(57)【要約】  薬剤を体内の任意の場所に局所的に除放性させることが可能であり、かつ生体吸収性があり、薬剤除放後、生体内に吸収分解される、剤形素材を提供することにある。  生体分解性樹脂と薬剤とを溶剤で溶解して、紡糸溶液を作成、紡糸溶液からエレクトロスピニングで紡糸することにより、上記課題を解決する、極めて徐放効果の高い剤形素材の開発に成功した。
2016159240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤及び生分解性樹脂を含有する平均外径が１μｍ以上１５０μｍ以下である繊維状物質から構成される、綿状又不織布状構造を有する生体吸収性綿状素材。
【請求項２】
前記繊維状物質の平均分子量が５万以上１００万未満である、請求項１に記載の生体吸収性綿状素材。
【請求項３】
かさ密度が０．０１ｇ／ｃｍ３〜０．１ｇ／ｃｍ３である、請求項１に記載の生体吸収性綿状素材。
【請求項４】
前記生分解性樹脂がＰＬＧＡまたはその共重合体であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の生体吸収性綿状素材。
【請求項５】
薬剤が抗がん剤である、請求項１から４のいずれか一項に記載の生体吸収性綿状素材。
【請求項６】
滅菌処理されている請求項１から５のいずれか一項に記載の生体吸収性綿状素材。
【請求項７】
１）生分解性樹脂と薬剤を溶剤に溶解して、紡糸溶液を作成し、
２）前記紡糸溶液からエレクトロスピニングで紡糸することにより生成することを特徴とする生体吸収性綿状素材の製造方法。
【請求項８】
ステップ２）において、紡糸溶液吐出側のノズル部分と、コレクター側のエタノール槽内に設置したプレート間に印加して、エレクトロスピニングで紡糸して、エタノール槽内に生体吸収性綿状素材を堆積させることにより、綿状の三次元立体構造を有する生体吸収性綿状素材を生成する、請求項７に記載の生体吸収性綿状素材の製造方法。
【請求項９】
ステップ３）として滅菌処理工程を含む、請求項７又は８に記載の生体吸収性綿状素材の製造方法。
【請求項１０】
前記生分解性樹脂はＰＬＧＡまたはその共重合体であり、前記溶剤はクロロホルムもしくはジクロロメタンである、請求項７から９のいずれか一項に記載の生体吸収性綿状素材の製造方法。
【請求項１１】
薬剤が抗がん剤である、請求項７から１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
１）患者の体内に請求項６に記載の生体吸収性綿状素材を埋設し、
２）生体吸収性綿状素材から薬剤を徐放させ、その結果、
３）徐放させた薬剤の効能によって、患者の疾患を治療又は予防する方法。
【請求項１３】
開腹手術で請求項６に記載の生体吸収性綿状素材を埋設することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
インジェクターを用いた低侵襲医療手技で請求項６に記載の生体吸収性綿状素材を埋設することを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
薬剤が抗がん剤であり、疾患ががんである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
患者が、がん組織又はがん細胞を切除後である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
がんが、悪性骨腫瘍である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１２又は１３に記載の方法に用いるための、請求項６に記載の生体吸収性綿状素材を含む、キット。
【請求項１９】
請求項１４に記載の方法に用いるための、インジェクター及び請求項６に記載の生体吸収性綿状素材を含む、キット。
【請求項２０】
請求項６に記載の生体吸収性綿状素材がインジェクターに内包されている、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１５年３月３１日に出願された米国仮出願６２／１４０７２２号明細書に対する優先権を主張し、前記米国仮出願は、全体を参照により本明細書に組み込む。【０００２】
本発明は、粉末状の薬剤（骨形成用無機粒子、抗がん剤、抗生物質等）を含んだ熱可塑性の生分解性樹脂（ポリ乳酸、ＰＬＧＡ等）をエレクトロスピニング用紡糸溶液として調製するための方法に関する。
本発明は、さらに、上記で調整されたエレクトロスピニング用紡糸溶液を用いてエレクトロスピニングで生分解性繊維を製造するための方法に関する。
本発明は、さらに、上記で調整された生分解性繊維を不織布又は綿として効率的に回収するための方法に関する。
本発明は、該製造方法により製造された生体吸収性綿状素材を含む、体内局所埋設型徐放出剤；ならびにその使用法（治療方法）に関する。
本発明に係る、薬剤を含有する生体吸収性綿状素材は局所性徐放性にすぐれ、かつ、薬効成分放出後、すみやかに体内に吸収分解されるので、経口投与剤以外の、持効性注射剤（デポ剤）や体内埋設型の剤形として極めて有効である。
【背景技術】
【０００３】
薬物の投与経路のうち、経口投与は約６０％を占めており、最も汎用されている投与経路である。しかしながら、最近では経口投与で十分な吸収性や安定性が期待できない高分子性医薬品であるペプチド・タンパク性医薬品が増加してきており、また将来的にはさらに分子量の大きな遺伝子・核酸性医薬品の臨床への応用が期待されている。さらに、経口投与の場合、小腸での吸収から全身の血流に乗るので、局所性や除放性を必要とする薬剤には不向きである。【０００４】
経口投与以外の投与経路としては、経鼻、経肺、点眼、直腸、経皮、注射などの様々な投与経路が存在する。注射剤は経口投与剤に次いで用いられている。しかしながら、注射剤でも、点滴静脈注射などの場合、経口投与と同様局所性持続性の効果が期待できない場合が多い。さらに注射剤は吸収が早い代わりに注射後の薬効の持続性に問題がある場合も多い。
一方、持効性注射剤（デポ剤）の開発も行われている。1回の注射で薬効が数日ないし数か月持続するようにつくられた注射剤で、ホルモン剤が多く、油性注射剤か懸濁性注射剤の形で適用されている。また継続的な経口投与に問題が生じやすい抗精神病薬などにも応用されている。これらは経皮注射又は筋肉注射され、注射後も持続的な効果が期待できるものの、標的とする部位（組織）のみに局所的に薬剤を効かせることは困難であった。【０００５】
生理活性物質の効果を長期間持続させる剤型として、生体内分解性ポリマーを用いたマイクロスフェア（多核マイクロカプセル）の研究もなされている（特開平6-211648号）。マイクロスフィアは通常、粒子径が数μm程度の球状の製剤をマイクロスフェアといい、１μm以下のものはナノスフェアと呼ばれることがある。局所での薬物の持続的放出性や局所性は満たされるものの、注射剤での投与（皮下注射など）を前提としているため、液体であり、薬剤としての安定性（拡散してしまう）に問題があり研究開発は現在も進行中である。【０００６】
薬剤としての拡散を抑え、安定性を保つため、担体に疎水性高分子（生体内非分解性高分子であるシリコーン）を用いた剤形の研究もなされている（特開2001-199879号）。しかしながら薬剤の拡散は抑えられるものの、体内に担体が残置されてしまうという問題が生じ、皮下など比較的取り出しやすい場所に適用するのには問題ないが、体内の任意の場所に埋め込むことはリスクが生じる。【０００７】
一方、骨再生材料の分野では、ポリ乳酸等の生分解性樹脂からなる繊維に骨形成因子を含有させて作成した材料を骨欠損部に埋め込む方法が実施されている（米国公開2011-000952号）。生分解性繊維は体内に埋め込まれた後、体液に接して加水分解して、含まれた薬剤を徐放すると共に、時間の経過とともに体内に吸収されて消失するため、効果的な骨形成が得られると共に、患者の負担が少なくて済む。【０００８】
上記で生分解性樹脂から繊維を作製する方法として、エレクトロスピニングが用いられている。エレクトロスピニング法では、紡糸溶液を電場で生じる静電引力により紡糸溶液をノズルから繊維として出射するので、そのように紡糸可能な溶液を調製することが必要である。
骨再生材料の分野ではこれまで、エレクトロスピニングの紡糸溶液は、生分解性樹脂を溶剤を用いて溶かして紡糸溶液を製造していた。  
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平6-211648号
【特許文献２】特開2001-199879号
【特許文献３】米国特許6689374号
【特許文献４】米国公開2011-0009522号
【特許文献５】国際公開2015/005205号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Walsh et al.β-TCP bone graft substitutes in a bilateral rabbit tibial defect model. Biomaterials 29 (2008) 266-271)
【非特許文献２】Obata et al. Electrospun microfiber meshes of silicon-doped vaterite/poly(lactic acid) hybrid for guided bone regeneration. Acta Biometatialla 6 (2010) 1248-1257
【非特許文献３】Fujiwara et al. Guided bone regeneration membrane made of polycaprolactone/calcium carbonate composite nano-fibers. Biomaterials 26 (2005) 4139-4147)
【非特許文献４】Hench LL. Polak JM: Third-generation biomedical materials. Science 2002, 295: 1014-1017)
【非特許文献５】Weiss  et al. Targeted expression of MYCN causes neuroblastomain transgenic mice.The EMBO Journal Vol.16 No.11 pp.2985-2995, 1997
【非特許文献６】Kishida  et al. Midkine Promotes Neuroblastoma through Notch2 Signaling. Cancer Res; 73(4) 1318-1327, 2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、薬剤を体内の任意の場所に局所的に除放性させることが可能であり、かつ生体吸収性があり、薬剤除放後、生体内に吸収分解される、剤形素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
患部に局所的に薬剤を投与するための一つの方法として、薬剤を生分解性繊維に含有させた材料を患部に埋め込んで徐放させる方法が提案されている（米国特許6689374号）。しかしながらエレクトロスピニングに使用可能な紡糸溶液を調製するために、微粒子をまず水又は溶剤中に分散させたうえで、それを、生分解性樹脂を溶かして作製した溶液に均一に分散させて混合している。しかし、これらの方法では粉末微粒子を多量に含む場合には、微粒子を紡糸溶液中に均一に分散させるのが容易でなく、その外径は小さくなり、その徐放期間は短かった。【００１３】
本願発明者らは鋭意研究の結果、
１）生分解性樹脂と薬剤とを溶剤で溶解して、紡糸溶液を作成、
２）該紡糸溶液からエレクトロスピニングで紡糸することにより、上記課題を解決する、外径が大きな繊維状物質を含む、極めて徐放効果の高い剤形素材の開発に成功した。【００１４】
即ち、本発明は本発明の構成は以下の［１］から［２０］の通りである。
［１］薬剤及び生分解性樹脂を含有する、平均外径が１μｍ以上１５０μｍ以下、好ましくは１０μｍ以上１５０μｍ以下、より好ましくは３０μｍ以上１１０μｍ以下、さらにより好ましくは６０μｍ以上１１０μｍ以下である、繊維状物質から構成される綿状又不織布状構造を有する生体吸収性綿状素材；
［２］前記繊維状物質の平均分子量が５万以上１００万未満である、好ましくは５万以上５０万未満、より好ましくは６万以上４０万未満である、［１］に記載の生体吸収性綿状素材；
［３］かさ密度が、乾燥時又は水和時において０．０１ g/cm3〜０．１g/cm3、より好ましくは０．０１ g/cm3〜０．０５g/cm3である、［１］に記載の生体吸収性綿状素材。
［４］前記生分解性樹脂がＰＬＧＡまたはその共重合体であることを特徴とする［１］〜［３］に記載の生体吸収性綿状素材。
［５］薬剤が抗がん剤である、［１］〜［４］のいずれかに記載の生体吸収性綿状素材。
［６］滅菌処理されている［１］〜［５］のいずれかに記載の生体吸収性綿状素材。【００１５】
［７］  １）生分解性樹脂と薬剤を溶剤に溶解して、紡糸溶液を作成し、
２）前記紡糸溶液からエレクトロスピニングで紡糸することにより生成することを特徴とする生体吸収性綿状素材の製造方法；
［８］ ステップ２）において、溶液吐出側のノズル部分と、コレクター側のエタノール槽内に設置したプレート間に印加して、エレクトロスピニングで紡糸して、エタノール槽内に生体吸収性綿状素材を堆積させることにより、綿状の三次元立体構造を有する生体吸収性綿状素材を生成する、［７］に記載の生体吸収性綿状素材の製造方法；
［９］ステップ３）として滅菌処理工程を含む、［７］又は［８］に記載の生体吸収性綿状素材の製造方法；
［１０］  前記生分解性樹脂はＰＬＧＡまたはその共重合体であり、前記溶剤はクロロホルムもしくはジクロロメタンである、［７］〜［９］のいずれかに記載の生体吸収性綿状素材の製造方法；
［１１］薬剤が抗がん剤である、［７］〜［１０］のいずれかに記載の製造方法。【００１６】
［１２］１）患者の体内に［６］に記載の生体吸収性綿状素材を埋設し、
２）生体吸収性綿状素材から薬剤を徐放させ、その結果、
３）徐放させた薬剤の効能によって、患者の疾患を治療又は予防する方法；
［１３］開腹手術で［６］に記載の生体吸収性綿状素材を埋設することを特徴とする、［１０］に記載の方法；
［１４］インジェクターを用いた低侵襲医療手技で［６］に記載の生体吸収性綿状素材を埋設することを特徴とする、［１２］に記載の方法；
［１５］薬剤が抗がん剤であり、疾患ががんである、［１２］に記載の方法；
［１６］患者が、がん組織又はがん細胞を切除後である、［１５］に記載の方法；
［１７］がんが、悪性骨腫瘍である、［１５］又は［１６］に記載の方法。【００１７】
［１８］［１２］又は［１３］に記載の方法に用いるための、［６］に記載の生体吸収性綿状素材を含む、キット；
［１９］［１４］に記載の方法に用いるための、インジェクター及び［６］に記載の生体吸収性綿状素材を含む、キット；
［２０］［６］に記載の生体吸収性綿状素材がインジェクターに内包されている、［１９］に記載のキット。【００１８】
「生分解性樹脂（生分解性ポリマー）」とは、一般的に「通常の使用状況下では一般のプラスチックと同様に使えて、使用後は分解され、最終的には二酸化炭素（炭酸ガス）と水に変換され、自然に還る樹脂」と定義される。本願発明においては、ヒト及び非ヒト哺乳動物（牛、ブタなどの家畜、イヌ、ネコなどの伴侶動物を含む）の体内において分解される樹脂（ポリマー）を意味する。特に限定しないが、セルロースやデンプンなどの天然ポリマーや優れた生体適合性を持ち、生分解速度と機械的強度が調整されたいくつかの種類の生分解性合成ポリマーであってもよい。例えば、合成ポリマーとして、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）やポリ乳酸（ＰＬＡ）（ポリＬ乳酸：ＰＬＬＡ、ポリＤ乳酸：ＰＤＬＡ）；並びにその共重合体；［ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体（ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体）（ＰＬＧＡ）］；或いはポリジオキサノン（ＰＤＳ）などが挙げられる。ＰＬＧＡの場合、目的とする分解速度に応じて、ＰＬＡとＰＧＡのモノマーに比率を変えることができる。その比率はＰＬＡ：ＰＧＡ＝９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０であってもよい。【００１９】
「溶剤」は揮発性で水への溶解性が低く、かつ、ポリマーの良溶媒であればなんでもよい。たとえば、クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素などがあげられる。また、これら溶媒と相溶する溶媒（例えば、エチルエーテル、酢酸エチル等）を添加した混合溶媒も使用することができる。「薬剤」の活性が損なわれない溶剤が好ましい。【００２０】
「薬剤」とは、生分解性繊維に含有されて人体に投与可能な無機又は有機材料であって、体内にインプラントされて、活性を発揮する物質を意味する。
たとえば、抗がん剤、抗生物質、生理活性を有するポリペプチド（インフルエンザワクチンやインシュリンなど）、解熱剤、鎮痛剤、免疫賦活剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、鎮咳剤、抗てんかん剤、抗ヒスタミン剤、降圧利尿剤、糖尿病治療剤、筋弛緩剤、抗潰瘍剤、抗うつ剤、抗アレルギー剤、狭心剤、不整脈治療剤、血管拡張剤、抗凝血剤、止血剤、抗結核剤、麻薬拮抗剤、ホルモン剤などがあげられるがこれに限定しない。いわゆる医薬分野の薬剤だけでなく、化粧分野の薬剤（ビタミン、プラセンタ、ヒアルロン酸など）もこれに該当してもよい。上記「溶剤」耐性であることが望ましい。【００２１】
「かさ密度」は綿のＪＩＳ規格Ｌ１０９７を参考に、計測される。【００２２】
「エレクトロスピニング（ES）」法とはシリンジに入った高分子溶液とコレクタ電極間に高電圧を印可することで，シリンジから押出された溶液が電荷を帯び，細かな繊維となってコレクターに付着する微小繊維製造方法を指す。【００２３】
「低侵襲医療手技」とは手術において、従来の手技（開腹手術など）に対して、体につける傷の大きさはもとより、患者の体力的精神的負担がより小さくなる手技を指す。内視鏡外科手術などがこれにあたる。
「インジェクター」（挿入器）とは、X線透視下等で経皮的に体内に挿入され、内部に包含された医薬又は医療器具を体内に残置させる器具を指す。内視鏡などが接続されていてもよい。【００２４】
「滅菌処理」の方法としては、放射線滅菌（ガンマ線、電子線）、酸化エチレンガス滅菌、高圧蒸気滅菌等がある。本発明ではγ線による放射線滅菌を好適に用いる。２５ｋＧｙ〜３５ｋＧｙのγ線による放射線滅菌を施すと、平均分子量は減少する（６万〜１０万）。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、生分解性樹脂に薬剤を含有させてエレクトロスピニングすることによって、薬剤を担持した生分解性繊維を製造する方法として有効である。
また、該生分解性繊維は、薬剤を体内の任意の場所に局所的に除放性させることが可能であり、かつ生体吸収性があり、薬剤除放後、生体内に吸収分解される、剤形素材を提供することが可能である。
さらに剤形を患者に埋設することにより、ＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）を高める治療／予防効果をもたらすことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１（Ａ）は、参考例１の方法で紡糸した繊維（４０ＴＣＰ−３０ＳｉＶ−３０ＰＬＬＡ）のＳＥＭ写真を示す。
【図１Ｂ】図１（Ｂ）は、参考例１と同じ配合比率でニーダー混練を経ないで紡糸して得られた繊維を示す。
【図２】図２は、参考例２の方法で紡糸した繊維（７０ＴＣＰ−３０ＰＬＬＡ）を示すＳＥＭ写真である。
【図３】図３は、参考例３のＰＬＬＡ１００％の実施態様で用いるエレクトロスピニング装置で紡糸した繊維を示す。
【図４】図４は、本発明で用いるエレクトロスピニング装置の構成を示す。
【図５】実施例１で紡糸した繊維（３０倍量カルボプラチン−ＰＬＧＡ）のＳＥＭ写真を示す。
【図６】圧縮率及び回復率の計算方法
【図７】実施例２の結果
【図８】形状
【図９】実施例３の結果
【図１０】実施例４の結果：綿状担体からのカルボプラチンの徐放挙動。168時間にわたって徐放している。
【図１１】実施例５の結果：がんを発症し、8週齢で死亡したマウスの解剖時の様子。左右の腎臓の間を埋めてしまうほどの非常に大きな腫瘍がある。
【図１２】実施例５の結果：綿状担体を埋植し、12週齢で安楽死させたマウスの解剖時の様子（F166）。まったく腫瘍が観察できない。綿状担体は残存している。
【図１３】実施例５の結果：埋植手術後のマウスの体重変化。綿状担体を埋植したマウスは、疑似手術（抗がん剤を担持させていないポリマーのみの綿状物の埋植手術）のマウスと同等の体重増加を示しており、抗がん剤による副作用は起きていないことがわかる。
【図１４】実施例５の結果：腹部神経節を摘出ホルマリン固定し、組織学的評価を行う。
【図１５】実施例５の結果：H&E染色切片。大動脈（黄矢印）の左に通常は見られない繊維芽細胞（核の形が細長い）の瘢痕が見られる
【図１６】実施例５の結果：H&E染色切片。石灰化部位（丸く抜けているように見える部分：青矢印）が確認できる。
【図１７】実施例５の結果：綿状担体が含有するカルボプラチンと同量を腹腔内に直接投与したマウス。動きが遅く、震えもあり、下腹部が明らかにやせ細っている。腸が壊死し、機能不全に陥っている。胃に摂取した食餌は溜まっているが、小腸から大腸にかけて内容物無し。
【図１８】実施例５の結果：PBSを腹腔内に直接投与したマウス。行動、外見ともに正常。内臓にも異常なし。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の一つの実施態様は、生分解性樹脂を溶剤に用いて溶かした溶液に、少量の薬剤を投入して混合して紡糸溶液を作製し、その紡糸溶液を用いて、エレクロスピニングで紡糸する。ポリ乳酸、ＰＬＧＡは溶剤で溶かしてエレクトロスピニングの紡糸溶液とすることが可能なので、ポリ乳酸又はＰＬＧＡの溶液にごく少量の薬剤を混合した紡糸溶液を作製して、エレクトロスピニングで紡糸することは可能である。
【００２８】
本発明の一つの実施態様は、上記で得られた溶液を紡糸溶液として、エレクトロスピニング装置のシリンジに充填して、ノズルから糸として出射させる。ノズルから出射された糸は、接地された電極をターゲットとして放物線を描いてコレクター上に堆積する。コレクターは、網状に形成されており、エタノール溶液を満たした容器内に収容されている。ノズルから出射された糸はエタノール液の液面に入射して、その入射した位置で液中に沈殿する。沈殿した糸はコレクター上に堆積され、不織布状又は綿状に形成される。綿状とは、手で変形でき（形状加工性）；千切れ、千切った後、再びまとめられ（サイズ加工性）；圧縮後復元し（弾性力）；手で絞って水和量を調整できる；形状を示す。
【００２９】
本発明の一つの実施態様は、エレクトロスピニング装置のコレクターの底面（15cmx25cm程度）を電極板として用いてノズルから繊維を出射させる。コレクターにはエタノール液は用いない。この方法によってコレクターに繊維を不織布状に堆積させることができる。
【実施例】
【００３０】
以下の実施例、比較例及び参考例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００３１】
＜参考例１＞  ＰＬＬＡとβーリン酸三カルシウムとＳｉ含有バテライト相炭酸カルシウム（４０ＴＣＰ−３０ＳｉＶ−３０ＰＬＬＡ）
ステップ１．
薬剤とポリ乳酸とを混合してニーダーで混練する。ニーダーの設定温度を１７０〜１９０℃に設定して予熱した上で、ポリＬ乳酸（PURAC PL24 分子量２０〜３０万  融点175-185℃）のペレット１５ｇを投入して、設定温度１８０℃〜１９０℃で４分間程度加熱混練する。その後、βーリン酸三カルシウム粉末２０ｇとＳｉＶ粉末１５ｇを混合した粉末を、ニーダーに投入して、さらに同じ設定温度で１０分程度混練する。
ニーダーの設定温度１８０℃〜１９０℃で加熱すると、その状態でニーダーでトルクをかけて混練することができる。ニーダーで加熱したポリＬ乳酸の状態は必ずしも明らかでないが、本発明者等の推測によれば、自身の融点に達して溶融している部分と、溶融寸前の軟化状態である部分とがあると考えられる。
ポリＬ乳酸を加熱することによって溶融状態には達せず軟化状態にとどまっていても、軟化した状態でニーダーでトルクをかけて混練できる限り、本発明で粉末微粒子をマトリクス樹脂中に均一に分散させることが可能である。
混練によって、後から投入したβーリン酸三カルシウムとＳｉＶの粉末はポリＬ乳酸と混合し、微粒子がポリＬ乳酸酸樹脂中に均一に分散する。分子レベルで見た分散状態は必ずしも明らかでないが、本発明の発明者等の知見では、ポリＬ乳酸のカルボキシル基とβーリン酸三カルシウムのカルシウムイオンとが配位結合し、ケイ素のアミノ基とカルボキシル基とがアミノ結合をすることで、ポリ乳酸のマトリクス樹脂中に固定されていると考えられる。【００３２】
ステップ２．
薬剤とポリ乳酸のコンポジットを作製する。その後、得られたβーリン酸三カルシウムとＳｉＶとポリＬ乳酸の混練物をニーダーから取り出して、常温で放置することで冷却することで、ポリＬ乳酸と薬剤のコンポジット塊が得られる。【００３３】
ステップ３．
上記で得られたコンポジット塊を溶剤（例クロロホルム）で溶かして、ポリＬ乳酸の濃度が約１０％の紡糸溶液を作製する。コンポジット塊を溶剤で溶かす方法としては、コンポジット塊をクロロホルムを満たした容器中に入れてmagnetic stirrer を用いてゆっくり回転させて５時間程度撹拌する。【００３４】
ステップ４．
上記で作製された紡糸溶液をエレクトロスピニング装置（例Mecc 社  nanon）のシリンジ（直径１５．８ｍｍ；押し出し速度１５ｍｌ／ｈ）に充填し、約３０ｋＶの電圧をかけてノズル（シリンジ針１８Ｇ）から繊維を出射し、ノズルを移動幅２００ｍｍ移動速度４０ｍｍ／ｓｅｃ、針先クリーニング間隔２分（＊）で移動させながら、繊維をコレクターに堆積させる（庫内条件温度３０度以下；湿度５０％以下；針先から装置床まで３７ｃｍ）。
（＊）針先にできる溶液だまりを自動クリーニングする間隔。【００３５】
図４に示すように、エレクトロスピニングにあたっては、設置した電極をコレクター側に設置し、その電極にノズルから出射される糸を電極方向に誘導する。コレクターはエタノール溶液を満たした容器に収容しており、ノズルから電極方向に誘導された糸は放物線を描いてエタノール液面に入射し、入射した位置でエタノール液中に沈む。沈んだ糸は網状に形成したコレクターのメッシュ上に堆積させることで、綿状に形成した。出射にあたっては、ノズルをレール上で一定距離と速度で往復移動させながらスピンすることで、コレクターの面上に広く堆積させると、回収率を高める上で効果的である。【００３６】
結果
上記エレクトロスピンでノズルから出射された繊維の径は約５０μｍ平均であった。得られた繊維のＳＥＭ写真を図１（Ａ）に示す。比較参考用に、図１（Ｂ）に参考例１と同じ組成比でニーダー混練を経ないで作製した溶液を用いてエレクトロスピン装置にかけて紡糸を試みた結果を示す。一応繊維状のものはできたが、エレクトロスピンで製造される繊維よりもかなり太い径のものであった。【００３７】
＜参考例２＞ βーリン酸三カルシウムとＰＬＬＡ（７０ＴＣＰ−３０ＰＬＬＡ）
ステップ１．
βーリン酸三カルシウムとポリＬ乳酸（PURAC PL24 分子量２０〜３０万）とをニーダーで混練する。
ニーダーの設定温度を１７０〜１９０℃に設定して３分間予熱した上で、ニーダーにポリＬ乳酸のペレット１５ｇを投入して、設定温度１８０℃〜１９０℃で４分間程度加熱混練する。その後、βーリン酸三カルシウム粉末３５ｇを、ニーダーに投入して両者を混合し、同じ設定温度でさらに１０分程度混練する。
ニーダーの設定温度１８０℃〜１９０℃で加熱すると、その状態でニーダーでトルクをかけて混練することができる。ニーダーで加熱したポリＬ乳酸の状態は必ずしも明らかでない。本発明者等の推測によれば、自身の融点に達して溶融している部分と、溶融寸前の軟化状態である部分とがあると考えられる。
混練によって、後から投入したβーリン酸三カルシウムの粉末はポリＬ乳酸とよく混合し、ポリＬ乳酸樹脂中に均一に分散する。分散状態について本発明の発明者等の推測では、ポリＬ乳酸のカルボキシル基とβーリン酸三カルシウムのカルシウムイオンとが配位結合することで、ポリ乳酸のマトリクス樹脂中に固定されていると考えられる。【００３８】
ステップ２．
βーリン酸三カルシウムとポリ乳酸のコンポジットを作製する。
その後、得られたβーリン酸三カルシウムとポリＬ乳酸の混練物をニーダーから取り出して、常温で放置することで冷却する。ポリＬ乳酸とＴＣＰのコンポジット塊が得られる。【００３９】
ステップ３．
上記で得られたＰＬＬＡとβーリン酸三カルシウムコンポジット塊を溶剤（例クロロホルム）で溶かして、ＰＬＬＡの濃度が約１０重量％の紡糸溶液を作成する。コンポジット塊を溶剤で溶かす方法としては、コンポジット塊を溶剤（例：クロロホルム）中に入れた容器をmagnetic stirrer を用いてゆっくり回転させて５時間程度撹拌する。【００４０】
ステップ４．
紡糸溶液をエレクトロスピニング装置のシリンジに充填し、ノズルから繊維を出射し、繊維をコレクターに堆積させる。【００４１】
図４に示すように、エレクトロスピニングにあたっては、設置した電極をコレクター側に設置し、その電極にノズルから出射される糸を電極方向に誘導する。コレクターはエタノール溶液を満たした容器に収容しており、ノズルから電極方向に誘導された糸は放物線を描いてエタノール液面に入射し、入射した位置でエタノール液中に沈む。沈んだ糸は網状に形成したコレクターのメッシュ上に堆積させることで、綿状に形成した。【００４２】
結果
エレクトロスピンでノズルから出射された繊維の径は上記ＰＬＬＡ−βＴＣＰ−ＳｉＶの場合と比較して安定していないが、繊維径は約６５−８０μｍ程度であった。得られた繊維のＳＥＭ写真を図２に示す。【００４３】
＜参考例３＞  ＰＬＬＡ１００％ 
参考例１と２で用いたＰＬＬＡ１００％からなる生分解性樹脂を同じ条件でエレクトロスピニングで紡糸した繊維を図３に示す。
混合する薬剤が微量であれば、エレクトロスピニングによる紡糸は同様の繊維が得られると考えられる。【００４４】
＜参考例４＞  ＰＬＧＡとＳｉＶ（５０ＳｉＶ−５０ＰＬＧＡ）
ステップ１．
薬剤とＰＬＧＡとをニーダーで混練する。
装置の設定温度を１６０〜１６５℃に設定して３分間加熱したニーダーにＰＬＧＡ（molar ratio 82:18、融点130-140℃）のペレット２５ｇを投入して、設定温度１６０℃〜１６５℃で４分間程度加熱混練する。その後、ＳｉＶ粉末２５ｇを混合した粉末を、ニーダーに投入して、さらに同じ設定温度で１０分程度混練する。
ニーダーの設定温度１６０℃〜１６５℃で加熱すると、その状態でニーダーでトルクをかけて混練することができる。ニーダーで加熱したＰＬＧＡの状態は必ずしも明らかでない。本発明者等の推測によれば、自身の融点に達して溶融している部分と、溶融寸前の軟化状態である部分とがあると考えられる。
ポリ乳Ｌ酸を加熱することによって溶融状態には達せず軟化状態であっても、軟化した状態でニーダーでトルクをかけて混練できる限り、粉末微粒子をマトリクス樹脂中に均一に分散させることが可能である。
混練によって、後から投入したＳｉＶの粉末はＰＬＧＡとよく混合し、マトリクス樹脂中に均一に分散する。分散状態について本発明の発明者等の推測では、ＰＬＧＡのカルボキシル基と炭酸カルシウムのカルシウムとが配位結合し、ケイ素のアミノ基とがアミノ結合をすることで、ポリ乳酸のマトリクス樹脂中に固定されていると考えられる。【００４５】
ステップ２．
ＳｉＶとＰＬＧＡのコンポジットを作製する。
その後、得られたＳｉＶとＰＬＧＡの混練物をニーダーから取り出して、常温で放置することで冷却する。ＰＬＧＡと薬剤のコンポジット塊が得られる。【００４６】
ステップ３．
上記で得られたＰＬＧＡとＳｉＶのコンポジット塊を溶剤（例クロロホルム）で溶かして、ＰＬＧＡの濃度が約１３〜１５重量％の紡糸溶液を作成する。コンポジット塊を溶剤で溶かす方法としては、コンポジット塊を溶剤（例：クロロホルム）中に入れた容器をmagnetic stirrer を用いてゆっくり回転させて５時間程度撹拌する。【００４７】
ステップ４．
紡糸溶液をエレクトロスピニング装置のシリンジに充填し、ノズルから繊維を出射し、繊維をコレクターに堆積させる。【００４８】
エレクトロスピニングにあたっては、設置した電極をコレクター側に設置し、その電極にノズルから出射される糸を電極方向に誘導する。コレクターはエタノール溶液を満たした容器に収容しており、ノズルから電極方向に誘導された糸は放物線を描いてエタノール液面に入射し、入射した位置でエタノール液中に沈む。沈んだ糸は網状に形成したコレクターのメッシュ上に堆積させることで、綿状に形成した。【００４９】
＜比較例１＞ＴＣＰ−ＳｉＶ−ＰＬＬＡ作成実績
参考例１と同様の条件でＰＬＬＡとβーリン酸三カルシウムとＳｉ含有バテライト相炭酸カルシウムの比率を変えて作成を試みた。以下の表１が成功した条件であり、表２が失敗した条件である。【００５０】
【表１】
2016159240.tif 000003
【００５１】
【表２】
2016159240.tif 000004
【００５２】
ポリマーの割合が20wt%では、粉体の割合が多く、混練できなかった。またニーダー工程を用いずに直接クロロホルムに溶解し混練すると、スピニングできず、溶液が針先からポタポタと落ちるだけであった。【００５３】
＜比較例２＞ＴＣＰ−ＳｉＶ−ＰＬＧＡ作成実績
ＰＬＬＡの代わりにＰＬＧＡ（LG855S  (Evonik社製、PLLA:PGA = 85：15)）を用いて作成を試みた。以下の表３が成功した条件であり、表４が失敗した条件である。【００５４】
【表３】
2016159240.tif 000005
【００５５】
【表４】
2016159240.tif 000006
【００５６】
ポリマーの割合が20wt%では、粉体の割合が多く、混練できなかった。また混練の温度が低いと、ポリマーが融けず混練できず、ニーダー工程を行わないものも、繊維としてスピニングできなかった。【００５７】
＜実施例１＞  ＰＬＬＡ又はＰＬＧＡと抗がん剤（カルボプラチン粉末、エトポシド粉末、ドキソルビシン塩酸塩粉末）、抗生物質
ＰＬＬＡ又はＰＬＧＡを溶剤で溶かした溶液に抗がん剤（カルボプラチン粉末、エトポシド粉末、ドキソルビシン塩酸塩粉末）、抗生物質を少量混合したものを紡糸溶液として、エレクトロスピニングで紡糸する。
材料
生分解性樹脂：ＰＬＧＡ（LG855S  (Evonik社製、PLLA:PGA = 85：15)）
カルボプラチン(cis-Diamine(1,1-cyclobutanedicarboxylato)platinum(II)）（CAS番号：41575-94-4  製品コード：C2043；東京化成工業株式会社）【００５８】
方法
ステップ１．
ＰＬＧＡ３ｇと以下の表５に記載の量のカルボプラチンをクロロホルムで溶かして、ＰＬＧＡの濃度が約６重量％の紡糸溶液を作成した。作製された紡糸溶液をエレクトロスピニング装置（例Mecc 社  nanon）のシリンジに充填し  上記で作製された紡糸溶液をエレクトロスピニング装置（例Mecc 社  nanon）のシリンジ（直径１５．８ｍｍ；押し出し速度１５ｍｌ／ｈ）に充填し、約２８ｋＶの電圧をかけてノズル（シリンジ針１８Ｇ）から繊維を出射し、ノズルを移動幅１００ｍｍ〜１５０ｍｍ移動速度４０ｍｍ／ｓｅｃ、針先クリーニング間隔２分で移動させながら、繊維をコレクターに堆積させた（庫内条件温度３０度以下；湿度５０％以下；針先から装置床まで３７ｃｍ）。堆積させた繊維を室温で乾燥し、カルボプラチン含有綿状物を得た。【００５９】
【表５】
2016159240.tif 000007
【００６０】
結果
得られたカルボプラチン含有ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（３０倍量）のＳＥＭ写真を図５に示す。繊維が３次元方向に絡み合って綿状を形成している。該繊維は長手方向に互いに接着されておらず、ふわふわの３次元立体綿構造を形成している。平均外径５０μｍ〜１１０μｍであり、一部外径１〜１０μｍの部分も散見された。【００６１】
＜実施例２＞  弾性力測定
実施例１で作成された３０倍量カルボプラチン含有ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（以下ＤＤＳ用サンプル）、及びＲｅＢＯＳＳＩＳ（登録商標）（参考例1の４０ＴＣＰ−３０ＳｉＶ−３０ＰＬＬＡ）の弾性力について既承認の人工骨製品であるリフィット（HOYA Technosurgical 株式会社）とオスフェリオン（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社）と比較し、測定した。
材料
使用する各サンプルの概要を表６に示す。
【表６】
2016159240.tif 000008
【００６２】
方法
内径22 mmの透明チューブにReBOSSIS及びＤＤＳ用サンプルは0.1 g、リフィット及びオスフェリオンは10×10×10 mm(1.0 ml)入れた。水和時実験には、ReBOSSISは0.8 cc、DDS用サンプルは1.6 cc、リフィット及びオスフェリオンには1 ccの純水を加えたもので行なった。その上に指定されたフタ(0.417 g)を載せる。この時の嵩高さをh0とする。
その後、指定された重り(9.911 g)をフタ上に載せ、この時の嵩高さをh1とする。
最後に、重りを取り除いた後の嵩高さをh2とする。h0、h1、h2はフタの四隅の高さを測定した平均値により算出した。
圧縮率及び回復率の計算方法を図６に示す。【００６３】
結果
弾性力試験結果を次頁に表７として示す。また、計算により算出した圧縮率・回復率を表８に示す。さらに、実験写真(左：加重前、中央：加重時、右：重り除去後)を併せて図７として示す。
【表７】
2016159240.tif 000009
【００６４】
【表８】
2016159240.tif 000010
【００６５】
リフィット及びオスフェリオンでは圧縮率、回復率共に0であったのに対し、ReBOSSIS及びDDS用サンプルでは一定の圧縮率、回復率が見られた。
なお、ＪＩＳ規格Ｌ１０９７を参考に計測した場合、実施例のDDS用サンプルのかさ密度は乾燥時：0.0177 g/cm3、水和時：0.0266 g/cm3であった。
従って、本願発明に係る生体吸収性綿状素材は、圧縮してインジェクター内などに挿入し、低侵襲医療手技にて体内にインジェクターを介して導入後、体内にて速やかにその体積を戻すことが可能であることが示唆された。【００６６】
＜実施例３＞  形状サイズ加工性
実施例１で作成された３０倍量カルボプラチン含有ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（以下ＤＤＳ用サンプル）、及びＲｅＢＯＳＳＩＳ（登録商標）（参考例1の４０ＴＣＰ−３０ＳｉＶ−３０ＰＬＬＡ）の形状加工性とサイズ加工性について、既承認の人工骨製品であるリフィット（HOYA Technosurgical 株式会社）とオスフェリオン（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社）と比較した。
使用する各サンプルの概要を表９に、形状を図８に示す。
【表９】
2016159240.tif 000011
【００６７】
１．形状加工性
各サンプルを直径8.5〜9 mmの円柱状のプラスチック容器に入るような形状に、器具を用いて加工できるかどうか検証した。使用する器具はピンセット、カッター、骨切りバサミとし、これらの器具で加工できるかどうかと、円柱状に加工するのに要する時間を調べた。各サンプルとも乾燥状態と水和状態にて行った。使用するサンプルや水和量は上記参照。【００６８】
２．サイズ加工性
各サンプルを手で半分に千切れるかどうか、また千切った後で再びまとめられるかどうかを調べた。各サンプルとも乾燥状態と水和状態にて行った。使用するサンプルや水和量は上記参照。【００６９】
結果
１．形状加工性
【表１０】
2016159240.tif 000012
【００７０】
加工後のサンプルとプラスチック容器に詰めた様子を図９に示す。
ReBOSSISは乾燥・水和状態共に用手成形が可能であり、プラスチック容器に詰める際も容易に形状を加工できたため、短時間で詰めることが出来た。リフィットは乾燥状態ではカッターでの加工が必要であり、成形に時間がかかったが、水和状態では多少手で形を変えられるため比較的早く成形できた。オスフェリオンは水和させてもほとんど性状が変化しないため、どちらも成形に時間がかかった。
DDS用サンプルはReBOSSIS同様、短時間で形状加工が可能であった。【００７１】
２．サイズ加工性
【表１１】
2016159240.tif 000013
【００７２】
ReBOSSISは乾燥・水和状態共に手で千切ることができ、その後再びまとめることもできた。リフィットは水和後に手で千切ることができたが、任意の形状に千切ることは出来ず、ReBOSISSほどのサイズ加工の自由度はなかった。DDS用サンプルはReBOSSISと同様に、手で千切ることができ、その後再度まとめることもできた。
従って、本願発明に係る生体吸収性綿状素材は、埋設する場所に併せて、極めて容易に成形可能であることが示唆された。【００７３】
＜実施例４＞  抗がん剤を担持させた生体吸収性綿状物の徐放能
方法
３０倍量カルボプラチン担持綿状物質25 mgを1.5 cm3エッペンチューブに秤り分けた。ここに純水0.5 cm3を加え、浸漬させる。指定した時間毎に綿状物をピンセットで抜き取り、空の1.5 cm3エッペンチューブに移した。空のエッペンチューブに新たに純水0.5 cm3を加えることで溶液を交換した。(1日以上のものは朝に一度交換した)。
各サンプリング時間のカルボプラチンの量を紫外分光光度計により測定した。各サンプリング時間の保管溶液から10 μl秤り取り、100 μlセル内に含むように超純水を加えて測定した(10倍希釈)。実験はn = 3のサンプル数で測定を行なった。徐放およびUVの測定条件は以下の通りである。【００７４】
測定条件
サンプリング時間        ：  ５  ｍｉｎ、１、２、４、６ｈ、１、２、３、４、７ｄａｙ  
検出条件                ：  ＵＶ（２２０ｎｍ）【００７５】
結果
綿状担体からは168時間にわたるカルボプラチンの徐放挙動も観察された(図１０)。
したがって、綿状担体は、抗がん剤を長期に局所投与が可能な非常に優れた薬剤担体と言える。【００７６】
＜実施例５＞  抗がん剤を担持させた生体吸収性綿状物の新規ドラッグデリバリー（DDS）素材としての有効性
方法
交感神経特異的な酵素であるTyrosine Hydroxylase (TH)のプロモーターからMYCN遺伝子を発現させるトランスジェニック (Tg) マウス（非特許文献５：Weiss  et al）を129tTer/SvJcl wild-type mice (CLEA Japan)でバッククロスして系統化したホモ接合型(Tg/Tg)マウスを用いた（非特許文献６：Kishida et al）。神経堤細胞が交感神経へと分化する運命を獲得し、マーカーの一つであるTHを発現するタイミングで同時にMYCNを発現させるこのマウスでは、交感神経節の一つである上腸間膜神経節から、神経芽腫を自然発症し、およそ７〜８〜９週齢で死亡し、ヘテロ接合型マウスは、性成熟の生後２ヶ月以降（９〜２０週にかけて）に、腫瘍を発生し死亡する。
実施例１で作成された３０倍体量カルボプラチン含有ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（生体吸収性綿状物（綿状担体））をホモ接合型(Tg/Tg)マウスの腹腔（主な神経芽腫発生部位である腹部上腸間膜神経節付近（両側の腎臓の間））に、以下の実験プロトコール（表１２）に従い留置した場合と、綿状担体が含有するカルボプラチン量と同量を、直接腹腔内に投与した場合、さらに比較対象としてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を腹腔内に投与した場合の実験を行った。【００７７】
【表１２】
2016159240.tif 000014
【００７８】
結果
綿状担体を埋植しなかったマウスは、７〜８週齢で死亡したが、綿状担体を埋植したマウスは、8週齢を超えて生存し続け、F166及びF179は12週齢時に安楽死させた。
がんを発症し、8週齢で死亡したマウスの解剖時の様子を図１１に、綿状担体を埋植し、12週齢時に安楽死させたマウス（F166）の解剖時の様子を図１２に示す。
埋植手術後のマウスの体重変化を図１３に示す。【００７９】
図１１では、左右の腎臓間を埋めてしまうほどの非常に大きな腫瘍が確認でき、がんによる死亡が明らかであったが、図１２では、12週も経っているにもかかわらず、腫瘍が全く観察できなかった。そのため、腹部神経節（F166）を摘出ホルマリン固定した（図１４）。
また、図１２で綿状担体が残存しているが、これは埋植後8週（12週齢）しか経っていないためで、埋植後半年程度で全量が生体に吸収されると思われる。
図１３では、綿状担体を埋植したマウスは、疑似手術のマウスと同等の体重増加を示しており、抗がん剤による副作用は起きていないことがわかる。疑似手術のマウスが8週齢でがん死した後も、順調に体重が増え続けており、がんが治癒していることが示唆される。【００８０】
綿状担体を埋植したマウス（図１４）のH&E染色切片の様子を、図１５及び図１６に示す。
図１５及び図１６より、下記の所見が得られた。
・細胞体が小さく細胞質の乏しい「神経芽腫細胞」は見られなかった。
・石灰化と繊維芽細胞を伴う瘢痕が確認できた。
以上より、綿状担体による抗がん作用により、がん細胞が死滅し、そのがん細胞の死滅痕が瘢痕という形で残ったものだと推測される。【００８１】
ここで、綿状担体が含有するカルボプラチンと同量を腹腔内に直接投与したマウスと、比較対象としてPBSを直接投与したマウスの外見と解剖時の様子を図１７及び図１８に示す。
なお、この腹腔内直接投与は健常マウスを用いたが、カルボプラチンを腹腔内投与したマウスは全匹が数日で死亡した。一方で、PBSでは投与後3週間以上生存したため、投与後4週目に安楽死させている。
図１７及び図１８により、綿状担体に含有されるカルボプラチンと同量を直接投与した場合は、重大な副作用を生じ、マウスは死亡した。
マウス腹腔内カルボプラチン投与のLD50（半数致死量）は150mg/kgであり、体重30gの場合、4.5mgである。30倍量担体0.05g中のカルボプラチン量は7.5mgであり、LD50より多量に留置した事になるが、M169 、F166及びF179のマウスは生存し、癌の治療に成功した。当該担体を用いることで、LD50を超す量であっても、徐放される事で副作用が軽減されると考えられた。【００８２】
まとめ
神経芽腫モデルマウスでの実験において、カルボプラチンを直接投与したマウスは、重大な副作用によって寿命を待たず数日で死亡した。一方で、綿状担体を埋植したマウスは、副作用も見られず、寿命である8週齢を超えて12週齢で剖検のため安楽死となったが、病理検査の結果がん細胞は観察されなかった。    
綿状担体により抗がん剤の、全身性の副作用を生じさせない局所投与が可能となり、なおかつがん細胞を死滅させることができたといえる。  【００８３】
以上より、抗がん剤を担持させた生体吸収性綿状物の新規ドラッグデリバリー（DDS）素材としての有効性は非常に高いものであると思われる。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
以上により本願発明に係る生分解性繊維は、薬剤を体内の任意の場所に局所的に長期除放性させることが可能であり、かつ生体吸収性があり、薬剤除放後、生体内に吸収分解される、剤形素材を提供することが可能である。
さらに剤形を患者に埋設することにより、全身性の副作用を生じさせず、ＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）を高める治療／予防効果をもたらすことが可能である。
【図１Ａ】
2016159240.tif 000015
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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