(57)【要約】  本発明の課題は、バイオ燃料、バイオマテリアルの原料となるセルロースを取り出しやすい形で高生産する能力を有する植物を提供することにある。  本発明は、対象とする植物において、シロイヌナズナ由来の「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子、又はそのホモログの機能を強化することでセルロースの生産を増加させる方法を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象となる植物の木質繊維細胞内において、下記(ア)〜(オ)のいずれかに示される転写制御因子の機能を強化する工程を含む、増加したセルロースを含有する植物の生産方法；
(ア)配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
(イ)配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
(ウ)配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写制御因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
(エ)配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
(オ)配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子。
【請求項２】
請求項１に記載の植物の生産方法であって、
前記転写制御因子の機能を強化する工程が、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを用いて、植物を形質転換する工程である、植物の生産方法；
（ａ）配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２、４、３４、３６、３８、若しくは、４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータが、NST1又はNST3 遺伝子のプロモータである、請求項２に記載の植物の生産方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法により生産された植物又はその子孫を用意する工程と、その少なくとも一部を取得して酵素糖化処理を施す工程とを含む、グルコースの製造方法。
【請求項５】
請求項２又は３に記載の植物の生産方法に使用される発現カセットであって、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセット；
（ａ）配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２、４、３４、３６、３８、若しくは、４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含むキット。
【請求項８】
請求項６に記載のベクターにより形質転換された、植物若しくはその子孫、又はそれらの一部。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物において特定の転写制御因子の発現を強化させることにより、取り出しやすい形でセルロースを高蓄積する植物の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
昨今、過剰な二酸化炭素の放出による地球温暖化の進行と化石燃料の枯渇に対する危機感、及びそれに伴う化石燃料の価格上昇、などの要因により、再生可能エネルギーやマテリアルの利用が注目を集めている。とくに植物由来バイオ燃料やバイオマテリアルは燃焼、廃棄等によって生じる二酸化炭素を新たな放出と捉える必要がない(カーボンニュートラル)ことから、非常に期待されている。しかし、従来のバイオ燃料やバイオマテリアルはトウモロコシのデンプンなど食糧になり得るものを原料として生産されており、世界人口の増加により食糧の需給が逼迫しつつある現況から考えて持続可能なものとは言いがたい。そこで、非可食であるセルロースを原料とした次世代バイオエタノール、バイオマテリアルの実用化が求められている。セルロースはグルコースが繰り返しβ-1,4-結合したポリマーである。菌類などを由来とするセルラーゼによって処理することによってグルコースが得られるので、それを酵母で発酵させることによりエタノールが得られる。また、近年ではセルロースそのものをナノセルロースファイバーとして樹脂などに混ぜ、強化剤として用いる方策も開発されつつある。セルロースは植物の一次細胞壁及び二次細胞壁中に大量に含まれているが、二次細胞壁中のセルロースはリグニンやヘミセルロースと複雑に絡み合っており、セルロースだけを取り出したり、分解してグルコースを得たりするのは容易ではない。一方で一次細胞壁中のセルロースは取り出しやすく、分解してグルコースを得るのも容易である。
植物の二次細胞壁形成を制御する遺伝子は本発明者らが発見したNST転写因子遺伝子がよく知られている(非特許文献１)。NST転写因子はモデル実験植物シロイヌナズナにおいて発見された遺伝子で、nst1 nst3二重変異体では、道管を除いて木質(二次細胞壁)がまったく形成されなくなる。そのような植物では結晶性の低いセルロースが一次細胞壁にしか含まれず、セルラーゼによる酵素糖化性が高まる(特許文献１、非特許文献２)が、個体あたりのセルロース量は少なくなり、最終的な糖収量は減少してしまう。しかも茎の強度が大幅に低下して直立することができない。逆に、NST転写因子を植物体全体で過剰に発現させると、あらゆる細胞で異所的な木質形成が起きてしまい、植物の成長が著しく阻害されてしまう。
バイオ燃料用にバイオマスを増強させる先行技術としては特許文献２及び非特許文献３があげられる。この文献ではヒトの糖ヌクレオチド(UDP-ガラクトース)輸送体をタバコに発現させることにより、全体的なバイオマスの増加を実現させているが、セルロースに焦点を絞ったものではなく、あらゆるものが増加している。
特許文献３は二次細胞壁を肥厚させる技術であるが、二次細胞壁はセルロースだけでなくリグニンやヘミセルロースを多く含み、そこからセルロースを効率よく取り出すのは容易ではない。
このようにセルロースを取り出しやすい形で選択的に生産させるのは容易ではなく、未だ確実な方法が確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ２００７／１０２３４６
【特許文献２】特開２０１０−５１２５２号公報
【特許文献３】特開２０１４−１３２８５８号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】The Plant Cell,2007 19,270-280
【非特許文献２】Journal of Biotechnology,2009 142,279-284
【非特許文献３】Journal of Bioscience and Bioengineering,2010 109,159-169
【非特許文献４】Plant Cell Physiol,2014, 56,299-310
【非特許文献５】Plant Cell,2013, 25,1609-1624
【非特許文献６】Methods Mol. Biol.,2011, 754,87-105
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明においては、セルロースを取り出しやすい形で植物に生産させ、セルロース又はその分解物であるグルコースの生産量を増やす技術を提供することを目的とする。グルコースはエタノールの原料となるほか、様々な化合物の合成原材料となりうる。また、セルロースそのものも紙パルプや添加剤等など様々な用途に利用できる。これらバイオ燃料、マテリアルの生産促進により低炭素化社会の実現に向けて貢献できる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
セルロースを取り出しやすい形で増産させるためには、なるべくセルロースだけの生合成を制御する遺伝子を強化するか、一次細胞壁を肥厚させる遺伝子を強化するなどして木質を蓄積する繊維細胞(以下、本明細書において「木質繊維細胞」という)で発現させるのが望ましいと考えられる。本発明者らは植物特異的な転写因子であるNACファミリー転写因子群をシロイヌナズナにおいて網羅的に機能解析する過程で、木質形成を根本的に制御する転写因子遺伝子として、NST転写因子群(NST1、NST2、NST3)を発見した(非特許文献１)。
これらのうちシロイヌナズナのnst1 nst3二重変異体では花茎や胚軸の木質繊維細胞で木質がまったく形成されなくなり、花茎の強度が大幅に低下した結果、直立することができなかった。しかし同様に木質が形成される道管においては木質の欠損が起こることはなく、植物の生存には影響がなかった(非特許文献１)。【０００７】
本発明者らはnst1 nst3二重変異体においてセルロース合成を制御するシロイヌナズナの転写因子遺伝子について広く検討するなかで、AP2/ERF転写制御因子遺伝子の一つであるCEF2又はCEF4遺伝子の機能を木質繊維細胞において強化した植物体を作製したところ、主にセルロースから成る一次細胞壁が大きく肥厚することを見出した。また、これらと共通する保存モチーフを持つ転写制御遺伝子の一つである、CEF1又はCEF3又はCEF5又はCEF6遺伝子も同様の機能を持つことを見出した。以上の知見から、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、
〔１〕対象となる植物の木質繊維細胞内において、下記(ア)〜(オ)のいずれかに示される転写制御因子の機能を強化する工程を含む、増加したセルロースを含有する植物の生産方法に関する；
(ア)配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
(イ)配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
(ウ)配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写制御因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
(エ)配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
(オ)配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子。
また、本発明は、一実施の形態においては、下記方法に関する。
〔１’〕対象となる植物の木質繊維細胞内において、下記(ア’)〜(ミ’)のいずれかに示される転写制御因子の機能を強化する工程を含む、増加したセルロースを含有する植物の生産方法；
（ア’）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（イ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ウ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子。
（エ’）配列番号２に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（オ’）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子。
（カ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（キ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ク’）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子。
（ケ’）配列番号４に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（コ’）配列番号４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子。
（サ’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（シ’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ス’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（セ’）配列番号３４に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ソ’）配列番号３４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子、
（タ’）配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（チ’）配列番号３５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ツ’）配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（テ’）配列番号３６に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ト’）配列番号３６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子、
（ナ’）配列番号３７に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（ニ’）配列番号３７に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ヌ’）配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ネ’）配列番号３８に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ノ’）配列番号３８に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子、
（ハ’）配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（ヒ’）配列番号３９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加しており、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（フ’）配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子、
（ヘ’）配列番号４０に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ホ’）配列番号４０に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの合成量を制御する活性を有する転写制御因子、
（マ’）配列番号４１に示されるコンセンサスアミノ酸配列を有する転写制御因子、
（ミ’）配列番号４１に示されるコンセンサスアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加した配列を有し、かつ、セルロースの合成を制御する活性を有する転写制御因子。【０００９】
また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法における一実施の形態によれば、
〔２〕上記〔１〕に記載の植物の生産方法であって、
前記転写制御因子の機能を強化する工程が、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを用いて、植物を形質転換する工程であることを特徴とする；
（ａ）配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２、４、３４、３６、３８、若しくは、４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
また、本発明は、一実施の形態において、下記方法に関する。
〔２’〕上記〔１’〕に記載の植物の生産方法であって、
前記転写制御因子の機能を強化する工程が、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ’)〜(ｍ’１)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを用いて、植物を形質転換する工程であることを特徴とする；
（ａ’）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ａ’１）前記(ａ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ａ’２）前記(ａ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ’）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｂ’１）前記(ｂ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’）配列番号３に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’１）前記(ｃ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’２）前記(ｃ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ’）配列番号４に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｄ’１）前記(ｄ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
（ｅ’）配列番号３３に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ’１）前記(ｅ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ’２）前記(ｅ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３３及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｆ’）配列番号３４に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｆ’１）前記(ｆ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’）配列番号３５に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’１）前記(ｇ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’２）前記(ｇ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３５及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｈ’）配列番号３６に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｈ’１）前記(ｈ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３６及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’）配列番号３７に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’１）前記(ｉ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’２）前記(ｉ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３７及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｊ’）配列番号３８に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｊ’１）前記(ｊ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３８及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’）配列番号３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’１）前記(ｋ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’２）前記(ｋ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３９及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｌ’）配列番号４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｌ’１）前記(ｌ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｍ’）配列番号４１に示される第一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、
（ｍ’１）前記(ｍ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００１０】
また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法における一実施の形態によれば、
〔３〕上記〔２〕の生産方法において、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータが、NST1又はNST3 遺伝子のプロモータであることを特徴とする。【００１１】
また、本発明の別の態様によれば、
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法により生産された植物又はその子孫を用意する工程と、その少なくとも一部を取得して酵素糖化処理を施す工程とを含む、グルコースの製造方法に関する。【００１２】
また、本発明の別の態様によれば、
〔５〕上記〔２〕又は〔３〕に記載の植物の生産方法に使用される発現カセットであって、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットに関する；
（ａ）配列番号１、３、３３、３５、３７、又は、３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）前記(ａ)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ）前記(ａ)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ）配列番号２、４、３４、３６、３８、又は、４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｅ）前記(ｄ)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２、４、３４、３６、３８、若しくは、４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
また、本発明は、一実施の形態において、下記方法に関する。
〔５’〕上記〔２’〕又は〔３〕に記載の植物の生産方法に使用される発現カセットであって、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、以下の(ａ’)〜(ｍ’１)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットに関する；
（ａ’）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ａ’１）前記(ａ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ａ’２）前記(ａ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ’）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｂ’１）前記(ｂ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’）配列番号３に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’１）前記(ｃ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’２）前記(ｃ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ’）配列番号４に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｄ’１）前記(ｄ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
（ｅ’）配列番号３３に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ’１）前記(ｅ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ’２）前記(ｅ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３３及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｆ’）配列番号３４に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｆ’１）前記(ｆ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’）配列番号３５に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’１）前記(ｇ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’２）前記(ｇ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３５及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｈ’）配列番号３６に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｈ’１）前記(ｈ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３６及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’）配列番号３７に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’１）前記(ｉ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’２）前記(ｉ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３７及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｊ’）配列番号３８に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｊ’１）前記(ｊ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３８及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’）配列番号３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’１）前記(ｋ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’２）前記(ｋ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３９及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｌ’）配列番号４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｌ’１）前記(ｌ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｍ’）配列番号４１に示される第一のアミノ酸配列を含むポリペプチドと配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、
（ｍ’１）前記(ｍ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。【００１３】
また、本発明の別の態様によれば、
〔６〕上記〔５〕に記載の発現カセットを含むベクターに関する。
また、本発明の別の態様によれば、
〔７〕上記〔６〕に記載のベクターを含むキットに関する。
また、本発明の別の態様によれば、
〔８〕上記〔６〕に記載のベクターにより形質転換された、植物若しくはその子孫、又はそれらの一部に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の植物の生産方法によれば、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子又はそのホモログの機能を強化することで一次細胞壁を肥厚させ、取り出しやすい形でセルロースの産生能が増強した植物を生産することが可能となる。これにより、植物一個体あたりから抽出できるセルロースの量を増加することができる。これらを増加できればバイオ燃料やマテリアル生産量を増やすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、シロイヌナズナの野生株(Col-O)、nst1 nst3二重変異体、及び、nst1 nst3 NST3pro:CEF2-VP16株(CEF2転写因子にVP16転写活性化ドメインを付加してシロイヌナズナNST3プロモータによりシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体において発現させた株)の茎を、それぞれ、明視野観察した画像(最上段)、紫外線下でリグニンの自家蛍光を観察した画像(２段目)、抗キシラン抗体により蛍光標識した画像(３段目)、結晶化セルロース結合タンパク質により蛍光標識した画像(最下段)を示す。  茎の横断切片における細胞壁の肥厚の様子を観察したところ、シロイヌナズナnst1 nst3二重変異体をCEF2-VP16をコードする核酸を含むベクターにより形質転換したシロイヌナズナ(以下、CEF2-VP16相補ラインともいう。)では野生株と同様の肥厚が見られた。しかし、紫外線下での自家蛍光によるリグニンの分布やキシラン抗体によるキシランの分布を観察したところ、いずれの存在も確認できなかった。一方で、結晶化セルロースの抗体により結晶化セルロースの分布を観察したところ、CEF2-VP16相補ラインでは野生株同様に結晶化セルロースの沈着が見られた。
【図２】図２は、シロイヌナズナの野生株(Col-O)、nst1 nst3二重変異体、及び、nst1 nst3 NST3pro:CEF4-VP16株(CEF4転写因子にVP16転写活性化ドメインを付加してシロイヌナズナNST3プロモータによりシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体において発現させた株)の茎を、それぞれ、明視野観察した画像(上段)、リグニンの自家蛍光を観察した画像(下段)、を示す。  茎の横断切片における細胞壁の肥厚の様子を観察したところ、シロイヌナズナnst1 nst3二重変異体をCEF4-VP16をコードする核酸を含むベクターにより形質転換したシロイヌナズナ(以下、CEF4-VP16相補ラインともいう。)では野生株と同様の肥厚が見られた。しかし、紫外線下での自家蛍光によるリグニンの分布を観察したところ、その存在が確認できなかった。このことから、CEF4-VP16相補ラインでもCEF2-VP16相補ラインと同様に、セルロースを中心とした細胞壁が肥厚していると考えられる。
【図３】図３は、シロイヌナズナの野生株(Col-O)、nst1 nst3二重変異体、及び、CEF2-VP16相補ライン(DR2342-8)の茎の下部10cmの細胞壁含量を比較したグラフを示す。CEF2-VP16相補ラインでは細胞壁含量が、野生株と同等レベルまで回復していた。
【図４】図４は、シロイヌナズナの野生株(Col-O)、nst1 nst3二重変異体、及び、CEF2-VP16相補ライン(DR2342-8)の茎の下部10cmから抽出した細胞壁成分についてセルラーゼによる酵素糖化率(Saccharification efficiency)(図４(ａ))、鮮重量あたりのグルコース収量(Glc yield)(図４(ｂ))を比較したグラフを示す。CEF2-VP16相補ラインでは酵素糖化率が、一次細胞壁しか持たないnst1 nst3二重変異体と同等レベルにまで高まっているが、図３で示したように細胞壁含量は野生株と同等であるから、最終的なグルコース収量は野生株に比べて約70％(１.７倍)増えていた。
【図５】図５は、シロイヌナズナの野生株(Col-O)、nst1 nst3二重変異体、及び、CEF2-VP16相補ラインの茎から抽出したRNAを用いて、RT-PCRによりセルロース合成酵素遺伝子の発現を比較したグラフである。CEF2-VP16相補ラインでは一次細胞壁のセルロース合成に関与するCESA1、CESA3、CESA6の発現が亢進しているが、二次細胞壁のセルロース合成に関与するCESA4、CESA7、CESA8の発現はnst1 nst3二重変異体同様に低いままであった。
【図６】図６は、シロイヌナズナのプロトプラストにおいて、CEF2遺伝子、CEF2-VP16遺伝子、CEF2-SRDX(CEF2転写因子にSRDX転写抑制化ドメインを付加したもの)遺伝子を導入した際の一次細胞壁再生の様子をコントロールと比較してカルコフローホワイトで可視化した写真(図６(a))、および一定時間経過後のカルコフローホワイトでの蛍光強度の度合いを表現したグラフ(図６(b))である。CEF2遺伝子、CEF2-VP16遺伝子を導入したプロトプラストでは一次細胞壁の再生が亢進しているが、逆にCEF2-SRDX遺伝子を導入したプロトプラストでは抑制されている。
【図７】図７は、シロイヌナズナの野生株(Wild-type)、nst1 nst3二重変異体の茎を、それぞれ、明視野観察した画像(上段)、リグニンの自家蛍光を観察した画像(下段)、を示す。
【図８】図８はnst1 nst3 NST3pro:CEF1-VP16株(CEF1転写因子にVP16転写活性化ドメインを付加してシロイヌナズナNST3プロモータによりシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体において発現させた株) 、nst1 nst3 NST3pro:CEF6-VP16株、nst1 nst3 NST3pro:CEF5-VP16株、nst1 nst3 NST3pro:CEF3-VP16株の茎を、それぞれ、明視野観察した画像(上段)、リグニンの自家蛍光を観察した画像(下段)、を示す。  茎の横断切片における細胞壁の肥厚の様子を観察したところ、シロイヌナズナnst1 nst3二重変異体をCEF1-VP16又はCEF6-VP16又はCEF5-VP16又はCEF3-VP16をコードする核酸を含むベクターにより形質転換したシロイヌナズナ(以下、CEF1-VP16相補ライン又はCEF6-VP16相補ライン又はCEF5-VP16相補ライン又はCEF3-VP16相補ラインともいう。)では野生株と同様の肥厚が見られた。しかし、紫外線下での自家蛍光によるリグニンの分布を観察したところ、その存在が確認できなかった。このことから、CEF1-VP16相補ライン又はCEF6-VP16相補ライン又はCEF5-VP16相補ライン又はCEF3-VP16相補ラインでもCEF2-VP16相補ラインと同様に、セルロースを中心とした細胞壁が肥厚していると考えられる。
【図９】図９は、シロイヌナズナの野生株(Wild-type)、nst1 nst3二重変異体、CEF4-VP16相補ライン、CEF5-VP16相補ライン、CEF6-VP16相補ライン、CEF1-VP16相補ライン、及び、CEF3-VP16相補ラインにおける茎の下部10cmの細胞壁含量(図８(ａ))、抽出した細胞壁成分についてセルラーゼによる酵素糖化率(Saccharification efficiency)(図８(ｂ))、鮮重量あたりのグルコース収量(Glc yield)(図８(ｃ))を比較したグラフを示す。CEF4-VP16相補ライン又はCEF5-VP16相補ライン又はCEF6-VP16相補ライン又はCEF1-VP16相補ライン又はCEF3-VP16相補ラインでは酵素糖化率が、一次細胞壁しか持たないnst1 nst3二重変異体と同等レベルにまで高まっているが、細胞壁含量は野生株と同等であるから、最終的なグルコース収量は野生株に比べて大幅に増えていた。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
１．本発明における一次細胞壁を肥厚させてセルロースの蓄積を増強した植物について
（１）本発明における一次細胞壁を肥厚させてセルロースの蓄積を制御する遺伝子について
本発明において植物に対して一次細胞壁を肥厚させてセルロースの蓄積を制御する遺伝子は、典型的には、シロイヌナズナ由来の配列番号２で表される「CEF2遺伝子」、配列番号４で表される「CEF4遺伝子」、配列番号３４で表される「CEF5遺伝子」、配列番号３６で表される「CEF3遺伝子」、配列番号３８で表される「CEF1遺伝子」、又は、配列番号４０で表される「CEF6遺伝子」である。「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」及び「CEF6遺伝子」によりコードされる「CEF2タンパク」、「CEF4タンパク」、「CEF5タンパク」、「CEF3タンパク」、「CEF1タンパク」及び「CEF6タンパク」は、同じAP2/ERFファミリーに属するタンパク質であり、配列番号４１で表される共通するコンセンサス配列を持つ。本願明細書において、一次細胞壁を肥厚させてセルロースの蓄積を制御する遺伝子として「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」を意味する際には、配列番号２で示される「CEF2遺伝子」、配列番号４で示される「CEF4遺伝子」、配列番号３３で示される「CEF5遺伝子」、配列番号３５で示される「CEF3遺伝子」、配列番号３７で示される「CEF1遺伝子」、又は、配列番号３９で示される「CEF6遺伝子」に限られず、そのオルソログ、パラログなどのホモログやその塩基配列の一部に変異が導入されたものも含まれる。そして、当該「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」若しくは「CEF6遺伝子」又はそれらのホモログによりコードされるタンパク質(転写制御因子)の機能を強化することで、セルロースの生産能が向上した植物を得ることができる。
【００１７】
たとえば「CEF2遺伝子」と「CEF4遺伝子」は、同じ機能を持っており、アライン可能領域内のアミノ酸レベルで約60％の相同性が認められる。このことから、シロイヌナズナ又は他の植物ゲノム中の相同遺伝子、又は一部に変異が導入された遺伝子のうちでも「CEF2遺伝子」又は「CEF4遺伝子」とアミノ酸レベルで少なくとも60％、好ましくは70％、80％、より好ましくは90％、のホモロジーを有する類似遺伝子であれば同様に用いられることが明らかである。また同一機能を保持している限り、そのフラグメントでもよい。そのような遺伝子は、アミノ酸配列では配列番号２又は配列番号４と少なくとも60％、好ましくは70％、80％、より好ましくは90％以上のホモロジーを有する。
【００１８】
（２）本発明における一次細胞壁が肥厚してセルロースが増強された形質を有する植物の作出方法
本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法は、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化する工程を含み、当該工程により増加したセルロースを含有する植物を得ることができる。
【００１９】
本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法において、機能強化の対象である「CEF2遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(ア’)〜(オ’)のように記載することができる；
（ア’）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（イ’)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ウ’）配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（エ’）配列番号２に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（オ’）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの発現量を制御する活性を有する転写制御因子。
【００２０】
また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法において、機能強化の対象である「CEF4遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(カ’)〜(コ’)のように記載することができる；
（カ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（キ’）配列番号３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ク’）配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（ケ’）配列番号４に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（コ’）配列番号４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
【００２１】
また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法において、機能強化の対象である「CEF5遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(サ’)〜(ソ’)のように記載することができる；
（サ’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（シ’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ス’）配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（セ’）配列番号３４に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ソ’）配列番号３４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
【００２２】
また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法において、機能強化の対象である「CEF3遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(タ’)〜(ト’)のように記載することができる；
（タ’）配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（チ’）配列番号３５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ツ’）配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（テ’）配列番号３６に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ト’）配列番号３６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
【００２３】
また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法において、機能強化の対象である「CEF1遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(ナ’)〜(ノ’)のように記載することができる；
（ナ’）配列番号３７に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（ニ’）配列番号３７に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（ヌ’）配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（ネ’）配列番号３８に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ノ’）配列番号３８に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
【００２４】
また、本発明の増加したセルロースを含有する植物の生産方法において、機能強化の対象である「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子とは、例えば、下記(ハ’)〜(ホ’)のように記載することができる；
（ハ’）配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなる転写制御因子、
（ヒ’）配列番号３９に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子、
（フ’）配列番号３９に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなる転写因子であって、かつ、セルロースの蓄積を制御する活性を有する転写制御因子。
（ヘ’）配列番号４０に示される塩基配列によりコードされる転写制御因子、
（ホ’）配列番号４０に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされる転写制御因子であり、かつ、セルロースの蓄積量を制御する活性を有する転写制御因子。
【００２５】
ここで、「アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加」しているとは、当該アミノ酸配列中のアミノ酸が、そのポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく改変していることを指す。また、「数個」とは、2〜50個，好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個の変異が存在することを指す。
【００２６】
また、上述のように、機能強化の対象となる転写制御因子としては、「CEF2遺伝子」又は「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有し、かつ、セルロースの発現を制御する活性を有する転写制御因子も含まれる。また、同一の機能を保持している限り、「CEF2遺伝子」又は「CEF4遺伝子」又は「CEF5遺伝子」又は「CEF3遺伝子」又は「CEF1遺伝子」又は「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有する転写制御因子は、そのフラグメントであってもよい。「CEF2遺伝子」又は「CEF4遺伝子」又は「CEF5遺伝子」又は「CEF3遺伝子」又は「CEF1遺伝子」又は「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列に対する同一性は、少なくとも60％、70％、80％であることが好ましい。
ここで、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列において、「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したもの」や「少なくとも60％の同一性を有するもの」の例としては、以下に限定されないが、例えば、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列同士をアライメントした際に、対応するアミノ酸同士が不一致となっている位置において、当該不一致となったアミノ酸へ互いに変異しているものを挙げることができる。なお、好ましい一実施の形態において、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列において変異を有する配列は、配列番号４１に示されるコンセンサス配列を有するものである。
＜コンセンサス配列（配列番号４１）＞
[YF][RVK]G[VA]R[MKRQ]R[QSNTNAREK]WG[KRS]WV[SC]EIR[EQ]P[RKGN][KR][KR][STNKR]RIWLG[TS][FY][SPVADNE][TSKN][PA][DEQ][MK]A[AM][RS]A[HY]D[AV]AA[LMVIF][ASTCYH][IL][KR][GK][GTSANHRCDEK][SATPNKM]
なお、上記コンセンサス配列中、[]は、[]内のいずれかのアミノ酸であることを示す。例えば、[MK]は、MまたはKのいずれかのアミノ酸であることを示す。
【００２７】
また、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号２、配列番号４、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、又は、配列番号４０に示す塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上の相同性を有する塩基配列からなるDNAの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。このようなストリンジェントな条件については、T.Maniatisら編、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratoryなどに記載の通常のハイブリダイゼーション操作におけるTm値を高めた条件として当業者には自明である。例えば、0.5％SDS、5×デンハルツ［Denhardt’s,0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400］及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)中で、50℃で4時間〜一晩保温を行う条件などである。
【００２８】
また、本発明の対象となる植物としては、イモ類、豆類、ナス科類などの双子葉植物一般に適用できるが、特にバイオマス資源の観点からは、ポプラ、ユーカリ、アカシアなどの双子葉木本植物が好ましい。ただし、本発明は、これらの植物に限定されるものではなく、ミスカンザス、エリアンサス、ダンチク、ソルガム、ススキなどの単子葉エネルギー植物の育種一般にも適用できる。
【００２９】
本発明によれば、例えば、上記に列挙するような植物について、増加したセルロースを含有する植物を得ることができる。また、本明細書において、「植物の子孫」というとき、当該植物の有性生殖又は無性生殖により得られる子孫をいい、当該植物のクローンを含む。例えば、当該植物体やその子孫から繁殖材料(例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等)を得て、それらを基に当該植物の子孫を作出することが可能である。また、本明細書において、「植物若しくはその子孫、又はそれらの一部」というときは、特別な場合を除き、当該植物又はその子孫の植物における、種子(発芽種子、未熟種子を含む)、器官又はその部分(葉、根、茎、花、雄蕊、雌蘂、それらの片を含む)、植物培養細胞、カルス、プロトプラストを含む。
【００３０】
また、本明細書において、「セルロースの合成を制御する活性」とは、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子が本来的に備えているセルロースの生合成に関係する遺伝子の転写制御活性をいう。本明細書においては、とりわけ、当該転写制御因子又はそのホモログや変異体において、その機能を強化した際に、植物体内においてセルロースの合成が増す場合、当該転写制御因子若しくはそのホモログ、又はそれらの変異体は、セルロースの合成を制御する活性を有しているということができる。また、当該転写制御因子が本来的に備えている転写の制御活性は、当該転写制御因子の機能と同義で使用される。
【００３１】
転写制御因子の機能を強化する手法は、植物体内における目的の転写因子の遺伝子又はタンパク質の発現を増強することであっても、当該転写因子により制御される下流の標的遺伝子の発現を増強させることであってもよい。なお、転写制御因子の機能を強化する方法は、当該分野において周知の技術が用いられればよく、当該転写制御因子をコードする遺伝子の発現増強、当該転写制御因子をコードする遺伝子に転写活性化ドメインをコードする遺伝子を付加するなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
なお、本発明において、転写制御因子の機能を強化する場合、好ましくは、植物の木質繊維細胞特異的に当該転写因子の機能を強化する手法である。そのような手法は、当業者であれば、例えば、プロモータとともに核酸を導入する手法において、木質繊維細胞特異的プロモータの利用などにより適宜実施することができる。
【００３２】
なお、以下では、本発明の一実施の形態である転写活性化ドメインを付加する手法を用いた「CEF2遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化する方法を、一例として具体的に説明する。しかしながら、本発明は、下記で説明する手法に限られず、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」若しくは「CEF6遺伝子」、又は、それらのホモログ(オルソログ及びパラログを含む)によりコードされる転写制御因子の機能を強化できる方法であれば上記に挙げたものを含めて採用することができる。
【００３３】
本発明の一実施の形態である転写活性化ドメインを付加する手法を用いた形質転換植物の作出方法では、シロイヌナズナ由来の「CEF2遺伝子」によりコードされる転写制御因子に「転写活性化ドメイン」が付加されたポリペプチドをコードする核酸を使用することができる。転写活性化ドメインとして用いられるポリペプチドとしてはVP16(配列番号５)が好ましく用いられている。
【００３４】
本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「CEF2遺伝子」の機能を強化する場合、セルロース増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ａ’）配列番号１に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ａ’１）前記(ａ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ａ’２）前記(ａ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号１及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ’）配列番号２に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｂ’１）前記(ｂ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００３５】
なお、本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「CEF4遺伝子」の機能を強化する場合、セルロース増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ｃ’）配列番号３に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’１）前記(ｃ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｃ’２）前記(ｃ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｄ’）配列番号４に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｄ’１）前記(ｄ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００３６】
なお、本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「CEF5遺伝子」の機能を強化する場合、セルロース増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ｅ’）配列番号３３に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ’１）前記(ｅ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｅ’２）前記(ｅ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３３及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｆ’）配列番号３４に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｆ’１）前記(ｆ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００３７】
なお、本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「CEF3遺伝子」の機能を強化する場合、セルロース増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ｇ’）配列番号３５に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’１）前記(ｇ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｇ’２）前記(ｇ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３５及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｈ’）配列番号３６に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｈ’１）前記(ｈ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３６及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００３８】
なお、本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「CEF1遺伝子」の機能を強化する場合、セルロース増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ｉ’）配列番号３７に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’１）前記(ｉ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｉ’２）前記(ｉ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３７及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｊ’）配列番号３８に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｊ’１）前記(ｊ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３８及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００３９】
なお、本発明の一実施の形態において、転写活性化ドメインを付加する手法を用いて「CEF6遺伝子」の機能を強化する場合、セルロース増強形質を発現するために導入される核酸(導入遺伝子)は、例えば、以下のように表現することができる；
（ｋ’）配列番号３９に示される第一のアミノ酸配列と配列番号５に示される第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’１）前記(ｋ’)に記載の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有しており、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｋ’２）前記(ｋ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、配列番号３９及び／又は配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸、
（ｌ’）配列番号４０に示される第一の塩基配列と配列番号６に示される第二の塩基配列とが連結した塩基配列からなる核酸、
（ｌ’１）前記(ｌ’)の核酸において、第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であり、かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００４０】
ここで、「配列番号１に示される第一のアミノ酸配列」、「配列番号３に示される第一のアミノ酸配列」、「配列番号３３に示される第一のアミノ酸配列」、「配列番号３５に示される第一のアミノ酸配列」、「配列番号３７に示される第一のアミノ酸配列」、又は、「配列番号３９に示される第一のアミノ酸配列」とは、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列であって、第二のアミノ酸配列とインフレームに連結するためにそのＣ末端側の一部を欠いていてもよいアミノ酸配列である。本発明に使用される「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列」としては、配列番号１、配列番号３、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、又は、配列番号３９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド以外に、下記(ｉ)又は(ｉｉ)のいずれかであって、かつ、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を有するポリペプチドも含まれる；（ｉ）当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したもの、又は、（ｉｉ）当該アミノ酸配列であって、少なくとも60％、より好ましくは、70％、80％、さらに好ましくは、90％以上の同一性を有するアミノ酸配列。本発明の一実施の形態である転写活性化ドメインを付加する手法を用いた植物の作出方法において、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF5遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF1遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を有するポリペプチドという場合、好ましくは、当該転写制御因子のDNA結合能を有するポリペプチドである。すなわち、当該転写制御因子のDNA結合領域を含むポリペプチドであれば、当該転写制御因子の断片のアミノ酸配列も、本発明に使用される「CEF2遺伝子」によりコードされる転写制御因子のアミノ酸配列に含まれる。
【００４１】
また、「配列番号５に示される第二のアミノ酸配列」とは、「CEF2遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化するために付加される「転写活性化ドメイン」である。本発明に使用される「転写活性化ドメイン」としては、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド以外に、下記(ｉ)又は(ｉｉ)のいずれかであって、かつ、第一のアミノ酸配列によりコードされる転写制御因子の機能を強化可能なポリペプチドも含まれる；（ｉ）当該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加したもの、又は、（ｉｉ）当該アミノ酸配列であって、少なくとも80％以上、より好ましくは、90％以上、さらに好ましくは95％の同一性を有するアミノ酸配列。
【００４２】
すなわち、上記(ａ’２)には、下記の一形態が含まれる：
（ａ’２−１）前記(ａ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ａ’２−２）前記(ａ’)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００４３】
また、上記(ｃ’２)には、下記の一形態が含まれる：
（ｃ’２−１）前記(ｃ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｃ’２―２）前記(ｃ’)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００４４】
また、上記(ｅ’２)には、下記の一形態が含まれる：
（ｅ’２−１）前記(ｅ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｅ’２―２）前記(ｅ’)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００４５】
また、上記(ｇ’２)には、下記の一形態が含まれる：
（ｇ’２−１）前記(ｇ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号３５に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｇ’２―２）前記(ｇ’)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００４６】
また、上記(ｉ’２)には、下記の一形態が含まれる：
（ｉ’２−１）前記(ｉ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号３７に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｉ’２―２）前記(ｉ’)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００４７】
また、上記(ｋ’２)には、下記の一形態が含まれる：
（ｋ’２−１）前記(ｋ’)の核酸において、第一のアミノ酸配列が、配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも60％(より好ましくは、70％以上、80％以上、さらに好ましくは、90％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
（ｋ’２―２）前記(ｋ’)の核酸において、第二のアミノ酸配列が、配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも80％(より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上)の同一性を有するアミノ酸配列からなり、
かつ、セルロースの合成量を増加する活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
【００４８】
また、「第一のアミノ酸配列及び／又は第二のアミノ酸配列が、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する」というとき、第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列において、（１）第一のアミノ酸配列の部分が１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する場合、（２）第二のアミノ酸配列の部分が１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する場合、及び、（３）第一のアミノ酸配列と第二のアミノ酸配列とが連結したアミノ酸配列全体において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を有する場合、を含む。
【００４９】
また、「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号２及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というとき、第一の塩基配列及び第二の塩基配列とが連結した塩基配列において、（４）第一の塩基配列の部分が、配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である場合、（５）第二の塩基配列の部分が、配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である場合、及び、（６）第一の塩基配列及び第二の塩基配列とが連結した塩基配列全体が、配列番号２に示される塩基配列と配列番号６に示される塩基配列とが連結した塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である場合、を含む。なお、「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というときも「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３４及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というときも「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３６及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というときも「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号３８及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というときも「第一の塩基配列及び／又は第二の塩基配列が、配列番号４０及び／又は配列番号６に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列である」というときも同様に上記(４)〜(６)の場合を含む。
【００５０】
また、「第一のアミノ酸配列」と「第二のアミノ酸配列」、又は「第一の塩基配列」と「第二の塩基配列」は、それぞれ、「ポリペプチドリンカー」又は「ポリヌクレオチドリンカー」を介して連結されていてもよい。なお、当該リンカーの使用は必須ではなく、必要に応じて適宜設計・使用することができる。当該リンカーのアミノ酸配列又は塩基配列は、当該転写制御因子の機能を強化可能なポリペプチドを産生できる限りにおいて特に限定されず、例えば、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカー又は配列番号８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドリンカーを好適に使用することができる。また、リンカーには、ベクターへの当該転写制御因子のゲートウェイクローニングの結果によって生じた配列を含ませることもできる。例えば、ゲートウェイLR反応によって生じたattＢ配列などを含ませることができる。従って、リンカーは上記の配列に限定されず、使用するベクターの種類等により、当業者であれば適宜好ましいリンカーを設計可能である。
【００５１】
なお、第一のアミノ酸配列又は塩基配列と、第二のアミノ酸配列又は塩基配列との配置の順序は、どちらがＮ末側又は５’側に配置されてもよい。好ましくは、Ｎ末側又は５’側より、（１）第一のアミノ酸配列又は塩基配列、（２）ポリペプチドリンカー又はポリヌクレオチドリンカー、（３）第二のアミノ酸配列又は塩基配列の順である。なお、(１)と(３)の位置を入れ替える際には、１つのポリペプチドとして翻訳されるように、適宜開始コドンや終止コドンの設計を行う。
【００５２】
また、本明細書において、「発現カセット」とは、そのカセットに内包された核酸(主に、遺伝子又はその断片)を発現することのできる一つの発現系単位をいう。発現カセットは、前記核酸を含む領域の他に、遺伝子発現に必要な発現調節領域を有する。そのような発現調節領域には、例えば、プロモータ及びターミネータが含まれる。また、その他の構成として、エンハンサ、ポリＡ付加シグナル、5’-UTR(非翻訳領域)、標識若しくは選抜マーカー遺伝子、マルチクローニング部位、複製開始点等を含むことができる。発現カセットには、特定の遺伝子等を発現させる上で必要な一つの発現系単位をゲノム上からそのまま取り出したものや、様々な生物由来の発現調節領域等を組み合わせる等して人工的に構築したものが存在する。本発明においては、いずれの発現カセットも利用することが可能である。また、上述する発現調節領域の構成については、本明細書中に記載のない限り、当該分野において公知の構成を適宜選択することが可能である。
【００５３】
本明細書において「発現カセット」は、目的とする植物内の「CEF2遺伝子」などによりコードされる転写制御因子の活性を強化する効果を提供し、その植物においてセルロースの合成量を増加させる機能を有する。
【００５４】
（２−１）転写活性化ドメインを付加する手法によりセルロースの合成が増強された植物の作出方法
転写活性化ドメインを付加する手法において用いられる導入遺伝子を発現させるためのプロモータは、「木質繊維細胞において遺伝子発現を誘導するプロモータ」であり、具体的には、NST3プロモータもしくはそのオルソログ遺伝子のプロモータ、NST結合配列(SNBE)を繰り返してコアプロモータの上流に配置した人工プロモータ、二次細胞壁セルロース合成酵素のプロモータ、リグニン合成に関与する酵素類のプロモータ、キシラン合成に関与する酵素類のプロモータである。特に、シロイヌナズナ由来のNST1及びNST3遺伝子のプロモータが、木質繊維細胞特異的に強い発現を促す点において好ましい。
導入遺伝子を木質繊維細胞で発現するプロモータの下流に配置したコンストラクト(組換えベクター)を構築し、野生株もしくはNST転写因子もしくはそのオルソログ転写因子遺伝子の機能が抑制された植物に形質転換して作製する。
【００５５】
本明細書において「ベクター」とは上記発現カセットを含むものであって、上記発現カセットに含まれる塩基配列からなる核酸の増殖に使用される大腸菌等へ導入されるベクターや、植物の形質転換を行うためのベクターを含む。本発明に使用されるベクターとしては、当該分野において公知のベクターを使用でき、導入する植物やベクターの使用する手法・目的に応じて適宜選択すればよい。ベクターとしては、例えば、下記実施例にて使用されるpDEST_NST3p_VP16_HSP_GWB5などを使用することができるが、これに限定されない。
【００５６】
本発明は、一つの態様として、増加したセルロースを含有する植物を生産するためのキットを提供する。当該キットの具体例としては、CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化するために使用されるベクターを挙げることができる。このようなベクターを含むキットとしては、木質繊維細胞で遺伝子発現を誘導するプロモータの下流に、上記(ａ)〜(ｅ)のいずれかに記載の核酸が作動可能に連結された発現カセットを含むベクターを少なくとも含んでいればよく、当該ベクターを植物細胞に導入するための試薬群を含んでいればより好ましい。当該試薬群としては、形質転換の種類に応じた酵素やバッファー等を挙げることができる。その他、必要に応じてマイクロ遠心チューブ等の実験用素材が添付されていてもよい。
【００５７】
遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、アグロバクテリウム法が典型的であるが、PEG-リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等、従来周知の方法が適用できる。
【００５８】
（３）「CEF2遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能が強化された植物の形質的特徴の評価
（３−１）酵素糖化性の評価
CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能が強化された植物においては、下記の実施例で示すように、一次細胞壁中のセルロース(すなわち、取り出しやすいセルロース)の合成量が増加する。増加したそのようなセルロースを評価するには、例えば、「酵素糖化処理」によりグルコースを得て、得られたグルコースの量を測定することにより間接的に評価することができる。
「酵素糖化処理」は、細胞壁成分に含まれるセルロースからどれだけ容易にグルコースを抽出できるかを評価するための周知の手法であり、セルラーゼが触媒する酵素反応によって遊離されたグルコースを取得する。
下記の実施例により得られたCEF2-VP16相補ラインシロイヌナズナ植物の花茎の下部10cmをサンプリングして細胞壁精製粉末を得た後、酵素糖化処理を行い、鮮重量あたりで得られるグルコースの量を比較したところ、CEF2-VP16相補ラインでは野生株よりも約70％(１．７倍)も多く得られることがわかった(図４)。
このように、本発明により得られる、セルロースの蓄積量が増加した植物は、好ましい実施形態において、野生株と比較した際に、30％(１.３倍)以上、好ましくは50％(１.５倍)以上、より好ましくは70％(１.７倍)以上取り出しやすい形で増加したセルロースを含有する。
【００５９】
（３−２）下流遺伝子発現の評価
「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能が強化された植物においては、細胞壁が肥厚しており取り出しやすいセルロースの合成量が増加する。肥厚した細胞壁が一次細胞壁であるか二次細胞壁であるかは、下流遺伝子の発現プロファイルを調べることで推定することができる。
CEF2-VP16相補ラインシロイヌナズナ植物の花茎からRNAを抽出して、一次細胞壁、二次細胞壁に含まれるセルロースそれぞれに特異的なセルロース合成酵素の発現をRT-PCRによって調べたところ、一次細胞壁のセルロース合成に関与するセルロース合成酵素の発現が、CEF2-VP16相補ラインにおいて、元株であるnst1 nst3二重変異体に比べて明らかに上昇していた(図５)。一方で二次細胞壁のセルロース合成に関与するセルロース合成酵素の発現は変化していなかった(図５)。
このことから、本発明により得られる、セルロースの蓄積量が増加した植物では一次細胞壁が肥厚していると推定された。
【００６０】
２．その他
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学的技術はJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning： A Laboratory Manual (2nd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., DNA Cloning, 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995)などに記載の方法により、又はそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種蛋白質やペプチド、あるいはそれらをコードするDNAについては、既存のデータベース(URL：http：//www.arabidopsis.org/又はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed等)から入手することができる。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００６２】
（実施例１）ProNST3：CEF2-VP16、ProNST3：CEF4-VP16、ProNST3：CEF5-VP16、ProNST3：CEF3-VP16、ProNST3：CEF1-VP16、又は、ProNST3：CEF6-VP16で形質転換したnst1 nst3二重変異体シロイヌナズナ植物体の作成
（１−１）形質転換ベクターProNST3：CEF2-VP16、ProNST3：CEF4-VP16、ProNST3：CEF5-VP16、ProNST3：CEF3-VP16、ProNST3：CEF1-VP16、又は、ProNST3：CEF6-VP16の構築
以下のように形質転換ベクターを構築した。
終止コドンを除いたシロイヌナズナ由来のCEF2又はCEF4タンパク質コード領域を下記のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとしたPCRで増幅し、ゲートウェイドナーベクターpDONR207ベクター(インビトロジェン社)に、BPクロナーゼによってクローニングした。
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccATGGGAAAACAAATCAACATAGAGAGTAG-3’(CEF2、配列番号９)
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcGTCATTTTGCCAATTAAACGGCTCTTCAAA-3’(CEF2、配列番号１０)
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctccATGGCAGAGGAATACTACAGCCTCCGCTC-3’(CEF4、配列番号１１)
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcGAGATCCCATGACAAGCCATGGCCAAAATT-3’(CEF4、配列番号１２)
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGACCGAGTCATCCATTATCTCCGTC-3’(CEF5、配列番号４２)
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttAGGAAAAAGGGGGCCAAAATTGGAAGAGTC-3’(CEF5、配列番号４３)
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGATAGCTTCAGAGAGTACCAAG-3’(CEF3、配列番号４４)
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttATAATTATACAGTCCTTGAAGATCCC-3’(CEF3、配列番号４５)
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGGAACGTGACGACTGCCGGAGATT-3’(CEF1、配列番号４６)
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttGTAACTTTGAGAGAGGAAGGGTTCTT-3’(CEF1、配列番号４７)
5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGACGTCACTCAACAGCTCTGCATCA-3’(CEF6、配列番号４８)
5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttGTGATTAAAGCTCCACAATTCCAG-3’(CEF6、配列番号４９)
つぎに非特許文献４に記載のpDEST_NST3p_VP16_HSP_GWB5ベクターにLRクロナーゼによって上記CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」のタンパク質コード領域を移し変えることによって、形質転換に使用したベクターを構築した。
なお、pDEST_NST3p_VP16_HSP_GWB5ベクターには、NST3プロモータの下流に「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」のタンパク質コード領域とVP16転写活性化ドメインをコードする塩基配列とがポリヌクレオチドリンカーを介して連結された状態で配置されている。これにより、当該ベクターを用いて形質転換された植物の木質繊維細胞内では、配列番号１３(CEF2-VP16)、配列番号１４(CEF4-VP16)、配列番号５０(CEF5-VP16)、配列番号５１(CEF3-VP16)、配列番号５２(CEF1-VP16)、又は、配列番号５３(CEF6-VP16)に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが発現される。【００６３】
（１−２）フローラルディップ法を用いたProNST3：CEF2-VP16、ProNST3：CEF4-VP16、ProNST3：CEF5-VP16、ProNST3：CEF3-VP16、ProNST3：CEF1-VP16、又は、ProNST3：CEF6-VP16によるシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体の形質転換
上記実施例(１−１)で得られたプラスミドを、土壌細菌(Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1 Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Schell 1986))株にエレクトロポレーション法で導入した。導入した菌を200mlの抗生物質(スペクチノマイシン(Spe)50mg/L、ゲンタマイシン(Gm)25mg/L及びリファンピシリン(Rif)50mg/L)を含むLB培地で2日間培養した。
次いで、培養液から菌体を回収し、500mlの浸潤培地(Infiltration medium;特許文献１を参照)に懸濁した。形質転換させる植物体として、米国シロイヌナズナバイオリソースセンター(ABRC)から取り寄せたT-DNAタグラインSALK_123077、SALK_149909を掛け合わせて作成したシロイヌナズナnst1 nst3二重変異体(非特許文献１を参照)を45日間〜60日間育てて花を咲かせ、主茎を切った後にさらに10日間育て形質転換に用いた。形質転換は、当該シロイヌナズナnst1 nst3二重変異体を菌体を懸濁させた浸潤培地に2分間浸して感染させ、通常通り育成しT1種子を収穫した。そののち、T1種子を50％ブリーチ、0.02％Triton X-100溶液で7分間滅菌した後、滅菌水で3回リンスし、30mg/lのハイグロマイシン(Hg)を含むMS選択培地に播種した。
上記ハイグロマイシンプレートで生育する形質転換植物体(ProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3, ProNST3：CEF4-VP16 nst1 nst3, ProNST3：CEF5-VP16 nst1 nst3, ProNST3：CEF3-VP16 nst1 nst3, ProNST3：CEF1-VP16 nst1 nst3, ProNST3：CEF6-VP16 nst1 nst3, T1)を選抜し、土壌に植え換えて生育し、種子を採取して播種し、次世代(T2)のシロイヌナズナ植物を得た。【００６４】
（実施例２）ProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物の花茎の切片観察
上記実施例(１−２)で得られたProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約80日で花茎を採取し、地上高約3cmのところで50μm厚の横断切片をバイブレーションミクロトームを用いて作成し、明視野条件化で木質繊維細胞の細胞壁を観察した。その結果、CEF2-VP16相補ラインでは野生株と同等レベルの細胞壁肥厚が見られた(図１)。一方、同横断切片を紫外線照射下に置きリグニンの自家蛍光を観察した。その結果、野生株では細胞壁肥厚が見られる木質繊維細胞及び維管束細胞で蛍光が観察されたのに対し、CEF2-VP16相補ラインでは維管束細胞でしか蛍光が認められなかった(図１)。また、同横断切片を抗キシラン抗体で抗体染色したところ、野生株では細胞壁肥厚が見られる木質繊維細胞及び維管束細胞で染色が観察されたのに対し、CEF2-VP16相補ラインでは維管束細胞でしか染色が認められなかった(図１)。しかし、同横断切片を結晶化セルロース結合タンパク質であるCBM3a(Plant probes社製)を用いて抗体染色したところ、CEF2-VP16相補ラインでも野生株と同様の染色が木質繊維細胞で認められた(図１)。このことは、CEF2-VP16相補ラインにおいて、セルロースが選択的に生産されていることを示している。【００６５】
（実施例３）ProNST3：CEF4-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF5-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF3-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF1-VP16 nst1 nst3、及びProNST3：CEF6-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物の花茎の切片観察
上記実施例(１−２)で得られたProNST3：CEF4-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF5-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF3-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF1-VP16 nst1 nst3、及びProNST3：CEF6-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約80日で花茎を採取し、地上高約3cmのところで50μm厚の横断切片をバイブレーションミクロトームを用いて作成し、明視野条件下で木質繊維細胞の細胞壁を観察した。その結果、CEF4-VP16相補ラインでは野生株と同等レベルの細胞壁肥厚が見られた(図２)。また、同様にCEF5-VP16、CEF3-VP16、CEF1-VP16、及びCEF6-VP16相補ラインでも野生株と同等レベルの細胞壁肥厚が見られた(図７および図８)。一方、同横断切片を紫外線照射下に置きリグニンの自家蛍光を観察した。その結果、野生株では細胞壁肥厚が見られる木質繊維細胞及び維管束細胞で蛍光が観察されたのに対し、CEF4-VP16相補ラインでは維管束細胞でしか蛍光が認められなかった(図２)。また、同様にCEF5-VP16、CEF3-VP16、CEF1-VP16、及びCEF6-VP16相補ラインでも維管束細胞でしか蛍光が認められなかった(図８)。
このことから、CEF4-VP16、CEF5-VP16、CEF3-VP16、CEF1-VP16、及びCEF6-VP16相補ライン相補ラインでもCEF2-VP16相補ラインと同様に、セルロースを中心とした細胞壁が肥厚していると考えられる。【００６６】
（実施例４）ProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物の細胞壁成分分析
（４−１）細胞壁成分の抽出と秤量
上記実施例(１−２)で得られたProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約80日で基部より10cmの部分を採取し、新鮮重量を測定した後、直ちに1cm以下の長さになるよう花茎を刻み、メタノールに浸し一晩以上静置した後、新しいメタノールで２回リンスすることでクロロフィルを除去した。80℃で10分間煮沸した後、新しいメタノールに交換した。この操作を２度繰り返した後、50％クロロホルム、50％メタノール溶液に浸し70℃で煮沸した後、新しい50％クロロホルム、50％メタノール溶液に交換した。この操作を２度繰り返した後、アセトン溶液に浸し、70℃で煮沸した後、新しいアセトン溶液に交換した。この操作を２度繰り返した後、100％エタノール溶液で３回リンスした後、70℃で２日間乾燥させた。これをアルコール不溶性残渣とし、重量を測定した。新鮮重量あたりのアルコール不溶性残渣の割合を細胞壁含量として評価したところ、CEF2-VP16相補ラインの細胞壁含量は野生株のそれと同等レベルにまで回復していた(図３)。【００６７】
（４−２）グルコース収量の分析
前記(４−１)で得たアルコール不溶性残渣をホモジナイザー(シェイクマスターネオ；バイオメディカルサイエンス社)を用いて2000rpm 10分間の粉砕処理を行い、細胞壁粉末を得た。得られた細胞壁粉末を1mlの50mMマレイン酸、2mM 塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液に懸濁し、70℃で10分間デンプンを糊化した後、4mlの50mMマレイン酸、2mM 塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液を加えて、室温で10分間静置した。その次に、500U α-アミラーゼ（ALPHA-AMYLASE (Porcine pancreas)；メガザイム社製）、0.33Uアミログルコシダーゼ（Amyloglucosidase (Aspergillus niger) ；メガザイム社製）、50mMマレイン酸、2mM塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液を1ml加えた後、37℃で18時間、デンプンを加水分解し、除デンプンを行った。除デンプンを行った細胞壁粉末懸濁液は、蒸留水で３回、100％エタノールで２回リンスした後、70℃で一晩乾燥させ、細胞壁精製粉末を得た。得られた細胞壁精製粉末2-3 mgを2mlマイクロチューブに分取した後、1mlの5mMクエン酸緩衝液(pH 4.8)、0.02％アジ化ナトリウム、0.4 FPU Celluclast 1.5L、0.8 CBU Novozyme 188溶液を加えて、50℃、200rpmで24時間振盪しながら、酵素糖化反応を行い得られるグルコース量を調べた。その結果CEF2-VP16相補ラインは野生株にくらべて酵素糖化性が約70％(１.７倍)高かった(図４(ａ))。この結果をもとに、新鮮重量あたりのグルコース収量を計算したところ、CEF2-VP16相補ラインは野生株にくらべて約70％(１.７倍)多くグルコースを得られると計算された(図４(ｂ))。この結果から、NST3pro: CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物系統はコントロール系統にくらべて単位栽培面積当たりより多くのグルコースを得ることができ、バイオエタノール生産等に有利であると考えられた。【００６８】
（実施例５）ProNST3：CEF4-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF5-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF3-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF1-VP16 nst1 nst3、及びProNST3：CEF6-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物の細胞壁成分分析
（５−１）細胞壁成分の抽出と秤量
上記実施例(１−２)で得られたProNST3：CEF4-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF5-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF3-VP16 nst1 nst3、ProNST3：CEF1-VP16 nst1 nst3、及びProNST3：CEF6-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約80日で基部より10cmの部分を採取し、新鮮重量を測定した後、直ちに1cm以下の長さになるよう花茎を刻み、メタノールに浸し一晩以上静置した後、新しいメタノールで２回リンスすることでクロロフィルを除去した。80℃で10分間煮沸した後、新しいメタノールに交換した。この操作を２度繰り返した後、50％クロロホルム、50％メタノール溶液に浸し70℃で煮沸した後、新しい50％クロロホルム、50％メタノール溶液に交換した。この操作を２度繰り返した後、アセトン溶液に浸し、70℃で煮沸した後、新しいアセトン溶液に交換した。この操作を２度繰り返した後、100％エタノール溶液で３回リンスした後、70℃で２日間乾燥させた。これをアルコール不溶性残渣とし、重量を測定した。新鮮重量あたりのアルコール不溶性残渣の割合を細胞壁含量として評価したところ、CEF4-VP16、CEF5-VP16、CEF3-VP16、CEF1-VP16、及びCEF6-VP16相補ラインの細胞壁含量はnst1 nst3二重変異体より増えており、野生株のそれと同等レベルにまで回復していたものもあった(図９(ａ))。【００６９】
（５−２）グルコース収量の分析
前記(５−１)で得たアルコール不溶性残渣をホモジナイザー(シェイクマスターネオ；バイオメディカルサイエンス社)を用いて2000rpm 10分間の粉砕処理を行い、細胞壁粉末を得た。得られた細胞壁粉末を1mlの50mMマレイン酸、2mM 塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液に懸濁し、70℃で10分間デンプンを糊化した後、4mlの50mMマレイン酸、2mM 塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液を加えて、室温で10分間静置した。その次に、500U α-アミラーゼ、0.33Uアミログルコシダーゼ、50mMマレイン酸、2mM塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウム溶液を1ml加えた後、37℃で18時間、デンプンを加水分解し、除デンプンを行った。除デンプンを行った細胞壁粉末懸濁液は、蒸留水で３回、100％エタノールで２回リンスした後、70℃で一晩乾燥させ、細胞壁精製粉末を得た。得られた細胞壁精製粉末2-3 mgを2mlマイクロチューブに分取した後、1mlの5mMクエン酸緩衝液(pH 4.8)、0.02％アジ化ナトリウム、0.4 FPU Celluclast 1.5L、0.8 CBU Novozyme 188溶液を加えて、50℃、200rpmで24時間振盪しながら、酵素糖化反応を行い得られるグルコース量を調べた。その結果CEF4-VP16、CEF5-VP16、CEF3-VP16、CEF1-VP16、及びCEF6-VP16相補ラインは野生株にくらべて酵素糖化性が高かった(図９(ｂ))。この結果をもとに、新鮮重量あたりのグルコース収量を計算したところ、CEF4-VP16、CEF5-VP16、CEF3-VP16、CEF1-VP16、及び、CEF6-VP16相補ラインは野生株にくらべて多くグルコースを得られると計算された(図９(ｃ))。この結果から、NST3pro: CEF4-VP16 nst1 nst3、NST3pro: CEF5-VP16 nst1 nst3、NST3pro: CEF3-VP16 nst1 nst3、NST3pro: CEF1-VP16 nst1 nst3、及びNST3pro: CEF6-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物系統は、NST3pro: CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物系統と同様に、コントロール系統にくらべて単位栽培面積当たりより多くのグルコースを得ることができ、バイオエタノール生産等に有利であると考えられた。【００７０】
（実施例６）ProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナ植物での下流遺伝子発現の測定
上記実施例(１−２)で得られたProNST3：CEF2-VP16 nst1 nst3シロイヌナズナT1植物において播種後約30-40日で先端より10cmの部分を採取し、RNAを抽出するまで-80℃で保存した。RNAを抽出するにあたっては、サンプルを液体窒素中でホモジナイザー(シェイクマスターネオ；バイオメディカルサイエンス社)によって破砕し、RNeasy Plantキット(QIAGEN)を用いてRNAを抽出した。精製したRNAは、PrimeScriptTM RT reagent KitのPrimeScript RT Enzyme Mix I(タカラ社)を用いて逆転写反応を行ない、cDNAを合成した。
cDNA、及び一次細胞壁、二次細胞壁のセルロース合成酵素を増幅させるオリゴヌクレオチドペア、SYBR Green Real-Time PCR Master Mix(Life Technology)のキットを混合し、ABI 7300(Life Technology)により、Real-Time PCRを行なった。UBQ1、ACT2、PP2AA3の平均発現量を用いて補正することで、セルロース合成酵素の相対的発現量を算出した。
Real-Time PCRに用いたセルロース合成酵素、及びUBQ1、ACT2、PP2AA3のプライマー配列は下記の通りである。
＜UBQ1プライマー＞
5’-TGAGCCTTCCTTGATGATGCT-3’      (配列番号１５)
5’-GCACTTGCGGCAAATCATCT-3’       (配列番号１６)
＜ACT2 プライマー＞
5’-ACATTGTGCTCAGTGGTGGA-3’       (配列番号１７)
5’-GAGATCCACATCTGCTGGAAT-3’      (配列番号１８)
＜PP2AA3 プライマー＞
5’-GACCAAGTGAACCAGGTTATTGG-3’    (配列番号１９)
5’-TACTCTCCAGTGCCTGTCTTCA-3’     (配列番号２０)
＜CESA1 プライマー＞
5’-TGTCTCATCACCGACAGATTCATC-3’   (配列番号２１)
5’-CATCTCAGCTCCAGGATTCCA-3’      (配列番号２２)
＜CESA3 プライマー＞
5’-CTCGATGACATAGAAGAGGGAGTT-3’   (配列番号２３)
5’-CCAGGCTCATTTGCGACATTAAGA-3’   (配列番号２４)
＜CESA4 プライマー＞
5’-CGGCAAGTTCATCATTCCTACGA-3’    (配列番号２５)
5’-CACTCCACCGGAGTTCTAAGA-3’      (配列番号２６)
＜CESA6 プライマー＞
5’-CTCTCTACCGCTCATCGTTTAC-3’     (配列番号２７)
5’-GACGAGAAGAGCGCCATGAA-3’       (配列番号２８)
＜CESA7 プライマー＞
5’-GGCAAACTCAAGTGGCTTGAGCG-3’    (配列番号２９)
5’-TAACTCCGCTCCATCTCAATTCC-3’    (配列番号３０)
＜CESA8 プライマー＞
5’-GTCACATCGAAAACCGCAGATGAT-3’   (配列番号３１)
5’-AAGTGACGTCGGAGGGATCAA-3’      (配列番号３２)
UBQ1、ACT2、PP2AA3の平均発現量を用いて補正することで、セルロース合成酵素の相対的発現量を算出した。その結果、CEF2-VP16相補ラインでは一次細胞壁のセルロース合成に関係するセルロース合成酵素(CESA1、CESA3、CESA6)の発現量が、元株であるnst1 nst3二重変異体よりも高いことを発見した(図５)。【００７１】
（実施例７）プロトプラスト一過的形質転換ベクター35S：CEF2-VP16又は35S：CEF2又は35S：CEF2-SRDXの構築
35S：CEF2及び35S:CEF2-VP16の構築は以下のように行った。
前記（１−１）で得た、終止コドンを除いたシロイヌナズナ由来のCEF2タンパク質コード領域がpDONR207にクローニングされたエントリークローンを、非特許文献５に記載されたpDEST_35SHSPベクター及びpDEST_35SVP16HSPベクターとLRクロナーゼによって組換えることにより、形質転換に使用したベクターの一部を構築した。
なお、pDEST_35SVP16HSPベクターには、CaMV 35Sプロモータの下流に、CEF2遺伝子のタンパク質コード領域とVP16転写活性化ドメインをコードする塩基配列とがポリヌクレオチドリンカーを介して連結された状態で配置されている。これにより、当該ベクターを用いて形質転換された植物のプロトプラスト内では、配列番号１３(CEF2-VP16)に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが発現される。
35S：CEF2-SRDXの構築は以下のように行った。
終止コドンを除いたシロイヌナズナ由来のCEF2タンパク質コード領域を下記のオリゴヌクレオチドペアをプライマーとしたPCRで増幅し、非特許文献６に記載のp35SSRDXGベクターをSmaIで切断した箇所にライゲーションした。
5’- gATGGGAAAACAAATCAACATAGAGAGTAG -3’(CEF2N、配列番号５４)
5’- GTCATTTTGCCAATTAAACGGCTCTTCAAA -3’(CEF2C、配列番号５５)
なお、p35SSRDXG ベクターには、CaMV 35Sプロモータの下流に、CEF2遺伝子のタンパク質コード領域とSRDX転写抑制化ドメインをコードする塩基配列とが配置されている。これにより、当該ベクターを用いて形質転換された植物のプロトプラスト内では、配列番号５６(CEF2-SRDX)に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが発現される。【００７２】
（実施例８）CEF2転写制御因子をシロイヌナズナ葉肉細胞のプロトプラストに遺伝子導入した際に一次細胞壁の回復に与える影響の測定
約20〜30日間生育させたシロイヌナズナの葉を、セロハンテープにより表皮を剥ぎとり葉肉細胞を露出させた後、その葉を適量の1.0% セルラーゼ-オノズカ R10（ヤクルト社製）、0.25% マセロザイム R-10（ヤクルト社製）、10 mM メルカプトエタノール、400 mMマンニトール、20 mM KCl、10 mM CaCl2、20 mM MES (pH5.7)溶液に浸し、22℃、50 rpmで振とうしながら、1時間インキュベートし、プロトプラストを遊離させた。プロトプラストは孔径70 μmのナイロンフィルターで濾した後、50ml容チューブに集め、100×g、10分間遠心しプロトプラストを回収した後、上清を捨て、150 mM NaCl、125 mM CaCl2、5 mM KCl、2 mM MES (pH5.7)緩衝液（Ｗ５緩衝液）で再懸濁した。再懸濁したプロトプラストは100×g、5分間遠心後、同緩衝液で再度懸濁した。この緩衝液による洗浄を２度繰り返した後、4℃で10分間インキュベートした。インキュベート後のプロトプラストは、100×g、5分間遠心後、400 mMマンニトール、15 mM MgCl2、4 mM MES (pH5.7)緩衝液で再懸濁した。その後、100×g、5分間遠心することでプロトプラストを回収した後、2.0〜3.0×105 cells/mlになるよう同緩衝液で細胞濃度を調製し、形質転換用プロトプラスト懸濁液を得た。得られた形質転換用プロトプラスト懸濁液35 μLに150 ng/μlのプラスミド溶液（35Spro:CEF2（CEF2ox）、35Spro:CEF2-VP16（CEF2-VP16）、35Spro:CEF2-SRDX(CEF2-SRDX)）を各10 μL、40% (w/v)PEG 4000、200 mM マンニトール、100 mM CaCl2溶液を45  μLずつ、それぞれ96穴プレート（ヌンク社製、丸底）に入れ、900 rpm、15秒間振とうし、溶液を混合した。混合液は10分間室温で静置した。静置後の混合液にＷ５緩衝液を200 μL勢いよく加えることでプロトプラストを懸濁させた後、100×g、5分間遠心し、プロトプラスト細胞をプレート底に集め、上清を200 μL捨てることで、プロトプラスト懸濁液を洗浄した。この作業を計４回行った後、各ウェルをパラフィルムでシールし、22℃で18時間静置し、一過的に導入された遺伝子を細胞内で発現させた。その後、プロトプラストは、１×Gamborg’s B5 混合塩（日本製薬社製）、1×Gamborg’s B5 ビタミン（シグマ社製）、250 mM マンニトール、200 mMグルコース、1.0 mg/L 2,4-D、0.022 mg/L thidiazuron, 200mg/Lアンピシリン、1.0 mg/L fungizone (Amphotericin B, シグマ社製)、0.1% エタノール溶液で再懸濁した後、22℃、2日間インキュベートし、プロトプラストの細胞壁を再生させた。再生した細胞壁は10 mg/Lカルコフロー溶液で染色し、UV照射下で発する蛍光を蛍光顕微鏡によって観察し、蛍光強度を指標に細胞壁の再生度合いを定量した。
その結果、CEF2及びCEF2-VP16を発現させたプロトプラストでは、コントロール（プラスミドを導入していないプロトプラスト）に比べ、カルコフローの蛍光がコントロールに比べ強かった、CEF2-SRDXを発現させたプロトプラストではコントロールに比べカルコフローの蛍光は弱かった（図６）。このことは、CEF2転写制御因子がプロトプラストの細胞壁の再生、すなわち一次細胞壁形成の制御に関与していることを示している。【００７３】
なお、上記の実施例においては、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化する対象の植物としてnst1 nst3二重変異体を用いた。これは、部分的に肥厚した細胞壁を検出しやすくするためである。なお、当業者であれば、「CEF2遺伝子」、「CEF4遺伝子」、「CEF1遺伝子」、「CEF3遺伝子」、「CEF5遺伝子」、又は、「CEF6遺伝子」によりコードされる転写制御因子の機能を強化することで、野生型の植物内においてもセルロースの合成量を増加させることが可能であると理解することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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