(57)【要約】  本発明は、低侵襲性かつ低コストで実施することができる、前立腺癌の病理組織診断に用いられている指標値を取得する方法を提供する。本発明に係る方法は、前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコアを推定する方法であって、検体中の、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（Prostate Specific Antigen：前立腺特異抗原）の含有量を測定し、その測定値が閾値よりも大きいことをもってグリーソンスコアが７以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってグリーソンスコアが６以下であると推定するグリーソンスコアの推定方法である。前記ＰＳＡの定量は、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子、例えばノダフジレクチン（ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（ＳＢＡ）またはカラスノエンドウレクチン（ＶＶＬ）、あるいは抗β−Ｎ−アセチルガラクトサミン抗体を前記ＰＳＡに結合させる工程を含む方法によって行うことが好ましい。
2017056844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコアを推定する方法であって、
検体中の、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（Prostate Specific Antigen：前立腺特異抗原）の含有量を測定し、その測定値が閾値よりも大きいことをもってグリーソンスコアが７以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってグリーソンスコアが６以下であると推定する、グリーソンスコアの推定方法。
【請求項２】
前記ＰＳＡの定量を、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子を前記ＰＳＡに結合させる工程を含む方法によって行う、請求項１に記載のグリーソンスコアの推定方法。
【請求項３】
前記β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子が、ノダフジレクチン（Westeria floribunda Lectin：ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（Soybean Agglutinin：ＳＢＡ）またはカラスノエンドウレクチン（Vicia Villosa Lectin：ＶＶＬ）、あるいは抗β−Ｎ−アセチルガラクトサミン抗体である、請求項２に記載のグリーソンスコアの推定方法。
【請求項４】
前記ＰＳＡの定量を表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いて行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載のグリーソンスコアの推定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グリーソンスコアとして知られている、前立腺癌の悪性度に係る病理組織の診断結果を推定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、主に６０歳以上の男性に発病し、欧米諸国では男性の癌において肺癌に次ぐ死亡原因となっている。前立腺癌の治療方針を決める上で、がんの進行度（病期）および悪性度が重要な指標となる。このうち、前立腺癌の悪性度には幅広い分布があり、ほとんど増殖が認められず無治療経過観察が可能であるものから、骨やリンパ節に転移し抗ホルモン薬への抵抗性を示す増悪をきたすものまで様々であるため、前立腺癌の悪性度を正確に判断することが望まれている。【０００３】
前立腺癌の悪性度を示す分類として、がんの病理組織の診断結果を点数化した「グリーソンスコア」が広く用いられている。前立腺癌のがん組織は、その形態や浸潤増殖様式によってグレード１からグレード５の５段階に分類することができる（グリーソン分類）。グリーソンスコアは、ある病理組織を顕微鏡で観察したときに、最も大きな面積を占める組織像についてグリーソン分類に基づき付与されるグレードと、その次に大きな面積を占める組織像のグレード（これら２つのグレードが同じになる場合もある）を合計した値である。一般的に、グリーソンスコアが２〜６の場合は悪性度が低い、７の場合は中程度、８〜１０の場合は悪性度が高いとされ、グリーソンスコアが７以上であるかそうでないかが主要な目安となっている。【０００４】
しかしながら、このような病理組織診断を行うためには、直腸から針（合計８本以上）を刺して前立腺組織を採取すること（針生検）が必要である。針生検は患者にとって侵襲性が高く、費用も高額である上、針が前立腺癌組織に当たらないと診断ができないという欠点もある。【０００５】
一方、前立腺癌および前立腺肥大症等の前立腺関連疾患について、患者の血液等の試料中に存在する、特定の糖鎖を有するＰＳＡ（prostate specific antigen：前立腺特異抗原）との関係性に注目した研究が進められている。従来、試料中の全てのＰＳＡ（トータルＰＳＡ）を定量し、その値を閾値と比較すること、またはα１−アンチキモトリプシンと結合しない遊離型ＰＳＡ（フリーＰＳＡ）を定量し、全てのＰＳＡの量に対する遊離型ＰＳＡの量の比率（フリーＰＳＡ／トータルＰＳＡ比）を閾値と比較することによって、前立腺癌に罹患しているか否かを診断する方法が知られていた。しかしながら近年では、患者が罹患している疾患によってＰＳＡが有する糖鎖の性状が変化すること、換言すれば特定の糖鎖を有するＰＳＡの量（割合）が変化することが分かってきており、そのことを利用して前立腺癌または前立腺肥大症疾患に罹患しているか否かを診断する方法がいくつか提案されている。【０００６】
たとえば、特許文献１（国際公開２００９／００８３８１号公報）には、質量分析法により、被験者由来の試料中のフコース非結合糖鎖を有するＰＳＡおよびフコース結合糖鎖を有するＰＳＡを、質量分析法により分析し、前者に対して後者の量が多い（前者のシグナル強度に対する後者のシグナル強度の比が１．０を超える）場合に前立腺癌であると識別し、そうでなければ良性前立腺肥大症であると識別する方法が開示されている。【０００７】
特許文献２（国際公開２０１０／０６４６８３号公報）には、被験者由来の試料中のＰＳＡの、ＬａｃｄｉＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖の量と、ＬａｃｄｉＮＡｃを持たないがＬａｃＮＡｃ（ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン）を有する糖鎖の量とを定量し、前者の量が後者の量の３０％を超える場合に前立腺癌であると判定する方法が開示されている。【０００８】
特許文献３（特開２０１１−１３７７５４号公報）には、被験者由来の試料中のＰＳＡの糖鎖構造を分析し、ＬａｃｄｉＮＡｃを有する３本鎖以上の糖鎖が存在するときに前立腺癌であると判定する方法が開示されている。【０００９】
特許文献４（国際公開２０１０／０９０２６４号公報）には、患者由来の試料（血清等）中のβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡおよび／またはフコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡを定量し、それらの絶対量および／またはＰＳＡ全体に対する割合を所定のカットオフ値より大きければ前立腺癌、そうでなければ前立腺肥大症と判定する方法が開示されている。β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡは、当該残基と親和性を有するレクチン、例えばＴＪＡ−ＩＩ（Trichosanthes japonica agglutinin-II：キカラスウリレクチン−ＩＩ）またはＷＦＡ（Westeria floribunda agglutinin：ノダフジレクチン）を用いて定量で、フコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡは、当該残基と親和性を有するレクチン、例えばＵＥＡ−Ｉ（Ulex europaeus agglutinin-I：ハリエニシダレクチン−Ｉ）またはＴＪＡ−ＩＩを用いて定量できると記載されている。また、前記所定の残基を有するＰＳＡは、例えば、担体にレクチンを結合させたカラム（レクチンアフィニティーカラム）を用いて吸着および溶出させることにより定量できると記載されている。【００１０】
さらに、特許文献５（特開２０１３−０７６６６６号公報）には、特許文献４と同じ特定の残基を有するＰＳＡを、当該ＰＳＡに対する固相一次抗体、および当該ＰＳＡが有する残基と高い親和性を有するレクチンを蛍光色素により標識化した二次捕捉分子を用いた、ＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）等のサンドイッチアッセイにより定量する方法が記載されている。【００１１】
しかしながら特許文献１〜５のいずれにも、それらに開示されている方法とグリーソンスコア等の前立腺癌の悪性度との相関性は記載されていない。特に、特許文献４の実施例１では、ＴＪＡ−ＩＩを用いて前記特定の糖鎖を有するＰＳＡを定量しており、前立腺肥大症患者と前立腺癌患者を区別することが可能であることが示されている一方、グリーソンスコアについては有意差が認められなかったと分析されている。また、特許文献４の実施例２では、ＷＦＡを用いて前記特定の糖鎖を有するＰＳＡを定量しており、ＴＪＡ−ＩＩと同様の傾向を示す（結合率はやや低いがほぼ相関している）こと、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基は有さずフコースα（１，２）ガラクトース残基のみを有するＰＳＡが存在する可能性があることなどが分析されているが、定量の対象としているのは前立腺癌患者由来の３検体のみであり、グリーソンスコアについては全く分析されていない。なお、特許文献４では、ＴＪＡ−ＩＩおよびＷＦＡはともに、糖鎖の非還元末端（タンパク質と結合している還元末端とは逆側の末端）に結合したβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有するレクチンとして例示されているが（段落［００２０］参照）、その他の残基に対する親和性においてこれらのレクチンには相違点がある。すなわち、ＴＪＡ−ＩＩは、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ；Ｒは糖鎖の他の残基またはタンパク質のアミノ酸残基を表す）およびフコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）の両方に強い親和性を有するレクチンである（段落［００２２］参照）。これに対して、ＷＦＡは、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃβ１→Ｒ）、例えばＧａｌＮＡｃ（β１→４）Ｇａｌ残基およびＧａｌＮＡｃ（β１→４）ＧｌｃＮＡｃ残基に強い親和性を有するものの、フコースα（１，２）ガラクトース残基（Ｆｕｃα１→２Ｇａｌβ１→Ｒ）には親和性を有さない（段落［００２３］参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開２００９／００８３８１号公報
【特許文献２】国際公開２０１０／０６４６８３号公報
【特許文献３】特開２０１１−１３７７５４号公報
【特許文献４】国際公開２０１０／０９０２６４号公報
【特許文献５】特開２０１３−０７６６６６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
前述したように、針生検を必要とする従来の病理組織診断は患者にとっての負担が大きい。前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコアのような前立腺癌の病理組織診断結果を、血液検査のように侵襲性が低く、コストも低い方法によって取得することができれば、患者にもたらされる利益は大きい。【００１４】
本発明は、低侵襲性かつ低コストで実施することができる、前立腺癌の病理組織診断に用いられている指標値を取得する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、血液から調製された検体に含まれるＰＳＡのうち、ＷＦＡと結合させることによって定量することのできるＰＳＡ、つまり"ＷＦＡと親和性を有するＰＳＡ"の含有量について、グリーソンスコアが７以上の前立腺癌患者に由来するサンプル群とそれ以外のサンプル群との間、およびグリーソンスコアが６以下の前立腺癌患者に由来するサンプル群とそれ以外のサンプル群との間、それぞれで統計学的に有意な差があり、適切な閾値を設定することにより、グリーソンスコアが７以上または６以下であることを高い精度で推定することができることを見出した。【００１６】
ここで、特許文献４に既に記載されているように、"ＴＪＡ−ＩＩと親和性を有するＰＳＡ"の含有量は、グリーソンスコアとの相関性を有さず、上記のようなグリーソンスコアの判別は行えない。このような判別の可否の違いは、ＷＦＡとＴＪＡ−ＩＩの糖鎖認識の違い、すなわちＷＦＡが結合するＰＳＡには、フコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡは含まれず、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡのみが含まれるのに対し、ＴＪＡ−ＩＩが結合するＰＳＡには、フコースα（１，２）ガラクトース残基を有するＰＳＡとβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡの両方が含まれる、という違いに起因しているものと推測される。【００１７】
さらに、本発明者らは上記のように"ＷＦＡと親和性を有するＰＳＡ"を定量することを拡張および一般化し、β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡだけではなく、α−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を有するＰＳＡ（ＰＳＡ糖鎖の質量分析の構造解析結果からは、このようなＰＳＡの存在量は低いと考えられる）を定量の対象に含めても同様の判定が可能であること、換言すれば、定量の対象とするＰＳＡは、ＷＦＡと親和性を有するＰＳＡだけでなく、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡと規定することが可能であることを見出した。【００１８】
このような知見に基づいてなされた本発明は、一つの側面において、「前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコアを推定する方法であって、検体中の、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡの含有量を測定し、得られた測定値が閾値よりも大きいことをもってグリーソンスコアが７以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってグリーソンスコアが６以下であると推定する、グリーソンスコアの推定方法」を提供する。【００１９】
換言すれば、本発明は一つの側面において、「検体中の、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡの含有量の測定方法であって、少なくとも、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子を前記ＰＳＡに結合させる工程を含む、測定方法」を提供する。この測定方法は、前立腺癌の悪性度を表すグリーソンスコアを推定するために利用することのできるものであり、得られた測定値が閾値よりも大きい場合はグリーソンスコアが７以上であると推定することができ、その測定値が閾値よりも小さい場合はグリーソンスコアが６以下であると推定することができる。【００２０】
なお、本発明における、グリーソンスコアが７以上であると推定するための閾値およびグリーソンスコアが６以下であると推定するための閾値は、従来技術における異なる目的のための閾値、例えば特許文献４に記載されている、前立腺癌か前立腺肥大症かを判定するための閾値とは相違する。そのような観点から、本発明を従来技術と区別することが可能である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、針生検のように患者に重い負担を強いる検査ではなく、血液検査のように低侵襲性かつ低コストで実施することができる検査によって、診断上重要な意味を持つ前立腺癌の悪性度、すなわちグリーソンスコアが７以上か否か、または６以下か否かを所望の精度で推定することができるようになる。それにより、前立腺癌患者のＱＯＬを維持しつつ、必要な治療をしたり、経過観察をしたりすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ＳＰＦＳ測定部材１６を用いて検体中のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１００を定量する際の、流路３６内の測定領域３８で起きる反応の模式図である。［Ａ］支持体６２に担持された抗ＰＳＡ抗体６４に、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１００を結合させるための捕捉工程における反応。［Ｂ］抗ＰＳＡ抗体６４に捕捉されたＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１００に、蛍光標識ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０を結合させるための標識工程における反応。
【図２】図２は、ＳＰＦＳシステム１の一般的な実施形態を示す模式図である。［Ａ］誘電体部材１２の上面１２ａに金属薄膜１４が直接形成されており、プラズモン励起センサ１６ａが、誘電体部材１２、金属薄膜１４および測定領域３８によって構成されている実施形態。［Ｂ］誘電体部材１２と分離可能な透明平面基板１３の上面に金属薄膜１４が形成されており、プラズモン励起センサ１６ａが、透明平面基板１３、金属薄膜１４および測定領域３８によって構成されている場合。
【図３】図３は、実施例１（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ）における、各被験試料中のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ分画量をＳＰＦＳで測定した結果を示すグラフである。このグラフは、表１に示す被検試料に付属する診療情報および病理組織診断結果（グリーソンスコア）をもとに層別化されている。
【図４】図４は、実施例２（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＳＢＡ）における、各被験試料中のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ分画量をＳＰＦＳで測定した結果を示すグラフである。このグラフは、グリーソンスコアが７以上か、６以下かで層別化されている。
【図５】図５は、実施例３（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＶＶＬ）における、各被験試料中のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ分画量をＳＰＦＳで測定した結果を示すグラフである。このグラフは、グリーソンスコアが７以上か、６以下かで層別化されている。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書において、下記の語句はそれぞれ短縮して称することがある。すなわち、「Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ」は「ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ」と称することがある。「Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子」は「ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子」と称することがある。「Ｎ−アセチルガラクトサミン残基」および「β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基」は、それぞれ「ＧａｌＮＡｃ残基」および「β−ＧａｌＮＡｃ残基」と称し、「Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子／レクチン」および「β−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子／レクチン」は、それぞれ「ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子／レクチン」および「β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子／レクチン」と称することがある。
【００２４】
本発明によるグリーソンスコアの推定方法は、検体中の、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の非還元末端に有するＰＳＡ（ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ）の含有量を測定し、その測定値が閾値よりも大きいことをもって、グリーソンスコアが７以上であると推定する、またはその測定値が閾値よりも小さいことをもってグリーソンスコアが６以下であると推定する方法である。
【００２５】
「検体」は、本発明のグリーソンスコアの推定方法を適用する対象から採取される、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの含有量を測定するための材料であって、血液、尿、腹水など、非侵襲性ないし低侵襲性の手法によって採取することのできる液性の検体が挙げられる。たとえば、抗凝固処理された全血から調製された検体、好ましくは血清または血漿は、本発明における検体として好適である。ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの定量方法に応じて必要であれば、検体は希釈液、試薬等を添加して調製された試料であってもよい。
【００２６】
本発明のグリーソンスコアの推定方法の適用対象、すなわち検体を採取する対象は、典型的にはヒトであるが、ヒトの疾患のモデル動物など、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。ヒトの対象としては、典型的には前立腺癌であると確定診断された患者、または前立腺癌に罹患している可能性のある者であって、前立腺癌の悪性度を知る必要のある者が挙げられ、ヒト以外の哺乳動物の対象としては、前立腺癌を発症させたマウス、ラット等のモデル動物が挙げられる。
【００２７】
［定量方法］
検体中のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの含有量を測定するための方法は、所定の閾値と比較することのできる精度を有する測定値が得られる限り、特に限定されるものではなく、様々な定量方法を用いることができる。
【００２８】
ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの定量方法としては、比較的簡便な手段によって実施することのできる、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子（ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子）をＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡに結合させる工程を含む方法が好ましいが、その他の方法、例えば質量分析法に基づく方法を用いることも可能である。
【００２９】
・ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子
ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子は、好ましくはβ−Ｎ−アセチルガラクトサミン残基に対して親和性を有する分子（β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子）である。また、ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子としては、ＧａｌＮＡｃ残基に対して親和性を有するレクチン（ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチン）またはＧａｌＮＡｃ残基をエピトープとする抗体（抗ＧａｌＮＡｃ抗体）用いることができる。
【００３０】
同様に、β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子としては、β−ＧａｌＮＡｃ残基に対して親和性を有するレクチン（β−ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチン）またはβ−ＧａｌＮＡｃ残基をエピトープとする抗体（抗β−ＧａｌＮＡｃ抗体）を用いることができる。以下に説明されている事項について、「ＧａｌＮＡｃ残基」は適宜「β−ＧａｌＮＡｃ残基」に読み替えることができる。
【００３１】
・ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチン
レクチンは、特定の糖残基に対する親和性を有する、つまり特定の糖残基を認識してそこに結合するタンパク質であり、様々な生物に由来する多数の種類のレクチン（凝集素と呼ばれることもある）が知られている。レクチンの種類によって親和性を有する糖残基は様々であり、また多くのレクチンは、１種類の糖残基だけでなく複数の種類の糖残基と親和性を有する（ただし、特定の糖残基に対する親和性が強く、他の糖残基に対する親和性は弱い）。一般的に、抗ＧａｌＮＡｃ抗体のように、糖鎖中の特定の糖残基をエピトープとする抗体は作製しにくいのに対し、ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチンは、安価で大量に入手することができ、また安定性にも優れており長期間保存も可能であるため、ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子として好ましい。
【００３２】
ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチンとしては様々なものが公知であり、また今後も新たな生物から単離される可能性もある。本発明では、ＧａｌＮＡｃ残基に対して十分に強い親和性を有している限り、つまり、そのレクチンが、他の糖残基に対する親和性を有さないものであるか、他の糖残基と親和性を有するが、他の糖残基に対する親和性がＧａｌＮＡｃ残基に対する親和性よりも十分に小さく（例えば、結合定数が数オーダー低く）、十分な精度でＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの定量を行うことができる限り、どのようなレクチンを用いてもよい。
【００３３】
ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチン、好ましくはβ−ＧａｌＮＡｃ残基親和性レクチンの具体例としては、ノダフジレクチン（Westeria floribunda Agglutinin：ＷＦＡ）、ダイズ凝集素（Soybean Agglutinin：ＳＢＡ）およびカラスノエンドウレクチン（Vicia Villosa Lectin：ＶＶＬ）を挙げることができる。これらのレクチンは、それぞれが由来する生物体、例えば種子から分離（抽出）して精製することもできるし、商品としても市販されているものを入手することもできる。
【００３４】
ＷＦＡは、ＷＦＬ（Westeria floribunda Lectin）と表記されることもある、ノダフジに由来するレクチン（凝集素）である。ＷＦＡは、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃ）、すなわちα−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（α−ＧａｌＮＡｃ）およびβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（β−ＧａｌＮＡｃ）の両方に親和性を有し、例えば糖鎖の非還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ(α１→６)Ｇａｌ残基、ＧａｌＮＡｃ(α１→３)Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ残基、ＧａｌＮＡｃ(β１→４)Ｇａｌ残基、およびＧａｌＮＡｃ(β１→４)ＧｌｃＮＡｃ残基、ならびに糖鎖の還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（セリンまたはスレオニン）などに結合することができる。また、ＷＦＡは、ラクトースおよびガラクトースに対しても比較的弱い親和性を有する。
【００３５】
ＳＢＡは、ダイズに由来するレクチン（凝集素）である。ＳＢＡも、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃ）、すなわちα−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（α−ＧａｌＮＡｃ）およびβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（β−ＧａｌＮＡｃ）の両方に親和性を有するが、前者に対する親和性の方が後者に対する親和性よりもやや強く、例えば糖鎖の非還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ(α１→３)Ｇａｌ残基、ＧａｌＮＡｃ(β１→４)Ｇａｌ残基、およびＧａｌＮＡｃ(β１→４)ＧｌｃＮＡｃ残基に結合することができる。また、ＳＢＡは、ガラクトースに対しても比較的弱い親和性も有する。
【００３６】
ＶＶＬは、ＶＶＡ（Vicia villosa Agglutinin）と表記されることもある、ヘアリーベッチに由来するレクチン（凝集素）である。ＶＶＬも、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（ＧａｌＮＡｃ）、すなわちα−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（α−ＧａｌＮＡｃ）およびβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン残基（β−ＧａｌＮＡｃ）の両方に対する親和性を有し、例えば糖鎖の非還元末端に位置するＧａｌＮＡｃ(α１→３)Ｇａｌ残基、ＧａｌＮＡｃ(β１→４)Ｇａｌ残基、およびＧａｌＮＡｃ(β１→４)ＧｌｃＮＡｃ残基に結合することができる。
【００３７】
・ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの定量方法の実施形態
ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子をＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡに結合させる工程を含む、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの定量方法の代表的な実施形態（第１実施形態）としては、ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子と共に、これとは別のＰＳＡに特異的に結合する分子をＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡに結合させ、これら３分子からなるサンドイッチ型複合体を形成させることを含む方法が挙げられる。このサンドイッチ型複合体の具体例としては、支持体に担持された（固相化された）ＰＳＡタンパク質をエピトープとする抗ＰＳＡ抗体と、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡと、蛍光標識されたＧａｌＮＡｃ親和性レクチンまたは抗ＧａｌＮＡｃ抗体とからなるサンドイッチ型複合体が挙げられる。
【００３８】
「抗ＰＳＡ抗体」は、一般的な手法により作製することも可能であり、市販されているものを購入することも可能である。測定の安定性からポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体を用いることが好ましい。また、糖鎖中の特定の糖残基（本発明においてはＧａｌＮＡｃ）を蛍光標識レクチンが認識して結合することを妨げないよう、ＰＳＡの糖鎖ではなくタンパク質の部分をエピトープとする抗体が好ましい。そのようなＰＳＡタンパク質をエピトープとする抗ＰＳＡモノクローナル抗体としては、例えば、ＰＳ２、ＰＳ３、ＰＳ４、ＰＳ５、ＰＳ６、ＰＳ１５、２Ｈ９、３Ｂ４、５Ａ６、５Ｇ６、８Ｇ４、９Ａ８、９Ｇ２、ＰＳ１、８Ａ６、２Ｈ９、１Ｈ１２、Ｎｏ．７９などのクローンが公知であり、市販もされている。抗ＧａｌＮＡｃ抗体、好ましくは抗β−ＧａｌＮＡｃ抗体も同様にして作製することができ、例えば、１００−２Ｈ５−Ａ、１１４−２Ｈ１２−Ｃ、２５９−２Ａ１、２７３−３Ｆ２、９９−２Ａ５−Ｂ、ＳＭＬＤＮ１．１などのクローンが公知である。
【００３９】
蛍光標識されたＧａｌＮＡｃ親和性レクチンは、前述したようなＧａｌＮＡｃ親和性レクチンに一般的な手法を用いて所望の蛍光物質を結合させることにより作製することができ、その際には市販されている蛍光物質ラベリングキットなどを用いることもできる。蛍光物質は特に限定されるものではなく、ＳＰＦＳによって適切な蛍光を発することのできる蛍光色素などを用いることができる。蛍光標識された抗ＧａｌＮＡｃ抗体も同様にして作製することができる。
【００４０】
上記のようなＧａｌＮＡｃ残基親和性分子を含むサンドイッチ型複合体の形成量、すなわち検体中のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの含有量を定量するための方法としては、測定対象を高感度かつ高精度で定量することができる方法として知られている、ＳＰＦＳ（Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy：表面プラズモン励起増強蛍光分光法）が好適である。ＳＰＦＳによって測定される、サンドイッチ型複合体に含まれる蛍光物質から発せられる蛍光強度に基づいて、検体中のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡを定量することができる。
【００４１】
ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子をＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡに結合させる工程を含む、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの定量方法の別の実施形態（第２実施形態）としては、ＧａｌＮＡｃ残基に対して親和性を有するレクチンが結合した担体を充填したカラム（レクチンアフィニティーカラム）を利用する方法が挙げられる。すなわち、上記レクチンアフィニティーカラムに検体をアプライしてＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡをそのレクチンに結合させ、次いでハプテン糖を含有する溶出用緩衝液をアプライしてＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡを解離させ、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡを含有する画分を回収した後、その画分のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの含有量を免疫測定法によって測定することができる。第２実施形態において、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ含有画分中のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡを定量する際には、当該画分中のＰＳＡは実質的に全てＧａｌＮＡｃ残基を有するものになっているため、標識化されたＧａｌＮＡｃ残基親和性分子（レクチン）を用いる必要は無く、ＰＳＡタンパク質をエピトープとする標識化された抗ＰＳＡ抗体を用いることができる。例えば、抗ＰＳＡ抗体結合磁性粒子／ＰＳＡ／アルカリフォスファターゼ標識抗ＰＳＡ抗体からなる免疫複合体を形成したのち、化学発光基質を添加して発光強度を測定する化学発光酵素免疫測定法や、固相化抗ＰＳＡ抗体／ＰＳＡ／蛍光標識抗ＰＳＡ抗体からなる免疫複合体を形成したのち、ＳＰＦＳにより蛍光強度を測定するＳＰＦＳ法により、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ含有画分中のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡを定量することができる。
【００４２】
・ＳＰＦＳ測定法
ＳＰＦＳは、誘電体部材の上面に形成された金属薄膜に裏面（誘電体部材と接触している側）から、全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる角度で入射光を照射したときに、金属薄膜を透過して表面（測定領域が形成されている側）に生じるエバネッセント波が表面プラズモンとの共鳴により数十倍〜数百倍に増強されることを利用し、その増強されたエバネッセント波を励起光として、測定領域に捕捉された測定対象物を標識している蛍光物質から効率的に蛍光を発生させる方法である。その蛍光の強度を測定することによって検体中の測定対象物を定量することができ、各検体についての測定値を、濃度が既知の標準試料を用いて測定したときの蛍光の強度の測定値と対比することにより、検体中の測定対象物の含有量（濃度）に換算することができる。このようにして行われるＳＰＦＳは、ＥＬＩＳＡのような従来の蛍光標識法などに比べて極めて感度が高いため、検体中の測定対象物の濃度が極めて低い場合の定量法として好適である。
【００４３】
なお、本発明では、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの検体中の含有量（濃度）に基づいてグリーソンスコアを推定するが、ＳＰＦＳ等の定量方法によって所定の測定プロトコールに従って得られた「測定値」を、ｎｇ／ｍＬ、Ｕ（ユニット）／ｍＬ等の所定の単位で表される「濃度」に換算しないまま、分析に用いることも可能である。たとえば、ＳＰＦＳでは通常、蛍光強度の測定値を任意単位（arbitrary unit: a.u.）で表すが、同一条件下において各検体について測定された任意単位で表される測定値に基づいて当該単位の閾値を設定し、同一条件下で測定された検体の測定値からグリーソンスコアの推定を行うようにしてもよい。
【００４４】
抗ＰＳＡ抗体／ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ／蛍光標識ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子からなるサンドイッチ型複合体を形成させたのち、その複合体（蛍光物質）から発せられる蛍光の強度をＳＰＦＳによって測定する際の一般的な実施形態を、図１に基づいて説明する。
【００４５】
ＳＰＦＳを実施する際に行われる工程は、「測定前段階」の工程と「測定段階」の工程に大別することができる。測定前段階の工程は、抗ＰＳＡ抗体／ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ／蛍光標識ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子からなるサンドイッチ型複合体を形成するまでの段階の工程であって、典型的には、図１［Ａ］に示されているような、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１００を抗ＰＳＡ抗体６４に結合させて測定領域３８内に捕捉する工程（捕捉工程）、および図１［Ｂ］に示されているような、蛍光標識ＧａｌＮＡｃ残基親和性分子８０をＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１００に結合させて蛍光標識化する工程（標識工程）などを含む。一方、測定段階の工程は、金属薄膜１４の裏面に入射光を照射し、測定領域３８に形成された所定のサンドイッチ型複合体から発生する蛍光の強度を測定する工程（測定工程）などを含む。
【００４６】
ＳＰＦＳには、誘電体部材１２と、その上面に形成された金属薄膜１４と、その表面に形成された測定領域３８とを備えたプラズモン励起センサ１６ａが用いられる。測定領域３８は、所定のサンドイッチ型複合体を形成するための反応が行われる場であって、金属薄膜１４の表面に形成されたＳＡＭ６０と、そのＳＡＭ６０の表面に結合した支持体６２と、その支持体６２に結合（担持）された抗ＰＳＡ抗体６４とによって構成されることが好ましい。このようなプラズモン励起センサ１６ａは、捕捉工程に先だってあらかじめ作製しておくようにする。
【００４７】
ＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer：自己組織化単分子膜）６０は、支持体６２を金属薄膜１４の表面側に連結させる足場を提供するとともに、蛍光物質８４が金属薄膜１４と接触することにより励起光が照射されても蛍光を発しなくなる、金属消光を防止するために形成される。ＳＡＭ６０は、金属薄膜１４と直接的または間接的に反応可能な官能基、および支持体６２を構成する分子と直接的または間接的に反応可能な官能基を、両末端に有するシランカップリング剤で形成することが好ましい。
【００４８】
支持体６２は、測定領域３８内に抗ＰＳＡ抗体６４がより高密度で含まれるようにするために形成される。すなわち、ＳＡＭ６０に抗ＰＳＡ抗体６４を直接結合させる場合よりも、ＳＡＭ６０に支持体６２を結合させ、その支持体６２に抗ＰＳＡ抗体６４を結合させる場合の方が、支持体６２が高さ方向への空間的な広がりを持っているため、単位面積当たりの抗ＰＳＡ抗体６４の個数（つまり密度）を高めることができる。このような支持体６２としては、疎水結合が一因となっている非特異的吸着を抑制するとともに、抗ＰＳＡ抗体６４と反応可能な官能基を多数有する親水性高分子、例えばデキストランからなる主鎖にカルボキシル基が多数導入されたカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）が好ましい。
【００４９】
例えば、シランカップリング剤である１０−カルボキシ−１−デカンチオールを含有する溶液を、金属薄膜１４の表面に接触させることにより、当該分子からなるＳＡＭ６０を形成することができる。続いて、１０−カルボキシ−１−デカンチオールから形成されたＳＡＭ６０に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）および水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を反応させることにより、ＳＡＭ６０の表面側に配向しているカルボキシル基を活性エステル化した後、ＣＭＤを含有する溶液を接触させることで、ＣＭＤからなる支持体６２を固相化することができる。さらに、ＣＭＤにＮＨＳおよびＷＳＣを反応させ、ＣＭＤが有するカルボキシル基を活性エステル化した後、抗ＰＳＡ抗体６４を含有する溶液を接触させることで、ＣＭＤからなる支持体６２に多数の抗ＰＳＡ抗体６４を担持させることができる。
【００５０】
捕捉工程では、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１００および非ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１１０を含有する検体を、流路３６に導入して測定領域３８に接触させるようにする。図１に示す実施形態においては、前述したようなレクチンアフィニティーカラムを用いた分画は事前に行われていないため、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１００とともに非ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１１０が検体中に含まれている。したがって、測定領域３８の抗ＰＳＡ抗体６４には、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１００だけでなく非ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１１０も結合して捕捉されることになる。
【００５１】
標識工程では、蛍光標識ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０を含有する溶液を、流路３６に導入して測定領域３８に接触させるようにする。蛍光標識ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０は、測定領域３８に捕捉されているＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１０に結合して、所定のサンドイッチ型複合体が形成されるが、ＧａｌＮＡｃ残基を有さない非ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１１０には（非特異的吸着によるやむを得ない結合を除いて）結合しない。
【００５２】
捕捉工程と標識工程の間、および標識工程の後には、流路３６に洗浄液（例えば界面活性剤を含有する緩衝液）を導入し、測定領域３８（支持体６２、抗ＰＳＡ抗体６４、ＳＡＭ６０など）に非特異的に吸着している、非ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ１１０や蛍光標識ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０を除去するようにすることが好ましい。測定工程では、流路３６を洗浄液または緩衝液で満たした状態で、蛍光の強度を測定することが好ましい。
【００５３】
・ＳＰＦＳシステム
続いて、上記のようなＳＰＦＳを行うために好適なＳＰＦＳシステムの一実施形態を、図２に基づいて説明する。
【００５４】
ＳＰＦＳシステム１は、ＳＰＦＳ測定部材１６、ＳＰＦＳ測定装置１０、および制御演算装置４０によって構成されている。
【００５５】
図２［Ａ］は、誘電体部材１２の上面１２ａに直接金属薄膜１４が形成されている実施形態を表しており、プラズモン励起センサ１６ａは、誘電体部材１２、金属薄膜１４および測定領域３８からなる。図２［Ｂ］は、誘電体部材１２と分離可能な透明平面基板１３の上面に金属薄膜１４が形成されている実施形態を表しており、プラズモン励起センサ１６ａは、透明平面基板１３、金属薄膜１４および測定領域３８からなる。
【００５６】
ＳＰＦＳ測定部材１６はプラズモン励起センサ１６ａおよび流路部材１６ｂで構成されている。プラズモン励起センサ１６ａの上面の一部または全部、すなわち流路３６の底面の一部または全部において、支持体６２および抗ＰＳＡ抗体６４からなる層が形成されている領域が測定領域３８となる。測定領域３８の面積は通常、一般的にレーザー光として照射される入射光２２の照射面積と等しいかそれより広くなるよう調整され、たとえば、入射光２２のスポット径が１ｍｍφ程度であれば、測定領域３８は通常、少なくとも数ｍｍ四方の面積を有する。
【００５７】
流路部材１６ｂは、プラズモン励起センサ１６ａの上部に、両末端に開口を有する流路３６を形成するための部材であり、流路部材１６ｂの上部に設けられる蛍光検出手段３２によって蛍光３２の強度の測定が正確に行えるよう、無色透明な素材、例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）で作製されている。流路部材１６ｂは、プラズモン励起センサ１６ａ（図２［Ａ］では誘電体部材１２、図２［Ｂ］では透明平面基板１３）と圧着されており、必要に応じて接着剤、マッチングオイル、透明粘着シートなどを用いて、隙間からの溶液の漏出を防止するようにしてもよい。また、流路部材１６ｂは、側壁部（スペーサー）と天板部とを組みあわせることによって構成されていてもよい。この場合、側壁部としては、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製で、流路となる貫通穴を中央部に有するシート状の部材を用いることができる。天板部としては、例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）製の無色透明で、側壁部の貫通穴（流路）の両端に相当する位置に２つの貫通穴を有するプレート状の部材を用いることができる。
【００５８】
このような「流路型」のＳＰＦＳ測定部材１６では、検体、蛍光標識ＧａｌＮＡｃ親和性分子８０の溶液、洗浄液等の各種の溶液は、送液手段（図示せず）によって、両端に設けられている開口から流路３６に導入され、往復送液または循環送液される。
【００５９】
なお、溶液を往復送液または循環送液する必要がない場合、ＳＰＦＳ測定部材１６は溶液を貯留する「ウェル型」とすることができる。その場合、流路部材１６ｂの代わりに、プラズモン励起センサ１６ａの上面に流路よりも容積の大きいウェルを形成することのできる、ウェル部材を用いればよい。ウェルの上部は開放されていてよく、たとえばピペット状の器具を用いることにより、各種の液体をウェルに添加し、除去することができる。
【００６０】
ＳＰＦＳ測定装置１０は、基本的に、測定部材装填部１８、照射手段２０、受光手段２６および蛍光検出手段３２を備え、必要に応じてさらに、送液手段（図示せず）を備えていてもよい。
【００６１】
測定部材装填部（ステージ）１８には、ＳＰＦＳ測定部材１６が着脱可能になっている。図２［Ａ］に示すような、誘電体部材１２を含むプラズモン励起センサ１６ａの使用が想定される場合、測定部材装填部１８はプリズム形状の誘電体部材１２を設置できるようになっている。図２［Ｂ］に示すような、透明平面基板１３を含むプラズモン励起センサ１６ａの使用が想定される場合、測定部材装填部１８にはあらかじめプリズム形状の誘電体部材１２が設置されており、その上面１２ａに透明平面基板１３を密着して載置できるようになっている。
【００６２】
送液手段（図示せず）は、例えば、移動手段を備えたピペット状の器具によって構成することができる。試料、試薬等の各種の溶液の収容部（図示せず）においてそれらの溶液を吸引した後、流路型のＳＰＦＳ測定部材１６の流路３６の末端に設けられている開口において吸引されていた溶液を吐出することで、その溶液を流路３６に導入することができる。必要に応じて、その場で吸引および吐出を繰り返すことにより、溶液を流路３６内で往復送液させ、測定領域３８における反応を促進させることができる。ＳＰＦＳ測定部材１６がウェル型の場合は、そのウェル内に吸引されていた溶液を吐出すればよい。また、ＳＰＦＳ測定部材１６が流路型の場合は、送液手段は、外部流路およびポンプによって構成することもできる。外部流路は、ＳＰＦＳ測定部材１６の流路３６の両末端に設けられた開口とポンプとを連通させる部材である。ポンプは、この外部流路を介して、試料、試薬等の各種の溶液を流路３６に導入し、往復送液または循環送液させることができる。
【００６３】
照射手段２０は、光源および光源可動手段を備え、必要に応じてさらに、光源と誘電体部材１２との間に偏光フィルタおよび減光フィルタを備えていてもよい。光源は、蛍光標識レクチン８０が有する蛍光物質８４を励起させるのに適した波長および強度を有する入射光２２を照射するものであり、一般的にはレーザーダイオードである（つまり入射光２２はレーザー光である）。光源可動手段は、入射光２２が誘電体部材１２の入射側面１２ｂから金属薄膜１４の裏面に、所定の入射角α１で照射されるよう、光源を移動させる。偏光フィルタは、光源から照射される入射光２２を、金属薄膜１４が表面プラズモン共鳴を効率的に発生させることができるＰ偏光にするために用いられる。減光フィルタは、蛍光検出手段３２が適切な強度の信号値を取得できるよう、光源から照射される入射光２２の強度（フォトン量）を調整するために用いられる。
【００６４】
受光手段２６は、受光器および受光器可動手段を備える。受光器は、入射光２２が金属薄膜１４の裏面で反射された光である、反射光２４を受光し、その強度を測定することができる。受光器可動手段は、光源可動手段による入射光２２の入射角α１の変化と同期して、反射角が変化した反射光２４を確実に受光できるよう、受光器を移動させることができる。入射光２２の強度に対する反射光２４の強度の比率、すなわち反射率が最も低いときに、表面プラズモン共鳴による電場増強効果が最も高くなり、そのような入射角α１において蛍光３２の強度を測定する測定工程を行うことが好ましい。
【００６５】
蛍光検出手段３２は、検出器、集光レンズおよびフィルタを備える。検出器は、プラズモン励起センサ１６ａの表面から発せられる、すなわち測定領域３８に捕捉された蛍光標識レクチン８０が有する蛍光物質８４から発せられる蛍光３０を受光し、その強度を測定するためのものであり、例えば光電子倍増管（ＰＭＴ）を用いることができる。集光レンズは、蛍光３０を検出器に集中させてその強度を正確に測定できるようにするためのものであり、例えば顕微鏡と同様の対物レンズを用いることができる。フィルタは、蛍光３０を含む所定の範囲の波長の光のみを透過させて検出器に到達させるためのものであり、その範囲を外れる波長を有する、散乱光等のノイズとなる光を除去することができる。
【００６６】
なお、ＳＰＦＳ測定部材１６（プラズモン励起センサ１６ａ）、照射手段２０および受光手段２６からなる構成は、ＳＰＲ測定部２８と称されることがある。ＳＰＲ測定部２８は、蛍光３０を測定するのではなく、測定領域３８に目的物質が捕捉されることで反射光２４の強度が減衰することによって目的物質を定量する、ＳＰＲ法（表面プラズモン共鳴法）のための装置と基本的に共通する構成を有するためである。一方で、ＳＰＦＳ測定部材１６（プラズモン励起センサ１６ａ）、照射手段２０および蛍光検出手段３２からなる構成は、ＳＰＦＳ測定部３４と称されることがある。
【００６７】
制御演算装置４０は、照射手段２０、受光手段２６、蛍光検出手段３２、および必要に応じて備えられる送液手段（図示せず）と接続されており、各手段が備える部材の動作を制御することができるとともに、各手段で測定された情報を記録ないし記憶し演算することができるよう、信号が送受信される。制御演算装置４０は、所定の制御演算用のプログラムおよび情報を記憶することのできる、パーソナルコンピュータを用いて構成することができる。
【００６８】
制御演算装置４０は、たとえば、送液手段が所定の手順で、所定の量の試料や試薬等の溶液を送液し、測定領域３８に所定の複合体を形成させた後、照射手段２０が所定のタイミングおよび入射角で入射光２２を照射し、蛍光検出手段３２が測定領域３８で発生する蛍光３０の強度を測定するよう、プログラムに従って自動的にそれらの各手段を作動させることができる。また、制御演算装置４０は、検体ごとに測定される蛍光３０の強度のデータを蛍光検出手段３２から受信して記憶し、好ましくは直ちに、その測定値をあらかじめ記憶させておいた所定の閾値と対比して、グリーソンスコアの推定結果をさらに記憶するようにしてもよい。
【００６９】
［推定方法］
測定された検体中のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの含有量（濃度）から、グリーソンスコアが７以上であると判定するための閾値、およびグリーソンスコアが６以下であると推定するための閾値はそれぞれ、他の診断マーカーまたは腫瘍マーカーについての閾値に準じた一般的な手法によって設定することができる。
【００７０】
たとえば、前立腺癌と確定診断され、グリーソンスコアも検査されている複数の患者に由来する検体について、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの濃度を測定したときに、測定値がある濃度以上の集団において実際のグリーソンスコアが７以上である検体が所望の割合以上を占めるようになる濃度を求めることができ、この濃度をグリーソンスコアが７以上であると推定するための閾値とすることができる。前記「所望の比率」が、グリーソンスコアが７以上であるとの推定に関する信頼性、即ち、推定が正しい確率に相当する。測定データの母集団であるサンプル数を多くするほど、信頼性の高い閾値を設定することが可能となる。ある検体中のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの含有量（濃度）の測定値を、そのようにして設定された閾値と比較し、測定値が閾値よりも大きければその検体を採取した前立腺癌患者はグリーソンスコアが７以上であると、所定の確率でもって推定することができる。グリーソンスコアが７以上であるという推定をなるべく高い精度で行うことができる閾値を設定し、測定値の濃度が閾値よりも大きいことをもって、侵襲性の高い針生検を行うことなく、グリーソンスコアが７以上であると推定（診断）することができるようになることが望ましい。
【００７１】
上記と同様にして、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの濃度を測定したときに、測定値がある濃度以下の集団において実際のグリーソンスコアが６以下である検体が所望の割合以上を占めるようになる濃度を求めることができ、この濃度をグリーソンスコアが６以下であると推定するための閾値とすることができる。グリーソンスコアが７以上と推定するための閾値と、６以下であると推定するための閾値は、異なる値となる可能性が高い。
【００７２】
以上のような、ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡのように特定の糖残基を含む糖鎖を有する糖タンパク質の定量方法、特にＳＰＦＳ法に基づく定量方法や、そのような含有量を所定の閾値を比較して診断等に用いることのできる特定の情報を得る方法に関して、本明細書に記載されている事項以外の一般的な事項や実施形態のバリエーションについては、例えば、国際公開２０１０／０９０２６４号公報（特許文献４）、特開２０１３−０７６６６６号公報（特許文献５）などを参照することができる。
【実施例】
【００７３】
（１）ＳＰＦＳ測定装置の構築
図２［Ｂ］に示す実施形態に準じたＳＰＦＳ測定装置を自作し、以下の実施例に使用した。照射手段２０の光源としては、波長６３５ｎｍの光を照射することができるレーザーダイオード（ＬＤ）を用い、光源と誘電体部材１２との間には、減光フィルタ（中性濃度フィルタ）を設けてフォトン量を調整できるようにした。誘電体部材１２としては、６０度のプリズム（シグマ光機(株)）を用いた。この誘電体部材１２の上面１２ａに、次に述べるようにして作製した、透明平面基板１３を含むプラズモン励起センサ１６ａと流路部材１６ｂとからなる部材（センサーチップ）を固定することによって、測定部材１６を構成した。蛍光検出手段３２の光検出器としては、光電子倍増管（ＰＭＴ）を用い、集光レンズとして対物レンズを設けた。【００７４】
（２）流路型ＳＰＦＳ測定部材の作製
屈折率１．７２、厚さ１ｍｍのガラス製の透明平面基板（(株)オハラ「Ｓ−ＬＡＬ  １０」）をプラズマ洗浄し、この基板の片面にクロム薄膜をスパッタリング法によって形成した。その後、その表面にさらに金薄膜をスパッタリング法によって形成した。クロム薄膜の厚さは１〜３ｎｍ、金薄膜の厚さは４４〜５２ｎｍであった。【００７５】
このようにして金薄膜が形成された基板を、１０−カルボキシ−１−デカンチオールを１ｍＭ含むエタノール溶液に２４時間以上浸漬し、金薄膜の表面に当該分子からなるＳＡＭを形成した。基板をこの溶液から取り出し、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄した後、エアガンを用いて乾燥した。【００７６】
この基板に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）０．５ｍＭ、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）０．５ｍＭおよびカルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）（名糖産業(株)「ＣＭＤ−５００−０６Ｉ４」，平均分子量５０万，置換度０．５１）１ｍｇ／ｍＬを含む２５ｍＭのＭＥＳ緩衝生理食塩水と、１０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）とを、それぞれ０．８ｍＬずつ滴下し、２０分間反応させてＳＡＭにＣＭＤを結合させることで、プラズモン励起センサの表面にＣＭＤ膜を形成した。【００７７】
ＣＭＤ膜が形成されたプラズモン励起センサ上に、幅２ｍｍ、長さ１４ｍｍの貫通穴を有する、厚さ０．５ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）製のスペーサーを積載した。さらにその上に、スペーサーの貫通穴の両端に対応する位置に貫通穴を有する、厚さ２ｍｍのポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の天板を積載した。プラズモン励起センサ、スペーサーおよび天板を圧着し、ビスで固定することで、天板の貫通穴を通じて試料、試薬等を送液することのできるスペーサーの貫通穴からなる流路を備えた、流路型ＳＰＦＳ測定部材を作製した。【００７８】
（３）抗体固相化基板の調製
［調製例１］抗ＰＳＡモノクローナル抗体固相化基板
上記のように作製した流路型ＳＰＦＳ測定部材に外部流路およびペリスタポンプを接続し、超純水を１０分間、その後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を２０分間、室温（２５℃）、流量５００μＬ／分の条件で循環送液させ、プラズモン励起センサの表面を平衡化した。【００７９】
続いて、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）を５０ｍＭと、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を１００ｍＭとを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５ｍＬを、２０分間循環送液した後、抗ＰＳＡモノクローナル抗体溶液２．５ｍＬを３０分間循環送液することで、ＣＭＤに当該抗体を結合させ、抗ＰＳＡモノクローナル抗体固相化ＣＭＤ膜（測定領域）を調製した。【００８０】
その後、１重量％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を３０分間循環送液することによって、流路内の非特異吸着防止処理を行った。【００８１】
（４）蛍光標識レクチンの作製
［作製例１］Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ
標記の蛍光標識レクチンを、蛍光物質ラベリングキット「Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ タンパク質ラベリングキット」（インビトロジェン社）を利用して作製した。ＷＦＡ（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社「Ｌ−１３５０」）１００μｇ相当と、上記キットに含まれる０．１Ｍ重炭酸ナトリウムと、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅとを混合し、室温で１時間反応させた後、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび限外濾過を行い、標識に利用されなかったＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅを取り除いて、蛍光標識ＷＦＡレクチンを得た。その後、吸光度を測定して標記の蛍光標識レクチンの濃度を定量した。【００８２】
［作製例２］Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＳＢＡ
ＷＦＡの代わりにＳＢＡ（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社「Ｌ-１０１０」）を用いたこと以外は作製例１と同様にして、標記の蛍光標識ＳＢＡを作製し、その濃度を定量した。【００８３】
［作製例３］Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＶＶＬ
ＷＦＡの代わりにＶＶＬ（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社「Ｌ-１２３０」）を用いたこと以外は作製例１と同様にして、標記の蛍光標識ＳＢＡを作製し、その濃度を定量した。【００８４】
（５）血清検体中のＮ−アセチルガラクトサミン残基を糖鎖の末端に有する前立腺特異抗原（ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ）の定量
［実施例１］Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡを用いたＳＰＦＳ測定
表１に示す各被験試料に含まれるＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡを、抗ＰＳＡモノクローナル抗体固相化基板を備えた流路型ＳＰＦＳ測定部材（調製例１）および蛍光標識ＷＦＡ（作製例１）を用いて、ＳＰＦＳにより定量した。詳しくは以下の通りである。【００８５】
【表１】
2017056844.tif 000003
被験試料（血清）２０μＬに希釈溶液１００μＬを添加し、チューブ内でよく撹拌して混合液を調製した。この混合液１００μＬを流路に循環送液し、測定領域と６０分間反応させた。その後、「Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０」を０．０５重量％含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）を送液して、３分間洗浄した。続いて、作製例１で得られたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ溶液（ＷＦＡ濃度：１０μｇ／ｍＬ）１００μＬを流路に循環送液し、測定領域と１０分間反応させた。その後再び、ＴＢＳ−Ｔを送液して、５分間洗浄した。そして、ＴＢＳ−Ｔで流路を満たした状態で励起光を照射し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度（シグナル）をＳＰＦＳにより測定した。【００８６】
各被験試料の蛍光強度の測定値と、濃度が既知の調製試料を用いて作成した検量線に基づいて、各被験試料のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの濃度（分画量）を算出した。結果を図３に示す。前立腺癌患者に由来する被験試料のうち、グリーソンスコア（ＧＳ）が７以上の群と６未満の群との間には統計学的に有意な差（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、Ｐ=０．０００３１）があることが明らかとなった。【００８７】
上記の結果に基づいて設定した、グリーソンスコアが７以上であること、およびグリーソンスコアが６以下であることについての、被験試料中のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの濃度に関するカットオフ値と的中率（予測性能）を、それぞれ表２および表３にまとめる。【００８８】
【表２】
2017056844.tif 000004
【００８９】
【表３】
2017056844.tif 000005
［実施例２］Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＳＢＡを用いたＳＰＦＳ測定
表１に示した被験試料から、グリーソンスコアが７以上の前立腺癌患者由来の４検体およびグリーソンスコアが６未満の前立腺癌患者由来の４検体の合計８検体をランダムに選択して測定の対象とし、またＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ溶液（ＷＦＡ濃度：１０μｇ／ｍＬ）の代わりに、作製例２で得られたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＳＢＡ（ＳＢＡ濃度：１０μｇ／ｍＬ）を用い、それ以外は実施例１と同様にして、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度（シグナル）をＳＰＦＳにより測定し、各被験試料のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの濃度（分画量）を算出した。【００９０】
結果を図４に示す。レクチンとしてＳＢＡを用いた場合も、ＷＦＡを用いた場合と同様の傾向を示すことが確認された（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、Ｐ＝０．００４２８）。【００９１】
［実施例３］Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＶＶＬを用いたＳＰＦＳ測定
表１に示した被験試料のうち、グリーソンスコアが７以上の前立腺癌患者由来の４検体およびグリーソンスコアが６未満の前立腺癌患者由来の４検体の合計８検体をランダムに選択して測定の対象とし、またＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＷＦＡ溶液（ＷＦＡ濃度：１０μｇ／ｍＬ）の代わりに、作製例３で得られたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識ＶＶＬ（ＳＢＡ濃度：１０μｇ／ｍＬ）を用い、それ以外は実施例１と同様にして、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の蛍光強度（シグナル）をＳＰＦＳにより測定し、各被験試料のＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡの濃度（分画量）を算出した。【００９２】
結果を図５に示す。レクチンとしてＶＶＬを用いた場合も、ＷＦＡを用いた場合と同様の傾向を示すことが確認された（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定、Ｐ＝０．００１４１）。
【符号の説明】
【００９３】
１            ＳＰＦＳシステム
１０          ＳＰＦＳ測定装置
１２          誘電体部材
１２ａ      上面
１２ｂ      入射側面
１２ｃ      反射側面
１３          透明平面基板
１４          金属薄膜
１６          ＳＰＦＳ測定部材（流路型）
１６ａ      プラズモン励起センサ
１６ｂ      流路部材
１８          測定部材装填部
２０          照射手段
２２          入射光
２４          反射光
２６          受光手段
２８          ＳＰＲ測定部
３０          蛍光
３２          蛍光検出手段
３４          ＳＰＦＳ測定部
３６          流路
３８          測定領域
４０          制御演算手段
６０          ＳＡＭ
６２          支持体
６４          抗ＰＳＡ抗体
８０          蛍光標識ＧａｌＮＡｃ親和性分子
８２          ＧａｌＮＡｃ親和性分子
８４          蛍光物質
１００        ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ
１０２        ＰＳＡタンパク質
１０４        非還元末端にＧａｌＮＡｃを有する糖鎖
１０４ａ    ＧａｌＮＡｃ
１１０        非ＧａｌＮＡｃ−ＰＳＡ
１１４        非還元末端にＧａｌＮＡｃを有さない糖鎖
【図１】
2017056844.tif 000006
【図２】
2017056844.tif 000007
【図３】
2017056844.tif 000008
【図４】
2017056844.tif 000009
【図５】
2017056844.tif 000010
【国際調査報告】
2017056844.tif 000011
2017056844.tif 000012
2017056844.tif 000013
2017056844.tif 000014
2017056844.tif 000015
2017056844.tif 000016