(57)【要約】  本発明は、下限臨界溶解温度を有するセグメントと疎水性セグメントとのブロックポリマーを含有する細胞培養基材であって、該細胞培養基材中に更に接着基質を有し、該接着基質が細胞外マトリクス及びまたは接着性合成基質であることを特徴とする細胞培養基材を提供するものである。  また、上記細胞外マトリクスが、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン及びそれらのフラグメントから選ばれる少なくとも一種である、及びまたは、接着性合成基質が、ｐｏｌｙ［２−（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ−（３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ］またはオリゴペプチド担持ポリマーである細胞培養基材を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下限臨界溶解温度を有するセグメントと疎水性セグメントとのブロックポリマーを含有する細胞培養基材であって、該細胞培養基材中に更に接着基質を有し、該接着基質が細胞外マトリクス及びまたは接着性合成基質であることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項２】
細胞外マトリクスが、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン及びそれらのフラグメントから選ばれる少なくとも一種である、請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項３】
接着性合成基質が、ｐｏｌｙ［２−（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ−（３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ］またはオリゴペプチド担持ポリマーである、請求項１または２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
前記下限臨界溶解温度を有するセグメントの重合度が４００−１００００である、請求項１から３のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項５】
前記疎水性セグメントが、下記式（１）で表されるモノマーを重合して得られるものである、請求項１から４のいずれかに記載の細胞培養基材。
【化１】
2018116904.tif 000014
・・・（１）
（上記式（１）中、Ｒ１は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２はフェニル基、アルキル炭素数１〜８のカルボキシアルキル基、アラルキル炭素数７または８のカルボキシアラルキル基、下記式（２）で表される基、下記式（３）で表される基のうちのいずれか１つを表す。
【化２】
2018116904.tif 000015
・・・（２）
（上記式（２）において、ｎは２または３を表し、Ｒ３は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）
【化３】
2018116904.tif 000016
・・・（３）
（上記式（２）において、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ４およびＲ５の合計炭素数が５以上であることを表す。））
【請求項６】
前記細胞培養基材上に、更にゼラチン、コラーゲンおよびまたはアルブミンから選ばれる少なくとも一種のタンパク質を含有するものである、請求項１から５のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項７】
請求項１に記載のブロックポリマー、ゼラチン、コラーゲンおよびまたはアルブミンから選ばれる少なくとも一種のタンパク質、請求項１に記載の接着基質の順に積層されることを特徴とする、請求項６に記載の細胞培養基材。
【請求項８】
乾燥細胞培養基材である、請求項１から７のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項９】
支持体上に積層されたことを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の細胞培養基材。
【請求項１０】
平均膜厚が１０００ｎｍ以下である、請求項９に記載の細胞培養基材。
【請求項１１】
請求項１に記載のブロックポリマー上に、
ゼラチン、コラーゲンおよびまたはアルブミンから選ばれる少なくとも一種のタンパク質を含有する溶液を塗布する工程と、
さらに請求項１に記載の接着基質を含有する溶液を塗布し細胞培養基材とする工程と、
得られた細胞培養基材を乾燥する工程とを有する、乾燥細胞培養基材の製造方法。
【請求項１２】
支持体と請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞培養基材とを有する細胞培養器材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用の基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞といったヒト多能性幹細胞は、病理解明や新薬開発並びに再生医療への応用可能性から注目されている。ヒト多能性幹細胞の利用には、安定かつ安全に培養し、さらには培養した細胞を回収したのちに、創薬や医療へ応用する必要がある。
従来より、ヒト多能性幹細胞はその低い培養率が課題となってきた。解決法のひとつとして、フィーダー細胞を利用した培養法が試みられてきたが、用いたフィーダー細胞がコンタミするという問題があることから、安全とはいえなかった。【０００３】
それに対する解決策として、特許文献１では、細胞培養基材上に細胞外マトリクスであるラミニン及びラミニンフラグメントを塗布することで、フィーダー細胞レスであってもヒト多能性幹細胞が培養可能であることが報告されている。
一方、特許文献１では基材上での培養は可能なものの、培養細胞の回収については言及されておらず、培養細胞を利用すると言う点では課題が残されている。例えば上記方法で培養された細胞は、細胞外マトリクスとの接着が強いことから、酵素処理した後にセルスクレパー（ゴムまたは樹脂製ヘラ）等で物理的に細胞を掻き集める方法で細胞を回収しており、作業効率が低い上に物理的刺激を与えることから細胞の生存率に悪影響を及ぼすという課題があった。【０００４】
一方、ラミニン等の細胞外マトリクスをヒト多能性幹細胞に利用するに当たっては、細胞外マトリクスが失活しやすいという課題がある。特に、基材表面が乾燥すると細胞外マトリクスが失活し、ヒト多能性幹細胞の培養効率が低下する。細胞培養基材の保存輸送等を考えると、乾燥状態でも培養効率を維持することが重要である。特許文献２では、ラミニン以外のタンパク質をコーティングすることで乾燥状態に耐えられる細胞培養基材が開示されているが、こちらについても培養は可能なものの、培養細胞の回収という課題は解決されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／０４３４０５
【特許文献２】ＷＯ２０１４／１９９７５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ヒト多能性幹細胞であっても高効率で培養可能であり、かつ培養後の細胞を高い生存率を維持したまま剥離させ回収することが可能な細胞培養基材を提供することにある。また、さらには、細胞剥離可能かつ乾燥状態にも耐えうる細胞培養基材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは鋭意検討した結果、下限臨界溶解温度を有するセグメントと疎水性セグメントとのブロックポリマーを含有する細胞培養基材であって、該細胞培養基材中に更に接着基質を有し、該接着基質が細胞外マトリクス及びまたは接着性合成基質であることを特徴とする細胞培養基材を提供することで、前記課題を解決できることを見出した。【０００８】
また、細胞外マトリクスが、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン及びそれらのフラグメントから選ばれる少なくとも一種である細胞培養基材、または接着性合成気質が、ｐｏｌｙ［２−（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ−（３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ］またはオリゴペプチド担持ポリマーである細胞培養基材を提供する。【０００９】
また、前記下限臨界溶解温度を有するセグメントの重合度が４００−１００００である細胞培養基材を提供する。【００１０】
また、前記疎水性セグメントが、下記式（１）で表されるモノマーを重合して得られるものである、細胞培養基材を提供する。【００１１】
【化１】
2018116904.tif 000002
・・・（１）
（上記式（１）中、Ｒ１は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２はフェニル基、アルキル炭素数１〜８のカルボキシアルキル基、アラルキル炭素数７〜８のカルボキシアラルキル基、下記式（２）で表される基、下記式（３）で表される基のうちのいずれか１つを表す。【００１２】
【化２】
2018116904.tif 000003
・・・（２）【００１３】
（上記式（２）において、ｎは２または３を表し、Ｒ３は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）【００１４】
【化３】
2018116904.tif 000004
・・・（３）
（上記式（２）において、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ４およびＲ５の合計炭素数が４以上であることを表す。））【００１５】
また、前記細胞培養基材上に、更にゼラチン、コラーゲンおよびまたはアルブミンから選ばれる少なくとも一種のタンパク質を含有するものである細胞培養基材を提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の細胞培養基材は、ヒト多能性幹細胞を高効率で培養可能な上、培養後の細胞を高い生存率のまま基材から剥離させ、回収することができる。
また、乾燥状態を経ても培養可能かつ細胞剥離可能な基材を開示する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、下限臨界溶解温度を有するセグメントと疎水性セグメントとのブロックポリマーを含有する細胞培養基材であって、該細胞培養基材中に更に接着基質を有し、該接着基質が細胞外マトリクス及びまたは接着性合成基質であることを特徴とする細胞培養基材を提供するものである。
【００１８】
［下限臨界溶解温度を有するセグメント］
本発明における下限臨界溶解温度を有するセグメントとは、ブロックポリマーにおけるセグメントであって、該セグメントは、ある一定温度以下になると水に溶解する重合体で構成されたセグメントのことをいう。
【００１９】
本発明における下限臨界溶解温度を有するセグメントとは、以下のようなある一定温度以下になると水に溶解する重合体である。下限臨界溶解温度を有する重合体としては、下記１）及び２）が挙げられる。
１）ホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマーを重合させて得られる重合体  
２）疎水化モノマーと親水性モノマーとの共重合体
【００２０】
１）は、ホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマーのみを重合させて得られる重合体セグメントである。ホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマーとしては、例えばＮ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−シクロプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エトキシエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリロイルピペリディン及びＮ−アクリロイルピロリディンが例示される。これらのモノマーは、単独でも複数種を同時に利用してもかまわない。
【００２１】
１）であるホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマーを重合させて得られるセグメントは、簡便に下限臨界溶解温度を有する重合体を製造することが可能である。しかしこれらのモノマーは、プラスチック表面との間に接着性が低く、水に触れると、塗布された重合体層が剥離しやすいと言う課題があるが、本願の細胞培養基材は、疎水性セグメントを含有することから、耐水性に優れるため、培養基材が剥離せずに使用することができる。
【００２２】
２）は、疎水化モノマーと親水性モノマーとの共重合体である。疎水化モノマーと親水性モノマーとの共重合体が下限臨界溶解温度を有するためには、
２−１）親水性モノマーが、ホモポリマーが下限臨界溶解温度を有するモノマーである場合と、
２−２）下記式（１）で表されるモノマー（ａ）と親水性のアミド系ビニルモノマー（ｂ）との共重合体（Ｂ１）、前記またはモノマー（ａ）と下記式（２）表されるモノマー（ｃ）との共重合体（Ｂ２）、またはモノマー（ａ）と下記式（３）表されるポリエチレングリコール鎖含有モノマー（ｄ）との共重合体（Ｂ３）、が挙げられる。
【００２３】
【化４】
2018116904.tif 000005
（式中、Ｒ１は水素原子またはメチル基、Ｒ２は炭素原子数２〜３のアルキレン基、Ｒ３は炭素原子数１〜２のアルキル基を表す。）
【００２４】
【化５】
2018116904.tif 000006
（式中、Ｒ４は水素原子またはメチル基、Ｒ５は炭素原子数２〜３のアルキレン基を表す。）
【００２５】
【化６】
2018116904.tif 000007
（式中、ｎは２〜２０の整数を表す。）
【００２６】
親水性のアミド系モノマー（ｂ）としては、ジメチルアクリルアミド、アクリルアミド、メチルアクリルアミド、エチルアクリルアミドなどが例示される。
【００２７】
疎水化モノマーとは、モノマー時は水溶性であるが重合すると水性溶媒に不溶化するモノマーである。このようなモノマーが共重合体に含有されている場合、耐水性に優れ支持体から剥がれにくい細胞培養基材とすることができる。
疎水化モノマーとしては、前記式（１）で表される化合物や、  疎水化モノマーとしては、前記式（１）で表される化合物や、ジアセトンアクリルアアミド、（メタ）アクリル酸ポリプロピレングリコール、メトキシジエチレングリコールアクリレート、メトキシトリエチレングリコールアクリレートが挙げられる。これらは単独でも複数種を同時に使用してもかまわない。中でも、アクリル酸２メトキシエチル、アクリル酸２エトキシエチル、アクリル酸３メトキシプロピルが好ましく、アクリル酸２メトキシエチル、アクリル酸２エトキシエチルが特に好ましい。
【００２８】
２−２）で開示される共重合体セグメントの場合、得られる共重合体セグメントの下限臨界溶解温度が、モノマーの種類や比率により幅広く制御でき、更に、細胞の種類に応じて、適宜モノマーの種類や比率を変え、より良好な細胞接着性と増殖性を持って細胞を培養できることから好ましい。例えば、モノマー（ａ）に対し、モノマー（ｂまたはｃ、またはｄ）の比率を増えるにつれ、得られる共重合体の下限臨界溶解温度が高温側へシフトする。この比率と下限臨界溶解温度がほぼ直線関係にある。細胞培養温度は通常３７℃であるため、得られる共重合体の下限臨界溶解温度は２０〜３２℃付近になるように調製することが好ましい。
【００２９】
また、本発明における下限臨界溶解温度を有するセグメントは、下限臨界溶解温度を有する範囲内で、ホモポリマが下限臨界溶解温度を有するモノマー、親水性モノマー及び疎水化モノマーからなる群に含まれないモノマーを含有することができる。
【００３０】
本発明のブロックポリマーにおいて、前記下限臨界溶解温度を有するセグメントの重合度は、４００−１００００であると好ましい。４００以上である場合、細胞剥離性がより良好となり、１００００より小さい場合は、ブロックポリマーの合成上、より容易であるからである。
好ましい重合としては１０００−８０００であり、この範囲であれば細胞剥離性と培養効率のバランスに優れる。特に好ましくは３０００―６０００である。
【００３１】
［疎水性セグメント］
本発明のブロックポリマーは、疎水性セグメントを有することを特徴とする。なお、本明細書において、ブロックポリマーのセグメントにおける「疎水性」とは、セグメントからなる重合体について、水中における２５℃での溶解度が０．５ｇ／１００ｍＬ未満であることを意味する。疎水性セグメントは、少なくとも疎水性モノマーのモノマー単位を含む。
本発明のブロックポリマーは、疎水性セグメントを有することから、耐水性に劣る下限臨界溶解温度を有するセグメントを有していても、耐水性に優れ支持体との密着性に優れる。
【００３２】
疎水性モノマーとしては、重合後に疎水化するモノマーであれば特に制限はされないが、好ましくは下記式（１）〜（３）で表されるモノマーが挙げられる。なお、これらの疎水性モノマーは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３３】
【化７】
2018116904.tif 000008
・・・（１）
【００３４】
（上記式（１）中、Ｒ１は水素原子またはメチル基であり、Ｒ２はフェニル基、アルキル炭素数１〜８のカルボキシアルキル基、アラルキル炭素数７〜８のカルボキシアラルキル基、下記式（２）で表される基、下記式（３）で表される基のうちのいずれか１つを表す。
【００３５】
【化８】
2018116904.tif 000009
・・・（２）
【００３６】
（上記式（２）において、ｎは２または３を表し、Ｒ３は炭素数１〜３のアルキル基を表す。）
【００３７】
【化９】
2018116904.tif 000010
・・・（３）
【００３８】
（上記式（２）において、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ４およびＲ５の合計炭素数が５以上であることを表す。））
【００３９】
この中でも、上記式（１）で表されるモノマーであれば、得られる重合体セグメントが疎水性となり、細胞培養基材の耐水性と支持体密着性に優れるため好ましい。
その中でも好ましくは、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、スチレンであり、特に好ましくはブチルアクリレートである。
【００４０】
本発明のブロックポリマーにおいて、前記疎水性セグメントの重合度は、５０−１０００であると好ましい。５０以上である場合、耐水性がより良好となり、１０００より小さい場合は、細胞剥離性がより良好となるためである。
【００４１】
［ブロックポリマー］
本発明のブロックポリマーは、前記下限臨界溶解温度を有するセグメントと、疎水性セグメントとを有するポリマーである。下限臨界溶解温度を有するセグメントをＡ、疎水性セグメントをＢとした時に、本発明のブロックポリマーはＡＢのジブロックタイプでもよく、ＡＢＡまたはＢＡＢのトリブロックタイプでも、それ以上のセグメント数を有するポリマーであってもかまわない。好ましくは、ジブロックタイプまたはトリブロックタイプであり、特に好ましくはジブロックタイプである。
【００４２】
［ブロックポリマーの分子量］
ブロックポリマーの分子量は、重量平均分子量（Ｍｗ）で、５００００〜１００００００が好ましく、７００００〜９０００００がより好ましく、４０００００〜８０００００がさらに好ましい。重量平均分子量が５００００以上であれば、細胞剥離性が高いため好ましく、１００００００以下であれば、取扱いが容易であるため好ましい。
【００４３】
［ブロックポリマーの製造方法］
ブロックポリマーの製造方法は、特に制限されず、公知の方法を採用することができる。このうち、精密ラジカル重合であることが好ましく、可逆的付加−開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）であることがより好ましく、ＲＡＦＴ重合であることがさらに好ましい。
【００４４】
〔ブロックポリマーの成形方法〕
本発明の細胞培養基材を形成させる好ましい方法として、本発明のブロックポリマーを含むコーティング剤を上述した支持体上に塗布する方法が挙げられる。
＜コーティング剤＞
前記コーティング剤は、ブロックポリマーと、溶媒と、を含む。その他、必要に応じて、添加剤等を含んでいてもよい。
【００４５】
［ブロックポリマー］
ブロックポリマーとしては、上述したものが用いられることからここでは説明を省略する。
なお、ブロックポリマーは１種のみを含んでいてもよいし、異なる構成を有する２種以上のブロックポリマーを含んでいてもよい。
ブロックポリマーの含有量は、コーティング剤の全質量に対して、０．０１〜９０質量％であることが好ましく０．１〜５０質量％であることがより好ましい。ブロックポリマーの含有量が０．０１質量％以上であると、得られる塗膜が表面親水性を発現しやすいことから好ましい。一方、ブロックポリマーの含有量が９０質量％以下であると、粘度が低いことから塗工適性が高まることから好ましい。
【００４６】
［溶媒］
コーティング剤に含有されうる溶媒としては、特に制限されず公知のものが使用されうる。
溶媒の具体例としては、水または有機溶媒が挙げられる。
前記有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール系溶媒；テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル系溶媒；シクロヘキサノン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒；アセトニトリル等のニトリル系溶媒；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキシド；ジオキシラン；ピロリドン等が挙げられる。これらのうち、有機溶媒としてはアルコール系溶媒を用いることが好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ｔｅｒｔ−ブタノールを用いることがより好ましい。
上述のうち、溶媒は、水、アルコール系溶媒であることが好ましく、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ｔｅｒｔ−ブタノールであることがより好ましい。
上述の溶媒は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
コーティング剤中の溶媒の含有量は、コーティング剤の全質量に対して、１０〜９９．９９質量％であることが好ましく、５０〜９９．９質量％であることがより好ましく、８０〜９９．５質量％であることがさらに好ましい。溶媒の含有量が１０質量％以上であると、コーティング剤溶液の粘度が低くなるため、塗工適正に優れることから好ましい。一方、溶媒の含有量が９９．９９質量％以下であると、コーティング後の塗膜の厚さが薄くなりすぎず好ましい。
【００４７】
［添加剤］
コーティング剤は、使用目的に応じて添加剤を含有してもよい。
当該添加剤としては、特に制限されず、公知のものが使用されうる。具体的には、賦形剤、
界面活性剤、可塑剤、消泡剤、顔料、抗酸化剤、抗生物質、紫外線吸収剤、結晶核剤、結晶化促進剤、安定化剤、抗菌剤等が挙げられる。これらの添加剤は、単独で用いても、２種以上を混合して用いてもよい。
コーティング剤の塗布方法は、特に制限はなく、スプレーコート法、フローコート法、浸漬法等が挙げられる。
また、基材がチューブ状である場合には、コーティング剤を通液させる方法等が挙げられる。この際、通液後は、通常、溶媒を通液させてチューブ内部の余分なコーティング剤を除去する。
乾燥条件についても特に制限されず、自然乾燥であっても加熱乾燥であってもよい。加熱乾燥である場合の乾燥温度は、使用するコーティング剤によっても異なるが、３０〜７０℃であることが好ましく、４０〜６０℃であることがより好ましい。なお、乾燥を制御することで、一部溶媒を残存させた塗膜を得ることができる。
【００４８】
〔接着基質〕
本発明の細胞培養基材は、接着基質を基材中に有することで、ヒト多能性幹細胞の培養性が向上する。接着基質としては、細胞外マトリクスと接着性合成基質が挙げられる。
【００４９】
細胞外マトリクスとしては、具体的には、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン及びそれらのフラグメントが挙げられる。好ましくは、ラミニン及びビトロネクチン、及びそれらのフラグメントが挙げられる。細胞外マトリクスとしては動物由来であれば利用できるが、好ましくはヒト及びマウス由来の細胞外マトリクスである。更に好ましくは組換えタンパク質として製造されたものである。市販品として、マトリゲル（コーニング社製）、ゲルトレックス（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ社製）、Ｌａｍｉｎｉｎ５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）等が利用可能である。
【００５０】
細胞外マトリクスと同時に、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ  ｋｉｎａｓｅ）阻害剤を使用しても良い。ＲＯＣＫ阻害剤を使用することで、単一細胞に分散したヒト多能性幹細胞の培養がさらに容易になる。Ｙ−２７６３２（和光純薬工業）やＦａｓｕｄｉｌ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（東京化成工業株式会社製）が挙げられる。
【００５１】
接着性合成基質としては、ｐｏｌｙ［２−（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ−（３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ］（以降ＰＭＥＤＳＡＨと略）またはオリゴペプチド担持ポリマーが挙げられる。オリゴペプチド担持ポリマーは、細胞接着活性を有するアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を有するオリゴペプチドをポリマーに共有結合させた基質である。市販品としてＳｙｎｔｈｅｍａｘ（コーニング社製）が挙げられる。
【００５２】
接着基質は、基材に対しどのような方法で供してもかまわない。例えば接着基質を基材中に混合してもよいし、塗布してもかまわない。また、細胞培養用の培地に接着剤基質を含有させ、培地と同時に基材と接触させる形で供しても良い。
当該接着基質は、基材中に均一に存在していても、不均一に存在していてもかまわない。好ましくは、基材表面に存在する場合である。塗布による接着剤基質の供給を行う場合、塗布方法としては接着基質の溶液を公知慣用の方法を用いて塗ればよく、スプレーコート、スピンコート、インクジェット等で塗布してもよいし、版を用いてスタンプしてもかまわない。溶液を基材上に注ぎ、一定期間静置したのちに溶液を除去する方法でもよく、使用方法に応じて適宜選択すればよい。
【００５３】
接着基質を細胞培養基材表面に塗布する場合、塗布量としては、細胞培養基材の面積あたり、０．０１〜５μｇ／ｃｍ２が好ましく、０．２〜２μｇ／ｃｍ２が更に好ましく、０．５〜１μｇ／ｃｍ２が特に好ましい。
【００５４】
〔ゼラチン、コラーゲンまたはアルブミン〕
更に接着基質の活性維持や細胞培養効率を上げるために、細胞培養基材上にゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンを存在させてもかまわない。ゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンは、前記接着基質と同様、細胞培養基材中に混合してもよいし、塗布してもかまわない。塗布する場合は、ゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンを先に塗布した後に接着基質を塗布するほうが、接着基質の活性維持や細胞培養効率においては好ましい。また、ゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンは、１種でもよいし複数種を同時に用いてもかまわない。
【００５５】
ゼラチン、コラーゲンまたはアルブミンの塗布量としては、０．５〜５００μｇ／ｃｍ２が好ましく、５〜２００μｇ／ｃｍ２が更に好ましく、２０〜１００μｇ／ｃｍ２が特に好ましい。
【００５６】
本発明の細胞培養基材は、単体で用いてもよいが、輸送や保管等の利便性の面から支持体上に形成されることが好ましい。特に好ましくは、支持体に細胞培養基材を積層して積層体とする方法である。
【００５７】
［その他の配合物］
本発明の細胞培養基材は、ブロックポリマーや細胞外マトリクス、ゼラチンまたはコラーゲンのほかに、配合物を有していても良い。例えば防腐剤や抗菌剤、着色料、香料、酵素、糖類、たんぱく質、ペプチド類、アミノ酸類、細胞、ＤＮＡ類、塩類、水溶性有機溶剤類、界面活性剤、高分子化合物、レベリング剤などを含んでもかまわない。
【００５８】
［細胞培養基材］
本発明の細胞培養基材の形状は、細胞培養でき、低温処理により培養細胞を容易に剥離できるものであれば、特に限定されない。例えば、フィルム状のもの、皿状のもの、ボトル（ビン）状のもの、チューブ状のもの、太さ５ｎｍ〜５ｍｍの糸状または棒状のもの、バッグ（袋）状のもの、マルチウエルプレート状のもの、マイクロ流路状のもの、多孔質膜状または網状のもの（例えばトランスウエル、セルストレイナー）、粒径が好ましくは１０〜２０００μｍ、より好ましくは１００〜５００μｍの球状のものなどが挙げられる。
【００５９】
本発明の細胞培養基材は、単体で用いてもよいが、支持体上に基材を形成した細胞培養器材として用いる事が好ましい。細胞培養器材とした場合、輸送や保管等の利便性に優れるほか、そのまま培養容器や培養用担体として用いることもできるからである。
【００６０】
本発明で用いられる支持体の材質は、培養基材が十分接着でき、且つ接着された培養基材上で細胞培養ができ、低温処理により培養細胞を容易に剥離できるものであれば、特に限定されない。例えば、ポリスチレンのようなスチレン系樹脂、ポリプロピレンのようなポリオレフィン系樹脂、ポリウレタン系樹脂、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスルホン系樹脂、フッ素系樹脂、セルロースのような多糖類天然高分子、ガラスやセラミックスのような無機材料、ステンレス、チタンのような金属類材料が好適に用いられる。
【００６１】
支持体の形状には特に限定はなく、本発明の細胞培養基材の支持体となりうる形状であればよい。例えばフィルム状のもの、膜状のもの、板状のもの、球状のもの、多角形状のもの、棒状のもの、皿状のもの、ボトル（ビン）状のもの、チューブ状のもの、針・糸状のもの、繊維状のもの、バッグ（袋）状のもの、マルチウエルプレート状のもの、マイクロ流路状のもの、多孔質膜状または網状のもの（例えばトランスウエル、セルストレイナー）等が挙げられる。これらを組み合わせた形状でも良いし、特定の形状を有さない不定形状の支持体であっても良い。
【００６２】
更に、本発明の細胞培養基材が、支持体と一体化して細胞培養器材として使用されるのは勿論のこと、支持体から剥がして単独に使用してもよい。
【００６３】
〔培養細胞〕
本発明の細胞培養基材は、様々な細胞、特に動物細胞を好適に培養することが可能である。動物細胞としては、由来は動物であればよく、ヒト、マウス、サル等が挙げられ、人工細胞であっても構わない。細胞種としては特に限定は無いが、上皮細胞（角膜上皮細胞など）、内皮細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞など）、線維芽細胞（ヒト皮膚線維芽細胞、マウス線維芽細胞など）、血球細胞、収縮性細胞（骨格筋細胞、心筋細胞など）、血液と免疫細胞（赤血球、マクロファージなど）、神経細胞（ニューロン、グリア細胞など）、色素細胞（網膜色素細胞など）、肝細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、幹細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、造血幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、ＥＣ細胞、ＥＧ細胞、神経幹細胞）等が挙げられる。中でも、本発明の細胞培養基材は、培養が難しい幹細胞、特にＥＳ細胞やｉＰＳ細胞に対し好適に利用可能である。
【００６４】
〔乾燥細胞培養基材〕
本発明の細胞培養基材は、乾燥状態を経てもヒト多能性幹細胞の培養が可能である。それゆえに、長期間保存や輸送に耐えうることから、産業上利用可能性が非常に高い。
乾燥方法としては特に限定は無く、後述する支持体上に細胞培養基材を積層したのち、乾燥させればよい。例えば室温乾燥（１８〜３０℃、湿度２０％〜６０％ＲＨ）、加熱乾燥（３０〜３７℃）、恒温乾燥機やデシケーターによる乾燥等が挙げられる。タンパクの変性を防ぐ観点から、室温乾燥が好ましい。
乾燥時の細胞培養基材の膜厚は、１０００ｎｍ以下であることが好ましく、５００ｎｍ以下であると更に好ましい。１０００ｎｍ以下であれば、細胞培養性が良好であるためである。
【００６５】
〔細胞の培養方法〕
培養方法としては、公知慣用の方法を用いればよく、例えば皿状容器の底面に形成させた培養基材に、所定量の培地や培養試薬を入れ、細胞を播種して、所定温度、ＣＯ２濃度条件で培養してもよいし、糸状や球状に形成させた培養基材を、培地の入った市販ポリスチレン容器に入れ、細胞を播種して培養してもかまわない。後者の場合、細胞はポリスチレン容器に接着せず、糸状や球状培養基材の表面に接着して増殖する。例えば太さ５０μｍの糸状培養基材を用いた場合、細胞は糸の長さ方向に増殖するため、細胞形状を制御した形で培養することもできる。また、球状培養基材を用いた場合、通常の皿状容器に比べ、表面積が大きく、より多くの細胞を培養できる利点がある。
【００６６】
〔細胞の剥離方法（温調法）〕
培養された細胞を基材から剥がす方法としては特に限定されないが、例えば、培養終了後、所定温度（６℃〜３０℃）の培地で３７℃の培地を置換し、所定温度（６℃〜３０℃）で静置して、細胞の自然剥離を待っても良いし、培養容器を軽く揺らしたり、ピペットで培地を吸ったり出したりする「ピペッティング」操作で、穏やかな水流で細胞に物理的刺激を与えて、細胞を剥離しても良い。
【００６７】
〔細胞の剥離方法（酵素法）〕
細胞同士の結合を切り、単一細胞にしたい場合は、酵素処理による剥離法を使用してもよい。使用するタンパク分解酵素の種類は、細胞の種類により適宜選択すればよい。例えば、トリプシン、トリプシン／ＥＤＴＡ、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）が挙げられる。処理温度や時間は、細胞の種類や基材との接着強さにより適宜調整すればよい。例えば、培養終了後、培養を除去し、緩衝液等で細胞を洗浄して、酵素溶液を加え、３７℃一定時間静置した後、酵素溶液を除去し、所定温度（６℃〜３７℃）の緩衝液または培地を加え、静置または「ピペッティング」操作により細胞を剥離する方法が挙げられる。勿論、低温処理と酵素使用を合わせて細胞を剥離しても良い。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例にのみ限定されるものではない。【００６９】
＜ＧＰＣ＞
ＧＰＣの測定方法は以下の通り。
装置：ＨＬＣ−８２２０ＧＰＣ（東ソー株式会社製）
溶媒：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＬｉＢｒ含有）
カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ  αーＭカラム（東ソー株式会社製）  ２本連結
標準物質：ＰＭＭＡ標準（Ｓｈｏｄｅｘ  Ｍ−７５）【００７０】
（ＮＭＲの測定方法）
１Ｈ−ＮＭＲ：ＪＥＯＬ製  ＪＮＭ−ＥＣＺ４００Ｓ
磁場強度：４００ＭＨｚ
積算回数：１６回
溶媒：重メタノール
試料濃度：１０質量％【００７１】
（ＡＦＭの測定方法）
原子間力顕微鏡：Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ製  ＮａｎｏＳｃｏｐｅ（Ｒ）  ＩＩＩａ
測定モード：ＤＦＭ、サンプル測定２箇所の平均【００７２】
［合成例１］  ブロックポリマー１の合成
ブチルアクリレート（和光純薬株式会社製）０．４７５ｇ、ＲＡＦＴ剤として２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．０１３ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．００６ｇ、ｔブタノール９．０ｇ、水１．０ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるブチルアクリレートのコンバージョンは８２％であった。
次いで、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下ＮＩＰＡＭ、株式会社ＫＪケミカル製）１．６８ｇ、ｔブタノール１０．８ｇ、水１．２ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌した。反応終了後、反応液にメタノール２２．９ｇを加えて、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ブチルアクリレートのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは１００％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝４１０００、Ｍｗ＝７４０００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。【００７３】
［合成例２］  ブロックポリマー２の合成
ブチルアクリレート  １．１９ｇ、ＲＡＦＴ剤として２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．０１３ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．００２ｇ、ｔブタノール８．０ｇ、水１．０ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるブチルアクリレートのコンバージョンは８４％であった。
次いで、ＮＩＰＡＭ  ６．３ｇ、ｔブタノール２０．８ｇ、水２．２ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌して、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ブチルアクリレートのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９７％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝１３７０００、Ｍｗ＝２７７０００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。  【００７４】
［合成例３］  ブロックポリマー３の合成
ブチルアクリレート  ０．４７４ｇ、ＲＡＦＴ剤として２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．０１３ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．００６ｇ、ｔブタノール８．０ｇ、水１．０ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるブチルアクリレートのコンバージョンは８７％であった。
次いで、ＮＩＰＡＭ  １０．５ｇ、ｔブタノール３０．５ｇ、水３．４ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌して、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ブチルアクリレートのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９９％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝２７４０００、Ｍｗ＝４８９０００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。【００７５】
［合成例４］  ブロックポリマー４の合成
ブチルアクリレート  ０．７１ｇ、ＲＡＦＴ剤として２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．００７８ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．００２４ｇ、ｔブタノール５．４ｇ、水０．６ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるブチルアクリレートのコンバージョンは９７％であった。
次いで、ＮＩＰＡＭ  ７．５５ｇ、ｔブタノール２４．３ｇ、水２．７ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌して、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ブチルアクリレートのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９９％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝２０００００、Ｍｗ＝４４００００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。【００７６】
［合成例５］  ブロックポリマー５の合成
ブチルアクリレート  ０．５９ｇ、ＲＡＦＴ剤として２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．００６５ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．００３６ｇ、ｔブタノール９．０ｇ、水１．０ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるブチルアクリレートのコンバージョンは８１％であった。
次いで、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下ＮＩＰＡＭ、株式会社ＫＪケミカル製）１０・５３ｇ、ｔブタノール４９．８６ｇ、水５．５４ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌した。反応終了後、反応液にメタノール６６．７ｇを加えて、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ブチルアクリレートのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９９％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝２２００００、Ｍｗ＝７６００００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。【００７７】
［合成例６］  ブロックポリマー６の合成
メトキシエチルアクリレート（以下ＭＥＡ、大阪有機化学株式会社製）１．２１ｇ、ＲＡＦＴ剤として２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．０１２９ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．００５４ｇ、ｔブタノール９．０ｇ、水１．０ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるＭＥＡのコンバージョンは９８％であった。
次いで、ＮＩＰＡＭ  ６．２９ｇ、ｔブタノール１８．０ｇ、水２．０ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌した。反応終了後、反応液にメタノール３７．５ｇを加えて、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ＭＥＡのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９８％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝１１４０００、Ｍｗ＝３３８０００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。【００７８】
［合成例７］  ブロックポリマー７の合成
ＭＥＡ  ０．９７ｇ、ＲＡＦＴ剤として２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．０１０４ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．００３２ｇ、ｔブタノール７．２ｇ、水０．８ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるＭＥＡのコンバージョンは９２％であった。
次いで、ＮＩＰＡＭ  ８．３９ｇ、ｔブタノール２６．５ｇ、水２．９ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌した。反応終了後、反応液にメタノール４６．８ｇを加えて、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ＭＥＡのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９０％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝１５２０００、Ｍｗ＝４３００００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。【００７９】
［合成例８］  ブロックポリマー８の合成
ＭＥＡ  １．４５ｇ、ＲＡＦＴ剤として２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．０１５６ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．００８ｇ、ｔブタノール１０．８ｇ、水１．２ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるＭＥＡのコンバージョンは９８％であった。
次いで、ＮＩＰＡＭ  １５．１ｇ、ｔブタノール４８．８ｇ、水５．４ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌した。反応終了後、反応液にメタノール８２．８ｇを加えて、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ＭＥＡのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９６％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝２０５０００、Ｍｗ＝５７６０００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。【００８０】
［合成例９］  ブロックポリマー９の合成
ＭＥＡ  １．４６ｇ、ＲＡＦＴ剤として２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．０１５６ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．００７７ｇ、ｔブタノール１０．８ｇ、水１．２ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるＭＥＡのコンバージョンは９８％であった。
次いで、ＮＩＰＡＭ  １８．８ｇ、ｔブタノール５８．８ｇ、水６．４ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌した。反応終了後、反応液にメタノール７２．８ｇを加えて、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ＭＥＡのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９７％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝２３４０００、Ｍｗ＝７３７０００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。【００８１】
［合成例１０］  ブロックポリマー１０の合成
ＭＥＡ  ０．９６ｇ、ＲＡＦＴ剤として２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．０１０５ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．００４９ｇ、ｔブタノール９ｇ、水１ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるＭＥＡのコンバージョンは９７％であった。
次いで、ＮＩＰＡＭ  １６．９ｇ、ｔブタノール５４．７ｇ、水６．３ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌した。反応終了後、反応液にメタノール８９ｇを加えて、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ＭＥＡのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９８％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝１９２０００、Ｍｗ＝７７２０００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。【００８２】
［合成例１１］  ブロックポリマー１１の合成
スチレン（以下Ｓｔ、和光純薬株式会社製）  ５．７９ｇ、ＲＡＦＴ剤として２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．０４０ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．０１２２ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるＳｔのコンバージョンは４０％であり、計算される重合度は２００であった。
ついで、得られたＲＡＦＴ剤含有ポリスチレンをジイソプロピルエーテル中で再沈殿後、７０℃で真空乾燥させて、モノマーを除去した。その後、ＲＡＦＴ剤含有ポリスチレン１ｇ、ＮＩＰＡＭ  ８．０２ｇ、酢酸エチル４５．２、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．０１２２ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌して、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９８％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝６２０００、Ｍｗ＝２２１０００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。【００８３】
［調整例１］  ４分岐ＲＡＦＴ剤の合成
非特許文献「Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３６、１５０５（２００３）」に従い、
下記の手順でＲＡＦＴ剤「テトラキス（３−１Ｓ−（１−メトキシカルボニル）エチルト
リチオカルボニルプロピオン酸）ペンタエリスリトール」を合成した。【００８４】
ジクロロメタン１０ｍＬ、ペンタエリスリトール（３−メルカプトプロピオネート）１
．２２ｇ、二硫化炭素２．００ｇ、トリエチルアミン２．０４ｇを入れ、１時間攪拌した
。ついで、２−ブロモプロピオン酸メチル１．９４ｇを入れ、更に５時間攪拌した後、５
％ＫＨＳＯ４水溶液で洗浄した。更に水洗の後、飽和食塩水で乾燥した。硫酸マグネシウ
ム処理後、エバポレーターを用いてジクロロメタンを除いた。得られた橙色油状生成物を
、ヘキサン／アセトンを溶離液とするシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してＲ
ＡＦＴ剤「テトラキス（３−１Ｓ−（１−メトキシカルボニル）エチルトリチオカルボニ
ルプロピオン酸）ペンタエリスリトール」を得た。【００８５】
［合成例１２］  ブロックポリマー１２の合成
ＭＥＡ  １．４８ｇ、ＲＡＦＴ剤として前記テトラキス（３−１Ｓ−（１−メトキシカルボニル）エチルトリチオカルボニルプロピオン酸）ペンタエリスリトール  ０．０１３ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．００４２ｇ、ｔブタノール７．２ｇ、水０．８ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるＭＥＡのコンバージョンは９７％であった。
次いで、ＮＩＰＡＭ  １２．９ｇ、ｔブタノール４５．７ｇ、水５ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌した。反応終了後、反応液にメタノール６０ｇを加えて、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ＭＥＡのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９８％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝２５００００、Ｍｗ＝７８２０００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。【００８６】
［合成例１３］  ブロックポリマー１３の合成
ブチルメタクリレート（以下ＢＭＡ、和光純薬株式会社製品）  １．９２ｇ、ＲＡＦＴ剤として２−（ドデシルチオカルボノチオイルチオ）プロパン酸０．０６０ｇ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ２，２’−ａｚｏｂｉｓ（２−ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）０．０１２ｇ、ｔブタノール１０．８ｇ、水１．２ｇを十分に窒素バブリングして酸素を除去した後、７０℃にて７時間攪拌して、第１の反応液を得た。この段階におけるＢＭＡのコンバージョンは８３％であった。
次いで、ＮＩＰＡＭ  ６．１ｇ、ｔブタノール１８ｇ、水２ｇの混合物を十分に窒素バブリングさせた後に、前述の反応液に添加し、更に７０℃にて２０時間攪拌して、ＡＢ型の温度応答性ブロックポリマー溶液を得た。このブロックポリマーのコンバージョンをＮＭＲで測定したところ、ＭＥＡのコンバージョンは１００％、ＮＩＰＡＭのコンバージョンは９９％であった。また、このブロックポリマーの分子量分布を測定したところ、Ｍｎ＝３４０００、Ｍｗ＝５１０００であった。コンバージョンから計算した疎水セグメントと下限臨界温度を有するセグメントの重合度は、それぞれ表１のようになった。また、後述する試験法でこのブロックポリマーの水ゲル分率を測定した結果を表１に示す。【００８７】
（培養基材の作製例）
［実施例１］
ブロックポリマー１をメタノールで希釈して０．５％溶液を作成し、３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（３５ｍｍ／Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ、ＡＧＣテクノグラス製）に６０ｕｌ添加した。その後、８０℃にて３０分間乾燥させ、さらに純水に１０分間浸漬させる操作を三回繰り返して洗浄し、４０℃にて一晩乾燥させることで、細胞培養基材を積層した細胞培養容器１を得た。得られた細胞培養基材の膜厚を原子間力顕微鏡で測定したところ、５０ｎｍであった。
この細胞培養基材を後述する方法でラミニンコートを行い、後述する試験法でｉＰＳ細胞培養性及び細胞の温感剥離性の評価を行った結果を表１に示す。【００８８】
［実施例２〜１３］
実施例１と同様の方法で、ブロックポリマー２〜１３からそれぞれ細胞培養基材を積層した細胞培養容器２〜１３を作成した。この細胞培養基材を後述する方法でラミニンコートを行い、後述する試験法でｉＰＳ細胞培養性及び細胞の温感剥離性の評価を行った結果を表１に示す。【００８９】
［比較例１］
市販の温感剥離培養容器「ＵＰＣＥＬＬ（ポリイソプロピルアクリルアミドホモポリマー固定化細胞培養基材、セルシード株式会社製品）」の３５ｍｍシャーレに、後述するラミニンコート法を用いてラミニンコートを行った後、後述する試験法でｉＰＳ細胞培養性及びｉＰＳ細胞温感剥離性の評価を行った。【００９０】
［比較例２］
市販の細胞培養容器３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（ＴＣＰＳ、３５ｍｍ／Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ、ＡＧＣテクノグラス製）に、後述するラミニンコート法を用いてラミニンコートを行った後、後述する試験法でｉＰＳ細胞培養性及びｉＰＳ細胞温感剥離性の評価を行った。【００９１】
〔実施例１〜１３、比較例１〜２のラミニン塗工方法〕
実施例１〜１３、比較例１〜２の細胞培養容器に、濃度１０ｕｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．５μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃、１時間静置した。その後、乾燥させることなく、後述するｉＰＳ細胞培養・温感剥離試験を行った。【００９２】
（水ゲル分率）
前記乾燥培養基材０．１ｇを２００メッシュのステンレス金網で包み、４℃の水中で２０時間放置前後のサンプルを１３０℃の熱風乾燥機で２時間乾燥させた重量をそれぞれ測定し、冷水中に静置した前後の重量減少率を調べた。この値が高いほど、培養基材の耐水性が高く、培養基材からの水による溶出が起こり難いと言える。【００９３】
［ｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価］
培養容器１にＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（添加量：０．５μｇ／ｍＬ培地）を加えたＳｔｅｍＦｉｔ  Ａｋ０２Ｎ培地（味の素株式会社製）を２ｍｌ添加し、更にヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株、ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社製）を一定量（約１×１０４個／ｃｍ２）入れ、５％ＣＯ２雰囲気の３７℃恒温器内で静置し、５日間培養を行なった。培地は２日に１回の頻度で交換を行った。次いで、温調剥離法で細胞を剥離した。即ち４℃の冷媒地で培地交換をし、室温で１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりする「ピペッティング操作」を約１０回行い、細胞剥離を行った。次いで、前記「細胞の剥離率と生存率、及び培養性の測定」方法に従って、剥離した細胞数と剥離細胞中の死細胞数、及び全培養細胞数を計測し、式（６）、（７）、（８）より剥離率、生存率及び培養性を算出した。【００９４】
（細胞の剥離率と生存率、及び培養性の測定）
培養終了後、温調法または酵素法で細胞剥離操作を行い、剥離された細胞懸濁液を細胞計測専用カセットに吸入しで吸い込み、細胞計数装置ＮＣ−１００（株式会社エムエステクノシステムズ社製）を用いて細胞懸濁液中剥離細胞中の死細胞数を計測する。また、剥離された細胞を培地ごとに１００μＬを１．５ｍｌのチューブに移し、ＲｅａｇｅｎｔＡとＲｅａｇｅｎｔＢ（株式会社エムエステクノシステムズ社製）を１００μｌずつ加え、数回ピペッティングして均一に混同した後、同様に新たなカセットで液を吸入し吸い上げ、細胞計数装置ＮＣ−１００にセットし剥離した細胞数を計測する。更に、剥離操作後の剥離細胞を全て除去したシャーレにＲｅａｇｅｎｔＡを適量加え、室温（２５℃）にて１０分間静置してスクレーパー（ゴムヘラ）を用いてシャーレに残存した細胞未剥離細胞を完全に剥離・溶解した剥がした後、ＲｅａｇｅｎｔＢを適量加え、数回ピペッティングして均一に混同して細胞計数装置ＮＣ−１００にセットしシャーレに残った未剥離の細胞数を計測する。細胞剥離率と生存率及び培養性はそれぞれ下記式（６）、（７）、（８）より算出する。
剥離率＝［剥離した細胞数／（剥離した細胞数＋未剥離の細胞数）］×１００
・・・（６）
生存率＝（１−剥離細胞中の死細胞数／剥離した細胞数）×１００
・・・（７）
培養性＝培養基材で得た細胞総数／ＴＣＰＳ（市販の組織培養用シャーレ）で得た細胞総数＊
・・・（８）
＊細胞総数＝剥離した細胞数＋未剥離の細胞数【００９５】
（アルカリホスファターゼ染色（ＡＰ染色）例）
未分化ｉＰＳ細胞は高いアルカリホスファターゼ活性を示すため、濃く染色される。逆に、分化細胞はアルカリホスファターゼ活性を示さず染色されない。
試薬としてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製の「Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｋｉｔ」を使用した。操作手順としては、培養終了後、シャーレ中の培地を除いてリン酸緩衝液を加え細胞を洗浄した後リン酸緩衝液を除く。次いで、固定液を加え約１分間製置してから固定液を除き水で洗浄した後、染色液を加え室温（２５℃）１時間静置する。染色液を除き、水で洗浄して、封入剤をいれカバーガラスで覆って顕微鏡で観察する。アルカリホスファターゼ活性を示す場合（陽性）、赤く染色される。【００９６】
【表１】
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【００９７】
＜保存安定性試験＞
実施例１４〜２９の培養基材は全て下記方法で作製した。
ブロックポリマー１２（実施例２６、２７はブロックポリマー８、実施例２８、２９はブロックポリマー１３）の１質量％メタノール溶液を、３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（３５ｍｍ／Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ、ＡＧＣテクノグラス株式会社製）に適量を入れ、スピンコーターを用いてシャーレの表面に薄く塗布し、８０℃の恒温器中で２０分間乾燥させた。次いで、滅菌水によりシャーレを洗浄した後、滅菌袋中でシャーレを４０℃、５時間乾燥して、細胞培養容器１４〜２９を得た。ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）を用いて塗膜の厚みを測定したところ、膜厚は約２０ｎｍであった。【００９８】
実施例１４、２６、２８の［ラミニンコート］  
細胞培養容器１４、２６、２８に、濃度１０μｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．５μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃、１時間静置して、該水溶液を捨て、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で１日静置して乾燥させた。【００９９】
実施例１５の［ラミニンコート］  
細胞培養容器１５に、濃度１０μｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．５μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃、１時間静置して、該水溶液を捨て、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で１日静置して乾燥させた後、更に、室温（２５℃、４０％ＲＨ）で３０日間静置した。【０１００】
実施例２７、２９の［ラミニンコート］  
細胞培養容器２７、２９に、濃度１０μｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．５μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃、１時間静置して、該水溶液を捨て、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で１日静置して乾燥させた後、更に、室温（２５℃、４０％ＲＨ）で６日間静置した。【０１０１】
実施例１６の［ラミニン／ゼラチン混合溶液のコート］  
細胞培養容器１６に、濃度０．２ｍｇ／ｍｌのゼラチン（新田ゼラチン株式会社製）と濃度１０μｇ／ｍＬのラミニンを含んだ水溶液を５００μＬ入れ（ゼラチンコート量１０μｇ／ｃｍ２相当、ラミニンコート量０．５μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃で１時間静置した後、該水溶液を捨て、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で１日乾燥させた。【０１０２】
実施例１７の［ラミニン／ゼラチン混合物のコート］  
細胞培養容器１６に、濃度３ｍｇ／ｍｌのゼラチン（新田ゼラチン株式会社製）と濃度１０μｇ／ｍＬのラミニンを含んだ水溶液を５００μＬ入れ（ゼラチンコート量１５０μｇ／ｃｍ２相当、ラミニンコート量０．５μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃で１時間静置した後、該水溶液を捨て、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で１日乾燥させた。【０１０３】
実施例１８の［ラミニン／ゼラチン混合物のコート］  
細胞培養容器１６に、濃度３ｍｇ／ｍｌのゼラチン（新田ゼラチン株式会社製）と濃度１μｇ／ｍＬのラミニンを含んだ水溶液を５００μＬ入れ（ゼラチンコート量１５０μｇ／ｃｍ２相当、ラミニンコート量０．５μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃で１時間静置した後、該水溶液を捨て、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で１日乾燥させた後、更に、室温（２５℃、４０％ＲＨ）で３０日間静置した。【０１０４】
実施例１９の［コラーゲンとラミニンのコート］  
細胞培養容器１９に、濃度０．１ｍｇ／ｍｌのコラーゲン（商品名：Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ  Ｉ−Ｃ、新田ゼラチン株式会社製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量５μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃で１時間静置した後、該水溶液を捨て、次いで、濃度１０μｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．５μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃、１時間静置して、該水溶液を捨て、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で１日乾燥させた。【０１０５】
実施例２０の［コラーゲンとラミニンのコート］  
実施例１９の濃度０．１ｍｇ／ｍｌのコラーゲン水溶液の代わりに、濃度１ｍｇ／ｍｌのコラーゲン水溶液を用いること以外は、実施例１９と同様にしてコラーゲンとラミニンのコートを行った。【０１０６】
実施例２１の［コラーゲンとラミニンのコート］  
実施例１９の濃度０．１ｍｇ／ｍｌのコラーゲン水溶液の代わりに、濃度２ｍｇ／ｍｌのコラーゲン水溶液を用いること以外は、実施例１９と同様にしてコラーゲンとラミニンのコートを行った。【０１０７】
実施例２２の［コラーゲンとラミニンのコート］  
実施例１９の濃度０．１ｍｇ／ｍｌのコラーゲン水溶液の代わりに、濃度４ｍｇ／ｍｌのコラーゲン水溶液を用いること以外は、実施例１９と同様にしてコラーゲンとラミニンのコートを行った。【０１０８】
実施例２３の［コラーゲンとラミニンのコート］  
実施例１９の濃度０．１ｍｇ／ｍｌのコラーゲン水溶液の代わりに、濃度１０ｍｇ／ｍｌのコラーゲン水溶液を用いること以外は、実施例１９と同様にしてコラーゲンとラミニンのコートを行った。【０１０９】
実施例２４の［コラーゲンとラミニンのコート］  
細胞培養容器２４に、濃度１ｍｇ／ｍｌのコラーゲン（商品名：Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ  Ｔｙｐｅ  Ｉ−Ｃ、新田ゼラチン株式会社製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量５０μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃で１時間静置した後、該水溶液を捨て、次いで、濃度１４μｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．７μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃、１時間静置して、該水溶液を捨て、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で１日乾燥させた。【０１１０】
実施例２５の［コラーゲンとラミニンのコート］  
実施例２４の「濃度１４μｇ／ｍＬのラミニン水溶液」の代わりに、濃度２０μｇ／ｍＬのラミニン水溶液を用いること以外は、実施例２４と同様にしてコラーゲンとラミニンのコートを行った。【０１１１】
［比較例３］
市販の細胞培養容器３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（ＴＣＰＳ、３５ｍｍ／Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ、ＡＧＣテクノグラス製）の３５ｍｍシャーレに、濃度１０μｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．５μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃、１時間静置して、該水溶液を捨て、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で１日静置して乾燥させた。【０１１２】
［比較例４］
市販の細胞培養容器３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（ＴＣＰＳ、３５ｍｍ／Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ、ＡＧＣテクノグラス製）に、濃度１０μｇ／ｍＬのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を５００μＬ入れ（コート量０．５μｇ／ｃｍ２相当）、３７℃、１時間静置して、該水溶液を捨て、室温２５℃（相対湿度３５〜５５％ＲＨ）で１日静置して乾燥させた後、更に、室温（２５℃、４０％ＲＨ）で６日間静置した。【０１１３】
【表２】
2018116904.tif 000012
【０１１４】
【表３】
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【０１１５】
（実施例３０）
ブロックポリマー１０をメタノールで希釈して０．１２％溶液を作成し、３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（３５ｍｍ／Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ、ＩＷＡＫＩ製）に４０ｕｌ添加した後、室温２時間静置して乾燥させ、更に超純水と滅菌水でそれぞれリンスし、４０℃にて一晩乾燥させることで、細胞培養基材を積層した細胞培養容器３０を得た。得られた細胞培養基材の膜厚を分光エリプソメトリ法により測定したところ、３５ｎｍであった。
［ｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価］
培養容器３０に、濃度０．５ｕｇ／ｕｌのラミニン（商品名：ｉＭａｔｒｉｘ、株式会社ニッピ製）水溶液を４．８ｕｌ、濃度３．４ｕｇ／ｕｌのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２を１．５ｕｌ、及び１．３ｘ１０４個のｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株、ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社製）を加えた培地（ＳｔｅｍＦｉｔ  Ａｋ０２Ｎ、味の素株式会社製）１．５ｍｌを入れ、５％ＣＯ２雰囲気の３７℃恒温器内で静置し、８日間培養を行なった。培養開始日の３日目より連続５日間毎日培地交換を行なった。【０１１６】
次いで、４℃の冷媒地で培地交換をし、室温で１０分間静置した後、ピペットで培地を吸ったり出したりする「ピペッティング操作」を約１０回行い、細胞剥離を行った。前記「細胞の剥離率と生存率、及び培養性の測定」方法に従って求めた細胞培養性は１．０（TCPS同等）、細胞剥離率は95％、回収細胞の生存率は75％であった。【０１１７】
（比較例５）
３５ｍｍポリスチレン製シャーレ（３５ｍｍ／Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ、ＩＷＡＫＩ製）を用いること以外は、実施例３０と同様にして、ｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価を行なった。その結果、ｉＰＳ細胞の培養、剥離率の評価を行なった。その結果、細胞培養性は１．０、細胞剥離率は５％、回収細胞の生存率は２０％であった。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明の細胞培養基材は、ヒト多能性幹細胞であっても高効率で培養可能であり、かつ培養後の細胞を高い生存率を維持したまま剥離させ回収することが可能な細胞培養基材を提供することにある。また、さらには、細胞剥離可能かつ乾燥状態にも耐えうる細胞培養基材を提供することにある。
【国際調査報告】
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