(57)【要約】  本発明は、乾燥時のゼラチン粒子の長径をａ、前記乾燥時のゼラチン粒子を４０℃の水中に大気圧下で６０分間浸漬して得られる膨潤処理後のゼラチン粒子の長径をｂとするとき、ｂ／ａで表される膨潤度は１．０以上１０．０以下であり、前記膨潤処理後のゼラチン粒子の粒子径は１．０ｎｍ以上５．０μｍ以下である、ゼラチン粒子に関する。本発明のゼラチン粒子は、細胞自らによる取り込みがなされやすい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥時のゼラチン粒子の長径をａ、前記乾燥時のゼラチン粒子を４０℃の水中に大気圧下で６０分間浸漬して得られる膨潤処理後のゼラチン粒子の長径をｂとするとき、ｂ／ａで表される膨潤度は１．０以上１０．０以下であり、前記膨潤処理後のゼラチン粒子の粒子径は１．０ｎｍ以上５．０μｍ以下である、ゼラチン粒子。
【請求項２】
前記乾燥時のゼラチン粒子のアスペクト比は１．０以上１．４以下である、請求項１に記載のゼラチン粒子。
【請求項３】
前記膨潤処理後のゼラチン粒子の長径ｂは２．０μｍ以下である、請求項１または２に記載のゼラチン粒子。
【請求項４】
造影剤を担持している、請求項１〜３のいずれか１項に記載のゼラチン粒子。
【請求項５】
前記ゼラチンは架橋されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のゼラチン粒子。
【請求項６】
溶融したゼラチンを含む液体の液滴を、前記液滴との温度差が２３５℃以下である加熱管または乾燥室の雰囲気中で、吐出して乾燥させることによりゼラチン粒子を得る、ゼラチン粒子の製造方法。
【請求項７】
前記液滴は、インクジェットヘッドのノズルから吐出される、請求項６に記載のゼラチン粒子の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のゼラチン粒子を細胞膜の内側に有する、ゼラチン粒子内包細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のゼラチン粒子と細胞とを液体に添加して、前記細胞の活動により前記ゼラチン粒子を前記細胞の細胞膜の内側に取り込ませる、ゼラチン粒子内包細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゼラチン粒子、ゼラチン粒子の製造方法、ゼラチン粒子内包細胞、およびゼラチン粒子内包細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゼラチンは、生体適合性が高く、かつ体内で分解して容易に吸収される性質を有する。そのため、粒子状に形成したゼラチンに試薬および薬剤などの物質（以下、単に「試薬等」ともいう。）を内包させて生体内に運搬し、これらの物質を生体内で放出させる技術が開発されている。【０００３】
たとえば、特許文献１には、ゼリー強度が８０〜１２０ｇの熱架橋されたゼラチンからなり、膨潤前の乾燥粒子の粒子径が２０〜１６００μｍであり、膨潤後の乾燥粒子の粒子径が５０〜２０００μｍである、中実休形状の膨潤ゼラチン粒子が記載されている。特許文献１によれば、この膨潤ゼラチン粒子は、保形性に優れ、かつ、外部応力が加わって変形しても破砕しにくいため、マイクロカテーテルまたは注射針を用いた血管内への投与に適しているとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−５８４６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に記載のゼラチン粒子は、血管や臓器などの内部に投与して試薬等を運搬および放出させる、いわゆるドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）用途に好適に用いられると考えられる。【０００６】
一方で、近年、生細胞の内部に試薬等を直接導入する技術に対する要求が高まっている。たとえば、生細胞に造影剤を導入すれば、非破壊で細胞の活性を検査することができる。また、造影剤を導入した生細胞を患者に移植すれば、移植した細胞が定着したか否かを、移植部位を再切開せずに低侵襲で外部から観察することができる。ゼラチンは生体適合性が高いため、ゼラチン粒子は、生細胞の内部に導入する試薬等を担持する担体としても好適であると考えられる。【０００７】
生細胞の内部に試薬等を担持するゼラチン粒子を導入する方法として、エレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法が考えられる。しかし、これらの方法は、細胞膜の形状を変化させて試薬等を細胞膜の内部に導入するため、細胞膜を部分的に破壊して細胞の活性を低下させるおそれがある。この細胞の活性の低下を最小限に抑える観点からは、試薬等は、細胞自らの活動によって取り込まれることが好ましく、そのためには、試薬等を担持するゼラチン粒子も、細胞自らの活動によって取り込まれやすいことが望ましい。しかし、本発明者らの知見によれば、特許文献１に記載のゼラチン粒子は、細胞自らの活動による細胞内への取り込みがなされにくかった。【０００８】
本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであり、細胞自らの活動による取り込みがなされやすいゼラチン粒子、そのようなゼラチン粒子の製造方法、そのようなゼラチン粒子を有する細胞、およびそのようなゼラチン粒子を有する細胞の製造方法を提供することを、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の課題は、以下の手段によって解決される。
［１］乾燥時のゼラチン粒子の長径をａ、前記乾燥時のゼラチン粒子を４０℃の水中に大気圧下で６０分間浸漬して得られる膨潤処理後のゼラチン粒子の長径をｂとするとき、ｂ／ａで表される膨潤度は１．０以上１０．０以下であり、前記膨潤処理後のゼラチン粒子の粒子径は１．０ｎｍ以上５．０μｍ以下である、ゼラチン粒子。
［２］前記乾燥時のゼラチン粒子のアスペクト比は１．０以上１．４以下である、［１］に記載のゼラチン粒子。
［３］前記膨潤処理後のゼラチン粒子の長径ｂは２．０μｍ以下である、［１］または［２］に記載のゼラチン粒子。
［４］造影剤を担持している、［１］〜［３］のいずれかに記載のゼラチン粒子。
［５］前記ゼラチンは架橋されている、［１］〜［４］のいずれかに記載のゼラチン粒子。
［６］溶融したゼラチンを含む液体の液滴を、前記液滴との温度差が２３５℃以下である加熱管または乾燥室の雰囲気中で、吐出して乾燥させることによりゼラチン粒子を得る、ゼラチン粒子の製造方法。
［７］前記液滴は、インクジェットヘッドのノズルから吐出される、［６］に記載のゼラチン粒子の製造方法。
［８］［１］〜［５］のいずれかに記載のゼラチン粒子を細胞膜の内側に有する、ゼラチン粒子内包細胞。
［９］［１］〜［５］のいずれかに記載のゼラチン粒子と細胞とを液体に添加して、前記細胞の活動により前記ゼラチン粒子を前記細胞の細胞膜の内側に取り込ませる、ゼラチン粒子内包細胞の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞自らによる取り込みがなされやすいゼラチン粒子、そのようなゼラチン粒子の製造方法、そのようなゼラチン粒子を有する細胞、およびそのようなゼラチン粒子を有する細胞の製造方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
前記の課題を解決すべく、本発明者らは細胞自らによって細胞内に取り込まれやすいゼラチン粒子の条件について鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、ゼラチン粒子が水を粒子内に取り込むことで生じる膨潤の度合いが小さく、かつ、水中で膨潤した後の粒子径が１．０ｎｍ以上５．０μｍ以下であるゼラチン粒子は、細胞自らの活動による細胞内への取り込みがなされやすいことを見出し、もって本発明を完成させた。
【００１２】
以下、本発明の代表的な実施形態を詳細に説明する。
【００１３】
１．ゼラチン粒子およびその製造方法
本実施形態は、ゼラチン粒子およびゼラチン粒子の製造方法に関する。
【００１４】
１−１．ゼラチン粒子
本実施形態に係るゼラチン粒子は、乾燥時のゼラチン粒子の長径をａ、前記乾燥時のゼラチン粒子を４０℃の水中に大気圧下で６０分間浸漬して得られる膨潤処理後のゼラチン粒子の長径をｂとするとき、ｂ／ａで表される膨潤度は１以上１０以下であり、かつ、膨潤処理後のゼラチン粒子の粒子径は１．０ｎｍ以上５．０μｍ以下である、ゼラチン粒子である。上記構成を有するゼラチン粒子は、後述するように細胞に取り込まれやすいという特徴を有しているため、本明細書においては、「易取込性ゼラチン粒子」ともいう。上記易取込性ゼラチン粒子は、単一の粒子でもよく、複数のゼラチン粒子からなる集合体でもよい。
【００１５】
なお、本明細書において、乾燥時のゼラチン粒子とは、８０℃の大気中に２４時間静置した後のゼラチン粒子を意味する。また、本明細書において、膨潤処理後のゼラチン粒子とは、乾燥時のゼラチン粒子を４０℃の水中に大気圧下で６０分間浸漬して得られるゼラチン粒子を意味する。
【００１６】
易取込性ゼラチン粒子の短径および長径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像した画像を解析して得られる値とすることができる。ゼラチン粒子が上記集合体であるとき、ゼラチン粒子の長径、短径、粒子径およびアスペクト比は、上記集合体から任意に選択した複数の膨潤処理後のゼラチン粒子（たとえば、２０個のゼラチン粒子）の長径、短径、粒子径およびアスペクト比を加算平均した値とすることができる。
【００１７】
上記易取込性ゼラチン粒子の膨潤度は、１．０以上１０．０以下である。膨潤度が１０．０より大きいゼラチン粒子は、膨潤する際に粒子内により多量の水を取り込み、取り込んだ水の作用によって凝集しやすい。多数の膨潤したゼラチン粒子が凝集すると、ゼラチン粒子の見かけ上の粒子径が大きくなるため、細胞によって異物と認識されやすくなり、細胞自らの活動による細胞内への取り込みがなされにくくなると考えられる。逆に、上記膨潤度が１０．０以下であるゼラチン粒子は、粒子内にさほど多くの水を取り込まない（膨潤度が小さい）ため、膨張しても凝集しにくく、上記見かけ上の粒子径の拡大が生じにくい。そのため、上記膨潤度が１０．０以下であるゼラチン粒子は、水を取り込んで膨潤しても、細胞によって異物と認識されにくく、細胞自らの活動によって細胞内に取り込まれやすいと考えられる。上記観点からは、上記膨潤度は１．０以上８．０以下であることが好ましく、１．０以上５．０以下であることがより好ましい。
【００１８】
膨潤処理後のゼラチン粒子の粒子径は、１．０ｎｍ以上５．０μｍ以下である。上記粒子径が５．０μｍ以下であるゼラチン粒子は、細胞自らの活動による細胞内への取り込みがなされやすい。これは、上記粒子径が５．０μｍ以下であるゼラチン粒子は細胞によって異物と認識されにくく、エンドサイトーシス等の活動により細胞内に取り込まれやすいからと考えられる。上記観点からは、膨潤処理後のゼラチン粒子の粒子径は、２．０μｍ以下であることが好ましく、１．５μｍ以下であることがより好ましい。一方で、上記粒子径が１．０ｎｍ以上であるゼラチン粒子は、粒子内に試薬等を担持させやすい。上記観点からは、膨潤処理後のゼラチン粒子の粒子径は、２．０ｎｍ以上であることが好ましい。また、膨潤処理後のゼラチン粒子の粒子径を０．５０μｍ以上とすることで、ハンドリング性がよく、また、試薬等の収容量を大きくすることができる。なお、上記易取込性ゼラチン粒子の粒子径は、ゼラチン粒子の長径と短径とを加算平均した値とすることができる。
【００１９】
乾燥時のゼラチン粒子のアスペクト比は、１．０以上１．４以下であることが好ましい。上記アスペクト比が１．４以下であると、ゼラチン粒子は膨潤の前後を通じてより球形に近い形状を保ちやすく、ゼラチン粒子および細胞を含む溶液において、ゼラチン粒子と細胞とがより均一な形状および大きさの接触面で接しやすくなるため、ゼラチン粒子間での取り込まれやすさの差が生じにくいと考えられる。そのため、上記アスペクト比を有する易取込性ゼラチン粒子は、細胞へ取り込まれるゼラチン粒子の量、およびゼラチン粒子を取り込む細胞の量、をより制御しやすいと考えられる。上記易取込性ゼラチン粒子のアスペクト比は、ゼラチン粒子の長径をゼラチン粒子の短径で除算して求めた値とすることができる。
【００２０】
膨潤処理後のゼラチン粒子の長径（ｂ）は、２．０μｍ以下であることが好ましい。上記長径（ｂ）が２．０μｍ以下であると、ゼラチン粒子は膨潤の前後を通じてより小さい粒子径を保ちやすく、細胞自らの活動によって細胞内に取り込まれやすいと考えられる。上記観点からは、上記長径（ｂ）は、１．８μｍ以下であることがより好ましく、１．５μｍ以下であることがさらに好ましい。
【００２１】
上記易取込性ゼラチン粒子は、その主成分がゼラチンからなる粒子であり、具体的には、アミノ酸測定装置で分析した際、アミノ酸１０００残基の内、グリシンが３００以上含まれており、アラニン、プロリン両方を含む粒子である。ゼラチンは、粒子を形成することができればよく、牛骨、牛皮、豚皮、豚腱、魚鱗および魚肉などに由来するコラーゲンを変性して得られる、公知のいかなるゼラチンを用いてもよい。ゼラチンは、以前から食用や医療用に使用されており、体内に摂取しても人体に害を与えることが少ない。また、ゼラチンは生体内で分散消失するため、生体内から除去する必要がないという利点を有する。なお、上記易取込性ゼラチン粒子は、細胞内へのゼラチン粒子取り込みが可能な限りにおいて、ゼラチン以外の成分を含有してもよい。なお、上記ゼラチン以外の成分の量は、体内に摂取したときに人体に与える害が無視できる範囲であることが好ましい。また、上記ゼラチン以外の成分は、生体内に蓄積せず排出されやすい物質からなることが好ましい。
【００２２】
上記易取込性ゼラチン粒子を構成するゼラチンの重量平均分子量は、上記粒子径および膨潤度の条件を満たすゼラチン粒子を形成しやすくする観点から、１０００以上１０００００以下であることが好ましい。上記重量平均分子量は、たとえばパギイ法第１０版（２００６年）に準じて測定された値とすることができる。
【００２３】
易取込性ゼラチン粒子を構成するゼラチンは、架橋していてもよい。架橋は、架橋剤による架橋でもよいし、架橋剤を用いずになされる自己架橋でもよい。
【００２４】
上記架橋剤は、たとえば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基およびイミダゾール基などと化学結合を作る官能基を複数有する化合物であればよい。このような架橋剤の例には、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホナート（ＣＭＣ）を含む水溶性カルボジイミド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテルおよびグリセロールポリグリシジルエーテルを含む２以上のエポキシ基を有する化合物、ならびにプロピレンオキサイドが含まれる。これらのうち、反応性をより高める観点からは、グルタルアルデヒドおよびＥＤＣが好ましく、グルタルアルデヒドがより好ましい。
【００２５】
上記自己架橋の例には、熱の付与または電子線もしくは紫外線の照射による架橋が含まれる。
【００２６】
易取込性ゼラチン粒子は、試薬等を担持してもよい。ゼラチン粒子が試薬等を担持するとは、試薬等がゼラチン粒子の表面または内部に存在することを意味する。試薬等をより長い時間細胞内に留める観点からは、試薬等は、ゼラチン粒子の内部に存在することが好ましい。
【００２７】
試薬等の例には、生体の活性などの検査、生体内の物質の測定および生体内の物質の定量などの用途に用いられる試薬、ならびに薬剤が含まれる。上記試薬の例には、造影剤が含まれる。
【００２８】
上記造影剤の例には、ＭＲＩ用の造影剤として用いられる磁性物質が含まれる。ＭＲＩ用の造影剤の例には、ガドリニウム（Ｇｄ）ならびに鉄（Ｆｅ３Ｏ４およびγ−Ｆｅ２Ｏ３など）を含む造影剤が含まれる。
【００２９】
上記薬剤は、ゼラチン粒子が担持できるものであればよい。このような薬剤の例には、医薬活性を有するタンパク質、プラスミド、アプタマー、アンチセンス核酸、リボザイム、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡおよび凝縮型ＤＮＡを含む医薬用途に用いられる核酸、ならびに医薬用途に用いられる抗原が含まれる。
【００３０】
上記医薬活性を有するタンパク質の例には、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ビタミンＡ（レチノイド）、ビタミンＤ３およびビタミンＤ３類似体、抗生物質、抗ウィルス性薬剤、ならびに抗細菌性薬剤が含まれる。
【００３１】
１−２．ゼラチン粒子の製造方法
上記易取込性ゼラチン粒子は、ゼラチンを粒子状に形成する公知の方法で製造することができる。このような方法の例には、溶融したゼラチンを含む液体（以下、単に「ゼラチン溶液」ともいう。）の液滴を加熱管または乾燥室の雰囲気中に吐出して乾燥させる方法（気中滴下法）、ゼラチン溶液の液滴を疎水性溶媒内に吐出して分散させる方法（液中滴下法）、およびゼラチン溶液をエマルジョン化してゼラチンを含む微小液滴を分散させる方法（液中分散法）が含まれる。気中滴下法の例には、インクジェット法およびスプレードライ法が含まれる。液中分散法の例には、エマルション法およびコアセルベーション法が含まれる。製造されるゼラチン粒子の粒子径をより均一にし、かつ、アスペクト比をより小さくする観点からは、気中滴下法が好ましく、インクジェット法がより好ましい。
【００３２】
本発明者らの新たな知見によれば、気中滴下法において、温度変化が少ない条件で上記液滴を乾燥させることが特に好ましい。このようにすることで、温度変化によるゼラチン粒子の変形または崩壊が防がれるため、粒子径が１．０ｎｍ以上５．０μｍ以下であるゼラチン粒子が製造される割合をより高め、かつ、製造されるゼラチン粒子の粒子径をさらに均一にできると考えられる。
【００３３】
たとえば、インクジェット法において、加熱された加熱管の内部に設けたインクジェットのノズルからゼラチン溶液の液滴を吐出して、同じ加熱管の内部に設けたフィルタで捕集することができる。ゼラチン粒子の変形または崩壊をより抑制する観点からは、上記加熱管の加熱は、加熱管の内部に、液滴の滴下方向と同じ方向（鉛直方向上方から下方に向かう方向）に熱風を通過させて行うことが好ましい。
【００３４】
また、スプレードライ法において、アトマイザーまたはノズルからゼラチン溶液を噴霧する乾燥室の内部を加熱してもよい。
【００３５】
上記効果をより高める観点からは、上記加熱管または乾燥室の中の雰囲気の温度と、滴下されるゼラチン溶液との温度差は、２３５℃以下であることが好ましく、効率よく安定してゼラチン粒子を得る観点からは、２０℃以上２００℃以下、さらに２０℃以上１００℃以下であることが望ましく、特に、加熱管又は乾燥室内の雰囲気温度を液滴温度よりも高くして、温度差２０℃以上８０℃以下とすることが望ましい。液滴の温度は、１５℃以上８０℃以下、より好ましくは２０℃以上５０℃以下とするのがよく、加熱管または乾燥室内の雰囲気温度は、４０℃以上２５０℃以下、より好ましくは４０℃以上１５０℃以下とするのがよい。
【００３６】
膨潤処理後の粒子径が１．０ｎｍ以上５．０μｍ以下であるゼラチン粒子が形成される割合をより高める観点からは、上記ゼラチン溶液が含有するゼラチンの濃度は、１．００×１０−８体積％以上６０体積％以下であることが好ましく、１．００×１０−７体積％以上５０体積％以下であることがより好ましく、１．００×１０−７体積％以上２０体積％以下とすることがさらに好ましい。
【００３７】
膨潤度が１．０以上１０．０以下であるゼラチン粒子が形成される割合をより高める観点からは、ゼラチン粒子は架橋させることが好ましい。
【００３８】
ゼラチン粒子の架橋は、前記した架橋剤によって行ってもよいし、熱の付与または電子線もしくは紫外線の照射によって自己架橋させて行ってもよい。
【００３９】
試薬等を担持した易取込性ゼラチン粒子を製造するときは、予めゼラチンと試薬等とを混合したゼラチン溶液を用いて、ゼラチンを粒子状に形成すればよい。
【００４０】
２．細胞
本実施形態は、易取込性ゼラチン粒子を細胞膜の内側に有する細胞、およびそのような細胞の製造方法に係る。
【００４１】
２−１．細胞
本実施形態に係る細胞（以下、単に「ゼラチン粒子内包細胞」ともいう。）は、易取込性ゼラチン粒子を細胞膜の内側に有する細胞である。
【００４２】
ゼラチン粒子を細胞膜の内側に有するとは、細胞を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で撮像した画像において、ゼラチン粒子が細胞膜の内側に確認されることを意味する。細胞へのゼラチン粒子の取り込みは、例えば、ゼラチン粒子が造影剤を含有している場合は、造影剤を染色し顕微鏡観察することにより、造影剤を含むゼラチン粒子が細胞内に取りこまれているか否かを確認することができる。また、造影剤を含有していないゼラチン粒子の場合は、予めゼラチン粒子を蛍光標識しておき、共焦点顕微鏡を用いて蛍光標識されたゼラチン粒子が細胞内に取り込まれているか否かを確認することができる。ゼラチン粒子の蛍光標識は、例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識した溶液（例えば、コスモ・バイオ社製ＦＩＴＣ−コラーゲンの１０ｍＭ酢酸溶液）、０．４Ｍ塩化ナトリウム、０．０４％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム含有５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５) を等量混合した後、６０℃で３０分間加熱処理することにより調製したＦＩＴＣ−ゼラチンを基質として用いることで行うことができる。
【００４３】
細胞に含まれる易取込性ゼラチン粒子は、造影剤、特には特にはＭＲＩ用の造影剤を担持していることが好ましい。このような細胞は、後述する、細胞自らの活動によって取り込ませる方法によって製造した後、細胞内の造影剤の有無を観察することで、非破壊で細胞の活性を検査することができる。
【００４４】
ゼラチン粒子を細胞膜の内側に含み得る細胞としては、骨髄、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、腸管、小腸、心臓弁、皮膚、血管、角膜、眼球、硬膜、骨、気管および耳小骨を含む各種臓器から摘出された生体試料または検体に由来する細胞、市販の株化細胞、ならびに皮膚幹細胞、表皮角化幹細胞、網膜幹細胞、網膜上皮幹細胞、軟骨幹細胞、毛包幹細胞、筋幹細胞、骨前駆細胞、脂肪前駆細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、外胚葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を含む幹細胞ならびにこれらの幹細胞から分化した細胞を含む公知の細胞を用いることができる。
【００４５】
これらの細胞のうち、細胞再生医療で患者に移植される細胞、特には幹細胞および幹細胞から分化した細胞は、造影剤、特にはＭＲＩ用の造影剤を担持する易取込性ゼラチン粒子を有することで、患者への移植後、移植部位の造影剤を観察することで、再手術をすることなく、ゼラチン粒子内包細胞が移植部位に定着したか否かを観測することができる。そのため、ＭＲＩ用の造影剤を担持するゼラチン粒子を含ませた、これらの細胞は、再生医療の治療を受ける患者の身体的、精神的、金銭的および時間的な負担を低減し、患者の生活の質（ＱＯＬ）を高めることができると考えられる。
【００４６】
２−２．細胞の製造方法
ゼラチン粒子内包細胞は、易取込性ゼラチン粒子を上記細胞に導入して、製造することができる。ゼラチン粒子を細胞に導入する方法の例には、液体中にゼラチン粒子と細胞とを添加して、エンドサイトーシスによる取り込みなどの細胞自らの活動によって取り込ませる方法、および外部からの操作によって導入する方法が含まれる。細胞自らの活動によって取り込ませる方法の例には、ゼラチン粒子と細胞とを液中で撹拌する方法や、ゼラチン粒子が含まれる細胞培養液中で細胞を培養する方法が含まれる。なお、上記易取込性ゼラチン粒子は、細胞自らによる取り込み効率が高いため、細胞への取り込みを促進するために他の成分との複合体を形成させる操作は特に必要ない。細胞の活性の低下を最小限に抑える観点からは、上記のうち、易取込性ゼラチン粒子と細胞とを液中で混合し培養する方法が好ましい。上記外部からの操作によって導入する方法の例には、エレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法が含まれる。これらのうち、ゼラチン粒子を導入させる際に細胞の活性を低下させにくくする観点からは、細胞自らの活動によって導入する方法が好ましく、上記複合体を形成せずに細胞に取り込ませる方法がより好ましい。
【００４７】
ゼラチン粒子及び細胞が添加される液体としては、細胞培養液を用いることができる。上記細胞培養液は、公知の緩衝液または生理食塩水であってもよく、例えば、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）およびその他の公知のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いることができる。
【００４８】
細胞の活性を高めて細胞自らの活動によってゼラチン粒子を細胞内に取り込ませやすくする観点からは、上記撹拌時の上記細胞培養液の温度は、１５℃以上５０℃以下であることが好ましく、３５℃以上４５℃以下であることがより好ましい。
【００４９】
細胞自らの活動によってゼラチン粒子を細胞膜の内側へ導入するとき、たとえば、ゼラチン粒子と上記細胞とを含む細胞培養液を振とうして、導入を促進してもよい。
【００５０】
なお、細胞自らの活動によってゼラチン粒子を導入するとき、活性が高い細胞はゼラチン粒子をより取り込みやすく、活性が低い細胞はゼラチン粒子を取り込みにくいと考えられる。そのため、造影剤を担持するゼラチン粒子と細胞とを液体に添加し必要に応じて振とうした後、細胞の内部に造影剤があるか否かを観察することで、非破壊で細胞の活性を検査することができる。
【実施例】
【００５１】
以下において、本発明の具体的な実施例を説明する。なお、これらの実施例によって、本発明の範囲は限定して解釈されない。【００５２】
１．ゼラチン粒子の作製
１−１．原料溶液の調製
ゼラチン（新田ゼラチン株式会社製、Ｇ−２６１３Ｐ）、純水、Ｆｅ２Ｏ３粉末（コアフロント社製３３１０ＤＸ(α−Ｆｅ２Ｏ３)）を混合し、ゼラチンとＦｅ２Ｏ３粉末との体積比が（ゼラチン：Ｆｅ２Ｏ３粉末＝１０：１）の原料溶液を調製した。ゼラチンおよびＦｅ２Ｏ３粉末の量は、上記原料溶液中の濃度がそれぞれ表１に記載に数値になるよう、調整した。【００５３】
１−２．インクジェット法によるゼラチン粒子の作製
１００℃に加熱した加熱管の内部に、鉛直方向上方から下方に向けて３Ｌ/ｍｉｎの空気流を送流した。インクジェットヘッド（コニカミノルタ株式会社製、５１２Ｓ）から、４０℃に加熱した上記原料溶液の４ｐＬまたは４２ｐＬの液滴を吐出周波数５ＫＨｚで上記空気流の中に滴下し、インクジェットヘッドの２００ｃｍ下方に設けた親水化処理された四フッ化エチレン樹脂（ＰＴＦＥ）のフィルタ（メルク（日本ミリポア）社製ミリポア、０．４５メッシュ）に上記滴下した液滴を着弾させた。上記滴下を５時間行ったのち、フィルタ上に捕集されたゼラチン粒子を回収した。【００５４】
１−３．スプレードライ法によるゼラチン粒子の作製
スプレードライヤー（株式会社プリス製、スプレーボーイ）を用いて、上記原料溶液を二流体ノズル方式のノズルから１ｋｇ／ｈで２００℃に加熱した乾燥室内に噴霧し、乾燥室の下部でゼラチン粒子を捕集し、回収した。【００５５】
１−４．架橋形成
上記作製されたゼラチン粒子を、真空状態にした加熱炉（ヤマト科学株式会社社製、真空角型乾燥機ＡＤＰ２００）内で表１に記載の時間１６０℃で加熱し、ゼラチン粒子１〜１５を得た。【００５６】
表１に、ゼラチン粒子１〜１６の作製に用いた原料溶液中のゼラチンおよびＦｅ２Ｏ３の体積％、粒子作製方法、インクジェット法で粒子を作製したときの液滴量、粒子作製時の系内の温度、および送液速度、ならびに加熱炉での加熱温度および加熱時間を示す。【００５７】
【表１】
2017110745.tif 000002
【００５８】
２．ゼラチン粒子の測定
２−１．乾燥時のゼラチン粒子の長径、平均粒子径およびアスペクト比
上記作製したゼラチン粒子１〜１６を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像し、撮像された画像をＭｏｕｎｔｅｃｈ社製画像解析式粒度分布ソフトウェアＭａｃ−Ｖｉｅｗを用いて解析することにより、任意に選択した２０個のゼラチン粒子の短径および長径を測定し、それらを加算平均して得られた値を、乾燥時のゼラチン粒子１〜１６それぞれの短径および長径（ａ）とした。上記任意に選択した２０個の乾燥時のゼラチン粒子の短径と長径とを加算平均して、２０個のゼラチン粒子それぞれの粒子径を求め、上記得られた２０個のゼラチン粒子それぞれの粒子径をさらに加算平均して得られた値を、乾燥時のゼラチン粒子１〜１６それぞれの平均粒子径とした。また、上記任意に選択した２０個の乾燥時のゼラチン粒子の長径を短径で除算して、２０個のゼラチン粒子それぞれのアスペクト比を求め、上記得られた２０個のゼラチン粒子それぞれのアスペクト比をさらに加算平均して得られた値を、乾燥時のゼラチン粒子１〜１６それぞれのアスペクト比とした。【００５９】
２−２．膨潤処理、および膨潤処理後のゼラチン粒子の長径および平均粒子径
０．１ｇの上記作製したゼラチン粒子１〜１６を４０℃の純粋１００ｍＬ中に浸漬して分散させ、６０分間静置（膨潤処理）した。その後、ゼラチン粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像し、撮像された画像をＭｏｕｎｔｅｃｈ社製画像解析式粒度分布ソフトウェアＭａｃ−Ｖｉｅｗを用いて解析することにより、任意に選択した２０個のゼラチン粒子の短径および長径を測定し、上記測定された短径と長径とを加算平均して、２０個のゼラチン粒子それぞれの粒子径を求め、上記得られた２０個のゼラチン粒子それぞれの粒子径をさらに加算平均して得られた値を、膨潤処理後のゼラチン粒子１〜１６それぞれの平均粒子径とした。【００６０】
２−３．膨潤度
上記膨潤処理後のゼラチン粒子の平均粒子径を乾燥時のゼラチン粒子の平均粒子径で除算して、それぞれのゼラチン粒子の膨潤率とした。【００６１】
表２に、ゼラチン粒子１〜１６の乾燥時の長径、平均粒子径およびアスペクト比、ならびに膨潤度を示す。【００６２】
【表２】
2017110745.tif 000003
【００６３】
３．細胞内への導入および評価
Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製細胞培養液ＭＥＭ  Ａｌｐｈａ  ｂａｓｉｃ（１Ｘ）５００ｍｌにウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｎｅ  ｓｅｒｕｍ）５０ｍｌを加えたものを細胞培養液として使用した。３ｍｌの細胞培養液に、それぞれ１ｍｇのゼラチン粒子１〜１６を加え、マウス骨芽由来の細胞（ＭＣ３Ｔ３Ｅ１）を６０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように添加し、細胞添加後の細胞培養液を２４時間４０℃で保温して、１６個の評価用サンプルを作製した。【００６４】
その後、それぞれの細胞分散液の一部を取り出し、以下の手順によって、細胞膜の内側に取り込まれたゼラチンが確認できるか否かを判定した。【００６５】
（細胞及びＦｅの染色）
培養した細胞に１％パラホルムアルデヒド１ｍｌを加えて細胞固定化処理を行った。次いで、下記組成のＦｅ染色液１ｍｌを加えてＦｅを染色した。さらに、下記の濃度に調整した核染色液１ｍｌを加えて細胞を染色した。【００６６】
（Ｆｅ染色液の組成）
下記の２液を同体積混合してＦｅ染色液を調製した。
・２０体積％  ＨＣＬ(濃塩酸を５倍希釈したもの）
・１０質量％  Ｋ４（Ｆｅ（ＣＮ６））水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）【００６７】
（核染色液の組成）
硫酸アンモニウム５質量部と、Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｓｔ  ｒｅｄ  ０．１質量部とを、蒸留水１００質量部に混合して核染色液を調製した。【００６８】
（Ｆｅを取り込んだ細胞数のカウント）
染色された細胞を光学顕微鏡で観察して、任意に選択された細胞２０個の中に染色されたＦｅが含まれているかどうかを評価した。【００６９】
膨潤度が１以上１０以下であり、膨潤処理後の平均粒子径が１．０ｎｍ以上５．０μｍ以下である、ゼラチン粒子１〜１１が分散している細胞分散液では、上記２０個の細胞のうち、１０％以上（２個以上）の細胞で、細胞膜の内側にゼラチンが取り込まれていることが確認できた。【００７０】
一方で、膨潤処理後の平均粒子径が５．０μｍ以上であるゼラチン粒子１２、１３、１５、１６が分散している細胞分散液では、上記２０個の細胞のうち、細胞膜の内側にゼラチン粒子を取り込んだ細胞は、１０％未満（２個未満）だった。これは、膨潤処理後の平均粒子径が大きく、細胞がゼラチン粒子を細胞が異物と認識したため、細胞自らの活動によるゼラチン粒子の取り込みがなされにくかったものと思われる。【００７１】
また、膨潤度が１０より大きいゼラチン粒子１４が分散している細胞分散液では、上記２０個の細胞のうち、細胞膜の内側にゼラチン粒子を取り込んだ細胞は、１０％未満（２個未満）だった。これは、水を多量に取り込んだゼラチン粒子が凝集し、ゼラチン粒子の見かけ上の粒子径が大きくなったため、細胞がゼラチン粒子を細胞が異物と認識して、細胞自らの活動によるゼラチン粒子の取り込みがなされにくかったものと思われる。【００７２】
なお、インクジェット法で製造したゼラチン粒子１〜８は、概してアスペクト比が小さく、例えば、ゼラチン粒子８は、同程度の粒子径を有するスプレードライ法で製造したゼラチン粒子９および１０よりもアスペクト比が小さかった。【００７３】
本出願は、２０１５年１２月２５日出願の日本国出願番号２０１５−２５４９５０号に基づく優先権を主張する出願であり、当該出願の特許請求の範囲および明細書に記載された内容は本出願に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明のゼラチン粒子は、たとえばＭＲＩ用の造影剤を含有させて、再生医療に用いられる移植用の細胞に導入することができる。このような細胞は、細胞自らの活動によってゼラチン粒子を取り込ませた後、ＭＲＩで撮像して造影剤が細胞の内部にあるか否かを観察することで、非破壊で細胞の活性を検査することができる。そのため、本発明のゼラチン粒子は、再生医療に用いられる細胞の廃棄率を低減して、上記細胞の利用効率を高めることができると考えられる。また、このような細胞を移植すれば、移植部位をＭＲＩで撮像することで、再手術をすることなく、細胞が移植部位に定着したか否かを観測することができる。そのため、本発明のゼラチン粒子は、患者への身体的、精神的、金銭的および時間的な負担を低減し、患者の生活の質（ＱＯＬ）を高めることができると考えられる。
【国際調査報告】
2017110745.tif 000004
2017110745.tif 000005
2017110745.tif 000006
2017110745.tif 000007