(57)【要約】  PDX1陽性NKX6.1陰性細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵芽細胞の製造方法を提供する。当該培養工程は、接着培養によって行われても良い。PDX1陽性NKX6.1陰性細胞は多能性幹細胞からインビトロで誘導することができ、本願方法によって多能性幹細胞から膵芽細胞の製造が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
PDX1陽性NKX6.1陰性細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵芽細胞の製造方法。
【請求項２】
前記培養が、接着培養条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Akt阻害剤が、AT7867である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記PDX1陽性NKX6.1陰性細胞が、次の２つの工程を含む方法で多能性幹細胞より製造された細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法：
（１）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、および
（２）工程（１）で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程。
【請求項５】
前記工程（１）が、アクチビンおよびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養した後、ＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンを含む培地で培養する工程である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（２）が、さらに、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（２）が、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養した後、細胞を解離し、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で接着培養する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記BMP阻害剤が、LDN193189である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、請求項５から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記レチノイン酸誘導体が、TTNPBである、請求項６から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヘッジホッグ経路阻害剤が、KAAD‐シクロパミンである、請求項６から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記膵芽細胞がPDX1陽性およびNKX6.1陽性である請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記膵芽細胞が、ヒト細胞である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
以下の工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を含む、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造する方法：
（ｉ）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程。
【請求項１５】
前記培養が、接着培養条件下で行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｉ）が、アクチビンおよびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養した後、ＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンを含む培地で培養する工程である、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ｉｉ）が、さらに、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ｉｉ）が、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養した後、細胞を解離し、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で接着培養する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Akt阻害剤が、AT7867である、請求項１４から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記BMP阻害剤が、LDN193189である、請求項１４から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記レチノイン酸誘導体が、TTNPBである、請求項１７から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヘッジホッグ経路阻害剤が、KAAD‐シクロパミンである、請求項１７から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記膵芽細胞が、PDX1陽性およびNKX6.1陽性である請求項１４から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記膵芽細胞が、ヒト細胞である、請求項１４から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
PDX1陽性細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、PDX1陽性細胞の増殖方法。
【請求項２７】
前記培養が、接着培養条件下で行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Akt阻害剤が、AT7867である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記BMP阻害剤が、LDN193189である、請求項２６から２８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵芽細胞の製造方法および同方法によって製造された膵芽細胞を含む膵疾患治療剤に関する。本願はさらに、当該膵芽細胞を用いる膵疾患の治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓は、膵リパーゼ、トリプシン、エラスターゼ、膵アミラーゼなどの消化酵素を分泌する外分泌腺および、グルカゴン、インスリン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド（PP）等の膵ホルモンを分泌する内分泌腺として機能している。近年、胃分泌ホルモンであるグレリンが膵臓の内分泌細胞からも分泌されることが報告されている。この膵ホルモンは、膵臓の中のα細胞、β細胞、δ細胞およびPP細胞の4種の細胞からなる膵島と呼ばれる細胞塊により産生されている。【０００３】
ここで、インスリンは、ブドウ糖の利用、蛋白の合成、中性脂肪の形成および貯蔵を促進し、血糖値を低下させ、血糖を正しい濃度に保つ重要な役割を果たす。グルカゴンは、肝糖原分解、糖新生作用などを介する血糖上昇ホルモンとしてインスリンと並び糖代謝調節機構において重要な役割を担っている。ソマトスタチンは、ソマトスタチンレセプターへの結合を介して作用を発現し、膵臓でのグルカゴン、インスリン等の種々のホルモン分泌を抑制する。ＰＰは、食物摂取に対応してランゲルハンス島の細胞から分泌されるホルモンであり、飽食因子として知られ、食物摂取を抑制し、体重増加を低減させる働きがある。グレリンは食物摂取を刺激し、脂肪酸化を低下させることによって体重を増加させることが知られている。【０００４】
糖尿病は、インスリンが不足したりその働きが失われたりすることによって発症する疾患であり、一度発症すると根治させることが難しい疾患である。糖尿病は、１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）と２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）の大きく２つのタイプに分類することができる。【０００５】
２型糖尿病は、インスリンに対する抵抗性を獲得することで発症する慢性疾患であり、食べ過ぎや運動不足によっておこる肥満やストレス等、生活習慣が発症メカニズムと考えられている糖尿病である。２型糖尿病は中高年で発病することが多く、糖尿病患者の多くは２型糖尿病に罹患している。【０００６】
一方、１型糖尿病は、自己免疫疾患やウイルス感染等によってβ細胞（インスリン産生細胞）が破壊され、インスリンが体内に分泌されないことによっておこる疾患である。インスリンの投与による対症療法が主に行われているが、体内で常に変化する血糖値を自動的にコントロールして、患者の負担を軽くできる治療法として、膵臓移植又は膵島移植も行われている。この治療法によって正常な血糖値を達成することは可能であるが、移植可能な膵臓又は膵島が不足しているのが現状である。また、移植片に対する免疫拒絶反応を回避するために、患者は免疫抑制剤を一生服用し続ける必要があり、感染症の危険性や免疫抑制剤による副作用等の問題が残る。【０００７】
１型糖尿病の治療法として、体外で患者由来の細胞からインスリン産生細胞自体を誘導し、誘導したインスリン産生細胞を患者の生体内に移植することが検討されている。インスリン産生細胞は例えば、患者の膵管上皮由来細胞を体外に取り出して分化させる等により得ることができる。【０００８】
インスリン産生細胞を得る他の方法としては、胚性幹（ES）細胞や人工多能性幹（iPS）細胞などの多能性幹細胞をアクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）やレチノイン酸（ＲＡ）を用いて分化誘導する方法が例示される（特許文献１、非特許文献１から５）。さらに、多能性幹細胞へＰＤＸ１を導入して培養する方法（特許文献２および特許文献３）、低分子化合物を適宜組み合わせて多能性幹細胞に作用させてインスリン産生細胞を製造する方法（特許文献４および非特許文献６）が知られている。しかしながらこのようにin vitroで得られたインスリン産生細胞を生体内に投与して、グルコース応答能を獲得したという報告は無い。一方、膵前駆細胞を製造し、生体内に投与した場合において、投与した細胞からグルコース濃度に応じてインスリンが分泌されたとの報告がある（非特許文献７および非特許文献８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−２２５６６１号公報
【特許文献２】米国特許７５３４６０８号公報
【特許文献３】特開２００６−０７５０２２号公報
【特許文献４】ＷＯ２０１１／０８１２２２
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】E.Kroon et al.,Nature Biotechnology(2008)Vol.26,No.4:443-452
【非特許文献２】K.A.D’Amour et al.,Nature Biotechnology(2006)Vol.24,No.11:1392-1401
【非特許文献３】W.Jiang,Cell Research(2007)17:333-344
【非特許文献４】J.H.Shim et al.,Diabetologia(2007)50:1228-1238
【非特許文献５】R.Maehr et al.,PNAS(2009),vol.106,No.37:15768-15773
【非特許文献６】Kunisada Y et al.,Stem Cell Res.(2012) vol.8,No.2:274-284
【非特許文献７】Kroon E et al.,Nat Biotechnol.(2008) vol.26,No.4:443-452
【非特許文献８】Rezania A et al., Diabetes.(2012) vol.61,No.8:2016-2029.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一の態様において、本願はPDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞を分化誘導する方法を提供することを目的とする。より具体的には、多能性幹細胞から誘導したPDX1陽性NKX6.1陰性細胞をさらに分化する工程を含み、膵芽細胞を分化誘導する方法を提供することを目的とする。
他の態様において、膵臓疾患治療剤、並びに膵臓疾患治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、PDX1陽性NKX6.1陰性細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地中で培養することで膵芽細胞を効率よく分化誘導できることを初めて見出した。さらに、Akt阻害剤は、PDX1陽性細胞を特異的に増殖する機能を有することを初めて見出した。本発明はそのような知見を基にして完成されたものである。【００１３】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
［１］  PDX1陽性NKX6.1陰性細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵芽細胞の製造方法。
［２］  前記培養が、接着培養条件下で行われる、［１］に記載の方法。
［３］  前記Akt阻害剤が、AT7867である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］  前記PDX1陽性NKX6.1陰性細胞が、次の２つの工程を含む方法で多能性幹細胞より製造された細胞である、［１］から［３］のいずれか１項に記載の方法：
（１）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、および
（２）工程（１）で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程。
［５］  前記工程（１）が、アクチビンおよびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養した後、ＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンを含む培地で培養する工程である、［４］に記載の方法。
［６］  前記工程（２）が、さらに、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、［４］または［５］に記載の方法。
［７］  前記工程（２）が、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養した後、細胞を解離し、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で接着培養する工程を含む、［６］に記載の方法。
［８］  前記BMP阻害剤が、LDN193189である、［１］から［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］  前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、［５］から［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］  前記レチノイン酸誘導体が、TTNPBである、［６］から［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］  前記ヘッジホッグ経路阻害剤が、KAAD‐シクロパミンである、［６］から［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］  前記膵芽細胞がPDX1陽性およびNKX6.1陽性である［１］から［１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１３］  前記膵芽細胞が、ヒト細胞である、［１］から［１２］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］  以下の工程（ｉ）から（ｉｉｉ）を含む、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造する方法：
（ｉ）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程。
［１５］  前記培養が、接着培養条件下で行われる、［１４］に記載の方法。
［１６］  前記工程（ｉ）が、アクチビンおよびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養した後、ＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンを含む培地で培養する工程である、［１４］または［１５］に記載の方法。
［１７］  前記工程（ｉｉ）が、さらに、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、［１４］または［１６］のいずれか１項に記載の方法。
［１８］  前記工程（ｉｉ）が、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養した後、細胞を解離し、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で接着培養する工程を含む、［１７］に記載の方法。
［１９］  前記Akt阻害剤が、AT7867である、［１４］から［１８］のいずれか１項に記載の方法。
［２０］  前記BMP阻害剤が、LDN193189である、［１４］から［１９］のいずれか１項に記載の方法。
［２１］  前記ＧＳＫ３阻害剤が、CHIR99021である、［１６］から［２０］のいずれか１項に記載の方法。
［２２］  前記レチノイン酸誘導体が、TTNPBである、［１７］から［２１］のいずれか１項に記載の方法。
［２３］  前記ヘッジホッグ経路阻害剤が、KAAD‐シクロパミンである、［１７］から［２２］のいずれか１項に記載の方法。
［２４］  前記膵芽細胞が、PDX1陽性およびNKX6.1陽性である［１４］から［２３］のいずれか１項に記載の方法。
［２５］  前記膵芽細胞が、ヒト細胞である、［１４］から［２４］のいずれか１項に記載の方法。
［２６］  PDX1陽性細胞を、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、PDX1陽性細胞の増殖方法。
［２７］  前記培養が、接着培養条件下で行われる、［２６］に記載の方法。
［２８］  前記Akt阻害剤が、AT7867である、［２６］または［２７］に記載の方法。
［２９］  前記BMP阻害剤が、LDN193189である、［２６］から［２８］のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によってPDX1陽性NKX6.1陰性細胞から効率良く膵芽細胞へ誘導することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造するプロトコールの概略図を示す。
【図２】図２は、各濃度のAT7867を第３工程（stage 3）にて添加した場合に得られた細胞数を計測した結果を示す。
【図３】図３は、第3工程（stage 3）の各日数におけるPDX1陽性細胞（左図）、PDX1陽性Ki67陽性細胞（中央図）およびPDX1陰性Ki67陽性細胞（中央図）の含有率を示す。
【図４Ａ】図４Aは、第3工程（stage 3）後のNKX6.1抗体の免疫染色像（上図）および核染色像（下図）を示す。白色が染色部分を示す。
【図４Ｂ】図４Bは、各濃度のAT7867を用いた場合のNKX6.1陽性細胞の含有率を示す。
【図５】図５Aは、第3工程（stage 3）後のPDX1抗体およびNKX6.1抗体を用いて染色した細胞群のフローサイトメトリーの結果を示す。図５Bは、当該フローサイトメトリーの結果から得られたPDX1陽性NKX6.1陰性細胞およびPDX1陽性NKX6.1陽性細胞の含有率を示す。
【図６】図６は、第3工程（stage 3）開始から終了までの期間（0-4日目）において、毎日定量ＰＣＲを行い、PDX1、PTF1AおよびNKX6.1の発現量を測定した結果を示す。実線はAT7867、点線は対照群であるDMSOを添加した場合の遺伝子発現量の推移を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本願の一つの態様として、PDX1陽性NKX6.1陰性細胞をKGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、膵芽細胞を製造する方法を提供する。
【００１７】
膵芽細胞とは、内分泌細胞、膵管細胞および外分泌細胞などの膵臓を形成する細胞へと分化誘導できる細胞であり、少なくともPDX1およびNKX6.1が発現している細胞が例示される。このほかにも、SOX9、またはGATA4などの遺伝子マーカーが発現している細胞であっても良い。
【００１８】
本態様によって製造される膵芽細胞は、他の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化された集団であってもよい。好ましくは、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上または８０％以上の膵芽細胞が含まれる細胞集団である。
【００１９】
PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞を製造するにあたり、当該PDX1陽性NKX6.1陰性細胞は、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で接着培養しても良い。
【００２０】
本願明細書及び請求の範囲において接着培養とは、コーティング処理された培養皿にて培養することである。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（BD Biosciences）、Synthemax（Corning）、ゼラチン、細胞外タンパク質（例えば、コラーゲン、ラミニン（例えば、ラミニン１１１、４１１または５１１）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン等）、または当該細胞外タンパク質の断片、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００２１】
PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞を製造するにあたり、取扱いの簡便さから接着培養にて行うことが好ましいが、細胞凝集塊を形成した浮遊培養を行ってもよい。
【００２２】
浮遊培養とは、細胞を培養皿へ非接着の状態で培養することである。特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないもの、または、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）または２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体（Lipidure）によるコーティング処理）したものを使用して行うことができる。
【００２３】
PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程に使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へKGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、B27サプリメントを含むIMEM Zinc Option培地である。
【００２４】
Akt阻害剤は、Ａｋｔの活性を抑制する薬物であればよく、例えば、Merck Millipore社の Akt Inhibitor（Akt Inhibitor、Akt Inhibitor II〜XIII）、MK-2206、Perifosine (KRX-0401)、 GSK690693、AT7867、Ipatasertib (GDC-0068)、AZD5363、SC79、Afuresertib (GSK2110183)、AT13148、TIC10、Triciribine、CCT128930、PHT-427、Palomid 529、PF-04691502、Honokiol、Miltefosine、Deguelin、A-674563、sc-221226、抗Ａｋｔ抗体、Ａｋｔのドミナントネガティブ変異体等が挙げられる。これらの薬物は市販されているか、公知の技術に基づいて適宜製造することができる。
【００２５】
Akt阻害剤としてAT7867を用いる場合、その濃度は、０．０１μMから４μM、好ましくは、０．１μMから１μM、より好ましくは、０．５μMである。
【００２６】
KGFは、Keratinocyte Growth Factorと呼ばれるタンパク質であり、FGF-7と呼ばれることもある。KGFは、R&D systems社等の市販されているものを使用することができる。KGFの濃度は、１ ng/mlから1 μg/ml、好ましくは、5 ng/mlから500 ng/ml、より好ましくは、10 ng/mlから200 ng/mlである。
【００２７】
EGFは、上皮成長因子またはEpidermal Growth Factorと呼ばれるタンパク質である。EGFは、R&D systems社等の市販されているものを使用することができる。EGFの濃度は、１ ng/mlから1 μg/ml、好ましくは、5 ng/mlから500 ng/ml、より好ましくは、10 ng/mlから100 ng/mlである。
【００２８】
BMP阻害剤は、Chordin、Noggin、Follistatin、などのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin (すなわち、6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)、その誘導体 (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904)およびLDN-193189（すなわち、4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline）が例示される。好ましくは、Nogginである。Nogginは、Peprotech社等の市販されているものを使用することができる。
【００２９】
BMP阻害剤としてLDN-193189を用いる場合、その濃度は、０．０１ μMから５μM、好ましくは、０．１μMから１μM、より好ましくは、０．２μMである。
【００３０】
PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程に使用される培地は、さらにROCK阻害剤、非筋ミオシンII阻害剤およびTGFβ阻害剤から成る群より選択される少なくとも一つの化合物を含んでいてもよい。
【００３１】
ROCK阻害剤は、Rho-キナーゼ（ROCK）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（例、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、SR3677（例、Feng Y et al., J Med Chem. 51: 6642-6645(2008)参照）、GSK269962（例、Stavenger RA et al., J Med Chem. 50: 2-5 (2007)またはWO2005/037197参照）、H-1152（例、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の公知の低分子化合物も使用できる（例えば、米国特許出願公開第2005/0209261号、同第2005/0192304号、同第2004/0014755号、同第2004/0002508号、同第2004/0002507号、同第2003/0125344号、同第2003/0087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、１種または２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。本工程で用いる好ましいROCK阻害剤としては、Y-27632、Fasudil/HA1077、SR3677、GSK269962およびH-1152が挙げられる。
【００３２】
ROCK阻害剤としてY-27632を用いる場合の培地中の濃度は、0.1μMから100μM、好ましくは、1μMから500μM、さらに好ましくは、10μＭから200μMである。
【００３３】
ROCK阻害剤としてFasudil/HA1077を用いる場合の培地中の濃度は、1μMから100μM、好ましくは、10μMから100μMである。
【００３４】
ROCK阻害剤としてSR3677を用いる場合の培地中の濃度は、0.1μMから50μM、好ましくは、0.5μMから50μMである。
【００３５】
ROCK阻害剤としてGSK269962を用いる場合の培地中の濃度は、0.001μMから100μM、好ましくは、0.005μMから50μM、さらに好ましくは、0.05μMから10μMである。
【００３６】
ROCK阻害剤としてH-1152を用いる場合の培地中の濃度は、5μMから100μM、好ましくは、10μMから50μMである。
【００３７】
非筋ミオシンII阻害剤は、非筋ミオシンIIの重鎖アイソフォームの一つである非筋ミオシンIIAまたは非筋ミオシンIIBの重鎖サブユニットのATPase活性の阻害剤、ミオシン軽鎖キナーゼの阻害剤が例示される。このような薬剤として、例えば、ブレビスタチン（Blebbistatin）A3、Calphostin C、Goe6976、Goe7874、Fasudil/HA1077、Hypericin、K-252a、KT5823、ML-7、ML-9、Piceatannol、Staurosporine、W-5、W-7、W-12、W-13、Wortmannin等が挙げられるがこれらに限定されない。本工程で用いる好ましい非筋ミオシンII阻害剤としては、ブレビスタチンおよびFasudil/HA1077が挙げられる。
【００３８】
本発明において、非筋ミオシンII阻害剤としてブレビスタチンを用いる場合の培地中の濃度は、1μMから200μM、好ましくは、10μMから100μMである。
【００３９】
TGFβ阻害剤は、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、またはALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されず、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345 、SD093、 SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO 2009146408) ALK5阻害剤II（２−［３−［６−メチルピリジン−２−イル］−１Ｈ−ピラゾル−４−イル］−１，５−ナフチリジン）、TGFβRIキナーゼ阻害剤VIII（６−［２−ｔｅｒｔ−ブチル−５−［６−メチル−ピリジン−２−イル］−１Ｈ−イミダゾル−４−イル］−キノキサリン）およびこれらの誘導体などが例示される。好ましくは、ALK5阻害剤IIであり得る。
【００４０】
TGFβ阻害剤としてALK5阻害剤IIを用いる場合の培地中の濃度は、０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１から５０μＭ、さらに好ましくは、１μＭから２０μＭである。
【００４１】
PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程の日数は、長期間培養することで膵芽細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、例えば、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上または１４日以上が挙げられる。好ましくは、３日以上２０日以下であり、より好ましくは、４日以上20日以下、例えば４日である。
【００４２】
PDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程において、培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2〜5％である。
【００４３】
PDX1陽性NKX6.1陰性細胞とは、PDX1を発現しているが、NKX6.1を発現していない細胞であれば、特に限定されない。PDX1を発現しているとは、公知の方法にて、PDX1遺伝子または遺伝子産物を検出できることを意味し、NKX6.1を発現していないとは、NKX6.1遺伝子または遺伝子産物を検出できないことを意味し、当該検出方法として、例えば、免疫染色法などが例示される。
【００４４】
本願の他の態様として、PDX1陽性細胞をKGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、PDX1陽性細胞を増殖する方法を提供する。PDX1陽性細胞とは、PDX1が陽性である細胞を意味し、他のマーカー遺伝子、特に、NKX6.1の発現については、特に限定されないが、好ましくは、NKX6.1陰性細胞である。PDX1陽性細胞を増殖するとは、少なくともPDX1陽性細胞が細胞分裂によって増えることを意味し、例えば、Ki67抗体で染色される細胞数が増加することを確認することによっても当該増殖を確認することができる。PDX1陽性細胞の増殖の条件は、上述したPDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞の培養工程と同じ条件を用いることによって行い得る。
【００４５】
PDX1陽性NKX6.1陰性細胞は、生体内から単離されていてもよく、既知の方法にて、多能性幹細胞等の他の細胞種から製造されてもよい。ある態様においてPDX1陽性NKX6.1陰性細胞は、次の工程を含む方法で多能性幹細胞より製造された細胞であっても良い：
（工程１）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、および
（工程２）工程１で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程。
従って、上述のPDX1陽性NKX6.1陰性細胞から膵芽細胞誘導する方法を工程３として適用することで、次の工程を含む、多能性幹細胞から膵芽細胞を製造する方法も提供する：
（工程１）多能性幹細胞を、アクチビンを含む培地で培養する工程、
（工程２）工程１で得られた細胞を、KGFを含む培地で培養する工程、        
（工程３）工程２で得られた細胞（PDX1陽性NKX6.1陰性細胞）を単一細胞へ分離後、KGF、EGF、BMP阻害剤およびAkt阻害剤を含む培地で培養する工程。
【００４６】
これらの態様の多能性幹細胞をアクチビンを含む培地で培養する工程（工程１）で使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へアクチビンを適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、B27サプリメントを含むRPMI 1640培地である。
【００４７】
本態様の工程１において、多能性幹細胞は、任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態として培養してもよく、または、細胞同士が接着した細胞凝集塊の状態で培養してもよい。より好ましくは、単一細胞の状態に分離して培養する。分離の方法としては、例えば、力学的分離や、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、トリプシンとコラゲナーゼの含有溶液Accutase(TM)およびAccumax(TM)（Innovative Cell Technologies, Inc）が挙げられる）またはコラゲナーゼ活性のみを有する分離溶液を用いた分離が挙げられる。多能性幹細胞は、コーティング処理された培養皿を用いて接着培養することができる。
【００４８】
多能性幹細胞を単一細胞の状態に分離した際のアポトーシスを抑制する目的でROCK阻害剤を基礎培地へ添加しても良い。ROCK阻害剤は、上述したものと同様のものを用いることができ、好ましくは、Y-27632である。本目的で、ROCK阻害剤を添加する場合、添加期間は特に限定されないが、１日以上、または２日以上が例示され、好ましくは１日である。
【００４９】
本態様の工程１における接着培養は、前述の条件と同じ方法によって行い得る。
【００５０】
アクチビンは、アクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＢのいずれのアクチビンもよいが、特にアクチビンＡが好適に用いられる。また、アクチビンとしてはヒト、マウス等いずれの哺乳動物由来のアクチビンをも使用することができる。本発明に使用するアクチビンとしては、分化に用いる多能性幹細胞と同一の動物種由来のアクチビンを用いることが好ましく、例えばヒト由来の多能性幹細胞を出発原料とする場合、ヒト由来のアクチビンを用いることが好ましい。これらのアクチビンは商業的に入手可能である。
【００５１】
アクチビンを用いる場合、培地中の濃度は、通常０．１から２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５から１５０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは１０から１００ｎｇ／ｍｌである。
【００５２】
工程１は、アクチビンおよびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養した後、ＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンを含む培地で培養する工程であっても良い。
【００５３】
ＧＳＫ３阻害剤とは、GSK−3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK−3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、SB415286（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK−3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK−3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能である。他の入手先から入手しても、あるいは自ら作製してもよい。本発明で使用されるGSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
【００５４】
CHIR99021を用いる場合、培地中の濃度は、通常０．０１μＭから１００μＭ、好ましくは０．１μＭから１０μＭ、より好ましくは１μＭから５μＭである。濃度は、適宜変更しても良く、例えば、３μＭの後、１μＭと変更しても良い。
【００５５】
アクチビンおよびＧＳＫ３阻害剤を含む培地で培養する場合、多能性幹細胞の培養開始時に添加することが望ましい。ＧＳＫ阻害剤の添加期間は特に限定されないが、１日以上、２日以上または３日以上が例示され、好ましくは１日から３日である。その後、ＧＳＫ３阻害剤を含まずアクチビンを含む培地で培養する。
【００５６】
工程１の日数は、例えば、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、または７日以上が挙げられる。長期間培養することで膵芽細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、効率の観点からは１０日以下、好ましくは８日以下とするのがよい。より好ましい工程１の日数は、４日である。
【００５７】
例えば多能性細胞をアクチビンＡに加えてＧＳＫ３阻害剤とＲＯＣＫ阻害剤を添加した培地で１日培養し、次いでアクチビンＡとＧＳＫ３阻害剤を含み、ＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で２日培養し、次いでアクチビンＡを含むがＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤は含まない培地でさらに１日培養する態様が例示される。
【００５８】
工程１において、培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2〜5％である。
【００５９】
工程１で得られた細胞をKGFを含む培地で培養する工程（工程２）で使用される培地は、動物細胞の培養に用いられる基礎培地へKGFを適宜添加して調製することができる。基礎培地としては、例えば、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。１つの実施形態において、基礎培地は、B27サプリメントを含むIMEM Zinc Option培地である。
【００６０】
工程２で用いるKGFは、上述と同様のものを用いることができ、KGFの濃度は、上述より低濃度を用いることが好ましく、例えば、１ ng/mlから500 ng/ml、好ましくは、10 ng/mlから100 ng/mlである。
【００６１】
工程２は、さらに、KGFに加えて、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養する工程を含んでもよい。
【００６２】
工程２で用いるBMP阻害剤は、上述と同様の条件で用いることができる。
【００６３】
工程２に用いるレチノイン酸誘導体は、天然のレチノイン酸が有する機能を保持する人工的に修飾されたレチノイン酸を意味し、例えば、4-[[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)carbonyl]amino]-Benzoic acid（AM580）（Tamura K,et al., Cell Differ. Dev. 32: 17-26 (1990)）、4-[(1E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propen-1-yl]-Benzoic acid（TTNPB）（Strickland S, et al., Cancer Res. 43: 5268-5272 (1983))、パルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３−デヒドロレチノイン酸、３−デヒドロレチノール、３−デヒドロレチナール、または、Abe, E., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 78: 4990-4994 (1981)、 Schwartz, E. L.et al., Proc.Am.Assoc.Cancer Res. 24: 18 (1983)、および Tanenaga, K. et al., Cancer Res. 40: 914-919 (1980) に記載されている化合物が挙げられる。本工程で用いる好ましいレチノイン酸誘導体としては、TTNPBが挙げられる。本工程で用いるレチノイン酸誘導体の濃度は、使用するレチノイン酸誘導体に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、レチノイン酸誘導体としてTTNPBを用いる場合、1ｎMから100ｎM、好ましくは、５ｎMから５0ｎM、さらに好ましくは、５ｎＭから１０ｎMである。
【００６４】
工程２に用いるヘッジホッグ経路阻害剤は、ソニック・ヘッジホッグ、インディアン・ヘッジホッグ、およびデザート・ヘッジホッグのいずれかが膜受容体であるPatchedに結合して起こるシグナル、例えば、Smoothenedの活性を阻害する化合物を意味し、ヘッジホッグが受容体に結合して起こるシグナルを阻害すれば、特に限定されないが、例えば、シクロパミン、ジェルビン、3-Keto-N-(aminoethyl-aminocaproyl- dihydro-cinnamoyl)（KAAD）-シクロパミン、CUR-61414、SANT-1、SANT-2、SANT-3、SANT-4、IPI-926、IPI-269609、GDC-0449およびNVP-LDE-225が挙げられる。好ましくは、KAAD-シクロパミンである。工程２で用いるヘッジホッグ経路阻害剤の濃度は、使用するヘッジホッグ経路阻害剤に応じて当業者に適宜選択可能であるが、例えば、ヘッジホッグ経路阻害剤としてKAAD-シクロパミンを用いる場合、0.1 nMから1 μＭ、好ましくは、1 nMから500 nMである。
【００６５】
工程２において、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で接着培養する場合、培養の途中で、任意の方法で実質的に分離（または解離）することで単一細胞の状態とし、再度、同条件で培養を継続しても良い。このとき、単一細胞の状態に分離した際のアポトーシスを抑制する目的でROCK阻害剤を基礎培地へ添加しても良い。ROCK阻害剤は、上述したものと同様のものを用いることができ、好ましくは、Y-27632である。本目的で、ROCK阻害剤を添加する場合、添加期間は特に限定されないが、１日以上、または２日以上が例示され、好ましくは１日である。
【００６６】
工程２の日数は、例えば、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、または８日以上が挙げられる。長期間培養することで膵芽細胞の製造効率に特に影響がないため上限はないが、効率の観点からは１０日以下、または９日以下とすることが好ましい。より好ましい日数は、７日である。KGFを含む培地で培養後、KGF、BMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ経路阻害剤を含む培地で培養する場合、KGFを含む培地での培養日数は、例えば、３日以上、または４日以上であり、より好ましくは、４日である。
【００６７】
一例として、工程１における接着培養にて得られた細胞の培地を、工程２においてまずKGFを含有する培地に交換して４日間培養し、次いでKGFに加えてBMP阻害剤、レチノイン酸誘導体およびヘッジホッグ阻害剤を含有する培地に交換して２日間培養する。その後細胞を培養容器の壁面から分離して単一細胞の状態とし、さらにROCK阻害剤を含む培地にて１日培養する態様が挙げられる。
【００６８】
工程２において、培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2〜5％である。工程２終了時に得られる細胞はPDX1陽性NKX6.1陰性細胞となる。工程２終了時に得られる細胞は、PDX1陽性NKX6.1陰性細胞以外の細胞種が含まれる細胞集団として提供されてもよく、純化された集団であってもよい。好ましくは、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上または７０％以上のPDX1陽性NKX6.1陰性細胞が含まれる細胞集団である。
【００６９】
本願明細書および請求の範囲において多能性幹細胞とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、例えば胚性幹(ES)細胞(J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）、精子幹細胞（「GS細胞」）(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)、胚性生殖細胞（「EG細胞」）(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)、人工多能性幹(iPS)細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；WO2007/069666）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）（WO2011/007900）などが含まれる。より好ましくは、多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞である。
【００７０】
iPS細胞は移植用膵芽細胞の材料として特に好適に用いられる。得られた膵芽細胞を医薬として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型と同一もしくは実質的に同一である体細胞から得たiPS細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。
【００７１】
他の態様においては、上記の工程を用いて得られた膵芽細胞を医薬（特に細胞医療の為の医薬）として利用することができる。当該細胞は、投与前に、放射線を照射する、または、マイトマイシンＣなどの細胞増殖を抑止する薬剤によって処理されても良い。
【００７２】
得られた膵芽細胞を生理食塩水等に懸濁させ細胞懸濁液を医薬として用い、患者の膵臓、腸間膜、脾臓、肝臓および腎臓（特に、腎被膜化）へ直接投与もしくはポリビニルアルコール（PVA）（Qi Z et al., Cell Transplant.21: 525-534 (2012)）またはアルギン酸（Dufrane D, et al., Transplantation 90: 1054-1062 (2010)）でカプセル化して投与することによって行い得る。投与の際、当該細胞は、ポリエチレングリコール、ゼラチン、またはコラーゲン等の足場材と共に投与しても良い。投与する細胞数は、体躯の大きさに合わせて適宜増減して用いても良く、例えば、１×１０８から１×１０１０細胞／個体、好ましくは、５×１０８から１×１０１０細胞／個体、さらに好ましくは、１×１０９から１×１０１０細胞／個体である。
【００７３】
当該膵芽細胞を含む医薬は、膵疾患の治療に用いても良く、膵疾患には、急性膵炎、慢性膵炎、糖尿病、膵癌、ランゲルハンス島腫瘍などが例示される。本発明の膵芽細胞は、体内で、グルコース濃度に対応して、インスリンを分泌するインスリン産生細胞へと誘導されることから、糖尿病に対して有効である。特に、インスリン産生細胞が死滅する、１型糖尿病に有効である。
【００７４】
本明細書中に記載される「細胞」の由来は、ヒト及び非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）であり、特に限定はされないが、ヒト由来の細胞が特に好ましい。
【００７５】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００７６】
iPS細胞株
末梢血単核球由来のiPS細胞株（585A1）（Okita K, et al, Stem Cells. 2013 31:458-466）は、京都大学iPS細胞研究所より入手可能である。京都大学より入手した585A1株を用いて、次の工程により、膵芽細胞へと分化誘導した。【００７７】
分化誘導工程（図１）
（Stage 1）
iPS細胞株（585A1）をMatrigelをコートした24 well plateに2.0×105/wellで播種し、2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地（ナカライテスク）に100 ng/ml アクチビンＡ（R&D systems）、3 μM CHIR99021（Axon Medchem）および10 μM Y-27632（WaKo）を添加して1日間培養した。培地を100 ng/mlアクチビンＡ、1 μM CHIR99021および2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地に交換し、2日間培養した。さらに、培地を100ng/ml アクチビンＡおよび2％のB27（Life Technologies）を含むRPMI1640培地に交換し、1日間培養した。【００７８】
（Stage 2-1）
第１工程で得られた細胞の培地を50 ng/ml KGF(R&D systems)および1％のB-27（Life Technologies）を含むImproved MEM Zinc Option培地(Invitrogen社)に交換して4日間培養した。【００７９】
（Stage 2-2）
第２-1工程で得られた細胞の培地を50 ng/ml KGF、0.2μM LDN193189（Axon Medchem）、10nM TTNPB（Santa Cruz Biotechnology）、0.5 μM 3−Keto−N−aminoethyl−N'−aminocaproyldihydrocinnamoyl Cyclopamine（KAAD‐シクロパミンまたはK-CYC）(Toronto Research Chemicals)および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地に交換して2日間培養した。【００８０】
（Stage 2-3）
続いて、得られた細胞をTrypsinを用いて単一細胞へと分離し、Matrigelをコートした24 well  plateに1.2×105/ cm2にて播種した。50 ng/ml KGF、0.2μM LDN193189、10nM TTNPB、0.5 μM KAAD‐シクロパミン、10 μM Y-27632および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地を加え、1日間培養した。【００８１】
第２工程終了時に得られた細胞をBD Cytofix/CytopermTM Kitを用いて処理した後、抗PDX1抗体（R&D systems）および抗NKX6.1抗体（University of Iowa）を用いて染色しフローサイトメーターにて調べたところ、得られた細胞の約６０％がPDX1陽性NKX6.1陰性の細胞であることが確認された。【００８２】
（Stage 3）
第2-3工程で得られた細胞の培地を100 ng/ml KGF、0.2μM LDN193189、50ng/ml EGF（R&D systems）、各濃度（0.01μM〜50μM）のAT7867（Selleck Chemicals）（陰性対照としてDMSO）および1％のB-27を含むImproved MEM Zinc Option培地（15×104/ml）を添加してさらに4日間培養した。【００８３】
細胞解析
Stage 3で得られた細胞を計数したところ、陰性対照であるDMSOと比較してAT7867の添加濃度依存的に得られる細胞数が増加することが確認された（図２）。さらに、Stage 3で1 μMのAT7867を添加して１から４日後に得られた細胞をPDX1抗体（R&D Systems）およびKi67抗体（Novocastra）にて免疫染色したところ、増殖する細胞は少なくともPDX１が陽性である細胞であることが確認された（図３）。【００８４】
Stage 3で得られた細胞をNKX6.1抗体（DSHB）にて免疫染色したところ（図４A）、AT7867の添加濃度依存的に、少なくともNKX6.1が陽性細胞の含有率が増加することが確認された（図４B）。同様に、PDX1抗体およびNKX6.1抗体で二重染色したところ、AT7867の添加によりPDX1陽性NKX6.1陽性細胞が増加することが確認された（図５AおよびB）。【００８５】
Stage 3で1μMのAT7867を添加して培養した。Stage 3の0日目から4日目まで毎日細胞を採取し、定量PCRを行ってPDX1、PTF1A およびNKX6.1それぞれの遺伝子発現量を測定した。細胞からのRNAの抽出はRNeasy kit (Qiagen)を使用し、逆転写反応はReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo)およびoligo (dT)20 primerを使用して行った。定量PCRはSYBR Premix Ex Taq II (Takara)を用い、StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied Biosystems)を使用して行った。遺伝子発現はGAPDHの発現により標準化し、遺伝子発現量の相対比を相対標準曲線を元に算出した（図６）。AT7867の添加により、経時的にPDX1および、膵芽細胞への分化の指標となる転写因子であるPTF1A およびNKX6.1の発現量が上昇することが確認された。【００８６】
以上のように、AT7867は、PDX１陽性細胞を特異的に増加させることで、NKX6.1+細胞への分化誘導を行うことができることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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