(57)【要約】【課題】癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの検出方法、及びそのためのキット及びプライマーセットを提供する。【解決手段】前記検出方法では、ＣＬＮ３の遺伝子の一部とＢＲＡＦ遺伝子の一部との融合遺伝子、あるいは、それがコードする融合タンパク質を検出する。前記プライマーセット又は検出用キットは、ＣＬＮ３をコードする部分から設計されるセンスプライマーと、ＢＲＡＦをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーとを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から得た試料中の、以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、セロイド−リポフスチノーシス，ニューロナル３（ＣＬＮ３）遺伝子とブイ−ラフミューリンサルコーマバイアルオンコジーンホモローグＢ１（ＢＲＡＦ）遺伝子との融合遺伝子の検出方法：
配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＣＬＮ３遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との融合遺伝子の検出用キット：
配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項４に記載のキット。
【請求項７】
ＣＬＮ３遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記ａ）及びｂ）からなる群より選択されるプライマーセット：
ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、及び
ｂ）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
【請求項８】
配列番号１の塩基番号１から３６９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号３７０から２０８０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【請求項９】
配列番号４の塩基番号１から４８４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号４の塩基番号４８５から２１９５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＲＡＦキナーゼ領域を含む新規の融合遺伝子または各融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブイ−ラフミューリンサルコーマバイアルオンコジーンホモローグＢ１（ｖ−ｒａｆｍｕｒｉｎｅ  ｓａｃｒｏｍａ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ１；ＢＲＡＦ）遺伝子は染色体７番長腕に存在し、１８個のエキソンからなる。コードする蛋白質はセリンスレオニンキナーゼであり、中央部にピーループ、アミノ末端側にラスバインディングドメイン及びシステインリッチドメインを有し、カルボキシ末端側にキナーゼドメインを有する。ＢＲＡＦはラス蛋白質のエフェクターとして作用し、マップキナーゼキナーゼ１（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  １；ＭＡＰ２Ｋ１）及びマップキナーゼキナーゼ２（ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ２；ＭＡＰ２Ｋ２）をリン酸化することが知られている（非特許文献１）。また、アミノ末端側に自己抑制領域を有していることも知られている（非特許文献２）。
【０００３】
毛様細胞性星膠腫において、ＫＩＡＡ１５４９遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子の間の染色体、約２メガベースの領域で直列重複がおこり、癌化能をもったＫＩＡＡ１５４９：ＢＲＡＦ融合キナーゼが発現していることが知られている（非特許文献３）。また、前立腺癌において染色体間転座により、ＳＬＣ４５Ａ３、胃癌においてＡＧＴＲＡＰと融合キナーゼが発現していることも知られている（非特許文献４）。これらの融合キナーゼは、ＢＲＡＦのアミノ末端側に存在する自己抑制領域を欠損し恒常的にＢＲＡＦが活性化され、細胞内シグナルが異常に活性化され癌化及び細胞増殖を引き起こしていることが考えられている。実際に、ＫＩＡＡ１５４９：ＢＲＡＦ融合遺伝子及びＳＬＣ４５Ａ３：ＢＲＡＦ融合遺伝子をマウス正常細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入すると癌細胞に形質転換することが知られている。またＳＬＣ４５Ａ３：ＢＲＡＦ融合遺伝子によって形質転換した。発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖は、ＲＡＦキナーゼ抑制化合物によって抑制されることから、これらの融合遺伝子が有望な治療標的分子及び診断マーカーとなる可能性が示唆されている（非特許文献３及び４）。
【０００４】
セロイド−リポフスチノーシス，ニューロナル３（Ｃｅｒｏｉｄ−ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ，ｎｅｕｒｏｎａｌ  ３；ＣＬＮ３）遺伝子は染色体１６番短腕に存在する。ＣＬＮ３はリソソームに存在し、劣性遺伝の神経疾患であるバッテン病において遺伝子変異があることが知られている（非特許文献５）。
【０００５】
これまでにＣＬＮ３とＢＲＡＦが融合しているという報告はなく、また肺癌でＢＲＡＦ融合遺伝子が存在しているとの報告は無い。
【非特許文献１】「カレント・オピニオン・イン・ファーマコロジー（Current Opinion in Pharmacology）、（英国）、２００８年、８巻、p.４１９−４２６」
【非特許文献２】「ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY）、（米国）、２００５年、２８０巻、ｐ.１６２４４−１６２５３」
【非特許文献３】「キャンサー・レサーチ（Cancer Research）、（米国）、２００８年、６８巻、ｐ.８６７３−８６７７」
【非特許文献４】「ネイチャー・メディシン（Nature Medicine）、（英国）、２０１０年、１６巻、７９３−７９８」
【非特許文献５】「カレント・オピニオン・イン・ニューロロジー（Current opinion in neurology）、（英国）、２００３年、１６巻、ｐ．１２１−１８１」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
肺癌の新たな原因遺伝子であるポリヌクレオチドを解明し、これにより、当該ポリヌクレオチド又はそれがコードするポリペプチドの検出方法、及びそのためのキット又はプライマーセットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、肺癌患者から得た検体からＣＬＮ３遺伝子の一部と、キナーゼであるＢＲＡＦ遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子を単離同定し（実施例１及び２）、これらの融合遺伝子が肺癌患者検体に存在すること（実施例３及び４）、またこれらの融合遺伝子を発現させるためレトロウイルスを作製し（実施例５）、感染細胞が腫瘍形成能を有し、癌の原因遺伝子であることを見出した（実施例６〜８）。本発明者は、これらの知見から、これらの融合遺伝子の検出法を構築し、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、これらの融合遺伝子またはそれにコードされる融合蛋白質を検出することにより、ＢＲＡＦ阻害薬物治療の対象となる癌患者を選別することを可能とした。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下に関する。
［１］被験者から得た試料中の、以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、セロイド−リポフスチノーシス，ニューロナル３（ＣＬＮ３）遺伝子とブイ−ラフミューリンサルコーマバイアルオンコジーンホモローグＢ１（ＢＲＡＦ）遺伝子との融合遺伝子の検出方法：
配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［２］前記ポリペプチドが、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［１］に記載の方法。
［３］前記ポリペプチドが、配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］以下のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＣＬＮ３遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との融合遺伝子の検出用キット：
配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［５］前記ポリペプチドが、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチドである、［４］に記載のキット。
［６］前記ポリペプチドが、配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、［４］又は［５］に記載のキット。
［７］ＣＬＮ３遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、下記ａ）及びｂ）からなる群より選択されるプライマーセット：
ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット、及び
ｂ）配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
［８］配列番号１の塩基番号１から３６９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号３７０から２０８０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
［９］配列番号４の塩基番号１から４８４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号４の塩基番号４８５から２１９５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【０００９】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＣＬＮ３遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子とを含む融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌）の存在の検出方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
【００１０】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＣＬＮ３遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子とを含む融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌）の診断方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
【００１１】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌）の存在の検出方法：
（１）被験者から得た試料を鋳型とし、前記［７］乃至［９］に記載されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
（２）ＰＣＲ産物の存在を検出する工程、
に関する。
【００１２】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌）の診断方法：
（１）被験者から得た試料を鋳型とし、前記［７］乃至［９］に記載されたプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、及び
（２）ＰＣＲ産物の存在を検出する工程、
に関する。
【００１３】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成（genomic rearrangement）を検出する方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする、染色体の再構成（genomic rearrangement）を検出する方法：
（１）ｉ）被験者から得た試料、ii）ＣＬＮ３遺伝子をコードする５’側ゲノム領域を含む標識プローブ、及びiii）ＢＲＡＦ遺伝子をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブを用い、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
（２）前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。
【００１５】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌）の存在の検出方法：
（１）ｉ）被験者から得た試料、ii）ＣＬＮ３遺伝子をコードする５’側ゲノム領域を含む標識プローブ、及びiii）ＢＲＡＦ遺伝子をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブを用い、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
（２）前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。
【００１６】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とする癌（特には肺癌）の診断方法：
（１）ｉ）被験者から得た試料、ii）ＣＬＮ３遺伝子をコードする５’側ゲノム領域を含む標識プローブ、及びiii）ＢＲＡＦ遺伝子をコードする３’ゲノム領域を含む蛍光標識プローブを用い、インサイチュハイブリダイゼーションを行う工程、及び
（２）前記標識のシグナルの重なりを検出する工程、
に関する。
【００１７】
また、本発明は、
下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（１）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
【００１８】
また、本発明は、被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程を含むことを特徴とする、ＣＬＮ３とＢＲＡＦとの融合タンパク質の検出方法：
（１）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
【００１９】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＣＬＮ３とＢＲＡＦとの融合タンパク質陽性の癌（特には肺癌）の存在の検出方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
【００２０】
また、本発明は、
下記工程を含むことを特徴とするＣＬＮ３とＢＲＡＦとの融合タンパク質陽性の癌（特には肺癌）の診断方法：
被験者から得た試料中の、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドの存在を検出する工程、
（１）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（２）配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、あるいは、
（３）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
に関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の検出方法は、ＣＬＮ３遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との融合遺伝子陽性の癌（特には肺癌）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法は、染色体の再構成を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、ＢＲＡＦ阻害剤の適用対象者であるか否かを鑑別することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
《本発明の検出方法》
本発明の検出方法は、融合遺伝子を検出する方法であり、該方法は、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドの存在を検出する工程を含む。被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された体液（好ましくは血液）、肺胞・気管支洗浄液、生検された試料、喀痰試料を用いるが、好適には、被験者の肺患部の生検試料又は喀痰試料を用いる。試料からゲノムＤＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることができる。特にはｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。
【００２３】
融合遺伝子の検出方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」において、その検出対象となるポリヌクレオチド（以下、「検出対象ポリヌクレオチド」と称する）は、「ＣＬＮ３遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との融合遺伝子」であり、これは、ＣＬＮ３遺伝子の一部とＢＲＡＦ遺伝子の一部とを含む遺伝子である。
【００２４】
「ＣＬＮ３遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との融合遺伝子」としては、下記（１）乃至（３）に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
（１）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド[以下、「相同ポリペプチド」とも称する]、
（２）配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、又は、配列番号２若しくは配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド[以下、「機能的等価改変体ポリペプチド」とも称する]、あるいは、
（３）配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００２５】
好ましい前記検出対象ポリヌクレオチドとしては、配列番号１又は配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＣＬＮ３遺伝子バリアント２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００００８６．２）の塩基番号１から３６９（エキソン１の３’末端に対応）とＢＲＡＦ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００４３３３．４）の塩基番号１２３９（エキソン１０の５’末端に対応）から２９４９までの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号１に示される塩基配列の内、塩基番号１〜３６９の配列はＣＬＮ３遺伝子に由来し、塩基番号３７０〜２０８０の配列はＢＲＡＦ遺伝子に由来する。この融合ポリヌクレオチドを、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１とも称する。配列番号１の塩基番号３２４〜１４９３は、融合タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、このＯＲＦにコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【００２６】
配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＣＬＮ３遺伝子バリアント１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００１０４２４３２．１）の塩基番号１から４８４（エキソン２の３’末端に対応）とＢＲＡＦ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００４３３３．４）の塩基番号１２３９（エキソン１０の５’末端に対応）から２９４９までの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。配列番号４に示される塩基配列の内、塩基番号１〜４８４の配列はＣＬＮ３遺伝子に由来し、塩基番号４８５〜２１９５の配列はＢＲＡＦ遺伝子に由来する。この融合ポリヌクレオチドを、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２とも称する。配列番号４の塩基番号３５５〜１６０８は、融合タンパク質のＯＲＦであり、このＯＲＦにコードされるアミノ酸配列を配列番号５に示す。
【００２７】
より好ましい前記検出対象ポリヌクレオチドとしては、配列番号３又は配列番号６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号３は、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１の部分配列であり、配列番号１の塩基番号１５７〜１７６７に対応する。配列番号６は、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２の部分配列であり、配列番号４の塩基番号２４７〜１８４９に対応する。
【００２８】
「相同ポリペプチド」は、「配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」であるが、該同一性が、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。
【００２９】
「機能的等価改変体ポリペプチド」としては、「配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列において、１〜１０個、好ましくは１〜数個、更に好ましくは１〜７個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」が好ましく、「配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」が特に好ましい。
【００３０】
なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２
【００３１】
あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、後記実施例６〜８に記載の方法で確認する。具体的には、当該融合遺伝子を導入した細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、一定期間観察し、腫瘍形成を確認する。
【００３２】
本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドとしては、「配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが好ましく、「配列番号２又は配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」をコードするポリヌクレオチドが最も好ましい。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドの検出方法における「ポリヌクレオチドの存在を検出する工程」は、被験者から得た試料のゲノム中の検出対象ポリヌクレオチド（融合点を含むゲノム配列）の存在を検出すること、あるいは、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物（例えばｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、検出対象ポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出することにより実施する。
【００３４】
ゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行うことができ、市販のＤＮＡ抽出キットを用いて簡便に行うことができる。
【００３５】
検出工程は公知の遺伝子解析法（例えば、遺伝子検出法として常用されるＰＣＲ、ＬＣＲ（Ligase chain reaction）、ＳＤＡ（Strand displacement amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification）、ＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）、ＬＡＭＰ法（Loop-mediated isothermal amplification）、ＴＭＡ法（Gen-Probe’s TMA system）、インサイチュハイブリダイゼーション法、更にマイクロアレイなど周知の方法）に従って実施することができる。例えば、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸をプローブとしたハイブリダイゼーション技術、又は、検出対象ポリヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用する。
【００３６】
具体的には、被験者から得た試料由来の核酸、例えば、ｍＲＮＡ等を用いて測定する。ｍＲＮＡ量の測定は、検出対象ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いて遺伝子増幅反応方法にて測定する。本発明の検出方法に用いられるプライマー、又は、検出用キットに含まれるプライマーは、検出対象ポリヌクレオチド配列を特異的に増幅できるものであれば、特には限定されず、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。ＰＣＲ増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Primer Express; PE Biosystems）などを利用してできる。また、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。
【００３７】
より具体的には、センスプライマー（５’−プライマー）をＣＬＮ３遺伝子に由来する部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）のＣＬＮ３遺伝子領域内の任意の部分）から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）をＢＲＡＦ遺伝子に由来する部分（例えば、前記融合ポリヌクレオチド（特にはｃＤＮＡ）のＢＲＡＦ遺伝子領域内の任意の部分）から設計する。あるいは、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方を、該融合ポリヌクレオチドの融合点（後述）を含む領域に対応するように設計してもよい。好ましくは、本発明の検出用キットに含まれるプライマーセットを用い、更に好ましくは、検出用キットに最も好適に含まれるプライマーセットを用いる。ＰＣＲ増幅モニター法では、各遺伝子に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。各増幅技術に適した方法によって目的とした遺伝子（全体又はその特異的部分）が増幅されたか否かを確認することができる。例えば、ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、検出対象ポリヌクレオチドが存在していたことになる。このように、検出対象ポリヌクレオチドの存在を検出することができる。
【００３８】
本発明の融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドの存在を遺伝子増幅反応により検出する工程に加え、さらに目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。
【００３９】
ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法などを使用して行う。ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、検出対象ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする連続した少なくとも３２塩基の核酸分子であって、融合点を中心にその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる配列（具体的には、配列番号１に示される塩基配列の第３５４番〜第３８５番（第３６９番／第３７０番）、又は配列番号４に示される塩基配列の第４６９番〜第５００番（第４８４番／第４８５番）。なお、括弧内の塩基番号は融合点を示す。）、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いることができる。
【００４０】
インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、公知のＦＩＳＨ法（fusion assay）に従って実施することができる。または、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）法を組み合わせたヒュージョンアッセイで実施することができる。
【００４１】
なお、本明細書における融合点とは、ＣＬＮ３遺伝子由来の部分とＢＲＡＦ遺伝子由来の部分とが融合した点を意味する。
【００４２】
また、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
【００４３】
さらには、ＲＴ−ＰＣＲ等の遺伝子増幅技術を利用することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Genome Res., 6(10), 986, 1996）を用いることにより、検出対象ポリヌクレオチドの存在について、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７９００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることが出来る。リアルタイムＰＣＲは公知の方法であり、そのための装置及びキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。
【００４４】
本発明における融合遺伝子の検出は、被験者から得た試料における、検出対象ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド（以下、「検出対象ポリペプチド」と称する）の存在を直接検出することによって実施してもよい。
【００４５】
例えば、ポリペプチドを検出する工程において、被験者から得た試料（例えば、被験者から得た癌組織や細胞）由来の可溶化液を調製し、その中に含まれる検出対象ポリペプチドを、融合ポリペプチドを構成する各タンパク質に対する抗体（例えば、ＣＬＮ３に対する抗体とＢＲＡＦに対する抗体）を組み合わせることによる免疫学的測定法又は酵素活性測定法等により実施してもよい。これらの手法としては、検出対象ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いた、酵素免疫測定法、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法等の手法が挙げられる。
【００４６】
本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドが、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、当該ポリヌクレオチド陽性の癌を有する対象（患者）であり、ＢＲＡＦ阻害剤による治療の適用対象となる。
【００４７】
《本発明の検出用キット、本発明のプライマーセット》
本発明の検出用キットには、少なくとも、本発明の検出方法における検出対象ポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマー（プライマーセットとも称する）が含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、検出対象ポリヌクレオチド増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
【００４８】
本発明のプライマーセットには、
ＣＬＮ３遺伝子に由来する部分から設計されるセンスプライマー及びＢＲＡＦ遺伝子に由来する部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＣＬＮ３遺伝子とＢＲＡＦ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、該アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、該センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる、プライマーセット
が含まれる。
本発明のプライマーセットにおいて、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方を、該融合ポリヌクレオチドの融合点（前述）を含む部分に対応するように設計してもよい。
【００４９】
本発明のプライマーセットの具体的な態様として、以下（１）及び（２）からなる群より選択されるプライマーセットが挙げられる：
（１）配列番号１の塩基番号１から３６９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号３７０から２０８０間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
（２）配列番号４の塩基番号１から４８４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号４の塩基番号４８５から２１９５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【００５０】
本発明のプライマーセットのより具体的な態様としては、以下（１）及び（２）からなる群より選択されるプライマーセットが挙げられる：
（１）配列番号３の塩基番号１から２１３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号２１４から１６１１間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
（２）配列番号６の塩基番号１から２３８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号６の塩基番号２３９から１６０３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
【００５１】
前記プライマーセットにおいては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。
また、本発明のプライマーは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。
【００５２】
本発明のプライマーセットは、本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチドを増幅及び検出するために用いることができる。また、本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
【００５４】
［実施例１］  ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ融合ポリヌクレオチド  ｖ１（ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１）の単離
非小細胞肺癌患者肺癌組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｌｇ０６７検体ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ（ｄＴ）２０プライマー、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
次に、プライマーＣＬＮ３  ｅｘｏｎ１  ｆｗｄ０６（配列番号７）及びＢＲＡＦ  ｅｘｏｎ１８  ｒｅｖ０１（配列番号８）を用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ株式会社）を行いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分を３０サイクル）を行った。その後、１０倍希釈した前述ＰＣＲ産物を鋳型として、同じプライマー、同じＤＮＡポリメラーゼ、同じプロトコルでＰＣＲを行い、電気泳動したところ、約１．６ｋｂのＰＣＲ産物を得た。本ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ株式会社）にクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ）。この決定された塩基配列を配列番号３に示す。
【００５５】
この結果、ＮＣＢＩに登録されているＣＬＮ３（ＮＭ＿００００８６．２）のエキソン１の３’末端に、ＢＲＡＦ（ＮＭ＿００４３３３．４）のエキソン１０の５’末端が融合されたポリヌクレオチド（ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１）の存在が明らかになった。この融合ポリヌクレオチドの全長配列を配列番号１に示す。
【００５６】
ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号１の塩基番号３２４〜１４９３の領域に存在する。このＯＲＦにコードされるＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。この融合タンパク質において、配列番号２のアミノ酸１〜１５まではＣＬＮ３タンパク質に由来し、アミノ酸１６〜３８９まではＢＲＡＦタンパク質に由来する。
【００５７】
この融合タンパク質を発現させるため、プライマーＣＬＮ３−ＢＲＡＦ（ＥｃｏＲＩ−ＰａｃＩ）−Ｆ（配列番号９）及びＢＲＡＦ（ＥｃｏＲＶ）−Ｒ（配列番号１０）にて、上記ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１のＰＣＲ産物を鋳型として、同条件によるＰＣＲを行い、シークエンスベクター（ｐＸＬ−ＴＯＰＯ／インビトロジェン  ライフテクノロジー社）にクローニングし、配列を確認した。配列確認後、制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い、ＯＲＦを含むＤＮＡ断片を抽出し、発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＥｃｏＲＩサイトにクローニングし、プライマーｐＭＸｓ−Ｆ（配列番号１８）にて挿入方向を確認し、発現プラスミドを構築した（ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ）。
【００５８】
［実施例２］  ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ融合ポリヌクレオチド  ｖ２（ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ  Ｃ２Ｂ１０）の単離
次に、プライマーＣＬＮ３  ｅｘｏｎ１  ｆｗｄ０１（配列番号１１）及びＢＲＡＦ  ｅｘｏｎ１８  ｒｅｖ０１（配列番号８）を用いて、実施例１で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ株式会社）を行いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分を３０サイクル）を行った。その後、１０倍希釈した前述のＰＣＲ産物を鋳型として、プライマーＣＬＮ３  ｅｘｏｎ１  ｆｗｄ０２（配列番号１２）及びＢＲＡＦ  ｅｘｏｎ１８  ｒｅｖ０２（配列番号１３）を用いて、同じＤＮＡポリメラーゼ、同じプロトコルでＰＣＲを行い、電気泳動したところ、約１．６ｋｂのＰＣＲ産物を得た。本ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ株式会社）にクローニングした。インサートはダイデオキシシーケンス法により配列を決定した（ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ）。この決定された塩基配列を配列番号６に示す。
【００５９】
この結果、ＮＣＢＩに登録されているＣＬＮ３（ＮＭ＿００１０４２４３２．１）のエキソン２の３’末端に、ＢＲＡＦ（ＮＭ＿００４３３３．４）のエキソン１０の５’末端が融合されたポリヌクレオチド（ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２）の存在が明らかになった。この融合ポリヌクレオチドの全長配列を配列番号４に示す。
【００６０】
ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２のＯＲＦは、配列番号４の３５５〜１６０８の領域に存在する。このＯＲＦにコードされるＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５に示す。この融合タンパク質において、配列番号５のアミノ酸４４〜４１７まではＢＲＡＦタンパク質に由来する。一方、配列番号５のアミノ酸１〜４３まではＣＬＮ３タンパク質に存在しないアミノ酸配列である。これは、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２のＯＲＦにおいて、ＣＬＮ３遺伝子に由来する領域については、野生型ＣＬＮ３のＯＲＦに対して読み枠のシフトが生じることに起因する。
【００６１】
この融合タンパク質を発現させるため、上記クローニングベクターを制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、３時間の酵素反応を行い、ＯＲＦを含むＤＮＡ断片を抽出し、発現ベクター（ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ；コスモバイオ社）のマルチクローニングサイトに存在するＥｃｏＲＩサイトにクローニングし、プライマーｐＭＸｓ−Ｆ（配列番号１８）にて挿入方向を確認し、発現プラスミドを構築した（ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ）。
【００６２】
［実施例３］  ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１融合ポリヌクレオチドの検出
非小細胞肺癌臨床検体由来ｃＤＮＡ（米国アステランド社）１８１サンプルを基質とし、プライマーＣ０１−Ｂ１０＿Ｑ＿Ｆ１３（配列番号１４）及びＣ０１−Ｂ１０＿Ｑ＿Ｒ１４（配列番号１５）をプライマーセットとして、定量的ＰＣＲキット（Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；ライフテクノロジーズ社）を用い、アプライドバイオシステムズ７９００ＨＴシステムにて、定量ＰＣＲ（９５℃  １０分の後、９５℃１５秒、５９℃６０秒  を４５サイクル）を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、上述のサンプルＬｇ０６７検体由来ｃＤＮＡのみで増幅が確認された。以上から、上記方法により、非小細胞肺癌臨床検体由来の試料中のＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１融合ポリヌクレオチドの存在を検出することができ、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１融合ポリヌクレオチド陽性患者を選択できることが示された。
【００６３】
［実施例４］  ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２融合ポリヌクレオチド
非小細胞肺癌臨床検体由来ｃＤＮＡ（米国アステランド社）１８１サンプルを基質とし、プライマーＣＬＮ０２−ＢＲＡＦ１０＿Ｑ＿Ｆ０４（配列番号１６）及びＣＬＮ０２−ＢＲＡＦ１０＿Ｑ＿Ｒ０４（配列番号１７）をプライマーセットとして、定量的ＰＣＲキット（Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ；ライフテクノロジーズ社）を用い、アプライドバイオシステムズ７９００ＨＴシステムにて、定量ＰＣＲ（９５℃  １０分の後、９５℃１５秒、５９℃６０秒  を４５サイクル）を行い遺伝子発現量を測定した。その結果、上述のサンプルＬｇ０６７検体由来ｃＤＮＡのみで増幅が確認された。以上から、上記方法により、非小細胞肺癌臨床検体由来の試料中のＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２融合ポリヌクレオチドの存在を検出することができ、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２融合ポリヌクレオチド陽性患者を選択できることが示された。
【００６４】
[実施例５]  ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ融合ポリヌクレオチドのレトロウイルス液の作製
上記、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ及びＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏを９μｇ、トランスフェクション試薬（ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ、ロシュ社）を用いて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ細胞にトランスフェクションを実施した。トランスフェクション２４時間後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ培地；インビトロジェン社）を交換し、さらに２４時間の培地上清を採取しレトロウイルス溶液を作製した。
【００６５】
[実施例６]  ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１による増殖因子非依存性増殖促進作用の検討
ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏを用いて作製したウイルス溶液にポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を４μｇ／ｍＬの濃度で添加したのち、ＢＡ／Ｆ３細胞に添加し感染させた。感染６時間後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）、１ｎｇ／ｍＬのマウスリコンビナントＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  １６４０；インビトロジェン社）培地に交換し培養した。感染１日後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）及び１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（シグマ社）を含むＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン社）培地を用いて、５％ＣＯ2存在下、３７℃で４週間培養を続け、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１を安定発現するＢＡ／Ｆ３細胞を取得した（ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１発現／ＢＡ／Ｆ３細胞と命名した）。
【００６６】
ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１発現／ＢＡ／Ｆ３細胞のＩＬ−３非存在下での増殖能を検討した。ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１発現／ＢＡ／Ｆ３細胞及び親株であるＢＡ／Ｆ３細胞を増殖因子ＩＬ−３の非存在下で、１ウェル当り１×１０3個となるように１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含みマウスリコンビナントＩＬ−３を含まないＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社）で９６ウェルプレートに撒き、５％ＣＯ2存在下、３７℃で培養後、翌日（Ｄａｙ１）及び４日後（Ｄａｙ４）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧｌｏTM  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー社）を用いた。
【００６７】
ＢＡ／Ｆ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対して、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１発現／ＢＡ／Ｆ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで約１０倍の細胞数の増加が観察された。以上により、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１融合ポリヌクレオチドは、増殖因子非依存性増殖亢進作用を有することがわかった。
【００６８】
[実施例７]  ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ融合ポリヌクレオチドの足場非依存的増殖亢進作用の検討
実施例３において、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏ及びＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２／ｐＭＸｓ−ｐｕｒｏを用いて作製したウイルス溶液にポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を４μｇ／ｍＬの濃度で添加したのち、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加し感染させた。添加６時間後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含むＤ−ＭＥＭ培地に交換し、感染１日後に１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）及び１μｇ／ｍＬのピューロマイシン（シグマ社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に交換し、５％ＣＯ2存在下、３７℃で４週間培養を続け、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１を安定発現するＮＩＨ３Ｔ３及びＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を取得した（それぞれ、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞と命名した）。
【００６９】
ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞の足場非依存的増殖亢進能を検討するため、９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト社）にＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及び親株であるＮＩＨ３Ｔ３細胞を、それぞれ１ウェル当り１×１０3個となるように１０％牛血清（ニチレイバイオサイエンス社）を含むＤ−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社）で播種した。５％ＣＯ2存在下、３７℃で培養後、翌日（Ｄａｙ１）及び４日後（Ｄａｙ４）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧｌｏTM Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー社）を用いた。
【００７０】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで細胞数のカウントは増加しなかったのに対して、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞はＤａｙ１からＤａｙ４までで、それぞれ約２倍及び約４倍の細胞数カウントの増加が確認された。以上のことから、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は足場非依存的細胞増殖を示すことが明らかとなった。
【００７１】
[実施例８]  ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ融合ポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ造腫瘍能の検討
実施例７において作製したＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞及びＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２発現／ＮＩＨ３Ｔ３細胞をヌードマウスの皮下に３×１０6個ずつ接種し１４日観察したところ腫瘍形成が確認された。以上から、ＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ１及びＣＬＮ３−ＢＲＡＦ＿ｖ２は癌の原因遺伝子であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の検出方法は、本明細書の融合遺伝子陽性の癌患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。
【配列表】
2014054185000001.app