(57)【要約】本発明は、ＳＧＰ物質を効率よく、簡便に精製することを目的とし、ＳＧＰ物質を含有する水溶液を、ＳＧＰ物質を透過させ、且つ、タンパク性不純物が透過しない１次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により透過液を得る工程（工程A）、及び、工程Ｂ：工程Ａの透過液を、ＳＧＰ物質が透過せず、且つ、低分子不純物が透過する２次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により濃縮液を得る工程（工程Ｂ）、を含むことを特徴とする、クロスフロー方式限外ろ過によるＳＧＰ物質の精製方法などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程Ａ及びＢを含むことを特徴とする、クロスフロー方式限外ろ過によるシアリルグリコペプチド（ＳＧＰ）又はＳＧＰと同一の糖鎖を含む、ＳＧＰのペプチド分解物（以下、合わせて「ＳＧＰ物質」という）の精製方法、
工程Ａ：ＳＧＰ物質を含有する水溶液を、ＳＧＰ物質を透過させ、且つ、タンパク性不純物が透過しない１次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により透過液を得る工程、及び、
工程Ｂ：工程Ａの透過液を、ＳＧＰ物質が透過しない２次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により濃縮液を得る工程。
【請求項２】
ＳＧＰ物質が、ＳＧＰであり、工程ＡにおけるＳＧＰ物質を含有する水溶液が、鳥類の卵黄成分を含む水溶液であることを特徴とする、請求項１の精製方法。
【請求項３】
鳥類の卵黄成分を含有する水溶液が、鶏卵の脱脂卵黄粉の水溶液である、請求項２の精製方法。
【請求項４】
１次膜が、１０ｋ〜５０ｋＤａの排除限界分子量の限外ろ過膜であり、２次膜が１０ｋＤａ以下の排除限界分子量であり、且つ、１次膜よりも小さい排除限界分子量を有する限外ろ過膜である、請求項２の精製方法。
【請求項５】
１次膜が、３０〜５０ｋＤａの排除限界分子量を有するセルロース系限外ろ過膜、又は、１０〜３０ＫＤａの排除限界分子量を有するＰＥＳ系限外ろ過膜であり、２次膜が１０ｋＤａ以下の排除限界分子量を有するセルロース系限外ろ過膜、又は、１０ＫＤａ以下の排除限界分子量を有するＰＥＳ系限外ろ過膜である、請求項４の精製方法。
【請求項６】
ＳＧＰ物質が、ＳＧＰと同一の糖鎖を含む、ＳＧＰのペプチド分解物であり、工程ＡにおけるＳＧＰ物質を含有する水溶液が、精製されたＳＧＰをペプチダーゼ処理した反応液であることを特徴とする、請求項１の精製方法。
【請求項７】
工程Ｂで得られた濃縮液を、ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーにより、ＳＧＰ物質を含有する画分を回収する工程を、さらに含む請求項１の精製方法。
【請求項８】
ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂が、逆相樹脂、順相樹脂、イオン交換樹脂、ゲルろ過樹脂または合成吸着樹脂である請求項６の精製方法。
【請求項９】
ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂が、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂、スチレン−ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂、メタクリル系合成吸着樹脂またはフェノール系合成吸着剤である請求項７の精製方法。
【請求項１０】
ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂が、スチレン−ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂である請求項８の精製方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかの方法で精製されたＳＧＰ物質を、適切な形態で包装する工程を含む、ＳＧＰ物質製品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵黄成分に含まれるシアリルグリコペプチドを、クロスフロー方式の限外ろ過を利用して、簡便且つ効率的に精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニワトリの卵黄に含まれるオリゴ糖ペプチドであるシアリルグリコペプチド（Ｓｉａｌｙｌ  ＧｌｙｃｏＰｅｐｔｉｄｅ：以下、「ＳＧＰ」という）は、含まれるオリゴ糖鎖がヒト型であるため、医薬品の原料として有用である。【０００３】
ＳＧＰの精製方法としては、特許文献１等において、ニワトリの脱脂卵黄含有物から、複数回の水性溶液への抽出操作に次いで、当該抽出液に対するエタノール等の水溶性有機溶媒により沈殿させる操作を複数回行い、得られた沈殿を水に溶解して、ＯＤＳ系逆相樹脂（逆相分配クロマトグラフィー用樹脂の一種）に吸着させ、溶出する方法が知られていた。【０００４】
また、特許文献１以前に知られていた技術は、複数の濃縮脱塩操作を必要とし、且つ純度や収率の点で不十分であり（特許文献２）、また、大量精製には不向きなカラムクロマトグラフィーによる精製（非特許文献１）によるものであった。【０００５】
特許文献３は、合成シリカゲルのような除タンパク剤を卵黄成分溶液に混合させ、分離することで、溶液中の不要なタンパク質を除去することを利用したＳＧＰの精製方法を開示している。【０００６】
限外ろ過（Ｕｌｔｒａ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は、溶液を膜に透過させることによって、溶液中の成分を濃縮、又は、除去するための方法である。限外ろ過膜には、個別に排除限界分子量が設定されており、溶液中の成分中、膜の限界排除分子量よりも大きな分子は膜に阻止されることで透過前液（以下、「濃縮液」）中に濃縮され、透過液からはこのような分子が除去される。限外ろ過は、水の浄化、飲料、食品、医薬品等の製造における不純物除去及び除菌、医療における透析、タンパク質や酵素の生産における分離、濃縮、研究分野におけるサンプルの分離・濃縮など、幅広い分野で活用されているが、ＳＧＰの精製に用いられた報告は無い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際特許公開公報  WO2011/027868
【特許文献２】国際特許公開公報  WO96/02255号
【特許文献３】国際特許公開公報  WO2014/208742号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Akira Seko, etal., Biochimica et BiophysicaActa, (1997), Vol. 1335, p.23-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来知られていた方法で、高純度のＳＧＰを工業スケールで精製するには、有機溶媒を用いた抽出や添加物の添加・分離といった操作が必要であったため、多くの時間と労力が必要であった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ＳＧＰの効率的な精製方法について、鋭意検討を重ね、卵黄成分の水溶液を、ＳＧＰが透過可能な１次膜とＳＧＰが透過できない２次膜を組み合わせて用いたクロスフロー方式の限外ろ過システムにより、高分子量と低分子量の不純物を除去し、ＳＧＰの効率的な精製を達成できることを見出し、さらに検討を重ねることで本発明を完成した。【００１１】
本発明は、以下の発明を提供する。
（１）  以下の工程Ａ及びＢを含むことを特徴とする、クロスフロー方式限外ろ過によるシアリルグリコペプチド（ＳＧＰ）又はＳＧＰと同一の糖鎖を含む、ＳＧＰのペプチド分解物（以下、合わせて「ＳＧＰ物質」という）の精製方法、
工程Ａ：ＳＧＰ物質を含有する水溶液を、ＳＧＰ物質を透過させ、且つ、タンパク性不純物が透過しない１次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により透過液を得る工程、及び、
工程Ｂ：工程Ａの透過液を、ＳＧＰ物質が透過しない２次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により濃縮液を得る工程。
（２）  ＳＧＰ物質が、ＳＧＰであり、工程ＡにおけるＳＧＰ物質を含有する水溶液が、鳥類の卵黄成分を含む水溶液であることを特徴とする、（１）の精製方法。
（３）  鳥類の卵黄成分を含有する水溶液が、鶏卵の脱脂卵黄粉の水溶液である、（２）の精製方法。
（４）  １次膜が、１０ｋ〜５０ｋＤａの排除限界分子量の限外ろ過膜であり、２次膜が１０ｋＤａ以下の排除限界分子量であり、且つ、１次膜よりも小さい排除限界分子量を有する限外ろ過膜である、（２）の精製方法。
（５）  １次膜が、３０〜５０ｋＤａの排除限界分子量を有するセルロース系限外ろ過膜、又は、１０〜３０ＫＤａの排除限界分子量を有するＰＥＳ系限外ろ過膜であり、２次膜が１０ｋＤａ以下の排除限界分子量を有するセルロース系限外ろ過膜、又は、１０ＫＤａ以下の排除限界分子量を有するＰＥＳ系限外ろ過膜である、（４）の精製方法。
（６）  ＳＧＰ物質が、ＳＧＰと同一の糖鎖を含む、ＳＧＰのペプチド分解物であり、工程ＡにおけるＳＧＰ物質を含有する水溶液が、精製されたＳＧＰをペプチダーゼ処理した反応液であることを特徴とする、（１）の精製方法。
（７）  工程Ｂで得られた濃縮液を、ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーにより、ＳＧＰ物質を含有する画分を回収する工程を、さらに含む（１）の精製方法。
（８）  ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂が、逆相樹脂、順相樹脂、イオン交換樹脂、ゲルろ過樹脂または合成吸着樹脂である（６）の精製方法。
（９）  ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂が、スチレン−ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂、スチレン−ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂、メタクリル系合成吸着樹脂またはフェノール系合成吸着剤である（７）の精製方法。
（１０）  ＳＧＰ物質を分離可能な樹脂が、スチレン−ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂である（８）の精製方法。
（１１）  （１）〜（１０）のいずれかの方法で精製されたＳＧＰ物質を、適切な形態で包装する工程を含む、ＳＧＰ物質製品の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の方法は、卵黄成分から、特別な添加剤等を加えずに、タンパク質のような高分子量の不純物とアミノ酸のような低分子量の不純物を簡便に除去できる。また、クロスフロー方式の限外ろ過システムは自動化が可能であるため、短時間、且つ、少ない労力でＳＧＰを効率的に精製することが可能である。また、限外ろ過工程において、目的とする濃縮精製液以外の溶液（回収外液）を、再度出発液に戻すことによって、ＳＧＰのロスを低減させ、収率を向上させることができる。さらに、使用される膜は洗浄して繰り返し再利用できるため、消耗材が少なく、ランニングコストを低く抑えることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＳＧＰ標準品のＨＰＬＣ測定結果のチャートである。
【図２】図２は、ＳＧＰ標準品のＬＣ／ＭＳ測定結果のチャートである。
【図３】図３は、ＳＧＰ標準品の１Ｈ−ＮＭＲ測定結果のチャートである。
【図４】図４は、実施例１で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣ測定結果のチャートである。
【図５】図５は、実施例１で精製された糖ペプチドのＬＣ／ＭＳ測定結果のチャートである。
【図６】図６は、実施例１で精製された糖ペプチドの１Ｈ−ＮＭＲ測定結果のチャートである。
【図７】図７は、実施例２で精製された糖ペプチドのＨＰＬＣ測定結果のチャートである。
【図８】図８は、実施例２で精製された糖ペプチドのＬＣ／ＭＳ測定結果のチャートである。
【図９】図９は、実施例２で精製された糖ペプチドの１Ｈ−ＮＭＲ測定結果のチャートである。
【図１０】図１０は、再生セルロース系ＵＦ膜であるＶｉｖａｆｌｏｗ５０ＲおよびＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ５０（Ｕｌｔｒａｃｅｌ）における、各排除限界分子量の膜を用いたクロスフロー式限外ろ過処理した際の、各処理液中の相対タンパク質濃度（棒グラフ）及びＳＧＰ回収率（折れ線グラフ）を表すグラフである。縦軸は、相対タンパク質濃度（％）及びＳＧＰ回収率（％）、両方の割合（％）を示す。横軸は、それぞれのＵＦ膜における各排除限界分子量と、各処理液の種類（Ａ：透過液、Ｂ：ＤＦ透過液、Ｃ：ＤＦ濃縮液）を表す。
【図１１】図１１は、ＰＥＳ系ＵＦ膜であるＶｉｖａｆｌｏｗ５０およびＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ５０（Ｂｉｏｍａｘ）における、各排除限界分子量の膜を用いたクロスフロー式限外ろ過処理した際の、各処理液中の相対タンパク質濃度（棒グラフ）及びＳＧＰ回収率（折れ線グラフ）を表すグラフである。縦軸は、相対タンパク質濃度（％）及びＳＧＰ回収率（％）、両方の割合（％）を示す。横軸は、それぞれのＵＦ膜における各排除限界分子量と、各処理液の種類（Ａ：透過液、Ｂ：ＤＦ透過液、Ｃ：ＤＦ濃縮液）を表す。
【図１２】図１２は、ＰＥＳ系ＵＦ膜であるＫｖｉｃｋ  ＳｔａｒｔおよびＭｉｎｉｍａｔｅにおける、各排除限界分子量の膜を用いたクロスフロー式限外ろ過処理した際の、各処理液中の相対タンパク質濃度（棒グラフ）及びＳＧＰ回収率（折れ線グラフ）を表すグラフである。縦軸は、相対タンパク質濃度（％）及びＳＧＰ回収率（％）、両方の割合（％）を示す。横軸は、それぞれのＵＦ膜における各排除限界分子量と、各処理液の種類（Ａ：透過液、Ｂ：ＤＦ透過液、Ｃ：ＤＦ濃縮液）を表す。
【図１３】図１３は、再生セルロース系ＵＦ膜であるＶｉｖａｆｌｏｗ５０ＲおよびＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ５０（Ｕｌｔｒａｃｅｌ）における、各排除限界分子量の膜を用いたクロスフロー式限外ろ過処理した際の、各処理液中の各種アミノ酸の相対濃度（黒バー：フェニルアラニン、白バー：トリプトファン、斜線バー：チロシン）を表すグラフである。縦軸は、相対アミノ酸濃度（％）を示す。横軸は、それぞれのＵＦ膜における各排除限界分子量と、各処理液の種類（Ａ：透過液、Ｂ：ＤＦ透過液、Ｃ：ＤＦ濃縮液）を表す。
【図１４】図１４は、ＰＥＳ系ＵＦ膜であるＶｉｖａｆｌｏｗ５０およびＰｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ５０（Ｂｉｏｍａｘ）における、各排除限界分子量の膜を用いたクロスフロー式限外ろ過処理した際の、各処理液中の各種アミノ酸の相対濃度（黒バー：フェニルアラニン、白バー：トリプトファン、斜線バー：チロシン）を表すグラフである。縦軸は、相対アミノ酸濃度（％）を示す。横軸は、それぞれのＵＦ膜における各排除限界分子量と、各処理液の種類（Ａ：透過液、Ｂ：ＤＦ透過液、Ｃ：ＤＦ濃縮液）を表す。
【図１５】図１５は、ＰＥＳ系ＵＦ膜であるＫｖｉｃｋ  ＳｔａｒｔおよびＭｉｎｉｍａｔｅにおける、各排除限界分子量の膜を用いたクロスフロー式限外ろ過処理した際の、各処理液中の各種アミノ酸の相対濃度（黒バー：フェニルアラニン、白バー：トリプトファン、斜線バー：チロシン）を表すグラフである。縦軸は、相対アミノ酸濃度（％）を示す。横軸は、それぞれのＵＦ膜における各排除限界分子量と、各処理液の種類（Ａ：透過液、Ｂ：ＤＦ透過液、Ｃ：ＤＦ濃縮液）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下において、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、以下の工程Ａ及びＢを含むことを特徴とする、クロスフロー方式限外ろ過によるＳＧＰ物質の精製方法、
工程Ａ：ＳＧＰ物質を含有する水溶液を、ＳＧＰ物質を透過させ、且つ、タンパク性不純物が透過しない１次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により透過液を得る工程、及び、
工程Ｂ：工程Ａの透過液を、ＳＧＰ物質が透過しない２次膜を用いたクロスフロー方式の限外ろ過処理により濃縮液を得る工程。
を提供する。
【００１６】
＜ＳＧＰ物質、シアリルグリコペプチド＞
本発明において、「ＳＧＰ物質」とは、シアリルグリコペプチド（ＳＧＰ）又はＳＧＰと同一の糖鎖を含む、ＳＧＰのペプチド分解物を意味する。
本発明において、「シアリルグリコペプチド（Ｓｉａｌｙｌ ＧｌｙｃｏＰｅｐｔｉｄｅ：以下、「ＳＧＰ」という）：とは、以下の構造式（Ｉ）及び配列式（ＩＩ）で示される、11個の糖からなるシアリルグリカンの還元末端のＧｌｃＮＡｃの１位炭素と、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−（配列番号１）の４位Ａｓｎの側鎖アミド基に由来する窒素原子が、β-Ｎグリコシド結合した、オリゴ糖ペプチドである。
【００１７】
【化１】
2017110984.tif 000002
（Ｉ）
【００１８】
【化２】
2017110984.tif 000003
（ＩＩ）
ＳＧＰは、鳥類の卵黄から精製することができるが、精製されたＳＧＰが市販されており、購入することもできる。例えば、東京化成工業（株）製のＳＧＰのＨＰＬＣチャート、ＬＣ／ＭＳスペクトル及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（実施例１に記載の条件で測定）は、それぞれ図１、図２及び図３に示すようなピークを示すため、これを標準品として、得られた糖ペプチドがＳＧＰであることを同定することができる。
本発明において、「ＳＧＰ製品」とは、ＳＧＰを主要な構成の一つとして含む製品であり、例えば、研究試薬、工業用原料、医薬品添加剤、食品添加剤等である。ＳＧＰ製品として製造される場合、本発明の方法で精製されたＳＧＰは、製品形態に応じた状態（凍結乾燥粉末、溶液等）に処理され、適切な容器に封入されて、包装され、製品として製造される。本発明の精製方法で得られるＳＧＰは高純度であるため、このようなＳＧＰ製品の原料としても有用である。
【００１９】
ＳＧＰは、ＳＧＰを分離可能な樹脂を用いたＨＰＬＣ等により検出又は定量することができ、そのようなＨＰＬＣの条件としては、例えば、以下の条件を挙げることができる。
【００２０】
[逆相カラムを用いたＨＰＬＣ分析条件]
ＨＰＬＣ：１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
カラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＥＣ−Ｃ１８  ２．７μｍ  φ３．０×５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）、ガードカラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＥＣ−Ｃ１８  ２．７μｍ  φ３．０×５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
（もしくは、カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  ３μｍ  φ３．０×５０ｍｍ（ジーエルサイエンス（株）製））
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＨ２Ｏ溶液（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＭｅＣＮ溶液（ｖ／ｖ）
グラジエント（移動相Ｂ%）：０％（０分）、１０％（５分）、３０％（７分）、３０％（８分）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ
[順相カラムを用いたＨＰＬＣ分析条件]
ＨＰＬＣ：１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  Ａｍｉｄｅ  ３μｍ  φ３．０×７５ｍｍ（ジーエルサイエンス（株）製）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＨ２Ｏ溶液（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＭｅＣＮ溶液（ｖ／ｖ）
グラジエント（移動相Ｂ%）：７０％（０分）、３０％（６分）、１０％（６．０１分）、１０％（７．５分）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ。
【００２１】
溶液中に含まれるＳＧＰは、対象溶液を上記のＨＰＬＣに供し、得られたＨＰＬＣチャートにおける、ＳＧＰに帰属するピーク面積値として算出することができる。例えば、出発材料溶液のＳＧＰ含有量に対する、対象溶液のＳＧＰの回収率を算出する場合、以下の式により算出することができる。
回収率（％）＝（対象溶液のＳＧＰピーク面積値×対象溶液量）／（出発原料溶液のＳＧＰピーク面積値×出発原料溶液量）×１００
また、被検ＳＧＰの純度は、標準品のＳＧＰの純度を１００％とした相対純度として算出することができる。標準品ＳＧＰとしては、例えば、市販されている東京化成工業（株）製のＳＧＰ等を利用することができる。測定方法としては、正確に秤量した被検ＳＧＰに、水等の水性溶媒を一定量加え、完全に溶解させた被検ＳＧＰ溶液を、上記の条件でＨＰＬＣ測定を行い、得られたＨＰＬＣチャートにおける、被検ＳＧＰのピーク面積値を測定する。同様に、標準品ＳＧＰについても同様の操作を行い、被ＳＧＰと同一の濃度の標準品ＳＧＰ溶液を調製後、同一条件のＨＰＬＣ測定を行い、以下の式によって被検ＳＧＰの純度を算出することができる。
被検ＳＧＰ純度（％）＝（被検ＳＧＰピーク面積値／標準品ＳＧＰピーク面積値）×１００
本発明において、「ＳＧ分解物」とは、上述したＳＧＰにおいて、含まれる配列番号１のペプチド部分が、ペプチド分解酵素処理により分解されて精製される分解物のうちＳＧＰと同一の糖鎖構造を有する物質を意味する。本発明のＳＧ分解物としては、ＳＧＰをアクチナーゼ処理することで得られる、ＳＧＰに含まれるペプチド部分が、糖鎖が結合するアスパラギン（Ａｓｎ）を残して欠失したＳＧ−Ａｓｎ（下記式（III））等を挙げることができる。
【００２２】
【化３】
2017110984.tif 000004
（ＩＩＩ）
ＳＧ−Ａｓｎの分析においては、上述したＳＧＰの分析条件を採用することができる。
【００２３】
＜出発物＞
本発明の精製方法に用いる出発物としては、ＳＧＰ物質を含有する水溶液であれば特に限定されず、様々なものを用いることができる。ＳＧＰ物質がＳＧ分解物である場合、精製されたＳＧＰをペプチド分解酵素で処理した反応液を用いることが好ましい。そのため、以下においては、ＳＧＰの精製方法について詳述する。
【００２４】
ＳＧＰは、鳥類の卵の卵黄に含まれていることが知られており、含まれる糖鎖構造がヒト型であるため、ヒトが摂取又は服用しても、アレルギー反応を起こしにくい。
【００２５】
本発明において、「鳥類の卵黄成分を含む水性溶液」とは、鳥類の卵の卵黄成分を水性溶媒と混合させた溶液を意味する。卵の由来は、鳥類であれば特に限定されず、ニワトリ、ウズラ、ハト、ダチョウ、カラス等をあげることができるが、好ましくはニワトリ由来の卵である。卵黄は、全卵から卵白と分離させたものをそのまま、乾燥させた乾燥卵黄として、脱脂処理をした脱脂卵黄として、又は、それらを粉末状にした卵黄粉、若しくは
脱脂卵黄粉として、本発明の方法に用いることができる。鶏卵の卵黄粉、脱脂卵黄粉などは、販売されており、購入することができる（ヨークプロテインＨ（キユーピー（株））、サニープロＤＦ（太陽化学（株））等）。
卵黄成分を溶解又は懸濁させる溶媒としては、水を主成分とする水性溶媒であり、タンパク質を変性させる成分を実質的に含まないものであれば、様々な水性溶媒を用いることができるが、好ましくは水である。限外ろ過工程に用いられる卵黄成分含有溶液は、卵黄、脱脂卵黄、それらの粉末等の卵黄成分を、水性溶媒と混合させ、不溶物を分離した溶解液部として用いることができる。
【００２６】
＜クロスフロー限外ろ過法＞
限外ろ過（Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）は、溶液に圧力を加えて限外ろ過膜を透過させることによって、溶液中の成分を濃縮、又は、除去するための方法である。限外ろ過膜（「ＵＦ膜」ともいう）には、個別に排除限界分子量が設定されており、溶液中の成分中、膜の限界排除分子量よりも大きな分子は膜に阻止されることで、透過前液（以下、「濃縮液」）中に濃縮される。一方で、透過液からは、このような高分子成分が除去される。本発明は、限外ろ過において、異なる排除限界分子量の膜を組み合わせて採用することにより、その中間の分子量領域に属する成分を、効率的に精製することを特徴とする。
限外ろ過の方式には、主に、デッドエンド方式とクロスフロー（タンジェンシャルフロー）方式の２種類がある。デッドエンド方式は、液体に対する圧力、すなわち液流の方向と垂直に膜が設置されているため、初期のろ過効率は高いが、不純物が多い溶液を処理する場合は、膜に粒子が堆積し、目詰まりし易く、ろ過効率が低下してしまう。一方で、クロスフロー方式は、膜が液流の方向と平行に設置されているため、膜表面が液流で洗浄されることで膜への粒子の堆積による目詰まりを起こしにくい特徴がある。本発明においては、卵黄成分のような不純物を多く含む水溶液から糖ペプチドを効率的に精製するためクロスフロー方式の限外ろ過を採用する。
限外ろ過には、その材質、形状、排除限界分子量等により多様な種類が存在し、本発明においては、出発液の種類や状態、適用する限外ろ過装置の種類等に応じて、適宜適切なものを選択することができる。
本発明において、「１次膜」とは、ＳＧＰが透過可能な限外ろ過膜である。１次膜は、ＳＧＰよりも大きな不純物を透過液から排除する役割を有するため、ＳＧＰを透過する膜の中で、できるだけ低い排除限界分子量の膜を採用することが好ましい。
また、「２次膜」とは、ＳＧＰが透過不可能な限外ろ過膜である。２次膜は、ＳＧＰよりも小さい不純物を濃縮液から除去する役割を有するため、ＳＧＰが透過できない膜の中で、できるだけ高い排除限界分子量の膜を採用することが好ましい。
限外ろ過膜の形状には、平膜タイプ、中空糸タイプ等があり、とくに限定はされないが、好ましくは平膜タイプである。限外ろ過膜の材質には、再生セルロース系（ＲＣ）、ポリエーテルスルホン系（ＰＥＳ）、ポリスルホン系（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル系（ＰＡＮ）、酢酸セルロース系（ＣＡ）等がある。同じ限界排除分子量が設定された膜でも、材質によりＳＧＰの分離挙動が異なる場合があるが、事前に複数の膜に対するＳＧＰの標準品の挙動を確認することで、適切な膜を選定することができる。
限外ろ過膜の排除限界分子量は、標準物質を用いたろ過試験によって規定されるが、標準物質の種類や試験条件等はメーカーにより異なる。また、標準物質がＳＧＰと性質が大きく異なる種類の物質である場合、ＳＧＰが標準物質とは異なる分離挙動を示すことがある。そのため、実際のＳＧＰの試験結果が、設定された排除限界分子量とは異なる場合もある。また、このような分離挙動は、膜の材質にも影響を受ける。そのため、膜の排除限界分子量の値は目安として捉え、実際の精製操作の前に、使用を予定している膜に対するＳＧＰの分離挙動を確認することによって、適切な膜を選択することができる。
本発明に用いる１次膜及び２次膜は、ＳＧＰの分離挙動に基づき、以下の方法により選択することができる。目的とするＳＧＰの水溶液を、使用する限外ろ過装置に供し、各種の限外ろ過膜を透過させ、その濃縮液と透過液の、それぞれにおけるＳＧＰの分布を確認することによって、当該膜に対するＳＧＰの分離挙動を確認する。このとき、ＳＧＰが透過する膜（このような膜において、最低の排除限界分子量を有する膜が好ましい）を１次膜に選択し、ＳＧＰが透過できない膜（このような膜において、最高の排除限界分子量を有する膜が好ましい）を２次膜として選択することができる。本発明においては、1次膜と２次膜として、異なる材質やメーカーの膜を組み合わせて使用してもよい。
１次膜としてはＳＧＰを透過する膜であり、好ましくはＳＧＰが透過し、且つ、タンパク質等の高分子成分の透過が少ない膜であり、より好ましくは、１０〜５０ｋＤａの排除限界分子量の膜を採用することができる。この場合、再生セルロース系膜であれば排除限界分子量が３０〜５０ｋＤａ、より好ましくは３０ｋＤａのものである。また、ＰＥＳ系膜であれば、１０〜３０ｋＤａのものが好ましい。
また、２次膜としては、ＳＧＰが透過できない膜であり、好ましくはＳＧＰが透過できず、且つ、アミノ酸等の低分子成分の多くが透過できる膜であり、より好ましくは１０ｋＤａ以下の排除限界分子量の膜を採用することができる。この場合、再生セルロース系膜であれば排除限界分子量が１０ｋＤａ以下、好ましくは１０又は５ｋＤａのものである。また、ＰＥＳ膜であれば、１０ｋＤａ以下、好ましくは５ｋＤａのものである。
クロスフロー方式を採用した限外ろ過には、ホースやパイプ等の流路部に、ポンプ、圧力計、限外ろ過膜等のデバイスを取り付けて構築したシステムを採用しても良く、一体型のクロスフロー限外ろ過装置を利用することもできる。
一体型のクロスフロー限外ろ過装置としては、例えばＳＡＲＴＯＦＬＯＷ  Ｓｌｉｃｅ２００  Ｂｅｎｃｈｔｏｐ  Ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＳＡＲＴＯＦＬＯＷ  Ａｄｖａｎｃｅｄ、ＳａｒｔｏＪｅｔ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＳＡＲＴＯＦＬＯＷ  Ａｌｐｈａ  ｐｌｕｓ、ＳＡＲＴＯＦＬＯＷ  Ｂｅｔａ  ｐｌｕｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ社製）、ＡＫＴＡｃｒｏｓｓｆｌｏｗ、ＡＫＴＡ  ｆｌｕｘ  ｓ、ＡＫＴＡ  ｆｌｕｘ  ６、Ｍｉｄｊｅｔ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＱｕｉｘＳｔａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＵｎｉＦｌｕｘ  １０、ＵｎｉＦｌｕｘ  ３０、ＵｎｉＦｌｕｘ  １２０、ＵｎｉＦｌｕｘ  ４００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．社製）、Ｌａｂｓｃａｌｅ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｏｇｅｎｔ  μＳｃａｌｅ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｏｇｅｎｔ  Ｍ１  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ社製）、ミニメイト  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｉｍ  ＩＩＩ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ、セントラメイト  ５００Ｓ  ＴＦＦＳｙｓｔｅｍ（ＰＡＬＬ  Ｃｏ．社製）、ＫｒｏｓＦｌｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩＩｉ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＫＭＰｉ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＫｒｏｓＦｌｏ  Ｐｉｌｏｔ  Ｐｌｕｓ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．社製）、ＰｕｒｅＴｅｃ  ＴＦＦ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳｃｉＬｏｇ，  Ｉｎｃ．社製）などを挙げることができる。
また、クロスフロー方式の限外ろ過システムを構築する場合、流路部のホースやパイプ、ポンプ、圧力計等は一般的に入手可能な材料や機器を採用することができる。限外ろ過膜は、専用ホルダと多様な膜が市販されており、適宜適切な膜をホルダにセットし、流路部に組み込むことができる。
限外ろ過膜、外装が一体となり、専用ホルダを必要とせず、簡便な接続方法で利用可能なカートリッジ型の多様な限外ろ過膜が市販されており、適宜選択することができる。このような、カートリッジ型限外ろ過膜としては、平膜タイプのものは、Ｖｉｖａｆｌｏｗシリーズ（５０Ｒシリーズ：再生セルロース系ＵＦ膜、５０シリーズ：ＰＥＳ系ＵＦ膜）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ社製）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎシリーズ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ：再生セルロース系ＵＦ膜、Ｂｉｏｍａｘ：ＰＥＳ系ＵＦ膜）（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ社製）、Ｋｖｉｃｋ  Ｓｔａｒｔシリーズ（ＰＥＳ系ＵＦ膜、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．社製）、Ｍｉｎｉｍａｔｅシリーズ（ＰＥＳ系ＵＦ膜、ＰＡＬＬ  Ｃｏ．社製）等を挙げることができる。中空糸タイプのカートリッジ型限外ろ過膜としては、ＭｉｄＧｒｅｅシリーズ、Ｘａｍｐｌｅｒシリーズ（ＰＳ系ＵＦ膜）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．社製）、ｍｉｃｒｏｚａペンシル型モジュールシリーズ、ｍｉｃｒｏｚａラボモジュールシリーズ（ＰＡＮ系ＵＦ膜、ＰＳ系ＵＦ膜）（旭化成ケミカルズ（株）製）、モルセップシリーズ（ＰＡＮ系ＵＦ膜、ＰＥＳ系ＵＦ膜、ＣＡ系ＵＦ膜）（ダイセン・メンブレン・システムズ（株）製）、ＭｉｃｒｏＫｒｏｓシリーズ、ＭｉｄｉＫｒｏｓシリーズ、ＭｉｎｉＫｒｏｓシリーズ、ＫｒｏｓＦｌｏシリーズ、ＣｅｌｌＦｌｏシリーズ（ＰＥＳ系ＵＦ膜、ＰＳ系ＵＦ膜）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．社製）等を挙げることができる。専用ホルダを用いる限外ろ過膜としては、Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅ  ２００  カセット、Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅ  カセット、Ｓａｒｔｏｃｏｎ  カセット、Ｓａｒｔｏｃｕｂｅ（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ：再生セルロース系ＵＦ膜、ＰＥＳ系ＵＦ膜）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ社製）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２  カセット、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ３  カセット（Ｕｌｔｒａｃｅｌ：再生セルロース系ＵＦ膜、Ｂｉｏｍａｘ：ＰＥＳ系ＵＦ膜）（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ社製）、Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  ＴＦＦ  カセット（Ｄｅｌｔａ：再生セルロース系ＵＦ膜、Ｏｍｅｇａ：ＰＥＳ系ＵＦ膜）（ＰＡＬＬ  Ｃｏ．社製）、Ｋｖｉｃｋ  Ｌａｂ  Ｐａｃｋｅｔ、Ｋｖｉｃｋ  Ｌａｂカセット、Ｋｖｉｃｋ  Ｌａｂ  ＳＣＵカセット、Ｋｖｉｃｋ  Ｆｌｏｗ  カセット（ＰＥＳ系ＵＦ膜）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．社製）等を挙げることができる。
限外ろ過膜には、その材質、形状、排除限界分子量等により多様な種類が存在し、本発明においては、出発液の種類や状態、適用する限外ろ過装置の種類等に応じて、適宜適切なものを選択することができる。
＜限外ろ過操作＞
本発明の方法において、限外ろ過工程は、出発液を１次膜に透過させ、その透過液を２次膜に透過させ、その濃縮液を目的物であるＳＧＰ物質の濃縮精製液として回収することを特徴とする。実際の精製処理前に、目的とするＳＧＰ物質の溶液を用いて予備試験を行い、膜間差圧（ＴＭＰ）、透過流束（Ｆｌｕｘ）などを求め、その相関から運転条件の最適化を行なうことができる。また、最適化を行なうことにより、膜面積を大きくすることでスケールアップを行なうことが可能である。ＳＧＰ以外のＳＧＰ物質を目的物とする場合には、ＳＧＰの精製処理で用いた条件と同一の条件を採用できる場合もあり、必要に応じて微調整することで、目的物に最適な条件を適宜選択することができる。
限外ろ過処理時の操作圧力に特に制限は無いが、高い圧力で操作を行なった場合、膜の閉塞や、膜や周辺設備へのダメージが生じる場合がある。また、０．０１ＭＰａといった低い圧力で操作を行なった場合、ろ過速度の低下により、作業効率が低下する恐れがある。好ましくは０．０１ＭＰａ〜０．５ＭＰａの範囲の操作であり、より好ましくは０．０５ＭＰａ〜０．３ＭＰａの範囲である。
限外ろ過処理時の温度に特に制限は無いが、高い温度で操作を行った場合、液体の粘度が下がるため、ろ過速度の上昇させることができる。しかし、膜へのダメージが生じる場合がある。さらには、別途、加温装置等の設備投資が必要となる。また、低い温度で操作を行った場合、液体の粘度の上昇によるろ過速度の低下や、液体の凍結などが生じる場合がある。好ましくは４℃〜６０℃であり、より好ましくは１５℃〜４０℃である。
ここで、１次膜の濃縮液と２次膜の透過液（併せて、「回収外液」）は、通常回収されないが、このような回収外液にもＳＧＰが含まれる場合がある。このような回収外液を、次の限外濾過操作の出発液と合わせて用いることによって、回収外液中に含まれるＳＧＰを回収することができ、必要に応じてこれを繰り返すこれにより、ＳＧＰの収率を向上させることが可能である。
＜限外ろ過処理液からのＳＧＰ物質の精製＞
上記の限外ろ過操作工程を経て得られた濃縮精製液から、様々なカラム充填剤を用いて、ＳＧＰをさらに精製することができる。このような精製に用いられるカラム充填剤としては、合成吸着樹脂、逆相樹脂、順相樹脂、イオン交換樹脂、ゲルろ過樹脂等を挙げることができる。逆相樹脂としては、ブチル基（Ｃ４）、オクチル基（Ｃ８），オクタデシル基（Ｃ１８）、トリアコンチル基（Ｃ３０）、フェニル基等の疎水性官能基を、シリカゲルの基材へ付加させた樹脂であり、特にオクタデシル基を付加したＯＤＳ系逆相樹脂（Ｗａｋｏｇｅｌ  １００Ｃ１８（和光純薬工業（株））を用いたＳＧＰの精製については、特許文献１に記載されている。また、イオン交換樹脂であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（東ソー（株））、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ−２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｗｘ２（Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いたＳＧＰの精製、ゲルろ過樹脂であるＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）を用いたＳＧＰの精製については、非特許文献１に、それぞれ記載されており、これらの文献に記載の条件を参考に、適宜精製することができる。
【００２７】
＜合成吸着樹脂＞
本発明は、精製工程におけるカラム充填剤として、合成吸着樹脂を採用するＳＧＰの精製方法を提供する。合成吸着樹脂とは、多孔質架橋構造ポリマーからなる充填剤であり、ポリマーの種類により、スチレン-ジビニルベンゼン系合成吸着剤、スチレン-ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂、メタクリル系合成吸着樹脂、フェノール系合成吸着樹脂等が挙げられる。ＳＧＰの精製に利用できることが知られていたＯＤＳ系逆相樹脂等の充填剤は、シリカゲルを基材とするため、アルカリ性溶液を用いた洗浄ができない。そのため有機溶媒を用いた洗浄だけでは不純物の除去が不十分であるため、再利用することができなかった。しかし、カラム充填剤として、合成吸着樹脂を採用することによって、有機溶媒を用いた洗浄に加え、アルカリ性溶液を用いた洗浄により樹脂回生が可能であることから、不純物の除去が十分に行なうことができ、合成吸着樹脂を再利用することが可能である。このような合成吸着樹脂としては、ＳＧＰを吸着できるものであれば様々な合成吸着樹脂を採用することができるが、好ましくは、スチレン-ジビニルベンゼン系合成吸着樹脂であり、より好ましくはスチレン-ジビニルベンゼン系修飾型合成吸着樹脂である。具体的な製品としてはＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７ＳＳ（三菱化学（株））等を挙げることができる。
ＳＧＰを精製する方法としては、上記工程で得られた濃縮精製溶液を、カラム充填剤を充填したカラムに透過させ、必要に応じて、クロマトグラフィーの分離モードに応じた適切な溶媒で洗浄し、クロマトグラフィーの分離モードに応じた移動相を用いて溶出させ、溶出液にＳＧＰが含まれる画分を回収することで、ＳＧＰを精製できる。この精製工程の前に、必要であれば、用いるカラム充填剤やクロマトグラフィーのモードに併せて、限外ろ過後溶液の条件を適宜調整しても良い。この溶液条件の変更により不溶物が生じる場合は、適宜、セライト等のろ過助剤を溶液に混合させ、溶解液部のみを回収する操作を行う。溶出画分に含まれるＳＧＰは上記のＨＰＬＣ条件でモニターすることもできるし、以前と同一条件による溶出であれば、溶出時間からＳＧＰの溶出画分を特定することもできる。このような精製の条件は、採用するカラム充填剤の種類、性質に応じて、適宜設定することができる。
例えば、カラム充填剤としてＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７ＳＳを用いる場合、濃縮精製液を、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ  ＳＰ２０７ＳＳを充填したカラムに透過させ、カラムを水で洗浄した後、水から２％アセトン水の濃度勾配で溶出を行うことができる。
【００２８】
得られた精製ＳＧＰ溶液は、そのまま凍結保存しても良いが、必要に応じて、濃縮又は凍結乾燥して保存することもできる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。ここに示された実施例は、本発明の実施態様の一例に過ぎず、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜実施例１．限外ろ過膜を用いたＳＧＰの精製−１＞
[１次ろ過処理]
１次膜として、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）／Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅ  Ｃａｓｓｅｔ（排除限界分子量：３０Ｋ、膜面積：０．１ｍ２、材質：再生セルロース膜、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ社製）を膜ホルダー（Ｓａｒｔｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅ  Ｈｏｌｄｅｒ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ社製）に装着して用い、送液ポンプ（リキポート  ＮＥ１．３００、ＫＮＦ社製）を用いて膜間差圧（ＴＭＰ）約０．０５ＭＰaの条件下で、クロスフロー式ろ過法で行う処理を１次ろ過処理とする。
脱脂卵黄粉（キユーピー（株））４ｋｇに水２０Ｌを添加し、１５分間よく撹拌した後、ＦＩＬＴＥＲ  ＰＡＰＥＲ  Ｎｏ．２（東洋濾紙（株））を用いたビフネルロート上で吸引ろ過を行なった。得られた水抽出液は、エバポール・ラボ（大川原製作所（株））を用いて、３．２Ｌになるまで濃縮を行なった。
得られた濃縮液は、よく攪拌しながら上記の１次ろ過処理をし、透過液２．６Ｌ、濃縮液６５０ｍＬを得た（透過液１および濃縮液１）。
得られた濃縮液１に水１．５Ｌを添加し、よく攪拌しながら、再度上記の１次ろ過処理を行ない、透過液１．５Ｌ、濃縮液６５０ｍＬを得た（透過液２および濃縮液２）。
得られた濃縮液２に水１．５Ｌを添加し、よく攪拌しながら、上記の１次ろ過処理し、透過液１．９Ｌを得た（透過液３）。【００３０】
[２次ろ過処理]
２次膜として、Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）／Ｓａｒｔｏｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅ  Ｃａｓｓｅｔ（排除限界分子量：１０Ｋ、膜面積：０．１ｍ２、材質：再生セルロース膜、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ社製）を膜ホルダー（Ｓａｒｔｃｏｎ  Ｓｌｉｃｅ  Ｈｏｌｄｅｒ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ社製）に装着して用い、ポンプ（リキポート  ＮＥ１．３００、ＫＮＥ社製）を用いて膜間差圧（ＴＭＰ）約０．０５ＭＰaの条件下で、クロスフロー式ろ過法による処理を２次ろ過処理とする。
上記透過液１は、よく攪拌しながら２次ろ過処理を行い、透過液２．４Ｌ、濃縮液１５０ｍＬを得た（濃縮液３）。
得られた濃縮液３に、透過液２を添加し、よく攪拌しながら、再度２次ろ過処理を行ない、透過液１．５Ｌ、濃縮液１５０ｍＬを得た（濃縮液４）。
得られた濃縮液４に、透過液３を添加し、よく攪拌しながら、再度２次ろ過処理を行い、透過液２Ｌ、濃縮液５０ｍＬを得た（濃縮液５）。
得られた濃縮液５に、水１．５Ｌを添加し、よく攪拌しながら、再度２次ろ過処理を行なった。２次ろ過処理中の濃縮液側に、さらに水１．５Ｌを添加し、２次ろ過処理を継続することで、最終的に透過液３Ｌを得た。また、クロスフロー経路内を水洗浄した洗浄水を濃縮液に加え、７２０ｍＬを得た（濃縮液６）。濃縮液６を凍結乾燥することで、１２ｇの糖ペプチド画分を得た。
得られた糖ペプチド画分とＳＧＰの標準品（東京化成工業（株）製ＳＧＰ）について１Ｈ−ＮＭＲ測定、ＬＣ／ＭＳ測定及び以下の条件によるＨＰＬＣ分析を行った。標準品のＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ及び１Ｈ−ＮＭＲによる測定結果を、それぞれ図１、図２及び図３に示す。得られた糖ペプチド画分のＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ及び１Ｈ−ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図４、図５および図６に示す。
得られた糖ペプチドは１Ｈ−ＮＭＲ測定及びＬＣ／ＭＳ測定による標準品との比較により、標準品と同様のマススペクトル及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが得られたことから、上記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表されるＳＧＰを含むことが確認された。また、ＨＰＬＣの結果において、得られたＳＧＰと標準品との、ＳＧＰに帰属するピークの相対面積値比により、得られたＳＧＰの純度は４７％であった。
［ＨＰＬＣ測定］
ＨＰＬＣ：１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
カラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＥＣ−Ｃ１８  ２．７μｍ  φ３．０×５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）、ガードカラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＥＣ−Ｃ１８  ２．７μｍ  φ３．０×５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＨ２Ｏ溶液（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＭｅＣＮ溶液（ｖ／ｖ）
グラジエント（移動相Ｂ％）：０％（０分）、１０％（５分）、３０％（７分）、３０％（８分）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ。
［ＬＣ／ＭＳ測定］
ＭＳ：６１３０  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
イオン化：ＥＳＩ
モード：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＨＰＬＣ：１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
カラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＥＣ−Ｃ１８  ２．７μｍ  φ３．０×５０ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）、ガードカラム：Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ  １２０  ＥＣ−Ｃ１８  ２．７μｍ  φ３．０×５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＨ２Ｏ溶液（ｖ／ｖ）
移動相Ｂ：０．１％ＨＣＯＯＨを含むＭｅＣＮ溶液（ｖ／ｖ）
グラジエント（移動相Ｂ％）：０％（０分）、１０％（５分）、３０％（７分）、３０％（８分）
流速：０．６ｍｌ／分
検出波長：２１０ｎｍ。
［１Ｈ−ＮＭＲ測定］
ＮＭＲ：ＡＶＡＮＣＥ５００（５００ＭＨｚ、ブルカー・バイオスピン（株）社製）
溶媒：ＤＥＵＴＥＲＩＵＭ  ＯＸＩＤＥ＋０．１％ＴＭＳＰ（ｅｕｒｉｓｏ−ｔｏｐ社製）
また、上記と同様の操作により、脱脂卵黄粉１ｋｇから、１．４ｇの糖ペプチド画分が得られ、同様の分析により当該糖ペプチド画分にＳＧＰを含むことが確認された（ＳＧＰ純度：４５％）。
＜実施例２．限外ろ過膜を用いたＳＧＰの精製−２＞
本実施例において、１次ろ過処理及び２次ろ過処理には、実施例１と同一の条件を採用した。
[１次ろ過処理]
脱脂卵黄粉（キユーピー（株））２０ｋｇに水１００Ｌを添加し、１５分間よく撹拌した後、ビフネルロート上で吸引ろ過を行なった。得られた水抽出液は、エバポール・ラボ（大川原製作所（株））を用いて、５．１Ｌになるまで濃縮を行なった。
得られた濃縮液は、よく攪拌しながら１次ろ過処理し、透過液３Ｌ、濃縮液２．１Ｌを得た（透過液１および濃縮液１）。得られた濃縮液１に水３Ｌを添加し、よく攪拌しながら、再度１次ろ過処理し、透過液３Ｌ、濃縮液２．１得た（透過液２および濃縮液２）。さらに、得られた濃縮液２に水３Ｌを添加し、よく攪拌しながら、再度１次ろ過処理し、透過液３Ｌ、濃縮液２．１Ｌを得た（透過液３および濃縮液３）。さらに、得られた濃縮液３に水３Ｌを添加し、よく攪拌しながら、再度１次ろ過処理し、透過液３Ｌ、濃縮液２．１Ｌを得た。（透過液４および濃縮液４）
得られた濃縮液４に水３Ｌを添加し、よく攪拌しながら、上記の１次膜を用いたクロスフロー式ろ過法でろ過処理し、透過液３Ｌを得た。（透過液５）
[２次ろ過処理]
上記透過液１および２をよく攪拌しながら、上記の２次ろ過処理を行ない、透過液５Ｌ、濃縮液１Ｌを得た。（濃縮液５）
得られた濃縮液５、透過液３および透過液４を添加し、よく攪拌しながら、再度２次ろ過処理を行ない、透過液４．２Ｌ、濃縮液２．８Ｌを得た。（濃縮液６）
得られた濃縮液６、透過液５を添加し、よく攪拌しながら、再度２次ろ過処理を行ない、透過液４Ｌ、濃縮液１．８Ｌを得た。（濃縮液７）
得られた濃縮液７に、水２Ｌを添加し、よく攪拌しながら、再度２次ろ過処理を行なった。２次ろ過処理中の濃縮液側に、さらに水２Ｌを添加し、２次ろ過処理を継続することで、最終的に透過液４Ｌを得た。また、クロスフロー経路内を水洗浄した洗浄水を濃縮液に加え、２．９Ｌを得た。（濃縮液８）
合成吸着樹脂としてＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＳＰ２０７ＳＳ（三菱化学（株））５．３Ｌ（２００Φｘ１６９ｍｍ）をカラムに充填し、水で平衡化を行なった。該カラムに、上記で得られた濃縮液８を流速２５０ｍＬ／分で付した後、水５０Ｌ流速１Ｌ／分で洗浄後、２％アセトン水溶液（ｖ／ｖ）流速１Ｌ／分で展開し、溶出画分１として５Ｌ、溶出画分２〜７として２．５Ｌ毎に分画した（溶出画分１乃至７）。
溶出画分４乃至６を合わせて、凍結乾燥することで、２９．７ｇの糖ペプチドを得た。【００３１】
得られた糖ペプチドのＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ及び１Ｈ−ＮＭＲによる測定結果をそれぞれ図７、図８および図９に示す。
得られた糖ペプチドは１Ｈ−ＮＭＲ測定及びＬＣ／ＭＳ測定による標準品のデータ（図1、図２および図３）との比較により、標準品と同様のマススペクトル及び１Ｈ−ＮＭＲスペクトルが得られたことから、上記式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表されるＳＧＰであることが確認された。また、ＨＰＬＣの結果において、得られたＳＧＰと
標準品との、ＳＧＰに帰属するピークの相対面積値比により、得られたＳＧＰの純度は１００％であった。
また、上記と同様の操作により、２０ｋｇ、１５ｋｇ及び１０ｋｇの脱脂卵黄粉から、それぞれ２５．３ｇ（純度：１０３％）、１８．４ｇ（純度：１０６％）及び１１．８ｇ（純度：１０３％）のＳＧＰを得た。なお、ＳＧＰの確認及び純度測定は、上記と同じ方法で行った。
＜実施例３．多様な限外ろ過膜のＳＧＰ精製への適用検討＞
次に、様々なＵＦ膜の、クロスフロー方式によるＳＧＰ精製への適用可能性について検討した。本発明の精製方法においては、不純物、特に不要なタンパク質が除去され、且つ、ＳＧＰが残存していることが重要であるため、限外ろ過膜で処理した後の各溶液（濃縮液、透過液）中のタンパク質とアミノ酸含量及びＳＧＰ回収率を指標とした検討を行った。
（１）限外ろ過膜のタンパク質とアミノ酸除去性能及びＳＧＰ回収率の検証
本実施例のクロスフロー方式限外ろ過は、クロスフローシステムとして、ＡＫＴＡｃｒｏｓｓｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．社製）を使用して、以下に示す異なる材質の各種ＵＦ膜（再生セルロース系ＵＦ膜、及び、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）系ＵＦ膜）について、脱脂卵黄粉中のタンパク質に対するタンパク質除去性能及びアミノ酸除去性能を評価し、また、脱脂卵黄粉中のＳＧＰに対する回収率を評価した。
［限外ろ過膜］
再生セルロース系ＵＦ膜として、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０Ｒシリーズは排除限界分子量５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ、１００Ｋ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ社製）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ５０（Ｕｌｔｒａｃｅｌ）シリーズは５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ社製）、を使用した。
ＰＥＳ系ＵＦ膜として、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０シリーズは５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ、５０Ｋ、１００Ｋ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ社製）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ５０（Ｂｉｏｍａｘ）シリーズは５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ、５０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ社製）、Ｋｖｉｃｋ  Ｓｔａｒｔシリーズは５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ、５０Ｋ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．社製）、Ｍｉｎｉｍａｔｅシリーズは５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ、５０Ｋ（ＰＡＬＬ  Ｃｏ．社製）、を使用した。【００３２】
［方法］
脱脂卵黄粉（キユーピー（株））に対して１０倍量の水を添加し（濃度１００ｍｇ／ｍＬ）、１５分間よく撹拌した後、ＦＩＬＴＥＲ  ＰＡＰＥＲ  Ｎｏ．２（東洋濾紙（株））を用いたビフネルロート上で吸引ろ過を行ない、ろ液を脱脂卵黄水溶液としてクロスフローシステムへ供した。
まず１段階目として、脱脂卵黄水溶液２００ｍＬを、膜間差圧（ＴＭＰ）０．１ＭＰaの条件下でろ過を行なった。Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０Ｒシリーズについては、流加速度２００ｍＬ／ｍｉｎ、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０シリーズについては、流加速度５０ｍＬ／ｍｉｎ、その他の限外ろ過膜については流加速度４０ｍＬ／ｍｉｎで運転し、透過液１６０ｍＬ、濃縮液４０ｍＬを得た（透過液および濃縮液）。
次に２段階目として、濃縮液に連続的に水２００ｍＬを加水しながら、膜間差圧（ＴＭＰ）０．１ＭＰaの条件下でダイアフィルトレーション（ＤＦ）を行った。Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０Ｒシリーズについては、流加速度２００ｍＬ／ｍｉｎ、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０シリーズについては、流加速度５０ｍＬ／ｍｉｎ、その他の限外ろ過膜については流加速度４０ｍＬ／ｍｉｎで運転し、透過液２００ｍＬ、濃縮液４０ｍＬを得た（ＤＦ透過液およびＤＦ濃縮液）。
得られた透過液、ＤＦ透過液、ＤＦ濃縮液を水で２００ｍＬにメスアップ後、以下の方法でタンパク質含有量の測定、アミノ酸含有量の測定及びＳＧＰ回収率の測定を行った。タンパク質含有量の測定結果及びＳＧＰ回収率の測定結果を図１０（再生セルロース系ＵＦ膜）、図１１および図１２（ＰＥＳ系ＵＦ膜）に示す。また、アミノ酸含有量の測定結果を図１３（再生セルロース系ＵＦ膜）、図１４および図１５（ＰＥＳ系ＵＦ膜）に示す。【００３３】
ａ）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法[Bradford, M. M.,Anal.Biochem. 72:248-254 (1976)]によるタンパク質含量の測定
スタンダード（ＢＳＡ（牛血清アルブミン、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．））と各処理液の上澄み液をそれぞれ３０μＬ分注し、発色液（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．））１．５ｍＬをそれぞれに添加して、攪拌後、室温で１０分以上保持して、５９５ｎｍの吸光度を測定した。結果は、脱脂卵黄水溶液のタンパク質濃度を１００％としたときの相対タンパク質濃度（％）を図内に表示した。
ｂ）ＨＰＬＣによるアミノ酸含量の測定
実施例１のＨＰＬＣ条件により分析を行い、各種アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）のピーク面積値を測定した。同様に、脱脂卵黄水溶液及び各処理液の上澄み液各５μＬをＨＰＬＣへ注入し、実施例１のＨＰＬＣ条件により分析を行い、各種アミノ酸のピーク面積値を測定した。各種アミノ酸の回収率は、脱脂卵黄水溶液の各種アミノ酸のピーク面積値を１００％としたときの相対ピーク面積値（％）を図内に表示した。
ｃ）ＨＰＬＣによるＳＧＰ回収率の測定
実施例１のＨＰＬＣ条件により分析を行い、ＳＧＰのピーク面積値を測定した。同様に、脱脂卵黄水溶液及び各処理液の上澄み液各５μＬをＨＰＬＣへ注入し、実施例１のＨＰＬＣ条件により分析を行い、ＳＧＰのピーク面積値を測定した。ＳＧＰの回収率は、脱脂卵黄水溶液のＳＧＰのピーク面積値を１００％としたときの相対ピーク面積値（％）を図内に表示した。【００３４】
［結果］
再生セルロース系ＵＦ膜の結果は図１０に示される。Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０Ｒシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のタンパク質濃度は、５Ｋ、１０Ｋ及び３０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、１００Ｋの膜においては透過液（Ａ）が高かった。Ｕｌｔｒａｃｅｌシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のタンパク質濃度は、５Ｋ、１０Ｋ及び３０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高かった。【００３５】
また、処理溶液中のＳＧＰ回収率は、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０Ｒシリーズの膜で処理した場合、５Ｋ及び１０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、３０Ｋ及び１００Ｋにおいては透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）が高かった。Ｕｌｔｒａｃｅｌシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のＳＧＰ回収率は、５Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、１０Ｋ及び３０Ｋの膜においては透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）が高かった。
また、上記のＵＦ膜による各処理液中のアミノ酸含有量を測定した結果を図１３（再生セルロース系ＵＦ膜）に示す。この結果から分かるように、何れの膜においても、ＤＦ濃縮液（Ｃ）にアミノ酸が検出されなかった。
これらの結果から、各メーカー間で膜の分離性能に若干の差が見られるものの、再生セルロース系ＵＦ膜を用いる場合、１次膜として３０Ｋ付近の膜を選択することで、ＳＧＰとタンパク質などの不純物を分離することができると考えられ、２次膜として１０Ｋ以下の膜を選択することで、ＳＧＰとアミノ酸などの低分子の不純物を分離することができると考えられる。
ＰＥＳ系ＵＦ膜の結果は図１１および図１２に示される。処理溶液中のタンパク質濃度は、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０シリーズの膜で処理した場合、５Ｋ、１０Ｋ及び３０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、５０Ｋ及び１００Ｋの膜においては透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）で高かった。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ５０（Ｂｉｏｍａｘ）シリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のタンパク質濃度は、５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ及び５０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高かった。Ｋｖｉｃｋ  Ｓｔａｒｔシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のタンパク質濃度は、５Ｋ、１０Ｋ、３０Ｋ及び５０Ｋの膜においてＤＦ濃縮液（Ｃ）が高かった。Ｍｉｎｉｍａｔｅシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のタンパク質濃度は、５Ｋ及び１０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、３０Ｋ及び５０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）、透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）のそれぞれに含まれていた。【００３６】
また、各処理液中のＳＧＰ回収率について、Ｖｉｖａｆｌｏｗ５０シリーズの膜で処理した場合、５Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、１０Ｋ、３０Ｋ、５０Ｋ及び１００Ｋの膜においては透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）で高かった。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  ５０（Ｂｉｏｍａｘ）シリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のＳＧＰ回収率は、５Ｋの膜においては、ＤＦ濃縮液（Ｃ）、透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）のそれぞれに含まれ、１０Ｋ、３０Ｋ及び５０Ｋの膜においては透過液（Ａ）、ＤＦ透過液（Ｂ）で高かった。Ｋｖｉｃｋ  Ｓｔａｒｔシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のＳＧＰ回収率は、５Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）が高く、１０Ｋ、３０Ｋ及び５０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）、透過液（Ａ）及びＤＦ透過液（Ｂ）のそれぞれに含まれていた。Ｍｉｎｉｍａｔｅシリーズの膜で処理した場合、処理溶液中のＳＧＰ回収率は、５Ｋ及び１０Ｋの膜においてはＤＦ濃縮液（Ｃ）、透過液（Ａ）及びＤＦ透過液（Ｂ）のそれぞれに含まれ、３０Ｋ及び５０Ｋの膜においては透過液（Ａ）及びＤＦ透過液（Ｂ）で高かった。
また、上記のＵＦ膜による各処理液中のアミノ酸含有量を測定した結果を図１４及び１５（ＰＥＳ系ＵＦ膜）に示す。この結果から分かるように、何れの膜においても、ＤＦ濃縮液（Ｃ）にアミノ酸が検出されなかった。
これらの結果から、各メーカー間で膜の分離性能に若干の差が見られるものの、ＰＥＳ系ＵＦ膜を用いる場合、１次膜として１０Ｋ〜３０Ｋ付近の膜を選択することで、ＳＧＰとタンパク質などの不純物を分離することができると考えられ、また２次膜として５Ｋ以下の膜を選択することで、ＳＧＰとアミノ酸などの低分子の不純物を分離することができると考えられる。【００３７】
以上、本発明の方法に用いられる限外ろ過膜の重要な性質であるＳＧＰとタンパク質などの不純物の分離、ＳＧＰとアミノ酸などの低分子の不純物の分離が得られることが示された。これらの限外ろ過膜を組み合わせることでＳＧＰを選択的に精製することができると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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