(57)【要約】本発明は、保存安定性が高く、安価に摂取することが出来る脳機能改善機能を有する食品素材を提供することを目的とした。特定のアミノ酸を有し、かつ、ジ・トリペプチド含量が一定量以上有するクルミたん白質加水分解物が脳機能改善効果が優れていることを見出した。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び／またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するクルミたん白質加水分解物を有効成分とする、脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物。
【請求項２】
クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して60重量％以上である、請求項１記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物。
【請求項３】
クルミたん白質加水分解物中の全アミノ酸量に対するチロシンの割合が3重量％以上であり、かつフェニルアラニンの割合が4.5重量%以上である、請求項１または２記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物。
【請求項４】
脳神経疾患の予防または脳機能改善が大脳皮質中のカテコールアミンの脳内放出の促進によるものである、請求項１または２記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物。
【請求項５】
クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び/またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するクルミたん白質加水分解物を有効成分とする、脳機能改善剤。
【請求項６】
脳神経疾患の予防または脳機能改善のためのクルミたん白質加水分解物の使用。
【請求項７】
クルミたん白質加水分解物が、クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び／またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するものである、請求項６記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善のためのクルミたん白質加水分解物の使用。
【請求項８】
クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して60重量％以上である、請求項７記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善のためのクルミたん白質加水分解物の使用。
【請求項９】
脳神経疾患の予防または脳機能改善が大脳皮質中のカテコールアミンの脳内放出の促進によるものである、請求項７または８記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善のためのクルミたん白質加水分解物の使用。
【請求項１０】
脳神経疾患の予防または脳機能改善に用いるためのクルミたん白質加水分解物。
【請求項１１】
クルミたん白質加水分解物が、クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び／またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するものである、請求項１０記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善に用いるためのクルミたん白質加水分解物。
【請求項１２】
クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して60重量％以上である、請求項１１記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善に用いるためのクルミたん白質加水分解物。
【請求項１３】
脳神経疾患の予防または脳機能改善が大脳皮質中のカテコールアミンの脳内放出の促進によるものである、請求項１１または１２記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善に用いるためのクルミたん白質加水分解物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳機能改善するための食品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
クルミは、欧米やアジア、また日本では長野県や山形県を中心として、世界各国で広く栽培されている。その中でも、中国では古来より健康食品として親しまれてきた食品のうちの1つであり、滋養薬として漢方にも用いられてきた。また近年、中国におけるクルミの消費量は国内生産では賄うことが出来ないほど大きく増加し、輸入量も増加しており、クルミによる健康増進機能に注目が集まっていることが分かる。【０００３】
中国には形状が似たものを食べるとその部位を補う作用があるという意味の「似類補類」という言葉があり、特にクルミの摂取は脳の健康および機能維持に有効であると広く考えられている。その関与成分としては、α-リノレン酸やドコサヘキサエン酸などのω-3系脂肪酸、メラトニン、ビタミンEやフラボノイド類が挙げられており、例えば非特許文献１では、クルミに含まれるω-3油脂に脳機能を改善する効果が存在することが示唆されている。
また、クルミには、一般的に脳機能改善効果を有することが知られている、フラボノイド類が含まれている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Carey AN et al., Nutr. Neurosci., 2013 Jan;16(1):13-20
【非特許文献２】Xiao-Ying Mao and Yu-Fei Hua, J. Food Sci. Technol., (August 2014) 51(8):1473-1482
【非特許文献３】T. ichinose, et al., B.B.B., 2015 ; 79(9) ;1542-7,                  DOI : 10.1080/09168451.2015.1044932
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、従来技術では、脳機能を改善する技術としてクルミに由来する脂肪酸やフラボノイド類が着目されていた。
しかしながら、非特許文献１の技術では、ω-3油脂は一般に酸化による劣化が問題であり、クルミからω-3油脂のみを抽出しても保存に伴う劣化が起こり、常温で長期保存が求められる食品用途では適していないという問題がある。
また、クルミに含まれるフラボノイド類は微量であるため、クルミに含まれるフラボノイド類のみを抽出する場合非常に高価となり、一般に食品として摂取するには適さないという問題がある。
本発明は、保存安定性が高く、安価に摂取することが出来る脳機能改善機能を有する食品素材を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題に対して鋭意検討を行った。
発明者らは、クルミたん白質が脳機能改善効果を有するどうか検討を行ったところ、クルミたん白質の加水分解物に脳機能を改善する機能があることがわかってきた。さらに検討したところ、クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び／またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するクルミたん白質加水分解物が、脳機能改善効果に優れていることを見出し、本発明を完成させた。【０００７】
すなわち、本発明は、
（１）クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び／またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するクルミたん白質加水分解物を有効成分とする、脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物、
（２）クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して60重量％以上である、（１）記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物、
（３）クルミたん白質加水分解物中の全アミノ酸量に対するチロシンの割合が3重量％以上であり、かつフェニルアラニンの割合が4.5重量%以上である、（１）または（２）記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物、
（４）脳神経疾患の予防または脳機能改善が大脳皮質中のカテコールアミンの脳内放出の促進によるものである、（１）または  （２）記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物、
（５）クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び/またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するクルミたん白質加水分解物を有効成分とする、脳機能改善剤、
（６）脳神経疾患の予防または脳機能改善のためのクルミたん白質加水分解物の使用、
（７）クルミたん白質加水分解物が、クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び／またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するものである、（６）記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善のためのクルミたん白質加水分解物の使用、
（８）クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して60重量％以上である、（７）記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善のためのクルミたん白質加水分解物の使用、
（９）脳神経疾患の予防または脳機能改善が大脳皮質中のカテコールアミンの脳内放出の促進によるものである、（７）または  （８）記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善のためのクルミたん白質加水分解物の使用、
（１０）脳神経疾患の予防または脳機能改善に用いるためのクルミたん白質加水分解物、
（１１）クルミたん白質加水分解物が、クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び／またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するものである、（１０）記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善に用いるためのクルミたん白質加水分解物、
（１２）クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して60重量％以上である、（１１）記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善に用いるためのクルミたん白質加水分解物、
（１３）脳神経疾患の予防または脳機能改善が大脳皮質中のカテコールアミンの脳内放出の促進によるものである、（１１）または（１２）記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善に用いるためのクルミたん白質加水分解物、
である。
また、換言すれば本発明は、
（１）クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び／またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するクルミたん白質加水分解物を有効成分とする、脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物、
（２）クルミたん白質加水分解物中の全アミノ酸量に対するチロシンの割合が3重量％以上であり、かつフェニルアラニンの割合が4.5重量%以上である、（１）記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物、
（３）脳神経疾患の予防または脳機能改善が大脳皮質中のカテコールアミンの脳内放出の促進によるものである、（１）または  （２）記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物、
（４）クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び/またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するクルミたん白質加水分解物を有効成分とする、脳機能改善剤、
である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のクルミたん白質加水分解物を摂取することにより、脳機能の改善に役立てることができる
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各たん白質加水分解物をマウスに経口投与した後の大脳皮質中のノルアドレナリン(NA)濃度を測定した結果を示す図である（実施例１、比較例１〜３）。
【図２】各たん白質加水分解物をマウスに経口投与した後の大脳皮質中の3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール(MHPG)濃度を測定した結果を示す図である（実施例１、比較例１〜３）。
【図３】各たん白質加水分解物をマウスに経口投与した後の大脳皮質中のドーパミン(DA)濃度を測定した結果を示す図である（実施例１、比較例１〜３）。
【図４】各ペプチドをマウスに経口投与した後の大脳皮質中の3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール(MHPG)濃度を測定した結果を示す図である（実施例２）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１１】
（クルミたん白質組成物）
本発明で使用されるクルミたん白質組成物は、原料であるクルミから調製することもできるし、クルミから油脂を取り除いた脱脂クルミ粕から調製することも出来るが、脱脂クルミ粕から調製することが好ましい。脳機能改善機能を少量で発揮するために、クルミたん白質組成物の粗蛋白質含量は高いほうが好ましく、クルミたん白質組成物の乾燥重量に対して60重量％以上であることが好ましく、70重量％以上であることがより好ましく、80重量％以上であることが最も好ましい。
【００１２】
(クルミたん白質加水分解物)
本発明で使用されるクルミたん白質加水分解物は、上記クルミたん白質組成物をプロテアーゼ処理することによって得られるペプチド混合物である。クルミたん白質加水分解物は分解度がより高いことが好ましく、特に加水分解物中におけるペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占める、ジペプチド及び／またはトリペプチドの割合が高いことが重要である。具体的には、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占めるジペプチド及び／またはトリペプチドの割合が55重量%以上であることが必要であり、60重量%以上であることが好ましい。
なお本発明では、ジペプチド及び／またはトリペプチドを、分子量500以下の画分から遊離アミノ酸を除いた画分と規定した。したがって、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占めるジペプチド及び／またはトリペプチドの割合は、ペプチド用ゲルろ過クロマトグラフィーにより加水分解物中の分子量500以下のペプチド画分の割合を測定した後、アミノ酸分析により測定した加水分解物中の遊離アミノ酸含量を差し引くことにより算出することが可能である。加水分解物中の遊離アミノ酸含量は10重量%以下であることが好ましく、５重量%以下であることがより好ましい。さらに、ペプチドはより低分子であることが望ましいことから、加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占める分子量500以上の画分の割合は40重量%以下であることが好ましく、35重量%以下であることがより好ましい。
【００１３】
本発明のクルミたん白質加水分解物にはチロシン及び／またはフェニルアラニンを含有するジペプチド及び／またはトリペプチドを含有することが重要である。
すなわち、本発明は該チロシン及び／またはフェニルアラニンを含有するジペプチド及び／またはトリペプチドを脳機能を改善する有効成分として作用させることを本質とするものである。
【００１４】
該チロシン及び／またはフェニルアラニンを含有するジペプチド及び／またはトリペプチドは、ジペプチドの場合ではチロシン残基またはフェニルアラニン残基を１または２残基含むものである。トリペプチドの場合はチロシン残基またはフェニルアラニン残基を１〜３残基含むものである。
このようなペプチドとしては、具体的には、ジペプチドとして、Lys-Tyr, Tyr-Lys, Gly-Tyr, Tyr-Gly, Asn-Tyr, Tyr-Gln, Ala-Tyr, Arg-Tyr, Tyr-Arg, Met-Tyr, Tyr-Met, Pro-Tyr, Tyr-Pro, Tyr-His, His-Tyr, Thr-Tyr, Ile-Tyr, Tyr-Leu, Gln-Tyr, Tyr-Ser, Val-Tyr, Tyr-Ile, Ser-Tyr, Tyr-Asn, Phe-Tyr, Glu-Tyr, Tyr-Glu, Tyr-Thr, Leu-Tyr, Tyr-Val,またはTyr-Alaが挙げられる。好ましくは、Arg-Tyr, Tyr-Asn, Phe-TyrまたはTyr-Pheである。より好ましくは、Phe-Tyrである。
【００１５】
クルミたん白質加水分解物中のチロシン及び／またはフェニルアラニンの全アミノ酸量に対する割合は、チロシンについては好ましくは3重量％以上であり、フェニルアラニンについては好ましくは4.5重量％以上である。
【００１６】
（プロテアーゼ）
酵素分解は上記クルミたん白質組成物のスラリー又は水溶液を基質とし、プロテアーゼ処理を行う。ここで用いるプロテアーゼは動物起源，植物起源あるいは微生物起源は問わず、プロテアーゼの分類において「金属プロテアーゼ」、「酸性プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼ、好ましくは「金属プロテアーゼ」、「チオールプロテアーゼ」、「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から適宜選択することができる。特に2種類以上、あるいは3種類以上の異なった分類に属する酵素を、順次若しくは同時に作用させる分解方法がジペプチドやトリペプチド等の比較的分子量の低いペプチドの割合を増加させることができ好ましい。
【００１７】
このプロテアーゼの分類は、酵素科学の分野において通常行われている活性中心のアミノ酸の種類による分類方法である。各々の代表として「金属プロテアーゼ」にはBacillus中性プロテアーゼ，Streptomyces中性プロテアーゼ，Aspergillus中性プロテアーゼ，『サモアーゼ』等、「酸性プロテアーゼ」にはペプシン，Aspergillus酸性プロテアーゼ，『スミチュームAP』等、「チオールプロテアーゼ」にはブロメライン，パパイン等、「セリンプロテアーゼ」にはトリプシン，キモトリプシン，ズブチリシン，Streptomycesアルカリプロテアーゼ，『アルカラーゼ』，『ビオプラーゼ』等が挙げられる。これら以外の酵素でも作用pHや阻害剤との反応性により、その分類を確認することができる。活性中心が異なる酵素間では、基質への作用部位が大きく異なるため、「切れ残り」を減らし、効率よく酵素分解物を得ることができる。あるいは異なった起源の（起源生物） の酵素を併用することにより、更に効率よく酵素分解物を製造することができる。同分類でも起源が異なれば、基質である蛋白質への作用部位も異なり、結果としてジペプチドやトリペプチドの割合を増やすことができる。これらプロテアーゼはエキソ活性が少ないことが好ましい。
【００１８】
プロテアーゼ処理の反応pHや反応温度は、用いるプロテアーゼの特性に合わせて設定すれば良く、通常反応pHは至適pH付近で行い、反応温度は至適温度付近で行えば良い。概ね反応温度は20〜80℃、好ましくは40〜60℃で反応を行うことができる。反応後は酵素を失活するのに十分な温度（60〜170℃程度）で加熱し、残存酵素活性を失活させる。
【００１９】
プロテアーゼ処理後の反応液は、そのまま又は濃縮して用いることもできるが、通常、殺菌して噴霧乾燥、凍結乾燥等して乾燥粉末の状態で利用することができる。殺菌は、加熱殺菌が好ましく、加熱温度は110〜170℃が好ましく、130〜170℃が更に好ましい。加熱時間は3〜20秒間が好ましい。また反応液を任意のpHに調整しておくこともでき、pH調整時に発生する沈殿物や懸濁物を遠心分離や濾過等により除去することもできる。また更に活性炭や吸着樹脂により精製することもできる。
【００２０】
（脳神経疾患の予防または脳機能改善）
脳神経疾患としては、記憶障害、注意障害、遂行機能障害、社会的行動障害などの高次脳機能障害や、これらの障害と病理学的に関連する症状、例えば、脳梗塞、頭部外傷、脳血管性認知症、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、総合失調症、うつ病、不安症などが挙げられる。
また、脳機能改善効果としては、具体的には記憶力改善、学習能向上、注意力改善、ストレス耐性、抗うつ作用、抗不安作用、集中力改善、睡眠の質改善などが挙げられる。
【００２１】
本発明においては、上記、チロシン及び／またはフェニルアラニンを含有するジペプチド及び／またはトリペプチドを含有するクルミたん白質加水分解物を用いることにより、大脳皮質中の脳内カテコールアミンの濃度が上昇する、具体的には、大脳皮質中のノルアドレナリンおよびその代謝物質である3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコールとドーパミンの濃度が上昇する。これらの脳内カテコールアミン濃度が上昇することにより脳神経疾患の予防または脳機能改善効果が期待できる。
【００２２】
本発明のクルミたん白質加水分解物は、医薬品の形態、あるいは食品または飼料に添加された形態として、必要により適宜その他の原材料と混合して使用することができる。医薬品の形態として供する場合は、液体，散薬，錠剤，カプセル等の種々の形態で使用することができる。食品に混合された形態として供する場合は、ビスケット，ケーキ，パン，フードバー，肉製品等の固形状食品に混合して使用しても差し支えなく、水に溶解して飲料として、または、ヨーグルト，プリンのような流動状，半固形状食品に混合しても問題ない。また、糖質，ビタミン，ミネラル等を混合してサプリメントとして利用することもできる。飼料に混合された形態として供する場合は、陸産，水産に限定されることなく、既知の飼料と混合して使用することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明の実施様態を具体的に説明する。【００２４】
(製造例１) 分離クルミたん白質組成物の調製
非特許文献２に記載の方法に準じて脱脂クルミ粕から分離クルミたん白質組成物を調製した。脱脂クルミ粕に対して1M NaOHでpH11.0に調整した脱イオン水を20倍量加え、25℃で2時間の条件で撹拌した。その後、10,000×g、30分間、4℃の条件で遠心分離し、上清を回収した。遠心分離により生じた沈殿に再度、1 M NaOHでpH11.0に調整した脱イオン水を20倍量加え、25℃で2時間の条件で撹拌し、10,000 ×g、30分間、4℃の条件で遠心分離し、上清を回収した。2回分の上清を合わせ、1 M HClを用いてpH4.5に調整後、4℃で2時間静置した。静置後、10,000×g、30分間、4℃の条件で遠心分離した。遠心分離により得られた沈殿に脱イオン水を加えて水洗後、1 M NaOHを用いてpH7とし、脱イオン水中に再溶解させた。その後、塩透析し、凍結乾燥することにより分離クルミたん白質組成物を得た。分離クルミたん白質組成物の粗蛋白質含量は、分離クルミたん白質組成物の乾燥重量に対して８５．０重量％であった。【００２５】
(製造例２) クルミたん白質加水分解物１の調製
製造例１で得られた分離クルミたん白質組成物の3重量%溶液に対して、プロテアーゼとして『アルカラーゼ』（起源;Bacillus Licheniformis、アルカリプロテアーゼ、ノボザイム社製）を対蛋白質当たり0.125重量%加え、pH9.0, 58℃で60分間作用させた。以上の処理の後、反応液を90℃, 20分間加熱して反応を停止した後、凍結乾燥し、加水分解を抑えた試料である、分離クルミたん白質加水分解物１を得た。【００２６】
(製造例３) クルミたん白質加水分解物２の調製
製造例１で得られた分離クルミたん白質組成物の3重量%溶液に対して、プロテアーゼとして『アルカラーゼ』を対蛋白質当たり0.5重量%加え、他は製造例２と同様に調製し、分離クルミたん白質加水分解物２を得た。【００２７】
(製造例４) クルミたん白質加水分解物３の調製
製造例１で得られた分離クルミたん白質組成物の3重量%溶液に対して、プロテアーゼとして『マルチフェクトPR6L』（起源;Bacillus Licheniformis、アルカリプロテアーゼ、ジェネンコア社製）を対蛋白質当たり3重量%加え、他は製造例２と同様に調製し、分離クルミたん白質加水分解物３を得た。【００２８】
(製造例５)ジペプチドおよび／またはトリペプチド高含有クルミたん白質加水分解物４の調製
製造例１で得られた分離クルミたん白質組成物の3重量%溶液に対して、第一のプロテアーゼとして『サモアーゼ』（起源;Bacillus thermoproteolyticus、金属プロテアーゼ、大和化成社製）を対蛋白質当たり1.5重量%加え、pH9.0, 58℃で60分間作用させた。次に該第一反応液に対して、第二のプロテアーゼとして『ビオプラーゼ』（起源;Bacillus sp., セリンプロテアーゼ、ナガセケムテック社製）を対蛋白質当たり1重量%加え、pH7.5に、58℃で60分間作用させた。次に該第二反応液に対して、第三のプロテアーゼとして『スミチームFP』（起源;Asprgillus sp.,  金属プロテアーゼ、新日本化学工業社製）を対蛋白質当たり1重量%加え、他は製造例２と同様に調製し、分離クルミたん白質加水分解物４を得た。【００２９】
また、他の食品由来蛋白質の加水分解物と比較するために、市販品を入手した。コラーゲン加水分解物として「FSP-AS-L」（ニッピ社製）を入手し、コントロールとして使用した。【００３０】
（粗蛋白質含量（CP）の測定）
105℃,12時間乾燥した各種蛋白質素材の乾燥重量に対して、ケルダール法により測定した粗蛋白質量の重量を、重量%で表した。尚、窒素係数は5.3とした。【００３１】
(マウスの飼育方法)
非特許文献３に記載の方法に準じて以下の通り、マウスの飼育を行った。8週齢の「C57BL/6」を日本チャールス・リバー株式会社より購入した。飼育は、25±1℃で12時間の明暗サイクル(8：00-20：00は明期、20：00-8：00は暗期)条件下で1週間行った。食事は自由摂取させ、固形飼料としては「CE-2」(日本クレア株式会社製)を給餌した。【００３２】
(マウスへのクルミたん白質加水分解物経口投与および大脳皮質の摘出)
非特許文献３に記載の方法に準じて以下の通り、マウスへのクルミたん白質加水分解物の経口投与および大脳皮質の摘出を行った。コントロールおよびクルミたん白質加水分解物1〜4をそれぞれマウスの体重30 g当たり0.26 g/ ml経口投与した。経口投与後30分後に吸入麻酔液「イソフルラン」(ファイザー株式会社製)を用いた麻酔下で大脳皮質を摘出し、以下の脳内カテコールアミン測定に用いた。【００３３】
(脳内カテコールアミンの測定)
非特許文献３に記載の方法に準じて以下の通り、HPLC法による脳内カテコールアミンの測定を行った。大脳皮質の5倍重量の0.2 M過塩素酸(0.1 mM EDTA・2Naを含む)および100μg分のイソプロテノールを大脳皮質に加え、十分に破砕した。破砕後、氷上に30分間放置し、20,000×g、30分間、4℃の条件下で遠心分離を行った。遠心分離後、上清を200μl回収し、0.2 M酢酸緩衝液を35μl添加後、フィルター(0.22μm、Merck Millipore)で濾過を行い、タンパク質除去を行った。タンパク質除去後、HPLC（HTEC-500：株式会社エイコム製）に供してカテコールアミンの測定を行った。【００３４】
(統計処理）
有意差検定は医学統計専用ソフトウェア「Dr.SPSS II」（SPSS社製）を使用し、コントロールとの比較としてDunnett-t（両側）法を用いて評価を行った。【００３５】
（遊離アミノ酸含量及びジ・トリペプチド含量の測定）
クルミたん白質加水分解物の分子量分布を、以下のゲルろ過カラムを用いたHPLC法により測定した。ペプチド用ゲルろ過カラムを用いたHPLCシステムを組み、分子量マーカーとなる既知のペプチドをチャージし、分子量と保持時間の関係において検量線を求めた。なお、分子量マーカーは、オクタペプチドとして[β-Asp]-Angiotensin IIのβ-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-PHe（分子量1046）、ヘキサペプチドとしてAngiotensin IVのVal-Tyr-Ile-His-Pro-PHe（分子量775）、ペンタペプチドとしてLeu-EnkepHalinのTyr-Gly-Gly-PHe-Leu（分子量555）、トリペプチドとしてGlu-Glu-Glu（分子量405）、遊離アミノ酸としてPro（分子量115）を用いた。加水分解物（1%）を10,000rpm、10分間で遠心分離した上清を、ゲル濾過用溶媒で2倍に希釈し、その５μlをHPLCにアプライした。加水分解物中のペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に占める分子量500以下のペプチド画分の割合（%）を、全体の吸光度のチャート面積に対する、分子量500以下の範囲（時間範囲）の面積の割合によって求めた（使用カラム：Superdex Peptide 7.5/300GL（GEヘルスケア・ジャパン株式会社製）。溶媒：1重量%SDS/10mMリン酸緩衝液, pH8.0, カラム温度25℃, 流速0.25ml/min, 検出波長：220nm）。【００３６】
次に、アミノ酸分析によりクルミたん白質加水分解物中の遊離アミノ酸含量の測定を行った。加水分解物（4mg/ml）を等量の3重量%スルホサリチル酸に加え、室温で15分間振とうした。10,000rpmで10分間遠心分離し、得られた上澄みを0.45μmフィルターでろ過し、アミノ酸分析器（日本電子製 JLC500V）にて、遊離アミノ酸を測定した。蛋白質中の遊離アミノ酸含量はケルダール法にて得られた蛋白質含量に対する割合として算出した。
以上より得られた、「分子量500以下のペプチド画分の割合」から「遊離アミノ酸含量」を差し引いた値を、さらに総たん白質量で割った値を加水分解物中の「ジ・トリペプチド含量」とした。なお、「ジ・トリペプチド含量」の用語は、本発明の請求項に記載の「ジペプチド及び／またはトリペプチド」の含量を意味する。【００３７】
(表１)各種食品たん白質加水分解物の分析値
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【００３８】
（表２）各クルミたん白質加水分解物のアミノ酸量
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【００３９】
(実施例１、比較例１〜３)
製造例５で得られた分離クルミたん白質分解物４の経口摂取による脳機能改善効果を評価するために、段落００３２〜００３３に記載された方法で、マウスへのクルミたん白質加水分解物の経口投与、大脳皮質の摘出および脳内カテコールアミンの測定を行った（実施例１）。
また、製造例２〜４で得られた分離クルミたん白質分解物について、実施例１と同様にして脳内カテコールアミンの測定を行った（比較例１〜３）。
脳内カテコールアミンの測定結果を表３及び図１〜３に示した。【００４０】
（表３）
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【００４１】
比較例１〜３におけるクルミたん白質加水分解物１〜３の経口摂取では、脳内におけるノルアドレナリンおよびその代謝物質である3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコールとドーパミン濃度のコントロールに対する有意な変化は観察されなかった。一方で、実施例１におけるクルミたん白質加水分解物４の経口摂取では、コントロールに対して有意な脳内のノルアドレナリンおよびその代謝物質である3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコールとドーパミンの濃度上昇が観察された。クルミたん白質加水分解物４とクルミたん白質加水分解物１〜３の差は、ジ・トリペプチド含量の違いが大きく(表１)、ジ・トリペプチド含量の違いが脳内カテコールアミン濃度変化に強く影響する可能性が示唆された。
ノルアドレナリンおよびドーパミンは、脳内において主要な神経伝達物質として広く知られており、認知、記憶や情動といった人間にとって重要な要素に強く関与している。また、脳内のノルアドレナリン濃度上昇だけでなく、その代謝物質である3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール濃度も上昇していることより、脳内で増加したノルアドレナリンが効率よく使用および代謝されていることが分かる。
またさらに、表１のように実施例で使用したクルミたん白質加水分解物４中には脂質がほとんど含まれていないため、実施例１でのクルミたん白質加水分解物４の経口摂取による脳機能改善効果は、クルミたん白質加水分解物４に主に含まれているペプチドに起因すると考えられる。以上より、クルミたん白質加水分解物４の摂取が特異的に脳機能改善効果を有することが強く示唆された。【００４２】
（実施例２）
マウスへのArg-Tyr, Tyr-Asn, Phe-Tyr, Tyr-Pheの経口投与を行い、実施例１と同様の方法で大脳皮質の摘出を行い、脳内の3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール（MHPG）の測定を行った。なお、Arg-Tyr, Tyr-Asn, Phe-Tyr, Tyr-Pheは、ジェンスクリプトジャパン株式会社で受託合成したものを用いた。
測定結果を図４に示した。【００４３】
Arg-Tyr, Tyr-Asn, Phe-Tyr, Tyr-Pheの４種のペプチドの経口摂取では、コントロールに対して有意な3-メトキシ-4-ヒドロキシフェニルグリコール（MHPG）の濃度上昇が観察された。従って、Arg-Tyr, Tyr-Asn, Phe-Tyr, Tyr-Pheの４種のペプチドの摂取が特異的に脳機能改善効果を有することが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月14日(2018.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び／またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するクルミたん白質加水分解物を有効成分とする、脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物。
【請求項２】
クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して60重量％以上である、請求項１記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物。
【請求項３】
クルミたん白質加水分解物中の全アミノ酸量に対するチロシンの割合が3重量％以上であり、かつフェニルアラニンの割合が4.5重量%以上である、請求項１または２記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物。
【請求項４】
脳神経疾患の予防または脳機能改善が大脳皮質中のカテコールアミンの脳内放出の促進によるものである、請求項１または２記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善するための食品組成物。
【請求項５】
クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量がペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び/またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するクルミたん白質加水分解物を有効成分とする、脳機能改善剤。
【請求項６】
脳神経疾患の予防または脳機能改善のためのクルミたん白質加水分解物の使用であって、該クルミたん白質加水分解物が、クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び／またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するものである、脳神経疾患の予防または脳機能改善のためのクルミたん白質加水分解物の使用。
【請求項７】
クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して60重量％以上である、請求項６記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善のためのクルミたん白質加水分解物の使用。
【請求項８】
脳神経疾患の予防または脳機能改善が大脳皮質中のカテコールアミンの脳内放出の促進によるものである、請求項６または７記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善のためのクルミたん白質加水分解物の使用。
【請求項９】
脳神経疾患の予防または脳機能改善に用いるためのクルミたん白質加水分解物であって、該クルミたん白質加水分解物が、クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して55重量％以上であり、かつ、構成アミノ酸としてチロシン及び／またはフェニルアラニンを有するジペプチド及び／またはトリペプチドを有するものである、脳神経疾患の予防または脳機能改善に用いるためのクルミたん白質加水分解物。
【請求項１０】
クルミたん白質加水分解物中の分子量500未満のペプチドの含量が、ペプチド及び遊離アミノ酸の合計量に対して60重量％以上である、請求項９記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善に用いるためのクルミたん白質加水分解物。
【請求項１１】
脳神経疾患の予防または脳機能改善が大脳皮質中のカテコールアミンの脳内放出の促進によるものである、請求項９または１０記載の脳神経疾患の予防または脳機能改善に用いるためのクルミたん白質加水分解物。
【国際調査報告】
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