(57)【要約】【課題】  シグナル強度が強くかつ基板上の糖鎖を汚染しにくい物質をグリッドマーカーとして用いる、糖鎖アレイを提供すること。【解決手段】  Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドの蛍光強度は強く、さらにこの蛍光色素は基板上の糖鎖に吸着しないことも見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の糖鎖と、グリッドマーカーとして、Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドとが、基板上に固定化されている糖鎖アレイ。
【請求項２】
前記複数の糖鎖にグリコサミノグリカンが含まれる、請求項１に記載の糖鎖アレイ。
【請求項３】
前記基板が、前記糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物で被覆されている基板である、請求項１又は２に記載の糖鎖アレイ。
【請求項４】
糖鎖アレイの製造方法であって、
複数の糖鎖と、グリッドマーカーとして、Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドとを、基板上に固定化する工程を含む方法。
【請求項５】
前記複数の糖鎖にグリコサミノグリカンが含まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記基板が、前記糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物で被覆されている基板であり、前記糖鎖とＮ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドとを前記基板上に固定化した後に、該基板を被覆している高分子化合物における余剰官能基をキャッピングする工程をさらに含む、請求項４又は５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドをグリッドマーカーとして用い、複数の糖鎖をプローブとして用いる糖鎖アレイ、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分野において、近年、核酸、タンパク質に続く第三の鎖として糖鎖分子が注目されている。糖鎖分子については、特に細胞の分化や癌化、免疫反応や受精等との関係について研究がなされており、その研究成果を基に新たな医薬や医療材料の開発が試みられている。しかしながら、糖鎖は、研究の重要性を認識されながら、その複雑な構造や多様性から、第一、第二の鎖である核酸、タンパク質に比較して研究の推進が著しく遅れている。
【０００３】
このような状況の下、糖鎖分析の効率化を図るために、複数の糖鎖が基板上に固定化されている糖鎖アレイの開発が行われている（例えば、特許文献１）。
【０００４】
糖鎖アレイを用いて、基板上に固定化された糖鎖と検出対象物質との結合を検出する場合、基板上の複数の糖鎖の中から、検出対象物質との結合が検出された糖鎖を特定する必要がある。この目的のため、各糖鎖のグリッド位置を特定する指標となるマーカー物質を基板上に固定化することが行われている（例えば、特許文献２）。そして、この目的で使用されるマーカー物質はグリッドマーカーと呼ばれている。
【０００５】
糖鎖アレイにおけるグリッドマーカーとしては、その検出に十分なシグナル（例えば、蛍光）を発することのみならず、基板上の糖鎖に吸着しにくいことが望ましい。そのため、これら条件を十分に満たす糖鎖アレイのグリッドマーカーとして有用な物質の探索が進められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１９１２８６号公報
【特許文献２】特開２０００−２７０８９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、シグナル強度が強くかつ基板上の糖鎖を汚染しにくい物質をグリッドマーカーとして用いる、糖鎖アレイを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドが、糖鎖アレイにおけるグリッドマーカーとして十分な蛍光シグナルを発することができることを見出した。また、驚くべきことに、Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドは正電荷を有しているにもかかわらず、グリコサミノグリカンなどの負電荷を有する糖鎖をアレイに用いた場合でも、基板上の糖鎖への吸着による汚染がないことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、複数の糖鎖と、グリッドマーカーとして、Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドとが、基板上に固定化されている糖鎖アレイを提供するものである。
【００１０】
本発明の糖鎖アレイの一つの好ましい態様は、前記複数の糖鎖にグリコサミノグリカンが含まれる、前記糖鎖アレイである。
【００１１】
本発明の糖鎖アレイの他の好ましい態様は、前記基板が、前記糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物で被覆されている、前記糖鎖アレイである。
【００１２】
また、本発明は、糖鎖アレイの製造方法であって、複数の糖鎖と、グリッドマーカーとして、Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドとを、基板上に固定化する工程を含む方法を提供するものである。
【００１３】
本発明の方法の一つの好ましい態様は、前記複数の糖鎖にグリコサミノグリカンが含まれる、前記方法である。
【００１４】
本発明の方法の他の好ましい態様は、前記基板が、前記糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物で被覆されている基板であり、前記糖鎖とＮ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドとを前記基板上に固定化した後に、該基板を被覆している高分子化合物における余剰官能基をキャッピングする工程をさらに含む、前記方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の糖鎖アレイを用いれば、該糖鎖アレイの基板上にプローブとして固定化された各糖鎖のグリッド位置を感度高く特定することができる。また、本発明の糖鎖アレイの製造方法によれば、複数の糖鎖が固定化された糖鎖アレイを、高品質で、すなわち、グリッドマーカーとして用いられる蛍光色素等による汚染を抑制しつつ製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】０．２μＭのローダミンをグリッドマーカーとして基板上に固定化した糖鎖アレイ（比較例１）並びに０．２μＭ及び０．１μＭのＮ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージド（ＩＣ３−ＯＳｕ）をグリッドマーカーとして基板上に各々固定化した糖鎖アレイ（実施例１及び２）において、グリッドマーカーが発する蛍光を観察した結果を示す写真である。
【図２】比較例１、実施例１及び２に記載の糖鎖アレイにおいて、グリッドマーカー及びヘパリンが発する蛍光を観察した結果を示す写真である。なお、各パネルにおいて、左側が基板上のグリッドマーカーを固定化した箇所を示し、右側が基板上の糖鎖（ヘパリン）を固定化した箇所を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、複数の糖鎖と、グリッドマーカーとして、Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドとが、基板上に固定化されている糖鎖アレイを提供する。
【００１８】
また、本発明は、複数の糖鎖と、グリッドマーカーとして、Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドとを基板上に固定化する工程を含む、糖鎖アレイの製造方法を提供する。
【００１９】
本発明において「糖鎖アレイ」とは、複数の糖鎖を基板上に配置した器具を意味する。
【００２０】
本発明において「糖鎖」とは、単糖類（単糖及びその誘導体）が２つ以上、グリコシド結合により繋がりあった多糖を意味し、１種類の単糖類から構成されるもの（ホモ糖鎖）であってもよく、２種類以上の単糖類から構成されるもの（ヘテロ糖鎖）であってもよい。糖鎖を構成する単糖類の種類、個数については特に制限はなく、また単糖類間のグリコシド結合はα結合、β結合のいずれであってもよい。さらに、糖鎖は天然由来のものであってもよく、天然由来のものに人工的に官能基の付加や置換等の修飾を加えたものであってもよく、化学的に合成されたものであってもよい。また、本発明の糖鎖アレイの基板上に固定される糖鎖の形態としては、特に制限はなく、他の低分子が結合している形態であってもよい。かかる形態としては、例えば、糖タンパク質、糖脂質が挙げられる。
【００２１】
本発明において「グリコサミノグリカン」とは、硫酸基が付加した二糖の繰り返し構造からなる多糖を意味する。本発明におけるグリコサミノグリカンとしては、例えば、へパリン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケタラン硫酸等が挙げられるが、これらに制限されない。
【００２２】
本発明において「グリッドマーカー」とは、基板上に固定化された各糖鎖のグリッド位置を特定する指標となるマーカー物質を示す。
【００２３】
本発明において、グリッドマーカーとしては「Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージド（Ｎ−Ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−［５−（Ｎ”−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）ｐｅｎｔｙｌ］ｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ）」を用いる。また、この蛍光色素は、株式会社同仁化学研究所から、商品名「ＩＣ３−ＯＳｕ」として販売されているため、該製造会社から購入することにより得ることができる。
【００２４】
Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドは、カチオン性の蛍光色素である。一方、グリコサミノグリカンは、多数の硫酸基及びカルボキシル基を有し、強く負に帯電しているため、当該蛍光色素と静電的に結合してしまうことが懸念された。しかしながら、後述の実施例で示す通り、Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドはグリコサミノグリカンを汚染することはない。従って、糖鎖アレイの基板上に固定化されている複数の糖鎖にグリコサミノグリカンが含まれている場合にも、当該蛍光色素はグリッドマーカーとして好適に用いることができる。
【００２５】
本発明における「基板」としては、複数の糖鎖及びＮ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドを固定化しうるものであれば特に制限はないが、好ましくは、糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物で被覆された基板である。
【００２６】
本発明において基板上に被覆する「糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物」としては、特に制限はないが、一級アミノ基を有するユニットを含む高分子化合物が好ましい。当該高分子化合物は、さらに、親水性を保持するためのユニットおよび疎水性基を有するユニットを含むことが好ましい。この形態の基板においては、親水性を保持するためのユニットが検出対象物質の基板への物理的吸着（非特異的吸着）を抑制する役割を、疎水性基を有するユニットが高分子化合物を基板に結合させる役割を、それぞれ果たす。
【００２７】
本発明における高分子化合物に含まれる一級アミノ基を有するユニットは、特に構造を限定されるものではないが、下記一般式〔１〕の構成単位の右部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル残基とオキシルアミノ残基とを含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。オキシルアミノ基の場合、Ｚは酸素原子を、ヒドラジド基の場合、ＺはＮＨを、セミカルバジド基の場合、ＺはＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨを、チオセミカルバジドの場合、ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨを示す。ｎは本来自然数であるが、各成分の組成割合として表記される場合がある。アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹの構造は、特に制限されるものではないが、下記一般式〔２〕又は〔３〕であることが好ましく、より好ましくは下記一般式〔２〕である。
【００２８】
【化１】
2014089148.tif 000002
【００２９】
【化２】
2014089148.tif 000003
【００３０】
【化３】
2014089148.tif 000004
【００３１】
本発明における高分子化合物に含まれる一級アミノ基を有するユニットの組成割合（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｎの比率）は、高分子の全ユニットに対して、１〜９４ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは２〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは、２０〜４０ｍｏｌ％である。組成値が下限値を下回ると糖鎖を十分量固定化できなくなる。また、上限値を上回ると非特異吸着が増加する。
【００３２】
高分子化合物に含まれる親水性のユニットはホスホリルコリン基に代表されるもので、特に構造を限定するものではないが、前記一般式〔１〕のユニットは、構成単位の左部の構成単位で示されるように、（メタ）アクリル残基とホスホリルコリン基が炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基Ｘの連鎖を介して結合した構造であることが好ましい。中でもＸはエチレンオキシ基であることが最も好ましい。式中のアルキレンオキシ基の繰り返し数は１〜２０の整数であり、繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。ｌは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
【００３３】
高分子化合物に含まれるホスホリルコリン基を有するユニットの組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｌの比率）は、高分子の全ユニットに対して、５〜９８ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％である。組成比が下限値を下回ると親水性が低くなり非特異吸着が多くなる。一方、上限値を上回ると水溶性が高まり、アッセイ中に高分子化合物が溶出してしまう可能性がある。
【００３４】
本発明における高分子化合物に含まれる疎水性基を有するユニットは、特に構造を限定しないが、前記一般式［１］の構成単位の中央部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル基残基に疎水性基が結合した構造であることが好ましい。疎水基は特に限定されないが、アルキル基や芳香族類が挙げられる。より好ましくは、前記アルキル基が炭素数２〜１０のアルキル基である。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。高分子化合物に疎水性基を有するユニットが含まれていることにより、プラスチックなど、疎水性の基板に対しても濡れ性が向上し、ムラなく塗布できるようになる。また、疎水性が増すことから、アッセイ中に該高分子化合物が溶出してしまうことを防止することができる。式中、ｍは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
【００３５】
高分子化合物に含まれる疎水性基を有するユニットの組成割合は（ｌ，ｍ，ｎの和に対するｍの比率）は、高分子の全ユニットに対して、１０〜９０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは２０〜８０ｍｏｌ％である。上限値を上回ると非特異吸着が増加する恐れが出てくる。
【００３６】
本発明における高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくとも一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマー、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物から保護基を除去する工程、を含む製造方法が好ましい。あるいは、少なくとも一級アミノ基を導入しうる官能基を有するモノマー、ホスホリルコリン基を有するモノマー、及び疎水性基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物に一級アミノ基を導入する工程、を含む製造方法が好ましい。
【００３７】
一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーは、特に構造を限定しないが、下記一般式［４］（式中、Ｒ３は水素原子またはメチル基、Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサー、Ｚは酸素原子又はＮＨ、Ｗは保護基を示す。）で表されるように、（メタ）アクリル基と、オキシルアミノ基又はヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。
【００３８】
【化４】
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【００３９】
保護基Ｗとしてはアミノ基を保護基できるものであれば何ら制限を受けるものではなく、任意に用いることができる。中でもｔ―ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）やベンジロキシカルボニル基（Ｚ基、Ｃｂｚ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）等が好適に用いられる。
【００４０】
具体的なモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。
【００４１】
【化５】
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【００４２】
脱保護化は、トリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができる。
【００４３】
ホスホリルコリン基を有するモノマーとしては、特に構造を限定しないが、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン等が挙げられるが、入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００４４】
疎水性基を有するモノマーの具体的な例としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ブチル（メタ）アクリレート、ｓｅｃ−ブチル（メタ）アクリレート、ｔ−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｓｅｃ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−オクタデシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで最も好ましいのが、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレートである。
【００４５】
一方、高分子化合物を重合した後に一級アミノ基を導入する方法としては、何ら制限を受けるものではないが、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、およびアルコキシ基を有するモノマーをラジカル共重合した後に、該高分子化合物に導入されたアルコキシ基とヒドラジンを反応させて、ヒドラジド基を生成する方法が簡便で好ましい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基等が好適である。
【００４６】
具体的なアルコキシ基を有するモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。
【００４７】
【化６】
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【００４８】
本発明における高分子化合物の合成溶媒としては、それぞれのモノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノールなどアルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独又は２種以上の組み合わせで用いられる。
【００４９】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルなどの有機過酸化物などを挙げることができる。
【００５０】
本発明における高分子化合物の分子量は、該高分子化合物と未反応の単量体との分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。
【００５１】
脱保護は前述のトリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができるが、脱保護の時期に関しては、以下の通りである。
【００５２】
通常は重合が完了し、高分子化合物が作製できた段階で行うことが一般的であり、重合終了後に脱保護を行うことで該高分子化合物を得ることができる。
【００５３】
一方、本発明においては、基板表面に該高分子化合物を被覆することにより糖鎖の非特異的吸着を抑制する性質、及び糖鎖を固定化する性質を容易に付与することが可能である。
【００５４】
この場合、脱保護を行った一級アミノ基を持つ高分子化合物を被覆することも可能であるが、反応性の高い一級アミノ基を持つ高分子材料を溶液にして被覆することは、場合によっては作業中に一級アミノ基が反応して不活化することも考えられる。従って、脱保護する直前で高分子化合物を精製し、基板表面を被覆した後に、脱保護の反応を行い、基板表面上に一級アミノ基が存在する状態を形成することが望ましい。
【００５５】
基板表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜５０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基板表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。
【００５６】
有機溶剤としてはエタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノールなどアルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、シクロヘキサノン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独又は２種以上の組み合わせで用いられる。中でも、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノールシクロヘキサノール等のアルコール類がプラスチック基板を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。
【００５７】
本発明に用いる「基板」としては特に制限はないが、形状の観点から、スライド形状基板、９６穴プレート、容器、マイクロフルイディスク基板が好ましい。また、材質の観点からは、例えば、プラスチック製基板、ガラス製基板、金属蒸着膜を有する基板等が挙げられる。プラスチック製基板の具体例としては、ポリスチレン、環状ポリオレフィンポリマー、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリサルフォン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートを素材とした基板が挙げられる。
【００５８】
特に、蛍光観察に用いる基板としては、環状ポリオレフィンポリマー、シクロオレフィンポリマーが有用である。前記基板を用いる場合においては、前記高分子化合物の疎水基が、シクロヘキシル基であると、基板との相互作用が良好で、同じ組成比の高分子材料を他の基板（例えばポリスチレンやガラス基板）に塗布した場合に比べ、吸着量が高くバックグランド値が低い良好な結果となる。
【００５９】
また、環状ポリオレフィンポリマーに、前記高分子化合物を塗布する場合、アミノオキシモノマー１００ｍｏｌ％の高分子化合物に関しては、塗布することができない。一方、ポリスチレンポリマーには塗布可能であるが、夾雑物の非特異的吸着は抑制されず汎用性に乏しい。
【００６０】
糖鎖の基板への固定化方法としては、スポッターを使用して糖鎖が溶解した溶液を点着する方法、糖鎖が溶解した溶液を容器等に分注して固定化する方法等がある。
【００６１】
糖鎖を溶解する溶液としては各種緩衝液が好適に用いられる。特に限定されないが、例えば、炭酸ナトリウム緩衝液、炭酸水素ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、リン酸水素二カリウム緩衝液、トリス塩酸緩衝液、トリス酢酸緩衝液、ＰＢＳ、クエン酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎe−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝液、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝液が用いられる。また、これら緩衝液には必要に応じて、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＶＡ等の界面活性剤が添加されていてもよい。本発明における緩衝液は、スポットの形状及びアッセイ後のスポット内の蛍光強度を均一にし易いという観点から、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及びＰＶＡが添加された酢酸ナトリウム緩衝液であることが好ましい。
【００６２】
糖鎖を溶解する場合、溶液のｐＨとしては、２〜８であることが好ましい。糖鎖の溶液中の濃度としては特に限定されないが、０．０００１〜１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。糖鎖の溶液を固定化する温度としては０〜１００℃が好ましい。
【００６３】
Ｎ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドをグリッドマーカーとして基板に固定化する場合も、上記糖鎖の場合と同様にして行うことができる。該蛍光色素を溶解する場合、溶液のｐＨとしては、２〜８であることが好ましい。該蛍光色素の溶液中の濃度としては特に限定されないが、０．０５〜０．２μＭであることが好ましい。当該濃度が前記下限未満ではグリッドマーカーがマイクロアレイスキャナで検出しにくくなる傾向にあり、他方、前記上限以下では、基板上に固定化されたグリコサミノグリカン等の負電荷を有する糖鎖は、グリッドマーカーによる汚染を受けにくい。該蛍光色素の溶液を固定化する温度として０〜１００℃が好ましい。
【００６４】
本発明の製造方法における「基板」として、例えば、糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物で被覆された基板を用いる場合には、糖鎖とＮ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージドとを基板上に固定化した後に、該基板を被覆している高分子化合物における余剰官能基をキャッピングする工程を含むことができる。
【００６５】
本発明において「余剰官能基」とは、糖鎖を基板上に固定化する工程において、糖鎖が捕捉されなかった官能基を意味する。余剰官能基のキャッピングは、例えば、酸無水物との反応やオキソ酸との縮合により行うことができる。酸無水物は特に限定されないが、反応性からカルボン酸無水物が好ましい。カルボン酸無水物の例としては、無水酢酸、無水プロピオン酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、無水安息香酸などが挙げられるが、中でも無水酢酸、無水コハク酸がより好ましい。具体的には、１〜３０ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸または無水酢酸水溶液に１０分〜一晩浸漬する。また、オキソ酸も特に限定されないが、反応性からカルボン酸が好ましい。カルボン酸の例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸等が挙げられるが、中でもギ酸、酢酸が好ましい。この場合、弱酸性条件下、水溶性カルボジイミドを用いて縮合するのが簡便である。
【００６６】
本発明の製造方法においては、次いで、基板上の糖鎖を洗浄してもよい。このような洗浄としては特に制限はなく、例えば、水洗い、ドデシル硫酸ナトリウム等のアニオン性界面活性剤による洗浄、及びこれらを組み合わせた洗浄が挙げられる。また、かかる洗浄は、必要に応じて複数回（例えば、２回、３回）行ってもよい。さらに、本発明の製造方法においては、さらに、基板を乾燥させる工程を含んでもよい。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
＜実施例１＞
本発明の糖鎖アレイを以下に示す方法にて作製した。
【００６９】
（糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物による基板の被覆）
マイクロアレイの作製には住友ベークライト製、環状ポリオレフィン樹脂製のスライドガラス形状のプラスチックス基板を使用した。そして、このプラスチックス基板を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−シクロヘキシルメタクリレート−Ｎ−［２−［２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ）エトキシ］エトキシ］エチル］−メタクリルアミド共重合体の１．０重量％エタノール溶液に浸漬することにより、この糖鎖を捕捉する官能基を含む高分子化合物を該プラスチックス基板の表面上に塗布した。塗布後、２Ｍ  ＨＣｌで３７℃、１６時間処理し、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）を脱保護した。
【００７０】
（糖鎖及びグリッドマーカーの固定化）
次に、ヘパリン（Ｉｄｕｒｏｎ社製、品番：ＨＥＰ００１）及び、グリッドマーカーとして用いるＮ−エチル−Ｎ’−［５−（Ｎ”−スクシンイミジルオキシカルボニル）ペンチル］インドカルボシアニンヨージド（株式会社同仁化学研究所製、品番：Ｉ２７１、以下「ＩＣ３−ＯＳｕ」とも称する）を、各々０．５ｍｇ／ｍＬ及び０．２μＭになるよう、下記溶液にて調製した。
糖鎖及びグリッドマーカー調製用溶液：１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液
(ｐＨ５．０)に、界面活性剤（０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び０．０１％ＰＶＡ（重合度＝１５００））を添加した溶液
次いで、このようにして調製したヘパリン溶液及びＩＣ３−ＯＳｕ溶液を、基板上に隣接するようスポットした。その後８０℃で１時間反応させ、ヘパリン及びＩＣ３−ＯＳｕを基板上に固定化した。
【００７１】
（官能基のキャッピング）
次に、ヘパリン及びＩＣ３−ＯＳｕを固定化した基板を水洗した後、糖鎖を捕捉する官能基をキャッピングするため、該基板を１０ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸（和光純薬工業株式会社製、１９８−０４３５５）水溶液に浸漬し、室温にて１時間静置した。その後、水洗を２回実施して基板を乾燥させ、本発明の糖鎖アレイを作製した。
【００７２】
＜実施例２＞
ＩＣ３−ＯＳｕを０．１μＭになるよう、前記糖鎖及びグリッドマーカー調製用溶液にて調製した以外は、実施例１と同様にして本発明の糖鎖アレイを作製した。
【００７３】
＜比較例１＞
ＤＮＡアレイ等においては、これまでグリッドマーカーとしてローダミン等が好適に利用されてきた。そこで、ローダミンについても糖鎖アレイのグリッドマーカーとして好適に利用できるか否かについて評価を試みた。すなわち、ＩＣ３−ＯＳｕの代わりに、テトラメチルローダミンイソチオシアナート  アイソマー混合物（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、カタログ番号：８７９１８、以下「ローダミン」とも称する）を糖鎖アレイのグリッドマーカーとして基板に固定化すべく、この蛍光色素を、前記糖鎖及びグリッドマーカー調製用溶液にて０．２μＭになるように調製して用いた以外は、実施例１と同様にして糖鎖アレイを作製した。そして、実施例１及び２に記載の糖鎖アレイと共に以下の方法にて、ＩＣ３−ＯＳｕ及びローダミンの糖鎖アレイにおけるグリッドマーカーとしての有効性について評価した。なお、ＩＣ３−ＯＳｕ及びローダミンは共に正に帯電しているカチオン性の蛍光色素である。
【００７４】
（蛍光強度の測定）
実施例１、２及び比較例１に記載の糖鎖アレイに固定化したグリッドマーカーの蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定にはＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いた。また、測定条件は、レーザー出力：９０％、光電子倍増管（ＰＭＴ）感度：４５％とした。得られた結果を図１及び表１に示す。
【００７５】
【表１】
2014089148.tif 000008
【００７６】
図１及び表１に示した結果から明らかなように、実施例１及び２に記載の糖鎖アレイにおいては、グリッドマーカーが発する蛍光の強度は強く、感度良く検出することができた。一方、比較例１に記載の糖鎖アレイに固定化したグリッドマーカーが発する蛍光の強度は弱く、ＰＭＴ感度：４５％の測定条件下において、グリッドマーカーが発する蛍光を視認することができなかった。
【００７７】
（ヘパリンへの汚染についての評価）
実施例１、２及び比較例１に記載の糖鎖アレイに固定化したグリッドマーカーと、それらに隣接するように固定化されたヘパリンとについて、蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定にはＳｃａｎＡｒｒａｙＬｉｔｅを用いた。また、測定条件は、レーザー出力：９０％、ＰＭＴ感度：１００％とした。得られた結果を図２及び表２に示す。
【００７８】
【表２】
2014089148.tif 000009
【００７９】
図２及び表２に示した結果から明らかなように、比較例１に記載の糖鎖アレイにおいては、ＰＭＴ感度を１００％に上げることにより、グリッドマーカーが発する蛍光を視認することができた。しかしながら、ヘパリンを固定化した箇所においても視認でき得る程度の蛍光シグナルが検出され、グリッドマーカーとして用いたローダミンがヘパリンに吸着していることが確認された。
【００８０】
一方、実施例１、２及び比較例１に記載の糖鎖アレイにおいては、ヘパリンを固定化した箇所において検出された蛍光シグナルはバックグランド値と殆ど変わらず、グリッドマーカーとして用いたＩＣ３−ＯＳｕは、ローダミン同様、正電荷を有しているものの、負電荷を有するヘパリンには吸着していないことが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
以上説明したように、本発明の糖鎖アレイを用いれば、該糖鎖アレイの基板上にプローブとして固定化された各糖鎖のグリッド位置を感度高く特定することができる。また、本発明の糖鎖アレイの製造方法によれば、複数の糖鎖が固定化された糖鎖アレイを、高品質で、すなわち、グリッドマーカーとして用いられる蛍光色素等による汚染を抑制しつつ製造することが可能となる。従って、本発明の糖鎖アレイは、糖鎖の研究や糖鎖が関連する疾患の診断法や治療法の開発に大きく貢献しうるものである。
【図１】
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【図２】
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