(57)【要約】  細胞支持複合体１０は、人工材料で形成された基材２０と、基材２０の少なくとも一部に接着するラミニン分子３０もしくはその断片と、ラミニン分子３０もしくはその断片を介して基材２０に付着した培養細胞４０と、を有する。ラミニン分子３０は、細胞支持複合体１０に対する培養細胞４０の単層上皮構造の安定性を向上させる。また、単層上皮構造に孔が形成されることを防止する。
2017082026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工材料で形成された基材と、
前記基材の少なくとも一部に接着するラミニン分子もしくはその断片と、
前記ラミニン分子もしくはその断片を介して前記基材に付着した培養細胞と、を有することを特徴とする細胞支持複合体。
【請求項２】
前記培養細胞は、実質的に重層化することなくコンフルエントな単層を形成していることを特徴とする請求項１に記載の細胞支持複合体。
【請求項３】
前記ラミニン分子は、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３１１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、ラミニン５２１、もしくはこれらの断片のうち１つ以上から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞支持複合体。
【請求項４】
前記ラミニン分子は、ラミニン３１１、ラミニン５１１、ラミニン５２１もしくはこれらの断片のうち１つ以上から選択されることを特徴とする請求項３に記載の細胞支持複合体。
【請求項５】
前記ラミニン分子もしくはその断片は、前記基材に対する接着量が０．０７μｇ／ｃｍ２以上のラミニン３１１の組み換え体、前記基材に対する接着量が０．０５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５１１の組み換え体、前記基材に対する接着量が０．１５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５１１のＥ８領域の改変体、前記基材に対する接着量が０．３３μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５２１の組み換え体、もしくはこれらの断片のうちのいずれか１つから選択されることを特徴とする請求項３に記載の細胞支持複合体。
【請求項６】
人工材料で形成された基材の少なくとも一部に、ラミニン分子もしくはその断片をコーティングするステップと、
前記基材に接着した前記ラミニン分子もしくはその断片に対して培養細胞を播種するステップと、
前記培養細胞を培養することにより、前記培養細胞の単層構造を形成するステップと、を含むことを特徴とする細胞支持複合体の製造方法。
【請求項７】
前記ラミニン分子は、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３１１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、ラミニン５２１、もしくはこれらの断片のうち１つ以上から選択されることを特徴とする請求項６に記載の細胞支持複合体の製造方法。
【請求項８】
前記ラミニン分子は、ラミニン３１１、ラミニン５１１、ラミニン５２１、もしくはこれらの断片のうち１つ以上から選択されることを特徴とする請求項６に記載の細胞支持複合体の製造方法。
【請求項９】
前記ラミニン分子もしくはその断片をコーティングするステップは、ラミニン３１１を２．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．０７μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５１１を２．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．０５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５１１のＥ８領域の改変体を１．４μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５２１を４．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．３３μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることのいずれか１つを含むことを特徴とする請求項６に記載の細胞支持複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞支持複合体、特に、尿細管上皮細胞を用いた細胞支持複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、急性及び、慢性腎不全患者の腎機能を代替するバイオ人工腎臓として、中空糸膜等のポリマー膜と尿細管上皮細胞をハイブリッド化したモジュールの開発が進められている。特に、バイオ人工腎臓の製造や供給、使用を考慮すると、数週間以上にわたって腎機能を維持できるバイオ人工腎臓が必要になる。【０００３】
しかし、腎臓から酵素処理により分離された尿細管上皮細胞は、生体内環境の消失やシャーレ上における培養による細胞の特徴の変化などから、本来の円柱状の細胞構造を維持できない。具体的には、尿細管上皮細胞をシャーレや人工膜上に播種すると、単層上皮構造を消失して細胞間に隙間が生じたり、細胞が重層化することが知られている。このような現象が生じることで、バイオ人工腎臓の血漿中の有用成分の再吸収機能が劣化する。【０００４】
尿細管上皮細胞の重層化や接触阻害を回避する手法として、特許文献１に開示されたバイオ人工尿細管が知られている。これは、ＭＥＫ阻害剤の適用により、尿細管上皮細胞の接触阻害や重層化を抑制し、コンフルエント（細胞が容器いっぱいに隙間なく増殖した状態）な単層を、人工膜内面に持続的に形成させる技術である（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−５３９８０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１の手法では、尿細管上皮細胞を人工膜上に播種後、コンフルエントに達するまで顕微鏡観察して確認した後に、ＭＥＫ阻害剤を作用させる必要がある。ところが特許文献１で使用される中空糸膜等の人工膜は、光を透過しない材質が多い。また、たとえ顕微鏡観察可能な中空糸膜を用いた場合でも、バイオ人工尿細管は中空糸膜を束ねてモジュール化した構造を有するため、顕微鏡観察で中空糸膜内腔に細胞がコンフルエントな状態にて接着していることを確認することは難しい。よって、特許文献１の手法では、人工膜上で尿細管上皮細胞がコンフルエントに達する時期が不明確のまま、最適ではないタイミングにてＭＥＫ阻害剤を投与することになる。そのため、尿細管上皮細胞間に隙間が生じている状態や、重層化している状態でＭＥＫ阻害剤を作用させる場合があった。その結果、性能のよいバイオ人工腎臓を得られないという問題点があった。【０００７】
本発明はこうした課題に鑑みてなされたものであり、細胞が形成する単層上皮構造の安定性が向上した細胞支持複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明のある態様の細胞支持複合体は、人工材料で形成された基材と、基材の少なくとも一部に接着するラミニン分子もしくはその断片と、ラミニン分子もしくはその断片を介して基材に付着した培養細胞と、を有する。【０００９】
この態様によると、顕微鏡観察をすることなく、基材上に培養細胞のコンフルエントな単層上皮構造を形成させることができる。その結果、単層上皮構造の安定性が向上した細胞支持複合体を提供することができる。また、細胞支持複合体の単層上皮構造に孔が形成されることを防止することができる。【００１０】
特に、ラミニン分子の断片を用いる場合には、完全長のラミニン分子を用いる場合に比べて、分子量が小さいためより安定したコーティングをすることができるという利点がある。また、微細領域のコーティングがしやすくなるという利点もある。また、ラミニン分子の凝集が生じにくくなることにより、コーティング時に形成されるコーティング斑の形成が低減される。それらによって、細胞層の不均一性や細胞の単層形成の不均一性を防止することができる。また、ラミニン分子の断片を用いることにより、高濃度かつ高密度にてラミニン分子をコーティングすることができるようになる。さらに、リコンビナントタンパク質は、分子量が小さいほど、生産効率および精製効率が上昇するため、ラミニン分子の収率を上昇させてコストをより低下させることができる。【００１１】
培養細胞は、実質的に重層化することなくコンフルエントな単層を形成していてもよい。なお、「実質的に」とは、重層化による物質の移動効率の低下が問題とならない程度に単層構造が維持されていることを意味し、必ずしも重層化が全く生じていないことを意味しない。【００１２】
ラミニン分子は、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３１１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、ラミニン５２１、もしくはこれらの断片のうち１つ以上から選択されてもよい。【００１３】
ラミニン分子は、ラミニン３１１、ラミニン５１１、ラミニン５２１、もしくはこれらの断片のうち１つ以上から選択されてもよい。【００１４】
ラミニン分子もしくはその断片は、基材に対する接着量が０．０７μｇ／ｃｍ２以上のラミニン３１１の組み換え体、基材に対する接着量が０．０５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５１１の組み換え体、基材に対する接着量が０．１５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５１１のＥ８領域の改変体、基材に対する接着量が０．３３μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５２１の組み換え体、もしくはこれらの断片のうちのいずれか１つから選択されてもよい。本願明細書において、組み換え体とは、遺伝子組換えを利用して得られた組み換え遺伝子から得られたタンパク質をいう。改変体とは、組み換え体が由来した遺伝子にさらに改変を加えて得られたタンパク質をいう。改変体には、組み換え体に変異を導入したタンパク質や、組み換え体の部分タンパク質、組み換え体由来のペプチドを有するタンパク質を含む。【００１５】
本発明の別の態様は、細胞支持複合体の製造方法である。この細胞支持複合体の製造方法は、人工材料で形成された基材の少なくとも一部に、ラミニン分子もしくはその断片をコーティングするステップと、ラミニン分子もしくはその断片に対して培養細胞を播種するステップと、培養細胞を培養することにより、培養細胞の単層構造を形成するステップと、を含む。【００１６】
この態様によると、顕微鏡観察をすることなく、基材上に培養細胞のコンフルエントな単層上皮構造を形成させることができる。その結果、単層上皮構造の安定性が向上した細胞支持複合体を提供することができる。また、細胞支持複合体の単層上皮構造に孔が形成されることを防止することができる。【００１７】
この細胞支持複合体の製造方法において、ラミニン分子は、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３１１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、ラミニン５２１、もしくはこれらの断片のうち１つ以上から選択されてもよい。【００１８】
この細胞支持複合体の製造方法において、ラミニン分子は、ラミニン３１１、ラミニン５１１、ラミニン５２１、もしくはこれらの断片のうち１つ以上から選択されてもよい。【００１９】
ラミニン分子もしくはその断片をコーティングするステップは、ラミニン３１１を２．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．０７μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５１１を２．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．０５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５１１のＥ８領域の改変体を１．４μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５２１を４．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．３３μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることのいずれか１つを含んでもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、細胞が形成する単層上皮構造の安定性が向上した細胞支持複合体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】従来技術の細胞支持複合体の構成を模式的に示す図である。図１（Ａ）は、一般的なコーティング剤を用いた従来の細胞支持複合体を示す図である。図１（Ｂ）は、コーティング剤を用いない従来の細胞支持複合体を示す図である。
【図２】実施の形態に係る細胞支持複合体の構成を模式的に示す図である。図２（Ａ）は、基材が水透過性を有する実施の形態に係る細胞支持複合体の構成を示す図である。図２（Ｂ）は、基材が水透過性を有さない実施の形態に係る細胞支持複合体において、短時間培養した場合を示す図である。図２（Ｃ）は、基材が水透過性を有さない実施の形態に係る細胞支持複合体において、長時間培養した場合を示す図である。
【図３】図３（Ａ）〜図３（Ｃ）は、実施の形態に係る細胞支持複合体を用いた装置の構造の一部を示す図である。図３（Ａ）は、基材としてＴｒａｎｓｗｅｌｌを用いた装置の構造の一部を示す図である。図３（Ｂ）は、基材として中空糸膜を用いた透析装置の構造の一部を示す図である。図３（Ｃ）は、基材としてシャーレ、ウェルプレート、微細流路、マイクロキャリア、または中空糸膜を用いた装置の構造の一部を示す図である。
【図４】シャーレに対してコーティングするラミニンのアイソフォームを変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。
【図５】シャーレに対してコーティングするラミニン５２１の濃度を変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。
【図６−１】図６（Ａ）〜図６（Ｄ）は、シャーレに対してコーティングする接着分子の濃度を変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。図６（Ａ）は、比較例としてＳｙｎｔｈｅｍａｘを用いた結果を示す図である。図６（Ｂ）は、比較例としてＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを用いた結果を示す図である。図６（Ｃ）は、実施例としてラミニン１１１を用いた結果を示す図である。図６（Ｄ）は、実施例としてラミニン２１１を用いた結果を示す図である。
【図６−２】図６（Ｅ）〜図６（Ｈ）は、シャーレに対してコーティングする接着分子の濃度を変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。図６（Ｅ）は、実施例としてラミニン２２１を用いた結果を示す図である。図６（Ｆ）は、実施例としてラミニン３１１を用いた結果を示す図である。図６（Ｇ）は、実施例としてラミニン３３２を用いた結果を示す図である。図６（Ｈ）は、比較例としてラミニン４１１を用いた結果を示す図である。
【図６−３】図６（Ｉ）〜図６（Ｋ）は、シャーレに対してコーティングする接着分子の濃度を変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。図６（Ｉ）は、実施例としてラミニン４２１を用いた結果を示す図である。図６（Ｊ）は、実施例としてラミニン５１１を用いた結果を示す図である。図６（Ｋ）は、実施例としてラミニン５２１を用いた結果を示す図である。
【図７】ラミニン５２１を用いた実施例およびゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）を用いた比較例に係る細胞支持複合体の顕微鏡写真である。
【図８】基材としてＥＶＯＨ中空糸膜を用いた場合におけるラミニン５２１を用いた実施例、ゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）を用いた比較例およびコーティング無しの比較例に係る細胞の増殖状態を示す顕微鏡写真である。
【図９】基材としてポリスルホン中空糸膜ミニモジュールを用いた場合におけるラミニン５２１を用いた実施例およびゼラチンを用いた比較例に係る核染色した細胞の蛍光顕微鏡画像である。
【図１０】基材としてＰＥＰＡ中空糸膜ミニモジュールを用いた場合におけるラミニン５２１を用いた実施例およびゼラチンを用いた比較例に係る核染色した細胞の蛍光顕微鏡画像である。
【図１１】図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）は、基材をＴｒａｎｓｗｅｌｌに固定した場合におけるラミニン５２１を用いた実施例およびゼラチンを用いた比較例を示す図である。図１１（Ａ）は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを側面から見た概略図である。図１１（Ｂ）は、ラミニン５２１を用いた実施例およびゼラチンを用いた比較例に係る核染色した細胞の蛍光顕微鏡画像である。図１１（Ｃ）は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの断面に関して細胞をＨＥ染色した顕微鏡画像である。
【図１２】シャーレに対してコーティングするラミニン分子３０の断片であるラミニン５１１−Ｅ８の濃度を変えた場合における播種１５日後における増殖状態を示す図である。
【図１３】シャーレに対してコーティングするラミニン分子３０の断片であるラミニン５１１−Ｅ８の濃度を変えた場合における細胞の形態の経時的な変化を示す図である。
【図１４】シャーレに対してコーティングするラミニン分子３０の断片であるラミニン５１１−Ｅ８の濃度を変えた場合における接着分子の質量測定の結果と細胞の増殖状態の経時的な変化を示す図である。
【図１５】ラミニン５１１−Ｅ８とラミニン５２１でコーティングした場合における播種後２、４、７、１１、１８日経過後のＴＥＥＲ値の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、図面を参照しながら、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を適宜省略する。
【００２３】
図１は、従来技術の細胞支持複合体の構成を模式的に示す図である。図１（Ａ）は、一般的なコーティング剤を用いた従来の細胞支持複合体を示す図である。図１（Ｂ）は、コーティング剤を用いない従来の細胞支持複合体を示す図である。たとえば図１に示すように、尿細管上皮細胞および一般的なコーティング剤を用いた従来の細胞支持複合体では、尿細管上皮細胞が重層化したり、逆に細胞間に隙間が空いてしまうことがあった。その結果、重層化した領域では、細胞頂端膜側から細胞基底膜側へのトランスポーターを介した有用物質の移動が効率よく行われないという問題があった（矢印Ｐ）。一方、細胞間に空いた隙間からは、人工膜を介して、濃度依存的な物質移動が生じるという問題があった（矢印Ｑ）。この点、図１（Ｂ）に示すコーティング剤を用いない従来の細胞支持複合体でも同様の問題があった。
【００２４】
［実施の形態］
図２は、実施の形態に係る細胞支持複合体１０の構成を模式的に示す図である。図２（Ａ）は、基材が水透過性を有する実施の形態に係る細胞支持複合体の構成を示す図である。図２（Ｂ）は、基材が水透過性を有さない実施の形態に係る細胞支持複合体において、短時間培養した場合を示す図である。図２（Ｃ）は、基材が水透過性を有さない実施の形態に係る細胞支持複合体において、長時間培養した場合を示す図である。
【００２５】
図２（Ａ）に示すように、細胞支持複合体１０は、人工材料で形成された基材２０と、基材の少なくとも一部に接着する接着分子であるラミニン（Ｌａｍｉｎｉｎ）分子３０もしくはその断片と、ラミニン分子３０もしくはその断片を介して基材２０に付着した培養細胞４０と、を有する。ここでいう「基材２０の少なくとも一部」とは、たとえば「平面または曲面を有する基材２０の少なくとも１つの面」をいう。基材２０が平板状構造の場合には、その少なくとも一方の面をいう。基材２０が円筒構造を有する場合には、その内側面または外側面の少なくとも一方をいう。培養細胞は、実質的に重層化することなくコンフルエントな単層を形成していることが好ましい。
【００２６】
（基材２０）
基材２０は、尿細管上皮細胞の培養に用いられるモジュールである。図２（Ａ）には、基材２０が水や各種イオンの透過性を有する場合を示す。この場合、基材２０は、糖や低分子タンパク質の透過性も有することが好ましい。そのため、基材２０には、孔が形成されている。基材２０の平均孔径は、５μｍ以下である。このような基材２０として、たとえば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社：平均孔径０．４または３．０μｍ）を用いることができる。平均孔径が５μｍ以上の場合には、基材２０を細胞が通過してしまう場合があるため好ましくない。
【００２７】
基材２０の形状は特に限定されないが、たとえば中空糸膜、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、平膜等の人工膜や、微細流路チップ、中実粒子、中空粒子であることが好ましい。これらの一例を、図３を用いて後述する。図２（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、接着分子の種類や濃度を検討したり、培養細胞４０による薬物の取込量を評価する際には、基材は必ずしも水透過性を有していなくともよい。この場合には、基材２０として水透過性を有さないシャーレやウェルプレートなどの上にラミニン分子３０もしくはその断片をコーティングし、その上で培養細胞４０を培養してもよい。短時間培養した場合には、培養細胞４０は有用物質５０を内部に取り込む（図２（Ｂ））。一方、長時間培養した場合には、取り込んだ有用物質５０を細胞基底膜側のトランスポーター４４から放出することなどによって、細胞層が浮き上がり、ドームを形成する現象が見られる（図２（Ｃ））。
【００２８】
基材２０の素材は特に限定されないが、たとえばポリスチレン、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエステル（ＰＥＴ）、ポリエステル系ポリマーアロイ（ＰＥＰＡ）、エチレン−ビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）、ポリエチレン、ポリスルホン（ＰＳｆ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）であることが好ましい。
【００２９】
（ラミニン分子３０）
ラミニン分子３０は、基材の少なくとも一部にコーティングされる接着分子であって、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ１本ずつ持つヘテロ三量体構造をとる。現時点では５種類のα鎖、３種類のβ鎖、３種類のγ鎖が同定されている。ラミニン分子３０は、これらの組合せによって少なくとも１２種類のアイソフォームを形成することが知られている。本実施の形態では、従来は細胞支持複合体に用いられることがなかったラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３１１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、ラミニン５２１、もしくはこれらの断片のうち１つ以上を用いる点を特徴とする。本実施の形態におけるラミニン分子３０には、上述したアイソフォームの１か所以上に所定の修飾基が付加された改変ラミニンも含まれる。
【００３０】
ラミニンのアイソフォームのうち、ラミニン３１１、ラミニン５１１、ラミニン５２１は、細胞間のバリア機能の指標である電気抵抗値がラミニン１１１よりも高いため、より好ましい。また、ラミニン５１１およびラミニン５２１は、たとえばラミニン１１１と比較してコストが安いため、より好ましい。
【００３１】
ラミニン分子３０の濃度は、細胞支持複合体１０が実用に耐える期間、性能を維持できるように適宜調整する。また、このような期間は、培養開始から２週間以上であることが好ましく、３週間以上であることがより好ましく、４週間以上であることが最も好ましい。ラミニン分子３０の濃度は、製造方法において後述する。
【００３２】
ラミニン分子３０の細胞支持複合体１０に対する接着量の測定は、当業者に公知の方法を用いることができる。ラミニン分子３０を含むコーティング溶液を４℃にて一晩静置することによってコーティングした後の接着分子量を、たとえば２−Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて定量する。または、風乾後の接着量を定量することもできる。
【００３３】
ラミニン１１１の場合、３．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることが好ましい。これにより、約１５日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。４．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．１９μｇ／ｃｍ２以上の濃度の接着量とすることがさらに好ましい。これにより、２８日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。ラミニン１１１の濃度が３．０μｇ／ｍｌ未満になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性があるためである。また、市販されたラミニン１１１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となるため、およびコストがかかるため、１００μｇ／ｍｌ以下の濃度が好ましい。
【００３４】
ラミニン２１１の場合、８．０μｇ／ｍｌ超の濃度でコーティングして約０．４５μｇ／ｃｍ２超の接着量とすることが好ましい。これにより、約１５日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．５２μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがより好ましい。これにより、２８日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。ラミニン２１１の濃度が８．０μｇ／ｍｌ以下になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性があるためである。また、市販されたラミニン２１１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となるため、およびコストがかかるため、１００μｇ／ｍｌ以下の濃度が好ましい。
【００３５】
ラミニン２２１の場合、８．０μｇ／ｍｌ超の濃度でコーティングして約０．３０μｇ／ｃｍ２超の接着量とすることが好ましい。これにより、約１５日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．３４μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがより好ましい。これにより、１８日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。ラミニン２２１の濃度が８．０μｇ／ｍｌ以下になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性があるためである。また、市販されたラミニン２２１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となるため、およびコストがかかるため、１００μｇ／ｍｌ以下の濃度が好ましい。
【００３６】
ラミニン３１１の場合、約２．５μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．１０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることが好ましい。これにより、約１５日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。４．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがさらに好ましい。これにより、２８日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。ラミニン３１１の濃度が約２．５μｇ／ｍｌ未満になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性があるためである。また、市販されたラミニン３１１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となるため、およびコストがかかるため、１００μｇ／ｍｌ以下の濃度が好ましい。
【００３７】
ラミニン３３２の場合、８．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングすることが好ましい。これにより、１５日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングすることがさらに好ましい。これにより、１８日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。ラミニン３３２の濃度が約８．０μｇ／ｍｌ未満になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性があるためである。また、市販されたラミニン３３２の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となるため、およびコストがかかるため、１００μｇ／ｍｌ以下の濃度が好ましい。
【００３８】
ラミニン４２１の場合、５．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．５０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることが好ましい。これにより、１５日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。６．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして、約０．５４μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがより好ましい。これにより、１８日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．６９μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがさらに好ましい。これにより、２８日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。ラミニン４２１の濃度が約５．０μｇ／ｍｌ未満になると、接着分子としての機能を十分に発揮できないためである。また、市販されたラミニン４２１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となるため、およびコストがかかるため、１００μｇ／ｍｌ以下の濃度が好ましい。
【００３９】
ラミニン５１１の場合、約８．０μｇ／ｍｌ超の濃度でコーティングして約０．３０μｇ／ｃｍ２超の接着量とすることが好ましい。これにより、約１５日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして、約０．３２μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがより好ましい。これにより、１８日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。ラミニン５１１の濃度が約８．０μｇ／ｍｌ未満になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性があるためである。また、市販されたラミニン５１１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となるため、およびコストがかかるため、１００μｇ／ｍｌ以下の濃度が好ましい。
【００４０】
ラミニン５２１の場合、約４．５μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．４０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることが好ましい。これにより、約１５日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。５．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．４４μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがさらに好ましい。これにより、２８日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。ラミニン５２１の濃度が約４．５μｇ／ｍｌ未満になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性があるためである。また、市販されたラミニン５２１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となるため、およびコストがかかるため、１００μｇ／ｍｌ以下の濃度が好ましい。
【００４１】
なお、ラミニン分子３０として改変ラミニンが使用される場合、修飾基は、たとえば増殖因子結合分子または細胞接着分子であってもよい。このような改変ラミニンを用いた場合にも、改変されていないラミニン分子と同様の作用効果を奏することができる。または、修飾基の有無にかかわらず、ラミニン分子３０としてラミニン分子３０の断片が使用されてもよいし、複数のアイソフォームの断片または全長が、混合されて、または混合されずに基材２０に対して順にコーティングされることによって使用されてもよい。ラミニン分子３０としてラミニン分子３０の断片が使用される場合には、細胞活性部位のみをペプチド合成し、使用されてもよい。また、この場合に使用されるラミニン分子３０の量は、上述した完全長のラミニン分子３０の分子量に相当する量であってもよい。
【００４２】
（ラミニン分子３０の断片が使用される場合）
ラミニン分子３０としてラミニン分子３０の断片が使用される場合、たとえば完全長ラミニンのうちドメインＩの細胞接着部位（インテグリン結合部位）を含むＥ８領域の改変体（ラミニン＊＊＊−Ｅ８と表記する）を好適に使用することができる。このような改変体として、たとえばラミニン１１１−Ｅ８、ラミニン２１１−Ｅ８、ラミニン４２１−Ｅ８、ラミニン５２１−Ｅ８が挙げられる。これらの分子量は、いずれも完全長ラミニンの１／５程度である。
【００４３】
ラミニン分子３０の断片として、たとえばラミニン５１１のＥ８領域の改変体（ラミニン５１１−Ｅ８）が使用される場合、市販されているラミニン５１１−Ｅ８（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１：株式会社ニッピ）の濃度を考慮すると、約１．４μｇ／ｍｌ以上約５００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングすることにより、０．１５μｇ／ｃｍ２以上、３１．１８μｇ／ｃｍ２以下の接着量とするが好ましい。これにより、培養細胞の単層構造を２８日以上維持することができる。約２．５μｇ／ｍｌ以上約５０μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングすることにより０．２１μｇ／ｃｍ２以上、６．２１μｇ／ｃｍ２以下の接着量とすることがさらに好ましい。１．３μｇ／ｍｌ以下の場合には、コーティングによる効果がほとんど見られない。一方、５００μｇ／ｍｌを超える場合には、コーティング溶液の調整が難しくなる。
【００４４】
ラミニン分子３０の断片として、Ｅ８領域の改変体もしくはその断片以外にも、細胞接着活性を有するラミニンペプチドを使用することもできる。このようなラミニンペプチドとして、たとえばβ鎖のドメインＩＩＩに由来するＹＩＧＳＲ含有ペプチド、β鎖のドメインＩＩＩに由来するＰＤＳＧＲ含有ペプチド、β鎖のドメインＩＩＩに由来するＲＹＶＶＬＰＲ含有ペプチド、α鎖のドメインＩＩＩに由来するＲＧＤ含有ペプチド、γ鎖のドメインＩに由来するＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ含有ペプチド、α鎖のドメインＩに由来するＩＫＶＡＶ含有ペプチド、β鎖のドメインＩに由来するＬＲＥ含有ペプチドなどを好適に使用することができる。ラミニン分子３０の断片の大きさには特に制限がない。ラミニンペプチドを用いる場合には、約０．５〜約５００μｇ／ｍｌの範囲でコーティング濃度を適宜選択すればよい。
【００４５】
なお、ラミニン分子３０として、ラミニン分子３０の断片を複数混合して用いてもよいし、ラミニン分子３０の断片と完全長ラミニンとを混合して用いてもよいし、ラミニン分子３０の断片とゼラチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、Ｍａｔｒｉｇｅｌなどの他の接着タンパク質を混合して用いてもよい。
【００４６】
（培養細胞４０）
培養細胞４０は、ラミニン分子３０もしくはその断片を介して基材２０に付着する。細胞支持複合体１０に使用されるためには、培養細胞４０は、ラミニン分子３０もしくはその断片を介して基材２０に固定された場合に、細胞頂端膜側のトランスポーター４２と、細胞基底膜側のトランスポーター４４とを発現する必要がある（図２）。
【００４７】
培養細胞４０の種類は特に限定されないが、たとえばヒト尿細管上皮細胞、またはヒトｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞由来の尿細管上皮様細胞であることが好ましい。具体的には、腎臓から採取・分離可能な尿細管上皮細胞、およびｉＰＳ細胞もしくはＥＳ細胞より分化誘導および遺伝子導入した尿細管上皮様細胞が想定される。尿細管上皮様細胞として、近位尿細管の細胞が主に想定されるが、近位尿細管の細胞だけではなく、遠位尿細管の上皮細胞や、集合管の上皮細胞であってもよい。または、尿細管上皮細胞の代わりに、尿細管細胞の不死化細胞、および株化細胞（ＨＫ−２細胞）または特定のトランスポーター等のタンパク質を発現させるために、これらの細胞に遺伝子導入した細胞を用いてもよい。または、ヒト尿細管上皮細胞の代わりに、他動物種由来の尿細管細胞（ＭＤＣＫ細胞、ＬＬＣ−ＰＫ１細胞、ＪＴＣ−１２細胞）を用いてもよい。
【００４８】
（培地など）
培養細胞４０の培養用の培地として、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を好適に使用することができる。これに代えて、ＥｐｉＣＭ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）やＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）等、尿細管細胞培養培地を用いこともできる。その他の材料についても、従来の細胞支持複合体に用いられていた材料を好適に使用することができる。
【００４９】
（製造方法）
次に、細胞支持複合体１０の製造方法について説明する。細胞支持複合体１０の製造方法は、人工材料で形成された基材２０の少なくとも一部に、ラミニン分子３０もしくはその断片をコーティングするステップ１と、基材２０に接着したラミニン分子３０もしくはその断片に対して培養細胞４０を播種するステップ２と、培養細胞４０を培養することにより、培養細胞４０の単層構造を形成するステップ３と、を含む。ここでいう「基材２０の少なくとも一部」は、上述のとおりである。
【００５０】
ステップ１においてコーティングされるラミニン分子３０は、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン２２１、ラミニン３１１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、ラミニン５２１、もしくはこれらの断片のうち１つ以上から選択されることが好ましい。ラミニン分子３０は、ラミニン３１１、ラミニン５１１、ラミニン５２１、もしくはこれらの断片のうち１つ以上から選択されることがより好ましい。ラミニン分子３０の断片として、たとえばラミニン５１１−Ｅ８を好適に使用することができる。これらのラミニン分子３０の好ましい濃度は、上述のとおりである。
【００５１】
ステップ２では、通常の方法にて細胞を播種する。播種する細胞密度は、約１．０×１０５〜約１．０×１０８個／ｍｌであることが好ましい。ラミニン分子３０もしくはその断片を適切に選択すると、培養細胞４０はコンフルエントになるまで増殖したあとコンフルエントな状態を維持する。そのため、細胞支持複合体１０の製造において、播種する細胞数は大きな制約とはならない。
【００５２】
ステップ３における培養条件は、たとえば培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２である。培養細胞４０がコンフルエントになるまでに、培養細胞４０を約５日以上培養することが好ましい。なお、培地は定期的に交換することが好ましい。たとえば２日毎に交換する。
【００５３】
（作用）
尿細管細胞として機能する培養細胞４０が単層上皮構造をとると、細胞頂端膜側のトランスポーター４２と細胞基底膜側のトランスポーター４４とを介した有用物質５０の移動がおこり、基材２０を介して有用物質５０の再吸収が促進される（図２）。
【００５４】
（装置）
図３（Ａ）〜図３（Ｃ）は、実施の形態に係る細胞支持複合体を用いた装置の構造の一部を示す図である。図３（Ａ）は、基材としてＴｒａｎｓｗｅｌｌを用いた装置の構造の一部を示す図である。図３（Ｂ）は、基材として中空糸膜を用いた透析装置の構造の一部を示す図である。図３（Ｃ）は、基材としてシャーレ、ウェルプレート、微細流路、マイクロキャリア、または中空糸膜を用いた装置の構造の一部を示す図である。
【００５５】
図３（Ａ）のＴｒａｎｓｗｅｌｌを用いた装置では、培養細胞４０が配置された側に液体を流すことによって、図２に示したメカニズムを用いて、この液体中にある有用物質５０を人工膜の反対側に移動させる。この透析装置は、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物評価モジュールとして使用可能である。
【００５６】
図３（Ｂ）の中空糸膜を用いた透析装置では、中空糸膜の管腔内に液体を流すことによって、図２に示したメカニズムを用いて、この液体中にある有用物質５０を管腔外へと移動させる。この透析装置は、血液濾過器で濾過した血漿成分中から、有用物質を回収するバイオ人工腎臓モジュールとして使用可能である。
【００５７】
図３（Ｃ）のシャーレ、ウェルプレート、微細流路、マイクロキャリア、中空粒子を用いた装置では、培養細胞４０が配置された側に微量の液体を流すことによって、細胞の有用物質５０の取り込みを確認できる。これらの装置は、細胞の機能や、薬物の取込・排出を微量液量で調べる薬物動態・薬効評価モジュールとして利用可能である。
【００５８】
装置は、これらの構造の１つ以上に加えて、これらを内部に収めるカートリッジを含む。カートリッジの材質は、従来の血漿濾過器等のカートリッジと同じ材料で作製されてよい。カートリッジの形状は、用途に応じて好適な形態をとることが好ましい。透析を目的に使用する場合は、カートリッジの形状はダイアライザの形状であることが好ましく、薬物評価モジュールとして使用する場合は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ形状や微細流路形状であることが好ましい。
【００５９】
本実施の形態によれば、顕微鏡観察をすることなく、基材上に培養細胞のコンフルエントな単層上皮構造を形成させることができる。その結果、単層上皮構造の安定性が向上した細胞支持複合体を提供することができる。また、細胞支持複合体の単層上皮構造に孔が形成されることを防止することができる。
【００６０】
特に、ラミニン分子の断片を用いる場合には、完全長のラミニン分子を用いる場合に比べて、分子量が小さいためより安定したコーティングをすることができるという利点がある。また、微細領域のコーティングがしやすくなるという利点もある。また、ラミニン分子の凝集が生じにくくなることにより、コーティング時に形成されるコーティング斑の形成が低減される。それらによって、細胞層の不均一性や細胞の単層形成の不均一性を防止することができる。また、ラミニン分子の断片を用いることにより、高濃度かつ高密度にてラミニン分子をコーティングすることができるようになる。さらに、リコンビナントタンパク質は、分子量が小さいほど、生産効率および精製効率が上昇するため、ラミニン分子の収率を上昇させてコストをより低下させることができる。
【００６１】
［実施例］
（基材がシャーレ（ウェルプレート）の場合：ラミニンのスクリーニング）
基材である９６ウェルプレート（ポリスチレン製：ＣＥＬＬＳＴＡＲ、ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ社）を、ラミニンスクリーニング用キット（ＬＡＭｓｃｒｅｅｎ、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）にてコーティングした。用いたラミニンは、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン３３２、ラミニン４２１、ラミニン５１１、ラミニン５２１である。比較例として、ラミニンをコーティングさせずに細胞を培養した（Ｎｏ  ｃｏａｔｉｎｇ）。また、ラミニン４１１を比較例として用いた。ラミニンのコーティングは、１０μｇ／ｍｌに希釈したラミニン溶液をウェルに添加し、４℃にて一晩静置（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）した。ここに、１．０×１０５個／ｍｌのヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を１４０μｌ（１．４×１０４個）播種して、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。播種してから１、８、２０日経過後の顕微鏡像（×１０）を図４に示す。
【００６２】
接着分子のコーティングは、接着分子を含むコーティング溶液を４℃で一晩静置してコーティングする方法（一晩静置（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）：接着分子の一部がコーティング）と、接着分子を含むコーティング溶液を４℃で溶液が完全に乾燥するまで静置する方法（風乾：接着分子全量がコーティング）で実施した。
【００６３】
図４は、シャーレに対してコーティングするラミニンのアイソフォームを変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。コーティング無しで培養した場合、培養約１週間超から細胞が凝集し始め、細胞の重層化が確認された（図４の矢印）。また、ラミニン３３２、ラミニン４１１でコーティングしてヒト近位尿細管上皮細胞を培養した場合には、培養約２０日までに細胞の重層化が確認された（図４の矢印）。一方、ラミニン１１１、ラミニン２１１、ラミニン４２１、ラミニン５１１、ラミニン５２１をコーティングした場合、２０日を過ぎても細胞が凝集化せずに単層を維持できることが確認された（図４）。なお、ラミニン３３２は、濃度を高めれば少なくとも２４日目まで単層を維持できる。この点は、図６を用いて後述する。
【００６４】
（基材がシャーレ（ウェルプレート）の場合：コーティング濃度の検討１）
９６ウェルプレート（ポリスチレン製：ＣＥＬＬＳＴＡＲ、ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ社）を１００、１０、５、２、１、０．１μｇ／ｍｌに調整したラミニン５２１溶液（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）でコーティングし、４℃にて一晩静置した。比較例として、接着分子であるラミニン５２１を用いない実験も行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。ここに、１．０×１０５個／ｍｌのヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を１４０μｌ（１．４×１０４個）播種して、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。播種１、１２日経過後の顕微鏡像（×１０）を図５に示す。
【００６５】
図５は、シャーレに対してコーティングするラミニン５２１の濃度を変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。図５より、播種１２日経過後には、Ｃｏｎｔｒｏｌ（ラミニン５２１なし）、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌにおいて細胞の凝集がみられた。このことから、ラミニン５２１の濃度の下限値は、２μｇ／ｍｌ超が好ましく、３μｇ／ｍｌ以上がより好ましく、５μｇ／ｍｌ以上が最も好ましいことが明らかとなった。一方、上限値については、市販のラミニン５２１の原液である１００μｇ／ｍｌであっても安定して機能することが明らかとなった。
【００６６】
（基材がシャーレ（ウェルプレート）の場合：コーティング濃度の検討２）
次に、ラミニン分子のコーティング濃度の検討を、より多くのラミニン分子（ラミニン１１１、２１１、２２１、３１１、３３２、４１１、４２１、５１１、５２１）について、濃度をより細かく振って、培養日数を長くして行った。ラミニン５２１についても条件をより細かく設定した。比較例として、ＳｙｎｔｈｅｍａｘとＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを用いた。
【００６７】
２４ウェルプレート（ポリスチレン製：ＣＥＬＬＳＴＡＲ、ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ社）をラミニンスクリーニング用キット（ＬＡＭｓｃｒｅｅｎ、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）にてコーティングした。コーティングは、１００、２０、１０、８．０、６．０、５．０、４．０、３．０、２．０、１．０、０．５、０．１μｇ／ｍｌにＰＢＳ（＋）で希釈したラミニン溶液をウェルに添加し、４℃にて一晩静置した。細胞播種前に、ラミニン溶液を吸引し、ヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を１．０×１０５個播種して、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。播種１、５、７、９、１２、１５、１８、２４、２８日経過後の培養状態を図６に示す。
【００６８】
比較例として、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘを用いた。２４ウェルプレート（ポリスチレン製：ＣＥＬＬＳＴＡＲ、ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ社）をＳｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）にてコーティングした。１０００００、５０００、３０００、２０００、１０００、５００、１００、７５、５０、２５、１０、５μｇ／ｍｌにＲＥＧＭで希釈した各Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ溶液をウェルに添加し、室温で静置した。２時間経過後、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ溶液を吸引し、室温で２時間乾燥させた。ここに、ヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を１．０×１０５個播種して、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。播種１、５、７、９、１２、１５、１８、２４、２８日経過後の培養状態を示す（図６）。
【００６９】
比較例として、Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅも用いた。２４ウェルプレート（ポリスチレン製：ＣＥＬＬＳＴＡＲ、ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ社）をＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ社）にてコーティングした。コーティングは、１０００００、５０００、３０００、２０００、１０００、５００、１００、７５、５０、２５、１０、５μｇ／ｍｌにＰＢＳ（−）で希釈した各Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ溶液をウェルに添加し、室温で静置した。２時間経過後、Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ溶液を吸引し、室温で２時間乾燥させた。ここに、ヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を１．０×１０５個播種して、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。播種１、５、７、９、１２、１５、１８、２４、２８日経過後の培養状態を示す（図６）。
【００７０】
（完全長ラミニン分子を用いた場合における接着分子の質量測定）
上述した手法でシャーレに接着分子をコーティング後、ＰＢＳ（−）で１回洗浄した。ここにタンパク質可溶化剤であるＭ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を添加後、ピペッティングして接着分子をシャーレ表面より剥離、回収した。これを２−Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または、ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ  ＦＩＴＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）にて接着分子をＦＩＴＣ標識して定量した（図６）。接着分子の定量には、ｗａｌｌａｃ  １４２０ＡＲＶＯ  ＭＸ／ＬＩＧＨＴ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いた。
【００７１】
図６（Ａ）〜図６（Ｋ）は、シャーレに対してコーティングする接着分子の濃度を変えた場合における細胞の増殖状態を経時的に示す図である。図６（Ａ）は、比較例としてＳｙｎｔｈｅｍａｘを用いた結果を示す図である。図６（Ｂ）は、比較例としてＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅを用いた結果を示す図である。図６（Ｃ）は、実施例としてラミニン１１１を用いた結果を示す図である。図６（Ｄ）は、実施例としてラミニン２１１を用いた結果を示す図である。図６（Ｅ）は、実施例としてラミニン２２１を用いた結果を示す図である。図６（Ｆ）は、実施例としてラミニン３１１を用いた結果を示す図である。図６（Ｇ）は、実施例としてラミニン３３２を用いた結果を示す図である。図６（Ｈ）は、比較例としてラミニン４１１を用いた結果を示す図である。図６（Ｉ）は、実施例としてラミニン４２１を用いた結果を示す図である。図６（Ｊ）は、実施例としてラミニン５１１を用いた結果を示す図である。図６（Ｋ）は、実施例としてラミニン５２１を用いた結果を示す図である。
【００７２】
なお、表中で「最大接着量（風乾）」とは、コーティング溶液が完全に蒸発することによってラミニン分子が基材にコーティングされるまで、コーティング溶液を４℃に静置した後に、測定したラミニン分子の接着分子量を示す。この場合、コーティング溶液に含まれるラミニン分子がすべて基材にコーティングされるため、接着分子量は乾燥前にコーティング溶液に含まれたラミニン分子の全量に等しい。一方、「接着量（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）」は、接着分子を含むコーティング溶液を４℃にて一晩静置することによってコーティングした後の接着分子量を示す。この場合、接着分子のうち実際にコーティングされた一部のラミニン分子に相当する接着分子量が測定される。また、「○」は、細胞の増殖によって細胞支持複合体の単層上皮構造の孔が塞がり、かつ細胞の単層上皮構造が維持されたことを示す。「△」の「凝集化傾向あり」とは、孔は生じていないが、一部分で細胞が積層してきた場合を示す。
【００７３】
図６（Ａ）より、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘでは濃度をどのように調節しても、７日を超えて培養細胞の単層構造が維持できなかった。同様に、図６（Ｂ）より、Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅでは濃度をどのように調節しても、７日を超えて培養細胞の単層構造が維持できなかった。
【００７４】
図６（Ｃ）より、ラミニン１１１の場合、３．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、約１５日以上培養細胞の単層構造が維持できた。４．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．１９μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、２８日以上培養細胞の単層構造が維持できた。ラミニン１１１の濃度が３．０μｇ／ｍｌ未満になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性がある。また、市販されたラミニン１１１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となる。また、コストがかかる。
【００７５】
図６（Ｄ）より、ラミニン２１１の場合、８．０μｇ／ｍｌ超の濃度でコーティングして約０．４５μｇ／ｃｍ２超の接着量とすれば、約１５日以上培養細胞の単層構造が維持できた。１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．５２μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、２８日以上培養細胞の単層構造が維持できた。ラミニン２１１の濃度が８．０μｇ／ｍｌ以下になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性がある。また、市販されたラミニン２１１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となる。また、コストがかかる。
【００７６】
図６（Ｅ）より、ラミニン２２１の場合、８．０μｇ／ｍｌ超の濃度でコーティングして約０．３０μｇ／ｃｍ２超の接着量とすれば、約１５日以上培養細胞の単層構造が維持できた。１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．３４μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、１８日以上培養細胞の単層構造が維持できた。ラミニン２２１の濃度が８．０μｇ／ｍｌ以下になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性がある。また、市販されたラミニン２２１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となる。また、コストがかかる。
【００７７】
図６（Ｆ）より、ラミニン３１１の場合、約２．５μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．１０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、約１５日以上培養細胞の単層構造が維持できた。４．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、２８日以上培養細胞の単層構造が維持できた。ラミニン３１１の濃度が約２．５μｇ／ｍｌ未満になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性がある。また、市販されたラミニン３１１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となる。また、コストがかかる。
【００７８】
図６（Ｇ）より、ラミニン３３２の場合、８．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングすれば、１５日以上培養細胞の単層構造が維持できた。１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングすれば、１８日以上培養細胞の単層構造が維持できた。ラミニン３３２の濃度が約８．０μｇ／ｍｌ未満になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性がある。また、市販されたラミニン３３２の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となる。また、コストがかかる。
【００７９】
図６（Ｈ）より、ラミニン４１１の場合、実用に耐える程度に細胞を重層化させることなく長期間培養することができなかった。
【００８０】
図６（Ｉ）より、ラミニン４２１の場合、５．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．５０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、１５日以上培養細胞の単層構造が維持できた。６．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして、約０．５４μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、１８日以上培養細胞の単層構造が維持できた。１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．６９μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、２８日以上培養細胞の単層構造が維持できた。ラミニン４２１の濃度が約０．５０μｇ／ｍｌ未満になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性がある。また、市販されたラミニン４２１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となる。また、コストがかかる。
【００８１】
図６（Ｊ）より、ラミニン５１１の場合、約８．０μｇ／ｍｌ超の濃度でコーティングして約０．３０μｇ／ｃｍ２超の接着量とすれば、約１５日以上培養細胞の単層構造が維持できた。１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして、約０．３２μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、１８日以上培養細胞の単層構造が維持できた。ラミニン５１１の濃度が約８．０μｇ／ｍｌ未満になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性がある。また、市販されたラミニン５１１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となる。また、コストがかかる。
【００８２】
図６（Ｋ）より、ラミニン５２１の場合、約４．５μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．４０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、約１５日以上培養細胞の単層構造が維持できた。５．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして約０．４４μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、２８日以上培養細胞の単層構造が維持できた。ラミニン５２１の濃度が約４．５μｇ／ｍｌ未満になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性がある。また、市販されたラミニン５２１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となる。また、コストがかかる。
【００８３】
（ＳＥＭを用いた細胞の層構造の観察）
ＮＭＰに溶解したＰＥＰＡ・ＰＥＳから、ドクターブレード法によりＰＥＰＡ・ＰＥＳ平膜を作製後、２４ウェルプレート（ポリスチレン製：ＣＥＬＬＳＴＡＲ、ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ−ｏｎｅ社）に設置し、１０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５２１溶液（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）を３００μｌ加え、４℃にて一晩静置した。ここに、ヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）１．０×１０５個を播種し、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。接着分子の比較例として、０．１％に調整したゼラチン溶液（コスモ・バイオ株式会社）を３００μｌずつ用いた。
【００８４】
３週間培養後、ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社）で洗浄後、４％パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬工業株式会社）と２％酸化オスミウム溶液（和光純薬工業株式会社）で固定した。さらに、エタノール（和光純薬工業株式会社）を７０、８０、９０、１００％の順で加えて脱水し、溶媒を１００％ブタノール（和光純薬工業株式会社）に置換した。これを凍結乾燥してＳＥＭ観察をした。ＳＥＭ写真（×５００、×２０００、×１００００）を図７に示す。
【００８５】
図７は、ラミニン５２１を用いた実施例およびゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）を用いた比較例に係る細胞支持複合体の顕微鏡写真である。ゼラチンをコーティングしたＰＥＰＡ中空糸膜上で近位尿細管上皮細胞を培養すると、細胞が重層化および扁平化して、細胞間に隙間が生じた。一方、ラミニン５２１をコーティングしたＰＥＰＡ中空糸膜上で近位尿細管上皮細胞を培養すると、敷石状細胞が単層で分布していたため、単層上皮構造の維持が確認された。
【００８６】
また、同様の試験を基材としてＰＥＳ膜を用いて実施したところ、同様にラミニン５２１では単層上皮構造の維持が確認され、ゼラチンでは細胞が重層化および扁平化して、細胞間に隙間が生じた。これらのことから、接着分子であるラミニン分子を適切に選択すれば、基材は比較的自由に選択できることが明らかとなった。
【００８７】
（基材が中空糸の場合１：ＥＶＯＨ中空糸膜ミニモジュール）
Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｖｉｎｙｌａｌｃｏｈｏｌ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ（ＥＶＯＨ）中空糸膜ミニモジュール（エバフラックス５Ａ２０、川澄化学工業株式会社）の内腔を１００％エタノールで洗浄後、１０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５２１溶液（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）にてコーティングし、４℃にて一晩静置した。接着分子の比較例として、０．１％に調整したゼラチン溶液（コスモ・バイオ株式会社）、および接着分子を含まないＰＢＳ（コーティング無し）を用いた。
【００８８】
ＰＢＳ洗浄後、１．０×１０７個／ｍｌに調整したヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を播種し、３７℃にて静置した。３時間経過後、ミニモジュールを上下反転し、再度、１．０×１０７個／ｍｌに調整したヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を播種し、３７℃にて静置した。３時間経過後、ミニモジュールを、培地であるＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）で満たした容器内に浸漬し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。播種１、１４日経過後の顕微鏡像（×２０）を図８に示す。
【００８９】
図８は、基材として中空糸膜を用いた場合におけるラミニン５２１を用いた実施例、ゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）を用いた比較例およびコーティング無しの比較例に係る細胞の増殖状態を示す顕微鏡写真である。コーティングしないＥＶＯＨ中空糸膜にヒト近位尿細管上皮細胞を播種すると、細胞がほとんど接着せず、１４日経過後もほとんど増殖しなかった。ゼラチンコーティングしたＥＶＯＨ中空糸膜にヒト近位尿細管上皮細胞を播種すると、培養１週間目以降、細胞の重層化が進み、培養１４日目には中空糸内腔を塞ぐほど大きくなった。一方、ラミニン５２１コーティングしたＥＶＯＨ中空糸膜にヒト近位尿細管細胞を播種すると、長期間単層構造が維持されることが確認された。
【００９０】
（基材がポリスルホン中空糸膜ミニモジュールの場合）
ポリスルホン中空糸膜ミニモジュールの内腔を１００％エタノールで洗浄後、１０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５２１溶液（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）にてコーティングし、４℃にて一晩静置した。比較例として、０．１％に調整したゼラチン溶液（コスモ・バイオ株式会社）を用いた。ＰＢＳ洗浄後、１×１０７個／ｍｌに調整したヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を播種し、３７℃にて静置した。３時間経過後、ミニモジュールを上下反転し、再度、１．０×１０７個／ｍｌに調整したヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を播種し、３７℃で静置した。３時間経過後、ミニモジュールを、培地であるＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）で満たした容器内に浸漬し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。
【００９１】
３週間培養後、ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社）で洗浄後、４％パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬工業株式会社）を用いて固定した。その後、エタノール（和光純薬工業株式会社）を７０、８０、９０、１００％の順で加えて脱水し、溶媒をキシレン（和光純薬工業株式会社）で置換した。そして、このミニモジュールから中空糸膜を切り出し、パラフィン（コスモ・バイオ株式会社）を用いて包埋処理した。この包埋したブロックから、ミクロトーム（大和光機工業株式会社）を用いて、横断面方向に厚さ５μｍの切片を切り出した。この切片を、スライドガラス（松浪硝子工業株式会社）に貼り付け、キシレン、１００、９０、８０、７０％エタノールの順で浸液させて脱パラフィン処理をし、培養細胞がハイブリッドした人工膜の断面を染色できる状態にした。次に、１０００倍希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（株式会社同仁化学研究所）で１時間反応させ、細胞核を染色した。そして、エタノール、キシレンで脱水処理をし、封入剤を用いて封入した。これらの核染色した細胞の蛍光顕微鏡画像を図９に示す。
【００９２】
図９は、基材としてポリスルホン中空糸膜ミニモジュールを用いた場合におけるラミニン５２１を用いた実施例およびゼラチンを用いた比較例に係る核染色した細胞の蛍光顕微鏡画像である。ゼラチンコーティングしたポリスルホン中空糸膜にヒト近位尿細管上皮細胞を播種すると、細胞が重層化してしまうことが確認された。一方、ラミニン５２１コーティングした中空糸膜にヒト近位尿細管上皮細胞を播種すると、長期間単層構造が維持されることが確認された。
【００９３】
（基材がＰＥＰＡ中空糸膜ミニモジュールの場合）
ＰＥＰＡ中空糸膜ミニモジュール（日機装株式会社）の内腔を１００％エタノールで洗浄後、１０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５２１溶液（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）にてコーティングし、４℃にて一晩静置した。比較例として、０．１％に調整したゼラチン溶液（コスモ・バイオ株式会社）を用いた。ＰＢＳ洗浄後、１．０×１０７個／ｍｌに調整したヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を播種し、３７℃で静置した。３時間経過後、ミニモジュールを上下反転し、再度、１×１０７個／ｍｌに調整したヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を播種し、３７℃で静置した。３時間経過後、ミニモジュールを、培地であるＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）で満たした容器内に浸漬し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。
【００９４】
３週間培養後、ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社）で洗浄後、４％パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬工業株式会社）を用いて固定した。その後、エタノール（和光純薬工業株式会社）を７０、８０、９０、１００％の順で加えて脱水し、溶媒をキシレン（和光純薬工業株式会社）で置換した。そして、このミニモジュールから中空糸膜を切り出し、パラフィン（コスモ・バイオ株式会社）を用いて包埋処理した。この包埋したブロックから、ミクロトーム（大和光機工業株式会社）を用いて、横断面方向に厚さ５μｍの切片を切り出した。この切片を、スライドガラスに貼り付け、キシレン、１００、９０、８０、７０％エタノールの順で浸液させて脱パラフィン処理し、近位尿細管がハイブリッドした人工膜の断面を染色できる状態にした。次に、１０００倍希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（株式会社同仁化学研究所）で１時間反応させ、細胞核を染色した。そして、エタノール、キシレンで脱水処理し、封入剤を用いて封入した。これらの核染色した細胞の蛍光顕微鏡画像を図１０に示す。
【００９５】
図１０は、基材としてＰＥＰＡ中空糸膜ミニモジュールを用いた場合におけるラミニン５２１を用いた実施例およびゼラチンを用いた比較例に係る核染色した細胞の蛍光顕微鏡画像である。ゼラチンコーティングしたＰＥＰＡ中空糸膜にヒト近位尿細管上皮細胞を播種すると、細胞が重層化してしまうことが確認された。一方、ラミニン５２１コーティングした中空糸膜にヒト近位尿細管上皮細胞を播種すると、長期間単層構造が維持されることが確認された。
【００９６】
（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの場合１）
図１１（Ａ）〜図１１（Ｃ）は、基材をＴｒａｎｓｗｅｌｌに固定した場合におけるラミニン５２１を用いた実施例およびゼラチンを用いた比較例を示す図である。図１１（Ａ）は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌを側面から見た概略図である。図１１（Ａ）の「人工膜＋コーティング基質」は、ラミニン５２１でコーティングされた基材を示す。図１１（Ａ）に示すように、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート（ＰＣ、ＰＥＴ；ポアサイズ０．４μｍ：Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社））を２４ウェルプレートに設置した。その後、インサート下部にＰＢＳ（ナカライテスク株式会社）を７００μｌ、インサート上部に１０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５２１溶液（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）を３００μｌ加え、４℃にて一晩静置した。比較例として、０．１％に調整したゼラチン溶液（コスモ・バイオ株式会社）を用いた。次に、１．０×１０５個／ｍｌのヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）１４０μｌ（１．４×１０４個）を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）をラミニン５２１でコーティングした基材に播種し、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。
【００９７】
３週間培養後、ＰＢＳ（ナカライテスク株式会社）で洗浄後、４％パラホルムアルデヒド溶液（和光純薬工業株式会社）を用いて固定した。次に、１０００倍希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（株式会社同仁化学研究所）で１時間反応させ、細胞核を染色した。これらの核染色した細胞の蛍光顕微鏡画像を図１１（Ｂ）に示す。
【００９８】
さらに、エタノールを７０、８０、９０、１００％の順で加えて脱水し、溶媒をキシレン（和光純薬工業株式会社）にて置換した。そして、このミニモジュールから中空糸膜を切り出し、パラフィン（コスモ・バイオ株式会社）を用いて包埋処理した。この包埋したブロックから、ミクロトーム（大和光機工業株式会社）を用いて、厚さ５μｍの切片を切り出した。この切片を、スライドガラスに貼り付け、キシレン、１００、９０、８０、７０％エタノールの順で浸液させて脱パラフィン処理し、近位尿細管がハイブリッドした人工膜の断面を染色できる状態にした。これに、細胞核染色試薬Ｍａｙｅｒ’ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（和光純薬工業株式会社）、細胞質染色試薬Ｅｏｓｉｎ  Ｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（和光純薬工業株式会社）を反応させた。そして、エタノール、キシレンで脱水処理し、封入剤を用いて封入した。これらのＨＥ染色した細胞の顕微鏡画像を図１１（Ｃ）に示す。
【００９９】
図１１（Ｂ）は、ラミニン５２１を用いた実施例およびゼラチンを用いた比較例に係る核染色した細胞の蛍光顕微鏡画像である。図１１（Ｃ）は、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの断面に関して細胞をＨＥ染色した顕微鏡画像である。基材である人工膜（ＰＣ、ＰＥＴ膜）でヒト近位尿細管上皮細胞を培養すると、実施例としてラミニン５２１コーティングした場合、核が人工膜上で均一に分布しており、細胞が単層に分布していた（図１１（Ｂ））。一方、比較例としてゼラチンコーティングした場合、核が人工膜上で凝集して分布しており、細胞が重なり合っていた（図１１（Ｂ））。また、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの断面図より、ヒト近位尿細管上皮細胞は、ゼラチンコーティングしたＰＥＴ膜上では重層しているのに対し、ラミニン５２１コーティングしたＰＥＴ膜上では単層の状態が維持されていた（図１１（Ｃ））。
【０１００】
この結果より、基材としてＰＣ、ＰＥＴ膜を用いた場合にも、ラミニン５２１コーティングすることによってヒト近位尿細管上皮細胞の単層構造を長期間維持可能であることがわかった。
【０１０１】
（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌの場合２：基材のポアサイズの検討）
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌセルカルチャーインサート（ＰＣ；ポアサイズ０．４、３．０、５．０、８．０μｍ：Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社））を２４ウェルプレートに設置した。その後、インサート下部にＰＢＳ（ナカライテスク株式会社）を７００μｌ、インサート上部に１０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５２１溶液（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）を３００μｌ加え、４℃にて一晩静置した。比較例として、０．１％に調整したゼラチン溶液（コスモ・バイオ株式会社）を用いた。これらに１．０×１０５個／ｍｌのヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）１４０μｌ（１．４×１０４個）をラミニン５２１でコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。接着分子の比較例として、０．１％に調整したゼラチン溶液（コスモ・バイオ株式会社）を３００μｌずつ用いた。培養後、２４ウェルプレート底部を顕微鏡観察し、人工膜より細胞が落下しているか調べた。
【０１０２】
その結果、ラミニン５２１でコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌの人工膜（ＰＣ）の孔径が５．０、８．０μｍの場合、播種した細胞が膜を通過した。ただし、５．０μｍの場合は、細胞は膜を通過しにくい場合があった。一方、０．３、３．０μｍの場合、播種した細胞が膜を通過しなかった。よって、人工膜上に任意の数の細胞を播種する場合、孔径が５．０μｍ未満の人工膜を使用することが好ましいことが明らかとなった。また、比較例としてゼラチンコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌを用いて同様の試験を実施した場合も、同様の傾向を示した。
【０１０３】
（完全長ラミニン分子を用いた場合における細胞上皮抵抗値の検討）
試験方法：１．０×１０５個／ｍｌのヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）１４０μｌ（１．４×１０４個）をラミニン３１１、ラミニン５１１、ラミニン５２１でコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２８日間培養した。培地は２日毎に交換した。培養中、細胞のバリア機能の指標である径上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ；Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＥＲＳ−２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で測定した。
【０１０４】
その結果、培養２８日後の電気抵抗値の値を比較（ラミニン１１１＝１）すると、ラミニン２１１＝０．８、ラミニン２２１＝０．８、ラミニン３１１＝１．３、ラミニン３３２＝０．８、ラミニン４１１＝０．９、ラミニン４２１＝０．８、ラミニン５１１＝１．１、ラミニン５２１＝１．２となった。よって、細胞層のバリア機能をラミニン１１１よりも高めるラミニン種は、ラミニン３１１、ラミニン５１１、ラミニン５２１であった。
【０１０５】
（ラミニン分子の断片を用いる場合：コーティング濃度の検討１）
２４ウェルプレート（ポリスチレン製：ＣＥＬＬＳＴＡＲ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ社）を５００、５０、２．５、１．０、０．５、０．１、０μｇ／ｍｌに調整したｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ラミニン５１１−Ｅ８溶液：株式会社ニッピ）にてコーティングした。コーティングは、ＰＢＳ（−）にてこれらの濃度に希釈したラミニン溶液をウェルに添加し、４℃にて一晩静置することにより行われた。ここにヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を１×１０５個播種して、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。播種１５日経過後の顕微鏡像（×１０）を示す。
【０１０６】
図１２は、シャーレに対してコーティングするラミニン分子３０の断片であるラミニン５１１−Ｅ８の濃度を変えた場合における播種１５日後における増殖状態を示す図である。図１２より、コーティング濃度１〜２μｇ／ｍｌの間で、ヒト近位尿細管細胞の形状が単層から凝集体を形成するように変化することが確認された。
【０１０７】
（ラミニン分子の改変体を用いる場合：コーティング濃度の検討２）
次に、５１１−Ｅ８の濃度を変化させた場合における細胞の増殖状態を経時的により詳細に確認した。ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ラミニン５１１−Ｅ８溶液：株式会社ニッピ）によるコーティングを、５００、１００、５０、１０、５、２．５、１．７、１．４３、１．２５、１．０、０．５、０μｇ／ｍｌに希釈したラミニン溶液を用いた点、および播種５、９、１２、１５、１８、２８日経過後の顕微鏡像（×１０）を取得した点が上述した「コーティング濃度の検討１」とは異なる。
【０１０８】
図１３は、シャーレに対してコーティングするラミニン分子３０の断片であるラミニン５１１−Ｅ８の濃度を変えた場合における細胞の形態の経時的な変化を示す図である。図１３より、コーティング濃度１．２５〜１．４３μｇ／ｍｌの間で、ヒト近位尿細管細胞の形状が単層から凝集体を形成するように変化することが確認された。
【０１０９】
（ラミニン分子の改変体を用いる場合：接着量の質量測定）
上述した「完全長ラミニン分子における接着分子の質量測定」と同様の手法にて、ラミニン分子の改変体としてラミニン分子の断片を用いる場合における接着量の質量測定を行った。播種５、７、９、１２、１５、１８、２４、２８日経過後の細胞形状とラミニン５１１−Ｅ８の接着量を図１４に示す。
【０１１０】
図１４は、シャーレに対してコーティングするラミニン分子３０の断片であるラミニン５１１−Ｅ８の濃度を変えた場合における接着分子の質量測定の結果と細胞の増殖状態の経時的な変化を示す図である。ラミニン５１１−Ｅ８を約１．４μｇ／ｍｌ以上約５００μｇ／ｍｌ以下の濃度でコーティングして０．１５μｇ／ｃｍ２以上、３１．１８μｇ／ｃｍ２以下の接着量とした場合には、培養細胞の単層構造を２８日以上維持することができた。１．３μｇ／ｍｌ以下の場合には、コーティングによる効果がほとんど見られなかった。一方、５００μｇ／ｍｌを超える場合には、コーティング溶液の調整が難しくなる。
【０１１１】
（ラミニン分子の改変体を用いる場合：細胞上皮抵抗値の検討）
試験方法：３．０×１０５個／ｍｌのヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）１５０μｌ（４．５×１０４個）を、１．５μｇ／ｃｍ２のラミニン５１１−Ｅ８、１．０μｇ／ｃｍ２のラミニン５２１でコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。培養中、細胞のバリア機能の指標である径上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ；Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＥＲＳ−２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で測定した。
【０１１２】
図１５は、ラミニン５１１−Ｅ８とラミニン５２１でコーティングした場合における播種後２、４、７、１１、１８日経過後のＴＥＥＲ値の経時変化を示す図である。図１５より、ラミニン５１１−Ｅ８とラミニン５２１でコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌにヒト近位尿細管上皮細胞を播種すると、ＴＥＥＲ値が上昇した。このことから、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上に細胞が密に接着していることが確認された。また、ラミニン５１１−Ｅ８をコーティングした方が、ラミニン５２１でコーティングしたよりも、ＴＥＥＲ値が高い傾向にあった。このことから、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上でラミニン５１１−Ｅ８の方がラミニン５２１よりも高密度に接着されていること、および細胞がより密に接着していることが示唆された。ラミニン３１１−Ｅ８、ラミニン５２１−Ｅ８などその他のラミニン分子のＥ８領域の改変体でも、同様の効果が期待される。
【０１１３】
以上、本発明を実施例にもとづいて説明した。本発明は上記実施の形態に限定されず、種々の設計変更が可能であり、様々な変形例が可能であること、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは、当業者に理解されるところである。
【符号の説明】
【０１１４】
１０…細胞支持複合体、２０…基材、３０…ラミニン分子、４０…培養細胞。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明は、細胞支持複合体、特に、尿細管上皮細胞を用いた細胞支持複合体に関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年2月2日(2018.2.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工材料で形成された基材と、
前記基材の少なくとも一部に接着するラミニン分子もしくはその断片と、
前記ラミニン分子もしくはその断片を介して前記基材に付着した培養細胞である尿細管上皮細胞または尿細管上皮様細胞と、を有し、
前記ラミニン分子もしくはその断片は、前記基材に対する接着量が０．１５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン１１１の組み換え体、前記基材に対する接着量が０．４５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン２１１の組み換え体、前記基材に対する接着量が０．３０μｇ／ｃｍ２以上のラミニン２２１の組み換え体、前記基材に対する接着量が０．０７μｇ／ｃｍ２以上のラミニン３１１の組み換え体、前記基材に対する風乾時の最大接着量が０．８μｇ／ｃｍ２以上のラミニン３３２の組み換え体、前記基材に対する接着量が０．５０μｇ／ｃｍ２以上のラミニン４２１の組み換え体、前記基材に対する接着量が０．０５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５１１の組み換え体、前記基材に対する接着量が０．１５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５１１のＥ８領域の改変体、前記基材に対する接着量が０．３３μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５２１の組み換え体、もしくはこれらの断片のうちの１つから選択されることを特徴とする細胞支持複合体。
【請求項２】
前記ラミニン分子もしくはその断片は、前記基材に対する接着量が０．１５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン３１１の組み換え体、前記基材に対する接着量が０．３２μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５１１の組み換え体、前記基材に対する接着量が０．１５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５１１のＥ８領域の改変体、前記基材に対する接着量が０．４４μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５２１の組み換え体、もしくはこれらの断片のうちの１つから選択されることを特徴とする請求項１に記載の細胞支持複合体。
【請求項３】
前記培養細胞は、実質的に重層化することなくコンフルエントな単層を形成していることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞支持複合体。
【請求項４】
人工材料で形成された基材の少なくとも一部に、ラミニン分子もしくはその断片をコーティングするステップと、
前記基材に接着した前記ラミニン分子もしくはその断片に対して培養細胞である尿細管上皮細胞または尿細管上皮様細胞を播種するステップと、
前記培養細胞を培養することにより、前記培養細胞の単層構造を形成するステップと、を含み、
前記ラミニン分子もしくはその断片をコーティングするステップは、ラミニン１１１を３．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン２１１を８．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．４５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン２２１を８．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．３０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン３１１を２．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．０７μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン３３２を５．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．８μｇ／ｃｍ２以上の風乾時の最大接着量とすること、ラミニン４２１を５．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．５０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５１１を２．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．０５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５１１のＥ８領域の改変体を１．４μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５２１を４．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．３３μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることのいずれか１つを含むことを特徴とする細胞支持複合体の製造方法。
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
前記ラミニン分子もしくはその断片をコーティングするステップは、ラミニン３１１を４．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５１１を１０．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．３２μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５１１のＥ８領域の改変体を１．４μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５２１を５．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．４４μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることのいずれか１つを含むことを特徴とする請求項４に記載の細胞支持複合体の製造方法。
【請求項１１】
前記培養細胞は、実質的に重層化することなくコンフルエントな単層を形成していることを特徴とする請求項４または１０に記載の細胞支持複合体の製造方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
技術分野
［０００１］
本発明は、細胞支持複合体、特に、尿細管上皮細胞を用いた細胞支持複合体に関する。
背景技術
［０００２］
近年、急性及び、慢性腎不全患者の腎機能を代替するバイオ人工腎臓として、中空糸膜等のポリマー膜と尿細管上皮細胞をハイブリッド化したモジュールの開発が進められている。特に、バイオ人工腎臓の製造や供給、使用を考慮すると、数週間以上にわたって腎機能を維持できるバイオ人工腎臓が必要になる。
［０００３］
しかし、腎臓から酵素処理により分離された尿細管上皮細胞は、生体内環境の消失やシャーレ上における培養による細胞の特徴の変化などから、本来の円柱状の細胞構造を維持できない。具体的には、尿細管上皮細胞をシャーレや人工膜上に播種すると、単層上皮構造を消失して細胞間に隙間が生じたり、細胞が重層化することが知られている。このような現象が生じることで、バイオ人工腎臓の血漿中の有用成分の再吸収機能が劣化する。
［０００４］
尿細管上皮細胞の重層化や接触阻害を回避する手法として、特許文献１に開示されたバイオ人工尿細管が知られている。これは、ＭＥＫ阻害剤の適用により、尿細管上皮細胞の接触阻害や重層化を抑制し、コンフルエント（細胞が容器いっぱいに隙間なく増殖した状態）な単層を、人工膜内面に持続的に形成させる技術である（特許文献１）。
先行技術文献
特許文献
［０００５］
特許文献１：国際公開第２００８／０４７７６０号
発明の概要
発明が解決しようとする課題
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月13日(2018.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工材料で形成された基材と、
前記基材の少なくとも一部に接着するラミニン分子もしくはその断片と、
前記ラミニン分子もしくはその断片を介して前記基材に付着した培養細胞である尿細管上皮細胞または尿細管上皮様細胞と、を有し、
前記ラミニン分子もしくはその断片は、前記基材に対する接着量が０．１５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン１１１、前記基材に対する接着量が０．４５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン２１１、前記基材に対する接着量が０．３０μｇ／ｃｍ２以上のラミニン２２１、前記基材に対する接着量が０．０７μｇ／ｃｍ２以上のラミニン３１１、前記基材に対する風乾時の最大接着量が０．８μｇ／ｃｍ２以上のラミニン３３２、前記基材に対する接着量が０．５０μｇ／ｃｍ２以上のラミニン４２１、前記基材に対する接着量が０．０５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５１１、前記基材に対する接着量が０．１５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５１１のＥ８領域の改変体、前記基材に対する接着量が０．３３μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５２１、もしくはこれらの断片のうちの１つから選択されることを特徴とする細胞支持複合体。
【請求項２】
前記ラミニン分子もしくはその断片は、前記基材に対する接着量が０．１５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン３１１、前記基材に対する接着量が０．３２μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５１１、前記基材に対する接着量が０．１５μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５１１のＥ８領域の改変体、前記基材に対する接着量が０．４４μｇ／ｃｍ２以上のラミニン５２１、もしくはこれらの断片のうちの１つから選択されることを特徴とする請求項１に記載の細胞支持複合体。
【請求項３】
前記培養細胞は、実質的に重層化することなくコンフルエントな単層を形成していることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞支持複合体。
【請求項４】
人工材料で形成された基材の少なくとも一部に、ラミニン分子もしくはその断片をコーティングするステップと、
前記基材に接着した前記ラミニン分子もしくはその断片に対して培養細胞である尿細管上皮細胞または尿細管上皮様細胞を播種するステップと、
前記培養細胞を培養することにより、前記培養細胞の単層構造を形成するステップと、を含み、
前記ラミニン分子もしくはその断片をコーティングするステップは、ラミニン１１１を３．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン２１１を８．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．４５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン２２１を８．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．３０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン３１１を２．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．０７μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン３３２を５．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．８μｇ／ｃｍ２以上の風乾時の最大接着量とすること、ラミニン４２１を５．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．５０μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５１１を２．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．０５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５１１のＥ８領域の改変体を１．４μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５２１を４．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．３３μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることのいずれか１つを含むことを特徴とする細胞支持複合体の製造方法。
【請求項５】
前記ラミニン分子もしくはその断片をコーティングするステップは、ラミニン３１１を４．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５１１を１０．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．３２μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５１１のＥ８領域の改変体を１．４μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．１５μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすること、ラミニン５２１を５．０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして０．４４μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることのいずれか１つを含むことを特徴とする請求項４に記載の細胞支持複合体の製造方法。
【請求項６】
前記培養細胞は、実質的に重層化することなくコンフルエントな単層を形成していることを特徴とする請求項４または５に記載の細胞支持複合体の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００８／０４７７６０号
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
（基材２０）
基材２０は、尿細管上皮細胞の培養に用いられるモジュールである。図２（Ａ）には、基材２０が水や各種イオンの透過性を有する場合を示す。この場合、基材２０は、糖や低分子タンパク質の透過性も有することが好ましい。そのため、基材２０には、孔が形成されている。基材２０の平均孔径は、５μｍ以下である。このような基材２０として、たとえば、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社：平均孔径０．４または３．０μｍ）を用いることができる。平均孔径が５μｍ超の場合には、基材２０を細胞が通過してしまう場合があるため好ましくない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
ラミニン５１１の場合、約８．０μｇ／ｍｌ超の濃度でコーティングして約０．３０μｇ／ｃｍ２超の接着量とすることが好ましい。これにより、約１５日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして、約０．３２μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすることがより好ましい。これにより、１８日以上培養細胞の単層構造を維持することができる。ラミニン５１１の濃度が約８．０μｇ／ｍｌ以下になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性があるためである。また、市販されたラミニン５１１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となるため、およびコストがかかるため、１００μｇ／ｍｌ以下の濃度が好ましい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
（完全長ラミニン分子を用いた場合における接着分子の質量測定）
上述した手法でシャーレに接着分子をコーティング後、ＰＢＳ（−）で１回洗浄した。ここにタンパク質可溶化剤であるＭ−ＰＥＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を添加後、ピペッティングして接着分子をシャーレ表面より剥離、回収した。これを２−Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）または、ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ  ＦＩＴＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて接着分子をＦＩＴＣ標識して定量した（図６）。接着分子の定量には、ｗａｌｌａｃ  １４２０ＡＲＶＯ  ＭＸ／ＬＩＧＨＴ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
図６（Ｊ）より、ラミニン５１１の場合、約８．０μｇ／ｍｌ超の濃度でコーティングして約０．３０μｇ／ｃｍ２超の接着量とすれば、約１５日以上培養細胞の単層構造が維持できた。１０μｇ／ｍｌ以上の濃度でコーティングして、約０．３２μｇ／ｃｍ２以上の接着量とすれば、１８日以上培養細胞の単層構造が維持できた。ラミニン５１１の濃度が約８．０μｇ／ｍｌ以下になると、接着分子としての機能を十分に発揮できない可能性がある。また、市販されたラミニン５１１の濃度を考慮すると、１００μｇ／ｍｌを超える濃度は処理が煩雑となる。また、コストがかかる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
（基材がポリスルホン中空糸膜ミニモジュールの場合）
ポリスルホン中空糸膜ミニモジュールの内腔を１００％エタノールで洗浄後、１０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５２１溶液（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）にてコーティングし、４℃にて一晩静置した。比較例として、０．１％に調整したゼラチン溶液（コスモ・バイオ株式会社）を用いた。ＰＢＳ洗浄後、１．０×１０７個／ｍｌに調整したヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を播種し、３７℃にて静置した。３時間経過後、ミニモジュールを上下反転し、再度、１．０×１０７個／ｍｌに調整したヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を播種し、３７℃で静置した。３時間経過後、ミニモジュールを、培地であるＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）で満たした容器内に浸漬し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
（基材がＰＥＰＡ中空糸膜ミニモジュールの場合）
ＰＥＰＡ中空糸膜ミニモジュール（日機装株式会社）の内腔を１００％エタノールで洗浄後、１０μｇ／ｍｌに調整したラミニン５２１溶液（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）にてコーティングし、４℃にて一晩静置した。比較例として、０．１％に調整したゼラチン溶液（コスモ・バイオ株式会社）を用いた。ＰＢＳ洗浄後、１．０×１０７個／ｍｌに調整したヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を播種し、３７℃で静置した。３時間経過後、ミニモジュールを上下反転し、再度、１．０×１０７個／ｍｌに調整したヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を播種し、３７℃で静置した。３時間経過後、ミニモジュールを、培地であるＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）で満たした容器内に浸漬し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
（完全長ラミニン分子を用いた場合における細胞上皮抵抗値の検討）
試験方法：１．０×１０５個／ｍｌのヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）１４０μｌ（１．４×１０４個）をラミニン３１１、ラミニン５１１、ラミニン５２１でコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２８日間培養した。培地は２日毎に交換した。培養中、細胞のバリア機能の指標である経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ；Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＥＲＳ−２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で測定した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
（ラミニン分子の断片を用いる場合：コーティング濃度の検討１）
２４ウェルプレート（ポリスチレン製：ＣＥＬＬＳＴＡＲ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ社）を５００、５０、２．５、１．０、０．５、０．１、０μｇ／ｍｌに調整したｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ラミニン５１１−Ｅ８溶液：株式会社ニッピ）にてコーティングした。コーティングは、ＰＢＳ（−）にてこれらの濃度に希釈したラミニン溶液をウェルに添加し、４℃にて一晩静置することにより行われた。ここにヒト近位尿細管細胞（Ｌｏｎｚａ社）を１．０×１０５個播種して、培地としてＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。播種１５日経過後の顕微鏡像（×１０）を示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
（ラミニン分子の改変体を用いる場合：細胞上皮抵抗値の検討）
試験方法：３．０×１０５個／ｍｌのヒト近位尿細管上皮細胞（Ｌｏｎｚａ社）１５０μｌ（４．５×１０４個）を、１．５μｇ／ｃｍ２のラミニン５１１−Ｅ８、１．０μｇ／ｃｍ２のラミニン５２１でコーティングしたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、ＲＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ社）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。培地は２日毎に交換した。培養中、細胞のバリア機能の指標である経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ；Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）をＭｉｌｌｉｃｅｌｌ  ＥＲＳ−２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で測定した。
【国際調査報告】
2017082026.tif 000020
2017082026.tif 000021
2017082026.tif 000022
2017082026.tif 000023
2017082026.tif 000024