(57)【要約】【課題】生産コストが低く、したがって使い捨てにすることができる、血液等の流動媒体の凝固時間を測定するための方法の提供。【解決手段】  試料を導入する手段（１）と連結された、流動媒体が毛細管力のみにより駆動されて流れることを可能とするマイクロ流路と、その流路の初めの位置にあって、流動媒体と反応し得る試薬を含み、凝固カスケードを開始する区域とを少なくとも備えてなるマイクロ流体デバイスを用意し、流動媒体の試料を導入し、流頭の位置を時間の関数Ｌ（ｔ）として読み取り、凝固が起こらないときの前記流動媒体の先頭の伝搬の理論値を、時間の関数として提示し、ここで凝固時間ＣＴが、反応が開始した時間から、読み取られた凝固関数Ｌ（ｔ）が、特定の閾値を超えて、理論値から逸脱した瞬間まで、に経過した時間として測定されることを特徴とする方法である。【選択図】  図２
2014038109.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液または血漿などの流動媒体の凝固時間を測定する方法であって、
・−流動媒体の試料を導入する手段（１）と、
−試料を導入する前記手段（１）と連結され、前記流動媒体がマイクロ流路の長さに沿って流れるようにされた領域であって、その領域の範囲内に、少なくとも一部に親水性材料でカバーされ、流動媒体が毛細管力のみにより駆動されて流れることを可能とするマイクロ流路を含んでなる領域と
−前記領域の初めの位置にあって、前記流動媒体と反応し得る試薬を含み、凝固カスケードを開始する区域と
を少なくとも備えてなるマイクロ流体デバイスを用意する工程と、
・流動媒体の試料を導入する前記手段（１）に、前記流動媒体の試料を導入する工程と、
・流頭の位置を時間の関数Ｌ（ｔ）として読み取る工程と、
・凝固が起こらないときの前記流動媒体の先頭の伝搬の理論値を、時間の関数として提示する工程と
を含んでなり、
ここで、凝固時間ＣＴが、反応が開始した時間から、読み取られた凝固関数Ｌ（ｔ）が、特定の閾値を超えて、理論値から逸脱した瞬間まで、に経過した時間として測定されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
ｌｏｇ  （ｔ）に対するｌｏｇ  Ｌ（ｔ）の勾配が変化したとき、前記読み取られた凝固関数Ｌ（ｔ）が、特定の閾値を超えて、理論値から逸脱したものとみなす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
関数Ｙ＝Ｙ（ｕ）＝ｌｏｇ  Ｌ（ｔ）が、変数ｕ＝ｌｏｇ  ｔを変化させることにより、読み取られた凝固関数Ｌ（ｔ）から得られ、ここで、第一次導関数ｄＹ／ｄｕが、特定の閾値を超えて、一定値０．５から逸脱したとき、ｌｏｇ  （ｔ）に対するｌｏｇ  Ｌ（ｔ）の勾配が変化したとする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
関数Ｙ＝Ｙ（ｕ）＝ｌｏｇ  Ｌ（ｔ）が、変数ｕ＝ｌｏｇ  ｔを変化させることにより、読み取られた凝固関数Ｌ（ｔ）から得られ、ここで、第二次導関数ｄ２Ｙ／ｄｕ２の減衰が、特定の閾値を超えて、０から逸脱したとき、ｌｏｇ  （ｔ）に対するｌｏｇ  Ｌ（ｔ）の勾配が変化したとする、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラボオンチップ（Lab-on-a-Chip）型デバイスおよび流動媒体の凝固時間の測定方法、特に血液の凝固時間の測定方法に関する。また、本発明は、本発明のラボオンチップと組み合わせて使用される凝固計などの測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
健常者では、血液粘度および濃度は、止血として知られているプロセスにより調整を受ける。この機構により、血管系から血液が損失するのが防止される。
【０００３】
血液凝固は、複雑なプロセスにより調整され、体内での出血が停止する。安定な血塊は、凝固タンパク質因子、血管および血小板の相互作用を介して形成される。このプロセスは、血塊が溶解したとき、治癒後も継続する。
【０００４】
血塊形成の第一段階中、血小板が凝集し、同時に、血液カスケードとして知られている現象が活性化する。このプロセスにおいて、可溶性血漿タンパク質であるフィブリノーゲンが、不溶性フィブリンメッシュまたは血塊に転化する。この転化は、血液中の不活性形態（プロトロンビン）で一般的に存在する酵素であるトロンビンにより触媒される。
【０００５】
血液疾患は、止血におけるアンバランスから生じる。これらは、抗リン脂質抗体症候群、過敏性腸症候群または癌等の他条件により引き起こされるか、または外部要因を介して獲得する、血友病またはフォンウィルブランド病におけるような遺伝的原因のことがあり、患者は、経口抗凝固薬を、血栓疾患、心疾患または血管疾患の治療または予防として服用する。
【０００６】
ワルファリン等の経口抗凝固薬療法は、広く使用され、治療指数が狭いため頻繁に監視する必要がある。投与量を定期的に調整して、血栓形成や、出血の危険を回避する必要がある。
【０００７】
公知の素因条件、例えば、不動性状態、肥満、媒介または外科治療もしくは歯科治療などを有するこれらおよび他の患者のために、家庭で定期的に凝固を監視できる信頼性のある試験とは、現在可能な臨床凝固試験に代わる、使いやすく、高速で、安価な試験でなければならないであろう。このような試験は、止血障害の診断において予備的な補助としても用いられることになるかもしれない。
【０００８】
世界で最も一般的な凝固分析は、いわゆる国際標準比（ＩＮＲ）である。この比は、凝固剤による活性化から血塊形成の開始までに経過した時間であるプロトロンビン時間（ＰＴ）により計算される。活性剤は組織因子またはトロンボプラスチンであり、この機構は「外因」経路と呼ばれている。異なるバッチ間や組織因子（生物学的に得られた生成物）の製造業者間で差が生じるため、結果を標準化するためにＩＮＲが考案された。ＩＮＲは、患者のプロトロンビン時間の、少なくとも２０人の健常人の平均プロトロンビン時間（ＭＮＰＴ）に対する比を、使用対照試料についての国際感受性指標（ＩＳＩ）値の累乗としたものである。各業者は商品化されたいずれかの因子組織についてＩＳＩを得て、特定の組織因子のバッチを、国際標準化試料と比較して示す。
【０００９】
もうひとつの、あまり一般的には使用されていない分析がある。この分析は、「内因」経路を介する類似凝固機構から構成されており、これは活性化部分プロトロンビン時間（ＡＰＴＴ）と呼ばれている。これらの分析の両方は、本願においては凝固時間と称する。
【００１０】
従来、ヨーロッパでは、これらの分析は実験室で実施されており、この場合、血液試料の調製はＰＴを測定する前に通常行う必要がある。近年、看護師または医師により直接使用されるか、あるいは患者が自分で使用するポイントオブケア（ＰＯＣ）デバイスまたは同じような名前の患者近接検査（ＮＰＴ）が用いられる傾向にあり、従来の方法に大きく取って変わっている。
【００１１】
初期に開発され、当該技術分野において知られている方法は、静脈穿刺により大量または正確な量の血液を抜き取り、続いて血液を処理してから試験をし、専門家によるプロセスを実施して、結果を解釈することを必要とする。これに対して、携帯用凝固計としても知られているポイントオブケア凝固計は、フィンガープリックにより全血滴を抜き出しして、直ちにＩＮＲの結果を得る必要がある。
【００１２】
ＷＯ９２／２１０２８号公報は、強磁性に基づく検出方法を記載している。この方法で用いるデバイスは、凝固チャンバーと制御チャンバーとを収容しており、これらの各々には振動磁場で回転する攪拌翼が装着されている。凝固チャンバーの翼の回転は、血液が凝固し始め、血液の移動に対する抵抗を示すとともに、遅くなる。凝固時間は、チャンバーにおける攪拌翼の相対的な動きが変化したときの時間として測定される。
【００１３】
米国特許第５，１１０，７２７号に記載のような他のデバイスは、金属粒子を分散した血液試料を収容している。振動磁場をかけると、粒子の前後の動きが生じるが、この動きは血液が凝固するとともに低速となる。速度の減少は、血液試料の粘度の増加や凝固の開始と関連がある。
【００１４】
ＷＯ００／０６７６１号およびＷＯ０２／４８７０７Ａ２号の両方とも、固定血液試料と接触した状態の電極を装着したデバイスを記載しており、血液の粘度の増加にともなう、導電率および電流の変動をそれぞれ測定する。
【００１５】
ＷＯ２００４／０５９３１６Ａ１号は、血液の凝固時間を測定するための低コストで使い捨てのデバイスを記載している。このデバイスは、少なくとも一部分が流体と接触しているマイクロセンサーを装着しており、血液が凝固し流れが停止したときの流路における血液のインピーダンス及び容量を測定する。
【００１６】
しかしながら、これらのデバイスに付随する生産コストが高く、使い捨てユニットとして使用が限定されている。
【００１７】
したがって、ＰＯＣおよび／またはＮＰＴ凝固時間の測定のための、正確、低コストで使い捨てのチップおよび検出方法が依然として必要とされていた。
【００１８】
また、検出試験でより小さい試料サイズが求められる傾向があり、材料科学ならびにエレクトロニクスおよび光学的方法の進歩により、マイクロリットルサイズのより小さくかつ未測定の全血試料が必要とされている。
【００１９】
ＷＯ２００７／０２５５５９Ａ１号は、血漿または全血試料における凝固を測定するための多層デバイスを開示している。このデバイスは、一つ以上の検出区域を備えてなり、これらの全てには少なくとも一つの凝固刺激試薬が備わっている。
【００２０】
米国特許２００７／０１２２８４９Ａ１号は、分析物の定量分析および検出のためのマイクロ流体チップにおける試料アッセイ構造を開示している。
【００２１】
欧州特許０３９４０７０Ｂ１号は、容積４０μＬで滞留時間２００秒の全血試料における  ＡＰＴＴを測定できるように最適化された一つの毛管路からなるマイクロ流体デバイスを記載している。このデバイスは、試薬として、活性化部分トロンボプラスチン時間測定用の活性物質の混合物およびリン脂質の混合物を使用している。この検出法は、毛管トラックを介して、ＬＥＤなどの可視または光学デバイスを用いており、デバイスに沿って血液の流れが停止したときのＡＰＴＴを測定する。
【００２２】
米国特許第６、９００、０２１号は、細胞に対する種々の化合物の反応および影響についての生体外研究をおこなうためのマイクロ流体デバイスを記載している。流体流動は、ポンプ、圧力差または電場を用いて制御され、マイクロ流体流路における毛管現象によっては制御されない。２つの入り口流路があり、これらが主流路と交差および統合して反応が生じるようになっている。したがって、主流路は、試薬を含む区域を備えていない。さらに、試薬は、チップには存在しないが、種々の時点および時間で添加される。これにより、チップを、種々の試薬を用いて種々の反応アッセイに使用できる。
【００２３】
これらの進歩にもかかわらず、今日使用されているポイントオブケア凝固計には、依然大きな難点がある：
−使用されるチップまたは試験ストリップのほとんどは使い捨てであるけれども、いくつかの部品、例えば、血液試料を採取する手段、電気電導度の変化を測定する手段または粘度の変化を測定する手段を備えてなる。ストリップにおける電気化学コンタクトまたは振動粒子などの活性成分が存在すると、使い捨てチップの製造が複雑かつ高価となる。さらに、サイズを、ストリップの品質を犠牲にすることなく小さくすることはできない。
−試験に用いる血液試料の必要量については進歩がなされているけれども、まだ最もよくて１０μｌの範囲で必要とされており、患者にとっては不利である。このことは、例えば、１μｌ以下の血液試料で正確にすることができるグルコース測定などの他の試験に使用される量と比較すると劣っている。
−公知の試験ストリップまたはチップとともに使用される検出および測定装置は、まだいくぶん複雑である。ある場合には、磁場またはポンプなどの血液試料を運搬または移動させる追加の手段を必要とする。他の場合には、装置はいくつかの検出手段を必要とする：キャリブレーションチップを必要とする試料におけるある性質の変化を測定する電気化学手段または磁器手段、および追加の搭載型の特性対照システムを読み取る追加の検出手段。これによりさらに複雑となり、したがって、携帯デバイスのコストが増加する。
【発明の概要】
【００２４】
これらの点に鑑みて、本発明の一つの目的は、工程数が最少であり、低コストであり、したがって、患者が自力で使用することができる、改善されたマイクロ流体デバイスおよび血液または血漿等の液状媒体の凝固時間を測定する方法を提供することである。本発明の別の目的は、簡単に製造でき、コンパクトで、患者が自力で使用することができる、マイクロ流体デバイスにおける試料の凝固時間および特性対照を検出および読取るための、凝固計等のマイクロ流体デバイスとともに使用される測定装置を提供することである。
【００２５】
本発明の第一の態様によれば、独立請求項１に記載の血液または血漿等の流動媒体の凝固時間を測定する低コストのマイクロ流体デバイスが提供される。
【００２６】
本発明の第二の態様によれば、独立請求項１９に記載のマイクロ流体デバイスを取り込むスロットと、流動媒体の少なくとも一つの性質を検出および／または読取る手段と、検出および／または読取手段により得られたデータを処理し、そして流動媒体の凝固時間を測定する手段とを備えてなる凝固計デバイスが提供される。
【００２７】
本発明の第三の態様によれば、独立請求項２５に記載の、流動媒体の凝固時間を測定する方法が提供される。
【００２８】
本発明のさらなる態様によれば、独立請求項２６に記載の、流動媒体の凝固時間を測定するマイクロ流体デバイスの製造方法が提供される。
【００２９】
本発明の好ましい実施態様が従属請求項に定義されている。
【００３０】
したがって、本発明によれば、製造コストが低く、簡単に使用でき、したがって、使い捨てをすることができる、流体の凝固時間を測定する改善されたマイクロ流体受動デバイスが提供される。さらに、本発明によるマイクロ流体デバイス（試験ストリップ）、測定装置（凝固計）および方法により、最少の血液試料を用いて、プロトロンビン時間を測定する正確な手段が提供され、したがって、静脈穿刺を必要とせず患者によって容易かつ自力で使用することができる。
【００３１】
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下に記載の実施態様から明らかであり、これらを参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
以下の添付の図を明細書と合わせて参照することにより、本発明をよりよく理解でき、かつその非常に多くの目的及び利点が当業者により明確になるであろう。
【００３３】
【図１】図１は、２つの層を別個に示す、本発明によるデバイスの実施態様の分解斜視図である。
【図２】図２は、図１の実施態様によるデバイスの上面図（図の左側部分）および側面図（図の右側部分）である。
【図２Ａ】図２Ａは、マイクロ流体デバイスの別の実施態様の上面図である。
【図３】図３は、凝固流路および対照流路における流れの先頭の位置を、重ねて表したグラフである。
【図４】図４は、凝固流路および対照流路における流れの先頭の速度を、重ねて表したグラフである。
【図５】図５は、図１の実施態様における凝固の前の流れの先頭位置の概略図である。
【図６】図６は、図１の実施態様における凝固の後の流れの先頭位置の概略図である。
【図７】図７は、血液の吸収係数の波長に対する図である。
【図８】図８は、ＬＥＤの発光スペクトルを示す。
【図９】図９は、緑がかった波長を検出するように最適化したフォトダイオードの反応曲線である。
【図１０】図１０は、凝固流路および対照流路についての異なるサイズの２つのチップにおける検出電流強度の時間に対するグラフである。
【図１１】図１１は、図１０についての電流強度曲線の微分係数を示す図である。
【図１２】図１２は、図１の実施態様のサーペンタイン(蛇行流路)の重ね合わせと、画素サイズ１９×１９μｍのＣＣＤアレイを示す図である。
【図１３】図１３は、理論曲線により凝固時間を測定するのに使用される式のグラフである。
【図１４】図１４は、理論曲線により凝固時間を測定するのに使用される式のグラフである。
【図１５】図１５は、理論曲線により凝固時間を測定するのに使用される式のグラフである。
【図１６】図１６は、理論曲線により凝固時間を測定するのに使用される式のグラフである。
【図１７】図１７は、実凝固試験での工程３における典型的なデータおよび理論的方法１または２に準じて求めた凝固時間を示す図である。
【００３４】
図面全体について、同様の参照数字は、同様の要素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明によれば、血液および血漿等の流体の凝固時間を測定する、チップまたは使い捨て試験ストリップの形態の装置、本発明の試験ストリップを用いた携帯用凝固計として使用される測定装置および本発明のマイクロ流体デバイスを用いた凝固時間を測定する方法が提供される。
【００３６】
ポイントオブケアデバイスとしての携帯用凝固計は、４つの主要な改善をほどこした技術である：コストの減少、血液試料の減少、特性対照および改良された携帯性。これらの４つの全ての面は、経済的見地および信頼性の見地から、普及している患者の自己試験にとってとりわけ重要である。
【００３７】
本発明は、現在の最先端の携帯用試験ストリップおよび凝固計として、顕著な利点がある。それは：
−コストの減少：使い捨てマイクロ流体チップは、多量低コスト生産技術および材料を用いて製造された極めて簡単（受動的な）部品である。
−血液試料の減少：５μＬよりもはるかに少ない血液試料を、必要な特性対照と精度を有するマイクロ流体チップ技術により試験することができる。
−特性対照：多数の異なる搭載型の特性対照を、本発明の使い捨てデバイスに適用し、単一の検出手段により読み取ることができる。さらに、デバイスでは、外部特性対照として較正血漿を使用できる。
改善された携帯性：検出システムは、極めてコンパクト、低コストで、薄い携帯用デバイスに組み込むことができる。
【００３８】
本発明では、適切なマイクロ流体流路は、血液または血漿等の流体試料の毛細管流動が可能であり、流体先頭の位置または速度を、試料流体と接触せずに、簡単な手段を用いて受動的な方法で正確に読み取ることができる。凝固カスケードの開始（試料を凝固試薬と接触させたとき）による試料流体のレオロジー変化および特に凝固終点での見掛け粘度変化は、読み取られる動的パラメータに大きな影響を及ぼす。
【００３９】
これらのパラメータは、同じ試料検出手段で読取り、凝固試薬を含まない対照試料と比較するか、異なる対照試薬を含有する対照試料と比較するか、または予測理論値と比較できる。
【００４０】
以下の理論に拘束されることを意図しないが、本発明のマイクロ流体システムは、ある意味で、血管の微小毛細管構造および血流の力学によく似ていると思われる。血液凝固段階（開始、増幅、伝搬および血塊形成）が複雑および高感度であるため、生体内の止血環境にできるだけ近づけて再現することが非常に好ましい。シカゴ大学［シカゴ大学Ｋａｓｔｒｕｐ、Ｃ．Ｊ．Ｒｕｎｙｏｎ、Ｍ．Ｋ．Ｓｈｅｎ、Ｆ．Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ、Ｒ．Ｆ．、Ｍｏｄｕｌａｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ（モジュール化学的機構が、止血の複雑なネットワークにおける開始の時空間的動態を予測する）、  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ（化学科および生物物理学動態協会）、ハーバード大学Ｇｅｏｒｇｅ  Ｍ.  Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ編］から発行された報告によれば、マイクロ流体生体外環境は、彼らが試験するヒト毛細血管における実際の凝固挙動によく似ていることがあり、それらの実証は、凝固時間の測定に極めて重要である。
【００４１】
さらに、本発明は、止血分子変化が検出できるように流動力学を連続的に読取りができ、高精度および高再現性を実現できる。特に最初の不溶性フィブリンの形成は、微小毛細管構造の大きさゆえ、レオロジー特性に対し測定可能な程度の影響を与える。
【００４２】
図１に示すように、一つの実施態様によれば、本発明のマイクロ流体デバイスは、下平面基板とカバー層を備えてなる二層を組立てたものである。下基板上には、試料分配システムのパターンが形成されており、適切な手段により端から試料導入区域までを結合させると、接続した一連の流路または導管が形成される。
【００４３】
流路は、毛細管現象により流れを生じさせる。当業者は、下基板上にパターン形成されている流路のサイズおよび形態を調整して、正確に読取ができる流れの位置または速度を得ることができる。流体試料の毛細管流動を生じさせるために、流路には親水性表面が必要であり、十分な負圧が誘発される。この親水性表面は、下基板上またはカバー層上に存在することができる。
【００４４】
一つの実施態様によれば、下基板はプラスチック製である。プラスチックが疎水性である場合には、流路における親水性は、化学処理、化学コーティングまたはプラズマ処理等の当業者に知られている手段により生じさせて、所望の表面エネルギーまたは接触角を得る必要がある。
【００４５】
好ましい実施態様によれば、親水性表面は、下層上にパターン形成したマイクロ流体流路をふさぐ上カバー層により生じさせる。この実施態様では、親水性材料を上カバー層として選択するか、あるいは親水性材料は、上記した親水性処理を施した材料とされる。
【００４６】
あるいは、好ましい実施態様によれば、親水性は、チップを形成する２つの層を接着するのに使用される接着剤により最表層に付与される。このような場合において、選択される接着剤コーティングは流体試料と反応しないか、または凝固反応を阻害することが重要である。
【００４７】
したがって、上カバー層は、熱シールおよび粘着剤等の種々の種類の接着性ポリマーフィルムから構成することができる。接着剤に界面活性剤を添加した親水性配合物を用いることができる。シール工程中に接着剤が流れるか、あるいはクリープにより流路を閉塞するのを防止するために、硬質の接着剤が好ましい。
【００４８】
図２および図２Ａは、以下で述べる要素を備えてなる、本発明のマイクロ流体デバイスの異なる実施態様を示す上面図である。
【００４９】
流動媒体の試料を導入する手段（１）は、主に投入口から構成されている。この投入口は分配毛細管流路（２）に連結されており、分配毛細管流路（２）は、分配流路（２）を第一領域（６ａ）と第二領域（６ｂ）に分割する流路分岐点（３）に連結されている。第一領域（６ａ）および第二領域（６ｂ）により、流動媒体が領域の長さに沿って流れることができる。任意に、分配流路は、セルフィルター（図１にのみ図示してある）を収容している。
【００５０】
好ましい実施態様によれば、第一領域（６ａ）および第二領域（６ｂ）は、同一の構造を有している。
【００５１】
領域（６ａおよび６ｂ）の各々は、分配流路から順次、第一及び第二（５ａおよび５ｂ）区域および少なくとも一つのマイクロ流体流路（スキャニング区域８ａという）を備えてなる。第一区域（５ａ）は、流動媒体と反応し得る第一試薬を含み、領域（６ａ）におけるマイクロ流体流路を反応流路としての役割を果たすようにする。一方、第二区域（５ｂ）は、空であるか、あるいは異なる試薬を含んで、領域（６ｂ）におけるマイクロ流体流路が対照流路としての役割を果たすようになっている。好ましくは、第一試薬は、流動媒体の凝固を引き起すことのできるものである。
【００５２】
別の実施態様によれば、３つ以上の領域がチップに存在する。これらの領域の一つは、上記したように、反応流路としての役割を果たし、他の２つ以上は対照流路である。
【００５３】
搭載型の特性対照として、対照流路であって、ここでは反応チャンバーが公知のかつ一定の（または狭い帯域の）凝固時間を与える特定の化合物を保持しており、この対照流路に沿って血液試料が毛細管駆動される。例えば、正常対照と異常対照の２種類のこのような対照を含ませて、凝固時間について、下の基準と上の基準を提供することができる。
【００５４】
対照流路は、反応流路に存在する試薬とは異なる試薬組成を有している。
【００５５】
したがって、一つの実施態様によれば、正常対照流路があり、この流路に存在する試薬は、例えば、少なくとも一種のビタミンＫ依存凝固因子であることができる。このような凝固因子は、乾燥または凍結乾燥した正常患者血漿プールから得ることができる。
【００５６】
別の実施態様によれば、異常対照流路が設けられている。この異常対照流路は、ヘパリン、クエン酸塩、しゅう酸塩、ＥＤＴＡ等の凝固因子阻害剤を含んでなる。さらに、異常対照流路は、正常対照流路と同じようなビタミンＫ依存凝固因子を含んでなることができる。
【００５７】
以下に、領域の数とそれらの機能性についての好ましい実施態様を説明する：
・２領域：一つは血液試料の凝固時間測定用の反応流路、そしてもう一つは凝固剤を含まないか、あるいは凝固阻害剤を含む対照流路。
・２領域：一つは理論曲線により血液試料の凝固時間測定用の反応流路、そしてもう一つは正常凝固時間を得るための対照流路。
・３領域：一つは血液試料の凝固時間測定用の反応流路、もう一つは凝固剤を含まないか、あるいは凝固阻害剤を含む対照流路、そしてさらなる一つは正常凝固時間を得るための対照流路。
・３領域：一つは理論曲線比較により血液試料の凝固時間測定用の反応流路、もう一つは正常凝固時間を得るための対照流路、そしてさらなる一つは公知の異常に大きな凝固時間を得るための対照流路。
【００５８】
全てのこれらの実施態様および当業者には明らかな他の変更態様は、本発明に含まれる。
【００５９】
本発明のデバイスにおいて、流れは、毛細管力のみにより駆動され、したがって、チップまたは試験ストリップは、外部力の必要がない受動デバイスである。親水性流路表面では、湿潤メニスカスが流路に沿って負の毛管圧の方向に移動し、一方、ディウェッティングメニスカスは投入口にとどまる。疎水性表面を生じさせることによるか、好適な流路開口を設計することにより、流れは停止弁の箇所で停止する。好ましい実施態様によれば、各領域（６ａ、６ｂ）は、流れ停止弁としての役割も果たす排出手段（７）、最も好ましくは通気口を含んでなる。図２では流路の端に示してあるが、通気口（７）は、マイクロ流体流路に沿った他の位置に位置することもできる。例えば、図２Ａに示すように、反応チャンバーの出口で流れ停止となるように通気口（７）を接続すると、毛細管流動がこの位置まで加速して最大化する。別の実施態様によれば、各流路は複数の通気口（７）を有しており、これらの通気口（７）は流体の速度および流れ特性を制御および調節することができる。
【００６０】
少なくとも流動媒体の性質、好ましくは流体先頭の位置または速度は、流動媒体が第一領域（６ａ）、第二領域（６ｂ）および任意の第三領域のスキャニング区域（８）を通過するときに読取がなされる。異なる領域における特性を比較すると、第一領域（６ａ）における反応が生じた瞬間の検出と流体試料についての凝固時間の測定が可能となる。領域は、好ましくは毛細管流路である。
【００６１】
このデバイスの動作原理は、マイクロ流体工学によるものである。マイクロ流体工学についての主要原理は、システムのスケールダウンにより従来の流動理論とは大きく異なる。
【００６２】
主要原理
一定断面の毛細管導管のニュートン挙動下の動的ファイリングは、粘度η、総流れ抵抗ＲＦＲおよび湿潤（先頭部）メニスカスとディウェッティング（後部）メニスカスとの間の圧力差ΔＰに依存する容積流量Ｑを介して求めることができる。
【数１】
2014038109.tif 000003
【００６３】
長さ「Ｌ」ならびに矩形断面Ａ、幅「ａ」および深さ「ｂ」の流路について、流れ抵抗ＲＦＲは、以下のように表すことができる：
【数２】
2014038109.tif 000004
但し、「ＲＨ」は、径深であり、
【数３】
2014038109.tif 000005
として定義される。
【００６４】
Ｌ＝Ｌ（ｔ）、すなわち、時間に対する流頭位置を求めるために、式（１）を時間で積分する必要がある。したがって、ＬおよびＬの時間についての導関数として計算される速度は、次のように表される：
【数４】
2014038109.tif 000006
【００６５】
これらは、粘度が一定であることを前提としたときの凝固前の主要な流動方程式である。凝固が開始すると、粘度が時間の関数であり、指数関数的に増加し、式（１）によれば、直線的に粘度に反比例する流速は、突然減少する。さらなる部分において示す曲線Ｌ（ｔ）および導関数は、可変粘度について数値的に求めた。
【００６６】
式（１）〜（３）について、最高の凝固時間までの永久流れとするのに必要とする流路長さの予備設計をおこなうことが可能である。一定部分の導管の試料容積「Ｖ」は、次のように推定できる：
【数５】
2014038109.tif 000007
【００６７】
したがって、デバイスを設計し、流路のサイズを、流路の幾何学的パラメータ、ａ、ｂおよびＬ、必要とする試料容積および最大凝固時間の間の既存の関係（４）にしたがって選択する必要がある。
【００６８】
理論曲線による凝固時間の測定
本発明の一つの実施態様によれば、流動力学による連続読取を利用して、凝固時間を、試料の測定特性を理論予測値と比較することにより求めたり、制御したりすることができる。
【００６９】
動的挙動が凝固前に十分予測されるので、式（３）からの理論曲線で得た特定の閾値を越えて読取凝固曲線が逸脱した瞬間に、凝固時間を求めることができる。このような逸脱が定性流動動的挙動のみに依存し、定量的には依存しないように、いくつかの数学操作が適用可能である。二つの、異なるが類似している方法を以下に説明する。
【００７０】
方法１：
工程１：
ニュートン挙動下の毛細管長さについての式（３）によれば、Ｌ（ｔ）は、時間のべき関数である。Ｌ（ｔ）およびｔ値（検出システムから抽出した値）からはじめ、以下の曲線を得ることができる：
【数６】
2014038109.tif 000008
読取曲線（凝固流路）および理論曲線は、図１３に示すグラフにプロットする。
【００７１】
工程２：
上記した式の両辺に対数を適用すると、勾配０．５の線形曲線が得られる（図１４のグラフも参照）：
【数７】
2014038109.tif 000009
定量項はｌｏｇＫであり、定性項は０．５ｌｏｇｔである。
【００７２】
工程３：
変数（ｕ＝ｌｏｇｔ）を変化させることにより、新しい関数Ｙ＝Ｙ（ｕ）を定義でき、それをｕに関して微分する（図１５のグラフも参照）。
【数８】
2014038109.tif 000010
【００７３】
工程４：
Ｙのｕに関する二次微分を実施する（図１６）：
【数９】
2014038109.tif 000011
【００７４】
速度曲線
【数１０】
2014038109.tif 000012
または加速度曲線
【数１１】
2014038109.tif 000013
における所定の閾値を超える一定値からの減衰から、凝固時間を求める。上記した操作では、一つの独立した凝固流路のみにより凝固時間測定ができるアルゴリズムの数学的基礎である。
【００７５】
本発明によるマイクロ流体チップは、血流が凝固前に支配的なニュートン挙動を有するものとして設計される。この挙動からの逸脱は、低流量で現れることがある疑似塑性効果のみによるものである。もしこれが生じると、このような疑似塑性効果が凝固効果よりもはるかに弱く、加速度曲線上で識別できるので、この方法はまだ適用され、適切に機能する。
【００７６】
方法２：
理論凝固時間測定のための第二および類似の数学的手法は、次のようにその概要が説明されるものである。同じ生データ、工程１で得られるＬ（ｔ）値およびｔ値から開始して、以下の曲線を得ることができる。
【数１２】
2014038109.tif 000014
【００７７】
この曲線は、式（３）から導かれ、粘度（η）に比例する。以下の工程（２、３および４）は、上記と同様に適用され（すなわち、対数の適用、第一導関数および第二導関数）、速度曲線および加速度曲線が作成される。
【００７８】
実試験データに基づいて、両方の方法が、概略同じ凝固時間（ＰＴ）となる。図１７のグラフに示すようなほぼ全ての読取曲線にみられる驚くべき結果は、凝固効果に反する初期の予想外の挙動であった（用語「反転」で示した両方の曲線において強調された区域を参照）。この効果は、実際には、常に凝固時間の直前にみられる約１または２秒の間の過渡的粘度減少である。したがって、この挙動は、ＰＴの瞬間時が明瞭な変曲点となる（方法１では最大、方法２では最小）ので、より容易に凝固時間を確認できる。この予想外の挙動の理由は明確ではないが、ある証拠によれば、これは、フィブリン重合体の形成前の見掛け粘度を減少するファーレウス-リンドクビスト効果とあいまったフィブリン不溶性モノマーの形成によることがあることが示唆されている。
【００７９】
凝固時間の測定の他に、上記した理論手法も、試験曲線と理論予測とを相関させることにより、特性対照にも用いることができる。正常の操作者（すなわち、患者の誤用がない）および正しいデバイス条件の下、凝固前の血液試料流は、上記した線形挙動に近くなければならない。このような挙動から大きく逸脱したときには、流量読取システムおよびプロセッサーにより検出し、処理して、検査抹消指令が出される。
【００８０】
好ましい実施態様によれば、流動媒体は、血液、好ましくは患者からフィンガープリックで採取した毛細管全血であり、公知の凝固時間を有する較正された血漿を、外部特性対照に使用することができる。前記流動媒体と反応することができる試薬は、凝固試薬、より好ましくは組織因子またはトロンボプラスチンである。
【００８１】
この場合、本発明のデバイスと方法は、特にプロトロンビン時間、すなわち、凝固作用と凝固の開始との間の経過時間を測定するのに特に適している。
【００８２】
デバイスは、標準ＩＮＲ値にしたがって設計できる；推奨最高ＩＮＲ範囲は、約８である。これも、ＰＴが約１００秒であることを意味する。このような最大ＩＮＲに到達するのに必要とされる寸法を、表１に示す。上記したように、種々の導管設計の必要寸法と総容積「Ｖｔ」は、式（３）により支配されている。
【００８３】
【表１】
2014038109.tif 000015
表１：このような最大ＩＮＲ範囲（１００秒）に到達するための、種々の導管設計の必要とする長さおよび総容積「Ｖｔ」。
【００８４】
この表は、流動設計をマイクロスケールまでスケールダウンすることにより、簡単に、標準ＩＮＲ範囲が、ほんの少しの血液滴を用いて達成できることを示している。
【００８５】
本発明の流路の形状および寸法は、１５μｌ以下の血液試料を用いて凝固時間を測定することができ、全ての回路が満たされているときに割り当てられた総容積は１０μｌ未満であり、投入口でのディウェッティングメニスカスを固定するのに必要な投入口内の残りの容積が確保できる。マイクロ流体流路は、数秒〜１００秒超継続する連続流れが可能であり、長時間範囲のＰＴ測定が可能となる。したがって、本発明によるチップと方法は、少量の血液試料、好ましくは１０μｌ未満、より好ましくは５μｌ未満、最も好ましくは約１μｌ以下の血液試料を用いて、正確な凝固時間の測定およびＩＮＲ測定が可能となる。このことは、患者の利便性にとり非常に重要である。
【００８６】
毛細管流路（６ａ、６ｂ）の長さは、試薬と流体との反応が、流頭が流路の端に到達する前に完了するのに十分なものでなければならない。好ましい実施態様によれば、毛細管流路（６ａ、６ｂ）は、湾曲形状、最も好ましくは蛇行形状トラックとして、流路の長さを維持しながらデバイス面積を最小にするようになっている。
【００８７】
流路の好ましい横断面は、製造上の制約から矩形であり、真の２Ｄ形状を可能にし、金型での加工プロセスが簡単になる。具体的な寸法は、流動力学として注意深く計算する必要があり、用いられる総容積は、流路寸法に非常に大きな影響を受ける。本明細書に示すように、寸法値が１００μｍをはるかに超えると、最高凝固時間まで流れを持続するのに必要な流路長さが非常に大きくなり、より大きな血液試料容積を必要とする。マイクロ流体設計の場合、換言すれば、約１００μｍ以下の流路横断面寸法の場合、流路長さを減少できるとともに、血液の使用量がほんの少しでよい。さらに、チップのサイズとそのコストも、かなり減少する。
【００８８】
好ましくは、反応・対照流路は、横断面がａ＝ｂのものである。この場合、ａおよびｂは、好ましくは３０〜１２５μｍ、より好ましくは５０〜１００μｍ、さらに好ましくは約８０μｍである。
【００８９】
また、試薬を含む区域、好ましくは試薬セルの寸法は、液体状態における試薬を分散するのに十分な容積とするのに適切なものとされなければならない。さらに、設計により、拡散時間が活性化血液容積を最大化するのに十分な試薬濃度とするものであるようにする必要がある。このことは、反応チャンバー内の表面：容積比を最大にすることにより実現できる。好ましくは、フットプリントチャンバー設計は、直径が１〜４ｍｍ、高さが４０〜１５０μｍの寸法を有する、液滴分配形状に適合する円形である必要がある。より好ましくは、直径が約１．５ｍｍ、高さが約８０μｍである。
【００９０】
分配流路の高さ寸法は、好ましくは１５０μｍ〜３５０μｍ、より好ましくは約２５０μｍである。
【００９１】
血液入り口部は、好ましくは分配流路上のチップの縁でのカバーとベース基板との間の間隙であり、したがって、前記分配流路の高さを有することができる。分配流路に割り当てられる容積は、続いての毛細管構造に割り当てられている容積よりもわずかに大きくして、分配流路が一旦完全に流体で満たされたら、空になることがないようすることができる。この容積で、最少試験試料容積要件が規定される。
【００９２】
構造上の制約と寸法上の制約を満たすために、マイクロ流体流路の横断面を変更すること、例えば、マイクロ流体流路を狭くすることによるか、あるいはテーパーマイクロ流体流路を導入することにより、受動流れ制御弁を設けることで流量Ｑを変更できる。
【００９３】
マイクロ流体デバイスの操作
本発明では、血液または血漿試料を投入口に入れる必要がある。投入口を通って血液または血漿が試料分配流路に入り、試料分配流路に沿って、同じ血液試料または血漿が反応／凝固流路と一つ以上の対照流路とに分割される。
【００９４】
血液凝固の前の時間ｔｍでの流路における流頭位置を、次のように表すことができる。
【数１３】
2014038109.tif 000016
但し、ＬおよびＬ’は、それぞれ凝固位置および対照位置である。時間ｔ＝０は、流れが凝固流路の反応セルを出る瞬間であり、それは組織因子またはトロンボプラスチンが可溶化し、反応機構が開始した瞬間である。
【００９５】
分割流は、凝固が凝固流路で開始されるまでほぼ同一の運動力学を有する。最初の血液凝固が生じた瞬間をプロトロンビン時間として確認する。このとき、例えば、粘度が突然増加する。この瞬間に、凝固流路に沿った流動力学が、対照流路（単一または複数）に対して減速する。時間の関数としての流頭位置を連続的に読取り（８）することにより、時間についての位置の導関数（流頭速度と称することができる）を、計算することができる。
【００９６】
図３には、２つの流路における流頭位置とプロトロンビン時間をどのように確認するかが示されている。これらの曲線は、以下の前提の下で数値的に計算された。ここで、変数ａ、ｂ、ηおよびＰＴは前記した通りであり、γは血液表面の張力である：
【００９７】
【表２】
2014038109.tif 000017
表２：数値的計算の前提。
【００９８】
ＰＴの前に、流路間の差が最少でなければならず、非均一環境条件、製造公差および検出ノイズによってのみ影響されるようにする。導関数は流頭速度として称されることができ、粘度変化により影響を受けることから、時間についての導関数曲線が好ましい。同様に、ＰＴ前の時間ｔｍで、凝固（Ｖ）および対照（Ｖ’）について、速度が監視される。ＶおよびＶ’は、次のように表される：
【数１４】
2014038109.tif 000018
【００９９】
これらの曲線を図４に示す。
【０１００】
速度間の差（Ｖ（ｔｍ）−Ｖ’（ｔｍ））についての好適な閾値「Δ」を規定することにより、ＰＴを求めることができる。ＰＴの前は、粘度は一定であり、流頭位置と速度の差は小さい（図５の概略図参照）。
【０１０１】
時間ｔｐで、速度差が閾値をちょうど上回る（図６参照）。この瞬間が、ＰＴである。
【０１０２】
検出手段
流頭移動Ｌ＝Ｌ（ｔ）またはｖ＝ｖ（ｔ）の連続検出または読取のために、差検出技術を使用することができる：
・フォトダイオードによる検出。
・電荷結合素子（ＣＣＤ）または相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）等の光学センサーによる検出。
【０１０３】
図７において、血液の吸収係数をプロットしてある。とりわけ４００ｎｍおよび緑色（５３０ｎｍ）付近も吸収されることがわかる。
【０１０４】
フォトダイオードによる検出
サーペンタイン(蛇行流路)にＬＥＤを照射し、透過光をフォトダイオードで検出する。移動する流頭は、直線的に吸収を増加する。したがって、検出強度はそれに応じて減少する。信号増幅器を用いて、とても小さな流れ位置の増分を読取ることができる。
【０１０５】
以下において、一部の計算を実施して、標準低コストコンポーネントを用いたこのような読取スキームの実行可能性を評価した。
【０１０６】
販売者から得た容易に入手できるＬＥＤおよびフォトダイオード（両方とも低コスト）を選択した。
【０１０７】
ＬＥＤはサイズが３ｍｍであり、放射角度は２０°である。強度は１５０００ｍｃｄ＝０．０３０９ワット／ｓｔｒであるので、全２０°立体角（０．０９５ｓｔｒ）とすることにより、総放射強度が０．００２９４に達する。
【０１０８】
ＬＥＤの発光スペクトルおよびフォトダイオードの応答曲線（標準シリコンのものであるが緑がかった波長を検出するための最適化もおこなってある）は、図８および図９のように示すことができる。
【０１０９】
これらの前提の下、スキャニング区域（８）、流路寸法および図３の実際のＬ（ｔ）曲線をさらに確保することにより、フォトダイオードにより検出された強度信号を得ることができる。単純にするために、さらに、チップは完全に透明であること、そしてフレネル反射が生じないことも前提とした。図１０にプロットした強度信号は、製造業者により規定された、２０ｐｉｃｏＡの暗電流ランダムノイズシュミレーションも含む。この曲線は、２５０×２５０μｍの流路部分に相当する。時間についての強度信号の導関数を計算することにより、図１１に示すように、流れ速度に比例する信号を得ることができる。
【０１１０】
２つの図示したプロット（図１０、１１）により、流頭の読取が実行可能であり、曲線に影響する無視できるノイズから推定すると、十分に高い感度を有する。さらに、フォトダイオードの時間応答が高応答であって、１０ＭＨｚの高い周波数サンプリングが可能であり、増幅器自体が１０Ｋｈｚに限定される。この値は、正確な読取のために必要とする周波数を超えた大きさのオーダー、約２０Ｈｚである。
【０１１１】
光学センサーによる検出
この検出スキームの場合、システムは同様な構成を用いるが、但しこの検出デバイスを代わりに使用するところが異なる。この場合、本発明では、ＣＣＤまたはＣＭＯＳセンサーを用いる。したがって、スキャニング表面の高周波数マッピング後に得られるデータを処理することにより、流頭位置が得られる。
【０１１２】
ＬＥＤシステムは、上記で定義したものと同様のものであることができる。興味深いことに、この場合には、ＣＣＤ内の各セルまたはピクセルは、この位置に流れがあるか、ないかを検出することであるので、高い感度は必要としない。図１２に示すように、標準のＣＣＤ有効区域にサーペンタインを重ね合わせることにより、マップイメージにより、流頭位置の確認ができ、十分な解像度と時間応答（＞１ＫＨｚ）を有する。
【０１１３】
この技術では、イメージデータ処理を必要とし、その結果、ぼけたイメージからメニスカス位置を確認することができる。これにより読取システムがさらに複雑になるが、フォトダイオード検出スキームとは対照的に、各セルまたはピクセルの感度に対する要求がそれほど厳しくなく、この意味で、ＣＣＤ検出スキームがよいことを示している。
【０１１４】
検出信号品質を改善するために、レンズ等の光学手段を一体化することができる。レンズとセンサーを組み込んだ市販の一体化ブロックは、今日非常に低コストで入手できる。例えば、携帯電話業界に供給される小型カメラなどがある。これらのブロックは、ほんの数ミリメータを測定し、したがって、非常にコンパクトで薄く携帯用システム、例えば、携帯凝固計に組み込むことができる。
【０１１５】
検出信号は、埋め込みソフトウエアを備えたマイクロプロセッサーによって処理される。動的流れデータ曲線を生成し、アルゴリズムを用いて凝固時間を測定し、また種々の特性対照にいてもまた用いられる。
【０１１６】
上記したように、本発明によるチップ（試験チップ）および方法には、同じ検出手段を、試料流体流れの読取りと、種々の特性対照の役割を十分に果たすという別の大きな利点がある。
【０１１７】
検出手段をＣＣＤ／ＣＭＯＳセンサーまたはマイクロカメラ等の人口視覚システムにより構成するとき、このような視覚システムの視野イメージ処理を通して、凝固計用試験ストリップで通常おこなわれる主に３つの特性対照を可能にする：
【０１１８】
安定な読取のための搭載型の周囲条件インジケーター：温度および湿度等の周囲条件を、こられの因子に対して色感度のある化合物を介して読取ることができる。選択された化合物は、温度および湿度の閾値を受けると、不可逆的色変化をして、欠陥チップの信号を発する。これらは、検出器の視野下で、反応チャンバーに直接か、ベース基板にか、あるいはカバー表面に付加できる。異なる感度の化合物を組み合わせてこの目的に使用することができる。感温化合物としての化合物の例：ロイコ染料、オキサジン、クリスタルバイオレットラクトン、フェノールフタレイン等。感湿化合物としての金属塩：塩化コバルト、硫酸カルシウム等。感温および感湿の両方の性質を有する化合物としてのＮ−オキシド化合物またはニトロソ化合物。
【０１１９】
これにより、測定装置（携帯凝固計等）が、患者に試験ストリップが品質管理に合格せず、処分する必要があることを知らせることができる。
【０１２０】
外部の特性対照：ＩＮＲおよびＰＴ試験較正を実施するための市販の公知の凝固時間を有する較正血漿を、外部特性対照として使用でき、その結果、携帯凝固計システム全体を評価できる。この実施態様によれば、人口視覚システムを調整して、流動血漿の検出ができる。血漿はほぼ透明な流体であるけれども、移動する血漿が明るい流路に沿って進む灰色の影のように認識されるので、効果的に血漿流を追跡するのに、照明誘導システムの調整や画像処理の必要性がほとんどない。
【０１２１】
印刷コードバー：とりわけ関連情報較正データ、トレーサビリティデータおよび有効期限を担持した印刷コード。この種の試験ストリップに使用される寸法が数ミリメートルの標準データマトリックスコードは、チップのカバー層または透明ラベル上に印刷できる。
【０１２２】
上記した好適な検出および／または読取手段は、外部デバイス（凝固計）に含まれる。外部デバイスは、本発明のマイクロ流体デバイスを収容するスロットを備えてなり、前記マイクロ流体デバイスと連携するように設計されている。
【０１２３】
さらに、外部デバイスは、検出および／または読取手段から得られるデータを処理する手段を備えてなり、表示手段に出力する信号を生成する。
【０１２４】
製造
本発明のマイクロ流体デバイスは、現在のプラスチック複写技術と組立て技術を用いて容易に製造できる。２つの密封コンポーネントにより、アセブリを形成する：図１に示すような、マイクロ構造をパターン化した下基板と、上基板またはカバー蓋。
【０１２５】
デバイスの下基板とカバー層との両方に好適な材料として、さまざまなポリマー、熱硬化性および／または熱可塑性材料があり、これらの材料は良好な光学特性と良好な寸法安定性を有する必要がある。例えば、ＣＯＣ、ＰＭＭＡ、ＰＣ、ＰＳＵ、ＳＡＮ、ＰＥＴＧ、ＰＳおよびＰＰを使用できる。
【０１２６】
ほとんどの高分子材料は、疎水性である。したがって、高度に疎水性な材料をパターン化基板として選択すると、上記したように、引き続き一部の表面を親水性にする生産工程が必要になる。このため、親水性であるかまたは少なくとも疎水性ではない（接触角＜９００）プラスチックが推奨される。周知の材料のうち、ＰＭＭＡ、セルロースアセテート、ＰＣ、ＣＯＣおよびＰＳがあげられる。特に好ましい一つの材料として、良好な接触角、光学特性および寸法安定性の点からＰＭＭＡがあげられる。
【０１２７】
下基板は、今日利用できる種々の技術および極めて高い精度を用いて容易に複製でき、ミクロ構造の公差を小さくできる。前記パターン化工程に関連する現在の手法として、マイクロインジェクション成形、熱エンボス加工およびソフトリソグラフィーインプリンティングがあげられる。
【０１２８】
シール工程は、多数の周知の技術、例えば、熱圧縮接合、接着、プラズマ励起接着、超音波接合、レーザー溶接等で実施できる。
【０１２９】
カバーは、好ましくは親水性膜である。カバーは、流体流動を正確に読取るために透明であることが好ましい。上記したように、親水性膜は、密閉性および流路の親水化を可能とし、表面処理工程を回避できる極めて経済的な手段である。この場合、製造技術は、圧力と温度の制御を必要とすることがある標準積層プロセスをからなる。他の製造技術として、エンボス加工またはプレス加工があげられる。
【０１３０】
上記したように、反応チャンバーは、種々の目的で多数の乾燥試薬化合物を割り当てることができる。主要化合物は、凝固カスケードを開始するトロンボプラスチンである。反応チャンバーの寸法が非常に小さいため、製造コストを大きく増加することなく、高性能化合物を添加できる。
【０１３１】
組み換え型ヒトトロンボプラスチンは、化学純度により、可溶化および感度の点で極めて有用な性質を持つ。前者の性質は、従来は特定の添加物を使用することにより高めてきた。本発明の構造では、マイクロリットル量のヒト組み換え因子の画分を分取して、可溶化および感度の点で優れた結果を得ることができる。
【０１３２】
多数の追加の薬剤が、乾燥試薬の適切な機能に関与する。これらは、迅速な可溶化だけでなく、制御拡散パラメータ用にも用いて加工工程や試薬安定性を向上させたり、以下の課題に対処できる：
ａ）液体の乾燥試薬への吸収の調節：単独重合体、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等。
ｂ）迅速な可溶化、安定剤、乾燥プロセスの短縮：アルブミン、グルタミン酸塩、糖類（例えば、グルコース、スクロース、トレハロース等）等。
ｃ）湿潤性の制御：トリトン、マコール、テトロニック、シルウェット、ゾニル、プルロニック等。
ｄ）安定な読取および分配制御用色指示薬：感温化合物（オキサジン、クリスタルバイオレットラクトン、フェノールフタレイン等）としてロイコ染料。感湿化合物としての金属塩、例えば、塩化コバルト、硫酸カルシウム等。感温化合物および感湿化合物としてのＮ−オキシドまたはニトロソ化合物。
ｅ）周囲条件下での安定性を高める：チメロサール等の有機水銀化合物。
ｆ）種々の機能性のための他の化合物：ポリブレン（抗ヘパリン剤）および緩衝剤。
【０１３３】
乾燥試薬を、多数の周知の手法により、反応チャンバーか、カバー基板上に適用できる：液滴分配、ゲル分配、ジェット分配、スクリーン印刷法、ブレード塗布法、選択スプレー法および膜キャスティング法。分配工程後に、乾燥工程をおこなう。
【０１３４】
好ましくは、乾燥試薬を、反応チャンバーに液状で分配してチャンバーのほとんどを占める液滴を形成する。この液滴は、乾燥すると薄い乾燥試薬層となる。
【０１３５】
有利なことに、製造法とそのように加工されたチップ（試験ストリップ）は、極めて簡単であり、電極または多層構造のいずれの形態等の埋め込みコンポーネントを必要としない。実際に、本発明の製造方法により低コスト製造ができ、安価な使い捨てデバイスを製造できる。
【０１３６】
マイクロ流体設計を介して本発明は、凝固時間測定用の極めて高感度および正確な手段を提供する。凝固時間（例えば、プロトロンビン時間）は、不溶性フィブリン分子が重合（後に血塊を形成する「メッシュ」を生成する）し始める瞬間に関する。典型的には数マイクロメータのオーダーのフィブリン重合体が形成すると、とりわけ流路断面が現在のマイクロ流体設計と同じ程度に非常に小さくなるときに血流の見掛け粘度が急激に増加する。精度と感度の観点において、本デバイスは、凝固時間測定に関して、従来のデバイスに対して上記した利点を有する。
【０１３７】
さらに、チップと本発明の測定装置により、複合的な利点が得られる。単一の光学検出手段を使用すると、流体流動の変化の検出と種々の品質管理を同時に実現することができる。このことは、標準コンポーネントを用いた携帯測定装置がより単純であり、よりコンパクトであることを意味している。実際に、測定装置は、携帯電話のサイズを有している。また、流れの読取を高周波数サンプリングで連続的にするので、従来の装置、とりわけ血流に基づく従来の装置に比して、精度および感度も大きく向上する。このように、血塊形成が血流に最初の減速効果を示すその瞬間を正確に測定することができる。
【０１３８】
当業者には、本願に記載の革新的な発想は、本発明の範囲内で修正および変更ができることは理解されるであろう。
【０１３９】
したがって、特許発明の要旨の範囲は、上記した具体的で典型的な教示のいずれにも限定されず、特許請求の範囲に定義した通りである。特許請求の範囲における参照記号は、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【０１４０】
本発明による具体的実施態様は以下のとおりである。
［１］  血液または血漿などの流動媒体の凝固時間を測定するマイクロ流体デバイスであって、
前記デバイスが、
−前記流動媒体の試料を導入する手段（１）と；
−試料を導入する前記手段（１）と連結され、前記流動媒体がその長さに沿って流れるようにされた第一領域（６ａ）と；
−前記第一領域の初めの位置にあって、前記流動媒体と反応し得る試薬を含む第一区域（５ａ）とを備えてなり、
前記デバイスが、
−試料を導入する前記手段（１）とまた連結され、前記流動媒体がその長さに沿って流れるようにされた第二領域（６ｂ）；をさらに備えてなり、
−前記第二領域（６ｂ）が、前記流動媒体と反応し得る試薬を含まないか、または、
−前記第二領域（６ｂ）の初めの位置にあって、前記第一区域（５ａ）の試薬とは異なる、前記流動媒体と反応し得る試薬を含む第二区域（５ｂ）を備えてなる
ことを特徴とする、マイクロ流体デバイス。
［２］  前記領域（６ａ、６ｂ）の各々が、少なくとも一つのマイクロ流体流路から構成されてなることを特徴とする、［１］に記載のマイクロ流体デバイス。
［３］  前記マイクロ流体流路（６ａ、６ｂ）が毛管流路であって、その流路の表面が親水性でありかつ毛管現象が前記流動媒体を移動させるための唯一の力として作用するものであることを特徴とする、［２］に記載のマイクロ流体デバイス。
［４］  前記領域の各々が、通気手段（７）を含んでなるものであることを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［５］  前記通気手段（７）が、流れ停止弁として機能する排出口からなるものである、［４］に記載のマイクロ流体デバイス。
［６］  前記第一領域の前記第一区域（５ａ）が、前記流動媒体の凝固を引き起すことができる試薬が入った反応セルから構成されてなることを特徴とする、［１］〜［５］のいずれか一項に記載のデバイス。
［７］  前記第二領域の前記第二区域（５ｂ）が、前記流動媒体の凝固を阻止することができる試薬が入った反応セルから構成されてなることを特徴とする、［１］〜［６］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［８］  前記デバイスが、試料を導入する前記手段（１）とまた連結され、その長さに沿って前記流動媒体が流れるようにされた第三領域をさらに備えてなり、前記第三領域の初めの位置に、前記第一区域（５ａ）または前記第二区域（５ｂ）の試薬とは異なる、前記流動媒体と反応し得る試薬が入った第三区域をさらに備えてなることを特徴とする、［１］〜［７］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［９］  前記試料を導入する手段が投入口（１）からなり、該投入口は、前記第一および第二領域（６ａ、６ｂ）と連結され、存在する場合は前記第三領域とも連結され、該連結は、分配流路（２）と、それに続く、前記第一領域、前記第二領域、および任意の前記第三領域とに分岐する（４）、流路分岐点（３）を介してなされていることを特徴とする、［１］〜［８］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１０］  前記第一領域（６ａ）、前記第二領域（６ｂ）および前記任意の第三領域が、湾曲形状をしていることを特徴とする、［１］〜［９］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１１］  前記第一領域（６ａ）、前記第二領域（６ｂ）および前記任意の第三領域が、蛇行形状トラックを有する流路から構成されていることを特徴とする、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１２］  前記流路が、矩形断面を有するものであることを特徴とする、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１３］  前記流路が、異なる断面を有するセグメントの組み合わせから構成されていることを特徴とする、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１４］  前記区域（５ａ）における前記試薬がトロンボプラスチンであり、前記凝固時間がプロトロンビン時間を表すことを特徴とする、［１］〜［１３］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１５］  前記第一領域（６ａ）が凝固流路としての機能を果たし、前記第二領域（６ｂ）が対照流路としての機能を果たすこと、および前記２つの領域が同一の構造を有するものであることを特徴とする、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１６］  前記第一領域（６ａ）が凝固流路としての機能を果たし、前記第二領域及び前記第三領域が対照流路としての機能を果たすこと、および前記３つの領域が同一の構造を有するものであることを特徴とする、［１］〜［１４］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１７］  特性対照のための光学機構をさらに備えてなる、［１］〜［１６］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
［１８］  −［１］〜［１７］に記載のマイクロ流体デバイスを取り込むスロットと；
−前記領域の各々における前記流動媒体の少なくとも一つの性質を連続的に検出および／または読取る光学手段と；
−前記検出および／または読取手段により得られたデータを処理し、そして前記流動媒体の凝固時間を測定する手段とを備えてなり、
前記光学手段が、前記マイクロ流体デバイスの特性対照における特徴をもまた、測定または読み取るものである、凝固計デバイス。
［１９］  前記流動媒体の前記性質が、前記領域の各々における前記流動媒体の先頭の位置および／またはその速度であることを特徴とする、［１８］に記載の凝固計デバイス。
［２０］  前記処理手段が、前記２つまたは３つの領域の各々における前記単一または複数の性質を比較する手段を備えてなることを特徴とする、［１８］または［１９］に記載の凝固計デバイス。
［２１］  前記処理手段が、前記第一流路（６ａ）における前記単一または複数の性質と、前記第二流路（６ｂ）および／または前記第三流路における前記単一または複数の性質との間の差が、所定の閾値に達した時点を検出する手段を備えてなることを特徴とする、［１８］〜［２０］のいずれか一項に記載の凝固計デバイス。
［２２］  前記検出手段および／または読取手段が、前記領域の各々を照射する手段と、前記領域の各々を透過または各々により反射された光を分析する手段を備えてなることを特徴とする、［１８］〜［２１］のいずれか一項に記載の凝固計デバイス。
［２３］  前記照射手段が、少なくともＬＥＤを備えてなり、前記分析手段が少なくとも光学センサーを備えてなることを特徴とする、［２４］に記載の凝固計デバイス。
［２４］  前記分析手段が、少なくともレンズを備えてなることを特徴とする、［２３］に記載の凝固計デバイス。
［２５］  血液または血漿等の流動媒体における凝固時間を測定する方法であって：
−流体が長さに沿って流れるようになっている第一および第二領域（６ａ、６ｂ）を有する［１］〜［１７］に記載のマイクロ流体デバイスに、前記流動媒体の試料を導入する工程と；
−前記第一領域（６ａ）の初めの位置に、前記流動媒体と反応し得る第一試薬（５ａ）を用意する工程と；
−前記第二領域（６ｂ）に、試薬を存在させないか、あるいは前記第一領域（６ａ）に第一試薬（５ａ）とは異なる第二試薬（５ｂ）を存在させる工程と；
−光学手段で、前記第一領域（６ａ）および前記第二領域（６ｂ）における前記流動媒体の少なくとも一つの性質を連続的に読取る工程と；
−前記第一領域（６ａ）における前記流動媒体の性質と少なくとも、前記第二領域（６ｂ）における前記流動媒体の同じ性質と、あるいはこの性質の理論値と比較する工程とを含む、方法。
［２６］  前記第一領域における前記流動媒体の前記性質を少なくとも、前記第二領域（６ｂ）における前記流動媒体の性質と比較することを特徴とする、［２５］に記載の血液または血漿等の流動媒体の凝固時間を測定する方法。
［２７］  前記第一領域における前記流動媒体の前記性質を少なくとも、前記性質の理論値と比較することを特徴する、［２５］に記載の血液または血漿等の流動媒体における凝固時間を測定する方法。
［２８］  前記読取った性質と理論曲線とを相関させることを含む、特性対照工程を含んでなる、［２５］または［２６］に記載の血液または血漿等の流動媒体の凝固時間を測定する方法。
［２９］  血液または血漿等の流動媒体における凝固時間を測定する［１］〜［１７］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスの製造方法であって：
−第一基板を用意する工程と；
−前記第一基板に、［１］〜［１７］のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスに対応する微細構造のパターンを形成する工程と；
−第二基板を用意する工程と；
−前記パターン化した第一基板の上部に前記第二基板を封止して、前記第二基板がカバー蓋としての機能を果たすようにする工程と、
を含んでなる方法。
［３０］  前記第二基板が親水性膜である、［２９］に記載の方法。
【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図５】
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【図６】
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【図１２】
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