(57)【要約】本発明は、リガンドに特異的に応答して蛍光特性が変化するリガンド蛍光センサータンパク質であって、前記リガンド蛍光センサータンパク質は、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、リガンド結合ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインとを含み、前記リガンド蛍光センサータンパク質に用いられる蛍光タンパク質がβバレル構造を有するものであり、前記第１の蛍光タンパク質ドメインが前記蛍光タンパク質のＮ末端からβ１〜β３のβシート領域と、これに続くαへリックス領域と、β４〜β６のβシート領域とを含み、前記第２の蛍光タンパク質ドメインが前記第１の蛍光タンパク質ドメインと同一の前記蛍光タンパク質のβ７〜β１１のβシート領域を含み、前記Ｎ末端側リンカー及び前記Ｃ末端側リンカーは、それぞれ独立して１個又は数個のアミノ酸からなるポリペプチドである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドに特異的に応答して蛍光特性が変化するリガンド蛍光センサータンパク質であって、
前記リガンド蛍光センサータンパク質は、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、リガンド結合ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインとを含み、
前記リガンド蛍光センサータンパク質に用いられる蛍光タンパク質がβバレル構造を有するものであり、
前記第１の蛍光タンパク質ドメインが前記蛍光タンパク質のＮ末端からβ１〜β３のβシート領域と、これに続くαへリックス領域と、β４〜β６のβシート領域とを含み、
前記第２の蛍光タンパク質ドメインが前記第１の蛍光タンパク質ドメインと同一の前記蛍光タンパク質のβ７〜β１１のβシート領域を含み、
前記Ｎ末端側リンカー及び前記Ｃ末端側リンカーは、それぞれ独立して１個又は数個のアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とするリガンド蛍光センサータンパク質。
【請求項２】
前記蛍光タンパク質がＢＦＰ、ＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、又はｍＡｐｐｌｅである請求項１に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
【請求項３】
前記リガンド蛍光センサータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、リガンド結合ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインとが、直接この順番にペプチド結合で連結してなるポリペプチドを含む請求項１又は２に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
【請求項４】
前記リガンド蛍光センサータンパク質は、２つのリガンド結合ドメインを含み、
Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のリガンド結合ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインと、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２のリガンド結合ドメインと、が、直接この順番にペプチド結合で連結してなるポリペプチドを含む請求項１又は２に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
【請求項５】
前記第１の蛍光タンパク質ドメインは、以下の（Ｂ１）〜（Ｂ３）のいずれかのポリペプチドを含み、
前記第２の蛍光タンパク質ドメインは、以下の（Ｃ１）〜（Ｃ３）のいずれかのポリペプチドを含み、
前記第１の蛍光タンパク質ドメインと第２の蛍光タンパク質ドメインとが同一の蛍光タンパク質に由来する請求項１又は２に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
（Ｂ１）配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｂ２）配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記第２の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド、
（Ｂ３）配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記第２の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド、
（Ｃ１）配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｃ２）配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記第１の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド、
（Ｃ３）配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記第１の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド
【請求項６】
前記リガンドが、ヌクレオチド若しくはその誘導体、核酸、糖鎖、タンパク質、脂質複合体、又は低分子化合物である請求項１〜５のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
【請求項７】
前記ヌクレオチド若しくはその誘導体が、ＡＴＰ、ｃＡＭＰ、又はｃＧＭＰである請求項６に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質が抗原又は抗体である請求項６に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
【請求項９】
以下の（Ｄ１）〜（Ｄ３）のいずれかのポリペプチドを含む請求項１〜８のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
（Ｄ１）配列番号９〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｄ２）配列番号９〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記ポリペプチド（Ｄ１）と同一の、リガンドへの結合能及び蛍光特性を有するポリペプチド、
（Ｄ３）配列番号９〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記ポリペプチド（Ｄ１）と同一の、リガンドへの結合能及び蛍光特性を有するポリペプチド
【請求項１０】
さらに、オルガネラ局在化シグナルペプチドを含む請求項１〜９のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
【請求項１１】
前記オルガネラ局在化シグナルペプチドがミトコンドリア局在化シグナルペプチドである請求項１０に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
【請求項１２】
前記オルガネラ局在化シグナルペプチドが核局在化シグナルペプチドである請求項１０に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
【請求項１３】
さらに、細胞膜透過性ペプチドを含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質を少なくとも１種類含むことを特徴とする細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも１種類含む染色体を有することを特徴とする細胞。
【請求項１８】
請求項１５に記載の発現ベクターを少なくとも１種類含むことを特徴とする細胞。
【請求項１９】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細胞を含むことを特徴とする非ヒト生物。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質、請求項１４に記載のポリヌクレオチド、請求項１５に記載の発現ベクター、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細胞、及び請求項１９に記載の非ヒト生物からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とするリガンド濃度測定用キット。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質と、既知の濃度のリガンドを含む標準溶液と接触させて、蛍光強度を測定し、検量線を作成する検量線作成工程と、
前記リガンド蛍光センサータンパク質と、未知の濃度のリガンドを含む溶液と接触させて、蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、
前記検量線作成工程において、作成された検量線に基づいて、前記蛍光測定工程において測定された蛍光強度に対するリガンド濃度を決定する濃度決定工程と、
を備えることを特徴とする被検試料中のリガンド濃度の決定方法。
【請求項２２】
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の細胞を用いて、経時的な蛍光強度を測定する工程を備えることを特徴とする生細胞におけるリガンド濃度の経時変化の検知方法。
【請求項２３】
請求項１９に記載の非ヒト生物を用いて、経時的な蛍光強度を測定する工程を備えることを特徴とする生きた非ヒト生物におけるリガンド濃度の経時変化の検知方法。
【請求項２４】
ＡＴＰ濃度に特異的に応答して蛍光特性が変化するＡＴＰ蛍光センサータンパク質であって、該ＡＴＰ蛍光センサータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、ＡＴＰ結合ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインとが、直接この順にペプチド結合で連結したポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、
第１の蛍光タンパク質ドメインは、蛍光タンパク質ＢＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ又はｍＡｐｐｌｅのＮ末端から、β１〜β３のβシート領域と、これに続くαヘリックス領域と、β４〜β６のβシート領域とを含み、
第２の蛍光タンパク質ドメインは、第１の蛍光タンパク質ドメインと同一の蛍光タンパク質のβ７〜β１１のβシート領域を含み、
ＡＴＰ結合ドメインはＦ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットからなり、
Ｎ末端側リンカー及びＣ末端側リンカーは、それぞれ、１個又は数個のアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とするＡＴＰ蛍光センサータンパク質。
【請求項２５】
（Ａ１１）ＡＴＰ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列であり、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号１及び２のアミノ酸配列であり、Ｎ末端及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号１６及び１７のアミノ酸配列である、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ａ１２）ＡＴＰ結合ドメイン、第１の蛍光タンパク質ドメイン、第２の蛍光タンパク質ドメイン、Ｎ末端側のリンカー、及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ独立に、配列番号１５、１、２、１６、及び１７のアミノ酸配列か、配列番号１３、１、２、１４、及び１５のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチド（Ａ１１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ｂ１１）ＡＴＰ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列であり、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号５及び６のアミノ酸配列であり、Ｎ末端及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、ＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）及び配列番号１８のアミノ酸配列である、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｂ１２）ＡＴＰ結合ドメイン、第１の蛍光タンパク質ドメイン、第２の蛍光タンパク質ドメイン、Ｎ末端側のリンカー及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ独立に、配列番号１５、５、６、ＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）、及び配列番号１８のアミノ酸配列か、配列番号１５、５、６、ＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）、及び配列番号１８のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチド（Ｂ１１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｃ１１）ＡＴＰ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列であり、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号７及び８のアミノ酸配列であり、Ｎ末端及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号１９及びＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のアミノ酸配列である、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドと、
（Ｃ１２）ＡＴＰ結合ドメイン、第１の蛍光タンパク質ドメイン、第２の蛍光タンパク質ドメイン、Ｎ末端側のリンカー及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号１５、７、８、１９、及びＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のアミノ酸配列か、配列番号１５、７、８、１９、及びＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチド（Ｃ１１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドとからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む請求項２４に記載のＡＴＰ蛍光センサータンパク質。
【請求項２６】
（Ａ２１）配列番号９のアミノ酸配列からなる、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ａ２２）配列番号９のアミノ酸配列のうち、配列番号１６及び１７のアミノ酸配列を除くアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチド（Ａ２１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ｂ２１）配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｂ２２）配列番号１０のアミノ酸配列のうち、配列番号１０の第１４６−１４８位のＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列と、配列番号１８のアミノ酸配列とを除くアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチド（Ｂ２１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｃ２１）配列番号１１のアミノ酸配列からなる、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドと、
（Ｃ２２）配列番号１１のアミノ酸配列のうち、配列番号１１の第２８８−２９０位のＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のアミノ酸配列と、配列番号１９のアミノ酸配列とを除くアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチド（Ｃ２１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドとからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む請求項２４又は２５に記載のＡＴＰ蛍光センサータンパク質。
【請求項２７】
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のＡＴＰ蛍光センサータンパク質を含むことを特徴とする蛍光組成物。
【請求項２８】
前記ＡＴＰ蛍光センサータンパク質は固体支持体に不動化される請求項２７に記載の蛍光組成物。
【請求項２９】
前記ＡＴＰ蛍光センサータンパク質は、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインの対の異なる少なくとも２種類のＡＴＰ蛍光センサータンパク質である請求項２８に記載の蛍光組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リガンド蛍光センサータンパク質とその使用に関する。
本願は、２０１５年１２月４日に、日本に出願された特願２０１５−２３７５２４号、及び２０１６年５月２４日に、米国に仮出願された米国特許第６２／３４０，５３３号明細書に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光生体イメージングとは、生きた組織又は臓器の内部を観察し、そこで生きた細胞及び分子の動態をリアルタイムで解析する新しい研究手法である。近年の光学機器及び蛍光イメージングの技術革新により、様々な組織又は臓器における、多種多様な生命現象に蛍光生体イメージングを適用することで、生きた細胞及び分子の動きを描出することが可能となってきた。【０００３】
蛍光生体イメージングにおいて、細胞内に存在する分子（リガンド）が特異的に結合するレセプターを用いることで、生きた組織又は臓器内のリガンドの動きを検出することができる。
具体的には、レセプターとして、例えば、生体内の分子に特異的に結合する抗体若しくは生体内に存在する抗体に対する抗原、特定の酵素に対する基質若しくは特定の基質に対する酵素、又はＡＴＰ、ｃＡＭＰ、若しくはｃＧＭＰ等の生体内の分子の結合ドメイン等を備える蛍光センサータンパク質を用いることで、細胞内のリガンドの濃度分布や時間変化（時空間ダイナミクス）を可視化解析できる。【０００４】
蛍光センサータンパク質は、単色型、レシオ型、及びＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）型に大きく分類される。単色型は、各蛍光センサータンパク質について特定される単一波長での蛍光強度がリガンド濃度に応じて変化するタイプである。レシオ型は、各蛍光センサータンパク質ごとに特定される２つの波長での蛍光強度の相対比がリガンド濃度に応じて変化するタイプである。ＦＲＥＴ型は、異なる２個の蛍光タンパク質断片を含む融合タンパク質のうち一方の断片が励起状態にあるとき、リガンド濃度に応じて他方の断片との距離が近接すると、励起状態の断片からエネルギーが他方の断片に無放射遷移するフェルスター共鳴エネルギー移動（Ｆoｒｓｔｅｒ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）現象を利用して、リガンド濃度に応じて前者の断片の蛍光強度と後者の断片の蛍光強度との相対比が変化するタイプである。
例えば、現在まで、単色型（例えば、非特許文献１参照）、ＦＲＥＴ型（例えば、非特許文献２参照）、及びレシオ型（例えば、非特許文献３、４参照）のＡＴＰ蛍光センサータンパク質が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kato-Yamada, Y., “Isolated epsilon subunit of Bacillus subtilis F1-ATPase binds ATP”, FEBS Lett., vol.579, no.30, p6875-6878, 2005.
【非特許文献２】Yaginuma H., et al., “Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging”, Sci Rep., 4:6522, 2014.
【非特許文献３】Tantama M., et al., “Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio”, Nat Commun., 4:2550, 2013.
【非特許文献４】Imamura H., et al., “Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators”, PNAS, vol.106, no.37, p15651-15656, 2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来の蛍光センサータンパク質には、いくつかの問題点がある。まず、ＦＲＥＴやレシオ型のセンサーによる解析には、高価な専用の顕微鏡が必要である。また、蛍光検出に広範囲の蛍光波長域を使用するため、多色解析に適さない。つまり、多種のリガンドの動態を同時に解析できない。さらに、異なる細胞小器官のリガンドの動態を同時に可視化して解析することは不可能である。【０００７】
これに対し、１波長で励起して１波長の蛍光を観察する単色型の蛍光タンパク質を基にした蛍光センサーはこれらの問題点を克服できる可能性がある。しかし、これまでに報告された単色型センサー（例えば、非特許文献１参照。）は、ダイナミックレンジ、すなわち、ＡＴＰの有無による蛍光強度の変化が最大で８％弱しかなく、細胞内のＡＴＰセンサーとして実用的に使うレベルには到底達していなかった。その後、当該報告よりダイナミックレンジの高い単色型のＡＴＰ蛍光タンパク質センサーは報告がない。
また、ＡＴＰに限定されず、所望のリガンドを検出可能なダイナミックレンジの高い単色型の蛍光タンパク質センサーは報告がない。【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、検出するリガンドの種類を選ばず、高感度なリガンド蛍光センサータンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］リガンドに特異的に応答して蛍光特性が変化するリガンド蛍光センサータンパク質であって、前記リガンド蛍光センサータンパク質は、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、リガンド結合ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインとを含み、前記リガンド蛍光センサータンパク質に用いられる蛍光タンパク質がβバレル構造を有するものであり、前記第１の蛍光タンパク質ドメインが前記蛍光タンパク質のＮ末端からβ１〜β３のβシート領域と、これに続くαへリックス領域と、β４〜β６のβシート領域とを含み、前記第２の蛍光タンパク質ドメインが前記第１の蛍光タンパク質ドメインと同一の前記蛍光タンパク質のβ７〜β１１のβシート領域を含み、前記Ｎ末端側リンカー及び前記Ｃ末端側リンカーは、それぞれ独立して１個又は数個のアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とするリガンド蛍光センサータンパク質。
［２］前記蛍光タンパク質がＢＦＰ、ＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、又はｍＡｐｐｌｅである［１］に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
［３］前記リガンド蛍光センサータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、リガンド結合ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインとが、直接この順番にペプチド結合で連結してなるポリペプチドを含む［１］又は［２］に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
［４］前記リガンド蛍光センサータンパク質は、２つのリガンド結合ドメインを含み、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のリガンド結合ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインと、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２のリガンド結合ドメインと、が、直接この順番にペプチド結合で連結してなるポリペプチドを含む［１］又は［２］に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
［５］前記第１の蛍光タンパク質ドメインは、以下の（Ｂ１）〜（Ｂ３）のいずれかのポリペプチドを含み、前記第２の蛍光タンパク質ドメインは、以下の（Ｃ１）〜（Ｃ３）のいずれかのポリペプチドを含み、前記第１の蛍光タンパク質ドメインと第２の蛍光タンパク質ドメインとが同一の蛍光タンパク質に由来する［１］又は［２］に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
（Ｂ１）配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｂ２）配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記第２の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド、
（Ｂ３）配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記第２の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド、
（Ｃ１）配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｃ２）配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記第１の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド、
（Ｃ３）配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記第１の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド
［６］前記リガンドが、ヌクレオチド若しくはその誘導体、核酸、糖鎖、タンパク質、脂質複合体、又は低分子化合物である［１］〜［５］のいずれか一つに記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
［７］前記ヌクレオチド若しくはその誘導体が、ＡＴＰ、ｃＡＭＰ、又はｃＧＭＰである［６］に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
［８］前記タンパク質が抗原又は抗体である［６］に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
［９］以下の（Ｄ１）〜（Ｄ３）のいずれかのポリペプチドを含む［１］〜［８］のいずれか一つに記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
（Ｄ１）配列番号９〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｄ２）配列番号９〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記ポリペプチド（Ｄ１）と同一の、リガンドへの結合能及び蛍光特性を有するポリペプチド、
（Ｄ３）配列番号９〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記ポリペプチド（Ｄ１）と同一の、リガンドへの結合能及び蛍光特性を有するポリペプチド
［１０］さらに、オルガネラ局在化シグナルペプチドを含む［１］〜［９］のいずれか一つに記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
［１１］前記オルガネラ局在化シグナルペプチドがミトコンドリア局在化シグナルペプチドである［１０］に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
［１２］前記オルガネラ局在化シグナルペプチドが核局在化シグナルペプチドである［１０］に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
［１３］さらに、細胞膜透過性ペプチドを含む［１］〜［１２］のいずれか一つに記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
［１４］［１］〜［１３］のいずれか一つに記載のリガンド蛍光センサータンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
［１５］［１４］に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
［１６］［１］〜［１３］のいずれか一つに記載のリガンド蛍光センサータンパク質を少なくとも１種類含むことを特徴とする細胞。
［１７］［１］〜［１３］のいずれか一つに記載のリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも１種類含む染色体を有することを特徴とする細胞。
［１８］［１５］に記載の発現ベクターを少なくとも１種類含むことを特徴とする細胞。
［１９］［１６］〜［１８］のいずれか一つに記載の細胞を含むことを特徴とする非ヒト生物。
［２０］［１］〜［１３］のいずれか一つに記載のリガンド蛍光センサータンパク質、［１４］に記載のポリヌクレオチド、［１５］に記載の発現ベクター、［１６］〜［１８］のいずれか一つに記載の細胞、及び［１９］に記載の非ヒト生物からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とするリガンド濃度測定用キット。
［２１］［１］〜［１３］のいずれか一つに記載のリガンド蛍光センサータンパク質と、既知の濃度のリガンドを含む標準溶液と接触させて、蛍光強度を測定し、検量線を作成する検量線作成工程と、
前記リガンド蛍光センサータンパク質と、未知の濃度のリガンドを含む溶液と接触させて、蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、
前記検量線作成工程において、作成された検量線に基づいて、前記蛍光測定工程において測定された蛍光強度に対するリガンド濃度を決定する濃度決定工程と、
を備えることを特徴とする被検試料中のリガンド濃度の決定方法。
［２２］［１６］〜［１８］のいずれか一つに記載の細胞を用いて、経時的な蛍光強度を測定する工程を備えることを特徴とする生細胞におけるリガンド濃度の経時変化の検知方法。
［２３］［１９］に記載の非ヒト生物を用いて、経時的な蛍光強度を測定する工程を備えることを特徴とする生きた非ヒト生物におけるリガンド濃度の経時変化の検知方法。
［２４］ＡＴＰ濃度に特異的に応答して蛍光特性が変化するＡＴＰ蛍光センサータンパク質であって、該ＡＴＰ蛍光センサータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、ＡＴＰ結合ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインとが、直接この順にペプチド結合で連結したポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、第１の蛍光タンパク質ドメインは、蛍光タンパク質ＢＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ又はｍＡｐｐｌｅのＮ末端から、β１〜β３のβシート領域と、これに続くαヘリックス領域と、β４〜β６のβシート領域とを含み、第２の蛍光タンパク質ドメインは、第１の蛍光タンパク質ドメインと同一の蛍光タンパク質のβ７〜β１１のβシート領域を含み、ＡＴＰ結合ドメインはＦ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットからなり、Ｎ末端側リンカー及びＣ末端側リンカーは、それぞれ、１個又は数個のアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とするＡＴＰ蛍光センサータンパク質。
［２５］（Ａ１１）ＡＴＰ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列であり、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号１及び２のアミノ酸配列であり、Ｎ末端及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号１６及び１７のアミノ酸配列である、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ａ１２）ＡＴＰ結合ドメイン、第１の蛍光タンパク質ドメイン、第２の蛍光タンパク質ドメイン、Ｎ末端側のリンカー、及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ独立に、配列番号１５、１、２、１６、及び１７のアミノ酸配列か、配列番号１５、１、２、１６、及び１７のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチド（Ａ１１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ｂ１１）ＡＴＰ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列であり、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号５及び６のアミノ酸配列であり、Ｎ末端及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、ＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）及び配列番号１８のアミノ酸配列である、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｂ１２）ＡＴＰ結合ドメイン、第１の蛍光タンパク質ドメイン、第２の蛍光タンパク質ドメイン、Ｎ末端側のリンカー及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ独立に、配列番号１５、５、６、ＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）、及び配列番号１８のアミノ酸配列か、配列番号１５、５、６、ＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）、及び配列番号１８のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチド（Ｂ１１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｃ１１）ＡＴＰ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列であり、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号７及び８のアミノ酸配列であり、Ｎ末端及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号１９及びＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のアミノ酸配列である、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドと、
（Ｃ１２）ＡＴＰ結合ドメイン、第１の蛍光タンパク質ドメイン、第２の蛍光タンパク質ドメイン、Ｎ末端側のリンカー及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号１５、７、８、１９、及びＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のアミノ酸配列か、配列番号１５、７、８、１９、及びＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチド（Ｃ１１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドとからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む［２４］に記載のＡＴＰ蛍光センサータンパク質。
［２６］（Ａ２１）配列番号９のアミノ酸配列からなる、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ａ２２）配列番号９のアミノ酸配列のうち、配列番号１６及び１７のアミノ酸配列を除くアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチド（Ａ２１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ｂ２１）配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｂ２２）配列番号１０のアミノ酸配列のうち、配列番号１０の第１４６−１４８位のＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列と、配列番号１８のアミノ酸配列とを除くアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチド（Ｂ２１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｃ２１）配列番号１１のアミノ酸配列からなる、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドと、
（Ｃ２２）配列番号１１のアミノ酸配列のうち、配列番号１１の第２８８−２９０位のＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のアミノ酸配列と、配列番号１９のアミノ酸配列とを除くアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチド（Ｃ２１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドとからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む［２４］又は［２５］に記載のＡＴＰ蛍光センサータンパク質。
［２７］［２４］〜［２６］のいずれか一つに記載のＡＴＰ蛍光センサータンパク質を含むことを特徴とする蛍光組成物。
［２８］前記ＡＴＰ蛍光センサータンパク質は固体支持体に不動化される、［２７］に記載の蛍光組成物。
［２９］前記ＡＴＰ蛍光センサータンパク質は、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインの対の異なる少なくとも２種類のＡＴＰ蛍光センサータンパク質である［２８］に記載の蛍光組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、検出するリガンドの種類を選ばず、高感度なリガンド蛍光センサータンパク質を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】実施例１におけるＭａＬｉｏｎ  ＢシリーズのＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質１９個の１０ｍＭのＡＴＰの存在下での蛍光強度とＡＴＰ非存在下での蛍光強度の比（以下、「ダイナミックレンジ」と称する場合がある。）のヒストグラム。
【図１Ｂ】実施例１におけるＭａＬｉｏｎ  ＧシリーズのＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質２７個のダイナミックレンジのヒストグラム。
【図１Ｃ】実施例１におけるＭａＬｉｏｎ  ＲシリーズのＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質４７個のＦ／Ｆ０のヒストグラム。
【図２Ａ】実施例２における１０ｍＭのＡＴＰ存在下及び非存在下でのＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ及びＲの励起スペクトル図。
【図２Ｂ】実施例２における１０ｍＭのＡＴＰ存在下及び非存在下でのＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ及びＲの蛍光スペクトル図。
【図２Ｃ】実施例２における１０ｍＭのＡＴＰ存在下及び非存在下でのｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ及びＲの蛍光スペクトル図。
【図３Ａ】実施例２におけるＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ及びＲの蛍光強度のＡＴＰ濃度依存的変化を示すグラフ。
【図３Ｂ】実施例２におけるＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ及びＲの蛍光強度のリガンド特異性を示すグラフ。
【図４Ａ】実施例２におけるＭａＬｉｏｎ  ＢのＡＴＰ存在下又はＡＴＰ非存在下での蛍光強度と、ダイナミックレンジとのｐＨ依存的変化を示すグラフ。
【図４Ｂ】実施例２におけるＭａＬｉｏｎ  ＧのＡＴＰ存在下又はＡＴＰ非存在下での蛍光強度と、ダイナミックレンジとのｐＨ依存的変化を示すグラフ。
【図４Ｃ】実施例２におけるＭａＬｉｏｎ  ＲのＡＴＰ存在下又はＡＴＰ非存在下での蛍光強度と、ダイナミックレンジとのｐＨ依存的変化を示すグラフ。
【図５Ａ】実施例４におけるＭａＬｉｏｎ  Ｇを発現させたＨｅＬａ細胞に解糖系ＡＴＰ産生を阻害するＮａＦを投与後の蛍光の変化を示すグラフ。
【図５Ｂ】実施例４におけるＭａＬｉｏｎ  Ｒを発現させたＨｅＬａ細胞に解糖系ＡＴＰ産生を阻害するＮａＦを投与後の蛍光の変化を示すグラフ。
【図５Ｃ】実施例４におけるＭａＬｉｏｎ  Ｂを発現させたＨｅＬａ細胞に解糖系ＡＴＰ産生を阻害するＮａＦを投与後の蛍光の変化を示すグラフ。
【図５Ｄ】実施例４におけるｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇを発現させたＨｅＬａ細胞に解糖系ＡＴＰ産生を阻害するＮａＦを投与後の蛍光の変化を示すグラフ。
【図５Ｅ】実施例４におけるｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒを発現させたＨｅＬａ細胞に解糖系ＡＴＰ産生を阻害するＮａＦを投与後の蛍光の変化を示すグラフ。
【図５Ｆ】実施例４におけるｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂを発現させたＨｅＬａ細胞に解糖系ＡＴＰ産生を阻害するＮａＦを投与後の蛍光の変化を示すグラフ。
【図５Ｇ】実施例４におけるＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｒ及びＢと、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｒ及びＢとについて、ＨｅＬａ細胞で発現させた各蛍光タンパク質の蛍光測定開始から２５分後の正規化した蛍光強度の平均値及び標準偏差を示す棒グラフ。
【図６】実施例４におけるＭａＬｉｏｎ  Ｇの発現ベクターと、ｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒの発現ベクターとをＨｅＬａ細胞に同時にトランスフェクションした後、２種類の異なるＡＴＰ蛍光センサータンパク質に対応する２つの波長における同一視野での蛍光顕微鏡画像撮影開始から３分後にオリゴマイシンを投与し、その後の蛍光の変化を示したグラフ。
【図７Ａ】実施例４における同一視野の分化したＷＴ−１細胞のＢ−ＧＥＣＯ（Ｃａ２＋イオン、青色）、Ｆｌａｍｉｎｄｏ２（ｃＡＭＰ、緑色）及びｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒ（ＡＴＰ、赤色）の蛍光顕微鏡画像。各コマの左上の数字は観察開始後の時間（分）を表す。矢印は１μＭのイソプレテレノールを添加したのが１コマ目と２コマ目との間（観察開始５分後）であることを表す。矢印は１μＭのイソプレテレノールを添加したのが１コマ目と２コマ目との間（観察開始５分後）であることを表す。
【図７Ｂ】実施例４における同一視野の分化したＷＴ−１細胞のＢ−ＧＥＣＯ（Ｃａ２＋イオン、青色）、Ｆｌａｍｉｎｄｏ２（ｃＡＭＰ、緑色）及びｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒ（ＡＴＰ、赤色）の正規化された蛍光強度の経時的変化を示すグラフ。矢印は１μＭのイソプレテレノールを添加したのが観察開始５分後であることを表す。
【図８Ａ】実施例４における線虫咽頭筋の細胞質及びミトコンドリアのＡＴＰ濃度の経時的変化の同時測定結果を示すグラフ。矢印は、麻酔剤として０．５％の１−フェノキシ−２−プロパノールを含むＭ９バッファーを観察開始５分後に投与したことを表す。
【図８Ｂ】実施例４における線虫咽頭筋の細胞質及びミトコンドリアのＡＴＰ濃度の経時的変化の同時測定結果を示すグラフ。矢印は、対照実験のＭ９バッファーを観察開始５分後に投与したことを表す。
【図９Ａ】実施例５における１００μＭのｃＧＭＰ存在下及び非存在下でのｃＧｕｌｌの蛍光スペクトル図。
【図９Ｂ】実施例５におけるｃＧｕｌｌを発現させたＨｅＬａ細胞に８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１ｍＭ）又は一酸化窒素供与体であるＳＮＡＰ（３００μＭ）を投与での蛍光顕微鏡画像撮影開始から２０分後までの蛍光の変化を示す画像。
【図９Ｃ】実施例５におけるｃＧｕｌｌを発現させたＨｅＬａ細胞に８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１ｍＭ）又は一酸化窒素供与体であるＳＮＡＰ（３００μＭ）を投与での蛍光顕微鏡画像撮影開始から２０分後までの蛍光の変化を示すグラフ。
【図１０Ａ】実施例６における１００μＭのｃＡＭＰ存在下及び非存在下でのＰｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏの蛍光スペクトル図。
【図１０Ｂ】実施例６におけるＰｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏを発現させたＨｅＬａ細胞にアデニル酸シクラーゼ活性化剤であるＦｏｒｓｋｏｌｉｎ（１００μＭ）又はホスホジエステラーゼ阻害剤であるＩＢＭＸ（５００μＭ）を投与での蛍光顕微鏡画像撮影開始から２０分後までの蛍光の変化を示す画像。
【図１０Ｃ】実施例６におけるＰｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏを発現させたＨｅＬａ細胞にアデニル酸シクラーゼ活性化剤であるＦｏｒｓｋｏｌｉｎ（１００μＭ）又はホスホジエステラーゼ阻害剤であるＩＢＭＸ（５００μＭ）を投与での蛍光顕微鏡画像撮影開始から２０分後までの蛍光の変化を示すグラフ。
【図１１Ａ】実施例７における１００μＭのＢＧＰ７Ｃ存在下及び非存在下でのｇＢＧＰの励起／蛍光スペクトル図。
【図１１Ｂ】実施例７におけるｇＢＧＰの蛍光強度のリガンド特異性及びＢＧＰ７Ｃ濃度依存的変化を示すグラフ。
【図１１Ｃ】実施例７におけるｇＢＧＰ又はＧＦＰ、及び細胞膜局在性ＰＭｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＧＰ７Ｃ又は細胞膜局在性ＰＭｍＣｈｅｒｒｙを発現させたＨｅＬａ細胞での蛍光を示す画像。
【図１１Ｄ】実施例７におけるｇＢＧＰ又はＧＦＰ、及び核局在性ＮＬＳｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＧＰ７Ｃ又は核局在性ＮＬＳｍＣｈｅｒｒｙを発現させたＨｅＬａ細胞での蛍光を示す画像。
【図１２】実施例８における２μＭのＨＳＡ存在下及び非存在下でのｇＨＳＡの蛍光スペクトル図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除および置換を行うことができる。
【００１３】
本明細書において「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、アミド基、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。また、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。
【００１４】
本発明において、ある特定のアミノ酸配列に「１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列」とは、ｎ以下の個数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をいう。ここでｎは、当該特定のアミノ酸配列の全アミノ酸の数の１０％を超えない整数である。すなわち、ある特定のアミノ酸配列に１個以上ｎ個以下のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列をいう。同様に、本発明のいずれかのドメインのＮ末端又はＣ末端が、ある特定のタンパク質又はタンパク質ドメインのＮ末端又はＣ末端に「さらに１個〜数個のアミノ酸がペプチド結合で追加して連結される」とは、当該本発明のいずれかのドメインのＮ末端又はＣ末端は、当該特定のタンパク質又はタンパク質ドメインのＮ末端又はＣ末端に１個以上ｎ個以下のアミノ酸がペプチド結合で追加して連結されることをいう。また本発明のいずれかのドメインのＮ末端又はＣ末端が、ある特定のタンパク質又はタンパク質ドメインのＮ末端又はＣ末端から「１個〜数個目のアミノ酸残基」であるとは、当該本発明のいずれかのドメインのＮ末端又はＣ末端は、当該特定のタンパク質又はタンパク質ドメインのＮ末端又はＣ末端から１個目以上ｎ個目以下のアミノ酸残基であることをいう。
【００１５】
≪リガンド蛍光センサータンパク質≫
一実施形態において、本発明は、リガンドに特異的に応答して蛍光特性が変化するリガンド蛍光センサータンパク質であって、前記リガンド蛍光センサータンパク質は、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、リガンド結合ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインとを含み、前記リガンド蛍光センサータンパク質に用いられる蛍光タンパク質がβバレル構造を有するものであり、前記第１の蛍光タンパク質ドメインが前記蛍光タンパク質のＮ末端からβ１〜β３のβシート領域と、これに続くαへリックス領域と、β４〜β６のβシート領域とを含み、前記第２の蛍光タンパク質ドメインが前記第１の蛍光タンパク質ドメインと同一の前記蛍光タンパク質のβ７〜β１１のβシート領域を含み、前記Ｎ末端側リンカー及び前記Ｃ末端側リンカーは、それぞれ独立して１個又は数個のアミノ酸からなるポリペプチドであるリガンド蛍光センサータンパク質を提供する。
【００１６】
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質によれば、検出するリガンドの種類を選ばず、高感度にリガンドを検出することができる。
【００１７】
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質は、リガンドの濃度に特異的に応答して蛍光特性が変化する。該蛍光特性は、蛍光強度を含むが、これに限られない。蛍光強度は、蛍光顕微鏡、蛍光顕微分光光度計等の蛍光光学機器を用いて、所定の励起光源からの光のスペクトルを励起光フィルターにより一定の波長帯域に制限して、本発明のリガンド蛍光センサータンパク質又はリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質を含む生物試料に照射し、その蛍光を蛍光フィルターにより一定の波長帯域の制限して冷却ＣＣＤカメラで撮像し、得られた画像のうち特定の視野又はその一部の領域の画素の輝度値を基に定量的に表される。
【００１８】
（リガンド）
なお、本明細書における「リガンド」とは、特定の受容体（レセプター）に特異的に結合する物質を意味する。リガンドとして具体的には、例えば、ヌクレオチド若しくはその誘導体、核酸、糖鎖、タンパク質、脂質複合体、低分子化合物等が挙げられ、これらに限定されない。
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質は、上述した特定のリガンドに対するレセプターを備えることで、高感度に生体内におけるリガンド濃度の分布や時間変化を簡便に検出することができる。
【００１９】
前記ヌクレオチド若しくはその誘導体としては、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、ヌクレオチド若しくはその誘導体としては、ＡＴＰ、ｃＡＭＰ、及びｃＧＭＰであることが好ましい。
【００２０】
ＡＴＰは、化学反応、輸送や筋収縮のエネルギー源になり、またシグナル伝達等の役割を担い、生命システムの維持に広範に関与している。ＡＴＰ産生が低下する、又はＡＴＰが消費されずに過剰になると、細胞はそのエネルギーバランスを失い、疾患が起る。
また、ｃＡＭＰは、グルカゴンやアドレナリンといったホルモン伝達の際の細胞内シグナル伝達においてセカンドメッセンジャーとして働くことが知られている。
また、ｃＧＭＰは、イオンチャネルの伝導性、グリコーゲン分解、細胞のアポトーシスなどを調整している。また、平滑筋の弛緩にも関わっている。その他に目の光情報伝達においてセカンドメッセンジャーの役割を果たしている。
よって、本実施形態において、リガンドがＡＴＰ、ｃＡＭＰ、又はｃＧＭＰであるリガンド蛍光センサータンパク質（すなわち、ＡＴＰ蛍光センサータンパク質、ｃＡＭＰ蛍光センサータンパク質、又はｃＧＭＰ蛍光センサータンパク質）を用いることで、細胞内の各種リガンドの濃度分布や時間変化（時空間ダイナミクス）を可視化解析でき、各種生命現象や疾患発症機構の解明に応用できる。
【００２１】
前記タンパク質としては、例えば、抗原、抗体、酵素等が挙げられ、これらに限定されない。中でも、タンパク質としては、抗原、又は抗体であることが好ましい。
リガンドが各種生体分子である場合、レセプターとして特定の生体分子に対する抗体を用いることで、生体分子の種類を選ばず、生体内における当該生体分子の濃度分布や時間変化を簡便且つ正確に検出することができる。
また、リガンドが生体内に存在する抗体である場合、例えば、レセプターとして各種アレルギー物質を用いることで、ヒト又は非ヒト動物におけるアレルギー物質に対する抗体の存在を簡便且つ正確に検出することができる。
【００２２】
抗体は抗体断片も含む。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域断片（Ｆｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディー、多特異性抗体、およびこれらの重合体等が挙げられる。
【００２３】
前記脂質複合体としては、例えば、リポタンパク質、ＤＮＡ−脂質複合体等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２４】
前記低分子化合物としては、例えば、水素イオン、カルシウム、塩素、酸素その他のイオン、グルコース、酸化還元物質等が挙げられ、これらに限定されない。
【００２５】
（構成）
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質及びリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質に含まれるポリペプチドのドメイン及びリンカーの構成は以下のとおりである。まず、リガンドと特異的に結合するドメインを「リガンド結合ドメイン」という。挿入又は円順列変異により分断された無脊椎動物由来の蛍光タンパク質及び該蛍光タンパク質の改変体のアミノ末端側ドメイン及びカルボキシル末端側ドメインを、以下では、「第１の蛍光タンパク質ドメイン」及び「第２の蛍光タンパク質ドメイン」という。リガンド結合ドメイン又は第１の蛍光タンパク質ドメインのアミノ末端に連結するポリペプチドリンカーを「Ｎ末端側リンカー」といい、リガンド結合ドメイン又は第２の蛍光タンパク質ドメインのカルボキシル末端に連結するポリペプチドリンカーを「Ｃ末端側リンカー」という。
【００２６】
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質において、リガンド結合ドメインを１つ含んでいてもよく、２つ含んでいてもよい。
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質において、リガンド結合ドメインを１つ含む場合、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、リガンド結合ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインとが、直接この順番にペプチド結合で連結してなるポリペプチドを含むことが好ましい。
【００２７】
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質において、リガンド結合ドメインを２つ含む場合、Ｎ末端からＣ末端に向かって、第１のリガンド結合ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインと、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２のリガンド結合ドメインと、が、直接この順番にペプチド結合で連結してなるポリペプチドを含むことが好ましい。また、前記第２の蛍光タンパク質ドメインと前記第１の蛍光タンパク質ドメインとの間にさらにポリペプチドリンカーを有していてもよい。
例えば、リガンド結合ドメインが抗体である場合、分子構造が大きいことから、後述実施例に示すとおり、抗体の重鎖（第１のリガンド結合ドメイン）と軽鎖（第２のリガンド結合ドメイン）とを分けた構成とすることで、リガンド蛍光センサータンパク質内に置いて、当該抗体と蛍光タンパク質との間に立体障害が生じることを防ぐことができる。
【００２８】
・蛍光タンパク質
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質及びリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質は、無脊椎動物由来の蛍光タンパク質の改変体と、リガンド結合タンパク質のリガンド結合ドメインとに基づく人工改変体タンパク質である。無脊椎動物由来の蛍光タンパク質は、下村脩博士らによって発見されたヒドロ虫類に属するオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）から単離された緑蛍光タンパク質や、造礁サンゴＤｉｓｃｏｓｏｍａ  ｓｐ．から単離された赤蛍光タンパク質ＤｓＲｅｄを含むが、これらに限られない。
【００２９】
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質及びリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質に用いる、無脊椎動物由来の蛍光タンパク質及び該蛍光タンパク質の改変体に含まれるポリペプチドは、典型的には１１個のβシート構造領域と１個のαヘリックス構造領域とを含み、該αヘリックス構造領域はＮ末端から３個目と４個目のβシート領域（以下、それぞれ、「β３」及び「β４」と称する場合がある。他のβシートもこれらに準じて表記する。）の間に存在する。前記ポリペプチドがフォールディングすると、樽状の立体構造を形成する。すなわち、前記１１個のβシート構造領域はアンチパラレルに配向して樽の側面を形成し、前記αヘリックス構造領域は、樽の側面をなすβシート構造領域が終わった前記樽の一方の端から樽の内部を貫いて反対側の端に伸びるポリペプチド部分であって、次のβシート構造領域につながる。無脊椎動物由来の蛍光タンパク質及び該蛍光タンパク質の改変体の発色団は、前記αヘリックス領域の２個のアミノ酸残基と、前記αヘリックスを挟んで相対する２本のβシート領域（β４及びβ１１）に含まれるそれぞれ１個のアミノ酸残基とで形成される。無脊椎動物由来の蛍光タンパク質及び該蛍光タンパク質の改変体がフォールディングして樽状の立体構造を形成するとき、前記の４個のアミノ酸残基は側鎖間で自発的に反応して多員環を形成し、蛍光を発生する発色団となる。無脊椎動物由来の蛍光タンパク質及び該蛍光タンパク質の改変体の発色団は、水分子その他の該蛍光タンパク質の外部環境から前記樽状の立体構造によって保護されるため、いつでも蛍光を発生することができる。また前記発色団は、水分子その他のタンパク質の外部環境から前記樽状の立体構造によって保護されるため、ｐＨその他の外部環境の変化の影響を受けにくい。
【００３０】
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質及びリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質に含まれるポリペプチドの第１の蛍光タンパク質ドメイン及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、いずれかの無脊椎動物由来の特定の蛍光タンパク質又はその改変体のＮ末端側及びＣ末端側のポリペプチドを含む。本実施形態に用いられる蛍光タンパク質としては、例えば、ＢＦＰ、ＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＡｐｐｌｅ等があげられ、これらに限定されない。ＢＦＰ、ＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＡｐｐｌｅは、それぞれ、Ｗａｃｈｔｅｒ，  Ｒ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９６０，  ９７５９−９７６５  （１９９７））、Ｃｈａｌｆｉｅ，Ｍ．ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３（５１４８），  ８０２−８０５  （１９９４））、Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ，  Ｏ．ら、（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ２９１８８−２９１９４  （２００１））、及びＳｈａｎｅｒ，  Ｎ．  Ｃら（Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５，  ５４５−５５１  （２００８））に報告されている。なお、ＢＦＰ及びｍＡｐｐｌｅは、Ｚｈａｏ，  Ｙ．ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３３３，  １８８８−１８９１  （２０１１））を参照して数カ所にアミノ酸置換変異を導入した（配列番号１、２、７及び８）。
【００３１】
典型的には、本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質及びリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質に含まれる第１の蛍光タンパク質ドメインは、無脊椎動物由来の特定の蛍光タンパク質又はその改変体（例えば、ＢＦＰ、ＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ又はｍＡｐｐｌｅ等）のＮ末端から、β１〜β３のβシート領域と、これに続くαヘリックス領域と、β４〜β６のβシート領域とを含む。しかし、第１の蛍光タンパク質ドメインのＮ末端又はＣ末端にさらに１個〜数個のアミノ酸がペプチド結合で追加して連結される場合もある。すなわち、第１の蛍光タンパク質ドメインのＮ末端は、無脊椎動物由来の特定の蛍光タンパク質又はその改変体（例えば、ＢＦＰ、ＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ又はｍＡｐｐｌｅ等）のＮ末端の場合がある。また、該Ｎ末端にさらに１個〜数個のアミノ酸がペプチド結合で追加して連結される場合がある。あるいは、第１の蛍光タンパク質ドメインのＮ末端は、無脊椎動物由来の特定の蛍光タンパク質又はその改変体（例えば、ＢＦＰ、ＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ又はｍＡｐｐｌｅ等）のＮ末端から１個〜数個目のアミノ酸残基の場合がある。
また、第１の蛍光タンパク質ドメインのＣ末端は、β６とβ７との間のいずれかのアミノ酸残基の場合がある。あるいは、これにさらに１個〜数個のアミノ酸がペプチド結合で追加して連結される場合もある。
【００３２】
典型的には、本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質及びリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質に含まれる第２の蛍光タンパク質ドメインは、第１の蛍光タンパク質ドメインと同一の蛍光タンパク質のβ７〜β１１のβシート領域を含む。第２の蛍光タンパク質ドメインのＮ末端は前記β７のＮ末端の場合がある。また、前記β７のＮ末端にさらに１個〜数個のアミノ酸がペプチド結合で追加して連結される場合もある。あるいは、第２の蛍光タンパク質ドメインのＮ末端は、前記β７のＮ末端から１個〜数個目のアミノ酸残基の場合がある。
また、第２の蛍光タンパク質ドメインのＣ末端は、無脊椎動物由来の特定の蛍光タンパク質又はその改変体（例えば、ＢＦＰ、ＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ又はｍＡｐｐｌｅ等）のＣ末端の場合がある。あるいは、これにさらに１個〜数個の追加のアミノ酸がペプチド結合で連結される場合もある。
【００３３】
第１の蛍光タンパク質ドメイン及び第２の蛍光タンパク質ドメインとして具体的には、例えば、以下の（Ｂ１）及び（Ｃ１）に示すポリペプチド等が挙げられる。
（Ｂ１）配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（Ｃ１）配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【００３４】
上記（Ｂ１）における配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列は、それぞれＢＦＰ、ＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、又はｍＡｐｐｌｅのβ１〜β３のβシート領域と、これに続くαヘリックス領域と、β４〜β６のβシート領域とからなるアミノ酸配列である。
また、上記（Ｃ１）における配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列は、それぞれＢＦＰ、ＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、又はｍＡｐｐｌｅのβ７〜β１１のβシート領域からなるアミノ酸配列である。
【００３５】
本実施形態における第１の蛍光タンパク質ドメイン及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、前記（Ｂ１）及び（Ｃ１）のポリペプチドと、機能的に同等なポリペプチドとして、下記（Ｂ２）及び（Ｃ２）のポリペプチドを含有する。
（Ｂ２）配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記第２の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド、
（Ｃ２）配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記第１の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド。
【００３６】
ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、１〜１５個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００３７】
本実施形態における第１の蛍光タンパク質ドメイン及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、前記（Ｂ１）及び（Ｃ１）のポリペプチドと、機能的に同等なポリペプチドとして、下記（Ｂ３）及び（Ｃ３）のポリペプチドを含有する。
（Ｂ３）配列番号１、３、５、又は７で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記第２の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド、
（Ｃ３）配列番号２、４、６、又は８で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記第１の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド。
【００３８】
前記（Ｂ１）及び（Ｃ１）のポリペプチドと機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９８％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００３９】
蛍光タンパク質として、ＢＦＰ、ＧＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、又はｍＡｐｐｌｅを用いるとき、第１の蛍光タンパク質ドメイン及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、「ＢＦＰ−Ｎドメイン」及び「ＢＦＰ−Ｃドメイン」、「ＧＦＰ−Ｎドメイン」及び「ＧＦＰ−Ｃドメイン」、「Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｎドメイン」及び「Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｃドメイン」、又は「ｍＡｐｐｌｅ−Ｎドメイン」及び「ｍＡｐｐｌｅ−Ｃドメイン」と称する場合がある。ＢＦＰ−Ｎドメイン及びＢＦＰ−Ｃドメインのアミノ酸配列は配列番号１及び２として配列表に列挙する。ＧＦＰ−Ｎドメイン及びＧＦＰ−Ｃドメインのアミノ酸配列は配列番号３及び４として配列表に列挙する。Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｎドメイン及びＣｉｔｒｉｎｅ−Ｃドメインのアミノ酸配列は配列番号５及び６として列挙する。ｍＡｐｐｌｅ−Ｎドメイン及びｍＡｐｐｌｅ−Ｃドメインのアミノ酸配列は配列番号７及び８として列挙する。
【００４０】
・リガンド結合ドメイン
無脊椎動物由来の蛍光タンパク質及び該蛍光タンパク質の改変体を用いて、リガンドの濃度変化に応答して蛍光特性が変化する蛍光センサータンパク質を作成するためには、隣接する２個のβシート構造領域を連結するポリペプチドに当該リガンドと結合する別のタンパク質のポリペプチドの一部（すなわち、リガンド結合ドメイン）を挿入することが試みられる。これにより、前記物質の影響で蛍光タンパク質の樽状の立体構造が乱れるために蛍光特性が変化することが期待されるからである。
【００４１】
リガンド結合ドメインとしては、特定のリガンドが特異的に結合可能なものであればよく、特別な限定はない。例えば、リガンドがＡＴＰ、ｃＡＭＰ、又はｃＧＭＰ等のヌクレオチド若しくはその誘導体である場合には、ＡＴＰ、ｃＡＭＰ、又はｃＧＭＰ等のヌクレオチド若しくはその誘導体の公知の結合ドメインをリガンド結合ドメインとして用いればよい。また、例えば、リガンドが任意の生体分子である場合には、該生体分子に対する抗体をリガンド結合ドメインとして用いればよい。また、例えば、リガンドが抗体である場合には、抗原をリガンド結合ドメインとして用いればよい。また、例えば、リガンドが水素イオン、カルシウム、塩素、酸素その他のイオン、グルコース、酸化還元物質等の低分子化合物である場合には、前記低分子化合物のレセプター（受容体）（具体的には、リガンドがグルコースである場合、グルコース輸送体内のグルコース結合部位等）をリガンド結合ドメインとして用いればよい。
【００４２】
リガンド結合ドメインとしてより具体的には、例えば、リガンドがＡＴＰである場合、ＡＴＰ結合ドメインとしては、Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニット等が挙げられる。前記εサブユニットは細菌のＦ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットであってもよく、枯草菌のＦ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットであってもよい。ＡＴＰ結合ドメインのＮ末端は、Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットのＮ末端であってもよい。あるいは、前記ＡＴＰ結合ドメインのＮ末端は、Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットのＮ末端から１個又は数個目のアミノ酸残基であってもよい。ＡＴＰ結合ドメインのＣ末端は、Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットのＣ末端であってもよい。あるいは、前記ＡＴＰ結合ドメインのＣ末端は、Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットのＣ末端から１個又は数個目のアミノ酸残基であってもよい。ＡＴＰ結合ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列であってもよい。
【００４３】
また、例えば、リガンドがｃＡＭＰである場合、ｃＡＭＰ結合ドメインとしては、ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｃＡＭＰ  １（ＥＰＡＣ１）等が挙げられる。前記ＥＰＡＣ１はヒト由来のものであってもよく、非ヒト動物由来のものであってもよい。ｃＡＭＰ結合ドメインのＮ末端は、ＥＰＡＣ１のＮ末端であってもよい。あるいは、前記ｃＡＭＰ結合ドメインのＮ末端は、ＥＰＡＣ１のＮ末端から１個又は数個目のアミノ酸残基であってもよい。ｃＡＭＰ結合ドメインのＣ末端は、ＥＰＡＣ１のＣ末端であってもよい。あるいは、前記ｃＡＭＰ結合ドメインのＣ末端は、ＥＰＡＣ１のＣ末端から１個又は数個目のアミノ酸残基であってもよい。ｃＡＭＰ結合ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列であってもよい。
【００４４】
また、例えば、リガンドがｃＧＭＰである場合、ｃＧＭＰ結合ドメインとしては、Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ５α（ＰＤＥ５α）等が挙げられる。前記ＰＤＥ５αはヒト由来のものであってもよく、非ヒト動物由来のものであってもよい。ｃＧＭＰ結合ドメインのＮ末端は、ＰＤＥ５αのＮ末端であってもよい。あるいは、前記ｃＧＭＰ結合ドメインのＮ末端は、ＰＤＥ５αのＮ末端から１個又は数個目のアミノ酸残基であってもよい。ｃＧＭＰ結合ドメインのＣ末端は、ＰＤＥ５αのＣ末端であってもよい。あるいは、前記ｃＧＭＰ結合ドメインのＣ末端は、ＰＤＥ５αのＣ末端から１個又は数個目のアミノ酸残基であってもよい。ｃＧＭＰ結合ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列であってもよい。
【００４５】
また、例えば、リガンドがオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ｂｏｎｅ  Ｇｌａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＧＰ））である場合、ＢＧＰ結合ドメインとしては、抗ＢＧＰ抗体等が挙げられる。前記抗ＢＧＰ抗体はヒト由来のものであってもよく、非ヒト動物由来のものであってもよい。ＢＧＰ結合ドメインを２つ含む場合、第１のＢＧＰ結合ドメインのＮ末端は、抗ＢＧＰ抗体の重鎖のＮ末端であってもよく、第２のＢＧＰ結合ドメインのＮ末端は、抗ＢＧＰ抗体の軽鎖のＮ末端であってもよい。あるいは、前記第１のＢＧＰ結合ドメインのＮ末端は、抗ＢＧＰ抗体の重鎖のＮ末端から１個又は数個目のアミノ酸残基であってもよく、前記第２のＢＧＰ結合ドメインのＮ末端は、抗ＢＧＰ抗体の軽鎖のＮ末端から１個又は数個目のアミノ酸残基であってもよい。第１のＢＧＰ結合ドメインのＣ末端は、抗ＢＧＰ抗体の重鎖のＣ末端であってもよく、第２のＢＧＰ結合ドメインのＮ末端は、抗ＢＧＰ抗体の軽鎖のＣ末端であってもよい。あるいは、前記第１のＢＧＰ結合ドメインのＣ末端は、抗ＢＧＰ抗体の重鎖のＣ末端から１個又は数個目のアミノ酸残基であってもよく、前記第２のＢＧＰ結合ドメインのＣ末端は、抗ＢＧＰ抗体の軽鎖のＣ末端から１個又は数個目のアミノ酸残基であってもよい。第１のＢＧＰ結合ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列であってもよく、第２のＢＧＰ結合ドメインは、配列番号２３のアミノ酸配列であってもよい。
【００４６】
・リンカー
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質及びリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質に含まれるポリペプチドでは、リガンド結合ドメインが、そのＮ末端側及びＣ末端側にそれぞれ１個〜数個のアミノ酸からなるポリペプチドリンカー（以下、それぞれ、「Ｎ末端側リンカー」及び「Ｃ末端側リンカー」と称する場合がある。）を介して第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインの間に挿入される。あるいは、第２及び第１の蛍光タンパク質ドメインが、そのＮ末端側リンカー及びＣ末端側リンカーを介して第１及び第２のリガンド結合ドメインの間に挿入される。
Ｎ末端側リンカー及びＣ末端側リンカーのアミノ酸配列は、それぞれの本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質及びリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質ごとに異なる。しかし、アミノ酸には、保存的置換が可能な場合がある。
【００４７】
なお、本明細書において、「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することを意味する。アミノ酸残基はその側鎖によって、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパルギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は、好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
したがって、本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質のＣ末端側リンカーのアミノ酸配列は、以下の実施例で特定されたアミノ酸配列と１個以上のアミノ酸が異なっていても、同じリガンド結合能及び蛍光特性を示す場合があり、かかるアミノ酸配列も本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質のＣ末端側リンカーのアミノ酸配列に含まれる。
【００４８】
（好適なリガンド蛍光センサータンパク質）
本実施形態におけるＡＴＰ蛍光センサータンパク質及びＡＴＰ蛍光センサー陰性対照タンパク質のうち、ＢＦＰ−Ｎドメイン及びＢＦＰ−Ｃドメインを第１の蛍光タンパク質ドメイン及び第２の蛍光タンパク質ドメインとして用いるものを、「ＭａＬｉｏｎ  Ｂシリーズ」という。
本実施形態におけるＡＴＰ蛍光センサータンパク質及びＡＴＰ蛍光センサー陰性対照タンパク質のうち、Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｎドメイン及びＣｉｔｒｉｎｅ−Ｃドメインを第１の蛍光タンパク質ドメイン及び第２の蛍光タンパク質ドメインとして用いるものを、「ＭａＬｉｏｎ  Ｇシリーズ」という。
本実施形態におけるＡＴＰ蛍光センサータンパク質及びＡＴＰ蛍光センサー陰性対照タンパク質のうち、ｍＡｐｐｌｅ−Ｎドメイン及びｍＡｐｐｌｅ−Ｃドメインを第１の蛍光タンパク質ドメイン及び第２の蛍光タンパク質ドメインとして用いるものを、「ＭａＬｉｏｎ  Ｒシリーズ」という。
本実施形態におけるｃＧＭＰ蛍光センサータンパク質のうち、Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｎドメイン及びＣｉｔｒｉｎｅ−Ｃドメインを第１の蛍光タンパク質ドメイン及び第２の蛍光タンパク質ドメインとして用いるものを、「ｃＧｕｌｌシリーズ」という。
本実施形態におけるｃＡＭＰ蛍光センサータンパク質のうち、ｍＡｐｐｌｅ−Ｎドメイン及びｍＡｐｐｌｅ−Ｃドメインを第１の蛍光タンパク質ドメイン及び第２の蛍光タンパク質ドメインとして用いるものを、「Ｐｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏシリーズ」という。
本実施形態におけるＢＧＰ蛍光センサータンパク質のうち、ＧＦＰ−Ｎドメイン及びＧＦＰ−Ｃドメインを第１の蛍光タンパク質ドメイン及び第２の蛍光タンパク質ドメインとして用いるものを、「ｇＢＧＰシリーズ」という。
【００４９】
以下の実施例で説明するとおり、本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質及びリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質は、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインとして、ＢＦＰ−Ｎドメイン及びＢＦＰ−Ｃドメインか、ＧＦＰ−Ｎドメイン及びＧＦＰ−Ｃドメインか、Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｎドメイン及びＣｉｔｒｉｎｅ−Ｃドメインか、ｍＡｐｐｌｅ−Ｎドメイン及びｍＡｐｐｌｅ−Ｃドメインかを用い、ＡＴＰ結合ドメインとして枯草菌のＦ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットか、ｃＧＭＰ結合ドメインとしてＰＤＥ５αか、ｃＡＭＰ結合ドメインとしてＥＰＡＣ１か、ＢＧＰ結合ドメインとして抗ＢＧＰ抗体かを用い、Ｎ末端側リンカー及びＣ末端側リンカーとしてさまざまなポリペプチドの組み合わせを用いて、それぞれ、ＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ及びＲシリーズタンパク質、ｃＧｕｌｌシリーズタンパク質、Ｐｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏシリーズタンパク質、並びにｇＢＧＰシリーズタンパク質の候補分子をエンコードするポリヌクレオチドを合成し、大腸菌発現ベクターに組み込んで、大腸菌で発現させ、それぞれの蛍光特性を解析して、リガンド存在下と、リガンド非存在下とでの蛍光強度の比（ダイナミックレンジ）に基づいて、最もダイナミックレンジの高い候補分子をＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ及びＲシリーズ、ｃＧｕｌｌシリーズ、Ｐｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏシリーズ、並びにＢＧＰ蛍光センサーシリーズのターン・オン型リガンド蛍光センサータンパク質（以下、それぞれ、「ＭａＬｉｏｎ  Ｂ」、「ＭａＬｉｏｎ  Ｇ」及び「ＭａＬｉｏｎ  Ｒ」、「ｃＧｕｌｌ」、「Ｐｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏ」、並びに「ｇＢＧＰ」と称する場合がある。）として選択した。また、最もダイナミックレンジが１に近い候補分子をＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ及びＲシリーズのＡＴＰ蛍光センサー陰性対照タンパク質（それぞれ、「ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂ」、「ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇ」及び「ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒ」という。）として選択した。
【００５０】
本明細書及び特許請求の範囲において参照する配列表の配列番号で特定されるアミノ酸配列と、本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質及びリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質、あるいは、これらのドメイン及びリンカーとの関係は以下の表に示すとおりである。
【００５１】
【表１】
2017094885.tif 000002
【００５２】
【表２】
2017094885.tif 000003
【００５３】
【表３】
2017094885.tif 000004
【００５４】
【表４】
2017094885.tif 000005
【００５５】
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質として、より具体的には、例えば、以下の（Ｄ１）のポリペプチド等が挙げられる。
（Ｄ１）配列番号９〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【００５６】
上記（Ｄ１）における配列番号９で表されるアミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［ＢＦＰ−Ｎドメイン］−［Ｎ末端側リンカー］−［ＡＴＰ結合ドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［ＢＦＰ−Ｃドメイン］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが連結された構造である。
上記（Ｄ１）における配列番号１０で表されるアミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｎドメイン］−［Ｎ末端側リンカー］−［ＡＴＰ結合ドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｃドメイン］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが連結された構造である。
上記（Ｄ１）における配列番号１１で表されるアミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［ｍＡｐｐｌｅ−Ｎドメイン］−［Ｎ末端側リンカー］−［ＡＴＰ結合ドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［ｍＡｐｐｌｅ−Ｃドメイン］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが連結された構造である。
上記（Ｄ１）における配列番号１２で表されるアミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｎドメイン］−［Ｎ末端側リンカー］−［ｃＧＭＰ結合ドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｃドメイン］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが連結された構造である。
上記（Ｄ１）における配列番号１３で表されるアミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［ｍＡｐｐｌｅ−Ｎドメイン］−［Ｎ末端側リンカー］−［ｃＡＭＰ結合ドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［ｍＡｐｐｌｅ−Ｃドメイン］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが連結された構造である。
上記（Ｄ１）における配列番号１４で表されるアミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［抗ＢＧＰ抗体の重鎖］−［Ｎ末端側リンカー］−［ＧＦＰ−Ｃドメイン］−［ペプチドリンカー］−［ＧＦＰ−Ｎドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［抗ＢＧＰ抗体の軽鎖］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが連結された構造である。
【００５７】
本実施形態におけるリガンド蛍光センサータンパク質は、前記（Ｄ１）のポリペプチドと、機能的に同等なポリペプチドとして、下記（Ｄ２）のポリペプチドを含有する。
（Ｄ２）配列番号９〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記ポリペプチド（Ｄ１）と同一の、リガンドへの結合能及び蛍光特性を有するポリペプチド。
【００５８】
ここで、欠失、置換、若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、１〜１５個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００５９】
本実施形態におけるリガンド蛍光センサータンパク質は、前記（Ｄ１）のポリペプチドと、機能的に同等なポリペプチドとして、下記（Ｄ３）のポリペプチドを含有する。
（Ｄ３）配列番号９〜１４のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記ポリペプチド（Ｄ１）と同一の、リガンドへの結合能及び蛍光特性を有するポリペプチド。
【００６０】
前記（Ｄ１）のポリペプチドと機能的に同等であるためには８０％以上の同一性を有する。係る同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９８％以上が特に好ましく、９９％以上が最も好ましい。
【００６１】
（その他の構成）
・細胞膜透過性ペプチド
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質又は本実施形態のリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質は、細胞膜を透過して細胞内に到達するために、従来技術において周知である細胞膜透過ペプチド（参考文献：Ｚｏｒｋｏ，  Ｍ．及びＬａｎｇｅｌ，  Ｕ．，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．  Ｒｅｖ．  ５７，  ｐ５２９−５４５，２００５．）を含んでいていもよい。細胞膜透過ペプチドとしては、例えば、配列番号３８〜４１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド等が挙げられ、これらに限定されない。
配列番号３８で表されるアミノ酸配列は、ＨＩＶ−１ウイルスｔａｔタンパク質の第４８番目から第６０番目までのアミノ酸配列である。
配列番号３９で表されるアミノ酸配列は、ショウジョウバエＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質の第３３９番目から第３５４番目までのアミノ酸配列（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎの第４３番目から第５８番目までのアミノ酸配列）である。
配列番号４０で表されるアミノ酸配列のペプチドのＣ末端がアミド化されたペプチドは、細胞膜を透過して細胞内に局在化できる。このアミノ酸配列はマウスＶＥカドヘリン前駆体タンパク質の第６１６番目から第６３３番目までのアミノ酸配列である。
また、配列番号４１で表されるアミノ酸配列は、アルギニンの７量体ホモオリゴマーである。
【００６２】
・細胞膜局在化ペプチド
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質又は本実施形態のリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質は、細胞膜上に局在化させるために、従来技術において周知である細胞膜局在化ペプチドを含んでいていもよい。
細胞膜局在化ペプチドとしては、例えば、配列番号４２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド等が挙げられ、これらに限定されない。
配列番号４２で表されるアミノ酸配列は、Ｚｕｂｅｒ，  Ｍ．Ｘ．ら（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ.３４１，ｐ３４５−３４８，１９８９．）に報告されるヒト神経タンパク質ＧＡＰ−４３（Ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）由来の細胞膜局在化ペプチドの第１番目から第２１番目までのアミノ酸配列である。
【００６３】
・オルガネラ局在化シグナルペプチド
本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質又は本実施形態のリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質は、特定のオルガネラに局在化させるために、従来技術において周知であるオルガネラ局在化シグナルペプチドを含んでいていもよい。前記オルガネラとしては、例えば、ミトコンドリア、核、核小体、小胞体、クロロプラスト、ペロキシゾーム、細菌ペリプラズム等が挙げられ、これらに限定されない。
【００６４】
核局在化シグナルペプチドとしては、例えば、配列番号４３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド等が挙げられ、これらに限定されない。
配列番号４３で表されるアミノ酸配列は、ＳＶ４０ウイルスＴ抗原の第１２６番目から第１３２番目までのアミノ酸配列である（Ｌａｎｆｏｒｄ，  Ｒ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ｖｏｌ.４６，ｐ５７５−５８２，１９８６．）。
【００６５】
ミトコンドリア局在化シグナルペプチドとしては、例えば、配列番号４４、４５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド等が挙げられ、これらに限定されない。
配列番号４４で表されるアミノ酸配列は、ヒトシトクロムｃオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩ−肝臓／心臓型（８Ａサブユニット又は８−２サブユニット）のアミノ酸配列の第２番目から第２９番目までのアミノ酸配列である。
配列番号４５で表されるアミノ酸配列は、ニワトリアスパラギン酸アミノ転移酵素の第２番目から２４番目までのアミノ酸配列である（Ｊａｕｓｓｉ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．２６０，  p１６０６０−１６０６３， １９８５.）。
【００６６】
小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）局在化シグナルペプチドとしては、例えば、配列番号４６、４７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド等が挙げられ、これらに限定されない。
配列番号４６で表されるアミノ酸配列は、ヒト骨格筋筋小胞体高親和性カルシウム結合タンパク質カルレティキュリンのアミノ酸配列の第１番目から１７番目までのアミノ酸配列である（Ｆｌｉｅｇｅｌ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，  ｖｏｌ．２６４，  ｎｏ．３６，  ｐ２１５２２−２１５２８，  １９８９．）。
配列番号４７で表されるアミノ酸配列は、ラットｇｒｐ７８タンパク質の小胞体膜局在化シグナルペプチドの第６５１番目から第６５４番目（Ｃ末端）のアミノ酸配列である（Ｍｕｎｒｏ，  Ｓ．及びＰｅｌｈａｍ  Ｈ．Ｒ．，  Ｃｅｌｌ，  ｖｏｌ．４８，  ｎｏ．５，  ｐ８９９−９０７，  １９８７．）。
【００６７】
中でも、本実施形態のリガンド蛍光センサータンパク質又は本実施形態のリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質は、核局在化シグナルペプチド又はミトコンドリア局在化シグナルペプチドを含むことが好ましい。
【００６８】
＜ＡＴＰ蛍光センサータンパク質＞
一実施形態において、本発明は、ＡＴＰ濃度に特異的に応答して蛍光特性が変化するＡＴＰ蛍光センサータンパク質であって、該ＡＴＰ蛍光センサータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、ＡＴＰ結合ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインとが、直接この順にペプチド結合で連結したポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、第１の蛍光タンパク質ドメインは、蛍光タンパク質ＢＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ又はｍＡｐｐｌｅのＮ末端から、β１〜β３のβシート領域と、これに続くαヘリックス領域と、β４〜β６のβシート領域とを含み、第２の蛍光タンパク質ドメインは、第１の蛍光タンパク質ドメインと同一の蛍光タンパク質のβ７〜β１１のβシート領域を含み、ＡＴＰ結合ドメインはＦ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットからなり、Ｎ末端側リンカー及びＣ末端側リンカーは、それぞれ、１個又は数個のアミノ酸からなるポリペプチドであるＡＴＰ蛍光センサータンパク質を提供する。
【００６９】
本実施形態のＡＴＰ蛍光センサータンパク質によれば、生理学的条件下で高濃度のＡＴＰの存在下での蛍光強度とＡＴＰ非存在下での蛍光強度の比が十分に高く、細胞の生理学的及び／又は病理学的なＡＴＰ濃度の変動を検出することができる。また、励起波長及び発光波長が異なる本実施形態のＡＴＰ蛍光センサータンパク質を複数種類用いることで、それぞれを同一細胞の異なるオルガネラに局在させ、あるいは、生物体内の異なる細胞に局在させ、蛍光顕微鏡の同一視野で同時に、あるいは、ほぼ同時に検出して、該細胞又は生物の生理的及び／又は病理的変化に伴うＡＴＰ濃度の経時的及び／又は空間的変化（時空間ダイナミクス）を光学的に解析する技術を提供することができる。
【００７０】
本実施形態のＡＴＰ蛍光センサータンパク質において、ポリペプチドは、
（Ａ１１）ＡＴＰ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列であり、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号１及び２のアミノ酸配列であり、Ｎ末端及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号１６及び１７のアミノ酸配列である、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ａ１２）ＡＴＰ結合ドメイン、第１の蛍光タンパク質ドメイン、第２の蛍光タンパク質ドメイン、Ｎ末端側のリンカー、及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ独立に、配列番号１５、１、２、１６、及び１７のアミノ酸配列か、配列番号１３、１、２、１４、及び１５のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチド（Ａ１１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ｂ１１）ＡＴＰ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列であり、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号５及び６のアミノ酸配列であり、Ｎ末端及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、ＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）及び配列番号１８のアミノ酸配列である、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｂ１２）ＡＴＰ結合ドメイン、第１の蛍光タンパク質ドメイン、第２の蛍光タンパク質ドメイン、Ｎ末端側のリンカー及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ独立に、配列番号１５、５、６、ＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）、及び配列番号１８のアミノ酸配列か、配列番号１５、５、６、ＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）、及び配列番号１８のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチド（Ｂ１１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｃ１１）ＡＴＰ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列であり、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号７及び８のアミノ酸配列であり、Ｎ末端及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号１９及びＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のアミノ酸配列である、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドと、
（Ｃ１２）ＡＴＰ結合ドメイン、第１の蛍光タンパク質ドメイン、第２の蛍光タンパク質ドメイン、Ｎ末端側のリンカー及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号１５、７、８、１９、及びＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のアミノ酸配列か、配列番号１５、７、８、１９、及びＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチド（Ｃ１１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドとからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含むことが好ましい。
【００７１】
本実施形態のＡＴＰ蛍光センサータンパク質において、ポリペプチドは、
（Ａ２１）配列番号９のアミノ酸配列からなる、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ａ２２）配列番号９のアミノ酸配列のうち、配列番号１６及び１７のアミノ酸配列を除くアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチド（Ａ２１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ｂ２１）配列番号１０のアミノ酸配列からなる、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｂ２２）配列番号１０のアミノ酸配列のうち、配列番号１０の第１４６−１４８位のＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列と、配列番号１８のアミノ酸配列とを除くアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチド（Ｂ２１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｃ２１）配列番号１１のアミノ酸配列からなる、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドと、
（Ｃ２２）配列番号１１のアミノ酸配列のうち、配列番号１１の第２８８−２９０位のＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）のアミノ酸配列と、配列番号１９のアミノ酸配列とを除くアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチド（Ｃ２１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドとからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含むことがより好ましい。
【００７２】
本実施形態のＡＴＰ蛍光センサータンパク質は、さらにオルガネラ局在化シグナルペプチドを含んでいてもよい。前記オルガネラ局在化シグナルペプチドとしては、上述の（その他の構成）において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、オルガネラ局在化シグナルペプチドとしては、核局在化シグナルペプチド又はミトコンドリア局在化シグナルペプチドであることが好ましい。
本実施形態のＡＴＰ蛍光センサータンパク質は、さらに細胞膜透過ペプチドを含んでいてもよい。
【００７３】
＜ＡＴＰ蛍光センサー陰性対照タンパク質＞
一実施形態において、本発明は、ＡＴＰ蛍光センサー陰性対照タンパク質ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ及びＲを提供する。
【００７４】
本実施形態のＡＴＰ蛍光センサー陰性対照タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の蛍光タンパク質ドメインと、Ｎ末端側リンカーと、ＡＴＰ結合ドメインと、Ｃ末端側リンカーと、第２の蛍光タンパク質ドメインとが、直接この順にペプチド結合で連結したポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、
（Ａ３１）ＡＴＰ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列であり、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号１及び２のアミノ酸配列であり、Ｎ末端及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号２７及び２８のアミノ酸配列である、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ａ３２）ＡＴＰ結合ドメイン、第１の蛍光タンパク質ドメイン、第２の蛍光タンパク質ドメイン、Ｎ末端側のリンカー及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ独立に、配列番号１５、１、２、２７、及び２８のアミノ酸配列か、配列番号１５、１、２、２７、及び２８のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチド（Ａ３１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ｂ３１）ＡＴＰ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列であり、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号５及び６のアミノ酸配列であり、Ｎ末端及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、ＰＲＧ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）及び配列番号２９のアミノ酸配列である、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｂ３２）ＡＴＰ結合ドメイン、第１の蛍光タンパク質ドメイン、第２の蛍光タンパク質ドメイン、Ｎ末端側のリンカー及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ独立に、配列番号１５、５、６、ＰＲＧ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）、及び配列番号２９のアミノ酸配列か、配列番号１５、５、６、ＰＲＧ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）、及び配列番号２９のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチド（Ｂ３１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ポリペプチドと、
（Ｃ３１）ＡＴＰ結合ドメインは配列番号１５のアミノ酸配列であり、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号７及び８のアミノ酸配列であり、Ｎ末端及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号３０及びＰＥＧ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列である、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドと、
（Ｃ３２）ＡＴＰ結合ドメイン、第１の蛍光タンパク質ドメイン、第２の蛍光タンパク質ドメイン、Ｎ末端側のリンカー及びＣ末端側のリンカーは、それぞれ独立に、配列番号１５、７、８、３０、及びＰＥＧ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列か、配列番号１５、７、８、３０、及びＰＥＧ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチド（Ｃ３１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有する、ポリペプチドとからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含むことが好ましい。
【００７５】
本実施形態のＡＴＰ蛍光センサー陰性対照タンパク質は、
（Ａ４１）配列番号２４のアミノ酸配列からなる、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチドと、
（Ａ４２）配列番号２４のアミノ酸配列のうち、配列番号２７及び２８のアミノ酸配列を除くアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂポリペプチド（Ａ４１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有するポリペプチドと、
（Ｂ４１）配列番号２５のアミノ酸配列からなるｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｂ４２）配列番号２５のアミノ酸配列のうち、配列番号２５の第１４６−１４８位のＰＲＧ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列と、配列番号２９とを除くアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチド（Ｂ４１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有するｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇポリペプチドと、
（Ｃ４１）配列番号２６のアミノ酸配列からなるｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチドと、
（Ｃ４２）配列番号２６のアミノ酸配列のうち、配列番号３０のアミノ酸配列と、配列番号２６の第２８８−２９０位のＰＥＧ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ）のアミノ酸配列とを除くアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒポリペプチド（Ｃ４１）と同一のＡＴＰ結合能及び蛍光特性を有するポリペプチドとからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含むことがより好ましい。
【００７６】
本実施形態のＡＴＰ蛍光センサー陰性対照タンパク質は、さらにオルガネラ局在化シグナルペプチドを含んでいてもよい。前記オルガネラ局在化シグナルペプチドとしては、上述の（その他の構成）において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、オルガネラ局在化シグナルペプチドとしては、核局在化シグナルペプチド又はミトコンドリア局在化シグナルペプチドであることが好ましい。
本実施形態のＡＴＰ蛍光センサー陰性対照タンパク質は、さらに細胞膜透過ペプチドを含んでいてもよい。
【００７７】
（用途）
・蛍光組成物
一実施形態において、本発明は、上述のＡＴＰ蛍光センサータンパク質を含む蛍光組成物を提供する。
【００７８】
本実施形態の蛍光組成物において、上述のＡＴＰ蛍光センサータンパク質は固体支持体に不動化されていてもよい。
【００７９】
前記固体支持体の形状としては、特別な限定はなく、例えば、平板状、球状等が挙げられる。
【００８０】
固体支持体の材質としては、たとえば無機物質としてシリカ、アルミナ、ガラス、金属等が挙げられる。また、有機高分子物質として熱可塑性樹脂等が挙げられる。
【００８１】
固体支持体として、より具体的には、担体（例えば、磁気担体、アフィニティーカラム精製用担体等）、細胞培養用基材、プレパラート、マイクロデバイス、膜等が挙げられる。細胞培養用基材としては、任意の数のウェルが配置されたマルチウェルプレート、シャーレ等が挙げられる。ウェルの数としては、プレート１枚当たり、たとえば、６、１２、２４、９６、３８４、１，５３６個等が挙げられる。
【００８２】
本実施形態の蛍光組成物において、上述のＡＴＰ蛍光センサータンパク質は、第１及び第２の蛍光タンパク質ドメインの対の異なる少なくとも２種類の励起波長及び蛍光波長のＡＴＰ蛍光センサータンパク質であってもよい。
後述の実施例に示すとおり、蛍光波長の異なる複数種類のＡＴＰ蛍光センサータンパク質を用いることにより、該ＡＴＰ蛍光センサータンパク質をそれぞれ異なるオルガネラに局在させ、あるいは、生物体内の異なる細胞に局在させ、蛍光顕微鏡の同一視野で同時に、あるいは、ほぼ同時に検出して、該細胞又は生物の生理的及び／又は病理的変化に伴うＡＴＰ濃度の経時的及び／又は空間的変化（時空間ダイナミクス）を光学的に解析することができる。
【００８３】
また、本実施形態の蛍光組成物の使用方法として、ＡＴＰ蛍光センサータンパク質が容器の壁面に不動化されている場合に、ＡＴＰか、ＡＴＰγＳのような非加水分解性のＡＴＰ類縁体かを含む溶液を注ぎ、これをブラックライトのようなわずかに眼で見える長波長の紫外線光源を励起光源として照射することができる。あるいは、ＡＴＰ蛍光センサータンパク質を不動化したビーズのような固体支持体を、ＡＴＰ又は非加水分解性のＡＴＰ類縁体を含む溶液に懸濁して、容器又は流路を流すことができる。例えば、容器をシャンパングラスの形状とし、該容器を複数層に積み上げておき、その頂上の容器に前記溶液を注ぐことにより、最上層の容器からあふれた溶液が直下の層の容器に注がれ、該直下の層の容器からあふれた溶液がさらに下の層の容器に注がれる、いわゆるシャンパンタワー又はトリクルダウン状態を、さまざまな角度及びタイミングの励起光源を照射することにより視覚的効果の高い蛍光照明を行うことができる。
【００８４】
≪ポリヌクレオチド≫
一実施形態において、本発明は、上述のリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００８５】
前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号４８又は４９で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は、配列番号４８又は４９で表される塩基配列と８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の同一性を有し、リガンドへの結合能及び蛍光特性を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド等が挙げられる。なお、配列番号４８又は４９で表される塩基配列は、配列番号１２又は１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列である。
【００８６】
本実施形態のポリヌクレオチドは、哺乳類、植物、及び／又は線虫における発現のためにコドン選択が最適化されていてもよい。
【００８７】
なお、本明細書において、「哺乳類、植物、及び／又は線虫における発現のためにコドン選択が最適化され」るとは、哺乳類、植物、及び／又は線虫でのコドン使用頻度及び／又はアミノアシルｔ−ＲＮＡ分子種の細胞内濃度の生物種間相違に対応して、それぞれの生物種で最も翻訳効率が高いようにコドンが選択された、所望のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドの塩基配列を設計することを意味する。コドン選択の最適化は、例えば、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，  Ｃ．ら（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２．７  （２００４）：  ３４６−３５３）等を参照して実行することができる。
【００８８】
≪発現ベクター≫
一実施形態において、本発明は、上述のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００８９】
なお、本明細書における「発現ベクター」とは、所望のタンパク質を宿主細胞内で発現できるように、該タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドの転写、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡプロセッシング、ＲＮＡ成熟、翻訳、翻訳後プロセッシングその他の機能に必要な、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター及びリボソーム結合部位を含むが、これらに限られない、核酸を含むベクターを意味する。
【００９０】
（発現ベクターの種類）
哺乳類における発現のための発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）における発現のための発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、Ｏｋｋｅｍａ，  Ｐ．Ｇ．及びＡｎｄｒｅｗ  Ｆ．（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０，  ２１７５−２１８６  （１９９４））が報告するｐＯＫベクター等を用いることができる。
植物における発現のための発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、タバコモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス等のウイルス及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
【００９１】
（発現ベクターの構成）
・哺乳類における発現のための発現ベクターの構成
哺乳類における発現のための発現ベクターは、例えば、前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含んでいていもよい。
【００９２】
本明細書において、「作動可能に連結」とは、遺伝子発現制御配列（例えば、プロモーター又は一連の転写因子結合部位）と発現させたい遺伝子（本実施形態においては、前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチド）との間の機能的連結を意味する。ここで、「発現制御配列」とは、その発現させたい遺伝子（本実施形態においては、前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチド）の転写を指向するものを意味する。
【００９３】
前記プロモーターとしては、特別な限定はなく、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。プロモーターの具体例としては、例えば、ウイルス性プロモーター、発現誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、又はエンハンサー配列やプロモーター配列を融合させたプロモーター等が挙げられる。上記プロモーターは、前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流（５’側）に連結されていることが好ましい。
【００９４】
本明細書において、「ウイルス性プロモーター」とは、ウイルス由来のプロモーターを意味する。由来となるウイルスとしては、例えば、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、シミアンウイルス、レトロウイルス等が挙げられる。
【００９５】
本明細書において、「発現誘導性プロモーター」とは、化学薬剤、物理的ストレス等の特定の刺激を与えたときに発現させたい遺伝子（本実施形態においては、前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチド）を発現することができ、刺激の非存在下では発現活性を示さないプロモーターを意味する。発現誘導性プロモーターとしては、例えば、ＴｅｔＯ（テトラサイクリンオペレーター）プロモーター、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、ＩＰＴＧ／ｌａｃＩプロモーター系、エクジソンプロモーター系、及び翻訳又は転写についての阻害配列を不可逆的に欠失させるための「ｌｏｘ  ｓｔｏｐ  ｌｏｘ」系等が挙げられ、これらに限定されない。
【００９６】
本明細書において、「組織特異的プロモーター」とは、特定の組織においてのみ活性を有するプロモーターを意味する。
【００９７】
エンハンサー配列やプロモーター配列を融合させたプロモーターとしては、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）の初期遺伝子のプロモーターとヒトＴ細胞白血病ウイルス１のロング・ターミナル・リピートの一部の配列からなるＳＲαプロモーター、サイトメガロウイルスの前初期（ＩＥ）遺伝子エンハンサーとニワトリβ−アクチンプロモーターからなるＣＡＧプロモーター等が挙げられる。特に、ＣＡＧプロモーターは、発現させたい遺伝子（本実施形態においては、前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチド）の３’末端にウサギのβ−グロビン遺伝子のｐｏｌｙＡ  ｓｉｇｎａｌサイトを有することにより、発現させたい遺伝子（本実施形態においては、前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチド）をほぼ全身で過剰発現させることができる。
【００９８】
哺乳類における発現のための発現ベクターにおいて、さらに、例えば、前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流（３’側）に、ｍＲＮＡの３’末端のポリアデニル化に必要なポリアデニル化シグナルが作動可能に連結されていてもよい。ポリアデニル化シグナルとしては、上記のウイルス由来、各種ヒト又は非ヒト動物由来の各遺伝子に含まれるポリアデニル化シグナル、例えば、ＳＶ４０の後期遺伝子又は初期遺伝子、ウサギβグロビン遺伝子、ウシ成長ホルモン遺伝子、ヒトＡ３アデノシン受容体遺伝子等のポリアデニル化シグナル等を挙げることができる。
【００９９】
・植物における発現のための発現ベクターの構成
植物における発現のための発現ベクターには、例えば、カリフラワーモザイクウイルス由来のプロモーター／エンハンサー、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の５’非翻訳領域（翻訳エンハンサー領域）、及び／又は、熱ショックタンパク質遺伝子由来ターミネーター等を含んでいていもよい。
【０１００】
・線虫における発現のための発現ベクターの構成
線虫における発現のための発現ベクターには、例えば、Ｍｙｏ２遺伝子由来のプロモーター等を含んでいていもよい。
【０１０１】
・その他発現ベクターの構成
プラスミドベクターには、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターその他の大腸菌を宿主とするベクターを改変したものや、ｐｃＤＮＡ３ベクターのように哺乳類で発現効率が高いＣＭＶプロモーター等を含んでいていもよい。
【０１０２】
上述の発現ベクターは、さらに、例えば、マルチクローニングサイト、スプライシングシグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
前記選択マーカーとしては、例えば、薬剤選択マーカー遺伝子等が挙げられる。
薬剤選択マーカー遺伝子として、具体的には、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。薬剤選択マーカー遺伝子を挿入することにより、後述に示す本実施形態の発現ベクターが導入された細胞において、該薬物を含む培地を用いて細胞を培養することで、発現ベクターが導入された細胞を選択することができる。
【０１０３】
≪細胞≫
上述のリガンド蛍光センサータンパク質又は上述のリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質の発現ベクターを細胞に導入することにより、上述のリガンド蛍光センサータンパク質又は上述のリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質に含まれる細胞膜透過ペプチドの作用で、あるいは、前記タンパク質を細胞内に送達するための試薬により、前記タンパク質が一時的又は恒久的に存在する細胞を提供することができる。
【０１０４】
本実施形態における細胞の由来となる生物種としては、特別な限定はなく、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞（特に、哺乳動物細胞）等が挙げられ、これらに限定されない。
前記哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、マーモセット、サル等が挙げられ、これらに限定されない。
【０１０５】
動物細胞として具体的には、例えば、生殖細胞（精子、卵子等）、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離されたがん細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が挙げられ、これらに限定されない。
【０１０６】
＜第一実施形態＞
一実施形態において、本発明は、上述のリガンド蛍光センサータンパク質を少なくとも１種類含む細胞を提供する。
【０１０７】
本実施形態の細胞によれば、生細胞におけるリガンドの濃度の変動を検出することができる。また、励起波長及び発光波長が異なる上述のリガンド蛍光センサータンパク質を複数種類含む細胞を用いることで、それぞれを同一細胞の異なるオルガネラに局在させ、蛍光顕微鏡の同一視野で同時に、あるいは、ほぼ同時に検出して、該細胞の生理的及び／又は病理的変化に伴う各種リガンド濃度の経時的及び／又は空間的変化（時空間ダイナミクス）を光学的に解析する技術を提供することができる。
【０１０８】
（細胞の作製方法）
上述のリガンド蛍光センサータンパク質又は上述のリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質を細胞内に導入するための方法としては、例えば、前記タンパク質を細胞内に送達するための試薬を用いる方法等が挙げられる。
前記試薬としては、例えば、陽イオン性脂質である塩化Ｎ−［１−（２，３−ジオレイロキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−（ＤＯＴＭＡ）と、中性脂質であるジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）との混合物、１，２−ジオレオイル−３−トリメチル−アンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）その他の陽イオン性脂質を含む脂質混合物等が挙げられ、これらに限定されない。
これらの試薬には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）タンパク質トランスフェクション試薬（いずれもＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）等の市販品が含まれる。
また、その他の上述のリガンド蛍光センサータンパク質又は上述のリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質を細胞内に送達するための試薬としては、例えば、脂質を含まないＸ−ｆｅｃｔ（商標）トランスフェクション試薬（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）等を用いてもよい。この試薬は上述のリガンド蛍光センサータンパク質又は上述のリガンド蛍光センサー陰性対照タンパク質が細胞膜透過性ペプチドを含む場合に細胞内に送達することができる。
【０１０９】
細胞に含まれる上述のリガンド蛍光センサータンパク質は１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。２種類以上含む場合、同一細胞内において容易に検出するために、各リガンド蛍光センサータンパク質は励起波長及び発光波長が異なることが好ましい。
【０１１０】
＜第二実施形態＞
一実施形態において、本発明は、上述のリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも１種類含む染色体を有する細胞を提供する。
【０１１１】
本実施形態の細胞によれば、生細胞におけるリガンドの濃度の変動を検出することができる。また、励起波長及び発光波長が異なる上述のリガンド蛍光センサータンパク質を複数種類含む細胞を用いることで、それぞれを同一細胞の異なるオルガネラに局在させ、蛍光顕微鏡の同一視野で同時に、あるいは、ほぼ同時に検出して、該細胞の生理的及び／又は病理的変化に伴う各種リガンド濃度の経時的及び／又は空間的変化（時空間ダイナミクス）を光学的に解析する技術を提供することができる。
【０１１２】
（細胞の作製方法）
本実施形態の細胞は、例えば、上述の発現ベクターをドナーベクターとして細胞内に導入し、相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘発する公知のゲノム編集技術を用いて作製することができる。
【０１１３】
上述の発現ベクターを細胞内に導入する方法としては、公知の遺伝子導入の手法を用いることができ、具体的には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等を用いることができる。
【０１１４】
公知のゲノム編集技術としては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システム、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼシステム等が使用できる。または、例えば、染色体における前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入したい部位と相同な配列を、上述の発現ベクターの前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流及び下流に付加することにより、相同組換え修復を誘発させる方法等が使用できる。
また、前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドに薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択により前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入が起きた細胞を効率よく選択できる。
【０１１５】
細胞が植物細胞である場合、例えば、アグロバクテリウム法、単離プロトプラストへのＤＮＡ導入法等を用いて、リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物細胞に導入し、相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘発させて作製することができる。
また、前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドに薬剤選択マーカーを持たせておくことにより、薬剤選択により前記リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入が起きた細胞を効率よく選択できる。
【０１１６】
（染色体上の構成）
染色体に導入された上述のリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、上流にプロモーター、下流にポリアデニル化シグナル等を備えていてもよい。
プロモーター及びポリアデニル化シグナルとしては、上述の≪発現ベクター≫において例示されたものと同様のものが挙げられる。
その他リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに高発現させるために、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、イントロンの一部を、プロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間或いは翻訳領域の３’下流に連結してもよい。
また、リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入が起きた細胞を効率よく選択するために、選択マーカー（例えば、薬剤選択マーカー遺伝子）を、プロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間或いは翻訳領域の３’下流に連結してもよい。
【０１１７】
染色体に導入されたリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドは１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。２種類以上含む場合、同一細胞内において容易に検出するために、各リガンド蛍光センサータンパク質は励起波長及び発光波長が異なることが好ましい。
【０１１８】
また、２種類以上のリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む場合、同一染色体上であってもよく、異なる染色体上であってもよい。
リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入される遺伝子座としては、セーフハーバー座位であることが好ましい。
【０１１９】
なお、本明細書における「セーフハーバー座位」とは、恒常的且つ安定的に発現が行われている遺伝子領域であり、かつ当該領域に本来コードされている遺伝子が欠損又は改変された場合であっても、生命の維持が可能な領域を意味する。
ＣＲＩＳＰＲシステムを用いて、外来ＤＮＡ（本実施形態においては、リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチド）をセーフハーバー座位に挿入する場合には、近傍にＰＡＭ配列を有することが好ましい。
セーフハーバー座位としては、例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座、ＡＡＶＳ１遺伝子座等が挙げられる。
【０１２０】
＜第三実施形態＞
一実施形態において、本発明は、上述の発現ベクターを少なくとも１種類含む細胞を提供する。
【０１２１】
本実施形態の細胞によれば、生細胞におけるリガンドの濃度の変動を検出することができる。また、励起波長及び発光波長が異なる上述のリガンド蛍光センサータンパク質を複数種類含む細胞を用いることで、それぞれを同一細胞の異なるオルガネラに局在させ、蛍光顕微鏡の同一視野で同時に、あるいは、ほぼ同時に検出して、該細胞の生理的及び／又は病理的変化に伴う各種リガンド濃度の経時的及び／又は空間的変化（時空間ダイナミクス）を光学的に解析する技術を提供することができる。
【０１２２】
（細胞の作製方法）
上述の発現ベクターを細胞内に導入する方法としては、公知の遺伝子導入の手法を用いることができ、上述の＜第二実施形態＞において例示されたものと同様の方法が挙げられる。
【０１２３】
導入された上述の発現ベクターは１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。２種類以上含む場合、同一細胞内において容易に検出するために、各発現ベクターから発現されるリガンド蛍光センサータンパク質は励起波長及び発光波長が異なることが好ましい。
【０１２４】
≪非ヒト生物≫
一実施形態において、本発明は、上述の細胞を含む非ヒト生物を提供する。
【０１２５】
本実施形態の非ヒト生物によれば、生理学的条件下で高濃度のリガンドの存在下での蛍光強度とリガンド非存在下での蛍光強度の比が十分に高く、非ヒト生物の生理学的及び／又は病理学的なリガンドの濃度の変動を検出することができる。また、励起波長及び発光波長が異なるリガンド蛍光センサータンパク質を複数種類発現する細胞を生物体内の１箇所若しくは複数箇所に含む非ヒト生物を用いることで、それぞれを同一細胞の異なるオルガネラに局在させ、あるいは、生物体内の異なる細胞に局在させ、蛍光顕微鏡の同一視野で同時に、あるいは、ほぼ同時に検出して、非ヒト生物の生理的及び／又は病理的変化に伴うリガンド濃度の経時的及び／又は空間的変化（時空間ダイナミクス）を光学的に解析する技術を提供することができる。
【０１２６】
なお、本明細書における「非ヒト生物」とは、ヒト以外の生物種であればよく、具体的には、上述の≪細胞≫において例示されたもののうちヒト以外のものが挙げられる。
本実施形態の非ヒト生物は、上述の細胞が移植された非ヒト生物であってもよく、リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドが生殖細胞系にも導入され、次世代に受け継がれた遺伝子改変非ヒト生物であってもよい。
【０１２７】
＜非ヒト生物の作製方法＞
本実施形態の非ヒト生物の作製方法としては、例えば、上述の細胞を非ヒト生物の体内に外科的又は非外科的に導入する方法、上述のベクターを直接非ヒト生物の細胞に導入する方法等が挙げられる。
【０１２８】
又は、非ヒト生物が非ヒト哺乳動物である場合、例えば、上述の≪細胞≫の＜第二実施形態＞において、細胞として非ヒト哺乳動物の受精卵、胚性幹細胞、精子又は未受精卵を用いて、リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入し、これらの細胞を用いて発生させた個体から、リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドが胚芽細胞を含むすべての細胞の染色体上に組み込まれた個体を選択する方法によっても作製することができる。
【０１２９】
得られた非ヒト哺乳動物の胚芽細胞においてリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドが存在することは、得られた動物の子孫がその胚芽細胞及び体細胞の全てに該導入遺伝子を有することで確認することができる。個体の選択は、個体を構成する組織、例えば、血液組織、上皮組織、結合組織、軟骨組織、骨組織、筋組織、口腔内組織又は骨格系組織の一部から調製したゲノムＤＮＡにリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドが存在することをＤＮＡレベルで確認することによって行われる。このようにして選択された個体は通常、相同染色体の片方にリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するヘテロ接合体であるため、ヘテロ接合体の個体同士を交配することにより、子孫の中からリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを相同染色体の両方に持つホモ接合体動物を取得することができる。このホモ接合体の雌雄の動物を交配することにより、すべての子孫がリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを安定に保持するホモ接合体となるので、通常の飼育環境で、非ヒト哺乳動物を繁殖継代することができる。
【０１３０】
又は、非ヒト生物が植物である場合、例えば、上述の≪細胞≫の＜第二実施形態＞においてアグロバクテリウム法、又は単離プロトプラストへのＤＮＡ導入法によって、作製された植物細胞を、植物組織培養法により遺伝子組換え植物全体を再分化させることで作製することができる。
又は、非ヒト生物が植物である場合、例えば、未成熟胚を酵素で部分的に分解し、エレクトロポレーション法等によって、リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入し、前記ポリヌクレオチドが染色体に挿入された胚細胞を植物組織培養法により再分化させることによって作製することができる。
【０１３１】
≪リガンド濃度測定キット≫
一実施形態において、本発明は、上述のリガンド蛍光センサータンパク質、上述のポリヌクレオチド、上述の発現ベクター、上述の細胞、及び上述の非ヒト生物からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むリガンド濃度測定キットを提供する。
【０１３２】
本実施形態のリガンド濃度測定キットによれば、生理学的条件下で高濃度のリガンドの存在下での蛍光強度とリガンド非存在下での蛍光強度の比が十分に高く、細胞又は非ヒト生物の生理学的及び／又は病理学的なリガンドの濃度の変動を検出することができる。
【０１３３】
また、例えば、リガンドがＡＴＰである場合、本実施形態のリガンド濃度測定キットを用いることで、ＡＴＰか、前記細胞又は生物によって代謝されるとＡＴＰが産生されるグルコースその他の生体エネルギー源かが存在するときにのみ蛍光を発生し、検出することができる。
また、リガンドがＡＴＰである場合、ルシフェラーゼによる発光反応を利用する従来の生細胞検出技術では、細胞膜を溶解して、酵素ルシフェラーゼ及び基質ルシフェリンに細胞内のＡＴＰを接触させる必要があった。しかし、本実施形態のリガンド濃度測定キットを用いれば、細胞を破壊してＡＴＰを拡散させることなく生細胞を検出することができるので、微生物フロラのように空間的な構造のどの場所に生細胞が分布するか検出することができる。
【０１３４】
本実施形態のリガンド濃度測定キットは、上述のリガンド蛍光センサータンパク質を含む場合に、１種類のリガンド蛍光センサータンパク質を含んでいてもよく、励起波長及び発光波長が異なる複数種類のリガンド蛍光センサータンパク質を含んでいてもよい。
また、本実施形態のリガンド濃度測定キットは、上述のリガンド蛍光センサータンパク質を含む場合に、前記リガンド蛍光センサータンパク質は固体支持体に固定化されていてもよい。
固体支持体としては、上述の≪リガンド蛍光センサータンパク質≫に記載されていたものと同様のもの等が挙げられる。
【０１３５】
本実施形態のリガンド濃度測定キットは、上述のポリヌクレオチドを含む場合に、リガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを１種類含んでいていもよく、励起波長及び発光波長が異なるリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを複数種類含んでいてもよい。
【０１３６】
本実施形態のリガンド濃度測定キットは、上述の発現ベクターを含む場合に、１種類のリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含んでいていもよく、励起波長及び発光波長が異なるリガンド蛍光センサータンパク質を含む発現ベクターを複数種類含んでいていもよい。
【０１３７】
本実施形態のリガンド濃度測定キットは、上述の細胞を含む場合に、１種類の細胞を含んでいていもよく、複数種類の細胞を含んでいてもよい。
また、本実施形態のリガンド濃度測定キットは、リガンド蛍光センサータンパク質が発現又は導入されている細胞を１種類含んでいてもよく、励起波長及び発光波長が異なるリガンド蛍光センサータンパク質が発現又は導入されている細胞を複数種類含んでいてもよい。
また、細胞内において１種類のリガンド蛍光センサータンパク質が発現又は導入されていてもよく、複数種類の励起波長及び発光波長が異なるリガンド蛍光センサータンパク質が発現又は導入されていてもよい。
【０１３８】
本実施形態のリガンド濃度測定キットは、上述の非ヒト生物を含む場合に、１種類の非ヒト生物を含んでいていもよく、複数種類の非ヒト生物を含んでいてもよい。
また、本実施形態のリガンド濃度測定キットは、リガンド蛍光センサータンパク質が発現又は導入されている非ヒト生物を１種類含んでいてもよく、励起波長及び発光波長が異なるリガンド蛍光センサータンパク質が発現又は導入されている非ヒト生物を複数種類含んでいてもよい。
また、本実施形態のリガンド濃度測定キットに含まれる非ヒト生物の同一細胞内において、１種類のリガンド蛍光センサータンパク質が発現又は導入されていてもよく、複数種類の励起波長及び発光波長が異なるリガンド蛍光センサータンパク質が発現又は導入されていてもよい。
また、本実施形態のリガンド濃度測定キットに含まれる非ヒト生物の異なる細胞内において、１種類のリガンド蛍光センサータンパク質が発現又は導入されていてもよく、複数種類の励起波長及び発光波長が異なるリガンド蛍光センサータンパク質が発現又は導入されていてもよい。
【０１３９】
本実施形態において、上述のリガンド蛍光センサータンパク質を含む場合、本実施形態のリガンド濃度測定キットは、さらに、上述の≪細胞≫の＜第一実施形態＞において例示された試薬を含んでいてもよい。
【０１４０】
本実施形態において、上述の発現ベクターを含む場合、本実施形態のリガンド濃度測定キットは、さらに、ベクター導入用のトランスフェクション試薬を含んでいてもよい。
ベクター導入用のトランスフェクション試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬及びリン酸カルシウムからなる群より選択される。このようなトランスフェクション試薬としては、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）、ＴｆｘＴＭ−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ）、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｘＧｅｎ  ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤ）等が挙げられ、それらに限定されない。
【０１４１】
本実施形態において、上述の細胞を含む場合、本実施形態のリガンド濃度測定キットは、さらに、細胞培養用培地を備えていてもよい。
細胞培養用培地としては、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）等を含む基本培地であればよく、細胞の種類により適宜選択することができる。
前記細胞培養用培地として具体的には、例えば、ＬＢ培地、大腸菌用最少培地（Ｄａｖｉｓ培地）、大腸菌用最少塩培地（ＭＳ）等の大腸菌培養用培地；枯草菌用最少培地（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ最少培地）、枯草菌用最少塩培地、枯草菌形質転換用培地Ｉ、枯草菌形質転換用培地ＩＩ等の枯草菌培養用培地；酵母用最少培地（ＹＰＤ培地）、酵母用完全培地（ＹＰＡＤ培地）等の酵母培養用培地；ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地（ＭＳ培地）、Ｂ５培地、ハイポネックス培地等の植物培養用培地；グレース昆虫培地、シュナイダー昆虫培地等の昆虫細胞培養用培地；ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）等の動物細胞培養用培地等が挙げられ、これらに限定されない。
【０１４２】
本実施形態のリガンド濃度測定キットは、さらに、励起用光源を含んでいていもよい。励起用光源は、蛍光センサータンパク質の励起波長に応じて、適宜選択すればよい。
【０１４３】
≪被検試料中のリガンド濃度の決定方法≫
一実施形態において、本発明は、上述のリガンド蛍光センサータンパク質と、既知の濃度のリガンドを含む標準溶液と接触させて、蛍光強度を測定し、検量線を作成する検量線作成工程と、前記リガンド蛍光センサータンパク質と、未知の濃度のリガンドを含む溶液と接触させて、蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、前記検量線作成工程において、作成された検量線に基づいて、前記蛍光測定工程において測定された蛍光強度に対するリガンド濃度を決定する濃度決定工程と、を備える被検試料中のリガンド濃度の決定方法を提供する。
【０１４４】
本実施形態の被検試料中のリガンド濃度の決定方法によれば、被検試料中のリガンド濃度を簡便且つ正確に決定することができる。
本実施形態の被検試料中のリガンド濃度の決定方法の各工程について、以下に詳細に説明する。
【０１４５】
［検量線作成工程］
まず、上述のリガンド蛍光センサータンパク質と、既知の濃度のリガンドを含む標準溶液とを接触させ、蛍光強度を測定する。
リガンドとしては、特別な限定はなく、上述の≪リガンド蛍光センサータンパク質≫において例示されたものと同様のものが挙げられる。
標準溶液は、１種類の濃度のリガンドを含む溶液を用いてもよく、複数種類の濃度のリガンドを含む溶液を用いてもよい。中でも、検量線を正確に作成するために、標準溶液は、複数種類の濃度のリガンドを含む溶液を用いることが好ましい。
【０１４６】
前記リガンド蛍光センサータンパク質は、溶媒中に懸濁された状態であってもよく、固体支持体に固定化された状態であってもよい。
前記リガンド蛍光センサータンパク質を懸濁する溶媒としては、リガンド蛍光センサータンパク質のリガンド結合能及び蛍光特性に影響を与えないものであればよい。溶媒として具体的には、例えば、水、塩化ナトリウム溶液（例えば、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、グルコース溶液（例えば、５％グルコース）、界面活性剤含有溶液（例えば、０．０１％ポリソルベート２０）、ｐＨ緩衝溶液（緩衝剤として、例えば、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸−酢酸ナトリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸、ホウ酸、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ等を含む溶液）等が挙げられ、これらに限定されない。
固体支持体としては、上述の≪リガンド蛍光センサータンパク質≫に記載されていたものと同様のもの等が挙げられる。
【０１４７】
蛍光強度の測定は、公知の定常蛍光測定装置を用いればよい。次いで、得られた蛍光強度と既知のリガンド濃度から、検量線を作成する。
【０１４８】
［蛍光測定工程］
次いで、前記リガンド蛍光センサータンパク質と、未知の濃度のリガンドを含む溶液と接触させて、蛍光強度を測定する。蛍光強度の測定は、公知の定常蛍光測定装置を用いればよい。
未知の濃度のリガンドを含む溶液としては、特別な限定はなく、例えば、ヒト又は非ヒト生物から採取された体液試料、ヒト又は非ヒト生物から採取された細胞の抽出液、ヒト又は非ヒト生物から採取された細胞の培養上清、ヒト又は非ヒト生物由来の培養細胞の抽出液、ヒト又は非ヒト生物由来の培養細胞の培養上清等が挙げられ、これらに限定されない。
【０１４９】
前記体液試料として、より具体的には、例えば、血液、血清、血漿、尿、パフィーコート、唾液、精液、胸部滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液、気管支肺胞洗浄液等が挙げられ、これらに限定されない。
【０１５０】
［濃度決定工程］
次いで、前記検量線作成工程において、作成された検量線に基づいて、前記蛍光測定工程において測定された蛍光強度に対するリガンド濃度を決定する。
前記検量線の作成及び蛍光強度に対するリガンド濃度の決定については、市販のデータ解析ソフトウェア等を用いて実施していもよい。
【０１５１】
≪リガンド濃度の経時変化の検知方法≫
上述の細胞又は上述の非ヒト生物を用いることで、生理学的条件下で高濃度のリガンドの存在下での蛍光強度とリガンド非存在下での蛍光強度の比が十分に高く、生きた細胞又は生きた非ヒト生物の生理学的及び／又は病理学的なリガンドの濃度の変動を簡便に検出することができる。
【０１５２】
＜第一実施形態＞
一実施形態において、本発明は、上述の細胞を用いて、経時的な蛍光強度を測定する工程を備える生細胞におけるリガンド濃度の経時変化の検知方法を提供する。
【０１５３】
本実施形態の検知方法によれば、生細胞におけるリガンドの濃度の経時的な変化を簡便に検出することができる。また、励起波長及び発光波長が異なる上述のリガンド蛍光センサータンパク質が複数種類導入された又は発現している細胞を用いることで、それぞれを同一細胞の異なるオルガネラに局在させ、蛍光顕微鏡の同一視野で同時に、あるいは、ほぼ同時に検出して、該細胞の生理的及び／又は病理的変化に伴う各種リガンド濃度の経時的及び／又は空間的変化（時空間ダイナミクス）を光学的に解析する技術を提供することができる。
【０１５４】
本実施形態の検知方法において、細胞を生きたままの状態で、定常蛍光測定装置を有する蛍光顕微鏡等を用いて、蛍光強度を測定することができる。さらに、継続的に蛍光強度を測定することにより、蛍光強度の経時的な変化を測定することができる。
【０１５５】
＜第二実施形態＞
一実施形態において、本発明は、上述の非ヒト生物を用いて、経時的な蛍光強度を測定する工程を備える生きた非ヒト生物におけるリガンド濃度の経時変化の検知方法を提供する。
【０１５６】
本実施形態の検知方法によれば、生理学的条件下で高濃度のリガンドの存在下での蛍光強度とリガンド非存在下での蛍光強度の比が十分に高く、非ヒト生物の生理学的及び／又は病理学的なリガンドの濃度の変動を検出することができる。また、励起波長及び発光波長が異なるリガンド蛍光センサータンパク質を複数種類発現する細胞を生物体内の１箇所若しくは複数箇所に含む非ヒト生物を用いることで、それぞれを同一細胞の異なるオルガネラに局在させ、あるいは、生物体内の異なる細胞に局在させ、蛍光顕微鏡の同一視野で同時に、あるいは、ほぼ同時に検出して、非ヒト生物の生理的及び／又は病理的変化に伴うリガンド濃度の経時的及び／又は空間的変化（時空間ダイナミクス）を光学的に解析する技術を提供することができる。
【０１５７】
本実施形態の検知方法において、非ヒト生物を生きたままの状態で、定常蛍光測定装置を有する蛍光顕微鏡等を用いて、蛍光強度を測定することができる。さらに、継続的に蛍光強度を測定することにより、蛍光強度の経時的な変化を測定することができる。
【実施例】
【０１５８】
以下、実施例及び比較例等を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。【０１５９】
［実施例１］ＡＴＰ特異的蛍光センサータンパク質の構築
１．試薬等
ＡＴＰ、ＡＤＰ、及びＡＭＰは和光純薬工業株式会社から購入し、ＧＴＰはシグマ−アルドリッジから購入した。フッ化ナトリウム（ＮａＦ）、オリゴマイシン、イソプロテレノール及び３−（３，４−ジクロロフェニル）−１，１−ジメチルウレア（ＤＣＭＵ）のようなその他の試薬はシグマ−アルドリッジから購入した。ｄＡＴＰはサーモサイエンティフィックから購入した。プライマー用の全てのポリヌクレオチドはシグマ−アルドリッジから購入した。ライゲーションはそれぞれの最適バッファー（タカラ）中でＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて反応を行った。ＰＣＲには、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）を用いた。ＰＣＲ反応産物又は制限酵素消化産物は、ルーティンとして、電気泳動（アガロースゲル）により精製し、その後ゲル抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ、株式会社キアゲン）を行った。大腸菌からのプラスミドＤＮＡ単離には、Ａｘｙ  Ｐｒｅｐ（商標）ミニプレップキット（Ａｘｙｇｅｎｂｉｏ、コーニングジャパン株式会社）を用いた。【０１６０】
２．ＡＴＰ蛍光センサータンパク質及びこれに対応する陰性対照タンパク質の設計
本発明のＡＴＰ蛍光センサータンパク質は、ＡＴＰ結合ドメインとして枯草菌Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のイプシロン（ε）サブユニットを用い、蛍光タンパク質として、ＢＦＰ（Ｗａｃｈｔｅｒ，  Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９６０，  ９７５９−９７６５  （１９９７））、Ｃｉｔｒｉｎｅ（Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ，  Ｏ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ２９１８８−２９１９４  （２００１））、及びｍＡｐｐｌｅ（Ｓｈａｎｅｒ，Ｎ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：５４５−５５１（２００８））を用いた。
なお、ＢＦＰ及びｍＡｐｐｌｅは、Ｚｈａｏ，  Ｙ．ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３３３，  １８８８−１８９１  （２０１１））を参照して数カ所にアミノ酸置換変異を導入した（配列番号１、２、７、及び８）。蛍光タンパク質ＢＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、及びｍＡｐｐｌｅの励起波長は、それぞれ、３８０、４９０、及び５５０ｎｍで、発光波長域は、それぞれ、４１０〜６００、５０５〜６５０及び５７５〜７００ｎｍである。εサブユニットのアミノ末端及びカルボキシル末端にさまざまなポリペプチドリンカーを連結して、蛍光タンパク質ＢＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ及びｍＡｐｐｌｅの内部に挿入した融合タンパク質を、ＡＴＰ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質として作製した（それぞれＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲシリーズと称する場合がある。）。【０１６１】
ＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質のドメイン及びリンカーの構成は以下のとおりである。まず、ＡＴＰと特異的に結合するドメインを「ＡＴＰ結合ドメイン」と称する場合がある。ＡＴＰ結合ドメインは、枯草菌Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットに由来し、そのアミノ酸配列は配列番号１５として配列表に列挙する。ＡＴＰ結合ドメインのアミノ末端に連結するポリペプチドリンカーを「Ｎ末端側リンカー」、ＡＴＰ結合ドメインのカルボキシル末端に連結するポリペプチドリンカーを「Ｃ末端側リンカー」と称する場合がある。。挿入により分断された各蛍光タンパク質ＢＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、及びｍＡｐｐｌｅのアミノ末端側ドメイン及びカルボキシル末端側ドメインを、以下では、「ＢＦＰ−Ｎドメイン」、「ＢＦＰ−Ｃドメイン」、「Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｎドメイン」、「Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｃドメイン」、「ｍＡｐｐｌｅ−Ｎドメイン」、及び「ｍＡｐｐｌｅ−Ｃドメイン」と称する場合がある。ＢＦＰ−Ｎドメイン及びＢＦＰ−Ｃドメインのアミノ酸配列は配列番号１及び２として列挙する。Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｎドメイン及びＣｉｔｒｉｎｅ−Ｃドメインのアミノ酸配列は配列番号５及び６として列挙する。ｍＡｐｐｌｅ−Ｎドメイン及びｍＡｐｐｌｅ−Ｃドメインのアミノ酸配列は配列番号７及び８として列挙する。【０１６２】
したがって、ＭａＬｉｏｎ  ＢシリーズのＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［ＢＦＰ−Ｎドメイン］−［Ｎ末端側リンカー］−［ＡＴＰ結合ドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［ＢＦＰ−Ｃドメイン］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが配置される。
同様に、ＭａＬｉｏｎ  ＧシリーズのＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｎドメイン］−［Ｎ末端側リンカー］−［ＡＴＰ結合ドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｃドメイン］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが配置される。
また、ＭａＬｉｏｎ  ＲシリーズのＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［ｍＡｐｐｌｅ−Ｎドメイン］−［Ｎ末端側リンカー］−［ＡＴＰ結合ドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［ｍＡｐｐｌｅ−Ｃドメイン］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが配置される。【０１６３】
ＡＴＰ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質の構築の手順は概略以下のとおりである。まず、ＡＴＰ結合ドメインとして、枯草菌Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットをコードするポリヌクレオチドを合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、株式会社医学生物学研究所）。つぎに、ＡＴＰ結合ドメインの両端にさまざまなアミノ酸配列のＮ末端側リンカー及びＣ末端側リンカーをコードするポリヌクレオチドを連結した。前記Ｎ末端側リンカー、ＡＴＰ結合ドメイン及びＣ末端側リンカーをエンコードするポリヌクレオチドが、アミノ酸配列の読み枠がずれないように、各蛍光タンパク質の発色団よりカルボキシル末端側で挿入された融合したキメラタンパク質をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ法により作製した。前記ＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質をコードするポリヌクレオチドをｐＲＳＥＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に挿入するために、ＭａＬｉｏｎ  ＧシリーズはＸｈｏＩ／ＢｓｔｂＩ部位を、ＭａＬｉｏｎ  Ｂ及びＲシリーズはＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いた。ＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質を含むｐＲＳＥＴＡベクターコンストラクトは大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）に形質転換され、ＡＴＰ蛍光センサーの各候補タンパク質を含む発現ベクターのクローンが単離された。各クローンの大腸菌は２．５ｍＬのＬＢ培地中で２０℃で３〜４日間培養された。その後、該大腸菌の懸濁液を１５，３００ｇで５分間遠心して、ペレットにし、ＰＢＳバッファー液で再懸濁して、３０秒間超音波処理（１３０Ｗ、２０ｋＨｚ、強度３０％、Ｖｉｂｒａ  ｃｅｌｌ（商標）、ＳＯＮＩＣＳ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｉｎｃ.）を施して菌体溶解液を得た。該菌体溶解液の遠心上清４０μＬに、４６０μＬのバッファー液（５０ｍＭ  Ｍｏｐｓ−ＫＯＨ（ｐＨ  ７．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び０．０５％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を添加した。最終濃度１０ｍＭのＡＴＰの存在下又は非存在下で、各クローンのＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質の蛍光特性を蛍光分光光度計（日立Ｆ−２７００、株式会社日立ハイテクサイエンス）を用いて測定した。【０１６４】
３．ＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質の蛍光特性の測定結果
図１ＡはＭａＬｉｏｎ  ＢシリーズのＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質１９種類のＡＴＰの存在下での蛍光強度とＡＴＰ非存在下での蛍光強度の比（以下、「ダイナミックレンジ」という。）のヒストグラムであり、図１ＢはＭａＬｉｏｎ  ＧシリーズのＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質２７種類のダイナミックレンジのヒストグラムであり、図１ＣはＭａＬｉｏｎ  ＲシリーズのＡＴＰ蛍光センサーの候補タンパク質４７種類のＦ／Ｆ０のヒストグラムである。ここでＡＴＰ存在下のＡＴＰ濃度はすべて１０ｍＭである。図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃの横軸はダイナミックレンジで、目盛の数字は各区間の端を表し、縦軸は、ダイナミックレンジの区間内にダイナミックレンジが含まれる候補タンパク質の個数を表す。図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃにおいて、ダイナミックレンジが１であれば、ＡＴＰの有無で蛍光特性に変化がないことを意味し、ダイナミックレンジが１を超える場合はＡＴＰ存在下で蛍光が強くなり（以下、「ターン・オン型」（ｔｕｒｎ−ｏｎ  ｔｙｐｅ）と称する場合がある。）、ダイナミックレンジが１未満の場合はＡＴＰ存在下で蛍光が弱くなる（以下、「ターン・オフ型」（ｔｕｒｎ−ｏｆｆ  ｔｙｐｅ）と称する場合がある。）。【０１６５】
ＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲシリーズで最もダイナミックレンジが大きい候補タンパク質をそれぞれＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ及びＲと命名した。ＭａＬｉｏｎ  ＢのＮ末端側リンカー及びＣ末端側リンカーのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１６及び１７に列挙する。ＭａＬｉｏｎ  ＧのＮ末端側リンカーのアミノ酸配列はＷＲＧ（Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）で、ＭａＬｉｏｎ  ＧのＣ末端側リンカーのアミノ酸配列を配列番号１８に列挙する。ＭａＬｉｏｎ  ＲのＮ末端側リンカーのアミノ酸配列を配列番号１９に列挙する。ＭａＬｉｏｎ  ＲのＣ末端側リンカーのアミノ酸配列はＰＥＥ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ）である。ＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲの全長アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号９、１０、及び１１に列挙する。【０１６６】
ＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲシリーズでダイナミックレンジが１に近い候補タンパク質の１つをそれぞれｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲと命名した。ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  ＢのＮ末端側リンカー及びＣ末端側リンカーのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２７及び２８に列挙する。配列番号ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  ＧのＮ末端側リンカーのアミノ酸配列はＰＲＧ（Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ）で、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  ＧのＣ末端側リンカーのアミノ酸配列を配列番号２９に列挙する。ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  ＲのＮ末端側リンカーのアミノ酸配列を配列番号３０に列挙する。ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  ＲのＣ末端側リンカーのアミノ酸配列はＰＥＧ（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ）である。ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲの全長アミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２４、２５、及び２６に列挙する。【０１６７】
［実施例２］ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等の蛍光特性の解析
１．ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等の精製
ＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲと、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲとを以下では「ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等」と称する場合がある。タンパク質精製の目的には、ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等をｐＲＳＥＴＡベクターに連結して、翻訳開始コドン、ヒスチジンヘキサマーポリペプチド等を含む融合タンパク質をＴ７プロモーターで駆動するコンストラクトとして大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）に導入した。ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等の発現ベクターを含む大腸菌は、１００ｍＬのＬＢ培地中で２０℃４日間培養した。その後、大腸菌の懸濁液は１５，３００ｇ、２０分間、４℃で遠心して上清を除去し、ペレットの凍結及び溶解を３回繰り返し、氷上で３分間超音波処理（３０Ｗ、２０ｋＨｚ、強度７０％、Ｖｉｂｒａ  ｃｅｌｌ（商標））を施して菌体溶解液を得た。該菌体溶解液の遠心上清をＮｉ−ＮＴＡアガロース（株式会社キアゲン）を充填したＰＤ−１０カラム（ＧＥ  ヘルスケア・ジャパン株式会社）に吸着させ、常法に従い、カラムを洗浄し、ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等の融合タンパク質を前記カラムから溶出した。ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等の融合タンパクはＢｒａｄｆｏｒｄ法タンパク質アッセイ（バイオラッドタンパク質アッセイ、バイオラッド  ラボラトリーズ株式会社）を用いて、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質とする較正曲線により定量した。【０１６８】
２．精製ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等の蛍光特性の測定
精製されたＡＴＰ蛍光センサータンパク質等の融合タンパクを蛍光分光光度計（日立Ｆ−２７００）による測定実験に用いた。以下の実験では、ｐＨを変化させる実験を除いて、Ｍｏｐｓバッファー（５０ｍＭ  Ｍｏｐｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び０．０５％  トリトン  Ｘ−１００）を用いた。ＡＴＰ濃度による蛍光特性の変化を調べる実験では、０−８ｍＭのさまざまな最終濃度のＡＴＰを用いた。分子特異性を調べる実験では、ＡＴＰの類縁体化合物のうち、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＴＰ、又はｄＡＴＰを最終濃度１０ｍＭで用いた。精製されたＡＴＰ蛍光センサータンパク質等の融合タンパクの吸光スペクトルの測定には該融合タンパク質の濃度を２０μＭに調整し、紫外線−可視光分光光度計（日本分光株式会社）を用いた。精製されたＡＴＰ蛍光センサータンパク質等の融合タンパクの反応速度論的解析には、ストップトフロー装置を備えた蛍光分光光度計（ＲＸ２０００、Ａｐｐｌｉｅｄ  ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いた。該タンパク質は、異なるＡＴＰ濃度の溶液と１：１で迅速に混合され、所定の波長（４４０ｎｍ、５２０ｎｍ及び５８５ｎｍ）での蛍光変化を記録して、各ＡＴＰ濃度での見かけの速度定数（ｋａｐｐを指数曲線の当てはめにより算出した。その後、各ＡＴＰ濃度でのｋａｐｐをプロットして、結合定数（ｋｏｎ）及び解離定数（ｋｏｆｆ）をそれぞれ決定した。ここで、これら３種類の定数の関係は以下の式（１）で表される。【０１６９】
【数１】
2017094885.tif 000006
【０１７０】
３．ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等の蛍光特性の測定結果
図２Ａは１０ｍＭのＡＴＰ存在下及び非存在下でのＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲの励起スペクトル図であり、図２Ｂは１０ｍＭのＡＴＰ存在下及び非存在下でのＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲの励起スペクトル及び蛍光スペクトル図である。図２Ａ及び図２Ｂの横軸は、それぞれ、励起波長及び蛍光波長を表し、縦軸は蛍光強度の相対値を表す。グラフの実線及び点線は、それぞれ、ＡＴＰ存在下及び非存在下でのスペクトル曲線を表す。図２Ａ及び図２Ｂから明らかなとおり、ＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲはいずれもＡＴＰ非存在下と比較して１０ｍＭのＡＴＰ存在下での蛍光が、それぞれ、８０％、３９０％及び３５０％も増大した。図２Ｃは１０ｍＭのＡＴＰ存在下及び非存在下でのｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲの蛍光スペクトル図である。図２Ｃから、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲはいずれもＡＴＰ非存在下と比較して１０ｍＭのＡＴＰ存在下での蛍光が、それぞれ、１０４％、９５％、及び１０６％増大した。【０１７１】
図３ＡはＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲの蛍光強度のＡＴＰ濃度依存的変化を示すグラフである。図３Ａの異なるＡＴＰ濃度と蛍光強度変化のプロットから解離平衡定数（ＫＤ）を算出した結果は以下の表５のとおりであった。【０１７２】
【表５】
2017094885.tif 000007
【０１７３】
細胞内のＡＴＰ濃度は、従来の知見より、諸説あるが、ほとんどの場合、５ｍＭ以下であることが知られている（Ｒａｎｇａｒａｊｕら、Ｃｅｌｌ．  １５６，  ８２５−３５  （２０１４）、Ｔｒａｕｔ，Ｔ．  Ｗ．、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４０，  １−２２  （１９９４））。したがって、ＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲの解離平衡定数を考慮すると、それぞれ、生理的な条件下で、十分に機能するものと期待できる。【０１７４】
図３ＢはＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲの蛍光強度の分子特異性を示すグラフである。ＡＴＰ非存在下と比較した１０ｍＭのＡＴＰ存在下での蛍光強度の相対値を正規化ダイナミックレンジとすると、ＡＴＰ類縁体化合物は正規化ダイナミックレンジの１０％以下しか蛍光強度に影響を与えないことが明らかになった。したがって、今回のＡＴＰ蛍光センサーは非常にＡＴＰに特異性が高い。またこの結果から、同じ枯草菌Ｆ０Ｆ１−ＡＴＰ合成酵素のεサブユニットをＡＴＰ結合ドメインとして利用するＡＴＰセンサータンパク質であっても、改変体ごとにＡＴＰ類縁体化合物の影響が異なり、ＭａＬｉｏｎ  Ｂ、及びＧでは、ＡＤＰ、ＡＭＰ、及びｄＡＴＰ存在下では蛍光が減少するが、ＭａＬｉｏｎ  Ｒでは蛍光が増大した。したがって、個々の蛍光センサーの蛍光特性は、ＡＴＰ結合ドメインの両端に連結されたＮ末端側リンカー及びＣ末端側リンカーの配列が決定しているといえる。【０１７５】
図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃは、それぞれ、ＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲのＡＴＰ存在下又はＡＴＰ非存在下での蛍光強度と、ダイナミックレンジとのｐＨ依存的変化を示すグラフである。図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃの横軸はｐＨ、左側の縦軸は蛍光強度、右側の縦軸はダイナミックレンジを表す。図４Ａ、図４Ｂ、及び図４Ｃから、ＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲは、ＡＴＰ濃度が同じでも、ｐＨが変化すると蛍光特性が変化し、そのｐＨによる蛍光特性への影響は、改変体ごとに異なる。これは、図３Ｂに示すＡＴＰ類縁体化合物の蛍光特性への影響と同様である。実際、ＡＴＰ蛍光センサー陰性対照タンパク質ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲのｐＨによる蛍光特性の変化パターンは、ＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲのｐＨによる蛍光特性の変化パターンと同じであった。そこで、ＡＴＰ濃度の変化と同時にｐＨも変化する可能性のある実験系では、ＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲによる蛍光測定と、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂ、Ｇ、及びＲの蛍光測定とを並行して行うことによって、ｐＨ変化による影響を除外してＡＴＰ濃度を決定することができる。【０１７６】
［実施例３］ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等の細胞内発現用ベクターの構築
１．哺乳類細胞内発現用ベクターの構築
哺乳類細胞内で発現させるために、ＭａＬｉｏｎ  Ｇ又はｎｅｇＭａＬｉｏｎ  ＧをコードするポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターのＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。ＭａＬｉｏｎ  Ｂ及びＲ、あるいは、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｂ及びＲをコードするポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等を哺乳類細胞ミトコンドリアに局在化させるために、ＡＴＰ蛍光センサータンパク質のアミノ末端にシトクロムｃオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩ由来局在化シグナル配列（ＳＶＬＴＰＬＬＬＲＧＬＴＧＳＡＲＲＬＰＶＰＲＡＫＩＨＳＬ、配列番号４４）を連結した融合タンパク質をミトコンドリア特異的発現ベクターで発現させた。すなわち、ＭａＬｉｏｎ  Ｒ又はｎｅｇＭａＬｉｏｎ  ＲをコードするポリヌクレオチドをｐＥＹＦＰ−Ｍｉｔｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）のＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位に挿入した。ＭａＬｉｏｎ  Ｒ又はｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒのアミノ末端にシトクロムｃオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩ由来局在化シグナル配列が連結した融合タンパク質を、「ｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒ」又は「ｍｉｔｏ−ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒ」と命名した。【０１７７】
２．線虫細胞内発現用ベクターの構築
線虫のミトコンドリアでＭａＬｉｏｎ  Ｒ又はｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒを局在化させるために、ＭａＬｉｏｎ  Ｒ又はｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒのアミノ末端に、ニワトリアスパラギン酸アミノ転移酵素由来のミトコンドリア局在化シグナル（ＡＬＬＱＳＲＬＬＬＳＡＰＲＲＡＡＡＴＡＲＡＳＳ、配列番号４５）が連結した融合タンパク質を「Ｃｅｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒ」又は「Ｃｅｍｉｔｏ−ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒ」と命名した。線虫の咽頭筋でＡＴＰ蛍光センサータンパク質等を発現させるためには、ｍｙｏ２ｐプロモーターを導入したｐＢｕｅＳｃｒｉｐｔ由来のベクターに、ＭａＬｉｏｎ  Ｇ、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｃｅｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒ、又はＣｅｍｉｔｏ−ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  ＲのそれぞれをコードするポリヌクレオチドをＸｈｏＩ／ＳａｃＩ部位に挿入した。【０１７８】
３．植物細胞内発現用ベクターの構築
植物のミトコンドリアでＭａＬｉｏｎ  Ｒ又はｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒを局在化させるために、ＭａＬｉｏｎ  Ｒ又はｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒのアミノ末端に、ＡＲ７９１（ＡＴ１Ｇ５２０８０、ＮＭ＿１０４０８９．３）が連結した融合タンパク質を、「Ｐｌｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒ」又は「Ｐｌｍｉｔｏ−ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｒ」と命名した。植物でＡＴＰ蛍光センサータンパク質等を発現させるためには、３５Ｓプロモーター２重連結したｐＧｒｅｅｎ＿０２８１ベクターに、植物（シロイヌナズナ）での翻訳にコドンが最適化されたＭａＬｉｏｎ  Ｇ、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｃｅｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒ、又はＣｅｍｉｔｏ−ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  ＲのそれぞれをコードするポリヌクレオチドをＸｈｏＩ／ＳａｃＩ部位に挿入した。【０１７９】
［実施例４］ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等を用いる細胞内ＡＴＰ濃度測定
１．ＨｅＬａ細胞の細胞内ＡＴＰの蛍光センサー測定
ＨｅＬａ細胞は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国バージニア州）から入手し、ウシ胎仔血清１０％、ペニシリン１００ＩＵ／ｍＬ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加したダルベッコ変法イーグル培地（グルコース４．５ｇ／Ｌ、以下、「増殖培地」と称する場合がある。）中３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。ＨｅＬａ細胞内で発現したＡＴＰ蛍光センサータンパク質等の蛍光顕微鏡測定には、ＨｅＬａ細胞を播種して５０％コンフルエントになった３．５ｃｍのガラス底ディッシュを用意した。ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等を含む発現ベクター０．２μｇと０．２μＬのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（プロメガ株式会社）とを予め添加した１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を前記３．５ｃｍのガラス底ディッシュ上のＨｅＬａ細胞に添加した。８時間培養後、新鮮な増殖培地に交換して、さらに２−３日培養した。蛍光測定の直前に培地をフェノールレッド不含増殖培地に交換した。【０１８０】
蛍光顕微鏡測定には、冷却ＣＣＤカメラ（Ｃｏｏｌ  ＳＮＡＰ  ＨＱ２、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）及び油浸対物レンズ（Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ６０×１．４２  ＮＡ）を備えた倒立顕微鏡（ＩＸ８１、オリンパス株式会社）を用いた。細胞質ＡＴＰ産生阻害実験にはＮａＦを用いた。【０１８１】
１．５ｍＬの増殖培地中でＨｅＬａ細胞を培養しているディッシュにＮａＦ４０ｍＭを含む増殖培地０．５ｍＬを添加してＮａＦの最終濃度を１０ｍＭにした。ミトコンドリアＡＴＰ産生阻害実験にはオリゴマイシンを用いた。９００μＬの増殖培地中でＨｅＬａ細胞を培養しているディッシュにオリゴマイシン１００μｇ／ｍＬを含む増殖培地１００μＬを添加して、オリゴマイシンの最終濃度を２０μｇ／ｍＬにした。【０１８２】
細胞の蛍光顕微鏡画像は１０秒ごとに撮影した。カメラ及びフィルターの制御と、データ記録には、ＭｅｔａＦｌｕｏｒソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＬＬＣ）を用いた。ＭａＬｉｏｎ  Ｇの単色蛍光撮像には、励起フィルターにＦＦ０１−５００／２４を、ダイクロイックミラーにＤｉ０２−ＦＦ５２０を、発光フィルターにＦＦ０１−５４２／２７を用いた（全てＳｅｍｒｏｃｋ、株式会社オプトライン）。ＭａＬｉｏｎ  Ｒの単色蛍光撮像には、励起フィルターにＢＰ５３５−５５５ＨＱを、ダイクロイックミラーにＤＭ５６５ＨＱを、発光フィルターにＢＡ５７０−６２５ＨＱを用いた（全てオリンパス株式会社）。ＭａＬｉｏｎ  Ｇ及びＲの細胞質又はミトコンドリア局在化融合タンパク質の同時撮像には、励起フィルターにＢＰ４６０−４８０ＨＱ及びＢＰ５３５−５５５ＨＱ（オリンパス株式会社）を、ダイクロイックミラーにＤｉ０１−ＦＦ４９３／５７４（Ｓｅｍｒｏｃｋ、株式会社オプトライン）を、発光フィルターにＢＡ４９５−５４０ＨＱ及びＢＡ５７０−６２５ＨＱを用いた（オリンパス株式会社）。ＭａＬｉｏｎ  Ｂの単色蛍光撮像には、励起フィルターにＦＦ０１−３７７を、ダイクロイックミラーにＤｉ０３−ＦＦ４０９を、発光フィルターにＦＦ０２−４４７を用いた（全てＳｅｍｒｏｃｋ、株式会社オプトライン）。全ての実験は、ＣＯ２インキュベーター付きの温度制御循環チャンバーを用いて実行した。【０１８３】
図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃは、それぞれ、ＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｒ、及びＢを発現させたＨｅＬａ細胞に解糖系ＡＴＰ産生を阻害するＮａＦを投与後の蛍光の変化を示すグラフである。図５Ａ、図５Ｂ、及び図５Ｃでは、縦軸は正規化した蛍光強度を表し、横軸は時間（分）を表す。測定開始３分後にＮａＦを最終濃度１０ｍＭとなるように添加した。各図の薄い灰色の３本の波形は、異なる３個のディッシュでの測定値を示し、濃い灰色の１本の波形はこれら３本の波形の平均値を示す。ターン・オン型のＡＴＰ蛍光センサーＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｒ、及びＢではＮａＦ添加から１５分後まで蛍光強度が減少した。これは細胞内のＡＴＰ濃度が低下したことを意味する。【０１８４】
図５Ｄ、図５Ｅ、及び図５Ｆは、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｒ、及びＢを発現させたＨｅＬａ細胞に解糖系ＡＴＰ産生を阻害するＮａＦを投与後の蛍光の変化を示すグラフである。図５Ｇは、図５Ａ〜図５Ｆのグラフの実験結果に基づいて、ＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｒ、及びＢと、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｒ、及びＢとについて、ＨｅＬａ細胞で発現させた各蛍光タンパク質の蛍光測定開始から２５分後の正規化した蛍光強度の平均値及び標準偏差を示す棒グラフである。【０１８５】
図５Ｄ、図５Ｅ、及び図５Ｆから、ＮａＦ投与後の蛍光の変化には、ＡＴＰの濃度変化にはほとんど反応しないｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｒ、及びＢでも蛍光強度の変化が起こった。これは、細胞質のｐＨが変化が原因である可能性がある（Ｂｅｒｇ，  Ｊ．ら、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６，  １６１-１６６  （２００９））。しかし、図５Ｇに示されるとおり、ＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｒ、及びＢの測定結果と、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｒ、及びＢの測定結果とを組み合わせると、前者の蛍光強度は後者の蛍光強度より有意に低かった。そこで、ＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｒ、及びＢの測定結果と、ｎｅｇＭａＬｉｏｎ  Ｇ、Ｒ、及びＢの測定結果とを組み合わせることにより、解糖系が阻害された細胞の細胞質のように、ＡＴＰ濃度の変化がｐＨの変化と同時に起こる条件でも、ＡＴＰ濃度をｐＨ変化の影響を除外して測定することが可能になった。【０１８６】
つぎに、蛍光波長の異なる２種類のＡＴＰ蛍光センサータンパク質を一方は細胞質に局在させ、他方はミトコンドリアに局在させて、ミトコンドリアでのＡＴＰ産生を阻害するが細胞質での解糖系ＡＴＰ産生は阻害しないオリゴマイシンを投与後の細胞質及びミトコンドリア両方のＡＴＰ濃度変化を同時に測定した。２種類のＡＴＰ蛍光センサータンパク質の発現ベクターの同時トランスフェクションには、細胞質に局在するＡＴＰ蛍光センサータンパク質を含む発現ベクター０．２μｇと、ミトコンドリアに局在するＡＴＰ蛍光センサータンパク質を含む発現ベクター０．２μｇと、０．２μＬのＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（プロメガ株式会社）とを予め添加した１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を用いた。図６は、ＭａＬｉｏｎ  Ｇの発現ベクターと、ｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒの発現ベクターとをＨｅＬａ細胞に同時にトランスフェクションした後、同一視野での２種類の異なるＡＴＰ蛍光センサータンパク質に対応する２つの波長での蛍光顕微鏡撮像開始から３分後にオリゴマイシンを投与し、その後の蛍光の変化を示したグラフである。【０１８７】
図６から明らかなとおり、ミトコンドリアでのＡＴＰ濃度は、ミトコンドリアのＡＴＰ産生阻害に伴って低下した。細胞質のＡＴＰ濃度は、オリゴマイシン投与直後は減少したが、その後１５分間にわたって増大した。この細胞質及びミトコンドリアのＡＴＰ動態は、ミトコンドリアのＡＴＰ産生阻害により細胞内ＡＴＰが減少しはじめると、解糖系のＡＴＰ産生が亢進したことを示唆する。本実施例は、同一細胞内の異なるオルガネラでのＡＴＰ動態の同時観察に成功した世界最初の実験である。がん細胞では、ミトコンドリアのＡＴＰ産生よりも解糖系のＡＴＰ産生のほうが発達していることが知られている（Ｗａｒｂｕｒｇ効果）。抗がん剤の開発では、これら２つのＡＴＰ産生系を阻止して細胞死に至らしめることをねらう戦略を採用することが多い。しかし、本実施例から、これら２つのＡＴＰ産生系は相互作用することが具体的に示された。そこで、ＡＴＰ産生系を作用点とする制がん剤等の今後の医薬開発では、ＡＴＰ蛍光センサータンパク質を用いる細胞質及びミトコンドリアのＡＴＰ動態の同時観察が薬物評価に利用されることが推察される。【０１８８】
２．褐色脂肪細胞での細胞内ＡＴＰの蛍光センサー測定
不死化褐色脂肪細胞（前脂肪細胞）株のマウスＷＴ−１細胞は、ウシ胎仔血清１０％、ＧｌｕｔａＭａｘ（商標）、並びにペニシリン１００ＩＵ／ｍＬ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加したダルベッコ変法イーグル培地（低グルコース、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）中３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。ＷＴ−１細胞はＤｒ．Ｙｕ−Ｈｕａ  Ｔｓｅｎｇ（Ｊｏｓｌｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ、Ｂｏｓｔｏｎ、アメリカ合衆国）から恵与された。ＷＴ−１細胞は、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）−７による分化誘導によりガラス底ディッシュ上で褐色脂肪細胞に分化した（Ｔｓｅｎｇら（Ｎａｔｕｒｅ、４５４：１０００−１００４（２００８））。簡潔には、細胞がコンフルエント状態に達した後、３．３ｎＭのＢＭＰ−７（３５４−ＢＰ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）、２０ｎＭのインシュリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ．）、及び１ｎＭのＴ３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ．）を添加した基本培地を用いて３日間前処理することで細胞分化を開始させた。コンフルエント状態の細胞は誘導カクテル（０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、０．１２５ｍＭのインドメタシン、５μＭのデキサメタゾン、２０ｎＭのインシュリン（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．  ＬＬＣ．））を添加した基本培地で２日間処理された。【０１８９】
その後、培地を２０ｎＭのインシュリン及び１ｎＭのＴ３を添加した基本培地に交換して、ＡＴＰ蛍光センサータンパク質の発現ベクターのトランスフェクションを行った。分化したＷＴ−１細胞の細胞質及びミトコンドリアのＡＴＰ濃度を測定する実験には、０．４μｇのＭａＬｉｏｎ  Ｇの発現ベクターと、０．４μｇのｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒの発現ベクターと、２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを用いてトランスフェクションを行った。分化したＷＴ−１細胞のカルシウムイオン、ｃＡＭＰ及びミトコンドリア内ＡＴＰの濃度を測定する実験には、１．０μｇのＢ−Ｇｅｃｏ（Ｚｈａｏ，  Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３３３，  １８８８-９１  （２０１１））の発現ベクター、０．３μｇのＦｌａｍｉｎｄｏ２（Ｏｄａｋａ，  Ｈ．ら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，  ｅ１００２５２  （２０１４））の発現ベクターと、０．２μｇのｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒ発現ベクターと、２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とを用いてトランスフェクションを行った。ここで、これらの蛍光タンパク質の発現ベクターは、すべてｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターを用いた。トランスフェクション後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で１２時間培養し、その後、培地を２０ｎＭのインシュリン及び１ｎＭのＴ３を添加した基本培地に交換して、２８℃で２日間培養した。蛍光観察実験の前に、ウシ胎仔血清やホルモンを含まない、４．５ｇ／Ｌのグルコースを添加したＤＭＥＭ培養で１日細胞を培養した。ＭａＬｉｏｎ  Ｇ及びｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒを用いる２波長蛍光観察は前節１．ＨｅＬａ細胞の細胞内ＡＴＰの蛍光センサー測定と同じプロトコールで行った。【０１９０】
３波長蛍光観察は、油浸対物レンズ（ＰＬＡＰＯ、６０×１．４５ＮＡ）を備えた共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００、オリンパス株式会社）で行った。Ｂ−Ｇｅｃｏ、Ｆｌａｍｉｎｄｏ２及びｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒは、それぞれ、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、及び５４３ｎｍのレーザー光で励起され、蛍光は、それぞれ、４０５−４７５ｎｍ、５００−５３０ｎｍ、及び５６０ｎｍを超える波長で撮像された。撮像は１０秒ごとに行った。薬物刺激実験には、イソプロテレノール及びフェニレフリンの原液２００μＬを１．８ｍＬの培養に添加して、それぞれ、最終濃度１μＭ及び１０μＭとした。全ての実験は、ＣＯ２インキュベーター付きの温度制御循環チャンバーを用いて実行された。【０１９１】
図７Ａは、同一視野の分化したＷＴ−１細胞のＢ−Ｇｅｃｏ（Ｃａ２＋イオン、青色）、Ｆｌａｍｉｎｄｏ２（ｃＡＭＰ、緑色）及びｍｉｔｏ−ＭａＬｉｏｎ  Ｒ（ＡＴＰ、赤色）の蛍光顕微鏡画像である。各コマの左上の数字は観察開始後の時間（分）を表す。図７Ｂは、各プローブの正規化された蛍光強度の経時的変化を示すグラフである。矢印は１μＭのイソプレテレノールを添加したのが観察開始５分後（図７Ａでは１コマ目と２コマ目との間）であることを表す。イソプロテレノールはβアドレナリン受容体のアゴニストであり、Ｂ−ＧｅｃｏはＣａ２＋イオンのターン・オン型蛍光プローブ（励起波長３７８ｎｍ、蛍光波長４４６ｎｍ）で、Ｆｌａｍｉｎｄｏ２はｃＡＭＰのターン・オフ型蛍光プローブ（励起波長５０４ｎｍ、蛍光波長５２３ｎｍ）である。【０１９２】
したがって、図７Ａ及び図７Ｂから、イソプロテレノールによるβアドレナリン受容体の活性化にともなって、まずｃＡＭＰが増大し、少し遅れてＡＴＰが減少することがわかった。褐色脂肪細胞は、受容体の刺激によって活性化された細胞膜上のアデニル酸シクラーゼがｃＡＭＰを合成し、これがシグナル伝達となって、ｃＡＭＰ依存性のＰＫＡを活性化する。その後、脂肪酸を遊離、ミトコンドリア膜上の脱共役タンパク質ＵＣＰ１と作用して、ミトコンドリア膜上の膜電位のもととなるプロトン勾配を解消させることが知られている（褐色脂肪細胞の熱産生）。図７Ａ及び図７Ｂの結果は、この提唱されているメカニズムに合致する。本実施例では、ｃＡＭＰ及びＡＴＰの蛍光プローブに加えてＣａ２＋イオンの蛍光プローブも同時に細胞内に発現させ、ｃＡＭＰ、ＡＴＰ及びＣａ２＋イオンの同一細胞内での局在をほぼ同時に経時的に定量測定することが可能であることを実証した。そこで、褐色脂肪細胞における熱産生におけるカルシウムイオンの役割の解明には、ＡＴＰ蛍光センサータンパク質が利用することができると推察された。【０１９３】
３．線虫咽頭筋の細胞内ＡＴＰの蛍光センサー測定
ＡＴＰ蛍光センサータンパク質等を発現するトランスジェニック線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）の成虫は、少量のシアノアクリル酸糊（Ａｒｏｎ  Ａｌｐｈａ  Ａ、Ｄａｉｉｃｈｉ−Ｓａｎｋｙｏ）を用いて、３．５ｃｍガラス底ディッシュ上に固定し、その上を厚さ０．５ｃｍの１．７％寒天ゲルパッドで覆った。固定された線虫はＭ９バッファー（２２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８６ｍＭ  ＮａＣｌ、４２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４及び１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）中に浸漬され、顕微鏡撮像に供された。室温は２５°Ｃに保たれ、試料調製は３０分以内に完了した。【０１９４】
線虫の撮像は、２０倍乾燥系対物レンズと、Ｎｉｐｋｏｗ−ディスク共焦点スキャナ（ＣＳＵ−１０、Ｙｏｋｏｇａｗａ）と、電子増倍電荷結合素子（ＥＭ−ＣＣＤ）カメラ（Ｃ９１００−０２、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）とを備えた倒立落射蛍光顕微鏡（Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｄ１、Ｚｅｉｓｓ）を用いて行った。ＭａＬｉｏｎ  Ｇ及びＭａＬｉｏｎ  ＲのＮｉｐｋｏｗ−ディスク共焦点照明による撮像には、それぞれ、光励起半導体４８８ｎｍレーザ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ４８８ＬＰ、５０ｍＷ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）及び５６８ｎｍレーザ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ５６８ＬＰ、５０ｍＷ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を、ダイクロイックミラー及び発光フィルターのセット（Ｄｉ０１−Ｔ  ４０５／４８８／５６８／６４７ビームスプリッター及びＦＦ０１−５２４／６２８デュアルバンド帯域通過フィルター、Ｓｅｍｒｏｃｋ）とともに用いた。レーザ光束の光路に電磁駆動シャッター（ＳＳＨ−Ｃ４ＲＡ、Ｓｉｇｍａｋｏｋｉ  ＣＯ．，ＬＴＤ．）を配置して、該シャッターの開閉は前記ＥＭ−ＣＣＤカメラと同期し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＬＬＣ）が制御した。露出時間は１００ミリ秒であった。撮像は１０秒ごとに３０分間行った。線虫の麻酔は、撮像開始５分後に０．５％の１−フェノキシ−２−プロパノールを含むＭ９生理食塩水を適用して行った。【０１９５】
図８Ａ及び図８Ｂは、線虫咽頭筋の細胞質及びミトコンドリアのＡＴＰ濃度の経時的変化の同時測定結果を示すグラフで、矢印は、麻酔剤として０．５％の１−フェノキシ−２−プロパノールを含む（図８Ａ）又は含まない（図８Ｂ）Ｍ９生理食塩水を観察開始５分後に投与したことを表す。【０１９６】
図８Ａから、線虫咽頭筋の細胞質ＡＴＰ濃度は麻酔剤投与の直後から急激に低下し、麻酔剤投与の３０秒後には正規化蛍光強度は麻酔剤投与時の２０％まで低下した。これに対しミトコンドリアＡＴＰ濃度は、ゆっくりと低下して、正規化蛍光強度が麻酔剤投与時の２０％まで低下するのは麻酔剤投与の３分後であった。この結果から、麻酔剤はミトコンドリアでのＡＴＰ産生をまず阻害し、これにともなって、細胞質のＡＴＰが低下したと考えられる。
図８Ｂから、線虫咽頭筋のＡＴＰ濃度は、細胞質でもミトコンドリアでも、対照のＭ９生理食塩水投与直後に大きい変化は認められなかった。正規化蛍光強度は観測開始から５分間で、ミトコンドリアで８０％に、細胞質で６０％まで低下した。これは、紫外線レーザ照射による線虫の疲労のためミトコンドリアでのＡＴＰ産生が低下し、これに伴って細胞質のＡＴＰ濃度も低下したことが考えられる。本実施例は、単一動物個体内の同一細胞内のＡＴＰ動態を異なるオルガネラで同時観察した世界で初めての例であり、本発明がなければ成し得なかったものである。ＡＴＰセンサーを恒常的に発現している線虫を用いることで、ＡＴＰ合成を阻害する薬物スクリーニングツール、つまり、抗がん剤や毒性スクリーニングの有用なツールとして利用できる可能性がある。【０１９７】
［実施例５］ｃＧＭＰ特異的蛍光センサータンパク質の構築
１．ｃＧＭＰ蛍光センサータンパク質の設計
ｃＧＭＰ蛍光センサータンパク質は、ｃＧＭＰ結合ドメインとしてＰｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ５α（ＰＤＥ５α）を用い、蛍光タンパク質として、Ｃｉｔｒｉｎｅ（Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ，  Ｏ．ら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ２９１８８−２９１９４  （２００１））を用いた。蛍光タンパク質Ｃｉｔｒｉｎｅの励起波長は、４９０ｎｍで、発光波長域は、５０５〜６５０ｎｍである。ＰＤＥ５αのアミノ末端及びカルボキシル末端にさまざまなポリペプチドリンカーを連結して、蛍光タンパク質Ｃｉｔｒｉｎｅの内部に挿入した融合タンパク質を、ｃＧＭＰ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質として作製した（ｃＧｕｌｌシリーズと称する場合がある。）。【０１９８】
ｃＧＭＰ蛍光センサーの候補タンパク質のドメイン及びリンカーの構成は以下のとおりである。まず、ｃＧＭＰと特異的に結合するドメインを「ｃＧＭＰ結合ドメイン」と称する場合がある。ｃＧＭＰ結合ドメインは、ＰＤＥ５αに由来し、そのアミノ酸配列は配列番号２１として配列表に列挙する。ｃＧＭＰ結合ドメインのアミノ末端に連結するポリペプチドリンカーを「Ｎ末端側リンカー」、ｃＧＭＰ結合ドメインのカルボキシル末端に連結するポリペプチドリンカーを「Ｃ末端側リンカー」と称する場合がある。【０１９９】
したがって、ｃＧｕｌｌシリーズのｃＧＭＰ蛍光センサーの候補タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｎドメイン］−［Ｎ末端側リンカー］−［ｃＧＭＰ結合ドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［Ｃｉｔｒｉｎｅ−Ｃドメイン］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが配置される。【０２００】
ｃＧＭＰ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質の構築の手順としては、ｃＧＭＰ結合ドメインとして、ＰＤＥ５αをコードするポリヌクレオチドを合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、株式会社医学生物学研究所）以外は、実施例１の「ＡＴＰ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質の構築」と同様の方法を用いて行った。最終濃度１００μＭのｃＧＭＰの存在下又は非存在下で、各クローンのｃＧＭＰ蛍光センサーの候補タンパク質の蛍光特性を蛍光分光光度計（日立Ｆ−２７００、株式会社日立ハイテクサイエンス）を用いて測定した。【０２０１】
詳細は省略するが、Ｎ末端側リンカー及びＣ末端側リンカーのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３１及び３２のとき、ダイナミックレンジが６．５倍となり、ｃＧＭＰ存在下での蛍光強度が最も大きいｃＧＭＰ蛍光センサータンパク質が得られた。
この最もダイナミックレンジが大きい候補タンパク質をｃＧｕｌｌと命名した。ｃＧｕｌｌの全長アミノ酸配列を配列番号１２に示す。【０２０２】
図９Ａは、１００μＭのｃＧＭＰ存在下及び非存在下でのｃＧｕｌｌの蛍光スペクトル図である。図９Ａの横軸は、蛍光波長を表し、縦軸は蛍光強度の相対値を表す。グラフの実線及び点線は、ｃＧＭＰ存在下及び非存在下でのスペクトル曲線を表す。
図９Ａから明らかなとおり、ｃＧｕｌｌはｃＧＭＰ非存在下と比較して１００μＭのｃＧＭＰ存在下での蛍光が、それぞれ、５５０％も増大した。【０２０３】
２．ＨｅＬａ細胞の細胞内ｃＧＭＰの蛍光センサー測定
実施例４と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞にｃＧＭＰ蛍光センサータンパク質を含む発現ベクターを導入した。次いで、蛍光測定の直前に培地をフェノールレッド不含増殖培地（１ｍＭ  ８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ含有）に交換した。蛍光顕微鏡測定には、冷却ＣＣＤカメラ（Ｃｏｏｌ  ＳＮＡＰ  ＨＱ２、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）及び油浸対物レンズ（Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ６０×１．４２  ＮＡ）を備えた倒立顕微鏡（ＩＸ８１、オリンパス株式会社）を用いた。
細胞質ｃＧＭＰ産生阻害実験には一酸化窒素供与体であるＳＮＡＰ（Ｓ−Ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ，Ｌ−Ｐｅｎｉｃｉｌｌａｍｉｎｅ）を用いた。１．５ｍＬの増殖培地中でＨｅＬａ細胞を培養しているディッシュにＳＮＡＰを添加してＳＮＡＰの最終濃度を３００μＭにした。細胞の蛍光顕微鏡画像は５分ごとに撮影した。カメラ及びフィルターの制御と、データ記録には、ＭｅｔａＦｌｕｏｒソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＬＬＣ）を用いた。単色蛍光撮像には、励起フィルターにＦＦ０１−５００／２４を、ダイクロイックミラーにＤｉ０２−ＦＦ５２０を、発光フィルターにＦＦ０１−５４２／２７を用いた（全てＳｅｍｒｏｃｋ、株式会社オプトライン）。全ての実験は、ＣＯ２インキュベーター付きの温度制御循環チャンバーを用いて実行した。【０２０４】
図９Ｂは、ｃＧｕｌｌを発現させたＨｅＬａ細胞に８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１ｍＭ）又は一酸化窒素供与体であるＳＮＡＰ（３００μＭ）を投与での蛍光顕微鏡画像撮影開始から２０分後までの蛍光の変化を示す画像である。
また、図９Ｃは、ｃＧｕｌｌを発現させたＨｅＬａ細胞に８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ（１ｍＭ）又は一酸化窒素供与体であるＳＮＡＰ（３００μＭ）を投与での蛍光顕微鏡画像撮影開始から２０分後までの蛍光の変化を示すグラフである。図９Ｃでは、縦軸は正規化した蛍光強度を表し、横軸は時間（分）を表す。各図の薄い灰色の２又は３本の波形は、異なる２又は３個のディッシュでの測定値を示し、濃い灰色の１本の波形はこれら３本の波形の平均値を示す。【０２０５】
ターン・オン型のｃＧＭＰ蛍光センサーｃＧｕｌｌでは、８−Ｂｒ−ｃＧＭＰ添加から５分後まで蛍光強度が上昇し維持されたのに対し、ＳＮＡＰ添加から２０分後まで蛍光強度が緩やかに上昇した。これは細胞内のｃＧＭＰ産生が一部阻害されたことを意味する。【０２０６】
［実施例６］ｃＡＭＰ特異的蛍光センサータンパク質の構築
１．ｃＡＭＰ蛍光センサータンパク質の設計
ｃＡＭＰ蛍光センサータンパク質は、ｃＡＭＰ結合ドメインとしてｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｃＡＭＰ  １（ＥＰＡＣ１）を用い、蛍光タンパク質として、ｍＡｐｐｌｅ（Ｓｈａｎｅｒ，Ｎ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：５４５−５５１（２００８））を用いた。なお、ｍＡｐｐｌｅは、Ｚｈａｏ，  Ｙ．ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３３３，  １８８８−１８９１  （２０１１））を参照して数カ所にアミノ酸置換変異を導入した（配列番号７及び８）。蛍光タンパク質ｍＡｐｐｌｅの励起波長は、５５０ｎｍで、発光波長域は、５７５〜７００ｎｍである。ＥＰＡＣ１のアミノ末端及びカルボキシル末端にさまざまなポリペプチドリンカーを連結して、蛍光タンパク質ｍＡｐｐｌｅの内部に挿入した融合タンパク質を、ｃＡＭＰ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質として作製した（Ｐｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏシリーズと称する場合がある。）。【０２０７】
ｃＡＭＰ蛍光センサーの候補タンパク質のドメイン及びリンカーの構成は以下のとおりである。まず、ｃＡＭＰと特異的に結合するドメインを「ｃＡＭＰ結合ドメイン」と称する場合がある。ｃＡＭＰ結合ドメインは、ＥＰＡＣ１に由来し、そのアミノ酸配列は配列番号２０として配列表に列挙する。ｃＡＭＰ結合ドメインのアミノ末端に連結するポリペプチドリンカーを「Ｎ末端側リンカー」、ｃＡＭＰ結合ドメインのカルボキシル末端に連結するポリペプチドリンカーを「Ｃ末端側リンカー」と称する場合がある。【０２０８】
したがって、Ｐｉｎｋ  ＦｌａｍｉｎｄｏシリーズのｃＡＭＰ蛍光センサーの候補タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［ｍＡｐｐｌｅｅ−Ｎドメイン］−［Ｎ末端側リンカー］−［ｃＡＭＰ結合ドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［ｍＡｐｐｌｅ−Ｃドメイン］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが配置される。【０２０９】
ｃＡＭＰ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質の構築の手順としては、ｃＡＭＰ結合ドメインとして、ＥＰＡＣ１をコードするポリヌクレオチドを合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、株式会社医学生物学研究所）以外は、実施例１の「ＡＴＰ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質の構築」と同様の方法を用いて行った。最終濃度１００μＭのｃＡＭＰの存在下又は非存在下で、各クローンのｃＡＭＰ蛍光センサーの候補タンパク質の蛍光特性を蛍光分光光度計（日立Ｆ−２７００、株式会社日立ハイテクサイエンス）を用いて測定した。【０２１０】
詳細は省略するが、Ｎ末端側リンカー及びＣ末端側リンカーのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３３及び３４のとき、ダイナミックレンジが４．５倍となり、ｃＡＭＰ存在下での蛍光強度が最も大きいｃＡＭＰ蛍光センサータンパク質が得られた。
この最もダイナミックレンジが大きい候補タンパク質をＰｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏと命名した。Ｐｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏの全長アミノ酸配列を配列番号１３に示す。【０２１１】
図１０Ａは、１００μＭのｃＡＭＰ存在下及び非存在下でのＰｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏの蛍光スペクトル図である。図１０Ａの横軸は、蛍光波長を表し、縦軸は蛍光強度の相対値を表す。グラフの実線及び点線は、ｃＡＭＰ存在下及び非存在下でのスペクトル曲線を表す。
図１０Ａから明らかなとおり、Ｐｉｎｋ  ＦｌａｍｉｎｄｏはｃＡＭＰ非存在下と比較して１００μＭのｃＡＭＰ存在下での蛍光が、それぞれ、３５０％も増大した。【０２１２】
２．ＨｅＬａ細胞の細胞内ｃＧＭＰの蛍光センサー測定
実施例４と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞にｃＡＭＰ蛍光センサータンパク質を含む発現ベクターを導入した。次いで、蛍光測定の直前に培地をフェノールレッド不含増殖培地（アデニル酸シクラーゼ活性剤であるＦｏｒｓｋｏｌｉｎ  １００μＭ含有）に交換した。蛍光顕微鏡測定には、冷却ＣＣＤカメラ（Ｃｏｏｌ  ＳＮＡＰ  ＨＱ２、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ）及び油浸対物レンズ（Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  ６０×１．４２  ＮＡ）を備えた倒立顕微鏡（ＩＸ８１、オリンパス株式会社）を用いた。
細胞質ｃＡＭＰ産生阻害実験にはホスホジエステラーゼ阻害剤であるＩＢＭＸ（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）を用いた。１．５ｍＬの増殖培地中でＨｅＬａ細胞を培養しているディッシュにＩＢＭＸを添加してＩＢＭＸの最終濃度を５００μＭにした。細胞の蛍光顕微鏡画像は５分ごとに撮影した。カメラ及びフィルターの制御と、データ記録には、ＭｅｔａＦｌｕｏｒソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  ＬＬＣ）を用いた。単色蛍光撮像には、励起フィルターにＢＰ５３５−５５５ＨＱを、ダイクロイックミラーにＤＭ５６５ＨＱを、発光フィルターにＢＡ５７０−６２５ＨＱを用いた（全てオリンパス株式会社）。全ての実験は、ＣＯ２インキュベーター付きの温度制御循環チャンバーを用いて実行した。【０２１３】
図１０Ｂは、Ｐｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏを発現させたＨｅＬａ細胞にＦｏｒｓｋｏｌｉｎ（１００μＭ）又はＩＢＭＸ（５００μＭ）を投与での蛍光顕微鏡画像撮影開始から２０分後までの蛍光の変化を示す画像である。
また、図１０Ｃは、Ｐｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏを発現させたＨｅＬａ細胞にＦｏｒｓｋｏｌｉｎ（１００μＭ）又はＩＢＭＸ（５００μＭ）を投与での蛍光顕微鏡画像撮影開始から２０分後までの蛍光の変化を示すグラフである。図９Ｃでは、縦軸は正規化した蛍光強度を表し、横軸は時間（分）を表す。各図の薄い灰色の３本の波形は、異なる３個のディッシュでの測定値を示し、濃い灰色の１本の波形はこれら３本の波形の平均値を示す。【０２１４】
ターン・オン型のｃＡＭＰ蛍光センサーＰｉｎｋ  Ｆｌａｍｉｎｄｏでは、Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ添加から３分後まで蛍光強度が急激に上昇し徐々に減少したのに対し、ＩＢＭＸ添加から２０分後まで蛍光強度が緩やかに上昇した。これは細胞内のｃＡＭＰ産生が一部阻害されたことを意味する。【０２１５】
［実施例７］ＢＧＰ特異的蛍光センサータンパク質の構築
１．ＢＧＰ蛍光センサータンパク質の設計
オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ｂｏｎｅ  Ｇｌａ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＧＰ））の細胞内での局在を観察するために、ＢＧＰ蛍光センサータンパク質を設計した。
ＢＧＰ蛍光センサータンパク質は、ＢＧＰ結合ドメインとして抗ＢＧＰ抗体を用い、蛍光タンパク質として、ＧＦＰ（Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ，  Ｏ．ら、（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ２９１８８−２９１９４  （２００１）））を用いた。蛍光タンパク質ＧＦＰの励起波長は、４８０ｎｍで、発光波長域は、５００〜５２０ｎｍである。また、ＧＦＰのＮ末端側１番目から１４４番目までのアミノ酸残基からなるドメインを「ＧＦＰ−Ｎドメイン」、ＧＦＰのＮ末端側から１４５番目から２３８番目までのアミノ酸残基からなるドメインを「ＧＦＰ−Ｃドメイン」と称する場合がある。ＧＦＰ−Ｎドメインのアミノ酸配列は配列番号３、ＧＦＰ−Ｃドメインのアミノ酸配列は配列番号４としてそれぞれ配列表に列挙する。ＧＦＰ−Ｃドメインのアミノ末端及びＧＦＰ−Ｎドメインのカルボキシル末端にさまざまなポリペプチドリンカーを連結して、抗ＢＧＰ抗体の重鎖と軽鎖との間に挿入した融合タンパク質を、ＢＧＰ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質として作製した（ｇＢＧＰシリーズと称する場合がある。）。【０２１６】
ＢＧＰ蛍光センサーの候補タンパク質のドメイン及びリンカーの構成は以下のとおりである。まず、ＢＧＰと特異的に結合するドメインを「ＢＧＰ結合ドメイン」と称する場合がある。ＢＧＰ結合ドメインは、抗ＢＧＰ抗体に由来し、そのアミノ酸配列は配列番号２２（重鎖）及び２３（軽鎖）として配列表に列挙する。ＧＦＰ−Ｃドメインのアミノ末端に連結するポリペプチドリンカーを「Ｎ末端側リンカー」、ＧＦＰ−Ｃドメインのカルボキシル末端及びＧＦＰ−Ｎドメインのアミノ末端に結合するポリペプチドリンカーを「中間リンカー」、ＧＦＰ−Ｎドメインのカルボキシル末端に連結するポリペプチドリンカーを「Ｃ末端側リンカー」と称する場合がある。【０２１７】
したがって、ｇＢＧＰシリーズのＢＧＰ蛍光センサーの候補タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［抗ＢＧＰ抗体の重鎖］−［Ｎ末端側リンカー］−［ＧＦＰ−Ｃドメイン］−［中間リンカー］−［ＧＦＰ−Ｎドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［抗ＢＧＰ抗体の軽鎖］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが配置される。【０２１８】
ＢＧＰ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質の構築の手順としては、ＢＧＰ結合ドメインとして、抗ＢＧＰ抗体の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、株式会社医学生物学研究所）以外は、実施例１の「ＡＴＰ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質の構築」と同様の方法を用いて行った。最終濃度１００μＭのＢＧＰ７Ｃの存在下又は非存在下で、各クローンのＢＧＰ蛍光センサーの候補タンパク質の蛍光特性を蛍光分光光度計（日立Ｆ−２７００、株式会社日立ハイテクサイエンス）を用いて測定した。【０２１９】
詳細は省略するが、Ｎ末端側リンカー、中間リンカー、及びＣ末端側リンカーのアミノ酸配列がそれぞれ配列番号３５、３６、及び３７のとき、ダイナミックレンジが４．０倍となり、ＢＧＰ７Ｃ存在下での蛍光強度が最も大きいＢＧＰ蛍光センサータンパク質が得られた。
この最もダイナミックレンジが大きい候補タンパク質をｇＢＧＰと命名した。ｇＢＧＰの全長アミノ酸配列を配列番号１４に、塩基配列を配列番号５０に示す。【０２２０】
図１１Ａは、１００μＭのＢＧＰ７Ｃ存在下及び非存在下でのｇＢＧＰの励起／蛍光スペクトル図である。図１１Ａの横軸は、励起波長及び蛍光波長を表し、縦軸は蛍光強度の相対値を表す。グラフの実線及び点線は、ＢＧＰ７Ｃ存在下及び非存在下でのスペクトル曲線を表す。
図１１Ａから明らかなとおり、ｇＢＧＰはＢＧＰ７Ｃ非存在下と比較して１００μＭのＢＧＰ７Ｃ存在下での蛍光が、それぞれ、３００％も増大した。【０２２１】
図１１Ｂは、ｇＢＧＰの蛍光強度のリガンド特異性及びＢＧＰ７Ｃ濃度依存的変化を示すグラフである。図１１Ｂの横軸は、ＢＧＰ７Ｃ又は対照であるＭｙｃの濃度を表し、縦軸は蛍光強度の相対値を表す。
図１１Ｂから明らかなとおり、ｇＢＧＰの蛍光強度はＢＧＰ７Ｃの濃度にのみ依存的に変化することが示された。【０２２２】
２．ＨｅＬａ細胞の細胞内ＢＧＰの蛍光センサー測定
まず、細胞膜局在性ペプチド（配列番号４２）及びｍＣｈｅｒｒｙが結合したＢＧＰ７Ｃ（以下、「ＰＭｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＧＰ７Ｃ」と称する場合がある。）並びに、核局在性ペプチド（配列番号４３）及びｍＣｈｅｒｒｙが結合したＢＧＰ７Ｃ（以下、「ＮＬＳｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＧＰ７Ｃ」と称する場合がある。）を発現するベクターを調製した。
次いで、実施例４と同様の方法を用いて、ＨｅＬａ細胞にＢＧＰ蛍光センサータンパク質を含む発現ベクター又はＧＦＰのみを含む発現ベクター、及びＰＭｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＧＰ７Ｃ、又はＮＬＳｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＧＰ７Ｃを含む発現ベクターを導入した。次いで、蛍光測定の直前に培地をフェノールレッド不含増殖培地に交換した。測定には、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、オリンパス株式会社）を用いた。レーザーの波長は、４８８ｎｍ及び５４３ｎｍであり、５００〜５３０ｎｍ、及び５６０ｎｍを超える波長で撮像された。【０２２３】
図１１Ｃは、ｇＢＧＰ又はＧＦＰ、及び細胞膜局在性ｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＧＰ７Ｃ又は細胞膜局在性ｍＣｈｅｒｒｙを発現させたＨｅＬａ細胞での蛍光を示す画像である。
また、図１１Ｄは、ｇＢＧＰ又はＧＦＰ、及び核局在性ｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＧＰ７Ｃ又は細胞膜局在性ｍＣｈｅｒｒｙを発現させたＨｅＬａ細胞での蛍光を示す画像である。【０２２４】
ターン・オン型のＢＧＰ蛍光センサーｇＢＧＰでは、ＰＭｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＧＰ７Ｃとともに導入した場合では、細胞膜上での局在が観察され、ＮＬＳｍＣｈｅｒｒｙ−ＢＧＰ７Ｃとともに導入した場合では、核内での局在が観察された。【０２２５】
［実施例８］ＨＳＡ特異的蛍光センサータンパク質の構築
１．ＨＳＡ蛍光センサータンパク質の設計
ヒト血清アルブミン（Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ；ＨＳＡ）蛍光センサータンパク質を設計した。
ＨＳＡ蛍光センサータンパク質は、ＨＳＡ結合ドメインとして抗ＨＳＡ抗体を用い、蛍光タンパク質として、ＧＦＰ（Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ，  Ｏ．ら、（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ２９１８８−２９１９４  （２００１）））を用いた。蛍光タンパク質ＧＦＰの励起波長は、４８０ｎｍで、発光波長域は、５００〜５２０ｎｍである。また、ＧＦＰのＮ末端側１番目から１４４番目までのアミノ酸残基からなるドメインを「ＧＦＰ−Ｎドメイン」、ＧＦＰのＮ末端側から１４５番目から２３８番目までのアミノ酸残基からなるドメインを「ＧＦＰ−Ｃドメイン」と称する場合がある。ＧＦＰ−Ｎドメインのアミノ酸配列は配列番号３、ＧＦＰ−Ｃドメインのアミノ酸配列は配列番号４としてそれぞれ配列表に列挙する。ＧＦＰ−Ｃドメインのアミノ末端及びＧＦＰ−Ｎドメインのカルボキシル末端にさまざまなポリペプチドリンカーを連結して、抗ＨＳＡ抗体の重鎖と軽鎖との間に挿入した融合タンパク質を、ＨＳＡ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質として作製した（ｇＨＳＡシリーズと称する場合がある。）。【０２２６】
ＨＳＡ蛍光センサーの候補タンパク質のドメイン及びリンカーの構成は以下のとおりである。まず、ＨＳＡと特異的に結合するドメインを「ＨＳＡ結合ドメイン」と称する場合がある。ＨＳＡ結合ドメインは、抗ＨＳＡ抗体に由来する。ＧＦＰ−Ｃドメインのアミノ末端に連結するポリペプチドリンカーを「Ｎ末端側リンカー」、ＧＦＰ−Ｃドメインのカルボキシル末端及びＧＦＰ−Ｎドメインのアミノ末端に結合するポリペプチドリンカーを「中間リンカー」、ＧＦＰ−Ｎドメインのカルボキシル末端に連結するポリペプチドリンカーを「Ｃ末端側リンカー」と称する場合がある。【０２２７】
したがって、ｇＨＳＡシリーズのＨＳＡ蛍光センサーの候補タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端の向きに、［抗ＨＳＡ抗体の重鎖］−［Ｎ末端側リンカー］−［ＧＦＰ−Ｃドメイン］−［中間リンカー］−［ＧＦＰ−Ｎドメイン］−［Ｃ末端側リンカー］−［抗ＨＳＡ抗体の軽鎖］の順にポリペプチドドメイン及びポリペプチドリンカーが配置される。【０２２８】
ＨＳＡ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質の構築の手順としては、ＨＳＡ結合ドメインとして、抗ＨＳＡ抗体の重鎖及び軽鎖をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、株式会社医学生物学研究所）以外は、実施例１の「ＡＴＰ蛍光センサータンパク質の候補タンパク質の構築」と同様の方法を用いて行った。最終濃度２μＭのＨＳＡの存在下又は非存在下で、各クローンのＨＳＡ蛍光センサーの候補タンパク質の蛍光特性を蛍光分光光度計（日立Ｆ−２７００、株式会社日立ハイテクサイエンス）を用いて測定した。【０２２９】
詳細は省略するが、Ｎ末端側リンカー、中間リンカー、及びＣ末端側リンカーのアミノ酸配列がそれぞれ、「ＬＥ」（Ｌｅｕ−Ｇｌｕ）、「ＧＧＴＧＧＳ」（配列番号５３）、及び「ＴＲ」（Ｔｈｒ−Ａｒｇ）のとき、ダイナミックレンジが１．２倍となり、ＨＳＡ存在下での蛍光強度が最も大きいＨＳＡ蛍光センサータンパク質が得られた。
この最もダイナミックレンジが大きい候補タンパク質をｇＨＳＡと命名した。ｇＨＳＡの全長アミノ酸配列を配列番号５１に、塩基配列を配列番号５２に示す。【０２３０】
図１２は、２μＭのＨＳＡ存在下及び非存在下でのｇＨＳＡの蛍光スペクトル図である。図１２の横軸は、蛍光波長を表し、縦軸は蛍光強度の相対値を表す。グラフの実線及び点線は、ＨＳＡ存在下及び非存在下でのスペクトル曲線を表す。
図１２から明らかなとおり、ｇＨＳＡはＨＳＡ非存在下と比較して２μＭのＨＳＡ存在下での蛍光が、２０％も増大した。
【産業上の利用可能性】
【０２３１】
本発明によれば、検出するリガンドの種類を選ばず、高感度なリガンド蛍光センサータンパク質を提供することができる。本発明によれば、生理学的条件下で高濃度のリガンドの存在下での蛍光強度とリガンド非存在下での蛍光強度の比が十分に高く、細胞又は非ヒト生物の生理学的及び／又は病理学的なリガンドの濃度の変動を検出することができる。
【図１Ａ】
2017094885.tif 000008
【図１Ｂ】
2017094885.tif 000009
【図１Ｃ】
2017094885.tif 000010
【図２Ａ】
2017094885.tif 000011
【図２Ｂ】
2017094885.tif 000012
【図２Ｃ】
2017094885.tif 000013
【図３Ａ】
2017094885.tif 000014
【図３Ｂ】
2017094885.tif 000015
【図４Ａ】
2017094885.tif 000016
【図４Ｂ】
2017094885.tif 000017
【図４Ｃ】
2017094885.tif 000018
【図５Ａ】
2017094885.tif 000019
【図５Ｂ】
2017094885.tif 000020
【図５Ｃ】
2017094885.tif 000021
【図５Ｄ】
2017094885.tif 000022
【図５Ｅ】
2017094885.tif 000023
【図５Ｆ】
2017094885.tif 000024
【図５Ｇ】
2017094885.tif 000025
【図６】
2017094885.tif 000026
【図７Ａ】
2017094885.tif 000027
【図７Ｂ】
2017094885.tif 000028
【図８Ａ】
2017094885.tif 000029
【図８Ｂ】
2017094885.tif 000030
【図９Ａ】
2017094885.tif 000031
【図９Ｂ】
2017094885.tif 000032
【図９Ｃ】
2017094885.tif 000033
【図１０Ａ】
2017094885.tif 000034
【図１０Ｂ】
2017094885.tif 000035
【図１０Ｃ】
2017094885.tif 000036
【図１１Ａ】
2017094885.tif 000037
【図１１Ｂ】
2017094885.tif 000038
【図１１Ｃ】
2017094885.tif 000039
【図１１Ｄ】
2017094885.tif 000040
【図１２】
2017094885.tif 000041
【配列表】
2017094885000001.app
【国際調査報告】
2017094885.tif 000042
2017094885.tif 000043
2017094885.tif 000044
2017094885.tif 000045