(57)【要約】  薬物等の被内包物を保持可能なタンパク質性のナノカプセルに関する技術であって、簡易な手法により細胞内に導入可能であり且つ内包物を細胞内に局所的に到達させることを可能とする技術を提供することを目的とする。  本発明は、リング構造を構成するＧｒｏＥＬサブユニットとしてＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含み且つ頂上部分を構成するサブユニットとしてＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットを含んでなる変異型シャペロニン複合体を、細胞内への局所的薬物送達システム用ナノカプセルの薬理成分内包用キャリア素材として含んでなることを特徴とする、薬物送達システム用ナノカプセルに関する。
2016185955.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リング構造を構成するＧｒｏＥＬサブユニットとしてＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含み、且つ、頂上部分を構成するサブユニットとしてＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットを含んでなる変異型シャペロニン複合体を、細胞内への局所的薬物送達システム用ナノカプセルの薬理成分内包用キャリア素材として含んでなることを特徴とする、薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項２】
前記ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体が、
（ａ−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、
（ａ−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列中、第３９８番目のアラニン以外の１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、又は、
（ａ−３）前記（ａ−１）又は（ａ−２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、
である、請求項１に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項３】
前記ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体が、
（ｂ−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、
（ｂ−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第５２番目及び第３９８番目のアラニン以外の１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、又は、
（ｂ−３）前記（ｂ−１）又は（ｂ−２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、
である、請求項１に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項４】
前記ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットが、
（ｃ−１）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＳサブユニット、
（ｃ−２）配列番号８に記載のアミノ酸配列中、１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列相同性を示す領域を有する、シャペロニン複合体の形成においてＧｒｏＥＳ活性を有するＧｒｏＥＳサブユニット、
（ｃ−３）前記（ｃ−１）又は（ｃ−２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体の形成においてＧｒｏＥＳ活性を有するＧｒｏＥＳサブユニット、
（ｄ−１）配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＧｐ３１サブユニット、
（ｄ−２）配列番号１１に記載のアミノ酸配列中、１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列相同性を示す領域を有する、シャペロニン複合体の形成においてＧｒｏＥＳ活性を有するＧｐ３１サブユニット、又は、
（ｄ−３）前記（ｄ−１）又は（ｄ−２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体の形成においてＧｒｏＥＳ活性を有するＧｐ３１サブユニット、
である、請求項１〜３のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項５】
前記ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットが細胞内小器官局在化ペプチド付加型又は挿入型のＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットである、請求項１〜４のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項６】
細胞内小器官への局所的薬物送達システム用ナノカプセルである、請求項５に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項７】
前記細胞内小器官局在化ペプチドが核移行シグナルペプチドである、請求項５に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項８】
細胞核への局所的薬物送達システム用ナノカプセルである、請求項７に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項９】
前記ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体が、外来性の細胞膜移行選択配列を含むペプチドの付加又は挿入がないものであって、且つ、細胞膜透過のための分子修飾が施されていないものである、請求項１〜８のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項１０】
前記ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体が、
（ｂ−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、
（ｂ−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第５２番目及び第３９８番目のアラニン以外の１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、又は、
（ｂ−３）前記（ｂ−１）又は（ｂ−２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、
であり、；
前記ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体が、外来性の細胞膜移行選択配列を含むペプチドの付加又は挿入がないものであって、且つ、細胞膜透過のための分子修飾が施されていないものであり、；
前記ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットが、
（ｃ−１）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＳサブユニット、
（ｃ−２）配列番号８に記載のアミノ酸配列中、１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列相同性を示す領域を有する、シャペロニン複合体の形成においてＧｒｏＥＳ活性を有するＧｒｏＥＳサブユニット、又は、
（ｃ−３）前記（ｃ−１）又は（ｃ−２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体の形成においてＧｒｏＥＳ活性を有するＧｒｏＥＳサブユニット、
であり、；
前記ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットが、
細胞内小器官局在化ペプチド付加型又は挿入型のＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットであって、前記細胞内小器官局在化ペプチドが核移行シグナルペプチドである、；
ことを特徴とする、請求項１に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項１１】
細胞核への局所的薬物送達システム用ナノカプセルである、請求項１０に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項１２】
変異型シャペロニン複合体に係るリング構造を構成するＧｒｏＥＬサブユニットについて、
（ｅ−１）全部がＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体である、又は、
（ｅ−２）半数以上がＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体であって、シャペロニン複合体として解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するものである、
請求項１〜１１のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項１３】
ＡＴＰ又はＡＴＰ代替化合物を含んでなる、請求項１〜１２のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項１４】
前記変異型シャペロニン複合体に係るリング構造内に薬理成分を内包してなる、請求項１〜１３のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項１５】
前記薬理成分が核酸、ペプチド、タンパク質、これらの修飾体若しくは誘導体、又はこれらを含むものである、請求項１４に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセルを用いることを特徴とする、細胞内に局所的に薬理成分を送達する方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセルをｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下の細胞に対して投与する工程を含むことを特徴とする、細胞内に局所的に薬理成分を送達する方法。
【請求項１８】
請求項１４又は１５のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセルを含んでなる医薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型シャペロニン複合体を利用した細胞内への局所送達を可能とする薬物送達システム用ナノカプセルに係る発明に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在常法として用いられる投薬手段としては、経皮投与、静脈投与、経口投与等の手段を挙げることができるが、いずれも体内循環しながら全身投与がされるため局所的な薬効を期待することができない。そのため、十分な薬効を得るために高濃度投与等が必要となる場合では、対象以外の臓器や組織への副作用等の問題が生じる危険性が危惧される場合が多い。
そこで、製薬及び医薬等に関する技術分野においては、次世代の投薬方法として、薬物送達システム（ＤＤＳ）に関する研究が精力的に取り組まれ、目的の細胞にだけ到達する局所性及び細胞膜透過等の技術開発が盛んに行われている。【０００３】
薬物送達システム用に用いられるキャリアとしては、細胞のエンドサイトーシス機能を利用して、薬剤を封入したリポソームを取り込ませる研究例が多く行われている（非特許文献１）。リポソームをＤＤＳキャリアとして使用するためには、膜受容体へ結合するリガンド、細胞表面に露呈するタンパク質を認識する抗体を備えるなど、細胞に認識させる部分はタンパク質に担わせる手段が挙げられる。
しかし、薬物送達キャリアは、毛細血管を通過できるサイズであり且つ均一な大きさで あることが望ましいところ、リポソームは粒径を均一に調整することが困難であるという課題がある。また、受容体を認識担体として結合すると粒径が大きくなり毛細血管の通過等の点で問題が生じる可能性がある。更に、効率的な受容体結合も簡単ではない。
また、リポソームに内包させた薬物等の局所送達には、リポソーム自体の構造上の工夫及び超音波発生機等の特定装置を使用した開閉制御手段が必要となり（例えば、非特許文献２）、容易な開閉制御が困難である。
また、リポソームに抗体等の表面修飾を行う操作が煩雑であるという課題も存在する。
そのため、リポソームをＤＤＳキャリアとして利用して局所性及び細胞透過性を具備した薬物送達に応用するためには、リポソームに代わるＤＤＳキャリアの技術開発が求められている。【０００４】
シャペロニン複合体（ＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ複合体）は、直径４〜８ｎｍ程度（大腸菌野生型では約５ｎｍ）の空洞を有し且つ水溶液中で安定且つ均一な立体構造をとるナノカプセル状のタンパク質となる。また、タンパク質であるため、ペプチド等の付加や結合も容易である。
そのため、シャペロニン複合体は、リポソームに代わるＤＤＳキャリア候補として注目されている分子である。【０００５】
ここで、シャペロニンは、基質タンパク質の正しいフォールディングを介助するいわゆる分子シャペロンの１種である。シャペロニンファミリーは、分子量５０〜６０ｋＤａのタンパク質であり、リング状の複合体構造をとり、ＡＴＰ依存的に基質タンパク質のフォールディングを介助するという共通の特徴を有している。シャペロニンの中でも、ＧｒｏＥＬは大腸菌が有するシャペロニンであり、ＡＴＰとＧｒｏＥＳ依存的にタンパク質のフォールディングを介助することが明らかにされている。
シャペロニンＧｒｏＥＬは、ＧｒｏＥＬサブユニットの７量体が１つのリングを構成し、このリングがさらに背中合わせに２つ重なった状態の合計で１４量体の構造をしている。また、ひとつのＧｒｏＥＬサブユニットはＡＴＰ結合部位を含む赤道ドメインと、基質タンパク質とＧｒｏＥＳの結合部位を含む頂点ドメインと、その両ドメインをつなぐ中間ドメインとから構成されている。【０００６】
基質タンパク質のフォールディングにおいては、まずシャペロニンＧｒｏＥＬサブユニットで構成されたリングの「入り口」に基質タンパク質が結合し、リングを構成するシャペロニンＧｒｏＥＬサブユニットに７つのＡＴＰがそれぞれ結合すると、シャペロニンＧｒｏＥＬの構造変化が起こって補因子であるＧｒｏＥＳがＧｒｏＥＬに結合可能となる。次いで、ＧｒｏＥＳがＧｒｏＥＬに結合すると、基質タンパク質がリングの空洞内に落とし込まれ、シャペロニン複合体を形成する。シャペロニン複合体ではリングの空洞内で落とし込まれた基質タンパク質のフォールディングが進行する。次いでリング内のＡＴＰが加水分解されるとＧｒｏＥＳが解離し、それと同時にリング内のフォールディングされた基質タンパク質も解離する。【０００７】
通常の野生型ＧｒｏＥＬでは、ＡＴＰの加水分解の時間は約８秒であり、短時間で被内包物が放出されてしまうという欠点があり、そのままでは薬物送達キャリアとして採用できない。
そこで、シャペロニン複合体の構成ユニットであるＧｒｏＥＬに注目して、ＧｒｏＥＬサブユニット７量体をチューブ状に組み合わせた複合体を構成し、その内部で薬物等の被内包物を封入する技術が報告されている（非特許文献３）。ここで、非特許文献３には、通常のタンパク質と同様にシャペロニン構成ユニットであるＧｒｏＥＬで構成される複合体構造はそのままでは細胞膜透過が困難であることが報告されており、ボロン酸誘導体でタンパク質表面を修飾することによりＧｒｏＥＬで構成される複合体構造の細胞膜透過を達成する技術が報告されている。
しかし、非特許文献３に係る技術では、原理的に細胞内の高ＡＴＰ濃度に反応することでＧｒｏＥＬチューブを構成するリングどうしが脱離し、被内包物を細胞内に放出することを基本原理としている。そのため、細胞透過の「直後に」当該チューブからの薬物放出が起こってしまい、核等の特定の細胞内小器官に局所的薬物送達を行うことが原理的に不可能な技術である。この点、核酸医薬を細胞内に局所的に到達可能とするＤＤＳ技術への応用には不向きな技術と認められる。また、当該技術では、細胞膜透過のためにボロン酸誘導体での表面修飾処理という余剰な処理工程が必要となるという課題もある。
このように、シャペロニンをＤＤＳキャリア用途に応用する研究は発展途上の分野であり、細胞内小器官（特に核内）への内容物送達の実用化に十分な検討がなされていない。【０００８】
以上に示したように、薬物等の被内包物を保持可能なタンパク質性のナノカプセルに関する技術であって、簡易な手法により細胞内に導入可能であり且つ内包物を細胞内に局所的に到達可能とする技術の開発が期待されているところ、実用化可能な技術は開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Patel L. N. et al., Cell Penetrating Peptides: Intracellular Pathways and Pharmaceutical Perspectives, Pharmaceutical Research (2007), 24(11), 1977-1992
【非特許文献２】薬学雑誌１３０（１１）ｐ１４８９−１４９６  ２０１０年
【非特許文献３】Biswas S. et al., Biomolecular robotics for chemomechanically driven guest delivery fuelled by intracellular ATP, Nat. Chem. (2013), 5(7), 613-20
【非特許文献４】Essential 細胞生物学  原書第３版  ｐ３８９
【非特許文献５】Tsukazaki et al., Structure and function of a protein export-enhancing membrane component SecDF, Nature, 474 (7350), 235-238, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は上記従来技術の事情に鑑みてなされたものであり、その課題とする処は、薬物等の被内包物を保持可能なタンパク質性のナノカプセルに関する技術であって、簡易な手法により細胞内に導入可能であり且つ内包物を細胞内に局所的に到達させることを可能とする技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、以下の知見を見出して本発明を想到するに至った。【００１２】
（１）本発明者らは、ＧｒｏＥＬサブユニットとして、「ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体」を含む変異型シャペロニン複合体を用いることによって、ナノカプセルであるシャペロニン複合体そのものが内包物を保持したまま細胞内に取り込まれることを見出した。
ここで注目すべき点は、Biswas et al. 2013（非特許文献３）に記載のように、ＧｒｏＥＬサブユニットで構成される複合体構造はそのままでは細胞膜を透過できないという報告があるにも関わらず、ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を採用して当該変異サブユニットとＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットを含むシャペロニン複合体を形成させることによって、細胞膜透過性選択ペプチド等の付加がないシャペロニン複合体においても、シャペロニン複合体の細胞膜透過能が確認された点である。即ち、本発明者らは、当該ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含む変異型シャペロニン複合体に被内包物を内包させた場合、特別な表面処理や分子修飾等の処理等を行うことなく、上記した内包物を保持した状態のまま変異型シャペロニン複合体が細胞質透過性を発揮することを見出した。これはBiswas et al. 2013（非特許文献３）の記載から想定される技術常識とは反対の知見である。
更に言及すべき点は、通常の野生型ＧｒｏＥＬは、ＡＴＰの加水分解の時間は約８秒という短時間でＧｒｏＥＳと被内包物の解離が起こってしまうことから、野生型のＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳ複合体を用いただけでは当該知見を得ることができない点である。この点、本発明者らがＡＴＰ加水分解活性低下型のＧｒｏＥＬ変異体を採用することを上記阻害事由下において着想して具現化可能であることを実験で示すことによって初めて得られた知見である。
また、通常のタンパク質（例えば、ＧＦＰ等）のような高分子がそのままでは細胞膜を通過できない点は、当該技術分野における周知技術である（例えば、非特許文献４参照）。また、タンパク質が膜を透過するためには、特別な膜タンパク構造と特定シグナルが必要と考えられている（例えば、非特許文献５参照）。これらの点から明らかなように、当該知見は、細胞膜透過に関する当該技術分野における複数の阻害事由存在下にも関わらずに得られた知見であり、創作困難性を有していた点と認められる。【００１３】
（２）次いで、本発明者らは、ＧｒｏＥＳサブユニットとして、「核移行シグナルペプチド（細胞内小器官局在化を可能とするペプチド）が付加されたＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニット」を用いて、上記ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬ変異体を含むシャペロニン複合体を合成することによって、細胞内に取り込まれたシャペロニン複合体を細胞核に局所的に到達可能となることを見出した。【００１４】
本発明に関する主たる技術的特徴は、上記（１）に係る知見に基づいて、ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体及びＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットを含んでなる変異型シャペロニン複合体を薬物送達システムキャリアとして用いることによって、細胞膜透過を実現して細胞内への局所的薬物送達が可能となる点を見出したことにより想到された。
また、本発明に関する更なる技術的特徴は、上記（２）に係る知見に基づいて細胞内小器官への局所的薬物送達がより効率的に実現可能となる点を見出したことにより想到された。【００１５】
本発明は、具体的には以下に係る発明に関する。
［項１］
リング構造を構成するＧｒｏＥＬサブユニットとしてＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含み、且つ、頂上部分を構成するサブユニットとしてＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットを含んでなる変異型シャペロニン複合体を、細胞内への局所的薬物送達システム用ナノカプセルの薬理成分内包用キャリア素材として含んでなることを特徴とする、薬物送達システム用ナノカプセル。
［項２］
前記ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体が、
（ａ−１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、
（ａ−２）配列番号１に記載のアミノ酸配列中、第３９８番目のアラニン以外の１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、又は、
（ａ−３）前記（ａ−１）又は（ａ−２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、
である、項１に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項３］
前記ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体が、
（ｂ−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、
（ｂ−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第５２番目及び第３９８番目のアラニン以外の１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、又は、
（ｂ−３）前記（ｂ−１）又は（ｂ−２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、
である、項１に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項４］
前記ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットが、
（ｃ−１）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＳサブユニット、
（ｃ−２）配列番号８に記載のアミノ酸配列中、１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列相同性を示す領域を有する、シャペロニン複合体の形成においてＧｒｏＥＳ活性を有するＧｒｏＥＳサブユニット、
（ｃ−３）前記（ｃ−１）又は（ｃ−２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体の形成においてＧｒｏＥＳ活性を有するＧｒｏＥＳサブユニット、
（ｄ−１）配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＧｐ３１サブユニット、
（ｄ−２）配列番号１１に記載のアミノ酸配列中、１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列相同性を示す領域を有する、シャペロニン複合体の形成においてＧｒｏＥＳ活性を有するＧｐ３１サブユニット、又は、
（ｄ−３）前記（ｄ−１）又は（ｄ−２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体の形成においてＧｒｏＥＳ活性を有するＧｐ３１サブユニット、
である、項１〜３のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項５］
前記ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットが細胞内小器官局在化ペプチド付加型又は挿入型のＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットである、項１〜４のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項６］
細胞内小器官への局所的薬物送達システム用ナノカプセルである、項５に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項７］
前記細胞内小器官局在化ペプチドが核移行シグナルペプチドである、項５に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項８］
細胞核への局所的薬物送達システム用ナノカプセルである、項７に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項９］
前記ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体が、外来性の細胞膜移行選択配列を含むペプチドの付加又は挿入がないものであって、且つ、細胞膜透過のための分子修飾が施されていないものである、項１〜８のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項１０］
前記ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体が、
（ｂ−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＬサブユニット変異体、
（ｂ−２）配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第５２番目及び第３９８番目のアラニン以外の１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、又は、
（ｂ−３）前記（ｂ−１）又は（ｂ−２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、
であり、；
前記ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体が、外来性の細胞膜移行選択配列を含むペプチドの付加又は挿入がないものであって、且つ、細胞膜透過のための分子修飾が施されていないものであり、；
前記ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットが、
（ｃ−１）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＧｒｏＥＳサブユニット、
（ｃ−２）配列番号８に記載のアミノ酸配列中、１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の配列相同性を示す領域を有する、シャペロニン複合体の形成においてＧｒｏＥＳ活性を有するＧｒｏＥＳサブユニット、又は、
（ｃ−３）前記（ｃ−１）又は（ｃ−２）に記載のアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなり、シャペロニン複合体の形成においてＧｒｏＥＳ活性を有するＧｒｏＥＳサブユニット、
であり、；
前記ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットが、
細胞内小器官局在化ペプチド付加型又は挿入型のＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットであって、前記細胞内小器官局在化ペプチドが核移行シグナルペプチドである、；
ことを特徴とする、項１に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項１１］
細胞核への局所的薬物送達システム用ナノカプセルである、項１０に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項１２］
変異型シャペロニン複合体に係るリング構造を構成するＧｒｏＥＬサブユニットについて、
（ｅ−１）全部がＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体である、又は、
（ｅ−２）半数以上がＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体であって、シャペロニン複合体として解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するものである、
項１〜１１のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項１３］
ＡＴＰ又はＡＴＰ代替化合物を含んでなる、項１〜１２のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項１４］
前記変異型シャペロニン複合体に係るリング構造内に薬理成分を内包してなる、項１〜１３のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項１５］
前記薬理成分が核酸、ペプチド、タンパク質、これらの修飾体若しくは誘導体、又はこれらを含むものである、項１４に記載の薬物送達システム用ナノカプセル。
［項１６］
項１〜１５のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセルを用いることを特徴とする、細胞内に局所的に薬理成分を送達する方法。
［項１７］
項１〜１５のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセルをｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下の細胞に対して投与する工程を含むことを特徴とする、細胞内に局所的に薬理成分を送達する方法。
［項１８］
項１４又は１５のいずれかに記載の薬物送達システム用ナノカプセルを含んでなる医薬剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、薬物等の被内包物を保持可能なタンパク質性のナノカプセルに関する技術であって、簡易な手法により細胞内に導入可能であり且つ内包物を細胞内に局所的に到達させることを可能とする技術を提供することを可能とする。
これにより本発明では、例えば、毛細血管の通過においても問題なく使用可能な均一なサイズのナノカプセルであって、タンパク質性であるため抗体等の付加修飾が容易であり、細胞膜透過及び細胞内局所送達を可能とするＤＤＳキャリアを提供することを可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】シャペロニンの作用機構モデルを示す概念図である。
【００１８】
【図２】実施例１にて調製したＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ発現ベクターについて、ＡｈＲシグナル配列挿入部位及びＧｒｏＥＳ遺伝子付近の構造を模式的に示す図である。ＸｂａＩ、ＮｃоＩ、及びＮｄｅＩは、ベクター上での制限酵素認識部位を示す。
【００１９】
【図３】実施例１にて調製したＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ発現ベクターについて、ＡｈＲシグナル配列挿入部位及びＧｒｏＥＳ遺伝子付近の塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。図中において、白色ボックスで囲んだアミノ酸配列はＡｈＲシグナル配列を示す。灰色ボックスで囲んだアミノ酸配列はＧｒｏ−ＷＴに相当する配列を示す。破線で示した部分は、それぞれＮｃоＩ又はＮｄｅＩの制限酵素認識部位を示す。
【００２０】
【図４】実施例１において調製したＧｒｏＥＳ−ＮＡＳについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して得たゲル写真像図（左図）及び抗ＧｒｏＥＳ抗体を用いたウェスタンブロットに供して得たシグナル像図（右図）である。レーン１：少量培養ＩＰＴＧ誘導なしでの試料。レーン２：少量培養ＩＰＴＧ誘導ありでの試料。レーン３：大量培養ＩＰＴＧ誘導ありでの試料。レーン４：野生型であるＧｒｏＥＳ−ＷＴ（精製タンパク質）。
【００２１】
【図５】実施例１において調製した変異型シャペロニン複合体について、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）にて分子構造を撮影した写真像図である。（Ａ）弾丸型複合体を示す画像図である。写真中のスケールバーは５０ｎｍを示す。（Ｂ）フットボール型複合体を示す画像図である。写真中のスケールバーは１００ｎｍを示す。
【００２２】
【図６】実施例２において、ＧＦＰを蛍光標識したシャペロニン複合体に内包させてＣＨＬ細胞に添加し、蛍光顕微鏡にて経時変化を撮影した結果を示す写真像図である。各写真のスケールバーは、２０μｍを示す。Ｓａｍｐｌｅ２−１：試料２−１の経時変化を撮影した一連の画像図。Ｓａｍｐｌｅ２−２：試料２−２の経時変化を撮影した一連の画像図。
【００２３】
【図７】実施例２の試料２−２について、ＣＨＬ細胞培養後４８時間経過時に蛍光顕微鏡画像を用いて作成した三次元スタック断面画像である。（Ａ）：蛍光顕微鏡観察画像。（Ｂ）：正面斜視からのスタック断面画像。図中において、（Ｂ）における断層面は（Ａ）における白破線部での横断面を示す。
【００２４】
【図８】実施例３（１）において調製した蛍光標識ＤＮＡをＰＡＧＥに供して得たゲル写真像図である。レーン１：ｐＵＣ１９（鋳型ＤＮＡ）のＥｔＢｒ染色像。レーン２：蛍光標識せずに増幅合成したＤＮＡのＥｔＢｒ染色像。レーン３：蛍光標識して増幅合成したＤＮＡのＥｔＢｒ染色像。レーン１’：ｐＵＣ１９（鋳型ＤＮＡ）の励起光460nm/蛍光515nm filter 蛍光検出像。レーン２’：蛍光標識せずに増幅合成したＤＮＡの励起光460nm/蛍光515nm filter 蛍光検出像。レーン３’：蛍光標識して増幅合成したＤＮＡの励起光460nm/蛍光515nm filter 蛍光検出像。
【００２５】
【図９】実施例３（４）で蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子を内包したＡｈＲ付加型ＧｒｏＥＳを含む変異型シャペロニン複合体（試料３−１）をＣＨＬ培養細胞に添加して培養した場合において、定点タイムラプス解析による蛍光検出結果を示した写真像図である。図中において上段は励起光466nm/蛍光525nm蛍光像及びＤＩＣ透過像の合成画像を示し、下段はＤＩＣ透過像を示す。各写真像の上に示した数字は試料投与時からの経過時間を示す。破線で示した円は蛍光シグナルが観察された細胞における細胞核の位置を示す。写真像の撮影倍率は８０倍であり、各写真像の一辺は２５５μｍに相当する。
【００２６】
【図１０】図９の励起光466nm/蛍光525nm蛍光像及びＤＩＣ透過像の合成画像について、蛍光シグナルが検出された細胞付近を階調反転及び拡大して示した写真像である。
【００２７】
【図１１】実施例３（４）で蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子を内包した野生型ＧｒｏＥＳを含む変異型シャペロニン複合体（試料３−２）をＣＨＬ培養細胞に添加して培養した場合において、定点タイムラプス解析による蛍光検出結果を示した写真像図である。図の構成等に関する説明は図９と同様である。
【００２８】
【図１２】図１１の励起光466nm/蛍光525nm蛍光像及びＤＩＣ透過像の合成画像について、蛍光シグナルが検出された細胞付近を階調反転及び拡大して示した写真像である。
【００２９】
【図１３】実施例３（４）で蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子（試料３−３）のみをＣＨＬ培養細胞に添加した場合において、定点タイムラプス解析による蛍光検出結果を示した写真像図である。図の構成等に関する説明は図９と同様である。
【００３０】
【図１４】実施例３（４）で試料投与せずにＣＨＬ培養細胞を培養した場合において、定点タイムラプス解析による蛍光検出結果を示した写真像図である。図の構成等に関する説明は図９と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本出願は、２０１５年５月１６日に日本国に本出願人により出願された特願２０１５−１００５８６に基づく優先権主張を伴う出願であり、その全内容は参照により本出願に組み込まれる。
【００３２】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明は、変異型シャペロニン複合体を利用した細胞内への局所送達を可能とする薬物送達システム用ナノカプセルに係る発明に関する。なお、本明細書中において「細胞内小器官」及び「細胞小器官」の用語は、本願に係る優先日における本願発明に関する技術分野の技術常識が示すように「オルガネラ（organelle）」を指す用語として用いられた用語である。
【００３３】
１．変異型シャペロニン複合体
本発明は、リング構造を構成するＧｒｏＥＬサブユニットとしてＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含み、且つ、頂上部分を構成するサブユニットとしてＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットを含んでなる変異型シャペロニン複合体を、細胞内への局所的薬物送達システム用ナノカプセルの薬理成分内包用キャリア素材として利用する技術に関するものである。
【００３４】
本明細書において「シャペロニン複合体」とは、ＧｒｏＥＬサブユニットとＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットを主たる構成要素とする、リング状の複合体構造を有するナノカプセル状タンパク質を指す。
ＧｒｏＥＬサブユニットは７量体のリング構造を形成し、リング構造が背中合わせに結合すると１４量体のダブルリング構造となる。頂上キャップ構造としてＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットが結合することで、直径４〜８ｎｍ程度（大腸菌野生型では約５ｎｍ）の閉鎖的な空洞を有し、且つ水溶液中で安定且つ均一な立体構造をとる。
【００３５】
一つのＧｒｏＥＬサブユニットは、ＡＴＰ結合部位を含む赤道ドメインと、基質タンパク質とＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットの結合部位を含む頂点ドメインと、その両ドメインをつなぐ中間ドメインとから構成されている。リングを構成するシャペロニンＧｒｏＥＬサブユニットに７つのＡＴＰ（ＡＴＰ代替化合物を含む）がそれぞれ結合すると、シャペロニンＧｒｏＥＬの構造変化が起こって補因子であるＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットがＧｒｏＥＬに結合可能となる。
次いで、ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットがＧｒｏＥＬに結合すると、基質タンパク質（被内包物）がリングの空洞内に落とし込まれ、シャペロニン複合体を形成する。シャペロニン複合体ではリングの空洞内で落とし込まれた基質タンパク質のフォールディングが進行する。
リング内のＡＴＰ（ＡＴＰ代替化合物を含む）が加水分解されると、ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットが解離し、それと同時にリング内のフォールディングされた基質タンパク質も解離する。
【００３６】
本発明に係るシャペロニン複合体は、ダブルリング構造であるＧｒｏＥＬ１４量体にＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニット（７量体）１分子が結合した「弾丸型複合体」が通常の構造体であるところ、ダブルリング構造であるＧｒｏＥＬ１４量体にＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニット（７量体）２分子が結合した「フットボール型複合体」も、本発明に係るシャペロニン複合体に含まれる。
また、フットボール型複合体がスプリットした状態であるシングルリング構造の複合体も、本発明に係るシャペロニン複合体に含まれる。また、リング界面に変異を有することによってダブルリング形成が阻害されたＳＲ変異体（ＧｒｏＥＬ変異体の一種）をサブユニットとする複合体についても、本発明に係るシャペロニン複合体に含まれる。
【００３７】
本願において「シャペロニン活性」とは、基質タンパク質の正しいフォールディングに際して、ＡＴＰ依存的（ＡＴＰ代替化合物を含む）に基質タンパク質のフォールディングを介助する活性を指す。特に、大腸菌由来のＧｒｏＥＬは、ＡＴＰとＧｒｏＥＳ依存的にタンパク質のフォールディングを介助する機構が明らかにされている。
【００３８】
本願において「アミノ酸の置換」としては、次のような例が挙げられる。一般にタンパク質の機能を維持するためには、置換後のアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。
このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、Ａｓｐ及びＧｌｕが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は好ましく許容される。
【００３９】
［ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体］
本発明に係る変異型シャペロニン複合体は、ＧｒｏＥＬサブユニットとして「ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体」を含んでなるものである。
本発明におけるシャペロニン複合体の細胞内への透過作用は、当該ＧｒｏＥＬサブユニット変異体がＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットともに、解離半減期が大幅に遅延した安定したシャペロニン複合体（ナノカプセル状の構造体）となることによって実現されるものである。シャペロニン複合体は、高分子タンパク質であり且つ親水性分子であるため、細胞への透過作用が発揮された点は驚くべき知見である。
また、本発明における細胞内での局所的な被内包物（薬物等）放出機能は、当該ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の解離半減期の遅延作用により実現されるものである。ここで、本明細書中のシャペロニン複合体の「解離」とは、複合体を構成していたＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットがＧｒｏＥＬサブユニットのリング構造から解離する反応を指す。シャペロニン複合体のリング構造内に被内包物が内包されている場合、当該解離反応の際に複合体の外部に放出される。
【００４０】
ここで、加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体とは、野生型ＧｒｏＥＬに対してＡＴＰ加水分解活性（ＡＴＰ代替化合物を含む）が低下した変異型タンパク質を指す。当該ＡＴＰ加水分解活性が低下することによりシャペロニン複合体のＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットとの解離反応時間に遅延が生じ、結果として複合体形成が長時間維持される機能が発揮される。
野生型ＧｒｏＥＬでのＡＴＰの加水分解の時間が約８秒と極めて短時間であるため、ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットと被内包物の解離反応が即座に起こってしまう。そのため、野生型のＧｒｏＥＬにて形成したシャペロニン複合体では、そのままでは薬物送達システム用のキャリア素材として採用することは不適である。
【００４１】
本発明に係る変異型シャペロニン複合体としては、好ましくはリング構造を構成するＧｒｏＥＬサブユニット７量体の全部がＡＴＰ加水分解活性低下型を示すサブユニット変異体であることが望ましい。また、リング構造を構成するＧｒｏＥＬサブユニットとして半数以上、好ましくは５／７以上、より好ましくは６／７以上、がＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体である場合、シャペロニン複合体に係る複合体形成の長時間維持が可能となり好適である。
この点、本発明に係る変異型シャペロニン複合体の製造工程において、通常の大腸菌でのタンパク質発現系を利用する場合、大腸菌自体が有する野生型ＧｒｏＥＬサブユニットが若干混在した場合であっても、得られたシャペロニン複合体に係る複合体形成を長時間維持する機能は十分に発揮されるものとなる（特許第５５４０３６７号公報、Koike-Takeshita et al., J. Biol. Chem. 2014）。
【００４２】
また、本発明に係る変異型シャペロニン複合体としては、ダブルリング構造を有するＧｒｏＥＬサブユニット１４量体の複合体であることが好適であるが、シングルリング構造のＧｒｏＥＬサブユニット７量体の複合体であっても良い。好ましくは、被内包物効率の点でＧｒｏＥＬサブユニット１４量体のフットボール型複合体が好適である。
【００４３】
本発明に係るＡＴＰ加水分解活性低下型サブユニットとしては、野生型ＧｒｏＥＬに対してＡＴＰ加水分解活性が低下したサブユニットであれば良いが、好ましくは、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）変異型サブユニットを挙げることができる。
ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）変異型サブユニットは、具体的には、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を指すものである。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含んでなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するものも当該変異型サブユニットに含まれる。
当該ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）サブユニットでは、野生型ＧｒｏＥＬのアミノ酸配列のうちの３９８番のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）に置換されたＧｒｏＥＬ変異体である。野生型ＧｒｏＥＬでのＡＴＰ加水分解を含む反応サイクル時間が約８秒であるところ、当該変異体ではシャペロニン複合体における解離半減期が３０〜６０分となる（Rye et al., Cell, Vol.97, 1999）。
【００４４】
また、本発明に係るＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列中、第３９８番目のアラニン以外の１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、シャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、好ましくはシャペロニン活性を有し且つシャペロニン複合体における解離半減期が２０分以上、好ましくは３０分以上、より好ましくは３０〜１２０分、さらに好ましくは３０〜６０分となるＧｒｏＥＬサブユニット変異体についても同様に用いることができる。大腸菌以外のバクテリア由来のＧｒｏＥＬ様サブユニット又はその変異体で、当該条件を満たすタンパク質もここに含まれる。
ここで、配列番号１のアミノ酸配列のうち第３９８番目以外のアラニン以外の変異に関する範囲としては、好適には配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して、配列相同性にて７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を示す領域を有するものであることが好適である。
また、当該第３９８番目のアラニン以外の位置におけるアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加した変異部位の数としては、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下であり、さらに好ましくは２５以下、特に好ましくは１０以下が好適である。
また、これら配列番号１の変異アミノ酸配列を含んでなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するものも当該サブユニット変異体に含まれる。
【００４５】
本発明に係るＡＴＰ加水分解活性低下型サブユニットとしては、さらに好ましくは、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異型サブユニットを用いることが好適である。
ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異型サブユニットとして具体的には、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を指すものである。また、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するものも当該変異型サブユニットに含まれる。
当該ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）サブユニットでは、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）サブユニットにおいて第５２番目のアスパラギン酸（Ｄ）がアラニン（Ａ）に置換されたＧｒｏＥＬ変異体であり、ＡＴＰの加水分解活性が著しく低下した性質を有する。
ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）サブユニットではシャペロニン複合体における解離半減期が約６日という著しく長い時間を示す。これは、ＧｒｏＥＬ（Ｄ３９８Ａ）サブユニットの約１５０〜３００倍という飛躍的に高い値である（特許第５５４０３６７号公報、Koike-Takeshita et al., J. Biol. Chem. 2014）。
ここで、ＧｒｏＥＬにおける第５２番目のアラニンへの変異置換が相乗的にＡＴＰ加水分解活性を低下させるという知見は、本発明者らが初めて見出した知見である。
【００４６】
また、本発明に係るＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体としては、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列中、第５２番目及び第３９８番目のアラニン以外の１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、シャペロニン活性を有するＧｒｏＥＬサブユニット変異体、好ましくはシャペロニン活性を有し且つシャペロニン複合体における解離半減期が２日以上、好ましくは５日以上、より好ましくは５〜７日、さらに好ましくは６日程度となるＧｒｏＥＬサブユニット変異体についても同様に用いることができる。大腸菌以外のバクテリア由来のＧｒｏＥＬ様サブユニット又はその変異体で、当該条件を満たすタンパク質もここに含まれる。
ここで、配列番号２のアミノ酸配列のうち第５２番目及び第３９８番目以外のアラニン以外の変異に関する範囲としては、好適には配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、配列相同性にて７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を示す領域を有するものであることが好適である。
また、第５２番目及び第３９８番目のアラニン以外の位置におけるアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加した変異部位の数としては、好ましくは１００以下、より好ましくは５０以下であり、さらに好ましくは２５以下、特に好ましくは１０以下が好適である。
また、これら配列番号２の変異アミノ酸配列を含んでなり、シャペロニン複合体を形成した際に解離半減期遅延型のシャペロニン活性を有するものも当該サブユニット変異体に含まれる。
【００４７】
ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を調製する手法としては、野生型ＧｒｏＥＬに変異を導入することで調製することが可能である。
変異導入方法としては、通常用いられる方法を特に制限なく用いることができる。例えば、ＰＣＲを用いる方法や、部位特異的突然変異導入キット（例えば、Stratagene社製等）等の遺伝子工学的手法を用いることができる。
なお、導入する変異としては、上記したＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体の機能が担保される限りであればシャペロニン活性やＡＴＰ加水分解活性に影響が少ない変異、ニュートラルな中立的変異、本発明のＧｒｏＥＬサブユニット変異体に別途の機能を追加する変異、等を許容して含むものであっても良い。
【００４８】
本発明に係るＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体としては、外来性の細胞膜移行選択配列を含むペプチドの付加又は挿入がないもの、及び／又は、細胞膜透過のための分子修飾を施したものを採用することを除外するものではないが、形成される複合体の全体の立体構造に影響によるシャペロニン活性が低下又は欠失しやすさを考慮するとＧｒｏＥＬサブユニットへのペプチド付加等や分子修飾を施した態様は好適ではない。
即ち、本発明に係るＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体としては、当該サブユニット変異体を含むシャペロニン複合体自体が優れた細胞膜透過能を有することから、外来性の細胞膜移行選択配列を含むペプチドの付加又は挿入がないものであって、且つ、細胞膜透過のための分子修飾を施さないものであることが好適である。当該態様は上記した複合体全体の立体構造等への影響を回避できることに加えて、余剰工程による複合体調製の煩雑化と費用増大が回避される点でも好適である。
ここで本明細書中「細胞膜移行選択配列」とは、選択的に細胞膜を透過する機能を発揮するアミノ酸配列を指すものであるが、具体的には細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ：Cell-Penetrating Peptide）が有するアミノ酸配列等を挙げることができる。詳しくは、細胞自体の生理機構であるマクロピノサイトーシスやエンドサイトーシス等を介して細胞に損傷を与えることなく非侵襲的に細胞内に取り込まれる性質を発揮するアミノ酸配列、を挙げることができる。なお、ここで「外来性」という用語はＧｒｏＥＬサブユニット以外のアミノ酸配列を指す用語として用いている。
また、本明細書中「細胞膜透過のための分子修飾」とは、細胞に損傷を与えることなく非侵襲的に細胞内に取り込まれる性質を発揮する分子修飾であれば特に制限はないが、例えばボロン酸誘導体の付加等を挙げることができる。
【００４９】
［ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニット］
本発明に係る変異型シャペロニン複合体は、頂上部分を構成するサブユニットとしてＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットを含んでなるものである。
【００５０】
ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットの本体（細胞内小器官局在化ペプチドを除いた領域）は、ＧｒｏＥＬとの結合能を有しシャペロニン複合体の頂上部分を構成するサブユニットであって、複合体が分子シャペロン活性を発揮するために補助因子として機能する領域である。ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットは、通常は７量体で１分子を構成しＧｒｏＥＬリング構造の補助因子として機能する。
本発明における「ＧｒｏＥＳ活性」とは、ＧｒｏＥＬとの結合能を有することでシャペロニン複合体の頂上部分を形成する機能を奏し、複合体が分子シャペロン活性を発揮するために補助因子として機能する活性を指すものである。
【００５１】
当該ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニット本体としては、上記機能及び活性を奏するＧｒｏＥＳ様のタンパク質であれば如何なるタンパク質を用いることができる。例えば、大腸菌由来のＧｒｏＥＳ、大腸菌以外のバクテリア由来のＧｒｏＥＳ相同タンパク質、ファージ由来のＧｒｏＥＳ様の立体構造及び類似機能を有するタンパク質、更には、これらのタンパク質由来の変異タンパク質なども好適に用いることができる。
【００５２】
本発明において、ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットの本体（細胞内小器官局在化ペプチドを除いた領域）としては、具体的には、野生型のＧｒｏＥＳサブユニットを用いることができる。ここで、野生型ＧｒｏＥＳサブユニットとは、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を指すものである。また、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含んでなり、シャペロニン複合体の形成において上記したＧｒｏＥＳ活性を有するものも当該サブユニットに含まれる。
また、配列番号８に記載のアミノ酸配列中、１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるサブユニット変異体であって、当該サブユニット変異体をシャペロニン複合体の構成サブユニットとなってシャペロニン複合体の形成において上記したＧｒｏＥＳ活性を有するものも同様に用いることができる。大腸菌以外のバクテリア由来のＧｒｏＥＳ様サブユニット又はその変異体で、当該条件を満たすタンパク質もここに含まれる。
ここで、配列番号８のアミノ酸配列の変異に関する範囲として、好適には、配列番号８に記載のアミノ酸配列に対して、配列相同性にて７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を示す領域を有するものであることが好適である。
また、配列番号８のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加した変異部位の数としては、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、さらに好ましくは５以下が好適である。
また、配列番号８に対して変異を有するアミノ酸配列を含んでなり、シャペロニン複合体の形成において上記したＧｒｏＥＳ活性を有するものも当該サブユニットに含まれる。
【００５３】
また、ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットの本体（細胞内小器官局在化ペプチドを除いた領域）としては、野生型のＴ４ファージ由来であるＧｐ３１サブユニットを用いることもできる。ここで、Ｇｐ３１サブユニットは、ＧｒｏＥＳと類似する立体構造を示すタンパク質であり、ＧｒｏＥＬとシャペロニン複合体を形成しＧｒｏＥＳ活性を発揮する分子として報告されているタンパク質である。なお、当該知見は当該技術分野における学術雑誌にて報告されている（Hunt et al., Cell 90, 2, (1997) 361-371）。
Ｇｐ３１サブユニットは、具体的には配列表の配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質を指すものである。また、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含んでなり、シャペロニン複合体の形成において上記したＧｒｏＥＳ活性を有するものも当該サブユニットに含まれる。
【００５４】
また、配列番号１１に記載のアミノ酸配列中、１若しくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるＧｐ３１サブユニット変異体であって、当該サブユニット変異体をシャペロニン複合体の構成サブユニットとなってシャペロニン複合体の形成において上記したＧｒｏＥＳ活性を有するものも同様に用いることができる。Ｔ４ファージ以外のファージ由来のＧｐ３１様サブユニット又はその変異体で、当該条件を満たすタンパク質もここに含まれる。
ここで、配列番号１１のアミノ酸配列の変異に関する範囲として、好適には、配列番号１１に記載のアミノ酸配列に対して、配列相同性にて７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を示す領域を有するものであることが好適である。
また、配列番号１１のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加した変異部位の数としては、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、さらに好ましくは５以下が好適である。
また、配列番号１１に対して変異を有するアミノ酸配列を含んでなり、シャペロニン複合体の形成において上記したＧｒｏＥＳ活性を有するものも当該サブユニットに含まれる。
【００５５】
本発明に係る変異シャペロニン複合体を構成するＧｒｏＥＳサブユニットとしては、好ましくは「細胞内小器官局在化ペプチドが付加又は挿入されたＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニット」であることが好適である。
当該態様でのＧｒｏＥＳサブユニットは、シャペロニン複合体を細胞内小器官への局在化機能を有するペプチドを付加したＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットとなる。当該特徴により、本発明に係る変異型シャペロニン複合体では、細胞内への局所的薬物送達作用が実現されるものである。
【００５６】
本発明において「細胞内小器官局在化ペプチド」とは、具体的には、シャペロニン複合体を特定細胞内小器官に移送して局在化させる機能を有するペプチドを指す。当該ペプチドとしては、具体的には、（i）シグナルペプチド、（ii）特定タンパク質との結合能を有するペプチド、などを挙げることができる。
なお、上記したＧｒｏＥＬサブユニット変異体にペプチドを付加又は挿入した場合、形成される複合体の全体の立体構造に影響を与えやすくシャペロニン活性が低下又は欠失しやすくなるため好適でない。
【００５７】
（i）本発明に係る細胞内小器官局在化ペプチドとしては、シグナルペプチドを用いることが好適である。ここで、シグナルペプチドとは、数アミノ酸〜数十アミノ酸残基（３〜６０アミノ酸残基程度）からなる特定のアミノ酸配列からなるペプチドであって、局在シグナルや移行シグナル等と呼ばれるペプチドである。
本発明においては、シグナルペプチドが有するシグナル配列によって細胞内におけるタンパク質の局在化及び輸送を指示する機能が発揮されるものであれば、公知の如何なるシグナルペプチドを用いることが可能である。
【００５８】
本発明では、任意の細胞内小器官への移行を可能とするシグナルペプチドを採用することが可能である。例えば、核移行、ミトコンドリアマトリクス移行、小胞体移行、ペルオキシソーム移行、色素体移行などを可能とするシグナル配列を含むペプチドを用いることが可能である。
特に、核移行シグナル配列は、核局在シグナル配列（ＮＬＳ）、核小体移行配列（ＮＯＳ）等があり、これらを採用した場合、シャペロニン複合体を細胞核付近又は核内に移行して効率的に局在させることが可能となる。即ち、核移行を可能とするシグナル配列を含む核移行シグナルペプチドを採用する態様では、本発明に係るシャペロニン複合体を細胞核付近又は核内へ局在化及び輸送することが可能となる。ここで核移行シグナル配列としては、核付近又は核内へ局在化及び輸送が達成されるものであれば特に制限はないが、例えばＡｈＲ（Aryl Hydrocarbon Receptor）などのシグナル配列等を挙げることができる。
【００５９】
（ii）また、本発明に係る細胞内小器官局在化ペプチドとしては、特定の細胞内小器官に局在するタンパク質と特異的結合能を有するペプチドを用いることができる。
このようなペプチドとしては、例えば、リガンド分子として機能して所望の細胞内小器官に局在するレセプターと結合するペプチドを用いることができる。
また、所望の細胞内小器官に局在するタンパク質に対して、分子特異的に相互作用及び結合する機能を有し二量体形成又は多量体形成に関与するペプチドを用いることも可能である。
【００６０】
上記（i）及び（ii）に記載の細胞内小器官局在化ペプチドは、ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットの本体に対して所望のペプチド配列を１つ含むものであれば良いが、２以上のペプチドを採用することもできる。
【００６１】
本発明に係るシャペロニン複合体においては、細胞内小器官局在化ペプチドを「付加」する位置としては、ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットのＮ端側及び／又はＣ端側に付加することが可能である。好ましくはＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットのＮ端側に付加することが好適である。また、付加の際には、立体構造や機能等に悪影響を与えない限り、リンカー領域となるペプチドを介在させることも可能である。
また、Ｎ端とＣ端以外にも、ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットの立体構造や機能等に悪影響を与えない場合、当該サブユニットタンパク質内にペプチド配列を「挿入」する形態とすることも可能である。
【００６２】
なお、細胞内小器官局在化ペプチドの付加は、ＧｒｏＥＬ（リング構造を形成するサブユニット）のＮ端及びＣ端に付加することは不適である。ＧｒｏＥＬのＮ端及びＣ端はリング構造の内部に突出しているため、上記ペプチドを付加したとしてもその作用効果は原理的に期待できない。
【００６３】
ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットへの細胞内小器官局在化ペプチドの付加又は挿入は、通常の融合タンパク質合成手法により行うことが可能である。
例えば、遺伝子工学的手法により、ＧｒｏＥＳ−細胞内小器官局在化ペプチドの融合タンパク質発現用のコンストラクトを構築し、発現ベクターによって大腸菌等により融合タンパク質を合成することができる。また、化学的手法により、重合させて合成タンパク質として調製することも可能である。
【００６４】
本発明に係る変異型シャペロニン複合体としては、ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニット７量体のうちの１つが細胞内小器官局在化ペプチド付加型又は挿入型のサブユニットであれば、被内包物の細胞内局所送達を実現することが好適となる。
本発明に係る変異型シャペロニン複合体としては、ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットとして細胞内小器官局在化ペプチド付加型又は挿入型のサブユニットを複数（２以上）含むものであっても良いが、当該サブユニットを１つしか含まないものであってもシャペロニン複合体の被内包物の細胞内局所送達効果は十分に発揮されるものとなる。
また、本発明に係る変異型シャペロニン複合体の製造工程において、通常の大腸菌でのタンパク質発現系を利用する場合、大腸菌自体が有する野生型ＧｒｏＥＳサブユニットが混在した場合であっても、得られたシャペロニン複合体の被内包物の細胞内局所送達効果は十分に発揮されるものとなる。
なお、本発明において、好ましくはＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニット７量体の半数以上、より好ましくは５／７以上、さらに好ましくは６／７以上、特に好ましくは全部が、細胞内小器官局在化ペプチド付加型又は挿入型のサブユニットであることがより好適である。
【００６５】
［ＡＴＰ等］
本発明に係るシャペロニン複合体としては、ＡＴＰ又はＡＴＰ代替化合物を含んでなる複合体であることが好適である。
本発明に係るシャペロニン複合体においては、特にＡＴＰを用いることが好適であるが、ＡＴＰ代替化合物を用いることも可能である。ここで、ＡＴＰ代替化合物としては、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体のＡＴＰ結合部位に結合可能で、シャペロニンＧｒｏＥＬ変異体の構造変化を引き起こすことが可能な化合物であれば特に制限はない。
ＡＴＰ代替化合物としては、例えば、ＡＤＰ、ＡＤＰとフッ化ベリリウムの付加物、ＡＤＰとフッ化アルミニウムの付加物、ＡＤＰとフッ化ガリウムの付加物等を挙げることができる（J. Biol. Chem., 279, 45737-45743 (2004)、J. Mol. Biol., 2003 May 23; 329(1): 121-34.）。また、ＡＴＰ代替化合物としては、ＧｒｏＥＬのＡＴＰ加水分解部位で加水分解されない化合物（例えば、ＡＤＰとフッ化ベリリウムの付加物等）を用いることで、さらに長時間にわたって被内包物が内包されたシャペロニン複合体を維持することができる。
【００６６】
［その他の構成素材等］
本発明に係るシャペロニン複合体としては、その他にシャペロニン複合体が薬物送達システムキャリアとしての機能を向上させる様々な構成素材を含んでなる形態を採用することができる。
例えば、金属イオン（好ましくはマグネシウムイオン）や、金属ナノ粒子（ＦｅＰｔ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＳｉО２、Ａｕ等）をさらに含むことにより、より効率的に被内包物をシャペロニン変異体内に内包させることができる（特開２０１３−１９９４５７号公報）。
【００６７】
また、本発明に係るシャペロニン複合体としては、臓器や特定細胞への指向性を担保するため、ＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体やＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットの表面に抗体等の修飾を行うことが可能である。
また、本発明に係るＡＴＰ加水分解活性低下型ＧｒｏＥＬサブユニット変異体やＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットとしては、上記したシャペロニン活性やＡＴＰ加水分解に関する遅延活性が機能担保される限り、糖鎖や蛍光物質が付加されたものや、リン酸化やメチル化等の官能基置換等の分子修飾がされたものも含まれる。
【００６８】
［変異型シャペロニン複合体の調製］
本発明の変異型シャペロニン複合体は、ＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＧｒｏＥＬサブユニットの集合から、通常の条件下、例えばＡＴＰ依存的（Nature, 1990 Nov 22; 348(6299): 339-42）に形成させて調製（製造、生産等）することができる。
具体的には、緩衝液中にてＧｒｏＥＬサブユニット変異体を含むＧｒｏＥＬサブユニットと被内包物（薬理成分等）を混合し、次いで、ＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニット及びＡＴＰ（ＡＴＰ代替化合物を含む）と接触するように混合する工程を挙げることができる。また、所望に応じて、金属イオン、金属ナノ粒子等を混合させて内包させることも可能である（特開２０１３−１９９４５７号公報）。
本発明においては、シャペロニン変異体のＡＴＰ加水分解活性が低下しているため、被内包物（薬理成分等）を内包したシャペロニン複合体の状態を長時間維持することが可能となる。
【００６９】
２．薬物送達システム用ナノカプセル
本発明に係る変異型シャペロニン複合体は、薬物等の被内包物を保持可能なタンパク質性のナノカプセルとして利用することが可能である。即ち、細胞内への局所送達のための薬物送達システム用ナノカプセルとして利用することが可能となる。当該ナノカプセルは、本発明に係る変異型シャペロニン複合体を薬物送達のためのキャリア素材として含んでなるものである。
【００７０】
本発明に係る変異型シャペロニン複合体は、そのリング構造内に薬理成分を内包可能なキャリア素材とすることが可能である。即ち、本発明に係る変異型シャペロニン複合体は、薬理成分内包用キャリア素材として含んでなる薬物送達システム用ナノカプセルとすることが可能である。
本発明に係るナノカプセルは、上記した変異型シャペロニン複合体の性質によって細胞内への局所的薬物送達システム用ナノカプセルとして利用することが可能である。特にＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットに細胞内小器官局在化ペプチドが付加又は挿入された態様では、細胞内小器官への局所的薬物送達システム用ナノカプセルとして好適に利用することが可能となる。更にＧｒｏＥＳ活性を有するサブユニットに核移行シグナルペプチドが付加又は挿入された態様では、細胞核への局所的薬物送達システム用ナノカプセルとして好適に利用することが可能となる。
【００７１】
本発明に係る変異型シャペロニン複合体は、そのカプセル状構造の空洞内に薬理成分を内包してなる複合体として形成させて製造することが可能である。即ち、本発明に係る変異型シャペロニン複合体は、そのリング構造内に薬理成分を内包してなるナノカプセルの形態とすることが可能である。当該形態においては薬理成分を内包したタンパク質性のナノカプセルとなるため医薬剤として好適に利用することが可能となる。
【００７２】
本発明における被内包物（薬理成分等）は、シャペロニン変異体に内包可能なものであれば、原理的には既知の薬理成分となる如何なる化合物を対象とすることができる。特に、癌、脳神経、遺伝子疾患の薬理成分を内包させることで、有効な薬物送達システム用キャリアナノカプセルとして好適に利用することができる。
【００７３】
具体的な薬理成分としては、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖類、これらの誘導体や修飾体などを内包させることができる。核酸としては特に制限はないが、例えばプラスミド、発現ベクター、核酸オリゴ、ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）、ｍｉＲＮＡ（micro RNA）、ゲノム編集用のガイドＲＮＡ、核酸アプタマー等を内包させることができる。また、タンパク質やペプチドとしては特に制限はないが、例えば抗体を内包させることも可能である。
また、薬理成分の態様としては、上記薬理成分を含むものを同様に内包することができる。詳しくは薬理成分を含む混合物や組成物、薬理成分と金属ナノ粒子等の担体との吸着体や結合体等を採用することも可能である。
また、有機合成した医薬化合物、ナノクリスタル（ナノ結晶化した化合物）、デンドリマーナノ粒子、などを内包させることも可能である。
なお、核酸等の低分子を内包させる場合、カチオン性の担体を用いることが好適である。カチオン性担体としては、例えば、正電荷に帯電した高分子ポリマーであるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、キトサン、ポリＬ−リシン（ＰＬＬ、poly-L-lysine）などを挙げることができる。また、カチオン性担体としては、金属ナノ粒子の表面をカチオン性分子で表面修飾したものを用いることも可能である。
また本発明における被内包物は、シャペロニン変異体に内包されることから、例えば、タンパク質の場合、１２０ｋＤａ以下、好ましくは９０ｋＤａ以下、さらに好ましくは６０ｋＤａ以下の大きさであることが望ましい。
【００７４】
本発明に係る薬物送達システム用ナノカプセルは核酸を内包させた態様においては核酸治療又は遺伝子治療の分野において好適に利用されることが期待される。本発明に係る薬物送達システム用ナノカプセルは細胞質中に局在する細胞内小器官への薬物送達に利用することも可能であるが、特に細胞核への局所的薬物送達システム用ナノカプセルとして利用することが期待される。
【００７５】
本発明に係る薬物送達システム用ナノカプセルは、変異型シャペロニン複合体に含まれるＡＴＰ（又はＡＴＰ代替化合物）の加水分解に伴って、徐々に（例えば、半減期である数十分〜数日で）被内包物を放出させることができる。このようなシャペロニン複合体の徐放性は、細胞内への局所的薬物送達キャリアとして極めて好適な性質である。
【００７６】
また、本発明に係る薬物送達システム用ナノカプセルにおいては、任意のタイミングで被内包物を放出させることもできる。具体的にはシャペロニン複合体を構成する金属イオン（好ましくは、マグネシウムイオン）の濃度を、通常用いられる方法（例えば、金属キレート化合物を用いる方法）で低下させることでシャペロニン複合体から被内包物を放出させることができる。
【００７７】
本発明に係る薬物送達システム用ナノカプセルは、原理的には変異型シャペロニン複合体が細胞膜を透過可能な細胞であれば如何なる細胞に対して用いることも可能である。広くは、細胞小器官を有する真核生物の細胞であれば対象細胞とすることができるが、好ましくは細胞壁等を有さない動物細胞、より好ましくは脊椎動物の細胞に対して好適に用いることが可能である。特には、本発明では、哺乳類細胞に対して好適に用いることが可能である。
また、本発明に係る薬物送達システム用ナノカプセルは、血管投与、皮下投与、腸管投与、経口投与、経皮投与等のｉｎ  ｖｉｖｏでの投与態様だけでなく、培養細胞等へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの投与態様への利用も可能である。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの投与形態の場合、細胞核に確実に内包物を到達させることが可能であることから、多能性幹細胞等に適用することで再生医療等に利用することも可能である。また、人工的に作製した多能性細胞である体細胞由来ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞に対しても好適に適用対象とすることが可能である。また、ｉＰＳ細胞調製時においても、山中因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）等を導入する際に好適に利用することが可能である。
また、細胞核に確実に内包物を到達可能な利点は、研究目的の遺伝子導入用キャリアとしても有益に利用可能である。例えば、ゲノム編集技術やＲＮＡｉ用のキャリアとしても好適に利用可能である。
【００７８】
本発明においては、上記した本発明に係る薬物送達システム用ナノカプセルを用いることによって、細胞内へ局所的に薬理成分を送達する方法（細胞内への局所的な薬物送達方法）の実現が可能となる。詳しくは、上記したｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下の細胞に対して本発明に係る薬物送達システム用ナノカプセルを投与する工程を行うことによって、被内包物である薬理成分を細胞内へ局所的に送達する方法の実現が可能となる。
更に本発明においては、上記した本発明に係る薬物送達システム用ナノカプセルの態様に応じて、細胞質中に局在する細胞内小器官へ局所的に薬理成分を送達する方法の効率的な実現が可能となる。また上記した本発明に係る薬物送達システム用ナノカプセルの態様に応じて、細胞核へ局所的に薬理成分を送達する方法の効率的な実現が可能となる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。【００８０】
［実施例１］『ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳを含むシャペロニン複合体の調製』
核移行シグナルペプチドをＮ端に付与したＧｒｏＥＳ変異サブユニットを含むシャペロニン複合体を調製した。【００８１】
（１）マウスＡｈＲシグナル配列オリゴマーの増幅
ＧｒｏＥＳのＮ末端に融合するマウスAryl Hydrocarbon Receptor（ＡｈＲ）シグナル配列であるアミノ酸残基１２番目から３８番目まで（配列番号７に記載のアミノ酸配列）をコードする塩基配列に対して、５’側に制限酵素ＮｃｏＩサイト及び３’側にＮｄｅＩサイトを付加した９６塩基対のオリゴマーの表鎖（配列番号３）及び裏鎖（配列番号４）を合成した。
また、当該制限酵素サイトを付加したマウスＡｈＲシグナル配列オリゴマーを増幅するため、配列番号５及び６に記載の塩基配列からなるＰＣＲプライマーを合成した。【００８２】
上記マウスＡｈＲシグナル配列オリゴマーの表鎖（配列番号３）及び裏鎖（配列番号４）を等量混合し、増幅用プライマー（配列番号５及び６）、合成酵素、ｄＮＴＰｓと共にGeneAmp(R) PCR System 9700（Applied Bioscience）で９５℃にて５分間予備加熱後、９５℃３０秒→５５℃３０秒→７２℃３０秒を２５サイクル行い、７２℃７分反応した。
ｐＴ７Ｂｌｕｅベクター（Takara）に増幅済みオリゴマーを挿入して、ＴＡクローニングを行い、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換してＬＢ／Ａｍｐ／ＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌプレートで培養し、ブルーホワイトセレクションにより２４クローンを採取した。
このうち１２クローンをＬＢ／Ａｍｐ培地で培養して集菌後、QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN）でプラスミド抽出し、制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｄｅＩ（Takara）で一夜処理後、７０℃１０分加熱処理して酵素を失活させた。
４％アガロースゲルで電気泳動を行い、予想された９０塩基長及び１６０塩基長の切断分子量を確認した。【００８３】
（２）ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ発現ベクターの構築
上記調製したＮｄｅＩ及びＮｃｏＩ制限酵素処理済みのマウスＡｈＲシグナル配列オリゴマーをアガロースゲルにて電気泳動し、目的分子量のＤＮＡ断片をゲルごと切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega, Cat. # A9282）で抽出した。また、ＮｄｅＩ及びＮｃｏＩ制限酵素処理済みのＧｒｏＥＳ  Ｎ−ｅｎｄ  Ｈｉｓ−Ｔａｇ／ｐＥＴ２１（ｂ）＋ｖｅｃｔｏｒについても同様にして、アガロースゲルにて電気泳動し、目的分子量のＤＮＡ断片をゲルごと切り出して抽出した。なお、本明細書中の「ｐＥＴ２１（ｂ）＋」は「ｐＥＴ−２１ｂ（＋）」と同一ベクターを指す名称として記載したものである。
得られたマウスＡｈＲシグナル配列オリゴマーをＧｒｏＥＳ／ｐＥＴ２１（ｂ）＋ｖｅｃｔｏｒに挿入し、コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、培養集菌後にプラスミドを抽出した。抽出プラスミドをＮｄｅＩ及びＮｃｏＩ制限酵素処理し、アガロース電気泳動により、１００塩基対付近に目的断片を確認した。【００８４】
T7 Universal Primer、T7 P(24) Primer、T7F Bgl II I UpFs1 Primer、T7 Reverse Primerを用い、抽出プラスミドを各プライマー、BigDye(R)（Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ABI）、Sequencing Buffer（ABI）と共に９６℃１分予備加熱後、９６℃１０秒→５０℃５秒→６０℃４分を２５サイクル行って増幅した。Performa Gel Filtration Cartridges（Edge Bio）で精製した。
反応溶液を真空乾燥後、HiDiホルムアミドで溶解し、Genetic Analyzer 3130 (ABI)で塩基配列を解析した。T7 Universal Primer、T7P (24) Primer により５’側からの配列を解読し、目的とするマウスＡｈＲシグナル配列オリゴマーがＧｒｏＥＳ／ｐＥＴ２１（ｂ）＋ｖｅｃｔｏｒに挿入されていることを確認した（図３、配列番号１０）。【００８５】
調製したコンストラクト構造（以下、ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ／ｐＥＴ２１（ｂ）＋ｖｅｃｔｏｒ又はＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ発現ベクターという場合がある。）におけるシグナル配列及びＧｒｏＥＳコード領域と対応アミノ酸を図３（配列番号９及び１０）に示す。【００８６】
（３）ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ融合タンパク質の発現と精製
上記発現ベクターを用いてＧｒｏＥＳ−ＮＡＳを発現させ、融合タンパク質の調製を行った。【００８７】
ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ／ｐＥＴ２１（ｂ）＋ｖｅｃｔｏｒで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）をＬＢ培地で培養し、ＯＤ＝０．８でＩＰＴＧ誘導を行い、集菌後に超音波破砕した。破砕液の遠心上清を試料に供して、ＣＢＢ染色と抗ＧｒｏＥＳ抗体によるウェスタンブロットにより、融合タンパク質の発現を確認した（図４）。
次いで、大量培養にてＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ発現ベクター／ＢＬ２１（ＤＥ３）を集菌した後、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中で超遠音波破砕し、４０，０００ｒｐｍで３０分遠心した上清が２０％飽和硫安溶液となるように硫酸アンモニウムを加えた。再度超遠心した上清を、Ｂｕｔｙｌ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｍ６５０（TOSOH）に適用し、２０→０％硫安勾配により分画した。
得られたＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ溶出画分をＭＷＣＯ ６０００−８０００の透析膜に入れ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む２５ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）で透析した。透析試料の遠心上清をＳＰ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｍ６５０（TOSOH）に適用し、０→１Ｍ ＮａＣｌ勾配によりＧｒｏＥＳ−ＮＡＳを溶出した。溶出画分をＵｌｔｒａｃｅｌ（Ｒ）−１５（ＭＷＣＯ  １０Ｋ）（Merck Millipore）を用いた限外濾過により濃縮した。【００８８】
（４）ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体の調製
ＡＴＰ加水分解活性低下型変異体であるＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体は、特許第５５４０３６７号明細書の実施例に記載の方法に従って調製した。ここで、調製した（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。【００８９】
（５）シャペロニン複合体の調製
上記調製したＧｒｏＥＳ−ＮＡＳタンパク質を用い、１００ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）（ＨＫＭ Ｂｕｆｆｅｒ）の緩衝溶液中で１μＭ ＧｒｏＥＬ／２μＭ ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ／１ｍＭ ＡＴＰの比率でのシャペロニン複合体の調製を行った。ここでＧｒｏＥＬとしては、上記調製したＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体を用いた。
また、野生型であるＧｒｏＥＳ−ＷＴタンパク質についても、上記と同様にしてシャペロニン複合体を調製した。【００９０】
ＧｒｏＥＳ−ＷＴ（野生型）を用いて調製したシャペロニン複合体を試料１−１、ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ（シグナルペプチド付加型）を用いて調製したシャペロニン複合体を試料１−２とした。得られた各調製試料（試料１−１、試料１−２）を、６％ Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ、透過型電子顕微鏡を用いて観察しシャペロニン複合体の合成を確認した。【００９１】
（６）ＴＥＭによる分子構造観察
調製した変異型シャペロニン複合体について、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて分子構造を観察した。【００９２】
０．２５μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体、０．５μＭ ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ、及び１ｍＭ ＡＴＰとなるようにＨＫＭ Ｂｕｆｆｅｒ中で混合し、１時間以上氷冷した。
次いで、イオンコーターで親水化処理したコロジオン支持膜４００ｍｅｓｈ銅グリッド（Ｕ１００６−４００／ＥＭ Ｊａｐａｎ）を準備した。
当該グリッドに、０．１μＭシャペロニン複合体となるように超純水で希釈した試料液３μｌを３０秒保持して濾紙で吸い取った。そして、超純水６μｌを載せて直ちに吸い取り、１％リンダングステン酸（ｐＨ４．０）６μｌを３０秒のせてネガティブ染色した。当該処理後のグリッドを、デシケーターで１２時間以上乾燥させた。
透過型電子顕微鏡ＪＥＭ１４００Ｐｌｕｓ（日本電子）にて加速電圧８０ｋＶで試料を観察し、明視野をＣＣＤカメラで撮影した。結果を図５に示した。【００９３】
その結果、ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳを含む変異型シャペロニン複合体について、ダブルリング構造を有するシャペロニン複合体が形成されていることが確認した。
詳しくは、図５（Ａ）に示すように、ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ７量体１分子及びダブルリング構造（ＧｒｏＥＬ１４量体）を有する「弾丸型」の分子構造を有するシャペロニン複合体が形成されていることを確認した。また、図５（Ｂ）に示すように、ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ７量体２分子及びダブルリング構造（ＧｒｏＥＬ１４量体）を有する「フットボール型」の分子構造を有するシャペロニン複合体が形成されていることを確認した。
【００９４】
［実施例２］『哺乳類細胞へのシャペロニン複合体導入』
被内包物を包含させたシャペロニン複合体を用いた哺乳類細胞への導入試験を行うことで、実施例１にて調製したシャペロニン複合体が有する細胞膜透過性及び細胞内局所送達作用を検証した。【００９５】
（１）ＧＦＰ内包シャペロニン複合体の調製
シャペロニン複合体の各構成タンパク質を蛍光標識し、被内包物としてＧＦＰを取り込ませたシャペロニン複合体をＣＨＬ細胞へ添加した後、蛍光共焦点顕微鏡を用いて経時観察を行った。【００９６】
ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ及びＧｒｏＥＳ−ＷＴをＣｙ３（GE Healthcare）で蛍光標識し、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）をＣｙ５（GE Healthcare）で蛍光標識した後、ＮＡＰ５ゲル濾過カラム（GE Healthcare）を用いて標識タンパク質を分取した。
次いで、６０℃１５分加熱変性させたＧＦＰタンパク質をＧｒｏＥＬに取り込ませ、２μＭ ＧｒｏＥＬ／４μＭ ＧｒｏＥＳ／４μＭ ＧＦＰ／１ｍＭ ＡＴＰの比率でのシャペロニン複合体の調製を行った。ここでＧｒｏＥＬとしては、ＡＴＰ加水分解活性低下型変異体であるＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体（配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質）を用いた。【００９７】
ＧｒｏＥＳ−ＷＴ（野生型）を用いて調製したシャペロニン複合体を試料２−１、ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ（シグナルペプチド付加型）を用いて調製したシャペロニン複合体を試料２−２とした。【００９８】
（２）チャイニーズハムスター（ＣＨＬ）細胞へのシャペロニン複合体導入
上記シャペロニン複合体（試料２−１、試料２−２）を調製した後、１０×ＨＫＭ  Ｂｕｆ．を１／１０容積加え、０．２２μｍメンブレンフィルターで濾過滅菌した。
ＣＨＬ細胞をφ６ｃｍディッシュにＭＥＭ培地と共に播種し、細胞が３０％コンフルエントのときに、シャペロニン複合体をＧｒｏＥＬ換算で終濃度０．０５μＭとなるように添加した。そして、３７℃５％ＣＯ２条件にて培養した。
ＧｒｏＥＳ−ＷＴ（野生型）を含むシャペロニン複合体を添加して培養した試験（試料２−１）、ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ（シグナルペプチド付加型）を含むシャペロニン複合体を添加して培養した試験（試料２−２）、それぞれの培養状態について蛍光共焦点顕微鏡ＦＬ１０００（OLYMPUS）を用いて、三重励起にて細胞の経時変化を観察した。経時観察の結果を示す蛍光顕微鏡写真像図を図６に示した。【００９９】
その結果、図に示すように、ＧｒｏＥＳ−ＷＴ（野生型）を含むシャペロニン複合体を添加して培養した試験（試料２−１）では、ＧＦＰ（緑色）、ＧｒｏＥＬ（白色）、及びＧｒｏＥＳ（赤色）を示す各蛍光シグナルが細胞質内で観察された。
ここで、ＧＦＰ等タンパク質は細胞膜透過性を示さない。また、ＧｒｏＥＬサブユニットにて構成される複合体構造はそのままでは細胞膜透過性を有さないことが報告されている（Biswas et al. 2013）。従って、シャペロニン複合体を構成する各タンパク質が細胞質内にて観察されたという結果は、Biswas et al. 2013（非特許文献３）の記載から想定される技術常識とは反対の知見である。
当該結果は、ＡＴＰ加水分解活性低下型のＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）サブユニット変異体の作用によって複合体形成が長時間維持され、これによって細胞膜透過が発揮される構造が長時間維持されて達成されたものと認められた。なお、当該結果はシャペロニン複合体の構造自体に細胞膜透過活性があることを初めて示す知見である。なお、野生型ＧｒｏＥＬサブユニットの複合体を形成させた場合、複合体の解離半減期が数秒という極めて短時間であるため、複合体構造を細胞内局所送達に必要な時間維持できず内包物の細胞内送達を行うことができないと認められる。
ここで、ＧｒｏＥＳ−ＷＴ（野生型）を含むシャペロニン複合体を添加して培養した試験（試料２−１）では、各蛍光シグナルの観察は細胞質内のみであり、７２時間の培養後でも核内へ到達したことを示す蛍光シグナルは得られなかった。また、培地や細胞質の影響で複合体自体が不安定なためか被内包物であるＧＦＰがやや早い時間で放出されてしまう傾向が見られた。【０１００】
また、ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ（シグナルペプチド付加型）を含むシャペロニン複合体を添加して培養した試験（試料２−２）では、ＧＦＰ（緑色）、ＧｒｏＥＬ（白色）、及びＧｒｏＥＳ（赤色）を示す各蛍光シグナルが細胞質内で観察された。さらに、薄黄色のシグナル（Ｃｙ３、ＧＦＰ、及びＣｙ５の蛍光が、同じ地点で三重に重複したシグナル）が核内において検出された。特に４８時間以降では、核内での薄黄色シグナルが多数観察された。
詳細な観察結果から、１２〜２４時間で細胞質に到達し、３６〜４８時間で核内に到達していると認められた。【０１０１】
【表１】
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【０１０２】
（３）スタック断面像
試料２−２における上記導入試験での４８時間経過時の蛍光顕微鏡観察において、０．１μｍスライス間隔にて１００枚の断面を撮影し、三次元スタック断面像を作成した。
図７に係る立体画像が示すように、薄黄色のシグナルが核内において多数検出されていることから、核内においてシャペロニン複合体が被内包物であるＧＦＰを保持していることが三次元立体画像中においても確認された。【０１０３】
（４）結論
以上の解析結果から、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）の変異型シャペロニン複合体に被内包物を内包させることによって、細胞膜を透過して細胞質に非内包物を送達可能であることが確認された。そして、核移行シグナルペプチド付加型ＧｒｏＥＳを含むＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）の変異型シャペロニン複合体を用いることによって、細胞核の核内に被内包物を分解させることなく送達可能なことが実証された。
【０１０４】
［実施例３］『核酸内包変異型シャペロニン複合体を用いた細胞核への局所送達』
核酸を包含させた変異型シャペロニン複合体を用いて哺乳類細胞への導入試験を行うことによって細胞核への核酸送達が可能かを検証した。【０１０５】
（１）蛍光標識ＤＮＡの作製
０．１３μｇ／μＬ 鋳型遺伝子ｐＵＣ１９ベクター（１μＬ）、１００μＭ Ｍ１３Ｍ４プライマー（０．５μＬ）、AmpliTaq Gold 360 Master Mix（２５μＬ）、ChromaTide(R) Alexa Fluor(R) 488-5-dUTP（Molecular Probes, Cat.#C-11397）（３．３μＬ）、滅菌水（２０．２μＬ）の組成となるように反応液５０μＬを滅菌マイクロチューブ内に調製した。ここで、ChromaTide(R) Alexa Fluor(R) 488-5-dUTP（Molecular Probe, Cat.#C-11397）は励起光に対して緑色蛍光を発する蛍光標識ｄＵＴＰである。また各ｄＮＴＰは本反応系に適した濃度となる量が予めAmpliTaq Gold 360 Master Mixに含まれている。
上記調製した混合液について、2720 Thermal Cycler（Applied Biosystems）を用いて９５℃で１分間予備加熱した後、９５℃３０秒→５２℃３０秒→７２℃３０分の工程を４０サイクル行い、７２℃で７分間保持した。反応終了後、得られた反応液を４℃に保存した。
また、電気泳動用の比較試料として蛍光標識ｄＵＴＰを添加しないことを除いては上記と同様にして増幅反応を行った。【０１０６】
反応溶液に、終濃度０．２％となるようにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液を混合し、2720 Thermal Cycler（Applied Biosystems）を用いて９８℃５分→２５℃１０分の加熱によるＳＤＳ処理を行った。
５００μＬの滅菌水で膨潤させたマイクロチューブ型樹脂カラム（Performa DTR Gel Filtration Cartridges, Edge Bio, Cat.#4050167）を８００×ｇで３分間遠心し、当該樹脂カラムを滅菌マイクロチューブの内側にセットした。ここにＳＤＳ処理した反応液５０μＬをカラム内の樹脂にアプライ充填し、８００×ｇで３分間遠心して未反応物を除去した。カラムからの精製溶出液を卓上バキュームローター（MicroVac MV-100, トミー精工）を用いて加熱乾燥させ、滅菌水５０μＬで再度溶解し−２５℃にて遮光保存した。
得られた増幅ＤＮＡを４．０％ＰＡＧＥに供し、レーン１には鋳型であるｐＵＣ１９を、レーン２には蛍光標識せずに増幅合成したＤＮＡを、レーン３には蛍光標識して増幅合成した蛍光標識ＤＮＡをアプライして電気泳動した。電気泳動後、励起光460nm/蛍光515nm filter（515nm以上の波長を透過させるフィルター）を用いて緑色蛍光の検出を行った。その後ＥｔＢｒ染色を行って増幅ＤＮＡの確認を行った。撮影したゲル写真像の結果を図８に示す。
その結果、上記サイクル反応によってｐＵＣ１９を鋳型として蛍光標識されたＤＮＡ断片が増幅合成され、精製回収されていることが確認された（図８：レーン３）。ここで、蛍光標識ＤＮＡは１本鎖ＤＮＡであるが、鋳型との会合又は立体構造形成によってＥｔＢｒインターカレートによる染色像が確認された。
そして、図８のレーン３’の蛍光シグナルが示すように、当該蛍光標識ＤＮＡは励起光に対して緑色蛍光を発するＤＮＡ断片であることが確認された（図８：レーン３’）。一方、蛍光標識せずに増幅合成したＤＮＡでは緑色蛍光は検出されなかった（図８：レーン２’）。【０１０７】
（２）金ナノ粒子への蛍光標識ＤＮＡの吸着
平均粒径２ｎｍの金ナノ粒子懸濁液（Spherical Gold Nanoparticles, Nanopartz Cat.# A-11-2.2）５００μＬを滅菌マイクロチューブに分取し、上記（１）で調製した蛍光標識ＤＮＡ溶液１０μＬを加えて、恒温振とう器（Eppendorf ThermoMixer (R) C）を用いて２５℃５００ｒｐｍで一夜混合した。
得られた懸濁液に終濃度０．３Ｍ酢酸ナトリウム及び９０％エタノールとなるように各試薬を加え、転倒混和後、卓上遠心機にて１４，５００ｒｐｍで５分間遠心した。上清除去後、沈殿物を滅菌水５０μＬで再懸濁して蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子の懸濁液を得た。【０１０８】
（３）蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子を内包したシャペロニン複合体の調製
ＨＫＭ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２）の緩衝液中に、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体を加え、上記（２）で調製した蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子懸濁液を添加し、１分間ピペッティングにより混和した。
当該混合液にＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ（ＡｈＲ付加型）及びＡＴＰを加えて、終濃度０．５μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）／１．０μＭ ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ／蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子（金ナノ粒子換算にて０．０２ｍｇ／ｍＬ）／１ｍＭ ＡＴＰの比率での変異型シャペロニン複合体を調製した。当該シャペロニン複合体を試料３−１とした。
また、上記混合液にＧｒｏＥＳ−ＷＴ（野生型）及びＡＴＰを加えて、終濃度０．５μＭ ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）／１．０μＭ ＧｒｏＥＳ−ＷＴ／蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子（金ナノ粒子換算にて０．０２ｍｇ／ｍＬ）／１ｍＭ ＡＴＰの比率での変異型シャペロニン複合体を調製した。当該シャペロニン複合体を試料３−２とした。
なお、本実施例で用いたＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）変異体、ＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ、及びＧｒｏＥＳ−ＷＴの各タンパク質は、実施例１に記載の方法と同様にして調製したものを用いた。【０１０９】
得られた蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子を内包したシャペロニン複合体を含む溶液は、遠心式フィルターユニット（Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters 100KDa, Merck Cat.#UFC5100BK）及びＨＫＭ  Ｂｕｆｆｅｒを用いた限外濾過により余剰物を除去した。当該遠心式フィルターによる限外濾過は卓上遠心機での４，０００ｒｐｍの遠心により行い、濾過膜から逆遠心操作により精製濃縮液を回収した。得られた溶液は４℃にて遮光保存した。【０１１０】
（４）ＣＨＬ細胞への投与試験
ノンコートの３５ｍｍガラスボトムディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に１０５個のＣＨＬ細胞（チャイニーズハムスター肺由来線維芽細胞）を播種し、３７℃及びＣＯ２濃度５％に設定したＣＯ２インキュベーター内にて一日培養することによって、５０％コンフルエントの状態に培養した。ここに、上記（３）にて調製した蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子を内包した変異型シャペロニン複合体を、ＧｒｏＥＬ濃度換算にて終濃度０．０１μＭとなるように添加した（試料３−１、試料３−２）。
一方、比較試験としては、上記（２）にて調製した蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子の懸濁液（試料３−３）を金ナノ粒子換算にて終濃度０．０００４ｍｇ／ｍＬとなるように添加して同様にして培養を行った。当該比較試験における蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子の濃度は本実施試験（試料３−１、試料３−２）と同濃度に調整した濃度である。【０１１１】
試料投与後、ガラスボトムディッシュを３７℃及びＣＯ２濃度５％に設定したＣＯ２インキュベーター内にて３時間の静置培養を行った後、培地交換により投与試料を除去した。その後３７℃及びＣＯ２濃度５％条件下のインキュベーター顕微鏡（LCV110-DSU, Olympus）内に当該ガラスボトムディッシュを配置して２時間静置培養した。ここでインキュベーター顕微鏡としては、ＧＦＰ用蛍光キューブ（Semrock GFP-4050B）、蛍光観察用光源（U-HGLGPS, Olympus）、−６５℃冷却ＣＣＤカメラ（浜松ホトニクス）、及び画像解析ソフト（MetaMorph）を搭載したものを用いた。上記ＧＦＰ用蛍光キューブは、励起フィルター（FF01-466/40-25）、ダイクロックミラー（FF495-Di03-25x36）、及び蛍光フィルター（FF03-525/50-25）等を構成物品として含んでなる励起光466nm/蛍光525nmの蛍光フィルターセットである。
１ディッシュあたり３カ所の観察定点を設定し、ＤＩＣ透過像（露出時間１５０ミリ秒）及び励起光466nm/蛍光525nm蛍光像（露出時間２００ｍ秒）を倍率×８０にて３時間ごとに撮影し、試料投与後経過時点での定点画像を取得した。なお、静置培養中の細胞は遊走状態を継続していたため観察時点に定点位置にいた細胞を撮影した。
一方、対照試験として試料を投与しなかったことを除いては上記と同様の操作により静置培養を行い、同様のタイミングにて培地交換やインキュベーター内での静置培養を行って定点画像を撮影した。なお、対照試験における時間経過の始点は他の試料投与試験の投与時に起算時として経過時間を計測した。【０１１２】
（５）画像解析
撮影したＤＩＣ透過像及び蛍光像について、画像解析ソフト（MetaMorph）を用いて重複画像を合成した。ここで、上記（１）で調製した蛍光標識ＤＮＡの存在は、画像中において蛍光シグナルとして検出することが可能となる。ＤＩＣ透過像及び蛍光像の合成画像を図９〜１４に示した。なお、蛍光シグナルが観察された箇所については、図１０及び図１２に階調反転した拡大像として示した。【０１１３】
その結果、図９及び図１０に示すように蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子を内包したＧｒｏＥＳ−ＮＡＳ（ＡｈＲ付加型ＧｒｏＥＳ）を含む変異型シャペロニン複合体（試料３−１）を添加した場合、添加後８時間経過時において細胞質内にて蛍光標識ＤＮＡ由来の蛍光シグナルが検出された。また添加後１１〜１４時間経過時には細胞核内において複数の蛍光シグナルが検出された。
ここで、タイムラプス解析にて経時的に検出された蛍光シグナルの検出位置は、変異型シャペロニン複合体の内包物を検出していると認められ、当該内包物到達地点は時間経過と伴に細胞質から細胞核に近づき、試料添加後１１〜１４時間経過時には核内に到達していると認められた。投与したＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）の変異型シャペロニン複合体の解離半減期が約６日であることを考慮すると、添加した大部分の複合体は核内到達後のタイミングにて内包物を維持していることが推測された。
この結果から、ＡｈＲ付加型ＧｒｏＥＳを含む変異型シャペロニン複合体を用いることによって、核酸を分解させることなく核内へ局所送達することが可能であることが実証された。【０１１４】
また、図１１及び１２に示すように、蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子を内包したＧｒｏＥＳ−ＷＴ（野生型ＧｒｏＥＳ）を含む変異型シャペロニン複合体（試料３−２）を添加した場合、添加後５〜１１時間経過時において細胞質内にて蛍光標識ＤＮＡ由来の蛍光シグナルが検出されたが、核内における蛍光シグナルは検出されなかった。
この結果から、野生型ＧｒｏＥＳを含む変異型シャペロニン複合体を用いた場合、核内への局所送達が可能であることまでは示されなかった。但し、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）の変異型シャペロニン複合体を用いることによって細胞膜を透過した細胞質内に被内包物を送達可能であるという結果は、細胞内への局所送達が可能であったことを示す好適な結果であった。【０１１５】
一方、図１３に示すように比較試験である蛍光標識ＤＮＡ吸着金ナノ粒子（試料３−３）のみを添加した場合では、細胞質及び核内のいずれにおいても蛍光標識ＤＮＡに由来する蛍光シグナルは検出されなかった。金ナノ粒子は凝集状態であり細胞内への取り込みが行われなかったためと推測された。【０１１６】
（６）結論
以上の解析結果から、ＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）の変異型シャペロニン複合体に核酸分子を内包させることによって、細胞膜を透過して細胞質に核酸分子を送達可能であることが確認された。そして、核移行シグナルペプチド付加型ＧｒｏＥＳを含むＧｒｏＥＬ（Ｄ５２，３９８Ａ）の変異型シャペロニン複合体を用いることによって、細胞核の核内に核酸分子を分解させることなく送達可能となることが実証された。【０１１７】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明に係る技術は、タンパク質性の生体由来ナノカプセルとして細胞内への局所的薬物送達システムにおける要素技術となることが期待される。特に、製薬業界において注目されている核酸医薬に関する細胞内局所的ＤＤＳキャリア技術として重要な要素技術となることが期待される。
【符号の説明】
【０１１９】
１：  細胞核
２：  ＧＦＰ、Ｃｙ５、及びＣｙ３が三重重複して薄黄色となった蛍光シグナル
３：  蛍光標識ＤＮＡに由来する蛍光シグナル【０１２０】
１１：  弾丸型シャペロニン複合体
１２：  フットボール型シャペロニン複合体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2016185955.tif 000015
【図１２】
2016185955.tif 000016
【図１３】
2016185955.tif 000017
【図１４】
2016185955.tif 000018
【配列表】
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【国際調査報告】
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