(57)【要約】【課題】Ｃａｎｄｉｄａ、黄色ブドウ球菌および他の免疫学的に関連する病原体に対する宿主免疫保護および受動的免疫保護を提供する効果的な免疫原を提供する。【解決手段】本発明は、細胞接着活性を有する単離されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーまたはその免疫原性断片を、必要に応じて医薬上許容され得る媒体中のアジュバントと共に含むワクチンを提供する。また、本発明は、播種性カンジダ症を治療または予防する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ表面アドヘシンタンパク質、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ表面接着タンパク質でのワクチン接種に対する免疫応答から得られた抗体、およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ表面接着タンパク質でカンジダ症および他の細菌感染を予防および／または治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
近年、Ｃａｎｄｉｄａ種によって引き起こされた院内感染の発生率の劇的な増大があった。血行的に散在したカンジダ感染の発生率は１９８０年から１９８９年にかけて１１倍増加した。この増大しつつある発生率は１９９０年代まで続いた。Ｃａｎｄｉｄａ種による感染は、今日、院内敗血症の第四番目の最も一般的な原因であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのそれと同等であり、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種によって引き起こされた発生率を凌ぐ。さらに、Ｃａｎｄｉｄａ種は、ひどい怪我を有する患者において執拗な真菌感染の最も一般的な原因である。骨髄移植を受けている個人の１１％まで、および同所性肝臓移植体を有する固体の１３％までが侵入性カンジダ感染を発生するであろう。
【０００３】
Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、この属における主な病原体は、２つの形態：出芽胞子で（出芽酵母）およびフィラメント状（菌糸および偽菌糸）相の間をスイッチすることができる。フィラメント化を調節する遺伝子に欠陥があるＣａｎｄｉｄａ突然変異体は、動物モデルにおいて低下したビルレンスを有すると報告されている。この低下したビルレンスは、出芽胞子からフィラメントへ変化する能力がＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの鍵となるビルレンス因子であることを示唆する。今日まで、これらのフィラメント化経路の必須のエフェクタはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓにおいて同定されていない。非特許文献１を参照。
【０００４】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染もまた一般的であり、益々、抗生物質に対する薬物耐性をもたらす。例えば、黄色ブドウ球菌は合衆国および世界中で皮膚および皮膚構造感染、心内膜炎および菌血症の通常の原因である。以前、地域感染型の黄色ブドウ球菌（ＣＡ−Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染は、セファゾリン、オキサシリン、メチシリン、ペニシリンおよびアモキシシリンのようなペニシリナーゼ−耐性ベータラクタムに対してほとんど均一に感受性であった。しかしながら、過去１０年間に渡って、ベータ−ラクタム耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）感染の伝染病は、世界中で多数の地域で見られている。特に、地域感染型ＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）。多くの場所において、ＭＲＳＡは、ＣＡ感染を引き起こす支配的な黄色ブドウ球菌株となった。最近の合衆国における３つの州での予測される集団−ベースの概観は、ＣＡ−ＭＲＳＡ感染の発生率が１００，０００集団当たり５００症例であると見積もっており、これは合衆国単独において１年あたりほぼ１５０万症例に換算される。薬物−耐性黄色ブドウ球菌感染の増大する頻度は、これらの感染を予防し、治療するための新しい方法に対する要望に焦点を当てている。
【０００５】
ビルレンスに寄与する生物の調節経路におけるエフェクタの同定は、現存の抗真菌剤よりもすぐれた方法および組成物での治療的介入に対する機会を提供する。ビルレンスに関与する調節経路に影響する細胞表面タンパク質の同定は特に有望である。なぜならば、タンパク質の特徴付けは、カンジダ感染と戦う場合に、現存の抗真菌剤よりも優れた免疫療法技術を可能とするからである。
【０００６】
Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのビルレンスは、宿主構成要素へのその接着、および酵母から菌糸へ変換する能力が病原性を決定するにおいて最も臨界的なうちにあるいくつかの推定ビルレンス因子によって調節される。Ｃａｎｄｉｄａに対して殺菌性である優れた抗真菌剤が存在するが、カンジダ血症に帰される死亡率は、アンフォテリシンＢのような優れた抗真菌剤での治療をもってさえほぼ３８％である。また、アンフォテリシンＢのような現存の剤は望ましくない毒性を呈する傾向がある。アンフォテリシンＢよりも毒性が低いさらなる抗真菌剤を開発することができるが、より優れた剤は開発されないであろう。従って、播種性カンジダ症を治療または予防するための受動的または能動的免疫療法は、標準的な抗真菌療法に代えて有望である。
かくして、Ｃａｎｄｉｄａ、黄色ブドウ球菌および他の免疫学的に関連する病原体に対する宿主免疫保護および受動的免疫保護を提供する効果的な免疫原に対する要望が存在する。本発明はこの要望を満足し、同様に、関連する利点を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃａｅｓａｒ−ＴｏｎＴｈａｔ，Ｔ．Ｃ．ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｃｕｔｌｅｒ，“Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｍｏｕｓｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃａｎｄｉｄａｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：５３５４−５３５７，１９９７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、医薬上許容され得る媒体中のアジュバントと共に、細胞接着活性を有する単離されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーまたはその免疫原性断片を含むワクチンを提供する。また、本発明は、播種性カンジダ症を治療または予防する方法も提供する。該方法は、医薬上許容され得る媒体中の、細胞接着活性を有する単離されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその免疫原性断片を含むワクチンの免疫原性量を投与することを含む。宿主細胞または組織へのＣａｎｄｉｄａの結合または侵入を阻害するのに有効な量の細胞接着活性を有する単離されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその機能的断片を投与することを含む播種性カンジダ症を治療または予防する方法も提供される。該Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａおよびＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓよりなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ株に由来することができ、該Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーはＡｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐまたはＡｌｓ９ｐを含む。また、黄色ブドウ球菌感染を治療また予防する方法も提供される。該方法は、医薬上許容され得る媒体中の、細胞接着活性を有する単離されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその免疫原性断片を含むワクチンの免疫原性量を投与することを含む。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
医薬上許容され得る媒体中の、細胞接着活性を有する単離されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその免疫原性断片を含むワクチンの免疫原性量を投与することを含む、黄色ブドウ球菌感染を治療または予防する方法。
（項目２）
前記Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーが、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ
ｇｌａｂｒａｔａ、およびＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓよりなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ株に由来するＡｌｓタンパク質を含む、項目１に記載の方法。（項目３）
前記Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーがＡｌｓ１ｐまたはＡｌｓ３ｐから選択される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記免疫原性断片がＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーのＮ末端領域断片を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記投与が能動免疫、受動免疫またはその組合せを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
細胞接着活性を有する単離されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその機能的断片の有効量を投与して、Ｃａｎｄｉｄａが宿主の細胞または組織へと結合または侵入するのを阻害することを含む、黄色ブドウ球菌感染を治療または予防する方法。
（項目７）
前記Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーが、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、およびＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓよりなる群から選択されるＣａｎｄｉｄａ株に由来するＡｌｓタンパク質を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーがＡｌｓ１ｐまたはＡｌｓ３ｐから選択される、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記細胞接着活性がゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、上皮細胞または内皮細胞への結合を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記機能的断片がＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーのＮ末端領域断片を含む、項目６に記載の方法。
（項目１１）
前記宿主細胞が内皮細胞または上皮細胞起源の細胞を含む、項目６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒト臍静脈内皮細胞へのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＡｌｓｌｐ接着の媒介を示す。値は、各々三連で行われた少なくとも３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。（Ａ）ＡＬＳ１１／ａｌｓ２  ａｌｓ１／ａｌｓ１およびＡＬＳ１−補足突然変異体および野生型ＣＡＩｌ２（３０）の内皮細胞接着。統計学的処理はＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定によって得られ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ修正での多数の比較について修正した。全ての比較について＊Ｐ＜０．００１。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒト臍静脈内皮細胞へのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのＡｌｓｌｐ接着の媒介を示す。値は、各々三連で行われた少なくとも３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。（Ｂ）野生型Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓと比較した、ＡＬＳ１を過剰発現するＰＡＤＨｌ−ＡＬＳ１突然変異体の内皮細胞接着。統計学的処理はＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定によって得られ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ修正での多数の比較について修正した。全ての比較について＊Ｐ＜０．００１。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ間接的免疫蛍光のフィラメントへのＡｌｓ１ｐの細胞表面局所化を示す。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのフィラメント化は、グルタミンと共にＲＰＭＩ  ｌ６４０培地中で酵母細胞を３７℃で１．５時間インキュベートすることによって誘導された。Ａｌｓ１ｐは、まず、抗Ａｌｓ１ｐマウスｍＡｂ、続いて、ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共に生物をインキュベートすることによって検出された。また、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞表面を、Ａｌｅｘａ  ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とコンジュゲートした抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓポリクローナルＡｂで染色した。黄色に染色される領域はＡｌｓ１ｐ局所化を表す（Ａ）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ野生型。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ間接的免疫蛍光のフィラメントへのＡｌｓ１ｐの細胞表面局所化を示す。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのフィラメント化は、グルタミンと共にＲＰＭＩ  ｌ６４０培地中で酵母細胞を３７℃で１．５時間インキュベートすることによって誘導された。Ａｌｓ１ｐは、まず、抗Ａｌｓ１ｐマウスｍＡｂ、続いて、ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共に生物をインキュベートすることによって検出された。また、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞表面を、Ａｌｅｘａ  ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とコンジュゲートした抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓポリクローナルＡｂで染色した。黄色に染色される領域はＡｌｓ１ｐ局所化を表す（Ｂ）ａｌｓ１／ａｌｓ１突然変異体株。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ間接的免疫蛍光のフィラメントへのＡｌｓ１ｐの細胞表面局所化を示す。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのフィラメント化は、グルタミンと共にＲＰＭＩ  ｌ６４０培地中で酵母細胞を３７℃で１．５時間インキュベートすることによって誘導された。Ａｌｓ１ｐは、まず、抗Ａｌｓ１ｐマウスｍＡｂ、続いて、ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共に生物をインキュベートすることによって検出された。また、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞表面を、Ａｌｅｘａ  ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とコンジュゲートした抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓポリクローナルＡｂで染色した。黄色に染色される領域はＡｌｓ１ｐ局所化を表す（Ｃ）野生型ＡＬＳ１を補足したａｌｓ１／ａｌｓ１。
【図２Ｄ】図２Ｄは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ間接的免疫蛍光のフィラメントへのＡｌｓ１ｐの細胞表面局所化を示す。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのフィラメント化は、グルタミンと共にＲＰＭＩ  ｌ６４０培地中で酵母細胞を３７℃で１．５時間インキュベートすることによって誘導された。Ａｌｓ１ｐは、まず、抗Ａｌｓ１ｐマウスｍＡｂ、続いて、ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共に生物をインキュベートすることによって検出された。また、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞表面を、Ａｌｅｘａ  ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とコンジュゲートした抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓポリクローナルＡｂで染色した。黄色に染色される領域はＡｌｓ１ｐ局所化を表す（Ｄ）ＰＡＤＨｌ−ＡＬＳ１過剰発現突然変異体。
【図３Ａ】図３Ａは、固体培地上でのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓフィラメント化に対するＡｌｓ１ｐの媒介を示す。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ出芽胞子をＬｅｅ寒天プレート上にスポットし、３７℃にて４日間（Ａ）インキュベートした。
【図３Ｂ】図３Ｂは、固体培地上でのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓフィラメント化に対するＡｌｓ１ｐの媒介を示す。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ出芽胞子をＬｅｅ寒天プレート上にスポットし、３７℃にて３日間（Ｂ）インキュベートした。
【図４Ａ】図４Ａは、ＥＦＧ１フィラメント化調節経路によるＡＬＳ１発現の制御を示す。異なるフィラメント化調節経路に欠陥がある突然変異体におけるＡＬＳ１の発現を示すノーザンブロット分析。全ＲＮＡは、３７℃にて９０分間、ＲＰＭ１  １６４０＋グルタイン培地中で増殖させてフィラメント化を誘導した細胞から抽出した。ブロットはＡＬＳ１およびＴＥＦ１でプローブした。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＥＦＧ１フィラメント化調節経路によるＡＬＳ１発現の制御を示す。ＥＦＧ１またはＰＡＤＨｌ−ＡＬＳ１いずれかを補足したｅｆｇｌ／ｅｆｇｌ突然変異体におけるＡＬＳ１の発現を示すノーザンブロット分析。全ＲＮＡは、３７℃にて９０分間、ＲＰＭ１  １６４０＋グルタイン培地中で増殖させてフィラメント化を誘導した細胞から抽出した。ブロットはＡＬＳ１およびＴＥＦ１でプローブした。
【図４Ｃ】図４Ｃは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓフィラメント化の媒介を示す。Ｌｅｅ寒天プレート上で３７℃にて４日間増殖させたｅｆｇｌ／ｅｆｇｌ突然変異体、およびＰＡＤＨｌ−ＡＬＳ１を補足したｅｆｇｌ／ｅｆｇｌ突然変異体の顕微鏡写真。
【図５Ａ】図５Ａは、（Ａ）雄Ｂａｌｂ／Ｃマウス（各酵母株についてｎ＝３０）に静止相出芽胞子（０．５ｍｌのＰＢＳ中マウスあたり１０６）で注射することによる、血行的に播種性のカンジダ症のマウスモデルにおけるビルレンスの低下を示す。曲線は三連実験の編集した結果である（各株についてｎ＝３０マウス）。３０℃にてＹＰＤ中で増殖させた全ての株の倍加時間は１．２９から１．５２時間の間の範囲であり、相互に統計学的に異ならなかった。全染色体ＤＮＡのサザーンブロット分析を用いて、感染した生物から検索したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株の遺伝子型の同一性を、マウスを感染させるのに用いたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株のそれにマッチさせた。統計学的解析は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定によって得られ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ修正にて多数の比較のために修正した。ａｌｓ１／ａｌｓ１突然変異体−ｖｓ−他の株の各々について＊Ｐ＜０．００２。
【図５Ｂ】図５Ｂ：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ野生型、ホモ接合性ａｌｓ１  ｎｕｌｌ突然変異体またはヘテロ接合性ＡＬＳ１補足突然変異体で感染させた腎臓の組織学的顕微鏡写真。腎臓試料を感染から２８時間後に検索し、パラホルムアルデヒド中で固定し、断面を銀で染色した（倍率×４００）。矢印はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃ：Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ野生型、ホモ接合性ａｌｓ１  ｎｕｌｌ突然変異体またはヘテロ接合性ＡＬＳ１補足突然変異体で感染させた腎臓の組織学的顕微鏡写真。腎臓試料を感染から４０時間後に検索し、パラホルムアルデヒド中で固定し、断面を銀で染色した（倍率×４００）。矢印はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を示す。
【図６】図６は、抗Ａｌｓ１ｐポリ血清を注入した動物についての３０日間に渡って生存する動物の関数としての播種性カンジダ症に対する抗ＡＬＳ抗体の予防効果を示す。
【図７】図７は、接着表現型によって配置された選択されたＡＬＳポリペプチドのＮ末端部分のポリペプチド配列整列である。頂部の３つの線はＡＬＳ１、３および５ポリペプチド（各々、配列番号１から３）からの配列であり、これは内皮細胞に結合する。底部の３つはＡＬＳ６、７および９ポリペプチドからの配列であり（各々、配列番号４から６）、これは内皮細胞に結合しない。最後の線はＡＬＳポリペプチドファミリーコンセンサス配列（配列番号７）を表す。
【図８】図８は、Ｓａｃｃｈａｒｏｎｚｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて不均一に発現させた場合に、Ａｌｓタンパク質が基材特異的接着特性を付与することを示す。各パネルは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓが接着することが知られている種々の基材への１つのＡｌｓｐ発現株のパーセント接着を示す（塗りつぶした棒線）。空のベクターで形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの接着（塗りつぶしていない棒線）は陰性対照として各パネルに含ませる。Ｇｅｌ、ゼラチン；ＦＮ、フィブロネクチン；ＬＮ、ラミニン；ＦａＤｕ、ＦａＤＵ上皮細胞；ＥＣ、内皮細胞。単一因子偏差分析によって空のプラスミド対照と比較した場合、＊ｐ＜０．０１。結果は三連で行った少なくとも３つの実験の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図９】図９は、ドメインスワッピングが、基材特異的接着が、Ａｌｓタンパク質のＮ末端ドメインの組成によって決定されることを示すことを示す。テストすべきＡｌｓ遺伝子または構築物の表示は、ＡＬＳ５（黒色）またはＡＬＳ６（白色）からの配列よりなる棒線として描かれる。各突然変異体の接着特性は、フィブロネクチン−被覆ビーズへの形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの接着を示す顕微鏡写真、および６−ウェルプレートアッセイで測定されたゼラチン（黒色棒線）および内皮細胞（灰色棒線）への接着を示すグラフとして表示される。結果は、各々が三連で行った少なくとも３つの実験の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図１０】図１０は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現された場合に、Ａｌｓタンパク質のサブセットが内皮細胞侵入を媒介することを示す。Ａ、Ａｌｓタンパク質を発現する、または空のプラスミド（対照）で形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の内皮細胞接着。データは、内皮細胞−関連生物の合計数を表し、高電力場当たりの細胞として表す。Ｂ、高電力場当たりの細胞内生物の数として表されたＡｌｓｐ発現Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の内皮細胞侵入の程度。単一因子偏差分析によって空のプラスミド対照と比較した場合、＊ｐ＜０．０１。結果は、三連で行った少なくとも３つの実験の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図１１】図１１は、公知の機能のＡｌｓタンパク質のＮ末端アミノ酸配列の整列が、ＣＲおよびＨＶＲの交互パターンを示すことを示す。Ａ、公知の機能のＡｌｓタンパク質のＮ末端領域内のコンセンサス同一性のパーセンテージ。シグナルペプチド領域（アミノ酸１から２０）は示されないことに注意されたい。塗りつぶしていないボックスは、ＨＶＲ１から７として命名された領域を示す。Ｂ、個々のＨＶＲの組成を示すＡｌｓタンパク質（各々、配列番号１から６）の模式的整列。該配列を配置して、少数の同定された基材に結合する、または全く同定された基材に結合しないタンパク質と、多数の基材に対して親和性を持つタンパク質とを比較する。各保存された領域におけるアミノ酸配列の数を括弧に入れて示す。
【図１２】図１２は、Ａｌｓ１タンパク質Ｎ末端ドメインのＣＤおよびＦＴＩＲスペクトルを示す。Ａ、リン酸緩衝化生理食塩水中の１０μＭ  Ａｌｓ１ｐの円二色スペクトル。Ｂ、Ｄ２Ｏ蒸気で水和されたＡｌｓ１ｐ自己−フィルムのＦＴＩＲスペクトル。
【図１３】図１３は、Ａｌｓタンパク質ファミリー内のＮ末端ドメインの予測された物理化学的特性の比較を示す。疎水性、静電性、または水素−結合特徴は各ドメインの水−接近可能表面に投影される。疎水性は以下のように示される：茶色、最も疎水性；青色、最も親水性。静電性（スペクトル連続）は以下のように示される：赤色、最も正の電荷（＋１０  ｋｃａｌ／モル）；青色、最も負の電荷（−１０  ｋｃａｌ／モル）。水素−結合ポテンシャル（Ｈ−結合）は以下のように示される：赤色、ドナー；青色、アクセプター。Ａｌｓタンパク質は、これらの特性の複合に基づいて３つの群に区別可能である。例えば、Ａｌｓ群Ａタンパク質内の同様な疎水性、静電性および水素−結合プロフィール、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、およびＡｌｓ５ｐに注意されたい。対照的に、Ａｌｓ群Ｂメンバー、Ａｌｓ６ｐおよびＡｌｓ７ｐは、Ａｌｓ群Ａのそれからの疎水性および静電性特徴の顕著な差を提示する。生化学的プロフィールに加えて、これらのドメイン内の予測される構造の差に注意されたい。
【図１４】Ａｌｓファミリータンパク質における構造−機能関係の概念的モデル。Ａｌｓタンパク質は３つの一般的成分：Ｎ末端ドメイン、タンデムリピート、およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞壁と界面を形成するグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーを含有するセリン／スレオニン−リッチなＣ−末端ドメインから構成される。説明したように、Ａｌｓタンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーに特徴的な、拡大されたスパンが間に存在する多数の保存された反―平行β−シート領域（ＣＲ１−ｎ）を含有する。β−シートドメインから突出するのは、ＨＶＲを含有するループ／コイル構造である。特異的Ａｌｓタンパク質ＨＶＲの三次元物理化学的特性は、恐らくは、接着および侵入機能をＣａｎｄｉｄａに付与する宿主基材との相互作用を支配する。説明目的で、３つのＮ末端β−シート／コイルドメインおよびそれらの各ＣＲ／ＨＶＲ成分のみを示す。この突出は、図１３に示した構造イメージに対して直角で見られることに注意されたい。
【図１５】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでのマウス（リタイアしたブリーダー）の免疫化は、引き続いての播種性カンジダ症の間の生存を改良する。Ａｌｓ１ｐ＋アジュバントで免疫化されたマウスの生存。Ｎ＝異なる日での二連実験における群当たり１６匹のマウス；Ａｄｊ．＝アジュバント。＊ｐ＜０．０５  ｖｓアジュバント。
【図１６】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでの免疫化は、リタイアしたブリーダーおよび若年マウス双方の生存を改良する。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの迅速に致死的な１０６接種物で感染させたリタイアしたブリーダー（Ａ）および若年性（Ｂ）マウスの生存。Ｎ＝異なる日の二連実験における群当たり１６匹のマウス；Ａｄｊ．＝アジュバント。＊ｐ＜０．０５  ｖｓアジュバント対照。
【図１７】抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ力価は生存と相関しない。アジュバントと共に、またはそれなくして、変化する用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎで免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスにおいて生起した抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎポリクローナル抗体の力価。Ａｄｊ．＝アジュバント。２００μｇ  ｖｓ．全ての他のものについて＊ｐ≦０．００５。
【図１８】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの保護用量のみがＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ−刺激Ｔｈ１脾臓細胞の増加を誘導する。異なる用量のｒＡｌｓ１ｐ−ＮワクチンによるＴｈ１（ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−４−）およびＴｈ２（ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ−ＩＬ−４＋）脾臓細胞の誘導。免疫化されたマウス（群当たりｎ＝９）からの脾臓細胞を熱で殺した予め発芽したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓで４８時間刺激し、次いで、３−色フローサイトメトリーによって分析した。＊ｐ＝０．０３  ｖｓ．アジュバント。
【図１９】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの保護用量のみがｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ刺激遅延タイプの過敏の増加を誘導する。ｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはＣＦＡ単独でワクチン接種したマウス（群当たりｎ＝９から１２）における、足蹠膨潤によって評価した遅延タイプの過敏。マウスを示した量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎで免疫化し、次いで、５０μｇのｒＡｌｓ１ｐ−Ｎを足蹠に注射した。足蹠膨潤は２４時間後に評価した。＊ｐ＜０．０５−ｖｓ−アジュバント、０．２μｇ、および２００μｇ。
【図２０】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、保護的免疫性を誘導するのにＢ細胞ではなくＴ細胞を必要とする。Ｂ細胞−欠乏、Ｔ細胞−欠乏（ヌード）およびコンジェニック野生型Ｂａｌｂ／ｃ対照マウス（群当たりｎ＝７または８）の生存を、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ＋アジュバントまたはアジュバント単独でのワクチン接種後に同時に評価した。＊ｐ＜０．０４−ｖｓ−アジュバント単独、ｐ＝０．００３−ｖｓ−野生型アジュバント−処理。
【図２１】ｒＡｌｓ１ｐ−ＮでのＳＱワクチン接種は免疫コンピテントマウスにおいてインビボＤＴＨ応答を誘導する。足蹠膨潤は、５０μｇのｒＡｌｓ１ｐ−ＮのＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝１０）における足蹠への注射から２４時間後に評価した。メジアン値は黒色棒線として表示する。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定によって＊ｐ＝０．００２  ｖｓ．対照。
【図２２】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、血行的に散在したカンジダ症を持つ免疫コンピテントマウスの生存を改良し、組織真菌負荷を低下させる。Ａ）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓで尾−静脈を介して引き続いて感染させた、ワクチン接種したまたは対照ＢＡＬＢ／ｃマウス（各々、２．５または５  ×  １０５接種物について群当たりｎ＝７または１０）の生存。各実験は感染から３０日後に停止し、全ての残りのマウスは良好に見えた。Ｌｏｇ順位検定により＊ｐ＜０．０５  ｖｓ．対照。Ｂ）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの５×１０５出芽胞子で尾静脈を介して感染させたＢＡＬＢ／ｃマウス（群当たりｎ＝７）における腎臓真菌負荷。ｙ軸はアッセイの検出の下限を反映する。メジアン値は黒色棒線として表示する。Ｗｉｌｘｏｃｏｎ順位和検定によって＊ｐ＝０．０１  ｖｓ対照。
【図２３】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは好中球減少症マウスにおいてＤＴＨ反応を誘導し、引き続いての血行的に播種性のカンジダ症の間のそれらの生存を改良する。Ａ）足蹠膨潤は、５０μｇのｒＡｌｓ１ｐ−ＮのＢＡＬＢ／ｃマウス（対照についてはｎ＝１０、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎについてはｎ＝８）の足蹠への注射から２４時間後に評価した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定により＊ｐ＝０．００６  ｖｓ対照。Ｂ）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの２．５  ×  １０４出芽胞子で感染させた好中球減少症ＢＡＬＢ／ｃマウス（２つの実験からの群当たりｎ＝１６）の生存。Ｌｏｇ順位検定により＊ｐ＝０．００７  ｖｓアジュバント対照。
【図２４】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、口腔咽頭カンジダ症を持つマウスの舌上での組織病理学的真菌病相のひどさを低下させる。群当たりＮ＝４匹マウス。テキスト中に記載されたような盲検観察者によって生じた炎症スコア。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定により＊ｐ＝０．０３。
【図２５】図２５は、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮワクチンではなくｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを接種したマウスの膣の真菌集落形成を減少させることを示す（Ｗｌｉｃｏｘｏｎ順位和検定により＊ｐ＝０．０１  ｖｓ  ＣＦＡ単独でワクチン接種したマウス）群当たりＮ＝１１匹マウス。
【図２６】図２６は、Ａｌｓ１ｐ相同性マップ−ｖｓ−黄色ブドウ球菌クランピング因子Ａ（ｃ１ｎ６７Ａ）を示す。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＡｌｓ１ｐおよび黄色ブドウ球菌のＣｌｆＡからのコンセンサス機能的部位はＡｌｓ１ｐ相同性モデルにマッピングされた。Ａｌｓ１ｐおよびＣｌｆＡのＮ末端からの多数の残基はコンセンサス溝モチーフにマッピングされ、これは、基材への結合が双方のアドヘシンについて起こると予測されるものである。
【図２７】図２７は、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、スタフィロコッカス血症マウスの生存を改良することを示す（Ｌｏｇ順位検定により＊ｐ＜０．００３  ｖｓ  ＣＦＡ単独でワクチン接種したマウス）。群当たりＮ＝２２匹マウス。
【図２８】図２８は、抗体力価が個々のワクチン接種したマウスにおける保護の程度と相関しないが、それらはワクチン接種していないマウスをワクチン接種したマウスから区別することを示す。各々、ＣＦＡ単独、またはｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−ＮのＣＦＡ＋２０μｇで免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスにおいて生起した抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎまたは抗ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎポリクローナル抗体の力価。総じて、抗体力価および生存の間に有意な相関があり（ｒｈｏ＝０．４７４，ｐ＝０．００５７）、これは、抗体力価をワクチン保護のための同族マーカーとして用いることができることを示す。しかしながら、ＣＦＡ単独を受けるマウスからのデータを排除すると、抗体−力価、およびｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎをワクチン接種したマウスの生存の間に相関はなく（ｒｈｏ＝０．０４１１４３，ｐ＝０．８４７）、これは、抗体がワクチンの保護の支配的メカニズムではないようであることを示す。
【図２９】図２９は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンが非近交系ＣＤ１マウスを血行的に播種性のカンジダ症から保護することを示す。Ａ）ＣＤ１マウス（群当たりｎ＝８）を、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（２０μｇ）＋ＣＦＡ、またはＣＦＡ単独でＳＱワクチン接種し、ブーストから１４日後にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＳＣ５３１４で尾−静脈を介して感染させた。Ｂ）ＣＤ１マウス（群当たりｎ＝８）を、ミョウバンと共に種々の用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎまたはミョウバン単独でＳＱワクチン接種し、ブーストから１４日後に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＳＣ５３１４で尾−静脈を介して感染させた。Ｌｏｇ順位検定により＊ｐ＜０．０５  ｖｓ．アジュバント対照。
【図３０】図３０は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのいくつかの株の１つで感染させたＢａｌｂ／ｃマウスの生存を改良することを示す。ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ＋ＣＦＡ−ｖｓ−ＣＦＡ単独で免疫化し、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  １５５６３（７×１０５出芽胞子）、１６２４０（４×１０５出芽胞子）、または３６０８２（４×１０５出芽胞子）で尾−静脈を介して感染させたＢａｌｂ／ｃマウスの生存（群当たりＮ＝８匹マウス）。Ｌｏｇ順位検定により＊ｐ＜０．０５  ｖｓ．アジュバント対照。
【図３１】図３１は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンが、Ｃａｎｄｉｄａのいくつかの非ａｌｂｉｃａｎｓ種で感染させたＢａｌｂ／ｃマウスにおける組織真菌負荷を低下させることを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（群当たりｎ＝５）をＣＦＡまたはＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（２０μｇ）でワクチン接種し、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓまたはＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓで尾−静脈を介して感染させた。感染接種物を種の名称の下に括弧に入れて示す。腎臓真菌負荷は感染から５日後に決定した。ｙ軸はアッセイの検出の下限を反映する。多数の比較のための非パラメーターＳｔｅｅｌ検定により＊ｐ＜０．０５  ｖｓ．アジュバント対照。
【図３２】図３２は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎに対して交差反応した抗体を、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ−免疫化マウスが生じたことを示す。ＣＦＡ単独、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ、またはＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎで免疫化した個々のマウスの力価。ＣＦＡおよびＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎについて群当たりＮ＝７匹マウス；ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎについてｎ＝６匹マウス。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定により＊ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＣＦＡ単独；＊＊ｐ＜０．００２  ｖｓ．ＣＦＡ単独＆  ｐ＜０．０１１ｖｓ．ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ。棒線はメジアンを示す。
【図３３】図３３は、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ双方がインビボ遅延型過敏応答につきマウスをプライムしたことを示す。マウス（ＣＦＡおよびＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎについて群当たりｎ＝７；ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎについてｎ＝６）をＣＦＡ単独、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ、またはＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチン接種した。インビボでの遅延型過敏を足蹠膨潤によって測定した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によって＊ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＣＦＡ単独。棒線はメジアンを示す。
【図３４】図３４は、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、ネズミの血行的に播種性のカンジダ症に対する同様な有効性を媒介したことを示す。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの５×１０５出芽胞子で尾−静脈を介して感染させたＢａｌｂ／ｃマウス（ＣＦＡおよびＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎについての２つの実験からの群当たりｎ＝１５、およびＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎについて２つの実験からｎ＝１４）の生存。実験は感染から２８日後に停止させ、全ての残りのマウスは良好に見えた。Ｌｏｇ順位検定により＊ｐ≦０．０００１  ｖｓ．ＣＦＡ対照。
【図３５】図３５は、インビボ遅延型過敏が播種性カンジダ症の間の生存と相関したことを示す。抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎまたは抗ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ抗体力価および足蹠膨潤反応を、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓでの尾−静脈を介する感染の２日前にマウス（ＣＦＡまたはＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎについて群当たりｎ＝７、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎについてｎ＝６）において測定した。Ｓｐｅａｒｍａｎ順位和検定で決定した相関。
【図３６】図３６は、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンがネズミ口腔咽頭カンジダ症の間において組織真菌負荷を有意に低下させたことを示す。口腔咽頭カンジダ症を持つマウス（ＣＦＡについてｎ＝７、およびｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチン接種群について８）における舌真菌負荷。ｙ軸はアッセイの検出の下限を反映する。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定により＊ｐ＝０．００５  ｖｓ．ＣＦＡ。
【図３７】図３７は、ネズミカンジダ膣炎におけるＣＦＡ単独およびＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ双方と比較して、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎが膣真菌負荷を低下させたことを示す。ＣＦＡ、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ、またはＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチン接種したマウス（２つの実験からの群当たりｎ＝１１）における膣真菌負荷。ｙ軸はアッセイの検出の下限を反映する。多数の比較のためのＳｔｅｅｌ検定により＊ｐ≦０．０２  ｖｓ  ＣＦＡおよびＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよび黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）はヒトにおける一般的な病原体である。例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは通常は無害な片利共生生物であるが、この生物は膣および／または口腔咽頭カンジダ症のような表層粘膜皮膚感染から、播種性カンジダ症における深器官関与の範囲の種々の疾患を引き起こし得る。病気を引き起こすに先立って、真菌は胃腸管および、ある場合には皮膚および粘膜でコロニー化する。宿主粘膜表面への接着はこの初期工程の鍵となる要件である。コロニー化後に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓは感染された血管内デバイスを介して、または化学療法、またはストレス潰瘍によって危うくされる胃腸粘膜を通じる移動によって血流に入る。次いで、生物が血流を介して散在し、血管内皮に結合し、それに貫入して、血管ツリーから脱出し、肝臓、脾臓および腎臓のような深い器官に侵入する。
本明細書中に記載された種々の例示的なＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーの同定および機能的特徴付けは、タンパク質のこのメンバーがカンジダ症の治療で効果的に利用されるのを可能とする。多用な基材および他の選択的細胞接着機能に対する特異的結合活性は、能動的または受動免疫のためのワクチンの生産において、宿主細胞の結合、吸着または侵入を阻害することによって初期感染を低下または予防するための細胞接着のペプチド、ミメティック阻害剤のアナログにおいて開発することができる。さらに、異なる結合および侵入プロフィールは、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーの活性の広いスペクトルまたは標的化阻害の設計および使用を可能とする。加えて、結合および／または侵入活性を付与する機能的断片は、望まない外来性タンパク質配列の排除を可能とし、かくして、Ａｌｓファミリータンパク質メンバーワクチンまたは治療阻害剤の効力を増大させる。
【００１１】
内皮細胞への接着によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの病原性の性質は、ここに具体的に引用してその全体を援用する米国特許第５，５７８，３０９において議論されている。アドヘシンとしての遺伝子産物の特徴付けを含めた、Ａｌｓ１遺伝子およびその特徴の記載については、Ｆｕ，Ｙ．，Ｇ．Ｒｉｅｇ，Ｗ．Ａ．Ｆｏｒｉｚｉ，Ｐ．Ｈ．Ｂｅｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｊ．Ｅｄｗａｒｄｓ，ａｎｄ  Ｓ．Ｇ．Ｆｉｌｌｅｒ．１９９８．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ｇｅｎｅ  ＡＬＳ１  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：１７８３−１７８６；Ｈｏｙｅｒ，Ｌ．Ｌ．１９９７．Ｆｕ  Ｙ，Ｉｂｒａｈｉｍ  ＡＳ，Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ＤＣ，Ｃｈｅｎ  Ｙ−Ｃ，Ｆｒｅｎｃｈ  ＳＷ，Ｃｕｔｌｅｒ  ＪＥ，Ｆｉｌｌｅｒ  ＳＧ，Ｅｄｗａｒｄｓ，ＪＥ，Ｊｒ．２００２．Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  Ａｌｓ１ｐ：ａｎ  ａｄｈｅｓｉｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ａ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＦＧ１  ｆｉｌａｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４４：６１−７２，Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ＤＣ，Ｙｅａｍａｎ  ＭＲ，Ｗｅｌｃｈ  ＷＨ，Ｐｈａｎ  ＱＴ，Ｆｕ  Ｙ，Ｉｂｒａｈｉｍ  ＡＳ，Ｆｉｌｌｅｒ  ＳＧ，Ｚｈａｎｇ  Ｍ，Ｗａｒｉｎｇ  ＡＪ，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊｒ．，ＪＥ  ２００４．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７９：３０４８０−３０４８９．Ｔｈｅ  ＡＬＳ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ  Ｓａｌｓｉｍｏｒｇｅ，Ｉｔａｌｙ：（Ａｂｓｔｒａｃｔ）；Ｈｏｙｅｒ，Ｌ．Ｌ．，Ｓ．Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ａ．Ｒ．Ｓｈａｔｚｍａｎ，ａｎｄ  Ｇ．Ｐ．Ｌｉｖｉ．１９９５．Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＬＳＩ：ｄｏｍａｉｎｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ａ  Ｓａｃｃｈａｒｏｎｚｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｅｘｕａｌ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：３９−５４参照。
【００１２】
この点に関しては、ヒト真菌病原体Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓはコロニー化し、広く種々の宿主の組織に侵入する。宿主構成要素への接着はこのプロセスにおいて重要な役割を演じる。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  Ａｌｓタンパク質ファミリーの２つのメンバー（Ａｌｓ１ｐおよびＡｌｓ５ｐ）は、接着を媒介することが判明しており、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーの結合、接着および細胞侵入活性が例示される。本明細書中に記載されるように、Ａｌｓ遺伝子ファミリーの膜をクローン化し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現させて、それらの個々の機能を特徴付けた。区別されるＡｌｓタンパク質は区別される接着プロフィールを多様な宿主基材に付与した。キメラＡｌｓ５ｐ−Ａｌｓ６ｐ構築物を用い、基材特異的接着を媒介する領域はＡｌｓタンパク質におけるＮ末端ドメインと突き止められた。具体的には、Ａｌｓタンパク質のサブセットもまた、細胞内皮侵入を媒介したが、これはこのファミリーのこれまでは未知であった機能である。これらの結果と合致して、相同モデリングは、Ａｌｓメンバーが、免疫グロブリンスーパーファミリーの接着または侵入と類似の拡大された領域が間に存在する反−平行β−シートモチーフを含有することを明らかにした。この知見は、Ａｌｓ１ｐのＮ末端ドメインの円二色およびフーリエ変換赤外分光分析を用いて確認された。アミノ酸過敏の特異的領域がＡｌｓタンパク質のＮ末端ドメイン内に見出され、エネルギー−ベースのモデルは、恐らくはＡｌｓファミリーメンバーの多様な機能を支配するＮ末端ドメインにおける同様性および差を予測した。まとめると、これらの結果は、Ａｌｓファミリー内の構造的および機能的多様性は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに、感染の間に広い範囲の宿主構成要素を認識し、それと相互作用できる細胞壁タンパク質のアレイを供することを示す。
【００１３】
本発明は、医薬上許容され得る媒体中の、細胞接着活性を有する単離されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその免疫原性断片、およびアジュバントを有するワクチンを提供する。該ワクチンは、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａまたはＣａｎｄｉｄａ、ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓのようなＣａｎｄｉｄａ種に由来するＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーであり得る。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、例えば、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐ、またはその免疫原性断片であり得る。Ｃａｎｄｉｄａ種内の全ての他のＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、同様に、本発明のワクチンとして使用することができる。
【００１４】
本発明は、播種性カンジダ症を治療し、予防し、または緩和するためのワクチンとしてのＣ．ａｌｂｉｃａｎｓアグルチニン様配列タンパク質ファミリーメンバーの遺伝子産物を利用する。該ワクチンはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの異なる株に対して、ならびに異なるＣａｎｄｉｄａ種に対して効果的である。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、例えば、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐであり得る。本発明は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓによる内皮細胞および／または上皮細胞への接着および侵入、および生物の病因を遅らせるためのワクチンとして使用されるＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー−発現表面タンパク質の罹患性におけるＡＬＳ遺伝子の役割を探求する。
【００１５】
本発明に従うと、ＡＬＳファミリーメンバー遺伝子は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する免疫治療戦略の標的として選択される表面アドヘシンをコードする。ＡＬＳ１遺伝子の発現産物であるＡｌｓ１ｐタンパク質は表面タンパク質に典型的な構造的特徴を有し、事実、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの細胞表面で発現されることを示すのは、宿主組織へのアドヘシンとして作用するタンパク質についての１つの基準である。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、Ｃ−末端におけるグリコシルホスファチジルイノシン（ＣＰＩ）繋留配列、およびスレオニンおよびセリンがリッチな反復を含む中央領域を有するものとして構造的に特徴付けることができる。また、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、細胞表面に発現されるタンパク質に典型的なＮ−およびＯ−グリコシル化部位を有する。ＡＬｓ１ｐのＮ末端に対して向けられたモノクローナル抗体を用いる間接的免疫蛍光は、例えば、ＡＬｓ１ｐが出芽胞子の対数期の間に発現されることを明らかにした。ＡＬｓ１ｐのこの発現は菌糸形成の間に増加し、菌糸エレメントが拡散した表面染色によって示されるように出芽胞子から伸びる接合点に位置する。さらに、このモノクローナル抗体は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ過剰発現突然変異体の内皮細胞への増強された接着をブロックし、それにより、ＡＬｓ１ｐを用いる免疫療法適用についての原理を確立する。機能的特徴は、それが他のＡｌｓファミリーメンバーの細胞接着および侵入に関するので、実施例ＶＩにおいて後にさらに記載する。
【００１６】
かくして、１つの態様によると、本発明は、医薬組成物に処方し、アジュバントを含むまたは含まないワクチンとして投与した場合に有用な特性を有する、例えば、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐと命名されたＡｌｓファミリーメンバー表面接着タンパク質またはその機能的断片、コンジュゲートまたはアナログを提供する。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー、２以上のＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーまたは１以上のその機能的断片、アナログ、コンジュゲートまたは誘導体の組合せは、たとえば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓから得ることができる。同様なアドヘシンまたはインバシン分子、またはそのアナログまたは誘導体はカンジダ起源のものとすることができ、たとえば、属Ｃａｎｄｉｄａ、たとえば、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａおよびＣａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓに属する種から得ることができる。本発明による表面アドヘシンまたはインバシンタンパク質は単離されたまたは純粋な形態で得ることができ、かくして、本発明の１つの実施形態によると、実質的に純粋なＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーＣａｎｄｉｄａ表面アドヘシンタンパク質、またはその機能的断片、免疫原性断片、アナログ、コンジュゲートまたは誘導体は、ワクチンとして処方されて、患者において免疫応答を引き起こして、Ｃａｎｄｉｄａに対して免疫応答を誘導し、および／または該生物の内皮細胞への接着をブロックする。無傷Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーと同様な結合、接着または侵入活性を呈するＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーの断片を、本明細書中においては、機能的断片という。Ｃａｎｄｉｄａ種に対する抗体または細胞性免疫応答を誘導することができるＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーの断片を、本明細書中においては、免疫原性断片という。例示的な機能的断片は実施例ＶＩにおいて後にさらに記載するＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーのＮ末端ポリペプチド領域を含む。例示的な免疫原性断片はＮ末端Ａｌｓポリペプチド領域、Ｃ−末端Ａｌｓポリペプチド領域、ならびに抗体免疫応答、細胞性免疫応答、あるいは抗体および細胞性両免疫応答を生じさせるのに十分ないずれかの他のＡｌｓ断片を含む。そのような免疫原性断片は、約４アミノ酸と小さく、かつ無傷ポリペプチド程度に大きくすることができ、ならびにその間の全てのポリペプチド長さを含む。
【００１７】
本発明による表面接着タンパク質のアナログまたは誘導体は、ＡＬＳファミリーメンバー遺伝子および／または遺伝子産物について本明細書中に記載された基準によって同定し、さらに特徴付けることができる。例えば、アナログまたは誘導体のヌル突然変異体は、対照と比較して、内皮細胞に対して顕著に低下した接着を有するであろう。同様に、適切なモデルにおけるアナログまたは誘導体の過剰発現は、対照と比較して内皮細胞への増大した接着を示し、前記した基準に従うと細胞表面アドヘシンとして確認される。また、アナログまたは誘導体に対する抗血清は抗Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー抗体と交差反応することができ、本明細書中に開示されたような播種性カンジダ症のマウスモデルに投与した場合に、増大した生存時間を呈することができる。
【００１８】
また、本発明は、播種性カンジダ症を治療または予防する方法を提供する。該方法は、医薬上許容され得る媒体中の、細胞接着または侵入活性を有する単離されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその免疫原性断片を含むワクチンの免疫原性量を投与することを含む。該ワクチンはアジュバントと共に、またはそれ無くして投与することができる。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーは異なるＣａｎｄｉｄａ株から、ならびにＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａおよびＣａｎｄｉｄａ、ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓのような異なるＣａｎｄｉｄａ種から由来することができる。播種性カンジダ症を治療または予防する方法で用いるＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーはＡｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐを含む。
【００１９】
異なるＣａｎｄｉｄａ株、異なるＣａｎｄｉｄａ種、他の細菌および感染剤に対する本発明のワクチンの有効性、およびその広い範囲の免疫活性は後にさらに記載し、実施例において例示する。例えば、実施例Ｖは、抗ＡＬＳ抗体が粘膜および血行的に播種性のカンジダ感染に対して有効的であることを示す。実施例ＶＩＩは、細胞−媒介免疫を高めることによって、マウス播種性カンジダ症の間における生存を、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでのワクチン接種が改良することを示す。実施例ＶＩＩＩは、本発明のワクチンは真菌負荷を低下させ、免疫応答性および免疫無防備マウス双方において生存を改良することを示す。実施例ＩＸは、黄色ブドウ球菌感染に対する本発明のＡＬＳワクチンの有効性を示す。実施例Ｘは、本発明のワクチンがＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの異なる株に対して、およびＣ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓおよびＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのような異なる種に対して効果的であることを例示し、異なる動物モデルにおける有効性を例示する。また、実施例ＸＩは、異なる動物モデルにおける本発明の異なるワクチンの有効性を例示し、ならびに誘導された異なる応答点および２つの代表的なＡＬＳワクチンの能力の比較を提供する。
【００２０】
さらに提供される発明は、細胞接着活性を有する単離されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその機能的断片の有効量を投与して、Ｃａｎｄｉｄａの宿主細胞または組織への結合または侵入を阻害することを含む、播種性カンジダ症を治療または予防する方法である。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーはＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａおよびＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓに由来することができる。播種性カンジダ症を治療または予防する方法で用いるＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐを含む。細胞接着活性は、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、上皮細胞または内皮細胞への結合、および／または細胞侵入への促進を含む。
【００２１】
加えて、本発明は、本明細書中に記載されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーを用いて黄色ブドウ球菌感染を治療または予防する方法も提供する。特に、黄色ブドウ球菌感染を治療または予防する方法は、医薬上許容され得る媒体中の、細胞接着活性を有する単離されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその免疫原性断片を含むワクチンの免疫原性量を投与することを含む。
【００２２】
Ａｌｓ１ｐおよびＡｌｓ３ｐは、黄色ブドウ球菌細胞表面タンパク質に対する有意な相同性のため特に効果的である。例えば、Ａｌｓ１ｐおよびＡｌｓ３ｐの配列および構造的相同性は、実施例ＩＸにおいて後にさらに記載する。本明細書中で提供される教示および指針があれば、当業者は、本発明のワクチンおよび方法を同様なＣａｎｄｉｄａおよびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）感染の治療に適用することができるのを理解するであろう。同様に、本明細書中に記載された教示および方法があれば、当業者であれば、本発明のワクチンおよび方法は、真菌、細菌などを含めた、本明細書中に記載されたＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーに対して同様な免疫原性、配列および／または構造的相同性を持つ細胞表面ポリペプチドを有する他の病原体にやはり適用することができるのを理解するであろう。
【００２３】
Ｃａｎｄｉｄａまたはブドウ球菌感染に対する細胞接着または侵入戦略の免疫療法および／またはＡｌｓポリペプチド阻害は、血管内皮細胞への結合のレベルにおいて、ならびにフィラメント化調節経路の下流エフェクタを介して働くことができる。可溶性Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーまたは機能的断片を用いる結合の免疫療法戦略または阻害はこの関係で有用である。なぜならば：（ｉ）血行的に播種性のカンジダ症および他の感染病因に関連する罹患率および死亡率は、現在利用可能な抗真菌療法でもってしても許容できないくらい高いままである；（ｉｉ）抗真菌および抗生物質耐性の上昇する発生率は、抗真菌および抗菌剤の増大する使用に関連し、（ｉｉｉ）ひどいＣａｎｄｉｄａおよびブドウ球菌感染の危険がある患者の集団はよく定義されており、非常に大きく、かつ手術後患者、移植体患者、癌患者、および低体重で誕生した幼児を含み；および（ｉｖ）ひどいＣａｎｄｉｄａ感染を発生する患者の高いパーセンテージは好中球減少症ではなく、かくして、ワクチンまたは競合ポリペプチドまたは化合物阻害剤に応答できるからである。これらの理由で、Ｃａｎｄｉｄａおよびブドウ球菌は、受動的免疫療法、能動的免疫療法、または受動的または能動的免疫療法の組合せについて魅力的な真菌および細菌標的である。加えて、Ｃａｎｄｉｄａは、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーポリペプチド、その機能的誘導体、および／または１以上のＡｌｓファミリーメンバーに結合し、Ｃａｎｄｉｄａの宿主細胞受容体への結合を妨げるその化合物またはミメティックを用いる競合阻害で魅力的である。
【００２４】
本明細書中で提供された教示および指針があれば、当業者であれば、当該分野でよく知られた免疫療法を、本発明のＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、その免疫原性断片、アナログ、コンジュゲート、および／または誘導体と共に使用して、アジュバントと共に、またはそれなくしてワクチンとして投与された医薬上許容され得る組成物中の免疫原として該分子を１以上に用いることができるのを理解するであろう。本発明の目的では、用語「医薬の」または「医薬上許容され得る」とは、非毒性であり、望まれた場合、安全にヒトに投与できる担体または添加剤と共に用いられる公知の技術によって処方された組成物をいう。投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下注射を含めた良く知られた経路を用いて行うことができる。本発明のそのようなワクチンは当業者に知られた緩衝液、塩または他の溶媒を含んで、溶液中でのワクチンの活性を維持することができる。同様に、当該分野でよく知られた広い範囲のアジュバントのいずれかを本発明のワクチンと共に使用して、Ｃａｎｄｉｄａまたはブドウ球菌の罹患性宿主細胞への結合、侵入および／または感染を低下し、またはブロックすることができる治療上有効な免疫応答を誘導し、促進し、または高めることができる。
【００２５】
同様に、本明細書中に提供された教示および指針があれば、当業者であれば、投与し、細胞表面分子のその同族受容体への結合を選択的にブロックするための当該分野でよく知られた治療方法を、本発明のＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、その機能的断片、アナログ、コンジュゲート、および／または誘導体と共に使用して、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーの１以上を医薬上許容され得る組成物中で阻害剤として用いることができるのを理解するであろう。ワクチン処方に関しては、阻害性処方は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下注射を含めた当該分野でよく知られた方法を用いて同様に投与することができる。Ａｌｓファミリーメンバー受容体に結合し、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー結合をブロックするそのような阻害性組成物は当業者に知られた緩衝液、塩または他の溶媒を含んで、溶液中でのワクチンの活性を維持することができる。さらに、当該分野でよく知られた広い範囲の処方のいずれかを本発明の阻害性組成物で使用して、Ｃａｎｄｉｄａまたはブドウ球菌の罹患性宿主細胞への結合、侵入および／または感染を低下させ、または阻害するように、送達または摂取を標的化し、および／または高めることができる。
【００２６】
本発明に従う治療免疫原または受容体結合阻害剤として用いる分子に関しては、当業者であれば、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー分子を、免疫原性ワクチンまたは細胞接着もしくは侵入阻害剤としての必須の性質を失うことなく切形または断片化することができるのを認識するであろう。例えば、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーを切形して、前記した、かつ実施例において後にさらに記載する機能的特性を維持したＣ−末端からの切形によってＮ末端断片を生じさせることができる。同様に、Ｃ−末端断片は、その機能的特性を維持したＮ末端からの切形によって生じさせることができる。本明細書中で提供された教示および指針に従った他の修飾を本発明に従って行って、他のＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーの機能的断片、その免疫原性断片、アナログまたは誘導体を作成して、天然タンパク質に関して本明細書中に記載された治療上有用な特性を達成することができる。
【００２７】
本発明のＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーおよび方法の治療的有効性の１つの態様はフィラメント化の調節への干渉を達成して、生物の宿主構成要素への接着をブロックし、およびイムノエフェクタ細胞および他の生理学的メカニズムによって生物のクリアランスを高める。内皮細胞は血管系の大部分を被覆するので、抗体、Ａｌｓファミリーメンバータンパク質、ポリペプチド、またはペプチドまたはそのいずれかの組合せを用いて内皮細胞への生物の接着、侵入および／または双方をブロックする戦略は、本発明の有用な実施形態を含む。既に記載したように、そのような接着および／または侵入をブロックする戦略は、カンジダアドヘシン、インバシン、または本明細書中に開示された同族受容体に対して向けられた能動的または受動的免疫療法、あるいは阻害性結合を含む。かくして、例えば、いずれの適当な宿主もタンパク質を注射し、血清を集めて、適当な精製および／または濃縮後に所望の抗アドヘシン抗体を得ることができる。注射に先立って、アドヘシンまたはインバシンタンパク質またはその組合せを適当なビヒクル、好ましくは、多糖のような公知の免疫刺激剤、またはリポソームのような送達処方、または時間−放出組成物中に処方することができる。かくして、さらなる態様によると、本発明は、ワクチンまたはＡｌｓ受容体阻害剤として用いるため、処方中に、１以上の医薬上許容され得る賦形剤と共にカンジダアドヘシンまたはインバシンタンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
本発明の方法は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの宿主構成要素の内皮または上皮細胞への接着をブロックすることによって、あるいは例えば抗体をブドウ球菌に結合させ、免疫メカニズムに病原体を除去させることによって、カンジダまたはブドウ球菌感染を緩和し、および／または阻害するものである。かくして、本発明の１つの態様によると、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーのアドヘシンまたはインバシンタンパク質、その機能的または免疫原性断片、誘導体、アナログ、またはコンジュゲートを含む医薬組成物を、注射または注入用の生体適合性担体を含有する医薬組成物中のワクチンまたはＡｌｓ受容体阻害剤として処方し、患者に投与される。また、Ａｌｓファミリーメンバータンパク質または単離されたまたは組換えＡｌｓファミリーメンバータンパク質に対して生起された抗血清の直接的投与を用いて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの哺乳動物宿主の構成要素への接着をブロックし、またはブドウ球菌病原体の除去を行うことができる。アドヘシンタンパク質に対する抗血清は公知の技術、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９９（１９７５）によって得ることができ、それをヒト化して、抗原生を低下させる（米国特許第５，６９３，７６２参照）。またはトランスジェニックマウスにおいて生産し、編集されていないヒト免疫グロブリン遺伝子を得ることができる（米国特許第５，８７７，３９７参照）。同様に、単離されたまたは組換えＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーもまた、例えば、後に実施例に記載される組換え生産を含めた、当業者によく知られた方法を用いて生産することもできる。
【００２９】
本発明のなおさらなる使用は、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーのアドヘシンまたはインバシンタンパク質を用いて、カンジダまたはブドウ球菌感染の予防および／または緩和のためのワクチン戦略を開発する。かくして、本発明の１つの態様によると、例えば、標準免疫学技術を使用してマルチ−成分ワクチン戦略を構築することができ、これは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの接着をブロックし、またはブドウ球菌病原体の排除を行うために宿主構成要素からの免疫応答を高め、および／または誘導することができる。
【００３０】
本発明のなおさらなる使用は、例えば、ＤＮＡワクチン戦略を開発することである。かくして、本発明の１つの態様によると、例えば、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーのアドヘシンまたはインバシン、またはその機能的断片をコードするＡＬＳファミリーメンバーポリヌクレオチドを、遺伝子産物に対する免疫応答を得るように設計されたプロトコルに従って投与される。例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ  米国特許第５，７０３，０５５参照。
【００３１】
本発明のなおさらなる使用は、例えば、組合せワクチン戦略を開発することである。かくして、本発明の１つの態様によると、例えば、抗ＡＬＳタンパク質ファミリーメンバー抗体は、カンジダまたはブドウ球菌感染を治療し、および／または予防する抗体と共に用いることができる。米国特許第５，５７８，３０９参照。
【００３２】
以下の実施例は、播種性カンジダ症の予防的尺度または治療のための基礎としてのＡＬＳ１アドヘシンの免疫治療的利用性を説明する。実施例１は、ＡＬＳ１の過剰発現によって特徴付けられるＡＬＳ１ヌル突然変異体およびＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの株を調製して、内皮細胞への接着の媒介を確認することを記載する。実施例２は、Ａｌｓ１ｐの局所化、およびｅｆｇフィラメント化調節経路の関与を記載する。実施例３は、ＡＬＳ１アドヘシンタンパク質の精製を記載する。実施例４は、表面アドヘシンタンパク質のブロッキングを示すために用いられる、ＡＬＳ１表面アドヘシンタンパク質に対して生起されたウサギポリクローナル抗体の調製を記載する。実施例５は、本発明に従って本明細書中に記載されたようにＡＬＳ１表面接着タンパク質に対して生起されたポリクローナル抗体を用いてインビボにて接着をブロックして、マウスモデルにおいて播種性カンジダ症に対して保護することを記載する。実施例ＶＩは、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーの構造的および機能的特徴を記載する。
【００３３】
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響しない修飾もまた本明細書中で提供される発明の定義内に含まれることは理解される。従って、以下の実施例は本発明を説明するものであり、限定することを意図しない。
【実施例】
【００３４】
（実施例Ｉ）
（Ａｌｓ１はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの内皮細胞への接着を媒介する）
ＵＲＡブラスター技術を用いて、Ａｌｓ１ｐの発現を欠如するＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのヌル突然変異体を構築した。ａｌｓ１／ａｌｓ１突然変異体は、Ｕｒａ−ブラスター技術（Ｆｏｎｚｉ  ａｎｄ  Ｉｒｗｉｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３４，  ７１７（１９９３））の修飾を用いてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株ＣＡＩ４において以下のように構築した。２つの別々のａｌｓ１／ｈｉｓＧ−ＩＲＡ３−ｈｉｓＧ−ａｌｓ１構築物を利用して、遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を破壊した。４．９ｋｂのＡｓＬＳ１コーディング配列は、以下のプライマーを用いて高い忠実度ＰＣＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）でもって生じさせた：
【００３５】
【化１】
2014148547.tif 000002
次に、ＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローン化し、かくして、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＡＬＳ１を得た。ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ構築物をＫｐｎ１およびＨｉｎｄ３での消化によってｐＭＧ−７から放出させ、これを用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＡＬＳ１のＫｐｎ１およびＨｉｎｄ３消化によって放出されたＡＬＳ１の一部を置き換えた。最終のａｌｓ１−ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ−ａｌｓ１構築物を、Ｘｈｏｌでの消化によってプラスミドから放出させ、これを用いて株ＣＡＩ−４の形質転換によってＡＬＳ１の最初の対立遺伝子を破壊した。
【００３６】
第２のａｌｓ１−ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ−ａｌｓ１構築物を２つの工程で生じさせた。まず、ｐＭＢ７のＢｇ１２−Ｈｉｎｄ３  ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨ１−Ｈｉｎｄ３部位にクローン化し、それにより、ｐＹＣ２を得た。次いで、ｐＹＣ２をＨｉｎｄ３で消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いてｄＡＴＰおよびｄＧＴＰで部分的に満たし、次いで、Ｓｍａ１で消化して新しいｈｉｓＧＵＲＡ３−ｈｉｓＧで断片を得た。第二に、ＡＬＳ１相補的フランキング領域を生じさせるために、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＡＬＳ１をＸｂａ１で消化し、次いで、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰで部分的に満たした。この断片をＨｐａ１で消化して、ＡＬＳ１の中央部分を欠失させ、次いで、ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ断片に連結させ、ｐＹＣ３を得た。次いで、このプラスミドをＸｈｏｌによって消化して、構築物を放出させ、これを用いて、ＡＬＳ１の第二の対立遺伝子を破壊した。実験を通じて増殖曲線を作成して、生じた突然変異が増殖速度に対して影響を有しないことを確認した。すべての組込みは、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでのｐＹＦ５の消化によって生じた０．９ｋｂのＡＬＳ１特異的プローブを用いてサザーンブロット分析によって確認した。
【００３７】
ヌル突然変異体を、ヒト臍静脈内皮細胞にインビトロで接着するその能力についてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣＡＩ−１２（ＵＲＡ＋リバータント株）と比較した。接着実験では、ＹＰＤ（２％グルコース、２％ペプトン、および１％酵母エキス）での一晩の培養からの酵母細胞を、グルタミンを含むＲＰＭ１中で２５℃にて１時間増殖させて、Ａｌｓ１ｐ発現を誘導した。ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｒｖｉｎｅ，  ＣＡ）中の３×１０２生物を内皮細胞の各ウェルに加え、その後、プレートを３７℃にて３０分間インキュベートした。接種物のサイズは、ＹＰＤ寒天中での定量的培養によって確認した。インキュベーション時間の最後に、非接着性生物を吸引し、内皮細胞単層を標準的な方法にてＨＢＳＳで２回すすいだ。ウェルをＹＰＤ寒天と重ね、接着性生物の数をコロニーカウンティングによって決定した。統計学的処理はＷｉｌｃｏｘｉｎ順位和検定によって得られ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ修正にて多数の比較のために修正した。Ｐ＜０．００１。
【００３８】
図１を参照し、ＡＬＳ１／ＡＬＳ１およびａｌｓ１／ａｌｓ１株の比較は、ＡＬＳ１ヌル突然変異体はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣＡＩ−１２よりも内皮細胞に３５％未満接着した。バックグラウンド接着を低下させるために、非ＡＬＳ１発現条件下で増殖させた野生型株の接着を、Ａｌｓ１ｐを自律的に発現する突然変異体と比較した。この突然変異体は、構成的ＡＤＨ１プロモーターの制御下のＡＬＳ１の第三のコピーを野生型Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに組込むことによって構築した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにおけるＡＬＳ１の構成的発現を達成するために、平滑末端ＰＣＲ生成ＵＲＡ３遺伝子を、ｐＯＣＵＳ−２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の平滑末端Ｂｇ１２部位へ連結して、ｐＯＵ−２を得た。（ｐＬＨ−ＡＤＨｐｔから単離され、親切にも、Ａ．Ｂｒｏｗｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫによって提供された）Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１）プロモーターおよびターミネーターを含有した２．４ｋｂのＮｏｔ１−Ｓｔｕ１断片を、Ｎｏｔ１およびＳｔｕ１での消化後にｐＯＵ−２にクローン化した。ｐＯＡＵ−３と命名された新しいプラスミドは、ＡＤＨ１プロモーターおよびターミネーターの間に唯一のＢｇ１２部位を有した。ＢａｍＨ１制限酵素部位が近接するＡＬＳ１コーディング配列は、鋳型としてのｐＹＦ−５、および以下のプライマーを用いて高忠実度ＰＣＲによって生じさせた：
【００３９】
【化２】
2014148547.tif 000003
このＰＣＲ断片をＢａｍＨ１で消化し、次いで、ｐＯＡＵ−３の適合するＢｇ１２部位にクローン化して、ｐＡＵ−１を得た。最後に、ｐＡＵ−１を、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＣＡＩ−４を形質転換するに先立ってＸｂａｌによって線状化した。部位−特異的組込みは、サザーンブロット分析によって確認した。図１Ｂを参照し、このＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１株におけるＡＬＳ１の過剰発現の結果、野生型Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓと比較して内皮細胞への接着の７６％増加がもたらされた。野生型の内皮細胞接着を過剰発現突然変異体と比較するにおいて、酵母細胞を２５℃においてＹＰＤ中で一晩増殖させた。（Ａｌｓ１ｐ非誘導性条件）。Ａｌｓ１ｐ発現は、野生型のバックグラウンド接着を低下させるように誘導されず、かくして、ＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１ハイブリッド遺伝子を通じての接着においてＡｌｓ１ｐの役割を拡大した。接着性アッセイは前記したように行った。統計学的処理はＷｉｌｃｏｘｉｎ順位和検定によって得られ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ修正を施して多数の比較のために修正した。Ｐ＜０．００１。
【００４０】
モノクローナル抗Ａｌｓ１ｐマウスＩｇＧ抗体を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＹＥＸｐｒｅｓｓ（ＴＭ）酵母発現系（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて発現させたＡｌｓ１ｐの精製され切形されたＮ末端（アミノ酸＃１７から＃４３２）に対して生起させた。これらのモノクローナル抗Ａｌｓ１ｐ抗体の接着性ブロッキング能力は、１：５０希釈にて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓを抗Ａｌｓ１抗体またはマウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）いずれかと共にＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞をインキュベートすることによって評価した。その後、酵母細胞を前記した接着アッセイで用いた。統計学的処理は、Ｗｉｌｃｏｘｉｎ順位和検定によって得られ、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ修正を施して多数比較のために修正した。Ｐ＜０．００１。結果は、ＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１株の接着が２６．８％±３．５％から１４．７％±５．３％まで低下したことを明らかにした。かくして、ＡＬＳ１欠失および過剰発現の効果は、Ａｌｓ１ｐが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの内皮細胞への接着を媒介することを示す。
【００４１】
（実施例ＩＩ）
（Ａｌｓ１ｐの局所化）
アドヘシンとして機能するＡｌｓ１ｐについては、それは細胞表面に位置しなければならない。Ａｌｓ１ｐの細胞表面位置決定は、抗Ａｌｓ１ｐモノクローナル抗体と共に間接的に免疫蛍光を用いて確認した。拡散染色は、指数関数的増殖の間に出芽胞子の表面で検出された。この染色は静止相において出芽胞子では検出不可能であった。図２Ａを参照し、出芽胞子を、フィラメントを生産するように誘導すると、強い染色が観察され、これは出現するフィラメントの基部に専ら位置付けられた。免疫蛍光はａｌｓ１−ａｌｓ１突然変異体で観察されず、これは、Ａｌｓ１ｐについてのこの抗体の特異性を確認する。図２Ｂ参照。これらの結果は、Ａｌｓ１ｐが細胞表面タンパク質であることを確立する。
【００４２】
出芽胞子−フィラメント接合へのＡｌｓ１ｐの特異的位置決定は、フィラメント化プロセスにおけるＡｌｓ１ｐを示唆する。メカニズムを決定するために、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＬＳ１突然変異体のフィラメント化表現型を分析した。図３Ａを参照し、ａｌｓ１／ａｌｓ１突然変異体はＬｅｅ固体培地上での４日間のインキュベーション後にフィラメントを形成できず、他方ＡＬＳ１／ＡＬＳ１およびＡＬＳ１／ａｌｓ１株ならびにＡＬＳ１−捕捉突然変異体は共にこの時点において豊富なフィラメントを生産した。ａｌｓ１／ａｌｓ１突然変異体は、より長いインキュベーション時間の後にフィラメントを形成することができた。さらに、ＡＬＳ１の過剰発現はフィラメント化を増大させ：ＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１株は３日間のインキュベーションの後に豊富なフィラメントを形成し、他方、野生型株はこの時点において乏しいフィラメントを生産した。図３Ｂ参照。フィラメント化におけるＡｌｓ１ｐの役割をさらに確認するために、ＡＬＳ１のコーディング配列を反対向きに挿入した以外は、ＡＬＳ１過剰発現突然変異体と同様な突然変異体を用いて陰性対照を提供した。得られた株のフィラメント化表現型は、野生型株のそれと同様であることが示された。Ａｌｓ１ｐのフィラメント−誘導特性は固体媒体上で増殖させた細胞に特異的である。なぜならば、前記した株の全ては液体培地中で匹敵するほどフィラメント化したからである。データは、Ａｌｓ１ｐがフィラメント化を促進し、フィラメント化制御経路の調節におけるＡＬＳ１発現を示唆することを示す。ｅｆｇ１／ｅｆｇ１、ｃｐｈ１／ｃｐｈ１、ｅｆｇ１／ｅｆｇ  ｃｐｈ１／ｃｐｈ１、ｔｕｐ１／ｔｕｐ１、およびｃｌａ４／ｃｌａ４突然変異体を含めた、これらの経路の各々における欠点を持つ突然変異体でのＡＬＳ１発現のノーザンブロット分析を行った。図４Ａを参照し、ＥＦＧ１の双方の対立遺伝子が破壊された突然変異体はＡＬＳ１を発現できなかった。野生型ＥＦＧ１のコピーのｅｆｇ１／ｅｆｇ１突然変異体への導入はＡＬＳ１発現を回復したが、低下したレベルのものであった。図４Ｂ参照。また、図４Ａで見られるように、他のフィラメント化調節突然変異のいずれも、ＡＬＳ１発現を有意に改変しなかった（図４Ａ）。かくして、Ｅｆｇ１ｐはＡＬＳ１発現で要求される。
【００４３】
もしＥｆｇ１ｐがＡＬＳ１の発現を刺激するならば、これは今度はフィラメント化を誘導するのであるが、ｅｆｇ１／ｅｆｇ１株におけるＡＬＳ１の発現はフィラメント化を回復するはずである。ＡＤＨ１プロモーターの制御下にあるＡＬＳ１の機能的対立遺伝子はｅｆｇ１／ｅｆｇ１株に組込まれた。ＡＬＳ１遺伝子産物がｅｆｇ１ヌル突然変異体におけるフィラメント化における欠陥を補足するという確率を調べるために、Ｕｒａ  ｅｆｇ１ヌル突然変異体を、線状化ｐＡＵ−１で形質転換した。Ｕｒａ＋クローンを選択し、ＡＬＳ１の第三のコピーの組込みは、プライマーを用いるＰＣＲで確認した。得られた株はＡＬＳ１を自律的に発現し、Ｌｅｅ寒天上でフィラメント化する能力を回復した：
【００４４】
【化３】
2014148547.tif 000004
図４ＢおよびＣ参照。従って、Ｅｆｇ１ｐはＡＬＳ１発現の活性化を通じてのフィラメント化を誘導する。
【００４５】
フィラメント化はＣ．ａｌｂｉｃｉｎｓにおける臨界的なビルレンス因子であるゆえに、フィラメント化を調節する経路の表示は病因についての重要な示唆を有する。ＡＬＳ１に先立って、これらの調節経路の下流エフェクタをコードする遺伝子は同定されていない。細胞表面タンパク質をコードする２つの他の遺伝子、ＨＷＰ１およびＩＮＴＩの破壊の結果、フィラメント化欠陥を持つ突然変異体がもたらされる。ＨＷＰ１発現もまたＥｆｇ１ｐによってやはり調節されるが、ｅｆｇ１／ｅｆｇ１突然変異体におけるＨＷＰ１の自律発現はフィラメント化を回復できなかった。従って、Ｈｗｐ１ｐ単独はＥＦＧ１の下流のフィラメント化のエフェクタとして機能しない。また、ＩＮＴ１発現を制御する調節エレメントは知られていない。かくして、Ａｌｓ１ｐは、フィラメント化の下流エフェクタとして機能する同定された最初の細胞−表面タンパク質であり、それにより、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのビルレンスにおけるこのタンパク質についての中枢的な役割を示唆する。
【００４６】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓビルレンスに対するＡｌｓ１ｐの寄与は、血行的に播種性のカンジダ症のモデルでテストした。Ａ．Ｓ．Ｉｂｒａｈｉｍら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３，１９９３（１９９５）。図５Ａを参照し、ａｌｓ１／ａｌｓ１ヌル突然変異体で感染させたマウスは、ＡＬＳ１／ＡＬＳ１株、ＡＬＳ１／ａｌｓ１突然変異体またはＡＬＳ１−捕捉突然変異体で感染させたマウスよりも有意に長く生存した。感染から２８時間後に、ａｌｓ１／ａｌｓ１突然変異体で感染させたマウスの腎臓は有意に少数の生物を含有した（５．７０±０．４６  ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｇ）（双方の比較について（Ｐ＜０．０００６）。テストした時点のいずれかにおいて株のいずれかで感染させたマウスの脾臓、肺、または肝臓から回収された生物のコロニーカウントにおいて、差は検出されなかった。これらの結果は、Ａｌｓ１ｐが、感染の最初の２８時間の間のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ増殖および腎臓における執拗性で重要であることを示す。図５Ｂを参照し、感染から２８時間後のマウスの腎臓の調査は、ａｌｓ１／ａｌｓ１突然変異体が、ＡＬＳ１−捕捉株の野生型いずれかよりも、有意により短いフィラメントを生産し、より弱い免疫応答を誘導したことを明らかとした。しかしながら、感染から４０時間までは、フィラメントの長さ、およびそれらを囲う白血球の数は全ての３つの株について同様であった。
【００４７】
組織病理学で見られたａｌｓ１／ａｌｓ１突然変異体のフィラメント化欠陥は、固体培地でのインビトロフィラメント化アッセイと並行した。この突然変異体は、インビボおよびインビトロ双方において初期の時点で欠陥があるフィラメント化を示した。この欠陥は、結局は、延長された感染／インキュベーションで解決された。これらの結果が、ＡＬＳ１から独立したフィラメント化調節経路がより遅い時点で操作可能となり得ることを示唆する。感染から４０時間までのこの代替フィラメント化経路の活性化は、なぜａｌｓ１／ａｌｓ１突然変異体で感染させたマウスが引き続いて次の２から３日において死滅するかの理由のようである。
【００４８】
まとめると、これらのデータは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＬＳ１が、内皮細胞への接着およびフィラメント化双方を媒介する細胞表面タンパク質をコードすることを示す。Ａｌｓ１ｐは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにおけるいずれかの既知のフィラメント化調節経路の唯一の同定された下流エフェクタである。加えて、Ａｌｓ１ｐは血行性カンジダ感染におけるビルレンスに寄与する。Ａｌｓ１ｐの細胞表面位置およびデュアル機能性は、それを、薬物および免疫−ベースの療法双方にとって魅力的な標的とする。
【００４９】
（実施例ＩＩＩ）
（ＡＬＳ１アドヘシンタンパク質精製）
Ｅ．ｃｏｌｉによって合成されたＡＬＳ１タンパク質は免疫原として適切である。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉによって合成された真核生物タンパク質は、不適切な折畳またはグリコシル化の欠如のため機能的ではないであろう。従って、ＡＬＳ１タンパク質が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの内皮細胞への接着をブロックできるかを決定するために、該タンパク質を好ましくは遺伝子工学により作成されたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓから精製する。
【００５０】
ＰＣＲを用いて、ヌクレオチド５２から１２９６のＡＬＳ１の断片を増幅した。この１２４６ｂｐ断片は、シグナルペプチドの端部からタンデムリピートの始まりまでの予測されたＡＬＳ１タンパク質のＮ末端を含む。ＡＬＳ１の領域を増幅した。というのは、それは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａｇａ１遺伝子産物の結合領域に対するその相同性に基づいて、アドヘシンの結合部位をコードするようだからである。加えて、予測されたＡＬＳ１タンパク質のこの部分はほとんどグリコシル化部位を有さず、そのサイズはＥ．ｃｏｌｉにおける効果的な発現で適切である。
【００５１】
ＡＬＳ１の断片をｐＱＥ３２へ連結してｐＩＮＳ５を得た。このプラスミドにおいて、タンパク質をｌａｃプロモーターの制御下で発現させ、それは、それがアフィニティー精製できるように、Ｎ末端に融合した６−ｈｉｓタグを有する。我々は、ｐＩＮＳ５でＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、それを（ＩＰＴＧの存在下で）誘導条件下でそれを成長させ、次いで、細胞を溶解させた。細胞溶解物をＮｉ２＋−アガロースカラムを通して、ＡＬＳ１−６Ｈｉｓ融合タンパク質をアフィニティー精製した。この手法により、実質的な量のＡＬＳ１−６Ｈｉｓを得た。融合タンパク質をさらにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製した。ポリクローナルウサギ抗血清がそれに対して生起できるように該タンパク質を含有するバンドをゲルから切り出した。本発明による表面アドヘシンタンパク質は、本発明の精神逸脱することなく種々の公知のプロセスによって調製し、精製できることは当業者によって認識されるであろう。Ａｌｓ１ｐの配列を図７にリストする。
【００５２】
（実施例ＩＶ）
（ＡＬＳ１タンパク質に対するポリクローナル抗血清の生起）
ＡＬＳ１タンパク質に対する抗体がＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの内皮および上皮細胞、選択された宿主構成要素への接着をインビトロにてブロックするか否かを決定するために、ＡＬＳ１タンパク質で形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでウサギを接種した。用いた免疫化プロトコルは、Ｃａｎｄｉｄａの種々の種内で抗原性関係を同定した抗血清の生産用のＨａｓｅｎｃｌｅｖｅｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌによって用いられた用量およびスケジュールであった。Ｈａｓｅｎｃｌｅｖｅｒ，Ｈ．Ｆ  および  Ｗ．Ｏ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ．１９６０。Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｎ  ｓｐｅｃｅｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｃａｎｄｉｄａ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７９：６７７−６８１。対照抗血清もまた、空のプラスミドで形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに対して生起させた。全ての酵母細胞をガラクトース中で増殖させて、ＡＬＳ遺伝子の発現を誘導した。接着実験でテストする前に、血清を５６Ｃにおいて加熱−不活化させて、全ての補体活性を除去した。
【００５３】
免疫化されたウサギからの血清を、空のプラスミドで形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの全細胞で吸収させて、ＡＬＳ１タンパク質以外の酵母の成分と反応性である抗体を除去した。抗血清の力価は、ＡＬＳ１遺伝子を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いる免疫蛍光によって決定した。ＦＩＴＣ−標識抗ウサギ抗体は商業的源（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）から購入した。アフィニティー−精製二次抗体は必須であった。なぜならば、多くの市販の血清は、酵母グルカンおよびマンナンと反応性である抗体を含有するからである。二次抗体はプラスミドで形質転換されたＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓならびにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いて予めテストし、必要に応じて吸収して、いずれの抗Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは抗Ｃａｎｄｉｄａ抗体も除去した。陰性対照は１）免疫前血清、２）空のプラスミドで形質転換させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、および３）ＡＬＳ（グルコース）遺伝子の発現を抑制する条件下で増殖させた以外はＡＬＳ遺伝子で形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであった。
【００５４】
前記実験に加えて、ウエスタンブロッティングを用いて、抗血清が、それがそれに対して生起したＡＬＳタンパク質に特異的に結合するというさらなる確認を供した。ＡＬＳ１で形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを誘導条件下で増殖し、その原形質膜は標準的な方法によって単離した。Ｐａｎａｒｅｔｏｕ  Ｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｐｉｐｅｒ．１９９６．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．ｐ．１１７−１２１．ＩｎＩ．Ｈ．Ｅｖａｎｓ．（ｅｄ．），Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ。原形質膜は空のプラスミドを形質転換し、かつ同一条件下で増殖させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからも調製した。膜タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、次いで、エレクトロブロッティングによってＰＶＤＦ膜に移した。Ｈａｒｌｏｗ，ＥおよびＤ．Ｌａｎｅ．１９８８．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ。無脂肪乳でブロックした後、ブロットをＡＬＳ抗血清と共にインキュベートした。予め吸収された抗血清は、空のプラスミドを含有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから抽出されたタンパク質と反応しなかった。この抗血清はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｐＹＦ５（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ
ＡＬＳ１を発現するクローン）の内皮細胞への接着をブロックした。
【００５５】
（実施例Ｖ）
（特異的ＡＬＳタンパク質に対するポリクローナル抗体は、粘膜および血行的に播種性のカンジダ感染からマウスを予防的に保護する）
前記条件下で、ＡＬＳ遺伝子で形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのクローンの接着をブロックする抗血清を同定した後、これらの抗血清は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  での静脈内チャレンジからマウスを保護することが示された。
【００５６】
ＡＬＳタンパク質に対する抗血清を、まず、血行的に播種性のカンジダ症のネズミモデルでテストした。アフィニティー−精製抗ＡＬＳ抗体は、酵母細胞の種々の基材への接着を妨げる点において効果的である（実施例３参照）。アフィニティー−精製はこの系で有用である。なぜならば、抗体は正確に決定できるからである。さらに、分画されていない抗血清は、疑いもなく、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅキャリアー細胞上の抗原に向けられた多量の抗体を含有するであろう。これらの抗Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ抗体の多くはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに結合するようであり、結果の解釈を不可能とするようである。加えて、ＡＬＳタンパク質を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから抗体を溶出させるのに用いる手法もまた、アジュバント−様活性を有し得る少量の酵母マンナンまたはグルカンを溶出することもできる可能性が高い。免疫アフィニティー−精製抗体は使用前にさらに精製される。それはマウス脾臓細胞で予め吸着することもできる。
【００５７】
抗体用量を投与して、最も活性な免疫化プロトコルにおいて予測することができる血清抗体のレベルを画定する範囲をカバーし、およびカンジダ症のネズミモデルにおいて受動免疫で典型的に用いる抗体用量の範囲をカバーすることができる。Ｄｒｏｍｅｒ，Ｆ．，Ｊ．Ｃｈａｒｒｅｉｒｅ，Ａ．Ｃｏｎｔｒｅｐｏｉｓ，Ｃ．Ｃａｒｂｏｎ，およびＰ．Ｙｅｎｉ．１９８７，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ｏｆ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ  ｂｙ  ａｎｔｉ−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｎｗｎｓ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５５：７４９−７５２；Ｈａｎ，Ｙ．ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｃｕｔｌｅｒ．１９９５，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｏｎｓｅ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：２７１４−２７１９；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｊ．，Ｍ．Ｄ．Ｓｃｈａｒｆｆ，ａｎｄ  Ａ．Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ．１９９２，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｎｗｎｓ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４５３４−４５４１；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｅ．，Ｄ．Ｍ．Ｌｕｐａｎ，Ａ．Ｍ．Ｓｃｈｌａｇｅｔｅｒ，ａｎｄ  Ｔ．Ｒ．Ｋｏｚｅｌ．１９９０，Ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｓｏｔｙｐｅ−ｓｗｉｔｃｈ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：１９１９−１９２３参照。ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７週齢、ＮＣＩ）に、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって、マウス脾臓細胞で吸収されている抗ＡＬＳを与えた。対照マウスは、各々、マウス脾臓細胞で吸収されている予め採血した血清、無傷抗ＡＬＳ血清、またはＤＰＢＳを受けた。予備的吸収のために、２ｍｌの抗ＡＬＳまたは予め採血した血清を、１００μｌのマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、７週齢の雌、ＮＣＩ）脾臓細胞（ｍｌ当たりほぼ９×１０６細胞）と室温にて２０分間混合した。混合物を遠心（＠３００ｘｇ）によって温かい滅菌ＤＰＢＳで３分間洗浄した。この手法を３回反復した。ｉ．ｐ．注射の用量はマウス当たり０．４ｍｌであった。４時間後、マウスをＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ（株ＣＡ−１；ｉ．ｖ．注射によりマウス当たり５×１０５親水性酵母細胞）でチャレンジした。次いで、その生存時間を測定した。図６参照。
【００５８】
従前の実験は、腹腔内経路を介して投与された抗体が血清へ迅速（数分内）かつほとんど完全に移ることを示している（Ｋｏｚｅｌ  ａｎｄ  Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ、未公表観察）。抗体製剤を投与する効力についての対照として、マウスの平行群を、ＡＬＳ遺伝子で形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａで吸収されたプレ−免疫前血清から単離された抗体で処理した。生存時間および腎臓のグラム当たりの酵母の数を測定した。再度、図６を参照し、ＡＬＳ１ヌル突然変異体の１０６出芽胞子を静脈内注射によって感染したマウスは、ＡＬＳ１の１つの対立遺伝子が欠失されているＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ
ＣＡＩ−１２またはＣａｎｄｉｄ  ａｌｂｉｃａｎｓで感染させたマウスと比較した場合、より長いメジアン生存時間を有した（ｐ＝０．００３）。
【００５９】
これらの結果は、ワクチンとしてＡＬＳ１タンパク質を用いる免疫療法戦略が、播種性カンジダ症に対して保護的予防効果を有することを示す。
【００６０】
（実施例ＶＩ）
（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  のＡｌｓタンパク質ファミリーにおける機能および構造の多様性）
非接着性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの異種補足によるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓＡＬＳ１遺伝子の単離および特徴付けは従前に記載されている（Ｆｕら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：１７８３−１７８６（１９９８））。ＡＬＳ１は、内皮細胞および上皮細胞への接着を媒介する細胞表面タンパク質をコードする。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓにおけるこの遺伝子の双方のコピーの破壊は、内皮細胞への接着の３５％低下に関連しており、ＡＬＳ１の過剰発現は接着を１２５％増大させる（Ｆｕら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２））。
【００６１】
ＡＬＳＩは、Ｈｏｙｅｒらによって元来記載された少なくとも８つのメンバーよりなる多数の大きなＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子ファミリーである（Ｈｏｙｅｒら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：１７６−１８０（２００１），Ｚｈａｏら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４９：２９４７−２９６０（２００３））。これらの遺伝子は、３つのドメインによって特徴付けられる細胞表面タンパク質をコードする。Ｎ末端領域は推定シグナルペプチドを含有し、Ａｌｓタンパク質の間で比較的保存されている。この領域は、貧弱にしかグリコシル化されていないと予測される（Ｚｈａｏら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４９：２９４７−２９６０（２００３），Ｈｏｙｅｒら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５７：１５５５−１５６７（２００１））。これらのタンパク質の中央部分は可変数のタンデムリピート（長さは〜３６アミノ酸）よりなり、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー配列を含有するセリン−スレオニン−リッチなＣ−末端領域がある（上記）が続く。この遺伝子ファミリーによってコードされるタンパク質は感染の間に発現することが知られているが（Ｈｏｙｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：４２５１−４２５５（１９９９），Ｚｈａｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３：２００５−２０１７（２００３））、異なるＡｌｓタンパク質の機能は詳細に調べられていない。
【００６２】
非接着性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＡｌｓタンパク質の異種発現を行って、Ａｌｓタンパク質の機能を評価し、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓによって発現された多数の他のアドヘシンによって媒介された高いバックグラウンド接着を回避した。この異種発現系は、アドヘシンＡＬＳ１，ＡＬＳ５およびＥＡＰ１の単離および特徴付けを含めた、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ遺伝子の実験で広範に用いられてきた（Ｌｉら，Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６６−１２７３（２００３），Ｆｕら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：１７８３−１７８６（１９９８），Ｇａｕｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：５２８９−５２９４（１９９７））。後にさらに記載するように、このモデル系を用い、Ａｌｓタンパク質は、多様な接着性および侵入性機能を有することが示された。これらの結果と合致して、相同性モデリングは、Ａｌｓタンパク質が、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーのアドヘシンおよびインバシンメンバーに対して構造が密接に関連していることを示した。ＣＤおよびフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）１分光分析を用いる構造解析により、Ａｌｓ１ｐのＮ末端ドメインが反−平行βシート、ターン、α−ラセン、および免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーの構造と合致する構造決定されていないドメインから構成されることが確認された。最後に、比較エネルギー−ベースのモデルは、それらの区別される接着および侵入性生物学的機能を支配し得る異なるＡｌｓタンパク質の間でＮ末端ドメインの鍵となる物理化学的特性の差を示唆する。
【００６３】
ＡＬＳファミリーメンバーをクローン化し、およびそれらをＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現させるために、ＡＬＳＩ、−３、−５、−６、−７、および−９を後に記載するように首尾よく増幅し、発現させた。簡単に述べれば、クローニングおよび他の培養工程について、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ１５０−２Ｂ（ｌｅｕ２  ｈｉｓ３  ｔｒｐ１  ｕｒａ３）を、従前に記載されているように異種発現で用いた（Ｆｕら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：２０７８−２０８４（１９９８））。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ株ＳＣ５３１４をゲノムクローニングで用いた。全ての株を、必要に応じて１．５％バクト−寒天（Ｄｉｆｃｏ）で固化させた最小規定培地（１００μｇ／ｍｌのＬ−ロイシン、−Ｌトリプトファン、Ｌ−ヒスチジン、および硫酸アデニンを補足した１×酵母窒素ベースブロス（Ｄｉｆｃｏ）、２％グルコース、および０．５％硫酸アンモニウム）中で増殖させた。ｕｒａ−株の増殖は、８０μｇ／ｍｌウリジン（Ｓｉｇｍａ）の添加によって支持された。ＡＳＬ５を含有するプラスミドｐＧＫ１０３、ＡＬＳ１を含有するｐＹＦ５、およびＡＬＳ９を含有するｐＡＬＳｎは従前に記載されている（Ｆｕら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６６：１７８３−１７８６（１９９８），Ｇａｕｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６５：５２８９−５２９７（１９９７），Ｌｕｃｉｎｏｄら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １０２ｎｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２０４，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，Ｕｔ．（２００２））。Ａ．Ｂｒｏｗｎ（Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫ）から得られたプラスミドｐＡＤＨ１はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨＩ）プロモーターおよびターミネーターを含有し、それはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで（機能的である）Ｂａｉｌｅｙら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５３５３−５３６０（１９９６））。このプラスミドを、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＡＬＳ遺伝子の構成的発現で用いた。
【００６４】
ヒト口腔上皮および血管内皮細胞を入手し、以下のように培養した。咽頭癌腫から単離されたＦａＤｕ口腔上皮細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、その推奨されるプロトコルに従って維持した。内皮細胞は臍帯静脈から単離し、Ｊａｆｆｅらの方法の我々の従前に記載した修飾によって維持した（Ｆｕら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２），Ｊａｆｆｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２：２７４５−２７５６（１９７３））。全ての細胞培養を、５％ＣＯ２を含有する湿潤環境中で３７℃に維持した。
【００６５】
ＡＬＳ遺伝子をクローニングするために、ＡＬＳファミリーのメンバーのゲノム配列を、（ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ａｔ  ＵＲＬ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｃａｎｄｉｄａ／ｓｅａｒｃｈ．ｈｔｍｌで入手可能な）ＳｔａｎｆｏｒｄデータベースのＢＬＡＳＴサーチングによって同定した。ＰＣＲプライマーは、５’ＢｇＩＩＩおよび３’Ｘｈｏｌ制限酵素部位を取り組み、表Ｉにて以下に示されたオープンリーディングフレームの各々を特異的に増幅するように作成した（配列番号１４から１９（各々、ＡＬＳ１、３、５、６、７および９センスプライマー）；配列番号２０から２５（各々、ＡＬＳ１、３、５、６、７および９アンチセンスプライマー））。各遺伝子は、Ｅｘｐａｎｄ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（高忠実度）ＰＣＲ系（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いるＰＣＲによってクローン化した。ＡＬＳ３、ＡＬＳ６、およびＡＬＳ７をＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＳＣ５３１４ゲノムＤＮＡから増幅し、他方、ＡＬＳ１、ＡＬＳ５、およびＡＬＳ９は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓゲノムライブラリーから従前に検索されているプラスミドから増幅した（Ｆｕら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６６：１７８３−１７８６（１９９８），Ｇａｕｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６５：５２８９−５２９７（１９９７），Ｌｕｃｉｎｏｄら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １０２ｎｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２０４，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，Ｕｔ．（２００２））。配列決定のために、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した。次いで、配列が確認されたＡＬＳオープンリーディングフレームを、ＢｇｌＩＩ−Ｘｈｏｌ共−消化によってｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙから放出させ、目的のＡＬＳ遺伝子がＡＤＨ１プロモーターの制御下となるように、ｐＡＤＨ１に連結した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株Ｓ１５０−２Ｂを、酢酸リチウム方法を用い、ＡＬＳ過剰発現構築物ならびに空のｐＡＤＨ１構築物の各々で形質転換した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける各ＡＬＳ遺伝子の発現をノーザンブロット分析によって確認し、しかる後、表現型分析を行った。
【００６６】
（表Ｉ）
（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａにおける異種発現のためのＡＬＳ遺伝子のコーディング領域を増幅するのに用いるＰＣＲプライマー）
【００６７】
【表１】
2014148547.tif 000005
ＡＬＳ  ｍＲＮＡ発現は各構築物につきノーザンブロット分析によって検出した。プライマーの３つの組の使用に拘わらず、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＳＣ５３１４のゲノムＤＮＡからのＡＬＳ２およびＡＬＳ４の増幅は不成功であった。ＡＬＳ遺伝子のタンデムリピートを横切った配列決定および組立の困難性を仮定すれば、この結果は、公表されたゲノムデーターベースで現在入手可能な配列アセンブリーにおける誤差を反映する可能性がある。
【００６８】
フローサイトメトリーにより、Ａｌｓタンパク質の各々がその各Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主の表面で発現されたことが確認された。簡単に述べれば、Ａｌｓ構築物の各々についての細胞表面発現の確認は、２つの異なるポリクローナル抗Ａｌｓ抗血清を使用する間接的免疫蛍光を用いて決定した。抗血清Ａは、Ａｌｓ１ｐの４１７−アミノ酸Ｎ末端断片でのウサギの免疫化によって生じた、抗Ａｌｓ１ｐ抗体よりなるものであった。抗血清Ｂは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞壁成分を認識するが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ｌａｔｒｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と交差反応しないウサギ抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓマンナン因子５であった。
【００６９】
各株については、１０７出芽胞子を一晩培養から単離し、１００μｌのヤギ血清でブロックし、次いで、１：２５希釈のポリクローナル抗血清ＡまたはＢいずれかで染色し、続いて、１：１００のフルオレセインイソチオシアネート−標識ヤギ抗ウサギＩｇＧで染色した。４８８  ｎｍにおいて発光するアルゴンレーザーを備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）機器をフローサイトメトリー分析で用いた。蛍光発光は５１５／４０−ｎｍバンドバスフィルターで検出した。１０，０００事象についての蛍光を集め、ベースライン（すなわち、空のプラスミドで形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を超える蛍光を持つ細胞の分布を、ＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて各株について分析した。
【００７０】
表ＩＩに示すように、２つの区別される抗血清は、Ａｌｓｐ−発現株の全ては、空のプラスミドで形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  と比較した場合に、蛍光の少なくとも４倍増加を呈したことを示した。Ａｌｓファミリーのメンバーの中の予測された構造多様性と合致して、抗血清は、個々のＡｌｓ発現株の認識において差を呈した。
【００７１】
（表ＩＩ）
（フローサイトメトリー分析によるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面上のＡｌｓタンパク質の検出）
ポリクローナル抗Ａｌｓ１ｐ抗血清（Ａ）またはポリクローナル抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞壁抗血清（Ｂ）いずれかでの間接的免疫蛍光を用い、各株の出芽胞子を染色し、次いで、フローサイトメトリーを用いて分析した。結果は、括弧に入れた−倍増加と共に、バックグラウンド（空のプラスミドで形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を超える陽性細胞のパーセンテージとして表す。
【００７２】
【表２】
2014148547.tif 000006
種々のＡｌｓタンパク質を発現したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅクローンを、種々の宿主基材に接着するそれらの能力について調べた。後に記載するように、結果は、Ａｌｓタンパク質が基材特異的接着の異なるプロフィールを呈することを示す。
【００７３】
真菌接着アッセイを行って、形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の接着特性を決定した。簡単に述べると、従前に記載された接着アッセイ（８）の修飾を以下のように使用した。ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）、ラミニン（Ｓｉｇｍａ）、またはフィブロネクチン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の０．０１  ｍｇ／ｍｌ溶液の１ｍｌを、６−ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルに加え、３７℃で一晩インキュベートすることによって、接着プレートを被覆した。内皮細胞については、第二継代細胞を、０．２％ゼラチンマトリックスを被覆した６−ウェル組織培養プレート中で密集するまで増幅させ、上皮細胞については、ＦａＤＵ細胞を、０．１％フィブロネクチンマトリックスで被覆した６−ウェル組織培養プレート中で密集するまで増殖させた（３日）。接着テストの前に、ウェルを１ｍｌの温かいハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄した。テストすべきＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を３０℃の最小規定培地中で一晩増殖させ、次いで、遠心によって収穫し、ＨＢＳＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄し、ヘマサイトメーターを用いて数えた。３００の生物を、目的の基材で被覆した６−ウェル組織培養プレートの各ウェルに加え、ＣＯ２中で３７℃にて３０分間インキュベートした。非接着性生物を、１０ｍｌのＨＢＳＳで標準化された方法にて２回洗浄することによって除去した。ウェルにＹＰＤ寒天（１％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、２％バクト−ペプトン（Ｄｉｆｃｏ）、２％Ｄ−グルコース、１．５％寒天）を重ね、接種物を定量的培養によって確認した。プレートを３０℃にて４８時間インキュベートし、コロニーをカウントした。接着は初期接種物のパーセンテージとして表した。接着の差は、単一因子偏差分析検定を用いて比較し、ｐ＜０．０１で有意と考えられた。
【００７４】
異なる基材へのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換体の接着プロフィールの顕著な差があった（図８）。Ａｌｓ１ｐ−、Ａｌｓ３ｐ−、およびＡｌｓ５ｐ−発現株はテストした全ての基材に結合したが、Ａｌｓ６ｐ−発現Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはゼラチンのみに接着し、およびＡｌｓ９ｐ−発現Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはバックグラウンドレベルを超えてラミニンのみに接着した。さらに、種々の基材への接着に定量的差があった。例えば、Ａｌｓ３ｐと比較した場合、Ａｌｓ１ｐはより大きな接着をゼラチンに付与したが、上皮細胞にはより小さな接着を付与した（ｐ＜０．０１、単一因子偏差分析）。Ａｌｓ７ｐを発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅだけがテストした基材のいずれにも接着しなかった。Ａｌｓタンパク質発現のレベルの小さな差は表ＩＩに示された免疫蛍光実験によって排除できないが、そのような差は本実験で見出された基材特異的結合パターンが原因であるようではない。細胞表面に発現されたＡｌｓタンパク質の量のそのような全体的増加または減少は、基材を横切っての接着の釣り合った増加または減少を生じ、観察された基材特異的差をもたらすものではないと予測されるであろう。
【００７５】
後に記載されるように、Ａｌｓタンパク質に対する基材結合特異性は、Ａｌｓタンパク質のＮ末端配列に存在する。簡単に述べれば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＡｌｓ５ｐ発現は、ゼラチンおよび内皮細胞を含めた多数の基材へ接着を付与し、他方、Ａｌｓ６ｐ発現はゼラチン単独への接着をもたらした。機能のこの顕著な差にかかわらず、Ａｌｓ５ｐおよびＡｌｓ６ｐはアミノ酸レベルにおいて８０％を超えて同一である。これらのタンパク質のタンデムリピートおよびＣ−末端部分は実質的に同一であり、配列の差の大部分はこれらの２つのタンパク質のＮ末端に集中している。これらのデータはＮ末端配列の変動性が基材に特異性を付与することを示す。
【００７６】
前記した結果は、キメラＡＬＳ５／ＡＬＳ６構築物の接着表現型を決定する実験の結果によって裏付けられる。簡単に述べれば、キメラＡｌｓ５／Ａｌｓ６タンパク質は、各タンパク質のＮ末端を交換することによって構築された。キメラＡＬＳ５／６遺伝子は以下のように構築された。５’２１１７ｂｐの遺伝子を含むＡＬＳ５のＢｇｌＩＩ−ＨｐａＩ断片を単離した。次いで、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＡＬＳ６をＢｇｌＩＩおよびＨｐａＩで消化して、ＡＬＳ６の対応する５’２１２６ｂｐを放出させ、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ＋ＡＬＳ６の３’配列よりなる断片を単離し、５’ＡＬＳ５断片に連結して、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−５Ｎ６Ｃを得た。対応するＡＬＳ６の５’断片およびＡＬＳ５の３’断片を用いる同一アプローチを用いて、プラスミドｐ−ＧＥＭ−Ｔ−６Ｎ５Ｃを得た。配列確認の後、各キメラＡＬＳ遺伝子をＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ消化によって放出し、前記したようにｐＡＴＨ１にサブクローンした。次いで、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ１５０−２Ｂをこれらの構築物で形質転換し、それらの接着特性の特徴付けの前に、発現をノーザンブロット分析によって確認した。
【００７７】
Ａｌｓ６ｐのＣ末端へのＡｌｓ５ｐのＮ末端のキメラ融合を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、Ａｌｓ５ｐと同様にゼラチンおよび内皮細胞双方に接着した（図９）。同様に、Ａｌｓ５ｐのＣ末端へのＡｌｓ６のＮ末端のキメラ融合を発現する株は、Ａｌｓ６ｐを発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがそうであったように、ゼラチンのみに接着した（図９）。さらに、Ａｌｓ５ｐおよびキメラＡｌｓ５Ｎ６Ｃタンパク質を発現する株は、フィブロネクチン−被覆ビーズを凝集させ、他方、Ａｌｓ６ｐおよびキメラＡｌｓ６Ｎ５Ｃタンパク質を発現するものは、これらのビーズに対して親和性はほとんどまたは全く有しなかった。まとめると、これらのデータは、これらの形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の接着プロフィールがＡｌｓタンパク質のＮ末端部分によって支配されていたことを示す。
【００７８】
Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーの間で示された基材特異性の差に加えて、他の生物学的機能の差も観察された。例えば、Ａｌｓタンパク質のサブセットは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによる内皮細胞侵入を媒介することが示された。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓはそれ自身のエンドサイトーシスを誘導することによって内皮細胞に侵入する（Ｆｉｌｌｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｅ．６３９７６−９８３（１９９５），Ｂｅｌａｎｇｅｒら，Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００２））。このエンドサイトーシスは、生物が内皮細胞に接着する後に起こる；しかしながら、このプロセスで必要とされるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓリガンドは未知である。さらに、区別されるカンジダリガンドは接着およびエンドサイトーシス双方で必要であるかは明らかでない。非接着性であることに加え、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは内皮細胞による有意なエンドサイトーシスを受けない。従って、Ａｌｓタンパク質がインバシンならびにアドヘシンとして働くことができるか否かをテストするために、内皮細胞に侵入するＡｌｓタンパク質を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の能力を決定した。
【００７９】
内皮細胞侵入を媒介するＡｌｓタンパク質の能力は、従前に記載された差分蛍光アッセイの修飾を用いて決定された（Ｐｈａｎら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：３４８５−３４９０（２０００））。簡単に述べれば、内皮細胞を、フィブロネクチンで被覆された１２−ｍｍ直径のカバーグラス上で密集するまで増殖させ、２４−ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に入れた。次いで、細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の各Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の１０５出芽胞子で感染させた。陽性対照として、細胞を同様な数のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ出芽胞子で感染させた。９０分間のインキュベーションの後、細胞を０．５ｍｌのＨＢＳＳで標準的な方法にて２回濯ぎ、３％パラホルムアルデヒドで固定した。内皮細胞の表面に接着したままである生物を、Ａｌｅｘａ  ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とコンジュゲートされている、ウサギ抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ抗血清（バイオデザイン）で１時間染色し、これは赤色の蛍光を発した。この抗血清は、２倍より高い希釈にてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと交差反応する。次いで、内皮細胞を、リン酸−緩衝化生理食塩水中の０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で１０分間浸透させ、その後、細胞−会合生物（内部化された＋接着性の生物）を、Ａｌｅｘａ４８８でコンジュゲートされた抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ抗血清で再度染色し、これは緑色の蛍光を発した。次いで、カバーグラスをエピ蛍光で観察した。内皮細胞によって内部化された生物の数を、（緑色の蛍光を発する）細胞−会合生物の数から（赤色の蛍光を発する）接着性生物の数を差し引くことによって決定した。少なくとも１００の生物が各カバーグラス上でカウントされ、全ての実験は少なくとも３つの別々の状況で三連にて行った。
【００８０】
フィブロネクチンビーズ接着アッセイを行って、特定のＡｌｓタンパク質の結合特徴をさらに特徴付けた。この点に関し、Ａｌｓ５ｐは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの表面で発現された場合に、フィブロネクチン−被覆ビーズの凝集を誘導するタンパク質の能力によって元来同定された（Ｇａｕｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６５：５２８９−５２９７（１９９７））。従って、フィブロネクチンのためにＡＬＳ５，ＡＬＳ６，５Ｎ６Ｃおよび６Ｎ５Ｃで形質転換されたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株を、この方法を用いてビーズ接着についてテストした（Ｇａｕｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６５：５２８９−５２９７（１９９７），（Ｇａｕｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：６０４０−６０４７（１９９９））。簡単に述べれば、トシル化磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を製造業者の指示に従ってフィブロネクチンで被覆した。次に、１０μｌの被覆ビーズ（１０６ビーズ）を、１ｍｌのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  １  ×  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液、ｐＨ７．０中の１×１０８形質転換Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと混合し、温和に混合しつつ４５分間インキュベートした。チューブを磁石中において、ビーズおよび接着性Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを非接着性生物から分離した。非接着性生物を含有する上清を吸引によって取り出し、残存するビーズを１ｍｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁させることによって３回洗浄し、続いて、磁気分離および上清の吸引を行った。最後に、洗浄されたビーズおよび接着性生物を１００μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁させ、共−凝集について顕微鏡で調べた。
【００８１】
結果は、Ａｌｓ１ｐ  Ａｌｓ３ｐおよびＡｌｓ５ｐを発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、細胞−会合生物のパーセンテージの有意な増加を呈することを示し、これは、内皮細胞に接着するそれらの能力を反映する。加えて、Ａｌｓ３ｐ、および程度は低いが、Ａｌｓ１ｐおよびＡｌｓ５ｐを発現する生物は有意な内皮細胞侵入を示した（図１０）。
【００８２】
前記した機能試験に加えて、Ａｌｓタンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーのアドヘシンおよびインバシンに相同であることも判明した。Ａｌｓタンパク質の分子モデリングにおける初期工程として、知識に基づくサーチアルゴリズムを用いて、Ａｌｓファミリーメンバーと有意な構造的同様性を共有する分子を同定した。簡単に述べれば、相同性およびエネルギー−ベースのモデリングを行って、Ａｌｓタンパク質の総じての物理化学的特徴を比較した。まず、知識に基づく方法（ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ）（Ｇｕｅｘら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８：２７１４−２７２３（１９９７），Ｓｃｈｗｅｄｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３３８１−３３８５（２００３））を用いて、相同な立体配座を持つタンパク質についてのＳｗｉｓｓおよびＢｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データベースにおいて構造のコンビナトーリアル拡張構造配列を分析し、比較した（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１：７３９−７４７（１９９８））。このアプローチは、ＥｘＮＲＬ−３Ｄデータベースにおいて一次配列同様性についてサーチするためのＢＬＡＳＴＰ２アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））を含んだ。平行して、動的配列整列アルゴリズムＳＩＭ（Ｈｕａｎｇら，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１２：３３７−３６７（１９９１））を用いて、最大の配列同一性を持つ候補鋳型を選択した。引き続いて、ＰｒｏＭｏｄｌｌを用いて、一次および洗練されたマッチ分析を行った。得られたタンパク質を、Ａｌｓタンパク質骨格軌跡の相同性モデリングのための鋳型として用いた。
【００８３】
Ａｌｓタンパク質のＮ末端ドメイン（例えば、アミノ酸１から４８０；初期タンデムリピートに先行）の頑強なモデルを、相補性アプローチを介して作り出した。Ａｌｓタンパク質のＮ末端ドメインを、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション（ＳＧＩ，Ｉｎｃ．）でオペレートするＳＹＢＹＬ  ６．９．１ソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用いて配列相同性（Ｃｏｍｐｏｓｅｒ（Ｔｏｐｈａｍら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．５７：１−９（１９９０））およびネジ処理方法（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  （Ｇｏｄｚｉｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：２２７−２３８（１９９２））および遺伝子−折畳（Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：１４３１−１４４０（１９９８），Ｇｏｄｚｉｋら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：４０９−４１６（１９９５），Ｇｏｄｚｉｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１２０９８−１２１０２（１９９２），Ｇｏｄｚｉｋら，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．７：３９７−４３８（１９９３））によって推定溶液立体配座に変換した。得られたコンフォーマーおよび標的Ａｌｓドメインのアミノ酸側鎖を分子ダイナミックスによって洗練し、ＡＭＢＥＲ９５強制場方法（Ｄｕａｎら，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２４：１９９９−２０１２（２００３））およびＰｏｗｅｌｌミニマイザー（Ｐｏｗｅｌｌら，Ｍａｔｈ．Ｐｒｏｇｒａｍ  １２：２４１−２５４（１９７７））を用いて株エネルギーを最小化した。
【００８４】
これらのアプローチは、ペプチド骨格原子の位置が固定された側鎖相互作用を最適化する。好ましい立体配座は、水性溶媒中の拡大された分子ダイナミックスから決定された。次に、全てのペプチド結合のねじれ角を最小の拘束にて１８０±１５°に調整した。いくつかの場合において、拘束なしで、またはα−ラセン領域を０．４−ｋＪペナルティーをカノニカルラマチャンドラン（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ）φおよびΨ角度に適用することによって拘束して、分子ダイナミックスを実行した。最終全エネルギー最小化を、全ての拘束および凝集体の除去の後に各モデルについて行った。得られたＡｌｓのＮ末端ドメインモデルは３つの基準：（ｉ）最も好都合な歪みエネルギー（分子メカニックス）；（ｉｉ）経験的位置エネルギー関数；および（ｉｉｉ）潜在的ジスルフィドブリッチングの空間的配置の保存に基づいて優先させた（Ｇｏｄｚｉｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：２２７−２３８（１９９２），Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４−１７０（１９９１），Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２７：３９６−４０４（１９９７），Ｆｉｓｃｈｅｒら，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１０：１２６−１３６（１９９６），Ｌｕｔｈｙら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：８３−８５（１９９２））。標準的な尺度を用いる相同性鋳型に対する関係においてＡｌｓモデルを確証のために評価した（ｅ−値（Ｗｅｌｃｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：７１６５−７１７３（１９９６），Ｗｅｌｃｈら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６０７４−６０８５（１９９４））。最後に、Ａｌｓモデルの物理化学的特性を、物理的特性がＡｌｓのＮ末端ドメインの水接近可能表面へ投影されるように、ＳＹＢＹＬおよびＨＩＮＴプラットフォーム（Ｋｅｌｌｏｇら，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．５：５４５−５５２（１９９１））において実行して、ＭＯＬＣＡＤ（Ｈｅｉｄｅｎら，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１４：２４６−２５０（１９９３））によって可視化した。
【００８５】
これらのモデルは、全てのＡｌｓタンパク質のＮ末端ドメインが、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーと合致して、多数の反−平行β−シートドメインを含有することを示す。結果は表ＩＩＩにて以下にまとめる。これらのタンパク質は、典型的には、それからループ／コイル構造が投影される、複雑な７−ストランド反−平行β−シートドメインよりなる。β−シートドメインは間に存在する領域によって相互から分離される。この構造は、しばしば、ビーズ−オン−ア−ストリングモチーフという。特に注意すべきは、Ａｌｓタンパク質の実質的に全てが公知のアドヘシンまたはインバシンホモログに対してモデル化されたことである（表ＩＩＩ）。同様性の異なるパターンが分析したＡｌｓタンパク質内で観察された。例えば、Ａｌｓ７ｐ以外の調べた全てのＡｌｓタンパク質は、黄色ブドウ球菌のコラーゲン−結合タンパク質との有意な相同性を共に有した。しかしながら、特異的な一次、二次および三次ホモログはほとんどのファミリーメンバーについて変化した（表ＩＩＩ）。例えば、Ａｌｓ２ｐおよびＡｌｓ９ｐは同一の一次、二次、および三次ホモログを共有した。
【００８６】
（表ＩＩＩ）
（Ａｌｓタンパク質間のホモログの比較）
各Ａｌｓタンパク質のホモログは記載された知識に基づくアルゴリズムによって同定し、１から３の構造相関の下降順でランク付けした。ＮＳ、相同性モデリングについて有意なモデルは同定されなかった（相関係数（（ｒ２）≦７０％。ＰＤＢ、バイオテクノロジー情報様式でのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒでのタンパク質データーバンクコード（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）。
【００８７】
【表３−１】
2014148547.tif 000007
【００８８】
【表３−２】
2014148547.tif 000008
Ａｌｓタンパク質は、予測されたループ／コイル構造にマップされるＮ末端超可変領域を含有するとも決定された。この点に関し、個々のＡｌｓタンパク質によって媒介される基材特異的接着の観察された差にも拘わらず、Ｎ末端ドメインにおける大きな配列の領域はこのファミリーを横切って保存されている。しかしながら、超可変領域（ＨＶＲ）１から７と命名されたＡｌｓタンパク質内の有意な多様性の７つの領域が見出された。（８以上のアミノ酸から構成される）これらの領域は、Ａｌｓタンパク質を横切っての明らかなコンセンサス同一性は含まず、かつ５０％未満のコンセンサス保存を含んだ。対照的に、介入する保存領域（ＣＲ）１から７は、Ａｌｓタンパク質を横切って３０％を超えるコンセンサス同一性、および５０％を超えるコンセンサス保存を呈した。既知の機能を持つＡｌｓタンパク質のＮ末端ドメイン（残基１から４２０）を含むこれらのアミノ酸配列の同一性プロットおよび模式的整列を図１１、ＡおよびＢに掲げる。特に、相同性モデリングは、異なるＡｌｓタンパク質のＨＶＲが、配列は識別可能でありつつ、ＣＲのβ−シート成分から投影される同様なループ／コイル構造に適合すると予測されることを明らかとした。かくして、これらの保存されたＨＶＲの存在は、それらが宿主構成要素と相互作用するのに入手可能であることを示す。
【００８９】
前記した相同性モデリングおよび関連決定に加えて、経験的決定は、加えて、Ａｌｓ１ｐのＮ末端ドメインの予測される構造を確認する。我々の相同性モデリングによって作り出される仮説を検定するために、ＣＤおよびＦＴＩＲ分光分析の補充的なアプローチを用い、Ａｌｓ１ｐのＮ末端ドメインの構造的特徴を決定した。Ａｌｓ１ｐのアミノ酸１７から４３２を含むこのタンパク質はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで生産され、Ｆｕら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４４：６１−７２（２００２）によって従前に記載されている。
【００９０】
簡単に述べれば、円二色スペクトルを、熱電気温度コントローラーを備えたＡＶＩＶ６２ＤＳスペクトロポラリメーター（Ａｖｉｖ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）で記録した。０．１−ｍｍ光路脱着可能水晶セルを用い、Ａｌｓ１ｐの水溶液（リン酸−緩衝化生理食塩水中１０μＭ）を２６０から１８５ｎｍまで１０ｎｍ／分の速度および０．２ｎｍの試料間隔でスキャンした。ペプチドを欠く緩衝液からのスペクトルを試料溶液から差し引いて、光散乱人工物を最小化し、最終スペクトルは２５℃で記録した８スキャンの平均であった。該機器は（＋）−１０−ショウノウスルホン酸（１−ｍｍ路長セル中１ｍｇ／ｍｌ）（Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７：２０５−２１４（１９９０））でルーチン的にキャリブレートされており、楕円度は平均残基楕円度（１）ＭＲＥ（度−ｃｍ２  ｄｍｏｌ−１）として表した。タンパク質濃度は、発現されたＡｌｓ１ｐドメインの芳香族アミノ酸組成に基づく２８０ｎｍにおける吸収によって決定された（Ｐａｃｅら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ４：２４１１−２４２３（１９９５））。ＣＤスペクトルは、インターネットに基づくＤｉｃｈｒｏｗｅｂ（Ｌｏｂｌｅｙら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８：２１１−２１２（２００２））インターフェース（ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／ｃｄｗｅｂ／ｈｔｍｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）を介してＳｅｌｃｏｎ（Ｓｒｅｅｒａｍａら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．８：３７０−３８０（１９９９））を用い、ラセン、β−シート、ターン、および乱れた構造に分割した。
【００９１】
Ａｌｓ１ｐ自己−フィルムの赤外スペクトルは、４の利得の、２５６スキャンにわたって平均され、かつ２ｃｍ−１の分解能にて、ジューテリウムトリグリシン硫酸ディテクターを備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ  ２２  ＦＴＩＲスペクトロメーター（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ）で２５℃にて記録した。５０μｌのリン酸−緩衝化生理食塩水中の５０マイクログラムのタンパク質を、５０×２０×２−ｍｍゲルマニウム減衰全反射試料結晶（Ｐｉｋｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の表面に広げ、乾燥させた。次いで、赤外スペクトルを記録するに先立って、乾燥タンパク質自己−フィルムをＤ２Ｏで１時間水和させた。赤外スペクトルのアミドＩバンドを、曲線−フィッティングソフトウェア（ＧＲＡＭＳ／３２，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５；Ｇａｌａｃｔｉｃ）を備えた成分ピークの面積計算によって二次立体配座について分析した。種々の立体配座についての周波数限界は以下の通りであった：α−ラセン（１６６２−１６４５  ｃｍ−１）、β−シート（１６３７−１６１３および１７１０−１６８２  ｃｍ−１）、β−ターンループ（１６８２−１６６２  ｃｍ−１）、および乱れた構造（１６４５−１６３７  ｃｍ−１）（５０−５２）。
【００９２】
Ａｌｓ１ｐのＮ末端ドメインの円二色結果を図１２Ａに示し、これは、２１７ｎｍにおける二色最小、および２００ｎｍ近くの強い正の二色最大を明らかとする。これらの特徴は、支配的な反−平行βシート成分を有するタンパク質の特徴である。ＣＤスペクトルの分解は、タンパク質は５０．１％βシートの立体配座を採り、他方、他の構造クラス寄与は乱れた構造（２６．９％）、ターン構造（１９．３％）、およびα−ラセン（３．７％）を含む。
【００９３】
図１２Ｂに示すように、水和したＡｌｓ１ｐの自己−フィルムのＦＴＩＲ測定により、試料が支配的なβ−シート立体配座を有することが強く確認された。これらのスペクトルにより、１６３４および１６２８ｃｍ１に中心があるピークを持つ強い低周波数アミドＩバンド、および１６８５ｃｍ−１に中心がある弱い高周波数バンドが明らかにされた。タンパク質アミドＩ赤外スペクトルの高および低周波数成分へのこの周波数分裂は、分子間反−平行β−シートの間の転移二極結合の効果に典型的であることが示されている（Ｈａｌｖｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６７０１−６７０３（１９９１））。スペクトルの曲線フィッティングは、タンパク質構築物が〜５７．２％反平行β−シートであることを示した。ＩＲスペクトルの曲線フィッティングからの他の二次構造立体配座は、乱れた構造（２０．５％）、ターン成分（１３．３％）、およびα−ラセン（９．０％）を含む。
【００９４】
一緒にすると、ＦＴＩＲおよびＣＤデータは、Ａｌｓ１ｐのＮ末端が、構造度が低い領域が中間に存在する、従たるα−ラセンおよびターン成分を含有する反−平行β−シート構造の支配的なドメインを含有することをさらに裏付ける。
【００９５】
三次元モデルは、さらに、ＡｌｓのＮ末端ドメインの間の物理化学的区別を示す。この点に関し、分子モデルは、宿主細胞およびいくつかの基材とのそれらの相互作用に影響するようであるＡｌｓタンパク質のＮ末端ドメインの予測された物理化学的属性の差を示した。図１３に示すように、Ａｌｓタンパク質は、疎水性、電荷、および水素結合ポテンシャルの表面分布に基づいて３つの区別される群に分離可能である。Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐおよびＡｌｓ５ｐは、各々、これらの特性の同様なパターンを共に有し、かくして、Ａｌｓ群Ａと考えられる。対照的に、Ａｌｓ６ｐおよびＡｌｓ７ｐのＮ末端ドメイン（Ａｌｓ群Ｂ）の予測された物理化学的特性は、Ａｌｓ群Ａのそれからの顕著な差を有する（図１３）。Ａｌｓ群Ａのメンバーにおけるカチオンポテンシャルは、典型的には、それらの中性またはアニオン面から分離されるが、正の電荷はＡｌｓ群ＢのメンバーＡｌｓ６ｐおよびＡｌｓ７ｐの全表面を横切って広く分布している。最後に、Ａｌｓ２ｐ、Ａｌｓ４ｐ、およびＡｌｓ９ｐのＮ末端は、Ａｌｓ群ＡまたはＢタンパク質いずれかとは構造的に異なるＡｌｓタンパク質の第三の群（Ａｌｓ群Ｃ）を構成するようである。Ａｌｓ群Ｃタンパク質は、疎水性または静電分布の点でＡｌｓ群Ｂタンパク質よりもＡｌｓ群Ａにより同様なように見えるであろう。
【００９６】
接着機能を持ついくつかのタンパク質はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓにおいて同定されている。Ｈｗｐ１ｐは、哺乳動物トランスグルタミナーゼに対する基質として作用することによって、頬上皮細胞への接着を媒介することが示されている（５）。ＥＡＰ１は、最近、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける異種発現によって同定されており、ポリスチレンおよび腎臓上皮細胞への接着をインビトロで媒介する（７）。Ａｌｓタンパク質ファミリーの８つのメンバーのうち、Ａｌｓ１ｐおよびＡｌｓ５ｐのみが機能的見込みから研究されている。Ａｌｓ１ｐの異種発現は、ヒト血管内皮細胞および上皮細胞への結合を媒介することが示されており、遺伝子分布実験を介してＣ．ａｌｂｉｃａｎｓにおいて確認されているという知見である（Ｆｕら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２），Ｆｕら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６６：１７８３−１７８６（１９９８））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＡＬＳ５の異種発現は接着性をコラーゲン、フィブロネクチン、ウシ血清アルブミン、およびラミニンに付与する（Ｇａｕｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６５：５２８９−５２９７（１９９７），Ｇａｕｒら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：６０４０−６０４７（１９９９），Ｇａｕｒら，Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ａｄｈｅｓ．９：４５−５７（２００２））。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのアドヘシンの基材特異性の大規模な比較は行われたことがない。本実験において、我々は、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーの構造的に多様な群の接着特性を比較した。我々のデータは、Ａｌｓタンパク質が、種々のヒト基材への接着に対する特異性の重複するスペクトルを持つ表面タンパク質の多様なファミリーを含むことを示す（図８）。さらに、本ドメイン交換実験からの結果は、Ａｌｓタンパク質のＮ末端ドメインが、それらの基材接着性プロフィールの特性を付与することを示す。
【００９７】
接着性を媒介するに加え、我々のデータは、Ａｌｓタンパク質はインバシンとしても機能できることを示唆する。興味あることに、Ａｌｓ１ｐおよびＡｌｓ３ｐ双方を発現するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは同様な内皮細胞接着を示したが、Ａｌｓ３ｐ−発現Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはかなり高い速度での内部化を受けた。これらの結果は、エンドサイトーシスが接着の延長であるばかりか、むしろ、リガンド−受容体相互作用によって影響され得る区別されるプロセスであることを示す。Ａｌｓタンパク質中のＮ末端配列の差は、接着で当てはまるように、これらの区別される機能を媒介するようである。
【００９８】
三次元空間に分布したタンパク質ドメインの物理化学的特性は、受容体−リガンド相互作用を支配する非常に重要な構造的特徴である（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２（１９８４），Ｗａｒｉｎｇら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｗ  Ｌｅｔｔ．３：１７７−１８４（１９９６），Ｈａｎｃｏｃｋら，Ｌａｎｃｅｔ３４９：４１８−４２２（１９９７））。Ａｌｓタンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーの他のアドヘシンおよびインバシンに特徴的な立体配座特徴を共有する。しかしながら、ここのＡｌｓタンパク質はそれらの一次ホモログが異なり、これは、Ａｌｓファミリーのメンバーが異なる基材結合プロフィールを呈することを示す実験データと合致する知見である。まとめると、Ａｌｓ相同性のこれらのパターンは、Ａｌｓタンパク質メンバーは構造および予測された折畳において全体的同様性を共有するが、機能のそれらの差の原因である区別されるＡｌｓタンパク質の間で構造的差が存在することを示す。
【００９９】
Ａｌｓファミリーメンバー構造決定に関する前記した結果は、Ａｌｓｐ１ｐのＮ末端領域が、少量の比較的構造化されていない領域と共に、ループ／コイル構造を含有する反−平行β−シートドメインから圧倒的に構成されることを示す相同性モデリングを裏付ける。これらの特徴は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーのモチーフを示す。これらの結果は、Ａｌｓ５ｐの円二色実験との有意な予測的裏付け（Ｈｏｙｅｒら，Ｙｅａｓｔ  １８：４９−６０（２００１））を示し、これは、Ａｌｓ５ｐのＮ末端が反−平行β−シートおよびループ／コイル領域の相対的圧倒性によって特徴付けられることを示す。かくして、Ａｌｓタンパク質ファミリーの全てのメンバーはこの総じての構造をかなり呈するようである。特に、前記した構造の結果もまた、ＨＶＲの多くが区別されるＡｌｓタンパク質のＮ末端中のβ−シートドメインから投影するフレキシブルなループ／コイル構造に対応することを示す相同性モデルとやはり合致する。まとめると、これらの結果は、これらの構造がＡｌｓタンパク質による基材特異的結合に一体化されることを示す（図１４）。前記した結果と合致して、マンノース−結合レクチンの類似領域、α−アグルチニン、および免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーが、基材結合特異性を付与するようである（Ｚｈａｏら，Ｈｙｂｒｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ２１：２５−３６（２００２），Ｗｏｊｃｉｅｃｈｏｗｉｃｚら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：２５５４−２５６３（１９９３））。さらに、これらの可変ループ領域の突然変異が、これらの相同タンパク質において基材結合を有意に改変する（Ｒｅｎｚら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２５：１３９５−１４０６（１９９４），Ｖｉｎｅｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２４８８−２４９７（１９９６））。
【０１００】
三次元モデリングの結果は、さらに、個々のＡｌｓタンパク質のＮ末端ドメインが、それらの接着プロフィールに関連する区別される分子シグニチュアを保有することを示す。これらのシグニチュアは、Ａｌｓタンパク質の中で構造的関係を区別する立体配置を生じる、表面領域、疎水性、および静電気電荷のようなパラメーターを取り込む。例えば、Ａｌｓ群Ａメンバー（Ａｌｓ１ｐ，Ａｌｓ３ｐおよびＡｌｓ５ｐ）のような多数の基材に結合するＡｌｓタンパク質が、立体バルク、疎水性分布、および静電ポテンシャルの点で同様な予測されるＬ−末端プロフィールを有する。なお、この群内においてさえ、該群内の機能的差を支配することができる特異的物理化学的区別が存在する（図１３）。対照的に、低下した接着能力を持つＡｌｓタンパク質は、疎水性および静電ポテンシャルを含めた、多数の物理化学的特性においてＡｌｓ群Ａタンパク質から区別されると予測される表面特徴を有する。これらの構造的特徴の差の集合効果は、区別されるＡｌｓタンパク質の特異的機能的特性をかなり付与するようである。
【０１０１】
広範な遺伝的変動性がＡＬＳ遺伝子ファミリー内で示されているＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの異なる単離体の特異的ＡＬＳ遺伝子における配列変動が観察されており（Ｚｈａｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３：２００５−２０１７（２００３），Ｈｏｙｅｒら，Ｙｅａｓｔ１８：４９−６０（２００１））、ＡＬＳファミリーの全てのメンバーが全ての単離体に存在するのではない。単一単離体における２つの異なる対立遺伝子の間の有意な配列多様性さえ見出されている（Ｚｈａｏら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４９：２９４７−２９６０（２００３），Ｚｈａｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３：２００５−２０１７（２００３））。この程度の遺伝的変動性は、これらのタンパク質が比較的高い周波数において再編成または突然変異を受け得ることを示唆する。そのようなメカニズムは、本実験において示された高度な構造的および機能的多様性を生じさせる能力を生物に供するであろう。この仮説に対する間接的裏付けは、この遺伝子が共に高突然変異性であり、これらの突然変異は選択圧に従うという双方を示唆したＡＬＳ７の対立遺伝子変動の最近の研究によって供される（Ｚｈａｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３：２００５−２０１７（２００３））。
【０１０２】
まとめると、前記結果は、構造および機能的レベルの双方において抗体およびＡｌｓタンパク質の間の類似性を示す。例えば、相同性モデリングは、これらのファミリーの構造的立体配置における同様性を過小評価しており、過剰変動はそうでなければ安定なフレームワーク内の局所化ドメインに標的化されている（例えば、Ａｌｓタンパク質のＨＶＲおよび免疫グロブリンにおけるＦａｂ領域）。さらに、抗体に関しては、ＡＬＳ遺伝子ファミリーの遺伝的変動性は、Ｃａｎｄｉｄａが、接着および侵入における特異性のスペクトルを持つタンパク質の多様なアレイを呈する機会を供するであろう。関連タンパク質のそのような群の入手可能性は、感染の間に異なる解剖学的および生理学的ニッチをコロニー化し、およびそれに侵入する生物の能力を改良するようである。
【０１０３】
本出願を通じて、種々の刊行物を括弧内に入れて引用した。これらの刊行物の開示の全体をここに引用して本明細書中に組込んで、本発明が属する分野の最先端技術を十分に記載する。
【０１０４】
本発明を開示された実施形態を参照して記載してきたが、当業者であれば、具体的実施例および前記した詳細な実験は本発明を説明するだけであることを容易に認識するであろう。本発明の精神を逸脱することなく種々の修飾を成すことができることは理解されるべきである。従って、本発明は以下の請求の範囲によってのみ限定される。
【０１０５】
（実施例ＶＩＩ）
（細胞−媒介の液性でない免疫を高めることによって、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでのワクチン接種はマウス播種性カンジダ症の間の生存を改良する）
本実施例は、Ａｌｓ１ｐの組換えＮ末端（ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ）でのＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化が、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの致死接種物での引き続いてのチャレンジの間に生存を改良したことを示す。保護的２０μｇ用量のｒＡｌｓ１ｐ−ＮはＴｈ１脾臓細胞のＣａｎｄｉｄａ−刺激を有意に増加させ、インビボ遅延型過敏を増加させた。対照的に、抗体力価は保護に相関しなかった。最後に、ワクチンはＴ細胞−欠乏マウスにおいて保護的ではなかったが、Ｂ細胞−欠乏マウスにおいては保護的であった。これらのデータは、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの作用メカニズムが、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する液性よりはむしろ細胞媒介免疫の刺激であることを示す。
【０１０６】
該実験で用いたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓはＳＣ５３１４、すなわち、Ｗ．Ｆｏｎｚｉ（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって供給された動物モデルにおいて高度にビルレントなよく特徴付けられた臨床単離体であった（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．７１：５７５６−５７６４（２００３））。該生物は、感染に先立って酵母ペプトンデキストロースブロス（Ｄｉｆｃｏ）において３回系列的に継代された。
【０１０７】
該実験で用いたマウス株はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手した雌ＢＡＬＢ／ｃマウスであった。ワクチン効力に対する年齢のインパクトを探求するために、若年性マウス（８から１０週）およびリタイアしたブリーダー（≧６月）の双方を利用した。ｉｇｈ遺伝子座のホモ接合性欠失を担う雌Ｂ細胞−欠乏マウス（Ｃ．１２９Ｂ６−ＩｇＨ−Ｊｈｄｔｍ１Ｄｈｕ）、Ｔ細胞−欠乏ヌードマウス（Ｃ．Ｃｇ／ＡｎＢｏｍＴａｃ−ＦｏｘｎｌｎｕＮ２０）、およびコンジェニック野生型ＢＡＬＢ／ｃ同腹子はＴａｃｏｎｉｃ農場（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手した。マウスを、照射した食物およびオートクレーブ処理した水を自由に備えた濾過ケイジに収容した。生存実験では、マウスを種々の用量の抗原（後記参照）で免疫化し、引き続いて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＳＣ５３１４出芽胞子の適当な接種物、またはＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）対照で尾静脈を介して感染させた。もし個々のデータベースが統計学的不均一を示さなければ、複連生存実験の結果を合わせた（後記参照）。マウスに関連する全ての手法は、動物収容および看護のためのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ指針に従い、制度的動物使用および看護委員会によって認可された。
【０１０８】
以下に記載されたｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ免疫化手法は以下のように行った。簡単に述べれば、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（Ａｌｓ１ｐのアミノ酸１７から４３２）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて生産され、ゲル濾過およびＮｉ−ＮＴＡマトリックスアフィニティー精製によって精製した（Ｆｕら，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２））。タンパク質の量は修飾されたＬｏｗｒｙアッセイによって定量した。高度な純度（約９０％）が、前記したような、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ならびに円二色性およびＦＴＩＲによって確認された。マウスは、０日目にフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合されたｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの腹腔内（ｉｐ）注射によって免疫化し、２１日目にフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むもう１つの用量の抗原でブースター注射し、次いで、ブーストから２週間後に感染した。
【０１０９】
得られた抗体力価は９６ウェルプレートにてＥＬＩＳＡによって決定した。簡単に述べれば、ウェルをＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌ  ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎのウェル当たり１００μｌで被覆した。３％ウシ血清アルブミンを含有するＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）（０．０１  ＭＴｒｉｓＨＣＩ，ｐＨ７．４，０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ）でのブロッキング工程に続いて、マウス血清を室温にて１時間インキュベートした。ウェルを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳで３回洗浄し、続いて、ＴＢＳでさらに３回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）とコンジュゲートさせたヤギ抗マウス２次抗体を１：５０００の最終希釈にて加え、プレートを室温にて１時間さらにインキュベートした。ウェルをＴＢＳで洗浄し、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、５０ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）、および１０μｌの３０％Ｈ２Ｏ２を含有する基質と共にインキュベートした。色を３０分間で発色させ、その後、１０％Ｈ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させ、光学密度（ＯＤ）をマイクロタイタープレートリーダーにて４９０ｎｍで決定した。陰性対照ウェルは希釈剤のみを受け、バックグラウンド吸収をテストウェルから差し引いて、最終ＯＤ読みを得た。ＥＬＩＳＡ力価は、正のＯＤ読みを与えた最後の血清希釈の逆数を取った（すなわち、≧陰性対照試料の平均ＯＤ＋２標準偏差）。
【０１１０】
以下に記載した他の方法は以下のように行った。簡単に述べると、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ−誘導サイトカインプロフィールを行って、細胞−媒介免疫性およびインビボサイトカインプロフィールに対するｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの効果を決定した。マウスを前記したように免疫化した。最終ブーストから２週間後に、脾臓細胞を収穫し、従前に記載されているように４×１０６細胞／ｍｌの密度にて完全培地中で培養した（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：５７５６−５７６４（２００３））。サイトカイン生産を刺激するために、脾臓細胞を熱で殺したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＳＣ５３１４芽菅と共に共培養した。我々は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの代わりに加熱して殺したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓを用いて、脾臓細胞を刺激して、感染の間にインビボ状況を模倣した。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ細胞を、グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で予め９０分間発芽させて、Ａｌｓ１ｐの発現を誘導した（Ｆｕら，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２））。得られたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ芽管を６０℃における９０分間のインキュベーションによって加熱により殺した（Ｉｂｒａｈｉｍら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：４３６８−７４（１９９５））。加熱して殺した真菌を２×１０７偽菌糸／ｍｌの密度にて脾臓培養に加えた（１白血球に対する５真菌の比率）。４８時間後に、従前に記載されているように、脾臓細胞を、細胞内サイトカイン検出およびフローサイトメトリーによってＴｈ１（ＣＤ４＋ＩＦＮ−”  ＋ＩＬ−４−）、Ｔｈ２（ＣＤ４＋ＩＦＮ−  −ＩＬ−４＋）、またはＣＤ４＋ＩＬ−１０＋周波数についてプロファイリングした（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：５７５６−５７６４（２００３））。３−色フローサイトメトリーは、製造業者の推奨に従ってＦＡＣＳＣｏｍｐソフトウェアを用い、ＣａｌｉＢＲＩＴＥビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でキャリブレートしたＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ機器で行った。データ獲得の間、ＣＤ４＋リンパ球は前方および側方散乱の連結、およびＦＩＴＣ−抗ＣＤ４抗体蛍光特性によって開閉した。各試料についてのデータは、１０，０００のＣＤ４＋リンパ球を分析するまで獲得した。結果は、Ｔｈ１またはＴｈ２細胞であった全ての開閉したリンパ球のパーセンテージのメジアン±２５および７５四分位として示す。
【０１１１】
足蹠膨潤はＯｏｍｕｒａらの方法によって決定した（４１）。簡単に述べれば、マウスを前記したように適当な用量のｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはＣＦＡ単独で免疫化した。ブーストから二週間後に、免疫化マウスのベースライン足蹠サイズを、電子デジタルキャリパーを用いて測定した。２５μｌのＰＢＳ中の５０μｇのｒＡｌｓ１ｐ−Ｎを右側足蹠に注射し、ＰＢＳ単独は免疫化マウスの左側足蹠に注射した。２４時間後に、足蹠を再度測定した。抗原−特異的足蹠膨潤を：（２４時間における右側足蹠厚み−ベースラインにおける右側足蹠厚み）−（２４時間後における左側足蹠厚み−ベースラインにおける左側足蹠厚み）として計算した。
【０１１２】
非パラメーターＬｏｇ順位テストを利用して、マウスの生存時間の差を決定した。抗体の力価、Ｔｈ１またはＴｈ２リンパ球の頻度、および足蹠膨潤を、適切には、非パラメーター多数比較のためにＳｔｅｅｌ検定（Ｒｈｙｎｅら，  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ２３：５３９−４９（１９６７））、および不対比較のためにＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によって比較した。相関はＳｐｅａｒｍａｎ順位和検定で計算した。不均一性が複連生存試験で存在するかを決定するために、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定を利用した。Ｐ値＜０．０５は有意と考えられた。
【０１１３】
ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ免疫原の最も有効な用量を決定するために、１０７−倍用量範囲を評価した（マウス当たり２０ｐｇから２００μｇ）。雌のリタイアしたブリーダーＢＡＬＢ／ｃマウスをｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ＋アジュバント（ＣＦＡ／ＩＦＡ）またはアジュバント単独で免疫化した。免疫化したマウスをブースティングから二週間後に採血して、抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ抗体力価を決定した（後記参照）。マウスを、引き続いて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（２×１０５出芽胞子）の致死接種物で感染させた。反復実験からの生存データを合わせた。というのは、個々の実験は統計学的不均一性を示さなかったからである（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定によるとｐ．＞０．０５）。２０μｇ用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎは、感染マウスの２５％の長期生存、およびアジュバント単独と比較した全生存の有意な増加（Ｌｏｇ順位検定によるとｐ＝０．０４４、図１）をもたらした。１０倍高い（図１５）または低い（データは示さず）用量いずれも、アジュバント単独と比較して生存を有意に増加させなかった。この結果は、中程度の用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンがネズミ播種性カンジダ症に対して保護を誘導することを示す。
【０１１４】
前記知見はｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンについての保護的用量を確立した。次に、ワクチンの有効性を、１０６出芽胞子で感染させたより迅速に致死的なマウスのモデルにおいて評価した（各々、メジアン生存３  ｖｓ．１１日、ワクチン接種されていないマウスにおいて１０６  ｖｓ．２×１０５接種物）。再度、反復実験からのデータを組み合わせた。というのは、個々の実験の結果は統計学的不均一性を示さなかったからである（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定によるとｐ＞０．０５）。１０６Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ出芽胞子で感染させたＢａｌｂ／ｃマウスに２０μｇ用量＋ＣＦＡとして投与した場合、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンはメジアン生存の２倍を超え、その結果、全生存の有意な増大−ｖｓ−ワクチン接種していない対照をもたらした（Ｌｏｇ順位テストによるとｐ＝０．００１、図１６Ａ）。マウスの年齢がｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンに対するそれらの応答に影響するかを決定するために、我々は若年マウスにおいてそれをテストした。若年マウスをワクチン接種し、同一の高い接種物で感染させた場合、同様な生存利益が見出された（Ｌｏｇ順位検定によるとｐ＝０．０２、図１６Ｂ）。
【０１１５】
２００μｇ用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの結果、２０μｇ用量と比較して劣った保護がもたらされたが、２００μｇ用量の抗原のみが血清抗Ａｌｓ１ｐ抗体力価の有意な増大を誘導した（２００μｇ用量  ｖｓ．全ての他の群についてｐ≦０．００５、図１７）。抗Ａｌｓ１ｐ抗体力価の有意な増加は、中程度の保護的抗原用量で検出されなかった（２０μｇ  ｖｓ．アジュバントについてｐ＝０．１）。個々のマウスの血清抗Ａｌｓ１ｐ抗体力価を各マウスの生存時間に対してプロットすると、抗体力価および生存の間で相関は見出されなかった（Ｒ２＝０．０３、Ｓｐｅａｒｍａｎ順位和検定によるとｐ＞０．０５）。事実、最高用量の抗原（２００μｇ）で免疫化したマウスは、１：１００，０００過剰の抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ抗体力価を有したが、その力価が検出の下限である（〜１：１００）抗原のより低い用量で免疫化したマウスから異ならない生存持続を有した。これらの結果は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンによって誘導された保護が抗体力価に相関するように見えないことを示す。
【０１１６】
液性免疫はｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ−誘導保護と相関しなかったので、我々は、保護および非保護用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎによって誘導された細胞−媒介免疫応答を調べた。マウスを、前記したように、０．２、２０、または２００μｇのｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ、またはアジュバント単独で免疫化した。ブーストから２週間後に、脾臓細胞を収穫し、Ａｌｓ１ｐを発現することが知られている、熱で殺した予め発芽させたＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの存在下で培養した（Ｆｕら，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２））。培養から４８時間後に、脾臓細胞をフローサイトメトリーによって細胞内サイトカイン検出のために収穫した。保護的２０μｇ用量の抗原で免疫化したマウスからのリンパ球のみが、アジュバント単独を与えられたマウスと比較してＴｈ１細胞の有意に増加した頻度を生じた（Ｐ＝０．０３、図１８）。Ｔｈ２の頻度（図１８）およびＩＬ−１０＋Ｔリンパ球の頻度（データは示さず）の有意な差は、アジュバントまたは該用量のいずれかの抗原で免疫化されたマウスの間で検出されなかった。
【０１１７】
タイプ１免疫がインビボでｒＡｌｓ１ｐ−Ｎによって刺激されたことを確認するために、足蹠膨潤によって遅延タイプ過敏をテストした。保護的２０μｇ用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでワクチン接種したマウスのみが、対照と比較して有意に増大した遅延型過敏反応を発生し、この応答は、非保護的０．２および２００μｇ用量によって誘導されたものよりもやはり有意に高かった（図１９、非パラメーターＳｔｅｅｌ検定によると、全ての比較−ｖｓ−２０μｇ用量についてｐ＜０．０５）。まとめると、これらの結果は、保護的用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ抗原が有意なＴｈ１偏光および遅延型過敏反応を誘導したことを示す。
【０１１８】
ワクチン−媒介保護における抗体およびｔ−細胞の役割を規定するために、Ｂ細胞欠乏、Ｔ細胞欠乏ヌード、またはコンジェニックＢＡＬＢ／ｃ野生型対照マウスを２０μｇのｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの＋アジュバントまたはアジュバント単独で免疫化し、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの致死接種物（８×１０５出芽胞子）で感染させた。Ｂ細胞−欠乏マウスは感染に対してより耐性である傾向があり、他方、Ｔ細胞−欠乏マウスはアジュバントのみが与えられた野生型対照マウスよりも感受性であった（各々、Ｂ細胞欠乏およびＴ細胞欠乏マウス−ｖｓ−野生型アジュバント−処理についてｐ＝０．０６５および０．０１、図２０）。最後に、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮワクチンはＢ細胞−欠乏マウスにおいてその効果を維持した（ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチン接種−ｖｓ−アジュバント単独についてｐ＝０．０４、図６）が、Ｔ細胞−欠乏マウスにおいて効果的でなかった（ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチン接種−ｖｓ−アジュバント単独についてｐ＝０．４、図２０）。これらの結果は、Ａｌｓ１ｐワクチンがＢ細胞欠乏マウスにおいて効果的であったがＴ細胞欠乏ヌードマウスにおいてはそうではなかったことを示す。
【０１１９】
前記したのは、このタンパク質のＮ末端での免疫化が、引き続いての血行的に播種性のカンジダ症の間に若年性および成熟ＢＡＬＢ／ｃマウス双方の生存を改良したことを示す結果である。特に、中間用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（２０  μｇ）は、より低い用量およびより高い用量（２００μｇ）双方と比較して優れた保護を供した。それにも拘わらず、非保護的２００μｇ用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎは免疫原性であった。というのは、それは保護的２０μｇ用量よりも１００倍高い抗体の力価を誘導したからである。
【０１２０】
最高用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎにおけるより低い保護での、逆Ｕ−形状用量−応答効力曲線は、最初に、与えられた用量の抗原による液性および細胞−媒介免疫の誘導の間の逆関係を記載したＰａｒｉｓｈら，の古典的研究を思い出させる。Ｐａｒｉｓｈの精液データとの関係で、逆Ｕ−形状用量−応答効力曲線は、もし：１）ワクチン効力が細胞−媒介免疫に依存し、および２）中程度の用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎが高い抗体−刺激用量と比較して優れた細胞−媒介免疫を刺激したならば説明することができよう。我々は、従って、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンで見られた逆Ｕ−形状用量応答効力曲線は、保護的な中程度の用量の抗原による細胞−媒介免疫の優れた誘導によるものであったと仮定した。
【０１２１】
この仮説を検定するために、Ｔｈ１細胞および遅延型過敏を刺激する高い、中程度、および低い用量の抗原の能力を決定した。脾臓細胞からのサイトカイン−生産を刺激するために、我々は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの代わりに熱で殺したＣ．ａｌｂｉｃａｎｓへの暴露によって細胞を特異的に活性化して、感染の間のインビボ状況を模倣した。保護的２０μｇの用量だけがＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ−刺激脾臓Ｔｈ１リンパ球の頻度を有意に増加させた。エクスビボＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ−刺激脾臓細胞で見られたＴｈ１の頻度は、マウスにおける播種性カンジダ症の間にインビボで検出されたのと同様であり（５９）、このアプローチの関連性を過小評価している。
【０１２２】
検出されたエクスビボＴｈ１細胞がインビボにて機能的重要性のものであるかを決定するために、我々は、異なる用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ免疫化によって誘導された遅延型過敏を比較した。Ｔｈ１細胞の頻度と一致して、保護的２０μｇ用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎだけが有意なインビボ遅延型過敏反応を刺激した。これらの結果は、ワクチン−誘導保護がタイプ１の誘導、細胞媒介免疫によるものであるという仮説と合致する。驚くべきことに、２００μｇ用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎによる顕著に上昇した抗体力価の誘導にも拘わらず、我々は、この用量でワクチン接種したマウスにおいて脾臓Ｔｈ２リンパ球の増加は見出さなかった。１つの可能な説明は、Ｔｈ２細胞が脾臓細胞よりはむしろ末梢リンパ節において活性化されたというものである。あるいは、他のＴ細胞集団（例えば、ＮＫＴ細胞）が、２００μｇ用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎに応答して見られた高い抗体力価を誘導する原因であっただろう。
【０１２３】
抗体力価および保護の間の相関の欠如は、ワクチン−誘導保護を媒介するにおける抗体の役割を完全には排除しなかった。例えば、ＥＬＩＳＡ力価は、種々の特異性および親和性を持つ抗体の列挙の結果である。従って、ワクチン−媒介保護に参画した抗体の小さなサブセットが生じたという可能性は、抗体力価を測定することによって排除することができなかった。ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチン−媒介保護における細胞−媒介の液性でない免疫の役割を確認するために、我々は、Ｂ細胞−およびＴ細胞−欠乏マウスにおけるワクチンの効果をテストした。Ｂ細胞−欠乏マウスは、野生型対照よりも播種性カンジダ症に対してより耐性である傾向があり、ワクチンの効果はＢ細胞−欠乏マウスにおいて無効にならなかった。対照的に、Ｔ細胞−欠乏マウスは野生型対照よりも播種性カンジダ症に対してより感受性であり、ワクチンの効果はＴ細胞−欠乏マウスにおいて失われた。我々の知見は、従って、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの効果はＴ細胞−媒介の主として液性ではない免疫の誘導に依存していることを確認する。同様に、Ｂ細胞―欠乏マウスはコンジェニック野生型同腹子よりも播種性カンジダ症に対してより感受性ではなかったゆえに、抗体はこのモデルにおいて播種性カンジダ症に対して支配的なエフェクタではない。
【０１２４】
まとめると、我々は、新規なｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、液性免疫よりはむしろ細胞−媒介免疫を誘導することによって実験的散在カンジダ症に対する保護を媒介すると報告する。ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの中程度の保護的効果の増強は、従って、最適化アジュバントおよび／またはサイトカインを用いる細胞−媒介免疫のさらなるプライミング、または代替免疫化経路で達成することができる。事実、我々の進行している研究においては、我々は、腹腔内と比較してｒＡｌｓ１ｐ−Ｎを皮下投与することによって効力の顕著な増大を既に見出している。
【０１２５】
（実施例ＶＩＩＩ）
（抗Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは真菌負荷を低下させ、免疫応答性および免疫無防備マウスの双方において生存を改善する）
本実施例は、免疫応答性および免疫無防備マウスの双方における皮下（ＳＱ）経路によって投与した場合の、実施例ＶＩＩに記載されたｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの効力の増強を記載する。まず、免疫応答性マウスにおけるｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの効力。アミノ酸１９から４３３の全長タンパク質を含むｒＡｌｓ１ｐ−Ｎを前記したようにＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて生産し、精製した。対象調製物を、同様に、空のプラスミドで形質転換したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから精製した。ＢＡＬＢ／ｃリタイアしたブリーダーマウス（２５から３０ｇ）を、０日目に、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）と混合したｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（２０μｇ）または対照調製物のＳＱ注射によって、続いて、２１日目にフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）中のブースター用量によって免疫化した。ブーストから２週間後に、ワクチンの免疫原性は、従前に記載されているように、遅延型過敏（ＤＴＨ）のマーカーとしての足蹠膨潤反応の強度を評価することによって確認した。ワクチン接種したマウスは、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ特異的ＤＴＨの顕著な増加を有した（図２１）。
【０１２６】
ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの効果は、感染したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける生存に対するｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチン接種のインパクトを決定することによって評価した（図２２Ａ）。ワクチン接種したまたは対照マウスを、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの迅速に致死的な接種物（２．５から５×１０５出芽胞子）で尾静脈を介して感染させた。我々は、そのような接種物で感染させたマウスがひどい敗血症ショックで死亡したことを従前に示した（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００５））。ワクチン接種は死亡までの時間を顕著に延長させ（Ｌｏｇ順位検定によると双方の接種物についてｐ＜０．０５）、３０日生存を改善した（５０から５７％  ｖｓ．０％、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｅｘａｃｔ検定によると双方の接種物についてｐ＜０．０５）。
【０１２７】
次いで、血行的に播種性のカンジダ症の間における組織真菌負荷に対するワクチン接種のインパクトを決定した。ブーストから１４日後に、ワクチン接種したおよび対照ＢＡＬＢ／ｃマウスをＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＳＣ５３１４の５×１０５出芽胞子で尾−静脈を介して感染させた。感染から６日後に、対照実験群における最初の死亡の開始の前に、腎臓を収穫し、ホモゲナイズし、Ｓａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天（Ｄｉｆｃｏ）中で定量的に培養した（１８）。ｒＡｌｓ１ｐ−ＮでのＳＱワクチン接種の結果、対照と比較して腎臓真菌負荷のメジアン１．５  ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇ減少がもたらされた（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定によるとｐ＝０．０１、図２２Ｂ）。
【０１２８】
ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの効力もまた、免疫無防備マウスにおいて評価した。免疫応答性マウスにおいて効力を証明したら、好中球減少症マウスにおいて免疫を誘導し、好中球減少症マウスを播種性カンジダ症から保護するｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの能力も評価した。ワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスを、シクロホスファミドの投与によって好中球減少症とした（記載されたように（Ｓｈｅｐｐａｒｄら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：１９０８−１１（２００４）、ほぼ１２日の好中球減少症をもたらす、感染に対して−２日に２００ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ、および＋９日に１００ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ）。足蹠膨潤反応をシクロホスファミドの最初の量から２日後に行った。ワクチン接種した好中球減少症マウスは免疫応答性マウスと同様な大きさのＤＴＨ反応を発生した（図２３Ａ  ｖｓ．１、平行して行った実験）。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの２．５×１０４出芽胞子で尾−静脈を介して感染させた好中球減少症マウスにおいて、ワクチン接種の結果、死亡までの時間（Ｌｏｇ順位検定  ｖｓ．対照によるとｐ＝０．００７）、メジアン生存時間（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定によると＞２１  ｖｓ  １２  ｄ，ｐ＝０．００８）、および全生存（８８％  ｖｓ．３８％，Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｅｘａｃｔ検定によるとｐ＝０．００５）の有意な改善がもたらされた（図２３Ｂ）。
【０１２９】
粘膜感染におけるｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチン接種の効力を決定するために、ワクチンをマウス口腔咽頭カンジダ症（ＯＰＣ）モデルでテストした（Ｋａｍａｉら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：５２５６−８（２００２）  ａｎｄ  Ｋａｍａｉら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：３１９５−９７（２００１））。ワクチン接種したマウスをコルチゾン酢酸（感染に対して−１、１および３日に２２５ｍｇ／ｋｇ  ＳＱ）で処理し、記載したように舌下感染させた。舌を感染から５日後に切り出した。ホモゲナイズした舌のコロニー形成単位は侵入性感染および表面−接着性コロニー化の間を区別できなかったゆえに、我々は組織病理学によって侵入の程度を評価した。盲検観察者（ＢＪＳ）は、舌の全長に沿ってスキャンし、４０×高−出力場当たりの真菌病巣のひどさを定量することによって各セクションをスコア取りした（０＝病巣なし、１＋＝中程度の粘膜炎症、２＋＝上皮に制限される有意な炎症、３＋＝全上皮層を通じて伸びる炎症、４＋＝上皮下まで伸びる炎症）。サンプリングの偏りを回避するために、少なくとも生きた介入組織セクションによって隔てられた各舌の２つのセクションをスコア取りした。全ての対照マウスは多数の場所においてその舌の顕著な真菌侵入を発生し、他方、唯２匹のワクチン接種したマウスがいずれかの舌病巣を発生した。全体として、対照マウスにおける舌当たりの病巣のメジアン数（７５、２５四分位）はワクチン接種したマウスについての１（２．５、０）と比較して６．５（８、５．７５）であった（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定によるとｐ＝０．０３）。感染のひどさの半定量的評価は、対照と比較してワクチン接種マウスにおいて有意な低下を示した（図２４、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定によるとｐ＝０．０３）。
【０１３０】
粘膜感染におけるｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチン接種の効力を決定するために、膣コロニー化のマウスモデルにおいてこれら２つのワクチンを評価した（Ｃｌｅｍｏｎｓら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７２：４８７８−８０（２００４）；Ｆｉｄｅｌ．Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：５１５−４８（２００２）  ａｎｄ  Ｗｏｚｎｉａｋら，ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．７０：５７９０−９（２００２））。ワクチン接種したマウスを感染に対して−３日目にエストロゲン（３０μｇ，与えられたＳＱ）で処理し、次いで、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの１０６出芽胞子を含有する１０μｌのリン酸緩衝化生理食塩水で膣においてチャレンジさせた。膣を接種から３日後に切り出し、ホモゲナイズし、系列希釈をＹＰＤプレート上で平板培養した。コロニー形成単位（ＣＦＵ）を３０から３５℃においてプレートのインキュベーションから２０から４８時間後に数えた。ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでワクチン接種したマウスから集めた膣は、対照マウス（すなわち、ＣＦＡ単独でワクチン接種したマウス）から集めた膣よりも低いＣＦＵを有したが、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでワクチン接種したマウスから集めたものはそうでなかった（図２５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定によるとｐ＝０．０１）。
【０１３１】
カンジダ症の発生率およびその継続する高い死亡率に徴すると、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．に対するワクチンの開発は非常に重要なものである。前記した結果は、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮでのＳＱワクチン接種は、免疫応答性および免疫無防備マウス双方におけるそうでなければ迅速に致死的な血行的に播種性のカンジダ症の間において、生存の顕著な改善、および真菌負荷の有意な低下がもたらされた。興味深いのは個々のワクチン接種したマウスから得られた腎臓真菌負荷の結果であり、これは、マウスのほぼ半分が５  ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇ下で腎臓真菌負荷を有したことを示す。我々は、致死的感染を示す腎臓真菌負荷の閾値は５  ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇであることを従前に見出しており；このレベルを超える腎臓真菌負荷を持つマウスは典型的には感染で死亡し、他方、この負荷未満の腎臓真菌負荷を持つマウスは感染から生存した（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ  （２００５））  ａｎｄ  （Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：５７５６−５７６４（２００３））。従って、ワクチン接種した群における突発的死亡はワクチン接種に関わらない高い真菌負荷を反映するようである。組織真菌負荷におけるマウス間変動は、宿主−病原相互作用および／または可変ワクチン応答性の複雑性を反映するであろう。
【０１３２】
まとめると、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは増大する通常のおよびかなり致死的な播種性カンジダ症の治療、ひどさの低下および／または予防で用いることができる。該ワクチンは免疫応答性マウスにおいて効果的であり、かつ効果は好中球減少症およびコルチコステロイド−処理宿主においてさえ保持される。最後に、ワクチンは膣および口腔咽頭カンジダ症を含めた粘膜皮膚カンジダ症を保護することができる。
【０１３３】
（実施例ＩＸ）
（黄色ブドウ球菌感染に対するＡｌｓワクチンの効果）
本実施例は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓからのＡｌｓタンパク質が黄色ブドウ球菌で感染させた動物モデルの生存を改善することを示す。
【０１３４】
Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのＡｌｓアドヘシンは、黄色ブドウ球菌でのアドヘシンに対して有意に相同あると同定された。この特徴を用いてＡｌｓアドヘシンを用い黄色ブドウ球菌に対する効果的なワクチンを設計し実施した。簡単に述べると、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＬＳファミリーは少なくとも９つの遺伝子よりなる（Ｈｏｙｅｒら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
１５７：１５５５−６７（２００１）；  Ｈｏｙｅｒ  ＬＬ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：１７６−８０（２００１））。前記したように、Ａｌｓタンパク質は生物学的に関連する基材へのアドヘシンとして機能する（Ｆｕら，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２）；Ｇａｕｒ  ａｎｄ  Ｋｌｏｔｚ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ  ６５：５２８９−９４（１９９７）；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：２４１５−２８（２００４）；Ｏｈら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１：６７３−８１（２００５）；Ｚｈａｏら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１：１６１９−３０（２００５））；  Ｈｏｙｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：３９−５４（１９９５））。特に、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−ＮのＮ末端は、コラーゲン結合タンパク質およびクランピング因子を含めた、病原性黄色ブドウ球菌によって発現された表面タンパク質に対して有意に相同である（表ＩＶ；Ｓｈｅｐｐａｒｄら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３０４８０−８９（２００４））。
【０１３５】
【表４】
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表ＩＶにおいて上記に掲げた相同性の計算は、配列整列および三次元表面構造の双方の特徴を考慮するものである。Ａｌｓ１ｐの相同性は、黄色ブドウ球菌のコラーゲン結合タンパク質またはクランピング因子と比較して９５％または９０％よりも大きいと計算された（ｒ２≧９０％；Ｓｈｅｐｐａｒｄら，上記）。同様に、Ａｌｓ３ｐの相同性は、黄色ブドウ球菌のコラーゲン結合タンパク質またはクランピング因子と比較して９５％または８０％よりも大と計算された（ｒ２≧９０％）。
【０１３６】
前記知見を裏付けるために、相同性およびねじ切り法を使用して、Ａｌｓ１ｐおよび黄色ブドウ球菌クランピング因子Ａの間の構造−機能調和をモデル化した（ＣｌｆＡ  −  ＰＤＢ  ｃｏｄｅ：ｃ１ｎ６７Ａ）。これらの方法は一次構造における特異的相同性を評価し、３−Ｄ立体配座およびパターン分析を行って、類似の機能モチーフを求めた。例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＰＲＯＳＩＴＥおよびＪＡＬＶＩＥＷ方法を使用して、ＡＬＳ  ｖｓ
ＣｌｆＡ一次配列の同様性および差を分析した（Ｙｏｕｎｔら  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：４３９５−４４０４（２００４）ａｎｄ  Ｙｏｕｎｔ  ａｎｄ  Ｙｅａｍａｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：７３６３−７３６８（２００４））。次いで、３−Ｄ  ＰＳＳＭを含めたインターネットベースの適用を用いて、さらなる分析のための潜在的ＡＬＳホモログを優先付けた（Ｓｈｅｐｐａｒｄら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３０４８０−３０４８９（２００４））。得られたデータに沿って、ＰＨＹＲＥ適用（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｌ．，Ｒ．Ｂｅｎｎｅｔｔ−Ｌｏｖｓｅｙ，Ａ．Ｈｅｒｂｅｒｔ，ａｎｄ  Ｋ．Ｆｌｅｍｉｎｇ；ウェブサイトは以下の通りである：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／〜ｐｈｙｒｅ／）を用いて、トポロジーマッピングを行い、および推定共有機能モチーフを同定する目的で、選択されたＡＬＳタンパク質に対する最大の構造的または機能的相同性を持つタンパク質によって共有された三次元モチーフを同定した。前記方法は公のドメインで広く入手可能であり、種々のプロテオミックおよび構造的生物学適用で用いられる。前記相同性およびねじ切り法結果に基づき、Ａｌｓ１ｐおよびＣｌｆＡの間の機能的部位相同性のコンセンサスを生じさせ、ＣｌｆＡに構築されたＡｌｓ１ｐモデルの特異的残基にマッピングした。いくつかの特別な知見は、以下に記載するこれらのモデリング分析から生じた。
【０１３７】
まず、Ａｌｓ１ｐおよびＣｌｆＡのＮ末端領域の間で、二次構造およびアミノ酸保存において、特に、アミノ酸３０から３００によって含まれる領域（双方のタンパク質のＮ末端）において、有意な相同性が同定された。
【０１３８】
第二に、確立されたＣｌｆＡアドヘシン決定基に基づく相同機能部位のコンセンサスマッピングは、Ａｌｓ１ｐにおける特異的トポロジー的モチーフに集中した。このトポロジー的モチーフを、２つのβ−シートドメインの隣接面の屈曲によって形成された溝として図２６に示される。
【０１３９】
第三に、一次構造相同性と合致して、Ａｌｓ１ｐにおける予測された機能的溝モチーフは、アミノ酸残基３０から３００を含むＮ末端領域における超可変領域に由来する特異的残基にマッピングされる。
【０１４０】
これらの結果は、調和した生物学的機能に対する構造的基礎、並びにＡｌｓ１ｐおよびＣｌｆＡに対する免疫学的応答を供した。これらの結果はＡｌｓ１ｐ構造−活性の我々の総じてのモデルをさらに裏付け、突然変異分析およびエピトープマッピングに対する標的化アプローチをさらに容易とする。最後に、これらの結果は、Ａｌｓ１ｐおよびＣｌｆＡが、多様な微生物病原体に存在する類似の構造および機能のアドヘシンであることを示す。
【０１４１】
黄色ブドウ球菌に対するモノクローナル抗体もまた同定され、これはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓによって引き起こされた感染を低下させることができる。前記構造的知見に関して、この特徴も用いて、Ａｌｓアドヘシンを用い、黄色ブドウ球菌に対する効果的なワクチンを設計し実施した。
【０１４２】
簡単に述べると、黄色ブドウ球菌上の表面アドヘシンを認識することが知られているヒト化抗ブドウ球菌モノクローナル抗体（Ａｕｒｅｘｉｓ（登録商標））は現在臨床試験中である。このモノクローナル抗体もやはりＡｌｓファミリーメンバーと交差反応する。ブドウ球菌血流感染の治療用のＡｕｒｅｘｉｓ（登録商標）の相ＩＩ臨床試験の好都合な結果が報告されている（Ｉｎｈｉｂｉｔｅｘ  Ｉｎｃ．，２００５；ｈｔｔｐ：／／ｐｈｘ．ｃｏｒｐｏｒａｔｅ−ｉｒ．ｎｅｔ／ｐｈｏｅｎｉｘ．ｚｈｔｍｌ？ｃ＝１７６９４４＆ｐ＝ｉｒｏｌ−ｎｅｗｓＡｒｔｉｃｌｅ＆ＩＤ＝７０７３２２＆ｈｉｇｈｌｉｇｈｔ＝において、２００５年９月１９日にアクセスされた）。簡単に述べると、この報告においては、血液中の公知の黄色ブドウ球菌を持つ患者に活性な感染に対する治療としてＡｕｒｅｘｉｓ（登録商標）抗体を投与した（すなわち、これは能動的ワクチン戦略または予防的実験ではない）。プラセボを受ける９人の患者はＣａｎｄｉｄａ  によって引き起こされた突発的な血流感染を経験し、他方、Ａｕｒｅｘｉｓ（登録商標）実験群においては、３人の患者のみがＣａｎｄｉｄａ血流感染を経験した。前記相同性および構造的知見と組合せて、黄色ブドウ球菌に対する抗体で治療した患者についてのＣａｎｄｉｄａ血液感染の減少を認識すると、免疫原性エピトープはＣａｎｄｉｄａおよび黄色ブドウ球菌の間で共有されており、これらの免疫原性エピトープはおよび他の種の治療用の１つの種に対して生起された免疫応答、抗体またはエフェクタメカニズムを用いて治療的利益について標的化できることを示す。従って、前記データを一緒にすると、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．と交差反応する黄色ブドウ球菌上の表面アドヘシンに対する免疫応答を提供する。
【０１４３】
前記戦略に従い、例示的なＡｌｓアドヘシンワクチンを設計し、それは、黄色ブドウ球菌に感染したマウスの生存を改善することが示された。ワクチン接種するのに用いた例示的なＡｌｓアドヘシンはｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎであり、これは前記したように生産し、用いた。簡単に述べれば、Ｃａｎｄｉｄａ、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎに対するこれらのＡｌｓワクチンが黄色ブドウ球菌に対して交差−種保護を媒介できるかを決定するために、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを従前に記載された養生法でワクチン接種した（０日目におけるフロイントの完全アジュバント＋２０μｇのｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ、続いての、３週間におけるフロイントの不完全アジュバント中のブースター用量；共に皮下投与した）。ワクチン接種から２週間後に、マウスを、メチリシリン−耐性であって、動物モデルにおいてビルレントであることが知られている、致死用量の黄色ブドウ球菌株６７−０で尾−静脈を介して感染させた。マウスの生存を示す結果を図２６に示す。示したように、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、これらの感染したマウスにおいて改善された長期生存を媒介した（図２７）。加えて、保護のメカニズムはＴｈ２よりはむしろＴｈ１の増強であるようである。というのは、Ａｂ力価、およびｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎいずれかでワクチン接種したマウスの生存の間に相関は観察されなかったからである（図２８）。
【０１４４】
（実施例Ｘ）
（抗Ｃａｎｄｉｄａ  ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは播種性カンジダ症に対する広い範囲の保護を媒介する）
本実施例は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンが非近交系マウスを播種性カンジダ症から保護し、Ｂａｌｂ／ｃマウスをＣ．ａｌｂｉｃａｎｓおよび非ａｌｂｉｃａｎｓ  Ｃａｎｄｉｄａの他のビルレント株に対して保護する。
【０１４５】
本実験を行って、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの他の株に対する、およびＣａｎｄｉｄａの非ａｌｂｉｃａｎｓ種に対する、フロイントのアジュバント以外の第二のアジュバントと組み合わせた、非近交系マウスにおけるその効力を特異的に評価することによりｒＡｌｓ１ｐ−Ｎによって誘導される保護の広さを説明する。
【０１４６】
ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでのワクチン接種は、播種性カンジダ症から非近交系マウスを保護した。簡単に述べると、非近交系マウスＣＤ１マウスはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  ＭＤ）から入手した。マウスに関連する全ての手法は、動物収容および介護についてのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ指針に従い、動物使用および看護制度委員会によって認可された。前記にて、および例えば、Ｉｂｒａｈｉｍら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：９９９−１００５（２００５）；Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：６１９１−９３（２００５）に記載されているように、マウスをｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ＋フロイントアジュバントでワクチン接種した。ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（Ａｌｓ１ｐのアミノ酸１７から４３２）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて生産され、ゲル濾過およびＮｉ−ＮＴＡマトリックスアフィニティー精製によって精製した。高度な純度（約９０％）は、前記にて、および例えば、Ｓｈｅｐｐａｒｄら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：３０４８０−８９（２００４）に記載されているように、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気詠動並びに円二色およびＦＴＩＲによって確認した。マウスは、０日目においてフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と混合されたｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（２０μｇ）のＳＱ注射、続いての２１日目におけるフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中のブースター用量によって免疫化した。対照マウスはＣＦＡ／ＩＦＡ単独で免疫化した。ブーストから１４日後に、我々は既に記載したように、免疫化されたマウスをＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＳＣ５３１４で尾−静脈を介して感染させた。Ｉｂｒａｈｉｍら，（２００５）上記；およびＳｐｅｌｌｂｅｒｇら（２００５）上記。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける我々の従前の知見と同様に、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは感染されたＣＤ１マウスの生存を顕著に改良した（図２９Ａ）。
【０１４７】
フロイントのアジュバントはヒトで用いるのにはあまりにも毒性であるゆえに、我々はミョウバン（２％  Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ，Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチン、ヒトで用いる合衆国食品薬品局（ＦＤＡ）によって現在認可された唯一のワクチンの用量応答を行った。ミョウバンでのワクチン接種は、１日目における免疫化、２１日目におけるブースト、および２週間後における感染にて、フロイントのアジュバントと同一のスケジュールで行った。我々は、ミョウバンと組合せたより高い用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの結果、播種性カンジダ症を持つマウスの生存の有意な改善をもたらしたことを見出した（図２９Ｂ）。また、用量応答の関係があるようであり、ミョウバンと組み合わせた場合に、より高い用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎにおいて改良された生存の傾向がある。
【０１４８】
また、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのいくつかの株で感染させたＢａｌｂ／ｃマウスの生存を改善することが示された。特に有用なワクチンは、免疫系が標的病原体の多数の株を認識するように開始することができる免疫原を利用する。ＤＮＡ配列分析によって、我々は、Ａｌｓ１ｐのＮ末端領域の予測されたアミノ酸配列が、血流（５株）、尿（５株）および口腔咽頭（１０株）感染（データは示さず）からの臨床Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ単離体の多様な群の中で９９．９％保存されていたことを見出した。これらの結果は、ｒａｌｓ１ｐ−ＮワクチンがＣ．ａｌｂｉｃａｎｓ株の広いアレイに対して効果的であり得ることを示す。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの他の株に対するｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの保護の広さを確認するために、マウスをｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ＋フロイントのアジュバントで前記したようにワクチン接種し、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのいくつかの臨床単離体の１つで感染させた（Ｉｂｒａｈｉｍら，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３：１９９３−９８（１９９５））。図３０に示したように、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、これらの株の各々で感染させたマウスの生存を有意に改善した。
【０１４９】
また、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、Ｃａｎｄｉｄａのいくつかの非ａｌｂｉｃａｎｓ種で感染させたマウスにおいて組織真菌負荷を低下させることが示された。簡単に述べると、ＡＬＳ遺伝子ファミリーはＣ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓおよびＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓを含めた他のＣａｎｄｉｄａ種に存在する（Ｈｏｙｅｒら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５７：１５５５−６７（２００１））。同様に、Ａｌｓファミリーメンバーに類似するアドヘシンはＣ．ｇｌａｂｒａｔａに記載されている（Ｃｏｒｍａｃｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２８５：５７８−８２（１９９９）；Ｆｒｉｅｍａｎら，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
４６：４７９−９２（２００２））。非ａｌｂｉｃａｎｓ種に対するｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの効力を確認するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを前記したようにｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ＋フロイントのアジュバントでワクチン接種し、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ  ３１０２８（Ｈａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒにおける微生物学研究所からの臨床的血流単離体）、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ  ９１−１１５９（親切にもＭｉｃｈａｅｌ  Ｒｉｎａｌｄｉ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，Ｔｅｘａｓによって提供された）、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ  ２２０１９（Ｈａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒからの臨床的血流単離体）、またはＣ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ  ４２４３（Ｈａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒからの臨床血流単離体）で尾−静脈を介して感染させた。図３１に示すように、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンはこれらの種の各々で感染させたマウスの腎臓真菌負荷を低下させた。
【０１５０】
まとめると、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、増大している通常のおよびかなり致死的な播種性カンジダ症のひどさを予防し、および／または低下させることができる。該ワクチンは、アジュバントとしてのミョウバンと混合した場合、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓの多数の株に対して、およびＣａｎｄｉｄａのいくつかの非ａｌｂｉｃａｎｓ種に対して、同系交配および非近交系マウスの双方において有効である。これらの結果は、本発明のＡＬＤＳワクチンが広く種々のカンジダおよび他の感染に対して有効であることをさらに裏付ける。
【０１５１】
（実施例ＸＩ）
（抗Ｃａｎｄｉｄａ  ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは播種性カンジダ症に対してｒＡｌｓ１ｐ−Ｎと同等に効果的であり、粘膜カンジダ症に対してより効果的である）
本実施例は、血行的に散在した口腔咽頭および膣カンジダ症のネズミモデルにおけるｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンの効力をｒＡｌｓ１ｐ−Ｎと比較する。
【０１５２】
ＡＬＳファミリーメンバーのうち、ＡＬＳ１およびＡＬＳ３遺伝子は基材親和性の最も広いアレイにてアドヘシンをコードする。相互に比較した場合、Ａｌｓ１ｐは内皮細胞およびゼラチンに対するより大きな接着を媒介したが、上皮細胞に対しては劣った接着を媒介した（Ｓｈｅｐｐａｒｄら，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：３０４８０−８９（２００４））。接着の質の個の差は、ｒＡｌｓ３ｐ−ＮがｒＡｌｓ１ｐ−Ｎと比較してワクチン免疫原として異なる有効性を有することができることを示唆した。
【０１５３】
ワクチンおよびワクチン接種は前記したように行った。簡単に述べれば、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ（Ａｌｓ１ｐまたはＡｌｓ３ｐのアミノ酸１７から４３２）はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで生産され、前記にて、およびＩｂｒａｈｉｍら，（２００５），上記；Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇら，（２００５），上記；に記載されたように、ゲル濾過およびＮｉ−ＮＴＡマトリックスアフィニティー精製によって精製した。タンパク質の量は修飾されたＬｏｗｒｙアッセイによって定量した。高度な純度（約９０％）は、前記にて、およびＩｂｒａｈｉｍら．，（２００５），上記；Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇら．，（２００５），上記；に記載されているように、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気詠動ならびに円二色性およびＦＴＩＲによって確認した。マウスを、０日目においてフロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と混合された２０μｇのｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎの皮下（ＳＱ注射によって免疫化し、２１日目においてもう１つの用量の抗原とフロイントの不完全なアジュバント（ＩＦＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でブースト注射し、次いで、ブーストから２週間後に感染させた。
【０１５４】
統計学的解析は以下のように行った。非パラメーターＬｏｇ順位検定を利用して、マウスの生存時間の差を決定した。抗体力価および足蹠膨潤は、適切であれば、非パラメーター多数比較のためのＳｔｅｅｌ検定（Ｒｈｙｎｅら．，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ２３：５３９−４９（１９６７））、または負対比較のためのＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によって比較した。相関はＳｐｅａｒｍａｎ順位検定で計算した。不均一が複連生存試験で存在するかを決定するために、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｍｏｖ検定を利用した。Ｐ値＜０．０５は有意と考えられた。
【０１５５】
ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでのワクチン接種は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎとの比較において抗体応答のより広いアレイを刺激することが示された。この点に関して、図３２に示される結果は、ＣＦＡ  ＋  ｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでワクチン接種したマウスは、ＣＦＡ単独を受けるマウスよりも有意に大きな抗体力価を発生させたことを示す。注目すべきことには、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチン接種したマウスは、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチン接種したマウスに対して同等な力価にて抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ抗体を生じた（図３２，上）。対照的には、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチン接種したマウスは、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでワクチン接種したマウスよりもｒＡｌｓ３ｐ−Ｎに対してより小さな力価を生じた（図３２，下）。しかしながら、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎは、図３３に示したように、同様な遅延型過敏応答をインビボにてもたらした。
【０１５６】
ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、播種性カンジダ症に対して同様な効果を媒介することも示されていた。簡単に述べれば、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンが、血行的に播種性のカンジダ症に対してｒＡｌｓ１ｐ−Ｎと同程度に効果的であることをさらに裏付けるために、マウスをＣＦＡ、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ、またはＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎをワクチン接種し、続いて、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓで尾−静脈を介して感染させた。図３４に示す結果は、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチン双方の結果、生存の有意な改良がもたらされたことを示す。
【０１５７】
抗Ａｌｓｐ抗体力価および遅延型過敏反応と、引き続いてＣ．ａｌｂｉｃａｎｓで感染させたワクチン接種したマウスにおける生存との相関も決定した。簡単に述べれば、抗体力価を、先に、およびＩｂｒａｈｉｍら，（２００５），上記；Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇら，（２００５），上記に我々が記載したように、９６ウェルプレートにおいてＥＬＩＳＡによって決定した。ウェルを、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌのｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎのウェル当たり１００μｌで被覆した。マウス血清を、３％ウシ血清アルブミンを含有するｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（０．０１  Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ  ７．４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）でのブロッキング工程に続いて室温にて１時間インキュベートした。ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳで３回洗浄し、続いて、Ｔｗｅｅｎを含まないＴＢＳでさらに３回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を１：５０００の最終希釈で加え、プレートを室温にて１時間さらにインキュベートした。ウェルをＴＢＳで洗浄し、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ  ５．０）；５０ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアニン（Ｓｉｇｍａ）、および１０μｌの３０％Ｈ２Ｏ２を含有する基質と共にインキュベートした。３０分間発色させ、その後、１０％Ｈ２ＳＯ４を加えることによって反応を停止させ、４９０ｎｍにてマイクロタイタープレートにおいて光学密度（ＯＤ）を決定した。陰性対照ウェルは無関係な抗体を受け、バックグラウンド吸光度をテストウェルから差し引いて、最終ＯＤ読みを得た。ＥＬＩＳＡ力価は、陽性ＯＤ読みを与えた最後の血清希釈の逆数として取られた（すなわち、＞は陰性対照試料の平均ＯＤ＋（標準偏差＊２）を意味する）。
【０１５８】
遅延型過敏反応は、足蹠膨潤テストを測定することによって評価した。簡単に述べれば、マウスをｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ、またはＣＦＡ単独で免疫化した。ブーストから２週間後に、免疫化マウスのベースライン足蹠サイズを電子デジタルキャリパーを用いて測定した。２５μｌのＰＢＳ中の５０μｇのｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎを右側足蹠に注射し、ＰＢＳ単独を免疫化マウスの左側足蹠に注射した。２４時間後に、足蹠を再度測定した。抗原−特異的足蹠膨潤は：（２４時間における右側足蹠厚み−ベースラインにおける右側足蹠）−（２４時間における左側足蹠厚み−ベースラインにおける左側足蹠厚み）として計算された。
【０１５９】
ワクチン接種したマウスから力価決定のために採血し、感染に２日先立って足蹠膨潤テストを受けさせた。感染で生き残らなかったワクチン接種マウスは、それにもかかわらず、図３５に示すように広い範囲の抗体力価を有した。多くのそのようなマウスは≧１：５０，０００（≧４．５ｌｏｇ１０）の抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎおよび抗ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ抗体力価を有した。その結果、抗体力価は生存に有意には相関しなかった。対照的に、足蹠膨潤反応の強さは生存と相関した（図３５、Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関テストによるとｐ＝０．６＆ｐ＝０．００９）。
【０１６０】
ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、粘膜カンジダ症の２つのモデルにおいてｒＡｌｓ１ｐ−Ｎよりも大きな効果を示した。Ａｌｓ３ｐはＡｌｓ１ｐと比較して上皮細胞に対して優れた接着を媒介したので、この観察は、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎが感染の粘膜モデルにおいてユニークな効果を呈することができることを示す。ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎと比較したｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの効力を、感染のステロイド−処理口腔咽頭モデルにおいて、およびカンジダ膣炎のモデルにおいて評価した。
【０１６１】
簡単に述べれば、前記マウス口腔咽頭でカンジダ症（ＯＰＣ）モデルにおけるワクチン実験を従前に記載されているように、およびＳｐｅｌｌｂｅｒｇら，（２００５），上記；Ｋａｍａｉら，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５：３１９５−５７（２００１），ａｎｄ  Ｋａｍａｉら，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０：５２５６−５８（２００２）に記載されているように行った。ワクチン接種マウスをコルチゾン酢酸（感染に対して−１、１および３日目にて２２５ｍｇ／ｋｇ  ＳＱ）での処理によって免疫無防備とした。感染の日に、ｋｇ当たり８ｍｇのキシラジンおよび１１０ｍｇケタミンでの腹腔内注射によってマウスを麻酔した。アルギン酸カルシウム尿道スワブを、それを３０℃のＨＢＳＳ中のｍｌ当たり１０６生物の懸濁液に入れることによって、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓで飽和させた。飽和したスワブを７５分間でマウスの口腔中で舌下に入れた。感染の５日後に、舌および舌下神経組織を切り出し、秤量し、ホモゲナイズし、次いで、定量的に培養して、経口真菌負荷を決定した。
【０１６２】
マウス膣カンジダ症に対するワクチンの有効性は、感染に対して−３日目に（共にＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからの）落花生油に溶解させた３０μｇの皮下エストラジオールバレレートで雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをワクチン接種して、プソイドエストラス（ｐｓｅｕｄｏｅｓｔｒｕｓ）を誘導することによって行った。感染の日に、１００ｍｇ／ｋｇのケタミンのｉｐ投与によってマウスを鎮静させた。鎮静させたマウスを１０μｌのＨＢＳＳ中のＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの１０６出芽胞子で膣内感染させた。感染から３日後に、膣およびほぼ１センチメートルの各子宮角をブロック上に切開し、ホモゲナイズし、定量的に培養した。
【０１６３】
図３６に示すように、口腔咽頭カンジダ症を持つコルチゾン−処理マウスにおいて、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは低下した舌真菌負荷に対する強い傾向を媒介した（ｐ＝０．０５４）。総じての利点の大きさは＜０．３ｌｏｇＣＦＵ／グラムであった（図３６）。比較において、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは統計学的に有意な舌真菌負荷の＞０．６ｌｏｇＣＦＵ／グラム減少を媒介した（ｐ＝０．００５，図３６）。同様に、カンジダ膣炎の非免疫無防備モデルにおいて、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、図３７に示すようにＣＦＡ単独と比較して膣真菌負荷の０．７ｌｏｇＣＦＵ／グラム減少を媒介した（ｐ＝０．０２）。比較において、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎは膣炎モデルにおいて利点を全く媒介せず、およびｒＡｌｓ３ｐ−ＮはｒＡｌｓ１ｐ−Ｎよりも有意に効果的であった（ｐ＝０．０１）。
【０１６４】
前記した結果は、アミノ酸レベルにおいてｒＡｌｓ１ｐ−Ｎに対して８５％相同であるｒＡｌｓ３ｐ−Ｎに基づくワクチンは播種性カンジダ症に対して同等に効果的であるが、粘膜感染に対してｒＡｌｓ１ｐ−Ｎよりも効果的であった。ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎの増大した有効性は口腔咽頭カンジダ症のステロイド−処理モデルおよびカンジダ膣炎の免疫応答性モデル双方で見られた。前期結果は、補助的抗真菌療法を伴わないカンジダ敗血症ショックのマウスモデルにおいて≧５０％長期生存の達成が刺激的であったことを示し、さらに、本発明の治療的利点の全てのＡＬＳワクチンをさらに裏付ける。
【０１６５】
抗体力価は、播種性カンジダ症の間におけるいずれかのワクチンの保護的効果と相関しなかったが、遅延型過敏の誘導はインビボにて保護と相関した。これらのデータは、さらに、ワクチン−感染保護のメカニズムがタイプ１の誘導、真菌に対する細胞−媒介免疫を裏付ける。ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎの双方はｒＡｌｓ１ｐ−Ｎに対する同等な力価の抗体を誘導したが、ｒＡｌｓ３ｐ−ＮがｒＡｌｓ１ｐ−Ｎよりも有意により高い力価の抗ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ抗体を誘導した。これらのデータは、その高度なアミノ酸配列相同性（８５％）にも拘わらず、液性免疫系はｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎの間を識別できることを示す。前記結果は、さらに、Ａｌｓ１ｐおよびＡｌｓ３ｐ上皮細胞接着特徴の差に拘わらず、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンが血行的に播種性の（すなわち、血管内）カンジダ症に対して保護するのに同等に効果的であることを裏付ける。
【０１６６】
まとめると、抗カンジダｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンよりも同等な細胞−媒介のものであるがより広い抗体−ベースの応答を誘導した。免疫原は、血行的に播種性のカンジダ症に対して同等な程度の保護をもたらしたが、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎは口腔咽頭および膣カンジダ症双方に対してより大きな保護を媒介した。
【０１６７】
本出願を通じて、種々の刊行物を括弧に入れて引用した。これらの刊行物の全ての開示をここに引用して本出願に取り込んで、本発明が属する分野の最先端技術をより十分に記載する。
【０１６８】
本発明を開示された実施形態を参照して記載してきたが、当業者であれば、前記にて詳細に記載した特別な実施例および実験は本発明を説明するものに過ぎないことを容易に認識するであろう。本発明の精神を逸脱することなく種々の修飾をなすことができるのは理解されるべきであろう。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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