(57)【要約】【課題】ブタノールを含む代謝産物を増殖非連動的に生産するブタノール生産微生物を利用してブタノールを生産するに際し、投入した基質に対するブタノールの生産量（収率）を大幅に向上させる。【解決手段】基質３を消費しながらブタノールを含む代謝産物７を増殖非連動的に生産しているブタノール生産微生物２に、酸化体と還元体の両形態をとり得る電子媒体物質５を介した一時的な電子の供給を行う工程を含むようにした。電子の供給は、例えば、基質３とブタノール生産微生物２と電子媒体物質５とを含む培養液４に電極９を浸漬し、電極９に還元電位を印加することにより行うことができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質を消費しながらブタノールを含む代謝産物を増殖非連動的に生産しているブタノール生産微生物に、酸化体と還元体の両形態をとり得る電子媒体物質を介した一時的な電子の供給を行う工程を含むことを特徴とするブタノール生産方法。
【請求項２】
前記電子の供給は、前記基質と前記ブタノール生産微生物と前記電子媒体物質とを含む培養液に電極を浸漬し、前記電極に還元電位を印加して前記電子媒体物質を還元することにより行う請求項１に記載のブタノール生産方法。
【請求項３】
前記工程を、前記ブタノール生産微生物の基質消費期間の中期に行う請求項１または２に記載のブタノール生産方法。
【請求項４】
前記ブタノール生産微生物は、アセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を行うクロストリジウム属細菌である請求項１〜３のいずれか１項に記載のブタノール生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を利用したブタノール生産方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、ブタノールを含む代謝産物を増殖非連動的に生産するブタノール生産微生物を利用してブタノール生産を行うのに好適なブタノール生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタノールは、エタノールよりもエネルギー含有量が多いことから次世代バイオ燃料として注目されている。また、イソプレン、イソブテン、ブテン等の様々な化学合成物質の原材料としても有用である。さらに、バイオディーゼル燃料の燃焼効率を向上させる添加剤としても有用である。これらのことから、効率的なブタノールの生産プロセスの確立が望まれている（非特許文献１及び２を参照）。
【０００３】
近年、ブタノールを生産するための方法の一つとして、C.acetobutylicum等に代表されるクロストリジウム属細菌のアセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を利用した方法が注目されている。ＡＢＥ発酵では、グルコース等の基質を消費して対数増殖期には主に酢酸や酪酸といった有機酸が生成され（酸生成期）、定常期には主にブタノール、アセトン及びエタノールが６：３：１の比で増殖非連動的に生成される（アルコール生成期）。つまり、糖類等の基質からアルコールとしてブタノールとエタノールを同時に生産することができ、特にブタノールを優占的に生産することが可能である（例えば、非特許文献３を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Pfromma  PH, Amanor-Boadub V, Nelson R, Vadlanid P, Madl R., Bio-butanol vs. bio-ethanol: A technical and economic assessment for corn and switchgrass fermented by yeast or Clostridium acetobutylicum. Biomass and Bioenergy, 2010. 34(4): p. 515-524.
【非特許文献２】Vert A, Qureshi N, Yukawa H, Blaschek HP., Biomass to Biofuels: Strategies for Global Industries, 2010.
【非特許文献３】D.T.JONES.1981. Solvent Production and Morphological changes in Clostridium acetobutylicum. Applied and Environmental Microbiology.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、図３２に示すように、ＡＢＥ発酵におけるグルコースを基質とした標準的なブタノール生産経路では、ピルビン酸から下流の反応において、ブタノールを合成するための還元力として４分子のＮＡＤＨを必要とする。これに対し、上流のグルコース消費反応（グルコースからピルビン酸）では２分子のＮＡＤＨを生産するのみである。よって、ブタノール１分子を合成するためには最低でもグルコースを２分子消費する。実際には、水素やエタノールなどその他の代謝産物にも還元力は分散するため、ブタノールの消費グルコースに対する収率は低い。つまり、ＡＢＥ発酵を利用したブタノール生産においては、投入した糖類等の基質に対して、ブタノールの収率が低いという問題があり、その改善が望まれていた。
【０００６】
また、この問題は、クロストリジウム属細菌のＡＢＥ発酵を利用したブタノールの生産に限らず、ブタノールを含む代謝産物を増殖非連動的に生産するブタノール生産微生物を利用したブタノールの生産全般について当て嵌まり得る問題であり、その改善が望まれていた。
【０００７】
そこで、本発明は、ブタノールを含む代謝産物を増殖非連動的に生産するブタノール生産微生物を利用してブタノールを生産するに際し、投入した基質に対するブタノールの生産量（収率）を大幅に向上させることのできる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
かかる課題を解決するため、本願発明者は、ブタノール生産微生物の細胞外からブタノール生産に必要な還元力を供給することで、ブタノールの生産性を大きく向上できる可能性があると考え、各種検討を行った。
【０００９】
その結果、C.acetobutylicumとグルコースとメチルビオロゲンとを含む培養液に電極を浸漬し、C.acetobutylicumがグルコースを消費しながらブタノールを含む代謝産物を増殖非連動的に生産している期間中に、電極への通電（還元電位の印加）を開始し、１０分間通電し続けてメチルビオロゲンを酸化型から還元型に還元した後に通電を停止することで、投入したグルコースに対するブタノールの生産量（収率）を大きく向上できることを知見するに至った。そして、この収率向上効果は、通電開始のタイミングを特にグルコースの消費中期とした場合に顕著に奏されることを知見するに至った。
【００１０】
本願発明者等は、上記知見に基づき、C.acetobutylicumに限らず、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属細菌全般について、さらにはブタノールを含む代謝産物を増殖非連動的に生産するブタノール生産微生物全般について、基質を消費しながらブタノールを生産している期間中に、酸化体と還元体の両形態をとり得る電子媒体物質を介した一時的な電子の供給を行うことによって、投入した基質に対するブタノールの生産量（収率）を大きく向上できる可能性が導かれることを知見し、さらに種々検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【００１１】
即ち、本発明のブタノール生産方法は、基質を消費しながらブタノールを含む代謝産物を増殖非連動的に生産しているブタノール生産微生物に、酸化体と還元体の両形態をとり得る電子媒体物質を介した一時的な電子の供給を行う工程を含むようにしている。
【００１２】
ここで、本発明のブタノール生産方法においては、電子の供給は、基質とブタノール生産微生物と電子媒体物質とを含む培養液に電極を浸漬し、電極に還元電位を印加して電子媒体物質を還元することにより行うことが好ましい。
【００１３】
また、本発明のブタノール生産方法においては、上記工程を、ブタノール生産微生物の基質消費期間の中期に行うことが好ましい。
【００１４】
さらに、本発明のブタノール生産方法においては、アセトン・ブタノール・エタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を行うクロストリジウム属細菌であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ブタノールを含む代謝産物を増殖非連動的に生産するブタノール生産微生物を利用してブタノールを生産するに際し、投入した基質に対するブタノールの生産量（収率）を大幅に向上させることが可能となる。したがって、投入した基質に対するブタノール生産量を従来よりも高めて、ブタノール生産にかかるコストの低減とブタノール生産効率の向上の両立を図ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のブタノール生産方法の概念を示す図である。
【図２】実施例にて使用した電気培養装置の構成概略図である。
【図３】メチルビオロゲンのサイクリックボルタモグラムである。
【図４】メチルビオロゲンの酸化還元反応式である。
【図５】連続通電による電気培養試験における、培養液中のグルコース濃度の経時変化を示す図である。
【図６】連続通電による電気培養試験における、培養液中の酪酸及び酢酸濃度の測定結果を示す図である。
【図７】連続通電による電気培養試験における、培養液中のエタノール及びブタノール濃度の測定結果を示す図である。
【図８】非通電時の培養液の自然電位変化を示す図である。
【図９】連続通電による通電時の電流値変化を示す図である。
【図１０】−０．７Ｖ印加時に推定される代謝の流れを示す図である。
【図１１】メチルビオロゲンを通電により還元した場合の電流値の経時変化を示す図である。
【図１２】一時的な通電による電気培養試験における、培養液中のグルコース濃度の経時変化を示す図である。
【図１３】一時的な通電による電気培養試験における、培養液中の酪酸及び酢酸濃度の測定結果を示す図である。
【図１４】一時的な通電による電気培養試験における、培養液中のエタノール及びブタノール濃度の測定結果を示す図である。
【図１５】一時的又は断続的な通電による電気培養試験における、培養液中のグルコース濃度の経時変化を示す図である。
【図１６】一時的又は断続的な通電による電気培養試験における、培養液中の酪酸及び酢酸濃度の測定結果を示す図である。
【図１７】一時的又は断続的な通電による電気培養試験における、培養液中のエタノール及びブタノール濃度の測定結果を示す図である。
【図１８】−０．７Ｖをグルコース消費中期に１０分間印加した培養においてに推定される代謝の流れを示す図である。
【図１９】代謝産物の網羅的解析に用いた試料の培養結果（グルコース濃度）を示す図である。
【図２０】代謝産物の網羅的解析に用いた試料の培養結果（酢酸濃度）を示す図である。
【図２１】代謝産物の網羅的解析に用いた試料の培養結果（酪酸濃度）を示す図である。
【図２２】代謝産物の網羅的解析に用いた試料の培養結果（エタノール濃度）を示す図である。
【図２３】代謝産物の網羅的解析に用いた試料の培養結果（ブタノール濃度）を示す図である。
【図２４】主要代謝産物の相対値（中央代謝系、アミノ酸代謝）を示す図である。
【図２５】主要代謝産物の相対値（アミノ酸代謝、プリン・ピリミジン代謝）を示す図である。
【図２６】主要代謝産物の相対値（ニコチン酸及びニコチンアミド代謝、その他）を示す図である。
【図２７】酪酸の相対面積を示す図である。
【図２８】ＮＡＤ＋の相対面積を示す図である。
【図２９】ＮＡＤＨの相対面積を示す図である。
【図３０】網羅的代謝分析から推定された−０．７Ｖ印加時（グルコース消費中期）の代謝の流れを示す図である。
【図３１】通電を断続的に８回行った場合の、ブタノール濃度の経時変化を示す図である。
【図３２】C.acetobutylicumの代謝経路を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。
【００１８】
図１に、本発明のブタノール生産方法の実施形態の一例を概念的に示す。本発明のブタノール生産方法は、基質３を消費しながらブタノールを含む代謝産物７を増殖非連動的に生産しているブタノール生産微生物２に、酸化体と還元体の両形態をとり得る電子媒体物質５を介した一時的な電子の供給を行う工程を含むようにしている。
【００１９】
本実施形態において、電子の供給は、例えば、基質３とブタノール生産微生物２と電子媒体物質５とを含む培養液４に電極９を浸漬し、電極９に還元電位を印加して電子媒体物質５を還元することにより行うようにしている。
【００２０】
ブタノール生産微生物２は、ブタノールを含む代謝産物を増殖非連動的に生産するブタノール生産微生物であれば特に限定されないが、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属細菌が好適である。ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属細菌としては、例えばC.acetobutylicum, C.beijerinckii, C. saccharoperbutylacetonicum, C. saccharobutylicumが挙げられ、特にC.acetobutylicumの使用が好適であるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
ブタノール生産微生物２の培養環境中の菌体密度は、増殖の定常期に相当する菌体密度あるいはそれに近いものとすることが好適である。例えば、ブタノール生産微生物２としてＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属細菌を用いる場合には、増殖の定常期において増殖非連動的にソルベント（アセトン、ブタノール、エタノール）が生産されるので、培養環境中の菌体密度を増殖の定常期に相当する菌体密度とすることで、培養開始直後から微生物２にブタノールを含む代謝産物を生産させることができる。
【００２２】
基質３は、ブタノール生産微生物２の代謝産物生成源となる物質であり、使用するブタノール生産微生物２に応じて適宜選択される。ここで、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属細菌を用いる場合には、グルコース等の単糖、デンプン・セルロース・キシラン等の多糖類を基質として使用できるのは勿論のこと、紙・小麦わら・稲わら等の植物繊維質、生ごみ、農産廃棄物、焼酎蒸留廃液、余剰汚泥（活性汚泥）の生ごみの混合物、デンプン廃液、廃パーム繊維などといった各種バイオマス系廃棄物を幅広く基質として使用することができる。このようなバイオマス系廃棄物を用いることで、ブタノール生産にかかるコストをさらに低減しながらも、バイオマス系廃棄物の有効利用の促進を図ることができる。
【００２３】
基質３の添加量は、ブタノール生産微生物２の増殖非連動的なブタノール生産に適した量とすればよい。但し、基質３を極端に高濃度にすることは発酵（ブタノール生産）の阻害要因となる。また、基質３が変換されて生じたブタノールの濃度が２％以上になることも発酵（ブタノール生産）の阻害要因となる。したがって、例えばＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属細菌を用い、基質３をグルコースとする場合、グルコースを１０〜５００ｍＭ、好適には１０〜３００ｍＭ、より好適には１０〜１００ｍＭ、さらに好適には５０ｍＭ程度添加すればよいが、必ずしもこの添加量に限定されるわけではない。
【００２４】
電子媒体物質５としては、酸化体と還元体の両形態をとり得る物質であり、且つブタノール生産微生物２を失活させることのない物質が適宜選択される。例えば、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属細菌を用いる場合には、電子媒体物質５は、ビオロゲン又はビオロゲン誘導体とすることが好適である。ビオロゲン誘導体としては、メチルビオロゲン、エチルビオロゲン、ベンジルビオロゲン等を用いることができ、メチルビオロゲンを用いることが好適である。但し、電子媒体物質５はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
電子媒体物質５の添加量は、電子媒体物質５の種類、使用するブタノール生産微生物２の種類、菌体密度等に応じてその最適量が適宜変化するが、概ね０．５〜１０ｍＭ、好適には０．５〜５ｍＭ、より好適には０．５〜３ｍＭ、さらに好適には２ｍＭ程度とすればよい。電子媒体物質５の添加量が少なすぎるとブタノール生産性の向上効果が得られにくくなる。また、電子媒体物質５の添加量が多すぎると、電子媒体物質５の種類によってはブタノール生産微生物２の活性が阻害されることもあり得る。例えば、電子媒体物質５をビオロゲン誘導体とし、その濃度を０．５〜３ｍＭ、特に１〜２ｍＭとすることで、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属細菌が極めて顕著なブタノール生産性向上効果を奏し得る。
【００２６】
培養液４の組成は、使用するブタノール生産微生物２に応じて適宜選択される。例えば、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属細菌を用いる場合には、ＴＹＡ培地、より好適には酢酸を含むＴＹＡ培地を用いることが好適である。酢酸を含むＴＹＡ培地を用いることで、ＡＢＥ発酵を行うクロストリジウム属細菌にブタノール生産を早期に行わせることが可能となる。但し、培養液４の組成は、これらには限定されない。また、培養方法としては、流加培養等の連続的な培養方法が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。
【００２７】
電極９としては、例えば炭素板やグラッシーカーボン等の炭素電極、白金電極等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
電極９に還元電位を印加することで、培養液４中の電子媒体物質５が酸化体から還元体に還元される。そして、還元型の電子媒体物質５からブタノール生産微生物２への電子の供給が起こり、その際に還元型の電子媒体物質５は酸化体に酸化される。つまり、ブタノール生産微生物２への電子媒体物質５を介した電子の供給が起こる。
【００２９】
電極９に印加する還元電位の値は、電子媒体物質５のサイクリックボルタモグラムに基づいて求めることができる。電子媒体物質５をメチルビオロゲン（ＭＶ）とした場合を例に挙げて説明すると、サイクリックボルタモグラムから、ＭＶの酸化還元反応は、−０．６１Ｖ、−０．９３Ｖを酸化ピーク、−０．６８Ｖ、−１．０Ｖを還元ピークとした２電子反応であり、ＭＶの２電子還元体（ＭＶ０）は不溶化することから、１電子還元体生成のための還元電位は−０．７Ｖ程度とすればよいと判断することができる。他の電子媒体物質を用いた場合にも、同様の考え方で還元電位を設定することができる。
【００３０】
ここで、本発明においては、電極９への還元電位の印加を一時的に行うようにして、ブタノール生産微生物２への電子媒体物質５を介した電子の供給を一時的に行うようにしている。また、通電開始タイミングは、ブタノール生産微生物２の基質消費期間中としている。このようにすることで、電極９に連続的に還元電位を印加した場合に生じる基質消費抑制作用を回避することができる。さらには、細胞内還元力の増加、ＮＡＤＨの増加が生じる一方で、ブタノールやエタノール以外の代謝副産物の合成抑制、菌体構成成分（アミノ酸や核酸）の合成抑制が生じる。つまり、不要な炭素や還元力の浪費を抑制し、ブタノール（さらにはエタノール）が生産されやすい状態とすることができる。これにより、基質３に対するブタノール生産性が向上する。
【００３１】
換言すれば、本発明におけるブタノール生産微生物２への電子媒体物質５を介した一時的な電子の供給は、ブタノール生産微生物２の代謝経路をブタノールを生産し易い代謝経路へスイッチングする役割、あるいはブタノール生産微生物２の代謝経路をブタノールを生産し易い状態へ誘導するトリガーとしての役割を果たしていると言える。
【００３２】
ここで、通電開始タイミングは、ブタノール生産微生物２の基質消費期間中とすればよいが、基質消費期間全体を１としたときに、基質消費期間のうち０．１〜０．９の期間内に通電を開始することが好適であり、０．３〜０．７の期間内に通電を開始することがより好適であり、０．４〜０．６の期間内に通電を開始することがさらに好適である。
【００３３】
また、通電時間については、短すぎると投入した基質に対するブタノール生産量を向上させる効果が得られ難くなり、長すぎると基質の消費抑制が起こることによりブタノールの生産量が減少する虞がある。したがって、培養環境中の電子媒体物質５の全量を還元させることができる時間、例えば、５分間〜１５分間、好適には７分間〜１３分間、より好適には９分から１１分間程度、さらに好適には１０分間程度とすればよいが、必ずしもこれらの時間に限定されるものではなく、本発明の効果を奏し得る範囲でこれらの時間を逸脱しても構わない。
【００３４】
また、本発明において、ブタノール生産微生物２への電子媒体物質５を介した一時的な電子の供給は、１回行えば十分な効果が得られるが、上記期間内に複数回行うようにしてもよい。これにより、投入した基質に対するブタノールの生産性をさらに向上させることができる。但し、１回目の通電から次回の通電までの間隔が短すぎると基質の消費が抑制されてブタノール生産量が減少する虞があるので、２〜４時間程度、好適には３時間程度の間隔を設けることが好適である。また、一時的な電子の供給の回数を多くし過ぎてもブタノール生産性の向上効果は飽和してしまうので、最大でも８回程度とすることが好適であり、５回程度とすることがより好適であり、３回程度とすることがさらに好適である。
【００３５】
上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。例えば、上述の実施形態では、ブタノール生産微生物２が生息する培養液中で電極９に還元電位を印加して電子媒体物質５を還元するようにしているが、電子媒体物質５を別の処理槽内にて電気化学的に還元して還元体として、これをブタノール生産微生物２が生息する培養液中に添加するようにしてもよい。この場合にも、ブタノール生産微生物２に電子媒体物質５を介した電子の供給が生じて、投入した基質に対するブタノール生産量の向上効果が奏され得る。
【実施例】
【００３６】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
【００３７】
１．実験方法
（１−１）使用菌株
ブタノールを発酵生産するクロストリジウム（Clostridium）属細菌の中で代表的なクロストリジウム  アセトブチリカム（C. acetobutylicum）  ＮＢＣＲ１３９４８Ｔを製品評価技術基盤機構より購入し、本実施例において使用した。
【００３８】
（１−２）培養方法
C. acetobutylicumは、以下に示す組成を有するチオグリコール酸培地を使用し、嫌気条件下（培養容器であるガラスバイアル瓶内の気相部分を窒素置換）にて、３０℃で振とう培養してから、後述する培養試験に供した。
【００３９】
[チオグリコール酸培地組成（ｇ／Ｌ）]
・Ｌ−システイン  ：０．５
・塩化ナトリウム  ：２．５
・グルコース      ：５．０
・酵母エキス      ：５．０
・カゼインペプトン：１５．０
・チオグリコール酸：０．５
ｐＨ７．０
【００４０】
（１−３）電気培養装置及び培養試験方法
本実施例において使用した電気培養装置１の構成を図２に示す。側面に２つの開口部を設けた２５０ｍＬ容のＤｕｒａｎ製ガラスバイアル瓶（以下、容器２０と呼ぶ）を培養槽とした。容器２０には蓋３０を取り付けた。蓋３０の上面３０ａにはシリコーンゴム栓を設けて、配線や電極、管を通した際の容器２０の密閉性を確保した。
【００４１】
対極槽として小容器２１を用いた。具体的には、１５ｍＬ容プラスチックチューブを縦に切断し、切断面に陰イオン交換膜６（株式会社アストム製、型番：ネオセプタ ＡＭＸ）を接着して半筒状に加工したものを小容器２１とした。陰イオン交換膜６の面積は１２ｃｍ２とした。小容器２１の内部には電解液４ａを収容すると共に対電極１０を収容して電解液４ａに浸した。小容器２１の上部はシリコン系接着剤で埋めて密閉した。
【００４２】
容器２０に培養液４を収容し、培養液４に小容器２１と作用電極９を浸漬した。作用電極９と対電極１０の配線は、蓋３０に設けたシリコーンゴム栓を介して容器２０の外側に引き出した。銀・塩化銀参照電極１１（ＲＥ−１Ｂ、ＢＡＳ株式会社）は容器２０の側面に設けられた二つの開口部のうちの下方から差し込んで培養液４と接触させた。
【００４３】
培養期間中に容器２０内にて発生したガスは、容器２０の上部に設置したアルミニウム製サンプリングバッグ４０（ジーエルサイエンス製、商品名：アルミニウムバッグ、１Ｌ）に回収した。
【００４４】
作用電極９と対電極１０は共に炭素板（７．５ｃｍ×２．５ｃｍ）とした。
【００４５】
容器２０に収容した培養液４はＴＹＡ培地とした。ＴＹＡ培地の組成を以下に示す。また、培養液４には、電子媒体物質として、酸化型のメチルビオロゲン（ＭＶ）を最終濃度２ｍＭとなるように添加した。
【００４６】
[ＴＹＡ培地の組成（ｇ／Ｌ）]
・グルコース              ：１０．０
・トリプトン              ：６．０
・酵母エキス              ：２．０
・酢酸アンモニウム        ：３．０
・リン酸二水素カリウム    ：０．５
・硫酸マグネシウム七水和物：０．３
・硫酸鉄七水和物          ：０．０１
ｐＨ７．０
【００４７】
小容器２１に収容した電解液４ａはＴＹＡ培地（ＭＶ未添加）とした。
【００４８】
尚、培養液４としてのＴＹＡ培地には、４０ｍＭの酢酸を添加し、定常期に到達したC. acetobutylicumのブタノール生産能の長期間培養による失活を抑制した（Paredes CJ, Jones SW, Senger RS, Borden JR, Sillers R, Papoutsakis ET., Molecular Aspects of Butanol Fermentation. Bioenergy, 2008）。
【００４９】
また、C. acetobutylicumは、ｐＨ４．７以下の条件においてアルコール生成が誘導されることが報告されていることから、培養液４のｐＨを１ＭのＫＯＨにより４．５に調整した。
【００５０】
容器２０を密栓した後、容器２０の側面に設けられた二つの開口部のうちの上方の開口部から窒素ガス通気を１時間行った。電気培養装置を恒温槽内に設置後、作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを３電極式の定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２に結線して、作用電極９の電位を厳密に制御可能とした。
【００５１】
植菌源としては、チオグリコール酸培地（１．２Ｌ）を用いて前培養を行い定常期に移行した菌体を回収、新しい培地で洗浄後、１９０ｍＬの培養液４を含む電気培養装置に初期菌体密度１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（定常期の菌体密度に相当）となるように植菌を行い、各種条件で電気培養試験を実施した。試験中、培養液４の温度は３０℃に制御した。また、培養液４には撹拌子を入れて、試験中は培養液４を撹拌し続けた。
【００５２】
電気培養試験期間中は、経時的に自然電位（非通電実験）、電流値（通電実験）の測定を行うと共に、定期的に容器２０の側面の開口部から培養液４を抜き取り、菌体密度、培養液４の成分の分析を行った。
【００５３】
また、コントロール試験として同様の電気培養試験を、酸化型のＭＶ存在下、通電せずに実施した。
【００５４】
（１−４）培養液の分析
培養過程において培養液４を分取し、培養液４の菌体密度計測と成分分析を行った。菌体密度は、顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ−４０、Ｎｉｃｏｎ）観察により計測した。培養液４の成分のうちグルコースはグルコースＣＩＩテストワコー（Ｗａｋｏ）を用い、酢酸、酪酸、エタノール、ブタノールは液体クロマトグラフィー（Ｌａｃｈｒｏｍｅ  Ｅｌｉｔｅ，  Ｈｉｔａｃｈｉ）、Ｇｅｌｐａｃｋカラム（ＧＬ−Ｃ６１０Ｈ−Ｓ）、検出器としてはＲＩ検出器を用い定性、定量分析を行った。
【００５５】
（１−５）エネルギー効率及び電子のブタノールへの変換効率の算出
エネルギー効率（ΔＷｂｕｔａｎｏｌ／Ｗｉｎ）は以下の式から算出した。
【００５６】
Ｗｉｎ＝Ｅａｐ・Ｃ
ΔＷｂｕｔａｎｏｌ＝（ブタノール燃焼熱量）×（非通電時のブタノール生産量−通電時のブタノール生産量）
【００５７】
上記式中、Ｅａｐは極間電圧（単位：Ｖ）であり、Ｃは電気量（単位：Ｃ）である。また、ブタノール燃焼熱量は２６７５．９ｋＪ／ｍｏｌであり、ブタノール生産量の単位はｍｏｌである。
【００５８】
また、電子のブタノールへの変換効率は、以下の式をもとに全ての電流がＮＡＤＨの変換に使用され、１分子のブタノールの生産に２分子のＮＡＤＨが使用されると仮定し、その変換されたモル数を計算して算出した。
ＮＡＤ＋  ＋Ｈ＋  ＋  ２ｅ−  →  ＮＡＤＨ
【００５９】
２．印加電位の検討
（２−１）設定電位の決定
メチルビオロゲン（ＭＶ）のサイクリックボルタモグラムをもとに、印加電位を決定した。ＭＶのサイクリックボルタモグラムを図３に示す。また、ＭＶの酸化還元反応式を図４に示す。ＭＶの酸化還元反応は−０．６１Ｖ、−０．９３Ｖを酸化ピークとし、−０．６８Ｖ，−１．０Ｖを還元ピークとする２電子反応である。ＭＶの２電子還元体（ＭＶ０）は不溶化することが報告されているため（Paul MS Monk., The Viologens: Physicochemical Properties, Synthesis and Applications of the Salts of 4,4'-Bipyridine, 1999.）、１電子還元体の生成のため還元電位の設定として−０．７Ｖを下限とした。
【００６０】
（２−２）電気培養試験
作用電極９の通電電位を、還元ピークの下限である−０．７Ｖまたは酸化電位（＋０．９Ｖ、＋０．６Ｖ、−０．５Ｖ）とし、電流値が安定後、前培養により回収した菌体を高菌体密度（１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）で植菌し、電気培養試験を実施した。尚、グルコースの濃度は５５．６ｍＭ（１０ｇ／Ｌ）とした。
【００６１】
通電条件と非通電条件において電流値、自然電位、グルコース濃度および培養終了後の代謝産物濃度を比較することで通電および印加電位の影響を検討した。培養液４のグルコース濃度の経時変化を図５に示し、試験終了後の培養液４の酢酸及び酪酸濃度を図６に示し、試験終了後の培養液４のエタノール及びブタノール濃度を図７に示す。
【００６２】
図５に示される結果から、−０．７Ｖを印加した条件において基質であるグルコースの消費速度および消費量がその他の通電条件（＋０．９Ｖ〜−０．５Ｖ）および非通電条件下に比べて抑制される傾向が見られた。各代謝産物の蓄積について非通電、通電で比較したところ、非通電条件と酸化電位印加条件では大きな傾向の違いは見られなかったが、ＭＶの還元電位である−０．７Ｖを印加した場合においてのみ異なる傾向を示した。即ち、−０．７Ｖ印加時では低下したグルコース消費量と相関して、酢酸、酪酸、エタノールの培養液中の蓄積濃度が少ない一方で、ブタノール生産量に関しては他の電位条件と同等程度であった（図６及び図７）。
【００６３】
次に、各条件の代謝産物について消費されたグルコースに対する炭素収率を算出した結果を表１に示す。尚、酢酸については、初期値４０ｍＭに対する増加分を対糖収率として算出した。
【００６４】
【表１】
2014045760.tif 000003
【００６５】
ブタノールの炭素収率は非通電条件（３．２％（ｍｏｌ−Ｃ／ｍｏｌ−Ｃ））と比較し、酸化電位印加条件では１．６％〜４．１％と同程度であったのに対して、−０．７Ｖを印加した場合では２８．８％と増加していることが示された。この収率の増加は少ない総グルコース消費量に対して、副産物の発生量が少なく、グルコース由来の炭素がブタノール生成に集中的に分配されたためと推定された。
【００６６】
次に、非通電時の自然電位変化を図８に示し、通電時の電流値変化を図９に示す。−０．７Ｖの電位を印加しながら培養した場合の培養期間中の電流値はグルコースの減少と同期するように還元電流の増大が見られた（最大：−３．０ｍＡ）。これはC.acetobutylicumが還元型ＭＶから電子を受け取った結果、再生された酸化型ＭＶを電極が再還元したことを意味する。即ち、電極から電子が還元力として細胞内へ供給されたと言える。また、−０．７Ｖを印加した条件では培養期間を通して培地は青色を呈していた。このことから、−０．７Ｖを印加した条件では、常に還元型ＭＶ（青）が存在している状態であることが示唆された。１電子還元型ＭＶもしくは電子の供給がブタノール収率を向上させる反面、グルコースの消費を抑制していることが推察された（図１０参照：矢印の太さが代謝の流れの大きさを示している。太い矢印は代謝量の増大を示し、灰色、点線で記載した経路は代謝が減少した経路を示している）。
【００６７】
３．ブタノール増産に効率的な通電方法の検討
ブタノール増産に効果のあった−０．７Ｖに印加電圧を固定し、これまで培養開始から終了まで連続的に通電を行ってきた電気培養条件を変更し、通電を開始するタイミングや通電時間を変えた場合のグルコース消費量とブタノール生産性について検討した。
【００６８】
（３−１）通電時間の検討
還元型ＭＶの生成に必要とされる通電時間を検討した。電気培養装置に菌体を含む培養液４を調製し、−０．７Ｖの電位印加を実施したところ、通電開始後１０分以内にＭＶの還元体を示す青色に培地色が変化し、ＭＶの還元に使用される電流は安定し、一定値を示した（図１１）。以上の結果より、通電時間は１０分間で十分と判断した。
【００６９】
（３−２）通電タイミングの検討
通電開始のタイミングとしては静止菌を用いた増殖非連動型試験の開始後、グルコースの消費を指標として以下の４条件を設定した。
（１）培養開始前
（２）グルコース消費初期
（３）グルコース消費中期
（４）グルコース消費後期
【００７０】
まず、（１）培養開始前、（２）グルコース消費初期および（３）グルコース消費中期について試験を実施した。また、非通電の場合についても同様に試験を実施した。培養液４のグルコース濃度は５５．６ｍＭ（１０ｇ／Ｌ）とした。培養液４のグルコース濃度の経時変化を図１２に示す。尚、図中、（１）は条件（１）における通電開始位置を示し、（２）は条件（２）における通電開始位置を示し、（３）は条件（３）における通電開始位置を示している。
【００７１】
いずれの条件においても、１０分間の通電によるＭＶの還元後に通電を停止したところ、培地は時間経過とともに還元色が薄くなり、３０分程度で還元色は消失し、通電前の培地色に戻った。このことから、還元型ＭＶの持つ電子がC.acetobutylicum細胞内に移行したことが示された。
【００７２】
代謝に対する通電の影響を検討したところ、いずれの通電条件においても非通電時と同様にグルコース分解が確認され、その消費量に差異は見られなかった（図１２）。よって、通電時間を極端に削減し、還元力の供給を低減することによりグルコース分解活性の抑制効果を回避することができたと推定された。
【００７３】
次に、通電による代謝への影響を調べるため、各培養条件における代謝産物の定量分析を行った。試験終了後の培養液４の酢酸及び酪酸濃度を図１３に示し、試験終了後の培養液４のエタノール及びブタノール濃度を図１４に示す。培養開始前に通電を行った条件（１）については、非通電条件と比較して、ブタノールを含む代謝産物の蓄積に大きな差異は見られなかった。一方、グルコース消費初期（培養１９時間後）に通電を行った条件（２）とグルコース消費中期（培養２８時間後）に通電を行った条件（３）では、短時間の通電にもかかわらず、非通電時と比較して酪酸の蓄積の減少及びエタノール・ブタノール増産効果が得られ、特に酪酸の蓄積の減少効果及びブタノール増産効果は、グルコース消費中期に短時間通電を行った条件（３）において顕著であった（ブタノール増産効果については、非通電時の１．５倍であった）。
【００７４】
次に、グルコース消費後期において断続的通電することのブタノール生産への影響に加えて、中期に通電する条件を詳細に検討した。具体的には、以下の条件について検討した。培養液４のグルコース濃度は５５．６ｍＭとした。また、本検討において、グルコース消費中期とは培養１３時間後を意味し、グルコース消費後期とは培養１９時間後を意味している。
（Ａ）グルコース消費中期に１０分間通電
（Ｂ）グルコース消費中期に１０分間通電を３時間おきに３回繰り返し
（Ｃ）グルコース消費後期に１０分間通電
（Ｄ）グルコース消費後期に１０分間通電を３時間おきに３回繰り返し
（Ｅ）グルコース消費後期から連続的に通電
【００７５】
培養液４のグルコース濃度の経時変化を図１５に示す。尚、図中、（Ａ）及び（Ｂ）は条件（Ａ）及び（Ｂ）における通電開始位置を示し、（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）は条件（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）における通電開始位置を示している。
【００７６】
図１５に示される結果から、本実験においてはグルコースの消費はいずれの条件においても培養開始後、速やかに始まり、後期に通電した３条件においては非通電時と変わらない消費速度を示すことが確認された。中期に通電したものについても顕著なグルコース消費速度の低下は見られないが、グルコースを完全に消費し尽くすまでの時間にわずかながら遅延が見られた（非通電：２０時間→通電・中期：２４時間）。
【００７７】
また、試験終了後の培養液４の酢酸及び酪酸濃度を図１６に示し、試験終了後の培養液４のエタノール及びブタノール濃度を図１７に示す。図１６及び図１７に示される結果から、後期に通電した３条件のうち条件（Ｅ）については、非通電と比較して有機酸、アルコールの生産についても変化が見られず、通電の効果がないことが明らかとなった。これに対し、条件（Ａ）〜（Ｄ）では、非通電時と比較して有機酸の生産抑制とエタノール、ブタノールの増産効果が認められ、その効果は特に条件（Ａ）と（Ｂ）において顕著であった（非通電時と比較して２倍程度のエタノール及びブタノール増産効果が見られた）。尚、いずれの条件においても菌体密度は植菌時より変化がないことが確認された。
【００７８】
以上の結果より、通電（還元電位の印加）を短時間に限ることで、グルコース消費抑制を回避することが可能であることが明らかとなった。また、特に、グルコースを活発に消費している中期に通電することによりブタノール増産効果が得られ易いことも明らかとなった。
【００７９】
４．還元力の供給によるブタノール増産効果とそのメカニズムに関する考察
上記３の試験においては、通電の条件として１０分間×１回と１０分間×３回では通電回数（投入される還元力）の増加に合わせてブタノール生産量は増加したが、その増産量は通電回数の増加と正比例関係にはなかった。両条件における各代謝産物の収率を表２に示す。尚、表２において、酢酸については初期値４０ｍＭに対する増加分を対糖収率として算出した。
【００８０】
【表２】
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【００８１】
両条件とも対糖収率として非通電時より２倍程度向上しており、わずか１０分の通電でブタノール生産を向上させる代謝制御が可能であることが明らかとなった。
【００８２】
次に、投入エネルギーに対するエネルギー回収効率を算出した結果を表３に示す。
【００８３】
【表３】
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【００８４】
電気培養時に流れた電流値の積算および極間電圧（２．３Ｖ程度）から算出される電気量は各電位において、１１．３Ｊ（１０分×１）、４４．２Ｊ（１０分×３）であった。
【００８５】
また、ブタノールの増産分から算出されるエネルギー量は２３５８．１Ｊ（１０分×１）、３１７３．４Ｊ（１０分×３）であった。よって、両条件のエネルギー効率はΔＷｂｕｔａｎｏｌ／ΔＷｉｎ  ＝  ２０９．３（１０分×１）、７１．２（１０分×３）と算出され、本発明の方法は通電による投入電気量よりも飛躍的に大きなエネルギー物質増産効果を得ることができる代謝制御技術と言えることが示された。
【００８６】
以上より、従来の電気培養法のように培養期間全体を通じて通電を行うのではなく、通電時間を絞り込みつつ、一時的又は断続的に通電を行うことで、投入電気量を劇的に低減させつつ、効率よくブタノール生産性を向上させることが可能であることが明らかとなった。
【００８７】
本発明の方法は、ブタノール生産経路へ電子として還元力を供給することでブタノールを増産する考えに基づいている。そこで、今回の試験において、還元されたＭＶの量について電流値をもとに算出した。電流が全てＭＶ・＋の生産に利用されたと仮定すると、通電培養試験（中期）において還元されたＭＶはそれぞれ、０．０４８ｍｍｏｌ（１０分×１）、０．１８ｍｍｏｌ（１０分×３）であった。さらに、一電子還元型ＭＶの持つ電子が全て直接ＮＡＤＨ変換され、かつＮＡＤＨの全てがブタノール生産に使用されたと仮定した時の、ブタノール増産量は０．０２４ｍｍｏｌ（１０分×１）、０．０９ｍｍｏｌ（１０分×３）と推定される。この値は通電によって実際に得られたブタノール増産量の１／１０−１／４０であり、還元力の供給による直接的なブタノールの増産という考え方ではこの増産量の差異は説明できない。また、通電によるブタノール増産効果がグルコース消費中期に通電した場合に特に顕著に得られたことからも、通電が単純な還元力の供給だけでなく、ブタノール増産に寄与するような想定外の代謝変動を引き起こした可能性が推定された（図１８を参照：矢印の太さが代謝の流れの大きさを示している。太い矢印は代謝量の増大を示し、灰色、点線で記載した経路は代謝が減少した経路を示している）。
【００８８】
５．代謝産物の網羅的解析
代謝産物は生体の状態変化（転写、翻訳を受けた）の直接的、化学的表現であるため、全代謝産物を解析することは生体の状態変化を理解する上で非常に有益な知見を与えると考えられる。そこで、還元電位の印加によりブタノール生産性が向上したメカニズムを理解し、代謝制御手法として確立するために、細胞内代謝産物の網羅解析を実施した。細胞の基本的な機能に関与する一次代謝物質のうち９２％は水溶性であり、さらにそれらの９６％は水溶液中で電荷をもつイオン性代謝物質である。そこで、本研究ではこれら水溶性かつイオン性代謝産物の分析に有効であり、同時に９００種を超える代謝産物を測定可能であるＣＥ−ＭＳを選択した。
【００８９】
（５−１）実験方法
非通電条件３検体、通電条件（−０．７Ｖ）２検体について上記３と同様に培養を実施した。培養開始後、通電条件についてはグルコース消費中期（１９時間後）から１０分ずつ、３時間おきに通電を行い、グルコースの残存濃度が２ｍＭとなったタイミングで１０分間の通電中に試料を１ｍＬ採取した。対照試料は非通電条件で同様に培養を行い、残存グルコース濃度２ｍＭとなった時点で試料を１ｍＬ採取した。採取した試料は吸引濾過装置を用いてフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｓｏｐｏｒｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  ＨＴＴＰ  ０．４μｍ  ｐｏｒｅ  ４７ｍｍ  ｄｉａｍｅｔｅｒ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に菌体を捕集した。フィルター上に捕集した菌体を１０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水で２回洗浄し、内部標準（Ｈ３３０４−１００２、ＨＭＴ）を含有するメタノール（ＬＣ／ＭＳ用、Ｗａｋｏ）２ｍＬを入れた密閉シャーレにフィルターの菌体付着面を下にしてフィルターをメタノールに浸漬させた。メタノールに浸漬させたフィルターを３０秒、超音波処理を行い、代謝産物抽出液を得た。抽出液は１６００μＬのクロロホルム及び６４０μＬのＭｉｌｌｉＱ水を加えて撹拌し、遠心分離を行った。遠心分離後、水層を限外濾過チューブ（ウルトラフリーＭＣ  ＰＬＨＣＣ遠心式フィルターユニット）に３２５μＬ×４本移し取った。これを遠心し、限外濾過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び５０μＬのＭｉｌｌｉＱ水に溶解し、代謝産物の測定に供した。代謝産物の分析はＣＥ−ＴＯＦ  ＭＳ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用し、陽イオン性物質および陰イオン性物質をカチオンモード、アニオンモードでそれぞれ測定した（Soga T, Heiger DN., Amino acid analysis by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem, 2000. 72(6): p. 1236-1241.、Soga T, Ohashi Y, Ueno Y, Naraoka H, Tomita M, Nishioka T., Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J Proteome Res, 2003. 2(5): p. 488-494.、Soga T, Ueno Y, Naraoka H, Ohashi Y, Tomita M, Nishioka T., Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem, 2002. 74(10): p. 2233-2239.）。
【００９０】
ＣＥ−ＴＯＦ  ＭＳで検出されたピークは自動積分ソフトウェアのＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ  ｖｅｒ．２．９．０．９を用いて自動抽出し、ピーク情報として質量電荷比（ｍ／ｚ）、泳動時間とピーク面積値を得た。得られたピーク面積値は下記の［式１］を用いて相対面積値に変換し、各試料の採取細胞数による補正を行った。次に、ｍ／ｚとＭＴの値をもとに、各試料間のピークの照合・整列化を行った。このとき、ピーク以外のノイズは削除した。また、これらのデータにはＮａ＋、Ｋ＋などのアダクトイオン及び、脱水、脱アンモニウムなどのフラグメントイオンが含まれているので、これらの分子量関連イオンを削除した。
【００９１】
相対面積値＝目的ピークの面積値／（内部標準物質の面積値×菌体数）・・・［式１］
【００９２】
検出されたピークに対してｍ／ｚ（質量）とＭＴ値（泳動時間）を元にＨＭＴ代謝物質データベースとの照合、検索を実施した。検索のための許容誤差はＭＴで±０．５分、ｍ／ｚでは±１０ｐｐｍとした。相対値は独立した３連（対照試験）もしくは２連（通電試験）の実験における平均値を示し、エラーバーは標準偏差もしくは平均値の範囲を示した。
【００９３】
（５−２）実験結果
採取した試料の菌体数は全ての試料において（１．４±０．１）×１０９ｃｅｌｌｓであった。試料採取後、速やかに細胞から代謝産物の抽出を行い、細胞内代謝産物解析に供した。また、培養液中の代謝産物変動についても液体クロマトグラフィーで実施した。グルコースについての結果を図１９に、酢酸についての結果を図２０に、酪酸についての結果を図２１に、エタノールについての結果を図２２に、ブタノールについての結果を図２３に示す。代謝産物の変動はこれまでと同様の傾向を示し、通電によりグルコース減少速度はわずかに低下し、有機酸蓄積は減少、エタノールおよびブタノール濃度は上昇した。
【００９４】
５検体（３検体、２検体）について細胞内代謝産物のメタボローム解析を実施したところ１７９ピークが候補化合物（カチオン６２、アニオン１１７）として検出された。これら検出された化合物についてそれぞれ相対定量を行い、得られたデータについて階層的クラスタリング解析（ＨＣＡ）行い、ヒートマップ表記を実施した結果、非通電時の試料と通電時の試料において明確な違いが確認され、通電が細胞内代謝に大きな変動を与えていることが巨視的に明らかとなった。
【００９５】
さらに、個々の代謝産物について得られた相対面積比を非通電試料と通電試料間で比較し、相対値（通電試料／非通電試料）を算出した。この値を代謝経路ごとに分類し、通電により増加した割合の大きいものから順で整列し、グラフとして取りまとめた。結果を図２４〜図２６に示す。
【００９６】
また、主要代謝経路に分類されない化合物が６９種検出されたが、これらのうちブタノール生産に関与する酪酸、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨのみ、図２７〜図２９に示した。酪酸について図２７に、ＮＡＤ＋について図２８に、ＮＡＤＨについて図２９に示す。
【００９７】
尚、図２４〜図２９における相対値は、通電／非通電の相対値であるため、１より大きい値は通電によって増加した産物、１より小さいものは通電によって低下したことを示す。
【００９８】
図２７より通電条件では細胞内酪酸の蓄積量に低下が確認され、培養液の分析と一致した結果を得た。さらに通電条件では代謝反応において重要な還元力であるＮＡＤＨの量の増加およびそれに連動したＮＡＤ＋の減少がみられ（図２８、図２９）、還元電位を印加することにより細胞内に還元力が供給されていることが本結果からも示唆された。
【００９９】
全体の傾向としては細胞内の主な同化反応であるアミノ酸代謝、核酸（プリン・ピリミジン）代謝、細胞壁生合成に関与するその他の糖代謝にグルーピングされた代謝産物のほとんどは通電により低下する傾向が見られた。その中において、プトレシン、アスパラギン、Ｎ−カルバモイルアスパラギン酸、チラミン（図２４、図２５）、プリン、ピリミジン代謝のグループではイノシン、ヒポキサンチン、アデノシン、ＡＭＰ、グアニンが通電により増加することが示された（図２５）。その他の糖代謝グループにおいては活性化糖類の蓄積も通電により低下していた（図２６）。
【０１００】
このように通電によって同化反応が抑制される一方、異化反応を支える中央代謝系（解糖系、ペントースリン酸経路、ＴＣＡサイクル）おいては通電によって比較的多くの代謝産物について増加が見られた。最も増加が見られたのはペントースリン酸経路上のリブロース５−リン酸であり、通電により２．５倍に増加した（図２４）。
【０１０１】
解糖系においてはグリセルアルデヒド３−リン酸を起点として上流部分では代謝産物量が通電により減少し、下流では増加する傾向が見られた。また、解糖系からの分岐産物としてジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール３−リン酸および乳酸について通電による増加が見られた。
【０１０２】
C.acetobutylicumはそのゲノム配列から、完全なＴＣＡサイクルを有していないとこれまで推測されてきたが、近年の代謝産物分析の結果から実際には完全なＴＣＡサイクル反応を有している可能性が示されている（Amador-Noguez D, Feng XJ, Fan J, Roquet N, Rabitz H, Rabinowitz JD., Systems-level metabolic flux profiling elucidates a complete, bifurcated tricarboxylic acid cycle in Clostridium acetobutylicum. J Bacteriol, 2010. 192(17): p. 4452-4461.）。本実施例においてもＴＣＡサイクル内に位置づけられる代謝産物が複数検出された。通電によってクエン酸の蓄積量が僅かに上昇した一方で、ＴＣＡサイクル後半のコハク酸、リンゴ酸について蓄積量の低下が見られた。
【０１０３】
（５−３）代謝変動の解釈と代謝制御メカニズムの推定
細胞外の電極反応で還元したＭＶを介して、細胞内に還元力を供給した結果、増加したＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比が以下のような代謝変動を引き起こしたことが推定された。細胞構成成分（アミノ酸、核酸、細胞壁）は全体的に細胞内量の低下が見られた。さらに、通電により増加した成分としてもプトレシンやチラミンのようなアミノ酸の分解産物や、ピリミジン（ＵＭＰ）合成の中間体であるＮ−カルバモイルアスパラギン酸や核酸の低エネルギー中間体が検出されたことから、全体として通電によって細胞を合成する同化反応が抑制される、もしくは逆に分解が進む方向に大きな変動が生じた可能性が推察された。細胞構成成分を合成する反応は炭素およびエネルギー資源（ＡＴＰやＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）を大量に使用するため、それらの抑制がブタノール増産に寄与したことが考えられる。
【０１０４】
一方、異化経路にあたる中央代謝経路においても代謝の変動が見られた。グルコース代謝の上流にあたる解糖系の準備期（グルコース→グリセルアルデヒド３リン酸）では、通電により全体的に産物量の減少が見られ、バイパス経路であるペントースリン酸経路上の代謝産物リブロース５−リン酸が通電により増加したことから、解糖系とペントースリン酸経路間での炭素の分配比が通電により変動したことが推定される。解糖系の準備期ではＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を消費する一方、バイパスであるペントースリン酸経路ではＡＴＰを消費せずＮＡＤＰＨが生産される。C.acetobutylicum  ATCC824ではブタノール生産酵素を３種持ち、そのうち１つはＮＡＤＰＨ依存性である（Saint-Amans S, Girbal L, Andrade J, Ahrens K, Soucaille P., Regulation of carbon and electron flow in Clostridium butyricum VPI 3266 grown on glucose-glycerol mixtures. J Bacteriol, 2001. 183(5): p. 1748-1754.）。よって、同化反応においてみられた変動と同様に限られたエネルギー資源の消費を抑制し、生産する傾向の代謝変動が生じたことが推定された。解糖系下流の報酬期（グリセルアルデヒド３−リン酸→ピルビン酸）では代謝産物量は通電による増加傾向が見られ、活発な反応が推定された。
【０１０５】
これまでにC.acetobutylicum細胞内のＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比率の上昇がグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を阻害することが報告されているが（Girbal L, Soucaille P., Regulation of Clostridium acetobutylicum metabolism as revealed by mixed-substrate steady-state continuous cultures: role of NADH/NAD ratio and ATP pool. J Bacteriol, 1994. 176(21): p. 6433-6438）、本実験では短時間の通電によるＮＡＤＨの増加と代謝による消費のバランスの結果、細胞内のＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比は低いレベルに維持されており（図２８、図２９）、グルコース消費抑制には至らなかったことが推定された。
【０１０６】
また、興味深いことに、中央代謝経路から分岐する代謝産物において、乳酸とジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール３リン酸の増加が見られた。ピルビン酸から乳酸を生産する経路およびフルクトース１，６ビスリン酸からジヒドロキシアセトンリン酸を経由し、グリセロール三リン酸を生産する分岐経路ではＮＡＤＨを必要とすることから、通電による細胞内の利用可能となったＮＡＤＨの増加に伴い、ブタノール同様に分岐経路に存在する代謝産物の生産が活性化されたと考えられる。
【０１０７】
グルコース異化の後段にあたるＴＣＡサイクルへの分岐点としてはピルビン酸から直接ＴＣＡサイクル上のオキサロ酢酸へ流入する経路と、ピルビン酸→アセチルＣｏＡ→クエン酸という二種類の経路がある。後者の経路ではアセチルＣｏＡからブタノール生産経路と分岐する。前者の経路ではピルビン酸がオキサロ酢酸を経由し、アスパラギン酸をはじめとしたアミノ酸やピリミジンに変換される。通電によって、アスパラギン酸をはじめとしたアミノ酸やピリミジンおよびＴＣＡサイクルのコハク酸、リンゴ酸の蓄積量が減少していることからＴＣＡサイクルに流入する炭素量は減少していることが推定される。その一方で、アセチルＣｏＡ自体の濃度は通電により低下していることから、全体としては、ＴＣＡサイクルに流入する炭素量を低減し、ブタノール生産経路への分配が上昇していることが示唆された。
【０１０８】
以上、通電によって非増殖期にある細胞内のＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比を増加させることが、下記二つの大きな代謝変動を誘導することによって、細胞内の限られた炭素資源やエネルギー資源を節約し、ブタノール生産に集中させるような代謝の切り替えが起こったことが示唆された（図３０を参照：矢印の太さが代謝の流れの大きさを示している。太い矢印は代謝量の増大を示し、灰色、点線で記載した経路は代謝が減少した経路を示している）。
（１）同化反応が抑制され、さらには余分なアミノ酸や核酸物質は分解される
（２）中央代謝系においてもＴＣＡサイクルが抑制される
【０１０９】
６．複数回通電によるブタノール増産効果の検討
上記３及び４の実験結果に加えて、さらに通電を断続的に８回実施した場合について検討を行った。
【０１１０】
グルコース消費中期（培養開始後１９時間）から３時間おきに８回、１０分間通電を行った。
【０１１１】
結果を図３１に示す。非通電時と比較して、大幅なブタノール増産効果が得られることが明らかとなった。
【０１１２】
次に、投入エネルギーに対するエネルギー回収効率を算出した結果を表４に示す。
【０１１３】
【表４】
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【０１１４】
投入電気エネルギーより、通電によって増産されるブタノール由来のエネルギーのほうが多く、本手法によるブタノール増産はエネルギーの観点から有益な手法と言える。通電回数を増やすことによりブタノール増産量の絶対値は増加するが、供給される還元力が過剰であるため、エネルギー効率は低下する傾向がある。よって、エネルギー効率を重視するのであれば通電回数を抑える、ブタノール生産量を重視するのであれば回数を増やすという選択肢を取り得る。８回通電時では絶対量も多く、エネルギー効率として１を超えているため充分効率的な条件と言える。
【符号の説明】
【０１１５】
２  ブタノール生産微生物
３  基質
４  培養液
５  電子媒体物質
７  代謝産物
【図３】
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【図４】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１８】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図３０】
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【図３２】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１】
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