(57)【要約】【課題】  被験血漿中のループスアンチコアグラントの影響を低減し、且つ活性化部分トロンボプラスチン時間を正確に測定することを可能にする試薬を提供することを課題とする。【解決手段】  25μg/mL以上の濃度でホスファチジルグリセロールを含む活性化部分トロンボプラスチン時間測定用試薬により上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
25μg/mL以上の濃度でホスファチジルグリセロールを含む活性化部分トロンボプラスチン時間測定用試薬。
【請求項２】
ホスファチジルグリセロールの濃度が50〜150μg/mLである請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
ホスファチジルグリセロールが合成リン脂質である請求項１または２に記載の試薬。
【請求項４】
活性化剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の試薬。
【請求項５】
活性化剤が、エラグ酸、カオリン、セライト、コロイダルシリカおよび無水ケイ酸からなる群より選択される少なくとも１種である請求項４に記載の試薬。
【請求項６】
ホスファチジルグリセロール以外のリン脂質をさらに含む請求項１〜５のいずれか１つに記載の試薬。
【請求項７】
ホスファチジルグリセロール以外のリン脂質が、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルコリンからなる群より選択される少なくとも１種である請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
活性化剤および25μg/mL以上のホスファチジルグリセロールを含む第１試薬と、
カルシウム塩を含む第２試薬と
を含む、活性化部分トロンボプラスチン時間測定用試薬キット。
【請求項９】
第１試薬のホスファチジルグリセロールの濃度が50〜150μg/mLである請求項８に記載の試薬キット。
【請求項１０】
カルシウム塩が塩化カルシウムである請求項８または９に記載の試薬キット。
【請求項１１】
被検血漿と、活性化剤および25μg/mL以上のホスファチジルグリセロールを含む第１試薬とを混合する第１混合工程と、
第１混合工程で得られた試料と、カルシウム塩を含む第２試薬とを混合する第２混合工程と、
第２混合工程で得られた試料の凝固時間を測定する工程と
を含む、活性化部分トロンボプラスチン時間測定方法。
【請求項１２】
被検血漿と、活性化剤および25μg/mL以上のホスファチジルグリセロールを含む第１試薬とを混合する第１混合工程と、
第１混合工程で得られた試料と、カルシウム塩を含む第２試薬とを混合する第２混合工程と、
第２混合工程で得られた試料の凝固時間を測定する工程と、
測定工程で得られた凝固時間に基づいて、被験血漿におけるループスアンチコアグラント以外に起因する血液凝固異常の有無を判定する工程と
を含む、ループスアンチコアグラント以外に起因する血液凝固異常の判定方法。
【請求項１３】
ループスアンチコアグラント以外に起因する血液凝固異常が、凝固因子の欠乏もしくは異常または凝固因子のインヒビターに関連する疾患である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第１試薬のホスファチジルグリセロールの濃度が50〜150μg/mLである請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)の測定のための試薬および試薬キットに関する。また、本発明は、APTT測定方法およびループスアンチコアグラント(LA)以外に起因する血液凝固異常の判定方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野においては、血液の凝固時間を測定することによって血液凝固因子の異常などを調べる検査が知られている。一般的な血液凝固能の臨床検査の一つとしてAPTT測定が挙げられる。APTTとは、出血時に血液が陰性荷電を有する異物と接触することにより開始される内因系凝固経路の機能を反映する凝固時間である。APTTの測定は、内因系凝固因子の欠乏もしくは異常のスクリーニング検査だけではなく、ヘパリン療法のモニタリングなどにも利用されている。
【０００３】
APTT測定は、古くから臨床検査で利用される凝固時間測定法として確立されている。この方法では、陰性荷電を有する活性化剤と、血小板第３因子の代替物であるリン脂質と、カルシウムイオンを供給するためのカルシウム塩とが用いられる。その測定原理は次のとおりである。まず、血漿にリン脂質及び活性化剤を加え、活性化剤によって血漿中の接触因子系を活性化させる。ここにカルシウム塩を添加すると、活性化した接触因子系およびリン脂質の作用により凝固反応が促進されて、最終的に血漿中にフィブリンが析出する。APTT測定ではフィブリンの析出をもって凝固とみなし、カルシウム塩の添加からフィブリン析出までの時間を凝固時間として測定する。
【０００４】
これまでに種々のAPTT測定用試薬が開発されているが、いずれの試薬も主要な成分としてリン脂質を含んでいる。APTT測定用試薬に用いられるリン脂質には天然由来リン脂質および合成リン脂質があるが、臨床感度、疾患鑑別や品質向上の観点から、近年では、複数種の合成リン脂質を混合して用いている(例えば、特許文献１参照)。また、合成リン脂質の種類としては、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、ホスファチジルコリン(PC)およびホスファチジルセリン(PS)の３種類を混合して試薬に含むことが主流となっている。
【０００５】
他方で、上記のようなAPTT測定用試薬を用いた測定では、被験者から得た血液試料中に抗リン脂質抗体の一種であるLAが含まれていた場合、LAが血液凝固に必要なリン脂質を阻害するので、凝固時間が延長することが知られている。近年では、この凝固時間の延長を利用して、リン脂質を含むAPTT測定用試薬によるLAのスクリーニング検査が行われている。このスクリーニング検査では、リン脂質濃度の低いAPTT測定用試薬を用いることにより、LAによるリン脂質への阻害反応を表れやすくしている。また、LAの検出のために、リン脂質濃度の異なる２種類のAPTT試薬を組み合わせた試薬キットも存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１３３３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、血友病や凝固因子異常症などの凝固因子の欠乏もしくは異常に関連する疾患が疑われる被験者の血液にLAが存在している場合、従来のAPTT測定用試薬による測定では、凝固時間の延長が凝固因子の欠乏もしくは異常に起因するのか、LAに起因するのかを判別することができない。この判別を行うためには、通常、LA検出用試薬キットによる検査をさらに行うか、または複数の異なる検査を組み合わせて行う必要がある。そのため、APTT測定によって、凝固因子の欠乏もしくは異常に関連する疾患のスクリーニング検査を行うニーズも存在する。
【０００８】
APTT測定用試薬のLAに対する感度を低下させるために、試薬中のリン脂質含有量を高めたり、特にヘキサゴナル型ホスファチジルエタノールアミン(PE)や陰性荷電を有するPSの濃度を高めたりすることが試みられている。しかし、これまでのところ、LAに対する感度を有効に低下させたか、またはLAの影響を受けないことを明確に示した試薬はまだ知られていない。
【０００９】
上記の事情に鑑みて、本発明は、試料中のLAの影響を低減し、且つAPTTを正確に測定することを可能にする試薬を提供することを目的とする。また、本発明は、その試薬を利用した試薬キット、並びにAPTT測定方法およびLA以外に起因する血液凝固異常の判定方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに、ホスファチジルグリセロール(PG)を、APTT測定用試薬に所定の濃度以上となるよう添加することにより、正常血漿に対する測定性能を変えることなく、LAに対する感度を低下できることを見出して、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
よって、本発明は、25μg/mL以上の濃度でPGを含むAPTT測定用試薬を提供する。また、本発明は、活性化剤および25μg/mL以上のPGを含む第１試薬と、カルシウム塩を含む第２試薬とを含むAPTT測定用試薬キットを提供する。
【００１２】
さらに、本発明は、被検血漿と、活性化剤および25μg/mL以上のPGを含む第１試薬とを混合する第１混合工程と、第１混合工程で得られた試料と、カルシウム塩を含む第２試薬とを混合する第２混合工程と、第２混合工程で得られた試料の凝固時間を測定する工程とを含むAPTT測定方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、被検血漿と、活性化剤および25μg/mL以上のPGを含む第１試薬とを混合する第１混合工程と、第１混合工程で得られた試料と、カルシウム塩を含む第２試薬とを混合する第２混合工程と、第２混合工程で得られた試料の凝固時間を測定する工程と、測定工程で得られた凝固時間に基づいて、被験血漿におけるループスアンチコアグラント以外に起因する血液凝固異常の有無を判定する工程とを含む、ループスアンチコアグラント以外に起因する血液凝固異常の有無の判定方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、LAによる影響を低減させてAPTTを測定することを可能にし、且つ試薬の白濁や沈殿が抑制された試薬および試薬キットが提供される。また、本発明によれば、LAによる影響を低減させてAPTTを測定することを可能にする方法が提供される。さらに、本発明によれば、LA以外に起因する血液凝固異常の有無を判定する方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のAPTT測定用試薬(以下、単に「試薬」ともいう)は、25μg/mL以上の濃度でPGを含む。本発明の実施形態において、PGは、生物学や製剤学などの分野において一般に用いられているPGであれば特に限定されない。また、PGは合成リン脂質であってもよいし、動物の大脳もしくは植物の組織または微生物の菌体膜などから得られる天然由来PGであってもよいが、試薬の品質の観点からは、合成されたPGを用いることが好ましい。なお、PGの脂肪酸側鎖は特に限定されず、例えばパルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸などが挙げられる。
【００１６】
本発明の試薬において、PGの濃度は25μg/mL以上であれば特に限定されないが、PG濃度を200μg/mL以上にしようとすると、PGが溶解しきれずに試薬中に白濁や沈殿が生じうる。したがって、試薬の品質の観点から、PG濃度は、試薬に白濁や沈殿が生じない範囲内が好ましく、具体的には150μg/mL以下が好ましい。本発明の好ましい実施形態においては、PG濃度は、25μg/mL以上であって、2〜8℃において試薬に白濁や沈殿が生じない150μg/mL以下で設定される。より具体的には、試薬のPG濃度は50〜150μg/mLが特に好ましい。
【００１７】
本発明の実施形態において、試薬の溶媒は、PGを溶解することができ且つAPTT測定を妨げない溶媒であれば特に限定されないが、好ましくは、APTT測定用試薬に通常用いられる緩衝液である。そのような緩衝液としては、例えば、HEPES、TRIS、MOPSなどが挙げられる。なお、試薬のpHは通常５〜９であり、好ましくは６〜８である。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態においては、試薬は活性化剤をさらに含む。活性化剤は、接触因子系を活性化させる物質であれば特に制限されず、例えば、エラグ酸、カオリン、セライト、コロイダルシリカ、無水ケイ酸などから選択される少なくとも１種を用いることができる。それらの中でも、エラグ酸およびコロイダルシリカが特に好ましい。
【００１９】
本発明の試薬中の活性化剤の濃度は特に制限されず、活性化剤の種類やAPTTの測定条件などに応じて適宜設定することができる。例えば、活性化剤の濃度としては、通常5〜1000μg/mLであり、好ましくは20〜500μg/mLである。活性化剤としてエラグ酸を用いる場合、試薬のエラグ酸濃度としては、通常5〜100μg/mLであり、好ましくは20〜50μg/mLである。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態においては、試薬はPG以外のリン脂質をさらに含む。そのようなリン脂質は、APTT測定用試薬に通常用いられるリン脂質であれば特に限定されず、例えば、PE、PCおよびPSから選択される少なくとも１種を用いることができる。PG以外のリン脂質は、合成リン脂質であってもよいし、ウサギ大脳、ウシ大脳、ヒト胎盤、大豆、卵黄などから抽出される天然由来リン脂質であってもよいが、試薬の反応特性や品質の観点からは合成リン脂質を用いることが好ましい。
【００２１】
本発明の試薬中のPG以外のリン脂質の濃度は特に制限されず、リン脂質の種類やAPTTの測定条件などに応じて適宜設定することができる。例えば、PG以外のリン脂質の濃度としては、通常30〜2000μg/mLであり、好ましくは100〜600μg/mLである。PG以外のリン脂質として、PE、PCおよびPSの３種を含む場合、本発明の試薬中のPE濃度は通常10〜700μg/mLであり、好ましくは30〜300μg/mLであり、PC濃度は通常20〜1000μg/mLであり、好ましくは30〜500μg/mLであり、PS濃度は通常3〜300μg/mLであり、好ましくは5〜150μg/mLである。
【００２２】
本発明の試薬は、保存性や安定性を向上させるための添加剤をさらに含んでいてもよい。そのような添加剤としては、APTT測定用試薬に通常用いられる添加剤であればよく、例えば、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤などが挙げられる。防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウム、フェノール、公知の抗生物質(例えばシプロフロキサシン)などが挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、ブチルヒドロキシアニソールなどが挙げられる。安定化剤としては、例えば、高分子ポリマー化合物が挙げられ、特にポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンが好ましい。
【００２３】
本発明の範囲には、上記の本発明の試薬を利用した試薬キットも含まれる。本発明のAPTT測定用試薬キット(以下、単に「試薬キット」ともいう)は、活性化剤および25μg/mL以上のPGを含む第１試薬と、カルシウム塩を含む第２試薬とを含む。
【００２４】
本発明の実施形態においては、第１試薬として、活性化剤を含む本発明のAPTT測定用試薬を好適に用いることができる。したがって、第１試薬に含まれるPGは、本発明の試薬に含まれるPGと同様である。すなわち、第１試薬に含まれるPGは、合成されたPGまたは天然由来PGのいずれであってもよいが、好ましくは合成されたPGである。また、第１試薬におけるPGの濃度は、25μg/mL以上であって且つ白濁や沈殿のない第１試薬が得られる範囲内で適宜決定することができ、50〜150μg/mLが特に好ましい。
【００２５】
第１試薬に含まれる活性化剤は、上記の本発明の試薬に用いられる活性化剤と同様であり、例えば、エラグ酸、カオリン、セライト、コロイダルシリカ、無水ケイ酸などから選択される少なくとも１種を用いることができる。それらの中でも、エラグ酸およびコロイダルシリカが特に好ましい。
【００２６】
本発明の実施形態において、第１試薬の溶媒は、PGおよび活性化剤を溶解することができ且つAPTT測定を妨げない溶媒であれば特に限定されないが、好ましくは、APTT測定用試薬に通常用いられる緩衝液である。そのような緩衝液としては、例えば、HEPES、TRIS、MOPSなどが挙げられる。なお、第１試薬のpHは通常５〜９であり、好ましくは６〜８である。
【００２７】
本発明の実施形態において、第１試薬は、PG以外のリン脂質をさらに含むことが好ましい。そのようなリン脂質は上記の本発明の試薬に用いられるリン脂質と同様であり、例えば、PE、PCおよびPSから選択される少なくとも１種を用いることができる。また、第１試薬におけるPG以外のリン脂質の濃度は、本発明の試薬について述べたことと同様である。
【００２８】
本発明の実施形態において、第１試薬は、保存性や安定性を向上させるための添加剤をさらに含んでいてもよい。そのような添加剤は、上記の本発明の試薬に用いられる添加剤と同様である。
【００２９】
第２試薬に含まれるカルシウム塩は、APTT測定に通常用いられるカルシウム塩であれば特に限定されず、カルシウムと無機酸または有機酸との塩から適宜選択できる。そのようなカルシウム塩としては、例えば、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、亜硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、酒石酸カルシウムなどが挙げられる。それらの中でも、塩化カルシウムが特に好ましい。第２試薬に含まれるカルシウム塩の濃度は、カルシウム塩の種類やAPTTの測定条件などに応じて適宜設定できるが、通常15〜50 mMであり、好ましくは20〜30 mMである。カルシウム塩として塩化カルシウムを用いる場合、第２試薬での濃度は15〜30 mMが好ましく、20〜25 mMがより好ましい。
【００３０】
本発明の試薬キットは、第１試薬および第２試薬以外に、APTT測定に通常用いられる参照用血漿などをその他の試薬としてさらに含んでいてもよい。そのような参照用血漿としては、例えば、正常血漿、精度管理用血漿、各種の凝固因子が欠乏した血漿、LA陽性血漿、第VIII因子インヒビター含有血漿などが挙げられる。
【００３１】
本発明の試薬および試薬キットではPGの添加によりLAに対する感度を低下させているが、凝固因子に対する感度は、一般的なAPTT測定条件の下では、従来のAPTT測定用試薬と同程度である。また、本発明の試薬および試薬キットの使用方法は、従来のAPTT測定用試薬の使用方法と特に変わるところはない。したがって、本発明の試薬および試薬キットを、一般的なAPTT測定条件の下で正常血漿に対して適切に使用した場合、従来のAPTT測定用試薬と同様の測定結果を得ることができる。
【００３２】
本発明の範囲には、上記の本発明の試薬キットを利用したAPTT測定方法も含まれる。本発明のAPTT測定方法(以下、単に「測定方法」ともいう)では、まず、第１混合工程として、被検血漿と、活性化剤および25μg/mL以上のPGを含む第１試薬とを混合する。なお、第１試薬については、上記の本発明の試薬キットに含まれる第１試薬について述べたことと同様である。
【００３３】
被検血漿は、全血から血球を除去して得られる血漿であれば特に限定されない。そのような被検血漿としては、例えば、被験者から採取した血液から得た血漿、上記の参照用血漿およびそれらの混合物が挙げられる。なお、全血から血漿を得る方法は当該技術において公知である。例えば、血液を溶血させないように遠心分離して血球成分を除くことにより、血漿を得ることができる。また、被験者から採取した血液には、血液凝固能の臨床検査に通常用いられる公知の抗凝固剤が添加されていてもよい。そのような抗凝固剤としては、例えばクエン酸３ナトリウムが挙げられる。
【００３４】
被検血漿と第１試薬との混合割合(体積比)は、通常８：２〜２：８であり、好ましくは６：４〜４：６であり、より好ましくは５：５である。また、被検血漿と第１試薬との反応時間は、通常１〜10分間であり、好ましくは３〜５分である。温度条件は、通常25〜45℃であり、好ましくは35〜38℃である。
【００３５】
第２混合工程においては、上記の第１混合工程で得られた試料と第２試薬とを混合する。ここで、第２試薬については、上記の本発明の試薬キットに含まれる第２試薬について述べたことと同様である。試料と第２試薬との混合割合(体積比)は、通常８：２〜５：５であり、好ましくは７：３〜６：４であり、より好ましくは２：１である。なお、温度条件は、第１混合工程と同様である。
【００３６】
凝固時間を測定する工程では、上記の第２混合工程で得られた試料の凝固時間を測定する。本発明の実施形態においては、人がストップウォッチなどを用いて目視によりフィブリンが析出するまでの時間を測定してもよいし、自動分析装置を用いて測定してもよい。そのような装置としては、例えば、試料から得られる透過光の変化や散乱光の変化などの光学的情報を測定する装置が挙げられる。測定装置としては、光学的情報検出部を備える市販の自動分析装置を好適に用いることができ、例えば、シスメックス株式会社製のCS-2000iおよびCS-5000が挙げられる。
【００３７】
本発明の範囲には、上記のAPTT測定方法を利用して、LA以外に起因する血液凝固異常の有無を判定することも含まれる。本発明のLA以外に起因する血液凝固異常の有無の判定方法(以下、単に「判定方法」ともいう)では、まず、第１混合工程として、被検血漿と、活性化剤および25μg/mL以上のPGを含む第１試薬とを混合する。なお、この第１混合工程は、上記の本発明のAPTT測定方法と同様にして行うことができる。また、被検血漿および第１試薬は、それぞれ上記の本発明の測定方法および試薬キットについて述べたことと同様である。
【００３８】
ここで、LA以外に起因する血液凝固異常とは、被検血漿中にLAが存在すること以外の原因によりAPTTが延長する凝固異常であれば特に限定されず、例えば、凝固因子の欠乏もしくは異常または凝固因子のインヒビターに関連する疾患が挙げられる。具体的な疾患としては、例えば、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォン・ヴィレブランド病、第XI因子欠乏症、第XII因子欠乏症、高分子キニノゲン欠乏症、プレカリクレイン欠乏症、ビタミンＫ欠乏症、後天性血友病などが挙げられる。
【００３９】
本発明の別の実施形態において、クロスミキシング試験によりLA以外の血液凝固異常の有無の判定を行う場合は、被検血漿として、被験者の血漿、正常血漿およびそれらを所定の割合で混合した血漿(混合血漿)の３種を用いる。混合血漿としては、被験者の血漿と正常血漿とを、体積比で表して１：１で混合した血漿を少なくとも用いる。好ましくは、被験者の血漿と正常血漿とを、体積比で表して８：２、５：５および２：８で混合した３種の血漿を用いる。被験者の血漿と正常血漿とを混合した後、インキュベーションすることが好ましい。インキュベーション時間は、対象とする血液凝固異常や混合比などに応じて適宜決定できる。例えば、後天性血友病のような凝固因子のインヒビターの存在が疑われる被検血漿の場合、インキュベーション時間としては、通常0.5〜４時間、好ましくは１〜３時間である。また、インキュベーション時の温度条件は、通常25〜45℃であり、好ましくは35〜38℃である。
【００４０】
本発明の判定方法における第２混合工程および凝固時間を測定する工程は、上記の本発明のAPTT測定方法と同様にして行うことができる。なお、第２試薬については、上記の本発明の試薬キットについて述べたことと同様である。
【００４１】
本発明の判定方法においては、測定工程で得られた凝固時間に基づいて、被験血漿におけるLA以外に起因する血液凝固異常の有無を判定する。本発明の試薬キットではLAに対する感度が低減されていることから、被験血漿について測定されたAPTTが所定の閾値を超える場合、その被検血漿にLA以外に起因する血液凝固異常の疑いがあると判定してもよい。そのような閾値は、健常人から得た正常血漿のAPTTデータの蓄積により定めることができ、例えば、正常基準値を用いることができる。なお、正常基準値の上限は、100例以上の健常人血漿のAPTTデータについて統計計算して得た「平均値＋1.96 SD(標準偏差)」である。あるいは、本発明の試薬による正常血漿のAPTTデータを蓄積し、そのデータからAPTTの正常範囲を定め、この範囲を超える場合に被検血漿にLA以外に起因する血液凝固異常の疑いがあると判定してもよい。
【００４２】
被検血漿として、コアグトロールＮ(シスメックス株式会社)のような正常標準血漿を用いている場合は、APTT比を算出して、この比が所定の閾値を超えた場合に、LA以外に起因する血液凝固異常の疑いがあるとしてもよい。なお、APTT比は、被験者の血漿のAPTTの値を正常血漿のAPTTの値で割ることで算出される。APTT比の閾値は、健常人から得た正常血漿のAPTTデータの蓄積により定めることができ、例えば、閾値を1.2以上と設定することができる。
【００４３】
クロスミキシング試験によりLA以外に起因する血液凝固異常の有無の判定を行う場合は、被検者の血漿と正常血漿との混合比を横軸とし、APTTを縦軸とした折線グラフにより、LA以外に起因する血液凝固異常を２種に判別することができる。すなわち、折線グラフの形が視覚的に下に凸であれば凝固因子の欠乏もしくは異常が疑われ、上に凸であれば凝固因子のインヒビターの存在が疑われる。
【００４４】
本発明の実施形態においては、判定方法の各工程を用手法で行ってもよいが、より精度の高い判定を行うために、全ての工程を自動分析装置によって行うことが好ましい。そのような装置としては、APTTを自動的に測定し、且つ測定値と閾値とを比較して判定結果を表示することができる装置であれば特に限定されず、例えば、全自動血液凝固測定装置CS-2000i(シスメックス株式会社)が好適に用いられる。
【００４５】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１：ホスファチジルグリセロールの添加によるLAに対する感度への影響の検討
(1-1)APTT測定用試薬の調製
PGを含まない従来のAPTT測定用試薬(試薬Ａ)を調製した。なお、試薬Ａに、白濁および沈殿は確認されなかった。
＜試薬Ａ＞
試薬Ａは、活性化剤として0.1 mmol/Lエラグ酸(キシダ化学株式会社)と、リン脂質として140μg/mL L-α-ホスファチジルエタノールアミン(Avanti Polar Lipids, Inc.)、160μg/mL L-α-ホスファチジルコリン(Avanti Polar Lipids, Inc.)および40μg/mL L-α-ホスファチジルセリン(Avanti Polar Lipids, Inc.)と、緩衝液として50 mM HEPES緩衝液(pH7.35)、防腐剤として0.1%アジ化ナトリウム、抗酸化剤として3-t-ブチル-4-ヒドロキシアニソール(ナカライテスク株式会社)とを含む。
【００４７】
本発明の試薬として、PGを含むAPTT測定用試薬(試薬Ｂ〜Ｅ)を調製した。なお、いずれの試薬も、白濁および沈殿は確認されなかった。
＜試薬Ｂ〜Ｅ＞
試薬Ｂ〜Ｅはそれぞれ、上記の試薬ＡにL-α-ホスファチジルグリセロール(Avanti Polar Lipids, Inc.)を25、50、75および100μg/mLの濃度で添加した試薬である。
【００４８】
上記の試薬Ａ〜Ｅの他に、対照として、市販のAPTT測定用試薬であるアクチンFSL(シーメンス社)も用いた。なお、この試薬に含まれるリン脂質は、家兎の大脳および大豆から抽出した天然由来リン脂質である。
【００４９】
(1-2)APTTの測定
(i)試料
試料として、正常血漿(29例)、LAを含む疑いのある血漿(６例)および凝固因子欠乏血漿(８例)を用いた。また、ロスナーインデックス値の算出のために、市販の正常血漿であるコアグトロールＮ(シスメックス株式会社)を用いた。
【００５０】
(ii)APTTの測定
試料(50μL)を反応キュベットに分注し、37℃で１分間加温した。ここに、予め37℃で加温した上記のAPTT測定用試薬(50μL)を添加して、37℃で３分間反応させた。そして、25mM塩化カルシウム液(50μL)を混合して凝固時間を測定した。また、各試薬のLAに対する感度の指標を得るために、Rosner .Eらの方法(Thromb. Haemast. 1987、57:144-147)に準じて、ロスナーインデックス値を算出した。すなわち、LAを含む疑いのある血漿と正常血漿(コアグトロールＮ)とを１：１で混合した血漿(１：１混合血漿)についても同様に凝固時間を測定して、下記の式(１)より算出した。なお、凝固時間の測定には、全自動血液凝固測定装置CS-2000i(シスメックス株式会社)を用いた。また、測定は各試料ついて２回ずつ行って、凝固時間の平均値を得た。
【００５１】
ロスナーインデックス値＝［((１：１混合血漿のAPTT)−(正常血漿のAPTT))／(LAを含む疑いのある血漿のAPTT)］×１００・・・式(１)
【００５２】
結果を、各試薬のリン脂質組成とともに表１に示す。なお、表１において、「LA陽性血漿」は、LAを含む疑いのある血漿６例のうち、LAを含むことが判明した血漿である。また、「Test(秒)」は、LA陽性血漿の凝固時間を示し、「1：1 mixing(秒)」は、LA陽性血漿と正常血漿とを１：１で混合した血漿の凝固時間を示す。
【００５３】
【表１】
2014190954.tif 000002
【００５４】
(1-3)性能評価
表１より、正常血漿の凝固時間は、いずれの試薬を用いた場合も27〜30秒の範囲内であった。ここで、当該技術分野においては、正常血漿のAPTTは26.0〜30.0秒の範囲内となることがAPTT測定用試薬の性能として一般的に要求されている。したがって、APTT測定用試薬にPGを添加しても正常血漿の測定には影響を及ぼさないことがわかった。
【００５５】
表１より、試薬中のPG濃度依存的に、LAを含む血漿のAPTTおよびロスナーインデックス値が低下していた。したがって、本発明のAPTT測定試薬では、LAに対する感度が低下していることが示された。これに対して、PGを含まない試薬Ａおよび市販品ではAPTTおよびロスナーインデックス値が大きく、LAへの感度が高いことが示された。なお、凝固因子欠乏血漿の測定結果より、APTT測定用試薬にPGを添加しても凝固因子に対する感度には影響を及ぼさないことがわかった(データ示さず)。
【００５６】
実施例２：リン脂質の組成の調節によるLAに対する感度への影響の検討
(2-1)APTT測定用試薬の調製
PGを含まず、且つPE、PCおよびPSのそれぞれを種々の濃度で含むAPTT測定用試薬(試薬Ｆ〜Ｎ)を調製した。なお、いずれの試薬も、活性化剤として0.1 mmol/Lエラグ酸(キシダ化学株式会社)と、緩衝液として50 mM HEPES緩衝液(pH7.35)、防腐剤として0.1%アジ化ナトリウム、抗酸化剤として3-t-ブチル-4-ヒドロキシアニソール(ナカライテスク株式会社)とを含む。以下に、各試薬のリン脂質の組成を示す。
【００５７】
＜試薬Ｆ〜Ｊ＞
試薬Ｆ〜Ｊはいずれも140μg/mL L-α-ホスファチジルエタノールアミン(Avanti Polar Lipids, Inc.)および160μg/mL L-α-ホスファチジルコリン(Avanti Polar Lipids, Inc.)を含み、L-α-ホスファチジルセリン(Avanti Polar Lipids, Inc.)を互いに異なる濃度で含む。すなわち、試薬Ｆ〜ＪはそれぞれL-α-ホスファチジルセリンを10、20、30、40および50μg/mLの濃度で含む。なお、試薬Ｉのリン脂質組成は、APTT測定用試薬として標準的な組成である。
【００５８】
＜試薬ＫおよびＬ＞
試薬ＫおよびＬはいずれも160μg/mL L-α-ホスファチジルコリン(Avanti Polar Lipids, Inc.)および40μg/mL L-α-ホスファチジルセリン(Avanti Polar Lipids, Inc.)を含み、L-α-ホスファチジルコリン(Avanti Polar Lipids, Inc.)を互いに異なる濃度で含む。すなわち、試薬ＫおよびＬはそれぞれL-α-ホスファチジルコリンを40および250μg/mLの濃度で含む。
【００５９】
＜試薬ＭおよびＮ＞
試薬ＭおよびＮはいずれも140μg/mL L-α-ホスファチジルエタノールアミン(Avanti Polar Lipids, Inc.)および40μg/mL L-α-ホスファチジルセリン(Avanti Polar Lipids, Inc.)を含み、L-α-ホスファチジルコリン(Avanti Polar Lipids, Inc.)を互いに異なる濃度で含む。すなわち、試薬ＭおよびＮはそれぞれL-α-ホスファチジルコリンを40および320μg/mLの濃度で含む。
【００６０】
上記の試薬Ｆ〜Ｎの他に、対照として、本発明のAPTT測定用試薬である上記の試薬Ｅも用いた。
【００６１】
(2-2)APTTの測定
試料として、実施例１と同じ試料を用いた。これらの試料について、上記(2-1)で調整した試薬を用いて、実施例１と同様にして凝固時間測定し、ロスナーインデックス値を算出した。結果を、各試薬のリン脂質組成とともに表２に示す。
【００６２】
【表２】
2014190954.tif 000003
【００６３】
(2-3)性能評価
試薬Ｆ〜Ｊの結果より、PS濃度が高くなるにつれて、LAを含む血漿のAPTTおよびロスナーインデックス値が低下するように見受けられたが、本発明の試薬に比べると高い値であった。また、試薬ＦおよびＪでは、正常血漿のAPTTが26〜30秒の範囲内ではなかった。さらに、PS濃度が30〜50μg/mLの間ではロスナーインデックス値に大きな差は認められなかった。なお、データは示さないが、本実施例では、試薬中のPS濃度が50μg/mLを超えると、PSが溶解しきれずに試薬に白濁や沈殿が発生していた。したがって、PS濃度の調節によりLAに対する感度を低下させることは困難と考えられる。
【００６４】
試薬Ｉ、ＫおよびＬの結果より、PE濃度が低いと、LAを含む血漿のAPTTおよびロスナーインデックス値が低下するように見受けられたが、本発明の試薬に比べると高い値であった。また、試薬Ｋでは、正常血漿のAPTTが26〜30秒の範囲内ではなかった。したがって、PE濃度の調節によりLAに対する感度を低下させることは困難と考えられる。なお、データは示さないが、本実施例では、試薬中のPE濃度が250μg/mLを超えると、PEが溶解しきれずに試薬に白濁や沈殿が発生していた。
【００６５】
試薬Ｉ、ＭおよびＮの結果より、PE濃度が高いと、LAを含む血漿のAPTTおよびロスナーインデックス値が低下するように見受けられたが、本発明の試薬に比べると高い値であった。また、試薬ＭおよびＮでは、正常血漿のAPTTが26〜30秒の範囲内ではなかった。なお、データは示さないが、本実施例では、試薬中のPC濃度が320μg/mLを超えると、PCが溶解しきれずに試薬に白濁や沈殿が発生していた。したがって、PC濃度の調節によりLAに対する感度を低下させることは困難と考えられる。