(57)【要約】  従来のアマドリアーゼと比較して糖化基質に対する比活性が向上したアマドリアーゼを提供すること。  配列番号１のアミノ酸配列における６４位に対応する位置のアミノ酸をグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸に置換したアマドリアーゼ並びにこれを用いたＨｂＡ１ｃの測定方法及び測定試薬キット。  ＨｂＡ１ｃを迅速、簡便に、かつ、精度よく定量できる測定方法、測定キットを提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)  アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における６４位に対応する位置のアミノ酸がグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であり、かつ糖化ペプチドに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii)  アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における６４位に対応する位置のアミノ酸がグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であり、かつα−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)  前記(i)または(ii)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６４位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖化ペプチドまたはαＦ８Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iv)  前記(i)または(ii)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、かつ糖化ペプチドまたはαＦ８Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
【請求項２】
前記アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、以下の（z）および（a）から（h）、
（z）配列番号１の９９位、
（a）配列番号１の６２位、
（b）配列番号１の６３位、
（c）配列番号１の１０２位、
（d）配列番号１の１０６位、
（e）配列番号１の１１０位、
（f）配列番号１の１１３位、
（g）配列番号１の３５５位、
（h）配列番号１の４１９位、
よりなる群から選択される位置に対応する位置に、１以上のアミノ酸残基の置換を有する請求項１に記載のアマドリアーゼ。
【請求項３】
（z）配列番号１の９９位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
（a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンである、
（b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジン又はグリシンである、
（c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
（d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
（e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン又はチロシンである、（f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、（g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、および／あるいは
（h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
請求項２に記載のアマドリアーゼ。
【請求項４】
前記アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（i）または（j）、
（i）配列番号１の６８位、
（j）配列番号１の３５６位、
の位置に対応する位置で１つまたは２つのアミノ酸残基の置換を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
【請求項５】
(i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、および／または
(j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
である、請求項４に記載のアマドリアーゼ。
【請求項６】
アマドリアーゼがさらに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置、
（i）２６２位、
（ii）２５７位、
（iii）２４９位、
（iv）２５３位、
（v）３３７位、
（vi）３４０位、
（vii）２３２位、
（viii）１２９位、
（ix）１３２位、
（x）１３３位、
（xi）４４位、
（xii）２５６位、
（xiii）２３１位、及び
（xiv）８１位、
に対応する位置で１以上のアミノ酸残基の置換を有しており、
場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
【請求項７】
αＦ８Ｐに対する比活性が0.1Ｕ／ｍｇ以上である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
【請求項８】
αＦ８Ｐに対する比活性が１Ｕ／ｍｇ以上である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
【請求項９】
αＦ８Ｐに対する比活性が４Ｕ／ｍｇ以上である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
【請求項１０】
アマドリアーゼがコニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
【請求項１１】
アマドリアーゼがコニオカエタ  エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム  テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ  エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム  エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア  クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ  バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス  ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア  ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス  ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ  ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム  エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)もしくはペニシリウム クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）由来である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ。
【請求項１２】
以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)  配列番号２１１または２１３に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６４位、９９位、６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９位、６８位、および３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ８Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iv)  前記(i)または(ii)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、かつαＦ８Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
【請求項１３】
前記アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（l）から（q）よりなる群から選択される位置に対応する位置で当該アマドリアーゼが１以上のアミノ酸残基の置換を有する請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアマドリアーゼ、
（l）配列番号１の６７位、
（m）配列番号１の７２位、
（n）配列番号１の７６位、
（o）配列番号１の９６位、
（p）配列番号１の１０９位、
（q）配列番号１の１１６位。
【請求項１４】
（l）配列番号１の６７位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
（m）配列番号１の７２位に対応する位置のアミノ酸が、セリンである、
（n）配列番号１の７６位に対応する位置のアミノ酸が、アラニンまたはフェニルアラニンである、
（o）配列番号１の９６位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン酸である、
（p）配列番号１の１０９位に対応する位置のアミノ酸が、アルギニンまたはリジンである、および／あるいは
（q）配列番号１の１１６位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンである請求項１３に記載のアマドリアーゼ。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアマドリアーゼを含む、ヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬キット。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアマドリアーゼを用いる、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、比活性が向上したアマドリアーゼならびにこれを用いた試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、およびアマドリアーゼを含む測定用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のα−アミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のε−アミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。【０００３】
これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。ＨｂＡ１ｃは、へモグロビン「β鎖」のＮ末端（アミノ末端）のＶａｌ（バリン）の、α−アミノ基にグルコースが結合したタンパク質である。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映することから、ＨｂＡ１ｃの値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。【０００４】
このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、従来、アマドリアーゼを用いる数種類の酵素的方法が知られている。【０００５】
アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（「アマドリ化合物」とも言う）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素の総称である。アマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃを酵素的方法により測定するために有用な酵素として知られている。アマドリアーゼにより酸化される基質としては、例えば、α−フルクトシルバリルヒスチジン（以降αＦＶＨと表す）が知られている。【０００６】
アマドリアーゼはこれまでに、細菌、酵母、真菌から見出されており、例えば、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６〜１５、非特許文献１〜９参照。）。これらの属のことを本明細書においてコニオカエタ(Coniochaeta)属等と呼ぶことがある。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。【０００７】
上述のような各種のアマドリアーゼを用いて、ＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法としては、プロテアーゼまたはペプチダーゼ（以下、プロテアーゼ等という）の切り出し用酵素でＨｂＡ１ｃを分解し、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端より特定の測定用物質を遊離させ、遊離した測定用物質を、上述のようなアマドリアーゼを用いて定量する方法が知られている（例えば、特許文献１〜７参照）。【０００８】
具体的には、ＨｂＡ１ｃを特定のプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端よりαＦＶＨを遊離させたのちに、遊離したαＦＶＨを定量する方法が知られており、この測定方法が、現在のＨｂＡ１ｃ酵素的測定法の主流となっている。【０００９】
さらに、アマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨｂＡ１ｃをＧｌｕ−Ｃプロテアーゼを用いて消化し、糖化されたβ鎖アミノ末端のバリンを含む６アミノ酸からなるα−フルクトシルヘキサペプチド（α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸、以降αＦ６Ｐと表す）を遊離させたのちに、遊離したαＦ６Ｐを定量する方法がある（例えば、特許文献１６−１８参照。）。この方法は、ＩＦＣＣ（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine）により定められたＨｂＡ１ｃ測定法（非特許文献１０参照）に則った、酵素によるＨｂＡ１ｃの測定方法である。【００１０】
しかしながら、前述のアマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃの測定方法では、プロテアーゼまたはペプチダーゼ（以下、プロテアーゼ等という）によりＨｂＡ１ｃを消化し、そのβ鎖アミノ末端のバリンを含む糖化ペプチドを遊離させる工程を欠かすことはできない。したがって、ＨｂＡ１ｃ由来の糖化ペプチドを測定する試薬キットには必ずプロテアーゼ等を処方する必要があるが、これは以下に述べる理由により本来好ましいことではない。【００１１】
まず、使用できるプロテアーゼが限定され、例えばＨｂＡ１ｃ由来のαＦ６Ｐを測定する場合はＧｌｕ−Ｃプロテアーゼのような、グルタミン酸残基のＣ末端側でＨｂＡ１ｃを切断するものに限られる。またプロテアーゼ等はタンパク質を加水分解する作用を示すため、タンパク質である酵素もまたプロテアーゼ等により加水分解される。したがって、アマドリアーゼもまたプロテアーゼにより加水分解されて失活し、その結果、糖化ペプチドと酸素を消費して過酸化水素を生成する反応が阻害される。これに対する対処法としては、アマドリアーゼの処方量を増やし、アマドリアーゼが完全に失活する前に測定を終えることが考えられるが、アマドリアーゼの増量は、プロテアーゼ等がＨｂＡ１ｃよりもアマドリアーゼを優先的に加水分解することに繋がり、本来好ましくはない。【００１２】
また、糖化ペプチドにアマドリアーゼを作用させて生じる過酸化水素を定量してＨｂＡ１ｃを測定する場合には、過酸化水素の定量にパーオキシダーゼを用いることがある。この場合、パーオキシダーゼもまたプロテアーゼ等により加水分解されて失活するため、好ましくない。【００１３】
また別の側面として、酵素によるＨｂＡ１ｃ測定には自動分析装置を使用することが一般的であり、この場合、一つの試料を用いてＨｂＡ１ｃを始めとする様々な生体マーカーを同時測定する。この際、各生体マーカーは酵素もしくは抗体を利用して測定するため、プロテアーゼ等がコンタミネーションすると、各生体マーカー測定試薬に含まれる酵素もしくは抗体が加水分解され、ＨｂＡ１ｃ以外の生体マーカーが正確に測定できない恐れがある。したがって、自動分析装置にセットする試薬には、本来プロテアーゼ等が含まれていないことが好ましい。【００１４】
以上の理由により、アマドリアーゼで直接ＨｂＡ１ｃのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成させるアマドリアーゼと、それを利用したＨｂＡ１ｃ測定法が求められていた。また、その際、短い反応時間でＨｂＡ１ｃを定量できるなど、実用的な方法及び試薬キットが望まれ、そのための、十分な比活性を有するアマドリアーゼが必要とされていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２００４／１０４２０３号
【特許文献２】国際公開第２００５／４９８５７号
【特許文献３】特開２００１−９５５９８号公報
【特許文献４】特公平０５−３３９９７号公報
【特許文献５】特開平１１−１２７８９５号公報
【特許文献６】国際公開第９７／１３８７２号
【特許文献７】特開２０１１−２２９５２６号公報
【特許文献８】特開２００３−２３５５８５号公報
【特許文献９】特開２００４−２７５０１３号公報
【特許文献１０】特開２００４−２７５０６３号公報
【特許文献１１】特開２０１０−３５４６９号公報
【特許文献１２】特開２０１０−５７４７４号公報
【特許文献１３】国際公開第２０１０／４１７１５号
【特許文献１４】国際公開第２０１０／４１４１９号
【特許文献１５】国際公開第２０１１／１５３２５号
【特許文献１６】国際公開第２００４／３８０３４号
【特許文献１７】国際公開第２００８／１０８３８５号
【特許文献１８】国際公開第２０１３／１６２０３５号
【特許文献１９】国際公開第２０１５／００５２５７号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Biochem. Biophys. Res. Commun. 311, 104-11, 2003
【非特許文献２】Biotechnol. Bioeng. 106, 358-66, 2010
【非特許文献３】J. Biosci. Bioeng. 102, 241-3, 2006
【非特許文献４】Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 813-9, 2007
【非特許文献５】Eur. J. Biochem. 242, 499-505, 1996
【非特許文献６】Mar. Biotechnol. 6, 625-32, 2004
【非特許文献７】Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1256-61, 2002
【非特許文献８】Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 2323-29, 2002
【非特許文献９】Biotechnol. Letters 27, 27-32, 2005
【非特許文献１０】Jeppsson JO, et al;Approved IFCC reference method for the measurement of HbA1c in human blood. Clin. Chem. Lab. Med. 40, 78-89,2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明が解決しようとする課題は、従来のアマドリアーゼと比較してα−フルクトシルオクタペプチド（αＦ８Ｐ）に対する比活性が向上したアマドリアーゼ、並びにそれを利用したＨｂＡ１ｃ測定法及び該比活性の向上したアマドリアーゼを含む試薬キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、コニオカエタ(Coniochaeta)属等に由来するアマドリアーゼにアミノ酸置換が導入された改変型アマドリアーゼが、従来のアマドリアーゼと比較してαＦ８Ｐに対する比活性が向上していることを見出し、本発明を完成させた。【００１９】
すなわち、本発明は以下を包含する。
[１]  以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)  アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における６４位に対応する位置のアミノ酸がグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であり、かつ糖化ペプチドに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii)  アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における６４位に対応する位置のアミノ酸がグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、およびイソロイシンからなる群より選択されるアミノ酸であり、かつα−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン（αＦ８Ｐ）に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)  前記(i)または(ii)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６４位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ糖化ペプチドまたはαＦ８Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iv)  前記(i)または(ii)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、かつ糖化ペプチドまたはαＦ８Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。   
[２]  前記アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、以下の（z）および（a）から（h）、
（z）配列番号１の９９位、
（a）配列番号１の６２位、
（b）配列番号１の６３位、
（c）配列番号１の１０２位、
（d）配列番号１の１０６位、
（e）配列番号１の１１０位、
（f）配列番号１の１１３位、
（g）配列番号１の３５５位、
（h）配列番号１の４１９位、
よりなる群から選択される位置に対応する位置に、１以上のアミノ酸残基の置換を有する１に記載のアマドリアーゼ。   
[３]  （z）配列番号１の９９位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
（a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンである、
（b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジン又はグリシンである、
（c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
（d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
（e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がフェニルアラニン、ヒスチジン、ロイシン又はチロシンである、（f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、（g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、および／あるいは
（h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
２に記載のアマドリアーゼ。   
[４]  前記アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（i）または（j）、
（i）配列番号１の６８位、
（j）配列番号１の３５６位、
の位置に対応する位置で１つまたは２つのアミノ酸残基の置換を有する、１〜３のいずれかに記載のアマドリアーゼ。   
[５](i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、および／または
(j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
である、４に記載のアマドリアーゼ。   
[６]  アマドリアーゼがさらに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置、
（i）２６２位、
（ii）２５７位、
（iii）２４９位、
（iv）２５３位、
（v）３３７位、
（vi）３４０位、
（vii）２３２位、
（viii）１２９位、
（ix）１３２位、
（x）１３３位、
（xi）４４位、
（xii）２５６位、
（xiii）２３１位、及び
（xiv）８１位、
に対応する位置で１以上のアミノ酸残基の置換を有しており、
場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい、１〜５のいずれかに記載のアマドリアーゼ。   
[７]  αＦ８Ｐに対する比活性が0.1Ｕ／ｍｇ以上である、１〜６のいずれかに記載のアマドリアーゼ。   
[８]  αＦ８Ｐに対する比活性が１Ｕ／ｍｇ以上である、１〜７のいずれかに記載のアマドリアーゼ。   
[９]  αＦ８Ｐに対する比活性が４Ｕ／ｍｇ以上である、１〜８のいずれかに記載のアマドリアーゼ。   
[１０]  アマドリアーゼがコニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、１〜９のいずれかに記載のアマドリアーゼ。   
[１１]  アマドリアーゼがコニオカエタ  エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム  テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ  エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム  エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア  クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ  バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス  ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア  ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス  ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ  ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム  エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)もしくはペニシリウム クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）由来である、１〜１０のいずれかに記載のアマドリアーゼ。   
[１２]  以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)  配列番号２１１または２１３に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、
(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６４位、９９位、６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９位、６８位、および３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ８Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iv)  前記(i)または(ii)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、６３〜６５位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、かつαＦ８Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。   
[１３]  前記アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（l）から（q）よりなる群から選択される位置に対応する位置で当該アマドリアーゼが１以上のアミノ酸残基の置換を有する１〜１２のいずれかに記載のアマドリアーゼ、
（l）配列番号１の６７位、
（m）配列番号１の７２位、
（n）配列番号１の７６位、
（o）配列番号１の９６位、
（p）配列番号１の１０９位、
（q）配列番号１の１１６位。   
[１４]（l）配列番号１の６７位に対応する位置のアミノ酸がヒスチジンである、
（m）配列番号１の７２位に対応する位置のアミノ酸が、セリンである、
（n）配列番号１の７６位に対応する位置のアミノ酸が、アラニンまたはフェニルアラニンである、
（o）配列番号１の９６位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン酸である、
（p）配列番号１の１０９位に対応する位置のアミノ酸が、アルギニンまたはリジンである、および／あるいは
（q）配列番号１の１１６位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンである１３に記載のアマドリアーゼ。   
[１５]  １〜１４のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、ヘモグロビンＡ１ｃ測定用試薬キット。   
[１６]  １〜１４のいずれかに記載のアマドリアーゼを用いる、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。【００２０】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-077112号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、ＨｂＡ１ｃを迅速、簡便に、かつ、精度よく良好に定量できるαＦ８Ｐに対する比活性の高いアマドリアーゼを提供できる。このようなアマドリアーゼを用いれば、短時間でＨｂＡ１ｃ定量反応を行うことができ、ＨｂＡ１ｃ直接測定法の感度向上に寄与し、アマドリアーゼの処方量を低減することができ、また、迅速な検査が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性を例示する１番目の図である。Co（Coniochaeta sp.）、Et（Eupenicillium terrenum）、Py（Pyrenochaeta sp.）、Ar（Arthrinium sp.）、Cc（Curvularia clavata）、Nv（Neocosmospora vasinfecta）のほか、Cn（Cryptococcus neoformans）、Pn（Phaeosphaeria nodorum）、An（Aspergillus nidulans）、En（Emericella nidulans）、Ul（Ulocladium sp.）及びPj（Penicillium janthinelum）をアライメントした。
【図１−２】図１−１のつづきである。
【図１−３】図１−２のつづきである。
【図１−４】図１−３のつづきである。
【図１−５】図１−４のつづきである。
【図２−１】各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性及び類似アミノ酸を例示する２番目の図である。Co、Et、Py、Ar、Cc、Nvのほか、Cn、Pn、An、En、Ul及びPjをアライメントした。
【図２−２】図２−１のつづきである。
【図２−３】図２−２のつづきである。
【図２−４】図２−３のつづきである。
【図２−５】図２−４のつづきである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
（糖化タンパク質、ヘモグロビンＡ１ｃ）
本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
【００２４】
（糖化ペプチド、フルクトシルペプチド）
本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する（ポリ）ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα−アミノ基、ペプチド内部のリジン残基側鎖のε−アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α−糖化ペプチド（α−フルクトシルペプチド）である。α−糖化ペプチドは、Ｎ末端のα−アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼ等による限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、対象の糖化タンパク質がヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）である場合、該当するα−糖化ペプチドは、Ｎ末端が糖化されているＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドを指す。１４６残基のアミノ酸により構成されているＨｂＡ１ｃのβ鎖もまたα−糖化ペプチドに該当する。
【００２５】
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質は、ＨｂＡ１ｃ、より具体的にはＨｂＡ１ｃのβ鎖である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出されるαＦ８Ｐであり、具体的には、α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジンである。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はαＦＶＨ（α−フルクトシルバリルヒスチジン）またはαＦＶ（α−フルクトシルバリン）またはαＦ６Ｐである。これよりも鎖長の長いα−糖化ペプチド基質も測定物質に包含される。
【００２６】
（アマドリアーゼ）
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα−ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。
【００２７】
本発明のアマドリアーゼはＨｂＡ１ｃに直接作用する。本明細書において、アマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用する、とは、アマドリアーゼが、酸素の存在下で、ＨｂＡ１ｃのβ鎖のＮ末端のフルクトシル基に作用し、2-ケト-Dグルコースおよび過酸化水素、ヘモグロビンのβ鎖が生じることをいう。ただしこれは当該アマドリアーゼがＨｂＡ１ｃのβ鎖由来のフルクトシルペプチド、例えばαＦ８Ｐやより短鎖のα−フルクトシルペプチドに反応することを排除するものではない。すなわち、ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃに直接作用するのみならず、ＨｂＡ１ｃのβ鎖由来のフルクトシルペプチド、例えばαＦ８Ｐやより短鎖のα−フルクトシルペプチドに対しても反応性を有する。
【００２８】
（アマドリアーゼ改変体）
本発明は、配列番号１、配列番号３８、配列番号４０、配列番号５４、又は配列番号６２、又は配列番号８９、又は配列番号９９に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼに基づき作製される、αＦ８Ｐに対して反応性を有し、かつＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼの改変体を提供する。本明細書において改変体とは変異体と交換可能に用いられ、アマドリアーゼのアミノ酸配列を野生型の配列と比較したときに、一部のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているものをいう。ここでいう付加には挿入も包含されるものとする。
【００２９】
本発明はさらに、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３又は配列番号１４５又は配列番号１４９に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼに基づき、αＦ８Ｐに対して反応性を有し、かつＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼの改変体を提供する。
【００３０】
また、本発明の知見に基づき、コニオカエタ(Coniochaeta)属等に由来する他の野生型アマドリアーゼに基づき、ＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼの改変体を取得することができる。
【００３１】
本発明のアマドリアーゼ改変体は、αＦ８Ｐに対して反応性を有し、かつＨｂＡ１ｃに直接作用する限り、酵素の他の特性を改変する変異をさらに有しうる。
【００３２】
（Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼに基づく改変体）
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するコニオカエタ属由来のアマドリアーゼに基づき作製された、ＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼの改変体である。
【００３３】
配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５、配列番号１８９、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１、配列番号１４１、配列番号１８５、配列番号１９９、配列番号２０３、配列番号２０９、配列番号２１１又は配列番号２１３のアミノ酸配列と高い配列同一性（例えば、５０％以上、好ましくは６０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）のアミノ酸配列を有し、かつαＦ８Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃに直接作用しうる。例えば配列番号２１１のアミノ酸配列を有するCFP-T7-H38および配列番号２１３のアミノ酸配列を有するCFP-DH3は、αＦ８Ｐに対する比活性が、それぞれ配列番号２０９のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ及び配列番号２０３のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して向上しており、かつＨｂＡ１ｃに直接作用する。
【００３４】
配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５、配列番号１８９、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１、配列番号１４１、配列番号１８５、配列番号１９９、配列番号２０３、配列番号２０９、配列番号２１１または配列番号２１３のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつαＦ８Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃに直接作用しうる。ここで１又は数個のアミノ酸とは、全長が４００アミノ酸を超えるアミノ酸配列について言う場合は１〜１５個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。また、１又は数個のアミノ酸とは、全長が２００〜４００アミノ酸の配列について言う場合は、１〜１０個、好ましくは１〜７個、好ましくは１〜５個、好ましくは１〜４個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。１又は数個のアミノ酸とは、全長が４０アミノ酸以上、２００アミノ酸未満の配列について言う場合は、１〜５個、好ましくは１〜４個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。１又は数個のアミノ酸とは、全長が４０アミノ酸未満の配列について言う場合は、１又は２個のアミノ酸をいう。
【００３５】
また、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、及び配列番号１６４、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１７６、配列番号１９０、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１４４、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８８、配列番号１９２、配列番号１４２、配列番号１８６、配列番号２００、配列番号２０４、配列番号２１０、配列番号２１２または配列番号２１４に示す塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、αＦ８Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼはＨｂＡ１ｃに直接作用しうる。ここでストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションはSambrookら, Molecular Cloning第２版（Cold Spring Harbor Laboratory press）やCurrent protocols in molecular biology（Frederick M. Ausubel ら, 編, 1987）等に記載されている。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、6〜10×SSC(0.15〜1.5M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃〜約50℃でインキュベートし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃〜約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。また別のストリンジェントな条件において、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
【００３６】
なお、本発明の変異体は、請求の範囲に記載された、基質特異性および／またはアミノ酸配列に関する条件を満たす限り、例えば、ユーペニシリウム属、ピレノケータ属、アルスリニウム属、カーブラリア属、ネオコスモスポラ属、クリプトコッカス属、フェオスフェリア属、アスペルギルス属、エメリセラ属、ウロクラディウム属、ペニシリウム属、フザリウム属、アカエトミエラ属、アカエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、レプトスフェリア属、オフィオボラス属、プレオスポラ属、コニオケチジウム属、ピチア属、コリネバクテリウム属、アグロバクテリウム属、若しくはアルスロバクター属のような、他の生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。
【００３７】
Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（配列番号１）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る。ここで、アマドリアーゼ改変体に関して用いる１又は複数のアミノ酸置換とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０のアミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２のアミノ酸置換をいう。ある実施形態ではアマドリアーゼ改変体に関して用いる１又は複数のアミノ酸置換は１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸置換である。  
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアラニン
（ｋ）６４位のアルギニン
（ｌ）９９位のヒスチジン
【００３８】
上記Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（配列番号１）において、好ましくは、（ａ）６２位のアルギニンは、アラニン、アスパラギンまたはアスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンは、ヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸は、リジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸は、アラニン、リジン、又はアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のグルタミンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｆ）１１３位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは（ｇ）３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のアラニンはリジンへと置換されていてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。本発明において（ｋ）６４位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換される。本発明のある実施形態において（ｌ）９９位のヒスチジンはセリンへと置換される。
【００３９】
場合によりConiochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼはさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号１の６７位、
（m）配列番号１の７２位、
（n）配列番号１の７６位、
（o）配列番号１の９６位、
（p）配列番号１の１０９位、
（q）配列番号１の１１６位
場合により（l）配列番号１の６７位に対応する位置のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号１の７２位に対応する位置のアミノ酸はセリンでありうる。場合により（n）配列番号１の７６位に対応する位置のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号１の９６位に対応する位置のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号１の１０９位に対応する位置のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号１の１１６位に対応する位置のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００４０】
Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ（PnFX、配列番号３８）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のセリン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグリシン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５１位のアラニン
（ｈ）４１６位のセリン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５２位のアラニン
（ｋ）６４位のアルギニン
（ｌ）９９位のヒスチジン
上記Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ（配列番号３８）において、場合により（ａ）６２位のセリンは置換されなくともよい。また、（ａ）６２位のセリンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンは置換されなくともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のグリシンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは３５１位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１６位のセリンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５２位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは（ｋ）６４位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において（ｌ）９９位のヒスチジンはセリンへと置換される。
【００４１】
場合によりPhaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼはさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号３８の６７位、
（m）配列番号３８の７２位、
（n）配列番号３８の７６位、
（o）配列番号３８の９６位、
（p）配列番号３８の１０９位、
（q）配列番号３８の１１６位
場合により（l）配列番号３８の６７位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号３８の７２位のアミノ酸はセリンでありうる。場合により（n）配列番号３８の７６位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号３８の９６位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号３８の１０９位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号３８の１１６位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００４２】
Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ（NvFX、配列番号５４）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のグリシン
（ｅ）１１０位のグルタミン酸
（ｆ）１１３位のリジン
（ｇ）３５５位のセリン
（ｈ）４２０位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアラニン
（ｋ）６４位のアルギニン
（ｌ）９９位のセリン
上記Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ（配列番号５４）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のグリシンはリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のグルタミン酸はロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。場合により１１３位のリジンは置換されなくともよいか又はアルギニンへと置換されてもよい。場合により３５５位のセリンは置換されなくともよい。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは（ｋ）６４位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。
【００４３】
場合によりNeocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼはさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号５４の６７位、
（m）配列番号５４の７２位、
（n）配列番号５４の７６位、
（o）配列番号５４の９６位、
（p）配列番号５４の１０９位、
（q）配列番号５４の１１６位
場合により（l）配列番号５４の６７位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号５４の７２位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により（n）配列番号５４の７６位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号５４の９６位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号５４の１０９位のアミノ酸はアルギニンのままであるかまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号５４の１１６位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００４４】
Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼ（AnFX、配列番号６２）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６１位のアルギニン
（ｂ）６２位のロイシン
（ｃ）１０１位のグルタミン酸
（ｄ）１０５位のグリシン
（ｅ）１０９位のリジン
（ｆ）１１２位のセリン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
（ｉ）６７位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
（ｋ）６３位のアルギニン
（ｌ）９８位のセリン
上記Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼ（配列番号６２）において、好ましくは（ａ）６１位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６２位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０１位のグルタミン酸はリジンと置換される。好ましくは（ｄ）１０５位のグリシンはリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１０９位のリジンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは１１２位のセリンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６７位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは（ｋ）６３位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。
【００４５】
場合によりAspergillus nidulans由来アマドリアーゼはさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号６２の６６位
（m）配列番号６２の７１位
（n）配列番号６２の７５位
（o）配列番号６２の９５位
（p）配列番号６２の１０８位
（q）配列番号６２の１１５位
場合により（l）配列番号６２の６６位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号６２の７１位のアミノ酸はセリンでありうる。場合により（n）配列番号６２の７５位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号６２の９５位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号６２の１０８位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号６２の１１５位のアミノ酸はアルギニンでありうる。配列番号１４７のAspergillus nidulans由来アマドリアーゼについても同様である。
【００４６】
Eupenicillium terrenum由来アマドリアーゼ（配列番号４０又は１４５）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン
（ｅ）１１０位のリジン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のグリシン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
（ｋ）６４位のアルギニン
（ｌ）９９位のセリン
上記Eupenicillium terrenum由来アマドリアーゼ（配列番号４０に示したEFP-T5、又は配列番号１４５）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギンはリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のリジンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のグリシンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは（ｋ）６４位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。
【００４７】
場合によりEupenicillium terrenum由来アマドリアーゼ（EFP-T5）はさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号４０の６７位、
（m）配列番号４０の７２位、
（n）配列番号４０の７６位、
（o）配列番号４０の９６位、
（p）配列番号４０の１０９位、
（q）配列番号４０の１１６位
場合により（l）配列番号４０の６７位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号４０の７２位のアミノ酸はセリンのままでもよい。場合により（n）配列番号４０の７６位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号４０の９６位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号４０の１０９位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号４０の１１６位のアミノ酸はアルギニンのままでもよい。
【００４８】
配列番号１４５のEupenicillium terrenum由来アマドリアーゼについても同様である。
【００４９】
Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９又は１４９）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のイソロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のセリン
（ｅ）１１０位のセリン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
（ｋ）６４位のアルギニン
（ｌ）９９位のヒスチジン
上記Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（CnFX、配列番号８９又は１４９）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のイソロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のセリンはリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のセリンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは（ｋ）６４位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において（ｌ）９９位のヒスチジンはセリンへと置換される。
【００５０】
場合によりCryptococcus neoformans由来アマドリアーゼはさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号８９又は１４９の６７位、
（m）配列番号８９又は１４９の７２位、
（n）配列番号８９又は１４９の７６位、
（o）配列番号８９又は１４９の９６位、
（p）配列番号８９又は１４９の１０９位、
（q）配列番号８９又は１４９の１１６位
場合により（l）配列番号８９又は１４９の６７位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号８９又は１４９の７２位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により（n）配列番号８９又は１４９の７６位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号８９又は１４９の９６位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号８９又は１４９の１０９位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号８９又は１４９の１１６位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００５１】
Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５４位のアラニン
（ｋ）６４位のアルギニン
（ｌ）９９位のヒスチジン
上記Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のアラニンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５４位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは（ｋ）６４位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において（ｌ）９９位のヒスチジンはセリンへと置換される。
【００５２】
場合によりPyrenochaeta sp.由来アマドリアーゼはさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号１１３の６７位、
（m）配列番号１１３の７２位、
（n）配列番号１１３の７６位、
（o）配列番号１１３の９６位、
（p）配列番号１１３の１０９位、
（q）配列番号１１３の１１６位
場合により（l）配列番号１１３の６７位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号１１３の７２位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により（n）配列番号１１３の７６位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号１１３の９６位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号１１３の１０９位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号１１３の１１６位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００５３】
Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアラニン
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５６位のアラニン
（ｈ）４２１位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５７位のアラニン
（ｋ）６４位のアルギニン
（ｌ）９９位のグリシン
上記Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアラニンはリジンまたはアルギニンへと置換されるかまたはアラニンのままでよい。好ましくは（ｅ）１１０位のグルタミンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは３５６位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２１位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５７位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは（ｋ）６４位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において（ｌ）９９位のグリシンはセリンへと置換される。
【００５４】
場合によりArthrinium sp.由来アマドリアーゼはさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号１１５の６７位、
（m）配列番号１１５の７２位、
（n）配列番号１１５の７６位、
（o）配列番号１１５の９６位、
（p）配列番号１１５の１０９位、
（q）配列番号１１５の１１６位
場合により（l）配列番号１１５の６７位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号１１５の７２位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により（n）配列番号１１５の７６位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号１１５の９６位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号１１５の１０９位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号１１５の１１６位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００５５】
Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５４位のアラニン
（ｋ）６４位のアルギニン
（ｌ）９９位のヒスチジン
上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のアラニンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５４位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは（ｋ）６４位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において（ｌ）９９位のヒスチジンはセリンへと置換される。
【００５６】
場合によりCurvularia clavata由来アマドリアーゼはさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号１１７の６７位、
（m）配列番号１１７の７２位、
（n）配列番号１１７の７６位、
（o）配列番号１１７の９６位、
（p）配列番号１１７の１０９位、
（q）配列番号１１７の１１６位
場合により（l）配列番号１１７の６７位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号１１７の７２位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により（n）配列番号１１７の７６位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号１１７の９６位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号１１７の１０９位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号１１７の１１６位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００５７】
Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）と９５％のアミノ酸配列同一性を有するケトアミンオキシダーゼ（Cc95FX、配列番号９９）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のセリン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５４位のアラニン
（ｋ）６４位のアルギニン
（ｌ）９９位のヒスチジン
上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）と９５％のアミノ酸配列同一性を有するケトアミンオキシダーゼ（配列番号９９）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のアラニンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のセリンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５４位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは（ｋ）６４位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において（ｌ）９９位のヒスチジンはセリンへと置換される。
【００５８】
場合によりCurvularia clavata由来アマドリアーゼ（Cc95FX）はさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号９９の６７位、
（m）配列番号９９の７２位、
（n）配列番号９９の７６位、
（o）配列番号９９の９６位、
（p）配列番号９９の１０９位、
（q）配列番号９９の１１６位
場合により（l）配列番号９９の６７位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号９９の７２位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により（n）配列番号９９の７６位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号９９の９６位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号９９の１０９位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号９９の１１６位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００５９】
Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６１位のアルギニン
（ｂ）６２位のロイシン
（ｃ）１０１位のグルタミン酸
（ｄ）１０５位のリジン
（ｅ）１０９位のアルギニン
（ｆ）１１２位のセリン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
（ｉ）６７位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
（ｋ）６３位のアルギニン
（ｌ）９８位のセリン
上記Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）において、好ましくは（ａ）６１位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６２位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０１位のグルタミン酸はリジンへと置換される。場合により（ｄ）１０５位のリジンは置換されずともよいかまたはアラニンもしくはアルギニンへと置換され得る。好ましくは（ｅ）１０９位のアルギニンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは１１２位のセリンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６７位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは（ｋ）６３位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。
【００６０】
場合によりEmericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼはさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号１１９の６６位
（m）配列番号１１９の７１位
（n）配列番号１１９の７５位
（o）配列番号１１９の９５位
（p）配列番号１１９の１０８位
（q）配列番号１１９の１１５位
場合により（l）配列番号１１９の６６位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号１１９の７１位のアミノ酸はセリンでありうる。場合により（n）配列番号１１９の７５位のアミノ酸は、アラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号１１９の９５位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号１１９の１０８位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号１１９の１１５位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００６１】
Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５４位のアラニン
（ｋ）６４位のアルギニン
（ｌ）９９位のヒスチジン
上記Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のアラニンはロイシンへ、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５４位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。好ましくは（ｋ）６４位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。本発明のある実施形態において（ｌ）９９位のヒスチジンはセリンへと置換される。
【００６２】
場合によりUlocladium sp.由来アマドリアーゼはさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号１２１の６７位、
（m）配列番号１２１の７２位、
（n）配列番号１２１の７６位、
（o）配列番号１２１の９６位、
（p）配列番号１２１の１０９位、
（q）配列番号１２１の１１６位
場合により（l）配列番号１２１の６７位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号１２１の７２位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により（n）配列番号１２１の７６位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号１２１の９６位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号１２１の１０９位のアミノ酸はアルギニンまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号１２１の１１６位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００６３】
Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のセリン
（ｅ）１１０位のリジン
（ｆ）１１３位のアスパラギン酸
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のセリン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
（ｋ）６４位のアルギニン
（ｌ）９９位のセリン
上記Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジン、アラニン又はグリシンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のセリンはリジン、アラニンまたはアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のリジンはロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換される。好ましくは１１３位のアスパラギン酸はリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のセリンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。Penicillium chrysogenum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼについても同様である。好ましくは（ｋ）６４位のアルギニンはグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンへと置換され得る。
【００６４】
場合によりPenicillium janthinellum由来アマドリアーゼはさらに、以下の位置において１以上のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（l）配列番号１２３の６７位、
（m）配列番号１２３の７２位、
（n）配列番号１２３の７６位、
（o）配列番号１２３の９６位、
（p）配列番号１２３の１０９位、
（q）配列番号１２３の１１６位
場合により（l）配列番号１２３の６７位のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号１２３の７２位のアミノ酸はセリンのままでよい。場合により（n）配列番号１２３の７６位のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号１２３の９６位のアミノ酸はグルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号１２３の１０９位のアミノ酸はアルギニンのままでよいかまたはリジンでありうる。場合により（q）配列番号１２３の１１６位のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００６５】
ある実施形態において、本発明のヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼは、好ましくは
基質としてヘモグロビンＡ１ｃのβ鎖を認識し、
作用としてヘモグロビンＡ１ｃのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成し、
至適ｐＨ範囲をｐＨ６〜８の範囲に有し、
作用ｐＨ範囲をｐＨ５〜９の範囲に有し、
作用温度が２５〜４０℃であり、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量が約４５〜５５ＫＤａ、例えば約４８〜５０ＫＤａであるものであり得る。
【００６６】
本発明のアマドリアーゼ変異体又は改変体からは、ＨｂＡ１ｃに対する活性を全く示さないアマドリアーゼは除くものとする。
【００６７】
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
これらのアマドリアーゼをコードする遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００６８】
次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction、ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
【００６９】
このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３−２３５５８５号公報）が挙げられる。
【００７０】
また、別の好ましい例として、Phaeosphaeria属由来のアマドリアーゼ遺伝子、Neocosmospora属由来のアマドリアーゼ遺伝子、Aspergillus属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びCryptococcus属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びCurvularia属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びEupenicillium属由来のアマドリアーゼ遺伝子が挙げられる。
【００７１】
これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7（国際公開第２００７／１２５７７９号）から、GenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Alcrich社製）を用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドpKK223-3-CFP-T7を、抽出、精製して得ることができる。他の生物由来のアマドリアーゼ遺伝子についても、当業者であれば慣用法により、同様の手順でＤＮＡを取得することができる。具体的には、Eupenicillium terrenum ATCC 18547株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドpUTE100K’-EFP-T5（国際公開第２００７／１２５７７９号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドpUTE100K’-EFP-T5を、細胞から抽出、精製して得ることができる。また、Aspergillus nidulans FGSC A26株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドpET22b-AnFX（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドpET22b-AnFXを、抽出、精製して得ることができる。また、Cryptococcus neoformans由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドpET22b-CnFX（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドpET22b-CnFXを、抽出、精製して得ることができる。また、Neocosmospora vasinfecta由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドpET22b-NvFX（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドpET22b-NvFXを、抽出、精製して得ることができる。
【００７２】
（ベクター）
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、pBluescriptII SK+（Stratagene社製）等が好ましい。
【００７３】
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
【００７４】
上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５−ブロモウラシル等を挙げることができる。
【００７５】
この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５〜１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０〜８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０〜１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、０２４〜３０、１９８９年６月号）。
【００７６】
蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Site-Specific Mutagenesisとして知られる手法を用いることができる。例えば、Kramer法（Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984)： Methods Enzymol., 154, 350 (1987)： Gene, 37, 73 (1985))、Eckstein法(Nucleic Acids Res., 13, 8749 (1985)： Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985)： Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986))、Kunkel法(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A., 82, 488 (1985)： Methods Enzymol., 154, 367 (1987))等が挙げられる。
【００７７】
また、一般的なＰＣＲ法として知られる手法を用いることもできる（Technique, 1, 11(1989)参照）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
【００７８】
上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定若しくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）等を用いることにより行うことができる。
【００７９】
（形質転換・形質導入）
上述のように得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ−１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。
【００８０】
（アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性）
アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（GENETYX社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント、またはCLUSTAL Wのマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該２以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで２以上のアミノ酸配列について、同一性％とは、Blosum62等のアルゴリズムを利用して２以上のアミノ酸配列のアラインメントを行った際に、アラインメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、２以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、例えばＣ末端に同一性が全く見られない付加配列が一方のアミノ酸配列にある場合、当該同一性のない領域はアラインメント不可能であるため、同一性％の算出には利用されない。
【００８１】
また、２以上のアマドリアーゼにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似（similar）と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
【００８２】
本明細書において「相同性領域」とは、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、ある基準となるアマドリアーゼと比較対象のアマドリアーゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が７４％以上であるアマドリアーゼをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１０位〜３２位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位は相同性領域に該当しうる。
【００８３】
好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として、第１１位〜３２位、３６〜４１位、５０〜５２位、５４〜５８位、８４〜８６位、８８〜９０位、１４５〜１５０位、１５７〜１６８位、２０２〜２０５位、２０７〜２１２位、２１５〜２２５位、２３６〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、３４７〜３５４位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、及び４０５〜４１０位のアミノ酸配列からなる領域である。
【００８４】
さらに好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１１〜１８位、２０〜３２位、５０〜５２位、５４〜５８位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７７〜２８６位、及び３７０〜３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。
【００８５】
本発明のアマドリアーゼ変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼとアライメントしたときに５０％以上、好ましくは６０％以上、好ましくは７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、αＦ８Ｐに対して高い反応性を有する。さらに、本発明のアマドリアーゼ変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１における相同性領域のアミノ酸配列と８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、好ましくは９５％、好ましくは９８％、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有する。
【００８６】
ある実施形態において、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号２１１または配列番号２１３のアマドリアーゼを基準として第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる領域、好ましくは第１１位〜３２位、３６〜４１位、５０〜５２位、５４〜５８位、８４〜８６位、８８〜９０位、１４５〜１５０位、１５７〜１６８位、２０２〜２０５位、２０７〜２１２位、２１５〜２２５位、２３６〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、３４７〜３５４位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、及び４０５〜４１０位のアミノ酸配列からなる領域、さらに好ましくは第１１〜１８位、２０〜３２位、５０〜５２位、５４〜５８位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７７〜２８６位、及び３７０〜３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。
【００８７】
ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、
(i)  配列番号２１１または配列番号２１３に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼであるか、または(ii)  前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号２１１または配列番号２１３のアミノ酸配列と７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、８０％以上または８５％以上の配列同一性を有し、配列番号２１１または配列番号２１３の第１０位〜３２位、３６〜４１位、４９〜５２位、５４〜５８位、７３〜７５位、８４〜８６位、８８〜９０位、１２０〜１２２位、１４５〜１５０位、１５６〜１６２位、１６４〜１７０位、１８０〜１８２位、２０２〜２０５位、２０７〜２１１位、２１４〜２２４位、２２７〜２３０位、２３６〜２４１位、２４３〜２４８位、２５８〜２６１位、２６６〜２６８位、２７０〜２７３位、２７５〜２８７位、２９５〜２９７位、３０６〜３０８位、３１０〜３１６位、３２４〜３２９位、３３２〜３３４位、３４１〜３４４位、３４６〜３５５位、３５７〜３６３位、３７０〜３８３位、３８５〜３８７位、３８９〜３９４位、４０５〜４１０位及び４２３〜４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼである。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、前記(ii)に規定される相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼである。
【００８８】
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、上記に加え、又は上記とは独立に配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置、
（i）６８位、及び
（ii）３５６位、
に対応する位置で１以上のアミノ酸残基の置換を有する。
【００８９】
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、上記に加え、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置、
（i）２６２位、
（ii）２５７位、
（iii）２４９位、
（iv）２５３位、
（v）３３７位、
（vi）３４０位、
（vii）２３２位、
（viii）１２９位、
（ix）１３２位、
（x）１３３位、
（xi）４４位、
（xii）２５６位、
（xiii）２３１位、及び
（xiv）８１位、
よりなる群から選択される位置に対応する位置に１以上のアミノ酸残基の置換を有する。さらなる実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、上記に加え、場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい。
【００９０】
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、上記に加え、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置、
（l）配列番号１の６７位、
（m）配列番号１の７２位、
（n）配列番号１の７６位、
（o）配列番号１の９６位、
（p）配列番号１の１０９位、
（q）配列番号１の１１６位、
よりなる群から選択される位置に対応する位置に１以上のアミノ酸残基の置換を有してもよい。場合により（l）配列番号１の６７位に対応する位置のアミノ酸はヒスチジンでありうる。場合により（m）配列番号１の７２位に対応する位置のアミノ酸はセリンでありうる。場合により（n）配列番号１の７６位に対応する位置のアミノ酸はアラニンまたはフェニルアラニンでありうる。場合により（o）配列番号１の９６位に対応する位置のアミノ酸は、グルタミン酸でありうる。場合により（p）配列番号１の１０９位に対応する位置のアミノ酸はアルギニンでありうる。場合により（q）配列番号１の１１６位に対応する位置のアミノ酸はアルギニンでありうる。
【００９１】
（アミノ酸配列における対応する位置の特定）
本明細書において、ある基準となるアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸が別の類似するアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸と対応する場合、これを対応するアミノ酸といい、そのアミノ酸の位置を対応する位置という。本明細書では便宜上、配列番号１に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列を基準として説明する。この場合、アミノ酸配列における「対応する位置」とは、配列番号１に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
【００９２】
アミノ酸配列における「対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００９３】
本発明において、「配列番号１に示すアミノ酸配列の６４位に対応する位置」とは、対象のアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるアマドリアーゼのアミノ酸配列とアライメント比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６４位に対応する位置をいう。これは上記のアミノ酸配列における対応する位置の特定に記載した方法で特定することができる。
【００９４】
以下の「配列番号１に示すアミノ酸配列の６２位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の６３位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の１０２位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の１０６位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の１１０位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の１１３位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の３５５位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の４１９位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の６８位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の３５６位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の９９位に対応する位置」についてもそれぞれ同様である。
【００９５】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の６４位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよび、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６４位のアルギニンであり、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ及びAspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のアルギニンである。
【００９６】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の６２位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６２位のアルギニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６２位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６１位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６１位のアルギニンである。
【００９７】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の６３位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６３位のイソロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは６２位のロイシンである。
【００９８】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の１０２位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０２位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０２位のリジン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０１位のグルタミン酸である。
【００９９】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１０６位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１０６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０６位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１０６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１０６位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０６位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１０５位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１０５位のグリシンである。
【０１００】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の１１０位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１０位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１０位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１１０位のグルタミン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１１０位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１０位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１１０位のグリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１０９位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは、１０９位のリジンである。
【０１０１】
配列番号１に示すアミノ酸配列の１１３位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１１３位のスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１３位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１１３位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１１２位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１１３位のアスパラギン酸である。
【０１０２】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の３５５位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５５位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５３位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３５５位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５１位のアラニンである。
【０１０３】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の４１９位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは４１９位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４１８位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４２１位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４２０位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４１６位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４１９位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４２０位のアラニンである。
【０１０４】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の６８位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６８位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ及びAspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは６７位のアスパラギン酸である。
【０１０５】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の３５６位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３５６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５４位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５７位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３５４位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３５６位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５６位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５２位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５６位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５６位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５４位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５６位のアスパラギンである。
【０１０６】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の９９位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは９９位のセリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは９９位のヒスチジン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは９９位のグリシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは９９位のヒスチジン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは９９位のセリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９９位のヒスチジン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは９９位のヒスチジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９８位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは９８位のセリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９９位のヒスチジン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９９位のセリンである。
【０１０７】
本発明のアマドリアーゼ変異体は、一重変異体であってもよいが、２以上のアミノ酸置換を有する多重変異体であってもよい。本発明者は、配列番号２０３のアミノ酸配列における第６４位に対応する位置のアミノ酸をグリシンへと置換したアマドリアーゼ（配列番号２１３）、及び配列番号２０９のアミノ酸配列における第６４位に対応する位置のアミノ酸をグリシンへと置換したアマドリアーゼ（配列番号２１１）が驚くべきことにαＦ８Ｐに対する比活性が向上することを見出した。これらのアマドリアーゼはＨｂＡ１ｃに対する活性も向上していると考えられる。配列番号１６３のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼに関し、第６４位のアミノ酸をアラニン、グルタミン酸又はヒスチジンへと置換したアマドリアーゼはαＦ６Ｐに対する活性が低下したことに鑑みれば、この知見は非常に驚きであった。
【０１０８】
本明細書では、これらの位置（64/62/63/102/106/110/113/355/419及び68/356）の変異を、アマドリアーゼの基質特異性を変化させる変異又はアマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。
【０１０９】
ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼはαＦ８Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1U/mg以上、0.2U/mg以上、0.3U/mg以上、0.4U/mg以上、0.5U/mg以上、0.6U/mg以上、0.7U/mg以上、0.8U/mg以上、0.9U/mg以上、例えば1U/mg以上である。該アマドリアーゼは、基質特異性を変化させるアミノ酸置換を１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上、有しうる。このような本発明のアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃに直接作用し、本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法に用いることができる。
【０１１０】
ある実施形態において、αＦ８Ｐに対する比活性（U/mg）が向上している本発明のアマドリアーゼは、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、
（a）配列番号１の６２位、
（b）配列番号１の６３位、
（c）配列番号１の１０２位、
（d）配列番号１の１０６位、
（e）配列番号１の１１０位、
（f）配列番号１の１１３位、
（g）配列番号１の３５５位、
（h）配列番号１の４１９位、
(i) 配列番号１の６８位、
(j) 配列番号１の３５６位、
(k) 配列番号１の６４位、及び
(l) 配列番号１の９９位
からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸が１つまたはそれ以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、例えば１０、置換されたものであり得る。なお、「配列番号１に示されるアミノ酸配列の６２位に対応する位置」のアミノ酸は、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では６２位のセリンである。これは配列番号１のアミノ酸配列から見れば６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がセリンとなった、すなわちセリンに置換されたものと同等である。したがって天然のアマドリアーゼとして、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）のような、配列番号１のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がセリンであるアマドリアーゼも便宜上、本明細書では、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに（a）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置にアミノ酸置換を有するアマドリアーゼに含めるものとする。
【０１１１】
ある実施形態において、αＦ８Ｐに対する比活性（U/mg）が向上している本発明のアマドリアーゼは、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（l）よりなる群から選択される位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の１つまたはそれ以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、例えば１２、例えば１１、例えば１０が以下の各々に記載されるアミノ酸残基であり得る：
（a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンである、
（b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジン又はグリシンである、
（c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
（d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
（e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンである、
（f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、
（g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
（h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
(j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
(k) 配列番号１の６４位に対応する位置のアミノ酸がグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンである、
(l) 配列番号１の９９位に対応する位置のアミノ酸がセリンである。
【０１１２】
（予備的な置換について）
アマドリアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列の第６０位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これをグリシンへと置換することによって、置換前にαＦＶＨ活性を示さなかった酵素が、置換後にαＦＶＨ活性を示すようになることが報告されている（特開２０１０−３５４６９号公報、国際公開第２０１２／０１８０９４号参照）。したがって、本発明に用いるアマドリアーゼの配列番号１の第６０位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これを予めグリシンへと置換しておくこともできる。あるいは、野生型において配列番号１の６０位に対応する位置がグリシンであるアマドリアーゼを用いて、上記配列番号１の第６４位、６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位に対応する位置並びに６８位及び３５６位に変異を導入してもよい。本発明のアマドリアーゼ変異体は、特に断らない限り、配列番号１の第６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであるものを包含する。例えば、Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼは、配列番号１の６０位に対応する配列番号１４７中の第５９位のアミノ酸が野生型ではセリンであるが、これをグリシンに置換したもの（配列番号６２）を本発明の変異体のための基となるアマドリアーゼとして用いてもよい。Penicillium janthinellum(Pj)由来アマドリアーゼ（配列番号１２３）についても同様である。
【０１１３】
（さらなる予備的な置換について−界面活性剤耐性を向上させる変異）
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその界面活性剤に対する耐性を向上させることができることを確認している。本発明のアマドリアーゼは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有しうる。
【０１１４】
界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。 
（１）２６２位のアスパラギンの置換、例えば、ヒスチジンへの置換。 
（２）２５７位のバリンの置換、例えば、システイン、セリン、スレオニンへの置換。 （３）２４９位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（４）２５３位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（５）３３７位のグルタミンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（６）３４０位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリンへの置換。 
（７）２３２位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（８）１２９位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（９）１３２位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（１０）１３３位のグルタミン酸の置換、例えば、アラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換。 
（１１）４４位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリンへの置換。 
（１２）２５６位のグリシンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（１３）２３１位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（１４）８１位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
【０１１５】
界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体は、上記アミノ酸置換を少なくとも１つ有していればよく、複数のアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４を有しうる。
【０１１６】
本明細書において、「配列番号１に示すアミノ酸配列の４４位に対応する位置」とは、対象のアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４４位に対応する位置をいう。これは、上記に記載した方法で特定することができる。
【０１１７】
以下の「配列番号１に示すアミノ酸配列の８１位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の１３３位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の２５３位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の２５６位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の２５７位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の２６２位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の３３７位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の３４０位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の１２９位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の１３２位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の２３１位に対応する位置」、「配列番号１に示すアミノ酸配列の２３２位に対応する位置」、および「配列番号１に示すアミノ酸配列の２４９位に対応する位置」についてもそれぞれ同様である。
【０１１８】
すなわち、「配列番号１に示すアミノ酸配列の４４位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは４４位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のロイシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４４位のプロリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３位のプロリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４３位のプロリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のプロリン、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のプロリンである。
【０１１９】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の８１位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは８１位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のヒスチジン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のアスパラギン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８０位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８０位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のアスパラギンである。
【０１２０】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の１３３位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１３３位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３１位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のリジン、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のアスパラギン酸である。
【０１２１】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の２５３位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２５３位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５１位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５３位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２５１位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２５３位のバリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４９位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５３位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５１位のグルタミン酸、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のグルタミンである。
【０１２２】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の２５６位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２５６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５４位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５６位のグリシン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２５４位のアスパラギン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２５６位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５２位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５６位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５４位のアスパラギン、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のアスパラギン酸である。
【０１２３】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の２５７位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２５７位のバリン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５５位のスレオニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のシステイン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２５５位のバリン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のシステイン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のシステイン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５３位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のスレオニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５７位のスレオニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５５位のバリン、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のバリンである。
【０１２４】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の２６２位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２６２位のヒスチジン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２６２位のヒスチジン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５８位のアスパラギン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸である。
【０１２５】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の３３７位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３３７位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３３５位のリジン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３３５位のスレオニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３３７位のリジン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のリジン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３３位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３７位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３５位のスレオニン、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のリジンである。
【０１２６】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の３４０位に対応する位置」のアミノ酸は、、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３４０位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３４１位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３４０位のプロリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３６位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸である。
【０１２７】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の１２９位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１２９位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２７位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２８位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２８位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のグルタミン酸である。
【０１２８】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の１３２位に対応する位置」のアミノ酸はEupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３０位のアスパラギン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３１位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３１位のアスパラギン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸である。
【０１２９】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の２３１位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２３１位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２２９位のグルタミン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２２９位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２２７位のヒスチジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２２９位のグルタミン、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸である。
【０１３０】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の２３２位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２３２位のアスパラギン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のグリシン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２２８位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のアスパラギン酸である。
【０１３１】
「配列番号１に示すアミノ酸配列の２４９位に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは２４９位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２４７位のリジン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは２４９位のヒスチジン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは２４７位のグルタミン酸、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは２４９位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のグルタミン酸、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４５位のグルタミン酸、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のアラニン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４９位のアラニン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４７位のセリン、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のグルタミンである。
【０１３２】
本明細書ではこれらの位置（44位/133位/253位/257位/262位/337位/340位並びに249位/232位/129位/132位/256位/231位/81位）の変異を、アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させる変異またはアマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、基質特異性を変化させる変異に加え、さらに界面活性剤耐性を向上させる変異を有し得る。
【０１３３】
（さらなる予備的な欠失について−カルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失）
本発明者らは以前に、アマドリアーゼのカルボキシル末端から、３アミノ酸残基を欠失させることにより、その熱安定性を向上させうることを報告した（国際公開第２０１３／１００００６号明細書を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは上記の置換に加え、さらにカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を欠失していてもよい。
【０１３４】
（カルボキシル末端の欠失箇所に対応する位置）
「配列番号１に示すアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」とは、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置をいう。Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼにおける、この位置の３残基の配列は、４３５位のプロリン、４３６位のリジン及び４３７位のロイシンからなり、これらに対応する位置のアミノ酸配列も、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
【０１３５】
すなわちEupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のヒスチジンおよび４３７位のロイシンからなり、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のアラニン、４３９位のリジンおよび４４０位のロイシンからなり、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４５０位のヒスチジン、４５１位のリジンおよび４５２位のロイシンからなり、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のセリン、４３９位のリジンおよび４４０位のロイシンからなり、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のアスパラギンおよび４３７位のロイシンからなり、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリジンおよび４３８位のメチオニンからなり、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリジンおよび４３８位のメチオニンからなり、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３９位のアラニン、４４０位のリジンおよび４４１位のロイシンからなり、Penicillium janthinelum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のリジンおよび４３７位のロイシンからなる。
【０１３６】
本明細書ではアマドリアーゼに関するこれらのカルボキシル末端アミノ酸残基の欠失を、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる欠失と呼ぶことがある。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、基質特異性を変化させる変異、界面活性剤耐性を向上させる変異に加え、熱安定性を向上させる欠失を有し得る。
【０１３７】
（アマドリアーゼの生産）
上記のようにして得られたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
【０１３８】
すなわち、本発明は、アマドリアーゼの生産能を有する菌株を、アマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件下で培養する工程、及び培養物又は培養液からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼの製造方法を提供する。この方法には、本発明のアマドリアーゼをコードする遺伝子を組み込んだベクターで形質転換された宿主細胞を用いることができる。ここでアマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件とは、アマドリアーゼ遺伝子が転写、翻訳され、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドが産生されることをいう。
【０１３９】
また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
【０１４０】
また、培地に当該アマドリアーゼが作用し得る基質やその類似化合物、例えば糖化アミノ酸、糖化ペプチド類、糖化タンパク質分解物、若しくは糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化タンパク質を添加することにより目的の酵素の製造量を向上させることができる。
【０１４１】
培地の初発ｐＨは、ｐＨ７〜９に調整するのが適当である。培養は、２０〜４２℃の培養温度、好ましくは２５〜３７℃前後の培養温度で４〜２４時間、さらに好ましくは２５〜３７℃前後の培養温度で８〜１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
【０１４２】
培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
【０１４３】
上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換性担体、疎水性担体、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望のアマドリアーゼを得ることができる。
【０１４４】
（本発明のアマドリアーゼのＨｂＡ１ｃに対する反応性）
上記のような手段で得られるアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、ＨｂＡ１ｃに直接作用しうる。
【０１４５】
ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、改変前のものと比較してαＦ８ｐに対する比活性が向上している。
【０１４６】
本発明のアマドリアーゼに関し、改変前のアマドリアーゼのαＦ８Ｐに対する比活性（Ｕ／ｍｇ）を１としたときの、改変後のアマドリアーゼの比活性は、１．１以上、１．２以上、１．３以上、１．４以上、１．５以上、１．６以上、１．７以上、または１．７５以上でありうる。
【０１４７】
比活性の向上した本発明のアマドリアーゼの一例としては、例えば、CFP-T7-H38およびCFP-DH3が挙げられる。このようなアマドリアーゼは、従来のアマドリアーゼと比較してαＦ８Ｐに対する反応性が向上しており、プロテアーゼを使用することなく、迅速にＨｂＡ１ｃを測定することができ、産業利用上非常に有利である。また、本発明のアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃを例えばＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ等で処理し、その結果生じるαＦ８Ｐの測定に使用することができ、産業利用上非常に有利である。
【０１４８】
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
【０１４９】
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や、酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
【０１５０】
本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りの無い限り、αＦ８Ｐを基質として用いる。必要に応じてαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐ、ＨｂＡ１ｃ等も基質とすることができる。本明細書において、特に断らない限り酵素力価は、αＦ８Ｐを基質として測定した時の、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
【０１５１】
また、比活性（U/mg）は、酵素1mg当たりの酵素力価（U）である。例えばある酵素のαＦ８Ｐに対する比活性が０．１Ｕ／ｍｇであれば、酵素量を１０倍とすることで、比活性が１Ｕ／ｍｇの酵素と同じ酵素力価が得られることとなる。
【０１５２】
本明細書において、アマドリアーゼについて「αＦ８Ｐに対して反応性を有し」という場合、特に断らない限りこれはαＦ８Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1U/mg以上、0.2U/mg以上、0.3U/mg以上、0.4U/mg以上、0.5U/mg以上、0.6U/mg以上、0.7U/mg以上、0.8U/mg以上、0.9U/mg以上、例えば1U/mg以上、2U/mg以上、3U/mg以上、例えば4U/mg以上である態様を含むものとする。
【０１５３】
ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、αＦ８Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1U/mg以上、0.5U/mg以上、1U/mg以上、2U/mg以上、3U/mg以上、4U/mg以上、5U/mg以上、または6U/mg以上である。
【０１５４】
ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、上記の比活性を有し、かつ界面活性剤に対する耐性を有する。界面活性剤に対する耐性は、界面活性剤での処理前の活性と比較して、界面活性剤での処理後の残存活性を測定することにより評価することができる。残存活性は、界面活性剤処理前の活性を１００とした場合の界面活性剤処理後の活性の割合をパーセンテージ（％）で表すことができる。界面活性剤に対する耐性を有する本発明のアマドリアーゼは、界面活性剤処理後の残存活性（％）が５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上又は９９％以上でありうる。
【０１５５】
αＦＶ、αＦＶＨ等の糖化ペプチドは、例えば、阪上らの方法に基づき合成、精製したものを用いることができる（特開２００１−９５５９８号公報参照）。例えば糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃで処理することにより、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）のβ鎖サブユニット由来のα−糖化ヘキサペプチド（フルクトシルVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu）が遊離する（Clin.Chem.,43,1994-1951(1997))。これをαＦ６Ｐ基質として使用することができる。また、合成基質として提供されるαＦ８ＰおよびαＦ６Ｐ（ペプチド研究所製）を用いることもできる。
【０１５６】
Ａ：試薬の調製
（アマドリアーゼのαＦ８Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦＶＨまたはαＦＶに対する活性の測定用試薬の調製例）
（試薬１）：５Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ、０．４９ｍＭ  ４−アミノアンチピリンを含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液  ｐＨ６．５
５．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４−アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、１０００ｍｌに定容する。
（試薬２）：１５ｍＭ  ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学研究所製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（試薬３）：基質溶液（３０ｍＭ；  終濃度１ｍＭ）
αＦ８Ｐ（ペプチド研究所製）  ３３４ｍｇ、若しくはαＦ６Ｐ（ペプチド研究所製）  ２５７．１ｍｇ、若しくはαＦＶＨ（キッコーマン社製）  １２４．９ｍｇ、若しくはαＦＶ（キッコーマン社製）  ８３．８ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
【０１５７】
Ｂ：活性測定法
（アマドリアーゼのαＦ８Ｐ、αＦ６Ｐ、αＦＶＨまたはαＦＶに対する活性の測定方法の例）
２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔAs）を測定する。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔA0）を測定する。３７℃で１分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(Ｕ)とし、下記の式に従って算出する。
活性(U/ml)＝｛(ΔAs−ΔA0)×3.0×df｝÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs：反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2：反応により生成されるキノイミン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
0.5：1 molの過酸化水素による生成されるキノイミン色素のmol数
df：希釈係数。
【０１５８】
（熱処理ＨｂＡ１ｃの定量法の例）
以下のＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製する。
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値  約５．６％、約７．７％、約１０．５％）
試薬Ａ１：試料前処理液
５．０％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
試薬Ａ２：試料前処理液
５．０％  ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド（シグマアルドリッチ社製）
試薬Ｂ：ロイコ色素、パーオキシダーゼ溶液
１５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
０．３０ｍＭ  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
１５Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
試薬Ｃ１：アマドリアーゼ溶液
１２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
１２０Ｕ／ｍｌの本発明のアマドリアーゼ。
【０１５９】
（アマドリアーゼのＨｂＡ１ｃに対する活性の測定方法の例）
試薬Ａ１もしくは試薬Ａ２で３０倍希釈した試料（本明細書において試料希釈液と表記することがある）を高温で所定時間、例えば９８℃で２分間インキュベートした後、試料希釈液２５μｌを５０μｌの試薬Ｂに添加して３７℃で５分間インキュベートし、その後、２５μｌの試薬Ｃ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させる。溶液中に過酸化水素が生じる場合、パーオキシダーゼの作用によりロイコ色素が発色し、７５１ｎｍの光の吸光度が増加する。試料のＨｂＡ１ｃ濃度に応じて得られた結果を基に、試料のＨｂＡ１ｃ濃度（ＮＧＳＰ値）と、過酸化水素の定量反応前後の７５１ｎｍの光の吸光度差ΔＡとをグラフにプロットすることができる。
【０１６０】
なお、ΔＡは下記の式に従って算出する。
ΔＡ＝（試薬Ｃ１添加５分後の吸光度）−（試薬Ｃ１添加直前の吸光度×０．７５）
【０１６１】
上記の例では、試薬Ｃ１添加により、反応液の容積が１．３３倍となるため、試薬Ｃ１添加直前の吸光度に０．７５を掛けたものを、試薬Ｃ１添加直後の吸光度と見なす。
【０１６２】
（酸処理ＨｂＡ１ｃの定量法の例）
以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ  Ｍａｊｅｓｔｙ  ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してＨｂＡ１ｃを測定する。
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値  約５．６％、約７．７％、約１０．５％）
試薬Ｄ：試料前処理液
８．３％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）またはポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ５８、和光純薬工業製）
０．１Ｍ  塩酸
試薬Ｅ：ロイコ色素溶液
３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ９．０
２９０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
０．１６ｍＭ  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
試薬Ｆ１：パーオキシダーゼ、アマドリアーゼ溶液
１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液  ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１８０Ｕ／ｍｌの本発明アマドリアーゼ（例えばＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５等）
【０１６３】
試薬Ｄで３０倍希釈した試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｅに添加して３７℃で５分間インキュベート後、５０μｌの試薬Ｆ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させる。
【０１６４】
一例としてΔＡは下記の式に従って算出することができる。
ΔＡ＝（試薬Ｆ１添加５分後の吸光度）−（試薬Ｆ１添加直前の吸光度×０．７５）
【０１６５】
（界面活性剤処理ＨｂＡ１ｃの定量法の例）
以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ  Ｍａｊｅｓｔｙ  ＪＣＡ−ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してＨｂＡ１ｃを測定する。
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値  約５．６％、約７．７％、約１０．５％）
試薬Ｇ１：試料前処理液
０．８０％  テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（東京化成工業製）
試薬Ｇ２：試料前処理液
０．７０％  ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（東京化成工業製）
試薬Ｈ１：ロイコ色素溶液
１２０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ６．５
１．６％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
０．１６ｍＭ  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
試薬Ｈ２：ロイコ色素溶液
１２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ６．５
１．６％  ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（同仁化学研究所製）
０．１６ｍＭ  Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４′− ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ−６４、和光純薬工業製）
試薬Ｉ１：パーオキシダーゼ、アマドリアーゼ溶液
１００ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１６０Ｕ／ｍｌ  本発明のアマドリアーゼ（例えばＣＦＰ−ＤＨ２等）
試薬Ｉ２：パーオキシダーゼ、アマドリアーゼ溶液
１００ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液  ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ  パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１６０Ｕ／ｍｌ  本発明のアマドリアーゼ
【０１６６】
試薬Ｇ１で２５倍希釈した試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｈ１に添加して３７℃で５分間インキュベート後、５０μｌの試薬Ｉ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させる。また、試料を試薬Ｇ２で２５倍希釈した場合は、希釈試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｈ２に添加して３７℃で５分間インキュベートした後、５０μｌの試薬Ｉ２を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。
【０１６７】
一例としてΔＡは下記の式に従って算出することができる。
ΔＡ＝（試薬Ｉ１またはＩ２添加５分後の吸光度）−（試薬Ｉ１またはＩ２添加直前の吸光度×０．７５）
【０１６８】
（ＨｂＡ１ｃの測定）
ＨｂＡ１ｃを含む試料にＨｂＡ１ｃオキシダーゼ（アマドリアーゼ）を作用させる。作用時間は例えば、５秒以上、１０秒以上、２０秒以上、３０秒以上、１分以上、１８０分未満、１５０分未満、１２０分未満、６０分未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満、例えば５分未満、例えば０．５分以上〜１２０分未満、０．５分以上〜６０分未満、１分以上〜３０分未満、１分以上〜２０分未満、１分以上〜１５分未満、例えば１分以上〜１０分未満、例えば１分以上〜５分未満とすることができる。作用時間が短すぎる場合、試料中のＨｂＡ１ｃを十分に測定しきれず、良好な測定が行えない。一方、作用時間が長すぎる場合には、測定時間が延長し、測定処理の効率が悪いという問題に加え、試料及び測定試薬が測定条件下に長くさらされる結果、試料中の基質あるいは試薬中の成分の分解、変性を招くという問題を生じる。さらに、特に微量測定系においては、長時間経過による乾燥に起因する試料容量の減少による濃度変化なども誤差の原因となり得る。ＨｂＡ１ｃオキシダーゼ作用時間を０．５〜６０分間、好ましくは１〜５０分間、１〜４０分間、１〜３０分間、１〜２０分間、１〜１５分間、例えば１〜１０分間、例えば１〜５分間とすることにより、迅速かつ良好にＨｂＡ１ｃを測定できる。作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、２０〜４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。
【０１６９】
本発明に使用するアマドリアーゼの好適な使用量は、試料溶液中に含まれる基質の量にもよるが、例えば、終濃度が、０．１〜５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．２〜１０Ｕ／ｍＬとなるように添加すればよい。作用させる際のｐＨは、アマドリアーゼの至適ｐＨを考慮し、反応に適したｐＨとなるように緩衝剤を用いて調整することが好ましいが、作用可能なｐＨであればこれに限定されない。例えば、ｐＨ３〜１１、特に好ましくはｐＨ５〜９、例えばｐＨ６〜８である。
【０１７０】
本発明の測定方法においては、酵素や試薬の安定化や反応性向上等の目的でｐＨを調節及び／又は維持するため、必要により適宜、各種の緩衝剤を使用することが好ましい。使用可能な緩衝剤としては、例えば、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、フタル酸、酒石酸等が挙げられる。さらに必要により、溶解補助剤、安定化剤、反応性向上剤、ＨｂＡ１ｃ変性剤等として、界面活性剤（ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクチル−β−Ｄ−マルトシド、１−ドデシルピリジニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、トリトンＸ−１００、ブリッジ３５、ブリッジ５８、ツイーン８０、コール酸塩、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、３−オキサトリデシル−α−Ｄ−マンノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、トレハロースＣ８、トレハロースＣ１０、トレハロースＣ１２、トレハロースＣ１４、トレハロースＣ１６、ＢＩＧＣＨＡＰ、ｄｅｏｘｙ−ＢＩＧＣＨＡＰ、ＭＥＧＡ−８、ＭＥＧＡ−９、ＭＥＧＡ−１０、ヘキサデシルピリジニウム塩、オクタデシルトリメチルアンモニウム塩、デシルトリメチルアンモニウム塩、ノニルトリメチルアンモニウム塩、オクチルトリメチルアンモニウム塩、へキシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム等）、還元剤（ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｌ−システイン等）、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロース等）等を適宜添加してもよい。
【０１７１】
本発明に用いる界面活性剤としては、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法を可能とする界面活性剤であれば特に制限は無く、非イオン性界面活性剤やイオン性の界面活性剤、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。本明細書において界面活性剤というとき、特に断らない限り、この表現は１以上の界面活性剤を包含するものとする。
【０１７２】
非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
【０１７３】
カチオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩、例えばアルキルピリジニウム塩、ホスホニウム塩、例えばアルキルホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、例えばアルキルイミダゾリウム塩、イソキノニウム塩、例えばアルキルイソキノニウム塩などが挙げられる。
【０１７４】
また本発明のカチオン性界面活性剤としては、以下の一般式で表される第四級アンモニウム塩（I)、ピリジニウム塩(II)やホスホニウム塩(III)が挙げられる。
【０１７５】
【化１】
2016159384.tif 000002
［式中、Ｒ１〜Ｒ４は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
【０１７６】
【化２】
2016159384.tif 000003
［式中、Ｒ５は、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルを表し、各Ｒａは、同一又は異なっていてもよく、水素原子又は置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、ｎは１〜５の整数を表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
【０１７７】
【化３】
2016159384.tif 000004
［式中、Ｒ６〜Ｒ９は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、Ｚ−は、１価の陰イオンを表す。］
【０１７８】
第四級アンモニウム塩としては、例えば、オクチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＯＴＡＣ）及びブロミド（ＯＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣ）及びブロミド（ＴＴＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）及びブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド（ＳＴＡＢ）、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド（ＢＤＤＡＢ）、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＴＡＣ）及びブロミド、ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＣＤＡＣ）及びブロミド、ジオクチルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、が挙げられる。
【０１７９】
ピリジニウム塩としては、例えば、１−デシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１−ドデシルピリジニウムクロリド（１−ＤＰＣ）及びブロミド、１−テトラデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１−ヘキサデシルピリジニウムクロリド（１−ＣＰＣ）及びブロミド（１−ＣＰＢ）、Ｎ−セチル−２−メチルピリジニウムクロリド及びブロミド、Ｎ−セチル−３−メチルピリジニウムクロリド及びブロミド、Ｎ−セチル−４−メチルピリジニウムクロリド（４Ｍｅ−１−ＣＰＣ）及びブロミド、１−オクタデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１−エイコシルピリジニウムクロリド及びブロミドが挙げられる。
【０１８０】
ホスホニウム塩としては、例えば、テトラエチルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルメチルホスホニウムクロリド及びブロミド及びヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド及びブロミド、テトラ−ｎ−オクチルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルドデシルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムクロリド及びブロミド（ＴＢＣＰＢ）、メチルトリフェニルホスホニウムクロリド及びブロミド及びヨージド、テトラフェニルホスホニウムクロリド及びブロミドが挙げられる。
【０１８１】
カチオン性界面活性剤の対となる陰イオンZ-は例えばCl-、Br-、I-等でありうる。
【０１８２】
アニオン性界面活性剤としては、例えば、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルファーオレフィンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、α−スルホ脂肪酸エステル塩及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩などが挙げられる。このような界面活性剤としては例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。
【０１８３】
両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどが挙げられる。
【０１８４】
本発明は、アマドリアーゼの作用による生成物又は消費物を測定することによりＨｂＡ１ｃを測定する方法を提供するが、測定が容易な生成物であり、測定対象として好ましいものとして過酸化水素が挙げられる。アマドリアーゼの作用により生成した過酸化水素は、発色基質等によって検出してもよく、本発明に用いられる発色基質としては、４−アミノアンチピリンの他に、例えば、ＡＤＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン）、ＡＬＯＳ（Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン）、ＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム）、ＤＡ−６７（１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３、７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノシアジン）、ＤＡ−６４（Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４、４’−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミン）等が挙げられる。ＡＤＯＳ、ＡＬＯＳ、ＴＯＯＳは４−アミノアンチピリンと縮合した際に発色する。ＤＡ−６４、ＤＡ−６７は４−アミノアンチピリンを必要とせず、単独で処方するだけで発色する。いずれの場合も、発色反応はパーオキシダーゼにより触媒される。過酸化水素の測定は、一般に、過酸化水素を生成する工程と同時に行うことが好ましく、アマドリアーゼの作用時と同時に進行させることが好ましい。また、測定する消費物としては、溶存酸素が挙げられ、溶存酸素計等を用いて反応液中の溶存酸素量を測定することができる。
【０１８５】
本発明は、上述のアマドリアーゼと過酸化水素の測定用試薬、それに所望により緩衝剤等を添加したＨｂＡ１ｃ測定用試薬を提供する。この試薬中には、各種既知の成分、例えば、界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加することができる。上述の本発明のＨｂＡ１ｃ測定用試薬は、各試薬を異なる容器に含むものとして調製すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供することもできる。また、これらの測定用試薬は、乾燥物又は溶解した状態で用いてもよく、薄膜上の担体、例えば、シート含浸性の紙等に含浸させて用いてもよい。また、測定用試薬に用いられる酵素類は、常法により固定化させて反復使用することもできる。ある実施形態において、本発明のＨｂＡ１ｃ測定用試薬は、糖化タンパク質からα−フルクトシルペプチドを切り出すためのプロテアーゼ等を含まない。ある実施形態において、本発明のＨｂＡ１ｃ測定用試薬は、任意の公知のプロテアーゼ、例えば糖化タンパク質からαＦ８Ｐを切り出すためのプロテアーゼを含んでもよい。プロテアーゼの例としてはエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ、トリプシン、トリプシン様プロテアーゼ、Achromobacter プロテイナーゼI、Lysobacter enzymogenes由来Ｌｙｓ−Ｃプロテアーゼ等が挙げられるが、これらに限られない。また適当なプロテアーゼを２以上組み合わせてもよい。
【０１８６】
本発明のＨｂＡ１ｃ測定用試薬の仕様や使用条件は、その含有成分等に応じて最適なものを選択すればよいが、例えば、測定を２０〜４５℃において行うよう設定することができる。測定に要する時間も種々の測定条件により適宜選択できるが、例えば、０．５〜６０分間、好ましくは、０．５〜３０分間、さらに好ましくは１〜１０分間が好ましい。例えば、上記測定試薬の発色の程度（吸光度変化量）を分光光度計により測定し、標準の吸光度と比較して、試料中に含まれる糖化ペプチドあるいは糖化蛋白質を測定することができる。測定には、通常の自動分析装置を用いることもできる。
【０１８７】
（ＨｂＡ１ｃの定量）
本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法は、定性的であってもよいが、定量的な測定方法とすることもできる。ここでＨｂＡ１ｃの定量的測定方法とは、試料中のＨｂＡ１ｃの濃度を決定する方法をいう。すなわち本発明の一実施形態は、アマドリアーゼを使用することを含む、試料中のＨｂＡ１ｃの定量法を提供する。この定量法は、ＨｂＡ１ｃを含む試料と本発明のアマドリアーゼとを接触させる工程、及び該アマドリアーゼのＨｂＡ１ｃに対する作用による生成物又は消費物を測定する工程を含む。ここでのＨｂＡ１ｃは天然の状態であってもよく、または変性した状態であってもよい。該定量法について用いる接触とは、本発明のアマドリアーゼがＨｂＡ１ｃの酸化反応を触媒しうるように、該アマドリアーゼと試料とを物理的に一緒にするあらゆる態様を包含し、例えば溶液中で遊離の酵素とＨｂＡ１ｃを混合する場合のみならず、固相担体に担持された本発明のアマドリアーゼにＨｂＡ１ｃを含む溶液試料を添加又は滴下するような態様も包含する。
【０１８８】
本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法に用いる試料は、糖化ヘモグロビンを含む可能性のあるあらゆる生物学的試料、例えば血液、体液、リンパ液等に由来する試料とすることができる。試料は適宜、加工処理されたものでありうる。
【０１８９】
アマドリアーゼとＨｂＡ１ｃとの反応効率を高めるためには、変性したＨｂＡ１ｃをアマドリアーゼとの反応に用いてもよい。変性ＨｂＡ１ｃは、適当な界面活性剤との混合により取得でき、熱処理により取得でき、または界面活性剤添加および熱処理により取得でき、あるいは酸・アルカリでの変性処理により取得できる。変性処理として界面活性剤添加と熱処理の両方を行う場合、その順序は任意である。熱処理はＨｂＡ１ｃの全部または一部を変性させるのに十分な温度及び時間で行われうる。処理温度は例えば６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、９０℃以上、例えば９８℃とすることができる。処理時間は温度にもよるが例えば１０秒以上、２０秒、３０秒以上、１分以上、または２分以上であり得る。界面活性剤の例は上述したとおりであり、これらを適当な濃度で添加しうる。
【０１９０】
用いるアマドリアーゼ変異体の酵素量及び反応時間（作用時間）を一定とし、添加するＨｂＡ１ｃの量を変化させた場合に、ＨｂＡ１ｃ添加量が減少するにつれて、検出される発光基質の吸光度も比例的に減少するＨｂＡ１ｃ濃度範囲を調べることで、当該アマドリアーゼを用いた場合の検出可能な最低ＨｂＡ１ｃ濃度を決定することができる。この濃度を本明細書において検出限界濃度ということがある。本発明のＨｂＡ１ｃ定量法では、ＨｂＡ１ｃの検出限界が、測定試料中のＨｂＡ１ｃ濃度又は血中糖化ヘモグロビン濃度よりも低くなるように酵素量及び反応時間を設定することが好ましい。
【０１９１】
本発明の定量的測定では、予め、濃度既知のＨｂＡ１ｃを含む対照の吸光度等の測定値から最小二乗法などの回帰分析を行うことによって検量線を作成しておくこともできる。作成した検量線に対し、ＨｂＡ１ｃ濃度が未知である試料の測定値をプロットすることで、当該試料中のＨｂＡ１ｃ濃度を定量できる。
【０１９２】
本発明者らは、６４位にグリシンを有するConiochaeta由来アマドリアーゼ変異体CFP-T7-H38が、置換前のCFP-T7-H37と比較してαＦ８Ｐに対する比活性が向上していることを示した。また６４位にグリシンを有するCFP-DH3が置換前のCFP-DH2と比較してαＦ８Ｐに対する比活性が向上していることを示した。これは驚くべき知見である。当業者であれば、これらの知見に基づき、CFP-T7-H38およびCFP-DH3のＨｂＡ１ｃに対する反応性も向上しているであろうと理解する。また配列番号１に示すアミノ酸配列における６４位に対応する位置にグリシン残基を有し、αＦ８Ｐに対する良好な活性を示す他のアマドリアーゼも同様にＨｂＡ１ｃに直接作用し、その定量的測定に用いることができるであろう、と理解する。当業者であればそのような定量的測定のための酵素量（酵素濃度）、反応時間等の条件を適宜設定することができる。
【０１９３】
（スクリーニング方法）
ある実施形態において、上記の（アマドリアーゼ活性の測定方法）に記載の方法を用いて、あるアマドリアーゼがαＦ８Ｐに対する反応性を示すかや、当該アマドリアーゼのαＦ８Ｐ対する比活性が向上しているか否かを、決定することができる。候補となるアマドリアーゼとしては、種々の天然アマドリアーゼまたはそれらの改変体における配列番号１に示すアミノ酸配列の６４位に対応する位置のアミノ酸をグリシン、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンとしたものが挙げられる。アマドリアーゼの、配列番号１に示すアミノ酸配列における６４位に対応する位置のアミノ酸が、グリシンではないものと比較して、あるいは、セリン、メチオニン、ロイシン、トレオニン、バリン、又はイソロイシンではないものと比較して、前記の候補アマドリアーゼのαＦ８Ｐに対する比活性が向上しているか測定することができる。こうした改変体の作製に当たっては、配列番号１のアミノ酸配列の（ａ）６２位に対応する位置のアミノ酸を、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、メチオニン、スレオニン又はプロリンへと置換すること、（ｂ）６３位に対応する位置のアミノ酸をヒスチジン又はアラニン又はグリシンへと置換すること、（ｃ）１０２位に対応する位置のアミノ酸をリジンへと置換すること、（ｄ）１０６位に対応する位置のアミノ酸をアラニン、リジン、又はアルギニンへと置換すること、（ｅ）１１０位に対応する位置のアミノ酸をロイシン、チロシン、フェニルアラニン又はヒスチジンへと置換すること、（ｆ）１１３位に対応する位置のアミノ酸をリジン又はアルギニンへと置換すること、（ｇ）３５５位に対応する位置のアミノ酸をセリンへと置換すること、（ｈ）４１９位に対応する位置のアミノ酸をリジンへと置換すること、（ｉ）６８位に対応する位置のアミノ酸をアスパラギンへと置換すること、（ｊ）３５６位に対応する位置のアミノ酸をスレオニンへと置換すること、（ｋ）９９位に対応する位置のアミノ酸をセリンへと置換すること、場合により６７位に対応する位置のアミノ酸をヒスチジンへと置換すること、７２位に対応する位置のアミノ酸をセリンへと置換すること、７６位に対応する位置のアミノ酸をアラニンまたはフェニルアラニンへと置換すること、９６位に対応する位置のアミノ酸をグルタミン酸へと置換すること、１０９位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンまたはリジンへと置換すること、１１６位に対応する位置のアミノ酸をアルギニンへと置換することを参考にしてもよい。
【０１９４】
用いるアマドリアーゼには、上記の界面活性剤耐性を向上させる変異を導入してもよく、かつ／又は上記の熱安定性を向上させる欠失を行ってもよい。また、ＨｂＡ１ｃに対する活性を有する限り、酵素のその他の特性を改変する変異を導入することもできる。
【０１９５】
本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットには、上述のＨｂＡ１ｃ測定用試薬に加え、必要に応じ、その他の公知の安定化剤や夾雑物質の消去系などを包含してもよい。ＨｂＡ1ｃに作用するプロテアーゼ等を使用しＨｂＡ1ｃを酵素法により測定することを目的とした、従来の各種の試薬やキットに用いられている技術を、適宜改変して本発明のアマドリアーゼを含むＨｂＡ１ｃ測定用キットに用いることができる。ただし、本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットはそのようなプロテアーゼ等を必ずしも必要としない。すなわち、ある実施形態において、本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットは、ＨｂＡ１ｃからα−フルクトシルペプチドを切り出すためのプロテアーゼ等を含まない。ある実施形態において、本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットは、ＨｂＡ１ｃからαＦ８Ｐを切り出すためのＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ等を含みうる。
【０１９６】
（実施例）
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【０１９７】
［実施例１］アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの調製
Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号１４２）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５）株（国際公開第２０１３／１６２０３５号参照）を、３ｍｌのＬＢ−ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
【０１９８】
この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、GenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Aldrich社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５を得た。
【０１９９】
［実施例２］アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミドの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５を鋳型として、配列番号１９３、１９４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
【０２００】
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５を５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
【０２０１】
反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（NEW ENGLAND BioLabs社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６）を得た。
【０２０２】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６を鋳型として、配列番号１９５、１９６のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７）を得た。
【０２０３】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７を鋳型として、配列番号２０５、２０６のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがグリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｇ）を得た。
【０２０４】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７を鋳型として、配列番号２０５、２１５のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ａ）を得た。
【０２０５】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７を鋳型として、配列番号２０５、２１６のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがバリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｖ）を得た。
【０２０６】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７を鋳型として、配列番号２０５、２１７のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがイソロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｉ）を得た。
【０２０７】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７を鋳型として、配列番号２０５、２１８のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがロイシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｌ）を得た。
【０２０８】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７を鋳型として、配列番号２０５、２１９のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがメチオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｍ）を得た。
【０２０９】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７を鋳型として、配列番号２０５、２２０のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｓ）を得た。
【０２１０】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７を鋳型として、配列番号２０５、２２１のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがスレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｔ）を得た。
【０２１１】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｇを鋳型として、配列番号２２２、２２３のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ１１０位のロイシンがチロシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹ）を得た。
【０２１２】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｇを鋳型として、配列番号２２２、２２４のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ１１０位のロイシンがフェニルアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＦ）を得た。
【０２１３】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｇを鋳型として、配列番号２２２、２２５のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ１１０位のロイシンがヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＨ）を得た。
【０２１４】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹを鋳型として、配列番号２２６、２２７のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１４１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、かつ３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ１１０位のロイシンがチロシンに置換され、かつ９９位のヒスチジンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹＳ）を得た。
【０２１５】
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６の安定性を向上させた変異体を得るために、安定性向上効果のある７個の変異を導入し、かつＣ末端から３アミノ酸を除いた、配列番号１９９で示す４３４アミノ酸からなる改変型ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３６（以降、ＣＦＰ−ＤＨ１と称する）を大腸菌で発現させることを試みた。なお、ＣＦＰ−ＤＨ1に導入した変異（E44P/E133A/E253K/V257C/N262H/Q337K/E340P）について、本発明者らは、これがアマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させることを確認している。具体的には２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の当該アマドリアーゼに０．０４％のテトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣ）を作用させても、変異を有しないCFP由来酵素の残存活性が２９．２％となるのに対し、変異（E44P/E133A/E253K/V257C/N262H/Q337K/E340P）を導入したものが１００％の残存活性を有することを確認している。これらの変異の効果は、国際公開２０１５／０２０２００号に記載されており、これらの文献は参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする。またＣＦＰ−ＤＨ１におけるカルボキシル末端のアミノ酸配列の欠失について、本発明者らは、これがアマドリアーゼの熱安定性を向上させることを報告した。該欠失の効果は国際公開第２０１３／１００００６号明細書に記載されている。
【０２１６】
配列番号１９９のアミノ酸配列をコードし、かつ大腸菌発現用にコドンを最適化した、配列番号２００で示す１３０５ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成により取得した。このとき、配列番号２００の５´末端、３´末端にはそれぞれＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した。続いて、取得したＣＦＰ−ＤＨ１の遺伝子を大腸菌発現用のプラスミドにサブクローニングするために以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子、およびｐＫＫ２２３−３  Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）をＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理した後にライゲーションし、ｐＫＫ２２３−３  ＶｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトにＣＦＰ−ＤＨ１の遺伝子が挿入された組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ１を取得した。得られた組換え体プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、実施例１と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、実際に、ｐＫＫ２２３−３ベクターのマルチクローニングサイトにＣＦＰ−ＤＨ１遺伝子が挿入された組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ１が得られたことを確認した。
【０２１７】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ１を鋳型として、配列番号２０１、２０２のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１９９記載のアミノ酸配列の３５６位のアラニンがスレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ２）を得た。
【０２１８】
続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ２を鋳型として、配列番号２０７、２０８のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  を用い、上記と同一の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１９９記載のアミノ酸配列の３５６位のアラニンがスレオニンに置換され、かつ６４位のアルギニンがグリシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ３）を得た。
【０２１９】
［実施例３］各種アマドリアーゼの生産、精製および比活性測定
上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ーＨ３７）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７ーＨ３８−Ｇ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ａ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｖ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｉ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｌ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｍ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｓ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｔ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＦ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＨ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹＳ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ２）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ３）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地２００ｍｌに植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液４０ｍｌを調製した。大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ２）および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣＦＰ−ＤＨ３）の培養菌体のみ、２ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液４０ｍｌを調製した。
【０２２０】
Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を充てんしたカラムを１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した後、調製したＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７、またはＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｇ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ａ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｖ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｉ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｌ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｍ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｓ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｔ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＦ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＨ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹＳを含む各粗酵素液をアプライしてアマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、３０ｍＭのＮａＣｌ濃度を含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２０カラム体積分送液し、夾雑タンパク質を溶出させた後、８０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
【０２２１】
Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を充てんしたカラムを２ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した後、調製したＣＦＰ−ＤＨ２、またはＣＦＰ−ＤＨ３を含む粗酵素液をアプライしてアマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、４ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を２０カラム体積分送液し、夾雑タンパク質を溶出させた後、３０ｍＭのＮａＣｌを含む４ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
【０２２２】
得られたそれぞれのアマドリアーゼ活性を示す画分を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３０Ｋ（ミリポア社製）により濃縮し、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００により精製した。樹脂の平衡化、溶出には１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた。溶出した各フラクションの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、夾雑タンパク質を含んでいないフラクションを回収し、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｇ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ａ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｖ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｉ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｌ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｍ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｓ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｔ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＦ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＨ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹＳ、ＣＦＰ−ＤＨ２、およびＣＦＰ−ＤＨ３の精製標品とした。
【０２２３】
ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｇ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ａ、ＣＦＰ−ＤＨ２、およびＣＦＰ−ＤＨ３の精製標品を用いてαＦ８Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１および表２に示す。比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ． ４，   ２４１１−２３，  １９９５参照）。また、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３５の精製標品は国際公開第２０１３／１６２０３５号記載の方法に従って調製した。
【０２２４】
【表１】
2016159384.tif 000005
【０２２５】
【表２】
2016159384.tif 000006
【０２２６】
表１、２に示した結果からＲ６４Ｇの変異は、２種類のアマドリアーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７およびＣＦＰ−ＤＨ２）の、αＦ８Ｐに対する比活性を１．５１〜１．７５倍向上させる効果があることが明らかとなった。
【０２２７】
ところで、国際公開第２０１５／００５２５８号では、Emericella nidulans由来のアマドリアーゼであるFPOX-16に対する、Ｒ６３Ｇ、またはＲ６３Ｐ、またはＲ６３Ａの置換により、αＦ６Ｐに対する活性が向上している。Emericella nidulans由来のアマドリアーゼの63位は、Coniochaeta sp.由来のアマドリアーゼ（例えば、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７）では64位に対応する。一方で、国際公開第２０１３／１６２０３５号では、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６（配列番号１６３）に対するＲ６４Ａ、Ｒ６４ＥおよびＲ６４Ｈの変異導入は、変異型ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ６生産株の細胞抽出液のαＦ６Ｐに対する活性を下げる効果があると報告されている。また、本出願では、Ｒ６４Ａは、変異型ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７生産株のαＦ８Ｐに対する比活性を下げる効果があることを示した。従って、本発明で着目したＲ６４Ｇの変異に、αＦ８Ｐに対する比活性向上効果が見出されたことは予想外であり、極めて驚くべきことである。
【０２２８】
次に、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３７、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｇ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｖ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｉ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｌ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｍ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｓ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−Ｔ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹ、ＣＦＰ−Ｔ７−Ｈ３８−ＧＹＳの精製標品を用いて、１０μＭのαＦ８Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表３に示す。比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ． ４，   ２４１１−２３，  １９９５参照）。
【０２２９】
【表３】
2016159384.tif 000007
【０２３０】
表３に示した結果から、６４位のアミノ酸をＶ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｔとする変異はアマドリアーゼのαＦ８Ｐに対する比活性を１．５７〜１．９２倍向上させた。これらの結果も予想外であり、極めて驚くべきことである。また、６４位の変異と、１１０位の変異との組み合わせ、あるいはさらに９９位の変異のと組み合わせによりアマドリアーゼのαＦ８Ｐに対する比活性が予想以上に向上した。
【０２３１】
[実施例４]各種アマドリアーゼへの点変異導入
本発明の知見は、まずConiochaeta属由来のアマドリアーゼを用いて検証されたが、配列同一性に基づく公知の整列処理による情報を参考にして、その他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における対応する位置に同様な変異を導入することにより、同様な効果を奏することが期待できるという示唆を与え得る。そこで、実際に本発明の知見を、Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ以外の複数のアマドリアーゼにも導入して、この検証を行った。
【０２３２】
Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号１８７はフルクトシルヘキサペプチドに対して作用する、Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以降ＰｎＦＸと称する）の改変体のアミノ酸配列であり、配列番号１８８のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株により生産できる（国際公開第ＷＯ２０１３／１６２０３５号参照）。
【０２３３】
組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸを鋳型として、配列番号２２８、２２９の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）、Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
【０２３４】
すなわち、１０×ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」−「５０℃、３０秒」−「６８℃、６分」のサイクルを６回繰り返した。
【０２３５】
こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（NEW ENGLAND BioLabs社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、その反応液を２μｌとり、そこにＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを５μｌ、Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅを１μｌ、滅菌水を７μｌ加えて、１６℃で１時間反応させた。この反応液を用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ−ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ−ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、その結果、配列番号１８７記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがセリン酸に置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ−６４Ｓを得た。
【０２３６】
そして、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ、ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ−６４Ｓを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ−６４Ｓ）株を得た。
【０２３７】
Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号１３７はフルクトシルヘキサペプチドに対して作用する、Neocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼ（以降ＮｖＦＸと称する）の改変体のアミノ酸配列であり、配列番号１３８のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株により生産できる（国際公開第ＷＯ２０１３／１６２０３５号参照）。
【０２３８】
ＮｖＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型にして、配列番号２３０、２３１の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ、Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績社製）を用い、実施例４と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＮｖＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１３７記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンがヒスチジンに置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌを得た。 
【０２３９】
続いて、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社）を使用して、キットに添付されたプロトコールに従って、ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌをコードする遺伝子と、ｐＫＫ２２３−３プラスミドを連結して、ＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌを得た。具体的には、配列番号２３２、２３３の合成オリゴヌクレオチドおよびｐＫＫ２２３−３プラスミドを用いたＰＣＲ反応により得られたＤＮＡ断片と、配列番号２３４、２３５の合成オリゴヌクレオチドおよびｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌを用いたＰＣＲ反応により得られたＤＮＡ断片とを、ｉｎ−ｆｕｓｉｏｎ反応により、連結させてｐＫＫ２２３−３−ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌを得た。
【０２４０】
さらに、上記（実施例４）と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号２３６、２３７、または配列番号２３６、２３８、または配列番号２３６、２３９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号１３７記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがメチオニン、またはセリン、またはスレオニンに置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ−６４Ｍ、ｐＫＫ２２３−３−ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ−６４Ｓ、ｐＫＫ２２３−３−ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ−６４Ｔを得た。これらのプラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、各改変型ＮｖＦＸの生産株として用いた。
【０２４１】
Curvularia clavata由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
配列番号１１７はCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼ（以降ＣｃＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号２４０のアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入した組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸを保持する大腸菌ＪＭ１０９株により生産できる（国際公開第ＷＯ２０１３／１６２０３５号参照）。
【０２４２】
ＣｃＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸを鋳型にして、配列番号２４１、２４２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ、Ｔ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｋｉｎａｓｅ（東洋紡績社製）を用い、上記（実施例４）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＣｃＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１１７記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＣｃＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ−６２Ｄを得た。
【０２４３】
さらに、上記（実施例４）と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ−６２Ｄを鋳型とし、配列番号２４１、２４３の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号１１７記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ、６３位のロイシンがヒスチジンに置換されたＣｃＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈを得た。
【０２４４】
さらに、上記（実施例４）と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈを鋳型とし、配列番号２４４、２４５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号１１７記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ、６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ、１０２位のグルタミン酸がリジンに、かつ、１０６位のアスパラギン酸がリジンに置換されたＣｃＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０２Ｋ／１０６Ｋを得た。
【０２４５】
さらに、上記（実施例４）と同様にして、ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０２Ｋ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号２４６、２４７、又は配列番号２４６、２４８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号１１７記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ、６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ、１０２位のグルタミン酸がリジンに、かつ、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ、６４位のアルギニンがロイシン、またはスレオニンに置換されたＣｃＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミドｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０２Ｋ／１０６Ｋ−６４Ｌ、ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０２Ｋ／１０６Ｋ−６４Ｔを得た。これらのプラスミドを保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、各改変型ＣｃＦＸの生産株として用いた。
【０２４６】
[実施例５]各種アマドリアーゼの生産および精製
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
上記のようにして得られたＰｎＦＸ生産能を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ−ＰｎＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ−６４Ｓ）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
【０２４７】
調製したＰｎＦＸの粗酵素液を前述の非特許文献（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, １０６, ３５８−３６６, ２０１０）記載の方法に従い、精製した。すなわち、粗酵素液を硫酸アンモニウムにより分画し、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、陰イオン交換クロマトグラフィー（本実施例ではＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いた）により精製し、ゲルろ過クロマトグラフィー（本実施例ではＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｅｐｒｄｅｘ  ２００を用いた）により精製した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＰｎＦＸの精製標品とした。
【０２４８】
（Neocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼの生産および精製）
大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ−６４Ｍ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ−６４Ｓ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＮｖＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ−６４Ｔ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
【０２４９】
調製した粗酵素液を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄し、続いて３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に吸着していた改変型ＮｖＦＸを溶出させ回収した。
【０２５０】
得られた改変型ＮｖＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型ＮｖＦＸ、または改変型ＮｖＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＮｖＦＸの精製標品とした。
【０２５１】
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼの生産および精製）
大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０２Ｋ／１０６Ｋ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０２Ｋ／１０６Ｋ−６４Ｌ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３−ＣｃＦＸ−６２Ｄ／６３Ｈ／１０２Ｋ／１０６Ｋ−６４Ｔ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ−ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
【０２５２】
調製した粗酵素液を１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＨｉＳｃｒｅｅｎ  Ｃａｐｔｏ  Ｑ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させた。次に０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄し、続いてＮａＣｌ濃度を３００ｍＭまで直線的に増加させて、樹脂に吸着していた改変型ＣｃＦＸを溶出させ回収した。
【０２５３】
得られた改変型ＮｖＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムにアプライして同緩衝液で改変型ＣｃＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＣｃＦＸの精製標品とした。
【０２５４】
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼのタンパク質濃度の測定）
精製した改変型Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ、改変型Neocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼ、改変型Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼのタンパク質濃度は、それぞれのタンパク質が有するFADに基づき、以下の方法で測定した。
【０２５５】
まず、0.3、1.0、3.0mg/ml のConiochaeta sp.由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＣＦＰ−Ｔ７）溶液を調製した。分光光度計（Ｕ−３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、各濃度のＣＦＰ−Ｔ７溶液の４５０ｎｍにおける吸光度を測定して、ＣＦＰ−Ｔ７濃度と吸光度の相関性を示す検量線を作成した。続いて、資料として、ＣＦＰ−Ｔ７の代わりに、改変型Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ、改変型Neocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼ、改変型Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼを用いて、同様の方法により、各酵素溶液の４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。測定により得られた吸光度を、前述の検量線に照らし合わせることにより、各酵素溶液のタンパク質濃度を定量した。
【０２５６】
次に、PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S及びPnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S-64Sの精製標品を用いて、１０μＭのαＦ８Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表４に示す。
【０２５７】
【表４】
2016159384.tif 000008
【０２５８】
表４の結果から６４位をＳとする変異は、PnFXについてもアマドリアーゼのαＦ８Ｐに対する比活性を向上させた。
【０２５９】
次に、CcFX-62D/63H/102K/106K、CcFX-62D/63H/102K/106K-64L、CcFX-62D/63H/102K/106K-64Tの精製標品を用いて、１０μＭのαＦ８Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表５に示す。
【０２６０】
【表５】
2016159384.tif 000009
【０２６１】
表５の結果から６４位をＬ、Ｔとする変異は、CcFXについてもアマドリアーゼのαＦ８Ｐに対する比活性を向上させた。
【０２６２】
次に、NvFX-62D/63H/106K/110L、NvFX-62D/63H/106K/110L-64M、NvFX-62D/63H/106K/110L-64S、NvFX-62D/63H/106K/110L-64Tの精製標品を用いて、１０μＭのαＦ８Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表６に示す。
【０２６３】
【表６】
2016159384.tif 000010
【０２６４】
表６の結果から６４位をＭ、Ｓ、Ｔとする変異は、NvFXについてもアマドリアーゼのαＦ８Ｐに対する比活性を向上させた。
【０２６５】
以上のとおり、本発明で見出した、αＦ８Ｐに対する比活性を向上させる変異を導入したアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃそのものに対する比活性も向上していると見積もられ、プロテアーゼを必要としないアマドリアーゼによるＨｂＡ１ｃ直接測定法の感度向上、アマドリアーゼ処方量低減に貢献し、産業上の利用価値が期待される。
【０２６６】
ＨｂＡ１ｃのＮ末端側からみて、塩基性アミノ酸であるリジンが初めて現れる糖化ペプチドはαＦ８Ｐ（α−フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミルグルタミルリジン）である。そのため、本発明のアマドリアーゼは、タンパク質をリジン残基のＣ末端側で切断するＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ等を使用してＨｂＡ１ｃを消化し、それにより生じるαＦ８Ｐの測定に用いることができる。
【０２６７】
配列表の簡単な説明
配列番号１  Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（CFP-T7）のアミノ酸配列配列番号２  配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号３−３３  PCRプライマー
配列番号３４  PCRプライマー
配列番号３５  PCRプライマー
配列番号３６  Aspergillus oryzae RIB40由来アマドリアーゼ（FAOAo2）のアミノ酸配列配列番号３７：  配列番号３６のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号３８  Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ（PnFX）のアミノ酸配列
配列番号３９  配列番号３８のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号４０  Eupenicillium terrenum由来アマドリアーゼ（EFP-T5）のアミノ酸配列
配列番号４１  配列番号４０のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号４２−５３  PCRプライマー
配列番号５４  Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ（NvFX）のアミノ酸配列
配列番号５５  配列番号５４のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号５６−６１  PCRプライマー
配列番号６２  Ｓ５９Ｇのアミノ酸置換を導入したAspergillus nidulans由来アマドリアーゼ（AnFX）のアミノ酸配列
配列番号６３  配列番号６２のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号６４−８８  PCRプライマー
配列番号８９  Cryptococcus neoformans由来アマドリアーゼ（CnFX）のアミノ酸配列
配列番号９０  配列番号８９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号９１−９８  PCRプライマー
配列番号９９  Curvularia clavataケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ（Cc95FX）のアミノ酸配列
配列番号１００  配列番号９９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１０１−１１２  PCRプライマー
配列番号１１３  Pyrenochaeta sp.(Py)由来アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１４  配列番号１１３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１１５  Arthrinium sp.(Ar) 由来アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１６  配列番号１１５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１１７  Curvularia clavata(Cc) 由来アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１８  配列番号１１７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１１９  Emericella nidulans(En) 由来アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２０  配列番号１１９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１２１  Ulocladium sp.(Ul) 由来アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２２  配列番号１２１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１２３  Penicillium janthinellum(Pj) 由来アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２４  配列番号１２３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１２５  Aspergillus fumigatus由来アマドリアーゼ（Amadoriase I）のアミノ酸配列
配列番号１２６  配列番号１２５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１２７  Aspergillus oryzae由来アマドリアーゼ（FAOAo1）のアミノ酸配列
配列番号１２８  配列番号１２７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１２９  Aspergillus fumigatus由来アマドリアーゼ（Amadoriase II）のアミノ酸配列
配列番号１３０  配列番号１２９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３１  Aspergillus terreus由来アマドリアーゼ（FAOD-A）のアミノ酸配列
配列番号１３２  配列番号１３１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３３  CFP-T7-H20のアミノ酸配列
配列番号１３４  配列番号１３３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３５  S62D、D106K、G110L、A113Kのアミノ酸置換を導入したPnFPOX の アミノ酸配列
配列番号１３６  配列番号１３５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３７  R62D、G106K、E110Lのアミノ酸置換を導入したNvFX(NvFX-62D/106K/110L)のアミノ酸配列
配列番号１３８  配列番号１３７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３９   R61D、G105K、K1091Lのアミノ酸置換を導入したAnFX(AnFX-61D/105K/109L)のアミノ酸配列
配列番号１４０  配列番号１３９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４１  R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K、A355Sのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H35)のアミノ酸配列
配列番号１４２  配列番号１４１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４３  R62D、L63H、D106K、K110L、T113K、A355Sのアミノ酸置換を導入したEFP-T5(EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S)のアミノ酸配列
配列番号１４４  配列番号１４３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４５  Eupenicillium terrenum由来野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１４６  配列番号１４５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４７  Aspergillus nidulans由来野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１４８  配列番号１４７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４９  Cryptococcus neoformans由来野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１５０  配列番号１４９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１５１  R62Aのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H1)のアミノ酸配列
配列番号１５２  配列番号１５１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１５３  R62Dのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-62D)のアミノ酸配列
配列番号１５４  配列番号１５３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１５５R62Dのアミノ酸置換を導入したEFP-T5(EFP-T5-R62D)のアミノ酸配列
配列番号１５６  配列番号１５５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１５７  R62A、Q110Lのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H2)のアミノ酸配列
配列番号１５８  配列番号１５７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１５９  R62A、Q110Yのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H4)のアミノ酸配列
配列番号１６０  配列番号１５９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１６１  R62N、Q110Lのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H2-62N)のアミノ酸配列
配列番号１６２  配列番号１６１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１６３  R62D、Q110Lのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H6)のアミノ酸配列
配列番号１６４  配列番号１６３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１６５  R62D、D106A、Q110Lのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H10)のアミノ酸配列
配列番号１６６  配列番号１６５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１６７  R62D、D106K、Q110Lのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H11)のアミノ酸配列
配列番号１６８  配列番号１６７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１６９  R62D、D106R、Q110Lのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H12)のアミノ酸配列
配列番号１７０  配列番号１６９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１７１  R62D、Q110L、A113Kのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H13)のアミノ酸配列
配列番号１７２  配列番号１７１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１７３  R62D、Q110L、A113Rのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H14)のアミノ酸配列
配列番号１７４  配列番号１７３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１７５  R62D、D106K、Q110L、A113Rのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H21)のアミノ酸配列
配列番号１７６  配列番号１７５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１７７  R62D、L63A、D106K、Q110L、A113Kのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H24)のアミノ酸配列
配列番号１７８  配列番号１７７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１７９  R62D、L63H、D106K、Q110L、A113Kのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H26)のアミノ酸配列
配列番号１８０  配列番号１７９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８１  R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113Kのアミノ酸置換を導入したCFP-T7（CFP-T7-H28）のアミノ酸配列
配列番号１８２  配列番号１８１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８３  R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K、A419Kのアミノ酸置換を導入したCFP-T7(CFP-T7-H29)のアミノ酸配列
配列番号１８４  配列番号１８３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８５  R61D、L62H、E101K、G105K、K109L、S112K、A355Sのアミノ酸置換を導入したAnFX（AnFX-61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S）のアミノ酸配列
配列番号１８６  配列番号１８５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８７  S62D、L63H、D106K、G110L、A113K、A351Sのアミノ酸置換を導入したPnFX（PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S）のアミノ酸配列
配列番号１８８  配列番号１８７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８９  R62D、S106K、S110L、A113Kのアミノ酸置換を導入したCnFX（CnFX-62D/106K/110L/113K）のアミノ酸配列
配列番号１９０  配列番号１８９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１９１  R62D、L63H、D106K、A110L、A113K、A353Sのアミノ酸置換を導入したCc95Fx（Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/353S）のアミノ酸配列
配列番号１９２  配列番号１９１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１９３−１９８  ＰＣＲプライマー
配列番号１９９  E44P、D68N、E133A、E253K、V257C、N262H、Q337K、E340Pのアミノ酸置換を導入し、P435、K436、L437を欠失させたCFP-T7-H35(CFP-DH1)のアミノ酸配列
配列番号２００  配列番号１９９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号２０１−２０２  ＰＣＲプライマー
配列番号２０３  A356Tのアミノ酸置換を導入したCFP-DH1(CFP-DH2)のアミノ酸配列
配列番号２０４  配列番号２０３のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
配列番号２０５−２０８  ＰＣＲプライマー
配列番号２０９  D68N、A356Tのアミノ酸置換を導入したCFP-T7-H35(CFP-T7-H37)のアミノ酸配列
配列番号２１０  配列番号２０９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号２１１  R64G、D68N、A356Tのアミノ酸置換を導入したCFP-T7-H35(CFP-T7-H38)のアミノ酸配列
配列番号２１２  配列番号２１１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号２１３  R64G、A356Tのアミノ酸置換を導入したCFP-DH1(CFP-DH3)のアミノ酸配列
配列番号２１４  配列番号２１３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号２１５−２３９  ＰＣＲプライマー
配列番号２４０  配列番号１１７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号２４１−２４８  ＰＣＲプライマー
【０２６８】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１−１】
2016159384.tif 000011
【図１−２】
2016159384.tif 000012
【図１−３】
2016159384.tif 000013
【図１−４】
2016159384.tif 000014
【図１−５】
2016159384.tif 000015
【図２−１】
2016159384.tif 000016
【図２−２】
2016159384.tif 000017
【図２−３】
2016159384.tif 000018
【図２−４】
2016159384.tif 000019
【図２−５】
2016159384.tif 000020
【配列表】
2016159384000001.app
【国際調査報告】
2016159384.tif 000021
2016159384.tif 000022
2016159384.tif 000023
2016159384.tif 000024