(57)【要約】  本発明は、Ｎ末側からＣ末側の方向に、ＰＣＮＡと結合する１又は複数のペプチドおよびＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含む融合ポリペプチド、当該ポリペプチドを使用した核酸増幅法、当該ポリペプチドを含有する組成物及びキットに関する。本発明により、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼでもＰＣＮＡ存在下での核酸増幅において、長鎖ＤＮＡを短時間で増幅することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末側からＣ末側の方向に、
ａ）ＰＣＮＡと結合する１又は複数のペプチド
および、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、
を含む融合ポリペプチド。
【請求項２】
ＰＣＮＡと結合するペプチドがＰＩＰボックスを有するペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
ＰＩＰボックスが、配列表の配列番号５２〜９１のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする、請求項２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
ＰＣＮＡと結合するペプチドがＤＮＡポリメラーゼ関連因子由来のＰＩＰボックスを有するペプチドであることを特徴とする、請求項１または２に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
ＰＣＮＡと結合するペプチドが複製因子Ｃラージサブユニット由来のＰＩＰボックスを有するペプチドであることを特徴とする、請求項１、２及び４のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
ＰＣＮＡと結合するペプチドが配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列、もしくは前記アミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする、請求項１、２、４及び５のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
ＰＣＮＡと結合するペプチドとＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの間に５〜５０アミノ酸のリンカーペプチドを有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
リンカーペプチドがセリンとグリシンから成るアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドがＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼもしくはそのフラグメントであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼもしくはそのフラグメントであることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドを含有する核酸増幅用組成物。
【請求項１３】
さらに、ＰＣＮＡを含有する、請求項１２に記載の核酸増幅用組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドを含有するキット。
【請求項１５】
さらに、ＰＣＮＡを含有する、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドならびにＰＣＮＡを含有する組成物を使用することを特徴とする、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ変異体に関する。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、特にＰＣＮＡ存在下での核酸増幅に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、試験管の中で鋳型となるＤＮＡ鎖に沿って新しくＤＮＡ鎖を合成することができる酵素であり、その反応には鋳型ＤＮＡの他にプライマーとなるオリゴヌクレオチドと４種のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）があれば、新しくＤＮＡ鎖が合成される。ＤＮＡポリメラーゼは塩基配列決定やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を含む核酸増幅法など数多くの操作に利用されている。【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼの有するＤＮＡ合成に関連する諸性質（伸長性、迅速性、正確性等）を向上させる関連因子として、好熱性古細菌から種々のタンパク質が見いだされている。関連因子として、例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来の複数のタンパク質が単離されている（特許文献１）。また、関連因子として、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ  ＫＯＤ１株からもＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原：ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＲＦＣ−Ｓ（複製因子Ｃスモールサブユニット：ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ  ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｕｎｉｔ）、ＲＦＣ−Ｌ（複製因子Ｃラージサブユニット：ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ  ｌａｒｇｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ）が単離された（特許文献２）。【０００４】
ＰＣＮＡは、ホモ多量体で「スライディング・クランプ（ｓｌｉｄｉｎｇ  ｃｌａｍｐ）」と呼ばれる環状構造を形成し、ＤＮＡ合成反応を促進する。ＰＣＮＡは酵母からヒトまで高度に保存されており、真核細胞において、ＰＣＮＡは細胞分裂、ＤＮＡ複製、修復、細胞周期調節、ＤＮＡメチル化やクロマチンリモデリングのような複製後修飾で重要な役割を担っている。【０００５】
ＲＦＣ（複製因子Ｃ：ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｃ）は５つのサブユニットから成るタンパク質複合体で、ＰＣＮＡをＤＮＡにロードする機能から「クランプローダー（ｃｌａｍｐ  ｌｏａｄｅｒ）」とも呼ばれる。また、ＲＦＣは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のγ複合体（γ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）と同等である。ＲＦＣのクランプローダーとしての機能を説明すると、（１）ＲＦＣがＤＮＡ鎖に結合する、（２）ＡＴＰを加水分解することで生じるエネルギーを用いてＲＦＣは環状ＰＣＮＡを開裂する、（３）ＰＣＮＡがＤＮＡ鎖を挟む、（４）さらにＡＴＰを加水分解することによりＲＦＣはＤＮＡから解離し、ＰＣＮＡはＤＮＡに結合する。【０００６】
ＰＣＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼやＲＦＣ以外にもさまざまなタンパク質と複合体を形成し、ＤＮＡの修復・複製やその他の遺伝子制御機能に関与する。ヒトでは少なくとも１２個のタンパク質がＰＣＮＡと結合することが知られている。各タンパク質はＰＩＰボックス（ＰＩＰ  ｂｏｘ：ＰＣＮＡ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｏｘ）を介してＰＣＮＡと結合することでＤＮＡ鎖上に留め置かれることになる。【０００７】
ＰＩＰボックスには共通性の高いアミノ酸配列が存在することや、いくつかのタンパク質がＰＩＰボックス部位によってＰＣＮＡと結合することが明らかにされている（非特許文献１）。【０００８】
上述のように、自然界においてはＰＣＮＡとＲＦＣが協調して機能することにより、ＤＮＡ複製が行われている。この中でも特に中心的な働きをするＰＣＮＡを利用して、ＰＣＲの効率を上げる試みがなされた。ＰＣＲで汎用される、好熱性真正細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のファミリーＡ（ポルＩ型）ＤＮＡポリメラーゼ（「Ｔａｑポリメラーゼ」ということもある）はＰＣＮＡと相互作用しない。しかしファミリーＢ（α型）ＤＮＡポリメラーゼと同様の形態になるように当該ＴａｑポリメラーゼのＣ末端に、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓのＰｏｌＢ由来のＰＩＰボックスを含む５０アミノ酸を融合させたキメラ融合タンパク質（キメラＴａｑ）は、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来ＰＣＮＡ存在下でＤＮＡを増幅することが報告された。しかし増幅されるＤＮＡのサイズが５ｋｂになると、合成物由来のバンドが薄くなることより、伸長性にまだ問題があった（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開ＷＯ１９９９／００５０６号パンフレット
【特許文献２】特開２００２−３６０２６１
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ジーンズ  トゥ  セルズ（Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ）、第７巻、第９号、９１１〜９２２頁（２００２年）
【非特許文献２】ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．）、第２７７巻、第１８号、１６１７９〜１６１８８頁（２００２年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上に述べたように、従来の技術では伸長性、迅速性、正確性といった諸性質をすべて満たすＤＮＡポリメラーゼが提供されているとは言い難い。【００１２】
本発明は、このような従来のファミリーＡ（ポルＩ型）ＤＮＡポリメラーゼが有していた問題を解決しようとするものであり、より便利で使い易く、伸長性及び迅速性に優れたＤＮＡポリメラーゼと当該ポリメラーゼを用いた核酸増幅法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らはＰＣＮＡ存在下での核酸増幅に利用できる新規なファミリーＡ（ポルＩ型）ＤＮＡポリメラーゼを提供することを目的に鋭意研究を重ねた結果、Ｎ末側からＣ末側の方向に、ＰＣＮＡと結合する１又は複数のペプチドおよびＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含む融合ポリペプチドを利用することで、ＰＣＮＡ存在下での核酸増幅反応が促進されることを見出し、本発明を完成させた。【００１４】
本発明を概説すれば、本発明は
［１］Ｎ末側からＣ末側の方向に、
ａ）ＰＣＮＡと結合する１又は複数のペプチド
および、
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、
を含む融合ポリペプチド、
［２］ＰＣＮＡと結合するペプチドがＰＩＰボックスを有するペプチドであることを特徴とする、［１］に記載の融合ポリペプチド、
［３］ＰＩＰボックスが、配列表の配列番号５２〜９１のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする、［２］に記載の融合ポリペプチド、
［４］ＰＣＮＡと結合するペプチドがＤＮＡポリメラーゼ関連因子由来のＰＩＰボックスを有するペプチドであることを特徴とする、［１］または［２］に記載の融合ポリペプチド、
［５］ＰＣＮＡと結合するペプチドが複製因子Ｃラージサブユニット由来のＰＩＰボックスを有するペプチドであることを特徴とする、［１］、［２］及び［４］のいずれかに記載の融合ポリペプチド、
［６］ＰＣＮＡと結合するペプチドが配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列、もしくは前記アミノ酸配列を含むペプチドであることを特徴とする、［１］、［２］、［４］及び［５］のいずれかに記載の融合ポリペプチド、
［７］ＰＣＮＡと結合するペプチドとＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの間に５〜５０アミノ酸のリンカーペプチドを有することを特徴とする、［１］〜［６］のいずれかに記載の融合ポリペプチド、
［８］リンカーペプチドがセリンとグリシンから成るアミノ酸配列であることを特徴とする、［７］に記載の融合ポリペプチド、
［９］ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドがＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼもしくはそのフラグメントであることを特徴とする、［１］〜［８］のいずれかに記載の融合ポリペプチド、
［１０］ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドがＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼもしくはそのフラグメントであることを特徴とする、［１］〜［９］のいずれかに記載の融合ポリペプチド、
［１１］［１］〜［１０］のいずれかに記載の融合ポリペプチドをコードする核酸、
［１２］［１］〜［１０］のいずれかに記載の融合ポリペプチドを含有する核酸増幅用組成物、
［１３］さらに、ＰＣＮＡを含有する、［１２］に記載の核酸増幅用組成物、
［１４］［１］〜［１０］のいずれかに記載の融合ポリペプチドを含有するキット、
［１５］さらに、ＰＣＮＡを含有する、［１４］に記載のキット、
［１６］［１］〜［１０］のいずれかに記載の融合ポリペプチドならびにＰＣＮＡを含有する組成物を使用することを特徴とする、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡの製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼでもＰＣＮＡ存在下での核酸増幅において、長鎖ＤＮＡを短時間で増幅することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、実施例１におけるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の精製に関する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析によって、Ｔａｑ８１〜Ｔａｑ８５の純度を確認した。
【図２】図２は、実施例１におけるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の精製に関する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析によって、Ｔａｑ９２〜Ｔａｑ９４の純度を確認した。
【図３】図３は、実施例２における表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いた物理的相互作用解析である。ＳＰＲ解析によって、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｔａｑ８１〜Ｔａｑ８５及びＴａｑ９４）とＰｆｕＰＣＮＡとの物理的相互作用を測定した。
【図４】図４は、実施例３（１）における１ｋｂのＤＮＡの増幅の結果を示す図である。ＰＣＲによって、Ｔａｑ８１〜Ｔａｑ８５のＤＮＡ増幅能を確認した。
【図５】図５は、実施例３（２）における８ｋｂのＤＮＡの増幅の結果を示す図である。ＰＣＲによって、ＰＣＮＡ存在下におけるＴａｑ８１〜Ｔａｑ８５のＤＮＡ増幅能を確認した。
【図６】図６は、実施例３（２）における８ｋｂのＤＮＡの増幅の結果を示す図である。ＰＣＲによって、ＰＣＮＡ存在下におけるＴａｑ９２〜Ｔａｑ９４のＤＮＡ増幅能を確認した。
【図７】図７は、実施例３（３）における１２ｋｂのＤＮＡの増幅の結果を示す図である。ＰＣＲによって、ＰＣＮＡ存在下におけるＴａｑ８１〜Ｔａｑ８５のＤＮＡ増幅能を確認した。
【図８】図８は、実施例３（３）における１５ｋｂのＤＮＡの増幅の結果を示す図である。ＰＣＲによって、ＰＣＮＡ存在下におけるＴａｑ８１〜Ｔａｑ８５のＤＮＡ増幅能を確認した。
【図９】図９は、実施例４におけるＰＣＲによる１２ｋｂのＤＮＡの増幅の結果を示す図である。ＰＣＲによって、ＰＣＮＡ存在下におけるＴａｑ９５〜Ｔａｑ９８のＤＮＡ増幅能を確認した。
【図１０】図１０は、実施例４におけるＰＣＲによる１２ｋｂのＤＮＡの増幅の相対値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義等：
本明細書において「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸分子が、一方のアミノ基と他方のカルボキシル基とから１分子の水がとれて結合した化合物をいう。一般的には、約１０個以下のアミノ酸から成るものをオリゴペプチド、それ以上のアミノ酸から成るものをポリペプチドというが、厳密な境界はない。
【００１８】
本明細書において「融合ポリペプチド」とは、天然状態では融合していない２以上のポリペプチドを含むポリペプチド、および天然状態では融合していないペプチドとポリペプチドを含むポリペプチドのことをいう。
【００１９】
本明細書において「ＰＣＮＡ」とは、増殖細胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）の略で、その独特な形状と機能から「スライディング・クランプ（ｓｌｉｄｉｎｇ  ｃｌａｍｐ）」と呼ばれるタンパク質分子の構成要素である。ＰＣＮＡは、ホモ多量体で環状構造を形成し、中央の穴にＤＮＡ鎖を挟み込み、表面でＤＮＡポリメラーゼと結合してＤＮＡ上に酵素を繋ぎとめることによりＤＮＡ鎖合成反応を促進する複製補助因子である。ＰＣＮＡは酵母からヒトまで高度に保存されており、真核細胞において、ＰＣＮＡは細胞分裂、ＤＮＡ複製、修復、細胞周期調節、ＤＮＡメチル化やクロマチンリモデリングのような複製後修飾で重要な役割を担っている。また、本発明においては、前記機能を有するタンパク質分子であれば、名称が異なっていてもすべてＰＣＮＡの範疇に属する。
【００２０】
本明細書において「ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド」とは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質として、鋳型核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）と相補的なＤＮＡ鎖を合成する活性を有するポリペプチドをいう。本発明には「ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド」として公知のＤＮＡポリメラーゼやその変異体を使用することができる。
【００２１】
本発明でＤＮＡポリメラーゼに関し、「活性」というときは、特に記載した場合を除き、ＤＮＡ合成活性と、プライマー伸長活性とを含む。ＤＮＡ合成活性には、ＤＮＡを鋳型としてそれに相補的なＤＮＡを合成する活性と、ＲＮＡを鋳型としてそれに相補的なＤＮＡを合成する活性とが含まれる。ＤＮＡ合成活性は、当業者にはよく知られているように、基質であるデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の取り込み活性として測定することができる。より具体的には、ＤＮａｓｅＩで部分的に消化した仔牛胸腺ＤＮＡやサケ精子ＤＮＡなどの鋳型と放射性同位体で標識されたｄＮＴＰを使用した相補鎖合成反応において、相補鎖に取り込まれた放射性同位体量としてＤＮＡポリメラーゼ活性が測定される。この方法はヌクレオチド取り込みアッセイと呼ばれ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を測定するための標準的な方法でもある。また、プライマーをハイブリダイズさせた鋳型ＤＮＡを基質とし、ＤＮＡポリメラーゼによって合成されるプライマー伸長産物の鎖長を測定してＤＮＡポリメラーゼの活性を評価することもできる。
【００２２】
以下に本発明について詳細に説明する。
【００２３】
（１）本発明の融合ポリペプチド
本発明の融合ポリペプチドは、Ｎ末側からＣ末側の方向に、ａ）ＰＣＮＡと結合する１又は複数のペプチドおよび、ｂ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、を含んでいる。よって、本発明の融合ポリペプチドはＤＮＡポリメラーゼ変異体であると言うことができる。
【００２４】
上記融合ポリペプチドを構成する「ＰＣＮＡと結合するペプチド」とは、ＰＣＮＡと結合する能力を有するペプチドであれば特に限定はない。該ペプチドとして、種々のＰＣＮＡ結合性タンパク質に存在するペプチドであるＰＩＰボックスを含むペプチドが例示される。当該ＰＩＰボックスはＰＣＮＡと相互作用するタンパク質に存在するアミノ酸配列で、ＰＣＮＡを介して当該タンパク質をＤＮＡ鎖上に留める働きをする。なお、本発明においては、前記機能を有するペプチドであれば、名称が異なっていてもすべてＰＩＰボックスの範疇に属する。例えば、ＤＮＡ複製などに関与する、好熱性細菌のタンパク質（例えば複製因子Ｃラージサブユニット等）がＰＩＰボックスを有していることが知られている。本発明において特に限定はされないが例えば、好適なＰＩＰボックスは、少なくとも８アミノ酸からなるオリゴペプチドであって、Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８と表記すると、Ａ１はグルタミン残基、Ａ２とＡ３は任意のアミノ酸残基、Ａ４はロイシン残基、イソロイシン残基およびメチオニン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基、Ａ５とＡ６は任意のアミノ酸残基、Ａ７はフェニルアラニン残基又はトリプトファン残基、Ａ８はフェニルアラニン残基、トリプトファン残基又はロイシン残基からなる群から選択されるアミノ酸残基、であるものが例示される。特に好ましくは、８アミノ酸のＱＡＴＬＦＤＦＬを含む配列表の配列番号３記載のものが挙げられる。さらに本発明においては、前記８アミノ酸のオリゴペプチドのＮ末端側にさらにリジン残基を有する９アミノ酸を含むものであってもよい。本発明を特に限定するものではないが、本発明で使用できるＰＩＰボックスのアミノ酸配列の例を表１に示す。
【００２５】
【表１−１】
2017090685.tif 000002
【００２６】
【表１−２】
2017090685.tif 000003
【００２７】
さらに本発明で使用するＰＩＰボックスは、特に限定はされないが好熱性細菌が産生するタンパク質由来のものが挙げられる。好ましくは好熱性細菌の複製因子Ｃラージサブユニット由来のＰＩＰボックスが例示され、さらに好ましくはＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓの複製因子Ｃラージサブユニット由来のＰＩＰボックスが例示される。あるいはこれと実質的に同等の活性を有する機能的同等物であってもよい。
また、これらのＰＩＰボックスは、本発明の融合ポリペプチド内に複数個存在してもよい。融合ポリペプチドに含まれるＰＩＰボックスの数は、特に限定はないが、１〜６個、好ましくは２〜４個が例示される。これら複数のＰＩＰボックスは、その機能を果たす限りにおいては、それぞれのアミノ酸配列が異なっていてもよい。また、複数のＰＩＰボックス同士の間には、例えば後述のリンカーペプチドなど、別のアミノ酸配列が挟まっていてもよい。
【００２８】
さらに上記ＰＩＰボックスのＣ末側には、「リンカーペプチド」が存在してもよい。本発明の融合ポリペプチドを構成する「リンカーペプチド」とは、本発明の融合ポリペプチドにおいて、その機能やフォールディングが阻害されるのを回避するために、融合されるポリペプチド同士あるいはペプチドとポリペプチドの間に挿入されるペプチドである。リンカーペプチドの長さに特に制限はないが、３〜１００アミノ酸、好ましくは５〜５０アミノ酸のペプチドが例示される。当該リンカーペプチドを構成するアミノ酸の種類に特に制限はないが、リンカー自身が複雑な高次構造を形成するものは避けた方がよく、側鎖が比較的小さいアミノ酸、例えばセリンやグリシンを多く含むペプチドがよく用いられる。本発明におけるリンカーペプチドとしては、セリンとグリシンからなるアミノ酸であることが、好ましい。
【００２９】
上記リンカーペプチドのＣ末側には、「ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド」が存在する。本発明の融合ポリペプチドを構成する「ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド」には公知のＤＮＡポリメラーゼやその変異体を使用することができる。本発明の融合ポリペプチドをＰＣＲで使用する場合には、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼならびにその変異体、好ましくは耐熱性のファミリーＡ（ポルＩ型）ＤＮＡポリメラーゼならびにその変異体、さらに好ましくはＴｈｅｒｍｕｓ属細菌のＤＮＡポリメラーゼもしくはその変異体が「ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド」として使用される。本発明を特に限定するものではないが、本発明によりＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの性能を飛躍的に向上させることができる。本発明において「Ｔａｑポリメラーゼ」又は「Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ」というときは、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼをいう。このＤＮＡポリメラーゼが有するアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする塩基配列は、それぞれ配列番号１及び２として、本明細書の一部である配列表に示されている。さらに、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓやＴｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓのポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを本発明に使用することもできる。本明細書において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドとしては、ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼの全長ポリペプチドまたはそのフラグメント、好適にはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの全長ポリペプチドまたはそのフラグメントが例示できる。ここで、これらのポリメラーゼのフラグメントは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有していれば、天然型であってもよく、変異型であってもよい。また、これらのポリメラーゼのフラグメントは、天然型でＰＩＰボックスを有していないポリメラーゼのフラグメントであってもよいし、天然型でＰＩＰボックスを有するポリメラーゼのフラグメントであってもよい。更に、天然型でＰＩＰボックスを有するポリメラーゼのフラグメント場合、該ＰＩＰボックスは取り除かれていてもよい。
【００３０】
本発明の一態様として、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓの複製因子Ｃラージサブユニット由来のＰＩＰボックス及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む融合ポリペプチドが例示される。この融合ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４、６、８、１０、１２、２０、２２、２４、２６に示す。
【００３１】
本発明の融合ポリペプチドは、ＰＣＮＡとの解離定数（Ｋｄ）が１×１０−８〜２５×１０−７Ｍ、好ましくは３×１０−８〜１５×１０−７Ｍ、より好ましくは５×１０−８〜１０×１０−７Ｍの範囲であるものが好適である。
【００３２】
さらに、本発明の融合ポリペプチドは、ＰＣＮＡと結合するペプチドを有しないＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドに比べて長鎖のＤＮＡを増幅することが可能である。特に、８ｋｂ以上、好ましくは１２ｋｂ以上、より好ましくは１５ｋｂ以上の長さのＤＮＡを増幅することが可能である。ゆえに、本発明の融合ポリペプチドは伸長性に優れたＤＮＡポリメラーゼであるということができる。さらに、本発明の融合ポリペプチドは、ＰＣＮＡと結合するペプチドを有しないＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドに比べて短時間でＤＮＡを増幅することが可能である。言い換えれば、本発明の融合ポリペプチドは、迅速性に優れたＤＮＡポリメラーゼであるということである。即ち、本発明の融合ポリペプチドは融合前のポリペプチドと比較して、ＤＮＡ伸長に要する時間が短くできる。そのため、ＤＮＡ伸長時間が従来よりも短く設定された核酸増幅反応において非常に有用である。さらに各サイクルごとのＤＮＡ伸長時間を短くできることから、核酸増幅方法の全所要時間についても従来よりも短縮することが可能である。例えば、８ｋｂの長さのＤＮＡを、９９℃で５秒、６６℃で４分のシャトルＰＣＲを３０サイクル行うことで、増幅することが可能である。好ましくは１２ｋｂ以上、より好ましくは１５ｋｂ以上の長さのＤＮＡを、９９℃で５秒、６６℃で１２分のシャトルＰＣＲを３０サイクル行うことで、増幅することが可能である。
【００３３】
（２）本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸
【００３４】
本発明は、前記（１）の融合ポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明の核酸を組換えベクターに組み入れて、当業者にはよく知られた方法によって本発明の融合ポリペプチドを製造することができる。本発明の核酸のヌクレオチド配列において、宿主細胞における融合ポリペプチドの発現に最適なコドンとなるように、ヌクレオチドを置換してもよい。次いで、本発明の核酸を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して発現ベクターを作製する。上記核酸は、宿主において本発明の融合ポリペプチドが発現されるようにベクターに組み込まれることが必要であり、ベクターは、プロモーターの他、リボソーム結合配列（例えば、ＳＤ配列：Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ターミネーター、エンハンサー等のシスエレメント、選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子）等を含有することができる。本発明の融合ポリペプチドを生産し得る形質転換体は、前記の発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。
【００３５】
また前記本発明の核酸は、発現させたタンパク質の精製を容易にするために、アフィニティタグをコードする核酸をさらに含んでいてもよい。本発明を何ら限定するものではないが、アフィニティタグをコードする核酸としては、例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＢＰ）タグ、８残基のアミノ酸（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ）からなるＳｔｒｅｐ（ＩＩ）タグなどをコードする核酸である。当該タグを付加する位置は、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸の５’末端および／または３’末端側のいずれでもよく、発現およびタグ機能の障害とならない位置に適宜付加すればよい。なお、該タグは、発現させたタンパク質の精製段階において切断できるタグが好ましい。
【００３６】
発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能なベクターや宿主染色体に組み込まれ得るベクターを使用することができる。かかるベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、使用する宿主に適したプラスミド、例えば大腸菌由来のプラスミド、バチルス属細菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドが当業者に周知であり、また、市販されているものも多い。本発明にはこれら公知のプラスミドやその改変体を使用することができる。ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ）等を使用することができ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを使用することができる。
【００３７】
宿主細胞には、本発明の融合ポリペプチドを発現し得る限り、原核細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等のいずれを使用してもよい。
【００３８】
原核細胞を宿主細胞とする場合、例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：大腸菌）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を宿主細胞として使用することができる。異種タンパク質の製造に使用可能な大腸菌は当業者に周知であり、また、市販されているものも多い（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１等）。また、バチルス属細菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＩ１１４、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ２０７−２１等、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌であるＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ等が異種タンパク質の製造用宿主として知られている。これらの宿主細胞を適切な発現ベクターと組み合わせ、本発明の融合ポリペプチドの製造に使用することができる。この場合、発現ベクターに搭載するプロモーターは宿主に応じて選択することができ、例えば大腸菌ではｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターやそれらの改変体を使用することができるが、前記のものに限定されるものではない。さらに、ファージ由来のプロモーターとＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み合わせた発現系（例えばｐＥＴ発現系等）を利用してもよい。さらに、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞を宿主とする異種タンパク質発現系も数多く構築されており、また、すでに市販もされている。本発明の融合ポリペプチドの製造にはこれらの発現系を使用してもよい。
【００３９】
発現ベクターの宿主への導入方法としては、宿主に核酸を導入し得る方法であれば特に限定されず、例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を使用することができる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入し得る限り特に限定されず、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を使用することができる。ファージベクターやウイルスベクターは、これらベクターに応じた方法で宿主細胞への感染を実施し、本発明の融合ポリペプチドを発現する形質転換体を得ることができる。
【００４０】
本発明の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを導入した形質転換体を培養する。形質転換体の培養は、宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。発現ベクターに搭載されたプロモーターの種類によっては、適切な誘導操作（誘導剤の添加や培養温度の変更）が実施される。
【００４１】
本発明の融合ポリペプチドは形質転換体の培養物より採取される。ここで、「培養物」には、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞又は菌体の破砕物のいずれもが含まれる。本発明の融合ポリペプチドが形質転換体の細胞内に蓄積される場合には、培養物を遠心分離することにより細胞を集め、該細胞を洗浄した後に細胞を破砕して、目的とするタンパク質を抽出し、精製のための出発材料とする。本発明の融合ポリペプチドが形質転換体の細胞外に分泌される場合には、培養物をそのまま、もしくは遠心分離等により細胞を除去した培養上清を精製の出発材料とする。本発明の融合ポリペプチドは、前記の出発材料より溶媒抽出、硫安等による塩析、有機溶媒による沈殿、各種のクロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー等）等により精製することができる。
【００４２】
（３）本発明の融合ポリペプチドを用いた核酸増幅法
本発明の融合ポリペプチドは、ＰＣＮＡと組み合わせることにより長鎖長の核酸の増幅や反応時間を短縮した核酸増幅に使用することができる。本発明の核酸増幅法は、等温核酸増幅法や変温核酸増幅方法のいずれにも使用できる。特に限定はされないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＭＡＬＢＡＣ法  （Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｏｐｉｎｇ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｙｃｌｅｓ）、ＭＤＡ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、鎖置換型ＤＮＡ伸長反応（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅法（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＲＣＡ）、交差プライミング増幅法（ｃｒｏｓｓ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ループ介在等温増幅法（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）、ＩＣＡＮ法（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）等のいずれにも好適に使用できる。例えば、本発明の融合ポリペプチドとＰＣＮＡの組み合わせは高い伸長性が期待できることからゲノム解析やゲノム編集用の長鎖長のＤＮＡ調製において有効であり、等温核酸増幅法に利用できる。また、本発明の融合ポリペプチドとＰＣＮＡの組み合わせは、ＤＮＡ合成速度を向上させる高速反応性に優れていることから反応時間を短縮させた高速ＰＣＲに使用できる。特に本発明を限定するものではないが、環状構造の安定性が低下するような変異を導入されたＰＣＮＡは本発明の融合ポリペプチドと組み合わせるのに好適である。
【００４３】
本発明で使用するＰＣＮＡとしては、公知のＰＣＮＡもしくはその変異体が挙げられるが、好ましくは耐熱性のＰＣＮＡもしくはその変異体が使用される。特に限定はされないがＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのＰＣＮＡあるいはＴ．ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓのＰＣＮＡなどが例示される。さらに変異型ＰＣＮＡも本発明の核酸増幅用組成物に使用することができる。変異型ＰＣＮＡとしては、例えば国際公開ＷＯ２００７／００４６５４号パンフレットに記載された変異型ＰＣＮＡ、すなわち、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓのＰＣＮＡの第８２番目、第８４番目、第１０９番目、第１３９番目、第１４３番目、第１４７番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した配列を有する変異型ＰＣＮＡが例示される。本発明の特に好ましい態様では、第１４３番目のアミノ酸残基をアスパラギン酸からアルギニン（Ｄ１４３Ｒ）に換えた配列を有する変異型ＰＣＮＡが例示される。本形態の変異型ＰＣＮＡは、下記実施例に示されるように、ＤＮＡ複製反応の伸長性および反応速度などについてバランス良く特に優れた補助作用を発揮する。
【００４４】
また本発明の核酸増幅法では、本発明の融合ポリペプチドとは異なるＤＮＡポリメラーゼと組み合わせてもよい。例えば、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを使用して作製された本発明の融合ポリペプチドは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するα型ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて核酸増幅法に使用してもよい。なお、このような３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の異なる２種類のＤＮＡポリメラーゼを含む反応液でＰＣＲを行う技術は、ＬＡ−ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  ＰＣＲ）として知られている。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドが異なる２種類の本発明の融合ポリペプチドの組み合わせであってもよい。
【００４５】
また、本発明の核酸増幅法においてプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、鋳型となる核酸の核酸配列に相補的な配列を有しており、使用される反応条件において鋳型となる核酸にハイブリダイズするものであれば特に限定されるものではない。プライマーの鎖長は、ハイブリダイゼーションの特異性の観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えば公知の方法により化学的に合成することができる。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば天然の試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作製しても良い。
【００４６】
さらに本発明の核酸増幅法は、リアルタイム検出技術と組み合わせてもよい。当該リアルタイム検出では、インターカーレーターや蛍光標識プローブを使用して、増幅反応と並行して増幅産物が経時的に検出される。インターカーレーターとしてはＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉやその他の核酸結合性色素が、蛍光標識プローブとしてはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、ＣｙＣｌｅａｖｅ（登録商標）プローブ、あるいはモレキュラービーコンプローブ等が、それぞれ挙げられる。
【００４７】
（４）本発明の融合ポリペプチドを含有する核酸増幅用組成物
本発明により得られる融合ポリペプチドは、上記（３）の核酸増幅法に使用可能な核酸増幅用組成物のコンポーネントとして使用する事ができる。さらに、核酸増幅用組成物はＤＮＡポリメラーゼの活性に必要な要素、例えば二価金属塩（マグネシウム塩等）、ｄＮＴＰ、ｐＨ維持のための緩衝成分等を含んでいてもよい。
【００４８】
好適には、本発明の核酸増幅用組成物は、本発明の融合ポリペプチドに加えてさらにＰＣＮＡを含有することができる。核酸増幅用組成物に含有されるＰＣＮＡとしては、上記（３）で説明したＰＣＮＡもしくはその変異体が使用できる。
【００４９】
また、本発明の組成物には、本発明の融合ポリペプチドとは異なるＤＮＡポリメラーゼが含まれていても良い。例えば、ポルＩ型ＤＮＡポリメラーゼを使用して作製された本発明の融合ポリペプチドは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するα型ＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて組成物を調製してもよい。
【００５０】
本発明の組成物に含まれる二価金属塩を構成する二価金属イオンとしては、マグネシウムイオン、マンガンイオン、及びコバルトイオンが例示される。各ＤＮＡポリメラーゼに適する二価金属イオンとその濃度は、当該分野で知られている。二価金属イオンは塩化物、硫酸塩、又は酢酸塩等の塩の形態で供給され得る。本発明を特に限定するものではないが、本発明の組成物中の二価金属イオンの濃度としては、例えば０．５〜２０ｍＭが例示される。
【００５１】
本発明には、ｄＮＴＰ、すなわちデオキシリボヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）及びそれらの誘導体の少なくとも１種が使用される。本発明の組成物に含まれるデオキシリボヌクレオチド三リン酸としては、好適にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの４種類の混合物が例示される。
【００５２】
また本発明の組成物は、緩衝成分を含んでいてもよい。当該成分は特に限定はされないが例えば、反応溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）の変動を和らげる作用を持つ化合物又は混合物のことをいう。一般に弱酸とその塩、あるいは弱塩基とその塩の混合溶液は強い緩衝作用を持つので、反応緩衝剤としてｐＨコントロールの目的で広く用いられている。本発明を特に限定するものではないが、本発明の組成物のｐＨは、ＰＣＲが実施される通常の範囲、例えばｐＨ８．０〜９．５の範囲に設定されるのが適当である。
【００５３】
さらに本発明の組成物には、リアルタイム検出用の成分を含んでいてもよい。特に限定はされないがインターカーレーターや蛍光標識プローブと組み合わせることができる。
【００５４】
（５）本発明の融合ポリペプチドを含有するキット
本発明の融合ポリペプチドを含有するキットは、本発明の一態様である。好適には、上記（１）に記載の融合ポリペプチドに加え、さらにＰＣＮＡを含有するキットが例示される。キットに含有されるＰＣＮＡとして、特に好適には上述の環状構造をより不安定化させた変異型ＰＣＮＡが挙げられる。本発明のキットは、さらに二価金属塩（マグネシウム塩等）、ｄＮＴＰ、ｐＨ維持のための緩衝成分等、本発明の核酸増幅用組成物の調製に使用される成分を個別のコンポーネントとして含有してもよく、これらのうちの複数を組み合わせて作製されたコンポーネントを含有してもよい。
【００５５】
さらに、リアルタイム検出用の成分をコンポーネントとして含んでいてもよい。特に限定はされないがインターカーレーターや蛍光標識プローブ等が例示される。
【００５６】
（６）本発明の鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡの製造方法
本発明の融合ポリペプチドならびにＰＣＮＡを含有する組成物は、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡの製造方法に使用することができる。ＤＮＡの製造方法には、上記（３）の核酸増幅方法が利用できる。これらの核酸増幅方法で製造したＤＮＡを利用することにより、標的核酸の塩基配列を決定したり、標的核酸を標識化したり、標的核酸に部位特異的変異を導入することも可能である。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されないものとする。【００５８】
実施例１  ＰＩＰボックス付きＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの精製
配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端またはＣ末端に、配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列を有するＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓの複製因子Ｃラージサブユニット（以下、ＰｆｕＲＦＣＬとする）のＰＩＰボックスを、リンカーペプチドを介して付加した。Ｎ末端にＰＩＰボックスが付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑ８１〜Ｔａｑ８５（ＰＩＰ−Ｌ５−Ｔａｑ、ＰＩＰ−Ｌ１０−Ｔａｑ、ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ、ＰＩＰ−Ｌ３５−Ｔａｑ、ＰＩＰ−Ｌ４７−Ｔａｑ）の５種類であり、Ｃ末端にＰＩＰボックスが付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑ９２〜Ｔａｑ９４（Ｔａｑ−Ｌ５−ＰＩＰ、Ｔａｑ−Ｌ１０−ＰＩＰ、Ｔａｑ−Ｌ１５−ＰＩＰ）の３種類である。さらに、Ｎ末端にＰＩＰボックスが２〜５個付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを作成した。すなわち、Ｔａｑ９５（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）、Ｔａｑ９６（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）、Ｔａｑ９７（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）、Ｔａｑ９８（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）の４種類である。本明細書におけるＰＩＰボックス付きＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの名称及び構造を表２に示す。表２の「構造」欄の「Ｌ」の後ろに付された数字は、セリン残基とグリシン残基の繰り返しから成るリンカーペプチドの長さ（アミノ酸残基数）を示す。【００５９】
【表２】
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【００６０】
（１）Ｔａｑ８１（ＰＩＰ−Ｌ５−Ｔａｑ）発現プラスミド
配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を鋳型として、配列表の配列番号２８記載の塩基配列を有するＴａｑＮＰＩＰ−５プライマーおよび配列表の配列番号２９記載の塩基配列を有するＴａｑ−３プライマーでＰＣＲを行った。
ＰＣＲ酵素はＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  Ｎｅｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用い、ＰＣＲの条件は、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３分を１サイクルとした３０サイクル反応で行った。増幅した断片をアガロースゲル電気泳動により精製した後、制限酵素ＮｄｅＩ（タカラバイオ社製）およびＮｏｔＩ（タカラバイオ社製）で切断した。この断片を同制限酵素で切断されたｐＥＴ２１ａ（ノバジェン社製）にライゲーションした。大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）をライゲーション産物で形質転換した後、ＬＢ−アンピシリンプレートに撒いた。生じたコロニーからプラスミドを精製し、塩基配列を読み、配列番号５の塩基配列が含まれていることを確認した。このプラスミドをｐＴａｑ８１と命名した。【００６１】
（２）Ｔａｑ８２（ＰＩＰ−Ｌ１０−Ｔａｑ）発現プラスミド
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いた部位特異的変異法によって、Ｔａｑ８１のＰＩＰボックスとリンカーペプチドの間に５アミノ酸が挿入されたポリペプチドをコードするＤＮＡ（配列番号７）を作製した。
鋳型としてｐＴａｑ８１、プライマーに、配列表の配列番号３０及び３１記載の塩基配列をそれぞれ有するｔａｑＮ１０−５およびｔａｑＮ１０−３を用いて、９５℃で３０秒、５５℃で６０秒、６８℃で８分を１サイクルとした１４サイクルのＰＣＲを行った。続いて、ＤｐｎＩで消化した反応液１μＬで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した後、ＬＢ−アンピシリンプレートに撒いた。生じたコロニーからプラスミドを精製し、塩基配列を読み、配列番号７の塩基配列が含まれていることを確認した。このプラスミドをｐＴａｑ８２と命名した。【００６２】
（３）Ｔａｑ８３（ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）発現プラスミド
実施例１（２）記載の変異導入方法で、Ｔａｑ８１のＰＩＰボックスとリンカーペプチドの間に１０アミノ酸に該当する配列を挿入したＴａｑ８３（ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、ｐＴａｑ８１を鋳型とし、使用するプライマーを配列表の配列番号３２及び３３記載の塩基配列をそれぞれ有するｔａｑＮ１５−５およびｔａｑＮ１５−３に変更してＰＣＲを行い、配列番号９の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをｐＴａｑ８３と命名した。【００６３】
（４）Ｔａｑ８４（ＰＩＰ−Ｌ３５−Ｔａｑ）発現プラスミド
実施例１（２）記載の変異導入方法で、Ｔａｑ８３のＰＩＰボックスとリンカーペプチドの間に２０アミノ酸に該当する配列を挿入したＴａｑ８４（ＰＩＰ−Ｌ３５−Ｔａｑ）発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、ｐＴａｑ８３を鋳型とし、配列表の配列番号３４及び３５記載の塩基配列をそれぞれ有するｔａｑ−ｐｌｕｓ２０−５およびｔａｑ−ｐｌｕｓ２０−３の２つのプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番号１１の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをｐＴａｑ８４と命名した。【００６４】
（５）Ｔａｑ８５（ＰＩＰ−Ｌ４７−Ｔａｑ）発現プラスミド
実施例１（２）記載の変異導入方法で、Ｔａｑ８４のリンカーペプチドの１４番目と１５番目のアミノ酸の間に１２アミノ酸に該当する配列を挿入したＴａｑ８５（ＰＩＰ−Ｌ４７−Ｔａｑ）発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、ｐＴａｑ８４を鋳型とし、配列表の配列番号３６及び３７記載の塩基配列をそれぞれ有するＴａｑ−ｐｌｕｓ１２−５およびＴａｑ−ｐｌｕｓ１２−３の２つのプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番号１３の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをｐＴａｑ８５と命名した。【００６５】
（６）Ｔａｑ９２（Ｔａｑ−Ｌ５−ＰＩＰ）発現プラスミド
配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を鋳型として、配列表の配列番号３８及び３９記載の塩基配列をそれぞれ有するＴａｑ−５およびＴｑ−Ｌ５−ＰＩＰ−３の２つのプライマーを使用し、実施例１（１）記載の操作でＰＣＲ、ライゲーション、形質転換及びプラスミド精製を行った。こうして得られた、配列番号１５の塩基配列が含まれているプラスミドをｐＴａｑ９２と命名した。【００６６】
（７）Ｔａｑ９３（Ｔａｑ−Ｌ１０−ＰＩＰ）発現プラスミド
配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を鋳型として、配列表の配列番号３８及び４０記載の塩基配列をそれぞれ有するＴａｑ−５およびＴｑ−Ｌ１０−ＰＩＰ−３の２つのプライマーを使用し、実施例１（１）記載の条件でＰＣＲ、ライゲーション、形質転換及びプラスミド精製を行った。こうして得られた、配列番号１７の塩基配列が含まれているプラスミドをｐＴａｑ９３と命名した。【００６７】
（８）Ｔａｑ９４（Ｔａｑ−Ｌ１５−ＰＩＰ）発現プラスミド
配列表の配列番号２記載の塩基配列を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を鋳型として、配列表の配列番号３８及び４１記載の塩基配列をそれぞれ有するＴａｑ−５およびＴｑ−Ｌ１５−ＰＩＰ−３を使用して実施例１（１）記載の条件でＰＣＲ、ライゲーション、形質転換及びプラスミド精製を行った。こうして得られた、配列番号１９の塩基配列が含まれているプラスミドをｐＴａｑ９４と命名した。【００６８】
（９）Ｔａｑ９５（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）発現プラスミド
実施例１（２）記載の変異導入方法で、Ｔａｑ８３のＰＩＰボックスとリンカーペプチドの間にＰＩＰボックスとリンカーペプチドに該当する配列を挿入したＴａｑ９５（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、ｐＴａｑ８３を鋳型とし、配列表の配列番号４８及び２９記載の塩基配列をそれぞれ有するＴａｑ９５−５およびＴａｑ−３の２つのプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番号２１の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをｐＴａｑ９５と命名した。【００６９】
（１０）Ｔａｑ９６（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）発現プラスミド
実施例１（２）記載の変異導入方法で、Ｔａｑ９５のＰＩＰボックスとリンカーペプチドの間にＰＩＰボックスとリンカーペプチドに該当する配列を挿入したＴａｑ９６（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、ｐＴａｑ９５を鋳型とし、配列表の配列番号４９及び２９記載の塩基配列をそれぞれ有するＴａｑ９６−５およびＴａｑ−３の２つのプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番号２３の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをｐＴａｑ９６と命名した。【００７０】
（１１）Ｔａｑ９７（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）発現プラスミド
実施例１（２）記載の変異導入方法で、Ｔａｑ９６のＰＩＰボックスとリンカーペプチドの間にＰＩＰボックスとリンカーペプチドに該当する配列を挿入したＴａｑ９７（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、ｐＴａｑ９６を鋳型とし、配列表の配列番号５０及び２９記載の塩基配列をそれぞれ有するＴａｑ９７−５およびＴａｑ−３の２つのプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番号２５の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをｐＴａｑ９７と命名した。【００７１】
（１２）Ｔａｑ９８（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）発現プラスミド
実施例１（２）記載の変異導入方法で、Ｔａｑ９７のＰＩＰボックスとリンカーペプチドの間にＰＩＰボックスとリンカーペプチドに該当する配列を挿入したＴａｑ９８（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）発現プラスミドを構築した。
本変異導入では、ｐＴａｑ９７を鋳型とし、配列表の配列番号５１及び２９記載の塩基配列をそれぞれ有するＴａｑ９８−５およびＴａｑ−３の２つのプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列番号２７の塩基配列が含まれているプラスミドを得た。このプラスミドをｐＴａｑ９８と命名した。【００７２】
（１３）ＰＩＰボックス付きＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの調製
大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（アジレント社製）を前記それぞれの発現プラスミド（ｐＴａｑ８１〜ｐＴａｑ８５及びｐＴａｑ９２〜ｐＴａｑ９４）で形質転換し、得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬアンピシリン及び３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１Ｌで振盪培養した。ＯＤ６００が０．２−０．３に達したところでＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように加えてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを発現誘導した後、さらに２５℃で約１８時間振盪培養した。培養後に菌体を回収し、ＰＢＳ溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）を用いて菌体を洗浄した後、再び菌体を回収し、−８０℃で保存した。【００７３】
凍結した菌体に１ｍＭ  ＰＭＳＦ（ナカライテスク社製）を含む溶液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２０ｍＬを加え、氷上で超音波破砕（１０秒  ｏｎ、１０秒  ｏｆｆ／ｔｏｔａｌ  １０分  ｏｎ）を行った。破砕液を遠心分離（２３７０８×ｇ、１０分、４℃）し、得られた上清を熱処理（７５℃、３０分）して再び遠心分離（２３７０８×ｇ、１０分、４℃）を行った。得られた上清に終濃度が１ＭとなるようにＮａＣｌを加え、さらに終濃度が０．１５％となるように５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンイミン溶液（ｐＨ８．０）を加えて氷上で２０分間静置した後、遠心分離（２３７０８×ｇ、１０分、４℃）を行った。得られた上清に８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを低温下でゆっくり加え、４℃で一晩静置した後、遠心分離（２３７０８×ｇ、１０分、４℃）した。得られた沈殿を、１Ｍ硫酸アンモニウムを含む溶液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ８．０）に懸濁し、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いて疎水カラムＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ  ５ｍＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に供した。溶液Ｂを用いて１Ｍから０Ｍまでの硫酸アンモニウム濃度勾配によってタンパク質を溶出させた。得られた溶出画分を溶液Ｃ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に対して一晩透析した後、透析溶液をアフィニティーカラムＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ  ５ｍＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に供し、５０ｍＭから１Ｍまでの塩化ナトリウム濃度勾配によってタンパク質を溶出させ、この溶出画分を最終精製産物とした。最終精製産物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢ染色により検出した。その結果を図１及び図２に示す。【００７４】
図１及び図２に示したように、野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰＩＰボックスが融合した融合タンパク質であるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｔａｑ８１〜Ｔａｑ８５及びＴａｑ９２〜Ｔａｑ９４）が単一に精製できた。また、同様の方法でＴａｑ９５〜Ｔａｑ９８も単一に精製できた。【００７５】
実施例２  ＳＰＲ法を用いた物理的相互作用解析
（１）方法
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析は、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｊ（ＢＩＡＣＯＲＥ社製）を用いた。Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓのＰＣＮＡ（Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１８１巻、第６５９１〜６５９９頁、１９９９年：以下ＰｆｕＰＣＮＡと記載する）をアミンカップリングによりＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）上に固定し、２５℃、流速３０μＬ／分、溶液Ｅ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．３）の条件下で測定を行った。１０、２０、４０、８０、１６０、３２０ｎＭに希釈したＴａｑ８１〜Ｔａｑ８５の試料溶液、もしくは１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、２μＭに希釈したＴａｑ９４の試料溶液をそれぞれ２分間添加した。得られたセンサーグラムをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍにより解析し、Ｔａｑ８１〜Ｔａｑ８５とＰｆｕＰＣＮＡおよびＴａｑ９４とＰｆｕＰＣＮＡの解離定数（Ｋｄ）を算出した。【００７６】
（２）結果
ＳＰＲ解析の結果を図３に示す。リンカーペプチドの長さが違う、Ｎ末端にＰＩＰボックスが付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ５種（Ｔａｑ８１、Ｔａｑ８２、Ｔａｑ８３、Ｔａｑ８４およびＴａｑ８５）とＰｆｕＰＣＮＡの結合に関する解離定数（Ｋｄ）を算出したところ、それぞれ７．１×１０−７Ｍ、４．４×１０−７Ｍ、２．４×１０−７Ｍ、２．５×１０−７Ｍ、２．０×１０−７Ｍであり、リンカーペプチドの長さに関わらずほぼ同等の値となった。この結果は、リンカーペプチドの長さに関わらず、Ｎ末端にＰＩＰボックスが付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとＰｆｕＰＣＮＡとの相互作用の強さがほぼ一定であることを示す。【００７７】
一方、Ｔａｑ９４とＰｆｕＰＣＮＡの解離定数（Ｋｄ）を算出したところ、２．５×１０−６Ｍであった。これはＴａｑ８１〜Ｔａｑ８５の解離定数の約１０倍であり、この結果から、Ｃ末端にＰＩＰボックスが付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとＰｆｕＰＣＮＡとの相互作用が弱いことが確認できた。【００７８】
実施例３  ＰＣＲによるＤＮＡの増幅
（１）１ｋｂのＤＮＡ増幅
実施例１（１３）で調製したＴａｑ８１〜Ｔａｑ８５を用いてラムダＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。反応液組成は、１ｎＭのＴａｑ８１〜Ｔａｑ８５、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１ｎｇ  ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ、各０．４μＭ  プライマーとし、反応液の最終容量は５０μＬとした。反応は９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒を１サイクルとして３０サイクル行った。
本ＰＣＲでは、配列表の配列番号４２及び４３記載の塩基配列をそれぞれ有するＦ１およびＲ２−２の２つのプライマーを用いた。得られた生成物を１％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色した。その結果、図４に示したように、市販のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（レーン１）、野生型のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（レーン２）およびＴａｑ８１〜Ｔａｑ８５（レーン３〜７）とも１ｋｂの位置にバンドが見られた。この結果から、Ｎ末端に付加したＰＩＰボックスおよびリンカーペプチドがＰＣＲに影響しないことが確認できた。【００７９】
（２）８ｋｂのＤＮＡ増幅
次に、ＰＣＮＡ非存在下および存在下でＰＣＲを行った。反応液組成は、１ｎＭの野生型Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ又はＴａｑ８１〜Ｔａｑ８５、国際公開ＷＯ２００７／００４６５４号パンフレット  実施例記載の方法で調製した４０ｎＭのＰｕｆＰＣＮＡ  Ｄ１４３Ｒ変異体（ＰＣＮＡ１３）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１ｎｇ  ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡ、各０．４μＭ  プライマーとし、反応液の最終容量は５０μＬとした。最初に反応液を９５℃で１分インキュベートした後、９９℃で５秒、６６℃で４分のシャトルＰＣＲを３０サイクル行った。本ＰＣＲでは、配列表の配列番号４４及び４５記載の塩基配列をそれぞれ有するＬＦ−３５およびＬＲ８−３５の２つのプライマーを用いた。得られた生成物を１％アガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色した。その結果、図５に示したように、野生型のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼでは、ＰＣＮＡ非存在下（レーン１）でもＰＣＮＡ存在下（レーン２）でも、８ｋｂの位置にバンドはほとんど見られなかったのに対し、Ｔａｑ８１〜Ｔａｑ８５では、ＰＣＮＡ非存在下ではバンドはほとんど見られなかった（レーン３、５、７、９、１１）が、ＰＣＮＡ存在下で、８ｋｂの位置に濃いバンドが見られた（レーン４、６、８、１０、１２）。
このことは、Ｎ末端にＰＩＰボックスが付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ８１〜Ｔａｑ８５がＰＣＮＡ存在下で８ｋｂのＤＮＡ増幅が可能であることを示す。
一方、図６に示したように、Ｃ末端にＰＩＰボックスが付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ９２〜Ｔａｑ９３は、ＰＣＮＡ存在下でも８ｋｂのＤＮＡ増幅はできなかった。【００８０】
（３）１２ｋｂおよび１５ｋｂのＤＮＡ増幅
１２ｋｂ及び１５ｋｂのＤＮＡ増幅について検討した。１２ｋｂ増幅においては、配列表の配列番号４４及び４６記載の塩基配列をそれぞれ有するＬＦ−３５およびＬＲ１２−３５の２つのプライマー、１５ｋｂのＤＮＡ増幅においては、配列表の配列番号４４及び４７記載の塩基配列をそれぞれ有するＬＦ−３５およびＬＲ１５−３５の２つのプライマー、を使用した点を除き、実施例３−（２）同様に反応液を調製した。【００８１】
ＰＣＲ条件は、最初に反応液を９５℃で１分インキュベートした後、次に９９℃で５秒、６６℃で１２分のシャトルＰＣＲを３０サイクル行った。得られた生成物の解析は、実施例３（２）と同様にして行った。その結果を図７及び図８に示す。【００８２】
図７に示したように、１２ｋｂのＤＮＡ増幅では、野生型のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＮＡ非存在下（レーン１）およびＰＣＮＡ存在下（レーン２）でバンドは現れなかったが、Ｔａｑ８１〜Ｔａｑ８５（レーン４、６、８、１０、１２）では、ＰＣＮＡ存在下で１２ｋｂの位置にバンドが現れた。同様に、図８に示したように１５ｋｂのＤＮＡ増幅においても、Ｔａｑ８１〜Ｔａｑ８５（レーン４、６、８、１０、１２）ではＰＣＮＡ存在下でバンドが確認できた。
このことは、Ｔａｑ８１〜Ｔａｑ８５がＰＣＮＡ存在下で１２ｋｂおよび１５ｋｂのＤＮＡ増幅が可能であることを示す。
また、本実施例で採用したシャトルＰＣＲの条件は、従来のシャトルＰＣＲの条件に比べてプライマーのアニーリングと相補鎖ＤＮＡの伸長にかかる時間が短い。それにもかかわらず従来と同じ長鎖長のＤＮＡを増幅できたことから迅速性においても優れていることが確認できた。【００８３】
実施例４  ＰＩＰボックスが複数個付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ
実施例１（１３）で調製したＴａｑ９５（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）、Ｔａｑ９６（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）、Ｔａｑ９７（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）およびＴａｑ９８（ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１４−ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）を用いて、実施例３（３）と同様にして、ＰＣＮＡ存在下で１２ｋｂのＰＣＲを行った。その結果を図９に示す。さらに、ＬＡＳ−３０００ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて増幅産物の定量を行った。上記ＰＣＲから定量までを３回繰り返し、Ｔａｑ８３（ＰＩＰ−Ｌ１５−Ｔａｑ）の増幅産物を１とした時の相対値をグラフ化した。その結果を図１０に示す。【００８４】
図９及び図１０に示したように、ＰＩＰボックスが複数個付加されたＴａｑ９５〜Ｔａｑ９８はＰＩＰボックスが１個のＴａｑ８３に比べてより多くの増幅産物が確認できた。特に、ＰＩＰボックスが３個付加されたＴａｑ９６において、もっとも増幅産物が多くなった。
このことは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端にＰＩＰボックスを複数個付加することにより、効率的なＤＮＡ増幅が可能となることを示す。【００８５】
実施例５  種々の配列を有するＰＩＰボックスが付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ
実施例１で使用した配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰＩＰボックスに代えて、表１に記載の配列表の配列番号５２〜９１に記載のアミノ酸配列を有するいずれかのペプチド（即ち、ＰＩＰボックス）を使用して、実施例１に記載された方法に準じて、いずれかのＰＩＰボックスがＮ末端に付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを精製する。かかるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、実施例３に記載された方法に準じて、ＰＣＮＡ存在下でＤＮＡ増幅を実施する。
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰＩＰボックスに代えて、表１に記載のいずれかのペプチドを使用する場合、前者と同様の効果が期待できる。【００８６】
さらに、実施例４に記載された方法に準じて、実施例１で使用した配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰＩＰボックスに代えて、表１に記載の配列表の配列番号５２〜９１に記載のアミノ酸配列を有するいずれかのペプチドが複数個Ｎ末端に付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＮＡ存在下でＰＣＲを行う。
配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＰＩＰボックスに代えて、表１に記載のいずれかのペプチドを使用する場合、前者と同様の効果が期待できる。【００８７】
なお、配列番号５２〜９１に記載のアミノ酸配列を有するいずれかのペプチドが付加されたＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの精製に使用する具体的なプライマーや、かかるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてのＤＮＡ増幅に使用する具体的なプライマーは、本願明細書の記載や前述の実施例を参考にして調製する。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明により、より便利で使い易く、伸長性及び迅速性に優れたファミリーＡ（ポルＩ型）ＤＮＡポリメラーゼ変異体と当該ポリメラーゼを用いた核酸増幅法が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、特にＰＣＮＡ存在下での核酸増幅に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
SEQ ID NO: 1: Taq DNA polymerase amino acid sequence
SEQ ID NO: 2: Taq DNA polymerase nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 3: Pyrococcus furiosus RFC-L PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 4: DNA polymerase variant Taq81 amino acid sequence
SEQ ID NO: 5: DNA polymerase variant Taq81 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 6: DNA polymerase variant Taq82 amino acid sequence
SEQ ID NO: 7: DNA polymerase variant Taq82 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 8: DNA polymerase variant Taq83 amino acid sequence
SEQ ID NO: 9: DNA polymerase variant Taq83 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 10: DNA polymerase variant Taq84 amino acid sequence
SEQ ID NO: 11: DNA polymerase variant Taq84 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 12: DNA polymerase variant Taq85 amino acid sequence
SEQ ID NO: 13: DNA polymerase variant Taq85 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 14: DNA polymerase variant Taq92 amino acid sequence
SEQ ID NO: 15: DNA polymerase variant Taq92 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 16: DNA polymerase variant Taq93 amino acid sequence
SEQ ID NO: 17: DNA polymerase variant Taq93 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 18: DNA polymerase variant Taq94 amino acid sequence
SEQ ID NO: 19: DNA polymerase variant Taq94 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 20: DNA polymerase variant Taq95 amino acid sequence
SEQ ID NO: 21: DNA polymerase variant Taq95 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 22: DNA polymerase variant Taq96 amino acid sequence
SEQ ID NO: 23: DNA polymerase variant Taq96 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 24: DNA polymerase variant Taq97 amino acid sequence
SEQ ID NO: 25: DNA polymerase variant Taq97 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 26: DNA polymerase variant Taq98 amino acid sequence
SEQ ID NO: 27: DNA polymerase variant Taq98 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 28: TaqNPIP-5 primer
SEQ ID NO: 29: Taq-3 primer
SEQ ID NO: 30: taqN10-5 primer
SEQ ID NO: 31: taqN10-3 primer
SEQ ID NO: 32: taqN15-5 primer
SEQ ID NO: 33: taqN15-3 primer
SEQ ID NO: 34: taq-plus20-5 primer
SEQ ID NO: 35: taq-plus20-3 primer
SEQ ID NO: 36: Taq-plus12-5 primer
SEQ ID NO: 37: Taq-plus12-3 primer
SEQ ID NO: 38: Taq-5 primer
SEQ ID NO: 39: Tq-L5-PIP-3 primer
SEQ ID NO: 40: Tq-L10-PIP-3 primer
SEQ ID NO: 41: Tq-L15-PIP-3 primer
SEQ ID NO: 42: F1 primer
SEQ ID NO: 43: R2-2 primer
SEQ ID NO: 44: LF-35 primer
SEQ ID NO: 45: LR8-35 primer
SEQ ID NO: 46: LR12-35 primer
SEQ ID NO: 47: LR15-35 primer
SEQ ID NO: 48: Taq95-5 primer
SEQ ID NO: 49: Taq96-5 primer
SEQ ID NO: 50: Taq97-5 primer
SEQ ID NO: 51: Taq98-5 primer
SEQ ID NO: 52: P. furiosus RFC-L PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 53: M.jannaschii RFC-L PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 54: P. furiosus PolBI PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 55: T.litoralis PolBI PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 56: A.fulgidus PolBI PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 57: P.occultum PolBII PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 58: M.jannaschii DP2 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 59: M.thermoautotrophicum DP2 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 60: H.sapiens Polδ p66 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 61: S.cerevisiae Pol32 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 62: S.pombe Cdc27 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 63: S.cerevisiae Pol2 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 64: P.furiosus Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 65: M.jannaschii Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 66: A.fulgidus Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 67: H.sapiens Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 68: D.melanogaster Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 69: S.cerevisiae Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 70: S.pombe Fen1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 71: H.sapiens DNA ligase I PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 72: X.laevis DNA ligase I PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 73: S.cerevisiae DNA ligase I PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 74: S.pombe DNA ligase I PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 75: H.sapiens MSH3 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 76: S.cerevisiae MSH3 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 77: H.sapiens MSH6 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 78: S.cerevisiae MSH6 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 79: H.sapiens UNG2 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 80: S.cerevisiae UNG PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 81: H.sapiens hMYH PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 82: H.sapiens XPG PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 83: C.elegans XPG PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 84: S.cerevisiae XPG PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 85: S.pombe XPG PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 86: S.cerevisiae Cac1 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 87: H.sapiens hRECQ5 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 88: S.cerevisiae Rrm3 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 89: H.sapiens Cdc25C PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 90: H.sapiens p15 PIP-box amino acid sequence
SEQ ID NO: 91: H.sapiens DNA-dependent protein kinase PIP-box amino acid sequence
【図１】
2017090685.tif 000005
【図２】
2017090685.tif 000006
【図３】
2017090685.tif 000007
【図４】
2017090685.tif 000008
【図５】
2017090685.tif 000009
【図６】
2017090685.tif 000010
【図７】
2017090685.tif 000011
【図８】
2017090685.tif 000012
【図９】
2017090685.tif 000013
【図１０】
2017090685.tif 000014
【配列表】
2017090685000001.app
【国際調査報告】
2017090685.tif 000015
2017090685.tif 000016
2017090685.tif 000017
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