(57)【要約】マンノース転移酵素遺伝子、当該遺伝子を構成するＤＮＡ、このような遺伝子やＤＮＡが翻訳されてなるタンパク質、前記マンノース転移酵素遺伝子が導入された組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体、および前記形質転換体を用いた１−Ｏ−β−マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法を提供する。マンノースとエリスリトールとから１−Ｏ−β−ＭＥを生合成する、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むマンノース転移酵素遺伝子を使用する。この遺伝子を導入して組換えベクターを作成し、４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌を形質転換する。得られた形質転換体を培養すると、１−Ｏ−β−ＭＥＬが生産される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノースとエリスリトールとから、下記式に示す１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシルエリスリトールを生合成するマンノース転移酵素をコードする遺伝子であって、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、マンノース転移酵素遺伝子。
【化１】
2016189988.tif 000008
【請求項２】
前記マンノース転移酵素は、配列番号６、配列番号７および／または配列番号８に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のマンノース転移酵素遺伝子。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載されるマンノース転移酵素遺伝子が導入された、組換えベクター。
【請求項４】
下記式で示される４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシルエリスリトールを生合成する菌のマンノース転移酵素活性を失活させた４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシルエリスリトールリピッド非生産菌を、請求項３に記載の組換えベクターを用いて形質転換したことを特徴とする形質転換体。
【化２】
2016189988.tif 000009
【請求項５】
前記４−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシルエリスリトールを生合成する菌が、下記式で示す４−Ｏ−β−マンノシルエリスリトールリピッドを生産する菌であることを特徴とする、請求項４に記載の形質転換体。
【化３】
2016189988.tif 000010
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３〜１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ５は、水素原子または炭素原子数３〜１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。）
【請求項６】
請求項４または５記載の形質転換体を培養することを特徴とする、下記式で示す１−Ｏ−β−マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【化４】
2016189988.tif 000011
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３〜１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ５は、水素原子または炭素原子数３〜１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。）
【請求項７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項８】
配列番号１と９０％以上の同一性を有することを特徴とする、請求項７記載のタンパク質。
【請求項９】
配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項１０】
配列番号２と９０％以上の同一性を有することを特徴とする、請求項９記載のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マンノース転移酵素をコードするマンノース転移酵素遺伝子、当該遺伝子を構成するＤＮＡ、このような遺伝子やＤＮＡが翻訳されてなるタンパク質、前記マンノース転移酵素遺伝子が導入された組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体、および前記形質転換体を用いた１−Ｏ−β−マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオサーファクタントは微生物が生産する天然の界面活性剤であり、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能も有する。食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等で使用すれば、環境調和型の社会を実現する上で有意義である。このようなバイオサーファクタントとして、従来から、マンノースにアルジトールがβグリコシド結合してマンノシルエリスリトール（以下、ＭＥとも称す。）を形成し、更に脂肪酸がエステル結合したマンノシルアルジトールリピッドが存在する。アルジトールがエリスリトールである化合物は、マンノシルエリスリトールリピッド（以下、ＭＥＬとも称す。）と称されている（特許文献１）。特許文献１では、大豆油やグルコースなどを添加した培地でシュードザイマ・ヒュベイエンシスＫＭ−５９株を培養し、ＭＥＬを得ている。ＭＥＬは、構成する糖アルコールとしてエリスリトールを含むが、培地にエリスリトールを添加することなく合成されるため、培地に添加した大豆油やグルコースを資化して栄養源として生育し、その際に副生されたエリスリトールを利用してＭＥＬを生産すると理解される。【０００３】
ＭＥＬを生合成する微生物の中には、ＭＥＬ生合成遺伝子クラスターを有するものがある。例えば、ウスティラゴ・マイディス（Ustilago maydis）の第７染色体には、マンノースとエリスリトールを結合してＭＥを生成する反応を触媒するマンノシルトランスフェラーゼ（Ｅｍｔ１ｐ）、脂質をＭＥに結合させるアシルトランスフェラーゼ（Ｍａｃ１ｐ、Ｍａｃ２ｐ）、アセチル基をＭＥに結合させるアセチルトランスフェラーゼ（Ｍａｔ１ｐ）、ＭＥＬを菌体外に分泌する推定トランスポーター（ｍｍｆ１）をコードする遺伝子で構成される遺伝子クラスターが存在する（非特許文献１）。【０００４】
図７に、水素原子、アセチル基、または炭素数３〜１８の脂肪酸残基をＲ１〜Ｒ５で示したＭＥＬの構造式を示す。ＭＥＬには結合する脂肪酸残基やアセチル基の位置や数等が相違する種々の構造が存在する。Ｒ３およびＲ４がアセチル基である構造物はＭＥＬ−Ａ、Ｒ３が水素原子でありＲ４がアセチル基である構造物はＭＥＬ−Ｂ、Ｒ３がアセチル基でありＲ４が水素原子である構造物はＭＥＬ−Ｃ、Ｒ３およびＲ４が水素である構造物はＭＥＬ−Ｄと定義されている。微生物や培地組成によって生成するＭＥＬが異なり、例えば、シュードザイマ・アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）やシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）は、大豆油、グルコース、またはｎ−アルカンを含む培地で培養するとＭＥＬ−Ａを主成分とし、その他ＭＥＬ−ＢおよびＭＥＬ−Ｃを含むＭＥＬを生産する（非特許文献１）。【０００５】
一方、ＭＥＬ生合成経路を欠損させたシュードザイマ（Pseudozyma）属酵母も開発されている(特許文献３）。シュードザイマ属は、ＭＥＬを多量に生産するためＭＥＬ生合成に消費されるエネルギーが大きい。ＭＥＬ生合成経路を欠損させることで、ＭＥＬ生合成系の消費エネルギーを異種タンパク質の生産に振り向けさせるというものである。実施例では、シュードザイマ・アンタークティカを使用し、ＭＥＬの糖骨格であるＭＥの合成反応を触媒するマンノーストランスフェラーゼをコードする遺伝子（以下、ＰａＥＭＴ１遺伝子とも称する。）を相同遺伝子組換法により欠損させ、ＭＥＬ生合成系遺伝子欠損型シュードザイマ属酵母を得ている。シュードザイマ・アンタークティカは、大豆油やグルコースを含有する培地で培養するとＭＥＬを生産するが、前記ＭＥＬ生合成系遺伝子欠損型シュードザイマ属酵母は、同条件で培養してもＭＥＬを生産しないという。【０００６】
ここで、エリスリトールは、図８（ａ）に示す炭素数４の糖アルコールであり、炭素鎖の両端にＣＨ２ＯＨ基を有している。ＤＬ表記法によれば、エリスリトールはＤＬ同一構造である。ただし、マンノースと結合するエリスリトールのヒドロキシメチル基が１位の炭素に由来するか、４位の炭素に由来するかによって、得られるＭＥの構造は、図８（ｂ）、（ｃ）に示すように相違する。前記特許文献１に記載されるシュードザイマ・ヒュベイエンシスＫＭ−５９株は、同図（ｂ）に示される、４−Ｏ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ（以下、この化合物を４−Ｏ−β−ＭＥとも称する。）を糖骨格とする化合物を生成する。得られる４−Ｏ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  Ｌｉｐｉｄを４−Ｏ−β−ＭＥＬとも称する。【０００７】
上記した４−Ｏ−β−ＭＥに対し、図８（ｃ）に示すように、１−Ｏ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ（以下、１−Ｏ−β−ＭＥとも称する。）を糖骨格とする１−Ｏ−β−Ｄ−ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  Ｌｉｐｉｄを製造する微生物もある（特許文献２）。便宜のため、この化合物を１−Ｏ−β−ＭＥＬとも称する。シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）を、オリーブ油を含む培地で培養したところ、１−Ｏ−β−ＭＥＬが生成されたという。この１−Ｏ−β−ＭＥＬは、４−Ｏ−β−ＭＥＬと比べて水和性が向上し、ベシクル形成能も高く、スキンケア剤などとして有望なバイオ素材となるという。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４９７８９０８号公報
【特許文献２】特開２０１１−１８２７４０号公報
【特許文献３】特開２０１１−１７２５２６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｎｎｏｓｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ  ｌｉｐｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ”，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３），Ｖｏｌ．９７，Ｐ．４６９１−４７００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
１−Ｏ−β−ＭＥＬが４−Ｏ−β−ＭＥＬよりも水和性に優れることは、マンノースに結合するエリスリトールの立体構造によってＭＥＬの特性が相違することを意味する。更に、１−Ｏ−β−ＭＥＬを構成する脂肪酸残基の数、アセチル基の導入位置などによって、ＭＥＬの水和性も異なるため、種々のＭＥＬを自在に製造できれば更なる用途の開発が可能となる。しかしながら、酵母を用いたＭＥＬの製造技術として培養条件に基づく種々の改良が重ねられているが、基本的に生産菌に依存するものであり、生産性に限界がある。特に１−Ｏ−β−ＭＥＬを生産しうる微生物は少なく、シュードザイマ・ツクバエンシスに依存しているのが現状である。しかも、シュードザイマ・ツクバエンシスは、ＭＥＬ−Ｂを主生成物とするが、ＭＥＬ−Ａはほとんど生合成することができない。従来の微生物を使用して目的のＭＥＬを生産するために、１−Ｏ−β−ＭＥＬを生合成しうる技術の開発が望まれる。【００１１】
ＭＥＬ生合成遺伝子クラスターを構成する遺伝子の中で、１−Ｏ−β−ＭＥＬの生産に直接関与する酵素として、マンノースとエリスリトールを結合してＭＥを生成する反応を触媒するマンノシルトランスフェラーゼがある。１−Ｏ−β−ＭＥＬを生合成できるマンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を使用すれば、従来の微生物を使用して１−Ｏ−β−ＭＥＬを生合成させることができる。したがって、１−Ｏ−β−ＭＥＬを生合成するための、マンノース転移酵素遺伝子、当該遺伝子を構成するＤＮＡ、このような遺伝子やＤＮＡが翻訳されてなるタンパク質の開発が望まれる。【００１２】
更に、このようなマンノース転移酵素遺伝子が導入された、組換えベクターや、前記組換えベクターを用いて形質転換してなる形質転換体、更には前記形質転換体を培養してなる１−Ｏ−β−ＭＥＬの製造方法の開発が望まれる。【００１３】
本発明は上記事情に鑑みなされたもので、１−Ｏ−β−ＭＥＬ生合成に関与するマンノース転移酵素遺伝子、当該遺伝子を構成するＤＮＡ、このような遺伝子やＤＮＡが翻訳されてなるタンパク質を提供することを目的とする。【００１４】
更に、本発明は、前記マンノース転移酵素遺伝子を導入した組換えベクター、前記組換えベクターを用いて形質転換してなる形質転換体、および前記形質転換体を培養してなる１−Ｏ−β−ＭＥＬの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ＭＥＬ生合成のための微生物の培養条件およびＭＥＬ生合成遺伝子クラスター、並びにＭＥＬ生産菌のマンノース転移酵素を詳細に検討した結果、１−Ｏ−β−ＭＥＬを生産するシュードザイマ・ツクバエンシスのマンノース転移酵素には、特有のアミノ酸配列が存在すること、このようなアミノ酸配列を有するマンノース転移酵素をコードする遺伝子は、１−Ｏ−β−ＭＥＬを生合成するためのマンノース転移酵素遺伝子として使用できること、このような遺伝子を導入して組換えベクターを作成し、この組換えベクターを用いて４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌を形質転換すると、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌の特性を維持しつつ、４−Ｏ−β−ＭＥＬに代えて１−Ｏ−β−ＭＥＬを生産しうることを見出し、本発明を完成させた。【００１６】
すなわち本発明は、マンノースとエリスリトールとから、下記式に示す１−Ｏ−β−Ｄ−マンノピラノシルエリスリトールを生合成するマンノース転移酵素をコードする遺伝子であって、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、マンノース転移酵素遺伝子を提供するものである。【００１７】
【化１】
2016189988.tif 000002
【００１８】
また、本発明は、前記マンノース転移酵素が、配列番号６、配列番号７および／または配列番号８に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記マンノース転移酵素遺伝子を提供するものである。【００１９】
また、本発明は、上記マンノース転移酵素遺伝子が導入された、組換えベクターを提供するものである。【００２０】
また本発明は、下記式で示される４−Ｏ−β−ＭＥを生合成する菌のマンノース転移酵素活性を失活させた４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌を、上記組換えベクターを用いて形質転換したことを特徴とする形質転換体を提供するものである。【００２１】
【化２】
2016189988.tif 000003
【００２２】
また、本発明は、前記４−Ｏ−β−ＭＥを生合成する菌が、下記式で示す４−Ｏ−β−ＭＥＬを生産する菌であることを特徴とする、前記形質転換体を提供するものである。【００２３】
【化３】
2016189988.tif 000004
【００２４】
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３〜１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ５は、水素原子または炭素原子数３〜１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。）
更に本発明は、前記形質転換体を培養することを特徴とする、下記式で示す１−Ｏ−β−ＭＥＬの製造方法を提供するものである。【００２５】
【化４】
2016189988.tif 000005
【００２６】
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３〜１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ５は、水素原子または炭素原子数３〜１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。）
加えて本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および前記配列番号１と９０％以上の同一性を有することを特徴とするタンパク質を提供するものである。【００２７】
また本発明は、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および前記配列番号２と９０％以上の同一性を有することを特徴とするＤＮＡを提供するものである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によって、１−Ｏ−β−ＭＥＬを生産できるマンノース転移酵素遺伝子が提供される。前記マンノース転移酵素遺伝子を含有する組換えベクターを調製し、該組換えベクターにより、４−Ｏ−β−ＭＥを生合成するマンノース転移酵素活性を失活させた４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌を形質転換することで、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌を用いて１−Ｏ−β−ＭＥＬを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】シュードザイマ・アンタークティカがＭＥＬ生産能を有し、当該シュードザイマ・アンタークティカのマンノース転移酵素をコードする遺伝子を破壊したＭＥＬ非生産株がＭＥＬ生産能を欠失したことを示すＴＬＣの図である。符号１は、ＭＥＬ生産菌の生産物を、符号２は、ＭＥＬ非生産菌の生産物を示す。
【図２】遺伝子発現ベクターｐＵＸＶ１−ＰｔＥＭＴ１の構造を示す図である。
【図３】遺伝子発現ベクターｐＵＸＶ１−ＰｔＥＭＴ１で形質転換されたＭＥＬ非生産株が、ＭＥＬの生産能を回復したことを示す図である。
【図４】遺伝子発現ベクターｐＵＸＶ１−ＰｔＥＭＴ１で形質転換されたＭＥＬ非生産菌から生産されたＭＥＬ精製物を薄層クロマトグラフィーで検出した結果を示す図である。
【図５】４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌が生産したＭＥＬと、形質転換体が生産したＭＥＬの１Ｈ−ＮＭＲ解析結果を示す図である。
【図６】４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌が生産したＭＥＬと、形質転換体が生産したＭＥＬの１３Ｃ−ＮＭＲ解析結果を示す図である。
【図７】ＭＥＬの構造を説明する図である。
【図８】エリスリトールの構造と、１位のＣＨ２ＯＨ基、または４位のＣＨ２ＯＨ基とマンノースとがβグリコシド結合した場合に、ＭＥＬの糖骨格の立体構造が異なることを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の第一は、マンノースとエリスリトールとから、１−Ｏ−β−ＭＥを生合成するマンノース転移酵素をコードする遺伝子であって、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むことを特徴とするマンノース転移酵素遺伝子、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および前記配列番号１と９０％以上の同一性を有することを特徴とするタンパク質、並びに、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および前記配列番号２と９０％以上の同一性を有することを特徴とするＤＮＡである。また、本発明の第二は、前記マンノース転移酵素遺伝子を導入した組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体、および前記形質転換体を用いた１−Ｏ−β−ＭＥＬの製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
（１）１−Ｏ−β−ＭＥＬ
本発明で製造される１−Ｏ−β−ＭＥＬは、下記式で示される。エリスルトールがマンノースにβグリコシド結合した１−Ｏ−β−ＭＥに、１〜４個の脂肪酸がエステル結合してなる化合物である。式中、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３〜１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ５は、水素原子または炭素原子数３〜１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。なお、本願明細書において、Ｒ３およびＲ４がアセチル基である構造物をＭＥＬ−Ａ、Ｒ３が水素原子でありＲ４がアセチル基である構造物をＭＥＬ−Ｂ、Ｒ３がアセチル基でありＲ４が水素原子である構造物をＭＥＬ−Ｃ、Ｒ３およびＲ４が水素である構造物をＭＥＬ−Ｄと称する。１−Ｏ−β−ＭＥＬは、主としてシュードザイマ・ツクバエンシスによって製造されてきたが、シュードザイマ・ツクバエンシスが生産する１−Ｏ−β−ＭＥＬはＭＥＬ−Ｂに限定されていた。また、シュードザイマ・ツクバエンシスが生産する１−Ｏ−β−ＭＥＬに含まれる脂肪酸残基は２または３に限定され、脂肪酸残基が１のものは存在しなかった。しかしながら、本発明で製造される１−Ｏ−β−ＭＥＬは、脂肪酸残基数が２または３に限定されず、かつアセチル基の配置もＭＥＬ−Ｂに限定されない。したがって、従来存在しない脂肪酸残基が３本鎖の１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ａや１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｃ、脂肪酸残基が１本鎖の１−Ｏ−β−ＭＥＬなどの新規化合物も含まれる。
【００３２】
【化５】
2016189988.tif 000006
【００３３】
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３〜１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ５は、水素原子または炭素原子数３〜１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。）
（２）マンノース転移酵素遺伝子
エリスリトールは炭素鎖の両端にＣＨ２ＯＨ基を有するため、何れのＣＨ２ＯＨ基とマンノシル基とがβ結合するかによって生産されるＭＥＬの立体構造が相違する。シュードザイマ・ヒュベイエンシスＫＭ−５９株が生成するＭＥＬは、図８（ｂ）に示される４−Ｏ−β−ＭＥを糖骨格とし、シュードザイマ・ツクバエンシスが生成するＭＥＬは、図８（ｃ）１−Ｏ−β−ＭＥを糖骨格とする。これらＭＥＬ生産菌は、マンノースにエリスルトールをβグリコシド結合する際に、エリスリトールの立体構造を認識して、１−Ｏ−β−ＭＥまたは４−Ｏ−β−ＭＥを生産すると推定される。一実施形態において、本発明では、ＭＥＬ生合成遺伝子クラスターを構成する遺伝子の中から、マンノースとエリスリトールとを結合してＭＥを生合成するマンノース転移酵素を選択し、１−Ｏ−β−ＭＥＬを製造するための遺伝子として使用する。
【００３４】
配列番号１に、シュードザイマ・ツクバエンシスのマンノース転移酵素のアミノ酸配列を示す。このマンノース転移酵素は、マンノースとエリスリトールとから１−Ｏ−β−ＭＥを生合成する反応を触媒する。一実施形態において、本発明では、配列番号１に示すアミノ酸配列の他、配列番号１と６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列をコードする遺伝子を好ましく使用することができる。一実施形態において、前記マンノース転移酵素が有するアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列とは異なることが好ましい。例えば、一実施形態において、前記マンノース転移酵素が有するアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されていることが好ましい。
【００３５】
アミノ酸配列の同一性は、市販の又はインターネットを通じて利用可能な解析ツール（例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェア）を用いて計算することができる。例えば、BLAST検索を初期条件で行うことにより同一性を測定することができる。BLAST検索の初期条件とは、例えば、次の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、及びLambda ratioをそれぞれ 11、1、0.85（デフォルト値）にして、他の各種パラメータもデフォルト値に設定して検索を行うことにより、アミノ酸配列の同一性の値（％）を算出することができる。
【００３６】
配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、各種タンパク質に関するアミノ酸配列が保存されている各種公知のデータベースから、解析ソフトにてアッセンブルを行い選択することができる。配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列として、例えば、ウスティラゴ・ホルデイ（Ustilago hordei）のＵＨＯＲ  ０４８７６タンパク質、メラノプシディウム・ペンシルバニカム（Melanopsichium pennsylvanicum）やスポリソリウム・レイリアヌム（Sporisorium reilianum）由来タンパク質、ウスティラゴ・マイディスのエリスリトール−マンノシル−トランスフェラーゼや、シュードザイマ・アフィディスのマンノシルトランスフェラーゼ、シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）やシュードザイマ・アンタークティカのグリコシルトランスフェラーゼ等がある。これらはいずれもアミノ酸数６００〜６２０のアミノ酸配列のタンパク質である。
【００３７】
上記した配列番号１と６０％以上の同一性を有するタンパク質の各アミノ酸配列を詳細に比較検討したところ、配列番号１で示すシュードザイマ・ツクバエンシス由来のマンノース転移酵素には、４−Ｏ−β−ＭＥを生合成する微生物のマンノース転移酵素と相違する、特徴的なアミノ酸配列が含まれることが判明した。このアミノ酸配列を配列番号６、配列番号７、配列番号８に示す。同一性評価のための検索結果は、データベースによって選択された各タンパク質のアミノ酸配列が相互に近似するように、適宜「−」が挿入された配列で表示される。配列番号１で示すアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸を第１アミノ酸とすると、配列番号６は、Ｎ末端から第２７１〜３００番目のアミノ酸配列であり、配列番号７は、同第３６９〜３９８番目のアミノ酸配列であり、配列番号８は、同第５６９〜６１２番目のアミノ酸配列に相当する。配列番号１と６０％以上の同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列は複数存在するが、前記３つの領域以外のアミノ酸配列（即ち、Ｎ末端から第２７０番目までのアミノ酸配列、同３０１〜３６８番目、および同第３９９〜５６８番目までのアミノ酸配列）は相互に極めて近似することが判明した。したがって、配列番号１と６０％以上の同一性を有し、かつ配列番号６、配列番号７、配列番号８に示すアミノ酸配列の少なくとも１の配列を有するタンパク質は、マンノースにエリスルトールをβグリコシド結合させて１−Ｏ−β−ＭＥを生合成できる可能性が極めて高い。本発明で使用するマンノース転移酵素遺伝子は、配列番号１と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子であってもよく、マンノースにエリスルトールをβグリコシド結合させて１−Ｏ−β−ＭＥを生合成できることを条件に、配列番号１と６０％以上の同一性を有するもの、より好ましくは配列番号６、配列番号７および／または配列番号８のアミノ酸配列を含むものをコードする遺伝子を広く使用することができる。なお、配列番号６、配列番号７、配列番号８のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が付加され、または欠失したものであっても、マンノースにエリスルトールをβグリコシド結合させて１−Ｏ−β−ＭＥを生合成できるものであれば、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子は、本発明のマンノース転移酵素遺伝子に含まれるものとする。一実施形態において、４−Ｏ−β−ＭＥの合成を触媒する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有し、配列番号１の第１番目〜第２７０番目、第３０１番目〜３６８番目、および第３９９番目〜第５６８番目において、少なくとも１つもアミノ酸残基が置換、欠失、不可、及び／又は削除されていることが好ましい。このような変異が導入されるアミノ酸残基の数は、特に制限されないが、例えば、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個に設定することができる。
【００３８】
一実施形態において、上記アミノ酸残基の変異は、アミノ酸残基の置換であることが好ましい。アミノ酸残基の置換の種類は、特に制限されないが、酵素活性に顕著な影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
【００３９】
配列番号６、配列番号７、配列番号８が挿入される位置は、配列番号１に示すアミノ酸配列のこれら配列に該当する位置の近傍であることが好ましい。例えば、配列番号６に関して説明すれば、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、Ｎ末端から第２６８〜２７０のアミノ酸配列にＥＮＨ配列を含む点で共通する。したがって、本発明では、ＥＮＨ配列に次いで配列番号６のアミノ酸配列が含まれるものを好適に使用することができる。同様に、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、Ｎ末端から第３５０〜３６０番にいずれもＫＬＮ配列を含む点で共通する。この配列を目安に、前記ＫＥＮ配列の後に配列番号７のアミノ酸を含むものを好適に使用することができる。同様に、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、Ｎ末端から第５４０〜５６０番にＡＡＡ配列を含む点で共通する。この配列を目安に、前記ＡＡＡ配列の後に配列番号８のアミノ酸配列を有するものを使用する。なお、配列番号６、配列番号７、配列番号８のアミノ酸配列は、前記した特有の配列の直後に存在するものであってもよく、ＥＮＨ配列と配列番号６、ＫＬＮ配列と配列番号７、ＡＡＡ配列と配列番号８との間に、７〜２０個のアミノ酸を更に含むものであってもよい。具体的には、前記したウスティラゴ・ホルデイのＵＨＯＲ  ０４８７６タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端から第２７１〜３０５番目のアミノ酸配列が配列番号６で置換され、同第３７３〜３０８番目のアミノ酸配列が配列番号７で置換され、同第５６８番目以降のアミノ酸配列が配列番号８で置換されたものなどを例示することができる。
【００４０】
なお、通常の遺伝子組換え技術を用いて、アミノ酸やＤＮＡの付加、欠失、挿入、置換等によって、本発明のマンノース転移酵素遺伝子の機能を保持した誘導体を得ることは当業者にとって容易である。ゆえにそのような常套手段で得られる１−Ｏ−β−ＭＥを生合成しうるマンノース転移酵素遺伝子も本発明の範囲に含まれるものとする。
【００４１】
（３）タンパク質およびＤＮＡ
本発明のタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。前記したように、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、シュードザイマ・ツクバエンシスに由来する、マンノースとエリスリトールとから１−Ｏ−β−ＭＥを生合成するマンノース転移酵素のアミノ酸配列である。本発明のタンパク質は、マンノースとエリスリトールとから１−Ｏ−β−ＭＥを生合成するマンノース転移反応を触媒することができ、マンノース転移酵素として使用することができる。ただし、マンノース転移活性に限定されず他の触媒活性を有する場合も含む。なお、本発明のタンパク質は、配列番号１と９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質であってもよい。
【００４２】
一実施形態において、本発明のＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列を有することが好ましい。配列番号２で表される塩基酸配列は、マンノースとエリスリトールとから１−Ｏ−β−ＭＥを生合成するマンノース転移酵素をコードするＤＮＡである。したがって、本発明のＤＮＡは、マンノースとエリスリトールとから１−Ｏ−β−ＭＥを生合成する上記マンノース転移酵素の遺伝子と同様に使用することができる。なお、本発明のＤＮＡが有する塩基配列は、上述する１−Ｏ−β−ＭＥを生合成するマンノース転移酵素をコードする限り任意であり、例えば、配列番号２と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するＤＮＡであってもよい。一実施形態において、１−Ｏ−β−ＭＥを生合成するマンノース転移酵素をコードするDNAは、配列番号２の塩基配列とは異なる塩基配列を有することが好ましい。
【００４３】
塩基配列の相同性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、BLAST検索の初期条件で求めることができる。初期条件とは例えば次の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastnを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（%）を算出することができる。
【００４４】
（４）マンノース転移酵素遺伝子の調製方法
配列番号１に示すアミノ酸配列は、シュードザイマ・ツクバエンシスのマンノース転移酵素のアミノ酸配列である。このアミノ酸配列をコードする遺伝子は、例えば、シュードザイマ・ツクバエンシスの全ゲノム配列情報を取得し、全遺伝子領域を推定し、４−Ｏ−β−ＭＥを生合成するマンノース転移酵素をコードするＤＮＡと同一性を比較し、同一性の高い遺伝子を選択することで調製することができる。また、シュードザイマ・ツクバエンシスを培養する際に、脂肪酸を含む培地で培養して１−Ｏ−β−ＭＥＬ生産に関与する遺伝子群を発現させ、発現量の多いｍＲＮＡなどを選択し、４−Ｏ−β−ＭＥを合成するマンノース転移酵素の遺伝子ゲノム情報を参照して、配列同一性の高い遺伝子を選択してもよい。このような遺伝子を構成するＤＮＡは、配列番号１をコードするＤＮＡ配列に基づいて化学合成したものであってもよい。マンノース転移酵素をコードするＤＮＡは、ここに開示される配列情報を基に、化学的DNA合成法、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、又は生化学的手法などを用いることによって容易に調製することができる
また、前記したウスティラゴ・ホルデイのＵＨＯＲ  ０４８７６タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端から第２７１〜３０５番目のアミノ酸配列が配列番号６で置換され、同第３７３〜３０８番目のアミノ酸配列が配列番号７で置換され、同第５６８番目以降のアミノ酸配列が配列番号８で置換されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であってもよい。このような遺伝子は、ウスティラゴ・ホルデイから全ゲノム配列情報を得て、ＵＨＯＲ  ０４８７６タンパク質をコードするＤＮＡを選択し、配列番号６、配列番号７、配列番号８に相当するＤＮＡで適宜置換して調製することができる。
【００４５】
選択した遺伝子が、マンノース転移酵素をコードするものであるかは、この遺伝子を、後記するマンノース転移酵素活性を欠失したＭＥＬ非生産株に導入し、ＭＥＬ生産条件で培養し、ＭＥＬを生産するかで評価し、更に得られたＭＥＬの構造を解析し、１−Ｏ−β−ＭＥＬを検出することで確認することができる。
【００４６】
（５）組換えベクターおよびその調製方法
本発明では、マンノース転移酵素遺伝子を適当な発現ベクターに導入して組換えベクターとして使用することができる。このような組換えベクターは、発現ベクターのプロモーターの下流に前記マンノース転移酵素遺伝子を挿入して調製することができ、従来公知の遺伝子工学に基づいて構築することができる。なお、使用する発現ベクターとしては、プラスミド、コスミドあるいはウイルス由来のもの等を使用することができる。例えば、シュードザイマ属の４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌を使用して形質転換する場合には、使用する発現ベクターとして、ｐＵＸＶ１  ＡＴＣＣ  ７７４６３、ｐＵＸＶ２  ＡＴＣＣ  ７７４６４、ｐＵＸＶ５  ＡＴＣＣ  ７７４６８、ｐＵＸＶ６  ＡＴＣＣ  ７７４６９、ｐＵＸＶ７  ＡＴＣＣ  ７７４７０、ｐＵＸＶ８  ＡＴＣＣ  ７７４７１、ｐＵＸＶ３  ＡＴＣＣ  ７７４６５、ｐＵ２Ｘ１  ＡＴＣＣ  ７７４６６、ｐＵ２Ｘ２  ＡＴＣＣ  ７７４６７等を例示することができる。
【００４７】
なお、上記は本発明の組換えベクターの一例に過ぎず、当業者が当該技術分野の常套手段に従って、種々の１−Ｏ−β−ＭＥＬを生合成するための組換えベクターを構築することができる。発現ベクターに導入するマンノース転移酵素遺伝子以外は、プロモーター、その他の条件は、既知のものから適宜選択することができる。
【００４８】
（６）形質転換体の調製方法
本発明では、４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌に、前記組換えベクターを導入して形質転換体を製造することができる。なお、本発明において「４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌」とは、本来４−Ｏ−β−ＭＥＬを生合成できる菌（以下、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌とも称する。）であるが、マンノースとエリスルトールとを結合して４−Ｏ−β−ＭＥを生合成するマンノース転移酵素活性が失活された菌を意味する。４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌としては、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃ、ＭＥＬ−Ｄのいずれの４−Ｏ−β−ＭＥＬを生産するものであってもよい。更に、「菌」の名称に限定されず、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産能を有することを条件に、酵母、カビ等の真核微生物、さらには他の高等生物の細胞でもよい。このような高等生物の細胞としては、動物細胞や培養植物細胞が例示される。４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌の好ましい例として、サッカロマイセス属の菌株（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）やシュードザイマ属の菌株（例えば、シュードザイマ・アンタークティカ）を例示することができる。一実施形態において、１−Ｏ−β−ＭＥの合成を触媒するマンノース転移酵素をコードするDNAを有する宿主細胞は、４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌に限定されず、目的に応じて任意に選択できる。
【００４９】
本発明で使用する４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌は、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌のマンノース転移酵素が失活され、４−Ｏ−β−ＭＥを生合成する従前の培養条件では４−Ｏ−β−ＭＥＬを生合成することができない。ただし、マンノースとエリスリトールとを結合するマンノース転移酵素が失活するのみであるから、例えばＭＥを含む培地で培養した場合に４−Ｏ−β−ＭＥＬを生合成するものであってもよい。本発明で使用する４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌は、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌のマンノース転移酵素を失活して調製することができ、このような方法は公知である。例えば特許文献３記載の方法で調製することができる。
【００５０】
なお、微生物が生合成するＭＥＬは、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃ、ＭＥＬ−Ｄの他に、ＭＥＬに導入される脂肪酸残基数が１〜３個の範囲のものが存在する。培養条件によって同じ微生物が異なるＭＥＬを生合成することもできる。従来知られているＭＥＬの種類と生産菌との関係の一部を表１に示す。なお、図７に示すように、マンノースにはＯＲ１、ＯＲ２、ＯＲ３およびＯＲ４が存在するが、脂肪酸残基数が１本鎖のＭＥＬは、Ｒ１〜Ｒ４のいずれか１カ所が脂肪酸残基で他の３カ所がアセチル基のタイプと、Ｒ１〜Ｒ４のいずれか１カ所が脂肪酸残基でアセチル基が存在せず他の３カ所が水素原子のタイプの２種類しか知られていない。現在知られている構造に基づいて表１を作成した。本発明では、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌として表１に示す微生物を好適に使用することができる。ただし、本発明で使用できる４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌は、下記に限定されるものではない。例えば、脂肪酸残基数が１本鎖のＭＥＬであって、Ｒ１〜Ｒ４のいずれか２カ所がアセチル基で他の１カ所が水素原子のＭＥＬや、Ｒ１〜Ｒ４のいずれか２カ所が水素原子で他の１カ所がアセチル基のＭＥＬを生産する微生物が知られた場合に、このような微生物を使用することもできる。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
本発明では、前記した組換えベクターを用いて４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌を形質転換し、形質転換体を得ることができる。４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌に前記組換えベクターを導入して形質転換する方法や形質転換体の選別方法は、従来公知の方法を用いて行うことができる。たとえば、エレクトロポレーション法で簡便に形質転換することができ、ハイグロマイシンＢなどを使用して形質転換体を選別することができる。
【００５３】
得られた形質転換体は、エリスリトールの立体構造を認識してマンノースにエリスリトールを結合して１−Ｏ−β−ＭＥを製造する以外は、形質転換前の４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌の特性を維持している。例えば、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌が４−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ａ生産菌である場合、形質転換体は１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ａを生産することができる。また、脂肪酸残基数が１の４−Ｏ−β−ＭＥＬを生合成する場合は、脂肪酸残基数が１の１−Ｏ−β−ＭＥＬを生合成することができる。したがって、形質転換体によって生産させる１−Ｏ−β−ＭＥＬの構造を基準に、対応する４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌を選択することができる。例えば、脂肪酸残基数が１の１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｃを製造する場合は、脂肪酸残基数が１の４−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ｃを生産するシュードザイマ・アンタークティカを用いて４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌を調製し、これを形質転換すればよい。
【００５４】
（７）１−Ｏ−β−ＭＥＬの製造方法
本発明の形質転換体は、１−Ｏ−β−ＭＥＬを生合成できるように改変されたものである。この形質転換体を培養し、形質転換体を含む培養物から１−Ｏ−β−ＭＥＬを採取する。培養条件は、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌の培養条件を好適に使用することができる。４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌がシュードザイマ属の場合には、一般には、ｐＨ５〜８、好ましくはｐＨ６、温度２０〜３５℃、好ましくは２２〜２８℃で３〜７日間培養すればよい。１−Ｏ−β−ＭＥＬは、定法にしたがって培養液中から回収することができる。
【００５５】
ＭＥＬは、アセチル基の結合位置や含まれる脂肪酸残基数、エリスリトールの立体構造等が相違すると、界面活性効果やベシクル形成能、水和性などが相違する。本発明によれば、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生合菌の培養条件と同じ培養条件で形質転換体を培養することで、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生合菌の特性を維持して１−Ｏ−β−ＭＥＬを製造することができる。形質転換体から生合成される産物の推定が容易であり、かつ従前の培養条件で効率的にＭＥＬを生合成することができる。
【００５６】
（８）１−Ｏ−β−ＭＥＬの用途
１−Ｏ−β−ＭＥＬは、親水性の糖骨格と、親油性の脂肪酸残基を有し、脂肪酸残基数によって１−Ｏ−β−ＭＥＬの親水性が異なる。したがって、生産された種々の１−Ｏ−β−ＭＥＬは、その特性に応じて、界面活性剤、医薬品、化粧品、食品などに使用することができる。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５８】
（実施例１）
（１）ＭＥＬ生産菌の培養
保存培地（麦芽エキス３ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌグルコース１０ｇ／Ｌ、寒天３０ｇ／Ｌ）に保存したシュードザイマ・ツクバエンシス株を、グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウムム３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌを含む液体培地（ａ）４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、２５℃で振とう培養し、菌体培養液（ａ）を得た。【００５９】
この菌体培養液（ａ）を、オリーブ油４０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌを含む液体培地（ｂ）２０ｍＬの入った坂口フラスコに接種し、２５℃で振とう培養を行い、菌体培養液（ｂ）を得た。【００６０】
（２）マンノース転移酵素の抽出と遺伝子配列の特定
上記菌体培養液（ｂ）に含まれる菌体を液体窒素で凍結し、フェノールおよびクロロホルムで処理しゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡの純度と量を分光光度計で確認した後、ゲノムシーケンス用のＤＮＡライブラリー調製キットを用いて、ＤＮＡライブラリーを調製した。調製したＤＮＡライブラリーに挿入された遺伝子サイズの分布をバイオアナライザーにて確認した。なお、ＤＮＡライブラリーの量は微量ＤＮＡ定量キットを用いて測定した。所定量のＤＮＡライブラリーを用いて、ゲノム配列を次世代シーケンサーで解読した。得られた配列情報は、解析ソフトにてアッセンブルを行い、断片化したゲノム情報を得た。このゲノム情報から遺伝子領域を推定した。次いで、４−Ｏ−β−ＭＥを生合成する既知のマンノース転移酵素のアミノ酸配列と、前記推定遺伝子領域とを対比し、配列同一性の高い遺伝子を選択した。この配列を配列番号３に示す。【００６１】
（３）４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌の調製
特許文献３に従い、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌であるシュードザイマ・アンタークティカＴ−３４の４−Ｏ−β−ＭＥを生合成するためのマンノース転移酵素を欠損させて、４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産株を調製した。【００６２】
（４）４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産菌のＭＥＬ生合成能の評価
４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌と４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産株とを上記（１）の菌体培養液（ｂ）を得る条件で７日間培養し、培養物をＴＬＣにて評価した。結果を図１に示す。Ｍはマーカーであり、図８（ｄ）に示す４−Ｏ−β−ＭＥＬの標品である。また、１は４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌の培養物を示し、２は、４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産株の培養物を示す。１で示される４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌であるシュードザイマ・アンタークティカＴ−３４は、ＭＥＬ−Ａを生産するが、２で示される４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産株は、上記培養条件ではいずれのＭＥＬも生産することができなかった。【００６３】
（５）組換えベクター構築
配列番号３に示す遺伝子を発現する組換えベクターを以下の方法で構築した。【００６４】
まず、配列番号３を参照して、配列番号４に示す開始コドンの上流にBamHIサイト（ggatcc）を導入したプライマーと、配列番号５に示す終始コドンの下流でBamHIサイトを導入するように設計したプライマーとの一対のプライマーを用いてＰＣＲを行い、前記した選択遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を、糸状菌(Ustilago maydis)用の発現ベクターのｐＵＸＶ１のクローニングサイトに連結し、ｇａｐプロモーターの制御下でこの遺伝子が発現される遺伝子組換えベクターｐＵＸＶ１−ＰｔＥＭＴ１を構築した。組換えベクターの構造を図２に示す。
Fwd:gtttggatccatgaaagtggcactgctttc（配列番号４）
Rvs:cgggatcccatgagggaactgatgtgcg（配列番号５）【００６５】
（６）形質転換体の調製
得られた組換えベクターを用いて４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産株を形質転換した。形質転換の方法は以下に従った。【００６６】
エレクトロポレーション法にて、前記遺伝子組換えベクターｐＵＸＶ１−ＰｔＥＭＴ１を、前記シュードザイマ・アンタークティカＴ−３４由来の４−Ｏ−β−ＭＥＬ非生産株に導入した。一方、コントロールとしてインサートを含まないベクターｐＵＸＶ１を用い、同様に操作した。次いで、Ｇ４１８を使用して形質転換体を選別した。【００６７】
（７）形質転換体のＭＥＬ生産能の評価
形質転換体を上記（１）の菌体培養液（ａ）を得る条件で１日間培養し、ついで菌体培養液（ｂ）を得る条件で７日間培養し、得られた菌体培養液からＭＥＬを抽出した。菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加し、十分攪拌した後、酢酸エチル層を分取した。酢酸エチル層に含まれるＭＥＬの確認は薄層クロマトグラフィーにて行った。結果を図３に示す。図中、Ｍはマーカーであり、符号１、２、３は酢酸エチル層を示す。ＴＬＣで検出したスポットは、既知のＭＥＬのスポットと一致した。図３に示すように、遺伝子発現ベクターｐＵＸＶ１−ＰｔＥＭＴ１で形質転換されたシュードザイマ・アンタークティカ由来のＭＥＬ非生産株は、ＭＥＬを生産することができた。【００６８】
（８）ＭＥＬの同定
形質転換体から生産されたＭＥＬを、シリカカラムクロマトグラフィーで精製した。次いで、精製品の化学構造を、１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲとにより解析した。精製後のＭＥＬのＴＬＣを図４に示す。図４においてＭはマーカーであり、１は精製品である。図４の結果から、ＭＥＬ非生産株が生産したＭＥＬは、ＭＥＬ−Ａと推定された。【００６９】
この精製品の１Ｈ−ＮＭＲの分析結果を図５に、１３Ｃ−ＮＭＲの分析結果を図６に示す。図５（Ａ）、は、ＭＥＬ非生産菌を調製する際に使用したシュードザイマ・アンタークティカが生産したＭＥＬ−Ａの１Ｈ−ＮＭＲの分析結果であり、図５（Ｂ）は形質転換体が生産したＭＥＬ−Ａの１Ｈ−ＮＭＲの分析結果である。図５（Ｂ）の１Ｈ−ＮＭＲの結果に示すように、シュードザイマ・ツクバエンシス由来のマンノース転移酵素を発現している形質転換体は、１−Ｏ−β−ＭＥＬに特徴的なＨ−４ａとＨ−４ｂのピークシフトを示し、１−Ｏ−β−ＭＥＬであることが確認された。同様に、図６（Ａ）はＭＥＬ非生産菌を調製する際に使用したシュードザイマ・アンタークティカが生産したＭＥＬ−Ａの１３Ｃ−ＮＭＲの分析結果であり、図６（Ｂ）は形質転換体が生産したＭＥＬ−Ａの１３Ｃ−ＮＭＲの分析結果である。図６（Ａ）、（Ｂ）を比較して明らかなように、エリスリトールの３位の炭素のピーク位置が大きく異なり、１−Ｏ−β−ＭＥＬであることが確認された。【００７０】
上記したように、４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌を使用して、１−Ｏ−β−ＭＥＬを製造することができた。しかも、使用した４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌は、主として４−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ａを生産するシュードザイマ・アンタークティカである。ＭＥＬ−Ｂを生合成するシュードザイマ・ツクバエンシス由来のマンノース転移酵素を使用して、形質転換体から１−Ｏ−β−ＭＥＬ−Ａを生産させることができた。これは、ＭＥＬ−Ｂを生合成するシュードザイマ・ツクバエンシス由来のマンノース転移酵素の遺伝子を使用し、従来の４−Ｏ−β−ＭＥＬ生産菌の生合成特性をそのまま利用し、マンノースに結合するエリスリトールの立体構造のみが異なる１−Ｏ−β−ＭＥＬを生産させうることを示すものである。【００７１】
１−Ｏ−β−ＭＥを生合成するためのマンノース転移酵素の遺伝子は、微生物が生合成するＭＥＬの糖構造を制御するためのターゲット遺伝子の一つとなり、該遺伝子を用いた組み換えベクターで形質転換することで、従来の微生物に１−Ｏ−β−ＭＥＬの生合成能力を付与できることが示された。この技術によって、より水になじみやすく実用性に優れた１−Ｏ−β−ＭＥＬの生産技術の向上や、遺伝子組換え技術を駆使した微生物プロセスによる新たなバイオ素材の開発への応用も期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のマンノース転移酵素遺伝子を用いると、種々の１−Ｏ−β−ＭＥＬを生産することができ、医薬、環境その他の産業に使用でき有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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