(57)【要約】  ロバスト、かつハイスループットである標的細胞の識別方法、及び標的細胞識別装置を提供する。標的細胞の識別方法は、検体に複数の異なる波長の光を照射し、検体に対する複数の位相差像を取得する画像取得工程と、複数の異なる波長の光に対する吸収係数の差に基づいて検体から複数の標的細胞候補を選択する選択工程と、複数の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得する輝度比取得工程と、輝度比に基づいて複数の標的細胞候補から標的細胞と非標的細胞とを選別する選別工程と、を有する。
2017057077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に複数の異なる波長の光を照射し、前記検体に対する複数の位相差像を取得する画像取得工程と、
前記複数の異なる波長の光に対する吸収係数の差に基づいて前記検体から複数の標的細胞候補を選択する選択工程と、
前記複数の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得する輝度比取得工程と、
前記輝度比に基づいて前記複数の標的細胞候補から標的細胞と非標的細胞とを選別する選別工程と、
を有する標的細胞の識別方法。
【請求項２】
前記吸収係数は細胞質の吸収係数である請求項１に記載の標的細胞の識別方法。
【請求項３】
前記細胞質の吸収係数が、ヘモグロビンの吸収係数である請求項２に記載の標的細胞の識別方法。
【請求項４】
前記複数の異なる波長の光のうちの一つの光の波長は、３００ｎｍ以上７００ｎｍ以下である請求項１から３の何れか一に記載の標的細胞の識別方法。
【請求項５】
前記選別工程において、前記輝度比から前記標的細胞と前記非標的細胞の厚みに関する情報を得る、請求項１から４の何れか一項に記載の標的細胞の識別方法。
【請求項６】
前記検体が母体血であり、前記標的細胞候補が赤血球であり、前記標的細胞が有核赤血球であり、前記非標的細胞が核を有さない赤血球である、請求項１から５の何れか一項に記載の標的細胞の識別方法。
【請求項７】
前記輝度比取得工程において、前記複数の標的細胞候補に対して、前記画像取得工程での前記複数の異なる波長の光とは、異なる波長の光を照射して追加の位相差像を取得し、前記追加の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得することを含む請求項１から６の何れか一項に記載の標的細胞の識別方法。
【請求項８】
前記複数の異なる波長の光において、隣り合う光の波長間隔は７２ｎｍ以上５４０ｎｍ以下である請求項１から７の何れか一項に記載の標的細胞の識別方法。
【請求項９】
複数の異なる波長の光を検体に出射する光源ユニットと、
前記複数の異なる波長の光に対する前記検体の複数の位相差像を取得する撮像ユニットと、
前記複数の位相差像に基づいて前記検体から標的細胞を識別する制御ユニットと、
を備え、
前記制御ユニットは、前記複数の異なる波長の光に対する吸収係数の差に基づいて前記検体から複数の標的細胞候補を選択し、前記複数の位相差像に基づいて各標的細胞候補内における中心部と周辺部との輝度比を取得し、前記輝度比に基づいて前記複数の標的細胞候補から標的細胞と非標的細胞とを選別する、標的細胞識別装置。
【請求項１０】
前記制御ユニットは、前記撮像ユニットを制御し、前記複数の標的細胞候補に対して前記複数の異なる波長の光とは、異なる波長の光を照射して追加の位相差像を取得し、前記追加の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得する、請求項９に記載の標的細胞識別装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞の識別方法、及び標的細胞識別装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
出生前診断として、母体血中から胎児由来の有核赤血球を識別し、この有核赤血球を利用して、例えば、染色体のＤＮＡ（デオキシリボ核酸：deoxyribonucleic acid）を分析することが検討されている。【０００３】
しかしながら、母体血中の胎児由来の有核赤血球は、母体血中に数ｍＬ（１ｍＬ＝１０−６ｍ３）中に１個程度しか存在しない。そのため、母体血中（検体）から胎児由来の有核赤血球（標的細胞）を効率的に識別することが重要となる。【０００４】
検体から対象物を識別する技術として、特許文献１には、検体中の対象物のイメージを取得し、イメージ中の目的とする対象物を識別し、識別された目的とする対象物の追加のイメージを複数の異なる波長にて取得し、抽出された細胞の特徴に基づく確率モデルに従って検体を分類することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１０−５４０９３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１の記載された技術では、検体を染色しない場合に、ロバストかつハイスループットに細胞を識別する方法について教示していない。【０００７】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、検体を染色しないで、ロバスト、かつハイスループットで標的細胞を識別することができる標的細胞の識別方法、及び標的細胞識別装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によると、標的細胞の識別方法は、検体に複数の異なる波長の光を照射し、検体に対する複数の位相差像を取得する画像取得工程と、複数の異なる波長の光に対する吸収係数の差に基づいて検体から複数の標的細胞候補を選択する選択工程と、複数の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得する輝度比取得工程と、輝度比に基づいて複数の標的細胞候補から標的細胞と非標的細胞とを選別する選別工程と、を有する。【０００９】
好ましくは、吸収係数は細胞質の吸収係数である。【００１０】
好ましくは、細胞質の吸収係数が、ヘモグロビンの吸収係数である。【００１１】
好ましくは、複数の異なる波長の光のうちの一つの光の波長は、３００ｎｍ以上７００ｎｍ以下である。【００１２】
好ましくは、選別工程において、輝度比から標的細胞と非標的細胞の厚みに関する情報を得る。【００１３】
好ましくは、検体が母体血であり、標的細胞候補が赤血球であり、標的細胞が有核赤血球であり、非標的細胞が核を有さない赤血球である。【００１４】
好ましくは、輝度比取得工程において、複数の標的細胞候補に対して、画像取得工程での複数の異なる波長の光とは、異なる波長の光を照射して追加の位相差像を取得し、追加の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得することを含む。【００１５】
好ましくは、複数の異なる波長の光において、隣り合う光の波長間隔は７２ｎｍ以上５４０ｎｍ以下である。【００１６】
本発明の別態様によると、標的細胞識別装置は、複数の異なる波長の光を検体に出射する光源ユニットと、複数の異なる波長の光に対する検体の複数の位相差像を取得する撮像ユニットと、複数の位相差像に基づいて検体から標的細胞を識別する制御ユニットと、を備え、制御ユニットは、複数の異なる波長の光に対する吸収係数の差に基づいて検体から複数の標的細胞候補を選択し、複数の位相差像に基づいて各標的細胞候補内における中心部と周辺部との輝度比を取得し、輝度比に基づいて複数の標的細胞候補から標的細胞と非標的細胞とを選別する。【００１７】
好ましくは、制御ユニットは、撮像ユニットを制御し、複数の標的細胞候補に対して複数の異なる波長の光とは、異なる波長の光を照射して追加の位相差像を取得し、追加の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、検体を染色しないで、ロバスト、かつハイスループットで標的細胞を識別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、標的細胞の識別方法の手順を示したフローチャート図である。
【図２】図２は、標的細胞識別装置の構成を示す構成図である。
【図３】図３は、制御ユニットのブロック図である。
【図４】図４は、複数の異なる波長の光をサンプルに照射し、取得した複数の位相差像である。
【図５】図５は、ヘモグロビンの波長に対する吸収係数を示すグラフである。
【図６】図６は、複数の位相差像から赤血球を特定した画像である。
【図７】図７は、複数の異なる波長の光で撮像した有核赤血球の位相差像である。
【図８】図８は、複数の異なる波長の光で撮像した核を有さない赤血球の位相差像である。
【図９】図９は、標的細胞候補の細胞の形状を示す模式図である。
【図１０】図１０は、標的細胞候補における中心部と周辺部の輝度比と、波長との関係を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ヒトの赤血球とニワトリの赤血球を共焦点顕微鏡により測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、添付図面にしたがって本発明の好ましい実施の形態について説明する。本発明は以下の好ましい実施の形態により説明される。本発明の範囲を逸脱すること無く、多くの手法により変更を行うことができ、本実施形態以外の他の実施の形態を利用することができる。したがって、本発明の範囲内における全ての変更が特許請求の範囲に含まれる。
【００２１】
ここで、図中、同一の記号で示される部分は、同様の機能を有する同様の要素である。また、本明細書中で、数値範囲を“  〜  ”を用いて表す場合は、“  〜  ”で示される上限、下限の数値も数値範囲に含むものとする。
【００２２】
＜標的細胞の識別方法＞
本実施形態の標的細胞の識別方法について、検体が母体血であり、標的細胞候補が赤血球であり、標的細胞が有核赤血球であり、非標的細胞が核を有さない赤血球である場合を例示して説明する。
【００２３】
図１は、本実施形態の標的細胞の識別方法の手順を示すフローチャート図である。本実施形態の標的細胞の識別方法は、検体準備工程（ステップＳ１）、画像取得工程（ステップＳ２）、選択工程（ステップＳ３）、輝度比取得工程（ステップＳ４）、及び選別工程（ステップＳ５）を備えている。検体準備工程（ステップＳ１）では、対象となる標的細胞と非標的細胞とを含む検体を、人体から採取し、標的細胞を識別するためのサンプルとして準備する。画像取得工程（ステップＳ２）では、検体に複数の異なる波長の光を照射し、検体に対する複数の位相差像を取得する。選択工程（ステップＳ３）では、複数の異なる波長の光に対する吸収係数の差に基づいて検体から複数の標的細胞候補を選択する。輝度比取得工程（ステップＳ４）では、複数の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得する。選別工程（ステップＳ５）では、輝度比に基づいて複数の標的細胞候補から標的細胞と非標的細胞とを選別する。以下、各工程について説明する。
【００２４】
＜検体準備工程（ステップＳ１）＞
検体準備工程では、対象となる標的細胞と非標的細胞とを含む検体を、人体から採取し、標的細胞を識別するためのサンプルとして準備する。サンプルとして準備する方法として、スライドガラスへの塗抹、シャーレへの格納、マルチウェルプレートへの格納等を挙げることができる。サンプルとして準備された検体は、定められた基準面の上に設置されていない。したがって、検体に含まれる標的細部は、検体内において自由な位置に存在する。
【００２５】
次に、母体血をスライドガラスへ塗抹する場合を例示して説明する。
【００２６】
最初に、妊娠母体から母体血を採取する。母体血としては、侵襲性の低い妊娠母体の末梢血であることが好ましい。母体の末梢血には、標的細胞候補である赤血球、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単球、リンパ球等の白血球等が含まれる。さらに、標的細胞候補である赤血球には、標的細胞である有核赤血球（母体由来と胎児由来とを含む）、及び非標的細胞である核のない赤血球が含まれる。
【００２７】
胎児由来の有核赤血球は、妊娠後、６週程度から母体血中に存在すると言われている。本実施形態の標的細胞の識別方法を出生前診断に適用する場合、妊娠後６週程度以降の母体の末梢血（母体血）をサンプルとして準備することが好ましい。
【００２８】
胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母体の血液中に存在する赤血球前駆体である。母体が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。この赤血球には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の１０６個に１個程度の割合で存在しているといわれており、母体血中には非常に存在確率が少ない。
【００２９】
採取工程で採取した母体血中の有核赤血球の濃縮を行うことが好ましい。濃縮する方法としては、公知の方法、例えば、密度勾配遠心分離法、ＭＡＣＳ法（Magnetic activated cell sorting）、ＦＡＣＳ法（Fluorescence activated cell sorting）、レクチン法、あるいは、フィルタ濾過法などを用いることができる。なかでも、血球細胞の特性を利用し、簡便な濃縮方法として、密度勾配遠心分離法により濃縮を行うことが好ましい。
【００３０】
次に、有核赤血球が濃縮された母体血の画分をスライドガラスの上に塗抹する。塗抹する方法としては、引きガラス法（ウエッジ法）、クラッシュ法（押し潰し法）、手伸ばし法、スピン法などにより行うことができ、特に引きガラス法で行うことが好ましい。チャンバースライドを用いて、遠心塗抹法によりスライドガラスの上に母体血を塗抹することができる。
【００３１】
準備された検体は染色処理を施さない状態で、図２に例示される標的細胞識別装置１０にサンプルＳとして提供される。検体に対して染色処理が施されていないので、染色剤に起因する標的細胞の損傷が抑制される。したがって、識別された標的細胞に対して正しい解析を行うことが可能となる。
【００３２】
標的細胞識別装置１０は、光源ユニット２０と、撮像ユニット３０と、制御ユニット５０を含むパーソナルコンピューター１００と、を備える。パーソナルコンピューター１００は、光源ユニット２０、及び撮像ユニット３０と電気的に接続されている。制御ユニット５０を含むパーソナルコンピューター１００は、標的細胞識別装置１０の全体の動作を制御する。パーソナルコンピューター１００は、操作入力部であるキーボード１１０、及び表示部であるディスプレイ１２０と、を備える。
【００３３】
光源ユニット２０は、光源２２と、フィルタ２４とを備えている。光源ユニット２０は、光源２２からの光を、フィルタ２４を透過させて光の波長を切り替えることで、複数の異なる波長の光をサンプルＳに出射することができる。フィルタ２４として干渉フィルタ等を挙げることができる。また、別の態様として、波長の異なる複数の光源を準備し、光源を切り替えることにより、複数の異なる波長の光をサンプルＳに出射することができる。
【００３４】
光源２２として、例えば、ＬＥＤ（light emitting diode）、又はＬＡＳＥＲ（light amplification by stimulated emission of radiation）を使用することができる。なお、異なる波長とはピーク波長が異なることを意味する。すなわち、光の波長はピーク波長で特定されることを意味する。
【００３５】
撮像ユニット３０は、代表的には位相差顕微鏡である。撮像ユニット３０は、光源ユニット２０の側から、リング絞り３２と、コンデンサレンズ３４と、テーブル３６と、対物レンズ３８と、位相板４０と、及び撮像装置４２と、を備えている。サンプルＳがテーブル３６により支持される。リング絞り３２は開口を有し、光源ユニット２０からの光がリング絞り３２により、例えばリングスリット状に絞られる。位相板４０は、リング絞り３２の開口と同じ形状の位相膜を備えている。位相板４０の位相膜を通過することにより、光の位相を進めたり、遅らせたりする。
【００３６】
撮像装置４２は結像位置に設置され、位相差像を撮像する。撮像装置４２としては、特に限定されず、例えば、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）カメラや、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）カメラを用いることができる。
【００３７】
図３は、制御ユニット５０のブロック図である。図３に示すように、制御ユニット５０は、画像取得部５２と、標的細胞候補選択部５４と、標的細胞輝度比取得部５６と、標的細胞選別部５８と、を備える。
【００３８】
標的細胞識別装置１０を使用することにより、画像取得工程（ステップＳ２）、選択工程（ステップＳ３）、輝度比取得工程（ステップＳ４）、及び選別工程（ステップＳ５）が実行される。
【００３９】
＜画像取得工程（ステップＳ２）＞
画像取得工程では、検体に複数の異なる波長の光を照射し、検体に対する複数の位相差像を取得する。
【００４０】
具体的には、第１に、母体血を検体とするサンプルＳをテーブル３６の上に置く。次に、制御ユニット５０の画像取得部５２からの制御信号により、光源ユニット２０は光源２２と一つのフィルタ２４との組み合わせを選択、すなわち、複数の異なる波長の光から一つの波長の光（第１の波長の光）を選択する。光源ユニット２０は、第１の波長の光をサンプルＳ（検体）に向けて照射する。
【００４１】
第１の波長の光はリング絞り３２を通過することにより、リング状の形状の光に絞られる。リング絞り３２を通過した第１の波長の光が、コンデンサレンズ３４を通過することにより集光され、サンプルＳ（検体）に照射される。サンプルＳに照射された第１の波長の光は、対物レンズ３８、及び位相板４０を通過して、撮像装置４２で結像する。
【００４２】
サンプルＳを通過した第１の波長の光は、サンプルＳ（検体）を透過した直接光とサンプルＳ（検体）により回折した回折光とに分かれる。対物レンズ３８を透過した直接光は、位相板４０の位相膜を通過し、撮像装置４２に結像する。一方、対物レンズ３８を透過した回折光は、位相板４０の位相膜の形成領域以外の部分を透過し、撮像装置４２に結像する。直接光は、位相板４０の位相膜を通過する際に１／４波長だけ進む方向、又は遅れる方向に位相がずらされる。
【００４３】
第１の波長の直接光と回折光とが干渉するので、結像面で結ばれる像は明暗のコントラストを有する位相差像となる。この明暗のコントラストを有する像が撮像装置４２により撮像され、第１の波長の検体に対する位相差像（第１の位相差像）が取得される。取得された第１の位相差像は、パーソナルコンピューター１００のディスプレイ１２０に表示され、不図示の記憶装置に記憶される。
【００４４】
次に、制御ユニット５０からの制御信号により光源ユニット２０は光源２２と他のフィルタ２４との組み合わせを選択、すなわち、複数の異なる波長の光から第１の波長の光と異なる波長の光（第２の波長の光）を選択する。光源ユニット２０は、第２の波長の光をサンプルＳ（検体）に向けて照射する。
【００４５】
第２の波長の光はリング絞り３２を通過することにより、リング状の形状の光に絞られる。リング絞り３２を通過した第２の波長の光が、コンデンサレンズ３４を通過することにより集光され、サンプルＳ（検体）に照射される。サンプルＳに照射された第２の波長の光は、対物レンズ３８、及び位相板４０を通過して、撮像装置４２で結像する。
【００４６】
第２の波長の直接光と回折光とが干渉するので、結像面で結ばれる像は明暗のコントラストを有する位相差像となる。この明暗のコントラストを有する像が撮像装置４２により撮像され、第２の波長の検体に対する位相差像（第２の位相差像）が取得される。取得された第２の位相差像は、パーソナルコンピューター１００のディスプレイ１２０に表示され、不図示の記憶装置に記憶される。
【００４７】
図４は、複数の異なる波長の光をサンプルに照射し、取得した複数の位相差像である。図４（Ａ）は、４２０ｎｍを第１の波長とする光をサンプルＳに照射することで取得した第１の位相差像である。図４（Ｂ）は、５４０ｎｍを第２の波長とする光をサンプルＳに照射することで取得した第２の位相差像である。本実施形態では、複数の位相差像として第１の位相差像と第２の位相差像とを取得した場合を説明した。これに限定されず、２以上の位相差像を取得することができる。
【００４８】
＜選択工程（ステップＳ３＞
選択工程では、複数の異なる波長の光に対する吸収係数の差に基づいて検体から複数の標的細胞候補を選択する。
【００４９】
図５は、赤血球の細胞質を構成するヘモグロビンの波長に対する吸収係数を示すグラフである。グラフは、縦軸に吸収係数（ａ．ｕ．）を、横軸に波長（ｎｍ）を表示する。赤血球は、白血球にないヘモグロビンを有する。ヘモグロビンは鉄―ポルフィリン錯体であり、ポルフィリン環に由来する３８０ｎｍから４５０ｎｍ付近にＳｏｒｅｔ帯と呼ばれる吸収、及び５００ｎｍから６００ｎｍ付近にＱ帯と呼ばれる吸収をもつ錯体である。
【００５０】
画像取得工程（ステップＳ２）では、第１の波長の光として４２０ｎｍの光をサンプルＳに照射し、第２の波長の光として５４０ｎｍの光をサンプルＳに照射する。図５に示すように、第１の波長の光と第２の波長の光とに対するヘモグロビンの吸収係数が異なる。第１の波長の光に対するヘモグロビンの吸収係数は、第２の波長の光に対するヘモグロビンの吸収係数より大きい。すなわち、第２の波長の光と比較して、第１の波長の光はより多くヘモグロビンに吸収される。
【００５１】
図５に従えば、少なくとも複数の異なる波長の光のうちの一つ光（第１の波長の光）は、３００ｎｍ以上７００ｎｍ以下の波長の光であることが好ましい。一方、複数の異なる波長の光のうちの他の波長の光（第２の波長の光）は、第１の波長の光とは吸収係数が異なる波長の光であることが好ましい。第１の波長の光とは吸収係数が異なる波長の光である限り、他の波長の光（第２の波長の光）は３００ｎｍ以上７００ｎｍ以下の範囲に限定されない。
【００５２】
次に、制御ユニット５０の標的細胞候補選択部５４は、以下の手順に従い複数の標的細胞候補である赤血球を選択する。
【００５３】
複数の異なる波長の光に対する吸収係数の差（第１の波長の光と第２の波長の光とに対するヘモグロビンの吸収係数の差）に基づいて、標的細胞候補である赤血球と、赤血球以外の血球とを区別する。上述したように、第１の波長の光と第２の波長の光とに対するヘモグロビンの吸収係数が異なる。したがって、第１の波長の光を照射した際の赤血球から発生する光と、第２の波長の光を照射した際の赤血球から発生する光との輝度比は大きくなる。一方で、赤血球以外の血球（例えば、白血球）は、ヘモグロビンを有していないので、複数の異なる波長の光に対する赤血球以外の血球から発生する光の輝度比は小さい。赤血球に対する複数の異なる波長の光に対する輝度比が、他の血球の輝度比より大きくなるので、細胞から赤血球と血球以外の血球とを容易に区別することができる。
【００５４】
なお、本工程においては、次の態様で行うことが好ましい。
【００５５】
制御ユニット５０の標的細胞候補選択部５４は、複数の異なる波長の光に対する位相差像、すなわち、第１の位相差像と第２の位相差像から細胞内の周辺部（細胞質）と非細胞領域の輝度比を取得する。培地等の非細胞領域は、複数の異なる波長の光に対する吸収係数の差が大きくない。したがって、複数の異なる波長の光（第１の波長の光と第２の波長の光）に対する非細胞領域から発生する光の差は小さい。輝度比を取得することにより、培地等の非細胞領域に起因するバックグラウンドの成分を、位相差像から除去、又は低減できる。サンプルＳ（検体）中の細胞（赤血球、及び赤血球以外の血球）を同定することができるので、好ましい。
【００５６】
図６は、画像取得工程（ステップＳ２）で取得した複数の位相差像から赤血球を特定した画像である。丸印で囲まれた細胞が赤血球である。図６（Ａ）に示すように、第１の波長の光として４２０ｎｍの光をサンプルＳに照射した場合、第１の波長の光は赤血球の細胞質を構成するヘモグロビンで吸収される。その結果、赤血球から発生する光が黒く観察される。一方、第２の波長の光として５４０ｎｍの光をサンプルＳに照射した場合、第２の波長の光は赤血球の細胞質を構成するヘモグロビンでほとんど吸収されない。その結果、赤血球から発生する光が白く観察される。したがって、サンプルＳ（検体）から赤血球を他の血球から区別できる。
【００５７】
上述したように、選択工程（ステップＳ３）では、細胞内の周辺部（細胞質）と非細胞領域の輝度比を取得することにより、ヘモグロビンの吸収係数の差に基づいて標的細胞候補をロバストに検出するので、容易に選択することができる。
【００５８】
＜輝度比取得工程（ステップＳ４）＞
輝度比取得工程では、複数の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得する。
【００５９】
一般に、撮像ユニット３０を構成する位相差顕微鏡は、検体の細胞により発生する直接光と回折光との重ね合わせにより、明暗のコントラストを有する位相差像を取得する。位相差像の明暗は直接光と回折光の位相差により決定されるため、細胞の厚み（光路差）や波長に依存する。
【００６０】
そのため、位相が進んでいるか、又は遅れているかを位相差像から判断できない。その結果、識別しようとする細胞が凸形状であるか、又は凹形状であるかを判断することができない。したがって、細胞が凸形状であっても、凹形状であっても（厚みに差があっても）、同じ領域が位相差像として「暗」として観察される。
【００６１】
標的細胞候補が赤血球である場合、標的細胞候補から標的細胞である有核赤血球と、非標的細胞である核を有さない赤血球と、を選別する必要がある。有核赤血球と核を有さない赤血球とでは、厚みが異なる。しかしながら、上述したように、この厚みの差は、通常の位相差像からは区別されない。
【００６２】
そこで、本実施形態では、選別工程（ステップＳ５）で説明するように、複数の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得することにより、標的細胞と非標的細胞とを区別し得る情報を取得する。区別し得る情報は、標的細胞と非標的細胞の形状に関する情報であり、さらには、標的細胞と非標的細胞の厚みに関する情報である。厚みに関する情報は、有核赤血球と核を有さない赤血球とを区別する場合に有用である。
【００６３】
図７は複数の異なる波長の光で撮像した有核赤血球の位相差像である。図７（Ａ）は４２０ｎｍの波長の光で撮像したニワトリの赤血球の位相差像であり、図７（Ｂ）は５４０ｎｍの波長の光で撮像したニワトリの赤血球の位相差像であり、図７（Ｃ）は４８０ｎｍの波長の光で撮像したニワトリの赤血球の位相差像であり、図７（Ｄ）は６５０ｎｍの波長の光で撮像したニワトリの赤血球の位相差像である。ニワトリの赤血球は核を有する。
【００６４】
図８は複数の異なる波長の光で撮像した核を有さない赤血球の位相差像である。図８（Ａ）は４２０ｎｍの波長の光で撮像したヒトの赤血球の位相差像であり、図８（Ｂ）は５４０ｎｍの波長の光で撮像したヒトの赤血球の位相差像であり、図８（Ｃ）は４８０ｎｍの波長の光で撮像したヒトの赤血球の位相差像であり、図８（Ｄ）は６５０ｎｍの波長の光で撮像したヒトの赤血球の位相差像である。ヒトの赤血球は脱核した赤血球である。
【００６５】
図７において、複数の標的細胞候補（ニワトリの赤血球）に対して、画像取得工程（ステップＳ２）で照射した複数の異なる波長の光（４２０ｎｍ、及び５４０ｎｍ）とは、異なる波長の光（４８０ｎｍ、及び６５０ｎｍ）を照射して追加の位相差像（図７（Ｃ）、及び図７（Ｄ））を取得する。また、図８において、複数の標的細胞候補（ヒトの赤血球）に対して、画像取得工程（ステップＳ２）で照射した複数の異なる波長の光（４２０ｎｍ、及び５４０ｎｍ）とは、異なる波長の光（４８０ｎｍ、及び６５０ｎｍ）を照射して追加の位相差像（図８（Ｃ）、及び図８（Ｄ））を取得する。
【００６６】
具体的には、制御ユニット５０は、撮像ユニット３０を制御し、複数の標的細胞候補に対して、画像取得工程（ステップＳ１）で照射した複数の異なる波長の光とは、異なる波長の光を照射して追加の位相差像を取得する。
【００６７】
輝度比取得工程において、追加の位相差像を取得することより、標的細胞と非標的細胞とを区別し得る情報を、より正確に取得することができる。
【００６８】
具体的には、制御ユニット５０の標的細胞輝度比取得部５６は、複数の位相差像（必要に応じて追加の位相差像を含む）に基づいて各標的細胞候補である赤血球における中心部と周辺部との輝度比を取得する。
【００６９】
図９は、標的細胞候補である赤血球Ｅを示す模式図である。ここで中心部Ｎとは、細胞内において核が存在しうる領域であり、周辺部Ｃとは、細胞内において核の存在しない細胞質の領域を意味する。
【００７０】
輝度比とは、標的細胞候補である赤血球Ｅの周辺部Ｃの輝度に対する中心部Ｎの輝度の比率を意味し、（中心部Ｎの輝度／周辺部Ｃの輝度）で算出することができる。
【００７１】
輝度比取得工程（ステップＳ４）では、具体的には、標的細胞候補である細胞の中心部（核）と細胞内の周辺部(細胞質)領域の輝度比を取得する。
【００７２】
＜選別工程（ステップＳ５）＞
選別工程は、輝度比に基づいて複数の標的細胞候補から標的細胞と非標的細胞とを選別する。
【００７３】
輝度比取得工程（ステップＳ４）で説明したように、輝度比を取得することにより、複数の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得することで、標的細胞と非標的細胞とを区別し得る情報、有核赤血球の持つ厚みに関する情報（光路差を反映した情報）を取得することができる。
【００７４】
図１０は、標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比と波長との関係を示すグラフである。横軸は位相差像を取得する際に照射した光の波長を示し、縦軸は各位相差像における標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を示す。図１０（Ａ）は有核赤血球であるニワトリの赤血球における中心部と周辺部との輝度比と波長との関係を示し、図１０（Ｂ）は核を有さない赤血球であるヒトの赤血球における中心部と周辺部との輝度比と波長との関係を示す。
【００７５】
各位相差像において、同じ場所に位置する標的細胞候補の中心部と周辺部との輝度比を算出する。例えば、図７（Ａ）から（Ｄ）に示すように、丸で囲んだ位置にある標的細胞候補に対して中心部と周辺部との輝度比を算出する。波長毎に輝度比をプロットし、各輝度比を直線で結ぶ。本実施形態では、１３個の赤血球を任意で選択し、波長毎に輝度比をプロットし、同じ場所に位置する赤血球の輝度比を直線で結ぶことで図１０（Ａ）のグラフを作成する。
【００７６】
同様に、例えば、図８（Ａ）から（Ｄ）に示すように、丸で囲んだ位置にある標的細胞候補に対して中心部と周辺部との輝度比を算出する。波長毎に輝度比をプロットし、各輝度比を直線で結ぶ。本実施形態では、８個の赤血球を任意で選択し、波長毎に輝度比をプロットし、同じ場所に位置する赤血球の輝度比を直線で結ぶことにより図１０（Ｂ）のグラフを作成する。
【００７７】
図１０（Ａ）に示す有核赤血球の輝度比を示すグラフによれば、輝度比の値が波長毎に大きく変化することが理解できる。一方、図１０（Ｂ）に示す核を有さない赤血球の輝度比を示すグラフによれば、輝度比の値が波長毎にほとんど変化しないことが理解できる。
【００７８】
したがって、複数の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得することで、標的細胞と非標的細胞とを区別し得る情報、有核赤血球の持つ厚みに関する情報（光路差を反映した情報）を取得することができる。その結果、波長に対する輝度比の変動の周期を算出することにより、ロバストに厚みを推定し、核の有無を関する情報を取得することが可能となる。
【００７９】
次に、有核赤血球における輝度比の変化が、有核赤血球の持つ厚み（光路差）を反映していることについて説明する。
【００８０】
図１１は、ヒトの赤血球とニワトリの赤血球を共焦点顕微鏡により測定した結果を示すグラフである。横軸に測定の対象を示しており、縦軸に測定の対象の厚みを示している。図１１に示すように、核を有さないヒトの赤血球の周辺部は約０．４９μｍ（４９０ｎｍ）の厚みで、中心部は約０．４７μｍ（４７０ｎｍ）の厚みである。ヒトの赤血球の周辺部と中心部との厚みの差は約２０ｎｍである。一方、ニワトリの核（赤血球の中心部に相当）は約１．４１μｍ（１４１０ｎｍ））の厚みであり、ニワトリの赤血球（周辺部に相当）は約０．７８μｍ（７８０ｎｍ）の厚みである。ニワトリの赤血球の周辺部と中心部との厚みの差は約６３０ｎｍである。
【００８１】
ニワトリの核を通過する光と核を通過しない光との光路差Ｌは、（１．３６−１）×厚み、で求めることができる。１．３６は細胞の屈折率であり、１は空気の屈折率である。測定された厚みは６３０（ｎｍ）であるので、計算によれば光路差Ｌは約２２７ｎｍとなる。
【００８２】
一方、図１０（Ａ）のニワトリの赤血球のグラフによれば、４２０ｎｍで観察される輝度比と６５０ｎｍで観察される輝度比とを比較すると、概ね同じ傾向であることが読み取れる。すなわち、１周期が概ね２３０ｎｍであると推測される。
【００８３】
共焦点顕微鏡で求めた光路差Ｌ（２２７ｎｍ）と、複数の位相差像から求めた輝度比の１周期（２３０ｎｍ）とから、有核赤血球の持つ厚み（光路差）を反映した輝度比の変化であることが理解できる。
【００８４】
次に、輝度比取得工程（ステップＳ４）において、隣り合う光の波長間隔は７２ｎｍ以上５４０ｎｍ以下であることが好ましい。上述したように、複数の位相差像から求めた輝度比には周期的な傾向が観察される。したがって、複数の位相差像を取得する際に、少なくとも２つの光の波長は、この周期内の間隔であることが好ましい。この周期は、核の厚み（光路差Ｌ）と関係する。核の厚みは０．２μｍ以上１．５μｍ以下の範囲である。光路差Ｌを求める式である（１．３６−１）×厚み、から算出すると７２ｎｍ以上５４０ｎｍ以下となる。なお、下限値は、好ましくは７２ｎｍ、より好ましくは１１５ｎｍ、更に好ましくは２３０ｎｍである。
【００８５】
具体的には、制御ユニット５０の標的細胞選別部５８は、複数の標的細胞候補から取得した輝度比に基づいて、複数の標的細胞候補から標的細胞と非標的細胞とを選別する。輝度比は標的細胞と非標的細胞とを区別し得る情報を含んでいる。
【００８６】
本実施形態では、標的細胞候補である赤血球から、輝度比から厚みに関する情報、すなわち、核の有無の情報を取得し、標的細胞である有核赤血球と、非標的細胞である核を有さない赤血球とを選別する。
【００８７】
上述したように、本実施形態では、標的細胞候補から標的細胞と非標的細胞とを選別する際、光路差を測定していないので、ハイスループットに標的細胞を識別することができる。また、複数の異なる波長の光に対する吸収係数の差に基づいて標的細胞候補を選択し、かつ複数の位相差像に基づいて各標的細胞候補における中心部と周辺部との輝度比を取得しているので、ロバストに選択、選別し、標的細胞を識別することが可能である。
【００８８】
また、検体に含まれる標的細胞が基準面に設置されない場合、例えば、サンプルの塗抹面が一定でない場合でも、標的細胞を識別することができる。
【００８９】
本実施形態の標的細胞の識別方法について、検体が母体血であり、標的細胞候補が赤血球であり、標的細胞が有核赤血球であり、非標的細胞が核を有さない赤血球である場合を例示して説明した。しかし、これらに限定されることなく、一般に、抹消血などの血液に適用することができ、更には、妊婦の羊水や、臍帯血等、に適用することができる。
【００９０】
本実施形態の標的細胞の識別方法として、検体準備工程（ステップＳ１）、画像取得工程（ステップＳ２）、選択工程（ステップＳ３）、輝度比取得工程（ステップＳ４）、及び選別工程（ステップＳ５）を備えている場合について説明した。しかしながら、本発明の好ましい実施態様として、検体準備工程（ステップＳ１）に代えて、既にスライドガラス上に塗抹されて保管されている検体等に対して標的細胞を識別することも可能である。
【００９１】
次に、本実施形態において、以下の取得工程、及び解析工程を実施することが好ましい。
【００９２】
＜取得工程＞
取得工程は、本実施形態の標的細胞の識別方法で識別された標的細胞を単離回収する。例えば、識別された標的細胞が有核赤血球である場合、単離回収方法としては、公知の方法を用いることができ、特に、マイクロマニピュレーション（ＭＭ：micromanipulation）法あるいはレーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ：laser microdissection）法を用いることが好ましい。
【００９３】
マイクロマニピュレーションシステムは、例えば、株式会社ナリシゲ社の各種マイクロマニピュレーターを組み合せることができる。また、レーザーマイクロダイセクションシステムは、例えば、ZEISS社のレーザーマイクロダイセクションシステムPALM MicroBeam等の市販されているシステムを使用することができる。
【００９４】
＜解析工程＞
解析工程は、取得工程で単離回収した標的細胞に対して遺伝子解析を行う。標的細胞が有核赤血球である場合、解析工程は、有核赤血球の染色体に含まれる核酸を増幅する増幅工程と、増幅した有核赤血球の増幅産物の量を確定し、かつ遺伝子解析により胎児由来の有核赤血球であることを確認する確定工程と、胎児由来の有核赤血球のＤＮＡの増幅産物の量を比較することで、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する決定工程とを含む。
【００９５】
［増幅工程］
増幅工程は、識別された有核赤血球、または、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に含まれる核酸を増幅する工程である。増幅工程は、マイクロウエルプレートなど、または、塗抹標本から単離された細胞からＤＮＡを抽出して、ゲノム増幅を行う。ゲノム増幅は、市販のキットを用いて行うことが可能である。
【００９６】
本実施形態で用いるゲノム増幅法としては、取得した細胞から、一般的な方法である界面活性剤を用いた細胞溶解、プロテアーゼＫ等を用いたタンパク質分解工程を経ることで、細胞から溶出することにより得られたゲノムＤＮＡを用いる。
【００９７】
全ゲノム増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）に基づく試薬PicoPLEX WGA kit（New England Biolabs社）、GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification kit（Sigma-Aldrich社）、MALBAC（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles）法（国際公開WO2012/166425A2号公報に掲載）を用いることができる。また、鎖置換型ＤＮＡ合成反応に基づく試薬GenomiPhi（ＧＥヘルスケア社）、REPLI-g（Qiagen社）も同様に用いることができる。本実施形態では、PicoPLEX WGA kit（New England Biolabs社）を用いることが好ましい。
【００９８】
全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物は、アガロースゲル電気泳動などにより増幅有無を確認することが可能である。更に、全ゲノム増幅産物をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社）を用いて精製することが好ましい。
【００９９】
また、全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物の濃度について、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific社）、Quantus Fluorometer（Promega社）、BioAnalyzer（Agilent社）、TapeStation（Agilent社）を用いて測定することが可能である。
【０１００】
［確定工程］
確定工程は、増幅工程により増幅した有核赤血球の増幅産物の量を確定するとともに、遺伝子解析により有核赤血球から胎児由来の有核赤血球を確認する。
【０１０１】
〔遺伝子解析〕
遺伝子解析は、ＤＮＡマイクロアレイ、デジタルＰＣＲ、次世代シーケンサー、nCounter System（NanoString社）を用いることが可能であるが、本実施形態においては、解析の精度及び速さ、１度に処理可能な試料数の多さ等の点で次世代シーケンサーを用いることが好ましい。
【０１０２】
本実施形態において次世代シーケンサーとは、サンガー法を利用したキャピラリーシーケンサー（第一世代シーケンサーと呼ばれる）に対比して分類されるシーケンサーを意味する。次世代シーケンサーは、第二世代、第三世代、第四世代、及び今後開発されるシーケンサーを含む。現時点で最も普及している次世代シーケンサーは、ＤＮＡポリメラーゼによる相補鎖合成又はＤＮＡリガーゼによる相補鎖結合に連動した蛍光又は発光をとらえ塩基配列を決定する原理のシーケンサーである。具体的には、MiSeq（Illumina社）、HiSeq2000（Illumina社、HiSeqは登録商標）、Roche454（Roche社）などが挙げられる。
【０１０３】
増幅工程で得られたＤＮＡの増幅産物を次世代シーケンサーで解析する場合、全ゲノムシーケンス、エキソームシーケンス、アンプリコンシーケンスを用いることが可能である。
【０１０４】
次世代シーケンサーで得られた配列データをアライメントする手段としては、Burrows-Wheeler Aligner（BWA）が挙げられ、BWAによって既知のヒトゲノム配列へ配列データをマッピングすることが好ましい。遺伝子を解析する手段としては、SAMtools及びBEDtoolsが挙げられ、これらの解析手段により遺伝子多型、遺伝子変異、及び染色体数を解析することが好ましい。
【０１０５】
《対立遺伝子による分析》
増幅工程により全ゲノム増幅を行った後、対立遺伝子の配列を決定することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球であることを確認することができる。
【０１０６】
有核赤血球として識別された標的細胞で、ポリメラーゼ連鎖反応（増幅工程）により増幅されたＤＮＡであって、数的異常を検査する対象となる染色体に対して、あらかじめ決定された100〜150bp（base pair：ベースペア）の領域の配列を有するＤＮＡの増幅産物の量をシーケンサーで求める。本実施形態においては、検査する対象となる染色体は、13番染色体であることが好ましい。胎児由来の有核赤血球は、通常、父親および母親から１組ずつの染色体を受け継いでおり、性染色体を除き、２本ずつの染色体を有している。これらの１組の染色体の対立遺伝子を分析し、父親由来の遺伝子の存在を確認することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か母体由来の有核赤血球かを選別することができる。
【０１０７】
父親由来の遺伝子の存在の確認は、母親由来の細胞についても同時に遺伝子解析を行い、母親由来の細胞にはない対立遺伝子が存在する場合に、この対立遺伝子が父親由来の遺伝子であると認定することができる。父親由来の遺伝子が確認された場合、その有核赤血球は胎児由来の有核赤血球であると選別することができる。遺伝子解析を行う母親由来の細胞は、特に限定されないが、母体血中に存在する白血球からのＤＮＡ分析を行うことが好ましい。
【０１０８】
分析する対立遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ（ＳＮＰｓ）：Single Nucleotide Polymorphism）、または、コピー数多型（ＣＮＰ（ＣＮＰｓ）Copy Number Polymorphism），縦列型反復配列（ＳＴＲ：Short Tandem Repeat）を分析することが好ましい。
【０１０９】
胎児の遺伝子は、両親から一対ずつの遺伝子を受け継いでおり、遺伝情報は４種類の塩基の化学物質の配列で記録されている。ヒトの場合には、約30億個の塩基があるが、1000〜2000個に１個の割合で、個人によって異なる配列部分が存在し、これを一塩基多型という。この一塩基多型を分析し、母体由来の細胞である白血球と比較することで、有核赤血球に一塩基多型の配列を確認することができれば、有核赤血球は胎児由来であると確認することができる。
【０１１０】
コピー数多型、縦列型反復配列とは、ＤＮＡの中に、あるＤＮＡ配列が一つの単位となり、このＤＮＡ配列が直列に、繰り返し並んでいる領域があり、この繰り返し領域のことである。胎児は、コピー数多型、縦列型反復配列を父親および母親から引き継ぐため、母体由来の白血球と異なるコピー数多型、縦列型反復配列を有する有核赤血球は胎児由来の有核赤血球であると確認することができる。
【０１１１】
《Ｙ染色体による分析》
胎児が男児である場合、増幅工程により全ゲノム増幅を行った後、Ｙ染色体の存在の有無を確認することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球であるかを確認することができる。
【０１１２】
Ｙ染色体は、男性にしか存在しないため、母体由来の有核赤血球には存在しない。したがって、胎児が男児である場合、Ｙ染色体の存在を確認することができれば、有核赤血球は胎児由来の有核赤血球であると確認することができる。
【０１１３】
［決定工程］
決定工程は、確定工程により確定した胎児由来の有核赤血球のＤＮＡの増幅産物の量を比較することで、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する工程である。
【０１１４】
胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する基準（あるいは参照）として、数的異常を検査する対象染色体以外の染色体を選択し、予め決定された100〜150bpの領域の配列を有するＤＮＡの増幅産物の増幅量をシーケンサーで求める。基準となる染色体（基準染色体）としては、胎児由来の有核赤血球の染色体の数的異常を検査する対象染色体以外の染色体の少なくとも１つを選択する態様、または、母体由来の有核赤血球であると同定された細胞に存在する染色体を選択する態様から選ばれる。本実施形態においては、母体由来の有核赤血球であると同定された細胞に存在する染色体を選択することが好ましい。
【０１１５】
次に、数的異常の検査の対象染色体のＤＮＡの増幅産物の量と、基準染色体のＤＮＡの増幅産物の量との比率により、胎児由来の染色体に数的異常が存在するか決定する。胎児が正常な状態であれば、数的異常を検査する胎児由来の対象染色体のＤＮＡの増幅産物の量と、基準染色体のＤＮＡの増幅産物の量とは、ほぼ、１：１の量比となると予想される。正常であれば２本である染色体が、３本存在するトリソミーである数的異常である場合には、1.0：1.5（あるいは２：３）の比になると予想される。
【０１１６】
また、決定工程に先立って、予め、複数の妊娠母体から採取した、正常な胎児を妊娠した場合の母体由来の染色体のＤＮＡの増幅産物の量に対する胎児由来の染色体のＤＮＡの増幅産物の量の比を複数求めた結果の分布と、トリソミーの胎児を妊娠した母体の、母親由来のＤＮＡの増幅産物の量に対する胎児由来のＤＮＡの増幅産物の量の比を複数求めた結果の分布とを求め、この２つの分布が重ならない領域にカットオフ値を設定しておき、このカットオフ値と、ＤＮＡの増幅産物の量の比を比較して数的異常が存在するかどうかを決定することも可能である。この場合、ＤＮＡの増幅産物の量の比がカットオフ値以下であれば、胎児は正常であり、カットオフ値以上であれば、トリソミーである数的異常であると、検査結果を解釈することができる。
【符号の説明】
【０１１７】
１０  標的細胞識別装置
２０  光源ユニット
２２  光源
２４  フィルタ
３０  撮像ユニット
３２  リング絞り
３４  コンデンサレンズ
３６  テーブル
３８  対物レンズ
４０  位相板
４２  撮像装置
５０  制御ユニット
５２  画像取得部
５４  標的細胞候補選択部
５６  標的細胞輝度比取得部
５８  標的細胞選別部
１００  パーソナルコンピューター
１１０  キーボード
１２０  ディスプレイ
【図１】
2017057077.tif 000003
【図２】
2017057077.tif 000004
【図３】
2017057077.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2017057077.tif 000011
【図１０】
2017057077.tif 000012
【図１１】
2017057077.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】平成30年3月26日(2018.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
しかしながら、母体血中の胎児由来の有核赤血球は、数ｍＬ（１ｍＬ＝１０−６ｍ３）中に１個程度しか存在しない。そのため、母体血中（検体）から胎児由来の有核赤血球（標的細胞）を効率的に識別することが重要となる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
＜選択工程（ステップＳ３）＞
選択工程では、複数の異なる波長の光に対する吸収係数の差に基づいて検体から複数の標的細胞候補を選択する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
複数の異なる波長の光に対する吸収係数の差（第１の波長の光と第２の波長の光とに対するヘモグロビンの吸収係数の差）に基づいて、標的細胞候補である赤血球と、赤血球以外の血球とを区別する。上述したように、第１の波長の光と第２の波長の光とに対するヘモグロビンの吸収係数が異なる。したがって、第１の波長の光を照射した際の赤血球から発生する光と、第２の波長の光を照射した際の赤血球から発生する光との輝度比は大きくなる。一方で、赤血球以外の血球（例えば、白血球）は、ヘモグロビンを有していないので、複数の異なる波長の光に対する赤血球以外の血球から発生する光の輝度比は小さい。赤血球に対する複数の異なる波長の光に対する輝度比が、他の血球の輝度比より大きくなるので、細胞から赤血球と赤血球以外の血球とを容易に区別することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
具体的には、制御ユニット５０は、撮像ユニット３０を制御し、複数の標的細胞候補に対して、画像取得工程（ステップＳ２）で照射した複数の異なる波長の光とは、異なる波長の光を照射して追加の位相差像を取得する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
図１１は、ヒトの赤血球とニワトリの赤血球を共焦点顕微鏡により測定した結果を示すグラフである。横軸に測定の対象を示しており、縦軸に測定の対象の厚みを示している。図１１に示すように、核を有さないヒトの赤血球の周辺部は約０．４９μｍ（４９０ｎｍ）の厚みで、中心部は約０．４７μｍ（４７０ｎｍ）の厚みである。ヒトの赤血球の周辺部と中心部との厚みの差は約２０ｎｍである。一方、ニワトリの赤血球の核（赤血球の中心部に相当）は約１．４１μｍ（１４１０ｎｍ）の厚みであり、ニワトリの赤血球（周辺部に相当）は約０．７８μｍ（７８０ｎｍ）の厚みである。ニワトリの赤血球の周辺部と中心部との厚みの差は約６３０ｎｍである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
本実施形態の標的細胞の識別方法について、検体が母体血であり、標的細胞候補が赤血球であり、標的細胞が有核赤血球であり、非標的細胞が核を有さない赤血球である場合を例示して説明した。しかし、これらに限定されることなく、一般に、末消血などの血液に適用することができ、更には、妊婦の羊水や、臍帯血等、に適用することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
本実施形態で用いるゲノム増幅法としては、取得した細胞から、一般的な方法である界面活性剤を用いた細胞溶解、プロテアーゼＫ等を用いたタンパク質分解工程を経ることで、溶出することにより得られたゲノムＤＮＡを用いる。
【国際調査報告】
2017057077.tif 000014
2017057077.tif 000015
2017057077.tif 000016
2017057077.tif 000017