(57)【要約】本発明の課題は、従来の薬剤に較べて副作用の少ない、アレルギー性疾患の治療法、及びその医薬を提供することにある。γδＴ細胞療法をアレルギー性疾患の患者にも適用する。
2016195086.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
γδＴ細胞を含む、アレルギー性疾患治療用又は予防用医薬組成物。
【請求項２】
γδＴ細胞が末梢血単核球由来である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
γδＴ細胞が末梢血単核球をビスホスホネートおよびインターロイキン−２の存在下で培養して得られる、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ビスホスホネートは、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
γδＴ細胞が、CD27-CD45RA-γδＴ細胞である、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
アレルギー性疾患がＩ型アレルギー性疾患である、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
Ｉ型アレルギー疾患がアトピー性疾患である、請求項６の医薬組成物。
【請求項８】
アレルギー性疾患治療用又は予防用医薬の製造のための、単離されたγδＴ細胞の使用。
【請求項９】
γδＴ細胞が末梢血単核球由来である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
γδＴ細胞が末梢血単核球をビスホスホネートおよびインターロイキン−２の存在下で培養して得られる、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ビスホスホネートは、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
γδＴ細胞が、CD27-CD45RA-γδＴ細胞である、請求項８〜請求項１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
アレルギー性疾患がＩ型アレルギー性疾患である、請求項８〜請求項１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
Ｉ型アレルギー疾患がアトピー性疾患である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
単離されたγδＴ細胞を患者に投与することを含む、アレルギー性疾患の治療又は予防方法。
【請求項１６】
γδＴ細胞が末梢血単核球由来である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
γδＴ細胞が末梢血単核球をビスホスホネートおよびインターロイキン−２の存在下で培養して得られる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ビスホスホネートは、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
γδＴ細胞が、CD27-CD45RA-γδＴ細胞である、請求項１５〜請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
アレルギー性疾患がＩ型アレルギー性疾患である、請求項１５〜請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
Ｉ型アレルギー疾患がアトピー性疾患である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
１）患者から末梢血単核球を単離するステップ、
２）末梢血単核球をビスホスホネートおよびインターロイキン−２の存在下で培養してγδＴ細胞を得るステップ、及び
３）得られたγδＴ細胞を患者に投与するステップを含む、
アレルギー性疾患の治療又は予防方法。
【請求項２３】
前記ビスホスホネートは、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アレルギー性疾患がＩ型アレルギー性疾患である、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｉ型アレルギー疾患がアトピー性疾患である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
採取した末梢血単核球にビスホスホネートおよびインターロイキン−２を施して培養して組成物を取得することからなる、該組成物を有効成分とするアレルギー性疾患治療剤又は予防剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γδT細胞を含むアレルギー性疾患の治療薬、該治療薬を用いた治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在がん免疫療法として、１）NK細胞療法、２）樹状細胞ワクチン療法、３）細胞傷害性T細胞（CTL）療法、４）αβT細胞療法、５）γδT細胞療法などが盛んに行われている（非特許文献１）。
NK（Natural Killer）細胞療法とは、末梢血中に含まれるNK細胞などの異常細胞を傷害する能力の高い細胞を、インターロイキン-2（IL-2)  など複数の刺激物質を用いて活性化、増殖させて体内に戻し、がんを治療する方法である。NK細胞は、自然免疫系を担うリンパ球の1種で、強い細胞傷害能を有しており、特に、MHC class I分子が発現低下または消失した細胞を認識し殺傷する機構を有すること、および、抗体依存性細胞傷害(ADCC)における主たるエフェクター細胞として機能することなどから、腫瘍細胞やウイルス感染細胞の拒絶に重要な細胞である。
樹状細胞ワクチン療法とは、末梢血液中の単球から分化させた樹状細胞（Dendritic Cells: DC）に、その標的となるがん細胞を貪食させて体内に戻し、がん細胞を傷害する能力のある細胞（主にT細胞）や抗体産生機能をもつB細胞にがんや病原体の目印（抗原）を伝える役割を担う「抗原提示細胞（Antigen Presenting Cell: APC）」として機能させることにより、がんを治療する方法である。
細胞傷害性T細胞（CTL）療法は、がん細胞を用いて末梢血液中のT細胞を刺激することにより、細胞傷害性T細胞（CTL）を誘導し、体内に戻す治療法である。がん細胞自体が抗原提示細胞（APC）としての役割を果たし、自身のがんに対する攻撃能力を持った細胞傷害性T細胞（CTL）を効率的に増やすことが可能になる。
αβT細胞療法とは、末梢血液中に含まれるリンパ球を約2週間、IL-2と抗CD3抗体を用いて培養し、その全体を活性化・増殖させたのち体内に戻す治療法である。末梢血のTリンパ球の大半がαβ型のT細胞受容体（T Cell Receptor: TCR）を持つαβT細胞であり、増殖した細胞の多くもαβT細胞ということになる。αβT細胞は、上記樹状細胞などから、抗原を提示され、その抗原をもつ細胞に攻撃を加える。
γδT細胞は、リンパ球ストレス（細胞傷害）監視機構(lymphoid stress-surveillance)と呼ばれる生体防御反応を担う中心的な細胞であり、γδT細胞療法とは、患者から採血した梢血中にわずかに存在する（1〜5％）γδ型T細胞受容体（Vγ9Vδ2受容体）をもつγδT細胞を選択的に増殖させ、体内に戻す治療法である。γδT細胞はαβT細胞が認識する「抗原」に依存することなく、がん細胞表面に比較的共通して発現する分子などを認識することでがんを殺傷する「抗原非特異的」な抗腫瘍効果が得られる（特許文献１及び非特許文献２）。【０００３】
免疫細胞治療は、従来の外科治療、放射線治療、化学治療の三大療法に比べて副作用がほとんどないという利点を有しており、第4のがん治療法として実際の肺がん患者に対して先進医療として施されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００６／００６７２０号パンフレット
【０００５】
【非特許文献１】メディネットホームページhttp://www.medinet-inc.co.jp/english/service/technology.html
【非特許文献２】Anti-tumour immunotherapy with Vγ9Vδ2 T lymphocytes: from the bench to the bedside; Br J Haematol. 2013 Jan;160(2):123-32
【非特許文献３】Noguchi A et al. “Impaired and imbalanced cellular immunological status assessed in advanced cancer patients and restoration of the T cell immune status by adoptive T-cell immunology”, Int Immunopharmacol. 2014 Jan;18(1):90-7
【非特許文献４】石田  俊雄，他:医学と薬学  58（6）：901〜907，2007
【非特許文献５】岩崎  栄作  他:小児科臨床  50-1-145〜151  1997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本願発明者である医師らは、上記がん免疫療法を実際に患者に施している臨床医師である。また、さまざまな疾患に対する細胞治療の研究開発に携わっており、皮膚のアレルギー症状にも詳しい医師である。本願発明者らはがん免疫療法を行い、患者の症状の経時観察を行ううちに、本来の症状以外に、アレルギー性疾患を併発している患者のアレルギー症状が緩和軽減されていることを発見した。
すなわち、本願発明はγδT細胞療法の別用途、アレルギー性疾患への適用拡大を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、上記γδT細胞療法を行った患者の経時観察以外に生化学的パラメータの検証を行い、γδT細胞療法により、アレルギー性疾患の症状の軽減緩和が確かになされていることを確認し、本願発明を完成させた。【０００８】
アレルギーとは、免疫反応が、特定の抗原に対して過剰に起こることをいう。アレルギー疾患とは、外部からの抗原に対し、免疫反応が起こる疾患をさす。現在、発生メカニズムにより、I：アナフィラキシー反応、II：細胞障害反応、III：免疫複合反応、IV：細胞性免疫反応および遅延型過敏症反応の4つに分類されている（ゲル‐クームス分類：Gell and Coombs classification）。【０００９】
I型アレルギー
2型ヘルパーT細胞（Th2）によって、B細胞がIgE免疫グロブリンの産生を促され、産生されたIgEが肥満細胞（マスト細胞）や好塩基球などの白血球に結合し、そこに抗原が結合するとこれらの細胞がヒスタミン、セロトニンなどの生理活性物質（メディエーター）を放出；ならびその他のメディエーター（例，プロスタグランジン，ロイコトリエン，血小板活性化因子，インターロイキン［IL］）の合成を引き起こす。これにより、血管拡張、血管透過性亢進、粘液の過剰分泌や平滑筋痙攣などが起こり、浮腫、掻痒などの症状があらわれる。この反応は抗原が体内に入るとすぐに生じ、即時型過敏と呼ばれ、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、蕁麻疹等の症状を伴う。また、反応が激しく、全身性のものをアナフィラキシーと呼び、さらに急速な血圧低下によりショック状態を呈したものをアナフィラキシーショックという。
代表的な疾患としては、蕁麻疹、PIE症候群、食物アレルギー、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性疾患（アトピー性皮膚炎）、アナフィラキシーショックがあげられる。【００１０】
II型アレルギー
IgG免疫グロブリンが、抗原を有する自己の細胞又は組織に結合し、細胞傷害性T細胞またはマクロファージおよび補体を活性化し，細胞又は組織を破壊する反応である（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）。代表的にはB型肝炎やC型肝炎などのウイルス性肝炎が挙げられる。ウイルスを体内から除去しようとする結果、肝細胞が破壊されるため症状を来している。
代表的な疾患としては自己免疫性溶血性貧血（AIHA）、不適合輸血、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、悪性貧血、リウマチ熱、臓器移植後の急性移植片拒絶反応，クームス陽性溶血性貧血，橋本甲状腺炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、円形脱毛症があげられる。【００１１】
III型アレルギー
免疫反応により、抗原・抗体・補体などが互いに結合した免疫複合体が形成される。この免疫複合体が血流に乗って流れた先で、周囲の組織を傷害する反応である。免疫複合体の傷害する部位が限局的な部位にとどまる反応をアルサス型反応といい、全身にわたるものを血清病と呼ぶ。
代表的な疾患としては血清病、全身性エリテマトーデス（ループス腎炎）（SLE）、急性糸球体腎炎、関節リウマチ（RA）、過敏性肺臓炎、リウマチ性肺炎、多発性動脈炎、アレルギー性血管炎、シェーグレン症候群血清病，白血球破壊性血管炎，クリオグロブリン血症，気管支肺アスペルギルス症があげられる。【００１２】
IＶ型アレルギー
IＶ型反応（遅延型過敏症）はＩ〜III型アレルギーと異なり、T細胞媒介性である。関与するT細胞亜集団に基づいた4つのサブタイプがある（1型ヘルパーT細胞（IVa型），2型ヘルパーT細胞（IVb型），細胞傷害性T細胞（IVc型），およびIL-8分泌T細胞（IVd型））。これらの細胞は特異的抗原と接触すると感作され，その抗原に再暴露することによって活性化される；活性化されたT細胞は直接的傷害作用またはサイトカイン放出により組織に損傷を与える。
代表的な疾患としては接触性皮膚炎（「かぶれ」）、ツベルクリン反応、移植免疫、腫瘍免疫、シェーグレン症候群、感染アレルギー、薬物過敏症、ギラン・バレー症候群があげられる。【００１３】
アトピー性疾患
アトピーとはIgE媒介性の過剰な免疫応答であり，全てのアトピー性疾患はＩ型アレルギーである。アトピー性疾患は，最も一般的には鼻，眼，皮膚，および肺を侵す。
アトピー性皮膚炎（Atopic dermatitis；以下ADともいう）は、幼少時期に始まり、寛解と増悪を繰り返しながら、慢性に経過する、湿疹を主体とした皮膚炎群である。臨床症状として、乳幼児に顔面頭部の湿疹様の湿潤性病変よりはじまり、小児期には躰幹四肢の乾燥性病変、やがて成人期になると頸部の色素沈着や顔面紅斑など、年齢により皮膚炎の好発部位や性状に変化があることを特徴とする。また、非常に強力な痒みを伴うのも特徴的である。【００１４】
ADの標準治療としては薬物治療が主であり、炎症の鎮静を目的としたステロイド外用薬治療や、保湿・皮膚バリア機能の保護を目的とした外用薬を用いた治療、繰り返し引き起こされる痒みを抑えることを目的とした抗ヒスタミン剤や抗アレルギー薬等の内服薬を用いた治療がおこなわれる。また、近年では、既存療法では効果が不十分であったり副作用によりこれらの投与ができないと判断された場合に、移植免疫抑制剤タクロリムス水和物が使用されている。【００１５】
これらのうち、ステロイド外用薬がAD治療の中心であり、皮膚症状の程度、部位、年齢に応じて適切なランクのステロイド外用薬が使用される。しかし、ステロイド外用薬治療は皮疹部位に対する薬剤の経皮吸収の違いにより副作用が生じやすく、特に経皮吸収が良い顔面の病変に対しては、症状のコントロールが難しいことが問題となっている。また、標準治療として用いられる薬剤の薬効の強さには限界があるため、適応範囲が限られることが課題となっている。【００１６】
現在、ADの成立に関わる重要な因子として皮膚粘膜のバリア機能の異常と、免疫学的な異常（抗原に対する生体の過剰反応）の2つが考えられており、これらがADの悪化と慢性化を引き起こす主要な役割を果たしている。【００１７】
皮膚粘膜バリア機能の異常としては、抗原による過剰なセリンプロテアーゼ反応によって皮膚のバリア機能の破壊が促進されることが報告されている。また、免疫学的な異常としては、抗原特異的なCD8+T細胞の過剰応答により、IgE産生が亢進し、好酸球の生存を維持すると共に、CD4+T細胞の活性化を誘導することにより、Th2とTh1の免疫応答のバランスの破綻に寄与していると考えられている。すなわち、表皮のバリア機能低下が外部からの抗原の侵入を容易にし、それに対するTh2優位の免疫応答が、ADの病態形成においては重要である。実際に、AD患者の皮膚ではIL-4陽性Th2細胞浸潤がみとめられ、血中のTh2系ケモカインTARC濃度がADの病勢と相関することも、ADにおけるTh2偏位の関与を示唆している。また、AD患者での詳細な報告はないものの、喘息などのアレルギー患者では健常人に比べて、IL-17、IL-4を産生するCD4+T細胞が有意に増加する一方で、IFN-γを産生するCD8+T細胞、γδT細胞が減少していることが報告されている。
【発明の効果】
【００１８】
AD患者に対して体外で増幅・活性化させた自己γδT細胞を投与することで、免疫強化を主体とした免疫応答バランス（Th2とTh1の比率）の改善をもたらす。本願発明を用いることにより、ステロイド投与などに比べて副作用の少ない、すなわち、患者のQOL（Quality Of Life）の高いアレルギー疾患の治療、アレルギー症状の軽減緩和を行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】γδT細胞療法後のアレルギー性疾患症状の評価スコアの経時変化
【図２】γδT細胞療法後のTh2（2型ヘルパーT細胞）の割合の経時変化
【図３】γδT細胞療法後のTARC（thymus and activation−regulated chemokine）の割合の経時変化
【図４】γδT細胞療法後の非特異的IgE濃度の経時変化
【発明を実施するための形態】
【００２０】
従って、本発明は本発明の構成は以下の［１］から［２６］の通りである。
［１］γδＴ細胞を含む、アレルギー性疾患治療用又は予防用医薬組成物；
［２］γδＴ細胞が末梢血単核球由来である、［１］の医薬組成物；
［３］γδＴ細胞が末梢血単核球をビスホスホネートおよびインターロイキン−２の存在下で培養して得られる、［２］の医薬組成物；
［４］前記ビスホスホネートは、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、［３］の医薬組成物；
［５］CD27-CD45RA-γδＴ細胞である、［１］〜［４］のいずれかの医薬組成物；
［６］アレルギー性疾患がＩ型アレルギー性疾患である、［１］〜［５］のいずれかの医薬組成物；
［７］Ｉ型アレルギー疾患がアトピー性疾患である、［６］の医薬組成物。
【００２１】
［８］アレルギー性疾患治療用又は予防用医薬の製造のための、単離されたγδＴ細胞の使用；
［９］γδＴ細胞が末梢血単核球由来である、［８］の使用；
［１０］γδＴ細胞が末梢血単核球をビスホスホネートおよびインターロイキン−２の存在下で培養して得られる、［９］の使用；
［１１］前記ビスホスホネートは、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、［１０］の使用；
［１２］γδＴ細胞が、CD27-CD45RA-γδＴ細胞である、［８］〜［１１］のいずれかの使用；
［１３］アレルギー性疾患がＩ型アレルギー性疾患である、［８］〜［１２］のいずれかの使用；
［１４］Ｉ型アレルギー疾患がアトピー性疾患である、［１３］の使用。
【００２２】
［１５］単離されたγδＴ細胞を患者に投与することを含む、アレルギー性疾患の治療又は予防方法；
［１６］γδＴ細胞が末梢血単核球由来である、［１５］の方法；
［１７］γδＴ細胞が末梢血単核球をビスホスホネートおよびインターロイキン−２の存在下で培養して得られる、［１６］の方法；
［１８］前記ビスホスホネートは、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、［１７］の方法；
［１９]γδＴ細胞が、CD27-CD45RA-γδＴ細胞である、［１５］〜［１８］のいずれかの方法；
［２０］アレルギー性疾患がＩ型アレルギー性疾患である、［１５］〜［１９］のいずれかの方法；
［２１］Ｉ型アレルギー疾患がアトピー性疾患である、［２０］の方法。
【００２３】
［２２］１）患者から末梢血単核球を単離するステップ、
２）末梢血単核球をビスホスホネートおよびインターロイキン−２の存在下で培養してγδＴ細胞を得るステップ、及び
３）得られたγδＴ細胞を患者に投与するステップを含む、
アレルギー性疾患の治療又は予防方法；
［２３］前記ビスホスホネートは、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、［２２］の方法；
［２４］アレルギー性疾患がＩ型アレルギー性疾患である、［２２］又は［２３］の方法；
［２５］Ｉ型アレルギー疾患がアトピー性疾患である、［２４］の方法。
【００２４】
［２６］採取した末梢血単核球にビスホスホネートおよびインターロイキン−２を施して培養して組成物を取得することからなる、該組成物を有効成分とするアレルギー性疾患治療剤又は予防剤の製造方法。
【００２５】
＜１．γδT細胞の製造方法＞
まず、γδT細胞の細胞源となるPBMCsを準備する。ここで「末梢血単核球（PBMCs）」とは、末梢血から分離された、リンパ球（ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーT細胞、αβT細胞、γδT細胞など）、単球などを含む細胞集団を意味する。PBMCsを準備する方法は、特に限定されない。たとえば、採血により得られた末梢血を密度勾配遠心することで、PBMCsを得ることができる。1回の採血量は、γδT細胞療法を行う患者に応じて適宜設定すればよいが、例えば45〜75mL程度である。
また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取することにより、直接PBMCsを取得することが可能である。
【００２６】
採取したPBMCsは培養液（培地）に懸濁し、得られた細胞懸濁液にビスホスホネートおよびIL-2を添加して、γδT細胞を培養する。PBMCsをビスホスホネートおよびIL-2の存在下で培養することにより、γδT細胞を選択的に増殖および活性化させて、活性化γδT細胞を高純度に含む細胞集団を調製することができる（特許文献１参照）。
【００２７】
PBMCsを懸濁させる培養液（培地）の種類は、γδT細胞を増殖させることができれば特に限定されない。そのような培養液の例には、AIM-V培地、RPMI-1640培地、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、イスコフ培地が含まれる。これらの培養液には、必要に応じて血清を添加してもよい。添加される血清の例には、ウシ胎仔血清（FCS）、AB血清、自己血漿が含まれる。
【００２８】
本発明において、ビスホスホネートとは、特に制限されず、Ｐ−Ｃ−Ｐの骨格を有する化合物をいう。本発明に用いるビスホスホネートは、例えば、下記一般式［化１］で表わされる化合物、その塩、及びそれらの水和物が挙げられる。
【００２９】
【化１】
2016195086.tif 000003
【００３０】
上記［化１］中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、またＲ１とＲ２は同じ環状構造の一部を形成してもよい。
上記Ｒ１とＲ２における置換基としては、例えば、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基等からなる群から選択される。
【００３１】
本明細書において、ハロゲン原子としては、例えば、フルオロ原子、クロロ原子、臭素原子等；アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘプチル、オクチル、ペンタデカニル基等の直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ３０アルキル基等；低級アルキル基としては、例えば、直鎖又は分枝鎖Ｃ１−Ｃ１０アルキル基等；アリール基としては、例えば、フェニル、ナフチル基等；アルアルキル基としては、例えば、アリール−低級アルキル基等；シクロアルキル基としては、例えば、シクロオクチル、アダマンチル等のＣ１−Ｃ１０シクロアルキル基等；複素環式基としては、ピリジル、フリル、ピロリジニル、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル基等をそれぞれ示す。
【００３２】
また、本発明において、ビスホスホネートは、薬学的に許容されるものが好ましく、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されているものがあげられる。その例として、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が含まれる。これらは、窒素原子を有するアミノビスホスホネートであり、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が特に好ましい。市販されているビスホスホネート系骨代謝改善薬としては、例えば、パミドロン酸二ナトリウム五水和物（AREDIA（登録商標）；ノバルティスファーマ株式会社）、ゾレドロン酸水和物（ZOMETA（登録商標）；ノバルティスファーマ株式会社）などが挙げられる。
【００３３】
PBMCsの培養時に添加するビスホスホネートの濃度は、0.05〜100μMの範囲内が好ましく、0.1〜30μMの範囲内がより好ましい。より具体的には、ビスホスホネートとしてパミドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物、アレンドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネートの濃度は、1〜30μM の範囲内が好ましい。また、ビスホスホネートとしてゾレドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネートの濃度は、0.1〜10μMの範囲内が好ましい。
【００３４】
PBMCsの培養時に添加するIL-2の濃度は、50〜2000U/mLの範囲内が好ましく、400〜1000U/mLの範囲内がより好ましい。
【００３５】
PBMCsの培養条件は、γδT細胞を増殖および活性化させることができれば特に限定されない。通常は、34〜38℃（好ましくは37℃）かつ2〜10％（好ましくは5％）CO２存在下で、7〜14日程度培養すればよい。この際、培養する細胞数に応じて、培養液を適宜追加する。更に、培養液量の増加に合わせて、IL-2を50〜2000U/mL、より好ましくは400〜1000U/mLとなるように適宜追加する。
【００３６】
以上の手順により、γδT細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。得られた細胞集団は、後述するようにγδT細胞療法において患者に投与する細胞として利用することができる。
【００３７】
採血時のγδT細胞と14日間の培養後のγδT細胞の細胞表面マーカーを比較すると、活性化マーカーであるNKG2DとCD69の発現が亢進している。また、採血時のγδT細胞は、CD27+CD45RA+のナイーブ細胞タイプやCD27+CD45RA-のセントラルメモリー細胞タイプであるのに対して、14日間の培養後のγδT細胞は、CD27-CD45RA-のエフェクター細胞タイプに変化している。
【００３８】
＜２．γδT細胞を含む医薬＞
本発明の医薬は、上述の本発明の製造方法により製造されたγδT細胞を含む、がん又は感染症等を治療／予防するための医薬である。
【００３９】
本発明の医薬は、例えば、本発明の製造方法により製造されたγδT細胞を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させた注射剤（細胞懸濁液）である。この注射剤は、静脈内や皮内、皮下などに注射されてもよいし、病変部に直接注入されてもよいし、点滴として全身投与されてもよい。
【００４０】
本発明の医薬は、必須成分として本発明の製造方法により製造されたγδT細胞を含むが、任意成分としてその他の成分を含んでいてもよい。
【００４１】
本発明の医薬に含まれるγδT細胞の数は、投与方法や疾患の種類、患者の症状などに応じて適宜設定されうる。通常は、10８〜10１２個／人（好ましくは10９個／人）となるように設定すればよい。
【００４２】
本発明の医薬の製造方法は、特に限定されない。たとえば、本発明の医薬は、１）本発明のγδT細胞の製造方法により得られたγδT細胞を遠心分離などにより回収し；２）回収したγδT細胞を洗浄液（例えば、生理食塩水やＰＢＳなど）で洗浄し；３）洗浄したγδT細胞を遠心分離などにより回収し；４）回収したγδT細胞を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させることで、経静脈投与が可能な点滴剤として製造されうる。
【００４３】
以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００４４】
＜１．対象患者＞
瀬田クリニックグループ医療法人社団滉志会において、免疫療法を行ったアトピー性皮膚炎を有する患者である。免疫療法開始時において、保険診療にて提供される標準的な薬物療法にても、症状が軽快せず、血清TARCが450pg/mL以上でかつ、Th1（1型へルパーT）／Th2（2型ヘルパーT）細胞比が低下している患者を対象とした。【００４５】
＜２．γδT細胞の培養投与＞
同意をいただいた患者から、末梢血を67.5mL採取し、遠心分離法により末梢血単核球を取得した。IL-2とビスホスホネートを添加した細胞培養用培地にて末梢血単核球の培養を行った。およそ14日間の培養を行い、活性化自己γδT細胞を調製した。品質検査後に得られた活性化自己γδT細胞を患者に経静脈投与する。【００４６】
γδT細胞投与時ならびに投与後に定期的（1ヶ月、2ヶ月、4ヶ月及び6ヶ月後）に問診及び診断を行い、（１）かゆみ、（２）特徴的な皮疹とその分布（３）慢性・反復性の経過などを記録した。さらに、採血を行い、末梢血中のTh1（1型ヘルパーT）細胞、Th2（2型ヘルパーT）細胞、γδT細胞の割合・数、TARC、及び非特異的IgEの量等を測定した。【００４７】
＜３．結果＞
１）評価スコア
問診及び診断の結果に基づき、日本皮膚科学会アトピー性皮膚炎重症度分類（簡便法）に則り、アトピー症状のスコアを算出した。その結果、複数の患者において有意にアトピー症状の緩和が見られた（表１及び図１）。
【表１】
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【００４８】
２）末梢血中における2型ヘルパーT細胞の割合
採取した末梢血中の2型ヘルパーT細胞の割合を所定の方法（非特許文献３）で調べた（表２及び図２）。
【表２】
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【００４９】
その結果複数の患者において有意にTh2細胞の減少が起こった。
ヘルパーT細胞は、はマクロファージやキラーT細胞を活性化させる1型ヘルパーT細胞（Th1）CD3+CD4+IFN-γ+IL-4-、B細胞にIgG抗体産生を促す2型ヘルパーT細胞（Th2）CD3+CD4+IFN-γ-IL-4+に分類され、未分化のヘルパーT細胞は、IL-12の作用を受けるとTh1細胞に、IL-4の作用を受けるとTh2細胞になる。Th2の細胞の割合が大きいほどIgEが過剰につくられ、アレルギー症状が悪化することを意味する。【００５０】
３）TARC（thymus and activation−regulated chemokine）の量（pg/mL）
採取した末梢血中の血清TARCの濃度を、ELISAを用いて所定の方法（非特許文献４）で調べた（表３及び図３）。
【表３】
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【００５１】
その結果、複数の患者において、有意にその値が減少した。
TARCは、白血球走化作用を持つケモカインの一種で、過剰産生されるとTh2細胞を病変局所に引き寄せ、IgE抗体の産生や好酸球の活性化が起こり、アレルギー炎症反応を惹起する。とりわけ、アトピー性皮膚炎において特異性がみられ、重症になるほど著明に上昇し、軽快に伴い減少する。
基準値(pg/mL)は、小児（6〜12ヶ月）：1367未満；小児（1〜2歳）：998未満小児（2歳以上）：743未満；成人：450未満である。成人の場合、アトピー性皮膚炎の目安として、血清TARC値 700pg/mL未満であれば、軽度；血清TARC値 700pg/mL以上であれば中等症以上と判断される。【００５２】
４）非特異的IgEの量（IU/mL）
末梢血中の非特異的IgEの量を所定の方法（非特許文献５）で測定した（表４及び図４）。
【表４】
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【００５３】
その結果、複数の患者において、有意にその値が減少した。
上記のようにIgE抗体Ｉ型アレルギーの発症に大きく関わってくる。アトピー性皮膚炎では必ずしも全員のIgEが高いわけではないが、IgEの数値と症状の程度はよく相関する。【００５４】
５）まとめ
以上により、γδT細胞療法は、アレルギー性疾患、とりわけアトピー性疾患の症状の治癒緩和に有効であることが、臨床医の総合的な診断の下、確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
ADに対しては、薬物治療を中心とした標準治療が広く実施されているものの、その多くは対症療法であり、長期の寛解維持または根治を達成する治療は限定的で、また副作用を伴うケースが少なくない。そのため、長期にわたって使用可能な、副作用の少ない低侵襲な治療法の開発が求められている。開発中の新規治療法の多くが、Th2を中心とした免疫抑制が主体である一方、γδT細胞療法による免疫強化を主体とした免疫応答バランスの改善は、免疫抑制を中心とした創薬開発とは一線を画す臨床上重要な意義を有している。本発明の治療薬は、ステロイド投与などに比べて副作用の少ない、すなわち、患者のQOL（Quality Of Life）の高いアレルギー疾患の治療、アレルギー症状の軽減緩和、とりわけアトピー性疾患の治療軽減緩和を行うことが可能である。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【国際調査報告】
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