(57)【要約】  腫瘍の判定方法の提供。以下を含む腫瘍の判定方法：１）被験組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程（該被験組織または細胞は、腫瘍に罹患した患者であって（i）該腫瘍がＭＳＩ検査でＭＳＩ−Ｈおよび／または該腫瘍が免疫組織化学検査でＭＬＨ１の発現がないかもしくは低下している、かつ（ii）遺伝学的検査によりＭＬＨ１に変異が認められない、と判定された患者由来である）；２）該亜硫酸水素塩処理ＤＮＡからＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲ増幅する工程；３）該ＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；４）該検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークであるか否かを判定する工程；５）該ピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合、該腫瘍をリンチ症候群ではない患者由来の腫瘍であると判定する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍の判定方法であって：
（１）被験組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程、
ここで、該被験組織または細胞は、以下：
腫瘍に罹患した患者であって、
（i）該腫瘍がＭＳＩ検査でＭＳＩ−Ｈ、および／または該腫瘍が免疫組織化学検査でＭＬＨ１の発現がないかもしくは低下している、かつ
（ii）遺伝学的検査によりＭＬＨ１に変異が認められない、
と判定された患者由来の組織または細胞である；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークであるか否かを判定する工程；
（５）工程（４）において、該ピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該腫瘍を、リンチ症候群ではない患者由来の腫瘍であると判定する工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記被験組織または細胞が、腫瘍を含む組織または細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍が、大腸、子宮内膜、胃、卵巣、小腸、胆道、膵臓、腎盂、尿管、脳または皮脂腺における腫瘍である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記工程（２）において、前記ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡの代わりに、ＭＬＨ１のプロモーター領域および／またはＩｎｔｒｏｎ１領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記イオン交換クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記イオン交換クロマトグラフィーに用いるカラム充填剤が、表面に強カチオン性基および弱カチオン性基の両方を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
腫瘍を判定するためのデータを得る方法であって：
（１）被験組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程、
ここで、該被験組織または細胞は、以下：
腫瘍に罹患した患者であって、
（i）該腫瘍がＭＳＩ検査でＭＳＩ−Ｈ、および／または該腫瘍が免疫組織化学検査でＭＬＨ１の発現がないかもしくは低下している、かつ
（ii）遺伝学的検査によりＭＬＨ１に変異が認められない、
と判定された患者由来の組織または細胞である；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークであるか否かを、該腫瘍がリンチ症候群ではない患者由来の腫瘍であるか否かを判定するためのデータとして取得する工程、
を含む方法。
【請求項８】
前記被験組織または細胞が、腫瘍を含む組織または細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍が、大腸、子宮内膜、胃、卵巣、小腸、胆道、膵臓、腎盂、尿管、脳または皮脂腺における腫瘍である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記工程（２）において、前記ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡの代わりに、ＭＬＨ１のプロモーター領域および／またはＩｎｔｒｏｎ１領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記イオン交換クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーである、請求項７〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記イオン交換クロマトグラフィーに用いるカラム充填剤が、表面に強カチオン性基および弱カチオン性基の両方を有する、請求項７〜１１のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン交換クロマトグラフィーによるメチル化ＤＮＡの検出を利用した腫瘍の判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡの異常なメチル化が癌化に深く関与することが明らかになり、注目を集めている。腫瘍における特徴的なエピジェネティック異常として、一部の遺伝子プロモーター領域におけるＣｐＧアイランドの異常なＤＮＡメチル化が知られている。ＣｐＧアイランドは、ホスホジエステル結合（ｐ）を介したシトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）の２塩基配列が高頻度で出現する領域のことであり、遺伝子上流のプロモーター領域に存在することが多い。ＣｐＧアイランドの異常なＤＮＡメチル化は、がん抑制遺伝子の不活化などを通じて発がんに関与する。大腸癌、胃癌等において、臨床病理学的因子と相関したＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化亢進が報告されている（非特許文献１〜４）。【０００３】
既に確立されたメチル化ＤＮＡの解析方法として、亜硫酸水素塩（重亜硫酸塩、バイサルファイト、ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）反応を利用した方法がある。この方法は、メチル化ＤＮＡの解析に最も汎用されている方法である。一本鎖ＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理すると、シトシンはスルホン化、加水脱アミノ化、脱スルホン化を経て、ウラシルに変換される。一方、メチル化されたシトシンは、最初に起こるスルホン化の反応速度が極めて遅いため、実際に行われる亜硫酸水素塩処理の反応時間の中ではメチル化シトシンのままである。従って、亜硫酸水素塩処理をしたＤＮＡを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うと、メチル化シトシンはシトシンのままであるが、非メチル化シトシンは、ウラシルからチミンに置き換わって増幅される。このＰＣＲ増幅産物の配列中に生じるシトシンとチミンという塩基の違いを利用してメチル化状態を解析する。これを基本原理として汎用されている方法が、特許文献１、非特許文献５に記載のＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ（ＭＳＰ）法、および非特許文献６、７に記載のＣｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）法である。ＭＳＰ法およびＣＯＢＲＡ法は、特別な装置なしにメチル化ＤＮＡの定量的な解析ができるという点で、現在でも広く使用されるメチル化ＤＮＡ解析方法であるが、解析に電気泳動法を利用する点と、ＣＯＢＲＡ法ではさらに制限酵素処理を必要とする点で、手間と時間がかかるという課題があった。【０００４】
別のメチル化ＤＮＡ解析方法として、パイロシークエンシングがある（非特許文献８、９）。この方法では、亜硫酸水素塩処理したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物をパイロシークエンシングにかけ、チミンに置き換わったメチル化シトシンを検出する。しかし、パイロシークエンシングは、専用のシークエンサーを必要とする、塩基を１つずつ読んでいく方法であるため、解析に時間がかかる、および高価な試薬が必要である、という課題がある。【０００５】
最近、亜硫酸水素塩処理したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることで、該クロマトグラフィーの検出シグナルの保持時間に基づいてＤＮＡのメチル化率を判定する方法が提案されている（特許文献２）。この方法は、従来の電気泳動やパイロシークエンシングを利用したメチル化ＤＮＡ解析方法に比べて、解析の時間が大幅に短縮されるという利点を有する。また、特許文献２の方法を用いて、腎細胞癌の予後を判定する方法が提案されている（特許文献３）。【０００６】
遺伝性大腸癌の一種である遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｎｏｎ−ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：ＨＮＰＣＣ）は、リンチ症候群（Ｌｙｎｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）とも呼ばれ、一般の大腸癌に比べ若年発症であり、かつ多発性（同時性、異時性）であり、右側結腸に好発する。また、散発性大腸癌より低分化腺癌の頻度が高く、粘液癌・印環細胞様分化、腫瘍内リンパ球浸潤が見られるなどの組織学的特徴がある。リンチ症候群による大腸癌は、臨床的特徴に乏しいため、非遺伝的な散発性大腸癌と区別なく取り扱われ、その多くが見逃されている可能性が高いとされている。またリンチ症候群患者は、婦人科癌や消化器癌などの、大腸癌以外の様々な悪性腫瘍の発生リスクが高いため、リンチ症候群の診断は重要である。リンチ症候群の診断のためのスクリーニング検査としてマイクロサテライト不安定性（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ＭＳＩ）検査およびミスマッチ修復（ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ：ＭＭＲ）関連タンパクの免疫組織化学を用いることは有用であり、前者はすでに保険適用となっている（非特許文献１０）。【０００７】
ＤＮＡの中で１〜数塩基の塩基配列が繰り返し出現する領域であるマイクロサテライトは、ＤＮＡ複製エラーが生じやすい部分である。マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）とは、ミスマッチ修復機構の機能低下によって腫瘍組織と正常組織でマイクロサテライトの反復回数にばらつきが生じることをいう。ＭＳＩは、リンチ症候群と診断された大腸癌組織の約９０％で認められる。【０００８】
ＭＳＩは、ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６およびＤ１７Ｓ２５０の５種類のマイクロサテライトマーカーで検出される繰り返し配列の不安定性を基準に、ＭＳＳ（ｓｔａｂｌｅ）、ＭＳＩ−Ｌ（ｌｏｗ）、ＭＳＩ−Ｈ（ｈｉｇｈ）に分類される（非特許文献１１）。より具体的には、ＭＳＩ陽性（高ＭＳＩ：ＭＳＩ−Ｈ）は、上記マクロサテライトマーカーの少なくとも２つのマーカーでＭＳＩが認められたことを意味する。１つの腫瘍マーカーでＭＳＩを認めた場合は、ＭＳＩ陰性（低ＭＳＩ：ＭＳＩ−Ｌ）と呼ばれる。５種類全てのマーカーについてＭＳＩ陰性と判定された場合は、マイクロサテライト安定（Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｓｔａｂｌｅ：ＭＳＳ）と呼ばれる。また、上記５種のマーカーを含む６以上のマーカーを使用してＭＳＩ検査を行う場合には、全マーカーの３０−４０％以上にＭＳＩを認めた場合にはＭＳＩ−Ｈ、それ以下の場合にはＭＳＩ−Ｌと判定する。ＭＳＩは、ミスマッチ修復遺伝子であるＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６またはＰＭＳ２の生殖細胞系列での変異が原因であることが知られている。【０００９】
ＭＳＩ−Ｈとなる大腸癌はわが国では全大腸癌の６−７％とされる（非特許文献１２および１３）。一方、リンチ症候群患者は全大腸癌の２−３％とされている。したがって、ＭＳＩ−Ｈ症例のうち、１/２−２/３の症例はリンチ症候群ではなく、ＭＬＨ１のプロモーター領域の後天的なメチル化による不活化と考えられる（非特許文献１４）。このようなメチル化症例をリンチ症候群患者の疑いのある患者から除外するためにベセスダ基準が設けられており（非特許文献１５）、これを満たす症例にＭＳＩ検査を行うことが効率的であるとも考えられる。一方で、ベセスダ基準は、５０歳代発症のｌｏｗ  ｐｅｎｅｔｒａｎｃｅのリンチ症候群を拾い落してしまうことが指摘されており、最近では、大腸癌全例（あるいは７０歳未満の大腸癌）に免疫組織化学あるいはＭＳＩ検査を行い、リンチ症候群を拾い上げることも提案されている（非特許文献１６）。特に、免疫組織化学でＭＬＨ１の発現消失が認められ、ＭＳＩ−Ｈである症例では、既往歴や家族歴から遺伝学的検査を先行させる場合もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５７８６１４６号公報
【特許文献２】国際公開公報第２０１４／１３６９３０号公報
【特許文献３】国際公開公報第２０１５／１２９９１６号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，４，９８８−９９３（２００４）
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，８６８１−８６８６（１９９９）
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０４，１８６５４−１８６５９（２００７）
【非特許文献４】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９，５４３８−５４４２（１９９９）
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，９８２１−９８２６（１９９６）
【非特許文献６】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，５０５８−５０５９（１９９６）
【非特許文献７】Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５，２５３２−２５３４（１９９７）
【非特許文献８】Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２８１，３６３−３６５（１９９８）
【非特許文献９】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１１，３−１１（２００１）
【非特許文献１０】平成１９年６月１日厚生労働省  事務連絡、および平成２０年４月診療報酬改定
【非特許文献１１】Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，７，  １５３−１６２（２０１０）
【非特許文献１２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，２１６，５５−６２（２００４）
【非特許文献１３】Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．，３０，４９４−４９９（２００９）
【非特許文献１４】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７，８０８−８１１（１９９７）
【非特許文献１５】Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９６，２６１−２６８（２００４）
【非特許文献１６】Ｇｕｔ．，６２，８１２−８２３（２０１３）
【非特許文献１７】Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．，２３，４０７２−４０７９（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
より正確な大腸癌診断のためには、より多くの大腸癌症例でＭＬＨ１プロモーター領域のメチル化の解析を行うことが必要である。これまで、ＭＬＨ１プロモーター領域のメチル化の解析はＤＮＡを亜硫酸水素塩処理した後に、ＰＣＲ−ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＭＳＰ法、ＲＦＬＰ法（メチル化を認識する酵素制限酵素多型）などを行うことにより行われてきた。臨床現場では、パイロシークエンシングを用いたメチル化スクリーニング法が応用されている（非特許文献１７）。しかし、パイロシークエンシングはコストと時間がかかるのが難点であり、より低コストで汎用性に富む手法の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、亜硫酸水素塩処理したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけて得られたシグナルが、マイクロサテライト不安定性陽性（ＭＳＩ−Ｈ）の腫瘍において、リンチ症候群患者と非リンチ症候群患者とで異なることを見出した。【００１４】
したがって、本発明は、以下を提供する。
〔１〕腫瘍の判定方法であって：
（１）被験組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程、
ここで、該被験組織または細胞は、以下：
腫瘍に罹患した患者であって、
（i）該腫瘍がＭＳＩ検査でＭＳＩ−Ｈ、および／または該腫瘍が免疫組織化学検査でＭＬＨ１の発現がないかもしくは低下している、かつ
（ii）遺伝学的検査によりＭＬＨ１に変異が認められない、
と判定された患者由来の組織または細胞である；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークであるか否かを判定する工程；
（５）工程（４）において、該ピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該腫瘍を、リンチ症候群ではない患者由来の腫瘍であると判定する工程、
を含む方法。
〔２〕前記被験組織または細胞が、腫瘍を含む組織または細胞である、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記腫瘍が、大腸、子宮内膜、胃、卵巣、小腸、胆道、膵臓、腎盂、尿管、脳または皮脂腺における腫瘍である、〔２〕記載の方法。
〔４〕前記工程（２）において、前記ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡの代わりに、ＭＬＨ１のプロモーター領域および／またはＩｎｔｒｏｎ１領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記イオン交換クロマトグラフィーがアニオン交換クロマトグラフィーである、〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記イオン交換クロマトグラフィーに用いるカラム充填剤が、表面に強カチオン性基および弱カチオン性基の両方を有する、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法は、従来のＭＳＩ検査等でリンチ症候群が疑われるが遺伝学的検査ではＭＬＨ１の異常が見られない患者において、リンチ症候群の可能性を否定するための鑑別診断に有用である。また本発明の方法によれば、より迅速、簡便、かつ高精度にリンチ症候群の可能性を判定することができるので、患者に対して適切な治療方法の選択が可能になる。したがって本発明は、患者の生存率の向上に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Ｒｅｇｉｏｎ  ＤｆＣｒについての患者ＩＤ：Ｓ−１からのＴ検体およびＮ検体、ならびに陰性対照および陽性対照のクロマトグラム。横軸はクロマトグラフィーの保持時間。
【図２】Ｒｅｇｉｏｎ  ＤｆＣｒについての患者ＩＤ：Ｓ−２からのＴ検体およびＮ検体、ならびに陰性対照および陽性対照のクロマトグラム。横軸はクロマトグラフィーの保持時間。
【図３】Ｒｅｇｉｏｎ  ＤｆＣｒについての患者ＩＤ：Ｓ−３からのＴ検体およびＮ検体、ならびに陰性対照および陽性対照のクロマトグラム。横軸はクロマトグラフィーの保持時間。
【図４】Ｒｅｇｉｏｎ  ＤｆＣｒについての患者ＩＤ：Ｓ−４からのＴ検体およびＮ検体、ならびに陰性対照および陽性対照のクロマトグラム。横軸はクロマトグラフィーの保持時間。
【図５】Ｒｅｇｉｏｎ  Ａについての患者ＩＤ：Ｓ−２からのＴ検体およびＮ検体、ならびに陰性対照および陽性対照のクロマトグラム。横軸はクロマトグラフィーの保持時間。
【図６】Ｒｅｇｉｏｎ  Ｂについての患者ＩＤ：Ｓ−２からのＴ検体およびＮ検体、ならびに陰性対照および陽性対照のクロマトグラム。横軸はクロマトグラフィーの保持時間。
【図７】Ｒｅｇｉｏｎ  Ｃについての患者ＩＤ：Ｓ−２からのＴ検体およびＮ検体、ならびに陰性対照および陽性対照のクロマトグラム。横軸はクロマトグラフィーの保持時間。
【図８】Ｒｅｇｉｏｎ  Ｄについての患者体ＩＤ：Ｓ−２からのＴ検体およびＮ検体、ならびに陰性対照および陽性対照のクロマトグラム。横軸はクロマトグラフィーの保持時間。
【図９】Ｒｅｇｉｏｎ  Ｅについての患者ＩＤ：Ｓ−２からのＴ検体およびＮ検体、ならびに陰性対照および陽性対照のクロマトグラム。横軸はクロマトグラフィーの保持時間。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において、「リンチ症候群（Ｌｙｎｃｈ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）」とは、ミスマッチ修復遺伝子の生殖細胞系列変異を原因とする常染色体優性遺伝性疾患であって、下記のリンチ症候群関連腫瘍への易罹患性腫瘍症候群を意味する。「リンチ症候群」は、一般に遺伝性大腸癌の一種である遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｎｏｎ−ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：ＨＮＰＣＣ）と同一疾患として取り扱われるが、リンチ症候群患者では、大腸だけでなく、子宮内膜、胃、卵巣、小腸、胆道、膵臓、腎盂・尿管、脳、皮脂腺等、様々な組織に腫瘍が発生する場合がある。リンチ症候群患者においてみられるこれらの腫瘍はリンチ症候群関連腫瘍と呼ばれる。本発明における「リンチ症候群関連腫瘍」とは、大腸癌に限られず、上述したリンチ症候群患者においてみられる様々な組織に発生する腫瘍を包含する。
【００１８】
「Ｅｐｉｍｕｔａｔｉｏｎ」は、影響を受けた遺伝子のＤＮＡ配列の変化をもたらさずに、通常はアクティブな遺伝子の転写サイレンシング（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）、又は通常はサイレントな遺伝子の活性化をもたらすエピジェネティックな異常である。
【００１９】
「Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｍｕｔａｔｉｏｎ」とは、個体の正常細胞に存在して（ただし生殖細胞には存在していなくともよい）、疾患のフェノタイプの原因となるエピミューテーションである。
【００２０】
「Ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ  ｅｐｉｍｕｔａｉｏｎ」は、（エピジェネティックな改変を受けていない）配偶子に存在する、親の片方の対立遺伝子に影響を与えるエピミューテーションである。
【００２１】
本明細書において、「腫瘍」とは良性腫瘍および悪性腫瘍（癌）を包含する。
【００２２】
本明細書において、「ＣｐＧサイト」とは、ＤＮＡ中でシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との間がホスホジエステル結合（ｐ）している部位のことを意味する。また本明細書において、ＣｐＧアイランドは、ホスホジエステル結合（ｐ）を介したシトシン（Ｃ）−グアニン（Ｇ）の２塩基配列が高頻度で出現する領域をいう。ＣｐＧアイランドは、遺伝子上流のプロモーター領域に存在することが多い。本明細書において、「（ある）遺伝子のＣｐＧサイトまたはＣｐＧアイランド」とは、当該遺伝子のコード領域に近い位置に存在するＣｐＧアイランド、または該ＣｐＧアイランドに含まれるＣｐＧサイトを意味し、好ましくは当該遺伝子のプロモーター領域に存在するＣｐＧサイトまたはＣｐＧアイランドを意味する。特定の遺伝子のＣｐＧサイトまたはＣｐＧアイランドは、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ法、パイロシークエンシング等の方法に基づいて同定することができる。
【００２３】
本明細書において、「ＤＮＡメチル化」とは、ＤＮＡにおいて、シトシンの５位の炭素がメチル化されている状態のことを意味する。また本明細書において、ＤＮＡの「メチル化を検出する」とは、当該ＤＮＡにおけるメチル化ＤＮＡの存在の有無もしくは存在量、存在量の比、または当該ＤＮＡのメチル化率を測定することを意味する。本明細書において、「ＤＮＡメチル化率」とは、検出の対象とする特定のＤＮＡにおいてＣｐＧサイトのシトシンがメチル化されている割合を意味し、例えば、検出の対象とする特定のＤＮＡ領域における全シトシン数（メチル化シトシンおよび非メチル化シトシン）に対するメチル化シトシン数の比率にて表すことができる。
【００２４】
本明細書において、「高メチル化ＤＮＡ（または単にメチル化ＤＮＡともいう）」とは、メチル化率が、例えば５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは９０％以上であるＤＮＡを意味する。また、「低メチル化ＤＮＡ（または非メチル化ＤＮＡともいう）」とは、ＤＮＡメチル化率が、例えば５０％未満、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下であるＤＮＡを意味する。また本明細書において、「高メチル化ＤＮＡ（または単にメチル化ＤＮＡ）を示すピーク」とは、高メチル化ＤＮＡから得られるクロマトグラフィー検出シグナルのピークを意味し、また「低メチル化ＤＮＡ（または非メチル化ＤＮＡ）を示すピーク」とは、低メチル化ＤＮＡから得られるクロマトグラフィー検出シグナルのピークを意味する。ＤＮＡメチル化率は、パイロシークエンシング等の公知の方法で決定することができるが、本発明の方法における「高メチル化ＤＮＡ」および「低メチル化ＤＮＡ」の判定は、後述する手順でイオン交換クロマトグラフィーのクロマトグラムから算出されたＤＮＡメチル化率に基づいて行われる。
【００２５】
本明細書において「保持時間」とは、カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーにおいて、カラムに物質が導入されてから溶出されるまでの時間を意味し、換言すると、カラムに物質が保持されている時間を意味する。また、保持時間のことを溶出時間という場合もある。イオン交換クロマトグラフィーの検出シグナルの保持時間（溶出時間）は、ＤＮＡメチル化率と相関する（特許文献２参照）。したがって、イオン交換クロマトグラフィーの検出シグナルの保持時間（溶出時間）を測定することにより、ＤＮＡメチル化率を算出できる。より詳細には、既知のメチル化率を有する標準ＤＮＡからクロマトグラフィー検出シグナルの保持時間の検量線を作成し、これに試料ＤＮＡのクロマトグラフィー検出シグナルの保持時間をあてはめることで、該試料ＤＮＡのメチル化率を算出することができる。複数の検出シグナル（ピーク）が認められるクロマトグラムからＤＮＡメチル化率を算出する場合は、例えば、特許文献３に開示されるように、検出シグナルの保持時間の平均値をまず算出し、次いでＤＮＡメチル化率の平均値に換算すればよい。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、腫瘍の判定方法であって、以下：
（１）被験組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程、
ここで、該被験組織または細胞は、以下：
腫瘍に罹患した患者であって、
（i）該腫瘍がＭＳＩ検査でＭＳＩ−Ｈ、および／または該腫瘍が免疫組織化学検査でＭＬＨ１の発現がないかもしくは低下している、かつ
（ii）遺伝学的検査によりＭＬＨ１に変異が認められない、
と判定された患者由来の組織または細胞である；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークであるか否かを判定する工程；
（５）工程（４）において、該ピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該腫瘍を、リンチ症候群ではない患者由来の腫瘍であると判定する工程、
を含む方法を提供する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、腫瘍患者の判定方法であって、以下：
（１）被験組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程、
ここで、該被験組織または細胞は、以下：
腫瘍に罹患した患者であって、
（i）該腫瘍がＭＳＩ検査でＭＳＩ−Ｈ、および／または該腫瘍が免疫組織化学検査でＭＬＨ１の発現がないかもしくは低下している、かつ
（ii）遺伝学的検査によりＭＬＨ１に変異が認められない、
と判定された患者由来の組織または細胞である；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークであるか否かを判定する工程；
（５）工程（４）において、該ピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該患者を、リンチ症候群ではない患者であると判定する工程、
を含む方法を提供する。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、腫瘍患者からリンチ症候群ではない患者を判定するためのメチル化ＤＮＡの測定方法であって、以下：
（１）被験組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程、
ここで、該被験組織または細胞は、以下：
腫瘍に罹患した患者であって、
（i）該腫瘍がＭＳＩ検査でＭＳＩ−Ｈ、および／または該腫瘍が免疫組織化学検査でＭＬＨ１の発現がないかもしくは低下している、かつ
（ii）遺伝学的検査によりＭＬＨ１に変異が認められない、
と判定された患者由来の組織または細胞である；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークであるか否かを判定する工程、
を含み、
該工程（４）において、該ピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該患者をリンチ症候群ではない患者であると判定する、
方法を提供する。
【００２９】
さらに別の実施形態において、本発明は、腫瘍を判定するためのデータを得る方法であって、以下：
（１）被験組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程、
ここで、該被験組織または細胞は、以下：
腫瘍に罹患した患者であって、
（i）該腫瘍がＭＳＩ検査でＭＳＩ−Ｈ、および／または該腫瘍が免疫組織化学検査でＭＬＨ１の発現がないかもしくは低下している、かつ
（ii）遺伝学的検査によりＭＬＨ１に変異が認められない、
と判定された患者由来の組織または細胞である；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークであるか否かを、該腫瘍がリンチ症候群ではない患者由来の腫瘍であるか否かを判定するためのデータとして取得する工程、
を含む方法を提供する。
【００３０】
上記本発明の実施形態が適用される被験体としては、腫瘍に罹患した患者であって、かつその腫瘍がリンチ症候群による腫瘍でないことを確認したい患者が挙げられる。より詳細には、被験体は、腫瘍に罹患した患者であって、（i）当該腫瘍がＭＳＩ検査でＭＳＩ−Ｈと判定されているか、および／または当該腫瘍が免疫組織化学検査でＭＬＨ１の発現がないかもしくは低下していると判定されており、かつ（ii）遺伝学的検査によりＭＬＨ１に変異が認められない、と判定されている患者である。腫瘍としては、特に限定されず、例えば、口腔、舌、咽頭、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸、肝臓、膵臓、胆のう、胆道、腎臓、腎盂、副腎、尿管、乳腺、前立腺、精巣、卵巣、子宮、肺、脳、皮脂腺、皮膚、血液、リンパ、骨髄などにおける腫瘍が挙げられ、好ましくは大腸、子宮内膜、胃、卵巣、小腸、胆道、膵臓、腎盂、尿管、脳または皮脂腺における腫瘍が挙げられる。より好ましくは、上記腫瘍は大腸腫瘍である。
本実施形態で使用される被験組織または細胞は、上記被験体に由来する、上記腫瘍を含む組織または細胞であり、好ましくは大腸、子宮内膜、胃、卵巣、小腸、胆道、膵臓、腎盂、尿管、脳または皮脂腺における腫瘍を含む組織または細胞である。あるいは、本実施形態で使用される被験組織または細胞は、上記被験体に由来する非腫瘍組織または細胞であってもよい。非腫瘍組織または細胞を用いた本実施形態の方法は、ｅｐｉｍｕｔａｔｉｏｎによるＤＮＡメチル化をきたしている患者の判定を可能にする。
【００３１】
さらなる実施形態において、本発明は、リンチ症候群由来と非リンチ症候群由来の組織または細胞の鑑別方法であって、以下：
（１）被験組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、メチル化ＤＮＡの検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られたメチル化ＤＮＡの検出シグナルのピーク値を対照群のピーク値と比較し、変動量を計測する工程、
を含む方法を提供する。
【００３２】
さらなる実施形態において、本発明は、組織または細胞の判定方法であって、以下：
（１）被験組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークであるか高メチル化ＤＮＡを示すピークであるかを判定する工程；
（５）(i)工程（４）において、該ピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該組織または細胞を、リンチ症候群関連腫瘍を発症していないかまたは発症する可能性の低い患者から得られた組織または細胞と判定するか、または、
(ii)工程（４）において、該ピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該組織または細胞を、リンチ症候群関連腫瘍を発症しているかまたは発症する可能性の高い患者から得られた組織または細胞と判定する、工程、
を含む方法を提供する。
【００３３】
さらなる実施形態において、本発明は、リンチ症候群関連腫瘍の発症可能性の判定方法であって、以下；
（１）被験体由来の組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークであるか高メチル化ＤＮＡを示すピークであるかを判定する工程；
（５）(i)工程（４）において、該ピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該被験体を、リンチ症候群関連腫瘍を発症していないかまたは発症する可能性の低い者と判定するか、または、
(ii)工程（４）において、該ピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該被験体を、リンチ症候群関連腫瘍を発症しているかまたは発症する可能性の高い者と判定する、工程、
を含む方法を提供する。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明は、リンチ症候群関連腫瘍の発症可能性を判定するためのメチル化ＤＮＡの測定方法であって、以下：
（１）被験体由来の組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークであるか高メチル化ＤＮＡを示すピークであるかを判定する工程、
を含み、
該工程（４）において、該ピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合には、該被験体は、リンチ症候群関連腫瘍を発症していないかまたは発症する可能性の低い者と判定され、該工程（４）において、該ピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合には、該被験体は、リンチ症候群関連腫瘍を発症しているかまたは発症する可能性の高い者と判定される、
方法を提供する。
【００３５】
さらなる実施形態において、本発明は、リンチ症候群関連腫瘍の発症可能性を判定するためのデータを得る方法であって、以下：
（１）被験体由来の組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークであるか高メチル化ＤＮＡを示すピークであるかを、該被験体がリンチ症候群関連腫瘍を発症しているか否か、または発症する可能性の高い者であるかもしくは低い者であるかを判定するためのデータとして取得する工程、
を含む方法を提供する。
【００３６】
さらなる実施形態において、本発明は、腫瘍の鑑別方法であって、以下：
（１）腫瘍を含む被験組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークであるか高メチル化ＤＮＡを示すピークであるかを判定する工程；
（５）(i)工程（４）において、該ピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該腫瘍を、リンチ症候群ではない患者から得られた腫瘍と判定するか、または
(ii)工程（４）において、該ピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該腫瘍を、リンチ症候群の疑いのある患者から得られた腫瘍と判定する、工程、
を含む方法を提供する。
【００３７】
さらなる実施形態において、本発明は、腫瘍患者の鑑別方法であって、以下：
（１）被験体由来の腫瘍を含む組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークであるか高メチル化ＤＮＡを示すピークであるかを判定する工程；
（５）(i)工程（４）において、該ピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該被験体を、リンチ症候群ではないと判定するか、または
(ii)工程（４）において、該ピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合に、該被験体を、リンチ症候群の疑いありと判定する、工程、
を含む方法を提供する。
【００３８】
さらなる実施形態において、本発明は、腫瘍患者を判定するためのメチル化ＤＮＡの測定方法であって、以下：
（１）被験体由来の腫瘍を含む組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークであるか高メチル化ＤＮＡを示すピークであるかを判定する工程、
を含み、
該工程（４）において、該ピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合には、該被験体を、リンチ症候群ではないと判定し、該工程（４）において、該ピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークと判定された場合には、該被験体を、リンチ症候群の疑いありと判定する、
方法を提供する。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明は、腫瘍の鑑別のためのデータを得る方法であって、以下：
（１）腫瘍を含む被験組織または細胞から調製されたゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する工程；
（２）工程（１）で得られた亜硫酸水素塩によって処理されたＤＮＡから、ＭＬＨ１プロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡをＰＣＲによって増幅する工程；
（３）工程（２）で得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけ、検出シグナルを得る工程；
（４）工程（３）で得られた検出シグナルのピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークであるか高メチル化ＤＮＡを示すピークであるかを、該腫瘍がリンチ症候群の疑いのある患者から得られた腫瘍であるか否かを鑑別するためのデータとして取得する工程、
を含む方法を提供する。
【００４０】
上記本発明のさらなる実施形態が適用される被験体としては、リンチ症候群関連腫瘍が疑われる患者が挙げられる。例えば、被験体としては、大腸、子宮内膜、胃、卵巣、小腸、胆道、膵臓、腎盂、尿管、脳または皮脂腺などに腫瘍が見つかった患者、または該腫瘍の治療が施された患者であって、該腫瘍がリンチ症候群関連腫瘍か否かの判定を必要とする者が挙げられる。あるいは、被験体としては、現在はリンチ症候群関連腫瘍に罹患していないが、将来リンチ症候群関連腫瘍を発症する可能性（発症リスク）の判定を必要とする者が挙げられる。好ましい実施形態において、上記被験体は、大腸腫瘍を有する患者であって、リンチ症候群か否かの判定を必要とする患者が挙げられる。
本実施形態で使用される被験組織または細胞は、上記被験体由来の組織または細胞であればよく、好ましくは大腸、子宮内膜、胃、卵巣、小腸、胆道、膵臓、腎盂、尿管、脳または皮脂腺の組織または細胞である。これらの腫瘍は、腫瘍を含む組織または細胞であっても、非腫瘍組織または細胞であってもよい。被験体から見つかった腫瘍がリンチ症候群関連腫瘍であるか否かを判定するためには、腫瘍を含む組織または細胞が使用される。リンチ症候群関連腫瘍の発症リスクの判定の場合には、腫瘍を含む組織または細胞および非腫瘍組織または細胞のいずれを使用してもよい。
【００４１】
上述したいずれの実施形態においても、上記被験組織または細胞は、例えば、生検や外科手術等において採取した組織または細胞、それらの凍結物もしくは固定化標本（ホルマリン固定、パラフィン包埋、パラフィンブロック等）、または培養細胞であり得る。非腫瘍組織または細胞としては、血液を使用することができる。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。
【００４２】
上記組織または細胞からゲノムＤＮＡを調製する方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。ＤＮＡを調製する公知の方法としては、フェノールクロロホルム法、または市販のＤＮＡ抽出キット、例えばＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、Ｃｌｅａｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（ＮｅｘＴｅｃ社製）、ＡｑｕａＰｕｒｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）、ＺＲ  Ｐｌａｎｔ／Ｓｅｅｄ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）、ｐｒｅｐＧＥＭ（ＺｙＧＥＭ社製）、ＢｕｃｃａｌＱｕｉｃｋ（ＴｒｉｍＧｅｎ社製）を用いるＤＮＡ抽出方法等が挙げられる。
【００４３】
次いで、抽出したゲノムＤＮＡを亜硫酸水素塩で処理する。ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理の方法としては、特に制限はなく、公知の手法を適宜選択して用いることができる。亜硫酸水素塩処理のための公知の方法としては、例えば、ＥｐｉＴｅｃｔ（登録商標）Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ（４８）（Ｑｉａｇｅｎ社製）や、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｐｔｙ社製）、Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣｐＧ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＣｐＧｅｎｏｍｅ  Ｔｕｒｂｏ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭＥＲＣＫ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）などの市販のキットを用いる方法が挙げられる。
【００４４】
次いで、亜硫酸水素塩によって処理されたゲノムＤＮＡをＰＣＲにかけ、標的ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲ増幅の方法としては特に制限はなく、増幅対象の標的ＤＮＡの配列、長さ、量などに応じて、公知の手法を適宜選択して用いることができる。
【００４５】
リンチ症候群においては、ＭＬＨ１プロモーター領域におけるＤＮＡメチル化がほとんど認められないとされている。したがって、本発明の方法においてＰＣＲ増幅される標的ＤＮＡは、好ましくは、上記ＭＬＨ１プロモーター領域におけるＤＮＡメチル化を検出できるように選択され、より好ましくは、上記ＭＬＨ１プロモーター領域のＣｐＧアイランドまたはＣｐＧサイトのメチル化を検出できるように選択される。例えば、標的ＤＮＡは、ＭＬＨ１のプロモーター領域の一部または全部を含むＤＮＡである。より好ましくは、上記ＭＬＨ１プロモーター領域のＣｐＧアイランドの一部または全部を含むＤＮＡである。
【００４６】
ＭＬＨ１はＲｅｆＳｅｑ  ＩＤ：ＮＧ＿００７１０９．２で特定される遺伝子である。ＭＬＨ１プロモーター領域は、表１に示す配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡである。したがって、本発明の方法においてＰＣＲ増幅される標的ＤＮＡは、好ましくは、配列番号１で示される塩基配列の全長またはその部分配列からなるＤＮＡである。該標的ＤＮＡのより好ましい例としては、配列番号１で示される塩基配列の４７０〜５６８番塩基領域、１〜１８２番塩基領域、１５９〜３６３番塩基領域、３３６〜５６８番塩基領域、４７０〜７０４番塩基領域または６８４〜８４１番塩基領域を含むＤＮＡが挙げられ、さらに好ましい例としては、配列番号１で示される塩基配列の４７０〜５６８番塩基領域、１〜１８２番塩基領域、１５９〜３６３番塩基領域、３３６〜５６８番塩基領域、４７０〜７０４番塩基領域または６８４〜８４１番塩基領域からなるＤＮＡである。本発明において、当該標的ＤＮＡは、その０〜１００％メチル化したＤＮＡを包含する。
【００４７】
【表１】
2017061609.tif 000002
【００４８】
ＰＣＲ増幅する標的ＤＮＡの鎖長は、ＰＣＲの増幅時間の短縮、ならびにイオン交換クロマトグラフィーでの分析時間の短縮や分離性能の維持等の要素を勘案して適宜選択することができる。本発明の方法でＰＣＲ増幅する標的ＤＮＡの鎖長は、好ましくは１０００ｂｐ以下、より好ましくは７００ｂｐ以下、さらに好ましくは５００ｂｐ以下、なお好ましくは３００ｂｐ以下である。一方、ＰＣＲにおける非特異的ハイブリダイズを避けるためには、標的ＤＮＡの鎖長は３０〜４０ｂｐ以上が好ましい。より好ましい実施形態において、標的ＤＮＡの鎖長は５０〜５００ｂｐ、さらに好ましくは７０〜３００ｂｐである。
【００４９】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の方法においてＰＣＲ増幅される標的ＤＮＡは、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡである。別の好ましい実施形態において、本発明の方法においてＰＣＲ増幅される標的ＤＮＡは、配列番号１で示される塩基配列の部分配列からなり、かつ塩基長５０〜５００ｂｐ、好ましくは７０〜３００ｂｐのＤＮＡである。別の好ましい実施形態において、本発明の方法においてＰＣＲ増幅される標的ＤＮＡは、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ中の、配列番号６と７、配列番号１８と１９、配列番号２０と２２、配列番号２５と２６、配列番号２９と２８、または配列番号３０と３２で示される塩基配列からなるプライマーのセットにより増幅される領域である。
【００５０】
あるいは、後天的な要因によるＭＬＨ１タンパクの欠失が疑われる場合には、ＭＬＨ１プロモーター領域および／またはＩｎｔｒｏｎ１領域（配列番号３３）（Ｃｅｌｌ  ｏｎｃｏｌ．，３６，４１１−４１９，２０１３）のＣｐＧアイランドまたはＣｐＧサイトのＤＮＡメチル化を検出できるように、標的ＤＮＡが選択される。例えば、標的ＤＮＡは、ＭＬＨ１のプロモーター領域および／またＩｎｔｒｏｎ１領域の一部または全部を含むＤＮＡである。より好ましくは、上記ＭＬＨ１プロモーター領域および／またＩｎｔｒｏｎ１領域のＣｐＧアイランドの一部または全部を含むＤＮＡである。
【００５１】
好ましい実施形態において、標的ＤＮＡは、その全塩基数に対するＣｐＧサイトのシトシン数が２％以上、より好ましくは５％以上となるように、領域および鎖長が決定されることが望ましい。
【００５２】
続いて、得られたＰＣＲ増幅産物をサンプルＤＮＡとして、イオン交換クロマトグラフィーにかける。本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーが好適である。本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーに用いるカラムの充填剤としては、表面に強カチオン性基を有する基材粒子であれば特に限定されないが、国際公開公報第２０１２／１０８５１６号に示される充填剤表面に強カチオン性基と弱カチオン性基の両方を有する基材粒子が好ましい。
【００５３】
本明細書において、上記強カチオン性基とは、ｐＨが１から１４の広い範囲で解離するカチオン性基を意味する。すなわち、上記強カチオン性基は、水溶液のｐＨに影響を受けず解離した（カチオン化した）状態を保つことが可能である。
【００５４】
上記強カチオン性基としては、４級アンモニウム基が挙げられる。具体的には例えば、トリメチルアンモニウム基、トリエチルアンモニウム基、ジメチルエチルアンモニウム基等のトリアルキルアンモニウム基等が挙げられる。また、上記強カチオン性基のカウンターイオンとしては、例えば、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲン化物イオンが挙げられる。
【００５５】
上記基材粒子の表面に導入される上記強カチオン性基量は、特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は１μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。上記強カチオン性基量が１μｅｑ／ｇ未満であると、保持力が弱く分離性能が悪くなることがある。上記強カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、保持力が強くなり過ぎてサンプルＤＮＡを容易に溶出させることができず、分析時間が長くなりすぎる等の問題が生じることがある。
【００５６】
本明細書において、上記弱カチオン性基とは、ｐｋａが８以上のカチオン性基を意味する。すなわち、上記弱カチオン性基は、水溶液のｐＨによる影響を受け、解離状態が変化する。すなわち、ｐＨが８より高くなると、上記弱カチオン性基のプロトンは解離し、プラスの電荷を持たない割合が増える。逆にｐＨが８より低くなると、上記弱カチオン性基はプロトン化し、プラスの電荷を持つ割合が増える。
【００５７】
上記弱カチオン性基としては、例えば、３級アミノ基、２級アミノ基、１級アミノ基等が挙げられる。なかでも、３級アミノ基であることが望ましい。
【００５８】
上記基材粒子の表面に導入される上記弱カチオン性基量は、特に限定されないが、充填剤の乾燥重量あたりの好ましい下限は０．５μｅｑ／ｇ、好ましい上限は５００μｅｑ／ｇである。上記弱カチオン性基量が０．５μｅｑ／ｇ未満であると、少なすぎて分離性能が向上しないことがある。上記弱カチオン性基量が５００μｅｑ／ｇを超えると、強カチオン性基と同様保持力が強くなり過ぎてサンプルＤＮＡを容易に溶出させることができず、分析時間が長くなりすぎる等の問題が生じることがある。
【００５９】
上記基材粒子表面の強カチオン性基または弱カチオン性基量は、アミノ基に含まれる窒素原子を定量することにより測定することができる。窒素を定量する方法として、例えばケルダール法が挙げられる。本発明（実施例）記載の充填剤の場合には、まず、重合後に強カチオン性基に含まれる窒素を定量し、次いで、弱カチオン性基を導入した後の強カチオン性基と弱カチオン性基に含まれる窒素を定量することにより、後から導入した弱カチオン性基量を算出することができる。このように定量することにより、充填剤を調製する際に、強カチオン性基量および弱カチオン性基量を上記範囲内に調整することができる。
【００６０】
上記基材粒子としては、例えば、重合性単量体等を用いて得られる合成高分子微粒子、シリカ系等の無機微粒子等を用いることができるが、合成有機高分子からなる疎水性架橋重合体粒子であることが望ましい。
【００６１】
上記疎水性架橋重合体は、少なくとも１種の疎水性架橋性単量体と少なくとも１種の反応性官能基を有する単量体を共重合して得られる疎水性架橋重合体、少なくとも１種の疎水性架橋性単量体と少なくとも１種の反応性官能基を有する単量体と少なくとも１種の疎水性非架橋性単量体とを共重合して得られる疎水性架橋重合体のいずれであってもよい。
【００６２】
上記疎水性架橋性単量体としては、単量体１分子中にビニル基を２個以上有するものであれば特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート等のジ（メタ）アクリル酸エステル、トリメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート等のトリ（メタ）アクリル酸エステル若しくはテトラ（メタ）アクリル酸エステル、またはジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等の芳香族系化合物が挙げられる。なお、本明細書において上記（メタ）アクリレートとは、アクリレートまたはメタクリレートを意味し、（メタ）アクリルとは、アクリルまたはメタクリルを意味する。
【００６３】
上記反応性官能基を有する単量体としては、グリシジル（メタ）アクリレート、イソシアネートエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００６４】
上記疎水性非架橋性単量体としては、疎水性の性質を有する非架橋性の重合性有機単量体であれば特に限定されず、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルや、スチレン、メチルスチレン等のスチレン系単量体が挙げられる。
【００６５】
上記疎水性架橋重合体が、上記疎水性架橋性単量体と上記反応性官能基を有する単量体とを共重合して得られるものである場合、上記疎水性架橋重合体における上記疎水性架橋性単量体に由来するセグメントの含有割合の好ましい下限は１０重量％、より好ましい下限は２０重量％である。
【００６６】
本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、上記基材粒子の表面に、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とを有する重合体層を有するものであることが好ましい。また、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とを有する重合体において、上記強カチオン性基と上記弱カチオン性基とはそれぞれ独立した単量体に由来するものであることが好ましい。具体的には、本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤は、上記疎水性架橋重合体粒子と、上記疎水性架橋重合体粒子の表面に共重合された強カチオン性基を有する親水性重合体の層とからなる被覆重合体粒子の表面に、弱カチオン性基が導入されたものであることが好適である。
【００６７】
上記強カチオン性基を有する親水性重合体は、強カチオン性基を有する親水性単量体から構成されるものであり、１種以上の強カチオン性基を有する親水性単量体に由来するセグメントを含有すればよい。すなわち、上記強カチオン性基を有する親水性重合体を製造する方法としては、強カチオン性基を有する親水性単量体を単独で重合させる方法、２種以上の強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合させる方法、強カチオン性基を有する親水性単量体と強カチオン性基を有しない親水性単量体を共重合させる方法等が挙げられる。
【００６８】
上記強カチオン性基を有する親水性単量体としては、４級アンモニウム基を有するものであることが好ましい。具体的には例えば、メタクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリル酸エチルジメチルエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリメチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルトリエチルアンモニウムクロリド、アクリルアミドエチルジメチルエチルアンモニウムクロリド等が挙げられる。
【００６９】
上記被覆重合体粒子の表面に上記弱カチオン性基を導入する方法としては、公知の方法を用いることができる。具体的には例えば、上記弱カチオン性基として３級アミノ基を導入する方法としては、グリシジル基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いでグリシジル基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法；イソシアネート基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、イソシアネート基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法；上記疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体と３級アミノ基を有する単量体とを共重合する方法；３級アミノ基を有するシランカップリング剤を用いて上記強カチオン性基を有する親水性重合体の層を有する被覆重合体粒子の表面に３級アミノ基を導入する方法；カルボキシ基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、カルボキシ基と３級アミノ基を有する試薬とを、カルボジイミドを用いて縮合させる方法；エステル結合を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、エステル結合部を加水分解した後、次いで、加水分解によって生成したカルボキシ基と３級アミノ基を有する試薬とを、カルボジイミドを用いて縮合させる方法等が挙げられる。なかでも、グリシジル基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、グリシジル基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法や、イソシアネート基を有する単量体に由来するセグメントを有する疎水性架橋重合体からなる疎水性架橋重合体粒子の表面において上記強カチオン性基を有する親水性単量体を共重合し、次いで、イソシアネート基に３級アミノ基を有する試薬を反応させる方法が好ましい。
【００７０】
グリシジル基やイソシアネート基等の反応性官能基に反応させる上記３級アミノ基を有する試薬としては、３級アミノ基と、反応性官能基に反応可能な官能基を有する試薬であれば、特に限定されない。上記反応性官能基に反応可能な官能基としては、例えば、１級アミノ基、水酸基等が挙げられる。なかでも、末端に１級アミノ基を有している基が好ましい。当該官能基を有する具体的な試薬としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノプロピルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノペンチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジプロピルアミノブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジブチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。
【００７１】
上記強カチオン性基、好ましくは４級アンモニウム塩と、上記弱カチオン性基、好ましくは３級アミノ基との相対的な位置関係は、上記強カチオン性基が上記弱カチオン性基よりも基材粒子の表面から遠い位置、即ち外側にあることが好ましい。例えば、上記弱カチオン性基は基材粒子表面から３０Å以内にあり、上記強カチオン性基は基材粒子表面から３００Å以内で、かつ、弱カチオン性基よりも外側にあることが好ましい。
【００７２】
本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィー用充填剤に使用される上記基材粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、好ましい下限は０．１μｍ、好ましい上限は２０μｍである。上記平均粒子径が０．１μｍ未満であると、カラム内が高圧になりすぎて分離不良を起こすことがある。上記平均粒子径が２０μｍを超えると、カラム内のデッドボリュームが大きくなりすぎて分離不良を起こすことがある。なお、本明細書において上記平均粒子径は体積平均粒子径を示し、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製など）を用いて測定することができる。
【００７３】
本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーに用いる溶離液の組成としては、公知の条件を用いることができる。
【００７４】
上記溶離液に用いる緩衝液としては、公知の塩化合物を含む緩衝液類や有機溶媒類を用いることが好ましく、具体的には例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスとＥＤＴＡからなるＴＥ緩衝液、トリスとホウ酸とＥＤＴＡからなるＴＢＡ緩衝液等が挙げられる。
【００７５】
上記溶離液のｐＨは特に限定されないが、好ましい下限は５、好ましい上限は１０である。この範囲に設定することで、上記弱カチオン性基も効果的にイオン交換基（アニオン交換基）として働くと考えられる。上記溶離液のｐＨのより好ましい下限は６、より好ましい上限は９である。
【００７６】
上記溶離液に含まれる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム等のハロゲン化物とアルカリ金属とからなる塩；塩化カルシウム、臭化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム等のハロゲン化物とアルカリ土類金属とからなる塩；過塩素酸ナトリウム、過塩素酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の無機酸塩、等を用いることができる。また、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、コハク酸ナトリウム、コハク酸カリウム等の有機酸塩を用いることもできる。上記塩は、いずれか単独または組み合わせて使用され得る。
【００７７】
上記溶離液の塩濃度としては、分析条件に合わせ適宜調整すればよいが、好ましい下限は１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましい上限は２０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましい下限は１００ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましい上限は１５００ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００７８】
さらに、本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィーに使用される溶離液には、分離性能をさらに高めるためにアンチカオトロピックイオンが含まれている。アンチカオトロピックイオンは、カオロトピックイオンとは逆の性質を有し、水和構造を安定化させる働きがある。そのため、充填剤と核酸分子との間の疎水性相互作用を強める効果がある。本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィーの主たる相互作用は静電的相互作用であるが、加えて、疎水性相互作用の働きも利用することにより分離性能が高まる。
【００７９】
上記溶離液に含まれるアンチカオトロピックイオンとしては、リン酸イオン（ＰＯ43-）、硫酸イオン（ＳＯ42-）、アンモニウムイオン（ＮＨ4+）、カリウムイオン（Ｋ+）、ナトリウムイオン（Ｎａ+）などが挙げられる。これらのイオンの組合せの中でも、硫酸イオンおよびアンモニウムイオンが好適に用いられる。上記アンチカオトロピックイオンは、いずれか単独または組み合わせて使用され得る。なお、上述のアンチカオトロピックイオンの一部には、上記溶離液に含まれる塩や緩衝液の成分が含まれる。このような成分を使用する場合、溶離液に含まれる塩としての性質または緩衝能と、アンチカオトロピックイオンとしての性質の両方を具備するので、本発明には好適である。
【００８０】
本発明で用いるイオン交換クロマトグラフィー用溶離液におけるアンチカオトロピックイオンの分析時の濃度は、分析対象物に合わせて適宜調整すればよいが、アンチカオトロピック塩として２０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが望ましい。具体的には、アンチカオトロピック塩の濃度を０〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲でグラジエント溶出させる方法を挙げることができる。従って、分析開始時のアンチカオトロピック塩の濃度は０ｍｍｏｌ／Ｌである必要はなく、また、分析終了時のアンチカオトロピック塩の濃度も２０００ｍｍｏｌ／Ｌである必要はない。上記グラジエント溶出の方法は、低圧グラジエント法であっても高圧グラジエント法であってもよいが、高圧グラジエント法による精密な濃度調整を行いながら溶出させる方法が好ましい。
【００８１】
上記アンチカオトロピックイオンは、溶出に用いる溶離液のうちの１種のみに添加してもよいが、複数種の溶離液に添加してもよい。また上記アンチカオトロピックイオンは、充填剤とサンプルＤＮＡとの間の疎水性相互作用を強める効果または緩衝能と、サンプルＤＮＡをカラムから溶出させる効果の両方の役割を備えていても良い。
【００８２】
本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーでサンプルＤＮＡを分析する際のカラム温度は、好ましくは３０℃以上であり、より好ましくは４０℃以上であり、さらに好ましくは４５℃以上である。イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が３０℃未満であると充填剤とサンプルＤＮＡとの間の疎水性相互作用が弱くなり、所望の分離効果を得ることが難しくなる。イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が４５℃未満である場合、メチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（メチル化ＤＮＡサンプル）と非メチル化ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（非メチル化ＤＮＡサンプル）との保持時間の差が小さい。さらに、カラム温度が６０℃以上では、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルの間の保持時間の差がさらに広がり、かつそれぞれのピークもより明瞭になるので、より精度のよいＤＮＡのメチル化の検出が可能になる。
【００８３】
さらに、イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が高くなると、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルとが明瞭に分離されるので、標的ＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡの存在比率に従って両者の保持時間のピーク面積またはピーク高さに差異が生じやすくなる。したがって、カラム温度を高くすれば、メチル化ＤＮＡサンプルと非メチル化ＤＮＡサンプルの間の保持時間のピークの面積または高さに基づいて、標的ＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡそれぞれの存在量や存在比率を測定することがより容易になる。
【００８４】
一方、イオン交換クロマトグラフィーのカラム温度が９０℃以上になると、サンプルＤＮＡ中の核酸分子の二本鎖が乖離するため分析上好ましくない。さらに、カラム温度が１００℃以上になると、溶離液の沸騰が生じる恐れがあるため分析上好ましくない。したがって、本発明で行われるイオン交換クロマトグラフィーでサンプルＤＮＡを分析する際のカラム温度は、３０℃以上９０℃未満であればよく、好ましくは４０℃以上９０℃未満であり、より好ましくは４５℃以上９０℃未満であり、さらに好ましくは５５℃以上９０℃未満であり、さらにより好ましくは５５℃以上８５℃以下であり、なお好ましくは６０℃以上８５℃以下である。
【００８５】
上記イオン交換クロマトグラフィーカラムへの試料注入量は、特に限定されずカラムのイオン交換容量および試料濃度に応じて適宜調整すればよい。流速は０．１ｍＬ／ｍｉｎから３．０ｍＬ／ｍｉｎが好ましく、０．５ｍＬ／ｍｉｎから１．５ｍＬ／ｍｉｎがより好ましい。流速が遅くなると分離の向上が期待できるが、遅くなりすぎると分析に長時間を要したり、ピークのブロード化による分離性能の低下を招く恐れがある。逆に流速が早くなると分析時間の短縮という面においてはメリットがあるが、ピークが圧縮されるため分離性能の低下を招く。よって、カラムの性能によって適宜調整されるパラメータではあるが、上記流速の範囲に設定することが望ましい。各サンプルの保持時間は、各サンプルについて予備実験を行うことによって予め決定することができる。送液方法はリニアグラジエント溶出法やステップワイズ溶出法など公知の送液方法を用いることができるが、本発明における送液方法としてはリニアグラジエント溶出法が好ましい。グラジエント（勾配）の大きさは溶出に用いる溶離液を０％から１００％の範囲で、カラムの分離性能および分析対象物（ここではサンプルＤＮＡ）の特性に合わせ適宜調整すればよい。
【００８６】
本発明においては、上述した手順で亜硫酸水素塩処理した標的ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物（すなわちサンプルＤＮＡ）をイオン交換クロマトグラフィーにかける。
【００８７】
ＤＮＡを亜硫酸水素塩処理した場合、当該ＤＮＡ中の非メチル化シトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンはシトシンのままである。亜硫酸水素塩処理したＤＮＡをＰＣＲ増幅すると、非メチル化シトシン由来のウラシルは、さらにチミンに置き換わるため、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの間で、シトシンとチミンの存在比率に差が生じる。したがって、サンプルＤＮＡは、もとになる標的ＤＮＡのメチル化率に応じた異なる配列を有する。該サンプルＤＮＡをイオン交換クロマトグラフィーにかけると、その塩基配列に応じて、異なるシグナルを示すクロマトグラムが得られる。したがって、サンプルＤＮＡのイオン交換クロマトグラフィーで得られた検出シグナルに基づいて、標的ＤＮＡのメチル化を検出することができる。
【００８８】
例えば、標的ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（すなわちサンプルＤＮＡ）からの検出シグナルを、標的ＤＮＡと塩基配列は同じであるがメチル化していないＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（以下、陰性対照という）からの検出シグナル、または標的ＤＮＡと塩基配列は同じでかつメチル化率が既知（例えば、１００％）であるＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物（以下、陽性対照という）からの検出シグナルと比較することにより、サンプルＤＮＡ中におけるメチル化ＤＮＡの存在の有無を測定することができる。
【００８９】
あるいは、サンプルＤＮＡからの検出シグナルを、陰性および陽性対照からの検出シグナルと比較することにより、標的ＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡの存在量、および非メチル化ＤＮＡとの存在量の比を測定することができる。またあるいは、標的ＤＮＡと塩基配列は同じでかつメチル化率が既知である複数のＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物に由来する複数のＰＣＲ増幅産物（以下、標準という）からの検出シグナルを、サンプルＤＮＡからの検出シグナルと比較することにより、標的ＤＮＡ中のメチル化ＤＮＡのメチル化率、存在量、および非メチル化ＤＮＡとの存在量の比を測定することができる。
【００９０】
したがって、上記クロマトグラフィーで得られたサンプルＤＮＡからの検出シグナルと、陰性もしくは陽性対照、または標準からの検出シグナルとを比較することによって、両者の検出シグナルの違いに基づいて、標的ＤＮＡのメチル化を検出することができる。
【００９１】
上記陰性対照、陽性対照および標準のＤＮＡとしては、化学的または遺伝子工学的に合成したＤＮＡを用いてもよい。また陰性対照、陽性対照および標準の調製には、市販品を用いることもでき、例えばＥｐｉＴｅｃｔ（登録商標）  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ  Ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用できる。
【００９２】
例えば、上記イオン交換クロマトグラフィーにおいては、上記サンプルＤＮＡと、上記陰性対照もしくは陽性対照、または上記標準とを、個別にイオン交換クロマトグラフィー分析に供することができる。カラムに吸着した試料を、複数の溶離液を用いてグラジエント溶出させることにより、サンプルＤＮＡと陰性対照もしくは陽性対照または標準とを、ＤＮＡメチル化率に応じて異なる保持時間で溶出することができる。
【００９３】
陰性対照からの検出シグナルは、サンプルＤＮＡの代わりに、標的ＤＮＡと塩基配列は同じであるがメチル化していないＤＮＡを用いて上述した手順で亜硫酸水素塩処理およびＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって獲得することができる。陽性対照からの検出シグナルは、サンプルＤＮＡの代わりに、標的ＤＮＡと塩基配列は同じでかつメチル化率が既知（例えば、１００％）であるＤＮＡを用いて上述した手順で亜硫酸水素塩処理およびＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ増幅産物をイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって獲得することができる。あるいは、上述した合成ＤＮＡや市販のＤＮＡを、陰性または陽性対照としてイオン交換クロマトグラフィーにかけることで、陰性または陽性対照からの検出シグナルを得てもよい。
【００９４】
例えば、サンプルＤＮＡから得られた検出シグナルのピークの保持時間が、陰性対照のピークの保持時間とずれていれば、標的ＤＮＡがメチル化していると判定できる。さらにこのとき、保持時間のずれが大きいほど、メチル化率がより大きいと推定できる。逆に、サンプルＤＮＡから得られた検出シグナルのピークの保持時間が、１００％メチル化陽性対照のピークの保持時間とずれているほど、標的ＤＮＡのメチル化率はより小さいと推定できる。
【００９５】
標準からの検出シグナルは、サンプルＤＮＡの代わりに、標的ＤＮＡと塩基配列は同じでかつメチル化率が既知である複数のＤＮＡを用いて上述した手順で亜硫酸水素塩処理およびＰＣＲを行い、得られた複数のＰＣＲ増幅産物をそれぞれイオン交換クロマトグラフィーにかけることによって獲得することができる。さらに、得られた各々の検出シグナルから検量線を作成してもよい。あるいは、上述した合成ＤＮＡや市販のＤＮＡを、標準としてイオン交換クロマトグラフィーにかけることで、標準からの検出シグナルを得てもよい。上記検量線により、ＤＮＡメチル化率と保持時間とを関連づけることができる。したがって、該検量線に基づいて、ＤＮＡメチル化率を求めることができる。
【００９６】
また例えば、サンプルＤＮＡから得られた検出シグナルのピークの高さまたはピーク面積を、メチル化ＤＮＡのメチル化率および混合比が既知のＤＮＡの亜硫酸水素塩処理物のＰＣＲ増幅産物から得られた検出シグナルのピークの高さまたはピーク面積と比較することによって、標的ＤＮＡにおけるメチル化ＤＮＡの存在比率（例えば非メチル化ＤＮＡの存在比率や、特定の割合でメチル化されたＤＮＡの存在比率など）を決定することができる。
【００９７】
一実施形態において、本発明の方法におけるＤＮＡメチル化率の判定は、陽性対照（１００％メチル化ＤＮＡ）および陰性対照（０％メチル化ＤＮＡ）のピークの保持時間とＤＮＡメチル化率との関連付けにより作成した２点検量線を基準にすることができる。この場合、陽性対照と陰性対照の保持時間の平均値をメチル化率５０％のＤＮＡの保持時間（基準値）とし、サンプルＤＮＡから得られた検出シグナルのピークの保持時間が基準値以下の場合、該ＤＮＡを高メチル化ＤＮＡと判定し、基準値より長い場合、該ＤＮＡを低メチル化ＤＮＡと判定することができる。
【００９８】
ピークを判定する場合、クロマトグラフィー検出シグナルから、ＪＩＳ  Ｋ  ０１２７：２０１３  イオンクロマトグラフィー通則に従い、定量下限、好ましくは検出下限を求める。ピークの形状は、ピークの分離度とクロマトグラムの傾きにより判定される。クロマトグラフィーによる検出シグナルのピークの有無を判定する方法としては、既存のデータ処理ソフトウェア、例えばＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ（島津製作所）、ＧＲＡＭＳ／ＡＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ社）などを用いたピーク検出が挙げられる。ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎを用いたピークの有無の判定方法を例示すると、具体的には、まずピークを検出させたい保持時間の区間を指定する。次に、ノイズなど不要なピークを除去するために、各種パラメータを設定する。例えば、パラメータ「ＷＩＤＴＨ」を不要なピークの半値幅よりも大きくする、パラメータ「ＳＬＯＰＥ」を不要なピークの立ち上り傾斜より大きくする、パラメータ「ＤＲＩＦＴ」の設定を変えることにより分離度の低いピークを垂直分割するかベースライン分割するか選択する、などが挙げられる。パラメータの値は、分析条件、選択した遺伝子マーカーの種類、検体の量などにより、異なるクロマトグラムが得られるため、クロマトグラムに応じて適切な値を設定すればよい。ピークの判定は、ＤＮＡメチル化率が０％のピークと１００％のピークそれぞれの立ち上がりおよび立ち下がりが含まれる保持時間の範囲で判定されることが好ましい。サンプルＤＮＡから複数のピークが検出された場合は、陽性対照のピークに最も近接したピークの保持時間をサンプルＤＮＡの保持時間として採用してもよいが、各ピークの保持時間の平均値をサンプルＤＮＡ全体の保持時間として採用してもよい。
【００９９】
保持時間、すなわちピークトップの時間は、上記のデータ処理ソフトウェアで自動的に計算することができる。例えば、クロマトグラムを一次微分し、微分係数が正から負へ変化する時間をピークトップの時間として取得することができる。
【０１００】
上記クロマトグラフィーによる検出シグナルの保持時間に基づいて、被験体がリンチ症候群か否かをスクリーニングすることができる。例えば、サンプルＤＮＡのクロマトグラフィーの結果、図１のＴ検体が示すような早い保持時間にピークを有する検出シグナルが得られた場合、標的ＤＮＡのメチル化率は高い。これは、標的ＤＮＡがメチル化によりサイレンシングされた腫瘍を含む組織または細胞に由来することを表す。一方、サンプルＤＮＡのクロマトグラフィーの結果、図２のＴ検体が示すような遅い保持時間にピークを有する検出シグナルが得られた場合、標的ＤＮＡのメチル化率は低い。これは、標的ＤＮＡがメチル化によりサイレンシングされていない腫瘍を含む組織または細胞に由来することを表す。
【０１０１】
本発明によれば、上記の手順で得られた腫瘍を含む被験組織または細胞由来のサンプルＤＮＡからのクロマトグラフィー検出シグナルのピークに基づいて、該腫瘍がリンチ症候群関連腫瘍であるか否かを判定することができる。例えば、上記検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークである場合には、上記腫瘍を、リンチ症候群関連腫瘍ではないと判定する。一方で、上記検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークでない場合（例えば、低メチル化ＤＮＡを示すピークである場合）には、上記腫瘍を、リンチ症候群関連腫瘍の疑いありと判定する。あるいは、上記検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークである場合には、上記腫瘍を有する被験体を、リンチ症候群ではないと判定する。一方で、上記検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークでない場合（例えば、低メチル化ＤＮＡを示すピークである場合）には、上記腫瘍を有する被験体を、リンチ症候群の疑いありと判定する。
【０１０２】
あるいは、上記の手順で得られた被験体の非腫瘍組織または細胞由来のサンプルＤＮＡのクロマトグラフィーで得られた検出シグナルのピークに基づいて、該被験体におけるリンチ症候群関連腫瘍の発症リスクを判定することができる。例えば、上記検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークである場合には、上記被験体のリンチ症候群関連腫瘍発症リスクは低いと判定する。一方で、上記検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークでない場合（例えば、低メチル化ＤＮＡを示すピークである場合）には、上記被験体のリンチ症候群関連腫瘍発症リスクは高いと判定する。
【０１０３】
よって本発明においては、クロマトグラフィー検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークであるサンプルＤＮＡは、リンチ症候群関連腫瘍を発症しているかもしくはその発症リスクの高い被験体由来でないＤＮＡ、または該被験体の組織もしくは細胞由来でないＤＮＡの候補として選択される。一方、クロマトグラフィー検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークでないサンプルＤＮＡは、リンチ症候群を発症しているかもしくはその発症リスクの高い被験体由来のＤＮＡ、または該被験体の組織もしくは細胞由来のＤＮＡの候補として選択される。
【０１０４】
本発明における腫瘍または被験体についてのリンチ症候群か否かの判定、及びリンチ症候群関連腫瘍の発症リスクの判定においては、上記ＤＮＡメチル化測定に加え、上記被験体から採取された腫瘍に対してＭＳＩ検査を実施することができる。該ＭＳＩ検査の結果、腫瘍がマイクロサテライト不安定性陽性（ＭＳＩ−Ｈ）であれば、上記被験体がリンチ症候群患者である可能性がさらに高まる。したがって、上記ＤＮＡメチル化測定とＭＳＩ検査とを組み合わせることで、被験体がリンチ症候群か否か、または被験体のリンチ症候群関連腫瘍の発症リスクをより精度よく判定することができる。
【０１０５】
ＭＳＩ検査では、被験体の腫瘍組織または細胞と、非腫瘍組織または細胞とのそれぞれから採取されたゲノムＤＮＡをＭＳＩ検査にかける。ＭＳＩ検査では、腫瘍組織または細胞と非腫瘍組織または細胞との間で、マイクロサテライトマーカーで検出されるマイクロサテライト反復回数を比較する。いずれかのマーカーにより腫瘍と非腫瘍との間で異なった反復回数が検出されれば該腫瘍はＭＳＩであり、２種類以上のマーカーについてＭＳＩであれば、該腫瘍はＭＳＩ−Ｈであると判定される。ＭＳＩ検査の結果、該腫瘍がＭＳＩ−Ｈであり、かつ上記クロマトグラフィーで得られた検出シグナルのピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークである場合には、上記被験体をリンチ症候群患者であると判定するか、または該被験体の組織または細胞をリンチ症候群患者から得られた組織または細胞であると判定する。あるいは、上記被験体をリンチ症候群関連腫瘍の発症リスクが高いと判定する。上記ＭＳＩ検査に使用されるマイクロサテライトマーカーは、臨床のＭＳＩ検査で一般的に使用されるものであれば特に限定されないが、好ましくはＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ２Ｓ１２３、Ｄ５Ｓ３４６およびＤ１７Ｓ２５０である。
【０１０６】
上記ＭＳＩ検査にかける腫瘍組織または細胞のゲノムＤＮＡは、上記亜硫酸水素塩処理のために調製したゲノムＤＮＡであってもよいが、同じ被験体から新たに調製したものであってもよい。新たに調製する場合に用いられる被験体の組織または細胞は、腫瘍を含む組織であればよく、上記亜硫酸水素塩処理用ゲノムＤＮＡの調製に用いたものと同種の組織または細胞であっても、異なる種類の組織または細胞であってもよい。また上記ＭＳＩ検査は、上記ＤＮＡメチル化測定より先に実施しても、後に実施してもよい。
【０１０７】
あるいは、上記ＭＳＩ検査に換えて、または上記ＭＳＩ検査に加えて、腫瘍の免疫組織化学検査をおこなってもよい。腫瘍組織または細胞の免疫組織化学検査においてＭＬＨ１の発現がないかもしくは低下していると判定された場合、上記被験体をリンチ症候群患者であると判定するか、または該被験体の組織または細胞をリンチ症候群患者から得られた組織または細胞であると判定する。あるいは、上記被験体をリンチ症候群関連腫瘍の発症リスクが高いと判定する。上記免疫組織化学検査にかける腫瘍組織または細胞は、上記亜硫酸水素塩処理用ゲノムＤＮＡの調製に用いたものと同じ組織または細胞であっても、同じ被験体から新たに調製したものであってもよい。
【０１０８】
またあるいは、上記ＭＳＩ検査および／または免疫組織化学検査に換えて、アムステルダム基準ＩＩまたは改定ベセスダガイドラインによるリンチ症候群のスクリーニングを実施してもよい。これらのスクリーニングの結果がリンチ症候群の疑いを表し、かつ上記クロマトグラフィーで得られた検出シグナルのピークが低メチル化ＤＮＡを示すピークである場合には、上記被験体をリンチ症候群患者であると判定するか、または該被験体の組織または細胞をリンチ症候群患者から得られた組織または細胞であると判定する。あるいは、上記被験体をリンチ症候群関連腫瘍の発症リスクが高いと判定する。
【０１０９】
上記クロマトグラフィーとＭＳＩ検査および／または免疫組織化学検査との組み合わせ判定によってリンチ症候群患者と判定された被験体は、さらに、遺伝学的検査により確定診断を受けてもよい。遺伝性大腸癌診療ガイドラインに示されるように、リンチ症候群の確定診断は、ミスマッチ修復遺伝子の遺伝学的検査（生殖細胞系列の遺伝子解析）により病的変異を同定することにより診断される（大腸癌研究会「遺伝性大腸癌診療ガイドライン  ２０１２年版」金原出版，２０１２）。ミスマッチ修復遺伝子の遺伝学的検査に用いる生体試料は、当該遺伝子の含まれている組織であれば限定されないが、侵襲性の低さの点から一般に採血により得られるリンパ球を用いる。当該遺伝子の解析方法には、一般にダイレクトシークエンス法が用いられる。変異が見つからない場合、遺伝子の一部が大きく欠損もしくは重複している、または再構成している可能性があるため、さらにＭＬＰＡ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法やサザンブロット法等を用いて当該遺伝子を解析する。
【０１１０】
本発明の方法の被験体が、腫瘍に罹患した患者であって、（i）当該腫瘍がＭＳＩ検査でＭＳＩ−Ｈと判定されているか、および／または当該腫瘍が免疫組織化学検査でＭＬＨ１の発現がないかもしくは低下していると判定されており、かつ（ii）遺伝学的検査によりＭＬＨ１に変異が認められない、と判定されている患者である場合、本発明の方法は、該被験体がリンチ症候群ではないことの確認に応用できる。すなわち、上記クロマトグラフィーで得られたサンプルＤＮＡからの検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークである場合には、上記腫瘍をリンチ症候群関連腫瘍ではないと判定するか、あるいは、上記腫瘍を有する被験体を、リンチ症候群ではないと判定する。あるいは、該クロマトグラフィー検出シグナルのピークが高メチル化ＤＮＡを示すピークであるサンプルＤＮＡを、リンチ症候群患者由来でないＤＮＡとして選択する。当該方法は、従来の遺伝学的検査でＭＬＨ１の異常が見られない患者に対するリンチ症候群の可能性を否定するための鑑別診断に有用である。
【実施例】
【０１１１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１１２】
〔患者および組織サンプル〕
がん研有明病院（日本国東京都江東区）が保有する、４名の患者から得られた大腸癌手術標本（Ｔｕｍｏｒ：以下、Ｔ検体またはＴとする）および末梢血（Ｎｏｒｍａｌ：以下、Ｎ検体またはＮとする）をそれぞれ解析した。なお、Ｔ検体はパラフィンブロックである。各患者はそれぞれ下記の１群〜４群に分類される。各群は、パイロシークエンスによるＤＮＡメチル化解析により、１群と４群がメチル化陽性群、２群と３群がメチル化陰性群であることが判明している。【０１１３】
１群：患者ＩＤ：Ｓ−１
Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｍｕｔａｔｉｏｎ症例の大腸癌患者。
当該患者は、生殖細胞系列のＭＬＨ１が高メチル化していることが確認されている。当該患者のＴ検体は、片アレルの高メチル化に加え、もう一方のアレルは高メチル化あるいはＬＯＨ（Ｌｏｓｓ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ：ヘテロ接合性の消失）による欠損があることが確認されている。当該患者のＮ検体は、片アレルのみ高メチル化があることが確認されている。【０１１４】
２群：患者ＩＤ：Ｓ−２
リンチ症候群患者。
当該患者は、マイクロサテライト不安定性検査が陽性であり（ＭＳＩ−Ｈ）、ＭＬＨ１のメチル化がほぼなく、ＭＬＨ１の変異が確認されている。【０１１５】
３群：患者ＩＤ：Ｓ−３
通常症例の大腸癌患者。
当該患者は、マイクロサテライト不安定性検査陰性（ＭＳＳ）、ＭＬＨ１メチル化がほぼないことが確認されている。【０１１６】
４群：患者ＩＤ：Ｓ−４
大腸癌患者。
当該患者は、マイクロサテライト不安定性検査が陽性であり（ＭＳＩ−Ｈ）、免疫組織化学にてＭＬＨ１タンパクの発現消失、およびパイロシークエンサーにてＭＬＨ１プロモーター領域の高メチル化が確認されている。【０１１７】
〔実施例１〕イオン交換クロマトグラフィーによるメチル化ＤＮＡの検出
（１）アニオン交換カラムの調製
攪拌機付き反応器中の３重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液２０００ｍＬに、テトラエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学工業社製）２００ｇ、トリエチレングリコールジメタアクリレート（新中村化学工業社製）１００ｇ、グリシジルメタクリレート（和光純薬工業社製）１００ｇおよび過酸化ベンゾイル（キシダ化学社製）１．０ｇの混合物を添加した。攪拌しながら加熱し、窒素雰囲気下にて８０℃で１時間重合した。次に、強カチオン性基を有する親水性単量体として、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬工業社製）１００ｇをイオン交換水に溶解した。これを同じ反応器に添加して、同様にして、攪拌しながら窒素雰囲気下にて８０℃で２時間重合した。得られた重合組成物を水およびアセトンで洗浄することにより、４級アンモニウム基を有する親水性重合体の層を表面に有する被覆重合体粒子を得た。得られた被覆重合体粒子について、粒度分布測定装置（ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７８０／Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて測定したところ、平均粒子径は１０μｍであった。【０１１８】
得られた被覆重合体粒子１０ｇをイオン交換水１００ｍＬに分散させ、反応前スラリーを準備した。次いで、このスラリーを撹拌しながら、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン（和光純薬工業社製）を１０ｍＬ加え、７０℃で４時間反応させた。反応終了後、遠心分離機（日立製作所社製、「Ｈｉｍａｃ  ＣＲ２０Ｇ」）を用いて上澄みを除去し、イオン交換水で洗浄した。洗浄後、遠心分離機を用いて上澄みを除去した。このイオン交換水による洗浄を更に４回繰り返し、基材粒子の表面に４級アンモニウム基と３級アミノ基とを有するイオン交換クロマトグラフィー用充填剤を得た。【０１１９】
上記イオン交換クロマトグラフィー用充填剤を液体クロマトグラフィーシステムのステンレス製カラム（カラムサイズ：内径４．６ｍｍ×長さ２０ｍｍ）に充填した。【０１２０】
（２）ゲノムＤＮＡの抽出と亜硫酸水素塩処理
各患者のＴ検体を、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて処理し、高分子量ＤＮＡを抽出した。各患者のＮ検体を、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて処理し、高分子量ＤＮＡを抽出した。各ＤＮＡ５００ｎｇを、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて亜硫酸水素塩処理した。【０１２１】
（３）ＰＣＲ
上記（２）で得られた亜硫酸水素塩処理ゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅した。増幅領域は、ＭＬＨ１プロモーターの表２記載のＰＣＲプライマーで挟まれる９９ｂｐ領域（Ｒｅｇｉｏｎ  ＤｆＣｒ）とした。ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡ  １０ｎｇ、ＧｅｎｅＡｍｐ  １×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、２００μｍｏｌ／Ｌ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．７５Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、０．２５μｍｏｌ／Ｌ  ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅプライマーを含んだ２５μＬの反応液で行った。なお、鋳型ＤＮＡにおけるプライマー結合領域にＣｐＧサイトが含まれるため、上記プライマーは、非メチルＤＮＡ対応プライマーとメチルＤＮＡ対応プライマーとをモル比５０：５０となるよう混合して使用された。ＰＣＲでは、９５℃５分間初期熱変性を行った後、９４℃３０秒→５７℃３０秒→７２℃４０秒を１サイクルとして４５サイクル続け、さらに７２℃１０分の伸張反応を行った。ＰＣＲ終了後、反応液５μＬにｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １μＬを混ぜた後、ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅを添加した３％アガロースゲルにアプライして電気泳動し、目的のＰＣＲ増幅産物が得られたことを確認した。陽性対照（１００％メチル化ＤＮＡ）および陰性対照（０％メチル化ＤＮＡ）としては、市販のコントロールＤＮＡ（ＥＰＩＴＥＣＴ（登録商標）ＰＣＲ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＤＮＡ，ＱＩＡＧＥＮ）を用いた。０％および１００％メチル化ＤＮＡのＰＣＲ増幅産物の配列、ならびに各ＰＣＲプライマーの配列を表２に示した。【０１２２】
【表２】
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【０１２３】
（４）ＨＰＬＣ分析
（１）で準備したアニオン交換カラムを用いて、以下の条件でイオン交換クロマトグラフィーを行い、（３）で得られた各ＰＣＲ増幅産物を分離検出した。
システム：ＬＣ−２０Ａシリーズ（島津製作所社製）
溶離液：溶離液Ａ  ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
溶離液Ｂ  ２５ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
＋１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム
分析時間：１５分
溶出法：以下のグラジエント条件により溶離液Ｂの混合比率を直線的に増加させた。
０分（溶離液Ｂ４０％）→１０分（溶離液Ｂ１００％）
検体：（２）で得られたＰＣＲ増幅産物
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２６０ｎｍ
試料注入量：５μＬ
カラム温度：７０℃【０１２４】
ＤＮＡメチル化率の判定は、陽性対照（１００％メチル化ＤＮＡ）および陰性対照（０％メチル化ＤＮＡ）のピークの保持時間とＤＮＡメチル化率とを関連付け、２点検量線を作成して行った。陽性対照と陰性対照の保持時間の平均値をメチル化率５０％のＤＮＡの保持時間（基準値）として算出した。検体ＤＮＡの検出シグナルのピークの保持時間が基準値以下の場合、該ＤＮＡを「高メチル化ＤＮＡ」、基準値より長い場合、該ＤＮＡを「低メチル化ＤＮＡ」と判定した。【０１２５】
（５）クロマトグラムに基づく大腸癌を含む組織の判定
患者ＩＤ：Ｓ−１から得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図１に、患者ＩＤ：Ｓ−２から得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図２に、患者ＩＤ：Ｓ−３から得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図３に、患者ＩＤ：Ｓ−４から得られたＨＰＬＣクロマトグラムを図４に示す。【０１２６】
患者ＩＤ：Ｓ−１のＴ検体は、片方のアレルが高メチル化されており、もう一方のアレルも高メチル化あるいはＬＯＨによる欠損の検体であることから、高メチル化率のピークが検出されると考えられた。また、Ｎ検体は片アレルのみメチル化されていることから、高メチル化ＤＮＡを示すピークと非メチル化ＤＮＡを示すピークの両方が検出されると考えられた。ＨＰＬＣ分析結果において、Ｔ検体では陽性対照（１００％メチル化ＤＮＡ）とほぼ同じ溶出時間（４．０８分付近）にてピークが検出された。Ｎ検体では陽性対照よりやや遅い溶出時間（４．１３分付近）と陰性対照（０％メチル化ＤＮＡ）のピークとほぼ同じ溶出時間（４．２５分付近）にそれぞれピークが検出され、実質的に二峰のクロマトグラムが得られた。本結果より、ＨＰＬＣによって、Ｔ検体の当該ＤＮＡ領域がほぼ１００％メチル化されていること、Ｎ検体の当該ＤＮＡ領域が非メチル／高メチルのヘテロであることが確認できた。すなわち、Ｔ検体のＨＰＬＣクロマトグラムより、患者ＩＤ：Ｓ−１が非リンチ症候群患者であると判定できる。また、Ｎ検体のＨＰＬＣクロマトグラムより、少なくともＭＬＨ１領域のＤＮＡがヘミメチル化されており、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｍｕｔａｔｉｏｎ症例の疑いがある患者であると判定できる。【０１２７】
患者ＩＤ：Ｓ−２のＴ検体は、ＭＳＩ検査がＭＳＩ−Ｈであり、ＭＬＨ１のメチル化がほぼない検体であることから、低メチル化ＤＮＡのピークが検出されると考えられた。また、Ｎ検体もＭＬＨ１のメチル化がほぼないことから、低メチル化ＤＮＡを示すピークが検出されると考えられた。ＨＰＬＣ分析結果において、Ｔ検体およびＮ検体の両方が、陰性対照（０％メチル化ＤＮＡ）のピークとほぼ同じ溶出時間（４．２８分付近）にそれぞれピークが検出された。本結果より、ＨＰＬＣによって、Ｔ検体とＮ検体の両方が当該ＤＮＡ領域において低メチル化であることが確認できた。すなわち、Ｔ検体のＨＰＬＣクロマトグラムより、患者ＩＤ：Ｓ−２がリンチ症候群患者である可能性があることを判定できる。【０１２８】
患者ＩＤ：Ｓ−３のＴ検体は、ＭＳＩ検査がＭＳＳであり、ＭＬＨ１のメチル化がほぼない検体であることから、低メチル化率のピークが検出されると考えられた。また、Ｎ検体もＭＬＨ１のメチル化がほぼないことから、低メチル化ＤＮＡを示すピークが検出されると考えられた。ＨＰＬＣ分析結果において、Ｔ検体およびＮ検体の両方が、陰性対照（０％メチル化ＤＮＡ）のピークとほぼ同じ溶出時間（４．２５分付近）にそれぞれピークが検出された。本結果より、ＨＰＬＣによって、Ｔ検体とＮ検体の両方が当該ＤＮＡ領域において低メチル化であることが確認できた。すなわち、Ｔ検体のＨＰＬＣクロマトグラムより、患者ＩＤ：Ｓ−３はリンチ症候群患者である可能性があることを判定される。しかし、患者ＩＤ：Ｓ−３については、Ｔ検体のＨＰＬＣクロマトグラムとＭＳＩ検査を組み合わせることにより、非リンチ症候群患者であると判定できる。【０１２９】
患者ＩＤ：Ｓ−４のＴ検体は、ＭＳＩ検査がＭＳＩ−Ｈであり、免疫組織化学にてＭＬＨ１タンパクの発現消失が確認され、パイロシークエンサーにてＭＬＨ１プロモーター領域の高メチル化が確認された検体であることから、高メチル化率のピークが検出されると考えられた。また、Ｎ検体はＭＬＨ１のメチル化がほぼないことから、低メチル化ＤＮＡを示すピークが検出されると考えられた。ＨＰＬＣ分析結果において、Ｔ検体では陽性対照（１００％メチル化ＤＮＡ）とほぼ同じの溶出時間（４．１０分付近）にてピークが検出された。Ｎ検体では陰性対照（０％メチル化ＤＮＡ）のピークとほぼ同じ溶出時間（４．２５分付近）にピークが検出された。本結果より、ＨＰＬＣによって、Ｔ検体の当該ＤＮＡ領域がほぼ１００％メチル化されていること、Ｎ検体は当該ＤＮＡ領域において低メチル化であることが確認できた。すなわち、Ｔ検体のＨＰＬＣクロマトグラムより、患者ＩＤ：Ｓ−４が非リンチ症候群患者であると判定できる。【０１３０】
〔実施例２〕
リンチ症候群患者である患者ＩＤ：Ｓ−２検体について、実施例１と異なるプライマーを用いて、ＭＬＨ１遺伝子プロモーターの異なる領域のメチル化をＨＰＬＣクロマトグラムにより判定できるか検討した。カラムは、実施例１（１）のカラムを使用した。実施例１（２）〜（４）の手順に従い、ＤＮＡを亜硫酸水素塩処理、ＰＣＲ、およびＨＰＬＣにかけた。ＰＣＲでは、ＭＬＨ１遺伝子プロモーター領域の一部である５つの領域（Ｒｅｇｉｏｎ  Ａ〜Ｅ）を増幅した。さらに、上記ＰＣＲ増幅領域におけるメチル化率が０％（陰性対照）および１００％（陽性対照）のＤＮＡについても、それぞれ同様の手順でＨＰＬＣ分析した。０％および１００％メチル化ＤＮＡの各ＰＣＲ増幅産物の配列を表３および表４に、各ＰＣＲプライマーの配列を表５に示した。Ｒｅｇｉｏｎ  Ｂ〜Ｅについては、鋳型ＤＮＡにおけるプライマー結合領域にＣｐＧサイトが含まれるため、非メチルＤＮＡ対応プライマーとメチルＤＮＡ対応プライマーとをモル比５０：５０となるよう混合して使用した。【０１３１】
【表３】
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【０１３２】
【表４】
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【０１３３】
【表５】
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【０１３４】
Ｒｅｇｉｏｎ  ＡについてのＨＰＬＣクロマトグラムを図５に、Ｒｅｇｉｏｎ  ＢについてのＨＰＬＣクロマトグラムを図６に、Ｒｅｇｉｏｎ  ＣについてのＨＰＬＣクロマトグラムを図７に、Ｒｅｇｉｏｎ  ＤについてのＨＰＬＣクロマトグラムを図８に、Ｒｅｇｉｏｎ  ＥについてのＨＰＬＣクロマトグラムを図９に示す。図５〜９に示されるように、Ｒｅｇｉｏｎ  Ａ〜ＥのいずれにおいてもＴ検体からは低メチル化ＤＮＡを示すピークが得られた。すなわち、配列番号１で示されるＭＬＨ１プロモーター領域中のＲｅｇｉｏｎ  Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのいずれの領域のＤＮＡメチル化を調べた場合でも、患者ＩＤ：Ｓ−２がリンチ症候群の可能性があると判定することができた。したがって、患者のＴ検体について、ＭＬＨ１プロモーター領域の１以上のＣｐＧサイトのメチル化状態をＨＰＬＣクロマトグラムで判定することにより、リンチ症候群の可能性のある患者を判定できることが示された。【０１３５】
本実施例において、クロマトグラフィー分析を用いてＭＬＨ１プロモーター領域におけるメチル化を測定することで、リンチ症候群および非リンチ症候群の患者を高精度に判別することができることが示された。パイロシークエンス法による従来のメチル化解析に数日程度かかるのに対し、本発明の方法では約１０分でクロマトグラムが得られるので、迅速かつ容易にリンチ症候群のスクリーニングを行うことができる。本発明の方法は、従来のＭＳＩ検査等でリンチ症候群が疑われるが遺伝学的検査ではＭＬＨ１の異常が見られない患者において、リンチ症候群の可能性を否定するための鑑別診断に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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