(57)【要約】【課題】  本発明は、植物、特にウキクサ科植物の生長を促進する機能を有する微生物の有効利用を目的とするものである。【解決手段】  本発明は、配列番号１〜５に示されるタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物（ただしアシネトバクター・カルコアセティカス  Ｐ２３を除く）を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法を提供する。本発明によれば、ＰＧＰＣ関連遺伝子を有するＰ２３株以外の新たな微生物を利用することができ、植物特にウキクサ科植物の生長を促進させることでバイオマス生産の効率を高めることが可能となる。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の１）〜５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物（ただしアシネトバクター・カルコアセティカス  Ｐ２３を除く）を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法。
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項２】
下記の１）〜５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に導入された微生物を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法。
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項３】
前記１）〜５）の遺伝子の少なくとも３つを有する微生物を植物と共存させる工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記１）〜５）の全ての遺伝子を有する微生物を植物と共存させる工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
植物がウキクサ科植物である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
下記の１）〜５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物（ただしアシネトバクター・カルコアセティカス  Ｐ２３を除く）を増殖させる工程を含む、植物生長促進物質の製造方法。
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列、若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項７】
下記の１）〜５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に導入された微生物を増殖させる工程を含む、植物生長促進物質の製造方法。
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項８】
前記１）〜５）の遺伝子の少なくとも３つを有する微生物を増殖させる工程を含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記１）〜５）の全ての遺伝子を有する微生物を増殖させる工程を含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項１０】
下記１）〜３）のいずれかのタンパク質。
１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質
２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質
３）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質
【請求項１１】
請求項１０に記載のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を発現可能に含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸又は請求項１２に記載のベクターで形質転換された微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の生長を促進する方法、植物生長促進物質を製造する方法、及びこれらの方法において利用されるタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウキクサ科植物（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）は、地球のほぼ全域に生息する淡水性の水生植物である。これまで、ウキクサ科植物、特にコウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｍｉｎｏｒ、英語名ｄｕｃｋｗｅｅｄ）の産業への利用は、根圏微生物を含むコウキクサを用いた産業廃水の水質浄化に関連するものが主流であった（例えば、特許文献１）。また、有用タンパク質の生産のための遺伝子組換え宿主としてウキクサ科植物を利用する技術も開発されている（特許文献２及び特許文献３）。【０００３】
近年、ウキクサ科植物が植物体重量当たり６０％程のデンプンと１５％を越えるタンパク質を有する極めて栄養価の高い植物であることが認識されるようになり、ウキクサ科植物をバイオマス、特にバイオマスエネルギーとして活用することへの関心が高まっている。特に、従来知られている水質浄化能力と組み合わせた都市下水、工場廃水、農業廃水などを利用したウキクサ科植物の栽培は、省エネ型の水質浄化とバイオマス生産を同時に達成することが可能となる点で、魅力的である。【０００４】
水質浄化及びバイオマス生産へのいずれの利用においても、低コストでウキクサ科植物の生長速度を高める技術の開発は有益である。係る観点から、本発明者らはコウキクサの生長を促進する機能を有する根圏微生物（Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＰＧＰＢ）及びＰｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｆｕｎｇｉ（ＰＧＰＦ））に注目して研究を行い、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）Ｐ２３（以下、Ｐ２３株と表す）がＰＧＰＢであること、及びＰ２３株の分泌する多糖が植物生長促進物質（Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ、ＰＧＰＣ）であることを見出している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２４７２７９号公報
【特許文献２】特表２００１−５１３３２５号公報
【特許文献３】特表２００９−５２３４３１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍ．Ｓｕｇａｗａｒａら、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ−ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｐ２３”、［ｏｎｌｉｎｅ］、平成２６年５月１９日、第１１４回米国微生物学会大会  発表番号Ｑ−１８５１［平成２７年６月１７日検索］、インターネット〈ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｍｏｎｌｉｎｅｅｄｕｃａｔｉｏｎ．ｃｏｍ／ｐｈｐ／ａｓｍ２０１４ａｂｓｔｒａｃｔｓ／ｄａｔａ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ〉
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、植物、特にウキクサ科植物の生長を促進する機能を有する微生物の有効利用を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、ウキクサの生長を促進させるＰＧＰＣの生合成に関する遺伝子群（ＰＧＰＣ関連遺伝子クラスターと表す）をＰ２３株のゲノム中に見いだし、下記の各発明を完成させた。【０００９】
（１）下記の１）〜５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物（ただしアシネトバクター・カルコアセティカス  Ｐ２３を除く）を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法。
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
（２）下記の１）〜５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に導入された微生物を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法。
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
（３）前記１）〜５）の遺伝子の少なくとも３つを有する微生物を植物と共存させる工程を含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記１）〜５）の全ての遺伝子を有する微生物を植物と共存させる工程を含む、（１）又は（２）に記載の方法。
（５）植物がウキクサ科植物である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）下記の１）〜５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物（ただしアシネトバクター・カルコアセティカス  Ｐ２３を除く）を増殖させる工程を含む、植物生長促進物質の製造方法。
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列、若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
（７）下記の１）〜５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に導入された微生物を増殖させる工程を含む、植物生長促進物質の製造方法。
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
（８）前記１）〜５）の遺伝子の少なくとも３つを有する微生物を増殖させる工程を含む、（６）又は（７）に記載の方法。
（９）前記１）〜５）の全ての遺伝子を有する微生物を増殖させる工程を含む、（６）又は（７）に記載の方法。
（１０）下記１）〜３）のいずれかのタンパク質。
１）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質
２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質
３）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、植物生長促進物質の生合成に関与するタンパク質
（１１）（１０）に記載のいずれかのタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸。
（１２）（１１）に記載の核酸を発現可能に含むベクター。
（１３）（１１）に記載の核酸又は（１２）に記載のベクターで形質転換された微生物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＰＧＰＣ関連遺伝子を有するＰ２３株以外の新たな微生物を利用することができ、植物特にウキクサ科植物の生長を促進させることでバイオマス生産の効率を高めることができる。また、遺伝子工学的手法を用いてＰＧＰＣ関連遺伝子を導入した組換え微生物を作製することで、植物の生長を促進させることのできる微生物種の範囲を拡大することができる他、ＰＧＰＣの効率的な生産又は生長促進が期待される植物に合わせた微生物の利用が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ｐ２３−２７５７〜２７６１を含むＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターをｐＢＢＲ−１  ＭＣＳ−２ベクターに組み込んで得られるｍｃｓ−ｎｏｖの模式図である。
【図２】組換えを行っていないＥ．ｃｏｌｉ、ＡＤＰ１又はＰ２３株を付着させた後に１０日間培養したコウキクサの葉状体数の推移を示すグラフである。
【図３】組換えを行っていないＥ．ｃｏｌｉ、ＡＤＰ１又はＰ２３株を付着させた後に１０日間培養したコウキクサのクロロフィル含量を示すグラフである。
【図４】組換えを行っていないＥ．ｃｏｌｉ、ＡＤＰ１又はＰ２３株を付着させた後に１０日間培養したコウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを示すグラフである。
【図５】Ｐ２３−２７５７〜２７６１が導入された組換え菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｃｓ−ｎｏｖ、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ）又は空のベクターが導入された組換え菌（ＡＤＰ１  ｍｃｓ２）を付着させた後に１０日間培養したコウキクサの葉状体数の推移を示すグラフである。
【図６】Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｃｓ−ｎｏｖ、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ又はＡＤＰ１  ｍｃｓ２を付着させた後に１０日間培養したコウキクサのクロロフィル含量を示すグラフである。
【図７】Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｃｓ−ｎｏｖ、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ又はＡＤＰ１  ｍｃｓ２を付着させた後に１０日間培養したコウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを示すグラフである。
【図８】Ｐ２３株、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ又はＡＤＰ１  ｍｃｓ２の培養上清由来多糖を添加した培養液で１０日間培養したコウキクサの葉状体数の推移を示すグラフである。
【図９】Ｐ２３株、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ又はＡＤＰ１  ｍｃｓ２の培養上清由来多糖を添加した培養液で１０日間培養したコウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを示すグラフである。
【図１０】Ｐ２３−２７５９〜２７６１が導入された組換え菌（ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ３）、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ又はＡＤＰ１  ｍｃｓ２を付着させた後に１０日間培養したコウキクサの葉状体数の推移を示すグラフである。
【図１１】ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ３、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ又はＡＤＰ１  ｍｃｓ２を付着させた後に１０日間培養したコウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを示すグラフである。
【図１２】ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ３、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ又はＡＤＰ１  ｍｃｓ２の培養上清由来多糖を添加した培養液で１０日間培養したコウキクサの葉状体数の推移を示すグラフである。
【図１３】ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ３、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ又はＡＤＰ１  ｍｃｓ２の培養上清由来多糖を添加した培養液で１０日間培養したコウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第１の態様は、下記の１）〜５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物（ただしＰ２３株を除く）を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法に関する。
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
【００１３】
Ｐ２３株は、植物、特にウキクサ科植物の生長を促進する作用を有するＰＧＰＢの一種で、グルコース、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンを構成成分として含む多糖類（以下、ＰＧＰＣ／Ｐ２３と表す）を産生する。
【００１４】
配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、Ｐ２３株からクローニングされた、ＰＧＰＣ／Ｐ２３の生合成に関与するＰＧＰＣ関連遺伝子クラスターを構成する５つの遺伝子にそれぞれコードされているタンパク質、すなわちＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質である。以下、ＰＧＰＣ／Ｐ２３の生合成に関与するＰＧＰＣ関連遺伝子クラスターをＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターと表す。ＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターを含むＰ２３株のゲノム塩基配列はデータベースＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＢＢＱＵ０１００００１２で登録されており、クローニングされたＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターの塩基配列（配列番号６）は、上記アクセッション番号で登録されている塩基配列の１０２，７２５〜１０７，０２６番目に相当する。
【００１５】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、その特徴的なモチーフ配列などから、グリコシルトランスフェラーゼの一種であると推察される。Ｐ２３株におけるこのタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子名Ｐ２３＿２７５７、アクセッション番号ＧＡＭ３２２３３として登録されており、配列番号６の１３０〜９５１番目の塩基配列に相補する塩基配列に相当する。Ｐ２３＿２７５７は、Ｐ２３＿２７５８及びＰ２３＿２７５９の転写方向とは逆向きに配置されている。
【００１６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は他のタンパク質と協同してＰＧＰＣ／Ｐ２３の生合成に関与しているタンパク質である。Ｐ２３株におけるこのタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子名Ｐ２３＿２７５８、アクセッション番号ＧＡＭ３２２３４として登録されており、配列番号６の１，４６１〜１，６７３番目の塩基配列に相当する。
【００１７】
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、その特徴的なモチーフ配列などから、マンノシルトランスフェラーゼの一種であると推察される。Ｐ２３株におけるこのタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子名Ｐ２３＿２７５９、アクセッション番号ＧＡＭ３２２３５として登録されており、配列番号６の１，７０９〜２，６２９番目の塩基配列に相当する。
【００１８】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、その特徴的なモチーフ配列などから、グリコシルトランスフェラーゼの一種であると推察される。Ｐ２３株におけるこのタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子名Ｐ２３＿２７６０、アクセッション番号ＧＡＭ３２２３６として登録されており、配列番号６の２，６４１〜３，５８２番目の塩基配列に相補する塩基配列に相当する。Ｐ２３＿２７６０は、Ｐ２３＿２７５８及びＰ２３＿２７５９の転写方向とは逆向きに配置されている。
【００１９】
配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、その特徴的なモチーフ配列などから、グリコシルトランスフェラーゼの一種であると推察される。Ｐ２３株におけるこのタンパク質をコードする遺伝子は、遺伝子名Ｐ２３＿２７６１、アクセッション番号ＧＡＭ３２２３７として登録されており、配列番号６の３，６２４〜４，２６２番目の塩基配列に相補する塩基配列に相当する。Ｐ２３＿２７６１は、Ｐ２３＿２７５８及びＰ２３＿２７５９の転写方向とは逆向きに配置されている。
【００２０】
ＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターを構成する上記５つの遺伝子について、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴで相同性検索を行った結果を表１に示す。表中、枠で囲われた遺伝子Ｐ２３＿２７５９〜２７６１は既知遺伝子との配列同一性が低く、新規の遺伝子であると考えられる。Ｐ２３＿２７５９〜２７６１はまた、Ｐ２３株と同様にフェノール分解能を持つ近縁種であるアシネトバクター・カルコアセティカスＰＨＥＡ−２及びアシネトバクター・カルコアセティカスＬＢ’−３のゲノム配列上には見出されない、又は配列同一性が低いことが確認されている。
【表１】
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【００２１】
本発明の第１の態様は、Ｐ２３株を除く微生物であって、配列番号１〜５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを発現可能に有する微生物を植物と共存させる工程を含む。
【００２２】
上記「同等のタンパク質をコードする遺伝子」とは、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に関連して、各タンパク質と実質的に同等のタンパク質をコードする遺伝子であり、具体的には、次の通りである。
【００２３】
・配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列又は配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質、特にグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
・配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列又は配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質タンパク質をコードする遺伝子。
・配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列又は配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質、特にマンノシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
・配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列又は配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質、特にグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
・配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列又は配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質、特にグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【００２４】
微生物は、配列番号１〜５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子のうちの少なくとも３つを発現可能に有する微生物が好ましく、配列番号１〜５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子のうちの少なくとも４つを発現可能に有する微生物がより好ましく、配列番号１〜５のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子のうちの５つ全てを発現可能に有する微生物がさらに好ましい。
【００２５】
Ｐ２３株が産生するＰＧＰＣ／Ｐ２３は、グルコース、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミンを構成成分として含む多糖類である。この多糖類は、配列番号１〜５の各アミノ酸配列からなるタンパク質の関与により生合成されていると推察される。本発明の第１の態様においては、ＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターを構成する各遺伝子と同一の遺伝子を有する微生物に限らず、上記タンパク質と同等のタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物も利用することができる。かかる同等の遺伝子を有する微生物が産生するＰＧＰＣは、ＰＧＰＣ／Ｐ２３とは少なくとも一部の構造が異なるＰＧＰＣであって、ＰＧＰＣ／Ｐ２３と同様の植物に対する生長促進作用を示すものであり得る。
【００２６】
微生物を植物と共存させるとは、微生物と植物とを同じ媒体中に存在させることを意味し、微生物が産生するＰＧＰＣが植物に接触することができる限り、微生物と植物とが直接的に接触することを必要としない。例えば、ＰＧＰＣは透過できるが微生物自身は透過できない程度の孔経を持つフィルターで微生物と植物とを隔てて存在させることも、本発明における「微生物を植物と共存させる」に包含される。
【００２７】
「微生物を植物と共存させる」の具体例は、例えば前記微生物が懸濁された液体例えば微生物を培養若しくは懸濁した培養液に植物の根を浸すこと、又は前記微生物の培養液を練り込んだ適当な土壌に植物を植えることなどが挙げられる。特に、微生物を培養又は懸濁した培養液に植物の根を浸すことが好ましく、微生物を懸濁した培養液に植物の根を浸して微生物を根に定着させた後に植物を生長させる、又はかかる培養液に植物の根を浸したまま植物を生長させることが特に好ましい。また、屋外で生息中の水生植物に対して本発明を適用する場合は、植物が生息している水に前記微生物の培養液を混合するなどしてもよい。微生物の数としては、１０４〜１０１０細胞／ｍＬ、好ましくは１０６〜１０８細胞／ｍＬとすればよい。
【００２８】
微生物と共存させる植物の部位は、微生物が産生するＰＧＰＣを感知あるいは吸収することができる部位である限り制限はなく、葉、茎、根（葉状体を含む）などのいずれの部位を微生物と共存させてもよいが、よりＰＧＰＣ吸収能が高い部位、例えば植物の葉又は根を微生物と共存させることが好ましい。
【００２９】
本発明の第１の態様において利用可能な微生物は、ＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスター全体の塩基配列（配列番号６）若しくはこれを構成する各遺伝子の塩基配列をクエリーとした、微生物のゲノム情報に対する相同性検索などのインシリコスクリーニングによって、又は前記塩基配列を有する適当な核酸分子を用いた微生物ゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーション法などによって候補微生物を選択し、さらに例えば前記候補微生物を懸濁した培養液を用いてコウキクサを生長させて、コウキクサの生長が促進されることを確認することで、選択することができる。
【００３０】
植物の生長促進は、植物個体の重量、葉又は葉状体の枚数などの植物の生長度合いの指標について、本発明にかかる微生物を利用せずに植物を生長させたときと比較して、本発明にかかる微生物を利用して植物を生長させたときに生ずる差、例えば植物個体の重量が増加する、葉の枚数が増加するなどを観察することによって確認することができる。具体例としては、適当数例えば葉状体数として１０〜２０枚のコウキクサを浮かべたホーグランド（Ｈｏａｇｌａｎｄ）培地などの植物培養液に微生物を添加して２８℃で一日インキュベートした後に、葉状体２枚ずつを新しい植物培養液に移し、さらに１０日間ほど生長させた後に葉状体数を数え、微生物を添加しないコントロールにおける葉状体数との差を確認すればよい。
【００３１】
本発明の第１の態様の方法が適用される植物としては、浮遊性、抽水性あるいは沈水性などの水生植物、特にウキクサ科植物が好ましい。ウキクサ科植物の例としては、アオウキクサ（Ｌｅｍｎａ）属植物例えばコウキクサ（Ｌ．ｍｉｎｏｒ）、Ｌ．ディスペルマ（Ｌ．ｄｉｓｐｅｒｍａ）、Ｌ．エクアドリエンシス（Ｌ．ｅｃｕａｄｏｒｉｅｎｓｉ）、イボウキクサ、Ｌ．ジャポニカ（Ｌ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、Ｌ．ミニスクラ（Ｌ．ｍｉｎｉｓｃｕｌａ）、Ｌ．オブスクラ（Ｌ．ｏｂｓｃｕｒａ）、Ｌ．ペルプシラ（Ｌ．ｐｅｒｐｕｓｉｌｌａ）、Ｌ．テネラ（Ｌ．ｔｅｎｅｒａ）、ヒンジモ（Ｌ．ｔｒｉｓｕｌｃａ）、Ｌ．ツリオニフェラ（Ｌ．ｔｕｒｉｏｎｉｆｅｒａ）、チリウキクサ（Ｌ．ｖａｌｄｉｖｉａｎａ）など、スピロデラ（Ｓｐｉｒｏｄｅｌａ）属植物例えばＳ．インテルメディア（Ｓ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、Ｓ．ポリリザ、Ｓ．ポンクタタ（Ｓ．ｐｕｎｃｔａｔａ）、ミジンコウキクサ（Ｗｏｌｆｆｉａ）属植物例えばＷａ．アングスタ（Ｗａ．ａｎｇｕｓｔａ）、Ｗａ．アリザ（Ｗａ．ａｒｒｈｉｚａ）、Ｗａ．オーストラリナ（Ｗａ．ａｕｓｔｒａｌｉｎａ）、Ｗａ．ボレアリス（Ｗａ．ｂｏｒｅａｌｉｓ）、Ｗａ．ブラジリエンシス（Ｗａ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｗａ．コロンビアナ（Ｗａ．ｃｏｌｕｍｂｉａｎａ）、Ｗａ．エロンガタ（Ｗａ．ｅｌｏｎｇａｔａ）、Ｗａ．グロバサ（Ｗａ．ｇｌｏｂｏｓａ）、Ｗａ．ミクロスコピア（Ｗａ．ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａ）、Ｗａ．ネグレクタ（Ｗａ．ｎｅｇｌｅｃｔａ）、ウォルフィエラ（Ｗｏｌｆｉｅｌｌａ）属植物例えばＷｌ．カウダタ（Ｗｌ．ｃａｕｄａｔａ）、Ｗｌ．デンティクラタ（Ｗｌ．ｄｅｎｔｉｃｕｌａｔａ）、Ｗｌ．グラディアタ（Ｗｌ．ｇｌａｄｉａｔａ）、Ｗｌ．ヒアリナ（Ｗｌ．ｈｙａｌｉｎａ）、Ｗｌ．リングラタ（Ｗｌ．ｌｉｎｇｕｌａｔａ）、Ｗｌ．レプンダ（Ｗｌ．ｒｅｐｕｎｄａ）、Ｗｌ．ロタンダ（Ｗｌ．ｒｏｔｕｎｄａ）、及びＷｌ．ネオトロピカ（Ｗｌ．ｎｅｏｔｒｏｐｉｃａ）及びランドルティア（Ｌａｎｄｏｌｔｉａ）属植物例えばＬ．ポンクタタ（Ｌ．ｐｕｎｃｔａｔａ）などを挙げることができる。
【００３２】
本発明の第２の態様は、下記の１）〜５）の遺伝子の少なくとも１つを発現可能に導入された微生物を植物と共存させる工程を含む、植物の生長を促進する方法に関する。
１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号１に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号３に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
４）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
５）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸が欠失され若しくは置換されたアミノ酸配列若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列に１〜数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＰＧＰＣの生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子
【００３３】
本発明の第２の態様における「微生物を植物と共存させる工程」及び植物に対する生長促進作用を確認する手段は、本発明の第１の態様において説明したとおりである。
【００３４】
本発明の第２の態様は、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子の少なくとも１つを発現可能に導入された微生物を植物と共存させる工程を含む。
【００３５】
微生物は、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子のうちの少なくとも３つが導入された微生物が好ましく、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子のうちの少なくとも４つが導入された微生物がより好ましく、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子のうちの５つ全てが導入された微生物がさらに好ましい。特に好ましくは、配列番号６に示される塩基配列からなる核酸が導入された微生物である。組み換える前の微生物が配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子及びこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子の幾つかを既に有しているときは、それら以外のタンパク質をコードする遺伝子を選択して導入すればよい。
【００３６】
複数の遺伝子を導入するときは、１のベクターに１又は複数の遺伝子を組み込んで導入することができる。例えば５つ全ての遺伝子を導入する場合、遺伝子を個別に組み込んだ５のベクター、複数の遺伝子を組み込んだ複数のベクター、５つ全ての遺伝子を組み込んだ１のベクターのいずれも用いることができる。ベクターの導入は、ベクター毎に連続して行ってもよく、ベクターの混合物を用いて同時に行ってもよい。
【００３７】
第２の態様において利用される微生物は、外来遺伝子の機能的発現を可能にする適当な宿主ベクター系が知られており、かつ安全性の高い微生物であることが好ましい。そのような微生物としては、非病原性大腸菌、枯草菌、酵母、ＰＧＰＢ例えばアシネトバクター属微生物、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）などのシュードモナス属微生物、セラチア・ホンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）などのセラチア属微生物、又はＰＧＰＦ例えばリゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、フザリウム属微生物又はペニシリウム属微生物などを挙げることができる。また、ＰＧＰＣを生産しないアシネトバクター属微生物、例えばアシネトバクター・ベイリ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ  ｂａｙｌｙｉ）なども利用可能である。特に好ましい微生物は非病原性大腸菌、シュードモナス・プチダ及びアシネトバクター・ベイリである。
【００３８】
配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子は、宿主となる微生物で発現可能な状態で導入されている限り、それぞれ異なるプロモーター配列その他の遺伝子の転写を調節する塩基配列（以下、転写調節領域と表す）の制御下にあるように導入されてもよく、又は複数の遺伝子が一種類の転写調節領域の支配下にあるように導入されてもよい。
【００３９】
また、転写調節領域は、宿主となる微生物ごとに公知の転写調節領域を選択して使用してもよいが、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子をＰＧＰＢ又はＰＧＰＦからクローニングして利用するときは、それぞれに固有の転写調節領域をそのまま使用してもよい。固有の転写調節領域を含む核酸の例は、配列番号６に示される塩基配列からなる核酸である。同様に、配列番号３〜５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はこれらと同等のタンパク質をコードする遺伝子をＰＧＰＢ又はＰＧＰＦからクローニングして利用するときは、それぞれに固有の転写調節領域をそのまま使用してもよい。固有の転写調節領域を含む核酸の例は、配列番号７に示される塩基配列からなる核酸である。
【００４０】
本発明の第２の態様にかかる微生物は、前記遺伝子をコードする塩基配列を含む核酸又はこれを組み込んだ発現ベクターによって前記微生物を形質転換した、組換え微生物である。発現ベクターは宿主内で前記遺伝子を一過性又は安定的に発現させることができるベクターであり、宿主となる微生物に応じて、例えばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどから適宜選択すればよい。また例えばｐＢＢＲ−１  ＭＣＳ−２などの広域宿主発現ベクターを利用することもできる。
【００４１】
核酸の調製、組換え、微生物の形質転換などの実験的操作は、いずれも当業者に公知又は周知の手法、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによる「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ」（１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）その他の、当分野の教科書又はハンドブックに記載され、当業者に広く利用されている手法を用いて行うことができる。また、市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、当該キットや試薬の製造者が定めたプロトコル及び／又はパラメータに従って行えばよい。
【００４２】
本発明の第３の態様は、前記第１の態様で説明した微生物（ただしＰ２３株を除く）を増殖させる工程を含む、ＰＧＰＣすなわち植物生長促進物質の製造方法に関する。また、本発明の第４の態様は、前記第２の態様で説明した組換え微生物を増殖させる工程を含む、ＰＧＰＣの製造方法に関する。
【００４３】
第３の態様及び第４の態様いずれの方法も、前記第１の態様で説明した微生物（ただしＰ２３株を除く）又は前記第２の態様で説明した組換え微生物を適当な培地を用いて増殖させることにより、微生物にＰＧＰＣを生産させる方法である。
【００４４】
ＰＧＰＣ／Ｐ２３は、液体培地で増殖させた上記微生物の菌体を除去した培養上清に硫酸アンモニウム等を加えた塩濃度５０％での塩析、沈殿物に水を添加した後の脱塩、フェノールを添加した攪拌抽出による除タンパク質、抽出後の水層に塩化ナトリウム及び１〜５倍量程度のエタノールを加えたエタノール沈殿、及び沈殿物に水を添加した後の脱塩によって調製することができる。ＰＧＰＣ／Ｐ２３以外のＰＧＰＣも、この方法又はこの方法に準じて調製することができる。また、ＰＧＰＣの植物に対する生長促進作用は、前記第１の態様において植物の生長促進を確認する方法に従い、微生物の代わりに適当量の例えば５〜２０μｇ／ｍＬとなるような量のＰＧＰＣを添加することで確認することができる。
【００４５】
上記方法で調製されたＰＧＰＣは、適当量の液体、例えば水若しくは緩衝液に懸濁若しくは溶解した状態で保存してもよく、又は凍結乾燥させて保存してもよい。
【００４６】
本発明の第５の態様は、前記第２の態様において説明した配列番号３〜５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びこれらと同等のタンパク質に関する。また、かかるタンパク質をコードする核酸、該核酸を発現可能に含む発現ベクター、該核酸又は発現ベクターで形質転換された微生物も本発明として提供される。発現ベクター又は微生物の種類は、前記第２の態様において説明したとおりであり、核酸の調製、組換え、微生物の形質転換などの実験的操作も、本発明の第２の態様で説明したとおりに当業者に広く利用されている手法を用いて行うことができる。
【００４７】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４８】
＜実施例１＞ＰＧＰＣ／Ｐ２３遺伝子クラスターのクローニング及び組換え菌の作製
データベースＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＢＢＱＵ０１００００１２で登録されているＰ２３株のゲノム塩基配列を元に、Ｐ２３−２７５７〜２７６１の５つの遺伝子を含む配列番号６に示される塩基配列を増幅できるように、配列番号８及び９に示される塩基配列からなるプライマーセット（Ｆｎｏｖ及びＲｐ２３ｎｏｖ）を作製した。【００４９】
Ａ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ  Ｐ２３の培養菌体から調製したゲノムＤＮＡに対して前記プライマーセット及びＫＯＤポリメラーゼを用いたＰＣＲを行い、約４．５ｋｂｐの増幅断片を得た。これを制限酵素ＳｍａＩで開環させた広域宿主ベクターｐＢＢＲ−１  ＭＣＳ−２（Ｋｏｖａｃｈ  ＭＥ  ら  Ｇｅｎｅ、１９９５年、第１６６巻、第１７５〜１７６ページ）に組み込んで、Ｐ２３−２７５７〜２７６１の５つの遺伝子を有するプラスミドｍｃｓ−ｎｏｖを作製した。このプラスミドのインサート部分について塩基配列解析を行い、図１に示す方向で５つの遺伝子が導入されていることを確認した。【００５０】
プラスミドｍｃｓ−ｎｏｖを塩化カルシウム法でＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α株に導入して形質転換させ、Ｐ２３−２７５７〜２７６１の５つの遺伝子を有する組換え菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｃｓ−ｎｏｖを作製した。さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｃｓ−ｎｏｖをＬＢ培地で培養して菌体からプラスミドを回収し、これをＡ．ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ−１に導入して、組換え菌ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖを作製した。上記５遺伝子を持たない空のベクターｐＢＢＲ−１  ＭＣＳ−２を導入したＡ．ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ１（ＡＤＰ１  ｍｃｓ２）も同様に作製した。【００５１】
＜実施例２＞組換え菌の植物生長促進活性評価
実施例１で作製したＥ．ｃｏｌｉ  ｍｃｓ−ｎｏｖ、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ及びＡＤＰ１  ｍｃｓ２の各組換え菌、並びに組換えを行っていないＥ．ｃｏｌｉ、ＡＤＰ１株及びＰ２３株について、コウキクサに対する生長促進活性の評価を行った。【００５２】
２−１．組換えを行っていないＥ．ｃｏｌｉ、ＡＤＰ１株及びＰ２３株の評価
１００ｍＬ容の培養フラスコにホーグランド培地５０ｍＬを分注し、これにホーグランド培地中で予め培養した滅菌コウキクサの葉状体２０枚を入れた。組換えを行っていないＥ．ｃｏｌｉ、ＡＤＰ１株及びＰ２３株を最終ＯＤ＝０．３（約１０８細胞／ｍＬ）になるように接種した後、３日間培養した。培養条件を以下に示す。以降、特に指定がない限り、同じ条件で培養を行った。
植物培養液：ホーグランド培地（表２）
【表２】
2017002929.tif 000004
温度：２８℃
相対湿度：６０〜７０％
１６時間の明期（５０００ルクス）／８時間の暗期【００５３】
培養終了後、４０ｍＬの新たなホーグランド培地を入れたチューブに植物を移し、チューブを２回反転させることにより非付着菌を洗浄除去した。この洗浄操作を２回行った後、２枚の葉状体を有する１個の植物体を、５０ｍＬのホーグランド培地を分注した１００ｍＬ容培養フラスコに移し、１０日間培養した。培養期間中は葉状体の数を２日毎に計数し、試験終了時にクロロフィル含量、植物の湿重量及び根の長さを測定した。クロロフィル含量の測定は、Ｓｕｚｕｋｉ  Ｗら、Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ．１１８（１）：４１−４に記載の方法により行った。【００５４】
結果を図２〜図４に示す。既に報告されているように、Ｐ２３株を付着させて培養したコウキクサは、菌を付着させずに培養したコントロール及びＥ．ｃｏｌｉ又はＡＤＰ１を付着させて培養した場合と比べて、葉状体の数、クロロフィル含量、湿重量が大きく増加した。なお、根に付着した菌数は、Ｐ２３株及びＡＤＰ１が約１０６ｃｆｕ／植物個体、Ｅ．ｃｏｌｉが約１０４ｃｆｕ／植物個体であった。【００５５】
２−２．組換え菌の評価
Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｃｓ−ｎｏｖ、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ及びＡＤＰ１  ｍｃｓ２が有する植物生長促進活性について、使用するホーグランド培地にカナマイシン（終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＰＴＧ（終濃度０．５ｍＭ）を添加した以外は上記２−１．と同様の方法で評価した。【００５６】
結果を図５〜図７に示す。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｃｓ−ｎｏｖ又はＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖを付着させて培養したコウキクサは、菌を付着させずに培養したコントロール及び空ベクターを導入したＡＤＰ１  ｍｃｓ２を付着させて培養した場合と比べて、葉状体の数、クロロフィル含量及び湿重量が増加し、その傾向はＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖにおいて特に顕著であった。ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖでは根の長さの増加も観察された。この結果から、Ｐ２３−２７５７〜２７６１を導入された菌は、植物生長促進活性を有することが示された。【００５７】
＜実施例３＞組換え菌により産生された多糖の植物生長促進活性評価
Ｐ２３株並びに実施例１で作製したＡＤＰ１  ｍｃｓ２及びＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖを、表３に示すＭ９Ｓ培地中で、３０℃、３日間、１２０ｒｐｍで振盪しながら培養し、１．５Ｌの培養上清を得た。
【表３】
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この培養上清に３１３ｇの硫酸アンモニウム（５０％飽和）を加え、４℃で一晩置いた後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）により沈殿を回収した。沈殿を２０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に懸濁し、３ＬのＭｉｌｌｉＱ水に対して透析を行った。透析中、少なくとも５回水を交換した。透析後、予め６５℃に加温した９０％フェノール２０ｍＬを加え、激しく撹拌した後に６５℃で１５分間維持した後、氷浴中で冷却し、遠心分離（５０００ｒｐｍ、３０分間、１０℃）により層を分離した。水層を回収し、残ったフェノール層及び中間層に予め６５℃に加熱した水を加え、上記のフェノール抽出操作を再度行った。回収した水層を合わせ、１０分の１量の１Ｍ  ＮａＣｌ及び５倍量の冷エタノールを加えた後、遠心分離（７５００ｒｐｍ、１５分間、４℃）により沈殿を回収した。沈殿を７０％エタノールで２回洗浄した後、ＭｉｌｌｉＱ水に懸濁し、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）により脱塩した。これを凍結乾燥して、多糖抽出物（ＰＳ）を得た。Ｐ２３株の培養上清から得たＰＳは６ｍｇ、ＡＤＰ１  ｍｃｓ２の培養上清から得たＰＳは１．５ｍｇ、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ培養上清から得たＰＳは２．０ｍｇであった。【００５８】
次いで、これらのＰＳの植物生長促進活性を評価した。評価は、菌を接種する代わりにＰＳを終濃度１０μｇ／ｍＬで添加した以外は、上記２−１．と同様の方法で実施した。【００５９】
結果を図８及び図９に示す。ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖのＰＳは、菌を接種せずに培養したコントロール及びＡＤＰ１  ｍｃｓ２のＰＳと比べて、コウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを増加させ、その活性の強さはＰ２３株のＰＳと同等であった。この結果から、Ｐ２３−２７５７〜２７６１の導入により、Ｐ２３のＰＧＰＣと同等の活性を持つＰＧＰＣの産生が誘導されることが示された。【００６０】
＜実施例４＞Ｐ２３−２７５９〜２７６１の３遺伝子を導入した組換え菌の作製
実施例１と同様に、Ｐ２３−２７５９〜２７６１の３つの遺伝子を含む領域を配列番号１０及び９に示される塩基配列からなるプライマーセット（Ｆｐ２３ｎｏｖ及びＲｐ２３ｎｏｖ）を用いたＰＣＲで増幅し、制限酵素ＳｍａＩで開環させた広域宿主ベクターｐＢＢＲ−１  ＭＣＳ−２に組み込んで、プラスミドｍｃｓ−ｎｏｖ３を作製し、これをＡ．ｂａｙｌｙｉ  ＡＤＰ−１に導入して、組換え菌ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ３を作製した。プラスミドｍｃｓ−ｎｏｖ３中の前記３遺伝子の向きは、プラスミドｍｃｓ−ｎｏｖのそれと同じであった。【００６１】
＜実施例５＞Ｐ２３−２７５９〜２７６１の３遺伝子を有する組換え菌の植物生長促進活性評価
ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ３、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ及びＡＤＰ１  ｍｃｓ２が有する植物生長促進活性について、ホーグランド培地に添加するＩＰＴＧの終濃度を０．０２ｍＭとした以外は実施例２の２−２．と同様の方法で評価した。結果を図１０及び図１１に示す。ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ３を付着させて培養したコウキクサは、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖを付着させて培養した場合には及ばないものの、菌を付着させずに培養したコントロール及び空ベクターを導入したＡＤＰ１  ｍｃｓ２を付着させて培養した場合と比べて葉状体の数及び湿重量が増加した。また、プラスミドｍｃｓ−ｎｏｖ３をＥ．ｃｏｌｉに導入して得た組換え菌についても同様の傾向が認められた。この結果から、Ｐ２３−２７５９〜２７６１を導入された菌もまた、植物生長促進活性を有することが示された。【００６２】
＜実施例６＞Ｐ２３−２７５９〜２７６１の３遺伝子を有する組換え菌により産生された多糖の植物生長促進活性評価
ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ３、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ及びＡＤＰ１  ｍｃｓ２を、カナマイシン（終濃度５０μｇ／ｍＬ）及びＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加した３００ｍＬのＭ９Ｓ培地中で、３０℃、３日間、１１０ｒｐｍで振盪しながら培養し、遠心分離及びろ過により培養上清を得た。この培養上清を硫酸アンモニウム沈殿（５０％飽和）、透析、凍結乾燥、熱フェノール抽出処理に順に供し、多糖抽出物（ＰＳ）を得た。個々の操作は実施例３と同様に行った。ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖの培養上清から得たＰＳは２．５ｍｇ、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ３の培養上清から得たＰＳは２．３ｍｇ、ＡＤＰ１  ｍｃｓ２の培養上清から得たＰＳは２．０ｍｇであった。【００６３】
次いで、これらのＰＳの植物生長促進活性を実施例３と同様に評価した。結果を図１２及び図１３に示す。ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖ３のＰＳは、ＡＤＰ１  ｍｃｓ−ｎｏｖのＰＳと同じように、菌を接種せずに培養したコントロール及びＡＤＰ１  ｍｃｓ２のＰＳと比べてコウキクサの葉状体数、湿重量及び根の長さを増加させた。この結果から、Ｐ２３−２７５９〜２７６１の導入によって、Ｐ２３−２７５７〜２７６１の導入と同程度にＰＧＰＣの産生が誘導されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、ＰＧＰＣ関連遺伝子を有するＰ２３株以外の新たな微生物、又は遺伝子工学的手法を用いてＰＧＰＣ関連遺伝子を導入した組換え微生物を利用することで植物の生長を促進させることができ、バイオマス生産における産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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