(57)【要約】  高純度メタノールを用いてマイトマイシンCの粗結晶の結晶化を行う工程を含むことを特徴とするマイトマイシンCの精製方法および該精製方法により得られるマイトマイシンC等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高純度メタノールを用いてマイトマイシンCの粗結晶の結晶化を行う工程を含むことを特徴とするマイトマイシンCの精製方法。
【請求項２】
高純度メタノールの純度が、99.00〜99.99%である請求項1記載の精製方法。
【請求項３】
高純度メタノールの純度が、99.50〜99.99%である請求項1記載の精製方法。
【請求項４】
高純度メタノール中の各金属濃度の総和が0.01〜300 ppbである請求項1〜3のいずれかに記載の精製方法。
【請求項５】
高純度メタノール中の各金属濃度の総和が0.01〜100 ppbである請求項1〜3のいずれかに記載の精製方法。
【請求項６】
高純度メタノール中の亜鉛濃度が0.01〜100 ppbである請求項1〜3のいずれかに記載の精製方法。
【請求項７】
高純度メタノール中の亜鉛濃度が0.01〜10 ppbである請求項1〜3のいずれかに記載の精製方法。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれかに記載の精製方法により得られるマイトマイシンC。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイトマイシンCの精製方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイトマイシンCは、ストレプトミセス・ケスピトーズスの菌株を培養することによって得られる抗腫瘍性抗生物質であり、広く臨床に供せられている。
従来、上記菌株を培養して得られる培養液からマイトマイシンCを精製する方法としては、菌体を分離して得られる培養ろ液に活性炭を加えて吸着させ、有機溶媒で溶出させる活性炭吸着法、あるいは培養ろ液から有機溶媒に転溶して得られるマイトマイシンＣの濃縮液を、アルミナクロマトグラフィー法もしくは向流分配法に付して精製した後に、溶出したマイトマイシンCの溶液を乾固するまで濃縮し、これに少量のアセトンを添加することにより結晶を得る方法が知られている（特許文献1）。【０００３】
また、培養液を逆相吸着樹脂に吸着させた後、アセトン、メタノールまたはエタノール等の溶媒で溶出し、溶出液を濃縮して溶媒を除去し、食塩を飽和してクロロホルムに転溶し、クロロホルム抽出液をアルミナカラムクロマトグラフィーに付して、分離溶出し、溶出液を濃縮して濃厚メタノール溶液とした後に、これにエーテル、石油エーテル、ベンジン又はリグロインを加えてマイトマイシンC純結晶を得て、母液を更に濃縮して同様なる操作を行って得られた粗悪結晶を10%メタノール、エーテル混液にて洗浄することによりマイトマイシンC純結晶を得る方法が知られている（特許文献2）。【０００４】
そして、培養液を逆相吸着樹脂に吸着させた後に、酢酸エチルでマイトマイシンCを溶出させ、溶出液を蒸留して溶媒を除去し、次いで残渣を粒径の小さい逆相吸着剤に吸着させた後に含水メタノールで溶出させ、溶出液を逆相吸着樹脂に吸着させ、該樹脂からメタノールでマイトマイシンCを溶出させ、溶出液を濃縮してマイトマイシンCを晶析させる方法が知られている（特許文献3）。【０００５】
さらに、マイトマイシンCを溶解しうる溶媒と、貧溶媒の組み合わせからなる溶媒系からマイトマイシンCの結晶を製造する方法が知られている（特許文献4）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特公昭35-17897号公報
【特許文献２】特公昭36-9094号公報
【特許文献３】特開平4-187092号公報
【特許文献４】特開2001-31680号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
注射剤用のマイトマイシンCおよび注射剤マイトマイシンCにおいて、マイトマイシンCに由来する不溶性の微粒子の数が急激に増大し、「容器あたり10 μm以上のものが6000個以下および25 μm以上のものが600個以下であること」という注射剤の規格（第16日本薬局方-注射剤の不溶性微粒子試験法）から逸脱した注射剤マイトマイシンCが生じる例が見られた。従って、注射剤用のマイトマイシンCおよび注射剤マイトマイシンCを製造するために、マイトマイシンCの粗結晶の精製方法の改善が必要となった。【０００８】
本発明の目的は、不溶性微粒子の経時的増加が抑制された、マイトマイシンCの精製方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意検討した結果、マイトマイシンCの粗結晶の精製の際に、高純度メタノールを使用することにより、不溶性微粒子の経時的増加が抑制されたマイトマイシンCが安定して得られることを見出した。
本発明は、例えば以下の(1)〜(23) に関する。
(1) 高純度メタノールを用いてマイトマイシンCの粗結晶の結晶化を行う工程を含むことを特徴とするマイトマイシンCの精製方法。
(2) 高純度メタノールの純度が、99.00〜99.99%である (1) 記載の精製方法。
(3) 高純度メタノールの純度が、99.50〜99.99%である (1) 記載の精製方法。
(4) 高純度メタノール中の各金属濃度の総和が0.01〜300 ppbである(1)〜(3) のいずれかに記載の精製方法。
(5) 高純度メタノール中の各金属濃度の総和が0.01〜100 ppbである(1)〜(3) のいずれかに記載の精製方法。
(6) 高純度メタノール中の亜鉛濃度が0.01〜100 ppbである(1)〜(3) のいずれかに記載の精製方法。
(7) 高純度メタノール中の亜鉛濃度が0.01〜10 ppbである(1)〜(3) のいずれかに記載の精製方法。
(8) (1)〜(7)のいずれかに記載の精製方法により得られるマイトマイシンC。
(9) 高純度メタノールを用いてマイトマイシンCの粗結晶の結晶化を行う工程を含むことを特徴とする不溶性微粒子生成の低減方法。
(10) 高純度メタノールの純度が、99.00〜99.99%である (9) 記載の低減方法。
(11) 高純度メタノールの純度が、99.50〜99.99%である (9) 記載の低減方法。
(12) 高純度メタノール中の各金属濃度の総和が0.01〜300 ppbである(9)〜(11) のいずれかに記載の低減方法。
(13) 高純度メタノール中の各金属濃度の総和が0.01〜100 ppbである(9)〜(11) のいずれかに記載の低減方法。
(14) 高純度メタノール中の亜鉛濃度が0.01〜100 ppbである(9)〜(11) のいずれかに記載の低減方法。
(15) 高純度メタノール中の亜鉛濃度が0.01〜10 ppbである(9)〜(11) のいずれかに記載の低減方法。
(16) 下記 (A)〜(E) の工程を含むマイトマイシンCの粗結晶の精製方法。
(A) マイトマイシンCの粗結晶に高純度メタノールを加えて溶解させる工程。
(B) 上記 (A) で得られたろ液を冷却する工程。
(C) 上記 (B) で得られた溶液に貧溶媒を添加する工程。
(D) 上記 (C) で得られた混合液のろ過を行い、結晶を得る工程。
(E) 上記 (D) で得られた結晶を乾燥させる工程。
(17) 高純度メタノールの純度が、99.00〜99.99%である(16) 記載の精製方法。
(18) 高純度メタノールの純度が、99.50〜99.99%である(16) 記載の精製方法。
(19) 高純度メタノール中の各金属濃度の総和が0.01〜300 ppbである(16) 記載の精製方法。
(20) 高純度メタノール中の各金属濃度の総和が0.01〜100 ppbである(16) 記載の精製方法。
(21) 高純度メタノール中の亜鉛濃度が0.01〜100 ppbである(16) 記載の精製方法。
(22) 高純度メタノール中の亜鉛濃度が0.01〜10 ppbである(16) 記載の精製方法。
(23) (16)〜(22) のいずれかに記載の精製方法により得られるマイトマイシンC。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、マイトマイシンCの精製方法、およびそれにより不溶性微粒子の経時的増加が抑制されたマイトマイシンC等が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のマイトマイシンCの粗結晶の精製方法について具体的に説明する。
本発明で用いるマイトマイシンCの粗結晶は、例えば、特公昭35-17897、特公昭36-9094、特開平4-187092等に記載の方法により得られ、具体的には、微生物の培養で得られた培養液に対して、例えば、活性炭または樹脂（例えば、逆相吸着樹脂等）への吸着を利用した精製法、アルミナクロマトグラフィー法、向流分配法等の処理を行って得られる粗結晶であり、
i) 確認試験に適合する。 ii) マイトマイシンCの粗結晶 1 mg中のマイトマイシンCの標準品 1 mgに対する含量が950 μg以上である。およびiii) 乾燥減量が1.0%以下である。
という条件を満たすマイトマイシンCを示す。
【００１２】
上記確認試験、含量および乾燥減量は、例えば、第16改正日本薬局方の「マイトマイシンC」の「確認試験」、「定量法」および「乾燥減量」の各項目に記載の方法等に従って測定することができる。
本願発明における単位v/wは、対象1 gに対する液体の体積 (mL) を表す。
本願発明における貧溶媒としては、例えば、エチルエーテル、石油エーテル等が挙げられる。
【００１３】
本願発明における金属としては、例えば、有機金属化合物、金属、金属塩等が挙げられる。該金属としては、例えば、ニッケル、鉛、カドミウム、鉄、亜鉛等が挙げられる。該金属塩としては、例えば、塩化ニッケル、酸化ニッケル等のニッケル塩、塩化鉛、酸化鉛等の鉛塩、塩化カドミウム、酸化カドミウム等のカドミウム塩、塩化鉄、酸化鉄等の鉄塩、塩化亜鉛、酸化亜鉛等の亜鉛塩等が挙げられる。
【００１４】
また、各金属濃度の総和は、例えば、第16改正日本薬局方の誘導結合プラズマ発光分光分析法及び誘導結合プラズマ質量分析法＜2.63＞等に記載の金属分析法等によって、各金属イオンとして検出される各金属含量の総和を示す。
本願発明における亜鉛としては、例えば、有機亜鉛化合物、金属亜鉛、亜鉛塩等が挙げられる。該亜鉛塩としては、例えば、塩化亜鉛、酸化亜鉛等が挙げられる。
製造法
マイトマイシンCの粗結晶に対して50〜100 v/w、好ましくは60〜70 v/wのメタノールを加えて、50〜70 ℃の間、好ましくは55〜67 ℃の間の温度で撹拌し、溶解させる。
【００１５】
得られる溶液は、所望によりろ過を行い不溶物等を除去することができる。
該メタノールとしては、例えば、各金属濃度の総和が低いメタノール等が挙げられ、各金属濃度の総和が低いメタノールとしては、例えば、市販のメタノールを蒸留して得られるメタノール、各金属濃度の総和が低い市販の高純度メタノール等が挙げられる。
該各金属濃度の総和が低い市販の高純度メタノールとしては、例えば、精製メタノール(東洋合成工業社製) 等の市販品が挙げられる。
【００１６】
該メタノールの純度は、例えば99.00〜99.99%、好ましくは99.50〜99.99%、さらに好ましくは99.60〜99.99%、とりわけ99.80〜99.99%の範囲内のものが好ましい。該メタノール中の各金属濃度の総和はなるべく低いものが好ましく、例えば0.01〜300 ppb、好ましくは0.01〜100 ppb、さらに好ましくは0.01〜30 ppb、特に0.01〜10 ppbの範囲内のものが好ましい。該メタノール中の亜鉛濃度は、なるべく低いものが好ましく、例えば0.01〜100 ppb、好ましくは0.01〜10 ppb、さらに好ましくは0.01〜7 ppb、特に0.01〜6 ppbの範囲内のものが好ましい。
【００１７】
上記で得られる溶液またはろ過終了後のろ液を冷却し、粗結晶に対して70〜110 v/w、好ましくは85〜95 v/wのエチルエーテルを加え、さらに粗結晶に対して200〜250 v/w、好ましくは220〜230 v/wの石油エーテルを加える。得られる混合液を-10〜15 ℃、好ましくは-5〜10 ℃で0.5〜2時間、好ましくは0.8〜1.2時間、撹拌または撹拌することなくそのままの状態で放置し、析出した結晶をろ取、乾燥させ、精製したマイトマイシンCを得る。
【００１８】
以下に、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１９】
マイトマイシンCの粗結晶（1.8 g）に、市販品のメタノール (和光純薬、一級品) から蒸留したメタノール（117 mL）を加え、外温65 ℃にて加熱、30分間撹拌した。溶液を孔径0.22 μm のメンブランフィルターでろ過しろ液を得た。ろ液を徐冷し、2 ℃で2時間冷却した。ろ液に-10 ℃に冷却したエチルエーテル（160 mL）を滴下し、続いて-7 ℃に冷却した石油エーテル（400 mL）を滴下した。-2 ℃で1時間熟成後、結晶を減圧ろ過して回収し、室温下で減圧乾燥しマイトマイシンC（1.61 g）を得た。
・比較例1
マイトマイシンCの粗結晶（1.8 g）および市販品のメタノール（和光純薬、一級品）を用いて実施例1と同様にしてマイトマイシンC（1.51 g）を得た。
・比較例2
マイトマイシンCの粗結晶（1.8 g）および市販品のメタノール（和光純薬、一級品）をロータリーエバポレーターを用いて5倍に濃縮したメタノールを用いて、実施例1と同様にしてマイトマイシンC（1.56 g）を得た。
・試験例1
メタノール中およびマイトマイシンC中の亜鉛の定量
1) メタノール
ナスフラスコにメタノール500 mLを入れ、エバポレーターで濃縮乾固した。ナスフラスコを特級硝酸（和光純薬）を薄めて得られた4%硝酸水溶液で洗いこみ50 mLとし、試料溶液とした。
2) マイトマイシンC
容器に、上記実施例1ならびに比較例1および2で得られたマイトマイシンCを0.2 g量りとり、特級硝酸（和光純薬）3 mLおよび特級過酸化水素水（純正化学）3 mLを加えた後、水を加えて正確に50 mLとし、試料溶液とした。【００２０】
試料溶液につき、誘導結合プラズマ発光分光分析法（日本薬局方の＜2.63＞）の検量線法により次の条件で試験を行った。
・試験条件
波長：亜鉛213.856 nm
高周波出力：1.2 kW
キャリヤーガス：アルゴン
キャリヤーガス流量：0.7 L／min
補助ガス流量：0.6 L／min
冷却ガス流量：10.0 L／min
上記実施例1ならびに比較例1および2のマイトマイシンCの粗結晶の精製に用いたメタノール中の亜鉛濃度の測定値を表1に示す。【００２１】
【表１】
2016195059.tif 000002
【００２２】
実施例1ならびに比較例1および2で精製して得られたマイトマイシンC中の亜鉛濃度の測定値を表2に示す。【００２３】
【表２】
2016195059.tif 000003
【００２４】
実施例1ならびに比較例1および2で得られた精製後のマイトマイシンCを保存する際に生成する微粒子の数を下記試験例2に記載の方法に従って調べた。
試験例2  苛酷安定性試験下でのマイトマイシンC中の微粒子数の変化
実施例1ならびに比較例1および2で得られたマイトマイシンCの300 mgをそれぞれバイアルに取り、50 ℃、湿度成り行きの条件でサンプルを保管し、保管開始からの延べ時間で0、191および300時間後にサンプリングを行い、下記「マイトマイシンC中の微粒子の定量」に従い、微粒子の増加を観察した。【００２５】
マイトマイシンC中の微粒子の定量
マイトマイシンC 10 mgを精密に量り、注射用水を用いて正確に25 mLとし、試料溶液とした。
マイトマイシンC中の微粒子はMFI DPA5200（Protein Simple）を用いて分析した。試料溶液分析前に、機器流路を注射用水で洗浄し、微粒子フリーのベースラインを得た。試料溶液1 mLをピペットチップで採取し、サンプルホルダーに導入した。流速0.1 mL/minで流路を試料溶液で置換後、試料溶液（分析容量0.61 mL）を分析した。【００２６】
得られたデータから、気泡除去を目的として、MVAS 1.3ソフトウエアでAspect Ratio < 0.85の微粒子のみを抽出し、Microsoft ExcelでマイトマイシンC 10 mg当たりの粒径が10 μm以上、25 μm以上の微粒子数をそれぞれカウントした。
以上の操作を3回繰り返し、その平均を定量値とした。【００２７】
【表３】
2016195059.tif 000004
【００２８】
以上の結果、実施例1で得られたマイトマイシンCは、延べ過酷条件時間300時間後でも粒径が10 μm以上のもの、および粒径が25 μm以上のもの、いずれについても微粒子の数はほとんど増大しなかった。一方、比較例1および2で得られた、実施例1よりも多くの亜鉛を含むマイトマイシンCは、延べ過酷条件時間300時間後には、粒径が10 μm以上のもの、および粒径が25 μm以上のもの、いずれについても微粒子の数が大幅に増大した。【００２９】
従って、本試験結果からマイトマイシンCの不溶性微粒子の経時的増加の抑制には、マイトマイシンC中の亜鉛濃度の低減が有効であることがわかった。そのためには、本発明の高純度メタノールを用いるマイトマイシンCの精製方法によるマイトマイシン中に残存する亜鉛濃度の低減が有効であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明により、マイトマイシンCの精製方法等が提供される。
【国際調査報告】
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2016195059.tif 000007
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