(57)【要約】  本発明の課題は、炎症性疾患の治療、とりわけ潰瘍性大腸炎の症状軽減方法、及びそのための医薬を提供することにある。  免疫細胞療法を炎症性疾患の患者にも適用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫細胞を含む、炎症性疾患治療用又は予防用医薬組成物。
【請求項２】
前記免疫細胞が、リンパ球である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記免疫細胞が、培養したリンパ球である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記免疫細胞が末梢血単核球由来である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記炎症性疾患が炎症性腸疾患である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項６の医薬組成物。
【請求項８】
ＴＮＦα阻害剤の投与と共にあるいは続いて投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＴＮＦα阻害剤が抗ＴＮＦα抗体である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
炎症性疾患治療用又は予防用医薬の製造のための、単離された免疫細胞の使用。
【請求項１１】
前記免疫細胞が単離されたリンパ球である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記リンパ球が単離された後、培養されたリンパ球である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記免疫細胞が末梢血単核球由来である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１５】
前記炎症性疾患が炎症性腸疾患である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
単離された免疫細胞を患者に投与することを含む、炎症性疾患の治療又は予防方法。
【請求項１８】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リンパ球が、培養されたリンパ球である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫細胞が末梢血単核球由来である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
１）患者から末梢血単核球を単離するステップ、
２）末梢血単核球を培養して免疫細胞を得るステップ、及び
３）得られた免疫細胞を患者に投与するステップを含む、
炎症性疾患の治療又は予防方法。
【請求項２５】
前記免疫細胞がリンパ球である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
採取した末梢血単核球を培養して組成物を取得することからなる、該組成物を有効成分とする炎症性腸疾患治療剤又は予防剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性疾患を対象とした医薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、がん免疫細胞治療として、１）樹状細胞ワクチン療法、２）ＮＫ細胞療法、３）γδＴ細胞療法、４）αβＴ細胞療法、５）細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）療法などが盛んに行われている（特許文献１及び非特許文献１）。【０００３】
樹状細胞ワクチン療法とは、末梢血液中の単球から分化させた樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ: ＤＣ）に、その標的となるがん細胞を貪食させて体内に戻し、がん細胞を傷害する能力のある細胞（主にＴ細胞）や抗体産生機能をもつＢ細胞にがんや病原体の目印（抗原）を伝える役割を担う「抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ: ＡＰＣ）」として機能させることにより、がんを治療する方法である。【０００４】
ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ）細胞療法とは、末梢血中に含まれるＮＫ細胞などの異常細胞を傷害する能力の高い細胞を、ＩＬ−２など複数の刺激物質を用いて活性化、増殖させて体内に戻し、がんを治療する方法である。ＮＫ細胞は、自然免疫系を担うリンパ球の１種で、強い細胞傷害能を有しており、特に、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ分子が発現低下または消失した細胞を認識し殺傷する機構を有すること、および、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における主たるエフェクター細胞として機能することなどから、腫瘍細胞やウイルス感染細胞の拒絶に重要な細胞である。【０００５】
γδＴ細胞は、リンパ球ストレス（細胞傷害）監視機構（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｓｔｒｅｓｓ-ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）と呼ばれる生体防御反応を担う中心的な細胞であり、γδＴ細胞療法とは、患者から採血した梢血中にわずかに存在する（１〜５％）γδ型Ｔ細胞受容体（Ｖγ９Ｖδ２受容体）をもつγδＴ細胞を選択的に増殖させ、体内に戻す治療法である。γδＴ細胞はαβＴ細胞が認識する「抗原」に依存することなく、がん細胞表面に比較的共通して発現する分子などを認識することでがんを殺傷する「抗原非特異的」な抗腫瘍効果が得られる。【０００６】
αβＴ細胞療法とは、末梢血液中に含まれるリンパ球を約２週間、インターロイキン−２（ＩＬ−２）と抗ＣＤ３抗体を用いて培養し、その全体を活性化・増殖させたのち体内に戻す治療法である。末梢血のＴリンパ球の大半がαβ型のＴ細胞受容体（Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ:  ＴＣＲ）を持つαβＴ細胞であり、増殖した細胞の多くもαβＴ細胞ということになる。αβＴ細胞は、上記樹状細胞などから、抗原を提示され、その抗原をもつ細胞に攻撃を加える。【０００７】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）療法は、体外でがん細胞を用いて末梢血単核球中のＴ細胞を刺激することにより、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導し、体内に戻す治療法である。がん細胞自体が抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての役割を果たし、自身のがんに対する攻撃能力を持った細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を効率的に増やすことが可能になる。【０００８】
免疫細胞治療は、従来の外科治療、放射線治療、化学治療の三大療法に比べて副作用がほとんどないという利点を有しており、第４のがん治療法として実際の肺がん患者に対して先進医療として施されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２００６／００６７２０号パンフレット
【００１０】
【非特許文献１】メディネットホームページｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｍｅｄｉｎｅｔ-ｉｎｃ.ｃｏ.ｊｐ/ｅｎｇｌｉｓｈ/ｓｅｒｖｉｃｅ/ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ.ｈｔｍｌ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本願発明者である医師らは、上記がん免疫細胞療法を実際に患者に施している臨床医師らである。本願発明者らは、がん免疫療法を行った患者の症状の経時観察を行ううちに、潰瘍性大腸炎を発症している患者の症状が緩和軽減されていることを発見した。
すなわち本願発明は、免疫細胞治療の別用途、炎症性疾患、特に潰瘍性大腸炎への適応拡大を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
炎症性疾患とは、炎症性サイトカインの過剰な生成を伴う疾患を指す。炎症性サイトカインとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα／β）などがある。
従って炎症性疾患とはこれに限定されないが、クローン病、関節リウマチ、乾癬（尋常性乾癬、関節症性乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症を含む）、強直性脊椎炎、潰瘍性大腸炎、ベーチェット病による難治性網膜ぶどう膜炎などがこれにあたる。【００１３】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ：ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）とは、クローン病および潰瘍性大腸炎を含み、下痢および腹痛をもたらす消化管各部の慢性炎症を特徴とする，再発と寛解を繰り返す病態である。
炎症は、消化管粘膜における細胞性免疫反応により生じる。病因については不明であるが、免疫反応には、サイトカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、及び脂質メディエーターなどの炎症メディエーターの放出が関与している。【００１４】
＜潰瘍性大腸炎＞
潰瘍性大腸炎（ＵＣ：Ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）とは、大腸の粘膜にびらんや潰瘍ができる大腸の炎症性疾患である。特徴的な症状としては、下血を伴うまたは伴わない下痢と腹痛が起こる。病変は、直腸から連続的に、そして上行性に広がる性質があり、最大で直腸から結腸全体に広がる。潰瘍性大腸炎は、病変の広がりや経過により下記のように分類される。
１）病変の拡がりによる分類：全大腸炎、左側大腸炎、直腸炎
２）病期の分類：活動期、寛解期
３）重症度による分類：軽症、中等症、重症、激症
４）臨床経過による分類：再燃寛解型、慢性持続型、急性激症型、初回発作型【００１５】
わが国の潰瘍性大腸炎の患者数は約１６万人で、若年者から高齢者まで発症し、性別による差は認められない。潰瘍性大腸炎の原因は、自己免疫反応の異常や食生活等が原因と考えられているが、現在も不明である。【００１６】
潰瘍性大腸炎を発症すると、下痢や血便が認められ、痙攣性または持続的な腹痛を伴うことがある。重症になると、発熱、体重減少、貧血などの全身症状がおこる。また、腸管以外の合併症として皮膚の症状、関節や目の症状が出現することもある。【００１７】
潰瘍性大腸炎に対しては、例えば、５−アミノサリチル酸薬（５−ＡＳＡ）製薬の経口・直腸からの投与、副腎皮質ステロイド薬、血球成分除去療法、免疫調節薬・抑制薬、抗ＴＮＦα受容体拮抗薬、抗ＴＮＦα抗体などの内的治療法により腸の炎症を抑えることで症状を改善することができるが、完治に導く方法は存在しない。内科的治療で、症状が改善しない場合には、大腸全摘術等の外科的治療が行われることもある。【００１８】
細胞性免疫反応に起因すると考えられているため、上記薬物療法・外科療法以外に、非薬物療法の治療法として、血球成分除去療法（ＣＡＰ療法）なども用いられている。たとえば、重症激症患者及び難治性患者に対しては、顆粒球、単球を除去するＧＣＡＰ療法、ステロイド治療抵抗性の患者に対しては白血球（顆粒球、単球及びリンパ球）除去療法（ＬＣＡＰ療法）なども適用され、一定の成果が上げられているものの、普遍的に有効な治療法はいまだが確立されておらず、厚生労働省の特定医療疾患に指定されている。【００１９】
本願発明者らは、上記免疫細胞療法を行った患者の経時観察以外に生化学的パラメータの検証を行い、上記血球成分除去療法とは逆に、体外で増殖させた免疫細胞を患者に戻す免疫細胞療法により、炎症性腸疾患の症状の軽減緩和が確かになされていることを確認し、本願発明を完成させた。【００２０】
従って、本発明は本発明の構成は以下の［１］から［２９］の通りである。
［１］免疫細胞を含む、炎症性疾患治療用又は予防用医薬組成物；
［２］免疫細胞が、リンパ球である、［１］の医薬組成物；
［３］免疫細胞が、培養されたリンパ球である、［１］に記載の医薬組成物；
［４］リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、［３］に記載の医薬組成物；
［５］免疫細胞が末梢血単核球由来である、［１］の医薬組成物；
［６］炎症性疾患が炎症性腸疾患である、［１］〜［５］のいずれかの医薬組成物；
［７］炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、［６］の医薬組成物；
［８］ＴＮＦα阻害剤の投与と共にあるいは続いて投与される、［１］〜［７］のいずれかの医薬組成物。
［９］ＴＮＦα阻害剤が抗ＴＮＦα抗体である、［８］の医薬組成物。【００２１】
［１０］炎症性疾患治療用又は予防用医薬の製造のための、単離された免疫細胞の使用；
［１１］免疫細胞が単離されたリンパ球である、［１０］の使用；
［１２］免疫細胞が単離された後、培養されたリンパ球である、［１１］の使用；
［１３］リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、［１２］の使用；
［１４］免疫細胞が末梢血単核球由来である、［１０］の使用；
［１５］炎症性疾患が炎症性腸疾患である、［１０］〜［１４］のいずれかの使用；
［１６］炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、［１５］の使用。【００２２】
［１７］単離された免疫細胞を患者に投与することを含む、炎症性疾患の治療又は予防方法；
［１８］免疫細胞がリンパ球である、［１７］の方法；
［１９］免疫細胞が、培養されたリンパ球である、［１７］の方法；
［２０］リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、［１９］の方法；
［２１］免疫細胞が末梢血単核球由来である、［１７］の方法；
［２２］炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、［１７］〜［２１］のいずれかの方法；
［２３］炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎である、［２２］の方法。【００２３】
［２４］１）患者から末梢血単核球を単離するステップ、
２）末梢血単核球を培養して免疫細胞を得るステップ、及び
３）得られた免疫細胞を患者に投与するステップを含む、
炎症性疾患の治療又は予防方法；
［２５］免疫細胞がリンパ球である、［２４］の方法；
［２６］リンパ球が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ＮＫ細胞又はＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞のいずれかを主成分とする、［２５］の方法；
［２７］炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、［２４］〜［２６］のいずれかの方法；
［２８］炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、［２７］の方法。【００２４】
［２９］採取した末梢血単核球を培養して組成物を取得することからなる、該組成物を有効成分とする炎症性腸疾患治療剤又は予防剤の製造方法。
【発明の効果】
【００２５】
本願発明を用いることにより、患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｆｅ）の高い炎症性疾患の治療、炎症の軽減緩和を行うことが可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。
＜免疫細胞調製の準備＞
まず、免疫細胞の細胞源となる末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）を準備する。ここでＰＢＭＣｓとは、末梢血から分離された、リンパ球（ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞など）、単球などを含む細胞集団を意味する。ＰＢＭＣｓを準備する方法は、特に限定されない。例えば、採血により得られた末梢血を密度勾配遠心法により分離し、ＰＢＭＣｓを得ることができる。一回の採血量は、免疫細胞療法の種類と治療を行う患者に応じて適宜設定すればよいが、例えば２０〜７５ｍＬ程度である。
また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取することにより、直接ＰＢＭＣｓを取得することが可能である。
【００２７】
採取したＰＢＭＣｓは培養液（培地）に懸濁し、増殖又は活性化させたい免疫細胞の種類に応じて、サイトカイン等を添加して培養を行う。培養とは、リンパ球等の細胞の増殖、活性化又は加工を目的として実施する工程を含む。
【００２８】
ＰＢＭＣｓを懸濁させる培養液の種類は、免疫細胞を増殖させることができれば特に限定されない。そのような培養液の例には、ＡＩＭ−Ｖ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ培地等が挙げられる。これらの培養液には必要に応じて血清を添加してもよい。添加される血清の例としては、自己血漿が挙げられる。
【００２９】
ＰＢＭＣｓの培養条件は、免疫細胞を増殖及び活性化させることができれば特に限定されない。通常は、３４〜３８℃（好ましくは３７℃）かつ２〜１０％（好ましくは５％）ＣＯ２条件下で、７〜２０日程度培養すればよい。この際、培養する細胞数に応じて、培養液を適宜追加する。さらに、培養液量の増加に合わせて、ＩＬ−２等を適宜追加する。
【００３０】
＜ＮＫ細胞の製造方法＞
ＮＫ細胞の製造する場合、抗ＣＤ１６抗体等、ＮＫ細胞に特異的に発現する分子のアゴニストや、ＩＬ−２等を培地に添加して培養する方法が一般的である（例えば、特許４２７５６８０等）。本発明の医薬に用いるＮＫ細胞としては、そのいずれの方法を用いても構わない。また、特許文献ＷＯ２００９／１５１１８３等に記載された方法により調製されたＣＤ１６＋及び／又はＣＤ５６＋細胞をＮＫ細胞として用いても構わない。
【００３１】
＜γδＴ細胞の製造方法＞
次に、γδＴ細胞の製造方法について例示する。
採取したＰＢＭＣｓをビスホスホネートおよびＩＬ−２を添加した培養液に播種し、γδＴ細胞を培養する。ＰＢＭＣｓをビスホスホネートおよびＩＬ−２の存在下で培養することにより、γδＴ細胞を選択的に増殖および活性化させて、活性化γδＴ細胞を高純度に含む細胞集団を調製することができる（特許文献１参照）。
【００３２】
本発明において、ビスホスホネートとは、特に制限されず、Ｐ−Ｃ−Ｐの骨格を有する化合物をいう。本発明に用いるビスホスホネートは、例えば、下記一般式［化１］で表わされる化合物、その塩、及びそれらの水和物が挙げられる。
【００３３】
【化１】
2017142014.tif 000002
【００３４】
上記［化１］中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、またＲ１とＲ２は同じ環状構造の一部を形成してもよい。
上記Ｒ１とＲ２における置換基としては、例えば、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基等からなる群から選択される。
【００３５】
本明細書において、ハロゲン原子としては、例えば、フルオロ原子、クロロ原子、臭素原子等；アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘプチル、オクチル、ペンタデカニル基等の直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ３０アルキル基等；低級アルキル基としては、例えば、直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ１０アルキル基等；アリール基としては、例えば、フェニル、ナフチル基等；アルアルキル基としては、例えば、アリール−低級アルキル基等；シクロアルキル基としては、例えば、シクロオクチル、アダマンチル等のＣ１−Ｃ１０シクロアルキル基等；複素環式基としては、ピリジル、フリル、ピロリジニル、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル基等をそれぞれ示す。
【００３６】
また、本発明において、ビスホスホネートは、薬学的に許容されるものが好ましく、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されているものがあげられる。その例として、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が含まれる。これらは、窒素原子を有するアミノビスホスホネートであり、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が特に好ましい。市販されているビスホスホネート系骨代謝改善薬としては、例えば、パミドロン酸二ナトリウム五水和物（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）；ノバルティスファーマ株式会社）、ゾレドロン酸水和物（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）；ノバルティスファーマ株式会社）などが挙げられる。
【００３７】
ＰＢＭＣｓの培養時に添加するビスホスホネートの濃度は、０．０５〜１００μＭの範囲内が好ましく、０．１〜３０μＭの範囲内がより好ましい。より具体的には、ビスホスホネートとしてパミドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物、アレンドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネートの濃度は、１〜３０μＭの範囲内が好ましい。また、ビスホスホネートとしてゾレドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネートの濃度は、０．１〜１０μＭの範囲内が好ましい。
【００３８】
ＰＢＭＣｓの培養時に添加するＩＬ−２の濃度は、５０〜２０００Ｕ／ｍＬの範囲内が好ましく、４００〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲内がより好ましい。
【００３９】
ＰＢＭＣｓの培養条件は、γδＴ細胞を増殖および活性化させることができれば特に限定されない。通常は、３４〜３８℃（好ましくは３７℃）かつ２〜１０％（好ましくは５％）ＣＯ２存在下で、７〜１４日程度培養すればよい。この際、培養する細胞数に応じて、培養液を適宜追加する。更に、培養液量の増加に合わせて、ＩＬ−２を５０〜２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００〜１０００Ｕ／ｍＬとなるように適宜追加する。
【００４０】
以上の手順により、γδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。得られた細胞集団は、後述するようにγδＴ細胞療法において患者に投与する細胞として利用することができる。
【００４１】
培養は、３４〜３８℃、好ましくは３７℃で、２〜１０％、好ましくは５％のＣＯ２条件下で行い、培養期間は１日〜２０日、特に１〜２週間程度が好ましい。
使用する培地は特に限定されないが、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン）、イスコフ培地（インビトロジェン）、ＫＢＭ培地（コージンバイオ）、ＡＬｙＳ培地（細胞科学研究所）等細胞培養に使用されている市販の培地を使用することができる。また、必要に応じて５〜２０％の牛血清、牛胎児血清、ヒト血清、ヒト血漿等を添加することができる。
【００４２】
＜αβＴ細胞の製造方法＞
次に、αβＴ細胞の製造方法について例示する。
αβＴ細胞を培養する方法としては、抗ＣＤ３抗体及びＩＬ−２を用いた方法が好ましい。
抗ＣＤ３抗体は培地中に添加しても、培養容器に固相化してもよいが、抗ＣＤ３抗体を固相化したフラスコ等の培養容器にリンパ球を播種することで、より好適に培養できることが知られている（例えば、特許３０５６２３０）。ＩＬ−２の濃度は培地中に１００〜２０００ＩＵ／ｍＬの濃度となるように添加することが好ましい。
培養は、３４〜３８℃、好ましくは３７℃で、２〜１０％、好ましくは５％のＣＯ２条件下で行い、培養期間は１日〜２０日、特に１〜２週間程度が好ましい。
使用する培地は特に限定されないが、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン）、ＲＰＭＩ−１６４０培地（インビトロジェン）、ダルベッコ改変イーグル培地（インビトロジェン）、イスコフ培地（インビトロジェン）、ＫＢＭ培地（コージンバイオ）、ＡＬｙＳ培地（細胞科学研究所）等細胞培養に使用されている市販の培地を使用することができる。また、必要に応じて５〜２０％の牛血清、牛胎児血清、ヒト血清、ヒト血漿等を添加することができる。
【００４３】
＜免疫細胞を含む医薬＞
本発明の医薬は、上述の本発明の製造方法により製造された免疫細胞を含む、炎症性疾患を治療・予防するための医薬である。
【００４４】
本発明の医薬は、例えば、本発明の製造方法により製造された免疫細胞を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させた注射剤（細胞懸濁液）である。この注射剤は、静脈内や皮内、皮下などに注射されてもよいし、病変部に直接注入されてもよいし、点滴として全身投与されてもよい。
【００４５】
本発明の医薬は、必須成分として免疫細胞を含むが、任意成分としてその他の成分を含んでいてもよい。
【００４６】
本発明の医薬に含まれる免疫細胞の数は、投与方法や疾患の種類に応じて適宜設定されうる。通常は、１０８〜１０１２個／人（好ましくは１０９個／人）となるように設定すればよい。
【００４７】
本発明の医薬の製造方法は、特に限定されない。例えば、本発明の医薬は、１）培養した免疫細胞を遠心分離法などにより回収し；２）回収した免疫細胞を洗浄液（例えば、生理食塩水やＰＢＳなど）で洗浄し；３）洗浄した免疫細胞を遠心分離法などにより回収し；４）回収した免疫細胞を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させることにより、経静脈投与が可能な点滴剤として製造されうる。
【００４８】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例１】
【００４９】
＜１．免疫細胞の培養及び投与＞
同意をいただいた患者から、末梢血を６７．５ｍＬ採取し、遠心分離法により末梢血単核球の培養を行った。瀬田クリニック新横浜ＣＰＣ（細胞加工施設）にて、およそ１４日間の培養を行い、活性化自己ＮＫ細胞を調製した。品質検査後、得られた活性化自己ＮＫ細胞を点滴剤として調製し、患者に経静脈投与を行った。【００５０】
＜２．結果＞
当該患者は、数年前から潰瘍性大腸炎により血便、頻便の症状があらわれており、メサラジン（５−アミノサリチル酸：５−ＡＳＡ）を服用しても改善が認められなかった。そこで、インフリキシマブの投与が２年前から開始され、一般的な用法・用量に従い２週間間隔の投与から４週間間隔に延長され、来院時も６〜８週間間隔で投与されていた。インフリキシマブ（抗ヒトＴＮＦαモノクローナル抗体）の投与により、症状の緩和は認められたが、血便の症状は続いていた。【００５１】
２０１５年３月にＮＫ細胞１回目投与後、翌日より血便が軽減し、まもなく血便が消失した。そのため、潰瘍性大腸炎の主治医と相談し、インフリキシマブの投与を中止し、経過観察を行うこととなった。これまでに計５回の投与を実施し、患者は血便やその他の潰瘍性大腸炎の自覚症状はなく、軽快状態を継続している（２０１７年１月末現在）。また、３回目投与後に実施した内視鏡検査の結果でも炎症状態の明らかな改善が確認された。【００５２】
まとめ
潰瘍性大腸炎の治療薬を長期にわたり投与しても改善しなかった症状が、免疫細胞の投与することで治療薬の投与なく軽快状態が続いていることから、免疫細胞治療は、炎症性疾患、とりわけ潰瘍性大腸炎の症状の治癒緩和に有効であることが、臨床医の総合的な診断の下、確認された。【００５３】
従って本願発明に係る免疫療法は、メサラジンやインフリキシマブなどのような、炎症性サイトカインの生成作用を阻害することにより症状の治癒緩和を生じる医薬の代用としてあるいは併用で用いることができる。
治療疾患対象としては、潰瘍性大腸炎だけでなく、炎症性サイトカイン、とりわけＴＮＦαと関連する疾患、たとえば、クローン病、関節リウマチ、乾癬（尋常性乾癬、関節症性乾癬、膿疱性乾癬、乾癬性紅皮症を含む）、強直性脊椎炎、ベーチェット病による難治性網膜ぶどう膜炎などにも適用できる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の治療薬は、従来、完治することができなかった内科的な手法により、炎症性疾患の治療、とりわけ潰瘍性大腸炎の症状軽減緩和を行うことが可能である。
【国際調査報告】
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