(57)【要約】  コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産を向上させる新規な技術を開発し、異種タンパク質の分泌生産法を提供する。異種タンパク質を分泌生産する能力を有し、且つ、特定の変異を有するphoS遺伝子を保持するように改変されたコリネ型細菌を培養し、異種タンパク質を分泌生産する。
2016171224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法であって、
前記コリネ型細菌が、変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されており、
前記変異型PhoSタンパク質が、異種タンパク質の分泌生産量を向上させる変異を有するPhoSタンパク質であり、
前記遺伝子構築物が、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含み、
前記異種タンパク質が、前記シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する、方法。
【請求項２】
前記変異が、野生型PhoSタンパク質において、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換される変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異が、野生型PhoSタンパク質において、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外の、ＨｉｓＫＡドメインのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換される変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記変異が、野生型PhoSタンパク質において、配列番号４の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換される変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法であって、
前記コリネ型細菌が、変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されており、
前記変異型PhoSタンパク質が、野生型PhoSタンパク質において、配列番号４の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換される変異を有するPhoSタンパク質であり、
前記遺伝子構築物が、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含み、
前記異種タンパク質が、前記シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する、方法。
【請求項６】
前記芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、セリン残基、システイン残基、メチオニン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記野生型PhoSタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法：
（ａ）配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項８】
前記シグナルペプチドがTat系依存シグナルペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Tat系依存シグナルペプチドが、TorAシグナルペプチド、SufIシグナルペプチド、PhoDシグナルペプチド、LipAシグナルペプチド、およびIMDシグナルペプチドからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記コリネ型細菌が、さらに、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が上昇するように改変されている、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Tat系分泌装置をコードする遺伝子が、tatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記シグナルペプチドがSec系依存シグナルペプチドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Sec系依存シグナルペプチドが、PS1シグナルペプチド、PS2シグナルペプチド、およびSlpAシグナルペプチドからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子構築物が、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子構築物が、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036（FERM BP-734）またはATCC13869に由来する改変株である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記コリネ型細菌が、細胞表層タンパク質の活性が低下しているコリネ型細菌である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されたコリネ型細菌であって、
前記変異型PhoSタンパク質が、野生型PhoSタンパク質において、配列番号４の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換される変異を有するPhoSタンパク質である、コリネ型細菌。
【請求項２１】
前記芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、セリン残基、システイン残基、メチオニン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基である、請求項２０に記載のコリネ型細菌。
【請求項２２】
前記野生型PhoSタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項２０または２１に記載のコリネ型細菌：
（ａ）配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項２３】
コリネバクテリウム属細菌である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のコリネ型細菌。
【請求項２４】
コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項２３に記載のコリネ型細菌。
【請求項２５】
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036（FERM BP-734）またはATCC13869に由来する改変株である、請求項２４に記載のコリネ型細菌。
【請求項２６】
細胞表層タンパク質の活性が低下している、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載のコリネ型細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種タンパク質の分泌生産法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物による異種タンパク質の分泌生産としては、これまでに、バチルス属細菌（非特許文献１）、メタノール資化性酵母Pichia pastoris（非特許文献２）、およびAspergillus属糸状菌（非特許文献３、４）等による異種タンパク質の分泌生産が報告されている。【０００３】
また、コリネ型細菌により異種タンパク質を分泌生産する試みもなされている。コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産については、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）（以後、C. glutamicumと略すことがある）によるヌクレアーゼ（nuclease）やリパーゼ（lipase）の分泌（特許文献１、非特許文献５）、サチライシン等のプロテアーゼの分泌（非特許文献６）、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質PS1やPS2（CspBともいう）のシグナルペプチドを利用したタンパク質の分泌（特許文献２）、PS2（CspB）のシグナルペプチドを利用したフィブロネクチン結合タンパク質の分泌（非特許文献７）、PS2（CspB）やSlpA（CspAともいう）のシグナルペプチドを利用したプロトランスグルタミナーゼの分泌（特許文献３）、変異型分泌装置を利用したタンパク質の分泌（特許文献４）、変異株によるプロトランスグルタミナーゼの分泌（特許文献５）等の報告がある。また、コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産量を高める技術として、細胞表層タンパク質の活性を低下させること（特許文献６、７）、ペニシリン結合タンパク質の活性を低下させること（特許文献６）、メタロペプチダーゼをコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献７）、リボソームタンパク質Ｓ１遺伝子に変異を導入すること（特許文献８）、シグナルペプチドと異種タンパク質との間にGln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列を挿入して異種タンパク質を発現させること（特許文献９）等が知られている。【０００４】
一般的なタンパク質分泌経路は、原核生物から真核生物まで広く存在するSec系と呼ばれる経路であるが、近年、Sec系とは全く異なるタンパク質分泌経路が植物細胞の葉緑体のチラコイド膜において見出された（非特許文献８）。この新規な分泌経路は、それにより分泌されるタンパク質のシグナル配列にアルギニン−アルギニンの配列が共通して存在していることから（非特許文献８）、Tat系（Twin-Arginine Translocation system）と名付けられた。Sec系ではタンパク質が高次構造を形成する前の状態で分泌されるのに対し、Tat系ではタンパク質は細胞内で高次構造を形成した後に細胞膜を通過して分泌されることが知られている（非特許文献９）。コリネ型細菌においても、Tat系依存シグナルペプチドを利用したタンパク質の分泌生産の報告がある（特許文献８、１０）。【０００５】
細菌が細胞内外の様々な環境変化に応答するシステムとして、二成分制御系と呼ばれるシグナル伝達経路が知られている。二成分制御系は、環境変化の刺激を感知する役割のセンサーキナーゼと、センサーキナーゼからシグナルを受け取り、さらに下流の遺伝子の発現を制御する役割のレスポンスレギュレーターの2つの成分からなる制御システムである。センサーキナーゼが刺激を感知すると、特定のヒスチジン残基が自己リン酸化し、そのリン酸基が、レスポンスレギュレーターの特定のアスパラギン酸残基に転移することによってシグナルが伝えられ、リン酸化されたレスポンスレギュレーターが活性化することで、転写因子として下流の遺伝子発現を調節する。【０００６】
C. glutamicumの二成分制御系に関する知見は、非特許文献１０等に詳しい。C. glutamicumにおいては、二成分制御系としてこれまでに少なくとも13種類のシステムが知られている。そのうちの一つがPhoRSシステムであり、センサーキナーゼのPhoSタンパク質と、レスポンスレギュレーターのPhoRタンパク質からなる。PhoRS欠損株の解析により、PhoRSシステムは環境中のリン酸欠乏を感知してシグナル伝達を行なう制御系であることが明らかにされている（非特許文献１１）。【０００７】
PhoSタンパク質は2ヵ所の膜貫通ドメインを有する膜タンパク質であり、刺激を感知するセンサードメイン、HAMPドメインと呼ばれるリンカードメイン、自己リン酸化するヒスチジン残基を有するHisKAドメイン、およびATP結合能とヒスチジン残基の自己リン酸化を触媒する機能を持つHATPaseドメインからなる。PhoRタンパク質は細胞内タンパク質であり、シグナルを受容するN末端側のレシーバードメインと、下流の遺伝子の発現調節を行うC末端側のエフェクタードメインからなる（非特許文献１０）。【０００８】
しかしながら、PhoRSシステムと、異種タンパク質の分泌生産との関係はこれまでに知られていない。また、コリネ型細菌において、PhoSタンパク質の変異が異種タンパク質の分泌生産に有効であることは知られていない。さらに、PhoSタンパク質における特定の変異が異種タンパク質の分泌生産に有効であることも知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許4965197
【特許文献２】特表平6-502548
【特許文献３】特許第4320769号
【特許文献４】特開平11-169182
【特許文献５】特許第4362651号
【特許文献６】WO2013/065869
【特許文献７】WO2013/065772
【特許文献８】WO2013/118544
【特許文献９】WO2013/062029
【特許文献１０】特許第4730302号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Microbiol. rev., 57, 109-137(1993)
【非特許文献２】Biotechnol., 11, 905-910(1993)
【非特許文献３】Biotechnol., 6, 1419-1422(1988)
【非特許文献４】Biotechnol., 9, 976-981(1991)
【非特許文献５】J. Bacteriol., 174, 1854-1861(1992)
【非特許文献６】Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613(1995)
【非特許文献７】Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400(1997)
【非特許文献８】EMBO J., 14, 2715-2722(1995)
【非特許文献９】J. Biol. Chem., 25;273(52), 34868-74(1998)
【非特許文献１０】Appl. Microbiol. Biotechnol., 94, 1131-1150(2012)
【非特許文献１１】J. Bacteriol., 188, 724-732(2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産を向上させる新規な技術を開発し、コリネ型細菌による異種タンパク質の分泌生産法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、特定の変異を有するphoS遺伝子を保持するようにコリネ型細菌を改変することにより、コリネ型細菌の異種タンパク質の分泌生産能が向上することを見出し、本発明を完成させた。【００１３】
すなわち、本発明は以下のとおり例示できる。
[１]
異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法であって、
前記コリネ型細菌が、変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されており、
前記変異型PhoSタンパク質が、異種タンパク質の分泌生産量を向上させる変異を有するPhoSタンパク質であり、
前記遺伝子構築物が、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含み、
前記異種タンパク質が、前記シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する、方法。
[２]
前記変異が、野生型PhoSタンパク質において、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換される変異である、前記方法。
[３]
前記変異が、野生型PhoSタンパク質において、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外の、ＨｉｓＫＡドメインのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換される変異である、前記方法。
[４]
前記変異が、野生型PhoSタンパク質において、配列番号４の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換される変異である、前記方法。
[５]
異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法であって、
前記コリネ型細菌が、変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されており、
前記変異型PhoSタンパク質が、野生型PhoSタンパク質において、配列番号４の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換される変異を有するPhoSタンパク質であり、
前記遺伝子構築物が、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含み、
前記異種タンパク質が、前記シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する、方法。
[６]
前記芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、セリン残基、システイン残基、メチオニン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基である、前記方法。
[７]
前記野生型PhoSタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
[８]
前記シグナルペプチドがTat系依存シグナルペプチドである、前記方法。
[９]
前記Tat系依存シグナルペプチドが、TorAシグナルペプチド、SufIシグナルペプチド、PhoDシグナルペプチド、LipAシグナルペプチド、およびIMDシグナルペプチドからなる群より選択される、前記方法。
[１０]
前記コリネ型細菌が、さらに、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が上昇するように改変されている、前記方法。
[１１]
前記Tat系分泌装置をコードする遺伝子が、tatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子からなる、前記方法。
[１２]
前記シグナルペプチドがSec系依存シグナルペプチドである、前記方法。
[１３]
前記Sec系依存シグナルペプチドが、PS1シグナルペプチド、PS2シグナルペプチド、およびSlpAシグナルペプチドからなる群より選択される、前記方法。
[１４]
前記遺伝子構築物が、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前記方法。
[１５]
前記遺伝子構築物が、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、前記方法。
[１６]
前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、前記方法。
[１７]
前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムである、前記方法。
[１８]
前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036（FERM BP-734）またはATCC13869に由来する改変株である、前記方法。
[１９]
前記コリネ型細菌が、細胞表層タンパク質の活性が低下しているコリネ型細菌である、前記方法。
[２０]
変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されたコリネ型細菌であって、
前記変異型PhoSタンパク質が、野生型PhoSタンパク質において、配列番号４の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基が芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換される変異を有するPhoSタンパク質である、コリネ型細菌。
[２１]
前記芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が、リジン残基、アラニン残基、バリン残基、セリン残基、システイン残基、メチオニン残基、アスパラギン酸残基、またはアスパラギン残基である、前記コリネ型細菌。
[２２]
前記野生型PhoSタンパク質が、下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質である、前記コリネ型細菌：
（ａ）配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｃ）配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質。
[２３]
コリネバクテリウム属細菌である、前記コリネ型細菌。
[２４]
コリネバクテリウム・グルタミカムである、前記コリネ型細菌。
[２５]
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12036（FERM BP-734）またはATCC13869に由来する改変株である、前記コリネ型細菌。
[２６]
細胞表層タンパク質の活性が低下している、前記コリネ型細菌。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】C. glutamicum YDK010株、並びにそのPhoS(W302C)変異株およびPhoS欠損株でCspB50TEV-Teri（CspBのシグナル配列および成熟CspBのN末端配列を融合したTeriparatide）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。
【図２】コリネバクテリウム属細菌のPhoSホモログのHisKAドメインのアミノ酸配列のアライメントを示す図。
【図３】C. glutamicum YDK010株およびそのPhoS(W302C)変異株でCspB6Xa-LFABP（CspBのシグナル配列および成熟CspBのN末端配列を融合したLFABP）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。
【図４】C. glutamicum YDK010株およびそのPhoS(W302C)変異株でCspB6TEV-ExCP（CspBのシグナル配列および成熟CspBのN末端配列を融合したExenatide）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。
【図５】pPK6ベクターの構築過程を示す図。
【図６】C. glutamicum YDK010株およびそのPhoS(W302C)変異株でE. coliのTorAシグナル配列を融合したプロトランスグルタミナーゼを発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。
【図７】C. glutamicum YDK010株およびそのPhoS(W302C)変異株でE. coliのTorAシグナル配列を融合したプロ構造部付きプロテイングルタミナーゼを発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。
【図８】C. glutamicum YDK010株およびそのPhoS(W302C)変異株でArthrobacter globiformisのイソマルトデキストラナーゼ（シグナル配列を含む）を発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。
【図９】C. glutamicum YDK010株のPhoS欠損株、およびそのPhoS相補株でCspB50TEV-Teriを発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。
【図１０】各種の変異型phoS(W302X)遺伝子を導入したC. glutamicum YDK010株のPhoS欠損株でCspB50TEV-Teriを発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。
【図１１】C. glutamicum ATCC13869株およびそのPhoS(W302C)変異株でCspB6TEV-ExCPを発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。
【図１２】C. glutamicum ATCC13869ΔcspB株およびそのPhoS(W302C)変異株でCspB6Xa-LFABPを発現させた際のSDS-PAGEの結果を示す写真。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
＜１＞本発明の異種タンパク質の製造方法
本発明は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌を培養し、分泌生産された異種タンパク質を回収することを含む、異種タンパク質の製造方法であって、前記コリネ型細菌が変異型PhoSタンパク質をコードするphoS遺伝子を保持するように改変されている、方法（以下、「本発明の方法」または「本発明の異種タンパク質の製造方法」ともいう）を提供する。
【００１７】
＜１−１＞本発明の方法に用いられるコリネ型細菌
本発明の方法に用いられるコリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有するコリネ型細菌であって、且つ、変異型phoS遺伝子を保持するように改変されたコリネ型細菌である。なお、本発明の方法に用いられるコリネ型細菌を、「本発明の細菌」あるいは「本発明のコリネ型細菌」ともいう。また、本発明の細菌が有する異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を「本発明に用いられる遺伝子構築物」ともいう。
【００１８】
＜１−１−１＞異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物（本発明に用いられる遺伝子構築物）を有することにより、異種タンパク質を分泌生産する能力を有する。
【００１９】
本発明において、タンパク質が「分泌」されるとは、タンパク質が細菌菌体外（細胞外）に移送されることをいう。細菌菌体外（細胞外）としては、培地中や菌体表層が挙げられる。すなわち、タンパク質が「分泌」されることには、最終的にそのタンパク質の全分子が培地中に完全に遊離状態におかれる場合に限られず、そのタンパク質の全分子が菌体表層に存在している場合や、そのタンパク質の一部の分子が培地中に存在し、残りの分子が菌体表層に存在している場合も含まれる。
【００２０】
すなわち、本発明において、「異種タンパク質を分泌生産する能力」とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体表層に異種タンパク質を分泌し、培地中または菌体表層から回収できる程度に蓄積する能力をいう。蓄積量は、例えば、培地中での蓄積量として、好ましくは10 μg/L以上、より好ましくは1 mg/L以上、特に好ましくは100 mg/L以上、さらに好ましくは1 g/L以上であってよい。また、蓄積量は、例えば、菌体表層での蓄積量として、菌体表層の異種タンパク質を回収し培地と同量の液体に懸濁した場合に懸濁液中での異種タンパク質濃度が好ましくは10 μg/L以上、より好ましくは1 mg/L以上、特に好ましくは100 mg/L以上となるような量であってよい。なお、本発明において分泌生産される「タンパク質」とは、オリゴペプチドやポリペプチド等のペプチドと呼ばれる態様をも含む概念である。
【００２１】
本発明において、「異種タンパク質」（heterologous protein）とは、同タンパク質を発現および分泌させるコリネ型細菌にとって外来性（exogenous）であるタンパク質をいう。異種タンパク質は、例えば、微生物由来のタンパク質であってもよく、植物由来のタンパク質であってもよく、動物由来のタンパク質であってもよく、ウィルス由来のタンパク質であってもよく、さらには人工的にアミノ酸配列をデザインしたタンパク質であってもよい。異種タンパク質は、単量体タンパク質（monomeric protein）であってもよく、多量体タンパク質（multimeric protein）であってもよい。多量体タンパク質とは、２またはそれ以上のサブユニットからなる多量体として存在しうるタンパク質をいう。多量体において、各サブユニットは、ジスルフィド結合等の共有結合で連結されていてもよく、水素結合や疎水性相互作用等の非共有結合で連結されていてもよく、それらの組み合わせにより連結されていてもよい。多量体においては、１またはそれ以上の分子間ジスルフィド結合が含まれるのが好ましい。多量体は、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。なお、多量体タンパク質がヘテロ多量体である場合には、多量体を構成するサブユニットの内、少なくとも１つのサブユニットが異種タンパク質であればよい。すなわち、全てのサブユニットが異種由来であってもよく、一部のサブユニットのみが異種由来であってもよい。異種タンパク質は、天然で分泌性であるタンパク質であってもよく、天然では非分泌性であるタンパク質であってもよいが、天然で分泌性であるタンパク質であるのが好ましい。また、異種タンパク質は、天然でTat系依存の分泌性タンパク質であってもよく、天然でSec系依存の分泌性タンパク質であってもよい。「異種タンパク質」の具体例は後述する。
【００２２】
生産される異種タンパク質は、１種類のみであってもよく、２またはそれ以上の種類であってもよい。また、異種タンパク質がヘテロ多量体である場合には、１種類のサブユニットのみが生産されてもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットが生産されてもよい。すなわち、「異種タンパク質を分泌生産する」ことには、目的の異種タンパク質を構成するサブユニットの内、全てのサブユニットを分泌生産する場合に加えて、一部のサブユニットのみを分泌生産する場合も含まれる。
【００２３】
コリネ型細菌は、好気性のグラム陽性桿菌である。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属細菌、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属細菌等が挙げられる。コリネ型細菌を使用することの利点としては、従来異種タンパク質の分泌生産に利用されている糸状菌、酵母、Bacillus属細菌等と比べ、もともと菌体外に分泌されるタンパク質が極めて少なく、異種タンパク質を分泌生産した場合の精製過程の簡略化や省略化が期待できること、また、糖、アンモニア、および無機塩等を含有するシンプルな培地で良く生育し、培地代や培養方法、培養生産性で優れていること、等が挙げられる。
【００２４】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・クレナタム（Corynebacterium crenatum）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）
【００２５】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
【００２６】
なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。
【００２７】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
【００２８】
とりわけ、野生株C. glutamicum ATCC 13869よりストレプトマイシン（Sm）耐性変異株として分離したC. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) は、その親株（野生株）に比べ、タンパク質の分泌に関わる機能を司る遺伝子に変異が存在することが予測され、タンパク質の分泌生産能が至適培養条件下での蓄積量としておよそ２〜３倍と極めて高く、宿主菌として好適である（WO02/081694）。AJ12036は、昭和59年3月26日に工業技術院  微生物工業技術研究所（現、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-734が付与されている。
【００２９】
また、Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539) は、昭和62年3月13日に工業技術院  微生物工業技術研究所（現、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-1539が付与されている。また、Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM BP-2205) は、昭和63年12月24日に工業技術院  微生物工業技術研究所（現、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に国際寄託として原寄託され、受託番号FERM BP-2205が付与されている。
【００３０】
また、上述したようなコリネ型細菌を親株として、突然変異法や遺伝子組換え法を利用してタンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜し、宿主として利用してもよい。例えば、紫外線照射またはN-メチル-N’-ニトロソグアニジン等の化学変異剤による処理を行なった後、タンパク質の分泌生産能が高まった株を選抜することができる。
【００３１】
さらに、このような菌株から細胞表層タンパク質を生産しないように改変した菌株を宿主として使用すれば、培地中または菌体表層に分泌された異種タンパク質の精製が容易となり、特に好ましい。そのような改変は、突然変異法または遺伝子組換え法により染色体上の細胞表層タンパク質のコード領域またはその発現調節領域に変異を導入することにより行うことができる。細胞表層タンパク質を生産しないように改変されたコリネ型細菌としては、C. glutamicum AJ12036 (FERM BP-734)の細胞表層タンパク質PS2の欠損株であるC. glutamicum YDK010株（WO2004/029254）が挙げられる。
【００３２】
異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌は、上述したようなコリネ型細菌に、本発明に用いられる遺伝子構築物を導入し保持させることにより得ることができる。本発明に用いられる遺伝子構築物やその導入法については後述する。
【００３３】
＜１−１−２＞変異型phoS遺伝子の導入
本発明の細菌は、変異型phoS遺伝子を保持するように改変されている。「変異型phoS遺伝子を保持する」ことを、「変異型phoS遺伝子を有する」または「phoS遺伝子に変異を有する」ともいう。また、「変異型phoS遺伝子を保持する」ことを、「変異型PhoSタンパク質を有する」または「PhoSタンパク質に変異を有する」ともいう。本発明の細菌は、異種タンパク質を分泌生産する能力を有するコリネ型細菌を、変異型phoS遺伝子を保持するように改変することによって得ることができる。また、本発明の細菌は、変異型phoS遺伝子を保持するようにコリネ型細菌を改変した後に、異種タンパク質を分泌生産する能力を付与することによっても得ることができる。本発明において、本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。なお、本発明の細菌の構築に用いられる、変異型phoS遺伝子を保持するように改変される前の株は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有すると仮定した場合に、異種タンパク質を分泌生産することができてもよく、できなくてもよい。すなわち、本発明の細菌は、例えば、変異型phoS遺伝子を保持するように改変されたことにより異種タンパク質を分泌生産する能力を獲得したものであってもよい。具体的には、例えば、本発明の細菌は、変異型phoS遺伝子を保持するように改変される前には異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有していても異種タンパク質を分泌生産することができなかった株から得られたものであって、変異型phoS遺伝子を保持するように改変されることにより異種タンパク質を分泌生産できるようになったものであってもよい。
【００３４】
以下、phoS遺伝子およびPhoSタンパク質について説明する。phoS遺伝子は、PhoRSシステムのセンサーキナーゼであるPhoSタンパク質をコードする遺伝子である。PhoRSシステムは、二成分制御系の１つであり、環境中のリン酸欠乏に対する応答を惹起する。PhoRSシステムは、phoS遺伝子にコードされるセンサーキナーゼPhoSと、phoR遺伝子にコードされるレスポンスレギュレーターPhoRとからなる。
【００３５】
本発明において、「特定の変異」を有するPhoSタンパク質を「変異型PhoSタンパク質」、それをコードする遺伝子を「変異型phoS遺伝子」ともいう。「変異型phoS遺伝子」は、言い換えると、「特定の変異」を有するphoS遺伝子である。また、本発明において、「特定の変異」を有さないPhoSタンパク質を「野生型PhoSタンパク質」、それをコードする遺伝子を「野生型phoS遺伝子」ともいう。「野生型phoS遺伝子」は、言い換えると、「特定の変異」を有さないphoS遺伝子である。なお、ここでいう「野生型」とは、「変異型」と区別するための便宜上の記載であり、「特定の変異」を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。「特定の変異」については後述する。
【００３６】
野生型phoS遺伝子としては、例えば、コリネ型細菌のphoS遺伝子が挙げられる。コリネ型細菌のphoS遺伝子として、具体的には、例えば、C. glutamicum YDK010株、C. glutamicum ATCC13032株、C. glutamicum ATCC14067株、C. callunae、C. crenatum、およびC. efficiensのphoS遺伝子が挙げられる。C. glutamicum YDK010株のphoS遺伝子の塩基配列を、配列番号３に示す。また、これらのphoS遺伝子がコードする野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４、５４、５５、５６、５７、および５８に示す。すなわち、野生型phoS遺伝子は、例えば、配列番号３に示す塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、野生型PhoSタンパク質は、例えば、配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。
【００３７】
野生型phoS遺伝子は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型phoS遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、野生型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型phoS遺伝子にコードされるタンパク質のバリアントであってもよい。そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。本発明において、「野生型phoS遺伝子」という用語は、上記例示した野生型phoS遺伝子に限られず、その保存的バリアントであって「特定の変異」を有さないものを包含するものとする。同様に、「野生型PhoSタンパク質」という用語は、上記例示した野生型phoS遺伝子にコードされるタンパク質に限られず、その保存的バリアントであって「特定の変異」を有さないものを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示した野生型phoS遺伝子や野生型PhoSタンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００３８】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、野生型phoS遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることであってよい。また、「元の機能が維持されている」とは、野生型PhoSタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有することであってよい。「PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能」とは、具体的には、レスポンスレギュレーターであるPhoRタンパク質と共役して環境中のリン酸欠乏に対する応答を惹起する機能であってよい。「PhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能」とは、より具体的には、環境中のリン酸欠乏を感知して自己リン酸化され、リン酸基転移によりPhoRタンパク質を活性化させる機能であってもよい。
【００３９】
PhoSタンパク質のバリアントがPhoRSシステムのセンサーキナーゼとしての機能を有するか否かは、例えば、同バリアントをコードする遺伝子をコリネ型細菌のphoS遺伝子の欠損株に導入し、リン酸欠乏に対する応答性が相補されるか否かを確認することにより、確認できる。リン酸欠乏に対する応答性の相補は、例えば、リン酸欠乏条件での生育の向上として、またはリン酸欠乏条件で発現が誘導されることが知られている遺伝子の発現の誘導として、検出できる（J. Bacteriol., 188, 724-732(2006)）。コリネ型細菌のphoS遺伝子の欠損株としては、例えば、C. glutamicum YDK010株のphoS遺伝子欠損株や、C. glutamicum ATCC13032株のphoS遺伝子欠損株を用いることができる。
【００４０】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【００４１】
野生型phoS遺伝子のホモログは、例えば、上記例示した野生型phoS遺伝子の塩基配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、野生型phoS遺伝子のホモログは、例えば、コリネ型細菌の染色体を鋳型にして、これら公知の野生型phoS遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得することができる。
【００４２】
野生型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４３】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加には、遺伝子が由来する細菌の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００４４】
さらに、野生型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８）全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【００４５】
野生型PhoSタンパク質においては、自己リン酸化されるヒスチジン残基が保存されているのが好ましい。すなわち、保存的変異は、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外のアミノ酸残基において生じるのが好ましい。「自己リン酸化されるヒスチジン残基」とは、野生型PhoSタンパク質の２７６位のヒスチジン残基を指す。また、野生型PhoSタンパク質は、例えば、上記例示した野生型PhoSタンパク質の保存配列を有するのが好ましい。すなわち、保存的変異は、例えば、上記例示した野生型PhoSタンパク質において保存されていないアミノ酸残基において生じるのが好ましい。
【００４６】
また、野生型phoS遺伝子は、「特定の変異」を有さず、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示した野生型phoS遺伝子の塩基配列（配列番号３、等）の相補配列又は同相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００４７】
上記プローブは、例えば、遺伝子の相補配列の一部であってよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。プローブとしては、例えば、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。そのような場合、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００４８】
また、野生型phoS遺伝子は、上記例示した野生型phoS遺伝子またはその保存的バリアントの塩基配列において、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換した塩基配列を有するものであってもよい。例えば、野生型phoS遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００４９】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers 及び Miller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Ｍath. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunsch (1970) J. Ｍol. Biol. 48:443 453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性を検索する方法、Karlin 及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877に記載されているような、改良された、Karlin及びAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムが挙げられる。
【００５０】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237 244 (1988)、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151 153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 331によく記載されている。
【００５１】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLAST (BLAST 2.0)を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００５２】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。
【００５３】
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、PhoRタンパク質、細胞表層タンパク質、Tat系分泌装置、本発明において分泌生産される異種タンパク質等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【００５４】
変異型PhoSタンパク質は、上述したような野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列において、「特定の変異」を有する。
【００５５】
すなわち、言い換えると、変異型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、上記例示した野生型PhoSタンパク質やその保存的バリアントと同一であってよい。具体的には、例えば、変異型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、具体的には、例えば、変異型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、具体的には、例えば、変異型PhoSタンパク質は、「特定の変異」を有する以外は、配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【００５６】
また、言い換えると、変異型PhoSタンパク質は、上記例示した野生型PhoSタンパク質において、「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに保存的変異を含むバリアントであってよい。具体的には、例えば、変異型PhoSタンパク質は、配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有し、且つ、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【００５７】
変異型phoS遺伝子は、上記のような変異型PhoSタンパク質をコードする限り、特に制限されない。
【００５８】
以下、変異型PhoSタンパク質が有する「特定の変異」について説明する。
【００５９】
「特定の変異」は、上述したような野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列が変化するものであって、且つ、異種タンパク質の分泌生産に有効なものであれば特に制限されない。
【００６０】
「特定の変異」は、異種タンパク質の分泌生産量を向上させる変異であるのが好ましい。「異種タンパク質の分泌生産量を向上させる」とは、変異型phoS遺伝子を有するよう改変されたコリネ型細菌（改変株）が、非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産できることをいう。「非改変株」とは、phoS遺伝子に変異を有さない対照株、すなわち変異型phoS遺伝子を有さない対照株をいい、例えば、野生株または親株であってよい。「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、異種タンパク質の分泌生産量が非改変株と比較して増大する限り特に制限されないが、例えば、培地中および／または菌体表層での蓄積量として、非改変株と比較して、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．３倍以上、さらに好ましくは２倍以上、特に好ましくは５倍以上の量の異種タンパク質を分泌生産することであってよい。また、「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、濃縮していない非改変株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できないが、濃縮していない改変株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できることであってもよい。なお、「異種タンパク質の分泌生産量を向上させる」とは、あらゆる異種タンパク質の分泌生産量が向上する必要はなく、分泌生産のターゲットとして設定した異種タンパク質の分泌生産量が向上すれば足りる。「異種タンパク質の分泌生産量を向上させる」とは、具体的には、例えば、CspB50TEV-Teri、CspB6Xa-LFABP、CspB6TEV-ExCP、E. coliのTorAシグナル配列を融合したプロトランスグルタミナーゼ、E. coliのTorAシグナル配列を融合したプロ構造部付きプロテイングルタミナーゼ、シグナル配列付きイソマルトデキストラナーゼ等の、実施例に記載の異種タンパク質の分泌生産量を向上させることを意味してもよい。
【００６１】
ある変異が異種タンパク質の分泌生産量を向上させる変異であるかどうかは、例えば、コリネ型細菌に属する菌株を基に当該変異を有するPhoSタンパク質をコードする遺伝子を有するよう改変された株を作製し、該改変株を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量を定量し、改変前の株（非改変株）を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量と比較することで確認することができる。
【００６２】
アミノ酸配列の変化としては、アミノ酸残基の置換が好ましい。すなわち、「特定の変異」は、野生型PhoSタンパク質のいずれかのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されるものであるのが好ましい。「特定の変異」により置換が生じるアミノ酸残基は、１残基であってもよく、２残基またはそれ以上の組み合わせであってもよい。「特定の変異」により置換が生じるアミノ酸残基は、好ましくは、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外のアミノ酸残基であってよい。「特定の変異」により置換が生じるアミノ酸残基は、より好ましくは、自己リン酸化されるヒスチジン残基以外の、ＨｉｓＫＡドメインのアミノ酸残基であってよい。「自己リン酸化されるヒスチジン残基」とは、野生型PhoSタンパク質の２７６位のヒスチジン残基を指す。「ＨｉｓＫＡドメイン」とは、野生型PhoSタンパク質の２６６〜３３０位のアミノ酸残基からなる領域を指す。「特定の変異」により置換が生じるアミノ酸残基は、特に好ましくは、野生型PhoSタンパク質の３０２位のトリプトファン残基（Ｗ３０２）であってよい。
【００６３】
上記変異において、置換後のアミノ酸残基としては、K（Lys）、R（Arg）、H（His）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、F（Phe）、W（Trp）、Y（Tyr）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、Q（Gln）の内、元のアミノ酸残基以外のものが挙げられる。置換後のアミノ酸残基としては、例えば、異種タンパク質の分泌生産量が向上するものを選択することができる。
【００６４】
Ｗ３０２が置換される場合、置換後のアミノ酸残基としては、芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基が挙げられる。「芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基」として、具体的には、K（Lys）、R（Arg）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、Q（Gln）が挙げられる。「芳香族アミノ酸およびヒスチジン以外のアミノ酸残基」として、より具体的には、K（Lys）、A（Ala）、V（Val）、S（Ser）、C（Cys）、M（Met）、D（Asp）、N（Asn）が挙げられる。
【００６５】
なお、phoS遺伝子における「特定の変異」とは、コードするPhoSタンパク質に上記のような「特定の変異」を生じさせる塩基配列上の変異を意味する。
【００６６】
本発明において、「野生型PhoSタンパク質のＸ位のアミノ酸残基」とは、配列番号４のＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。例えば、「Ｗ３０２」とは、配列番号４の３０２位のトリプトファン残基に相当するアミノ酸残基を意味する。上記アミノ酸残基の位置は相対的な位置を示すものであって、アミノ酸の欠失、挿入、付加などによってその位置は前後することがある。例えば、配列番号４に示すアミノ酸配列からなる野生型PhoSタンパク質において、Ｘ位よりもＮ末端側の位置で１アミノ酸残基が欠失した、または挿入された場合、元のＸ位のアミノ酸残基は、それぞれ、Ｎ末端から数えてＸ−１番目またはＸ＋１番目のアミノ酸残基となるが、「野生型PhoSタンパク質のＸ位のアミノ酸残基」とみなされる。具体的には、例えば、配列番号４、５４、５５、５６、５７、および５８に示す野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列において、「Ｗ３０２」とは、それぞれ、３０２位、３０２位、３０２位、３２１位、２７５位、および２８６位のトリプトファン残基を指す。また、配列番号４、５４、５５、５６、５７、および５８に示す野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列において、「野生型PhoSタンパク質の２７６位のヒスチジン残基（自己リン酸化されるヒスチジン残基）」とは、それぞれ、２７６位、２７６位、２７６位、２９５位、２４９位、および２６０位のヒスチジン残基を指す。また、また、配列番号４、５４、５５、５６、５７、および５８に示す野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列において、「野生型PhoSタンパク質の２６６〜３３０位のアミノ酸残基からなる領域（ＨｉｓＫＡドメイン）」とは、それぞれ、２６６〜３３０位、２６６〜３３０位、２６６〜３３０位、２８５〜３４９位、２３９〜３０３位、および２５０〜３１４位のアミノ酸残基からなる領域を指す。
【００６７】
なお、ここでいう「Ｗ３０２」は、通常トリプトファン残基であるが、トリプトファン残基でなくてもよい。すなわち、野生型PhoSタンパク質が配列番号４、５４、５５、５６、５７、または５８に示すアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有する場合には、「Ｗ３０２」はトリプトファン残基でないことがあり得る。よって、例えば、「Ｗ３０２がシステイン残基に置換される変異」には、「Ｗ３０２」がトリプトファン残基である場合に当該トリプトファン残基がシステイン残基に置換される変異に限られず、「Ｗ３０２」がK（Lys）、R（Arg）、H（His）、A（Ala）、V（Val）、L（Leu）、I（Ile）、G（Gly）、S（Ser）、T（Thr）、P（Pro）、F（Phe）、Y（Tyr）、M（Met）、D（Asp）、E（Glu）、N（Asn）、またはQ（Gln）である場合に当該アミノ酸残基がシステイン残基に置換される変異も包含される。他の変異についても同様である。
【００６８】
任意のPhoSタンパク質のアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「配列番号４におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該任意のPhoSタンパク質のアミノ酸配列と配列番号４のアミノ酸配列とアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
【００６９】
変異型phoS遺伝子は、例えば、野生型phoS遺伝子を、コードされるPhoSタンパク質が上述した「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。改変の元になる野生型phoS遺伝子は、例えば、野生型phoS遺伝子を有する生物からのクローニングにより、または、化学合成により、取得できる。また、変異型phoS遺伝子は、野生型phoS遺伝子を介さずに取得することもできる。例えば、化学合成により変異型phoS遺伝子を直接取得してもよい。取得した変異型phoS遺伝子は、さらに改変して利用してもよい。
【００７０】
遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。
【００７１】
以下、変異型phoS遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変する手法について説明する。
【００７２】
変異型phoS遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変することは、変異型phoS遺伝子をコリネ型細菌に導入することにより達成できる。また、変異型phoS遺伝子を有するようにコリネ型細菌を改変することは、コリネ型細菌の染色体上のphoS遺伝子に上述した「特定の変異」を導入することによっても達成できる。染色体上の遺伝子への変異導入は、自然変異、変異原処理、または遺伝子工学的手法により達成できる。
【００７３】
変異型phoS遺伝子をコリネ型細菌に導入する手法は特に制限されない。本発明の細菌において、変異型phoS遺伝子は、コリネ型細菌で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、phoS遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。本発明の細菌において、変異型phoS遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。本発明の細菌は、変異型phoS遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピー有していてもよい。本発明の細菌は、１種類の変異型phoS遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類の変異型phoS遺伝子を有していてもよい。変異型phoS遺伝子の導入は、例えば、後述する、遺伝子の発現を上昇させる手法における遺伝子の導入や、本発明に用いられる遺伝子構築物の導入と同様に行うことができる。
【００７４】
本発明の細菌は、野生型phoS遺伝子を有していてもよく、有していなくともよいが、有していないのが好ましい。
【００７５】
野生型phoS遺伝子を有さないコリネ型細菌は、染色体上の野生型phoS遺伝子を破壊することにより取得できる。野生型phoS遺伝子の破壊は公知の手法により行うことができる。具体的には、例えば、野生型phoS遺伝子のプロモーター領域および／またはコード領域の一部または全部を欠損させることにより野生型phoS遺伝子を破壊できる。
【００７６】
また、染色体上の野生型phoS遺伝子を変異型phoS遺伝子で置換することにより、野生型phoS遺伝子を有さず、且つ、変異型phoS遺伝子を有するように改変されたコリネ型細菌を取得できる。このような遺伝子置換を行う方法としては、例えば、「Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などが挙げられる（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００７７】
PhoSタンパク質は、レスポンスレギュレーターであるPhoRタンパク質と共役して機能する、すなわち環境中のリン酸欠乏に対する応答を惹起する。したがって、本発明の細菌は、変異型PhoSタンパク質が機能するよう、phoR遺伝子を有する。phoR遺伝子は、PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターであるPhoRタンパク質をコードする遺伝子である。「phoR遺伝子を有する」ことを、「PhoRタンパク質を有する」ともいう。通常、本発明の細菌が本来的に有するPhoRタンパク質が変異型PhoSタンパク質と共役して機能すれば足りる。一方、本発明の細菌には、本発明の細菌が本来的に有するphoR遺伝子に加えて、あるいは代えて、適当なphoR遺伝子が導入されていてもよい。導入されるphoR遺伝子は、変異型PhoSタンパク質と共役して機能するPhoRタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。
【００７８】
phoR遺伝子としては、例えば、コリネ型細菌のphoR遺伝子が挙げられる。コリネ型細菌のphoR遺伝子として、具体的には、例えば、C. glutamicum YDK010株、C. glutamicum ATCC13032株、C. glutamicum ATCC14067株、C. callunae、C. crenatum、およびC. efficiensのphoR遺伝子が挙げられる。C. glutamicum ATCC13032株のphoR遺伝子の塩基配列およびPhoRタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号９６および９７に示す。
【００７９】
phoR遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したphoR遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、PhoRタンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示したPhoRタンパク質のバリアントであってもよい。すなわち、例えば、「phoR遺伝子」という用語には、上記例示したphoR遺伝子に加え、その保存的バリアントが含まれるものとする。同様に、「PhoRタンパク質」という用語には、上記例示したPhoRタンパク質に加え、その保存的バリアントが含まれるものとする。PhoRタンパク質およびphoR遺伝子のバリアントについては、上述したPhoSタンパク質およびphoS遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、phoR遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「元の機能が維持されている」とは、PhoRタンパク質にあっては、タンパク質のバリアントが、PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能を有することであってよい。「PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能」とは、具体的には、センサーキナーゼであるPhoSタンパク質と共役して環境中のリン酸欠乏に対する応答を惹起する機能であってよい。「PhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能」とは、より具体的には、環境中のリン酸欠乏を感知して自己リン酸化されたPhoSタンパク質からのリン酸基転移により活性化され、環境中のリン酸欠乏に応答する遺伝子の発現を制御する機能であってもよい。
【００８０】
PhoRタンパク質のバリアントがPhoRSシステムのレスポンスレギュレーターとしての機能を有するか否かは、例えば、同バリアントをコードする遺伝子をコリネ型細菌のphoR遺伝子の欠損株に導入し、リン酸欠乏に対する応答性が相補されるか否かを確認することにより、確認できる。リン酸欠乏に対する応答性の相補は、例えば、リン酸欠乏条件での生育の向上として、またはリン酸欠乏条件で発現が誘導されることが知られている遺伝子の発現の誘導として、検出できる（J. Bacteriol., 188, 724-732(2006)）。コリネ型細菌のphoR遺伝子の欠損株としては、例えば、C. glutamicum YDK010株のphoR遺伝子欠損株や、C. glutamicum ATCC13032株のphoR遺伝子欠損株を用いることができる。
【００８１】
＜１−１−３＞細胞表層タンパク質の活性低下
本発明の細菌は、細胞表層タンパク質の活性が低下しているものであってよい。以下に、細胞表層タンパク質およびそれをコードする遺伝子について説明する。
【００８２】
細胞表層タンパク質は、細菌や古細菌の細胞表層（Ｓ層）を構成するタンパク質である。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、C. glutamicumのPS1およびPS2（CspB）（特表平6-502548）、ならびにC. stationisのSlpA（CspA）（特開平10-108675）が挙げられる。これらの中では、PS2タンパク質の活性を低下させるのが好ましい。
【００８３】
C. glutamicum ATCC13869のcspB遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするPS2タンパク質（CspBタンパク質）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６７および６８に示す。
【００８４】
また、例えば、28株のC. glutamicumについて、CspBホモログのアミノ酸配列が報告されている（J Biotechnol., 112, 177-193(2004)）。これら28株のC. glutamicumとcspB遺伝子ホモログのＮＣＢＩデータベースのGenBank accessionナンバーを以下に例示する（カッコ内がGenBank accessionナンバーを示す）。
C. glutamicum ATCC13058（AY524990）
C. glutamicum ATCC13744（AY524991）
C. glutamicum ATCC13745（AY524992）
C. glutamicum ATCC14017（AY524993）
C. glutamicum ATCC14020（AY525009）
C. glutamicum ATCC14067（AY524994）
C. glutamicum ATCC14068（AY525010）
C. glutamicum ATCC14747（AY525011）
C. glutamicum ATCC14751（AY524995）
C. glutamicum ATCC14752（AY524996）
C. glutamicum ATCC14915（AY524997）
C. glutamicum ATCC15243（AY524998）
C. glutamicum ATCC15354（AY524999）
C. glutamicum ATCC17965（AY525000）
C. glutamicum ATCC17966（AY525001）
C. glutamicum ATCC19223（AY525002）
C. glutamicum ATCC19240（AY525012）
C. glutamicum ATCC21341（AY525003）
C. glutamicum ATCC21645（AY525004）
C. glutamicum ATCC31808（AY525013）
C. glutamicum ATCC31830（AY525007）
C. glutamicum ATCC31832（AY525008）
C. glutamicum LP-6（AY525014）
C. glutamicum DSM20137（AY525015）
C. glutamicum DSM20598（AY525016）
C. glutamicum DSM46307（AY525017）
C. glutamicum 22220（AY525005）
C. glutamicum 22243（AY525006）
【００８５】
コリネ型細菌が属する種又は菌株によって、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示した細胞表層タンパク質をコードする遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、細胞表層タンパク質は、元の機能が維持されている限り、上記例示した細胞表層タンパク質のバリアントであってもよい。すなわち、例えば、「cspB遺伝子」という用語には、上記例示したcspB遺伝子に加え、その保存的バリアントが含まれるものとする。同様に、「CspBタンパク質」という用語には、上記例示したCspBタンパク質に加え、その保存的バリアントが含まれるものとする。細胞表層タンパク質およびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したPhoSタンパク質およびphoS遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、細胞表層タンパク質をコードする遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「元の機能が維持されている」とは、細胞表層タンパク質にあっては、例えば、コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有することであってよい。
【００８６】
「コリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質」とは、コリネ型細菌で活性を低下させたときに非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する能力をコリネ型細菌に付与する性質をいう。「非改変株」とは、細胞表層タンパク質の活性が低下していない対照株をいい、例えば、野生株または親株であってよい。「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、異種タンパク質の分泌生産量が非改変株と比較して増大する限り特に制限されないが、例えば、培地中および／または菌体表層での蓄積量として、非改変株と比較して、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．３倍以上、特に好ましくは２倍以上の量の異種タンパク質を分泌生産することであってよい。また、「非改変株よりも多い量の異種タンパク質を分泌生産する」とは、濃縮していない非改変株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できないが、濃縮していない改変株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供しＣＢＢで染色した際には異種タンパク質を検出できることであってもよい。
【００８７】
あるタンパク質がコリネ型細菌で活性を低下させたときに異種タンパク質の分泌生産量を非改変株と比べて上昇させる性質を有するかどうかは、コリネ型細菌に属する菌株を基にそのタンパク質の活性が低下するよう改変された株を作製し、該改変株を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量を定量し、改変前の株（非改変株）を培地で培養した際に分泌生産される異種タンパク質の量と比較することで確認することができる。
【００８８】
本発明において、「細胞表層タンパク質の活性が低下している」ことには、細胞表層タンパク質の活性が低下するようにコリネ型細菌が改変された場合、および、コリネ型細菌においてもともと細胞表層タンパク質の活性が低下している場合が含まれる。「コリネ型細菌においてもともと細胞表層タンパク質の活性が低下している場合」には、コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない場合が含まれる。すなわち、細胞表層タンパク質の活性が低下しているコリネ型細菌としては、例えば、もともと細胞表層タンパク質を有さないコリネ型細菌が挙げられる。「コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない場合」としては、例えば、コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質をコードする遺伝子を有さない場合が挙げられる。なお、「コリネ型細菌がもともと細胞表層タンパク質を有さない」とは、コリネ型細菌が、当該コリネ型細菌が属する種の他の株に見出される細胞表層タンパク質から選択される１またはそれ以上のタンパク質をもともと有さないことであってよい。例えば、「C. glutamicumがもともと細胞表層タンパク質を有さない」とは、C. glutamicum株が、他のC. glutamicum株に見出される細胞表層タンパク質から選択される１またはそれ以上のタンパク質、すなわち、例えばPS1および／またはPS2（CspB）、をもともと有さないことであってよい。もともと細胞表層タンパク質を有さないコリネ型細菌としては、例えば、もともとcspB遺伝子を有さないC. glutamicum ATCC 13032が挙げられる。
【００８９】
以下に、細胞表層タンパク質等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。なお、以下に記載するタンパク質の活性を低下させる手法は、野生型PhoSタンパク質の破壊にも利用できる。
【００９０】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００９１】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株と比較して減少することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００９２】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【００９３】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が含まれる。
【００９４】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【００９５】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【００９６】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００９７】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子としては、遺伝子の全領域あるいは一部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を挿入した遺伝子、ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子が挙げられる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、欠失型遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、両端に染色体上の野生型遺伝子の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、野生型遺伝子の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、１ステップで野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することができる。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【００９８】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００９９】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０１００】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【０１０１】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１０２】
タンパク質の量が低下したことの確認は、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの強度を確認することによって行うことが出来る。また、タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１０３】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【０１０４】
＜１−１−４＞タンパク質の分泌系
本発明の細菌は、タンパク質の分泌系を有する。タンパク質の分泌系は、目的の異種タンパク質を分泌できるものであれば、特に制限されない。タンパク質の分泌系としては、Sec系（Sec系分泌装置）やTat系（Tat系分泌装置）が挙げられる。本発明の細菌は、タンパク質の分泌系が増強されていてもよい。例えば、本発明の細菌は、Tat系分泌装置をコードする遺伝子から選択される１またはそれ以上の遺伝子の発現が上昇するように改変されていてもよい。本発明において、このような改変を「Tat系分泌装置の増強」ともいう。Tat系分泌装置の増強は、特に、Tat系依存シグナルペプチドを利用して異種タンパク質を分泌生産する場合に好適である。Tat系分泌装置をコードする遺伝子の発現を上昇させる手法については特許第4730302号に記載されている。
【０１０５】
Tat系分泌装置をコードする遺伝子としては、C. glutamicumのtatA遺伝子、tatB遺伝子、およびtatC遺伝子が挙げられる。C. glutamicum ATCC 13032のtatA遺伝子、tatB遺伝子、およびtatC遺伝子は、それぞれ、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_003450 (VERSION NC_003450.3 GI:58036263)として登録されているゲノム配列中、1571065〜1571382位の配列の相補配列、1167110〜1167580位の配列、および1569929〜1570873位の配列の相補配列に相当する。また、C. glutamicum ATCC 13032のTatAタンパク質、TatBタンパク質、およびTatCタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_600707 (version NP_600707.1 GI:19552705、locus_tag=”NCgl1434”)、GenBank accession NP_600350 (version NP_600350.1 GI:19552348、locus_tag=”NCgl1077”)、およびGenBank accession NP_600706 (version NP_600706.1 GI:19552704、locus_tag=”NCgl1433”)として登録されている。C. glutamicum ATCC 13032のtatA遺伝子、tatB遺伝子、およびtatC遺伝子の塩基配列ならびにTatAタンパク質、TatBタンパク質、およびTatCタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６９〜７４に示す。
【０１０６】
また、Tat系分泌装置をコードする遺伝子としては、E. coliのtatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子が挙げられる。E.coli K-12 MG1655のtatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子は、それぞれ、ＮＣＢＩデータベースにGenBank accession NC_000913(VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、4019968〜4020237位の配列、4020241〜4020756位の配列、4020759〜4021535位の配列、658170〜658373位の配列に相当する。また、E.coli K-12 MG1655のTatAタンパク質、TatBタンパク質、TatCタンパク質、およびTatEタンパク質は、それぞれ、GenBank accession NP_418280 (version NP_418280.4 GI:90111653、locus_tag=”b3836”)、GenBank accession YP_026270 (versionYP_026270.1 GI:49176428、locus_tag=”b3838”)、GenBank accession NP_418282 (version NP_418282.1 GI:16131687、locus_tag=”b3839”)、およびGenBank accession NP_415160 (versionNP_415160.1 GI:16128610、locus_tag=”b0627”)として登録されている。
【０１０７】
Tat系分泌装置をコードする遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したTat系分泌装置をコードする遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、Tat系分泌装置は、元の機能が維持されている限り、上記例示したTat系分泌装置のバリアントであってもよい。すなわち、例えば、「tatA遺伝子」、「tatB遺伝子」、「tatC遺伝子」、および「tatE遺伝子」という用語には、それぞれ、上記例示したtatA遺伝子、tatB遺伝子、tatC遺伝子、およびtatE遺伝子に加え、その保存的バリアントが含まれるものとする。同様に、「TatAタンパク質」、「TatBタンパク質」、「TatCタンパク質」、および「TatEタンパク質」という用語には、それぞれ、上記例示したTatAタンパク質、TatBタンパク質、TatCタンパク質、およびTatEタンパク質に加え、その保存的バリアントが含まれるものとする。Tat系分泌装置およびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したPhoSタンパク質およびphoS遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、Tat系分泌装置をコードする遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「元の機能が維持されている」とは、Tat系分泌装置にあっては、Tat系依存シグナルペプチドがN末端に付加されたタンパク質を細胞外に分泌する機能を有することであってよい。
【０１０８】
以下に、Tat系分泌装置をコードする遺伝子等の遺伝子の発現を上昇させる手法について説明する。
【０１０９】
「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の発現が非改変株に対して上昇していることを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的の遺伝子の発現が上昇するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現の上昇の程度は、遺伝子の発現が非改変株と比較して上昇していれば特に制限されない。遺伝子の発現は、非改変株と比較して、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。
【０１１０】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【０１１１】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。具体的には、例えば、標的遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、両端に染色体上の置換対象部位の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換して、置換対象部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、置換対象部位を標的遺伝子に置換することができる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子を備えていてよい。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP0805867B1）。トランスポゾンとしては、人工トランスポゾンを利用してもよい（特開平9-70291）。
【０１１２】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【０１１３】
また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、pHM1519（Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11；特開平10-215883号公報に記載のpVK7、特開平9-070291号公報に記載のpVC7等が挙げられる。
【０１１４】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の細菌で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、後述するような、コリネ型細菌で機能するプロモーターを利用することができる。
【０１１５】
遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、本発明の細菌において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。
【０１１６】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【０１１７】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。
【０１１８】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。
【０１１９】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列としては、例えば、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域が挙げられる。発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節配列の改変は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる。相同組み換えを利用した改変手法としては、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）が挙げられる。
【０１２０】
遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。コリネ型細菌で利用できる強力なプロモーターとしては、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（EF-Tu）プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【０１２１】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる（Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235）。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（5’-UTR）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【０１２２】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。例えば、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。すなわち、導入される遺伝子は、例えば、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
【０１２３】
また、遺伝子の発現の上昇は、標的遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、標的遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【０１２４】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【０１２５】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。コリネ型細菌の形質転換は、具体的には、例えば、プロトプラスト法（Gene, 39, 281-286(1985)）、エレクトロポレーション法（Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)）、電気パルス法（特開平2-207791号公報）等により行うことができる。
【０１２６】
遺伝子の発現が上昇したことは、例えば、同遺伝子から発現するタンパク質の活性が上昇したことを確認することにより確認できる。タンパク質の活性が上昇したことは、同タンパク質の活性を測定することにより確認できる。例えば、Tat系分泌装置の活性が上昇したことは、例えば、Tat系依存シグナルペプチドがN末端に付加されたタンパク質の分泌生産量が増大したことを確認することにより確認できる。その場合、Tat系依存シグナルペプチドがN末端に付加されたタンパク質の分泌生産量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇しているのが好ましい。
【０１２７】
また、遺伝子の発現が上昇したことは、例えば、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
【０１２８】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇しているのが好ましい。
【０１２９】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの強度を確認することによって行うことが出来る。また、タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇しているのが好ましい。
【０１３０】
＜１−１−５＞異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物
分泌性タンパク質（secretory protein）は、一般に、プレタンパク質（プレペプチドともいう）またはプレプロタンパク質（プレプロペプチドともいう）として翻訳され、その後、プロセッシングにより成熟タンパク質（mature protein）になることが知られている。具体的には、分泌性タンパク質は、一般に、プレタンパク質またはプレプロタンパク質として翻訳された後、プレ部分であるシグナルペプチドがプロテアーゼ（一般にシグナルペプチダーゼと呼ばれる）によって切断されて成熟タンパク質またはプロタンパク質に変換され、プロタンパク質はプロテアーゼによってさらにプロ部分が切断されて成熟タンパク質になる。よって、本発明の方法においては、異種タンパク質の分泌生産にシグナルペプチドを利用する。なお、本発明において、分泌型タンパク質のプレタンパク質およびプレプロタンパク質を総称して「分泌型タンパク質前駆体」という場合がある。本発明において、「シグナルペプチド」（「シグナル配列」ともいう）とは、分泌性タンパク質前駆体のN末端に存在し、かつ、通常、天然の成熟タンパク質には存在しないアミノ酸配列をいう。
【０１３１】
本発明に用いられる遺伝子構築物は、５’から３’方向に、コリネ型細菌で機能するプロモーター配列、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドをコードする核酸配列、および異種タンパク質をコードする核酸配列を含む。シグナルペプチドをコードする核酸配列は、プロモーター配列の下流に、同プロモーターによる制御を受けてシグナルペプチドが発現するよう連結されていればよい。異種タンパク質をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に、同シグナルペプチドとの融合タンパク質として異種タンパク質が発現するよう連結されていればよい。当該融合タンパク質を「本発明の融合タンパク質」ともいう。なお、本発明の融合タンパク質において、シグナルペプチドと異種タンパク質とは隣接していてもよく、していなくてもよい。すなわち、「異種タンパク質がシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する」とは、異種タンパク質がシグナルペプチドに隣接して同シグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する場合に限られず、異種タンパク質が他のアミノ酸配列を介してシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現する場合も包含される。例えば、後述するように、本発明の融合タンパク質において、シグナルペプチドと異種タンパク質との間には、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列や酵素的切断に使用されるアミノ酸配列等の挿入配列が含まれ得る。核酸配列は「遺伝子」と読み替えてもよい。例えば、異種タンパク質をコードする核酸配列を「異種タンパク質をコードする遺伝子」または「異種タンパク質遺伝子」ともいう。核酸配列としては、ＤＮＡが挙げられる。また、本発明に用いられる遺伝子構築物は、コリネ型細菌で本発明の融合タンパク質を発現させるために有効な制御配列（オペレーターやターミネーター等）を、それらが機能し得るように適切な位置に有していてもよい。
【０１３２】
本発明で使用されるプロモーターは、コリネ型細菌で機能するプロモーターである限り特に制限されない。プロモーターは、コリネ型細菌由来（例えば宿主由来）のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、異種タンパク質遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。「コリネ型細菌で機能するプロモーター」とは、コリネ型細菌においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。
【０１３３】
異種由来のプロモーターとして、具体的には、例えば、tacプロモーター、lacプロモーター、trpプロモーター、およびaraBADプロモーター等のE.coli由来のプロモーターが挙げられる。中でも、tacプロモーター等の強力なプロモーターや、araBADプロモーター等の誘導型のプロモーターが好ましい。
【０１３４】
コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質であるPS1、PS2（CspBともいう）、SlpA（CspAともいう）の遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターが挙げられる。各種アミノ酸生合成系遺伝子のプロモーターとして、具体的には、例えば、グルタミン酸生合成系のグルタミン酸脱水素酵素遺伝子、グルタミン合成系のグルタミン合成酵素遺伝子、リジン生合成系のアスパルトキナーゼ遺伝子、スレオニン生合成系のホモセリン脱水素酵素遺伝子、イソロイシンおよびバリン生合成系のアセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子、ロイシン生合成系の2-イソプロピルリンゴ酸合成酵素遺伝子、プロリンおよびアルギニン生合成系のグルタミン酸キナーゼ遺伝子、ヒスチジン生合成系のホスホリボシル-ATPピロホスホリラーゼ遺伝子、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニン等の芳香族アミノ酸生合成系のデオキシアラビノヘプツロン酸リン酸（DAHP）合成酵素遺伝子、イノシン酸およびグアニル酸のような核酸生合成系におけるホスホリボシルピロホスフェート（PRPP）アミドトランスフェラーゼ遺伝子、イノシン酸脱水素酵素遺伝子、およびグアニル酸合成酵素遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【０１３５】
また、コリネ型細菌で機能するプロモーターとしては、上述したような、コリネ型細菌で利用できる強力なプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の−３５、−１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（5’-UTR）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。
【０１３６】
本発明で使用されるシグナルペプチドは、コリネ型細菌で機能するシグナルペプチドである限り特に制限されない。シグナルペプチドは、コリネ型細菌由来（例えば宿主由来）のシグナルペプチドであってもよく、異種由来のシグナルペプチドであってもよい。シグナルペプチドは、異種タンパク質の固有のシグナルペプチドであってもよく、他のタンパク質のシグナルペプチドであってもよい。「コリネ型細菌で機能するシグナルペプチド」とは、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、コリネ型細菌が当該タンパク質を分泌することができるペプチドをいう。あるシグナルペプチドがコリネ型細菌で機能するかどうかは、例えば、目的のタンパク質を当該シグナルペプチドと融合させて発現させ、当該タンパク質が分泌されるかを確認することで確認できる。
【０１３７】
シグナルペプチドとしては、Tat系依存シグナルペプチドやSec系依存シグナルペプチドが挙げられる。
【０１３８】
「Tat系依存シグナルペプチド」とは、Tat系によって認識されるシグナルペプチドをいう。「Tat系依存シグナルペプチド」とは、具体的には、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、Tat系分泌装置により当該タンパク質が分泌されるペプチドであってよい。
【０１３９】
Tat系依存シグナルペプチドとしては、例えば、E. coliのTorAタンパク質（トリメチルアミン-N-オキシドレダクターゼ）のシグナルペプチド、E. coliのSufIタンパク質（ftsIのサプレッサー）のシグナルペプチド、Bacillus subtilisのPhoDタンパク質（ホスホジエステラーゼ）のシグナルペプチド、Bacillus subtilisのLipAタンパク質（リポ酸シンターゼ）のシグナルペプチド、Arthrobacter globiformisのIMDタンパク質（イソマルトデキストラナーゼ）のシグナルペプチドが挙げられる。これらのシグナルペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。
TorAシグナルペプチド：MNNNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA（配列番号７５）
SufIシグナルペプチド：MSLSRRQFIQASGIALCAGAVPLKASA（配列番号７６）
PhoDシグナルペプチド：MAYDSRFDEWVQKLKEESFQNNTFDRRKFIQGAGKIAGLSLGLTIAQS（配列番号７７）
LipAシグナルペプチド：MKFVKRRTTALVTTLMLSVTSLFALQPSAKAAEH（配列番号７８）
IMDシグナルペプチド：MMNLSRRTLLTTGSAATLAYALGMAGSAQA（配列番号７９）
【０１４０】
Tat系依存シグナルペプチドは、ツイン・アルギニンモチーフを有する。ツイン・アルギニンモチーフとしては、例えば、S/T-R-R-X-F-L-K（配列番号８０）やR-R-X-#-#（#:疎水性残基）（配列番号８１）が挙げられる。
【０１４１】
「Sec系依存シグナルペプチド」とは、Sec系によって認識されるシグナルペプチドをいう。「Sec系依存シグナルペプチド」とは、具体的には、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、Sec系分泌装置により当該タンパク質が分泌されるペプチドであってよい。
【０１４２】
Sec系依存シグナルペプチドとしては、例えば、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドが挙げられる。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質については、上述の通りである。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質としては、C. glutamicumに由来するPS1及びPS2（CspB）（特表平6-502548）、及びC. stationisに由来するSlpA（CspA）（特開平10-108675）が挙げられる。C. glutamicumのPS1のシグナルペプチド（PS1シグナルペプチド）のアミノ酸配列を配列番号８２に、C. glutamicumのPS2（CspB）のシグナルペプチド（PS2シグナルペプチド）のアミノ酸配列を配列番号８３に、C. stationisのSlpA（CspA）のシグナルペプチド（SlpAシグナルペプチド）のアミノ酸配列を配列番号８４に示す。
【０１４３】
Tat系依存シグナルペプチドは、ツイン・アルギニンモチーフを有し、且つ、元の機能が維持されている限り、上記例示したTat系依存シグナルペプチドのバリアントであってもよい。また、Sec系依存シグナルペプチドは、元の機能が維持されている限り、上記例示したSec系依存シグナルペプチドのバリアントであってもよい。シグナルペプチドおよびそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述したPhoSタンパク質およびphoS遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。例えば、シグナルペプチドは、上記例示したシグナルペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。なお、シグナルペプチドのバリアントにおける上記「１又は数個」とは、具体的には好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個を意味する。なお、本発明において、「TorAシグナルペプチド」、「SufIシグナルペプチド」、「PhoDシグナルペプチド」、「LipAシグナルペプチド」、「IMDシグナルペプチド」、「PS1シグナルペプチド」、「PS2シグナルペプチド」、および「SlpAシグナルペプチド」という用語には、それぞれ、配列番号７５、７６、７７、７８、７９、８２、８３、および８４に記載のペプチドに加え、その保存的バリアントが含まれるものとする。
【０１４４】
Tat系依存シグナルペプチドについての「元の機能が維持されている」とは、Tat系によって認識されることをいい、具体的には、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、Tat系分泌装置により当該タンパク質が分泌される機能を有することであってよい。あるペプチドがTat系依存シグナルペプチドとしての機能を有するかどうかは、例えば、当該ペプチドをN末端に付加したタンパク質の分泌生産量がTat系分泌装置の増強により増大することを確認することや、当該ペプチドをN末端に付加したタンパク質の分泌生産量がTat系分泌装置の欠損により減少することを確認することにより確認できる。
【０１４５】
Sec系依存シグナルペプチドについての「元の機能が維持されている」とは、Sec系によって認識されることをいい、具体的には、目的のタンパク質のN末端に連結した際に、Sec系分泌装置により当該タンパク質が分泌される機能を有することであってよい。あるペプチドがSec系依存シグナルペプチドとしての機能を有するかどうかは、例えば、当該ペプチドをN末端に付加したタンパク質の分泌生産量がSec系分泌装置の増強により増大することを確認することや、当該ペプチドをN末端に付加したタンパク質の分泌生産量がSec系分泌装置の欠損により減少することを確認することにより確認できる。
【０１４６】
シグナル配列は、一般に、翻訳産物が菌体外に分泌される際にシグナルペプチダーゼによって切断される。なお、シグナルペプチドをコードする遺伝子は、天然型のままでも使用できるが、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変してもよい。
【０１４７】
本発明で用いられる遺伝子構築物においては、シグナルペプチドをコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列が挿入されていてもよい（WO2013/062029）。なお、当該「Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列」を「本発明で用いられる挿入配列」ともいう。本発明で用いられる挿入配列としては、WO2013/062029に記載されたGln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列が挙げられる。本発明で用いられる挿入配列は、特に、Sec系依存シグナルペプチドと組み合わせて好適に用いることができる。
【０１４８】
本発明で用いられる挿入配列は、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質CspBの成熟タンパク質（以下、「成熟CspB」または「CspB成熟タンパク質」ともいう）のN末端からの３アミノ酸残基またはそれ以上からなる配列であるのが好ましい。「N末端からの３アミノ酸残基またはそれ以上からなる配列」とは、N末端の１位のアミノ酸残基から、３位またはそれ以上のアミノ酸残基までのアミノ酸配列をいう。
【０１４９】
コリネ型細菌の細胞表層タンパク質CspBについては、上述の通りである。CspBとして、具体的には、例えば、C.glutamicum ATCC13869のCspBや上記例示した28株のC. glutamicumのCspB、およびそれらのバリアントが挙げられる。配列番号６８に示すC.glutamicum ATCC13869のCspBのアミノ酸配列中、１〜３０位のアミノ酸残基がシグナルペプチドに相当し、３１〜４９９位のアミノ酸残基がCspB成熟タンパク質に相当する。シグナルペプチド部分３０アミノ酸残基を除いた、C.glutamicum ATCC13869のCspB成熟タンパク質のアミノ酸配列を配列番号８５に示す。なお、C.glutamicum ATCC13869の成熟CspBにおいて、N末端の１〜３位のアミノ酸残基がGln-Glu-Thrに相当する。
【０１５０】
本発明で用いられる挿入配列は、成熟CspBの１位のアミノ酸残基から、３〜５０位のいずれかのアミノ酸残基までのアミノ酸配列であるのが好ましい。本発明で用いられる挿入配列は、成熟CspBの１位のアミノ酸残基から、３〜８、１７、５０位のいずれかのアミノ酸残基までのアミノ酸配列であるのがより好ましい。本発明で用いられる挿入配列は、成熟CspBの１位のアミノ酸残基から、４、６、１７、５０位のいずれかのアミノ酸残基までのアミノ酸配列であるのが特に好ましい。
【０１５１】
本発明で用いられる挿入配列は、例えば、下記Ａ〜Ｈのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。
（Ａ）Gln-Glu-Thr
（Ｂ）Gln-Glu-Thr-Xaa1（配列番号８６）
（Ｃ）Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2（配列番号８７）
（Ｄ）Gln-Glu-Thr-Xaa1-Xaa2-Xaa3（配列番号８８）
（Ｅ）Gln-Glu-Thrに成熟CspBの４〜７位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
（Ｆ）Gln-Glu-Thrに成熟CspBの４〜８位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
（Ｇ）Gln-Glu-Thrに成熟CspBの４〜１７位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
（Ｈ）Gln-Glu-Thrに成熟CspBの４〜５０位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列
Ａ〜Ｈのアミノ酸配列において、Xaa1はAsn、Gly、Thr、Pro、またはAlaであり、Xaa2はPro、Thr、またはValであり、Xaa3はThrまたはTyrである。また、Ａ〜Ｈのアミノ酸配列において、「Gln-Glu-Thrに成熟CspBの４〜Ｘ位のアミノ酸残基が付加された」とは、Gln-Glu-ThrのThrに成熟CspBのN末端の４位からＸ位までのアミノ酸残基が付加されていることを意味する。なお、通常、成熟CspBのN末端の１〜３番目のアミノ酸残基はGln-Glu-Thrであり、その場合、「Gln-Glu-Thrに成熟CspBの４〜Ｘ位のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列」とは、成熟CspBの１〜Ｘ位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と同義である。
【０１５２】
また、本発明で用いられる挿入配列は、具体的には、例えば、Gln-Glu-Thr-Asn-Pro-Thr（配列番号８９）、Gln-Glu-Thr-Gly-Thr-Tyr（配列番号９０）、Gln-Glu-Thr-Thr-Val-Thr（配列番号９１）、Gln-Glu-Thr-Pro-Val-Thr（配列番号９２）、およびGln-Glu-Thr-Ala-Val-Thr（配列番号９３）からなる群より選択されるアミノ酸配列であるのが好ましい。
【０１５３】
本発明において、「成熟CspBのＸ位のアミノ酸残基」とは、配列番号８５におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基を意味する。任意の成熟CspBのアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「配列番号８５におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該任意の成熟CspBのアミノ酸配列と配列番号８５のアミノ酸配列とアライメントを行うことにより決定できる。
【０１５４】
本発明の方法により分泌生産される異種タンパク質としては、例えば、生理活性タンパク質、レセプタータンパク質、ワクチンとして使用される抗原タンパク質、酵素が挙げられる。
【０１５５】
酵素としては、例えば、トランスグルタミナーゼ、プロテイングルタミナーゼ、イソマルトデキストラナーゼ、プロテアーゼ、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、コラゲナーゼ、およびキチナーゼ等が挙げられる。トランスグルタミナーゼとしては、例えば、Streptoverticillium mobaraense IFO 13819（WO01/23591）、Streptoverticillium cinnamoneum IFO 12852、Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776、Streptomyces lydicus（WO9606931）等の放線菌や、Oomycetes（WO9622366）等の糸状菌の分泌型のトランスグルタミナーゼが挙げられる。プロテイングルタミナーゼとしては、例えば、Chryseobacterium proteolyticumのプロテイングルタミナーゼが挙げられる（WO2005/103278）。イソマルトデキストラナーゼとしては、例えば、Arthrobacter globiformisのイソマルトデキストラナーゼが挙げられる（WO2005/103278）。
【０１５６】
生理活性タンパク質としては、例えば、成長因子（増殖因子）、ホルモン、サイトカイン、抗体関連分子が挙げられる。
【０１５７】
成長因子（増殖因子）として、具体的には、例えば、上皮成長因子（Epidermal growth factor；EGF）、インスリン様成長因子-1（Insulin-like growth factor-1；IGF-1）、トランスフォーミング成長因子（Transforming growth factor；TGF）、神経成長因子（Nerve growth factor；NGF）、脳由来神経栄養因子（Brain-derived neurotrophic factor；BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（Vesicular endothelial growth factor；VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte-colony stimulating factor；G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor；GM-CSF）、血小板由来成長因子（Platelet-derived growth factor；PDGF）、エリスロポエチン（Erythropoietin；EPO）、トロンボポエチン（Thrombopoietin；TPO）、酸性線維芽細胞増殖因子（acidic fibroblast growth factor；aFGFまたはFGF1）、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor；bFGFまたはFGF2）、角質細胞増殖因子（keratinocyto growth factor；KGF-1またはFGF7, KGF-2またはFGF10）、肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor；HGF）が挙げられる。
【０１５８】
ホルモンとして、具体的には、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン（somatostatin）、ヒト成長ホルモン（human growth hormone；hGH）、副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone；PTH）、カルシトニン（calcitonin）、エキセナチド（exenatide）が挙げられる。
【０１５９】
サイトカインとして、具体的には、例えば、インターロイキン、インターフェロン、腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Factor；TNF）が挙げられる。
【０１６０】
なお、成長因子（増殖因子）、ホルモン、およびサイトカインは互いに厳密に区別されなくともよい。例えば、生理活性タンパク質は、成長因子（増殖因子）、ホルモン、およびサイトカインから選択されるいずれか１つのグループに属するものであってもよく、それらから選択される複数のグループに属するものであってもよい。
【０１６１】
また、生理活性タンパク質は、タンパク質全体であってもよく、その一部であってもよい。タンパク質の一部としては、例えば、生理活性を有する部分が挙げられる。生理活性を有する部分として、具体的には、例えば、副甲状腺ホルモン（parathyroid hormone；PTH）の成熟体のN末端３４アミノ酸残基からなる生理活性ペプチドTeriparatideが挙げられる。
【０１６２】
抗体関連分子とは、完全抗体を構成するドメインから選択される単一のドメインまたは２もしくはそれ以上のドメインの組合せからなる分子種を含むタンパク質をいう。完全抗体を構成するドメインとしては、重鎖のドメインであるＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３、ならびに軽鎖のドメインであるＶＬおよびＣＬが挙げられる。抗体関連分子は、上述の分子種を含む限り、単量体タンパク質であってもよく、多量体タンパク質であってもよい。なお、抗体関連分子が多量体タンパク質である場合には、単一の種類のサブユニットからなるホモ多量体であってもよく、２またはそれ以上の種類のサブユニットからなるヘテロ多量体であってもよい。抗体関連分子として、具体的には、例えば、完全抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）からなる二量体、Ｆｃ融合タンパク質、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）２、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙが挙げられる。
【０１６３】
レセプタータンパク質は、特に制限されず、例えば、生理活性タンパク質やその他の生理活性物質に対するレセプタータンパク質であってよい。その他の生理活性物質としては、例えば、ドーパミン等の神経伝達物質が挙げられる。また、レセプタータンパク質は、対応するリガンドが知られていないオーファン受容体であってもよい。
【０１６４】
ワクチンとして使用される抗原タンパク質は、免疫応答を惹起できるものであれば特に制限されず、想定する免疫応答の対象に応じて適宜選択すればよい。
【０１６５】
また、その他のタンパク質として、Liver-type fatty acid-binding protein（LFABP）が挙げられる。
【０１６６】
これらのタンパク質をコードする遺伝子は、使用する宿主に応じて、および望みの活性を得るために改変することができる。例えば、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、これらのタンパク質に１又は数個のアミノ酸の付加、欠失、置換などが含まれるよう改変されてもよい。上述したPhoSタンパク質およびphoS遺伝子のバリアントに関する記載は、本発明の方法により分泌生産される異種タンパク質およびそれをコードする遺伝子にも準用できる。また、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、必要により宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンに変換してもよい。
【０１６７】
本発明の遺伝子構築物は、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列をコードする核酸配列と異種タンパク質をコードする核酸配列との間に、さらに、酵素的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでいてもよい。酵素的切断に使用されるアミノ酸配列を本発明の融合タンパク質に挿入することで、発現した融合タンパク質を酵素的に切断し、目的の異種タンパク質を得ることができる。
【０１６８】
酵素的切断に使用されるアミノ酸配列は、ペプチド結合を加水分解する酵素により認識され切断される配列であれば特に制限されず、目的の異種タンパク質のアミノ酸配列に応じて使用可能な配列を適宜選択すればよい。酵素的切断に使用されるアミノ酸配列をコードする核酸配列は、同アミノ酸配列に基づいて適宜設定すればよく、また、例えば、宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを用いればよい。
【０１６９】
酵素的切断に使用されるアミノ酸配列は、基質特異性の高いプロテアーゼの認識配列であるのが好ましい。そのようなアミノ酸配列として、具体的には、例えば、Factor Xaプロテアーゼの認識配列やproTEVプロテアーゼの認識配列が挙げられる。Factor Xaプロテアーゼはタンパク質中のIle-Glu-Gly-Arg（=IEGR）（配列番号９４）のアミノ酸配列を、proTEVプロテアーゼはタンパク質中のGlu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln（=ENLYFQ）（配列番号９５）のアミノ酸配列を認識し、各配列のC末端側を特異的に切断する。
【０１７０】
本発明の方法により最終的に得られる異種タンパク質のN末端領域は、天然のタンパク質と同一であってもよく、天然のタンパク質と同一でなくてもよい。例えば、最終的に得られる異種タンパク質のN末端領域は、天然のタンパク質と比較して、１又は数個のアミノ酸を余分に付加された、あるいは欠失したものであってもよい。なお上記「１又は数個」とは、目的の異種タンパク質の全長や構造等によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【０１７１】
また、分泌生産される異種タンパク質は、プロ構造部が付加したタンパク質（プロタンパク質）であってもよい。分泌生産される異種タンパク質がプロタンパク質である場合、最終的に得られる異種タンパク質はプロタンパク質であってもよく、そうでなくてもよい。すなわち、プロタンパク質はプロ構造部を切断されて成熟タンパク質になってもよい。切断は、例えば、プロテアーゼにより行うことができる。プロテアーゼを使用する場合は、最終的に得られるタンパク質の活性という観点から、プロタンパク質は一般には天然のタンパク質とほぼ同じ位置で切断されることが好ましく、天然のタンパク質と完全に同じ位置で切断され天然のものと同一の成熟タンパク質が得られるのがより好ましい。従って、一般には、天然に生じる成熟タンパク質と同一のタンパク質を生じる位置でプロタンパク質を切断する特異的プロテアーゼが最も好ましい。しかしながら、上述の通り、最終的に得られる異種タンパク質のN末端領域は、天然のタンパク質と同一でなくてもよい。例えば、生産される異種タンパク質の種類や使用目的等によっては、天然のタンパク質に比較してN末端がアミノ酸１〜数個分長いあるいは短いタンパク質がより適切な活性を有することがある。本発明において使用できるプロテアーゼには、Dispase（ベーリンガーマンハイム社製）のような商業的に入手できるものの他、微生物の培養液、例えば放線菌の培養液等から得られるものが含まれる。そのようなプロテアーゼは未精製状態で使用することもでき、必要に応じて適当な純度まで精製した後に使用してもよい。なお、プロ構造部を切断して成熟タンパク質を得る場合には、挿入したGln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列はプロ構造部とともに切断除去されるため、Gln-Glu-Thrを含むアミノ酸配列の後に酵素的切断に使用されるアミノ酸配列を配位せずとも目的のタンパク質を得ることができる。
【０１７２】
本発明に用いられる遺伝子構築物をコリネ型細菌に導入する手法は特に制限されない。「本発明に用いられる遺伝子構築物の導入」とは、同遺伝子構築物を宿主に保持させることをいう。「本発明に用いられる遺伝子構築物の導入」には、予め構築した同遺伝子構築物を宿主に一括して導入する場合に限られず、少なくとも異種タンパク質遺伝子が宿主に導入され、且つ宿主内で同遺伝子構築物が構築される場合も含まれる。本発明の細菌において、本発明に用いられる遺伝子構築物は、プラスミドのように染色体外で自律増殖するベクター上に存在していてもよく、染色体上に組み込まれていてもよい。本発明に用いられる遺伝子構築物の導入は、例えば、上述した、遺伝子の発現を上昇させる手法における遺伝子の導入と同様に行うことができる。なお、本発明の細菌を構築するに当たり、本発明に用いられる遺伝的構築物の導入、変異型phoS遺伝子の導入、およびその他の改変は、任意の順番で行うことができる。
【０１７３】
本発明に用いられる遺伝子構築物は、例えば、同遺伝子構築物を含むベクターを用いて宿主に導入できる。例えば、本発明に用いられる遺伝子構築物をベクターと連結して同遺伝子構築物の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子構築物を宿主に導入することができる。また、例えば、ベクターがコリネ型細菌で機能するプロモーターを備える場合、当該プロモーターの下流に本発明の融合タンパク質をコードする塩基配列を連結することによっても、本発明に用いられる遺伝子構築物の発現ベクターを構築することができる。ベクターは、コリネ型細菌で自律複製可能なものであれば特に制限されない。コリネ型細菌で利用できるベクターについては上述の通りである。
【０１７４】
また、本発明に用いられる遺伝子構築物は、例えば、人工トランスポゾン等のトランスポゾンを使用して宿主の染色体上に導入できる。トランスポゾンが使用される場合は、相同組換えまたはそれ自身の転移能によって本発明に用いられる遺伝子構築物が染色体上に導入される。また、本発明に用いられる遺伝子構築物は、その他、相同組換えを利用する導入法により宿主の染色体上に導入できる。相同組換えを利用する導入法としては、例えば、直鎖状ＤＮＡ、温度感受性複製起点を含むプラスミド、接合伝達可能なプラスミド、または宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクター等を用いる方法が挙げられる。また、少なくとも異種タンパク質遺伝子を染色体上に導入し、本発明に用いられる遺伝子構築物を染色体上に構築してもよい。その場合、異種タンパク質遺伝子以外の、本発明に用いられる遺伝子構築物の構成要素の一部または全部は宿主の染色体上にもともと存在するものであってもよい。具体的には、例えば、宿主の染色体上にもともと存在するプロモーター配列と同プロモーター配列の下流に接続されたシグナルペプチドをコードする核酸配列をそのまま利用し、同シグナルペプチドをコードする核酸配列の下流に接続された遺伝子のみを目的の異種タンパク質遺伝子に置換することによっても、染色体上に本発明に用いられる遺伝子構築物が構築され、本発明の細菌を構築できる。異種タンパク質遺伝子等の、本発明に用いられる遺伝子構築物の一部の染色体への導入は、本発明に用いられる遺伝子構築物の染色体への導入と同様に行うことができる。
【０１７５】
本発明に用いられる遺伝子構築物やその構成要素（プロモーター配列、シグナルペプチドをコードする核酸配列、異種タンパク質をコードする核酸配列、等）は、例えば、クローニングにより取得できる。具体的には、例えば、目的の異種タンパク質を有する生物からのクローニングにより異種タンパク質遺伝子を取得し、シグナル配列をコードする塩基配列の導入やプロモーター配列の導入等の改変を行い、本発明に用いられる遺伝子構築物を取得できる。また、本発明に用いられる遺伝子構築物やその構成要素は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子構築物やその構成要素は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。
【０１７６】
なお、２またはそれ以上の種類のタンパク質を発現する場合、各タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物は、目的の異種タンパク質の分泌発現が達成できるように本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、例えば、各タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。「２またはそれ以上の種類のタンパク質を発現する場合」とは、例えば、２またはそれ以上の種類の異種タンパク質が分泌生産される場合や、ヘテロ多量体タンパク質が分泌生産される場合をいう。
【０１７７】
本発明に用いられる遺伝子構築物のコリネ型細菌への導入方法は特に限定されず、一般に使用される方法、例えば、プロトプラスト法（Gene, 39, 281-286(1985)）、エレクトロポレーション法（Bio/Technology, 7, 1067-1070(1989)）、電気パルス法（特開平2-207791号公報）等を使用することができる。
【０１７８】
＜１−２＞異種タンパク質の製造法
上記のようにして得られる本発明の細菌を培養し、異種タンパク質を発現させることにより、菌体外に分泌された多量の異種タンパク質が得られる。
【０１７９】
本発明の細菌は通常用いられる方法および条件に従って培養することができる。例えば、本発明の細菌は炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。
【０１８０】
炭素源としてはグルコースおよびシュークロースのような炭水化物、酢酸のような有機酸、アルコール類、その他を使用することができる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩、その他が使用できる。無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン等を必要に応じて適宜使用する。培養はpH5.0〜8.5、15℃〜37℃の適切な範囲にて好気的条件下で行い、１〜７日間程度培養する。また、コリネ型細菌のＬ−アミノ酸生産における培養条件や、その他Sec系依存、Tat系依存のシグナルペプチドを用いたタンパク質の製造法に記載の条件を用いることが出来る（WO01/23591、WO2005/103278参照）。また、異種タンパク質の発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加して培養を行うこともできる。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、目的タンパク質は菌体内で多量に生産され効率よく菌体外に分泌される。なお、本発明の方法によれば、生産された異種タンパク質は菌体外に分泌されるため、例えばトランスグルタミナーゼ等の微生物の菌体内で多量に蓄積すると一般に致死的であるタンパク質も、致死的影響を受けることなく連続的に生産できる。
【０１８１】
本発明の方法によって培地中に分泌されたタンパク質は、当業者によく知られた方法に従って培養後の培地から分離精製することができる。例えば、菌体を遠心分離等により除去した後、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。また、ある場合には、培養物や培養上清をそのまま使用してもよい。本発明の方法によって菌体表層に分泌されたタンパク質も当業者によく知られた方法、例えば塩濃度の上昇、界面活性剤の使用等によって可溶化した後に、培地中に分泌された場合と同様にして分離精製することができる。また、ある場合には、菌体表層に分泌されたタンパク質を可溶化せずに、例えば固定化酵素として使用してもよい。
【０１８２】
目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの分子量を確認することにより確認できる。また、目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、抗体を用いたウェスタンブロットによって確認できる（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。また、目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、プロテインシークエンサーを用いて目的タンパク質のN末端アミノ酸配列を検出することによって確認できる。また、目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、質量分析計を用いて、目的タンパク質の質量を決定することによって確認できる。また、目的の異種タンパク質が酵素や何らかの測定可能な生理活性を有するものである場合には、目的の異種タンパク質が分泌生産されたことは、培養上清および／または菌体表層を含む画分を試料として、目的の異種タンパク質の酵素活性または生理活性を測定することにより確認できる。
【０１８３】
＜２＞変異型phoS遺伝子を保持するコリネ型細菌
また、本発明は、変異型phoS遺伝子を保持するように改変されたコリネ型細菌を提供する。当該コリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌生産能を有していてもよく、有していなくともよい。すなわち、当該コリネ型細菌は、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有していてもよく、有していなくともよい。当該コリネ型細菌については、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を有していなくともよいこと以外は、上述した「本発明の方法に用いられるコリネ型細菌」についての記載を準用できる。当該コリネ型細菌は、例えば、異種タンパク質の分泌発現用の遺伝子構築物を保持させることにより、異種タンパク質の分泌生産に好適に利用できる。すなわち、当該コリネ型細菌の一態様は、上述した「本発明の方法に用いられるコリネ型細菌」である。
【実施例】
【０１８４】
本発明は以下の実施例によって、更に具体的に説明されるが、これらはいかなる意味でも本発明を限定するものと解してはならない。【０１８５】
実施例１：C. glutamicum YDK010株由来のPhoS変異株の取得
（１）phoS遺伝子に変異を有する自然変異株の取得
WO2014/126260に記載の、生理活性ペプチドであるTeriparatideの分泌発現プラスミドpPKK50TEV-Teriを用いて、WO2002/081694に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。なお、pPKK50TEV-Teriは生理活性ペプチドであるTeriparatideの分泌発現用ベクターであって、C. glutamicum ATCC13869株のcspB遺伝子のプロモーター領域、同プロモーターの下流に発現可能に連結された同株のCspBシグナルペプチド、同株の成熟CspBのN末端50アミノ酸残基、ProTEVプロテアーゼの認識配列ENLYFQ、およびTeriparatideの融合タンパク質（以下、CspB50TEV-Teriと表記する）をコードする塩基配列を有するプラスミドである（WO2014/126260）。C. glutamicum YDK010株は、C. glutamicum AJ12036（FERM BP-734）の細胞表層タンパク質CspBの欠損株である（WO2002/081694）。得られた形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むCMDex寒天培地（グルコース 5 g、硫酸マグネシウム七水和物 0.4 g、硫酸鉄七水和物 0.01 g、硫酸マンガン五水和物 0.01 g、リン酸二水素カリウム 1 g、ビオチン 10 μg、DifcoTM Select Soytone（Becton Dickinson）10 g、BactoTM Yeast Extract（Becton Dickinson）10 g、尿素 3 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 1.2 g）、寒天抹 20 g、水で1 LにしてpH6.5に調整）上で30℃で培養してコロニーを形成させた。【０１８６】
培養後、phoS遺伝子に変異が導入された自然変異株を選択し、YDK0107株と命名した。YDK0107株が有する変異型phoS遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードする変異型PhoSタンパク質のアミノ酸配列を、<配列番号01>および<配列番号02>に示す。YDK0107株の変異型phoS遺伝子では、YDK010株の野生型phoS遺伝子の塩基配列<配列番号03>における906位のGがTに変異している。この変異によって、YDK0107株の変異型PhoSタンパク質では、YDK010株のphoS遺伝子によってコードされる野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列<配列番号04>における302位のトリプトファン残基がシステイン残基に置換されている。この変異をPhoS(W302C)変異と命名した。尚、ゲノムDNAの調製はPurEluteTM Genomic DNA Kit（EdgeBio）を用い、塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。【０１８７】
（２）変異型PhoS(W302C)をコードするphoS遺伝子置換用ベクターの構築
<配列番号05>および<配列番号06>に記載のプライマーを用いて、PurEluteTMGenomic DNA Kit（EdgeBio）を用いて調製したC. glutamicum YDK0107株の染色体DNAを鋳型として、変異型PhoS(W302C)をコードするphoS遺伝子（変異型phoS遺伝子または変異型phoS(W302C)遺伝子ともいう）を含む約1.5 kbpの領域をPCR法によって増幅した。PCR反応にはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。【０１８８】
次に、増幅した約1.5 kbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的のバンドを切り出し、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いてゲルより回収した。回収したDNA断片をWO2006/057450に記載のpBS5TのSma I部位に挿入した後、E. coli JM109（Takara Bio）のコンピテントセルに導入した。変異型phoS遺伝子を含むDNA断片がクローン化されたプラスミドを保持する菌株を取得し、これよりプラスミドを回収し、変異型phoS遺伝子がクローン化されたプラスミドpBS5T-phoS(W302C)を得た。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子がクローン化されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。【０１８９】
（３）YDK010株におけるPhoS(W302C)変異置換株の構築
実施例１（２）で構築したプラスミドpBS5T-phoS(W302C)でWO2002/081694に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた形質転換体からWO2006/057450に記載の方法に従って菌株の選択を行い、染色体上の野生型phoS遺伝子が変異型phoS遺伝子に置換されたYDK010::phoS(W302C)株を得た。なお、YDK010::phoS(W302C)株は、YDK0107株の染色体DNAを利用せずとも、例えば遺伝子工学的に取得した変異型phoS遺伝子断片等を利用して再現的に構築できる。【０１９０】
（４）phoS遺伝子欠損用ベクターpBS5TΔphoSの構築
PurEluteTMGenomic DNA Kit（EdgeBio）を用いて調製したC. glutamicum ATCC13869株の染色体DNAを鋳型として、<配列番号07>と<配列番号08>のプライマーを用いてphoS遺伝子の5’側上流約1 kbpを、<配列番号09>と<配列番号10>のプライマーを用いてphoS遺伝子の3’側下流約1 kbpの領域を、それぞれPCR法によって増幅した。PCRにはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。増幅したそれぞれ約1 kbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的のバンドを切り出し、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いてゲルより回収した。回収した2つのDNA断片を、インフュージョン反応によりWO2006/057450に記載のpBS5TのSma I部位に挿入することによって、phoS遺伝子欠損用ベクターpBS5TΔphoSを得た。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。【０１９１】
（５）YDK010株のPhoS欠損株の構築
実施例１（４）で構築したpBS5TΔphoSでWO2002/081694に記載のC. glutamicum YDK010株を形質転換した。得られた形質転換体からWO2006/057450に記載の方法に従って菌株の選択を行い、phoS遺伝子が欠損したYDK010ΔphoS株を得た。【０１９２】
実施例２：PhoS(W302C)変異株およびPhoS欠損株におけるCspBシグナル配列を用いたCspB50TEV-Teriparatide融合タンパク質の分泌発現
WO2014/126260に記載の、生理活性ペプチドであるTeriparatideの分泌発現プラスミドpPKK50TEV-Teriを用いて、WO2002/081694に記載のC. glutamicum YDK010株、実施例１（１）で得られたYDK0107株、実施例１（３）で得られたYDK010::phoS(W302C)株、実施例１（５）で得られたYDK010ΔphoS株のそれぞれを形質転換し、YDK010/pPKK50TEV-Teri株、YDK0107/pPKK50TEV-Teri株、YDK010::phoS(W302C)/pPKK50TEV-Teri株、およびYDK010ΔphoS/pPKK50TEV-Teri株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5 μlを還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange（Life Technologies）にて染色を行った。その結果、YDK0107株およびYDK010::phoS(W302C)株では、YDK010株と比較して、CspB50TEV-Teri分泌量が顕著に向上していた（図１）。染色後、画像解析ソフトMulti Gauge（FUJIFILM）を用いてCspB50TEV-Teriのバンド強度の数値化を行い、各株でCspB50TEV-Teriを発現させた際のバンド強度の平均値を、YDK010株でCspB50TEV-Teriを発現させた際のバンド強度の平均値を1とした時の相対値として算出した。その結果、YDK0107株およびYDK010::phoS(W302C)株では、YDK010株と比較して、CspB50TEV-Teri分泌量がそれぞれ約13.2倍、約12.5倍に向上していることが確認された（表１）。一方、YDK010ΔphoS株では、YDK010株と比較して、CspB50TEV-Teri分泌量が約0.2倍に減少していた。このことから、PhoS(W302C)変異は、CspB50TEV-Teri分泌において、顕著な分泌量向上をもたらす有効変異であることが明らかとなった。一方で、phoS遺伝子欠損はCspB50TEV-Teri分泌において有利な効果が認められなかった。【０１９３】
【表１】
2016171224.tif 000003
【０１９４】
Appl. Environ. Microbiol., 94, 1131-1150(2012)によると、C. glutamicum ATCC13032株のPhoSタンパク質の266-330位の領域はHisKAドメインであると考えられており、HisKAドメインは自己リン酸化するヒスチジン残基を含んでいる。302位のトリプトファン残基はこのHisKAドメインの中に存在するため、種々のコリネバクテリウム属細菌のPhoSホモログにおけるHisKAドメインのアミノ酸配列を比較した。BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて解析した塩基配列から推定されるC. glutamicum YDK0107株、C. glutamicum YDK010株、およびC. glutamicum ATCC13869株のPhoSタンパク質のHisKAドメインのアミノ酸配列、さらに、配列番号４のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索によって相同性70%以上のホモログとしてデータベースから取得したC. glutamicum ATCC13032株（Genbank Accession No. NP_601807）、C. glutamicum ATCC14067株（Genbank Accession No. KEI24167）、C. callunae（Genbank Accession No. WP_015652043）、C. crenatum（Genbank Accession No. WP_031512002）、およびC. efficiens（Genbank Accession No. WP_006769148）のPhoSホモログのHisKAドメインのアミノ酸配列のアライメントを図２に示し、302位のアミノ酸残基を枠で囲んで示した。その結果、302位のトリプトファン残基は、YDK0107株以外のコリネバクテリウム属細菌間で共通して保存されていることが判明した。PhoSタンパク質は二成分制御系のセンサーキナーゼタンパク質であることが知られているが、異種タンパク質分泌発現に及ぼす影響はこれまでに知られていなかった。さらには、W302のような保存性が高いアミノ酸残基の変異が、異種タンパク質分泌量の向上をもたらすことを予測することは、容易にはできない困難なことであった。【０１９５】
実施例３：YDK010::phoS(W302C)株におけるCspBシグナル配列を用いた成熟CspBのN末端アミノ酸残基を融合したLiver-type fatty acid-binding protein（LFABP）の分泌発現
（１）CspBの成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基を融合したLiver-type Fatty acid-binding protein（LFABP）の分泌発現プラスミドの構築
ヒトのLiver-type fatty acid-binding protein（以下、LFABPと表記する）のアミノ酸配列は既に決定されている（Genbank Accession No. NP_001434）。このアミノ酸配列を<配列番号11>に示した。C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮し、LFABPをコードする塩基配列をデザインした。さらに、C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのシグナルペプチド30アミノ酸残基、同株由来のCspB成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基、FactorXaプロテアーゼの認識配列IEGR、およびLFABPの融合タンパク質（以下、CspB6Xa-LFABPと表記する）と、その融合タンパク質をコードする塩基配列をデザインした。デザインした融合タンパク質をコードする塩基配列を<配列番号12>に、融合タンパク質のアミノ酸配列を<配列番号13>に示した。【０１９６】
次に、<配列番号12>に記載のDNAの上流にC. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーターを繋げ、さらに5’-側と3’-側の両端にKpn Iサイトを付加した、CspB6Xa-LFABPの発現カセットを全合成した。全合成したDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、CspB6Xa-LFABPの分泌発現プラスミドであるpPK4_CspB6Xa-LFABPを構築した。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りのCspB6Xa-LFABPをコードする遺伝子が構築されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。【０１９７】
（２）CspBの成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基を融合したLiver-type Fatty acid-binding protein（LFABP）の分泌発現
実施例３（１）で構築した成熟CspBのN末端6アミノ酸残基およびFactorXaプロテアーゼ認識配列IEGRを融合したLFABPの分泌発現プラスミドであるpPK4_CspB6Xa-LFABPを用いて、WO2002/081694に記載のC. glutamicum YDK010株と、実施例１（３）で作製したYDK010::phoS(W302C)株のそれぞれを形質転換し、YDK010/pPK4_CspB6Xa-LFABP株とYDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6Xa-LFABP株を得た。【０１９８】
得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン 0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）で30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清6.5 μlを還元SDS-PAGEに供してからQuick-CBB（Wako Pure Chemical Industries）にて染色を行った。【０１９９】
その結果、YDK010::phoS(W302C)株では、YDK010株と比較して、CspB6Xa-LFABPの分子量を有するタンパク質を示すバンドが濃く検出され、CspB6Xa-LFABP分泌量が有意に向上している事が確認された（図３）。染色後、画像解析ソフトMulti Gauge（FUJIFILM）を用いてCspB6Xa-LFABPのバンド強度の数値化を行い、YDK010::phoS(W302C)株でCspB6Xa-LFABPを発現させた際のバンド強度の平均値を、YDK010株でCspB6Xa-LFABPを発現させた際のバンド強度の平均値を1とした時の相対値として算出した。その結果、YDK010::phoS(W302C)株では、YDK010株と比較して、CspB6Xa-LFABP分泌量が約1.9倍に向上していることが確認された（表２）。このことから、PhoS(W302C)変異は、CspB6Xa-LFABPの分泌においても、有意な分泌量向上をもたらす有効変異であることが分かった。【０２００】
【表２】
2016171224.tif 000004
【０２０１】
実施例４：YDK010::phoS(W302C)株におけるCspBシグナル配列を用いた成熟CspBのN末端アミノ酸残基を融合したExenatide前駆体（ExCP）の分泌発現
（１）CspBの成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基を融合したExenatide前駆体（ExCP）の分泌発現プラスミドの構築
生理活性ペプチドExenatideのアミノ酸配列は既に決定されている（Genbank Accession No. P26349）。活性型ExenatideはC末端がアミド化されたペプチドであるため、アミド化Exenatideの前駆体として、C末端にCys-Proを付加したExenatide前駆体（以下、ExCPと表記する）のアミノ酸配列を<配列番号14>に示した。C. glutamicumのコドン使用頻度を考慮し、ExCPをコードする塩基配列をデザインした。さらに、C. glutamicum ATCC13869株由来のCspBのシグナルペプチド30アミノ酸残基、同株由来のCspB成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基、ProTEVプロテアーゼの認識配列ENLYFQ、およびExCPの融合タンパク質（以下、CspB6TEV-ExCPと表記する）と、その融合タンパク質をコードする塩基配列をデザインした。デザインした融合タンパク質をコードする塩基配列を<配列番号15>に、融合タンパク質のアミノ酸配列を<配列番号16>に示した。【０２０２】
次に、<配列番号15>に記載のDNAの上流にC. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーターを繋げ、さらに5’-側と3’-側の両端にKpn Iサイトを付加した、CspB6TEV-ExCPの発現カセットを全合成した。全合成したDNA断片を制限酵素Kpn I処理後に、特開平9-322774に記載のpPK4のKpn I部位に挿入することによって、CspB6TEV-ExCPの分泌発現プラスミドであるpPK4_CspB6TEV-ExCPを構築した。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りのCspB6TEV-ExCPをコードする遺伝子が構築されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。【０２０３】
（２）CspBの成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基を融合したExenatide前駆体（ExCP）の分泌発現
実施例４（１）で構築した成熟CspBのN末端6アミノ酸残基およびProTEVプロテアーゼ認識配列を融合したExCPの分泌発現プラスミドであるpPK4_CspB6TEV-ExCPを用いて、WO2002/081694に記載のC. glutamicum YDK010株と、実施例１（３）で作製したYDK010::phoS(W302C)株のそれぞれを形質転換し、YDK010/pPK4_CspB6TEV-ExCP株とYDK010::phoS(W302C)/pPK4_CspB6TEV-ExCP株を得た。【０２０４】
得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン 0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）で30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清6.5 μlを還元SDS-PAGEに供してからQuick-CBB（Wako Pure Chemical Industries）にて染色を行った。【０２０５】
その結果、YDK010株ではCspB6TEV-ExCPの分子量を有するタンパク質を示すバンドがほとんど検出されなかったのに対して、YDK010::phoS(W302C)では、CspB6TEV-ExCPのバンドが濃く検出され、CspB6TEV-ExCP分泌量が有意に向上している事が確認された（図４）。また、各株によるCspB6TEV-ExCP分泌量を平均化し、「±」〜「＋＋＋」で表３に示した。このことから、PhoS(W302C)変異は、CspB6TEV-ExCP分泌においても、有意な分泌量向上をもたらす有効変異であることが分かった。【０２０６】
【表３】
2016171224.tif 000005
【０２０７】
実施例２〜４より、WO2013/062029に記載されているようにCspB融合法（成熟CspBのN末端アミノ酸残基を融合して異種タンパク質を発現する方法）でSec系分泌装置を利用して異種タンパク質を分泌発現する際、発現させるタンパク質の種類、融合させる成熟CspBのN末端アミノ酸残基の数、およびプロテアーゼ認識配列の種類によらず、PhoS(W302C)変異株を用いることによって、目的タンパク質の分泌発現量を有意に向上できることが分かった。【０２０８】
実施例５：PhoS(W302C)変異株におけるTorAシグナル配列を用いたプロトランスグルタミナーゼの分泌発現
（１）Tat系分泌装置をコードするtatABC遺伝子とTorAシグナル配列が付加されたプロトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子の共発現プラスミドの構築
（ａ）pPK4ベクター中のNae I認識サイトを改変したベクター（pPK5）の構築
特開平9-322774に記載のpPK4の中には、制限酵素Nae Iの認識配列が一ヵ所存在する。この配列を改変するため、Nae I認識配列gccggcをgcaggcに改変した配列とpPK4におけるその周辺配列を含む<配列番号17>および<配列番号18>に記載のプライマーを合成した。次に、pPK4を鋳型として、<配列番号17>と<配列番号18>のプライマーを用いて、約5.6 kbpのプラスミド全長をPCR法によって増幅した。PCR反応にはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は95℃ 5分、（95℃ 30秒、55℃ 1分、72℃ 12分）x 12cycleで行った。【０２０９】
次に、得られたPCR産物を制限酵素Dpn Iで処理し、メチル化されている鋳型DNAを消化した。Dpn I消化後に得られた非メチル化プラスミドを、E. coli JM109（Takara Bio）のコンピテントセルに導入し、プラスミドを取得した。塩基配列決定の結果、予想通りNae I認識サイトが改変されたプラスミドが構築されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。こうして得られた、pPK4ベクター中のNae I認識サイトを改変したベクターをpPK5と名付けた。【０２１０】
（ｂ）pPK5ベクターにtatABC遺伝子を搭載したベクター（pPK5-tatABC）の構築
次に、WO2005/103278に記載のTat系分泌装置の増幅プラスミドであるpVtatABCを鋳型にして、<配列番号19>と<配列番号20>のプライマーを用いて、tatABC遺伝子をコードする配列を含む約3.7 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号20>のプライマーには制限酵素Kpn IとApa Iの認識配列がデザインしてある。PCRにはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このDNA断片の末端をBKL Kit（Takara Bio）を用いてリン酸化し、別途Kpn I処理し、さらにBKL Kit (TakaraBio)を用いて平滑末端化し、さらにCIAP（Takara Bio）を用いて末端を脱リン酸化処理したpPK5ベクターに挿入することによって、tatABC遺伝子搭載ベクターであるpPK5-tatABCを構築した。ライゲーション反応にはDNA Ligation Kit Ver.2.1（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。
（ｃ）pPK5-tatABCベクター中のtatABC遺伝子内Kpn IおよびXba I認識サイトを改変したベクター（pPK6）の構築
（ｂ）で構築したpPK5-tatABCプラスミド中のtatABC遺伝子領域の中には、制限酵素Kpn IおよびXba Iの認識配列が1ヵ所ずつ存在する。これらの配列を改変するため、Kpn I認識配列ggtaccをggaaccに改変した配列とpPK5-tatABCにおけるその周辺配列を含む<配列番号21>および<配列番号22>に記載のプライマーと、Xba I認識配列tctagaをtgtagaに改変した配列とpPK5-tatABCにおけるその周辺配列を含む<配列番号23>および<配列番号24>に記載のプライマーを合成した。【０２１１】
まず、pPK5-tatABCを鋳型として、<配列番号21>と<配列番号22>のプライマーを用いて、tatABC遺伝子領域内のKpn I認識サイトを改変するよう約9.4 kbpのプラスミド全長をPCR法によって増幅した。PCR反応にはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は95℃ 5分、（95℃ 30秒、55℃ 1分、72℃ 12分）x 12cycleで行った。【０２１２】
次に、得られたPCR産物を制限酵素Dpn Iで処理し、メチル化されている鋳型DNAを消化した。Dpn I消化後に得られた非メチル化プラスミドを、E. coli JM109（Takara Bio）のコンピテントセルに導入し、プラスミドを取得した。こうしてtatABC遺伝子領域内のKpn I認識サイトを改変したベクターであるpPK5-tatABCΔKpn Iを構築した。【０２１３】
次に、pPK5-tatABCΔKpn Iを鋳型として、<配列番号23>と<配列番号24>のプライマーを用いて、tatABC遺伝子領域内のXba I認識サイトを改変するよう約9.4 kbpのプラスミド全長をPCR法によって増幅した。PCR反応にはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は95℃ 5分、（95℃ 30秒、55℃ 1分、72℃ 12分）x 12cycleで行った。【０２１４】
次に、得られたPCR産物を制限酵素Dpn Iで処理し、メチル化されている鋳型DNAを消化した。Dpn I消化後に得られた非メチル化プラスミドを、E. coli JM109（Takara Bio）のコンピテントセルに導入し、プラスミドを取得した。こうしてtatABC遺伝子領域内のXba I認識配列を改変したベクターであるpPK5-tatABCΔKpn IΔXba Iを取得した。塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が構築されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。【０２１５】
こうして得られた、pPK4ベクターを基にしたtatABC遺伝子搭載ベクターをpPK6と名付けた。pPK4からpPK6を構築した過程を図５に示した。Tat系によるタンパク質分泌発現において、TatABC分泌装置を増幅する場合、WO2005/103278に記載の方法では、目的タンパク質の分泌発現プラスミドと、Tat系分泌装置の増幅プラスミドであるpVtatABCの2つのプラスミドを用いる必要があったが、pPK6ベクターを用いることによって、目的タンパク質の発現と、TatABC分泌装置の増幅を、1プラスミドで実施することが可能となった。【０２１６】
（ｄ）pPK6ベクターにcspBプロモーターおよびTorAシグナル配列をコードするDNAを搭載したベクター（pPK6-TorAss）の構築
Appl. Environ. Microbiol., 72, 7183-7192(2006)に記載のpPTGFPを鋳型として、<配列番号25>と<配列番号26>のプライマーを用いて、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーター領域とE. coli由来のTorAシグナル配列をコードする塩基配列を含む約0.7 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号26>のプライマーには制限酵素Apa IとNae Iの認識配列がデザインしてある。PCRにはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このDNA断片を制限酵素Kpn IおよびApa Iで処理し、（ｃ）で作製したpPK6ベクターのKpn I-Apa I部位に挿入することによって、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーター領域とE. coli由来のTorAシグナル配列をコードする塩基配列を搭載したベクターであるpPK6-TorAssを得た。ライゲーション反応にはDNA Ligation Kit Ver.2.1（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が構築されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。【０２１７】
（ｅ）pPK6-TorAssベクターを用いたプロトランスグルタミナーゼ分泌発現用ベクターの構築
WO2001/23591に記載のプロトランスグルタミナーゼの分泌発現用ベクターpPKSPTG1を鋳型に、<配列番号27>と<配列番号28>のプライマーを用いて、プロトランスグルタミナーゼをコードする約1.1 kbpのDNA断片をPCR法によって増幅した。<配列番号28>のプライマーには制限酵素Xba Iの認識配列がデザインしてある。PCRにはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このDNA断片を制限酵素Xba Iで処理し、（ｄ）で構築したpPK6-TorAssベクターのNae I-Xba I部位に挿入することによって、TatABC分泌装置と、TorAシグナル配列が付加されたプロトランスグルタミナーゼの共発現ベクターであるpPK6_T_PTGを構築した。ライゲーション反応にはDNA Ligation Kit Ver.2.1（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。【０２１８】
（２）YDK010株およびYDK010::phoS(W302C)株におけるTorAシグナル配列を用いたプロトランスグルタミナーゼの分泌発現
実施例５（１）（ｅ）で得られたプロトランスグルタミナーゼ分泌発現プラスミドpPK6_T_PTGを用いて、WO2002/081694に記載のC. glutamicum YDK010株および実施例１（３）で得られたYDK010::phoS(W302C)株のそれぞれを形質転換し、YDK010/pPK6_T_PTG株およびYDK010::phoS(W302C)/pPK6_T_PTG株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5 μlを還元SDS-PAGEに供してからQuick-CBB（Wako Pure Chemical Industries）にて染色を行った。その結果、YDK010::phoS(W302C)株では、YDK010株と比較して、プロトランスグルタミナーゼ分泌量が顕著に向上していた（図６）。染色後、画像解析ソフトMulti Gauge（FUJIFILM）を用いてプロトランスグルタミナーゼのバンド強度の数値化を行い、YDK010::phoS(W302C)株でプロトランスグルタミナーゼを発現させた際のバンド強度の平均値を、YDK010株でプロトランスグルタミナーゼを発現させた際のバンド強度の平均値を1とした時の相対値として算出した。その結果、YDK010::phoS(W302C)株では、YDK010株と比較して、プロトランスグルタミナーゼ分泌量が約7.2倍に向上していることが確認された（表４）。このことから、PhoS(W302C)変異は、E. coli由来のTorAシグナル配列を用いたプロトランスグルタミナーゼ分泌においても、顕著な分泌量向上をもたらす有効変異であることが明らかとなった。【０２１９】
【表４】
2016171224.tif 000006
【０２２０】
実施例６：PhoS(W302C)変異株におけるTorAシグナル配列を用いたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼの分泌発現
（１）Tat系分泌装置をコードするtatABC遺伝子とTorAシグナル配列が付加されたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ発現遺伝子の共発現プラスミドの構築
WO2005/103278に記載のプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ発現プラスミドpPKT-PPGを鋳型とし、<配列番号29>と<配列番号30>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法によって、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーター領域、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたE. coli由来のTorAシグナルペプチドとChryseobacterium proteolyticum由来のプロ構造付きプロテイングルタミナーゼの融合タンパク質をコードする塩基配列を増幅した。<配列番号29>と<配列番号30>に記載の両プライマーにはいずれも制限酵素Xba Iの認識配列がデザインしてある。PCRにはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このDNA断片を制限酵素Xba Iで処理し、実施例５（１）で構築したpPK6ベクターのXba I部位に挿入することによって、TatABC分泌装置と、TorAシグナル配列が付加されたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼの共発現ベクターであるpPK6_T_PPGを構築した。ライゲーション反応にはDNA Ligation Kit <Mighty Mix>（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。【０２２１】
（２）YDK010株およびYDK010::phoS(W302C)株におけるTorAシグナル配列を用いたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼの分泌発現
実施例６（１）で得られたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ発現プラスミドpPK6_T_PPGを用いて、WO2002/081694に記載のC. glutamicum YDK010株および実施例１（３）で得られたYDK010::phoS(W302C)株のそれぞれを形質転換し、YDK010/pPK6_T_PPG株およびYDK010::PhoS(W302C)/pPK6_T_PPG株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5 μlを還元SDS-PAGEに供してからQuick-CBB（Wako Pure Chemical Industries）にて染色を行った。その結果、YDK010::phoS(W302C)株では、YDK010株と比較して、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼ分泌量が顕著に向上していた（図７）。染色後、画像解析ソフトMulti Gauge（FUJIFILM）を用いてプロ構造付きプロテイングルタミナーゼのバンド強度の数値化を行い、YDK010::phoS(W302C)株でプロ構造付きプロテイングルタミナーゼを発現させた際のバンド強度の平均値を、YDK010株でプロ構造付きプロテイングルタミナーゼを発現させた際のバンド強度の平均値を1とした時の相対値として算出した。その結果、YDK010::phoS(W302C)株では、YDK010株と比較して、プロ構造付きプロテイングルタミナーゼ分泌量が約8.3倍に向上していることが確認された（表５）。このことから、PhoS(W302C)変異は、E. coli由来のTorAシグナル配列を用いたプロ構造付きプロテイングルタミナーゼ分泌においても、顕著な分泌量向上をもたらす有効変異であることが明らかとなった。【０２２２】
【表５】
2016171224.tif 000007
【０２２３】
実施例７：PhoS(W302C)変異株におけるIMDシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼの分泌発現
（１）Tat系分泌装置をコードするtatABC遺伝子とイソマルトデキストラナーゼをコードする遺伝子の共発現プラスミドの構築
WO2005/103278に記載のイソマルトデキストラナーゼ発現プラスミドpPKI-IMDを鋳型とし、<配列番号29>と<配列番号31>に記載のDNAをプライマーとして用いたPCR法によって、C. glutamicum ATCC13869株由来のcspB遺伝子のプロモーター領域、同プロモーターの下流に発現可能に連結されたArthrobacter globiformis由来のIMD遺伝子配列（IMDシグナル配列のコード領域を含む）を増幅した。<配列番号29>と<配列番号31>に記載の両プライマーにはいずれも制限酵素Xba Iの認識配列がデザインしてある。PCRにはPrimeSTAR(R) GXL DNA Polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。このDNA断片を制限酵素Xba Iで処理し、実施例５（１）で構築したpPK6ベクターのXba I部位に挿入することによって、TatABC分泌装置と、IMDシグナル配列を含むイソマルトデキストラナーゼの共発現ベクターであるpPK6_I_IMDを構築した。ライゲーション反応にはDNA Ligation Kit <Mighty Mix>（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。【０２２４】
（２）YDK010株およびYDK010::phoS(W302C)株におけるIMDシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼの分泌発現
実施例７（１）で得られたイソマルトデキストラナーゼ発現プラスミドpPK6_I_IMDを用いて、WO2002/081694に記載のC. glutamicum YDK010株および実施例１（３）で得られたYDK010::phoS(W302C)株のそれぞれを形質転換し、YDK010/pPK6_I_IMD株およびYDK010::phoS(W302C)/pPK6_I_IMD株を得た。得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5 μlを還元SDS-PAGEに供してからQuick-CBB（Wako Pure Chemical Industries）にて染色を行った。その結果、YDK010::phoS(W302C)株では、YDK010株と比較して、イソマルトデキストラナーゼ分泌量が顕著に向上していた（図８）。染色後、画像解析ソフトMulti Gauge（FUJIFILM）を用いてイソマルトデキストラナーゼのバンド強度の数値化を行い、YDK010::phoS(W302C)株でイソマルトデキストラナーゼを発現させた際のバンド強度の平均値を、YDK010株でイソマルトデキストラナーゼを発現させた際のバンド強度の平均値を1とした時の相対値として算出した。その結果、YDK010::phoS(W302C)株では、YDK010株と比較して、イソマルトデキストラナーゼ分泌量が約6.6倍に向上していることが確認された（表６）。このことから、PhoS(W302C)変異は、A. globiformis由来のIMDシグナル配列を用いたイソマルトデキストラナーゼ分泌においても、顕著な分泌量向上をもたらす有効変異であることが明らかとなった。【０２２５】
【表６】
2016171224.tif 000008
【０２２６】
実施例５〜７より、WO2005/103278に記載されているようにTat系分泌装置を利用して異種タンパク質を分泌発現する際、発現させるタンパク質の種類、および利用するシグナル配列の種類によらず、PhoS(W302C)変異株を用いることによって、目的タンパク質の分泌発現量を有意に向上できることが分かった。【０２２７】
即ち、実施例２〜７より、利用する分泌経路の種類、利用するシグナル配列の種類、および発現させるタンパク質の種類の違いによらず、PhoS(W302C)変異株を用いることによって、異種タンパク質分泌量を有意に向上できることが分かった。【０２２８】
実施例８：phoS遺伝子のプラスミド増幅によるPhoS欠損株の機能相補
（１）野生型phoS遺伝子および変異型phoS(W302C)遺伝子の増幅プラスミドの構築
（ａ）野生型phoS遺伝子の増幅プラスミドの構築
<配列番号32>および<配列番号33>に記載のプライマーを用いて、PurEluteTM Genomic DNA Kit（EdgeBio）を用いて調製したC. glutamicum YDK010株の染色体DNAを鋳型として、野生型phoS遺伝子を含む約1.5 kbpの領域をPCR法によって増幅した。PCR反応にはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。【０２２９】
次に、増幅した約1.5 kbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的のバンドを切り出し、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いてゲルより回収した。回収したDNA断片を特開平9-070291に記載のpVC7ベクター（クロラムフェニコール耐性遺伝子を有する、大腸菌およびコリネ型細菌の両方で複製可能なシャトルベクター）のSma I部位にインフュージョン反応を用いて挿入することによって、野生型phoS遺伝子の増幅用プラスミドpVphoS(WT)を得た。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。【０２３０】
（ｂ）変異型phoS(W302C)遺伝子の増幅プラスミドの構築
同様に、<配列番号32>および<配列番号33>に記載のプライマーを用いて、PurEluteTMGenomic DNA Kit（EdgeBio）を用いて調製したC. glutamicum YDK010::phoS(W302C)株の染色体DNAを鋳型として、変異型phoS(W302C)遺伝子を含む約1.5 kbpの領域をPCR法によって増幅した。PCR反応にはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。【０２３１】
次に、増幅した約1.5 kbpのDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的のバンドを切り出し、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いてゲルより回収した。回収したDNA断片を特開平9-070291に記載のpVC7ベクターのSma I部位にインフュージョン反応を用いて挿入することによって、変異型phoS(W302C)遺伝子の増幅用プラスミドpVphoS(W302C)を得た。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が挿入されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。【０２３２】
（２）PhoS欠損株を用いたCspB50TEV-Teri分泌発現における野生型phoS遺伝子または変異型phoS(W302C)遺伝子の増幅効果
WO2014/126260に記載のpPKK50TEV-Teriと、実施例８（１）で構築したpVphoS(WT)またはpVphoS(W302C)を用いて、実施例１（５）で作成したYDK010ΔphoS株を形質転換した。また、対照として、特開平9-322774に記載のpPK4ベクターと、実施例８（１）で構築したpVphoS(WT)またはpVphoS(W302C)を用いて、実施例１（５）で作成したYDK010ΔphoS株を形質転換した。得られた各形質転換体を、6 mg/lのクロラムフェニコールと25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5 μlを還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange（Life Technologies）にて染色を行い、CspB50TEV-Teriの分泌量の比較を行った（図９）。また、一部の株について、CspB50TEV-Teri分泌量を「＋」〜「＋＋＋」で表７に示した。その結果、YDK010ΔphoS株にpVphoS(WT)を導入した場合は、YDK010株と同等のCspB50TEV-Teri分泌量が得られ、YDK010ΔphoS株にpVphoS(W302C)を導入した場合は、YDK010::phoS(W302C)株と同等のCspB50TEV-Teri分泌量が得られた（表７）。このことから、野生型および変異型のいずれについても、phoS遺伝子をプラスミドで増幅することによって、染色体上のphoS遺伝子の欠損を機能相補できることが分かった。したがって、変異型phoS遺伝子を発現させるプラスミドを利用することで、染色体上のphoS遺伝子を変異させた場合と同等の効果が得られることが分かった。【０２３３】
【表７】
2016171224.tif 000009
【０２３４】
実施例９：野生型PhoSタンパク質の302位のトリプトファン残基を任意のアミノ酸残基に改変した変異型PhoS(W302X)発現株を用いた異種タンパク質の分泌発現
（１）各種の変異型PhoS(W302X)タンパク質をコードする変異型phoS遺伝子の発現プラスミドの構築
野生型PhoSタンパク質の302位のトリプトファン残基（W302）を他のアミノ酸残基に置換した変異型PhoS(W302X)を発現させるためのプラスミドpVphoS(W302X)の構築を行った。「X」は、任意のアミノ酸残基を表す。【０２３５】
変異型PhoS(W302S)タンパク質発現用のプラスミドpVphoS(W302S)の構築においては、実施例８（１）で構築したpVphoS(WT)プラスミドを鋳型として、<配列番号32>および<配列番号34>のプライマーを用いてphoS遺伝子のN末端側を含む約0.9 kbpの領域を、<配列番号33>および<配列番号35>のプライマーを用いてphoS遺伝子のC末端側を含む約0.6 kbpの領域を、PCR法によってそれぞれ増幅した。<配列番号34>および<配列番号35>のプライマーは、PhoSタンパク質の302位のトリプトファン残基をコードするコドン（tgg）を、セリン残基をコードするコドン（tcc）に置換するようデザインした。PCR反応にはPyrobest(R) DNA polymerase（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。増幅したそれぞれのDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的のバンドを切り出し、Wizard(R) SV Gel and PCR Clean-Up System（Promega）を用いてゲルより回収した。回収した2つのDNA断片を、特開平9-070291に記載のpVC7ベクターのSma I部位にインフュージョン反応を用いて挿入することによって、変異型phoS(W302S)遺伝子の増幅用プラスミドpVphoS(W302C)を得た。インフュージョン反応にはIn-Fusion(R) HD Cloning Kit（Takara Bio）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。挿入断片の塩基配列決定の結果、予想通りの遺伝子が構築されていることを確認した。塩基配列の決定はBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）と3130 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて行った。【０２３６】
同様にして、変異型PhoS(W302A)タンパク質発現用プラスミドのpVphoS(W302A)、変異型PhoS(W302V)タンパク質発現用プラスミドのpVphoS(W302V)、変異型PhoS(W302M)タンパク質発現用のプラスミドpVphoS(W302M)、変異型PhoS(W302F)タンパク質発現用のプラスミドpVphoS(W302F)、変異型PhoS(W302Y)タンパク質発現用のプラスミドpVphoS(W302Y)、変異型PhoS(W302D)タンパク質発現のプラスミドpVphoS(W302D)、変異型PhoS(W302N)タンパク質発現用のプラスミドpVphoS(W302N)、変異型PhoS(W302H)発現用のプラスミドpVphoS(W302H)、および変異型PhoS(W302K)タンパク質発現用のプラスミドpVphoS(W302K)を構築することで、10種類の変異型PhoS(W302X)タンパク質発現用プラスミドを構築した。プラスミド構築時のPCRにおいて用いた、phoS遺伝子のN末端側を含む領域を増幅する際のプライマーセットおよびC末端側を含む領域を増幅する際のプライマーセットを表８に示した。【０２３７】
【表８】
2016171224.tif 000010
【０２３８】
（２）PhoS欠損株を用いたCspB50TEV-Teri分泌発現における各種の変異型PhoS(W302X)タンパク質の増幅効果
WO2014/126260に記載のpPKK50TEV-Teriと、実施例９（１）で構築した各種のpVphoS(W302X)プラスミドを用いて、実施例１（５）で作成したYDK010ΔphoS株を形質転換した。得られた各形質転換体を、6 mg/lのクロラムフェニコールと25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）でそれぞれ30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清5 μlを還元SDS-PAGEに供してからSYPRO Orange（Life Technologies）にて染色を行い、CspB50TEV-Teriの分泌量の比較を行った（図１０）。また、各株によるCspB50TEV-Teri分泌量を「＋」〜「＋＋＋」で表９に示した。その結果、野生型PhoSタンパク質と比較して、野生型PhoSタンパク質の302位のトリプトファン残基を芳香族アミノ酸及びヒスチジン以外のアミノ酸残基に置換した場合、システイン残基への置換と同様に、CspB50TEV-Teri分泌量が有意に向上することが分かった。尚、pVphoS(W302Y)導入株は、形質転換体を取得することができなかったため、CspB50TEV-Teri分泌量を評価することができなかった。【０２３９】
このことから、野生型PhoSタンパク質の302位のトリプトファン残基の変異は、システイン残基に変異させる場合に限られず、芳香族アミノ酸及びヒスチジン以外の任意のアミノ酸残基に変異させる場合にも、異種タンパク質分泌量を有意に向上できることが分かった。【０２４０】
【表９】
2016171224.tif 000011
【０２４１】
実施例１０： Corynebacterium glutamicum ATCC13869株におけるPhoS(W302C)変異株の構築と異種タンパク質の分泌発現
（１）C. glutamicum ATCC13869::phoS(W302C)株の構築
実施例１（２）で構築した、変異型phoS遺伝子置換用ベクターであるpBS5T-phoS(W302C)を用いて、C. glutamicum ATCC13869株を形質転換した。得られた形質転換体からWO2006/057450に記載の方法に従って菌株の選択を行い、染色体上の野生型phoS遺伝子が変異型phoS遺伝子に置換されたATCC13869::phoS(W302C)株を得た。【０２４２】
（２）C. glutamicum ATCC13869::phoS(W302C)株における、CspBの成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基を融合したExenatide前駆体（ExCP）の分泌発現
実施例４（１）で構築した成熟CspBのN末端6アミノ酸残基およびProTEVプロテアーゼ認識配列を融合したExCPの分泌発現プラスミドであるpPK4_CspB6TEV-ExCPを用いて、C. glutamicum ATCC13869株と、実施例１０（１）で作製したATCC13869::phoS(W302C)株のそれぞれを形質転換し、ATCC13869/pPK4_CspB6TEV-ExCP株とATCC13869::phoS(W302C)/pPK4_CspB6TEV-ExCP株を得た。【０２４３】
得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン 0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）で30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清6.5 μlを還元SDS-PAGEに供してからQuick-CBB（Wako Pure Chemical Industries）にて染色を行った。【０２４４】
その結果、YDK010株を遺伝的背景として用いた場合と同様に、ATCC13869株ではCspB6TEV-ExCPの分子量を有するタンパク質を示すバンドがほとんど検出されなかったのに対して、ATCC13869::phoS(W302C)では、CspB6TEV-ExCPのバンドが濃く検出され、CspB6TEV-ExCP分泌量が有意に向上している事が確認された（図１１）。このことから、PhoS(W302C)変異は、ATCC13869株を遺伝的背景とした場合においても、CspB6TEV-ExCPの有意な分泌量向上をもたらす有効変異であることが分かった。【０２４５】
実施例１１： Corynebacterium glutamicum ATCC13869::phoS(W302C)株におけるCspB欠損株の構築と異種タンパク質の分泌発現
（１）C. glutamicum ATCC13869::phoS(W302C)ΔcspB株の構築
WO2013/065869に記載のcspB遺伝子欠損用のベクターpBS5T-ΔcspBを用いて、実施例１０（１）で構築したATCC13869::phoS(W302C)を形質転換した。得られた形質転換体からWO2006/057450に記載の方法に従って菌株の選択を行い、cspB遺伝子が欠損したATCC13869::phoS(W302C)ΔcspB株を得た。【０２４６】
（２）C. glutamicum ATCC13869::phoS(W302C)ΔcspB株における、CspBの成熟タンパク質のN末端6アミノ酸残基を融合したLFABPの分泌発現
実施例３（１）で構築した成熟CspBのN末端6アミノ酸残基およびFactorXaプロテアーゼ認識配列IEGRを融合したLFABPの分泌発現プラスミドであるpPK4_CspB6Xa-LFABPを用いて、WO2013/065869に記載のC. glutamicum ATCC13869ΔcspB株と、実施例１１（１）で作製したATCC13869::phoS(W302C)ΔcspB株のそれぞれを形質転換し、ATCC13869ΔcspB/pPK4_CspB6Xa-LFABP株とATCC13869::phoS(W302C)ΔcspB/pPK4_CspB6Xa-LFABP株を得た。【０２４７】
得られた各形質転換体を、25 mg/lのカナマイシンを含むMMTG液体培地（グルコース 120 g、硫酸マグネシウム七水和物 3 g、硫酸アンモニウム 30 g、リン酸二水素カリウム 1.5 g、硫酸鉄七水和物 0.03 g、硫酸マンガン五水和物 0.03 g、チアミン塩酸塩 0.45 mg、ビオチン 0.45 mg、DL-メチオニン 0.15 g、大豆塩酸加水分解液（全窒素量 0.2 g）、炭酸カルシウム 50 g、水で1 LにしてpH7.0に調整）で30℃、72時間培養した。培養終了後、各培養液を遠心分離して得られた培養上清6.5 μlを還元SDS-PAGEに供してからQuick-CBB（Wako Pure Chemical Industries）にて染色を行った。【０２４８】
その結果、YDK010株を遺伝的背景として用いた場合と同様に、ATCC13869::phoS(W302C)ΔcspB株では、ATCC13869ΔcspB株と比較して、CspB6Xa-LFABPの分子量を有するタンパク質を示すバンドが安定して濃く検出され、CspB6Xa-LFABP分泌量が有意に向上している事が確認された（図１２）。このことから、PhoS(W302C)変異は、ATCC13869ΔcspB株を遺伝的背景とした場合においても、安定してCspB6Xa-LFABPの有意な分泌量向上をもたらす有効変異であることが分かった。【０２４９】
実施例１０〜１１より、ATCC13869株あるいはATCC13869ΔcspB株を遺伝的背景とした場合においても、PhoS(W302C)変異株を用いることによって、目的タンパク質の分泌発現量を有意に向上できることが分かった。【０２５０】
即ち、実施例２〜１１より、宿主株の遺伝的背景の違いによらず、PhoS(W302C)変異株を用いることによって、異種タンパク質分泌量を有意に向上できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０２５１】
本発明により、異種タンパク質を効率よく分泌生産することができる。【０２５２】
〔配列表の説明〕
配列番号１：C. glutamicum YDK0107の変異型phoS遺伝子の塩基配列
配列番号２：C. glutamicum YDK0107の変異型PhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３：C. glutamicum YDK010の野生型phoS遺伝子の塩基配列
配列番号４：C. glutamicum YDK010の野生型PhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５〜１０：プライマー
配列番号１１：LFABPのアミノ酸配列
配列番号１２：CspB6Xa-LFABPをコードする塩基配列
配列番号１３：CspB6Xa-LFABPのアミノ酸配列
配列番号１４：Exenatide前駆体のアミノ酸配列
配列番号１５：CspB6TEV-ExCPをコードする塩基配列
配列番号１６：CspB6TEV-ExCPのアミノ酸配列
配列番号１７〜５３：プライマー
配列番号５４：C. glutamicum ATCC 13032のPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５５：C. glutamicum ATCC 14067のPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５６：C. callunaeのPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５７：C. crenatumのPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５８：C. efficiensのPhoSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５９：C. glutamicum YDK0107のPhoSタンパク質のHisKAドメインのアミノ酸配列
配列番号６０：C. glutamicum YDK010のPhoSタンパク質のHisKAドメインのアミノ酸配列
配列番号６１：C. glutamicum ATCC 13869のPhoSタンパク質のHisKAドメインのアミノ酸配列
配列番号６２：C. glutamicum ATCC 13032のPhoSタンパク質のHisKAドメインのアミノ酸配列
配列番号６３：C. glutamicum ATCC 14067のPhoSタンパク質のHisKAドメインのアミノ酸配列
配列番号６４：C. callunaeのPhoSタンパク質のHisKAドメインのアミノ酸配列
配列番号６５：C. crenatumのPhoSタンパク質のHisKAドメインのアミノ酸配列
配列番号６６：C. efficiensのPhoSタンパク質のHisKAドメインのアミノ酸配列
配列番号６７：C. glutamicum ATCC 13869のcspB遺伝子の塩基配列
配列番号６８：C. glutamicum ATCC 13869のCspBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６９：C. glutamicum ATCC 13032のtatA遺伝子の塩基配列
配列番号７０：C. glutamicum ATCC 13032のTatAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７１：C. glutamicum ATCC 13032のtatB遺伝子の塩基配列
配列番号７２：C. glutamicum ATCC 13032のTatBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７３：C. glutamicum ATCC 13032のtatC遺伝子の塩基配列
配列番号７４：C. glutamicum ATCC 13032のTatCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７５：TorAシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号７６：SufIシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号７７：PhoDシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号７８：LipAシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号７９：IMDシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号８０、８１：ツイン・アルギニンモチーフのアミノ酸配列
配列番号８２：PS1シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号８３：PS2シグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号８４：SlpAシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号８５：C. glutamicum ATCC 13869のCspB成熟タンパク質のアミノ酸配列
配列番号８６〜９３：本発明で用いられる挿入配列の一態様のアミノ酸配列
配列番号９４：Factor Xaプロテアーゼの認識配列
配列番号９５：ProTEVプロテアーゼの認識配列
配列番号９６：C. glutamicum ATCC 13032のphoR遺伝子の塩基配列
配列番号９７：C. glutamicum ATCC 13032のPhoRタンパク質のアミノ酸配列
【図１】
2016171224.tif 000012
【図２】
2016171224.tif 000013
【図３】
2016171224.tif 000014
【図４】
2016171224.tif 000015
【図５】
2016171224.tif 000016
【図６】
2016171224.tif 000017
【図７】
2016171224.tif 000018
【図８】
2016171224.tif 000019
【図９】
2016171224.tif 000020
【図１０】
2016171224.tif 000021
【図１１】
2016171224.tif 000022
【図１２】
2016171224.tif 000023
【配列表】
2016171224000001.app
【国際調査報告】
2016171224.tif 000024
2016171224.tif 000025
2016171224.tif 000026
2016171224.tif 000027