(57)【要約】    【課題】発泡性アルコール飲料などのように、製造時に２０℃未満での酵母発酵が行われる場合に、酵母の増殖活性の鈍化によって発酵効率が低下する問題を解決する手段を提供する。    【解決手段】培地中の遊離トリプトファン量を０．３ｐｐｍ以上含有し、かつ遊離チロシン及び遊離フェニルアラニンの総量に対する遊離トリプトファンの割合を０．３以上である培地を用いて、20℃未満で酵母発酵することにより解決できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離トリプトファンを０．３ｐｐｍ以上含有し、かつ遊離チロシン及び遊離フェニルアラニンの総量に対する遊離トリプトファン量比が０．３以上である培地を用いて、２０℃未満で酵母発酵することを特徴とする発酵物の製造方法。
【請求項２】
さらに培地に対して、分子量２００以上５００以下のペプチドを含んだものである、請求項１記載の発酵物の製造方法。
【請求項３】
培地に対して、分子量２００以上５００以下のペプチドを２００ｐｐｍ以上添加することを特徴とする請求項２記載の発酵物の製造方法。
【請求項４】
アミノ酸、ペプチド及び蛋白質の総量に対して、分子量２００以上５００以下のペプチドを１０重量％以上添加することを特徴とする請求項２記載の発酵物の製造方法。
【請求項５】
アミノ酸、ペプチド及び蛋白質の総量に対して分子量２００未満の遊離アミノ酸が１０重量％以下である、請求項４記載の発酵物の製造方法。
【請求項６】
発酵物が発泡性アルコール飲料であることを特徴とする請求項１乃至５記載の発酵物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母により低温域で発酵させて得られる食品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は、醤油・味噌・パン・酒といった多くの発酵飲食品を製造する過程で使われている。また、一部の酵母は分子生物学のモデル生物としても利用されている。このように酵母は産業界や学術界で広く利用されている微生物であり、温度や培地組成などの培養条件に関しては活発な研究が展開されている。
酵母が効率良く増殖する上で、重要な環境因子の一つが温度である。酵母の至適温度は酵母の種類によって異なるが、３０℃付近の温度でよく生育するものが多く、２０℃未満という低温においては、酵母の増殖能力は大きく低下する。これは酵母の生育が環境ストレスの１つである低温ストレスによって阻害されるためと考えられる。
また、酵母の増殖を左右するものに菌体外の栄養源の存在がある。酵母が増殖するには、糖などの炭素源、アミノ酸や蛋白質などの窒素源の他に、ビタミンなどの微量の栄養源が必要である。窒素源としては、通常硫酸アンモニウムのような無機物や、アミノ酸・タンパク質のような有機物が使われており、大豆蛋白質を加水分解した大豆ペプチドも窒素源として利用されつつある。例えばビールや麦芽使用率が低いか又は麦芽を使用しないビール様飲料などの発泡性アルコール飲料の製造における酵母発酵において、大豆ペプチドが使用されている。
発泡性アルコール飲料では、２０℃未満という低温で発酵がしばしば行われているが、上述のように低温ストレスによって酵母の増殖活性が鈍くなり、これによって発酵効率が低下し、発酵時間が長くなる問題がある。この場合、風味の点では利点があるが、より短時間で低温発酵を終了することができれば製造効率上の利点はより大きい。
このような課題に関連する知見として、大豆β−コングリシニンの分解物を培地に添加すると低温での酵母の増殖が増強されることが報告されている（特許文献１）。しかしながら、特許文献１の技術では低温における酵母の増殖促進効果はまだ満足できるものではなく、さらに改善する技術が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１０／０６１５７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、発泡性アルコール飲料などのように、製造時に２０℃未満での酵母発酵が行われる場合に、酵母の増殖活性の鈍化によって発酵効率が低下する問題を解決するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題に鑑み、本発明者は鋭意研究を行った結果、遊離トリプトファンを０．３ｐｐｍ以上含有し、かつ遊離チロシン及び遊離フェニルアラニンの総量に対する遊離トリプトファンの割合が０．３以上である培地を用いて低温で酵母発酵することで、低温での酵母の増殖が活発になること、また、さらに一定量以上の分子量２００以上５００以下のペプチドを添加することでさらに増殖を活発に出来ることにより、低温における発酵効率が低下する問題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、
（１）遊離トリプトファンを０．３ｐｐｍ以上含有し、かつ遊離チロシン及び遊離フェニルアラニンの総量に対する遊離トリプトファン量比が０．３以上である培地を用いて、２０℃未満で酵母発酵することを特徴とする発酵物の製造方法。
（２）さらに培地に対して、分子量２００以上５００以下のペプチドを含んだものである、（１）記載の発酵物の製造方法。
（３）培地に対して、分子量２００以上５００以下のペプチドを２００ｐｐｍ以上添加することを特徴とする（２）記載の発酵物の製造方法。
（４）アミノ酸、ペプチド及び蛋白質の総量に対して、分子量２００以上５００以下のペプチドを１０重量％以上添加することを特徴とする（２）記載の発酵物の製造方法。
（５）アミノ酸、ペプチド及び蛋白質の総量に対して分子量２００未満の遊離アミノ酸が１０重量％以下である、（４）記載の発酵物の製造方法。
（６）発酵物が発泡性アルコール飲料であることを特徴とする（１）乃至（５）記載の発酵物の製造方法。
である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、遊離フェニルアラニンと遊離チロシンの総量に対する遊離トリプトファンを一定量以上になるよう調製した混合物を発酵培地に添加することにより、20℃未満の低温域において酵母の増殖を促進させることが出来る。また、分子量２００以上５００以下のペプチドを一定量以上添加することで増殖をさらに活発にさせることができる。発酵を早く進めるためには、低温下で酵母を増殖させることが必須であるが、本発明ではその増殖時間を短縮できることにより、従来よりも短時間で、ビール等の発酵飲食品の製造が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
（酵母による低温下での発酵物の製造）
本発明の発酵物は、酵母による低温における発酵の際、培地中の遊離トリプトファン量が一定以上含有し、かつ遊離チロシン及び遊離フェニルアラニンの総量に対する遊離トリプトファン量を一定以上含有する培地を用いて、低温で酵母発酵することにより製造することができる。また、さらに一定量以上の分子量２００以上５００以下のペプチドを添加することにより、さらに効果的に発酵物を製造することが出来る。
本発明において、「低温」とは２０℃未満の温度を指し、好ましくは１５℃以下である。ただし培養液が凍結してしまう凍結域の温度ではそもそも酵母が増殖できず、さらに酵母の活性の低下にも繋がるので、少なくとも培養液の凍結域の温度以上であることを示す。具体的には０℃以上、より限定的には３℃以上である。
【０００９】
（遊離トリプトファン、遊離チロシン、遊離フェニルアラニン）
本発明においては、遊離トリプトファンの培地中の含量及び、遊離トリプトファンの遊離チロシン及び遊離フェニルアラニンの総量に対する割合が重要である。
培地中の遊離トリプトファン量は０．３ｐｐｍ以上、好ましくは０．９ｐｐｍ以上、さらに好ましくは３ｐｐｍ以上で酵母の増殖速度を速めることが出来る。遊離トリプトファン量が多くなるほど効果は高まるが、１００００ｐｐｍを超える量については効果の頭打ちが見られる。
また、遊離トリプトファンの、遊離チロシン及び遊離フェニルアラニンの総量に対する割合は０．３以上が必要である。この割合が大きくなるほど効果が高まる傾向にある。遊離チロシンと遊離フェニルアラニンの比率に制限はなく任意の比率を選択することができる。
遊離トリプトファン、遊離チロシン、遊離フェニルアラニンの添加方法は特に制限はなく、それぞれ別個に培地に添加する方法、予め混合物を調製後培地中に添加する方法等が挙げられる。
【００１０】
（ペプチド）
ペプチドは、蛋白質などに対してプロテアーゼ分解などの加水分解処理やアミノ酸を用いた合成等により得られるものである。蛋白質としては、大豆、小麦、綿実、トウモロコシ、カゼイン、エンドウなどの様々な動物由来、植物由来のものを用いることが出来るが、中でも大豆蛋白質が好ましい。ペプチドは酵母が資化できる低分子であることが望ましく、特にジペプチド及びトリペプチドの割合が多いことが好ましい。
蛋白質のプロテアーゼ分解は蛋白質スラリーまたは水溶液を基質として行う。ここで用いるプロテアーゼは動物起源、植物起源あるいは微生物起源は問わず、プロテアーゼの分類において「金属プロテアーゼ」,「酸性プロテアーゼ」,「チオールプロテアーゼ」,「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼ、好ましくは「金属プロテアーゼ」,「チオールプロテアーゼ」,「セリンプロテアーゼ」に分類されるプロテアーゼの中から適宜選択することができる。特に２種類以上、あるいは３種類以上の異なった分類に属する酵素を、順次もしくは同時に作用させる分解方法がジペプチドやトリペプチド等の比較的分子量の低いペプチドの割合を増加させることができ好ましい。このプロテアーゼの分類は、酵素化学の分野において通常行われている活性中心のアミノ酸の種類による分類方法である。
各々の代表として「金属プロテアーゼ」にはＢａｃｉｌｌｕｓ中性プロテイナーゼ, Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中性プロテイナーゼ, Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ中性プロテイナーゼ,サモアーゼ等、「酸性プロテアーゼ」にはペプシン, Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ酸性プロテイナーゼ,スミアームAP等、「チオールプロテアーゼ」にはブロメライン,パパイン等、「セリンプロテアーゼ」にはトリプシン,キモトリプシン,ズブチリシン, Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓアルカリプロテアーゼ, アルカラーゼ, ビオプラーゼ等が挙げられる。
これら以外の酵素でも作用pHや阻害剤との反応性により、その分類を確認することができる。活性中心が異なる酵素間では、基質への作用部位が大きく異なるために、「切れ残り」を減らし、効率良く酵素分解物を得ることができる。或いは異なった起源(起源生物)の酵素を併用することで、更に効率よく酵素分解物を製造することが出来る。同分類でも起源が異なれば、基質である蛋白質への作用部位も異なり、結果としてジペプチドやトリペプチドの割合を増やすことができる。これらプロテアーゼはエキソ活性が少ないものが好ましい。
反応ｐＨや反応温度は、用いるプロテアーゼの特性に合わせて設定すればよく、通常反応ｐＨは至適ｐＨ付近で行い、反応温度は至適温度付近で行えばよい。概ね反応温度は２０〜８０℃、好ましくは４０〜６０℃で反応を行うことができる。反応後は酵素の失活するに十分な温度（６０〜１００℃程度）で加熱し、残存酵素活性を失活させる。
【００１１】
（分子量２００以上５００以下のペプチド）
本発明における分子量２００以上５００以下のペプチドは、ジペプチド及びトリペプチドの含有量が多いペプチドである。培地に対して分子量２００以上５００以下のペプチドを、好ましくは２００ｐｐｍ以上、より好ましくは４００ｐｐｍ以上、さらに好ましくは６００ｐｐｍ以上となるように添加することが望ましい。  
また、アミノ酸，ペプチド及び蛋白質の総量中に分子量２００以上５００以下のペプチドを、培地に対して、好ましくは１０重量％以上、より好ましくは２０重量%以上、さらに好ましくは３０重量％以上となるように添加することが望ましい。
また、アミノ酸、ペプチド及び蛋白質の総量に対する分子量２００未満の遊離アミノ酸は少ない方が酵母の増殖が良好で、好ましくは１０重量％以下、より好ましくは５重量％以下、さらに好ましくは３重量％以下である。
分子量２００以上５００以下のペプチドの添加方法は特に制限はなく、ジペプチド、トリペプチドをそれぞれ別々に添加しても良いし、予め混合した後添加しても良い。また、ジペプチド及びトリペプチドを含有するペプチドを添加しても良いし、ジペプチド及びトリペプチドを含有するペプチドから分画したものを添加しても良い。
【００１２】
（蛋白質加水分解物中のペプチドの分子量分布の測定方法）
蛋白質加水分解物の分子量分布を、以下のゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣ法により測定する。
ペプチド用ゲルろ過カラムを用いたＨＰＬＣシステムを組み、分子量マーカーとなる既知のペプチドをチャージし、分子量と保持時間の関係において検量線を求める。なお、分子量マーカーは、オクタペプチドとして［β−Ａｓｐ］−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩのβ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（分子量１０４６）、ヘキサペプチドとしてＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＶのＶａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（分子量７７５）、ペンタペプチドとしてＬｅｕ−ＥｎｋｅｐｈａｌｉｎのＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（分子量５５５）、トリペプチドとしてＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（分子量４０５）、遊離アミノ酸としてＰｒｏ（分子量１１５）を用いる。蛋白質加水分解物（１重量％）を１０，０００ｒｐｍ、１０分で遠心分離した上清を、ゲル濾過用溶媒で２倍に希釈し、その５μｌをＨＰＬＣにアプライした。蛋白質加水分解物中の分子量５００より小さいペプチド画分の割合（％）は、全体の吸光度のチャート面積に対する、分子量５００より小さく、分子量２００より大きい範囲（時間範囲）の面積の割合によって求める（使用カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ７．５／３００ＧＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製）、溶媒：１％ＳＤＳ／１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、カラム温度２５℃、流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２２０ｎｍ）。
【００１３】
（培地）
本発明に使用する培地は、SD培地等の一般的な酵母生育用培地を使用することができる。
また、予め、アミノ酸として遊離トリプトファン，遊離チロシン，遊離フェニルアラニン、分子量２００以上５００以下のペプチドを酵母の主要な窒素源の一つとして培地に配合し、酵母生育用培地とすることができる。酵母生育用培地の種類は、天然培地、合成培地、半合成培地のいずれでもよく、液体培地、固体培地のいずれでもよい。他の窒素源としてペプトン、酵母抽出物、酵母窒素ベース、硫化アンモニウム、アミノ酸、ヌクレオチド等も添加することができ、炭素源としてはグルコース、ガラクトース、ラフィノース、デキストロース等を添加することができる。
この酵母生育用培地で酵母を２０℃未満の低温で培養すると、低温であっても増殖が活発となる。これは、遊離アミノ酸混合物や、分子量２００以上５００以下のペプチドが酵母の受ける低温ストレスから酵母を保護する低温ストレス保護剤としての作用によるものと考えられる。
【００１４】
（発酵飲食品の製造）
本発明の低温発酵促進剤は上記のように市販の酵母生育用培地の培地成分として添加できるほか、低温での酵母発酵により製造される発酵飲食品の製造において、発酵前原料として混合し、これに酵母を接種して発酵させることも有効である。
低温で酵母発酵により製造されうる発酵飲食品の例としては、酒類としてビールや、麦芽の使用率が低いもしくは麦芽を使用しないビール様飲料等の発泡性アルコール飲料、ワイン、ウイスキー、清酒、焼酎などが挙げられ、調味料として醤油、みそ、食酢などが挙げられ、一般食品としてパン、発酵乳、発酵バター、ケフィール、漬物などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、低温で酵母発酵を行うあらゆる発酵飲食品に対して適用可能である。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例により本発明のより具体的な実施態様について説明する。なお、例中の％は重量基準を意味する。
【００１６】
（製造例１）分離大豆蛋白の調製
別途、低変性脱脂大豆から以下のように分離大豆蛋白を調製した。
１）低変性脱脂大豆の温水抽出スラリーを遠心分離機にてオカラ画分を除き脱脂豆乳とした。
２）得られた脱脂豆乳のｐＨを４．５に調整して等電点沈殿せしめ、遠心分離機にて酸沈殿カードを得て中和した。
３）次にこの中和液を噴霧乾燥し、分離大豆蛋白（ＳＰＩ）とした。
得られた分離大豆蛋白から国際公開WO2006/134752号公報を参考に、以下のようにプロテアーゼによる酵素分解物を調製した。
3%大豆蛋白質溶液に対して、サモアーゼ(起源；Bacillus thermoproteolyticus, 金属プロテアーゼ, 大和化成)を対蛋白質あたり2%加え、pH9.0, 58℃で60分間作用させた。次にビオプラーゼ(起源；Bacillus sp., セリンプロテアーゼ, ナガセケムテック)を対蛋白質あたり1%加え、pH7.5, 58℃で60分間作用させた。スミチームFP(起源；Aspergillus sp., 金属プロテアーゼ, 新日本化学工業)を対蛋白質あたり1%加え、pH7.5, 58℃で60分間作用させた。以上の処理の後、90℃, 20分で反応を停止した。
【００１７】
（製造例２）分子量２００以上５００以下のペプチドの調製
製造例１で作成した分解物をゲル濾過用溶媒を用いて20mg/mlの溶液を調製し、その１０ｍｌをアプライした。各分子量画分の含有量比率％については、全体の吸光度のチャート面積に対する、特定の分子量範囲（時間範囲）の面積の割合によって求めた。（カラム：HiLoad 26/600 Superdex 30 prep grade、溶媒：50 mMリン酸緩衝液, 0.15M NaCl pH7.2、25℃、流速：1.0ml/min、検出：OD220nm）。上記分析より分子量２００が溶出する時間を算出し、分子量２００未満の低分子及び５００を超過する高分子を除いた画分のみ取得した。得られたサンプルを卓上電気透析装置マイクロアシライザー(株式会社アストム社製)、及びペプチド用カートリッジ（AC-110分画分子量100）を用いて脱塩し、分子量200以上500以下のペプチドを調製した。
なお、分子量については分子量マーカーを用いて確認した。分子量マーカーは、オクタペプチドとして［β−Ａｓｐ］−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩのβ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（分子量１０４６）、ヘキサペプチドとしてＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＶのＶａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（分子量７７５）、ペンタペプチドとしてＬｅｕ−ＥｎｋｅｐｈａｌｉｎのＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（分子量５５５）、トリペプチドとしてＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（分子量４０５）、遊離アミノ酸としてＰｒｏ（分子量１１５）を用いた。
【００１８】
（実施例１）
遊離アミノ酸混合物を添加した培地を用いて、遊離チロシン、遊離フェニルアラニン、及び遊離トリプトファンの量的関係について検証した。培地は酵母生育用であるＳＤ培地に窒素源として遊離アミノ酸を添加した。具体的には、Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and anmoniuum sulfate０．１７％、グルコース２％、アデニン１４．６ｍｇ／Ｌ、ウラシル２０ｍｇ／Ｌ、リジン塩酸塩３０ｍｇ／Ｌ、ロイシン９０ｍｇ／Ｌ、ヒスチジン２０ｍｇ／Ｌの混合物に、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンを任意の割合で混合したものを添加して培地を作成した。また、同時に添加するトリプトファン量の比較も行った。この培地に出芽酵母「ＹＰＨ４９９株」を１ｍＬあたりの細胞数が１０６個になるように植菌し、１０℃で１２０時間培養した後の細胞数を測定して、増殖を評価した（表１）。
【００１９】
（表１）
2014045707.tif 000002
Xは遊離トリプトファンの量を遊離チロシンと遊離フェニルアラニンの総量で除した値を示す。
×：増殖がほとんどみられない
○：増殖がみられる
◎：顕著な増殖がみられる
◆：さらに顕著な増殖がみられる
【００２０】
（実施例２）
製造例２で得られた分子量２００以上５００以下のペプチドを実施例１で調製した培地に対して０〜１０００ｐｐｍになるように添加して実施例１と同様に培養し、低温における酵母の増殖について評価した（表２）。
【００２１】
（表２）
2014045707.tif 000003
×：増殖がほとんどみられない
△：わずかに増殖がみられる
○：増殖がみられる
◎：顕著な増殖がみられる
◆：さらに顕著な増殖がみられる
カッコ内の数字はアミノ酸、ペプチド及び蛋白質の総量に対して、分子量２００以上５００以下のペプチドが占める割合を表す。
【００２２】
表１の結果に示すとおり、培地中に遊離トリプトファンの量が０．３ｐｐｍ以上で、かつ遊離チロシン及び遊離フェニルアラニンに対する遊離トリプトファン量の割合が０．３以上の時に低温における酵母の増殖が活発になった。さらに表２に示す通り、分子量２００以上５００以下のペプチドを２００ｐｐｍ以上添加した場合に低温における酵母の増殖はさらに高まり、また分子量２００以上５００以下のペプチドが６００ｐｐｍ以上添加した場合にその効果が顕著であった。
【００２３】
（実施例３）
実施例１で調製した培地に製造例２で得られたペプチドを加え、さらに製造例２で除去した分子量２００未満の遊離アミノ酸を任意の割合で添加して実施例１と同様に培養し、低温における酵母の増殖について評価した（表３）。
【００２４】
表３の結果に示す通り、アミノ酸・ペプチド・及び蛋白質の総量に対する遊離アミノ酸の割合が１０重量％以下の時に低温における酵母の増殖が活発になった。またその効果は５重量％以下の場合により顕著であり、３重量％以下でさらに高まった。
【００２５】
（表３）
2014045707.tif 000004
【００２６】
以上の通り、遊離トリプトファン量が０．３ｐｐｍ以上で、かつ遊離チロシン及び遊離フェニルアラニンに対する遊離トリプトファンの割合が０．３以上の時に低温における酵母の増殖が顕著となり、さらに分子量２００以上５００以下のペプチドを添加することで効果が高まることが明らかとなった。