(57)【要約】  本発明の課題は、高塩濃度条件においてバイオ鉱物を生成する微生物の獲得と、溶存ストロンチウム (Ｓｒ) をバイオ鉱物中に固化する新規の放射性核種の回収方法を確立することである。本発明によれば、ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度３％の条件下において放射性核種を固化する能力を有する微生物が提供される。
2017002962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度３％の条件下において放射性核種を固化する能力を有する微生物。
【請求項２】
ストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力を有する、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ストロンチウム（Sr）とカルシウム（Ca）の複合炭酸塩としてストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力を有する、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
Bacillus属に属する、請求項１から３の何れか１項に記載の微生物。
【請求項５】
長径が2〜3μm及び短径が0.5〜1μmの大きさを有する運動性のない桿菌であり、コロニーは乳白色で光沢がある明瞭な円形である、請求項１から４の何れか１項に記載の微生物。
【請求項６】
ＮａＣｌ濃度３％を含むろ過済み培地において、初発濃度5.0 mMから0.1 mMの溶存ストロンチウム（Ｓｒ）を少なくとも0.06mMまで、0.02 mMの溶存ストロンチウム（Ｓｒ）を少なくとも0.0１mMまで固化する能力を有する、請求項１から５の何れか１項に記載の微生物。
【請求項７】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０６３を有する、微生物。
【請求項８】
放射性核種を含む液体中で、請求項１から７の何れか１項に記載の微生物を培養することを含む、放射性核種を固化する方法。
【請求項９】
放射性核種を含む液体が、ＮａＣｌ濃度３％以上である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
放射性核種を含む液体が、カルシウムイオンを含む液である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
放射性核種がストロンチウム（Ｓｒ）である、請求項８から１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８から１０の何れか１項に記載の方法により、放射性核種を含む液体中の放射性核種を固化する工程、及び固化した放射性核種を回収する工程を含む、放射性核種の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性核種を固化する能力を有する好塩菌に関する。本発明はさらに、上記好塩菌による放射性核種の回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物が生成する炭酸カルシウム (カルサイト) やリン酸カルシウム (アパタイト) は、バイオ鉱物 (バイオカルサイト、バイオアパタイト) と称される。バイオ鉱物を用いた地下水や土壌中の放射性Ｓｒの共沈や吸着による浄化の研究などが進められている（非特許文献１〜４）。一方、海水 (塩濃度３％) などの高塩濃度条件下における放射性Ｓｒの微生物の代謝物による浄化の研究はほとんど行われていない。【０００３】
バイオ鉱物の１種であるバイオカルサイトは、微生物が産生するウレアーゼによって尿素が加水分解されてできた炭酸イオンと溶液体中のＣａイオンが結合することで生成される (反応式１及び２)（非特許文献１及び５）。カルサイト生成の際に、溶存Ｓｒイオンは炭酸イオンと結合し、炭酸ストロンチウムとしてカルサイトと共沈し溶液体中から除去される (反応式２)。
Ｈ2ＮＣＯＮＨ2＋３Ｈ2Ｏ  →  ２ＮＨ4+＋ＨＣＯ3-＋ＯＨ-（反応式１）
Ｓｒ2+／Ｃａ2+＋２ＨＣＯ3-  →  Ｓｒ／ＣａＣＯ3＋ＣＯ2＋Ｈ2Ｏ（反応式２）
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Y. Fujita,他、“Stimulation of microbial urea hydrolysis in groundwater to enhance calcite precipitation," Environ. Sci. Technol., vol. 42, no. 8, pp. 3025-3032, 2008
【非特許文献２】Y. Fujita,他、“Evaluating the potential of native ureolytic microbes to remediate a 90Sr contaminated environment," Environ. Sci. Technol., vol. 44, no. 19, pp. 7652-7658, 2010
【非特許文献３】V. Achal,他、“Bioremediation of strontium (Sr) contaminated aquifer quartz sand based on carbonate precipitation induced by Sr resistant Halomonas sp.," Chemosphere, vol. 89, no. 6, pp. 764-768, 2012
【非特許文献４】S. Handley-Sidhu,他、“Bacterially Produced Calcium Phosphate Nanobiominerals: Sorption Capacity, Site Preferences, and Stability of Captured Radionuclides," 2014
【非特許文献５】Y. Fujita, 他、“Strontium incorporation into calcite generated by bacterial ureolysis," Geochim. Cosmochim. Acta, vol. 68, no. 15, pp. 3261-3270, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、高塩濃度条件においてバイオ鉱物を生成する微生物の獲得と、溶存ストロンチウム (Ｓｒ) をバイオ鉱物中に固化する新規の放射性核種の回収方法を確立することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決することを目的として、高塩濃度条件においてウレアーゼを産生する微生物を分離し、炭酸ストロンチウムとしてSr固化物が生じるかどうかを調べた結果、上記微生物が高塩濃度条件においてＳｒ固化物を生成できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明の態様は以下に関する。
［１］  ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度３％の条件下において放射性核種を固化する能力を有する微生物。
［２］  ストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力を有する、［１］に記載の微生物。
［３］  ストロンチウム（Sr）とカルシウム（Ca）の複合炭酸塩としてストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力を有する、［１］又は［２］に記載の微生物。
［４］  Bacillus属に属する、［１］から［３］の何れかに記載の微生物。
［５］  長径が2〜3μm及び短径が0.5〜1μmの大きさを有する運動性のない桿菌であり、コロニーは乳白色で光沢がある明瞭な円形である、［１］から［４］の何れかに記載の微生物。
［６］  ＮａＣｌ濃度３％を含むろ過済み培地において、初発濃度5.0 mMから0.1 mMの溶存ストロンチウム（Ｓｒ）を少なくとも0.06mMまで、0.02 mMの溶存ストロンチウム（Ｓｒ）を少なくとも0.0１mMまで固化する能力を有する、［１］から［５］の何れかに記載の微生物。
［７］  受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０６３を有する、微生物。
［８］  放射性核種を含む液体中で、［１］から［７］の何れかに記載の微生物を培養することを含む、放射性核種を固化する方法。
［９］  放射性核種を含む液体が、ＮａＣｌ濃度３％以上である、［８］に記載の方法。
［１０］  放射性核種を含む液体が、カルシウムイオンを含む液である、［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］  放射性核種がストロンチウム（Ｓｒ）である、［８］から［１０］の何れか記載の方法。
［１２］  ［８］から［１０］の何れかに記載の方法により、放射性核種を含む液体中の放射性核種を固化する工程、及び固化した放射性核種を回収する工程を含む、放射性核種の回収方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の微生物は、放射性核種を回収する能力を有する新規微生物である。本発明の微生物を用いることにより、高塩濃度条件において放射性核種を回収することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、分離用平板培地の赤色ハローを示す。
【図２】図２は、候補株によるSr除去試験を示す。
【図３】図３は、TK2d株のSr除去試験における溶存Srおよび溶存Ca濃度の経時変化を示す。
【図４】図４は、TK2d株が生成した固化物のSEM-EDX解析を示す。A: 固化物の反射電子像 (BSE)、Bar = 10 μm、B: Srマッピング像 (青)、C: Caマッピング像 (橙)、D: 固化物 (Spot iおよびBlank) のEDXスペクトル
【図５】図５は、TK2d株の光学顕微鏡像を示す。
【図６】図６は、Bacillus属の16S rRNA遺伝子領域に基づいた系統樹を示す。
【図７】図７は、ろ過済みMB を用いたTK2d株のSr除去試験を示す。
【図８】図８は、Sr初発濃度 (5.0 mM、1.0 mM、0.1 mM、0.02 mM) 変化におけるTK2d株の溶存Srおよび溶存Ca濃度を示す。
【図９】図９は、TK2d株が生成したbiotic Sr-Ca coprecipitateおよび非生物的(Abiotic) Sr含有カルサイトの電子顕微鏡像および元素マッピング、EDXスペクトル (A-C：Biotic、A: Sr 0.1mM; B Sr 1.0 mM; C: Sr 5.0 mM、D：Abiotic、E：A-Cの各スポットのEDX spectra、Bar: 10 μm)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明の微生物は、ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度３％の条件下において放射性核種を固化する能力を有する微生物である。
微生物のウレアーゼ産生能は、尿素の加水分解による培地のpH上昇 を微生物のウレアーゼ活性の指標とすることにより判定することができる。例えば、pH8以上で黄色から赤色に変化するPhenol redの呈色反応を利用することにより、培地のpH上昇を可視化することができる。ウレアーゼ産生微生物は、コロニー周辺に赤色のハローを形成するので、赤色のハローの観察により微生物のウレアーゼ産生能を判定することができる。
【００１１】
本発明の微生物が、ＮａＣｌ濃度３％の条件下において放射性核種を固化する能力を有することを特徴とする。海水に近いＮａＣｌ濃度３％の条件下において放射性核種を固化する能力を有する微生物は、本出願人の知る限りこれまでに報告がない。ＮａＣｌ濃度３％の条件下としては、他の塩が含まれていてもよく、また海水は、ＮａＣｌ濃度３％の条件下を満たす一例である。
【００１２】
放射性核種とは、放射能を有する核種を意味し、放射性同位体と称される場合もある。放射性核種としては、自然界に存在する天然放射性核種（ウラン238、カリウム40及びラジウム226、トリウム232など）及び人工放射性核種（セシウム134、セシウム137、ヨウ素131、キセノン133、ストロンチウム89、ストロンチウム90、クリプトン85、ジルコニウム95、ルテニウム106、セリウム144、コバルト６０、炭素１４、トリウム232）などを挙げることができる。
本発明の微生物は、上記した放射性核種のうちの少なくとも１種以上を固化する能力を有すればよい。好ましくは、本発明の微生物は、人工放射性核種を固化する能力を有する微生物であり、より好ましくはストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力を有する微生物である。
【００１３】
本発明の微生物は好ましくは、放射性核種を炭酸塩として固化することができる微生物であり、特にカルシウムイオンが存在する場合には、放射性核種とカルシウム（Ca）の複合炭酸塩として、放射性核種を固化することができる微生物である。本発明の微生物の一例としては、ストロンチウム（Sr）とカルシウム（Ca）の複合炭酸塩としてストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力を有する微生物を挙げることができる。
【００１４】
ストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力を有する微生物について、ストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力としては特に限定されないが、ＮａＣｌ濃度３％を含むろ過済み培地において、初発濃度5.0 mMから0.1 mMの溶存ストロンチウム（Ｓｒ）を少なくとも0.06mMまで、0.02 mMの溶存ストロンチウム（Ｓｒ）を少なくとも0.0１mMまで固化する能力を有することが好ましい。
【００１５】
本発明において、固化とは、液体中に溶存している放射性核種が不溶化することを意味する。微生物が放射性核種を固化する能力を有することは、実施例に記載の方法により確認することができる。具体的には、放射性核種を含む液を添加した微生物用培地に、微生物を含む試料を接種し、微生物を増殖できる条件下で培養した後、サンプリング試料の上清中における放射性核種を測定することによって、放射性核種を固化する能力を測定することができる。本発明の微生物は、上記又はそれに準じた方法により、野生株、変異株等の中からスクリーニングすることで単離採取することができる。
【００１６】
本発明の微生物が属する属は、特に限定されない。環境試料などから採取した微生物について、１６ＳｒＲＮＡの情報等に基づいて微生物を分類（属種の同定）する方法は公知である。本発明で使用する微生物は、野生株、変異株、遺伝子工学的手法等により作製される組換え体などの何れの微生物であってもよい。
【００１７】
本発明の微生物が属する属は、好ましくはBacillus属に属する微生物である。本発明においては、16S rRNA遺伝子の塩基配列において、Bacillus属する微生物と９４％以上の相同性を有する微生物を使用することができる。
【００１８】
Bacillus属に属する微生物の一例としては、本明細書の実施例で単離されたＴＫ２ｄ株を挙げることができる。ＴＫ２ｄ株は、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２０６３として、２０１５年６月３日に独立行政法人  製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託され、２０１６年５月１６日にブタペスト条約に基づく国際寄託に移管請求された（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０６３）。ＴＫ２ｄ株は、長径が２〜３μm及び短径が0.5〜1μmの大きさを有する運動性のない桿菌であり、コロニーは乳白色で光沢がある明瞭な円形であるという微生物学的特徴を有している。
ＴＫ２ｄ株の培養に用いる培地としては、LB培地, Lennox （Trypton10g/L, Yeast Extract 5g/L, NaCl 5g/L）が好ましいが、Difco Marine Broth 2216でも増殖可能である、培地のpH（滅菌前）は7.6が好ましい。培養温度は30℃が好ましく、培養期間は１〜2日間が好ましい。培養は、好気培養で、振とう培養が好ましい。
【００１９】
更に本発明によれば、放射性核種を含む液体中で、上記した本発明の微生物を培養することを含む、放射性核種を固化する方法が提供される。
放射性核種を含む液体が、ＮａＣｌ濃度３％以上であることが好ましく、さらにカルシウムイオンを含む液体であることも好ましい。上記の条件を満たす液体としては、海水を挙げることができる。固化する放射性核種の具体例は、上記の通りであり、特に好ましくはストロンチウム（Ｓｒ）である。
【００２０】
本発明の微生物を培養する方法は、放射性核種を固化できる限り特に限定されず、使用する微生物の性質に応じて好適な培養条件を適宜選択することができる。例えば、実施例で使用したＴＫ２ｄ株の場合には、振とう培養などの好気条件下、温度２５〜４０℃、好ましくは温度２５〜３５℃、特に好ましくは２８〜３２℃で培養を行うことができる。
【００２１】
本発明によれば、上記した方法により放射性核種を含む液体中の放射性核種を固化した後に、固化した放射性核種を回収することができる。放射性核種の回収は、遠心分離、フィルター濾過、又はそれらの組み合わせなど公知の方法で行うことができる。
【００２２】
本発明による放射性核種を固化する方法は、放射性核種を含む液体（たとえば、放射性核種で汚染された海水）などに適用することができる。
【００２３】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により特に限定されるものではない。
【実施例】
【００２４】
（１）試験方法
（１−１）海洋性環境試料
微生物の分離源として、東京湾 (7ヶ所)、鹿児島湾 (4ヶ所) の計11ヶ所から海底泥が採取された。環境試料は滅菌生理食塩水（NaCl 0.9%(w/v)）により10 % (w/v) に希釈され、ボルテックスにより混合された。これらの環境試料希釈液はスクリーニングに用いられた。【００２５】
（１−２）培地
Marine Broth 2216 (MB；3.74g/L) (Becton Dickinson and Company、MD、USA)にNaCl (30 g/L) および尿素 (20 g/L) を添加した培地(pH 7.6)が基本培地として用いられた。分離用培地として、MBにpH指示薬のPhenol red (12 mg/L) を添加された。Sr除去試験用培地として、MBにSrCl2溶液をSrが終濃度1mMとなるように添加された。スクリーニング時では静置培養、Sr除去試験では120rpmで振とう培養が共に温度30℃で行われた。Sr固化能の特徴付けには、オートクレーブ後に培地中に生じた不溶性成分をフィルター (0.45 μm pore size、Corning、NY、USA)でろ過して取り除いたMB (ろ過済みMB) が使用された。固体培地を作製する時は寒天 (15 g/L)が使用された。【００２６】
（１−３）ウレアーゼ産生微生物の探索
海水中の放射性核種をバイオカルサイトにより除去するために、高塩濃度存在下においてウレアーゼを産生する微生物を海洋環境試料から分離を試みた。尿素の加水分解による培地のpH上昇 (反応式1) を微生物のウレアーゼ活性の指標とした。すなわち、pH8以上で黄色から赤色に変化するPhenol redの呈色反応を利用し、分離用平板培地のpH上昇を可視化した。分離用平板培地でウレアーゼ産生微生物は、そのコロニー周辺に赤色のハローを形成すると思われる。この赤色のハローの観察により、その微生物のウレアーゼ活性の有無が判別される。希釈された環境試料溶液 (20 μL) は分離用平板培地に塗抹され、コロニーが出現するまで30℃で静置培養された。出現したコロニーのうち、赤色ハローを形成した株のみ、新しい分離用平板培地に継代培養された。継代培養を2回繰り返した後、赤色ハローの再現性が得られた株を、ウレアーゼ産生候補株とした。これら候補株は、後述のSr除去試験に供された。【００２７】
（１−４）候補株によるSr除去試験
候補株の溶存Srの除去時におけるSrを含むカルサイトの生成を明らかにするために、培養液体中のSr濃度の経時変化を調べた。候補株は、10 mlのMBが入ったガラス試験管に白金耳を用いて無菌的に植菌され、12時間前培養 (30℃、120 rpm) された。前培養液は125 ml三角フラスコ内の50ml試験用培地に1% (v/v) 植菌され、7日間本培養(30℃、120 rpm、Sr 1.0 mM)された。サンプリングは適時行われた。サンプリングされた培養液は、遠心分離 (2,1000 ×g、15 min、4℃) され、上清および沈殿に分画された。得られた上清は、フィルター(0.2 μm pore size、KURABO、Osaka、Japan)でろ過され、元素濃度の分析用試料として用いられた。沈殿物は、菌体観察および固体分析の試料として用いられた。候補株を接種していないMBを同条件下におけるコントロールとした。【００２８】
（１−５）分離株によるSrの固化能の特徴付け
初発溶存Sr濃度の違いによるSr固化能への影響を明らかにするために、ろ過済みMBを用いてSr除去試験が行われた。試験は、初発溶存Sr濃度を5.0 mM、1.0 mM、0.1 mM、0.02 mMに設定して、上述のSr除去試験と同様の方法で10日間行われた。サンプリングは適時行われ、上述と同様の方法で分析試料が作られた、ろ過後の上清は元素濃度の分析用試料として用いられた。沈殿物は菌体観察および固体分析の試料として用いられた。分離株を接種していないろ過済みMBを同条件下においてコントロールとした。【００２９】
（１−６）元素濃度分析
各分析用試料の原液を超純水 (Barnstead NANOpureR DIamond、Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL、USA) で適宜希釈し、誘導結合プラズマ発光分光分析装置 (ICP-AES；iCAP6300DUO：Thermo Fisher Scientific) により元素の定量を行った。検量線は検量線用標準溶液 (XSTC-622：SPEX CetriPrep、NJ、USA) を用いて作成された。1サンプルにつき3回繰り返し測定を行い、偏差が5％以内の値の平均値を測定結果とした。【００３０】
（１−７）走査型電子顕微鏡による菌体観察とエネルギー分散型X線解析装置による元素分析
培養液から得られた沈殿物は、0.9%滅菌生理食塩水で3回洗浄した後、滅菌イオン交換水で1回洗浄されてから観察に用いられた。試料は観察用フィルター（Nano-Percolator、JEOL、Tokyo、Japan）に滴下後に、シリンジで吸引され、電子顕微鏡観察用試料とした。観察に卓上型電子顕微鏡 (SEM；TM3000：Hitachi High-Technologies、Tokyo、Japan) を用い、元素分析にはエネルギー分散型X線解析装置 (EDX；Quantax70：Bruker AXS Microanalysis、Karlsruhe、Germany) が用いられた。【００３１】
（１−８）分子生物学試験（16S rRNA遺伝子の塩基配列の決定）
分離株の属種を同定するために、16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した。MBで3日間培養された分離株は、遠心分離 (21,000 ×g、4℃、5分) により集菌され、0.9%滅菌生理食塩水を用いて2回洗浄された後に、ゲノムDNAがISOPLANT (Nippon Gene、Tokyo、Japan) のプロトコルに従って抽出された。16S rRNA遺伝子のPCR増幅は、抽出したゲノムDNAを鋳型に、9F (5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')（配列番号１） と 1541R (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3')（配列番号２） のプライマーセットと、GO Taq Green Master Mix (Promega、Tokyo、Japan)を用い    95℃で5分間保持後、次の条件（変性 (95℃、1分) 、アニーリング (56℃、1分)、伸長 (72℃、1分) ）を30サイクルで行った。この反応はPCR増幅装置Mastercecler (Eppendorf、Tokyo、Japan) を用いて行われた。増幅されたDNAは、WizardR SV gel and PCR Clean-Up System (Promega) を用いて精製された。16S rRNA遺伝子塩基配列は、精製DNAを鋳型として、複数のプライマー（9F、515F（5'-GTGCCAGCAGCCGCGGT-3'）（配列番号３）、1115R（5'-AGGGTTGCGCTCGTTG-3'）（配列番号４）、1541R）を用いてApplied Biosy-stems 3730xl DNA Analyzer（Applied Biosystems、CA、USA）により決定、解析された。【００３２】
（１−９）系統樹作成
決定した16S rRNA遺伝子配列は、NCBIの提供するBLAST(S. F. Altschul, 他、“Basic local alignment search tool," J. Mol. Biol., vol. 215, no. 3, pp. 403-410, 1990)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Bla-st.cgi)により相同性検索が行われた。高い相同性を示した菌種の塩基配列を基に、CLASTAL Wおよび系統樹作成ソフトMolecular Evolutionary Genetics Analysis（MEG5.0）を用いてneighbor-joining method（N. Saitou,他、“The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees," Mol. Biol. Evol., vol. 4, no. 4, pp. 406-425, 1987）により系統樹を作成した。【００３３】
（１−１０）非生物的カルサイトの合成
微生物によるSr固化物は、非生物的にSrを含有するカルサイトを用いて形状比較された。非生物的Sr含有カルサイトは、SrとCaの終濃度がそれぞれ1 mMおよび10 mMとなるように調製されたSrCl2およびCaCl2の各溶液を混合し、そこに終濃度が36.6 mM になるようにNa2CO3を添加して、24時間30℃で振とうすることにより合成された（反応式3）。合成した固化物は、遠心分離 (21,000 ×g、4℃、15分) により沈殿物として回収され、SEM-EDXで分析された。また、遠心分離で得られた上清を試料に用いて、溶存SrおよびCa濃度がICP-AESを用いて定量された。
Na2CO3 + Sr/CaCl2 → Sr/CaCO3↓ + 2NaCl  (反応式３)【００３４】
（２）結果及び考察
（２−１）好塩性カルサイト生成微生物の分離
海底泥サンプルからウレアーゼ産生微生物の分離を試みた結果、分離用平板培地上で赤色ハロー (図1) を形成した8個のコロニーを得た。これらのコロニーは継代培養され、赤色ハローを繰り返し形成したことから安定してウレアーゼを産生する候補株と考えた。【００３５】
これらの微生物候補株がSr固化物を生成するかどうかを調べるために、候補8株の培養液体中における溶存Srの濃度を経時的に測定した。培養12日目の各培養液体中の溶存Srの濃度は初発濃度の1.0 mMから、TK2a株では0.7 mM、 TK2b株では0.6 mM、TK2d株では0.1 mM、TK4c株では0.6 mM、まで減少された (図2)。その他の4株（TK2c, TK4a, TK4b, TK4d）では、ネガティブコントロールと同様にほとんど溶存Srの減少が見られなかった。これら４株は分離用平板培地では赤色ハロー (pH上昇) を示したが、このpH上昇は尿素分解反応によるものではなく、他の代謝反応により塩基性物質を生成したためではないかと考えられる。そして、尿素の分解が出来なかったために、この4株はカルサイトを生成せず溶存Srを減少しなかったと考えられる。溶存Srの減少を示した4株のうち、12日間で最も溶存Srの減少量が大きいTK2d株に注目し、再現性試験を行った (図3)。TK2d株は、溶存Srを初発濃度の1 mMから培養3日目に0.03 mMまで、培養5日目に0.01 mM まで減少させた。Sr初発濃度を100%と考えると、TK2d株は5日間で99.3%の溶存Srを培養液から除去したことになる。また、MB由来の溶存Ca濃度も、添加した溶存Sr濃度と同様の減少傾向を示した (図3)。培養液のpHは、初期のpH7.6から培養3日目にpH7.8にまで上昇し、培養5日目まで同じpHが保たれていた。TK2d株が培養5日目に生成した固化物をSEM-EDXにより解析した。固化物は、数μmの微粒子が凝集しており (図4A) 、その凝集物全体に均一にSrとCaを含有していた (図4B、C)。さらに、EDXのスポット分析により、固化物は、SrやCaの他に酸素 (O)を含んでいた (図4D)。これらの結果から、TK2d株は尿素を加水分解してアンモニアによるpHを上昇すると共に、加水分解時に生じた炭酸イオンと溶存SrとCaが結合し共沈して、複合炭酸塩 (biotic Sr-Ca coprecipitate) を形成した可能性が考えられた。この固化物は、その不定形な形状からアモルファスであると推察された。EDXのスポット分析で検出された固化物中のマグネシウム (Mg) (図4D) は、培地中の不溶性または可溶性のMgが取り込まれたと考えられる。オートクレーブ後のMBには不溶性成分の析出が多く見られることから、生成された固化物の正確な分析のために、MB中の析出物をフィルター除去する必要があると考えられた。なお、EDX分析用の観察用フィルターの基材に炭素 (C) が使用されているため、固化物中のCの有無は明らかにされなかった。
以上の結果から、TK2d株はNaCl濃度3 %の条件下において、Sr初発濃度が1 mMの場合、培養5日で99.3% (0.99mM) の溶存Srを培養液体中から除去し、biotic Sr-Ca coprecipitateとして回収可能な株であることを見出した。【００３６】
（２−２）TK2d株の形態学的観察および系統分類学的同定
分離したTK2d株は、光学顕微鏡観察により長径が2-3 μm、短径が0.5-1 μmで運動性のない桿菌であった (図5)。MB平板培地上のTK2d株のコロニーは、乳白色で光沢がある明瞭な円形であった。
TK2d株を分子生物学的に同定するために、16S rRNA遺伝子の一部の塩基配列を解読し、相同性検索を行った。TK2dの16S rRNA遺伝子のうち639塩基の部分配列（配列表の配列番号５）を明らかにした (DDBJ 登録番号：LC034238)。BLASTのデーターベースとこの塩基配列を比較すると、Bacillus humi LMG 22167 (NR 025626) と98.3%、Bacillus pervagus 8-4-E12 (NR 125564) と97.2%、およびBacillus alkalitelluris DL37 (JF411269) と97.2%の相同性が認められた。そのほかのBacillus属の基準株とはB. massiliosenegalensis JC6 と97.0%、B. herbersteinensis D-15aと96.4%、B. thioparans BMP-1と96.1%、B. subterraneus と95.8%、B. boroniphilus T-15Zと95.6%、B. niacin IFO15566と95.6%、B. alkalitelluris BA288 と94.8%の相同性があった。これらの微生物の16S rRNA遺伝子に基づいた系統樹は、TK2d株がBacillus属に分類されることを示した (図6)。最も相同性の高かったB. humi LMG 22167は、長径が4-7 μm、短径が0.7-0.9 μmの桿菌で、オランダのDrentse A 農業研究エリアの土から分離され、温度30℃・pH7-9・NaCl濃度7%で増殖が可能であり、ウレアーゼ活性が陰性であった（J. Heyrman,他、“Bacillus arenosi sp. nov., Bacillus arvi sp. nov. and Bacillus humi sp. nov., isolated from soil," Int. J. Syst. Evol. Microbiol., vol. 55, no. Pt 1, pp. 111-117, 2005）。以上の結果から、TK2d株はBacillus humi と異なるBacillus sp. TK2dと命名された。【００３７】
（２−３）Bacillus sp. TK2d株のSr固化能の特徴付け
図4の実験結果から、我々はMB中の不溶性成分がbiotic Sr-Ca coprecipitateの正確な分析を阻害するのではないかと考え、オートクレーブ後に培地に生じる不溶性成分をフィルターにより除去したMB (ろ過済みMB) をSr除去試験に用いることにした。次に、ろ過済みMB を用いて、TK2d株のSr除去試験の再試験が行われた。TK2d株は初発1.2 mM濃度の溶存Srを培養5日間に1.0 mMにまで緩やかに減少し、培養6日目で0.3 mMにまで急速に減少し、培養9日目までに0.03 mMにまで緩やかに減少し、その後溶存Srの減少は平衡に達した (図7)。この結果から、TK2d株は、ろ過済みMBにおいて培養9日目までに初発濃度の97.6%  (1.17 mM) にあたる溶存Srを培養液体中から除去した。MB由来の溶存Ca濃度は溶存Sr濃度と同様の減少傾向を示し、培養9日目までに0.14 mMに減少した。これは初発濃度の94.6% (1.06 mM) にあたる。フィルターろ過していないMBを用いたSr除去実験 (図3) では、培養3日目までに初発溶存Srの濃度の99.3%除去したことから、ろ過済みMBを用いた本実験では除去にかかる日数が6日も長かった。これは、MB中の不溶化成分がTK2d株のSr除去に大きく関与していることが考えられた。【００３８】
（２−４）様々なSr初発濃度におけるTK2d株のSr除去試験
Sr初発濃度を5.0 mM、1.0 mM、0.1 mM、0.02 mMに設定して、TK2d株によるSr固化能を評価した。初発濃度0.02 mMは、SrCl2溶液を添加せず、MB培地由来のSr濃度で調製された。試験には、ろ過済みMBが用いられた。すべての条件において培養液のpHは培養開始1日で約pH9まで上昇し、それ以降変化しなかった。TK2d株における培養9日目の溶存Srは5 mMから0.06 mMに、1 mMから0.03 mMに、0.1 mMから0.06 mMに、0.02 mMから0.01 mMに減少した (図8A)。TK2d株は初発濃度にかかわらず実験した条件では溶存Srを0.06 mM以下に減少させた。また、溶存Srは、Sr初発濃度5.0 mMおよび0.1 mMの場合は培養5日から7日にかけて、初発濃度1.0 mMの場合は培養7日目から9日目にかけて急激に減少し、Sr初発濃度0.02 mMの場合は9日目まで緩やかに減少した。MB培地由来の溶存Caは初発濃度が約2.5 mMであり、Sr初発濃度に関係なく、培養9日目までに0.4 mM以下に減少した(図8B)。つまり溶存CaはSr初発濃度に関わらずどの条件においても同様の減少傾向であった。このことから、本実験の条件では、溶存Sr/溶存Ca比に影響されず、TK2d株は、5.0 mMから0.02 mMまでの幅広い濃度の溶存Srを0.06 mM以下にまで減少し、固化除去できるということが示された。【００３９】
（２−５）TK2d株が生成するSr固化物の性状解析
TK2d株のSr除去試験で生成された沈殿固化物をSEM-EDXにより解析した。図9はろ過済みMBを用いた時のSr固化物の電子顕微鏡像および元素マッピング、EDXスペクトルを示す。これらのすべてのSr固化物は、Sr培養初発濃度に関わらず、SrとCaを均一に含む1-50 μm程度の微粒子であった (図9A-C)。この結果は、図4で明らかにされたbiotic Sr-Ca coprecipitateと同じ特徴であった。また、EDXスペクトルにより、Sr固化物の主成分はSr、Caであることが示され、図4でみられた培地由来のMgピークはほとんど検出されなかった (図９Ｅ)。これらのことから、TK2d株は、Sr初発濃度に関わらず、SrおよびCaを複合炭酸塩として固化沈殿していることが示唆された。また、Sr Lα1ピーク強度がSr初発濃度に依存していることから、biotic Sr-Ca coprecipitateに含まれるSrの重量比は初発濃度に依存することが示された。以上のことから、TK2d株は溶存Srを数十μmの微粒子径のbiotic Sr-Ca coprecipitateとして固化し、培養液体中から除去したことが示された。【００４０】
biotic Sr-Ca coprecipitateの化学状態の解析を行うために、まずはSEM-EDXを用いてbiotic Sr-Ca coprecipitateと非生物的Sr含有カルサイトの形状を比較した。非生物的カルサイトの生成時に溶存Srが共沈することが知られている（N. E. Pingitore,他、“The coprecipitation of Sr2+ with calcite at 25℃ and 1 atm," Geochim. Cosmochim. Acta, vol. 50, no. 10, pp. 2195-2203, 1986）。本研究の非生物的カルサイトの生成では、溶存Srは初発濃度1.0 mMから0.27 mMにまで減少した。SEM-EDXの結果から、非生物的Sr含有カルサイトには、SrもCaも粒子全体に均一に分布していた (図9D)。この均一な分布は、TK2d株由来のbiotic Sr-Ca coprecipitateと非生物的Sr含有カルサイトの両方で観察された。一方、非生物的Sr含有カルサイトの形状は、一辺が10-30μmほどの立方体状 (図9D黒矢印) と50μmほどの球状 (図9D白矢印) が存在している。立方体状固化物は、カルサイトで見られる典型的な三方晶系結晶構造であると考えられた。球状固化物は、非晶質（アモルファス）であると考えられた。カルサイトは、固化反応が極めて速い場合やMgが取り込まれた場合、また、微生物の細胞外物質とCaの結合など、さまざまな要因でアモルファス状になることが報告されている（M. Fukue,他、“Cementation of sands due to microbiologically-induced carbonate precipitation," Soils Found., vol. 51, no. 1, pp. 83-93, 2011；G. A. Silva-Castro,他、“Carbonate precipitation of bacterial strains isolated from sediments and seawater: formation mechanisms," Geomicrobiol. J., vol. 30, no. 9, pp. 840-850, 2013；及びM. Obst, 他、“Precipitation of amorphous CaCO3 (aragonite-like) by cyanobacteria: A STXM study of the influence of EPS on the nucleation process," Geochim. Cosmochim. Acta, vol. 73, no. 14, pp. 4180-4198, 2009）。非生物的Sr含有カルサイトのアモルファスは、沈殿生成時にMgが含まれていないことから、急速な沈殿により生成されたと考えられる。一方で、biotic Sr-Ca coprecipitateは、EDXスペクトルの結果から、Mgの有無に関わらずアモルファス状であることがわかる (図10)。このことから、Mg以外にアモルファスを生成する原因があると考えられる。Sporosarcina pasteurii (Bacillus pasteurii) ATCC 11859は淡水条件でウレアーゼを生産し、バイオカルサイトを形成することが知られている（非特許文献５、及びJ. Dick, 他、“Bio-deposition of a calcium carbonate layer on degraded limestone by Bacillus species.," Biodegradation, vol. 17, no. 4, pp. 357-67, 2006）。S. pasteurii は、CaとSrが混合した条件では、一片が5-10 μmで、ギザギザの縁と表面に穴があいたラフな斜方晶形を生成し（非特許文献５）、CaとMgが混合した条件では、アモルファス状の固化物を生成した（J. Dick, 他、“Bio-deposition of a calcium carbonate layer on degraded limestone by Bacillus species.," Biodegradation, vol. 17, no. 4, pp. 357-67, 2006）。また、Fukueらが土壌から分離したウレアーゼ産生細菌は、Caを含む条件では、一片が20-30μmの三方晶形カルサイトを生成し、CaとMgを混合した条件では20-60 μmほどの不定形アモルファスを生成した（M. Fukue,他、“Cementation of sands due to microbiologically-induced carbonate precipitation," Soils Found., vol. 51, no. 1, pp. 83-93, 2011）。このように、微生物が生成するバイオカルサイトは、温度や培地組成などの培養条件により、形状や結晶質の種類（三方晶形、斜方晶形、アモルファスなど）が異なる。しかし、その生成メカニズムや性状はまだ完全には明らかにされていない。TK2d株が生成したSr固化物の詳細な化学状態を解明するためには、TEMによる観察やXAFSによる原子レベルの分析が必要であると考えられた。【００４１】
（３）まとめ
本実施例により得られた成果は以下の通りである。
東京湾海底泥試料から溶存Srの減少を示す4株を分離した。このうちTK2d株は、最も溶存Srを減少した。TK2d株は、MB培地において培養3-5日で溶存Srを1.0 mMから0.03 mMにまで減少した。TK2d株が生成した固化物は、1-50 μmのアモルファス状の微粒子であり、その主成分はSrおよびCaの複合炭酸塩（バイオカルサイト）と考えられた。TK2d株は、塩濃度3%を含むろ過済みMB培地において、初発濃度5.0 mMから0.1 mMの溶存Srを少なくとも0.06mMまで、0.02 mMの溶存Srを少なくとも0.0１mMまで除去固化することから、海水中のSr除去に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年12月2日(2016.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウレアーゼを産生し、ＮａＣｌ濃度３％の条件下において、ストロンチウム（Ｓｒ）とカルシウム（Ｃａ）の複合炭酸塩からなる２０μｍ〜５０μｍの微粒子としてストロンチウム（Ｓｒ）を固化する能力を有し、ＮａＣｌ濃度３％の条件下において、ストロンチウム（Ｓｒ）濃度が１ｍＭの場合、培養５日で９９．３％以上の溶存Ｓｒを培養液体中から除去する微生物。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する、請求項１に記載の微生物。
【請求項５】
長径が２〜３μｍ及び短径が０．５〜１μｍの大きさを有する運動性のない桿菌であり、コロニーは乳白色で光沢がある明瞭な円形である、請求項１又は４に記載の微生物。
【請求項６】
ＮａＣｌ濃度３％を含むろ過済み培地において、初発濃度５．０ｍＭから０．１ｍＭの溶存ストロンチウム（Ｓｒ）を少なくとも０．０６ｍＭまで、０．０２ｍＭの溶存ストロンチウム（Ｓｒ）を少なくとも０．０１ｍＭまで固化する能力を有する、請求項１、４及び５の何れか１項に記載の微生物。
【請求項７】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０６３を有する、微生物。
【請求項８】
ストロンチウム（Ｓｒ）を含む液体中で、請求項１及び４から７の何れか１項に記載の微生物を培養することを含む、ストロンチウム（Ｓｒ）を固化する方法。
【請求項９】
ストロンチウム（Ｓｒ）を含む液体が、ＮａＣｌ濃度３％以上である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ストロンチウム（Ｓｒ）を含む液体が、カルシウムイオンを含む液である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
請求項８から１０の何れか１項に記載の方法により、ストロンチウム（Ｓｒ）を含む液体中のストロンチウム（Ｓｒ）を固化する工程、及び固化したストロンチウム（Ｓｒ）を回収する工程を含む、ストロンチウム（Ｓｒ）の回収方法。
【国際調査報告】
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