(57)【要約】  新たな蛍光タンパク質を提供する。  本発明の新規タンパク質は、下記（Ｆ１）のタンパク質であることを特徴とする。（Ｆ１）  配列番号１のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１のアミノ酸配列において、５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｆ１）のタンパク質であることを特徴とする、新規タンパク質。
（Ｆ１）  配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質
【請求項２】
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
Ｘａａ５２が、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３が、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４が、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹである、請求項１記載の新規タンパク質。
【請求項３】
Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、下記（ａａ１）〜（ａａ１１）および（ａａ１２）のいずれか１つの組合せである、請求項１または２記載の新規タンパク質。
【表１】
2016204123.tif 000124
【請求項４】
２０５番目のアミノ酸Ｘａａ２０５が、Ｉに置換された、請求項１から３のいずれか一項記載の新規タンパク質。
【請求項５】
１９８番目のアミノ酸Ｘａａ１９８が、Ｌに置換された、請求項１から４のいずれか一項記載の新規タンパク質。
【請求項６】
１９８番目のアミノ酸Ｘａａ１９８が、Ｈに置換された、請求項１から４のいずれか一項記載の新規タンパク質。
【請求項７】
前記（Ｆ１）のタンパク質が、配列番号２〜１３、３４〜６６、および６７からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１から６のいずれか一項に記載の新規タンパク質。
【請求項８】
下記（ｆ１）のポリヌクレオチドであることを特徴とする、新規遺伝子。
（ｆ１）  配列番号１４の塩基配列からなり、
前記配列番号１４の塩基配列において、
１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、および１５６番目の塩基Ｎ１５６が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、および３９９番目の塩基Ｎ３９９が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２が、任意のアミノ酸をコードするコドンであるポリヌクレオチド
【請求項９】
前記配列番号１４の塩基配列において、
Ｎ１５４、Ｎ１５５、およびＮ１５６が、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ３９７、Ｎ３９８、およびＮ３９９が、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２が、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹをコードするコドンである、請求項８記載の新規遺伝子。
【請求項１０】
Ｎ１５４、Ｎ１５５、およびＮ１５６のコドン、Ｎ３９７、Ｎ３９８、およびＮ３９９のコドン、ならびにＮ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２のコドンの組合せが、下記（ａａ１’）〜（ａａ１１’）および（ａａ１２’）のいずれか１つのアミノ酸の組合せをコードするコドンの組合せである、請求項８または９記載の新規遺伝子。
【表２】
2016204123.tif 000125
【請求項１１】
Ｎ１５４、Ｎ１５５、およびＮ１５６のコドン、Ｎ３９７、Ｎ３９８、およびＮ３９９のコドン、ならびにＮ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２のコドンが、下記（ｎ１）〜（ｎ１７）および（ｎ１８）のいずれか１つの組合せである、請求項８から１０のいずれか一項に記載の新規遺伝子。
【表３】
2016204123.tif 000126
【請求項１２】
６１３番目の塩基Ｎ６１３、６１４番目の塩基Ｎ６１４、および６１５番目の塩基Ｎ６１５が、Ｉをコードするコドンに置換された、請求項８から１１のいずれか一項に記載の新規遺伝子。
【請求項１３】
５９２番目の塩基Ｎ５９２、５９３番目の塩基Ｎ５９３、および５９４番目の塩基Ｎ５９４のコドンが、Ｌをコードするコドンに置換された、請求項８から１２のいずれか一項に記載の新規遺伝子。
【請求項１４】
Ｎ５９２、Ｎ５９３、およびＮ５９４のコドンが、Ｈをコードするコドンに置換された、請求項８から１２のいずれか一項に記載の新規遺伝子。
【請求項１５】
前記（ｆ１）のポリヌクレオチドが、配列番号１５〜３２、６８〜１００、および１０１からなる群から選択された少なくとも１つの塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項８から１４のいずれか一項に記載の新規遺伝子。
【請求項１６】
請求項８から１５のいずれか一項に記載の新規遺伝子を含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項１７】
請求項８から１５のいずれか一項に記載の新規遺伝子を含むことを特徴とする、形質転換体。
【請求項１８】
前記形質転換体が、植物である、請求項１７記載の形質転換体。
【請求項１９】
宿主に、請求項８から１５のいずれか一項に記載の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とする、形質転換体の製造方法。
【請求項２０】
さらに、前記宿主に、前記新規遺伝子を発現させる発現工程を含む、請求項１９記載の形質転換体の製造方法。
【請求項２１】
前記宿主が、植物である、請求項１９または２０記載の形質転換体の製造方法。
【請求項２２】
請求項１から７のいずれか一項に記載の新規タンパク質に変異を導入した候補タンパク質から、配列番号１のアミノ酸配列における５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する選抜工程を含むことを特徴とする、新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法。
【請求項２３】
前記選抜工程において、
前記配列番号１のアミノ酸配列におけるＸａａ５２に対応するアミノ酸が、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹであり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する、請求項２２記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
前記選抜工程において、
前記配列番号１のアミノ酸配列におけるＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４に対応するアミノ酸の組合せが、下記（ａａ１）〜（ａａ１１）および（ａａ１２）のいずれか１つの組合せであり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する、請求項２２または２３記載のスクリーニング方法。
【表４】
2016204123.tif 000127
【請求項２５】
前記選抜工程において、
前記配列番号１のアミノ酸配列における２０５番目のアミノ酸Ｘａａ２０５に対応するアミノ酸が、Ｉに置換されており、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する、請求項２２から２４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
前記選抜工程において、
前記配列番号１のアミノ酸配列における１９８番目のアミノ酸Ｘａａ１９８に対応するアミノ酸が、Ｌに置換されており、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する、請求項２２から２５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
前記選抜工程において、
前記配列番号１のアミノ酸配列における１９８番目のアミノ酸Ｘａａ１９８に対応するアミノ酸が、Ｈに置換されており、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する、請求項２２から２５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２８】
請求項８から１５のいずれか一項に記載の新規遺伝子に変異を導入した変異ポリヌクレオチドがコードする候補タンパク質から、配列番号１のアミノ酸配列における５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する、請求項２２から２７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規タンパク質、新規遺伝子、発現ベクター、形質転換体、形質転換体の製造方法、および新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光タンパク質として、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）やＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）等が、一般的に用いられている（非特許文献１）。前記蛍光タンパク質は、研究等の様々な用途に使用されている。しかしながら、各種用途に適した蛍光タンパク質が、必ずしも存在するわけではない。このため、新たな蛍光タンパク質が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Chalfie  M  et  al.,  “Green  fluorescent  protein  as  a  marker  for  gene  expression”,  Science,  February  1994,  Vol.263,  no.5148,  p802-805.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、新たな蛍光タンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の新規タンパク質は、下記（Ｆ１）のタンパク質であることを特徴とする。
（Ｆ１）  配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質【０００６】
本発明の新規遺伝子は、下記（ｆ１）のポリヌクレオチドであることを特徴とする。
（ｆ１）  配列番号１４の塩基配列からなり、
前記配列番号１４の塩基配列において、
１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、および１５６番目の塩基Ｎ１５６が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、および３９９番目の塩基Ｎ３９９が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２が、任意のアミノ酸をコードするコドンであるポリヌクレオチド【０００７】
本発明の発現ベクターは、前記本発明の新規遺伝子を含むことを特徴とする。【０００８】
本発明の形質転換体は、前記本発明の新規遺伝子を含むことを特徴とする。【０００９】
本発明の形質転換体の製造方法は、宿主に、前記本発明の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とする。【００１０】
本発明の新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法は、前記本発明の新規タンパク質に変異を導入した候補タンパク質から、配列番号１のアミノ酸配列における５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する選抜工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、新規な蛍光タンパク質を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、実施例１における異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実施例１における異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例３における異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例３における異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施例３における異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例３における異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例３における異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、実施例３における異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。
【図３Ｄ】図３Ｄは、実施例３における異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例４における異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例５における各タンパク質発現がん細胞の蛍光強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜新規タンパク質＞
本発明の新規タンパク質は、前述のように、下記（Ｆ１）〜（Ｆ３）からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする。
（Ｆ１）  配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質
（Ｆ２）  前記（Ｆ１）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質
（Ｆ３）  前記（Ｆ１）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質
【００１４】
本発明者らは鋭意研究の結果、前記配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質において、５２番目、１３３番目、および１５４番目のアミノ酸が、前記タンパク質の蛍光活性と関連性を有することを見出した。具体的には、前記タンパク質の５２番目、１３３番目、および１５４番目のアミノ酸が、例えば、前記タンパク質の発色団と相互作用すると推定された。このため、本発明の新規タンパク質によれば、５２番目、１３３番目、および１５４番目のアミノ酸を任意のアミノ酸とすることにより、前記タンパク質の蛍光活性を調整でき、例えば、相対的に低い波長の励起光（例えば、紫外線（以下同様））においても、より強い蛍光を発するタンパク質や、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発するタンパク質を得られる。なお、上記推定は、本発明を何ら制限しない。
【００１５】
以下、前記新規タンパク質は、新規蛍光タンパク質ともいう。前記新規蛍光タンパク質は、本発明者らが新たに作製したタンパク質である。本発明において、前記新規蛍光タンパク質は、例えば、１種類のタンパク質を含んでもよいし、２種類以上のタンパク質を含んでもよい（以下、同様）。
【００１６】
前記（Ｆ１）における配列番号１のアミノ酸配列は、以下の通りである。以下のアミノ酸配列において、３箇所の四角で囲んだアミノ酸（Ｘ）は、１箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ５２、２箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ１３３、３箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸である。また、２箇所の下線を引いたアミノ酸（Ｘ）は、１箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ１９８、２箇所目のアミノ酸が、Ｘａａ２０５に対応するアミノ酸である。
【００１７】
2016204123.tif 000003
【００１８】
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ５２は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｃ、Ｍ、またはＴである。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ５２は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｈである。
【００１９】
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１３３は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴである。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１３３は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｔである。
【００２０】
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１５４は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹである。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１５４は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｋである。
【００２１】
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、特に制限されず、例えば、
Ｘａａ５２は、例えば、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３は、例えば、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４は、例えば、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹである。
【００２２】
前記（Ｆ１）において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、好ましくは、
Ｘａａ５２は、例えば、Ｃ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３は、例えば、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４は、例えば、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹである。
以下、前記（Ｆ１）がこのようなＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せを有する場合、前記（Ｆ１）を、（Ｂ１）ともいい、前記（Ｆ２）および（Ｆ３）において、前記（Ｆ１）が（Ｂ１）の場合、前記（Ｆ２）および（Ｆ３）を、それぞれ、（Ｂ２）および（Ｂ３）ともいう。また、以下の説明において、前記（Ｂ２）および（Ｂ３）は、例えば、前記（Ｆ２）および（Ｆ３）の説明において、（Ｆ１）を（Ｂ１）に、（Ｆ２）を（Ｂ２）に、（Ｆ３）を（Ｂ３）に、それぞれ読み替えて、その説明を援用できる。
【００２３】
具体例として、本発明の新規タンパク質において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、例えば、下記（ａａ１）〜（ａａ１１）および（ａａ１２）のいずれか１つの組合せである。また、本発明の新規タンパク質において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ１）、（ａａ３）、（ａａ６）、（ａａ９）、（ａａ１０）、または（ａａ１２）が好ましく、下記（ａａ１）、または（ａａ９）の組合せがより好ましい。また、本発明の新規タンパク質において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せは、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ２）の組合せが好ましい。本発明の新規タンパク質は、例えば、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、それぞれ、Ｈ、ＳおよびＲの組合せ、ならびにＤ、ＳおよびＲの組合せのタンパク質を除く。
【００２４】
【表１】
2016204123.tif 000004
【００２５】
本発明の新規タンパク質において、Ｘａａ２０５は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、Ｉに置換されていることが好ましい。また、本発明の新規タンパク質において、Ｘａａ１９８は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、ＬまたはＨに置換されていることが好ましい。前記新規タンパク質において、１９８番目および２０５番目のアミノ酸は、例えば、それぞれが、前記タンパク質の発色団と相互作用すると推定される。このため、１９８番目および２０５番目のアミノ酸の少なくとも一方について、上述の置換を行なうことにより、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発するタンパク質を得られると推定される。ただし、上記推定は、本発明を何ら制限しない。本発明の新規タンパク質において、Ｘａａ１９８およびＸａａ２０５は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、さらに強い蛍光を発することから、ＬおよびＩの組合せ、またはＨおよびＩの組合せに、それぞれ置換されていることがより好ましい。
【００２６】
前記（Ｆ１）のタンパク質は、例えば、配列番号２〜１３、３４〜６６、および６７からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。前記（Ｆ１）が配列番号２〜１３および３４〜６７のアミノ酸配列からなるタンパク質である場合、前記（Ｆ１）は、それぞれ、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４６）ともいい、前記（Ｆ２）は、それぞれ、（Ｆ２−１）〜（Ｆ２−４６）ともいい、前記（Ｆ３）は、それぞれ、（Ｆ３−１）〜（Ｆ３−４６）ともいう。
【００２７】
前記（Ｂ１）のタンパク質は、例えば、配列番号２、４、７、１０、１１、１３、および３４〜６７からなる群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。前記（Ｂ１）における各配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質の説明は、前記（Ｆ１）における各配列番号のアミノ酸配列からなるタンパク質の説明を援用できる。
【００２８】
前記（Ｆ１）における配列番号２〜１３および３４〜６７のアミノ酸配列は、以下の通りである。前記配列番号２〜１３のアミノ酸配列は、前記配列番号１のアミノ酸配列において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、それぞれ、前記（ａａ１）〜（ａａ１２）の組合せの場合に対応する。前記配列番号３４〜４８のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、前記（ａａ１）の組合せの場合に対応する。前記配列番号４９〜６７のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、前記（ａａ９）の組合せの場合に対応する。
【００２９】
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【００３０】
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【００３１】
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【００３２】
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【００３３】
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【００３４】
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【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
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【００４２】
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【００４３】
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【００４４】
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【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
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【００５３】
2016204123.tif 000029
【００５４】
2016204123.tif 000030
【００５５】
2016204123.tif 000031
【００５６】
2016204123.tif 000032
【００５７】
2016204123.tif 000033
【００５８】
2016204123.tif 000034
【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【００６３】
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【００６４】
2016204123.tif 000040
【００６５】
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【００６６】
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【００６７】
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【００６８】
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【００６９】
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【００７０】
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【００７１】
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【００７２】
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【００７３】
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【００７４】
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【００７５】
前記（Ｆ２）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質ということもできる。前記（Ｆ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（Ｆ２）が、前記蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（Ｆ２）のアミノ酸配列において、「１もしくは数個」は、例えば、１〜４３個、１〜３３個、１〜２２個、１〜１１個、１〜９個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。本発明において、個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１〜５個」との記載は、「１、２、３、４、５個」の全ての開示を意味する（以下、同様）。前記（Ｆ１）において、Ｘａａ２０５が、Ｉに置換されている場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ２０５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、およびＸａａ２０５が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１９８が、ＬまたはＨに置換されている場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ１９８が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、およびＸａａ１９８が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１９８およびＸａａ２０５が、ＬおよびＩの組合せ、またはＨおよびＩの組合せに、ぞれぞれ置換されている場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ１９８およびＸａａ２０５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ２）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、Ｘａａ１９８、およびＸａａ２０５が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。前記「１もしくは数個」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【００７６】
前記（Ｆ３）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質ということもできる。前記（Ｆ３）において、「同一性」は、例えば、前記（Ｆ３）が、前記蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（Ｆ３）のアミノ酸配列において、「同一性」は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記「同一性」は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。前記（Ｆ１）において、Ｘａａ２０５が、Ｉに置換されている場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ２０５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、およびＸａａ２０５が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。また、前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１９８が、ＬまたはＨに置換されている場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ１９８が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、およびＸａａ１９８が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。前記（Ｆ１）において、Ｘａａ１９８およびＸａａ２０５が、ＬおよびＩの組合せ、またはＨおよびＩの組合せに、ぞれぞれ置換されている場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、前記（Ｆ１）のＸａａ１９８およびＸａａ２０５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（Ｆ３）のタンパク質は、例えば、前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、Ｘａａ１５４、Ｘａａ１９８、およびＸａａ２０５が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質である。前記「同一性」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【００７７】
本発明の新規蛍光タンパク質は、例えば、以下のような化学的特性を有する。なお、以下で示す励起波長、励起極大波長、蛍光波長および蛍光極大波長は、例えば、３５０〜６５０ｎｍの波長の範囲における化学的特性である。
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３８６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５０６〜５２４ｎｍ
【００７８】
本発明の新規蛍光タンパク質が前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４６）である場合、前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４６）は、例えば、それぞれ、以下のような化学的特性を有する。なお、前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４６）の励起波長または蛍光波長において、複数の蛍光強度の極大値が存在する場合、複数の励起極大波長および蛍光極大波長を示している。
【００７９】
（Ｆ１−１）
励起波長：３５０〜５６０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００８０】
（Ｆ１−２）
励起波長：３５０〜６００ｎｍ
励起極大波長：５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００８１】
（Ｆ１−３）
励起波長：３５０〜６２０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
【００８２】
（Ｆ１−４）
励起波長：３５０〜６２５ｎｍ
励起極大波長：４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００８３】
（Ｆ１−５）
励起波長：３５０〜６１５ｎｍ
励起極大波長：５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００８４】
（Ｆ１−６）
励起波長：３５０〜６２５ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
【００８５】
（Ｆ１−７）
励起波長：３５０〜６２５ｎｍ
励起極大波長：４７６〜４８４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５０６〜５１４ｎｍ
【００８６】
（Ｆ１−８）
励起波長：３５０〜６０５ｎｍ
励起極大波長：４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００８７】
（Ｆ１−９）
励起波長：３５０〜６１５ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００８８】
（Ｆ１−１０）
励起波長：３５０〜５９０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
【００８９】
（Ｆ１−１１）
励起波長：３５０〜５７５ｎｍ
励起極大波長：４７６〜４８４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５０６〜５１４ｎｍ
【００９０】
（Ｆ１−１２）
励起波長：３５０〜５９５ｎｍ
励起極大波長：３８６〜３９４ｎｍ、５０６〜５１４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１６〜５２４ｎｍ
【００９１】
（Ｆ１−１３）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００９２】
（Ｆ１−１４）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００９３】
（Ｆ１−１５）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００９４】
（Ｆ１−１６）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００９５】
（Ｆ１−１７）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００９６】
（Ｆ１−１８）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００９７】
（Ｆ１−１９）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００９８】
（Ｆ１−２０）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【００９９】
（Ｆ１−２１）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１００】
（Ｆ１−２２）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ  
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１０１】
（Ｆ１−２３）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１０２】
（Ｆ１−２４）
励起波長：３５０〜６４５ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１０３】
（Ｆ１−２５）
励起波長：３５０〜５８０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１０４】
（Ｆ１−２６）
励起波長：３５０〜５６０ｎｍ
励起極大波長：３９６〜４０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１０５】
（Ｆ１−２７）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：３９１〜３９９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１０６】
（Ｆ１−２８）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１０７】
（Ｆ１−２９）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１０８】
（Ｆ１−３０）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１０９】
（Ｆ１−３１）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１１０】
（Ｆ１−３２）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１１１】
（Ｆ１−３３）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１１２】
（Ｆ１−３４）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１１３】
（Ｆ１−３５）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０６〜４１４ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１１４】
（Ｆ１−３６）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１１５】
（Ｆ１−３７）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１１６】
（Ｆ１−３８）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１１７】
（Ｆ１−３９）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４１６〜４２４ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１１８】
（Ｆ１−４０）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１１９】
（Ｆ１−４１）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１２０】
（Ｆ１−４２）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４１６〜４２４ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１２１】
（Ｆ１−４３）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４２１〜４２９ｎｍ、５０１〜５０９ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１２２】
（Ｆ１−４４）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１２３】
（Ｆ１−４５）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１２４】
（Ｆ１−４６）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ
励起極大波長：４０１〜４０９ｎｍ、４９６〜５０４ｎｍ
蛍光波長：３５０〜６５０ｎｍ
蛍光極大波長：５１１〜５１９ｎｍ
【０１２５】
前記励起波長、前記励起極大波長、前記蛍光波長、および前記蛍光極大波長の測定方法は、特に制限されず、例えば、ＪＩＳ  Ｋ０１２０に基づいて行うことができる。前記励起波長、前記励起極大波長、前記蛍光波長、および前記蛍光極大波長の測定方法は、例えば、後述する実施例１の測定方法に準じて行ってもよい。
【０１２６】
前記新規蛍光タンパク質は、蛍光活性を有していればよく、例えば、さらに、その他の活性を有してもよい。
【０１２７】
＜新規遺伝子＞
本発明の新規遺伝子は、前述のように、下記（ｆ１）〜（ｆ７）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする。
（ｆ１）  配列番号１４の塩基配列からなり、
前記配列番号１４の塩基配列において、
１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、および１５６番目の塩基Ｎ１５６（以下、「Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン」ともいう。）が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、および３９９番目の塩基Ｎ３９９（以下、「Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン」ともいう。）が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２（以下、「Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドン」ともいう。）が、任意のアミノ酸をコードするコドンであるポリヌクレオチド
（ｆ２）  前記（ｆ１）の１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、１５６番目の塩基Ｎ１５６、３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、３９９番目の塩基Ｎ３９９、４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２以外の塩基配列において、
１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ３）  前記（ｆ１）の１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、１５６番目の塩基Ｎ１５６、３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、３９９番目の塩基Ｎ３９９、４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２以外の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ４）  前記（ｆ１）の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、前記相補的な配列において、前記（ｆ１）の１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、１５６番目の塩基Ｎ１５６、３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、３９９番目の塩基Ｎ３９９、４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２に対応する塩基が保存され、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ５）  配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ６）  前記（ｆ５）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｆ７）  前記（ｆ５）の５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３、および１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４以外のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【０１２８】
前記新規遺伝子は、前記本発明の新規蛍光タンパク質をコードする遺伝子であることから、以下、新規蛍光タンパク質遺伝子ともいう。前記新規蛍光タンパク質遺伝子は、例えば、１種類のポリヌクレオチドを含んでもよいし、２種類以上のポリヌクレオチドを含んでもよい（以下、同様）。
【０１２９】
前記（ｆ１）における配列番号１４の塩基配列は、以下の通りである。以下の塩基配列において、３箇所の四角で囲んだ塩基配列（ＮＮＮ）は、１箇所目の塩基配列が、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、２箇所目の塩基配列が、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、３箇所目の塩基配列が、Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンに対応する塩基配列である。２箇所の下線を引いたコドンは、１箇所目のコドンが、５９２番目の塩基Ｎ５９２、５９３番目の塩基Ｎ５９３、および５９４番目の塩基Ｎ５９４、２箇所目のコドンが、６１３番目の塩基Ｎ６１３、６１４番目の塩基Ｎ６１４、および６１５番目の塩基Ｎ６１５に対応するコドンである。
【０１３０】
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【０１３１】
前記（ｆ１）において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドンは、任意のアミノ酸をコードするコドンである。前記任意のアミノ酸をコードするコドンは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹをコードするコドンであり、好ましくは、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴをコードするコドンであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｃ、Ｍ、またはＴをコードするコドンである。また、前記（ｆ１）において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドンは、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｈをコードするコドンである。
【０１３２】
前記（ｆ１）において、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドンは、任意のアミノ酸をコードするコドンである。前記任意のアミノ酸をコードするコドンは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹをコードするコドンであり、好ましくは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴをコードするコドンである。また、前記（ｆ１）において、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドンは、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｔをコードするコドンである。
【０１３３】
前記（ｆ１）において、Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、任意のアミノ酸をコードするコドンである。前記任意のアミノ酸をコードするコドンは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹをコードするコドンであり、好ましくは、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹをコードするコドンであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹをコードするコドンである。また、前記（ｆ１）において、Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｋをコードするコドンである。
【０１３４】
前記（ｆ１）において、Ｎ１５４、Ｎ１５５、およびＮ１５６のコドン、Ｎ３９７、Ｎ３９８、およびＮ３９９のコドン、ならびにＮ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２のコドンの組合せは、特に制限されず、例えば、
Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドンは、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドンは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹをコードするコドンである。
【０１３５】
前記（ｆ１）において、Ｎ１５４、Ｎ１５５、およびＮ１５６のコドン、Ｎ３９７、Ｎ３９８、およびＮ３９９のコドン、ならびにＮ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２のコドンの組合せは、例えば、前記新規蛍光タンパク質遺伝子がコードする新規蛍光タンパク質が、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、好ましくは、
Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドンは、Ｃ、Ｍ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドンは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴをコードするコドンであり、
Ｎ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹをコードするコドンである。
以下、前記（ｆ１）がこのようなＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せを有する場合、前記（ｆ１）を、（ｂ１）ともいい、前記（ｆ２）〜（ｆ４）において、前記（ｆ１）が（ｂ１）の場合、前記（ｆ２）〜（ｆ４）を、それぞれ、（ｂ２）〜（ｂ４）ともいう。また、以下の説明において、前記（ｂ２）〜（ｂ４）は、例えば、前記（ｆ２）〜（ｆ４）の説明において、（ｆ１）を（ｂ１）に、（ｆ２）を（ｂ２）に、（ｆ３）を（ｂ３）に、（ｆ４）を（ｂ４）にそれぞれ読み替えて、その説明を援用できる。
【０１３６】
具体例として、本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ１５４、Ｎ１５５、およびＮ１５６のコドン、Ｎ３９７、Ｎ３９８、およびＮ３９９のコドン、ならびにＮ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２のコドンの組合せは、例えば、下記（ａａ１’）〜（ａａ１１’）および（ａａ１２’）のいずれか１つのアミノ酸の組合せをコードするコドンの組合せである。本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、例えば、前記新規蛍光タンパク質遺伝子がコードする新規蛍光タンパク質が、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ１’）、（ａａ３’）、（ａａ６’）、（ａａ９’）、（ａａ１０’）、または（ａａ１２’）のアミノ酸の組合せをコードするコドンの組合せであることが好ましく、下記（ａａ１’）または（ａａ９’）のアミノ酸の組合せをコードするコドンの組合せであることが好ましい。また、本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ２’）のアミノ酸の組合せをコードするコドンの組合せであることが好ましい。本発明の新規遺伝子は、例えば、Ｎ１５４、Ｎ１５５、およびＮ１５６のコドン、Ｎ３９７、Ｎ３９８、およびＮ３９９のコドン、ならびにＮ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２のコドンの組合せが、それぞれ、Ｈ、ＳおよびＲをコードするコドンの組合せ、ならびにＤ、ＳおよびＲをコードするコドンの組合せの遺伝子を除く。
【０１３７】
【表２】
2016204123.tif 000052
【０１３８】
本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、例えば、下記（ｎ１）〜（ｎ１７）および（ｎ１８）のいずれか１つの組合せである。本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、例えば、前記新規蛍光タンパク質遺伝子がコードする新規蛍光タンパク質が、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、下記（ｎ１）、（ｎ２）、（ｎ３）、（ｎ６）、（ｎ１０）、（ｎ１１）、（ｎ１４）、（ｎ１５）、（ｎ１６）、および（ｎ１８）のいずれか１つの組合せが好ましく、相対的に低い波長の励起光において、さらに強い蛍光を発することから、下記（ｎ１）、（ｎ２）、（ｎ３）、（ｎ１４）および（ｎ１５）のいずれか１つの組合せが好ましい。また、本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンは、例えば、前記新規蛍光タンパク質遺伝子がコードする新規蛍光タンパク質が、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、下記（ｎ４）または（ｎ５）の組合せが好ましい。
【０１３９】
【表３】
2016204123.tif 000053
【０１４０】
本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５のコドンは、前記新規蛍光タンパク質遺伝子がコードする新規蛍光タンパク質が、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、例えば、Ｉをコードするコドンに置換されていることが好ましい。この場合、Ｉをコードするコドンは、ＡＴＡであることが好ましい。また、本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ５９２、Ｎ５９３、およびＮ５９４のコドンは、前記新規蛍光タンパク質遺伝子がコードする新規蛍光タンパク質が、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、例えば、ＬまたはＨをコードするコドンに置換されていることが好ましい。この場合、Ｌをコードするコドンは、ＣＴＣであることが好ましく、Ｈをコードするコドンは、ＣＡＣであることが好ましい。本発明の新規蛍光タンパク質遺伝子において、Ｎ５９２、Ｎ５９３、およびＮ５９４、ならびに、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、さらに強い蛍光を発することから、ＬおよびＩをコードするコドンの組合せ、またはＨおよびＩをコードするコドンの組合せに置換されていることがより好ましい。この場合、ＬおよびＩをコードするコドンは、それぞれ、ＣＴＣおよびＡＴＡであることが好ましく、ＨおよびＩをコードするコドンは、それぞれ、ＣＡＣおよびＡＴＡであることが好ましい。
【０１４１】
前記（ｆ１）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１５〜３２、６８〜１００、および１０１からなる群から選択された少なくとも１つの塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。前記（ｆ１）が配列番号１５〜３２、および６８〜１０１からなる塩基配列である場合、前記（ｆ１）は、それぞれ、（ｆ１−１）〜（ｆ１−５２）ともいい、前記（ｆ２）は、それぞれ、（ｆ２−１）〜（ｆ２−５２）ともいい、前記（ｆ３）は、それぞれ、（ｆ３−１）〜（ｆ３−５２）ともいい、前記（ｆ４）は、それぞれ、（ｆ４−１）〜（ｆ４−５２）ともいい、前記（ｆ５）は、それぞれ、（ｆ５−１）〜（ｆ５−５２）ともいい、前記（ｆ６）は、それぞれ、（ｆ６−１）〜（ｆ６−５２）ともいい、前記（ｆ７）は、それぞれ、（ｆ７−１）〜（ｆ７−５２）ともいう。
【０１４２】
前記（ｂ１）のポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１５〜１７、２０、２４、２５、２８〜３０、３２、および６８〜１０１からなる群から選択された少なくとも１つの塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。前記（ｂ１）における各配列番号の塩基配列からなるポリヌクレオチドの説明は、前記（ｆ１）における各配列番号の塩基配列からなるポリヌクレオチドの説明を援用できる。
【０１４３】
前記（ｆ１）における配列番号１５〜３２、および６８〜１０１の塩基配列は、以下の通りである。前記配列番号１５〜３２の塩基配列は、それぞれ、前記配列番号１４の塩基酸配列において、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンが、前記（ｎ１）〜（ｎ１８）の場合に対応する。また、下記（ｆ１−１）〜（ｆ１−３）は、前記（Ｆ１−１）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−４）および（ｆ１−５）は、前記（Ｆ１−２）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−６）は、前記（Ｆ１−３）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−７）および（ｆ１−８）は、前記（Ｆ１−４）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−９）は、前記（Ｆ１−５）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１０）および（ｆ１−１１）は、前記（Ｆ１−６）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１２）は、前記（Ｆ１−７）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１３）は、前記（Ｆ１−８）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１４）および（ｆ１−１５）は、前記（Ｆ１−９）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１６）は、前記（Ｆ１−１０）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１７）は、前記（Ｆ１−１１）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであり、下記（ｆ１−１８）は、前記（Ｆ１−１２）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。前記配列番号６８〜８２の塩基配列は、前記配列番号１４の塩基配列においてＮ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンが、前記（ｎ３）の場合に対応する。また、下記（ｆ１−１９）〜（ｆ１−３３）は、それぞれ、前記（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−２７）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。前記配列番号８３〜１０１の塩基配列は、前記配列番号１４の塩基配列においてＮ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンが、前記（ｎ１５）の場合に対応する。また、下記（ｆ１−３４）〜（ｆ１−５２）は、それぞれ、前記（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−４６）のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。
【０１４４】
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【０１４５】
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【０１４６】
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【０１４７】
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【０１４８】
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【０１４９】
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【０１５０】
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【０１５１】
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【０１５２】
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【０１５３】
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【０１５４】
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【０１５５】
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【０１５６】
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【０１５７】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
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【０１６１】
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【０１６２】
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【０１６３】
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【０１６４】
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【０１６５】
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【０１６６】
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【０１６７】
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【０１６８】
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【０１６９】
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【０１７０】
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【０１７１】
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【０１７２】
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【０１７３】
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【０１７４】
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【０１７５】
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【０１７６】
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【０１７７】
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【０１７８】
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【０１７９】
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【０１８０】
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【０１８１】
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【０１８２】
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【０１８３】
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【０１８４】
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【０１８５】
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【０１８６】
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【０１８７】
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【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
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【０１９１】
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【０１９２】
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【０１９３】
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【０１９４】
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【０１９５】
2016204123.tif 000105
【０１９６】
前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２が保存され、前記（ｆ１）のポリヌクレオチドにおいて、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドということもできる。前記（ｆ２）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（ｆ２）の「１もしくは数個」は、例えば、１〜１３２個、１〜９９個、１〜６６個、１〜３３個、１〜２６個、１〜２０個、１〜１３個、１〜７個、１個、２個、３個、または４個である。前記（ｆ１）において、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が、Ｉをコードするコドンに置換されている場合、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、前記（ｆ１）のＮ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。また、前記（ｆ１）において、Ｎ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４が、ＬまたはＨをコードするコドンに置換されている場合、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、前記（ｆ１）のＮ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記（ｆ１）において、Ｎ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４、ならびに、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が、ＬおよびＩをコードするコドンの組合せ、またはＨおよびＩをコードするコドンの組合せに、それぞれ置換されている場合、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ５９２、Ｎ５９３、Ｎ５９４、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｆ２）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ５９２、Ｎ５９３、Ｎ５９４、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記「１もしくは数個」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【０１９７】
前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、およびＮ４６２が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドということもできる。前記（ｆ３）において、「同一性」は、例えば、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（ｆ３）の同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記（ｆ１）において、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が、Ｉをコードするコドンに置換されている場合、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、前記（ｆ１）のＮ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。また、前記（ｆ１）において、Ｎ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４が、ＬまたはＨをコードするコドンに置換されている場合、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、前記（ｆ１）のＮ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記（ｆ１）において、Ｎ５９２、Ｎ５９３およびＮ５９４、ならびに、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が、ＬおよびＩをコードするコドンの組合せ、またはＨおよびＩをコードするコドンの組合せに、それぞれ置換されている場合、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ５９２、Ｎ５９３、Ｎ５９４、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存されていることが好ましい。この場合、前記（ｆ３）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ１）のＮ１５４、Ｎ１５５、Ｎ１５６、Ｎ３９７、Ｎ３９８、Ｎ３９９、Ｎ４６０、Ｎ４６１、Ｎ４６２、Ｎ５９２、Ｎ５９３、Ｎ５９４、Ｎ６１３、Ｎ６１４、およびＮ６１５が保存され、前記（ｆ１）の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。前記「同一性」は、例えば、前述の説明を援用できる。
【０１９８】
前記（ｆ４）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ｆ１）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular  Cloning：  A  Laboratory  Manual  2nd  Ed.）」〔Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press  （１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
【０１９９】
前記（ｆ４）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Molecular  Cloning：  A  Laboratory  Manual  2nd  Ed.）」〔Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press  （１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
【０２００】
前記（ｆ５）のポリヌクレオチドは、例えば、前記（ｆ５）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、蛍光活性を有する塩基配列であればよい。前記（ｆ５）のポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４のアミノ酸に基づいて、対応するコドンに置き換えることで設計可能である。前記（ｆ５）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質は、例えば、前記本発明の新規タンパク質における（Ｆ１）のタンパク質ということもでき、その説明を援用できる。
【０２０１】
前記（ｆ５）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質、すなわち前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４のアミノ酸の組合せが、前記（Ｂ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４のアミノ酸の組合せである場合、前記（ｆ５）を、（ｂ５）ともいい、前記（ｆ６）および（ｆ７）において、前記（ｆ５）が（ｂ５）の場合、前記（ｆ６）および（ｆ７）を、それぞれ（ｂ６）および（ｂ７）ともいう。また、以下の説明において、また、以下の説明において、前記（ｂ６）および（ｂ７）は、例えば、前記（ｆ６）および（ｆ７）の説明において、（ｆ６）を（ｂ６）に、（ｆ７）を（ｂ７）に、（Ｆ２）を（Ｂ２）に、（Ｆ３）を（Ｂ３）に、それぞれ読み替えて、その説明を援用できる。
【０２０２】
前記（ｆ６）において、アミノ酸配列に関する「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｆ６）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（ｆ６）の「１もしくは数個」は、例えば、１〜４３個、１〜３３個、１〜２２個、１〜１１個、１〜９個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。前記（ｆ６）のタンパク質は、前記本発明の新規タンパク質における前記（Ｆ２）のタンパク質ということもでき、その説明を援用できる。
【０２０３】
前記（ｆ７）において、アミノ酸配列に関する「同一性」は、例えば、前記（ｆ７）のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が、蛍光活性を有する範囲であればよい。前記（ｆ７）の同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記（ｆ７）のタンパク質は、前記本発明の新規タンパク質における前記（Ｆ３）のタンパク質ということもでき、その説明を援用できる。
【０２０４】
本発明において、前記各種ポリヌクレオチドは、例えば、公知の遺伝子工学的手法または合成手法によって製造できる。
【０２０５】
＜新規タンパク質の発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、前述のように、前記本発明の新規遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の発現ベクターによれば、例えば、前記発現ベクターを前記宿主に導入することで、前記本発明の新規タンパク質を容易に製造できる。本発明の発現ベクターは、例えば、前記本発明の新規遺伝子の説明等を援用できる。
【０２０６】
前記発現ベクターは、例えば、前記本発明の新規遺伝子である前記ポリヌクレオチドがコードする新規タンパク質を発現可能なように、機能的に、前記ポリヌクレオチドを含んでいればよく、その他の構成は、特に制限されない。
【０２０７】
前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう。）に、前記ポリヌクレオチドを挿入することで作製できる。前記ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターがあげられる。前記ベクターは、例えば、バイナリーベクターが好ましい。植物に形質転換を行う場合、前記ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ型バイナリーベクターが好ましい。アグロバクテリウムを使用する方法により、植物に形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、ｐＢＩ１２１ベクター、ｐＰＺＰ２０２ベクター、ｐＢＩＮＰＬＵＳベクター、ｐＢＩＮ１９ベクター、ｐＢＩＧ２１１３Ｎ、ｐＢＩＧ２１１３ＳＦ、ｐＲＩ１０１ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ社製）、ｐＲＩ２０１ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ社製）、ｐＲＩ９０９ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ社製）、ｐＲＩ９１０ＤＮＡベクター（ＴａＫａＲａ社製）等があげられる。大腸菌等の微生物に形質転換を行う場合、前記ベクターは、例えば、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクター（ノバジェン社）、ｐＱＥ−８０Ｌベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫベクター、ｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ｐｃＤＮＡ３．２／Ｖ５−ＧＷ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦＰベクター、ｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（−）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等があげられる。
【０２０８】
前記発現ベクターは、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現および前記ポリヌクレオチドがコードする前記本発明の新規タンパク質の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記ポリヌクレオチドの発現およびこれがコードする前記新規タンパク質の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【０２０９】
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【０２１０】
＜新規タンパク質の製造方法＞
本発明の新規タンパク質の製造方法は、特に制限されず、例えば、遺伝子工学的手法により製造してもよいし、公知の合成方法により製造してもよい。前者の場合、本発明の製造方法は、前記本発明の新規遺伝子を発現させる発現工程を含む。これにより、本発明の新規タンパク質の製造方法は、例えば、前記本発明の新規蛍光タンパク質を容易に製造できる。
【０２１１】
前記本発明の新規遺伝子であるポリヌクレオチドの発現は、例えば、前記本発明の発現ベクターを使用して行ってもよい。
【０２１２】
前記ポリヌクレオチドを発現させる方法は、特に制限されず、公知の方法が採用でき、例えば、無細胞タンパク質合成系を使用してもよいし、宿主を使用してもよい。
【０２１３】
前者の場合、無細胞タンパク質合成系において前記ポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。この場合、前記ポリヌクレオチドの発現には、発現ベクターを使用してもよい。前記無細胞タンパク質合成系は、例えば、細胞抽出液と、各種成分を含むバッファーと、目的のポリヌクレオチドが導入された発現ベクターとを用いて、公知の方法により行うことができ、例えば、市販の試薬キットが使用できる。
【０２１４】
後者の場合、例えば、前記ポリヌクレオチドが導入された前記宿主を使用し、前記宿主の培養により、前記宿主において前記ポリヌクレオチドを発現させることが好ましい。このように、例えば、前記ポリヌクレオチドを宿主に導入することで、本発明の新規タンパク質を合成する形質転換体を製造でき、また、前記形質転換体の培養により、本発明の新規タンパク質を合成できる。
【０２１５】
前記宿主は、例えば、微生物、植物、動物、昆虫またはこれらの培養細胞等の非ヒト宿主、単離したヒト細胞またはその培養細胞等があげられ、好ましくは、植物である。前記宿主が植物の場合、前記植物は、例えば、植物体またはその部分であってもよい。前記植物体の部分は、例えば、器官、組織、細胞または栄養繁殖体等があげられる。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎、根等があげられる。前記組織は、例えば、前記器官の部分である。前記細胞は、例えば、前記植物体またはその組織から採取した細胞、前記細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。前記植物の由来は、特に制限されず、例えば、アブラナ科、ナス科、イネ科、マメ科、バラ科、ナデシコ科、キク科、リンドウ科、ゴマノハグサ科、クマツヅラ科、サクラソウ科、サボテン科、ラン科等があげられる。前記アブラナ科は、例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）等のシロイヌナズナ属等があげられる。前記ナス科は、例えば、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）等のタバコ属、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ×ｈｙｂｒｉｄａ）等のツクバネアサガオ属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、ニーレンベルギア（Ｎｉｅｒｅｍｂｅｒｇｉａ ｈｉｐｐｏａｍａｎｉｃａ）等のアマモドキ属、カリブラコア（Ｃａｌｉｂｒａｃｈｏａ ｈｙｂｒｉｄ Ｃｕｌｔｉｖａｒ）等のカリブラコア属等があげられる。前記イネ科は、例えば、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）等のトウモロコシ属、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）等のイネ属等があげられる。前記マメ科は、例えば、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）等のダイズ属等があげられる。前記バラ科は、例えば、バラ（Ｒｏｓａ）等のバラ属があげられる。前記ナデシコ科は、例えば、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）等のナデシコ属等があげられる。前記キク科は、例えば、栽培ギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）等のキク属、ガーベラ（Ｇｅｒｂｅｒａ ｃｖｓ．）等のガーベラ（オオセンボンヤリ）属等があげられる。前記リンドウ科は、例えば、トルコキキョウ（Ｅｕｓｔｏｍａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｍ）等のユーストマ属等があげられる。前記ゴマノハグサ科は、例えば、トレニア（Ｔｏｒｅｎｉａ ｆｏｕｒｎｉｅｒｉ）等のトレニア属等があげられる。前記クマツヅラ科は、例えば、バーベナ（Ｇａｒｄｅｎ ｖｅｒｂｅｎａ）等のバーベナ属等があげられる。前記サクラソウ科は、例えば、シクラメン（Ｃｙｃｌａｍｅｎ ｐｅｒｓｉｃｕｍ）等のシクラメン属等があげられる。前記サボテン科は、例えば、アウストロキリンドロプンティア属、アストロフィツム属、エキノカクツス属、エキノセレウス属、エキノプシス属、エピフィラム属、オプンティア属、カニバサボテン属、カマエセレウス属、キリンドロプンティア属、ギムノカリキウム属、シャコバサボテン属、セレニセレウス属、テフロカクツス属、ネオブクスバウミア属、ネオライモンディア属、ノパレア属、フェロカクツス属、マミラリア属、メロカクツス属、リプサリス属、ロセオカクツス属、ロフォフォラ属等があげられる。前記ラン科は、例えば、ファレノプシス（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｃｖｓ．）等のファレノプシス（コチョウラン）属、シンビジウム（Ｃｙｍｂｉｄｉｕｍ ｃｖｓ．）等のシンビジウム（シュンラン）属、デンドロビウムのノビル系（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ ｈｙｂｒｉｄｓ）、デンドロビウムのデンファレ系（Ｄ． ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ ｈｙｂｒｉｄｓ）等のデンドロビウム（セッコク）属、オンシジウム（Ｏｎｃｉｄｉｕｍ ｃｖｓ．）等のオンシジウム属、カトレア（Ｃａｔｔｌｅｙａ ｃｖｓ．）等のカトレア属等があげられる。前記微生物は、例えば、真核生物、原核生物等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等があげられる。
【０２１６】
前記ポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法、すわなち、前記宿主の形質転換の方法は、特に制限されず、例えば、前記発現ベクターを用いて導入する方法でもよいし、前記発現ベクターを用いずに導入する公知の方法でもよい。後者の場合、前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法は、例えば、ヒートショック法、酢酸リチウム法、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記宿主が植物の場合、前記導入方法は、アグロバクテリウムを介する方法が好ましい。前記本発明の新規遺伝子であるポリヌクレオチドは、例えば、前記本発明の発現ベクターにより前記宿主に導入してもよい。
【０２１７】
前記宿主の培養の方法は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜設定できる。前記宿主の培養に使用する培地は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。
【０２１８】
前記宿主の培養に使用する培地の形態は、特に制限されず、例えば、固体培地、液体培地、寒天培地等、従来公知の培地を適宜使用できる。前記培地に含まれる成分は、特に制限されない。前記培地は、例えば、市販の培地を含んでもよい。前記宿主が植物である場合、前記植物の市販培地は、特に制限されず、例えば、Murashige-Skoog（ＭＳ）培地等があげられる。前記宿主が植物細胞である場合、前記植物細胞の市販培地は、特に制限されず、例えば、ハイポネックス培地、ＭＳ培地、Gamborg  B5（Ｂ５）培地、White培地等があげられる。前記宿主が微生物である場合、前記微生物の市販培地は、特に制限されず、例えば、ＬＢ培地、スーパーブロス培地、Ｍ９培地等があげられる。前記培地は、例えば、１種類を単独で使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。前記培地のｐＨは、特に制限されず、例えば、ｐＨ６〜８の範囲、ｐＨ６．５〜７．５の範囲である。
【０２１９】
前記宿主の培養方法は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記宿主が植物の場合、前記培養方法は、例えば、前記植物を土壌栽培、水性栽培する方法等があげられる。前記植物が植物細胞の場合、前記培養方法は、例えば、カルス培養、根の培養、胚珠培養、胚培養等があげられる。
【０２２０】
前記宿主の培養時の培養温度は、特に制限されず、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記宿主が植物の場合、前記培養温度は、例えば、植物の生育可能温度、生育最適温度等があげられる。具体的には、前記培養温度は、例えば、１５〜４０℃の範囲、３０〜３７℃の範囲等で行うことができる。前記宿主が植物細胞の場合、前記培養温度は、例えば、植物細胞の生育可能温度、生育最適温度等があげられる。具体的には、前記培養温度は、例えば、１５〜４０℃の範囲、３０〜３７℃の範囲等で行うことができる。
【０２２１】
前記宿主は、例えば、好気的条件下で培養してもよく、嫌気的条件下で培養してもよい。前記好気的条件または嫌気的条件は、特に制限されず、従来公知の方法を用いて設定できる。
【０２２２】
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前述のように、前記本発明の新規遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の形質転換体は、前記本発明の新規遺伝子を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の形質転換体は、前記本発明の新規遺伝子を含むため、例えば、蛍光活性を有する。本発明の形質転換体は、例えば、前記本発明の新規タンパク質等の説明を援用できる。
【０２２３】
本発明において、前記形質転換体は、特に制限されず、動物、植物等があげられるが、植物が好ましい。前記形質転換体が動物である場合、前記形質転換体としては、例えば、ヒト大腸がん細胞等のがん細胞があげられる。前記形質転換体が植物である場合、前記植物および植物の由来は、特に制限されず、例えば、前述の説明を援用できる。具体的に、前記植物は、例えば、植物体またはその部分であってもよい。前記植物体の部分は、例えば、器官、組織、細胞または栄養繁殖体等があげられる。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎、根等があげられる。前記組織は、例えば、前記器官の部分である。前記細胞は、例えば、前記植物体またはその組織から採取した細胞、前記細胞の培養細胞、プロトプラスト、カルス等があげられる。
【０２２４】
本発明において、前記形質転換体が植物の場合、本発明の形質転換体は、例えば、さらに繁殖させることができる。この際、本発明の形質転換体は、前記繁殖材料として使用できる。前記繁殖材料は、特に制限されず、例えば、前記形質転換体の全体でもよいし、部分でもよい。前記形質転換体が、前記植物体またはその部分の場合、前記繁殖材料は、例えば、種子、果実、シュート、塊茎等の茎、塊根等の根、株、プロトプラスト、カルス等があげられる。
【０２２５】
本発明の形質転換体の繁殖方法は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。前記繁殖方法は、例えば、有性生殖および無性生殖のいずれでもよく、好ましくは無性生殖である。前記無性生殖による繁殖は、例えば、栄養繁殖（vegetative  propagation）があげられ、栄養生殖（vegetative  reproduction）ともいう。前記栄養繁殖の方法は、特に制限されず、前記植物体またはその部分の場合、例えば、挿し芽、挿し木による繁殖、器官からの植物個体への細分化、カルスによる増殖等があげられる。前記器官は、例えば、前述したような葉、茎、根等が利用できる。
【０２２６】
前記形質転換体を栄養繁殖することにより得られる繁殖体を、以下、本発明の栄養繁殖体という。本発明の栄養繁殖体は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を有することが好ましい。本発明の栄養繁殖体は、前記形質転換体と同様に、特に制限されず、例えば、植物体またはその部分があげられる。
【０２２７】
また、前記形質転換体を有性生殖した場合、例えば、種子、これから生育した生育体等の子孫が得られる。本発明の子孫は、前記本発明の形質転換体と同一の性質を得ることが好ましい。本発明の子孫は、例えば、前記形質転換体と同様に、例えば、植物体またはその部分のいずれでもよい。
【０２２８】
本発明の形質転換体は、例えば、さらに加工してもよい。加工する前記形質転換体の種類は、特に制限されず、例えば、花、葉、枝等があげられる。前記形質転換体の加工品は、特に制限されず、例えば、花、葉、枝等を乾燥させたポプリ、押し花、ドライフラワー、プリザーブドフラワー、樹脂密封品等があげられる。また、本発明の加工品は、例えば、前記形質転換体の栄養繁殖体、器官、組織または細胞の加工品でもよい。
【０２２９】
＜形質転換体の製造方法＞
本発明の形質転換体の製造方法は、前述のように、宿主に、本発明の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とする。本発明の形質転換体の製造方法は、宿主に、本発明の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の形質転換体の製造方法によれば、例えば、前記本発明の形質転換体を容易に製造できる。
【０２３０】
本発明の形質転換体の製造方法は、さらに、前記宿主に、前記新規遺伝子を発現させる発現工程を含んでいてもよい。
【０２３１】
前記導入工程において、本発明の新規遺伝子を前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、例えば、前記本発明の新規タンパク質の製造方法における前記ポリヌクレオチドを前記宿主に導入する方法の説明を援用できる。本発明の製造方法において、前記宿主は、植物が好ましい。
【０２３２】
前記発現工程は、例えば、宿主内で、本発明の新規遺伝子から本発明の新規タンパク質を発現させる工程である。前記発現工程において、前記宿主は、例えば、本発明の新規遺伝子または前記発現ベクターが導入された形質転換体であることが好ましく、前記形質転換体の培養により、前記宿主において本発明の新規タンパク質を発現させることが好ましい。
【０２３３】
前記宿主が植物の場合、本発明の形質転換体の製造方法は、さらに、前記導入工程により得られた形質転換体を繁殖する繁殖工程を含んでもよい。前記繁殖工程における繁殖方法は、例えば、前述の説明を援用できる。また、本発明の形質転換体の製造方法は、繁殖した形質転換体から採種する採種工程を含んでもよく、さらに、前記採種工程で得られた種子から生育体を生育する生育工程を含んでもよい。
【０２３４】
＜新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法＞
本発明の新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」ともいう。）は、前述のように、前記本発明の新規タンパク質に変異を導入した候補タンパク質から、配列番号１のアミノ酸配列における５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する選抜工程を含むことを特徴とし、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明のスクリーニング方法によれば、例えば、蛍光活性を有するタンパク質を容易にスクリーニングできる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記本発明の新規タンパク質、新規遺伝子、発現ベクター、および製造方法等の説明を援用できる。
【０２３５】
前記候補タンパク質は、前記本発明の新規タンパク質に変異を導入したタンパク質である。前記新規タンパク質に導入する変異の種類は、特に制限されず、例えば、アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加である。具体例として、前記候補タンパク質は、例えば、前記新規タンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、または前記新規タンパク質のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質があげられる。
【０２３６】
前記候補タンパク質のアミノ酸配列において、「１もしくは数個」は、例えば、１〜４３個、１〜３３個、１〜２２個、１〜１１個、１〜９個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１または２個である。
【０２３７】
前記候補タンパク質のアミノ酸配列において、「同一性」は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【０２３８】
前記候補タンパク質は、前記候補タンパク質のアミノ酸配列に基づき、公知のタンパク質の合成方法により製造してもよいし、遺伝子工学的手法により製造してもよい。後者の場合、本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記新規タンパク質をコードする塩基配列、すなわち、本発明の新規遺伝子に変異を導入し、変異ポリヌクレオチドを作製する変異工程、前記変異ポリヌクレオチドから前記候補タンパク質を発現させる発現工程を含む。
【０２３９】
前記変異工程において、前記新規遺伝子に導入する変異は、特に制限されず、例えば、塩基の欠失、置換、挿入および／または付加である。前記新規遺伝子への変異の導入方法は、特に制限されず、例えば、公知のポリヌクレオチドへの変異導入方法により実施でき、具体例として、前記本発明の新規遺伝子のポリヌクレオチドのランダムな断片化とＰＣＲを用いる再結合により、遺伝子を再構築する方法（いわゆる、ＤＮＡシャフリング法）等があげられる。
【０２４０】
前記発現工程において、前記変異ポリヌクレオチドを発現させる方法は、特に制限されず、例えば、前述の本発明の新規タンパク質の製造方法の説明を援用でき、無細胞タンパク質合成系を使用してもよいし、宿主を使用してもよい。前記宿主は、例えば、原核生物、特に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を用いることが好ましい。
【０２４１】
本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記発現工程において得られた候補タンパク質を精製する工程を含んでもよい。前記精製方法は、特に制限されず、例えば、塩析、各種カラムクロマトグラフィー等があげられる。前記各種精製工程において使用する溶媒は、特に制限されず、例えば、緩衝液が使用できる。本発明のスクリーニング方法は、例えば、前記発現工程において得られた候補タンパク質を、そのまま後述する選抜工程で使用してもよいし、部分的に精製した部分精製候補タンパク質を使用してもよいし、単一に精製した精製候補タンパク質を使用してもよい。
【０２４２】
前記選抜工程は、候補タンパク質から、配列番号１のアミノ酸配列における５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する工程である。
【０２４３】
前記選抜工程において、選抜された候補タンパク質のＸａａ５２に対応するアミノ酸は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｃ、Ｍ、またはＴである。また、前記選抜された候補タンパク質において、Ｘａａ５２は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｈである。
【０２４４】
前記選抜された候補タンパク質のＸａａ１３３は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴである。また、前記選抜された候補タンパク質において、Ｘａａ１３３は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｔである。
【０２４５】
前記選抜された候補タンパク質において、Ｘａａ１５４は、任意のアミノ酸である。前記任意のアミノ酸は、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹであり、好ましくは、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹであり、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、またはＹである。また、前記選抜された候補タンパク質において、Ｘａａ１５４は、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、より好ましくは、Ｋである。
【０２４６】
前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列におけるＸａａ５２に対応するアミノ酸が、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹであり、且つ蛍光活性を有するタンパク質である。
【０２４７】
前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、例えば、前記配列番号１のアミノ酸配列におけるＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４に対応するアミノ酸の組合せが、下記（ａａ１）〜（ａａ１１）および（ａａ１２）のいずれか１つの組合せであり、且つ蛍光活性を有するタンパク質である。また、前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ１）、（ａａ３）、（ａａ６）、（ａａ９）、（ａａ１０）、または（ａａ１２）の組合せであり、且つ蛍光活性を有することが好ましく、下記（ａａ１）、または（ａａ９）の組合せであり、且つ蛍光活性を有することが好ましい。また、前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、例えば、同一強度の励起光で励起した際に、より強い蛍光を発することから、下記（ａａ２）の組合せであり、且つ蛍光活性を有することが好ましい。
【０２４８】
【表４】
2016204123.tif 000106
【０２４９】
前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、Ｘａａ２０５が、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、Ｉに置換されており、且つ蛍光活性を有することが好ましい。また、前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、Ｘａａ１９８が、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、より強い蛍光を発することから、ＬまたはＨに置換されており、且つ蛍光活性を有することが好ましい。前記選抜工程において、前記選抜された候補タンパク質は、Ｘａａ１９８およびＸａａ２０５は、例えば、相対的に低い波長の励起光においても、さらに強い蛍光を発することから、ＬおよびＩの組合せ、またはＨおよびＩの組合せに、それぞれ置換されており、且つ蛍光活性を有することが好ましい。
【０２５０】
前記選抜工程において、前記候補タンパク質のアミノ酸配列の同定方法は、特に制限されず、例えば、公知のアミノ酸の同定方法により実施できる。前記候補タンパク質を前記変異ポリヌクレオチドから発現させる場合、前記候補タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、前記変異ポリヌクレオチドの塩基配列のコドンを対応するアミノ酸配列に置き換えることで同定してもよい。
【０２５１】
前記選抜工程において、前記候補タンパク質の蛍光活性の確認方法は、特に制限されず、公知の蛍光活性の確認方法が使用でき、例えば、公知の光学測定機器を用い、各励起波長の励起光により生じる蛍光のスペクトルを測定することにより確認できる。前記候補タンパク質を前記大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に発現させている場合、前記蛍光活性の確認方法は、特に制限されず、例えば、ＬＥＤＵＶ（Ｌｉｇｈｔ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｄｉｏｄｅ  Ｕｌｔｒａ  Ｖｉｏｌｅｔ）光源およびＵＶ透過フィルタを用いて、確認できる。
【０２５２】
本発明のスクリーニング方法は、前記選抜工程において、前記配列番号１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質を選抜することが好ましい。前記「同一性」は、例えば、前記選抜された候補タンパク質が、前記蛍光活性を有する範囲であればよい。前記「同一性」は、例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【実施例】
【０２５３】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。【０２５４】
［実施例１］
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。【０２５５】
（１）発現ベクターの構築
新規蛍光タンパク質（配列番号２〜１３）をコードする新規遺伝子（配列番号１７、１８、２０、２１、２３、２５〜２７および２９〜３２）をそれぞれ含む１２種類のベクター挿入配列（配列番号３３）は、化学合成により取得した。前記ベクター挿入配列において、かっこで囲んだ下線部の塩基配列が、前記新規蛍光タンパク質をコードする前記新規遺伝子に対応する塩基配列である。前記ベクター挿入配列における四角で囲んだＮ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンと、前記新規蛍光タンパク質と、前記新規遺伝子との関係を下記表５に示す。また、Ｎ１５４Ｎ１５５Ｎ１５６コドン、Ｎ３９７Ｎ３９８Ｎ３９９コドン、およびＮ４６０Ｎ４６１Ｎ４６２コドンが、（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）であるベクター挿入配列を、それぞれ、（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）ベクター挿入配列とした。【０２５６】
2016204123.tif 000107
【０２５７】
【表５】
2016204123.tif 000108
【０２５８】
前記（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）ベクター挿入配列を、それぞれ、制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩを用いて切断し、前記制限酵素で切断したｐＥＧＦＰベクター（ＣＬＯＮＴＥＣ社製）に連結した。前記（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）のベクター挿入配列を挿入したベクターを、それぞれ、（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）発現ベクターとした。なお、発現ベクター構築は、Ｇｅｎｅ  Ｓｃｒｉｐｔ社が行った。【０２５９】
（２）大腸菌への導入
大腸菌ＤＨ５α株に、前記（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）発現ベクターを、それぞれ単独で、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、抗生物質（アンピシリン）１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地を用いて、３７℃で１０時間培養した。そして、培養した菌体を集菌し、得られたペレットを、プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ロシュ社製）を１錠含むＰＢＳ溶液４０ｍＬを用いて、２回洗浄した。前記洗浄後のペレットを、前記プロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳ溶液８００μＬに懸濁した。つぎに、得られた懸濁液を、超音波ホモジナイザー（ＱＳＯＮＩＣＡ、ワケンビーテック株式会社製）を用いて、Ａｍｐ２５％、１分間の条件で、２回超音波処理した。そして、前記処理後の懸濁液を、１３００ｒｐｍ、４℃の条件で、１０分間遠心し、得られた上清を回収した。以下、前記（ｆ１−３）、（ｆ１−４）、（ｆ１−６）、（ｆ１−７）、（ｆ１−９）、（ｆ１−１１）〜（ｆ１−１３）および（ｆ１−１５）〜（ｆ１−１８）発現ベクターを導入した形質転換体から得られた上清を、それぞれ、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−１２）タンパク質とした。前記各上清中のタンパク質濃度は、前記各上清に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）を添加後、マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）  Ｍ１０００Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、５９５ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。【０２６０】
（３）蛍光活性の測定
前記（２）の上清を、前記（２）で得られた各上清のタンパク質濃度に基づき、前記各上清中のタンパク質濃度が、０．２ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。前記希釈後の各上清５０μＬについて、前記マイクロプレートリーダーを用い、下記測定条件で蛍光強度（ＦＩ）を測定した。また、ネガティブコントロールは、前記発現ベクターに代えて、前記ｐＵＣベクターを形質導入した以外は同様にして、測定した。【０２６１】
（測定条件）
励起波長：３５０〜６５０ｎｍ（バンド幅：５ｎｍ）
蛍光（検出）波長：３５０〜６５０ｎｍ（バンド幅：５ｎｍ）
レーザー強度（Ｇａｉｎ）：１０５【０２６２】
励起波長（Ｅｘ）が３７５ｎｍであり、蛍光波長（Ｅｍ）が５１５ｎｍの場合の結果を下記表６Ａに、励起波長が４０５ｎｍであり、蛍光波長が５１５ｎｍの場合の結果を下記表６Ｂに、励起波長が５００ｎｍであり、蛍光波長が５２５ｎｍの場合の結果を下記表６Ｃに、励起波長が５１０ｎｍであり、蛍光波長が５３５ｎｍの場合の結果を下記表６Ｄに示す。前記表６Ａ〜Ｄに示すように、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−１２）タンパク質は、いずれの波長においても蛍光活性を示した。これに対して、ネガティブコントロール（ｐＵＣ）は、蛍光活性を示さなかった。また、前記表６Ａに示すように、励起波長が３７５ｎｍであり、蛍光波長が５１５ｎｍの場合、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−６）、（Ｆ１−９）、（Ｆ１−１０）、および（Ｆ１−１２）タンパク質の蛍光活性が強く、（Ｆ１−９）タンパク質の蛍光活性が特に強かった。前記表６Ｂに示すように、励起波長が４０５ｎｍであり、蛍光波長が５１５ｎｍの場合、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−４）、および（Ｆ１−９）タンパク質の蛍光活性が強く、（Ｆ１−９）タンパク質の蛍光活性が特に強かった。前記表６Ｃに示すように、励起波長が５００ｎｍであり、蛍光波長が５２５ｎｍの場合、（Ｆ１−２）タンパク質の蛍光活性が強かった。前記表６Ｄに示すように、励起波長が５１０ｎｍであり、蛍光波長が５３５ｎｍの場合、（Ｆ１−２）タンパク質の蛍光活性が強かった。なお、表には示していないが、前記発現ベクターに代えて、前記（Ｆ１−１）のアミノ酸配列をコードする（ｆ１−１）および（ｆ１−２）のポリヌクレオチド、前記（Ｆ１−２）のアミノ酸配列をコードする（ｆ１−５）のポリヌクレオチド、前記（Ｆ１−４）のアミノ酸配列をコードする（ｆ１−８）のポリヌクレオチド、前記（Ｆ１−６）のアミノ酸配列をコードする（ｆ１−１０）のポリヌクレオチド、ならびに前記（Ｆ１−９）のアミノ酸配列をコードする（ｆ１−１４）のポリヌクレオチドをそれぞれ含む発現ベクターを用い場合においても同様に蛍光活性を示した。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。【０２６３】
【表６Ａ】
2016204123.tif 000109
【０２６４】
【表６Ｂ】
2016204123.tif 000110
【０２６５】
【表６Ｃ】
2016204123.tif 000111
【０２６６】
【表６Ｄ】
2016204123.tif 000112
【０２６７】
また、励起波長の全範囲および蛍光波長の全範囲の測定結果を図１ＡおよびＢに示す。図１ＡおよびＢは、異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。図１Ａにおいて、（Ａ）〜（Ｇ）は、それぞれ、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−７）タンパク質の結果を示し、図１Ｂにおいて、（Ｈ）〜（Ｎ）は、それぞれ（Ｆ１−８）〜（Ｆ１−１２）タンパク質、およびネガティブコントロール（ｐＵＣ）の結果、ならびに各グラフにおける各軸の説明を示す。図１Ｂの（Ｎ）に示すように、図１Ａの（Ａ）〜（Ｇ）および図１Ｂの（Ｈ）〜（Ｎ）において、Ｘ軸方向が、励起波長を示し、Ｙ軸方向が、蛍光波長を示し、Ｚ軸方向が、蛍光強度を示す。図１ＡおよびＢの（Ａ）〜（Ｌ）に示すように、（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−１２）タンパク質は、蛍光活性を示した。これに対して、図１Ｂの（Ｍ）に示すように、ネガティブコントロールは、蛍光活性を示さなかった。また、図１Ａの（Ｂ）に示すように、（Ｆ１−２）タンパク質は、同一強度の励起光で励起した際に、他のタンパク質と比較してより強い蛍光活性を示した。【０２６８】
さらに、図１Ａの（Ａ）、（Ｃ）および（Ｆ）、ならびに図１Ｂの（Ｉ）、（Ｊ）および（Ｌ）に矢印で示すように、（Ｆ１−１）タンパク質、（Ｆ１−３）タンパク質、（Ｆ１−６）タンパク質、（Ｆ１−９）タンパク質、（Ｆ１−１０）タンパク質、および（Ｆ１−１２）タンパク質は、他のタンパク質と比較して相対的に低い励起波長（３５０〜４３５ｎｍ）においてもより強い蛍光活性を示した。具体的に、前記（Ｆ１−１）タンパク質、（Ｆ１−３）タンパク質、（Ｆ１−６）タンパク質、（Ｆ１−９）タンパク質、（Ｆ１−１０）タンパク質、および（Ｆ１−１２）タンパク質は、下記表７の励起波長で励起した場合においても、５２０ｎｍ付近の蛍光を発した。なお、前記表７において、励起極大波長は、励起波長が３５０〜４３５ｎｍの場合において、蛍光強度が極大値となる励起波長である。【０２６９】
【表７】
2016204123.tif 000113
【０２７０】
これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。【０２７１】
［実施例２］
本発明のスクリーニング方法により、新規蛍光タンパク質をスクリーニングできることを確認した。【０２７２】
（１）発現ベクターの構築
ＤＮＡシャフリング法を用いて、変異ポリヌクレオチドを作製し、前記変異ポリヌクレオチドをベクターに連結して、変異ポリヌクレオチド発現ベクターを構築した。具体的には、以下のようにして行った。まず、（ｆ１−３）のポリヌクレオチド（配列番号１７）および（ｆ１−１５）のポリヌクレオチド（配列番号２９）を、以下のプライマーセットを用いて、１ｓｔＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅し、１ｓｔＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ反応液は、ＴａＫａＲａ  ＥＸ  Ｔａｑ（登録商標）（タカラバイオ社製）のキットを用い、説明書に従って調製した。【０２７３】
プライマーセット
プライマー配列１（配列番号１０２）
5'-ATGCTTCCGGCTCGTATGTTG-3'
プライマー配列２（配列番号１０３）
5'-GTACGGCCGACTAGTAGGCC-3'【０２７４】
前記１ｓｔＰＣＲ産物１．９μｇを、デオキシリボヌクレアーゼ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）が入った以下の組成の緩衝液に懸濁し、２５℃で２０分間反応させ、さらに、９０℃で１０分間反応させることにより、ＤＮＡの断片化を行った。【０２７５】
［緩衝液の組成］
総量                                ４０μＬ
ＤＮａｓｅI（ＴａＫａＲａ  社製）  
０．０５Ｕ    （（ｆ１−３）のポリヌクレオチドのＰＣＲ産物）
０．０２５Ｕ  （（ｆ１−１５）のポリヌクレオチドのＰＣＲ産物）
Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ                    ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
ＭｎＣｌ２                          １０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｐＨ７．４【０２７６】
断片化されたＤＮＡそれぞれを、アガロースゲル電気泳動およびゲル抽出により精製した。そして、得られた精製物を、液中濃度が１０〜３０μｇ／μＬとなるように前記ＰＣＲ反応液に添加し、２ｎｄＰＣＲにより増幅し、多数の２ｎｄＰＣＲ産物を得た。なお、２ｎｄＰＣＲにおいては、前記プライマーセットを用いなかった。そして、前記多数の２ｎｄＰＣＲ産物の５０分の１の量を、それぞれ、前記ＰＣＲ反応液に添加し、前記プライマーセットを用いて、３ｒｄＰＣＲにより増幅し、変異ポリヌクレオチドを得た。前記変異ポリヌクレオチドを、前記制限酵素を用いて切断し、前記制限酵素で切断した前記ｐＥＧＦＰベクターに連結した。前記変異ポリヌクレオチドを挿入したベクターを、変異ポリヌクレオチド発現ベクターとした。このようにして、多数の変異ポリヌクレオチド発現ベクターを得た。【０２７７】
（２）大腸菌への導入
大腸菌ＪＭ１０９株に、前記変異ポリヌクレオチド発現ベクターを、それぞれ単独で、ヒートショック法により形質導入した。得られた形質転換体を、抗生物質（アンピシリン）１００μｇ／ｍＬを含有するＬＢ培地を用いて、約１０００コロニーが生えるまで３７℃で一晩（１８時間）培養した。【０２７８】
（３）蛍光活性の確認
そして、培養した菌体を集菌し、光源として、ＬＥＤＵＶ光源（ＮＳ３７５ＬＩＭ、ナイトライド・セミコンダクター社製）、フィルタとして、ＵＬ３６０（オーエムジー社製）を用いて、前記菌体の蛍光活性を確認した。蛍光活性が確認できた前記菌体について、プラスミドを精製し、本実施例２（１）および（２）の操作を、３回繰り返した後に、同様にして、菌体の蛍光活性を確認した。【０２７９】
（４）大腸菌のシーケンス
前記（３）で蛍光活性が確認できた菌体のコロニーを収集し、プラスミドを精製し、以下の条件でダイレクトシーケンスに供した。その結果、蛍光活性が確認できた前記菌体は、前記本発明の新規遺伝子（配列番号６８〜１０１）を有していることが確認できた。これらの結果から、本発明のスクリーニング方法により、本発明の新規蛍光タンパク質をスクリーニングできることがわかった。【０２８０】
［ダイレクトシーケンスの条件］
シーケンサー          ABI  3130xl（Applied  Biosystems社製）
シーケンス試薬        BigDye  Terminator  V1-1  cycle  sequencing  kit（Applied  Biosystems社製）
シーケンスプライマー
プライマー配列１（配列番号１０２）
5'-ATGCTTCCGGCTCGTATGTTG-3'
プライマー配列２（配列番号１０３）
5'-GTACGGCCGACTAGTAGGCC-3'【０２８１】
［実施例３］
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。なお、実験条件、実験方法等の記載は、特に記載がない限り、前記実施例１と同様とした。【０２８２】
（１）発現ベクターの構築
新規蛍光タンパク質（配列番号３４〜４８）をコードする新規遺伝子（配列番号６８〜８２、（ｆ１−１９）〜（ｆ１−３３））の塩基配列の５’末端に５’末端配列（5’-AAGCTTG-3’）を、３’末端に３’末端配列（5’-AATTC-3’）を付加した１４種類のベクター挿入配列は、それぞれ化学合成により取得した。また、新規蛍光タンパク質（配列番号４９〜６７）をコードする新規遺伝子（配列番号８３〜１０１、（ｆ１−３４）〜（ｆ１−５２））の塩基配列の５’末端に前記５’末端配列（5’-AAGCTTG-3’）を、３’末端に前記３’末端配列（5’-AATTC-3’）を付加した１９種類のベクター挿入配列は、それぞれ化学合成により取得した。前記新規遺伝子が、（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）であるベクター挿入配列を、それぞれ、（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）ベクター挿入配列とした。【０２８３】
前記（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）ベクター挿入配列を、それぞれ、前記制限酵素を用いて切断し、前記制限酵素で切断した前記ｐＥＧＦＰベクターに連結した。前記（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）のベクター挿入配列を挿入したベクターを、それぞれ、（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）発現ベクターとした。【０２８４】
（２）大腸菌への導入
下記に示す実験条件以外は、前記実施例１（２）と同様にして、前記（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）発現ベクターを、前記大腸菌ＤＨ５α株に導入し、前記（ｆ１−１９）〜（ｆ１−５２）を導入した形質転換体から得られた上清を、それぞれ、（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−４６）タンパク質とし、前記各上清中のタンパク質濃度を、吸光度を測定することにより決定した。実験条件は、前記形質転換体の培養時間は１６〜１８時間とし、洗浄後のペレットを懸濁するＰＢＳ溶液は１．５ｍＬとし、得られた懸濁液を、前記超音波ホモジナイザーを用いて、Ａｍｐ３５％、１０秒／３０秒、２分間の条件で、４回の超音波処理とした。前記超音波処理後の懸濁液の遠心条件は、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で、１０分間とした。前記各上清中のタンパク質濃度は、前記マイクロプレートリーダーを用いて、５６２ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。【０２８５】
（３）蛍光活性の測定
前記（２）の上清を、前記（２）で得られた各上清のタンパク質濃度に基づき、前記各上清中のタンパク質濃度が、１．５〜２．０ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。前記希釈後の各上清５０〜７０μＬについて、前記マイクロプレートリーダーを用い、前記実施例１（３）と同様の測定条件で蛍光強度（ＦＩ）を測定した。また、コントロールは、前記発現ベクターに代えて、前記（ｆ１−３）発現ベクターおよび前記（ｆ１−１５）発現ベクターを形質導入し、前記（Ｆ１−１）タンパク質および前記（Ｆ１−９）タンパク質を得た以外は同様にして、測定した。【０２８６】
（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−２７）タンパク質、（Ｆ１−１）タンパク質および（Ｆ１−９）タンパク質についての結果を下記表８Ａに、（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−４６）タンパク質、（Ｆ１−１）タンパク質および（Ｆ１−９）タンパク質についての結果を下記表８Ｂに、（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−４６）タンパク質および（Ｆ１−９）の結果を下記表８Ｃに示す。下記表８Ａ〜Ｃは、前記各タンパク質について、励起波長（Ｅｘ）の値、蛍光波長（Ｅｍ）の値および蛍光強度（ＦＩ）の値を示す。前記表８Ａに示すように、（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−２７）タンパク質は、（Ｆ１−１）タンパク質および（Ｆ１−９）タンパク質と比較し、より強い蛍光活性を示した。特に、（Ｆ１−１４）〜（Ｆ１−２７）タンパク質は、極めて強い蛍光活性を示した。また、表８Ｂに示すように、（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−４６）タンパク質は、（Ｆ１−１）タンパク質および（Ｆ１−９）タンパク質と比較して、より強い蛍光活性を示した。そして、前記表８Ｃに示すように、（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−４６）タンパク質は、（Ｆ１−９）タンパク質と比較して、より強い蛍光活性を示した。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。【０２８７】
【表８Ａ】
2016204123.tif 000114
【０２８８】
【表８Ｂ】
2016204123.tif 000115
【０２８９】
【表８Ｃ】
2016204123.tif 000116
【０２９０】
また、励起波長の全範囲および蛍光波長の全範囲の測定結果を図２および図３に示す。図２および図３は、異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。図２Ａにおいて、（Ａ）〜（Ｆ）は、それぞれ、（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−１８）タンパク質の結果を示し、図２Ｂにおいて、（Ｇ）〜（Ｌ）は、それぞれ、（Ｆ１−１９）〜（Ｆ１−２４）タンパク質の結果を示し、図２Ｃにおいて、（Ｍ）〜（Ｑ）は、それぞれ、（Ｆ１−２５）〜（Ｆ１−２７）、（Ｆ１−１）、および（Ｆ１−９）タンパク質の結果を示す。図３Ａにおいて、（Ａ）〜（Ｆ）は、それぞれ、（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−３３）タンパク質の結果を示し、図３Ｂにおいて、（Ｇ）〜（Ｌ）は、それぞれ、（Ｆ１−３４）〜（Ｆ１−３９）タンパク質の結果を示し、図３Ｃにおいて、（Ｍ）〜（Ｒ）は、それぞれ、（Ｆ１−４０）〜（Ｆ１−４５）タンパク質の結果を示し、図３Ｄにおいて、（Ｓ）〜（Ｕ）は、それぞれ、（Ｆ１−４６）、（Ｆ１−１）、および（Ｆ１−９）タンパク質の結果を示す。図１Ｂの（Ｎ）に示したように、図２Ａ〜Ｃの（Ａ）〜（Ｑ）および図３Ａ〜Ｄの（Ａ）〜（Ｕ）において、Ｘ軸方向が、励起波長を示し、Ｙ軸方向が、蛍光波長を示し、Ｚ軸方向が、蛍光強度を示す。図２Ａ〜Ｃの（Ａ）〜（Ｏ）および図３Ａ〜Ｄの（Ａ）〜（Ｓ）に示すように、（Ｆ１−１３）〜（Ｆ１−２７）タンパク質および（Ｆ１−２８）〜（Ｆ１−４６）タンパク質は、（Ｆ１−１）および（Ｆ１−９）タンパク質と比較して、より強い蛍光活性を示した。特に、図２Ａ〜Ｃの（Ｂ）〜（Ｏ）に示すように、（Ｆ１−１４）〜（Ｆ１−２７）タンパク質は、極めて強い蛍光活性を示した。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。【０２９１】
［実施例４］
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。なお、実験条件、実験方法等の記載は、特に記載がない限り、前記実施例１と同様とした。【０２９２】
各タンパク質のＮ末端に、ヒスチジン６残基からなるタグ（６×Ｈｉｓタグ）を付加した以外は、前記実施例１と同様にして、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−９）、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質の上清を得た。前記上清を、ＴＡＬＯＮ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｓｅｓｉｎ（ＴａＫａＲａ社製）の使用説明書に従って、タンパク質精製し、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−９）、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質をそれぞれ含む溶出液を得た。前記各溶出液中のタンパク質濃度が、０．２ｍｇ／ｍＬとなるように希釈した。前記希釈後の各上清５０μＬについて、前記マイクロプレートリーダーを用い、下記測定条件で蛍光強度（ＦＩ）を測定した。【０２９３】
（測定条件）
励起波長：５０５〜５２０ｎｍ（バンド幅：１ｎｍ）
蛍光（検出）波長：３５０〜５２５ｎｍ（バンド幅：１ｎｍ）
レーザー強度（Ｇａｉｎ）：１０５【０２９４】
励起波長（Ｅｘ）が４００ｎｍ付近であり、蛍光波長（Ｅｍ）が５１５ｎｍ付近の場合の、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−９）、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質の結果を下記表９Ａに、励起波長（Ｅｘ）が５０７ｎｍであり、蛍光波長（Ｅｍ）が５１５ｎｍ付近の場合の、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−９）および（Ｆ１−４２）タンパク質の結果を下記表９Ｂに示す。前記表９Ａに示すように、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質は、（Ｆ１−１）および（Ｆ１−９）タンパク質と比較し、より強い蛍光活性を示した。特に、（Ｆ１−２７）タンパク質は、極めて強い蛍光活性を示した。また、前記表９Ｂに示すように、（Ｆ１−２）および（Ｆ１−４２）タンパク質は、（Ｆ１−９）タンパク質と比較し、より強い蛍光活性を示した。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。【０２９５】
【表９Ａ】
2016204123.tif 000117
【０２９６】
【表９Ｂ】
2016204123.tif 000118
【０２９７】
また、励起波長の全範囲および蛍光波長の全範囲の測定結果を図４に示す。図４は、異なる励起波長および蛍光波長における蛍光強度を示すグラフである。図４において、（Ａ）〜（Ｅ）は、それぞれ、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−９）、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質の結果を示す。図１Ｂの（Ｎ）に示したように、図４の（Ａ）〜（Ｅ）において、Ｘ軸方向が、励起波長を示し、Ｙ軸方向が、蛍光波長を示し、Ｚ軸方向が、蛍光強度を示す。図４に示すように、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−９）、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質は、蛍光活性を示した。また、（Ｆ１−１）、（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質は、相対的に低い励起波長（４００ｎｍ付近）においてもより強い蛍光活性を示し、特に、（Ｆ１−２７）タンパク質は、極めて強い蛍光活性を示した。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。【０２９８】
［実施例５］
本発明の新規タンパク質が蛍光活性を有することを確認した。なお、実験条件、実験方法等の記載は、特に記載がない限り、前記実施例１と同様とした。【０２９９】
（１）発現ベクターの構築
新規蛍光タンパク質（配列番号３、４８、６３）をコードする新規遺伝子（配列番号１８、８２、９７）のＮ末端に、Ｈｉｓタグ配列を付加した配列をそれぞれ含むベクター挿入配列（それぞれ、配列番号１０４、１０５、１０６）は、化学合成により取得した。前記ベクター挿入配列において、かっこで囲んだ下線部の塩基配列が、前記新規蛍光タンパク質をコードする前記新規遺伝子に対応する塩基配列であり、かっこで囲んだ外における下線部の塩基配列が、Ｈｉｓタグ配列である。前記ベクター挿入配列における四角で囲んだＮ５９２Ｎ５９３Ｎ５９４コドンおよびＮ６１３Ｎ６１４Ｎ６１５コドンと、前記新規蛍光タンパク質と、前記新規遺伝子との関係を下記表１０に示す。また、Ｎ５９２Ｎ５９３Ｎ５９４コドンおよびＮ６１３Ｎ６１４Ｎ６１５コドンが、（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）であるベクター挿入配列を、それぞれ、（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）ベクター挿入配列とした。【０３００】
2016204123.tif 000119
【０３０１】
2016204123.tif 000120
【０３０２】
2016204123.tif 000121
【０３０３】
【表１０】
2016204123.tif 000122
【０３０４】
前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）ベクター挿入配列を、それぞれ、制限酵素ＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩを用いて切断し、前記制限酵素で切断したｐｃＤＮＡ３．１−ｈｙｇｒｏ（−）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に連結した。前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）ベクター挿入配列を挿入したベクターを、それぞれ、（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）発現ベクターとした。【０３０５】
（２）プラスミドＤＮＡの増幅および精製
前記実施例１（２）と同様にして、前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）発現ベクターを、大腸菌ＤＨ５α株に導入し、前記大腸菌を３７℃、５％ＣＯ２下で１０時間培養することにより、前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを増幅した。そして、Ｍｉｄｉ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用い、添付のプロトコルに従って、前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを精製した。【０３０６】
（３）大腸がん細胞へのプラスミドＤＮＡの導入（トランスフェクション）
まず、ヒト大腸がん由来ＨＣＴ１１６細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を、６穴プレートに、約７０％コンフルエントとなるように播種した。培地は、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ改変培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用し、培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、精製した前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、（ｆ１−４８）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、添付プロトコルに従って、トランスフェクションした。なお、前記ウェルあたりの組成は、以下のように設定した。前記（ｆ１−４）、（ｆ１−３３）、および（ｆ１−４８）遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを含む前記がん細胞を、それぞれ、（Ｆ１−２）、（Ｆ１−２７）、および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞とした。【０３０７】
（ウェルあたりの組成）
培養液                                        ３０００μＬ
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００            １０μＬ
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）  ２５０μＬ
プラスミドＤＮＡ                              ２．５μｇ【０３０８】
（４）ＦＡＣＳ解析による蛍光活性の測定
トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養した後、ハイグロマイシンＢ溶液（Wako社製）を、５００μｇ／ｍＬとなるように各ウェルに添加し、さらに、１４日間培養した。培養後、前記ウェル中の細胞から、FACSaria  III（BD  Biosciences社製）を用いて、約２×１０５〜１×１０６細胞の蛍光シグナル陽性細胞を分取（ソーティング）し、分取した細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下でさらに５日間培養した。そして、培養した細胞を、以下に示す条件で、ＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）解析に供した。コントロールは、前記発現ベクターを導入しない以外は、同様にして解析に供した。【０３０９】
（ＦＡＣＳ解析の条件）
測定装置      FACSaria  III（BD  Biosciences社製）
フィルタ設定
488  nm  blue  laser;  502  nm  LP  mirror  with  a  530/30  nm  band  pass  filter
405  nm  violet  laser;502  nm  LP  mirror  with  a  530/30  nm  band  pass  filter【０３１０】
これらの結果を、図５に示す。図５は、前記各フィルタで取得した各タンパク質発現がん細胞の蛍光活性を示すグラフである。図５において、縦軸は、細胞数を示し、横軸は、蛍光強度を示し、図中の実線で示すヒストグラムは、各タンパク質発現がん細胞の結果を示し、グレーで示すヒストグラムは、コントロールの結果を示す。図５に示すように、コントロールは、蛍光活性を示すピークが観察されなかったのに対し、Ｖ５００のフィルタで解析した（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞、ならびにＦＩＴＣのフィルタで解析した（Ｆ１−２）および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞では、蛍光活性を示すピークが観察された。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、蛍光活性を有することがわかった。【０３１１】
つぎに、Ｖ５００のフィルタで解析した（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞、ならびにＦＩＴＣのフィルタで解析した（Ｆ１−２）および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞における蛍光強度のＭＦＩ（mean  fluorescence  intensity）を計算した結果を、下記表１１に示す。前記表１１に示すように、Ｖ５００のフィルタで解析した（Ｆ１−２７）および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞、ならびにＦＩＴＣのフィルタで解析した（Ｆ１−２）および（Ｆ１−４２）タンパク質発現がん細胞は、いずれも高いＭＦＩを示した。これらの結果から、本発明の新規蛍光タンパク質が、優れた蛍光活性を有することがわかった。【０３１２】
【表１１】
2016204123.tif 000123
【０３１３】
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。【０３１４】
この出願は、２０１５年６月１９日に出願された日本出願特願２０１５−１２４２２９および２０１６年４月２８日に出願された日本出願特願２０１６−０９２０９５を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０３１５】
本発明によれば、新規な蛍光タンパク質を提供できる。このため、本発明は、例えば、生命科学分野、医療分野、農芸分野等の分野において、極めて有用な技術といえる。
【図１Ａ】
2016204123.tif 000128
【図１Ｂ】
2016204123.tif 000129
【図２Ａ】
2016204123.tif 000130
【図２Ｂ】
2016204123.tif 000131
【図２Ｃ】
2016204123.tif 000132
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2016204123.tif 000134
【図３Ｃ】
2016204123.tif 000135
【図３Ｄ】
2016204123.tif 000136
【図４】
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【図５】
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【配列表】
2016204123000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年11月17日(2017.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ｆ１）または（Ｆ３）のタンパク質であることを特徴とする、新規タンパク質。
（Ｆ１）  配列番号１のアミノ酸配列からなり、
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４が、任意のアミノ酸であるタンパク質
（Ｆ３）前記（Ｆ１）のＸａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４が保存され、前記（Ｆ１）のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質
【請求項２】
前記配列番号１のアミノ酸配列において、
Ｘａａ５２が、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、またはＴであり、
Ｘａａ１３３が、Ｌ、Ｑ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘａａ１５４が、Ａ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｖ、またはＹである、請求項１記載の新規タンパク質。
【請求項３】
Ｘａａ５２、Ｘａａ１３３、およびＸａａ１５４の組合せが、下記（ａａ１）〜（ａａ１１）および（ａａ１２）のいずれか１つの組合せである、請求項１または２記載の新規タンパク質。
【表１】
2016204123.tif 000139
【請求項４】
２０５番目のアミノ酸Ｘａａ２０５が、Ｉに置換された、請求項１から３のいずれか一項記載の新規タンパク質。
【請求項５】
１９８番目のアミノ酸Ｘａａ１９８が、Ｌに置換された、請求項１から４のいずれか一項記載の新規タンパク質。
【請求項６】
下記（ｆ１）または（ｆ３）のポリヌクレオチドであることを特徴とする、新規遺伝子。
（ｆ１）  配列番号１４の塩基配列からなり、
前記配列番号１４の塩基配列において、
１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、および１５６番目の塩基Ｎ１５６が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、および３９９番目の塩基Ｎ３９９が、任意のアミノ酸をコードするコドンであり、
４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２が、任意のアミノ酸をコードするコドンであるポリヌクレオチド
（ｆ３）前記（ｆ１）の１５４番目の塩基Ｎ１５４、１５５番目の塩基Ｎ１５５、１５６番目の塩基Ｎ１５６、３９７番目の塩基Ｎ３９７、３９８番目の塩基Ｎ３９８、３９９番目の塩基Ｎ３９９、４６０番目の塩基Ｎ４６０、４６１番目の塩基Ｎ４６１、および４６２番目の塩基Ｎ４６２以外の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、蛍光活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項７】
請求項６記載の新規遺伝子を含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項８】
請求項６記載の新規遺伝子を含むことを特徴とする、形質転換体。
【請求項９】
宿主に、請求項６記載の新規遺伝子を導入する導入工程を含むことを特徴とする、形質転換体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれか一項に記載の新規タンパク質に変異を導入した候補タンパク質から、配列番号１のアミノ酸配列における５２番目のアミノ酸Ｘａａ５２に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１３３番目のアミノ酸Ｘａａ１３３に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、
１５４番目のアミノ酸Ｘａａ１５４に対応するアミノ酸が、任意のアミノ酸であり、且つ蛍光活性を有するタンパク質を選抜する選抜工程を含むことを特徴とする、新規蛍光タンパク質のスクリーニング方法。
【国際調査報告】
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