(57)【要約】  本発明は、癌細胞を簡便に判定できる方法の提供を課題とする。  本発明は、「下記工程１〜３を含む、癌細胞の判定方法：（１）少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部を含む細胞由来の核酸をバイサルファイト反応に付す工程１、（２）工程１で得られた反応産物のうち、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸のバイサルファイト反応産物を増幅する工程２、（３）工程２で得られた増幅産物を電気泳動に付した結果に基づいて当該細胞が癌細胞か否かの判定を行う工程３」、「配列番号６で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８の一部又は全部からなり少なくとも配列番号７で示される塩基配列を含む塩基配列からなるリバースプライマー又は配列番号９で示される塩基配列からなるリバースプライマーからなるプライマーセット」、並びに「前記プライマーセットを含む細胞の癌判定用試薬」に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程１〜３を含む、癌細胞の判定方法：
（１）少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部を含む細胞由来の核酸をバイサルファイト反応に付す工程１、
（２）工程１で得られた反応産物のうち、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸のバイサルファイト反応産物を増幅する工程２、
（３）工程２で得られた増幅産物を電気泳動に付した結果に基づいて当該細胞が癌細胞か否かの判定を行う工程３。
【請求項２】
工程２で増幅する核酸が、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号５で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸のバイサルファイト反応産物である、請求項１記載の判定する方法。
【請求項３】
工程２で増幅する核酸が、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号４で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸のバイサルファイト反応産物である、請求項１記載の判定する方法。
【請求項４】
工程２で増幅する核酸が、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号３で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸のバイサルファイト反応産物である、請求項１記載の判定する方法。
【請求項５】
工程２の増幅する工程がＰＣＲ反応によりなされる、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＲ反応が、配列番号６で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８の一部又は全部からなり少なくとも配列番号７で示される塩基配列を含む塩基配列からなるリバースプライマー又は配列番号９で示される塩基配列からなるリバースプライマーを用いてなされる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
電気泳動がゲル電気泳動である、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
配列番号６で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８の一部又は全部からなり少なくとも配列番号７で示される塩基配列を含む塩基配列からなるリバースプライマー又は配列番号９で示される塩基配列からなるリバースプライマーからなるプライマーセット。
【請求項９】
請求項８記載のプライマーセットを含む、癌細胞判定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＦＯＸＢ２遺伝子を用いた癌細胞の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フォークヘッド又はウイングド・ヘリックス  ＤＮＡ  結合ドメインを持った転写因子の一群をＦＯＸ  （Ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘ）と呼んでおり、ヒトでは  約５０  種類存在している。主に発生調節因子、組織特異的調節因子、細胞周期調節因子として機能しているが、作用がほとんど解明されていないものも多数ある。その中で、ＦＯＸＢ２は、アフリカツメガエルでは胚の神経形成に関与しているとの報告がなされているが、哺乳動物での機能については未だ解明されていない。
一方、ＤＮＡのメチル化は癌化と関連があることが知られており、特開２００８−２８３９４７（特許文献１）では、ＦＯＸＢ２遺伝子のＣｐＧ  アイランド（ＣｐＧジヌクレオチド：−ＣＧ−配列）におけるメチル化率を元に食道癌を検出する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２８３９４７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記特許文献１には、癌細胞がＣｐＧジヌクレオチドのシトシンのメチル化を受けることが多いと記載されており、更に、食道癌のＦＯＸＢ２遺伝子をＢＡＭＣＡ法で測定し、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンがメチル化されていることを確認したことが記載されている。しかしながら、この方法により癌細胞か否かを判定するためには、塩基配列を解読しＣｐＧジヌクレオチドのシトシンがメチル化されているか否かを確認する必要があった。そのため、簡便に細胞が癌細胞であるか否かを判定する方法が望まれていた。即ち、本発明は、癌細胞を簡便に判定できる方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、癌細胞と正常細胞とを容易に判別する方法としてバイサルファイト反応産物の検出方法について鋭意検討した結果、バイサルファイト反応後のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域のうち特定の塩基配列を含む核酸を増幅し、電気泳動することで癌細胞由来の増幅産物と正常細胞由来の増幅産物とを分離できることを見出した。バイサルファイト反応に付した後に増幅される塩基配列は、癌細胞であっても正常細胞であっても同じ長さであるため、それらの増幅産物を電気泳動で分離するのは難しいと考えられた。しかし、特定の塩基配列を含む核酸を増幅すると予想外に、癌細胞由来の増幅産物と正常細胞由来の増幅産物を分離できることを見出し、本発明者らは本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、「下記工程１〜３を含む、癌細胞の判定方法：
（１）少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部を含む細胞由来の核酸をバイサルファイト反応に付す工程１、（２）工程１で得られた反応産物のうち、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸のバイサルファイト反応産物を増幅する工程２、（３）工程２で得られた増幅産物を電気泳動に付した結果に基づいて当該細胞が癌細胞か否かの判定を行う工程３」、「配列番号６で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８の一部又は全部からなり少なくとも配列番号７で示される塩基配列を含む塩基配列からなるリバースプライマー又は配列番号９で示される塩基配列からなるリバースプライマーからなるプライマーセット」、並びに「前記プライマーセットを含む細胞の癌判定用試薬」に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の方法によれば、従来法のように塩基配列を解読する必要がなく、制限酵素処理等を行うこともなく、バイサルファイト反応産物の特定塩基配列からなる核酸を増幅し、得られた増幅産物を電気泳動に付すことで、目的の細胞が癌細胞であるか否かの判定をすることができる。即ち、非常に簡便な方法で短時間に目的の細胞が癌細胞であるか否かの判定をすることができる。また、塩基配列を解読する必要や制限酵素処理等を行う必要がないため、それに要するコストや手間を削減できるメリットも有する。更にまた、本発明の方法は、良性の腫瘍は非癌細胞と判定することができ、高い精度で癌を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例１において、ｈｉＰＳの正常細胞とヒトグリオーマ細胞（Ｕ２５１−ＭＧ−Ｐ１）の癌細胞を用いて本発明の方法によりＰＣＲ増幅産物を泳動した結果を示す。
【図２】実験例１において、ｈｉＰＳの正常細胞とＵ２５１−ＭＧ−Ｐ１の癌細胞を用いてシトシンのメチル化を分析した結果を示す。
【図３】実施例２において、ｈｉＰＳの正常細胞とＵ２５１−ＭＧ−Ｐ１の癌細胞のＦＯＸＢ２プロモータ領域のプラスミドを用いて得たＰＣＲ増幅産物を泳動した結果と、比較例１において、ｈｉＰＳの正常細胞とヒトグリオーマ細胞（Ｕ２５１−ＭＧ−Ｐ１）の癌細胞を用いてＦＯＸＢ１遺伝子のＰＣＲ増幅産物を泳動した結果を示す。
【図４】比較例２において、ｈｉＰＳの正常細胞とＵ２５１−ＭＧ−Ｐ１の癌細胞を用いてＦＯＸＢ２遺伝子の増幅配列１を泳動した結果を示す。
【図５】比較例２において、ｈｉＰＳの正常細胞とＵ２５１−ＭＧ−Ｐ１の癌細胞を用いてＦＯＸＢ２遺伝子の増幅配列２を泳動した結果を示す。
【図６】比較例２において、ｈｉＰＳの正常細胞とＵ２５１−ＭＧ−Ｐ１の癌細胞を用いてＦＯＸＢ２遺伝子の増幅配列３を泳動した結果を示す。
【図７−１】実施例３において、乳癌患者由来の細胞（正常組織、腫瘍、リンパ節）を用いてＦＯＸＢ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物を泳動した結果を示す。
【図７−２】実施例３において、乳癌患者由来の細胞（正常組織、腫瘍、リンパ節）を用いてＦＯＸＢ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物を泳動した結果を示す。
【図７−３】実施例３において、乳癌患者由来の細胞（正常組織、腫瘍、リンパ節）を用いてＦＯＸＢ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物を泳動した結果を示す。
【図８−１】実施例４において、大腸癌患者由来の細胞（正常組織、腫瘍）を用いてＦＯＸＢ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物を泳動した結果を示す。
【図８−２】実施例４において、大腸癌患者由来の細胞（正常組織、腫瘍）を用いてＦＯＸＢ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物を泳動した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［本発明の癌細胞の判定方法］
本発明の癌細胞の判定方法（以下、本発明の方法と略記する場合がある）は、（１）少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部を含む細胞由来の核酸をバイサルファイト反応に付す工程１、（２）工程１で得られた反応産物のうち、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸のバイサルファイト反応産物を増幅する工程２、（３）工程２で得られた増幅産物を電気泳動に付した結果に基づいて当該細胞が癌細胞か否かの判定を行う工程３からなる。
【０００９】
［工程１］
工程１における核酸は、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部を含む核酸であって、細胞由来のものであればよい。
当該細胞は、判定する癌に応じてその細胞の種類は選択され、例えば、腎臓、子宮、肝臓、乳腺、卵巣、大腸（結腸、直腸）、前立腺、肺、膵臓等の上皮細胞由来の細胞、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球等の白血球、骨髄細胞、Ｔ細胞等の造血器由来の細胞、肉腫等の非上皮性細胞由来の細胞、神経芽細胞等の神経由来の細胞などが挙げられ、上皮細胞由来の細胞が好ましく、中でも、乳腺、肺、大腸等の上皮細胞由来の細胞が好ましい。また、当該細胞は、哺乳動物由来のものが好ましく、ヒト由来のものが特に好ましい。
また、当該細胞は、血液（全血、血清及び血漿）、リンパ液、尿、乳頭分泌物、糞便等の体液、組織、細胞等の生体試料、これらの培養物等の試料から自体公知の方法により取得することができる。
【００１０】
工程１における核酸は、上記の細胞から抽出すればよく、当該抽出方法は、自体公知のＤＮＡの抽出方法に基づいてなされればよい。当該ＤＮＡの抽出方法としては、具体的には、例えば、試料と界面活性剤（コール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム等）を含む処理液とを混合し、得られた混合液を物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波粉砕等）に付し、試料に含まれるＤＮＡを混合液中に遊離させることによりＤＮＡを抽出する方法、フェノール・クロロホルムを用いて試料からＤＮＡを抽出する方法、カラム抽出法が挙げられる。中でも、フェノール・クロロホルムを用いて試料からＤＮＡを抽出する方法及びカラム抽出法が好ましい。
【００１１】
フェノール・クロロホルムを用いて試料からＤＮＡを抽出する方法とは、タンパク質変性剤であるフェノールとタンパク質の変性を促進するクロロホルムを用いて、試料中に存在するタンパク質を除きＤＮＡを抽出する方法である。具体的な方法は、自体公知の方法に基づいてなされればよく、市販のキット［例えば、Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌ（ＱＴＢ株式会社製）等］を用いて行ってもよい。
【００１２】
また、カラム抽出法とは、メンブレン等を内部に備えたカラム等の筒状の容器に試料を添加し、物質の大きさ、吸着力、電荷、疎水性等の違いを利用して、試料中からＤＮＡを抽出する方法である。具体的な方法は、自体公知の方法に基づいてなされればよく、市販のキット［例えば、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＳＰ  ｋｉｔ  ＤＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ（倉敷紡績株式会社製）等］を用いて行ってもよい。
【００１３】
工程１における核酸としては、例えば、肝癌を判定する場合には肝細胞由来の核酸であって少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部を含む核酸を用いればよく、例えば、前立腺癌を判定する場合には前立腺細胞由来の核酸であって少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部を含む核酸を用いればよい。また、白血球が癌細胞か否かを判定する場合には、血液から取り出した（分離した）白血球又は血液そのものを用いて白血球由来の核酸であって少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部を含む核酸を用いればよい。
【００１４】
工程１における核酸は、少なくともＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域に存在する配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部を含む核酸であればよい。配列番号１で示される塩基配列は、ＦＯＸＢ２遺伝子の一部であり、ＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域と推定される領域の塩基配列である。尚、本明細書において、ＦＯＸＢ２遺伝子とは、ＦＯＸＢ２タンパク質の構造遺伝子だけでなくそのプロモータ領域、エンハンサー領域、サイレンサー領域等を含む。
工程１における核酸の好ましい例としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、少なくとも配列番号３で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部を含む核酸、少なくとも配列番号４で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部を含む核酸、並びに、少なくとも配列番号５で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部を含む核酸が挙げられ、中でもゲノムＤＮＡが特に好ましい。
尚、上記配列番号１で示される塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＬ３５３６３７の塩基番号１０６５６６−１０７０６５に記載されており、上記配列番号２で示される塩基配列は、同Ｎｏ．の塩基番号１０６８１２−  １０６９６１に記載されており、上記配列番号３で示される塩基配列は、同Ｎｏ．の塩基番号１０６７７９−１０６９９０に記載されており、上記配列番号４で示される塩基配列は、同Ｎｏ．の塩基番号１０６７７９−１０６９９５に記載されており、上記配列番号５で示される塩基配列は、同Ｎｏ．の塩基番号１０６７７９−１０７０６５に記載されている。
【００１５】
工程１は、例えばＷＯ２０１３／０８９０６３等に記載されている自体公知のバイサルファイト法に準じてなされればよく、具体的には、例えば上記細胞から抽出した上記核酸を、要すれば一本鎖化処理に付した後、亜硫酸塩と反応させてシトシンをスルホン酸化し、スルホン酸化したシトシンを加水分解させ、更に、アルカリ存在下で脱スルホン酸化させることによりなされる。該反応によれば、メチル化シトシンは反応せずそのままであり、非メチル化シトシンのみがウラシルに変換される。
【００１６】
工程１は、ＷＯ２０１３／０８９０６３に記載の下記一般式［１］〜［８］で示される化合物の少なくとも１種の存在下でバイサルファイト反応を行ってもよい。その場合のこれら化合物中の置換基（Ｒ１〜Ｒ３９）の具体例、化合物の具体例、化合物の使用量、その使用方法等については、ＷＯ２０１３／０８９０６３の記載に準じて設定・実施されればよい。
【００１７】
一般式［１］で示される化合物
2017142070.tif 000002
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立して、水素又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｎは１〜３の整数を表す）、
【００１８】
一般式［２］で示される化合物
2017142070.tif 000003
（式中、Ｙは、炭素原子、酸素原子又は窒素原子を表し、Ｒ７〜Ｒ１２は、それぞれ独立して水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、ｋは０〜２の整数を表すが、Ｙが酸素原子の場合は０を、Ｙが窒素原子の場合は１を、Ｙが炭素原子の場合は２を表す。）
【００１９】
一般式［３］で示される化合物
2017142070.tif 000004
（式中、Ｒ１３〜Ｒ１５は、それぞれ独立して水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基を表す）、
【００２０】
一般式［４］で示される化合物
2017142070.tif 000005
（式中、Ｒ１７及びＲ１９は、それぞれ独立して水素原子、アミノ基又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ１６、Ｒ１８及びＲ２０は、それぞれ独立して水素原子、アミノ基、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数２〜６のジアルキルアミノ基を表し、Ｒ１６とＲ１７は、Ｒ１６の隣の炭素原子、Ｒ１７の隣の炭素原子と共にベンゼン環を形成してもよい。）、
【００２１】
一般式［５］で示される化合物
2017142070.tif 000006
（式中、Ｒ２１及びＲ２２はそれぞれ独立して炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｘ１はカウンターアニオンを表す）、
【００２２】
一般式［６］で示される化合物
2017142070.tif 000007
（式中、Ｒ２３は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ２４〜Ｒ２８は、それぞれ独立して水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｘ２はカウンターアニオンを表す）、
【００２３】
一般式［７］で示される化合物
2017142070.tif 000008
（式中、Ｒ２９〜Ｒ３４は、それぞれ独立して水素原子、又は炭素数１〜６のアルキル基を表す）
【００２４】
般式［８］で示される化合物
2017142070.tif 000009
［式中、Ｚは窒素原子又は炭素原子を表し、ｍは０又は１の整数を表し、Ｚが窒素原子の場合は０を表し、Ｚが炭素原子の場合は１を表す。Ｒ３５〜Ｒ３９はそれぞれ独立して水素又は炭素数１〜６のアルキル基を表す］。
【００２５】
工程１における核酸は、水（滅菌水）や緩衝液等の溶液に当該核酸を溶解した状態で使用される。該緩衝液としては、例えばｐＨ６〜８の、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液等が挙げられる。ここで用いられる溶液としては、滅菌水が好ましい。該溶液中のＤＮＡ量は特に限定はされないが、通常溶液１〜１０μＬ中に１０ｎｇ〜１μｇである。
【００２６】
工程１における核酸の一本鎖化処理は、自体公知の一本鎖化処理により行えばよい。例えば通常８０〜１００℃で、好ましくは８５〜９５℃で通常３０秒〜１０分、好ましくは１〜３分間加熱することによりなされる熱処理や、例えば工程１における核酸をアルカリに接触させることによりなされるアルカリ処理等が挙げられるが、熱処理が好ましい。特に、一般式［１］〜［８］で示される化合物の存在下でバイサルファイト反応を行う場合、反応温度を８０〜１００℃にしてもＤＮＡが分解することなく反応を進めることができるため、工程１における核酸を８０〜１００℃でバイサルファイト反応に付し、一本鎖化処理とバイサルファイト反応を同時に進めてもよく、処理が簡素化されるため、一本鎖化処理を行う場合該方法がより好ましい。
【００２７】
上記アルカリ処理としては、具体的には例えばアルカリ又はその水溶液を工程１における核酸又は該核酸を含む溶液に添加して溶液を通常ｐＨ１０〜１４、好ましくは１２〜１４のアルカリ性にすることによりなされる。該アルカリとしては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属水酸化物、炭酸ナトリウム等のアルカリ金属の炭酸塩、アンモニア、アミン類が挙げられるが、中でも水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属水酸化物が好ましく、これらの中でも水酸化ナトリウムが特に好ましい。
【００２８】
上記バイサルファイト反応において、工程１における核酸と亜硫酸塩の反応における亜硫酸塩としては、例えば亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸アンモニウム等が挙げられ、亜硫酸水素ナトリウムが好ましい。その使用量は、通常工程１における核酸５０〜５００ｎｇを含む１〜５００μＬの溶液に対して反応液中の終濃度が１〜６ｍｏｌ／Ｌとなるように添加される。該工程１における核酸と亜硫酸塩との反応は、通常３０〜１００℃、好ましくは５０〜１００℃、より好ましくは８０〜９５℃で、通常６０分〜２０時間、好ましくは６０分〜５時間、より好ましくは６０分〜３時間反応させることによりなされる。該反応により、シトシンがスルホン酸化される。
【００２９】
上記バイサルファイト反応におけるスルホン酸化したシトシンの加水分解は、通常この分野でなされている方法であれば特に限定はされないが、通常３０〜１００℃、好ましくは８０〜９５℃で、通常６０分〜２０時間、好ましくは６０分〜５時間、より好ましくは６０分〜３時間加熱することによりなされる。尚、該加水分解処理は、上記工程１における核酸と亜硫酸塩の反応と同時に進めてもよい。その場合には、工程１における核酸と亜硫酸塩の反応における反応温度及び反応時間を、スルホン酸化したシトシンの加水分解条件に合わせて設定すればよい。
【００３０】
上記加水分解を行った工程１における核酸については、脱スルホン酸化処理をする前に、精製処理に付すのが好ましい。該精製処理は、バイサルファイト反応において用いられる高濃度の亜硫酸塩等を取り除くことを目的としてなされるものであり、通常この分野でなされるＤＮＡの精製方法に準じてなされればよい。具体的には、例えば工程１における核酸又は工程１における核酸を含む溶液に、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム等のカオトロピック剤を添加し、それを、ＨＰＬＣ法等により分離精製する方法や、例えばフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出精製、アルコール沈殿法、シリカゲルを充填したカラムによる精製、フィルターろ過法等が挙げられ、中でもアルコール沈殿法が好ましい。該アルコール沈殿法としては、具体的には以下のようになされる。
【００３１】
即ち、加水分解処理後の工程１における核酸を含む溶液１０μＬに対して、通常アルコール４０〜１１０μＬ、緩衝液３０〜１００μＬを添加し、遠心分離を行う。遠心分離後、上清を除去しアルコールで洗浄することにより、工程１における核酸を分離精製することができる。上記アルコール及び緩衝液添加の際、分離後の上清の除去を容易にするために、工程１における核酸を含む溶液１０μＬに対して０．１〜１μＬのエタチンメイトやグリコーゲンを添加してもよい。上記アルコールとしては、エタノール、イソプロパノール、ブタノール等が挙げられるが、イソプロパノールが特に好ましい。イソプロパノールを用いると、ＤＮＡのみを効率よく沈殿させることができ、効率よく反応を進めることが可能となる。上記緩衝液としては、例えばＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液等が挙げられ、中でも、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝液、トリス緩衝液等が好ましく、トリス緩衝液が特に好ましい。これら緩衝液のｐＨは、通常７〜８、好ましくは７〜７．５であり、緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常０．１〜５  ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜２  ｍｏｌ／Ｌの範囲である。上記遠心分離は、通常この分野でなされる態様であれば特に限定されないが、通常１２，０００〜２２，０００ｇで１０〜３０分間なされる。
【００３２】
上記バイサルファイト反応中のアルカリ存在下での脱スルホン酸化反応としては、上記一本鎖化処理の項のアルカリ処理と同じ方法が挙げられ、その好ましい態様も同じものが挙げられる。具体的には、例えば以下の如くなされればよい。
即ち、加水分解処理後の溶液又は加水分解処理後精製処理に付した溶液１０μＬに対して、０．５〜３ｍｏｌ／Ｌのアルカリ水溶液を通常１〜１０μＬ、好ましくは１〜５μＬ添加して、反応溶液のｐＨを１１〜１４、好ましくは１２〜１４にし、通常５〜６０分間、好ましくは５〜３０分間、通常２５〜７０℃、好ましくは３０〜５０℃で加温することにより脱スルホン酸化反応を行う。
【００３３】
上記工程１（バイサルファイト反応）の好ましい具体例を以下に説明する。
即ち、例えば、ＤＮＡ抽出キット等を用いてゲノムＤＮＡを含む目的の細胞からゲノムＤＮＡを自体公知の方法により抽出し、ゲノムＤＮＡ１μｇを例えば滅菌水１０〜３０μＬに溶解する。該溶液３〜５μＬに、例えば２〜５ｍｏｌ／Ｌの亜硫酸水素ナトリウム（ｐＨ５．０〜７．０）５０〜１００μＬ、及び、一般式［１］〜［８］で示される化合物が液体の場合には、反応溶液中の濃度が３〜１０％となるように、一般式［１］〜［８］で示される化合物が固体の場合には、反応溶液中の濃度が１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、一般式［１］〜［８］で示される化合物又はそれらを含有する水溶液１〜１２μＬを添加して、８０〜１００℃で６０分〜３時間加熱する。該反応により、ゲノムＤＮＡは一本鎖ＤＮＡになり、該一本鎖ＤＮＡ中のシトシンをスルホン酸化すると同時にスルホン酸化されたシトシンを加水分解することができる。次いで、１ｍｏｌ／Ｌ  トリス緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）及びイソプロパノールを、４０：６０〜６０：４０、好ましくは４０：６０〜５０：５０の割合でそれぞれ加水分解後の溶液の５〜１０倍量添加し、加水分解後のＤＮＡを沈殿させる。この際、エタチンメイトやグリコーゲンを１〜３μＬ添加するとＤＮＡ沈殿の確認が容易となる。その後、１２，０００〜２０，０００ｇで１０〜２０分間遠心分離し、上清を取り除き、得られたＤＮＡをエタノールで洗浄する。これにより、加水分解後のＤＮＡを抽出精製することができる。更に、得られたＤＮＡ  １μｇを例えば滅菌水３０〜４０μＬに溶解し、該溶液に、１〜３ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム５〜２０μＬを添加し、３０〜４０℃で２０〜６０分間反応させ、脱スルホン酸化する。その後、要すれば、例えば市販のキット等を用いて低分子量のＤＮＡを取り除き精製する。これにより、本発明に係るバイサルファイト反応が完了し、ゲノムＤＮＡ中の非メチル化シトシンが効率よくウラシルに変換されたＤＮＡ（バイサルファイト処理核酸（バイサルファイト反応産物））が得られる。
【００３４】
工程１によれば、工程１における核酸をバイサルファイト反応に付した核酸、即ちバイサルファイト反応産物が得られる。
より具体的には、工程１における核酸をバイサルファイト反応に付すことにより、工程１における核酸中のメチル化されていないシトシン（非メチル化シトシン）は、Ｕ（ウラシル）に変換される。一方、工程１における核酸中のメチル化されているシトシン（メチル化シトシン）は、塩基が変換されずＣ（シトシン）のままとなる。
即ち、バイサルファイト反応産物は、工程１における核酸中の非メチル化シトシンがウラシルに置換された配列を有するものである。
従って、バイサルファイト反応産物は、工程１においてバイサルファイト反応に付した工程１における核酸をもとに、「工程１における核酸に対応する核酸」と言うこともできる。
【００３５】
［工程２］
工程２は、工程１で得られた反応産物のうち、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸のバイサルファイト反応産物を増幅する工程である。
工程２において増幅される核酸（以下、本発明に係る目的の核酸と略記する場合がある）は、工程１においてバイサルファイト反応が行われた後の核酸（バイサルファイト反応産物）のうち、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸に対してバイサルファイト反応が行われた後の核酸（バイサルファイト反応産物）である。
言い換えれば、本発明に係る目的の核酸は、工程１のバイサルファイト反応に付す前の塩基配列が各配列番号で示される塩基配列からなる核酸であり、当該核酸をバイサルファイト反応に付すことによって得られたバイサルファイト反応産物（当該核酸のバイサルファイト反応産物）の全部又は一部である。
本発明に係る目的の核酸としては、例えば、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号５で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸のバイサルファイト反応産物（少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号５で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸をバイサルファイト反応に付した核酸）が好ましく、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号４で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸のバイサルファイト反応産物（少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号４で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸をバイサルファイト反応に付した核酸）がより好ましく、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号３で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸のバイサルファイト反応産物（少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号３で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸をバイサルファイト反応に付した核酸）が特に好ましい。
また、本発明に係る目的の核酸は、配列番号２で示される塩基配列とその３’末端又は／及び５’末端に連続する塩基配列を有する核酸である。
本発明に係る目的の核酸の塩基の数は、通常１５０〜５１０個、好ましくは１５０〜２９０個、より好ましくは１５０〜２２０個、更に好ましくは１５０〜２１２個である。
【００３６】
より具体的に述べれば、核酸をバイサルファイト反応に付すことにより、核酸中のメチル化されていないシトシン（非メチル化シトシン）は、Ｕ（ウラシル）に変換される。一方、核酸中のメチル化されているシトシン（メチル化シトシン）は、塩基が変換されずＣ（シトシン）のままとなる。
例えば、工程１の核酸が［・・・・ＣＧ・・・・ＣＧ・・・・］であり、この中の全てのＣがメチル化されている場合は、工程２で増幅される塩基配列（工程１の核酸に対応する核酸）は、［・・・・ＣＧ・・・・ＣＧ・・・・］そのものの配列である。また、工程１の核酸が［・・・・ＣＧ・・・・ＣＧ・・・・］であり、この中の全てのＣがメチル化されていない場合は、工程２で増幅される塩基配列（工程１の核酸に対応する核酸）は、［・・・・ＵＧ・・・・ＵＧ・・・・］の配列である。さらに、工程１の核酸が［・・・・ＣＧ・・・・ＣＧ・・・・］であり、この中の一部のＣがメチル化されており（左側のＣ）、一部のＣがメチル化されていない（右側のＣ）場合は、工程２で増幅される塩基配列（工程１の核酸に対応する核酸）は、［・・・・ＣＧ・・・・ＵＧ・・・・］の配列である。
そのため、工程１における核酸（バイサルファイト反応に付される前の核酸）中のメチル化シトシンの有無及びメチル化シトシンの箇所により、工程２において増幅される核酸の塩基配列は変化する。
従って、本発明に係る目的の核酸は、上記のような種々の塩基配列を有するものである場合を含めて、例えば、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号１で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸に対応する核酸、好ましくは、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号５で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸に対応する核酸、より好ましくは、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号５で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸に対応する核酸、更に好ましくは、少なくとも配列番号２で示される塩基配列を含み、且つ配列番号３で示される塩基配列の一部又は全部からなる核酸に対応する核酸と言うこともできる。
【００３７】
本発明に係る目的の核酸を増幅する方法としては、上記バイサルファイト反応産物を、本発明に係る目的の核酸を増幅するように設計されたプライマーを用いてＰＣＲ反応に付すことによりなされればよい。
【００３８】
上記ＰＣＲ反応は、自体公知の方法例えばＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，Ｖｏｌ．１９，３７４９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９９４，  Ｖｏｌ．１６，  １１３４−１１３７に記載の方法に準じて行えばよいが、具体的には以下のようになされる。即ち、鋳型となるバイサルファイト反応産物の核酸量１〜１００ｎｇに、２種のプライマーをそれぞれ通常０．１〜１００ｐｍｏｌ、好ましくは０．１〜５０ｐｍｏｌ、ＤＮＡポリメラーゼを通常０．０５〜１０  Ｕｎｉｔｓ、好ましくは０．１〜５Ｕｎｉｔｓ、並びに４種類の混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を通常０．１〜１０ｎｍｏｌ、好ましくは、１〜１０ｎｍｏｌ添加し、ｐＨ７〜９のトライシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液中で、例えば９３〜９８℃、１〜１０分の反応後、（１）９２〜９８℃、１０〜３０秒→（２）５０〜６０℃、１０〜３０秒→（３）６８〜７４℃、３０秒〜５分間を１サイクルとして２０〜４０サイクル反応させ、更に６８〜７４℃、１〜１０分反応を行うことにより、本発明に係る目的の核酸を増幅することができる。
【００３９】
上記ＰＣＲ反応においては、反応後、通常この分野で用いられている精製方法、例えばフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合溶液による抽出、アルコール沈殿、カラム精製、フィルターろ過等の方法により、得られたＤＮＡを精製するのが好ましい。また、上記精製の後、目的の塩基対（ｂｐ）を有するＤＮＡを抽出するのがより好ましい。該抽出方法としては、自体公知の方法、例えばアガロースゲル電気泳動を用いる方法、液体クロマトグラフィー法を用いる方法や増補版ラボマニュアル遺伝子工学，１９９０，２７−２８に記載のポリアクリルアミドゲル等の電気泳動を用いた方法等が挙げられる。また、上記の如きＰＣＲ反応により得たＤＮＡ（ＰＣＲ産物）については、より多くの量を得るため、更に同様の条件でＰＣＲ反応に付してもよい。
【００４０】
上記ＰＣＲ反応における２種のプライマーとしては、本発明に係る目的の核酸を増幅するように設計されたものであればよく、具体的には、フォワードプライマーは配列番号２で示される塩基配列の上流側にアニールするもの、リバースプライマーは配列番号２で示される塩基配列の下流側にアニールするものを設計すればよい。そのヌクレオチド数は通常２０〜４５、好ましくは２２〜４０、より好ましくは２５〜３５である。具体的には、フォワードプライマーとしては、下記配列番号６記載の配列のものが挙げられる。リバースプライマーとしては、配列番号８の一部又は全部からなり少なくとも配列番号７で示される塩基配列を含む連続する塩基配列からなるもの又は配列番号９で示される塩基配列からなるものが挙げられ、配列番号８の一部又は全部からなり少なくとも配列番号７で示される塩基配列を含む連続する塩基配列からなるものが好ましく、配列番号７で示される塩基配列からなるものがより好ましい。
【００４１】
フォワードプライマー
ＧＴＡＧＴＴＡＧＴＴ  ＴＴＡＧＴＡＴＴＴＡ  ＧＴＴＴＴＴＧＧ（配列番号６）
リバースプライマー
ＣＣＣＴＣＴＣＴＡ  ＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣ  ＣＴＡＣＣＴＴＣＴＣ（配列番号７）
ＣＣＡＡＡＣＣＣＴＣ  ＴＣＴＡＣＴＴＣＴＣ  ＴＣＴＣＣＴＡＣＣＴ  ＴＣＴＣ（配列番号８）
ＣＣＴＴＡＡＴＣＡＣ  ＣＣＣＣＡＴＣＡＡＴ  ＣＣＡＡＡＡＴＣＣ（配列番号９）
【００４２】
本発明の方法における工程２においては、上記フォワードプライマー又は／及びリバースプライマーをそのまま用いるのが好ましいが、標識物質で標識して標識プライマーとしてもよい。該標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。具体的には、例えば、放射性同位体としては３２Ｐ，３３Ｐ，３５Ｓ等、酵素としてはアルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等、蛍光物質としてはＣｙａｎｉｎｅ  Ｄｙｅ系のＣｙ３，Ｃｙ５（アマシャムバイオサイエンス株式会社）、フルオレセイン等、発光物質としてはＡｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒを含む化学発光試薬等が挙げられる。
【００４３】
上記プライマーを放射性同位体により標識する方法としては、プライマーを合成する際に、放射性同位体で標識されたヌクレオチドを取り込ませることによって、プライマーを標識する方法や、プライマーを合成した後、放射性同位体で標識する方法等が挙げられる。具体的には、一般によく用いられているランダムプライマー法、ニックトランスレーション法、Ｔ４ポリヌクレオチド  キナーゼによる５’−末端標識法、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ等を用いた３’−末端標識法、ＲＮＡラベリング法等が挙げられる。
【００４４】
上記プライマーを酵素で標識する方法としては、アルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素分子を、標識するプライマーに直接共有結合させる等の、この分野における常法である直接標識法が挙げられる。
【００４５】
上記プライマーを蛍光物質で標識する方法としては、例えばフルオレセイン標識したヌクレオチドをこの分野における常法の標識手法によりプライマーに取り込ませればよい。また、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列のオリゴヌクレオチドの一員として置換する方法（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８６年，  第１４巻，  ｐ．６１１５参照）でもヌクレオチドを蛍光物質で標識することができる。その場合、５位にリンカーアームを有するウリジンを特開昭６０−５００７１７  号公報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、上記オリゴヌクレオチド鎖に蛍光物質を導入する方法もある。
【００４６】
上記プライマーを発光物質又はビオチンで標識するには、通常この分野で行われているヌクレオチドを発光標識又はビオチン標識する常法に従って行えばよい。
【００４７】
尚、ＰＣＲ反応においては、フォワードプライマーがアニールする配列からリバースプライマーがアニールする配列まで（フォワードプライマーの相補配列から配列番号２の相補配列を含みリバースプライマーの相補配列までの領域）が増幅される塩基配列（核酸）になる。
【００４８】
上記ＰＣＲ反応におけるＤＮＡポリメラーゼとしては、通常この分野で用いられるＤＮＡポリメラーゼであれば何れでもよいが、５’→３’ポリメラーゼ活性を有するものが好ましく、中でも、エキソヌクレアーゼ活性を有するが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないものがより好ましい。具体的には、例えばＫＡＰＡ２Ｇポリメラーゼ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ−ｐｌｕｓ等の変異型又は混合型のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡ  ポリメラーゼが好ましく、中でもＫＡＰＡ２Ｇポリメラーゼが特に好ましい。
【００４９】
上記ＰＣＲ反応におけるｄＮＴＰｓは、通常この分野で用いられる４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の混合物であれば特に限定はされない。
【００５０】
工程２（本発明に係る目的の核酸の増幅方法）の好ましい具体例を以下に説明する。
即ち、まず、上記［バイサルファイト反応］の項で記載したように、細胞から抽出した核酸を一本鎖化処理した後、バイサルファイト反応に付して、バイサルファイト反応産物を得る。その後、得られたバイサルファイト反応産物を、本発明に係る目的の核酸を増幅するように設計されたプライマーを用いたＰＣＲ反応に付す。具体的には、バイサルファイト反応により得られたバイサルファイト反応産物  １〜１００ｎｇを含む溶液０．５〜２μＬに、１〜２０μｍｏｌ／Ｌの増幅対象となるＤＮＡのフォワードプライマー（例えば配列番号６）０．５〜２μＬと１〜２０μｍｏｌ／Ｌの増幅対象となるＤＮＡのリバースプライマー（例えば配列番号７、配列番号８又は配列番号９）０．５〜２μＬ、１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）の混合溶液１〜１０μＬ、並びに、０．１〜５ＵｎｉｔｓのＢｌｅｎｄ  Ｔａｑ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ０．１〜１０μＬを添加して、例えば９２〜９８℃、１〜５分→［９３〜９８℃、１０〜３０秒→５０〜６０℃、１０〜３０秒→６８〜７４℃、３０秒〜５分間を１サイクルとして２０〜４０サイクル］→６８〜７４℃、１〜１０分の条件で反応を行う。これにより、非メチル化シトシンがウラシルに変換された、本発明に係る目的の核酸が増幅される。具体的には、配列番号６のフォワードプライマーと配列番号７のリバースプライマーの組み合わせの場合、配列番号３で示される塩基配列からなる核酸が増幅される。また、配列番号６のフォワードプライマーと配列番号８のリバースプライマーの組み合わせの場合、配列番号４で示される塩基配列からなる核酸が増幅され、配列番号６のフォワードプライマーと配列番号９のリバースプライマーの組み合わせの場合、配列番号５で示される塩基配列からなる核酸が増幅される。
【００５１】
［工程３］
工程３における電気泳動としては、物質の荷電強度に依存して異なる速度で移動又は異なる距離を移動させる方法に基づくものであればよく、具体的には例えば等電点電気泳動法やＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、アガロースゲル電気泳動法、アクリルアミドゲル電気泳動法等のゲル電気泳動法等を用いることができる。中でも、分子量の大きいものほど移動が遅い又は移動距離が短くなる分子ふるい効果を利用する電気泳動法が好ましく、更に分子の立体構造の違いに基づいて分子を分離することができる電気泳動法がより好ましい。具体的には、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、アガロースゲル電気泳動法、アクリルアミドゲル電気泳動法等のゲル電気泳動法が好ましく、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、アクリルアミドゲル電気泳動法がより好ましく、アクリルアミドゲル電気泳動法が特に好ましい。
尚、ゲル電気泳動におけるゲル濃度（ｗ／ｖ）は、通常５〜１５％、好ましくは５〜１０％、より好ましくは７〜１０％である。例えば、アクリルアミドゲル電気泳動法を用いる場合、通常５〜１５％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドを用いればよく、５〜１０％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドが好ましく、７〜１０％（ｗ／ｖ）のアクリルアミドがより好ましい。上記電気泳動の測定条件や対象物質の検出方法については、自体公知の方法に準じて適宜設定されればよい。
【００５２】
上記電気泳動の後、本発明に係る目的の核酸を検出する方法としては、例えばインターカレーターを用いて検出する方法が挙げられ、該方法が特に好ましい。尚、インターカレーターを用いて検出する場合、必要に応じてＵＶ照射して検出してもよい。
該インターカレーターとしては、具体的には、例えば下記（１）〜（５）のインターカレーター並びに下記（６）及び（７）のインターカレーター類似物質が挙げられる。
（１）アクリジンオレンジ等のアクリジン色素
（２）例えば臭化エチジウム，エチジウムホモダイマー１（ＥｔｈＤ−１），エチジウムホモダイマー２（ＥｔｈＤ−２），臭化エチジウムモノアジド（ＥＭＡ），ジヒドロエチジウム等のエチジウム化合物
（３）例えばヨウ素化プロピジウム，ヨウ素化ヘキシジウム等のヨウ素化合物、例えば７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、例えばＰＯＰＯ−１，  ＢＯＢＯ−１，  ＹＯＹＯ−１，  ＴＯＴＯ−１，  ＪＯＪＯ−１，  ＰＯＰＯ−３，  ＬＯＬＯ−１，  ＢＯＢＯ−３，  ＹＯＹＯ−３，  ＴＯＴＯ−３等のシアニンダイマー系色素（何れもモレキュラープローブ社商品名）
（４）例えばＰＯ−ＰＲＯ−１，  ＢＯ−ＰＲＯ−１，  ＹＯ−ＰＲＯ−１，  ＴＯ−ＰＲＯ−１，  ＪＯ−ＰＲＯ−１，  ＰＯ−ＰＲＯ−３，  ＬＯ−ＰＲＯ−１，  ＢＯ−ＰＲＯ−３，  ＹＯ−ＰＲＯ−３，  ＴＯ−ＰＲＯ−３，  ＴＯ−ＰＲＯ−５等のシアニンモノマー系色素（何れもモレキュラープローブ社商品名）
（５）例えばＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ，  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ａｎｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ，  ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ，  ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ，  ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ等のＳＹＴＯＸ系色素（何れもモレキュラープローブ社商品名）、例えばＧｅｌＲｅｄ（和光純薬社商品名）等のＧｅｌＲｅｄ系色素
（６）ＤＮＡ二重らせんのマイナーグルーブに結合するもの〔例えば４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ：モレキュラープローブ社商品名）等〕
（７）アデニン−チミン（Ａ−Ｔ）配列に特異的に結合するもの〔例えばペンタハイドレ−ト（ビス−ベンズイミド）（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８：モレキュラープローブ社商品名），トリヒドロクロライド（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２：モレキュラープローブ社商品名），ビスベンズイミド色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３４５８０：モレキュラープローブ社商品名）等、例えば９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン（ＡＣＭＡ），ビス−（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）スペルミン（アクリジンホモダイマー）等のアクリジン色素、例えばヒドロキシスチルバミジン等〕
上記具体例の中でも、（５）ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ，  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ａｎｄ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ，  ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ，  ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ，  ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ等のＳＹＴＯＸ系色素（何れもモレキュラープローブ社商品名）、ＧｅｌＲｅｄ（和光純薬社商品名）等のＧｅｌＲｅｄ系色素が好ましく、ＧｅｌＲｅｄ系色素がより好ましい。
【００５３】
本発明に係る目的の核酸を検出する方法としては、プライマーが標識プライマーである場合には、その標識方法に応じて検出すればよい。具体的には、前記標識物質で標識したプライマーを用いて工程２で本発明に係る目的の核酸を増幅し、得られた増幅産物を上記電気泳動の後、標識物質に応じて検出すればよく、例えば標識物質が蛍光物質であればその蛍光を検出すればよい。
【００５４】
標識プライマーを用いる方法においては、工程２で本発明に係る目的の核酸を増幅したのち、遊離の標識プライマーを除くのが好ましい。遊離の標識プライマーを除く方法としては、増幅反応で得られた本発明に係る目的の核酸を、核酸を沈殿させる常法（エタノール沈殿法、イソプロパノールを用いた沈殿法等）により沈殿させた後、沈殿しなかった遊離の標識プライマーを含有する上清を除去する方法等が挙げられる。また、増幅させた本発明に係る目的の核酸を適当な条件下、ゲルクロマトグラフィーで処理して、プライマー伸長産物と遊離の標識プライマーを分離する方法、電気泳動法により分離する方法等も挙げられる。
【００５５】
目的の細胞（工程１における核酸の由来となる細胞）が癌細胞か否かの判定は、上記電気泳動の結果に基づいて判定される。具体的には、癌細胞又は非癌細胞（本明細書において非癌細胞とは、癌細胞でないことが判明している細胞全てを含む）であることが判別されている細胞を本発明の方法に付して電気泳動した電気泳動パターン（泳動距離又は泳動時間）と、目的の細胞を用いて本発明の方法に付して電気泳動した電気泳動パターン（泳動距離又は泳動時間）とを比較し、それらが同じであるか異なるかを基に癌細胞か非癌細胞かを判定する。
【００５６】
より具体的には、例えば癌細胞を本発明の方法に付して電気泳動した電気泳動パターン（バンドパターン又はピークパターン）が、目的の細胞を用いて本発明の方法に付して電気泳動した電気泳動パターン（バンドパターン又はピークパターン）と同じであった場合、その細胞は癌細胞であると判定され、両者の電気泳動パターン（バンドパターン又はピークパターン）が異なるようであれば癌細胞ではないと判定される。
また、例えば非癌細胞を本発明の方法に付して電気泳動した電気泳動パターン（バンドパターン又はピークパターン）が、目的の細胞を用いて本発明の方法に付して電気泳動した電気泳動パターン（バンドパターン又はピークパターン）と同じであった場合、その細胞は癌細胞ではないと判定され、両者の電気泳動パターン（バンドパターン又はピークパターン）が異なるようであれば癌細胞であると判定される。
【００５７】
尚、上記電気泳動パターンの比較については、電気泳動で得られた泳動像の全体（全てのバンド又は全てのピーク）を比較しても、癌細胞と非癌細胞の違いを確認できる部分を比較してもよい。癌細胞と非癌細胞の違いを確認できる部分としては、癌細胞と非癌細胞とで異なるバンド又はピークが出現している部分や、癌細胞と非癌細胞の一方でバンド又はピークが消失している部分等が挙げられ、具体的には、例えば２５０ｂｐの増幅産物が泳動される距離又は時間付近の部分や、２２０ｂｐの増幅産物が泳動される距離又は時間付近から２５０ｂｐの増幅産物が泳動される距離又は時間付近までの部分等が挙げられる。
【００５８】
更に、予め、癌細胞と非癌細胞との電気泳動パターン（バンドパターン又はピークパターン）の比較を行い、その結果から癌細胞に特有に出現する又は／及び消失する、バンド又はピークの泳動距離、泳動時間又はこれらから換算した分子量を確認・設定しておき、目的の細胞を本発明の方法に付して電気泳動して得られた結果において、確認・設定した泳動距離、泳動時間又は分子量に対応するバンド又はピークの有無を確認（バンド又はピークの出現又は／及び消失の確認）して癌細胞か非癌細胞かの判定を行ってもよい。具体的には、例えば非癌細胞には認められない２２０ｂｐの増幅産物、当該増幅産物が泳動される距離又は時間に対応するバンド又はピークの癌細胞での出現や、非癌細胞に認められる２５０ｂｐの増幅産物、当該増幅産物が泳動される距離又は時間に対応するバンド又はピークの癌細胞での消失等を確認して癌細胞か非癌細胞かの判定を行ってもよい。
【００５９】
尚、工程１における核酸の由来となる細胞が、単一の癌細胞のみからなるものではなく、癌細胞と非癌細胞の両方を含む細胞群である場合がある。このような場合、得られる電気泳動パターンは癌細胞で得られる泳動パターンと非癌細胞で得られる泳動パターンとを重ね合わせた泳動パターンとなる。この場合、電気泳動パターン（バンドパターン又はピークパターン）の比較を行って、癌細胞に特有に出現するバンド又はピークが確認されれば癌細胞であると判定される。従って、本発明の方法において、非癌細胞に特有に出現するバンド又はピークが確認された場合であっても、癌細胞に特有に出現するバンド又はピークが確認されれば癌細胞であると判定される。
【００６０】
工程３の具体的な方法としては、例えば以下の如くなされる。即ち、工程２で増幅された本発明に係る目的の核酸を、要すれば泳動用バッファーを添加した後、分子量マーカーと共に、５〜１５（Ｗ／Ｖ）％、好ましくは５〜１０（Ｗ／Ｖ）％、より好ましくは７〜１０（Ｗ／Ｖ）％アクリルアミドゲル電気泳動する。次いでＧｅｌＲｅｄ系色素で染色した後、ＵＶ照射して目的物を検出する。一方、正常細胞と癌細胞それぞれを本発明に係る工程１及び２に付して、それぞれ本発明に係る目的の核酸を増幅する。各核酸を上記５〜１５％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは５〜１０（Ｗ／Ｖ）％、より好ましくは７〜１０（Ｗ／Ｖ）％アクリルアミドゲル電気泳動を行い、同様に目的物を検出し、そのバンドパターンと上記本発明に係る目的の核酸のバンドパターンとを比較し、目的の細胞が癌細胞か否かの判定を行う。
なお、上記工程３の結果により得られたデータ（増副産物の電気泳動結果又は／及び癌細胞か否かの判定結果）は、工程１における核酸の由来となる細胞（または当該細胞を含有する試料）を有する動物が癌に罹患しているか又は当該動物に癌細胞が存在しているか否かを判定するためのデータとして使用することができ、本発明の方法は、このような判定を行うためのデータを取得する方法としても有用である。
【００６１】
［本発明のプライマーセット］
本発明のプライマーセットとしては、配列番号６で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８の一部又は全部からなり少なくとも配列番号７で示される塩基配列を含む連続する塩基配列からなるリバースプライマーの組み合わせや、配列番号６で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号９で示される塩基配列からなるリバースプライマーの組み合わせ等が挙げられる。配列番号６で示される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８の一部又は全部からなり少なくとも配列番号７で示される塩基配列を含む連続する塩基配列からなるリバースプライマーの組み合わせが好ましく、中でもリバースプライマーが配列番号７で示される塩基配列のものがより好ましい。
【００６２】
［本発明の細胞の癌判定用試薬］
本発明の細胞の癌判定用試薬は、前記本発明のプライマーセットを含むものであり、該プライマーセットの具体的なもの及び好ましいものは、上記と同じである。該試薬は、この分野で通常用いられる緩衝液、安定化剤、防腐剤等の試薬の安定性を阻害せず、ＰＣＲ反応を阻害しないものが含まれていてもよい。その濃度や含有量は、通常この分野で用いられる範囲から適宜設定されればよい。
【００６３】
緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのｐＨも特に限定されないが、通常５〜９の範囲が好ましい。
【００６４】
また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲＴＭ  Ｇｒｅｅｎなど）あるいはＦＡＭやＴＡＭＲＡ等の標識検出物質などを含んでいてもよい。
【００６５】
尚、本発明の試薬は自体公知のバイサルファイト反応試薬と組みあわせて試薬キットとしてもよい。該バイサルファイト試薬としては、例えば、上記一般式［１］〜［８］で示される化合物、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸アンモニウム等の亜硫酸塩、緩衝液、水酸化ナトリウム等を含有するもの等が挙げられる。該試薬中の濃度は、上記工程１のバイサルファイト反応の項で記載した濃度となるように適宜設定されればよい。
以下に、実施例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。
【実施例】
【００６６】
実施例１  正常細胞及び癌細胞のＦＯＸＢ２遺伝子（プロモータ領域）の解析
（１）ゲノムＤＮＡの抽出
下記２種類の細胞を用いて、ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＳＰ  ｋｉｔ  ＤＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ（倉敷紡績（株）製）によりその現品説明書に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。
・ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ、Ｃｅｌｌ  ｎａｍｅ  ：  ２０１Ｂ７）  ：正常細胞
・ヒトグリオーマ細胞（Ｕ２５１−ＭＧ−Ｐ１）：癌細胞【００６７】
（２）バイサルファイト反応
（１）で得たゲノムＤＮＡ各４００ｎｇに蒸留水を加えて１０μＬの水溶液を調製した。その後、ＥｐｉＳｉｇｈｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（和光純薬工業（株）製）を用いて説明書に従って、それぞれをバイサルファイト反応に付した。【００６８】
（３）ＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域の増幅（ＰＣＲ反応）
（２）で得たバイサルファイト反応産物  １μＬそれぞれに、蒸留水１７．３μＬ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（東洋紡（株）製）２．５μＬ、２  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡）２μＬ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ−Ｐｌｕｓ（東洋紡（株）製）０．２μＬ（０．５Ｕ）、フォワードプライマー（１０μＭ）１μＬ、及びリバースプライマー（１０μＭ）１μＬを加えて混合し、反応溶液とした。これらプライマーの塩基配列は下記の通りである。また、これらによる増幅鎖長は２１２ｂｐである。
フォワードプライマー  ：  ＧＴＡＧＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧ（配列番号６）
リバースプライマー    ：  ＣＣＣＴＣＴＣＴＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＡＣＣＴＴＣＴＣ（配列番号７）
上記反応溶液それぞれをサーマルサイクラー（バイオラッド社製）にセットし、下記反応条件で反応を行った。【００６９】
＊反応条件
９４℃  ２分間
↓
９４℃  ２０秒間→５５℃  ２０秒間→７２℃  ３０秒間を１サイクルとして３６サイクル
↓
７２℃  ２分間【００７０】
上記ＰＣＲ反応により得られる増幅産物は、下記配列番号３となる。
ｇｃａｇｃｃａｇｃｔ  ｃｃａｇｃａｃｔｃａ  ｇｔｃｔｔｔｇｇｃｃ  ａｃｃｃｇｇｇｇｇａ  ａｇａｃｇｃａｇａｇ  ａａｇｇｃｇｇｃｇｇ
ｔａａａｃｃｔｇｇｔ  ｇｃａｃｔｃｃｇｃｃ  ｃｇｃｇａｃｔｇｔｇ  ｃｇｃｇｃｃａｇｔｃ  ｇｇｃａａｃｃｇｔｃ  ｇｇｇｇｃｃａｇａａ
ｇｔｔｇｃｃａｇｃｔ  ｔｃｃｇａｇａｇｃｔ  ｇａｇｔａｇｇｃｃｃ  ｇａａａｇｇｃｃａａ  ｇｇｔｃｇｇａｇａｃ  ａｃｃａｇｇｃａａｔ
ｔｃｇｇａｇａａｇｇ  ｃａｇｇａｇａｇａｇ  ａａｇｃａｇａｇａｇ  ｇｇ    （配列番号３）【００７１】
次いで、２種の得られたＰＣＲ増幅産物２５μＬ及び２５ｂｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｅｐ  Ｌａｄｄｅｒ（和光純薬工業（株）製）それぞれに、６×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｙｅ（（株）ニッポンジーン製）５μＬを加えて混合し、混合物をスーパーセップエース  ７．５％（アクリルアミドゲル、和光純薬工業（株）製）で２０ｍＡ定電流にて電気泳動した。泳動後、ＧｅｌＲｅｄ核酸ゲル染色液（和光純薬工業（株）製）で染色し、ＵＶ照射装置によりＰＣＲ増幅産物を確認した。ｈｉＰＳの正常細胞及びヒトグリオーマ細胞（Ｕ２５１−ＭＧ−Ｐ１）の癌細胞から得たＰＣＲ増幅産物の泳動結果を図１に示す。【００７２】
図１の結果より、ＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域については、バイサルファイト反応後のＰＣＲ増幅産物をアクリルアミドゲル電気泳動で確認することにより、メチル化状態（癌細胞）であれば非メチル化状態（正常細胞）のバンドよりも低分子側にバンドが現れることが分かった。言い換えれば、この方法により癌の判定が可能であることが分かった。【００７３】
実験例１  実施例１で使用したゲノムＤＮＡのメチル化状態の確認
（１）ＰＣＲ増幅産物のクローニング
実施例１（３）で得た２種のＰＣＲ増幅産物それぞれを１．５％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、ＧｅｌＲｅｄ核酸ゲル染色液（和光純薬工業（株）製）で染色し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて現品説明書に従ってＰＣＲ増幅産物を回収した。【００７４】
（２）ＰＣＲ増幅産物に制限酵素認識部位を付加するためのＰＣＲ反応
（１）で得たＰＣＲ増幅産物１μＬそれぞれに、蒸留水１７．３μＬ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（東洋紡）２．５μＬ、２  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡）２μＬ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）０．２μＬ（０．５Ｕ）、フォワードプライマー（１０μＭ）１μＬ、及びリバースプライマー（１０μＭ）１μＬを加えて混合した。フォワードプライマーは、配列番号６のフォワードプライマーに制限酵素認識部位（ＨｉｎｄＩＩＩ：配列中の下線部）を付加した下記配列（配列番号１０）を、リバースプライマーは、配列番号７のリバースプライマーに制限酵素認識部位（ＢａｍＨＩ：配列中の下線部）を付加した下記配列（配列番号１１）を用いた。
フォワードプライマー  ：  ＴＴＡＣＣＡＴＡＡＧＣＴＴ  ＧＴＡＧＴＴＡＧＴＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧ（配列番号１０）
リバースプライマー    ：  ＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣ  ＣＣＣＴＣＴＣＴＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＡＣＣＴＴＣＴＣ（配列番号１１）
上記反応溶液それぞれをサーマルサイクラーにセットし下記条件で反応を行った。【００７５】
＊反応条件
９４℃  ２分間
↓
９４℃  ２０秒間→５５℃  ２０秒間→７２℃  ３０秒間を１サイクルとして１０サイクル
↓
７２℃  ２分間【００７６】
次いで、ＰＣＲ増幅産物２５μＬそれぞれに、６×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｙｅ（（株）ニッポンジーン製）５μＬを加えて混合し、混合物を１．５％アガロースゲルにて電気泳動した。泳動後、ＧｅｌＲｅｄ核酸ゲル染色液（和光純薬工業（株）製）で染色し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて現品説明書に従ってＰＣＲ増幅産物を回収した。【００７７】
（３）制限酵素処理
（２）で得たＰＣＲ増幅産物４３μＬそれぞれに、１０×Ｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（（株）ニッポンジーン製）５μＬ、ＨｉｎｄＩＩＩ（（株）ニッポンジーン製）１μＬ、及びＢａｍＨＩ（（株）ニッポンジーン製）１μＬを加えて混合した後、３７℃で１時間インキュベートした。同様にｐＵＣ１９（（株）ニッポンジーン製）５００ｎｇに蒸留水を加えて４３μＬに調製し、更に、ＨｉｎｄＩＩＩ（（株）ニッポンジーン製）１μＬ、及びＢａｍＨＩ（（株）ニッポンジーン製）１μＬを加えて混合した後、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、結合Ｂｕｆｆｅｒ（５．５Ｍグアニジン塩酸塩（和光純薬工業（株）製）及び２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．６（和光純薬工業（株）製））を２５０μＬ加えて混合した後、エコノスピン（（株）ジーンデザイン製）に移し、１２０００×ｇ、室温、１分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。その後、洗浄Ｂｕｆｆｅｒ［エタノールを８０％含む２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５（（株）ニッポンジーン製）］を５００μＬ添加し、１２０００×ｇ、室温、１分間遠心分離し、チューブの溶液を除去した。更に、１２０００×ｇ、室温、１分間遠心分離した後、新しいチューブに交換し、溶出Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５）（（株）ニッポンジーン製）を２５μＬ添加し、１２０００×ｇ、室温、１分間遠心分離し溶液を除去した。これにより、制限酵素処理したＰＣＲ増幅産物及びｐＵＣ１９を回収した。【００７８】
（４）形質転換
制限酵素処理したＰＣＲ増幅産物１μＬそれぞれに、制限酵素処理したｐＵＣ１９  １μＬ、及びＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ）（タカラバイオ（株）製）２μＬを加えて混合し、１６℃で１時間インキュベートした。次いで、全量４μＬをＥＣＯＳＴＭ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（（株）ニッポンジーン製）に形質転換し、アンピシリン添加ＬＢ寒天培地にスプレッドした。その後、コロニーをアンピシリン添加ＬＢ培地で３７℃、１６時間培養した。更に、プラスミドキットＳ  ＩＩ（倉敷紡績）を用いて現品説明書に従ってプラスミド抽出を行った。
得られたプラスミドを用いて、タカラバイオ（株）のシーケンス受託サービスにて塩基配列を解析した。【００７９】
塩基配列解読結果に基づき、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが非メチル化シトシン及びメチル化シトシンの何れであるかを表した図を、図２に示す。尚、図中の○は、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが非メチル化のものであることを、●は、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンがメチル化されているものであることを表す。【００８０】
図２の結果より、ｈｉＰＳの正常細胞中のシトシンはほぼ非メチル化シトシンであり、ヒトグリオーマ細胞（Ｕ２５１−ＭＧ−Ｐ１）の癌細胞中のシトシンは、ほとんどがメチル化されていることが確認された。従って、本発明の方法によれば、細胞中のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域中のシトシンのメチル化（メチル化シトシン）又は非メチル化（非メチル化シトシン）を簡便な方法で判別できることが示された。即ち、本発明の方法によれば、細胞が癌細胞か否かを簡便な方法で判別できることが分かった。【００８１】
実施例２  クローニングしたプラスミドを用いたＦＯＸＢ２遺伝子（プロモータ領域）の解析
実験例１で得られたｈｉＰＳ  及びＵ２５１−ＭＧ−Ｐ１由来のＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域のプラスミド（ＰＣＲ増幅鎖長２１２ｂｐ）をそれぞれ鋳型にしてＰＣＲ増幅後、アクリルアミドゲル電気泳動により確認した。
具体的には、プラスミドＤＮＡ  １μＬ（５０ｎｇ）それぞれに、蒸留水１７．３μＬ、１０ｘＢｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ（東洋紡）２．５μＬ、２  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（東洋紡）２μＬ、Ｂｌｅｎｄ  Ｔａｑ−Ｐｌｕｓ（東洋紡）０．２μＬ（０．５Ｕ）、フォワードプライマー（１０μＭ）１μＬ、及びリバースプライマー（１０μＭ）１μＬを加えて混合し反応溶液を得た。尚、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、実施例１（３）記載のものと同じものを用いた。
上記反応溶液それぞれをサーマルサイクラーにセットし下記条件で反応を行った。【００８２】
＊反応条件
９４℃  ２分間
↓
９４℃  ２０秒間→５５℃  ２０秒間→７２℃  ３０秒間を１サイクルとして１０サイクル
↓
７２℃  ２分間【００８３】
次いで、ＰＣＲ増幅産物２５μＬ及び２５ｂｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｅｐ  Ｌａｄｄｅｒ（和光純薬工業（株）製）それぞれに、６ｘＬｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｙｅ（（株）ニッポンジーン製）５μＬを加えて混合し、混合物をスーパーセップエース  ７．５％（アクリルアミドゲル、和光純薬工業（株）製）にて電気泳動した。泳動後、ＧｅｌＲｅｄ核酸ゲル染色液（和光純薬工業（株）製）で染色し、ＵＶ照射装置によりＰＣＲ増幅産物を確認した。その結果を図３に示す。【００８４】
比較例１  正常細胞及び癌細胞のＦＯＸＢ１遺伝子（プロモータ領域）の解析
実施例１（３）のフォワードプライマーとリバースプライマーを下記配列番号１２記載のフォワードプライマーと下記配列番号１３記載のリバースプライマーを用いた以外は、実施例１と同様に、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）及びヒトグリオーマ細胞（Ｕ２５１−ＭＧ−Ｐ１）を用いて、ＦＯＸＢ１遺伝子のプロモータ領域のＰＣＲ増幅産物を電気泳動した。その結果を実施例２のＦＯＸＢ２の結果と併せて図３に示す。
フォワードプライマー  ：  ＧＴＡＧＡＧＧＡＡＡＴＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＡＡＧ（配列番号１２）
リバースプライマー  ：  ＣＴＴＡＡＣＣＡＡＴＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＴＣＣＡＡＣＴＣ（配列番号１３）
尚、電気泳動した増幅産物は、増幅鎖長が２２７ｂｐの下記配列番号１４のＦＯＸＢ１遺伝子である。該塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＣ００９６５４の塩基番号９２７１４−９２９４０に記載されている。【００８５】
ＧＣＡＧＡＧＧＡＡＡ  ＣＡＧＡＡＴＡＣＣＣ  ＣＡＧＣＣＡＡＧＣＡ  ＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴ  ＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴ  ＣＣＧＣＧＣＧＧＣＴ
ＧＣＴＣＣＡＴＣＴＧ  ＴＧＡＡＣＧＴＧＡＧ  ＴＧＧＴＣＧＣＣＴＧ  ＧＣＴＣＣＣＴＣＴＴ  ＣＣＧＣＧＧＣＧＧＣ  ＣＧＣＴＴＣＣＴＣＡ
ＴＡＣＣＴＴＣＡＣＡ  ＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣ  ＣＧＧＣＣＧＧＣＧＣ  ＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣ  ＣＴＧＣＣＣＡＧＴＧ  ＧＣＣＧＡＧＧＣＴＣ
ＴＴＣＣＣＣＣＴＣＧ  ＣＣＣＡＧＴＣＴＴＧ  ＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴ  ＧＡＴＴＣＣＴＡＴＴ  ＧＧＣＣＡＡＧ  （配列番号１４）【００８６】
図３の結果より、ＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域について、バイサルファイト反応後のプラスミドを用いたＰＣＲ増幅産物をアクリルアミドゲル電気泳動することによっても、同様にメチル化シトシンの有無を判別できることが分かった。一方、ＦＯＸＢ１遺伝子のプロモータ領域については、メチル化シトシンの有無で泳動距離に違いがなく、判別できないことが分かった。【００８７】
比較例２  各種ＦＯＸＢ２遺伝子の解析
実施例１で増幅させた塩基配列とは異なる下記領域（増幅配列１〜３）について、ＦＯＸＢ２遺伝子を増幅し、電気泳動を行った。増幅配列１はＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域の一部とＦＯＸＢ２遺伝子の構造遺伝子の一部の塩基配列であり、増幅配列２および増幅配列３はＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域である塩基配列３の一部である。
増幅配列１：配列番号２４
ＧＧＡＡＴＴＡＧＴＧ  ＧＧＧＧＣＡＧＣＣＡ  ＧＧＣＣＣＣＡＧＧＡ  ＡＣＧＧＡＧＴＧＣＧ  ＧＡＧＡＧＡＴＴＣＴ  ＧＴＧＧＴＣＣＡＧＴ  ＧＣＧＧＧＣＣＧＧＡ  ＧＧＧＣＧＧＴＧＧＡ  ＧＧＡＧＣＣＧＧＧＧ  ＧＣＧＡＴＧＣＣＧＣ  ＧＧＣＣＧＧＧＧＡＡ  ＧＡＧＣＴＣＧＴＡＣ  ＡＧＣＧＡＣＣＡＡＡ  ＡＡＣＣＧＣＣＣＴＡ  ＣＴＣＴＴＡＣＡＴＣ  ＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧ  ＣＣＡＴＧＧＣＡＡＴ  ＣＣＡＧＣＡＣＴＣＧ  ＧＣＣＧＡＧＡＡＧＡ  ＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴ  ＧＡＧＣＧＡＣＡＴＣ  ＴＡＣＡＡＧＴＴＣＡ  ＴＣＡＴＧＧＡＧＣＧ  ＣＴＴＣＣＣＣＴＡＣ  ＴＡＣＣＧＣＧＡＧＣ  ＡＣＡＣＡＣＡＧＣＧ  ＣＴＧＧＣＡＧＡＡＣ  ＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣ  ＡＣＡＡＣＣＴＣＴＣ  ＣＴＴＣＡＡＣＧＡＣ  ＴＧＣＴＴＣＡＴＣＡ  ＡＧＡＴＴＣＣＧＣＧ  ＧＡＧＧＣＣＣＧＡＣ  ＣＡＧＣＣＴＧＧＣＡ  ＡＧＧＧＴＡＧＣＴＴ  ＣＴＧＧＧ  
増幅配列２：配列番号２５
ＧＧＴＡＡＡＣＣＴＧ  ＧＴＧＣＡＣＴＣＣＧ  ＣＣＣＧＣＧＡＣＴＧ  ＴＧＣＧＣＧＣＣＡＧ  ＴＣＧＧＣＡＡＣＣＧ  ＴＣＧＧＧＧＣＣＡＧ  ＡＡＧＴＴＧＣＣＡＧ  ＣＴＴＣＣＧ
増幅配列３：配列番号２６
ＧＴＴＧＣＣＡＧＣＴ  ＴＣＣＧＡＧＡＧＣＴ  ＧＡＧＴＡＧＧＣＣＣ  ＧＡＡＡＧＧＣＣＡＡ  ＧＧＴＣＧＧＡＧＡＣ  ＡＣＣＡＧＧＣＡＡＴ  ＴＣＧＧＡＧＡＡＧＧ  ＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧ  ＡＡＧＣＡＧＡＧＡＧ  ＧＧ
具体的には、実施例１（３）のフォワードプライマーとリバースプライマーの代わりに、下記フォワードプライマー１とリバースプライマー１を用いた以外は、実施例１と同様に実験し、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）及びヒトグリオーマ細胞（Ｕ２５１−ＭＧ−Ｐ１）を用いて、ＦＯＸＢ２遺伝子のＰＣＲ増幅産物（増幅配列１）を電気泳動した。また、フォワードプライマーとリバースプライマーの代わりに、ｈｉＰＳの場合は下記非メチル化フォワードプライマー２と非メチル化リバースプライマー２をＵ２５１−ＭＧ−Ｐ１の場合は下記メチル化フォワードプライマー２とメチル化リバースプライマー２を用いた以外は、実施例１と同様に実験し、ＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域のＰＣＲ増幅産物（増幅配列２）を電気泳動した。更に、フォワードプライマーとリバースプライマーの代わりに、ｈｉＰＳの場合は下記非メチル化フォワードプライマー３とリバースプライマー３をＵ２５１−ＭＧ−Ｐ１の場合は下記メチル化フォワードプライマー３とリバースプライマー３を用いた以外は、実施例１と同様に実験し、ＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域のＰＣＲ増幅産物（増幅配列３）を電気泳動した。【００８８】
増幅配列１の泳動結果を図４に示す。尚、図４の左側には比較として、実施例２を再度行った結果を併せて示す。また、増幅配列２の泳動結果を図５に、増幅配列３の泳動結果を図６にそれぞれ示す。尚、電気泳動した増幅産物の増幅鎖長は、それぞれ順に３５５ｂｐ（増幅配列１）、７６ｂｐ（増幅配列２）、９２ｂｐ（増幅配列３）である。【００８９】
フォワードプライマー１  ：  ＧＧＡＡＴＴＡＧＴＧＧＧ  ＧＧＴＡＧＴＴＡＧＧＴＴＴＴＡＧＧ（配列番号１５）
リバースプライマー１    ：  ＣＣＣＡＡＡＡＡＣＴＡＣＣＣＴＴＡＣＣＡＡＡＣＴＡＡＴＣ（配列番号１６）【００９０】
非メチル化フォワードプライマー２  ：  ＧＧＴＡＡＡＴＴＴＧＧＴＧＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧ（配列番号１７）
メチル化フォワードプライマー２    ：  ＧＧＴＡＡＡＴＴＴＧＧＴＧＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＧ（配列番号１８）
非メチル化リバースプライマー２  ：  ＣＡＡＡＡＡＣＴＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＡＣＣＣＣ（配列番号１９）
メチル化リバースプライマー２    ：  ＣＧＡＡＡＡＣＴＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＡＣＣＣＣ（配列番号２０）【００９１】
非メチル化フォワードプライマー３：  ＧＴＴＧＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＡＧ（配列番号２１）
メチル化フォワードプライマー３  ：  ＧＴＴＧＴＴＡＧＴＴＴＴＣＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＴＡＧ（配列番号２２）
リバースプライマー３  ：  ＣＣＣＴＣＴＣＴＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＴＡＣＣＴＴＣＴＣ（配列番号２３）【００９２】
図４〜６の結果より、本発明の方法により電気泳動でメチル化シトシンの有無を判別できる配列は、ＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域の特定の領域のみであることが分かった。即ち、実施例１で確認した塩基配列３中のＣＧ塩基を有する配列（即ち、配列番号２）を少なくとも有する必要があることが分かった。【００９３】
実施例３  乳癌患者由来細胞を用いたＦＯＸＢ２遺伝子（プロモータ領域）の解析
実施例１（１）における細胞として８人の乳癌患者の乳腺細胞を用いた以外は、実施例１と同様に、ＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域のＰＣＲ増幅産物を電気泳動した。その泳動結果を図７−１、７−２及び７−３それぞれに示す。尚、図７−１中の乳癌患者５の細胞は、良性腫瘍である。【００９４】
図７−１〜７−３の結果より、本発明の方法によれば、腫瘍や転移したリンパ節は癌細胞と同じ位置に泳動が確認され、癌細胞である（細胞が癌化されている）と判定できた。また、腫瘍近傍の正常組織であっても正常細胞と判定することができ、更に、良性の腫瘍も正常細胞と判定できることが分かった。【００９５】
実施例４  大腸癌患者由来細胞を用いたＦＯＸＢ２遺伝子（プロモータ領域）のメチル化解析
実施例１（１）における細胞として８人の大腸癌患者の大腸細胞を用いた以外は、実施例１と同様に、ＦＯＸＢ２遺伝子のプロモータ領域のＰＣＲ増幅産物を電気泳動した。
その泳動結果を図８−１及び８−２にそれぞれ示す。【００９６】
図８−１〜８−２の結果より、本発明の方法によれば、大腸癌由来の細胞を用いても、腫瘍は癌細胞と同じ位置に泳動が確認され、癌細胞であると判定できることが分かった。【００９７】
以上の実施例および比較例で用いた配列の位置関係を以下に示す。
2017142070.tif 000010
【図１】
2017142070.tif 000011
【図２】
2017142070.tif 000012
【図３】
2017142070.tif 000013
【図４】
2017142070.tif 000014
【図５】
2017142070.tif 000015
【図６】
2017142070.tif 000016
【図７−１】
2017142070.tif 000017
【図７−２】
2017142070.tif 000018
【図７−３】
2017142070.tif 000019
【図８−１】
2017142070.tif 000020
【図８−２】
2017142070.tif 000021
【配列表】
2017142070000001.app
【国際調査報告】
2017142070.tif 000022
2017142070.tif 000023
2017142070.tif 000024
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