(57)【要約】  ピンホールアレーディスク２６を回転させながら複数のピンホール２６ａから、分子を励起させる第１の光と分子の励起を抑制する第２の光とを含む照明光を透過させて複数の走査用照明光を生成し、これら複数の走査用照明光を第１の光及び第２の光に対して光透過性を有する空間変調素子２７及び顕微鏡対物レンズ２８を経て回折限界を超える複数の蛍光スポットとして試料１０に照射して、試料１０を複数の蛍光スポットで走査する。
2017082357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分子を励起させる第１の光と前記分子の励起を抑制する第２の光とを含む照明光を、前記第１の光及び前記第２の光の少なくとも一部を空間的に重ね合わせて前記試料に照射する照明光学系と、
前記照明光の前記試料への照射による該試料からの応答光を検出する検出光学系と、を備え、
前記照明光学系は、走査用照明光生成部と、空間変調素子と、顕微鏡対物レンズと、を有し、
前記走査用照明光生成部は、入射される前記照明光から異なる軌跡で変位する複数の走査用照明光を生成し、
前記顕微鏡対物レンズは、前記走査用照明光生成部からの複数の前記走査用照明光を前記試料に集光し、
前記空間変調素子は、前記第１の光及び前記第２の光に対して光透過性を有し、前記顕微鏡対物レンズにより集光される複数の前記走査用照明光の各々を、前記第１の光が光強度の極大値を持ち、前記第２の光が光強度の極小値を持つように、前記第１の光及び前記第２の光のいずれか一方の少なくとも一部を空間変調し、
前記検出光学系は、複数の前記走査用照明光による前記試料からの前記応答光を光電変換する二次元光センサを備え、
前記試料を複数の前記走査用照明光で走査して、前記二次元センサの出力に基づいて前記試料を観察する、超解像顕微鏡。
【請求項２】
請求項１に記載の超解像顕微鏡において、
前記空間変調素子は、前記第１の光及び前記第２の光のいずれか一方の偏光状態又は位相状態を変調する、超解像顕微鏡。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の超解像顕微鏡において、
前記走査用照明光生成部は、回転可能なピンホールアレーディスクを備え、
前記ピンホールアレーディスクは、回転軸と直交する平面に複数配列されたピンホールを有し、前記照明光を前記平面の一部の複数の前記ピンホールから透過させて複数の前記走査用照明光を生成し、
前記ピンホールアレーディスクを回転させながら前記試料を複数の前記走査用照明光で走査する、超解像顕微鏡。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の超解像顕微鏡において、
前記走査用照明光生成部は、回転可能なマイクロレンズアレーディスクを備え、
前記マイクロレンズアレーディスクは、回転軸と直交する平面に複数配列されたマイクロレンズを有し、前記照明光を前記平面の一部の複数の前記マイクロレンズから透過させて複数の前記走査用照明光を生成し、
前記マイクロレンズアレーディスクを回転させながら前記試料を複数の前記走査用照明光で走査する、超解像顕微鏡。
【請求項５】
請求項４に記載の超解像顕微鏡において、
前記空間変調素子は、前記マイクロレンズアレーディスクの各々の前記マイクロレンズに接合して設けられている、超解像顕微鏡。
【請求項６】
請求項４に記載の超解像顕微鏡において、
前記照明光学系は、前記マイクロレンズアレーディスクに対する前記照明光の入射面側又は射出面側に配置され、前記マイクロレンズアレーディスクと一体に回転可能な空間変調素子アレーディスクをさらに備え、
前記空間変調素子アレーディスクは、回転軸と直交する平面に前記マイクロレンズアレーディスクにおける前記マイクロレンズの配列パターンと同じ配列パターンで、複数の前記マイクロレンズの各々の光軸上に位置するように複数配列された前記空間変調素子を有する、超解像顕微鏡。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の超解像顕微鏡において、
前記走査用照明光生成部は、一体に回転可能なマイクロレンズアレーディスク及びピンホールアレーディスクを備え、
前記マイクロレンズアレーディスクは、回転軸と直交する平面に複数配列されたマイクロレンズを有し、
前記ピンホールアレーディスクは、前記回転軸と直交する平面に前記マイクロレンズの配列パターンと同じ配列パターンで複数配列されたピンホールを有し、前記ピンホールが前記マイクロレンズの像側焦点位置に位置するように配置され、
前記照明光を複数の前記マイクロレンズ及び複数の前記ピンホールを透過させて複数の前記走査用照明光を生成し、
前記マイクロレンズアレーディスク及び前記ピンホールアレーディスクを回転させながら前記試料を複数の前記走査用照明光で走査する、超解像顕微鏡。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
前記照明光学系は、前記照明光を偏向して前記試料の走査領域を移動させる偏向部を備え、
複数の前記走査領域における前記二次元センサの出力に基づいて、複数の前記走査領域を結合した前記試料の画像信号を生成する、超解像顕微鏡。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
前記検出光学系は、
前記顕微鏡対物レンズに入射する前記照明光又は前記走査用照明光の光路中に配置され、前記照明光又は前記走査用照明光を透過させ、前記顕微鏡対物レンズを経て入射する前記試料からの前記応答光を反射させるダイクロイックミラーと、
前記ダイクロイックミラーで反射される前記応答光を前記二次元センサに結像させる結像レンズと、
前記結像レンズと前記二次元センサとの間の光路中に配置され、前記応答光を透過する分光フィルタと、をさらに備える超解像顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載の超解像顕微鏡において、
前記照明光学系は、前記走査用照明光生成部に入射させる前記照明光による照射領域の形状を整形するビーム整形部をさらに備える、超解像顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超解像顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
超解像顕微鏡として、例えば特許文献１、２には、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ分子を含む試料を、２重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能で観察可能な蛍光顕微鏡が開示されている。特許文献１、２に開示の蛍光顕微鏡は、試料中の分子を安定状態から第１量子状態に励起させて蛍光を発生させるためのポンプ光と、分子を更に他の第２量子状態に遷移させて蛍光の発生を抑制すためのイレース光とを用いて、回折限界以下に収縮した蛍光スポット（励起光スポット）により試料面を空間走査する。そして、各計測点の蛍光信号をコンピュータ上で２次元的に配列して画像処理することにより、回折限界の空間分解能を上回る解像度を有する蛍光画像を得ている。【０００３】
特許文献１、２に開示の蛍光顕微鏡は、優れた機能を有するものの、ポンプ光とイレース光とを一組とする１本の走査ビームで試料を走査するため、１画面を計測するのに時間がかかる。そのため、生きた生物試料を観察する場合は、レーザ光の集光点における生物試料の部位の形態や位置の変化により空間分解能が低下して、良好な超解像顕微鏡画像が得られない場合がある。【０００４】
なお、１本の走査ビームで短時間に画像を得る方法としては、例えば観測領域を狭くしたり、観測点毎の蛍光信号の積算時間を短くしたりすることが考えられる。しかし、前者の場合は試料全体の構造が把握しにくくなるといった不便が発生し、後者の場合は画像のＳ／Ｎ低下を招くことになる。【０００５】
一方、他の超解像顕微鏡として、例えば特許文献３には、試料を励起する励起光と誘導放出により試料の励起を抑制する抑制光とを用いるＳＴＥＤ（stimulated emission depletion:）顕微鏡が開示されている。特許文献３に開示のＳＴＥＤ顕微鏡は、複数のマイクロレンズを配列して保持するレンズディスクと、マイクロレンズの配列と同じパターンで形成された複数のピンホールを有するピンホールディスクと、マイクロレンズに形成された位相調整部とを有する。そして、レンズディスクとピンホールディスクとを一体的に回転させながら、同軸に重ね合わされた励起光と抑制光とを複数のマイクロレンズに同時に入射させて、対をなすピンホールを経て試料に照射している。【０００６】
特許文献３に開示のＳＴＥＤ顕微鏡によると、回折限界を超える複数の蛍光スポットにより試料を走査するので、高速走査が可能となり、短時間で超解像顕微鏡画像を得ることが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−１００１０２号公報
【特許文献２】特開２０１０−１５０２６号公報
【特許文献３】特開２０１２−２２６１４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、特許文献３に開示のＳＴＥＤ顕微鏡においては、マイクロレンズの位相調整部に抑制光透過フィルタを形成し、マイクロレンズの位相調整部以外の領域に励起光透過フィルタを形成している。ここで、抑制光透過フィルタは、抑制光を透過させて励起光を透過させない特性を有する。また、励起光透過フィルタは、励起光を透過させて抑制光を透過させない特性を有する。そのため、小径のマイクロレンズに抑制光透過フィルタと励起光透過フィルタとを分離して形成するのが容易ではなく、コストアップを招くことが懸念される。また、励起光と抑制光との口径内の透過領域を分割して遮蔽しているため、励起光と抑制光との強度が極端に低下する。特に、抑制光は強い強度を要するため、高出力のレーザー光源を必要とする。更には、それぞれの瞳領域が遮蔽されているため、集光したビーム形状が広がったり、変形して十分な超解像機能が得られ難い。【０００９】
したがって、かかる観点に鑑みてなされた本発明の目的は、短時間で良好な超解像顕微鏡画像が得られる改善された超解像顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成する本発明に係る超解像顕微鏡は、
試料中の分子を安定状態から第１量子状態に励起させる第１の光と前記分子の励起を抑制する第２の光とを含む照明光を、前記第１の光及び前記第２の光の少なくとも一部を空間的に重ね合わせて前記試料に照射する照明光学系と、
前記照明光の前記試料への照射による該試料からの応答光を検出する検出光学系と、を備え、
前記照明光学系は、走査用照明光生成部と、空間変調素子と、顕微鏡対物レンズと、を有し、
前記走査用照明光生成部は、入射される前記照明光から異なる軌跡で変位する複数の走査用照明光を生成し、
前記顕微鏡対物レンズは、前記走査用照明光生成部からの複数の前記走査用照明光を前記試料に集光し、
前記空間変調素子は、前記第１の光及び前記第２の光に対して光透過性を有し、前記顕微鏡対物レンズにより集光される複数の前記走査用照明光の各々を、前記第１の光が光強度の極大値を持ち、前記第２の光が光強度の極小値を持つように、前記第１の光及び前記第２の光のいずれか一方の少なくとも一部を空間変調し、
前記検出光学系は、複数の前記走査用照明光による前記試料からの前記応答光を光電変換する二次元光センサを備え、
前記試料を複数の前記走査用照明光で走査して、前記二次元センサの出力に基づいて前記試料を観察するものである。【００１１】
前記空間変調素子は、前記第１の光及び前記第２の光のいずれか一方の偏光状態又は位相状態を変調するとよい。【００１２】
前記走査用照明光生成部は、回転可能なピンホールアレーディスクを備え、
前記ピンホールアレーディスクは、回転軸と直交する平面に複数配列されたピンホールを有し、前記照明光を前記平面の一部の複数の前記ピンホールから透過させて複数の前記走査用照明光を生成し、 
前記ピンホールアレーディスクを回転させながら前記試料を複数の前記走査用照明光で走査してもよい。【００１３】
前記走査用照明光生成部は、回転可能なマイクロレンズアレーディスクを備え、
前記マイクロレンズアレーディスクは、回転軸と直交する平面に複数配列されたマイクロレンズを有し、前記照明光を前記平面の一部の複数の前記マイクロレンズから透過させて複数の前記走査用照明光を生成し、
前記マイクロレンズアレーディスクを回転させながら前記試料を複数の前記走査用照明光で走査してもよい。【００１４】
前記空間変調素子は、前記マイクロレンズアレーディスクの各々の前記マイクロレンズに接合して設けられてもよい。【００１５】
前記照明光学系は、前記マイクロレンズアレーディスクに対する前記照明光の入射面側又は射出面側に配置され、前記マイクロレンズアレーディスクと一体に回転可能な空間変調素子アレーディスクをさらに備え、
前記空間変調素子アレーディスクは、回転軸と直交する平面に前記マイクロレンズアレーディスクにおける前記マイクロレンズの配列パターンと同じ配列パターンで、複数の前記マイクロレンズの各々の光軸上に位置するように複数配列された前記空間変調素子を有してもよい。【００１６】
前記走査用照明光生成部は、一体に回転可能なマイクロレンズアレーディスク及びピンホールアレーディスクを備え、
前記マイクロレンズアレーディスクは、回転軸と直交する平面に複数配列されたマイクロレンズを有し、
前記ピンホールアレーディスクは、前記回転軸と直交する平面に前記マイクロレンズの配列パターンと同じ配列パターンで複数配列されたピンホールを有し、前記ピンホールが前記マイクロレンズの像側焦点位置に位置するように配置され、
前記照明光を複数の前記マイクロレンズ及び複数の前記ピンホールを透過させて複数の前記走査用照明光を生成し、
前記マイクロレンズアレーディスク及び前記ピンホールアレーディスクを回転させながら前記試料を複数の前記走査用照明光で走査してもよい。【００１７】
前記照明光学系は、前記照明光を偏向して前記試料の走査領域を移動させる偏向部を備え、
複数の前記走査領域における前記二次元センサの出力に基づいて、複数の前記走査領域を結合した前記試料の画像信号を生成してもよい。【００１８】
前記検出光学系は、
前記顕微鏡対物レンズに入射する前記照明光又は前記走査用照明光の光路中に配置され、前記照明光又は前記走査用照明光を透過させ、前記顕微鏡対物レンズを経て入射する前記試料からの前記応答光を反射させるダイクロイックミラーと、
前記ダイクロイックミラーで反射される前記応答光を前記二次元センサに結像させる結像レンズと、
前記結像レンズと前記二次元センサとの間の光路中に配置され、前記応答光を透過する分光フィルタと、をさらに備えてもよい。【００１９】
前記照明光学系は、前記走査用照明光生成部に入射させる前記照明光による照明領域の形状を整形するビーム整形部をさらに備えてもよい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によると、コストアップを招くことなく容易に構成でき、短時間で良好な超解像顕微鏡画像が得られる改善された超解像顕微鏡を実現することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。
【図２】図１の部分断面図である。
【図３Ａ】空間変調素子の一例の概略構成を示す平面図である。
【図３Ｂ】図３Ａの空間変調素子の光学特性を説明するための図である。
【図４Ａ】空間変調素子の他の例の概略構成を示す平面図である。
【図４Ｂ】図４Ａの空間変調素子の光学特性を説明するための図である。
【図５】第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。
【図６Ａ】図５のマイクロレンズアレーディスクの部分底面図である。
【図６Ｂ】図５のマイクロレンズアレーディスクの部分断面図である。
【図７】第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。
【図８】第４実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。
【図９】第５実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。
【図１０】第６実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。
【図１１】図１０のマイクロレンズアレーディスクに対する照明光による照射領域を説明する図である。
【図１２】第７実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
【００２３】
（第１実施の形態）
図１は、第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。本実施の形態に係る超解像顕微鏡は、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ蛍光色素で染色された試料１０を、２重共鳴吸収過程を用いて超解像で観察する。そのため、図１に示す超解像顕微鏡は、蛍光色素を安定状態から第１量子状態に励起するための第１の光（ポンプ光）と蛍光色素を更に他の第２量子状態に遷移させて蛍光分子の励起を抑制するための第２の光（イレース光）とを照明光として用いる。
【００２４】
ポンプ光及びイレース光は、それぞれ直線偏光の連続波又はパルス波として光源部２０から同軸に合成されて照明光として射出される。光源部２０は、例えばポンプ光用のレーザ光源及びイレース光用のレーザ光源を有し、これらレーザ光源から直接又はフィルタ等を介して射出されるポンプ光及びイレース光を公知のビームコンバイナで同軸に合成して照明光として射出する。なお、光源部２０は、単一のレーザ光源からの基本波及び所定の高調波をポンプ光及びイレース光として用いるように構成してもよい。
【００２５】
光源部２０から射出される照明光は、シングルモードファイバ２１を経て顕微鏡本体部２２に導光される。光源部２０から射出される照明光は、ポンプ光及びイレース光が連続波でもよいし、パルス波でもよい。パルス波の場合、両者の射出タイミングは同時でもよいし、イレース光の射出タイミングをポンプ光の射出タイミングに対して、最大で試料１０の蛍光分子の励起寿命の時間（数ナノ秒から数マイクロ秒）遅らせてもよい。
【００２６】
顕微鏡本体部２２において、シングルモードファイバ２１から射出される照明光は、コリメータレンズ２３、走査用照明光生成部５０、ダイクロイックミラー２５及び空間変調素子２７を経て顕微鏡対物レンズ２８により試料１０に集光される。
【００２７】
コリメータレンズ２３は、シングルモードファイバ２１の射出端面から拡散して射出される照明光を平行光に変換して、照明光を拡大して走査用照明光生成部５０に入射させる。
【００２８】
走査用照明光生成部５０は、照明光から異なる軌跡で変位する複数の走査用照明光を生成する。本実施の形態において、走査用照明光生成部５０は、マイクロレンズアレーディスク２４とピンホールアレーディスク２６とを備える。マイクロレンズアレーディスク２４及びピンホールアレーディスク２６は、例えばニポウ式共焦点顕微鏡におけるマイクロレンズアレーディスク及びピンホールアレーディスクと同様に構成されて、モータ等を有するディスク駆動部２９により同軸上で一体に回転駆動される。すなわち、マイクロレンズアレーディスク２４は、回転軸と直交する平面に回転軌跡を異ならせて複数配列されたマイクロレンズ２４ａを有して構成される。
【００２９】
同様に、ピンホールアレーディスク２６は、回転軸と直交する平面にマイクロレンズ２４ａの配列パターンと同じ配列パターンで複数配列されたピンホール２６ａを有して構成される。ピンホールアレーディスク２６は、各ピンホール２６ａがマイクロレンズアレーディスク２４の対応するマイクロレンズ２４ａの焦点に位置するように配置されて、ピンホール２４ａが共焦点ピンホールとして機能する。なお、図１では、図面を明瞭とするために、対応する４つのマイクロレンズ２４ａと４つのピンホール２６ａとを示している。
【００３０】
コリメータレンズ２３から平行光で射出される照明光は、走査用照明光生成部５０においてマイクロレンズアレーディスク２４の回転軸と平行に、回転軸から所定距離の位置においてマイクロレンズアレーディスク２４の平面の一部に照射される。これにより、照明光は、マイクロレンズアレーディスク２４の照射領域内に位置する複数のマイクロレンズ２４ａに同時に入射される。マイクロレンズアレーディスク２４に入射された照明光は、図２に図１の部分断面図を示すように、複数のマイクロレンズ２４ａでそれぞれ集光されて複数の走査用照明光として対応するピンホール２６ａを透過する。
【００３１】
ダイクロイックミラー２５は、マイクロレンズアレーディスク２４とピンホールアレーディスク２６との間の走査用照明光の光路中に配置される。ダイクロイックミラー２５は、走査用照明光を透過し、後述する試料１０からの蛍光（応答光）を反射するように構成される。
【００３２】
複数のピンホール２６ａを透過した複数の走査用照明光は、対応するマイクロレンズ２４ａの作用により顕微鏡対物レンズ２８の口径サイズまで拡大されて顕微鏡対物レンズ２８により試料１０の異なる位置に集光される。
【００３３】
空間変調素子２７は、ピンホールアレーディスク２６と顕微鏡対物レンズ２８との間の走査用照明光の光路中に配置される。空間変調素子２７は、ポンプ光及びイレース光に対して光透過性を有する。空間変調素子２７は、顕微鏡対物レンズ２８により集光される走査用照明光の各々に対し、ポンプ光が光強度の極大値を持ち、イレース光が光強度の極小値を持つように、ポンプ光及びイレース光のいずれか一方の少なくとも一部を空間変調するように構成される。
【００３４】
例えば、空間変調素子２７は、ポンプ光については顕微鏡対物レンズ２８により通常のガウスビームとしてビーム整形されることなく集光させる。また、イレース光については顕微鏡対物レンズ２８の焦点で強度が最小となる中空状にビーム整形されて集光されるように変調する。これにより、試料１０には、ポンプ光の照射領域の周囲の蛍光発光が抑制された回折限界を超える複数の蛍光スポットが形成される。
【００３５】
空間変調素子２７は、例えば、（１）光学多層膜、（２）エッチング、（３）波長板、（４）フォトニック材料、等を用いて、ポンプ光及びイレース光のいずれか一方の偏光状態又は位相状態を変調するように構成される。
【００３６】
上記（１）の場合、空間変調素子２７は、例えば図３Ａ及び図３Ｂに示すように構成される（例えば、特開２０１０−１５０２６号公報参照）。図３Ａは空間変調素子２７の概略構成を示す平面図であり、図３Ｂは空間変調素子２７の光学特性を説明するための図である。この空間変調素子２７は、ガラス基板２７ａ上の入射光束の全領域を変調領域とし、この変調領域に光軸の周りに分割された複数領域、ここでは８領域を有し、その８領域にイレース光の波長λ２に対して、λ２／８ずつ位相が異なるように多層膜２７ｂが形成されている。
【００３７】
ここで、多層膜２７ｂは、図３Ｂにポンプ光及びイレース光の位相分布を模式的に示すように、イレース光に対してはラゲール・ガウシアンビームとなるように段階的に位相が増加し、全体で２π周回する様に設計される。一方、ポンプ光に対しては、多層膜２７ｂは、波長分散性により各領域でポンプ光の波長λ１に対して２πの整数倍の位相変化が発生するように設計される。
【００３８】
また、空間変調素子２７は、例えば図３Ａの多層膜２７ｂに代えて、各領域に独立に単層膜をコートして、ポンプ光とイレース光とに位相差（光路差）を与えるように構成してもよい（例えば、特開２０１４−１８２２３９号公報参照）。
【００３９】
上記（２）の場合、空間変調素子２７は、例えばガラス基板を放射線状に分割し、各領域のエッチングの深さを調整して、ポンプ光とイレース光とに対して独立の位相差を与えるように構成される。
【００４０】
上記（３）の場合、空間変調素子２７は、例えば図４Ａ及び図４Ｂに示すように構成される（例えば、Opt. Lett. Vol. 40, Issue 6, pp. 1057-1060 (2015)参照）。図４Ａは空間変調素子２７の概略構成を示す平面図であり、図４Ｂは空間変調素子２７の光学特性を説明するための図である。この空間変調素子２７は、同心円状に接合された円柱基板２７ｃ及び輪帯基板２７ｄを有する。
【００４１】
円柱基板２７ｃ及び輪帯基板２７ｄは、それぞれ直交する進相軸（実線矢印で示す）及び遅相軸（破線矢印で示す）を有する例えば水晶基板からなり、円柱基板２７ｃの進相軸と輪帯基板２７ｄの進相軸とが直交するよう接合される。円柱基板２７ｃ及び輪帯基板２７ｄは、イレース光に対しては半波長板、ポンプ光に対しては１波長板となるように、それぞれの厚みが調整されて、ポンプ光及びイレース光の偏光状態を変調する。
【００４２】
図４Ａの空間変調素子２７は、図４Ｂに示すように、ポンプ光は同相で透過し、イレース光は位相が反転されて透過する。この空間変調素子２７を透過したポンプ光は、顕微鏡対物レンズ２８で集光されると、通常のガウスビームに近い形で集光される。これに対し、空間変調素子２７を透過したイレース光は、顕微鏡対物レンズ２８で集光されると、干渉により焦点のみで電場相殺されるので、３次元的な中空ビームとして集光される。したがって、この場合は、光軸方向にも蛍光スポットを収縮できるので、３次元的な超解像効果が得られる。
【００４３】
上記（４）の場合、空間変調素子２７は、フォトニック結晶材料からなる結晶基板に回折限界の微小なホール又はピットパターンを配列して構成される。ホール又はピットパターンは、そのサイズ及び／又は間隔を調整することで、特定の波長に対する屈折率を調整することができる。
【００４４】
例えば、ホール又はピットパターンを、結晶基板の平面内で直交する方向に対して、異なるサイズ及び／又は間隔で配列すると、直交方向で異なる屈折率を与えることができる。この特性を利用することで、ポンプ光及びイレース光に対して独立に異なる屈折率を与えることができる。これにより、空間変調素子２７を透過したポンプ光及びイレース光を、顕微鏡対物レンズ２８により、同様に、ポンプ光は光強度の極大値を持ち、イレース光は光強度の極小値を持つように、試料１０に集光させることができる。
【００４５】
一方、複数の走査用照明光の照射により試料１０からそれぞれ発光する蛍光は、対応する走査用照明光の光路とは逆の光路を辿って、顕微鏡対物レンズ２８、空間変調素子２７及び対応するピンホール２６ａを経てダイクロイックミラー２５に入射される。ダイクロイックミラー２５に入射された蛍光は、該ダイクロイックミラー２５で反射された後、結像レンズ３０及び分光フィルタ３１を経て画像センサ３２上に結像されて、該画像センサ３２から光電変換信号として出力される。画像センサ３２から出力される光電変換信号は、画像処理部３３に入力される。画像処理部３３は、入力される光電変換信号を処理して、試料１０の蛍光画像信号を出力する。
【００４６】
分光フィルタ３１は、画像処理部３３から出力される蛍光画像信号のＳ／Ｎを向上させるために、ダイクロイックミラー２５で反射される光の波長成分から、試料１０で発光された蛍光の波長成分の光を透過させるように構成される。なお、分光フィルタ３１は、ダイクロイックミラー２５が所望の波長成分の蛍光のみを反射し、他の波長成分は透過する特性を有する場合は省略してもよい。画像センサ３２は、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）、ＢＢＤ（Bucket Brigade Device）、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）等の固体撮像素子からなる二次元センサで構成される。
【００４７】
本実施の形態において、照明光学系は、コリメータレンズ２３、マイクロレンズアレーディスク２４、ダイクロイックミラー２５、ピンホールアレーディスク２６、空間変調素子２７及び顕微鏡対物レンズ２８を含んで構成される。また、検出光学系は、顕微鏡対物レンズ２８、空間変調素子２７、ピンホールアレーディスク２６、ダイクロイックミラー２５、結像レンズ３０、分光フィルタ３１及び画像センサ３２を含んで構成される。
【００４８】
上述した光源部２０、ディスク駆動部２９及び画像処理部３３は、制御部３５により制御される。制御部３５は、コンピュータ等を使用してソフトウエアで実現してもよいし、例えばＤＳＰ（デジタルシグナルプロセッサ）等の専用のプロセッサによって構成してもよい。なお、画像処理部３３は、制御部３５に内蔵されていてもよい。
【００４９】
本実施の形態では、光源部２０を駆動してシングルモードファイバ２１からポンプ光及びイレース光を有する照明光を射出させながら、ディスク駆動部２９によりマイクロレンズアレーディスク２４及びピンホールアレーディスク２６を同軸上で一体に所定の回転速度で回転させる。マイクロレンズアレーディスク２４が回転すると、マイクロレンズアレーディスク２４上に照射される照明光の照射領域を複数のマイクロレンズ２４ａが異なる回転軌跡で移動する。これにより、試料１０は、異なる軌跡で変位する複数の走査用照明光による回折限界を超える複数の蛍光スポットによって例えばラスタ走査され、その複数の蛍光スポットによる画像が画像センサ３２に結像される。
【００５０】
画像処理部３３は、画像センサ３２の画素位置から読み出される光電変換信号を、マイクロレンズアレーディスク２４の回転速度、マイクロレンズアレーディスク２４に照射される照明光の照射領域を通過するマイクロレンズ２４ａの位置情報に基づいて処理して、試料１０の蛍光画像信号を出力する。この蛍光画像信号は、例えばモニタに入力して蛍光画像を表示したり、記録部に入力して記録媒体に記録したりすることができる。
【００５１】
本実施の形態によると、回折限界を超える複数の蛍光スポットにより試料１０を走査するので、試料１０の観測領域を狭くしたり、観測点毎の蛍光信号の積算時間を短くしたりすることなく試料１０の３次元的な観測が可能となる。したがって、観測領域の縮小化や顕微鏡画像のＳ／Ｎ低下を招くこともない。また、空間変調素子２７は、ポンプ光及びイレース光に対して光透過性を有するので、コストアップを招くことなく容易に構成できる。以上により、本実施の形態によると、短時間で良好な超解像顕微鏡画像が得られる改善された超解像顕微鏡を実現することが可能となる。また、本実施の形態では、走査用照明光生成部５０がマイクロレンズアレーディスク２４を有するので、光源部２０からの照明光を複数のマイクロレンズ２４ａにより有効利用することができる。したがって、光源部１０を比較的低パワーのレーザ光源を用いて簡単に構成することが可能となる。
【００５２】
（第２実施の形態）
図５は、第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。本実施の形態に係る超解像顕微鏡は、図１に示した構成において、ピンホールアレーディスク２６及び空間変調素子２７を省略している。また、走査用照明光生成部５０は、マイクロレンズアレーディスク２４により構成され、マイクロレンズアレーディスク２４の各マイクロレンズ２４ａに空間変調素子３７が接合して設けてある。
【００５３】
空間変調素子３７は、例えば図６Ａ及び図６Ｂにマイクロレンズアレーディスク２４の部分底面図及び部分断面図を示すように、各マイクロレンズ２４ａの像側表面に直接、例えば光学多層膜又は単層膜を接合して構成される。これにより、コリメータレンズ２３からの照明光が入射する複数のマイクロレンズ２４ａ及び対応する複数の空間変調素子３７によって、ポンプ光及びイレース光のいずれか一方が空間変調された複数の走査用照明光が生成される。これら複数の走査用照明光は、顕微鏡対物レンズ２８によりビーム成形されて試料１０に集光される。その他の構成は、図１と同様であるので説明を省略する。
【００５４】
本実施の形態によると、各マイクロレンズ２４ａを経て顕微鏡対物レンズ２８で集光される蛍光スポットは、図４Ａ及び図４Ｂに示した空間変調素子２７を用いる場合と同様に光軸方向にも収縮できる３次元的な超解像機能を有する。したがって、図１に示したようなピンホールアレーディスク２６を用いることなく、３次元的な超解像観測が可能となるので、図１の場合よりも簡単な構成で、同様の効果を得ることが可能となる。
【００５５】
（第３実施の形態）
図７は、第３実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。本実施の形態に係る超解像顕微鏡は、図５に示した構成において、空間変調素子３７をマイクロレンズ２４ａに接合して設ける代わりに、コリメータレンズ２３とマイクロレンズアレーディスク２４との間に回転可能に空間変調素子アレーディスク３８を設けたものである。
【００５６】
空間変調素子アレーディスク３８は、回転軸と直交する平面にマイクロレンズ２４ａの配列パターンと同じ配列パターンで複数配列された空間変調素子３７を有して構成される。空間変調素子アレーディスク３８は、各マイクロレンズ２４ａの光軸上に空間変調素子２８が位置するように配置されて、ディスク駆動部２９によりマイクロレンズアレーディスク２４と一体に回転駆動される。その他の構成は、図１と同様であるので説明を省略する。
【００５７】
したがって、本実施の形態においても第２実施の形態と同様に３次元的な超解像観測が可能となる。また、本実施の形態によると、空間変調素子アレーディスク３８を用いるので、第２実施の形態の場合と比較して、ポンプ光及びイレース光の照明光の波長の変更に対して空間変調素子アレーディスク３８の交換で即時に対応することが可能となる。
【００５８】
（第４実施の形態）
図８は、第４実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。本実施の形態に係る超解像顕微鏡は、図１に示した構成において、マイクロレンズアレーディスク２４を省略して、走査用照明光生成部５０をピンホールアレーディスク２６により構成したものである。
【００５９】
本実施の形態において、コリメータレンズ２３から平行光で射出される照明光は、ダイクロイックミラー２５を透過して、ピンホールアレーディスク２６の回転軸と平行に、回転軸から所定距離の位置においてピンホールアレーディスク２６の平面の一部に照射される。これにより、照明光の照射領域内に位置する複数のピンホール２６ａを照明光が同時に透過して複数の走査用照明光が生成される。
【００６０】
複数のピンホール２６ａをそれぞれ透過して生成された走査用照明光は、それぞれ顕微鏡対物レンズ２８の口径サイズまで拡大されて空間変調素子２７を経て顕微鏡対物レンズ２８により試料１０の異なる位置に集光される。その他の構成は、図１と同様であるので説明を省略する。
【００６１】
本実施の形態によると、マイクロレンズアレーディスクを用いることなく、ピンホールアレーディスク２６を回転させることにより、回折限界を超える複数の蛍光スポットにより試料１０を走査することができる。したがって、図１の場合よりも簡単な構成で、短時間で良好な超解像顕微鏡画像を得ることが可能となる。
【００６２】
（第５実施の形態）
図９は、第５実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。本実施の形態に係る超解像顕微鏡は、図１に示した構成において、コリメータレンズ２３とマイクロレンズアレーディスク２４との間に、マイクロレンズアレーディスク２４への照明光の入射位置を偏向する偏向部４０を設けたものである。
【００６３】
偏向部４０は、例えばガルバノミラー４１及び瞳投影レンズ４２を有して構成され、コリメータレンズ２３からの照明光をガルバノミラー４１で二次元方向に偏向して瞳投影レンズ４２を経てマイクロレンズアレーディスク２４に照射する。ガルバノミラー４１は、制御部３５によりミラー駆動部４３を経て駆動される。ガルバノミラー４１により照明光が偏向されると、マイクロレンズアレーディスク２４への照明光の入射位置が変位して、複数の走査用照明光による試料１０の走査領域が移動する。
【００６４】
本実施の形態では、ミラー駆動部４３によるガルバノミラー４１の駆動を制御部３５により制御して試料１０の走査領域を移動させ、その複数の走査領域の各々においてマイクロレンズアレーディスク２４及びピンホールアレーディスク２６の回転により、回折限界を超える複数の蛍光スポットで試料１０を走査する。なお、ガルバノミラー４１は、試料１０における複数の走査領域が連続するように照明光を偏向するのが好ましい。
【００６５】
画像処理部３３は、制御部３５による制御のもとに、各走査領域において得られる蛍光画像信号を、ガルバノミラー４１による照明光の偏向情報すなわち試料１０の走査領域の移動情報に基づいて結合して、複数の走査領域を結合した試料１０の蛍光画像信号を生成する。その他の構成は、図１と同様であるので説明を省略する。
【００６６】
本実施の形態によると、偏向部４０により試料１０の走査領域を移動させ、各々の走査領域において回折限界を超える複数の蛍光スポットで試料１０を走査して、複数の走査領域が結合された蛍光画像信号を得る。したがって、試料１０の広範囲に亘る超解像顕微鏡画像をＳ／Ｎ低下を招くことなく、短時間で観測することが可能となる。
【００６７】
（第６実施の形態）
図１０は、第６実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。本実施の形態に係る超解像顕微鏡は、図９に示した構成において、瞳投影レンズ４２とマイクロレンズアレーディスク２４との間に、ビーム整形部６０を設けたものである。ビーム整形部６０は、例えばシリンドリカルレンズ６１と、テレスコープ６２とを備える。
【００６８】
シリンドリカルレンズ６１は、瞳投影レンズ４２からの断面円形状の照明光を、断面帯状に集光させる。テレスコープ６２は、シリンドリカルレンズ６１により断面帯状に集光される照明光を平行光に変換する。これにより、ビーム整形部６０は、瞳投影レンズ４２からの断面円形状の照明光を断面帯状の照明光にビーム整形してマイクロレンズアレーディスク２４に照射する。その他の構成は、図９と同様であるので説明を省略する。
【００６９】
図１１は、マイクロレンズアレーディスク２４に対するビーム整形部６０からの照明光による照射領域を説明する図である。図１１に示すマイクロレンズアレーディスク２４は、ニポウ式共焦点顕微鏡におけるマイクロレンズアレーディスクと同様に、複数のマイクロレンズ２４ａが螺旋状に配列された螺旋状配列パターン６３を複数有する。本実施の形態では、偏向部４０による照明光の偏向に応じて、例えばマイクロレンズアレーディスク２４の内周側と外周側とに、ビーム整形部６０により断面帯状にビーム整形される照明光を選択的に照射して、試料１０の走査領域を移動させる。
【００７０】
これにより、内周側の帯状の照射領域６４ａにおいて、マイクロレンズアレーディスク２４の回転に同期して、各螺旋状配列パターン６３の内周側に位置する複数のマイクロレンズ２４ａに照明光を入射させて試料１０を走査する。同様に、外周側の帯状の照射領域６４ｂにおいて、マイクロレンズアレーディスク２４の回転に同期して、各螺旋状配列パターン６３の外周側に位置する複数のマイクロレンズ２４ａに照明光を入射させて試料１０を走査する。このようにして、照射領域６４ａ及び６４ｂにそれぞれ対応する帯状の走査領域において、回折限界を超える複数の蛍光スポットで試料１０を走査して、複数の走査領域が結合された蛍光画像信号を得る。
【００７１】
本実施の形態によると、マイクロレンズアレーディスク２４の選択した領域をビーム整形部６０により集中的に照明するので、強い蛍光抑制効果を効率的に誘導できる。その結果、空間分解能をより向上させることが可能となる。すなわち、２重共鳴吸収過程を用いる超解像蛍光顕微鏡の空間分解能は、蛍光分子を第１量子状態から第２量子状態にいかに速やかに遷移させるかに係っている。つまり、イレース光の照射により、どれだけの蛍光分子が第１量子状態から第２量子状態に遷移したかによって、蛍光スポットのサイズが決定される。一般には、イレース光の強度が高いほど、第１量子状態から第２量子状態の遷移が進行し、蛍光スポットサイズが小さくなり、空間分解能向上する。特に、断面積の小さい蛍光分子を扱う場合は、できるだけイレース光の強度が高い方が望ましい。したがって、本実施の形態におけるように、照明光をビーム整形部６０によりビーム整形して、マイクロレンズアレーディスク２４の選択した領域を集中的に照明すれば、イレース光の強度を高くできるので、空間分解能をより向上することが可能となる。
【００７２】
（第７実施の形態）
図１２は、第７実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成図である。本実施の形態に係る超解像顕微鏡は、図１に示した構成において、ピンホールアレーディスク２６が省略されているとともに、空間変調素子２７が図４Ａ及び図４Ｂに示した円柱基板２７ｃ及び輪帯基板２７ｄを有して構成されている。その他の構成は、図１と同様であるので説明を省略する。
【００７３】
本実施の形態によると、極めてシンプルな超解像顕微鏡を構成することができる。すなわち、図１において、共焦点ピンホールとして機能するピンホールアレーディスク２６は、縦分解能を向上させて３次元立体像を取得可能に設けられる。しかし、図４Ａ及び図４Ｂに示した空間変調素子２７を用いれば、縦方向の空間分解も向上できる。したがって、ピンホールアレーディスク２６を省略して、図４Ａ及び図４Ｂに示した輪帯形状の空間変調素子２７を用いることで、縦方向の空間分解も向上させた極めてシンプルな超解像顕微鏡を構成することができる。
【００７４】
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、第３実施の形態においては、空間変調素子アレーディスク３８をマイクロレンズアレーディスク２４の入射面側に配置したが、空間変調素子アレーディスク３８はマイクロレンズアレーディスク２４の射出面側に配置してもよい。また、第５実施の形態における偏向部４０は、第２〜４、７実施の形態に適用してもよい。また、第２実施の形態及び第３実施の形態においては、第１実施の形態と同様に、ピンホールアレーディスクを設けてもよい。この場合、ピンホールアレーディスクは、試料１０の観察深さ位置に応じて回転軸方向に変位可能としてもよい。また、上記各実施の形態において、走査用照明光生成部５０は、例えばデジタル・マイクロミラー・デバイス（ＤＭＤ）を用いて構成してもよい。
【００７５】
また、第６実施の形態に示したビーム整形部６０は、第２〜４、７実施の形態に適用することができる。また、ビーム整形部６０は、シリンドリカルレンズ６１及びテレスコープ６２を用いる構成に限らず、例えば液晶型の位相空間素子を用いて構成してもよい。液晶型の位相空間素子を用いれば、ビーム面の位相分布を制御することで任意の集光ビームパターンを生成できるので、マイクロレンズアレーディスク２４のレンズ配列パターンと一致した、例えば螺旋状のパターンも容易に形成することができる。
【００７６】
また、本発明は２重共鳴吸収過程を用いる超解像顕微鏡に限らず、ＳＴＥＤ顕微鏡、ＲＥＳＯＬＦＴ（reversible saturable optical fluorescence transitions）顕微鏡、ＧＳＤ（ground state depletion）顕微鏡等の公知の超解像顕微鏡にも有効に適用することができる。すなわち、本発明に係る超解像顕微鏡は、２準位以上の量子状態、例えば３重項状態や光異性化状態が関わる光化学反応により、蛍光量や蛍光波長の変化を伴う分光過程にも適用できる。
【符号の説明】
【００７７】
１０  試料
２０  光源部
２１  シングルモードファイバ
２２  顕微鏡本体部
２３  コリメータレンズ
２４  マイクロレンズアレーディスク
２４ａ  マイクロレンズ
２５  ダイクロイックミラー
２６  ピンホールアレーディスク
２６ａ  ピンホール
２７  空間変調素子
２８  顕微鏡対物レンズ
２９  ディスク駆動部
３０  結像レンズ
３１  分光フィルタ
３２  画像センサ
３３  画像処理部
３５  制御部
３７  空間変調素子
３８  空間変調素子アレーディスク
４０  偏向部
４１  ガルバノミラー
４２  瞳投影レンズ
４３  ミラー駆動部
５０  走査用照明光生成部
６０  ビーム整形部
【図１】
2017082357.tif 000003
【図２】
2017082357.tif 000004
【図３Ａ】
2017082357.tif 000005
【図３Ｂ】
2017082357.tif 000006
【図４Ａ】
2017082357.tif 000007
【図４Ｂ】
2017082357.tif 000008
【図５】
2017082357.tif 000009
【図６Ａ】
2017082357.tif 000010
【図６Ｂ】
2017082357.tif 000011
【図７】
2017082357.tif 000012
【図８】
2017082357.tif 000013
【図９】
2017082357.tif 000014
【図１０】
2017082357.tif 000015
【図１１】
2017082357.tif 000016
【図１２】
2017082357.tif 000017
【国際調査報告】
2017082357.tif 000018
2017082357.tif 000019
2017082357.tif 000020
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