(57)【要約】  本発明は、Ｎε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの工業的製造に適した性能を有する酵素を用いたＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの製造方法を提供する。より具体的には、本発明は、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質の存在下において、カルボン酸もしくはその塩およびＬ−リジンもしくはその塩を反応させて、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンを生成することを含む、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンの製造方法を提供する：（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；または（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質の存在下において、カルボン酸もしくはその塩およびＬ−リジンもしくはその塩を反応させて、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンを生成することを含む、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンの製造方法：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質がロドサーマス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する細菌に由来する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が精製酵素である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
反応が前記タンパク質を産生する微生物またはその処理液を用いて行われる、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
前記微生物がコリネバクテリウム属に属する細菌である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
カルボン酸が、炭素原子数５以上のカルボン酸である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
カルボン酸が、オクタン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、リノール酸、オレイン酸、安息香酸、メトキシメチル安息香酸、フェニルプロピオン酸、シンナモイル酸、またはメトキシシンナモイル酸である、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
カルボン酸がオクタン酸またはドデカン酸であり、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンがΝε−オクタノイル−Ｌ−リジンまたはΝε−ドデカノイル−Ｌ−リジンである、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
反応が水溶性溶媒中で行われることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
処理液が殺微生物処理液である、請求項４〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
反応が４０℃以上で行われる、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
反応がカルボン酸もしくはその塩の非乳化条件下で行われる、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
反応がカルボン酸もしくはその塩またはＬ−リジンもしくはその塩を５００ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で含む溶液中で行われる、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎε−アシル−Ｌ−リジンは、その構造特性および環境負荷の低さのため、両性界面活性剤原料として汎用性を有する。例えば、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンは、一般洗浄剤、殺菌消毒剤、繊維柔軟材、防錆剤、浮遊選鉱剤、接着剤、清澄剤、染料固着剤、帯電防止剤、乳化剤、化粧品用界面活性剤などに有用である。特に、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンは、水や通常の有機溶剤に極めて溶けにくく、かつ、撥水性、抗酸化性、滑沢性などとして使用できるという特徴を有することから、有機系の新しい粉黛素材として、化粧品、潤滑剤などの分野で着目されている。【０００３】
Ｎε−アシル−Ｌ−リジンの製造には、従来、酵素を使用しない化学的方法が使用されてきたが、製造工程、製造作業が煩雑であり、また、重金属である銅の使用を必要としていた。したがって、より温和な条件下での反応、例えば、酵素の使用によりＮε−アシル−Ｌ−リジンを製造することが所望されている。【０００４】
ところで、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンを特異的に加水分解することができる酵素に関する報告は少なく、アクロモバクター・ペスチフェル（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｐｅｓｔｉｆｅｒ）由来の酵素、ラット腎由来の酵素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）  ｓｐ．  ＫＴ−８３由来の酵素などが報告されているが、これらの酵素によるＮε−アシル−Ｌ−リジンの合成については報告されていない。【０００５】
特許文献１には、カプサイシン分解合成酵素がＮε−アシル−Ｌ−リジンの合成に利用できることが記載されている。カプサイシン分解合成酵素に関連して、特許文献２には、特許文献３記載のカプサイシン分解合成酵素がＮε−ドデカノイル（ラウロイル）−Ｌ−リジンを収率９５％で生成することが記載されている。しかし、特許文献２には、本酵素による反応が２日間という長期の反応時間を要すること、ならびに本酵素はε−アミノ基のみならずα−アミノ基に対しても高い反応性を示すため、最終的には、Ｎα−ドデカノイル−Ｌ−リジンとＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの混合物が生成することが記載されている。【０００６】
特許文献４および５には、ストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）がＬ−リジンのε−アミノ基をアシル化する能力を有する酵素を産生すること、およびストレプトミセス・モバラエンシスから精製された本酵素によりＬ−リジン塩酸塩とドデカン酸からＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンを特異的に合成できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−２１０１６４号公報
【特許文献２】特開２００４−８１１０７号公報
【特許文献３】特開２００３−２１０１６４号公報
【特許文献４】国際公開第２００６／０８８１９９号
【特許文献５】国際公開第２０１０／０６７８７１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来の酵素は、その性能がＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの工業的製造に十分であるとは云えなかった。例えば、従来の酵素は、必ずしもＬ−リジンのε−アミノ基を特異的にアシル化できなかったことから、上述したように、Ｎα−ドデカノイル−Ｌ−リジンとＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの混合物が生成し、これらの分離という煩雑な工程を要していたという欠点があった。また、従来の酵素には、安定性に欠け、失活し易い等の欠点があったことから、工業的製造に利用し難いという課題があった。【０００９】
本発明者らは、鋭意検討した結果、上記欠点が改善された酵素（例、Ｌ−リジンのε−アミノ基を特異的にアシル化する能力を有する安定な酵素）を見出すこと、および本酵素を用いてＮε−アシル−Ｌ−リジンを特異的に製造することに成功し、もって本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質の存在下において、カルボン酸もしくはその塩およびＬ−リジンもしくはその塩を反応させて、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンを生成することを含む、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンの製造方法：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
〔２〕前記タンパク質がロドサーマス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する細菌に由来する、〔１〕の方法。
〔３〕前記タンパク質が精製酵素である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕反応が前記タンパク質を産生する微生物またはその処理液を用いて行われる、〔１〕または〔２〕の方法。
〔５〕前記微生物がコリネバクテリウム属に属する細菌である、〔４〕の方法。
〔６〕前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムである、〔５〕の方法。
〔７〕カルボン酸が、炭素原子数５以上のカルボン酸である、〔１〕〜〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕カルボン酸が、オクタン酸、ドデカン酸、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、リノール酸、オレイン酸、安息香酸、メトキシメチル安息香酸、フェニルプロピオン酸、シンナモイル酸、またはメトキシシンナモイル酸である、〔１〕〜〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕カルボン酸がオクタン酸またはドデカン酸であり、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンがΝε−オクタノイル−Ｌ−リジンまたはΝε−ドデカノイル−Ｌ−リジンである、〔１〕〜〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕反応が水溶性溶媒中で行われることを特徴とする、〔１〕〜〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕処理液が殺微生物処理液である、〔４〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕反応が４０℃以上で行われる、〔１〕〜〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕反応がカルボン酸もしくはその塩の非乳化条件下で行われる、〔１〕〜〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕反応がカルボン酸もしくはその塩またはＬ−リジンもしくはその塩を５００ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で含む溶液中で行われる、〔１〕〜〔１３〕のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明で用いられるタンパク質は、安定性（例、溶液中での保存安定性、温度安定性、およびｐＨ安定性）に優れ得る。したがって、このようなタンパク質の存在下で行われる本発明の方法は、長期反応性に優れ、広範な温度およびｐＨにおいて行うことができるという利点を有し得る。
本発明で用いられるタンパク質はまた、熱処理に対する耐性に優れ得る。したがって、このようなタンパク質の存在下で行われる本発明の方法は、タンパク質を産生する微生物を熱処理により死滅させた後であっても微生物により産生された熱処理液中のタンパク質が失活しないことから、熱処理液を反応に良好に用いることができるという利点を有し得る。本利点は、滅菌を可能にしつつ、反応に用いられる酵素液を併せて容易に調製できるという点で、環境安全面および工程の簡便化の観点からも望ましいものである。
本発明で用いられるタンパク質はさらに、弱酸性条件下で高い活性を示すという特性を有し得る。したがって、このようなタンパク質の存在下で行われる本発明の方法は、後に詳述するように、製造されるＮε−アシル−Ｌ−リジンの結晶の性状を改善できるという利点を有し得る。
本発明で用いられるタンパク質はまた、高濃度の基質による阻害を受け難いという特性を有し得る。このようなタンパク質の存在下で行われる本発明の方法は、高濃度の基質を利用可能であるため、大量のＮε−アシル−Ｌ−リジンを製造することができるという利点を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来ＥＬＡ（本発明で用いられる酵素）とＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ由来ＥＬＡ（ＷＯ２００６／０８８１９９開示の酵素）との温度依存性の比較を示す図である。
【図２】図２は、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来ＥＬＡ（本発明で用いられる酵素）とＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ由来ＥＬＡ（ＷＯ２００６／０８８１９９開示の酵素）との温度安定性の比較を示す図である。
【図３】図３は、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来ＥＬＡ（本発明で用いられる酵素）とＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ由来ＥＬＡ（ＷＯ２００６／０８８１９９開示の酵素）とのｐＨ依存性の比較を示す図である。
【図４】図４は、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来ＥＬＡ（本発明で用いられる酵素）とＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ由来ＥＬＡ（ＷＯ２００６／０８８１９９開示の酵素）とのｐＨ安定性の比較を示す図である。
【図５】図５は、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来ＥＬＡ（ＲｍＥＬＡ）酵素液（本発明で用いられる酵素）とＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ由来ＥＬＡ（ＳｍＥＬＡ）酵素液（ＷＯ２００６／０８８１９９開示の酵素）との保存安定性の比較を示す図である。（ａ）４℃で保存、（ｂ）１５℃で保存、および（ｃ）２５℃で保存。
【図６】図６は、Ｎε−ドデカノイル（ラウロイル）−Ｌ−リジンの合成反応におけるＬ−リジン量の経時変化（ｐＨ７．０）を示す図である。
【図７】図７は、Ｎε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの合成反応におけるＬ−リジン量の経時変化（ｐＨ６．０）を示す図である。
【図８】図８は、Ｎε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの結晶（上：ｐＨ７．０、下：ｐＨ６．０）を示す図である。
【図９】図９は、Ｎε−オクタノイル（カプリロイル）−Ｌ−リジンの合成反応におけるＬ−リジン量の経時変化を示す図である。
【図１０】図１０は、Ｎε−オクタノイル−Ｌ−リジンの合成反応におけるＬ−リジン量の経時変化（ＲｍＥＬＡ）を示す図である。
【図１１】図１１は、Ｎε−オクタノイル−Ｌ−リジンの合成反応におけるＬ−リジン量の経時変化（ＳｍＥＬＡ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンの製造方法を提供する。本発明の方法は、以下（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質の存在下において、カルボン酸もしくはその塩およびＬ−リジンもしくはその塩を反応させて、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンを生成することを含む：
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１４】
タンパク質（ａ）は、以下の理化学的性質を有する。
（１）作用及び基質特異性：Ｎε−アシル−Ｌ−リジンの分解及び／または合成反応を触媒する。
（２）至適温度範囲：約７５℃。
（３）至適ｐＨの範囲：約ｐＨ５。
（４）温度安定性：８０℃、６０分処理において失活しない。
【００１５】
タンパク質（Ｂ）では、アミノ酸残基の欠失、置換、付加および挿入からなる群より選ばれる１、２、３または４種の変異により、１個または数個のアミノ酸残基が改変され得る。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１個または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１個または数個」が示す数は、例えば、１〜１００個、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個または１〜５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
【００１６】
タンパク質（Ｃ）では、配列番号１のアミノ酸配列との相同性％は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。上述したアミノ酸配列および後述する塩基配列の相同性（即ち、同一性または類似性）は、例えばＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））、ＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）、これらのプログラムをデフォルト設定で用いて、相同性を計算してもよい。また、相同性としては、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を採用している株式会社ゼネティックスのソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ７．０．９を使用し、ＯＲＦにコードされるポリペプチド部分全長を用いて、Ｕｎｉｔ  Ｓｉｚｅ  ｔｏ  Ｃｏｍｐａｒｅ＝２の設定で類似性をｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ計算させた際の数値を用いてもよい。あるいは、相同性は、ＮＥＥＤＬＥプログラム（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９７０；４８：４４３−４５３）検索において、デフォルト設定のパラメータ（Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、Ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２）を用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）であってもよい。これらの計算で導き出される相同性％の値のうち、最も低い値を採用してもよい。相同性％としては、好ましくは同一性％が利用される。
【００１７】
本発明で用いられるタンパク質は、Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有することから、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンの特異的な生成に優れ得るという特性を有する。本明細書中で用いられる場合、用語「Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性」とは、Ｌ−リジンにおけるα位のアミノ基よりもε位のアミノ基に対して、カルボン酸またはその塩におけるアシル基をより特異的に転移させる能力をいう。具体的には、本発明で用いられるタンパク質の本活性によるＮε−アシル−Ｌ−リジンの生成百分率「（Ｎε−アシル−Ｌ−リジンの生成量／Ｎα−アシル−Ｌ−リジンおよびＮε−アシル−Ｌ−リジンの合計生成量）×１００（％）」は、例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または９９．５％以上である。
【００１８】
本発明で用いられるタンパク質はまた、安定性に優れ得るという特性を有する。このような安定性としては、例えば、溶液中での保存安定性、温度安定性、およびｐＨ安定性からなる群より選ばれる１以上の安定性が挙げられる。具体的には、本発明で用いられるタンパク質は、水溶液中において４〜２５℃で長期（例、４０日間）保存後であっても、保存前の活性に比し、例えば、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％の活性を維持できる。本発明で用いられるタンパク質はまた、高温、例えば、約５０℃以上、約６０℃以上、約７０℃以上、または約８０℃（典型的には約５０℃〜８０℃）の水溶液（例、緩衝液）中において十分な時間（例、１時間）のインキュベート後であっても、インキュベート前の活性に比し、例えば、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％の活性を維持できる。本発明で用いられるタンパク質はさらに、低ｐＨ、例えば、約６．５以下、約６．０以下、約５．５以下、約５．０以下、約４．５以下、または約４．０のｐＨ（典型的には約４．０〜６．５のｐＨ）の水溶液（例、緩衝液）中において十分な時間（例、１時間）のインキュベート後であっても、インキュベート前の活性に比し、例えば、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％の活性を維持できる。したがって、本発明の方法は、長期反応性に優れ、広範な温度およびｐＨにおいて行うことができるという利点を有し得る。
【００１９】
本発明で用いられるタンパク質はさらに、熱処理に対する耐性に優れ得るという特性を有する。具体的には、本発明で用いられるタンパク質は、微生物の死滅が可能である高温条件下の熱処理、例えば、約６０℃以上、約７０℃以上、または約８０℃の水溶液（例、緩衝液）中において十分な時間（例、０．５〜１時間）のインキュベート後であっても、インキュベート前の活性に比し、例えば、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％の活性を維持できるという利点を有する。したがって、本発明は、本発明で用いられるタンパク質を産生する微生物を熱処理により死滅させた後であっても微生物により産生された熱処理液中のタンパク質が失活しないことから、熱処理液を反応に良好に用いることができるという利点を有し得る。本利点は、滅菌を可能にしつつ、反応に用いられる酵素液を併せて容易に調製できるという点で、環境安全面および工程の簡便化の観点からも望ましいものである。
【００２０】
本発明で用いられるタンパク質はまた、弱酸性条件下で高い活性を示し得るという特性を有する。弱酸性条件下では、反応液は水層（Ｌ−リジンまたはその塩）と油層（カルボン酸またはその塩）の２層に分離することから、反応液の粘性が低くなり易い。一方、中性条件下では、反応液は２層に分離せず、反応液中のカルボン酸もしくはその塩が乳化し得ることから、反応液の粘性が高くなり易い。Ｎε−アシル−Ｌ−リジンについて、良好な性状の結晶（例、短径が長い結晶）を得るためには、粘性が低い反応液を用いることが望ましい。本発明で用いられるタンパク質は弱酸性条件下で高い活性を示すことから、本発明は、粘性が低い反応液を好適に利用することができ、カルボン酸もしくはその塩が乳化し得る条件（中性条件）下で反応を行う必要がない。したがって、本発明は、製造されるＮε−アシル−Ｌ−リジンの結晶の性状を改善できるという利点を有し得る。
【００２１】
本発明で用いられるタンパク質はさらに、高濃度の基質による阻害を受け難いという特性を有し得る。具体的には、本発明で用いられるタンパク質は、例えば、約５００ｍＭ以上、約６００ｍＭ以上、約７００ｍＭ以上、約８００ｍＭ以上、約９００ｍＭ以上、約１０００ｍＭ（典型的には約５００〜１０００ｍＭ）の基質濃度でさえも、カルボン酸もしくはその塩およびＬ−リジンもしくはその塩を十分に反応させて、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンを生成することができる。したがって、本発明は、高濃度の基質を利用可能であるため、大量のＮε−アシル−Ｌ−リジンを製造することができるという利点を有し得る。
【００２２】
本発明で用いられるタンパク質は、目的特定を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に、変異が導入されていてもよい。目的特性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかである。具体的には、当業者は、１）同種の特性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、本発明で用いられるタンパク質のアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００２３】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００２４】
本発明で用いられるタンパク質はまた、異種部分とペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であってもよい。このような異種部分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等の目的タンパク質の精製に利用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能を有するペプチド成分（例、全長タンパク質またはその一部）、ならびにリンカーが挙げられる。
【００２５】
上述したような本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、ロドサーマス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する細菌、より具体的にはロドサーマス・マリナス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ）に由来するタンパク質、天然に生じるそのホモログ、または人為的に作出された変異タンパク質が挙げられる。変異タンパク質は、例えば、目的タンパク質をコードするＤＮＡに変異を導入し、得られた変異ＤＮＡを用いて変異タンパク質を産生させることにより、得ることができる。変異導入法としては、例えば、部位特異的変異導入、ならびに無作為変異導入処理（例、変異剤による処理、および紫外線照射）が挙げられる。
【００２６】
一実施形態では、本発明の方法は、本発明で用いられるタンパク質自体を用いて行うことができる。本発明で用いられるタンパク質として、天然タンパク質または組換えタンパク質を利用することができる。組換えタンパク質は、例えば、無細胞系ベクターを用いて、または本発明で用いられるタンパク質を産生する微生物から得ることができる。本発明で用いられるタンパク質は、未精製、粗精製または精製タンパク質として利用することができる。これらのタンパク質としては、反応において、固相に固定された固相化タンパク質として利用されてもよい。
【００２７】
本発明で用いられるタンパク質を公知の方法で単離し、場合によっては更に精製することにより、目的とするタンパク質が得られる。タンパク質を産生する微生物としては、形質転換体が好ましい。形質転換体を用いた場合には、不活性な目的タンパク質会合体、すなわちタンパク質封入体として目的タンパク質を得た後、これを適当な方法で活性化することも可能である。活性化後、活性型タンパク質を公知の方法で分離精製することにより目的タンパク質を得てもよい。
【００２８】
微生物を培養するための培地は公知であり、例えば、ＬＢ培地などの栄養培地や、Ｍ９培地などの最小培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添加して用いることができる。形質転換体は宿主に応じて、通常、１６〜４２℃、好ましくは２５〜３７℃で５〜１６８時間、好ましくは８〜７２時間培養される。宿主に依存して、振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌を行ってもよく、通気を行ってもよい。放線菌を発現宿主として選択する場合は、目的タンパク質を生産させるために使用し得る条件を適宜用いることが出来る。また、目的タンパク質の発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。
【００２９】
産生された目的タンパク質は、形質転換体の抽出物から公知の塩析、等電点沈殿法もしくは溶媒沈殿法等の沈殿法、透析、限外濾過もしくはゲル濾過等の分子量差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の疎水度の差を利用する方法やその他アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、等電点電気泳動法等、またはこれらの組み合わせにより、精製および単離することが可能である。目的タンパク質を分泌発現させた場合には、形質転換体を培養して得られた培養液から、菌体を遠心分離等で除くことで目的タンパク質を含む培養上清が得られる。この培養上清からも目的タンパク質を精製および単離することが可能である。
【００３０】
例えば、形質転換体の培養終了後、遠心により集菌した菌体を菌体破砕用バッファー（２０〜１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕を約１０分間行うことにより菌体を破砕することができる。菌体破砕は、トルエン等の溶媒を培養液に加え行うこともできる。この破砕処理液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を上述した精製操作をすることができる。また、前記遠心後の沈殿について必要に応じて塩酸グアニジウムまたは尿素などで可溶化したのち更に精製することもできる。目的タンパク質を分泌発現させた場合には、形質転換体の培養終了後、培養液を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を上述した精製操作をすることができる。
【００３１】
具体的には、目的タンパク質の精製は、例えば以下のように行うことができる。宿主の培養終了後、培養上清または細胞抽出物に硫酸アンモニウム（２．８Ｍ）を加えて沈殿分画後、更に、ＣＭ  セファデックス  Ｃ−５０、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０イオン交換カラムクロマトグラフィー、オクチルセファロースＣＬ−４ＢおよびフェニルセファロースＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィー等の操作を行うことによって、ポリアクリルアミドゲル電気泳動した場合にゲル上で単一バンドを呈する程度にまで精製することができる。
【００３２】
得られた目的タンパク質の活性は、Ｎε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性またはＮε−アセチル−Ｌ−リジン加水分解活性を測定することにより評価することができる。例えば、本発明の酵素１Ｕ（ユニット）は、Ｎε−アセチル−Ｌ−リジン溶液を基質として３７℃にてインキュベート（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）し、遊離したＬ−リジンを定量した場合、１時間あたり１マイクロモルのＮε−アセチル−Ｌ−リジンを加水分解するのに必要な酵素量と定義することができる。
【００３３】
別の実施形態では、本発明の方法は、本発明で用いられるタンパク質を産生する微生物またはその処理液を用いて行うことができる。本発明で用いられるタンパク質を産生する微生物としては、例えば、本発明で用いられるタンパク質を天然に産生する微生物（例、ロドサーマス属に属する細菌）、および形質転換体が挙げられる。好ましくは、形質転換体またはその処理液が用いられる。
【００３４】
本発明で用いられるタンパク質を産生する微生物の処理液としては、任意の方法により処理された、目的タンパク質を含有する処理液を使用することができる。このような処理としては、例えば、上述した単離および精製で言及した方法、ならびに微生物の死滅を可能にする殺微生物処理方法が挙げられる。殺微生物処理方法としては、微生物の死滅を可能にする任意の方法を用いることができるが、例えば、熱処理、酸性処理、アルカリ性処理、界面活性剤処理、および有機溶媒処理が挙げられる。本発明で用いられるタンパク質は熱処理、ならびに低ＰＨおよび高ｐＨ条件下での処理に対する耐性に優れることから、処理液として熱処理液や酸性処理液およびアルカリ性処理液を用いることが好ましい。本発明で用いられるタンパク質は熱処理に対する耐性に特に優れることから、処理液として熱処理液を用いることが特に好ましい。このような熱処理としては、例えば、微生物の死滅が可能である高温条件下の熱処理条件が挙げられる。具体的には、熱処理条件としては、例えば、約６０℃以上、約７０℃以上、または約８０℃の水溶液（例、緩衝液）中における十分な時間（例、０．５〜１時間）のインキュベートが挙げられる。
【００３５】
好ましい実施形態では、本発明で用いられる形質転換体は、上記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む宿主細胞である。
【００３６】
より好ましい実施形態では、本発明で用いられる形質転換体は、以下（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む宿主細胞である：
（ａ）配列番号２もしくは３の塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２もしくは３の塩基配列と７０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、かつＮε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２もしくは３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつＮε−アシル−Ｌ−リジン特異的アミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
【００３７】
上記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。配列番号２および３の塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする。
【００３８】
上記ポリヌクレオチド（ｂ）では、配列番号２もしくは３の塩基配列に対する塩基配列の相同性％は、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。
【００３９】
上記ポリヌクレオチド（ｃ）において、用語「ストリンジェント条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、ストリンジェント条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００４０】
上記ポリヌクレオチド（ｄ）において、用語「縮重変異体」とは、変異前のポリヌクレオチド中の所定のアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンが、同一アミノ酸残基をコードする別のコドンに変更されたポリヌクレオチド変異体をいう。このような縮重変異体はサイレント変異に基づく変異体であることから、縮重変異体によりコードされるタンパク質は、変異前のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質と同一である。
【００４１】
好ましくは、縮重変異体は、それが導入されるべき宿主細胞のコドン使用頻度に適合するようにコドンが変更されたポリヌクレオチド変異体である。ある遺伝子を異種宿主細胞（例、微生物）で発現させる場合、コドン使用頻度の相違により、対応するｔＲＮＡ分子種が十分に供給されず、翻訳効率の低下および／または不正確な翻訳（例、翻訳の停止）が生じることがある。例えば、エシェリヒア・コリでは、表１に示される低頻度コドンが知られている。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
したがって、本発明では、後述するような宿主細胞（例、微生物）のコドン使用頻度に適合する縮重変異体を利用することができる。例えば、本発明の縮重変異体は、アルギニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、およびプロリン残基からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸残基をコードするコドンが変更されたものであってもよい。より具体的には、本発明の縮重変異体は、低頻度コドン（例、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＧＧＡ、ＡＵＡ、ＣＵＡ、およびＣＣＣ）からなる群より選ばれる１種以上のコドンが変更されたものであってもよい。好ましくは、縮重変異体は、以下からなる群より選ばれる１種以上（例、１種、２種、３種、４種、または５種）のコドンの変更を含んでいてもよい：
ｉ）Ａｒｇをコードする４種のコドン（ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、およびＣＧＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のコドンの、Ａｒｇをコードする別のコドン（ＣＧＵ、またはＣＧＣ）への変更；
ｉｉ）Ｇｌｙをコードする１種のコドン（ＧＧＡ）の、別のコドン（ＧＧＧ、ＧＧＵ、またはＧＧＣ）への変更；
ｉｉｉ）Ｉｌｅをコードする１種のコドン（ＡＵＡ）の、別のコドン（ＡＵＵ、またはＡＵＣ）への変更；
ｉｖ）Ｌｅｕをコードする１種のコドン（ＣＵＡ）の、別のコドン（ＵＵＧ、ＵＵＡ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、またはＣＵＣ）への変更；ならびに
ｖ）Ｐｒｏをコードする１種のコドン（ＣＣＣ）の、別のコドン（ＣＣＧ、ＣＣＡ、またはＣＣＵ）への変更。
本発明の縮重変異体がＲＮＡの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、本発明の縮重変異体がＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、１〜５００個、１〜４００個、１〜３００個、１〜２００個、または１〜１００個である。
【００４４】
低頻度コドンの同定は、当該分野で既知の技術を利用することにより、任意の宿主細胞の種類およびゲノム配列情報に基づいて容易に行うことができる。したがって、縮重変異体は、低頻度コドンの非低頻度コドン（例、高頻度コドン）への変更を含むものであってもよい。また、低頻度コドンのみならず、生産菌株のゲノムＧＣ含量への適合性などの要素を考慮して変異体を設計する方法が知られているので（Ａｌａｎ  Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２００６  Ｊｕｎ  ６；７：２８５．）、このような方法を利用してもよい。このように、上述の変異体は、それが導入され得る任意の宿主細胞（例、後述するような微生物）の種類に応じて適宜作製できる。
【００４５】
用語「発現単位」とは、タンパク質として発現されるべき所定のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生を可能にする最小単位をいう。発現単位は、ターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。発現単位は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。発現単位は、宿主細胞に対して同種であっても異種であってもよいが、異種発現単位が好ましい。
【００４６】
発現単位は、宿主細胞に対して同種であっても異種であってもよいが、好ましくは異種発現単位である。用語「異種発現単位」とは、発現単位が宿主細胞に対して異種であることを意味する。したがって、本発明では、発現単位を構成する少なくとも１つのエレメントが宿主細胞に対して異種である。宿主細胞に対して異種である、発現単位を構成するエレメントとしては、例えば、上述したエレメントが挙げられる。好ましくは、異種発現単位を構成する、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはプロモーターの一方、または双方が、宿主細胞に対して異種である。したがって、本発明では、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはプロモーターの一方、または双方が、宿主細胞以外の生物（例、原核生物および真核生物、または微生物、昆虫、植物、および哺乳動物等の動物）もしくはウイルスに由来するか、または人工的に合成されたものである。あるいは、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞に対して異種であってもよい。好ましくは、目的タンパク質が、宿主細胞に対して異種である。
【００４７】
異種発現単位を構成するプロモーターは、その下流に連結されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を宿主細胞で発現させることができるものであれば特に限定されない。例えば、プロモーターは、宿主細胞に対して同種であっても異種であってもよい。例えば、組換えタンパク質の産生に汎用される構成または誘導プロモーターを用いることができる。このようなプロモーターとしては、例えば、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターが挙げられる。好ましくは、宿主細胞で強力な転写活性を有するプロモーターを用いることができる。宿主細胞で強力な転写活性を有するプロモーターとしては、例えば、宿主細胞で高発現している遺伝子のプロモーター、およびウイルス由来のプロモーターが挙げられる。また、宿主細胞としてコリネ型細菌を選択する場合、ｃｓｐＢプロモーターなどを好適に利用することができる。
【００４８】
宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、放線菌およびコリネ型細菌を含む種々の微生物が挙げられる。本発明において宿主細胞として用いられる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）には一般にクローニングや異種タンパク質の発現によく利用される菌株、例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＪＭ１０９、ＣＪ２３６、ＭＶ１１８４が含まれる。本発明において宿主細胞として用いられる放線菌には一般に異種タンパク質の発現によく利用される菌株、例えば、Ｓ．リビダンス  ＴＫ２４やＳ．セリカラーＡ３（２）が含まれる。本発明において宿主細胞として用いられるコリネ型細菌とは好気性のグラム陽性桿菌であり、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４１，２５５（１９８１））、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。コリネ型細菌を使用することの利点には、これまでにタンパク質の分泌に好適とされてきたカビ、酵母やＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌と比べて本来的に菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、目的タンパク質を分泌生産した場合にその精製過程が簡略化、省略化できること、分泌生産した酵素を用いて酵素反応を行う場合には、培養上清を酵素源として用いることができるため、菌体成分、夾雑酵素等による不純物、副反応を低減させることができること、糖、アンモニアや無機塩等を含む単純な培地で容易に生育するため、培地代や培養方法、培養生産性の点で優れていることが含まれる。また、Ｔａｔ系分泌経路を利用することにより、これまでに知られていたＳｅｃ系分泌経路では分泌生産が困難なタンパク質であったイソマルトデキストラナーゼやプロテイングルタミナーゼ等産業上有用なタンパク質も効率良く分泌させることが可能である（ＷＯ２００５／１０３２７８）。本発明において用いられる目的タンパク質もＴａｔ系分泌経路等の適切な分泌経路を利用することにより菌体外に分泌させることができる。「Ｔａｔ系」とは、「ツイン・アルギニン移行経路」（Ｔｗｉｎ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ−ｐａｔｈｗａｙ）とも呼ばれる経路であり、シグナルペプチド中に保存されたアルギニン−アルギニンの保存領域を認識して、ＴａｔＡ、Ｂ、Ｃ、Ｅを含む膜タンパク質によりタンパク質を分泌する機構あるいは経路を意味する。Ｔａｔ系シグナルペプチドとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来トリメチルアミンＮ−オキシドレダクターゼ（ＴｏｒＡ）のシグナルペプチド等が挙げられる。コリネ型細菌の例としては以下のものが挙げられる。
【００４９】
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、
コリネバクテリウム・アルカノリティカム、
コリネバクテリウム・カルナエ、
コリネバクテリウム・グルタミカム、
コリネバクテリウム・リリウム、
コリネバクテリウム・メラセコーラ、
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス、
コリネバクテリウム・ハーキュリス、
ブレビバクテリウム・ディバリカタム、
ブレビバクテリウム・フラバム、
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、
ブレビバクテリウム・ロゼウム、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム、
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、
ブレビバクテリウム・アルバム、
ブレビバクテリウム・セリヌム、
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム。
【００５０】
具体的には、下記のような菌株を例示することができる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム  ＡＴＣＣ１３８７０、
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム  ＡＴＣＣ１５８０６、
コリネバクテリウム・アルカノリティカム  ＡＴＣＣ２１５１１、
コリネバクテリウム・カルナエ  ＡＴＣＣ１５９９１、
コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０３２，ＡＴＣＣ１３０６０，ＡＴＣＣ１３８６９，ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３４、
コリネバクテリウム・リリウム  ＡＴＣＣ１５９９０、
コリネバクテリウム・メラセコーラ  ＡＴＣＣ１７９６５、
コリネバクテリウム・エッフィシエンス  ＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９）、
コリネバクテリウム・ハーキュリス  ＡＴＣＣ１３８６８、
ブレビバクテリウム・ディバリカタム  ＡＴＣＣ１４０２０、
ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＴＣＣ１３８２６，ＡＴＣＣ１４０６７，ＡＪ１２４１８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２２０５）、
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム  ＡＴＣＣ１４０６８、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム  ＡＴＣＣ１３８６９、
ブレビバクテリウム・ロゼウム  ＡＴＣＣ１３８２５、
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム  ＡＴＣＣ１４０６６、
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス  ＡＴＣＣ１９２４０、
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ６８７１、ＡＴＣＣ６８７２、
ブレビバクテリウム・アルバム  ＡＴＣＣ１５１１１、
ブレビバクテリウム・セリヌム  ＡＴＣＣ１５１１２、
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラス  ＡＴＣＣ１５３５４。
【００５１】
とりわけ、野生株コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃ．グルタミカム）ＡＴＣＣ１３８６９よりストレプトマイシン（Ｓｍ）耐性変異株として分離したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１２０３６（ＷＯ０２／０８１６９４参照）はその親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能遺伝子に変異が存在することが予測され、タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２〜３倍と極めて高いため、宿主菌として好適である。
さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中に分泌された目的タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。細胞表層タンパク質を生産しないように改変されたコリネ型細菌としては、ＡＪ１２０３６の細胞表層タンパク質（ＰＳ２）破壊株であるＣ．グルタミカムＹＤＫ０１０株が挙げられる（ＷＯ０１／２３４９１参照）。
【００５２】
本発明で用いられる形質転換体は、当該分野において公知の任意の方法により作製することができる。例えば、このような発現単位は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた形態、または宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれていない形態（例、発現ベクターの状態）において、宿主細胞に含まれる。発現単位を含む宿主細胞は、当該分野において公知の任意の方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法）により、発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれず、宿主細胞内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。あるいは、ゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ））により発現単位を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことが可能である。
【００５３】
本発明で用いられる発現ベクターは、発現単位として上述した最小単位に加えて、宿主細胞で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【００５４】
発現ベクターはまた、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの相同組換えのために、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする領域をさらに含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは、それに含まれる発現単位が一対の相同領域（例、宿主細胞のゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位が導入されるべき宿主細胞のゲノム領域（相同領域の標的）としては、特に限定されないが、宿主細胞において発現量が多い遺伝子のローカスであってもよい。
【００５５】
発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、または人工染色体であってもよい。発現ベクターはまた、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクター（例、レトロウイルス）であってもよい。発現ベクターはまた、汎用される発現ベクターを用いてもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体が挙げられる。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのようなコリネ型細菌を宿主細胞として選択する場合、高コピーベクターであるｐＰＫ４などを好適に利用することができる。
【００５６】
本発明の方法は、上述したように、上記タンパク質自体、および／または上記タンパク質を産生する微生物もしくはその処理液の存在下で、カルボン酸もしくはその塩およびＬ−リジンもしくはその塩を含む反応系において行うことができる。
【００５７】
カルボン酸としては、Ｌ−リジンのε位のアミノ基との反応のためにアシル基を供給できる任意のカルボン酸を使用することができる。このようなカルボン酸としては、例えば、直鎖または分枝した飽和または不飽和の脂肪酸、および飽和または不飽和の側鎖を有する芳香族カルボン酸が挙げられる。このようなカルボン酸は、好ましくは炭素数が５以上、より好ましくは炭素数が８以上のカルボン酸である。カルボン酸の炭素数はまた、例えば、３０以下、２５以下または２０以下であってもよい。より具体的には、本発明の方法において用いられるカルボン酸としては、例えば、オクタン酸（カプリル酸）、ノナン酸（ペラルゴン酸）、デカン酸（カプリン酸）、ドデカン酸（ラウリン酸）、テトラデカン酸（ミスチリン酸）、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、オクタデカン酸（ステアリン酸）、リノール酸、オレイン酸、安息香酸、メトキシメチル安息香酸、フェニルプロピオン酸、シンナモイル酸、メトキシシンナモイル酸、リノレン酸、ケイ皮酸が挙げられる。オクタン酸、ドデカン酸が特に好ましい。
【００５８】
カルボン酸またはＬ−リジンの塩としては、任意の塩を用いることができる。このような塩としては、例えば、無機酸塩（例、塩酸塩）、無機塩基塩（例、アンモニウム塩）、有機酸塩（例、酢酸塩）、および有機塩基塩（例、トリエチルアミン塩）等の非金属塩、ならびにアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩）、およびアルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩、マグネシウム塩）等の金属塩が挙げられる。
【００５９】
反応系における基質（例、カルボン酸もしくはその塩、および／またはＬ−リジンもしくはその塩）濃度は、上記タンパク質によるＮε−アシル−Ｌ−リジンの生成が可能である限り特に限定されず、例えば、１ｍＭ、１０ｍＭまたは１００ｍＭ以上の濃度であってもよい。本発明で用いられるタンパク質は高濃度の基質による阻害を受け難いという特性を有するので、例えば、約５００ｍＭ以上、約６００ｍＭ以上、約７００ｍＭ以上、約８００ｍＭ以上、約９００ｍＭ以上、約１０００ｍＭ（典型的には約５００〜１０００ｍＭ）の基質濃度でさえも、カルボン酸もしくはその塩およびＬ−リジンもしくはその塩を十分に反応させて、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンを生成することができる。したがって、本発明の方法は、高濃度の基質を利用可能であるため、大量のＮε−アシル−Ｌ−リジンを製造することができるという利点を有する。基質であるL-リジンもしくはその塩、およびカルボン酸もしくはその塩の一方が反応系に過剰量存在していてもよく、必要に応じて不足している基質を反応中に追加してもよい。
【００６０】
本発明の方法における反応温度は、上記タンパク質によるＮε−アシル−Ｌ−リジンの生成が可能である限り特に限定されず、例えば、約４℃〜８０℃の温度条件下で反応を行うことができる。本発明で用いられるタンパク質は高温で安定であることから、例えば、約５０℃以上、約６０℃以上、約７０℃以上、または約８０℃（典型的には約５０℃〜８０℃）の温度条件下で反応を行うことができる。
【００６１】
本発明の方法におけるｐＨは、上記タンパク質によるＮε−アシル−Ｌ−リジンの生成が可能である限り特に限定されず、例えば、約４．０〜１１．０のｐＨ条件下で反応を行うことができる。本発明で用いられるタンパク質は特に低ｐＨで安定であることから、例えば、約６．５以下、約６．０以下、約５．５以下、約５．０以下、約４．５以下、または約４．０のｐＨ（典型的には約４．０〜６．５のｐＨ）条件下で反応が行われてもよい。
【００６２】
好ましくは、本発明の方法では、カルボン酸もしくはその塩の非乳化条件下の反応液中で反応が行われてもよい。一般に、より低いｐＨ条件下では、反応液は水層（Ｌ−リジンまたはその塩）と油層（カルボン酸またはその塩）の２層に分離し、より高いｐＨ条件では、油層が水層に溶解して透明な反応液が得られる。しかし、それらの中間のｐＨ条件では、反応液中の油層が乳化し得ることから、反応液の粘性が高くなり易い。Ｎε−アシル−Ｌ−リジンについて、良好な性状の結晶（例、短径が長い結晶）を得るためには、粘性が低い非乳化条件下の反応液を用いることが望ましい。カルボン酸もしくはその塩の非乳化条件は、用いられるカルボン酸もしくはその塩の種類に応じて異なる。例えば、オクタン酸をカルボン酸として用いる場合、非乳化条件はｐＨ５．５以下（２層分離の反応液）またはｐＨ６．８以上（透明な反応液）であり、乳化条件はｐＨ５．５よりも大きく、かつｐＨ６．８未満の条件である。また、ドデカン酸をカルボン酸として用いる場合、非乳化条件はｐＨ６．２以下（２層分離の反応液）またはｐＨ７．５以上（透明な反応液）であり、乳化条件はｐＨ６．２よりも大きく、かつｐＨ７．５未満の条件である。当業者は、用いるカルボン酸もしくはその塩の種類に応じて反応系のｐＨを適宜調整することにより、このような非乳化条件を達成することができる。反応は、このような非乳化条件下で適宜行うことができるが、オクタン酸をカルボン酸として用いる場合であればｐＨ６．８以上の非乳化条件下、ドデカン酸をカルボン酸として用いる場合であればｐＨ６．２以下の非乳化条件下で反応を行ってもよい。カルボン酸もしくはその塩の非乳化条件下で反応を行うことにより、製造されるＮε−アシル−Ｌ−リジンの結晶の性状（例、短径の長さ）を改善することができる。
【００６３】
反応時間は、適宜設定することができる。本発明で用いられるタンパク質は、長期（例、４０日間）保存後であっても高度に活性を維持できることから、長期の反応、ひいてはＮε−アシル−Ｌ−リジンの大量製造に利用することができる。
【００６４】
反応系としては、例えば、上記タンパク質自体または上記処理液を用いるのであれば、緩衝液等の水溶液を用いることができる。また、上記タンパク質を産生する微生物を用いるのであれば、液体培地等の任意の培地で培養することにより行うことができる。この場合、培養温度は、例えば、１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃である。宿主細胞の培養は、例えば、ｐＨ５．５〜８．５、好ましくはｐＨ６〜８で行うことができる。このような条件であれば、宿主細胞が十分に増殖するため、上記タンパク質を大量に得ることができる。培養は、例えば、バッチ培養法、流加培養法、および連続培養法等の公知の発酵方法により行われてもよい。液体培地は、宿主細胞の培養に用いられる任意の液体培地を利用することができる。例えば、液体培地としては、炭素源としてグルコース、フルクトース、グリセロール、スターチなどの炭水化物を含有するものが挙げられる。液体培地はまた、無機もしくは有機窒素源（例、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン等）を含んでいてもよい。液体培地はさらに、他の栄養源、例えば、無機塩（例、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（例、ビタミンＢ１）、抗生物質を含んでいてもよい。
【００６５】
また、上記反応系としては、水溶性溶媒を好適に用いることができる。特に、前記カルボン酸が比較的長鎖であって、前記反応が水溶性溶媒中で行われる場合、生成するNε-アシル-L-リジンは水に不溶性または難溶性であるため析出して反応系から容易に除去され、従って、ε-アシル-L-リジンの合成反応がその逆反応であるNε-アシル-L-リジンの分解反応よりも顕著に優先的かつ効率よく進む。また、このような場合、合成反応生成物であるNε-アシル-L-リジンは速やかに水相から分離してくるので非常に容易に回収することができる。例えば、分離したNε-アシル-L-リジンを直接回収する、または、有機溶媒によって容易にNε-アシル-L-リジンを水性反応系から抽出して回収することができる。本発明によってNε-アシル-L-リジンを製造する場合、前記比較的長鎖のカルボン酸は、例えば使用する水溶性溶媒に対する溶解性を基準として選択することができる。なお、本明細書において“水溶性溶媒”には勿論水自身も含まれる。また、反応を水溶性溶媒中で行う場合であっても、別途油層（有機溶媒層）を重層し、水溶性溶媒／有機溶媒の２相反応とすることもできる。
【実施例】
【００６６】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６７】
実施例１：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来アミノアシラーゼ（ＲｍＥＬＡ）のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍによる生産
１−１）ｐＰＫ４ベクター中のＮａｅＩ認識サイトを改変したベクター（ｐＰＫ５）の構築
特開平９−３２２７７４号公報に記載のｐＰＫ４の中には、制限酵素Ｎａｅ  Ｉの認識配列が一ヵ所存在する。この配列を改変するため、ＮａｅＩ認識配列ｇｃｃｇｇｃをｇｃａｇｇｃに改変した配列とｐＰＫ４におけるその周辺配列を含む配列番号４及び配列番号５に記載のプライマーを合成した。次に、ｐＰＫ４を鋳型として、配列番号４及び配列番号５のプライマーを用いて、約５．６ｋｂｐのプラスミド全長をＰＣＲ法によって増幅した。ＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標）  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。【００６８】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理し、メチル化されている鋳型ＤＮＡを消化した。ＤｐｎＩ消化後に得られた非メチル化プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）のコンピテントセルに導入し、プラスミドを取得した。塩基配列決定の結果、予想通りＮａｅＩ認識サイトが改変されたプラスミドが構築されていることを確認した。塩基配列の決定はＢｉｇＤｙｅ（登録商標）  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。こうして得られた、ｐＰＫ４ベクター中のＮａｅＩ認識サイトを改変したベクターをｐＰＫ５と命名した。【００６９】
５’−ｃｇａｇｃｃａｃｃａｇｇｃａｇｇｃｇｇｇａａａａｔｃｇ−３’（配列番号４）
５’−ｃｇａｔｔｔｔｃｃｃｇｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｇｇｃｔｃｇ−３’（配列番号５）【００７０】
１−２）ｐＰＫ５ベクターにｔａｔＡＢＣ遺伝子を搭載したベクター（ｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣ）の構築
次に、ＷＯ２００５／１０３２７８に記載のＴａｔ系分泌装置の増幅プラスミドであるｐＶｔａｔＡＢＣを鋳型にして、配列番号６と配列番号７のプライマーを用いて、ｔａｔＡＢＣ遺伝子をコードする配列を含む約３．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅した。配列番号７のプライマーはｐＶｔａｔＡＢＣと相補的な塩基配列の５’末端側に制限酵素ＫｐｎＩとＡｐａＩの認識配列を付加したデザインにしてある。【００７１】
得られたＰＣＲ産物の末端をＢＫＬ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用いてリン酸化し、別途ＫｐｎＩ処理し、さらにＢＫＬ  Ｋｉｔ（ＴａｋａｒａＢｉｏ）を用いて平滑末端化し、さらにＣＩＡＰ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用いて末端を脱リン酸化処理したｐＰＫ５ベクターとライゲーションした。ライゲーション反応にはＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２．１（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。得られたライゲーション産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）のコンピテントセルに導入し、プラスミドを取得した。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が挿入されていることを確認した。こうして得られた、ｐＰＫ５ベクターにｔａｔＡＢＣ遺伝子を搭載したベクターをｐｐＫ５−ｔａｔＡＢＣと命名した。【００７２】
５’−ｃｃｃｇｃｔｔｇａｔｃａｔｔｃｃｔｔｔａａｇｇ−３’（配列番号６）
５’−ａａｔｇｇｇｃｃｃｔｔｔｇｇｔａｃｃｃｃｔａａａｔａａｔａｔｃｇｇｔｃｃ−３’（配列番号７）【００７３】
１−３）ｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣベクター中のｔａｔＡＢＣ遺伝子内ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ認識サイトを改変したベクター（ｐＰＫ６）の構築
１−２）で構築したｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣベクター中のｔａｔＡＢＣ遺伝子領域の中には、制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｂａＩの認識配列が１ヵ所ずつ存在する。これらの配列を改変するため、ＫｐｎＩ認識配列ｇｇｔａｃｃをｇｇａａｃｃに改変した配列とｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣにおけるその周辺配列を含む配列番号８および配列番号９に記載のプライマーと、ＸｂａＩ認識配列ｔｃｔａｇａをｔｇｔａｇａに改変した配列とｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣにおけるその周辺配列を含む配列番号１０および配列番号１１に記載のプライマーを合成した。【００７４】
まず、ｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣを鋳型として配列番号８と配列番号９のプライマーを用いて、ｔａｔＡＢＣ遺伝子領域内のＫｐｎＩ認識サイトを改変するよう約９．４ｋｂｐのプラスミド全長をＰＣＲ法によって増幅した。【００７５】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理し、メチル化されている鋳型ＤＮＡを消化した。ＤｐｎＩ消化後に得られた非メチル化プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）のコンピテントセルに導入し、プラスミドを取得した。塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子に改変されていることを確認した。こうして得られたｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣベクター中のｔａｔＡＢＣ遺伝子領域内ＫｐｎＩ認識サイトを改変したベクターをｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣΔＫｐｎＩと命名した。【００７６】
次に、ｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣΔＫｐｎＩを鋳型として、配列番号１０と配列番号１１のプライマーを用いて、ｔａｔＡＢＣ遺伝子領域内のＸｂａＩ認識サイトを改変するよう約９．４ｋｂｐのプラスミド全長をＰＣＲ法によって増幅した。【００７７】
得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理し、メチル化されている鋳型ＤＮＡを消化した。ＤｐｎＩ消化後に得られた非メチル化プラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）のコンピテントセルに導入し、プラスミドを取得した。塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子に改変されていることを確認した。こうして得られた、ｐＰＫ５−ｔａｔＡＢＣベクター中のｔａｔＡＢＣ遺伝子領域内ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ認識サイトを改変したベクターをｐＰＫ６と命名した。【００７８】
５’−ｃｇｔｇｃｔｃｔａｇｇｇｇａａｃｃｇｔｇｃｇｔｔｃｃｃ−３’（配列番号８）
５’−ｇｇｇａａｃｇｃａｃｇｇｔｔｃｃｃｃｔａｇａｇｃａｃｇ−３’（配列番号９）
５’−ｃｇａｃｇｃｔｇａａｇｔｔｇｔａｇａｇａｔｃａｔｃｃｇ−３’（配列番号１０）
５’−ｃｇｇａｔｇａｔｃｔｃｔａｃａａｃｔｔｃａｇｃｇｔｃｇ−３’（配列番号１１）【００７９】
１−４）ｔａｔＡＢＣ遺伝子とＴｏｒＡシグナル配列が付加されたＲｍＥＬＡをコードする遺伝子を共発現するプラスミドの構築（ｐＰＫ６−ＲｍＥＬＡ）
ＫｐｎＩ認識配列（ｇｇｔａｃｃ）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９由来ｃｓｐＢ遺伝子のプロモーター領域、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０由来ＴｏｒＡシグナル配列、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来ａｍｉｄｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＮＣＢＩ；ＷＰ＿０１２８４４８５４．１、配列番号１）をコードする遺伝子（配列番号２）、及びＡｐａＩ認識部位（ｇｇｇｃｃｃ）を、記載順に連結したＤＮＡを化学合成によって取得した（配列番号３）。ＲｍＥＬＡをコードする遺伝子は、「コドン使用データベース」に開示されている情報を基に、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように設計した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ；  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８，２９２（２０００））。【００８０】
次に、得られた合成ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩとＡｐａＩで処理し、別途ＫｐｎＩとＡｐａＩで処理したｐＰＫ６ベクターとライゲーションした。得られたライゲーション産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）のコンピテントセルに導入し、プラスミドを取得した。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が挿入されていることを確認した。こうして得られた、Ｔａｔ系分泌装置をコードするｔａｔＡＢＣ遺伝子とＴｏｒＡシグナル配列が付加されたＲｍＥＬＡをコードする遺伝子の共発現プラスミドをｐＰＫ６−ＲｍＥＬＡと命名した。【００８１】
１−５）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＷＤＫ０１０株へのプラスミド導入
１−４）で構築したｐＰＫ６−ＲｍＥＬＡを用いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９由来の変異株より取得したＷＤＫ０１０株（ＷＯ２０１０／０６７８７１）を形質転換して、カナマイシンを２５ｍｇ／ｌ含むＣＭ２Ｇ寒天培地（酵母エキストラクト  １０ｇ、ポリペプトン  １０ｇ、グルコース  ５ｇ、塩化ナトリウム  ５ｇ、ＤＬ−メチオニン  ０．２ｇ、寒天  １５ｇ、ｐＨ７．２、水で１Ｌにする）で形質転換体を選択した。得られた形質転換体を、ＷＤＫ０１０／ｐＰＫ６−ＲｍＥＬＡ株と命名した。【００８２】
１−６）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＷＤＫ０１０株におけるＲｍＥＬＡの発現
カナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むシード液体培地（酵母エキストラクト  １０ｇ、ポリペプトン  １０ｇ、グルコース  ５ｇ、大豆加水分解物  窒素量として０．１ｇ、ＤＬ−メチオニン  ０．０２ｇ、ｐＨ７．２、水で１Ｌにする）５０ｍｌを入れた全容５００ｍｌ坂口フラスコ試験管にＷＤＫ０１０／ｐＰＫ６−ＲｍＥＬＡ株を１白金耳分接種し、３０℃で８時間振とう培養した。このようにして得られた培養液０．９ｍｌを、カナマイシン  ２５ｍｇ／ｌを含むメイン液体培地（グルコース  １２０ｇ、硫酸アンモニウム  ３ｇ、リン酸二水素カリウム  １．５ｇ、大豆加水分解物  窒素量として０．２ｇ、硫酸マグネシウム七水和物  ３ｇ、ＤＬ−メチオニン  ０．１５ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物  ０．０３ｇ、硫酸マンガン（ＩＩ）五水和物  ０．０３ｇ、硫酸亜鉛七水和物  ０．０４ｇ、塩化カルシウム  ０．２５ｇ、チアミン塩酸塩  ０．４５ｍｇ、ビオチン  ０．４５ｍｇ、ディスホームＧＤ−１１３Ｋ（日本油脂株式会社製）０．１ｍｌ、ｐＨ６．２、水で１Ｌにする）３００ｍｌを入れた１０００ｍｌ容ジャーファーメンターに添加し、メイン培養を開始した。メイン培養は３０℃、通気１／１ｖｖｍ、アンモニアでｐＨを６．６に制御し、グルコースが消費されるまで行った。溶存酸素濃度が５％以上になるよう攪拌を５００ｒｐｍ以上で制御した。【００８３】
得られた培養液を遠心分離し、上清を回収した。この培養上清中のＮε−アセチル−Ｌ−リジンの分解活性を測定した。その結果、培養上清１ｍｌあたり２１Ｕの活性を検出した。【００８４】
活性測定は、Ｎε−アセチル−Ｌ−リジン  ４０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ（ｐＨ７．０）、３７℃で行い、Ｎε−アセチル−Ｌ−リジンの分解に伴い生成するリジンの濃度を測定した。リジンの測定にはＢＦ−５及びリジン電極（王子計測機器（株）製）を用いた。１Ｕは、１分あたり１μｍｏｌのリジンをＮε−アセチル−Ｌ−リジンより遊離させる酵素量と定義した。【００８５】
実施例２：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来アミノアシラーゼ（ＲｍＥＬＡ）のＥ．ｃｏｌｉによる生産
２−１）ＲｍＥＬＡ  Ｅ．ｃｏｌｉ発現株の作製
ｐＰＫ６−ＲｍＥＬＡを鋳型として、配列番号１２と配列番号１３のプライマーを用いてＲｍＥＬＡ遺伝子をコードする配列を含む約１．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ法によって増幅した。配列番号１２及び配列番号１３のプライマーは、ＲｍＥＬＡ遺伝子と相補的な塩基配列の５’末端側に、それぞれ制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩの認識配列を付加したデザインにしてある。【００８６】
次に、得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで処理して、別途ＮｄｅＩとＸｈｏＩで処理したプラスミドベクターｐＥＴ−２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とライゲーションした。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）のコンピテントセルに導入し、プラスミドを取得した。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が挿入されていることを確認した。こうして得られた、ｐＥＴ２１ａベクターを基にしたＲｍＥＬＡをコードする遺伝子発現プラスミドをｐＥＴ２１ａ−ＲｍＥＬＡと命名した。【００８７】
続いて、プラスミドｐＥＴ２１ａ−ＲｍＥＬＡをＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリンを１００ｍｇ／ｌ含むＬＢ培地で形質転換体を選択した。こうして得られたＲｍＥＬＡ  Ｅ．ｃｏｌｉ発現株を、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＲｍＥＬＡ株と命名した。【００８８】
５’−ａａａＣＡＴＡＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＣＴＡＴＧＣＡＧＧＣＡ−３’（配列番号１２）
５’−ａａａａＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＧＡＧＧＣＣＧＧＡＣＡＣＡＧＡＣＣＴＧＣＴＧＣ−３’（配列番号１３）【００８９】
２−２）Ｅ．ｃｏｌｉを用いたＲｍＥＬＡの発現
アンピシリンを１００ｍｇ／ｌ含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ）  ５０ｍｌを入れた５００ｍｌ溶坂口フラスコに試験管にＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＲｍＥＬＡ株１白金耳分接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。【００９０】
得られた培養液を用いて、Ｎε−アセチル−Ｌ−リジンの分解活性を測定したところ、培養液１ｍｌあたり約３．９Ｕの活性を確認した。一方、ＲｍＥＬＡ遺伝子を挿入していないプラスミドベクターｐＥＴ−２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株の培養液を用いた場合には活性は検出されなかった。【００９１】
実施例３：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来アミノアシラーゼ（ＲｍＥＬＡ）の精製
アンピシリンを１００ｍｇ／ｌ含むＯｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｉｎｓｔａｎｔ  ＴＢ培地（Ｎｏｖａｇｅｎ）５０ｍｌを入れた５００ｍｌ溶坂口フラスコにＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１ａ−ＲｍＥＬＡ株１白金耳分接種し、３７℃で２４時間振とう培養した。【００９２】
得られた培養液を遠心分離後に上清を除去して菌体を回収し、生理食塩水（０．８５％  ＮａＣｌ）で２回洗浄した後に２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍｌに懸濁したものを洗浄菌体とした。得られた洗浄菌体の総活性は１９４Ｕであった。【００９３】
次に、洗浄菌体を超音波破砕し、遠心分離より得られた上清を可用性タンパク質溶液として回収した。可用性タンパク質溶液の総活性は１４７Ｕ、比活性は１Ｕ／ｍｇであった。【００９４】
続いて、可用性タンパク質溶液を７５℃、３０分の加熱処理を行った後、遠心分離により得られた上清を加熱処理液として回収した。加熱処理液の総活性は１５８Ｕ、比活性は１１Ｕ／ｍｇであった。【００９５】
さらに、加熱処理液（実測ｐＨ７．９）を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝１ｍｌ）に供し、０〜５００ｍＭのＮａＣｌ濃度勾配で溶出した。その結果、活性画分は約２５０ｍＭの条件で溶出された。活性画分の総活性は８４Ｕ、比活性は１５Ｕ／ｍｇであった。【００９６】
最後に、この活性画分をアミコンウルトラ−１５  ３０ｋ（ミリポア製）を用いて濃縮し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したゲルろ過クロマトグラフィーカラムＨｉｌｏａｄ  １６／６０  ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＣＶ＝１２０ｍｌ）に供し、１ｍｌ／ｍｉｎの流速でタンパクの溶出を行った。その結果、活性画分の総活性は３８Ｕ、比活性は２８Ｕ／ｍｇであった。この活性画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約６０ｋＤａの単一バンドになる程度に精製されたことが分かった。また、ゲルろ過クロマトグラフィーでの溶出条件から予想される分子量は約６０ｋＤａであり、本酵素は単量体で存在すると考えられた。【００９７】
実施例４：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ  由来アミノアシラーゼ（ＲｍＥＬＡ）の基質特性
４−１）アシルリジン加水分解
本酵素のアシルリジン加水分解の基質特異性を見るために、各種アシルリジンに対する、本発明の酵素の反応性を調べた。結果の一覧を以下の表２に示す。酵素は実施例３で取得した精製酵素を用いて評価した。活性測定は、各種アシルリジン４ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ（ｐＨ７．０）、３７℃で行い、アシルリジンの分解に伴い生成するリジンの濃度を測定することで算出した。Ｌ−リジンの測定にはＢＦ−５及びリジン電極（王子計測機器（株）製）を、Ｄ−リジンの測定にアミノ酸アナライザー分析（（株）日立製作所製）は用いた。１Ｕは、１分あたり１μｍｏｌのリジンをアシルリジンより遊離させる酵素量と定義した。【００９８】
【表２】
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【００９９】
本酵素はＮε−アセチル−Ｌ−リジン及びＮε−ベンゾイル−Ｌ−リジンに対して分解活性を示す一方で、Ｎα−アセチル−Ｌ−リジン及びＮα−ベンゾイル−Ｌ−リジンに対しては加水分解活性を示さなかった。また、Ｎε−アセチル−Ｄ−リジンに対して加水分解活性を示さなかった。すなわち、本酵素はε−位アミノ基とＬ体リジンへの高い選択性を持つ酵素であることが示された。【０１００】
４−２）アシルリジン脱水縮合
本酵素のアシルリジン脱水縮合の基質特異性を見るために、Ｌ−リジンと各種カルボン酸を基質として本酵素によるアシルリジン合成能を調べた。酵素は実施例３で取得した精製酵素を用いて評価した。合成反応は、Ｌ−リジン塩酸塩４５ｍＭ、各種カルボン酸４５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ（ｐＨ８．０）、メタノール１０％（ｖ／ｖ）、４５℃で行い、反応液を質量分析（ＤＡＲＴ−ＭＳ：日本電子（株）製）することでアシルリジンの分子量の検出を確認した。【０１０１】
その結果、本酵素によってＬ−リジンと各種カルボン酸〔オクタン酸（カプリル酸）、ドデカン酸（ラウリン酸）、テトラデカン酸（ミスチリン酸）、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、リノール酸、オレイン酸、安息香酸、メトキシメチル安息香酸、フェニルプロピオン酸、シンナモイル酸、及びメトキシシンナモイル酸〕の縮合物が反応液中に生成することが分かった。酵素を添加していない場合には、縮合物の生成は検出されなかった。【０１０２】
また、Ｌ−リジン塩酸塩とオクタン酸を基質とした酵素反応液、及びＬ−リジン塩酸塩とドデカン酸を基質とした酵素反応液についてはＨＰＬＣ分析によって、それぞれＮε−オクタノイル−Ｌ−リジン及びＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンが生成していることを確認した。また、これらの反応液中にはＮα−オクタノイル−Ｌ−リジン及びＮα−ドデカノイル−Ｌ−リジンは検出されず、ε−位アミノ基への高い選択性を持つことが示された。ＨＰＬＣ分析は、カラムＹＭＣ−ＵｌｔｒａＨＴ  Ｐｒｏ  Ｃ１８、５０ｘ２．０ｍｍＩＤ、Ｓ−２ｕｍ、１２ｎｍ（ＹＭＣ）、移動層０．３Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４／ＭｅＯＨ＝１／１、ＵＶ  ２１０ｎｍで行った。【０１０３】
以上の結果から、本酵素はＬ−リジンとカルボン酸に作用してＮε−アシルリジンを生成すること、作用可能なカルボン酸には飽和または不飽和の直鎖脂肪酸や、飽和または不飽和の側鎖を有する芳香族カルボン酸が含まれることが示された。【０１０４】
【表３】
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【０１０５】
実施例５：Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｍａｒｉｎｕｓ由来アミノアシラーゼ（ＲｍＥＬＡ）の温度及びｐＨに対する影響
５−１）温度に対する影響
実施例３記載の方法で取得した精製酵素を用いて、Ｎε−アセチル−Ｌ−リジンを基質とした場合の酵素の反応至適温度及び温度安定性を調べた。【０１０６】
所定温度（３０〜８０℃）、ｐＨ７．０（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液での活性を測定した。その結果を図１に示す。活性は最高値における活性値を１００とした時の相対活性（％）で表した。本酵素の反応至適温度は７５℃であった。【０１０７】
続いて、所定温度（３０〜１００℃）で１時間インキュベートした後の残存活性を測定した。その結果を図２に示す。活性はインキュベート前の活性値を１００とした時の相対活性（％）で表した。本酵素は、各温度で１時間インキュベートした場合、８０℃まで活性の低下が認められず安定であった。【０１０８】
Ｎε−アセチル−Ｌ−リジンに対して加水分解活性を示すＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ由来のＥＬＡは４０℃以上で１時間インキュベートした場合、活性が低下することが分かっており、本酵素はそれよりも安定であることが示された。【０１０９】
５−２）ｐＨに対する影響
実施例３記載の方法で取得した精製酵素を用いて、Ｎε−アセチル−Ｌ−リジンを基質とした場合の酵素の至適ｐＨ及びｐＨ安定性を調べた。【０１１０】
３７℃、各種緩衝液（ｐＨ４．２〜６．０：酢酸緩衝液、ｐＨ７．２〜８．８：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．３〜９．８：ホウ酸緩衝液）を用いて、種々のｐＨにおける活性を測定した。その結果を図３に示す。活性は最高値における活性値を１００とした時の相対活性（％）で表した。本酵素の至適ｐＨはｐＨ５．０であった。【０１１１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ由来のＥＬＡは至適ｐＨがｐＨ８．０〜ｐＨ９．０にあり、ｐＨ４．０〜６．０の弱酸性領域では活性が大きく低下する傾向があるのに対して、本酵素は弱酸性領域（ｐＨ４．５〜５．５）に至適ｐＨを持つ酵素であることが示された。【０１１２】
続いて、各種緩衝液（ｐＨ２．２〜３．０：リン酸緩衝液、ｐＨ４．１〜６．０：酢酸緩衝液、ｐＨ７．１〜８．９：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．５〜１０．９：ホウ酸緩衝液）中で、３７℃、１時間インキュベートした後の残存活性を測定した。その結果を図４に示す。活性はインキュベート前の活性値を１００とした時の相対活性（％）で表した。本酵素は３７℃、１時間のインキュベート中、ｐＨ６．０〜８．０の範囲で安定であった。【０１１３】
実施例６：酵素活性を維持した状態でのＲｍＥＬＡ発現株の殺菌
ＲｍＥＬＡのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ発現株を、酵素活性を維持した状態で加熱殺菌することが可能か調べた。実施例１、１−６）記載の方法で取得した培養液１５０μｌをＰＣＲチューブに分注し、ブロックヒーターを用いて７５℃で３０分間熱処理を行ったものを熱処理培養液とした。熱処理培養液及び、熱処理培養液を生理食塩水（０．８５％  ＮａＣｌ）で段階希釈（〜希釈倍率ｘ１０２）したものを、カナマイシンを２５ｍｇ／ｌ含むＣＭ２Ｇ寒天培地（酵母エキストラクト  １０ｇ、ポリペプトン  １０ｇ、グルコース  ５ｇ、塩化ナトリウム  ５ｇ、ＤＬ−メチオニン  ０．２ｇ、寒天  １５ｇ、ｐＨ７．２、水で１Ｌにする）に塗布して、形成したコロニーをカウントすることでＲｍＥＬＡ発現株の生菌数を調査した。その結果、コロニー形成は認められず、７５℃、３０分間の熱処理で培養液が殺菌されていることが分かった。熱処理していない培養液を同様の方法で調査をした場合、生菌数は７．０ｘ１０１０ｃｆｕ／ｍｌであった。【０１１４】
続いて、培養液及び上記載の熱処理培養液をそれぞれ遠心分離し、上清を回収し上清中のＮε−アセチル−Ｌ−リジンの分解活性を測定した。その結果、熱処理前後で同等の酵素活性値を示し、熱処理によって酵素活性の低下が認められないことが分かった。【０１１５】
以上の結果から、ＲｍＥＬＡ発現菌を、酵素活性を維持した状態で加熱殺菌することが可能であることが示された。【０１１６】
実施例７：Ｒｍ−ＥＬＡの保存安定性
実施例１、１−６）記載の方法で取得したＲｍＥＬＡのＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ発現株の培養液を、遠心分離して上清を回収した後に、０．４５μｍのフィルターで膜除菌したものをＲｍＥＬＡ酵素液とした。また、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ由来ＥＬＡ（ＳｍＥＬＡ）のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ発現株であるＷＤＫ０１０／ｐＰＫＴ−ｔａｔＡＢＣ株（ＷＯ２０１００６７８７１）を同様の手順で培養及び除菌したものをＳｍＥＬＡ酵素液とした。【０１１７】
これらの酵素液を４℃、１５℃、２５℃条件で保管し、酵素活性の推移を調べた。その結果を図５に示す。活性は保管開始時の活性値を１００とした時の相対活性（％）で表した。ＲｍＥＬＡ酵素液はいずれの保管温度においても酵素活性が低下しなかった。一方、ＳｍＥＬＡ酵素液は保管日数が経つにつれて酵素活性が低下する傾向があり、３７日後の残存している活性は４℃保管で約６割まで低下した。【０１１８】
以上の結果から、本発明での酵素（ＲｍＥＬＡ）はＳｍＥＬＡと比較し安定的に保存が可能であることが示された。【０１１９】
実施例８：ＲｍＥＬＡ酵素液によるＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの合成
実施例７記載の方法で調整したＲｍＥＬＡ酵素液を用いて、Ｎε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの合成反応を実施した。終濃度が、ドデカン酸  ３００ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−リジン塩酸塩  ３００ｍｍｏｌ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、メタノール  １０％、ＲｍＥＬＡ酵素液  ３Ｕ／ｍｌとなるように反応液２００ｍｌを調製し、５００ｍｌ溶ジャーファーメンターを用いて３００ｒｐｍにて攪拌した。ｐＨは７．０となるように１Ｎ  ＮａＯＨで調製し、反応温度は５５℃となるように調整した。【０１２０】
反応中、経時的に反応液のサンプリングを行い、反応液中のＬ−リジン濃度を測定した結果、２４時間後に投入Ｌ−リジンの９８％が消費されていることが分かった（図６、反応開始時のリジン濃度を１００％とした）。また、２４時間後の反応液をＨＰＬＣにて分析したところ、Ｎε−ドデカノイル−Ｌ−リジンが対Ｌ−リジン収率で９８％生成しており、消費されたＬ−リジンがＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンに変換されていることが確認された。なお、Ｎα−ドデカノイル−Ｌ−リジンは対Ｌ−リジン収率０．０６％しか生成しなかった。【０１２１】
リジンの測定にはＢＦ−５及びリジン電極（王子計測機器（株）製）を用いた。また、ＨＰＬＣ分析は、カラム  ＹＭＣ−ＵｌｔｒａＨＴ  Ｐｒｏ  Ｃ１８、５０ｘ２．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．（（株）ＹＭＣ製）、移動層  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ３．０）／ＭｅＯＨ＝３／７、ＵＶ  ２１０ｎｍで行った。【０１２２】
反応ｐＨをｐＨ７．０からｐＨ６．０に変更して、上記と同様の方法でＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの合成反応を実施したところ、２４時間後に投入Ｌ−リジンの９６％が消費された（図７）。生成したＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの結晶形状を光学顕微鏡で観察すると、ｐＨ７．０での反応で生成した結晶と比較して短径が３倍に増大していた（図８）。ｐＨ７．０条件では反応液中のドデカン酸が乳化しており粘性の高い溶液になっている。一方で、ｐＨ６．０条件では水層（Ｌ−リジン水溶液）と油層（ドデカン酸）の２層分離した状態であり、粘性の低い溶液となっている。こうした液性の違いが酵素反応で生成するＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジン結晶形成に変化を与えていると考えられた。【０１２３】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ由来のＥＬＡ（ＳｍＥＬＡ）は至適ｐＨがｐＨ８．０〜ｐＨ９．０にあり、ｐＨ４．０〜６．０の弱酸性領域では活性が大きく低下するため、ｐＨ６．５以下での条件でＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの合成反応がほとんど進行しないことが知られていた（ＪＡＯＣＳ，Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．９，２００５）。以上の結果から、本発明の酵素ＲｍＥＬＡはｐＨ弱酸性領域でＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンを合成可能な新規な酵素であり、当条件で生成するＮε−ドデカノイル−Ｌ−リジンの結晶が、ドデカン酸の乳化が進むｐＨ７．０付近での反応で生成する結晶と比較して短径が増大する傾向があることが示された。【０１２４】
実施例９：ＲｍＥＬＡ酵素液によるＮε−オクタノイル−Ｌ−リジンの合成
実施例７記載の方法で調整したＲｍＥＬＡ酵素液を用いて、Ｎε−オクタノイル−Ｌ−リジンの合成反応を実施した。終濃度が、オクタン酸３００ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｌ−リジン塩酸塩  ３００ｍｍｏｌ／Ｌ、ＺｎＳＯ４  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、ＲｍＥＬＡ酵素液  ２．１Ｕ／ｍｌとなるように反応液１００ｍｌを調製し、２００ｍｌ溶ジャーファーメンターを用いて３００ｒｐｍにて攪拌した。ｐＨは７．０となるように１Ｎ  ＮａＯＨで調製し、反応温度は５０℃となるように調整した。【０１２５】
反応中、経時的に反応液のサンプリングを行い、反応液中のＬ−リジン濃度を測定した結果、２３時間後に投入Ｌ−リジンの８０％が消費されていることが分かった（図９、反応開始時のリジン濃度を１００％とした）。また、２３時間後の反応液をＨＰＬＣにて分析したところ、Ｎε−オクタノイル−Ｌ−リジンが対Ｌ−リジン収率で８０％生成しており、消費されたＬ−リジンがＮε−オクタノイル−Ｌ−リジンに変換されていることが確認された。なお、Ｎα−オクタノイル−Ｌ−リジンのピークは検出されなかった。【０１２６】
ＨＰＬＣ分析は、カラムＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  １５０×６．０ｍｍＩ．Ｄ．、Ｓ−５ｕｍ、１２ｎｍ（（株）ＹＭＣ製、品番：ＡＡ１２Ｓ０５−１５０６ＷＴ）を用いて、溶離液：ＭｅＯＨ／リン酸緩衝液＝５０／５０（１５分）  →  グラジエント（１５分）  →  ９０／１０  →  グラジエント（３分）  →  ５０／５０（１２分）（リン酸緩衝液＝０．１ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＨ２ＰＯ４  ａｑ．にＨ３ＰＯ４を加えてｐＨ２．５に調整）の溶出条件下で行った。【０１２７】
上記反応条件における基質（オクタン酸、Ｌ−リジン塩酸塩）終濃度を、（１）５００ｍｍｏｌ／Ｌ、（２）７５０ｍｍｏｌ／Ｌ、（３）１０００ｍｍｏｌ／Ｌに変更してＮε−オクタノイル−Ｌ−リジンの合成反応を実施した。【０１２８】
反応中、経時的に反応液のサンプリングを行い、反応液中のＬ−リジン濃度を測定した結果、いずれの条件でも反応時間の経過とともにＬ−リジンが減少し、Ｎε−オクタノイル−Ｌ−リジン合成反応が進行することが分かった（図１０）。反応時間と投入Ｌ−リジンに対する消費率はそれぞれ、（１）３５時間後に８７％、（２）３５時間後に９２％、（３）５７時間後に９４％となった。【０１２９】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ由来のＥＬＡ（ＳｍＥＬＡ）を用いて、同様にＮε−オクタノイル−Ｌ−リジンの合成反応を実施したところ、基質（オクタン酸Ｌ−リジン塩酸塩）終濃度が３００ｍｍｏｌ／Ｌにおいては、反応時間の経過とともにＬ−リジンが減少し、Ｎε−オクタノイル−Ｌ−リジン合成反応が進行することが確認された（図１１）。一方で、終濃度が５００ｍｍｏｌ／Ｌ条件では、反応液中のＬ−リジン量に変化が見られず、反応が進行しないことが分かった（図１１）。基質濃度を高くすることで、酵素活性が失活または反応阻害をうけていると予想された。【０１３０】
以上の結果から、本発明の酵素ＲｍＥＬＡは、既知酵素ＳｍＥＬＡが反応阻害を受ける基質（オクタン酸、Ｌ−リジン塩酸塩）濃度条件においても、Ｎε−オクタノイル−Ｌ−リジン合成反応を進行させる酵素であることが示された。【０１３１】
ＳｍＥＬＡでのＮε−オクタノイル−Ｌ−リジンの合成反応における基質終濃度以外の条件は以下の通りに実施した。終濃度が、ＺｎＳＯ４  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、ＳｍＥＬＡ酵素液  ５．７Ｕ／ｍｌとなるように反応液１００ｍｌを調製し、２００ｍｌ溶ジャーファーメンターを用いて３００ｒｐｍにて攪拌した。ｐＨは８．０となるように１Ｎ  ＮａＯＨで調製し、反応温度は３０℃となるように調整した。【０１３２】
ＳｍＥＬＡ酵素液の活性値は、Ｎε−アセチル−Ｌ−リジン  ４０ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ（ｐＨ８．０）、３７℃で行い、Ｎε−アセチル−Ｌ−リジンの分解に伴い生成するリジンの濃度から算出し、１Ｕは１分あたり１μｍｏｌのリジンをＮε−アセチル−Ｌ−リジンより遊離させる酵素量と定義した。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明は、Ｎε−アシル−Ｌ−リジンの製造に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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