(57)【要約】  所望のテルペノイドの生産を可能とする、新規な形質転換体、および、当該形質転換体を用いたテルペノイドの製造方法を提供するために、本発明の形質転換体は、ロドトルラ属に属する微生物に、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子が導入されたものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物に、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項２】
上記テルペノイドは、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、または、カロテノイドであることを特徴とする請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
上記酵素は、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドサイクラーゼ、モノテルペノイドシンターゼ、セスキテルペノイドシンターゼ、ジテルペノイドシンターゼ、または、トリテルペノイドシンターゼであることを特徴とする請求項１または２に記載の形質転換体。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の形質転換体を培養する培養工程と、上記培養工程にて得られた形質転換体からテルペノイドを回収する回収工程と、を有することを特徴とするテルペノイドの製造方法。
【請求項５】
上記培養工程では、上記形質転換体を液体培養することを特徴とする請求項４に記載のテルペノイドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換体、および当該形質転換体を用いたテルペノイドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テルペノイド（テルペン又はイソプレノイドとも称する）は、これまでに植物や微生物等から約４万種類が単離されている化合物群であり、自然界で最も複雑かつ多様な化合物群である。テルペノイドとその誘導体とは、様々な生理活性を有していることが報告されており、医薬品、機能性食品、または香料等として広く市場に流通している。【０００３】
テルペノイドは、天然における存在量が少ないこと、および、構造が複雑な化合物が多いことなどから、テルペノイドの効率的な生産技術の開発が期待されてきた。【０００４】
近年、様々な宿主（例えば、大腸菌、酵母、または、植物）の代謝経路を改変することによって、テルペノイドを生産する技術の開発が試みられている（例えば、特許文献１〜３、および非特許文献１〜２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２００１−１９０２９４号公報」
【特許文献２】日本国公開特許公報「特表２００６−５０００４６号公報」
【特許文献３】日本国公開特許公報「特表２００６−５０００５５号公報」
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Falk Matthaus et. al., Production of Lycopene in the Non-Carotenoid-Producing Yeast Yarrowia lipolytica, Appl Environ Microbiol, 2014 Mar, 80(5):1660-1669
【非特許文献２】Kiyotaka Y Hara et. al., Development of a multi-gene expression system in Xanthophyllomyces dendrorhous, Microbial Cell Factories, 2014 Dec 4, 13(1):175
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のようにテルペノイドを生産する技術の開発が進んでいるが、現在までに開発されてきた技術だけでは十分とはいえず、さらなるテルペノイドの生産技術の開発が要望されている。【０００８】
本発明は、上記の問題点を鑑みてなされたものであり、その目的は、所望のテルペノイドの生産を可能とする、新規な形質転換体、および当該形質転換体を用いたテルペノイドの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、膨大な種類存在する微生物の中でも、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物中には、脂肪酸、ステロイド、または、カロテノイドを多量に生産する種が存在することを、新たに見出した。そして、本発明者らは、これらの種に、当該種とは異なる生物種に由来する酵素（具体的には、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素）をコードする遺伝子を導入して形質転換体を作製すれば、当該形質転換体によって、種々の構造のテルペノイド（例えば、これまでに知られていないような新規な構造のテルペノイド）を効率よく製造し得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
本発明の形質転換体は、上記課題を解決するために、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物に、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子が導入されているものであることを特徴としている。【００１１】
本発明のテルペノイドの製造方法は、上記課題を解決するために、本発明の形質転換体を培養する培養工程と、上記培養工程にて得られた形質転換体からテルペノイドを回収する回収工程とを有することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る形質転換体によれば、種々の構造のテルペノイドを製造することができるという効果を奏する。【００１３】
本発明に係る形質転換体によれば、テルペノイドの生合成に関連する酵素をコードする遺伝子を導入することによって、テルペノイド生合成系を活性化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本願の実施例における、コロニーＰＣＲの結果を示す図である。
【図２】本願の実施例における、ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。
【図３】本願の実施例における、ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図４】本願の実施例における、ブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼが触媒する反応を示す図である。
【図５】本願の実施例における、コロニーＰＣＲの結果を示す図である。
【図６】本願の実施例における、ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。
【図７】本願の実施例における、ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図８】本願の実施例における、コロニーＰＣＲの結果を示す図である。
【図９】本願の実施例における、ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。
【図１０】本願の実施例における、ＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図１１】本願の実施例における、アルテミシア・アヌア由来のアモルファジエン合成酵素が触媒する反応を示す図である。
【図１２】本願の実施例における、コロニーＰＣＲの結果を示す図である。
【図１３】本願の実施例における、ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。
【図１４】本願の実施例における、ＧＣ−ＭＳによる分析結果を示す図である。
【図１５】本願の実施例における、グリチライザ  ウラレンシス由来のβ−アミリン合成酵素が触媒する反応を示す図である。
【図１６】本願の実施例における、コロニーＰＣＲの結果を示す図である。
【図１７】本願の実施例における、ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。
【図１８】本願の実施例における、ＧＣ−ＭＳによる分析結果を示す図である。
【図１９】本願の実施例における、グリチライザ  ウラレンシス由来のルペオール合成酵素が触媒する反応を示す図である。
【図２０】本願の実施例における、コロニーＰＣＲの結果を示す図である。
【図２１】本願の実施例における、ｍＲＮＡの検出結果を示す図である。
【図２２】本願の実施例における、ＧＣ−ＭＳによる分析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意図する。
【００１６】
本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。ここで、遺伝子は、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、または、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態であり得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡは、コード鎖（センス鎖）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖）であってもよい。また、遺伝子は、化学的に合成されたものであってもよく、コードするタンパク質の発現が向上するように、コドンユーセージ（Codon usage）が変更されたものであってもよい。同じアミノ酸をコードするコドン同士であれば置換することも可能である。また、用語「タンパク質」は、「ペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、塩基およびアミノ酸の表記は、適宜ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める１文字表記または３文字表記を使用する。
【００１７】
本明細書中において「テルペノイド」とは、テルペノイド生合成酵素の触媒活性により、基質としてゲラニル二リン酸（ＧＤＰ、ＧＰＰとも称する）（ＧＰＰの各種異性体を含む）、ファルネシル二リン酸（ＦＤＰ、ＦＰＰとも称する）（ＦＰＰの各種異性体を含む）、および／または、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＤＰ、ＧＧＰＰとも称する）（ＧＧＰＰの各種異性体を含む）から生成されるＣｘＨｙＯｚ（ｘは１０、１５、２０、３０、または、４０であり、ｙは１４〜５４であり、ｙは０〜４である）の化学式を有する化合物、および、当該化合物に対して、炭素原子数の増加、炭素原子数の減少、または、酸化等の修飾を施した化合物、を意図する。テルペノイドの触媒活性による基質の環化、酸化、水酸化等の生体内の酵素反応、および付随する非酵素反応により脱水反応等が行われることがあるが、これらに限定されない。テルペノイドは、非環、単環または多環の任意の形態をとり得るが、共通して、テルペノイド基本骨格を有する。したがって、テルペノイド基本骨格を有する任意の化合物は、本明細書におけるテルペノイドの概念に包含される。
【００１８】
〔１．本発明に関して〕
ロドトルラ属に属する微生物には、脂肪酸、ステロイド、または、カロテノイドを多量に生産する種が存在することを本願発明者らは独自に見出した。つまり、これらの種には、脂肪酸、ステロイド、カロテノイド、および、これらの代謝物（例えば、これらの前駆体となる化合物、および／または、これらから合成される化合物）が、大量に含まれている。本発明では、これらの微生物内で、当該微生物とは異なる生物種に由来する所望の酵素を発現させるので、当該酵素が多量の基質と接触することになる。その結果、本発明は、所望のテルペノイド（例えば、新規な構造を有するテルペノイド）を大量に生産することができる。
【００１９】
ロドトルラ属に属する微生物に、所望の遺伝子を導入する技術についてはこれまでのところ報告されていない。そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、ロドトルラ属に属する微生物に対して、容易に外来遺伝子を導入する技術を確立した。それ故に、本発明は、これらの微生物に所望の遺伝子を導入することによって、所望のテルペノイドを容易に生産することができる。
【００２０】
なお、後述する実施例に示すように、本発明の形質転換体は、固体培地を用いて培養した場合よりも、液体培地を用いて培養した方が、菌体１ｇに含まれるテルペノイドの量が多い。それ故に、本発明は、形質転換体の培養スケール（換言すれば、テルペノイドの生産スケール）を、容易に所望のスケールに調節できる。例えば、液体培養であれば、固体培養と比較して、単位スペース中で培養できる微生物の量が多いので、形質転換体の培養スケールを容易に大きくすることができる。更に、液体培養であれば、形質転換体を連続培養することができるので、テルペノイドを、連続的かつ大量に生産することができる。
【００２１】
本発明の形質転換体は、固体培地を用いて培養した場合よりも、液体培地を用いて培養した場合の方が、菌体１ｇに含まれるテルペノイドの量が多い。このことは、本発明の形質転換体が、自身の生育やテルペノイド生産において過剰な量の酸素を要求しないことを示している。本発明は、形質転換体の培養時に過剰な量の酸素を供給する必要が無いので、形質転換体の培養装置を安価にできる（換言すれば、安価にテルペノイドを生産できる）。
【００２２】
以下、本発明について詳説する。
【００２３】
〔２．形質転換体〕
本実施の形態の形質転換体は、特定の微生物に対して、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子が導入されたものである。本発明であれば、元々微生物中に存在しなかった代謝経路（例えば、テルペノイドを合成する代謝経路、テルペノイドに修飾（例えば、官能基）を加える代謝経路、または、テルペノイドを他の化合物へ変換する代謝経路など）を微生物中に人工的に構築することによって、または、元々微生物中に存在する代謝経路にさらに改良することによって、所望のテルペノイドを大量に製造することができる微生物を実現することができる。
【００２４】
遺伝子が導入される微生物（換言すれば、宿主）は、脂肪酸、ステロイド、および、カロテノイドからなる群より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または、３つの生産能力が高い微生物であってもよい。より具体的に、遺伝子が導入される微生物は、脂肪酸およびステロイドの生産能力が高い微生物であってもよいし、カロテノイドの生産能力が高い微生物であってもよい。
【００２５】
なお、脂肪酸の生産能力が高い微生物とは、本願の実施例の＜１＞に記載の方法にて測定した時に、１ｇの乾燥菌体に含まれる脂肪酸の量が、１００ｍｇ以上、好ましくは１１０ｍｇ以上、より好ましくは１２０ｍｇ以上、より好ましくは１３０ｍｇ以上、より好ましくは１４０ｍｇ以上、より好ましくは１５０ｍｇ以上、より好ましくは１６０ｍｇ以上、最も好ましくは１７０ｍｇ以上である微生物を意図する。なお、１ｇの乾燥菌体に含まれる脂肪酸の量の上限値は、特に限定されないが、例えば、５００ｍｇ、３００ｍｇ、または２００ｍｇであってもよい。
【００２６】
また、ステロイドの生産能力が高い微生物とは、本願の実施例の＜１＞に記載の方法にて測定した時に、１ｇの乾燥菌体に含まれるステロイドの量が、５０ｍｇ以上、より好ましくは６０ｍｇ以上、より好ましくは７０ｍｇ以上、より好ましくは８０ｍｇ以上、最も好ましくは９０ｍｇ以上である微生物を意図する。なお、１ｇの乾燥菌体に含まれるステロイドの量の上限値は、特に限定されないが、例えば、５００ｍｇ、３００ｍｇ、２００ｍｇ、または１００ｍｇであってもよい。
【００２７】
また、カロテノイドの生産能力が高い微生物とは、本願の実施例の＜１＞に記載の方法にて測定した時に、１ｇの乾燥菌体に含まれるカロテノイドの量が、５ｍｇ以上、好ましくは６ｍｇ以上、より好ましくは７ｍｇ以上、より好ましくは８ｍｇ以上、より好ましくは９ｍｇ以上、最も好ましくは１０ｍｇ以上である微生物を意図する。なお、１ｇの乾燥菌体に含まれるカロテノイドの量の上限値は、特に限定されないが、例えば、５００ｍｇ、３００ｍｇ、２００ｍｇ、１００ｍｇ、または５０ｍｇであってもよい。
【００２８】
遺伝子が導入される微生物のより具体的な例としては、ロドトルラ属に属する微生物を挙げることができる。
【００２９】
更に具体的に、ロドトルラ属に属する微生物としては、ロドトルラ・アウランティアカ（Rhodotorula aurantiaca）、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum）、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）、ロドトルラ・アクタ（Rhodotorula acuta）、ロドトルラ・アラウカリアエ（Rhodotorula araucariae）、ロドトルラ・アルメニアカ（Rhodotorula armeniaca）、ロドトルラ・オーランティアカ（Rhodotorula aurantiaca）、ロドトルラ・アウリクラリアエ（Rhodotorula auriculariae）、ロドトルラ・バカラム（Rhodotorula bacarum）、ロドトルラ・ベンチカ（Rhodotorula benthica）、ロドトルラ・ビオルゲイ（Rhodotorula biourgei）、ロドトルラ・ボゴリエンシス（Rhodotorula bogoriensis）、ロドトルラ・ブロンキアリス（Rhodotorula bronchialis）、ロドトルラ・ブッフォニ（Rhodotorula buffonii）、ロドトルラ・カリプトジニア（Rhodotorula calyptogenae）、ロドトルラ・グラディエンシス（Rhodotorula cladiensis）、ロドトルラ・クレゾリカ（Rhodotorula cresolica）、ロドトルラ・クロセア（Rhodotorula crocea）、ロドトルラ・シクロクラスティカ（Rhodotorula cycloclastica）、ロドトルラ・エベルグラディエンシス（Rhodotorula evergladiensis）、ロドトルラ・フェルリカ（Rhodotorula ferulica）、ロドトルラ・フォリオルム（Rhodotorula foliorum）、ロドトルラ・フラガリア（Rhodotorula fragaria）、ロドトルラ・フジサネンシス（Rhodotorula fujisanensis）、ロドトルラ・フトロネンシス（Rhodotorula futronensis）、ロドトルラ・ゲラティノーサ（Rhodotorula gelatinosa）、ロドトルラ・グラシアリス（Rhodotorula glacialis）、ロドトルラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis）、ロドトルラ・グラミニス（Rhodotorula graminis）、ロドトルラ・グリンベルグシ（Rhodotorula grinbergsii）、ロドトルラ・ヒマラエンシス（Rhodotorula himalayensis）、ロドトルラ・ヒヌレア（Rhodotorula hinnulea）、ロドトルラ・ヒストリティカ（Rhodotorula histolytica）、ロドトルラ・ヒロフィラ（Rhodotorula hylophila）、ロドトルラ・インカルナタ（Rhodotorula incarnata）、ロドトルラ・インゲニオサ（Rhodotorula ingeniosa）、ロドトルラ・ジャワニカ（Rhodotorula javanica）、ロドトルラ・コイシカウエンシス（Rhodotorula koishikawensis）、ロドトルラ・ラクトーサ（Rhodotorula lactosa）、ロドトルラ・ラメリブラキア（Rhodotorula lamellibrachiae）、ロドトルラ・ラリニギス（Rhodotorula laryngis）、ロドトルラ・リグノフィラ（Rhodotorula lignophila）、ロドトルラ・リニ（Rhodotorula lini）、ロドトルラ・ロンジシマ（Rhodotorula longissima）、ロドトルラ・ラドウィギー（Rhodotorula ludwigii）、ロドトルラ・リシノフィラ（Rhodotorula lysinophila）、ロドトルラ・マリナ（Rhodotorula marina）、ロドトルラ・マトリテンシス（Rhodotorula matritensis）、ロドトルラ・メリ（Rhodotorula meli）、ロドトルラ・ミヌタ（Rhodotorula minuta）、ロドトルラ・ムシラジノーサ（Rhodotorula mucilaginosa）、ロドトルラ・ニテンス（Rhodotorula nitens）、ロドトルラ・ノトファギ（Rhodotorula nothofagi）、ロドトルラ・オリーゼ（Rhodotorula oryzae）、ロドトルラ・パシフィカ（Rhodotorula pacifica）、ロドトルラ・パリダ（Rhodotorula pallida）、ロドトルラ・フィリア（Rhodotorula philyla）、ロドトルラ・ピリマナ（Rhodotorula pilimanae）、ロドトルラ・ピニコラ（Rhodotorula pinicola）、ロドトルラ・プシクロフェノリカ（Rhodotorula psychrophenolica）、ロドトルラ・プシクロフィラ（Rhodotorula psychrophila）、ロドトルラ・パスツーラ（Rhodotorula pustula）、ロドトルラ・レチノフィラ（Rhodotorula retinophila）、ロドトルラ・ロスラタ（Rhodotorula rosulata）、ロドトルラ・ルブラ（Rhodotorula rubra）、ロドトルラ・ルブロルゴサ（Rhodotorula rubrorugosa）、ロドトルラ・シルベストリス（Rhodotorula silvestris）、ロドトルラ・シネンシス（Rhodotorula sinensis）、ロドトルラ・スルーフィエ（Rhodotorula slooffiae）、ロドトルラ・ソンキー（Rhodotorula sonckii）、ロドトルラ・ストラミニア（Rhodotorula straminea）、ロドトルラ・スベリコラ（Rhodotorula subericola）、ロドトルラ・テルペノイダリス（Rhodotorula terpenoidalis）、ロドトルラ・テリア（Rhodotorula terrea）、ロドトルラ・トキオエンシス（Rhodotorula tokyoensis）、ロドトルラ・ウルザマエ（Rhodotorula ulzamae）、ロドトルラ・バニリカ（Rhodotorula vanillica）、ロドトルラ・ブイレミニ（Rhodotorula vuilleminii）、ロドトルラ・ヤロウィ（Rhodotorula yarrowii）、ロドトルラ・ユンナネンシス（Rhodotorula yunnanensis）、および、ロドトルラ・ゾルティー（Rhodotorula zsoltii）を挙げることができる。
【００３０】
これらの微生物の中では、ロドトルラ・アウランティアカ（Rhodotorula aurantiaca）、または、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis）が好ましい。その理由は、これらの微生物は、他の微生物を比較して、脂肪酸、ステロイド、または、カロテノイドの生産量が高いからである。
【００３１】
上述した微生物は、以下の機関から入手可能である。つまり、（１）PYCC（Portuguese Yeast Culture Collection）、（２）NBRC NITE Biological Resource Center、（３）CBS CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre（An institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences）、（４）BCRC Bioresource Collection and Research Center、（５）DBVPG（Industrial Yeasts Collection）、（６）DSM DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（７）JCM（Japan Collection of Microorganisms）、（８）KCTC（Korean Collection for Type Cultures）、（９）MUCL（（Agro）industrial fungi & yeasts collection）、（１０）NRRL（ARS Culture Collection）、（１１）CCTCC（China Center for Type Culture Collection）、（１２）ATCC（American Type Culture Collection）、（１３）CECT（Spanish Type Culture Collection）、（１４）RIFY Research Institute of Fermentation、（１５）VKM All-Russian Collection of Microorganisms、（１６）IGC Center of Biology, Gulbenkian Institute of Science、（１７）CCY Culture Collection of Yeasts, Institute of Chemistry, Slovak Academy of Sciences、（１８）NCYC National Collection of Yeast Cultures、（１９）NCIM National Collection of Industrial Microorganisms, National Chemical Laboratory、（２０）CGMCC China General Microbiological Culture Collection Center, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences、（２１）NCAIM National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms、（２２）VTT VTT Culture Collection, VTT Technical Research Center of Finland、または、（２３）FMJ Faculty of Medicine, Juntendo University、にて、上述した微生物を入手可能である。
【００３２】
本実施の形態の形質転換体は、宿主の微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素を発現している。つまり、本実施の形態の形質転換体は、ロドトルラ属に属していない微生物に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素を発現している。当該酵素は、宿主に元々存在する酵素が触媒作用を及ぼすことが無かった反応に対して触媒作用を及ぼすものであることが好ましい。上記構成であれば、宿主内に元々存在しなかった新たな代謝経路を形質転換体内に形成することができるので、所望のテルペノイド（例えば、新規なテルペノイド）を効率よく生産することができる。また、宿主内に存在する酵素と同じ酵素活性を有する酵素であって、宿主の微生物とは異なる生物種に由来する酵素（例えば、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素）を発現させることで、所望のテルペノイド（例えば、新規なテルペノイド）を効率よく生産することができる。宿主の微生物とは異なる生物種は、特に限定されず、細菌、酵母、糸状菌、藻類、昆虫、植物、または動物であってもよい。
【００３３】
上記テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素は、特に限定されないが、その一例として、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、または、カロテノイドを生合成する酵素、または、基質とする酵素を挙げることができる。更に具体的に、上記酵素は、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、または、カロテノイドに、様々な官能基（例えば、−ＣＯ−、−ＯＨ、−Ｏ−、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｃ＝Ｃ＝Ｃ−、−Ｏ−Ｏ−、−ＮＨ２、または、−Ｃ≡Ｃ−）を導入する酵素であってもよい。
【００３４】
基質となるモノテルペノイドは、特に限定されず、その一例として、ミルセン、リナロール、ネロール、リモネン、カルボン、α−ピネン、メンタン、メントール、ゲラニオール、シトロネロール、シトロネラール、シトラール、シトロネリルアセテート、ゲラニルアセテート、リナリルアセテート、およびカンファーを挙げることができる。
【００３５】
基質となるセスキテルペノイドは、特に限定されず、その一例として、アモルファジエン、ゲルマクレン、エレメン、オイデスメン、グアイエン、ヒマカレン、オイデスモール、ファルネソール、カジネン、フムレン、ヌートカトン、セドロール、グアイアズレン、バーノレピン、プタキロシド、ペリプラノン、アブシシン酸、およびゴシポールを挙げることができる。
【００３６】
基質となるジテルペノイドは、特に限定されず、その一例として、レチノール、レチナール、α−トコフェノール、フィトール、アビエチン酸、ジベレリン、インゲノール、アビエタジエン、タキサジエン、およびモミラクトンを挙げることができる。
【００３７】
基質となるトリテルペノイドは、特に限定されず、ステロイド類も含みその一例として、スクアレン、アンブレイン、エルゴステロール、ラノステロール、コレステロール、７−デヒドロコレステロール、コレカルシフェロール、オレアノール、ボスウェリン酸、β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール、β−アミリン、α−アミリン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、ルペオールおよびガノデリン酸を挙げることができる。
【００３８】
基質となるカロテノイドは、特に限定されず、その一例として、カロテン類（例えば、αカロテン、βカロテン、γカロテン、およびδカロテン）、リコペン、トルレン、およびキサントフィル類（例えば、ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アスタキサンチン、アンテラキサンチン、およびビオラキサンチン）を挙げることができる。
【００３９】
上記テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素の更に具体的な例としては、特に限定されないが、その一例として、カロテノイドケトラーゼ（ｃｒｔＷ、または、ｃｒｔＯ）、カロテノイドサイクラーゼ、モノテルペノイドシンターゼ、セスキテルペノイドシンターゼ、ジテルペノイドシンターゼ、および、トリテルペノイドシンターゼを挙げることができる。
【００４０】
また、上記テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素の別の例として、カロテノイドジオキシゲナーゼ、カロテノイドヒドロキシラーゼ、カロテノイドオキシゲナーゼ、カロテノイドデサチュラーゼ、カロテノイドメチルトランスフェラーゼ、カロテノイドヒドラターゼ、カロテノイドオキシドレダクターゼ、カロテノイドイソメラーゼ、カロテノイドグリコシルトランスフェラーゼ、カロテノイドエポキシダーゼ、カロテノイドデエポキシダーゼ、カロテノイドデヒドロゲナーゼ、モノテルペノイドジオキシゲナーゼ、モノテルペノイドヒドロキシラーゼ、モノテルペノイドオキシゲナーゼ、モノテルペノイドデサチュラーゼ、モノテルペノイドメチルトランスフェラーゼ、モノテルペノイドヒドラターゼ、モノテルペノイドオキシドレダクターゼ、モノテルペノイドイソメラーゼ、モノテルペノイドグリコシルトランスフェラーゼ、モノテルペノイドエポキシダーゼ、モノテルペノイドデエポキシダーゼ、モノテルペノイドデヒドロゲナーゼ、セスキテルペノイドジオキシゲナーゼ、セスキテルペノイドヒドロキシラーゼ、セスキテルペノイドオキシゲナーゼ、セスキテルペノイドデサチュラーゼ、セスキテルペノイドメチルトランスフェラーゼ、セスキテルペノイドヒドラターゼ、セスキテルペノイドオキシドレダクターゼ、セスキテルペノイドイソメラーゼ、セスキテルペノイドグリコシルトランスフェラーゼ、セスキテルペノイドエポキシダーゼ、セスキテルペノイドデエポキシダーゼ、セスキテルペノイドデヒドロゲナーゼ、ジテルペノイドジオキシゲナーゼ、ジテルペノイドヒドロキシラーゼ、ジテルペノイドオキシゲナーゼ、ジテルペノイドデサチュラーゼ、ジテルペノイドメチルトランスフェラーゼ、ジテルペノイドヒドラターゼ、ジテルペノイドオキシドレダクターゼ、ジテルペノイドイソメラーゼ、ジテルペノイドグリコシルトランスフェラーゼ、ジテルペノイドエポキシダーゼ、ジテルペノイドデエポキシダーゼ、ジテルペノイドデヒドロゲナーゼ、トリテルペノイドジオキシゲナーゼ、トリテルペノイドヒドロキシラーゼ、トリテルペノイドオキシゲナーゼ、トリテルペノイドデサチュラーゼ、トリテルペノイドメチルトランスフェラーゼ、トリテルペノイドヒドラターゼ、トリテルペノイドオキシドレダクターゼ、トリテルペノイドイソメラーゼ、トリテルペノイドグリコシルトランスフェラーゼ、トリテルペノイドエポキシダーゼ、トリテルペノイドデエポキシダーゼ、および、トリテルペノイドデヒドロゲナーゼを挙げることができる。
【００４１】
上記カロテノイドケトラーゼは、例えば、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかに示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カロテノイドケトラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、カロテノイドケトラーゼ活性を有するタンパク質。
【００４２】
なお、タンパク質がカロテノイドケトラーゼ活性を有するか否かは、周知の方法によって確認することができる。例えば、所望のタンパク質と基質とを接触させた後、当該基質の赤外線スペクトル、または核磁気共鳴スペクトルを解析し、基質に「−ＣＯ−」が導入されていることが確認できれば、タンパク質がカロテノイドケトラーゼ活性を有していると判定することができる。あるいは、所望のタンパク質と基質とを接触させた後、当該基質と対照物質（基質に「−ＣＯ−」が導入されている物質）とをクロマトグラフィーにて分離し、当該分離の過程において、基質と対照物質とが同じ挙動（例えば、同じ溶出液にて溶出される）をとれば、タンパク質がカロテノイドケトラーゼ活性を有していると判定することができる。
【００４３】
上記カロテノイドサイクラーゼは、例えば、以下の（ｄ）〜（ｆ）の何れかに示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（ｄ）〜（ｆ）の何れかに示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ｄ）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｅ）配列番号７で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、カロテノイドサイクラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｆ）配列番号７で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、カロテノイドサイクラーゼ活性を有するタンパク質。
【００４４】
上記モノテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（ｇ）〜（ｉ）の何れかに示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（ｇ）〜（ｉ）の何れかに示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ｇ）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｈ）配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、モノテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
（ｉ）配列番号９で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、モノテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
【００４５】
上記セスキテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（ｊ）〜（ｌ）の何れかに示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（ｊ）〜（ｌ）の何れかに示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ｊ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｋ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、セスキテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
（ｌ）配列番号１１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、セスキテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
【００４６】
上記ジテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（ｍ）〜（ｏ）の何れかに示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（ｍ）〜（ｏ）の何れかに示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ｍ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｎ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ジテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
（ｏ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ジテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
【００４７】
上記トリテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（ｐ）〜（ｒ）の何れかに示されるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（ｐ）〜（ｒ）の何れかに示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ｐ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｑ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、トリテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
（ｒ）配列番号１５で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、トリテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質。
【００４８】
なお、タンパク質が、カロテノイドサイクラーゼ活性、モノテルペノイドシンターゼ活性、セスキテルペノイドシンターゼ活性、ジテルペノイドシンターゼ活性、または、トリテルペノイドシンターゼ活性を有するか否かは、周知の方法によって確認することができる。例えば、所望のタンパク質と基質とを接触させた後、当該基質の赤外線スペクトル、または核磁気共鳴スペクトルを取得し、これらのスペクトルを、対照物質の赤外線スペクトル、または核磁気共鳴スペクトルと比較することによって確認することができる。あるいは、所望のタンパク質と基質とを接触させた後、当該基質と対照物質（基質に「−ＣＯ−」が導入されている物質）とをクロマトグラフィーにて分離し、当該分離の過程において、基質と対照物質とが同じ挙動（例えば、同じ溶出液にて溶出される）をとれば、タンパク質が、カロテノイドサイクラーゼ活性、モノテルペノイドシンターゼ活性、セスキテルペノイドシンターゼ活性、ジテルペノイドシンターゼ活性、または、トリテルペノイドシンターゼ活性を有していると判定することができる。
【００４９】
本明細書における「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」では、欠失、置換若しくは付加が生じる位置は特に限定されない。
【００５０】
また、「１若しくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、２０個以内、１９個以内、１８個以内、１７個以内、１６個以内、１５個以内、１４個以内、１３個以内、１２個以内、１１個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、２個以内、または、１個のアミノ酸であり得る。
【００５１】
アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。なお、保存的置換とは、特定のアミノ酸から、当該アミノ酸と同様な化学的性質および／または構造を有する他のアミノ酸に置換されることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度（疎水性および親水性）、電荷（中性、酸性および塩基性）が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、または、側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。
【００５２】
保存的置換の例としては、例えば、セリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンアミノとの置換、が挙げられる。勿論、本発明は、これらの置換に限定されない。
【００５３】
なお、アミノ酸配列の相同性は、BLASTN（核酸レベル）やBLASTX（アミノ酸レベル）のプログラム(Altschul et al. J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990) を利用して決定することができる。該プログラムは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-2268, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877, 1993) に基づいている。BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore ＝１００、wordlength ＝１２とする。また、BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore ＝５０、wordlength ＝３とする。また、Gapped BLASTプログラムを用いて、アミノ酸配列を解析する場合は、Altschulら（Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997）に記載されているように行うことができる。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。比較対象の塩基配列またはアミノ酸配列を最適な状態にアラインメントするために、付加または欠失（例えば、ギャップ等）を許容してもよい。
【００５４】
更に具体的に、上記カロテノイドケトラーゼは、例えば、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（Ａ）または（Ｂ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（Ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（Ｂ）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、カロテノイドケトラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５５】
上記カロテノイドサイクラーゼは、例えば、以下の（Ｃ）または（Ｄ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（Ｃ）または（Ｄ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（Ｃ）配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（Ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、カロテノイドサイクラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５６】
上記モノテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（Ｅ）または（Ｆ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（Ｅ）または（Ｆ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（Ｅ）配列番号１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（Ｆ）配列番号１０で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、モノテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５７】
上記セスキテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（Ｇ）または（Ｈ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（Ｇ）または（Ｈ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（Ｇ）配列番号１２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（Ｈ）配列番号１２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、セスキテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５８】
上記ジテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（Ｉ）または（Ｊ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（Ｉ）または（Ｊ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（Ｉ）配列番号１４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（Ｊ）配列番号１４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００５９】
上記トリテルペノイドシンターゼは、例えば、以下の（Ｋ）または（Ｌ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質からなるタンパク質、または、以下の（Ｋ）または（Ｌ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子にコードされるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（Ｋ）配列番号１６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（Ｌ）配列番号１６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、トリテルペノイドシンターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成され、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドが形成されない条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士、例えば完全にマッチしたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。
【００６１】
例えば、一例を示すと、０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６〜２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、１％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。
【００６２】
他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほど、特異性の高いハイブリダイズとなる。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。このことは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory（2001）等に記載されている。
【００６３】
本実施の形態の形質転換体は、特定の微生物に対して、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子を導入することによって作製され得る。
【００６４】
ロドトルラ属に属する微生物を形質転換するためのベクターは、これまで、未知であった。後述する実施例に示すように、プロモーター遺伝子、酵素をコードする遺伝子、および、ターミネーター遺伝子を連結してなるオペロンをｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ社製）へ挿入した後、オペロンのみをＰＣＲ法によって増幅する。増幅されたオペロンを精製した後、当該オペロンをロドトルラ属に属する微生物に導入することによって、所望の形質転換体を取得することができる。
【００６５】
本発明は、以下のように構成することもできる。
【００６６】
＜１＞本発明の形質転換体は、上記課題を解決するために、ロドトルラ（Rhodotorula）属に属する微生物に、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子が導入されているものであることを特徴としている。
【００６７】
＜２＞本発明の形質転換体では、上記テルペノイドは、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、または、カロテノイドであることが好ましい。
【００６８】
＜３＞本発明の形質転換体では、上記酵素は、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドサイクラーゼ、モノテルペノイドシンターゼ、セスキテルペノイドシンターゼ、ジテルペノイドシンターゼ、または、トリテルペノイドシンターゼであることが好ましい。
【００６９】
〔３．テルペノイドの製造方法〕
本実施の形態のテルペノイドの製造方法は、本発明の形質転換体を培養する培養工程と、培養工程にて得られた形質転換体からテルペノイドを回収する回収工程と、を有している。本発明の形質転換体については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
【００７０】
上記培養工程では、形質転換体を、固体培地を用いて培養（固体培養）してもよいし、液体培地を用いて培養（液体培養）してもよいが、形質転換体の培養スケール（換言すれば、テルペノイドの生産スケール）の調節の容易性、および、テルペノイド生産の低コスト化の観点からは、液体培地を用いて培養することが好ましい。また、液体培地を用いた培養であれば、形質転換体を連続培養することによって、テルペノイドの生産量を飛躍的に上げることができる。
【００７１】
上記培養工程に用いる培地、培養温度、および、培養時間は、宿主に応じて適宜選択することができる。培地としては、Ｆ培地、またはＹＰＤ培地を挙げることができるが、本発明は、これらの培地に限定されない。培養温度としては、１５〜４８℃、または２６〜３７℃を挙げることができるが、本発明は、これらの培養温度に限定されない。培養時間としては、１２〜１２０時間、７２〜９６時間、または９６時間以上を挙げることができるが、本発明は、これらの培養時間に限定されない。
【００７２】
本実施の形態のテルペノイドの製造方法は、上述した培養工程の後に、培養工程にて得られた形質転換体からテルペノイドを回収する回収工程を有している。回収工程の具体的な構成は特に限定されないが、回収工程は、以下に説明する抽出工程、および／または、精製工程を包含する工程であってもよい。
【００７３】
本実施の形態のテルペノイドの製造方法は、上述した培養工程の後に、形質転換体からテルペノイドを抽出するための抽出工程を有していてもよい。当該構成であれば、純度の高いテルペノイドを取得することができる。
【００７４】
抽出工程では、形質転換体と有機溶媒とを接触させ、形質転換体によって生産されたテルペノイドを有機溶媒中に移行させる。そして、当該有機溶媒を回収することによって、テルペノイドを回収することができる。また、抽出工程では、炭酸ガス、メタノール、および水等を用いて、テルペノイドを超臨界抽出することもできる。
【００７５】
形質転換体と有機溶媒とを接触させる場合には、形質転換体を含む培地と有機溶媒とを混合してもよいし、形質転換体を含む培地を遠心分離して形質転換体を回収し、当該形質転換体を水に懸濁した後、当該水と有機溶媒とを混合してもよい。より純度の高いテルペノイドを取得するという観点からは、形質転換体を含む培地を遠心分離して形質転換体を回収し、当該形質転換体を水に懸濁した後、当該水と有機溶媒とを混合する方が好ましい。
【００７６】
上述した有機溶媒の種類は、テルペノイドの種類に応じて、適宜選択すればよい。有機溶媒としては、例えば、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチルメチルケトン、アセトン、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルフォキシド、クロロフォルム、ジクロロメタン、四塩化炭素、アセトニトリル、または、ピリジンを単独で使用してもよいし、これらの溶媒の少なくとも２つを混合して使用してもよい。
【００７７】
本実施の形態のテルペノイドの製造方法は、上述した抽出工程の後に、抽出物に含まれるテルペノイドをクロマトグラフィーで精製する精製工程を有していてもよい。当該構成であれば、更に純度の高いテルペノイドを取得することができる。
【００７８】
この際使用される分離用の担体としては、例えば、シリカゲル、硝酸銀添加シリカゲル、オクタデシルジメチルシリル修飾シリカゲル、ジメチルシリル修飾シリカゲル、オクチルジメチルシリル修飾シリカゲル、プロピルアミノ修飾シリカゲル、シアノプロピル修飾シリカゲル、フェニル修飾シリカゲル等の各種化学修飾シリカゲル、アルミナ、活性炭等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本発明は、以下のように構成することもできる。
【００８０】
＜４＞本発明のテルペノイドの製造方法は、上記課題を解決するために、本発明の形質転換体を培養する培養工程と、上記培養工程にて得られた形質転換体からテルペノイドを回収する回収工程とを有することを特徴としている。
【００８１】
＜５＞本発明のテルペノイドの製造方法では、上記培養工程にて、上記形質転換体を液体培養することが好ましい。
【実施例】
【００８２】
＜１．脂肪酸、ステロイド、およびカロテノイドを多量に生産する微生物の探索＞
様々な微生物（例えば、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アウランティアカ、ロドトルラ・グルチニス、ロドトルラ・アケニオラム）、サッカロマイセス・セルビシア（Saccharomyces cerevisiae）、ヤロビア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidas））を、各々、Ｆ培地中で、２５℃の条件下で１２０時間培養した。【００８３】
なお、ロドトルラ・アウランティアカは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用い、ロドトルラ・グルチニスは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用い、ロドトルラ・アケニオラムは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用い、サッカロマイセス・セルビシアは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用い、ヤロビア・リポリチカは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用い、ロドスポリジウム・トルロイデスは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用い、クリプトコッカス・アルビダスは、NBRC（NITE Biological Resource Center）から購入したものを用いた。【００８４】
培養の後、遠心分離によって各菌体を回収し、回収した菌体を乾燥させた。その後、１ｇの乾燥菌体に含まれる、脂肪酸、ステロイドおよびカロテノイドの量を、周知の方法（例えば、日本生化学会編：新生化学実験講座４  脂質ＩＩ  リン脂質、東京化学同人（1991）、および、日本生化学会編：基礎生化学実験法  第５巻  脂質・糖質・複合糖質、東京化学同人（2000）参照）にしたがって測定した。測定結果を、下記の表１に示す。【００８５】
表１に示すように、ロドトルラ属に属する株は、カロテノイドの生産能力が高いことが明らかになった。【００８６】
【表１】
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＜２．テルペノイドを基質とする酵素（ｃｒｔＷ）をコードする遺伝子の導入＞
まず、周知の方法にしたがって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）とブレバンディモナス属（Brevundimonas sp.）に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼ遺伝子（ｃｒｔＷ）が挿入されたベクター１を作製した。なお、ベクター１の基本骨格としては、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ株式会社製）を用いた。【００８７】
ブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼ遺伝子の具体的な塩基配列を配列番号２にて示し、当該遺伝子にコードされているカロテノイドケトラーゼの具体的なアミノ酸配列を配列番号１にて示す。【００８８】
また、ブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼが触媒する反応を図４に示す。図４に示すように、ブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼ（ｃｒｔＷ）は、基質であるβ−カロテンにケト基を導入すると考えられる。【００８９】
ベクター１では、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。【００９０】
次いで、上述したベクター１を、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum））に導入した。以下に、導入方法を説明する。【００９１】
まず、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地（組成：ＹＰＤ液体培地１Ｌあたり、Bacto peptoneを２０ｇ、Yeast extractを１０ｇ、および、４０％グルコース溶液を５０ｍＬ、含む）中にて、上記微生物を２〜３日間培養した。【００９２】
培養後の微生物の一部を、５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ液体培地に加え、２０〜２８℃にて２４時間培養した。培養後、増殖した微生物を遠心分離によって回収した。回収した微生物を、滅菌された蒸留水に懸濁して洗浄した後、当該微生物を、遠心分離によって回収した。【００９３】
回収された微生物を、１ｍＬの０．１Ｍ  ＬｉＡｃ溶液中に懸濁した。微生物を含有するＬｉＡｃ溶液を５０μＬ分取し、分取された当該溶液に、７０％  ＰＥＧ＃４０００溶液１７１μＬ、滅菌された蒸留水６９μＬ、２Ｍ  ＬｉＡｃ溶液１５μＬ、Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ溶液（２ｍｇ−Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＭＡ／ｍＬ）１５μＬ、および、ベクター１１０μｇの混合物を加えた。【００９４】
上記混合溶液を２０〜２８℃にて数時間静置した後、当該混合溶液に対して３０〜４０℃にて５分間のヒートショックを加えた。ヒートショックを加えた後の混合溶液から微生物を遠心分離にて回収し、当該微生物を、ＹＰＤ液体培地中で数時間培養した。培養後の微生物を遠心分離によって回収し、当該微生物を、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ固体培地上で培養した。【００９５】
数日間の培養の後、ＹＰＤ固体培地上に現れたコロニーを形成する形質転換体を複数ピックアップし、周知のコロニーＰＣＲ法にて、各形質転換体中にハイグロマイシン耐性遺伝子とカロテノイドケトラーゼ遺伝子とが導入されているか否か確認した。以下に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出に用いたプライマーセット１、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の検出に用いたプライマーセット２、および、ＰＣＲの反応条件を示す。【００９６】
＜プライマーセット１＞
フォワードプライマー  ：５’−atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg−３’（配列番号３）
リバースプライマー    ：５’−gttagcctcccccatctcccgatccccacg−３’（配列番号４）
＜プライマーセット２＞
フォワードプライマー  ：５’−atgaccgccgccgtcgccgagccccgcatc−３’（配列番号５）
リバースプライマー    ：５’−agactcgccgcgccacaaacgccaccaggg−３’（配列番号６）
＜ＰＣＲの反応条件＞
６８℃にて１．５分間の反応（アニーリング反応、および、伸長反応を兼ねた反応）、および、９８℃にて１０秒間の変性反応からなる反応サイクルを３０回繰り返す反応条件。【００９７】
図１に、コロニーＰＣＲの結果を示す。図１において、左側の写真は、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出結果を示している。また、図１において、「Ｍ」は、１ｋｂ  ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」〜「８」は、各形質転換体に対応している。以下、「２」〜「８」の形質転換体の各々を、「Ｗｈｙｇ１」〜「Ｗｈｙｇ７」とも呼ぶ。【００９８】
図１に示すように、ピックアップされた７個の形質転換体の各々には、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならず、カロテノイドケトラーゼ遺伝子も導入されていることが明らかになった。【００９９】
次いで、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびカロテノイドケトラーゼ遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か、試験した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。【０１００】
上述した「２」〜「８」に対応する形質転換体の各々を、１００ｍＬのＦ培地（組成：Ｆ培地１Ｌあたり、グルコースを４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．１ｇ、ＮａＣｌを０．１ｇ、および、Yeast extractを１．５ｇ含み、ｐＨ５．５）に植菌した。【０１０１】
上記形質転換体を２５℃、１８０ｒｐｍにて３日間培養した後、当該形質転換体を遠心分離によって回収した。【０１０２】
市販のキット（ニッポンジーン社製のＲＮＡ抽出キット  ＩＳＯＧＥＮ  ＩＩ）を用いて、各形質転換体からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出するとともに、当該Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。なお、抽出および合成の具体的な方法は、キットに添付のプロトコールにしたがった。【０１０３】
上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびカロテノイドケトラーゼ遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か確認した。なお、当該ＰＣＲでは、プラーマーとして、上述したプライマーセット１またはプライマーセット２を用い、かつ、反応条件として、コロニーＰＣＲ法で採用したものと同じ反応条件を用いた。【０１０４】
図２に試験結果を示す。図２において、左側の写真は、カロテノイドケトラーゼ遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示している。また、図２において、「Ｍ」は、１ｋｂ  ラダーマーカーに対応し、「１」〜「７」は、形質転換体である「Ｗｈｙｇ１」〜「Ｗｈｙｇ７」に対応し、「８」は、ポジティブコントロールに対応し、「９」は、カロテノイドケトラーゼ遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていない野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）に対応している。【０１０５】
図２に示すように、ピックアップされた７個の形質転換体の各々では、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならずカロテノイドケトラーゼ遺伝子からも、ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。【０１０６】
＜３．形質転換体からのカロテノイドの抽出＞
取得された形質転換体、および、野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）の各々から、テルペノイドを精製した。以下に、精製方法について説明する。【０１０７】
まず、各微生物をＦ培地（具体的には、液体状のＦ培地（換言すれば、液体培地）、または、固体状のＦ培地（換言すれば、固体培地））を用いて培養した後、増殖した各微生物を遠心分離によって回収した。回収した１ｇ（湿重量）の微生物に対して、（ａ）１ｍＬの蒸留水または有機溶媒を加え、更に（ｂ）５ｍＬの３％  Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ−ＭｅＯＨ溶液、および、（ｃ）１ｍＬの６０％  ＫＯＨ溶液を加えた後、当該混合溶液を３０分間、７０℃に加熱した。加熱後の混合溶液に対して、更に（ｄ）１１ｍＬの１％  ＮａＣｌ溶液を加えた。【０１０８】
当該混合溶液に有機溶媒を加えて撹拌した後、静置し、水の層から分離した有機溶媒の層を回収した。更に、残った水の層に対して、再び有機溶媒を加えて撹拌した後、静置し、水の層から分離した有機溶媒の層を回収した。有機溶媒としては、２ｍＬのｎ−Ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ溶液（ｎ−Ｈｅｘａｎｅ：ＥｔＯＡｃ＝９：１）と、２ｍＬのＥｔ２Ｏとの混合物を用いた。【０１０９】
回収した２つの有機溶媒の層を合わせて１つとし、減圧下で有機溶媒を蒸発させて、残渣を回収した。当該残渣を２ｍＬの有機溶媒（１ｍＬのベンゼンと、１ｍＬの３％  Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ−ＭｅＯＨ溶液との混合溶液）に溶解した。【０１１０】
抽出操作の過程で水の層に残った菌体を回収したところ、野生型のロドトルラ属に属する微生物の菌体と比較して、形質転換体の菌体は、より深い赤色を呈していた。また、抽出操作で得られた残渣を有機溶媒に溶解した溶液を確認したところ、野生型のロドトルラ属に属する微生物に由来する溶液と比較して、形質転換体に由来する溶液は、より深い赤色を呈していた。なお、これらの現象は、液体培地を用いた場合も、固体培地を用いた場合も、確認された。これらのことは、形質転換体が、テルペノイドの中でも特にカロテノイドを生産したことを示唆している。【０１１１】
＜４．形質転換体が生産するカロテノイドの分析＞
抽出操作で得られた残渣をＨＰＬＣ（high-performance liquid chromatography）に供し、残渣に含まれるカロテノイドを分析した。【０１１２】
以下に、ＨＰＣＬの分析条件を示す；
カラム        ：ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）、
カラム温度    ：３０℃、
溶出溶媒の流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、
検出方法      ：４５０ｎｍ（ＶＩＳ）、
外部標準      ：β−カロテン。【０１１３】
溶出溶媒としては、溶媒Ａ、溶媒Ｂおよび溶媒Ｃを所望の比率で含有する溶出溶媒を用い、経時的に溶出溶媒中に含まれる各溶媒の比率を変化させながら、溶出操作を行った。【０１１４】
以下に、溶媒Ａ〜溶媒Ｃの成分を示す；
溶媒Ａ：水、
溶媒Ｂ：メタノール、
溶媒Ｃ：アセトン。【０１１５】
以下の表２に、溶出溶媒中に含まれる溶媒Ａ〜溶媒Ｃの比率（％）の経時的な変化（グラジエント溶出のプログラム）を示す。【０１１６】
【表２】
2017047651.tif 000003
図３に、残渣に含まれている成分に関する、ＨＰＬＣによる分析結果を示す。更に、検出された４５０ｎｍ（ＶＩＳ）に基づいて、以下のＡ値〜Ｆ値をβ-カロテン相当量として算出した。その結果を、表３に示す。
Ａ値：湿菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／ｇ−ＦＷ］、
Ｂ値：乾燥菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／ｇ−ＤＣＷ］、
Ｃ値：培地１Ｌあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／Ｌ］、
Ｄ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるβ−カロテンおよびβ−カロテンの異性体の量［ｍｇ／ｇ−ＦＷ］、
Ｅ値：湿菌体１ｇあたりに含まれる目的のカロテノイド（図３中の「酸化物」）の量［ｍｇ／ｇ−ＦＷ］、
Ｆ値：β−カロテンおよびβ−カロテンの異性体から、目的のカロテノイド（図３中の「カンタキサンチン」および「酸化物」）への変換率［％］。【０１１７】
【表３】
2017047651.tif 000004
形質転換体に由来する残渣を分析した場合には、カロテノイド（図３中の「カンタキサンチン」および「酸化物」）に対応するピークが検出されたのに対し、野生型のロドトルラ属に属する微生物に由来する残渣を分析した場合には、カロテノイドに対応するピークが検出されなかった（Ｎ．Ｄ．）。このことは、形質転換体が、野生型のロドトルラ属に属する微生物では生産されないカロテノイドを生産し得ることを示している。【０１１８】
また、液体培地で培養した形質転換体に由来する残渣を分析した時に検出される、カロテノイドに対応するピークは、固体培地で培養した形質転換体に由来する残渣を分析した時に検出される、カロテノイドに対応するピークと比較して、高かった。このことは、液体培地で培養した形質転換体が、固体培地で培養した形質転換体と比較して、より多くのカロテノイドを生産し得ることを示している。【０１１９】
また、液体培地で培養した形質転換体に由来する残渣を分析した時に検出される、β−カロテンおよびβ−カロテンの異性体に対応すると考えられるピークは、同条件下で培養した野生株に由来する残渣を分析した時に検出される、β−カロテンおよびβ−カロテンの異性体に対応すると考えられるピークと比較して、高かった。このことは、液体培地で培養した形質転換体が、同条件下で培養した野生株と比較して、より多くのβ−カロテンおよびβ−カロテンの異性体を生産し得ること（換言すれば、テルペノイドの合成経路をより活性化し得ること）を示している。【０１２０】
＜５．テルペノイドを基質とする酵素（ｃｒｔＹ）をコードする遺伝子の導入＞
まず、周知の方法にしたがって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）とパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ遺伝子（ｃｒｔＹ）が挿入されたベクター２を作製した。なお、ベクター２の基本骨格としては、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ株式会社製）を用いた。【０１２１】
パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ遺伝子の具体的な塩基配列を配列番号８にて示し、当該遺伝子にコードされているカロテノイドサイクラーゼの具体的なアミノ酸配列を配列番号７にて示す。【０１２２】
また、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼが触媒する反応を図４に示す。図４に示すように、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ（ｃｒｔＹ）は、基質であるリコペンを環状化すると考えられる。【０１２３】
ベクター２では、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。【０１２４】
次いで、上述したベクター２を、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum））に導入した。以下に、導入方法を説明する。【０１２５】
まず、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地（組成：ＹＰＤ液体培地１Ｌあたり、Bacto peptoneを２０ｇ、Yeast extractを１０ｇ、および、４０％グルコース溶液を５０ｍＬ、含む）中にて、上記微生物を２〜３日間培養した。【０１２６】
培養後の微生物の一部を、５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ液体培地に加え、２０〜２８℃にて２４時間培養した。培養後、増殖した微生物を遠心分離によって回収した。回収した微生物を、滅菌された蒸留水に懸濁して洗浄した後、当該微生物を、遠心分離によって回収した。【０１２７】
回収された微生物を、１ｍＬの０．１Ｍ  ＬｉＡｃ溶液中に懸濁した。微生物を含有するＬｉＡｃ溶液を５０μＬ分取し、分取された当該溶液に、７０％  ＰＥＧ＃４０００溶液１７１μＬ、滅菌された蒸留水６９μＬ、２Ｍ  ＬｉＡｃ溶液１５μＬ、Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ溶液（２ｍｇ−Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＭＡ／ｍＬ）１５μＬ、および、ベクター１１０μｇの混合物を加えた。【０１２８】
上記混合溶液を２０〜２８℃にて数時間静置した後、当該混合溶液に対して３０〜４０℃にて５分間のヒートショックを加えた。ヒートショックを加えた後の混合溶液から微生物を遠心分離にて回収し、当該微生物を、ＹＰＤ液体培地中で数時間培養した。培養後の微生物を遠心分離によって回収し、当該微生物を、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ固体培地上で培養した。【０１２９】
数日間の培養の後、ＹＰＤ固体培地上に現れたコロニーを形成する形質転換体を複数ピックアップし、周知のコロニーＰＣＲ法にて、各形質転換体中にハイグロマイシン耐性遺伝子とカロテノイドサイクラーゼ遺伝子とが導入されているか否か確認した。以下に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出に用いたプライマーセット１、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の検出に用いたプライマーセット３、および、ＰＣＲの反応条件を示す。【０１３０】
＜プライマーセット１＞
フォワードプライマー  ：５’−atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg−３’（配列番号３）
リバースプライマー    ：５’−gttagcctcccccatctcccgatccccacg−３’（配列番号４）
＜プライマーセット３＞
フォワードプライマー  ：５’−atgcaaccgcattatgatctgattctcgtg−３’（配列番号１７）
リバースプライマー    ：５’−acgatgagtcgtcataatggcttgcaatgc−３’（配列番号１８）
＜ＰＣＲの反応条件＞
６８℃にて１．５分間の反応（アニーリング反応、および、伸長反応を兼ねた反応）、および、９８℃にて１０秒間の変性反応からなる反応サイクルを３０回繰り返す反応条件。【０１３１】
図５に、コロニーＰＣＲの結果を示す。図５おいて、左側の写真は、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出結果を示している。また、図５において、「Ｍ」は、１ｋｂ  ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」〜「４」は、各形質転換体に対応している。以下、「２」〜「４」の形質転換体の各々を、「Ｙｈｙｇ１」〜「Ｙｈｙｇ３」とも呼ぶ。【０１３２】
図５に示すように、ピックアップされた３個の形質転換体の各々には、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならず、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子も導入されていることが明らかになった。【０１３３】
次いで、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か、試験した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。【０１３４】
上述した「２」〜「４」に対応する形質転換体の各々を、１００ｍＬのＦ培地（組成：Ｆ培地１Ｌあたり、グルコースを４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．１ｇ、ＮａＣｌを０．１ｇ、および、Yeast extractを１．５ｇ含み、ｐＨ５．５）に植菌した。【０１３５】
上記形質転換体を２５℃、１８０ｒｐｍにて３日間培養した後、当該形質転換体を遠心分離によって回収した。【０１３６】
市販のキット（ニッポンジーン社製のＲＮＡ抽出キット  ＩＳＯＧＥＮ  ＩＩ）を用いて、各形質転換体からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出するとともに、当該Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。なお、抽出および合成の具体的な方法は、キットに添付のプロトコールにしたがった。【０１３７】
上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か確認した。なお、当該ＰＣＲでは、プライマーとして、上述したプライマーセット１またはプライマーセット３を用い、かつ、反応条件として、コロニーＰＣＲ法で採用したものと同じ反応条件を用いた。【０１３８】
図６に試験結果を示す。図６において、左側の写真は、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示している。また、図６において、「Ｍ」は、１ｋｂ  ラダーマーカーに対応し、「１」は、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていない野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）に対応し、「２」は、ポジティブコントロールに対応し、「３」〜「５」は、形質転換体である「Ｙｈｙｇ１」〜「Ｙｈｙｇ３」に対応している。【０１３９】
図６に示すように、ピックアップされた３個の形質転換体の各々では、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならずカロテノイドサイクラーゼ遺伝子からも、ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。【０１４０】
＜６．形質転換体が生産するカロテノイドの分析＞
＜３．形質転換体からのカロテノイドの抽出＞にて説明した抽出操作と同様の抽出操作で得られた残渣をＨＰＬＣ（high-performance liquid chromatography）に供し、残渣に含まれるカロテノイドを分析した。【０１４１】
以下に、ＨＰＣＬの分析条件を示す；
カラム        ：ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）、
カラム温度    ：３０℃、
溶出溶媒の流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、
検出方法      ：４５０ｎｍ（ＶＩＳ）、
外部標準      ：β−カロテン。【０１４２】
溶出溶媒としては、溶媒Ａおよび溶媒Ｂを所望の比率で含有する溶出溶媒を用い、経時的に溶出溶媒中に含まれる各溶媒の比率を変化させながら、溶出操作を行った。【０１４３】
以下に、溶媒Ａおよび溶媒Ｂの成分を示す；
溶媒Ａ：水／メタノール＝１０／９０、
溶媒Ｂ：メタノール／アセトン＝５０／５０。【０１４４】
以下の表４に、溶出溶媒中に含まれる溶媒Ａおよび溶媒Ｂの比率（％）の経時的な変化（グラジエント溶出のプログラム）を示す。【０１４５】
【表４】
2017047651.tif 000005
図７に、残渣に含まれている成分に関する、ＨＰＬＣによる分析結果を示す。更に、検出された４５０ｎｍ（ＶＩＳ）に基づいて、以下のＡ値〜Ｄ値をβ-カロテン相当量として算出した。その結果を、表５に示す。
Ａ値：湿菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／ｇ−ＦＷ］、
Ｂ値：乾燥菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／ｇ−ＤＣＷ］、
Ｃ値：培地１Ｌあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／Ｌ］、
Ｄ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるβ−カロテンの量［ｍｇ／ｇ−ＦＷ］。【０１４６】
【表５】
2017047651.tif 000006
残渣を分析した結果、形質転換体では、同条件で培養した野生型のロドトルラ属に属する微生物に比べて、湿菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量が２．４倍になっていた。このことは、形質転換体が、野生型のロドトルラ属に属する微生物と比較して、多くのカロテノイドを生産し得ることを示している。【０１４７】
＜７．テルペノイドを基質とする酵素（ｃｒｔＹ、およびｃｒｔＷ）をコードする遺伝子の導入＞
まず、周知の方法にしたがって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ遺伝子（ｃｒｔＹ）、および、ブレバンディモナス属（Brevundimonas sp.）に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼ遺伝子（ｃｒｔＷ）が挿入されたベクター３を作製した。なお、ベクター３の基本骨格としては、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ株式会社製）を用いた。【０１４８】
パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ遺伝子の具体的な塩基配列を配列番号８にて示し、当該遺伝子にコードされているカロテノイドサイクラーゼの具体的なアミノ酸配列を配列番号７にて示す。また、ブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼ遺伝子の具体的な塩基配列を配列番号２にて示し、当該遺伝子にコードされているカロテノイドケトラーゼの具体的なアミノ酸配列を配列番号１にて示す。【０１４９】
また、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ、およびブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼが触媒する反応を図４に示す。図４に示すように、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）に由来するカロテノイドサイクラーゼ（ｃｒｔＹ）は、基質であるリコペンを環状化すると考えられる。一方、ブレバンディモナス属に属する微生物に由来するカロテノイドケトラーゼ（ｃｒｔＷ）は、基質であるβ−カロテンにケト基を導入すると考えられる。【０１５０】
ベクター３では、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。【０１５１】
次いで、上述したベクター３を、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum））に導入した。以下に、導入方法を説明する。【０１５２】
まず、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地（組成：ＹＰＤ液体培地１Ｌあたり、Bacto peptoneを２０ｇ、Yeast extractを１０ｇ、および、４０％グルコース溶液を５０ｍＬ、含む）中にて、上記微生物を２〜３日間培養した。【０１５３】
培養後の微生物の一部を、５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ液体培地に加え、２０〜２８℃にて２４時間培養した。培養後、増殖した微生物を遠心分離によって回収した。回収した微生物を、滅菌された蒸留水に懸濁して洗浄した後、当該微生物を、遠心分離によって回収した。【０１５４】
回収された微生物を、１ｍＬの０．１Ｍ  ＬｉＡｃ溶液中に懸濁した。微生物を含有するＬｉＡｃ溶液を５０μＬ分取し、分取された当該溶液に、７０％  ＰＥＧ＃４０００溶液１７１μＬ、滅菌された蒸留水６９μＬ、２Ｍ  ＬｉＡｃ溶液１５μＬ、Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ溶液（２ｍｇ−Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＭＡ／ｍＬ）１５μＬ、および、ベクター１１０μｇの混合物を加えた。【０１５５】
上記混合溶液を２０〜２８℃にて数時間静置した後、当該混合溶液に対して３０〜４０℃にて５分間のヒートショックを加えた。ヒートショックを加えた後の混合溶液から微生物を遠心分離にて回収し、当該微生物を、ＹＰＤ液体培地中で数時間培養した。培養後の微生物を遠心分離によって回収し、当該微生物を、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ固体培地上で培養した。【０１５６】
数日間の培養の後、ＹＰＤ固体培地上に現れたコロニーを形成する形質転換体を複数ピックアップし、周知のコロニーＰＣＲ法にて、各形質転換体中にハイグロマイシン耐性遺伝子、カロテノイドケトラーゼ遺伝子、およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子が導入されているか否か確認した。以下に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出に用いたプライマーセット１、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の検出に用いたプライマーセット２、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の検出に用いたプライマーセット３、および、ＰＣＲの反応条件を示す。【０１５７】
＜プライマーセット１＞
フォワードプライマー  ：５’−atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg−３’（配列番号３）
リバースプライマー    ：５’−gttagcctcccccatctcccgatccccacg−３’（配列番号４）
＜プライマーセット２＞
フォワードプライマー  ：５’−atgaccgccgccgtcgccgagccccgcatc−３’（配列番号５）
リバースプライマー    ：５’−agactcgccgcgccacaaacgccaccaggg−３’（配列番号６）
＜プライマーセット３＞
フォワードプライマー  ：５’−atgcaaccgcattatgatctgattctcgtg−３’（配列番号１７）
リバースプライマー    ：５’−acgatgagtcgtcataatggcttgcaatgc−３’（配列番号１８）
＜ＰＣＲの反応条件＞
６８℃にて１．５分間の反応（アニーリング反応、および、伸長反応を兼ねた反応）、および、９８℃にて１０秒間の変性反応からなる反応サイクルを３０回繰り返す反応条件。【０１５８】
図８に、コロニーＰＣＲの結果を示す。図８において、左側の写真は、カロテノイドケトラーゼ遺伝子の検出結果を示し、中央の写真は、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子の検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出結果を示している。また、図８において、「Ｍ」は、１ｋｂ  ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」〜「４」は、各形質転換体に対応している。以下、「２」〜「４」の形質転換体の各々を、「ＷＹｈｙｇ１」〜「ＷＹｈｙｇ３」とも呼ぶ。【０１５９】
図８に示すように、ピックアップされた３個の形質転換体の各々には、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならず、カロテノイドケトラーゼ遺伝子、およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子も導入されていることが明らかになった。【０１６０】
次いで、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子、カロテノイドケトラーゼ遺伝子、およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か、試験した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。【０１６１】
上述した「２」〜「４」に対応する形質転換体の各々を、１００ｍＬのＦ培地（組成：Ｆ培地１Ｌあたり、グルコースを４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．１ｇ、ＮａＣｌを０．１ｇ、および、Yeast extractを１．５ｇ含み、ｐＨ５．５）に植菌した。【０１６２】
上記形質転換体を２５℃、１８０ｒｐｍにて３日間培養した後、当該形質転換体を遠心分離によって回収した。【０１６３】
市販のキット（ニッポンジーン社製のＲＮＡ抽出キット  ＩＳＯＧＥＮ  ＩＩ）を用いて、各形質転換体からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出するとともに、当該Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。なお、抽出および合成の具体的な方法は、キットに添付のプロトコールにしたがった。【０１６４】
上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子、カロテノイドケトラーゼ遺伝子、およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か確認した。なお、当該ＰＣＲでは、プライマーとして、上述したプライマーセット１、プライマーセット２、または、プライマーセット３を用い、かつ、反応条件として、コロニーＰＣＲ法で採用したものと同じ反応条件を用いた。【０１６５】
図９に試験結果を示す。図９において、左側の写真は、カロテノイドケトラーゼ遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、中央の写真は、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示している。また、図９において、「Ｍ」は、１ｋｂ  ラダーマーカーに対応し、「１」は、カロテノイドケトラーゼ遺伝子、カロテノイドサイクラーゼ遺伝子、およびハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていない野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）に対応し、「２」は、ポジティブコントロールに対応し、「３」〜「５」は、形質転換体である「ＷＹｈｙｇ１」〜「ＷＹｈｙｇ３」に対応している。【０１６６】
図９に示すように、ピックアップされた３個の形質転換体の各々では、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならずカロテノイドケトラーゼ遺伝、およびカロテノイドサイクラーゼ遺伝子からも、ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。【０１６７】
＜８．形質転換体が生産するカロテノイドの分析＞
＜３．形質転換体からのカロテノイドの抽出＞にて説明した抽出操作と同様の抽出操作で得られた残渣をＨＰＬＣ（high-performance liquid chromatography）に供し、残渣に含まれるカロテノイドを分析した。【０１６８】
以下に、ＨＰＣＬの分析条件を示す；
カラム        ：ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３（４．６×２５０ｍｍ）、
カラム温度    ：３０℃、
溶出溶媒の流速：１．５ｍＬ／ｍｉｎ、
検出方法      ：４５０ｎｍ（ＶＩＳ）、
外部標準      ：β−カロテン。【０１６９】
溶出溶媒としては、溶媒Ａおよび溶媒Ｂを所望の比率で含有する溶出溶媒を用い、経時的に溶出溶媒中に含まれる各溶媒の比率を変化させながら、溶出操作を行った。【０１７０】
以下に、溶媒Ａおよび溶媒Ｂの成分を示す；
溶媒Ａ：水／メタノール＝１０／９０、
溶媒Ｂ：メタノール／アセトン＝５０／５０。【０１７１】
以下の表６に、溶出溶媒中に含まれる溶媒Ａおよび溶媒Ｂの比率（％）の経時的な変化（グラジエント溶出のプログラム）を示す。【０１７２】
【表６】
2017047651.tif 000007
図１０に、残渣に含まれている成分に関する、ＨＰＬＣによる分析結果を示す。更に、検出された４５０ｎｍ（ＶＩＳ）に基づいて、以下のＡ値〜Ｄ値をβ-カロテン相当量として算出した。その結果を、表７に示す。
Ａ値：湿菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／ｇ−ＦＷ］、
Ｂ値：乾燥菌体１ｇあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／ｇ−ＤＣＷ］、
Ｃ値：培地１Ｌあたりに含まれる全カロテノイドの総量［ｍｇ／Ｌ］、
Ｄ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるカンタキサンチンの量［ｍｇ／ｇ−ＦＷ］。【０１７３】
【表７】
2017047651.tif 000008
残渣を分析した結果、形質転換体では、同条件で培養した野生型のロドトルラ属に属する微生物に比べて、全カロテノイドの総量が１．２７倍になっていた。このことは、形質転換体が、複数のカロテノイド生合成遺伝子を発現させてもカロテノイドを生産し得ることを示している。【０１７４】
＜９．アモルファジエン合成酵素（ＡＤＳ）をコードする遺伝子の導入＞
まず、周知の方法にしたがって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）とアルテミシア・アヌア(Artemisia annua)に由来するアモルファジエン合成酵素遺伝子（ＡＤＳ）が挿入されたベクター４を作製した。なお、ベクター４の基本骨格としては、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ株式会社製）を用いた。【０１７５】
アルテミシア・アヌア(Artemisia annua)に由来するアモルファジエン合成酵素遺伝子（ＡＤＳ）の具体的な塩基配列を配列番号１２にて示し、当該遺伝子にコードされているアモルファジエン合成酵素の具体的なアミノ酸配列を配列番号１１にて示す。【０１７６】
また、アルテミシア・アヌア(Artemisia annua)に由来するアモルファジエン合成酵素が触媒する反応を図１１に示す。図１１に示すように、アルテミシア・アヌア(Artemisia annua)に由来するアモルファジエン合成酵素は、基質であるＦＰＰを環状化すると考えられる。【０１７７】
ベクター４は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、アモルファジエン合成酵素遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、アモルファジエン合成酵素遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、アモルファジエン合成酵素遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。【０１７８】
次いで、上述したベクター４を、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum））に導入した。以下に、導入方法を説明する。【０１７９】
まず、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地（組成：ＹＰＤ液体培地１Ｌあたり、Bacto peptoneを２０ｇ、Yeast extractを１０ｇ、および、４０％グルコース溶液を５０ｍＬ、含む）中にて、上記微生物を２〜３日間培養した。【０１８０】
培養後の微生物の一部を、５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ液体培地に加え、２０〜２８℃にて２４時間培養した。培養後、増殖した微生物を遠心分離によって回収した。回収した微生物を、滅菌された蒸留水に懸濁して洗浄した後、当該微生物を、遠心分離によって回収した。【０１８１】
回収された微生物を、１ｍＬの０．１Ｍ  ＬｉＡｃ溶液中に懸濁した。微生物を含有するＬｉＡｃ溶液を５０μＬ分取し、分取された当該溶液に、７０％  ＰＥＧ＃４０００溶液１７１μＬ、滅菌された蒸留水６９μＬ、２Ｍ  ＬｉＡｃ溶液１５μＬ、Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ溶液（２ｍｇ−Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＭＡ／ｍＬ）１５μＬ、および、ベクター１１０μｇの混合物を加えた。【０１８２】
上記混合溶液を２０〜２８℃にて数時間静置した後、当該混合溶液に対して３０〜４０℃にて５分間のヒートショックを加えた。ヒートショックを加えた後の混合溶液から微生物を遠心分離にて回収し、当該微生物を、ＹＰＤ液体培地中で数時間培養した。培養後の微生物を遠心分離によって回収し、当該微生物を、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ固体培地上で培養した。【０１８３】
数日間の培養の後、ＹＰＤ固体培地上に現れたコロニーを形成する形質転換体を複数ピックアップし、周知のコロニーＰＣＲ法にて、各形質転換体中にハイグロマイシン耐性遺伝子とアモルファジエン合成酵素遺伝子とが導入されているか否か確認した。以下に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出に用いたプライマーセット１、アモルファジエン合成酵素遺伝子の検出に用いたプライマーセット４、および、ＰＣＲの反応条件を示す。【０１８４】
＜プライマーセット１＞
フォワードプライマー  ：５’−atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg−３’（配列番号３）
リバースプライマー    ：５’−gttagcctcccccatctcccgatccccacg−３’（配列番号４）
＜プライマーセット４＞
フォワードプライマー  ：５’−atgtcacttacagaagaaaaacctattcgc−３’（配列番号１９）
リバースプライマー    ：５’−tatactcataggataaacgagtagagactttatg−３’（配列番号２０）
＜ＰＣＲの反応条件＞
６８℃にて１．５分間の反応（アニーリング反応、および、伸長反応を兼ねた反応）、および、９８℃にて１０秒間の変性反応からなる反応サイクルを３０回繰り返す反応条件。【０１８５】
図１２に、コロニーＰＣＲの結果を示す。図１２において、左側の写真は、アモルファジエン合成酵素遺伝子の検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出結果を示している。また、図１２において、「Ｍ」は、１ｋｂ  ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」〜「３」は、各形質転換体に対応している。以下、「２」〜「３」の形質転換体の各々を、「ＡＤＳｈｙｇ１」〜「ＡＤＳｈｙｇ２」とも呼ぶ。【０１８６】
図１２に示すように、ピックアップされた２個の形質転換体の各々には、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならず、アモルファジエン合成酵素遺伝子も導入されていることが明らかになった。【０１８７】
次いで、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびアモルファジエン合成酵素遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か、試験した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。【０１８８】
上述した「２」〜「３」に対応する形質転換体の各々を、１００ｍＬのＦ培地（組成：Ｆ培地１Ｌあたり、グルコースを４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．１ｇ、ＮａＣｌを０．１ｇ、および、Yeast extractを１．５ｇ含み、ｐＨ５．５）に植菌した。【０１８９】
上記形質転換体を２５℃、１８０ｒｐｍにて３日間培養した後、当該形質転換体を遠心分離によって回収した。【０１９０】
市販のキット（ニッポンジーン社製のＲＮＡ抽出キット  ＩＳＯＧＥＮ  ＩＩ）を用いて、各形質転換体からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出するとともに、当該Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。なお、抽出および合成の具体的な方法は、キットに添付のプロトコールにしたがった。【０１９１】
上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびアモルファジエン合成酵素遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か確認した。なお、当該ＰＣＲでは、プライマーとして、上述したプライマーセット１またはプライマーセット４を用い、かつ、反応条件として、コロニーＰＣＲ法で採用したものと同じ反応条件を用いた。【０１９２】
図１３に試験結果を示す。図１３において、左側の写真は、アモルファジエン合成酵素遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示している。また、図１３において、「Ｍ」は、１ｋｂ  ラダーマーカーに対応し、「１」は、アモルファジエン合成酵素遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていない野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）に対応し、「２」は、ポジティブコントロールに対応し、「３」〜「４」は、形質転換体である「ＡＤＳｈｙｇ１」〜「ＡＤＳｈｙｇ２」に対応している。【０１９３】
図１３に示すように、ピックアップされた２個の形質転換体の各々では、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならずアモルファジエン合成酵素遺伝子からも、ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
＜１０．形質転換体が生産するセスキテルペノイドの分析＞
各微生物をＦ培地（具体的には、液体状のＦ培地（換言すれば、液体培地）、または、固体状のＦ培地（換言すれば、固体培地））を用いて培養した後、増殖した各微生物を遠心分離によって回収した。回収した１ｇ（湿重量）の微生物に対して、（ａ）１ｍＬの蒸留水または有機溶媒を加え３０分間抽出した後、更に（ｂ）１０ｍＬの蒸留水を加えた。【０１９４】
当該混合溶液に有機溶媒を加えて撹拌した後、静置し、水の層から分離した有機溶媒の層を回収した。更に、残った水の層に対して、再び有機溶媒を加えて撹拌した後、静置し、水の層から分離した有機溶媒の層を回収した。さらに同操作を２回行い、計３回抽出操作をおこなった。有機溶媒としては、３ｍＬのＥｔＯＡｃを用いた。【０１９５】
回収した３つの有機溶媒の層を合わせて１つとし、窒素気流下で有機溶媒を揮発させて、残渣を回収した。当該残渣を１ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解した。
抽出操作で得られたＥｔＯＡｃ溶液をＧＣ−ＭＳ（Gas Chromatography -  mass spectrometry）に供し、残渣に含まれるセスキテルペノイドを分析した。【０１９６】
以下に、ＧＣ−ＭＳの分析条件を示す；
カラム        ：ＨＰ−５ＭＳ（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）、
気化室温度    ：２５０℃
カラム温度    ：１００℃（２分間保持）〜（昇温：１０℃／ｍｉｎ）〜２８０℃
（５分間保持）
ガス          ：ヘリウム
線速度        ：３０．５ｃｍ／ｓｅｃ、
スピリット比  ：１０、
イオン源温度  ：２５０℃
インターフェース温度：２８０℃、
溶媒溶出時間  ：３ｍｉｎ、
イオン化法    ：ＥＩ、
スキャン速度  ：４ｓｃａｎ／ｓｅｃ
スキャン範囲  ：ｍ／ｚ  ４０〜６００
外部標準      ：アモルファ−４，１１−ジエン。【０１９７】
図１４に、残渣に含まれている成分に関する、ＧＣ−ＭＳによる分析結果を示す。更に、検出されたピークエリア面積に基づいて、以下のＡ値〜Ｄ値をアモルファ−４，１１−ジエン量として算出した。その結果を、表８に示す。【０１９８】
Ａ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるセスキテルペノイドの量［μｇ／ｇ−ＦＷ］、
Ｂ値：乾燥菌体１ｇあたりに含まれるアモルファ−４，１１−ジエンの量の総量［μｇ／ｇ−ＤＣＷ］、
Ｃ値：培地１Ｌあたりに含まれるアモルファ−４，１１−ジエンの量の総量［ｍｇ／Ｌ］、
Ｄ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるアモルファ−４，１１−ジエンの量［μｇ／ｇ−ＦＷ］。【０１９９】
【表８】
2017047651.tif 000009
残渣を分析した結果、野生型のロドトルラ属に属する微生物ではアモルファ−４，１１−ジエンを含むセスキテルペンが検出されないのに対して、形質転換体では、同条件で培養した、培地１Ｌあたりに含まれるアモルファ−４，１１−ジエンが０．１８０ｍｇ／Ｌ検出された。このことは、形質転換体が、野生型のロドトルラ属に属する微生物と比較して、セスキテルペノイドを生産し得ることを示している。【０２００】
＜１１．β―アミリン合成酵素（ｂＡＳ）をコードする遺伝子の導入＞
まず、周知の方法にしたがって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）とグリチライザ  ウラレンシス(Glycyrrhiza  uralensis)に由来するβ―アミリン合成酵素遺伝子（ｂＡＳ）が挿入されたベクター５を作製した。なお、ベクター５の基本骨格としては、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ株式会社製）を用いた。【０２０１】
グリチライザ  ウラレンシス(Glycyrrhiza  uralensis)に由来するβ―アミリン合成酵素遺伝子（ｂＡＳ）の具体的な塩基配列を配列番号１６にて示し、当該遺伝子にコードされているβ―アミリン合成酵素の具体的なアミノ酸配列を配列番号１５にて示す。【０２０２】
また、グリチライザ  ウラレンシス(Glycyrrhiza  uralensis)に由来するβ―アミリン合成酵素が触媒する反応を図１５に示す。図１５に示すように、グリチライザ  ウラレンシス(Glycyrrhiza  uralensis)に由来するβ―アミリン合成酵素は、基質である2,3-オキシドスクアレンを環状化すると考えられる。【０２０３】
ベクター５は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、β―アミリン合成酵素遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、β―アミリン合成酵素遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、β―アミリン合成酵素遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。【０２０４】
次いで、上述したベクター５を、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum））に導入した。以下に、導入方法を説明する。【０２０５】
まず、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地（組成：ＹＰＤ液体培地１Ｌあたり、Bacto peptoneを２０ｇ、Yeast extractを１０ｇ、および、４０％グルコース溶液を５０ｍＬ、含む）中にて、上記微生物を２〜３日間培養した。【０２０６】
培養後の微生物の一部を、５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ液体培地に加え、２０〜２８℃にて２４時間培養した。培養後、増殖した微生物を遠心分離によって回収した。回収した微生物を、滅菌された蒸留水に懸濁して洗浄した後、当該微生物を、遠心分離によって回収した。【０２０７】
回収された微生物を、１ｍＬの０．１Ｍ  ＬｉＡｃ溶液中に懸濁した。微生物を含有するＬｉＡｃ溶液を５０μＬ分取し、分取された当該溶液に、７０％  ＰＥＧ＃４０００溶液１７１μＬ、滅菌された蒸留水６９μＬ、２Ｍ  ＬｉＡｃ溶液１５μＬ、Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ溶液（２ｍｇ−Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＭＡ／ｍＬ）１５μＬ、および、ベクター１１０μｇの混合物を加えた。【０２０８】
上記混合溶液を２０〜２８℃にて数時間静置した後、当該混合溶液に対して３０〜４０℃にて５分間のヒートショックを加えた。ヒートショックを加えた後の混合溶液から微生物を遠心分離にて回収し、当該微生物を、ＹＰＤ液体培地中で数時間培養した。培養後の微生物を遠心分離によって回収し、当該微生物を、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ固体培地上で培養した。【０２０９】
数日間の培養の後、ＹＰＤ固体培地上に現れたコロニーを形成する形質転換体を複数ピックアップし、周知のコロニーＰＣＲ法にて、各形質転換体中にハイグロマイシン耐性遺伝子とβ―アミリン合成酵素遺伝子とが導入されているか否か確認した。以下に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出に用いたプライマーセット１、β―アミリン合成酵素遺伝子の検出に用いたプライマーセット５、および、ＰＣＲの反応条件を示す。【０２１０】
＜プライマーセット１＞
フォワードプライマー  ：５’−atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg−３’（配列番号３）
リバースプライマー    ：５’−gttagcctcccccatctcccgatccccacg−３’（配列番号４）
＜プライマーセット５＞
フォワードプライマー  ：５’−aaggacccatacatatacagcacaaacaac−３’（配列番号２１）
リバースプライマー    ：５’−caatggaacccgtctacgatactcagctag−３’（配列番号２２）
＜ＰＣＲの反応条件＞
６８℃にて１．５分間の反応（アニーリング反応、および、伸長反応を兼ねた反応）、および、９８℃にて１０秒間の変性反応からなる反応サイクルを３０回繰り返す反応条件。【０２１１】
図１６に、コロニーＰＣＲの結果を示す。図１６において、左側の写真は、β−アミリン合成酵素遺伝子の検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出結果を示している。また、図１６において、「Ｍ」は、１ｋｂ  ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」〜「５」は、各形質転換体に対応している。以下、「２」〜「５」の形質転換体の各々を、「ｂＡＳｈｙｇ１」〜「ｂＡＳｈｙｇ４」とも呼ぶ。【０２１２】
図１６に示すように、ピックアップされた４個の形質転換体の各々には、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならず、β―アミリン合成酵素遺伝子も導入されていることが明らかになった。【０２１３】
次いで、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびβ−アミリン合成酵素遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か、試験した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。【０２１４】
上述した「２」〜「５」に対応する形質転換体の各々を、１００ｍＬのＦ培地（組成：Ｆ培地１Ｌあたり、グルコースを４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．１ｇ、ＮａＣｌを０．１ｇ、および、Yeast extractを１．５ｇ含み、ｐＨ５．５）に植菌した。【０２１５】
上記形質転換体を２５℃、１８０ｒｐｍにて３日間培養した後、当該形質転換体を遠心分離によって回収した。【０２１６】
市販のキット（ニッポンジーン社製のＲＮＡ抽出キット  ＩＳＯＧＥＮ  ＩＩ）を用いて、各形質転換体からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出するとともに、当該Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。なお、抽出および合成の具体的な方法は、キットに添付のプロトコールにしたがった。【０２１７】
上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびβ―アミリン合成酵素遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か確認した。なお、当該ＰＣＲでは、プライマーとして、上述したプライマーセット１またはプライマーセット５を用い、かつ、反応条件として、コロニーＰＣＲ法で採用したものと同じ反応条件を用いた。【０２１８】
図１７に試験結果を示す。図１７において、左側の写真は、β―アミリン合成酵素遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示している。また、図１７において、「Ｍ」は、１ｋｂ  ラダーマーカーに対応し、「１」は、β―アミリン合成酵素遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていない野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）に対応し、「２」は、ポジティブコントロールに対応し、「３」〜「６」は、形質転換体である「ｂＡＳｈｙｇ１」〜「ｂＡＳｈｙｇ４」に対応している。【０２１９】
図１７に示すように、ピックアップされた４個の形質転換体の各々では、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならずβ―アミリン合成酵素遺伝子からも、ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。
＜１２．形質転換体が生産するトリテルペノイドの分析＞
各微生物をＦ培地（具体的には、液体状のＦ培地（換言すれば、液体培地）、または、固体状のＦ培地（換言すれば、固体培地））を用いて培養した後、増殖した各微生物を遠心分離によって回収した。回収した１ｇ（湿重量）の微生物に対して、（ａ）１ｍＬのクロロフォルム及び２ｍＬのメタノールを加え３０分間抽出した後、更に（ｂ）２ｍＬのクロロフォルム及び２ｍＬの蒸留水を加えた。【０２２０】
当該混合溶液を撹拌した後、静置し、水/メタノールの層から分離したクロロフォルムの層を回収した。回収したクロロフォルムの層を減圧条件下で有機溶媒を揮発させて、残渣を回収した。【０２２１】
回収した残渣に１ｍＬの２Ｎ水酸化カリウム・メタノール溶液を加え７０℃で３０分加熱した。１Ｎ塩酸を２．５ｍＬ及び加えた後、１ｍＬの有機溶媒を加えて撹拌した後、静置し、水の層から分離した有機溶媒の層を回収した。さらに同操作を１回行い、計２回抽出操作をおこなった。有機溶媒としては、ＥｔＯＡｃを用いた。【０２２２】
回収した２つの有機溶媒の層を合わせて１つとし、減圧条件下で有機溶媒を揮発させて、残渣を回収した。当該残渣を０．５ｍＬのＥｔＯＡｃに溶解した。【０２２３】
当該溶解液から５０μＬを取り出し、窒素気流下で有機溶媒を揮発させた後、５０μＬのN-メチル-N-(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミドを加え７０℃で３０分加熱しトリメチルシリル化を行った。【０２２４】
抽出操作で得られたトリメチルシリル化溶液をＧＣ−ＭＳ（Gas Chromatography -  mass spectrometry）に供し、残渣に含まれるトリテルペノイドを分析した。【０２２５】
以下に、ＧＣ−ＭＳの分析条件を示す；
カラム        ：ＤＢ−１ＭＳ（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）、
気化室温度    ：２５０℃
カラム温度    ：６０℃（１分間保持）〜（昇温：２０℃／min）〜３００℃
（２８分間保持）
ガス          ：ヘリウム
線速度        ：３６．５ｃｍ／ｓｅｃ、
注入法        ：スピリットレス、
イオン源温度  ：２８０℃
インターフェース温度：３００℃、
溶媒溶出時間  ：４ｍｉｎ、
イオン化法    ：ＥＩ、
スキャン速度  ：３ｓｃａｎ／ｓｅｃ
スキャン範囲  ：ｍ／ｚ  ５０〜８００
外部標準      ：β−アミリン。【０２２６】
図１８に、残渣に含まれている成分に関する、ＧＣ−ＭＳによる分析結果を示す。更に、検出されたピークエリア面積に基づいて、以下のＡ値〜Ｄ値をβ―アミリン量として算出した。その結果を、表９に示す。
Ａ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるトリテルペノイドの量［μｇ／ｇ−ＦＷ］、
Ｂ値：乾燥菌体１ｇあたりに含まれるβ−アミリンの量の総量［μｇ／ｇ−ＤＣＷ］、
Ｃ値：培地１Ｌあたりに含まれるβ−アミリンの量の総量［ｍｇ／Ｌ］、
Ｄ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるβ−アミリンの量［μｇ／ｇ−ＦＷ］。【０２２７】
【表９】
2017047651.tif 000010
残渣を分析した結果、野生型のロドトルラ属に属する微生物ではβ―アミリン等の植物ステロールを含むトリテルペンが検出されないのに対して、形質転換体では、同条件で培養した、培地１Ｌあたりに含まれるβ―アミリンが２．７５ｍｇ／Ｌ検出された。このことは、形質転換体が、野生型のロドトルラ属に属する微生物と比較して、他の生物種由来のトリテルペノイドを生産し得ることを示している。【０２２８】
＜１３．ルペオール合成酵素（ＬＵＳ）をコードする遺伝子の導入＞
まず、周知の方法にしたがって、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇｒ）とグリチライザ  ウラレンシス(Glycyrrhiza  uralensis)に由来するルペオール合成酵素遺伝子（ＬＵＳ）が挿入されたベクター６を作製した。なお、ベクター６の基本骨格としては、ｐＵＣ１１８ベクター（タカラバイオ株式会社製）を用いた。【０２２９】
グリチライザ  ウラレンシス(Glycyrrhiza  uralensis)に由来するルペオール合成酵素遺伝子（ＬＵＳ）の具体的な塩基配列を配列番号２４にて示し、当該遺伝子にコードされているルペオール合成酵素の具体的なアミノ酸配列を配列番号２３にて示す。【０２３０】
また、グリチライザ  ウラレンシス(Glycyrrhiza  uralensis)に由来するルペオール合成酵素が触媒する反応を図１９に示す。図１９に示すように、グリチライザ  ウラレンシス(Glycyrrhiza  uralensis)に由来するルペオール合成酵素は、基質である2,3-オキシドスクアレンを環状化すると考えられる。【０２３１】
ベクター６は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。一方、ルペオール合成酵素遺伝子の上流にはＧＰＤプロモーター（ＵｍＰＧＰＤ）が連結され、かつ、ルペオール合成酵素遺伝子の下流にはＴｃｙｃ１ターミネーターが連結されている。そして、ルペオール合成酵素遺伝子の発現は、ＧＰＤプロモーターによって制御されている。【０２３２】
次いで、上述したベクター６を、ロドトルラ属に属する微生物（具体的には、ロドトルラ・アケニオラム（Rhodotorula acheniorum））に導入した。以下に、導入方法を説明する。【０２３３】
まず、５０ｍＬのＹＰＤ液体培地（組成：ＹＰＤ液体培地１Ｌあたり、Bacto peptoneを２０ｇ、Yeast extractを１０ｇ、および、４０％グルコース溶液を５０ｍＬ、含む）中にて、上記微生物を２〜３日間培養した。【０２３４】
培養後の微生物の一部を、５０ｍＬの新鮮なＹＰＤ液体培地に加え、２０〜２８℃にて２４時間培養した。培養後、増殖した微生物を遠心分離によって回収した。回収した微生物を、滅菌された蒸留水に懸濁して洗浄した後、当該微生物を、遠心分離によって回収した。【０２３５】
回収された微生物を、１ｍＬの０．１Ｍ  ＬｉＡｃ溶液中に懸濁した。微生物を含有するＬｉＡｃ溶液を５０μＬ分取し、分取された当該溶液に、７０％  ＰＥＧ＃４０００溶液１７１μＬ、滅菌された蒸留水６９μＬ、２Ｍ  ＬｉＡｃ溶液１５μＬ、Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ溶液（２ｍｇ−Ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＭＡ／ｍＬ）１５μＬ、および、ベクター１１０μｇの混合物を加えた。【０２３６】
上記混合溶液を２０〜２８℃にて数時間静置した後、当該混合溶液に対して３０〜４０℃にて５分間のヒートショックを加えた。ヒートショックを加えた後の混合溶液から微生物を遠心分離にて回収し、当該微生物を、ＹＰＤ液体培地中で数時間培養した。培養後の微生物を遠心分離によって回収し、当該微生物を、ハイグロマイシンを含有するＹＰＤ固体培地上で培養した。【０２３７】
数日間の培養の後、ＹＰＤ固体培地上に現れたコロニーを形成する形質転換体を複数ピックアップし、周知のコロニーＰＣＲ法にて、各形質転換体中にハイグロマイシン耐性遺伝子とルペオール合成酵素遺伝子とが導入されているか否か確認した。以下に、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出に用いたプライマーセット１、ルペオール合成酵素遺伝子の検出に用いたプライマーセット６、および、ＰＣＲの反応条件を示す。【０２３８】
＜プライマーセット１＞
フォワードプライマー  ：５’−atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg−３’（配列番号３）
リバースプライマー    ：５’−gttagcctcccccatctcccgatccccacg−３’（配列番号４）
＜プライマーセット６＞
フォワードプライマー  ：５’−ggaagctgaagataggagaaggaggagcgg−３’（配列番号２５）
リバースプライマー    ：５’−gtgagcacacaagacttggcgacgatactc−３’（配列番号２６）
＜ＰＣＲの反応条件＞
６８℃にて１．５分間の反応（アニーリング反応、および、伸長反応を兼ねた反応）、および、９８℃にて１０秒間の変性反応からなる反応サイクルを３０回繰り返す反応条件。【０２３９】
図２０に、コロニーＰＣＲの結果を示す。図２０において、左側の写真は、ルペオール合成酵素遺伝子の検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の検出結果を示している。また、図２０において、「Ｍ」は、１ｋｂ  ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」〜「５」は、各形質転換体に対応している。以下、「２」〜「５」の形質転換体の各々を、「ＬＵＳｈｙｇ１」〜「ＬＵＳｈｙｇ４」とも呼ぶ。【０２４０】
図２０に示すように、ピックアップされた４個の形質転換体の各々には、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならず、ルペオール合成酵素遺伝子も導入されていることが明らかになった。【０２４１】
次いで、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびルペオール合成酵素遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か、試験した。以下に、試験方法および試験結果を説明する。【０２４２】
上述した「２」〜「５」に対応する形質転換体の各々を、１００ｍＬのＦ培地（組成：Ｆ培地１Ｌあたり、グルコースを４０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４を０．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを０．５ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを０．１ｇ、ＮａＣｌを０．１ｇ、および、Yeast extractを１．５ｇ含み、ｐＨ５．５）に植菌した。【０２４３】
上記形質転換体を２５℃、１８０ｒｐｍにて３日間培養した後、当該形質転換体を遠心分離によって回収した。【０２４４】
市販のキット（ニッポンジーン社製のＲＮＡ抽出キット  ＩＳＯＧＥＮ  ＩＩ）を用いて、各形質転換体からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出するとともに、当該Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。なお、抽出および合成の具体的な方法は、キットに添付のプロトコールにしたがった。【０２４５】
上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、各形質転換体に導入されたハイグロマイシン耐性遺伝子およびルペオール合成酵素遺伝子からｍＲＮＡが発現しているか否か確認した。なお、当該ＰＣＲでは、プライマーとして、上述したプライマーセット１またはプライマーセット６を用い、かつ、反応条件として、コロニーＰＣＲ法で採用したものと同じ反応条件を用いた。【０２４６】
図２１に試験結果を示す。図２１において、左側の写真は、ルペオール合成酵素遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示し、右側の写真は、ハイグロマイシン耐性遺伝子から発現されるｍＲＮＡの検出結果を示している。また、図６において、「Ｍ」は、１ｋｂ  ラダーマーカーに対応し、「１」は、ポジティブコントロールに対応し、「２」〜「５」は、形質転換体である「ＬＵＳｈｙｇ１」〜「ＬＵＳｈｙｇ４」に対応し、「６」は、ルペオール合成酵素遺伝子、および、ハイグロマイシン耐性遺伝子が導入されていない野生型のロドトルラ属に属する微生物（具体的には、Rhodotorula acheniorum）に対応している。【０２４７】
図２１に示すように、ピックアップされた４個の形質転換体の各々では、ハイグロマイシン耐性遺伝子のみならずルペオール合成酵素遺伝子からも、ｍＲＮＡが発現していることが明らかになった。【０２４８】
＜１２．形質転換体が生産するトリテルペノイドの分析＞にて説明した抽出操作と同様の抽出操作で得られたトリメチルシリル化溶液をＧＣ−ＭＳ（Gas Chromatography -  mass spectrometry）に供し、残渣に含まれるカロテノイドを分析した。【０２４９】
以下に、ＧＣ−ＭＳの分析条件を示す；
カラム        ：ＤＢ−１ＭＳ（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）、
気化室温度    ：２５０℃
カラム温度    ：６０℃（１分間保持）〜（昇温：２０℃／min）〜３００℃
（２８分間保持）
ガス          ：ヘリウム
線速度        ：３６．５ｃｍ／ｓｅｃ、
注入法        ：スピリットレス、
イオン源温度  ：２８０℃
インターフェース温度：３００℃、
溶媒溶出時間  ：４ｍｉｎ、
イオン化法    ：ＥＩ、
スキャン速度  ：３ｓｃａｎ／ｓｅｃ
スキャン範囲  ：ｍ／ｚ  ５０〜８００
外部標準      ：ルペオール。【０２５０】
図２２に、残渣に含まれている成分に関する、ＧＣ−ＭＳによる分析結果を示す。更に、検出されたピークエリア面積に基づいて、以下のＡ値〜Ｄ値をルペオール量として算出した。その結果を、表１０に示す。【０２５１】
Ａ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるトリテルペノイドの量［μｇ／ｇ−ＦＷ］、
Ｂ値：乾燥菌体１ｇあたりに含まれるルペオールの量の総量［μｇ／ｇ−ＤＣＷ］、
Ｃ値：培地１Ｌあたりに含まれるルペオールの量の総量［ｍｇ／Ｌ］、
Ｄ値：湿菌体１ｇあたりに含まれるルペオールの量［μｇ／ｇ−ＦＷ］。【０２５２】
【表１０】
2017047651.tif 000011
残渣を分析した結果、野生型のロドトルラ属に属する微生物ではルペオール等の植物ステロールを含むトリテルペンが検出されないのに対して、形質転換体では、同条件で培養した、培地１Ｌあたりに含まれるルペオールが１．８５ｍｇ／Ｌ検出された。このことは、形質転換体が、野生型のロドトルラ属に属する微生物と比較して、他の生物種由来のトリテルペノイドを生産し得ることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０２５３】
本発明は、医薬品、飼料、食品添加物、機能性食品、香料、バイオ燃料などの種々の産業において利用可能である。
【図１】
2017047651.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2017047651.tif 000021
【図１１】
2017047651.tif 000022
【図１２】
2017047651.tif 000023
【図１３】
2017047651.tif 000024
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2017047651.tif 000029
【図１９】
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【図２０】
2017047651.tif 000031
【図２１】
2017047651.tif 000032
【図２２】
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【配列表】
2017047651000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年3月29日(2017.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属に属する微生物であるロドトルラ・アウランティアカ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、またはロドトルラ・アケニオラム（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ａｃｈｅｎｉｏｒｕｍ）に、当該微生物とは異なる生物種に由来する、テルペノイドを生合成する酵素、または、テルペノイドを基質とする酵素をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項２】
上記テルペノイドは、モノテルペノイド、セスキテルペノイド、ジテルペノイド、トリテルペノイド、または、カロテノイドであることを特徴とする請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
上記酵素は、カロテノイドケトラーゼ、カロテノイドサイクラーゼ、モノテルペノイドシンターゼ、セスキテルペノイドシンターゼ、ジテルペノイドシンターゼ、または、トリテルペノイドシンターゼであることを特徴とする請求項１または２に記載の形質転換体。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の形質転換体を培養する培養工程と、上記培養工程にて得られた形質転換体からテルペノイドを回収する回収工程と、を有することを特徴とするテルペノイドの製造方法。
【請求項５】
上記培養工程では、上記形質転換体を液体培養することを特徴とする請求項４に記載のテルペノイドの製造方法。
【国際調査報告】
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