(57)【要約】  葉たばこを収穫するための栽培に適したタバコ植物体を提供する。本発明は、わき芽の発達を抑制する変異が導入されているタバコ植物体、および当該タバコ植物体の製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）〜（５）のポリペプチド：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（２）配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（３）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（４）配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；ならびに
（５）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方
のいずれかをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されており、
上記機能抑制は、わき芽の発達を抑制する、タバコ植物体。
【請求項２】
上記機能抑制は、上記わき芽のうち、１次わき芽の除去の後に発達する２次わき芽の発達を抑制する、請求項１に記載のタバコ植物体。
【請求項３】
上記機能抑制は、上記２次わき芽の数または重量を、野生株植物と比べて１／２以下に減少させる、請求項２に記載のタバコ植物体。
【請求項４】
上記機能抑制は、野生株植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタバコ植物体。
【請求項５】
上記機能抑制は、野生株植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、請求項４に記載のタバコ植物体。
【請求項６】
上記機能抑制は、野生株植物と比べたときの、上記遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少である、請求項４に記載のタバコ植物体。
【請求項７】
上記機能抑制は、上記遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進である、請求項４に記載のタバコ植物体。
【請求項８】
上記変異は、上記遺伝子に導入されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタバコ植物体。
【請求項９】
上記変異は、自然突然変異、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されている、請求項８に記載のタバコ植物体。
【請求項１０】
上記変異は、上記ｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記遺伝子の存在する領域外への挿入である、請求項７に記載のタバコ植物体。
【請求項１１】
上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、請求項１０に記載のタバコ植物体。
【請求項１２】
ニコチアナ・タバカムまたはニコチアナ・ルスチカに属する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のタバコ植物体。
【請求項１３】
タバコ植物体の製造方法であって、
（１）〜（５）のポリペプチド：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（２）配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（３）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（４）配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；ならびに
（５）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方
のいずれかをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を導入するステップを包含しており、
上記機能抑制は、わき芽の発達を抑制する、製造方法。
【請求項１４】
上記導入するステップにおいて生成される個体から、上記わき芽のうち、１次わき芽の除去の後に発達する２次わき芽の発達が抑制されている個体を選抜するステップをさらに包含している、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
上記選抜するステップにおいて、上記２次わき芽の数または重量が野生株植物と比べて減少している個体を選抜する、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
上記導入するステップは、上記変異を上記遺伝子に導入することを含んでいる、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１７】
上記導入するステップは、自然突然変異、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施される、請求項１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
上記導入するステップは、上記遺伝子から転写されるｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドを、上記遺伝子の存在する領域外に挿入することを含んでいる、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１９】
上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタバコ植物体または請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたタバコ植物体の、子孫または当該タバコ植物体の交配によって得られた育種後代。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタバコ植物体、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたタバコ植物体、または請求項２０に記載の子孫もしくは育種後代から収穫された、葉たばこ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉たばこを収穫するための栽培に適したタバコ植物体およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種子植物は、その生長過程において、種子の胚が発達して子葉および頂端分裂組織（shoot apical meristem）が形成される。上記頂端分裂組織の細胞分裂によって、葉原基（leaf primordium）が次々に形成され、葉原基の向軸側に腋生分裂組織（axillary meristem）が形成される。腋生分裂組織は、それから頂端分裂組織として機能して、わき芽（axillary Bud）になる。植物体の栄養成長時には、わき芽の発達は、通常、一時的に休眠状態にある（抑制されている）。主茎（primary shoot）の頂端分裂組織が、栄養成長状態から生殖成長状態に移行した場合、または死滅した場合に、わき芽の発達は、休眠状態から解放されて、促進される。わき芽の発達について、ナス科植物（例えば、トマトおよびタバコ）、他の植物（例えば、イネおよびシロイヌナズナ）において、複数の研究報告がある。【０００３】
葉を収穫するための栽培植物としてのタバコ植物は、その栽培において、収穫葉の質および量の向上（例えば、収穫葉の、内容成分の蓄積、成熟および展開）を目的として、心止め（花を付けた頂端部の茎の切除）が施される。心止めを施すと、タバコ植物は、葉の付け根（葉腋）などから旺盛にわき芽の発達を開始する。わき芽の発達は、栄養分を当然消費するので、収穫葉に供給される栄養分を相対的に減少させる。よって、わき芽の発達および伸長は、収穫葉の品質および収量の低下につながる。心止めと同様の理由から、心止めから葉の収穫までの間に、わき芽は、除去または発達抑制などの処理を受ける。なお、少なくともタバコ植物において、わき芽をいったん除去しても、同じ葉の付け根から繰り返しわき芽が発達することが知られており、葉たばこ収穫のためのタバコ植物の栽培において、わき芽の処理は、解決すべき大きな問題点である。【０００４】
わき芽を除去する方法としては、手作業または機械による摘み取りが挙げられる。手作業による摘み取りには、莫大な労力（およびこれに伴う人件費の増大）、および低い効率性の問題がある。機械による摘み取りには、手作業に劣る作業の正確さのために植物体を損傷させる問題がある。また、わき芽を発達抑制する方法としては、農薬の使用および遺伝子改変による抑制が挙げられる。農薬の使用には、効果を持続させるための繰り返しの散布、植物体の生育への影響、農薬残留による収穫葉への影響、および残留農薬の検査コストの増大という問題がある。【０００５】
ここで、わき芽の発達に関して、特許文献１、２および非特許文献１〜１９に開示されている。特許文献１および２は、わき芽の発達を抑制するための技術を開示している。【０００６】
以下に非特許文献１〜１９に基づいて、わき芽の原基形成に関する遺伝子について説明する。【０００７】
わき芽の原基形成に関する遺伝子として、タバコ以外の植物から複数の遺伝子について報告がある。代表的な遺伝子として、ＬＡＴＥＲＡＬ  ＳＵＰＰＬＥＳＳＯＲ（ＬＳ）、Ｂｌｉｎｄ（Ｂｌ）、ＲＥＶＯＬＵＴＡ（ＲＥＶ）、ＣＵＰ-ＳＨＡＰＥＤ  ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ（ＣＵＣ）が挙げられる。【０００８】
ＬＳは、シロイヌナズナ（非特許文献１）、トマト（非特許文献２）、イネ（非特許文献３）から単離され、わき芽原基形成に必要な遺伝子であることが報告されている。シロイヌナズナのＬＳ遺伝子の変異体では、茎性葉のわき芽は正常であるが、上位２枚以外のロゼッタ葉にはわき芽がほとんどみられなくなった（非特許文献１）。トマトのＬＳ遺伝子の変異体では栄養生長期（vegetative stage）のわき芽がなくなるが、生殖生長期（reproductive stage）には上位２か所のわき芽が形成された（非特許文献２）。イネのＬＳ遺伝子の変異体（ｍｏｃ１）では栄養生長期（tillering stage）、生殖生長（heading stage）のどちらにおいても、イネのわき芽に相当する分げつ（tiller）は全くみられなかった（非特許文献３）。タバコにおいては、ＬＳオルソログ遺伝子と推定されたｃＤＮＡ配列は公開されている（アクセッション番号：ＥＵ０９３５５８１.１）が、タバコにおいて当該遺伝子の機能については確認されていない。【０００９】
Ｂｌはシロイヌナズナ（非特許文献４および５）、トマト（非特許文献６）から遺伝子が単離されている。トマトでは１遺伝子の変異体によって、摘心した場合でも葉位に因らず、わき芽がほとんど形成されなかった（非特許文献６および７）。シロイヌナズナには、Ｂｌオルソログとして少なくとも機能重複した３遺伝子（ＲＥＧＵＬＡＴＯＲ  ＯＦ  ＡＸＩＬＬＡＲＹ  ＭＥＲＩＳＴＥＭ（ＲＡＸ）１、２および３）が報告されている。ＲＡＸ１単独変異体でも抑制はみられるが、３重変異体ではロゼッタ葉にわき芽がほとんど形成されず、茎性葉のわき芽も大きく低減した（非特許文献４および５）。ＲＡＸ１単独変異体では、主茎切除の後にも、わき芽形成がみられなかった下位のロゼッタ葉から、わき芽の発達（outgrowth）はみられなかった。シロイヌナズナのＲＡＸ遺伝子配列、ならびにブドウおよびトマトのゲノム配列から推定した推定アミノ酸配列の相同性の比較から、シロイヌナズナのＲＡＸ１のトマトのオルソログ遺伝子は、Ｂｌｉｎｄ以外にＣ遺伝子があることが推定された。しかし、Ｃ遺伝子は、わき芽形成ではなく、葉の形態形成に関与する遺伝子であった（非特許文献８）。タバコでは、Ｂｌオルソログ遺伝子と推定されるｃＤＮＡ配列の報告はないが、トマトＢｌのアミノ酸配列と９３％同一なＥＳＴ配列が公開されている（アクセッション番号：ＦＳ４０２９４０.１）。しかし、タバコにおけるその遺伝子の機能は、報告されていない。【００１０】
ＲＥＶは、シロイヌナズナから遺伝子が単離され（非特許文献１０および１１）、ＲＥＶの変異体は、ロゼッタ葉および茎性葉の両方においてわき芽原基の形成が低下し、摘心（decapitation）によってわき芽原基形成の促進がみられなかった（非特許文献９、１０および１２）。タバコでは、ＲＥＶオルソログ遺伝子と推定されるｃＤＮＡ配列は報告されていないが、シロイヌナズナＲＥＶとアミノ酸レベルで７９％同一なＥＳＴ配列（アクセッション番号：ＦＧ１３５７７８.１）が公開されている。また、ＲＥＶオルソログ遺伝子と推定されたタバコ（品種：ＳＲ−１）の全長ｃＤＮＡ配列が公開されている（アクセッション番号：JQ686937）。しかし、タバコにおけるＲＥＶと相同性が高い遺伝子の機能は、報告されていない。【００１１】
ＣＵＣは、シロイヌナズナから３遺伝子（ＣＵＣ１、２および３）が単離され(非特許文献１６〜１８)、ＣＵＣ１と２はともに茎頂分裂組織の調節に機能しており、機能的に重複している（非特許文献１５）。ＣＵＣ３遺伝子単独の変異体においてロゼッタ葉のわき芽の形成抑制がみられるが、ＣＵＣ２および３の二重変異体ではわき芽抑制程度が大きくなった（非特許文献１３および１４）。タバコにおいてはＣＵＣオルソログ遺伝子と推定されるｃＤＮＡ配列は報告されていないが、シロイヌナズナのＣＵＣ１遺伝子の保存ドメインであるＮＡＭドメイン配列のアミノ酸配列と８１％同一なＥＳＴ配列（ＦＧ６４４０７８.１）が公開されている。また、ラフマ（Ａｐｏｃｙｎｕｍ  ｖｅｎｅｔｕｍ）のＣＵＣ３と推定した配列を用いたＲＮＡｉ組換えタバコにおいて、タバコの何らかの遺伝子（配列が非公開）の発現が抑制され、シロイヌナズナのＣＵＣ変異体と類似した葉の形態異常が観察されたことが報告されている（非特許文献１９）。しかし、タバコにおいてＣＵＣと相同性の高い遺伝子の機能については明らかではなく、少なくとも、わき芽に対する機能についての報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０２４９５１８（２００９年１０月１日公開）
【特許文献２】国際公開第２０１０／０８１９１７号パンフレット（２０１０年７月２２日公開）
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Greb T, Clarenz O, Schafer E, Muller D, Herrero R, Schmitz G, Theres K (2003) Molecular analysis of the LATERAL SUPPRESSOR gene in Arabidopsis reveals a conserved control mechanism for axillary meristem formation. Genes Dev. 17: 1175-1187
【非特許文献２】Schumacher K, Schmitt T, Rossberg M, Schmitz G, Theres K (1999) The Lateral suppressor (Ls) gene of tomato encodes a new member of the VHIIDprotein family. Proc Natl Acad Sci USA 96: 290-295
【非特許文献３】Xueyong L, Qian Q, Zhiming F, Yonghong W, Guosheng X, Dali Z, Xiaoqun W, Xinfang L, Sheng T, Fujimoto H, Ming Y, Da L, Bin H & Jiayang L (2003) Control of tillering in rice. Nature 402(10):618-621
【非特許文献４】Keller, T., Abbott, J., Moritz, T., and Doerner, P (2006) Arabidopsis  REGULATOR OF AXILLARY MERISTEMS1 controls a leaf axil stem cell nicheand modulates vegetative development. The Plant Cell 18: 598-611
【非特許文献５】Muller D, Schmitz G, Theres K (2006) Blind homologous R2R3 Myb genes control the pattern of lateral meristem initiation in Arabidopsis. The Plant Cell 18: 586-597
【非特許文献６】Schmitz G, Tillman E, Carriero F, Fiore C, Cellini F, TheresK (2002) The tomato Blind gene encodes a MYB transcription factor that controlsthe formation of lateral meristems. Proc Natl Acad Sci USA 99: 1064-1069
【非特許文献７】Mapelli SC, Lombardi L (1982) A comparative auxin and cytokinin study in normal and to-2 mutant tomato plants. Plant Cell Physiol. 23: 751-757
【非特許文献８】Busch BL, Schmitz G, Rossmann S, Piron F, Ding J, BendahmaneA, Theres K (2011) Shoot branching and leaf dissection in totamto are regulatedby homologous gene modules. The Plant Cell 23: 3595-3609
【非特許文献９】Talbert PB, Adler HT, Parks DW, Comai L (1995) The REVOLUTA gene is necessary for apical meristem development and for limiting cell divisions in the leaves and stems of Arabidopsis thaliana. Development 121: 2723-2735.
【非特許文献１０】Otsuga D, DeGuzman B, Prigge MJ, Drews GN, Clark SE (2001) REVOLUTA regulates meristem initiation at lateral positions. The Plant Journal 25: 223-236
【非特許文献１１】Zhong R, Ye ZH (1999) IFL1, a gene regulating interfascicular fiber differentiation in Arabiodpsis, encodes a homeodomain-leucine zipper protein. The Plant Cell 11: 2139-2152
【非特許文献１２】Zhong R, Taylor JJ, Ye ZH (1997) Disruption of interfascicular fiber differentiation in an Arabidopsis mutant. The Plant Cell 9: 2159- 2170
【非特許文献１３】Hibara K, Karim MR, Takada S, Taoka K, Furutani M, Aida M, Tasaka M (2006) Arabidopsis CUP-SHAPED COTYLEDON3 regulates postembryonic shootmeristem and organ boundary formation. The Plant Cell 18: 2946-2957
【非特許文献１４】Raman, S., Greb, T., Peaucelle, A., Blein, T., Laufs, P. and Theres, K (2008)  Interplay of miR164, CUP-SHAPED COTYLEDON genes and LATERALSUPPRESSOR controls axillary meristem formation in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 55: 65-76
【非特許文献１５】Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., and Tasaka, M (2001) The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development 128: 1127-1135
【非特許文献１６】Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, and Tasaka M (1997) Genes lnvolved in Organ Separation in Arabidopsis: An Analysis of the cup-shaped cotyledon Mutant. The Plant Cell 9: 841-857
【非特許文献１７】Takada S, Hibara K, Ishida T, and Tasaka M (2001) The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation. Development 128: 1127-1135
【非特許文献１８】Vroemen CW, Mordhorst AP, Albrecht C, Kwaaitaal MA, de Vries SC (2003) The CUP-SHAPED COTYLEDON3 gene is required for boundary and shoot meristem formation in Arabidopsis. The Plant Cell 15(7): 1563-77
【非特許文献１９】Sun J, Jia H, Wang X, Yuan X and Zhao B (2012) Inhibition of tobacco axillary bud differentiation by silencing CUP-SHAPED COTYLEDON 3 Afr. J. Biotech 11(16): 3929-3927
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかし、上述の文献から知り得るのは、タバコ植物以外においてわき芽を低減させ得ることに過ぎない。よって、わき芽の発達に基づく問題を解消または軽減した、葉たばこを収穫するために栽培されるタバコ植物が、どのようにすれば得られるか否かは、不明である。【００１５】
本発明の課題は、葉たばこを収穫するための栽培に適したタバコ植物体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題に鑑みて、タバコ植物においてわき芽発達に関与すると予想される遺伝子を同定し、当該遺伝子から発現されるタンパク質の、タバコ植物体における存在量を減少させた場合に得られる有利な影響を探索した結果として、本発明を完成するに至った。【００１７】
すなわち、本発明に係るタバコ植物体は、上記課題を解決するために、（１）〜（５）のポリペプチド：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（２）配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（３）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（４）配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；ならびに
（５）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方
のいずれかをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されており、
上記機能抑制は、わき芽の発達を抑制することを特徴としている。【００１８】
本発明に係るタバコ植物体の製造方法は、上記課題を解決するために、（１）〜（５）のポリペプチド：
（１）〜（５）のポリペプチド：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（２）配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（３）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（４）配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；ならびに
（５）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方
のいずれかをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を導入するステップを包含しており、
上記機能抑制は、わき芽の発達を抑制することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、わき芽発達の選択的な抑制が可能であるため、葉たばこを収穫するための栽培に適したタバコ植物体を提供できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施例に係るＮｔＲＥＶ遺伝子の発現抑制の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例に係るＮｔＢｌ１遺伝子の発現抑制の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例に係るＮｔＬＳ遺伝子の発現抑制の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例に係る＃１５３６０遺伝子の発現抑制の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例に係る＃０７４３７遺伝子の発現抑制の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例に係るＮｔＲＥＶ遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例に係るＮｔＬＳ遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図８】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍによって、ＮｔＢｌ１遺伝子に変異を導入するために使用したベクターの構成を示す模式図である。
【図９】本発明の実施例に係るＮｔＢｌ１遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例に係るＮｔＢｌ１遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例に係るＮｔＢｌ１遺伝子またはＮｔＬＳ遺伝子に導入した変異の、わき芽の発達位置に対する影響を確認した図である。
【図１２】本発明の実施例に係るＮｔＢｌ１遺伝子に導入した変異の、タバコ植物の生育に対する影響を確認した図である。
【図１３】本発明の実施例に係るＮｔＬＳ遺伝子に導入した変異の、タバコ植物の生育に対する影響を確認した図である。
【図１４】ＮｔＲＥＶ遺伝子に導入した変異の、タバコ植物の生育に対する影響を確認した図である。
【図１５】ＬＳ遺伝子に導入した変異の、タバコ植物の生育に対する影響を確認した図である。
【図１６】ＬＳ遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図１７】ＲＥＶ遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図１８】ＬＳ遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図１９】ＲＥＶ遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図２０】ＲＥＶ遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図２１】＃１５３６０に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図２２】Ｂｌ１遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図２３】Ｂｌ１遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図２４】Ｂｌ１遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図２５】ＬＳ遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【図２６】ＬＳ遺伝子に導入した変異の、わき芽発達に対する影響を確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
〔１．タバコ植物体〕
１つの局面において、本発明は、特定のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されているタバコ植物体を提供する。ここで、当該機能抑制は、わき芽の発達を抑制する。
【００２２】
特定の上記ポリペプチドの具体例は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；ならびに配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方、のいずれかである。
【００２３】
上記タバコ植物体は、後述の実施例に示す通り、１次わき芽の数もしくは重量において野生型と実質的な差異を示さないが、１次わき芽を除去した後に生じるわき芽（２次わき芽および３次わき芽）の数もしくは重量な大幅な減少（例えば、野生株植物の１／２以下）を示すか、または１次わき芽を除去した後にさらなるわき芽を生じない。したがって、本発明に係るタバコ植物体からわき芽を除去する作業は、ほぼ１回で完了するので、葉たばこを収穫するためのタバコ植物体の栽培における従来のわき芽処理と比較して、数分の１以下の労力で済む。
【００２４】
上述の通り、従来技術の文献には、タバコ植物以外において、わき芽の発達が全体的に抑制されることのみが開示されている。しかし、以下の述べる理由から、わき芽の発達を全体的に抑制することは、必ずしも利点のみを有するわけではない。わき芽の発達能は、種子植物にとって、個体の健全さを維持するために重要な機能である。例えば、生長中の組織が損傷を受けた場合に、わき芽がこれらに代わって生長を開始することによって、個体は、自身の生存を図っている。よって、この機能を全体的に損なうことによって、個体の健全性にリスクを負わせることが、必然的に予想される。実際に非特許文献９（Fig. 1のlegend）には、植物体の成長を部分的に衰えさせることが言及されている。また、わき芽を完全に消失した個体は、風水害などによって損傷を受けた場合に、高い死滅のリスクを有している。したがって、葉たばこ生産を考えると、わき芽の発達は、場合によって重要な意味を有している。生育途中に主茎が損傷した場合、下位節のわき芽を、主茎の代わりに伸長および発達させることによって、葉たばこ生産量を確保することができる。
【００２５】
本明細書に使用される場合、「タバコ植物体」および「タバコ」は、個体全体（例えば、成体、苗および種子）、組織（例えば、葉、茎、花、根、生殖器官、胚およびこれらの一部など）、およびこれらの乾燥物を包含している。
【００２６】
本明細書に使用される場合、「わき芽（axillary bud）」は、葉原基（leaf primordium）の葉腋（leaf axil）部に形成される腋生分裂組織（axillary meristem）から生じる、芽（bud）および当該芽が発達したシュートの両方を指す。わき芽は、心止め後において、１次わき芽（primary axillary bud）、２次わき芽（secondary axillary bud）および３次わき芽（tertiary axillary bud）の順にしたがって、同じ葉の付け根に発達する。まず、心止め後に、１次わき芽が発達し、１次わき芽を除去すると、続いて２次わき芽が発達する。わき芽の「発達」は、上記腋生分裂組織から分化した状態に留まっていたわき芽が、茎頂の除去などによって活発な活動を始め、生長および伸長することを意味する。
【００２７】
わき芽の「数または重量」は、１個体における発達したわき芽の数または採取したわき芽の総質量（新鮮重量）を意味し、１次わき芽、２次わき芽または３次わき芽にも適用される。
【００２８】
本明細書に使用される場合、「（アミノ酸配列の）配列同一性」は、基準となる（アミノ酸）配列に対して、言及されている（アミノ酸）配列が一致している割合を意味する。ここで、配列の一致していない部分は、（アミノ酸残基の）置換、付加、欠失または挿入が存在している部分である。
【００２９】
ここで、配列表に記載したアミノ酸配列を用いてポリペプチドを特定する記載「〜に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド」は、野生型ポリペプチドを意味する。当該野生型ポリペプチドは、後述のタバコ属植物に通常存在しているポリペプチドを意味する。
【００３０】
したがって、本発明に係るタバコ植物体において存在量の減少している上記特定のポリペプチドは、配列表に示したそれぞれのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドであればよく、当該配列同一性は、より高い割合（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上）であることが好ましい。
【００３１】
ポリペプチドの「存在量の減少」は、野生型ポリペプチドの存在量を基準にして、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の当該ポリペプチドの存在を意味する。上記野生型ポリペプチドの存在量を基準にした上記ポリペプチドの存在量は、２次わき芽の数または重量の減少を結果としてもたらす上述の値から、適宜選択され得る。
【００３２】
なお、本発明に係るタバコ植物体における上述のポリペプチドの存在量の減少は、当該タバコ植物体から得られる、培養細胞、カルス、プロトプラスト、種子、および子孫において、遺伝的に安定して受け継がれていることが好ましい。したがって、本発明に係るタバコ植物体は、人為的な操作を介して生成された培養細胞、カルス、プロトプラスト、種子、および子孫から発生した個体であり得、当該個体を得るためのこれらの材料は、本発明の範囲に包含される。
【００３３】
本発明に係るタバコ植物体は、交配によって得られた育種後代をさらに包含し得る。イネ、コムギ、オオムギ、ダイズをはじめ、多くの植物種で変異体を用いた育種が行われている。例えば、変異原で処理した変異体集団から単離した変異体の場合、目的の遺伝子以外にも多数の変異を有している。そのため一般的には、余分な変異を除くために戻し交雑を行う。この時、優良形質を持つ栽培品種と交配することにより、変異体の持つ形質を栽培品種に導入することで、より高付加価値を持つ栽培品種を得ることができる。変異体の持つ形質は変異に由来するため、戻し交雑を進めるためには、変異を持つ個体を選抜することが必要である。効率的な戻し交雑を進めるためには、変異の有無と変異がホモ接合型かヘテロ接合型かを簡便に検出する方法が必要である。この方法は後述する変異を検出する方法を用いて行うことができる。加えて、変異体と栽培品種間で多型を示すバックグラウンドマーカーを用いてＭＡＳ（Marker Assisted Selection）を行うことにより、栽培品種への戻り率が高い系統を少ない交雑回数で効率的に得ることができる。多形マーカーとしては、タバコで公知のＳＮＰ、ＳＳＲ（Simple Sequence Repeat）を利用することができる。必要であれば、用いるタバコのゲノム配列を解読して塩基配列の違い、反復配列数の違いを特定することにより、新たに多形マーカーを獲得、利用できる。
【００３４】
本明細書に使用される場合、「遺伝子の機能抑制」は、ゲノム上にある遺伝子が本来の機能を発揮しない状態を意味する。したがって、「遺伝子の機能抑制」は、「遺伝子の破壊」、「遺伝子の変異」および当該遺伝子以外（外来遺伝子を包含する）による当該「遺伝子の発現抑制」を包含する用語である。
【００３５】
以下の説明において、遺伝子およびゲノムに関して、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）を基準にして説明する。以下の説明における基準であるＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）は、複二倍体であり、祖先種であるＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ由来のゲノム（Ｓゲノム）およびＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノム（Ｔゲノム）の両方を有する。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍにおいて、同一の名称によって表される遺伝子は、多くの場合、各ゲノムにそれぞれ存在している、二倍体であるため、当該遺伝子は、Ｓゲノムに２つ、Ｔゲノムに２つの対立遺伝子を有している。つまり、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍのゲノム上には、同一の名称によって表される遺伝子が４つ存在している場合が多い。
【００３６】
なお、タバコ植物体について、種間において実質的に同じ機能を果たすタンパク質をコードする遺伝子の一部（すべてではない）の、コード領域における塩基配列は、栽培品種間に１〜数％、栽培品種および近縁野生種の間に約１０％以下の差異を有し得る。
【００３７】
「遺伝子の破壊」は、ゲノム上に本来ある遺伝子が存在しないこと、またはゲノム上にある遺伝子から転写産物が生成されないことを意味する。「遺伝子の変異」は、本来の機能的なタンパク質が生成されない遺伝子の変異、タンパク質が生成されるものの、生成される量が低下する遺伝子の変異、またはタンパク質が生成されるものの、タンパク質の安定性が低下する遺伝子の変異を意味している。「遺伝子の発現抑制」は、当該遺伝子には変化を生じていないが、遺伝子の機能（ｍＲＮＡへの転写からそれに続くタンパク質への翻訳まで）が他の因子を介して修飾されて、タンパク質の生成量が低下しているか、またはタンパク質の生成が生じていない状態を意味する。「遺伝子の発現抑制」は、例えば、当該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの分解によって生じ得る。
【００３８】
本明細書に使用される場合、「変異」は、本願の技術分野において通常に理解される通りの意味を有しており、例えば、野生型のゲノム上にある塩基、または野生型タンパク質にあるアミノ酸残基の変化（例えば、置換、欠失、挿入、付加、重複または逆位など）を意味する。ゲノム上にある塩基の変化は、以上の例に加えて、複数の塩基の転座を包含している。
【００３９】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７または１９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドは、野生株植物に存在するポリペプチド（またはそのバリアント）である。したがって、本発明に係るタバコ植物体は、上記ポリペプチドの存在量が野生株植物と比べて減少しているので、野生株植物の有している上記機能と比べて劣っている。当該機能は、例えば、野生株植物における、腋生分裂組織を形成する機能、腋生分裂組織からわき芽に分化する機能、またはわき芽の発達能を維持するか、もしくは向上させる機能である。
【００４０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号２に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。配列番号３に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号４に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。これらのポリヌクレオチドは、後述の実施例に示されているＮｔＲＥＶ遺伝子のｃＤＮＡに該当し、配列番号２は、ＳゲノムのＮｔＲＥＶ遺伝子のｃＤＮＡ配列を、配列番号４は、ＴゲノムのＮｔＲＥＶ遺伝子のｃＤＮＡ配列をそれぞれ示している。配列番号２１および２２はそれぞれ、ＮｔＲＥＶ遺伝子のＳゲノムおよびＴゲノムにおける塩基配列を示している。配列番号５４および５５はそれぞれ、ＮｔＲＥＶ遺伝子（５’上流および３’下流を含む）の、ＳゲノムおよびＴゲノムにおける塩基配列を示している。
【００４１】
配列番号５に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号６に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。配列番号７に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号８に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。これらのポリヌクレオチドは、後述の実施例に示されているＮｔＬＳ遺伝子のｃＤＮＡに該当し、配列番号６は、ＳゲノムのＮｔＬＳ遺伝子のｃＤＮＡ配列を、配列番号８は、ＴゲノムのＮｔＬＳ遺伝子のｃＤＮＡ配列をそれぞれ示している。配列番号２３および２４はそれぞれ、ＮｔＬＳ遺伝子のＳゲノムおよびＴゲノムにおける塩基配列を示している。配列番号５６および５７はそれぞれ、ＮｔＬＳ遺伝子（５’上流および３’下流を含む）の、ＳゲノムおよびＴゲノムにおける塩基配列を示している。
【００４２】
配列番号９に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号１０に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号１２に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。これらのポリヌクレオチドは、後述の実施例に示されているＮｔＢｌ１遺伝子のｃＤＮＡに該当し、配列番号１０は、ＳゲノムのＮｔＢｌ１遺伝子のｃＤＮＡ配列を、配列番号１２は、ＴゲノムのＮｔＢｌ１遺伝子のｃＤＮＡ配列をそれぞれ示している。配列番号２５および２６はそれぞれ、ＮｔＢｌ１遺伝子のＳゲノムおよびＴゲノムにおける塩基配列を示している。配列番号５８〜６１はそれぞれ、ＮｔＢｌ１遺伝子（５’上流および３’下流を含む）の、ＳゲノムおよびＴゲノムにおける塩基配列を示している。
【００４３】
配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号１４に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号１６に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。これらのポリヌクレオチドは、後述の実施例に示されている＃１５３６０のｃＤＮＡに該当し、配列番号１４は、Ｓゲノムの＃１５３６０のｃＤＮＡ配列を、配列番号１６は、Ｔゲノムの＃１５３６０のｃＤＮＡ配列をそれぞれ示している。配列番号２７および２８はそれぞれ、＃１５３６０のＳゲノムおよびＴゲノムにおける塩基配列を示している。配列番号６２および６３はそれぞれ、＃１５３６０（５’上流および３’下流を含む）の、ＳゲノムおよびＴゲノムにおける塩基配列を示している。
【００４４】
配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号１８に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号２０に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。これらのポリヌクレオチドは、後述の実施例に示されている＃０７４３７のｃＤＮＡに該当し、配列番号１８は、Ｓゲノムの＃０７４３７のｃＤＮＡ配列を、配列番号２０は、Ｔゲノムの＃０７４３７のｃＤＮＡ配列をそれぞれ示している。配列番号２９および３０はそれぞれ、＃０７４３７のＳゲノムおよびＴゲノムにおける塩基配列を示している。
【００４５】
なお、上記＃０７４３７遺伝子は、配列相同性からＣＵＣに分類される遺伝子と考えられる。ＣＵＣ遺伝子は、シロイヌナズナではＣＵＣ１〜３の３遺伝子が報告されており、変異体の表現型は単独の変異より複数の変異を集積した方が大きな影響を示すことも知られている。当該ファミリー遺伝子として、我々はタバコから＃０７４３７以外に５種の遺伝子を単離した。よって、これらのファミリー遺伝子は＃０７４３７と集積して利用することにより、より大きな効果を発揮することが期待される。
【００４６】
本発明のタバコ植物体において、特定の上記ポリペプチドの存在量が減少していることが好ましい。詳細には、当該存在量は、上記野生型ポリペプチドをコードする遺伝子の、変異もしくは破壊、または発現抑制を介して減少している。
【００４７】
上記遺伝子の変異または破壊は、例えば、自然突然変異、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトの結果として生じている。上記遺伝子の自然突然変異は、複製エラーおよび遺伝子の損傷によって一般的に生じる。当該損傷の原因は、天然に存在するか、もしくは人工的に生成された後に自然環境に留まっている公知の変異原（例えば、放射線、紫外線もしくは変異誘導物質（例えばＥＭＳなど））への暴露などである。上記遺伝子の変異原処理は、上記変異原をタバコ植物体に対して人為的に作用させること（および必要に応じて遺伝子修復機能の抑制との組合せ）によって、実施され得る。上記遺伝子の組換えは、公知の遺伝子組換え手法にしたがって、標的遺伝子の一部または全部を組換え配列によって相同的に組み換えることによって実施され得る。上記遺伝子のゲノム編集は、公知の技術（例えば、zinc-finger nucleases：ＺＦＮ、transcription activator-like effector nucleases：ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍなど）によって実施され得る。上記遺伝子ノックアウトは、公知のトランスポザーゼを利用した遺伝子の転移、またはＴ−ＤＮＡの挿入によって、実施され得る。
【００４８】
上述の通り、タバコ植物体は、２組の遺伝子をＴゲノムおよびＳゲノムに有している場合が多い。よって、当該遺伝子の機能を完全に消失させるためには、ＴゲノムおよびＳゲノムにあるすべての遺伝子（４つ）の機能を欠損させる必要がある。しかし、遺伝子量効果（dosage effect）を示す場合、ＴゲノムおよびＳゲノムの機能を欠損しなくても、上記遺伝子の機能は抑制され得る。
【００４９】
置換によって機能を欠損する場合、プロモーター配列（コード領域を基準にして上流（５’側）にある配列、および下流（３’側）にある配列が挙げられる）、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域、イントロンの両端にある保存配列（５’ＧＴ−ＡＧ３’）、ならびにコード領域の少なくとも１つに、当該置換は存在し得る。プロモーター配列、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域にある遺伝子発現活性調節に重要な塩基配列に置換が生じることにより、その遺伝子の転写活性や安定性による転写産物量が低下し、タンパク質の量が低下することが想定される。イントロンの保存配列に置換が生じた場合には、スプライシングが正常に起こらずに、イントロンを付加した形で翻訳されることになる。そのため、フレームシフトにより、本来とは異なったアミノ酸配列を持つタンパク質が翻訳されることが想定される。コード領域に置換が生じた場合の一例として、アミノ酸をコードしないストップコドンへの置換（ナンセンス変異）により、Ｃ末端側が短くなった不完全な長さのタンパク質が翻訳されることで機能が欠損することが想定される。ナンセンス変異の挿入位置は完全長のタンパク質ができない位置であればよいが、数アミノ酸以上が短くなることが好ましい。
【００５０】
もう一つにはアミノ酸配列が置換されることにより、タンパク質の機能が低下することが想定される。アミノ酸配列の置換により、立体構造の変化、活性機能に重要なアミノ酸が活性を有さないアミノ酸に変化よって引き起こされることが想定される。非保存的置換（non-conservative substitutions）は、機能低下を生じやすいことから、アミノ酸置換として好ましい。非保存的置換としては、電荷または疎水性が異なるアミノ酸への置換（例えば、塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸、極性アミノ酸から非極性アミノ酸への置換）、及びアミノ酸の側鎖のかさ（立体的な大きさ）が異なるアミノ酸への置換などが挙げられる。
【００５１】
欠失、挿入などの置換以外の変異の場合、プロモーター配列、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域内に生じたのであれば、置換と同様の転写活性や安定性の低下による転写産物量の低減、タンパク質の量の低減が想定される。イントロンの保存配列でも、置換と同様、本来とは異なったアミノ酸配列を持つタンパク質が翻訳されることが想定される。コード領域に生じた場合には、アミノ酸残基の欠失もしくは挿入（３の倍数の、連続する塩基の欠失または挿入によって生じる）、またはフレームシフトにより本来とは異なったアミノ酸配列を持つタンパク質が翻訳されることが想定される。また、その遺伝子全体を含む大きな欠失や大断片の挿入の場合、その遺伝子の発現自体がなくなることも想定される。
【００５２】
上記遺伝子の変異または破壊の結果として生じた個体は、本明細書においてタバコ植物体の変異体（単に変異体と記載する）と呼ばれる。上記変異体は、ＳゲノムおよびＴゲノムのいずれかに上述の変異を有し得、ＳゲノムおよびＴゲノムの両方に上述の変異を有していることが好ましい。なお、機能を欠損させるための変異は１遺伝子に１種の変異を有しても良いし、複数の変異を有していても良く、変異の種類は問わない。ＳゲノムおよびＴゲノムのそれぞれに２ずつある計４つの遺伝子の変異は、同じでも良いし、異なっていても良い。
【００５３】
上記遺伝子の発現抑制は、当該遺伝子からｍＲＮＡへの転写の抑制、当該遺伝子からｍＲＮＡを介したタンパク質への翻訳の抑制（例えば、当該ｍＲＮＡの分解）、および翻訳されたタンパク質の機能の抑制を包含している。転写の抑制は、上記遺伝子からの転写を促進する転写因子の阻害、および転写開始因子の上記遺伝子へのアクセス阻害などによって実現され得る。翻訳の抑制は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子、または共抑制分子を用いて実現され得る。タンパク質の機能の抑制は、機能的なタンパク質との結合によって当該タンパク質の機能を阻害する分子（例えば、デコイ核酸、リボザイム、抗体および阻害ペプチド）によって実現され得る。
【００５４】
以上において説明した種々の変異は、例えば以下に示す各遺伝子の公知のゲノム配列、および配列番号５４〜６３に示す各遺伝子のゲノム配列を参照した当業者によって、タバコ植物体に対して容易に導入され得る。すなわち、これらの配列情報に基づいて、本発明の概念に包含される種々のタバコ植物体のゲノムに存在する、変異を導入すべき領域が適宜決定され得る。
ＮｔＲＥＶ：（Ｓゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession # Ntab-K326_AWOJ-SS17907、および（Ｔゲノム）SOL accession # Ntab-K326_AWOJ-SS9429
ＮｔＬＳ：（Ｓゲノム）SOL accession # Ntab-K326_AWOJ-SS1238、および（Ｔゲノム）SOL accession # Ntab-K326_AWOJ-SS5309
ＮｔＢｌ１：（Ｓゲノム）SOL accession # Ntab-K326_AWOJ-SS18396、および（Ｔゲノム）SOL accession # Ntab-K326_AWOJ-SS12956
＃１５３６０：（Ｓゲノム）SOL accession # Ntab-K326_AWOJ-SS587および（Ｔゲノム）SOL accession # Ntab-K326_AWOJ-SS20471
＃０７４３７：（Ｓゲノム）SOL accession # Ntab-K326_AWOJ-SS943、ならびに（Ｔゲノム）GeneBank accession # AYMY01348769.1、AWOK01667329.1およびASAG01052465.1。
【００５５】
上述の抑制（転写、翻訳およびタンパク質機能）は、例えば、当該抑制を実現するための分子を植物体に直接に導入することか、または目的の遺伝子を挿入したベクターを用いた植物体の形質転換を介して当該分子を植物体に発現させることによって、実現され得る。植物体の形質転換において、上記分子を発現させるための目的の遺伝子は、上記植物体のゲノムの任意の領域に組み込まれていればよく、ＳゲノムおよびＴゲノムの両方に必ずしも組み込まれていなくてもよい。
【００５６】
上記タバコ植物体は、タバコ属植物であれば特に限定されず、タバコ属植物としては、タバコ（Nicotiana）属に属する植物であれば特に限定されず、例えば、ニコチアナ・アカウリス（Nicotiana acaulis）、ニコチアナ・アカミナタ（Nicotiana acuminata）、ニコチアナ・アカミナタ・ヴァリエーション・ムルツユロラ（Nicotiana acuminata var. multzjlora）、ニコチアナ・アフリカナ（Nicotiana africana）、ニコチアナ・アラタ（Nicotiana alata）、ニコチアナ・アンプレクシカウリス（Nicotiana amplexicaulis）、ニコチアナ・アレンツィイ（Nicotiana arentsii）、ニコチアナ・アテヌアタ（Nicotiana attenuata）、ニコチアナ・ベナビデシイ（Nicotiana benavidesii）、ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）、ニコチアナ・ビゲロビイ（Nicotiana bigelovii）、ニコチアナ・ボナリエンシス（Nicotiana bonariensis）、ニコチアナ・カビコラ（Nicotiana cavicola）、ニコチアナ・クレベランディイ（Nicotiana clevelandii）、ニコチアナ・コルディフォリア（Nicotiana cordifolia）、ニコチアナ・コリンボサ（Nicotiana corymbosa）、ニコチアナ・デブネイ（Nicotiana debneyi）、ニコチアナ・エクセルシオール（Nicotiana excelsior）、ニコチアナ・フォゲッチアナ（Nicotiana forgetiana）、ニコチアナ・フラグランス（Nicotiana fragrans）、ニコチアナ・グラウカ（Nicotiana glauca）、ニコチアナ・グルチノサ（Nicotiana glutinosa），ニコチアナ・グッドスピーディイ（Nicotiana goodspeedii）、ニコチアナ・ゴセイ（Nicotiana gossei）、ニコチアナ・イングルバ（Nicotiana ingulba）、ニコチアナ・カワカミイ（Nicotiana kawakamii）、ニコチアナ・ナイチアナ（Nicotiana knightiana）、ニコチアナ・ラングスドルフィ（Nicotiana langsdorfi）、ニコチアナ・リニアリス（Nicotiana linearis）、ニコチアナ・ロンギフロラ（Nicotiana longiflora）、ニコチアナ・マリチマ（Nicotiana maritima）、ニコチアナ・メガロシフォン（Nicotiana megalosiphon）、ニコチアナ・ミエルシイ（Nicotiana miersii）、ニコチアナ・ノクチフロラ（Nicotiana noctiflora）、ニコチアナ・ヌディカウリス（Nicotiana nudicaulis）、ニコチアナ・オブツシフォリア（Nicotiana obtusifolia）、ニコチアナ・オクシデンタリス（Nicotiana occidentalis）、ニコチアナ・オクシデンタリス・サブスピーシーズ・ヘスペリス（Nicotiana occidentalis subsp. Hesperis）、ニコチアナ・オトフォラ（Nicotiana otophora）、ニコチアナ・パニクラタ（Nicotiana paniculata）、ニコチアナ・パウクツユロラ（Nicotiana pauczjlora）、ニコチアナ・ペチュニオイデス（Nicotiana petunioides）、ニコチアナ・プランバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）、ニコチアナ・クアドリヴァルヴィス（Nicotiana quadrivalvis）、ニコチアナ・レイモンディイ（Nicotiana raimondii）、ニコチアナ・レパンダ（Nicotiana repanda）、ニコチアナ・ロズラタ（Nicotiana rosulata）、ニコチアナ・ロズラタ・サブスピーシーズ・イングルバ（Nicotiana rosulata subsp. Ingulba）、ニコチアナ・ロツンディフォリア（Nicotiana rotundifolia）、ニコチアナ・ルスチカ（Nicotiana rustica）（マルバタバコ）、ニコチアナ・セッチェルリイ（Nicotiana setchellii）、ニコチアナ・シムランス（Nicotiana simulans），ニコチアナ・ソラニフォリア（Nicotiana solanifolia）、ニコチアナ・スペガウイニイ（Nicotiana spegauinii）、ニコチアナ・ストックトニイ（Nicotiana stocktonii）、ニコチアナ・スアヴェオレンス（Nicotiana suaveolens）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・チルシフロラ（Nicotiana thyrsiflora）、ニコチアナ・トメントサ（Nicotiana tomentosa）、ニコチアナ・トメントシフォミス（Nicotiana tomentosifomis）、ニコチアナ・トリゴノフィラ（Nicotiana trigonophylla）、ニコチアナ・アンブラティカ（Nicotiana umbratica）、ニコチアナ・アンドゥラタ（Nicotiana undulata）、ニコチアナ・ベルンチナ（Nicotiana velutina）、ニコチアナ・ウィガンディオイデス（Nicotiana wigandioides）、およびタバコ属植物のハイブリッドなどが挙げられる。中でもニコチアナ・ベンサミアナ、ニコチアナ・ルスチカおよびニコチアナ・タバカムがより好ましく、葉たばこ生産の原料として用いられるニコチアナ・ルスチカおよびニコチアナ・タバカムが特に好ましい。
【００５７】
上述の作用に加えてさらに、本発明に係るタバコ植物体は、１次わき芽の位置が葉の付け根からずれるので、葉を傷つけることなく当該わき芽を除去可能という、実際の栽培現場において有用であり得る。この有用性に関して、本発明に係るタバコ植物体は、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド；ならびに
配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド
のいずれかをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されており、上記機能抑制は、わき芽の発達を抑制することが好ましい。また、後述の実施例に示す通り、本発明に係るタバコ植物体は、ＮｔＢｌ１およびＮｔＬＳに変異を導入した変異体であることが特に好ましい。
【００５８】
〔２．タバコ植物体の製造方法〕
１つの局面において、本発明は、上述のタバコ植物体の製造方法を提供する。上記製造方法は、上述した特定のポリペプチドのいずれかをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を導入するステップを包含している。
【００５９】
上記導入するステップは結果として、当該変異によって引き起こされる上記遺伝子の機能抑制を介して、わき芽の発達を抑制する。上記遺伝子の機能抑制を介した、わき芽の発達を抑制することの概要については、上述の通りである。よって、上記ステップを実施するための具体例として、ベクターを用いたタバコ植物体の形質転換を介した遺伝子の発現抑制および遺伝子への変異の導入を挙げて以下に説明する。
【００６０】
遺伝子の発現抑制または遺伝子への変異の導入を目的としたタバコ植物の形質転換に使用されるベクターとしては、ベクター内に挿入されたポリヌクレオチドを植物細胞内で発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。当該ベクターとしては、例えば、アグロバクテリウムを介して植物細胞に目的のポリヌクレオチドを導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、およびｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられる。特に、バイナリーベクター系（ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１、およびｐＰＺＰ２０２など）のプラスミドが好ましい。
【００６１】
遺伝子の発現抑制をＲＮＡｉによって実現する場合、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制するために使用されるトリガー配列が、上記ベクターに挿入される。当該トリガー配列は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７もしくは１９に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１〜１％の置換を有し得る）の一部、または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８もしくは２０を有しているポリヌクレオチド（０．１〜１％の置換を有し得る）の一部である、連続する少なくとも２１〜３０塩基（例えば、２１塩基以上、２２塩基以上、２３塩基以上、２４塩基以上、２５塩基以上、２６塩基以上、２７塩基以上、２８塩基以上、２９塩基以上、および３０塩基以上）の塩基配列に示されるポリヌクレオチド（センスＲＮＡ部分）、ならびに当該ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列に示されるポリヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ部分）である。上述の「連続する少なくとも２１〜３０塩基」の塩基配列は、より詳細には、連続する２１塩基以上、２３塩基以上、２５塩基以上、３０塩基以上、３５塩基以上、４０塩基以上、４５塩基以上、５０塩基以上、６０塩基以上、７０塩基以上、８０塩基以上、９０塩基以上、または１００塩基以上の塩基配列を意味する。
【００６２】
上述の通り、本発明に係るタバコ植物体における遺伝子の発現抑制は、遺伝的に受け継がれていることが好ましい。したがって、上記トリガー配列は、上記タバコ植物体のゲノムに組み込まれていることが好ましい。
【００６３】
タバコ植物体の遺伝子に対する変異の導入は、公知のゲノム編集技術によって実現され得る。当該ゲノム編集技術としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍでは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質が、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮでは、融合タンパク質（ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼが融合されている）が、標的細胞内に存在すれば、ゲノム編集可能である。したがって、上記ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質、ならびに上記融合タンパク質はいずれも、標的細胞に直接的に導入され得る。これらを標的細胞に直接的に導入する方法としては、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、およびパーティクルボンバードメント法などが挙げられる。
【００６４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍでは、ゲノム上のＸＧＧのすぐ上流にある塩基配列の相補的な配列が、ガイドＲＮＡの一部と塩基対を形成し、当該塩基配列内において２本鎖のゲノムＤＮＡがＣａｓ９によって切断を受ける。当該塩基配列は、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７もしくは１９に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１〜１％の置換を有し得る）、または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８もしくは２０を有しているポリヌクレオチド（０．１〜１％の置換を有し得る）の一部のうち、ＸＧＧのすぐ上流にある連続する１０塩基以上（例えば、１５塩基以上、好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１８塩基以上、より一層好ましくは１９塩基以上、最も好ましくは２０塩基以上）である。
【００６５】
ＴＡＬＥＮでは、二量体を形成する人工ヌクレアーゼの一対のＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５〜２０塩基のスペーサを介して存在する塩基配列と結合する。当該塩基配列は、２本鎖ゲノムＤＮＡの一方の鎖および他方の鎖に存在し、したがって、上記一対のＤＮＡ結合ドメインの一方は当該一方の鎖に、他方は、当該他方の鎖に結合する。当該ＤＮＡ結合ドメインは、３３〜３４アミノ酸残基を繰り返し単位（モジュール）として、結合する塩基数と対応する数のモジュールから構成されている。ＤＮＡ結合ドメインによって結合される塩基配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７もしくは１９に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１〜１％の置換を有し得る）、または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８もしくは２０を有しているポリヌクレオチド（０．１〜１％の置換を有し得る）ならびに当該ポリヌクレオチドと相補鎖を形成するポリヌクレオチドの一部のうち、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５〜２０塩基のスペーサを介して存在する、それぞれ連続する６塩基以上、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１８塩基以上である。
【００６６】
ＺＦＮでは、ＴＡＬＥＮと同様に、二量体を形成する人工ヌクレアーゼの一対のＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５〜２０塩基のスペーサを介して存在する塩基配列と結合する。当該ＤＮＡ結合ドメインは、複数のジンクフィンガーモジュールから構成されている。当該塩基配列は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７もしくは１９に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１〜１％の置換を有し得る）、または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８もしくは２０を有しているポリヌクレオチド（０．１〜１％の置換を有し得る）ならびに当該ポリヌクレオチドと相補鎖を形成するポリヌクレオチドの一部のうち、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５〜２０塩基のスペーサを介して存在する、それぞれ連続する９塩基以上、好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１８塩基以上である。
【００６７】
以上のＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮについての説明のそれぞれは、全項目の記載にしたがって、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７もしくは１９に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドを、当該ポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有している、タバコ属に含まれている他の種に存在する相同分子種のポリペプチドと読み替え可能である。また、同様にして、前段落の記載は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８もしくは２０を有しているポリヌクレオチドを、当該ポリヌクレオチドと９０％以上の配列同一性を有している、タバコ属に含まれている他の種に存在する相同遺伝子のポリヌクレオチドと読み替え可能である。
【００６８】
上述の通り、本発明に係るタバコ植物体に導入された、遺伝子の変異は、遺伝的に受け継がれていることが好ましい。しかし、ゲノム編集のためにタバコ植物体に導入された外因性のポリヌクレオチドは、所望の変異がタバコ植物体に導入されたことを確認した後に当該タバコ植物体から排除されることが好ましい。上記外因性のポリヌクレオチドがタバコ植物体に維持されていると、所望されない変異が導入され（続け）ることによって、所望の形質（例えば、２次わき芽の抑制）が失われたり、タバコ植物体の生存を脅かすおそれがあるためである。
【００６９】
タバコ植物体の遺伝子に対する変異の導入は、他の生物工学的な手法（例えば、トランスポゾンまたはアグロバクテリウムを利用した手法）によって実施され得る。当該手法の具体例は、タバコのレトロトランスポゾンｔｎｔ１もしくは他の植物におけるトランスポゾン、またはアグロバクテリウムのＴ１プラスミドにおけるＴ−ＤＮＡをタバコ植物体に導入する方法である。
【００７０】
代替的に、タバコ植物体の遺伝子に対する変異の導入は、他の手法（タバコ植物体の変異原処理）によって実施され得る。変異源の例としては、小分子の化合物（例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、N-エチル-N-ニトロソウレア（ＥＮＵ）、アジ化ナトリウムなど）、および放射線（例えば、γ線、重イオンビーム、Ｘ線、中性子線、紫外線など）が挙げられる。
【００７１】
変異は、再生可能な任意のタバコ植物体に導入され得る。当該タバコ植物体の例は、種子、根、葉、花、生殖器官または胚であり、好ましくは種子である。
【００７２】
以上の手法によって得られるのは、種々の変異を有している（または変異を有していない）植物体の変異体集団であり得る。したがって、当該変異体集団から、所望の表現型を示す個体がさらに選抜され得る。個体を選抜することの例として、変異原を用いて処理した場合に得られる変異体集団（パネル）から所望の個体を選抜する手順を説明する。
【００７３】
Ｔゲノム、Ｓゲノム両方の合計４個の遺伝子に変異を有した機能欠損したタバコ変異体は、例えば、以下の方法で獲得できる。上述のようにタバコを変異原で処理し、タバコゲノム全体に変異を生じさせたタバコの変異体集団（パネル）を作製し、ゲノムＤＮＡを抽出する。Ｓゲノム、Ｔゲノムそれぞれの遺伝子特異的プライマーを利用して、パネルのゲノムＤＮＡから標的遺伝子（ポリヌクレオチド）を増幅し、その産物の塩基配列を決定し、ホモ接合型の変異を有する系統を選抜する。まず、Ｓゲノム、Ｔゲノムそれぞれにホモ接合型変異を有する系統（Ｍ２）を取得し、それらを交配したＦ１を作製する。さらにその自殖後代（Ｆ２）を育成し、その中からＳ、Ｔ両ゲノムともホモ接合型の変異を有する系統を取得する（二因子劣性のため１／１６の確率で得られる）。
【００７４】
本発明に係るタバコ植物体の製造方法は、上記生成するステップにおいて生成されたタバコ植物体から、１次わき芽の除去の後に発達する、２次わき芽の数または重量が、上記野生株植物と比べて１／２以下に減少している個体を選抜するステップをさらに包含している。上記選抜するステップは、例えば、上述した特定のポリペプチドをコードする遺伝子の破壊、変異または発現抑制に基づいて実施される。
【００７５】
遺伝子の変異または破壊は、当該遺伝子における変異の有無の検出によって決定され得る。遺伝子における変異を検出する方法としては、（１）市販のシーケンサー等を利用して、ＤＮＡ塩基配列を直接解読する方法、（２）ＳＳＣＰ（Single Strand ConformationPolymorphism）法を用いて配列に違いを電気泳動の距離の違いで検出する方法、（３）
ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ法を用いて、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism）を検出する方法、（４）Ｔ７  ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＩなどを用いてミスマッチ部位を切断することにより変異の有無を検出する方法、（５）制限酵素処理による切断の有無から変異の有無が判別できるＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法、（６）意図的にミスマッチを含むプライマーセットを用いることにより、制限酵素による切断の有無から変異の有無が判別できるｄＣＡＰＳ（derived CAPS）法、（７）変異配列に特異的にハイブリダイズするプローブを用いてプローブがハイブリダイズされたか否かを検出することにより変異の有無を判別する方法（ＴａｑＭａｎプローブを用いたＰＣＲ法、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ解析法）、（８）欠失や挿入の場合には、電気泳動の移動度の差から変異を検出方法などがあるが、変異の有無が判別できる方法であればよい。代替的に、遺伝子の変異または破壊は、遺伝子の改変の結果として生じるタンパク質、または野生型タンパク質の発現量の検出（例えば、ウェスタンブロット）によって決定され得る。
【００７６】
上述の変異を導入するステップに先立って、発現抑制する遺伝子および／または変異を導入する遺伝子を決定するために、以下に示す手順（１および２）が、必要に応じて実施される。
【００７７】
１．わき芽の発達を制御すると推定されるタバコ遺伝子の単離
わき芽を制御する可能性がある遺伝子は、他植物における先行技術文献（例えば、遺伝子とわき芽の関係が確認された非特許文献）から選択し、その遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の同一性を指標に、タバコから遺伝子を獲得することができる。例えば、公知のデータベースに登録されている配列に対して、ｂｌａｓｔ（Basic Local Alignment Search Tool）による検索を行うことで、公知のタバコ遺伝子ないしは、タバコに近縁な植物種の遺伝子（例えば、トマト）の塩基配列、アミノ酸配列を入手することができる。公知の配列が部分長であった場合、既知の配列情報を利用して、一般的な方法、例えば、ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング、Ｒａｃｅ（Rapid amplification of cDNA ends）法により、全長ｃＤＮＡを入手することができる。
【００７８】
新規にわき芽を制御する可能性がある遺伝子は、例えば、標的とする組織や処理により発現する遺伝子を選抜することにより得ることができる。標的とする組織や処理は以下に挙げる情報を基に選択することができる。わき芽の原基形成に関与する遺伝子は、わき芽原基の形成に先立って発現し、わき芽原基の維持や生長に関する遺伝子はわき芽原基で発現することが知られている（例えば、ＬＳ、Ｂｌｉｎｄ遺伝子）。わき芽の休眠や発達に関与する遺伝子は休眠、脱休眠わき芽で発現が増減することが知られている（例えばＢＲＡＮＣＨＥＤ１）。また、いくつかの植物ホルモンがわき芽の制御に関与していることが知られている。オーキシンが頂芽優勢に、ストリゴラクトンがわき芽の発達抑制に、サイトカイニンがわき芽の伸長に、アブシジン酸が休眠に関与している。
【００７９】
わき芽の発達を制御する可能性のある遺伝子の新たな選抜は、発現特異性を利用した一般的な方法によって実施され得る。当該方法としては、例えば、（１）ｃＤＮＡの塩基配列から遺伝子発現プロファイリングデータを取得する方法、および対象組織で発現する遺伝子のｃＤＮＡライブラリーを作製して末端配列をシーケンスする方法や、制限酵素断片を直列につないでシーケンスするＳＡＧＥ（Serial Analysis of Gene Expression）法などが挙げられる。（２）ディファレンシャルハイブリダイゼーションにより遺伝子発現プロファイリングデータを取得する方法。マクロアレイ、ＤＮＡチップが良く知られている。（３）ディファレンシャルディスプレイ法により複数のサンプル間で発現レベルの異なる遺伝子（Differentially Expressed Genes：DEGs）を得ることができる。ＰＣＲ増幅断片の量を比較する方法が挙げられる。
【００８０】
単離した遺伝子の増幅
ポリヌクレオチドの増幅はＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法で行うことができるが、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法やＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法などで行ってもよい。
【００８１】
ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーは、Ｓゲノム、Ｔゲノムの遺伝子が混在するタバコゲノムから、各ゲノムの目的遺伝子を特異的に増幅することができるプライマーであればよい。目的遺伝子を特異的に増幅できるのであれば、１またはそれ以上の置換、欠失、挿入、付加を含んでいてもよい。また、プライマーは必要に応じて蛍光物質、放射線等で標識されていてもよい。
【００８２】
増幅の鋳型として使用するゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行えばよく、市販の抽出キットを用いても良い。ゲノムＤＮＡは簡易抽出した粗精製物であっても、精製工程を経た精製物でもよい。
【００８３】
２．わき芽の発達に関与すると推定される遺伝子の同定
対象とする遺伝子の発現や機能を抑制した組換え体及び変異体を作製し、温室、人工気象室、網室或いは圃場で栽培することにより、遺伝子の効果を確認することができる。発生するわき芽の数や重量を、対照と比較することにより、わき芽の発生、発達に対する効果が確認できる。わき芽の数や重量は心止めを行わないで行ってもよいが、好ましくは心止めにより脱休眠させてわき芽の発達を促進させて行う。わき芽の数や重量の調査はいずれかの時期に1度行ってもよいし、複数回行ってもよい。１回の計測では１次わき芽については評価できるが、２次わき芽、３次わき芽の評価には適さないため、複数回行うことが好ましい。２次わき芽、３次わき芽に対する効果を確認するためには、それぞれ１次わき芽、２次わき芽を除去することが好ましい。１次わき芽、２次わき芽の除去はそれぞれのわき芽が発達後のいつ行ってもよいが、取り残しがないようにする必要がある。わき芽の茎の伸長が確認された時期に除去することが好ましい。複数回調査する場合は、間隔を置いて、１次わき芽、２次わき芽、３次わき芽に分けて調査することが好ましい。例えば、週に１回、１次わき芽、２次わき芽、３次わき芽ごとに対象となるわき芽の数を数え、それらを採取して重量を調査する方法で行うことができる。
【００８４】
調査は特定のわき芽（例えば２次芽）だけに着目して行ってもよいし、数だけ、重量だけに絞って別々に行ってもよい。その場合、回数、間隔はそれぞれの調査に適した方法で行うことが好ましい。
【００８５】
〔３．タバコ植物体における２次わき芽を選択的に抑制する方法〕
一局面において、本発明は、タバコ植物体における２次わき芽を選択的に抑制する方法を提供する。２次わき芽の選択的な抑制は、タバコ植物体における、上述した特定のポリペプチドのいずれかをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を導入することによって生じる。ここで、当該機能抑制は、わき芽の発達を抑制する。つまり、本発明の一局面におけるタバコ植物体は、当該機能抑制を生じており、本発明の他の局面におけるタバコ植物体の製造方法は、その製造過程において、当該機能抑制をタバコ植物体に生じさせる。したがって、当該機能抑制を、タバコ植物体において生じさせる方法の詳細については、タバコ植物体およびその製造方法に関するこれまでの項目を参照すればよい。
【００８６】
以上の各実施形態をまとめると、本発明は、以下のように要約され得る。
【００８７】
すなわち、（１）〜（５）のポリペプチド：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（２）配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（３）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（４）配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；ならびに
（５）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方
のいずれかをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されており、
上記機能抑制は、わき芽の発達を抑制する、タバコ植物体。
【００８８】
上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、上記わき芽のうち、１次わき芽の除去の後に発達する２次わき芽の発達を抑制することが好ましい。
【００８９】
上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、上記２次わき芽の数または重量を、野生株植物と比べて１／２以下に減少させることが好ましい。
【００９０】
上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、野生株植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少であることが好ましい。
【００９１】
上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、野生株植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少であることが好ましい。
【００９２】
上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、野生株植物と比べたときの、上記遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少であることが好ましい。
【００９３】
上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、上記遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進であることが好ましい。
【００９４】
上記植物体において、上記変異は、上記遺伝子に導入されていることが好ましい。
【００９５】
上記タバコ植物体において、上記変異は、自然突然変異、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されていることが好ましい。
【００９６】
上記タバコ植物体において、上記変異は、上記ｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記遺伝子の存在する領域外への挿入であることが好ましい。
【００９７】
上記タバコ植物体において、上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子であることが好ましい。
【００９８】
上記タバコ植物体は、ニコチアナ・タバカムまたはニコチアナ・ルスチカに属することが好ましい。
【００９９】
タバコ植物体の製造方法であって、
（１）〜（５）のポリペプチド：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（２）配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（３）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（４）配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；ならびに
（５）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方
のいずれかをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を導入するステップを包含しており、
上記機能抑制は、わき芽の発達を抑制する、製造方法。
【０１００】
上記製造方法において、上記導入するステップにおいて生成される個体から、上記わき芽のうち、１次わき芽の除去の後に発達する２次わき芽の発達が抑制されている個体を選抜するステップをさらに包含していることが好ましい。
【０１０１】
上記製造方法において、上記選抜するステップにおいて、上記２次わき芽の数または重量が野生株植物と比べて減少している個体を選抜することが好ましい。
【０１０２】
上記製造方法において、上記導入するステップは、上記変異を上記遺伝子に導入することを含んでいることが好ましい。
【０１０３】
上記製造方法において、上記導入するステップは、自然突然変異、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施されることが好ましい。
【０１０４】
上記製造方法において、上記導入するステップは、上記遺伝子から転写されるｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドを、上記遺伝子の存在する領域外に挿入することを含んでいることが好ましい。
【０１０５】
上記製造方法において、上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子であることが好ましい。
【０１０６】
上記タバコ植物体または製造方法によって得られたタバコ植物体の、子孫または当該タバコ植物体の交配によって得られた育種後代。
【０１０７】
上記タバコ植物体、上記製造方法によって得られたタバコ植物体、または上記子孫もしくは育種後代から収穫された、葉たばこ。
【０１０８】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【０１０９】
〔１．タバコ植物におけるわき芽発達に関与する候補遺伝子〕
他の植物におけるわき芽発達に関与する複数の遺伝子（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のRevolutla（ＲＥＶ）、トマトのLateral suppressor（ＬＳ）およびトマトのBlind（Ｂｌ））のタバコオルソログの候補（以下、単に候補群Ａと記載する）を、Basic Local Alignment Search Tool（blast）解析によって決定した。一方で、タバコ植物においてわき芽発達に関与する遺伝子の候補（以下、単に候補群Ｂと記載する）を、トランスクリプトーム解析によって決定した。それぞれの解析および解析の結果に基づいて得られた遺伝子について以下に説明する。【０１１０】
（１−１．候補群Ａ）
（ａ）blast解析
シロイヌナズナのＲＥＶ遺伝子のアミノ酸配列をクエリとして、NCBIのウェブページ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）においてｔｂｌａｓｔｎを行った結果、８０％の高いアミノ酸配列同一性を有しているトマトのＲＥＶホモログ遺伝子配列を得た。トマトのＲＥＶホモログ遺伝子のアミノ酸配列をクエリとして、ｃＤＮＡライブラリー（つくば１号の葉、茎頂および根の混合物に由来）のＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）解析結果に対するｔｂｌａｓｔｎを行って、タバコの推定ＲＥＶ  ｃＤＮＡクローン群を選抜した。【０１１１】
トマトのＬＳ遺伝子と８７％のアミノ酸配列同一性を有しているタバコのｃＤＮＡ配列が、公開されているＤＢに登録されていた（アクセッション番号：ＥＵ９３５５８１）。さらに、ＥＵ９３５５８１と高い同一性を有しているタバコＥＳＴ配列（アクセッション番号：ＡＭ８４８５８４）が、公開されているＤＢに登録されていた。【０１１２】
トマトのＢｌ遺伝子のアミノ酸配列をクエリとして、ｃＤＮＡライブラリー（つくば１号の葉、茎頂および根の混合物に由来）のＥＳＴ解析結果に対してｔｂｌａｓｔｎを行って、タバコの推定Ｂｌクローン群を選抜した。【０１１３】
（ｂ）個体由来のゲノムＤＮＡ断片およびｃＤＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ由来）の調製
ゲノムＤＮＡ断片を、簡易抽出法またはＣＴＡＢ法にしたがって、タバコ（つくば１号またはPetit Havana SR-1（SR-1））の葉から抽出した。ＣＴＡＢ法は、公知の手法なので詳述を省く。簡易抽出法を次の手順の通りに行った。０．３〜０．５ｍｌの抽出バッファー（０．２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．４ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ）に入れた葉片を、破砕装置（マルチビーズショッカー（安井器械）またはシェイクマスターネオ（バイオメディカルサイエンス）など）を用いて摩砕（２５００ｒｐｍ、１分間）した。摩砕後の懸濁物から上澄を取り、エタノール沈殿によって上澄からゲノムＤＮＡ断片を精製した。【０１１４】
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを次のように抽出した。RNAlater（Ａｍｂｉｏｎ）にタバコの茎頂、芽生えおよびわき芽のそれぞれをを浸漬し、冷凍保存した。その後サンプルを融解させ、これに２０μｌの１ＭのＤＴＴを加えた０．５ｍｌのＲＴＬバッファー（QIAGEN）を加えた。混合物を、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて摩砕（２５００ｒｐｍ、１分間）した。摩砕後の懸濁物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）することによって得た上澄から、マグトレーション（プレジションシステムサイエンス）またはRNeasy Kit（QIAGEN）を用いて、DNaseありの条件においてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。【０１１５】
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、以下のキットのいずれかを用いて、各キットに添付のマニュアルにしたがって、ｃＤＮＡを調製した。
・PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ）
・PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser（タカラバイオ）。【０１１６】
（ｃ）候補群Ａの遺伝子の生成
（ｂ）において得られたｃＤＮＡを鋳型として用いたＲＴ−ＰＣＲによって、３遺伝子を増幅させた。PrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ）を酵素として用いた場合、反応条件を以下のように設定した。
９４℃で３０秒
９８℃で１０秒、５５℃で５秒および７２℃で１０秒＊を１サイクルとして、３０〜４０サイクル
７２℃で１０秒
＊７２℃の伸長反応は、増幅断片の長さ１ｋｂにつき１０秒に設定した。【０１１７】
Tks Gflex DNA Polymerase（タカラバイオ）と酵素として用いた場合、反応条件を以下のように設定した。
９４℃で３０秒
９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、６８℃で６０秒＊を１サイクルとして３０〜４０サイクル
６８℃で６０秒
＊６８℃の伸長反応は、増幅断片の長さ１ｋｂにつき６０秒に設定した。【０１１８】
ＲＴ−ＰＣＲ用の対象遺伝子およびプライマーの組合せを、以下に示す。
（セット１：ＮｔＬＳ、Ｔゲノム、つくば１号の芽生え）
ＬＳ＿Ｔｏｍ＿Ｆ１：AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC、およびＮｔＬＳ＿ｑＲＶ１：ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAATの組合せ
ＬＳ２＿Ｆ２：ACACCTAATGCATCATCTAATGTT、およびＬＳ＿Ｓｙｌ＿Ｒ１：CAAATAAAGATTAAGTTCAGGATCTGの組合せ
（セット２：ＮｔＬＳ、Ｓゲノム、つくば１号の芽生え）
ＬＳ＿Ｆ２＿ｓｅｑ：ATTTCCCCTCCTCCATCATTG、およびＮｔＬＳ＿ｑＲＶ１：ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAATの組合せ
ＬＳ１＿Ｆ２：CTTGACACCATCTAATGTTGTTG、およびＬＳ＿Ｔｏｍ＿Ｒ１：CAAATAAAGATTAAGTTCAGGATCTGの組合せ
（セット３：ＮｔＲＥＶ、Ｔゲノム、つくば１号の芽生え）
ＲＥＶ＿ＲＴ＿Ｆ２：AAGCTGTTTGCAGGGAATATATC、およびＧ０５３３３０＿ＲＶ３：TCTCTGGCTAAATGTTCGAAGの組合せ
ＲＥＶ＿ＲＴ＿Ｆ３：GTAAGTTGTGAGTCTGTGGTAACTAC、およびＲＥＶ＿ＲＴ＿Ｒ１：GGAAACAAACATCTGCACTCAAの組合せ
（セット４：ＮｔＢｌ、Ｓゲノム、つくば１号の芽生え）
Ｂｌ１＿Ｆ１ｓｅｑ２：GTCCATCTGTCTATATAGGTAGAATG、およびＢｌ１−２＿ＲＴ＿Ｒ１： TGAATCTTCTTGGCAACCCCCの組合せ
（セット５：ＮｔＲＥＶ、Ｓゲノム、ＳＲ−１のわき芽）
Ns_in0_F1：TTGTTTGGGATTTTGGGGTTTGAGGG、およびREV_S_R1：AATTGTATGGCCAAGTGGCATTATTATCTGA
REV_S_F1：CACTTCCGTTCCTCTTTCACCGCTG、およびNtREV_S_RV1：TCCGTTCAACTGTGTTCCTGG
（セット６：ＮｔＲＥＶ、Ｔゲノム、ＳＲ−１のわき芽）
REV_RT_F2：AAGCTGTTTGCAGGGAATATATC、およびNtREV1_RV1：TCCGTTCAACTGTGTTCCTG
（セット７：ＮｔＬＳ、Ｓゲノム、ＳＲ−１のわき芽）
LS_Tom_F1：AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC、およびLS_Tom_R1：CAAATAAAGATTAAGTTCAGGATCTGの組合せ
（セット８：ＮｔＬＳ、Ｔゲノム、ＳＲ−１のわき芽）
LS_Tom_F1：AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC、およびLS2-F2compR：AACATTAGATGATGCATTAGGTGTの組合せ
LS2-F2：ACACCTAATGCATCATCTAATGTT、およびLS_Syl_R1：TTGGCCTCTAATTAAATAGACTGATAの組合せ。【０１１９】
また、（ｂ）において得られたゲノムＤＮＡ断片を鋳型として用いたゲノムＰＣＲによって、３遺伝子を増幅させた。使用した酵素および酵素に対応する反応条件は、上述のＲＴ−ＰＣＲと同様であるので、対象遺伝子およびプライマーの組合せを以下に示す。
（セット１：ＮｔＲＥＶ、Ｓゲノム、つくば１号の葉）
REV_F3：TCTCAAAGCTGGCTGTTTTATGTAT、およびREV_R14：TACCATTCTCCAGGGTGGTTGTGTATの組合せ
Ns_in4_F1：GAAAATTCAGTATTGCCATGTC、およびG053330_RV2：GCAAAAACTAGTTCAGAACAの組合せ
NtREV_TrFW2：CACCGCCTATGTAGCTTCGTCAATG、および
NtREV_RT-R1：GGAAACAAACATCTGCACTCAAの組合せ
（セット２：ＮｔＲＥＶ、Ｔゲノム、つくば１号の葉）
REV_F3：TCTCAAAGCTGGCTGTTTTATGTAT、およびREV_R14：TACCATTCTCCAGGGTGGTTGTGTATの組合せ
Nt_in4_F1：AAAAAAATTCAGTATTGCCACGTGC、およびG053330_RV2：GCAAAAACTAGTTCAGAACAの組合せ
NtREV_TrFW2：CACCGCCTATGTAGCTTCGTCAATG、およびNtREV_RT-R1：GGAAACAAACATCTGCACTCAAの組合せ
（セット３：ＮｔＬＳ、Ｓゲノム、つくば１号の葉）
LS_F1_seq：AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC、およびLS_TRV_R3：TCGCTTGATTAGCAGTCAGCの組合せ
LS_F1_seq：AGGTTCTTCTTCCTTAATATTGAGTC、およびNtLS_QPCR_RV1：ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT
LS_TRV_F3：CACCGAAGAAACTGATGATCAACGG、およびLS_TRV_R2：GAAGACCTCTTTGTCCTTCACCATGCAGの組合せ
（セット４：ＮｔＬＳ、Ｔゲノム、つくば１号の葉）
LS_F2_seq：ATTTCCCCTCCTCCATCATTG、およびNtLS_QPCR_RV1：ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAATの組合せ
LS_TRV_F3：CACCGAAGAAACTGATGATCAACGG、およびLS_TRV_R2：GAAGACCTCTTTGTCCTTCACCATGCAGの組合せ
（セット５：ＮｔＢｌ１、Ｓゲノム、つくば１号およびＳＲ−１の葉）
Bl1_F1seq2：GTCCATCTGTCTATATAGGTAGAATG、およびBl1_R1seq：CACCATGTTTGATATTAGGCCTTAの組合せ
Bl1_F3seq2：TGATGAGATTTATGTTGGGAACTG、およびBl1_R2seq：TCTCATCATTGAACACGAACATACTの組合せ
（セット６：ＮｔＢｌ１、Ｔゲノム、つくば１号およびＳＲ−１の葉）
Bl1_F1seq1：CCACTTGTCTATATAGCAAGAAAGA、およびBl1_R1seq：CACCATGTTTGATATTAGGCCTTAの組合せ
Bl1_F2seq：CTAAGGCCTAATATCAAACATGGT、およびBl1_R2seq：TCTCATCATTGAACACGAACATACTの組合せ。【０１２０】
（ｄ）得られた遺伝子の配列決定
上記３遺伝子を増幅させたＰＣＲ産物のそれぞれを、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing Kit（ライフテクノロジー）を用いてクローニングした。なお、当該ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動およびMiniEluteカラム（QIAGEN）を組み合わせた一般的な手法によって、必要に応じて、クローニング前に精製した。クローニングした遺伝子のそれぞれの塩基配列を、BigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI）を用いて、キャピラリーシーケンサー3730xl DNA Analyzer（ABI）にかけて決定した（配列番号２１〜３０）。【０１２１】
（１−２．候補群Ｂ）
植物体の葉原基において発現が向上していると予想される遺伝子を同定するために、以下のようにトランスクリプトーム解析を行った。【０１２２】
（ａ）ＲＮＡ抽出サンプルの調製
播種から４〜５週間後のタバコ苗（品種：ＳＲ−１）から得た茎頂部を包埋したパラフィン塊を作製した（詳細は、Takahashi H, Kamakura H, Sato Y, Shiono K, Abiko T, Tsutsumi N, Nagamura Y, Nishizawa NK, Nakazono M. (2010) A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. J Plant Res 123: 807-813を参照）。当該パラフィン塊を、ミクロトーム（RM2125 RTS；ライカ）を用いて、厚さ２０μｍの連続切片にした。当該連続切片から、Shoot ApicalMeristem（SAM）の中心部およびその周辺を含んでいる切片を選んだ。当該切片から、Applied Biosystems（登録商標） ArcturusXT（商標）レーザキャプチャーマイクロダイセ
クションシステムを用いて、わき芽原基が未形成の葉原基の付け根（わき芽原基サンプル）、葉原基および茎頂分裂組織の下部（対照サンプル）を、直径１００〜２００μｍの大きさにそれぞれ切り出した。わき芽原基サンプルおよび対照サンプルのそれぞれを、CapSure（登録商標） LCM Cap（アプライドバイオシステム）に回収し、ＲＮＡ抽出用のチューブに移してＲＮＡ抽出まで−８０℃において凍結保存した。【０１２３】
（ｂ）ＲＮＡ精製
PicoPure RNA isolation Kit（Arcturus）を用いて、キットに添付のマニュアルにしたがって、（ａ）のＲＮＡ抽出サンプルから、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを精製した。バイオアナライザー（アジレントテクノロジー）を用いて、精製されたＲＮＡ溶液の、ＲＮＡ濃度を推定し、かつ品質（ＲＮＡの分解程度）を確認した。【０１２４】
（ｃ）次世代シーケンサ（454 Genome Sequnecer Titanium、Roche）を用いた塩基配列決定および遺伝子発現量の予測
（ｂ）において得られたＲＮＡをタカラバイオに送り、当該ＲＮＡからの、シーケンサ解析に用いるｃＤＮＡライブラリの作製を、同社に依頼した。そのｃＤＮＡライブラリに含まれているｃＤＮＡの５’末端部分の塩基配列解析を株式会社ジナリスに委託した。塩基配列の決定において、ｃＤＮＡライブラリが由来する植物の部分ごとに、３／４プレート分をシーケンサにかけた。各部分ごとに得られた全配列情報を用いたde novoアッセンブリー解析によって、アッセンブル配列を取得した。取得したアッセンブル配列に、各部分に由来するｃＤＮＡライブラリから得られたリード配列をマッピング（アラインメント）させ、各部分ごとに、各遺伝子に対応するリード数を集計した。集計したリード数を、各部分に由来するｃＤＮＡライブラリ間において正規化した上で、当該リード数に基づいて、各部分ごとに全遺伝子の発現量を予測した。【０１２５】
（ｄ）候補群Ｂの決定
わき芽原基サンプル（上述の（ａ）参照）において、２００塩基以上の配列データがあり、わき芽原基サンプルのリード数が４以上で対照サンプルより１０倍以上の発現量を有している遺伝子を、わき芽原基形成に関与する１次候補遺伝子として選択した。わき芽原基形成といった器官形成を制御するマスタースイッチとなる遺伝子は、複数の遺伝子発現を制御する転写因子であると推測される。よって、１次発現特性で選択された候補遺伝子から、転写因子をコードする可能性が高い遺伝子をさらに絞り込むことによって、２次候補遺伝子を選抜した。これら遺伝子の発現抑制がタバコにおけるわき芽の発達を抑制するかどうかを確認し、最終的に候補群Ｂ（２遺伝子）を決定した。【０１２６】
（ｅ）２遺伝子の全長配列およびｃＤＮＡ配列の生成
次世代シーケンス解析結果から、リード配列をアッセンブルすることによって、コンセンサス配列「isogroup15360」および「isogroup07437」を得た。これらのコンセンサス配列を用いたＲａｃｅ、ＲＴ−ＰＣＲおよびゲノムＰＣＲによって、上記２遺伝子の全長配列およびｃＤＮＡ配列を生成させた。【０１２７】
１−１．の（ｂ）の記載にしたがって調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用い、かつSMARTer RACE cDNA Amplification Kit（クローンテック）を用いて、キットに添付のマニュアルにしたがって、Ｒａｃｅを実施した。Ｒａｃｅのｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲには、３００倍希釈した１ｓｔ  ＰＣＲ産物を鋳型として使用した。Ｒａｃｅにおける反応条件を以下のように設定した。
（１ｓｔ  ＰＣＲ）
９８℃で１０秒および７２℃で１０秒を１サイクルとして、５サイクル
９８℃で１０秒、７０℃で５秒および７２℃で５秒を１サイクルとして、５サイクル
９８℃で１０秒、６０℃で５秒および７２℃で５秒を１サイクルとして、２５サイクル
（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）
９８℃で１０秒、５５℃で５秒および７２℃で５秒を１サイクルとして、２５サイクル。【０１２８】
Ｒａｃｅ用のプライマーとして、キットに付属のプライマー、および以下に示す遺伝子に特異的なプライマーを使用した。
（１ｓｔ  ＰＣＲ：＃１５３６０、ＳゲノムおよびＴゲノム、ＳＲ−１の茎頂）
５’Ｒａｃｅ１ｓｔプライマー：Ｒ−GAACCACCAGGGACTAAACTCTGCAA、および３’Ｒａｃｅ１ｓｔプライマー：Ｆ−TTGCAGAGTTTAGTCCCTGGTGGTTCの組合せ
（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ：＃１５３６０、ＳゲノムおよびＴゲノム、ＳＲ−１の茎頂）
５’ＲａｃｅＮｅｓｔｅｄプライマー：Ｒ−GAAACGATCACTGATTCTATGCC、および３’ＲａｃｅＮｅｓｔｅｄプライマー：Ｆ−TACAATGTTAGAAGAAGCAATTCACの組合せ。【０１２９】
１−１．の（ｃ）の記載の通りにＲＴ−ＰＣＲを行った。使用したプライマーおよび対象遺伝子は以下の通りである。
（セット１：＃０７４３７、Ｓゲノム、ＳＲ−１の茎頂）
フォワード：TACTTCCCTTTCTCACTTTGGTTTC、およびリバース：AATATTCCCATCAATAGATCACAACの組合せ
（セット２：＃０７４３７、Ｔゲノム、つくば１号の芽生え）
０７４３７＿Ｔ＿Ｆ１：CTACTACATCACTTAATATCATTCATT、および０７４３７＿Ｔｏｍ＿ＲＴ＿Ｒ１：CAATAGATTGCAACTTTACATTAGTCGの組合せ
（セット３：＃０７４３７、Ｓゲノム、つくば１号の芽生え）
０７４３７＿Ｓ＿Ｆ１：TACTATCACTTAATACCATCATTCATC、および０７４３７＿Ｓｙｌ＿ＲＴ＿Ｒ１：CCCATCAATAGATCACAACTTTAGTの組合せ
（セット４：＃１５３６０、Ｓゲノム、つくば１号の芽生え）
１５３６０−２_Ｆ２：AAATAGAGGTAATTAGTTGTATCAATGG、および１５３６０−Ｎｔｓ_Ｒ２：ACAACATACCATACTACCACACACTAの組合せ
（セット５：＃１５３６０、Ｔゲノム、つくば１号の芽生え）
１５３６０−１_Ｆ１：TGCATGGACAATCTCCTCTT、および１５３６０−Ｎｔｓ_Ｒ２：ACAACATACCATACTACCACACACTAの組合せ
（セット６：＃１５３６０、Ｓゲノム、ＳＲ−１のわき芽）
15360-2_F1：GCATGGACAATCTCATCTTCTC、および15360-1_R1-2：CAACAGGAGTTGAGTTATTCTCATの組合せ
（セット７：＃１５３６０、Ｔゲノム、ＳＲ−１のわき芽）
15360_TrFW1：CACCTTCTTCAAGCAAAATTAATGAC、および15360_TrRV1：ATTAGAGTCATGAGCCATTAGCの組合せ。【０１３０】
１−１．の（ｃ）の記載の通りにゲノムＰＣＲを行った。使用したプライマーおよび対象遺伝子は以下の通りである。
（セット１：＃１５３６０、Ｓゲノム、つくば１号の葉）
15360-2_F1：GCATGGACAATCTCATCTTCTC、および15360-2_R1：CTGGGCAATATTCCACCATTの組合せ
15360-2_F2：AATGGTGGAATATTGCCCAG、および15360_NtsR2：ACAACATACCATACTACCACACACTAの組合せ
（セット２：＃１５３６０、Ｔゲノム、つくば１号の葉）
15360-1_F1：TGCATGGACAATCTCCTCTT、および15360-1_R1-2：CAACAGGAGTTGAGTTATTCTCATの組合せ
15360-1_F2-2：ATGAGAATAACTCAACTCCTGTTG、および15360_NtsR2：ACAACATACCATACTACCACACACTAの組合せ
（セット３：＃０７４３７、Ｓゲノム、つくば１号の葉）
07437-S_F1：TACTATCACTTAATACCATCATTCATC、および07437-S_R1：TCCCTGTACTTTGGGACATGAの組合せ
07437-S_F2：GTGTACCAGCTAGTTATTATTGCG、および07437-S_R2：CCTGATCCGTTCTGATAGATCGの組合せ
07427-S_F3：ATTTGTTAAAAAGTTGTAATAAAATTGG、および07437-S_R3：TTTCTTTGAATTGCTAACGAGGAの組合せ
07437-S_F4：TCCTCGTTAGCAATTCAAAGAAA、および07437-S_R5：AGAATATAAAGAGCAGCCTGAATTACの組合せ
07437-S_F1：TACTATCACTTAATACCATCATTCATC、および07437-S_R2：CCTGATCCGTTCTGATAGATCGの組合せ
07437-S_F2：GTGTACCAGCTAGTTATTATTGCG、および07437-S_R3：TTTCTTTGAATTGCTAACGAGGAの組合せ
（セット４：＃０７４３７、Ｔゲノム、つくば１号の葉）
07437-T_F1：CTACTACATCACTTAATATCATTCATT、および07437-T_R1：TCCCTGTACTTTGGGACATGAの組合せ
07437-T_F2：TGCATTAACATGAATGCGAC、および07437-T_R2：TCTAAATAGCGAGTAATAAGGATGAGAの組合せ
07437-T_F3：GTTTGTTAAAAAATTGTAATAAACTTGG、および07437-T_R3：TTTCTTTGAAGTGCAAAAGGAATの組合せ
07437-T_F4：ATTCCTTTTGCACTTCAAAGAAA、および07437-T_R4：ATTATGGAAAAACAACTCTTCTATTの組合せ
07437-T_F1：CTACTACATCACTTAATATCATTCATT、および07437-T_R2：TCTAAATAGCGAGTAATAAGGATGAGAの組合せ
07437-T_F2：TGCATTAACATGAATGCGAC、および07437-T_R3：TTTCTTTGAAGTGCAAAAGGAATの組合せ。【０１３１】
（１−３．ゲノム上の目的遺伝子の全長配列決定）
１−１．の（ｂ）に記載にしたがってゲノムＤＮＡ断片を得た。当該ゲノムＤＮＡ断片を鋳型として用いたＰＣＲによって、目的遺伝子の５’上流および３’下流のそれぞれを増幅させた。ＰＣＲの反応条件は、１−１．の（ｃ）に記載の通り。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通り。【０１３２】
【表１】
2017170796.tif 000002
Zero Blunt（登録商標）TOPO（登録商標） PCR Cloning Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いてそのマニュアル通りに、大腸菌（Mach1（商標）-T1R）を、増幅させたＰＣＲ産物のそれぞれによって形質転換した。形質転換した大腸菌をプレートにおいて播いた。プレート上に形成されたコロニーを用いて、コロニーＰＣＲを行った。コロニーＰＣＲの増幅産物を、ExoSAP-IT（登録商標） For PCR Product Clean-UP（Affimetrix）を用いてそのマニュアル通りに精製した後に、後述するシーケンス反応の鋳型に使用した。同時に、コロニーを液体培養した後に、QIAGEN Plasmid Mini Kit（QIAGEN）を用いて、培養した菌体からプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドも、後述するシーケンス反応の鋳型に使用した。【０１３３】
上記鋳型を、BigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）を用いてそのマニュアル通りに、反応させた。反応生成物を、BigDye（登録商標） XTerminator（商標） Purification Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて、精製した。精製した反応生成物の塩基配列を、キャピラリーシーケンサー3730xl DNA Analyzer（Applied Biosystems）によって決定した。シーケンスプライマーは配列情報から適宜設計して使用した。【０１３４】
決定した塩基配列を、ATGCシーケンスアッセンブリソフトウェア（ゼネティックス）を用いてつなぐことによって、目的遺伝子における非翻訳領域の塩基配列を決定した。非翻訳領域および構造遺伝子部分をさらにつないで、目的遺伝子の完全長のゲノムＤＮＡ配列を決定した（配列番号５４〜６３）。【０１３５】
（１−４．結果）
候補群Ａとして決定したＲＥＶ、ＬＳおよびＢｌのタバコオルソログ遺伝子のそれぞれを、ＮｔＲＥＶ、ＮｔＬＳおよびＮｔＢｌ１と名付けた。また、トランスクリプトーム解析の結果から、候補群Ｂとして決定した遺伝子のそれぞれを＃１５３６０および＃０７４３７と名付けた。【０１３６】
〔２．候補物ＡおよびＢのいずれかの発現抑制の、わき芽発達に対する影響の確認〕
候補物ＡおよびＢのいずれかの発現抑制の、わき芽発達に対する影響を調べるために、各遺伝子の発現が抑制された組換え体（以下、単に組換え体と記載する）におけるわき芽発達の変化を確認した。【０１３７】
（２−１．組換え体の作製）
（ａ）形質転換の準備
組換え体の作製のために、まず形質転換用のベクターを、以下のように準備した。【０１３８】
ＮｔＲＥＶ、ＮｔＢｌ１、ＮｔＬＳ、＃１５３６０および＃０７４３７（まとめて対象遺伝子とも記載する）の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガー配列を、１．の結果に基づいて生成させたＳＲ−１由来のｃＤＮＡを鋳型にして、PrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ）を用いてＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲの条件およびプライマーは、以下の通りである。
（ＰＣＲ条件）
９４℃で３０秒
９８℃で１０秒、５５℃で５秒、および７２℃で１０秒を１サイクルとして、３０〜４０サイクル
７２℃で１０秒
（＃１５３６０用プライマー）
15360_TrFW1：CACCTTCTTCAAGCAAAATTAATGAC、および
15360_TrRV1：ATTAGAGTCATGAGCCATTAGCの組合せ
（＃０７４３７用プライマー）
07437_TrFW1：ACCACCTGGTTTTAGGTTTCATCC、および
07437_TrRV1：TATTCTGCATATCACCCATTCCの組合せ
（ＮｔＬｓ用プライマー）
LS_TRV_F3：CACCGAAGAAACTGATGATCAACGG、および
LS_TRV_R3：TCGCTTGATTAGCAGTCAGCの組合せ
（ＮｔＢｌ１用プライマー）
N.t_BL(hit1)_TRV_F1：CACCTCAAGAAAAAGCTTATGGG、および
N.t_BL(hit1)_TRV_R1：GCAGCAGCTAACAAGTTGTAの組合せ
（ＮｔＲＥＶ用プライマー）
NtREV_TrFW2：CACCGCCTATGTAGCTTCGTCAATG、および
NtREV_TrRV2：CACTGTAGCCAGAGACCACAの組合せ。【０１３９】
以上に示す通り、ＮｔＲＥＶの発現抑制のために、ＨＤ−Ｚｉｐドメインの下流側（３’側）にある翻訳領域の配列をＲＮＡｉトリガー配列として選択し、ＮｔＢｌ１の発現抑制のために、Ｍｙｂドメインの下流側（３’側）にある翻訳領域の配列をＲＮＡｉトリガー配列として選択し、ＮｔＬＳの発現抑制のために、翻訳領域の５’末端側をＲＮＡｉトリガー配列として選択し、＃１５３６０の発現抑制のために、ｂＨＬＨドメインを含んでいる配列をＲＮＡｉトリガー配列として選択し、＃０７４３７の発現抑制のために、ＮＡＭドメイン領域の配列をＲＮＡｉトリガー配列として選択した。また、ＰＣＲによって増幅された各ＲＮＡｉトリガー配列は、５’末端にＣＣＡＣが付加され、かつＲＮＡｉトリガー配列が４００〜５００ｂｐの長さになるように設計された。【０１４０】
ＰＣＲ産物を、pENTR（商標）/D-TOPOベクター（ライフテクノロジー）にクローニングし、各ＲＮＡｉトリガー配列の塩基配列を確認した後に、Gateway LR Clonase II Enzyme Mix（ライフテクノロジー）を用いて、各ＲＮＡｉトリガー配列をpSP231ベクターに導入した。導入された配列を確認するために、pSP231ベクター（pHellsgate12（文献：Wesley et al., 2001, Plant J., 27, 581-590参照）のＳａｃＩ部位にＧＦＰ（Green-fluorescent protein遺伝子）発現カセットを挿入したベクターであり、トリガー配列の逆位反復配列がｐｄｋ/ｃａｔイントロンを挟んで配置し、ＲＮＡｉ配列をカリフラワーモザイクウィルス３５ＳＲＮＡ遺伝子プロモーターで発現させることができるバイナリーベクター）に導入した各ＲＮＡｉトリガー配列を、センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれを個別にＰＣＲによって、TaKaRa Ex TaqおよびPrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ）を用いて増幅させた。ＰＣＲ産物を、MiniElute（QIAGEN）を用いて精製した後に、シーケンサにかけた。pSP231ベクターに導入したＲＮＡｉトリガー配列の塩基配列は、配列番号３１（ＮｔＲＥＶ）、配列番号３２（ＮｔＢｌ１）、配列番号３３（ＮｔＬＳ）、配列番号３４（＃１５３６０）および配列番号３５（＃０７４３７）に示す通りである。なお、配列表に示されている塩基配列において、５’末端にあるＣＡＣＣは、省略されている。【０１４１】
各トリガー配列を含んでいるpSP231ベクターを用いて、アグロバクテリウム（Agrobacteriumu tumefaciens）  LBA4404をエレクトロポレーションによって形質転換した。LBA4404において、各ＲＮＡｉトリガー配列が増幅されたことをＰＣＲによって確認した後に、当該アグロバクテリウムを、タバコの形質転換に使用した。【０１４２】
（ｂ）タバコの形質転換、および形質転換された種子の採種
品種MC1（ＮｔＢｌ１の形質転換）またはSR-1（ＮｔＲＥＶ、ＮｔＬＳ、＃１５３６０および＃０７４３７それぞれの形質転換）を用いて、以下の通り一般的な方法によってタバコの形質転換を行った。形質転換された上記アグロバクテリウムをタバコ葉の切片に感染させ、カナマイシンを含んでいるLinsmaier and Skoog培地において培養することによって得られたカルスからカナマイシン耐性の再分化個体を得た。これらの再分化個体から、葉全体におけるＧＦＰに基づく強い蛍光、およびスペーサ部分（PPDKイントロン）の高発現が確認された個体を選抜した。選抜した個体（Ｔ０個体）を、３号鉢に移植し、２３〜２５℃の閉鎖系温室において一定条件のもとに栽培した。Ｔ０個体を自殖させて、Ｔ１種子を採種した。【０１４３】
（ｃ）Ｔ１組換え体の選抜
Ｔ１種子をLinsmaier and Skoog培地に無菌的に播種し、芽生えのＧＦＰに基づく蛍光を観察した。導入遺伝子の遺伝子型（ホモ接合型（ホモ）／ヘミ接合型（ヘテロ）およびヌル分離個体（ヌル））の分離比から、導入遺伝子のローカス数が１〜２と推定される系統を選抜した。【０１４４】
Ｔ１系統の葉または根から単離したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを用いたｑＰＣＲによって、対象遺伝子の発現レベルを決定した。発現レベルを、ヌルの発現レベルに対するホモの発現レベルの比として評価した。ホモまたはヌルの系統のうち、当該比の小さい（すなわち、対象遺伝子の発現抑制の程度が大きい）系統を選抜した。上記ｑＰＣＲの詳細は、以下の通りである。【０１４５】
ｑＰＣＲのプライマーおよびプローブの設計を、専用のソフトウェア（PrimerExpress、ABI）を用いて行うか、またはシグマアルドリッチジャパンに依頼した。１−１．の（ｂ）に記載の通りに、葉または根から単離したｔｏｔａｌ  ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。２〜５倍に希釈したｃＤＮＡ、上述の通りに得られたプライマー、およびTaq Man Fast Advanced Master Mix（ABI）を用いて、ｑＰＣＲを行った。定量化の対照として、eukaryotic elongation factor-1α遺伝子（accession No. AF120093、efla）を増幅させた。定量化用プローブとして、レポータ色素−クエンチャーの組合せ（FAM-TAMURA（解析対象の遺伝子）およびVIC-TAMURA（対照））を用いた。ｑＰＣＲ用のプライマーおよびプローブの配列を示す。以下の各遺伝子を対象にしている配列において、１番目はフォワードプライマーであり、２番目はリバースプライマーであり、３番目はプローブである。
（ＮｔＬＳ）
NtLS_qFW1：CCGGTACTGGAAATGACCTTGA
NtLS_qRV1：ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAAT
NtLS_P1：CCCTTCGTAGAACCGGAGATCGTTTAGCT
（ＮｔＢｌ１）
NtBl1_qFW1：GAGAAAACAAATGTAAGTACACCATTAGG
NtBl1_qRV1：GAAAAAGTTTGAATCTTCTTGCCAA
NtBl1_P1：GATTTGAAAGGGCGTTTGGGTATGGG
（ＮｔＲＥＶ）
NtREV1_qFW1：TCTCCAGGCTCCCCTGAAG
NtREV1_qRV1：TGTCCCCATGTGATAACTGTAGCT
NtREV1_P1：AACGTTGTCGCACTGGATCTGCCA
（＃０７４３７）
Nt_07437_1-F：ATGGCTACCCTACAAGCTTGAAA
Nt_07437_1-R：TTGCCAATGTGTAGTTGTTGTGG
Nt_07437_1-P：TCTTAACACAGCAACATCAGCAGAAGCAGC
（＃１５３６０）
Nt_15360_48821-F：ACTCCTGTTGAGAATGCACAAATAA
Nt_15360_48821-R：CCAGAAATATTAGTTTCTTCTCCTTGG
Nt_15360_48821-P：CCATCTGAAAATGCATAACCTGGAAGCTGC。【０１４６】
以上の選抜の結果として、わき芽評価試験に供するために、発現抑制されている対象遺伝子ごとに選抜した個体は、以下の通りである。
・ＮｔＲＥＶ：発現レベルを評価した１０個体のＴ１系統のうち、ローカス数が１であり、かつ顕著な発現抑制を示す３個体のＴ１系統（系統番号：３、８および１４）
・ＮｔＢｌ１：発現レベルを評価した１５個体のＴ１系統のうち、ローカス数が１であり、かつ顕著な発現抑制を示す３個体のＴ１系統（系統番号：６、９および１２）
・ＮｔＬＳ：発現レベルを評価した２４個体のＴ１系統のうち、ローカス数が１であり、かつ顕著な発現抑制を示す３個体のＴ１系統（系統番号：１０、１５および１９）
・＃１５３６０：発現レベルを評価した２２個体のＴ１系統のうち、ローカス数が１または２であり、かつ顕著な発現抑制を示す３個体のＴ１系統（系統番号：１１、１４および１７）
・＃０７４３７：発現レベルを評価した２０個体のＴ１系統のうち、ローカス数が１であり、かつ顕著な発現抑制を示す３個体のＴ１系統（系統番号：１、１０および２２）。【０１４７】
各組換え体のＴ１系統群における対象遺伝子の発現レベルの比（ヌルの発現を１に設定）を以下に示す。
・ＮｔＲＥＶ−系統３：０．５６、系統８：０．５７、系統１４：０．７４
・ＮｔＢｌ１−系統６：０．３３、系統９：０．３５、系統１２：０．２５
・ＮｔＬＳ−系統１０：０．５０、系統１５：０．５８、系統１９：０．４３
・＃１５３６０−系統１１：０．０７、系統１４：０．１０、系統１７：０．０８
・＃０７４３７−系統１：０．２４、系統１０：０．１７、系統２２：０．１３。【０１４８】
（２−２．温室におけるわき芽評価）
上述のようにして得られた各組換え体のＴ１系統の種子を、播種して、閉鎖系温室またはコイトトロン（小糸製作所）において栽培した。閉鎖系温室を、２３〜２５℃の室温に保った自然日長の条件、コイトトロンを、１２時間日長の、２５℃（明期）および１８℃（暗期）の条件に設定した。個体を、５００ｍＬ／鉢の肥土を詰めた５号鉢において栽培した。肥土の組成は、堆肥：４０Ｌ、原野土：３０Ｌ、赤玉（小）：１０Ｌ、赤玉（中）：１０Ｌ、バーミキュライト：１０Ｌ、肥料（S625）：１０００ｇであった。【０１４９】
発蕾から開花前の期間の、１２〜１３枚の本葉が生じた時点で心止めし、地上部にある下から４枚目以上にあたる本葉に生じたわき芽を評価対象に選んだ。心止めの日から１週間目ごとに、約５ｍｍ以上の長さの茎を有しているわき芽の数を記録し、記録した対象のわき芽を芽元から手作業でもぎ取り、もぎ取ったわき芽の新鮮重量（ＦＷ）を測定した。新たなわき芽の発達が認められなくなるまで、ほぼ５回にわたって、わき芽の数および重量を調べた。【０１５０】
まず、ＮｔＲＥＶ発現を抑制した組換え体（閉鎖系温室で栽培）におけるわき芽発達を評価した結果を図１に示す。ＮｔＲＥＶ発現を抑制した組換え体の３系統のホモ（図１において系統数の後ろに「Ｈ」が付されている）のすべては、対応するヌル（図１において系統数の後ろに「Ｎ」が付されている）と比べて、２次わき芽の数において統計的に有意に減少しており、そのうちの２系統は、２次わき芽を生じなかった。一方で、系統１２のホモにおいて、対応するヌルと比べて、１次わき芽の数が統計的に有意な増加を示した点を除いて、１次わき芽の数および新鮮重量において、ホモおよびヌル間で統計的な有意差は認められなかった。なお、図２〜５において、「Ｎ」および「Ｈ」の意味は、図１と同じである。【０１５１】
ＮｔＢｌ１発現を抑制した組換え体（コイトトロンで栽培）におけるわき芽発達を評価した結果を図２に示す。ＮｔＢｌ１発現を抑制した組換え体の３系統のホモのすべては、２次わき芽を生じず、対応するヌルは、２次わき芽を生じた。一方で、１次わき芽の数および新鮮重量において、ホモおよびヌル間で統計的な有意差は認められなかった。【０１５２】
ＮｔＬＳ発現を抑制した組換え体（コイトトロンで栽培）におけるわき芽発達を評価した結果を図３に示す。ＮｔＬＳ発現を抑制した組換え体の３系統のホモのすべては、対応するヌルと比べて、２次わき芽の数において統計的に有意に減少していた。また、１つのホモは、対応するヌルと比べて、２次わき芽の新鮮重量において統計的に有意に減少しており、残る２つは、統計的に有意ではなかったものの、新鮮重量の減少を示した。一方で、１次わき芽の数および新鮮重量において、ホモおよびヌル間で統計的な有意差は認められなかった。【０１５３】
♯１５３６０発現を抑制した組換え体（コイトトロンで栽培）におけるわき芽発達を評価した結果を図４に示す。♯１５３６０発現を抑制した組換え体の３系統のホモのすべては、対応するヌルと比べて、２次わき芽の数において統計的に有意に減少していた。また、２つのホモは、対応するヌルと比べて、２次わき芽の新鮮重量において統計的に有意に減少しており、残る１つは、統計的に有意ではなかったものの、新鮮重量の減少を示した。一方で、系統１７のホモは、対応するヌルと比べて、１次わき芽の新鮮重量において統計的に有意に増加していた点を除いて、１次わき芽の数および新鮮重量において、ホモおよびヌル間で統計的な有意差は認められなかった。【０１５４】
♯０７４３７発現を抑制した組換え体（コイトトロンで栽培）におけるわき芽発達を評価した結果を図５に示す。♯０７４３７発現を抑制した組換え体の３系統のうち、系統１のホモは、対応するヌルと比べて、２次わき芽の数および新鮮重量において統計的に有意に減少していた。また、残る２系統のホモは、対応するヌルと比べて、統計的に有意ではなかったものの、２次わき芽の数および新鮮重量の減少を示した。一方で、１次わき芽の数および新鮮重量において、ホモおよびヌル間で統計的な有意差は認められなかった。【０１５５】
以上の結果から、５つの対象遺伝子の発現抑制は、１次わき芽の発達を抑制せずに、２次わき芽の発達を選択的に抑制し得ることが分かった。【０１５６】
〔３．対象遺伝子に導入された変異の、わき芽発達に対する影響の確認（１）〕
（３−１．ＥＭＳ処理によって生成させた変異体）
（ａ）変異体のスクリーニング
種子をメタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）処理することによって、タバコ（品種：つくば１号）の変異体パネル（TUM）を作製した（文献：平成２３年日本植物病理学会大会  ｐ２３４、タバコ変異体パネルの作出）。この変異体パネルは、数千個の種子に対して、変異原としてＥＭＳを処理し、育成した個体（Ｍ１世代）毎に得られた変異体自殖後代種子（Ｍ２バルク種子）のセットと、これらＭ２種子を播種し、育成した各系統８個体の幼苗から抽出したバルクＤＮＡのセットからなる。このＤＮＡサンプルを鋳型にして、変異体ライブライリのゲノムを、Single-strand conformation polymorphism（SSCP）解析またはＰＣＲ増幅断片のダイレクトシーケンシングした結果に基づいて、ＮｔＲＥＶまたはＮｔＬＳに変異を有している変異体を選抜した。SSCPでは、標的部位を、蛍光色素を結合させたＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲによって増幅させ、増幅させた断片を、キャピラリー電気泳動装置（ＡＢＩ  ３１３０ｘｌＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ）用いて検出した。ＰＣＲを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、キットに添付のマニュアルにしたがって実施した。当該ＰＣＲプライマーの配列は、以下の通りである。
（ＮｔＲＥＶ、Ｓゲノム）
Nt_in0_F1：TTGGTTTGGGATTTTGAGGTTTGAGG、およびNt_ex1_R1：TCCATCACTGATCTAACTAATCCAAGの組合せ
Ns_in1_F1：TTTGGAATTGAGGGTGAACATTGTGC、およびNs_in2_R1：ACGTTACCATTCGTCTACAGTAAGCの組合せ
Ns_in2_F1：CCAATAAACAAGAAACAGATGATGG、およびNs_in3_R1：GAATGGACACCATAGACGGAAAGGAの組合せ
Ns_in3_F1：TTTCCGTCTATGGTGTCCATTCTCC、およびNs_in4_R1：GAGACATGGCAATACTGAATTTTCAの組合せ
Ns_in4_F1：GAAAATTCAGTATTGCCATGTC、およびNs_in6_R1：AGCCTACGTGAAGATTGATGAGAAGの組合せ
（ＮｔＲＥＶ、Ｔゲノム）
Nt_in0_F1：TTGGTTTGGGATTTTGAGGTTTGAGG、およびNt_ex1_R1：TCCATCACTGATCTAACTAATCCAAGの組合せ
Nt_in1_F1：TCGATTGGGTTGTATGAGTTAACCGT、およびNt_in2_R1：GTTACCATAAGCTGTGGAATATCAGGの組合せ
Nt_in2_F1：AACCAATGGACAAGAAACGGATGGCA、およびNt_in4_R1：TTTAGCTATCCAGTCAAAGAGGCACGの組合せ
Nt_in4_F1：AAAAAAATTCAGTATTGCCACGTGC、およびNt_in6_R1：AGCCTACGTGAAGATTGATGAGAAAの組合せ
（ＮｔＬＳ、Ｓゲノム）
LS_F2_seq：ATTTCCCCTCCTCCATCATTG、およびLS1-R1：CAACAACATTAGATGGTGTCAAGの組合せLS1-F2 ：CTTGACACCATCTAATGTTGTTG、およびNtLS_QPCR_RV1：ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAATの組合せ
LS1,2-F3：TTCGTAGAACCGGAGATCGT、およびLS1,2_R3：GCAAAGTTGCTTCCAATGAATの組合せ
LS1,2_F4：GTGGAGGCTTTGGATTATTATG、およびN.t_LS_TRV_R2：GAAGACCTCTTTGTCCTTCACCATGCAGの組合せ
（ＮｔＬＳ、Ｔゲノム）
LS_F2_seq：ATTTCCCCTCCTCCATCATTG、およびLS2-R1：AACATTAGATGATGCATTAGGTGTの組合せLS2-F2 ：ACACCTAATGCATCATCTAATGTT、およびNtLS_QPCR_RV1：ATCTAAGGCCTAAAGAGTGAGCAAATの組合せ
LS1,2-F3：TTCGTAGAACCGGAGATCGT、およびLS1,2_R3：GCAAAGTTGCTTCCAATGAATの組合せ
LS1,2_F4：GTGGAGGCTTTGGATTATTATG、およびN.t_LS_TRV_R2：GAAGACCTCTTTGTCCTTCACCATGCAGの組合せ。【０１５７】
変異が導入された遺伝子の配列の同定を、Ｍ２世代の変異個体のゲノムからのＰＣＲ増幅断片をクローニングし、かつその断片の塩基配列を決定することによって行った。変異が導入された遺伝子によって発現されるポリペプチドと野生型タンパク質（ＷＴ）との相違は以下の通りである。【０１５８】
Ｓゲノムにおける変異が導入されたＮｔＲＥＶによって発現されるポリペプチド（ＭＴ、Ｎｓ１６３０変異体、配列番号３６）は、野生型タンパク質と以下の相違を有していた。
・ＭＴ：１１１ａａ、ＷＴ：８３８ａａ
１１２番目のグルタミン（Ｑ）がストップコドンに変化したことによって、全長が１１１ａａに短縮された。【０１５９】
Ｔゲノムにおける変異が導入されたＮｔＲＥＶによって発現されるポリペプチド（Ｎｔ１６０５変異体、配列番号３７）は、野生型タンパク質と以下の相違を有していた。
・ＭＴ：１１６ａａ、ＷＴ：８３９ａａ
１１７番目のグルタミン（Ｑ）がストップコドンに変化したことによって、全長が１１６ａａに短縮された。【０１６０】
Ｔゲノムにおける変異が導入されたＮｔＲＥＶによって発現されるポリペプチド（Ｎｔ５８５０変異体、配列番号３８）は、野生型タンパク質と以下の相違を有していた。
・ＭＴ：６８ａａ、ＷＴ：８３９ａａ
６９番目のグルタミン（Ｑ）がストップコドンに変化したことによって、全長が６８ａａに短縮された。【０１６１】
Ｔゲノムにおける変異が導入されたＮｔＬＳによって発現されるポリペプチド（Ｎｔ１１４５変異体、配列番号３９）は、野生型タンパク質と以下の相違を有していた。
・ＭＴ：３９８ａａ、ＷＴ：４１０ａａ
３９９番目のグルタミン（Ｑ）がストップコドンに変化したことによって、全長が３９８ａａに短縮された。【０１６２】
Ｔゲノムにおける変異が導入されたＮｔＬＳによって発現されるポリペプチド（Ｎｔ１０２５変異体、配列番号４０）は、野生型タンパク質と以下の相違を有していた。
・ＭＴ：１４５ａａ、ＷＴ：４１０ａａ
１４６番目のグルタミン（Ｑ）がストップコドンに変化したことによって、全長が１４５ａａに短縮された。【０１６３】
Ｓゲノムにおける変異が導入されたＮｔＬＳによって発現されるポリペプチド（Ｎｓ３６９変異体、配列番号４１）は、野生型タンパク質と以下の相違を有していた。
・ＭＴ：１６３ａａ、ＷＴ：４０７ａａ
１６４番目のグルタミン（Ｑ）がストップコドンに変化したことによって、全長が１６３ａａに短縮された。【０１６４】
（ｂ）Ｍ２変異体集団からの、所望の変異体の選抜
標的遺伝子に変異を有していると推定されるＭ２変異体集団から、ＴゲノムおよびＳゲノムの両方に標的遺伝子の変異をホモに有している変異体（Ｔ＋Ｓ＋）、ならびにＴゲノムおよびＳゲノムの両方に標的遺伝子の変異を有していない変異体（Ｔ−Ｓ−）を以下の手順にしたがって作製した。【０１６５】
まず、Ｍ２変異体集団から、以下の４つの集団を選抜した。
Ｔゲノムに標的遺伝子の変異をホモに有しているＭ２変異体（Ｔ＋）
Ｓゲノムに標的遺伝子の変異をホモに有しているＭ２変異体（Ｓ＋）
Ｔゲノムに標的遺伝子の変異を有していないＭ２変異体（Ｔ−）
Ｓゲノムに標的遺伝子の変異を有していないＭ２変異体（Ｓ−）
それから、Ｔ＋およびＳ＋を交配して作製したＦ１系統を自殖させて、目的のＦ２変異体（Ｔ＋Ｓ＋）を作製した。同様にして、Ｔ−Ｓ−を作製した。【０１６６】
上記手順において、ゲノム上における変異の有無を決定するために、CycleavePCR法を次の段落に記載のように実施した。ＮｔＲＥＶ遺伝子の変異を確認するCycleavePCRにおける鋳型としては、簡易抽出法を用いて抽出されたゲノムＤＮＡを用いた。ＮｔＬＳ遺伝子の変異を確認するCycleavePCRにおける鋳型としては、ゲノムＤＮＡ（ＴおよびＳゲノムのそれぞれ）からＰＣＲによって増幅させた断片を、３００〜５００倍に希釈して用いた。当該ＰＣＲは、Tks Gflex（商標） DNA polymerase（タカラバイオ）を用いて実施され、当該ＰＣＲの反応条件およびプライマーは以下の通りである。
（反応条件）
９４℃で３０秒
９８℃で１０秒、５５℃で１５秒および６８℃で９０秒を１サイクルとして、３５サイクル
６８℃で９０秒
（プライマー）
Ｔゲノム
NtLS_prePCR_Ntom_F1：CCCAGACCCCCTTTTCCTCT
NtLS_prePCR_Ntom_R1：AATTTCCCTTATAATTTAACGCC
Ｓゲノム
NtLS_prePCR_Nsyl_F1：CCCTAGAGAGACCCCTTTTTC
NtLS_prePCR_Nsyl_R1：GGGTTTTAAATTTAACGCCAA。【０１６７】
CycleavePCR法用のプライマーおよびプローブ（表１）を、タカラバイオのウェブページから利用可能なCycleave（登録商標）RPCR Assay Designer（SNPs）を用いて設計した。当該プライマーおよびプローブとともに、CycleavePCR Reacrion Mix（タカラバイオ）を用いて、同社の提供するマニュアルにしたがって、CycleavePCR法を実施した。ＰＣＲ反応を、Applied Biosystems（登録商標） StepOnePlus（商標） リアルタイムPCRシステム（サーモフィッシャー）を用いて実施した。【０１６８】
【表２】
2017170796.tif 000003
（ｃ）圃場におけるわき芽評価
圃場における栽培
葉たばこ研究所圃地において、通常の耕作期（３月の播種、４月の植付）に畦長１６ｍ、畦間１２０ｃｍ、株間４３ｃｍ、３７本／畦の条件で、高畦およびマルチ栽培法によって、変異体の各系統を栽培した。１系統の栽培に１畦を割り当て、移植から１か月後に同程度の生長を示している１０〜１５の個体を、外観から判断して予備的に選抜し、そのうち１０個体を続く試験に供した。試験中には一切のわき芽抑制剤（例えば、コンタクト）を使用しなかった。【０１６９】
開花期の決定
開花の時期に地上葉数、および心止め直前に推定の開花期を決定した。第１花枝＋１〜４枚の葉を切除して心止めすることによって、比較して評価する系統間において地上葉数を揃えた。【０１７０】
わき芽発達の評価
心止めおよび心止めの日から１週間目ごとの合計７回にわたって、茎の長さが約５ｍｍに達しているわき芽の数を記録し、記録した対象のわき芽を芽元から手作業でもぎ取り、もぎ取ったわき芽の新鮮重量（ＦＷ）を測定した。１次わき芽、２次わき芽および３次わき芽について個体ごとに、記録および測定の結果をまとめた。【０１７１】
ＮｔＲＥＶに変異を導入した変異体におけるわき芽発達を評価した結果を図６に示す。ＮｔＲＥＶ＿Ｈｏｍｏ系統（Ｔ＋Ｓ＋）は、２次わき芽および３次わき芽を生じなかった。ＮｔＲＥＶ＿Ｎｕｌｌ系統（Ｔ−Ｓ−）は、２次わき芽および３次わき芽を生じた（Ｔ＋Ｓ＋と比べて統計的に有意差あり）。一方で、１次わき芽の数および新鮮重量において、２群間で統計的な有意差は認められなかった。【０１７２】
ＮｔＬＳに変異を導入した変異体におけるわき芽発達を評価した結果を図７に示す。ＮｔＬＳ＿Ｈｏｍｏ系統（Ｔ＋Ｓ＋）は、ＮｔＬＳ＿Ｎｕｌｌ系統（Ｔ−Ｓ−）と比べて、２次わき芽の数および新鮮重量において統計的に有意に減少していた。また、３次わき芽を生じなかった（ＮｔＬＳ＿Ｎｕｌｌ系統との統計的な有意差あり）。一方で、１次わき芽の数および新鮮重量において、２群間で統計的な有意差は認められなかった。【０１７３】
以上の結果から、ＮｔＲＥＶまたはＮｔＬＳの変異体においても、遺伝子発現の抑制と同じく、２次わき芽（および３次わき芽）の発達が選択的に抑制され得ることが分かった。【０１７４】
（３−３．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍによって生成されたＮｔＢｌ１の変異体）
（ａ）形質転換の準備
アグロバクテリウムを形質転換ベクターとして、バイナリベクターpRI-201-AN（タカラバイオ）を用いた。pRI-201-ANのNdeI-SalI間に、植物用にコドン最適化されたpcoCas9（参考文献２）を、KpnI-BamHI間にsgRNA発現カセットを導入した。ガイド配列GN20GG用のプロモータとしてAtU6-1（参考文献３）、ガイド配列AN20GG用のプロモータとしてAtU3B（参考文献４）、およびscaffold-polyT配列として参考文献２に報告されている配列を用いた。構築したベクターの模式図を図８に示す（図中のtarget sequenceは本文中のガイド配列）。つまり、3’末端のPAM配列（NGG）を除いたガイド配列が、プロモータおよびscaffold-polyT配列の間に挿入されているsgRNA発現カセットを設計した。５’末端にKpnIサイトおよび３’末端に末端側にはBamHIサイトが付加されているsgRNA発現カセットを、ライフテクノロジーのGeneArt（登録商標） Strings（商標） DNA Fragmentsから合成を委託した（化１）。５’末端にNdeIサイトおよび３’末端にSalIが付加されているCas9の人工合成を、タカラバイオに委託して、当該Cas9を入手した（化２および３）。【０１７５】
【化１】
2017170796.tif 000004
【０１７６】
【化２】
2017170796.tif 000005
【０１７７】
【化３】
2017170796.tif 000006
Cas9およびsgRNA発現カセットが導入されたpRI201-ANを用いて、アグロバクテリウム  LBA4404を、エレクトロポレーションによって形質転換した。２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含んでいるＡＢプレートにおいてアグロバクテリウムを増殖させ、単コロニーのアグロバクテリウムを、単離した。【０１７８】
（ｂ）タバコの形質転換、および形質転換体の栽培
播種１０日目のタバコ（品種：ＳＲ−１）から採取した子葉片を、上述の通りに得られた形質転換されたアグロバクテリウムと、３日にわたって共存培養した。それから、抗菌剤（セフォタキシム）を含んでいる蒸留水を用いて、子葉片を洗浄することによって、アグロバクテリウムを子葉片から除去した。洗浄後の子葉片を、抗菌剤を含んでいるLinsmaier and Skoog培地において４日にわたって培養することによって、アグロバクテリウムを完全に除去した。それから、子葉片を、抗生物質（カナマイシン）を含んでいるLinsmaier and Skoog培地に移して培養し、カナマイシン耐性の再分化個体（シュート）を得た。シュートを、Linsmaier and Skoog培地に移して発根させた。発根させたシュートから、Cas9mRNAを高発現（対照のeukaryotic elfaと比べて２倍以上の発現量）している個体を、選択し、移植用土（堆肥：４０Ｌ、原野土：３０Ｌ、赤玉（小）：１０Ｌ、赤玉（中）：１０Ｌ、バーミキュライト：１０Ｌ、肥料（S625）：１０００ｇ）の入った３号鉢に移植し、生育させた。【０１７９】
（ｃ）変異の有無および変異配列の確認
タバコ形質転換体の葉から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、Tks Gflex（商標） DNA polymerase（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにおける反応条件およびプライマーは以下の通りである。
（反応条件）
９４℃で３０秒
９８℃で１０秒、５５℃で１５秒および６８℃で６０秒を１サイクルとして、４０サイクル
６８℃で６０秒
（プライマー）
Ｔゲノム
NtBl1-1_2A_F1：AAGTATTACTACTACAAAATTCCAACG、および
Nb_Bl1_2A_R1：CCATCTGATGAAGAACAACTTGCの組合せ
Ｓゲノム
NtBl1-2_1A_F1：TTAAACACTAGAGAGTGAGAGAGTGC、および
NtBl1-2_2A_F1：CAGATGTTTAATTATTAAGACAAAGTTCCの組合せ。【０１８０】
ＰＣＲ反応後に、変性／アニーリングを次の条件で行った。変性：95℃5分、アニール：85℃1秒/85℃1秒、60℃1秒、30℃一定であった。８５〜６０℃におけるRamp Rateは5%（0.1℃/秒の降下率）であり、６０〜３０℃におけるRamp Rateは10%（0.1℃/秒の降下率）であった。変性／アニーリング後の５μｌのＰＣＲ産物を、１０μｌの反応系において１ＵのT7 endonuclease I（New England Biolabs）用いて処理し、電気泳動により分離し、ＰＣＲ産物が酵素による切断を受けたか否かを確認した。別途、ＰＣＲ産物を、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、その塩基配列を決定した。【０１８１】
（ｄ）組換え体の選抜
ＴゲノムおよびＳゲノムの両方に変異（１塩基以上の欠失または挿入）を有している、Ｔ０世代の個体を、自殖させ、採種することによって、Ｔ１系統を得た。Ｔ１系統の個体における変異の有無を、（ｃ）と同様にして確認した。確認した結果から、ＴゲノムおよびＳゲノムにおいて、ホモ変異を有しているＴ１系統（Ｔ＋Ｓ＋）の個体を自殖して得たＴ２系統（Ｔ＋Ｓ＋）の個体を試験に使用した。【０１８２】
得られたＴ２系統の個体における変異体ポリペプチド
・2A-1_121、2A-1_126、2A-133_1、2A-161_17（Bl1-1-Ｔゲノム: 1b deletion）
WTが336アミノ酸からなるのに対し、107アミノ酸まで同一のアミノ酸に加えて、関係のない12アミノ酸（TGILNSRKSLWD）が付加したポリペプチド（配列番号９２、９４、９６、１０６）が生成される
・2A-1_121、2A-1_126（Bl1-2-Ｓゲノム: 5b deletion）
WTが337アミノ酸からなるのに対し、106アミノ酸まで同一のアミノ酸に加えて、関係のない3アミノ酸（LEY）が付加したポリペプチド（配列番号９１、９３）が生成される
・2A-133_1（Bl1-2-Ｓゲノム: 3b deletion）
WTが337アミノ酸の内、107番目N（アスパラギン）が欠失した337アミノ酸のポリペプチド（配列番号９５）が生成される
・2A-161_8、2A-161_122（Bl1-1-Ｔゲノム: 22b deletion）
WTが336アミノ酸からなるのに対し、101アミノ酸まで同一のアミノ酸に加えて、関係のない11アミノ酸（EILNSRKSLWD）が付加したポリペプチド（配列番号１０４、１０８）が生成される
・2A-161_8、2A-161_17、2A-161_122（Bl1-2-Ｓゲノム: 2b deletion）
WTが337アミノ酸からなるのに対し、106アミノ酸まで同一のアミノ酸に加えて、関係のない4アミノ酸（KLEY）が付加したポリペプチド（配列番号１０３、１０５、１０７）が生成される。【０１８３】
（ｅ）温室におけるわき芽評価
（ｄ）において得られたＴ２系統の個体（Ｔ＋Ｓ＋）を温室において栽培して、わき芽について評価した。評価の詳細は、２−２．に記載した通りである。【０１８４】
ＮｔＢｌ１に変異を導入した変異体におけるわき芽発達を評価した結果を図９および１０に示す。図９および１０に示す通り、ＮｔＢＬ１遺伝子に変異を導入した個体のいずれもが、１次わき芽の数および重量において、野生型と有意差を示さず、２次わき芽の数および重量において、野生型と比べて統計的に有意な減少を示した。【０１８５】
以上の結果から、ＮｔＢｌ１の変異体においても、遺伝子発現の抑制と同じく、２次わき芽の発達が選択的に抑制され得ることが分かった。【０１８６】
〔４．対象遺伝子に導入された変異の、わき芽の発達位置に対する影響の確認〕
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍによって作製したＮｔＢｌ１変異体を、ＷＴ（ＳＲ−１）と同様にコイトトロンにおいて栽培した。心止めから１週間後に１次わき芽の発達位置を確認した（図１１上）。つくば１号変異体パネルから選抜し、作製したＮｔＬＳ変異体（Ｈｏｍｏ系統）を、ＮｔＬＳ変異体（Ｎｕｌｌ系統）と同様に圃場において栽培した。移植６３日目に１次わき芽の発達位置を確認した（図１１下）。【０１８７】
図１１に示すように、２つの変異体において、１次わき芽が葉腋からずれた位置に形成されていた。したがって、これらの変異体から１次わき芽を摘み取ることが極めて容易である。この理由は、わき芽を摘み取るときに次のような問題を生じるためである。わき芽を摘み取るとき、葉腋にわき芽が形成されていると、収穫葉を付けている側枝に傷をつけることがある。このような傷は、病原体の侵入経路なり得るので、葉の収量および品質に多大な悪影響を及ぼす。【０１８８】
〔５．対象遺伝子に導入された変異の、タバコ植物の生育に対する影響の確認〕
（ａ）試験対象
３−２．の（ｃ）において評価した系統、および３−３．の（ｅ）において評価したBl1_2A-1_121を自殖して得た後代のＴ３系統について、各遺伝子の変異の、植物体の生育に対する影響を、以下のように調べた。比較群として、各変異体の作出に用いた品種を用いた。【０１８９】
（ｂ）条件
温室（２５℃に一定）において、３号鉢に植えた各個体を発蕾まで栽培した。肥土の組成は、２−２．と同じである。発蕾時に、各個体の草丈、新鮮重量および乾燥重量、ならびに各葉位の葉長および葉幅を測定した。草丈は、鉢の肥土表面から最上位花枝の付け根までの長さである。新鮮重量は、１６枚（ＮｔＬＳ変異体、ＮｔＲＥＶ変異体）または１４枚（ＮｔＢｌ１変異体）の地上葉を収穫した直後における、収穫葉および植物体の合計重量である。乾燥重量は、新鮮重量を測定した収穫葉および植物体の、７０℃および相対湿度７％において熱風乾燥させた後における重量である。葉長は葉柄から葉の先端までの縦方向の長さ、葉幅は葉の横幅の最大長さである。葉長および葉幅の決定のために、葉位を表す番号を、最下位葉（１）から上位に向かって順に付した。【０１９０】
（ｃ）結果
図１２（変異体：ｎ＝３、ＷＴ（つくば１号）：ｎ＝２）、１３（変異体およびＷＴ（つくば１号）：ｎ＝３）、および１４（変異体：ｎ＝２、ＷＴ（つくば１号）：ｎ＝３）のそれぞれから明らかな通り、草丈、新鮮重量および乾燥重量について、変異体群および対照群の間に統計的有意差は認められなかった。また、これらの図から明らかな通り、葉長および葉幅についても、変異体群および対照群の間に顕著な差は認められなかった。【０１９１】
以上のことから、各変異体は、対照群と実質的に同程度の生育および葉の収量を示した。したがって、これらの実施例に係る変異体は、（１）わき芽の処理が容易である、（２）収量の低下が生じない、（３）植物体の生存性が高いなどの理由から、葉の収穫を目的とするタバコ植物として、極めて有用であることが分かった。【０１９２】
〔６．対象遺伝子に導入された変異の、わき芽発達に対する影響の確認（２）〕
以下のプロファイルを有している変異体を作製し、当該変異体の、成育状態、わき芽発達およびわき芽抑制剤を用いた場合のわき芽発達を評価した。【０１９３】
LS_21_Null：Ｎｓ３６９変異体とＮｔ１０２５変異体とを交配して得たF1を2回自殖したF3個体であり、ＳゲノムにＮｓ３６９変異体（配列番号４１のポリペプチドを発現）の変異をホモに有し、ＴゲノムにＮｔ１０２５変異体（配列番号４０のポリペプチドを発現）の変異をホモに有する変異体（T+S+）である。【０１９４】
LS19_WT：Ｎｓ３６９変異体とＮｔ１０２５変異体とを交配して得たF1を2回自殖したF3個体であり、Ｔゲノム、Ｓゲノム両方にＬＳ遺伝子の変異を有していない変異体（T-S-）
LS15_Null、LS85_Null：Ｎｓ３６９変異体とＮｓ１１４５変異体とを交配して得たF1を2回自殖したF3個体であり、ＳゲノムにＮｓ３６９変異体（配列番号４１のポリペプチドを発現）の変異をホモに有し、ＴゲノムにＮｔ１１４５変異体（配列番号３９のポリペプチドを発現）の変異をホモに有する変異体（T+S+）である。【０１９５】
LS_57_WT：Ｎｓ３６９変異体とＮｓ１１４５変異体を交配して得たF1を2回自殖したF3個体であり、Ｔゲノム、Ｓゲノム両方にＬＳ遺伝子の変異を有していない変異体（T-S-）
REV_26_Nu-WおよびREV_89_Nu-W：ＴゲノムにＮｔ１６０５変異体（配列番号３７のポリペプチドを発現）の変異をホモに有し、ＳゲノムにＮｓ１６３０変異体（配列番号３９のポリペプチドを発現）の変異をホモに有する変異体（T+S+）に、K326を交配してF1を得た。F1にK326を1回戻し交雑して得たBC1F1を、2回自殖して、BC1F3個体を得た。該BC1F3個体のうち、ＴゲノムにＮｔ１６０５変異体（配列番号３７のポリペプチドを発現）の変異をホモに有し、ＳゲノムにＲＥＶ遺伝子の変異を有していない変異体（T+S-）を、REV_26_Nu-WおよびREV_89_Nu-Wとした。【０１９６】
REV_26_Nu-HeおよびREV_89_Nu-He：ＴゲノムにＮｔ１６０５変異体（配列番号３７のポリペプチドを発現）の変異をホモに有し、ＳゲノムにＮｓ１６３０変異体（配列番号３９のポリペプチドを発現）の変異をホモに有する変異体（T+S+）にK326を交配してF1を得た。該F1にK326を1回戻し交雑して得たBC1F1を、2回自殖して、BC1F3個体を得た。該BC1F3個体のうち、ＴゲノムにＮｔ１６０５変異体（配列番号３７のポリペプチドを発現）の変異をホモに有し、ＳゲノムにはＮｓ１６３０変異体（配列番号３９のポリペプチドを発現）の変異をヘテロに有する変異体（T+S+/-）を、REV_26_Nu-HeおよびREV_89_Nu-Heとした。【０１９７】
REV35_WT：ＴゲノムにＮｔ１６０５変異体（配列番号３７のポリペプチドを発現）の変異をホモに有し、ＳゲノムにＮｓ１６３０変異体（配列番号３９のポリペプチドを発現）の変異をホモに有する変異体（T+S+）にK326を交配してF1を得た。該F1にK326を1回戻し交雑して得たBC1F1を、2回自殖して、BC1F3個体を得た。該BC1F3個体のうち、Ｔゲノム、Ｓゲノム両方にＲＥＶ遺伝子の変異を有していない変異体（T-S-）を、REV35_WTとした。【０１９８】
REV_F3_Null：Ｎｔ１６０５変異体とＮｓ１６３０変異体を交配して得たF1を2回自殖したF3個体で、ＴゲノムにＮｔ１６０５変異体（配列番号３７のポリペプチドを発現）の変異をホモに有し、ＳゲノムにＮｓ１６３０変異体（配列番号３９のポリペプチドを発現）の変異をホモに有する変異体（T+S+）である。【０１９９】
REV_F3_WT：Ｎｔ１６０５変異体とＮｓ１６３０変異体を交配して得たF1を2回自殖したF3個体で、Ｔゲノム、Ｓゲノム両方にＲＥＶ遺伝子の変異を有していない変異体（T-S-）である。【０２００】
（１）生育状態の評価
LS変異体ヌル系統を3系統、当該変異体ヌル系統の対照となる系統を2系統、および変異体の親品種であるつくば１号を調査に用いた。変異体ヌル系統としては、LS_21-1_Null、LS_15_Null、およびLS_85_Nullを用いた。変異体ヌル系統の対照としては、変異体ヌル系統LS_21-1_Nullの対照として、F2分離系統でLSに変異を持たないLS_19_WTを、変異体ヌル系統LS_15_Null、およびLS_85_Nullの対照として、F2分離系統でLSに変異を持たないLS_57_WTを用いた。【０２０１】
上記の各系統の個体を、葉たばこ研究所圃地において、通常よりやや遅い耕作期（3〜4月に播種、5月に植付）に、株間43cm、畦間120cmの条件で、高畦およびマルチ栽培法によって栽培した。肥料として、堆肥を2000kg/10a、アグリ622を120kg/10a用いた。栽培した各系統の個体の開花日数、草丈、地上葉数、生葉重、および乾燥重量を評価した。なお、本明細書中において、開花日数は播種した日から魁花が開花するまでの日数とした。草丈は地面から最上位花枝の付け根までの高さを指す。地上葉数は、地上から第一花枝の直下の葉までに位置している葉の総数を指す。地上葉の全葉の乾燥前の総重量を生葉重、地上葉の全葉の乾燥後の重量を乾燥重量とした。系統ごとに6個体ずつを評価し、それぞれの評価値の平均と標準偏差を算出した。変異体ヌル系統と対照との間で、それぞれの評価値に統計的有意差が存在するか調査した。【０２０２】
結果を、図１５を参照して説明する。LS_15_Nullの草丈が対照（LS_57_WT）に比べて有意に高く、LS_15_Nullの開花日数が対照（LS_57_WT）に比べて有意に短い点と、LS_85_Nullの地上葉数が対照（LS_57_WT）に比べて有意に多い点を除いて、対照と変異体ヌル系統との間で評価値に有意差はみられなかった。以上のことから、ＬＳ遺伝子の変異は、生育に大きな影響は及ぼさないと考えられた。【０２０３】
（２）わき芽発達の評価
（１）と同様に、各個体を栽培した。LS変異体およびその対照として、変異体ヌル系統（LS_21）とその対照（LS_19_WT）、LSヌル変異体（LS_15、LS_85）とその対照（LS57_WT）を用いて試験した。LS_21は2つの畦で栽培することで反復試験とした。ＲＥＶ変異体およびその対照として、戻し交雑をしたBC2F3分離系統（戻し交雑親：K326）の4系統（REV_26_Nu-W、REV_26_Nu-He、REV89_Nu-W、REV_89_Nu-He）とその対照（REV_35_WT）を用いた。さらにＲＥＶ変異体およびその対照として、戻し交雑をしていないREVヌル変異体（REV_F3_Null）とその対照（REV_F3_WT）を用いた。さらに、各変異体の親品種であるつくば１号およびBC2F3分離系統の戻し交雑親のK326を試験に用いた。【０２０４】
開花期に第一花枝の直下で心止めを行い、地上葉に発生したわき芽を調査した。心止め当日に１回目の調査を行い、以後1週間ごとに合計8回調査した。わき芽の茎長が5mm以上のわき芽を調査対象とし、個体ごとに、わき芽の採取時に該わき芽の位置を記録し、わき芽の採取後に該わき芽の重量を測定した。１次わき芽、２次わき芽、および３次わき芽はそれぞれ別個にまとめて調査および集計した。【０２０５】
結果を、図１６および１７を参照して、以下に説明する。図１６はＬＳ変異体の評価結果を示し、図１７はＲＥＶ変異体の評価結果を示す。【０２０６】
図１６に示す通り、３種類のＬＳ変異体ヌル系統はいずれも、対照に比べて、１次わき芽の数が多く、生葉重（FW）が少ない傾向がみられた。ＬＳ変異体ヌル系統の１次わき芽の数が多い原因としては、ＬＳ変異体ヌル系統では対照に比べて地上葉数が多い傾向があることが可能性として挙げられる（図１５）。一方、２次わき芽、３次わき芽は対照に比べて大きく低減されたか、または全く形成されなかった。以上の結果から、LSの異なる変異を有する変異体において、２次わき芽、および２次わき芽以降のわき芽の形成が抑制されることが確認された。【０２０７】
図１７に示す通り、ＲＥＶ遺伝子の全対立遺伝子に変異が導入されたREV_F3_Nullでは、２次わき芽および３次わき芽が全く形成されなかった。また、Ｔゲノムにおける２対立遺伝子、およびＳゲノムにおける１対立遺伝子に変異を有する２系統（REV_26_Nu-He、REV_89_Nu-He）では、２次わき芽は形成されるものの、対照（REV_35_WT）に比べて数、および生葉重ともに、１／２以下に減少し、当該減少には統計的な有意があった。【０２０８】
一方、Ｔゲノムにおける２対立遺伝子に変異を有しており、Ｓゲノムに変異を有していない２系統（REV_26_Nu-W、REV_89_Nu-W）では、２次わき芽の数、および生葉重が対照（REV_35_WT）と同等であった。以上のことから、ＲＥＶ遺伝子に関して、ＴゲノムおよびＳゲノムにおける全対立遺伝子に変異が導入されなくても、合計して３つの対立遺伝子に変異が導入されていれば、２次わき芽抑制効果を有することが確認された。【０２０９】
（３）わき芽抑制剤を用いた場合のわき芽発達
5Lの肥土を詰めた菊鉢（内径25ｃｍ、高さ24ｃｍ）を用い、網室にて栽培した。肥土の組成は、堆肥：40L、原野土：10L、桐生砂：15L、赤玉（小）：15L、赤玉（中）：15L、バーミキュライト：10L、バーレーS625（肥料）：1000gであった。播種は5月に行い、移植後1.5か月程度経過した後に肥土を2L追加した。開花期に第一花枝の下2枚までを切除し（心止め）、3日後に30倍希釈したコンタクト（OATアグリオ）を株当たり20ml散布した。散布4〜7日後にコンタクトが１次わき芽に接触したかどうかを調査し、コンタクトが接触していない１次わき芽を記録し、伸長後にコンタクトが接触していない１次わき芽を除去した。以後、コンタクトが１次わき芽に接触しなかった部位から形成された２次わき芽は調査対象から外した。コンタクトが１次わき芽に接触しなかった部位は、株当たり平均1〜2か所存在した。コンタクト散布後、週1回、13回にわたって、２次わき芽の発生を調査した。系統当たりの平均着葉数は25〜31枚と差がみられたため、着葉数当たりに発生した２次わき芽の割合を比較した。LSのヌル変異体であるLS_15_null、およびLS_85_nullと、それらの対照でありLSに変異を持たないLS_77_wt、LSのヌル変異体であるLS_14_null、およびLS24_nullと、それらの対照でありLSに変異を持たないLS_19_wtを比較した。【０２１０】
結果を、図１８を参照して説明する。コンタクト散布後に発生した２次わき芽の数（着葉数当たり）は、ＬＳ遺伝子の変異により、統計的有意に、大きく減少した。【０２１１】
〔７．対象遺伝子に導入された変異の、わき芽発達に対する影響の確認（３）〕
（７−１．ＲＥＶ変異体および＃１５３６０変異体）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍを用いて、新たな変異体を作製し、わき芽発達を評価した。作製の手順は、３−３．の記載にしたがっているので、３−３．からの変更点のみを説明する。【０２１２】
（ａ）形質転換の準備
アグロバクテリウムを形質転換するベクターの構築において、sgRNA発現カセットの合成をライフテクノロジーに合成を委託した。入手したsgRNA発現カセットの塩基配列は以下の通り。【０２１３】
【化４】
2017170796.tif 000007
【０２１４】
【化５】
2017170796.tif 000008
【０２１５】
【化６】
2017170796.tif 000009
（ｂ）タバコの形質転換、および形質転換体の栽培
タバコ植物体の形質転換および形質転換体の栽培は、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡレベルに基づく個体の選抜を行わなかった点を除いて、３−３．の（ｂ）に記載の通りである。【０２１６】
（ｃ）変異の有無および変異配列の確認
栽培した形質転換体における変異の有無および変異配列の確認を、３−３．の（ｃ）に記載の通りに実施した。ゲノムＤＮＡ上にある、ガイド配列を含んでいる領域を特異的に増幅させるプライマーを設計した。各プライマーの配列を以下の表に示す。【０２１７】
【表３】
2017170796.tif 000010
ＰＣＲの反応条件は以下の通り。
（REVG2）
９４℃で６０秒
９８℃で１０秒、６０℃で１５秒および６８℃で５０秒を１サイクルとして、４５サイクル
（REVG5、ROXG1）
９４℃で６０秒
９８℃で１０秒、６２℃で１５秒および６８℃で５０秒を１サイクルとして、４５サイクル。【０２１８】
（ｄ）組換え体の選抜
ＴゲノムおよびＳゲノムの両方に変異（１塩基以上の欠失または挿入）を有しているT0世代の個体を自殖させ、採種することにより、T1系統を得た。T1系統の個体における変異の有無と配列を、表３のプライマーを用いて確認した。ＳゲノムおよびＴゲノムの両方の対立遺伝子の4か所全てに変異を有するT1個体を選抜し、試験に使用した。得られたT1個体の詳細は、以下の通りであった。
REV_G2-15
Ｔゲノム：6塩基CAAGGCが欠失している。WTが839アミノ酸からなるのに対し、175-176番目の2アミノ酸（KA）が欠失した837アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号６５）が生成される。
Ｓゲノム：1塩基Aが挿入されている。WTが838アミノ酸からなるのに対し、176アミノ酸までWTと同一のアミノ酸配列に加え、関係のない5アミノ酸（YRNCC）が付加したポリペプチド（配列番号６４）が生成される。
REV_G2_94
Ｔゲノム：1塩基Tが挿入されている。WTが839アミノ酸からなるのに対し、176アミノ酸までWTと同一のアミノ酸配列に加え、関係のない5アミノ酸（YRNCC）が付加したポリペプチド（配列番号６７）が生成される。
Ｓゲノム：1塩基Tが挿入されている。WTが838アミノ酸からなるのに対し、176アミノ酸までWTと同一のアミノ酸配列に加え、関係のない5アミノ酸（YRNCC）が付加したポリペプチド（配列番号６６）が生成される。
REV_G5_18
Ｔゲノム：1塩基Cが挿入されている。WTが839アミノ酸からなるのに対し、212アミノ酸までWTと同一のアミノ酸配列に加え、関係のない4アミノ酸（MWSC）が付加したポリペプチド（配列番号６８）が生成される。
Ｓゲノム：5塩基TCGACが挿入されている。WTが838アミノ酸からなるのに対し、212アミノ酸までWTと同一のアミノ酸配列に加え、関係のない7アミノ酸（RHVVLLV）が付加したポリペプチド（配列番号６９）が生成される。
REV_G5_59
Ｔゲノム：28塩基が欠失している。WTが839アミノ酸からなるのに対し、211アミノ酸までWTと同一のアミノ酸配列に加え、関係のない54アミノ酸（QRLLRSSKIDLLGSEIAGTLKFSQCFLQEMEQLNFCTRRYMLLPPWLLHVIFGL）が付加したポリペプチド（配列番号７１）が生成される。
Ｓゲノム：3塩基GCAが欠失している。WTが838アミノ酸からなるのに対し、212番目の1アミノ酸（A）が欠失した837アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号７０）が生成される。
ROX_G1-1（15360＿Ｇ1-1）、ROXG1-30（15360＿Ｇ1-30）
Ｔゲノム：1塩基Aが挿入されている。WTが165アミノ酸からなるのに対し、40アミノ酸までWTと同一のアミノ酸配列に加え、関係のない3アミノ酸（KKA）が付加したポリペプチド（配列番号１２３、１２５）が生成される。
Ｓゲノム：1塩基のAが欠失している。WTが168アミノ酸からなるのに対し、40アミノ酸までWTと同一のアミノ酸配列に加え、関係のない14アミノ酸（EGIESVIVSRFCRV）が付加したポリペプチド（配列番号１２２、１２４）が生成される。
ROX_G1-131（15360＿G1-131）
Ｔゲノム：1塩基のAが欠失している。WTが165アミノ酸からなるのに対し、40アミノ酸までWTと同一のアミノ酸配列に加え、関係のない14アミノ酸（EGIESVIVSRFCRV）が付加したポリペプチド（配列番号１２９）が生成される。
Ｓゲノム：39塩基および13塩基が挿入されている。WTが168アミノ酸からなるのに対し、39アミノ酸までWTと同一のアミノ酸配列に加え、関係のない4アミノ酸（FLCG）が付加したポリペプチド（配列番号１２８）が生成される。
ROX_G1-46（15360＿G1-46）
Ｔゲノム：20塩基が欠失している。WTが165アミノ酸からなるのに対し、36アミノ酸までWTと同一のアミノ酸配列に加え、関係のない3アミノ酸（ENQ）が付加したポリペプチド（配列番号１２７）が生成される。
Ｓゲノム：1塩基のGが挿入されている。WTが168アミノ酸からなるのに対し、40アミノ酸までWTと同一のアミノ酸配列に加え、関係のない3アミノ酸（EKA）が付加したポリペプチド（配列番号１２６）が生成される。【０２１９】
（ｅ）温室におけるわき芽発達の評価
（ｄ）において得られたT1系統の個体を温室において栽培し、２−２．に記載の通りに評価した。ＲＥＶ変異体の評価結果を図１９および２０に、＃１５３６０変異体の評価結果を図２１に示す。【０２２０】
図１９および２０に示す通り、REVに変異を導入した4系統全てにおいて、１次わき芽の数および新鮮重量では野生型との間で有意差がなく、２次わき芽の数および新鮮重量は野生型に比べて統計的に有意に減少していた。図２１に示す通り、#15360に変異を導入した4系統全てにおいて、１次わき芽の数および新鮮重量では野生型と有意差を示さず、２次わき芽の数および新鮮重量は野生型に比べて統計的に有意な減少を示した。以上の結果から、REVについてはEMS処理により作製したTUMから選抜した変異体に加えて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍによって作製した複数の異なる変異体でも、２次わき芽の発達が選択的に抑制された。#15360においては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍによって作製した複数の異なる変異体において、遺伝子発現の抑制と同じく、２次わき芽の発達が選択的に抑制されることが確認された。【０２２１】
（７−２．Ｂｌ１変異体およびＬＳ変異体）
（ａ）形質転換の準備
アグロバクテリウムを形質転換するベクターの構築において、5’末端にKpnIサイトおよび3’末端に末端側にはBamHIサイトが付加されているsgRNA発現カセットの合成を、GeneArt（登録商標） Strings（商標） DNA Fragmentsから、ライフテクノロジーに合成を委託した。入手したsgRNA発現カセットの塩基配列は以下の通り。【０２２２】
【化７】
2017170796.tif 000011
また、5’末端にKpnIサイト、および3’末端に末端側にはBamHIサイトが付加されているsgRNA発現カセットを、ユーロフィンジェノミクスの人工遺伝子合成サービスを利用して合成した。入手したsgRNA発現カセットの塩基配列は以下の通り。なお、続く、タバコ形質転換および形質転換体の栽培には、３−３．から変更点はないので記載を省略した。【０２２３】
【化８】
2017170796.tif 000012
【０２２４】
【化９】
2017170796.tif 000013
【０２２５】
【化１０】
2017170796.tif 000014
（ｂ）変異の有無および変異配列の確認
栽培した形質転換体における変異の有無および変異配列の確認を、３−３．の（ｃ）に記載の通りに実施した。ゲノムＤＮＡ上にある、ガイド配列を含んでいる領域を特異的に増幅させるプライマーを設計した。各プライマーの配列を以下に示す。また、以下に示す通り、一部のＰＣＲのみ条件を変更して実施した。
（2A-1_14、2A-1_19、2A-1_119、2A-1_120、2A_133_17、2A_133_122、2A_133_142：Ｔゲノム）
NtBl1-1_2A_F1：AAGTATTACTACTACAAAATTCCAACG、および
Nb_Bl1_2A_R1：CCATCTGATGAAGAACAACTTGCの組合せ
（2A-1_14、2A-1_19、2A-1_119、2A-1_120、2A_133_17、2A_133_122、2A_133_142：Ｓゲノム）
NtBl1-2_1A_F1：TTAAACACTAGAGAGTGAGAGAGTGC、およびNtBl1-2_2A_F1：CAGATGTTTAATTATTAAGACAAAGTTCCの組合せ
（2G-35_10、2G-37_103、2G-126_10、2G-126_139：Ｔゲノム）
NtBl1-1_2G_F1：ATATGTTTGAATATAGGGGGAGGG、およびNtBl1-1_2G_R1：TGGTTTACAAAAGGAAAAGTTTTC
（2G-35_10、2G-37_103、2G-126_10、2G-126_139：Ｓゲノム）
NtBl1-2_2G_F1：ATATGTTTGAGTATAAAGGGAGGA、およびNtBl1-2_2G_R1：TTGGTTTACTAGAGAAAAAATTTCCの組合せ
（LS_1A-8_4、13、LS_1A-9_32、48:Ｔゲノム）
LS_1A_F_T：TACCGGTACTGGAAATGACCTC、およびLS_1A_R_T：TCCTTAACATTTCGCGGTCTの組合せ
（LS_1A-8_4、13、LS_1A-9_32、48:Ｓゲノム）
LS_1A_F_S：CCGGTACTGGAAATGACCTTG、およびLS_1,2_R3：GCAAAGTTGCTTCCAATGAATの組合せ
（LS_3A-12、LS_3A-15、およびLS_3A-30:Ｔゲノム）
LS_3A_4G_F_T：GTTTGGTTCGGAAGAGAAATTATAG、およびLS_3A_4G_R_T：CTTTGTCCTTCACCATGCAGの組合せ
（LS_3A-12、LS_3A-15、およびLS_3A-30:Ｓゲノム）
LS_3A_4G_F_S：TTGGTTCGGGAGAGAAATAATTGA、およびLS_3A_4G_R_S：CGCCAAGAAGATATGGAAAAの組合せ
（Bl_4A-11、Bl_4A-13、Bl4A-16:Ｔゲノム）
Bl_3A_4A_F_T：ATTTCTTCTGCCCACCAGC、およびBl_3A_4A_R_ST：TCTCATCATTGAACACGAACAの組合せ
（Bl_4A-11、Bl_4A-13、Bl4A-16:Ｓゲノム）
Bl_3A_4A_F_S：CCTAATTTGGGTGCTACAAATAAT、およびBl_3A_4A_R_ST：TCTCATCATTGAACACGAACAの組合せ。
（変更した一部のＰＣＲ条件）
LS_1AのＴゲノム
９４℃で６０秒
９８℃で１０秒、５７℃で１５秒および６８℃で５０秒を１サイクルとして、４０サイクル
LS_1AのＳゲノム
９４℃で６０秒
９８℃で１０秒、６５℃で１５秒および６８℃で５０秒を１サイクルとして、４５サイクル
LS_3AのＴゲノム
９４℃で６０秒
９８℃で１０秒、５５℃で１５秒および６８℃で３５秒を１サイクルとして、４５サイクル
LS_3AのＳゲノム
９４℃で６０秒
９８℃で１０秒、６０℃で１５秒および６８℃で５０秒を１サイクルとして、４０サイクル
Bl_4AのＴゲノム、Ｓゲノム
９４℃で６０秒
９８℃で１０秒、６０℃で１５秒および６８℃で５０秒を１サイクルとして、４０サイクル。【０２２６】
（ｃ）組換え体の選抜
３−３．に記載にしたがって、以下のＴ２系統およびＴ１系統を選抜した。まず、得られたＴ２系統の個体における変異体ポリペプチドを以下に示す。
2A-1_14
Ｔゲノム：WTが336アミノ酸からなるのに対し、107アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない12アミノ酸（TGILNSRKSLWD）が付加したポリペプチド（配列番号８４）が生成される。
Ｓゲノム：WTが337アミノ酸からなるのに対し、WTと同じポリペプチドおよびWTと106アミノ酸まで同一のアミノ酸に加えて、関係のない3アミノ酸（LEY）が付加したポリペプチド（配列番号８３）が生成される。
2A-1_19
Ｔゲノム：WTが336アミノ酸からなるのに対し、WTと同じポリペプチドおよびWTと107アミノ酸まで同一のアミノ酸に加えて、関係のない12アミノ酸（TGILNSRKSLWD）が付加したポリペプチド（配列番号８６）が生成される。
Ｓゲノム：WTが337アミノ酸からなるのに対し、106アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない3アミノ酸（LEY）が付加したポリペプチド（配列番号８５）が生成される。
2A_133_17
Ｔゲノム：WTが336アミノ酸からなるのに対し、107アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない12アミノ酸（TGILNSRKSLWD）が付加したポリペプチド（配列番号９８）が生成される。
Ｓゲノム：WTと同じ337アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号９７）が生成される。
2A_133_122
Ｔゲノム：WTが336アミノ酸からなるのに対し、107アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない12アミノ酸（TGILNSRKSLWD）が付加したポリペプチド（配列番号１００）が生成される。
Ｓゲノム：WTが337アミノ酸からなるのに対し、WTと同じポリペプチドおよびWTの107番目のアスパラギンが欠失した336アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号９９）が生成される。
2A_133_142
Ｔゲノム：WTが336アミノ酸からなるのに対し、107アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない12アミノ酸（TGILNSRKSLWD）が付加したポリペプチド（配列番号１０２）が生成される。
Ｓゲノム：WTが337アミノ酸からなるのに対し、WTと同じポリペプチドおよびWTの107番目のアスパラギンが欠失した336アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号１０１）が生成される。
2A_1_119
Ｔゲノム：WTが336アミノ酸からなるのに対し、107アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない12アミノ酸（TGILNSRKSLWD）が付加したポリペプチド（配列番号８８）が生成される。
Ｓゲノム：WTと同じ337アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号８７）が生成される。
2A_1_120
Ｔゲノム：WTが336アミノ酸からなるのに対し、107アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない12アミノ酸（TGILNSRKSLWD）が付加したポリペプチド（配列番号９０）が生成される。
Ｓゲノム：WTと同じ337アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号８９）が生成される。
2G-35_10
Ｔゲノム：WTが336アミノ酸からなるのに対し、56アミノ酸まで同一のアミノ酸に加えて、関係のない8アミノ酸（KMAKLSKA）が付加したポリペプチド（配列番号１１０）が生成される。
Ｓゲノム：WTが337アミノ酸からなるのに対し、56アミノ酸まで同一のアミノ酸からなるポリペプチド（配列番号１０９）が生成される。
2G-37_103
Ｔゲノム：WTが336アミノ酸からなるのに対し、55と56番目の2アミノ酸が欠失した334アミノ酸からなるポリペプチド（配列番号１１２）が生成される。
Ｓゲノム：WTが337アミノ酸からなるのに対し、54アミノ酸まで同一のアミノ酸に加えて、関係のない7アミノ酸（MAKLFKA）が付加したポリペプチド（配列番号１１１）が生成される。
2G-126_10
Ｔゲノム：WTが336アミノ酸からなるのに対し、56アミノ酸まで同一のアミノ酸に加えて、関係のない2アミノ酸（DG）が付加したポリペプチド（配列番号１１４）が生成される。
Ｓゲノム：WTが337アミノ酸からなるのに対し、56アミノ酸まで同一のアミノ酸からなるポリペプチド（配列番号１１３）が生成される。
2G-126_139
Ｔゲノム：WTが336アミノ酸からなるのに対し、54アミノ酸まで同一のアミノ酸に加えて、関係のない1アミノ酸（I）が付加したポリペプチド（配列番号１１８）が生成される。
Ｓゲノム：WTが337アミノ酸からなるのに対し、52アミノ酸まで同一のアミノ酸に加えて、関係のない6アミノ酸（AKLFKA）が付加したポリペプチド（配列番号１１７）が生成される。【０２２７】
次に、得られたＴ１系統の個体における変異体ポリペプチドは以下の通りであった。
LS_1A-8
Ｔゲノム：WTが410アミノ酸からなるのに対し、247アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない15アミノ酸（TQALKRPRNVKDFFA）が付加したポリペプチド（配列番号７３）が生成される。
Ｓゲノム：WTが407アミノ酸からなるのに対し、243アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない15アミノ酸（PQALERPRKVKDFFA）が付加したポリペプチド（配列番号７２
）が生成される。
LS_1A-9
Ｔゲノム：WTが410アミノ酸からなるのに対し、246アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない3アミノ酸（TGS）が付加したポリペプチド（配列番号７６）が生成される。
Ｓゲノム：WTが407アミノ酸からなるのに対し、244アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない15アミノ酸（SQALERPRKVKDFFA）が付加したポリペプチド（配列番号７５）および244アミノ酸まで同一のアミノ酸に加えて、関係のない15アミノ酸（TQALERPRKVKDFFA）が付加したポリペプチド（配列番号７４）が生成される。
LS_3A-12
Ｔゲノム：WTが410アミノ酸からなるのに対し、394アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない18アミノ酸（SWVGKINPFFPYLLGVKL）が付加したポリペプチド（配列番号７８）が生成される。
Ｓゲノム：WTが407アミノ酸からなるのに対し、391アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない66アミノ酸（SWVGKINPFFPYLLGVKFKTLKNKIFIYLHGEGQRGLQSQVLFFFFYIYILFGFKVIGLMNVLILT）が付加したポリペプチド（配列番号７７）が生成される。
LS_3A-15
Ｔゲノム：WTが410アミノ酸からなるのに対し、394アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない18アミノ酸（SWVGKINPFFPYLLGVKL）が付加したポリペプチド（配列番号８０）が生成される。
Ｓゲノム：WTが407アミノ酸からなるのに対し、391アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない66アミノ酸（SWVGKINPFFPYLLGVKFKTLKNKIFIYLHGEGQRGLQSQVLFFFFYIYILFGFKVIGLMNVLILT）が付加したポリペプチド（配列番号７９）が生成される。
LS_3A-30
Ｔゲノム：WTが410アミノ酸からなるのに対し、397アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない14アミノ酸（LAKSTPFFHIFLAL）が付加したポリペプチド（配列番号８２）が生成される。
Ｓゲノム：WTが407アミノ酸からなるのに対し、394アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない18アミノ酸（LAKSTPFFHIFLALNLKP）が付加したポリペプチド（配列番号８１）が生成される。
Bl_4A-11
Ｔゲノム：WTが336アミノ酸からなるのに対し、301アミノ酸までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない29アミノ酸（MATMAVLLDVTTTTVCSCSMMRIITSQMR）が付加したポリペプチド（配列番号１２１）が生成される。
Ｓゲノム：WTが337アミノ酸からなるのに対し、302までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない5アミノ酸（QWQQW）が付加したポリペプチド（配列番号１２０）、および同じく302までWTと同一のアミノ酸に加えて、関係のない4アミノ酸（YYWM）が付加したポリペプチドが（配列番号１１９）生成される。【０２２８】
（ｅ）温室におけるわき芽発達の評価
Ｂｌ１遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子に変異を有していない７つのＴ２系統の個体（2A-1_14、2A-133_122、2A-133_142、2A-1_19、2A-133_17、2A-1_119、および2A-1_120）を温室において栽培して、３−３．の記載にしたがってわき芽について評価した。2A-1_14、2A-133_122および2A-133_142は、ＳゲノムにおけるＢｌ１の一方の対立遺伝子に変異を有していない（Ｔ＋／＋Ｓ＋／−）。2A-1_19は、ＴゲノムにおけるＢｌ１の一方の対立遺伝子に変異を有していない（Ｔ＋／−Ｓ＋／＋）。2A-133_17、2A-1_119および2A-1_120は、ＳゲノムにおけるＢｌ１の両方の対立遺伝子に変異を有していない（Ｔ＋／＋Ｓ−／−）。評価した７系統のいずれも、対照であるWT（SR-1）と比べて、１次わき芽の数、重量に差はみられないが、２次わき芽の数、重量とも有意な減少を示した（図２２）。したがって、２次わき芽の抑制には、ＳおよびＴゲノム上にあるＮｔＢｌ１遺伝子の全対立遺伝子（４つ）に変異を導入する必要がなく、ＳまたはＴゲノム上にあるＮｔＢｌ１遺伝子の２つの対立遺伝子に変異を導入すればよいことが分かった。【０２２９】
５つのＴ２系統（2G-35_10、2G-37_103、2G-126_10、2G-126_139、Bl_4A-11）を、わき芽について評価した。これらの系統は、異なる遺伝子（ＬＳまたはＢｌ１）に変異が導入されているが、当該変異が、フレームシフトを生じさせ、野生型ポリペプチドより短いポリペプチドを産生させる点において共通する。2G-35_10、2G-37_103、2G-126_10、2G-126_139を評価した結果を図２３に、Bl_4A-11を評価した結果を図２４に示す。なお、図２３および２４には、心止め後に実施した３回のわき芽の評価がまとめられている。Ｂｌ１遺伝子に変異を導入した2Gの4系統、Bl_4Aの1系統のいずれにおいても、１次わき芽の数、重量に差はみられないが、２次わき芽の数、重量とも顕著な減少を示した。特に、2Gの4系統では全く２次わき芽の発達がみられなかった。以上の結果から、Ｂｌ１遺伝子においても、複数の異なる変異体で、２次わき芽の発達が選択的に抑制された。【０２３０】
次に、５つのＴ１系統（LS_1A-8、LS_1A-9、LS_3A-12、LS_3A-15、LS_3A-30）を同様に評価した。LS_1A-8、LS_1A-9を評価した結果を図２５に示す。LS_3A-12、LS_3A-15、LS_3A-30を評価した結果を図２６に示す。なお、図２５および２６には、心止め後に実施した３回のわき芽の評価がまとめられている。LS_1Aの2系統、LS_3Aの3系統いずれも、１次わき芽の数、重量に差はみられないが、２次わき芽の発達は全くみられなかった。以上の結果から、LS遺伝子においても、REV遺伝子と同様、EMS処理により作製したTUMから選抜した変異体に加えて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍによって作製した複数の異なる変異体でも、２次わき芽の発達が選択的に抑制された。【０２３１】
〔参考文献〕
１．Takahashi H, Kamakura H, Sato Y, Shiono K, Abiko T, Tsutsumi N, Nagamura Y, Nishizawa NK, Nakazono M. (2010) A method for obtaining high quality RNA from paraffin sections of plant tissues by laser microdissection. J Plant Res 123: 807-813
２．Li JF, Norville JE, Aach J, McCormack M, Zhang D, Bush J, Church GM, Sheen J. (2013) Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotechnol. 31(8), 688-91.
３．Waibel F, Filipowicz W. (1990) U6 snRNA genes of Arabidopsis are transcribedby RNA polymerase III but contain the same two upstream promoter elements as RNA polymerase II-transcribed U-snRNA genes. Nucleic Acids Res. 25;18(12), 3451-8.４．Marshallsay C1, Kiss T, Filipowicz W. (1990) Amplification of plant U3 and U6 snRNA gene sequences using primers specific for an upstream promoter element and conserved intragenic regions. Nucleic Acids Res. 25;18(12), 3459-66。
【産業上の利用可能性】
【０２３２】
本発明によれば、タバコ植物の栽培時における不要なわき芽の発達を抑制できるので、栽培の手間およびコストを減らすとともに、収穫される葉の品質の向上につながる。また、本発明によれば、２次わき芽の発達を選択的に抑制できるので、災害などに起因する損傷による植物体の死滅を回避する可能性を高め得る。
【図１】
2017170796.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
2017170796000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月1日(2018.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）〜（５）のポリペプチド：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（２）配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（３）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（４）配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；ならびに
（５）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方
のいずれかをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異がゲノムに導入されており、
上記機能抑制は、わき芽のうち、１次わき芽の除去の後に発達する２次わき芽の発達を抑制する、タバコ植物体。
【請求項２】
上記機能抑制は、上記２次わき芽の数または重量を、野生株植物と比べて１／２以下に減少させる、請求項１に記載のタバコ植物体。
【請求項３】
上記機能抑制は、野生株植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、請求項１または２に記載のタバコ植物体。
【請求項４】
上記機能抑制は、野生株植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、請求項３に記載のタバコ植物体。
【請求項５】
上記機能抑制は、野生株植物と比べたときの、上記遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少である、請求項３に記載のタバコ植物体。
【請求項６】
上記機能抑制は、上記遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進である、請求項３に記載のタバコ植物体。
【請求項７】
上記変異は、上記遺伝子に導入されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタバコ植物体。
【請求項８】
上記変異は、自然突然変異、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されている、請求項７に記載のタバコ植物体。
【請求項９】
上記変異は、上記ｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記遺伝子の存在する領域外への挿入である、請求項６に記載のタバコ植物体。
【請求項１０】
上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、請求項９に記載のタバコ植物体。
【請求項１１】
ニコチアナ・タバカムまたはニコチアナ・ルスチカに属する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタバコ植物体。
【請求項１２】
タバコ植物体の製造方法であって、
（１）〜（５）のポリペプチド：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（２）配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（３）配列番号９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；
（４）配列番号１３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方；ならびに
（５）配列番号１７に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド、および配列番号１９に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドの少なくとも一方
のいずれかをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を導入するステップを包含しており、
上記機能抑制は、わき芽のうち、１次わき芽の除去の後に発達する２次わき芽の発達を抑制する、製造方法。
【請求項１３】
上記導入するステップにおいて生成される個体から、上記わき芽のうち、１次わき芽の除去の後に発達する２次わき芽の発達が抑制されている個体を選抜するステップをさらに包含している、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
上記選抜するステップにおいて、上記２次わき芽の数または重量が野生株植物と比べて減少している個体を選抜する、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
上記導入するステップは、上記変異を上記遺伝子に導入することを含んでいる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１６】
上記導入するステップは、自然突然変異、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施される、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
上記導入するステップは、上記遺伝子から転写されるｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドを、上記遺伝子の存在する領域外に挿入することを含んでいる、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、請求項１７に記載の製造方法。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のタバコ植物体または請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたタバコ植物体の、子孫または当該タバコ植物体の交配によって得られた育種後代。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のタバコ植物体、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたタバコ植物体、または請求項１９に記載の子孫もしくは育種後代から収穫された、葉たばこ。
【国際調査報告】
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