(57)【要約】  最小限のアミノ酸付加で、高い環状化効率を実現し、元のタンパク質の生物学的特性を保持した、安定性の高い環状化変異タンパク質の製法を提供する。  元のタンパク質の立体構造情報からＮ／Ｃ末端の二次構造を形成しない領域を削除し、削除後の二次構造を形成する部分のＮ／Ｃ末端と、類似した二次構造部分を有するタンパク質をデータベースから検索する。検索の結果に基づき、元のタンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端を連結させるべきループ構造のアミノ酸長を決定する。決定されたアミノ酸長のループ構造を有する環状化変異タンパク質を作製する。
2016167291.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の三次元構造を有するタンパク質を、次の（ｉ）〜（ｖ）の工程を経て改変することを特徴とする、元のタンパク質の生物学的特性は低下せず、かつ元のタンパク質と比べて安定性が向上する、環状化変異タンパク質の製造方法：
（ｉ）当該タンパク質の立体構造情報を基に、当該タンパク質のＮ末端及びＣ末端における二次構造を形成しない領域を決定し、かつ、当該二次構造を形成しない領域を仮に取り除いた場合の、当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端を決定する工程、
（ｉｉ）前記二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端と、類似した二次構造部分を有するタンパク質を、タンパク質のデータベースから検索する工程、
（ｉｉｉ）検索の結果に基づいて、当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端とＣ末端とを連結させるべきループ構造のアミノ酸長を決定する工程、
（ｉｖ）決定されたアミノ酸長を有するループ構造により当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端とＣ末端とが連結された環状化変異タンパク質を得るための、環状化可能な直鎖状変異タンパク質を設計し、作製する工程、並びに、
（ｖ）化学的又は生物学的な手法により、当該直鎖状変異タンパク質のＮ末端とＣ末端とを連結させて環状化させ、環状化変異タンパク質を得る工程。
【請求項２】
工程(ｖ)の環状化に、スプリットインテインによるトランス-スプライシング反応を利用する、請求項１に記載の環状化変異タンパク質の製造方法。
【請求項３】
特定の三次元構造を有するタンパク質が、ヘリックスバンドル構造を有するサイトカインであり、元のタンパク質の生物学的特性が、受容体に対する親和性である、請求項１又は２に記載の環状化変異タンパク質の製造方法。
【請求項４】
特定の三次元構造を有するタンパク質が、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)である、請求項３に記載の環状化変異タンパク質の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、環状化変異タンパク質。
【請求項６】
特定の三次元構造を有するタンパク質のＮ末端及びＣ末端における二次構造を形成しない領域が削除され、かつ削除後の当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端に所定の個数のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなり、ここで前記所定の個数のアミノ酸残基は、当該二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端と類似した二次構造部分を有する、他のタンパク質の二次構造部分同士を連結しているアミノ酸の長さに対応した個数のアミノ酸残基である、環状化変異タンパク質。
【請求項７】
特定の三次元構造を有するタンパク質が、ヘリックスバンドル構造を有するサイトカインである、請求項６に記載の環状化変異タンパク質。
【請求項８】
特定の三次元構造を有するタンパク質が、配列番号１で示すアミノ酸配列からなる顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)であり、配列番号１で示すアミノ酸配列のＮ末端からアミノ酸残基が０〜１１のいずれかの個数削除され、同じくＣ末端から０〜３のいずれかの個数削除され、削除後のＮ末端及び／又はＣ末端にセリン又はシステイン残基が付加され、同じくＣ末端にプロリン以外のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなる、請求項６又は７に記載の環状化変異タンパク質。
【請求項９】
配列番号６〜９のいずれか一つに記載の環状化されたアミノ酸配列からなる、請求項６〜８のいずれか一項に記載の環状化変異タンパク質。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の環状化変異タンパク質を作製することを目的として設計された直鎖状変異タンパク質であって、当該直鎖状変異タンパク質は、特定の三次元構造を有するタンパク質のＮ末端及びＣ末端における二次構造を形成しない領域が削除され、かつ削除後の当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端に所定の個数のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなり、ここで前記所定の個数のアミノ酸残基は、当該二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端と類似した二次構造部分を有する、他のタンパク質の二次構造部分同士を連結しているアミノ酸の長さに対応した個数のアミノ酸残基であり、かつ付加された所定の個数のアミノ酸残基のうち、少なくとも最もＮ末端側及び最もＣ末端側のアミノ酸残基は当該直鎖状変異タンパク質の環状化を可能とするためのアミノ酸残基である、直鎖状変異タンパク質。
【請求項１１】
請求項９に記載の環状化変異タンパク質を作製することを目的として設計された、配列番号２〜５のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載の直鎖状変異タンパク質。
【請求項１２】
スプリットインテインとしてNostoc punctiforme由来のDnaEのDnaEインテイン‐Cと同インテイン‐Nを利用して請求項９に記載の環状化変異タンパク質を作製することを目的として設計された、配列番号１０〜１３のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項１０に記載の直鎖状変異タンパク質。
【請求項１３】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載の変異タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の形質転換体を用いて、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の変異タンパク質を製造する方法。
【請求項１７】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載の変異タンパク質を活性成分とすることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１８】
請求項５〜１２のいずれか一項に記載の変異タンパク質を活性成分とすることを特徴とする、好中球減少症治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療向けの生物学的に活性なタンパク質、好ましくはヘリックスバンドル型の高次構造を有するサイトカイン、さらに好ましくは顆粒球産出の促進や好中球の機能を高める作用がある顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、の新規改良型タンパク質、該タンパク質をコードする核酸、及びそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（医薬として用いる際のタンパク質の不安定性の問題点）
ヒトの治療のために投与される時、生物学的に活性なタンパク質は、多くの場合、望ましくない代謝半減期を有する。それらの固有の代謝半減期は、多くの場合、最適に満たない治療効能、服薬遵守の問題、並びに、患者の不便を招く投薬スケジュール及び投与計画を強いる。【０００３】
（従来の主要な安定性向上策と、その問題点）
ヒトの治療向けの生物学的に活性なタンパク質の製造において、代謝半減期の延長は、物理的手段(例えば、投与経路の変更、ナノ粒子カプセル化、及びリポソーム封入)、化学修飾(例えば、エマルジョン、PEG化、糖鎖付加)、並びに、遺伝子工学的修飾(例えば、アミノ酸置換、ヒト血清アルブミン融合、糖鎖翻訳後修飾の取り込み)を通じて試みられている(非特許文献１、非特許文献２)。しかしながら、そのようなアプローチは多くの場合、高価で、かつ、時間のかかる製造中の追加の加工を伴う。また、PEGはそれ自体に免疫原性があり、抗PEG抗体が産生されることによってPEG化タンパク質の薬剤効率の低下や、安全性の低下が生じることが指摘されている(非特許文献３)。【０００４】
（環状化による安定性向上の試みと、その問題点）
生物学的に活性なペプチドにおける代謝半減期の短さは、一般的に、タンパク質における場合よりも深刻である。直鎖状のペプチドを環状に閉じることで代謝半減期を延長することが試みられた(特許文献１、特許文献２)。従来記述されてきた環状化ペプチドを生成する種々の方法では、自然界に存在する環状化ペプチドを模倣して、生物学的方法と化学的方法とが組み合わされた。例えば、化学修飾もしくは遺伝子工学的修飾によって導入したシステイン残基を介してジスルフィド結合を生じさせる手法がある(特許文献１)。また別の技術では細胞内(例えばバクテリア)において直鎖状前駆体を生成し、次いで外因性の作用因子(例えば酵素)を添加し、直鎖状前駆体を化学的に環状化する。また別の技術では、遺伝子工学的修飾により細胞内(例えばバクテリア)で環状化ペプチドを生成する。例えば特許文献３に記述されているように、スプリットインテインのトランス-スプライシング能力を利用して、そのスプリットインテインの２つの部分間に介在する前駆体ペプチドを環状化する。
また、別の方法では、非天然アミノ酸や架橋剤分子を導入することで、化学的修飾を通して環状化ペプチドを生成する。例えばオレフィンメタセシス反応を用いて(S')-α-(2'-pentenyl) alanine同士を架橋させて、分子内でペプチドを環状化させる技術が知られている(特許文献４)。
以上で述べた環状化方法は、ペプチドだけでなく、タンパク質の代謝半減期を延長する方法としても用いられる。ペプチドと比較して化学合成的な加工に脆弱なタンパク質においては、遺伝子工学的修飾、もしくは、遺伝子工学的修飾と温和な条件における化学的修飾を組み合わせた手法が汎用される。しかしながら、これらのアプローチでは、いずれも環状化反応が進行する為に必要なアミノ酸配列や架橋剤を野生型のタンパク質に付加することが求められる。一般的に野生型のタンパク質にアミノ酸の置換、挿入を施すことは、タンパク質の物理的、生物的な特徴を擾乱することになるため、可能な限り野生型のアミノ酸から配列を変更せずに環状化反応を果たすことは重要である。
また、環状化反応の反応効率が十分でない場合、環状化タンパク質と未反応の直鎖状のタンパク質とを分離する、追加の精製工程が必要となる。環状化タンパク質と未反応の直鎖状タンパク質は、分子量、表面電荷といった点における差異が極めて小さく、その分離精製は容易ではない。一方、環状化反応の効率は、環状化反応に用いる外的因子(例えば酵素)の性質と、環状化させる目的タンパク質の性質とに依存し、その効率を高める普遍的な手法は確立されていない。【０００５】
（ヘリックスバンドル型の高次構造を有するサイトカインについて）
顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)やエリスロポエチン等のサイトカインは、ヒトの治療向けの生物学的に活性なタンパク質の中でも、早くから臨床応用されてきた。これらはヘリックスバンドル型の高次構造を有し、立体的な相同性が高い。高次構造の安定化を基盤として代謝半減期の延長を目指す際に、高次構造が相似のタンパク質は、類似の手法が有効である場合が多い(非特許文献４)。また、上記サイトカインは、ともにＮ末端とＣ末端が近接しているなど共通の構造的特徴を示す。【０００６】
（G-CSFについて）
顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)は、顆粒球造血幹細胞の分化誘導因子として発見された造血因子であり、生体内では好中球造血を促進することから、骨髄移植や癌化学療法後の好中球減少治療剤として臨床応用されている。G-CSFは多数の起源から取得及び精製できる。真核宿主細胞発現産物としてグリコシル化形態のG-CSF及び原核宿主細胞発現産物として非グリコシル化形態のG-CSFを商業規模の量で生産することが可能となった。例えば、前者は天然タンパク質と同一のアミノ酸174個のポリペプチド鎖として作製されるレノグラスチム、一方後者はＮ末端に追加されたメチオニル残基以外は天然タンパク質と同一のアミノ酸175個のポリペプチド鎖として作製されるフィルグラスチムが、治療用途のために数カ国で入手可能である(特許文献５、特許文献６)。フィルグラスチムが示すように、Ｎ末端のメチオニル基の付加、グリコシル化の欠損がG-CSFの機能に影響を与えないことは既知の事象である。それに加えて、Ｎ末端領域(1〜17残基)に位置するアミノ酸を置換もしくは欠損させた変異体や、Ｃ末端に12アミノ酸からなるペプチド配列を付加した変異体が、G-CSFの機能を保持していることを報告した例がある(非特許文献５、非特許文献６)。これらの報告例は、G-CSFのＮ末端、Ｃ末端が変異導入に寛容であることを示すものである。【０００７】
（G-CSFの安定性改良例）
G-CSFの代謝半減期を延長する為の種々の改変が報告されている。それらの改変は、遺伝子的にアミノ酸を置換し改変する手法、もしくは化学的にPEG等を付加する手法によってなされた(特許文献７、特許文献８)。例えば、前者は、Ｎ末端にある追加のメチオニル残基、ならびにThr2、Leu4、Gly5、Pro6、及びCys18の残基のAla、Thr、Tyr、Arg、及びSer各残基による置換が天然タンパク質と異なるアミノ酸175個のポリペプチド鎖として作製されるナルトグラスチム、後者はフィルグラスチムとモノメトキシポリエチレングリコールとの共役縮合体であるペグフィルグラスチムが、治療用途のために数カ国で入手可能である。フィルグラスチムのPEG化は一般的なPEG化と同様に、安定性の増大と活性の低下をもたらすことが示されている。例えば、代謝半減期はフィルグラスチムと比較して1.79時間から7.05時間へ増大することが示されており(特許文献７)、一方で活性はフィルグラスチムの68〜21％程度に低減することが示されている(特許文献８)。
上記に加えて、G-CSFのＮ末端、Ｃ末端が立体構造的に近接していることを利用して、環状化ポリペプチド鎖に改変する試みがなされ(特許文献９)、Ｎ末端に複数のGly残基、Ｃ末端にLeu、Pro、Xaa、Thr及びGlyを付加したG-CSFを発現、単離し、これに黄色ブドウ球菌由来ソルターゼＡを添加することで、試験管内で化学的に環状化ポリペプチド鎖を製造した例が報告されている(Xaaは任意のアミノ酸)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４,０３３,９４０号
【特許文献２】米国特許第４,１０２,８７７号
【特許文献３】米国特許第７,８４６,７１０号
【特許文献４】特表２００８−５０１６２３号
【特許文献５】米国特許第４,８１０,６４３号
【特許文献６】米国特許第５,１０４,６５１号
【特許文献７】米国特許第５,８２４,７７８号
【特許文献８】米国特許第５,９８５,２６５号
【特許文献９】米国特許第８,９４０,５０１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】B.I.Lord, L.B.Woolford, and G.Molineux, Clin. Cancer Res., 2001, 7, 2085-90.
【非特許文献２】P.van Der Auwera, E.Platzer, Z.X.Xu, R.Schulz, O.Feugeas, R.Capdeville, and D.J.Edwards, Am. J. Hematol., 2001, 66, 245-51.
【非特許文献３】Guidance for Industry “Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein2”, U.S. Departmemt of Health and Human Services, Food and Drug Administration, August 2014, 1-36
【非特許文献４】M.W.Popp, S.K.Dougan, T.Y.Chuang, E.Spooner, and H.L.Ploegh, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2011, 108, 3169-74.
【非特許文献５】T.Kuga, Y.Komatsu, M.Yamasaki, S.Sekine, H.Miyaji, T.Nishi, M.Sato, Y.Yokoo, M.Asano, M.Okabe, M.Morimoto, and S.Itoh, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, 159, 103-111.
【非特許文献６】Y.Oshima, A.Tojo, Y.Niho, and S.Asano, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, 267, 924-7.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、環状化タンパク質の生産における従来技術の問題点を解消することにある。
上述したように、環状化ペプチドや環状化タンパク質の生産において、いずれの場合も一旦直鎖状のポリペプチドを合成し、その後に化学的あるいは生物学的方法で環状化反応を行うことが共通している。この際、野生型のアミノ酸配列に環状化反応のための配列を付加することは、目的タンパク質の物理的、生物的特徴を予期せず変化させる可能性がある。また、環状化反応効率の低さのために直鎖状のポリペプチドが副生成物として混入すると、続く精製工程が一般的に困難になり、高純度の目的物が得られなくなる。
本発明は、環状化タンパク質の生産において、最小限のアミノ酸付加をもって、高い環状化反応効率を実現することができ、これにより、元のタンパク質の生物学的特性を保持し、かつ高純度の環状化タンパク質を得ることを可能にする製法を構築することを課題とする。
特に、医薬品として高安定改変体の開発が望まれているサイトカイン(例えばG-CSF)に最小限のアミノ酸付加を施して高純度環状化改変体を得る製法を構築すること、またその高純度環状化サイトカインを得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、環状化させるタンパク質の立体構造におけるＮ末端、Ｃ末端の近接度合が環状化効率を決定する要因であると考え、当該観点から末端配列に種々の改変を加えた環状化タンパク質を設計、合成した。
具体的には、上記観点で設計した新規な環状化サイトカイン群を製造し、環状化効率を比較した。また、精製した環状化サイトカイン群の機能と構造を精査し、直鎖状サイトカインと比較して同程度の機能と高い安定性を有することを示した。【００１２】
即ち、本出願は、以下の発明を提供するものである。
〈１〉特定の三次元構造を有するタンパク質を、次の（ｉ）〜（ｖ）の工程を経て改変することを特徴とする、元のタンパク質の生物学的特性は低下せず、かつ元のタンパク質と比べて安定性が向上する、環状化変異タンパク質の製造方法：
（ｉ）当該タンパク質の立体構造情報を基に、当該タンパク質のＮ末端及びＣ末端における二次構造を形成しない領域を決定し、かつ、当該二次構造を形成しない領域を仮に取り除いた場合の、当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端を決定する工程、
（ｉｉ）前記二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端と、類似した二次構造部分を有するタンパク質を、タンパク質のデータベースから検索する工程、
（ｉｉｉ）検索の結果に基づいて、当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端とＣ末端とを連結させるべきループ構造のアミノ酸長を決定する工程、
（ｉｖ）決定されたアミノ酸長を有するループ構造により当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端とＣ末端とが連結された環状化変異タンパク質を得るための、環状化可能な直鎖状変異タンパク質を設計し、作製する工程、並びに、
（ｖ）化学的又は生物学的な手法により、当該直鎖状変異タンパク質のＮ末端とＣ末端とを連結させて環状化させ、環状化変異タンパク質を得る工程。
〈２〉工程(ｖ)の環状化に、スプリットインテインによるトランス-スプライシング反応を利用する、〈１〉に記載の環状化変異タンパク質の製造方法。
〈３〉特定の三次元構造を有するタンパク質が、ヘリックスバンドル構造を有するサイトカインであり、元のタンパク質の生物学的特性が、受容体に対する親和性である、〈１〉又は〈２〉に記載の環状化変異タンパク質の製造方法。
〈４〉特定の三次元構造を有するタンパク質が、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)である、〈３〉に記載の環状化変異タンパク質の製造方法。
〈５〉〈１〉〜〈４〉のいずれかに記載の製造方法により製造された、環状化変異タンパク質。
〈６〉特定の三次元構造を有するタンパク質のＮ末端及びＣ末端における二次構造を形成しない領域が削除され、かつ削除後の当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端に所定の個数のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなり、ここで前記所定の個数のアミノ酸残基は、当該二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端と類似した二次構造部分を有する、他のタンパク質の二次構造部分同士を連結しているアミノ酸の長さに対応した個数のアミノ酸残基である、環状化変異タンパク質。
〈７〉特定の三次元構造を有するタンパク質が、ヘリックスバンドル構造を有するサイトカインである、〈６〉に記載の環状化変異タンパク質。
〈８〉特定の三次元構造を有するタンパク質が、配列番号１で示すアミノ酸配列からなる顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)であり、配列番号１で示すアミノ酸配列のＮ末端からアミノ酸残基が０〜１１のいずれかの個数削除され、同じくＣ末端から０〜３のいずれかの個数削除され、削除後のＮ末端及び／又はＣ末端にセリン又はシステイン残基が付加され、同じくＣ末端にプロリン以外のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなる、〈６〉又は〈７〉に記載の環状化変異タンパク質。
〈９〉配列番号６〜９のいずれか一つに記載の環状化されたアミノ酸配列からなる、〈６〉〜〈８〉のいずれかに記載の環状化変異タンパク質。
〈１０〉〈６〉〜〈９〉のいずれかに記載の環状化変異タンパク質を作製することを目的として設計された直鎖状変異タンパク質であって、当該直鎖状変異タンパク質は、特定の三次元構造を有するタンパク質のＮ末端及びＣ末端における二次構造を形成しない領域が削除され、かつ削除後の当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端に所定の個数のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなり、ここで前記所定の個数のアミノ酸残基は、当該二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端と類似した二次構造部分を有する、他のタンパク質の二次構造部分同士を連結しているアミノ酸の長さに対応した個数のアミノ酸残基であり、かつ付加された所定の個数のアミノ酸残基のうち、少なくとも最もＮ末端側及び最もＣ末端側のアミノ酸残基は当該直鎖状変異タンパク質の環状化を可能とするためのアミノ酸残基である、直鎖状変異タンパク質。
〈１１〉〈９〉に記載の環状化変異タンパク質を作製することを目的として設計された、配列番号２〜５のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなる、〈１０〉に記載の直鎖状変異タンパク質。
〈１２〉スプリットインテインとしてNostoc punctiforme由来のDnaEのDnaEインテイン‐Cと同インテイン‐Nを利用して〈９〉に記載の環状化変異タンパク質を作製することを目的として設計された、配列番号１０〜１３のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなる、〈１０〉に記載の直鎖状変異タンパク質。
〈１３〉〈５〉〜〈１２〉のいずれかに記載の変異タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸。
〈１４〉〈１３〉に記載の核酸を含有する組換えベクター。
〈１５〉〈１４〉に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
〈１６〉〈１５〉に記載の形質転換体を用いて、〈５〉〜〈１２〉のいずれかに記載の変異タンパク質を製造する方法。
〈１７〉〈５〉〜〈１２〉のいずれかに記載の変異タンパク質を活性成分とすることを特徴とする、医薬組成物。
〈１８〉〈５〉〜〈１２〉のいずれかに記載の変異タンパク質を活性成分とすることを特徴とする、好中球減少症治療用医薬組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明で具体的に開発したG-CSF(C177)は、直鎖型対照G-CSFに２アミノ酸のみを追加したアミノ酸配列から構成された環状化タンパク質である。また、G-CSF(C163)はＮ末端、Ｃ末端領域の非構造領域を排除した上で２アミノ酸のみを追加したアミノ酸配列から構成された環状化タンパク質である。また、G-CSF(C166)、G-CSF(C170)はＮ末端、Ｃ末端領域の非構造領域を排除した上でそれぞれ５、９アミノ酸残基を追加したアミノ酸配列から構成された環状化タンパク質である。
市販されるフィルグラスチム、及び直鎖型対照G-CSFと比較して、いずれも本来のレセプター結合活性を維持しつつ、熱安定性、タンパク質分解酵素に対する耐性が向上している。中でも、G-CSF(C163)、G-CSF(C166)、G-CSF(C170)は少ないアミノ酸付加で高い環状化効率を実現できた。
現在、G-CSFは癌化学療法による好中球減少症をはじめとして広く臨床応用されており、変異型G-CSF、化学修飾したG-CSFなど多様な戦略で安定性向上を図ったバイオベター医薬品の開発が進んでいる。中でも、ポリペプチド鎖を環状化する手法は、タンパク質としてのアミノ酸配列及び立体構造の変化を最小限に抑えて安定性向上を図る手法であり、免疫原性の上昇などの望まない性質変化を最小限に抑えうる手法であって、ヒトの治療に向けた生物学的に活性なタンパク質を製造する上で大きな利点を持つと考えられる。
本発明は、上述の現状にあって、環状化による安定性向上の最大の短所である、環状化反応に必要な配列の追加を最低限に抑え、さらに環状化反応効率の低さ、精製段階の煩雑さを解決するものであり、その技術発展に大いに貢献するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】フィルグラスチム及びその一部のアミノ酸を置換した直鎖型対照G-CSFと、設計した４種の環状化G-CSFのアミノ酸配列を比較したものである。最上段に示した模式図は、既知のG-CSF立体構造(PDBコード；2D9Q)を基にヘリックス形成領域を予測したものである。
【図２】インテインを利用した環状化G-CSFの合成スキームである。
【図３】環状化G-CSF改変体群(G-CSF(C177)、G-CSF(C163))の精製後のSDS-PAGEである。
【図４】環状化G-CSF改変体群(G-CSF(C177)、G-CSF(C163))のG-CSFレセプターに対する結合活性を表面プラズモン共鳴で測定したセンサグラムである。
【図５】環状化G-CSF改変体群(G-CSF(C177)、G-CSF(C163))の細胞活性を示したグラフである。
【図６】環状化G-CSF改変体群(G-CSF(C177)、G-CSF(C163))の熱安定性を二色性円偏光で測定したグラフである。
【図７】環状化G-CSF改変体群(G-CSF(C177)、G-CSF(C163))のプロテアーゼ耐性を反応後の残存量で評価したグラフである。
【図８】環状化G-CSF改変体群(G-CSF(C177)、G-CSF(C163))の環状化した末端領域を表すＸ線結晶構造解析により得られた当該領域の電子密度マップである。
【図９】環状化G-CSF改変体群のうちG-CSF(C170)、G-CSF(C166)のサイズ排除クロマトグラフィ精製後のSDS-PAGEである。
【図１０】環状化G-CSF改変体群のうちG-CSF(C170)、G-CSF(C166)、filgrastimのG-CSFレセプターに対する結合活性を表面プラズモン共鳴で測定したセンサグラム、および、直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)のG-CSFレセプターに対する結合活性を再測定したセンサグラムである。
【図１１】環状化G-CSF改変体群のうちG-CSF(C170)、G-CSF(C166)の熱安定性を二色性円偏光で測定したグラフ、および、直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)の熱安定性を再測定したグラフである。
【図１２】環状化G-CSF改変体群のうちG-CSF(C170)、G-CSF(C166)のプロテアーゼ耐性を反応後の残存量で評価したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（環状化変異タンパク質及びその製法）
本発明の製法では、特定の三次元構造を有するタンパク質を、以下の（ｉ）〜（ｖ）の工程を経て、環状化変異タンパク質に改変する。
（ｉ）当該タンパク質の立体構造情報を基に、当該タンパク質のＮ末端及びＣ末端における二次構造を形成しない領域を決定し、かつ、当該二次構造を形成しない領域を仮に取り除いた場合の、当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端を決定する工程、
（ｉｉ）前記二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端と、類似した二次構造部分を有するタンパク質を、タンパク質のデータベースから検索する工程、
（ｉｉｉ）検索の結果に基づいて、当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端とＣ末端とを連結させるべきループ構造のアミノ酸長を決定する工程、
（ｉｖ）決定されたアミノ酸長を有するループ構造により当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端とＣ末端とが連結された環状化変異タンパク質を得るための、環状化可能な直鎖状変異タンパク質を設計し、作製する工程、並びに、
（ｖ）化学的又は生物学的な手法により、当該直鎖状変異タンパク質のＮ末端とＣ末端とを連結させて環状化させ、環状化変異タンパク質を得る工程。
下記に、特定の三次元構造を有するタンパク質として顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)を使用した場合の環状化変異タンパク質の製法例を示すが、本発明の製法はこれに限定されず、様々なタンパク質の環状化に広く適用が可能である。本発明の製法は、アミノ酸配列が既知で、かつ立体構造（三次構造）が判明しているタンパク質であれば如何なるタンパク質の環状化にも適用が可能であり、中でも、環状化効率の観点からは、Ｎ末端とＣ末端とが立体構造的に近接しているタンパク質の環状化への適用が好ましい。また、G-CSFは三次構造としてヘリックスバンドル構造を有することが知られており、本発明の製法は、G-CSFと同じヘリックスバンドル構造を有するタンパク質（例えば、エリスロポエチン、インターフェロンα）の環状化に特に好適であると考えられる。当業者であれば、下記のG-CSFの環状化手法を参考に他のタンパク質についても同様な手法で本発明の製法による環状化を実施することができる。上記製法は最低限のアミノ酸の付加で高効率の環状化が可能であり、また上記製法により得られた環状化変異タンパク質は、元のタンパク質の二次構造が変動されていないため、元のタンパク質の生物学的特性が維持されており、かつ元のタンパク質と比較して安定性が向上しているという利点を有する。
【００１６】
（G-CSFの説明）
顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)は、顆粒球コロニー刺激因子レセプター(G-CSFレセプター)と結合し、好中球の産生などを誘導するサイトカインであり、癌化学療法などにおける好中球減少症の治療に用いられる。治療に対する有用性が高い一方で安定性の低さが問題点として挙げられており、その安定性を高める試みがなされてきた(参照文献１)。G-CSFのＮ末端とＣ末端はその三次元構造上近接していることが知られており、これを共有結合によって連結することで、熱安定性が上昇することが報告されている(参照文献２)。
本発明では、改良の出発点となる直鎖型対照G-CSFとして、配列番号１で示した175アミノ酸からなる直鎖状のポリペプチドを用いた。直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列は、フィルグラスチムのアミノ酸配列(配列番号１４)と比較して、2番目のスレオニン、18番目のシステインがそれぞれアラニン、セリンに置換されている。これらの変異がG-CSFの活性に影響を与えないことは、先行報告によって示されている(参照文献３)。
【００１７】
（本発明で開発した変異体の説明）
本発明で開発した改良型タンパク質は、上記の直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列をもとに人為的に設計したアミノ酸配列からなるものであって、G-CSFレセプター結合活性を損なうことなく、また最低限のアミノ酸の付加によって高効率に環状化した形体で製造されることを可能にする。
【００１８】
（本発明で開発した具体的変異体の配列）
本発明で設計、開発した４種類の改良型タンパク質は、以下に示される４種類のアミノ酸配列からなるポリペプチドから構成される(図１)。
G-CSF(C177)は、配列番号２で示した177アミノ酸からなるポリペプチドから構成され、配列番号６で示したようにＮ末端のセリンのアミノ基とＣ末端のグリシンのカルボニル基がペプチド結合によって連結されている。配列番号２のアミノ酸配列は、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列(配列番号１)のＮ末端にセリン、Ｃ末端にグリシンを付加した配列に相当する。
G-CSF(C170)は、配列番号３で示した170アミノ酸からなるポリペプチドから構成され、配列番号７で示したようにＮ末端のセリンのアミノ基とＣ末端のグリシンのカルボニル基がペプチド結合によって連結されている。配列番号３のアミノ酸配列は、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列(配列番号１)のＮ末端の4アミノ酸残基及びＣ末端の3アミノ酸残基を削除した上で、Ｎ末端にセリン、Ｃ末端にグリシンを付加した配列に相当する。
G-CSF(C166)は、配列番号４で示した166アミノ酸からなるポリペプチドから構成され、配列番号８で示したようにＮ末端のセリンのアミノ基とＣ末端のグリシンのカルボニル基がペプチド結合によって連結されている。配列番号４のアミノ酸配列は、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列(配列番号１)のＮ末端の8アミノ酸残基及びＣ末端の3アミノ酸残基を削除した上で、Ｎ末端にセリン、Ｃ末端にグリシンを付加した配列に相当する。
また、G-CSF(C163)は、配列番号５で示した163アミノ酸からなるポリペプチドから構成され、配列番号９で示したようにＮ末端のセリンのアミノ基とＣ末端のグリシンのカルボニル基がペプチド結合によって連結されている。配列番号５のアミノ酸配列は、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列(配列番号１)のＮ末端の11アミノ酸残基及びＣ末端の3アミノ酸残基を削除した上で、Ｎ末端にセリン、Ｃ末端にグリシンを付加した配列に相当する。
【００１９】
（環化反応のための、Ｎ末端、Ｃ末端へのアミノ酸付加について）
本発明においては、タンパク質を環状化するため、インテインタンパク質を用いた細胞内環状化反応を使用することができる。インテインタンパク質にはNostoc punctiforme由来のDnaEが使用可能であり、より具体的には配列番号１５、配列番号１６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるDnaE-C、DnaE-Nが使用可能である。このDnaE-C、DnaE-Nとの間に目的タンパク質を連結したポリペプチド鎖においては、DnaEの自己触媒能によって自発的にスプライシングが進行し、目的タンパク質のＮ末端のアミノ基とＣ末端のカルボニル基の間でペプチド結合が形成された環状化タンパク質が合成される(スプリットインテイン、図２参照)。
スプリットインテインを利用する場合、目的タンパク質のＮ末端かＣ末端のいずれかにシステインかセリンが必須であり、またＣ末端のプロリンは反応効率を著しく低下させる(参照文献６)。このため、本発明の上記改良型タンパク質の事例では、目的タンパク質のＮ末端にセリンを、また、Ｃ末端にグリシンを付加したが、Ｎ末端、Ｃ末端に使用可能なアミノ酸はこれに限られるものではなく、組み合わせの上では、これを加え78通りの配列が選択可能である。それらの配列の優劣を評価する場合には、合成、精製したタンパク質を比較する手法以外に、後述する既知立体構造のループ領域をモデル上で各配列に置換し、計算科学的に自由エネルギーを比較する手法などが可能である。
上記改良型G-CSFの事例において、本発明者らは、上記観点から、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列(配列番号１)のＮ末端にセリン、Ｃ末端にグリシンを付加した配列(配列番号２)を設計し、スプリットインテインを利用してG-CSF(C177)を作製した。G-CSF(C177)は、直鎖型対照G-CSFと匹敵するG-CSFレセプター結合活性を有し、細胞活性、熱安定性、プロテアーゼ耐性及び代謝半減期において、より優れた特性を示したが、環状化効率がやや低かった(表１参照)。
【００２０】
（元のタンパク質のＮ末端、Ｃ末端から取り除く配列の選定（上記工程（ｉ）））
タンパク質を改変し、元のタンパク質と同様の生物活性を有するものを得るためには、元のタンパク質の高次構造を損なわないことが重要であり、また、高い環状化効率を得るためには、改変したタンパク質のＮ末端とＣ末端がタンパク質の立体的構造において近接していることが重要と考えられる。
このような観点から改良型G-CSFを設計するために、本発明者らは、元のタンパク質のＮ末端配列、Ｃ末端配列において立体構造的に乱雑さの大きい領域を取り除くことを試みた。具体的には、既知のG-CSF立体構造モデルにおいて二次構造を形成している領域は強固な高次構造を有している領域と判断し、二次構造を有していない領域を乱雑さの大きい領域と判断した。より具体的には、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列(配列番号１)の1番目のメチオニンから11番目のプロリンまでの11アミノ酸、173番目のアラニンから175番目のプロリンまでの3アミノ酸は二次構造を形成しない領域と判断し、取り除いた。
立体構造モデルにおいて二次構造を形成している領域を判別するアルゴリズムは複数のものが報告されており(参照文献４、５)、特に二次構造の末端部位において判別結果が異なる場合が多い。よって採用するアルゴリズムの違いによって切断箇所の候補は複数が挙げられる。また、乱雑さの大きい領域を判別するために、分子動力学的な手法を用いて末端部位の構造変化を計算することも利用可能である。複数の方法で判別結果が異なる場合は、統計処理によりそれらの代表値を採用することが合理的である。代表値としては、最頻値(モード)が好ましい。結果が複数となる場合は、二次構造をとる領域が最も小さくなる値を採用する。
G-CSF以外のタンパク質についても、立体構造情報が判明しているタンパク質であれば、上記と同様にＮ末端及びＣ末端における二次構造を形成しない領域を決定し、仮にそれを取り除いたとした場合の、タンパク質のＮ末端及びＣ末端（二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端）を決定することができる。なお、本工程では実際にタンパク質から二次構造を形成しない領域を欠失変異等により取り除く必要はなく、あくまで設計思想上において、二次構造を形成しない領域を考慮に入れず、二次構造を形成する領域のみを考慮してＮ末端及びＣ末端を決定することで足りる。
【００２１】
（ループの設計）
末端の二次構造を有していない領域を取り除いた後のタンパク質の両末端はそれぞれ二次構造を有しているため、そのままではこれらを連結し、環状化することは困難と考えられる。そこで、本発明者らは、G-CSFのＮ末端配列、Ｃ末端配列から立体構造的に乱雑さの大きい領域を取り除いた後に、それぞれの末端に、環状化後にこれらの末端を連結する適切な長さのループを形成するためのアミノ酸残基(または配列)を付加した。なお、本明細書において、ループは、末端の二次構造を形成しない領域を取り除いた後のタンパク質の両末端（タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端とＣ末端）を繋ぐアミノ酸配列から構成される部分を指す。
適切なループの長さは、以下の手法により決定した。
【００２２】
（類似タンパク質の検索（上記工程（ｉｉ）））
まずデータベース上に登録されているタンパク質立体構造の中から、２本のヘリックスがループで繋がった「ヘリックス−ループ−ヘリックス」という二次構造を持つタンパク質群を抽出し、さらにG-CSFと構造類似性の高いタンパク質群を選抜した。具体的には、各ヘリックスのループを挟んだ内側4アミノ酸(計8アミノ酸)の部分が、G-CSFの両ヘリックス末端（二次構造を有していない領域を取り除いた後の、二次構造を形成する領域のＮ末端及びＣ末端）に位置する4アミノ酸(計8アミノ酸)の部分と構造的に類似している、ヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有するタンパク質群を抽出した。例えば、G-CSFと対象のタンパク質とを、両ヘリックス末端に位置する各4アミノ酸残基（α炭素原子）において重ねあわせた場合の平均二乗偏差が、例えば1.5Å未満、好ましくは1Å未満のものを、構造類似のタンパク質として抽出することができる。ただし、ここで比較対象とする両ヘリックス末端のアミノ酸残基の長さは4でなければならないことはなく、選別される構造類似のヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有するタンパク質群の個数の大小に応じて、例えば1〜10、好ましくは3〜6の範囲で調節してもよい。つまり、比較対象とする両ヘリックス末端のアミノ酸残基の長さが短いと、選別される構造類似のタンパク質群の個数は多くなり、長いと、選別される構造類似のタンパク質群の個数は少なくなる。そのため、選別される構造類似のタンパク質群の個数が所望の程度（例えば100個以内〜1000個以内、好ましくは50〜100個程度）となるように、比較対象とする両ヘリックス末端のアミノ酸残基の長さを適宜調節すればよい。データベースとしては、例えば、Protein Data Bank(PDB； http：//www.rcsb.org/)を利用することができる。データベースから抽出すべきタンパク質群の条件として、例えば、タンパク質立体構造の分解能の高さ（例えば3.0Å以上、好ましくは2.5Å以上のもの）を条件に加えてもよい。
G-CSF以外のタンパク質についても、上記のG-CSFの場合と同様にして、二次構造を形成する領域のＮ末端及びＣ末端と類似した二次構造部分を有するタンパク質を、データベースから検索することができる。
【００２３】
（ループ長の決定（上記工程（ｉｉｉ）））
次に、G-CSFと構造類似性が高いとして選別されたそれらのタンパク質群の持つループのアミノ酸残基数を分析した。その結果、アミノ酸残基数がそれぞれ２、５、９のループが多く観察された（２アミノ酸残基が全体の２２％、５アミノ酸残基が全体の２６％、９アミノ酸残基が全体の１６％）。以上をもって、G-CSFにおいてはＮ末端、Ｃ末端の非構造領域を取り除いた後に2アミノ酸を付加するという手順で、最小サイズの環状化改変体を構築できると予測した。更に、5、9アミノ酸付加によっても安定な環状化改変体を構築できると予測した。
G-CSF以外のタンパク質についても、検索の結果として得られた、類似した二次構造部分を有するタンパク質の当該二次構造部分同士を連結しているアミノ酸の長さに対応させて、当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端とＣ末端とを連結させるべきループ構造のアミノ酸長を決定することができる。具体的には、検索の結果、構造類似性が高いとされた類似タンパク質群において二次構造部分同士を連結しているアミノ酸の長さを確認し、それらの中でも頻度の高いアミノ酸の長さを、環状化したいタンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端とＣ末端とを連結させるべきループ構造のアミノ酸長（ループ長）として決定する。ここで、ループ長として選択すべきアミノ酸の長さの頻度の高さとしては、例えば、選別されたタンパク質群の１０％以上、好ましくは１５％以上において観察された、二次構造部分同士を連結しているアミノ酸の長さを選択することができる。頻度の高いアミノ酸長が複数得られた場合は、その中からいずれかのアミノ酸長を選択すればよい。ループ構造のアミノ酸長は、最小サイズの環状化改変体を構築する目的では短いことが好ましいが、必ずしも短ければよいわけではなく、安定性や環状化効率の観点から、適切な長さを選択することが望ましい。上記の工程により、タンパク質の二次構造を形成する領域の構造は変化させずに、そのＮ末端及びＣ末端を繋ぐための最適なループ長を決定することができる。
【００２４】
（直鎖状変異タンパク質の設計及び環状化（上記工程（ｉｖ）及び（ｖ））
上記の予測に基づき、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列(配列番号１)のＮ末端の11アミノ酸残基及びＣ末端の3アミノ酸残基（二次構造を形成しない領域）を削除した上で、Ｎ末端にセリン、Ｃ末端にグリシン（計２アミノ酸残基）を付加した配列(配列番号５)を設計し、次いでスプリットインテインを利用して、ループ長が２アミノ酸であるG-CSF(C163)を作製した。G-CSF(C163)は、直鎖型対照G-CSFと匹敵するG-CSFレセプター結合活性を有し、細胞活性、熱安定性、プロテアーゼ耐性及び代謝半減期については、G-CSF(C177)よりも若干劣るものの、高い環状化効率(100％)を示した(表１参照)。
これらの結果から、G-CSF(C163)よりも長くG-CSF(C177)よりも短いアミノ酸配列を有する任意の環状化改変体も、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)と同様の好ましい特性を有することが予測できる。特に、ループ長が9アミノ酸、5アミノ酸に調節された改変体は、直鎖型対照G-CSFの構造を維持しながら、環状化反応効率の向上、安定性の向上が果たされている可能性が高い。
ループを構成するアミノ酸の種類を決定する上では、環状化に用いる手法に応じて利用可能な配列が制限される。例えばスプリットインテインを利用する場合は、上述のとおり、目的タンパク質のＮ末端かＣ末端のいずれかにシステインかセリンが必須であり、またＣ末端のプロリンは反応効率を著しく低下させる(参照文献６)ことから、環状化後にループを形成するために付加されるアミノ酸残基(又はアミノ酸配列の末端の残基)は、Ｎ末端かＣ末端のいずれかがシステイン又はセリンであり、Ｃ末端はプロリンでないことが必要とされる。
【００２５】
（ループの改良）
上記の予測に基づき、更に、ループ長が９アミノ酸または５アミノ酸に調節された改変体を作製した。スプリットインテインを利用した環状化に必要なアミノ酸残基であるN末端、C末端のセリン、グリシンを除く７アミノ酸、３アミノ酸は、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列が可能な限り維持されるように設計した。即ち、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列（配列番号1）のN末端の4アミノ酸残基及びC末端の3アミノ酸残基を削除した上で、N末端にセリン、C末端にグリシンを付加した配列（配列番号3）を設計し、スプリットインテインを利用して、ループ長が９アミノ酸のG-CSF(C170)を作製した。同様に、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列（配列番号1）のN末端の８アミノ酸残基及びC末端の3アミノ酸残基を削除した上で、N末端にセリン、C末端にグリシンを付加した配列（配列番号４）を設計し、スプリットインテインを利用して、ループ長が５アミノ酸のG-CSF(C166)を作製した。
G-CSF(C170)、G-CSF(C166)はともに、直鎖型対照G-CSFと匹敵するG-CSFレセプター結合活性を有し、G-CSF(C177)を越える熱安定性を有していた。また、環状化効率はG-CSF(C163)と比べると同等もしくは若干劣るものの、G-CSF（C177）と比べると顕著に向上していた（表3参照）。特に、G-CSF(C166)の熱安定性は他の改変体と比較して著しく向上しており、G-CSFの構造安定化に最適なループ長であると見なせる。
これらの結果から、G-CSF(C163)よりも長くG-CSF(C177)よりも短いアミノ酸配列を有する任意の環状化改変体、すなわち、配列番号１で示すアミノ酸配列のＮ末端からアミノ酸残基が０〜１１、好ましくは１〜１１のいずれかの個数削除され、同じくＣ末端から０〜３、好ましくは１〜３のいずれかの個数削除され、削除後のＮ末端及び／又はＣ末端にセリン又はシステイン残基が付加され、同じくＣ末端にプロリン以外のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるG-CSF環状化改変体も、同様に好ましい特性を有することが予測できる。
【００２６】
G-CSF以外のタンパク質についても、決定されたアミノ酸長を有するループ構造で当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端とＣ末端とが連結された環状化変異タンパク質を得るために、環状化可能な直鎖状変異タンパク質を設計、作製し、次いで直鎖状変異タンパク質のＮ末端とＣ末端とを連結させて環状化させて、環状化変異タンパク質を得ることができる。
直鎖状変異タンパク質の設計の際は、ループ構造を形成するためのアミノ酸配列の一部が、元のタンパク質の二次構造を形成する部分のアミノ酸配列のＮ末端に付加され、残りがＣ末端に付加されるように設計する。Ｎ末端に付加されるアミノ酸残基数とＣ末端に付加されるアミノ酸残基数との合計が、上記で決定されたループ構造のアミノ酸長となるようにすればよい。好ましくは、元のタンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端、Ｃ末端にそれぞれ１以上のアミノ酸残基が付加されるように設計することが好ましい。
ここで、ループ構造を形成するためのアミノ酸配列は、好ましくは、上記工程（ｉ）において設計思想上取り除いた二次構造を形成しない領域のアミノ酸配列を、必要なアミノ酸長分、戻したアミノ酸配列となるように設計する。すなわち、ループ構造部分のアミノ酸配列は、元のタンパク質のアミノ酸配列をできる限り維持するように設計することが好ましい。得られた環状化変異タンパク質を医薬組成物として使用する観点からは、本来のタンパク質構造と可能な限り同じ立体構造を有するように設計することが望ましいからである。
ただし、直鎖状変異タンパク質の少なくとも最もＮ末端側及び最もＣ末端側のアミノ酸残基は、環状化に必要なアミノ酸残基を該当させることが必要である。上記のように、環状化にスプリットインテインを利用する場合は、最もＮ末端か最もＣ末端のいずれかをシステイン又はセリンとし、最もＣ末端はプロリン以外のアミノ酸残基とする。
従ってこの場合、元のタンパク質の二次構造を形成しない領域のアミノ酸配列をそのまま維持した部分のアミノ酸長と、環状化のために必要なアミノ酸残基数（スプリットインテインを利用する場合は最もＮ末端側及び最もＣ末端側の計２アミノ酸残基）とを足し合わせたアミノ酸長が、上記で決定したループ構造のアミノ酸長となるように設計すればよい。
言い換えれば、上記製法により得られる直鎖状変異タンパク質又は環状化変異タンパク質は、好ましくは、元のタンパク質のＮ末端側及びＣ末端側の各々から、二次構造を形成しない領域の一部を所定のアミノ酸残基数分削除し、削除後に、環状化のために必要なアミノ酸残基をＮ末端及びＣ末端の各々に付加したアミノ酸配列を有していると言うことができる。この結果、元のタンパク質の立体構造は可能な限り維持され、かつ最小限のアミノ酸付加で環状化効率の向上を達成することができる。
【００２７】
（その他の環状化の手法について）
環状化の手法としてインテイン以外を用いる場合、ループ配列の設計における条件が異なる。例えば、ジスルフィド結合を利用して環状化する場合、Ｎ末端、Ｃ末端にシステインを付加することとなる。また、ソルターゼによるイソペプチド結合の形成を利用して環状化する場合、利用するソルターゼの基質特異性に適したアミノ酸配列を持ったループを設計することが必須となる。具体的には、黄色ブドウ球菌由来ソルターゼＡを利用する場合、Ｎ末端に複数のGly残基、Ｃ末端にLeu、Pro、Xaa、Thr及びGlyを付加した配列をもってループ領域とする必要がある(Xaaは任意のアミノ酸)。
【００２８】
（改良型タンパク質の製造）
（１）遺伝子工学的手法による改良型タンパク質の製造
ａ．改良型タンパク質をコードする遺伝子
本発明においては、上記設計された改良型タンパク質を製造するため、遺伝子工学的方法を使用することできる。
このような方法に使用する遺伝子は、例えば上述の改良型G-CSFの具体的事例においては、上述の配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする核酸からなるものであるが、これらと同様のG-CSFレセプター結合活性を有するタンパク質をコードする核酸からなるものであれば、これらに限られるものではない。
例えば、上記配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５で示されるアミノ酸配列中の、上述の環化反応のためにＮ末端及びＣ末端に付加されたアミノ酸残基以外の部位において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、かつG-CSFレセプターに結合活性を有するタンパク質をコードする核酸や、当該アミノ酸配列において、Ｎ末端かＣ末端のいずれかがシステインかセリンに変更され、またＣ末端がプロリン以外のアミノ酸に変更されたタンパク質をコードする核酸からなるものであってもよい。
このような遺伝子としては、例えば、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０で示される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
また、本発明において使用する遺伝子としては、当該配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列から上述の環化反応のためにＮ末端及びＣ末端に付加されたアミノ酸残基をコードする部分を除いた核酸と相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつG-CSFレセプターに結合活性を有するタンパク質をコードする核酸の、Ｎ末端及びＣ末端のいずれかにシステイン又はセリンをコードする核酸を付加し、Ｃ末端にプロリン以外のアミノ酸をコードする核酸を付加した遺伝子もあげられる。ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性(相同性が60％以上、好ましくは80％以上)を有する核酸がハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が150〜900mM、好ましくは600〜900mMであり、温度が60〜68℃、好ましくは65℃での条件をいう。例えばハイブリダイゼーション条件が65℃であり、洗浄の条件が0.1％SDSを含む0.1×SSC中で65℃、10分の場合に、慣例的な手法、例えばサザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーションなどによってハイブリダイズすることが確認された場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするといえる。
【００２９】
以上に加えて、環状化反応のために使用する遺伝子は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５で示されるアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端に配列番号１５、配列番号１６で示される２つのアミノ酸配列が連結したアミノ酸配列(配列番号１０、１１、１２、１３)を有するか、あるいは配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５で示されるアミノ酸配列に上述の変更が加えられたアミノ酸配列、若しくは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする核酸の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸に上述の加工が施された核酸によってコードされるアミノ酸配列を有し、かつG-CSFレセプターに結合活性を有するタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端に配列番号１５、配列番号１６で示される２つのアミノ酸配列が連結したアミノ酸配列を有し、自己触媒的に配列番号１５、配列番号１６に挟まれたアミノ酸配列を環状化する機能を有するタンパク質をコードする核酸からなるものである。
このような遺伝子としては、例えば、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４で示される塩基配列からなる核酸が挙げられる。
【００３０】
ｂ．遺伝子、組換えベクターおよび形質転換体の作製
前記した本発明の遺伝子は、化学合成、PCR、カセット変異法、部位特異的変異導入法などにより合成することができる。たとえば、末端に20塩基対程度の相補領域を有する100塩基程度までのオリゴヌクレオチドを複数、化学合成し、これらを組み合わせてオーバーラップ伸長法(参照文献７)を行うことにより目的の遺伝子を全合成することができる。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに上記の塩基配列を含む遺伝子を連結(挿入)することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主中で複製可能なもの又は目的の遺伝子を宿主ゲノムに組み込み可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。
【００３１】
プラスミドDNAとしては、放線菌由来のプラスミド(例えばpK4，pRK401，pRF31等)、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322，pBR325，pUC118，pUC119，pUC18等)、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110，pTP5等)、酵母由来のプラスミド(例えばYEp13，YEp24，YCp50等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ(λgt10、λgt11、λZAP等)が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
ベクターに遺伝子を挿入するには、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。遺伝子は、本発明の改良型タンパク質が発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、遺伝子の塩基配列のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列(SD配列)、開始コドン、終止コドンなどを連結することができる。また、製造するタンパク質の精製を容易にするためのタグ配列を連結することもできる。タグ配列としては、Hisタグ、GSTタグ、MBPタグなどの公知のタグをコードする塩基配列を利用することができる。
【００３２】
遺伝子がベクターに挿入されたか否かの確認は、公知の遺伝子工学技術を利用して行うことができる。たとえば、プラスミドベクターなどの場合、コンピテントセルを用いてベクターをサブクローニングし、DNAを抽出後、DNAシーケンサーを用いてその塩基配列を特定することで確認できる。他のベクターについても細菌あるいは他の宿主を用いてサブクローニング可能なものは、同様の手法が利用できる。また、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを利用したベクター選別も有効である。
形質転換体は、本発明の組換えベクターを、本発明の改良型タンパク質が発現し得るように宿主細胞に導入することにより得ることができる。形質転換に使用する宿主としては、タンパク質又はポリペプチドを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌(大腸菌、枯草菌等)、酵母、植物細胞、動物細胞(COS細胞、CHO細胞等)、昆虫細胞が挙げられる。
【００３３】
細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、開始コドン、本発明の改良型タンパク質をコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ(Escherichia coli)DH5αなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００３４】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
遺伝子が宿主に導入されたか否かの確認は、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からDNAを調製し、DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。ついで、PCRの増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SyberGreen液等により染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。
【００３５】
ｃ．形質転換体培養による改良型タンパク質の取得
組換えタンパク質として製造する場合、本発明の改良型タンパク質は、上述の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００３６】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、20〜37℃で12時間〜3日間行う。
【００３７】
培養後、本発明の改良型タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより該タンパク質を採取する。また、該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明の改良型タンパク質を単離精製することができる。
また、タンパク質の生合成反応にかかわる因子(酵素、核酸、ATP、アミノ酸など)のみを混合させた、いわゆる無細胞合成系を利用すると、生細胞を用いることなく、ベクターから本発明の改良型タンパク質を試験管内で合成することができる(参照文献８)。その後、前記と同様の精製法を用いて、反応後の混合溶液から本発明の改良型タンパク質を単離精製することができる。
単離精製した本発明の改良型タンパク質が、目的通りのアミノ酸配列からなるタンパク質であるかを確認するため、該タンパク質を含む試料を分析する。分析方法としては、SDS-PAGE、ウエスタンブロッティング、質量分析、アミノ酸分析、アミノ酸シーケンサーなどを利用することができる(参照文献９)。
【００３８】
（２）他の手法による改良型タンパク質の製造
本発明の改良型タンパク質は、有機化学的手法、例えば固相ペプチド合成法などによっても製造することができる。このような手法を利用したタンパク質の生産方法は当技術分野で周知であり、以下に簡潔に説明する。
固相ペプチド合成法により化学的にタンパク質を製造する場合、好ましくは自動合成機を利用して、活性化されたアミノ酸誘導体の重縮合反応を繰り返すことにより、本発明の改良型タンパク質のアミノ酸配列を有する保護ポリペプチドを樹脂上で合成する。ついで、この保護ポリペプチドを樹脂上から切断すると共に側鎖の保護基も同時に切断する。この切断反応には、樹脂や保護基の種類、アミノ酸の組成に応じて適切なカクテルがあることが知られている(参照文献１０)。この後、有機溶媒層から粗精製タンパク質を水層に移し、目的の変異型タンパク質を精製する。精製法としては、逆相クロマトグラフィー等を利用することができる(参照文献１０)。
【００３９】
（改良型タンパク質の性能確認試験）
上記のようにして製造された改良型タンパク質は、以下の性能確認試験を行い良好なものを選択することができるが、本発明の改良型タンパク質はいずれも良好な性能を有していた。
【００４０】
（１）G-CSFレセプター結合性試験
本発明の改良型タンパク質のG-CSFレセプター結合性は、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、プルダウンアッセイ、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)、表面プラズモン共鳴(SPR)法などを利用して確認・評価することができる。中でもSPR法は、生体間の相互作用をラベルなしでリアルタイムに経時的に観察することが可能であることから、改良型タンパク質の結合反応を速度論的観点から定量的に評価することができる。
【００４１】
（２）改良型タンパク質の細胞活性試験
本発明の改良型タンパク質の細胞活性はG-CSF依存性培養細胞(NFS-60)の増殖能を指標として評価できる。NFS-60はG-CSF依存性増殖を示す細胞株であり、NIBSCの製造するG-CSF標準品をはじめ、G-CSFの生物活性測定に汎用される細胞株であることから、改良型タンパク質の細胞活性を評価する上で適切な細胞株である。
【００４２】
（３）改良型タンパク質の熱安定性試験
本発明の改良型タンパク質の熱安定性は、円偏光二色性(CD)スペクトル、蛍光スペクトル、赤外分光法、示差走査熱量測定法、加熱後の残留活性などを利用して評価することができる。中でもCDスペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることから、改良型タンパク質の温度に対する立体構造の変化を観測し、構造安定性を熱力学的に定量的に評価することができる。
【００４３】
（４）改良型タンパク質のタンパク質分解酵素に対する安定性試験
本発明の改良型タンパク質のタンパク質分解酵素に対する安定性は、カルボキシペプチダーゼＹなどのタンパク質分解酵素と改良型タンパク質を混合し、反応にて生じる分解物の量あるいは未反応の残留物の量をSDS-PAGE、液体クロマトグラフィーなどを用いて経時的に分析することなどにより評価することができる。中でも、SDS-PAGEによる分析は簡便かつ微量のタンパク質で行うことができることから改良型タンパク質のタンパク質分解酵素に対する安定性を評価するうえで適切な方法である。
【００４４】
（５）改良型タンパク質の生体中における安定性試験
本発明の改良型タンパク質の生体中における安定性は、ラットに改良型タンパク質を静脈から注射し、血液中に存在するG-CSF濃度をELISA、SDS-PAGE、液体クロマトグラフィーなどを用いて経時的に分析することなどにより評価することができる。中でも、ELISAによる分析は、血清成分が混在する試料においても簡便かつ高精度に微量のG-CSFを定量できることから、生体中における安定性を評価するうえで適切な方法である。
【００４５】
（６）改良型タンパク質の立体構造解析
本発明の改良型タンパク質の立体構造は、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴法などによって評価できる。中でもＸ線結晶構造解析は高分解能の回折像を分析することで、環状化した末端領域の立体構造を含む局所構造を詳細に観察することが可能であり、改良型タンパク質の立体構造を評価するうえで適切な方法である。
【実施例】
【００４６】
実施例１．改良型G-CSF の設計
（１）本発明では、改良の出発点となる直鎖型対照G-CSFを次のように定義する。即ち、配列番号１で示した175アミノ酸からなる直鎖状のポリペプチドである。直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列は、フィルグラスチムのアミノ酸配列(配列番号１４)と比較して、2番目のスレオニン、18番目のシステインがそれぞれアラニン、セリンに置換されている。これらの変異がG-CSFの活性に影響を与えないことは、先行報告によって示されている(参照文献３)。
（２）目的のポリペプチドがインテインの触媒機能によって環状化するためには、Ｎ末端、Ｃ末端のうち少なくとも1残基がセリンもしくはシステインであることが必要である。またＣ末端がプロリンの場合、反応は進行しないことが知られている。そこで、最少の変異導入でインテイン反応が進行するように改変した変異体として、直鎖型対照G-CSFのＮ末端とＣ末端にそれぞれセリンとグリシンを付加した配列を設計し、G-CSF(C177)とした(配列番号２)。
（３）次に末端配列を環状化反応のために最適化したG-CSFを設計した。まず、ヒトG-CSFの立体構造座標データを、国際的なタンパク質立体構造データベースであるProtein Data Bank(PDB； http：//www.rcsb.org/)よりダウンロードした(PDBコード：2D9Q-A鎖)。次に、G-CSFのＮ末端、Ｃ末端に位置するアミノ酸のうち、環状化反応に不利となる非構造領域を選抜し取り除いた。PDB上で実装されている二次構造判別アルゴリズムであるSTRIDEによると、Ｎ末端領域においては、11番目のグルタミンから37番目のセリンまで(直鎖型対照G-CSFにおいては12番目から38番目までに相当する)がヘリックスを形成しており(helix A)、一方でＣ末端領域においては143番目のアラニンから171番目のロイシンまで(直鎖型対照G-CSFにおいては144番目から172番目までに相当する)がヘリックス構造を形成している(helix D)(図１)。そこで、直鎖型対照G-CSFから、1番目のメチオニンから11番目のプロリンまでの11アミノ酸、173番目のアラニンから175番目のプロリンまでの3アミノ酸を取り除いた配列を、環状化に適した骨格と定めた。
次に、Ｎ末端とＣ末端をつなぐ上で最適なループ長を、以下の手順で決定した。
PDBに登録されている分解能2.5Å以上の高分解能立体構造を収集し、それらの構造群から２本のヘリックスに挟まれたループ構造を抽出した。このうち、各ヘリックスの末端に位置する4アミノ酸(計8アミノ酸)が、上記骨格の両末端に位置する4アミノ酸ずつ(計8アミノ酸)と構造的に類似している(α炭素の平均二乗偏差が1Å未満)57個のループ構造を抽出した。これらのループ構造をアミノ酸の数を基準として比較すると、2アミノ酸から構成されるループ構造が13個確認された(全体の22％)。そこで、Ｎ末端とＣ末端をつなぐループは2アミノ酸で十分であると判断した。ループ配列としてセリンとグリシンを付加したアミノ酸配列を、環状化反応に適した最小の改良型G-CSF、G-CSF(C163)とした(配列番号５)。
また、ループ領域の最小化は環状化反応効率を高める一方で、立体構造に歪みを生じさせることで安定性の低下をもたらす可能性がある。そこで、環状化反応効率の向上と構造安定化の効果が総合的に最大となるアミノ酸配列がG-CSF(C177)とG-CSF(C163)の間に存在すると予測できる。具体的には配列番号３、配列番号４で示したG-CSF(C170)、G-CSF(C166)がその候補の例に挙げられる。【００４７】
実施例２．直鎖型対照G-CSF発現用プラスミドの合成
（１）直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列(配列番号１)をコードする核酸配列(配列番号２５)を化学合成したものを購入した。
（２）化学合成した核酸を鋳型として、配列番号２６、配列番号２７の２種のプライマーを用いてPCR増幅を行った。精製したPCR産物は、制限酵素NcoI、BamHIで消化した。次に大腸菌ベクターpET16bを制限酵素NcoI、BamHIで消化し、5600bp付近のバンドを切り出し、精製した。E.coliアルカリホスファターゼを用いて、脱リン酸化した。上記の２つの精製サンプルをT7 DNAリガーゼで結合した。
（３）(２)の結合反応産物を大腸菌DH5αに形質転換し、100μg/mlアンピシリン入りLBプレート培地上で培養した。得られた形質転換体をcolony PCR、DNA sequencing(GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v3.1)により選別し、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)を用いて直鎖型対照G-CSF発現用プラスミドを抽出した。【００４８】
実施例３．インテインベクターの作製
（１）Nostoc punctiforme由来のインテイン配列(配列番号１５及び配列番号１６の連続配列)をコードする塩基配列(配列番号２８)の合成遺伝子を購入した。
（２）(１)の合成遺伝子を制限酵素NcoI、XhoIと混合し、37℃で4時間、切断反応させた。ゲル電気泳動後、450bp付近のバンドを切り出し、精製した。次に大腸菌ベクターpET16bをNcoI、XhoIで切断し、5600bp付近のバンドを切り出し、精製した。E.coliアルカリホスファターゼを用いて、脱リン酸化した。上記の２つの精製サンプルをT7 DNAリガーゼで結合した。
（３）(２)の結合反応産物を大腸菌DH5αに形質転換し、100μg/mlアンピシリン入りLBプレート培地上で培養した。得られた形質転換体をcolony PCR、DNA sequencing (GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v3.1)により選別し、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)を用いてインテインプラスミドを抽出した。【００４９】
実施例４．G-CSF(C177)発現用プラスミドの合成
G-CSF(C177)のアミノ酸配列をコードする核酸(配列番号１７)は、直鎖型対照G-CSF発現用プラスミドを鋳型に、２種の一本鎖DNA(配列番号２９)、(配列番号３０)をプライマーに用いたPCR反応によって合成した。これを制限酵素NheI、NdeIで消化した後、精製した。次に、インテインプラスミドを制限酵素NheI、NdeIで消化した後、精製した。上記の２つの精製サンプルをT7 DNAリガーゼで結合した。
上記の結合反応産物を大腸菌DH5αに形質転換し、100μg/mlアンピシリン入りLBプレート培地上で培養した。得られた形質転換体をcolony PCR、DNA sequencing(GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v3.1)により選別し、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)を用いてG-CSF(C177)発現用プラスミドを抽出した。【００５０】
実施例５．G-CSF(C163)発現用プラスミドの合成
G-CSF(C163)のアミノ酸配列をコードする核酸(配列番号２０)は、直鎖型対照G-CSF発現用プラスミドを鋳型に、２種の一本鎖DNA(配列番号３５)、(配列番号３６)をプライマーに用いたPCR反応によって合成した。これを制限酵素NheI、NdeIで消化した後、精製した。次に、インテインプラスミドを制限酵素NheI、NdeIで消化した後、精製した。上記の２つの精製サンプルをT7 DNAリガーゼで結合した。
上記の結合反応産物を大腸菌DH5αに形質転換し、100μg/mlアンピシリン入りLBプレート培地上で培養した。得られた形質転換体をcolony PCR、DNA sequencing(GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v3.1)により選別し、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen)を用いて変異型G-CSF(C163)発現用プラスミドを抽出した。【００５１】
実施例６．直鎖型対照G-CSFおよびG-CSF(C177)、G-CSF(C163)の製造
（１）直鎖型対照G-CSF発現用プラスミドを用いて、発現用大腸菌BL21(DE3) (Novagen) を形質転換した。前培養した形質転換体を、1ml/200mlでLB培地に継代し、O.D.600=0.8〜1.0になるまで振とう培養した。直鎖型対照G-CSFを発現させるためIPTG(0.4mM)を加え、さらに37℃で4時間振とう培養した。
（２）回収した菌体を10mlの溶解バッファに懸濁した。溶解バッファは、1％(w/v)デオキシコール酸ナトリウム(DOC)、1.2kU/mlリゾチーム、25U/mlベンゾナーゼを含むPBSである。懸濁後、室温で15分間振とうし、2分間超音波破砕を行った後、4℃で10分間、10,000×gで遠心分離した。上清を取り除き、沈殿物に20mlの洗浄バッファ１を加えて懸濁した。洗浄バッファ１は、50mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)、5mM EDTA、2％ Tween20を含む。懸濁したサンプルを遠心分離し、上清を取り除き、沈殿物に20mlの洗浄バッファ２を加えて懸濁した。洗浄バッファ２は、50mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)、5mM EDTA、1％(w/v) DOCを含む。懸濁したサンプルを遠心分離し、上清を取り除き、沈殿物に20mlの洗浄バッファ３を加えて懸濁した。洗浄バッファ３は、50mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)、5mM EDTA、1M NaClを含む。懸濁したサンプルを遠心分離し、上清を取り除き、沈殿物に10mlの可溶化バッファを加えて、室温で18時間振とうした。可溶化バッファは50mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)、5mM EDTA、6M塩酸グアニジンを含む。可溶化させたサンプルを限外ろ過で濃縮し、氷冷した10倍量の巻戻しバッファへと滴下した。そのまま、4℃で18時間撹拌した。巻戻しバッファには、100mM Tris-HCl pH8.0 (4℃)、2mM EDTA、400mM L-アルギニン、1mM還元型グルタチオン、0.1mM酸化型グルタチオンを含む。次に、巻戻したサンプルを内液、100倍量の20mM Tris-HCl pH8.0 (4℃)を外液として透析を行った(4℃、18時間)。遠心分離で上清を回収し、0.22μmシリンジフィルターでろ過したサンプルを、20mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)で透析した。
（３）ろ過滅菌した透析内液をHiTrap Q HPカラム(GE Healthcare Bioscience)をセットした液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GE Healthcare Bioscience)に注入し、陰イオン交換クロマトグラフィー法(泳動バッファ： 20mM Tris-HCl pH8.0 (25℃) ； 溶出バッファ： 20mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)、1M NaCl)により直鎖型対照G-CSFを精製した。さらに上記精製サンプルを、Superdex75 10/300 GLカラム(GE Healthcare Bioscience)をセットした液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier(GE Healthcare Bioscience)に注入し、サイズ排除クロマトグラフィー法(泳動バッファ：20mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)、150mM NaCl)により精製した。精製サンプルはPBSで透析した後、4℃で保存した。
（４）G-CSF(C177)、G-CSF(C163)の製造については、上記(１)、(２)、(３)と同様に行った。但し、インテイン反応の副生成物として生じる直鎖状型分子体を分離するために、G-CSF(C177)の精製工程には以下の操作を加えた。サイズ排除クロマトグラフィー法により精製したサンプルを限外ろ過で濃縮後、100倍量の20mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)で透析した。ろ過滅菌した透析内液をMonoQカラム(GE Healthcare Bioscience)をセットした液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GE Healthcare Bioscience)に注入し、陰イオン交換クロマトグラフィー法(泳動バッファ：20mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)；溶出バッファ：20mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)、1M NaCl)により精製した。上記カラムに対して、G-CSF(C177)の添加量が20μg以下の場合において、環状化した主生成物と直鎖状の副生成物は独立した２つのピークとして分離された。精製サンプルはPBSに透析した後に4℃で保存した。【００５２】
実施例７．SDS-PAGEによる環状化効率の測定
本実施例では、SDS-PAGEを用いて、精製後の各G-CSFの純度を評価した。
精製後のG-CSFをそれぞれ50μM程度の濃度の水溶液に調製したのち、SDS-PAGE(4-20％ precast gels(Bio-Rad)、200V、30min)を行い、Oriole(R)Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad)でバンドを検出し純度を確認した。その結果、直鎖型対照G-CSFおよびG-CSF(C163)は、測定したすべてのサンプルのメジャーバンドとして検出され、精製度が充分であることが確認された。G-CSF(C177)は、サイズ排除クロマトグラフィー後のサンプルにおいては直鎖状型分子体が30％程度含まれており、環状化生成物の純度は70％以下であることが確認された。但し、MonoQカラムを用いた最終精製後には95％以上の純度であることが確認された(図３、表１)。【００５３】
表１．環状化G-CSF改変体の環状化効率、及び、当該改変体の機能と安定性の直鎖型対照との対比
【表１】
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【００５４】
実施例８．表面プラズモン共鳴法による、G-CSFレセプター結合活性の測定
以下のようにして、直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)のレセプター結合活性を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価した。
なお、SPR法は、生体高分子間の特異的相互作用を経時的に測定し、反応を速度論的観点から定量的に解釈できる優れた方法であることが認識されているものである。
まず、センサーチップCM5(GE Health care)のフローセルに、マレイミドカップリング反応を用いてプロテインGを固定化した。次いで、Fc融合G-CSFレセプターを、ランニング緩衝液であるHBS-P (10mM HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 0.05％v/v Surfactant P20)に溶解させたものを添加し、チップ上に固定化した。SPRの測定は、Biacore T100 (Biacore)を用い、反応温度25℃で行った。試料溶液は、公比２倍の希釈系列を1.25nMから20nMまで調製し、シングルカイネティクスモードで測定、解析した。
観測結果の解析にはBIAevaluation version 4.1を用いて、解離定数を算出した。その結果、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)のG-CSFレセプターに対する解離定数は直鎖型対照G-CSFと同程度の値となり、親和性を維持していることが確認された(図４、表１)。【００５５】
実施例９．細胞活性測定
本実施例においては、フィルグラスチム、直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)の細胞活性を評価した。
G-CSF依存性増殖を示す細胞株NFS-60を10ng/ml rhG-CSF含10％FBS含RPMI1640培地中，37°C及び5％ CO2の条件下で維持培養し，対数増殖期にある細胞を10％FBS含RPMI1640培地(培養用rhG-CSF不含)で2×105cells/mLに調製して実験に用いた。直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)は10％FBS含RPMI1640培地で公比５の希釈系列となるように3nMから192fMとなるように調製した。細胞溶液、各G-CSF溶液を等量ずつ混合し、37℃、5％CO2条件下で48時間培養した後、Cell counting Kit-8 (同仁化学)を用いて細胞数を測定した。
直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)のG-CSF活性はNFS-60細胞に対する増殖活性としてLogistic式に当てはめ，50％有効濃度(EC50)を算出することにより評価した。各試料の各濃度区で得られた吸光度データから媒体対照区(VC)の平均値を差し引いた後、プレート毎に標準品の最大活性濃度区の平均値で除し、相対活性(％，Relative activity)を算出した。最大値を100％として、Logistic式(Hill equation)に当てはめてEC50値を算出した。
その結果、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)は、フィルグラスチム、直鎖型対照G-CSFと同程度の細胞活性を示すことが確認された(図５、表１)。【００５６】
実施例１０．円偏光二色性スペクトルによる熱安定性の測定
本実施例においては、直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)の熱安定性を評価した。円偏光二色性(CD)スペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることが知られている。CDスペクトルの強度に相当するモル楕円率を試料の温度を変化させながら観測することで、試料がどの程度の温度で変性するのかを明らかにすることができる。
直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)をそれぞれ5μMの濃度で含む水溶液(10mM HEPES緩衝液、pH7.4、150 mM塩化ナトリウム)に調製した。この試料溶液を円筒型セル(セル長0.2cm)に注入し、J805型円偏光二色性分光光度計(日本分光)を用いて測定した。
10℃の温度で測定波長を260nmから200nmに移動させ、円偏光二色性スペクトルを得た。その結果、直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)は同様の二次構造を持つことが確認された。同じ試料を80℃まで加熱し、80℃から10℃に冷却した後に再び円偏光二色性スペクトルを測定したところ、モル楕円率は回復せず、不可逆的な熱変性を生じていることが確認された。
次に、10℃から80℃まで毎分1℃の割合で昇温しながら、波長222nmにおける円偏光二色性を走査測定した。得られた熱融解曲線について二状態相転移モデルの理論式(参照文献11)を用いて解析し、変性温度Tm、およびTmにおける変性のエンタルピー変化ΔHmを決定した。その結果、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)の熱安定性については、直鎖型対照G-CSFの熱安定性に比べて、それぞれ9.7℃、1.8℃向上していることが明らかになった(図６、表１)。【００５７】
実施例１１．プロテアーゼ耐性試験
本実施例では、フィルグラスチム、直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)のプロテアーゼ耐性を評価した。
カルボキシペプチダーゼＹと各G-CSFを混和し、未反応のG-CSFの割合をSDS-PAGEによって定量した。カルボキシペプチダーゼＹはタンパク質のＣ末端からアミノ酸を切断する酵素であり、反応に対する基質特異性、配列特異性が低いため、プロテアーゼ耐性を包括的に評価する上で有効である。
単離精製した直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)とカルボキシペプチダーゼＹを100mM酢酸緩衝液(pH6.5)に希釈し、最終濃度が10μg/ml、1μg/mlとなるように混合した。37℃で0、60、120、180、240分間反応を行い、10μlずつサンプリングを行った。SDS-PAGE(4-20％ precast gels(Bio-Rad)、200V、30min)を行い、Oriole(R) Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad)でバンドを検出した。バンドの検出、画像密度の定量には画像撮影システム(ChemiDocTM、Biorad)、画像解析ソフト(QuantityOneTM、Biorad)を使用した。0分の結果を100％としてバンドの残存度を数値化し、カルボキシペプチダーゼＹによる消化反応を擬一次反応と仮定して、半減期を算出した(図７、表１)。その結果、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)は直鎖型対照G-CSFと比較して、著しくプロテアーゼ耐性が向上していることが確認された。【００５８】
実施例１２．代謝半減期測定試験
本実施例では、直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)の薬物動態を評価した。
７週齢のオスのSprague-Dawleyラットに100μg protein/kgとなるように各試料を尾静脈へ単回投与した。投与後20分、1.5時間、3時間、4.5時間、6時間、24時間後に尾静脈より100μl採血した。遠心分離で分画した血漿中の残存G-CSF濃度をG-CSF Human ELISA Kit (abcam(R))を用いて定量した。
その結果、直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)の代謝半減期はそれぞれ、0.95時間、1.13時間、1.05時間と算出され、生体中でのクリアランスを受ける効率が低下したことが示された(表１)。【００５９】
実施例１３．Ｘ線結晶構造解析
本実施例においては、改良型タンパク質の単結晶を作成し、立体構造をＸ線回折解析により決定した。Ｘ線結晶構造解析は、高分解能でタンパク質の構造を観察できる手法であり、確かに環状化が生じていること、環状化によってレセプター結合界面に変化が生じていないことを確認することが可能である。
G-CSF(C177)は、200mM Li2SO4、100mM Tris-HCl (pH8.4)、20％(w/v) PEG 4000を母液とした結晶化条件において柱状の単結晶が得られ、この結晶から分解能3.0Åの回折データが得られた。一方、G-CSF(C163)は、0.4Mリン酸アンモニウムを母液とした結晶化条件において正八面体状の単結晶が得られ、この結晶から分解能1.65Åの回折データが得られた。これら２つの回折データからそれぞれ立体構造モデルを構築した。
まず、Ｎ末端領域とＣ末端領域が環状化していることを確認した。G-CSF(C177)、G-CSF(C163)のいずれも、Ｎ末端のセリン残基とＣ末端のグリシン残基が結合していることを明確に表す電子密度マップが得られた(図８)。また、既知の直鎖型対照G-CSFの立体構造(PDBコード；2DQ9-A鎖)とG-CSF(C177)、G-CSF(C163)の立体構造を重ね合わせて、導入した変異がG-CSFレセプター結合界面に影響を与えていないことを確認した。
G-CSFレセプターとの相互作用界面は２つに分かれており(siteII、siteIII)、それぞれ８個ずつのアミノ酸が結合に必須であると報告されている(参照文献１２)。これら１６個のアミノ酸の位置を直鎖型対照G-CSFとG-CSF(C177)、G-CSF(C163)とで比較した結果、いずれもα炭素の距離が3Å未満であり、立体構造の違いは見られなかった(表２)。【００６０】
表２．Ｘ線結晶構造解析による、既知のヒトG-CSFの立体構造(PDBコード；2D9Q-A鎖)とG-CSF(C177)、G-CSF(C163)の立体構造におけるG-CSFレセプター結合界面を形成するアミノ酸のα炭素の位置の対比
【表２】
2016167291.tif 000004
【００６１】
実施例１４．ループ長の改良
実施例１の、データベース(PDB)に登録されたタンパク質立体構造モデルとG-CSFとの構造比較の結果、9アミノ酸からなるループ構造を持つ類似立体構造モデルが9個見つかった(全体の16％)。同様に、5アミノ酸からなるループ構造を持つ類似立体構造モデルが15個見つかった(全体の26％)。そこで、N末端、C末端のセリン、グリシンを除く７アミノ酸、３アミノ酸が、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列が可能な限り維持されるように設計された2種類のG-CSF改変体を設計、作成した。即ち、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列（配列番号1）のN末端の4アミノ酸残基及びC末端の3アミノ酸残基を削除した上で、N末端にセリン、C末端にグリシンを付加した配列（配列番号3）を設計し、スプリットインテインを利用して、G-CSF(C170)を作製した。同様に、直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列（配列番号1）のN末端の８アミノ酸残基及びC末端の3アミノ酸残基を削除した上で、N末端にセリン、C末端にグリシンを付加した配列（配列番号４）を設計し、スプリットインテインを利用して、G-CSF(C166)を作製した。【００６２】
実施例１５．G-CSF(C170)発現用プラスミドの合成
G-CSF(C170)のアミノ酸配列をコードする核酸（配列番号18）は、直鎖型対照G-CSF発現用プラスミドを鋳型に、2種の一本鎖DNA（配列番号31）、（配列番号32）をプライマーに用いたPCR反応によって合成した。これを制限酵素NheI、NdeIで消化した後、精製した。次に、インテインプラスミドを制限酵素NheI、NdeIで消化した後、精製した。上記の2つの精製サンプルをT7 DNA リガーゼで結合した。
上記の結合反応産物を大腸菌DH5αに形質転換し、100 μg/ml アンピシリン入りLBプレート培地上で培養した。得られた形質転換体をcolony PCR、DNA sequencing (GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v3.1) により選別し、QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) を用いてG-CSF(C170)発現用プラスミドを抽出した。【００６３】
実施例１６．G-CSF(C166)発現用プラスミドの合成
G-CSF(C166)のアミノ酸配列をコードする核酸（配列番号19）は、直鎖型対照G-CSF発現用プラスミドを鋳型に、2種の一本鎖DNA（配列番号33）、（配列番号34）をプライマーに用いたPCR反応によって合成した。これを制限酵素NheI、NdeIで消化した後、精製した。次に、インテインプラスミドを制限酵素NheI、NdeIで消化した後、精製した。上記の2つの精製サンプルをT7 DNA リガーゼで結合した。
上記の結合反応産物を大腸菌DH5αに形質転換し、100 μg/ml アンピシリン入りLBプレート培地上で培養した。得られた形質転換体をcolony PCR、DNA sequencing (GE Healthcare Bioscience, BigDye Terminator v3.1) により選別し、QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) を用いて変異型G-CSF(C166)発現用プラスミドを抽出した。【００６４】
実施例１７．G-CSF(C170)、G-CSF(C166)の製造
（1）G-CSF(C170)発現用プラスミド、G-CSF(C166)発現用プラスミドを用いて、発現用大腸菌BL21(DE3) (Novagen) を形質転換した。前培養した形質転換体を、1ml / 200mlでLB培地に継代し、O.D.600 = 0.8〜1.0になるまで振とう培養した。直鎖型対照G-CSFを発現させるためIPTG（0.4mM）を加え、さらに37℃で4時間振とう培養した。
（2）回収した菌体を10mlの溶解バッファに懸濁した。溶解バッファは、1％(w/v) デオキシコール酸ナトリウム(DOC)、1.2 kU/ml リゾチーム、25 U/ml ベンゾナーゼを含むPBSである。懸濁後、室温で15分間振とうし、2分間超音波破砕を行った後、4℃で10分間、10,000×g で遠心分離した。上清を取り除き、沈殿物に20 mlの洗浄バッファ1を加えて懸濁した。洗浄バッファ1は、50 mM Tris-HCl pH 8.0 (25℃)、5 mM EDTA、2％ Tween20 を含む。懸濁したサンプルを遠心分離し、上清を取り除き、沈殿物に20 ml の洗浄バッファ2を加えて懸濁した。洗浄バッファ2は、50 mM Tris-HCl pH 8.0 (25℃)、5 mM EDTA、1％(w/v) DOCを含む。懸濁したサンプルを遠心分離し、上清を取り除き、沈殿物に20 ml の洗浄バッファ3を加えて懸濁した。洗浄バッファ3は、50 mM Tris-HCl pH 8.0 (25℃)、5 mM EDTA、1M NaClを含む。懸濁したサンプルを遠心分離し、上清を取り除き、沈殿物に10 ml の可溶化バッファを加えて、室温で18時間振とうした。可溶化バッファは50 mM Tris-HCl pH 8.0 (25℃)、5 mM EDTA、6 M 塩酸グアニジンを含む。可溶化させたサンプルを限外ろ過で濃縮し、氷冷した10倍量の巻戻しバッファへと滴下した。そのまま、4℃で18時間撹拌した。巻戻しバッファには、100 mM Tris-HCl pH 8.0 (4℃)、2 mM EDTA、400 mM L-アルギニン、1 mM 還元型グルタチオン、0.1 mM 酸化型グルタチオンを含む。次に、巻戻したサンプルを内液、100倍量の20 mM Tris-HCl pH 8.0 (4℃)を外液として透析を行った(4℃、18時間)。遠心分離で上清を回収し、0.22 μm シリンジフィルターでろ過したサンプルを、20 mM Tris-HCl pH 8.0 (25℃)で透析した。
（3）ろ過滅菌した透析内液をHiTrap Q HPカラム (GE Healthcare Bioscience)をセットした液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GE Healthcare Bioscience)に注入し、陰イオン交換クロマトグラフィー法（泳動バッファ: 20mM Tris-HCl pH8.0 (25℃) ; 溶出バッファ: 20mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)、1 M NaCl）により精製した。さらに上記精製サンプルを、Superdex75 10/300 GLカラム (GE Healthcare Bioscience)をセットした液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GE Healthcare Bioscience)に注入し、サイズ排除クロマトグラフィー法（泳動バッファ: 20mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)、150 mM NaCl）により精製した。サイズ排除クロマトグラフィー法により精製したサンプルを限外ろ過で濃縮後、100倍量の20 mM Tris-HCl pH 8.0 (25℃)で透析した。ろ過滅菌した透析内液をMonoQカラム (GE Healthcare Bioscience)をセットした液体クロマトグラフィー装置AKTApurifier (GE Healthcare Bioscience)に注入し、陰イオン交換クロマトグラフィー法（泳動バッファ: 20mM Tris-HCl pH8.0 (25℃) ; 溶出バッファ: 20mM Tris-HCl pH8.0 (25℃)、1 M NaCl）により精製した。精製サンプルはPBSに透析した後に4℃で保存した。【００６５】
実施例１８．SDS-PAGEによる環状化効率の測定
本実施例では、SDS-PAGEを用いて、精製後の各G-CSFの純度を評価した。
精製後のG-CSFをそれぞれ50 μM程度の濃度の水溶液に調製したのち、SDS-PAGE（4-20％precast gels(Bio-Rad)、 200 V、30 min）を行い、Oriole(R) Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad)で バンドを検出し純度を確認した。その結果、G-CSF(C170)およびG-CSF(C166)は、測定したすべてのサンプルのメジャーバンドとして検出され、精製度が充分であることが確認された。サイズ排除クロマトグラフィー後のサンプルをMonoQカラムで分画したところ、G-CSF(C170)においてはシングルピークとなり直鎖状型分子体は観察されなかった。またG-CSF（C166）においては直鎖状型分子体がピーク面積に換算して4％観察された (表3)。【００６６】
表３．環状化G-CSF改変体のうちG-CSF(C170)、G-CSF(C166)の環状化効率、及び、当該改変体の機能と安定性の直鎖型対照との対比
【表３】
2016167291.tif 000005
【００６７】
実施例１９．表面プラズモン共鳴法による、G-CSFレセプター結合活性の測定
以下のようにして、G-CSF(C170)、G-CSF(C166)のレセプター結合活性を表面プラズモン共鳴(SPR)法により評価した。
なお、SPR法は、生体高分子間の特異的相互作用を経時的に測定し、反応を速度論的観点から定量的に解釈できる優れた方法であることが認識されているものである。
まず、センサーチップCM5(GE Health care)のフローセルに、アミンカップリング反応を用いて市販のプロテインＡ(ナカライ)を固定化した。次いで、Fc融合G-CSFレセプターを、ランニング緩衝液であるHBS-P (10mM HEPES pH7.4, 150mM NaCl, 0.05％ v/v Surfactant P20)に溶解させたものを添加し、チップ上に固定化した。SPRの測定は、Biacore T200 (Biacore)を用い、反応温度25℃で行った。試料溶液は、公比2倍の希釈系列を1.25 nMから20 nMまで調製し、シングルカイネティクスモードで測定、解析した。実施例8と比較して、Biacore T100より感度の高いBiacore  T200の使用、市販のプロテインＡの使用などの改善点により、測定の感度と再現性が向上した。そこで、実施例8で測定した直鎖型G-CSF、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)においても再測定を実施し、それらの解析値を比較に用いた。
観測結果の解析にはBIAevaluation version 4.1を用いて、解離定数を算出した。その結果、G-CSF(C170)、G-CSF(C166)のG-CSFレセプターに対する解離定数は直鎖型対照G-CSFと同程度の値となり、親和性を維持していることが確認された(図10、表3)。【００６８】
実施例２０．円偏光二色性スペクトルによる熱安定性の測定
本実施例においては、G-CSF(C170)、G-CSF(C166)の熱安定性を評価した。円偏光二色性（CD）スペクトルは、タンパク質の二次構造の変化を鋭敏に反映する分光学的分析方法であることが知られている。CDスペクトルの強度に相当するモル楕円率を試料の温度を変化させながら観測することで、試料がどの程度の温度で変性するのかを明らかにすることができる。
G-CSF(C170)、G-CSF(C166)をそれぞれ5 μMの濃度で含む水溶液（10 mM  HEPES緩衝液、pH 7.4、150 mM 塩化ナトリウム）に調製した。この試料溶液を円筒型セル（セル長0.2cm）に注入し、J805型円偏光二色性分光光度計（日本分光）を用いて測定した。
10℃の温度で測定波長を260nmから200nmに移動させ、円偏光二色性スペクトルを得た。その結果、G-CSF(C170)、G-CSF(C166)は同様の二次構造を持つことが確認された。同じ試料を90℃まで加熱し、90℃から10℃に冷却した後に再び円偏光二色性スペクトルを測定したところ、モル楕円率は回復せず、不可逆的な熱変性を生じていることが確認された。
次に、10℃から90℃まで毎分1℃の割合で昇温しながら、波長222nmにおける円偏光二色性を走査測定した。得られた熱融解曲線について二状態相転移モデルの理論式（参照文献11）を用いて解析し、変性温度Tmを決定した。カーブフィッティングの際には、変性に伴う熱容量変化をΔCp=7.5 kJ・mol-1・K-1と仮定して固定した。実施例10と比較して、より高い温度まで熱融解を測定し、固定した熱容量変化の値を使用したことで、より再現性の高い結果を得ることができた。G-CSF(C177)においては、同条件で再測定と再解析を実施し、また直鎖型対照G-CSF、G-CSF(C163)においては再解析を実施して、それらの解析値を比較に用いた。
その結果、G-CSF(C170)、G-CSF(C166)の熱安定性については、直鎖型対照G-CSFの熱安定性に比べて、それぞれ7.6℃、12.6℃向上していることが明らかになった（図11、表3）。また、G-CSF(C177)、G-CSF(C163)の熱安定性については、直鎖型対照G-CSFの熱安定性に比べて、それぞれ5.6℃、1.7℃向上していることが明らかになった。総合すると、G-CSF(C166)が熱安定性において、最も安定性の向上した改変体であった。【００６９】
実施例２１．プロテアーゼ耐性試験
本実施例では、G-CSF(C170)、G-CSF(C166)のプロテアーゼ耐性を評価した。
カルボキシペプチダーゼYと各G-CSFを混和し、未反応のG-CSFの割合をSDS-PAGEによって定量した。カルボキシペプチダーゼYはタンパク質のC末端からアミノ酸を切断する酵素であり、反応に対する基質特異性、配列特異性が低いため、プロテアーゼ耐性を包括的に評価する上で有効である。
単離精製したG-CSF(C170)、G-CSF(C166)とカルボキシペプチダーゼYを100 mM 酢酸緩衝液(pH6.5)に希釈し、最終濃度が10 μg/ml、1 μg/mlとなるように混合した。37℃で0、60、120、180、240分間反応を行い、10 μlずつサンプリングを行った。SDS-PAGE（4-20％ precast gels(Bio-Rad)、 200 V、30 min）を行い、Oriole(R)Fluorescent Gel Stain(Bio-Rad)で バンドを検出した。バンドの検出、画像密度の定量には画像撮影システム(ChemiDocTM、Biorad)、画像解析ソフト(QuantityOneTM、Biorad)を使用した。0分の結果を100％としてバンドの残存度を数値化し、カルボキシペプチダーゼYによる消化反応を擬一次反応と仮定して、半減期を算出した(図12、表3)。その結果、G-CSF(C170)、G-CSF(C166)は直鎖型対照G-CSFと比較して、著しくプロテアーゼ耐性が向上していることが確認された。【００７０】
なお、本願は、以下の発明にも関する。
〈１〉特定の三次元構造を有するタンパク質を、次の(ａ)、(ｂ)、及び／又は、(ｃ)〜(ｆ)の工程を経て改変することを特徴とする、元のタンパク質の生物学的特性は低下せず、かつ元のタンパク質と比べて安定性が向上する、環状化変異タンパク質の製造方法。
（ａ）当該タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にスプリットインテインによるトランス−スプライシング反応により相互にペプチド結合が形成可能な残基を付加する工程、但し、当該タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のアミノ酸残基が当該反応によりペプチド結合が形成可能な残基である場合はそのままでもよい；及び、
（ｂ）スプリットインテインによるトランス−スプライシング反応を利用することにより、当該Ｎ末端とＣ末端を連結し、ポリペプチド主鎖を環状化する工程、
上記(ａ)、(ｂ)の工程により十分な環状化効率が得られない場合は、
（ｃ）当該タンパク質の立体構造情報を基にＮ末端とＣ末端の二次構造を形成しない領域を決定し、それらの領域を欠失変異させる工程；
（ｄ）工程(ｃ)で得られたタンパク質のＮ末端とＣ末端の二次構造と類似する二次構造同士を連結するループ構造を公知のタンパク質のデータベースから検索し、適切なループの長さを決定する工程；
（ｅ）環状化により(ｃ)工程で得られたタンパク質のＮ末端とＣ末端を連結する適切な長さのループ構造を形成するべきアミノ酸残基若しくはアミノ酸配列をＮ末端及び／またはＣ末端に付加する工程；及び、
（ｆ）化学的または生物学的な手法によりＮ末端とＣ末端を連結し、ポリペプチド主鎖を環状化する工程。
〈２〉工程(ｆ)のポリペプチド主鎖の環状化にスプリットインテインによるトランス-スプライシング反応を利用することを特徴とする、〈１〉に記載の環状化変異タンパク質の製造方法。
〈３〉特定の三次元構造を有するタンパク質がヘリックスバンドル構造を有するサイトカインであり、元のタンパク質の生物学的特性が受容体に対する親和性である、〈１〉又は〈２〉に記載の環状化変異タンパク質の製造方法。
〈４〉〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の製造方法により作成された、環状化変異タンパク質。
〈５〉元のサイトカインが顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)である、〈４〉に記載の環状化変異タンパク質。
〈６〉元のサイトカインが配列番号１で示すアミノ酸配列からなる顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)である、〈５〉に記載の環状化変異タンパク質。
〈７〉配列番号１で示すアミノ酸配列のＮ末端からアミノ酸残基を0〜11のいずれかの個数削除し、同じくＣ末端から0〜3のいずれかの個数削除し、削除後のＮ末端及び／又はＣ末端にセリン又はシステイン残基を付加し、同じくＣ末端にプロリン以外のアミノ酸残基を付加したアミノ酸配列からなる、〈６〉に記載の環状化変異タンパク質。
〈８〉配列番号６〜９のいずれか一つに記載の環状化されたアミノ酸配列からなる、〈７〉に記載の環状化変異タンパク質。
〈９〉〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の方法に従い〈８〉に記載の環状化変異タンパク質を作製することを目的として設計された、配列番号２〜５のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなる、直鎖状変異タンパク質。
〈１０〉〈１〉〜〈３〉のいずれかに記載の方法においてスプリットインテインにとしてNostoc punctiforme由来のDnaEのDnaEインテイン‐Cと同インテイン‐Nを利用して〈８〉に記載の変異タンパク質を作製することを目的として設計された、配列番号１０〜１３のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなる、直鎖状変異タンパク質。
〈１１〉〈４〉〜〈１０〉のいずれかに記載の変異タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸。
〈１２〉〈１１〉に記載の核酸を含有する組換えベクター。
〈１３〉〈１２〉に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
〈１４〉〈１３〉に記載の形質転換体を用いて、〈４〉〜〈１０〉のいずれかに記載の変異タンパク質を製造する方法。
〈１５〉〈５〉〜〈９〉のいずれかに記載の変異タンパク質を活性成分とすることを特徴とする医薬組成物。
〈１６〉〈５〉〜〈９〉のいずれかに記載の変異タンパク質を活性成分とすることを特徴とする好中球減少症治療用医薬組成物。【００７１】
（参照文献一覧）
参照文献１；B.I.Lord, L.B.Woolford, and G.Molineux, Clin.Cancer Res., 2001, 7, 2085-90.
参照文献２；M.W.Popp, S.K.Dougan, T.Y.Chuang, E.Spooner, and H.L.Ploegh, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2011, 108, 3169-74
参照文献３；T.Kuga, Y.Komatsu, M.Yamasaki, S.Sekine, H.Miyaji, T.Nishi, M.Sato, Y.Yokoo, M.Asano, M.Okabe, M.Morimoto, and S.Itoh, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, 159, 103-111.
参照文献４；W.Kabsch and C.Sander, Biopolymers, 1983, 22, 2577-637.
参照文献５；D.Frishman and P. Argos, Proteins, 1995, 23, 566-79.
参照文献６；C.P.Scott, E.Abel-Santos, M.Wall, D.C.Wahnon, and S.J.Benkovic, Proc. Natl. Acad. Sci., 1999, 96, 13638-13643.
参照文献７；R.M.Horton, H.D.Hunt, S.N.Ho, J.K.Pullen, and L.R.Pease, Gene, 1989, 77, 61-8.
参照文献８；岡田雅人、宮崎香(2004)タンパク質実験ノート(上)、羊土社
参照文献９；大野茂男、西村善文監修(1997)タンパク質実験プロトコール１−機能解析編、秀潤社
参照文献１０；大野茂男、西村善文監修(1997)タンパク質実験プロトコール２−構造解析編、秀潤社
参照文献１１：有坂文雄(2004)バイオサイエンスのための蛋白質科学入門、裳華房
参照文献１２；T.Tamada, E.Honjo, Y.Maeda, T.Okamoto, M.Ishibashi, M.Tokunaga, and R. Kuroki, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2006, 103, 3135-40.【００７２】
（配列番号の説明一覧）
配列番号１：直鎖型対照G-CSFのアミノ酸配列
配列番号２：G-CSF(C177)のアミノ酸配列
配列番号３：G-CSF(C170)のアミノ酸配列
配列番号４：G-CSF(C166)のアミノ酸配列
配列番号５：G-CSF(C163)のアミノ酸配列
配列番号６：環状化したG-CSF(C177)のアミノ酸配列
配列番号７：環状化したG-CSF(C170)のアミノ酸配列
配列番号８：環状化したG-CSF(C166)のアミノ酸配列
配列番号９：環状化したG-CSF(C163)のアミノ酸配列
配列番号１０：DnaEと連結したG-CSF(C177)のアミノ酸配列
配列番号１１：DnaEと連結したG-CSF(C170)のアミノ酸配列
配列番号１２：DnaEと連結したG-CSF(C166)のアミノ酸配列
配列番号１３：DnaEと連結したG-CSF(C163)のアミノ酸配列
配列番号１４：フィルグラスチムのアミノ酸配列
配列番号１５：DnaE-Cのアミノ酸配列
配列番号１６：DnaE-Nのアミノ酸配列
配列番号１７：G-CSF(C177)の塩基配列
配列番号１８：G-CSF(C170)の塩基配列
配列番号１９：G-CSF(C166)の塩基配列
配列番号２０：G-CSF(C163)の塩基配列
配列番号２１：DnaEと連結したG-CSF(C177)の塩基配列
配列番号２２：DnaEと連結したG-CSF(C170)の塩基配列
配列番号２３：DnaEと連結したG-CSF(C166)の塩基配列
配列番号２４：DnaEと連結したG-CSF(C163)の塩基配列
配列番号２５：直鎖型対照G-CSFの塩基配列
配列番号２６：直鎖型対照G-CSFの塩基配列番号を増幅するためのプライマー配列
配列番号２７：直鎖型対照G-CSFの塩基配列番号を増幅するためのプライマー配列
配列番号２８：DnaE-C、DnaE-Nを連続的にコードする塩基配列
配列番号２９：G-CSF(C177)の塩基配列番号を増幅するためのプライマー配列
配列番号３０：G-CSF(C177)の塩基配列番号を増幅するためのプライマー配列
配列番号３１：G-CSF(C170)の塩基配列番号を増幅するためのプライマー配列
配列番号３２：G-CSF(C170)の塩基配列番号を増幅するためのプライマー配列
配列番号３３：G-CSF(C166)の塩基配列番号を増幅するためのプライマー配列
配列番号３４：G-CSF(C166)の塩基配列番号を増幅するためのプライマー配列
配列番号３５：G-CSF(C163)の塩基配列番号を増幅するためのプライマー配列
配列番号３６：G-CSF(C163)の塩基配列番号を増幅するためのプライマー配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年11月15日(2017.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の三次元構造を有するタンパク質を、次の（ｉ）〜（ｖ）の工程を経て改変することを特徴とする、元のタンパク質の生物学的特性は低下せず、かつ元のタンパク質と比べて安定性が向上する、環状化変異タンパク質の製造方法：
（ｉ）当該タンパク質の立体構造情報を基に、当該タンパク質のＮ末端及びＣ末端における二次構造を形成しない領域を決定し、かつ、当該二次構造を形成しない領域を仮に取り除いた場合の、当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端を決定する工程、
（ｉｉ）前記二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端と、類似した二次構造部分を有するタンパク質を、タンパク質のデータベースから検索する工程、
（ｉｉｉ）検索の結果に基づいて、当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端とＣ末端とを連結させるべきループ構造のアミノ酸長を決定する工程、
（ｉｖ）決定されたアミノ酸長を有するループ構造により当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端とＣ末端とが連結された環状化変異タンパク質を得るための、環状化可能な直鎖状変異タンパク質を設計し、作製する工程、並びに、
（ｖ）化学的又は生物学的な手法により、当該直鎖状変異タンパク質のＮ末端とＣ末端とを連結させて環状化させ、環状化変異タンパク質を得る工程。
【請求項２】
工程（ｖ）の環状化に、スプリットインテインによるトランス−スプライシング反応を利用する、請求項１に記載の環状化変異タンパク質の製造方法。
【請求項３】
特定の三次元構造を有するタンパク質が、ヘリックスバンドル構造を有するサイトカインであり、元のタンパク質の生物学的特性が、受容体に対する親和性である、請求項１又は２に記載の環状化変異タンパク質の製造方法。
【請求項４】
特定の三次元構造を有するタンパク質が、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)である、請求項３に記載の環状化変異タンパク質の製造方法。
【請求項５】
特定の三次元構造を有するタンパク質のＮ末端及びＣ末端における二次構造を形成しない領域が削除され、かつ削除後の当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端に所定の個数のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなり、ここで前記所定の個数のアミノ酸残基は、当該二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端と類似した二次構造部分を有する、他のタンパク質の二次構造部分同士を連結しているアミノ酸の長さに対応した個数のアミノ酸残基である、環状化変異タンパク質。
【請求項６】
特定の三次元構造を有するタンパク質が、ヘリックスバンドル構造を有するサイトカインである、請求項５に記載の環状化変異タンパク質。
【請求項７】
特定の三次元構造を有するタンパク質が、配列番号１で示すアミノ酸配列からなる顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)であり、配列番号１で示すアミノ酸配列のＮ末端からアミノ酸残基が０〜１１のいずれかの個数削除され、同じくＣ末端から０〜３のいずれかの個数削除され、削除後のＮ末端及び／又はＣ末端にセリン又はシステイン残基が付加され、同じくＣ末端にプロリン以外のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなる、請求項５又は６に記載の環状化変異タンパク質。
【請求項８】
配列番号６〜９のいずれか一つに記載の環状化されたアミノ酸配列からなる、請求項５〜７のいずれか一項に記載の環状化変異タンパク質。
【請求項９】
請求項５〜８のいずれか一項に記載の環状化変異タンパク質を作製することを目的として設計された直鎖状変異タンパク質であって、当該直鎖状変異タンパク質は、特定の三次元構造を有するタンパク質のＮ末端及びＣ末端における二次構造を形成しない領域が削除され、かつ削除後の当該タンパク質の二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端に所定の個数のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなり、ここで前記所定の個数のアミノ酸残基は、当該二次構造を形成する部分のＮ末端及びＣ末端と類似した二次構造部分を有する、他のタンパク質の二次構造部分同士を連結しているアミノ酸の長さに対応した個数のアミノ酸残基であり、かつ付加された所定の個数のアミノ酸残基のうち、少なくとも最もＮ末端側及び最もＣ末端側のアミノ酸残基は当該直鎖状変異タンパク質の環状化を可能とするためのアミノ酸残基である、直鎖状変異タンパク質。
【請求項１０】
請求項８に記載の環状化変異タンパク質を作製することを目的として設計された、配列番号２〜５のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の直鎖状変異タンパク質。
【請求項１１】
スプリットインテインとしてNostoc punctiforme由来のDnaEのDnaEインテイン‐Cと同インテイン‐Nを利用して請求項８に記載の環状化変異タンパク質を作製することを目的として設計された、配列番号１０〜１３のいずれか一つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の直鎖状変異タンパク質。
【請求項１２】
請求項５〜１１のいずれか一項に記載の変異タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の組換えベクターを導入した形質転換体。
【請求項１５】
請求項１４に記載の形質転換体を用いて、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の変異タンパク質を製造する方法。
【請求項１６】
請求項５〜１１のいずれか一項に記載の変異タンパク質を活性成分とすることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項５〜１１のいずれか一項に記載の変異タンパク質を活性成分とすることを特徴とする、好中球減少症治療用医薬組成物。
【国際調査報告】
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