(57)【要約】  本開示は、長寿命で高感度の検知システムを提供する。本開示による検知システムは、外部からの刺激を検知する受容体を含み、受容体が刺激を受けたことにより生体分子を放出する細胞と、生体分子と反応して、酸化剤または還元剤を生成する酵素と、生成された酸化剤または還元剤によって酸化または還元されるメディエータであって、メディエータと接続された作用電極の電位を変化させるメディエータと、作用電極の電位を測定するセンサとを備える（図１参照）。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
刺激を検知する受容体を含み、前記受容体が刺激を受けたことにより生体分子を放出する細胞と、
前記生体分子と反応して、酸化剤または還元剤を生成する酵素と、
前記生成された酸化剤または還元剤によって酸化または還元されるメディエータであって、前記メディエータと接続された作用電極の電位を変化させるメディエータと、
前記作用電極の電位を測定するセンサと、
を備えることを特徴とする検知システム。
【請求項２】
前記検知システムはさらに、
前記作用電極の基準電位を決定する参照電極を備えることを特徴とする請求項１記載の検知システム。
【請求項３】
前記参照電極は、銀−塩化銀電極であることを特徴とする請求項２記載の検知システム。
【請求項４】
前記作用電極の電位により、前記作用電極の近傍にある分子を酸化または還元することを特徴とする請求項１記載の検知システム。
【請求項５】
前記検知システムはさらに、
前記作用電極に対して電流を供給する対向電極を備えることを特徴とする請求項２記載の検知システム。
【請求項６】
前記センサは電界効果型トランジスタであることを特徴とする請求項１記載の検知システム。
【請求項７】
前記受容体は、嗅覚受容体、味覚受容体、光受容体、温覚受容体、冷覚受容体、痛覚受容体のいずれか一つを含むことを特徴とする請求項１記載の検知システム。
【請求項８】
前記生体分子は、ノルアドレナリン、ドーパミン、L-dopaのいずれかであることを特徴とする請求項１記載の検知システム。
【請求項９】
前記酵素は、モノアミンオキシダーゼ、ドーパ脱炭酸酵素の両方またはいずれかであることを特徴とする請求項１記載の検知システム。
【請求項１０】
前記酵素は、前記作用電極に固定されていることを特徴とする請求項１記載の検知システム。
【請求項１１】
前記酵素は、半透膜により前記細胞と隔絶されていることを特徴とする請求項１記載の検知システム。
【請求項１２】
前記メディエータがフェロセン誘導体であることを特徴とする請求項１記載の検知システム。
【請求項１３】
前記メディエータは、前記作用電極上に固定されていることを特徴とする請求項１記載の検知システム。
【請求項１４】
前記作用電極の表面が金で被覆されており、前記メディエータのチオール基と結合することで自己組織化膜を形成することを特徴とする請求項１３に記載の検知システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大気中または液中の物質を測定する検知システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
大気中の分子を測定する化学物質センサは、ガスセンサあるいは匂いセンサと呼ばれ、特に、金属酸化物の焼結体を利用した半導体式ガスセンサが可燃性ガス、及び、毒ガスの警報器などの用途で広く使用されている。【０００３】
ヒータにより加熱された半導体式ガスセンサ中の金属酸化物表面には清浄空気中の酸素が吸着し、酸素イオンとして存在する。酸素はイオン化する際に金属酸化物より電子を引き抜くため、表面近傍領域はキャリア密度が低下し空乏層が形成され、金属酸化物の抵抗値が増加する。【０００４】
もし、金属酸化物が接する空気が清浄ではなく、還元性ガスを含んでいる場合、金属酸化物表面に吸着した酸素イオンと反応し電子を放出することでキャリア密度が増加するために、金属酸化物の抵抗値が清浄空気に比べて減少する。前述のような抵抗値の変化が、空気中に含まれるメタン、ブタン、水素、一酸化炭素などの還元性ガス濃度によって変化するために、可燃性、及び、毒ガスセンサとして利用できる。【０００５】
半導体式ガスセンサは小型かつ安価であるが、酸素イオンと反応する還元性ガスであれば応答するため、測定分子の選択性が乏しい。したがって、ガスに夾雑成分がある場合や、混合ガスの多成分分析を行う場合はガスクロマトグラフィー（GC：Gas Chromatography）が利用される。【０００６】
GCは、混合ガスがカラム内の固定相または充填剤に対する沸点や極性に応じた吸着特性の違いにより、各成分がカラム内を流れる際に選択的に遅延することで分離し、順次検出器に導入され、各成分濃度を測定する分析手法である。検出器は、水素炎イオン化検出器、熱伝導度検出器、質量分析計などが使用できるが、各検出器の動作原理については省略する。GCを用いた分析装置は、半導体式ガスセンサに比べて大型かつ高価であり、成分分離のために遅延時間を設けているため、リアルタイムに測定することが困難である。【０００７】
上述した化学物質センサは、装置サイズ、分子選択性、応答速度の観点で、全てを満たすことは難しいが、生体における嗅覚は、数センチから数ミリの小型の器官でありながら、分子選択性の異なる数百から数千種の嗅覚受容体を用いて１秒以下の応答速度で大気中の成分を弁別することができる。感度については、どの測定手法も測定成分に依存するが、生体は数ppt（part per trillion：１兆分の１）以下の濃度であっても感じることができるので、生体の感度は、ＧＣの検出器に質量分析計を用いたガスクロマトグラフ質量分析計（GC-MS：Gas Chromatography-Mass Spectrometry）の感度と同等かそれ以上である。【０００８】
生体の嗅覚と同等の、小型かつ高感度、高速応答の高選択性センサを実現するために、細胞やタンパク質または脂質膜等の生体材料を利用したバイオセンサが研究されている。具体的には、嗅覚受容体及び蛍光タンパク質を共発現している昆虫細胞を用いて匂い分子の濃度を蛍光強度として得る匂いセンサがある（特許文献１参照）。【０００９】
光学的手法以外にも、電気的に測定する手法がある（特許文献２参照）。特許文献２では、嗅細胞より産生される神経伝達物質を、酸化酵素及びメディエータを固定した酸素電極を用いて、電気的に検知する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１３−２７３７６号公報
【特許文献２】特開２０１１−７７４１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Bor-Ran Li et al.， “An Ultrasensitive Nanowire-Transistor Biosensor for Detecting Dopamine Release from Living PC12 Cells under Hypoxic Stimulation”， J. Am. Chem. Soc. 2013， 135， 16034-16037.
【非特許文献２】Kumiko Ui-Tei et al.， “Chemical analysis of neurotransmitter candidates in clonal cell lines from Drosophila central nervous system”， Neurosci. Lett.， 1994， 174(1)， 85-88.
【非特許文献３】沼田朋大 et al.， “TRPチャネルの構造と多様な機能”， 生化学2009， 81， 962-983.
【非特許文献４】Kenji Ono et al.， “Glutamate release from astrocyte cell-line GL261 via alterations in the intracellular ion environment”， J Neural Transm.， 2014， 121(3)， 245-257.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
生体は、百万個規模の細胞を用いることで、高感度かつ高い識別能を持った匂いセンサを、わずか数センチのスケールで実現している。生体と同等かそれ以上の性能を人工的に実現するためには、高感度化、小型化、並列化、長寿命化の観点で多くの課題がある。【００１３】
細胞の蛍光測定一般において、励起光により副次的に発生する活性酸素及びフリーラジカルによる光毒性が懸念され、センサの低寿命化の一因となっている可能性がある。さらに、蛍光測定のためには、光電変換素子以外に、光源及びレンズといった結像光学系が必要であるため、光学測定法に比べて電気的測定法が小型化に向いている。【００１４】
しかし、電気的測定の中でも、電流測定法は電位測定法に比べて入力インピーダンスが低いため、電極に固定したメディエータの酸化・還元状態に影響を与えてしまう。具体的には、酸化電位よりも電極電位が高ければ、メディエータが還元されてもすぐに酸化状態に戻ってしまうため、低濃度測定に感度が得られないという課題がある。【００１５】
一方、従来の電位測定法は、メディエータの反応が進行し測定感度が低下した際に、測定溶液に酸化剤あるいは還元剤を外部より添加することで初期化する方法が用いられていたが、細胞を用いたセンシングの場合、添加する酸化・還元剤によって細胞が破壊され、センサ寿命が短くなるという問題があった。【００１６】
本発明の目的は、小型で高感度の検知システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記目的を達成するために、本発明は、刺激を検知する受容体を含み、前記受容体が刺激を受けたことにより生体分子を放出する細胞と、前記生体分子と反応して、酸化剤または還元剤を生成する酵素と、前記生成された酸化剤または還元剤によって酸化または還元されるメディエータであって、前記メディエータと接続された作用電極の電位を変化させるメディエータと、前記作用電極の電位を測定するセンサとを備える構成を採用する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、検知システムを高感度で長寿命にできるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態である化学物質センシング装置の概略構成図である。
【図２】本発明の一実施形態である酵素を電極に固定した化学物質センシング装置の概略構成図である。
【図３】本発明の一実施形態であるポテンションスタットおよび測定回路図である。
【図４】本発明の一実施形態である化学物質センシング装置の初期化及び測定時のタイムチャートである。
【図５】本発明の一実施形態である参照電極及び対向電極を基板上に配置した化学物質センシング装置の概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本実施形態では、化学的及び物理的刺激を検知することにより活性化した受容体により、イオンチャネルが開くことで細胞内のイオン濃度が変化し、前記細胞より生体分子が放出される。放出された前記生体物質に対応する酵素と反応させることで酸化・還元剤を生成し、作用電極と結合したメディエータの酸化・還元状態を変化させることができる。
【００２１】
作用電極の電位は、作用電極と結合した前記メディエータの酸化・還元状態により変化するために、作用電極の電位を測定することで、化学物質や物理刺激を選択的に検知することができる。さらに、酸化・還元反応が進行した前記メディエータが結合した前記作用電極に対して電圧を印加し、前記メディエータの酸化・還元状態を初期化することで測定感度を維持したまま繰り返し測定が行える。
【００２２】
本発明の一実施例を、以下に詳細に説明する。
【００２３】
本実施例では、化学物質及び物理センサとして、嗅覚受容体を発現した細胞を用いた化学物質センシング装置を説明する。
【００２４】
図１は、化学物質センシング装置の概略構成図である。測定溶液中の化学物質が、細胞C1の表面に発現させた嗅覚受容体R1に結合すると、カルシウムチャネルが開き、測定溶液S1と細胞内液のイオン濃度差に従って、カウルシウムイオンの移動が生じる。
【００２５】
一般に、細胞内液のカルシウムイオン濃度は、細胞外液に対して低く保たれているため、カルシウムチャネルが開くことで細胞内液のカルシウムイオン濃度は上昇する。細胞内液のカルシウムイオン濃度上昇により、細胞外へ生体分子BM1が放出される。
【００２６】
具体的には、ラット副腎褐色細胞腫（PC12）細胞はドーパミンを放出する（非特許文献１）。放出されたドーパミンは、測定溶液中のドーパミン酸化酵素E1と反応する過程で過酸化水素を発生し、過酸化水素により電極に結合したメディエータM1（例えば、電極を被覆する金原子とチオール基）とを結合することで、自己組織化膜を形成したフェロセニルアルカンチオール（フェロセン誘導体の一種）が酸化され、作用電極電位が変化する。作用電極WE1は、電界効果型ドランジスタのゲート絶縁膜上に配線されており、作用電極電位の変化を、ソース−ドレイン電流として測定器MI1により測定することができる。
【００２７】
受容体を発現させる細胞はPC12に限らず、受容体刺激に応じて生体分子を分泌する細胞であれば使用することができる。各細胞種および分泌される生体分子と、それに対応する酸化酵素の組み合わせを表１に例示する。
【００２８】
【表１】
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ML-DmBG2-c2細胞を含む昆虫細胞は、室温（25℃）の条件で培養できるため、室温より高い温度（37℃）で培養する必要がある哺乳類細胞（PC12細胞）に比べて、温度管理が容易である。一方で、ML-DmBG2-c2細胞が分泌する生体分子であるL-dopaから酸化剤である過酸化水素を生成するには二種類の酵素が必要であるのに対し、PC12細胞の分泌する生体分子の酵素は一種類のみでよいため、装置費用が低減できる。
【００２９】
本実施例における、細胞が発現している嗅覚受容体R1は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて人工的に発現させたものであり、同様な化学物質センサとしては、味覚受容体でもよい。例えば、特定の化学物質に応答する受容体からmRNAを抽出し、cDNAを合成・単離した後、適当なベクターに組み込み、細胞へ導入することができる。嗅覚受容体R1を人工的に発現させることにより、細胞を発現させた嗅覚受容体R1に対応した化学物質に応答するセンサとすることができる。
【００３０】
酵素E1の配置法としては、測定溶液に溶解する方法や、図２に示すように、電極または別の構造体に固定する方法が存在する。酵素が未固定であると、溶液交換時に酵素も同時に排出されるため、測定コストが増加する問題がある。一方で、酵素を固定すると、酵素によっては活性が低下するうえに、強く酵素が固定されるほど交換が容易ではなくなる。そこで、本実施例では酵素を固定化せず、かつ酵素の拡散を防ぐために、図１に示すように細胞C1とメディエータM1を固定した作用電極WE1を半透膜SM1で隔てる構成を採用する。
【００３１】
高分子化合物である酵素E1は、半透膜SM1を透過できないため、電極側から細胞側への拡散を防ぐことができる。一方、低分子化合物である生体物質BM1は、半透膜SM1を透過するため、細胞側から拡散し酵素と反応することができる。さらに、酵素反応生成物である過酸化水素は、活性酸素の一種であるため、蛍光測定時の光毒性と同様に、センサを短寿命化する原因となりえるが、蛍光測定と異なり、活性酸素が細胞に接触するためには必ず半透膜を通過する必要があるため、活性酸素によるダメージを半透膜が代替することで、細胞への影響を抑制することができる。
【００３２】
電界効果型トランジスタを用いた作用電極電位測定法は、作用電極WE1が絶縁されているために、入力インピーダンスが高く、電流測定法に比べて、低濃度領域の測定により適している。しかし、細胞C1から放出される生体分子BM1を測定し続けることで、メディエータM1の大部分が酸化されてしまい、測定感度が低下する。そこで、メディエータM1を測定前の還元状態へ初期化し、測定感度およびダイナミックレンジを回復する処置が必要となる。しかし、メディエータM1を還元するためにフェロシアン化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、ジチオトレイトールといった還元剤を利用すると、細胞が低寿命化するため、電気化学的にメディエータM1を初期化する必要がある。
【００３３】
メディエータM1を酸化・還元するためには、メディエータM1を固定した電極を作用電極WE1とした、二電極方式または三電極方式の電気化学セルを構成する必要がある。二電極方式と三電極方式との違いは、対向電極CE1の有無であるが、参照電極RE1の電位が変動しない程度の微小電流で十分反応が進む場合は、対向電極CE1のない二電極方式で十分である。本実施例では、三電極方式を用いた化学物質センシング装置の構成を示す。
【００３４】
本実施例においては、図３のポテンションスタットおよび測定回路図に示すように、測定用ＦＥＴとスイッチ用ＦＥＴが用意されており、図１および図２に示すように、作用電極WE1は、測定用ＦＥＴのゲート電極GE1、及びスイッチ用ＦＥＴのドレイン電極DE2に配線されている。参照電極RE1は、取扱が容易かつ安定性が高いことから、銀−塩化銀電極が望ましく、銀−塩化銀電極は、温度と液中の塩化物イオン濃度が一定である限り、固定された基準電位を決定することができる。対向電極CE1は、作用電極WE1における電子移動反応に必要な電流を供給し、かつ溶液を汚染しない必要があるため、作用電極WE1よりも大きな表面積を備える白金電極が望ましい。
【００３５】
図４は、化学物質センシング装置の初期化及び測定時のタイムチャートである。メディエータＭ１の初期化のために、ポテンションスタットＰ１を用いて、還元電位（ＶＲＳＳ）をスイッチ用ＦＥＴの参照電極−ソース電極間に印加する。このとき、スイッチ用ＦＥＴのゲート電極−ソース電極間に印加する電圧（ＶＧＳＳ）を閾値電圧以上にすることで、スイッチ用ＦＥＴのドレイン電極−ソース電極間で電流（ＩＤＳＳ）を流し、メディエータＭ１を還元する。ドレイン電極−ソース電極間に電流が流れる状態であっても、有限の抵抗が存在するため、電圧降下が生じる。したがって、ＶＲＳＳは、電圧降下の影響を加味して設定する必要がある。
【００３６】
スイッチ用ＦＥＴのゲート電極−ソース電極間に印加されている電圧が閾値電圧以下であっても、有限のドレイン電流（サブスレッショルド・リーク電流）が流れるため、メディエータ初期化のためのスイッチ用ＦＥＴを追加することで、その特性によっては、かえって感度が悪化する場合がある。したがって、スイッチ用ＦＥＴのサブスレッショルド・リーク電流を、測定用ＦＥＴのゲート・リーク電流の１０分の１以下となるように、スイッチ用ＦＥＴを設計する。具体的には、スイッチ用ＦＥＴのソース電極−ゲート間距離（ゲート長）を長くすることで、サブスレッショルド・リーク電流を低減することができる。
【００３７】
しかし、ゲート長を長くすると、素子サイズが大きくなるため、許容されるＦＥＴ特性及び製造プロセスに適した、ゲート幅の低減やインプラント濃度の低減、またはLightly Doped Drain手法を選択することで、素子サイズを維持したままサブスレッショルド・リーク電流を低減することができる。
【００３８】
メディエータＭ１が還元され、ＩＤＳＳが安定化した後、スイッチ用ＦＥＴのゲート電極ＧＥ１の電圧を閾値電圧よりも小さくし、ＶＲＳＳおよびＶＧＳＳの電圧印加を停止し、メディエータの状態を保持する。この状態で、測定用ＦＥＴのゲート電極−ソース電極間には、作用電極ＷＥ１に固定したメディエータＭ１の酸化体と還元体の比率に対応した、ネルンストの式に従う電圧（ＶＧＳＭ）が印加されている。
【００３９】
ＶＧＳＭが、測定ＦＥＴの閾値電圧（ＶＴｈＭ）以上であれば、測定器Ｍ１より測定用ＦＥＴのドレイン電極−ソース間にバイアス電圧（ＶＤＳＭ）を印加することで、ドレイン電流(ＩＤＳＭ)が流れる。もし、電流が流れすぎて消費電力及び発熱面で問題がある場合は、参照電極−ソース電極間に印加する電圧（ＶＲＳＭ）を調整することで回避できる。もしくは、初期状態のＶＧＳＭがＶＴｈＭ以下であると、低濃度において感度が得られない問題があるため、ＶＲＳＭを調整してＶＧＳＭをＶＴｈＭ以上とする。
【００４０】
本実施例では、参考電極RE1及び対向電極CE1を測定溶液S1上部に配置したが、図５に示すように、作用電極WE1と同様に絶縁層IL1表面に配置してもよい。絶縁層IL1表面に配置することで、装置のサイズを小さくできる。
【００４１】
本実施例では、嗅覚受容体を発現した細胞を用いたが、Transient Receptor Potential（TRP）チャネルのような、温度や機械刺激に応答する受容体を発現した細胞を用いることで、物理センシング装置として使用することもできる。TRPチャネルはセンサとしての機能が明らかになっており（非特許文献３参照）、TRPチャネルを発現した細胞を用いることで種々の外部刺激を検知することができる。各TRPチャネルの検出対象を表２に例示する。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
本実施例では、嗅覚受容体を発現した細胞を用いたが、ロドプシンのような光刺激に応答する受容体を発現した細胞を用いることで、光センシング装置として使用することもできる。ロドプシンファミリータンパクは、光を用いた細胞内のイオン濃度変化の手法として用いられており（非特許文献４参照）、ロドプシンを発現した細胞を用いることで光刺激を検知することができる。好ましくは、光受容とイオンチャネルの両方の機能を持つチャネルロドプシンを発現させる。
【００４４】
本実施例により、生物の持つ高い感度と選択性を両立した検知システムを実現することができ、さらに、分子の酸化・還元状態を初期化することで、繰り返し高い感度を維持したままで、検知対象を測定することができる。
【００４５】
特に嗅覚受容体を用いた場合においては、本実施例により、可搬型の高感度、高選択性を備えた化学物質センサを実現し、訓練を受けた犬やマウスなどの動物の嗅覚に頼らざるを得なかった、爆発物や麻薬、遭難者の探知や、医療用呼気分析の家庭向け応用に利用することができる。
【符号の説明】
【００４６】
ＢＭ１  生体分子
Ｃ１  細胞
ＣＥ１  対向電極
ＤＥ１  測定用ＦＥＴのドレイン電極
ＤＥ２  スイッチ用ＦＥＴのドレイン電極
Ｅ１  酵素
ＧＥ１  測定用ＦＥＴのゲート電極
ＧＥ２  スイッチ用ＦＥＴのゲート電極
ＩＬ１  絶縁層
Ｍ１  メディエータ
Ｐ１  ポテンションスタット
Ｒ１  受容体
ＲＥ１  参照電極
Ｓ１  測定溶液
ＳＥ１  測定用ＦＥＴのソース電極
ＳＥ２  スイッチ用ＦＥＴのソース電極
ＳＭ１  半透膜
ＷＥ１  作用電極
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
2017212730.tif 000010
2017212730.tif 000011
2017212730.tif 000012
2017212730.tif 000013