(57)【要約】  微粒子検出システムは、微粒子を含む試料が移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置面に設置されうるステージ部と、流路に照明光を照射する照射部と、照明光の照射により、試料中の微粒子から生ずる散乱光を撮像する撮像部と、撮像部が撮像した画像に基づいて、画像に含まれる微粒子を微粒子毎に識別する識別部と、識別部が識別した微粒子毎に、微粒子の粒子径を判定する粒子径判定部と、識別部が識別した微粒子毎に、微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定部と、粒子径判定部が判定した微粒子毎の粒子径と、ゼータ電位判定部が判定した微粒子毎のゼータ電位とを、微粒子毎に関連付けする相関部とを備える。
2016171198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子を含む試料が移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうる設置面を有するステージ部と、
前記流路を移動する前記微粒子の粒子径を判定する粒子径判定部と、
前記流路を移動する前記微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定部と、
前記微粒子の前記粒子径と前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする相関部と、
を備える微粒子検出システム。
【請求項２】
前記流路に照明光を照射する照射部と、
前記照明光の照射により生ずる散乱光を撮像する撮像部と、
前記撮像部が撮像した画像に基づいて、前記画像に含まれる前記微粒子を前記微粒子毎に識別する識別部と、
を更に備え、
前記粒子径判定部と前記ゼータ電位判定部は、それぞれ、前記識別部が識別した前記微粒子毎に、前記粒子径と前記ゼータ電位とを判定する、請求項１に記載の微粒子検出システム。
【請求項３】
前記粒子径の基準範囲と、前記ゼータ電位の基準範囲とをそれぞれ示す基準範囲情報を記憶する基準記憶部
を更に備える請求項１又は請求項２に記載の微粒子検出システム。
【請求項４】
前記相関部が前記微粒子毎に前記粒子径と前記ゼータ電位とを関連付けて得た相関情報と、前記基準記憶部が記憶する前記基準範囲情報とに基づいて、前記微粒子の状態を判定する状態判定部
を更に備える請求項３に記載の微粒子検出システム。
【請求項５】
前記状態判定部は、
前記相関情報が、前記基準範囲情報が示す基準範囲に含まれるか否かに基づいて、前記相関情報に対応する前記微粒子の種類を特定する
請求項４に記載の微粒子検出システム。
【請求項６】
前記微粒子は、表面の生体分子と別の物質が結合した複合体を含み、
前記状態判定部は、
前記相関情報と前記基準範囲情報とに基づいて、前記複合体の種類を特定する
請求項４又は請求項５に記載の微粒子検出システム。
【請求項７】
前記状態判定部の判定に基づいて前記微粒子の状態の分布を評価する評価部
を更に備える請求項４から請求項６のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
【請求項８】
前記基準範囲情報は、前記状態判定部の判定に基づいて前記微粒子の状態の前記分布毎に予め記憶される
請求項４から請求項７のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
【請求項９】
前記基準範囲情報は、表面の生体分子に物質が結合していない複数の前記微粒子の前記粒子径及び前記ゼータ電位の分布に基づいて定められる
請求項３から請求項８のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
【請求項１０】
前記基準範囲情報が示す前記粒子径のしきい値及び前記ゼータ電位のしきい値によって区分される領域毎に、当該領域に含まれる前記微粒子の数を計数する計数部
を更に備える請求項３から請求項８のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
【請求項１１】
前記計数部が計数する前記微粒子の数の、前記領域間の比率を算出する比率算出部と、
ある物質と反応させる前の前記微粒子について、前記比率算出部が算出する前記領域間の前記微粒子の数の比率と、前記物質と反応させた後の前記微粒子について、前記比率算出部が算出する前記領域間の前記微粒子の数の比率との変化率を算出する変化率算出部と
を更に備える請求項１０に記載の微粒子検出システム。
【請求項１２】
前記粒子径判定部は、
前記識別部が識別した前記微粒子のブラウン運動に基づいて前記粒子径を判定する
請求項２から請求項１１のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
【請求項１３】
前記ゼータ電位判定部は、
前記識別部が識別した前記微粒子の移動速度に基づいて前記ゼータ電位を判定する
請求項２から請求項１２のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
【請求項１４】
前記照射部は、前記設置面と直交し前記流路と平行な面と交差する第１方向に平行な光軸に沿って前記流路に照明光を照射し、
前記流路の内部において、前記照明光の前記第１方向と直交する第２方向の幅が最小となり、かつ、前記流路の照射光入射側の側面の位置における照射領域が前記側面内に収まるように前記照明光を収束させる調整部
を更に備える請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
【請求項１５】
前記微粒子は、細胞、細胞外小胞体、合成高分子若しくは金属を基材とする微粒子、磁性微粒子、及び、高分子ミセル構造を有する微粒子からなる群より選択される、請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
【請求項１６】
前記細胞外小胞体は、別の物質が結合していない又は結合しているエクソソームである
請求項１５に記載の微粒子検出システム。
【請求項１７】
前記識別部は、識別した前記微粒子毎に、固有の微粒子識別子を付与し、
前記相関部は、前記粒子径判定部が粒子径を判定する前記微粒子に対して付与された前記微粒子識別子と、前記ゼータ電位判定部がゼータ電位を判定する前記微粒子に対して付与された前記微粒子識別子との一致に基づいて、前記微粒子毎の前記粒子径と、前記ゼータ電位判定部が判定した前記微粒子毎の前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする
請求項２から請求項１４のいずれか一項に記載の微粒子検出システム。
【請求項１８】
微粒子を含む試料を移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうる設置面を有するステージ部を備えるコンピュータに、
前記流路を移動する前記微粒子の粒子径を判定する粒子径判定ステップと、
前記流路を移動する前記微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定ステップと、
前記微粒子の前記粒子径と前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする相関ステップと、
を実行させるための微粒子検出プログラム。
【請求項１９】
前記流路に照明光を照射する照射ステップと、
前記照明光の照射により生ずる散乱光を撮像する撮像ステップと、
前記撮像ステップにおいて撮像された画像に基づいて、前記画像に含まれる前記微粒子を前記微粒子毎に識別する識別ステップと、
を更に実行させ、
前記粒子径判定ステップと前記ゼータ電位判定ステップは、それぞれ、前記識別ステップで識別された前記微粒子毎に、前記粒子径と前記ゼータ電位とを判定する、請求項１８に記載の微粒子検出プログラム。
【請求項２０】
前記照射ステップは、前記設置面と直交し前記流路と平行な面と交差する第１方向に平行な光軸に沿って前記流路に照明光を照射し、
前記流路の内部において、前記照明光の前記第１方向と直交する第２方向の幅が最小となり、かつ、前記流路の照射光入射側の側面の位置における照射領域が前記側面内に収まるように前記照明光を調整する、
請求項１９に記載の微粒子検出プログラム。
【請求項２１】
微粒子を含む試料が移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうる設置面を有するステージ部と、
前記設置面と直交し前記流路と平行な面と交差する第１方向に平行な光軸に沿って前記流路に照明光を照射する照射部と、
前記流路の内部において、前記照明光の前記第１方向と直交する第２方向の幅が最小となり、かつ、前記流路の照射光入射側の側面の位置における照射領域が前記側面内に収まるように前記照明光を収束させる調整部と、
前記照明光の照射により生ずる散乱光を撮像する撮像部と、
前記撮像部が撮像した画像に基づいて、前記画像に含まれる前記微粒子を前記微粒子毎に識別する識別部と、
前記識別部が識別した前記微粒子毎に、前記微粒子の粒子径を判定する粒子径判定部と、
前記識別部が識別した前記微粒子毎に、前記微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定部と、
前記粒子径判定部が判定した前記微粒子毎の前記粒子径と、前記ゼータ電位判定部が判定した前記微粒子毎の前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする相関部と、
を備える微粒子検出システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微粒子検出システム及び微粒子検出プログラムに関するものである。
本願は、２０１５年４月２１日に，日本に出願された特願２０１５−０８７０２１号に基づき優先権を主張し，その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
媒質中を移動する微粒子を暗視野照明のもとでの顕微鏡観察により撮像し、撮像した画像を処理することによって、その微粒子の数や移動速度を計測する装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。このような装置においては、異なるタイミングで撮像された複数枚の画像に基づいて、微粒子の移動の軌跡を追跡することにより、微粒子の数や移動速度を計測している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−２２９１０３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、例えば、特許文献１記載の技術では、媒質中に存在する複数の微粒子のゼータ電位と、微粒子径との相関までは、判定することができなかった。
本発明は、媒質中に存在する細胞外小胞体などの微粒子のゼータ電位と、微粒子径との相関を判定することができる微粒子検出システム及び微粒子検出プログラムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様は、微粒子を含む試料が移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうる設置面を有するステージ部と、前記流路を移動する前記微粒子の粒子径を判定する粒子径判定部と、前記流路を移動する前記微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定部と、前記微粒子の前記粒子径と前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする相関部と、を備える微粒子検出システムである。【０００６】
また、本発明の一態様は、微粒子を含む試料を移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうる設置面を有するステージ部を備えるコンピュータに、前記流路を移動する前記微粒子の粒子径を判定する粒子径判定ステップと、前記流路を移動する前記微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定ステップと、前記微粒子の前記粒子径と前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする相関ステップと、を実行させるための微粒子検出プログラムである。【０００７】
また、本発明の一態様は、微粒子を含む試料が移動可能な流路を備えた流体デバイスが設置されうる設置面を有するステージ部と、前記設置面と直交し前記流路と平行な面と交差する第１方向に平行な光軸に沿って前記流路に照明光を照射する照射部と、前記流路の内部において、前記照明光の前記第１方向と直交する第２方向の幅が最小となり、かつ、前記流路の照射光入射側の側面の位置における照射領域が前記側面内に収まるように前記照明光を収束させる調整部と、前記照明光の照射により生ずる散乱光を撮像する撮像部と、前記撮像部が撮像した画像に基づいて、前記画像に含まれる前記微粒子を前記微粒子毎に識別する識別部と、前記識別部が識別した前記微粒子毎に、前記微粒子の粒子径を判定する粒子径判定部と、前記識別部が識別した前記微粒子毎に、前記微粒子のゼータ電位を判定するゼータ電位判定部と、前記粒子径判定部が判定した前記微粒子毎の前記粒子径と、前記ゼータ電位判定部が判定した前記微粒子毎の前記ゼータ電位とを、前記微粒子毎に関連付けする相関部と、を備える微粒子検出システムである。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施形態に係る粒子検出システムの概略的な平面図である。
【図２】本実施形態に係る粒子検出装置の概略的な正面図である。
【図３】本実施形態に係る細胞外小胞体分析チップの基本構造を示す斜視図である。
【図４】図３におけるＩＩ−ＩＩ線断面図である。
【図５】本実施形態に係るステージ部の設置面に流体デバイスが設置された平面図である。
【図６】本実施形態に係る流体デバイスをｙｚ平面で部分的に断面した部分断面図である。
【図７】図６におけるＡ−Ａ線断面図である。
【図８】本実施形態に係る照射部及び調整部の概略構成を示す図である。
【図９】本実施形態に係る調整部および流体デバイスの部分詳細図である。
【図１０】本実施形態に係る照明光がリザーバ部材の端面および流路の側面を通過する光路を模式的に示す図である。
【図１１】本実施形態に係る制御装置の概略構成を示す図である。
【図１２】本実施形態に係る記憶部が記憶する粒子リストの一例を示す図である。
【図１３】本実施形態に係る記憶部が記憶する粒子相関リストの一例を示す図である。
【図１４】本実施形態の記憶部が記憶するしきい値の一例を示す図である。
【図１５】本実施形態の制御装置の動作の一例を示す図である。
【図１６】本実施形態の評価部が出力する粒子径及びゼータ電位の分布の一例を示す図である。
【図１７】本実施形態の制御装置の構成の一例を示す構成図である。
【図１８】本実施形態の制御装置の動作の変形例を示す図である。
【図１９】本実施形態のしきい値及び領域の一例を示す図である。
【図２０】本実施形態の計数部による計数結果の一例を示す表である。
【図２１】本実施形態の複数のレーンにそれぞれ種類が異なる抗体を添加する場合の一例を示す模式図である。
【図２２】本実施形態の疾患の判定パネルの一例を示す表である。
【図２３】本実施形態の疾患の診断及び指導パネルの一例を示す表である。
【図２４】本実施形態のゲート領域の一例を示す図である。
【図２５】本実施形態の演算部による微粒子の物性評価の動作の一例を示す図である。
【図２６】本実施形態の評価部による評価の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本実施形態の粒子検出システム１は、粒子検出装置１００と、制御装置５とを備えている。なお、以下の説明において、粒子検出システム１が検出する粒子が、細胞外小胞体である場合には、この粒子検出システム１を細胞外小胞体検出システムとも称する。まず、粒子検出装置１００について、図１から図１０を参照して説明する。
【００１０】
［粒子検出装置の構成］
図１は、実施形態に係る粒子検出システム１の概略的な平面図である。図２は、実施形態に係る粒子検出装置１００の概略的な正面図である。
【００１１】
粒子検出装置１００は、流体デバイスＣを検出対象として流体デバイスＣに照明光Ｌ１を照射し、流体デバイスＣからの散乱光Ｌ２を観察することにより、流体デバイスＣ内の粒子に関する情報を検出する。粒子検出装置１００は、光源部ＬＳ、照射部２０、調整部ＣＬ、ステージ部ＳＴ、検出部３０、送信部４０、および制御装置５を備えている。粒子検出装置１００および流体デバイスＣによって粒子検出システム１が構成される。
【００１２】
以下の説明においては、ステージ部ＳＴの設置面ＳＴａと直交し、照明光Ｌ１と平行な面（不図示）と直交する方向をｘ方向（ｘ軸；第３方向）、設置面ＳＴａと平行でｘ方向と直交する方向をｙ方向（ｙ軸）、ｘ方向およびｙ方向と直交する鉛直方向をｚ方向（ｚ軸；第２方向）として適宜説明する。
【００１３】
まず、検出対象である流体デバイスＣについて説明する。
本実施形態における流体デバイスＣは、一例として、検体を分析する際に用いられる電気泳動分析チップである。検体となる微粒子としては、細胞、細菌、ウィルス、細胞外小胞体（細胞外ベシクル）、合成高分子、無機物、若しくは金属を基材とする微粒子、磁性微粒子、高分子ミセル構造を有する微粒子等が挙げられる。合成高分子を基材とする微粒子としては、例えばポリスチレン等のラテックス粒子が挙げられる。無機物を基材とする微粒子としては、例えばシリカ粒子が挙げられる。金属を基材とする微粒子としては、例えば鉄製ビーズが挙げられる。磁性微粒子としては、例えば鉄、酸化鉄、ニッケル等を含む磁性を有するビーズが挙げられる。合成高分子、無機物、若しくは金属を基材とする微粒子、及び磁性微粒子のいずれも、ペプチド、タンパク質、細胞、各種化合物等で表面を修飾された粒子を含む。
本実施形態では、電気泳動分析チップとして、細胞外小胞体を分析するための細胞外小胞体分析チップを用いる場合について説明する。本明細書において、細胞外小胞体とは、エクソソーム（エキソソーム）、アポトーシス小体、マイクロベシクル等を含む、脂質小胞を意味するものとする。細胞外小胞体の大きさは直径３０ｎｍから１μｍ程度である。細胞外小胞体は、細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来のタンパク質を発現している。
以下に、エクソソームを分析する場合を例として、本実施形態に係る細胞外小胞体分析チップ（電気泳動分析チップ）について説明する。
【００１４】
［エクソソーム］
エクソソームは、直径３０〜２００ｎｍ程度の脂質小胞であり、エンドソームと細胞膜との融合体として、腫瘍細胞、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞等、種々の細胞から、血液、尿、唾液等の体液中に分泌される。
生体内に存在する癌細胞等の異常細胞は、その細胞膜に特有のタンパク質を発現している。エクソソームは細胞の分泌物であり、その表面に分泌源の細胞由来のタンパク質を発現している。
【００１５】
そこで、エクソソームの表面に発現しているタンパク質を分析することで、分泌源の細胞の異常を検出することができる。ここで、エクソソームの表面とは、細胞から分泌される脂質小胞の膜表面であって、分泌されたエクソソームが生体内の環境と接する部分をいう。
【００１６】
エクソソームは、生体内で循環している血液中で検出されるため、エクソソームを分析することで、バイオプシー検査をしなくとも、生体内の異常を検出することができる。
【００１７】
［エクソソームの分析］
細胞外小胞体分析チップを用いたエクソソームの分析は、一例として次のようにして行うことができる。まず、検出対象のエクソソームを精製する。次に、エクソソームと特異的結合物質とを接触させる。ここで、特異的結合物質とは、エクソソームの表面に存在する分子に特異的に結合することができる物質を意味し、詳細は後述する。次に、細胞外小胞体分析チップを用いて、エクソソームのゼータ電位を計測し、分析を行う。本分析は、エクソソームに限らず、広く細胞外小胞体一般の分析にも適用できる。
【００１８】
（特異的結合物質）
特異的結合物質としては、例えば、抗体、改変抗体、アプタマー、リガンド分子等が挙げられる。抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等が挙げられる。ＩｇＧとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が挙げられる。ＩｇＡとしては、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等が挙げられる。ＩｇＭとしては、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２等が挙げられる。改変抗体としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ等が挙げられる。アプタマーとしては、ペプチドアプタマー、核酸アプタマー等が挙げられる。リガンド分子としては、エクソソームの表面に存在する検出対象分子が、レセプタータンパク質である場合の、当該レセプタータンパク質のリガンド等が挙げられる。例えば、エクソソームの表面に存在する分子がインターロイキンである場合、リガンド分子としてはＧタンパク質等が挙げられる。
【００１９】
また、特異的結合物質は、標識物質で標識されていてもよい。標識物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グルタチオン、蛍光色素、ポリエチレングリコール、メリト酸等の電荷分子等が挙げられる。
【００２０】
（エクソソームの精製）
本分析の各工程について説明する。まず、エクソソームを含有する試料から該エクソソームを精製する。試料としては、目的に応じて、血液、尿、母乳、気管支肺胞洗浄液、羊水、悪性滲出液、唾液、細胞培養液等が挙げられる。中でも、血液及び尿からは、エクソソームを精製しやすい。
【００２１】
エクソソームを精製する方法としては、超遠心分離、限外ろ過、連続フロー電気泳動、クロマトグラフィー、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）デバイスを使用する方法等が挙げられる。
【００２２】
（エクソソームと特異的結合物質との反応）
次に、エクソソームと特異的結合物質（抗体、アプタマー等）とを接触させる。エクソソームの表面に検出対象の分子が存在した場合、特異的結合物質−エクソソーム複合体が形成される。特異的結合物質を適切に選択することにより、例えば、癌、肥満、糖尿病、神経変性疾患等の疾患に関連する異常を検出することができる。また、例えば人工的に膜表面にあるペプチドやタンパク質を発現させたエクソソームに対し、そのペプチドやタンパク質に対して特異的に結合する特異的結合物質を用いるなど、機能を改変したエクソソームを評価することもできる。
【００２３】
（ゼータ電位の計測）
一例として、特異的結合物質として抗体を使用した場合について説明する。エクソソームと抗体とを反応させた後、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を計測する。ゼータ電位とは、溶液中の微粒子の表面電荷である。例えば、エクソソームが負に帯電しているのに対し、抗体は正に帯電している。このため、抗体−エクソソーム複合体のゼータ電位は、エクソソーム単独のゼータ電位と比較して正にシフトしている。したがって、抗体と反応させたエクソソームのゼータ電位を測定することによって、エクソソームの膜表面における抗原の発現を検出することができる。これは、抗体に限らず、正に帯電した特異的結合物質でも同様である。
【００２４】
エクソソームのゼータ電位ζは、一例として、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で、エクソソームの電気泳動を行い、エクソソームの電気泳動速度Ｓを光学的に測定し、測定されたエクソソームの電気泳動速度Ｓに基づいて、以下の式（１）に示すスモルコフスキー（Ｓｍｏｌｕｃｈｏｗｓｋｉ）の式を用いて算出することができる。
【００２５】
【数１】
2016171198.tif 000003
【００２６】
式（１）中、Ｕは測定対象のエクソソームの電気泳動移動度、ε及びηは、それぞれ、サンプル溶液の誘電率及び粘性係数である。また、電気泳動移動度Ｕは、電気泳動速度Ｓをマイクロ流路内の電界強度で除して算出することができる。
【００２７】
エクソソームの電気泳動速度Ｓは、一例として、エクソソームを、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で電気泳動し、一例として、レーザー光を、マイクロ流路内を流れるエクソソームに照射して、レイリー散乱光による粒子画像を取得することにより、測定することができる。レーザー光としては、一例として、波長４０５ｎｍ、強度１５０ｍＷのものが挙げられる。
【００２８】
（粒子径の計測）
エクソソームの粒子径ｄは、一例として、細胞外小胞体分析チップのマイクロ流路内で、エクソソームの電気泳動を行い、エクソソームの電気泳動速度Ｓを光学的に測定し、測定されたエクソソームの電気泳動速度Ｓに基づいて、以下の式（２）に示すアインシュタイン・ストークスの式を用いて算出することができる。
【００２９】
【数２】
2016171198.tif 000004
【００３０】
式（２）中、ｄはエクソソームの粒子径、ｋはボルツマン定数、Ｔは絶対温度、ηはサンプル溶液の粘性係数、Ｄは微粒子の拡散係数である。すなわち、エクソソームの粒子径ｄは、測定対象のエクソソームのブラウン運動の状態に基づいて、算出することができる。
【００３１】
［細胞外小胞体分析チップの基本構造］
図３は、実施形態に係る細胞外小胞体分析チップの基本構造を示す斜視図である。図４は、図３におけるＩＩ−ＩＩ線断面図である。細胞外小胞体分析チップＣＨは、第１リザーバ１１０と、第２リザーバ１２０と、第１リザーバ１１０と第２リザーバ１２０とを接続する泳動流路１５０と、基材１６０とを備えている。泳動流路１５０は、例えば、ミリ流路やマイクロ流路である。泳動流路１５０は、一例として、幅２００μｍ、高さ４００μｍ、長さ１０ｍｍ程度の大きさである。泳動流路１５０の断面は矩形でなくてもよく、例えば、円、楕円、多角形、又はトンネル形状としてもよい。泳動流路１５０は、細胞外小胞体、あるいは、細胞外小胞体の表面に存在する生体分子に特異的に結合する特異的結合物質と細胞外小胞体とが相互作用してなる、特異的結合物質−細胞外小胞体複合体（一例として、抗体−エクソソーム複合体）を電気泳動するものである。特異的結合物質の一例として、抗体、アプタマー、またはこれらの組み合わせからなるものが挙げられる。アプタマーは例えば、核酸アプタマー、ペプチドアプタマーなどである。特異的結合物質が認識する分子としては、例えば抗原、膜タンパク質、核酸、糖鎖、糖脂質等が挙げられる。
【００３２】
泳動流路１５０は、その一方の端部が第１リザーバ１１０と接続され、その他方の端部が第２リザーバ１２０と接続されている。また、第１リザーバ１１０及び第２リザーバ１２０は、基材１６０に設けられ、それぞれ電極１３０及び電極１４０を有している。例えば、電極１３０は第１リザーバ１１０の底部に設けられ、電極１４０は第２リザーバ１２０の底部に設けられている。図４に示すように、電極１３０及び電極１４０は、それぞれ泳動流路１５０の端部の近傍に設けられている。また、例えば、第１リザーバ１１０は検体（例、分析対象のエクソソーム）が導入され、第２リザーバ１２０は緩衝液が導入される。なお、その緩衝液は第１リザーバ１１０に導入されてもよい。
【００３３】
本細胞外小胞体分析チップＣＨは、細胞外小胞体のゼータ電位を計測するのに好適である。以下に、検体又は細胞外小胞体としてエクソソームを分析する場合を例として、本細胞外小胞体分析チップを用いた、エクソソームのゼータ電位の測定方法について説明する。
【００３４】
まず、分析対象のエクソソームを含む試料液が、第１リザーバ１１０に導入される。分析対象のエクソソームは、特異的結合物質と反応させたものであってもよい。エクソソームは例えば培養上清や血清から抽出したものであり、試料液は、例えば、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）等の緩衝液にエクソソームが懸濁されたエクソソーム懸濁液である。次に、エクソソームを含む試料液が泳動流路１５０に導入される。一例として、シリンジを第２リザーバ１２０に接続して試料液を吸引することにより、エクソソームを泳動流路１５０に導入することができる。次に、緩衝液を、第１リザーバ１１０及び第２リザーバ１２０に入れる。後述する液位調整手段により、第１リザーバ１１０と第２リザーバ１２０との液位（液面高）を調整して揃え、泳動流路１５０に生じる静水圧流の発生を防ぎ、ゼータ電位測定の精度を向上させることが可能となる。続いて、制御部（例、後述の制御装置５、又はコンピュータなど）によって電極１３０及び１４０の間に電圧を印加し、エクソソームを電気泳動する。一例として、制御部は約５０Ｖ／ｃｍの電界強度の電圧を約１０秒間印加する。
【００３５】
電気泳動中に、泳動流路１５０にレーザー光を照射し、泳動流路１５０からの出射光であるエクソソームを介した散乱光を、対物レンズ等を用いて集光し、受光センサ（例、高感度カメラ）を用いて、エクソソーム又は特異的結合物質−エクソソーム複合体を撮影する。対物レンズの倍率は、一例として６０倍程度である。レーザーの波長及び強度は、一例として、波長４０５ｎｍ、強度１５０ｍＷである。
【００３６】
本実施形態における細胞外小胞体分析チップを用いることにより、特異的結合物質−エクソソーム複合体のゼータ電位の平均値だけでなく、特異的結合物質−エクソソーム複合体のゼータ電位を１粒子レベルで計測することができる。そのため、ゼータ電位の平均値からは、特異的結合物質が認識する分子（例えば、抗原等）を有するエクソソームが試料中に存在しないように思われる場合であっても、マイナーポピュレーションとして存在する、該抗原を有するエクソソームを検出することができる。
【００３７】
［流体デバイスＣの構造］
図５は、実施形態に係るステージ部ＳＴの設置面ＳＴａに流体デバイスＣが設置された平面図である。図６は、実施形態に係る流体デバイスＣをｘｚ平面で部分的に断面した部分断面図である。図７は、図６におけるＡ−Ａ線断面図である。
【００３８】
図５に示すように、流体デバイスＣは、平面視矩形状に形成されている。図６に示すように、流体デバイスＣは、ｚ方向に順次積み重ねられたリザーバ部材（第１基材）１０および底板（第２基材）１１を備えている。例えば、本実施形態における流体デバイスＣは、少なくともリザーバ部材１０、底板１１で構成された、積層構造（積層体）である。
この場合、流体デバイスＣの積層構造は二層構造となっている。また、例えば、このような流体デバイスＣの積層構造は、リザーバ部材１０と、底板１１とを互いに貼りあわせて形成される。
【００３９】
リザーバ部材１０は、外力などによって少なくとも一方向に弾性変形可能な材料で形成してもよい。リザーバ部材１０の材料には、一例として、エラストマーであり、シリコーンゴム、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）などが挙げられる。底板１１は、照明光Ｌ１の照射によって発生した散乱光Ｌ２が透過する材料で形成されている。底板１１は、一例として、ガラス材で形成されている。
【００４０】
流体デバイスＣは、長さ方向（ｘ方向）に配列された複数（図５では３つ）のレーン２を備えている。各レーン２は、第１リザーバ１２Ａ、第２リザーバ１２Ｂ、流路１３および電極１８Ａ、１８Ｂを備えている。第１リザーバ１２Ａ及び第２リザーバ１２Ｂは、ｘ方向に間隔をあけて配置されている。例えば、第１リザーバ１２Ａ及び第２リザーバ１２Ｂは、流路１３の流路方向に間隔をあけて配置されている。このように、複数のレーンが流路方向に（直列に）配列されていることによって、側方からの光の照射が容易となる。
複数のレーンをレーンごとに順番に分析してもよく、また、複数の検出系によって同時に分析してもよい。なお、複数のレーン２は高さ方向（ｚ方向）に配列されていてもよい。
この場合、溶液は長さ方向（ｘ方向）から注入されてもよく、ｙ方向から注入されてもよい。照射光源は例えば複数あって、それぞれの光源が対応する高さのレーン２を流れる微粒子を照射する。また、少なくとも一つの照射光源から照射方向を変えることでレーン２を流れる微粒子を照射してもよい。
【００４１】
ここで、レーン２が複数ある場合には、対物レンズの移動により照明光の形状を調整することにより、各レーン２に照射される照明光を調整してもよい。また、レーン２が複数ある場合には、流体デバイスＣが載置されるステージの移動によって、複数レーン２のうち測定対象のレーン２を選択（切換え）する構成であってもよい。
【００４２】
第１リザーバ１２Ａは、ｘｙ平面と平行な面での断面が円形状でｚ方向に延在する保持空間１４Ａと、保持空間１４Ａの＋ｚ側端部から＋ｚ方向に向かうに従って漸次拡径する漏斗状の導入部１５Ａとを備えている。保持空間１４Ａは、−ｚ側の端部が底板１１と対向して開口する。保持空間１４Ａは、流路１３と接続される。
【００４３】
第２リザーバ１２Ｂは、ｘｙ平面と平行な面での断面が円形状でｚ方向に延在する保持空間１４Ｂと、保持空間１４Ｂの＋ｚ側端部から＋ｚ方向に向かうに従って漸次拡径する漏斗状の導入部１５Ｂとを備えている。保持空間１４Ｂは、−ｚ側の端部が底板１１と対向して開口する。保持空間１４Ｂは、流路１３と接続される。
【００４４】
流路１３は、電気泳動用流路（電気泳動のための流路）である。流路１３は、流体デバイスＣの長さ方向であるｙ方向に延在する。流路１３は、底板１１と対向する側の面に保持空間１４Ａと保持空間１４Ｂとを接続するように設けられている。流路１３は、図７に示すように、リザーバ部材１０に形成された溝部１０Ａと、底板１１の表面（第２面）１１ａとで囲まれた断面矩形に形成されている。溝部１０Ａは、ｘ方向に対向する側面（第１面）１６ａ、１６ｂと、底板１１の表面１１ａとｚ方向で対向する底面（第２面）１６ｃに囲まれて形成される。側面１６ａ、１６ｂ、底面１６ｃおよび溝部１０Ａを構成する表面１１ａは鏡面加工されている。第１面は、第１側面である側面１６ａと第２側面である側面１６ｂとを含む。側面１６ａと側面１６ｂとは、互いに向かい合っており、第１方向であるｘ方向に互いに離間している。
【００４５】
レーン２は、流体デバイスＣの幅方向である照明光Ｌ１の光軸方向（入射方向）について、中心よりも＋ｘ側の端面１７に近い側に偏って配置されている。レーン２は、入射する照明光Ｌ１の光軸方向である流体デバイスＣの幅方向（図５におけるｘ方向）について、中心よりも照明光Ｌ１の入射側の端面１７に近い側に偏って配置されている。端面１７は、ｙ方向に関して少なくともレーン２が設けられる範囲が鏡面加工されている。流路１３は、一例として、幅２００μｍ、高さ（溝部１０Ａの深さ）４００μｍ、長さ１０ｍｍ程度の大きさに形成されている。
【００４６】
底板１１の表面１１ａには、保持空間１４Ａに臨んで電極１８Ａが設けられている。底板１１の表面１１ａには、保持空間１４Ｂに臨んで電極１８Ｂが設けられている。電極１８Ａ及び電極１８Ｂの素材としては、金、白金、カーボン等が挙げられる。図７に示すように、底板１１における照明光Ｌ１の入射側に位置する端面（第２端面）１９は、ｘ方向について、リザーバ部材１０の端面１７の位置よりも、照明光Ｌ１の入射側とは逆側である−ｘ側に離間している。
【００４７】
図１に戻り、光源部ＬＳは、粒子に対して悪影響を及ぼさない波長として、上述したように、一例として、波長４０５ｎｍ、強度１５０ｍＷでビーム径（ピーク値に対して1/e２となる径）０．８ｍｍでｚ方向を偏向方位とするレーザー光を照明光Ｌ１として発光する。なお、照明光Ｌ１は、偏光（例えば、直線偏光など）であっても、無偏光であってもよいが、本実施形態では、垂直偏光を用い、レイリー散乱の指向性が無い構成を採る。
照明光Ｌ１は、上述した直交面と交差する方向に延びる光軸に沿って流体デバイスＣに照射される。本実施形態では、照明光Ｌ１の光軸は、ｘ方向と平行である。本実施形態の照明光Ｌ１は、ｘ方向に延びる光軸に沿って流体デバイスＣに照射される。
【００４８】
図８は、実施形態に係る照射部２０及び調整部ＣＬの概略構成を示す図である。照射部２０は、照明光Ｌ１の光軸に沿って順次配置されたλ／２板２１およびエキスパンダレンズ２２を備えている。なお、図１に示される光源部ＬＳおよび照射部２０は、照明光Ｌ１の光軸がｙ方向に延びているが、最終的に流体デバイスＣ（流路１３）を照射する照明光Ｌ１はｘ方向に沿った光軸であるため、図８に示す照明光Ｌ１は、光軸がｘ方向に沿うものとして図示している。
【００４９】
光源部ＬＳが発光した照明光Ｌ１は、λ／２板２１を透過することで偏光方位がｙ方向に回転する。なお、光源部ＬＳがｙ方向を偏向方位とする照明光Ｌ１を発光する場合にはλ／２板２１は不要である。エキスパンダレンズ２２は、対向するシリンドリカルレンズ２２Ａ、２２Ｂを備える。シリンドリカルレンズ２２Ａ、２２Ｂは、ｙ方向についてはパワーを有していないため、照明光Ｌ１はｙ方向の幅が一定である。照明光Ｌ１のｚ方向の幅は、シリンドリカルレンズ２２Ａ、２２Ｂの光軸方向の距離に応じて拡大または縮小する。本実施形態では、エキスパンダレンズ２２は、照明光Ｌ１のｚ方向の幅を、一例として、２倍に拡大する。
【００５０】
調整部ＣＬは、エキスパンダレンズ２２でｚ方向の幅が拡大されて入射した照明光Ｌ１を調整する。調整部ＣＬは、光源部ＬＳと対物レンズ３１との間の光路に配置されている。また、調整部ＣＬは、λ／２板２１又はエキスパンダレンズ２２と対物レンズ３１との間の光路に配置されている。調整部ＣＬは駆動機構を備えていてもよく、調整部ＣＬが移動することで収光点を調整できてもよい。調整部ＣＬは例えばｘ方向に駆動可能である。
この場合、流路１３の位置が異なるチップを用いた場合であっても、流路１３内に収光点が位置するように調整することが可能である。また、収光点と流路１３の中心とがほぼ一致するように調整してもよく、検出部の中心部と収光点とがほぼ一致するように調整してもよい。
図９は、実施形態に係る調整部ＣＬおよび流体デバイスＣの部分詳細図である。調整部ＣＬは、一例として、シリンドリカルレンズで構成される。調整部ＣＬは、照明光Ｌ１のｚ方向の幅が流路１３の内部において最小となり、且つ、流路１３の照射光入射側の側面１６ａの位置における照明光Ｌ１の通過領域が側面１６ａ内に限定されるように収束する収束角度に調整している。調整部ＣＬは、照明光Ｌ１のｚ方向の幅が流路１３の内部において最小となり、且つ、流路１３の照射光入射側の側面１６ａの位置における照明光Ｌ１の照射領域が側面１６ａ内に集光するような収束角度に照明光Ｌ１を調整している。また、調整部ＣＬは、流路１３の照射光射出側の側面１６ｂの位置における照明光Ｌ１（照射光束）の通過領域が側面１６ｂ内に限定されるように収束する収束角度に調整している。
調整部ＣＬは、流路１３の照射光射出側の側面１６ｂの位置における照明光Ｌ１（照射光束）の照射領域が側面１６ｂ内に集光するような収束角度に照明光Ｌ１を調整している。
また、調整部ＣＬは、リザーバ部材１０の端面１７の位置における照明光Ｌ１の照射領域が端面１７内に収束する収束角度に調整している。さらに、調整部ＣＬは、照明光Ｌ１が流路１３内の検出領域において収束点が存在するような収束角に調整している。
例えば、流路１３の検出領域において検出部３０の焦点深度外の照明光Ｌ１の照明光束は焦点深度内の照明光束よりも少なくなるような収束角を有する。なお、例えば、上述の直交面は、リザーバ部材１０の端面１７、流路１３の照射光入射側の側面１６ａ、又は流路１３の照射光射出側の側面１６ｂを含む。
【００５１】
ここで、照明光Ｌ１が光軸方向（ｘ方向）について、流路１３の中央（ｘ＝０とする）でｚ方向の幅が最小幅ω０となる場合、照明光Ｌ１の流路１３内の媒質での収束角をθ、照明光Ｌ１の波長をλ、位置ｘおよび収束角θでのｚ方向のビーム幅をω（ｘ、θ）、照明光Ｌ１のビームプロファイルファクタをＭ２、最小幅ω０となるｘ方向の位置から側面１６ａまでの距離をｘＬとすると、下記の式（３）、式（４）において、式（５）を満足する必要がある。
【００５２】
【数３】
2016171198.tif 000005
【００５３】
【数４】
2016171198.tif 000006
【００５４】
【数５】
2016171198.tif 000007
【００５５】
従って、調整部ＣＬは、少なくとも式（３）〜（５）を満足し、且つｘ＝ｘＬのときのビーム幅ω（ｘＬ、θ）が側面１６ａのｚ方向の長さよりも小さく、側面１６ａ内に収束する収束角θで照明光Ｌ１を収束させるように調整された光学特性を有するものが設置される。
【００５６】
なお、照明光Ｌ１がガウシアン光である場合には、上記の式（３）〜（５）に含まれるビーム幅ω（ｘ、θ）は、照明光Ｌ１の強度がピーク値に対して１／ｅ２となる幅で規定される。収束角θが式（１）〜（３）を満足する場合でも、ピーク値に対して１／ｅ２以下となる強度の照明光Ｌ１がビーム幅ω（ｘＬ、θ）の外側で側面１６ａの位置に入射するため、収束角θを設定する際はピーク値に対して１／ｅ２以下となる強度の照明光Ｌ１のビーム幅も考慮する。
【００５７】
また、検出部３０によって照明光Ｌ１の光軸方向（ｘ方向）について、流路１３の全域を検出領域とするには、流路１３の全体に亘って照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦが入る必要がある。照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦが入る照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦが入るためには、リザーバ部材１０の端面１７および流路１３の側面１６ａの光軸に対する傾きも考慮する必要がある。図１０は、実施形態に係る照明光Ｌ１がリザーバ部材１０の端面１７および流路１３の側面１６ａを通過する光路を模式的に示す図である。流路１３の幅全体に亘って照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦ（図９参照）が入るためには、下記の式（６）を満足する必要がある。
【００５８】
【数６】
2016171198.tif 000008
【００５９】
ここで、角度δ３は、焦点面Ｆから見た照明光軸の仰角であり、焦点面Ｆから反時計回り方向を正方向とする。一方で、界面での入射角・出射角、リザーバ部材１０の端面１７及び流路１３の側面１６ａのｙｚ平面に対する傾斜角、空気中・流路デバイスＣの材質中・流路中の照明光束の焦点面Ｆに対する仰角、および流路デバイスＣの外側の媒質・流路デバイスＣの材質・流路１３内の媒質の屈折率には以下の関係が成立している。
【００６０】
ｎ１ｓｉｎα１＝ｎ２ｓｉｎα２
ｎ２ｓｉｎα３＝ｎ３ｓｉｎα４
α１＋β１＝δ１
α２＋β１＝δ２
α３＋β２＝δ２
α４＋β２＝δ３
【００６１】
ここで、
α１：自由空間からリザーバ部材１０の端面１７への照明光Ｌ１の入射角
α２：端面１７からリザーバ部材１０内の照明光Ｌ１の出射角
α３：リザーバ部材１０内から流路１３の壁面１６ａへの照明光Ｌ１の入射角
α４：壁面１６ａから流路１３内部への照明光Ｌ１の出射角
β１：端面１７の傾斜角
β２：壁面１６ａの傾斜角
δ１：自由空間においての照明光Ｌ１の焦点面Ｆからの仰角
δ２：リザーバ部材１０内においての照明光Ｌ１の焦点面Ｆからの仰角
δ３：流路１３内においての照明光Ｌ１の焦点面Ｆからの仰角
ｎ１：自由空間媒質の屈折率
ｎ２：リザーバ部材１０材質の屈折率
ｎ３：流路１３内の媒質の屈折率
であり、
入射角・出射角：端面１７および壁面１６ａへの垂線からの角度
傾斜角：焦点面Ｆの垂線からの角度
仰角：焦点面Ｆからの角度
としている。また、符号は全て反時計回り方向を正とする。
【００６２】
上記の式から流路１３における照明光Ｌ１の仰角δ３は、以下の式（７）で表される。
【００６３】
【数７】
2016171198.tif 000009
【００６４】
従って、流路１３のｘ方向の幅全体に亘って、照明光Ｌ１の光束内に検出部３０の焦点深度ＤＯＦが入るためには、以下の式（８）を満足する必要がある。
【００６５】
【数８】
2016171198.tif 000010
【００６６】
従って、リザーバ部材１０の端面１７および流路１３の壁面１６ａの傾斜角、照明光Ｌ１の仰角δ３は、自由空間媒質の屈折率ｎ１、リザーバ部材１０の材質の屈折率ｎ２および流路１３内の媒質の屈折率ｎ３に応じて、式（８）を満足するように、選択・製造・調整されている必要がある。
【００６７】
ステージ部ＳＴは、図２に示すステージ駆動部６０の駆動によって、ｘ方向、ｙ方向およびｚ方向に移動する。ステージ駆動部６０の駆動は、制御装置５によって制御される。
図５に示すように、ステージ部ＳＴは、流体デバイスＣが設置される設置面ＳＴａを備える。設置面ＳＴａは、ｘｙ平面と平行の面である。設置面ＳＴａは、ｙ方向に間隔をあけて配置されている。設置面ＳＴａは、流路デバイスＣのレーン２が設けられていないｙ方向の両端部を−Ｚ側から支持する。流体デバイスＣは、レーン２が配される領域が検出部３０による−Ｚ側からの観察に支障を来すことなく設置面ＳＴａに支持される。また、流体デバイスＣにおけるレーン２に照射されるまでの照明光Ｌ１の光路にステージ部ＳＴが存在しないため、流体デバイスＣに入射する照明光Ｌ１の一部がステージ部ＳＴに入射して、後述する粒子検出に悪影響を及ぼすことを抑制できる。
【００６８】
設置面ＳＴａには、固定ピン５１が突出して設けられている。固定ピン５１は、流体デバイスＣの長辺に当接する二つの固定ピン５１ａと、流体デバイスＣの短辺に当接する一つの固定ピン５１ｂとから構成される。固定ピン５１ａは流体デバイスＣのｙ方向の両側の近傍にそれぞれ配置される。固定ピン５１ｂは、＋ｙ側に位置する短辺に当接する。当該＋ｙ側に位置する固定ピン５１ａと固定ピン５１ｂとが配置された角部と対角に位置する角部には、押し付けコマ５２が設けられている。押し付けコマ５２は、ステージ部ＳＴに対して流体デバイスＣを対角方向に押し付ける。押し付けられた流体デバイスＣは、固定ピン５１ａ、５１ｂに当接することで、流路１３（レーン２）がｙ方向と平行になるように、ｘｙ方向に関してステージ部ＳＴに位置決めされた状態で固定される。
【００６９】
検出部３０は、対物レンズ３１、撮像部３２を備えている。対物レンズ３１は、ステージ部ＳＴおよび流体デバイスＣの−Ｚ側に配置されている。図９に示すように、対物レンズ３１は、検出軸３１ａがｘ方向について流路１３の中心を通る位置に配置される。検出軸３１ａは、照明光Ｌ１の光軸と直交する。撮像部３２は、一例として、ＥＭＣＣＤ（Electron Multiplying Charge Coupled Device）カメラを備えており、入射する光の画像を撮像する。撮像部３２は、対物レンズ３１を介して入射する側方散乱光の画像情報を取得する。
送信部４０は、撮像部３２で撮像された画像情報を制御装置５へ送信する。
【００７０】
［粒子検出装置の動作］
粒子検出装置１００の動作は、設置工程、導入工程、照射工程、検出工程を含む。
設置工程は、流体デバイスＣをステージ部ＳＴの設置面ＳＴａに設置する工程である。
具体的には、図５に示したように、押し付けコマ５２により流体デバイスＣを対角方向に押し付けることにより、流体デバイスＣは、固定ピン５１ａ、５１ｂに押し付けられ、流路１３（レーン２）がｙ方向と平行になるように、ステージ部ＳＴに位置決めされた状態で設置面ＳＴａに設置される。
【００７１】
導入工程は、粒子を含む試料を流体デバイスＣの保持空間１４Ａ、１４Ｂおよび流路１３に導入する工程である。試料としては、一例として、リン酸緩衝液等の緩衝液（媒質）にエクソソームが懸濁されたエクソソーム懸濁液を用いることができる。
試料が流路１３に導入されたら、制御装置５はステージ駆動部６０を駆動して、検出対象となるレーン２が照明光Ｌ１の光路および検出部３０の検出軸３１ａ上に位置させる。
検出対象となるレーン２が検出位置に移動すると、制御装置５は、電源部ＢＴを制御して電極１８Ａ及び電極１８Ｂに電界を印加させ、エクソソームを流路１３に沿って電気泳動させる力を付与する。一例として、制御装置５は、約５０Ｖ／ｃｍの電界強度の電圧を約１０秒間印加する。エクソソームの移動方向は、ｙ方向と平行である。
【００７２】
照射工程は、照明光Ｌ１をｘ方向と平行に流路デバイスＣの流路１３に照射する工程である。
照明光Ｌ１を照射する照射部２０および調整部ＣＬは、ｙ方向の幅が一定で、上述した式（３）〜式（８）を満足する収束角θでｚ方向に収束するシートビーム状の照明光Ｌ１を照射する。照明光Ｌ１の最小ビーム厚（ｚ方向のビーム幅）は、一例として、１０μｍである。照明光Ｌ１の最小ビーム厚（ｚ方向のビーム幅）方向は、図７および図９のｚ方向またはｚ方向と平行な方向である。照明光Ｌ１の最小ビーム厚（ｚ方向のビーム幅）方向は、入射面（端面１７および側面１６ａ）における照明光Ｌ１の光軸方向及び流路方向とは異なる方向であり、該光軸方向及び流路方向と直交する方向である。流路方向は、流路１３が延在する方向である。流路方向は、流路１３を流体が流れる方向である。
照射された照明光Ｌ１は、流体デバイスＣの一方の端面（照明光入射側端面）１７、流路１３の側面（照明光入射側側面）１６ａ、流路１３の内部、流路１３の側面（照明光射出側側面）１６ｂ、流体デバイスＣの他方の端面（照明光射出側端面）２７（図５参照）を順次通過する。照明光Ｌ１は、エクソソームの移動方向と直交する方向に照射される。
照射された照明光Ｌ１は、図９に示すように、流路１３の内部においてｚ方向の幅が最小となるように収束し、且つ、流路１３の側面１６ａの位置における照射光束の通過領域が側面１６ａ内に限定されるように収束する。さらに、照射された照明光Ｌ１は、流路１３の照明光射出側の側面１６ｂの位置における照射光束の通過領域が側面１６ａ内に限定されるように収束する。照明光Ｌ１は、側面１６ａの位置における照射領域が側面１６ａ内に集光し、側面１６ｂの位置における照射領域が側面１６ｂ内に集光するような収束角に調整されている。また、照射された照明光Ｌ１は、流路１３における検出部３０の検出領域において収束点が存在する。
【００７３】
検出工程は、照明光Ｌ１のｘ方向と平行な照射によって流路１３内部の粒子から生じる散乱光を検出部３０によって観察（イメージング）し検出する。検出部３０における対物レンズ３１の検出軸３１ａが照明光Ｌ１の光軸と直交しているため、検出部３０は粒子から生じる側方散乱光を検出する。検出部３０は、ｘ方向と平行に照射された照明光Ｌ１の照射によって、ｘ方向と垂直なｚ方向に向かって散乱した光を検出する。散乱光が観察された粒子の像は撮像部３２で撮像される。送信部４０は、撮像部３２で撮像された画像情報を制御装置５へ送信する。
【００７４】
［制御装置の構成］
制御装置５は、粒子検出システム１を統括的に制御する。制御装置５は、ステージ駆動部６０を介してステージ部ＳＴおよび流体デバイスＣの移動を制御する。制御装置５は、電源部（印加部）ＢＴを制御して、電極１８Ａ、１８Ｂに流路１３に沿った方向の電界を印加させる。また、制御装置５は、粒子検出装置１００が撮像した画像を処理することにより、種々の判定を行う。この制御装置５の構成の詳細について、図１１から図１６を参照して説明する。
【００７５】
図１１は、本実施形態の制御装置５の概略構成を示す図である。制御装置５は、演算部５００と、記憶部５２０とを備えている。この記憶部５２０は、フラッシュメモリ、ＨＤＤ（Ｈａｒｄ  Ｄｉｓｋ  Ｄｒｉｖｅ）、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｃｅｓｓ  Ｍｅｍｏｒｙ）、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ  Ｏｎｌｙ  Ｍｅｍｏｒｙ）、レジスタなどの記憶装置を備えている。記憶部５２０には、演算部５００が実行するプログラム（ファームウェア）が予め格納される。また、記憶部５２０には、演算部５００が演算処理を行った演算結果が格納される。
【００７６】
演算部５００は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）を備えており、各種の演算を行う。この演算部５００は、その機能部として、取得部５０１と、識別部５０２と、ゼータ電位判定部５０３と、粒子径判定部５０４と、相関部５０５と、状態判定部５０６と、評価部５０７とを備えている。
【００７７】
取得部５０１は、粒子検出装置１００が撮像した画像を取得する。具体的には、上述したように、粒子検出装置１００の撮像部３２は、対物レンズ３１を介して入射する側方散乱光の画像を撮像して、撮像した画像の画像情報を、送信部４０に出力する。取得部５０１は、撮像部３２が撮像した側方散乱光の画像の画像情報を、送信部４０を介して取得する。取得部５０１は、取得した画像を識別部５０２に出力する。
【００７８】
識別部５０２は、粒子検出装置１００が撮像した画像のなかから、微粒子の画像を抽出する。例えば、識別部５０２は、取得部５０１から供給される画像に対して既知のフィルタ処理やパターンマッチング処理を施すことにより、微粒子の画像を抽出する。このとき、識別部５０２は、抽出した微粒子の画像に対して、微粒子ごとに粒子番号を付与してもよい。なお、識別対象の微粒子が細胞外小胞体である場合には、この粒子番号とは、細胞外小胞体識別子であってもよい。つまり、識別部５０２は、微粒子の粒子に対してラベリングを行ってもよい。このことによって後述する相関部において、微粒子のゼータ電位ζと微粒子の粒子径ｄとの関連付けが容易となる。このラベリングの際には、取得部が取得した複数の画像のうち、第１の時刻において撮像された画像に含まれる第１の微粒子の画像と、第１の時刻とは異なる第２の時刻において撮像された画像に含まれる第２の微粒子の画像とが、同一の微粒子を示す画像であるか否かを、媒質中のブラウン運動による微粒子の移動量に基づいて判定してもよい。また、識別部５０２は、ラベリングした微粒子の粒子について、粒子検出装置１００が撮像した画像のフレーム間の差分に基づいて、トラッキングを行う。ここで、トラッキングとは、画像内の粒子の座標の経時的変化を追跡することをいう。識別部５０２が、微粒子のトラッキングを行った結果の一例を図１２に示す。
【００７９】
図１２は、本実施形態の記憶部５２０が記憶する粒子リストＬＳ１の一例を示す図である。この粒子リストＬＳ１には、行方向をラベリングされた粒子番号とし、列方向を撮像時刻として、各時刻における各微粒子の画像の座標（Ｘ、Ｙ）が記憶される。この一例においては、時刻ｔ０から、時刻ｔ５０までの各時刻における、微粒子Ｐ１から微粒子Ｐｎまでの、各微粒子の座標が粒子リストＬＳ１に記憶される。
【００８０】
図１１に戻り、ゼータ電位判定部５０３は、識別部５０２がトラッキングした結果に基づいて、微粒子毎のゼータ電位ζを判定する。例えば、ゼータ電位判定部５０３は、識別部５０２が行った微粒子Ｐ１についてのトラッキング結果のうち、時刻ｔ０から、時刻ｔ１までの微粒子Ｐ１の移動速度ｖ１に基づいて、微粒子Ｐ１のゼータ電位ζ１を判定する。
ゼータ電位判定部５０３は、上述の式（１）に基づいてゼータ電位ζを判定する。なお、この一例では、サンプル溶液の誘電率ε及びサンプル溶液の粘性係数ηは、予め記憶部５２０に記憶されている。ゼータ電位判定部５０３は、記憶部５２０に記憶されているサンプル溶液の誘電率ε及びサンプル溶液の粘性係数ηと、識別部５０２によるトラッキング結果から求めた微粒子の移動速度とに基づいて、微粒子のゼータ電位ζを判定する。
【００８１】
粒子径判定部５０４は、サンプル溶液中のブラウン運動による微粒子の移動量と、上述の式（２）とに基づいて、微粒子の径を判定する。ここでは、粒子径判定部５０４が、微粒子Ｐ１の粒子径を判定する場合の具体例について説明する。なお、この一例においては、ボルツマン定数ｋ及びサンプル溶液の絶対温度Ｔは、予め記憶部５２０に記憶されている。粒子径判定部５０４は、識別部５０２がトラッキングした結果に基づいて、微粒子Ｐ１の移動量を算出する。また、粒子径判定部５０４は、算出した微粒子Ｐ１の移動量と、記憶部５２０に記憶されているボルツマン定数ｋ及び絶対温度Ｔと、上述の式（２）とに基づいて、微粒子Ｐ１の粒子径ｄ１を判定する。
【００８２】
相関部５０５は、ゼータ電位判定部５０３が判定した微粒子のゼータ電位ζと、粒子径判定部５０４が判定した微粒子の粒子径ｄとを関連付ける。具体的には、ゼータ電位判定部５０３において第１の微粒子に対して判定した第１のゼータ電位ζ１と、粒子径判定部５０４において第１の微粒子に対して判定した第１の粒子径ｄ１とを、相関部５０５において第１の微粒子に関するデータとして相互に結び付ける。この相関部５０５が関連付けした結果である粒子相関リストＬＳ２の一例を、図１３に示す。
【００８３】
図１３は、本実施形態の記憶部５２０が記憶する粒子相関リストＬＳ２の一例を示す図である。この粒子相関リストＬＳ２において、識別部５０２によって付与された粒子番号毎に、粒子径ｄと、ゼータ電位ζとが関連付けられている。相関部５０５は、微粒子Ｐ１について、微粒子Ｐ１の粒子径ｄ１と、微粒子Ｐ１のゼータ電位ζ１とを関連付けて、粒子相関情報ＰＣ１（ｄ１、ζ１）として、粒子相関リストＬＳ２に記憶させる。また、相関部５０５は、微粒子Ｐ２について、微粒子Ｐ２の粒子径ｄ２と、微粒子Ｐ２のゼータ電位ζ２とを関連付けて、粒子相関情報ＰＣ２（ｄ２、ζ２）として、粒子相関リストＬＳ２に記憶させる。
このように、本実施形態によれば、媒質中に存在する微粒子の状態の相関を判定することができる。
【００８４】
状態判定部５０６は、相関部５０５が生成した粒子相関リストＬＳ２に基づいて、微粒子の状態を判定する。記憶部５２０には、粒子径ｄの基準範囲と、ゼータ電位ζの基準範囲とをそれぞれ示す基準範囲情報が記憶されている。ここでは、状態判定部５０６による状態判定の一例として、エクソソーム以外の粒子が含まれる試料において、識別部５０２が識別した微粒子を、エクソソームであるか否かを判定する場合について説明する。
エクソソームの特徴として、粒径が直径３０〜２００ｎｍ程度の微粒子であること、そしてまた、構成因子としてシャペロン分子であるＨｓｃ７０、Ｈｓｃ９０やテトラスパニン（ＣＤ９，  ＣＤ６３，  ＣＤ８１）が特異的に存在していることが挙げられる。
この場合、記憶部５２０には、粒子径のしきい値Ｔｈｄが、基準範囲情報として記憶されている。また、記憶部５２０には、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζが、基準範囲情報として記憶されている。これらの場合、記憶部５２０を基準記憶部と言い換えてもよい。このしきい値Ｔｈｄ、及びしきい値Ｔｈζの一例を図１４に示す。
【００８５】
図１４は、本実施形態の記憶部５２０が記憶するしきい値の一例を示す図である。ここで、一例として、エクソソームの粒子径が、直径３０〜１００ｎｍ程度であり、判定対象の微粒子のうち、エクソソーム以外の微粒子の粒子径が、直径１００ｎｍを超える場合について説明する。また、ここでは、一例として、エクソソームのゼータ電位ζが、しきい値Ｔｈζ以下であり、エクソソーム以外の微粒子のゼータ電位ζが、しきい値Ｔｈζを超える場合について説明する。この一例の場合には、状態判定部５０６は、微粒子の粒子径、及び微粒子のゼータ電位ζに基づいて、微粒子の判定を行うことができる。なお、状態判定部５０６が行う微粒子の判定を、微粒子の特定と言い換えてもよい。
具体的には、この一例の場合、記憶部５２０には、粒子径のしきい値Ｔｈｄとして、１００ｎｍが記憶されている。また、記憶部５２０には、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζとして、−６ｍＶが記憶されている。状態判定部５０６は、粒子相関リストＬＳ２に記憶されている粒子相関情報ＰＣのうち、粒子径ｄが、しきい値Ｔｈｄ以下である微粒子であり、かつ、ゼータ電位ζがしきい値Ｔｈζ以下である微粒子を、エクソソームであると判定する。一方、状態判定部５０６は、粒子相関リストＬＳ２に記憶されている粒子相関情報ＰＣのうち、粒子径ｄが、しきい値Ｔｈｄを超える微粒子や、ゼータ電位ζが、しきい値Ｔｈζを超える微粒子を、エクソソームでないと判定する。
【００８６】
また、一例として、エクソソームの粒子径が、直径３０〜１００ｎｍ程度であり、判定対象の微粒子のうち、エクソソーム以外の微粒子の粒子径が、直径２００ｎｍを超える場合がある。この場合には、一例として、粒子径ｄのしきい値Ｔｈｄを１５０ｎｍにすることにより、状態判定部５０６は、粒子径のみに基づいて微粒子の状態を判定することができる。
【００８７】
また、直径１００〜２００ｎｍの範囲には、エクソソーム以外の微粒子が含まれる場合がある。この場合には、粒子径のしきい値Ｔｈｄ（２００ｎｍ）は、微粒子がエクソソームであるか否かを判定するための一要素として、利用することができる。
また、直径が２００ｎｍよりも大きい範囲には、単一のエクソソームが含まれていない場合がある。この場合には、粒子径のしきい値Ｔｈｄ（２００ｎｍ）は、微粒子が単一のエクソソームであるか否かを判定するための一要素として、利用することができる。
また、直径が２００ｎｍよりも大きい範囲には、単一のエクソソームが複数個凝集した微粒子が含まれている場合がある。この場合には、粒子径のしきい値Ｔｈｄ（２００ｎｍ）は、微粒子が単一のエクソソームであるか、凝集したエクソソームであるかを判定するための一要素として、利用することができる。
このように、基準記憶部において記憶される基準値となるしきい値を、微粒子の状態の判定のための要因として用いることができる。
【００８８】
また、状態判定部５０６は、識別部５０２が識別した微粒子がエクソソームである場合に、このエクソソームが、抗体と反応しているか否かを判定する。この一例の場合、記憶部５２０には、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζが、基準範囲情報として記憶されている。上述したように、抗体−エクソソーム複合体のゼータ電位は、エクソソーム単独のゼータ電位と比較して正にシフトしている。この場合、記憶部５２０には、エクソソーム単独のゼータ電位と、抗体−エクソソーム複合体のゼータ電位との間のゼータ電位（例えば、−６ｍｖ）が、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζとして記憶されている。状態判定部５０６は、粒子相関リストＬＳ２に記憶されている粒子相関情報ＰＣのうち、微粒子のゼータ電位が、しきい値Ｔｈζ未満である微粒子を、抗体と反応していない単独のエクソソームであると判定する。一方、状態判定部５０６は、粒子相関リストＬＳ２に記憶されている粒子相関情報ＰＣのうち、微粒子のゼータ電位が、しきい値Ｔｈζ以上である微粒子を、抗体−エクソソーム複合体であると判定する。
【００８９】
また、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζ（例えば−６ｍＶ）の付近には、単体のエクソソーム及び、抗体−エクソソーム複合体以外の微粒子が存在している場合がある。この場合には、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζ（−６ｍＶ）は、微粒子が単体のエクソソームであるか否かを判定するための一要素として、利用することができる。
【００９０】
また、状態判定部５０６は、粒子径ｄのしきい値とゼータ電位ζのしきい値とを組み合わせて、微粒子の状態を判定することもできる。具体的には、抗体−エクソソーム複合体は、単独のエクソソームと比較して、ゼータ電位が低い。このため、微粒子間に働くクーロン力は、抗体−エクソソーム複合体の方が、単独のエクソソームと比較して、弱い。この微粒子間に働くクーロン力は、微粒子間の間隔を遠ざける斥力として作用する。つまり、抗体−エクソソーム複合体の方が、単独のエクソソームと比較して、微粒子間に働く斥力が弱い。このため、抗体−エクソソーム複合体の方が、単独のエクソソームと比較して、凝集しやすい傾向がある。ここで、微粒子どうしが凝集すると、凝集した複数の微粒子が１つの微粒子として振る舞うため、ブラウン運動の運動量に変化が生じる。したがって、粒子径判定部５０４は、凝集した複数の微粒子を１つの微粒子として判定することにより、凝集していない場合に比べて、粒子径ｄが大きくなる方向にシフトする。
ここで、粒子径ｄが２００ｎｍ以下の微粒子をエクソソームであると判定する場合を一例にして説明する。粒子径判定部５０４は、抗体−エクソソーム複合体を直径が２００ｎｍを超える微粒子であると判定することがある。このため、状態判定部５０６が粒子径ｄのみによって判定した場合には、抗体−エクソソーム複合体の粒子径ｄが、エクソソームであるか否かの粒子径ｄのしきい値Ｔｈｄを超えるため、抗体−エクソソーム複合体がエクソソームではないと判定される場合がある。そこで、状態判定部５０６は、粒子径ｄが２００ｎｍ以下の微粒子をエクソソームであると判定するとともに、粒子径ｄが２００ｎｍを超える微粒子であっても、ゼータ電位ζがしきい値Ｔｈζ以下である場合には、その微粒子をエクソソームであると判定する。つまり、状態判定部５０６は、粒子径ｄのしきい値Ｔｈｄとゼータ電位ζのしきい値Ｔｈζとを組み合わせて、微粒子がエクソソームであるか否かを判定する。
【００９１】
また、微粒子がエクソソームであるか否かの判定には、テトラスパニン（ＣＤ９，ＣＤ８１など）のように、エクソソームに特異的に結合される抗体を利用することができる。
つまり、エクソソームに対して抗体を作用させることによるゼータ電位ζ及び粒子径ｄの、それぞれの変化に基づいて、微粒子がエクソソームであるか否かを判定することができる。
本実施形態の粒子検出システム１は、ゼータ電位ζ及び粒子径ｄに基づく、上述のような評価条件を様々に組み合わせて、微粒子の評価を行うことができる利点を有する。
【００９２】
また、状態判定部５０６は、粒子径ｄのしきい値Ｔｈｄとゼータ電位ζのしきい値Ｔｈζとを組み合わせた上で、識別部５０２によるトラッキングの結果に基づいて、微粒子の状態を判定することもできる。具体的には、状態判定部５０６は、単独のエクソソームに抗体を反応させ、さらに抗体−エクソソーム複合体どうしが凝集するまでの経過を、識別部５０２によるトラッキングの結果に基づいて追跡する。具体的には、状態判定部５０６は、各微粒子の粒子径ｄとゼータ電位ζとが、時間の経過により、図１４に示す領域ＤＭ１〜領域ＤＭ４のうち、いずれの領域からいずれの領域に移動するかによって、微粒子の状態を判定する。一例として、状態判定部５０６は、領域ＤＭ３に存在する微粒子（例えば、単独のエクソソーム）が、領域ＤＭ２に移動した場合には、エクソソームが抗体と反応して、抗体−エクソソーム複合体に変化したと判定する。また、状態判定部５０６は、このエクソソームが、領域ＤＭ２から領域ＤＭ１に移動した場合には、抗体−エクソソーム複合体どうしが凝集したと判定する。
【００９３】
評価部５０７は、微粒子の状態の良否を評価する。一例として、評価部５０７は、状態判定部５０６が判定した微粒子の状態に基づいて、微粒子の状態をＡランク、Ｂランク、Ｃランクにランク付けする。ここで、Ａランクとは、微粒子の粒子径ｄ及びゼータ電位ζのいずれもが、基準範囲内に含まれる場合である。また、Ｂランクとは、微粒子の粒子径ｄ及びゼータ電位ζのいずれか一方が基準範囲内に含まれない場合である。また、Ｃランクとは、微粒子の粒子径ｄ及びゼータ電位ζのいずれもが基準範囲内に含まれない場合である。
【００９４】
一例として、評価部５０７が、微粒子が単独のエクソソームであるか否かを評価する場合について説明する。この場合、評価部５０７は、微粒子が領域ＤＭ３に存在する場合には、この微粒子のランクを、ランクＡであると判定する。また、評価部５０７は、微粒子が領域ＤＭ２又は領域ＤＭ４に存在する場合には、この微粒子のランクを、ランクＢであると判定する。また、評価部５０７は、微粒子が領域ＤＭ１に存在する場合には、この微粒子のランクを、ランクＣであると判定する。
【００９５】
［制御装置の動作］
次に、図１５を参照して、制御装置５の動作について説明する。
図１５は、本実施形態の制御装置５の動作の一例を示す図である。ここでは、粒子検出装置１００が、所定の時間間隔によって側方散乱光の画像を撮像する場合について説明する。
【００９６】
取得部５０１は、粒子検出装置１００の撮像部３２が撮像した画像を、粒子検出装置１００から１枚ずつ取得する（ステップＳ１０）。この画像には、泳動流路１５０を電気泳動する微粒子の画像が含まれている。また、この微粒子の画像には、エクソソームの画像が含まれている。
【００９７】
次に、識別部５０２は、ステップＳ１０において取得された画像の中から、微粒子の画像を抽出し、微粒子毎に固有の粒子番号を付与する。つまり、識別部５０２は、微粒子をラベリングする（ステップＳ２０）。識別部５０２は、すべての撮像済み画像について、ラベリングが終了したか否かを判定する（ステップＳ３０）。識別部５０２は、すべての撮像済み画像について、ラベリングが終了していないと判定した場合（ステップＳ３０；ＮＯ）には、処理をステップＳ１０に戻し、次の画像についてラベリングを行う。識別部５０２は、すべての撮像済み画像について、ラベリングが終了したと判定した場合（ステップＳ３０；ＹＥＳ）には、処理をステップＳ４０に進め、識別した微粒子についてトラッキングを行う。
【００９８】
次に、ゼータ電位判定部５０３は、識別部５０２がトラッキングした結果に基づいて、微粒子毎のゼータ電位ζを判定する（ステップＳ５０）。また、粒子径判定部５０４は、識別部５０２がトラッキングした結果に基づいて、微粒子毎の粒子径を判定する（ステップＳ６０）。なお、ステップＳ５０と、ステップＳ６０とは、順序が逆であってもよく、並列して実行されてもよい。
【００９９】
次に、相関部５０５は、ゼータ電位判定部５０３が判定した微粒子のゼータ電位ζと、粒子径判定部５０４が判定した微粒子の粒子径ｄとを関連付ける（ステップＳＳ７０）。
相関部５０５は、関連付けした結果を示す粒子相関リストＬＳ２を生成し、生成した粒子相関リストＬＳ２を記憶部５２０に記憶させる。相関部５０５は、すべての微粒子について関連付けが終了していないと判定した場合（ステップＳ８０；ＮＯ）には、処理をステップＳ４０に戻す。相関部５０５は、すべての微粒子について関連付けが終了したと判定した場合(ステップＳ８０；ＹＥＳ）には、処理をステップＳ９０に進める。
【０１００】
次に、状態判定部５０６及び評価部５０７は、ステップＳ７０において生成された粒子相関リストＬＳ２に基づいて、粒子の状態の判定及び評価を行う。これら、状態判定部５０６による粒子の状態の判定、及び評価部５０７による評価の具体例について、以下説明する。
【０１０１】
［評価の例（その１）：物質の作用前後の比較］
評価部５０７は、微粒子に対して物質を作用させる前の粒子径及びゼータ電位の分布と、作用させた後の粒子径及びゼータ電位の分布とを比較評価することができる。具体例として、微粒子がヒト繊維肉芽腫由来のエクソソームである場合に、評価部５０７は、このエクソソームに抗ＣＤ８１抗体を作用させた場合の粒子径及びゼータ電位の分布を評価する。この具体例の場合、相関部５０５は、抗ＣＤ８１抗体を作用させる前のエクソソームについて、ゼータ電位ζと、粒子径ｄとを関連付けて、粒子相関リストＬＳ２−１を生成する。次に、相関部５０５は、抗ＣＤ８１抗体を作用させた後のエクソソームについて、ゼータ電位ζと、粒子径ｄとを関連付けて、粒子相関リストＬＳ２−２を生成する。評価部５０７は、抗ＣＤ８１抗体を作用させる前のエクソソームについての粒子相関リストＬＳ２−１と、抗ＣＤ８１抗体を作用させた後のエクソソームについての粒子相関リストＬＳ２−２とに基づいて、図１５に示すように、粒子径及びゼータ電位の分布を出力する。
【０１０２】
図１６は、本実施形態の評価部５０７が出力する粒子径及びゼータ電位の分布の一例を示す図である。同図に示すように、評価部５０７は、エクソソームに対して抗ＣＤ８１抗体を作用させる前の粒子径及びゼータ電位の分布と、作用させた後の粒子径及びゼータ電位の分布とを重ねて出力する。これにより、粒子検出システム１は、微粒子に物質を作用させた場合の粒子径及びゼータ電位の分布の変化を提示することができる。
【０１０３】
［評価の例（その２）：評価しきい値（基準範囲情報）の算出］
これまで、粒子径及びゼータ電位の評価のしきい値は、予め定められているとして説明した。評価部５０７は、微粒子の状態に基づいて、評価のしきい値を算出する構成であってもよい。具体例として、評価部５０７が、物質を作用させる前のエクソソームの状態に基づいて、評価のしきい値を算出し、この算出したしきい値に基づいて、物質を作用させた後のエクソソームについて評価する場合について、図１７から図１９を参照して説明する。
【０１０４】
図１７は、本実施形態の制御装置５ａの構成の一例を示す構成図である。制御装置５ａは、制御装置５の演算部５００が備える各機能部に加え、計数部５０８と、比率算出部５０９と、変化率算出部５１０とを備える。
計数部５０８は、基準範囲情報が示す粒子径のしきい値Ｔｈｄ及びゼータ電位のしきい値Ｔｈζによって区分される領域毎に、当該領域に含まれる細胞外小胞体の数を計数する。ここで、領域の一例には、図１４を参照して説明した、領域ＤＭ１〜領域ＤＭ４がある。
比率算出部５０９は、計数部５０８が計数する細胞外小胞体の数の、領域間の比率を算出する。具体的には、比率算出部５０９は、計数部５０８が計数した細胞外小胞体の数を１００％とした場合の、各領域内の細胞外小胞体の数の割合を、領域毎に算出する。
変化率算出部５１０は、物質を作用させる前の細胞外小胞体の比率と、物質を作用させた後の細胞外小胞体の比率との変化率を、領域毎に算出する。例えば、変化率算出部５１０は、抗ＣＤ８１抗体を作用させる前のエクソソームの領域毎の比率と、抗ＣＤ８１抗体を作用させた後のエクソソームの領域毎の比率との間の変化率を、領域毎に算出する。
【０１０５】
次に、制御装置５ａの動作の一例について説明する。図１８は、本実施形態の制御装置の動作の変形例を示す図である。図１９は、本実施形態のしきい値及び領域の一例を示す図である。
粒子径判定部５０４は、抗体作用前のエクソソームについて、粒子径ｄを判定する。評価部５０７は、粒子径判定部５０４が判定した粒子径ｄの平均値を算出する（ステップＳ１１０）。この一例では、評価部５０７は、平均粒径を１２０ｎｍとして算出する。評価部５０７は、算出した平均粒径１２０ｎｍを、粒子径のしきい値Ｔｈｄとして、記憶部５２０に記憶させる（ステップＳ１２０）。図１９に、評価部５０７が算出したしきい値Ｔｈｄの一例を示す。
ゼータ電位判定部５０３は、抗体作用前のエクソソームについて、ゼータ電位ζを判定する。評価部５０７は、ゼータ電位判定部５０３が判定したゼータ電位ζの平均値を算出する（ステップＳ１３０）。この一例では、評価部５０７は、平均ゼータ電位を−（マイナス）１３ｍＶとして算出する。評価部５０７は、算出した平均ゼータ電位−１３ｍＶを、粒子径のしきい値Ｔｈζとして、記憶部５２０に記憶させる（ステップＳ１４０）。図１９に、評価部５０７が算出したしきい値Ｔｈζの一例を示す。
ステップＳ１１０からステップＳ１４０の処理によって、記憶部５２０にしきい値が記憶される。
【０１０６】
次に、計数部５０８は、抗体作用前のエクソソームの各領域毎の粒子数を計数する（ステップＳ１５０）。この計数部５０８による計数結果の一例を、図２０に示す。
【０１０７】
図２０は、本実施形態の計数部５０８による計数結果の一例を示す表である。具体的には、計数部５０８は、抗体作用前のエクソソームについて、領域ＤＭ１〜領域ＤＭ４の粒子数を、２４個、２８個、１６個、１９個と計数する。
次に、比率算出部５０９は、計数部５０８が計数したエクソソームの粒子数に基づいて、領域間の粒子数の比率を算出する。具体的には、図２０に示すように、比率算出部５０９は、領域ＤＭ１〜領域ＤＭ４の粒子数の比率を、２８％、３１％、１９％、２２％と算出する。
【０１０８】
次に、計数部５０８は、抗体作用後のエクソソームの各領域毎の粒子数を計数する（ステップＳ１６０）。具体的には、計数部５０８は、抗体作用後のエクソソームについて、領域ＤＭ１〜領域ＤＭ４の粒子数を、１３個、０個、６個、２６個と計数する。
【０１０９】
次に、比率算出部５０９は、計数部５０８が計数したエクソソームの粒子数に基づいて、領域間の粒子数の比率を算出する。具体的には、図２０に示すように、比率算出部５０９は、領域ＤＭ１〜領域ＤＭ４の粒子数の比率を、２９％、０％、１３％、５８％と算出する。
【０１１０】
次に、変化率算出部５１０は、ステップＳ１５０において算出された比率と、ステップＳ１６０において算出された比率との変化率を算出する（ステップＳ１７０）。具体的には、図２０に示すように、変化率算出部５１０は、領域ＤＭ１〜領域ＤＭ４の変化率を、＋３．５％、−１００％、−３２％、＋１６３％と算出する。
評価部５０７は、算出された変化率と、予め求められている変化率の傾向との比較により、微粒子の状態を評価する。
【０１１１】
なお、ここでは、評価部５０７は、粒子径のしきい値Ｔｈｄを、粒子径の平均値に基づいて算出し、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζを、ゼータ電位の平均値に基づいて算出したが、これに限られない。評価部５０７は、粒子径分布の最大値と最小値の間から選択される、粒子径を示す軸と平行な線分を、粒子径のしきい値Ｔｈｄとして算出してもよい。また、評価部５０７は、ゼータ電位分布の最大値と最小値の間から選択される、ゼータ電位を示す軸と平行な線分を、ゼータ電位のしきい値Ｔｈζとして算出してもよい。
【０１１２】
［評価の例（その３）：各領域の増減の要因に基づく評価］
評価部５０７は、抗体の作用前後における各領域の粒子数の増減について、次に示すような傾向に基づいて、微粒子の状態を評価してもよい。すなわち、領域ＤＭ１について、粒子数の増加要因には、凝集発生があり、減少要因には、抗体結合、及び凝集発生がある。また、領域ＤＭ２について、粒子数の増加要因には、凝集解消があり、減少要因には、抗体結合、及び凝集発生がある。また、領域ＤＭ３について、粒子数の増加要因には、抗体結合があり、減少要因には、凝集発生がある。また、領域ＤＭ４について、粒子数の増加要因には、抗体結合及び凝集発生があり、減少要因には、凝集解消がある。
また、評価部５０７は、抗体結合によって予測される各領域の粒子数の増減について、次に示すような傾向に基づいて、微粒子の状態を評価してもよい。すなわち、領域ＤＭ１について、抗体作用の結果、粒子が領域ＤＭ４に移行する。この場合、想定される機構は、抗体結合である。また、領域ＤＭ２について、抗体作用の結果、粒子数が減少する。この場合、想定される機構は、抗体結合及び凝集発生である。また、領域ＤＭ３について、抗体作用の結果、粒子が領域ＤＭ４に移行する。この場合、想定される機構は、抗体結合及び凝集発生である。また、領域ＤＭ４について、抗体作用の結果、粒子数が増加する。
この場合、想定される機構は、抗体結合及び凝集発生である。
【０１１３】
この一例の場合、上述の傾向を示すしきい値が、変化率のしきい値として記憶部５２０に記憶されている。評価部５０７は、図１８から図２０に示した手順により算出した増減率と、記憶部５２０に記憶されている変化率のしきい値とを比較することにより、微粒子の状態を評価する。
【０１１４】
［評価の例（その４）：流路毎に異なる種類の抗体を反応させることによる評価］
また、粒子検出システム１は、複数のレーンを備えているため、レーンごとに微粒子の種類及び抗体の種類を変えることができる。具体例を図２１から図２３に示す。
図２１は、本実施形態の複数のレーンにそれぞれ種類が異なる抗体を添加する場合の一例を示す模式図である。
図２２は、本実施形態の疾患の判定パネルの一例を示す表である。
図２３は、本実施形態の疾患の診断及び指導パネルの一例を示す表である。
これら図２１から図２３に示すように、評価部５０７は、レーンごとに異なる抗体を添加し、それぞれのレーンにおける微粒子の状態を評価することもできる。すなわち、粒子検出システム１によれば、目的の疾患の診断に最適な抗体の組合せを任意に選択して検査することができる。また、粒子検出システム１によれば、複数レーンを同時に評価することができるため、単一のレーンによって評価する場合に比べて、評価時間を短縮することができる。
【０１１５】
［評価の例（その５）：機能改変したエクソソームの物性評価］
評価部５０７は、微粒子の物性評価を行うこともできる。具体例として、評価部５０７が、機能を改変したエクソソームの物性評価を行う場合について、図２４から図２６を参照して説明する。
【０１１６】
図２４は、本実施形態のゲート領域Ｇの一例を示す図である。ここで、ゲート領域Ｇとは、粒子径ｄの下限しきい値Ｔｈｄ１及び上限しきい値Ｔｈｄ２と、ゼータ電位ζの下限しきい値Ｔｈζ１及び上限しきい値Ｔｈζ２とに囲まれた領域をいう。本実施形態の評価部５０７は、粒子径ｄの下限しきい値Ｔｈｄ１と、粒子径ｄの上限しきい値Ｔｈｄ２との間を、粒子径ｄのゲート領域Ｇｄとして、粒子の物性を評価する。また、評価部５０７は、ゼータ電位ζの下限しきい値Ｔｈζ１と、ゼータ電位ζの上限しきい値Ｔｈζ２との間を、ゼータ電位ζのゲート領域Ｇζとして、粒子の物性を評価する。以下、これらの各しきい値は、記憶部５２０に予め記憶されているとして説明するが、これに限られない。これらの各しきい値は、演算部５００が演算によって算出してもよいし、制御装置５の外部から供給されてもよい。
【０１１７】
次に、図２５を参照して、演算部５００による微粒子の物性評価の動作の一例を説明する。
図２５は、本実施形態の演算部５００による微粒子の物性評価の動作の一例を示す図である。
評価部５０７は、記憶部５２０から、粒子径ｄの下限しきい値Ｔｈｄ１及び上限しきい値Ｔｈｄ２と、ゼータ電位ζの下限しきい値Ｔｈζ１及び上限しきい値Ｔｈζ２とを読み出す（ステップＳ２１０）。
評価部５０７は、ステップＳ２１０において読み出した各しきい値に基づいて、ゲート領域を示す情報を、ディスプレイ（不図示）に表示する（図２４のゲート領域Ｇを参照）（ステップＳ２２０）。
次に、ゼータ電位判定部５０３は、評価対象の微粒子のゼータ電位ζを判定する。また、粒子径判定部５０４は、評価対象の微粒子の粒子径ｄを判定する（ステップＳ２３０）。この具体例において、評価対象の微粒子とは、機能改変されたエクソソームである。
次に、相関部５０５は、ステップＳ２３０において判定されたゼータ電位ζと、粒子径ｄとを、微粒子毎に関連付けする（ステップＳ２４０）。また、相関部５０５は、関連付けしたゼータ電位ζと、粒子径ｄとを、微粒子毎にディスプレイ（不図示）に表示する。
計数部５０８は、ゲート領域Ｇ内に存在する微粒子の粒子数を計数する（ステップＳ２５０）。また、計数部５０８は、ゲート領域Ｇ外に存在する微粒子の粒子数を計数する（ステップＳ２６０）。
比率算出部５０９は、計数部５０８が計数した粒子数に基づいて、ゲート領域Ｇ内の粒子数と、ゲート領域Ｇ外の粒子数との比率を算出して（ステップＳ２７０）、処理を終了する。
【０１１８】
次に、評価部５０７による評価の一例について、図２６を参照して説明する。
図２６は、本実施形態の評価部５０７による評価の一例を示す図である。同図に示すように、評価部５０７は、ゲート領域Ｇ内に存在する粒子が比較的多い場合に、適合と判定し、ゲート領域Ｇ内に存在する粒子が比較的少ない場合に、不適合と判定する。つまり、評価部５０７は、ゲート領域Ｇ内の粒子数と、ゲート領域Ｇ外の粒子数に基づいて、評価対象の微粒子の適合性を判定する。
【０１１９】
ここで、エクソソームを疾病の治療目的に応じて、その機能を改変する技術が知られている。例えば、エクソソームをドラッグデリバリシステムにおける薬剤のキャリアとして利用することができる。一例として、遺伝子工学的手法を用いて、ウイルスベクターを用いて任意のタンパク質遺伝子を細胞に導入し、その細胞からエクソソームを回収する。このことによってｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡなどのデリバリーキャリアとしてエクソソームを利用することが可能である。また、例えばエクソソームに特異的結合物質を結合させた機能改変エクソソームを作製し、使用することも可能である。
上述の評価部５０７によれば、機能改変したエクソソームが、上述のドラッグデリバリシステムに適合するものであるか否かについて、評価することができる。
【０１２０】
［まとめ］
以上説明したように、本実施形態に係る粒子検出システム１は、微粒子の粒子径と、ゼータ電位とを、微粒子毎に求めるとともに、求めた粒子径とゼータ電位とを相関づける。
これにより、粒子検出システム１によれば、粒子径又はゼータ電位のいずれか一方だけでは判定が困難であった微粒子の状態を判定することができる。
また、本実施形態に係る粒子検出システム１は、照明光をレーン２の側面から入射させることにより、微粒子から生ずる散乱光を精度よく検出することができる。これにより、粒子検出システム１によれば、微粒子の粒子径やゼータ電位を精度よく判定することができる。したがって、粒子検出システム１によれば、微粒子の状態を精度よく判定することができる。
【０１２１】
なお、上記実施形態では、電界による力を付与して粒子に流路１３内を移動させる構成を例示したが、これに限定されるものではなく、媒質に流速を付与することにより、粒子を所定方向に移動させる構成、または粒子を所定方向に移動させる力を与えない構成であってもよい。
【０１２２】
なお、上記実施形態では、粒子から−Ｚ側に向けて発生する散乱光を検出する構成としたが、これに限られず、例えば、＋ｙ側または−ｙ側または＋ｚ側に向けて散乱する散乱光を検出する構成であってもよい。検出部は流路の底面側に限られず、流路の側面側でもよい。例えば、流路の側面から照明光を照射した場合に、流路の底面側から側方散乱光を検出してもよいし、流路の上面側から側方散乱光を検出してもよい。また、前方散乱光を検出する構成であってもよい。例えば、流路の側面から照明光を照射した場合に、流路の照明光出射側から後方散乱光を検出してもよく、流路の照明光出射側から前方散乱光を検出してもよい。
【０１２３】
なお、上記実施形態では、長さ方向（ｙ方向）に配列された複数のレーン２を備えた流体デバイスＣを例示したが、複数のレーン２は高さ方向（ｚ方向）に配列されていてもよい。この場合、溶液は長さ方向（ｘ方向）から注入されてもよく、ｙ方向から注入されてもよい。照射光源は例えば複数あって、それぞれの光源が対応する高さのレーン２を流れる微粒子を照射する。また、少なくとも一つの照射光源から照射方向を変えることでレーン２を流れる微粒子を照射してもよい。
【０１２４】
なお、照明光Ｌ１のｚ方向の幅が最小サイズとなる位置を調整するには、例えば、第２調整部として、焦点距離が異なる複数の調整部ＣＬ（レンズ）をターレット板に設け、ターレット板を回転させて所望の焦点距離を有するレンズを照明光Ｌ１の光路に位置させる構成や、ズームレンズを用いる構成を採ることができる。また、有効径の異なる調整部ＣＬを複数用い、所望の有効径を有するレンズを照明光Ｌ１の光路に位置させる構成や可変ＮＡ絞りを用いて集光レンズの有効径を可変としてもよい。さらに、倍率の異なるエキスパンダレンズ２２を複数用い、所望の有効径を有するエキスパンダレンズ２２照明光Ｌ１の光路に位置させる構成や、ズームレンズを用いる構成を採って、倍率を可変としてもよい。
【０１２５】
なお、照明光Ｌ１の光軸がｘ軸と平行である構成を例示したが、これに限定されるものではなく、上述した直交面と交差する範囲であれば、例えば、ｘ軸に対して±１０度、または±５度で傾いてもよい。照明光Ｌ１の光軸がｘ軸と平行で側面１６ａと直交して入射した場合には、原理的にはレイリー散乱光の散乱角依存性が最も弱くなるが、上述したように、測定対象の粒子よりも大きい粒子からのミー散乱光をカットした場合にはノイズが低減され、照明光Ｌ１の光軸がｘ軸に対して傾いていた方がレイリー散乱光の信号強度が高くなる可能性がある。
【０１２６】
なお、上記実施形態では、粒子としてエクソソームを用いる構成を例示したが、本装置および本システムは、エクソソーム以外にも適用できることは言うまでもない。例えば、本装置および本システムは、エクソソーム（細胞外小胞体）のような自己細胞由来粒子、細菌・ウィルスのような外来粒子、に代表される有機物粒子のみならず、金属・シリカのような無機物粒子まで適用範囲を広げることが可能である。
【０１２７】
なお、上記実施形態では、粒子検出システム１が、微粒子の状態の判定と、微粒子の種類の特定を行う場合について例示した。ここで、粒子検出システム１が判定する微粒子の状態には、微粒子どうしの凝集や、微粒子と抗体との結合状態等が含まれる。また、粒子検出システム１が特定する微粒子の種類には、エクソソーム、マイクロベシクル、アポトーシス小体、細胞、高分子ミセル等が含まれる。
【０１２８】
粒子検出装置１００は、粒子から生じる側方散乱光を検出しているため、前方散乱光を受光した場合と比較してノイズの少ない画像情報が得られる。また、例えば、照明光Ｌ１が側面１６ａの位置における照射光束の通過領域が側面１６ａ内に限定されずに、照明光Ｌ１の一部Ｋが底板１１を介して流路１３の内部に入射した場合には、側面１６ｂまたは底面１６ｃで散乱光が発生する可能性がある。側面１６ｂまたは底面１６ｃで発生した散乱光の信号強度は、観察対象の粒子で発生した散乱光の信号強度よりも数桁以上大きく、撮像部３２のダイナミックレンジを超えてしまう。粒子を観察する状態においては、側面１６ｂまたは底面１６ｃ（以下、壁面と称する）で発生した散乱光は撮像部３２を飽和させる可能性がある。そして、この散乱光がｚ方向について広範囲から発生する場合、デフォーカスによる拡がりの発生のため、撮像部３２上において散乱光が流路内の観察領域を大きく浸食することになる。本実施形態では、側面１６ａの位置において照明光Ｌ１の通過領域が側面１６ａ内に限定され、且つ、端面１７の位置において照明光Ｌ１の通過領域が端面１７内に限定されるように照明光Ｌ１を収束させているため、信号強度の大きい散乱光の発生を抑制することができる。そのため、粒子検出装置１００は、流路１３内の粒子に関する情報を高精度で検出することができる。
【０１２９】
また、検出部３０の焦点深度ＤＯＦの外側の粒子からの散乱光は、デフォーカスのためにバックグラウンド光となり、粒子状に検出することができない。本実施形態では、流路１３の内部でｚ方向の幅が最小となり、流路１３内の観察領域外におけるアックグラウンド光を抑えているため、照明光Ｌ１で照明された粒子を高精度に検出することが可能になる。また、本実施形態では、端面１７が鏡面加工されているため、端面１７で散乱光がノイズとなり粒子検出精度に悪影響が及ぶことを抑制できる。また、本実施形態では、照明光Ｌ１が端面１７に直交して入射しているため、光軸調整が容易になる。さらに、本実施形態では、底板１１の端面１９がリザーバ部材１０の端面１７よりも照明光Ｌ１の入射側とが逆側に離間しているため、照明光Ｌ１の一部が端面１７に入射する前に端面１９に入射することを回避できる。
【０１３０】
なお、上述した実施形態における粒子検出装置１００において、電気泳動によって微粒子を所定方向に移動させる場合について説明したが、これに限られない。例えば、粒子検出装置１００は、媒質に流速を与えることによって、微粒子を所定方向に移動させてもよい。また、粒子検出装置１００は、微粒子を所定方向に移動させる力を与えない構成であってもよい。
【０１３１】
また、上述した実施形態において、粒子検出装置１００と制御装置５とが別体である場合について説明したが、これに限られない。粒子検出システム１において、粒子検出装置１００と制御装置５とが、一体の装置であってもよい。例えば、粒子検出システム１において、制御装置５が粒子検出装置１００に組み込まれるコンピュータとして構成されていてもよい。このように構成することにより、粒子検出システム１は、別体構成の場合に比較して、装置の大きさや設置面積を低減することができる。
【０１３２】
なお、上述した実施形態における粒子検出装置１００の一部をコンピュータで実現するようにしてもよい。その場合、この制御機能を実現するためのプログラムをコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録して、この記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータシステムに読み込ませ、実行することによって実現してもよい。なお、ここでいう「コンピュータシステム」とは、粒子検出装置１００に内蔵されたコンピュータシステムであって、ＯＳや周辺機器等のハードウェアを含むものとする。また、「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ等の可搬媒体、コンピュータシステムに内蔵されるハードディスク等の記憶装置のことをいう。さらに「コンピュータ読み取り可能な記録媒体」とは、インターネット等のネットワークや電話回線等の通信回線を介してプログラムを送信する場合の通信線のように、短時間、動的にプログラムを保持するもの、その場合のサーバやクライアントとなるコンピュータシステム内部の揮発性メモリのように、一定時間プログラムを保持しているものも含んでもよい。また上記プログラムは、前述した機能の一部を実現するためのものであってもよく、さらに前述した機能をコンピュータシステムにすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであってもよい。また、上述した実施形態における粒子検出装置１００の各機能ブロックの一部、または全部を、ＬＳＩ（Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）等の集積回路として実現してもよい。粒子検出装置１００の各機能ブロックは個別にプロセッサ化してもよいし、一部、または全部を集積してプロセッサ化してもよい。また、集積回路化の手法はＬＳＩに限らず専用回路、または汎用プロセッサで実現してもよい。
また、半導体技術の進歩によりＬＳＩに代替する集積回路化の技術が出現した場合、当該技術による集積回路を用いてもよい。
【０１３３】
以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施形態について説明したが、本発明は係る例に限定されないことは言うまでもない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。
【符号の説明】
【０１３４】
１…粒子検出システム、５…制御装置、１００…粒子検出装置、５０１…取得部、５０２…識別部、５０３…ゼータ電位判定部、５０４…粒子径判定部、５０５…相関部、５０６…状態判定部、５０７…評価部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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