(57)【要約】要約  糸状菌培養において培養のスケールアップを行っても、培養中の溶存酸素飽和度の低下を抑制可能な、糸状菌によるタンパク質の製造方法が開示されている。タンパク質の製造方法は、セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養することを含む。ＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を用いると、キシロースとセルロースを誘導剤として使用しても、溶存酸素飽和度の低下を抑制することが可能となる。
2017170917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養することを含む、トリコデルマ属真菌によるタンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記誘導剤を５重量％（ｗｔ／ｗｔ）以上培地に添加して培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記誘導剤に含まれるキシランの含有量が１５〜４０重量％である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記トリコデルマ属真菌がトリコデルマ・リーセイである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記トリコデルマ・リーセイがカーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質がセルラーゼ組成物である請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．００６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、セロビオヒドロラーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上、β-グルコシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．２５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記β−キシロシダーゼ比活性が０．００２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、前記β-グルコシダーゼ比活性が０．３Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖とグルコースの製造方法。
【請求項１１】
セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてトリコデルマ属真菌を培養する際の溶存酸素飽和度の減少を抑制する方法であって、前記トリコデルマ属真菌として、ＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を用いる、溶存酸素飽和度の減少抑制方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するセルラーゼ組成物。
（ａ）β−キシロシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．００６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下
（ｂ）セロビオヒドロラーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上
（ｃ）β-グルコシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．２５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上
（ｄ）該セルラーゼ組成物のタンパク質濃度が３ｇ／Ｌ以上
【請求項１３】
前記タンパク質濃度が９ｇ／Ｌ以上である、請求項１２に記載のセルラーゼ組成物。
【請求項１４】
ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロビオシドの分解活性が該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である、請求項１２または１３に記載のセルラーゼ組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリコデルマ属真菌によるタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌はそのタンパク質分泌能力の高さから、タンパク質の生産に非常に適している。それゆえ、これまで糸状菌を使用したタンパク生産方法が数多く行われてきた。しかしながら、糸状菌は好気微生物であるため、糸状菌を液体培養する際には、培地中に酸素を供給して、培養中は、培地中の溶存酸素飽和度を一定以上に保つ必要がある。糸状菌は菌糸を有するため、培養が進むにつれ培地の粘度が高まるという特徴を有している。粘度が高まると、酸素や栄養素の分布が不均一になり、糸状菌の生育や、タンパク質の生産性が低下してしまうので、糸状菌を培養して効率的にタンパク質を生産させるためには、培養液を撹拌したり、酸素供給量を増加させたりする必要がある。【０００３】
また、培養槽が大型化すると、酸素移動容量係数が低くなるため、培養中の溶存酸素飽和度を一定以上に保つためには、撹拌数や酸素供給量を増やす必要がある。しかしながら、撹拌数を増やすと、菌体に大きなせん断ダメージを与えてしまうという課題があり、酸素供給量を増やすためにはより大きなエネルギーが必要になる課題がある。【０００４】
培養液の粘度を低下させる方法として、特許文献１では、培地に菌糸伸長阻害物質を添加して菌糸形態をペレット状にする方法が開示されており、特許文献２には粘度の原因物質となるタンパク質の分泌を抑制した糸状菌の変異株が開示されている。【０００５】
一方、糸状菌を使用してタンパク質の生産量を増加させるためには、タンパク質の生産を誘導する誘導剤を添加する方法が知られており、例えば、特許文献３には、タンパク質としてセルラーゼの生産性を向上させるために、培地にセルロースや場合に応じてキシランなどを誘導剤として添加する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平７−３１４６７
【特許文献２】ＷＯ２０１２０２７５８０
【特許文献３】特開２０１４−１５０７４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、糸状菌培養のスケールアップの主な課題は、スケールアップに伴う撹拌エネルギーの増大と、培養液への酸素供給量であった。また、実施例で後述するように、糸状菌であるトリコデルマ属真菌を培養する際、誘導剤としてセルロースとキシランを添加すると、セルロースまたはキシランを単独で添加する培養と比較して、酸素利用速度が高くなるという課題を新規に見出した。酸素利用速度が高くなると、培養中の溶存酸素飽和度は、さらに低下してしまう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らが鋭意検討した結果、セルロースとキシランを誘導剤として使用しても、トリコデルマ属真菌のβ-キシロシダーゼをコードするＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマを使用すると、トリコデルマ属真菌の酸素利用速度が低下し、培養中の溶存酸素飽和度の低下が抑制されることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１６）を提供する。
（１）セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養することを含む、トリコデルマ属真菌によるタンパク質の製造方法。
（２）前記誘導剤を５重量％（ｗｔ／ｗｔ）以上培地に添加して培養する、（１）に記載の方法。
（３）前記誘導剤に含まれるキシランの含有量が１５〜４０重量％である（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記トリコデルマ属真菌がトリコデルマ・リーセイである、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記トリコデルマ・リーセイがカーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株である、（４）に記載の方法。
（６）前記タンパク質がセルラーゼ組成物である（１）から（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．００６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、セロビオヒドロラーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上、β-グルコシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．２５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である（６）に記載の方法。
（８）前記β−キシロシダーゼ比活性が０．００２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、前記β-グルコシダーゼ比活性が０．３Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である（７）記載の方法。
（９）（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖の製造方法。
（１０）（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖とグルコースの製造方法。
（１１）セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてトリコデルマ属真菌を培養する際の溶存酸素飽和度の減少を抑制する方法であって、前記トリコデルマ属真菌として、ＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を用いる、溶存酸素飽和度の減少抑制方法。
（１２）以下の（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するセルラーゼ組成物。
（ａ）β−キシロシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．００６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下
（ｂ）セロビオヒドロラーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上
（ｃ）β-グルコシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．２５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上
（ｄ）該セルラーゼ組成物のタンパク質濃度が３ｇ／Ｌ以上
（１３）前記タンパク質濃度が９ｇ／Ｌ以上である、（１２）に記載のセルラーゼ組成物。
（１４）ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロビオシドの分解活性が該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である、（１２）または（１３）に記載のセルラーゼ組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を用いると、キシロースとセルロースを誘導剤として使用しても、溶存酸素飽和度の低下を抑制することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の比較例において測定した、ＢＸＬ１遺伝子が破壊されていないトリコデルマ属真菌を培養した際の溶存酸素飽和度の経時変化を示す図である。
【図２】本発明の実施例において測定した、ＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養した際の溶存酸素飽和度の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において誘導剤とは、糸状菌がタンパク質を生産するのを誘導し、タンパク質生産量を増加させる働きのあるものを指す。一般的にはセルロースなどが知られている。本発明において使用される誘導剤はセルロースとキシランを含むバイオマスである。キシランおよびセルロースを含有するバイオマスはキシランおよびセルロースを含有する植物由来の資源であれば特に限定されず、種子植物、シダ植物、コケ植物、藻類、水草などの植物の他、パルプ、廃建材なども用いることができる。種子植物は、裸子植物と被子植物に分類されるが、どちらも好ましく用いることができる。裸子植物の具体例としては、ソテツ、イチョウ、マツ、モミ、トウヒ、スギなどが挙げられる。被子植物はさらに単子葉植物と双子葉植物に分類されるが、単子葉植物の具体例としては、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わらなどが挙げられ、双子葉植物の具体例としては、ビートパルプ、ユーカリ、ナラ、シラカバなどが好ましく用いられる。
【００１３】
これらの誘導剤は培養液に添加しやすいように、処理がされていても良い。具体的な処理方法には、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理など公知の手法を用いることができる。
【００１４】
誘導剤であるバイオマスに含まれるキシラン含有量は、特に限定はされないがバイオマス固形分重量に対して５重量％以上が好ましく、より好ましくは１０重量％以上、さらに好ましくは１５％重量以上であり、さらに好ましくは１５％重量以上５０％重量以下であり、さらに好ましくは１５％重量以上４０％重量以下であり、さらに好ましくは１５％重量以上３０％重量以下である。また、セルロース含有量は、特に限定はされないがバイオマス固形分重量に対して５０重量％以上が好ましく、より好ましくは６０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上、さらに好ましくは８０重量％以上である。なお、当然ながら、キシラン含有量とセルロース含有量の合計が１００重量％を超えることはない。また、バイオマスには、リグニンやヘミセルロース等、セルロースとキシラン以外の成分が含まれていてもよい。バイオマスに含まれるセルロース含有量、キシラン含有量の測定方法は特に限定されないが、具体的には以下の方法で測定することができる。まず、測定したいバイオマス試料を風乾後ウィレーミルなどにより粉砕し、適量を分取し、１０５℃で乾燥後の重量減から水分率（ｗｔ％）を算出する。その後、試料の適量（約０．３ｇ）を天秤ではかりとり、７２％硫酸３ｍＬを加え、３０℃でときどき攪拌しながら１時間放置する。この反応液を精製水８４ｍＬと混合した後、１２０℃で１時間オートクレーブで加熱分解する。加熱分解後、分解液と残渣をろ別し、ろ液と残渣の洗液を加えて１００ｍＬにメスアップし、高速液体クロマトグラフ法により単糖（グルコース、キシロース等）の定量を行う。得られた単糖濃度（グルコース、キシロース）と、試料分解量（水分率から無水ベース重量を算出）から、試料中の含有量（セルロース、キシラン）を算出する。
【００１５】
本発明において誘導剤として使用するバイオマスの添加量は培地に対し終濃度として２重量％以上が好ましい。さらに、誘導剤の添加量が増加すればするほど親株よりも後述の培養期間中の溶存酸素濃度の最低飽和度がより高くなり、タンパク質の生産量が増加するため、より好ましいバイオマスの添加量は、終濃度として４重量％以上、さらに好ましくは５重量％以上、さらに好ましくは６重量％以上、さらに好ましくは７重量％以上、さらに好ましくは８重量％以上である。また、本発明のＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養し、得られたタンパク質をセルラーゼ組成物として使用する際にも、培養時に誘導剤として添加するバイオマスの添加量が増加するほどβ-グルコシダーゼ活性、セロビオハイドラーゼ活性が増加し、β-キシロシダーゼ活性が低下する。グルコースとキシロオリゴ糖の製造に適したセルラーゼ組成物を得るためのバイオマスの添加量は、終濃度として４重量％以上、さらに好ましくは５重量％以上、さらに好ましくは６重量％以上、さらに好ましくは７重量％以上、さらに好ましくは８重量％以上、さらに好ましくは１０重量％以上である。本発明においては酸素要求性の低い糸状菌を使用することで、誘導剤の添加量を増加させ、その結果、糸状菌が産生するタンパク質量を増加させ、糖化反応時にグルコースとキシロオリゴ糖を効率よく生産することができる。ここで、誘導剤を添加する時期については特に限定されないが、培養開始時には添加されてあるのが好ましい。また、誘導剤の添加量が多すぎると攪拌のエネルギーが増加するため、３０重量％以下が好ましく、さらに好ましくは２０重量％以下である。
【００１６】
本発明で用いるトリコデルマ属真菌は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属し、タンパク質を生産する能力を有していれば特に制限はない。好ましくはトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）である。また、トリコデルマ属に由来し、変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施し、タンパク質の生産性が向上した変異株を利用してもよい。例えば、トリコデルマ・リーセイに由来する公知の変異株であるＱＭ６ａ株（ＮＢＲＣ３１３２６）、ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ３１３２９）、ＰＣ−３−７株（ＡＴＣＣ６６５８９）、ＱＭ９１２３株（ＮＢＲＣ３１３２７）、ＲｕｔＣ−３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）、ＣＬ−８４７株（Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０，３４１−３４６（１９８８））、ＭＣＧ７７株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｓｙｍｐ．８, ８９（１９７８））、ＭＣＧ８０株（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１２，４５１−４５９（１９８２））及びこれらの派生株などが挙げられる。
【００１７】
さらに、本発明で用いるトリコデルマ属真菌は、カーボン・カタボライト・リプレッションが解除されていることが好ましい。カーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株は、セルラーゼなどのタンパク質の生産量が向上しているため、より多くのタンパク質を生産することが可能になる。さらに好ましくは、カーボン・カタボライト・リプレッサーＩを介してなされるカーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株であることが好ましい。例えばカーボン・カタボライト・リプレッサーI遺伝子（ｃｒｅ１）に変異が入って入ることによりカーボン・カタボライト・リプレッサ−Ｉを介してなされるカーボン・カタボライト・リプレッションが解除される。ｃｒｅ１遺伝子がコードするＣＲＥ１タンパク質はグルコースによるカタボライト・リプレッションにより、セルラーゼ遺伝子の発現を抑制することが知られている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ., ３７６, １０３−１０７, １９９５）。よってｃｒｅ１遺伝子に変異が入るとセルラーゼ遺伝子の発現抑制が解除され、セルラーゼの生産量が高まる。そのため、ｃｒｅ１遺伝子に変異が入った株はよりタンパク質やセルラーゼ組成物の製造に適する。具体的なカーボン・ｃｒｅ１遺伝子の変異の例としては、ＰＣ−３−７株（ＡＴＣＣ６６５８９）のｃｒｅ１遺伝子において、２３２番目のＡがＣに置換され、その結果アミノ酸配列の７８番目のスレオニンがプロリンに置換されていることが挙げられる。この変異が入ることにより、セルラーゼの生産量が向上することが知られている（Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., ７７ （３）, ５３４−５４３，２０１３）。また、ＲｕｔＣ−３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）ではｃｒｅ１遺伝子が部分的に切断され、カーボン・カタボライト・リプレッションが解除されていることが知られている（ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ.,９, ３２７, ２００８）。ここでｃｒｅ１遺伝子に変異が入っている株とは、遺伝子変異剤、紫外線照射、などによりｃｒｅ１遺伝子領域内の塩基の欠失若しくは挿入によるフレームシフト、又は塩基の置換によるストップコドン変異、又は塩基の切断が入っている株を含み、さらに組換えなどによりｃｒｅ１遺伝子の全部又は一部を除去又は他の遺伝子と置換している株も含まれる。具体的には、ＰＣ−３−７株（ＡＴＣＣ６６５８９）やＲｕｔＣ−３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）さらに、ＰＣ−３−７株（ＡＴＣＣ６６５８９）やＲｕｔＣ−３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）の特徴を引き継いだ株が好ましく用いられ、さらに好ましくは、ＰＣ−３−７株（ＡＴＣＣ６６５８９）または、ＰＣ−３−７株（ＡＴＣＣ６６５８９）の特徴を受け継いだ株である。ここでＰＣ−３−７（ＡＴＣＣ６６５８９）やＲｕｔＣ−３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）の特徴を引き継いだ株には、ＰＣ−３−７株（ＡＴＣＣ６６５８９）やＲｕｔＣ−３０株（ＡＴＣＣ５６７６５）の特徴を引き継いだ株に新たに変異を加えた株や組換えにより機能を向上させた株も含まれる。
【００１８】
本発明ではＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養する。ＢＸＬ１遺伝子は、β−キシロシダーゼ活性を有する。β-キシロシダーゼは、キシロースがβ-１，４-結合したキシロビオースを分解してキシロースを産生する酵素である。β−キシロシダーゼ活性の測定方法は特に限定されないが、例えば、ｐ-ニトロフェニル-β-キシロピラノシド（ｐＮＰ−Ｘｙｌ）を基質として活性を測定することができる。具体的には以下の通りである。セルラーゼの最適ｐＨであるｐＨ５．０に調整した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に、１ｍＭとなるようにｐ−ニトロフェニル―β―Ｄ―キシロピラノシドを溶解したものを基質溶液として、９０μＬの基質溶液に酵素液１０μＬを添加し、３０℃で静置反応させる。反応時間は３０分間を基本とし、酵素活性の高さに応じて１０〜６０分間まで適宜変更する。反応後、炭酸ナトリウム溶液１０μＬを添加して反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定することでｐ−ニトロフェノールを定量する。上記反応系にて、１分間に１μｍｏｌのｐ―ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕとして定義する。本発明では活性は酵素液中に含まれるタンパク質１ｍｇ当たりのＵとして算出する。
【００１９】
タンパク質濃度の測定方法は特に限定されないが、例えば、市販のタンパク質濃度測定試薬（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を使用して測定することができる。具体的には以下の通りである。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬２５０μＬに希釈した酵素液を５μＬ添加し、室温で５分間〜４０分間静置後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定する。標準品としてＢＳＡを使用し、検量線に照らし合わせてタンパク質濃度を算出する。
【００２０】
本発明で「ＢＸＬ１遺伝子が破壊された」とはＢＸＬ１遺伝子内に変異、挿入、欠失があり、β-キシロシダーゼ活性が低下することを指す。
【００２１】
本発明で、β―キシロシダーゼ活性が低下するとは、ＢＸＬ１遺伝子を破壊する前の親株と比較して、β-キシロシダーゼ活性が低下していることを指す。β―キシロシダーゼ活性は、ＢＸＬ１遺伝子の破壊前に比べて、２分の１以下に低下していることが好ましく、より好ましくは５分の１以下、より好ましくは１０分の１以下に低下、より好ましくは２０分の１以下、さらに好ましくは５０分の１以下、特に好ましくは８０分の１以下、最も好ましくは１００分の１以下である。ＢＸＬ１遺伝子を破壊する方法は特に限定されないが、例えば、遺伝子変異剤、紫外線照射、などによる遺伝子変異処理、部位特異的変異法等により、ＢＸＬ１遺伝子にフレームシフト変異を導入したり、ストップコドンを挿入したりすることにより行うことができ、また、遺伝子組換え（他の遺伝子との相同組み換え等、下記実施例参照）により、ＢＸＬ１遺伝子の全部又は一部を除去又は他の遺伝子と置換することにより行うことができる。トリコデルマ属真菌のＢＸＬ１遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ；１８４８３０６０）は公知であるので、ＢＸＬ１遺伝子の破壊は常法により容易に行うことができる。
【００２２】
次に本発明におけるトリコデルマ属真菌の培養方法について説明する。培養方法については特に制限はなく、タンパク質が生産される方法であれば良く、トリコデルマ属真菌の培養に常用されている方法を採用することができる。使用する培地に含まれる炭素源としては上述した誘導剤に用いるセルロースとキシランを含むバイオマスが好ましく使用される。窒素源としては、例えば、ポリペプトン、肉汁、CSL、大豆かすなどが用いられる。その他、この培地には目的とするセルラーゼを生産する上で必要とされる成分を添加することができる。培養には、振とう培養、撹拌培養、撹拌振とう培養、静置培養、連続培養など、様々な培養方式を採用しうるが、好ましくは、振とう培養または撹拌培養である。培養温度は、通常、２０℃〜３５℃、好ましくは２５℃〜３１℃である。
【００２３】
本発明のＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌は、破壊される前の親株よりもタンパク質濃度が増加し、よりタンパク質の製造に適する。タンパク質濃度の増加率は増加していれば特に限定はされないが０．０１％以上であることが好ましく、さらに好ましくは０．０２％以上、さらに好ましくは０．０４％以上、さらに好ましくは０．０５％以上、さらに好ましくは０．０６％以上、さらに好ましくは０．０８％以上、さらに好ましくは０．１％以上、さらに好ましくは０．５％以上、さらに好ましくは１％以上、さらに好ましくは２％以上、さらに好ましくは３％以上、さらに好ましくは４％以上、さらに好ましくは５％以上、さらに好ましくは６％以上、さらに好ましくは７％以上、さらに好ましくは８％以上、さらに好ましくは９％以上、さらに好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１１％以上、さらに好ましくは１２％以上である。
【００２４】
本発明では、トリコデルマ属真菌のＢＸＬ１遺伝子を破壊することによって、セルロースとキシランを誘導剤として培地に添加して培養した際のトリコデルマ属真菌の酸素利用速度（Ｏｘｙｇｅｎ  Ｕｐｔａｋｅ  Ｒａｔｅ）が低下し、培養中の溶存酸素飽和度を抑制することができる。
【００２５】
セルロースとキシランを誘導剤として培地に添加して培養した際にＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌と、破壊される前の親株を同様の条件で培養すると、ＢＸＬ１遺伝子が破壊された株は、破壊される前の親株と比べて、培養液中の酸素利用速度（ＯＵＲ）が顕著に低下し、培養中の溶存酸素飽和度は増加する。
【００２６】
本発明における酸素利用速度（ｍＭ／Ｌ／ｈｒ）は培養開始後２４時間後の単位時間当たりの培養液１Ｌ当たりの酸素消費速度のことを指す。具体的な算出方法は、培養条件を一定に保って培養を行い、培養開始後２４時間時点で酸素の供給を止め、溶存酸素（ｍｇ／Ｌ）の値（ＤＯ値）を１０秒間ごとにプロットし、その曲線の中で対数的に減少している３点以上のプロットについて、その傾き（Ａ）（単位；ｍｇ／Ｌ／sec）を求める。酸素利用速度の算出式は以下である。
【００２７】
酸素利用速度（ｍＭ／Ｌ／ｈｒ）＝（−Ａ）×（１／３２）×６０×６０・・・（式１）。
ＤＯ値の測定には市販のＤＯ計を使用することができる。使用するＤＯ計には特に制限はなく、ＤＯ値を正確に測定できるものであれば良い。例として、密閉型ＤＯ電極（エイブル株式会社）や溶存酸素センサ（メトラー・トレド株式会社）などが挙げられる。ＤＯ計は予め０点校正とスパン校正を行っておく。０点校正は亜硫酸ソーダ２％溶液を使用して行う。スパン校正は実際に培養する条件において菌体が存在しない状態で通気、攪拌を行い、溶存酸素が飽和になるまで待ち、その後計器の指示値が安定していることを確認し、その温度での飽和溶存酸素に合わせて校正を行う。また、培養槽を加圧してＤＯ測定を行う際は、圧補正を行う必要がある。さらに、培養槽が大きい場合は静水圧補正を行う必要がある。補正を行う際の計算式は以下である。
Ｄ＝ＤＯ（１＋α＋β）・・・（式２）
Ｄ：補正した飽和溶存酸素
ＤＯ：１気圧、純水中での飽和溶存酸素
α：ゲージ圧（ｋｇ／ｃｍ２）
β：静水圧（ＤＯ計取り付け位置の液深(ｍ)／１０）
【００２８】
溶存酸素飽和度は、培養開始前の飽和溶存酸素を１００％とした場合、飽和溶存酸素に対する培養期間中の溶存酸素の割合を溶存酸素飽和度として算出する。溶存酸素（ｍｇ／Ｌ）は、水中に溶解している酸素の濃度を表す。飽和溶存酸素とは、実際に培養を行なう培養条件において、菌体が存在しない状態で通気、攪拌を行い、溶存酸素が一定になった状態での溶存酸素のことを指す。また、溶存酸素飽和度を算出する際は、培養期間中に通気条件など培養条件を変化させることはしないこととする。酸素要求性が低下すると、溶存酸素飽和度は増加する。溶存酸素飽和度の算出方法は以下である。
溶存酸素飽和度（％）＝（培養中の溶存酸素）／（培養開始前の飽和溶存酸素）×１００・・・（式３）。
【００２９】
本明細書中では、培養期間中の溶存酸素飽和度を経時的に測定した際、最も溶存酸素飽和度が低下した値を最低飽和度と記載する。最低飽和度の値が高いほどスケールアップに適している。
【００３０】
酸素利用速度や、溶存酸素飽和度を比較する場合には、培地、酸素供給量、撹拌速度、温度、培養容量、植菌量などの培養条件を揃えることが望ましい。植菌量は本培養液に対し、１０％（ｖ／ｖ）で行うのが良い。
【００３１】
ＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌と、破壊される前の親株を同様の条件で培養すると、ＢＸＬ１遺伝子が破壊された株は、破壊されていない株に比べて、最低飽和度の値が高くなり、好ましくは１％以上、より好ましくは２％以上、より好ましくは４％以上、より好ましくは５％以上、さらに好ましくは６％以上、さらに好ましくは７％以上、さらに好ましくは８％以上、さらに好ましくは９％以上、さらに好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１１％以上、さらに好ましくは１２％以上、さらに好ましくは１３％以上、さらに好ましくは１４％以上、特に好ましくは１５％以上高くなる。
【００３２】
本発明ではタンパク質の製造方法を提供している。本発明におけるタンパク質としては特に限定はされないが、工業、医療、農業、食品などの分野で使用されるタンパク質が例として挙げられる。これらのタンパク質は糸状菌由来の天然タンパク質だけではなく、糸状菌由来以外の異種タンパク質を糸状菌で生産させても良い。具体的なタンパク質の例としては、セルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、リアーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、クロロフィラーゼ、ヒドロホビン、キモシン、炭酸脱水酵素、チミジル酸シンターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チロシンキナーゼ、多剤耐性タンパク質、カルミバル-Ｐシンターゼ、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼ、ジヒドロオロターゼ、トポイソネラーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ、並びに抗体、糸状菌で発現することができる他の酵素および非酵素タンパク質が挙げられる。使用するプロモーターは特に限定はされないが、発現量が高いセロビオハイドラーゼ遺伝子やエンドグルカナーゼ遺伝子、キシラナーゼ遺伝子のプロモーターを使用して、目的遺伝子を発現させるのが好ましい。
【００３３】
本発明ではさらに、本発明の製造方法で得られたタンパク質をセルラーゼ組成物として使用することも提供する。本発明におけるセルラーゼ組成物とは、β−１，４−グルカンのグリコシド結合を加水分解する種々の加水分解酵素の混合物である。セルラーゼに含まれる加水分解酵素とは例えば、セロビオハイドラーゼ、キシラナーゼ、エンドグルカナーゼ、β―グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、キシランエステラーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、α‐グルクロニダーゼ、キトサナーゼ、キチナーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、α‐ガラクトシダーゼ、β‐ガラクトシダーゼなどが挙げられる。
【００３４】
本発明のＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養して得られたセルラーゼ組成物は、破壊される前の親株を培養して得られたセルラーゼ組成物よりもβ−グルコシダーゼ活性が増加し、糖化反応時のグルコース生産量が増加するため、グルコースの製造に適する。β-グルコシダーゼ活性の増加率は増加していれば特に限定はされないが、０．５％以上が好ましく、より好ましくは１％以上、さらに好ましくは２％以上、さらに好ましくは３％以上、さらに好ましくは４％以上、さらに好ましくは５％以上である。
【００３５】
本発明で得られたセルラーゼ組成物のβ―キシロシダーゼ、β―グルコシダーゼ、セロビオハイドラーゼ活性は以下のように定義される。β―キシロシダーゼは上述したように測定することができ、その値は具体的には０．０４０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０３０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下であり、さらに好ましくは０．０２０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下であり、さらに好ましくは０．０１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、さらに好ましくは０．００８０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下であり、さらに好ましくは０．００６０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下であり、さらに好ましくは０．００５０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下であり、さらに好ましくは０．００４０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下であり、さらに好ましくは０．００３Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下であり、さらに好ましくは０．００２０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下である。
【００３６】
β−グルコシダーゼ活性の測定方法は特に限定されないが、例えば、ｐ-ニトロフェニル-β-グルコピラノシド（ｐＮＰ−ｇｙｌ）を基質として活性を測定することができる。具体的には以下の通りである。セルラーゼの最適ｐＨであるｐＨ５．０に調整した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に、１ｍＭとなるように４−ニトロフェニル―β―Ｄ―グルコピラノシドを溶解したものを基質溶液として、９０μＬの基質溶液に酵素液１０μＬを添加し、３０℃で静置反応させる。反応時間は１０分間を基本とし、酵素活性の高さに応じて１０〜６０分間まで適宜変更する。反応後、炭酸ナトリウム溶液１０μＬを添加して反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定することでｐ−ニトロフェノールを定量する。上記反応系にて、１分間に１μｍｏｌのｐ―ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕとして定義する。本発明で得られたセルラーゼ組成物のβ―グルコシダーゼ活性の値は０．２００Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であることが好ましく、さらに好ましくは０．２５０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．２８０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．３００Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．３２０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である。
【００３７】
セロビオハイドロラーゼ活性の測定方法は特に限定されないが、例えば、ｐ-ニトロフェニル-β-ラクトピラノシド（ｐＮＰ−ｌａｃ）を基質として活性を測定することができる。具体的には以下の通りである。セルラーゼの最適ｐＨであるｐＨ５．０に調整した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に、１ｍＭとなるようにｐ−ニトロフェニル―β―Ｄ―ラクトピラノシドを溶解したものを基質溶液として、９０μＬの基質溶液に酵素液１０μＬを添加し、３０℃で静置反応させる。反応時間は６０分間を基本とし、酵素活性の高さに応じて１０〜６０分間まで適宜変更する。反応後、炭酸ナトリウム溶液１０μＬを添加して反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定することで４−ニトロフェノールを定量する。上記反応系にて、１分間に１μｍｏｌのｐ―ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕとして定義する。本発明で得られたセルラーゼ組成物のセロビオハイドロラーゼ活性の値は０．１００Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であることが好ましく、さらに好ましくは０．１２０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．１５０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．１６０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である。
【００３８】
本発明で製造されたセルラーゼ組成物の使用方法は特に限定されないが、糖の製造に好ましく使用される。さらに好ましくはキシロオリゴ糖の製造に使用され、さらに好ましくはキシロオリゴ糖とグルコースの製造に使用される。
【００３９】
本発明におけるキシロオリゴ糖とは、少なくともキシロースが２個以上β−グリコシド結合で連結したキシロオリゴ糖のことを指す。キシロオリゴ糖の重合度は、特に限定されないが、水溶性が高い２糖（キシロビオース）から６糖（キシロヘキサオース）であることが好ましい。最も好ましくは、腸内細菌が炭素源として資化しやすい、キシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオースを含むことが好ましい。
【００４０】
本発明においてセルラーゼ組成物はトリコデルマ属真菌を培養して得られ、バイオマスの糖化反応に使用される。セルラーゼ組成物の調整方法は特に限定はされないが、培養液に含まれるトリコデルマ属真菌の菌体が除去、もしくは生育していないことが好ましい。これはセルラーゼ組成物とバイオマスを糖化反応する際に生じるグルコースやキシロオリゴ糖が菌体により消費されるのを防ぐためである。菌体の除去方法としては、遠心分離、膜分離などが例として挙げられる。菌体が生育しないようにする処理方法としては、熱処理、薬剤処理、酸・アルカリ処理、ＵＶ処理などが挙げられる。
【００４１】
トリコデルマ属真菌を培養して得られたセルラーゼ組成物を用いて糖を製造する方法は特に限定されないが、セルラーゼ組成物でバイオマスを糖化することができる。糖化反応に使用するバイオマスは上述したセルロースとキシランを含むバイオマスが利用できる。また、糖化反応に使用するバイオマスはあらかじめ前処理を行っていても良い。前処理方法としては、特に限定されないが、具体的には、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、アルカリ処理、水熱処理、亜臨界処理、微粉砕処理、蒸煮処理など公知の手法を用いることができる。また、反応ｐＨに関しても特に限定はされないが、ｐＨが３から７付近が好ましく、より好ましくは４から６であり、より好ましくは５付近である。反応温度についても特に限定はされないが、４０度から７０度が好ましい。
【００４２】
糖化反応によって、キシロオリゴ糖を得ることが出来る。またはキシロオリゴ糖とグルコースを得ることができる。キシロオリゴ糖とグルコース以外に、セルラーゼ組成物に含まれる加水分解酵素によって生じたマンノース、アラビノース、ガラクトースなどの単糖や、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、マンノビオース、ガラクトビオースなどのオリゴ糖などが含まれていてもよい。
【００４３】
本発明の糖化反応から製造される反応後液には、不純物として、無機塩、アミノ酸、タンパク質、リグニンなども含まれていてもよく、またこれらの不純物を除去するために、精製操作を行ってもよい。精製操作としては、イオン交換、膜分離、晶析、脱塩など公知の手法が適用できる。
【００４４】
本発明により製造された単糖画分（グルコース、キシロース等）とキシロオリゴ糖等画分は後工程により分離されることが好ましい。グルコースは発酵原料として化学品の製造に好ましく使用され、キシロオリゴ糖は飼料や食品、化粧品用途に好ましく使用される。化学品の具体例としては、エタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸などの有機酸、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、カダベリンなどのアミン化合物を挙げることができる。一方、キシロースは発酵原料として使用できる微生物が限られている。さらにキシロースは飼料として豚等に与えると半分程度が尿として排出されてしまう。このため、キシランおよびキシロオリゴ糖からキシロースへの分解を最小限に抑え、キシロオリゴ糖収率を向上させることが好ましい。
【００４５】
本発明で単糖画分とキシロオリゴ糖画分の分離方法は特に限定はされないが、膜分離が好ましく用いられる。この際にキシロースの割合が少ないほどキシロオリゴ糖、セロビオースなどオリゴ糖画分に混入するキシロースの量が低下するため、膜分離工程において有利に働く。
【００４６】
本発明では更にキシロオリゴ糖とグルコースの製造に適したセルラーゼ組成物も提供する。本発明のセルラーゼ組成物はβ-キシロシダーゼ活性、セロビオハイドラーゼ活性、β-グルコシダーゼ活性、タンパク質濃度が以下の特徴を有するように定義される。β―キシロシダーゼ活性は上述したように測定することができ、その値は具体的には該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｍｇ当たり０．００６Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下であり、さらに好ましくは０．００５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、さらに好ましくは０．００４Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、さらに好ましくは０．００３Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、さらに好ましくは０．００２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下である。セロビオハイドラーゼ活性は上述したように測定することができ、その値は具体的には該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｍｇ当たり０．１００Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であることが好ましく、さらに好ましくは０．１２０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．１５０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．１６０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である。β―グルコシダーゼ活性は上述したように測定することができ、その値は具体的には該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｍｇ当たり０．２００Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であることが好ましく、さらに好ましくは０．２５０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．２８０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．３００Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．３２０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である。タンパク質濃度は上述したように測定することができ、その値は３ｇ／Ｌ以上が好ましく、さらに好ましくは４ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは５ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは６ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは７ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは８ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは９ｇ／Ｌ以上である。
【００４７】
本発明のセルラーゼ組成物はｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ−キシロビオシドの分解活性を定義することで更にキシロオリゴ糖とグルコースの製造に適したセルラーゼ組成物を提供する。ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ−キシロビオシドの分解活性はｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ−キシロビオシドを基質として活性を測定することができる。具体的には以下の通りである。セルラーゼの最適ｐＨであるｐＨ５．０に調整した５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に、０．５ｍＭとなるようにｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ−キシロビオシドを溶解したものを基質溶液として、９０μＬの基質溶液に酵素液１０μＬを添加し、３０℃で静置反応させる。反応時間は３０分間を基本とし、酵素活性の高さに応じて１０〜６０分間まで適宜変更する。反応後、炭酸ナトリウム溶液１０μＬを添加して反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定することでｐ−ニトロフェノールを定量する。上記反応系にて、１分間に１μｍｏｌのｐ―ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕとして定義する。本発明で得られたセルラーゼ組成物のｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ−キシロビオシドの分解活性の値は２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であることが好ましく、さらに好ましくは３Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは４Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である。
【００４８】
上記のとおり、本発明によりトリコデルマ属真菌によりタンパク質の製造することにより溶存酸素飽和度の減少が抑制されるので、本発明は、また、セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてトリコデルマ属真菌を培養する際の溶存酸素飽和度の減少を抑制する方法であって、前記トリコデルマ属真菌として、ＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を用いる、溶存酸素飽和度の減少抑制方法をも提供するものである。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００５０】
参考例１    タンパク質濃度測定方法
市販のタンパク質濃度測定試薬（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬２５０μＬに希釈した糸状菌由来セルラーゼ溶液を５μＬ添加し、室温で５分間静置後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。標準品としてＢＳＡを使用し、検量線に照らし合わせてタンパク質濃度を算出した。【００５１】
参考例２    β-キシロシダーゼ活性測定方法
１ｍＭｐ-ニトロフェニル-β-キシロピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ-ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは  １ｍＭｐ-ニトロフェニル-β-キシロピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。この際に４０５ｎｍの吸光度が１を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はｐ−ニトロフェノール溶液を濃度０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように調製し、酵素希釈液の代わりに１０μＬを入れ、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。【００５２】
参考例３    β-グルコシダーゼ活性測定方法
１ｍＭｐ-ニトロフェニル-β-グルコピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加して３０℃で１０分間反応させた。その後２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ-ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは  １ｍＭｐ-ニトロフェニル-β-グルコピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。この際に４０５ｎｍの吸光度が１を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はｐ−ニトロフェノール溶液を濃度０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように調製し、酵素希釈液の代わりに１０μＬを入れ、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。【００５３】
参考例４    セロビオハイドロラーゼ活性測定方法
１ｍＭｐ-ニトロフェニル-β-ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で６０分間反応させた。その後、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ-ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは  １ｍＭｐ-ニトロフェニル-β-ラクトピラノシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。この際に４０５ｎｍの吸光度が１を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はｐ−ニトロフェノール溶液を濃度０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように調製し、酵素希釈液の代わりに１０μＬを入れ、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。【００５４】
参考例５    ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ−キシロビオシドの分解活性測定方法
０．５ｍＭｐ-ニトロフェニル-β-ラクトピラノシド（社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに酵素希釈液１０μＬを添加し５０℃で３０分間反応させた。その後、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。１分間あたり１μｍｏｌのｐ-ニトロフェノールを遊離する活性を１Ｕと定義した。ブランクは  １ｍＭｐ-ニトロフェニル-β-キシロビオシドを含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合し、その後酵素希釈液１０μＬを添加し３０℃で３０分間反応させた。その後、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定した。この際に４０５ｎｍの吸光度が１を超えないように酵素液を希釈しておいた。また、検量線はｐ−ニトロフェノール溶液を濃度０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭになるように調製し、酵素希釈液の代わりに１０μＬを入れ、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して発色させ、測定した吸光度から作成した。【００５５】
参考例６    糖濃度の測定
キシロオリゴ糖、グルコース、キシロースは、日立高速液体クロマトグラフ  ＬａＣｈｒｏｍ  Ｅｉｔｅ（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて、以下の条件で定量分析した。【００５６】
キシロオリゴ糖であるキシロビオース、キシロトリオース、キシロテトラオース、キシロペンタオース、キシロヘキサオース、およびグルコース、キシロースの標品で作製した検量線をもとに、定量分析した。なお、本実施例で記すキシロオリゴ糖とは、キシロース単位がβグリコシド結合により２〜６個結合したキシロオリゴ糖を指す。
カラム：ＫＳ８０２、ＫＳ８０３（Ｓｈｏｄｅｘ）
移動相：水
検出方法：ＲＩ
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
温度：７５℃【００５７】
実施例１    ＰＣ−３−７株のＢＸＬ１遺伝子破壊組み換え株の作製
ＰＣ−３−７株のＢＸＬ１遺伝子のＯＲＦ領域を、アセトアミドダーゼ（ＡｍｄＳ）遺伝子で置換することによって、ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を作製し、ＢＸＬ１遺伝子が破壊された株として以下の実験に用いた。すなわち、ＡｍｄＳ遺伝子を含むＤＮＡ配列の上流及び下流に、ＢＸＬ１遺伝子座の導入目的箇所に相同的な部分を付加するように破壊用プラスミドを作製し、デザインしたプライマー（配列番号１、配列番号２）を用いて相同領域を含んだＡｍｄＳ遺伝子をＰＣＲで増幅させ、得られたＰＣＲ断片をＰＣ−３−７株に形質転換した。形質転換は、標準的な方法であるプロトプラスト-ＰＥＧ法で行った。より具体的には、相同組み換え及び形質転換はＧｅｎｅ，６１，１６５−１７６（１９８７）に記載されたようにして行った。【００５８】
比較例１    ＰＣ−３−７を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（誘導剤８％添加）
前培養
トリコデルマ・リーセイ  ＰＣ−３−７株の胞子を１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液２．５ｍＬを１Ｌバッフル付フラスコに入れた表１に記した組成で構成される前培養液２５０ｍＬへ接種させた。接種させた前培養液を２８℃、１６０ｒｐｍの培養条件にて３日間培養を行った。この際の培養液当たりの乾燥菌体量を測定したところ、１１ｍｇ／ｍＬであった。【００５９】
【表１】
2017170917.tif 000003
＊微量元素溶液は、０．３ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、１．３ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１０ｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２を含む。
＊＊マンデルスは、７ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、３ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、３ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む。【００６０】
本培養
トリコデルマ・リーセイ  ＰＣ−３−７株の前培養液１０ｍＬをそれぞれ２００ｍＬ容ミニジャーに入れた表２に示した本培養液１００ｍＬ（バイオマス１０ｇをさらに含む）へ接種させ、２８℃、７００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５の培養条件にて５日間培養を行った。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、８重量％（ｗｔ／ｗｔ）であった。中和は３．３％アンモニアと０．２Ｎ硫酸を使用した。使用したバイオマスは、セルロースとキシランを含むＡｒｂｏｃｅｌ(登録商標)（Ｊ．Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ＆Ｓｏｈｎｅ）を使用した。ＤＯ計は密閉型溶存酸素電極ＳＤＯＣ−１２Ｆ−Ｌ１２０（エイブル株式会社）を使用した。また、培養槽の加圧は行わなかった。【００６１】
【表２】
2017170917.tif 000004
＊微量元素溶液は、０．３ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、１．３ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１０ｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２を含む。
＊＊マンデルスは、７ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、３ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、３ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む。
＊＊＊バイオマスは他成分を混合し、メスアップした後に添加する。【００６２】
培養液の採取
培養開始より１日おきに５００μＬずつ培養液を採取した。そして、１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液を培養上清液とし、タンパク質濃度を測定した。酵素活性測定には培養５日目の培養上清液を使用した（表３）。【００６３】
【表３】
2017170917.tif 000005
【００６４】
酸素利用速度の算出
培養開始２４時間後に酸素供給を停止し、培養液の溶存酸素量の値（ＤＯ値）の経時変化を１０秒ごとに測定し、プロットした。プロットした曲線の中で対数的に減少している３点以上のプロットの傾きを求め、その傾きから酸素利用速度を求めた（表４）。【００６５】
【表４】
2017170917.tif 000006
【００６６】
実施例２    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（誘導剤８％添加）
使用株を実施例１で作製したトリコデルマ・リーセイ  ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株にする以外は比較例１と同様にして、酵素活性（表３）、酸素利用速度（表４）を求めた。また、その際の前培養液当たりの乾燥菌体量を測定した結果、１１ｍｇ／ｍＬであり、親株（ＰＣ−３−７株）と同じであった。活性測定の結果、親株（ＰＣ−３−７株）と比較してβ-キシロシダーゼ活性が１００分の１以下に低下し、β-グルコシダーゼ活性が増加していることが判明した。さらに、酸素利用速度は比較例１の親株の結果と比較して実施例２のＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株では半分以下の３６％に低下していることが判明した。なお、誘導剤として用いたバイオマスは、Ａｒｂｏｃｅｌ（商品名）であり、セルロース含有量が約８０重量％、キシラン含有量が約２０重量％である。【００６７】
比較例２    ＰＣ−３−７株を用いたキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（誘導剤８％添加）【００６８】
誘導剤として、ｂｅｅｃｈ  ｗｏｏｄ  ｘｙｌａｎ（シグマアルドリッチ社製）を使用すること以外は比較例１と同様にして、酸素供給速度を算出した（表４）。【００６９】
比較例３    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（誘導剤８％添加）
誘導剤として、ｂｅｅｃｈ  ｗｏｏｄ  ｘｙｌａｎ（シグマアルドリッチ社製）を使用し、使用株をトリコデルマ・リーセイ  ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株にする以外は比較例１と同様にして、酸素利用速度（表４）を求めた。その結果、キシランを誘導剤として使用した場合には、親株（ＰＣ−３−７株）の培養結果（比較例２）と比較すると、比較例３の酸素利用速度は、親株の２９６％に増加した。【００７０】
比較例４    ＰＣ−３−７を用いたセルロースを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（誘導剤８％添加）
誘導剤として、微結晶セルロースであるＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）を使用すること以外は比較例１と同様にして、酸素利用速度を算出した（表４）。【００７１】
比較例５    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（誘導剤８％添加）
誘導剤として、Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）を使用し、使用株をトリコデルマ・リーセイ  ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株にする以外は比較例１と同様にして、酸素利用速度（表４）を求めた。その結果、セルロースを誘導剤として使用した場合には、親株（ＰＣ−３−７株）の培養結果（比較例４）と比較すると、比較例５の酸素利用速度は、親株の７３％に低下した。【００７２】
比較例１〜５と実施例２の培養結果から、セルロースとキシランを誘導剤として使用した場合、親株ではセルロース単独、またはキシラン単独を誘導剤として添加した場合と比較して酸素利用速度が著しく増加してしまうことがわかった。さらに、ＢＸＬ１遺伝子を破壊することで、セルロースとキシランを誘導剤として使用した場合には酸素利用速度が著しく低下することがわかった。また、セルロースとキシラン、セルロース単独を誘導剤として添加した際に得られた培養液のタンパク質濃度はほぼ同等であった。一方、キシラン単独を誘導剤として添加した際に得られた培養液のタンパク質濃度は非常に低く、セルロースとキシランを誘導剤として添加した際と比較して１０分の１以下に低下しており、タンパク質の製造に不適であることがわかった。【００７３】
比較例６    ＰＣ−３−７を用いたセルローとキシランを誘導剤として添加した培養評価（誘導剤８％添加）
本培養液１００ｍＬに対し、誘導剤として、微結晶セルロースであるＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）を８．５ｇ、ｂｅｅｃｈ  ｗｏｏｄ  ｘｙｌａｎ（シグマアルドリッチ社製）を１．５ｇ使用すること以外は比較例１と同様にして、酸素利用速度を算出した（表５）。その結果、キシラン含有量が１５重量％の誘導剤を使用した場合には、キシラン単独（比較例２）、またはセルロース単独（比較例４）の誘導剤を使用した場合と比較して、酸素利用速度は大幅に増加していることがわかった。【００７４】
実施例３    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルローとキシランを誘導剤として添加した培養評価（誘導剤８％添加）
本培養液１００ｍＬに対し、誘導剤として、微結晶セルロースであるＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）を８．５ｇ、ｂｅｅｃｈ  ｗｏｏｄ  ｘｙｌａｎ（シグマアルドリッチ社製）を１．５ｇ使用すること以外は比較例１と同様にして、酸素利用速度を算出した（表５）。その結果、キシラン含有量が１５重量％の誘導剤を使用した場合には、親株（ＰＣ−３−７株）の培養結果（比較例６）と比較すると、実施例３の酸素利用速度は、親株の５６％に低下した。【００７５】
【表５】
2017170917.tif 000007
【００７６】
比較例７    ＰＣ−３−７を用いたセルローとキシランを誘導剤として添加した培養評価（誘導剤８％添加）
本培養液１００ｍＬに対し、誘導剤として、微結晶セルロースであるＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）を７ｇ、ｂｅｅｃｈ  ｗｏｏｄ  ｘｙｌａｎ（シグマアルドリッチ社製）を３ｇ使用すること以外は比較例１と同様にして、酸素利用速度を算出した（表５）。その結果、キシラン含有量が３０重量％の誘導剤を使用した場合には、キシラン単独（比較例２）、またはセルロース単独（比較例４）の誘導剤を使用した場合と比較して、酸素利用速度は大幅に増加していることがわかった。【００７７】
実施例４    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルローとキシランを誘導剤として添加した培養評価（誘導剤８％添加）
本培養液１００ｍＬに対し、誘導剤として、微結晶セルロースであるＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）を７ｇ、ｂｅｅｃｈ  ｗｏｏｄ  ｘｙｌａｎ（シグマアルドリッチ社製）を３ｇ使用すること以外は比較例１と同様にして、酸素利用速度を算出した（表５）。その結果、キシラン含有量が３０重量％の誘導剤を使用した場合には、親株（ＰＣ−３−７株）の培養結果（比較例７）と比較すると、実施例４の酸素利用速度は、親株の５５％に低下した。【００７８】
比較例８    ＰＣ−３−７を用いたセルローとキシランを誘導剤として添加した培養評価（誘導剤８％添加）
本培養液１００ｍＬに対し、誘導剤として、微結晶セルロースであるＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）を６ｇ、ｂｅｅｃｈ  ｗｏｏｄ  ｘｙｌａｎ（シグマアルドリッチ社製）を４ｇ使用すること以外は比較例１と同様にして、酸素利用速度を算出した（表６）。その結果、キシラン含有量が３０重量％の誘導剤を使用した場合には、キシラン単独（比較例２）、またはセルロース単独（比較例４）の誘導剤を使用した場合と比較して、酸素利用速度は大幅に増加していることがわかった。【００７９】
実施例５    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルローとキシランを誘導剤として添加した培養評価（誘導剤８％添加）
本培養液１００ｍＬに対し、誘導剤として、微結晶セルロースであるＣｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）を６ｇ、ｂｅｅｃｈ  ｗｏｏｄ  ｘｙｌａｎ（シグマアルドリッチ社製）を４ｇ使用すること以外は比較例１と同様にして、酸素利用速度を算出した（表６）。その結果、キシラン含有量が４０重量％の誘導剤を使用した場合には、親株（ＰＣ−３−７株）の培養結果（比較例８）と比較すると、実施例５の酸素利用速度は、親株の８５％に低下した。【００８０】
比較例６〜８と実施例３〜５の培養結果から、セルロースとキシランを誘導剤として使用した場合、親株ではセルロース単独、またはキシラン単独を誘導剤として添加した場合と比較して酸素利用速度が著しく増加してしまうことがわかった。さらに、ＢＸＬ１遺伝子を破壊することで、セルロースとキシランを含み、キシラン含有量が１５〜４０重量％である誘導剤として使用した場合には、親株と比較して酸素利用速度が著しく低下することがわかった。【００８１】
比較例９    ＰＣ−３−７株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（５Ｌジャー）（誘導剤８％添加）
２００ｍＬ容のジャーで酸素利用速度が減少するという効果が確認されたため、より大きい５Ｌスケールで培養し、全培養期間でのＤＯ値推移を測定することにした。前培養は比較例１と同様にして行った。本培養はトリコデルマ・リーセイ  ＰＣ−３−７株の前培養液２５０ｍＬをそれぞれ５Ｌ容ミニジャーに入れた表２に示した本培養液２．５Ｌへ接種させ、２８℃、７００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ５の培養条件にて５日間培養を行った。中和は１０％アンモニアと１Ｎ硫酸を使用した。誘導剤であるセルロースとキシランを含むバイオマスとして、Ａｒｂｏｃｅｌ（登録商標）（Ｊ．Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ＆Ｓｏｈｎｅ）を使用した。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、８重量％（ｗｔ／ｗｔ）であった。培養開始後、溶存酸素飽和度の推移を培養終了後まで測定し（図１）、最低飽和度を算出した（表６）。また、培養開始４日後のタンパク質濃度を測定した（表６）。ＤＯ計は密閉型溶存酸素電極ＳＤＯＣ−１２Ｆ−Ｌ２６０（エイブル株式会社）を使用した。また、培養槽の加圧は行わなかった。【００８２】
【表６】
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【００８３】
実施例６    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（５Ｌジャー）（誘導剤８％添加）
使用株をトリコデルマ・リーセイ  ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株にする以外は比較例９と同様にして、全培養期間の溶存酸素飽和度推移を測定し（図２）、最低飽和度を算出し（表６）、培養開始４日後のタンパク質濃度を測定した（表６）。その際、前培養の菌体量は比較例９と同じであった。その結果、比較例９の親株（ＰＣ−３−７）の培養結果と比較して実施例６のＢＸＬ１遺伝子破壊株では酸素要求性が低下して、最低飽和度が顕著に増加した。また、タンパク質濃度に関しても比較例９よりも１２％増加していた。【００８４】
比較例１０    ＰＣ−３−７株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（５Ｌジャー）（誘導剤２％添加）
本培養培地を表７の組成にすること以外は比較例９と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始４日後のタンパク質濃度を測定した（表６）。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、２重量％（ｗｔ／ｗｔ）であった。【００８５】
【表７】
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＊微量元素溶液は、０．３ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、１．３ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１０ｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２を含む。
＊＊マンデルスは、７ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、３ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、３ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含む。
＊＊＊バイオマスは他成分を混合し、メスアップした後に添加する。
【００８６】
実施例７    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（５Ｌジャー）（誘導剤２％添加）
使用株をトリコデルマ・リーセイ  ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株にする以外は比較例１０と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始４日後のタンパク質濃度を測定した（表６）。比較例１０の結果と比較すると、誘導剤２％の場合においても最低飽和度が増加し、タンパク質濃度は親株よりも１％増加することが判明した。【００８７】
比較例１１    ＰＣ−３−７株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（５Ｌジャー）（誘導剤４％添加）
本培養培地に添加するバイオマスを培地１Ｌに対して４６ｇに変更し、その他成分は表７の組成にし、比較例９と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始４日後のタンパク質濃度を測定した（表８）。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、４重量％（ｗｔ／ｗｔ）であった。【００８８】
実施例８    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（５Ｌジャー）（誘導剤４％添加）
使用株をトリコデルマ・リーセイ  ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株にする以外は比較例１１と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始４日後のタンパク質濃度を測定した（表８）。さらに、活性を測定した（表１０）。比較例１１の結果と比較すると、誘導剤４％の場合においても最低飽和度が増加し、タンパク質濃度は親株よりも１％増加することが判明した。【００８９】
比較例１２    ＰＣ−３−７株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（５Ｌジャー）（誘導剤５％添加）
本培養培地に添加するバイオマスを培地１Ｌに対して５８ｇに変更し、その他成分は表７の組成にし、比較例９と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始４日後のタンパク質濃度を測定した（表８）。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、５重量％（ｗｔ／ｗｔ）であった。【００９０】
実施例９    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（５Ｌジャー）（誘導剤５％添加）
使用株をトリコデルマ・リーセイ  ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株にする以外は比較例１２と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始４日後のタンパク質濃度を測定した（表８）。さらに、活性を測定した（表１０）。比較例１２の結果と比較すると、誘導剤５％の場合においても最低飽和度が増加し、タンパク質濃度は親株よりも８％増加することが判明した。【００９１】
比較例１３    ＰＣ−３−７株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（５Ｌジャー）（誘導剤６％添加）
本培養培地に添加するバイオマスを培地１Ｌに対して７０ｇに変更し、その他成分は表７の組成にし、比較例９と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始４日後のタンパク質濃度を測定した（表９）。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、６重量％（ｗｔ／ｗｔ）であった。【００９２】
実施例１０    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（５Ｌジャー）（誘導剤６％添加）
使用株をトリコデルマ・リーセイ  ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株にする以外は比較例１３と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始４日後のタンパク質濃度を測定した（表９）。さらに、活性を測定した（表１０）。比較例１３の結果と比較すると、誘導剤６％の場合においても最低飽和度が増加し、タンパク質濃度は親株よりも１０％増加することが判明した。【００９３】
比較例１４    ＰＣ−３−７株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（５Ｌジャー）（誘導剤７％添加）
本培養培地に添加するバイオマスを培地１Ｌに対して８３ｇに変更し、その他成分は表７の組成にし、比較例９と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始４日後のタンパク質濃度を測定した（表９）。培養開始時のバイオマスの添加量を測定した結果、７重量％（ｗｔ／ｗｔ）であった。【００９４】
実施例１１    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養評価（５Ｌジャー）（誘導剤７％添加）
使用株をトリコデルマ・リーセイ  ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株にする以外は比較例１４と同様にして、最低飽和度を算出し、培養開始４日後のタンパク質濃度を測定した（表９）。さらに、活性を測定した（表１０）。比較例１４の結果と比較すると、誘導剤７％の場合においても最低飽和度が増加し、タンパク質濃度は親株よりも１１％増加することが判明した。【００９５】
比較例９〜１４、実施例６〜１１の結果から、本発明のＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌をセルロースとキシランを含む誘導剤を添加して培養した際に、誘導剤の添加量を増加させるほど、親株よりも最低飽和度がより高くなることが判明した。さらに、誘導剤の添加量を５重量％以上にすると、親株よりもタンパク質濃度が顕著に増加し、よりタンパク質の製造に適することが判明した。【００９６】
【表８】
2017170917.tif 000010
【００９７】
【表９】
2017170917.tif 000011
【００９８】
【表１０】
2017170917.tif 000012
【００９９】
比較例１５    ＰＣ−３−７株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（誘導剤８％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価
比較例９で得られた培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。得られたろ過液は糖化反応に使用した。糖化反応に使用したバガスはアルカリ処理（前処理）を行ったバガスを使用した。糖化反応は以下のようにして行った。２ｍＬチューブの中にアルカリ処理をしたバガスを乾燥重量５０ｍｇ分入れ、バガスの固形分濃度が反応開始時に５重量％となるように純水を加えつつ、希塩酸を用いてｐＨ５．０に調整した。ｐＨを調製した前処理物に８ｍｇ／ｇ−バイオマスになるようにセルラーゼ組成物（タンパク質）を添加して、ヒートブロックローテーターを用いてｐＨ５．０、５０℃の反応条件で反応を開始した。反応中は適宜ｐＨ５になるように調整を行った。８時間後に９９度の湯浴に５分間浸けて反応を停止した。反応液は８，０００×ｇの条件下で５分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液を参考例５に従いキシロオリゴ糖とグルコースの分析に供した。キシロオリゴ糖の結果を表１１に、グルコースの結果を表１２に示す。【０１００】
【表１１】
2017170917.tif 000013
【０１０１】
【表１２】
2017170917.tif 000014
【０１０２】
実施例１２    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（誘導剤８％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価
実施例６で得られた培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例１５と同様にして行い、キシロオリゴ糖とグルコースの分析に供した（表１１、表１２）。その結果、親株（ＰＣ−３−７）と比較してＢＸＬ１破壊株ではキシロオリゴ糖の収量が顕著に増加していることが判明した。さらに、グルコースの収量も親株と比較して増加していることが判明した。【０１０３】
比較例１６  ＰＣ−３−７株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（キシラン含有率１５％、誘導剤８％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価
比較例６で得られた培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例１５と同様にして行い、グルコースの分析に供した（表１３）。【０１０４】
実施例１３    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（キシラン含有率１５％、誘導剤８％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価
実施例３で得られた培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例１５と同様にして行い、グルコースの分析に供した（表１３）。【０１０５】
比較例１７    ＰＣ−３−７株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（キシラン含有率３０％、誘導剤８％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価
比較例７で得られた培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例１５と同様にして行い、グルコースの分析に供した（表１３）。【０１０６】
実施例１４    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（キシラン含有率３０％、誘導剤８％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価
実施例４で得られた培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例１５と同様にして行い、グルコースの分析に供した（表１３）。【０１０７】
比較例１８    ＰＣ−３−７株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（キシラン含有率４０％、誘導剤８％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価
比較例８で得られた培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例１５と同様にして行い、グルコースの分析に供した（表１４）。【０１０８】
実施例１５    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（キシラン含有率４０％、誘導剤８％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価
実施例５で得られた培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。糖化反応は比較例１５と同様にして行い、グルコースの分析に供した（表１４）。【０１０９】
比較例１５〜１８、実施例１２〜１５の結果から、本発明のＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌をセルロースとキシランを含む誘導剤を添加して培養した際に得られたタンパク質をセルラーゼ組成物として使用し、セルロースとキシランを含むバイオマスに糖化反応させると、親株と比較してグルコースの収量が意外にも増加することが判明した。【０１１０】
【表１３】
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【０１１１】
【表１４】
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【０１１２】
比較例１９    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（誘導剤８％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価
比較例３で得られた培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。培養開始４日後の培養液は遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。得られたろ過液は活性、タンパク質濃度を測定し（表１６）、糖化反応に使用した。糖化反応はセルラーゼ組成物（タンパク質）の添加量を２ｍｇ／ｇ−バイオマスにすることと、反応時間を２４時間にすること以外は比較例１５と同様にして行い、キシロオリゴ糖の分析に供した（表１５）。【０１１３】
【表１５】
2017170917.tif 000017
【０１１４】
比較例２０    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（誘導剤８％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価
比較例５で得られた培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。得られたろ過液は糖化反応に使用した。糖化反応は比較例１９と同様にして行い、キシロオリゴ糖の分析に供した（表１５）。【０１１５】
実施例１６    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（誘導剤８％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価
実施例２で得られた培養開始４日後の培養液を遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。得られたろ過液は活性、タンパク質濃度を測定し（表１６）、その後糖化反応に使用した。糖化反応は比較例１９と同様にして行い、キシロオリゴ糖の分析に供した（表１５）。その結果、セルロースとキシランを誘導剤として添加した培養液が最もキシロオリゴ糖の収率が高くなった。二番目に収率が高かったのは、キシランを誘導剤とした場合であった。しかし、キシロース／（キシロース＋キシロオリゴ糖）の割合がセルロースとキシランを誘導剤にした場合の方が低く、キシロオリゴ糖とキシロースの膜分離がより容易になることが判明した。さらにキシランを誘導剤として添加した培養では、セルロースとキシランを誘導剤とした場合の培養と比較して、タンパク質（セルラーゼ組成物）が１０分の１程度しか生産されないため、糖化反応時により多くの培養液が必要になる。【０１１６】
表１０と表１６の結果から、本発明のＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養する際に誘導剤の添加量を増加させると、得られるセルラーゼ組成物のβ-キシロシダーゼ活性か低下し、さらにβ-グルコシダーゼ活性、セロビオヒドロラーゼ活性が増加し、よりグルコースとキシロオリゴ糖の製造に適したセルラーゼ組成物になることが判明した。特に誘導剤の添加量を５重量％以上添加した際には２重量％添加した際と比較して、β-キシロシダーゼ活性が２分の１以下に低下しているため、グルコースとキシロオリゴ糖製造により適している。また、特に誘導剤の添加量を６重量％以上添加した際には２重量％添加した際と比較して、β-グルコシダーゼ活性が顕著に増加し、さらにグルコースとキシロオリゴ糖の製造に適する。【０１１７】
【表１６】
2017170917.tif 000018
【０１１８】
比較例２１    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（誘導剤２％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価
使用した株をＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株にし、本培養の組成を表７に示した組成にし、バイオマスにｂｅｅｃｈ  ｗｏｏｄ  ｘｙｌａｎ（シグマアルドリッチ社製）を使用する以外は比較例１と同様の条件にて培養を行った。培養開始４日後の培養液は遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。得られたろ過液は活性、タンパク質濃度を測定し（表１６）、糖化反応に使用した。糖化反応は比較例１９と同様にして行い、キシロオリゴ糖とグルコースの分析に供した（表１７、表１８）。【０１１９】
【表１７】
2017170917.tif 000019
【０１２０】
【表１８】
2017170917.tif 000020
【０１２１】
実施例１７    ＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株を用いたセルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤として添加した培養（誘導剤２％添加）から得られたセルラーゼ組成物を使用したバガスの糖化反応評価。
使用した株をＰＣ−３−７／△ＢＸＬ１株にし、本培養の組成を表７に示した組成にする以外は比較例１と同様の条件にて培養を行った。培養開始４日後の培養液は遠心分離した後、上清を限外ろ過膜にてろ過し、菌体除去を行った。得られたろ過液は活性を測定した（表１６）。その結果、誘導剤を８％添加した場合では、誘導剤を２％添加した場合と比較してβ-キシロシダーゼの活性が低下し、β-グルコシダーゼの活性、ｐ−ニトロフェニル-β-D-キシロビオシドの分解活性が増加していた。その後、得られたろ過液は糖化反応に使用した。糖化反応は比較例１９と同様にして行い、キシロオリゴ糖とグルコースの分析に供した（表１７、表１８）。その結果、誘導剤添加の割合が同じ場合では、キシランよりもセルロースとキシランを誘導剤としたほうが、キシロオリゴ糖収量、グルコース収量が増加していた。さらに、キシロース／（キシロース＋キシロオリゴ糖）の割合がセルロースとキシランを誘導剤にした場合の方がキシランを誘導剤にした場合より低かった。また、セルロースとキシランを誘導剤とした場合では、誘導剤を２％よりも８％添加して培養して得られたセルラーゼ組成物を使用したほうが、キシロオリゴ糖、グルコースの収量が増加し、キシロース／（キシロース＋キシロオリゴ糖）割合も低下していた。これらの結果から、セルロースとキシランを誘導剤として８％添加し培養して得られたセルラーゼ組成物が、最もキシロオリゴ糖とグルコースの生産に適していることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
セルロースとキシランを誘導剤として添加した培養においても、ＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を使用することにより、溶存酸素飽和度が高い条件でタンパク質を製造することができ、スケールアップが容易になる。さらに、本発明で得られたタンパク質をセルラーゼ組成物として使用することでキシロオリゴ糖とグルコースを効率良く製造することができる。
【図１】
2017170917.tif 000021
【図２】
2017170917.tif 000022
【配列表】
2017170917000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年10月18日(2017.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養することを含む、トリコデルマ属真菌によるタンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記誘導剤を５重量％（ｗｔ／ｗｔ）以上培地に添加して培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記誘導剤に含まれるキシランの含有量が１５〜４０重量％である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記トリコデルマ属真菌がトリコデルマ・リーセイである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記トリコデルマ・リーセイがカーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質がセルラーゼ組成物である請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．００６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、セロビオヒドロラーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上、β-グルコシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．２５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記β−キシロシダーゼ比活性が０．００２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、前記β-グルコシダーゼ比活性が０．３Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖とグルコースの製造方法。
【請求項１１】
セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてトリコデルマ属真菌を培養する際の溶存酸素飽和度の減少を抑制する方法であって、前記トリコデルマ属真菌として、ＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を用いる、溶存酸素飽和度の減少抑制方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するトリコデルマ属真菌由来のセルラーゼ組成物。
（ａ）β−キシロシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．００６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下
（ｂ）セロビオヒドロラーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上
（ｃ）β-グルコシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．２５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上
（ｄ）該セルラーゼ組成物のタンパク質濃度が３ｇ／Ｌ以上
【請求項１３】
前記タンパク質濃度が９ｇ／Ｌ以上である、請求項１２に記載のセルラーゼ組成物。
【請求項１４】
ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロビオシドの分解活性が該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である、請求項１２または１３に記載のセルラーゼ組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１６）を提供する。
（１）セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養することを含む、トリコデルマ属真菌によるタンパク質の製造方法。
（２）前記誘導剤を５重量％（ｗｔ／ｗｔ）以上培地に添加して培養する、（１）に記載の方法。
（３）前記誘導剤に含まれるキシランの含有量が１５〜４０重量％である（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記トリコデルマ属真菌がトリコデルマ・リーセイである、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記トリコデルマ・リーセイがカーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株である、（４）に記載の方法。
（６）前記タンパク質がセルラーゼ組成物である（１）から（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．００６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、セロビオヒドロラーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上、β-グルコシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．２５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である（６）に記載の方法。
（８）前記β−キシロシダーゼ比活性が０．００２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、前記β-グルコシダーゼ比活性が０．３Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である（７）記載の方法。
（９）（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖の製造方法。
（１０）（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖とグルコースの製造方法。
（１１）セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてトリコデルマ属真菌を培養する際の溶存酸素飽和度の減少を抑制する方法であって、前記トリコデルマ属真菌として、ＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を用いる、溶存酸素飽和度の減少抑制方法。
（１２）以下の（ａ）〜（ｄ）の特徴を有するトリコデルマ属真菌由来のセルラーゼ組成物。
（ａ）β−キシロシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．００６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下
（ｂ）セロビオヒドロラーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上
（ｃ）β-グルコシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．２５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上
（ｄ）該セルラーゼ組成物のタンパク質濃度が３ｇ／Ｌ以上
（１３）前記タンパク質濃度が９ｇ／Ｌ以上である、（１２）に記載のセルラーゼ組成物。
（１４）ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロビオシドの分解活性が該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である、（１２）または（１３）に記載のセルラーゼ組成物。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明では更にキシロオリゴ糖とグルコースの製造に適したトリコデルマ属真菌由来のセルラーゼ組成物も提供する。本発明のセルラーゼ組成物はβ-キシロシダーゼ活性、セロビオハイドラーゼ活性、β-グルコシダーゼ活性、タンパク質濃度が以下の特徴を有するように定義される。β―キシロシダーゼ活性は上述したように測定することができ、その値は具体的には該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｍｇ当たり０．００６Ｕ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ以下であり、さらに好ましくは０．００５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、さらに好ましくは０．００４Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、さらに好ましくは０．００３Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、さらに好ましくは０．００２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下である。セロビオハイドラーゼ活性は上述したように測定することができ、その値は具体的には該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｍｇ当たり０．１００Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であることが好ましく、さらに好ましくは０．１２０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．１５０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．１６０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である。β―グルコシダーゼ活性は上述したように測定することができ、その値は具体的には該セルラーゼ組成物中のタンパク質１ｍｇ当たり０．２００Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であることが好ましく、さらに好ましくは０．２５０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．２８０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．３００Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上であり、さらに好ましくは０．３２０Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である。タンパク質濃度は上述したように測定することができ、その値は３ｇ／Ｌ以上が好ましく、さらに好ましくは４ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは５ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは６ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは７ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは８ｇ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは９ｇ／Ｌ以上である。
【手続補正書】
【提出日】平成30年2月15日(2018.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養することを含む、トリコデルマ属真菌によるタンパク質の製造方法。
【請求項２】
前記誘導剤を５重量％（ｗｔ／ｗｔ）以上培地に添加して培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記誘導剤に含まれるキシランの含有量が１５〜４０重量％である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記トリコデルマ属真菌がトリコデルマ・リーセイである、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記トリコデルマ・リーセイがカーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質がセルラーゼ組成物である請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．００６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、セロビオヒドロラーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上、β-グルコシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．２５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記β−キシロシダーゼ比活性が０．００２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、前記β-グルコシダーゼ比活性が０．３Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である請求項７記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖の製造方法。
【請求項１０】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖とグルコースの製造方法。
【請求項１１】
セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてトリコデルマ属真菌を培養する際の溶存酸素飽和度の減少を抑制する方法であって、前記トリコデルマ属真菌として、ＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を用いる、溶存酸素飽和度の減少抑制方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１１）を提供する。
（１）セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を培養することを含む、トリコデルマ属真菌によるタンパク質の製造方法。
（２）前記誘導剤を５重量％（ｗｔ／ｗｔ）以上培地に添加して培養する、（１）に記載の方法。
（３）前記誘導剤に含まれるキシランの含有量が１５〜４０重量％である（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記トリコデルマ属真菌がトリコデルマ・リーセイである、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記トリコデルマ・リーセイがカーボン・カタボライト・リプレッションが解除されている株である、（４）に記載の方法。
（６）前記タンパク質がセルラーゼ組成物である（１）から（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記セルラーゼ組成物のβ−キシロシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．００６Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、セロビオヒドロラーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ラクトピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．１Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上、β-グルコシダーゼ比活性がｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを分解する酵素活性として該セルラーゼ組成物のタンパク質１ｍｇ当たり０．２５Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である（６）に記載の方法。
（８）前記β−キシロシダーゼ比活性が０．００２Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以下、前記β-グルコシダーゼ比活性が０．３Ｕ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ以上である（７）記載の方法。
（９）（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖の製造方法。
（１０）（６）〜（８）のいずれか１項に記載の方法により製造されたセルラーゼ組成物でキシランとセルロースを含むバイオマスを加水分解する、キシロオリゴ糖とグルコースの製造方法。
（１１）セルロースとキシランを含むバイオマスを誘導剤としてトリコデルマ属真菌を培養する際の溶存酸素飽和度の減少を抑制する方法であって、前記トリコデルマ属真菌として、ＢＸＬ１遺伝子が破壊されたトリコデルマ属真菌を用いる、溶存酸素飽和度の減少抑制方法。
【国際調査報告】
2017170917.tif 000023
2017170917.tif 000024
2017170917.tif 000025
2017170917.tif 000026
2017170917.tif 000027
2017170917.tif 000028
2017170917.tif 000029
2017170917.tif 000030