(57)【要約】  本発明は、被験試料とチオフラビンＴとを接触させるステップと、チオフラビンＴの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得るステップと、時間ｔ１〜ｔ２の時間分解蛍光スペクトル、及び時間ｔ３〜ｔ４の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得るステップと、両規格化スペクトルに基づいて、前記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在するか否かを判定するステップと、を含み、ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４であり、時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルと比較して、時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルが低波長側にシフトしていることが、前記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在することを示す、アミロイドβオリゴマーの検出方法に関する。
2017056905.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料とチオフラビンＴとを接触させるステップと、
チオフラビンＴの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得るステップと、
時間ｔ１〜ｔ２の時間分解蛍光スペクトル、及び時間ｔ３〜ｔ４の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得るステップと、
両規格化スペクトルに基づいて、前記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在するか否かを判定するステップと、を含み、
ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４であり、
時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルと比較して、時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルが低波長側にシフトしていることが、前記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在することを示す、アミロイドβオリゴマーの検出方法。
【請求項２】
判定するステップにおいて、
両規格化スペクトルの波長λ１（ただし、λ１＞４８０ｎｍ）における蛍光強度の値から下記式に従い蛍光比ｓ１を算出し、
蛍光比ｓ１＝（時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルの波長λ１における蛍光強度）／（時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルの波長λ１における蛍光強度）
蛍光比ｓ１が１未満の場合、アミロイドβオリゴマーが存在すると判定する、又は蛍光比ｓ１が１以上の場合、アミロイドβオリゴマーが存在しないと判定する、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
判定するステップにおいて、
両規格化スペクトルの波長λ２（ただし、λ２＜４８０ｎｍ）における蛍光強度の値から下記式に従い蛍光比ｓ２を算出し、
蛍光比ｓ２＝（時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルの波長λ２における蛍光強度）／（時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルの波長λ２における蛍光強度）
蛍光比ｓ２が１を超える場合、アミロイドβオリゴマーが存在すると判定する、又は蛍光比ｓ２が１以下の場合、アミロイドβオリゴマーが存在しないと判定する、請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】
判定するステップにおいて、
両規格化スペクトルのピークトップの波長を比較し、
時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルのピークトップの波長が、時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルのピークトップの波長よりも短い場合、アミロイドβオリゴマーが存在すると判定する、又は時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルのピークトップの波長が、時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルのピークトップの波長と同じか若しくは長い場合、アミロイドβオリゴマーが存在しないと判定する、請求項１に記載の検出方法。
【請求項５】
被験試料とチオフラビンＴとを接触させるステップと、
チオフラビンＴの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得るステップと、
時間ｔ１〜ｔ２の時間分解蛍光スペクトル、及び時間ｔ３〜ｔ４の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得るステップと、
を含む、アミロイドβオリゴマーの検出のためのデータ収集方法であって、
ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４であり、
時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルと比較して、時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルが低波長側にシフトしていることが、前記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在することを示す、データ収集方法。
【請求項６】
被験試料に接触させたチオフラビンＴの時間分解蛍光スペクトルデータを取得する取得手段と、
取得した時間分解蛍光スペクトルデータから、時間ｔ１〜ｔ２の時間分解蛍光スペクトル、及び時間ｔ３〜ｔ４の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを算出する算出手段と、
両規格化スペクトルを比較する比較手段と、
比較結果に基づき、前記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在するか否かを判定する判定手段と、を備え、
ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４である、
アミロイドβオリゴマー検出装置。
【請求項７】
コンピュータを、
被験試料に接触させたチオフラビンＴの時間分解蛍光スペクトルデータを取得する取得手段、
取得した時間分解蛍光スペクトルデータから、時間ｔ１〜ｔ２の時間分解蛍光スペクトル、及び時間ｔ３〜ｔ４の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを算出する算出手段（ただし、ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４である）、
両規格化スペクトルを比較する比較手段、
比較結果に基づき、前記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在するか否かを判定する判定手段、
として機能させるためのアミロイドβオリゴマー検出プログラム。
【請求項８】
請求項７に記載のアミロイドβオリゴマー検出プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドβオリゴマーの検出方法、アミロイドβオリゴマー検出装置及びアミロイドβオリゴマー検出プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
社会的問題となっているアルツハイマー型認知症（以下、「ＡＤ」と略すこともある。）の研究においては、根本的治療の観点からアミロイドβペプチド（以下、「Ａβ」と略すこともある。）が診断及び治療のターゲットとして注目を浴びている。これは、ＡＤにおいて、Ａβの脳内蓄積が最初にあらわれる病態だからである。Ａβは蓄積及び凝集化することで神経細胞に悪影響を与えるため、診断及び治療の研究では、Ａβの濃度又は凝集度に関する情報を測定することが重要となる。【０００３】
最近の研究から、Ａβの神経細胞に対する毒性は、Ａβが凝集したＡβ線維よりむしろ、Ａβオリゴマーと呼ばれる凝集前駆体に由来することが明らかとなってきている（例えば、特許文献１参照）。【０００４】
Ａβオリゴマーを検出する方法として、例えば、特許文献２には、ゲル電気泳動及びゲルろ過クロマトグラフィーによる方法が開示されている。また、特許文献３及び４には、抗体を用いたＡβオリゴマーの検出方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００９−５４４９５４号公報
【特許文献２】特開２０１０−１６８３８５号公報
【特許文献３】特表２００９−５４４９５４号公報
【特許文献４】特表２０１２−５２４０２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来のＡβオリゴマーを検出する方法は、計測に手間と時間がかかったり、また高価な試薬が必要となるなど、未だ充分なものではなかった。【０００７】
例えば、特許文献２に記載のようなゲル電気泳動及びゲルろ過クロマトグラフィーによる方法では、Ａβオリゴマーか否かの識別は容易であるが、計測に手間と時間がかかる、Ａβオリゴマーの分布を画像化することができない等の問題がある。【０００８】
また、特許文献３及び４に記載のような抗体を使用する方法では、抗体反応を利用していることから高感度なＡβオリゴマー検出が可能となるが、実験操作が煩雑で特殊な抗体を必要とする。また測定に時間も必要なことから、簡便で安価な計測法とは言えない。【０００９】
本発明は、上述の問題点に鑑み、簡便かつ安価にＡβオリゴマーを検出できるアミロイドβオリゴマーの検出方法を提供することを目的とする。本発明はまた、アミロイドβオリゴマー検出装置及びアミロイドβオリゴマー検出プログラムを提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、被験試料とチオフラビンＴとを接触させるステップと、チオフラビンＴの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得るステップと、時間ｔ１〜ｔ２の時間分解蛍光スペクトル、及び時間ｔ３〜ｔ４の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得るステップと、両規格化スペクトルに基づいて、上記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在するか否かを判定するステップと、を含み、ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４であり、時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルと比較して、時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルが低波長側にシフトしていることが、上記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在することを示す、アミロイドβオリゴマーの検出方法に関する。【００１１】
本発明は、ＡβオリゴマーをチオフラビンＴ（以下、「ＴｈＴ」ともいう。）で蛍光染色したときのＴｈＴ由来の時間分解蛍光スペクトルが、時間の経過と共に低波長側にシフトする、という新規な知見に基づく。この低波長側へのシフトは、Ａβオリゴマーに特異的であり、Ａβ線維では観察されない。本発明の検出方法は、この新規な知見に基づいているため、簡便かつ安価にＡβオリゴマーを検出することができる。【００１２】
上記検出方法は、判定するステップにおいて、両規格化スペクトルの波長λ１（ただし、λ１＞４８０ｎｍ）における蛍光強度の値から下記式に従い蛍光比ｓ１を算出し、
蛍光比ｓ１＝（時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルの波長λ１における蛍光強度）／（時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルの波長λ１における蛍光強度）
蛍光比ｓ１が１未満の場合、アミロイドβオリゴマーが存在すると判定する、又は蛍光比ｓ１が１以上の場合、アミロイドβオリゴマーが存在しないと判定するものであってよい。蛍光比ｓ１を指標とすることにより、より客観的な判定が可能となる。【００１３】
上記検出方法は、判定するステップにおいて、両規格化スペクトルの波長λ２（ただし、λ２＜４８０ｎｍ）における蛍光強度の値から下記式に従い蛍光比ｓ２を算出し、
蛍光比ｓ２＝（時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルの波長λ２における蛍光強度）／（時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルの波長λ２における蛍光強度）
蛍光比ｓ２が１を超える場合、アミロイドβオリゴマーが存在すると判定する、又は蛍光比ｓ２が１以下の場合、アミロイドβオリゴマーが存在しないと判定するものであってよい。蛍光比ｓ２を指標とすることにより、より客観的な判定が可能となる。【００１４】
上記検出方法は、判定するステップにおいて、両規格化スペクトルのピークトップの波長を比較し、時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルのピークトップの波長が、時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルのピークトップの波長よりも短い場合、アミロイドβオリゴマーが存在すると判定する、又は時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルのピークトップの波長が、時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルのピークトップの波長と同じか若しくは長い場合、アミロイドβオリゴマーが存在しないと判定するものであってよい。ピークトップの波長を指標とすることにより、より客観的な判定が可能となる。【００１５】
本発明は、被験試料とチオフラビンＴとを接触させるステップと、チオフラビンＴの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得るステップと、時間ｔ１〜ｔ２の時間分解蛍光スペクトル、及び時間ｔ３〜ｔ４の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得るステップと、を含む、アミロイドβオリゴマーの検出のためのデータ収集方法であって、ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４であり、時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルと比較して、時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルが低波長側にシフトしていることが、上記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在することを示す、データ収集方法と捉えることもできる。【００１６】
本発明はまた、被験試料に接触させたチオフラビンＴの時間分解蛍光スペクトルデータを取得する取得手段と、取得した時間分解蛍光スペクトルデータから、時間ｔ１〜ｔ２の時間分解蛍光スペクトル、及び時間ｔ３〜ｔ４の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを算出する算出手段と、両規格化スペクトルを比較する比較手段と、比較結果に基づき、上記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在するか否かを判定する判定手段と、を備え、ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４である、アミロイドβオリゴマー検出装置にも関する。【００１７】
本発明はさらに、コンピュータを、被験試料に接触させたチオフラビンＴの時間分解蛍光スペクトルデータを取得する取得手段、取得した時間分解蛍光スペクトルデータから、時間ｔ１〜ｔ２の時間分解蛍光スペクトル、及び時間ｔ３〜ｔ４の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを算出する算出手段（ただし、ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４である）、両規格化スペクトルを比較する比較手段、比較結果に基づき、上記被験試料にアミロイドβオリゴマーが存在するか否かを判定する判定手段、として機能させるためのアミロイドβオリゴマー検出プログラムにも関する。【００１８】
本発明はさらにまた、上記アミロイドβオリゴマー検出プログラムが記録されたコンピュータ読み取り可能な記録媒体にも関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、簡便かつ安価にＡβオリゴマーを検出できる。すなわち、本発明によれば、従来煩雑で高価な試薬類を必要としたＡβオリゴマーの識別及び検出を、簡便かつ安価な蛍光染色による計測によって実現できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ａβオリゴマー検出装置Ｄのハードウェア的構成を示す概要図である。
【図２】Ａβオリゴマー検出装置Ｄの機能的構成を示す概要図である。
【図３】Ａβオリゴマー検出方法のフローチャートである。
【図４】（Ａ）Ａβ４２線維の規格化スペクトルである。（Ｂ）Ａβ４２オリゴマーの規格化スペクトルである。
【図５】Ａβ４２線維とＡβ４２オリゴマーの規格化スペクトルから算出した蛍光比ｓを示すグラフである。
【図６】Ａβ４０線維とＡβ４２オリゴマーの規格化スペクトルから算出した蛍光比ｓを示すグラフである。
【図７】Ａβ４０繊維とＡβ４０オリゴマーの規格化スペクトルから算出した蛍光比ｓを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２２】
〔アミロイドβオリゴマーの検出方法〕
本実施形態に係るＡβオリゴマーの検出方法は、被験試料とチオフラビンＴとを接触させるステップ（「接触ステップ」ともいう。）と、チオフラビンＴの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得るステップ（「取得ステップ」ともいう。）と、時間ｔ１〜ｔ２の時間分解蛍光スペクトル、及び時間ｔ３〜ｔ４の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得るステップ（「規格化ステップ」ともいう。）と、両規格化スペクトルに基づいて、被験試料にＡβオリゴマーが存在するか否かを判定するステップ（「判定ステップ」ともいう。）と、を含む。
【００２３】
（接触ステップ）
接触ステップでは、被験試料とチオフラビンＴとを接触させる。接触させる方法には特に制限はなく、例えば、アミロイドをＴｈＴで蛍光染色する際に用いられる方法を採用することができる。
【００２４】
被験試料は、Ａβオリゴマーの存在の有無を調べたい試料であれば特に制限されるものではない。被験試料の具体例としては、脳切片、脳脊髄液、血液、粘膜が挙げられる。
【００２５】
チオフラビンＴは、下記式で表され、４−（３，６−ジメチル−１，３−ベンゾチアゾール−３−イウム−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンクロリドとも称される公知の化合物である。ＴｈＴは、アミロイドの染色（ＴｈＴ染色）に汎用されている蛍光色素である。
【化１】
2017056905.tif 000003
【００２６】
本実施形態に係る検出方法には、例えば、市販されているＴｈＴ試薬を特に制限なく使用することができる。
【００２７】
ＴｈＴは、４８０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光（励起波長は、例えば、４０５ｎｍ）を発する。一方、ＴｈＴは、光照射により、４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光（励起波長は、例えば、３５０ｎｍ）を発する光反応物（蛍光性不純物）を生じる。市販されているＴｈＴ試薬は、この蛍光性不純物を含むものである。
【００２８】
Ａβオリゴマーの検出感度をより一層向上させる観点からは、本実施形態に係る検出方法には、この蛍光性不純物が除去されたＴｈＴを使用することが好ましい。蛍光性不純物が除去されたＴｈＴは、例えば、遮光下又は赤色光下で、蛍光性不純物とＴｈＴの混合物を水等の極性溶媒に溶解し、ヘキサン等の無極性溶媒で液液抽出を繰り返すことにより、極性溶媒層に溶解した形態で得ることができる。
【００２９】
Ａβオリゴマーは、プロトフィブリルとも呼ばれるＡβ線維の前駆体である。Ａβオリゴマーは、Ａβペプチドモノマーが集まった凝集体であり、分子量は通常９〜２００ｋＤａ程度である。Ａβオリゴマーに含まれるＡβペプチドモノマーの数は、通常、２〜４０程度である。
【００３０】
（取得ステップ）
取得ステップでは、被験試料と接触させたチオフラビンＴの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得る。
【００３１】
被験試料と接触させたチオフラビンＴの時間分解蛍光スペクトルは、公知の手法により得ることができる。具体的には、例えば、蛍光寿命測定装置により、被験試料と接触させたＴｈＴに波長４００〜４２０ｎｍ（好ましくは４０５ｎｍ）の光を照射し、これに応じた波長４２０〜６２０ｎｍの発光（蛍光）を測定することにより得ることができる。より具体的には、例えば、被験試料とＴｈＴとを含む溶液を測定サンプルとし、蛍光寿命測定装置（例えば、小型蛍光寿命測定装置：Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ型、浜松ホトニクス株式会社製）を用いて、時間相関単光子係数法により、励起波長４０５ｎｍにおける蛍光減衰曲線を波長４２０ｎｍから６２０ｎｍまで１０ｎｍおきに測定し、所定の時間（例えば、測定開始から１０〜２０ｎｓ等）の蛍光減衰曲線の値を積算し、これを波長別にプロットすることで時間分解蛍光スペクトルを得ることができる。
【００３２】
時間分解蛍光スペクトルは、バックグラウンド値を補正したものであることが好ましい。バックグラウンド値は、例えば、ＴｈＴを含まない測定サンプルに対して同様の測定を行ったときの測定値とすることができる。例えば、被験試料の測定値からバックグラウンド値を引くことによって、被験試料とは無関係の発光成分（例えば、ラマン散乱光）を除去することができ、より精度高くＡβオリゴマーを検出することができる。
【００３３】
（規格化ステップ）
規格化ステップでは、時間ｔ１〜ｔ２の時間分解蛍光スペクトル、及び時間ｔ３〜ｔ４の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得る。ここで、ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４である。
【００３４】
規格化は、時間分解蛍光スペクトルにおける最大の蛍光強度で各波長の蛍光強度を除することを意味する。規格化後の規格化スペクトルにおける相対蛍光強度の最大値は１である。
【００３５】
ｔ１、ｔ２、ｔ３及びｔ４は、例えば、蛍光測定を開始した時刻を０としたときの経過時間であってもよく、取得ステップで測定された蛍光減衰曲線のピーク値の５％の立ち上がりの時刻を０としたときの経過時間であってもよい。後者の場合、ｔ１、ｔ２、ｔ３及びｔ４は、通常、ピコ秒（ｐｓ）〜マイクロ秒（μｓ）のオーダーである。具体的には、例えば、取得ステップで測定された蛍光減衰曲線のピーク値の５％の立ち上がりの時刻を０としたとき、通常、０秒≦ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４＜１００ナノ秒（ｎｓ）であり、０秒≦ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４＜５０ｎｓであることが好ましく、０秒≦ｔ１＜ｔ２≦ｔ３＜ｔ４＜３０ｎｓであることがより好ましい。
【００３６】
（判定ステップ）
判定ステップでは、両規格化スペクトルに基づいて、被験試料にＡβオリゴマーが存在するか否かを判定する。
【００３７】
本実施形態に係る検出方法では、時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルと比較して、時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルが低波長側にシフトしていることが、被験試料にＡβオリゴマーが存在することを示す。したがって、判定ステップでは、低波長側にシフトしていることを判定できる限り、任意の手段によって判定を行うことができる。以下、判定手段の具体例について詳細に説明するが、判定ステップはこれら具体例に限定されるものではない。
【００３８】
第１の判定手段は、両規格化スペクトルの波長λ１（ただし、λ１＞４８０ｎｍ）における蛍光強度の値から下記式に従い蛍光比ｓ１を算出し、
蛍光比ｓ１＝（時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルの波長λ１における蛍光強度）／（時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルの波長λ１における蛍光強度）
蛍光比ｓ１が１未満の場合、Ａβオリゴマーが存在すると判定する、又は蛍光比ｓ１が１以上の場合、Ａβオリゴマーが存在しないと判定する。
【００３９】
波長λ１は、時間分解蛍光スペクトルのピークトップの波長より長い波長であればよい。通常は、λ１は４８０ｎｍ超６００ｎｍ以下の範囲内で適宜設定することができる。λ１は例えば５００ｎｍである。ピークトップの波長とは、相対蛍光強度が１になる波長である。
【００４０】
第２の判定手段は、両規格化スペクトルの波長λ２（ただし、λ２＜４８０ｎｍ）における蛍光強度の値から下記式に従い蛍光比ｓ２を算出し、
蛍光比ｓ２＝（時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルの波長λ２における蛍光強度）／（時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルの波長λ２における蛍光強度）
蛍光比ｓ２が１を超える場合、Ａβオリゴマーが存在すると判定する、又は蛍光比ｓ２が１以下の場合、Ａβオリゴマーが存在しないと判定する。
【００４１】
波長λ２は、時間分解蛍光スペクトルのピークトップの波長より短い波長であればよい。通常は、λ２は４３０ｎｍ以上４８０ｎｍ未満の範囲内で適宜設定することができる。λ２は例えば４６０ｎｍである。
【００４２】
第３の判定手段は、両規格化スペクトルのピークトップの波長を比較し、時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルのピークトップの波長が、時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルのピークトップの波長よりも短い場合、Ａβオリゴマーが存在すると判定する、又は時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルのピークトップの波長が、時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルのピークトップの波長と同じか若しくは長い場合、Ａβオリゴマーが存在しないと判定する。
【００４３】
〔アミロイドβオリゴマーの検出のためのデータ収集方法〕
本実施形態に係るＡβオリゴマーの検出のためのデータ収集方法は、被験試料とチオフラビンＴとを接触させるステップと、チオフラビンＴの蛍光を測定し、時間分解蛍光スペクトルを得るステップと、時間ｔ１〜ｔ２の時間分解蛍光スペクトル、及び時間ｔ３〜ｔ４の時間分解蛍光スペクトルをそれぞれ規格化し、規格化スペクトルを得るステップと、を含む。当該方法により収集されたデータ（時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトル、時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトル）は、被験試料にＡβオリゴマーが存在するか否かの判定に使用できる。
【００４４】
〔アミロイドβオリゴマー検出装置〕
Ａβオリゴマー検出装置の構成について説明する。図１は、一実施形態に係るアミロイドβオリゴマー検出装置Ｄのハードウェア的構成を示す概要図であり、図２は、一実施形態に係るＡβオリゴマー検出装置Ｄの機能的構成を示す概要図である。
【００４５】
図１に示すように、Ａβオリゴマー検出装置Ｄは、物理的には、ＣＰＵ  Ｄ１１、ＲＯＭ  Ｄ１２及びＲＡＭ  Ｄ１３等の主記憶装置、キーボード及びマウス等の入力デバイスＤ１４、ディスプレイ等の出力デバイスＤ１５、例えば撮像装置Ｃ等の他の装置との間でデータの送受信を行うためのネットワークカード等の通信モジュールＤ１６、ハードディスク等の補助記憶装置Ｄ１７等を含む通常のコンピュータとして構成される。後述するＡβオリゴマー検出装置Ｄの各機能は、ＣＰＵ  Ｄ１１、ＲＯＭ  Ｄ１２、ＲＡＭ  Ｄ１３等のハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、ＣＰＵ  Ｄ１１の制御の下で入力デバイスＤ１４、出力デバイスＤ１５、通信モジュールＤ１６を動作させるとともに、主記憶装置Ｄ１２、Ｄ１３や補助記憶装置Ｄ１７におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。
【００４６】
図２に示すように、Ａβオリゴマー検出装置Ｄは、機能的構成要素として、取得手段Ｄ１、算出手段Ｄ２、比較手段Ｄ３、判定手段Ｄ４、及び表示手段Ｄ５を備える。
【００４７】
取得手段Ｄ１は、蛍光寿命測定装置（図示せず）で得た時間分解蛍光スペクトルデータを取得するものである。算出手段Ｄ２は、取得した時間分解蛍光スペクトルデータから、上述の規格化スペクトルを算出するものである。比較手段Ｄ３は、算出した時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルと、時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルを比較するものである。判定手段Ｄ４は、比較した結果に基づき、Ａβオリゴマーが検出されたか否かを判定するものである。表示手段Ｄ５は、判定した結果を表示するものである。
【００４８】
〔アミロイドβオリゴマー検出プログラム〕
Ａβオリゴマー検出プログラムは、コンピュータを、上述した取得手段Ｄ１、算出手段Ｄ２、比較手段Ｄ３、判定手段Ｄ４、及び表示手段Ｄ５として機能させるものである。コンピュータにＡβオリゴマー検出プログラムを読み込ませることにより、コンピュータはＡβオリゴマー検出装置Ｄとして動作する。Ａβオリゴマー検出プログラムは、例えば、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されて提供される。記録媒体は、非一時的記録媒体であってもよい。記録媒体としては、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ等の記録媒体、ＲＯＭ等の記録媒体、半導体メモリ等が例示される。
【００４９】
（アミロイドβオリゴマー検出方法）
Ａβオリゴマー検出装置Ｄにより行われるＡβオリゴマー検出方法について説明する。図３はＡβオリゴマー検出方法のフローチャートである。Ａβオリゴマー検出装置Ｄにより行われるＡβオリゴマー検出方法により、被験試料が、Ａβオリゴマーを含むか否かを自動的に精度高く行うことができる。
【００５０】
［取得ステップＳ１］
最初に、取得手段Ｄ１が蛍光測定装置から時間分解蛍光スペクトルデータを取得する。
【００５１】
［算出ステップＳ２］
次に、算出手段Ｄ２が取得した時間分解蛍光スペクトルデータから規格化スペクトルを算出する。
【００５２】
［比較ステップＳ３］
次に、比較手段Ｄ３が、算出ステップＳ２にて算出した時間ｔ１〜ｔ２の規格化スペクトルと、時間ｔ３〜ｔ４の規格化スペクトルを比較し、その結果を抽出する。
【００５３】
［判定ステップＳ４］
次に、判定手段Ｄ４が、比較ステップＳ３にて抽出した比較の結果に基づき、Ａβオリゴマーが検出されたか否か（被験試料にＡβオリゴマーが存在するか否か）を判定する。
【００５４】
［表示ステップＳ５］
次に、表示手段Ｄ５が、判定ステップＳ４にて判定した結果を表示する。例えば、被験試料にＡβオリゴマーが存在するか否かが表示手段Ｄ５によって表示される。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５６】
〔実施例１：ＡβオリゴマーとＡβ線維の識別１〕
（Ａβオリゴマーの調製）
非特許文献（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３年，２７８巻（１３号），ｐｐ．１１６１２−１１６２２）に記載された方法に基づき、下記手順でＡβオリゴマーを調製した。まず、Ａβ１−４２（商品名：Ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒоｔｅｉｎ  Ｈｕｍａｎ、１−４２、株式会社ペプチド研究所製）をジメチルスルホキシドに５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、さらにハム培地（Ｌ−グルタミン含有、フェノールレッド不含）を用いて、Ａβ１−４２の濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。得られたＡβの調製液は、インキュベータを用いて４℃で２４時間インキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、Ａβオリゴマー（Ａβ４２オリゴマー）を含む試料を調製した。【００５７】
（Ａβ線維の調製）
上述の非特許文献に記載された方法に基づき、下記手順でＡβ線維を調製した。まず、Ａβ１−４２をジメチルスルホキシドに５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、さらにハム培地（Ｌ−グルタミン含有、フェノールレッド不含）を用いて、Ａβ１−４２の濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。得られたＡβの調製液は、インキュベータを用いて３７℃で２４時間インキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、Ａβ線維（Ａβ４２線維）を含む試料を調製した。【００５８】
（ＴｈＴ染色）
ＴｈＴ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ  Ｉｎｃ．社製）３．４ｍｇを２０ｍＬの純水に溶解してＴｈＴ溶液を調製した。この水溶液には蛍光性不純物が含まれているため、水溶液を分液ロートに入れ、ヘキサン５０ｍＬを添加し、勢いよく混合して抽出操作を行った後、分液ロートの下方のコックからＴｈＴ溶液を取り出した。このＴｈＴ溶液の一部をキュベットに取り、蛍光分光光度計ＲＦ−５０００（株式会社島津製作所製）で励起波長３５０ｎｍ、観測波長４４０ｎｍにおける蛍光強度を測定した。上記抽出操作を、蛍光強度がバックグラウンドレベルに達するまで（蛍光強度の測定値がそれ以上低下しなくなるまで）、１０回繰り返した。染色に用いるＴｈＴ水溶液は、上記操作により調製した蛍光性不純物を含まないＴｈＴ水溶液を、蒸留水でＴｈＴ濃度が１００μｍｏｌ／Ｌになるまで希釈して調製した。Ａβオリゴマー又はＡβ線維を含む試料１０μＬに、１００μｍｏｌ／ＬのＴｈＴ水溶液２０μＬ、５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ９．０）２２０μＬを添加及び混合し、ＴｈＴ染色した。【００５９】
（蛍光測定）
染色された試料を、内径３ｍｍの石英セルに分注し、小型蛍光寿命測定装置（Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ型、浜松ホトニクス株式会社製）を用い、時間相関単光子係数法を用いて、励起波長４０５ｎｍにおける蛍光減衰曲線を、４２０ｎｍから６２０ｎｍまで１０ｎｍおきに測定した。測定された蛍光減衰曲線のピーク値の５％の立ち上がり部分を時刻０とし、時間０〜２ｎｓ及び時間１０〜１８ｎｓの蛍光減衰曲線の測定値をそれぞれ積算し、積算値からバックグラウンド値を引いた値を波長別にプロットすることで時間分解蛍光スペクトルを得た。バックグラウンド値は、ハム培地（Ｌ−グルタミン含有、フェノールレッド不含）１０μＬに蒸留水２４０μＬを添加及び混合した試料を上記と同様の方法で測定して得られた値である。【００６０】
（規格化スペクトル）
各時間分解蛍光スペクトルについて、蛍光強度の最大値で各波長の蛍光強度を除して、蛍光強度の最大値が１となるように規格化を行った。【００６１】
（判定）
このようにして得られた時間０〜２ｎｓ及び時間１０〜１８ｎｓの規格化スペクトルをそれぞれ図４に示した。図４（Ａ）は、Ａβ４２線維の規格化スペクトルであり、図４（Ｂ）は、Ａβ４２オリゴマーの規格化スペクトルである。時間０〜２ｎｓの規格化スペクトルと時間１０〜１８ｎｓの規格化スペクトルを比較すると、Ａβ線維ではわずかな長波長シフトが見られるのに対して、Ａβオリゴマーでは明らかな短波長シフトが生じているのが分かる。【００６２】
上記短波長シフトに基づいて、下記判別式によりＡβオリゴマーを識別した。時間０〜２ｎｓの規格化スペクトルのピークトップの波長よりも長い波長（実施例１では５００ｎｍ）を選択し、この波長における時間１０〜１８ｎｓの規格化スペクトルの蛍光強度と時間０〜２ｎｓの規格化スペクトルの蛍光強度の比（蛍光比ｓ）を、下記に従って計算した。
蛍光比ｓ＝時間１０〜１８ｎｓの規格化スペクトルの蛍光強度（波長５００ｎｍ）／時間０〜２ｎｓの規格化スペクトルの蛍光強度（波長５００ｎｍ）【００６３】
このようにして算出した蛍光比ｓを図５に示す。図５に示すとおり、Ａβ線維（Ａβ４２線維）の蛍光比ｓは１以上であるのに対し、Ａβオリゴマー（Ａβ４２オリゴマー）の蛍光比ｓは１未満である。すなわち、蛍光比ｓが１未満であることをもってＡβオリゴマーであると識別される。なお、本発明者らは、様々な条件で実験を繰り返した結果、上記の判別方法が一般的に当てはまることを確認している。【００６４】
〔実施例２：ＡβオリゴマーとＡβ線維の識別２〕
実施例２は、Ａβ線維の調製及び蛍光測定を下記方法で実施したこと以外は、実施例１と同様の手順により実施した。【００６５】
（Ａβ線維の調製）
まず、Ａβ１−４０（商品名：Ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒоｔｅｉｎ  Ｈｕｍａｎ、１−４０、株式会社ペプチド研究所製）をジメチルスルホキシドで５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、さらに５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、Ａβ１−４０の濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。得られたＡβの調製液は、インキュベータを用いて３７℃で１０日間インキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、Ａβ線維（Ａβ４０線維）を含む試料を調製した。【００６６】
（蛍光測定）
染色された試料を、内径３ｍｍの石英セルに分注し、小型蛍光寿命測定装置（Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ型、浜松ホトニクス株式会社製）を用い、時間相関単光子係数法を用いて、励起波長４０５ｎｍにおける蛍光減衰曲線を、４２０ｎｍから６２０ｎｍまで１０ｎｍおきに測定した。測定された蛍光減衰曲線のピーク値の５％の立ち上がり部分を時刻０とし、時間０〜２ｎｓ及び時間１０〜１８ｎｓの蛍光減衰曲線の測定値をそれぞれ積算し、積算値からバックグラウンド値を引いた値を波長別にプロットすることで時間分解蛍光スペクトルを得た。バックグラウンド値は、５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１０μＬに蒸留水２４０μＬを添加及び混合した試料を上記と同様の方法で測定して得られた値である。【００６７】
（判定）
実施例１と同様にして蛍光比ｓを計算した。計算された蛍光比ｓを図６に示す。図６に示すとおり、Ａβモノマーの種類が異なっても、Ａβ線維（Ａβ４０線維）の蛍光比ｓは１以上である。すなわち、別種のＡβモノマーから構成されるＡβ線維が存在しても、実施例１と同様の手順によりＡβオリゴマー（Ａβ４２オリゴマー）を識別できることが示された。【００６８】
〔実施例３：ＡβオリゴマーとＡβ線維の識別３〕
実施例３は、Ａβオリゴマーの調製、Ａβ線維の調製及び蛍光測定を下記方法で実施したこと以外は、実施例１と同様の手順により実施した。【００６９】
（Ａβオリゴマーの調製）
まず、Ａβ１−４０（商品名：Ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒоｔｅｉｎ  Ｈｕｍａｎ、１−４０、株式会社ペプチド研究所製）をジメチルスルホキシドで５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、さらに５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、Ａβ１−４０の濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。得られたＡβの調製液は、インキュベータを用いて３７℃で１日間インキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、Ａβオリゴマー（Ａβ４０オリゴマー）を含む試料を調製した。【００７０】
（Ａβ繊維の調製）
まず、Ａβ１−４０（商品名：Ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｒоｔｅｉｎ  Ｈｕｍａｎ、１−４０、株式会社ペプチド研究所製）をジメチルスルホキシドで５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように溶解し、さらに５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて、Ａβ１−４０の濃度が１００μｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。得られたＡβの調製液は、インキュベータを用いて３７℃で７日間インキュベートした。上記インキュベートを行うことによって、Ａβ線維（Ａβ４０線維）を含む試料を調製した。【００７１】
（蛍光測定）
染色された試料を、内径３ｍｍの石英セルに分注し、小型蛍光寿命測定装置（Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ型、浜松ホトニクス株式会社製）を用い、時間相関単光子係数法を用いて、励起波長４０５ｎｍにおける蛍光減衰曲線を、４２０ｎｍから６２０ｎｍまで５ｎｍおきに測定した。測定された蛍光減衰曲線のピーク値の５％の立ち上がり部分を時刻０とし、時間０〜２ｎｓ及び時間１０〜１８ｎｓの蛍光減衰曲線の測定値をそれぞれ積算し、積算値からバックグラウンド値を引いた値を波長別にプロットすることで時間分解蛍光スペクトルを得た。バックグラウンド値は、０．８％ＤＭＳＯを含む５０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）１０μＬに５０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−水酸化ナトリウム溶液（ｐＨ９．０）２４０μＬを添加及び混合した試料を上記と同様の方法で測定して得られた値である。【００７２】
（判定）
実施例１と同様にして蛍光比ｓを計算した。計算された蛍光比ｓを図７に示す。図７に示すとおり、Ａβ線維（Ａβ４０線維）の蛍光比ｓは１以上であるのに対し、Ａβオリゴマー（Ａβ４０オリゴマー）の蛍光比ｓは１未満である。すなわち、実施例１と同様の手順によりＡβオリゴマー（Ａβ４０オリゴマー）を識別できることが示された。
【符号の説明】
【００７３】
Ｄ…アミロイドβオリゴマー検出装置、Ｄ１…取得手段、Ｄ２…算出手段、Ｄ３…比較手段、Ｄ４…判定手段、Ｄ５…表示手段、Ｄ１１…ＣＰＵ、Ｄ１２…ＲＯＭ、Ｄ１３…ＲＡＭ、Ｄ１４…入力デバイス、Ｄ１５…出力デバイス、Ｄ１６…通信モジュール、Ｄ１７…補助記憶装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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