(57)【要約】【課題】測定精度の高いバイオセンサを提供することを目的とする。【解決手段】絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層１１０と、スリット１０４が形成されて、該スリット１０４が作用極および対極の先端側に配置されて電極層１１０の一方面に積層されるスペーサ層１２０と、電極層１１０およびスリット１０４により形成されて試料が供給されるキャビティ１０３と、キャビティ１０３に連通する空気穴が形成されてスペーサ層１２０に積層されるカバー層１３０と、キャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に設けられた反応層１０６とを備えるバイオセンサ１００において、反応層１０６が、非水溶性の棒状微粒子を含むことにより、血液試料の血球等を濾過する機能が向上し、これにより、血液試料のヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響の低減効果が向上する。【選択図】図２
2014089097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、
スリットが形成されて、前記スリットが前記作用極および前記対極の先端側に配置されて前記電極層の前記一方面に積層されるスペーサ層と、
前記電極層および前記スリットにより形成されて試料が供給されるキャビティと、
前記キャビティに連通する空気穴が形成されて前記キャビティを被覆して前記スペーサ層に積層されるカバー層と、
前記キャビティに露出する前記作用極および前記対極の先端側に設けられた反応層とを備えるバイオセンサにおいて、
前記反応層は、棒状部を有する非水溶性の微粒子を含む
ことを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記反応層は、親水性高分子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記反応層は、
前記電極層上に設けられ、前記微粒子および前記親水性高分子を含むフィルタ層と、
前記フィルタ層上に設けられ、測定対象物質と反応する酵素を含む試薬層と
を備えることを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記フィルタ層は、
前記電極層上に設けられ、前記親水性高分子を含む親水層と、
前記親水層上に設けられ、前記微粒子を含む微粒子層と
を備えることを特徴とする請求項３に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記棒状部は、尖頭を有することを特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記微粒子は、酸化チタンから成ることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、キャビティを形成するためのスリットが形成されて電極層に積層されるスペーサ層と、キャビティに連通する空気穴が形成されてスペーサ層に積層されるカバー層と、作用極および対極に設けられた反応層とを備えるバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
図７の従来のバイオセンサに示すように、作用極５０１および対極５０２を含む電極系と、測定対象物質と特異的に反応する酵素を含む反応層５０３とを有するバイオセンサ５００を用いて、試料に含まれる測定対象物質と反応層５０３とが反応することで生成される還元物質を作用極５０１と対極５０２との間に電圧を印加して酸化することにより得られる酸化電流を計測することで測定対象物質の定量を行う物質の測定方法が知られている（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
図７に示すバイオセンサ５００は、例えば、試料に含まれるグルコースを定量するためのセンサであって、ポリエチレンテレフタレートやポリイミドなどの絶縁性基板に電極が設けられて形成された電極層５０４と、カバー層５０６と、電極層５０４とカバー層５０６とに挟まれて配置されるスペーサ層５０５とが積層されて形成される。また、スペーサ層５０５には、試料が供給されるキャビティ５０７を形成するためのスリットが設けられており、電極層５０４にスペーサ層５０５を介してカバー層５０６が積層されて接着されることで、電極層５０４と、スペーサ層５０５のスリットの部分と、カバー層５０６とにより試料が供給されるキャビティ５０７が形成される。そして、スリットの開口部分によりバイオセンサ５００の側面に形成される試料導入口からキャビティ５０７に試料が供給される。また、カバー層５０６には、毛細管現象による試料のキャビティ５０７への供給を円滑に行うために、キャビティ５０７の終端部と連通する空気穴５０６ａが形成されている。
【０００４】
また、電極層５０４には、作用極５０１および対極５０２が設けられ、これらの電極５０１，５０２にそれぞれ電気接続される電極パターンが設けられることにより電極層５０４に電極系が形成されている。また、作用極５０１および対極５０２上には反応層５０３が設けられており、作用極５０１および対極５０２は、それぞれバイオセンサ５００に形成されたキャビティ５０７に露出するように電極層５０４に設けられている。
【０００５】
したがって、液体から成る試料がキャビティ５０７に試料導入口から供給されると、キャビティ５０７に露出する各電極５０１，５０２と反応層５０３とが試料に接触すると共に、反応層５０３が試料に溶解する。
【０００６】
また、作用極５０１および対極５０２上に設けられた反応層５０３は、電極層５０４上に設けられ、スメクタイト等からなる球状の無機微粒子を含有する無機微粒子層５０３ａと、無機微粒子層５０３ａに積層され、試料に含まれるグルコースと特異的に反応するグルコースオキシダーゼ（酵素）およびメディエータ（電子受容体）としてのフェリシアン化カリウムを含む試薬層５０３ｂとにより形成されている。
【０００７】
また、フェリシアン化カリウムが試料に溶解することで電離したフェリシアン化イオンは、グルコースがグルコースオキシダーゼと反応してグルコノラクトンに酸化される際に放出される電子によりフェロシアン化イオン（フェリシアン化イオンの還元体）に還元される。したがって、バイオセンサ５００に形成されたキャビティ５０７にグルコースを含む試料が試料導入口から供給されると、試料に含まれるグルコースの濃度に応じた量だけフェロシアン化イオンが生成される。
【０００８】
このよう構成されたバイオセンサ５００では、酵素反応の結果生じたメディエータの還元体を作用極５０１上で酸化することにより得られる酸化電流が、試料中のグルコース濃度に依存した大きさとなるため、この酸化電流を計測することにより試料に含まれるグルコースの定量を行うことができる。
【０００９】
ところで、この種のバイオセンサ５００を用いて血液中に含まれるグルコースを定量する場合、上記した酸化電流の大きさは、血液試料中の血球の容積の割合を示すヘマトクリット値の大きさに影響されることが知られている。この酸化電流への影響は、血球が作用極５０１や対極５０２の表面等に付着することに起因する。そこで、上記したバイオセンサ５００では、球状の無機微粒子を含有する無機微粒子層５０３ａが電極層５０４に設けられることにより、血液試料が濾過されて血球の電極層５０４方向への移動が抑制されることで、ヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響の低減が図られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第４６２１８３９号公報（図２など）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、従来のバイオセンサ５００では、血液試料の濾過というフィルタ機能を有する無機微粒子層５０３ａが球状の無機微粒子を用いて形成されているため、無機微粒子の周面により形成される微粒子間の隙間が比較的大きい。したがって、血液試料中の血球が、当該隙間を通過して作用極５０１や対極５０２に付着すると測定精度が劣化するので、ヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響の低減効果をさらに向上することができる技術が要望されている。
【００１２】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、従来と比較して血球の濾過効率が高く測定精度の高いバイオセンサを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記した目的を達成するために、本発明のバイオセンサは、絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、スリットが形成されて、前記スリットが前記作用極および前記対極の先端側に配置されて前記電極層の前記一方面に積層されるスペーサ層と、前記電極層および前記スリットにより形成されて試料が供給されるキャビティと、前記キャビティに連通する空気穴が形成されて前記キャビティを被覆して前記スペーサ層に積層されるカバー層と、前記キャビティに露出する前記作用極および前記対極の先端側に設けられた反応層とを備えるバイオセンサにおいて、前記反応層は、棒状部を有する非水溶性の微粒子を含むことを特徴としている。
【００１４】
このように構成することにより、微粒子間の隙間が、例えば、他の非水溶性の微粒子が有する棒状部により埋められたり、棒状部が重なったりすることによってより微細なものとなるため、反応層において従来よりも微粒子間の隙間が小さい緻密なフィルタ構造を形成することができる。したがって、例えば、試料が血液である場合には、従来と比較して血球の濾過効率が高く、血液中の血球の電極層方向への移動が抑制される効果が向上するため、ヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響の低減効果を向上することができ、従来と比較して測定精度の高いバイオセンサを提供することができる。
【００１５】
また、血液試料中に含まれる血球等を濾過する機能を有する微粒子に、非水溶性の微粒子を用いることにより、例えば、水溶性の微粒子や水分により膨潤する微粒子を用いる場合と比較して、微粒子が、反応層を形成する際に使用される溶液中の水分により変形するのが抑制されるため、微粒子間の隙間が溶液中の水分により微粒子が膨潤することによって変化することがなく、フィルタ機能の劣化を防止することができる。
【００１６】
また、前記反応層は、親水性高分子をさらに含んでいてもよい。一般的に、親水性高分子は血液試料に含まれる血球の移動を阻止する効果を有するため、反応層にさらに親水性高分子を含有させることにより、ヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響の低減効果がさらに向上する。また、親水性高分子が増粘剤として機能することにより、電極層と反応層との接着強度が増加するため、外部応力等により反応層が電極層から剥離するのを防止することができる。
【００１７】
また、前記反応層は、前記電極層上に設けられ、前記微粒子および前記親水性高分子を含むフィルタ層と、前記フィルタ層上に設けられ、測定対象物質と反応する酵素を含む試薬層とを備えていてもよい。このように構成することにより、測定対象物質と反応する酵素等を含む試薬層とフィルタ層とが分離して配置されるため、例えば、フィルタ層の親水性高分子と試薬層に含まれる物質（例えば、メディエータ）とが反応して測定精度が劣化するのを抑制することができる。
【００１８】
また、前記フィルタ層は、前記電極層上に設けられ、前記親水性高分子を含む親水層と、前記親水層上に設けられ、前記微粒子を含む微粒子層とを備えていてもよい。電極層上に微粒子層を設ける場合、微粒子が作用極や対極に付着するが、このような場合、微粒子が付着した部分では、還元体を酸化して酸化電流を得るための電気化学反応が付着した微粒子により阻害されるためバイオセンサの測定精度が劣化するおそれがある。そこで、フィルタ層を親水層と微粒子層とに分離し、電極層上に親水層を設けることにより、測定精度の劣化の要因となる、電極上への微粒子の付着を防止することができる。
【００１９】
また、前記棒状部は尖頭を有していてもよい。このように構成すると、微粒子の尖頭部分により微粒子間の隙間をより細かく埋めることができるため、反応層において、より緻密なフィルタ構造を形成することができる。
【００２０】
また、前記微粒子を酸化チタンで形成してもよい。このようにすると、微粒子が酸化チタンで形成された実用的なバイオセンサを提供することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、測定精度の低下の要因となる試料中の物質を濾過する機能を有する微粒子を、棒状部を有する非水溶性微粒子で形成することにより、微粒子間の隙間が、微粒子の細い棒状部により埋められるため、反応層において微粒子間の隙間の少ない緻密なフィルタ構造を形成することができる。したがって、例えば、試料が血液である場合には、血液中の血球の電極層方向への移動が抑制される効果が向上し、これにより、ヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響の低減効果が優れた高精度なバイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一実施形態にかかるバイオセンサを示す図であって、（ａ）は分解斜視図、（ｂ）は斜視図である。
【図２】図１のバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。
【図３】図１のバイオセンサの製造方法を示す図であって、（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ異なる工程を示す。
【図４】図１のバイオセンサの反応層に含まれる微粒子の形状の一例を示す図である。
【図５】微粒子の形状の他の例を示す図であって、（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ異なる形状を示す。
【図６】図１のバイオセンサで計測した酸化電流値とヘマトクリット値との関係を示す図である。
【図７】従来のバイオセンサを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
＜第１実施形態＞
本発明の一実施形態にかかるバイオセンサおよびこのバイオセンサの製造方法について図１〜図５を参照して説明する。なお、図１は本発明の一実施形態にかかるバイオセンサを示す図であって、（ａ）は分解斜視図、（ｂ）は斜視図である。図２は図１のバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。図３は本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であって、（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ異なる工程を示す。図４はバイオセンサの反応層に含まれる微粒子の形状の一例を示す図である。図５は微粒子の形状の他の例を示す図であって、（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ異なる形状を示す。なお、図４および図５（ａ）〜（ｃ）それぞれは微粒子の平面図、図５（ｄ）は微粒子の斜視図を示す。
【００２４】
（バイオセンサの構成および製造方法）
本実施形態にかかるバイオセンサ１００は、作用極１０１および対極１０２を含む電極系と、メディエータおよび測定対象物質と反応する酵素を含む反応層１０６とを有し、測定器（図示省略）に装着されて使用されるものである。具体的には、バイオセンサ１００が測定器の所定の位置に装着された状態で、当該バイオセンサの先端側に設けられたキャビティ１０３に血液などの試料が供給される。供給された試料はキャビティ１０３内に設けられた反応層１０６と接触するとともに、試料と反応層１０６とが反応し、反応層１０６に含まれる物質が還元された還元物質が生成される。
【００２５】
例えば、試料が血液である場合、血液中のグルコースと反応層１０６に含まれるグルコースオキシターゼ（酵素）とが反応し、グルコースが酸化された反応物質であるグルコノラクトンが生成される。その際に放出された電子により、反応層１０６に含まれるフェリシアン化カリウム（メディエータ）が電離したフェリシアン化イオンが還元され、フェロシアン化カリウム（還元物質：フェリシアン化カリウムの還元体）が生成される。
【００２６】
そして、バイオセンサ１００において、作用極１０１および対極１０２との間に電圧を印加することにより、この反応により生成された還元物質を酸化し、その際に得られる酸化電流を計測する。この酸化電流は、例えば、試料が血液である場合、その血液に含まれるグルコースの濃度に依存した値となるため、上記した各反応を経て得られた酸化電流をバイオセンサ１００で計測することにより、試料に含まれる測定対象物質（例えば、試料が血液である場合のグルコース）の定量を行うことができる。
【００２７】
より具体的には、バイオセンサ１００は、図１および図２に示すように、絶縁基板の一方面に作用極１０１および対極１０２を含む電極系が設けられた電極層１１０と、スリット１０４が形成されて、該スリット１０４が作用極１０１および対極１０２の先端側に配置されて電極層１１０の一方面に積層されるスペーサ層１２０と、電極層１１０およびスペーサ層１２０のスリット１０４により形成されて試料が供給されるキャビティ１０３と、該キャビティ１０３に連通する空気穴１０５が形成されてキャビティ１０３を被覆してスペーサ層１２０に積層されるカバー層１３０と、キャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に設けられた反応層１０６とを備え、電極層１１０およびカバー層１３０に挟まれて配置されるスペーサ層１２０とが、試料導入口１０３ａが設けられる先端側が揃った状態で積層されて接着されることにより形成される。そして、バイオセンサ１００は、その後端側から測定器の所定の挿入口に挿入されることで測定器に装着される。
【００２８】
電極層１１０は、ポリエチレンテレフタレート、セラミック、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料などの絶縁材料からなる絶縁性基板により形成される。また、電極層１１０を形成する絶縁基板の一方面に、白金、金、パラジウムなどの貴金属やカーボン、銅、アルミニウム、チタン、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ  Ｔｉｎ  Ｏｘｉｄｅ：酸化インジウム錫）、ＺｎＯ（Ｚｉｎｃ  Ｏｘｉｄｅ：酸化亜鉛）などの導電性物質からなる導電層が、スクリーン印刷やスパッタリング蒸着法により形成される。そして、絶縁性基板の一方面に形成された導電層に、レーザ加工やフォトリソグラフィによるパターン形成が施されることにより、作用極１０１および対極１０２と、バイオセンサ１００が測定器に装着されたときに、作用極１０１および対極１０２のそれぞれと測定器とを電気的に接続する電極パターン１０１ａ，１０２ａとを含む電極系が形成される。
【００２９】
また、作用極１０１および対極１０２は、それぞれの先端が、キャビティ１０３に露出するように配置される。また、作用極１０１および対極１０２それぞれの後端側の電極パターン１０１ａ，１０２ａは、試料導入口１０３ａと反対側の電極層１１０の端縁であって、スペーサ層１２０が積層されない電極層１１０の端縁まで延伸されて形成される。
【００３０】
次に、上記したようにして形成された電極層１１０にスペーサ層１２０が積層される。スペーサ層１２０は、ポリエチレンテレフタレート、セラミック、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料などの絶縁材料からなる絶縁性基板により形成され、基板の先端縁部のほぼ中央にキャビティ１０３を形成するためのスリット１０４が形成されている。そして、スリット１０４が、作用極１０１および対極１０２の先端側に配置されて、スペーサ層１２０が電極層１１０の一方面を部分的に被覆して積層されることにより、電極層１１０およびスリット１０４により試料が供給されるキャビティ１０３が形成される。
【００３１】
続いて、キャビティ１０３部分がプラズマにより洗浄処理された後に、反応層１０６が形成される。なお、プラズマ洗浄工程において使用されるプラズマは、酸素プラズマ、窒素プラズマ、アルゴンプラズマなど、プラズマによる金属活性化処理において使用される種々のプラズマを使用することができ、減圧プラズマであっても大気圧プラズマであってもよい。
【００３２】
反応層１０６は、図３（ａ）〜（ｃ）に示すように、カバー層１３０がスペーサ層１２０に積層される前に、キャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの親水性高分子を含有する試薬２０１と、棒状部を有する非水溶性の微粒子をを含有する試薬２０２と、メディエータ、酵素、親水性高分子などを含有する試薬２０３とを順番に滴下することにより形成される。また、キャビティ１０４への血液などの試料の供給を円滑にするために、界面活性剤やリン脂質などの親水化剤がキャビティ１０３内壁に塗布される。
【００３３】
具体的には、反応層１０６は、電極層１１０上に設けられ、親水性高分子を含む親水層１０６ａと、親水層１０６ａ上に設けられ、棒状部を有する非水溶性の微粒子を含む微粒子層１０６ｂと、微粒子層１０６ｂ上に設けられ、測定対象物質と反応する酵素、メディエータ（電子受容体）、親水性高分子を含む試薬層１０６ｃとを備え、次のように形成される。
【００３４】
すなわち、図３（ａ）に示すように、親水性高分子であるＣＭＣを含有する試薬２０１が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥されることにより親水層１０６ａが形成される（親水層形成工程）。次に、図３（ｂ）に示すように、酸化チタン等で形成された棒状部を有する非水溶性の微粒子を含有する試薬２０２が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥されることにより微粒子層１０６ｂが形成される（微粒子層形成工程）。この実施形態における試薬２０２は、非水溶性の微粒子、ｔｒｉｔоｎＸ（シグマアルドリッチ社製）および水の混合液であり、微粒子層１０６ｂは、微粒子を５ｗｔ％、ｔｒｉｔоｎＸを０．１％含有した混合液が０．５μＬ滴下されることにより形成される。なお、親水層１０６ａおよび微粒子層１０６ｂが本発明におけるフィルタ層に相当する。
【００３５】
また、微粒子層１０６ｂに含有する非水溶性の微粒子は、酸化チタンからなり、その形状が、図４に示すように、長辺の平均長さＡが５．１５μｍに形成された棒状微粒子を使用する（例えば、ＦＴＬ−３００：石原産業製）。また、非水溶性の微粒子の素材としては、上記した酸化チタンのほか、酸化亜鉛、硫酸バリウムなどの非水溶性無機化合物や、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）などの有機化合物を用いることができる。
【００３６】
なお、非水溶性の微粒子の形状は、上記した棒状微粒子に限らず、種々の形状を用いることができる。例えば、図５に示す微粒子の形状の変形例のように、棒状微粒子の少なくとも一端が先細りの針状微粒子（図５（ａ）参照）および楔状の微粒子（図５（ｂ）参照）のように尖頭を有するものや、図５（ｃ）に示すように、棒状部の少なくとも一端が折れ曲がったかぎ状の微粒子や、図５（ｄ）に示すように、樹枝状の微粒子を用いることができる。また、棒状微粒子（棒状部）についても、角柱状、円柱状など種々の形状を用いることができる。
【００３７】
続いて、図３（ｃ）に戻って、メディエータ（例えば、フェリシアン化カリウム）、酵素（例えば、グルコースデヒトロゲナーゼ）、親水性高分子（例えば、メチルセルロース）を含有する試薬２０３が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥されることにより試薬層１０６ｃが形成され（試薬層形成工程）、これらの各工程により反応層１０６が形成される。この場合、試薬２０３中に含まれる親水性高分子はなくてもかまわない。また、試薬２０３中に、親水性高分子の代わりに、またはこの親水性高分子とともに両親媒性高分子を含有させる構成であってもよい。
【００３８】
なお、反応層１０６は、単層であってもよい。この場合、親水層１０６ａ、微粒子層１０６ｂ、試薬層１０６ｃそれぞれの試薬２０１，２０２，２０３を混合した試薬を作製し、その試薬を電極層１１０上に滴下・乾燥することにより、反応層１０６を形成するとよい。また、親水層１０６ａと微粒子層１０６ｂとが一層に形成されたフィルタ層と試薬層１０６ｃとで反応層１０６を形成してもかまわない。
【００３９】
ところで、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は、メディエータを還元することが知られている。これは、酸素原子の二重結合を有する官能基がメディエータに対して求核攻撃することによりメディエータが還元されるためと考えられるが、このように測定対象物質と酵素との酸化還元反応に基づく反応と異なる反応によりメディエータが還元されると、上記した酸化電流を計測する際に、当該親水性高分子により還元されたメディエータが酸化することによる酸化電流もバックグラウンド電流として、本来計測すべき測定対象物質に基づく酸化電流と一緒に計測されるので、測定精度が低下する。
【００４０】
したがって、試薬層１０６ｃにメディエータと親水性高分子とを含有させる場合は、親水性高分子に、メディエータが還元されにくい酸素原子の二重結合を有さないものを用いるのが好ましい。
【００４１】
一方、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子と比較して血液試料を濾過する機能が高いため、親水層１０６ａが含有する親水性高分子には、酸素原子の二重結合を有するものを用いるのが好ましい。
【００４２】
この場合、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子としては、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどを用いることができる。
【００４３】
また、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子としては、上記したＣＭＣの他、カルボニル基、アシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホ基、スルホニル基、スルホキシド基、トシル基、ニトロ基、ニトロソ基、エステル基、ケト基、ケテン基などを有するポリマーを用いることができる。なお、これらの親水性高分子は、増粘剤として機能する。また、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は、それぞれ、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。また、カラギーナンやアルギン酸ナトリウムなどのゲル化剤も血液等の試料の濾過機能を有するため、親水性高分子に代えて、または親水性高分子とともに、反応層１０６にこれらのゲル化剤を含有させてもよい。
【００４４】
また、両親媒性高分子として、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどを用いることができる。また、これらの両親媒性高分子を、それぞれ２種類以上組み合わせて用いてもよい。
【００４５】
なお、酵素としては、上記したグルコースデヒドロゲナーゼの他、グルコースオキシターゼ、乳酸オキシターゼ、コレステロールオキシターゼ、アルコールオキシターゼ、ザルコシンオキシターゼ、フルクトシルアミンオキシターゼ、ピルビン酸オキシターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールエステラーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができ、これらの酵素を測定対象物質（グルコース、乳酸、コレステロール、アルコール、ザルコシン、フルクトシルアミン、ピルビン酸、ヒドロキシ酪酸）に応じて選択することで種々のセンサを形成することができる。
【００４６】
例えば、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼを用いれば血液試料中のグルコースを検出するグルコースセンサを形成でき、アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼを用いれば血液試料中のエタノールを検出するアルコールセンサを形成でき、乳酸オキシダーゼを用いれば血液試料中の乳酸を検出する乳酸センサを形成でき、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとの混合物を用いれば総コレステロールセンサを形成できる。
【００４７】
また、メディエータとしては、上記したフェリシアン化カリウムの他、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などを用いることができる。
【００４８】
また、親水化剤としては、ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（ｎ≒１０）（ＴｒｉｔｏｎＸ１００：シグマアルドリッチ社製）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ２０：東京化成工業社製）、ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウムなどの界面活性剤、レシチンなどのリン脂質を用いることができる。また、親水化剤は、上記したようにキャビティ１０３に塗布する以外に、試薬２０３に混合してキャビティ１０３に滴下したり、試薬層１０６ｃが形成された後にキャビティ１０４に滴下してもよい。また、カバー層１３０のスペーサ層側の面に、スピンコート、スクリーン印刷、スプレーコータなどを用いて塗布してもよい。また、試料に含まれるイオン濃度のばらつきを低減するために、リン酸などの緩衝剤を設けてもよい。
【００４９】
次に、反応層１０６がキャビティ１０３に形成された後に、ポリエチレンテレフタレート、セラミック、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料などの絶縁材料からなる絶縁性基板により形成されたカバー層１３０が、スペーサ層１２０に積層されることにより、バイオセンサ１００が形成される。図１（ａ），（ｂ）に示すように、カバー層１３０には、スペーサ層１２０に積層されたときにキャビティ１０３と連通する空気穴１０５が形成されており、カバー層１３０は、キャビティ１０３を被覆してスペーサ層１２０に積層される。
【００５０】
なお、この実施形態におけるバイオセンサ１００は、血液中のグルコースの定量を行うことを目的に形成されており、測定対象物質としてのグルコースと特異的に反応する酵素としてＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）を補酵素とするＧＤＨ（グルコースデヒドロゲナーゼ）（以下、ＦＡＤ−ＧＤＨと表記する）を含み、測定対象物であるグルコースとＦＡＤ−ＧＤＨとの反応により生成される電子により還元されて還元物質と成るメディエータとしてフェリシアン化カリウムを含む反応層１０６がキャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に設けられている。
【００５１】
このように構成されたバイオセンサ１００では、上記したように、先端の試料導入口１０３ａに血液から成る試料を接触させることにより、毛細管現象により試料が空気穴１０５に向かって吸引されてキャビティ１０３に試料が供給される。そして、キャビティ１０３に供給された試料に反応層１０６（試薬層１０６ｃ）が溶解することにより、試料中の測定対象物質であるグルコースとＦＡＤ−ＧＤＨとの酵素反応により電子が放出され、放出された電子によりフェリシアン化イオンが還元されて還元物質であるフェロシアン化イオンが生成される。そして、反応層１０６が試料に溶解することによる酸化還元反応により生成された還元物質を、バイオセンサ１００の作用極１０１と対極１０２との間に電圧（例えば０．３Ｖ）を印加して電気化学的に酸化することにより、作用極１０１と対極１０２との間に流れる酸化電流を計測することで試料中のグルコースの定量が測定器において行われる。なお、バイオセンサ１００の作用極１０１と対極１０２との間に電圧が印加された後、３〜５秒後の電流値が酸化電流として計測される。
【００５２】
（計測酸化電流の比較例）
図６は、従来のバイオセンサおよび本実施形態にかかるバイオセンサ１００それぞれで計測した酸化電流値とヘマトクリット値との関係を示す図であり、横軸が血液中の血球の容積の割合を示すヘマトクリット値の大きさ（％）を示し、縦軸が酸化電流の大きさ（μＡ）を示す。また、同図中の▲は、反応層に微粒子が含まれていない従来のバイオセンサの酸化電流を示し、同図中の◆は、反応層に球状の微粒子が含まれている従来のバイオセンサの酸化電流を示し、同図中の■は、本実施形態のバイオセンサ１００の酸化電流を示す。
【００５３】
なお、図６における球状の微粒子が含まれた従来のバイオセンサの微粒子は、ポリスチレンからなる球状微粒子であって、その平均粒径（直径）が８μｍのものを使用し、本実施形態の棒状微粒子は、その長辺の平均長さＡが５．１５μｍのものを使用している。また、これらのバイオセンサの微粒子層それぞれは、水、ｔｒｉｔоｎＸ、微粒子の混合液（微粒子：５ｗｔ％、ｔｒｉｔоｎＸ：０．１％）が０．５μＬ滴下されることにより形成されたものである。また、図６の酸化電流は、計測用の試料（血液試料）をキャビティ１０３に供給した後、通常の手順と同様に計測した。
【００５４】
図６に示すように、反応層に微粒子を含まない従来のバイオセンサでは、ヘマトクリット値が大きくなるのにほぼ比例して計測された酸化電流値が小さくなっており、計測される酸化電流値が血液試料のヘマトクリット値に大きく影響を受けている。また、球状微粒子を含む従来のバイオセンサでは、微粒子を含まないバイオセンサにおける酸化電流と比較すると、ヘマトクリット値の増大に伴う影響が若干低減している。すなわち、ヘマトクリット値の増大に伴う酸化電流の低下率が小さい。これらの計測結果に対して、本実施形態のバイオセンサ１００の場合は、特にヘマトクリット値が０％〜５０％の領域において、ヘマトクリット値の変動に対して計測される酸化電流値の変化量が従来のバイオセンサと比較して小さく、ヘマトクリット値の変動に伴う測定精度への影響の低減効果が従来のバイオセンサと比較して高くなっている。
【００５５】
したがって、上記した実施形態によれば、血液試料に含まれる血球等を濾過するフィルタ機能を有する微粒子層１０６ｂに、従来のバイオセンサで用いられる球状微粒子とは異なる棒状微粒子を含有させることにより、微粒子間の隙間が、例えば棒状微粒子の先端等の細い部分により埋められるため、微粒子層１０６ｂにおいて微粒子間の隙間が少ない緻密なフィルタ構造を形成することができる。したがって、例えば、試料が血液である場合には、血液中の血球の電極層１１０方向への移動が抑制される効果が向上し、これにより、ヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響の低減効果が優れた高精度のバイオセンサ１００を提供することができる。
【００５６】
また、図５（ａ）および（ｂ）に示す微粒子のように、微粒子が尖頭を有する場合には、その尖った部分により上記した微粒子間の隙間を埋める効果が向上するため、より測定精度の高いバイオセンサ１００を提供することができる。
【００５７】
また、血液試料中に含まれる血球等を濾過する機能を有する微粒子に、非水溶性の微粒子を用いることにより、例えば、水溶性の微粒子や水分により膨潤する微粒子を用いる場合と比較して、微粒子が反応層を形成する際に使用される溶液中の水分により変形しにくくなるため、微粒子間の隙間が大きくなることがなく、フィルタ機能を十分に確保することができる。
【００５８】
また、図６に示す計測酸化電流とヘマトクリット値の関係において、本実施形態にかかるバイオセンサ１００の反応層１０６に含有させる棒状微粒子の含有量（５ｗｔ％）を少なくしても、球状微粒子を含有する従来のバイオセンサと同等の効果を得ることが可能である。このように反応層１０６の棒状微粒子の含有量を減らすと、微粒子の添加量のばらつきを少なくすることができるため、微粒子の添加量のばらつきに起因するバイオセンサ１００の測定精度の劣化を防止することができる。
【００５９】
また、微粒子層１０６ｂに含有する微粒子が酸化チタンで形成されているため、微粒子が酸化チタンで形成された実用的なバイオセンサ１００を提供することができる。
【００６０】
また、本実施形態のバイオセンサ１００では、血液試料に含まれる血球の移動を阻止する効果がある親水性高分子を含有する親水層１０６ａが、電極層１１０上にさらに設けられているため、バイオセンサ１００におけるヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響の低減効果がさらに向上する。また、親水層１０６ａが、血液試料の血球の移動を阻止する効果が高い酸素原子の二重結合を有する親水性高分子であるＣＭＣで形成されているため、より一層、ヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響の低減効果が向上する。
【００６１】
また、親水層１０６ａおよび試薬層１０６ｃそれぞれに含まれる親水性高分子が増粘剤として機能することにより、電極層１１０、親水層１０６ａ、微粒子層１０６ｂ、試薬層１０６ｃそれぞれの接着界面の接着強度が増加するため、外部応力等により反応層１０６が電極層１１０から剥離するのを防止することができる。
【００６２】
また、親水層１０６ａに含有するＣＭＣは、酸素原子の二重結合を有するため、ＣＭＣと試薬層１０６ｃに含有するメディエータとが接触すると上記したようにメディエータが還元されることにより、バイオセンサ１００の測定精度が劣化する。そこで、本実施形態では、メディエータを含有する試薬層１０６ｃとＣＭＣを含有する親水層１０６ａとを分離して配置することにより、メディエータがＣＭＣにより還元されるのを防止することができるように構成した。さらに、親水層１０６ａと試薬層１０６ｃとの間に微粒子層１０６ｂを配置することで、より一層、ＣＭＣによるメディエータの還元を防止することができる。
【００６３】
また、電極層１１０上に微粒子層１０６ｂを設けると、電極層１１０の作用極１０１および対極１０２に微粒子層１０６ｂの微粒子が付着し、その付着した部分で酸化電流を得るための電気化学反応が阻害されて測定精度が低下するが、本実施形態では、電極層１１０と微粒子層１０６ｂとの間に親水層１０６ａが配置されているため、測定精度の低下の要因となる、電極１０１，１０２上の微粒子の付着を防止することができる。
【００６４】
なお、本発明は上記した各実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて、上記したもの以外に種々の変更を行なうことが可能である。
【００６５】
例えば、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を、複数種類組み合わせて試薬層１０６ｃに適切に混合することにより、血液試料中の血球の移動を効果的に阻止したり、酵素層およびメディエータ層の拡散、混合が低減されてメディエータの還元を防止する防止効果を向上することができる。
【００６６】
また、上記したバイオセンサ１００の反応層１０６に含まれる酵素およびメディエータの組合せを変更することによりエタノールセンサや乳酸センサなどを形成してもよい。
【００６７】
また、上記した各実施形態では、バイオセンサ１００は、作用極１０１および対極１０２を有する二極電極構造に形成されているが、参照極をさらに設けることによりバイオセンサ１００を三極電極構造に形成してもよい。この場合、対極１０２を接地して電圧出力部により参照極に参照電位を印加した状態で、作用極１０１に対極１０２を基準とする所定電位を印加すればよい。
【００６８】
また、上記した実施形態では、作用極１０１と対極１０２との間に所定電圧を印加することにより、作用極１０１と対極１０２との間に流れる電流を監視することで、キャビティ１０３に血液試料が供給されたことが検出されるが、キャビティ１０３に試料が供給されたことを検知するための検知用電極をさらに設けてもよい。この場合、対極１０２と検知用電極との間に所定電圧を印加することにより、対極１０２と検知用電極との間に流れる電流を監視することで、キャビティ１０３に試料が供給されたことを検出すればよい。
【００６９】
また、バイオセンサ１００，１００ａを形成する電極層１１０、スペーサ層１２０およびカバー層１３０のうち、少なくともカバー層１３０は、キャビティ１０３に血液試料が供給されたことを視認できるように透明な部材で形成するのが望ましい。
【００７０】
また、本発明は、種々のバイオセンサに適用することができる。
【符号の説明】
【００７１】
１００  バイオセンサ
１０１  作用極
１０２  対極
１０３  キャビティ
１０４  スリット
１０５  空気穴
１０６  反応層
１０６ａ  親水層
１０６ｂ  微粒子層
１０６ｃ  試薬層
１１０  電極層
１２０  スぺーサ層
１３０  カバー層
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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