(57)【要約】【課題】組み換えベクター及びその応用で産生した遺伝子組み換え魚卵と生物材料の提供。【解決手段】本発明の組み換えベクター及びその応用で産生した遺伝子組み換え魚卵と生物材料は、特定部位において組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを分泌できる遺伝子組換え魚を提供し、分泌された組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを備えた魚体の特定部位を生物材料として利用するか、そのうちの組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを精製することができる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚体から得た組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを含むことを特徴とする、生物材料。
【請求項２】
前記魚体の少なくとも１つの魚鱗を含み、そのうち前記魚鱗が前記組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンの発現を備えたことを特徴とする、請求項１に記載の生物材料。
【請求項３】
前記組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンが、前記魚体でヒトコラーゲン遺伝子から発現されることを特徴とする、請求項１に記載の生物材料。
【請求項４】
魚類染色体と、
ヒトコラーゲン遺伝子を含み、前記魚類染色体中に組み込まれた組み換えベクターと、
を含むことを特徴とする、遺伝子組換え魚卵。
【請求項５】
前記組み換えベクターがさらに上流遺伝子を含み、前記ヒトコラーゲン遺伝子が前記上流遺伝子の下流に連結されたことを特徴とする、請求項４に記載の遺伝子組換え魚卵。
【請求項６】
前記上流遺伝子が魚体中に存在するプロモーター、エンハンサー、またはその組み合わせであることを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子組換え魚卵。            
【請求項７】
前記組み換えベクターがさらにレポーター遺伝子を含み、前記レポーター遺伝子が前記ヒトコラーゲン遺伝子の下流に連結されたことを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子組換え魚卵。
【請求項８】
前記組み換えベクターがさらにレポーター遺伝子を含み、前記レポーター遺伝子が前記ヒトコラーゲン遺伝子の下流に連結されたことを特徴とする、請求項４に記載の遺伝子組換え魚卵。
【請求項９】
魚体から得た上流遺伝子と、
前記上流遺伝子の下流に連結されたヒトコラーゲン遺伝子と、
を含むことを特徴とする、組み換えベクター。
【請求項１０】
レポーター遺伝子を含み、前記レポーター遺伝子が前記ヒトコラーゲン遺伝子の下流に連結されたことを特徴とする、請求項９に記載の組み換えベクター。
【請求項１１】
前記上流遺伝子が前記魚体中に普遍的に存在するプロモーターであることを特徴とする、請求項９に記載の組み換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医用生体材料の製造技術に関し、特に、組み換えベクター及びその応用で産生した遺伝子組み換え魚卵と生物材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは医用生体材料の重要な素材であり、主に組織の生長、整型、火傷創傷被覆材、創傷治癒等の機能が含まれ、かつ市場規模は拡大を続けているため、医療価値がより高く、より多様性を備えたコラーゲン及びその誘導体を開発し、各種用途に応用することは、現今の研発者が解決に取り組む課題となっている。
【０００３】
現在、組換えコラーゲンを産生する発現系には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母菌、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、遺伝子導入動物、遺伝子導入植物が含まれる。しかし、大腸菌発現系は沒有翻訳後修飾がない。酵母菌発現系はプロリル−４−水酸化酵素活性が欠乏しているが、メチロトローフ酵母中のコラーゲン産量はこれら発現系中で最も高い。哺乳動物細胞株の発現系は産量が低く、かつ特定の細胞類型に制限される。昆虫細胞の発現系中のプロリル−４−水酸化酵素活性も低い。遺伝子導入動物（例：蚕、マウス）及び遺伝子導入植物（例：煙草）は、コラーゲン産物が過度に架橋される。
【０００４】
現在すでにヒトプロリル−４−水酸化酵素とコラーゲンをエンコードする遺伝子を含むバキュロウイルス発現系（米国特許第５０７７２１４号及び第５５９３８５９号を参照）が確立されている。しかしながら、トランスフェクションを経た昆虫細胞は７２時間以内に死亡し、単なる一過的な組換えコラーゲンの産生となっている。このほか、細胞溶解作用により、組換えコラーゲンの回収と精製が非常に困難である。かつ、バキュロウイルスの小胞体またはゴルジ体に対する破壊によって、コラーゲンの産生がさらに制限される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５０７７２１４号明細書
【特許文献２】第５５９３８５９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、組み換えベクター及びその応用で産生した魚卵と生物材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施例において、本発明の生物材料は、魚体から産生して得た組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲン（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎまたはｃｏｌｌａｇｅｎ）を含む。
【０００８】
一部の実施例において、前記生物材料はさらに魚体の少なくとも１つの魚鱗を含み、かつ各魚鱗が組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを発現する。
【０００９】
一部の実施例において、組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンは魚体に遺伝子導入したヒトコラーゲン遺伝子から発現される。
【００１０】
別の一実施例において、遺伝子組換え魚卵は、魚類染色体と、組み換えベクターを含み、前記組み換えベクターは魚類染色体中に組み込まれ、かつこの組み換えベクターがヒトコラーゲン遺伝子を含む。
【００１１】
さらに別の一実施例において、組み換えベクターは上流遺伝子と、ヒトコラーゲン遺伝子を含み、前記上流遺伝子が魚体から得られ、前記ヒトコラーゲン遺伝子が上流遺伝子の下流に連結され、そのうち、前記上流遺伝子は魚体中に存在するプロモーター、エンハンサーまたはその組み合わせとすることができる。
【００１２】
一部の実施例において、組み換えベクターはさらにレポーター遺伝子を含み、前記レポーター遺伝子がヒトコラーゲン遺伝子の下流に連結される。
【００１３】
上述をまとめると、本発明に基づく組み換えベクター及びその応用で産生した遺伝子組換え魚卵と生物材料は、特定部位において組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを分泌する遺伝子組換え魚を提供し、分泌された組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを有する魚体の特定部位を利用して生物材料とするか、或いはそのうちの組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施例に基づく遺伝子組換え魚卵の遺伝子導入方法のフローチャートである。
【図２】本発明の一実施例に基づく組み換えベクターの概略図である。
【図３】図１の工程Ｓ１０の一実施例の細部フローチャートである。
【図４】図３の工程Ｓ１１０の一実施例の細部フローチャートである。
【図５】図３の工程Ｓ１２０の一実施例の細部フローチャートである。
【図６】図３の工程Ｓ１３０の一実施例の細部フローチャートである。
【図７】図３の工程Ｓ１４０の一実施例の細部フローチャートである。
【図８】Ｉ型ヒトコラーゲン遺伝子の組換体プラスミドの一実施例の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下で述べる「第１」から「第２３」等の通し番号用語は、それぞれが指す部材を区別するために用いるもので、それらが指す部材の差異性を配列または限定するために用いるものではなく、本発明の範囲を限定するためにも用いられない。
【００１６】
図１に示すように、遺伝子組換え魚卵の遺伝子導入方法は、ヒトコラーゲン遺伝子を備えた組み換えベクターを構築する工程（工程Ｓ１０）、適切な制限酵素（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ）を利用して構築した組み換えベクターを線形化する工程（工程Ｓ２０）、線形の組み換えベクターを魚類の胚中に導入し、胚中の魚類染色体中に組み込む工程（工程Ｓ３０）を含む。
【００１７】
ここで、図２に示すように、組み換えベクターはさらに上流遺伝子ＵＧを備え、ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧはこの上流遺伝子ＵＧの下流に連結される。この上流遺伝子ＵＧは少なくとも特異的に特定組織において下流遺伝子配列（即ち、ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧ）を駆動して発現させるプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、このプロモーターで作用するエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）またはその組み合わせを含む。つまり、この組み換えベクターを魚体に導入した後、この組み換えベクターは魚体上で組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを発現することができる。
【００１８】
ここで、プロモーターは魚体中に存在し、組織特異的発現を具える。エンハンサーは魚体中に存在する。
【００１９】
一部の実施例において、プロモーターは例えばケラチン４（ｋｅｒａｔｉｎ  ４；Ｋ４）プロモーター、ケラチン５（ｋｅｒａｔｉｎ  ５）プロモーター、またはケラチン１ｃ６（ｋｒｔｔ１ｃ６）プロモーターとしてもよい。
【００２０】
そのうち、ケラチン４プロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示す配列である。ケラチン１ｃ６プロモーターはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示す配列である。
【００２１】
一部の実施例において、ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧは、一重らせん構造または三重らせん構造のヒトコラーゲンのアミノ酸配列とすることができる。
【００２２】
ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧは、Ｉ型からＸＸＶＩＩＩ型中のいずれか一種またはそのペアとすることができる。ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧは一重らせん構造または多重らせん構造とすることができる。例えば、Ｉ型ヒトコラーゲンは２本のα１鎖と１本のα２鎖を備え、ＩＩ型ヒトコラーゲンは３本のα１鎖を備える。ヒトコラーゲンのペアの総類は当業者の知るところであるため、ここでは説明を省略する。
【００２３】
そのうち、Ｉ型ヒトコラーゲン遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３及び４に示す配列である。ＩＩ型ヒトコラーゲン遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示す配列である。ここでは、例示的にＩ型及びＩＩ型ヒトコラーゲン遺伝子の一重らせん構造の遺伝子配列を示すが、本発明はこれに限らない。
【００２４】
一部の実施例において、組み換えベクターはさらにレポーター遺伝子ＲＧを備え、かつこのレポーター遺伝子ＲＧはこのヒトコラーゲン遺伝子ＣＧの下流に連結される。
【００２５】
ここで、レポーター遺伝子ＲＧは、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、蛍光タンパク質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、またはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ；β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子等とすることができる。
【００２６】
そのうち、蛍光タンパク質遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）遺伝子、修飾緑色蛍光タンパク質（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＧＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＦＰ）遺伝子、高感度赤色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＥＲＦＰ）遺伝子、青色蛍光タンパク質（ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＦＰ）遺伝子、高感度青色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＢＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＹＦＰ）遺伝子、高感度黄色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＹＦＰ）遺伝子、シアン蛍光タンパク質（ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＣＦＰ）遺伝子、または高感度シアン蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＥＣＦＰ）遺伝子等とすることができる。
【００２７】
一部の実施例において、組み換えベクターは組換体プラスミド、組み換えウイルスベクター、コスミド（ｃｏｓｍｉｄ）、または人工染色体（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）等とすることができる。
【００２８】
工程Ｓ３０において、組み換えベクターを胚に導入する方法は、顕微注射、トランスフェクション（例：ＤＥＡＥ−デキストランまたはリン酸カルシウム沈殿による）、ウイルスベクター（例：レトロウイルス、アデノウイルス）による感染、電気穿孔法、細胞膜透過性増加、遺伝子銃、脂質伝達（例：Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（脂質トランスフェクション試薬）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）（脂質トランスフェクション試薬）、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（脂質トランスフェクション試薬）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）（脂質トランスフェクション試薬）またはその他従来の方法に基づいて発展した脂質体）、またはレセプターが仲介する吸収及びその他飲作用等を含む。
【００２９】
図３に示すように、工程Ｓ１０は魚類にプロモーターをクローニングする工程（工程Ｓ１１０）、ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧをクローニングする工程（工程Ｓ１２０）、クローニングしたプロモーターと第１発現ベクターを利用して上流遺伝子ＵＧを構築する工程（工程Ｓ１３０）、クローニングしたヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧと上流遺伝子ＵＧを利用して組み換えベクターを構築する工程（工程Ｓ１４０）を含むことができる。
【００３０】
図４に示すように、工程Ｓ１１０は、遺伝子データベースで見つけたプロモーター（またはエンハンサー）のアミノ酸配列に対応するフォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ；５’ｐｒｉｍｅｒ）とリバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；３’ｐｒｉｍｅｒ）を設計する工程（工程Ｓ１１１）、魚体（魚類組織）を利用してＤＮＡ（デオキシリボ核酸；ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）を抽出し、ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）を得る工程（工程Ｓ１１２）、工程Ｓ１１２で取得したゲノムＤＮＡを使用してテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）とし、及び工程Ｓ１１１で設計したフォワードプライマー及びリバースプライマーをプライマーとし、かつＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｓｐｈａｔｅ；ｄＮＴＰ）等の試薬を利用して共同でポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を実施して、第１産物を得る工程（工程Ｓ１１３）、得られた第１産物と第１ベクターを連結して第２ベクターを産生する工程（工程Ｓ１１４）、第２ベクターを用いコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）中で形質転換して培養とコロニースクリーニングを行い、プロモーター（またはエンハンサー）を含有する菌株を得る工程（工程Ｓ１１５）、及びプロモーター（またはエンハンサー）を含有する菌株中から必要なプロモーター（またはエンハンサー）を精製し、アガロースゲル電気泳動（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を利用して確認する工程（工程Ｓ１１６）を含む。
【００３１】
そのうち、魚体はゼブラフィッシュ（Ｚｅｂｒａ  ｆｉｓｈ）等とすることができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されるプロモーターを例とすると、フォワードプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示される配列及びリバースプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示される配列とすることができる。
【００３２】
図５に示すように、工程Ｓ１２０は、遺伝子データベースで見つけたヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧのｍＲＮＡ（伝令リボ核酸；ｍｅｓｓａｇｅ  ＲＮＡ）配列に基づき対応するフォワードプライマーとリバースプライマーを設計する工程（工程Ｓ１２１）、ヒト細胞を利用してＲＮＡ（リボ核酸；ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）の抽出を行い、クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により分離と精製を行ってｍＲＮＡを取得する工程（工程Ｓ１２２）、工程Ｓ１２２で取得したｍＲＮＡを使用してテンプレートとし、工程Ｓ１２１で設計したリバースプライマーをプライマーとして、逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を行いｃＤＮＡ（相補的デオキシリボ核酸；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ）を得る工程（工程Ｓ１２３）、工程Ｓ１２３で取得したｃＤＮＡを使用してテンプレートとし、工程Ｓ１２１で設計したフォワードプライマー及びリバースプライマーをプライマーとして、かつＤＮＡポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸等の試薬を利用し、共同でＰＣＲを行って第２産物を得る工程（工程Ｓ１２４）、得られた第２産物と第３ベクターを連結して第４ベクターを産生する工程（工程Ｓ１２５）、第４ベクターを用いコンピテントセル中で形質転換して培養とコロニースクリーニングを行い、ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧを含有する菌株を得る工程（工程Ｓ１２６）、及びヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧを含有する菌株中から必要なヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧを精製し、アガロースゲル電気泳動を利用して確認する工程（工程Ｓ１２７）を含む。
【００３３】
そのうち、ヒト細胞は線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、または軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）等とすることができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で示されるヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧを例とすると、フォワードプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８及び１０で示される配列とすることができ、リバースプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９及び１１で示される配列とすることができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示されるヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧを例とすると、フォワードプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２で示される配列とすることができ、リバースプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示される配列とすることができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示されるヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧを例とすると、フォワードプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４及び１６で示される配列とすることができ、リバースプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５及び１７で示される配列とすることができる。
【００３４】
図６に示すように、工程Ｓ１３０は、１個または２個の制限酵素を利用してそれぞれ工程Ｓ１１６で得られたプロモーター及び第１発現ベクターに対して切断を行う工程（工程Ｓ１３１）、切断後のプロモーターと第１発現ベクターをアニーリングして上流遺伝子ＵＧを形成する工程（工程Ｓ１３２）、上流遺伝子ＵＧを用いコンピテントセル中で形質転換して培養とコロニースクリーニングを行い、プロモーターを含有する菌株を得る工程（工程Ｓ１３３）、プロモーターを含有する菌株から必要な上流遺伝子ＵＧを精製し、アガロースゲル電気泳動を利用して確認する工程（工程Ｓ１３４）を含む。
【００３５】
図７に示すように、工程Ｓ１４０は、１個または２個の制限酵素を利用してそれぞれ工程Ｓ１２７で得られたヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧ及び工程Ｓ１３４で得られた上流遺伝子ＵＧに対して切断を行う工程（工程Ｓ１４１）、切断後のヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧと上流遺伝子ＵＧをアニーリングして第２発現ベクターを形成する工程（工程Ｓ１４２）、第２発現ベクターを用いコンピテントセル中で形質転換して培養とコロニースクリーニングを行い、ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧを含有する菌株を得る工程（工程Ｓ１４３）、ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧを含有する菌株中から必要な第２発現ベクターを精製し、アガロースゲル電気泳動を利用して確認する工程（工程Ｓ１４４）、１個または２個の制限酵素を利用してそれぞれ工程Ｓ１４４で得られた第２発現ベクターとレポーター遺伝子ＲＧに対して切断を行う工程（工程Ｓ１４５）、切断後の第２発現ベクターとレポーター遺伝子ＲＧをアニーリングして組み換えベクターを形成する工程（工程Ｓ１４６）、組み換えベクターを用いコンピテントセル中で形質転換して培養とコロニースクリーニングを行い、レポーター遺伝子ＲＧを含有する菌株を得る工程（工程Ｓ１４７）、レポーター遺伝子ＲＧを含有する菌株中から必要な組み換えベクターを精製し、アガロースゲル電気泳動を利用して確認する工程（工程Ｓ１４８）を含むこともできる。
【００３６】
一部の実施例において、組み換えベクターにレポーター遺伝子ＲＧを挿入しないとき、工程Ｓ１４５から工程Ｓ１４８は不要であり、このとき工程Ｓ１４４で得られる第２発現ベクターが即ち必要な組み換えベクターとなる。
【００３７】
ここで、当業者であれば、多くの適合するコンピテントセルを熟知しているはずであり、かつ例えば細菌や真核細胞等、多くのコンピテントセルが購入可能であるため、ここでは説明を省略する。
【００３８】
当業者であれば分かるように、本発明で述べる遺伝子組換え魚卵とは、前述の組み換えベクターを人工導入した胚、またはこの胚から孵化した魚体が産生した魚卵、或いはこの魚体の後代が産生した魚卵を指す。説明の利便性のため、前述の組み換えベクターを人工導入した胚から孵化した魚体及びその後代を本文では遺伝子組換え魚と呼ぶ。つまり、遺伝子組換え魚の細胞中には組み換えベクターの少なくとも１つの複製体がある。説明の利便性のため、人工導入した組み換えベクター及びその複製体を以下では組換え遺伝子構造と呼ぶ。
【００３９】
このため、選択した上流遺伝子ＵＧの種類に基づき、複製体中の上流遺伝子ＵＧは直接または間接的に複製体中のヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧが遺伝子組換え魚の鱗片、表皮または眼等の特定部位で組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを分泌するように駆動することができる。さらに、分泌された組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを備えた魚体の特定部位を生物材料（例えば、組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲン及び無機成分を備えた生物材料）として利用するか、そのうちの組換えヒトコラーゲンを精製することができる。
【００４０】
ここで、各組換えヒトプロコラーゲンはＩ型からＸＸＶＩＩＩ型コラーゲン中のいずれか１つのらせん構造とすることができる。各組換えヒトコラーゲンはＩ型からＸＸＶＩＩＩ型コラーゲン中のいずれか一種またはそのペアとすることができる。さらに、分泌される組換えヒトコラーゲンの三重らせん構造がいずれもヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧに由来するか、或いはそのうちの一重らせん構造または二重らせん構造のみがヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧに由来し、残りのらせん構造は魚コラーゲン遺伝子に由来するものとできる。
【００４１】
一部の実施例において、組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを備えた魚の特定部位は、魚鱗、皮膚、魚眼等部位のうちの１つまたはその組み合わせとすることができる。
【００４２】
以下、実施例に基づき詳細に説明するが、これらの実施例は例を挙げて説明するためのものであり、本発明の範疇を限定しない。ここで言及するＤＮＡシークエンスは源資国際生物科技股▲分▼有限公司（Ｔｒｉ−Ｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のサポートによりシークエンシングされ、使用したシークエンス機器はＡＢＩ  ３７３０ ＤＮＡアナライザ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）である。使用したＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｉｎｉ）培養液の調製は、２０ｇのＬＢ粉末（ｐｏｗｄｅｒ）に水を１Ｌまで加えた後、オートクレーブで滅菌してから使用することができる。ＬＢ粉末（Ｂｉｏ  Ｂａｓｉｃ  Ｉｎｃ．より購入）の成分には、１０ｇのトリプトン（Ｔｒｙｐｔｏｎ）、５ｇの酵母エキス（Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ）、５ｇの塩化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＮａＣｌ）が含まれる。ＬＢ／Ａｍｐ（ＬＢ  ｐｌａｔｅ ｗｉｔｈ  ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ；アンピシリン入りＬＢ培地）培養基はＬＢ培養液中に５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を加えている。
【実施例１】
【００４３】
魚体を利用したＤＮＡ抽出
ここでは、野生型ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、ＡＢ  ｓｔｒａｉｎ）を例として、ゲノムＤＮＡ精製キット（ＧｅｎｏＭａｋｅｒ  ｋｉｔ）を利用してゼブラフィッシュのゲノムＤＮＡ抽出を行った。ＧｅｎｏＭａｋｅｒ  ｋｉｔは、ＧｅｎｏＭａｋｅｒ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｅｎｏＭａｋｅｒ試薬）、ＲＮａｓｅ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（分解酵素混合物）とＥｔｈａｎｏｌ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（エタノール沈殿バッファ）を含む。
【００４４】
まず、液体窒素または組織ホモジナイザーを用いてゼブラフィッシュ組織を研磨する。その後、約１０ｍｇ〜１００ｍｇの研磨後の魚組織を取り、かつ１ｍｌのＧｅｎｏＭａｋｅｒ試薬で細胞を溶解し、均質に溶解した試料を得る。均質に溶解した試料（１ｍｌ）を室温に３〜５分間静置した後、５００μｌのフェノール（Ｐｈｅｎｏｌ）／クロロホルム（Ｃｈｌｏｒｆｏｒｍ）（１：１）を加えて均一に混合し、第１混合液を得る。第１混合液を回転速１２０００ｒｐｍで５分間遠心した後、慎重に第１混合液の上清液を吸取り、新しい遠心管に入れる。さらに０．７〜０．８ｍｌのイソプロピルアルコールを遠心管内に加えて均一に混合し、第２混合液を得る。第２混合液を回転速１２０００ｒｐｍで５分間遠心した後、遠心管中の第２混合液の上清液をきれいに除去し、沈殿物を遠心管中に残す。４０μｌのＲＮａｓｅ混合物を沈澱物の入った遠心管中に加えて３７℃中に５分間静置し、半湿状態の沈澱物を溶解させる。その後さらに６００μｌのエタノール沈殿バッファを遠心管中に加えて均一に混合し、第３混合液を得る。第３混合液を回転速１２０００ｒｐｍで５分間遠心した後、遠心管中の第３混合液の上清液をきれいに除去し、沈澱物を遠心管中に残す。最後に５０〜２００μｌのＴＥバッファを遠心管中に加えて沈澱物を溶解させると、魚のゲノムＤＮＡが得られる。得られたゲノムＤＮＡを−２０℃で保管し、実験での使用に待機させる。
【実施例２】
【００４５】
魚類プロモーターのクローニング
ポリメラーゼ連鎖反応：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で示されるＫ４プロモーターを例とする。ここで、フォワードプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６で示される配列及びリバースプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示される配列を採用する。
【００４６】
次の表１に基づき０.２ｍｌのマイクロチューブ中に加えてポリメラーゼ連鎖反応を行い、第１産物を得る。ここで、ポリメラーゼ連鎖反応の条件は、ステップ１：９４℃で１分間反応、ステップ２：５８℃で１分間反応、ステップ３：７２℃で１分１０秒反応、かつ３つのステップを順に３５サイクル行う。
【００４７】
かつ、１％アガロースゲル電気泳動を利用して第１産物について必要なＫ４プロモーターが存在するか否かを確認する。
【００４８】
【表１】
2014045774.tif 000003
【００４９】
アニーリング反応（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）：
以下の表２に基づき反応試薬を０.２ｍｌのマイクロチューブ中に加えてアニーリング反応を行い（４℃、オーバーナイト）、第４混合液を得る（そのうちに第２ベクターが含まれる）。
【００５０】
【表２】
2014045774.tif 000004
【００５１】
形質転換反応（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）：
ここで使用するコンピテントセルは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＥＣＯＳ  １０１の菌株である。
【００５２】
１０μｌの第４混合液を１００μｌのコンピテントセル中に加えて均一に混合し、第１菌液を形成する。混合後すぐに第１菌液を氷浴中に約５分間入れる。その後、第１菌液を４２℃の水浴中に４５秒間入れてヒートショック（ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ）反応を行う。ヒートショック反応後、第１菌液をすぐに氷浴中に５分間入れる。最後に、氷浴後の第１菌液をＬＢ／Ａｍｐ培養基上に均一に塗布し、かつ３７℃で静置してオーバーナイトで培養を行う。
【００５３】
コロニースクリーニング：
前述のＬＢ／Ａｍｐ培養基上のコロニーを新しいＬＢ／Ａｍｐ培養基上で再度培養し、３７℃で静置してオーバーナイトで培養を行う。
【００５４】
第１プラスミド精製：
ここでは、プラスミド少量調製精製キット（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（Ｐｒｏｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｃｏ．, Ｌｔｄ．より購入）を利用して第１プラスミドの調製を行う。
【００５５】
まず、１.５ｍｌの第２菌液を取り出し、回転速１２,０００×ｇで５分間遠心する。遠心後、菌体沈澱物が得られる。
【００５６】
菌体沈澱物を含有する微量遠心管中に２００μｌの溶液Ｉ（Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ；再懸濁液）を加え、菌体が懸濁状態になるまで振盪する。さらに２００μｌの溶液ＩＩ（Ｌｙｓｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を加えて軽く混合し、菌体を完全に溶解させ、第１プラスミドを溶出させる。最後に２００μｌの溶液ＩＩＩ（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ；中和溶液）を加えて軽く混合し、均質にする。その後、回転速１２,０００×ｇで５分間遠心し、上清液を取り出してスピンカラム（ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ）（ＤＮＡ吸着膜を含有）とコレクションチューブ（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅ）中に加える。上清液を備えたスピンカラムとコレクションチューブを回転速１２,０００×ｇで１分間遠心し、上清液中のＤＮＡをＤＮＡ吸着膜上に吸着させる。続いて、３５０ｍｌの洗浄液（ｗａｓｈ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をスピンカラム中に加え、回転速１２,０００×ｇで１分間遠心し、この動作を１回繰り返す。さらにスピンカラムを回転速１２,０００×ｇで３分間遠心し、残留するアルコールを除去する。最後に、スピンカラムを新しい１.５ｍｌの微量遠心管中に入れ、５０μｌの溶出バッファ（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（溶出バッファはあらかじめ６８℃に予熱しておく）を加えて５分間静置した後、最後に回転速１２,０００×ｇで３分間遠心し、遠心されたＤＮＡ（即ち、第１プラスミド）を収集し、制限酵素で大きさを確定する。適量のＤＮＡと適量の制限酵素（ＢａｍＨ  Ｉ及びＳａｌ  Ｉ）を取り、１０Ｘ反応バッファ（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）を加え、かつ水を加えて体積を１５μｌとして第５混合液を形成する。第５混合液を３７℃で少なくとも１時間反応させた後、１％アガロースゲル電気泳動分析を行い、組み込みたいＫ４プロモーターのＤＮＡ断片が含有されているか否かを確定する。
【実施例３】
【００５７】
ＩＩ型ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧのクローニング
ポリメラーゼ連鎖反応：
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で示されるＩＩ型ヒトコラーゲン遺伝子（ｈＣｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ２  ａｌｐｈａ  １；ｈＣＴ２Ａ１）を例とする。ここでフォワードプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４で示される配列を採用し、リバースプライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５で示される配列を採用する。
【００５８】
次の表３に基づき反応試薬を０.２ｍｌのマイクロチューブ中に加えてポリメラーゼ連鎖反応を行い、第２産物を得る。ここで、ポリメラーゼ連鎖反応の条件は、ステップ１：９８℃で１０秒間反応、ステップ２：６４℃で３０秒間反応、ステップ３：７２℃で４分３０秒反応、かつ３つのステップを順に３０サイクル行う。
【００５９】
かつ、１％アガロースゲル電気泳動を利用して第２産物について必要なヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧが存在するか否かを確認する。
【００６０】
【表３】
2014045774.tif 000005
そのうち、テンプレートＤＮＡはヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧのｃＤＮＡである。
【００６１】
アニーリング反応（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）：
以下の表４に基づき反応試薬を０.２ｍｌのマイクロチューブ中に加えてアニーリング反応を行い（２２℃、４時間）、第６混合液を得る（そのうちに第４ベクターが含まれる）。
【００６２】
【表４】
2014045774.tif 000006
【００６３】
形質転換反応（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）：
作製したＥ． ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０菌液を１０μｌの第６混合液に加え、氷の上に３０分間静置した後、４２℃の水浴中に１〜２分間入れてヒートショック反応を行う。ヒートショック反応後すぐに氷浴中に３〜５分間入れ、ＬＢ培養液を加え、総体積を１ｍｌとして第３菌液を得る。第３菌液を３７℃下で１時間振盪培養する。ＬＢ−Ａｍｐ培養基上に１００μｌの１００ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）と５０ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇeｌ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）２０μｌを塗布し、最後に第３菌液をＬＢ−Ａｍｐ培養基上に均一に塗布して３７℃に静置し１２〜１６時間培養する。
【００６４】
ここで、例えば青白選択（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ；レポーター遺伝子アッセイ）等の高速スクリーニング方式でヒトコラーゲン遺伝子を含有する菌株の初歩的なスクリーニングを行うこともできる。高速スクリーニング方式は当業者の知るところであるため、ここでは説明を省略する。
【００６５】
第２プラスミド精製：
マイクロピペットで白色単一コロニーを取り試験管中で１０ｍｌのＬＢ／ａｍｐ培養基と混合して８時間培養する。その後、いくつかのコロニーを選び、３７℃で１４時間振盪培養し、ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧを含有する第２プラスミド（ｈＣＴ２Ａ１−ｙｔ＆Ａ）の精製に使用する。ここでは、プラスミド少量調製精製キット（Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（Ｐｒｏｔｅｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  Ｃｏ．, Ｌｔｄ．より購入）を利用して第２プラスミドの調製を行い、かつ制限酵素（ＢａｍＨ  Ｉ及びＳａｌ  Ｉ）で大きさを確定する。その後、１％アガロースゲル電気泳動分析を行い、組み込みたいヒトコラーゲン遺伝子のＤＮＡ断片が含有されているか否かを確定する。そのうち、精製方法は当業者の知るところであるため、ここでは説明を省略する。
【実施例４】
【００６６】
ＩＩ型ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧに適用する上流遺伝子の構築
以下の表５に基づき、制限酵素（ＡｐａＩ及びＢａｍＨＩ）を利用して第１プラスミド（Ｋ４−ｙｔ＆Ａ）及び第１発現ベクター（ｐＴ２−ＬＦＡＢＰ−ｔＴａ）に対して切断を行い（３７℃下で静置して少なくとも２時間作用させる）、第７混合液（Ｋ４を含む）と第８混合液（ｐＴ２−ｔＴａを含む）をそれぞれ得る。
【００６７】
【表５】
2014045774.tif 000007
【００６８】
作用後、第７混合液（Ｋ４を含む）と第８混合液（ｐＴ２−ｔＴａを含む）をそれぞれ１％アガロースゲルに導入して電気泳動分析を行い、かつ特定の大きさのＤＮＡ断片に切断し、ゲルＤＮＡ回収試薬キット（Ｇｅｌ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＧｅｎｅＭａｒｋより購入）を利用してＤＮＡ産物（即ち、Ｋ４及びｐＴ２−ｔＴａ）を回収する。
【００６９】
以下の表６に基づき、まず２つのＤＮＡ産物（即ち、Ｋ４及びｐＴ２−ｔＴａ）を混合し、７０℃で３分間処理した後、すぐに氷浴中に置く。その後、残りの試薬を加えて均一に混合し、２２℃下で静置して４時間作用させ、アニーリング反応を行い、第９混合液を得る（そのうちに上流遺伝子が含まれる）。
【００７０】
【表６】
2014045774.tif 000008
【００７１】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０の菌株をコンピテントセルとし、第９混合液中の上流遺伝子を用いＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０中で形質転換し、培養（菌株培養）を行う。その後、培養した菌株から上流遺伝子を備えた菌株をスクリーニングし、精製キットを利用して上流遺伝子（ｐＴ２−Ｋ４−ｔＴａ）を精製する。
【００７２】
そのうち、菌株培養方法、スクリーニング方法、精製方法は当業者の知るところであるため、ここでは説明を省略する。
【実施例５】
【００７３】
組換体プラスミドの構築
以下の表７に基づき、制限酵素（Ｓａｌ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉ）を利用してｐＴ２−Ｋ４−ｔＴａ及びｈＣＴ２Ａ１−ｙｔ＆Ａに対して切断を行い（３７℃下で静置して少なくとも２時間作用させる）、第１０混合液（ｐＴ２−Ｋ４を含む）及び第１１混合液（ｈＣＴ２Ａ１を含む）をそれぞれ得る。
【００７４】
【表７】
2014045774.tif 000009
【００７５】
作用後、第１０混合液（ｐＴ２−Ｋ４を含む）と第１１混合液（ｈＣＴ２Ａ１を含む）を１％アガロースゲルにそれぞれ導入して電気泳動分析を行い、特定の大きさのＤＮＡ断片に切断し、ゲルＤＮＡ回収試薬キット（Ｇｅｌ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＧｅｎｅＭａｒｋより購入）を利用してＤＮＡ産物（即ち、ｐＴ２−Ｋ４及びｈＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｔ２Ａ１）を回収する。
【００７６】
以下の表８に基づき、まず２つのＤＮＡ産物（即ち、ｐＴ２−Ｋ４及びｈＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｔ２Ａ１）を混合し、７０℃で３分間処理した後、すぐに氷浴中に置く。その後、残りの試薬を加えて均一に混合し、２２℃下で静置して４時間作用させ、アニーリング反応を行い、第１２混合液を得る（そのうちに第２発現ベクターが含まれる）。
【００７７】
【表８】
2014045774.tif 000010
【００７８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０の菌株をコンピテントセルとし、第１２混合液中の第２発現ベクターを用いＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０中で形質転換し、培養（菌株培養）を行う。その後、培養した菌株から第２発現ベクターを備えた菌株をスクリーニングし、精製キットを利用して第２発現ベクター（ｐＴ２−Ｋ４−ｈＣＴ２Ａ１）を精製する。
【００７９】
ここでは、緑色蛍光タンパク質遺伝子をレポーター遺伝子として採用する。
【００８０】
以下の表９に基づき、制限酵素（Ｓａｌ  Ｉ及びＣｌａ  Ｉ）を利用してレポーター遺伝子（ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ）及びｐＴ２−Ｋ４−ｈＣＴ２Ａ１に対して切断を行い（３７℃下で静置して少なくとも２時間作用させる）、第１３混合液（ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰを含む）及び第１４混合液（ｐＴ２−Ｋ４−ｈＣＴ２Ａ１を含む）をそれぞれ得る。
【００８１】
【表９】
2014045774.tif 000011
【００８２】
作用後、第１３混合液（ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰを含む）と第１４混合液（ｐＴ２−Ｋ４−ｈＣＴ２Ａ１を含む）を１％アガロースゲルにそれぞれ導入して電気泳動分析を行い、特定の大きさのＤＮＡ断片に切断し、ゲルＤＮＡ回収試薬キット（Ｇｅｌ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＧｅｎｅＭａｒｋより購入）を利用してＤＮＡ産物（即ち、ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ及びｐＴ２−Ｋ４−ｈＣＴ２Ａ１）を回収する。
【００８３】
以下の表１０に基づき、まず２つのＤＮＡ産物（即ち、ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ及びｐＴ２−Ｋ４−ｈＣＴ２Ａ１）を混合し、７０℃で３分間処理した後、すぐに氷浴中に置く。その後、残りの試薬を加えて均一に混合し、２２℃下で静置して４時間作用させ、アニーリング反応を行い、第１５混合液を得る（そのうちに組換体プラスミドが含まれる）。
【００８４】
【表１０】
2014045774.tif 000012
【００８５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０の菌株をコンピテントセルとし、第１５混合液中の組換体プラスミドを用いＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０中で形質転換し、培養（菌株培養）を行う。その後、培養した菌株から組換体プラスミドを備えた菌株をスクリーニングする。そのうち、菌株培養方法、スクリーニング方法は当業者の知るところであるため、ここでは説明を省略する。
【００８６】
ここで、組換体プラスミドを用いＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０中で形質転換した後、冷凍保存液（２０％グリセリン（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）：ＬＢ＝１：１）を加えて混合することができる。
【００８７】
組換体プラスミドの精製：
スクリーニングしてシーケンシングを確認した菌株を２００ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培養液中に接種し、３７℃下、１７５ｒｐｍで振盪培養する。培養後、１３,０００×ｇで５分間遠心し、菌体沈澱物を取得する。
【００８８】
まず平衡カラム（ｂａｌａｎｃｅ  ｃｏｌｕｍｎ）を１０ｍｌの平衡バッファ（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）に加え、その後遠心した菌体沈澱物を４ｍｌの細胞懸浮バッファ（ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）に加えて沈殿物がなくなるまで振盪し、第１６混合液を得る。
【００８９】
４ｍｌの細胞溶解剤（ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を第１６混合液中に加え、慎重に混合した後室温下で５分間静置する。さらに４ｍｌの中和バッファを加え、慎重に混合した後１５,０００×ｇで１０分間（２５℃）遠心する。遠心後、上層液を平衡カラム中に吸取り、１０ｍｌの洗浄液で２回洗浄する。さらに５ｍｌの溶出バッファを平衡カラム中に加え、流出するＤＮＡ溶液を収集する。
【００９０】
続いて、３．５ｍｌのイソプロピルアルコールを収集したＤＮＡ溶液中に加えた後、１５,０００×ｇで３０分間遠心する。遠心後、上層液を除去して沈殿物を残し、さらに３ｍｌの７０％アルコールを加える。その後、１５,０００×ｇで５分間遠心し、アルコールを除去する。アルコールを除去した後、風乾したＤＮＡを２００μｌのＴＥバッファに加えてＤＮＡを溶解させ、組換体プラスミド（ｐＴ２−Ｋ４−ｈＣＴ２Ａ１−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ）を含有する溶液を得る。ＤＮＡが全部溶解した後、２μｌを取り吸光値を測定して（ＯＤ２６０ｎｍ）ＤＮＡ定量を行い、残りは−８０℃で保存する。
【００９１】
ここで、降温方式は先に４℃中に１時間置いてから、−２０℃中に１時間置き、最後に−８０℃中において保存することができる。
【実施例６】
【００９２】
Ｉ型ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧのクローニング
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で示されるＩ型ヒトコラーゲン遺伝子（ｈＣｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  １  ａｌｐｈａ  １；ｈＣＴ１Ａ１）を例として、ここではフォワードプライマーにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で示される配列を採用し、リバースプライマーにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９で示される配列を採用する。
【００９３】
実験の流れは上述の実施例３とほぼ同じであるため、ここでは説明を省略する。ここで、ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧを含む第２プラスミド（ｈＣＴ１Ａ１−ｙｔ＆Ａ）が得られる。
【実施例７】
【００９４】
Ｉ型ヒトコラーゲン遺伝子ｈＣＧに適用する上流遺伝子の構築
以下の表１１に基づき、制限酵素（ＡｐａＩ及びＢａｍＨＩ）を利用して第１プラスミド（Ｋ４−ｙｔ＆Ａ）及び第１発現ベクター（ｐＴ２−ＬＦ２．９−ＡｍＣｙａｎ１）に対して切断を行い（３７℃下で静置して少なくとも２時間作用させる）、第１７混合液（Ｋ４を含む）と第１８混合液（ｐＴ２−ＡｍＣｙａｎ１を含む）をそれぞれ得る。
【００９５】
【表１１】
2014045774.tif 000013
【００９６】
作用後、第１７混合液（Ｋ４を含む）と第１８混合液（ｐＴ２−ＡｍＣｙａｎ１を含む）を１％アガロースゲルにそれぞれ導入して電気泳動分析を行い、特定の大きさのＤＮＡ断片に切断し、ゲルＤＮＡ回収試薬キット（Ｇｅｌ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＧｅｎｅＭａｒｋより購入）を利用してＤＮＡ産物（即ち、Ｋ４及びｐＴ２−ＡｍＣｙａｎ１）を回収する。
【００９７】
以下の表１２に基づき、まず２つのＤＮＡ産物（即ち、Ｋ４及びｐＴ２−ＡｍＣｙａｎ１）を混合し、７０℃で３分間処理した後、すぐに氷浴中に置く。その後、残りの試薬を加えて均一に混合し、２２℃下で静置して４時間作用させ、アニーリング反応を行い、第１９混合液を得る（そのうちに上流遺伝子が含まれる）。
【００９８】
【表１２】
2014045774.tif 000014
【００９９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０の菌株をコンピテントセルとし、第１９混合液中の上流遺伝子を用いＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０中で形質転換し、培養（菌株培養）を行う。その後、培養した菌株から上流遺伝子を備えた菌株をスクリーニングし、精製キットを利用して上流遺伝子（ｐＴ２−Ｋ４−ＡｍＣｙａｎ１）を精製する。
【０１００】
そのうち、菌株培養方法、スクリーニング方法、精製方法は当業者の知るところであるため、ここでは説明を省略する。
【実施例８】
【０１０１】
組換体プラスミドの構築
以下の表１３に基づき、制限酵素（Ｓａｌ  Ｉ及びＡｇｅ  Ｉ）を利用してｐＴ２−Ｋ４−ＡｍＣｙａｎ１及びｈＣＴ１Ａ１−ｙｔ＆Ａに対して切断を行い（３７℃下で静置して少なくとも２時間作用させる）、第２０混合液（ｐＴ２−Ｋ４を含む）及び第２１混合液（ｈＣＴ１Ａ１を含む）をそれぞれ得る。
【０１０２】
【表１３】
2014045774.tif 000015
【０１０３】
作用後、第２０混合液（ｐＴ２−Ｋ４を含む）と第２１混合液（ｈＣＴ１Ａ１を含む）を１％アガロースゲルにそれぞれ導入して電気泳動分析を行い、特定の大きさのＤＮＡ断片に切断し、ゲルＤＮＡ回収試薬キット（Ｇｅｌ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＧｅｎｅＭａｒｋより購入）を利用してＤＮＡ産物（即ち、ｐＴ２−Ｋ４及びｈＣＴ１Ａ１）を回収する。
【０１０４】
以下の表１４に基づき、まず２つのＤＮＡ産物（即ち、ｐＴ２−Ｋ４とｈＣＴ１Ａ１）を混合し、７０℃で３分間処理した後、すぐに氷浴中に置く。その後、残りの試薬を加えて均一に混合し、２２℃下で静置して４時間作用させ、アニーリング反応を行い、第２２混合液を得る（そのうちに組換体プラスミドが含まれる）。
【０１０５】
【表１４】
2014045774.tif 000016
【０１０６】
第２２混合液中の組換体プラスミドを用いＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０中で形質転換し、培養（菌株培養）を行う。その後、培養した菌株から組換体プラスミドを備えた菌株をスクリーニングし、精製キットを利用して組換体プラスミド（ｐＴ２−Ｋ４−ｈＣＴ１Ａ１）を精製する。
【０１０７】
ｐＴ２−Ｋ４−ｈＣＴ１Ａ１の組換体プラスミドを用いＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０中で形質転換し、培養（菌株培養）を行う。その後、培養した菌株からｐＴ２−Ｋ４−ｈＣＴ１Ａ１組換体プラスミドを備えた菌株をスクリーニングして精製し、図８に示すように、構築済みのｐＴ２−Ｋ４−ｈＣＴ１Ａ１組換体プラスミドを得る。そのうち、実験の流れはほぼ上述の実施例５と同じである。
【０１０８】
図８において、Ｋ４  Ｐ１．２Ｋ（ｋｅｒａｔｉｎ  ４  Ｐ１．２ｋ）はゼブラフィッシュケラチン４プロモーター１．２ｋｂの断片を指し、ＣＯＬ１Ａ１はヒトＩ型α1コラーゲンのｃＤＮＡを指し、Ｔｏｌ２は転移（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）するトランスポゾンＴｏｌ２（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ（メダカ由来トランスポゾン）、ｎｕｍｂｅｒ  ２）トランスポザーゼ認識配列（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を指す。ここで、ゼブラフィッシュＫ４プロモーターＡｐａＩ／ＢａｍＨＩでｐＴ２−ＬＦ２．９−ＡｍＣｙａｎ１のＬＦ２．９プロモーターＡｐａＩ／ＢａｍＨＩの切断個所を置換し、ｐＴ２−Ｋ４−ＡｍＣｙａｎ１となる。その後ｈＣＴ１Ａ１ ＡｇｅＩ／ＳａｌＩでｐＴ２−Ｋ４−ＡｍＣｙａｎ１のＡｍｃｙａｎ１  ＡｇｅＩ／ＸｈｏＩを置換し（ＳａｌＩとＸｈｏＩの切断個所はアイソシゾマー（Ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒ）で、かつｌｉｇａｔｉｏｎ後ＳａｌＩとＸｈｏＩが同時に破壊される）、ｐＴ２−Ｋ４−ｈＣＴ１Ａ１（ｐＴ２−ｚＫ４ｈＣ１Ａ１；受託番号ＤＳＭ２７６１６）を得る。
【実施例９】
【０１０９】
魚類胚の調製：
野生型ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、ＡＢ  ｓｔｒａｉｎ）の成魚を２８℃の恒温下で飼育する。飼育条件は明暗周期を１４時間日光／１０時間暗室に設定し、朝晩飼料を与える。
【０１１０】
一定して朝オスとメスを同じ水槽に入れて（オス：メス＝２：１）交配・産卵させる。交配の約３０〜４０分後に胚を収集し（このとき胚の時期は約１細胞期（１−ｃｅｌｌ  ｓｔａｇｅ））、遺伝子の導入に使用する。
【実施例１０】
【０１１１】
導入したい組換体プラスミドの調製：
以下の表１５に基づき、反応試薬を均一に混合した後、３７℃下で静置し、少なくとも３時間作用させ、適切な制限酵素を利用して構築した組換体プラスミド（実施例５または実施例８の産物に同じ）線形のＤＮＡにする。
【０１１２】
【表１５】
2014045774.tif 000017
【０１１３】
ゲルＤＮＡ回収試薬キット（Ｇｅｌ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＧｅｎｅＭａｒｋより購入）を利用してＤＮＡ産物を回収し、適量の無菌水を加えてＤＮＡを再溶解し、線形ＤＮＡの最終濃度を０．１μｇ／μｌにする。
【０１１４】
顕微注射の前に、４０μｌの線形ＤＮＡを５μｌの１％追跡用色素（ここではフェノールレッド（ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ）を使用）を均一に混合し、第２３混合液を得る。第２３混合液を−２０℃下で保存し、顕微注射に用いる。
【実施例１１】
【０１１５】
組換体プラスミドの導入：
収集した胚をアガロースゲルの溝内に置き、胚を固定する。顕微注射方式で前述の第２３混合液を固定した胚内に導入する。
【０１１６】
注射後の胚を孵化槽に移して２４時間培養し、蛍光顕微鏡で胚上に発現する緑蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）を観察し、写真を撮って記録する。ここで、蛍光タンパク質の発現はヒトコラーゲン遺伝子の発現も表す。
【０１１７】
遺伝子組換え胚で親世代（Ｆ０世代）の遺伝子組換えゼブラフィッシュを確立する。Ｆ０世代の遺伝子組換えゼブラフィッシュを性成熟（約３〜５ヶ月）飼育し、野生型ゼブラフィッシュの種魚と交配を行い、蛍光発現のあるＦ１世代（子世代）遺伝子組換えゼブラフィッシュを得ることができる。Ｆ１世代遺伝子組換えゼブラフィッシュをさらに３〜５ヶ月飼育すると、交配してＦ２世代（子世代）遺伝子組換えゼブラフィッシュを産生することができる。
【０１１８】
ここで、Ｋ４ケラチンはヒトコラーゲン遺伝子を駆動して魚鱗上に発現させることができ、遺伝子組換えゼブラフィッシュに組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを魚鱗上で分泌させる。
【０１１９】
ここではレポーター遺伝子を利用して導入した組換え遺伝子構造の発現を確認しているが、本発明はこれに限定されない。当業者であれば組換え遺伝子構造を備えた魚体を意の適した方法で検査できることを知っているはずである。例えば、当該魚体の染色体をＰＣＲ検査して、組換え遺伝子構造を備えているかを検出してもよい。組換え遺伝子構造の発現産物（組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲン）に対して測定を行うと、実際に導入遺伝子を発現した魚体を検出することができる。さらに、現在周知の遺伝子導入動物に用いることができる関連の検査方法も遺伝子組換え魚体の鑑定に用いることができ、例えば、ノーザンブロッティング法またはサザンブロッティング法で魚体中に導入遺伝子の核酸配列があるか否かを測定したり、ポリメラーゼ連鎖反応及びその他配列特異性のある核酸拡大技術を使用したりして上述の測定を行うことができる。
【実施例１２】
【０１２０】
組換体プラスミドの導入
また、日本の学者Ｋａｗａｋａｍｉにより発展された遺伝子導入技術を参照して、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（細胞外転写）でＴｏｌ２  ｔｒａｎｓｐｏｎａｓｅ  ｍＲＮＡ（Ｔｏｌ２トランスポザーゼ伝令リボ核酸）を合成し、第２３混合液と一緒にゼブラフィッシュ胚中に顕微注射することができる。遺伝子導入技術は文献「Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（ゼブラフィッシュにおけるトランスポゾンツール及び方法）」Ｄｅｖ． Ｄｙｎ． ２３４(２)：２４４〜２５４、 ２００５を参照することができる。
【実施例１３】
【０１２１】
生物材料の調製
遺伝子組換え魚から１個以上の魚鱗を収集し、収集した魚鱗に洗浄、細胞除去、脱水等の処理手順を行い、各魚鱗を組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを備えた生物材料に処理する。
【０１２２】
ここで、さらにプレス手順を行い、前述の処理後の１個以上の魚鱗を特定の形状及び（または）サイズの組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを備えた生物材料にプレスしてもよい。
【０１２３】
さらに、プレス前に、先に前述の処理後の１個以上の魚鱗に対して研磨処理を行うことができる。このほか、研磨後の魚鱗顆粒を篩い異なる粒径の粉末を分離し、異なる粒径の粉末で組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを備えた生物材料を提供してもよい。
【０１２４】
また、これらの生物材料は滅菌を行い、滅菌生物材料とすることもできる。
【０１２５】
関連の処理手順は、米国第１２／３２４５５１号、第１２／６５９２８２号、第１２／８８０３４９号、第１３／０１９１３４号特許出願案を参照することができる。
【実施例１４】
【０１２６】
Ｅ． ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０コンピテントセルの作製
ここで使用するＥ． ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０の遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）はＦ-ｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃΧ７４  ｒｅｃＡ１  ａｒａＤ１３９ Δ(ａｒａ−ｌｅｕ)７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ(ＳｔｒＲ)ｅｎｄＡ１  ｎｕｐG λ-である。
【０１２７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ  １０を適量のＬＢ培養基中でオーバーナイト培養してから、それを５ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ培養基（体積約１／１００の菌液を加える）中に取り２回培養を行い、３７℃の培養箱でＯＤ６００吸光値約０．５〜０．６の間まで振盪する。
【０１２８】
続く工程はすべて氷の上で操作する。菌液を氷の上に１０分間静置し、続いて２ｍＬを取りＯ.Ｄ値が０.５になるまで培養した菌液を４０００×ｇ、４℃下で３分間遠心する（または５０００×ｇ、４℃で４分間遠心する）。遠心完了後、マイクロピペット（ｐｉｐｐｅｔ）で上清液を除去し、１ｍＬの２５０ｍＭ（または２００ｍＭ）ＣａＣｌ2（塩化カルシウム）を加えて均一に混合し、菌を完全に再溶解させる。再溶解させた菌液を氷の上に１０分間静置した後、再度遠心する。遠心完了後、再度ピペットで上清液を除去した後、さらにＣａＣｌ2を約１５０μｌ〜２００ｍｌ加えて均一に混合し、菌を完全に再溶解させ、氷の上に１０分間以上静置して使用する。
【０１２９】
上述をまとめると、本発明の組み換えベクター及びその応用で産生した遺伝子組み換え魚卵と生物材料により、特定部位で組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを分泌できる遺伝子組換え魚を提供し、分泌された組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを備えた魚体の特定部位を利用して生物材料としたり、そのうちの組換えヒトプロコラーゲンまたはコラーゲンを精製したりすることができる。
【符号の説明】
【０１３０】
Ｓ１０            ヒトコラーゲン遺伝子を備えた組み換えベクターを構築する工程 
Ｓ２０            制限酵素を利用して構築した組み換えベクターを線形化する工程
Ｓ３０            線形の組み換えベクターを魚類の胚中に注入し、魚類染色体中に組み込む工程 
Ｓ１１０          魚類のプロモーター（またはエンハンサー）をクローニングする工程
Ｓ１２０          ヒトコラーゲン遺伝子をクローニングする工程
Ｓ１３０          クローニングしたプロモーター（またはエンハンサー）と第１発現ベクターを利用して上流遺伝子を構築する工程 
Ｓ１４０          クローニングしたヒトコラーゲン遺伝子と上流遺伝子を利用して組み換えベクターを構築する工程
Ｓ１１１          プロモーター（またはエンハンサー）のアミノ酸配列に対応するフォワードプライマーとリバースプライマーを設計する工程
Ｓ１１２          魚体を利用してＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡを得る工程
Ｓ１１３          取得したゲノムＤＮＡを使用してテンプレートとし、対応するフォワードプライマー及びリバースプライマーをプライマーとしてポリメラーゼ連鎖反応を実施し、第１産物を得る工程
Ｓ１１４          得られた第１産物と第１ベクターを接合して第２ベクターを産生する工程 
Ｓ１１５          第２ベクターを用いコンピテントセル中で形質転換して培養とコロニースクリーニングを行い、プロモーター（またはエンハンサー）を含有する菌株を得る工程 
Ｓ１１６          プロモーター（またはエンハンサー）を含有する菌株中から必要なプロモーター（またはエンハンサー）を精製し、アガロースゲル電気泳動を利用して確認する工程 
Ｓ１２１          ヒトコラーゲン遺伝子のアミノ酸配列に対応するフォワードプライマーとリバースプライマーを設計する工程 
Ｓ１２２          ヒト細胞を利用してＲＮＡ抽出を行い、クロマトグラフィーにより分離と精製を行ってｍＲＮＡを取得する工程
Ｓ１２３          取得したｍＲＮＡを使用してテンプレートとし、設計したリバースプライマーをプライマーとして、逆転写を行い、ｃＤＮＡを得る工程 
Ｓ１２４          取得したｃＤＮＡを使用してテンプレートとし、対応するフォワードプライマー及びリバースプライマーをプライマーとして、ＰＣＲを行い、第２産物を得る工程
Ｓ１２５          得られた第２産物と第３ベクターを接合して第４ベクターを産生する工程 
Ｓ１２６          第４ベクターをコンピテントセル中で形質転換して培養とコロニースクリーニングを行い、ヒトコラーゲン遺伝子を含有する菌株を得る工程
Ｓ１２７          ヒトコラーゲン遺伝子を含有する菌株中から必要なヒトコラーゲン遺伝子を精製し、アガロースゲル電気泳動を利用して確認する工程
Ｓ１３１          制限酵素を利用してプロモーター（またはエンハンサー）及び第１発現ベクターに対して切断を行う工程
Ｓ１３２          切断後のプロモーター（またはエンハンサー）と第１発現ベクターをアニーリングして上流遺伝子を形成する工程 
Ｓ１３３          上流遺伝子を用いコンピテントセル中で形質転換して培養とコロニースクリーニングを行い、プロモーター（またはエンハンサー）を含有する菌株を得る工程 
Ｓ１３４          プロモーター（またはエンハンサー）を含有する菌株から必要な上流遺伝子を精製し、アガロースゲル電気泳動を利用して確認する工程
Ｓ１４１          制限酵素を利用してヒトコラーゲン遺伝子と上流遺伝子に対して切断を行う工程 
Ｓ１４２          切断後のヒトコラーゲン遺伝子と上流遺伝子をアニーリングして第２発現ベクターを形成する工程
Ｓ１４３          第２発現ベクターを用いコンピテントセル中で形質転換して培養とコロニースクリーニングを行い、ヒトコラーゲン遺伝子を含有する菌株を得る工程 
Ｓ１４４          ヒトコラーゲン遺伝子を含有する菌株中から必要な第２発現ベクターを精製し、アガロースゲル電気泳動を利用して確認する工程
Ｓ１４５          制限酵素を利用して精製された第２発現ベクターとレポーター遺伝子に対して切断を行う工程
Ｓ１４６          切断後の第２発現ベクターとレポーター遺伝子をアニーリングして組み換えベクターを形成する工程 
Ｓ１４７          組み換えベクターを用いコンピテントセル中で形質転換して培養とコロニースクリーニングを行い、レポーター遺伝子を含有する菌株を得る工程 
Ｓ１４８          レポーター遺伝子を含有する菌株中から必要な組み換えベクターを精製し、アガロースゲル電気泳動を利用して確認する工程 
ＵＧ            上流遺伝子
ｈＣＧ            ヒトコラーゲン遺伝子
ＲＧ            レポーター遺伝子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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