(57)【要約】  本発明は、シート状細胞培養物の評価方法、およびシート状細胞培養物を評価するためのシステムの提供を目的とする。  本発明は、シート状細胞培養物に光線を照射するステップ、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定するステップ、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出するステップを含む、シート状細胞培養物の評価方法に関する。
2016152592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シート状細胞培養物に光線を照射するステップ、
光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定するステップ、
透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出するステップ、
を含む、シート状細胞培養物の評価方法。
【請求項２】
指標が、シート状細胞培養物の細胞密度、細胞数、収縮率および厚さからなる群から選択される１または２以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シート状細胞培養物が、培養基材から剥離された後のシート状細胞培養物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
光線がレーザー光線である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
算出された指標と設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定するステップをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
シート状細胞培養物に光線を照射し、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定し、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出し、算出された指標が設定値以上であることを判定することを含む、設定値以上の品質を有するシート状細胞培養物を製造する方法。
【請求項７】
シート状細胞培養物に光線を照射する照射部、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定する測定部、および透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出する解析部を含む、シート状細胞培養物を評価するためのシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シート状細胞培養物の評価方法、およびシート状細胞培養物を評価するためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の心臓病に対する治療の革新的進歩にかかわらず、重症心不全に対する治療体系は未だ確立されていない。心不全の治療法としては、βブロッカーやＡＣＥ阻害剤による内科治療が行われるが、これらの治療が奏功しないほど重症化した心不全には、補助人工心臓や心臓移植などの置換型治療、つまり外科治療が行われる。【０００３】
このような外科治療の対象となる重症心不全には、進行した弁膜症や高度の心筋虚血に起因するもの、急性心筋梗塞やその合併症、急性心筋炎、虚血性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）などによる慢性心不全やその急性憎悪など、多種多様の原因がある。
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。【０００４】
この中で、ＩＣＭやＤＣＭによる高度の左室機能低下から心不全を来たしたものについては、心臓移植や人工心臓による置換型治療のみが有効な治療法とされてきた。しかしながら、これら重症心不全患者に対する置換型治療は、慢性的なドナー不足、継続的な免疫抑制の必要性、合併症の発症など解決すべき問題が多く、すべての重症心不全に対する普遍的な治療法とは言い難い。【０００５】
その一方、最近、重症心不全治療の解決策として新しい再生医療の展開が不可欠と考えられている。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。【０００６】
近年、その一例として、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いることによって、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む心臓に適用可能な三次元に構成された細胞培養物と、その製造方法が提供された（特許文献１）。【０００７】
また、製造工程由来不純物を用いない方法でシート状細胞培養物を製造する試みがなされてきた。例えば、播種細胞数のコントロールや、加圧などによって、製造工程由来不純物を含まないシート状細胞培養物およびその製造方法が提供された（特許文献２および３）。【０００８】
一方、シート状細胞培養物を製造する過程において、シート状細胞培養物が正しく形成されたか否かを判定する技術は知られている。例えば特許文献４には、全播種細胞のうち培養容器に接着した細胞の割合を接着率として計測し、接着率が設定値以上である場合にシート状細胞培養物が形成されたと判定する方法が開示されている。【０００９】
これらの方法により製造されたシート状細胞培養物を、医療の現場において、対象に投与して治療する場合、投与記録として、投与するシート状細胞培養物の品質に関する情報を記録しておくことが望ましい。しかし、シート状細胞培養物の品質を確認するためには、シート状細胞培養物を酵素処理などで破壊してシングルセルの状態にして、品質の指標となり得る細胞数や細胞密度を観察する必要があるため、実際に使用するシート状細胞培養物の品質を評価することはできなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【特許文献２】特開２０１０−８１８２９号公報
【特許文献３】特開２０１０−２２６９６２号公報
【特許文献４】特開２０１２−１５２１８９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、シート状細胞培養物の評価方法、およびシート状細胞培養物の製造工程において、実際に使用するシート状細胞培養物を破壊することなく品質を確認することができる、シート状細胞培養物を評価するためのシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を進める中、シート状細胞培養物の品質がシート状細胞培養物の透過率に依存していることを新たに見出した。さらに鋭意研究を続ける中で、シート状細胞培養物に光線を照射して透過率を測定するという単純な方法で、シート状細胞培養物の品質に関する指標を簡単かつ非破壊的に算出することができることを見出し、本発明を完成させた。【００１３】
すなわち、本発明は以下に関する。
（１）シート状細胞培養物に光線を照射するステップ、
光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定するステップ、
透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出するステップ、
を含む、シート状細胞培養物の評価方法。
（２）指標が、シート状細胞培養物の細胞密度、細胞数、収縮率および厚さからなる群から選択される１または２以上である、上記（１）に記載の方法。
（３）シート状細胞培養物が、培養基材から剥離された後のシート状細胞培養物である、上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）光線がレーザー光線である、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法。
（５）算出された指標と設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定するステップをさらに含む、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法。
（６）シート状細胞培養物に光線を照射し、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定し、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出し、算出された指標が設定値以上であることを判定することを含む、設定値以上の品質を有するシート状細胞培養物を製造する方法。
（７）シート状細胞培養物に光線を照射する照射部、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定する測定部、および透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出する解析部を含む、シート状細胞培養物を評価するためのシステム。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、シート状細胞培養物の品質に関する指標を簡単かつ非破壊的に算出することが可能となる。したがって、医療などの現場において投与するシート状細胞培養物の品質に関する情報を記録することが可能となる。そして、かかる情報と投与後の経過観察から有効量を特定することで、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止することが可能となる。さらに、かかる指標と事前設定された設定値とを比較して、シート状細胞培養物の品質を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、細胞数の異なる複数のシート状細胞培養物を示す図である。
【図２】図２は、シート状細胞培養物の透過率と細胞数との相関性を示す図である。
【図３】図３は、剥離前と剥離後のシート状細胞培養物の透過率（中心）と細胞数との相関性を示す図である。
【図４】図４は、剥離前と剥離後のシート状細胞培養物の透過率（平均値）と細胞数との相関性を示す図である。
【図５】図５は、シート状細胞培養物の透過率と収縮率との相関性を示す図である。
【図６】図６は、均一に細胞を播種したシート状細胞培養物の透過率（図中左側）、および、不均一に細胞を播種したシート状細胞培養物の透過率（図中右側）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【００１７】
本発明の一側面は、シート状細胞培養物に光線を照射するステップ、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定するステップ、および、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出するステップを含む、シート状細胞培養物の評価方法（以下、「本発明の評価方法」と称することがある）に関する。本発明の評価方法は、シート状細胞培養物に光線を照射するステップの前に、シート状細胞培養物を形成するステップを含んでもよい。
【００１８】
本発明の評価方法における細胞は、シート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたものであってもよい。本発明の評価方法における細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。
【００１９】
本発明において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、シート状細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。
【００２０】
本発明のシート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本発明のシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本発明のシート状細胞培養物は、好ましくは、シート状細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
【００２１】
本発明における細胞は、シート状細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。
【００２２】
シート状細胞培養物の形成に用いる細胞は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いることもできる。また、生体から単離して得た細胞などにおいては、細胞が複数種の細胞を含むことが多く、全ての細胞種を特定することが困難である場合があるため、細胞種への言及は、ある細胞集団における最も比率の多い細胞のみにとどめることがある。例えば、ある細胞集団が所定の比率の細胞Ａと、細胞Ａ以外の１種または２種以上の細胞を含み、細胞Ａの比率が最も多い場合、当該細胞集団を便宜的に細胞Ａと称し、当該細胞集団で構成されるシート状細胞培養物を、「細胞Ａで構成されるシート状細胞培養物」と称することがある。本発明の好ましい態様において、シート状細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の比率（純度）は、シート化培養開始時、または、シート状細胞培養物製造終了時において、約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約７５％以上である。
【００２３】
細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本発明においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本発明の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本発明の一態様において、細胞は自家細胞である。本発明の別の態様において、細胞は他家細胞である。
【００２４】
本発明の評価方法における、シート状細胞培養物を形成するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、特許文献２に記載されたものが挙げられる。シート状細胞培養物を形成するステップは、培養基材上で行うことができる。また、シート状細胞培養物を形成するステップは、細胞を培養基材上に播種するステップ、および、播種した細胞をシート化するステップを含んでもよい。
【００２５】
培養基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材が挙げられる。具体的には、親水性の表面を有する基材、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R) TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。
【００２６】
培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平2-211865、特開2003-33177参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、CellSeed Inc.のUpCell(R)）、これらを本発明の評価方法に使用することができる。
【００２７】
上記培養基材は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、典型的には、約１ｃｍ２〜約２００ｃｍ２、好ましくは約２ｃｍ２〜約１００ｃｍ２、より好ましくは約３ｃｍ２〜約５０ｃｍ２である。
【００２８】
培養基材への細胞の播種は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。培養基材への細胞の播種は、例えば、細胞を培養液に懸濁した細胞懸濁液を培養基材（培養容器）に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。
【００２９】
本発明の好ましい態様において、播種は、細胞が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で行われる。「細胞が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」とは、成長因子を実質的に含まない非増殖系の培養液で培養した場合に、シート状細胞培養物を形成することができる細胞密度を意味する。例えば、骨格筋芽細胞の場合、成長因子を含む培養液を用いる方法では、シート状細胞培養物を形成するために、細胞を約６，５００個／ｃｍ２の密度で培養基材に播種するが（例えば、特許文献１参照）、かかる密度の細胞を、成長因子を含まない培養液で培養してもシート状の細胞培養物を形成しない。したがって、本態様における播種密度は、成長因子を含む培養液を用いる手法におけるものよりも高いものである。かかる密度は、具体的には、例えば、骨格筋芽細胞について典型的には約１．０×１０５個／ｃｍ２以上である。播種密度の上限は、シート状細胞培養物の形成が損なわれず、細胞が分化に移行しなければ特に制限されないが、骨格筋芽細胞については、約３．４×１０６個／ｃｍ２未満である。
【００３０】
したがって、骨格筋芽細胞における「実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」は、ある態様では約１．０×１０５〜約３．４×１０６個／ｃｍ２、別の態様では約３．０×１０５〜約３．４×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では約３．５×１０５〜約３．４×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では約１．０×１０６〜約３．４×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では約３．０×１０５〜約１．７×１０６個／ｃｍ２、別の態様では約３．５×１０５〜約１．７×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では約１．０×１０６〜約１．７×１０６個／ｃｍ２である。上記範囲は、上限が約３．４×１０６個／ｃｍ２未満である限り、上限および下限の両方、または、そのいずれか一方を含んでもよい。したがって、上記密度は、例えば、約３．０×１０５個／ｃｍ２以上かつ約３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限を含み、上限は含まない）、約３．５×１０５個／ｃｍ２以上かつ約３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限を含み、上限は含まない）、約１．０×１０６個／ｃｍ２以上かつ約３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限を含み、上限は含まない）、約１．０×１０６個／ｃｍ２超かつ約３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限も上限も含まない）、約１．０×１０６個／ｃｍ２超かつ約１．７×１０６個／ｃｍ２以下（下限は含まないが、上限は含む）であってもよい。当業者であれば、骨格筋芽細胞以外の細胞について、本発明に適した細胞密度を、本明細書の教示に従い、実験により適宜決定することができる。一態様において、「細胞が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」は、細胞がコンフルエントに達する密度もしくはそれ以上、または、コンフルエント密度以上である。
【００３１】
播種した細胞をシート化するステップも、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特許文献１、２などに記載されている。細胞のシート化は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、播種した細胞をシート化するステップは、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。かかる条件としては、例えば、約３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の圧力下（大気圧下、非加圧下）で行うことができる。当業者であれば、播種する細胞の種類に応じて最適な条件を選択することができる。本明細書において、播種した細胞をシート化するための培養を、「シート化培養」と称することもある。
【００３２】
本発明の一態様において、細胞の培養は、所定の期間内、好ましくは、細胞が分化に移行しない期間内に行われる。したがって、この態様において、細胞は、培養期間中、未分化の状態に維持される。細胞の分化への移行は、当業者に知られた任意の方法で評価することができる。例えば、骨格筋芽細胞の場合は、ＭＨＣの発現、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性、細胞の多核化、筋管の形成などを分化の指標とすることができる。本発明の好ましい態様において、培養期間は約４８時間以内、より好ましくは約４０時間以内、さらに好ましくは約２４時間以内である。
【００３３】
細胞の培養は、当該技術分野で通常なされている条件で行うことができる。例えば、典型的な培養条件としては、約３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の圧力下（大気圧下、非加圧下）で行うことができる。培養期間は、シート状細胞培養物の十分な形成、および、細胞分化防止の観点から、好ましくは約４８時間以内、より好ましくは約４０時間以内、さらに好ましくは約２４時間以内である。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。シート状細胞培養物の大きさや形状は、培養容器の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。
【００３４】
本発明の好ましい態様において、細胞は計測誤差の範囲を超えて増殖しない。細胞が増殖したか否かは、例えば、播種時の細胞数と、シート状細胞培養物形成後の細胞数とを比較することにより評価することができる。本発明において、シート状細胞培養物形成後の細胞数は、典型的には播種時の細胞数の約３００％以下、好ましくは約２００％以下、より好ましくは約１５０％以下、さらに好ましくは約１２５％以下、特に好ましくは約１００％以下である。
【００３５】
細胞の増殖は、様々な条件、例えば播種細胞数（播種細胞密度）、培養環境（例えば、培養時間、培養温度など）、培地の組成などにより左右されるため、これらの条件を調節することにより、細胞を実質的に増殖させないことができる。これらの条件のうち、播種細胞密度を高めることにより、細胞の増殖を抑えながら、比較的短時間でシート状細胞培養物を得ることができるため、本発明においては播種細胞密度により増殖をコントロールすることが好ましい。細胞が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度については、すでに上記したとおりである。
【００３６】
本発明の評価方法における、シート状細胞培養物に光線を照射するステップは、既知の任意の手法および条件により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物に、光線、例えば、可視光線を照射することなどが挙げられる。光線の光源としては、発生する光線の波長を一定に保つことができるものであれば特に限定されないが、例えば、レーザー、ＬＥＤ、蛍光灯、白熱灯、高輝度放電灯、水銀灯などが挙げられる。光線の波長としては、限定されずに、例えば、３８０〜４３０ｎｍ、３８０〜４３０ｎｍ、４３０〜４９０ｎｍ、４９０〜５５０ｎｍ、５５０〜５９０ｎｍ、５９０〜６４０ｎｍ、６４０〜７７０ｎｍ、好ましくは６４０〜７７０ｎｍとすることができる。光線の照射は、シート状細胞培養物の全体、または、シート状細胞培養物の中心部、上部、下部、右側、左側など、複数の点に対して行われてもよい。また、光線の照射面積は、特に限定されないが、例えば、１００〜０．０１ｍｍ２、好ましくは、１０〜０．０１ｍｍ２、より好ましくは５〜０．０５ｍｍ２とすることができる。本発明の好ましい態様において、光線は、指向性、単色性、コヒーレンス、波長の一定性の観点から、レーザー光線を使用してもよい。
【００３７】
本発明の評価方法における、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物の光線が照射された部分を、光度計で計測することなどが挙げられる。ここで、「透過率」とは、光線が物質を通過する間に吸収された光量に関する数値であり、例えば、シート状細胞培養物に入射する前の光線と、シート状細胞培養物を通過した後の光線との強度比から算出することができる。透過率の測定は、光線が照射されたシート状細胞培養物上の１または２以上の点に対して行ってもよい。２以上の点に対して行う場合は、測定値の平均値を算出してもよい。
【００３８】
本発明の評価方法における、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。ここで、「シート状細胞培養物の品質に関する指標」とは、シート状細胞培養物の細胞密度、細胞数、収縮率、厚さなどを意味する。かかる手法としては、限定されずに、例えば、透過率からシート状細胞培養物の細胞密度を算出することなどが挙げられる。
シート状細胞培養物の透過率は、シート状細胞培養物の細胞密度に依存して変化し得る。すなわち、シート状細胞培養物の細胞密度が高ければ、光線がシート状細胞培養物を通過する間に細胞に吸収される光量が大きいため、透過率が低くなる。逆に、シート状細胞培養物の細胞密度が低ければ、光線がシート状細胞培養物を通過する間に細胞に吸収される光量が小さいため、透過率が高くなる。
【００３９】
シート状細胞培養物の透過率と細胞密度との相関性は、これに限定するものではないが、例えば、サンプル用の複数のシート状細胞培養物にそれぞれ光線を照射して透過率を測定した後、シート状細胞培養物をそれぞれ酵素処理して細胞数を計測し、得られた透過率、細胞数から検量線を描くことで、事前に求めておくことが挙げられる。本発明において、シート状細胞培養物の細胞数とは、シート状細胞培養物形成後のシート状細胞培養物に含まれる細胞数を意味する。これにより、シート状細胞培養物の透過率から、細胞数を簡単に算出することができる。シート状細胞培養物の細胞密度は、シート状細胞培養物の細胞数とシート状細胞培養物の面積から簡単に算出することができる。一態様において、本発明の評価方法は、シート状細胞培養物の面積を測定するステップを含んでもよい。
【００４０】
また、シート状細胞培養物の収縮率は、シート状細胞培養物の細胞密度に依存して変化し得る。すなわち、培養基材上への細胞の播種密度が小さい場合は、１細胞当たりの基材上への接着面積が大きく、各細胞は培養基材上で広がった形状で他の細胞と接着しシート状細胞培養物を形成する。そして、例えば、シート状細胞培養物を培養基材から剥離すると、広がった形状の各細胞が細胞間接着を維持しながら徐々に元の形状に戻ろうとするため、シート状細胞培養物も全体的に徐々に収縮する。逆に、播種密度が大きい場合は、１細胞当たりの基材上への接着面積が小さく、各細胞が培養基材上で広がる度合いが小さいため、剥離後のシート状細胞培養物の収縮する度合いは小さい。
【００４１】
シート状細胞培養物の細胞密度と収縮率との相関性は、上記のようにサンプル用の複数のシート状細胞培養物を使用して細胞密度と収縮率を計測することにより、予め求めておくことができる。シート状細胞培養物の収縮率は、シート状細胞培養物の面積を培養基材から剥離する前と後とで比較したり、剥離したシート状細胞培養物の面積の変化を経時的に観察したりすることで求めることができる。そして、上述の透過率と細胞密度との相関性から、透過率と収縮率との相関性も簡単に求めることができる。これにより、シート状細胞培養物の透過率から、シート状細胞培養物の収縮後の大きさを推定することができる。
【００４２】
さらに、シート状細胞培養物の透過率は、シート状細胞培養物の厚さに依存して変化し得る。すなわち、シート状細胞培養物の厚さが大きければ、光線がシート状細胞培養物を通過する間に細胞に吸収される光量が大きいため、透過率が低くなる。逆に、シート状細胞培養物の厚さが小さければ、光線が細胞に吸収される光量が小さいため、透過率が高くなる。この透過率と厚さとの相関性も、上記のようにサンプル用の複数のシート状細胞培養物の透過率と厚さを測定することにより求めることができる。
【００４３】
以上のように、シート状細胞培養物の透過率から、シート状細胞培養物の細胞密度、細胞数、収縮率、厚さなどのシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出することができる。これにより、これまではシート状細胞培養物を破壊または剥離することでしか確認できなかった、シート状細胞培養物の品質に関する指標を、シート状細胞培養物を破壊または剥離することなく推定することが可能になる。シート状細胞培養物の品質に関する情報は、移植部位や移植方法を決定するために重要な情報であり、事前にこれらが把握できれば、移植手術をスムーズに進めることができる。また、実際に移植に使用するシート状細胞培養物の品質に関する様々な情報を記録することができるため、有効量の特定などを正確に行うことができる。
【００４４】
また、シート状細胞培養物の製造工程において、算出されたシート状細胞培養物の品質に関する指標と、事前設定された設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定することもできる。これにより、例えば、剥離前のシート状細胞培養物の品質を判定して、その後の剥離工程を行うかどうかを選択したり、剥離後のシート状細胞培養物の品質を判定して、移植部位や移植方法を決定したりすることもできる。したがって、本発明の評価方法は、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出するステップの後に、算出された指標と設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定するステップを含んでもよい。算出された指標と設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定するステップは、既知の任意の手法により行うことができる。
【００４５】
シート状細胞培養物の品質に関する指標の算出は、シート状細胞培養物上の１または２以上の点を対象にして行われてもよい。例えば、シート状細胞培養物の中心、上、下、右、左の５点の透過率をそれぞれ測定して品質に関する指標を算出することで、例えば、シート状細胞培養物における細胞密度、細胞数、収縮率、厚さなどの均一性を判定してもよい。本発明において、シート状細胞培養物は、培養基材から剥離される前のものでも、培養基材から剥離された後のものでもよい。
【００４６】
本発明の一側面は、シート状細胞培養物に光線を照射し、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定し、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出し、算出された指標が設定値以上であることを判定することを含む、設定値以上の品質を有するシート状細胞培養物を製造する方法に関する。
【００４７】
本発明の評価方法において採用されているステップは、特にシート状細胞培養物に光線を照射し、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定し、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出し、算出された指標と設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定することを可能にする。
したがって、本発明の一側面は、シート状細胞培養物に光線を照射する照射部、光線が照射されたシート状細胞培養物の透過率を測定する測定部、透過率からシート状細胞培養物の品質に関する指標を算出する解析部、算出された指標と設定値とを比較してシート状細胞培養物の品質を判定する判定部を含む、シート状細胞培養物を評価するためのシステムが包含される。
【実施例】
【００４８】
本発明を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。
例１
温度応答性培養皿（セルシード社製  Ｕｐｃｅｌｌ  １２ｗｅｌｌ、表面積：３．５ｃｍ２／ｗｅｌｌ）上に、骨格筋芽細胞を播種細胞数を変えて２４時間培養し、細胞数の異なる複数のシート状細胞培養物を調製して培養基材から剥離した（図１）。中心部にレーザー光線を照射して各シート状細胞培養物の透過率を測定した（測定機：キーエンス社製レーザセンサアンプＬＸ２−Ｖ１０、レーザセンサヘッドＬＸ２−１００、波長：６７０ｎｍ）。その後、シート状細胞培養物を酵素処理して細胞数を測定した。結果を下表１および図２に示す。【００４９】
【表１】
2016152592.tif 000003
【００５０】
表１および図２から明らかなように、透過率は、細胞数が多いシート状細胞培養物よりも細胞数が少ないシート状細胞培養物の方が高いことが確認された。これらの結果は、シート状細胞培養物の透過率と細胞数との相関性が高いことを示すものである。【００５１】
例２
温度応答性培養皿（セルシード社製  Ｕｐｃｅｌｌ  １２ｗｅｌｌ、表面積：３．５ｃｍ２／ｗｅｌｌ）上に、骨格筋芽細胞を播種細胞数を変えて２４時間培養し、細胞数の異なる複数のシート状細胞培養物を調製した。シート状細胞培養物を培養皿から剥離する前と後で、中心と５点とで透過率を測定した（測定機：キーエンス社製レーザセンサアンプＬＸ２−Ｖ１０、レーザセンサヘッドＬＸ２−１００、波長：６７０ｎｍ）。その後、シート状細胞培養物を酵素処理して細胞数を測定した。シート状細胞培養物の中心の透過率と細胞数を測定した結果を下表２および図３に、シート状細胞培養物の５点の透過率の平均値と細胞数を測定した結果を下表３および図４に示す。【００５２】
【表２】
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【００５３】
表２および図３から明らかなように、透過率は、細胞数が多いシート状細胞培養物よりも細胞数が少ないシート状細胞培養物の方が高いことが確認された。これらの結果は、剥離前でも、剥離後でも、シート状細胞培養物の透過率と細胞数との相関性が高いことを示すものである。【００５４】
【表３】
2016152592.tif 000005
【００５５】
表３および図４から明らかなように、透過率は、細胞数が多いシート状細胞培養物よりも細胞数が少ないシート状細胞培養物の方が高いことが確認された。これらの結果は、シート状細胞培養物の透過率の測定は、シートの中心に対して行っても、シートの複数の点に対して行っても良いことを示すものである。【００５６】
例３
温度応答性培養皿（セルシード社製  Ｕｐｃｅｌｌ  １２ｗｅｌｌ、表面積：３．５ｃｍ２／ｗｅｌｌ）上に、骨格筋芽細胞を播種細胞数を変えて２４時間培養して、細胞数の異なる複数のシート状細胞培養物を調製した。シート状細胞培養物を培養皿から剥離する前に、中心と５点とで透過率を測定した（測定機：キーエンス社製レーザセンサアンプＬＸ２−Ｖ１０、レーザセンサヘッドＬＸ２−１００、波長：６７０ｎｍ）。その後、シート状細胞培養物を剥離して収縮率を測定した。結果を下表４および図５に示す。【００５７】
【表４】
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【００５８】
表４および図５から明らかなように、透過率は、収縮率が大きいシート状細胞培養物よりも収縮率が小さいシート状細胞培養物の方が高いことが確認された。これらの結果は、シート状細胞培養物の透過率と収縮率との相関性が高いこと、また、剥離前のシート状細胞培養物の透過率から収縮率を算出し、剥離後のシート状細胞培養物の大きさを推定できることを示すものである。【００５９】
例４
温度応答性培養皿（セルシード社製  Ｕｐｃｅｌｌ  ３．５ｃｍ、表面積：８．８ｃｍ２）上に、骨格筋芽細胞を均一に播種して２４時間培養したシート状細胞培養物と、不均一に播種して２４時間培養したシート状細胞培養物を調製した。シート状細胞培養物を培養皿から剥離する前に５点の透過率をそれぞれ５回測定し（測定機：キーエンス社製レーザセンサアンプＬＸ２−Ｖ１０、レーザセンサヘッドＬＸ２−１００、波長：６７０ｎｍ）、各点の透過率の平均値を算出した。結果を下表５および図６に示す。【００６０】
【表５】
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【００６１】
表５および図６から明らかなように、均一に細胞を播種したシート状細胞培養物（図中左側）は、透過率のバラツキが小さく、不均一に細胞を播種したシート状細胞培養物（図中右側）は、透過率のバラツキが大きいことが確認された。これらの結果は、シート状細胞培養物の厚さの均一性を、シート状細胞培養物の複数の点の透過率を測定することで確認できることを示すものである。【００６２】
本明細書に記載された本発明の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、すべて本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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