(57)【要約】  組織切片の種類や診断者による統計値のバラツキを抑制しながら、解析時間を短縮する。当該目的生体物質の解析システム１は、染色後の組織標本を撮像する顕微鏡１０と、顕微鏡１０の撮像結果を受ける解析装置２０と、を備える。解析装置２０では、染色後の組織標本の顕微鏡画像を生成し、前記顕微鏡画像を一定のサイズで区画し、前記顕微鏡画像の染色状態を区画ごとに解析し、その解析結果に基づき一定の統計値を算出する。
2016204027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色後の組織標本の顕微鏡画像を生成する生成手段と、
前記顕微鏡画像を一定のサイズで区画する区画手段と、
前記顕微鏡画像の染色状態を区画ごとに解析する解析手段と、
前記解析手段の解析結果に基づき一定の統計値を算出する算出手段と、
を備えることを特徴とする目的生体物質の解析装置。
【請求項２】
請求項１に記載の目的生体物質の解析装置において、
前記区画手段が、前記顕微鏡画像を、１つの細胞もしくは組織のサイズと同等のサイズで、または１つの細胞もしくは組織のサイズの１／５〜５倍に縮小もしくは拡大したサイズで区画することを特徴とする目的生体物質の解析装置。
【請求項３】
請求項１または２に記載の目的生体物質の解析装置において、
前記区画手段が、前記解析手段による解析対象の区画を決定するための基準領域を指定し、
前記解析手段が、前記区画手段により区画された区画のうち、前記基準領域の基準を満たす区画を、解析対象の区画とすることを特徴とする目的生体物質の解析装置。
【請求項４】
請求項３に記載の目的生体物質の解析装置において、
前記生成手段が、目的生体物質を含まない染色後の組織標本から第２の顕微鏡画像を生成し、
前記区画手段が、前記第２の顕微鏡画像から、前記解析手段による解析対象の区画を決定するための基準領域を指定することを特徴とする目的生体物質の解析装置。
【請求項５】
請求項３または４に記載の目的生体物質の解析装置において、
前記生成手段が、前記顕微鏡画像として蛍光画像を生成し、
前記解析手段が、前記蛍光画像の蛍光輝点数を前記解析対象の区画ごとに算出し、
前記算出手段が、前記統計値として、前記解析対象の区画の蛍光輝点数の平均値を算出することを特徴とする目的生体物質の解析装置。
【請求項６】
請求項１または２に記載の目的生体物質の解析装置において、
前記生成手段が、前記顕微鏡画像として蛍光画像を生成し、
前記解析手段が、前記区画手段により区画されたすべての区画を、解析対象の区画とし、
前記算出手段が、前記統計値として、前記解析対象の区画の蛍光輝点数の中央値を算出することを特徴とする目的生体物質の解析装置。
【請求項７】
請求項１または２に記載の目的生体物質の解析装置において、
前記生成手段が、前記顕微鏡画像として蛍光画像を生成し、
前記解析手段が、前記区画手段により区画されたすべての区画を、解析対象の区画とし、
前記算出手段が、前記統計値として、前記解析対象の区画の蛍光輝点数のヒストグラムピーク値に対応する階級値を算出することを特徴とする目的生体物質の解析装置。
【請求項８】
請求項３または４に記載の目的生体物質の解析装置において、
前記生成手段が、前記顕微鏡画像として蛍光画像を生成し、
前記算出手段が、前記統計値として、前記解析対象の区画の蛍光輝点数の中央値を算出することを特徴とする目的生体物質の解析装置。
【請求項９】
請求項３または４に記載の目的生体物質の解析装置において、
前記生成手段が、前記顕微鏡画像として蛍光画像を生成し、
前記算出手段が、前記統計値として、前記解析対象の区画の蛍光輝点数のヒストグラムピーク値に対応する階級値を算出することを特徴とする目的生体物質の解析装置。
【請求項１０】
請求項３、４、５、８または９に記載の目的生体物質の解析装置において、
前記基準領域の指定を自動で行うことを特徴とする目的生体物質の解析装置。
【請求項１１】
請求項１から請求項１０までのいずれか一項に記載の目的生体物質の解析装置において、
前記区画が、４角形状、円形状又はハニカム状であることを特徴とする目的生体物質の解析装置。
【請求項１２】
染色後の組織標本を撮像する顕微鏡と、
前記顕微鏡の撮像結果を受ける、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の目的生体物質の解析装置と、
を備えることを特徴とする目的生体物質の解析システム。
【請求項１３】
染色後の組織標本の顕微鏡画像を生成する工程と、
前記顕微鏡画像を一定のサイズで区画する工程と、
前記顕微鏡画像の染色状態を区画ごとに解析する工程と、
前記解析工程の解析結果に基づき一定の統計値を算出する工程と、
を備えることを特徴とする目的生体物質の解析方法。
【請求項１４】
コンピュータを、
染色後の組織標本の顕微鏡画像を生成する生成手段、
前記顕微鏡画像を一定のサイズで区画する区画手段、
前記顕微鏡画像の染色状態を区画ごとに解析する解析手段、
前記解析手段の解析結果に基づき一定の統計値を算出する算出手段、
として機能させるための目的生体物質の解析プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は目的生体物質の解析装置、解析システム、解析方法および解析プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
患者の適切な治療のためには適切な診断が必要であり、その最終診断として病理診断は大きな役割を果たしている。「病理診断」とは、患者の病気の治療方針を決めたり治療の効果を評価したりするために、主に患部から採取された組織の一部を顕微鏡で調べて、病変の種類や性質などを見分けるものである。【０００３】
本出願人は病理診断に有用な技術を特許文献１に開示している。
特許文献１の技術では、組織切片における細胞の形態を表す明視野画像と、組織切片の同一範囲における特定のタンパク質の発現を蛍光輝点で表す蛍光画像とを取得し、明視野画像から特定のタンパク質の発現領域を包含する細胞領域を推定するとともに、蛍光画像から蛍光輝点を抽出し、推定された各細胞領域に含まれる細胞核および蛍光輝点に基づいて、各細胞領域に関する特徴量を算出し、その算出された特徴量に基づいて各細胞領域が癌であるか否かと特定のタンパク質の発現状況とを判定しうるようになっている。
近年では、組織標本中（明視野画像）で複数の細胞が重畳している場合でも、蛍光画像の蛍光輝点がいずれの細胞に帰属しているかが判別されるようになっており、その結果特定のタンパク質の発現数を正確に定量可能となり、病理診断の精度が向上している（特許文献２、段落００６９〜００８０、００９６、図９〜図１５参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１４６８４３号
【特許文献２】特願２０１４−１２１０７８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１、２のような技術では、病理診断専用のソフトウエアを使用するといっても、組織切片の細胞株の種類によって形態（形状やサイズなど）は異なるし、診断者自身が明視野画像から細胞領域を抽出したり、蛍光画像の蛍光輝点をいずれの細胞に帰属させるのかを判別したりするための操作をする必要があり、組織切片の細胞株の種類や診断者によって診断結果にバラツキが生じる可能性があるし、蛍光輝点の細胞への帰属などには解析時間もかかる。【０００６】
図１５は、ＳＫＯＶ−３、Ａ５４９、Ｃａｌｕ３、Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７の５種の細胞株を含む組織切片をそれぞれサンプルとして、現実に特許文献１、２のような手法で、複数人の診断者がタンパク質定量値と１細胞あたりの蛍光輝点数との関係を求めた結果の一例である。「ＳＫＯＶ−３」はヒト卵巣がん細胞由来の細胞株であり、「Ａ５４９」はヒト肺がん細胞由来の細胞株であり、「Ｃａｌｕ３」はヒト肺がん細胞由来の細胞株であり、「Ｔ４７Ｄ」はヒト乳腺がん細胞由来の細胞株であり、「ＭＣＦ７」はヒト乳がん細胞由来の細胞株である。図１５中、横軸の「タンパク質定量値」はフローサイトメトリーで測定した１細胞あたりの蛍光値（ａ．ｕ．）である。なお、図１５中、縦軸の「１細胞あたりの蛍光輝点数」を計測するにあたり、組織標本の作製から蛍光輝点を含む蛍光画像を得るまでは、特許文献１、２の記載に準じる、本願明細書の後述の第１の実施形態（［染色工程］および［撮像工程］）の記載のように実施した。ここでは、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体を、蛍光物質集積ナノ粒子に結合させた免疫染色剤を準備し、その免疫染色剤で免疫染色して蛍光画像を得た。その後、病理診断専用のソフトウエアを利用し、１細胞あたりの蛍光輝点数を計測した。
図１５中、黒点が蛍光輝点数の平均値を示し、黒点に対する上下の線分が標準偏差を示している。図１５に示すとおり、タンパク質定量値が大きくなるほど蛍光輝点数の標準偏差は大きくなっており、組織切片の細胞株の種類や診断者によって診断結果（統計値）にバラツキが生じているのがわかる。
したがって本発明の主な目的は、組織切片の種類や診断者による統計値のバラツキを抑制しながら、解析時間を短縮することができる目的生体物質の解析装置、解析システム、解析方法および解析プログラムを提供することにある。
さらに本発明の目的としては、目的生体物質としてタンパク質のほか、核酸・糖鎖・酵素などを組織切片の蛍光観察により輝点計測することも含まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明の第１の態様によれば、
染色後の組織標本の顕微鏡画像を生成する生成手段と、
前記顕微鏡画像を一定のサイズで区画する区画手段と、
前記顕微鏡画像の染色状態を区画ごとに解析する解析手段と、
前記解析手段の解析結果に基づき一定の統計値を算出する算出手段と、
を備えることを特徴とする目的生体物質の解析装置が提供される。【０００８】
本発明の第２の態様によれば、
染色後の組織標本を撮像する顕微鏡と、
前記顕微鏡の撮像結果を受ける前記目的生体物質の解析装置と、
を備えることを特徴とする目的生体物質の解析システムが提供される。【０００９】
本発明の第３の態様によれば、
染色後の組織標本の顕微鏡画像を生成する工程と、
前記顕微鏡画像を一定のサイズで区画する工程と、
前記顕微鏡画像の染色状態を区画ごとに解析する工程と、
前記解析工程の解析結果に基づき一定の統計値を算出する工程と、
を備えることを特徴とする目的生体物質の解析方法が提供される。【００１０】
本発明の第４の態様によれば、
コンピュータを、
染色後の組織標本の顕微鏡画像を生成する生成手段、
前記顕微鏡画像を一定のサイズで区画する区画手段、
前記顕微鏡画像の染色状態を区画ごとに解析する解析手段、
前記解析手段の解析結果に基づき一定の統計値を算出する算出手段、
として機能させるための目的生体物質の解析プログラムが提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、組織切片の種類や診断者による統計値のバラツキを抑制しながら、解析時間を短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】目的生体物質の解析方法の工程を概略的に示す図である。
【図２】目的生体物質の解析システムの概略的な構成を示す図である。
【図３Ａ】明視野画像の一例を示す図である。
【図３Ｂ】蛍光画像の一例を示す図である。
【図４】解析工程を概略的に示す図である。
【図５Ａ】明視野画像を指定する例を示す図である。
【図５Ｂ】蛍光画像からバックグランド領域を指定する例を示す図である。
【図６Ａ】解析工程を概略的に説明するための図である。
【図６Ｂ】解析工程を概略的に説明するための図である。
【図７】統計値（平均値）とタンパク質定量値との相関例を示す図である。
【図８】統計値（中央値）とタンパク質定量値との相関例を示す図である。
【図９】すべての区画に対する、一定数の蛍光輝点を有する区画を示すヒストグラム例を示す図である。
【図１０Ａ】第２の実施形態にかかる明視野画像の一例を示す図であって、目的生体物質を含まない組織標本から生成した図である。
【図１０Ｂ】第２の実施形態にかかる蛍光画像の一例を示す図であって、目的生体物質を含まない組織標本から生成した図である。
【図１１】第２の実施形態にかかる統計値（平均値）とタンパク質定量値との相関例を示す図である。
【図１２Ａ】第３の実施形態にかかる明視野画像からバックグランド領域を指定する例を示す図である。
【図１２Ｂ】第３の実施形態にかかる蛍光画像からバックグランド領域を指定する例を示す図である。
【図１３Ａ】第３の実施形態にかかる解析工程を概略的に説明するための図である。
【図１３Ｂ】第３の実施形態にかかる解析工程を概略的に説明するための図である。
【図１４】第３の実施形態にかかる統計値（平均値）と目視で測定した単位面積当たりの蛍光輝点数との相関例を示す図である。
【図１５】従来の統計値（平均値）とタンパク質定量値との相関例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態について説明する。
【００１４】
［第１の実施形態］
本実施形態では主に、顕微鏡画像を解析し一定の統計値を算出する解析方法を提供する。かかる解析方法は主に、図１に示すとおり、
（Ｓ１）一定の染色剤で組織標本を染色する工程と、
（Ｓ２）一定の顕微鏡で染色後の組織標本の染色像を撮像する工程と、
（Ｓ３）顕微鏡画像を解析し一定の統計値を算出する工程とを、備えている。
【００１５】
はじめに染色工程Ｓ１について説明し、その後に撮像工程Ｓ２および解析工程Ｓ３について説明する。特に、後者の撮像工程Ｓ２および解析工程Ｓ３では図２の解析システム１を使用する。
【００１６】
［染色工程］
染色工程Ｓ１では、目的生体物質を含む組織標本Ａを作製し、これを免疫染色用の染色剤や形態観察用の染色剤で免疫染色および形態観察染色する。
【００１７】
（１）目的生体物質
目的生体物質とは、主に病理診断の観点からの検出または定量のために、蛍光標識体を用いた免疫染色の対象とするものをいい、組織切片に発現している生体物質、特にタンパク質（抗原）、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）である。
典型的な目的生体物質としては、各種の癌組織の細胞膜で発現しており、バイオマーカーとして利用することができる生体物質が挙げられる。
【００１８】
〔生体物質認識部位と蛍光ナノ粒子との結合〕
本実施の形態に係る生体物質認識部位とは、目的とする生体物質と特異的に結合又は反応する部位である。目的とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質（ペプチド）および核酸（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、抗体等が挙げられる。したがって、そのような目的とする生体物質に結合する物質としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やそれに特異的に結合する他のタンパク質等、および前記核酸にハイブリダイズする塩基配列を有する核酸等が挙げられる。具体的には、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体（ＥＲ）に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体等があげられる。中でも抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＲ抗体を蛍光ナノ粒子に結合させたものは、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。
【００１９】
特定抗原としては以下を例示することができ、各抗原を認識する抗体はさまざまな抗体メーカーから入手可能であるとともに一般的な知識に基づいて作成可能である。例示としてＭ．アクチン、Ｍ．Ｓ．アクチン、Ｓ．Ｍ．アクチン、ＡＣＴＨ、Ａｌｋ−１、α１−アンチキモトリプシン、α１−アンチトリプシン、ＡＦＰ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、β−カテニン、ＢＣＡ  ２２５、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、カルシトニン、カルレチニン、ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６１、ＣＤ６８、ＣＤ７９ａ、″ＣＤ９９、ＭＩＣ２″、ＣＤ１３８、クロモグラニン、ｃ−ＫＩＴ、ｃ−ＭＥＴ、コラーゲン  タイプＩＶ、Ｃｏｘ−２、サイクリンＤ１、ケラチン、サイトケラチン（高分子量）、パンケラチン、パンケラチン、サイトケラチン５／６、サイトケラチン  ７、サイトケラチン  ８、サイトケラチン８／１８、サイトケラチン  １４、サイトケラチン  １９、サイトケラチン  ２０、ＣＭＶ、Ｅ−カドヘリン、ＥＧＦＲ、ＥＲ、ＥＭＡ、ＥＢＶ、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、ファッシン、ＦＳＨ、ガレクチン−３、ガストリン、ＧＦＡＰ、グルカゴン、グリコフォリン  Ａ、グランザイムＢ、ｈＣＧ、ｈＧＨ、ヘリコバクターピロリ、ＨＢｃ  抗原、ＨＢｓ  抗原、ヘパトサイト特異抗原、ＨＥＲ２、ＨＳＶ  −Ｉ、ＨＳＶ  −ＩＩ、ＨＨＶ−８、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩＧＦ−１Ｒ、インヒビン、インスリン、カッパ  Ｌ鎖、Ｋｉ６７、ラムダ  Ｌ鎖、ＬＨ、リゾチーム、マクロファージ、メランＡ、ＭＬＨ−１、ＭＳＨ−２、ミエロパーオキシダーゼ、ミオゲニン、ミオグロビン、ミオシン、ニューロフィラメント、ＮＳＥ、ｐ２７  （Ｋｉｐ１）、ｐ５３、ｐ５３、Ｐ６３、ＰＡＸ  ５、ＰＬＡＰ、ニューモシスティス  カリニ、ポドプラニン（Ｄ２−４０）、ＰＧＲ、プロラクチン、ＰＳＡ、前立腺酸性フォスファターゼ、Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ、Ｓ１００、ソマトスタチン、スペクトリン、シナプトフィジン、ＴＡＧ−７２、ＴｄＴ、サイログロブリン、ＴＳＨ、ＴＴＦ−１、ＴＲＡｃＰ、トリプターゼ、ビリン、ビメンチン、ＷＴ１、Ｚａｐ−７０が挙げられる。
【００２０】
目的とする生体物質が核酸の場合、病気との関連が指摘されている特定核酸遺伝子としては以下を例示することができ、各特定核酸遺伝子を認識するプローブは、ＢＡＣプローブとして入手可能であるとともに一般的な知識に基づいて作成可能である。具体的な特定核酸遺伝子の例示は以下の通り。癌の増殖や分子標的薬の奏効率に関係する遺伝子として、ＨＥＲ２、ＴＯＰ２Ａ、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、Ｐ５３、ＭＥＴなどが挙げられ、さらに、各種癌関連遺伝子として知られている遺伝子として、以下のものが挙げられる。チロシンキナーゼ関連遺伝子として、ＡＬＫ、ＦＬＴ３、ＡＸＬ、ＦＬＴ４（ＶＥＧＦＲ３、ＤＤＲ１、ＦＭＳ（ＣＳＦ１Ｒ）、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、ＨＥＲ４（ＥＲＢＢ４）、ＥＭＬ４−ＡＬＫ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＰＨＡ１、ＩＮＳＲ、ＥＰＨＡ２、ＩＲＲ（ＩＮＳＲＲ）、ＥＰＨＡ３、ＫＩＴ、ＥＰＨＡ４、ＬＴＫ、ＥＰＨＡ５、ＭＥＲ（ＭＥＲＴＫ）、ＥＰＨＡ６、ＭＥＴ、ＥＰＨＡ７、ＭＵＳＫ、ＥＰＨＡ８、ＮＰＭ１−ＡＬＫ、ＥＰＨＢ１、ＰＤＧＦＲα（ＰＤＧＦＲＡ）、ＥＰＨＢ２、ＰＤＧＦＲβ（ＰＤＧＦＲＢ）ＥＰＨＢ３、ＲＥＴ、ＥＰＨＢ４、ＲＯＮ（ＭＳＴ１Ｒ）、ＦＧＦＲ１、ＲＯＳ（ＲＯＳ１）、ＦＧＦＲ２、ＴＩＥ２（ＴＥＫ）、ＦＧＦＲ３、ＴＲＫＡ（ＮＴＲＫ１）、ＦＧＦＲ４、ＴＲＫＢ（ＮＴＲＫ２）、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）、ＴＲＫＣ（ＮＴＲＫ３）が挙げられる。また、乳がん関連の遺伝子としてＡＴＭ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＣＡ３、ＣＣＮＤ１、Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＲＢＢ２、ＥＴＶ６、ＦＧＦＲ１、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ｐ５３、ＰＴＥＮが挙げられる。カルチノイド腫瘍に関連する遺伝子として、ＢＣＬ２、ＢＲＤ４、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＨＥＳ１、ＭＡＰ２、ＭＥＮ１、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＵＴ、ＲＡＦ、ＳＤＨＤ、ＶＥＧＦＡが挙げられる。大腸がん関連遺伝子として、ＡＰＣ、ＭＳＨ６、ＡＸＩＮ２、ＭＹＨ、ＢＭＰＲ１Ａ、ｐ５３、ＤＣＣ、ＰＭＳ２、ＫＲＡＳ２（ｏｒＫｉ−ｒａｓ）、ＰＴＥＮ、ＭＬＨ１、ＳＭＡＤ４、ＭＳＨ２、ＳＴＫ１１、ＭＳＨ６が挙げられる。肺がん関連の遺伝子としては、ＡＬＫ、ＰＴＥＮ、ＣＣＮＤ１、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＲＢ１、ＥＧＦＲ、ＲＥＴ、ＥＭＬ４、ＲＯＳ１、ＫＲＡＳ２、ＴＰ５３、ＭＹＣが挙げられる。肝臓がん関連の遺伝子としては、Ａｘｉｎ１、ＭＡＬＡＴ１、ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ、ｐ１６  ＩＮＫ４Ａ、ｃ−ＥＲＢＢ−２、ｐ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＲＢ１、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１、ＳＭＡＤ２、ＥＧＦＲ、ＳＭＡＤ４、ＩＧＦＲ２、ＴＣＦ１、ＫＲＡＳが挙げられる。腎臓がん関連遺伝子として、Ａｌｐｈａ、ＰＲＣＣ、ＡＳＰＳＣＲ１、ＰＳＦ、ＣＬＴＣ、ＴＦＥ３、ｐ５４ｎｒｂ／ＮＯＮＯ、ＴＦＥＢが挙げられる。甲状腺がん関連遺伝子として、ＡＫＡＰ１０、ＮＴＲＫ１、ＡＫＡＰ９、ＲＥＴ、ＢＲＡＦ、ＴＦＧ、ＥＬＥ１、ＴＰＭ３、Ｈ４／Ｄ１０Ｓ１７０、ＴＰＲが挙げられる。卵巣がん関連遺伝子として、ＡＫＴ２、ＭＤＭ２、ＢＣＬ２、ＭＹＣ、ＢＲＣＡ１、ＮＣＯＡ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ｐ５３、ＥＲＢＢ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＧＡＴＡ４、ＲＢ、ＨＲＡＳ、ＲＥ���、ＫＲＡＳ、ＲＮＡＳＥＴ２が挙げられる。前立腺がん関連遺伝子として、ＡＲ、ＫＬＫ３、ＢＲＣＡ２、ＭＹＣ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＮＫＸ３．１、ＥＺＨ２、ｐ５３、ＧＳＴＰ１、ＰＴＥＮが挙げられる。骨腫瘍関連遺伝子として、ＣＤＨ１１、ＣＯＬ１２Ａ１、ＣＮＢＰ、ＯＭＤ、ＣＯＬ１Ａ１、ＴＨＲＡＰ３、ＣＯＬ４Ａ５、ＵＳＰ６が挙げられる。
【００２１】
生体物質認識部位と蛍光ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合等の結合力の強い結合が好ましい。
【００２２】
（２）免疫染色剤（抗体−蛍光ナノ粒子の結合体）
免疫染色剤としては、蛍光標識の効率を向上させて蛍光の劣化につながる時間経過をなるべく抑えるために、一次抗体および蛍光ナノ粒子が間接的に、つまり抗原抗体反応などを利用した、共有結合以外の結合によって連結される複合体を用いることが好ましい。染色操作を簡便にするため、免疫染色剤として、一次抗体または二次抗体に蛍光ナノ粒子が直結している複合体を用いることもできる。
【００２３】
免疫染色剤の一例として、［目的生体物質に対する一次抗体］…［一次抗体に対する抗体（二次抗体）］〜［蛍光ナノ粒子］が挙げられる。
“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“〜”が示す結合の態様としては特に限定されず、たとえば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、抗原抗体結合、ビオチンアビジン反応、物理吸着、化学吸着などが挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
【００２４】
（３）抗体
一次抗体には、目的生体物質としてのタンパク質を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。たとえば、ＨＥＲ２を目的生体物質とする場合は抗ＨＥＲ２抗体を、ＨＥＲ３を目的生体物質とする場合は抗ＨＥＲ３抗体を、それぞれ用いることができる。
二次抗体には、一次抗体を抗原として特異的に認識して結合する抗体（ＩｇＧ）を用いることができる。
一次抗体および二次抗体はいずれも、ポリクローナル抗体であってもよいが、定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましい。抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。
【００２５】
（４）蛍光ナノ粒子
蛍光ナノ粒子とは、励起光の照射を受けて蛍光発光するナノサイズの粒子であって、目的生体物質を１分子ずつ輝点として表すのに十分な強度の蛍光を発光しうる粒子である。
蛍光ナノ粒子として、好ましくは量子ドット（半導体ナノ粒子）、蛍光物質集積ナノ粒子が使用される。
【００２６】
（４．１）量子ドット
量子ドットとしては、ＩＩ−ＶＩ族化合物、ＩＩＩ−Ｖ族化合物またはＩＶ族元素を含有する半導体ナノ粒子が使用される。たとえば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。
【００２７】
（４．２）蛍光物質集積ナノ粒子
蛍光物質集積ナノ粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光物質（たとえば、上記量子ドット、蛍光色素など）がその中に内包されているおよび／またはその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。
蛍光物質集積ナノ粒子としては、母体と蛍光物質とが、互いに反対の電荷を有する置換基または部位を有し、静電的相互作用が働くものであることが好適である。
蛍光物質集積ナノ粒子としては、量子ドット集積ナノ粒子、蛍光色素集積ナノ粒子などが使用される。
【００２８】
（４．２．１）母体
母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル−スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル−スチレン−アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができる。
母体のうち、無機物としては、シリカ、ガラスなどを例示することができる。
【００２９】
（４．２．２）量子ドット集積ナノ粒子
量子ドット集積ナノ粒子とは、上記量子ドットが、上記母体の中に内包されている、および／またはその表面に吸着している構造を有する。
量子ドットが母体に内包されている場合、量子ドットは母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
【００３０】
（４．２．３）蛍光色素集積ナノ粒子
蛍光色素集積ナノ粒子とは、蛍光色素が、上記母体の中に内包されている、および／またはその表面に吸着している構造を有する。
蛍光色素としては、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。
蛍光色素としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子、ＣＦ（登録商標、Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）系色素分子、ＤＹ（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）系色素分子、ＣＡＬ（登録商標、ＢｉｏＳｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）系色素分子などを用いることができる。
【００３１】
蛍光色素の具体的な名称は次のとおり例示することができる。５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン  ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（登録商標、アナスペック社製）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ  ５９４（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）、ＭＦＰ  ５９４（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）、５，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィンテトラスルホン酸、亜鉛５，１０，１５，２０−テトラフェニルポルフィンテトラスルホン酸、フタロシアニンテトラスルホン酸、亜鉛フタロシアニンテトラスルホン酸、Ｎ，  Ｎ−Ｂｉｓ−（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１，６，７，１２−（４−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）−ｐｅｒｙｌｅｎ−３，４，９，１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｎａｃｉｄｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ，Ｎ′−Ｂｉｓ（２，６−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）−１，６，７，１２−ｔｅｔｒａｐｈｅｎｏｘｙｐｅｒｙｌｅｎｅ−３，４：９，１０−ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｄｉｉｍｉｄｅ、Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，  ４，４′，４′′，４′′′−［（１，３，８，１０−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−１，３，８，１０−ｔｅｔｒａｏｘｏｐｅｒｙｌｏ［３，４−ｃｄ：９，１０−ｃ′ｄ′］ｄｉｐｙｒａｎ−５，６，１２，１３−ｔｅｔｒａｙｌ）ｔｅｔｒａｌｉｓ（ｏｘｙ）］ｔｅｔｒａｋｉｓ−等を挙げることができる。なお、蛍光色素は、単独でも複数種を混合したものを用いてもよい。
なお、蛍光色素が母体に内包されている場合、蛍光色素は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していてもよいし、していなくてもよい。
【００３２】
（５）組織切片の染色方法
染色方法の一例について説明する。
この染色方法が適用できる組織切片（単に「切片」ともいい、病理切片などの切片も含まれる。）の作製法は特に限定されず、公知の手順により作製されたものを用いることができる。
【００３３】
（５．１）組織標本の作製
（５．１．１）脱パラフィン処理
キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
【００３４】
次いでエタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
【００３５】
水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
【００３６】
（５．１．２）賦活化処理
公知の方法に倣い、目的生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。
ｐＨ条件は用いる組織切片に応じてｐＨ２．０〜１３．０の範囲から、シグナルが出て、組織の荒れがシグナルを評価できる程度となる条件で行う。通常はｐＨ６．０〜８．０で行うが、特殊な組織切片ではたとえばｐＨ３．０でも行う。
加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０〜１３０℃、時間は５〜３０分で行うことができる。
【００３７】
次いでＰＢＳを入れた容器に、賦活処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
【００３８】
（５．２）免疫染色工程
免疫染色工程では、目的生体物質を染色するために、目的生体物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光ナノ粒子を含む免疫染色剤の溶液を、切片に乗せ、目的生体物質との反応を行う。免疫染色工程に用いる免疫染色剤の溶液については、この工程の前にあらかじめ調製しておけばよい。
【００３９】
免疫染色工程を行う上での条件、すなわち免疫染色剤の溶液に組織標本を浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
上述したような処理を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
【００４０】
（５．３）標本後処理工程
免疫染色工程を終えた組織標本は、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
【００４１】
固定化・脱水処理は、組織標本を固定処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノールなどの架橋剤）に浸漬すればよい。透徹処理は、固定化・脱水処理を終えた組織標本を透徹液（キシレンなど）に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた組織標本を封入液に浸漬すればよい。
これらの処理を行う上での条件、たとえば組織標本を所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
【００４２】
（５．４）形態観察染色工程
免疫染色工程とは別に、明視野において細胞、組織、臓器などの形態を観察することができるようにするための、形態観察染色を行う。
形態観察染色工程は、常法に従って行うことができる。
組織標本の形態観察に関しては、細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤〜濃赤色に染色される、エオジンを用いた染色が標準的に用いられている。細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色〜淡青色に染色される、ヘマトキシリンを用いた染色も標準的に用いられている（これら２つの染色を同時に行う方法はヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）として知られている）。
形態観察染色工程は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。
【００４３】
［解析システム］
撮像工程Ｓ２および解析工程Ｓ３では図２の解析システム１を使用する。
解析システム１は顕微鏡１０、解析装置２０および表示装置３０を備えている。顕微鏡１０は光源１２および撮像カメラ１４を備えている。顕微鏡１０にはこれらを制御する解析装置２０が接続され、解析装置２０には顕微鏡画像（図３、図５〜図６参照）や処理結果（図７〜図９参照）などを表示するための表示装置３０が接続されている。
【００４４】
［撮像工程］
（１）明視野画像の取得
撮像工程Ｓ２では、解析装置２０で顕微鏡１０を制御し、形態観察染色後の組織標本Ａを撮像カメラ１４で撮像する。その後、解析装置２０で、撮像カメラ１４の撮像結果を受け、図３Ａのような明視野画像１００を生成する。
【００４５】
（２）蛍光画像の取得
撮像工程Ｓ２では、明視野画像１００の取得とは別に、解析装置２０で顕微鏡１０を制御し、明視野画像１００を取得した際の同一視野において、光源１２から、免疫染色後の組織標本Ａに対し励起光を照射し、免疫染色剤の蛍光ナノ粒子を蛍光発光させて蛍光輝点を出現させ、その蛍光輝点を含む免疫染色像を撮像カメラ１４で撮像する。その後、解析装置２０で、撮像カメラ１４の撮像結果を受け、図３Ｂのような蛍光画像２００を生成する。
なお、励起光の照射は、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる励起光用フィルターを用いることで照射することができる。かかる場合、免疫染色像の撮像のときには、目的とする蛍光のみを含み、目的としない蛍光やノイズとなる励起光およびその他の光を排除した免疫染色像を撮像することができる。
【００４６】
［解析工程］
解析工程Ｓ３では、解析装置２０で、顕微鏡画像を画像処理して一定の統計値を算出し、表示装置３０に表示させる。当該顕微鏡画像はここでは明視野画像１００および蛍光画像２００である。
具体的には、図４に示すとおり、解析装置２０において主に、
（Ｓ３１）顕微鏡画像を一定のサイズで区画する工程と、
（Ｓ３２）顕微鏡画像の染色状態を区画ごとに解析する工程と、
（Ｓ３３）その解析結果に基づき一定の統計値を算出する工程と、の処理を実行する。
【００４７】
なお、解析装置２０は実行部および記憶部を備え、当該記憶部には上記した明視野画像１００および蛍光画像２００の生成、ならびに図４のＳ３１〜Ｓ３３の処理を実行するための目的生体物質の解析プログラムが記憶されている。
ここでは、当該実行部がその目的生体物質の解析プログラムを読み出し、明視野画像１００および蛍光画像２００の生成、ならびに図４のＳ３１〜Ｓ３３の処理を実行するようになっている。
【００４８】
区画化工程Ｓ３１では、はじめに、図５Ａに示すとおり、明視野画像１００からバックグラウンド領域１０２を指定する。
「バックグラウンド領域１０２」とは、後述の解析工程Ｓ３２で蛍光輝点数を算出するための対象区画を決定する際の基準となる領域（基準領域）であって、ここでは細胞がない領域、間質など癌細胞が存在しない領域などが指定される。
その後、図５Ｂに示すとおり、蛍光画像２００から、明視野画像１００のバックグラウンド領域１０２と同じ領域を、バックグラウンド領域２０２として指定する。明視野画像１００からバックグラウンド領域１０２を指定せずに、直接的に蛍光画像２００から蛍光輝点が観察されない領域としてバックグラウンド領域２０２を指定してもよい。
その後、図６Ａに示すとおり、蛍光画像２００を、バックグラウンド領域２０２と同じサイズで区画化し、複数の区画２０４を形成する。あらかじめ蛍光画像２００に複数の区画を形成しておき、それら区画のなかから１つの区画をバックグラウンド領域２０２として指定してもよい。
【００４９】
解析工程Ｓ３２では、蛍光画像２００を画像処理し、蛍光画像２００における、バックグラウンド領域２０２に対応する区画と区画２０４に対応する区画とについて、区画ごとに蛍光輝点数を算出する。
蛍光画像２００の画像処理に用いることができるソフトウエアとしては、たとえば「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）が挙げられる。このような画像処理ソフトウエアを利用することにより、蛍光画像２００から、所定の輝度以上の蛍光輝点数を算出する処理を、半自動的に、迅速に行うことができる。
【００５０】
その後、区画２０４の蛍光輝点数が、バックグラウンド領域２０２の蛍光輝点数以上である（基準領域の基準）かどうかを判別し、図６Ｂに示すとおり、複数の区画２０４を、（ｉ）蛍光輝点
数がバックグラウンド領域２０２の蛍光輝点数未満の区画２０６と、（ｉｉ）蛍光輝点数がバックグラウンド領域２０２の蛍光輝点数以上の区画２０８とに選別し、区画２０６を解析対象から除外し、区画２０８のみを解析対象の区画とする。区画２０６、２０８の選別は、バックグラウンド領域２０２の蛍光輝点数に一定の係数を加えた値を基準としてもよい。
【００５１】
算出工程Ｓ３３では、区画２０８の蛍光輝点数の平均値を算出する。当該平均値は統計値の一例である。図６Ｂでは、縦６×横７の４２個の区画２０４のうち、５個の区画２０６を解析対象から除外し、残り３７個の区画２０８を解析対象とする例を示している。
【００５２】
その後、区画２０８の蛍光輝点数の平均値とタンパク質定量値とを対応付けプロットする。その結果、図７のような相関図を得ることができる。
図７は図１５と同様のサンプルおよび条件で求めた相関図であり、図７では相関係数は０．９９であった。図７の相関図を得るにあたっては、バックグラウンド領域１０２、２０２および区画２０４のサイズ（面積）を、１０μｍ×１０μｍ＝１００μｍ２と設定している。
【００５３】
なお、バックグラウンド領域１０２、２０２および区画２０４のサイズは好ましくは１つの細胞のサイズと同等の１００μｍ２と設定するのがよい。
ただ、バックグラウンド領域１０２、２０２および区画２０４のサイズは変更してもよく、たとえば１つの細胞のサイズに対し１／１０〜１／２倍程度に縮小させてもよいし、２〜１０倍程度に拡大してもよい。
図７の相関図を得るにあたり、バックグラウンド領域１０２、２０２および区画２０４のサイズを縮小および拡大させた場合の相関係数は表１のとおりであった。表１の結果から、バックグラウンド領域１０２、２０２および区画２０４のサイズは、１つの細胞のサイズと同等か、または１／５〜５倍程度に縮小もしくは拡大するのがよい。
【００５４】
【表１】
2016204027.tif 000003
【００５５】
さらにバックグラウンド領域１０２、２０２および区画２０４の形状自体も、４角形状以外の多角形状、円形状、ハニカム状などに変更してもよい。
【００５６】
以上の本実施形態によれば、バックグラウンド領域２０２の蛍光輝点数に基づき、複数の区画２０４を、非解析対象の区画２０６と解析対象の区画２０８とに選別し、区画２０８のみを解析対象として蛍光輝点数の平均値を算出するため、当該統計値が一義的かつ迅速に算出される。そのため、組織切片の種類や診断者による統計値のバラツキを抑制しながら、解析時間を短縮することができる。
【００５７】
［変形例１］
算出工程Ｓ３３では、統計値として蛍光輝点数の中央値を算出してもよい。
すなわち、解析工程３２ではすべての区画２０４を解析対象とし、算出工程３３では区画２０４の蛍光輝点数を加算しその総数の中央値を統計値とする。たとえば、すべての区画２０４の蛍光輝点数の総数が１６０である場合、中央値は８０である。
その後、区画２０４の蛍光輝点数の中央値とタンパク質定量値とを対応付けプロットすると、図８のような相関図を得ることができる。
図８も図１５と同様のサンプルおよび条件で求めた相関図であり、図８では相関係数は０．９８であった。
なお、変形例１では区画２０６、２０８の選別が不要であり、区画化工程Ｓ３１ではバックグラウンド領域１０２、２０２は指定しなくてもよい。
【００５８】
［変形例２］
算出工程Ｓ３３では、統計値として蛍光輝点数のヒストグラムピーク値を算出してもよい。
すなわち、解析工程３２ではすべての区画２０４を解析対象とし、算出工程では、１区画２０４あたりの蛍光輝点数と、すべての区画２０４に対する、一定数の蛍光輝点が存在する区画２０４の割合とを算出してヒストグラムを生成し、細胞株ごとに、ヒストグラムのピーク値に対応する階級値を統計値とする。
図９は図１５と同様のサンプルおよび条件で求めた当該ヒストグラムの一例を示す図である。
図９では、横軸が１区画２０４あたりの蛍光輝点数を示し、縦軸がすべての区画２０４に対する、一定数の蛍光輝点が存在する区画２０４の割合を示している。
図９の例では、たとえば、ＳＫＯＶ−３については、１０個の蛍光輝点が存在する区画の割合が２０％程度と最も多いため、当該ピーク値（２０％）に対応する階級値（階級１０）を統計値とする。これと同様に、Ａ５４９については階級１３であり、Ｃａｌｕ３については階級１５であり、Ｔ４７Ｄについては階級１９であり、ＭＣＦ７については階級２１であり、これら階級値を統計値とする。
その後、区画２０４の蛍光輝点数のヒストグラムピーク値に対応する階級値とタンパク質定量値とを対応付けプロットすると、一定の相関図を得ることができ、当該一定の相関図では相関係数は０．９８であった。
なお、変形例２でも区画２０６、２０８の選別が不要であり、区画化工程Ｓ３１ではバックグラウンド領域１０２、２０２は指定しなくてもよい。
【００５９】
［第２の実施形態］
第２の実施形態は下記の点で第１の実施形態と異なっており、それ以外は同様となっている。
【００６０】
［染色工程］
染色工程Ｓ１では、目的生体物質を含む組織標本Ａに加えて、目的生体物質を含まない組織標本Ｂも作製し、これらを免疫染色用の染色剤や形態観察用の染色剤で免疫染色および形態観察染色する。
「目的生体物質を含まない組織標本Ｂ」とは、検出または定量対象のタンパク質を発現しない培養細胞などの組織標本である。
第２の実施形態では、目的生体物質を含まない組織標本Ｂとして、マウス骨肉腫細胞株ＬＭ８（培養細胞）の組織標本を使用した例について説明する。
【００６１】
［撮像工程］
撮像工程Ｓ２では、形態観察後の組織標本Ａから、図３Ａのような明視野画像１００と図３Ｂのような蛍光画像２００とを生成したのと同様に、形態観察後の組織標本Ｂから、図１０Ａのような明視野画像３００と図１０Ｂのような蛍光画像４００とを生成する。
なお、組織標本Ｂは目的生体物質を含まないため、図１０Ｂに示すとおり、蛍光輝点は基本的には出現しない。
【００６２】
［解析工程］
区画化工程Ｓ３１では、はじめに、図１０Ａに示すとおり、明視野画像３００からバックグラウンド領域３０２を指定する。
「バックグラウンド領域３０２」とは、後述の解析工程Ｓ３２で蛍光輝点数を算出するための対象区画を決定する際の基準となる領域であって、バックグラウンド領域１０２に代わる領域である。
その後、図１０Ｂに示すとおり、蛍光画像４００から、明視野画像３００のバックグラウンド領域３０２と同じ領域を、バックグラウンド領域４０２として指定する。明視野画像３００からバックグラウンド領域３０２を指定せずに、直接的に蛍光画像４００からバックグラウンド領域４０２を指定してもよい。
なお、上記のとおり、組織標本Ｂは目的生体物質を含まない（蛍光輝点は基本的には出現しない）ため、明視野画像３００および蛍光画像４００のいずれの領域からバックグラウンド領域３０２、４０２を指定してもよい。
その後、図６Ａに示すとおり、蛍光画像２００を、バックグラウンド領域４０２と同じサイズで区画化し、複数の区画２０４を形成する。
【００６３】
解析工程Ｓ３２では、図５Ｂのバックグラウンド領域２０２を、図１０Ｂのバックグラウンド領域４０２に置き換え、第１の実施形態と同様の処理を実行する。
【００６４】
その結果、算出工程Ｓ３３では、図７に対応する、図１１のような相関図を得ることができる。
図１１は図１５と同様のサンプルおよび条件で求めた相関図である。図１１では相関係数は０．９９であり、図７の相関図を得るのと同様の精度が保持されていた。図１１の相関図を得るにあたっても、バックグラウンド領域３０２、４０２および区画２０４のサイズ（面積）を、１０μｍ×１０μｍ＝１００μｍ２と設定している。
【００６５】
バックグラウンド領域３０２、４０２および区画２０４のサイズも好ましくは１つの細胞のサイズと同等の１００μｍ２と設定するのがよい。
ただ、バックグラウンド領域３０２、４０２および区画２０４のサイズは変更してもよく、たとえば１つの細胞のサイズに対し１／１０〜１／２倍程度に縮小させてもよいし、２〜１０倍程度に拡大してもよい。
さらにバックグラウンド領域３０２、４０２および区画２０４の形状自体も、４角形状以外の多角形状、円形状、ハニカム状などに変更してもよい。
【００６６】
以上の第２の実施形態によれば、目的生体物質を含まない組織標本Ｂを作製し、組織標本Ｂから明視野画像３００および蛍光画像４００を生成してバックグラウンド領域３０２、４０２を指定し、バックグラウンド領域４０２に基づき統計値を算出している。
第１の実施形態にかかる図７の相関図を得る実験と、第２の実施形態にかかる図１１の相関図を得る実験とを、それぞれ８回繰り返し、ＳＫＯＶ−３、Ａ５４９、Ｃａｌｕ３、Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ７の５種の細胞株についての再現性を検証したところ、図７の相関図を得る実験ではＣＶ値（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）＝（標準偏差／平均値）が８％程度であったのに対し、図１１の相関図を得る実験ではＣＶ値が６．２％と改善されていた。このことから、目的生体物質を含まない組織標本Ｂを作製しそこからバックグラウンド領域４０２を指定することが、統計値のバラツキを抑制するのに特に有用であることがわかった。
【００６７】
［第３の実施形態］
第３の実施形態は下記の点で第１の実施形態と異なっており、それ以外は同様となっている。
【００６８】
［染色工程］
染色工程Ｓ１では、目的生体物質を含む組織標本として、目的生体物質を含む組織自体の組織標本Ｃを作製し、これを免疫染色用の染色剤や形態観察用の染色剤で免疫染色および形態観察染色する。
「組織（自体）」とは、生物学的に細胞より大きい構造体をいい、たとえば、血管、リンパ管、糸球体、腺管、乳管、卵胞などがある。
第３の実施形態では、組織標本Ｃとして老人斑（アルツハイマー病の脳の組織）の組織標本を使用し、抗アミロイドβ抗体を用いて染色した例を説明する。
【００６９】
［撮像工程］
撮像工程Ｓ２では、形態観察後の組織標本Ａから、図３Ａのような明視野画像１００と図３Ｂのような蛍光画像２００とを生成したのと同様に、形態観察後の組織標本Ｃから、図１２Ａのような明視野画像５００と図１２Ｂのような蛍光画像６００とを生成する。
【００７０】
［解析工程］
解析工程Ｓ３では、明視野画像１００および蛍光画像２００を、明視野画像５００および蛍光画像６００に置き換え、第１の実施形態にかかる処理と同様の処理を実行する。
【００７１】
すなわち、解析工程Ｓ３では、解析装置２０で、顕微鏡画像を画像処理して一定の統計値を算出し、表示装置３０に表示させる。当該顕微鏡画像はここでは明視野画像５００および蛍光画像６００である。
【００７２】
区画化工程Ｓ３１では、はじめに、図１２Ａに示すとおり、明視野画像５００からバックグラウンド領域５０２を指定する。
「バックグラウンド領域５０２」とは、後述の解析工程Ｓ３２で蛍光輝点数を算出するための対象区画を決定する際の基準となる領域であって、ここでは老人斑がない領域が指定される。
その後、図１２Ｂに示すとおり、蛍光画像６００から、明視野画像５００のバックグラウンド領域５０２と同じ領域を、バックグラウンド領域６０２として指定する。明視野画像５００からバックグラウンド領域５０２を指定せずに、直接的に蛍光画像６００から蛍光輝点が観察されない領域としてバックグラウンド領域６０２を指定してもよい。
その後、図１３Ａに示すとおり、蛍光画像６００を、バックグラウンド領域６０２と同じサイズで区画化し、複数の区画６０４を形成する。あらかじめ蛍光画像６００に複数の区画を形成しておき、それら区画のなかから１つの区画をバックグラウンド領域６０２として指定してもよい。
【００７３】
解析工程Ｓ３２では、蛍光画像６００を画像処理し、蛍光画像６００における、バックグラウンド領域６０２に対応する区画と区画６０４に対応する区画とについて、区画ごとに蛍光輝点数を算出する。
【００７４】
その後、区画６０４の蛍光輝点数が、バックグラウンド領域６０２の蛍光輝点数以上であるかどうかを判別し、図１３Ｂに示すとおり、複数の区画６０４を、（ｉ）蛍光輝点数がバックグラウンド領域６０２の蛍光輝点数未満の区画６０６と、（ｉｉ）蛍光輝点数がバックグラウンド領域６０２の蛍光輝点数以上の区画６０８とに選別し、区画６０６を解析対象から除外し、区画６０８のみを解析対象とする。区画６０６、６０８の選別は、バックグラウンド領域６０２の蛍光輝点数に一定の係数を加えた値を基準としてもよい。
【００７５】
算出工程Ｓ３３では、区画６０８の蛍光輝点数の平均値を算出する。当該平均値は統計値の一例である。図１３Ｂでは、縦６×横７の４２個の区画６０４のうち、５個の区画６０６を解析対象から除外し、残り３７個の区画６０８を解析対象とする例を示している。
【００７６】
その後、区画６０８の蛍光輝点数の平均値と、目視で蛍光画像６００から老人斑の存在する領域（＝２０μｍ×２０μｍ＝４００μｍ２）を同定し目視で測定した単位面積（４００μｍ２）当たりの蛍光輝点数と、を対応付けプロットすると、図１４のような相関図を得ることができる。
図１４は５種のアルツハイマー検体について求めた相関図であり、図１４では相関係数は０．９９であった。図１４の相関図を得るにあたっては、バックグラウンド領域５０２、６０２および区画６０４のサイズ（面積）を、２０μｍ×２０μｍ＝４００μｍ２と設定している。
【００７７】
なお、バックグラウンド領域５０２、６０２および区画６０４のサイズは好ましくは１つの組織のサイズと同等のサイズに設定するのがよい。
ここでは、バックグラウンド領域５０２、６０２および区画６０４のサイズは老人斑のサイズと同等の４００μｍ２と設定するのがよい。
ただ、バックグラウンド領域５０２、６０２および区画６０４のサイズは変更してもよく、たとえば１つの組織のサイズに対し１／１０〜１／２倍程度に縮小させてもよいし、２〜１０倍程度に拡大してもよい。
図１４の相関図を得るにあたり、バックグラウンド領域５０２、６０２および区画６０４のサイズを縮小および拡大させた場合の相関係数は表２のとおりであった。表２の結果から、バックグラウンド領域５０２、６０２および区画６０４のサイズは、１つの老人斑のサイズと同等か、または１／５〜５倍程度に縮小もしくは拡大するのがよい。
【００７８】
【表２】
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【００７９】
さらにバックグラウンド領域５０２、６０２および区画６０４の形状自体も、４角形状以外の多角形状、円形状、ハニカム状などに変更してもよい。
【００８０】
以上の第３の実施形態によれば、目的生体物質を含む組織自体の組織標本Ｃを作製しこれに基づき統計値を算出しており、組織標本が細胞レベルから組織レベルに変わっても、第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００８１】
なお、第３の実施形態でも、第１の実施形態の変形例１、２と同様に、算出工程Ｓ３３では、統計値として蛍光輝点数の中央値を算出してもよいし、統計値として蛍光輝点数のヒストグラムピーク値を算出してもよい。
第３の実施形態では、第２の実施形態と同様に、目的生体物質を含まない組織自体の組織標本を作製し、当該組織標本から明視野画像および蛍光画像を生成してバックグラウンド領域を指定し、当該バックグラウンド領域に基づき統計値を算出してもよい。たとえば、老人斑に対する、「目的生体物質を含まない組織自体の組織標本」としては、マウスなどの動物実験の場合、若齢の脳やその他には間質、骨格筋組織などの組織標本がある。
【００８２】
［第４の実施形態］
第４の実施形態は、第１の実施形態に記載の「（５．２）免疫染色工程」の代わりに、下記「［生体物質認識部位が結合された蛍光ナノ粒子を用いた染色工程］」としたこと以外は第１の実施形態と同様となっている。
【００８３】
［生体物質認識部位が結合された蛍光ナノ粒子を用いた染色工程］
生体物質認識部位が結合された蛍光ナノ粒子のＰＢＳ分散液を組織切片に載せ、目的とする生体物質と反応させる。蛍光ナノ粒子と結合させる生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光ナノ粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光ナノ粒子ＰＢＳ分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次組織切片に載せてもよい。
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
蛍光ナノ粒子による染色を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳ等、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織切片を浸漬させ、未反応蛍光ナノ粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。カバーガラスを組織切片に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
なお、ＨＥ染色試薬を用いて染色を行う場合、カバーガラスによる封入前にＨＥ染色を行う。その結果、第１の実施形態における結果と同等の輝点計測データを得ることが出来た。
【００８４】
以上の第１〜第４の実施形態は上記に限定されず適宜改良されてもよい。
たとえば、第１〜第４の実施形態（変形例１、２を含む。）では、顕微鏡画像の染色状態を解析する工程で、蛍光画像２００、６００の蛍光輝点数を算出している。
これに代えて、明視野画像１００、５００の染色の色度、色ごとの強度、色ごとの面積などを算出し、その算出結果に基づき統計値を算出してもよい。
【００８５】
さらに、明視野画像、蛍光画像又は蛍光画像からバックグランド領域、細胞がない領域並びに間質など癌細胞が存在しない領域を指定する場合においては、操作者等が操作部などを介して何らかの操作を行うことなく、本発明の目的生体物質の解析装置が全て自動的に処理を行って指定してもよい。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
以上のように、本発明は、組織切片の種類や診断者による統計値のバラツキを抑制しながら、解析時間を短縮することができる目的生体物質の解析装置、解析システム、解析方法および解析プログラムを提供することに適している。
【符号の説明】
【００８７】
１  解析システム
１０  顕微鏡
１２  光源
１４  撮像カメラ
２０  解析装置
３０  表示装置
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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