(57)【要約】  本発明のナノ粒子は、親水性ブロックと疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体からなる。両親媒性ブロックポリマーは生分解性を有することが好ましい。本発明のナノ粒子は、等電点が７以下のアミノ酸の存在下で、両親媒性ブロックポリマーを粒子化することにより得られる。一形態では、両親媒性ブロックポリマーを含有する溶液またはその乾固物を、水系液体と接触させることにより、粒子化が行われる。両親媒性ブロックポリマーを含有する溶液および水系液体の少なくともいずれか一方に、等電点が７以下のアミノ酸を含有させることにより、アミノ酸の存在下での粒子化を行い得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体からなるナノ粒子を製造する方法であって、
等電点が７以下のアミノ酸の存在下で、親水性ブロックと疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーを粒子化することを特徴とする、ナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
前記両親媒性ブロックポリマーと等電点が７以下のアミノ酸とを含有する溶液、またはその乾固物を、水系液体と接触させることにより前記粒子化が行われる、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
前記両親媒性ブロックポリマーを含有する溶液、またはその乾固物を、等電点が７以下のアミノ酸を含有する水系液体と接触させることにより前記粒子化が行われる、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記両親媒性ブロックポリマーが生分解性を有する、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
前記両親媒性ブロックポリマーは、前記親水性ブロックがアルキレンオキシド単位および／またはサルコシン単位を有し、前記疎水性ブロックがヒドロキシ酸単位を有する、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
前記両親媒性ブロックポリマーが、サルコシン単位を有する親水性ブロックと、乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項７】
前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位が２〜３００個である、請求項６に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位が５〜１５０個である、請求項７に記載の分子集合体の製造方法。
【請求項９】
親水性ブロックと疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体からなるナノ粒子であって、
前記分子集合体は、等電点が７以下のアミノ酸を含み、
前記アミノ酸は、アミノ基およびカルボキシ基が電離可能な状態で前記分子集合体に含まれている、ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両親媒性ブロックポリマーの分子集合体からなり、液体中での安定性に優れるナノ粒子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナノテクノロジーへの関心が高まっており、ナノサイズ物質特有の性質を活かした新規機能性材料の開発や応用が進んでいる。例えば、ナノ粒子をキャリアとして、ＥＰＲ効果（Enhanced Permeability and Retention Effect）を利用した薬物搬送システム（ＤＤＳ）によるがん治療法等が検討されている。がんの初期増殖時に顕著に見られる新生血管では、透過性が異常に亢進しているため血中に投与された粒子径数十ｎｍ〜数百ｎｍのナノ粒子が毛細血管系から腫瘍組織より漏出しやすく、リンパ管が未発達であるために腫瘍組織に到達した物質が蓄積しやすい。そのため、所定の粒子径を有するナノ粒子を生体に投与すれば、腫瘍組織に薬剤を含むナノ粒子を蓄積させることができ、効率的なＤＤＳを構築できる。【０００３】
また、腫瘍やその他の疾病を診断するための生体分子イメージング技術においては、病変部位への高い集積選択性を有し、かつ低侵襲性のプローブ剤が求められており、生分解性を有するナノ粒子の利用が注目されている。【０００４】
例えば、特許文献１には、サルコシン単位を含む親水性ブロックと疎水性アミノ酸単位および／またはヒドロキシ酸単位を含む疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーの分子集合体からなるＤＤＳ用ナノ粒子が開示されている。また、特許文献２には、サルコシン単位を含む親水性ブロックと乳酸単位を含む疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーが、水溶液中において自己組織化し高分子ミセル（ラクトソーム）を形成することが開示されている。特許文献２には、ラクトソームが高い血中滞留性を有しかつ肝臓への集積量が低いため、ＥＰＲ効果を利用した癌疾部位を標的とするＤＤＳキャリアや分子イメージング用プローブ剤として有用であることが記載されている。【０００５】
上記のように、両親媒性ブロックポリマーの分子集合体から構成されるナノ粒子は、所定の粒子径を有することにより、生体内の特定部位に特異的に集積する（あるいは集積しない）との特長を利用して、ＤＤＳや分子イメージング等への応用が期待されている。このような用途においては、ナノ粒子の粒子径の制御が重要となる。例えば、両親媒性ブロックポリマーの疎水性ブロックおよび親水性ブロックの構成単位の種類や、ブロック鎖の長さ（構成単位数）等を選択することにより、ナノ粒子の粒子径を制御できる。また、両親媒性ブロックポリマーの分子集合体に、疎水性ポリマー等を内包させたり、薬剤やシグナル剤等を、担持、内包または結合させたりすることにより、ナノ粒子の粒子径を制御することもできる。【０００６】
薬剤搬送システムや分子イメージング等に用いられるナノ粒子は、作製時（粒子化時）の粒子径制御に加えて、作製から生体へ適用するまでの保存環境および投与後の生体内環境においても、粒子径の変化が小さいことが求められる。【０００７】
ナノ粒子の粒子径を維持する方法としては、界面活性剤や電荷付与機能を有する化合物あるいは官能基を、分散助剤として粒子表面に結合または吸着させ、粒子の二次凝集を抑制する方法が知られている（例えば特許文献３参照）。特許文献４では、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルにおいて、ミセルの内核に荷電性セグメントと反対の電荷を有する薬物を担持させ、架橋剤と反応させることにより、ミセルを安定化できることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−２４８１６号公報
【特許文献２】ＷＯ２００９／１４８１２１号パンフレット
【特許文献３】特開平５−１９４２００号公報
【特許文献４】ＷＯ２００４／１０５７９９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献３に開示されているような分散助剤を用いる方法は、生体への投与を想定したものではなく、分散助剤の安全性が確立されていないため、ＤＤＳや生体イメージング用のナノ粒子への適用は困難である。特許文献４に開示されている架橋反応を用いる方法は、架橋構造を導入できる薬剤やイメージング剤が制限される。また、架橋反応のための化学修飾が必要であるため、ポリマーや薬剤、イメージング剤等の調製過程が煩雑となる。これらに鑑み、本発明は、生体への投与が可能であり、安定性に優れるナノ粒子の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らが検討の結果、所定範囲の等電点を有するアミノ酸の存在下で、両親媒性ブロックポリマーの粒子化を行うことにより、分散液等の液体中でも粒子径が変化し難く安定性に優れるナノ粒子が得られることを見出し、本発明に至った。【００１１】
本発明は、両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体からなるナノ粒子およびその製造方法に関し、等電点が７以下のアミノ酸の存在下で、親水性ブロックと疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーの粒子化が行われる。一形態では、両親媒性ブロックポリマーを含有する溶液またはその乾固物を、水系液体と接触させることにより、両親媒性ブロックポリマーの粒子化が行われる。両親媒性ブロックポリマーを含有する溶液および水系液体の少なくともいずれか一方に、等電点が７以下のアミノ酸を含有させることにより、アミノ酸の存在下での粒子化を行い得る。ナノ粒子を構成する分子集合体は、アミノ基およびカルボキシ基が電離可能な状態のアミノ酸を含んでいることが好ましい。【００１２】
両親媒性ブロックポリマーは生分解性を有するものが好ましい。両親媒性ブロックポリマーとしては、親水性ブロックがアルキレンオキシド単位および／またはサルコシン単位を有し、疎水性ブロックがヒドロキシ酸単位を有するものが好ましく用いられる。中でも、サルコシン単位を有する親水性ブロックと、乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーが好ましく用いられる。親水性ブロックに含まれるサルコシン単位は、好ましくは２〜３００個である、疎水性ブロックに含まれる乳酸単位は、好ましくは５〜１５０個である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のナノ粒子は安定性に優れ、液体中でも粒子径の変化が小さいため、ＥＰＲ効果を利用した癌疾部位を標的とするＤＤＳキャリアや分子イメージング用プローブ剤として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のナノ粒子は、両親媒性ブロックポリマーの分子集合体から構成される。両親媒性ブロックポリマーは、親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とを有するブロックポリマーであり、水系液体（水または水溶液）との接触により、自己組織化して分子集合体のナノ粒子を形成する。ナノ粒子の粒子径は、例えば１０ｎｍ〜５００ｎｍ程度であり、用途に応じて粒子径が調整される。分子集合体の形状としては、ミセルやベシクル等が挙げられる。
【００１５】
両親媒性ブロックポリマーが水系液体と接触して、疎水性ブロック鎖がコアを形成すると、親水性ブロック鎖を外側に向けて、分子が自己組織化し、ミセルを形成する。ミセル形成時に薬剤等を共存させることにより、ミセルの内部に薬剤等を内包させたり、親水性部と疎水性部との境界付近や、親水性部分の表層に薬剤等を担持させることができる。
【００１６】
両親媒性ブロックポリマーの自己組織化により球殻状の多重膜ベシクルが形成される場合もある。ベシクルは通常、内部の中空空間が水相で満たされており、この水相に、薬剤等を内包することができる。また、ベシクルの膜表面の親水性部分と薬剤等とを相互作用させることもできる。
【００１７】
ＥＰＲ効果等により生体内の特定部位にナノ粒子を集積させ、薬剤搬送システムや生体分子イメージングに応用するためには、ナノ粒子の粒子径が、１５ｎｍ〜１５０ｎｍであることが好ましく、２０ｎｍ〜１００ｎｍがより好ましい。粒子径が１５ｎｍより小さいものは、尿中への排泄等に起因して血中滞留性が低下し、ＥＰＲ効果による患部集積性が低下する傾向がある。粒子径が１５０ｎｍより大きいものは、血中での免疫を惹起しやすく、肝臓集積が促進される場合がある。粒子径を上記範囲とするために、ナノ粒子はミセルとして形成されることが好ましい。ここで「粒子径」とは、粒径分布で最も出現頻度の高い粒径、すなわち中心粒径をいう。分子集合体の粒子径は、動的光散乱（Dynamic Light Scattering：ＤＬＳ）法により測定できる。
【００１８】
［両親媒性ブロックポリマー］
本発明のナノ粒子は、両親媒性ブロックポリマーの疎水性相互作用がドライビングフォースとなって形成される分子集合体により構成される。すなわち、両親媒性ブロックポリマーは、分子集合体の基本的要素である。両親媒性ブロックポリマーは、親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖を有するブロックポリマーである。
【００１９】
親水性ブロック鎖が有する「親水性」とは、疎水性ブロック鎖に対して相対的に親水性が強いことを意味する。具体的には、当該親水性ブロック鎖が疎水性ブロック鎖とブロックコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の親水性を意味する。同様に、疎水性ブロック鎖が有する「疎水性」とは、親水性ブロック鎖に対して、相対的に疎水性が強いことを意味する。具体的には、当該疎水性ブロック鎖が、親水性ブロック鎖とブロックコポリマーを形成することによって、コポリマー分子全体として両親媒性を実現することが可能となる程度の疎水性を意味する。
【００２０】
生体投与、特にヒトへの投与を目的とするナノ粒子の形成に用いられる両親媒性ポリマーは、生分解性を有することが好ましい。生分解性を有する親水性ブロック鎖のモノマー単位としては、エチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシド、サルコシン等が挙げられる。生分解性を有する疎水性ブロック鎖のモノマー単位としては、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシイソ酪酸等のヒドロキシ酸や、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸メチル、グルタミン酸ベンジル、アスパラギン酸メチル、アスパラギン酸エチル、アスパラギン酸ベンジル等の疎水性アミノ酸あるいはアミノ酸誘導体が挙げられる。これらの中でも、疎水コアを形成しやすく、かつ高い生分解性を有することから、ヒドロキシ酸が好ましい。
【００２１】
上記例示の中でも、親水性ブロック鎖がサルコシン単位を有し、疎水性ブロック鎖が乳酸単位を有する両親媒性ポリマーは、粒子径が均一なナノ粒子を形成しやすく、癌疾部位等を標的とした分子イメージングや薬剤搬送用のナノキャリアとして適している。
【００２２】
以下では、両親媒性ブロックポリマーの例として、サルコシン単位を有する親水性ブロック鎖と、乳酸単位を有する疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーについて説明する。両親媒性ブロックポリマーは、直鎖状または分枝状のいずれでもよい。親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とは、リンカーを介して結合している。
【００２３】
（親水性ブロック鎖）
親水性ブロック鎖は、サルコシン単位（Ｎ−メチルグリシン単位）を含む。サルコシンは、水溶性が高い。また、ポリサルコシンはＮ置換アミドを有することからシス−トランス異性化が可能であり、かつ、α炭素まわりの立体障害が少ないことから、高い柔軟性を有する。そのため、ポリサルコシン鎖を構成単位として用いることにより、高い親水性と柔軟性とを併せ持つ親水性ブロック鎖が形成される。
【００２４】
親水性ブロック鎖は、２個以上のサルコシン単位を含むことが好ましい。サルコシン単位を２個以上有する場合、隣接して存在するブロックポリマーの親水性ブロック同士が凝集しやすく、自己凝集性が高められるため、ミセルが形成されやすくなる。親水性ブロック鎖中のサルコシン単位の数の上限は特に制限されないが、分子集合体の構造を安定化させる観点からは３００個以下が好ましい。親水性ブロックにおけるサルコシン単位の数は、１０〜２００個がより好ましく、２０〜１５０個がさらに好ましく、３０〜１００個が特に好ましい。
【００２５】
親水性ブロック鎖は、全てのサルコシン単位が連続していてもよく、上記のポリサルコシンの特性を損なわない限りにおいてサルコシン単位が非連続であってもよい。親水性ブロック鎖がサルコシン以外のモノマー単位を有する場合、サルコシン以外のモノマー単位は特に限定されないが、例えば親水性アミノ酸あるいはアミノ酸誘導体が挙げられる。アミノ酸は、α‐アミノ酸、β‐アミノ酸、γ‐アミノ酸を含み、好ましくは、α‐アミノ酸である。親水性のα‐アミノ酸としては、セリン、スレオニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。また、親水性ブロックは、ポリエーテル（アルキレンオキシド単位が複数結合したもの）や糖鎖等を有していてもよい。親水性ブロックは、末端（疎水性ブロックとのリンカー部と反対側の末端）に、水酸基等の親水性基を有することが好ましい。
【００２６】
親水性ブロック鎖は、直鎖状でもよく、分枝構造を有していてもよい。親水性ブロック鎖が分枝構造を有する場合、各分枝鎖に２個以上のサルコシン単位が含まれることが好ましい。
【００２７】
（疎水性ブロック鎖）
疎水性ブロックは、乳酸単位を含む。ポリ乳酸は、優れた生体適合性および安定性を有する。また、ポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから、代謝が早く、生体内においてがん組織以外への集積性が低い。そのため、ポリ乳酸を構成ブロックとした両親媒性ポリマーから得られる分子集合体は、生体、特に人体への応用において有用である。また、ポリ乳酸は、低沸点溶媒への溶解性が高いため、分子集合体を製造するための溶液（両親媒性ブロックポリマー溶液）に、低沸点の有機溶媒を使用可能である。そのため、分子集合体の製造効率が高められる。
【００２８】
疎水性ブロック鎖は、５個以上の乳酸単位を含むことが好ましい。乳酸単位が５個以上であれば、疎水コアが形成されやすく、自己凝集性が高められるため、疎水コアの形成が促進されミセルが形成されやすくなる。疎水性ブロック鎖中の乳酸単位の数の上限は特に制限されないが、分子集合体の構造を安定化させる観点からは１５０個以下が好ましく、３０〜１００個が特に好ましい。
【００２９】
疎水性ブロック鎖を構成する乳酸単位は、Ｌ‐乳酸でもＤ‐乳酸でもよい。また、Ｌ‐乳酸とＤ‐乳酸が混在していてもよい。疎水性ブロック鎖は、全ての乳酸単位が連続していてもよく、乳酸単位が非連続であってもよい。疎水性ブロック鎖に含まれる乳酸以外のモノマー単位は特に限定されないが、例えば、グリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸等のヒドロキシ酸や、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸メチルエステル、グルタミン酸ベンジルエステル、アスパラギン酸メチルエステル、アスパラギン酸エチルエステル、アスパラギン酸ベンジルエステル等の疎水性アミノ酸あるいはアミノ酸誘導体が挙げられる。
【００３０】
疎水性ブロック鎖は、直鎖状でもよく、分枝構造を有していてもよい。疎水性ブロック鎖が分枝していない方が、分子集合体形成時にコンパクトな疎水コアが形成されやすく、親水性ブロック鎖の稠密度が増大する傾向がある。そのため、粒子径が小さく、構造安定性の高い分子集合体を形成するためには、疎水性ブロック鎖は直鎖状であることが好ましい。
【００３１】
（両親媒性ブロックポリマーの構造および合成方法）
両親媒性ポリマーは、親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とを結合させたものである。親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とは、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーとしては、疎水性ブロック鎖の構成単位である乳酸モノマー（乳酸やラクチド）またはポリ乳酸鎖と結合可能な官能基（例えば、水酸基、アミノ基等）と、親水性ブロックの構成単位であるサルコシンモノマー（例えばサルコシンやＮ−カルボキシサルコシン無水物）またはポリサルコシンと結合可能な官能基（例えばアミノ基）とを有するものが好ましく用いられる。リンカーを適宜に選択することにより、親水性ブロック鎖や疎水性ブロック鎖の分枝構造を制御することができる。
【００３２】
両親媒性ブロックポリマーにおいて、親水性ブロック鎖に含まれるサルコシン単位の数、および疎水性ブロック鎖に含まれる乳酸単位の数は、両親媒性ブロックポリマーが水系液体中で自己組織化して、分子集合体を形成できるように調整される。両親媒性ブロックポリマー中のサルコシン単位の数ＮＳと乳酸単位の数ＮＬとの比ＮＳ／ＮＬは、０．０５〜１０程度であることが好ましい。ＮＳ／ＮＬは、０．５〜７．５が好ましく、１〜５がより好ましい。
【００３３】
両親媒性ブロックポリマーの合成法は、特に限定されず、公知のペプチド合成法、ポリエステル合成法、デプシペプチド合成法等を用いることができる。詳細には、ＷＯ２００９／１４８１２１号（上記特許文献２やＷＯ２０１２／１７６８８５号等を参照して、両親媒性ブロックポリマーを合成することができる。
【００３４】
分子集合体の形状および大きさの制御をより容易とするためには、疎水性ブロック鎖におけるポリ乳酸の鎖長を調整することが好ましい。ポリ乳酸の鎖長の制御を容易とするためには、両親媒性ブロックポリマーの合成の際に、一端にリンカーが導入されたポリ乳酸を先に合成した後、ポリサルコシンを導入することが好ましい。重合反応における開始剤とモノマーとの仕込み比、反応時間、温度等の条件を調整することにより、ポリサルコシン鎖およびポリ乳酸鎖の鎖長を調整できる。親水性ブロック鎖および疎水性ブロック鎖の鎖長（ブロック鎖における構成モノマー単位数）は、例えば １Ｈ‐ＮＭＲにより確認できる。
【００３５】
［アミノ酸］
アミノ酸の存在下で、上記の両親媒性ブロックポリマーの分子集合体を形成することにより、ナノ粒子が得られる。分子集合体形成時に共存させるアミノ酸としては、等電点が７以下のものが用いられる。等電点が７以下のアミノ酸の存在下で両親媒性ブロックポリマーの分子集合体を形成することにより、ナノ粒子を安定化できる。
【００３６】
等電点が７以下のアミノ酸としては、アラニン（ｐＩ＝６．００）、アスパラギン（ｐＩ＝５．４１）、アスパラギン酸（ｐＩ＝２．７７）、システイン（ｐＩ＝５．０５）、グルタミン（ｐＩ＝５．６５）、グルタミン酸（ｐＩ＝３．２２）、グリシン（ｐＩ＝５．９７）、イソロイシン（ｐＩ＝６．０５）、ロイシン（ｐＩ＝５．９８）、メチオニン（ｐＩ＝５．７４）、フェニルアラニン（ｐＩ＝５．４８）、プロリン（ｐＩ＝６．３０）、セリン（ｐＩ＝５．６８）、スレオニン（ｐＩ＝６．１６）、トリプトファン（ｐＩ＝５．８９）、チロシン（ｐＩ＝５．６６）、バリン（ｐＩ＝５．９６）等が挙げられる。なお、アミノ酸は、等電点（ｐＩ）が７以下であれば、天然アミノ酸に限定されず非天然アミノ酸でもよい。アミノ酸は、α‐アミノ酸に限定されず、β‐アミノ酸やγ‐アミノ酸でもよい。アミノ酸はＬ‐アミノ酸でもＤ‐アミノ酸でもよい。
【００３７】
等電点が７以下のアミノ酸の存在下で粒子化が行われることにより、液体中での安定性に優れるナノ粒子が得られる。そのため、本発明のナノ粒子は、粒子化後生体へ適用するまでの間の保存環境（分散液中）における粒子径の変化が小さく、ＤＤＳや生体分子イメージングのナノキャリアとして使用した場合に、疾患等の目的部位に特異的に集積させることが可能となる。
【００３８】
後述の実施例に示すように、アミノ酸の存在下で両親媒性ポリマーの粒子化を行うと、アミノ酸の使用量の増大に伴って初期粒子径（粒子化直後の粒子径）が大きくなる傾向があることから、分子集合体にアミノ酸が内包または担持されていると推定される。ペプチド等のポリマー鎖を構成するアミノ酸は、アミノ基およびカルボキシ基がペプチド結合に関与しているのに対して、粒子化の際に共存させたアミノ酸は、アミノ基およびカルボキシ基が電離可能な状態で分子集合体に含まれるため、ｐＨ調整機能を有していると考えられる。
【００３９】
ポリヒドロキシ酸（例えばポリ乳酸）は、アルカリ環境で加水分解されやすい。一方、等電点が７以下のアミノ酸は、分子集合体の存在環境を、中性ないしは弱酸性に維持する作用がある。そのため、等電点が７以下のアミノ酸の存在下で形成された分子集合体は、両親媒性ポリマーのブロック鎖や疎水性ポリマーの加水分解が生じ難く、分子集合体の自己崩壊が抑制されるために、安定性に優れ、液体中でも粒子径を維持できると考えられる。また、電離可能な状態のアミノ酸が分子集合体の表面付近に担持され、電荷同士の反発による二次凝集防止効果が付与されることも、ナノ粒子の安定化に寄与している可能性が考えられる。
【００４０】
［分子集合体の付加成分］
ナノ粒子を構成する分子集合体は、両親媒性ブロックポリマーおよびアミノ酸以外の物質を含有していてもよい。例えば、分子集合体形成のための両親媒性ブロックポリマー溶液中に、上記両親媒性ブロックポリマーとは別に疎水性ポリマーを含有させることにより、疎水コアの形成促進や、分子集合体の粒子サイズを調整することができる。また、溶液中に、薬剤等を含めることにより、これらを分子集合体中に取り込むこともできる。
【００４１】
（疎水性ポリマー）
疎水性ポリマーは、疎水コアの形成促進や、分子集合体のサイズ（粒子径）調整等の働きを有する。すなわち、両親媒性ブロックポリマーと疎水性ポリマーとを共存させることにより、分子集合体における疎水コアの体積を増大させ、粒子径を制御することができる。両親媒性ブロックポリマー溶液中に配合される疎水性ポリマーの分子量や含有量を調整することにより、分子集合体のサイズを調整できる。疎水性ポリマーの構成単位数は特に限定されないが、疎水コアの形成促進や、分子集合体のサイズを制御するためには、１０個以上の乳酸単位を有する疎水性ポリマーが好ましく用いられる。疎水性ポリマーの乳酸単位は、より好ましくは１５個以上である。疎水性ポリマーによるサイズ制御と分子集合体の構造安定性を両立させる観点から、疎水性ポリマーの乳酸単位の数は、２０〜３００個が好ましく、２５〜２００個がより好ましく、３０〜１００個がさらに好ましい。
【００４２】
疎水性ポリマーは乳酸単位以外の構成単位を有していてもよい。乳酸以外の構成単位としては、ヒドロキシ酸、疎水性アミノ酸あるいはアミノ酸誘導体等、疎水性ブロックの構成単位として先に例示したものが好ましく用いられる。
【００４３】
（機能性分子）
分子集合体は、シグナル剤、リガンド、薬剤等の機能性分子を含んでいてもよい。また、上記の疎水性ポリマー等に、機能性分子を結合させて用いることもできる。
【００４４】
シグナル剤はシグナル基を含む化合物である。シグナル剤を含むナノ粒子は、シグナル基の検出によるイメージングが可能であるため、シグナル剤を含むナノ粒子は、生体分子イメージング用プローブ剤として有用である。シグナル基としては、蛍光基、放射性元素含有基、磁性基等が挙げられる。リガンドとしては、分子集合体を生体に投与した際に目的部位に分子集合体を特異的に結合させるためのターゲティングを目的とするリガンドや、シグナル剤等を配位させるためのリガンド等が挙げられる。
【００４５】
ターゲティングを目的とするリガンドとしては、抗体、アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸（ＲＧＤ）等の接着因子等が挙げられる。目的部位へ搬送すべき薬剤やシグナル剤等を配位させるためのリガンドとしては、遷移金属を配位できるトリカルボン酸等が挙げられる。
【００４６】
薬剤としては、抗がん剤、抗菌剤、抗ウィルス剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、ステロイド剤、ホルモン剤、血管新生阻害剤等の目的部位（対象疾患等）へ搬送すべき薬剤が挙げられる。抗がん剤の具体例としては、カンプトテシン、エキサテカン（カンプトテシン誘導体）、ゲムシタビン、ドキソルビシン、イリノテカン、ＳＮ−３８（イリノテカン活性代謝物）、５−ＦＵ、シスプラチン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル等が挙げられる。これら薬剤は、複数種を組み合わせで用いてもよい。
【００４７】
上記疎水性ポリマーに機能性分子を結合させる場合、１個のポリマーに結合する機能性分子の数は１個でもよく、２個以上でもよい。機能性分子の結合部位は、疎水性ポリマーのどの部分であってもよい。疎水性ポリマーがポリ乳酸である場合、機能性分子は、ポリ乳酸の末端構成単位に結合していても、内部構成単位に結合していてもよい。ここで、疎水性ポリマーと機能性分子との「結合」とは、具体的には共有結合をさし、疎水性ポリマーの特定箇所に直接的に結合している形態と、スペーサ基等を介して間接的に結合している形態の両者を含む。疎水性ポリマーと機能性分子との結合に用いられるスペーサ基は、特に限定されない。スペーサの例としては、アルキル基；カルボキシメチルセルロース、アミロース等の多糖；ポリアルキレンオキシド鎖、ポリビニルアルコール鎖等の水溶性高分子等が挙げられる。
【００４８】
機能性分子は、疎水性ポリマーに結合させる以外に、他のポリマー等に結合させて分子集合体中に含ませることもできる。例えば、上記両親媒性ブロックポリマーの疎水性ブロック鎖、親水性ブロック鎖、リンカー等に、機能性分子を結合させてもよい。また、機能性分子は、ポリマーに結合させる以外に、ミセル内部の疎水コアや、親水性部と疎水性部との境界付近に内包させたり、分子集合体の親水性表面との分子間相互作用により、分子集合体に担持させることができる。
【００４９】
［ナノ粒子の形成］
上記の両親媒性ポリマーを、等電点が７以下のアミノ酸の存在下で粒子化することによりナノ粒子が得られる。両親媒性ポリマーを粒子化する方法は特に限定されず、両親媒性ポリマーおよびその他の付加成分（上記の疎水性ポリマーや機能性分子等）が、分子集合体を形成できる方法であればよい。粒子化方法の具体例としては、両親媒性ポリマーを含む溶液を乾固させて得られたフィルムと水系液体とを接触させ、水系液体中にナノ粒子が分散した分散液を得る方法（フィルム法）や、当該溶液を水系液体と接触させて分散液を得る方法（インジェクション法）等が挙げられる。
【００５０】
アミノ酸の存在下での粒子化方法としては、両親媒性ポリマーを含む溶液中にアミノ酸を共存させる方法や、溶液あるいはその乾固物（フィルム）と接触させる水系液体にアミノ酸を含有させておく方法等が挙げられる。両親媒性ポリマーを含む溶液と水系液体の両方にアミノ酸を含有させてもよい。分子集合体にアミノ酸を効率的に内包あるいは担持させるためには、両親媒性ポリマーを含む溶液中にアミノ酸を共存させる方法、すなわち、両親媒性ブロックポリマーと等電点が７以下のアミノ酸とを含有する溶液、またはその乾固物を、水系液体と接触させる方法が好ましい。一方、アミノ酸が有機溶媒に不溶または難溶である場合は、水系液体にアミノ酸を溶解させておくことが好ましい。
【００５１】
両親媒性ブロックポリマーを含む溶液は、両親媒性ポリマーを溶媒に溶解することにより調製できる。溶媒は、分子集合体の構成成分を溶解し得るものであれば特に限定されない。フィルム法には、低沸点溶媒が好ましく用いられる。低沸点溶媒とは、１気圧における沸点が１００℃以下、好ましくは９０℃以下のものをいう。具体的には、クロロホルム、ジエチルエーテル、アセトニトリル、エタノール、トリフルオロエタノール、イソプロパノール、ヘキサフルオロイソプロパノール、アセトン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ヘキサン等が挙げられる。インジェクション法では、上記の低沸点溶媒の他、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の高沸点溶媒も制限なく用いることができる。
【００５２】
ブロックポリマー溶液の固形分（両親媒性ブロックポリマー、疎水性ポリマー、および機能性分子）の濃度は、特に限定されない。溶媒の除去効率を高める観点からは、溶液の固形分濃度は高いことが好ましい。一方、溶液の濃度が過度に高いと、ナノ粒子形成前の溶液中でのポリマー析出等の不具合を生じる場合がある。これらを勘案して、溶媒の種類等に応じて固形分濃度を設定すればよい。ブロックポリマー溶液の固形分濃度は、例えば、０．１〜２０重量％程度である。
【００５３】
両親媒性ブロックポリマーを含む溶液または粒子化のための水系液体に等電点が７以下のアミノ酸を共存させる場合、アミノ酸の含有量は、両親媒性ポリマー１００重量部に対して、１重量部以上が好ましく、５重量部以上がより好ましく、１０重量部以上がさらに好ましい。両親媒性ポリマーに対するアミノ酸の含有量が少なすぎると、ナノ粒子の安定化効果を十分に発揮できない場合がある。溶液中のアミノ酸の含有量が大きいほど、ナノ粒子の安定化効果が高められる傾向がある。一方、アミノ酸の含有量が大過剰であると、両親媒性ポリマーの凝集阻害等により分子集合体の形成が妨げられたり、分子集合体に取り込まれるアミノ酸が過剰となることにより粒子径が増大する傾向がある。そのため、溶液中または水系液体中のアミノ酸の含有量は、両親媒性ポリマー１００重量部に対して、１００００重量部以下が好ましく、５０００重量部以下がより好ましく、３０００重量部以下がさらに好ましい。なお、両親媒性ブロックポリマーを含む溶液および水系液体の両方にアミノ酸が含まれる場合は、両者のアミノ酸含有量の合計が上記範囲となるようにアミノ酸濃度を調整すればよい。
【００５４】
（フィルム法）
フィルム法は、ガラス容器等の容器中に、上記溶液を用意する工程；溶液から有機溶媒を除去し、容器の内壁に両親媒性ポリマーを含むフィルムを得る工程；および、容器中に水系液体を加え、フィルム状物質を、近赤外線吸収有機分子を内包する分子集合体に変換してナノ粒子の分散液を得る工程、を含む。
【００５５】
容器内の溶液から溶媒を除去することにより、容器内壁に両親媒性ポリマーのフィルムが形成される。溶液中にアミノ酸を含めることにより、両親媒性ポリマーとアミノ酸とが共存するフィルムが得られる。溶媒の除去の方法は特に限定されず、使用する溶媒の沸点等に応じて、適宜決定できる。例えば、減圧下における溶媒除去を行ってもよいし、自然乾燥による溶媒除去を行ってもよい。
【００５６】
このフィルムが張り付いた容器中に、水系液体を加え、容器内壁からフィルムが剥がれる過程で分子集合体が形成される。水系液体は、水または水溶液であり、生化学的、薬学的に許容することができるものであればよく、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液等が挙げられる。両親媒性ポリマーを含む溶液にアミノ酸が含まれていない場合は、水系液体にアミノ酸を含めることにより、アミノ酸の存在下での粒子化を行うことができる。
【００５７】
容器内壁からフィルムを剥離させ、ナノ粒子の形成を促進するために、容器内に水系液体が加えられた後、加温処理や超音波処理が行われてもよい。加温処理は、例えば７０〜１００℃、５〜６０分の条件下で行うことができる。
【００５８】
なお、容器の内壁にフィルムを形成する代わりに、樹脂フィルムやガラス板等の基材上に両親媒性ポリマーのフィルムを形成し、基材上に形成されたフィルムと水系液体とを接触させることにより、ナノ粒子を形成することもできる。基材上のフィルムと水系液体との接触は、例えば、フィルムが形成された基材を水系液体中に浸漬することにより行い得る。
【００５９】
（インジェクション法）
インジェクション法では、上記の溶液を水系液体に分散させ、精製処理、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、超遠心等の処理を行った後、有機溶媒を除去することによってナノ粒子を調製することができる。インジェクション法において、溶液の溶媒として、生体に有害な有機溶媒を用いた場合は、有機溶媒の除去を厳密に行うことが好ましい。
【００６０】
（粒子化後の後処理）
水系液体中に回収されたナノ粒子は、適宜の後処理に供してもよい。後処理としては、ナノ粒子の形成に寄与していないポリマー成分等の不純物の除去や、有機溶媒の除去等が挙げられる。不純物や有機溶媒を除去するための精製処理としては、例えばゲルろ過クロマトグラフィー、フィルタリング、透析、超遠心等が挙げられる。このようにして、分子集合体（ナノ粒子）の溶液ないしは分散液を得ることができる。
【００６１】
ナノ粒子の分散液は、そのまま実用に供してもよく、フィルタ処理や凍結乾燥等により水系液体等を除去してナノ粒子粉体を形成してもよい。凍結乾燥処理の方法としては公知の方法を用いることができる。例えばナノ粒子の分散液を液体窒素等により凍結させ、減圧下で昇華させることにより、分子集合体の凍結乾燥処理物が得られる。これにより、ナノ粒子を凍結乾燥処理物として保存することが可能になる。必要に応じ、この凍結乾燥物に水系液体を加えて、ナノ粒子の分散液を得ることにより、ナノ粒子を使用に供することができる。前述のように、本発明のナノ粒子は、液体中での安定性に優れるため、分散液の状態でより長期間保存可能である。
【００６２】
［ナノ粒子の用途］
前述のように、両親媒性ブロックポリマー溶液中および／または水系液体中にシグナル剤、リガンド，薬剤等の機能性分子を含有させる方法や、両親媒性ブロックポリマーや疎水性ポリマー等に機能性分子を結合させる方法により、機能性分子を含有する分子集合体のナノ粒子が得られる。ナノ粒子は、薬剤搬送システムや分子イメージング等に用いられる。分子集合体を生体内に投与することにより、薬剤搬送システムおよび分子イメージングを行い得る。
【００６３】
体内へのナノ粒子の投与方法としては、血中投与、経口投与、経皮投与、経粘膜投与等が挙げられる。分子集合体の投与対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。非ヒト動物としては、ヒト以外の哺乳類、より具体的には、霊長類、齧歯類（マウス、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ等が挙げられる。生体内への投与方法は特に限定されず、全身投与および局所投与のいずれでもよい。すなわち、ナノ粒子の投与は、注射、内服、外用のいずれの方法によっても行うことができる。
【００６４】
本発明のナノ粒子は、液体中での安定性に優れ、生体内環境でも粒子径の変化が小さい。そのため、ＥＰＲ (enhanced permeability and retention) 効果による血管病変部位（例えば、悪性腫瘍部位、炎症部位、動脈硬化部位、血管新生部位など）への特異的集積性に優れている。投与ターゲットとしては、肝臓がん、すい臓がん、肺がん、子宮頸がん、乳がん、大腸がん等の癌疾が挙げられる。また、ナノ粒子は、物質送達キャリアとして、化粧品、食品等に用いることもできる。
【実施例】
【００６５】
以下に、実施例として、アミノ酸共存下でのナノ粒子の作製例を示すが、本発明は以下の例に限定されるものではない。【００６６】
［両親媒性ブロックポリマーの合成例］
ＷＯ２００９／１４８１２１号に記載の方法を参照して、３１個の乳酸単位を有するアミノ化ポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ３１）を合成した。さらに、アミノ化ポリＬ−乳酸とサルコシン−Ｎ−カルボン酸無水物をＤＭＦ溶液中で反応させた後、グリコール酸、Ｏ−（ベンゾトリアゾル−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を加えて反応させ、サルコシン単位６９個からなる親水性ブロックとＬ−乳酸単位３１個からなる疎水性ブロックとを有する直鎖状の両親媒性ブロックポリマー（ＰＳａｒ６９−ＰＬＬＡ３１）を合成した。【００６７】
［ナノ粒子の作製例］
ガラス容器内に、上記の両親媒性ブロックポリマー（２０ｍｇ）を１ｍＬのクロロホルムに溶解した（２０ｍｇ／ｍＬ）。そこに、アミノ酸濃度が１重量％（ポリマー１００重量部に対して２００重量部）または５重量％（ポリマー１００重量部に対して１０００重量部）となるようにアミノ酸を加えて、両親媒性ブロックポリマーとアミノ酸を含む溶液を調製した。アミノ酸としては、アスパラギン酸（ｐＩ＝２．７７）、アスパラギン（ｐＩ＝５．４１）、グルタミン（ｐＩ＝５．６５）、グリシン（ｐＩ＝５．９７）、ヒスチジン（ｐＩ＝７．５９）、およびアルギニン（ｐＩ＝１０．７６）を用いた。【００６８】
上記の溶液から溶媒を減圧留去し、ガラス容器の壁面に、ポリマーおよびアミノ酸を含むフィルムを形成させた。ガラス容器内に水を加え、温度８２℃で２０分間湯せんした後、室温で３０分間放置して、両親媒性ブロックポリマー粒子の分散液を得た。参照試料として、アミノ酸を加えていない両親媒性ブロックポリマー溶液を用いて同様の操作を行い、両親媒性ブロックポリマー粒子の分散液を得た。【００６９】
［粒子径の測定および安定性の評価］
両親媒性ブロックポリマーのナノ粒子分散液の調製直後に、Malvern社製 Zetasizer Nano Sを用い、動的光散乱（ＤＬＳ）法により、分散液におけるナノ粒子の粒子径を測定した。２０℃で８日間時間静置した後、再度粒子径の測定を行い、調製直後と８日後の粒子径の比（変化率）を算出した。【００７０】
アミノ酸の種類および溶液中のアミノ酸濃度、粒子化直後に測定した粒子径、ならびに８日後の粒子径を表１に示す。【００７１】
【表１】
2017047364.tif 000002
【００７２】
いずれのアミノ酸を用いた場合も、アミノ酸を添加しなかった参照試料に比べて粒子化直後の粒子径が大きくなっており、アミノ酸濃度の上昇に伴って粒子径が増大する傾向がみられた。これらの結果から、粒子化の際にアミノ酸を共存させることにより、分子集合体にアミノ酸が取り込まれたと考えられる。【００７３】
アミノ酸を添加しなかった参照試料、およびアミノ酸の共存下で粒子化を行った試料の全てにおいて、粒子化直後に比べて８日後の粒子径が増大していた。ｐＩ＝７．５９のヒスチジンの共存化で粒子化を行った場合、アミノ酸濃度１重量％では８日後の粒子径変化率が参照試料の粒子径変化率（１．４６倍）と同等であり、アミノ酸濃度５重量％では８日後の粒子径変化率が参照試料の粒子径変化率よりも大きくなっていた。ｐＩ＝１０.７６のアルギニンの共存化で粒子化を行った場合は、アミノ酸濃度１重量％および５重量％のいずれにおいても、８日後の粒子径変化率が参照試料の粒子径変化率よりも大きくなっており、アルギニン添加量の増加に伴って粒子径変化率が大きくなる傾向がみられた。【００７４】
これに対して、等電点が７以下のアミノ酸である、グリシン、グルタミン、アスパラギンまたはアスパラギン酸の共存下で粒子化を行った場合は、アミノ酸濃度１重量％および５重量％のいずれにおいても、８日経過後の粒子径変化率が参照試料の粒子径変化率よりも小さかった。【００７５】
これらの結果から、等電点の高いアミノ酸の共存下で粒子化を行うとナノ粒子の構造が不安定化する傾向があるのに対して、等電点が７以下のアミノ酸の共存下で粒子化を行うと、アミノ酸非存在下で粒子化を行った場合に比べてナノ粒子の構造が安定化することが分かる。
【手続補正書】
【提出日】平成30年5月14日(2018.5.14)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、両親媒性ブロックポリマーの分子集合体からなり、液体中での安定性に優れるナノ粒子の製造方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性ブロックポリマーを含む分子集合体からなるナノ粒子を製造する方法であって、
親水性ブロックと疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーおよび等電点が７以下のアミノ酸を含有する溶液、またはその乾固物を、水系液体と接触させることにより、粒子化することを特徴とする、ナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
前記両親媒性ブロックポリマーが生分解性を有する、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
前記両親媒性ブロックポリマーは、前記親水性ブロックがアルキレンオキシド単位および／またはサルコシン単位を有し、前記疎水性ブロックがヒドロキシ酸単位を有する、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記両親媒性ブロックポリマーが、サルコシン単位を有する親水性ブロックと、乳酸単位を有する疎水性ブロックとを有する、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
前記親水性ブロックに含まれるサルコシン単位が２〜３００個である、請求項４に記載のナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
前記疎水性ブロックに含まれる乳酸単位が５〜１５０個である、請求項５に記載の分子集合体の製造方法。
【国際調査報告】
2017047364.tif 000003
2017047364.tif 000004
2017047364.tif 000005
2017047364.tif 000006