ｏ−Ｐで表される結合でシリカと結合していると考えられる。加えて、さらにリン酸化物の少なくとも一部は、Ｚｒ−Ｏ−Ｐで表される結合でジルコニアと結合していると考えられる。以下、多孔質シリカ（Ａ）に含まれるリン酸化物成分を「Ｐ成分」とも記す。また、本発明において、リン酸化物前駆体は、焼成等により酸化物となるリン化合物が好ましい。以下、「リン化合物前駆体」を「前駆体Ｐ」とも記す。
【００１８】
前駆体Ｚｒで多孔質シリカを処理することで、耐アルカリ性を付与することができるが、一方で、細孔形状が変化するという知見を得た。おそらく、前駆体Ｚｒで多孔質シリカを処理する際に、多孔質シリカ表面にＺｒ成分の分布が不均一となり、細孔形状が変化すると考えられる。Ｚｒ成分が多孔質シリカ表面に不均一に分布すると、多孔質シリカ表面にＺｒ成分が存在しない部分では、耐アルカリ性が低下することがある。
本発明によれば、前駆体Ｚｒとともに、前駆体Ｐで多孔質シリカを処理することで、細孔形状を処理前後で維持することができる。細孔形状が維持されることから、Ｚｒ成分が多孔質シリカ表面に均一に形成されることがわかる。
これは、多孔質シリカの表面上でＰ成分とＺｒ成分とが相互作用することで、多孔質シリカの表面にＺｒ成分がより均一に分布するためと考えられる。
したがって、本発明によれば、Ｚｒ成分が多孔質シリカ上に均一に分布するため、耐アルカリ性を高めることができる。
【００１９】
また、本発明によれば、前駆体Ｚｒおよび前駆体Ｐで多孔質シリカを処理することで、処理前後で細孔形状を維持することができる。これより、多孔質シリカをクロマトグラフィ担体に用いた場合に、理論段数の低下を防ぎ、理論段数の高い多孔質シリカを得ることができる。
【００２０】
多孔質シリカは、単位比表面積当たり、１〜１５μｍｏｌ／ｍ２のジルコニウム原子を含む。なお、以下、「ジルコニウム原子」を「Ｚｒ原子」とも記す。
Ｚｒ原子を有するＺｒ成分は、多孔質シリカの表面に存在していることが好ましい。ここで、「表面に存在する」とは、Ｚｒ成分がシリカの表面から内部方向に濃度傾斜を有して存在していることも意味する。
前駆体Ｚｒを多孔質シリカに付着させ焼成することで、多孔質シリカの表面にＺｒ成分を存在させることができる。
前駆体Ｚｒとしては、塩化ジルコニウム（ＩＶ）、塩化ジルコニウム（ＩＩＩ）、オキシ塩化ジルコニウム、テトラアルコキシジルコニウム、ジアルコキシジルコニウムジクロリド等を挙げることができる。
テトラアルコキシジルコニウムの例としては、ジルコニウムテトラ−ｎ−プロポキシド、ジルコニウムテトラ−ｉｓｏ−プロポキシド、ジルコニウムテトラエトキシド、ジルコニウムテトラ−ｎ−ブトキシド等を挙げることができる。
これらは単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
この前駆体Ｚｒを焼成することで、Ｚｒ成分を多孔質シリカの表面に形成することができる。
【００２１】
Ｚｒ原子の含有量が、多孔質シリカの単位比表面積当たり１μｍｏｌ／ｍ２以上であることで、耐アルカリ性の作用を高めることができる。この値は、好ましくは２μｍｏｌ／ｍ２以上であり、より好ましくは２．５μｍｏｌ／ｍ２以上である。
一方、Ｚｒ原子の含有量が、多孔質シリカの単位比表面積当たり１５μｍｏｌ／ｍ２以下であることで、多孔質シリカの細孔形状を維持することができる。一方、Ｚｒ原子が過剰に配合されると、理論段数が低下することがある。Ｚｒ原子含有量の値は、好ましくは１３．５μｍｏｌ／ｍ２以下であり、より好ましくは１０μｍｏｌ／ｍ２以下である。
ここで、Ｚｒ原子の単位比表面積当たりのモル数は、ＩＣＰ分析法によって多孔質シリカ全体に対するＺｒ原子含有量（質量％）を求め、このＺｒ原子含有量（質量％）と多孔質シリカの比表面積とから求めることができる。多孔質シリカの比表面積の測定方法は後述するとおりである。
【００２２】
多孔質シリカは、単位比表面積当たり１〜２５μｍｏｌ／ｍ２のリン原子を含む。なお、以下、「リン原子」を「Ｐ原子」とも記す。
Ｐ原子を有するＰ成分は、多孔質シリカの表面に存在していることが好ましい。
前駆体Ｐを多孔質シリカに付着させ焼成することで、多孔質シリカの表面にＰ成分を存在させることができる。
前駆体Ｐとしては、オキシ塩化リン、ホスホリルエタノールアミン、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二化ナトリウム、トリアルキルホスフィン、トリフェニルホスフィン、トリアルキルホスフィンオキシド、トリフェニルホスフィンオキシド、リン酸エステル、ポリリン酸およびその塩、オルトリン酸およびその塩、五酸化二リン等を挙げることができる。これらは単独で、または２種以上を組み合わせて用いることができる。
この前駆体Ｐを多孔質シリカに付着させ焼成することで、Ｐ成分を多孔質シリカの表面に形成することができる。
【００２３】
Ｐ原子の含有量が、多孔質シリカの単位比表面積当たり１μｍｏｌ／ｍ２以上であることで、耐アルカリ性の作用を高めることができる。Ｚｒ成分のみを配合する場合では、Ｚｒ成分が多孔質シリカの表面に不均一に形成されることがある。本発明では、Ｚｒ成分の分布が不均一であると、耐アルカリ性が十分に得られないという知見を得た。そこで、Ｚｒ成分とともにＰ成分を配合すると、Ｚｒ成分の分布が均一となり、結果として耐アルカリ性を高めることができる。
Ｐ原子含有量の値は、好ましくは３．０μｍｏｌ／ｍ２以上であり、より好ましくは１０．０μｍｏｌ／ｍ２以上である。
一方、Ｐ原子の含有量は、多孔質シリカの単位比表面積当たり２５μｍｏｌ／ｍ２以下であることが好ましい。これによって、多孔質シリカの細孔形状を維持しながら均一な分布のＺｒ成分が形成できると考えられる。このため理論段数の低下を抑制できる。
Ｐ原子含有量の値は、好ましくは２０μｍｏｌ／ｍ２以下であり、より好ましくは１７．５μｍｏｌ／ｍ２以下である。
ここで、Ｐ原子の単位比表面積当たりのモル数の測定方法としては、上記したＺｒ原子と同様に測定することができる。
【００２４】
上記多孔質シリカ（Ａ）は次の特性を有することが好ましい。
多孔質シリカ（Ａ）の形状としては、球状粒子であることが好ましく、真球体および楕円体を含めた球状とすることができる。クロマトグラフィ担体の用途では、カラムへの充填性、使用時の圧力損失の抑制の観点から、真球体に近い形状であることが好ましい。
【００２５】
アフィニティクロマトグラフィ担体で用いられる多孔質シリカ（Ａ）の平均粒子径としては、５μｍ以上であることが好ましく、より好ましくは７μｍ以上であり、さらに好ましくは１０μｍ以上である。
一方、多孔質シリカ（Ａ）の平均粒子径としては、５００μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは２００μｍ以下であり、さらに好ましくは１００μｍ以下である。
ここで、多孔質シリカ（Ａ）の平均粒子径はコールターカウンター法による測定方法によって測定される。
【００２６】
アフィニティクロマトグラフィ担体で用いられる多孔質シリカ（Ａ）の粒子径分布の体積換算の積算量が小さいほうから１０％の粒子径（Ｄ１０）と９０％の粒子径（Ｄ９０）の比（Ｄ９０／Ｄ１０）としては、レーザー式光散乱法において、３以下であり、好ましくは２以下であり、さらに好ましくは１．６以下である。Ｄ９０／Ｄ１０が１．６以下であることで、平均粒子径が小さな多孔質シリカ（Ａ）であっても圧力損失の増大を防ぐことができる。また、Ｄ９０／Ｄ１０は、１に近いほど粒子径分布が均等であり好ましい。
【００２７】
ここで、多孔質シリカ（Ａ）のＤ９０／Ｄ１０はコールターカウンター法による測定方法によって測定される。Ｄ１０は、コールターカウンター法による粒子径分布において、粒子径の体積を粒子径の小さな側から積算していった場合に合計体積の１０％となるときの粒子径であり、Ｄ９０は同様に積算体積が９０％となる粒子径である。Ｄ９０／Ｄ１０はこれらの粒子径の比であることから、多孔質シリカ（Ａ）をベックマン・コールター社製「Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩＩ」等にて測定して得られたＤ１０およびＤ９０から求めることができる。
【００２８】
アフィニティクロマトグラフィ担体で用いられる多孔質シリカ（Ａ）の比表面積としては、水銀圧入法において、好ましくは５５ｍ２／ｇ〜７５ｍ２／ｇであり、より好ましくは６０ｍ２／ｇ〜７５ｍ２／ｇである。比表面積としては、上記した平均細孔径および細孔容積とともに目的に合わせて適正化することができる。比表面積が大きいことで抗体分子を吸着する能力が向上するため好ましいが、大きくなると多孔質シリカ（Ａ）の強度が低下するため、上記範囲内で設定するとよい。
【００２９】
アフィニティクロマトグラフィ担体で用いられる多孔質シリカ（Ａ）の平均細孔径としては、水銀圧入法において、３０ｎｍ〜５００ｎｍであり、好ましくは７０ｎｍ〜３００ｎｍであり、より好ましくは８５ｎｍ〜１１５ｎｍである。平均細孔径が３０ｎｍ以上であることで、抗体分子を吸着する能力が向上し大容量の担体を提供することができる。また、平均細孔径が５００ｎｍ以下であることで、抗体分子の吸着量を大きく保ちながら多孔質シリカ（Ａ）の強度の低下を防ぐことができる。
【００３０】
アフィニティクロマトグラフィ担体で用いられる多孔質シリカ（Ａ）の細孔容積としては、水銀圧入法において、０．５ｍＬ／ｇ以上であり、好ましくは１．０ｍＬ／ｇ以上であり、より好ましくは１．５ｍＬ／ｇ以上である。細孔容積が０．５ｍＬ／ｇ以上であることで、抗体分子を吸着する能力が向上し大容量の担体を提供することができる。また、細孔容積は、多孔質シリカ（Ａ）の強度の観点から、２．０ｍＬ／ｇ以下であることが好ましい。
【００３１】
これらの水銀圧入法による細孔物性は、島津製作所社製「水銀ポロシメーター  オートポアＩＶ９５１０」等を用いて測定することができる。
また、陽イオン交換クロマトグラフィ担体、陰イオン交換クロマトグラフィ担体、逆相クロマトグラフィ担体、サイズ排除クロマトグラフィ担体で用いられる多孔質シリカ（Ａ）は、特に限定するものではないが、通常、平均粒子径０．５〜１０，０００μｍ、好ましくは１〜５００μｍ、平均細孔径０．５〜６００ｎｍ、比表面積５０〜１０，０００ｍ２／ｇ、好ましくは１００〜１，０００ｍ２／ｇ程度のものが望ましい。
【００３２】
上記した多孔質シリカ（Ａ）は、クロマトグラフィ担体として用いることができる。クロマトグラフィ担体としては、上記した多孔質シリカ（Ａ）を支持体として含み、この多孔質シリカにリガンドが固定されたものを用いることができる。
アフィニティクロマトグラフィ担体では、リガンドとして、プロテインＡ、プロテインＧ、コンカナバリンＡ、抗原、抗体等を用いることができる。
陽イオン交換クロマトグラフィ担体では、リガンドとして、スルホン酸、カルボキシル基等を用いることができる。
陰イオン交換クロマトグラフィ担体では、リガンドとして、１級アミン、２級アミン、３級アミン、４級アミン等のアミンを用いることができる。
逆相クロマトグラフィ担体では、リガンドとして、アルキル基、フェニル基、フッ化アルキル基等を用いることができる。アルキル基としては、炭素数１〜３０のアルキル基を用いることが好ましく、例えば、メチル基、ブチル基、オクチル基、オクタデシル基等を挙げることができる。
サイズ排除クロマトグラフィ担体では、リガンドとしてジオール基等を用いることができる。
【００３３】
リガンドとしてプロテインＡを用いる場合、アフィニティクロマトグラフィ担体は、上記した多孔質シリカ（Ａ）を基材として用いることで、プロテインＡの固定化量が９．５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上とすることができ、より好ましくは１０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上であり、さらに好ましくは１０．５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上である。プロテインＡの固定化量の上限は特に制限は無いが、３０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以下が好ましく、２５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以下がより好ましい。
また、動的結合容量は３５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上であり、かつ、室温で５００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液に２０時間浸漬し、浸漬前の動的結合容量に対する浸漬後の動的結合容量の割合は６０％以上であることが好ましい。
ここで、プロテインＡの固定化量の測定方法としては、プロテインＡを固定化した担体を乾燥して、この担体を元素分析して求めることができる。
【００３４】
以下、本発明の多孔質シリカの製造方法について説明する。
本発明の多孔質シリカの製造方法は、前駆体Ｐおよび前駆体Ｚｒを任意の順でまたは同時に多孔質シリカに付着させ、次いで焼成することを特徴とする。
以下、前駆体Ｚｒおよび前駆体Ｐを多孔質シリカに付着させる処理をそれぞれ、「Ｚｒ処理」および「Ｐ処理」とも記す。Ｐ処理とＺｒ処理を行った後に焼成を行うことにより、多孔質シリカが製造される。
【００３５】
本発明の多孔質シリカの製造方法により、多孔質シリカ（Ａ）を製造することができ、また、多孔質シリカ（Ａ）を製造する方法として好ましい方法である。しかし、多孔質シリカ（Ａ）に限られず、リン酸化物成分とジルコニウム酸化物成分とを含む、多孔質シリカ（Ａ）以外の多孔質シリカを製造することもできる。
本発明の多孔質シリカの製造方法において、前駆体Ｐおよび前駆体Ｚｒの使用量を、得られる多孔質シリカのＰ原子含有量およびＺｒ原子含有量が前記多孔質シリカ（Ａ）における含有量となる量使用することにより、多孔質シリカ（Ａ）が得られる。得られる多孔質シリカのＰ原子含有量およびＺｒ原子含有量の少なくとも一方が前記多孔質シリカ（Ａ）における含有量となる量以外の量使用することにより、多孔質シリカ（Ａ）以外の、リン酸化物成分とジルコニウム酸化物成分とを含む多孔質シリカが得られる。
本発明の製造方法により得られる、多孔質シリカ（Ａ）以外の多孔質シリカとしては、たとえば、多孔質シリカの単位比表面積当たりの原子の量として、Ｐ原子含有量が１μｍｏｌ／ｍ２〜２５μｍｏｌ／ｍ２であって、かつＺｒ原子含有量が１μｍｏｌ／ｍ２未満または１５μｍｏｌ／ｍ２を超える多孔質シリカ、Ｚｒ原子含有量の量が１μｍｏｌ／ｍ２〜１５μｍｏｌ／ｍ２であって、かつＰ原子含有量が１μｍｏｌ／ｍ２未満または２５μｍｏｌ／ｍ２を超える多孔質シリカ、等が挙げられる。多孔質シリカ（Ａ）以外の多孔質シリカのＰ原子含有量の下限は０．０１μｍｏｌ／ｍ２が好ましく、上限は５０μｍｏｌ／ｍ２が好ましい。Ｚｒ原子含有量の下限は０．０１μｍｏｌ／ｍ２が好ましく、上限は３０μｍｏｌ／ｍ２が好ましい。
【００３６】
本発明の多孔質シリカの製造方法は、多孔質シリカ（Ａ）を製造する方法であることが好ましい。以下、多孔質シリカ（Ａ）を製造する方法を例に本発明の製造方法を説明する。なお、多孔質シリカ（Ａ）以外の多孔質シリカは、前駆体Ｐや前駆体Ｚｒの使用量を変えることにより、同様の方法で製造することができる。
【００３７】
原料のシリカとしては、特に限定されないが、クロマトグラフィ担体に適する形状および細孔物性を有するシリカであることが好ましい。
例えば、原料のシリカの平均粒子径、Ｄ９０／Ｄ１０、比表面積、平均細孔径、細孔容積は、上記した多孔質シリカ（Ａ）と同様の範囲内であることが好ましい。
Ｚｒ処理、Ｐ処理および焼成の前後において、これらの物性に変化は少ないためである。
【００３８】
原料の多孔質シリカの製造方法としては、特に限定されない。例えば、噴霧法、エマルション・ゲル化法等が挙げられる。エマルション・ゲル化法としては、例えば、シリカ前駆体を含む分散相と連続相とを乳化し、得られたエマルションをゲル化して多孔質シリカを得ることができる。必要であれば、多孔質シリカの平均細孔径および細孔容積を大きくするための処理を適宜行ってもよい。
乳化方法としては、シリカ前駆体を含む分散相を連続相に微小孔部または多孔質膜を介して供給しエマルションを作製する方法が好ましい。これによって、均一な液滴径のエマルションを作製して、結果として均一な粒子径の多孔質シリカを得ることができる。このような乳化方法としては、マイクロミキサー法や膜乳化法を用いることができる。
本発明の製造方法では、マイクロミキサー法によって作製された多孔質シリカを好ましく用いることができる。マイクロミキサー法については、例えば、国際公開第２０１３／０６２１０５号に開示されている。
【００３９】
多孔質シリカに前駆体Ｐと前駆体Ｚｒとを付着させる方法としては、スラリー濃縮乾固法、スラリー濾過法、乾式法、気相法等を用いることができる。
本製造方法の好ましい態様としては、多孔質シリカにまず前駆体Ｐを付着させ、次に前駆体Ｚｒを付着させ、その後に焼成する方法である。別の態様としては、多孔質シリカに前駆体Ｐと前駆体Ｚｒを同時に付着させ、その後に焼成する方法、および、多孔質シリカに前駆体Ｚｒを付着させた後に前駆体Ｐを付着させ、その後に焼成する方法がある。
【００４０】
スラリー濃縮乾固法としては、原料の多孔質シリカに、前駆体Ｐ溶液と前駆体Ｚｒ溶液とを任意の順でまたは同時に接触させ、濃縮（好ましくは減圧濃縮）して乾固し、乾燥し、焼成し、多孔質シリカ（Ａ）を得る方法である。
たとえば、多孔質シリカと前駆体Ｐ溶液とを混合して多孔質シリカに前駆体Ｐを接触させた後、圧力常圧〜−０．１ＭＰａ、温度１０〜１００℃で濃縮して乾固し、温度１０〜１８０℃、時間５分〜４８時間で乾燥する。次いで、この乾燥体と前駆体Ｚｒ溶液とを混合して、この乾燥体の多孔質シリカに前駆体Ｚｒを接触させる。
前駆体Ｐは水や極性有機溶媒と親和性が高いため、前駆体Ｐ溶液に用いる溶媒としては、蒸留水、食塩水等の水性溶媒、１−プロパノール、アセトニトリル等の有機溶媒等を好ましく用いることができる。
また、Ｐ処理後にＺｒ処理をする場合は、Ｚｒ処理で用いる溶媒によって前駆体Ｐが再溶出しないように、前駆体Ｚｒ溶液に用いる溶媒としては、有機溶媒を用いることが好ましく、１−プロパノール、アセトニトリル、トルエン、酢酸エチル、ヘキサン等の有機溶媒等を好ましく用いることができる。
また、Ｚｒ処理後にＰ処理をする場合は、多孔質シリカと前駆体Ｚｒ溶液とを混合して多孔質シリカに前駆体Ｚｒを接触させた後、前記と同様の条件で濃縮して乾固し、乾燥し、次いで、得られた乾燥体と前駆体Ｐ溶液とを混合して、この乾燥体の多孔質シリカに前駆体Ｐを接触させる。この場合は、前駆体Ｚｒ溶液に用いる溶媒としては、蒸留水、食塩水等の水性溶媒、１−プロパノール、アセトニトリル等の水溶性有機溶媒等を用いることが好ましい。
さらに、Ｐ処理とＺｒ処理を同時に行う場合は、多孔質シリカと前駆体Ｐ溶液と前駆体Ｚｒ溶液とを混合して、多孔質シリカに前駆体Ｐと前駆体Ｚｒを接触させる。この場合は、前駆体Ｐに合わせて、蒸留水、食塩水等の水性溶媒、１−プロパノール、アセトニトリル等の水溶性有機溶媒等を用いることが好ましい。
【００４１】
Ｐ処理とＺｒ処理を行った後の多孔質シリカ分散液の最終段階の濃縮としては、圧力常圧〜−０．１ＭＰａで、温度１０〜１００℃で行うことが好ましい。
最終段階の乾燥としては、温度１０〜１８０℃、時間５分〜４８時間の範囲内で、１段階または２段階以上で行うことが好ましい。
上記乾燥を行った後、焼成を行う。焼成温度としては、好ましくは３００〜５００℃、より好ましくは３５０〜４５０℃である。これによって、多孔質シリカの変質を防ぐとともに、前駆体Ｚｒおよび前駆体ＰからＺｒ成分およびＰ成分を生成することができる。また、焼成時間は、３０分〜２４時間であることが好ましい。
【００４２】
好ましいスラリー濃縮乾固法は、原料の多孔質シリカに、水溶性の前駆体Ｐの水性溶媒溶液を接触させ、濃縮乾固および乾燥後、この乾燥体に、前駆体Ｚｒの有機溶媒溶液を接触させ、濃縮乾固、乾燥および焼成する方法である。
【００４３】
スラリー濾過法は、スラリー濃縮乾固法における濃縮乾固の代わりに濾過により溶媒を除き、溶媒を除いた以降は上記スラリー濃縮乾固法と同様の方法で多孔質シリカ（Ａ）を得る方法である。
前駆体Ｐ溶液と前駆体Ｚｒ溶液との接触、用いる溶媒の選択、乾燥、焼成等は、上記したスラリー濃縮乾固法と同様に行うことができる。
好ましいスラリー濾過法は、原料の多孔質シリカに、水溶性の前駆体Ｐの水性溶媒溶液を接触させ、濾過および乾燥後、この乾燥体に、前駆体Ｚｒの有機溶媒溶液を接触させ、濾過、乾燥および焼成する方法である。
【００４４】
スラリー濾過法としては、原料の多孔質シリカにアミノプロピル修飾多孔質シリカを用いる方法も好ましい。原料の多孔質シリカにアミノプロピル修飾多孔質シリカを用いることで、前駆体Ｐの再溶出を防ぐことができ、前駆体Ｚｒを水性溶媒で処理することができる。この場合、各濾過の後に、水性溶媒や有機溶媒で洗浄することが好ましい。
【００４５】
乾式法は、原料の多孔質シリカに、前駆体Ｐ溶液と前駆体Ｚｒ溶液とを任意の順でまたは同時に接触させ、これら溶液の全量を吸収させて粉末とし、この粉末を乾燥して吸収されている溶媒を除去し、溶媒を除いた以降は上記スラリー濃縮乾固法と同様の方法で多孔質シリカ（Ａ）を得る方法である。
前駆体Ｐ溶液と前駆体Ｚｒ溶液との接触、溶媒の選択、乾燥、焼成等は、上記したスラリー濃縮乾固法と同様に行うことができる。
【００４６】
好ましい乾式法は、原料の多孔質シリカに、水溶性の前駆体Ｐの水性溶媒溶液を接触させてその全量を吸収させ、乾燥後、この乾燥体に、前駆体Ｚｒの有機溶媒溶液を接触させてその全量を吸収させ、乾燥および焼成する方法である。
【００４７】
気相法としては、前駆体Ｐや前駆体Ｚｒを加熱することで気化または昇華させて、その気体を原料の多孔質シリカと接触させ、焼成し、多孔質シリカ（Ａ）を得る方法である。
【００４８】
なお、上記した多孔質シリカ（Ａ）の製造方法において、前駆体Ｐおよび前駆体Ｚｒの使用量は、得られる多孔質シリカ（Ａ）のＰ原子含有量およびＺｒ原子含有量が前記含有量となる量である。
【００４９】
次に、多孔質シリカ（Ａ）にプロテインＡを固定化してアフィニティクロマトグラフィ担体を製造する方法の一例について説明する。
上記した多孔質シリカ（Ａ）にプロテインＡを固定させる方法としては、リンカーと称される構造を多孔質シリカ（Ａ）とリガンドの間に介在させ、リンカーの一端を多孔質シリカ（Ａ）に結合させ、かつリンカーの他端をリガンドに結合させることにより、リガンドを多孔質シリカに固定させる方法が挙げられる。
【００５０】
以下、一例として、多孔質シリカ（Ａ）とエポキシ基含有化合物とを反応させ、さらにプロテインＡを反応させる方法について説明する。
【００５１】
多孔質シリカ（Ａ）とエポキシ基含有化合物とを反応させることで、多孔質シリカ（Ａ）表面にエポキシ基含有化合物を固定化し、リンカーを形成することができる。リンカーは末端にエポキシ基を有する。
【００５２】
エポキシ基含有化合物としては、エポキシ基を有するシランカップリング剤が好ましく用いられる。エポキシ基含有シランカップリング剤としては、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン等を用いることができる。
【００５３】
多孔質シリカ（Ａ）とエポキシ基含有化合物とを反応させる方法としては、特に限定されないが、例えば、多孔質シリカ（Ａ）とエポキシ基含有化合物とを溶媒中で加温する方法を用いることができる。反応温度は例えば３０〜４００℃程度であり、１００〜３００℃が好ましい。反応時間は例えば０．５〜４０時間程度であり、３〜２０時間が好ましい。
【００５４】
溶媒としては、エポキシ基含有化合物と反応せず、かつ、反応温度下で安定なものであれば、特に限定されない。エポキシ基本含有化合物の溶解性、沸点、さらには他の溶媒との親和性（すなわち洗浄時における除去性）などの観点から、通常、ベンゼン、トルエン、キシレン、オクタン、イソオクタン、テトラクロロエチレン、クロロベンゼン、ブロモベンゼン等を用いることができる。また、反応操作は溶媒の還流下で行ってもよい。
【００５５】
エポキシ基含有化合物の固定化量は、一般的には多いほど、つまり、多孔質シリカ（Ａ）表面全体を緻密に覆う量であることが、多孔質シリカ（Ａ）の耐アルカリ性を向上させる観点から好ましい。具体的には、多孔質シリカ（Ａ）の１ｇあたりのエポキシ基含有化合物の量（エポキシ基含有化合物の固定化量を多孔質シリカ（Ａ）の質量で除した値）が２２０μｍｏｌ／ｇ以上となるように反応させることが好ましい。エポキシ基含有化合物の固定化量は、２２０〜３２０μｍｏｌ／ｇがより好ましく、２４０〜３００μｍｏｌ／ｇが特に好ましい。
【００５６】
なお、エポキシ基含有化合物の固定化量は公知の方法に基づいて求められる。例えば、エポキシ基含有化合物を固定化した後の多孔質シリカ（Ａ）について元素分析法により測定した炭素含有率をもとに、エポキシ基含有化合物１分子に含まれる炭素量、および、多孔質シリカ（Ａ）の質量とを用いて、エポキシ基含有化合物の固定化量を算出できる。
【００５７】
多孔質シリカ（Ａ）とエポキシ基含有化合物との反応系には、さらに、トリエチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン等のアミン化合物を存在させてもよい。これによって、アミンの触媒作用により、多孔質シリカ（Ａ）とエポキシ基含有化合物との反応が促進される。
【００５８】
好ましくは、得られたエポキシ修飾した多孔質シリカ（Ａ）を、さらにジオール化し、グリセロールポリグリシジルエーテルで処理する。
ジオール化の方法としては、例えば、希塩酸等の酸によりエポキシ基を開環させることにより、ジオール修飾多孔質シリカを得る方法を用いることができる。
グリセロールポリグリシジルエーテルの処理方法としては、例えば、グリセロールポリグリシジルエーテル（商品名「デナコールＥＸ−３１４」、ナガセケムテック社製）と、メタノール等の有機溶媒とを混合し、乾燥させる。この乾燥体に、デカン等の有機溶媒と三フッ化水素ジエチルエーテルとを加えて混合し、洗浄および乾燥して、グリセロールポリグリシジルエーテル修飾多孔質シリカ（Ａ）を得ることができる。
得られたグリセロールポリグリシジルエーテル修飾多孔質シリカ（Ａ）をホルミル化することで、この多孔質シリカ（Ａ）にプロテインＡを還元的アミノ化反応によって担持させることができる。ホルミル化は、例えば、多孔質シリカを過ヨウ素酸ナトリウムを用いて処理することで行うことができる。
【００５９】
次に、リンカーが導入された多孔質シリカ（Ａ）にプロテインＡを固定させる。プロテインＡとしては、リジンアミノ基を有するものを用いることができる。中でも、リコンビナントプロテインＡを好ましく用いることができる。
【００６０】
上記した多孔質シリカ（Ａ）のリンカー構造にリガンドを結合させる方法としては、これに限定されないが、多孔質シリカ（Ａ）とプロテインＡを含む溶液とを混合し、適宜触媒や反応試薬などを用いて適当な溶媒下で行うことができる。リンカー構造とリガンドとの反応においては、例えば、反応温度を２０〜３０℃とすることができ、反応時間を１〜２４時間とすることができる。反応系のｐＨは８〜９．５であることが好ましく、緩衝液によって調整することができる。
【００６１】
プロテインＡの配合量としては、充填容積あたり１０．０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上に相当する量であることが好ましく、より好ましくは１１．５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上である。
【００６２】
また、リンカー構造に残存するホルミル基を失活させるために、多孔質シリカにリガンドを結合した後に、エタノールアミンやトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いて反応させることが好ましい。
また、次いでトリメチルアミンボランやシアノ水素化ホウ素ナトリウム等によって処理することが好ましい。これによって、生成したイミン結合がより安定なアミン結合に還元される。
【００６３】
反応後の後処理としては、特に制限されることなく、ろ過および洗浄等の通常採用される方法で行うことができる。
洗浄としては、リン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ、ＰＨ７．４）、クエン酸緩衝液（ｐＨ２．２）、水酸化ナトリウム水溶液、蒸留水等を用いて複数回行うことができる。
【００６４】
また、リガンドが固定化された担体は、ｐＨ５〜６で４〜８℃で冷蔵保存することが好ましく、さらに防腐剤としてベンジルアルコール等を添加してもよい。
【００６５】
プロテインＡの固定化量としては、充填容量あたりのプロテインＡの量（プロテインＡの固定化量を充填容量で除した値）が９．５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上となるように反応させることが好ましい。より好ましくは、プロテインＡの固定化量は、１０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上である。
【００６６】
プロテインＡの固定化量は公知の方法に基づいて求められる。例えば、配合したプロテインＡ溶液の濃度と、この溶液と多孔質シリカ（Ａ）を混合してプロテインＡを結合させた後、多孔質シリカ（Ａ）を分離して得られるプロテインＡ溶液の濃度との差分から、多孔質シリカ（Ａ）に固定化された量を計算できる。溶液濃度は光学的に測定できる。
【００６７】
本発明のサイズ排除クロマトグラフィ担体は、高い理論段数を有する。理論段数は下記により求めることができる。すなわち、多孔質シリカ（Ａ）を充填したカラムを用いた分子量４５３の標準ポリスチレンの測定により検出されたピークから以下の計算式で求められる。
Ｎ＝５．５４×［ｔ／Ｗ０．５］２
ここで、Ｎは理論段数、ｔは成分の保持時間、Ｗ０．５はピーク高さの５０％位置におけるピーク幅である。この理論段数は２０００段以上が好ましく、３０００段以上がより好ましい。また、この理論段数は５００，０００段以下が好ましく、１００，０００段以下がより好ましい。
【００６８】
また本発明のプロテインＡを固定化したアフィニティクロマトグラフィ担体は、耐アルカリ性が高く、かつ、高流速での分離性能に優れる。分離性能は動的結合容量（ＤＢＣ）で示される。ＤＢＣは、濃度既知の標準タンパク質溶液をカラムに添加し、溶出液の吸光度をモニターし、添加したサンプルの吸光度の１０％の漏出が見られた時点の添加タンパク質量から求める。ＤＢＣは３５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上が好ましく、４０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以上がより好ましい。ＤＢＣの上限値は特に制限されないが、１１０ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以下が好ましく、１００ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄ以下がより好ましい。
また耐アルカリ性は、アルカリに浸漬する前後でのＤＢＣの保持率で求めることができる。すなわち室温で５００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液に２０時間浸漬する前後でのＤＢＣを比較し、浸漬前のＤＢＣに対する浸漬後のＤＢＣの割合を算出する。当該割合は、６０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましい。理想的な上限値は１００％である。
【００６９】
上記したクロマトグラフィ担体を用いてクロマトグラフィを行う場合は、クロマトグラフィ担体をカラムに充填して使用する。カラムとしては、ガラス製、ステンレス製、樹脂製等のカラムを適宜用いることができる。
本発明はまた、上記各クロマトグラフィ担体を用いてクロマトグラフィを行う方法である。本発明はさらに上記クロマトグラフィ担体を用いてタンパク質を精製するタンパク質の製造方法である。特に前記タンパク質がＩｇＧであることが好ましい。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。以下の説明において、共通する成分は同じものを用いている。また、特に記述のない成分については、関東化学社製のものを用いている。【００７１】
例１〜２８
＜多孔質シリカ（Ａ）の作製＞
表１に、例１〜例２８の多孔質シリカの処方を示す。
例１〜例２８では、原料の多孔質シリカとしてＡＧＣエスアイテック社製「Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ  ＳＩＬ  ＥＰ−ＤＦ−５−３００Ａ」を用いた。以下、この原料の多孔質シリカをシリカゲルと記す。
このシリカゲルの物性は、以下の通りである。
平均粒子径：４．４４μｍ、均等係数（Ｄ９０／Ｄ１０）：１．４４、平均細孔径：２６．２ｎｍ、細孔容積：１．３０ｍＬ／ｇ、比表面積：１９１ｍ２／ｇ。
ここで、平均粒子径はＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒIII（ベックマン・コールター社製）を用いてコールターカウンター法によって測定した。均等係数は同法によってＤ１０粒子径およびＤ９０粒子径を測定し、その比（Ｄ９０／Ｄ１０）から求めた。平均細孔径、細孔容積および比表面積は、オートポアＩＶ９５１０（島津製作所社）を用いて、水銀圧入法によって測定した。以下同じ。【００７２】
例１は未処理のシリカゲルであり、例２はＰ処理を行わない例であり、例３〜１６、２２は製造例１にしたがってスラリー濃縮乾固法（表１における「処理方法」の項目で「Ａ」で示す。）より作製した例であり、例１７は製造例２にしたがってスラリー液濾過法（表１における「処理方法」の項目で「Ｂ」で示す。）により作製した例であり、例１８〜２１は製造例３にしたがって乾式法（表１における「処理方法」の項目で「Ｃ」で示す。）により作製した例である。【００７３】
（製造例１：スラリー濃縮乾固法）
例３の製造方法について説明する。
５ｇのシリカゲルと、６９ｍＬの蒸留水と、０．２２１ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）との混合液を室温で３０分撹拌した。この混合液を７２℃、−０．０９ＭＰａで減圧濃縮し、乾固した後、１８０℃で一昼夜乾燥させた。
この乾燥体に６９ｍＬの１−プロパノールと、３．７７ｍＬの７０質量％ジルコニウムテトラ−ｎ−プロポキシドの１−プロパノール溶液（東京化成社製、以下７０％Ｚｒ（ＯＰｒ）４と略すことがある。）とを加え、室温で４時間撹拌した。
その後、６０℃、−０．０９ＭＰａで減圧濃縮し、乾固した後、室温で一昼夜風乾し、７０℃で３時間、１２０℃で５時間乾燥させた。次いで、４００℃で７時間焼成して、多孔質シリカ（Ａ）を得た。【００７４】
例２では、表１の処方にしたがって、Ｐ処理をしない以外は、上記例３と同様にして多孔質シリカを得た。
例４〜８、１０〜１６、２２では、表１の処方にしたがって、上記例３と同様にして多孔質シリカを得た。
例９では、表１の処方にしたがって、Ｚｒ処理をしない以外は、上記例３と同様にして多孔質シリカを得た。【００７５】
（製造例２：スラリー濾過法）
例１７の製造方法について説明する。
７ｇのシリカゲルと、９７ｍＬの蒸留水と、１．４５６ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）との混合液を室温で３０分撹拌した。これを濾過した後、１８０℃で一昼夜乾燥させた。
この乾燥体に、９７ｍＬの１−プロパノールと、５．５２ｍＬの７５質量％のジルコニウムテトラ−ｎ−プロポキシドの１−プロパノール溶液（マツモトファインケミカル社製、オルガチックスＺＡ−４５、以下７５％Ｚｒ（ＯＰｒ）４と略すことがある。）を加え、室温で４時間撹拌した。
これを濾過した後、室温で一昼夜風乾し、７０℃で３時間、１２０℃で５時間乾燥させた。次いで、４００℃で７時間焼成して多孔質シリカ（Ａ）を得た。【００７６】
（製造例３：乾式法）
例１８の製造方法について説明する。
５ｇのシリカゲルに、５．８６ｍＬの蒸留水と、１．０４０ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）との混合液を加え、室温で３０分混合し、混合液の全量をシリカゲルに吸収させた。これを１８０℃で一昼夜乾燥させた。
この乾燥体に、２．１１ｍＬの１−プロパノールと、３．９４ｍＬの７５質量％ジルコニウムテトラ−ｎ−プロポキシドの１−プロパノール溶液（マツモトファインケミカル社製、オルガチックスＺＡ−４５（７５％Ｚｒ（ＯＰｒ）４））との混合液を加え、室温で３０分混合し、混合液の全量をシリカゲルに吸収させた。
これを室温で一昼夜風乾燥し、７０℃で３時間、１２０℃で５時間乾燥させた。次いで、４００℃で７時間焼成して多孔質シリカ（Ａ）を得た。
例１９〜２１、２３〜２８では、表１の処方にしたがって、上記例１８と同様にして多孔質シリカ（Ａ）を得た。【００７７】
＜評価＞
得られた例１〜２８の多孔質シリカを用いて、以下の評価を行った。結果を表２に示す。
（Ｐ量の測定）
得られた多孔質シリカについて、ＩＣＰ分析により多孔質シリカ全体に対するＰ原子含有量であるＰ量（質量％）を測定した。そして、このＰ量と後述する多孔質シリカの比表面積とから、Ｐ量（μｍｏｌ／ｍ２）を算出した。【００７８】
（Ｚｒ量の測定）
得られた多孔質シリカについて、ＩＣＰ分析により多孔質シリカ全体に対するＺｒ原子量であるＺｒ含有量（質量％）を測定した。そして、このＺｒ量と後述する多孔質シリカの比表面積とからＺｒ量（μｍｏｌ／ｍ２）を算出した。【００７９】
（Ｓｉ溶出量の測定）
例１〜２８によって作製した多孔質シリカ０．５ｇに、５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液１３ｍＬを加え、２３℃、３時間ロータリーミキサーにて撹拌した。遠心分離後、上澄み液を０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過し、この濾液中のシリカ濃度を公知の方法であるモリブデン黄吸光光度法を用いて求めた。
また、１００ｍＭおよび５００ｍＭの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液を用いて、同様の操作を行った。
５０ｍＭ、１００ｍＭ、５００ｍＭのＮａＯＨについて、例１のＳｉ溶出量を１００％として、例２〜２２の相対Ｓｉ溶出量を、以下の計算によって求めた。結果を表２に示す。
各例の５０ｍＭのＮａＯＨの相対Ｓｉ溶出量＝（各例の５０ｍＭのＮａＯＨのＳｉ溶出量）／（例１の５０ｍＭのＮａＯＨのＳｉ溶出量）×１００（％）。
各例の１００ｍＭのＮａＯＨの相対Ｓｉ溶出量＝（各例の１００ｍＭのＮａＯＨのＳｉ溶出量）／（例１の１００ｍＭのＮａＯＨのＳｉ溶出量）×１００（％）。
各例の５００ｍＭのＮａＯＨの相対Ｓｉ溶出量＝（各例の５００ｍＭのＮａＯＨのＳｉ溶出量）／（例１の５００ｍＭのＮａＯＨのＳｉ溶出量）×１００（％）。【００８０】
（ＨＰＬＣを用いたＧＰＣ評価）
例１〜２８によって作製した多孔質シリカを、それぞれ、内径４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍのステンレスカラムに充填し、このカラムをクロマトグラフィ装置「ＥＬＩＴＥ  Ｌａｃｈｒｏｍ（ＨＩＴＡＣＨＩ社製）」に装填して、次の条件で測定した。
溶離液：テトラヒドロフラン。
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ。
温度：２３℃。
検出器：ＵＶ  ａｔ  ２３０ｎｍ。
サンプル：ＴＳＫ  ＧＥＬ  標準ポリスチレン（東ソー社製）。
標準ポリスチレンは、次の重量平均分子量のサンプルを用いた。
Ａ３００；分子量４５３、Ａ１０００；分子量１０５０、Ａ２５００；分子量２５００、Ａ５０００；分子量５８７０、Ｆ１；分子量９４９０、Ｆ２；分子量１７１００、Ｆ４；分子量３７２００、Ｆ１０；分子量９８９００、Ｆ２０；分子量１８９０００、Ｆ４０；分子量３９７０００、Ｆ８０；分子量７０７０００、Ｆ１２８；分子量１１１００００。【００８１】
各例の多孔質シリカを充填したカラムを用いて各分子量の標準ポリスチレンの測定を行った。検出されたピークについて、ＤＡＢ（ドイツ薬局法）の計算方法にしたがって、理論段数を次の計算によって求めた。
Ｎ＝５．５４×［ｔ／Ｗ０．５］２
ここで、Ｎは理論段数、ｔは成分の保持時間、Ｗ０．５はピーク高さの５０％位置におけるピーク幅である。
Ａ３００（分子量４５３）の理論段数を表２に示す。【００８２】
（細孔物性の評価）
得られた多孔質シリカについて、比表面積（ｍ２／ｇ）、細孔容積（ｍＬ／ｇ）、細孔径（ｎｍ）を測定した。これらの水銀圧入法による細孔物性は、島津製作所社製「水銀ポロシメーター  オートポアＩＶ９５１０」を用いて測定した。結果を表２に示す。【００８３】
【表１】
2016163480.tif 000003
【００８４】
【表２】
2016163480.tif 000004
【００８５】
各表に示す通り、本発明の要件を満たす実施例は、相対Ｓｉ溶出量が少ないためアルカリ耐性が高く、また、理論段数の低下を防ぐことができた。
例３〜８、１０〜１２、１４、１６〜２８は、本発明の要件を満たす。
詳しくは、例２〜１６、２２では、スラリー濃縮乾固法（処理方法：Ａ）を用いた例であり、以下のことがわかった。
例２では、Ｐ処理をせず、Ｚｒ処理をしたものであり、相対Ｓｉ溶出量が少なくなるものの、理論段数が低下した。
例３〜８、２２では、Ｐ処理およびＺｒ処理をしたものであり、相対Ｓｉ溶出量が少なく、理論段数の低下を防いだ。
例９では、Ｚｒ処理をせず、Ｐ処理をしたものであり、理論段数が低下しなかったものの、相対Ｓｉ溶出量が多かった。
例１０〜１２、１４、１６では、Ｐ処理およびＺｒ処理をしたものであり、相対Ｓｉ溶出量が少なかった。
例１０、１１、１４では、さらに、理論段数の低下を防いだ。
例１３および例１５ではＺｒ処理量が多く、相対Ｓｉ溶出量が少なくなるものの、理論段数が低下した。【００８６】
例１７では、スラリー液濾過法（処理方法：Ｂ）によって、Ｐ処理およびＺｒ処理をしたものであり、比較的Ｓｉ溶出量が少なく、理論段数の低下を防いだ。
例１８〜２１、２２〜２８では、乾式法（処理方法：Ｃ）によって、Ｐ処理およびＺｒ処理をしたものであり、相対Ｓｉ溶出量が少なく、理論段数の低下を防いだ。【００８７】
＜グラフの説明＞
図１に、例１、２、８についてポリスチレン分子量に対する理論段数のグラフを示す。
例１は未処理のシリカゲルである。
例２は、Ｐ処理を行わずＺｒ処理のみの例であり、理論段数が特に低分子量側で低下した。
例８は、Ｐ処理およびＺｒ処理をした例であり、未処理の例１に対して理論段数の低下を防ぐことができた。
図示しないが、本発明の要件を満たすその他の例についても同様の傾向であった。【００８８】
図２に、例１、２、８について相対Ｓｉ溶出量のグラフを示す。
例１は未処理のシリカゲルである。
例２は、Ｐ処理を行わずＺｒ処理のみの例であり、相対Ｓｉ溶出量が低く、耐アルカリ性を確認することができた。
例８は、Ｐ処理およびＺｒ処理をした例であり、Ｚｒ処理のみの例２に比べて、相対Ｓｉ溶出量がより低く、耐アルカリ性をより高めることができた。
図１および図２を通して、Ｚｒ処理とともにＰ処理をすることで、処理前後で多孔質シリカの細孔形状が維持され、さらに耐アルカリ性も向上することがわかる。【００８９】
図３に、例２〜８のデータを用いて、Ｚｒ（ＯＰｒ）４量を固定化して、ＫＨ２ＰＯ４量に対する、１００ｍＭのＮａＯＨの相対Ｓｉ溶出量および理論段数（Ａ３００）のグラフを示す。
例２は、Ｐ処理を行わずＺｒ処理のみの例である。
ＫＨ２ＰＯ４量が多くなるほど、１００ｍＭのＮａＯＨの相対Ｓｉ溶出量が低くなり、理論段数が高くなることがわかる。Ｐ成分の量は、細孔形状に影響しにくいと考えられる。
図３から、Ｐ原子含有量は、１μｍｏｌ／ｍ２以上であることが好ましく、より好ましくは３．０μｍｏｌ／ｍ２以上であり、さらに好ましくは１０．０μｍｏｌ／ｍ２以上であることがわかる。【００９０】
図４に、例７、９〜１３を用いて、ＫＨ２ＰＯ４量を固定化して、Ｚｒ（ＯＰｒ）４量に対する、１００ｍＭのＮａＯＨの相対Ｓｉ溶出量および理論段数（Ａ３００）のグラフを示す。
例９は、Ｚｒ処理を行わずＰ処理のみの例である。
Ｚｒ（ＯＰｒ）４量が多くなるほど、１００ｍＭのＮａＯＨの相対Ｓｉ溶出量が低くなるが、理論段数が低下することがわかる。Ｚｒ成分の量が多くなると、多孔質シリカ表面のＺｒ成分量が多くなって、細孔形状が変化し、理論段数が低下すると考えられる。
図４から、Ｚｒ原子含有量は、１〜１５μｍｏｌ／ｍ２であることが好ましく、より好ましく２〜１３．５μｍｏｌ／ｍ２であり、さらに好ましくは２．５〜１０μｍｏｌ／ｍ２であることがわかる。【００９１】
例３１、３２
＜大粒径の多孔質シリカ（Ａ）の作製＞
表３に、例３１、３２の多孔質シリカの処方を示す。
例３１、３２では、シリカゲルとしてＡＧＣエスアイテック社製「Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ  ＳＩＬ  ＥＰ−ＤＭ−３５−１０００ＡＷ」を用いた。（合成方法はＷＯ２０１３／０６２１０５に従う。）
このシリカゲルの物性は、以下の通りである。
平均粒子径：３１．７μｍ、均等係数（Ｄ９０／Ｄ１０）：１．２９、平均細孔径：１０７．０ｎｍ、細孔容積：１．６８ｍＬ／ｇ、比表面積：６１ｍ２／ｇ。
例３１は未処理のシリカゲルであり、例３２は製造例４にしたがって乾式法により作製した例である。【００９２】
（製造例４：乾式法）
例３２の製造方法について説明する。
シリカゲル５０ｇと、８３ｍＬの蒸留水と、３．３２１ｇのリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）との混合液を加えて、室温で３０分混合し、混合液の全量をシリカゲルに吸収させ、１８０℃で一昼夜乾燥させた。
この乾燥体に、７０ｍＬの１−プロパノールと、１２．５０ｍＬの７５質量％ジルコニウムテトラ−ｎ−プロポキシドの１−プロパノール溶液（マツモトファインケミカル社製、オルガチックスＺＡ−４５）とを加え、室温で３０分混合し、混合液の全量をシリカゲルに吸収させた。
これを室温で一昼夜風乾し、７０℃で３時間、１２０℃で５時間乾燥させた。次いで、４００℃で７時間焼成して多孔質シリカ（Ａ）を得た。【００９３】
（評価）
上記した例１〜２８と同様にして、Ｐ量、Ｚｒ量、相対Ｓｉ溶出量、理論段数および細孔物性を求めた。結果を表４に示す。
なお、相対Ｓｉ溶出量は、５０ｍＭ、１００ｍＭ、５００ｍＭのＮａＯＨについて、それぞれ例３１のＳｉ溶出量を１００％として、例３２の相対Ｓｉ溶出量を求めた。【００９４】
【表３】
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【００９５】
【表４】
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【００９６】
上記表４に示す通り、例３２では、原料多孔質シリカに平均細孔径１０７．０ｎｍのシリカゲルを用いて、乾式法によって、Ｐ処理およびＺｒ処理をしたものであり、相対Ｓｉ溶出量が少なく、また、例３１に対して理論段数の低下を防いだ。【００９７】
例４１〜４３
（製造例５：リンカーおよびリガンドの導入）
例３２で得られた多孔質シリカ（Ａ）５ｇに、２２ｍＬのトルエン、０．８５ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、１．０８ｍＬの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを加えて、４．５時間還流させた。
放冷後、濾過し、１００ｍＬのトルエン、５０ｍＬのテトラヒドロフラン、６５ｍＬのメタノールを用いて、この順序で洗浄した。
その後、２０ｍＬの０．５％塩酸水溶液を加え、室温で一昼夜浸漬させ、濾過し、１５０ｍＬの蒸留水、１５０ｍＬのメタノールで洗浄し、７０℃で一昼夜乾燥させた。
得られたジオール修飾多孔質シリカ３ｇに、０．６４ｇのデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテック社製）と１．３８ｍＬのメタノールとの混合液を加えて、室温で３０分混合した。その後、７０℃で一昼夜乾燥させた。
これに１８．２ｍＬのデカン、１．１μＬの三フッ化ホウ素ジエチルエーテルを加えて、１１０℃で４時間撹拌した。放冷後、濾過し、１３０ｍＬのヘキサン、１３０ｍＬのテトラヒドロフラン、１３０ｍＬの０．５％塩酸水溶液、６５０ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液、６５０ｍＬの蒸留水、１３０ｍＬのメタノールで洗浄し、７０℃で一昼夜乾燥させた。
得られたデナコール−多孔質シリカ（Ａ）０．５ｇに、２．５ｍＬの２．５重量％過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を加えて、２３℃で１．５時間ロータリーミキサーにて撹拌し、遠心分離後、上澄み液を除去し、残渣を同様の操作で３０ｍＬの蒸留水、３０ｍＬの０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液を用いて洗浄した。
これに１．１ｍＬの０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液と０．９１ｍＬのリコンビナントプロテインＡを加えて、２３℃で３時間撹拌した。さらに、０．１４２ｍＬのエタノールアミンを加えて３５℃で１．５時間、６．３ｍｇのトリメチルアミンボランを加えて、２３℃で３時間撹拌した。
これを濾過し、１５ｍＬのリン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ、ＰＨ７．４）、１５ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ２．２）、再度１５ｍＬのＰＢＳ、７．７ｍＬの５０ｍｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液、１５ｍＬの蒸留水で洗浄し、１％ベンジルアルコールを含む０．１％酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を３．２ｍＬ加え、プロテインＡを導入した最終品（例４１）を得た。プロテインＡの固定量は１１．５ｍｇ／ｍＬ−ｂｅｄであった。また元素分析値はＣ率：５．５７％、Ｎ率：０．５６％であった。【００９８】
例４１のアフィニティクロマトグラフィ担体の最終品を内径５ｍｍ×長さ５０ｍｍのガラス製カラムに充填し、それをクロマトグラフィ装置「ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓ」（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に装填して、カラムに０．５ｍｇ／ｍＬのポリクローナルｈｕｍａｎ  ＩｇＧを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を通液した。通液した０．５ｍｇ／ｍＬのポリクローナルｈｕｍａｎ  ＩｇＧを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）の吸光度に対し、溶出液の吸光度が１０％漏出した時点で、添加したポリクローナルｈｕｍａｎ  ＩｇＧの質量を求め、動的結合容量を算出した。流速は１．２ｍＬ／分（滞留時間は０．８２分）とした。
耐アルカリ性は、室温で５００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液に所定時間浸漬する前後でのＤＢＣを比較し、浸漬前のＤＢＣに対する浸漬後のＤＢＣの割合を算出した。ＤＢＣの値を表５に、相対ＤＢＣの値を表６に示す。本願実施例の例４１では、高流速においても高ＤＢＣが達成でき、かつ、アルカリ耐性も高いことが明らかとなった。
比較例（例４２）として、ＧＥヘルスケア社製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ（アガロース担体）を用いた。また比較例（例４３）として、東ソー社製、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＣ−６５０Ｆ（ポリメタクリレート担体）を用いた。ただし例４２および例４３における流速は０．５ｍＬ／分（滞留時間は１．９６分）とした。【００９９】
【表５】
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【０１００】
【表６】
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【０１０１】
（例４４）
製造例５と同様にして得られたジオール修飾多孔質シリカ１ｇに、１５ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、７６ｍｇのｔ−ブトキシカリウム（和光純薬社製）、８２ｍｇの１−ブロモブタン（和光純薬社製）を加えて、室温で４時間撹拌した。その後濾過し、２０ｍＬのメタノール、２０ｍＬの５０％メタノール水溶液、２０ｍＬのメタノールを用いて、この順序で洗浄し、７０℃で一昼夜乾燥した。これにより、ブチル基修飾多孔質シリカ（逆相クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体）が得られた。【０１０２】
（例４５）
例３２で得られた多孔質シリカ（Ａ）５ｇに、２２ｍＬのトルエン、０．８５ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、１．０８ｍＬの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを加えて、４．５時間還流させた。放冷後濾過し、１００ｍＬのトルエン、５０ｍＬのテトラヒドロフラン、６５ｍＬのメタノールを用いて、この順序で洗浄した。その後、７０℃で一昼夜乾燥させてエポキシ修飾多孔質シリカを得た。
得られたエポキシ修飾多孔質シリカ０．３ｇに、０．４４ｇの亜硫酸水素ナトリウムに１００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７に調整した水溶液１０ｍＬを加えて、室温で４時間撹拌した。その後濾過し、２０ｍＬの蒸留水で洗浄し、１０ｍＬの１０％硫酸水溶液を加えて室温１時間で浸漬し、２０ｍＬの蒸留水、２０ｍＬのメタノールを用いて、この順序で洗浄し、７０℃で一昼夜乾燥した。これにより、スルホン酸修飾多孔質シリカ（陽イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体）が得られた。【０１０３】
（例４６）
例４５と同様にして得られたエポキシ修飾多孔質シリカ０．３ｇに、６ｍＬのテトラヒドロフラン、３２ｍｇの無水エチレンジアミン（東京化成社製）を加えて、室温で４時間撹拌した。その後濾過し、２０ｍＬの蒸留水、２０ｍＬのメタノールを用いて、この順序で洗浄し、７０℃で一昼夜乾燥した。これにより、アミノ基修飾多孔質シリカ（陰イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体）が得られた。【０１０４】
（例４７）
例４６で得られたアミノ基修飾多孔質シリカに１，４−ジオキサン中で無水コハク酸を作用させ、カルボキシル基修飾多孔質シリカ（陽イオン交換クロマトグラフィ用のクロマトグラフィ担体）を得る。
なお、２０１５年４月１０日に出願された日本特許出願２０１５−０８０７０５号の明細書、特許請求の範囲、要約書および図面の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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