(57)【要約】【課題】本発明は、基材上の細胞に高効率的に遺伝子導入することが可能な遺伝子導入用基材を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、遺伝子導入用基材の製造方法であって、  基材を、遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液と、２０〜４０℃にて接触させ、該溶液中で形成された、該遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子を該基材表面に沈降及び固定化し、該基材表面に該複合粒子からなる層を形成する工程を含み、該遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液が、初期濃度として、遺伝子１〜１００μｇ/ｍＬ、Ｃａ成分１．８〜５．５ｍＭ、Ｐ成分０．９〜２．８ｍＭ、Ｋ及び/又はＮａ成分（合算）１０〜２００ｍＭ、、並びに、Ｃｌ成分１０〜２００ｍＭを含む、上記方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子導入用基材の製造方法であって、
基材を、遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液と、２０〜４０℃にて接触させ、該溶液中で形成された、該遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子を該基材表面に沈降及び固定化し、該基材表面に該複合粒子からなる層を形成する工程を含み、該遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液が、初期濃度として、遺伝子１〜１００μｇ/ｍＬ、Ｃａ成分１．８〜５．５ｍＭ、Ｐ成分０．９〜２．８ｍＭ、Ｋ及び/又はＮａ成分（合算）１０〜２００ｍＭ、並びに、Ｃｌ成分１０〜２００ｍＭを含む、上記方法。
【請求項２】
遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液が、初期濃度として、遺伝子１０〜４０μｇ/ｍＬ、Ｃａ成分１．８〜５．５ｍＭ、Ｐ成分０．９〜２．８ｍＭ、Ｋ成分５．３〜９．０ｍＭ、Ｎａ成分１３０．８〜１３２．０ｍＭ、並びに、Ｃｌ成分１２３．６〜１２９．７ｍＭを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複合粒子が、粒径のそろったサブミクロン真球粒子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
複合粒子に含まれるリン酸カルシウムがアモルファスリン酸カルシウムを主成分とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
基材がその表面にリン酸カルシウム捕捉層を備える、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法によって製造される、遺伝子導入用基材。
【請求項７】
基材と、該基材の表面に形成された、遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子からなる層を備えてなる、遺伝子導入用基材。
【請求項８】
複合粒子が、粒径のそろったサブミクロン真球粒子である、請求項７に記載の遺伝子導入用基材。
【請求項９】
複合粒子に含まれるリン酸カルシウムがアモルファスリン酸カルシウムを主成分とする、請求項７又は８に記載の遺伝子導入用基材。
【請求項１０】
基材がその表面にリン酸カルシウム捕捉層を備え、該基材と、該遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子からなる層とが該リン酸カルシウム捕捉層を介して結合されている、請求項７〜９のいずれか１項に記載の遺伝子導入用基材。
【請求項１１】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入用基材に細胞を播種して培養することを含む、該細胞への遺伝子導入方法。
【請求項１２】
遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液より２０〜４０℃にて析出形成された、該遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子であって、該遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液が、初期濃度として、遺伝子１〜１００μｇ/ｍＬ、Ｃａ成分１．８〜５．５ｍＭ、Ｐ成分０．９〜２．８ｍＭ、Ｋ及び/又はＮａ成分（合算）１０〜２００ｍＭ、並びに、Ｃｌ成分１０〜２００ｍＭを含む、上記複合粒子。
【請求項１３】
遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液が、初期濃度として、遺伝子１０〜４０μｇ/ｍＬ、Ｃａ成分１．８〜５．５ｍＭ、Ｐ成分０．９〜２．８ｍＭ、Ｋ成分５．３〜９．０ｍＭ、Ｎａ成分１３０．８〜１３２．０ｍＭ、並びに、Ｃｌ成分１２３．６〜１２９．７ｍＭを含む、請求項１２に記載の複合粒子。
【請求項１４】
サブミクロン真球粒子である、請求項１２又は１３に記載の複合粒子。
【請求項１５】
粒子形成直後において、複合粒子に含まれるリン酸カルシウムがアモルファスリン酸カルシウムを主成分とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の複合粒子。
【請求項１６】
請求項６〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子導入用基材を製造するための、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の複合粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子を備える遺伝子導入用基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞やiPS細胞等の多分化能を有する細胞は、その分化を制御することにより、所望する細胞及び組織を構築することが可能であり、これらの細胞を利用した再生医療が注目を集めている。
【０００３】
今日では、多分化能を有する細胞を細胞の接着及び増殖の足場となる基材に播種し、in vitro又はin vivoにおいて目的の細胞及び組織へと分化を誘導する試みが盛んに行われている。
【０００４】
基材上に播種された細胞の分化を誘導する方法として、遺伝子導入が挙げられる。従来的に、遺伝子導入は、目的とする遺伝子を、ウィルスや、リン酸カルシウム、脂質、カチオニックな高分子等に担持させ、この複合体を培養液中に添加、あるいは生体内に注入し、細胞と接触させることによって行われていた。
【０００５】
しかし、上記の複合体は粒子状であって、どこにも固定されていない遊離した状態では、培養液や体液中で流動、拡散するので、その動態を制御することは困難である。このため、遺伝子導入の場所や導入効率を制御することが困難であった。また、in vivoにおいては、目的の場所から複合体粒子が散逸すると、遺伝子導入の効果が低減したり、目的外の細胞に遺伝子が導入されたり、肝臓などの臓器に複合体粒子が蓄積されるなどの懸念があった。
【０００６】
かかる問題を解決すべく、基材の表面に遺伝子を担持させ、当該基材上の細胞に遺伝子を導入する方法が開発されている（特許文献１−２、非特許文献１−３）。この方法においては、遺伝子とアパタイトの複合体からなる網目及び／又は凹凸構造を有する連続的な層を表面に備える基材を作製し、当該基材上に細胞を播種、または当該基材を生体内に埋入し、基材上の細胞に遺伝子を導入する。この方法によれば、生体適合性に優れたアパタイトを主成分とする連続層が、細胞の接着および増殖の足場（スキャホールド）として機能すると同時に、遺伝子導入剤としても機能する。その結果、基材上の細胞に、安全かつ効率よく遺伝子導入を行うことが可能である。
【０００７】
本発明者らはこれまでに、遺伝子とアパタイトの複合体からなる網目及び／又は凹凸構造を有する連続的な層に、細胞接着因子（特許文献１）、または脂質（特許文献２）を複合担持させると、同表面における遺伝子導入効率を向上できることを報告している。
【０００８】
しかしながら、当該分野においては依然として、基材上の細胞により高効率に遺伝子導入可能な手法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開2008-49146号公報
【特許文献２】特開2011-139839号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Shen H et al, Nature Mater. 3:569, (2004)
【非特許文献２】Sun BB et al, Biomaterials 30:6386 (2009)
【非特許文献３】Luong NL et al, Biomaterials, 30, 6996 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、基材上の細胞に高効率的に遺伝子を導入できる遺伝子導入用基材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、遺伝子とアモルファスリン酸カルシウムを含むサブミクロン真球粒子からなる層を表面に備える遺伝子導入用基材が、細胞の接着・増殖の足場として機能しつつ、基材上の細胞に高効率に遺伝子を導入できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
［１］  遺伝子導入用基材の製造方法であって、
基材を、遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液と、２０〜４０℃にて接触させ、該溶液中で形成された、該遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子を該基材表面に沈降及び固定化し、該基材表面に該複合粒子からなる層を形成する工程を含み、該遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液が、初期濃度として、遺伝子１〜１００μｇ/ｍＬ、Ｃａ成分１．８〜５．５ｍＭ、Ｐ成分０．９〜２．８ｍＭ、Ｋ及び/又はＮａ成分（合算）１０〜２００ｍＭ、、並びに、Ｃｌ成分１０〜２００ｍＭを含む、上記方法。
［２］  遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液が、初期濃度として、遺伝子１０〜４０μｇ/ｍＬ、Ｃａ成分１．８〜５．５ｍＭ、Ｐ成分０．９〜２．８ｍＭ、Ｋ成分５．３〜９．０ｍＭ、Ｎａ成分１３０．８〜１３２．０ｍＭ、並びに、Ｃｌ成分１２３．６〜１２９．７ｍＭを含む、［１］の方法。
［３］  複合粒子が、粒径のそろったサブミクロン真球粒子である、［１］又は［２］の方法。
［４］  複合粒子に含まれるリン酸カルシウムがアモルファスリン酸カルシウムを主成分とする、［１］〜［３］の方法。
［５］  基材がその表面にリン酸カルシウム捕捉層を備える、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］  ［１］〜［５］のいずれかの方法によって製造される、遺伝子導入用基材。
［７］  基材と、該基材の表面に形成された、遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子からなる層を備えてなる、遺伝子導入用基材。
［８］  複合粒子が、粒径のそろったサブミクロン真球粒子である、［７］の遺伝子導入用基材。
［９］  複合粒子に含まれるリン酸カルシウムがアモルファスリン酸カルシウムを主成分とする、［７］又は［８］の遺伝子導入用基材。
［１０］  基材がその表面にリン酸カルシウム捕捉層を備え、該基材と、該遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子からなる層とが該リン酸カルシウム捕捉層を介して結合されている、［７］〜［９］のいずれかの遺伝子導入用基材。
［１１］  ［６］〜［１０］のいずれかの遺伝子導入用基材に細胞を播種して培養することを含む、該細胞への遺伝子導入方法。
［１２］  遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液より２０〜４０℃にて析出形成された、該遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子であって、該遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液が、初期濃度として、遺伝子１〜１００μｇ/ｍＬ、Ｃａ成分１．８〜５．５ｍＭ、Ｐ成分０．９〜２．８ｍＭ、Ｋ及び/又はＮａ成分（合算）１０〜２００ｍＭ、、並びに、Ｃｌ成分１０〜２００ｍＭを含む、上記複合粒子。
［１３］  遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液が、初期濃度として、遺伝子１０〜４０μｇ/ｍＬ、Ｃａ成分１．８〜５．５ｍＭ、Ｐ成分０．９〜２．８ｍＭ、Ｋ成分５．３〜９．０ｍＭ、Ｎａ成分１３０．８〜１３２．０ｍＭ、並びに、Ｃｌ成分１２３．６〜１２９．７ｍＭを含む、［１２］の複合粒子。
［１４］  サブミクロン真球粒子である、［１２］又は［１３］の複合粒子。
［１５］  粒子形成直後において、複合粒子に含まれるリン酸カルシウムがアモルファスリン酸カルシウムを主成分とする、［１２］〜［１４］のいずれかの複合粒子。
［１６］  ［６］〜［１０］のいずれかの遺伝子導入用基材を製造するための、［１２］〜［１５］のいずれかの複合粒子。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、基材上の細胞に高効率的に遺伝子導入することが可能な遺伝子導入用基材を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図1は、(a)未処理の焼結水酸アパタイト円盤（HAP）および(b)未処理のポリスチレン基板（u-PS）表面の走査型電子顕微鏡（SEM）写真を示す。
【図２】図2は、低温液（上段）または高温液（下段）に24時間浸漬された各試料表面のSEM写真を示す。
【図３】図3は、高温液に24時間浸漬されたプラズマ処理されたポリスチレン基板（p-PS）の表面から回収した析出物のX線回折（XRD）パターンを示す（シリコン無反射板の上に回収して測定）。
【図４】図4は、低温液（白）または高温液（黒）に24時間浸漬された各試料表面のDNA担持量を示すグラフ図である。
【図５】図5は、低温液（白）または高温液（黒）に24時間浸漬された各試料表面のカルシウム担持量(a)およびリン担持量(b)を示すグラフ図である。
【図６】図6は、低温液（白）または高温液（黒）に24時間浸漬された各試料表面で培養された細胞のルシフェラーゼ活性（遺伝子導入効率）を示すグラフ図である。
【図７】図7は、比較例1において作製された各試料の表面のSEM写真を示す。
【図８】図8は、比較例1において作製された、DNAおよび脂質添加CP溶液（NaCl142 mM、CaCl2 3.75 mM、K2HPO4・3H2O 20 mM、トリスヒドロキシメチルアミノメタン50 mM、pH=7.40、25℃）浸漬後の試料（DLp）表面の薄膜XRDパターンを示す。
【図９】図9は、高温液に24時間浸漬された各試料、および比較例1において作製された各試料表面で培養された細胞のルシフェラーゼ活性（遺伝子導入効率）を示すグラフ図である。
【図１０】図10は、市販のCaP導入剤による遺伝子導入効率を示すグラフ図である。
【図１１】図11は、高温液に24〜72時間浸漬後のp-PS表面のSEM写真を示す。
【図１２】図12は、高温液に24〜72時間浸漬後のp-PS表面のCa、P、およびDNA担持量を示すグラフ図である。(a) Ca担持量、(b) P担持量、(c) DNA担持量。
【図１３】図13は、高温液に24〜72時間浸漬後のp-PS表面における遺伝子導入効率を示すグラフ図である。
【図１４】図14は、高温液に1〜24時間浸漬後のp-PS表面のSEM写真を示す。
【図１５】図15は、高温液に1〜24時間浸漬後のp-PS表面における遺伝子導入効率を示すグラフ図である。
【図１６】図16は、高温液からDNAを除いた溶液に24時間浸漬後のp-PS表面のSEM写真を示す。
【図１７】図17は、DNA濃度の異なる高温液に24時間浸漬後のu-PS表面における遺伝子導入効率を示すグラフ図である。
【図１８】図18は、高温液のカルシウムおよびリン酸イオン濃度を0.5〜2倍に変化させた溶液に6時間浸漬後のp-PS表面のSEM写真を示す。
【図１９】図19は、高温液のカルシウムおよびリン酸イオン濃度を0.5〜2倍に変化させた溶液に6時間浸漬後のp-PS表面における遺伝子導入効率を示すグラフ図である。
【図２０】図20は、市販のCaP導入剤液を添加した培養液中に48時間浸漬後のp-PS表面のSEM写真を示す。（左：低倍率写真、右：析出物のない表面の高倍率写真）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（１．基材）
本発明において「基材」とは、無機、有機いずれの材料であっても良いし、それらの複合体であっても良い。無機基材としては、金属、セラミックス、無機高分子等が挙げられ、有機基材としては、有機高分子、低分子有機化合物、超分子等が挙げられる。
【００１７】
ここで、「金属」としては、例えば、チタン、タンタル、ニオブ、コバルト、クロム、モリブデン、プラチナ、アルミニウム、又はこれらの2種以上の金属の合金、あるいはステンレス、真ちゅう等が挙げられる。また、「セラミックス」としては、例えば、焼結リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム硬化体、焼結アパタイト、シリカ、チタニア、アルミナ、ジルコニア、部分安定化ジルコニア、コージェライト、ゼオライト、炭化ケイ素、窒化ケイ素、窒化ホウ素、炭化チタン、ダイアモンド、シリカガラス、ソーダ石灰ガラス、ケイ酸塩ガラス、鉛ガラス、ホウケイ酸塩ガラス、アルミノケイ酸塩ガラス、リン酸塩ガラス、カルコゲンガラス、ハンダガラス、コパール用ガラス、Pyrexガラス、これらの結晶化ガラス等が挙げられる。そして、「無機高分子」としてはシリコーンポリマー等のケイ素含有ポリマー等が挙げられる。
【００１８】
さらに、「有機高分子」としては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリアルキレングリコール、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン等の酸素含有高分子、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、ポリスルフォン、ポリアミン、ポリウレア、ポリイミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリ塩化ビニル等の合成高分子、こられの共重合体、セルロース、アミロース、アミロペクチン、キチン、キトサン等の多糖類、コラーゲン等のポリペプチド、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸等のムコ多糖類等の天然高分子が挙げられる。
【００１９】
「基材」は、その少なくとも一表面にリン酸カルシウム捕捉層を備えることが好ましい。「リン酸カルシウム捕捉層」とは、リン酸カルシウムに対して低い界面エネルギーを有する層であり、過飽和水溶液中においてリン酸カルシウムを基材表面に堅固に固定化できる層を意味する。基材がリン酸カルシウム捕捉層を備えることによって、下記の遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子（サブミクロン真球粒子）を基材表面に堅固に固定化することができる。
【００２０】
リン酸カルシウム捕捉層は、基材の少なくとも一表面を親水化処理、および/または、プレコート処理することによって形成しても良いし、あるいは基材が元来、リン酸カルシウム捕捉層を構成する物質からなるか、又は含んでいることによって形成されたものであっても良い。
【００２１】
「親水化処理」としては、公知の方法を利用することが可能であり、例えば、プラズマ処理、レーザー処理、グロー放電処理、コロナ放電処理、アルカリ溶液処理、酸溶液処理、酸化剤処理、親水性官能基のグラフト処理、シランカップリング処理、陽極酸化処理、粗面化処理等が挙げられる。
【００２２】
「プレコート処理」は、リン酸カルシウムからなるプレコート層を基材の表面に形成させる処理であり、公知の方法を利用することが可能である。例えば、バイオミメティック法、交互浸漬処理（基材をカルシウムイオン溶液とリン酸イオン溶液に交互に浸漬する処理）、レーザーアブレーション法、プラズマ溶射法、等が挙げられる。
【００２３】
「リン酸カルシウム捕捉層を構成する物質」としては、Si-OH基、Ti-OH基、カルボキシル基、リン酸基、硫酸基、水酸基等の官能基（これらの官能基やその前駆体を含有するシランカップリング剤やグラフト鎖、金属酸化物ゲル等も包含される）や、それらの官能基にアルカリ金属またはアルカリ土類金属イオンを結合させたものや、炭酸カルシウム、アパタイト、アパタイトの前躯体であるリン酸カルシウム等、少なくともリン、及び／又は、カルシウムを含む化合物が挙げられ、特に好ましくは、アパタイトや、アモルファスリン酸カルシウム等のアパタイトの前躯体が挙げられる。
【００２４】
本発明においては、上記のリン酸カルシウム捕捉層を含む、又はリン酸カルシウム捕捉層からなる基材を、好適に利用することができる。具体的には例えば、プラズマ処理により表面に親水性官能基を導入したポリスチレン基板や、焼結水酸アパタイトからなる基板を、「基材」として好適に使用することができる。
【００２５】
基材の形状は特に限定されないが、例えば、ブロック状、平板状、フィルム状、膜状、棒状、筒状、メッシュ状、繊維状、多孔体状、粒子状、スポンジ状、織物状などの形態をとることができる。
【００２６】
上記の基材上に下記のリン酸カルシウム過飽和溶液を接触させると、溶液中で形成された遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子（サブミクロン真球粒子）が同基材上に沈降し、基材表面に固定化される。
【００２７】
（２．遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液）
本発明において「遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液」とは、遺伝子と、リン酸カルシウムの飽和濃度を超えるカルシウムイオン及びリン酸イオンを含み、かつ、調製後２４時間以内に溶液全体でリン酸カルシウム種粒子を均一形成し、この種粒子をサブミクロン真球粒子に成長させる溶液を意味する。したがって、リン酸カルシウムに対して過飽和でありながら、調製後２４時間以上に渡ってリン酸カルシウム粒子を生成しない、ハンクス溶液や１倍濃度擬似体液などは、本発明における「リン酸カルシウム過飽和溶液」に含まれない。
【００２８】
ここで「リン酸カルシウム種粒子」とは、過飽和溶液中に存在するリン酸カルシウムの成分イオンやサブナノクラスターが自発的に集合して、臨界核のサイズ（ナノ領域）に達し、過飽和溶液中で解離せずに自発的に成長するようになった初期粒子を意味する。この種粒子の主成分はアモルファスリン酸カルシウムであり、遺伝子が複合化されていても良いし、遺伝子自身が種形成剤として働き、リン酸カルシウム種粒子の均一形成を誘起していても良い。リン酸カルシウム種粒子の「均一形成」とは、上記のリン酸カルシウム種粒子が、過飽和溶液中の基材や固体粒子・粉体、あるいは容器の壁の助けを借りずに、溶液全体で均一に、自然発生的・自発的に生成することを意味する。「リン酸カルシウム種粒子」の「均一形成」は、種粒子がある程度の大きさにまで成長すれば、レーザーポインター、光散乱法などの手法で確認することができ、さらに大きく成長すれば、溶液全体が白濁することで目視確認することができる。溶液中で形成された粒子の直径は、光散乱法や、回収した粒子の電子顕微鏡観察などで計測することができる。
【００２９】
本発明における「リン酸カルシウム過飽和溶液」は、２０℃〜４０℃、好ましくは37℃にて、溶液調製完了後24時間以内、好ましくは１時間以内、さらに好ましくは１０分以内にリン酸カルシウム種粒子を均一形成し、この種粒子を溶液調製完了後２４時間以内、好ましくは１０時間以内にサブミクロン真球粒子に成長させるものが好ましい。溶液調製完了後からリン酸カルシウム種粒子の均一形成までの時間、ならびに生成した種粒子の成長速度は、過飽和溶液のリン酸カルシウムに対する過飽和度によって調整することが可能である。また、リン酸カルシウムに対する過飽和度は、溶液の成分濃度、ｐＨ、温度等によって調整できる。
【００３０】
リン酸カルシウムに対する過飽和度が高すぎると、リン酸カルシウムの種粒子が急速生成・成長し、ミクロンサイズ以上となる。また、種粒子の成長が均等に進行しないため、真球状ではなく不定形粒子となってしまう。一方、リン酸カルシウムに対する過飽和度が低くなると、基材上に固定化される粒子の量が少なくなる。さらに過飽和度が低くなると、溶液調製完了後２４時間以内にリン酸カルシウム種粒子を均一形成させることができなくなる。種粒子の均一形成に２４時間以上を要すると、溶液中の遺伝子の分子構造が変化してしまい、導入効率の点で好ましくない。種粒子の均一形成に２４時間以上を要するような低過飽和溶液であっても、溶液中の基材やその表面のリン酸カルシウム補足層、あるいは容器の壁を足場として２４時間以内にリン酸カルシウム層が形成される場合もある。しかし、このような不均一形成反応によって得られるのは、連続的なリン酸カルシウム層であって、サブミクロン真球粒子からなる層を得ることはできない。
【００３１】
すなわち、本発明における「リン酸カルシウム過飽和溶液」としては、溶液調製完了後２４時間以内に、リン酸カルシウム種粒子がミクロンサイズ以上に成長しない（サブミクロンサイズに留めておける）範囲内で、リン酸カルシウム種粒子を均一形成できる溶液が好ましい。
【００３２】
リン酸カルシウム過飽和溶液は、種々の公知の方法で調製することができる。例えば、医療用輸液製剤、透析・腹膜灌流液、輸液の補正用製剤、カルシウム製剤、透析・腹膜灌流液の補充液、注射用水の中から選ばれた２種以上の溶液と遺伝子とを混合することで調製することができる。この場合は、遺伝子以外の全ての溶液が既に医療用に認可されており、しかも滅菌済みであるため、生体用に使用するのに好都合である。医療用輸液製剤の、Ｃａ成分を含みＰ成分を含まない電解質輸液、Ｐ成分を含みＣａ成分を含まない電解質輸液、塩化ナトリウム輸液、透析・腹膜灌流液の補充液の透析液専用炭酸水素ナトリウム補充液は特に好適に使用されるが、これらに限定するものではない。Ｃａ成分を含みＰ成分を含まない電解質輸液としては、例えばリンゲル液「オーツカ」（大塚製薬）や塩化Ｃａ補正液１ｍＥｑ／ｍＬ（大塚製薬）を用いればよい。Ｐ成分を含みＣａ成分を含まない電解質輸液としては、例えばクリニザルツ（登録商標）輸液（アイロム製薬）やリン酸二カリウム補正液１ｍＥｑ／ｍＬ（大塚製薬）を用いればよい。塩化ナトリウム輸液としては、例えば大塚生食注を用いればよい。透析液専用炭酸水素ナトリウム補充液としては、例えばメイロン静注（登録商標）７％（大塚製薬）を用いれば良い。
【００３３】
リン酸カルシウム過飽和溶液中にはさらに、リン酸カルシウムの種粒子の生成および成長速度を遅延する、１種または２種以上のさらなる成分、例えば、無機塩（塩化カリウム、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化亜鉛など）、水溶性ポリマー（例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなど）、糖質（例えば、キシリトールなど）等、を含めてもよい。
【００３４】
また、リン酸カルシウム過飽和溶液中にはさらに、細胞への遺伝子導入効率を向上させる１種または２種以上のさらなる成分、例えば、フィブロネクチンやラミニン等の細胞接着分子、抗体、DOTAPやDOPE等の脂質、ポリエチレンイミンやポリ-L-リジン等のカチオニック高分子、等を含めてもよい。
【００３５】
本発明における「遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液」とは具体的には、遺伝子１〜１００μｇ／ｍＬ、Ｃａ成分１．８〜５．５ｍＭ、Ｐ成分０．９〜２．８ｍＭ、Ｋ及び／又はＮａ成分（合算）１０〜２００ｍＭ、Ｃｌ成分１０〜２００ｍＭを含み、ｐＨが７〜９（室温にて測定）である溶液である（いずれも調製直後の初期の濃度・ｐＨ）。より好ましくは、「遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液」とは、遺伝子１０〜４０μｇ/ｍＬ、Ｃａ成分１．８〜５．５ｍＭ、Ｐ成分０．９〜２．８ｍＭ、Ｋ成分５．３〜９．０ｍＭ及びＮａ成分１３０．８〜１３２．０ｍＭ、並びに、Ｃｌ成分１２３．６〜１２９．７ｍＭを含み、ｐＨが７〜８である溶液である（いずれも調製直後の初期の濃度・ｐＨ）。さらに好ましくは、「遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液」とは、遺伝子４０μｇ／ｍＬ、Ｃａ成分３．７ｍＭ、リン酸成分１．８ｍＭ、Ｋ成分７．２ｍＭ、Ｎａ成分１３１．４ｍＭ、及びＣｌ成分１２６．７ｍＭ、を含み、ｐＨが７〜８である溶液である（いずれも調製直後の初期の濃度・ｐＨ）。
【００３６】
本発明における「遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液」における「遺伝子」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡ・ＲＮＡハイブリッドのいずれの形態であっても良く、また、一本鎖、二本鎖、及び環状（プラスミドやベクターに含まれているものも含む）のいずれの形態であっても良い。リン酸カルシウム過飽和溶液に含める遺伝子の濃度は、遺伝子の形態や大きさに応じて上記の範囲（１〜１００μｇ／ｍＬ）から選択することができる。リン酸カルシウム過飽和溶液に含める遺伝子の濃度を調節することによって、遺伝子導入用基材に担持させる遺伝子の量を調節することができ、これによって、細胞に対する遺伝子の導入効率を調節することができる。
【００３７】
遺伝子は、リン酸カルシウム過飽和溶液の調製過程及び調製後のいずれの時点においても、添加することができる。添加する遺伝子は、凍結乾燥されたものであっても良いし、超純水、培養液や生理食塩水に溶解されたものであっても良い。
【００３８】
（３．遺伝子とリン酸カルシウムを含む複合粒子）
上記の遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液を調製後、２０℃〜４０℃、好ましくは37℃にて静置することによって、リン酸カルシウムのアモルファス種粒子を溶液全体で自発的に均一形成させることができる。形成された種粒子は、周囲の溶液から成分イオン（カルシウムイオン、リン酸イオン、ナトリウムイオンなど）やリン酸カルシウムクラスター、遺伝子を、吸着又は化学結合で取り込みながら、自発的に成長する。この粒成長は、溶液中で三次元的・等方的に進むため、一定時間経過後には、遺伝子とリン酸カルシウムを含む、サブミクロン領域で粒径の揃った真球状の粒子（サブミクロン真球粒子）となる。ここで、「サブミクロン真球」粒子とは、粒子の直径が、どの場所においてもほぼ等しく、１００ｎｍ〜５００ｎｍ、好ましくは２５０ｎｍ〜５００ｎｍ、さらに好ましくは３５０±７０ｎｍである粒子を指す。
【００３９】
上記の遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液に上記の基材を接触させておく（例えば過飽和溶液中に基材を浸漬しておく）と、同基材上に、上記のサブミクロン真球粒子が重力沈降し、基材上に固定化される。この「固定化」は、粒子と基材表面との物理吸着、および/または、化学吸着による。基材の表面にリン酸カルシウム補足層が存在すると、リン酸カルシウム捕捉層、あるいは、同捕捉層を足場として形成（不均一形成）されたリン酸カルシウムの連続層を介して、基材上に粒子が化学的に吸着、結合するので、粒子の固定をより強固にできる。過飽和溶液と基材との接触時間を長くすると、基材上に次々と粒子が沈降していき、基材上のほぼ全面（基材の上面の6割以上）に、上記のサブミクロン真球粒子が高密度に集積及び積層してなる複合層を得ることができる。集積・積層した粒子同士は、表面エネルギーを下げるために、互いの接触点を通じて化学的に結合する。上記の、基材と粒子、および粒子と粒子との接触面積は小さいものの（点接触）、同粒子がサブミクロンサイズの微小粒子であるために、基材上に固定化することができる。基材上に固定化された粒子は、一般的な生化学実験における試料洗浄工程（超純水や生理食塩水などの洗浄液中に基材をディップ、洗瓶を用いて基材側面から洗浄液を静かに流す、等）を経ても、基材上から取り去られず、基材の表面に留まる。
【００４０】
なお、リン酸カルシウム過飽和溶液で形成される粒子が上記のサブミクロンサイズ（１００ｎｍ〜５００ｎｍ）よりも小さいと、溶液中でのブラウン運動が優勢となり重力沈降しないので、基材上に固定化することができない。また、粒子が上記のサブミクロンサイズよりも大きくなると、たとえリン酸カルシウム捕捉層を有する基材上に沈降させても、基材上に十分強固には固定されず、洗浄等によって容易に基材上から取り去られてしまう。仮に基材上に残存できても、そのような大型粒子・析出物では、細胞内に効率的に遺伝子を導入することはできない。
【００４１】
上記のサブミクロン真球粒子に含まれるリン酸カルシウムは、少なくとも形成直後の段階においては、アモルファスリン酸カルシウムを主成分とするが、さらに副成分としてオクタリン酸カルシウムなどを含み得る。「主成分」とは、X線回折法などの分析法において検出された、同粒子に含まれるリン酸カルシウムにおいて、最も大きな割合を占める成分を意味する。
【００４２】
（４．遺伝子導入用基材）
本発明における「遺伝子導入用基材」は、上記「基材」の少なくとも一表面の６割以上、７割以上、８割以上、９割以上、またはそれ以上に、遺伝子とリン酸カルシウムを含むサブミクロン真球粒子が高密度に固定化及び積層してなる複合層を備える。当該複合層は、１００nm〜１０μｍ、好ましくは５００nm〜３μmの厚みを有する。なお、本明細書において、当該複合層を「D-CaP層」と記載する場合がある。
【００４３】
遺伝子導入用基材は、上記「基材」を、上記「遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液」と接触させる工程によって製造することができる。より詳細には、温度20℃〜40℃、好ましくは37℃にて、上記「基材」を、上記「遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液」に浸漬する、あるいは、上記「基材」を設置した容器、または上記「基材」からなる容器内に、上記「遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液」を添加する。上記の工程は、当該溶液の調製完了後直ちに開始することが好ましい。上記工程開始後２４時間以内に、当該溶液中においてリン酸カルシウム種粒子が均一形成し、サブミクロンの粒径にまで成長すると、基材表面に重力沈降し、基材上に固定化される。
【００４４】
基材と、遺伝子を含むリン酸カルシウム過飽和溶液とを接触させる時間（本明細書において、この接触時間を「浸漬時間」と記載する場合がある。）は限定されないが、接触時間が短すぎると、基材上に固定化される粒子の量が少なくなり、十分な遺伝子導入効率を得ることができない。一方、接触時間が長すぎると、遺伝子の分子構造変化によって、遺伝子導入効率が低下する。従って、接触時間としては、１時間〜７２時間、好ましくは３時間〜２４時間、さらに好ましくは３時間〜１０時間の範囲から選択すれば良い。
【００４５】
本発明における「遺伝子導入用基材」は、in vtro又はin vivo において、細胞の接着・増殖の足場として機能しつつ、基材上の細胞に遺伝子を導入することができる。遺伝子導入に際しては、本発明の遺伝子導入用基材上に細胞を播種して培養、あるいは遺伝子導入用基材を生体内に埋入すれば良い。in vitroでの細胞培養期間は、細胞の種類や培養条件などの要因によって変わり得るが、およそ２４〜１６８時間、好ましくは４８〜７２時間の範囲から選択することができる。
【００４６】
本発明の遺伝子導入用基材において、上記複合粒子は粒子の形態を留めながら、基材及び／又は隣接する別の複合粒子と点接触によって結合して上記複合層を形成しており、従来公知の遺伝子導入用基材（特開2008-49146号公報；特開2011-139839号公報；Shen H et al, Nature Mater. 3:569, (2004)；Sun BB et al, Biomaterials 30:6386 (2009)；Luong NL et al, Biomaterials, 30, 6996 (2010)）と異なり、一体化した連続的な層を形成していない。このため、本発明の遺伝子導入用基材は培養液又は生体内環境に曝された際に、複合層より複合粒子を、細胞内にエンドサイトーシスしやすいサブミクロン真球粒子の形状で放出でき、結果として細胞に対する遺伝子の導入効率を高めることができる。
【００４７】
本発明の遺伝子導入用基材において、上記複合粒子はリン酸カルシウムとして、アモルファスリン酸カルシウムを主成分として含み、従来公知の遺伝子導入用基材（特開2008-49146号公報；特開2011-139839号公報）と異なり、アパタイトを主成分としない。アモルファスリン酸カルシウムはアパタイトと比べて、溶解性が高く、細胞内のエンドソーム中にて速やかに溶解し、遺伝子の核への移行を促進し、結果として細胞に対する遺伝子の導入効率を高めることができる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００４９】
（実施例1）
〔実験方法〕
基材の作製
基材として、焼結水酸アパタイト円盤（以下、「HAP」と記載する）、前処理無しのポリスチレン基板（以下、「u-PS」と記載する）、又はプラズマ処理されたポリスチレン基板（以下、「p-PS」と記載する）からなる以下の3種類を作製した。
【００５０】
【表１】
2014054326.tif 000002
【００５１】
HAPは、水酸アパタイトの原料粉（アドバンス、粒径＜75 μm）を98 MPaで加圧・成型した後、1150℃で1時間焼結することにより作製した。
【００５２】
u-PSは、溶融、加圧・成型して得られた厚さ1 mmのポリスチレン（Aldrich Chemical）基板を縦10 mm、横10 mmの大きさに打ち抜き、表面研磨後、エタノールで超音波洗浄し、80oCで24時間真空乾燥させて作製した。
HAPおよびu-PSの表面の走査型電子顕微鏡（SEM）写真を図1に示す。
【００５３】
p-PSは、u-PSの片面にさらに酸素プラズマ処理（0.5 W/cm2、30秒間）を施すことにより作製した（酸素プラズマ処理面を表面、非処理面を裏面とする）。このプラズマ処理により、基材表面に親水性の酸素含有官能基が導入され、対水接触角が減少し、親水性が向上した。
【００５４】
u-PSはリン酸カルシウム捕捉層を表面に有さない基材であり、p-PSは表面処理によりリン酸カルシウム捕捉層（水酸基、カルボキシル基などの酸素を含む親水性官能基）を導入した基材である。HAPはリン酸カルシウム捕捉層をもともと含む基材である。リン酸カルシウムに対する界面エネルギーは、HAP＜p-PS＜u-PSの順に大きくなる。
【００５５】
過飽和溶液の調製
リン酸カルシウムに対して過飽和なDNA含有過飽和溶液として、成分濃度および基材浸漬温度の異なる以下の2種類の溶液を調製した。
【００５６】
【表２】
2014054326.tif 000003
【００５７】
六崎らの手法（Mutsuzaki H. et al. J Biomed Mater Res Part B: Appl Biomater 86B: 365-374, 2008）に基づき37℃で基材の浸漬を行う過飽和溶液を高温液とし、鶴嶋らの手法（Tsurushima H. et al. Acta Biomaterialia 6 (2010) 2751-2759）に基づき25℃で基材の浸漬を行う過飽和溶液を低温液とする。いずれの溶液も、上記の各浸漬温度において24時間以内にリン酸カルシウムの種粒子の均一形成を誘起する不安定な過飽和溶液である。ただし、高温液の方がリン酸カルシウムに対する過飽和度が高いので、低温液に比べてより速やかに均一形成を誘起することができる。
【００５８】
各過飽和溶液は、以下の表3に示す通り、DNA溶液に、またはDNA溶液に生理食塩水（大塚生食注、大塚製薬）を加えた溶液に、各種医療用輸液製剤から調製されるカルシウムイオン溶液、リン酸イオン溶液、および炭酸イオン溶液を所定の容量比で添加、混合することにより調製した。DNAとしては、ルシフェラーゼの相補的遺伝子を含むプラスミド（pGL3-contlol vector、Promega）を用いた。
【００５９】
カルシウムイオン溶液としては、リンゲル液「オーツカ」（大塚製薬）、またはそれに塩化Ca補正液1mEq/mL（大塚製薬）を添加した溶液を用いた。
【００６０】
リン酸イオン溶液としては、クリニザルツ（登録商標）輸液（アイロム製薬）、またはそれにリン酸二カリウム補正液1mEq/mL（大塚製薬）を添加した溶液を用いた。
【００６１】
炭酸イオン溶液としては、メイロン静注（登録商標）7％（大塚製薬）を注射用水PL「フソー」（扶桑薬品）を用いて5倍希釈し、pHを8.80に調整した溶液を用いた。
【００６２】
【表３】
2014054326.tif 000004
【００６３】
試料の作製
HAPは160℃で2時間加熱滅菌し、p-PSおよびu-PSはエチレンオキシドガスで滅菌した。各基材を、上記の過飽和溶液2 mL中に25℃（低温液）または37℃（高温液）で24時間浸漬し、試料とした。過飽和溶液浸漬後、表面構造評価用の試料は超純水で洗浄し、遺伝子導入効率評価用の試料はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。
【００６４】
試料の表面構造評価
得られた試料の表面構造および組成を、SEM観察およびエネルギー分散型X線分析により調べた。
【００６５】
試料の表面層を2 mLの10 mMクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.43）に溶解し、同溶解液中のCaおよびPの量を高周波誘導結合プラズマ発光分光分析（以下、「ICP」と記載）により、DNAの量を紫外-可視（以下、「UV-Vis」と記載）分光分析により求めた。この結果をもとに、試料表面のCa、P、およびDNA担持量を求めた。
【００６６】
また、試料の表面層をスパチュラで削り取ってシリコン無反射試料板の上に固定し、その結晶構造を薄膜X線回折分析（以下、「TF−XRD」と記載）により調べた。TF−XRDにおいては、CuKα線を照射X線とした。
【００６７】
遺伝子導入効率評価
細胞培養用24ウェルプレート内の各ウェル内に上記試料を1つずつ設置し、CHO−K1細胞を播種した（5.0×104 cells／0.5 mL培養液／ウェル）。培養液としては、10 vol%のウシ胎児血清（FBS、GIBCO）を添加したRPMI1640培養液（Gibco）を用いた。3日間培養（5 %炭酸雰囲気中、37℃）した後、試料表面に接着した細胞のルシフェラーゼ活性をLuciferase Assay Kit（Promega）及びルミノメーターを用いて評価することにより、それぞれの表面における細胞へのルシフェラーゼ遺伝子の導入効率を調べた。
【００６８】
〔結果と考察〕
試料の表面構造評価
各試料の表面構造評価の結果を図2〜5に示す。
図2のSEM写真に示すように、低温液に浸漬されたu-PSの表面には、サブミクロンスケールの真球粒子からなる層が観察されたが、HAPおよびp-PSの表面には明確な粒子群は観察されなかった。ただし、未処理HAPおよびp-PSの表面構造（図1左）と比較すると、低温液浸漬後のHAPおよびp-PS表面にも、何らかの析出層が形成されたものと考えられた。
【００６９】
高温液に浸漬された試料の表面にはいずれも、低温液よりも大きなサブミクロンスケールの真球粒子が多量に観察された。p-PS表面層中の粒子の直径は、0.35 ± 0.07 μmであった。また、いずれの溶液に浸漬された場合でも、HAPおよびp-PSの表面には、ほぼ全面に一様な層が観察されたのに対し、u-PSの表面には、一部の領域にしか粒子層が観察されず、場所によって粒子生成量にむらがあった。
【００７０】
EDXの結果から、いずれの試料の表面層も、微量のマグネシウムおよびナトリウムを含むリン酸カルシウムからなることが確認された。図3のTF−XRDの結果から、p-PS表面のリン酸カルシウムは主としてアモルファスリン酸カルシウムであることが分かった。表面層の主成分がアモルファスリン酸カルシウムであることは、独立した複数回の実験によって再現性を確認した。ただし、副成分として、ごく少量のオクタリン酸カルシウムが明瞭に検出される場合と、ほとんど検出されない場合とがあった。これは、XRD測定にかけた表面層の量の違い、あるいは、リン酸カルシウム中のオクタリン酸カルシウム含有量の違いによると考えられる。
【００７１】
ICPおよびUV-Visの結果から算出された試料表面のDNA担持量を図4に、カルシウムおよびリンの担持量を図5に示す。低温液と高温液を比べると、高温液浸漬試料表面に、より多くのDNA、カルシウム、およびリンが担持されていた。高温液浸漬試料のDNA担持量は、u-PS、p-PS、HAPの順に大きくなった。カルシウムおよびリンの担持量は、u-PSよりもp-PSの方が大きかった（HAPについては基材自体がカルシウムおよびリンを溶出するために担持量を算出できなかった）。
【００７２】
以上の結果から、高温液または低温液に24時間浸漬することにより、いずれの基材の表面にもDNAとリン酸カルシウムの複合層（以下「D-CaP層」と記載）が形成されたことが確認された。D-CaP層の形成量は、低温液浸漬試料よりも高温液浸漬試料の方が多く、また高温液浸漬試料の中ではu-PSよりもp-PS、p-PSよりもHAPの方が多くなることが示された。
【００７３】
D-CaP層の形成過程
以上に示したように、D-CaP層の表面形状および形成量は、過飽和溶液および基材の種類によって大きく異なった。これは、以下に記すD-CaP層形成過程の違いに起因すると考えられる。高温液中では、いずれの基材を浸漬した場合にも、溶液全体でリン酸カルシウム種粒子の均一形成が速やかに（溶液調製後30分以内）誘起される。いったんリン酸カルシウムの種粒子が生成すると、それらは周囲の溶液から成分イオン（カルシウムイオン、リン酸イオン、ナトリウムイオンなど）やリン酸カルシウムクラスター、DNA分子を取り込みながら、自発的に成長していく。この粒成長は、溶液中で三次元的・等方的に進むため、一定時間経過後には粒径の揃った真球状の粒子が形成される。粒子がサブミクロンサイズにまで成長すると、基材表面に沈降、固定化される。以上の過程により、高温液中においては、多数のサブミクロン粒子からなるD-CaP層が形成される。HAPおよびp-PSは、表面のリン酸カルシウム捕捉層、および/または、同捕捉層を足場として形成されたリン酸カルシウムまたはD-CaP層を介して、沈降粒子と強固に結合するので、基材の表面全面に均一性と密着性に優れたD-CaP層が形成される。一方、u-PSはリン酸カルシウム捕捉層を表面に有していないので、沈降粒子との結合が不十分である。このため、浸漬後の洗浄により沈降粒子の一部が基材上から脱離してしまい、不均一でむらのあるD-CaP層となる。各基材表面のD-CaP層形成量の違いは、上記のリン酸カルシウム捕捉層の有無・種類の違いによると考えられる。すなわち、基材がリン酸カルシウム粒子を捕捉する能力（基材と沈降粒子との結合力）は、リン酸カルシウム捕捉層を有さないu-PS、リン酸カルシウム捕捉層として親水性官能基を表面に設けたp-PS、もともとリン酸カルシウム捕捉層を表面に有するHAPの順に大きくなると考えられる。このため、D-CaP層の形成量がu-PS＜p-PS＜HAPの順に増大したものと考えられる（図4、5）。
【００７４】
一方、高温液に比べてカルシウム・リン酸イオン濃度および浸漬温度の低い低温液中では、リン酸カルシウムに対する過飽和度が低いため、溶液中におけるリン酸カルシウム種粒子の均一形成、粒成長、沈降の反応速度が高温液中に比して遅くなる。このため、高温液浸漬後のu-PS表面の粒子は、低温液浸漬後の同表面のそれに比べてサイズが小さく、かつ少量であったと考えられる（図2、右）。また、リン酸カルシウム捕捉層を表面に有するHAPおよびp-PSの表面では、基材表面からのリン酸カルシウム形成反応（リン酸カルシウム捕捉層を足場とする不均一形成反応）の方が、溶液中でのリン酸カルシウム種粒子の均一形成反応に優先して進行するため、明瞭な粒子群が観察されず、図2の左上に示すような連続的な層が形成されたものと考えられる。以上のようなD-CaP層の形成速度の違い（u-PS）あるいは形成過程の違い（p-PS、HAP）により、低温液浸漬試料表面のD-CaP層形成量は、高温液浸漬後の基材表面に担持されたそれよりも少なくなったものと考えられる（図4、5）。
【００７５】
遺伝子導入効率評価
試料表面で培養されたCHO−K1細胞のルシフェラーゼ活性（遺伝子導入効率）を図6に示す。測定に用いたルミノメーターのバックグランドは5〜20 countであるので、いずれの試料表面に接着した細胞にも、ルシフェラーゼの遺伝子が導入されたことが確認された。高温液浸漬試料の遺伝子導入効率は、低温液浸漬試料のそれに対して、HAPでは約8100桁、p-PSでは約7500倍、u-PSでは約500倍高かった。高温液浸漬試料の表面に形成された、多量のサブミクロン真球粒子群からなるD-CaP層が、同層表面の細胞への遺伝子導入を効果的に促したためと考えられる。また、高温液浸漬試料の遺伝子導入効率は、u-PS、p-PS、HAPの順に向上した。これは、主としてD-CaP層の形成量の違いに起因すると考えられる。
【００７６】
以上の結果から、高温液を用いることにより、遺伝子導入効率に優れたD-CaP層を形成できることが分かった。また、基材としてリン酸カルシウム捕捉層を表面に有する材料を用いることが、D-CaP層の均一性および基材に対する密着性の向上、形成量の増大、ならびに遺伝子導入効率の向上に有効であることが分かった。
【００７７】
（比較例1）
従来公知の過飽和溶液を用いて、D-CaP層、フィブロネクチン担持D-CaP層、および脂質担持D-CaP層を高分子基材上に形成させた。これらの従来のD-CaP層、および実施例1で得られたD-CaP層の構造および遺伝子導入効率を比較した。
【００７８】
〔実験方法〕
基材の準備
溶融、加圧・成型して得られた厚さ1 mmのエチレンビニルアルコール共重合体（以下、「EVOH」と記載）基板を縦10 mm、横10 mmの大きさに打ち抜き、片面を#2000の研磨紙で研磨後、アセトンおよびエタノールで超音波洗浄し、100℃で24時間真空乾燥させた。上記基板を、200 mM CaCl2水溶液 20 mLに10秒間、同量の超純水に1秒間浸した後乾燥させ、次いで、200 mM K2HPO4・3H2O水溶液 20 mLに10秒間、同量の超純水に1秒間浸浸した後乾燥させた。以上のカルシウム及びリン酸イオン水溶液への交互浸漬処理を3回繰り返した。本工程により、リン酸カルシウム捕捉層として機能するアモルファスリン酸カルシウムのプレコート層がEVOH表面に形成される。
【００７９】
従来の過飽和溶液の調製
従来のリン酸カルシウム過飽和溶液（以下、「CP溶液」と記載）を、超純水にNaCl（142 mM）、CaCl2、（3.75 mM）、及びK2HPO4・3H2O（20 mM）を溶解した後、Tris（50 mM）と1M HClを用いて25℃でpHを7.40に調整することにより調製した。このCP溶液を用いて、DNA（40 μg/mL）添加CP溶液、DNA（40 μg/mL）およびフィブロネクチン（10 μg/mL）添加CP溶液、およびDNA（0.5 μg/mL）および脂質（40 μg/mL）添加CP溶液を調製した。DNAとしては、ルシフェラーゼの相補的遺伝子を含むプラスミド（pGL3-contlol vector、Promega）を用いた。フィブロネクチンとしては、ウシ胎児血漿由来のフィブロネクチン（Sigma−Aldlich）を用いた。脂質としては、第一世代ポリアミドアミンデンドロンを含む脂質［片山化学提供；(CH3(CH2)17)2NCH2CH2CONHCH2CH2N(CH2CH2CONHCH2CH2NH2)2］を用いた。脂質を添加する際には、予めDNAおよび脂質の混合溶解液を調製し、これをCP液に添加した。この混合溶解液は、20 mMトリスヒドロキシメチルアミノメタン−HCl緩衝液（pH = 7.40 / 25℃）1800 μLに、DNAを26.7 μg/mLの濃度で添加した後、133.8 μgの脂質を添加することにより調製した。
【００８０】
上記のフィブロネクチンおよび脂質の添加条件は、得られる複合層の遺伝子導入効率の点から従来研究で最適化された条件である。また、上記の過飽和溶液はいずれも、調製後24時間以上リン酸カルシウムの析出を誘起しない準安定な過飽和溶液である。
【００８１】
試料の作製
EVOHをエチレンオキシドガスで滅菌した後、上記の過飽和溶液3 mL中に25℃で24時間浸漬し、比較試料とした。過飽和溶液浸漬後、表面構造評価用の試料は超純水で洗浄し、遺伝子導入効率評価用の試料はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄した。以後、DNA添加CP溶液浸漬後の試料をD、DNAおよびフィブロネクチン添加CP溶液浸漬後の試料をDF、DNAおよび脂質添加CP溶液浸漬後の試料をDLpとする。
【００８２】
試料の表面構造評価
前項で得られた比較試料の表面構造を、SEM観察および薄膜X線回折分析（TF−XRD）により調べた。TF−XRDにおいては、CuKα線を照射X線とした。また、基材浸漬前後の過飽和溶液中のCaおよびPの量を高周波誘導結合プラズマ発光分光分析（ICP）により、DNAの量を紫外-可視（UV-Vis）分光分析により求めた。この結果をもとに、試料表面のCa、P、およびDNA担持量を求めた。
【００８３】
試料の遺伝子導入効率評価
比較試料、および実施例1で作製された高温液浸漬試料の遺伝子導入効率を、実施例1と同様にして評価した。
【００８４】
〔結果と考察〕
試料の表面構造評価
SEM観察、TF−XRD、ICPおよびUV−Vis分光分析の結果から、D表面にはD−CaP層が、DF表面にはフィブロネクチン担持D−CaP層が、DLp表面には脂質担持D−CaP層が形成されたことが確認された。図7に示すように、これらの複合層はいずれも、サブミクロンスケールの微細構造を有する連続的な層であった。またTF-XRDの結果から、複合層中のCaPの結晶相はいずれも、低結晶性のアパタイトであると同定された。例として、DLpの表面のTF−XRDパターンを図8に示す。
【００８５】
Dの表面に担持されたCa、PおよびDNAの量はそれぞれ、120 ± 7 μg/cm2、64 ± 4 μg/cm2、および14 ± 4 μg/cm2であった。DFの表面に担持されたCa、P、DNAおよびフィブロネクチンの量はそれぞれ、124 ± 12、66 ± 6、14 ± 3、および21 ± 4 μg/cm2であった。また、DLpの表面に担持されたDNAおよび脂質の総量は4.5 ± 0.1 μg/cm2であった。
【００８６】
遺伝子導入効率評価
種々の試料表面で培養されたCHO−K1細胞のルシフェラーゼ活性（遺伝子導入効率）を図9に示す。高温液浸漬試料の遺伝子導入効率はいずれも、比較試料Dのそれに対して2桁以上高かった。この結果から、高温液を用いて形成されたD−CaP層は、従来のCP溶液を用いて形成されたD−CaP層よりも、遺伝子導入効率において優れていることが分かった。なお、前項の結果から、高温液を用いてp-PSおよびu-PS表面に形成されたD−CaP層中のCa、PおよびDNAの担持量は、CP溶液を用いて形成されたD−CaP層のそれよりも少なかった。従来研究および実施例1の結果から、これらの成分、特にDNAの担持量の低下は、D−CaP層の遺伝子導入効率を低減させることが知られている。にも関わらず、前者（高温液を用いて形成されたD−CaP層）の遺伝子導入効率の方が後者（CP溶液を用いて形成されたD−CaP層）に比して高かったのは、CP溶液を用いて形成されたD−CaP層が連続的な層であった（図7）のに対し、高温液中で形成されたD−CaP層が粒径の揃ったサブミクロン真球粒子群から構成されていた（図2、下）ことに起因すると考えられる。連続的なD−CaP層の表面では、同層から溶出したDNA分子が周囲のカルシウムイオンやリン酸カルシウムクラスターなどと結合して、細胞内に取り込まれると考えられる。あるいは、部分的に剥離したD−CaP層の小片が細胞内に取り込まれると考えられる。これに対し、サブミクロン真球粒子群からなるD−CaP層では、粒子同士が点接触によって結合しているために、上記の複合層に比べて各粒子が分離・剥離し易く、またその粒子の形状がサブミクロン真球状であることで、細胞内にエンドサイトーシスで取りこまれ易いものと考えられる。さらに、CP溶液を用いて形成されたD−CaP層が低結晶性のアパタイトを主成分としていたのに対し、高温液中で形成されたD−CaP層がアパタイトよりも溶解性の高いアモルファスリン酸カルシウムを主成分としていたことも、後者の優れた遺伝子導入効率に寄与していると考えられる。溶解性の高いアモルファスリン酸カルシウムは、細胞内のエンドソーム中において速やかに溶解することで、エンドソームからのDNAの離脱、ならびに核への移行を促進すると考えられる。
【００８７】
さらに、図9の結果によれば、高温液中で形成されたD−CaP層は、導入効率を向上させるためにフィブロネクチンや脂質を複合担持させたD−CaP層（比較試料DFおよびDLp）よりも高い、またはそれとほぼ同等の遺伝子導入効率を示した。フィブロネクチンや脂質の複合担持は、図9（右側の3試料）に示されているように、D−CaP層の遺伝子導入効率の向上に極めて効果的である。DLpは、血清存在下での細胞実験において、市販の脂質系遺伝子導入剤をプロトコール通りに用いた場合（培養細胞の上に振りかけて遺伝子導入を行う）よりも、高効率に細胞内に遺伝子を導入できることが報告されている。すなわちDLpによる遺伝子導入法は、ウィルスを用いない遺伝子導入システムとしては極めて高効率であると言える。しかし、フィブロネクチンは動物由来のタンパク質であること、脂質は細胞毒性を有することなどから、医療応用のためのハードルが高かった。高温液を用いることで、フィブロネクチンや脂質を用いずとも、DFおよびDLpに匹敵する高い遺伝子導入効率を達成できたことは、応用上意義が大きいと考えられる。
【００８８】
（比較例2）
市販のリン酸カルシウム系遺伝子導入剤（CaP導入剤）をメーカープロトコールどおりに用いた場合の遺伝子導入効率を調べた。具体的には、プロトコールに従い調製したCaP導入剤を、前培養しておいた細胞の上に振りかけて（細胞培養液中に添加して）遺伝子導入を行った。
【００８９】
〔実験方法〕
CaP導入剤液の調製
市販のリン酸カルシウム系遺伝子導入剤ProFection（登録商標）（Promega）のプロトコールに従い、DNA含有カルシウム水溶液500 μLを、ボルテックス混合下でリン酸イオン水溶液中500 μL中に滴下した後、30分間インキュベートすることにより、CaP導入剤液を調製した。リン酸イオン水溶液は、280 mM NaClおよび1.5 mM Na2HPO4を含む50 mMのHEPES [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid] 緩衝溶液（pH=7.1）である。カルシウムイオン溶液は、30 μg/mLのDNAおよび248 mMのCaCl2を含む水溶液である。すなわち、CaP導入剤液中のカルシウムイオン濃度は124 mM、リン酸イオン濃度は0.75 mMである。
【００９０】
遺伝子導入効率評価
細胞培養用24ウェルプレート内の各ウェル内に、CHO−K1細胞を播種した（5.0×104cells／0.5 mL培養液／ウェル）。培養液としては、10 vol%のFBS（GIBCO）を添加したRPMI1640培養液（Gibco）を用いた。24時間培養（5 %炭酸雰囲気中、37℃）した後、培養液を新しい培養液に交換し、上記のCaP導入剤液を34 μLまでの種々の量で添加した。48時間培養（5 %炭酸雰囲気中、37℃）を行った後、培養細胞への遺伝子導入効率を、実施例1と同様にして評価した。
【００９１】
〔結果と考察〕
図10に、上記のCaP導入剤による遺伝子導入効率を示す。遺伝子導入効率は、培養液へのCaP導入剤液の添加量に応じて異なった。最高効率は、CaP導入剤液の添加量が6.8 μLの条件で得られたが、実施例1で作製された高温液浸漬試料の効率よりも低かった。
【００９２】
（実施例2）
高温液への浸漬時間の延長
〔実験方法〕
試料の作製、表面構造評価、および遺伝子導入効率評価
高温液への浸漬時間を２４時間から４８時間または72時間に延長した以外は、実施例１と同様にしてp−PS基材の表面にD−CaP層を形成させた。得られた試料の表面構造および遺伝子導入効率を、実施例1と同様にして評価した。
【００９３】
〔結果と考察〕
試料の表面構造評価
図11のSEM写真に示すように、高温液へのp−PSの浸漬時間を24から72時間まで変化させた場合にも、ほぼ同様のサブミクロン真球粒子群から構成されるD−CaP層の形成が確認された。50個以上の粒子の直径を計測した結果、24、48 、72時間浸漬後の試料表面の構成粒子の直径はそれぞれ、0.35 ± 0.07 μm、0.34 ± 0.06 μm、および0.36 ± 0.06 μmであった。試料間に有意差は認められず、24時間以上に浸漬時間を延長しても、粒子サイズは大きくならないことが分かった。これには、高温液中に存在する各種成分（DNA分子、酢酸イオン、炭酸イオンなど）のリン酸カルシウム成長阻害作用が寄与していると考えられる。一方、試料表面に担持されたCa、PおよびDNAの量は、浸漬時間とともに増大した（図12）。以上の結果は、浸漬時間の延長によって、D−CaP層中の構成粒子のサイズは変わらず、数が増大したことを示している。また、XRDの結果によれば、高温液に72時間浸漬して得られたD−CaP層のリン酸カルシウムも、24時間浸漬で得られたD−CaP層と同様（図8参照）、その主成分はアモルファスリン酸カルシウムであった（XRDパターンにおいて、30度付近にハローが検出された）。アモルファスリン酸カルシウムはアパタイトの前駆体であり、中性水溶液中ではアパタイトに変化することが知られている。また、従来研究において、遺伝子を除いた高温液中に４８時間浸漬して得られるリン酸カルシウムは、低結晶性のアパタイトであると報告されている。しかし、遺伝子を含む高温液中に７２時間浸漬して得られた試料に、アパタイトのピークは全く検出されなかった。高温液中に含まれる遺伝子がアモルファスリン酸カルシウムからアパタイトへの変化を阻害している可能性が示唆された。
【００９４】
遺伝子導入効率評価
上記試料表面で培養されたCHO−K1細胞のルシフェラーゼ活性（遺伝子導入効率）を図13に示す。高温液へのp−PSの浸漬時間を24から72時間まで変化させても、D-CaP層の遺伝子導入効率は変化しないことが分かった。D−CaP層中の構成粒子数の増大は遺伝子導入効率を向上させる一方、長時間の浸漬では過飽和溶液中のDNAの分子構造が変化して遺伝子導入効率を低減すると考えられ、この相反する効果によって24〜72時間の浸漬では遺伝子導入効率が変化しなかった可能性がある。
【００９５】
以上の結果から、高温液への基材浸漬時間は、24時間以内で十分であることが分かった。
【００９６】
（実施例3）
高温液への浸漬時間の短縮
〔実験方法〕
試料の作製、表面構造評価、および遺伝子導入効率評価
高温液への浸漬時間を２４時間から１時間、３時間、６時間、または１０時間にまで短縮した以外は、実施例１と同様にしてp−PS基材の表面にD−CaP層を形成させた。得られた試料の表面構造および遺伝子導入効率を、実施例1と同様にして評価した。
【００９７】
〔結果と考察〕
試料の表面構造評価
図14のSEM写真に示すように、高温液へのp−PSの浸漬時間を24時間から短縮した場合、浸漬時間３時間以下では明らかに試料表面のサブミクロン真球粒子の量が減少した。浸漬時間が6時間以上の場合に、試料の一表面の６割以上がサブミクロン粒子群で覆われることが分かった。また、浸漬１時間後には、少量ではあるもののサブミクロン真球粒子が基材上に固定されることが分かった。この粒子は真球形状をとり、点接触で基材表面に固定化されていることから、リン酸カルシウム捕捉層を足場とした不均一形成反応によって基材上に形成されたものではなく、溶液中で形成された種粒子がサブミクロン粒子にまで成長した後、基材上に沈降・固定化したものと考えられる。すなわち、高温液中では、溶液調製完了後たった1時間程の時間内に、溶液中でリン酸カルシウムの種粒子の均一形成が開始され、少なくともその一部はサブミクロン粒子にまで成長、重力沈降することが確認された。
【００９８】
粒子の直径を計測した結果、１時間、３時間、６時間、１０時間、２４時間浸漬後の試料表面の構成粒子の直径はそれぞれ、0.30 ± 0.09 μm、0.31 ± 0.08 μm、0.35 ± 0.16 μm、0.35 ± 0.11 μm、および0.35 ± 0.08 μmであった。試料間に有意差は認められず、24時間から1時間にまで浸漬時間を短縮しても、粒子サイズは小さくならないことが分かった。上記のサブミクロンサイズよりも小さい粒子は重力沈降せず、サブミクロンサイズにまで成長して初めて、基材表面に沈降するためと考えられる。
【００９９】
遺伝子導入効率評価
上記試料表面で培養されたCHO−K1細胞のルシフェラーゼ活性（遺伝子導入効率）を図15に示す。高温液への浸漬時間を24時間から1時間にまで短縮すると遺伝子導入効率が低減したが、3〜10時間浸漬では遺伝子導入効率が向上した。浸漬時間の短縮によってD−CaP層中の構成粒子数が減少する負の効果と、DNAの分子構造変化を低減できる正の効果のバランスによって、3〜10時間の浸漬時間において遺伝子導入能の高いD−CaP層が得られたものと考えられる。遺伝子導入効率を向上させるためには、ある程度の数のサブミクロン粒子を含むD−CaP層を形成できる条件内で、浸漬時間を短縮した方が良いと考えられた。
【０１００】
（実施例4）
高温液中のDNA濃度の変更
試料の作製、表面構造評価、および遺伝子導入効率評価
高温液中のDNA濃度を変更した以外は、実施例１と同様にしてu−PSまたはp−PS基材の表面にD−CaP層を形成させた。得られた試料の遺伝子導入効率を、実施例1と同様にして評価した。
【０１０１】
〔結果と考察〕
試料の表面構造評価
図16に、高温液からDNAを除いた溶液に24時間浸漬後のp-PS表面のSEM写真を示す。高温液からDNAを除くと、粒子サイズのばらつきが大きくなり、また、基材の表面全体には粒子群が固定されなくなることが分かった。これは、リン酸カルシウムの成長阻害因子として作用するDNA分子が、過飽和溶液からなくなったためと考えられる。すなわち、ネガティブにチャージしているDNA分子はカルシウムイオンと強固に結合するので、過飽和溶液中のフリーなカルシウムイオン濃度を低減し、リン酸カルシウムの過飽和度を低くする。さらに、リン酸カルシウム粒子の表面に吸着したDNA分子は、粒成長を抑制する。このようなDNA分子によるリン酸カルシウムの成長阻害効果が、サイズの揃ったサブミクロン真球粒子群の形成に寄与していると考えられる。
【０１０２】
遺伝子導入効率評価
図17に、DNA濃度の異なる高温液に24時間浸漬後のu-PS表面で培養されたCHO−K1細胞のルシフェラーゼ活性（遺伝子導入効率）を示す。高温液中のDNA濃度の増加に伴い、遺伝子導入効率が向上することが分かった。これは、D−CaP層中のDNA担持量の増加によると考えられる。
【０１０３】
（実施例5）
高温液のカルシウムおよびリン酸濃度の変更（過飽和度の変更）
〔実験方法〕
試料の作製、表面構造評価、および遺伝子導入効率評価
高温液のカルシウムおよびリン酸イオン濃度を０．５倍〜２．０倍まで変化させた（他のイオン濃度も微変）以外は実施例１と同様にして、４種類のリン酸カルシウム過飽和溶液を調製した（表４）。なお、溶液中のカルシウムおよびリン酸イオン濃度が高いほど、リン酸カルシウムに対する過飽和度が高くなる。これらの過飽和溶液はいずれも、調製完了後１０分以内に白濁することが、目視によってが確認された。このことから、いずれの溶液も調整完了後１０分以内に、リン酸カルシウム種粒子を均一形成することが分かった。上記の各過飽和溶液を用いて、実施例１と同様にしてp−PS基材の表面にD−CaP層を形成させた。ただし、溶液への浸漬時間は実施例３の結果をもとに６時間に変更した。得られた試料の表面構造および遺伝子導入効率を、実施例1と同様にして評価した。
【０１０４】
【表４】
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【０１０５】
〔結果と考察〕
試料の表面構造評価
図１８のSEM写真に示すように、高温液のカルシウムおよびリン酸イオン濃度を0.5倍に低減すると、試料表面のサブミクロン真球粒子の量が減少した。これは、過飽和度の低下により、溶液中でのリン酸カルシウム種粒子の均一形成・成長速度が低下したためと考えられる。また、高温液のカルシウムおよびリン酸イオン濃度を１．５倍以上に高めると、サブミクロン真球粒子は観察されなくなった。１．５倍濃度高温液浸漬後の試料表面には、不均質でミクロンサイズの凹凸や不定形の孔を含むD−CaP層が観察された。２．０倍濃度高温液浸漬後の試料表面には、サブミクロンの凹凸を有する連続層（左部、右上部）と、その上にミクロンサイズ以上の不定形沈殿物（中央部）が観察された。同試料については、溶液浸漬後の洗浄によって、基材上から表面層の一部が剥離し、取り去られる様子が目視で確認された。この試料の表面に観察された上記の不定形沈殿物は、洗浄後に残存したD-CaP層の一部と推定される。
【０１０６】
遺伝子導入効率評価
上記試料表面で培養されたCHO−K1細胞のルシフェラーゼ活性（遺伝子導入効率）を図19に示す。遺伝子導入効率は、1倍濃度高温液浸漬後の試料上、すなわち高密度のサブミクロン真球粒子群からなるD−CaP層の表面で最も高かった。高温液のカルシウムおよびリン酸イオン濃度を0.5倍にすると、遺伝子導入効率が低下した。これは、試料上に固定されるサブミクロン真球粒子の量が減少したためと考えられる。また、高温液のカルシウムおよびリン酸イオン濃度を１.５倍あるいは２．０倍にした場合にも、遺伝子導入効率が低下した。これは、図１８に示したD−CaP層の形態変化によると考えられる。以上の結果から、D−CaP層中に含まれるサブミクロン真球粒子が遺伝子導入の効率向上に寄与していることが、再確認された。
【０１０７】
（比較例3）
市販のCaP導入剤は通常、前培養しておいた細胞の上に振りかけて（細胞培養液中に添加して）使用する（比較例2参照）。本比較例では、細胞を用いず、リン酸カルシウム捕捉層を有する基材（p-PS）を、通常使用と同様のCaP導入剤添加培養液中に48時間浸漬し、基材の表面構造変化を調べた。
【０１０８】
〔実験方法〕
試料の作製と評価
実施例1で作製したp-PSを、細胞培養用24ウェルプレート内の各ウェル内に1つずつ設置した。同ウェル内に、10 vol%のFBS（GIBCO）を添加したRPMI1640培養液（Gibco）500 μLを添加した後、比較例2で調製したCaP導入剤液34 μLを添加した。本CaP導入剤が使用される時と同じ環境下（5 %炭酸雰囲気中、37℃）で、24時間浸漬を行い、比較試料とした。浸漬後の試料を超純水で洗浄し、その表面構造をSEMにより観察した。
【０１０９】
〔結果と考察〕
試料の表面構造評価
SEM観察およびEDX分析の結果、CaP導入剤液浸漬後のp-PS基材の表面には、数十μmサイズの不定形のリン酸カルシウム析出物がごく少量観察された（図20左）。析出物のない表面を高倍率で観察しても、サブミクロン真球粒子は全く観察されなかった（図20右）。ナノ〜サブミクロンスケールの凹凸が観察されたが、これは基材表面のリン酸カルシウム捕捉層を足場として培養液中で形成されたリン酸カルシウム層であると推定される。
【０１１０】
CaP導入剤液を添加した培養液中には多量のリン酸カルシウムの析出物が存在し、p-PS基材はリン酸カルシウム捕捉層を有していたにも関わらず、両者を接触させても同析出物を基材の表面全体に固定できないことが分かった。これは次のような理由によると考えられる。CaP導入剤液は、高温液および低温液に比べ30倍以上高濃度のカルシウムイオンを含むため、過飽和度が極めて高い（中性溶液中では、カルシウムイオン濃度の方が、リン酸イオン濃度よりも過飽和度への寄与が大きい）。このため、CaP導入剤の原料であるカルシウムイオン溶液と、同液中に滴下されたリン酸イオン液滴との界面から、直ちにリン酸カルシウムが不均一形成する。析出粒子は急速に成長し、ミクロンサイズを超える不定形析出物となる。そのような不定形の大型粒子となってしまうと、たとえリン酸カルシウム捕捉層を有する基材上に沈降させても、基材上に十分強固には固定されず、浸漬後の洗浄によって容易に基材上から取り去られると考えられる。試料表面にごく少量観察された不定形粒子（図18左）は、たまたま取り去られずに基材上に残存したものであると考えられる。
【０１１１】
以上の結果から、従来のCaP導入剤を含む培養液中に、リン酸カルシウム捕捉層を表面に有する基材を浸漬しても、同導入剤を基材の表面全体に均等に固定させることは困難と考えられた。リン酸カルシウム種粒子を均一形成し、かつ同粒子を均等に三次元成長させるように調製された過飽和溶液を用いることが、サブミクロン粒子群を基材表面に固定化するために重要と考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明によれば、遺伝子導入効率の高い遺伝子導入用基材を提供することができる。本発明の遺伝子導入用基材は、遺伝子導入機能を備える、細胞培養用基材、組織再生用スキャホールド、及び生体材料として利用することが可能であり、再生医療をはじめ様々な分野において大いに貢献することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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