(57)【要約】  幹細胞投与方法は、動物（ドナー動物）から採取された幹細胞または当該幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞を含有する幹細胞含有液を、注射針で競走馬（ドナー競走馬）または競技馬（ドナー競技馬）に注入する投与工程を含み、競走馬または競技馬の症状改善方法は、上記幹細胞投与方法を用い、非正常状態を示す競走馬（ドナー競走馬）または競技馬（ドナー競技馬）に幹細胞を含有する幹細胞含有液を投与する。
2016204230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物から採取された幹細胞または前記幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞を含有する幹細胞含有液を、注射針で競走馬または競技馬に注入する投与工程を含むことを特徴とする幹細胞投与方法。
【請求項２】
前記投与工程において、前記注射針で前記競走馬または前記競技馬に前記幹細胞含有液を注入する手段が静脈内注射である請求項１に記載の幹細胞投与方法。
【請求項３】
前記注射針が、内径０．６ｍｍ以上である請求項１または２に記載の幹細胞投与方法。
【請求項４】
前記幹細胞含有液に含有される前記幹細胞の生細胞数を確認する生細胞数確認工程を含む請求項１から３のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
【請求項５】
前記幹細胞含有液が、前記注射針に連結された注射用容器に収容されており、
前記投与工程の途中または前記投与工程の終了後に、前記注射用容器に前記競走馬に注入可能な洗浄液を充填し、前記注射用容器の内壁に付着した前記幹細胞を前記洗浄液で洗浄するとともに前記競走馬に注入する洗浄工程を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
【請求項６】
前記動物がウマ科の動物である請求項１から５のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
【請求項７】
前記ウマ科の動物が競走馬または競技馬である請求項６に記載の幹細胞投与方法。
【請求項８】
前記幹細胞を採取される競走馬であるドナー競走馬と前記幹細胞を投与される被投与競走馬とが同一血統または兄弟であるか、または
前記幹細胞を採取される競技馬であるドナー競技馬と前記幹細胞を投与される被投与競技馬とが同一血統または兄弟である請求項７に記載の幹細胞投与方法。
【請求項９】
動物から採取された幹細胞を凍結する凍結保存工程、
前記凍結保存工程において凍結された前記幹細胞を解凍する解凍工程、
前記解凍工程後の前記幹細胞の解凍工程後生細胞数が確認される所定の時から前記幹細胞が前記競走馬または前記競技馬に投与されるまでの推奨される推奨時間経過時における生存率と、前記競走馬または前記競技馬へ前記幹細胞を投与する際の希望生細胞数と、を用いて生細胞絶対数を決定する生細胞数決定工程、
前記解凍工程後の前記幹細胞を用い、前記生細胞絶対数を満たす前記幹細胞を含む幹細胞含有剤を調製する幹細胞含有剤調製工程、および、
投与が実施される実施エリアに前記幹細胞含有剤を輸送する輸送工程、
を更に含む請求項１から８のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
【請求項１０】
前記輸送工程は、前記幹細胞含有剤が収容された第一容器と共に、前記第一容器とは異なる第二容器を輸送することを含み、
前記第二容器は、前記幹細胞含有剤と同一の組成である生細胞数確認用サンプルが収容されている請求項９に記載の幹細胞投与方法。
【請求項１１】
前記生細胞数決定工程は、前記解凍工程によって解凍された前記幹細胞の生細胞数を測定し、前記所定の時の前記生細胞数を決定する解凍工程後生細胞数測定工程をさらに含む請求項９または１０に記載の幹細胞投与方法。
【請求項１２】
前記幹細胞が、予め幹細胞投与を受けた前記動物から採取された幹細胞である請求項９から１１のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
【請求項１３】
前記解凍工程において解凍された前記幹細胞自体を前記生細胞数決定工程に供する第一態様、または
前記解凍工程において解凍された前記幹細胞を継代培養し、前記継代培養の実施により得られた幹細胞である継代培養幹細胞を前記生細胞数決定工程に供する第二態様を含む請求項９から１２のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法を用い、非正常状態を示す競走馬に幹細胞を含有する幹細胞含有液を投与することを特徴とする競走馬または競技馬の症状改善方法。
【請求項１５】
前記非正常状態を示す症状が、以下に示す第１から第７までのいずれか１以上の症状である請求項１４に記載の競走馬の症状改善方法、
第１の症状が、屈腱炎の症状である、
第２の症状が、骨折である、
第３の症状が、管骨骨膜炎、
第４の症状が、歩様の非正常化である、
第５の症状が、腰麻痺の症状である、
第６の症状が、乳酸値の上昇または体表面において観察される局所的な熱感である、
第７の症状が、呼吸器疾患である。
【請求項１６】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法に用いられ、幹細胞含有液を収容可能な容器本体を有し注射針に連結可能な注射用容器であって、
密封容器に収容されており、
前記容器本体に幹細胞を含有する幹細胞含有液が収容されており、
前記幹細胞含有液が前記注射用容器から漏出することを防止する封止部を備えることを特徴とする注射用容器。
【請求項１７】
前記注射針に直接または間接に連結可能であるとともに前記容器本体から前記注射針に対し前記幹細胞含有液を流通可能とする針結合部を有し、
前記封止部により、前記注射針と連結する前の状態である前記針結合部が封止されている請求項１６に記載の注射用容器。
【請求項１８】
前記注射用容器の付帯要素として、前記競走馬または前記競技馬の馬名を確認可能な馬名情報を備える請求項１７に記載の注射用容器。
【請求項１９】
請求項１６から１８のいずれか一項に記載の注射用容器と、前記注射用容器に収容された幹細胞含有液と同一の組成である生細胞数確認用サンプルが収容されている容器と、を備える幹細胞注射セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、競走馬または競技馬に幹細胞を投与するための幹細胞投与方法、および競走馬または競技馬の症状改善方法、ならびにこれらに用いられる注射用容器および幹細胞注射セットに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、種々の幹細胞を動物に投与する技術が提案されている。
たとえば特許文献１には、ヒト間葉系幹細胞を有効性成分として含んでなるアトピー性皮膚炎治療剤の発明が開示されている。【０００３】
また特許文献２には、ウマ科動物の羊水から分離した幹細胞を培地で培養し、培養された細胞を回収する工程を含み、所定の特性を示しかつ培養前の幹細胞より均質度が改善されたウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法の発明が開示されている。同文献の明細書の実施例には、上記羊水由来多分化能幹細胞の、軟骨細胞、骨細胞、および脂肪細胞への分化能を確認する試験を実施したことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２４２２６５号公報
【特許文献２】特表２０１３−５４１３２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、競走馬は、競走馬特有の怪我や疾病（以下、怪我等ともいう）が生じることが知られている。たとえば屈腱炎は、発症数の高い競走馬特有の疾病である。屈腱炎とは、骨と筋肉を結ぶ腱組織のうち肢を屈曲させる筋肉（屈筋）に続く屈腱に生じた炎症を意味する。屈腱炎の症状が確認された競走馬は、患部を冷され、また休養させられるといった対処がとられることが一般的である。これらの対処法以外の屈腱炎に対する有効な治療方法や予防方法は未だ確立されていない。また、骨折も競走馬にとって重大な怪我の一つである。骨折は、競走馬に特有の怪我とまではいえないものの、騎手を乗せた状態で全力疾走をすることを余技なくされる競走馬は、他の動物よりも骨折の発生が著しく多い。【０００６】
以上に述べた、屈腱炎および骨折は、競走馬に生じ得る怪我等の例示であり、これらに限らず、競走馬において怪我等の発生を防止し、また発生した怪我等を充分に治療することについて強い要望がある。これに対し、競走馬に幹細胞を投与することにより、上記要望の少なくとも一部を満たすことが期待されるものの、これまで具体的な研究は何らなされていない。【０００７】
たとえば特許文献２には、ウマ科動物の羊水由来多分化能幹細胞の製造方法の発明が開示されており、競走馬などの骨、腱、および筋肉の損傷および欠失疾患の治療に有用であるとの記載があるものの、競走馬に対する具体的な投与方法については何ら検討がなされていなかった。【０００８】
上述した競走馬に関する特有の課題は、競技馬に関しても同様のことがいえる。
本発明は上記課題に鑑みてなされたものである。即ち、本発明は、幹細胞を競走馬または競技馬に投与する方法、および幹細胞を競走馬または競技馬に投与することによる競走馬の症状改善方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の幹細胞投与方法は、動物から採取された幹細胞または上記幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞を含有する幹細胞含有液を、注射針で競走馬または競技馬に注入する投与工程を含むことを特徴とする。【００１０】
また本発明の競走馬または競技馬の症状改善方法は、本発明の幹細胞投与方法を用い、非正常状態を示す競走馬または競技馬に幹細胞を含有する幹細胞含有液を投与することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の幹細胞投与方法によれば、競走馬または競技馬に幹細胞を投与し、有意に当該幹細胞の投与による効果を競走馬または競技馬に供与することができる。
また本発明の競走馬または競技馬の症状改善方法によれば、競走馬または競技馬の種々の怪我等の症状を改善し、または怪我等の発生を未然に防ぎ、重大な怪我等が発生することを予防することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。【００１３】
【図１】競走馬の第４世代までの血統を示す説明図である。
【図２】（ａ）は幹細胞含有剤の提供方法の第一の例を示すフローチャートであり、（ｂ）は幹細胞含有剤の提供方法の第二の例を示すフローチャートである。
【図３】幹細胞含有剤の提供方法の第三の例を示すフローチャートである。
【図４】幹細胞注射セットの一例を示す説明図である。
【図５】実施例１における幹細胞投与前の被投与競走馬１における前足の腱の横断面を映したエコー画像であり、屈腱炎が発症していることを示す。
【図６】実施例１における幹細胞投与後の被投与競走馬１における前足の腱の横断面を映したエコー画像であり、屈腱炎の症状が改善されたことを示す。
【図７】実施例３における幹細胞投与前の被投与競走馬３における管骨のレントゲン写真であり、骨瘤付近に骨折の症状があることを示す。
【図８】実施例３における幹細胞投与後の被投与競走馬３における管骨のレントゲン写真であり、骨折の症状が改善していることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について説明する。説明には適宜、図面を用いる。以下に述べる本発明の実施形態は、競走馬を例に説明するが、当該説明は競走馬に限定されるものではなく、適宜、競技馬に関する本発明の説明として参照され、また適宜、競走馬を競技馬と読み替えることができる。本発明に関し、本発明の幹細胞投与方法によって幹細胞を投与される競走馬（以下、「被投与競走馬」と称呼する場合がある）は、競走馬用の馬を意味し、競走馬として登録された馬だけでなく、競走馬として登録可能な育成中の馬も含む。
【００１５】
本発明に関し、「競技馬」とは、競技を行うために大会に出場することが可能な馬を指す。競技馬には、血統を有し、血統情報を付して登録されている競技馬、および血統情報を有さずに登録された競技馬を含む。たとえば、オリンピックや国体、国際試合へ参加できる競技馬の年齢は１０歳以上と規定されており、種々の症状を改善し、また健康状態を良好に維持するために、競技馬に本発明を適用することは非常に有効である。ここで競技とは、乗馬競技、馬術競技、牛追い、ロデオ、ポロ、ホルター等を含み、複数の競技馬が参加して、種々の観点で優劣を競うことを趣旨とする。
【００１６】
本発明に関し幹細胞とは、動物から採取された幹細胞自体、または動物から採取された幹細胞を継代培養して得た継代幹細胞のいずれかまたは混合を含む。また上記の幹細胞は、動物から採取され、または継代培養された後、速やかに幹細胞含有液として調製されてもよいし、凍結保存され解凍された後に幹細胞含有液に調製されてもよい。
【００１７】
＜第一実施形態＞
以下に本発明の第一実施形態として、本発明の幹細胞投与方法について説明する。
本実施形態における幹細胞投与方法は、動物から採取された幹細胞または当該幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞を含有する幹細胞含有液を、注射針で競走馬に注入する投与工程を含む。
【００１８】
本実施形態によれば、被投与競走馬に対し、切開して体内に埋設する手技ではなく、注射針を用い注射という簡易な手技で幹細胞を投与することができる。これにより、低侵襲で、幹細胞投与の効果を有効に競走馬に供与することができる。ここで注射とは、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射など、一般的に注射として知られる手技を広く含む。
上記幹細胞投与方法によれば、幹細胞投与の手技による競走馬への負担を回避し得る。そのため、疾病または怪我などの治療や予防といった観点で幹細胞を投与するだけでなく、競走馬の体力や健康を増強するために日常的に幹細胞を競走馬に投与するといったことも可能になる。上記幹細胞投与方法は低侵襲であるため、幹細胞投与を投与した競走馬を、連闘、または中１週もしくは中２週程度の比較的短い間隔でレースに出走させ得る。
【００１９】
尚、競走馬は、病気などで動物病院に連れてこられるペット動物や、病院または研究室で使用されるマウスなどと異なり、大型の動物であるため、移動させることが容易ではない。幹細胞の投与のために、幹細胞を調製する施設（以下、調製施設ともいう）と馬房とを頻繁に往復させると競走馬に精神的な疲労を与える虞もある。そのため、競走馬の健康維持や怪我の防止、治療などを日常の居所である馬房または馬房に近い病院などの施設（以下、馬房等ともいう）で行いたいという要望がある。特に、競走馬を、連闘、または中１週もしくは中２週程度の比較的短い間隔でレースに出走させる場合には、馬房等と調製施設との往復を避け、馬房等にて適切な処置を受けさせたいという潜在的な要望があった。当該要望を満たすために、調製施設にて調製された幹細胞含有液を、一般の輸送機関などを利用して馬房等に輸送することが有用である。ただし、輸送時におけるトラブルによって、予定していた輸送時間を超過し、また輸送時の温度管理が不徹底になる等して、幹細胞含有液に含まれる幹細胞が予定した以上に死滅してしまう場合も起こり得る。これに対し、後述する生細胞数確認工程を投与工程前に実施することで、生きた幹細胞を予定していた数だけ投与できるのか否かを、投与前に把握することができ、本実施形態の幹細胞投与方法の信頼性を向上させることができる。
【００２０】
以下に本実施形態の幹細胞投与方法の詳細について説明する。
【００２１】
（投与工程）
本実施形態における幹細胞投与方法は、幹細胞含有液を、注射針で競走馬に注入する投与工程を含む。以下に、投与工程の詳細について説明する。
投与工程は、その投与を行う者、投与場所などを特に限定するものではない。投与工程は、切開などの手技を行う必要がなく、注射という簡易な方法で幹細胞を投与するため、たとえば馬房などの衛生的に充分な施設ではない任意の場所でも投与工程を行うことができる。
【００２２】
本実施形態において、幹細胞が採取される動物は、哺乳類全般を含む。以下の説明において、幹細胞を採取される動物を、適宜「ドナー動物」と称呼する場合がある。従来は、自己の幹細胞を投与するという手法が一般的であったが、近年は、一の動物から採取された幹細胞を他の動物に投与する、所謂、固体間投与が可能となっている。そのため、競走馬に対し、当該競走馬自身の幹細胞を投与するのではなく、哺乳類一般をドナー動物とするものである。
【００２３】
たとえば、動物（ドナー動物）の好ましい例として、ウマ科の動物を挙げることができる。被投与競走馬に投与することを前提に調製される幹細胞含有液は、ウマ科の動物から採取された幹細胞を含有することで、被投与競走馬に対する生体適合性または親和性が良好であることが期待される。上述したウマ科の動物としては、たとえばウマ、ロバ、シマウマ、およびノロバなどを挙げることができる。
【００２４】
特に上記ウマ科の動物（ドナー動物）が競走馬であることは、本実施形態において好ましい態様といえる。以下の説明において、ドナー動物である競走馬を適宜「ドナー競走馬」と称呼する場合がある。ドナー競走馬から採取された幹細胞を被投与競走馬に投与することによって、競走馬ではない動物の幹細胞が被投与競走馬に混入することを回避し、被投与競走馬の血統の維持に疑念が生じることを回避する。ドナー競走馬と被投与競走馬とは異なる競走馬であってもよいし、同一の競走馬であってもよい。
【００２５】
本実施形態において、ドナー競走馬は、幹細胞を採取される競走馬を意味し、現役の競走馬だけではなく、デビュー前の競走馬用の馬、および競馬を引退した馬を含む。被投与競走馬の血統の維持という観点からは、用いられる幹細胞は、ドナー競走馬の血統が明らかであるであることが重要であって、当該ドナー競走馬が、現役の競走馬であるか否かは問題ではないためである。
【００２６】
本実施系形態において、幹細胞を採取される競走馬であるドナー競走馬と、幹細胞を投与される被投与競走馬とが同一血統または兄弟であることが好ましい。
【００２７】
従来の競走馬の研究において、競走馬は、血統により引き継がれる性質を有する傾向にあることが知られており、一世代前（即ち、父母）の性質は３割強程度、引き継がれるとされている。競走馬において血統は重要な要素である。したがって被投与競走馬に対し、同一血統または兄弟であるドナー競走馬から採取された幹細胞を提供することは、被投与競走馬の血統の維持という観点で望ましい影響を与え得る。従来、同一血統または兄弟であるドナー競走馬から採取された幹細胞を被投与競走馬に対し提供することで血統を維持するという技術的思想は何ら報告されておらず、本発明において初めてその有効性の示唆とともに実現可能な提供方法を示す。
【００２８】
被投与競走馬Ｘの血統を表す図１を示す。図１は、被投与競走馬Ｘの１代先祖から４代先祖までの血統を示す図であり、４代血統表である。本実施形態において同一血統とは、ドナー競走馬が被投与競走馬Ｘの先祖であるか、ドナー競走馬と被投与競走馬Ｘとが同一の競走馬である場合をいう。本実施形態では、ドナー競走馬が、被投与競走馬Ｘの第９世代以下の範囲で同一血統であることが好ましく、第５世代以下の範囲で同一血統であることがより好ましい。たとえば、ドナー競走馬が図１における馬名ＡＢである場合には、当該ドナー競走馬は、被投与競走馬Ｘの父の父の父であり、３代先祖であって被投与競走馬Ｘと同一血統である。
本実施形態において競走馬に関し兄弟とは、両親が同じである全兄弟、父または母のいずれか一方が同じである半兄弟を含む。また兄弟は、姉妹、姉弟、兄妹、および双子を含む。
【００２９】
尚、本実施形態において馬名とは、競走馬として競馬に出走するにあたり登録された当該競走馬の正式名称を意味する。競走馬は馬名登録義務があり、たとえば日本では、所定の団体（平成２７年４月現在、公益財団法人ジャパン・スタッドブック・インターナショナル）による馬名審査を通過した名前が正式な馬名として登録される。ドナー競走馬と被競走馬とが同一血統であるか否かを確認可能とするために、投与工程に用いられる幹細胞含有液は、これに含まれる幹細胞のドナーとなったドナー競走馬の馬名が確認可能であることが好ましい。
【００３０】
幹細胞含有液に関し、ドナー競走馬の馬名を確認可能とするために、たとえば、幹細胞含有液がドナー競走馬の馬名情報が記された容器に収容されるか、または幹細胞含有液を収容する容器に、馬名情報が記された付帯物が添付されていることが好ましい。ここで馬名情報とは、幹細胞含有液を使用する者がドナー競走馬の馬名を知るための情報であって、たとえば、馬名自体、または別途作成された馬名データベースと照合可能な番号などを挙げることができる。
【００３１】
次に、幹細胞含有液に含有される幹細胞について説明する。
本実施形態において用いられる幹細胞は、動物から採取された幹細胞または当該幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞である。
幹細胞は、自己複製能および多分化能（種々の細胞に分化する能力）を有する細胞である。本実施形態に用いられる幹細胞は、動物のいずれの組織から採取されたかは、特に限定されない。たとえば、上記幹細胞は、脂肪由来の幹細胞（脂肪幹細胞）、臍帯、臍帯血または胎盤（以下、臍帯等ともいう）由来の幹細胞（臍帯幹細胞）、骨髄由来の幹細胞（骨髄幹細胞）などを挙げることができるが、これに限定されない。
幹細胞は、その分化能から、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞などが知られる。本実施形態において用いられる幹細胞は、これらのいずれか一種または二種以上を混合して用いてもよい。
【００３２】
たとえば本実施形態において、幹細胞は、間葉系幹細胞を含むと良い。間葉系幹細胞は、骨、血管、筋または腱等の生体内の多くの組織の再構築に関与可能であり、競走馬に対し投与することで、種々の効果が期待されるからである。具体的には、間葉系幹細胞の投与により、競走馬の怪我や疾病などの症状の改善、良好な体調の維持、また腱や内臓の強化などの効果が期待される。
【００３３】
間葉系幹細胞は、間葉系組織のある組織に存在し、たとえば、骨髄から採取される間葉系幹細胞である骨髄間葉系幹細胞、脂肪から採取される間葉系幹細胞である脂肪間葉系幹細胞、臍帯等から採取される間葉系幹細胞である臍帯間葉系幹細胞などが存在する。
【００３４】
本実施形態における幹細胞含有液は、間葉系幹細胞を含むことが好ましく、実質的に幹細胞含有液に含まれる幹細胞は間葉系幹細胞であることがより好ましい。
【００３５】
本実施形態におけるより望ましい態様としては、幹細胞は、ドナー競走馬から採取された間葉系幹細胞を含む。
たとえば、本実施形態における幹細胞は、競走馬（ドナー競走馬）から採取された脂肪から採取された脂肪由来の間葉系幹細胞または臍帯等から採取された臍帯等由来の間葉系幹細胞を含むことが好ましい。
競走馬は一般的に脂肪率が数パーセントと非常に低く、他の動物に比べて脂肪を採取することが容易ではない。しかし、本発明者の研究によれば、ドナー競走馬の脂肪から分画された間葉系幹細胞を含む幹細胞は、その後の継代培養において良好な増殖率を示し、また競走馬に投与した際の患部への定着率も高いことが確認された。そのため、被投与競走馬に投与するための幹細胞としてドナー競走馬から採取された脂肪由来の間葉系幹細胞を選択することは、幹細胞の確保および投与の効果の両面から望ましい。
【００３６】
本実施形態における幹細胞の他の好ましい例としては臍帯等から採取された臍帯幹細胞を挙げることができる。骨髄幹細胞または脂肪幹細胞等を採取する場合には、適宜の医療行為が必要となり、ドナー動物に対し、体力的なダメージを与える虞がある。これに対し、臍帯等は、ドナー動物の出産において特段の外科的行為を必要とせずに入手することができる。したがって、ドナー動物に対し幹細胞を採取するために体力的なダメージを与える虞がない。特にドナー競走馬は脂肪率が数％程度と非常に低いことが一般的であるため、ドナー競走馬の臀部などを切開して脂肪を採取した後、切開部の治癒に数週間を要する。
尚、臍帯は母馬と子馬とを繋ぐものであるところ、本実施形態において、臍帯血または臍帯から採取された幹細胞は、母馬側の幹細胞であると定義する。したがって本発明において、臍帯等から採取された幹細胞のドナー競走馬は、当該母馬である。
【００３７】
動物から幹細胞を採取する方法は、特に限定されず、動物における任意の組織から幹細胞のみを採取する方法、または幹細胞以外の任意の他の生体成分とともに幹細胞を採取する方法を含み、公知の採取方法を適宜採用することができる。ここで生体成分とは、細胞、ホルモンまたは血液成分などの上記動物の生体物質または生体物質から構成される物質を意味し、幹細胞以外の任意の他の生体成分とは、幹細胞を除く生体成分を意味する。生体物質とは、生体を構成する生体高分子（多糖、核酸、またはタンパク質など）や、当該生体高分子を構成する各種の糖、脂質、ビタミン、ホルモンなどを意味する。幹細胞含有液には、動物由来の成分として実質的に幹細胞のみを含有していてもよいし、幹細胞と任意の他の生体成分を含んでいてもよい。
【００３８】
幹細胞の継代培養方法に用いられる培地は特に限定されないが、無血清培地が好ましく用いられる。無血清培地を用いた継代培養により得られた継代幹細胞は、幹細胞のドナーである動物と、被投与動物とが、異なる個体である場合（即ち、個体間投与を行う場合）に好ましい。継代培養は、動物から採取された幹細胞を播種して行ってもよいし、凍結保存し解凍した後の幹細胞を播種してもよい。
培地は、ヒト血清アルブミン、インスリン、リノール酸およびトランスフェリンを含有するとともに、メタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッドおよびメルカプトエタノールをいずれも含有しないことが好ましい。培地がメタバナジン酸アンモニウム、フェノールレッドおよびメルカプトエタノールをいずれも含有しないことにより、幹細胞含有液を投与することによる副作用の発生が抑制される。また上記物質を含有しないことで、競走馬に幹細胞含有液を投与する場合でも、出場するレースの時期との関係で投与のタイミングを図る必要がない。
【００３９】
つぎに、幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞を含有する幹細胞含有液（以下、「幹細胞含有剤」と呼称する場合がある）の提供方法について説明する。かかる提供方法を「本提供方法」と呼称する場合がある。図２（ａ）は本提供方法の第一の例を示すフローチャートである。はじめに、本提供方法の概要を説明する。
【００４０】
本提供方法は、図２（ａ）に示すように、凍結保存工程Ｓ１、解凍工程Ｓ２、生細胞数決定工程Ｓ３、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４、輸送工程Ｓ５を備える。本実施形態では、図２（ａ）に示すとおり、凍結保存工程Ｓ１、解凍工程Ｓ２、生細胞数決定工程Ｓ３、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４、および輸送工程Ｓ５が、記載の順に実施される。
【００４１】
凍結保存工程Ｓ１は、動物から採取された幹細胞を凍結する工程である。
解凍工程Ｓ２は、凍結保存工程Ｓ１において凍結された幹細胞を解凍する工程である。
生細胞数決定工程Ｓ３は、解凍工程Ｓ２後の幹細胞の解凍工程後生細胞数が確認された所定の時から幹細胞が競走馬（被投与競走馬Ｘ）に投与されるまでの推奨される推奨時間経過時における生存率と、競走馬（被投与競走馬Ｘ）へ幹細胞を投与する際の希望生細胞数と、を用いて生細胞絶対数を決定する工程である。なお、本発明において解凍工程後とは、解凍工程を実施した後の所定の時間範囲を含み、解凍工程を実施した直後から、たとえば解凍工程を実施し、次いで継代培養を行い当該継代培養が終了した時点を含む。
幹細胞含有剤調製工程Ｓ４は、解凍工程Ｓ２後の前記幹細胞を用い、上記生細胞絶対数を満たす幹細胞を含む幹細胞含有剤１２（図４参照）を調製する工程である。
輸送工程Ｓ５は、投与が実施される実施エリアに幹細胞含有剤１２を輸送する工程である。
【００４２】
本提供方法によれば、凍結保存工程Ｓ１後に生細胞数決定工程Ｓ３を実施し、その後に輸送工程Ｓ５を行うことによって、投与の現場において、所望の生細胞数の幹細胞を確実に被投与競走馬Ｘに投与することが可能である。これにより、被投与競走馬Ｘを馬房等から調製施設に移動させることなく、所望の場所（例えば馬房など）で幹細胞を被投与競走馬Ｘに投与することが可能である。本提供方法は、たとえばレースの出走間隔が短い場合、あるいは短期間に複数回の幹細胞投与が望まれる場合など、特に被投与競走馬Ｘが馬房等と調製施設とを往復することを回避したい状況において、非常に望ましく幹細胞の投与を実現可能とする。
【００４３】
以下に、本提供方法の詳細を説明する。
【００４４】
（凍結保存工程Ｓ１）
本実施形態における凍結保存工程Ｓ１は、動物から採取された幹細胞を凍結する工程である。凍結保存工程Ｓ１において凍結保存される幹細胞の形態は、幹細胞単体の状態であってもよいが、採取された幹細胞を含む採取物、当該採取物を遠心分離等して得られた幹細胞含有分画物、採取された幹細胞を継代培養して得られた継代培養物、当該継代培養物を遠心分離等して得られた幹細胞含有培養分画物など、任意の混合物であってもよい。上述する任意の状態の幹細胞は、たとえば、不凍液を含む凍結保存液に混合した状態で凍結保存される。凍結保存液としては、たとえば、１０〜２０質量％のジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ：ＤＭＳＯ）および、５〜１０質量％のグリセロールを含有することができるが、これに限定されない。
【００４５】
凍結保存工程Ｓ１における凍結温度および凍結方法は特に限定されず、幹細胞を所望の期間、良好に保存できる方法であればよい。良好に保存とは、保存中または保存後の生存率を高い状態（たとえば７０％以上９５％以下）に保つことをいう。保存期間が比較的短期間である場合には、設定温度が−２０℃前後であるフリーザ、または設定温度が−８０℃前後のディープフリーザを用いることができる。幹細胞の保存期間が数年以上となることが予想される場合には、設定温度が−８０℃前後のディープフリーザを用いることが好ましく、液体窒素保存（たとえば−１９６℃）がより好ましい。凍結保存される幹細胞の形態にもよるが、液体窒素保存（たとえば−１９６℃）を行う場合には、幹細胞を、まず−８０℃のディープフリーザにて２４時間程度保存して凍結し、次いで液体窒素タンクに移すことが好ましい。凍結保存された幹細胞を解凍する際には、適度な温度が維持されたウォーターバス（たとえば３７℃前後）などを用い、凍結時に幹細胞の多数が死滅しないよう考慮する。
【００４６】
幹細胞は、予め幹細胞投与を受けた動物から採取された幹細胞であることが好ましい。詳細なメカニズムは明らかではないが、幹細胞を投与された経験のある動物から最小された幹細胞は、良質であり再生医療効果が高いからである。
【００４７】
凍結保存工程Ｓ１は、凍結保存される幹細胞のドナーとなったドナー競走馬の馬名が確認可能な状態で当該幹細胞を保存すると良い。これにより、本提供方法により、幹細胞含有剤を提供するにあたり、ドナー競走馬と、被投与競走馬Ｘと、の血統の関係を把握することができる。
【００４８】
本提供方法は、図２（ａ）に示すように血統照合工程Ｓ１０を備えてもよい。
血統照合工程Ｓ１０は、凍結保存された幹細胞のドナーとなったドナー競走馬と、幹細胞含有剤の投与が予定される競走馬（被投与競走馬Ｘ）と、の血統または兄弟関係を照合し、同一血統または兄弟であるドナー競走馬の幹細胞を後述する解凍工程Ｓ２に供与する幹細胞として決定する工程である。血統照合工程Ｓ１０は、解凍工程Ｓ２前に実施されることが好ましい。
ドナー競走馬と被投与競走馬Ｘとの兄弟関係を照合するために、凍結保存工程Ｓ１は、凍結保存される幹細胞のドナーとなったドナー競走馬の父および母の馬名情報が確認可能な状態で当該幹細胞を保存すると良い。例えば、凍結保存される幹細胞の容器に当該幹細胞に固有のロット番号を付すとともに、当該幹細胞のドナーとなったドナー競走馬の馬名および父、母の馬名である馬名情報を保有するとよい。
【００４９】
血統照合工程Ｓ１０は、ドナー競走馬が被投与競走馬Ｘの先祖であること、または兄弟であることが照合可能な手段により適宜実施することができる。例えば、図１に示す被投与競走馬Ｘの血統表に示される先祖にドナー競走馬が含まれることを確認することで血統照合工程Ｓ１０を実行することができる。血統表におけるドナー競走馬の馬名の確認方法は特に限定されず、血統表を目視で確認して行ってもよいし、情報処理システムを用いてもよい。情報処理システムとしては、たとえば、被投与競走馬Ｘの血統関係が構築されたデータベースを作成し、ドナー競走馬の馬名を入力する馬名入力ステップ、馬名入力ステップで入力された馬名と同一の馬名が上記データベースに存在するか否かを照合する照合ステップ、照合ステップにより照合された結果を表示する表示ステップを有する馬名照合処理システムを用いてもよい。
【００５０】
尚、臍帯は母馬と子馬とを繋ぐものであるところ、本実施形態において、臍帯等から採取された幹細胞は、母馬側の幹細胞であると定義する。したがって本発明において、臍帯等から採取された幹細胞のドナー競走馬は、当該母馬である。
【００５１】
（解凍工程）
次に、解凍工程Ｓ２について説明する。解凍工程Ｓ２は、凍結保存工程Ｓ１において凍結された幹細胞を解凍する工程である。解凍方法は特に限定されず、たとえば、ディープフリーザで約−８０℃で凍結保存された幹細胞の場合、当該ディープフリーザから当該幹細胞を取出し、約３７℃に水温が調製されたウォーターバスに容器ごと浸漬させた状態を数分間保持し解凍することができる。解凍工程Ｓ２では、凍結された幹細胞になるべくダメージを与えない条件で解凍することを配慮する。また凍結前の幹細胞に対する解凍後の幹細胞の生存率を予備実験で確認した場合（即ち、後述する凍結保存生細胞数確認試験Ｓ３０３を実施した場合）には、当該予備実験と同様の条件で解凍するとよい。
【００５２】
本実施形態では、解凍工程Ｓ２の後、解凍工程Ｓ２により解凍された幹細胞自体を生細胞数決定工程Ｓ３に供与する。ここでいう幹細胞自体とは、解凍工程Ｓ２において解凍された後、継代培養されていない幹細胞を意味する。
【００５３】
（生細胞数決定工程）
生細胞数決定工程Ｓ３は、本提供方法によって提供される幹細胞含有剤を被投与競走馬Ｘに投与するときに、当該幹細胞含有剤に、所望の数（希望生細胞数）の生きた幹細胞が含まれていることを担保するための生細胞絶対数を決定する工程である。
即ち、生細胞数決定工程Ｓ３は、解凍工程Ｓ２後の幹細胞の解凍工程後生細胞数が確認された所定の時から幹細胞が競走馬（被投与競走馬Ｘ）に投与されるまでの推奨される推奨時間経過時における幹細胞の生存率と、競走馬（被投与競走馬Ｘ）へ幹細胞を投与する際の希望生細胞数と、から生細胞絶対数を決定する工程である。本実施形態では、図２（ａ）に示すとおり、上述する生細胞絶対数を決定するために、演算工程Ｓ３０２を実施する。
【００５４】
具体的に、たとえば上記所定の時から本提供方法により提供される幹細胞含有剤が被投与競走馬Ｘに投与されるまでの推奨される時間である推奨時間が４８時間である場合における生細胞絶対数とそれを決定するための具体的な演算工程Ｓ３０２について説明する。所定の時から４８時間経過時における幹細胞の生存率が上記所定の時の生細胞数（解凍工程後生細胞数）１００％に対し約７０％であり、被投与競走馬Ｘに対し投与が希望される幹細胞の希望生細胞数が１０００万個である場合には、生細胞絶対数Ｚは、以下のとおりの計算式（１）により約１４２９万個である。即ち、演算工程Ｓ３０２は、希望生細胞数を生存率で除して１００倍することによって生細胞絶対数を求めることができる。
[数１]
生細胞絶対数Ｚ（万個）＝１０００（万個）÷７０（％）×１００  （１）
尚、推奨時間経過時における生存率は、用いられる幹細胞の所定の時から適宜の時間経過後の生存率を予め実測して把握することができる。生細胞数決定工程Ｓ３以降の工程に供与される幹細胞は、可能な限り当該幹細胞の生存に適した温度環境（たとえば０℃以上１０℃以下、好ましくは４℃±３℃程度）で取り扱われることが好ましい。したがって、所定の時以降、当該温度環境下において管理された幹細胞の適宜の時間経過時の生細胞数を測定し、上述する所定の時の生細胞数（解凍工程後生細胞数）に対する当該適宜の時間経過時の生細胞数の比率から、適宜の時間経過時の生存率を算出することができる。そして、上述する適宜な時間のうち、充分な生存率が確認された時間を推奨時間とすることができる。たとえば本発明者の事前の実測によれば、馬から採取した一般的な幹細胞は、解凍工程Ｓ２後の所定の時から、冷蔵環境下で保存された幹細胞の生存率は、２４時間経過時では約８０％、４８時間経過時では約７０％、７２時間経過時では約６０％であることが把握されている。ここで冷蔵環境下とは、０℃超えて１０℃以下の温度環境下のことをいう。
【００５５】
ここで所定の時とは、生細胞数決定工程Ｓ３において、解凍工程後生細胞数が任意の方法で確認される時のことをいう。所定の時は、幹細胞含有剤を投与するまでの推奨時間の起算開始時となる。ただし、所定の時は、解凍工程後生細胞数が任意の方法で確認される時と秒単位または数分単位で厳密に一致することまで必ずしも求めなくてもよい。
解凍工程後生細胞数とは、解凍工程Ｓ２を経て、生細胞数決定工程Ｓ３に供与された幹細胞の生細胞数を意味する。解凍工程Ｓ２の後に速やかに生細胞数決定工程Ｓ３が実施される態様では、解凍工程後生細胞数は、解凍工程Ｓ２の後、継代培養を経ずに速やかに生細胞数決定工程Ｓ３に供与された幹細胞の生細胞数である。解凍工程Ｓ２の後、継代培養工程Ｓ３０（図３参照）により得られた継代培養幹細胞を生細胞数決定工程Ｓ３に供与する態様では、解凍工程後生細胞数は、決定工程Ｓ３に供与された継代培養幹細胞の生細胞数である。
即ち、本提供方法は、生細胞数決定工程Ｓ３の前工程として凍結保存工程Ｓ１および解凍工程Ｓ２を含む。凍結保存工程Ｓ１および解凍工程Ｓ２においてある程度、幹細胞の死滅が予想される。そのため、解凍工程Ｓ２後に生細胞数決定工程Ｓ３に供与された幹細胞の生細胞数（解凍工程後生細胞数）を確認し、その確認した時を所定の時と呼ぶものである。解凍工程後生細胞数の確認方法は特に限定されず、生細胞数決定工程Ｓ３に供与された幹細胞の生細胞数を把握可能な方法であればよい。本実施形態では、解凍工程後生細胞数を確認するために、生細胞数決定工程Ｓ３において解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１さらに含む。
【００５６】
即ち、図２（ａ）に示すとおり、本提供方法は、生細胞数決定工程Ｓ３が、解凍工程Ｓ２によって解凍された幹細胞の生細胞数を測定し、解凍工程後生細胞数を決定する解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１をさらに含む。解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を含むことにより、後述する幹細胞含有剤調製工程Ｓ４において調製される幹細胞含有剤に含有される生細胞数の精度が高くなる。
【００５７】
ただし、生細胞数決定工程Ｓ３における確認方法は、解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１に限定されない。解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を含まない、本実施形態の第二の例を図２（ｂ）に示す。当該例は、解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を含まず、凍結保存生細胞数確認試験Ｓ３０３を有する。
かかる第二の例では、予め、凍結保存工程Ｓ１と同様の温度条件で凍結保存し、解凍工程Ｓ２と同様の解凍条件で解凍した幹細胞の生細胞数の生存率を確認する凍結保存生細胞数確認試験Ｓ３０３を行う。凍結保存生細胞数確認試験Ｓ３０３において、解凍後の生細胞数の確認が、当該解凍後Ｘ分後であるとき、第二の例における所定の時は、解凍工程Ｓ２における幹細胞の解凍後Ｘ分後である。
このように、解凍工程Ｓ２後の幹細胞の生細胞数を実際に測定する以外の方法で、解凍工程Ｓ２の幹細胞の生細胞数を把握してもよい。
【００５８】
尚、本発明は、さらなる変形例として、凍結保存生細胞数確認試験Ｓ３０３および解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１のいずれも含む本提供方法を包含する。即ち、凍結保存生細胞数予め凍結保存生細胞数確認試験Ｓ３０３を実施し、凍結保存工程Ｓ１前の生細胞数に対する凍結保存工程Ｓ１および解凍工程Ｓ２実施後の生細胞数の概数を把握する。加えて、解凍工程Ｓ２後に、解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を実施して所定の時の生細胞数を正しく測定してもよい。
【００５９】
（幹細胞含有剤調製工程）
次に幹細胞含有剤調製工程Ｓ４について説明する。幹細胞含有剤調製工程Ｓ４は、上述する前記解凍工程後の前記幹細胞を用い、生細胞数決定工程Ｓ３において決定された上記生細胞絶対数を満たす幹細胞を含む幹細胞含有剤を調製する工程である。
本提供方法は、生細胞数決定工程Ｓ３および幹細胞含有剤調製工程Ｓ４を含むことにより、凍結保存工程Ｓ１、解凍工程Ｓ２および後述する輸送工程Ｓ５を有しながらも、所望の生細胞数以上の幹細胞を被投与競走馬Ｘに対し投与することを可能とする。
【００６０】
幹細胞含有剤調製工程Ｓ４において生細胞絶対数を満たす幹細胞とは、生細胞絶対数以上の生細胞を含む幹細胞を意味する。即ち、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４は、生細胞絶対数以上の生きた幹細胞が含有されるよう幹細胞含有剤における幹細胞の含有量を調整する。具体的には、たとえば、生細胞数決定工程Ｓ３において確認された解凍工程後生細胞数がＹ万個／ｍｌであって、上記計算式（１）によって算出された生細胞絶対数Ｚが、約１４２９万個である場合には、幹細胞含有剤に含有される幹細胞（厳密には生細胞数決定工程Ｓ３に供された、幹細胞を含有する材料）は、（１４２９÷Ｙ）ｍｌ以上である。
【００６１】
本実施形態において、幹細胞含有剤とは、幹細胞を含有し、被投与競走馬Ｘに投与可能な剤を意味する。幹細胞含有剤は、幹細胞と当該幹細胞を含有する媒体のみから構成することもできるが、幹細胞と幹細胞以外の上記生体成分とが含まれていてもよい。また本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、幹細胞含有剤には、幹細胞および上記媒体以外の任意の添加剤が含有されていてもよい。
【００６２】
幹細胞含有剤の形態は特に限定されない。たとえば幹細胞含有剤は、幹細胞をリンゲル液などの適宜の液体に含有させた液状幹細胞含有剤、幹細胞を含みゼラチン化またはゲル化させてなる半固体状幹細胞含有剤、または幹細胞を含み上記半固体状幹細胞含有剤よりも体積変化が小さい固体状幹細胞含有剤などであってよい。液状幹細胞含有剤は、被投与競走馬Ｘに対し、注射により幹細胞を投与することができるため、投与作業が容易であり、後述する輸送工程完了後、速やかに被投与競走馬Ｘに対し幹細胞を投与することができる。
【００６３】
（輸送工程）
次に輸送工程Ｓ５について説明する。輸送工程Ｓ５は、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４において調製した幹細胞含有剤を、投与が実施される実施エリアに輸送する工程である。
【００６４】
輸送工程Ｓ５における輸送とは、道路、鉄道、船舶および航空などの公衆の利用できる公開された施設を利用する移動を意味する。利用可能な輸送の手段としては、郵便や宅配便などが挙げられるがこれに限定されず、幹細胞が凍結保存された施設から、上記公開された施設を用いて、幹細胞含有剤を移動させる種々の手段を広く包含する。
【００６５】
実施エリアとは、投与が実施される所定の場所、または当該場所に近接する施設を含む所定領域を意味する。所定領域とは、投与が実施される所定の場所まで上述する輸送の施設を使用せずとも移動可能な領域である。より具体的には、たとえば実施エリアとは、投与が実施される馬房または当該馬房に近接する施設を含む領域であり、輸送工程Ｓ５においてたとえば当該馬房または当該施設に幹細胞含有剤が送り届けられる。
【００６６】
輸送工程Ｓ５は、０℃を超えて１０℃以下の温度環境を維持した状態で実施されることが好ましい。これにより、輸送工程Ｓ５における幹細胞の死滅や活性低下を抑制し、良質な幹細胞含有剤を提供することが可能であるからである。たとえば民営会社の有料サービスである低温温度管理可能な宅配便などを利用してもよい。
【００６７】
輸送工程Ｓ５に費やされる時間は、上述する所定の時から幹細胞含有剤が被投与競走馬Ｘに投与されるまでの推奨される推奨時間未満であることが望ましい。
より具体的には、たとえば上記所定の時から、７２時間未満に幹細胞含有剤を競走馬（被投与競走馬Ｘ）に投与可能に輸送工程を完了することが好ましく、４８時間以内であることがより好ましく、３０時間以内であることがさらに好ましい。
本発明者の検討によれば、幹細胞含有剤は、冷蔵保存（０℃を超えて１０℃以下で保存）の状態を維持した場合であっても、保存時間があまり長くなると、生存率が顕著に低下するという弊害とともに、死滅した幹細胞が変質し、被投与競走馬Ｘに対し望ましくない影響を与える虞があることがわかった。これを回避するために、所定の時から輸送工程の完了までの時間を上述する範囲とすることが好ましい。
【００６８】
本実施形態における輸送工程Ｓ５では、幹細胞含有剤１２が収容された注射用容器１０と共に、この注射用容器１０とは異なる第二容器４０を輸送してもよい（図４参照）。第二容器４０は、幹細胞含有剤１２と同一の組成である生細胞数確認用サンプル１２０が収容されている。
【００６９】
上記実施エリアにおいて確認用サンプル１２０の生細胞数を測定し希望生細胞数を満たすことを確認することによって、幹細胞含有剤１２の生細胞数が希望生細胞数を満たすことを把握することができる。これにより幹細胞含有剤１２の投与の確実性と信頼性を向上させることができる。
たとえば輸送工程Ｓ５における輸送トラブルによって、予定していた輸送時間を超過し、また輸送時の温度管理が不徹底になる等して、幹細胞含有剤１２が希望生細胞数を下回ってしまった場合、その幹細胞含有剤１２の投与を回避することができる。かかる趣旨からは、確認用サンプル１２０の生細胞数の測定は、輸送工程Ｓ５後、幹細胞含有剤１２を被投与競走馬Ｘに対し投与する前に実施されることが望ましい。
ただし上述は、希望生細胞数を下回ってしまった幹細胞含有剤１２を被投与競走馬Ｘに投与することを禁止する趣旨ではない。たとえば、本提供方法を複数回実施し、幹細胞含有剤１２が所定期間を空けて複数回投与される場合、希望生細胞数を下回った幹細胞含有剤１２を投与するとともに、それ以降に実施する投与時の希望生細胞数を適宜増加するよう調整することができる。
また確認用サンプル１２０と投与用の幹細胞含有剤１２とを異なる容器に収容しているため、投与前の生細胞数の測定作業時における幹細胞含有剤１２のコンタミネーションを回避することができる。そのため馬房などのクリーンルームのない環境でも安心して投与前に、生細胞数の測定を実施することができる。
【００７０】
本実施形態に好適に用いられる幹細胞注射セット（幹細胞提供セット）１００の詳細については後述する。
【００７１】
解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１や、幹細胞含有剤１２の投与前に確認用サンプル１２０を用いて行われる生細胞数の測定は、任意の方法で実施してよい。たとえば、一般的には、カウントされる幹細胞を少量採取しトリパンブルーなどの染色液で正確に希釈し、血球計算盤で生細胞数と死細胞数とを測定する方法が挙げられる。異なる方法としては、上述のとおりトリパンブルーで希釈された幹細胞を、色の違いにより死細胞（青色に染色された幹細胞）と生細胞（染色されなかった幹細胞）とに識別可能な画像処理装置に読み込み生細胞数をカウントしてもよい。
【００７２】
本提供方法としては、解凍工程Ｓ２において解凍された幹細胞自体を生細胞数決定工程Ｓ３に供する第一態様について示した。ただし幹細胞含有剤の提供方法は、これに限定されず、解凍工程Ｓ２において解凍された幹細胞を継代培養し、継代培養の実施により得られた幹細胞である継代培養幹細胞を生細胞数決定工程に供する第二態様を含む。
【００７３】
次に図３を用い、本提供方法の第三の例として、解凍工程Ｓ２において解凍された幹細胞を継代培養し、継代培養の実施により得られた幹細胞である継代培養幹細胞を生細胞数決定工程に供する第二態様について以下に説明する。第三の例は、解凍工程Ｓ２と、生細胞数決定工程Ｓ３との間に継代培養工程Ｓ３０を有する。
図３は、本発明の第三の例にかかる幹細胞含有剤の提供方法の一例を示すフローチャートである。第三の例における本提供方法は、解凍工程Ｓ２の後であって生細胞数決定工程Ｓ３の前に、解凍された幹細胞を用いて継代培養を行う継代培養工程Ｓ３０を実施し、当該継代培養によって得られた幹細胞である継代培養幹細胞を生細胞数決定工程Ｓ３に供与する点で、第一実施形態と異なる。第三の例に関し、第一実施形態と同様の工程については、適宜第一実施形態の説明が参照される。
継代培養工程Ｓ３０を備える第三の例において、所定の時とは、解凍工程Ｓ２後であって継代培養工程Ｓ３０を実施した後の上記継代培養幹細胞の生細胞数が確認される時である。
【００７４】
第二態様は、たとえば、凍結保存工程Ｓ１における保存期間が充分に長い場合に、有効である。即ち、長期間、冷凍状態にあった幹細胞は、解凍後、継代培養によりリフレッシュし、本来の活性を充分に取り戻すことが可能だからである。また、凍結保存工程Ｓ１においてストックされる幹細胞が少ない場合にも、第二態様は有効である。継代培養において幹細胞を所望の数に増やし、当該継代培養にて数の増大した継代培養幹細胞を細胞数決定工程Ｓ３に供与することができるからである。
一方、上述する第一態様は、凍結保存工程Ｓ１において保存された幹細胞を被投与競走馬Ｘに対し投与する必要が生じた場合に、速やかに当該幹細胞を提供できる点で優れている。
【００７５】
上記継代培養を実施する第二態様は、図２（ａ）に示す生細胞数決定工程Ｓ３と同様に、解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を実施し、生細胞数決定工程Ｓ３に供与された継代培養幹細胞の解凍工程後生細胞数を測定するとよい。継代培養後に生細胞数を測定することによって正しく把握し、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４において希望生菌数を満たす幹細胞を含有する幹細胞含有剤を調製するためである。
第三の例において、解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を実施する場合には、生細胞数決定工程Ｓ３に供与された継代培養幹細胞の生細胞数が、解凍工程後生細胞数に相当する。換言すると、生細胞数決定工程Ｓ３に供与された継代培養幹細胞の生細胞数を測定することによって解凍工程後生細胞数測定工程Ｓ３０１を実施することができる。これにより解凍工程後生細胞数を把握することができ、続く、幹細胞含有剤調製工程Ｓ４において調製される幹細胞含有剤に含有される生細胞数の精度を高くすることができる。
【００７６】
以上説明した本提供方法によれば、投与する幹細胞の生細胞数が所望の数に調整された幹細胞を、調製施設とは異なる投与場所まで輸送にて提供することが可能である。
【００７７】
次に幹細胞含有液について説明する。本実施形態における幹細胞含有液は、上述にて説明する幹細胞を含有し、注射針を通じて被投与競走馬に注入可能な剤である。幹細胞含有液は、たとえば幹細胞、または幹細胞を含有する細胞液に対し、リンゲル液または生理食塩水などの輸液製剤を混合して適度な粘度に調整することによって作成することができる。上記細胞液とは、幹細胞を含有する液状物であればよく、たとえばドナー動物から採取された幹細胞を継代培養して得られた培養液の一部、幹細胞を含有する解凍後の凍結保存液などを挙げることができるが、これらに限定されない。
幹細胞含有液は、注射器から被投与動物に注入可能な程度に粘度が低く調製されていることが好ましい。
【００７８】
本実施形態における幹細胞含有液は、生体由来の物質として実質的に幹細胞のみを含んでいてもよく、また幹細胞に加えて任意の他の生体成分を含んでいてもよい。
上記他の生体成分としては、たとえば、サイトカインを挙げることができる。本実施形態における幹細胞含有液は、幹細胞とともにサイトカインを含有していてもよい。
サイトカインは、細胞から産生される生理活性タンパク質であり、一般的には分子量８万以下、より多くは３万以下の低分子のものが多く知られる。生理活性とは、生体内において、化学物質が特定の生理的な調節機能に対して作用する性質を意味する。被投与動物に対し幹細胞とともにサイトカインが投与されることで、被投与動物の体内における幹細胞の自己複製能または多分化能の発現に対し、当該サイトカインが好適に関与し得る。
上記サイトカインは、幹細胞含有液に含まれる幹細胞から産生されたものであってもよいし、異なる細胞から産生されたものであってもよい。
【００７９】
たとえばサイトカインとしては、ケモカイン、細胞増殖因子、インターロイキン、若しくはインターフェロン、またはこれらの誘導体を例示することができるが、これに限定されない。上記ケモカインは、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、ＣケモカインまたはＣＸ３Ｃケモカインに大別される８ｋＤａから約１４ｋＤａ程度の低分子量のタンパク質である。ケモカインは、ケモカイン受容体を介して作用する。
幹細胞含有液に含まれるサイトカインの好ましい例として、ＣＸＣＬ１２またはその誘導体を挙げることができる。ＣＸＣＬ１２またはその誘導体は、被投与動物の体内において幹細胞の自己複製能または多分化能の発現を良好に促進し得る。
【００８０】
またＣＸＣＬ１２またはその誘導体を含む幹細胞含有液には、ＣＸＣＬ１２の受容体であるＣＸＣＲ４またはその誘導体が含まれることが好ましい。幹細胞と共に投与されたＣＸＣＬ１２を有効に作用させるためである。また、被投与動物に投与された幹細胞は、直接に、または肺、脾臓、肝臓などの臓器を経て順次、炎症などを起こしている患部に到達するホーミング効果があることが知られている。ここでＣＸＣＬ１２とその受容体であるＣＸＣＲ４を幹細胞とともに投与することによって、当該ホーミング効果を向上させ得る。
【００８１】
次に本実施形態における注射針について説明する。本実施形態において用いられる注射針は、被投与競走馬の体表面から体内に向けて刺し、当該注射針の内部に形成された流通路を通じて幹細胞含有液を被投与競走馬に投与可能な部材である。たとえば注射針は、先端が先細りであるとともに横断面が環状に形成され、長手方向の内部に幹細胞含有液が流通可能な流通路が延在する細径の筒状体である。注射針は長手方向の両端が開口し、一方の開口から他方の開口まで幹細胞含有液を流通可能な流通路を有する。
注射針は、投与時に被投与競走馬に刺すタイプ、または予め被投与競走馬の任意の箇所に刺しておく留置針のいずれであってもよい。
また注射針は、注射筒（所謂、シリンジ）と連結可能な部材であってもよいし、点滴用チューブを介して点滴容器に連結可能な部材であってもよい。上記点滴容器には、点滴バック、および点滴ボトルを含む。即ち、本実施形態の投与工程は、注射筒と注射針を有する注射器を用いて実施することもできるし、点滴容器と点滴用チューブと留置針とを有する点滴装置を用いて実施することもできる。
【００８２】
本実施形態において、注射針は、内径０．６ｍｍ以上であることが好ましい。かかる範囲の内径を有する注射針を用いることによって、注射針の内部を通過する幹細胞が注入圧によって損傷することを良好に回避し得る。また注入時に幹細胞を損傷しないという観点では、競走馬に対する幹細胞の注入速度を充分に遅くすることも肝要である。ここで内径０．６ｍｍ以上の注射針を用いることで、単位時間当たりの幹細胞の注入量を増やすことができるため、注入速度を遅くしても、注入にかかる時間を短くすることができ、被投与競走馬に対する負担を軽減することができる。
【００８３】
注射針の太さは、一般的に「ゲージ」で示される。これは注射針の外径が１インチの何分の１であるかを示すものであって、たとえば２３ゲージは１／２３インチである。本実施形態における注射針の外径は特に限定されない。一般的に、外径に応じて内径も定められること、および内径は上述したとおり適度に太いことが好ましいという観点からは、本実施形態における注射針は、２３ゲージ以上であることが好ましく、２０ゲージ以上であることがより好ましく、１９ゲージ以上であることがさらに好ましい。
【００８４】
本実施形態に用いられる注射針は、特定の注射の態様に限定されず、公知の注射という手技に用いられる注射針から適宜選択することができる。換言すると、本実施形態の幹細胞投与方法は、注射針を用い、静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、筋肉内注射など、注射として知られる手段から適宜選択して実施することができる。
【００８５】
投与工程において、注射針で競走馬（被投与競走馬）に幹細胞含有液を注入する手段は静脈内注射であることが好ましい。
患部（たとえば腱）に直接に注射すると患部を傷つける虞があるため注射を行う手技者の手腕に頼る必要がある。これに対し、静脈内注射であれば、静脈血とともに一旦、幹細胞含有液を心臓に送り、その後に、幹細胞等のホーミング効果により炎症部まで幹細胞を到達させることによって、手技者の手腕に依存することなく、投与工程を望ましく実施することができる。
【００８６】
また静脈内注射により幹細胞含有液を注射した場合、脾臓を含む臓器を幹細胞含有液が循環するため、副次的な効果が期待される。本実施形態の幹細胞投与方法は、競走馬に対し幹細胞含有液を静脈内注射で投与することで、単に競走馬に対し低侵襲であるといった効果を超えた、優れた効果を与え得る。
即ち、競走馬に対し、静脈内注射で幹細胞含有液を投与した場合、幹細胞含有液に含まれる幹細胞は、肺、脾臓、肝臓などの臓器を通過してその何割かが消費され、残余が炎症などを発生した患部に到達し得る。
上記臓器の中で脾臓は、一般的にはリンパ器官として知られるが、運動時などに循環血流に放出するための大量の血液を貯蔵する機能も有している。特に競走馬は、競馬の試合中に大量に消費される血液を脾臓に貯蔵しているため、体重に対する脾臓重量が他の動物（たとえば牛）などよりも大きい傾向にある。競走馬の脾臓に貯蔵された血液は、試合中に大量に放出され消費されるため、試合後の競走馬の脾臓は顕著に疲労しており、また次の試合に向けて、速やかに大量の血液を貯蔵することが求められる。また、試合後の競走馬は、腱や筋肉の炎症を起こし易い。即ち、競走馬は、脾臓の疲労と腱などの炎症が同じタイミングで発生するという他の動物には見られない体調変化が生じる。これに対し、注射用幹細胞含有液を競走馬に注射することによって、これに含まれる幹細胞を脾臓および腱などの炎症部分のいずれにも好適に作用させ得る。
【００８７】
（幹細胞注射セット／幹細胞提供セット）
つぎに、本実施形態に用いられる注射用容器について図４を用いて説明する。図４は、注射用容器１０を含む幹細胞注射セット（幹細胞提供セット）１００の一例を示す説明図である。
【００８８】
注射用容器１０は、幹細胞含有液１２を収容可能な容器本体１６を有し注射針（図示せず）に連結可能である。注射用容器１０を第一容器と呼称する場合がある。注射用容器１０は、密封容器３２に収容されている。容器本体１６には、幹細胞を含有する幹細胞含有液１２が収容されており、幹細胞含有液１２が注射用容器１０から漏出することを防止する封止部（キャップ１９）を備える。本実施形態における幹細胞含有液１２に含有される幹細胞は、動物から採取されたもの、および動物から採取された幹細胞を継代培養して得た継代培養幹細胞を含む。
【００８９】
上述のとおり注射用容器１０の容器本体１６には、幹細胞含有液１２が予め収容されているとともに、注射用容器１０に封止部（キャップ１９）が設けられている。そのため、本実施形態の注射用容器１０によれば、速やかに注射可能な状態で、幹細胞含有液１２を運搬または輸送することができる。また注射用容器１０は、密封容器３２に収容されているため、衛生状態を良好に維持しつつ幹細胞含有液１２を運搬または輸送することができる。そのため、調製施設から任意の場所（例えば馬房等）まで、幹細胞含有液１２を汚染することなく提供することが可能であり、提供された場所で、注射という容易な方法で、速やかに被投与動物に対し幹細胞含有液１２を投与することが可能である。
したがって、従来のように、被投与動物を投与施設に移動させて幹細胞を投与することで当該被投与動物に移動の負荷を与えることを抑制することができ、被投与動物に対し幹細胞投与による効果を充分に供与することが可能である。
また本実施形態の注射用容器１０によれば、幹細胞含有液１２を投与する場所を任意に選択することが可能であるとともに上記手技者以外の者が投与操作を行うことを可能とするため、幹細胞投与技術の汎用性を高めることができる。
【００９０】
注射用容器１０は、幹細胞含有液１２を収容可能な容器本体１６を有し注射針に連結可能な容器である。図示省略する注射針に連結することで、容器本体１６に収容された幹細胞含有液１２を被投与動物に注入することが可能である。注射用容器１０は、注射筒に限定されず、たとえば点滴バック、または点滴ボトルなどの注射針に対し連結可能な容器を広く包含する。
本発明は、このように幹細胞含有液１２を注射用容器１０に収容したことで幹細胞をたとえば切開等して被投与動物の体内に設置するなどの高度な医療行為を必要とせず、容易かつ速やかに投与することを可能とする。また予め注射用容器１０に幹細胞含有液１２が収容されていることによって、投与の現場において、衛生的かつ迅速に、幹細胞含有液１２の投与を実施することができる。
【００９１】
本実施形態における注射用容器１０は、図４に示すように注射筒である。注射用容器１０は、幹細胞含有液１２を収容可能な容器本体１６と、ピストン１８とを備える注射筒である。注射筒である注射用容器１０は、容器本体１６に対し相対的にピストンヘッド１８０の位置を固定するための、ストッパ１５が設けられている。これによって、容器本体１６に収容された幹細胞含有液１２に対し、ピストン１８の圧力がかからないようになっている。ストッパ１５は注射用容器１０から取り外し可能であり、幹細胞含有液１２を投与する前にストッパ１５を容易に取り外すことができる。ストッパ１５の取り外し手段は特に限定されない。
【００９２】
注射用容器１０は、図示省略する注射針に直接または間接に連結可能であるとともに容器本体１６から注射針に対し幹細胞含有液１２を流通可能とする針結合部１７を有している。
針結合部１７を注射針に連結させるとは、容器本体１６に収容された幹細胞含有液１２が針結合部１７を流通し、当該注射針より動物に注入可能な状態にすることをいう。本実施形態における針結合部１７は、容器本体１６の一方の端部に設けられ外方向に突出する筒状部である。筒状部である針結合部１７の外径は、注射筒である容器本体１６の外径よりも小さい。針結合部１７の内部には幹細胞含有液１２が流通可能な流路が設けられており図示省略する注射針の内部に設けられた注射液が流通する流路と直接または間接に連結され得る。針結合部１７と注射針とは直接または間接に連結される。
【００９３】
注射用容器１０は、封止部（キャップ１９）により、注射針と連結する前の状態である針結合部１７が封止されている。
針結合部１７が封止されているとは、針結合部１７を通じて容器本体１６に収容された幹細胞含有液１２が漏出しない程度に、針結合部１７を直接または間接に密封することをいう。これにより注射用容器１０は、幹細胞含有液１２を収容するとともに注射針を連結する前の状態で運搬または輸送することができ、取扱性が容易である。そのため任意の場所に幹細胞含有液１２を収容した注射用容器１０を運搬または輸送するとともに、当該任意の場所等において速やかに幹細胞含有液１２を被投与動物に対し投与することができる。
【００９４】
本実施形態において、封止部は、針結合部１７を覆うキャップ１９である。キャップ１９は、針結合部１７に対し嵌合した状態を維持することによって幹細胞含有液１２が針結合部１７から漏出することを防止するとともに、針結合部１７を通じて幹細胞含有液１２が汚染されること防止する。図示省略する封止部の変形例は、キャップ１９の替わりに、たとえば針結合部１７を覆うシール部材などであってもよい。また予め注射針が連結された注射用容器１０において、封止部は、当該注射針を覆うとともに当該注射針から幹細胞含有液１２の漏出を防止する注射針キャップであってもよい。
【００９５】
本実施形態の注射用容器１０は、密封容器３２に収容されている。ここで密封とは、目視で隙間が確認されない程度に封をされた状態を意味し、望ましくは、密封容器３２の内部が雑菌に汚染されない程度に厳重に封をされることが好ましい。即ち、密封容器３２は内容物の滅菌状態が維持可能な容器であることが好ましい。密封容器３２の形状は特に限定されず、注射用容器１０を収容可能な袋状、または所定形状などの任意の容器であってよい。
図４では、密封容器３２に１つの注射用容器１０が収容された態様を図示している。この変形例として、密封容器３２に２つ以上注射用容器１０が収容され、また注射用容器１０以外の物が収容されていてもよい。
【００９６】
次に幹細胞含有液１２の詳細について説明する。本実施形態において幹細胞含有液１２は注射用容器１０の容器本体１６に収容されている。幹細胞含有液１２は、動物から採取された幹細胞を含有する液状の剤である。幹細胞含有液１２は、注射器から被投与動物に注入可能な程度に粘度が低く調製されていることが好ましい。
【００９７】
幹細胞含有液１２に含有される幹細胞は、凍結保存され、解凍された細胞であってもよい。凍結保存された幹細胞を、適宜解凍した後、幹細胞含有液１２を調製することができる。このときの解凍方法は、特に限定されず、凍結された幹細胞になるべくダメージを与えない条件で解凍することを配慮した上で、適宜実施することができる。たとえば、ディープフリーザで約−８０℃で凍結保存された幹細胞の場合、当該ディープフリーザから当該幹細胞を取出し、水温が約４０℃程度に調製されたウォーターバスに容器ごと浸漬させた状態を数分間保持し解凍することができる。
【００９８】
幹細胞を採取される動物が上述したとおりドナー競走馬である場合に、注射用容器１０は、付帯要素として、競走馬（ドナー競走馬）の馬名を確認可能な馬名情報２４を備えていることが好ましい。
上記付帯要素を備える注射用容器１０は、幹細胞含有液１２に含まれる幹細胞の由来を、競走馬（ドナー競走馬）の個体で認識することができ、幹細胞含有液１２の信頼性を向上させることができる。これによって、ドナー競走馬と被投与競走馬との血統の関係を確認することが容易となる。より具体的には、ドナー競走馬と、被投与競走馬と、が同一血統であるか否かを容易に判断することができる。
【００９９】
上記付帯要素は、注射用容器１０に付帯して運搬または輸送可能なものであればよく、その形態は特に限定されない。たとえば本実施形態において馬名情報２４は、注射用容器１０の容器本体１６外側面に貼り付けられたラベル１４に記されている。したがって本実施形態において付帯要素は、馬名情報２４が記され、注射用容器１０に貼り付けられたラベル１４である。ラベル１４に記された馬名情報２４は、馬名であってもよいし、馬名を確認するための整理番号、バーコードなどであってもよい。異なる上記付帯要素としては、注射用容器１０に添えられるマニュアル２０などの添付品であって馬名情報２４が記録されているものであってもよい。図４に、注射用容器１０とマニュアル２０とを同封する幹細胞注射セット１００を示す。付帯要素は、たとえば注射用容器１０を収容する密封容器３２の内部に注射用容器１０とともに収容されるか、あるいは密封容器３２の外側に配置される。
【０１００】
本実施形態の幹細胞注射セット１００は、上述した注射用容器（第一容器）１０と、この注射用容器（第一容器）１０に収容された幹細胞含有液１２と同一の組成である生細胞数確認用サンプル１２０が収容されている第二容器４０と、を備える。
幹細胞注射セット１００によれば、速やかに注射可能な状態で幹細胞含有液１２を運搬または輸送することができるとともに、任意の場所で幹細胞含有液１２を投与する際に、第二容器４０に収容された確認用サンプル１２０の生細胞数を測定することで幹細胞含有液１２の生細胞数を把握することができる。
【０１０１】
幹細胞含有液１２と確認用サンプル１２０とが同一の組成とは、これらの液に含まれる幹細胞の濃度、輸液等が実質的に同一であることを意味する。たとえば、幹細胞含有液１２として用いた液の一部を第二容器４０に収容することによって確認用サンプル１２０を得ることができる。本実施形態において、確認用サンプル１２０と、幹細胞含有液１２とは、実質的に同一の液である。幹細胞含有液１２と同一の液を注射用容器１０とは異なる第二容器４０に収容することによって、幹細胞含有液１２を汚染することなく、確認用サンプル１２０の生細胞数を測定し、これによって幹細胞含有液１２の生細胞数を正しく把握することができ、幹細胞含有液１２の投与の確実性と信頼性を向上させることができる。
【０１０２】
次に注射用容器１０に収容された幹細胞含有液１２における幹細胞の生細胞数について説明する。上述のとおり、幹細胞は、自己複製能および多分化能を有する細胞である。幹細胞含有液１２が投与されることで被投与動物の体内において幹細胞の自己複製能および多分化能が発現することを期待する場合には、幹細胞含有液１２に含有される幹細胞の少なくとも一部は、生きた細胞であることが好ましい。
【０１０３】
一例としては、幹細胞含有液１２に含まれる幹細胞の生細胞数は、たとえば８００万個以上であり、上記幹細胞の総細胞数に対する上記生細胞数の割合が６０％以上であることが好ましい。
生細胞数とは、幹細胞含有液１２に含まれる幹細胞のうち、生きた幹細胞の数を意味する。幹細胞の生細胞の確認方法は特に限定されず、たとえば生細胞をトリパンブルーなどの染色液で特異的に染色する方法などを挙げることができる。トリパンブルーで幹細胞を染色すると、死んだ細胞が青く染色されるため、色の違いを確認することで生細胞を確認（測定）することができる。また生細胞の確認には、一般的には血球計算盤やマイクロプレートリーダーなどの公知の細胞数測定具を用いることができるが、これに限定されない。
【０１０４】
投与される幹細胞含有液１２において生きた幹細胞の数（生細胞数）が８００万個以上であることにより、幹細胞投与の有意な効果が期待される。幹細胞投与の有意な効果を発揮せしめるという観点からは、当該生細胞数は、１０００万個以上であることが好ましく、２０００万個以上であることが好ましく、５０００万個以上であることがさらに好ましく８０００万個以上であることが好ましい。尚、多数の生細胞を投与したい場合には、１つの注射用容器１０に当該多数の生細胞を全部収容しなくてもよく、所定期間の間隔を空けて投与を複数回に分けて実施し、所定期間内に生細胞が希望数だけ投与することもできる。このように所定期間に連続的に投与する場合には、特に注射用容器１０を用いることが好ましい。被投与動物を繰り返し、投与のために移動させるのではなく、被投与動物が居る場所に注射用容器１０を運搬または輸送することができるからである。
【０１０５】
また幹細胞含有液１２における幹細胞の総細胞数に対する生細胞数の割合が６０％以上であることが好ましい。死滅した幹細胞が被投与動物に投与された場合に、当該被投与動物の体内において死滅した幹細胞が変質し、当該被投与競走馬に対し望ましくない影響を与える虞があることが本発明者の研究でわかった。そのため、幹細胞含有液１２に含まれる死んだ幹細胞の数は少ない方がよく、この観点から上記生細胞数の割合は６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましい。
【０１０６】
幹細胞含有液１２における幹細胞の総細胞数に対する生細胞数の割合は、幹細胞含有液１２またはこれと同一の組成のサンプルの幹細胞の総数と生細胞数とを測定して求めることができる。もちろん当該サンプルにおける死細胞数を測定し、上記総数から死細胞数を減じて生細胞数を確認してもよい。たとえば、幹細胞含有液１２において生細胞数が１０００万個であり、当該生細胞数を含む幹細胞の総数に対する生細胞数の割合が７０％である場合には、幹細胞の総数は、約１４２９万個である。このような生細胞数の数および比率であれば、幹細胞投与における有意な効果が充分に期待されるとともに、幹細胞含有液１２において含まれる死細胞が被投与動物に対して与える望ましくない影響を充分に小さく抑制することが可能である。
【０１０７】
以下に幹細胞注射セット１００の詳細について説明する。本実施形態では、競走馬から採取された幹細胞を含む幹細胞含有液１２を備える例を用いて説明する。ただし、これは本発明の幹細胞注射セット１００における幹細胞含有液１２を何ら限定するものではない。尚、注射用容器１０は、第一実施形態において説明した内容と同様であるため、ここでの説明は割愛する。
【０１０８】
本実施形態において、第二容器４０は、注射用容器１０に対し比較的小型である。第二容器４０の形状および構造は確認用サンプル１２０を収容可能な範囲において特に限定されないが、たとえば、第二容器４０は、容器本体４２と、容器本体４２に対し開閉が繰り返し可能な蓋部４４とを備える。第二容器４０には確認用サンプル１２０が収容されている。幹細胞含有液１２と確認用サンプル１２０とは、幹細胞含有液を調製する工程において得られた同一の幹細胞含有液であり、幹細胞の濃度が略等しく、一般的には、確認用サンプル１２０の量の方が少ない。本実施形態において第二容器４０は、密封容器３４に収容されている。密封容器３４は、密封容器３２と同様の密封容器である。これによって幹細胞注射セット１００が運搬または輸送されている間に、確認用サンプル１２０が雑菌から汚染されることが防止されている。本実施形態では、注射用容器１０と第二容器４０とは異なる密封容器（密封容器３２、密封容器３４）に収容されているが、これらは１つの密封容器にまとめて収容されてもよい。
【０１０９】
幹細胞注射セット１００は、さらに任意で他の物品を有していてもよい。本実施形態の幹細胞注射セット１００は、注射用容器１０および第二容器４０に加え、鎮痛剤５２が収容された第三容器５０およびマニュアル２０を備える。
【０１１０】
第三容器５０は、幹細胞含有液１２を注射投与する前に被投与動物に対し投与するための鎮痛剤５２を収容している。鎮痛剤５２は、幹細胞含有液１２を注射投与する前に、被投与動物に投与されるための剤である。鎮痛剤５２の事前投与により、幹細胞含有液１２を注射投与したときに、被投与動物の痛みを緩和させることができ、幹細胞含有液１２の投与作業をスムーズにする。
【０１１１】
本実施形態の第三容器５０は、収容された液が鎮痛剤５２であること、およびラベル１４が容器本体１６の外表面に付されていないこと以外は、注射用容器１０と同様の構成であってよい。たとえば、予め被投与動物に打たれた留置針（図示省略）に対し、まず第三容器５０の針結合部１７を結合して鎮痛剤５２を被投与動物に投与する。次いで、第三容器５０を留置針から取り外し、注射用容器１０の針結合部１７を留置針に結合して、幹細胞含有液１２を投与することができる。ただし、幹細胞含有液１２の投与方法はこれに限定されるものではない。第三容器５０は、注射用容器１０と同様に、密封容器３６に収容されている。
【０１１２】
マニュアル２０は、幹細胞含有液１２の投与に関連する情報を備える。本実施形態のマニュアル２０は、馬名情報２４、投与時間情報２２、馬名２６、投与方法２８等を備える。
【０１１３】
馬名情報２４は、ラベル１４に付された馬名情報２４と同様の情報である。馬名情報２４を確認することによって、幹細胞含有液１２が特定の競走馬から採取されたことを容易に知ることができる。
【０１１４】
投与時間情報２２は、幹細胞注射セット１００に収容された幹細胞含有液１２が被投与動物（被投与競走馬Ｘ）に投与されるまでの推奨される時間の情報である。幹細胞注射セット１００を提供する者は、出荷時の幹細胞含有液１２における幹細胞の生細胞数および輸送時等における当該幹細胞の生存率を把握し、望ましい生細胞数を確実に投与するために投与までの推奨時間を投与時間情報２２として伝達するとよい。具体的には、たとえば投与時間情報２２として「○月×日△時までに幹細胞含有液１２を投与してください」等の記載をマニュアル２０に設けることができる。
本発明者の検討によれば、幹細胞含有液１２の準備から投与までの間を、できるだけ幹細胞の生存に適した環境に維持することを前提として、以下のことがわかった。即ち、幹細胞注射セット１００の作成において、幹細胞含有液１２における幹細胞の生細胞数が確認された時から投与までの時間は７２時間未満であることが好ましく、４８時間以内であることがより好ましく、３０時間以内であることがさらに好ましい。上述した投与までの時間が７２時間以上を経過すると、幹細胞の生存率が顕著に低下するという弊害とともに、死滅した幹細胞が変質し、被投与動物に対し望ましくない影響を与える虞があることがわかった。そのため、投与時間情報２２はこれらの時間範囲を考慮して設定されることが好ましい。ここで幹細胞の生存に適した環境とは、幹細胞を０℃を超えて１０℃以下の温度環境である。
【０１１５】
馬名２６は、幹細胞含有液１２が採取されたドナー競走馬の馬名を示す。例えば被投与競走馬Ｘに対し幹細胞含有液１２を投与することを予定する場合、図１に示す被投与競走馬Ｘの血統表において、馬名２６「ＡＢＣＤ」が、２代先祖であることを容易に確認することができる。ただしマニュアル２０において馬名２６が省略された場合であっても、馬名情報２４から確認される馬名によって同様に、被投与競走馬Ｘとドナー競走馬とが同一血統であるかどうかを容易に確認可能である。もちろん馬名２６を馬名情報２４として取り扱ってもよい。
投与方法２８は、幹細胞含有液１２を投与する方法、および、これに関連する作業についての情報を含む。本実施形態の幹細胞注射セット１００は、第二容器４０および鎮痛剤５２を収容する第三容器５０を備えるため、たとえば投与方法２８として「１．第二容器４０に収容され確認用サンプル１２０を用いて幹細胞の生細胞数を測定し、所定の数の生細胞数が含まれることを確認する。２．次に第三容器５０である注射用容器を留置針に連結し、被投与競走馬Ｘに対し鎮痛剤を投与する。３．注射用容器１０を留置針に連結し、鎮痛剤投与後に、幹細胞含有液１２を投与する。」といった情報を含んでよい。
【０１１６】
幹細胞注射セット１００は、さらに任意の他の物品を備えていてもよい。たとえば、幹細胞注射セット１００は、図示省略する注射針、または幹細胞含有液１２を注射により投与した後に容器本体１６の内側面に付着した残余の幹細胞を洗浄し、次いで当該残余の幹細胞とともに上記競走馬に投与される洗浄液などをさらに備えてもよい。洗浄液としては、被投与競走馬に注入可能な溶液であればよく、たとえばリンゲル液や生理食塩水などの輸液を用いることができる。
本実施形態の幹細胞注射セット１００は、幹細胞注射セット１００を構成する注射用容器１０、マニュアル２０、第二容器４０、第三容器５０を１つの容器３０に収容している。容器３０は、収容物の温度を所定範囲に管理可能な容器であることが好ましく、たとえば、断熱性を備える保冷容器などであることが好ましい。
【０１１７】
尚、幹細胞注射セット１００が輸送により任意の場所に提供される場合には、幹細胞含有液１２に含まれる幹細胞の生存に適した環境となるよう配慮されることが好ましい。具体的には、上記輸送は、０℃を超えて１０℃以下の温度環境を維持した状態で実施されることが好ましい。これにより、輸送中の幹細胞の死滅や活性低下を抑制し、良質な幹細胞含有液１２を提供することが可能である。たとえば民営会社の有料サービスである低温温度管理可能な宅配便などを利用してもよい。尚、本明細書において輸送とは、道路、鉄道、船舶および航空などの公衆の利用できる公開された施設を利用する移動を意味する。利用可能な輸送の手段としては、郵便や宅配便などが挙げられるがこれに限定されず、幹細胞が凍結保存された施設から、上記公開された施設を用いて、幹細胞含有液を移動させる種々の手段を広く包含する。
【０１１８】
幹細胞注射セット１００の輸送時におけるトラブルによって、予定していた輸送時間を超過し、また輸送時の温度管理が不徹底になる等して、幹細胞含有液１２が予定した以上に死滅してしまう場合も起こり得る。これに対し、幹細胞注射セット１００は、確認用サンプル１２０を備えるため、幹細胞含有液１２の投与前に、確認用サンプル１２０を用いて幹細胞の生細胞数を測定し、幹細胞含有液１２が生きた幹細胞を充分に含むか否かを把握することができる。そのため幹細胞含有液１２の信頼性が高い。
【０１１９】
上記に説明した注射用容器１０によれば、幹細胞含有液１２を無菌状態で任意の場所に提供することを可能とするとともに、提供された場所において注射という汎用の手段で速やかに被投与動物に対し幹細胞含有液１２を投与することを可能とする。
【０１２０】
幹細胞注射セット１００は、注射用容器１０とともに、当該注射用容器１０に収容された幹細胞含有液１２と同一の組成の生細胞数確認用サンプル１２０が収容されている第二容器４０を備える。そのため、任意のタイミングで生細胞数確認用サンプル１２０の生細胞数を測定することによって、幹細胞含有液１２における幹細胞の生細胞数を把握することができる。
【０１２１】
競走馬から採取された幹細胞を含有する本実施形態の幹細胞含有液１２は、血統が重んじられる競走馬に対し、非競走馬の幹細胞が競走馬に混入することを回避し、競走馬の血統の維持に疑念が生じることを回避することができる。
また同様に、競技馬から採取された幹細胞を含有する本実施形態の幹細胞含有液１２は、血統を維持する競技馬に対し、血統を有しない競技馬の幹細胞が血統を維持する競技馬に混入することを回避し、競技馬の血統の維持に疑念が生じることを回避することができる。
【０１２２】
以上、本発明の幹細胞投与方法に供するための幹細胞含有液の提供方法と、幹細胞含有液を輸送し、そして競走馬に注射するための幹細胞注射セット１００について説明した。幹細胞含有液を注射針で競走馬に注入する投与工程について説明を戻す。
【０１２３】
投与工程を実施するタイミングは特に限定されていないが、たとえば投与工程を、幹細胞含有液が調製されたときから７２時間未満に実施することが好ましく、５０時間以内であることがより好ましい。
未凍結の状態で細胞を取り扱う場合には、細胞に適した温度環境（例えば０℃を超えて１０℃以下）を維持することが一般的である。本発明者の検討によれば、調製された幹細胞含有液を実質的に０℃を超えて１０℃以下の温度環境で取り扱った場合でも、当該幹細胞含有液に含有される幹細胞は、経時的に死滅していくことがわかった。幹細胞含有液に含まれる幹細胞の総数に対する、生きた幹細胞の数の比率を生存率としたとき、当該生存率は、概ね、２４時間後では８０％、４８時間後では７０％、７２時間後では、５０％から６０％程度であった。したがって７２時間未満であれば、５０％を超えた生存率である幹細胞含有液を、被投与競走馬に投与できること、および、死滅した幹細胞を多量に被投与競走馬に投与することを防止することができる。また幹細胞含有液が調製されたときから５０時間以内の投与であれば、幹細胞含有液に含有される幹細胞の総数に対し、有意に半数を超える生きた幹細胞を投与することができ好ましい。
【０１２４】
（生細胞数確認工程）
本実施形態における幹細胞投与方法は、上述した投与工程に加えて、幹細胞含有液に含有される幹細胞の生細胞数を確認する生細胞数確認工程を含んでもよい。生細胞数確認工程を実施することによって、被投与競走馬に対し投与される生きた幹細胞の数を把握することができ、幹細胞投与方法の信頼性を向上させることができる。
【０１２５】
生細胞数確認工程の実施のタイミングは特に限定されないが、上述した輸送工程の終了後、かつ投与工程の実施の前に行うことが好ましい。投与工程の前に、生細胞数確認工程を実施して幹細胞含有液に含まれる幹細胞の生細胞数を確認することによって、当該幹細胞含有液が正常であることを確認でき投与工程の信頼性が向上する。ここで、生細胞数を確認する、とは、幹細胞含有液に含まれる生きた幹細胞の数を把握することを意味する。上記生細胞数の確認には、幹細胞含有液を用いて、これに含まれる生細胞数を測定する態様、および幹細胞含有液と同一の組成の他のサンプルを用いて生細胞数を測定し、その測定結果から、幹細胞含有液に含まれる生きた幹細胞の数を推定する態様を含む。
【０１２６】
本実施形態の生細胞数確認工程では、上述したように、幹細胞含有液１２と同一の組成であり第二容器４０に収容された確認用サンプル１２０に含まれる生細胞数を測定し、注射用容器１０に充填された幹細胞含有液１２に含まれる生細胞数を推定することにより行うことができる。確認用サンプル１２０に含まれる生細胞数を測定するにあたっては、確認用サンプル１２０の全量または一部を採取してトリパンブルーなどの染色液で細胞を染色したうえで生細胞を目視または画像処理装置によって計数するとよい。
【０１２７】
（洗浄工程）
また本実施形態における幹細胞投与方法は、幹細胞含有液が、注射針に連結された注射用容器に収容されている場合に、さらに洗浄工程を有していてもよい。
ここで洗浄工程は、投与工程の途中または投与工程の終了後に、注射用容器に競走馬（被投与競走馬）に注入可能な洗浄液を充填し、注射用容器の内壁に付着した幹細胞を当該洗浄液で洗浄するとともに競走馬（被投与競走馬）に注入する工程である。
【０１２８】
幹細胞は、容器壁面に付着する性質があることが知られているところ、洗浄工程を有する本実施形態の投与方法によれば、注射用容器に付着した幹細胞を効率よく被投与競走馬に投与することができ、幹細胞の投与数のロスを減らすことができる。
【０１２９】
＜第二実施形態＞
次に、本発明の第二実施形態として本発明の競走馬の症状改善方法（以下、本症状改善方法ともいう）について説明する。
本実施形態の競走馬の症状改善方法は、上述した本発明の幹細胞投与方法を用い、非正常状態を示す競走馬に幹細胞を含有する幹細胞含有液を投与することを特徴とする。本実施形態における幹細胞投与方法は、上述した第一実施形態の説明を適宜参照することができる。尚、本実施形態において症状の改善とは、非正常状態を正常状態にし、または正常状態に近づけることをいう。
【０１３０】
本症状改善方法によれば、正常状態とは異なる症状を示す競走馬（即ち、非正常状態である競走馬）に幹細胞を投与することによって、当該症状を改善することが可能である。より具体的には、本症状改善方法によれば、たとえば競走馬の怪我等の症状の改善を行い、または怪我等の発生を予防することが可能である。
本症状改善方法の実施による非正常状態の改善のメカニズムは明らかでないが、注射により競走馬に投与された幹細胞含有液（またはこれに含まれる幹細胞）は、競走馬の炎症部分などの非正常な局部に到達し、当該局部を正常な状態に戻すための有意な作用を発揮するものと推測される。
【０１３１】
本実施形態において、非正常状態とは、正常な状態とは異なる症状を有する状態をいう。具体的には、一の競走馬において、疾病、怪我、またはレースもしくはトレーニング後の疲労などのない状態を正常状態とし、当該正常状態では確認されなかった不良な状態を非正常状態という。即ち、非正常状態は、レースやトレーニング後の疲労状態、および疾病等が観察される状態を含む。
【０１３２】
非正常状態である疲労状態は、例えば、正常状態と相対的に比較される乳酸値の上昇、体表面において観察される局所的な熱感、または正常状態と異なる歩様の観察などで、確認することができる。このような疲労を残したまま、レースに出走し、またはトレーニングすることによって、怪我等を誘引する虞がある。また、疲労状態にある競走馬において、怪我等の誘引を虞、充分に休養させることによって、レース間隔が長くなり、またトレーニング不足になる虞がある。
これに対し、疲労状態が確認された競走馬に、本症状改善方法を実施することによって、通常よりも早く疲労を回復させ、非正常状態を改善することが可能である。
【０１３３】
非正常状態である怪我等は、特に限定されず、競走馬において生じる種々の怪我または疾病を含む。たとえば、怪我等は、屈腱炎(tendonitis)等の運動系の疾患、骨折、歩様の非正常化（所謂、コズミまたはスクミといった症状を含む）、管骨骨膜炎（所謂、ソエの症状を含む）、腰麻痺（所謂、腰フラの症状を含む）、蹄疾患（趾間フレグモーネ）、眼科系の疾患、生殖機能疾患、神経系の疾患、皮膚病、毛艶不良、心肺系疾患、循環器系疾患、泌尿器系疾患、消火器系疾患、骨折、喘鳴症(Whistling; the throat ringing)などの呼吸器疾患、内分泌免疫疾患、鼻出血などを挙げることができるが、これに限定されない。
【０１３４】
尚、歩様の非正常化は、疲労状態にある競走馬、および、怪我等の状態にある競走馬のいずれにも発生し得るが、歩様の非正常化の原因を特定せずとも、本症状改善方法を実施することによって、歩様が正常化され得る。かかる理由は明らかではないが、静脈注射等の注射で幹細胞含有液を投与することで、当該幹細胞含有液（またはこれに含まれる幹細胞）を血流に乗せ種々の臓器を巡らせるとともに、炎症などが生じている局部に到達させ得るためであると推測される。
【０１３５】
たとえば本症状改善方法に関し、非正常状態を示す症状は、以下に示す第１から第７までのいずれか１以上の症状である。
即ち、第１の症状が、屈腱炎の症状である。第２の症状が、骨折である。第３の症状が、管骨骨膜炎である。第４の症状が、歩様の非正常化である。第５の症状が、腰麻痺の症状である。第６の症状が、乳酸値の上昇または体表面において観察される局所的な熱感である。第７の症状が、喘鳴症などの呼吸器疾患である。本症状改善方法を、これらの症状を有する競走馬に対し実施することで、当該症状を良好に改善し得る。
尚、本実施形態において症状とは、競走馬が怪我等を有する場合、または怪我等が発生し易い状態にある場合に認められる正常（健常）な状態からの変化を意味する。
以下に、第１の症状から第６の症状について、詳細に説明する。
【０１３６】
上述のとおり第１の症状は、屈腱炎の症状である。
屈腱炎とは、骨と筋肉を結ぶ腱組織のうち肢を屈曲させる筋肉（屈筋）に続く屈腱に生じた炎症である。屈腱炎は、競走馬の前足の管骨（第三中手骨）の後面にある浅屈腱に生じることが多いが、深屈腱に生じた炎症、および後足の浅屈腱または深屈腱に生じた炎症も本発明においていう屈腱炎に含む。屈腱炎の症状は、競走馬の外部観察による腱の付近の腫れ、熱感、触診時に競走馬が痛がるなどの臨床症状の有無で確認することもできるが、軽度な屈腱炎の症状も確認可能とするために超音波で診断することが望ましい。超音波診断は、競走馬の屈腱に超音波診断装置のプローブをあてて、腱の横断面のエコー像を観察することで行う。正常（健常）な屈腱は、白黒のエコー画像において白っぽく観察される。屈腱炎を発症している場合には、屈腱において炎症部が黒く観察されるため、その症状を容易に確認することができる。屈腱炎の損傷度合は、上記エコー画像に映し出される屈腱の横断面積に対する炎症部（即ち、黒く映し出された部分）の面積の比率で算出することができる。
上述した臨床症状の低減、または上記エコー画像における黒く映し出された部分の減少を確認することで、屈腱炎の症状が改善されたことを把握することができる。
【０１３７】
屈腱炎の発生した競走馬に対し、本症状改善方法を実施して注射で幹細胞含有液を投与することで、一般的な屈腱炎の治癒速度よりも有意に早く、屈腱炎の症状を改善することができる。
【０１３８】
上述のとおり第２の症状は、骨折である。
本実施形態において骨折とは、骨の構造の連続性が絶たれた状態を広く含み、たとえば剪断骨折、圧迫骨折、捻転骨折、屈曲骨折、剥離骨折などを含む。また管骨瘤(shin splints)にみられる骨折(fissure fracture)を含む。骨折は臨床症状などでも一応の診断をつけ得るが、エコー画像またはレントゲンで観察し診察することが一般的である。骨折した場合に、患部は炎症が生じることが一般的である。
【０１３９】
骨折した競走馬に対し、本症状改善方法を実施して注射で幹細胞含有液を投与することで、一般的な骨折の治癒速度よりも有意に早く、骨折の症状を改善することができる。
【０１４０】
上述のとおり第３の症状は、管骨骨膜炎である。管骨骨膜炎は、ソエとも呼ばれる。
管骨骨膜炎とは、管骨（第３中手骨）の前面に生じた炎症を指す。一般的には、骨が完全に化骨していない若い競走馬に過度なトレーニングを行わせることで、管骨骨膜炎が生じる。炎症症状があるため、投与された幹細胞含有液またはこれに含まれる幹細胞が、当該炎症症状の生じた局部に到達し、その症状を改善するよう作用し得る。
【０１４１】
上述のとおり、第４の症状は、歩様の非正常化である。歩様の非正常化は、多数の原因があると考えられており、所謂、コズミまたはスクミと呼ばれる症状を含む。
コズミとは、筋肉痛、筋肉疲労、または腱もしくは靭帯の痛みなどが原因で起こる競走馬の歩様の変化（非正常化）を意味する。かかる症状のある競走馬に対し、本改善方法を実施することで、当該競走馬のマッサージ等のメンテナンスや休養期間を抑制し得る。
スクミとは、一般的には麻痺性筋色素尿症と呼ばれ、休養明けの激しい運動などの直後に突然歩様が乱れるといった非正常状態を示す。スクミを起こした競走馬の筋肉組織を顕微鏡で観察すると、筋肉組織が溶けている場合がある。これに対し、スクミの症状を有する競走馬に対し本改善方法を実施することによって、幹細胞の作用により筋肉組織の再生を図ることが可能である。
【０１４２】
上述した第５の症状は、腰麻痺の症状であり、通常、腰フラとも呼ばれる。
上記腰麻痺とは、腰部の運動麻痺を主たる特徴とする疾病である。全く前兆がなく、突然に沈鬱状態となり、反射が衰えるなどの神経障害を発症し、その後に運動障害を発生する。数日以内に治癒する急性症を除き、慢性症または再発などの場合には、後肢の運動機能不全など重傷化することが多い。腰麻痺の発症した競走馬に対し、注射という簡易な手技で幹細胞含有液を投与し、腰麻痺の症状を改善し得る。
【０１４３】
上述した第６の症状は、乳酸値の上昇または体表面において観察される局所的な熱感である。
第６の症状に関し、観察とは、定量的な観察と定性的な観察とを含む。第６の症状は、既に怪我等が発生している競走馬、および怪我等の発生の虞のある競走馬のいずれにおいても観察される症状である。
即ち、既に屈腱炎または骨折などの怪我等が発生している競走馬は、炎症を起こしている局部の付近が熱を帯びる傾向があるため、競走馬の体表面の観察により容易に非正常状態であることを把握することができる。
また、怪我等が発生していない競走馬であっても、レースやトレーニングなどによる疲労が蓄積している場合には、正常な状態に比べて乳酸値が上昇し、また体表面において局所的に熱感を発する場合がある。このような症状を放置して、短い間隔でレースに出走し、またはトレーニングを行うと怪我等を誘引する虞がある。
【０１４４】
したがって、第６の症状を有する競走馬に対し、本症状改善方法を実施して、早い段階で、乳酸値を正常な値に近づけ、または局所的な熱感を解消することで、怪我等の重傷化を防止し、また怪我等を誘引することを防止することができる。
【０１４５】
上述した第７の症状は、喘鳴症などの呼吸器疾患である。呼吸器疾患とは、呼吸器に関連する種々の疾患を広く含み、その多くは、競走馬または競技馬の平常時の呼吸の状態、呼吸の音、または鼻孔、側胸、もしくは腹部などの動きの異常として観察可能である。上述した外部観察以外にも内視鏡を使用し患部を観察することでより詳しい症状を確認することができる。本発明において、喘鳴症は、喉から「ゼェゼェ」「ヒューヒュー」「ゴロゴロ」といった異常音を発する症例一般を広く含み、気管支炎などの炎症由来の症状および神経疾患由来の症状を含む。
全力で疾走し、または規定の競技を実施することを求められる競走馬または競技馬が呼吸器疾患を患うと、著しく競走能力または競技能力が損なわれる虞があり問題である。
【０１４６】
第７の症状を有する競走馬または競技馬に対し、本症状改善方法を実施することで、薬剤投与や外科手術を回避し、あるいは適度に抑制した上で、第７の症状を改善することが可能である。
【０１４７】
本症状改善方法において実施される幹細胞投与方法で投与される幹細胞の生細胞数は特に限定されない。たとえば、当該幹細胞投与方法における投与工程を１回、または複数日に分けて複数回実施することによって、生細胞数を合計１０００万個以上、競走馬に投与することが好ましく、合計２０００万個以上を投与することがより好ましく、合計５０００万個以上であることがさらに好ましく、合計８０００万個以上であることが特に好ましい。上述した範囲の生きた幹細胞を、上述した第１の症状から第６の症状を含む非正常状態の競走馬に投与することで、有意に、症状を改善することが可能である。
【０１４８】
幹細胞含有液に含まれる生きた幹細胞の数（生細胞数）を確実に確認するためには、第一実施形態において説明した生細胞数測定工程を実施することが好ましい。ただし生細胞数確認工程を実施せずとも、幹細胞含有液を調製する際に、投与を予定する生細胞数を充分に上回る生きた幹細胞を予め含有させておくことで、上述した範囲の生細胞数の合計個数を満たす投与工程を実施することが可能である。
【０１４９】
上述した各実施態様は、競走馬を例に説明したが、いずれも競技馬の実施態様として参照することができる。
競走馬および競技馬は、競馬の試合または各種の大会に出場するにあたり厳密なドーピング検査を受ける必要があり、治療等において規制物質を除く限定的な薬剤等の使用が余儀なくされている。これに対し、規制物質として定義されていない幹細胞を用いて競走馬または競技馬の症状の改善を行う本発明は、投与のタイミングを気にせずに競走馬または競技馬の症状を改善し、または体調を良好に維持するために非常に有効である。また幹細胞が、将来的に規制物質として定義された場合であっても、本発明は、幹細胞の投与のタイミングを計ることで充分に競走馬または競技馬の症状改善を図ることが可能である。
【実施例】
【０１５０】
以下に、本発明の実施例を示す。
まず、実施例の実施のために、ドナー競走馬から幹細胞を採取し、当該幹細胞を継代培養して継代幹細胞を入手した。上記継代幹細胞を、凍結保存した後に解凍し、次いで、生細胞数決定工程、幹細胞含有剤調製工程、および輸送工程を実施して競走馬に投与した。競走馬への投与は、解凍工程後生細胞数が確認された所定の時から投与までの推奨時間を４８時間、一回の投与における生きた幹細胞の希望投与数である希望生細胞数を約１×１０７個とした。また４℃の環境に幹細胞を保存した時の当該幹細胞の生存率を予め確認したところ、保存前の生細胞数に対する保存後の生細胞数の割合である生存率は、約７０％であった。【０１５１】
（幹細胞の採取）
馬の臀部を切開し脂肪細胞を約５ｇ採取し幹細胞採取用の試料とした。上記試料を、１ｍｍ角程度に裁断した後、コラゲナーゼ溶液を用いて３７℃で１時間処理し、次いで、処理後の当該試料を約１０分間、４００×ｇの遠心力で遠心分離し、１００μｍのメッシュを備えたセルストレイナーで未消化の脂肪組織片を除去した後、脂肪由来の間葉系幹細胞を含む間質血管画分（Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ）を得た。【０１５２】
（幹細胞の継代培養）
市販の動物細胞用の無血清培地に抗生物質（ゲンタシン）を添加して調製した培地が収容されたフラスコを準備した。上記フラスコに上述で得た分画物を播種し、３７℃／５％ＣＯ２条件下で液体静置培養を行った。２日置きに培地の上澄みを全量収集してフレッシュな培地に交換し、位相差顕微鏡にてフラスコの底面の面積１００％に対し、約８０％以上９０％以下の範囲に細胞が付着したことが確認された段階で培養を終了し、プロテアーゼを含む剥離剤をフラスコに添加してフラスコの内側壁面（特に内側底面）に付着した細胞を回収した。回収された細胞の生細胞数を血球測定盤を用いて測定し、適当な細胞数となるまで上述と同様の方法で継代培養を繰り返した。ジメチルスルホキシドを含有する無血清細胞凍結保存液に上記細胞を混合し、凍結用試料を得た。【０１５３】
（幹細胞の凍結保存）
上述のとおり得た凍結用試料１ｍｌ（幹細胞を約２×１０７個含む）を凍結保存容器に収容し、−８０℃に調整されたディープフリーザにて凍結保存した。【０１５４】
（凍結保存された幹細胞の解凍）
凍結保存工程終了後、凍結保存容器をディープフリーザから取出し、３７℃に調整されたウォーターバスにて凍結用試料を解凍し、幹細胞を含む解凍済試料を得た。【０１５５】
（生細胞数の測定および生細胞絶対数の算出）
上述のとおり解凍されて得た幹細胞（解凍済みサンプル）を、リンゲル液で洗浄した。洗浄後の幹細胞の一部にトリパンブルーを添加して、死滅した幹細胞を染色した上、生細胞数を測定したところ、解凍済サンプル１ｍｌには、約１．５×１０７個以上の生きた幹細胞が含まれていることが確認された。上述のとおり生細胞数の測定を行った時点を所定の時とした。
本実施例では、上記所定の時から被投与競走馬に投与されるまでの推奨される推奨時間が４８時間、希望生細胞数が１×１０７個、および事前に確認した４８時間における幹細胞の生存率が７０％である。これらの条件から、輸送工程を経て、被投与競走馬に対し希望生細胞数を投与可能とするために注射用容器１０に含まれるべき生細胞絶対数Ｚを、以下の計算式（１）により求めた。その結果、生細胞絶対数Ｚは、約１４２９万個であった。
[数２]
生細胞絶対数Ｚ（万個）＝１０００（万個）÷７０（％）×１００  （２）【０１５６】
尚、本実施例の前に、予め、上述した幹細胞の培養、凍結保存工程、解凍工程、生細胞数決定工程を実施して、凍結保存生細胞数確認試験を行い、当該解凍工程後において、約５％以上２０％以下の幹細胞が死滅していたことを確認した。本実施例における凍結保存工程に供与した幹細胞の生細胞数に対する解凍工程後に測定した生細胞数は、この凍結保存生細胞数確認試験で把握した生細胞数と同程度であった。【０１５７】
（注射用幹細胞含有液の調製）
上述にて生細胞数の測定された解凍済みサンプルを用い、生きた幹細胞約１．５×１０７個を含む解凍済サンプル１ｍｌに対し、リンゲル液を１．５ｍｌ添加して混合した。これにより、生細胞絶対数Ｚ（約１４２９万個）を満たす生きた幹細胞を含む注射用幹細胞含有液（幹細胞含有液）を得た。即ち、生きた幹細胞約１×１０７×１．５個を含む解凍済サンプル１ｍｌに対し、リンゲル液を１．５ｍｌ添加して混合し、幹細胞含有剤を調製した。【０１５８】
（注射用容器および幹細胞注射セットの作成）
上述のとおり調製された注射用幹細胞含有液（幹細胞含有液）を、図４で示した注射用容器１０と同様の構成でありドナー競走馬の馬名情報を含むラベルが貼られた注射用容器に収容するとともに針結合部をキャップで封止した。また容器本体に対するピストンの相対的な位置を固定するためにストッパを当該ピストンに対し装着して注射用容器を作成した。幹細胞含有液が収容された上記注射用容器を密封容器に収容した。また、上記注射用容器に収容された幹細胞含有液と同一の液である生細胞数確認用サンプルを上記注射用容器とは異なる第二容器に収容し、当該第二容器を密封容器に収容した。
ドナー競走馬の馬名情報、および上記所定の時から被投与競走馬に投与されるまでの推奨される時間の情報（投与時間情報）が記載されたマニュアルを作成した。そして上述のとおり作成された注射用容器、第二容器、およびマニュアルを１つの保冷バックに梱包し、幹細胞注射セットを得た。【０１５９】
（幹細胞含有液の調製）
上述のとおり解凍されて得た幹細胞（解凍済試料）を、リンゲル液で洗浄した。洗浄後の幹細胞の一部にトリパンブルーを添加して、死滅した幹細胞を染色した上、生細胞数を測定したところ、解凍済試料１ｍｌに、幹細胞が約１．４×１０７個が含まれていることを確認した。次いで、幹細胞を約１．４×１０７個を含む解凍済試料１ｍｌに対し、リンゲル液を１．５ｍｌ添加して混合し、これを幹細胞含有液とした。【０１６０】
上述のとおり調製された幹細胞含有液を、速やかに注射針が連結されていない注射筒に収容し、収容された幹細胞含有液が漏出しないよう、当該注射筒を封止して注射用容器を得た。【０１６１】
上述のとおり得た幹細胞含有液を収容した幹細胞注射セットを、ヤマト運輸のクール便（温度管理条件：０℃〜１０℃）で投与施設に対し出荷した。出荷後、約２４時間後に、投与施設に幹細胞注射セットが到着した。投与工程の実施は、幹細胞含有液が調製されたときから約４８時間と設定し、投与までの間、約４℃の温度環境で、幹細胞含有液を収容した幹細胞注射セットを保管した。投与まで幹細胞注射セットに含まれる注射用容器および第二容器を冷蔵保存した。マニュアルに記載された投与時間情報の範囲内において、確認用サンプルを用いて生細胞数を測定し、希望生細胞数１×１０７個以上の生きた幹細胞が存在することを確認した。確認後、速やかに注射用容器を用いて、幹細胞含有液を被投与競走馬に投与した。投与は、被投与競走馬の首にまず留置針を留置し、当該留置針に注射用容器を連結して注射し、幹細胞含有液を被投与競走馬に注入する方法で実施した。【０１６２】
（実施例１）
獣医により屈腱炎の症状が確認された競走馬（馬名：ネオヴィータローザ、３歳、牡）を被投与競走馬１とした。
具体的には、被投与競走馬１は、図５に示すとおり、エコー画像において、腱全体の横断面Ａ１の中心側部分に、黒い画像（低エコー像）として写し出される損傷部Ａ２が存在することが確認された。また屈腱炎が発生している付近の外部観察から、熱感があることが確認された。これによって、被投与競走馬１は、屈腱炎の症状を有していると診断された。また、図５に示すエコー画像から、横断面Ａ１の面積が１．７０ｃｍ２であり、損傷部Ａ２の面積が０．８７ｃｍ２であり、横断面Ａ１の面積に対する損傷部Ａ２の面積の割合から、損傷率は５１％であることが確認された。【０１６３】
屈腱炎と診断された被投与競走馬１の首部に予め、静脈内注射用の留置針を留置した。注射針は、１８ゲージ（内径０．９４μｍ）の寸法のものを用いた。そして、上述のとおり輸送され保管された注射筒を上記注射針に連結し、収容された幹細胞含有液を静脈内注射により被投与競走馬に投与した。尚、投与時の幹細胞含有液に含有される幹細胞の生細胞数は、約１０００万個であることを予め把握した。
同様の投与方法で、数日の間隔を空けて、３回投与した。投与の間隔は表１に示す。【０１６４】
３回目の投与工程を実施した日の８日後に、被投与競走馬１の屈腱炎の症状のあった箇所のエコー画像を撮影した。そのときのエコー画像を図６として示す。図６から明らかなとおり、幹細胞の投与工程を実施する前に確認された損傷部Ａ２（図５参照）が投与後のエコー写真ではほとんど観察されなかった。また投与前に観察された熱感も消失していた。これにより被投与競走馬１の屈腱炎の症状が改善されたことが確認された。
また一般的に、屈腱炎のエコー観察を行った場合、発症から１か月程度で、損傷部を示す低エコー像の面積が小さくなり、３、４か月程度で、当該低エコー像がエコー画像で観察されなくなることが知られる。これに対し、実施例１では、発症が確認された日から３回の幹細胞投与を経て２１日後に損傷部Ａ２がエコー写真においてほとんど消失したことから、屈腱炎の症状の改善における幹細胞の投与の効果が有意に発揮されたことが示された。【０１６５】
（実施例２）
獣医により軽度の屈腱炎の症状が確認された競走馬（馬名：ネオヴァンキッシュ、５歳、牡）を被投与競走馬２として実施例２を行った。尚、被投与競走馬２は、エコー画像により屈腱炎の損傷率が約５％であると診断された。
具体的には、表１に示す投与回数および投与間隔に変更したこと以外は、実施例１に用いたものと同様の幹細胞含有液を用い、実施例１と同様の方法で投与工程を実施した。【０１６６】
被投与競走馬２に対し４回目の投与工程を実施した日から２日後に、被投与競走馬２の屈腱炎の症状のあった箇所のエコー画像を撮影した。その結果、損傷部を示す黒い画像（低エコー像）が消失していた。これにより、被投与競走馬２の屈腱炎が、幹細胞含有液の投与により改善されたことが確認された。【０１６７】
被投与競走馬２に対して、全９回、各回に約１０００万個で合計約９０００万個の幹細胞の生細胞を投与したところ屈腱炎が治癒し、治療開始から約８カ月後にあたる２０１５年７月１５日に名古屋競馬場で行われたレースに出走し、そして勝利した。更にその約１カ月後にあたる２０１５年８月２６日にも名古屋競馬場で行われたレースに出走し、復帰後２勝目を挙げた。そして、２０１５年１２月１０日にも名古屋競馬場で行われたレースに出走し、復帰後３勝目を挙げた。このように本発明の幹細胞投与方法によれば、極めて短期間のうちに屈腱炎が治癒し、また極めて低侵襲の施術であるため術後の回復も早いため、現役の競走馬としての活動を継続することが可能である。そして、屈腱炎の治癒の度合いも、単に走ることが可能になる程度ではなく、競馬レースに出走し、そして勝利することができる程度に十分に治癒することが確認された。【０１６８】
（実施例３）
管骨に熱および痛みを伴う骨瘤を有し、レントゲン写真において当該骨瘤付近に骨折線が観察された競走馬（馬名：ネオヴァルカス、２歳、牡）を被投与競走馬３として実施例３を行った。被投与競走馬３の管骨の骨瘤付近における骨折の状態を示すレントゲン写真を図７に示す。獣医の診断により、図７において、管骨の中間部に骨瘤（モヤモヤ影の部分）が映し出されており、この骨瘤付近に骨折線が確認された。かかる被投与競走馬３に対し、実施例１に用いたものと同様の幹細胞含有液を用い、１回の投与量を２倍（２０００万個）にしたこと以外は、実施例１と同様の方法で投与工程を実施した。【０１６９】
被投与競走馬３に対し投与工程を実施した日から１１日後に、被投与競走馬３の骨折の確認された箇所を含む管骨のレントゲンを撮影した。このレントゲン写真を図８に示す。その結果、獣医の診断により、投与前に存在していた骨折線が消失していることが観察され、骨折症状の改善が確認された。また、幹細胞を投与した翌日に被投与競走馬３の患部を観察したところ、骨瘤が残っているものの、熱および痛みが改善されたことが観察された。
実施例３では、一度の幹細胞投与により短期間で、管骨の骨瘤における熱、痛み、および骨折の症状が改善され、幹細胞投与の効果がこれらの症状の改善に有意に作用したことが確認された。
尚、図７および図８は、レントゲン写真を白黒反転させたものである。【０１７０】
（実施例４）
喘鳴音が確認された競走馬（馬名：ネオヴァシュラン、３歳、牝）を被投与競走馬４として実施例４を行った。１回目の投与工程（６月３日）の２日前（６月１日）に、被投与競走馬４に対し咽頭部の内視鏡検査を行った。内視鏡検査により撮影された動画を確認したところ、上部気道にある正面視にて左右一対の披裂軟骨の動作が左右同調せず、一方側の披裂軟骨の完全な外転が維持されておらず、非正常状態であることが観察された。上記内視鏡検査から、被投与競走馬４の喘鳴音は、披裂軟骨の動作不良（喉頭片麻痺）によるものであり、かかる喘鳴音が神経疾患に由来するものであると診断された。
そこで、被投与競走馬４に対し、実施例１に用いたものと同様の幹細胞含有液を用い、１回の投与量を５倍（５０００万個）にし、投与回数と投与間隔を表１に示す内容に変更したこと以外は、実施例１と同様の方法で投与工程を実施した。尚、被投与競走馬４は、２回の投与工程期間を含む約１か月間、休養、運動制限、および他の治療を受けることなく通常通りの調教（トレーニング）を受けた。【０１７１】
被投与競走馬４に対し、２回目の投与工程（６月９日）を実施した日から約３週間後（７月１日）に、再度、咽頭部の内視鏡検査を行った。上記内視鏡検査により撮影された動画を確認したところ、投与前に動作不良が確認された披裂軟骨の動作が改善され、また被投与競走馬４の喘鳴音が小さくなったことが確認された。これにより、被投与競走馬４は、喘鳴症が改善したという診断を受けた。
実施例４の結果から、本発明が喘鳴症に対しても効果を発揮し得ることが確認された。本発明によれば、特に神経疾患由来の喘鳴症に対し、外科的手術を受けることなく症状を改善し得ることが確認された。
ところで馬において、咽頭部の各器官を動かす神経は、脳を出発して心臓に連続する大動脈を経由し咽頭部に至るため、その長さは２．５ｍ以上の長さであると言われている。そのような末端神経の疾患に対し症状の改善が確認された実施例４から、本発明が喘鳴症を超えて、他の神経疾患の改善にも良好に作用すること示唆された。【０１７２】
【表１】
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【０１７３】
上記４頭に加え更に１３頭の被投与競走馬に対して、同様に幹細胞含有液を静脈内注射により投与した。これら１３頭の症例としては、蹄骨骨折(Hoof bone fracture)、腰麻痺(cervical stenotic myelopathy)、腎不全(chronic renal failure)、捻挫(sprain)、疝痛(colic)、体調不良による著しい体重減少と毛艶劣化、繁殖受胎と母体の向上、重度の蹄葉炎(Chronic laminitis)、蟻洞(hollow wall)、重度のフレグモーネ(phlegmon)、歩行困難状態、胎盤炎(Placentitis)、胎盤炎による流産(Abortion by Placentitis)など多様であった。【０１７４】
被投与競走馬１から４を含む合計１７頭の被投与競走馬に対し、１回あたり平均２６４５万個、３１回の投与で合計の８億２０００万個の生細胞を投与したところ、上記の多様な症例の改善が見られた一方、異常の発生は一度も見られなかった。以上の実施例から、本発明の幹細胞含有液の投与の効果および安全性が確認された。【０１７５】
上記実施形態および実施例は、以下の技術思想を包含するものである。
（ａ１）動物から採取された幹細胞または前記幹細胞を継代培養して得られた継代幹細胞を含有する幹細胞含有液を、注射針で競走馬または競技馬に注入する投与工程を含むことを特徴とする幹細胞投与方法。
（ａ２）前記投与工程において、前記注射針で前記競走馬または前記競技馬に前記幹細胞含有液を注入する手段が静脈内注射である上記（ａ１）に記載の幹細胞投与方法。
（ａ３）前記注射針が、内径０．６ｍｍ以上である上記（ａ１）または（ａ２）に記載の幹細胞投与方法。
（ａ４）前記幹細胞含有液に含有される前記幹細胞の生細胞数を確認する生細胞数確認工程を含む上記（ａ１）から（ａ３）のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
（ａ５）前記幹細胞含有液が、前記注射針に連結された注射用容器に収容されており、
前記投与工程の途中または前記投与工程の終了後に、前記注射用容器に前記競走馬に注入可能な洗浄液を充填し、前記注射用容器の内壁に付着した前記幹細胞を前記洗浄液で洗浄するとともに前記競走馬に注入する洗浄工程を含む上記（ａ１）から（ａ４）のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
（ａ６）前記投与工程を、前記幹細胞含有液が調製されたときから７２時間未満に実施する上記（ａ１）から（ａ５）のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
（ａ７）前記幹細胞が、間葉系幹細胞を含む上記（ａ１）から（ａ６）のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
（ａ８）前記動物がウマ科の動物である上記（ａ１）から（ａ７）のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法。
（ａ９）前記ウマ科の動物が競走馬または競技馬である上記（ａ８）に記載の幹細胞投与方法。
（ａ１０）前記幹細胞を採取される競走馬であるドナー競走馬と前記幹細胞を投与される被投与競走馬とが同一血統または兄弟であるか、または前記幹細胞を採取される競技馬であるドナー競技馬と前記幹細胞を投与される被投与競技馬とが同一血統または兄弟である上記（ａ９）に記載の幹細胞投与方法。
（ａ１１）前記幹細胞が、前記競走馬または前記競技馬から採取された脂肪から採取された間葉系幹細胞である上記（ａ９）または（ａ１０）に記載の幹細胞投与方法。
（ａ１２）上記（ａ１）から（ａ１１）のいずれか一項に記載の幹細胞投与方法を用い、非正常状態を示す競走馬に幹細胞を含有する幹細胞含有液を投与することを特徴とする競走馬または競技馬の症状改善方法。
（ａ１３）前記非正常状態を示す症状が、以下に示す第１から第７までのいずれか１以上の症状である上記（ａ１２）に記載の競走馬の症状改善方法、
第１の症状が、屈腱炎の症状である、
第２の症状が、骨折である、
第３の症状が、管骨骨膜炎、
第４の症状が、歩様の非正常化である、
第５の症状が、腰麻痺の症状である、
第６の症状が、乳酸値の上昇または体表面において観察される局所的な熱感である、
第７の症状が、呼吸器疾患である。
（ａ１４）前記幹細胞投与方法における投与工程を１回、または複数日に分けて複数回実施することによって、生細胞数を合計１０００万個以上、前記競走馬または前記競技馬に投与する上記（ａ１２）または（ａ１３）に記載の症状改善方法。【０１７６】
上記実施形態および実施例は、更に以下の技術思想を包含する。
（ｂ１）競走馬または競技馬に投与される幹細胞含有剤の提供方法であって、
動物から採取された幹細胞を凍結する凍結保存工程、
前記凍結保存工程において凍結された前記幹細胞を解凍する解凍工程、
前記解凍工程後の前記幹細胞の解凍工程後生細胞数が確認される所定の時から前記幹細胞が前記競走馬または前記競技馬に投与されるまでの推奨される推奨時間経過時における生存率と、前記競走馬または前記競技馬へ前記幹細胞を投与する際の希望生細胞数と、を用いて生細胞絶対数を決定する生細胞数決定工程、
前記解凍工程後の前記幹細胞を用い、前記生細胞絶対数を満たす前記幹細胞を含む幹細胞含有剤を調製する幹細胞含有剤調製工程、および、
投与が実施される実施エリアに前記幹細胞含有剤を輸送する輸送工程、
を含む幹細胞含有剤の提供方法。
（ｂ２）前記輸送工程は、前記幹細胞含有剤が収容された第一容器と共に、前記第一容器とは異なる第二容器を輸送することを含み、
前記第二容器は、前記幹細胞含有剤と同一の組成である生細胞数確認用サンプルが収容されている上記（ｂ１）に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（ｂ３）前記動物が、ウマ科の動物である上記（ｂ１）または（ｂ２）に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（ｂ４）前記ウマ科の動物が、ドナー競走馬であるか、またはドナー競技馬である上記（ｂ３）に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（ｂ５）前記凍結保存工程は、凍結保存される前記幹細胞のドナーとなった前記ドナー競走馬または前記ドナー競技馬の馬名が確認可能な状態で当該幹細胞を保存する上記（ｂ４）に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（ｂ６）凍結保存された前記幹細胞のドナーとなったドナー競走馬と、前記幹細胞含有剤の投与が予定される前記競走馬と、の血統または兄弟関係を照合し、または、
凍結保存された前記幹細胞のドナーとなったドナー競技馬と、前記幹細胞含有剤の投与が予定される前記競技馬と、の血統または兄弟関係を照合し、
同一血統、または兄弟である前記ドナー競走馬または前記ドナー競技馬の前記幹細胞を前記解凍工程に供与する幹細胞として決定する血統照合工程を前記解凍工程前に含む上記（ｂ４）または（ｂ５）に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（ｂ７）前記生細胞数決定工程は、前記解凍工程によって解凍された前記幹細胞の生細胞数を測定し、前記所定の時の前記生細胞数を決定する解凍工程後生細胞数測定工程をさらに含む上記（ｂ１）から（ｂ６）のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（ｂ８）前記輸送工程が、０℃を超えて１０℃以下の温度環境を維持した状態で実施される上記（ｂ１）から（ｂ７）のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（ｂ９）前記所定の時から、７２時間未満に前記幹細胞含有剤を前記競走馬または前記競技馬に投与可能に前記輸送工程を完了する上記（ｂ１）から（ｂ８）のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（ｂ１０）前記幹細胞が、予め幹細胞投与を受けた前記動物から採取された幹細胞である上記（ｂ１）から（ｂ９）のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（ｂ１１）前記幹細胞含有剤の提供方法は、
前記解凍工程において解凍された前記幹細胞自体を前記生細胞数決定工程に供する第一態様、または
前記解凍工程において解凍された前記幹細胞を継代培養し、前記継代培養の実施により得られた幹細胞である継代培養幹細胞を前記生細胞数決定工程に供する第二態様を含む上記（ｂ１）から（ｂ９）のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法。
（ｂ１２）上記（ｂ１）から（ｂ１１）のいずれか一項に記載の幹細胞含有剤の提供方法によって提供される幹細胞含有剤を含み、
前記幹細胞含有剤は、前記幹細胞含有剤の提供方法における解凍工程後の所定の時から、前記幹細胞が前記競走馬または前記競技馬に投与されるまでの時間の情報が付されていることを特徴とする幹細胞提供セット。
（ｂ１３）前記幹細胞含有剤が含有された第一容器と、前記第一容器とは異なる第二容器と、を含み、
前記第二容器は、前記幹細胞含有剤と同一の組成である生細胞数確認用サンプルが収容された上記（ｂ１２）に記載の幹細胞提供セット。
（ｂ１４）前記第一容器が、前記幹細胞含有剤を前記競走馬または前記競技馬に投与するために用いられる注射針に、直接または間接に連結される注射用容器である上記（ｂ１３）に記載の幹細胞提供セット。
（ｂ１５）前記幹細胞含有剤が採取された動物がドナー競走馬またはドナー競技馬であり、
前記ドナー競走馬または前記ドナー競技馬の馬名情報が含まれている上記（ｂ１２）から（ｂ１４）のいずれか一項に記載の幹細胞提供セット。
（ｂ１６）前記幹細胞含有剤を注射投与する前に投与される鎮痛剤を含む上記（ｂ１２）から（ｂ１５）のいずれか一項に記載の幹細胞提供セット。【０１７７】
上記実施形態および実施例は、更に以下の技術思想を包含する。
（ｃ１）幹細胞含有液を収容可能な容器本体を有し注射針に連結可能な注射用容器であって、
密封容器に収容されており、
前記容器本体に幹細胞を含有する幹細胞含有液が収容されており、
前記幹細胞含有液が前記注射用容器から漏出することを防止する封止部を備えることを特徴とする注射用容器。
（ｃ２）前記注射針に直接または間接に連結可能であるとともに前記容器本体から前記注射針に対し前記幹細胞含有液を流通可能とする針結合部を有し、
前記封止部により、前記注射針と連結する前の状態である前記針結合部が封止されている上記（ｃ１）に記載の注射用容器。
（ｃ３）前記幹細胞が、ウマ科の動物の幹細胞である上記（ｃ１）または（ｃ２）に記載の注射用容器。
（ｃ４）前記ウマ科の動物が、競走馬または競技馬である上記（ｃ３）に記載の注射用容器。
（ｃ５）前記注射用容器の付帯要素として、前記競走馬または前記競技馬の馬名を確認可能な馬名情報を備える上記（ｃ４）に記載の注射用容器。
（ｃ６）前記幹細胞含有液に含まれる前記幹細胞の生細胞数が８００万個以上であり、前記幹細胞の総細胞数に対する前記生細胞数の割合が６０％以上である上記（ｃ１）から（ｃ５）のいずれか一項に記載の注射用容器。
（ｃ７）前記幹細胞含有液が、サイトカインを含有する上記（ｃ１）から（ｃ６）のいずれか一項に記載の注射用容器。
（ｃ８）前記サイトカインとしてＣＸＣＬ１２またはその誘導体を含むとともに、前記ＣＸＣＬ１２の受容体であるＣＸＣＲ４またはその誘導体を含む上記（ｃ７）に記載の注射用容器。
（ｃ９）上記（ｃ１）から（ｃ８）のいずれか一項に記載の注射用容器と、前記注射用容器に収容された幹細胞含有液と同一の組成である生細胞数確認用サンプルが収容されている容器と、を備える幹細胞注射セット。
（ｃ１０）競走馬または競技馬から採取された幹細胞を含有する注射用幹細胞含有液。
（ｃ１１）前記幹細胞が、前記競走馬または前記競技馬の臍帯、臍帯血または胎盤由来の臍帯幹細胞である上記（ｃ１０）に記載の注射用幹細胞含有液。【０１７８】
この出願は、２０１５年６月１７日に日本国に出願された特願２０１５−１２２３７５号、特願２０１５−１２２３７６号および特願２０１５−１２２３７７号、ならびに２０１５年７月２２日に日本国に出願された特願２０１５−１４４５５９号、特願２０１５−１４４５６０号および特願２０１５−１４４５６１を基礎とする優先権を主張し、その開示の総てをここに取り込む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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