(57)【要約】  本発明の課題は、タクロリムスに比べて有効性と安全性が向上し、個人差なく血中濃度が一定に維持されることによって、血中動態（血中トラフ濃度）による投与量のコントロールが不要である製剤を得ることである。  本発明は、ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基に、ポリエチレングリコールセグメント及びタクロリムスのアルコール性水酸基が結合しているタクロリムスの高分子誘導体に関する。【選択図】なし
2017119272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基に、ポリエチレングリコールセグメント及びタクロリムスのアルコール性水酸基が結合しているタクロリムスの高分子誘導体。
【請求項２】
下記一般式（１）で表される請求項１に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
【化１】
2017119272.tif 000021
［式中、Ｒ１は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基及びポリエチレングリコールセグメントからなる群から選択される基であり、Ｒ２は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される基であり、Ｒ３はタクロリムスのアルコール性水酸基の残基であり、Ｒ４はポリエチレングリコールセグメントであり、Ｒ５は−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）であり（Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよい、炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である）、Ｘ１は結合又は結合基であり、ａ及びｂは各々１〜２９９の整数であり、ｃ、ｄ及びｅは各々０又は２９８以下の整数であり、且つａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅは２〜３００の整数であり、ポリアスパラギン酸誘導体の各繰り返し単位の配列順は任意である。］
【請求項３】
下記一般式（２）で表される請求項１に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
【化２】
2017119272.tif 000022
［式中、Ｒ１は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基及びポリエチレングリコールセグメントからなる群から選択される基であり、Ｒ２は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される基であり、Ｒ３はタクロリムスのアルコール性水酸基の残基であり、Ｒ４はポリエチレングリコールセグメントであり、Ｒ５は−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）であり（Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよい、炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である）、Ｘ１は結合又は結合基であり、ｆ、ｇ、ｈ及びｉは各々０又は２９９以下の整数であり、ｆ＋ｇ及びｈ＋ｉは各々１〜２９９以下の整数であり、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ及びｎは各々０又は２９８以下の整数であり、且つｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎは２〜３００の整数であり、ポリアスパラギン酸誘導体の各繰り返し単位の配列順は任意である。］
【請求項４】
Ｘ１が結合である請求項２又は請求項３に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
【請求項５】
Ｘ１がアスパラギン酸誘導体である請求項２又は請求項３に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
【請求項６】
Ｘ１が、下記一般式（３）又は一般式（４）である請求項２又は請求項３に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
【化３】
2017119272.tif 000023
［式中、Ｒ８、Ｒ９はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基であり、Ｒ１０はアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族アミノ基及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸結合残基からなる群から選択される１種以上の基であり、並びにＣＹ−ＣＺはＣＨ−ＣＨ若しくはＣ＝Ｃ（二重結合）である。］
【請求項７】
Ｒ８、Ｒ９が共に水素原子であり、及びＣＹ−ＣＺがＣＨ−ＣＨである請求項６に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
【請求項８】
Ｒ４のポリエチレングリコールセグメントが、下記一般式（５）である請求項２乃至７の何れかの一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
【化４】
2017119272.tif 000024
［式中、Ｒ１１は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、Ｒ１２は炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキレン基であり、Ｘ２は前記ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖のカルボキシ基に対して、結合可能な官能基であり、及びｏは５〜１１５００の整数である。］
【請求項９】
Ｒ１が炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基又は下記一般式（６）で表されるポリエチレングルコールセグメントである請求項２乃至８の何れかの一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
【化５】
2017119272.tif 000025
［式中、Ｒ１３は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、Ｒ１４は炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキレン基であり、及びｐは５〜１１５００の整数である。］
【請求項１０】
Ｒ２が炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基であり、ｏが１０〜３０００の整数であり、及び（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）又は（ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ）が４〜２５０の整数である請求項８又は９に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
【請求項１１】
Ｒ２が炭素数（Ｃ１〜Ｃ３）のアシル基であり、ｏが２０〜１５００の整数であり、及び（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）又は（ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ）が８〜２００の整数である請求項８又は９に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
【請求項１２】
Ｒ１がメチル基であり、及びＲ２がアセチル基である請求項２乃至１１の何れか一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
【請求項１３】
ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖のカルボキシ基に、タクロリムスのアルコール性水酸基及びポリエチレングリコールセグメントを、有機溶媒中、脱水縮合剤を用いてエステル結合、アミド結合及び／又はチオエステル結合させることを特徴とする請求項１乃至１２の何れか一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１２の何れか一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体を有効成分とするマクロライド系免疫抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマクロライド系化合物の高分子誘導体、その製造方法及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明において使用されるマクロライド系化合物は、ＦＫＢＰ型イムノフィリンに対する親和性を有し、かつペプチジル−プロリルイソメラーゼ及び／またはロタマーゼ酵素活性を阻害するという共通の活性を有する。マクロライド系化合物の例としては、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ５０６）、アスコマイシンなどを含むトリシクロ化合物がある。【０００３】
マクロライド系化合物または医薬として許容されるその塩は、優れた免疫抑制作用、抗菌活性、およびその他の薬理活性を有し、その為、臓器あるいは組織の移植に対する拒絶反応、移植片対宿主反応、自己免疫疾患、および感染症等の治療および予防に有用であることが、例えば、特許文献１等に記載されている。【０００４】
タクロリムスは臓器移植後の拒絶反応抑制、骨髄移植後の移植片対宿主病、難治性の活動期潰瘍性大腸炎などの治療に汎用されている。しかしながら、タクロリムスは水に難溶（２．４〜３．６μＭ、室温）であり、経口投与時のバイオアベイラビリティーが低い。また、タクロリムスの治療域は狭く、体内動態の個体間・個体内変動が大きいため、血中濃度のコントロールが困難な薬物である。タクロリムスの体内動態変動因子として、水への低い溶解度や、消化管粘膜でのＰ−糖タンパク質や薬物代謝酵素ＣＹＰ３Ａの発現量及び遺伝子型の個体差などが知られている（非特許文献１、２）。【０００５】
タクロリムスの主な副作用の一つに腎毒性および膵臓毒性がある。腎毒性は、腎細動脈の血管収縮作用により血流量および糸球体濾過量低下が起こり、さらに尿細管細胞への栄養補給が滞ることが原因である。膵臓毒性は主に膵β細胞のインシュリンｍＲＮＡ転写阻害に基づく膵β細胞からのインシュリン産生抑制による耐糖能異常発症である。これらの毒性は、タクロリムスの血漿中濃度に依存して発現する。【０００６】
タクロリムスの中枢神経系の副作用として、ヒトでは可逆性後白質脳症症候群・高血圧性脳症等が報告されている（市販後調査を含め０．１〜０．５％未満）。また、ラットへのタクロリムスの静脈内投与が、軽度の呼吸促迫、自発運動低下、腹臥位、常同行動等を誘発することが認められている。（非特許文献３）【０００７】
ポリマーと薬剤が結合することにより、薬剤の水溶性が向上したり、生体内における薬物動態が改善し、その結果として薬効の増強、副作用の軽減、薬効の持続性などの実用上優れた効果が得られることが知られている。ポリマーと薬剤の結合様式は、ポリマーと薬剤が共有結合する場合とポリマーと薬剤とが物理的に吸着する場合とがある。ポリマーと共有結合した薬剤は、体内において加水分解反応などによりポリマーから放出される。一方、ポリマーに物理的に吸着した薬剤は、加水分解反応のような化学反応に因らず、体内においてポリマーから薬剤が徐々に放出する。いずれもポリマーからの薬剤の放出に酵素は関与しないが、ポリマーと薬剤の結合様式の違いは、薬剤の放出機構に違いをもたらすと考えられる。【０００８】
特許文献２及び特許文献３には、ポリエチレングリコール類及びポリアスパラギン酸からなる共重合体と薬剤から得られる高分子誘導体が記載されている。特許文献２及び特許文献３に記載の該高分子誘導体は、共重合体と薬剤が物理的に吸着している。該高分子誘導体の徐放性は共重合体から徐々に薬剤が解離することに起因し、患部に選択的に薬効を示すとともに副作用が少ない。【０００９】
特許文献４には、タクロリムスをａｌｋｙｌ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  （ＭＰＥＧ−ｈｅｘＰＬＡ）からなるポリマーに物理的に吸着させた化合物を得る方法が開示されている。しかしながら、血中濃度あるいはタクロリムスが患部へ特異的に移行することに関して記載はない。【００１０】
非特許文献４には、ＰＥＧポリマーにタクロリムスを化学的に結合させて合成したＰＥＧ化タクロリムスについて報告がある。しかしながら、ＰＥＧ化タクロリムスはアジュバント関節炎マウス及びループス腎炎マウスなどの炎症疾患モデル動物に対し、タクロリムス以上の効果が得られていない。【００１１】
非特許文献５には、Ｐｏｌｙ  （ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｅｓｔｅｒｓ−Ｐｏｌｙ  ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ（ＰＥＧ−ＰＣＬ）ポリマーにタクロリムスを物理的に吸着させて合成されたミセルについての報告がある。ＰＥＧ−ＰＣＬタクロリムスミセルはＤＳＳ誘発潰瘍性大腸炎マウスに対し、タクロリムスと比較して体重減少の抑制、大腸の短縮化抑制及び大腸の出血や陰窩細胞の消失などの炎症改善効果が高いことが明らかにされている。しかしながら、ＰＥＧ−ＰＣＬタクロリムスミセルが炎症改善効果を示すためには、１日１回１２日間連続で投与していることから、この化合物では血中濃度を長く維持することができないと考えられる。【００１２】
非特許文献６及び７には、Ｐｏｌｙ  ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ−ｂ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）（ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＯ）から成るポリマーにタクロリムスを物理的に吸着させて合成したミセルについての報告がある。ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＯタクロリムスミセルは、タクロリムスと比較して細胞内に徐々に取り込まれることが記載されている。また、ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＯタクロリムスミセルは５ｍｇ／ｋｇを６日間隔で３回尾静脈内投与することにより、坐骨神経損傷モデルラットの自発運動性を改善することが示されている。しかしながら、ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＯタクロリムスミセルから遊離したタクロリムスは脳に高く集積することから、ＰＣＬ−ｂ−ＰＥＯタクロリムスミセルは免疫抑制剤としての機能よりも、神経保護剤としての機能に特化していると考えられる。【００１３】
非特許文献８には、ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＰＬＧＡ）またはｐＨ感受性Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｐ−４１３５Ｆから成るポリマーにタクロリムスを物理的に吸着させて合成したナノパーティクルについての報告がある。該ナノパーティクルはコラーゲン誘発関節炎及びＤＳＳ誘発大腸炎マウスに対し、タクロリムスよりも高い炎症改善効果を示している。しかしながら、該ナノパーティクルが炎症改善効果を示すためには、１日１回１２日間連続で投与していることから、この化合物では血中濃度を長く維持することができないと考えられる。さらに、腎障害の指標であるＢＵＮ、血清クレアチニン、クレアチニンクリアランスに対する改善作用も十分ではなかった。【００１４】
現在までに、患部への高い集積性を示し、タクロリムスに比べて有効性と安全性が顕著に向上し、個人差なく血中濃度が一定に維持されることによって、血中動態（血中トラフ濃度）による投与量のコントロールが不要となる製剤は未だなく、その開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開９３／００５０５９号
【特許文献２】国際公開２００３／０００７７１号
【特許文献３】国際公開２００４／０８２７１８号
【特許文献４】国際公開２０１３／１５７６６４号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９９９、６７、ｐ．３３３−３３５
【非特許文献２】Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９８、１５、ｐ．１６０９−１６１３
【非特許文献３】藤沢薬品工業株式会社（現アステラス製薬株式会社）プログラフカプセル（０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ）プログラフ注射液（５ｍｇ）に関する資料  ５３頁  平成１３年６月部会審議  承認申請資料概要
【非特許文献４】Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０１１、３４、１３０１−１３１０
【非特許文献５】Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３、９、ｐ．１４７−１５７
【非特許文献６】Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．２０００、７、ｐ．１３９−１４５
【非特許文献７】Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９９９、１４２１、ｐ．３２−３８
【非特許文献８】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００６、３１６、ｐ．１３８−１４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、薬剤を炎症部位に集積させ低投与量でより高い効果を有し、また目標血中濃度で維持させることにより長い投与間隔及び毒性を軽減する新規な免疫抑剤又は抗炎症剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者はポリアミノ酸誘導体の側鎖のカルボキシ基に、ポリエチレングリコールセグメント及びタクロリムスのアルコール性水酸基が結合しているタクロリムスの高分子誘導体が本発明の課題を解決することを見出した。【００１９】
本発明は以下の［１］〜［１４］に関する。
［１］ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基に、ポリエチレングリコールセグメント及びタクロリムスのアルコール性水酸基が結合しているタクロリムスの高分子誘導体。
［２］下記一般式（１）で表される前記［１］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。【００２０】
【化１】
2017119272.tif 000003
【００２１】
［式中、Ｒ１は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基及びポリエチレングリコールセグメントからなる群から選択される基であり、Ｒ２は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される基であり、Ｒ３はタクロリムスのアルコール性水酸基の残基であり、Ｒ４はポリエチレングリコールセグメントであり、Ｒ５は−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）であり（Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよい、炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である）、Ｘ１は結合又は結合基であり、ａ及びｂは各々１〜２９９の整数であり、ｃ、ｄ及びｅは各々０又は２９８以下の整数であり、且つａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅは２〜３００の整数であり、ポリアスパラギン酸誘導体の各繰り返し単位の配列順は任意である。］
［３］下記一般式（２）で表される前記［１］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。【００２２】
【化２】
2017119272.tif 000004
【００２３】
［式中、Ｒ１は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基及びポリエチレングリコールセグメントからなる群から選択される基であり、Ｒ２は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される基であり、Ｒ３はタクロリムスのアルコール性水酸基の残基であり、Ｒ４はポリエチレングリコールセグメントであり、Ｒ５は−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）であり（Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよい、炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である）、Ｘ１は結合又は結合基であり、ｆ、ｇ、ｈ及びｉは各々０又は２９９以下の整数であり、ｆ＋ｇ及びｈ＋ｉは各々１〜２９９の整数であり、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ及びｎは各々０又は２９８以下の整数であり、且つｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎは２〜３００の整数であり、ポリアスパラギン酸誘導体の各繰り返し単位の配列順は任意である。］
［４］Ｘ１が結合である前記［２］又は［３］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［５］Ｘ１がアスパラギン酸誘導体である前記［２］又は［３］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［６］Ｘ１が、下記一般式（３）又は一般式（４）である前記［２］又は［３］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。【００２４】
【化３】
2017119272.tif 000005
【００２５】
［式中、Ｒ８、Ｒ９はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基であり、Ｒ１０はアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族アミノ基及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸結合残基からなる群から選択される１種以上の基であり、並びにＣＹ−ＣＺはＣＨ−ＣＨ若しくはＣ＝Ｃ（二重結合）である。］
［７］Ｒ８、Ｒ９が共に水素原子であり、及びＣＹ−ＣＺがＣＨ−ＣＨである前記［６］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［８］Ｒ４のポリエチレングリコールセグメントが、下記一般式（５）である前記［２］乃至［７］の何れかの一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体。【００２６】
【化４】
2017119272.tif 000006
【００２７】
［式中、Ｒ１１は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、Ｒ１２は炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキレン基であり、Ｘ２は前記ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖のカルボキシ基に対して結合可能な官能基であり、及びｏは５〜１１５００の整数である。］
［９］Ｒ１が炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアルキル基又は下記一般式（６）で表されるポリエチレングルコールセグメントである前記［２］乃至［８］の何れかの一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体。【００２８】
【化５】
2017119272.tif 000007
【００２９】
［式中、Ｒ１３は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基であり、Ｒ１４は炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキレン基であり、及びｐは５〜１１５００の整数である。］
［１０］Ｒ２が炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）のアシル基であり、ｏが１０〜３０００の整数であり、及び（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）又は（ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ）が４〜２５０の整数である前記［８］又は［９］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［１１］Ｒ２が炭素数（Ｃ１〜Ｃ３）のアシル基であり、ｏが２０〜１５００の整数であり、及び（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）又は（ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ）が８〜２００の整数である前記［８］又は［９］に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［１２］Ｒ１がメチル基であり、及びＲ２がアセチル基である前記［２］乃至［１１］の何れか一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体。
［１３］ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖のカルボキシ基に、タクロリムスのアルコール性水酸基及びポリエチレングリコールセグメントを、有機溶媒中、脱水縮合剤を用いて結合させることを特徴とする前記［１］乃至［１２］の何れか一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体の製造方法。
［１４］前記［１］乃至［１２］の何れか一項に記載のタクロリムスの高分子誘導体を有効成分とするマクロライド系免疫抑制剤。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体は、ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖のカルボキシ基に直接又は結合基を介して、ポリエチレングリコールセグメント及びタクロリムスのアルコール性水酸基が結合していることを特徴とする。この高分子誘導体は生体内において安定であり、酵素非依存的にタクロリムスを徐放することができ、優れた血中滞留性を示すことで、低投与量で治療効果に優れている。また、酵素に依存しない生理活性物質の放出及び血中濃度の維持が可能であることによって、血中動態（血中トラフ濃度）による投与量のコントロールが不要となり、安全性が顕著に向上することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】試験例１における、実施例１及び比較例１の全タクロリムス量に対する放出されたタクロリムス量の割合を示す。
【図２】試験例１における、実施例１、２、５、６及び８の全タクロリムス量に対する放出されたタクロリムス量の割合を示す。
【図３】試験例１における、実施例３、４、７及び９の全タクロリムス量に対する放出されたタクロリムス量の割合を示す。
【図４】試験例２における、実施例１、２、８及び比較例１及びタクロリムスのラット血中濃度推移を示す。
【図５】試験例３における、実施例３、７及び９のラット血中濃度推移を示す。
【図６】試験例４における、比較例１のラットコラーゲン関節炎に対する抗炎症効果を示す。
【図７】試験例４における、実施例１のラットコラーゲン関節炎に対する抗炎症効果を示す。
【図８】試験例４における、実施例２及び８のラットコラーゲン関節炎に対する抗炎症効果を示す。
【図９】試験例４における、実施例３、７及び９のラットコラーゲン関節炎に対する抗炎症効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体はポリアスパラギン酸誘導体の側鎖のカルボキシ基に直接又は結合基を介して、ポリエチレングリコールセグメント及びタクロリムスのアルコール性水酸基が結合していることを特徴とする。以下に、その詳細について説明する。
【００３３】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体は、複数単位のポリアスパラギン酸誘導体をポリマー主鎖構造とする高分子化合物である。すなわち、複数の側鎖カルボキシ基を有するポリアスパラギン酸誘導体を高分子担体の主鎖構造とし、該側鎖カルボキシ基が、ポリエチレングリコールセグメント及びマクロライド系免疫抑制剤により化学的に官能基化された高分子化誘導体である。
【００３４】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体において用いられる側鎖カルボキシ基を有するポリアスパラギン酸誘導体は、α−アミド結合型重合体であっても、側鎖カルボキシ基とのアミド結合型重合体であっても、β−アミド結合型重合体であっても、その混合物であってもよく、好ましくはα−アミド結合型重合体、α−アミド結合型重合体及びβ−アミド結合型重合体の混合物である。本発明のタクロリムスの高分子誘導体は、例えば、下記一般式（１）又は一般式（２）で表される構造を有する。
【００３５】
【化６】
2017119272.tif 000008
【００３６】
【化７】
2017119272.tif 000009
【００３７】
上記一般式（１）及び（２）中、Ｒ１は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基及びポリエチレングリコールセグメントからなる群から選択される基であり、Ｒ２は水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される基であり、Ｒ３はタクロリムスのアルコール性水酸基の残基であり、Ｒ４はポリエチレングリコールセグメントであり、Ｒ５は−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）であり（Ｒ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよい、炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である）、Ｘ１は結合又は結合基である。
【００３８】
上記一般式（１）中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅはいずれも平均値である。ａ及びｂは各々１〜２９９の整数である。且つｃ、ｄ及びｅは各々０又は２９８以下の整数であり、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅは２〜３００の整数である。
【００３９】
上記一般式（２）中、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ、ｌ、ｍ及びｎはいずれも平均値である。ｆ、ｇ、ｈ及びｉは各々０又は２９９以下の整数である。且つｆ＋ｇ及びｈ＋ｉは各々１〜２９９の整数であり、且つｊ、ｋ、ｌ、ｍ及びｎは各々０または２９８以下の整数であり、ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎは２〜３００の整数である。
【００４０】
なお、各繰り返し単位の配列順は特に限定されるものではなく、ランダムに配置されていてよく、一般式（１）及び一般式（２）に記載のものに限られない。
【００４１】
前記ポリアスパラギン酸誘導体の末端基は、Ｎ末端基（一般式（１）及び一般式（２）のＲ２）及びＣ末端基（一般式（１）及び一般式（２）のＲ１）共に特に限定されるものではなく、無保護の遊離アミノ基及び遊離カルボン酸、並びにそれらの塩であっても良く、Ｎ末端基及びＣ末端基の適当な修飾体であっても良い。
【００４２】
該ポリアスパラギン酸誘導体のＮ末端基の修飾体としては、アシルアミド型修飾体、アルコキシカルボニルアミド型修飾体（ウレタン型修飾体）、アルキルアミノカルボニルアミド型修飾体（ウレア型修飾体）等を挙げることができる。一般式（１）及び一般式（２）におけるＮ末端基であるＲ２の修飾体は、アシルアミド型修飾体、アルコキシカルボニルアミド型修飾体（ウレタン型修飾体）である。
【００４３】
一方、該ポリアスパラギン酸誘導体のＣ末端基の修飾体としては、エステル型修飾体、アミド型修飾体、チオエステル型修飾体が挙げられる。一般式（１）及び一般式（２）におけるＣ末端基であるＲ１の修飾体は、アミド型修飾体である。
【００４４】
該ポリアスパラギン酸誘導体のＮ末端基及びＣ末端基の修飾基は、任意の修飾基であって良い。好ましくは、Ｎ末端基及びＣ末端基に結合する適当な結合基を介して、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ６〜Ｃ１８）の芳香族基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基等である末端修飾基を挙げることができる。又は、水溶性を付与できるポリエチレングリコールセグメントであっても良く、Ｎ末端基及びＣ末端基に結合する適当な結合基を介して結合した末端修飾基であることが挙げられる。
【００４５】
すなわち、Ｎ末端基は、適当なアシルアミド型修飾体又はアルコキシカルボニルアミド型修飾体（ウレタン型修飾体）であることが好ましく、カルボニル基又はカルボニルオキシ基を介した、前記置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ６〜Ｃ１８）の芳香族基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基であることが好ましい。
【００４６】
一方、Ｃ末端基としては、適当なアミド型置換基又はエステル型置換基であることが好ましく、アミド基又はエステル基を介した、前記置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ６〜Ｃ１８）の芳香族基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基又はポリエチレングリコールセグメントであることが好ましい。
【００４７】
上記Ｃ末端基である、一般式（１）及び（２）のＲ１のポリエチレングリコールセグメントは、エチレンオキシ基：（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位の繰り返し構造を有するセグメントである。好ましくはエチレンオキシ基単位の繰り返し数の平均値（重合度）が５〜１１５００のユニット、より好ましくは重合度が１０〜３０００のユニット、特に好ましくは重合度が２０〜１５００のユニットのポリエチレングリコール鎖を含むセグメント構造である。すなわち該ポリエチレングリコールセグメントとは、ポリエチレングリコール相当の平均分子量として２００ダルトン〜５００キロダルトンである。好ましくは分子量として５００ダルトン〜１５０キロダルトンであり、さらに好ましくは分子量が１０００ダルトン〜７０キロダルトンである。特に、分子量が１０００ダルトン〜５０キロダルトンであることが好ましい。
【００４８】
Ｒ１のポリエチレングリコールセグメントの構造例として、下記一般式（６）で表される構造が挙げられる。すなわち、エチレンオキシ基単位の酸素原子と、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキレン基がエーテル結合した構造であることが好ましい。
【００４９】
【化８】
2017119272.tif 000010
【００５０】
一般式（６）のｐは平均値であり、５〜１１５００程度の整数であるが、好ましくは１０〜３０００程度、特に好ましくは２０〜１５００程度である。
【００５１】
Ｒ１のポリエチレングリコールセグメントの末端基（Ｒ１３）は特に限定されるものではなく、水素原子、置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキニル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）アラルキル基等を挙げることができる。該アルキル基、アルキニル基、アラルキル基における置換基としては、水酸基、アミノ基、ホルミル基、カルボキシル基等が挙げられる。
【００５２】
Ｒ１のポリエチレングリコールセグメントの末端基において、置換基を有してもよい直鎖状アルキル基とは、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−へキシル基等を挙げることができる。置換基を有してもよい分岐鎖状アルキル基としては、例えばイソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基等が挙げられる。置換基を有してもよい環状アルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
【００５３】
Ｒ１のポリエチレングリコールセグメントの末端基において、直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が有しても良い置換基としては、チオール基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アルキルチオ基、炭素環若しくは複素環アリール基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換又は無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基又はシリル基等を挙げることができる。
【００５４】
Ｒ１のポリエチレングリコールセグメントの末端基において、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基とは、例えば、２−プロピニル、３−ブチニル基、４−ヘプチニル基、５−ヘキシニル基等が挙げられる。
【００５５】
Ｒ１のポリエチレングリコールセグメントの末端基において、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）アラルキル基とは、いずれか１カ所の水素原子がアリール基で置換されている直鎖または分岐鎖アルキル基である。例えば、ベンジル基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。好ましくはベンジル基、４−フェニルブチル基、８−フェニルオクチル基である。
【００５６】
Ｒ１のポリエチレングリコールセグメントにおける、ポリアスパラギン酸主鎖との結合側末端基（Ｒ１４）は、該ポリアスパラギン酸誘導体への適当な結合基であれば特に限定されるものではない。好ましくは置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキレン基である。例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、ブチレン基、ヘキサメチレン基、オクタメチレン基等が挙げられる。一般式（６）のＲ１４としてはトリメチレン基が好ましい。
【００５７】
前記一般式（１）及び一般式（２）のＲ２は、水素原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基及び炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基である。
【００５８】
前記炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基としては、直鎖状、分岐鎖状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシル基である。例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、シクロプロピルカルボニル基、シクロペンタンカルボニル基等が挙げられる。
【００５９】
前記炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基としては、直鎖状、分岐鎖状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニル基である。例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ペントキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基、シクロプロポキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【００６０】
本発明において、前記一般式（１）及び一般式（２）のＲ３であるタクロリムスのアルコール性水酸基の残基とは、ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基に直接又は結合基を介して、タクロリムスのアルコール性水酸基がエステル結合をしたタクロリムスをいう。
【００６１】
タクロリムスは、下記式（Ｉ）で表される。タクロリムスのアルコール性水酸基は、複数あるが、アルコール性水酸基であれば置換位置は限定されない。
【００６２】
【化９】
2017119272.tif 000011
【００６３】
ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基に直接又は結合基を介して結合したポリエチレングリコールセグメントは前記一般式（１）及び一般式（２）のＲ１のポリエチレングリコールセグメントと同じく、エチレンオキシ基単位の繰り返し構造を有し、その重合度及び平均分子量もＲ１のポリエチレングリコールセグメントと同じである。前記一般式（１）及び一般式（２）のＲ４は、ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基に直接又は結合基を介して、結合したポリエチレングリコールセグメントである。
【００６４】
ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基に直接又は結合基を介して結合したポリエチレングリコールセグメントは、ポリアスパラギン酸誘導体１分子に対し、１〜２００ユニットが結合している。すなわち、当該タクロリムスの高分子誘導体は、複数ユニットのポリエチレングリコールセグメントを有する。好ましくは１〜１５０ユニットのポリエチレングリコールセグメントを有し、さらに好ましくは１〜１００ユニットを有する。
【００６５】
前記一般式（１）及び一般式（２）におけるＲ４としては、例えば下記一般式（５）で表される構造が挙げられる。
【００６６】
【化１０】
2017119272.tif 000012
【００６７】
一般式（５）中、Ｒ１１は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキニル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基からなる群から選択される基である。Ｒ１２は炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキレン基である。Ｘ２は前記ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖のカルボキシ基に対して、それぞれ結合可能な官能基である。ｏは平均値であり、５〜１１５００の整数であり、好ましくは１０〜３０００であり、特に好ましくは２０〜１５００である．
【００６８】
Ｒ１１は特に限定されるものではなく、水素原子、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキニル基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基等を挙げることができる。該アルキル基、アルキニル基、アラルキル基における置換基としては、水酸基、アミノ基、ホルミル基、カルボキシル基等が挙げられる。
【００６９】
Ｒ１１において、置換基を有してもよい直鎖状アルキル基とは、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−へキシル基等を挙げることができる。置換基を有してもよい分岐鎖状アルキル基としては、例えばイソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、イソペンチル基、２−メチルブチル基、ネオペンチル基、１−エチルプロピル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基等が挙げられる。置換基を有してもよい環状アルキル基としては、例えばシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
【００７０】
Ｒ４のポリエチレングリコールセグメントの一方の末端基において、直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が有していても良い置換基とは、チオール基、水酸基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、アルキルチオ基、炭素環若しくは複素環アリール基、アリールチオ基、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、スルファモイル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アシルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、カルバモイルオキシ基、置換又は無置換アミノ基、アシルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、ウレイド基、スルホニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、ホルミル基、アシル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基又はシリル基等を挙げることができる。
【００７１】
Ｒ４のポリエチレングリコールセグメントの一方の末端基において、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニル基とは、例えば、２−プロピニル基、３−ブチニル基、４−ヘプチニル基、５−ヘキシニル基等が挙げられる。
【００７２】
Ｒ４のポリエチレングリコールセグメントの一方の末端基において、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキル基とは、いずれか１カ所の水素原子がアリール基で置換されている直鎖または分岐鎖アルキル基である。例えば、ベンジルオキシ基、２−フェニルエチル基、４−フェニルブチル基、３−フェニルブチル基、５−フェニルペンチル基、６−フェニルへキシル基、８−フェニルオクチル基等が挙げられる。好ましくはベンジル基、４−フェニルブチル基、８−フェニルオクチル基である。
【００７３】
本発明において、Ｒ１１は水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ６）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキル基が好ましい。
【００７４】
Ｒ４のポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基と結合する側の末端基（Ｒ１２）は、前記ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖のカルボキシ基に対して、それぞれ結合可能な官能基であれば、特に限定されるものではない。本発明においては炭素数（Ｃ２〜Ｃ６）のアルキレン基であり、例えば、エチレン基、トリメチレン基、ブチレン基等が挙げられ、特にトリメチレン基が好ましい。
【００７５】
一般式（５）のＸ２は前記ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖のカルボキシ基に対して、結合可能な官能基であれば、特に限定されるものではないが、本発明においては−ＮＨ−、−Ｏ−又は−Ｓ−が好ましい。
【００７６】
一般式（１）及び一般式（２）のＲ５は−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）を取り得る。ここでＲ６、Ｒ７は同一でも異なっていてもよい、炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキル基又は三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基である。
【００７７】
炭素数（Ｃ３〜Ｃ６）の環状アルキルとしては、例えば、シクロヘキシル基等が挙げられる。
【００７８】
三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基としては、例えば、エチル基、イソプロピル基、３−ジメチルアミノプロピル基等が挙げられる。
【００７９】
三級アミノ基で置換されていてもよい炭素数（Ｃ１〜Ｃ５）のアルキル基の三級アミノ基はジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等である。
【００８０】
本発明において、前記タクロリムスのアルコール性水酸基の残基、ポリエチレングリコールセグメント及び一般式（１）及び一般式（２）のＲ５は、それぞれ一般式（１）及び一般式（２）のＸ１を介してポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基に結合している。前記一般式（１）及び一般式（２）におけるＸ１は、前記Ｒ３、Ｒ４及びＲ５と、ポリアスパラギン酸主鎖の側鎖カルボニル基とを結合する結合基であっても、又は単に結合であってもよく、Ｘ１が結合基である場合、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５の結合性官能基と、該ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基に対して、それぞれ結合可能な官能基を両末端に有するならば、特に限定されるものではない。
【００８１】
Ｘ１が結合基である場合、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５側の末端結合性官能基としては、カルボキシ基、オキシカルボキシ基、アミノカルボキシ基が好ましい。Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が分子中にアミノ基、水酸基及び／又はチオール基を有することから、これらの結合性官能基は、該アミノ基、水酸基及び／又はチオール基とアミド結合、エステル結合、チオエステル結合、ウレタン結合、カーボネート結合及びウレア結合する。
【００８２】
Ｘ１のもう一方の、前記側鎖カルボキシ基側の末端結合性官能基としては、アミノ基、水酸基又はチオール基が好ましい。これらの結合性官能基は、側鎖カルボキシ基とアミド結合、エステル結合、チオエステル結合できる。
【００８３】
すなわちＸ１は、一方の末端基がカルボキシ基、オキシカルボキシ基又はアミノカルボキシ基であり、もう一方の末端基がアミノ基、水酸基又はチオール基である置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキレン基又はアルケニレン基であることが好ましい。
【００８４】
Ｘ１が結合基である場合の具体例は下表に記載の物が挙げられるが、本発明の高分子誘導体の合成又は性能に影響を与えないものであればこれらに限られない。いずれのＸ１も、側鎖カルボキシ基とはアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する。
【００８５】
【表１】
2017119272.tif 000013
【００８６】
前記Ｘ１のアルキレン基は、水素原子が適当な置換基により修飾されていても良い。該置換基としては、水酸基、アミノ基、ハロゲン原子、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルカルボニルアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルカルボニルアミド基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルカルボニルアルキルアミド基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルアリール基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキルアミノ基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアシルアミド基、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルコキシカルボニルアミノ基等を挙げることができる。
【００８７】
Ｘ１としては−ＣＯ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−、−ＣＯ−（ＣＨ２）ｙ−Ｏ−が好ましい。特に好ましくは、Ｒ３、Ｒ４又はＲ５とアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合することができるカルボキシ基を有すると共に、該側鎖カルボキシ基とアミド結合できるアミノ基を有する−ＣＯ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−である。
【００８８】
Ｘ１中のｙとして好ましくは１乃至６であり、さらに好ましくは１、２、３、又は５である。最も好ましいＸ１としては−ＣＯ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−（ｙ＝１、２、３、又は５）である。
【００８９】
Ｘ１として挙げた置換基を有していても良い−ＣＯ−（ＣＨ２）ｙ−ＮＨ−において、ｙが１の場合はアミノ酸骨格と同義である。したがって、Ｘ１として、アミノ酸誘導体を用いても良い。
【００９０】
Ｘ１がアミノ酸誘導体の場合、アミノ酸のＮ末端のアミノ基が前記側鎖カルボキシ基とアミド結合し、Ｃ末端のカルボキシ基が該Ｒ３、Ｒ４又はＲ５のアミノ基、水酸基又はチオール基とアミド結合、エステル結合又はチオエステル結合する。
【００９１】
Ｘ１として用いられるアミノ酸は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸であってよく、Ｌ体、Ｄ体のいずれでも特に限定されずに用いることができる。例えば、グリシン、β−アラニン、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン等の炭化水素系アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等を用いることができる。
【００９２】
Ｘ１としてのアミノ酸誘導体はアスパラギン酸誘導体が好ましい。該アスパラギン酸誘導体としては、α−カルボキシ基が前記Ｒ３、Ｒ４又はＲ５と結合し、β−カルボキシ基がアミド体であるアスパラギン酸誘導体である。または、β−カルボキシ基が前記Ｒ３、Ｒ４又はＲ５と結合し、α−カルボキシ基がアミド体であるアスパラギン酸誘導体であっても良い。該Ｒ３、Ｒ４又はＲ５の結合に関与しない、もう一方のカルボキシ基がアミド体である場合は、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜２０）のアルキルアミド、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族アミド、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキルアミド又はカルボキシ基が保護されたアミノ酸結合残基等が挙げられる。
【００９３】
該アスパラギン酸誘導体の置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜２０）のアルキルアミドとしては、例えば、メチルアミド、エチルアミド、イソプロピルアミド、ｔ−ブチルアミド、シクロヘキシルアミド、ドデシルアミド、オクタデシルアミド等が挙げられる。
【００９４】
該アスパラギン酸誘導体の置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族アミドとしては、例えば、フェニルアミド、４−メトキシフェニルアミド、４−ジメチルアミノフェニルアミド、４−ヒドロキシフェニルアミド等が挙げられる。該アスパラギン酸誘導体の置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）のアラルキルアミドとしては、例えば、ベンジルアミド、２−フェニルエチルアミド、４−フェニルブチルアミド、８−フェニルオクチルアミド等が挙げられる。該アスパラギン酸誘導体のカルボキシ基が保護されたアミノ酸結合残基としては、例えば、下記式（７−１）〜（７−４）で表されるグリシニル−メチルエステル基、グリシニル−エチルエステル基、グリシニル−プロピルエステル基、グリシニル−ベンジルエステル基、下記式（８−１）〜（８−４）で表されるアラニニル−メチルエステル基、アラニニル−エチルエステル基、アラニニル−プロピルエステル基、アラニニル−ベンジルエステル基、下記式（９−１）〜（９−４）で表されるバリニル−メチルエステル基、バリニル−エチルエステル基、バリニル−プロピルエステル基、バリニル−ベンジルエステル基、下記式（１０−１）〜（１０−４）で表されるロイシニル−メチルエステル基、ロイシニル−エチルエステル基、ロイシニル−プロピルエステル基、ロイシニル−ベンジルエステル基、下記式（１１−１）〜（１１−４）で表されるフェニルアラニニル−メチルエステル基、フェニルアラニニル−エチルエステル基、フェニルアラニニル−プロピルエステル基、フェニルアラニニル−ベンジルエステル基、等が挙げられる。
【００９５】
【化１１】
2017119272.tif 000014
【００９６】
前記Ｘ１は、下記一般式（３）又は一般式（４）で示されるアスパラギン酸誘導体又はマレイン酸誘導体もとり得る。
【００９７】
【化１２】
2017119272.tif 000015
【００９８】
ここで、一般式（３）及び一般式（４）中、Ｒ８、Ｒ９はそれぞれ独立して水素原子又は炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基である。Ｒ１０はアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキルアミノ基、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族アミノ基、及びカルボキシ基が保護されたアミノ酸結合残基からなる群から選択される１種以上の基である。ＣＸ−ＣＹはＣＨ−ＣＨ若しくはＺ配置のＣ＝Ｃ（二重結合）である。
【００９９】
Ｒ８、Ｒ９における、炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基は、直鎖状、分岐鎖状又は環状の炭素数（Ｃ１〜Ｃ８）のアルキル基である。
直鎖状アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−へキシル基等を挙げることができる。
分岐鎖状アルキル基としては、例えば、イソプロピル基、ｔ−ブチル基、１−メチル−プロピル基、２−メチル−プロピル基、２，２−ジメチルプロピル基等が挙げられる。
環状アルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
【０１００】
Ｒ１０において、置換基を有していても良い炭素数（Ｃ１〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアルキルアミノ基とは、例えばメチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｔ−ブチルアミノ基、シクロヘキシルアミノ基、ｎ−オクチルアミノ基、ドデシルアミノ基、オクタデシルアミノ基が挙げられる。
置換基を有していても良い炭素数（Ｃ７〜Ｃ２０）の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアラルキルアミノ基としては、例えば、ベンジルアミノ基、２−フェニルエチルアミノ基、４−フェニルブチルアミノ基、８−フェニルオクチルアミノ基等が挙げられる。
置換基を有していても良い炭素数（Ｃ５〜Ｃ２０）の芳香族アミノ基としては、例えば、アニリノ基、４−メトキシアニリノ基、４−ジメチルアミノアニリノ基、４−ヒドロキシアニリノ基等が挙げられる。
【０１０１】
また、前記Ｒ１０は、カルボキシ基が保護されたアミノ酸結合残基であっても良い。カルボキシ基が保護されたアミノ酸結合残基としては、例えば、下記式（７−１）〜（７−４）で表されるグリシニル−メチルエステル基、グリシニル−エチルエステル基、グリシニル−プロピルエステル基、グリシニル−ベンジルエステル基、下記式（８−１）〜（８−４）で表されるアラニニル−メチルエステル基、アラニニル−エチルエステル基、アラニニル−プロピルエステル基、アラニニル−ベンジルエステル基、下記式（９−１）〜（９−４）で表されるバリニル−メチルエステル基、バリニル−エチルエステル基、バリニル−プロピルエステル基、バリニル−ベンジルエステル基、下記式（１０−１）〜（１０−４）で表されるロイシニル−メチルエステル基、ロイシニル−エチルエステル基、ロイシニル−プロピルエステル基、ロイシニル−ベンジルエステル基、下記式（１１−１）〜（１１−４）で表されるフェニルアラニニル−メチルエステル基、フェニルアラニニル−エチルエステル基、フェニルアラニニル−プロピルエステル基、フェニルアラニニル−ベンジルエステル基、等が挙げられる。
【０１０２】
【化１３】
2017119272.tif 000016
【０１０３】
一般式（１）で表されるタクロリムスの高分子誘導体における全α−アスパラギン酸数の平均値はａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅで表され、２〜３００個程度であり、好ましくは４〜２５０個程度であり、特に好ましくは８〜２００個である。
【０１０４】
全α−アスパラギン酸数（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）に対するタクロリムスの結合したアスパラギン酸数（ａ）の割合は１〜９９％、好ましくは１〜８０％、更に好ましくは１〜６０％である。ポリエチレングリコールセグメント結合アスパラギン酸単位と併存する必要から、そのバランスを考慮すると１〜５０％、更には１〜３０％、特には５〜３０％である事が好ましい。
又、α−アスパラギン酸数（ａ）として１〜２００個、好ましくは２〜１５０個程度、特に好ましくは２〜１００個程度、若しくは２〜４０個程度である。
【０１０５】
全α−アスパラギン酸数（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）に対するポリエチレングリコールセグメントの結合したアスパラギン酸数（ｂ）の割合は１〜９９％、好ましくは１〜８０％、更に好ましくは１〜６０％である。前記のタクロリムス結合アスパラギン酸単位と併存する必要から、そのバランスを考慮すると１〜４０％、特には２〜４０％である事が好ましい。
又、α−アスパラギン酸数（ｂ）として１〜２００個、好ましくは１〜１５０個程度、特に好ましくは１〜１００個程度、若しくは２〜４０個程度である。
【０１０６】
一般式（２）で表されるタクロリムスの高分子誘導体における全アスパラギン酸数の平均値はｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎで表され、２〜３００個程度であり、好ましくは４〜２５０個程度であり、特に好ましくは８〜２００個である。
【０１０７】
全アスパラギン酸数（ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ）に対するタクロリムスの結合したアスパラギン酸数（ｆ＋ｇ）の割合は１〜９９％、好ましくは１〜８０％、更に好ましくは１〜６０％である。ポリエチレングリコールセグメント結合アスパラギン酸単位と併存する必要から、そのバランスを考慮すると１〜５０％、更には１〜３０％、特には５〜３０％である事が好ましい。
又、タクロリムスの結合したアスパラギン酸数（ｆ＋ｇ）は１〜２００個、好ましくは２〜１５０個程度、特に好ましくは２〜１００個程度、若しくは２〜４０個程度である。
【０１０８】
全アスパラギン酸数（ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ）に対するポリエチレングリコールセグメントの結合したアスパラギン酸数（ｈ＋ｉ）の割合は１〜９９％、好ましくは１〜８０％、更に好ましくは１〜６０％である。前記のタクロリムス結合アスパラギン酸単位と併存する必要から、そのバランスを考慮すると１〜４０％、特には２〜４０％である事が好ましい。
又、タクロリムスの結合したアスパラギン酸数（ｈ＋ｉ）は１〜２００個、好ましくは１〜１５０個程度、特に好ましくは１〜１００個程度、若しくは２〜４０個程度である。
【０１０９】
全アスパラギン酸数（ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎ）に対するα−アスパラギン酸（ｆ＋ｈ＋ｊ＋ｌ）の割合は１〜８０％であり、好ましくは１〜５０％である。この割合は、例えば、ポリアスパラギン酸の保護基の脱保護条件等を選ぶことにより適宜変えることができる。
【０１１０】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体の分子量は、上記の構成部分の各構成分子量を合算した計算値を該「タクロリムスの高分子誘導体の分子量」として採用する。すなわち、（１）ポリアスパラギン酸主鎖の分子量、（２）ポリエチレングリコールセグメントの分子量にその結合数を乗じたポリエチレングリコールセグメントの総分子量、（３）タクロリムスの結合残基分子量にその結合数を乗じたタクロリムスの総分子量、（４）任意のポリエチレングリコールセグメントに結合したＸ１残基の分子量にその結合数を乗じたＸ１残基の総分子量、並びに（５）任意のタクロリムスに結合したＸ１残基分子量にその結合数を乗じたＸ１残基の総分子量、を合算した計算値を該分子量とする。
【０１１１】
該ポリアスパラギン酸誘導体の分子量は、キロダルトン単位での精度による分子量規定が求められるものである。したがって、前記各構成部分の分析方法は、該ポリアスパラギン酸誘導体のキロダルトン単位での分子量測定において、十分な精度の分析方法であれば特に限定されるものではなく、様々な分析方法を適宜選択して良い。以下に、各構成部分における好ましい分析方法を挙げる。
【０１１２】
前記（１）ポリアスパラギン酸主鎖の分子量は、該主鎖の重合モノマー単位の分子量にその重合数を乗じた計算値である。該重合数は１Ｈ−ＮＭＲの積分値から算出された重合数、アミノ酸分析により算出される重合数、中和滴定により算出される重合数を用いることができる。
【０１１３】
前記（２）ポリエチレングリコールセグメントの総分子量は、ポリエチレングリコールセグメントの分子量にその結合数を乗じた計算値である。ポリエチレングリコールセグメントの分子量は、用いるポリエチレングリコールセグメント構造化合物の、ポリエチレングリコール標準品を基準としたＧＰＣ法により測定されるピークトップ分子量により求められる平均分子量を採用する。
【０１１４】
ポリエチレングリコールセグメントの結合数は、タクロリムスの高分子誘導体から、ポリエチレングリコールセグメントを開裂させて、遊離するポリエチレングリコールセグメントを定量分析することにより求める方法が挙げられる。または、該ポリアスパラギン酸主鎖に対しポリエチレングリコールセグメントを導入する反応において、ポリエチレングリコールセグメントの消費率から算出する方法であっても良い。
【０１１５】
前記（３）タクロリムスの総分子量は、タクロリムスの結合残基分子量にその結合数を乗じた計算値である。該タクロリムスの結合数は、該タクロリムスの高分子誘導体を加水分解し、遊離するタクロリムス又はその分解生成物を必要に応じて誘導体化し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて定量分析することにより求める方法が挙げられる。又は、該ポリアスパラギン酸主鎖に対しタクロリムスを導入する反応において、タクロリムスの消費率から算出する方法であっても良い。
【０１１６】
前記（４）の任意のポリエチレングリコールセグメントに結合したＸ１残基の総分子量は、Ｘ１残基の分子量にその結合数を乗じた計算値である。該ポリアスパラギン酸主鎖に対し該Ｘ１を導入する反応において、Ｘ１の消費率から算出する方法であっても良い。
【０１１７】
前記（５）の任意のタクロリムスに結合したＸ１残基の総分子量は、Ｘ１残基の分子量にその結合数を乗じた計算値である。該ポリアスパラギン酸主鎖に対しＸ１を導入する反応において、Ｘ１の消費率から算出する方法であっても良い。
【０１１８】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体は、該高分子誘導体におけるポリエチレングリコールセグメントの質量含有率が３０質量％以上９５質量％以下であることを特徴とする。該ポリエチレングリコールセグメントの質量含有率は、前述の該タクロリムスの高分子誘導体の分子量に対する、前記（２）のポリエチレングリコールセグメントの総分子量の含有比率により算出することができる。すなわち、ポリエチレングリコールセグメントの質量含有率は、以下の式で算出する。
【０１１９】
（計算式）
ＰＥＧの質量含有率（％）＝ＰＥＧ総分子量／ＴＡＣの高分子誘導体分子量×１００
注）ＰＥＧ：ポリエチレングリコールセグメント
注）ＴＡＣ：タクロリムス
【０１２０】
前記ポリエチレングリコールセグメントの質量含有率のより好ましい範囲は３０質量％以上９５質量％以下であり４０質量％以上９５質量％以下であることが特に好ましい。
【０１２１】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体は、該高分子誘導体におけるタクロリムスの質量含有率が、質量２％以上質量５０％以下であることが好ましい。
【０１２２】
該ポリアミノ酸誘導体におけるマクロライド系免疫抑制剤の質量含有率は、前述の該ポリアスパラギン酸誘導体の分子量に対する、前記（３）タクロリムスの総分子量の含有比率により算出することができる。すなわち、タクロリムスの質量含有率は、以下の式で算出する。
【０１２３】
（計算式）
ＴＡＣの質量含有率（％）＝ＴＡＣの総分子量／ＴＡＣの高分子誘導体分子量×１００
注）ＴＡＣ：タクロリムス
【０１２４】
前記タクロリムスの質量含有率のより好ましい範囲は、２質量％以上で５０質量％以下である。タクロリムス含量が２質量％以上で４０質量％以下であることが特に好ましい。
【０１２５】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体は、ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基とタクロリムスのアルコール性水酸基及びポリエチレングリコールセグメントを有機溶媒中、脱水縮合剤を用いてエステル結合、アミド結合及び／又はチオエステル基で結合させることにより得られ、本製造方法も本発明に含まれる。すなわち、ポリエチレングリコール構造部分−ポリアスパラギン酸のブロック共重合体と、必要に応じて反応させる基以外の官能基を保護したタクロリムスとを、両者が溶解する有機溶媒中、好ましくはＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の非プロトン性極性溶媒中、０〜１８０℃、好ましくは５〜５０℃でジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）、１−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキシキノリノン（ＥＥＤＱ）等の脱水縮合剤を用いた反応に付す製造方法である。又、縮合反応の際にＮ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等の反応補助剤を用いてもよい。縮合反応後、必要に応じて脱保護を行い、通常の分離精製等の操作によりタクロリムスの高分子誘導体が製造される。
【０１２６】
又、Ｒ５が−Ｎ（Ｒ６）ＣＯＮＨ（Ｒ７）基であるタクロリムスの高分子誘導体は、上記のカルボジイミド類を縮合剤として用いても得られる。
【０１２７】
ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基とタクロリムス及びポリエチレングリコールセグメントを導入する方法としては、ポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基を上記の方法にて活性化してから添加したい量の対応するタクロリムスのアルコール性水酸基及びポリエチレングリコールセグメントを塩基性条件下で反応させる方法、対応するタクロリムス及びポリエチレングリコールセグメントを活性化させてからポリアスパラギン酸誘導体の側鎖カルボキシ基と反応させる方法等も可能である。
【０１２８】
ポリアミノ酸誘導体の側鎖カルボキシ基へのタクロリムス及びポリエチレングリコールセグメントの導入順としては、タクロリムスを導入し次いでポリエチレングリコールセグメントを導入してもよく、ポリエチレングリコールセグメントを導入し次いでタクロリムスを導入してもよく、同時であってもよい。又、タクロリムス又はポリエチレングリコールセグメントを導入した高分子誘導体を合成し精製した後に、同様の反応でポリアミノ酸誘導体中の未反応のカルボキシ基を再活性化させることができ、ここにタクロリムス又はポリエチレングリコールセグメントを導入してもよい。ただし、本発明のタクロリムスの高分子誘導体の製造法は上記の方法に限定されるわけではない。
【０１２９】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体は、生体内に投与後、タクロリムスを徐々に遊離する性質を有し、該タクロリムスを有効成分とする医薬としての用途を有する。
【０１３０】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体の医薬品としての用途は、該タクロリムスにより治療効果を奏する疾病であれば特に限定されるものではない。例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患、臓器移植及び骨髄移植における拒絶反応の抑制等の治療に用いられる医薬に適する。特に好ましくは、自己免疫疾患あるいは炎症性疾患の治療用医薬である。自己免疫疾患としては、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎等を挙げることができ、炎症性疾患としては、間質性肺炎等が挙げられる。
【０１３１】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体を含む医薬は、医薬品として通常容認される他の添加剤を有していても良い。該添加剤としては、賦形剤、増量剤、充填剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等が挙げられる。
【０１３２】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体を含む医薬は、治療用の医薬品製剤として調製されても良い。該製剤としては、経口、注射、直腸内投与、門脈内投与、臓器の灌流液に混合、患部臓器への局所投与等いずれの投与方法でも可能であるが、好ましくは非経口的投与であり、注射による静脈内投与、動脈内投与又は患部臓器への局所投与がより好ましく、通常、例えば、水、生理食塩水、５％ブドウ糖又はマンニトール液、水溶性有機溶媒（例えば、グリセロール、エタノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ポリエチレングリコール、クレモホール等及びそれらの混合液）並びに水と該水溶性有機溶媒の混合液等が使用される。
【０１３３】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体の投与量は、患者の性別、年齢、生理的状態、病態等により当然変更され得るが、非経口的に、通常、成人１日当たり、活性成分として０．０１〜５００ｍｇ／ｍ２、好ましくは０．１〜２５０ｍｇ／ｍ２を投与する。注射による投与は、静脈、動脈、患部（炎症部）等に行われる。
【０１３４】
本発明のタクロリムスの高分子誘導体は患部に集積し、低投与量でタクロリムス単剤より高い効果を有する。また、酵素に依存しない生理活性物質の放出及び血中濃度の維持が可能であることから、血中動態（血中トラフ濃度）による投与量のコントロールが不要となり、長い投与間隔及び安全性が顕著に向上する。このため、本発明のタクロリムスの高分子誘導体は臓器あるいは組織の移植に対する拒絶反応、移植片対宿主反応、自己免疫疾患、および感染症等の治療および予防に有用な免疫抑制剤又は抗炎症剤である。
【実施例】
【０１３５】
以下、本発明を実施例により更に説明する。ただし、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。また、本発明の化合物は必要に応じて製剤化を行った後に使用した。【０１３６】
合成例１
ポリエチレングリコール−αβ−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ポリアスパラギン酸重合数９５）の合成（化合物１）
片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、１０．０ｇ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、１３０ｍＬ）に溶解後、γ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、１３．８ｇ、２００当量）を加え、３２．０℃にて一夜攪拌した。反応液を、エタノール（７５５ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（３１０１Ｌ）の混合溶媒中に１時間かけて滴下し、室温にて１時間攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（４１．８ｇ）を得た。
得られた固形物（４０．０ｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、８００ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（１．２６ｍＬ）を加えて３２．５℃にて撹拌した。反応液を、エタノール（８００ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（７２００ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、室温にて攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（３２．２ｇ）を得た。得られた固形物（３０ｇ）をアセトニトリル（ＭｅＣＮ、１２００ｍＬ）に懸濁後、０．２規定の水酸化ナトリウム水溶液（１２００ｍＬ）及び精製水（１８０ｍＬ）を加えて、２３℃にて加水分解を行った。反応液に２規定の塩酸を加えて中和したのち、減圧濃縮にてアセトニトリルを除去後、酢酸エチル（１８００ｍＬ）を用い濃縮液を３回洗浄した。水層を減圧濃縮後、１規定の水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のｐＨを１０．７に調整し、食塩（６０．８ｇ）を添加後、分配吸着樹脂カラムクロマトグラフィー及びイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いて精製・脱塩し、溶出した溶液を減圧濃縮したのち、凍結乾燥し、化合物１（１５．１ｇ）を得た。０．１規定の水酸化カリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のアスパラギン酸の重合数は９４．９であった。【０１３７】
合成例２
ポリエチレングリコール−αβ−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ポリアスパラギン酸重合数４３）の合成（化合物２）
合成例１記載の方法に準じ、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコールに対してＢＬＡ−ＮＣＡを５２．２当量用いることにより、表記化合物２を得た。０．１規定の水酸化カリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のアスパラギン酸の重合数は４３．２であった。【０１３８】
合成例３
ポリエチレングリコール−αβ−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ポリアスパラギン酸重合数７３）の合成（化合物３）
片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、１０．０ｇ）をＤＭＳＯ（１９０ｍＬ）に溶解後、ＢＬＡ−ＮＣＡ（８．８９ｇ、１２９当量）を加え、３２℃にて一夜攪拌した。反応液を、エタノール（４００ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（１６００ｍＬ）の混合溶媒中に１時間かけて滴下し、室温にて１時間攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（２６．５ｇ）を得た。
得られた固形物（２３．０ｇ）をアセトニトリル（４６０ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（７２４ｍＬ）を加えて３５℃にて３時間撹拌した後２３℃まで冷却した．反応液に０．２規定の水酸化ナトリウム（５３９ｍＬ）を滴下し、２３℃にて加水分解を行った。反応液に２規定の塩酸を加えて中和したのち、減圧濃縮にてアセトニトリルを除去後、酢酸エチル（７２０ｍＬ）を用い濃縮液を３回洗浄した。水層を減圧濃縮後、１規定の水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のｐＨを１０．６に調製し、食塩（５７．５ｇ）を添加後、分配吸着樹脂カラムクロマトグラフィー、続いてイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、溶出した溶液を減圧濃縮したのち、凍結乾燥し、化合物３（１３．０ｇ）を得た。０．１規定の水酸化カリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のアスパラギン酸の重合数は７２．８であった。【０１３９】
合成例４
αβ−ポリアスパラギン酸重合体（ポリアスパラギン酸重合数７８）の合成（化合物４）
ｎ−ブチルアミン（東京化成製、１８．３ｍｇ）をＤＭＳＯ（３０ｍＬ）に溶解後、ＢＬＡ−ＮＣＡ（５．６１ｇ、９０当量）を加え、３０℃にて一夜攪拌した。反応液を、エタノール（１２０ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（４８０ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、室温にて攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物を得た。得られた固形物全量に１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ、３５ｍＬ）を加え、７８℃にて溶解後、７０℃にて無水酢酸２．５ｍＬを加えた。３時間撹拌後、反応液を酢酸エチル（１７５ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（７００ｍＬ）の混合溶液中に滴下し、室温にて一夜撹拌した．沈析物を濾取後、真空乾燥し固形物（３．７４ｇ）を得た。
得られた固形物（３．７４ｇ）をアセトニトリル（３０ｍＬ）に溶解し、０．２規定の水酸化ナトリウム水溶液（１３８ｍＬ）を添加し、室温にて加水分解を行った。反応後、減圧濃縮にてアセトニトリルを除去後、酢酸エチル（４２０ｍＬ）を用い濃縮液を３回洗浄した。水層を減圧濃縮後、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、凍結乾燥を行い、化合物４（２．２９ｇ）を得た。ＮＭＲに基づく本化合物１分子中のアスパラギン酸の重合数は７８であった。【０１４０】
合成例５
αβ−ポリアスパラギン酸重合体（ポリアスパラギン酸重合数１１２）の合成（化合物５）
ｎ−ブチルアミン（東京化成製、１５．８ｍｇ）をＤＭＳＯ（３０ｍＬ）に溶解後、ＢＬＡ−ＮＣＡ（７．２６ｇ、１３５当量）を加え、３０℃にて一夜攪拌した。反応液を、エタノール（１２０ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（４８０ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、室温にて攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（５．３７ｇ）を得た。得られた固形物（５．３７ｇ）にＤＭＩ（３５ｍＬ）を加え、８０℃にて溶解後、６８℃にて無水酢酸２．５ｍＬを加えた。３時間撹拌後、反応液を酢酸エチル（２００ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（８００ｍＬ）の混合溶液中に滴下し、室温にて一夜撹拌した．沈析物を濾取後、真空乾燥し固形物（５．１６ｇ）を得た。
得られた固形物（５．１６ｇ）をアセトニトリル（２２ｍＬ）に溶解し、０．２規定の水酸化ナトリウム水溶液（１６７ｍＬ）を添加し、室温にて加水分解を行った。反応後、減圧濃縮にてアセトニトリルを除去後、酢酸エチル（５１０ｍＬ）を用い濃縮液を３回洗浄した。水層を減圧濃縮後、イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、凍結乾燥を行い、化合物５（３．００ｇ）を得た。ＮＭＲに基づく本化合物１分子中のアスパラギン酸の重合数は１１２であった。【０１４１】
合成例６
ポリエチレングリコール−α−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ポリアスパラギン酸重合数８７）の合成（化合物６）
片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、６．０ｇ）をＤＭＳＯ（１１４ｍＬ）に溶解後、ＢＬＡ−ＮＣＡ（１５．０ｇ、１２０当量）を加え、３０℃にて一夜攪拌した。反応液を、エタノール（２２８ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（９１２ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、室温にて攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（２３．８ｇ）を得た。得られた固形物全量をＤＭＦ（２００ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（０．７５ｍＬ）を加えて３０℃にて３時間撹拌した。反応液を、酢酸エチル（２００ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（１８００ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、室温にて攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（１５．８ｇ）を得た。
得られた固形物（８．７２ｇ）を１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ、１４０ｍＬ）に溶解後、１０％パラジウム−炭素（０．８７ｇ）を加えて、３５℃にて一夜加水素分解を行った。反応液に活性炭を加えて１時間撹拌したのち、１０％パラジウム−炭素を濾別した。濾液を、酢酸エチル（２００ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（１０００ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、室温にて一夜攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（４．１８ｇ）を得た。固形物全量を精製水（４１８ｍＬ）に溶解し、食塩（２０．９ｇ）を添加、溶解し、２規定の水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のｐＨを１１．０に調製後、分配吸着樹脂カラムクロマトグラフィー、続いてイオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、溶出した溶液を減圧濃縮したのち、凍結乾燥することによって、化合物６（７６０ｍｇ）を得た。ＮＭＲに基づく本化合物１分子中のアスパラギン酸の重合数は８７であった。【０１４２】
合成例７
ポリエチレングリコール−α−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ポリアスパラギン酸重合数４０）の合成（化合物７）
合成例６記載の方法に準じ、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコールに対してＢＬＡ−ＮＣＡを５１．３当量用いることにより、表記化合物７を得た。この際、ＮＭＰの代わりにＤＭＦを使用した。０．１規定の水酸化カリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のアスパラギン酸の重合数は４０．２であった。【０１４３】
合成例８
ポリエチレングリコール−α−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（ポリエチレングリコール分子量１２０００、ポリアスパラギン酸重合数９０）の合成（化合物８）
片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、１０．０ｇ）をＤＭＳＯ（２００ｍＬ）に溶解後、ＢＬＡ−ＮＣＡ（２８．７ｇ、１４０当量）を加え、３２．５℃にて一夜攪拌した。反応液を、エタノール（４００ｍＬ）及びジイソプロピルエーテル（１６００ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、室温にて攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（２８．６ｇ）を得た。得られた固形物（１８．１ｇ）をＮＭＰ（１８１ｍＬ）に溶解し、無水酢酸（０．５７ｍＬ）を加えて３０℃にて一夜撹拌した。反応液を、ジイソプロピルエーテル（２０００ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、室温にて攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物を得た。
得られた固形物（１５．３ｇ）をＮＭＰ（１５５ｍＬ）に溶解後、１０％パラジウム−炭素（３．４６ｇ）を加えて、３５℃にて一夜加水素分解を行った。反応液に活性炭を加えて３０分間撹拌したのち、１０％パラジウム−炭素を濾別した。濾液を、ジイソプロピルエーテル（３７００ｍＬ）の混合溶媒中に滴下し、室温にて攪拌した。沈殿物を濾取後、真空乾燥し固形物（５．６４ｇ）を得た。得られた固形物（４．５３ｇ）を精製水（４５３ｍＬ）に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液にて溶解液のｐＨを１１．０に調製後、陰イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィー、続いて陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィーを用いて精製し、溶出した溶液を減圧濃縮したのち、凍結乾燥することによって、化合物８（３．４３ｇ）を得た。０．１規定の水酸化カリウム水溶液を用いた滴定値に基づく本化合物１分子中のアスパラギン酸の重合数は９０．０であった。【０１４４】
実施例１
一般式（２）においてＲ１として一般式（６）の構造を有し、Ｒ２がアセチル基、Ｒ３がタクロリムスのアルコール性水酸基の残基、Ｒ４として一般式（５）の構造を有し、Ｒ５がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｒ１１及びＲ１３がメチル基、Ｒ１２及びＲ１４がトリメチレン基、Ｘ１が結合、Ｘ２が−ＮＨ−基、ｏ及びｐの平均値が２７２、ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎの平均値が４３．２、ｆ＋ｇの平均値が７．０、ｈ＋ｉの平均値が５．２である高分子誘導体（化合物９）
化合物２（２４５ｍｇ）、タクロリムス（２５０ｍｇ）、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、８６２ｍｇ）をＮＭＰ（６．２ｍＬ）に溶解し、２５℃にてＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、３７．９ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ、１９２μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１８６ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（７ｍＬ）に溶解後、精製水（７ｍＬ）及びイオン交換樹脂（７ｍＬ）を加え、撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物９（１．１２ｇ）を得た。化合物９のタクロリムス含量は６．８４％と計算された。【０１４５】
実施例２
一般式（２）においてＲ１として一般式（６）の構造を有し、Ｒ２がアセチル基、Ｒ３がタクロリムスのアルコール性水酸基の残基、Ｒ４として一般式（５）の構造を有し、Ｒ５がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｒ１１及びＲ１３がメチル基、Ｒ１２及びＲ１４がトリメチレン基、Ｘ１が結合、Ｘ２が−ＮＨ−基、ｏ及びｐの平均値が２７２、ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎの平均値が７２．８、ｆ＋ｇの平均値が１４．１、ｈ＋ｉの平均値が５．０である高分子誘導体（化合物１０）
化合物３（１３０ｍｇ）、タクロリムス（２４０ｍｇ）、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、３８２ｍｇ）をＮＭＰ（４．６ｍＬ）に溶解し、２５℃にてＤＭＡＰ（２８．３ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（１４３μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１３９ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解後、精製水（５ｍＬ）及びイオン交換樹脂（５ｍＬ）を加え、撹拌した後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１０（５２８ｍｇ）を得た。化合物１０のタクロリムス含量は１２．３％と計算された。【０１４６】
実施例３
一般式（２）においてＲ１として一般式（６）の構造を有し、Ｒ２がアセチル基、Ｒ３がタクロリムスのアルコール性水酸基の残基、Ｒ４として一般式（５）の構造を有し、Ｒ５がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｒ１１及びＲ１３がメチル基、Ｒ１２及びＲ１４がトリメチレン基、Ｘ１が結合、Ｘ２が−ＮＨ−基、ｏ及びｐの平均値が２７２、ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎの平均値が９４．９、ｆ＋ｇの平均値が７．４、ｈ＋ｉの平均値が１２．８である高分子誘導体（化合物１１）
化合物１（５．３０ｇ）、タクロリムス（１２ｇ）、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、３４．７ｇ）をＮＭＰ（４３０ｍＬ）に溶解し、２５℃にてＤＭＡＰ（１．３１ｇ）、ＤＩＰＣＩ（６．５９ｍＬ）を加えて二夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１３Ｌ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により固形物（４１．５ｇ）を得た。得られた固形物（４１．０ｇ）をＤＭＦ（５７５ｍＬ）に溶解し、イオン交換樹脂（１３０ｍＬ）を加え１時間撹拌後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液をジイソプロピルエーテル（１８．５Ｌ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により固形物（３９．５ｇ）を得た。得られた固形物（３７．０ｇ）をアセトニトリル（３７０ｍＬ）に溶解後、精製水（３７０ｍＬ）を加え、減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１１（３７．２ｇ）を得た。化合物１１のタクロリムス含量は３．２２％と計算された。【０１４７】
実施例４
一般式（２）においてＲ１として一般式（６）の構造を有し、Ｒ２がアセチル基、Ｒ３がタクロリムスのアルコール性水酸基の残基、Ｒ４として一般式（５）の構造を有し、Ｒ５がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｒ１１及びＲ１３がメチル基、Ｒ１２及びＲ１４がトリメチレン基、Ｘ１が結合、Ｘ２が−ＮＨ−基、ｏ及びｐの平均値が２７２、ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎの平均値が７２．８、ｆ＋ｇの平均値が５．５、ｈ＋ｉの平均値が９．１である高分子誘導体（化合物１２）
化合物３（４．５０ｇ）、タクロリムス（４．１３ｇ）、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、２４．１ｇ）をＮＭＰ（２２９ｍＬ）に溶解し、２５℃にてＤＭＡＰ（９７９ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（４．９７ｍＬ）を加えて二夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（６．０Ｌ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物（２８．８ｇ）をＤＭＦ（４０４ｍＬ）に溶解し、イオン交換樹脂（９５．１ｍＬ）を加え１時間撹拌後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液をジイソプロピルエーテル（１３．０Ｌ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（２９４ｍＬ）に溶解後、精製水（２９４ｍＬ）を加え、減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１２（２７．３ｇ）を得た。化合物１２のタクロリムス含量は３．２４％と計算された。【０１４８】
実施例５
一般式（２）においてＲ１がｎ−ブチル基、Ｒ２がアセチル基、Ｒ３がタクロリムスのアルコール性水酸基の残基、Ｒ４として一般式（５）の構造を有し、Ｒ５がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｒ１１がメチル基、Ｒ１２がトリメチレン基、Ｘ１が結合、Ｘ２が−ＮＨ−基、ｏ及びｐの平均値が２７２、ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎの平均値が７８、ｆ＋ｇの平均値が７．４、ｈ＋ｉの平均値が１０．１である高分子誘導体（化合物１３）
化合物４（８３．２ｍｇ）、タクロリムス（１５０ｍｇ）をＮＭＰ（７．５ｍＬ）に溶解し、２５℃にてＤＭＡＰ（４４．１ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（２２３μＬ）を加えて1時間撹拌後、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、１．１２ｇ）を添加し３５℃に昇温し一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（２２５ｍＬ）に滴下し、一夜撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（４０ｍＬ）に溶解し、精製水（４０ｍＬ）を加え、イオン交換樹脂（２０ｍＬ）を加え、氷冷化で撹拌後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１３（１．１６ｇ）を得た。化合物１３のタクロリムス含量は４．４０％と計算された。【０１４９】
実施例６
一般式（２）においてＲ１がｎ−ブチル基、Ｒ２がアセチル基、Ｒ３がタクロリムスのアルコール性水酸基の残基、Ｒ４として一般式（５）の構造を有し、Ｒ５がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｒ１１がメチル基、Ｒ１２がトリメチレン基、Ｘ１が結合、Ｘ２が−ＮＨ−基、ｏ及びｐの平均値が２７２、ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ＋ｊ＋ｋ＋ｌ＋ｍ＋ｎの平均値が１１２、ｆ＋ｇの平均値が１０．４、ｈ＋ｉの平均値が１４．６である高分子誘導体（化合物１４）
化合物５（８５．８ｍｇ）、タクロリムス（１５０ｍｇ）をＮＭＰ（７．５ｍＬ）に溶解し、２５℃にてＤＭＡＰ（４５．６ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（２３０μＬ）を加えて１時間撹拌後、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、１．１２ｇ）を添加し３５℃に昇温し一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（２２５ｍＬ）に滴下し、一夜撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（４０ｍＬ）に溶解し、精製水（４０ｍＬ）を加え、イオン交換樹脂（２０ｍＬ）を加え、氷冷化で撹拌後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１４（１．１８ｇ）を得た。化合物１４のタクロリムス含量は４．４１％と計算された。【０１５０】
実施例７
一般式（１）においてＲ１として一般式（６）の構造を有し、Ｒ２がアセチル基、Ｒ３がタクロリムスのアルコール性水酸基の残基、Ｒ４として一般式（５）の構造を有し、Ｒ５がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｒ１１及びＲ１３がメチル基、Ｒ１２及びＲ１４がトリメチレン基、Ｘ１が結合、Ｘ２が−ＮＨ−基、ｏ及びｐの平均値が２７２、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅの平均値が４０．２、ａの平均値が５．９、ｂの平均値が５．０である高分子誘導体（化合物１５）
化合物７（３．３０ｇ）、タクロリムス（４．８１ｇ）、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、１１．９ｇ）をＮＭＰ（１６０ｍＬ）に溶解し、３５℃にてＤＭＡＰ（５００ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（２．４７ｍＬ）を加えて二夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（４．８Ｌ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により固形物（１５．１ｇ）を得た。得られた固形物（１５．０ｇ）をＤＭＦ（２１０ｍＬ）に溶解し、イオン交換樹脂（５０ｍＬ）を加え１時間撹拌後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液をジイソプロピルエーテル（６．８Ｌ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により固形物（１４．２g）を得た。得られた固形物（１３．７ｇ）をアセトニトリル（２７５ｍＬ）に溶解後、精製水（２７５ｍＬ）を加え、減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１５（１２．４ｇ）を得た。化合物１６のタクロリムス含量は５．７４％と計算された。【０１５１】
実施例８
一般式（１）においてＲ１として一般式（６）の構造を有し、Ｒ２がアセチル基、Ｒ３がタクロリムスのアルコール性水酸基の残基、Ｒ４として一般式（５）の構造を有し、Ｒ５がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｒ１１及びＲ１３がメチル基、Ｒ１２及びＲ１４がトリメチレン基、Ｘ１が結合、Ｘ２が−ＮＨ−基、ｏ及びｐの平均値が２７２、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅの平均値が８７、ａの平均値が１９．４、ｂの平均値が５．０である高分子誘導体（化合物１６）
化合物６（１５７ｍｇ）、タクロリムス（３７５ｍｇ）、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、４２５ｍｇ）をＮＭＰ（５．５ｍＬ）に溶解し、３５℃にてＤＭＡＰ（３８．０ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（１９１μＬ）を加えて二夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１６５ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（１３ｍＬ）に溶解し、精製水（１３ｍＬ）を加え、イオン交換樹脂（６．５ｍＬ）を加え、氷冷化で撹拌後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、化合物１６（６３０ｍｇ）を得た。化合物１６のタクロリムス含量は１４．９％と計算された。【０１５２】
実施例９
一般式（１）においてＲ１として一般式（６）の構造を有し、Ｒ２がアセチル基、Ｒ３がタクロリムスのアルコール性水酸基の残基、Ｒ４として一般式（５）の構造を有し、Ｒ５がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基、Ｒ１１及びＲ１３がメチル基、Ｒ１２及びＲ１４がトリメチレン基、Ｒ１３がメチル基、Ｒ１４がトリメチレン基、Ｘ１が結合、Ｘ２が−ＮＨ−基、ｏ及びｐの平均値が２７２、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅの平均値が９０．０、ａの平均値が２１．６、ｂの平均値が５．３である高分子誘導体（化合物１７）
化合物８（３．０ｇ）、タクロリムス（７．２７ｇ）、片末端メトキシ基及び片末端３−アミノプロピル基のポリエチレングリコール（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、日油社製、平均分子量１２キロダルトン、８．５０ｇ）をＮＭＰ（８０．３ｍＬ）に溶解し、３５℃にてＤＭＡＰ（７３３ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（３．７２ｍＬ）を加えて二夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（３１５０ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物（１４．０ｇ）をＤＭＦ（１９６ｍＬ）に溶解し、イオン交換樹脂（４６ｍＬ）を加え撹拌後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液をジイソプロピルエーテル（６．３Ｌ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥することによって、化合物１７（１２．９ｇ）を得た。化合物１７のタクロリムス含量は１６．６％と計算された。【０１５３】
比較例１
タクロリムス結合ポリエチレングリコール−αβ−ポリアスパラギン酸ブロック共重合体（化合物１８）
化合物２（３５０ｍｇ）、タクロリムス（３６６ｍｇ）をＤＭＦ（６．０ｍＬ）に溶解し、１５℃にてＤＭＡＰ（１０．９ｍｇ）、ＤＩＰＣＩ（３１５μＬ）を加えて一夜撹拌した。反応液をジイソプロピルエーテル（１８０ｍＬ）に滴下し、撹拌した。沈殿物を濾取し、真空乾燥により得られた固形物をアセトニトリル（１７ｍＬ）に溶解後、精製水（１７ｍＬ）及びイオン交換樹脂（７ｍＬ）を加え、氷冷化で３時間撹拌後、イオン交換樹脂を濾別した。濾液を減圧濃縮した後、凍結乾燥することによって、下記式（１２）で表される化合物１８（４９９ｍｇ）を得た。化合物１８のタクロリムス含量は３３．２％と計算された。【０１５４】
【化１４】
2017119272.tif 000017
【０１５５】
式中、ｔの平均値は２７２、ｑ＋ｒ＋ｓ＋ｕ＋ｖ＋ｗ＋ｘの平均値が４２．８、ｑ＋ｒの平均値が１０．０、Ｒ１５はタクロリムスのアルコール性水酸基の残基、Ｒ１６がイソプロピルアミノカルボニルイソプロピルアミノ基である。【０１５６】
本発明における化合物のタクロリムス含量は、以下のＨＰＬＣ条件により測定した反応溶液中のタクロリムスの消費率から算出した。【０１５７】
ＨＰＬＣの分析条件
カラム    ：Shim-pack  XR-ODSIII、2.0φ×200mm
カラム温度：40℃
溶離液  Ａ液：0.1%リン酸水溶液、Ｂ液：アセトニトリル
Ａ液／Ｂ液＝80/20
流  速    ：0.5mL／分
検出器（検出波長）：UV（254nm）【０１５８】
又は、該タクロリムスの高分子誘導体を酸加水分解し、遊離するタクロリムスの分解物であるピペコリン酸を誘導体化し、以下のＨＰＬＣ条件により定量分析することにより算出した。【０１５９】
ＨＰＬＣの分析条件
カラム    ：Shim-pack  XR-ODSIII、2.0φ×200mm
カラム温度：40℃
溶離液  Ａ液：0.1%リン酸水溶液、Ｂ液：アセトニトリル
Ａ液／Ｂ液＝80/20から10/90へのグラジエント溶出
流  速    ：0.5mL／分
検出器（検出波長）：蛍光（励起波長：450nm、蛍光波長：590nm）【０１６０】
試験例１
リン酸緩衝生理食塩水中の薬剤放出性試験
実施例１〜９、比較例１の化合物をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に１．０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解し、３７℃にて定温放置した。放出されたタクロリムス量をＨＰＬＣにて経時的に測定し、使用した化合物中の全タクロリムス量に対する放出されたタクロリムス量の割合を求めた。実施例１及び比較例１の結果を図１に、実施例１、２、５、６及び８の結果を図２に、実施例３、４、７及び９の結果を図３に示す。【０１６１】
この結果、実施例１乃至６の化合物は比較例１の化合物と比較して酵素非存在下、薬剤の放出が早いことが示された。さらに実施例７乃至９の化合物は実施例１乃至６の化合物と比較して酵素非存在下、薬剤の放出が遅いことが示された。【０１６２】
試験例２
ラット血中濃度推移（１）
８週齢雌性ＳＤラット（日本チャールズ・リバー株式会社）にタクロリムスまたは実施例１、２、８及び比較例１の化合物５ｍｇ／ｋｇを各群２匹ずつ単回尾静脈内投与した。投与後５分、１、６、２４及び７２時間にイソフルラン麻酔下で頸静脈から継時的に０．３ｍＬずつ採血し、採取血液中のタクロリムス濃度を測定した。実施例１、２、８、比較例１及びタクロリムスの結果を図４に示す。また、各化合物の血中濃度パラメータを表２に示す。ただし実施例１、２、８及び比較例１の結果はミセルから切り出されたタクロリムスの濃度及びパラメータである。【０１６３】
【表２】
2017119272.tif 000018
【０１６４】
この結果、実施例１、２、８及び比較例１はタクロリムスに比べ血中濃度半減期及びＭＲＴｉｎｆ．の延長を示し、タクロリムスを高分子誘導化することで血中での滞留性が向上していることは明らかである。
また、比較例１と比べ実施例１、２及び８では、より長い血中濃度半減期及びＭＲＴｉｎｆ．を示した。【０１６５】
試験例３
ラット血中濃度推移（２）
８週齢雌性ＳＤラット（日本チャールズ・リバー株式会社）に実施例３、７及び９の化合物１５ｍｇ／ｋｇを各群２匹ずつ単回尾静脈内投与した。投与後５分、１、６、２４及び７２時間後にイソフルラン麻酔下で頸静脈から継時的に０．２ｍＬずつ採血し、採取血液中のタクロリムス濃度を測定した。実施例３、７及び９の結果を図５に示す。また、各化合物の血中濃度パラメータを表３に示す。ただし、実施例３、７及び９の結果はミセルから切り出されたタクロリムスの濃度及びパラメータである。【０１６６】
【表３】
2017119272.tif 000019
【０１６７】
この結果、実施例３、７及び９共に長い血中濃度半減期及びＭＲＴｉｎｆ．を示した。【０１６８】
試験例４
ラットコラーゲン関節炎に対する抗炎症効果（１）
ウシ関節軟骨由来タイプＩＩコラーゲン（免疫グレード：コラーゲン技術研修会有限会社）０．３ｍｇを９週齢雌性ＤＡラット（日本エスエルシー株式会社）の背部に皮内投与することにより、コラーゲン関節炎を誘発した。タイプＩＩコラーゲン感作日及び感作後７日、１４日、２１日目に比較例１、実施例１、２及び８の化合物の生理食塩水（５ｍｇ／ｋｇ）を各群５匹ずつ尾静脈内に投与した。対照としては未投与群を設定した。関節炎の判定は、目視によるスコア化により行った。比較例１の化合物の結果を図６に、実施例１の化合物の結果を図７に、実施例２及び８の化合物の結果を図８にそれぞれ示す。また、コラーゲン感作後２８又は２９日目の平均関節炎スコアを表４に示す。【０１６９】
ウシ関節軟骨由来タイプＩＩコラーゲンの感作後より、ラットの右後肢及び左後肢の炎症の進展をモニタリングした。右後肢乃至左後肢の足趾に発赤が認められたとき、コラーゲン関節炎が発症したと判断した。関節炎の程度は次のように０〜５の６段階で評価した。０；変化なし、１；右後肢乃至左後肢の足趾一カ所以上に発赤、２；右後肢乃至左後肢の足趾一カ所以上に発赤及び軽度の浮腫、３；右後肢乃至左後肢の足全体に浮腫、４；右後肢乃至左後肢の足全体に強度の浮腫、５；右後肢乃至左後肢の足根関節の可動が正常時と比べて制限される（関節の変形）。右後肢及び左後肢の内、関節炎スコアが高い方をその個体の関節炎スコアとして採用した。【０１７０】
試験例５
ラットコラーゲン誘導関節炎に対する抗炎症効果（２）
試験例４と同様の方法で、ＤＡラットにコラーゲン関節炎を誘発した。タイプＩＩコラーゲン感作日及び感作後１４日目に実施例３、７及び９の化合物の生理食塩水（１５ｍｇ／ｋｇ）を各群５匹ずつ尾静脈内に投与した。対照としては未投与群を設定した。関節炎の判定は、目視によるスコア化により行った。結果を図９に示す。また、コラーゲン感作後２８日目の平均関節炎スコアを表４に示す。【０１７１】
【表４】
2017119272.tif 000020
【０１７２】
試験例４及び５の結果より、未投与群は関節炎の発症を認めた。一方で、本発明の化合物は、未投与群と比較して、関節炎の発症を抑制した。さらに、実施例１、２及び８は、側鎖にポリエチレングリコールを導入することで、比較例１よりも関節炎に対して強い抑制効果を認めた。
【図１】
2017119272.tif 000026
【図２】
2017119272.tif 000027
【図３】
2017119272.tif 000028
【図４】
2017119272.tif 000029
【図５】
2017119272.tif 000030
【図６】
2017119272.tif 000031
【図７】
2017119272.tif 000032
【図８】
2017119272.tif 000033
【図９】
2017119272.tif 000034
【国際調査報告】
2017119272.tif 000035
2017119272.tif 000036
2017119272.tif 000037
2017119272.tif 000038
2017119272.tif 000039