(57)【要約】ヒアルロン酸誘導体の製造方法は、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩と、アミノ基を有し、かつ、分子量が９０以上である有機化合物とを反応させる工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩と、アミノ基を有し、かつ、分子量が９０以上である有機化合物とを反応させる工程を含む、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記有機化合物はカルボキシル基をさらに有する、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記有機化合物では、前記アミノ基と前記カルボキシル基とが異なる炭素原子に結合している、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記有機化合物では、前記アミノ基がアルキレン基に結合している、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、以下の構成単位（１）を有する、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【化１】
2016159159.tif 000011
・・・（１）
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５は独立して、水素原子、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基、または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基を表し、ｎは１以上７，５００以下の数を示す。（ただし、当該カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩全体のＲ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５がいずれも水素原子を表す場合を除く。））
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記カルボキシメチル基修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を構成する２糖単位に対するカルボキシメチル化率が５％以上２００％以下である、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記有機化合物に含まれる前記アミノ基が−ＮＨ２で表される基である、ヒアルロン酸誘導体の製造方法。
【請求項８】
以下の構成単位（２）を有する、ヒアルロン酸誘導体。
【化２】
2016159159.tif 000012
・・・（２）
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５は独立して、水素原子、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基、−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基、または下記式（３）で表される基を表し、ｎは１以上７，５００以下の数を示す（ただし、当該ヒアルロン酸誘導体全体に含まれるＲ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５で表される基のうち少なくとも１つが下記式（３）で表される基である。））
【化３】
2016159159.tif 000013
・・・（３）
（式中、Ｒは、分子量が７４以上である有機基を示す。）
【請求項９】
請求項８において、
前記構成単位（２）を構成するヒアルロン酸骨格の２糖単位において、前記式（３）で表される基が含まれる割合が１０％以上である、ヒアルロン酸誘導体。
【請求項１０】
請求項８または９において、
前記構成単位（２）は、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基および／または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基を含む、ヒアルロン酸誘導体。
【請求項１１】
請求項８ないし１０のいずれか１項において、
請求項１ないし７のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法により得られる、ヒアルロン酸誘導体。
【請求項１２】
請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体を含有する、化粧料。
【請求項１３】
請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体を含有する、食品組成物。
【請求項１４】
請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のヒアルロン酸誘導体を含有する、医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸誘導体およびその製造方法、ならびにヒアルロン酸誘導体を含む化粧料、食品組成物および医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒアルロン酸等の多糖類を修飾する試みがなされている（特許文献１）。例えば、多糖類の特性を変えたり、有機化合物を生体に取り込みやすくしたりすることを目的として、多糖類に有機化合物を修飾する試みがなされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平８−５３５０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、修飾ヒアルロン酸と有機化合物とのヒアルロン酸誘導体およびその製造方法、ならびにヒアルロン酸誘導体を含む化粧料、食品組成物および医薬組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１．本発明の一態様に係るヒアルロン酸誘導体の製造方法は、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩と、アミノ基を有し、かつ、分子量が９０以上である有機化合物とを反応させる工程を含む。【０００６】
２．上記１に記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法において、前記有機化合物はカルボキシル基をさらに有することができる。【０００７】
３．上記１または２に記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法において、前記有機化合物では、前記アミノ基と前記カルボキシル基とが異なる炭素原子に結合していることができる。【０００８】
４．上記１ないし３のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法において、前記有機化合物では、前記アミノ基がアルキレン基に結合していることができる。【０００９】
５．上記１ないし４のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法において、前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、以下の構成単位（１）を有することができる。【００１０】
【化１】
2016159159.tif 000002
・・・（１）
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５は独立して、水素原子、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基、または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基を表し、ｎは１以上７，５００以下の数を示す。（ただし、当該カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩全体のＲ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５がいずれも水素原子を表す場合を除く。））【００１１】
６．上記１ないし５のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法において、前記カルボキシメチル基修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を構成する２糖単位に対するカルボキシメチル化率が５％以上２００％以下であることができる。【００１２】
７．上記１ないし６のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法において、前記有機化合物に含まれる前記アミノ基が−ＮＨ２で表される基であることができる。【００１３】
８．本発明の一態様に係るヒアルロン酸誘導体は、以下の構成単位（２）を有する。【００１４】
【化２】
2016159159.tif 000003
・・・（２）
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５は独立して、水素原子、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基、−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基、または下記式（３）で表される基を表し、ｎは１以上７，５００以下の数を示す（ただし、当該ヒアルロン酸誘導体全体に含まれるＲ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５で表される基のうち少なくとも１つが下記式（３）で表される基である。））【００１５】
【化３】
2016159159.tif 000004
・・・（３）
（式中、Ｒは、分子量が７４以上である有機基を示す。）【００１６】
９．上記８に記載のヒアルロン酸誘導体において、前記構成単位（２）を構成するヒアルロン酸骨格の２糖単位において、前記式（３）で表される基が含まれる割合が１０％以上であることができる。【００１７】
１０．上記８または９に記載のヒアルロン酸誘導体において、前記構成単位（２）は、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基および／または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基を含むことができる。【００１８】
１１．上記８ないし１０のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体は、上記１ないし７のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法により得ることができる。【００１９】
１２．本発明の一態様に係る化粧料は、上記８ないし１１のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を含有する。【００２０】
１３．本発明の一態様に係る食品組成物は、上記８ないし１１のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を含有する。【００２１】
１４．本発明の一態様に係る医薬品組成物は、上記８ないし１１のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体を含有する。
【発明の効果】
【００２２】
上記１ないし７のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体の製造方法によれば、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩と、アミノ基を有し、かつ、分子量が９０以上である有機化合物とを反応させる工程を含むことにより、前記有機化合物を前記修飾ヒアルロン酸および／またはその塩に効率良く結合させることができる。【００２３】
上記８ないし１１のいずれかに記載のヒアルロン酸誘導体によれば、分子量が９０以上である前記有機化合物に由来する部位を有する。前記ヒアルロン酸誘導体は例えば、化粧料、食品組成物および医薬組成物の成分として好適に使用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、格別に断らない限り、「部」は「質量部」を意味し、「％」は「質量％」を意味する。
【００２５】
［ヒアルロン酸誘導体］
本発明のヒアルロン酸誘導体とは、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩に、アミノ基を有し、かつ、分子量が９０以上である有機化合物を結合させたものをいう。
【００２６】
［ヒアルロン酸誘導体の製造方法］
本発明の一実施形態に係るヒアルロン酸誘導体の製造方法（以下、単に「製造方法」と記載することもある。）は、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩（以下、単に「修飾ヒアルロン酸」と記載することもある。）と、アミノ基を有し、かつ、分子量が９０以上である有機化合物（以下、単に「有機化合物Ａ」と記載することもある。）とを反応させる工程を含む。上記反応させる工程によって、後述する実施形態に係るヒアルロン酸誘導体を得ることができる。
【００２７】
（反応させる工程）
前記反応させる工程によって、修飾ヒアルロン酸に前記有機化合物Ａを結合させることができる。より具体的には、前記反応させる工程によって、修飾ヒアルロン酸に含まれるカルボキシル基と、前記有機化合物Ａ中のアミノ基とが反応してアミド結合が形成されることにより、修飾ヒアルロン酸に前記有機化合物Ａを結合させることができる。
【００２８】
前記反応させる工程において使用する試薬は、一般的なペプチド合成の際に使用される試薬を使用することができる。そのような試薬としては、例えば、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ,Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のカルボジイミド系縮合剤、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）等のトリアジン系縮合剤、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）等のイミダゾール系脱水縮合剤、１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＢＯＰ）等のホスホニウム系縮合剤、又は｛{[（１−シアノ−２−エトキシ−２−オキソエチリデン）アミノ]オキシ}−４−モルホリノメチレン｝ジメチルアンモニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＣＯＭＵ）等のウロニウム系縮合剤等が挙げられる。また、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシアザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等の縮合反応用添加剤を前記縮合剤と併用することもできる。
【００２９】
なお、試薬と修飾ヒアルロン酸との比率（モル比：試薬／修飾ヒアルロン酸）は通常１／１００以上３／１以下であり、また、修飾ヒアルロン酸と有機化合物Ａとの比率（モル比：修飾ヒアルロン酸／有機化合物Ａ）は通常１／１００以上４／１以下である。
【００３０】
上記反応させる工程における反応時間は通常１時間以上１００時間以下（好ましくは１時間以上５０時間以下）であり、上記反応させる工程における反応温度は通常４℃以上１００℃以下（好ましくは１０℃以上８０℃以下）であり、上記反応させる工程における反応液のｐＨは通常１以上１２以下（好ましくは３以上１０以下）である。
【００３１】
（原料：修飾ヒアルロン酸）
本実施形態に係る製造方法において原料として使用する修飾ヒアルロン酸および／またはその塩（以下、「原料ヒアルロン酸」と区別するうえで、「原料修飾ヒアルロン酸」と記載することもある。）は通常、分子量が８００以上４００万以下であり、例えば２，０００以上であることが好ましく、３，０００以上であることがより好ましく、一方、１００万以下であることが好ましく、６０万以下であることがより好ましく、さらに５万以下がより好ましい。なお、修飾ヒアルロン酸の分子量は以下の方法によって測定することができる。
【００３２】
ゲル濾過カラムを用いて、分子量が既知である複数のヒアルロン酸（基準物質）を液体クロマトグラフィー分析することで、それらの保持時間より検量線を作成する。同様に、測定対象である修飾ヒアルロン酸を液体クロマトグラフィー分析し、前記検量線を用いて分子量を求めることで、修飾ヒアルロン酸の分子量を求めることができる。
【００３３】
前記液体クロマトグラフィー分析に使用することができる液体クロマトグラフィー分析装置としては、例えば、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０  ＨＰＬＣ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５  ＨＰＬＣ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、１２００  Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）が挙げられる。また、液体クロマトグラフィー分析に使用することができるカラムとしては、例えば、ｓｈｏｄｅｘ社製配位子交換クロマトグラフィー用カラム（配位子交換モード＋サイズ排除モード)、型名「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０１」、「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０２」、「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０３」、「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０４」、「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０５」、「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０６」、「ＳＵＧＡＲＫＳ−８０７」や、ＴＯＳＯＨ製サイズ排除クロマトグラフィーカラム、型名「ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＰＷ」が挙げられる。
【００３４】
また、修飾ヒアルロン酸は、カルボキシメチル化率が５％以上であることができ、１０％以上であることが好ましく、２０％以上であることが好ましく、例えば３０％以上であってもよい。また、前記カルボキシメチル化率は２００％以下であることができ、１５０％以下であることがより好ましく、例えば１００％以下であってもよく、さらには８５％以下であってもよい。
【００３５】
なお、本実施形態に係る製造方法において、修飾ヒアルロン酸のカルボキシメチル化率と有機化合物Ａの修飾率との間には相関関係があり、修飾ヒアルロン酸のカルボキシメチル化率が高くなると、前記修飾率が高くなる傾向があることから、有機化合物Ａは主にカルボキシメチル基と反応していることが推測される。
【００３６】
本発明において、修飾ヒアルロン酸のカルボキシメチル化率は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、ヒアルロン酸骨格中のＣ−２位に結合するＮ−アセチル基のメチル基（−ＣＨ３）のプロトンを示すピーク（２ｐｐｍ付近に発現）の積算値に対する、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈおよび／または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基中のメチレン基（−ＣＨ２−）のプロトンを示すピーク（３．８ｐｐｍ以上４．２ｐｐｍ以下の範囲に発現）の積算値の割合（％）で表される。
【００３７】
（修飾ヒアルロン酸の製造方法）
本実施形態に係る製造方法において使用される修飾ヒアルロン酸は例えば、以下の方法にて製造することができる。
【００３８】
（原料ヒアルロン酸および／またはその塩）
本発明において、「ヒアルロン酸」とは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの二糖からなる繰り返し構成単位を１以上有する多糖類をいう。また、「ヒアルロン酸の塩」としては、特に限定されないが、食品または薬学上許容しうる塩であることが好ましく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００３９】
ヒアルロン酸は、基本的にはβ−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンとから基本的に構成され、２糖単位が複数個結合したものである。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。
【００４０】
本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸の製造に用いられる原料ヒアルロン酸および／またはその塩（以下、単に「原料ヒアルロン酸」と略して記載する。）は、動物等の天然物（例えば鶏冠、臍帯、皮膚、関節液などの生体組織など）から抽出されたものでもよく、または、微生物、動物細胞もしくは植物細胞を培養して得られたもの（例えばストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法）、化学的または酵素的に合成されたものなどを使用することができる。
【００４１】
原料ヒアルロン酸としては、当該粗抽出物および精製物のいずれを用いてもよいが、精製物、具体的には、カルボキシメチル化が円滑に進行できる点で、純度が９０％（質量比）以上の原料ヒアルロン酸を用いることが好ましい。
【００４２】
（原料ヒアルロン酸の平均分子量）
本実施形態に係る製造方法において、前記反応させる工程で溶解させる原料ヒアルロン酸の平均分子量は通常、カルボキシメチル化を円滑に行うことができる点で、４，０００以上４００万以下であることが好ましく、３００万以下であることがより好ましい。なお、原料ヒアルロン酸の平均分子量は、下記の方法にて測定することができる。
【００４３】
（分子量の測定方法）
即ち、約０．０５ｇの（精製）ヒアルロン酸（本品）を精密に量り、０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液に溶かし、正確に１００ｍＬとした溶液及びこの溶液８ｍＬ、１２ｍＬ並びに１６ｍＬを正確に量り、それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液を加えて正確に２０ｍＬとした溶液を試料溶液とする。この試料溶液および０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液につき、日本薬局方（第十六改正）一般試験法の粘度測定法（第１法毛細管粘度測定法）により３０．０±０．１℃で比粘度を測定し（式（Ａ））、各濃度における還元粘度を算出する（式（Ｂ））。還元粘度を縦軸に、本品の換算した乾燥物に対する濃度（ｇ／１００ｍＬ）を横軸にとってグラフを描き、各点を結ぶ直線と縦軸との交点から極限粘度を求める。ここで求められた極限粘度をＬａｕｒｅｎｔの式（式（Ｃ））に代入し、平均分子量を算出する（Ｔｏｒｖａｒｄ Ｃ Ｌａｕｒｅｎｔ，ＭａｒｉｏｎＲｙａｎ，ａｎｄ Ａｄｏｌｐｈ Ｐｉｅｔｒｕｓｚｋｉｅｗｉｃｚ，”Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ”,Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｃｔａ．，４２,４７６−４８５(１９６０)、四方田千佳子、「ヒアルロン酸ナトリウム製剤のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳによる分子量評価」、国立衛研報、第１２１号，０３０−０３３(２００３)）。
（式Ａ）
比粘度＝｛試料溶液の所要流下秒数｝／（０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液の所要流下秒数）｝−１
（式Ｂ）
還元粘度（ｄＬ／ｇ）＝比粘度／（本品の換算した乾燥物に対する濃度ｇ／１００ｍＬ））
（式Ｃ）
極限粘度（ｄＬ／ｇ）＝３．６×１０−４Ｍ０．７８Ｍ：平均分子量
【００４４】
（原料ヒアルロン酸の含有量）
原料ヒアルロン酸において、原料ヒアルロン酸の含有量は、原料ヒアルロン酸の純度の指標であり、原料ヒアルロン酸の含有量が多いほど、原料ヒアルロン酸の純度が高いといえる。
【００４５】
本発明において、原料ヒアルロン酸におけるヒアルロン酸の含有量は、カルバゾール硫酸法（例えば日本薬局方）にて測定されたグルクロン酸定量値から算出された値である。
【００４６】
カルバゾール硫酸法は、ホウ酸ナトリウム・硫酸溶液中にヒアルロン酸水溶液を加えて混和し、ヒアルロン酸を加熱分解した後冷却し、カルバゾール・エタノール溶液を加えて混和し、加熱後放冷した試料液の吸光度（５３０ｎｍ）を測定する方法である。同様に処理したＤ−グルクロノラクトンを用いて検量線を作成し、Ｄ−グルクロノラクトン換算値を算出した後、１．１０２を乗じてグルクロン酸定量値を求める。得られたグルクロン酸定量値に（ヒアルロン酸の分子量／グルクロン酸の分子量）を乗じてヒアルロン酸の含有量を算出する。
【００４７】
（カルボキシメチル化）
本発明において、「カルボキシメチル基」とは、「−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ」または「−ＣＨ２−ＣＯ２−」で表される基のことをいう。したがって、本発明において、「カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩」とは、少なくとも一部にカルボキシメチル基が導入されているヒアルロン酸および／またはその塩のことをいう。
【００４８】
より具体的には、本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸では、例えば、原料であるヒアルロン酸（下記式（４）参照）を構成する水酸基（下記式（４）において、ヒアルロン酸を構成するＮ−アセチルグルコサミンのＣ−４位、Ｃ−６位、ならびに、ヒアルロン酸を構成するグルクロン酸のＣ−２位、Ｃ−３位）の少なくとも一部の水酸基の水素原子が、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈおよび／または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基)に置換されていることができる。すなわち、本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸では、これらの位置にある水酸基のうち１または２以上の位置にある水酸基の水素原子が、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈおよび／または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基に置換されていてもよい。
【００４９】
本発明において、「ヒアルロン酸骨格の２糖単位」とは、ヒアルロン酸を構成する、隣り合って結合する２糖（グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミン）で構成される１構成単位をいい、「ヒアルロン酸骨格の２糖単位に対するカルボキシメチル化率」とは該１構成単位に含まれるカルボキシメチル基の数であり、より具体的には、該１構成単位を１００％とした場合、該１構成単位に含まれるカルボキシメチル基の数の割合（％）をいう。
【００５０】
【化４】
2016159159.tif 000005
・・・（４）
（式中、ｎは１以上７，５００以下の数を示す。）
【００５１】
本実施形態に係る製造方法において使用する原料修飾ヒアルロン酸は例えば、下記式（１）で表される構成単位を有することができる。本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体において、有機化合物Ａとの反応性により優れている点で、前記原料修飾ヒアルロン酸は、Ｒ２の少なくとも一部が−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基であることが好ましい。
【００５２】
【化５】
2016159159.tif 000006
・・・（１）
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５は独立して、水素原子、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基、または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基を表し、ｎは１以上７，５００以下の数を示す。（ただし、当該原料修飾ヒアルロン酸全体のＲ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５がいずれも水素原子を表す場合を除く。））
【００５３】
（ｐＨ）
本実施形態に係る製造方法において、水酸基の求核性を高めることができる点で、前記反応に使用する塩基性条件下で行われることが好ましく、反応液（含水溶媒）のｐＨが９以上（９以上１４以下、好ましくは１０以上１４以下、より好ましくは１１以上１４以下）であることがより好ましい。
【００５４】
なお、反応液を塩基性に調整するために、塩基性電解質を反応液中で使用することができる。塩基性電解質としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム等のアルカリ土類金属の水酸化物が挙げられる。後述する第１の製造例および第２の製造例のいずれの修飾ヒアルロン酸効率良く得ることができる点で、反応液中の塩基性電解質の濃度は例えば、０．２モル／Ｌ以上１０モル／Ｌ以下であり、好ましくは、０．５モル／Ｌ以上であり、８モル／Ｌ以下である。
【００５５】
また、後述する第１の製造例および第２の製造例のいずれの修飾ヒアルロン酸を効率良く得ることができる点で、前記含水溶媒における前記ヒアルロン酸の濃度が０．０５ｇ／ｍＬ以上０．５ｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。
【００５６】
（ハロ酢酸および／またはその塩）
本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸の製造方法（以下、単に「本実施形態に係る製造方法」と略することもある。）において、ハロ酢酸および／またはその塩は、カルボキシメチル基を原料ヒアルロン酸および／またはその塩に導入するために使用される。
【００５７】
ハロ酢酸は例えば、モノハロ酢酸および／またはその塩であることができ、より具体的には、クロロ酢酸および／またはその塩、または、ブロモ酢酸またはその塩であることが好ましい。ハロ酢酸の塩は例えば、クロロ酢酸のアルカリ金属塩および／またはブロモ酢酸のアルカリ金属塩であることが好ましく、クロロ酢酸ナトリウムおよび／またはブロモ酢酸ナトリウムであることがより好ましい。
【００５８】
（ハロ酢酸および／またはその塩の使用量）
ハロ酢酸および／またはその塩の使用量は通常、原料ヒアルロン酸および／またはその塩の使用量の１０％以上５００％以下（質量比）であり、５０％以上２００％以下（質量比）あることが好ましい。
【００５９】
（含水溶媒）
本実施形態に係る製造方法において、前記含水溶媒が、水、または水溶性有機溶媒と水との混合液であることにより、原料ヒアルロン酸および／またはその塩の溶解性に優れている。
【００６０】
含水溶媒が水溶性有機溶媒と水との混合液である場合、すなわち、含水溶媒が水および水溶性有機溶媒の両方を含む場合、ヒアルロン酸の溶解性を高めることができる点で、該含水溶媒中における水溶性有機溶媒の割合は通常６０ｖ／ｖ％以下（０ｖ／ｖ％を超えて６０ｖ／ｖ％以下）であり、４０ｖ／ｖ％以下（０ｖ／ｖ％を超えて４０ｖ／ｖ％以下）であることが好ましい。
【００６１】
水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどのアルコール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等を挙げることができ、これらを単独でまたは組み合わせて使用することができる。このうち、イソプロパノール、エタノール等の炭素原子数１、２または３の低級アルコールが好ましい。
【００６２】
（反応温度）
前記反応において、カルボキシル化を円滑に進行でき、かつ、分子量の低下を抑制できる点から、反応液の温度は通常３０℃以下（好ましくは０℃を超えかつ３０℃以下）であることが好ましく、１０℃以下（好ましくは０℃を超えかつ３０℃以下）であることがより好ましい。特に、反応液の温度を１０℃以下とすることにより、高分子量（８０万以上）の修飾ヒアルロン酸を簡便に得ることができる。
【００６３】
例えば、ハロ酢酸および／またはその塩としてクロロ酢酸および／またはその塩を使用する場合、カルボキシメチル化が円滑に進行でき、かつ、得られる修飾ヒアルロン酸の褐変を抑えることができる点で、前記反応における反応液の温度は通常（好ましくは０℃を超えかつ３０℃以下）であることができ、１℃以上３０℃以下であることが好ましい。
【００６４】
また、例えば、ハロ酢酸および／またはその塩としてブロモ酢酸および／またはその塩を使用する場合、カルボキシメチル化が円滑に進行でき、得られる修飾ヒアルロン酸の褐変および分子量の低下を抑えることができる点で、前記反応における反応液の温度は通常１０℃以下（好ましくは０℃を超えかつ１０℃以下）であることができ、１℃以上１０℃以下であることが好ましい。
【００６５】
より具体的には、後述する第１の製造例である、高分子量（例えば分子量８０万以上）であり、かつ、ヒアルロン酸骨格の２糖単位に対するカルボキシメチル化率（以下、単に「カルボキシメチル化率」ともいう。）が高い（例えば５％以上、好ましくは５％以上２００％以下））修飾ヒアルロン酸を製造するためには、ハロ酢酸および／またはその塩として、ブロモ酢酸および／またはその塩を使用して、反応液の温度を１０℃以下（例えば、０℃を超えかつ１０℃以下）で反応を行うことが好ましい。
【００６６】
また、後述する第２の製造例である、低分子量（例えば分子量８０万未満）であり、カルボキシメチル化率が高い（例えば３０％以上、好ましくは３０％以上２００％以下）修飾ヒアルロン酸を製造するためには、反応液の温度を１０℃以上（例えば、１０℃以上３５℃以下、好ましくは１５℃以上、より好ましくは２０℃以上、さらに好ましくは室温）で反応を行うことが好ましい。
【００６７】
（反応時間）
前記反応において、カルボキシル化を円滑に進行でき、かつ、分子量の低下を抑制できる点から、反応時間は通常３０分以上１００時間以下であることが好ましく、６０分以上６０時間以下であることがより好ましい。
【００６８】
（第１製造例）
上記製造方法によって、分子量が８０万以上である修飾ヒアルロン酸を簡便に得ることができる。すなわち、本実施形態に係る製造方法によれば、高分子量であり、かつ、白色度が高い修飾ヒアルロン酸を簡便に得ることができる。
【００６９】
この場合、得られる修飾ヒアルロン酸のカルボキシメチル化率が５％以上２００％以下であることができる。
【００７０】
（第２製造例）
あるいは、上記製造方法によって、分子量が８００以上８０万未満である、修飾ヒアルロン酸を簡便に得ることができる。
【００７１】
この場合、得られる修飾ヒアルロン酸のカルボキシメチル化率が３０％以上２００％以下であることができる。すなわち、上記製造方法によって、分子量が８００以上８０万未満と比較的低く、カルボキシメチル基が３０％以上２００％以下と高く、かつ、白色度が高い修飾ヒアルロン酸を簡便に得ることができる。
【００７２】
（原料：有機化合物Ａ）
有機化合物Ａは、後述の実施形態に係るヒアルロン酸誘導体において、有機基（例えば、後述する式（２）で表される基においてＲで表される基）としてヒアルロン酸骨格の２糖単位に結合する部分となる。有機化合物Ａが、アミノ基を有することにより、前記反応させる工程において修飾ヒアルロン酸に含まれる官能基（カルボキシル基や水酸基、特にカルボキシル基）と反応して、ヒアルロン酸骨格の２糖単位に結合することができる。
【００７３】
有機化合物Ａに含まれるアミノ基は例えば、−ＮＨ２で表される基、−ＮＨ−で表される基のいずれであってもよいが、修飾ヒアルロン酸に含まれる官能基（特にカルボキシル基）との反応性により優れている点で、有機化合物Ａに含まれるアミノ基は、−ＮＨ２で表される基であることが好ましい。また、有機化合物Ａは、アミノ基の運動性をより高めることができる点で、アルキレン基（−ＣｎＨ２ｎ−、ｎは１以上の整数を表す。）に結合するアミノ基を有することが好ましい。
【００７４】
未修飾ヒアルロン酸との反応性が低く、修飾ヒアルロン酸を用いることで反応性が高まるため、本願発明に好適であるという観点から、有機化合物Ａの分子量は１４０以上であることが好ましく、１５０以上であることがより好ましく、一方、修飾ヒアルロン酸との反応性を担保できる点で、５００以下であることが好ましく、３５０以下であることがより好ましい。
【００７５】
有機化合物Ａは、アミノ基とともに、カルボキシル基をさらに有することができる。すなわち、有機化合物Ａはアミノ酸であることができる。
【００７６】
なお、本発明において「アミノ酸」とは、同一分子内にアミノ基およびカルボキシル基を有する有機化合物をいう。有機化合物Ａにおいて、カルボキシル基はアミノ基と同じ炭素原子に結合していてもよいし、あるいは、カルボキシル基がアミノ基と異なる炭素原子に結合していてもよい。また、有機化合物Ａは、アミノ基と同じ炭素原子に結合するカルボキシル基と、アミノ基と異なる炭素原子に結合するカルボキシル基との両方を有していてもよい。
【００７７】
有機化合物Ａにおいて、カルボキシル基がアミノ基と異なる炭素原子に結合している場合、カルボキシル基が結合している炭素原子と、アミノ基が結合している炭素原子との間に炭素鎖または環が存在していることができる。前記炭素鎖または環に含まれる炭素原子数の数は通常１以上、好ましくは２以上であり、一方、１０以下、好ましくは６以下であってもよい。
【００７８】
有機化合物Ａは、アミノ基およびカルボキシル基を含み、該アミノ基と該カルボキシル基とが自己縮合する性質を有するものであってもよい。当該自己縮合によりアミド結合が形成される。なお、有機化合物Ａは、自己縮合するアミノ基およびカルボキシル基の他に、他のアミノ基および／またはカルボキシル基を有していても良い。
【００７９】
本発明において、「アミノ基とカルボキシル基とが自己縮合する性質」とは、上述したアミノ酸合成のための試薬を用いてアミド結合の形成を行う際に、同一分子内に存在するアミノ基とカルボキシル基との間にアミド結合が形成される性質又は、異なる分子の有機化合物Ａ同士で縮合する（１の有機化合物Ａに含まれるアミノ基と他の有機化合物Ａに含まれるカルボキシル基との間でアミド結合が形成される）性質をいう。本実施形態に係る製造方法によれば、有機化合物Ａが自己縮合する性質を有していても、修飾ヒアルロン酸は、カルボキシル基を末端に有するカルボキシメチル基を有しているため、有機化合物Ａとの反応性に優れている。このため、有機化合物Ａの自己縮合を抑制しつつ、ヒアルロン酸誘導体を効率良く得ることができる。
【００８０】
有機化合物Ａとしては、例えば、アスパラギン酸、リジン、グルタミン酸、セリン、チロシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、トラネキサム酸、アルギニン、γ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、レボドパ等のアミノ酸、グルコサミン、シアル酸等の糖類、メキシレチン、核酸等が挙げられる。なかでも、有機化合物Ａが、例えばトラネキサム酸等の自己縮合する性質を有する場合、本実施形態に係る製造方法によれば、有機化合物Ａの自己縮合を抑制することができるため、ヒアルロン酸誘導体を効率良く得ることができる。
【００８１】
また、有機化合物Ａが自己縮合する性質を有する有機化合物である場合、ヒアルロン酸に結合させることが困難である場合がある。その理由としては、ヒアルロン酸との反応よりも、有機化合物Ａの自己縮合が優先的に生じるためであると推測される。
【００８２】
これに対して、本実施形態に係る製造方法によれば、上述したように、修飾ヒアルロン酸のカルボキシメチル基に起因して、有機化合物Ａと修飾ヒアルロン酸との反応性に優れているため、有機化合物Ａが自己縮合する性質を有していても、該自己縮合よりも修飾ヒアルロン酸と有機化合物Ａとの反応が優先的に進行するため、該自己縮合に起因する有機化合物Ａの消費を低減することができ、これにより、ヒアルロン酸誘導体を効率良く得ることができる。
【００８３】
（分離する工程）
なお、本実施形態に係る製造方法において、前記反応させる工程によって、前記有機化合物中の前記アミノ基と前記カルボキシル基との自己縮合体が得られ、前記自己縮合体と前記ヒアルロン酸誘導体とを分離する工程をさらに含むことができる。
【００８４】
この場合、前記分離する工程としては、例えば、濾過による前記自己縮合体の除去、カラムクロマトグラフィー等の分離処理による除去が挙げられる。
【００８５】
（作用効果）
本実施形態に係る製造方法によれば、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩と、アミノ基を有し、かつ、分子量が９０以上である有機化合物Ａとを反応させる工程を含むことにより、有機化合物Ａを前記修飾ヒアルロン酸および／またはその塩に効率良く結合させることができる。その理由は明らかではないが、カルボキシメチル基は、メチレン基（−ＣＨ２−）に結合するカルボキシル基を末端に有しているため、該カルボキシメチル基に含まれるカルボキシル基は、ヒアルロン酸骨格からより離れた位置に配置される。このため、有機化合物Ａと修飾ヒアルロン酸とがより接近しやすいため、その結果、有機化合物Ａと修飾ヒアルロン酸とが反応しやすくなり、有機化合物Ａと前記修飾ヒアルロン酸および／またはその塩とを効率良く結合させることができると推測される。
【００８６】
また、修飾ヒアルロン酸は、カルボキシメチル基を有しているため、アミノ基との反応性に優れている。このため、本実施形態に係る製造方法によれば、有機化合物Ａがヒアルロン酸とは反応しにくいものであっても、カルボキシメチル基に起因して修飾ヒアルロン酸との反応性に優れているため、修飾ヒアルロン酸を構成するヒアルロン酸骨格の２糖単位に対する有機化合物Ａの修飾率が１０％以上であるヒアルロン酸誘導体を効率良く得ることができる。
【００８７】
（ヒアルロン酸誘導体）
本発明の一実施形態に係るヒアルロン酸誘導体は、上記反応させる工程によって得ることができる。より具体的には、本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体は、以下の構成単位（２）を有することができる。なお、本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体は、上記式（１）において、当該ヒアルロン酸誘導体全体に含まれるＲ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５で表される基のうち少なくとも１つが、第１族元素に属する金属（例えばナトリウム、カリウム等）、第２族元素に属する金属（例えばカルシウム、マグネシウム、バリウム等）、第１１族元素に属する金属（例えば銅、銀、金）、第１２族元素に属する金属（例えば亜鉛）、第１３族元素に属する金属（例えばアルミニウム）で置換されていてもよい。
【００８８】
【化６】
2016159159.tif 000007
・・・（２）
（式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５は独立して、水素原子、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基、−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基、または下記式（３）で表される基を表し、ｎは１以上７，５００以下の数を示す。（ただし、当該ヒアルロン酸誘導体全体に含まれるＲ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，およびＲ５で表される基のうち少なくとも１つが下記式（３）で表される基である。））
【００８９】
【化７】
2016159159.tif 000008
・・・（３）
（式中、Ｒは、分子量が７４以上である有機基を示す。）
【００９０】
すなわち、本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体では、該ヒアルロン酸誘導体を構成する構成単位のうち少なくとも１つが、上記式（２）で表される構成単位であることができる。上記（３）で表される基の運動性をより高めることができる点で、上記式（２）において表される構成単位は、Ｒ２の少なくとも一部が上記式（３）で表される基であることが好ましい。
【００９１】
また、本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体において、親水性をより高めることができる点で、前記構成単位（２）は、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基および／または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基を含むことが好ましい。
【００９２】
より具体的には、本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体では、上記式（２）において表される構成単位は、Ｒ２の少なくとも一部が上記式（３）で表される基であり、上記式（３）で表される基以外のＲ２が水素原子、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基、または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基であることが好ましい。
【００９３】
なお、上記式（２）において表される構成単位において、Ｒ１，Ｒ３，Ｒ４およびＲ５は水素原子、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基、−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基、または上記式（３）で表される基であってもよい。
【００９４】
上記式（３）においてＲで表される分子量が７４以上である有機基は、炭素原子および水素原子を含み、かつ、酸素原子、窒素原子、および硫黄原子から選ばれる少なくとも１種をさらに有していてもよい。また、該有機基としては、鎖状であっても環状であってもよく、あるいは、鎖状部分と環状部分の両方を有していても良い。また、該有機基の分子量は通常４８４以下であり、１２４以上であることが好ましく、１３４以上であることがより好ましい。
【００９５】
上記式（３）においてＲで表される有機基は、Ｒが保有するアルキレン基を介してアミド結合しているものであってもよい。前記アルキレン基としては、例えばメチレン基（−ＣＨ２−）、エチレン基（−ＣＨ２−ＣＨ２−）などの炭素原子数１以上２０以下（一例として、炭素原子数１以上６以下のアルキレン基）が挙げられる。本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体では、ヒアルロン酸骨格とアミド結合とを有し、該アミド結合のアミノ基（−ＮＨ−）の隣にアルキレン基（−ＣｎＨ２ｎ−）を介して有機基が結合していることにより、該有機基の運動性を高めることができる。
【００９６】
例えば、上記式（３）で表される基は、後述する表１に示される有機化合物Ａに由来する基であってもよい。例えば、ヒアルロン酸誘導体において、有機化合物Ａがトラネキサム酸（実施例１ないし４）の場合、トラネキサム酸に含まれるアミノ基と修飾ヒアルロン酸のカルボキシル基とを反応させることにより、アミド結合を介して、修飾ヒアルロン酸のヒアルロン酸骨格に、トラネキサム酸に由来する部位が結合している。この場合、上記式（３）で表される基は下記式（５）で表される基であることができる。
【００９７】
【化８】
2016159159.tif 000009
・・・（５）
【００９８】
トラネキサム酸は、美白作用、止血作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用等の生理活性を有することが知られている。
【００９９】
また、実施例５乃至７の有機化合物Ａについても、同様の結合様式により修飾ヒアルロン酸のヒアルロン酸骨格に結合している。
【０１００】
本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体は、ヒアルロン酸骨格の２糖単位（上記式（２）で表される、２糖から構成されるヒアルロン酸骨格）において、上記式（３）で表される基が含まれる（結合している）割合（本明細書において「修飾率」ともいう。）が１０％以上であることができ、２０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがより好ましく、一方、１５０％以下であることが好ましく、１００％以下であることがより好ましい。
【０１０１】
本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体は、色の色相を表すｂ値が０以上１０以下であることができ、１以上であることが好ましく、５以下であることが好ましい。本発明において、色の色相を表すｂ値は例えば、色差計（商品名「ＣＯＬＯＲ  ＡＮＤ  ＣＯＬＯＲ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＣＥ  ＭＥＴＥＲ  ＭＯＤＥＬ  １００１  ＤＰ」、日本電色工業株式会社製）に１０φレンズを装着し、ガラスセルに測定試料１ｇ以上を敷き詰めて測定することができる。
【０１０２】
（分子量）
本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体は、分子量が通常８００以上４００万以下であり、例えば２，０００以上であることが好ましく、３，０００以上であることがより好ましく、一方、１００万以下であることが好ましく、６０万以下であることがより好ましく、さらに５万以下がより好ましい。
【０１０３】
（作用効果）
本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体は、上記構成要件（２）を有することにより、有機化合物Ａに由来する部位と、修飾ヒアルロン酸を構成するヒアルロン酸の２糖単位とがアミド結合を介して結合しているため、生体内でアミド結合が加水分解されて、有機化合物Ａまたは有機化合物Ａに由来する成分を生じさせることができる。このため、該ヒアルロン酸誘導体が生体内に取り込まれた場合、前記アミド結合の加水分解が徐々に進行することによって、有機化合物Ａまたは有機化合物Ａに由来する成分を生体内で徐放させることができる。このため、有機化合物Ａまたは有機化合物Ａに由来する成分が有する生理活性を生体内で徐々に発揮させることができる。
【０１０４】
［化粧料］
本発明の一実施形態に係る化粧料は、上記実施形態に係るヒアルロン酸誘導体を含有する。本実施形態に係る化粧料における、ヒアルロン酸誘導体の含有量は例えば０．００１質量％以上５質量％以下であり、使用形態に応じて適宜決定することができる。
【０１０５】
本実施形態に係る化粧料の態様は特に限定されないが、例えば、皮膚用化粧料が挙げられる。上記実施形態に係るヒアルロン酸誘導体を皮膚用化粧料に使用することにより、該ヒアルロン酸誘導体に含まれる、前記有機化合物Ａ（または該有機化合物Ａに由来する成分）が生体内で該ヒアルロン酸誘導体から徐々に分離されるため、該有機化合物Ａ（または該有機化合物Ａに由来する成分）の作用の徐放性に優れているのに加えて、適度な粘度を有し、かつ、保水効果が高いため、皮膚に潤いを付与し、皮膚のかさつき感を改善することができる。
【０１０６】
本実施形態に係る皮膚用化粧料の態様としては、例えば、洗顔料、洗浄料、化粧水（例えば、美白化粧水）、クリーム（例えば、バニシングクリーム、コールドクリーム）、乳液、美容液、パック（例えば、ゼリー状ピールオフタイプ、ペースト状拭き取りタイプ、粉末状洗い流しタイプ）、クレンジング、ファンデーション、口紅、リップクリーム、リップグロス、リップライナー、頬紅、シェービングローション、アフターサンローション、デオドラントローション、ボディローション（ハンドケアローション、フットケアローションを含む）、ボディオイル、石鹸、入浴剤が挙げられる。
【０１０７】
本実施形態に係る化粧料にはさらに、以下の成分が配合されていてもよい。前記成分としては、例えば、カチオン化多糖類（例えば、カチオン化ヒアルロン酸、カチオン化ヒドロキシエチルセルロース、カチオン化グアーガム、カチオン化澱粉、カチオン化ローカストビーンガム、カチオン化デキストラン、カチオン化キトサン、カチオン化ハチミツ等）、アニオン界面活性剤（例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、オレフィンスルホン酸塩、脂肪酸塩、ジアルキルスルホコハク酸塩等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体等）、陽イオン界面活性剤（例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム等）、両性界面活性剤（例えば、アルキルベタイン、アルキルアミドプロピルベタイン、イミダゾリニウムベタイン、卵黄レシチン、大豆レシチン等）、油分（例えば、シリコーン、シリコーン誘導体、流動パラフィン、スクワラン、ミツロウ、カルナバロウ、オリーブ油、アボガド油、ツバキ油、ホホバ油、馬油等）、保湿剤（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、加水分解ヒアルロン酸、アセチル化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ジメチルシラノール、セラミド、ラウロイルグルタミン酸ジフィトステリルオクチルドデシル、フィトグリコーゲン、加水分解卵殻膜、トレハロース、グリセリン、アテロコラーゲン、ソルビトール、マルチトール、１，３−ブチレングリコール等）、高級脂肪酸（例えば、ラウリン酸、ベヘニン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸等）、高級アルコール（例えば、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、イソステアリルアルコール、バチルアルコール等）、多価アルコール（例えば、グリセリン、ジグリセリン、１，３−プロパンジオール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ペンチレングリコール等）、増粘剤（例えば、セルロースエーテル、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム、パルミチン酸デキストリン等）、両性高分子樹脂化合物（例えば、ベタイン化ジアルキルアミノアルキルアクリレート共重合体等）、カチオン性高分子樹脂化合物（例えば、ビニルピロリドン／ジメチルアミノエチルメタクリレート共重合体カチオン化物、ポリジメチルジアリルアンモニウムハライド型カチオン性ポリマー等）、防腐剤（例えば、メチルパラベン、エチルパラベン、ブチルパラベン、プロピルパラベン、フェノキシエタノール等）、酸化防止剤（例えば、トコフェノール、ＢＨＴ等）、金属封鎖剤（例えば、エデト酸塩、エチドロン酸塩等）、紫外線吸収剤（例えば、ベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、メトキシ桂皮酸誘導体等）、紫外線反射剤（例えば、酸化チタン、酸化亜鉛等）、タンパク質加水分解物（例えば、ケラチンペプチド、コラーゲンペプチド、大豆ペプチド、コムギペプチド、ミルクペプチド、シルクペプチド、卵白ペプチド等）、アミノ酸（例えば、アルギニン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、ヒドロキシプロリン、システイン、セリン、Ｌ−テアニン等）、天然物エキス（クジンエキス、カモミールエキス、海草エキス、ユーカリエキス、ローヤルゼリーエキス、ローズマリーエキス、ブナの木エキス等）、その他の機能性成分（コエンザイムＱ１０、アルブチン、ポリクオタニウム５１、エラスチン、白金ナノコロイド、パルミチン酸レチノール、パンテノール、アラントイン、ジラウロイルグルタミン酸リシンナトリウム、リン酸アスコルビルマグネシウム、Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド、エラグ酸、コウジ酸、リノール酸、トラネキサム酸等）、リン脂質ポリマー、香料、色素が挙げられる。
【０１０８】
［食品組成物］
本発明の一実施形態に係る食品組成物は、上記実施形態に係るヒアルロン酸誘導体を含有する。本実施形態に係る食品組成物における、ヒアルロン酸誘導体の含有量は例えば０．００１質量％以上５質量％以下であり、使用形態に応じて適宜決定することができる。上記実施形態に係るヒアルロン酸誘導体を食品組成物に使用することにより、該ヒアルロン酸誘導体に含まれる、前記有機化合物Ａ（または該有機化合物Ａに由来する成分）が生体内で該ヒアルロン酸誘導体から徐々に分離されるため、該有機化合物Ａ（または該有機化合物Ａに由来する成分）の作用の徐放性に優れているのに加えて、同程度の分子量を有するヒアルロン酸と比較して粘度が抑えられているため、食感に優れている。
【０１０９】
本実施形態に係るヒアルロン酸誘導体を含有する食品組成物の態様は特に限定されないが、例えば、主食である米飯加工食品、製パン類等、副食であるレトルト缶詰、冷凍食品、惣菜、乾燥食品等、マヨネーズ等調味料、飲料、菓子、デザート類、液状，ゲル状またはソフトカプセル状等のサプリメント類等の一般食品全般のほか、生理機能を表現することを許可された特定保健用食品全般を挙げることができる。
【０１１０】
［医薬品組成物］
本発明の一実施形態に係る医薬品組成物は、上記実施形態に係るヒアルロン酸誘導体を含有する。本実施形態に係る医薬品組成物における、ヒアルロン酸誘導体の含有量は例えば０．００１質量％以上５質量％以下であり、使用形態に応じて適宜決定することができる。上記実施形態に係るヒアルロン酸誘導体を医薬品組成物に使用することにより、該ヒアルロン酸誘導体に含まれる、前記有機化合物Ａ（または該有機化合物Ａに由来する成分）が生体内で該ヒアルロン酸誘導体から徐々に分離されるため、該有機化合物Ａ（または該有機化合物Ａに由来する成分）の作用の徐放性に優れている。
【０１１１】
本実施形態に係る医薬品組成物の使用形態には、特に制限はなく、粉末状、顆粒状、高濃度液状、低濃度液状等の使用形態とすることができる。上記実施形態に係るヒアルロン酸誘導体の分子量の安定性を鑑み、液状より乾燥形態が好ましい。
【０１１２】
なお、本実施形態に係る医薬品組成物には、必要に応じて、増量剤、結合剤、滑沢剤、保存剤、酸化防止剤、香料、甘味料、酸味料、賦形剤等を配合することができる。また、ビタミンＣ、ビタミンＢ２、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ等のビタミン類、核酸、コンドロイチン硫酸、コラーゲン等の栄養成分、鉄、亜鉛等のミネラル成分等の各種栄養成分を配合することもできる。
【０１１３】
［実施例］
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。
【０１１４】
（調製例：カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の製造方法）
３０ｍＬのサンプル瓶に水酸化ナトリウム２．３ｇを秤り取った後、水６ｍＬを添加して溶解させた。次に、原料ヒアルロン酸（分子量約１０，０００）２．０ｇを添加し溶解させた後、モノブロモ酢酸３．６ｇを添加して溶解させて、室温で４０時間静置した。ここで、前記反応液のｐＨは１３であった。その後、２００ｍＬビーカーにエタノール８０ｍＬを入れ、該反応液を撹拌しながら添加し、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸を沈殿させた。その後、４００メッシュのろ布で沈殿を２００ｍＬビーカーに回収した後、１０％塩化ナトリウム水溶液４０ｍＬを添加して沈殿を溶解させた。さらに、８％塩酸水溶液でｐＨを調製した後、溶解液に撹拌しながらエタノール８０ｍＬを入れ、再度カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸を沈殿させた。８０％含水エタノール１００ｍＬで３回洗浄した後、減圧濾過し、５５℃で３時間減圧乾燥することにより、実施例１のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸を得た。
【０１１５】
原料ヒアルロン酸の分子量、水の使用量、水酸化ナトリウムの使用量、反応温度、および反応時間を変更した以外は、実施例１と同様の方法によって、実施例２乃至７、比較例１のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸を得た。より具体的には、実施例２乃至７、比較例１でそれぞれ使用した原料ヒアルロン酸の分子量は表１に示した通りである。また、実施例３、４、５、７および比較例１では、水の使用量を１２ｍＬとし、かつ、水酸化ナトリウムの使用量を２．１ｇとした。さらに、実施例３、４、５、７および比較例１では、反応温度を４℃とした。加えて、実施例３、４、５、７および比較例１では、反応時間をそれぞれ２４時間、２４時間、６時間、２４時間、６時間とした。なお、本実施例において、「室温」とは、２０℃以上３０℃以下の温度を意味する。
【０１１６】
（実施例１：ヒアルロン酸誘導体の製造方法）
５００ｍＬビーカーに純水１００ｍＬを入れた後、表１に示す各分子量を有する原料ヒアルロン酸または表１に示す各分子量および原料修飾ヒアルロン酸（カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸）１ｇ（２．５ｍｍｏｌ）を添加し、溶解させた。続いて、ＥＤＣ・ＨＣｌ４８０ｍｇ（２．５ｍｍｏｌ）を添加し、さらに有機化合物Ａとしてトラネキサム酸４３２ｍｇ（２．７５ｍｍｏｌ）を添加し、室温（２５℃）で３時間反応させた。さらに、トラネキサム酸４３２ｍｇ（２．７５ｍｍｏｌ）をさらに添加して、室温で一晩反応させた。次いで、塩化ナトリウム５ｇを添加した後、エタノール２００ｍＬを添加し、その後、静置してから、デカンテーションにより上澄み液を除去した。さらに、８０％エタノール水溶液１００ｍＬにて２回洗浄し、さらにエタノール１００ｍＬで洗浄した後、得られた残渣を乾燥させて、実施例１に係るヒアルロン酸誘導体を得た。
【０１１７】
（実施例２ないし７および比較例１）
使用する原料ヒアルロン酸、原料修飾ヒアルロン酸および有機化合物Ａの種類を本願表１のものとした以外は、実施例１と同様の方法にて、本願実施例２ないし７ならびに比較例１に係るヒアルロン酸誘導体を得た。
【０１１８】
【表１】
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【０１１９】
なお、表１に示される修飾率および透過率は、以下の方法によって測定された値である。
【０１２０】
（修飾率の測定方法）
なお、上記実施例および比較例に係るヒアルロン酸誘導体において、ヒアルロン酸骨格の２糖単位に含まれる有機化合物Ａの割合（修飾率：％）は、本実施例に係るヒアルロン酸誘導体の１質量％水溶液を以下の方法で１Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析して得られた値である。
【０１２１】
＜１Ｈ−ＮＭＲによる修飾率の測定＞
サンプル濃度：１．０％（Ｄ２Ｏ）
装置：Ｖａｒｉａｎ  ＮＭ  ｓｙｓｔｅｍ  ４００ＮＢ型（バリアン  テクノロジーズ  ジャパン  リミテッド）
観測周波数：４００ＭＨｚ
温度：３０℃
基準：ＤＳＳ（０ｐｐｍ）
パルス幅：４５度
積算回数：６４回
【０１２２】
なお、実施例１、２、３および４の場合、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、約３．４ｐｐｍ付近に発現するピークは、ヒアルロン酸骨格中のプロトン１個を表すピークであり、約１．０ｐｐｍ付近に発現するピークは、有機化合物Ａであるトラネキサム酸由来の構造に含まれるプロトン２個（−ＮＨ２）を表すピークであると考えられる。この２つのピークから、以下の式に基づいて、ヒアルロン酸骨格の２糖単位に結合しているトラネキサム酸の割合（修飾率（％））を算出した。
【０１２３】
実施例５乃至７、比較例１の各ヒアルロン酸誘導体についても、ヒアルロン酸および各有機化合物に由来するピークの積分値およびプロトン数から修飾率を算出した。より具体的には、実施例５のヒアルロン酸誘導体では、有機化合物ＡであるＧＡＢＡ由来の構造に含まれるプロトン２個（−ＮＨ２）を表すピークは１．８ｐｐｍ付近に発現し、実施例６のヒアルロン酸誘導体では、有機化合物Ａであるアルギニン由来の構造に含まれるプロトン２個（−ＮＨ２）を表すピークは１．７ｐｐｍ付近に発現し、実施例７のヒアルロン酸誘導体では、有機化合物Ａであるレポドパ由来の構造に含まれるプロトン１個（−ＮＨ−）を表すピークは６．９ｐｐｍ付近に発現し、比較例１のヒアルロン酸誘導体では、グリシン由来の構造に含まれるプロトン２個（−ＮＨ２）を表すピークは３．６ｐｐｍ付近に発現した。
【０１２４】
修飾率（％）＝（有機化合物Ａ由来の所定ピークの積分値／有機化合物Ａ由来の所定ピークのプロトン数）／（ヒアルロン酸由来の所定ピークの積分値／ヒアルロン酸由来の所定ピークのプロトン数）×１００
【０１２５】
（透過率）
なお、表１に示される反応液の透過率は、有機化合物Ａの自己縮合体の生成度合を示す指標である。より具体的には、透過率は、上記実施例および比較例で得られた各ヒアルロン酸誘導体の１質量％水溶液を、分光光度計ＵＶ−２４４０（形名、株式会社島津製作所製）を用いて、波長６６０ｎｍの光の吸光度を測定し、該ヒアルロン酸誘導体を添加する前の水溶液の吸光度を１００％とした場合の値として示される。反応液の透過率が低いほど、前記水溶液の濁度が高く、自己縮合体の生成量が多いと推測される。
【０１２６】
表１に示されるように、本実施形態に係る製造方法によれば、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩と、アミノ基を有し、かつ、分子量が９０以上である有機化合物とを反応させる工程を含むことにより、本実施例１ないし７に示されるように、原料ヒアルロン酸を用いた場合と比較して、修飾率を効率よく高められる（表１の実施例１ないし７によれば、原料修飾ヒアルロン酸を用いた場合、原料ヒアルロン酸を用いた場合と比較して、修飾率が１３０％以上（より具体的には１６９％〜１１２４％）増加している。）ヒアルロン酸誘導体が得られることが理解できる。
【０１２７】
これに対して、本願比較例１では、分子量が９０未満の有機化合物（グリシン）を使用したため、原料修飾ヒアルロン酸を用いた場合の修飾率は、原料ヒアルロン酸を用いた場合の修飾率よりも若干高くなる（１２７％の増加）に留まった。
【国際調査報告】
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