(57)【要約】【課題】本発明は、薬物送達、具体的には、カチオン性リポソームに基づくワクチンの分野におけるものである。【解決手段】態様において、本発明は、ウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する、または、ウイルス性疾患を治療または予防するための分子の送達に有用なリガンド−標的化（例えば、抗体−または抗体フラグメント−標的化）リポソームの製造方法を提供する。送達システムの特異性はターゲティングリガンドに由来する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類にリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を投与することを含む、哺乳類においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法、ここで、カチオン性リポソーム複合体は以下を含む：
（ａ）カチオン性リポソーム；
（ｂ）カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化したリガンド；
（ｃ）カチオン性リポソームに結合した１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および
（ｄ）カチオン性リポソームに結合した１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項２】
該ウイルス抗原が、インフルエンザウイルス、ＨＩＶウイルス、ＳＡＲＳウイルス、鳥インフルエンザウイルス、エボラウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび天然痘ウイルスからなる群から選択されるウイルスからのものである請求項１の方法。
【請求項３】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項４】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項５】
該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として投与される請求項１の方法。
【請求項６】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項７】
該リガンドが一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントである請求項１の方法。
【請求項８】
該一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントが抗−トランスフェリン受容体一本鎖  Ｆｖ  （ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項７の方法。
【請求項９】
該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項１の方法。
【請求項１０】
哺乳類にリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を投与することを含む、哺乳類においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法、ここで、カチオン性リポソーム複合体は以下を含む：
（ａ）カチオン性リポソーム；
（ｂ）カチオン性リポソームに化学的に結合したリガンド；
（ｃ）カチオン性リポソームに結合した１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および
（ｄ）カチオン性リポソームに結合した１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項１１】
該ウイルス抗原が、インフルエンザウイルス、ＨＩＶウイルス、ＳＡＲＳウイルス、鳥インフルエンザウイルス、エボラウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび天然痘ウイルスからなる群から選択されるウイルスからのものである請求項１０の方法。
【請求項１２】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項１０の方法。
【請求項１３】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項１０の方法。
【請求項１４】
該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介してボーラスとしてまたは注入として投与される請求項１０の方法。
【請求項１５】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１０の方法。
【請求項１６】
該リガンドが一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントである請求項１０の方法。
【請求項１７】
該一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントが抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項１６の方法。
【請求項１８】
該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項１０の方法。
【請求項１９】
哺乳類にカチオン性リポソーム複合体を投与することを含む、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防する方法、ここで、カチオン性リポソーム複合体は以下を含む：
（ａ）カチオン性リポソーム；
（ｂ）カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化したリガンド；
（ｃ）カチオン性リポソームに結合した１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および、
（ｄ）カチオン性リポソームに結合した１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項２０】
該ウイルス性疾患が、インフルエンザ、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ、鳥インフルエンザ、エボラ、Ｂ型肝炎および天然痘からなる群から選択される請求項１９の方法。
【請求項２１】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項１９の方法。
【請求項２２】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項１９の方法。
【請求項２３】
該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として投与される請求項１９の方法。
【請求項２４】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１９の方法。
【請求項２５】
該リガンドが一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントである請求項１９の方法。
【請求項２６】
該一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントが抗−トランスフェリン受容体一本鎖  Ｆｖ  （ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項２５の方法。
【請求項２７】
該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ  （ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項１９の方法。
【請求項２８】
哺乳類にカチオン性リポソーム複合体を投与することを含む、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防する方法、ここで、カチオン性リポソーム複合体は以下を含む：  （ａ）カチオン性リポソーム；
（ｂ）カチオン性リポソームに化学的に結合したリガンド；
（ｃ）カチオン性リポソームに結合した１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および、
（ｄ）カチオン性リポソームに結合した１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項２９】
該ウイルス性疾患が、インフルエンザ、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ、鳥インフルエンザ、エボラ、Ｂ型肝炎および天然痘からなる群から選択される請求項２８の方法。
【請求項３０】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項２８の方法。
【請求項３１】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項２８の方法。
【請求項３２】
該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として投与される請求項２８の方法。
【請求項３３】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項２８の方法。
【請求項３４】
該リガンドが一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントである請求項２８の方法。
【請求項３５】
該一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントが抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項３５の方法。
【請求項３６】
該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む、請求項２８の方法。
【請求項３７】
哺乳類に抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）−標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を投与することを含む、哺乳類の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に１以上の活性薬剤を送達する方法、ここで、抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）−標的化カチオン性免疫リポソーム複合体は、カチオン性リポソーム、ＴｆＲｓｃＦｖ、および１以上の活性薬剤を含み、ＴｆＲｓｃＦｖはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している。
【請求項３８】
該ＡＰＣがプロフェッショナルＡＰＣである請求項３７の方法。
【請求項３９】
該ＡＰＣが非プロフェッショナルＡＰＣである請求項３７の方法。
【請求項４０】
該活性薬剤が１以上の核酸分子を含む請求項３７の方法。
【請求項４１】
該核酸分子が１以上のウイルスタンパク質をコードする請求項４０の方法。
【請求項４２】
該核酸分子が１以上のインターロイキンをコードする請求項４０の方法。
【請求項４３】
該核酸分子が１以上のウイルスタンパク質と１以上のインターロイキンとの両方をコードする請求項４０の方法。
【請求項４４】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項４１または請求項４３の方法。
【請求項４５】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項  ４２または請求項４３の方法。
【請求項４６】
該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として投与される請求項３７の方法。
【請求項４７】
該ＡＰＣが、肝臓、脾臓、リンパ節、腸および／または呼吸器に位置する請求項３７の方法。
【請求項４８】
カチオン性リポソーム、ＴｆＲｓｃＦｖ、および１以上の活性薬剤を含む抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）−標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、１以上の活性薬剤を哺乳類の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達する方法であって、ＴｆＲｓｃＦｖがカチオン性リポソームに化学的に結合している方法。
【請求項４９】
該ＡＰＣがプロフェッショナルＡＰＣである請求項４８の方法。
【請求項５０】
該ＡＰＣが非プロフェッショナルＡＰＣである請求項４８の方法。
【請求項５１】
該活性薬剤が１以上の核酸分子を含む請求項４８の方法。
【請求項５２】
核酸分子が１以上のウイルスタンパク質をコードする請求項５１の方法。
【請求項５３】
該核酸分子が１以上のインターロイキンをコードする請求項５１の方法。
【請求項５４】
該核酸分子が１以上のウイルスタンパク質と１以上のインターロイキンとの両方をコードする請求項５１の方法。
【請求項５５】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項５２または請求項５４の方法。
【請求項５６】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項  ５３または請求項５４の方法。
【請求項５７】
該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として投与される請求項４８の方法。
【請求項５８】
該ＡＰＣが、肝臓、脾臓、リンパ節、腸および／または呼吸器に位置する請求項４８の方法。
【請求項５９】
以下の方法によって調製されるリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法：
（ａ）リガンドを調製する工程；
（ｂ）リガンドとカチオン性リポソームとを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソームを形成させる工程、ここで、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している；および
（ｃ）リガンド−標的化カチオン性リポソームを以下と混合してリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程：
１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および、
１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項６０】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項５９の方法。
【請求項６１】
該リガンドが一本鎖Ｆｖフラグメントである請求項６０の方法。
【請求項６２】
該一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントが抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項６１の方法。
【請求項６３】
該抗体フラグメントがカルボキシ末端にてシステイン部分を含む請求項６０の方法。
【請求項６４】
該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームと結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項５９の方法。
【請求項６５】
該カチオン性リポソームが１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項５９の方法。
【請求項６６】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：１から約１：１００（ｗ：ｗ）の範囲の比にて混合される請求項５９の方法。
【請求項６７】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：１０から約１：５０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて混合される請求項６６の方法。
【請求項６８】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：２０から約１：４０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて混合される請求項６７の方法。
【請求項６９】
該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物を含む請求項５９の方法。
【請求項７０】
該核酸分子が、約０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項５９の方法。
【請求項７１】
該核酸が、約１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項６０の方法。
【請求項７２】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約０．５：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項５９の方法。
【請求項７３】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項７２の方法。
【請求項７４】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが約１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の重量比にて存在する請求項７３の方法。
【請求項７５】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項５９の方法。
【請求項７６】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項５９の方法。
【請求項７７】
以下の方法によって調製されるリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防する方法：
（ａ）リガンドを調製する工程；
（ｂ）リガンドとカチオン性リポソームとを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソームを形成させる工程、ここで、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している；および
（ｃ）リガンド−標的化カチオン性リポソームと以下とを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程：
１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および、
１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項７８】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項７７の方法。
【請求項７９】
該リガンドが一本鎖Ｆｖフラグメントである請求項７７の方法。
【請求項８０】
該一本鎖Ｆｖフラグメントが抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項７９の方法。
【請求項８１】
該抗体フラグメントがカルボキシ末端にシステイン部分を含む請求項７８の方法。
【請求項８２】
該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項７７の方法。
【請求項８３】
該カチオン性リポソームが１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項７７の方法。
【請求項８４】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが、約１：１から約１：１００（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項７７の方法。
【請求項８５】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：１０から約１：５０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項８４の方法。
【請求項８６】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：２０から約１：４０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項８５の方法。
【請求項８７】
該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物を含む請求項７７の方法。
【請求項８８】
該核酸分子が、約０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項７７の方法。
【請求項８９】
該核酸が、約１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項８８の方法。
【請求項９０】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約０．５：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項７７の方法。
【請求項９１】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項９０の方法。
【請求項９２】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の重量比にて存在する請求項９１の方法。
【請求項９３】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項７７の方法。
【請求項９４】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項７７の方法。
【請求項９５】
以下の方法によって調製されるリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法：
（ａ）リガンドを調製する工程；
（ｂ）リガンドとカチオン性リポソームとを化学的に結合させてリガンド−標的化カチオン性リポソームを形成させる工程；および、
（ｃ）リガンド−標的化カチオン性リポソームと以下とを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程：
１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および、
１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項９６】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項９５の方法。
【請求項９７】
該リガンドが一本鎖Ｆｖフラグメントである請求項９５の方法。
【請求項９８】
該一本鎖Ｆｖフラグメントが抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項９７の方法。
【請求項９９】
該抗体フラグメントがカルボキシ末端にシステイン部分を含む請求項９６の方法。
【請求項１００】
該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項９５の方法。
【請求項１０１】
該リガンドが、該化学的結合の前に該リガンド上のカルボキシ末端のスルフヒドリル基の一部であった硫黄原子を介して該カチオン性リポソームに化学的に結合する請求項９５の方法。
【請求項１０２】
該カチオン性リポソームが１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項９５の方法。
【請求項１０３】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：１から約１：１００（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項９５の方法。
【請求項１０４】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：１０から約１：５０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１０３の方法。
【請求項１０５】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：２０から約１：４０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１０４の方法。
【請求項１０６】
該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物を含む請求項９５の方法。
【請求項１０７】
該核酸分子が、約０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項９５の方法。
【請求項１０８】
該核酸が、約１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項１０７の方法。
【請求項１０９】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、約０．５：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項１０８の方法。
【請求項１１０】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項１０９の方法。
【請求項１１１】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、約１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の重量比にて存在する請求項１１０の方法。
【請求項１１２】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項９５の方法。
【請求項１１３】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項９５の方法。
【請求項１１４】
以下の方法によって調製されるリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防する方法：
（ａ）リガンドを調製する工程；
（ｂ）リガンドとカチオン性リポソームとを化学的に結合させてリガンド−標的化カチオン性リポソームを形成させる工程；および、
（ｃ）以下とリガンド−標的化カチオン性リポソームとを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程：
１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および、
１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項１１５】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１１４の方法。
【請求項１１６】
該リガンドが一本鎖Ｆｖフラグメントである請求項１１４の方法。
【請求項１１７】
該一本鎖Ｆｖフラグメントが抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項１１４の方法。
【請求項１１８】
該抗体フラグメントがカルボキシ末端にシステイン部分を含む請求項１１５の方法。
【請求項１１９】
該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項１１４の方法。
【請求項１２０】
該リガンドが、該化学的結合の前にリガンドの上のカルボキシ末端のスルフヒドリル基の一部であった硫黄原子を介してカチオン性リポソームに化学的に結合する請求項１１４の方法。
【請求項１２１】
該カチオン性リポソームが１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項１１４の方法。
【請求項１２２】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：１から約１：１００（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１１４の方法。
【請求項１２３】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：１０から約１：５０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１２２の方法。
【請求項１２４】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：２０から約１：４０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１２３の方法。
【請求項１２５】
該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物を含む請求項１１４の方法。
【請求項１２６】
該核酸分子が、約０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項１１４の方法。
【請求項１２７】
該核酸が、約１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項１２６の方法。
【請求項１２８】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、約０．５：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項１１４の方法。
【請求項１２９】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項１２８の方法。
【請求項１３０】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該リガンド−標的化カチオン性リポソーム  が、約１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の重量比にて存在する請求項１２９の方法。
【請求項１３１】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項１１４の方法。
【請求項１３２】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項１１４の方法。
【請求項１３３】
以下の工程を含む、リガンド−標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を調製する方法：
（ａ）リガンドを調製する工程；
（ｂ）リガンドとカチオン性リポソームとを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソームを形成させる工程、ここで、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している；および、
（ｃ）リガンド−標的化カチオン性リポソームと以下とを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程：
１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および、
１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項１３４】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１３３の方法。
【請求項１３５】
該リガンドが一本鎖Ｆｖフラグメントである請求項１３４の方法。
【請求項１３６】
該一本鎖Ｆｖフラグメントが抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項１３５の方法。
【請求項１３７】
該抗体フラグメントがカルボキシ末端にシステイン部分を含む請求項１３４の方法。
【請求項１３８】
該カチオン性リポソームに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドを混合する工程をさらに含む請求項１３３の方法。
【請求項１３９】
該カチオン性リポソームが１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項１３３の方法。
【請求項１４０】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：１から約１：１００（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１３３の方法。
【請求項１４１】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：１０から約１：５０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１４０の方法。
【請求項１４２】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：２０から約１：４０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１４１の方法。
【請求項１４３】
該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物を含む請求項１３３の方法。
【請求項１４４】
該核酸分子が、約０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項１３３の方法。
【請求項１４５】
該核酸が、約１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項１４４の方法。
【請求項１４６】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、約０．５：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項１３３の方法。
【請求項１４７】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項１４６の方法。
【請求項１４８】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、約１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の重量比にて存在する請求項１４７の方法。
【請求項１４９】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項１３３の方法。
【請求項１５０】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項１３３の方法。
【請求項１５１】
以下の工程を含む、リガンド−標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を調製する方法：
（ａ）リガンドを調製する工程；
（ｂ）リガンドとカチオン性リポソームとを化学的に結合させてリガンド−標的化カチオン性リポソームを形成させる工程；および、
（ｃ）リガンド−標的化カチオン性リポソームと以下とを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程：
１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および、
１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項１５２】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１５１の方法。
【請求項１５３】
該リガンドが一本鎖Ｆｖフラグメントである請求項１５１の方法。
【請求項１５４】
該一本鎖Ｆｖフラグメントが抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項１５３の方法。
【請求項１５５】
該抗体フラグメントがカルボキシ末端にシステイン部分を含む請求項１５２の方法。
【請求項１５６】
該カチオン性リポソームに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドを混合する工程をさらに含む請求項１５１の方法。
【請求項１５７】
該リガンドが、直接的結合の前にリガンド上のカルボキシ末端のスルフヒドリル基の一部であった硫黄原子を介してカチオン性リポソームに化学的に結合する請求項１５１の方法。
【請求項１５８】
該カチオン性リポソームが１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項１５１の方法。
【請求項１５９】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：１から約１：１００（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１５１の方法。
【請求項１６０】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：１０から約１：５０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１５９の方法。
【請求項１６１】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが約１：２０から約１：４０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１６０の方法。
【請求項１６２】
該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物を含む請求項１５１の方法。
【請求項１６３】
該核酸分子が、約０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項１５１の方法。
【請求項１６４】
該核酸が、約１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項１６３の方法。
【請求項１６５】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約０．５：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項１５１の方法。
【請求項１６６】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項１６５の方法。
【請求項１６７】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の重量比にて存在する請求項１６６の方法。
【請求項１６８】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項１５１の方法。
【請求項１６９】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項１５１の方法。
【請求項１７０】
請求項１２９または請求項１５１の方法によって調製されるリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１７１】
カチオン性リポソーム、リガンド、１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、および１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含むリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している、リガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１７２】
カチオン性リポソーム、リガンド、１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、および１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含むリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合している、リガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１７３】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１７４】
該核酸分子が該カチオン性リポソーム内にカプセル封入されている請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１７５】
該核酸分子が該カチオン性リポソームの内側または外側単層に結合している請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１７６】
該リガンドが一本鎖Ｆｖフラグメントである請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１７７】
該抗体フラグメントが抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項１７６のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１７８】
該カチオン性リポソームが１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１７９】
該抗体または抗体フラグメントと該カチオン性リポソームとが約１：１から約１：１００（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１８０】
該抗体または抗体フラグメントと該カチオン性リポソームとが約１：１０から約１：５０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１７９のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１８１】
該抗体または抗体フラグメントと該カチオン性リポソームとが約１：２０から約１：４０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１８０のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１８２】
該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物を含む請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１８３】
該核酸分子が、約０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１８４】
該核酸が、約１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項１８３のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１８５】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約０．５：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１８６】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて存在する請求項１８５のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１８７】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の重量比にて存在する請求項１８６のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１８８】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１８９】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１９０】
該複合体に結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１９１】
請求項１７１または請求項１７２のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を含む医薬組成物。
【請求項１９２】
１以上の抗菌薬、１以上の保存料、１以上の緩衝剤および１以上の界面活性剤からなる群から選択される１以上の賦形剤をさらに含む請求項１９１の医薬組成物。
【請求項１９３】
以下を含む医薬組成物：
カチオン性リポソーム、リガンドおよび１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む第一のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している第一のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体；および
カチオン性リポソーム、リガンドおよび１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含む第二のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している第二のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１９４】
以下を含む医薬組成物：
カチオン性リポソーム、リガンドおよび１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む第一のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合している第一のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体；および、
カチオン性リポソーム、リガンドおよび１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含む第二のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合している第二のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項１９５】
該核酸分子が該カチオン性リポソーム内にカプセル封入されている請求項１９４または請求項  １９５の医薬組成物。
【請求項１９６】
該核酸分子が該カチオン性リポソームの内側または外側単層に結合している請求項１９４または請求項１９５の医薬組成物。
【請求項１９７】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１９４または請求項１９５の医薬組成物。
【請求項１９８】
該リガンドが一本鎖Ｆｖフラグメントである請求項１９４または請求項１９５の医薬組成物。
【請求項１９９】
該抗体フラグメントが抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項１９８の医薬組成物。
【請求項２００】
該第一および第二のカチオン性リポソームが１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項１９４または請求項１９５の医薬組成物。
【請求項２０１】
該カチオン性リポソームのそれぞれの該抗体または抗体フラグメントが約１：１から約１：１００（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項１９４または請求項１９５の医薬組成物。
【請求項２０２】
該カチオン性リポソームのそれぞれの該抗体または抗体フラグメントが約１：１０から約１：５０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項２０１の医薬組成物。
【請求項２０３】
該カチオン性リポソームのそれぞれの該抗体または抗体フラグメントが約１：２０から約１：４０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項２０２の医薬組成物。
【請求項２０４】
該第一および第二のカチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物を含む請求項１９４または請求項１９５の医薬組成物。
【請求項２０５】
該核酸分子が、約０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項１９４または請求項１９５の医薬組成物。
【請求項２０６】
該核酸が、約１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項２０５の医薬組成物。
【請求項２０７】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームがそれぞれ、約０．５：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて該第一および第二のカチオン性リポソーム中に存在する請求項１９４または請求項１９５の医薬組成物。
【請求項２０８】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームがそれぞれ、約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比にて該第一および第二のカチオン性リポソーム中に存在する請求項２０７の医薬組成物。
【請求項２０９】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、約１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の重量比にて存在する請求項２０８の医薬組成物。
【請求項２１０】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択される請求項１９４または請求項１９５の医薬組成物。
【請求項２１１】
該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項１９４または請求項１９５の医薬組成物。
【請求項２１２】
該複合体のそれぞれに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）  （配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項１９４または請求項１９５の医薬組成物。
【請求項２１３】
１以上の抗菌薬、１以上の保存料、１以上の緩衝剤および１以上の界面活性剤からなる群から選択される１以上の賦形剤をさらに含む請求項１９４または請求項１９５の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、薬物送達、具体的には、カチオン性リポソームに基づくワクチンの分野におけるものである。態様において、本発明は、ウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する、または、ウイルス性疾患を治療または予防する、分子の送達に有用なリガンド−標的化（例えば、抗体−または抗体フラグメント−標的化）リポソームを製造する方法を提供する。送達システムの特異性はターゲティングリガンドに由来する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ワクチンは、高度に伝染性の感染性病原体に対する強力な武器であり、前世紀において感染性疾患の負荷を顕著に低減するのに役立った。しかし、感染性疾患によりもたらされる世界的な健康に対する脅威は低減しておらず、むしろ国家的および全世界的重要事項となっている。結核およびマラリアなどのウイルス性病原体の衝撃は、例えば、世界的規模で感じられ続けており、新たに現れた病原体、例えば、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ＳＡＲＳ−コロナウイルスおよび最近出現している感染爆発のインフルエンザ、即ち「鳥インフルエンザ」ウイルスは公衆衛生に対する新たな挑戦である。
【０００３】
ほとんどのワクチン技術には、不活性化ワクチン製剤、タンパク質サブユニットに基づくものまたは弱毒性の性質のものを伴う。例えば、インフルエンザワクチンの現在の生産および製造技術は、鶏卵の接種に基づき、依然として時間と労力のかかる方法である。弱毒性ウイルスである天然痘ワクチンは、免疫不全集団においては重篤な有毒な事象が伴う。したがって、現在のワクチン技術は旧式であり、ワクチンに対する国家的または世界的要求を満たすには不十分である。
【０００４】
それゆえ、高度に易変性の出現しつつある病原体によってもたらされる挑戦に取り組む新しいワクチン技術を開発することが緊急の要求である。本発明は、抗原に対する免疫応答の誘発における使用および患者におけるウイルス性疾患の治療または予防のためのカチオン−リポソームに基づく薬物送達システムを提供することによってかかる要求を満たすものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の簡単な概要
一つの態様において、本発明は、リガンド−標的化（ｌｉｇａｎｄ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）（例えば、タンパク質／ペプチド−標的化、抗体−または抗体フラグメント−標的化）カチオン性リポソームを調製する方法を提供する。好適な態様において、かかる方法は、リガンド（例えば、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体、または抗体フラグメント）を調製する工程およびリガンドとカチオン性リポソームとを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソームを形成させる工程を含む。好適には、リガンドはカチオン性リポソームと直接的に結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）／複合体化しているが、カチオン性リポソームに化学的に結合してはいない。別の態様において、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していてもよい。次いで、リガンド−標的化カチオン性リポソームを１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、および／または１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子と混合して、リガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる。好適な態様において、抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、または一本鎖Ｆｖフラグメント、例えば、抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）が用いられる。さらなる態様において、方法はさらに、リガンド−標的化カチオン性リポソームとＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドとを混合する工程を含んでいてもよい。
【０００６】
好適には、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）はカチオン性リポソームと約１：１から約１：１００、好適には約１：１０から約１：５０（ｗ：ｗ）、より好適には約１：２０から約１：４０の範囲の比にて混合される。例示的な態様において、カチオン性リポソームは、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＤＯＴＡＰ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および／またはコレステロール（ｃｈｏｌ）との混合物；または、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物を含む。
【０００７】
核酸は好適には約０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比；約１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する。例えば、約１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、の比が利用できる。例示的な態様において、カチオン性免疫リポソームは、１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、および１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子と、約１：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）、好適には約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）、例えば、約１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の重量比にて混合される。
【０００８】
核酸分子によってコードされうるウイルスタンパク質の例としては、これらに限定されないが、ＨＩＶウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、Ａ、ＢまたはＣ型肝炎ウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、西ナイルウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択されるウイルスタンパク質が挙げられる。核酸分子によってコードされうるインターロイキンの例としては、これらに限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択されるインターロイキンが挙げられる。好適な態様において、核酸は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５をコードする。本発明はまた、本発明の様々な方法によって調製されるカチオン性免疫リポソーム複合体を提供する。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、カチオン性リポソーム、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）、１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、および１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含むリガンド−標的化（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント−標的化）カチオン性リポソーム複合体を提供し、ここでリガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している。さらなる態様において、リガンドはリポソームに化学的に結合していてもよい。
【００１０】
本発明はさらに、本発明の様々なリポソーム複合体を含む医薬組成物を提供する。本発明のさらなる医薬組成物は、カチオン性リポソーム、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）および１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む第一のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を含み、ここでリガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している。さらなる態様において、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していてもよい。好適な態様において、医薬組成物はさらに、カチオン性リポソーム、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）および１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含む第二のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を含み、ここでリガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している。さらなる態様において、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していてもよい。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、カチオン性リポソーム、ＴｆＲｓｃＦｖ、および１以上の活性薬剤を含む抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）−標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に１以上の活性薬剤を送達する方法を提供し、ここでＴｆＲｓｃＦｖはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが、直接的にカチオン性リポソームと結合／複合体化している。さらなる態様において、ＴｆＲｓｃＦｖはカチオン性リポソームに化学的に結合していてもよい。好適には、方法は、プロフェッショナルおよび非プロフェッショナルＡＰＣ、例えば肝臓、脾臓、リンパ節、腸および／または呼吸器に位置するＡＰＣに薬剤（例えば、核酸）を送達する。
【００１２】
本発明はまた、本発明の様々なカチオン性リポソーム複合体、または本発明の医薬組成物を哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、本発明の様々なカチオン性リポソーム複合体、または本発明の医薬組成物を哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防する方法を提供する。
【００１４】
図／図面の簡単な説明
特許または出願のファイルはカラーでなされた少なくとも１つの図を含む。カラー図を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な料金の支払いにより庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、抗−トランスフェリン受容体一本鎖抗体フラグメント（ｓｃ）およびルシフェラーゼレポーター遺伝子と複合体化したリポソーム（ＨｏＫＣペプチドを含むまたは含まない）によりトランスフェクトしたＨｅｐ３Ｂ細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す。
【００１６】
【図２】図２は、ｓｃ、ＧａｌまたはＬ−３７−ｐＡおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＤＮＡと複合体化した３種類のリポソーム（Ａ、ＤおよびＧ）によりトランスフェクトした初代チンパンジー肝細胞におけるルシフェラーゼ発現を示す。すべてのデータは平均＋ＳＤ（ｎ＝３）として示す。
【００１７】
【図３】図３は、以下と複合体化したＥＧＦＰを発現する２０−２５μｇのＤＮＡを接種された２連のマウスからの肝臓抽出物におけるＧＦＰ発現を非処理マウス（ＵＴ）と比較して示すウェスタンブロットを示す：リピドＡ（ｓｃＬＡ）、リピドＡおよびＨｏＫＣ（ｓｃＬＡＨＫ）、リピドＤおよびＨｏＫＣ（ｓｃＬＤＨＫ）、リピドＧおよびＨｏＫＣ（ｓｃＬＧＨＫ）と結合したＴｆＲｓｃＦｖリガンド（ｓｃ）、リピドＡ（ＧａｌＬＡ）と結合したガラクトースおよびリピドＡ（Ｌ−３７ｐＡＬＡ）と結合したＬ−３７ｐＡ。
【００１８】
【図４】図４は、ＨＣＶ抗原ＮＳ３−ＮＳ５Ｂを発現するＤＮＡプラスミド（ｐＡＧ４１０）によりトランスフェクトされた細胞のウェスタンブロットを示す。ブロットは、ＮＳ５Ｂに対するモノクローナル抗体（左）および慢性的に感染したチンパンジーからの血清（右）によりプローブした。
【００１９】
【図５】図５は、ｐＳＣＭＶおよびＣＭＶプロモーターの下でのＩＬ−２の発現比較を示す。
【００２０】
【図６】図６は、ｓｃＬと複合体化したまたは遊離のｐＡＧ４１０の静脈内注射の後のマウス肝臓におけるＮＳ３のＤＮＡ  ＰＣＲ増幅を示す。
【００２１】
【図７】図７は、ｓｃＬ−ＨＣＶ／ｓｃＬ−ＩＬ１２を接種されたマウスにおけるＨＣＶ組換えワクシニアウイルス複製の阻害を示す。
【００２２】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、未処理動物（Ｃｈ１６０１）および回復した動物（Ｃｈ１５８７）のワクチン接種およびＨＣＶによる攻撃の際のＨＣＶ抗−ＨＶＲ１抗体（棒）およびＲＮＡプロファイル（黒三角）を示す。抗−ＨＶＲ１はＰ／Ｎ比として表す。Ｐ／Ｎは試験血清のＯＤ４０５を、同じチンパンジーからのワクチン前サンプルについて得たものによって割ることにより算出する。カットオフ値はＰ／Ｎ＝２である。
【００２３】
【図９】図９Ａ−９Ｃは、２匹の回復したチンパンジー（Ｃｈ１５８８およびＣｈ１６０６）および未処理チンパンジー（Ｃｈ６３９４）のＴ細胞に基づくワクチン接種およびＨＣＶによる攻撃の際の疾患プロファイルを示す。ＲＮＡタイター（ｔｉｔｅｒ）（黒四角）、ＡＬＴレベル（黒三角）。免疫化動物のＨＣＶ攻撃は、０週目に行った（１００  ＣＩＤ５０のｃＨＣＶ）。
【００２４】
【図１０】図１０Ａ−１０Ｃは、ｓｃＬ−ＨＣＶにより免疫され、組換えアデノウイルスにより追加免疫されたチンパンジー（Ｃｈ１６１１およびＣｈ６４０７）または、ｓｃＬ−空ベクターにより免疫され、非組換えアデノウイルスにより追加免疫されたチンパンジー（Ｃｈ０２５７）におけるペプチドプールに対するエリスポット応答を示す。
【００２５】
【図１１】図１１Ａ−１１Ｃは、免疫化（Ｃｈ６４０７および１６１１）および対照（Ｃｈ０２５７）チンパンジーにおける攻撃前後のエリスポット応答を示す。
【００２６】
【図１２】図１２Ａ−１２Ｃは、ワクチン接種した（Ｃｈ６４０７および１６１１）および対照（Ｃｈ０２５７）チンパンジーにおける肝臓内サイトカインｍＲＮＡレベルを示す。
【００２７】
【図１３】図１３は、対照（Ｃｈ０２５７）およびワクチン接種した（Ｃｈ６４０７および１６１１）チンパンジーにおける攻撃後のＨＣＶ  ＲＮＡタイターを示す。
【００２８】
【図１４】図１４は、対照（Ｃｈ０２５７）およびワクチン接種した（Ｃｈ６４０７および１６１１）チンパンジーにおける攻撃後の血清ＡＬＴレベルを示す。
【００２９】
【図１５】図１５は、慢性的に感染したチンパンジーにおけるＰＢＭＣ  Ｔ−細胞応答を示す。
【００３０】
【図１６】図１６Ａ−１６Ｃは、遊離（裸（ｎａｋｅｄ））プラスミドＤＮＡ（ＬＵＣ）として（Ｂ）、またはｓｃＬナノ免疫リポソーム複合体（ｓｃＬＬＵＣ）にカプセル封入された（Ｃ）、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡのＩＮ投与、次いでルシフェリン基質注射の後のＢＡＬＢ／ｃマウスの光学イメージングを示す。パネル  Ａは非処理対照を表す。
【００３１】
【図１７】図１７Ａ−１７Ｃは、遊離（裸）プラスミドＤＮＡ（ＬＵＣ）として（Ｂ）、またはｓｃＬナノ免疫リポソーム複合体（ｓｃＬＬＵＣ）にカプセル封入された（Ｃ）、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡの静脈内投与、次いでルシフェリン基質注射の後のＢＡＬＢ／ｃマウスの光学イメージングを示す。パネルＡは非処理対照を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
一つの態様において、本発明の態様によるリガンド−標的化（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント−標的化）カチオン性リポソームまたはカチオン性ポリマー複合体は、好適には、所望の複合体の成分が所定の比および所定の順序にて混合される簡便かつ効率的な非化学的結合方法によって作られる。さらなる態様において、リガンド−標的化カチオン性リポソームまたはカチオン性ポリマー複合体は、リガンドがカチオン性リポソームの表面に化学結合を介して化学的に結合する化学的結合方法によって作られうる。
【００３３】
「免疫複合体」、「免疫リポソーム」、「複合体」、「ナノ複合体」、「免疫ナノ複合体」、「リポソーム複合体」および「ナノ免疫リポソーム」という用語は本明細書に渡って互換的に本発明のカチオン性リポソームを指すために用いられる。本発明の実施における使用のための例示的なカチオン性リポソームおよびその生産方法は、米国公開特許出願番号２００３／００４４４０７および２００６年９月１４日出願の米国特許出願番号１１／５２０，７９６に開示されており、それぞれの開示内容は引用によりその全体を本明細書に含める。
【００３４】
本明細書において用いる場合、「約」という用語は、言及された値ならびにその言及された値の１０％の範囲内にある値をいう。例えば、「約１００ｎｍ」には、その範囲の間の値を含む９０ｎｍから１１０ｎｍの値が含まれる。
【００３５】
本明細書において用いる場合、「リガンド」という用語は、カチオン性リポソームに化学的に結合していてもよいし、あるいはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に結合／複合体化していてもよい、あらゆる好適なターゲティング部分をいう。本発明の実施における使用のための例示的なリガンドとしては、これらに限定されないが、タンパク質（例えば、トランスフェリンまたは葉酸）、ペプチド（例えば、Ｌ−３７ｐＡ）、抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメントおよび一本鎖Ｆｖフラグメント）および糖類（例えば、ガラクトース）、ならびにその他のターゲティング分子が挙げられる。
【００３６】
本発明の態様による複合体が簡便かつ効率的な非化学的結合によって作られる例示的な方法および組成は、米国公開特許出願番号２００３／００４４４０７および２００６年９月１４日出願の米国特許出願番号１１／５２０，７９６に開示されている。本発明の態様による複合体が化学的結合を介して作られる例示的な方法および組成は、２００１年１０月１日出願の米国特許出願番号０９／９１４，０４６に開示されている。これら特許出願のそれぞれの開示内容はそれらの全体を引用により本明細書に含める。
【００３７】
例示的な態様において、抗体全体または抗体フラグメントが本発明の複合体の作製のためのリガンドとして使用できる。好適な態様において、抗体フラグメントが用いられ、例えば、抗体のＦａｂフラグメントおよび一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）が挙げられる。一つの好適な抗体は抗−トランスフェリン受容体（抗−ＴｆＲ）モノクローナル抗体であり、好適な抗体フラグメントは抗−ＴｆＲモノクローナル抗体に基づくｓｃＦｖである。好適な抗−ＴｆＲモノクローナル抗体は５Ｅ９である（例えば、Ｈａｙｅｓ，  Ｂ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  （５Ｅ９）  ｔｈａｔ  Ｄｅｆｉｎｅｓ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，”  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２７：３４７−３５２  （１９８１）；  Ｂａｔｒａ，  Ｊ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ  ｏｒ  Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  Ｔｏｘｉｎ：  Ａｎｔｉ−ＴＦＲ（Ｆｖ）−ＰＥ４０  ａｎｄ  ＤＴ３８８−Ａｎｔｉ−ＴＦＲ（Ｆｖ），”  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１：２２００−２２０５  （１９９１）を参照；これらの開示内容は引用により本明細書に含める）。５Ｅ９抗体に基づくｓｃＦｖは、このＭＡｂによって認識されるＴｆＲのエピトープに対する完全な抗体結合部位を一本のおよそ分子量２６，０００のポリペプチド鎖として含む。ｓｃＦｖは第一の可変領域のＣ−末端と第二の可変領域のＮ−末端をＶＨ−ペプチド−ＶＬまたはＶＬ−ペプチド−ＶＨの順で架橋する適宜に設計されたペプチドによりそれぞれ重鎖および軽鎖からの成分であるＶＨおよびＶＬ可変領域を連結することにより形成される。さらなるリガンド、例えば、明細書中に記載のものも、本発明の実施において使用することができる。
【００３８】
一つの態様において、システイン部分がｓｃＦｖのＣ−末端に付加される。理論に拘束される意図はないが、遊離のスルフヒドリル基を提供するシステインは、化学的結合および非化学的結合の両方の態様において抗体とリポソームとの間の複合体の形成を促進しうると考えられる。システインが無くてもあっても、タンパク質は大腸菌内のインクルージョンボディーにて発現され得、再フォールディングされて活性形態における抗体フラグメントが生産される。
【００３９】
複合体の形成において立体的に安定化された免疫リポソームの使用が望ましい場合以外は、例示的な非化学的結合した本発明の複合体の製造における第一工程は、カチオン性リポソームまたはリポソームの組合せを選択された抗体または抗体フラグメントと混合することを含む。多種多様なカチオン性リポソームが本発明の複合体の調製において有用である。公開ＰＣＴ出願ＷＯ９９／２５３２０は、いくつかのカチオン性リポソームの調製を記載している。好適なリポソームの例としては、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）ならびにジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＤＯＴＡＰ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および／またはコレステロール（ｃｈｏｌ）の混合物；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）およびＤＯＰＥおよび／またはｃｈｏｌの混合物を含むものが挙げられる。脂質の比は、特定の標的細胞のタイプに対する治療用分子の取り込みの効率を最適化させるために変動されうる。リポソームは、１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含みうる。カチオン性脂質の中性またはヘルパー脂質に対する望ましい比は約１：（０．５−３）、好ましくは１：（１−２）（モル比）である。
【００４０】
好適なリガンド、例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメントは、標的細胞の表面に結合するものであり、好ましくは、標的細胞上に示差的に発現する受容体に結合するものである。リガンドはカチオン性リポソームまたはポリマーと、室温で、リガンド（例えば、タンパク質）：脂質比（重量：重量）が約１：１０から約１：５０の範囲、好適には約１：２０から約１：４０（ｗ：ｗ）の範囲にて混合される。
【００４１】
リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）およびリポソームを室温で短時間、典型的には約１０−１５分間インキュベートし、次いで混合物を選択した治療または診断薬と混合する。リポソーム複合体と複合体化されうる治療用分子または薬剤の例としては、遺伝子、高分子量ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、リボザイム、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡおよびアンチセンス）、低分子、ウイルス粒子、免疫調節剤、イメージングのための造影剤、タンパク質および化学薬品が挙げられる。
【００４２】
リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）およびリポソームの組合せは、治療薬と約０．５：１から約１：４０（μｇの治療薬：ｎｍｏｌの総脂質）、好適には約１：１０から１：２０（μｇの治療薬：ｎｍｏｌｅの総脂質）の範囲の比にて混合され、室温で短時間、典型的には約１０から１５分間インキュベートされる。リポソーム複合体のサイズは典型的にはＭａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）３０００またはＭａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）  ＮＡＮＯ−ＺＳを用いて動的光散乱により測定して約５０−５００ｎｍの範囲内である。その開示内容全体を引用により本明細書に含める米国公開特許出願番号２００３／００４４４０７および米国特許出願番号１１／５２０，７９６を参照されたい。
【００４３】
本発明の一つの態様において、複合体の形成に用いられるリポソームは立体的に安定化されたリポソームである。立体的に安定化されたリポソームとは、そのなかに親水性ポリマー、例えば、ＰＥＧ、ポリ（２−エチルアクリル酸）、またはポリ（ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）が統合したリポソームである。かかる改変リポソームは治療薬と複合体化した場合に特に有用であり得る。というのはそれらは典型的には、改変されていない対応するリポソームと同じように迅速には細網内皮系によって血流から排除されないからである。本発明の立体的に安定化されたリポソーム複合体を製造するためには、抗体または抗体フラグメント、リポソームおよび治療または診断薬を混合する順序を上記の順序とは逆のものとする。第一工程において、上記のカチオン性リポソームはまず上記の治療薬と約０．５：１から約１：４０（μｇの治療薬：ｎｍｏｌの脂質）、好適には約１：１０から１：２０（μｇの治療薬：ｎｍｏｌｅの脂質）の範囲の比にて混合される。このリポプレックスに、生理的に許容される緩衝剤中のＰＥＧポリマーの溶液を約０．１：１００（ｎｍｏｌのＰＥＧ：ｎｍｏｌのリポソーム）、好適には、約０．５：５０、例えば、約１：４０（ｎｍｏｌのＰＥＧ：ｎｍｏｌのリポソーム）の比にて添加する。その結果得られた溶液を、ポリマーがリポソーム複合体に統合するのに十分な時間室温でインキュベートする。リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）を次いで、安定化されたリポソーム複合体と室温でリガンド（例えば、タンパク質）：脂質の比が約１：５から約１：４０（ｗ：ｗ）の範囲にて混合する。
【００４４】
本発明にしたがって調製されたリポソーム複合体は、医薬上許容される製剤としてインビボ投与のために製剤されうる。複合体は医薬上許容される媒体または担体と混合されてもよい。組成物は、例えば、治療用分子または複合体中のその他のペイロードの投与により利益を被る哺乳類、例えば、ヒト患者への静脈内投与のために製剤されうる。複合体は静脈内投与の後に体中に分布するのに適当なサイズとされる。あるいは、複合体は、その他の投与経路、例えば、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル、経皮的、経口、内視鏡下、局所、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放インプラント、または皮下投与、あるいは浸透圧または機械的ポンプを用いる投与を介して送達されうる。かかる方法を介する送達のための製剤の調製、およびかかる方法を用いる送達は当該技術分野において周知である。
【００４５】
複合体は、脂質の選択および比、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）のリポソームとの比、リガンドおよびリポソームの治療薬との比、およびリガンドおよび治療薬の選択を介して標的細胞タイプについて最適化することが出来る。
【００４６】
本発明の方法にしたがって製造された複合体は、核酸、治療用分子、またはその他のペイロードの複合体による全身的送達における使用のためのキットの形態で提供されうる。好適なキットは、別々に、好適な容器、リポソーム、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）、および核酸、治療または診断薬を含みうる。成分は無菌条件下で適当な順序で混合され得、調製の後、合理的な時間内、一般的には、約３０分間から約２４時間内に患者に投与されうる。キット成分は好ましくは、溶液または乾燥粉末として提供される。溶液形態にて提供される成分は、好ましくは、適当な緩衝剤、浸透圧調節剤等とともに注射用無菌水中に製剤される。完全な複合体はまた乾燥粉末として製剤してもよい（凍結乾燥）（例えば、その開示内容全体を引用により本明細書に含める米国公開特許出願番号２００５／０００２９９８を参照されたい）。
【００４７】
その開示内容を引用により本明細書に含める米国公開特許出願番号２００３／００４４４０７および米国特許出願番号１１／５２０，７９６にわたって議論されているように、記載されるカチオン性免疫リポソーム複合体は、抗−トランスフェリン一本鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）を用いるターゲティングを介して腫瘍細胞に様々な治療および診断薬を送達するのに成功している。具体的には、核酸分子、例えば、アンチセンスおよびｓｉＲＮＡ、ならびにプラスミドＤＮＡ（例えば、ｐ５３およびＲＢ９４）が、本発明の免疫リポソーム複合体を用いる送達に成功している（米国公開特許出願番号２００３／００４４４０７および米国特許出願番号１１／５２０，７９６を参照）。低分子も開示されている方法およびリポソームによって送達されている（２００７年５月１１日出願のその開示内容全体を引用により本明細書に含める米国特許出願番号１１／７９８，２９６を参照）。全体に渡って議論されているように、このたび、ＴｆＲｓｃＦｖをターゲティング部分として用いることにより、肝臓肝細胞、クッパー細胞、肝臓類洞上皮細胞（ＬＳＥＣ）および樹状細胞を含むがこれらに限定されない、体中のあらゆる場所における抗原提示細胞（ＡＰＣ）に標的化され、それら細胞を効率的にトランスフェクトするためのワクチンコンストラクトを調製しうることが発見された。
【００４８】
ワクチン接種のためのカチオン性リポソーム複合体
一つの態様において、本発明は、哺乳類（本明細書において用いる場合、哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ラット、マウス、チンパンジー、サル、類人猿などならびにヒト）におけるウイルス複製一次部位、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による場合は肝臓、具体的には抗原提示細胞（ＡＰＣ）にて、カチオン性リポソーム複合体を用いてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。一例として、ＨＣＶにおいて、Ｔ細胞応答が感染の際にウイルス複製部位（肝臓）にてより迅速かつより有効であることが判明した。本発明はそれゆえ、ＨＣＶから回復した哺乳類において起こるＴ細胞プライミングを模倣する方法を提供し、かかる方法は、組換えプラスミドＤＮＡを送達するカチオン性リポソーム、およびウイルスベクターを用いる（ｖｉｒａｌ−ｖｅｃｔｏｒｅｄ）免疫を介してインビボで肝臓（例えば、クッパー細胞、肝臓類洞上皮細胞、樹状細胞および肝細胞）に位置する細胞を標的化する免疫応答（例えば、予防ワクチン）を誘発することによる。本発明はまた、慢性（および急性）病原体感染の予防および治療のための免疫治療薬として使用するためのワクチンを提供する。様々なリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を体の正常細胞（即ち、腫瘍ではない細胞）に送達する能力は予期せぬ驚くべき結果である。本発明の例示的な方法は哺乳類（例えば、ヒト）の治療に用いられているが、本発明の方法、リポソーム製剤および組成物は、鳥類、魚類などを含むその他の動物の治療にも利用可能であることを理解すべきである。
【００４９】
本発明のカチオン性免疫リポソーム複合体は好適には、抗−トランスフェリン受容体一本鎖抗体分子（ＴｆＲｓｃＦｖ）をその表面に含む。このターゲティング分子はウイルスタンパク質を発現するカプセル封入／結合された核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）の、送達およびＡＰＣによる取り込みを促進することが判明した。例えば、米国公開特許出願番号２００３／００４４４０７および米国特許出願番号１１／５２０，７９６を参照されたい。さらに、本発明は、免疫応答を刺激するために同じ免疫リポソーム複合体中でのインターロイキン（ＩＬ）アジュバントを発現する核酸の同時投与を提供する。
【００５０】
免疫応答のサイトカイン増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）
サイトカインは、活性化刺激に応答して体内の細胞によって放出される小さいタンパク質（〜２５ｋＤａ）である。それらは自然および獲得免疫応答を調節する特定の受容体に結合することによって自己分泌および傍分泌の様式で応答を誘発する。それらは精製タンパク質（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  Ｊ．Ａ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１７０：１５１−１７２  （１９９９））または所望のサイトカイン産物を発現するＤＮＡプラスミド（Ｔｏｋａ  Ｆ．Ｎ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９：１００−１１２  （２００４））のいずれかの共投与を介してワクチンの活性を向上させるために広く用いられている。これらアジュバントの遺伝子送達に関するほとんどの研究は投与の筋肉内または皮内経路に焦点をあてたものであり、静脈内送達は徹底的には評価されていない（Ｔｏｋａ参照）。ＣＤ４細胞はそれらのサイトカイン遺伝子転写および分泌に基づいて２つの主要なタイプに分けられる。Ｔｈ１細胞はそのＩＬ−２およびガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）の分泌によって特徴づけられるが、Ｔｈ２細胞はＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０を産生する。アジュバントはＴｈ１またはＴｈ２方向のいずれかに向けられたＴ−細胞応答を誘発し得、それはワクチンの結果に顕著な影響を有しうる。免疫を向上させ、有効なＴｈ１−型応答を刺激するために、ＩＬ−２、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５を発現する核酸、例えば、プラスミドが好適には記載されるカチオン性リポソームに結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）／カプセル封入される。
【００５１】
ＩＬ−２：ＩＬ−２（１５．５−ｋＤａ糖タンパク質）の大部分はＣＤ４  Ｔｈ１型細胞によって産生され、その主要な作用は、ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）増殖、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー細胞、単球、およびマクロファージを刺激することである。ＩＬ−２は抗原特異的免疫応答の開始および維持において重要な役割を果たすことが知られており、いくつかのＤＮＡワクチンによって誘発される免疫応答を増強することが示された。その機構は、ＤＣにおけるＣＤ４８およびＣＤ８０の発現の上方制御ならびにそれらそれぞれのリガンド、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２およびＣＤ２８の上方制御であるようである（Ｔｏｋａ参照）。
【００５２】
ＩＬ−１２：ヒトＩＬ−１２は、２つのサブユニットであるｐ３５およびｐ４０から構成されるヘテロダイマーである。それは病原体感染に応答して貪食細胞およびＤＣによって産生される炎症誘発性サイトカインであり、ＩＦＮ−γ産生を誘発する。このサイトカインはＴｈ２細胞よりもＴｈ１の分化を好み、自然耐性と獲得免疫とを結びつける。ＤＮＡに基づくＨＣＶワクチンにより免疫されたマウスにおいて、ＩＬ−１２ＤＮＡの送達はＣＴＬ応答およびコア−ｒＶＶのクリアランスを向上させた。
【００５３】
ＩＬ−１５：ＩＬ−１５は、多面的かつ多機能的に作用する１４ｋＤａ糖タンパク質である。それは多種多様な細胞、例えば、単球、マクロファージ、ＤＣ、クッパー細胞、肝細胞および内皮細胞によって発現される。それは同じ受容体成分を用いる２つのサイトカインとしてＩＬ−２と共通して多くの生物活性を有する。ＩＬ−１５はＮＫ細胞およびＣＴＬの細胞溶解活性を増強し得、ＮＫおよびＴ細胞からのＩＦＮ−γ産生を誘発しうる。さらにそれはＣＤ８＋メモリーおよびエフェクターＴ細胞の増殖を誘発し、そのためそれは抗ウイルスＣＤ８＋メモリーＴ細胞応答を誘発する場合にアジュバントとして含めるための魅力的な候補である。
【００５４】
例示的な態様において、カチオン性リポソームはＨＫペプチドを有するかまたは有さない、一本鎖トランスフェリン受容体抗体（ｓｃＬまたはｓｃＬＨＫ）およびＨＣＶゲノムのＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ（ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ）部分を発現する１以上のプラスミドを含む（ｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶ）。しかし、記載されるように、いずれのウイルスタンパク質を発現するいずれの核酸分子も本発明のリポソームにカプセル封入／結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）されうることに注目すべきである。
【００５５】
ワクチン接種され、組換えアデノウイルスにより追加免疫された未処理（ｎａｉｖｅ）チンパンジーにおける結果は、アジュバントとしてＩＬ−１２を発現するプラスミドＤＮＡを含む全身的ｓｃＬ−ＨＣＶアプローチは、ＨＣＶ−特異的免疫応答を引き起こしうることを示す。ＨＣＶ複製は攻撃の後に劇的に抑制され、それにはＨＣＶ−特異的Ｔ細胞応答が伴った。ＨＣＶＮＳ３タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスによる接種後のＴ細胞応答「攻撃」を評価するマウス細胞性免疫実験においてもｓｃＬ−ＨＣＶ／ＩＬ群におけるウイルス複製の阻害が示され、これらの結果は、ウイルス抗原に対する免疫応答を誘発するための予防ワクチン接種についてのこのアプローチの使用を支持する。
【００５６】
例示的な態様において、本発明は、リガンド−標的化（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント−標的化）カチオン性リポソーム複合体を調製する方法を提供する。好適な態様において、かかる方法は、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）を調製する工程、および、リガンドとカチオン性リポソームとを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソームを形成させる工程を含み、ここでリガンドは、カチオン性リポソームに化学的に結合していないがカチオン性リポソームに直接的に結合／複合体化している。リガンド−標的化カチオン性リポソームは次いで１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、および１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子と混合され、リガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体が形成される。別の例示的な態様において、本発明は、リガンド−標的化（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント−標的化）カチオン性リポソーム複合体を調製する方法を提供する。好適な態様において、かかる方法は、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）を調製する工程、および、リガンドとカチオン性リポソームとを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソームを形成させる工程を含み、ここでリガンドは、化学的結合を介してカチオン性リポソームと直接的に複合体化される。リガンド−標的化カチオン性リポソームは次いで、１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、および／または１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子と混合され、リガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体が形成される。
【００５７】
本明細書において記載されるように、核酸分子は好適には、１以上の核酸分子とリポソームとを処理の間に単に混合することによって、本発明のリポソーム複合体にカプセル封入、含有または複合体化／結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）される。核酸分子：リポソーム複合体の好適な比は、当業者に容易に決定される。例示的な態様において、核酸は、約１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する。例えば、１以上のウイルスタンパク質をコードする核酸分子は１以上のインターロイキンをコードする核酸分子と約０．１：１０から約１０：０．１、好適には約０．５：１から約２：１、より好適には約１：１の範囲のモル比にて、例えば、リポソームとの複合体形成の前に一緒に混合され、核酸溶液が形成されるが、これら範囲外のさらなるモル比を用いることも可能である。別の態様において、核酸分子はリポソームに対して別々に（即ち、異なる溶液中で）複合体化されうるが、依然として所望のモル比を維持している。
【００５８】
好適には、核酸分子対リポソーム複合体のモル比は約０．５：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）、好適には約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）、より好適には約１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の範囲内である。本明細書において用いる場合、核酸分子対リポソーム複合体のモル比には、核酸の両方の「集団」が含まれ、即ち、核酸の総量には１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、および１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子が含まれる。
【００５９】
明細書中に記載されるように、核酸分子の送達のために望ましいカチオン性リポソームの例としては、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＤＯＴＡＰ）とジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および／またはコレステロール（ｃｈｏｌ）との混合物；およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）とＤＯＰＥおよび／またはｃｈｏｌとの混合物を含むものが挙げられる。脂質の比は、特定の標的細胞タイプに対する核酸分子の取り込み効率を最適化するために変動されうる。リポソームは、１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含みうる。カチオン性脂質対中性またはヘルパー脂質の望ましい比は、約１：（０．５−３）、好ましくは約１：（１−２）（モル比）である。本発明の実施に有用な様々な脂質の例示的な比としては、これらに限定されないが以下が挙げられる：
【表１】
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（ＤＯＴＡＰ＝ジオレオイルトリメチルアンモニウム（ａｍｉｎｎｏｎｉｕｍ）ホスフェート、ＤＤＡＢ＝ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド；ＤＯＰＥ＝ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン；ｃｈｏｌ＝コレステロール）。
【００６０】
本明細書において議論されるように、好適な態様において、本発明の組成物および方法において有用なリガンドは、抗体フラグメント、例えば、一本鎖Ｆｖフラグメント、例えば、抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である。好適には、抗体または抗体フラグメントはカチオン性リポソームと約１：１から約１：１００、好適には約１：１０から約１：５０（ｗ：ｗ）、より好適には約１：３０、または約１：３３（抗体または抗体フラグメント：脂質）の範囲の比にて混合され、標的化カチオン性免疫リポソームが形成される。さらなる態様において、リポソームはまた、エンドソーム破壊（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ）ペプチド、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ）により製造されているＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（ＨＫ）（配列番号１）ペプチドをリポソームと結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）して含んでいてもよい。エンドソーム破壊ペプチドＨｏＫＣは、細胞の細胞質における薬剤の放出を助けうる。
【００６１】
例示的な態様において、カチオン性リポソーム製剤Ａ（１：１モル比のＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ）、Ｂ（１：１のＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ）、Ｇ（１：１：１のＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール）およびＨ（１：１：１のＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ：コレステロール）または本明細書において記載されるいずれかの脂質製剤は本明細書において記載されるようにエタノール注射方法を用いて調製される。各リポソーム製剤はまた好適には総脂質の５モルパーセントにてＭＰＢ−ＤＯＰＥを含む。ＨｏＫＣペプチド（Ｋ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ）は末端システインを担持しているので、ＭＰＢ−ＤＯＰＥをすべてのリポソーム組成物に含めてペプチドのリポソームへの結合を可能とした。Ｌｉｐ−ＨｏＫＣリポソームは、マレイミド基を担持するカチオン性リポソーム（Ｌｉｐ−ＭＰＢ）とペプチドとの間のカップリング反応を用いて調製した。システイン上に遊離チオール基を有するペプチドの０．１ｍｍｏｌのアリコートを１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中の２ｍｍｏｌのＬｉｐ−ＭＰＢ溶液に添加し、室温で２時間回転させた（２０−３０ｒ．ｐ．ｍ．）。結果として得られたＬｉｐ−ＨｏＫＣの脂質濃度は１．４ｍＭである。
【００６２】
完全な複合体は、ＨｏＫＣを含まないＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ：ＤＮＡ複合体の生産に用いられたものと同じようにして形成される。この場合でも、抗−トランスフェリン受容体一本鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）が特定の比にて穏やかに反転させることによりＬｉｐ−ＨｏＫＣと混合され、室温で１０分間インキュベートされる。ＤＮＡが次いでＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ−ＨｏＫＣ溶液に添加され、穏やかに反転させることにより混合され、さらに室温で１５分間インキュベートされ、その後、デキストロースまたはスクロースが５−１０％の終濃度となるように添加され、さらに穏やかに反転させることにより混合される。ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ−ＨｏＫＣ：ＤＮＡ複合体についての好適な比は０．３ｍｇ：７ｎｍｏｌ：１ｍｇである。
【００６３】
さらなる態様において、本発明の方法は、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）を調製する工程、および、リガンドをカチオン性リポソームの表面に化学的に結合させてカチオン性免疫リポソームを形成させる工程を含む。カチオン性リポソームは次いで、１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、および１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子と混合されて、リガンド−標的化リポソーム複合体が形成される。リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）をカチオン性リポソームに化学的に結合させるための例示的な方法、組成、比および条件は、その開示内容全体を引用により本明細書に含める２００１年１０月１日出願の米国特許出願番号０９／９１４，０４６に開示されている。
【００６４】
本発明の実施における使用のための例示的な核酸分子としてはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、プラスミドおよびベクターが挙げられる。１以上のウイルスタンパク質をコードする核酸分子はいずれのウイルスタンパク質をコードするものであってもよい。本明細書において用いる場合、「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は互換的に用いられ、２以上のアミノ酸のあらゆる鎖または鎖群を意味し、産物の特定の長さを言及するものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２以上のアミノ酸の鎖または鎖群をいうために用いられるあらゆるその他の用語は、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語の定義に含まれる。
【００６５】
本発明を用いて送達される核酸によってコードされうるウイルスペプチド／タンパク質の例としては、ウイルス性病原体（例えば、インフルエンザ、ＨＩＶ、エボラ、ポックスウイルス（天然痘）、西ナイルウイルス、ＳＡＲＳ、等）等が挙げられる。本発明において用いられる核酸によってコードされうるウイルスタンパク質のさらなる例としては、これらに限定されないが、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド、例えば、カリシウイルスカプシド抗原、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、例えば、西ナイルウイルスＥ−糖タンパク質、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド、例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎および／またはＣ型肝炎、ヘルペスウイルスポリペプチド、例えば、単純ヘルペスウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質、免疫不全ウイルスポリペプチド、例えば、ヒト免疫不全ウイルスエンベロープまたはプロテアーゼ、伝染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、インフルエンザウイルスポリペプチド、例えば、インフルエンザＡポリペプチド、例えば、赤血球凝集素または細胞外Ｍ２タンパク質（Ｍ２ｅ）、ノイラミニダーゼ、または核タンパク質、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルトミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、ラッサ熱ポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド、例えば、赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド、例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド、ポックスウイルスポリペプチド、例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド（例えば、天然痘）、狂犬病ウイルスポリペプチド、例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、およびロタウイルスポリペプチドが挙げられる。かかるウイルスタンパク質をコードする核酸分子は当該技術分野において入手可能であり、かかる核酸分子を含むベクターおよびプラスミドが挙げられる。例えば、公共データベース、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）は、本発明の実施に使用できる核酸分子の様々な例を含んでいる。
【００６６】
１以上のインターロイキンをコードする核酸分子も当該技術分野において周知であり、公共データベース、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）から容易に入手可能である。本発明の実施に有用な核酸分子によってコードされうる例示的なインターロイキンとしては、これらに限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３が挙げられる。好適な態様において、核酸はＩＬ−２、ＩＬ−１２またはＩＬ−１５をコードする。
【００６７】
本発明はまた、本明細書において記載される方法にしたがって調製されるカチオン性免疫リポソーム複合体を提供する。例えば、本発明は、カチオン性リポソーム、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）、１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、および１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含むリガンド−標的化（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント−標的化）カチオン性リポソーム複合体を提供し、ここでリガンドは、カチオン性リポソームに化学的に結合してはいないが、カチオン性リポソームに直接的に複合体化／結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）している。リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）は好適には、リガンドとリポソームとの間の相互作用（例えば、静電気的、ファンデルワールス、またはその他の非化学的結合による相互作用）を介してリポソームに結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）している。一般的に、リンカーまたはスペーサー分子（例えば、ポリマーまたはその他の分子）は、非化学的結合している場合のリガンドとリポソームとの結合には用いられない。
【００６８】
本明細書において記載されるように、さらなる態様において、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）は、例えば、マレイミジル基またはその他のスルフヒドリル反応基を含むカチオン性リポソーム、およびリガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）上の硫黄原子との間の化学的相互作用を介してカチオン性リポソームに化学的に結合している。核酸は次いでリポソームに添加されてリポソーム−ＤＮＡ複合体が形成されるか、または核酸が最初に添加され、次いでリガンドと複合体化されてもよい。かかる方法はその開示内容全体を引用により本明細書に含める２００１年１０月１日出願の米国特許出願番号０９／９１４，０４６に開示されている。
【００６９】
核酸を含むトランスフェリン（Ｔｆ）−結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）リポソーム（Ｔｆ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ）は、以前に記載された処方にしたがって調製される（その開示内容全体を引用により本明細書に含める、Ｘｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｐ５３  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ，”  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １０（１８）：２９４１−２９５２．  （１９９９））。放射線照射と組合せたトランスフェリン−リポソーム−媒介全身的ｐ５３遺伝子治療の結果、ヒト頭頸部癌異種移植片の退縮が起こる。簡単に説明すると、好適な調製のために、２５ｍｌのＴｆ（５ｍｇ／ｍｌ、鉄飽和ホロ−トランスフェリン；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および５０ｍｌのＬｉｐ（２ｍＭ総脂質）＋７５ｍｌの水をポリプロピレンチューブ中で混合し、５−１５分間室温で頻繁に揺り動かしながらインキュベートする。１２０ｍｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ７．４中の１０μｇのプラスミドＤＮＡをチューブに添加し、すぐに徹底的に混合し、２０分間室温で頻繁に揺り動かしながらインキュベートした。３０μｌの５０％デキストロース溶液を次いでチューブに添加する。最終的なＤＮＡ：脂質：Ｔｆ比は約１：１０：１２．５（ｍｇ／ｎｍｏｌ／ｍｇ）である。さらなる態様において、ＨＥＰＥＳ緩衝剤は水で置換してもよい。
【００７０】
核酸分子はカチオン性リポソーム内にカプセル封入されてもよく、カチオン性リポソームの炭化水素鎖領域に含まれてもよく、カチオン性リポソームの内側または外側単層（例えば、頭部領域）に結合していてもよく（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）、またはそれらのいずれかの組合せであってもよい。好適には、本発明のカチオン性免疫リポソームは単層リポソーム（即ち、一つの二重層）であるが、いくつかの同心円状の二重層を含む多重膜リポソームも用いることが出来る。本発明の一つの二重層のカチオン性リポソームは、核酸分子が中にカプセル封入されうる内部水性体積を含む。それらはまた、その中に中性またはほとんど無電荷に調整された核酸分子が含まれうる炭化水素鎖領域（即ち、脂質の脂質鎖領域）を有する一つの二重層も含む。さらに、核酸分子は、例えば、負に荷電している核酸分子と正に荷電しているカチオン性リポソームとの間の電荷−電荷相互作用を介してリポソーム膜の内側単層および／または外側単層（即ち、脂質の頭部領域）のいずれかまたは両方と複合体化または結合しうる（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）。さらなる態様において、核酸分子は、本発明のカチオン性リポソーム複合体のこれらの領域のいずれかまたはすべての中にカプセル封入／結合／複合体化されうる。
【００７１】
本明細書において議論されるように、好適には、核酸分子は、約０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在し；特に、約１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、約１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子をリポソーム複合体において用いることが出来る。脂質、ターゲティングリガンドおよび核酸分子の好適な量／比もまた本明細書において記載される。例示的な態様において、１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、およびリポソームは、約０．５：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇ脂質）、好適には約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇ脂質）、例えば、約１：１０（μｇ全核酸：μｇ脂質）の重量比にて存在する。本発明の例示的なリポソーム組成物は、全核酸、脂質およびリガンド、例えば、一本鎖抗体（例えば、ＴｆｓｃＦｖ）を、約１：１０：０．３３（μｇ全核酸：μｇ脂質：μｇ一本鎖抗体）の重量比にて含む。
【００７２】
本発明のカチオン性リポソームにおいて用いられる核酸分子によってコードされうる例示的なウイルスタンパク質としては、本明細書において記載されるものが含まれ、例えば、ＨＩＶウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、Ａ、Ｂおよび／またはＣ型肝炎ウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質その他が挙げられる。本発明のカチオン性リポソームにおいて用いられる核酸分子によってコードされうる例示的なインターロイキンとしては、本明細書において記載されるものが含まれ、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３が挙げられ、好適には、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５である。
【００７３】
例示的な態様において、本発明の実施における使用のためのウイルスタンパク質および／またはインターロイキンをコードする核酸は、核酸プロモーター、例えば、米国公開特許出願番号２００７／００６５４３２に記載のプロモーターの下流に配置される。
【００７４】
本発明はまた、本明細書において記載されるリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を含む医薬組成物を提供する。好適な態様において、医薬組成物はさらに、１以上の抗菌薬（例えば、アンホテリシンＢ、クロルテトラサイクリン、ゲンタマイシン、ネオマイシン）、１以上の保存料（例えば、塩化ベンゼトニウム、ＥＤＴＡ、ホルムアルデヒド、２−フェノキシエタノール）、１以上の緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤、ホウ酸ナトリウム、塩化ナトリウム）、１以上の界面活性剤（ポリソルベート２０、８０）、１以上のタンパク質安定化剤（例えば、アルブミン、ラクトース、グルタミン酸カリウム）、糖類、例えば、スクロースまたはデキストロース、およびアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）からなる群から選択される１以上の賦形剤を含む。さらなる賦形剤は当該技術分野において周知であり、本発明の実施において容易に利用できる。
【００７５】
本発明はまた、カチオン性リポソーム、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）、および１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む第一のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を含む医薬組成物を提供し、ここでリガンドは、カチオン性リポソームに化学的に結合してはいないがカチオン性リポソームと直接的に複合体化／結合している。さらなる態様において、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合したものであってもよい。医薬組成物はまた好適には、カチオン性リポソーム、リガンド（例えば、タンパク質／ペプチド、抗体または抗体フラグメント）、および１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含む第二のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を含み、ここで、リガンドは、カチオン性リポソームに化学的に結合してはいないがカチオン性リポソームと直接的に複合体化／結合している。さらなる態様において、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合したものであってもよい。
【００７６】
特定のかかる態様において、１以上のウイルスタンパク質をコードする核酸分子は１以上のインターロイキンをコードする核酸と同じ組成物中にて送達されるが、同じカチオン性リポソームにカプセル封入／結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）されるよりはむしろ、それらは２種の（またはそれより多い）異なるカチオン性リポソームと結合され（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）、その後、同じ組成物中にて送達される（即ち、２種類のリポソーム集団が混合されて一緒になる）。別の態様において１以上のウイルスタンパク質をコードする核酸分子および１以上のインターロイキンをコードする核酸分子は同じプラスミドベクターに含まれていてもよい。本発明はまた、哺乳類に２つの別々の免疫リポソーム組成物を投与することも包含し、一方はウイルスタンパク質をコードする核酸を含み、他方はインターロイキンをコードする核酸を含む。本発明の医薬組成物に使用するための好適な脂質、ターゲティング分子および核酸分子の例ならびに、かかる成分の比は本明細書において記載される。
【００７７】
本発明はまた、１以上の活性薬剤を哺乳類の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達する方法を提供する。好適な態様において、かかる方法は、カチオン性リポソーム、ＴｆＲｓｃＦｖ、および１以上の活性薬剤を含む抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）−標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含み、ここで、ＴｆＲｓｃＦｖはカチオン性リポソームに化学的に結合してはいないがカチオン性リポソームと直接的に複合体化／結合している。さらなる態様において、ＴｆＲｓｃＦｖはカチオン性リポソームに化学的に結合している。本発明のかかる方法は、体のあらゆる臓器または組織、例えば、肝臓、リンパ節、腸および／または呼吸器におけるＡＰＣに薬剤を送達するために用いることが出来る。好適には、ＡＰＣは、例えば、プロフェッショナル、または非プロフェッショナルＡＰＣであり得る。「プロフェッショナルＡＰＣ」とは、その表面上にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するものをいう。
【００７８】
好適な態様において、送達される薬剤は核酸分子であるが、その他の薬剤、例えば、化学薬品、例えば、低分子、ならびにペプチドおよびタンパク質も送達され得る。薬剤は、プロフェッショナルならびに非プロフェッショナルＡＰＣ、例えば、肝臓、脾臓、リンパ節、腸および／または呼吸器に位置するＡＰＣへと送達されうる。例示的な態様において、送達される薬剤は、１以上のウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質または天然痘ウイルスタンパク質）および／または１以上のインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８またはＩＬ−２３）をコードする。
【００７９】
さらなる態様において、本発明は、リガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。好適な態様において、カチオン性リポソーム複合体は以下を含む：カチオン性リポソーム；カチオン性リポソームに化学的に結合していないがカチオン性リポソームと直接的に複合体化／結合したリガンド；カチオン性リポソームと結合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；およびカチオン性リポソームと結合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。さらなる態様において、リガンドは、例えば、リガンド上（例えば、抗体または抗体フラグメント上）の硫黄含有基とリポソーム上の基、例えば、マレイミド基との間の化学的結合を介してカチオン性リポソームに化学的に結合している。例示的なリガンドが本明細書において記載され、例えば、これらに限定されないが、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、例えば、抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ））が挙げられる。
【００８０】
本明細書において用いる場合、「ウイルス抗原に対する免疫応答の誘発」とは、哺乳類（例えば、いずれかの哺乳類、例えば、ヒト）の免疫系がウイルス抗原を同定し、それを除くため、あるいはウイルス抗原の存在に対して応答するようにトリガーされるプロセスをいう。抗原にはそれに対する抗体の産生が引き起こされるあらゆるウイルス性物質が含まれる。特定のウイルス抗原または抗原の群に対する免疫応答を誘発することにより、哺乳類はワクチン接種されることになり、抗原にさらに曝されると、結果として応答／抗原の排除が起こる。
【００８１】
免疫応答が引き起こされうるウイルス抗原の例としては、当該技術分野において知られているあらゆるウイルス抗原が含まれ、本明細書において記載されるものが挙げられ、例えば、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ型）ウイルス、インフルエンザウイルス、ＨＩＶウイルス、エボラウイルス、ＳＡＲＳウイルス、鳥インフルエンザウイルス、天然痘ウイルス等と関連する抗原が挙げられる。カチオン性リポソームがＡＰＣを標的化する能力により、免疫応答のプライミングに関与する細胞への直接的かつ効率的な核酸分子の送達が可能となり、それにより、哺乳類におけるウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する非常に有効かつ強力な方法が提供される。
【００８２】
本発明の治療方法に用いられる核酸分子によって発現されうる好適なウイルスタンパク質は本明細書において記載され、例えば、これらに限定されないが、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質が挙げられる。核酸分子によってコードされうる例示的なインターロイキンとしては本明細書において記載されるものが含まれ、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３が挙げられる。例示的な態様において、本発明の様々な方法において送達されるリガンド−標的化カチオン性リポソームは、カチオン性リポソームと結合して（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）Ｋ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む。
【００８３】
さらなる態様において、本発明は、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防する方法を提供する。好適には、方法は哺乳類にカチオン性リポソーム複合体を投与することを含み、ここでカチオン性リポソーム複合体は以下を含む：カチオン性リポソーム；カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化したリガンド；カチオン性リポソームと結合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；およびカチオン性リポソームと結合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。投与方法としては、これらに限定されないが、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル、経皮的（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経口、内視鏡下、局所、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放インプラント、または皮下投与、または浸透圧または機械的ポンプを用いる投与を介するものが挙げられる。それらはボーラスとしてまたは注入として投与されうる。さらなる態様において、リガンドは、本明細書に記載する様々な方法またはその他の当該技術分野において公知の方法を用いてカチオン性リポソームに化学的に結合していてもよい。
【００８４】
本発明の方法を用いて治療または予防されうるウイルス性疾患の例としては、当該技術分野において公知のあらゆるウイルス性疾患が含まれ、例えば限定されないが、本明細書において記載されるもの、例えば、肝炎（Ａ、ＢまたはＣ型）、インフルエンザ、ＨＩＶ、エボラ、ＳＡＲＳ、鳥インフルエンザ、天然痘等が挙げられる。したがって哺乳類においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発することに加えて、本発明はまた、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防する方法も提供する。これには最近（例えば、約１年未満内、好適には、約６ヶ月未満内または約１ヶ月未満内）に感染した哺乳類ならびに慢性感染を患う哺乳類（例えば、例えば１年以上感染している哺乳類）が含まれる。
【００８５】
本発明の治療または予防の方法における使用のための例示的なリガンドは本明細書において記載され、例えば、様々なペプチドおよびタンパク質、例えば、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖ抗体フラグメント、例えば、抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ））が挙げられる。本発明の治療および予防の様々な方法を用いて送達される核酸分子によってコードされうる例示的なウイルスタンパク質およびインターロイキンは本明細書において記載されている。例示的な態様において、本発明の様々な治療および予防方法において送達されるリガンド−標的化カチオン性リポソームはさらに、カチオン性リポソームに結合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）Ｋ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドを含む。
【００８６】
本発明はまた、本明細書において記載される様々な方法によって調製されるリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を哺乳類に投与することを含む、哺乳類におけるウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。さらに、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防する方法は、哺乳類に本発明の様々な方法／プロセスによって調製されるリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を投与することを含む。かかる方法における使用のための好適なリガンド、リポソームおよび核酸は本明細書において記載されている。
【００８７】
免疫応答の誘発およびウイルス性疾患の治療または予防ならびにＡＰＣへの送達を含む本発明の様々な治療／予防方法において、様々な本発明のリポソーム複合体をいずれかの所望の経路を介して投与することが出来る。例示的な送達経路としては、これらに限定されないが、静脈内、経口、局所、吸入を介するもの、筋肉内注射、腫瘍内注射、皮内注射、経皮注射、皮下注射、腹腔内注射、鼻腔内注射、眼内注射または点眼剤、頭蓋内注射、臓器内投与（例えば、肝臓内）またはその他の経路、例えば、徐放インプラントまたは浸透圧または機械的ポンプを介するものが挙げられる。それらはボーラスとしてまたは注入として投与されうる。
【００８８】
本発明はまた、様々な本発明のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、１以上の賦形剤、例えば、１以上の抗菌薬、１以上の保存料、１以上の緩衝剤および／または１以上の  界面活性剤をさらに含んでいてもよい。
【００８９】
さらなる態様において、本発明はまた、２以上のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を含む医薬組成物を提供する。例えば、組成物は、カチオン性リポソーム、リガンド、および１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む第一のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を含みうる。好適な態様において、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していないがカチオン性リポソームと直接的に複合体化している。別の態様において、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合している。
【００９０】
組成物はさらに以下を含む第二のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を含みうる：カチオン性リポソーム、リガンド、および１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。好適には、リガンドは該カチオン性リポソームに化学的に結合していないが該カチオン性リポソームと直接的に複合体化しており、別の態様においては、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合している。
【００９１】
以下に示す実施例は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）タンパク質の送達のための免疫リポソーム複合体の生産、および予防ワクチン接種／ＨＣＶに感染した哺乳類の治療について記載するが、あらゆるウイルスタンパク質をコードする核酸分子が本発明の様々な方法において利用でき、本明細書において記載される免疫リポソーム複合体中に結合／カプセル封入されうることを理解すべきである。核酸分子によってコードされる最終的なウイルスタンパク質は本発明の免疫リポソーム複合体の形成能力に影響を有さない。単に核酸分子の負の荷電が、核酸分子がカチオン性免疫リポソームと結合する／カチオン性免疫リポソームにカプセル封入されることを可能にするようである。それゆえ、本発明は、ＨＣＶタンパク質の送達に限定されず、あらゆるウイルスタンパク質および／またはあらゆるインターロイキンをコードするあらゆる核酸（例えば、プラスミド、ベクター）の送達を包含する。
【００９２】
さらに、異なるウイルスタンパク質をコードする数種類の核酸が免疫リポソーム複合体にカプセル封入／結合し得、したがって、本発明は一つのリポソーム系により、あるいは複数の異なるリポソーム複合体により、多種多様なウイルス感染についてワクチン接種／治療するための複合体および方法を提供する。
【００９３】
関連技術分野の当業者には、本明細書に記載する方法および用途に対するその他の好適な改変および適用が、本発明の範囲またはそのいずれかの態様から逸脱することなくなされうることが明らかであろう。本発明を詳細に説明してきたが、本発明を限定する意図はなく、例示の目的のみで本明細書に含める以下の実施例を参照することにより同じことはより明確に理解されよう。
【実施例】
【００９４】
実施例１
カチオン性リポソームに基づくＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ワクチン接種および治療システムの調製および使用
ＨＣＶ再感染からの保護は、チンパンジーにおいて自然の感染によっては誘発されないという以前の教義（Ｆａｒｃｉ  Ｐ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：  １４０  （１９９２）；  Ｐｒｉｎｃｅ  Ａ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．、１６５：  ４３８−４４３  （１９９２））に反して、回復したヒトおよびチンパンジーにおいては、再感染は起こるもののメモリー免疫応答が存在し、それが再感染の際にウイルス複製の即時の制御および迅速なクリアランスを導くということがこのたび明らかとなった。ＨＣＶからの自然な回復の後、休止したＨＣＶ−特異的メモリーＴ細胞が数十年間にわたり末梢血において検出することが出来、多くの場合、検出可能なＨＣＶ−抗体の非存在下で検出できる（Ｔａｋａｋｉ  Ａ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、６：５７８−５８２  （２０００））。ＨＣＶ−特異的細胞免疫応答は、回復したチンパンジーにおいて実証されるように肝臓においても存続し、再感染の際の防御免疫を媒介する（例えば、Ｂａｓｓｅｔｔ  Ｓ．Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３３：４７９−１４８７  （２００１）を参照）。二次感染の持続時間は短く、初期感染と比較して血液および肝臓におけるウイルスタイターは低下しており、アラニンアミノトランスフェラーゼレベル（ＡＬＴ）によって示されるように肝臓の炎症も低下している（Ｂａｓｓｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）。ヒトにおいても以前の曝露の後に類似のメモリー応答が存在し、ＨＣＶ感染を迅速に制御し、排除することができるということが患者の研究から示されている（Ｍｅｈｔａ  Ｓ．Ｈ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ、３５９：１４７８−１４８３  （２００２））。明細書中に記載されるように、本発明は、ＡＰＣ、例えば限定されないが肝臓におけるＡＰＣに効率的に送達される、ＨＣＶの非構造タンパク質に注目した、予防と治療の両方のためのＴ細胞に基づくワクチンを提供する。肝臓はＨＣＶ複製の一次部位であり、したがって、肝臓における免疫応答の誘発は、自然の感染の際に誘発される免疫応答を模倣し、攻撃の際に保護またはウイルスの迅速なクリアランスを導く。
【００９５】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有するエンベロープを持ったウイルスである。そのＲＮＡの長さは〜９．６ｋｂであり、〜３４１−塩基の５’非翻訳領域（ＮＴＲ）、すべてのウイルス−特異的タンパク質（〜３０１１アミノ酸）をコードする長いオープンリーディングフレーム、および３’ＮＴＲからなる。ゲノムＲＮＡの翻訳はキャップ非依存的であり、配列内リボソーム進入部位として機能する５’ＮＴＲによって媒介される。その結果得られるポリタンパク質は、２つの宿主プロテアーゼおよび２つのウイルスプロテアーゼによって翻訳中および翻訳後の両方に切断されて、以下の産物を生じる：ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨ。構造タンパク質（Ｃ、Ｅ１、およびＥ２）はＮ−末端に位置する；非構造（ＮＳ）成分は残りの部分によってコードされる（総説としてその開示内容全体を引用により本明細書に含めるＭａｊｏｒ  Ｍ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｉｎ：  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｋｎｉｐｅ  Ｄ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ  Ｐ．Ｍ．  （ｅｄｓ．），  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ｐｐ．  １１２７−１１６１  （２００１）を参照されたい）。すべてのＲＮＡウイルスについて、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製は誤りがちであり、変異体が連続して生じることとなる。かかる変異体は、プール即ち「疑似種」を提供し、これは迅速に、例えば、免疫応答によって奏される淘汰圧に適応することができる。この変異性はＨＣＶ生存および進化に重要であるようであるが、ＨＣＶ分子生物学、病原性、免疫応答の正確な研究そして最終的にはワクチン開発を困難なものともする。
【００９６】
ＨＣＶ感染は典型的には非経口経路によるが、経粘膜感染、例えば、性的および母子感染も起こる。慢性Ｃ型肝炎の治療において顕著な進展がなされた。ペグ化されたＩＦＮ−αおよびリバビリンによる現在の治療法では、およそ５０％の症例においてＨＣＶ感染が排除されるが、治療はいまだに非常に高価であり、６−１２ヶ月の治療を必要とし、そして重篤な副作用の顕著なリスクが伴う。予防ワクチンが、米国および全世界の両方においてＨＣＶ−関連疾患の最終的な制御のために重要である。治療のための免疫学的アプローチも必要である。
【００９７】
キメラヒト肝臓を有するＳＣＩＤマウスモデルの開発にも拘わらず、チンパンジーがいまだにＨＣＶ感染についての唯一の確立された動物モデルである（Ｇｒａｋｏｕｉ  Ａ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３３：４８９−４９５  （２００１）に概説されている）。したがって、それは実験的ワクチンが投与され、その有効性が評価されうる唯一のモデルである。チンパンジー免疫系に関与するタンパク質の多くは、ヒトオルソログと同一であるかまたは非常に密接に関連しているので、検出に必要とされる試薬は互換的である。甚大なコストのために、チンパンジーにおいてすべての有望なＨＣＶワクチンアプローチを試験することは不可能である。ワクチン研究は現在まで、多数の免疫戦略を試験するために正常免疫適格性マウスを使用していた（例えば、Ｆｏｒｎｓ  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １７：１９９２−２００２  （１９９９）を参照）。ヒトクラスＩ  ＭＨＣ分子を発現するトランスジェニックマウスが、特異的ＨＣＶエピトープ分析および代替保護システムのために用いられてきた（Ｑｉａｏ  Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３７：５２−５９  （２００３））。ワクチン戦略はしたがって今まで、組換えタンパク質、ウイルスベクター、ウイルス−様粒子およびＤＮＡ−に基づく免疫に基づくものであった。急性感染の排除におけるＨＣＶ  ＮＳ３に対する免疫応答の関与についての強力な支持がある（Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ  Ｈ．Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７１：６０１１−６０１９  （１９９７））。この抗原は現在ではあらゆるＨＣＶ  Ｔ細胞ワクチンの重要な成分であると考えられている。報告によると、ＮＳ３タンパク質を発現するコンストラクトにＮＳ４Ａを含めると、その結果としてマウスにおけるより良好な発現および向上した免疫応答が起こることが示されている（Ｆｒｅｌｉｎ  Ｌ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１０：６８６−６９９  （２００３））。広範な、多選択性Ｔ細胞応答がＨＣＶ感染の排除において重要であることも同定されてきており、それゆえ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂタンパク質は重要なＴ細胞ワクチン成分であろう。
【００９８】
ＨＣＶは、米国において慢性肝臓疾患の４０−６０％に関与している。これら患者のうち、３分の１は、進行性の線維症および硬変を発症する（Ｌｉａｎｇ  Ｔ．Ｊ．、ｅｔ  ａｌ，．  Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．、１３２：２９６−３０５  （２０００））。Ｃ型肝炎は現在ではＢ型肝炎にとってかわって日本における肝細胞癌（ＨＣＣ）の主な原因となっており、ＣＤＣによると、ＨＣＶ−関連硬変および癌に起因して米国のみにおいて毎年８，０００−１０，０００名が死亡している。ＨＣＶ−関連ＨＣＣの機構は未知である。それは主に長年の感染にわたる慢性免疫媒介肝細胞障害および再生により誘発されると考えられている。ＨＣＶのコア遺伝子産物は、多数の細胞タンパク質と相互作用することが示されている。それは核移行シグナルを含み、ＲＮＡ結合活性を有し、そして細胞において複数の機能、例えば、トランス活性化および抑制、を発揮することが示されている（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７１：１３０１−１３０９  （１９９７））。ＨＣＶコアのトランス活性化因子または抑制因子としての機能を同定する研究では、生物学的レベルよりも桁違いに高いインビトロでの発現レベルを用いていた。しかし、数十年にわたるかかるタンパク質の低レベルの発現は感染細胞において有害事象を導びき得、それがＨＣＣ進行において役割を果たしている可能性がある。ＨＣＣと闘う最善の手段は、予防、初期の検出およびより良好な治療法による。したがって、Ｃ型肝炎ウイルス感染を予防することによって、ＨＣＣも予防されうる。
【００９９】
ＨＣＶ複製を支持する特定の細胞タイプはいまだに同定されていないが、ＨＣＶ複製の主な場所は肝臓であると考えられており、感染した個体の肝臓の病態と一致する。正常な肝臓は、免疫応答の媒介において重要な役割を果たしている。ほとんどの臓器とは異なり、肝臓における抗原の提示の結果、未処理（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞の活性化が起こりうるという証拠がある（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｏ  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ８０：８４−９２  （２００２））。肝臓に入ると、血液中の抗原はまず、類洞細胞集団、即ち肝臓類洞上皮細胞（ＬＳＥＣ）およびクッパー細胞と接触することになる。抗原の肝臓への送達の結果、Ｔ細胞の局所活性化が起こり、それはおそらくこれら同じ細胞によるものであり、それら両方は抗原提示細胞として作用することが示されている。肝臓における抗原の提示の結果、Ｔ−細胞プライミングまたはＴ−細胞トレランスが起こりうる。
【０１００】
癌の治療および腫瘍へのターゲティングのためのカチオン性免疫リポソームの使用に反して（米国公開特許出願番号２００３／００４４４０７および米国特許出願番号１１／５２０，７９６におけるようなもの）、本願の実施例は、有効に取り込まれ（受容体媒介エンドサイトーシスおよび促進されたエンドソーム放出）、肝臓を含む体内のいずれの場所で起こったとしても抗原がＴ細胞に提示されるように、ＨＣＶタンパク質を発現するＤＮＡを送達するためにＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム（ＨＫペプチドを含むかまたは含まない）複合体を利用する。
【０１０１】
ＴｆＲｓｃＦｖの存在は、カチオン性リポソーム複合体を効率的に細胞内に移動させる受容体−媒介エンドサイトーシスを提供し、一方ＨＫペプチドは（必要というわけではないが）ＤＮＡの細胞質へのエンドソーム放出を促進する。
【０１０２】
肝細胞のためにインビボで使用するためのもっとも適当な製剤を決定するために様々なリポソーム複合体を用いたインビトロでの比較研究を行った。２つの肝細胞−特異的リガンドである、ガラクトース（ＧＡＬ）（アシアロ糖タンパク質受容体に結合する）およびＬ−３７ｐＡ（ＨＣＶに対する推定受容体であるスカベンジャー受容体、ＳＲ−Ｂ１に結合する）を試験した。これらを非改変リポソーム製剤およびトランスフェリン（Ｔｆ）受容体の一本鎖Ｆｖフラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）で改変した複合体と比較した。３タイプの脂質をこれら分析に用いた：リピドＡ（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ、１：１モル比）；リピドＤ（ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ、１：１モル比）；およびリピドＧ（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ、１：１：１モル比）である。３つのサンプル調製方法を比較した。方法Ａ：ＤＮＡが直接リガンド−改変リポソームと混合されるプレコーティング方法。方法Ｂ：ＤＮＡがリポソームと混合されてカチオン性リピドＤＮＡコア（リポプレックス）が形成された後、リガンドがリポプレックスの表面に結合されるポストコーティング方法。方法Ｃ：ＤＮＡがリポソームまたはヒスチジル化オリゴリジン（ＨｏＫＣ）ペプチド修飾を有するリポソームと混合されてリポプレックスが形成された後、特定のリガンドを担持するアニオン性（ＰＳｃｈｏｌ）または中性（ＰＣｃｈｏｌ）リポソームが添加されてリポプレックスをカプセル封入する方法。
【０１０３】
Ａ．方法
１．複合体形成
化学的結合による複合体形成
リポソーム表面に直接的に化学的に結合した抗体または抗体フラグメントを含むカチオン性免疫リポソームを調製するための例示的な方法は、２００１年１０月１日出願の、その開示内容全体を引用により本明細書に含める米国特許出願番号０９／９１４，０４６に開示されている。例えば、４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート−ＤＯＰＥ（ＭＰＢ−ＤＯＰＥ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）は総脂質の５−８％モルにて上記に記載の７つのリポソーム製剤に含まれる。ＭＰＢ−リポソームは当該技術分野において周知の方法によって調製される。例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＭＪ  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９５  Ｊｕｎ；１８（６）：１０２７−３２）に記載のものから改変されたエタノール注射方法を本発明において用いることが出来る。簡単に説明すると、すべての脂質をエタノールに可溶化し、混合し、５０−６０℃のボルテックスしている純水にハミルトンシリンジにて注入する。溶液をさらに１０−１５分間ボルテックスする。終濃度は１−２ｍＭ総脂質である。１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５（ｐＨ７．０−８．０）を終濃度１０−２０ｍＭにて添加する。マレイミド基はｐＨ＞７の水溶液中では不安定であるので、リポソームは水（ｐＨ５−６．５）中で調製すべきである。ｐＨはｓｃＦｖ−ＳＨとの結合の前に１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ７．０−８．０を用いて７．０−８．０に調整するとよく、それによりポストコーティング反応が促進される。
【０１０４】
ｓｃＦｖ−ＳＨを約１：１から約１：１００、好適には、約１：１０から約１：５０（ｗ：ｗ）、より好適には約１：２０から約１：４０のタンパク質／脂質比にてＭＰＢ−リポソームに添加する。溶液を３０分間室温での穏やかな回転（〜２０−３０ＲＰＭ）により混合し、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐを作る。ｓｃＦｖ−Ｌｉｐは精製せずに用いられるが、それはＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィーにより精製してもよい。プラスミドＤＮＡを水に希釈し、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐに約０．５：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇ脂質）、好適には約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇ脂質）、例えば、約１：１０（μｇ全核酸：μｇ脂質）のＤＮＡ／脂質比にて添加し、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ複合体を作る。ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡは精製せずに用いられるが、それはＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィーにより精製してもよい。８０−１００％のｓｃＦｖがリポソームに結合されると期待されうる。
【０１０５】
単純な混合による複合体形成
結合したＴｆＲｓｃＦｖ−免疫リポソームはその免疫学的活性を保持している。ｃｙｓ−ＴｆＲｓｃＦｖはリポプレックスに化学的に結合することができ（２００１年１０月１日出願の米国特許出願番号０９／９１４，０４６参照）、ヒト前立腺腫瘍細胞をインビトロおよびインビボで効率的にトランスフェクトしうることが確立されている。様々な化学的結合方法を用いてリポソームに結合させるのは一本鎖抗体フラグメントについての慣行である。ｃｙｓ−ＴｆＲｓｃＦｖとカチオン性リポソーム（還元性基、例えば、マレイミドＤＯＰＥまたはいずれかの還元性基を有する脂質を含まない）との、化学的結合ではなく単純な混合の結果、免疫学的に活性な複合体が形成されることも判定され、ここでリガンドはリンカーまたは化学的結合分子を使用せずにリポソームに直接的に結合しており、また、依然として腫瘍細胞に効率的に結合しトランスフェクトすることが判定された（例えば、そこに開示される組成および方法を含めてその開示内容を引用により本明細書に含める米国公開特許出願番号２００３／００４４４０７を参照）。
【０１０６】
ｃｙｓ−ＴｆＲｓｃＦｖ−免疫リポソーム複合体は、本明細書において記載される範囲内において混合された複合体中に所定の比の一本鎖タンパク質対リポソーム、および、ＤＮＡ対ｎモル（またはｕｇ）総脂質となるようにｃｙｓ−ＴｆＲｓｃＦｖとリポソーム組成物Ａとを混合することによって調製される。以下に記載する複合体の調製は以下の一般的手順にしたがった。適当な量の２ｍＭリポソーム（上記のＡ−Ｈ）をなんらかの水（例えば、ＤＩ水）と混合して所望の体積とし、反転させて混合する。リポソーム−水混合物に、適当な量のｃｙｓ−ＴｆＲｓｃＦｖを添加し、所望の比とし、約１秒から約２分間穏やかな反転により混合する。この混合物を室温で約１０分間から約２０分間維持する（およそ５分間後、５−１０秒間穏やかに反転させる）。同時に、適当な量のＤＮＡを約１秒から約２分間なんらかの水と反転により混合し、所望の体積とする。典型的には、インビトロアッセイにおける使用のためには、ＤＮＡ濃度がウェルあたり約０．０１μｇから約２μｇの範囲にあるのが望ましく；インビボでの使用のためには、注射あたり約５μｇから約１００μｇのＤＮＡを提供するのが望ましい。ＤＮＡ溶液をｃｙｓ−ＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム溶液に迅速に添加し、混合物を約１秒から約２分間反転させる。最終混合物を室温で約１０分間から約２０分間維持し、およそ５分間後に５−１０秒間穏やかに反転する。インビボでの使用のためには５０％デキストロースまたは５０％スクロースを終濃度１−２０％（Ｖ：Ｖ）、好適には５−２０％（Ｖ：Ｖ）となるように添加し、穏やかな反転により約１秒から約２分間混合する。１：３０（ｃｙｓ−ＴｆＲｓｃＦｖ：リポソーム、ｗ：ｗ）および１：１４（μｇＤＮＡ：ｎモル総脂質）の好適な比での具体例は以下の通りである。最終体積８００μｌ中の４０μｇのＤＮＡについて、１８３μｌ水と２８０μｌの２ｍＭリポソーム溶液を混合する。３４μｌのｃｙｓ−ＴｆＲｓｃＦｖ（濃度０．４μｇ／ｍｌ）を添加する。１８３μｌの水と４０μｌの１μｇ／１μｌ  ＤＮＡを混合する。８０μｌの５０％デキストロースを最終工程として添加する。
【０１０７】
本発明の方法によって調製される最終的な複合体のサイズは約１００から４００（ｎｍ）であってＭａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）３０００またはＭａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）ＮＡＮＯ−ＺＳを用いる動的光散乱により判定して正のゼータ電位を有する。このサイズは腫瘍毛細血管床を効率的に通過し、腫瘍細胞に到達するのに十分に小さく、また、毛細血管床を効率的に通過し、標的ＡＰＣ細胞に到達するのに十分に小さい。
【０１０８】
２．ＨＣＶ−特異的抗原に対する免疫応答の評価
標的ＨＣＶ抗原
ワクチン研究に含めるＨＣＶ抗原はＮＳ３からＮＳ５Ｂである。これらの配列は遺伝子型１ａ  Ｈ７７株に由来する。その開示内容全体を引用により本明細書に含めるＭａｊｏｒ  Ｍ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｉｎ：  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｋｎｉｐｅ  Ｄ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ  Ｐ．Ｍ．  （ｅｄｓ．），  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  ｐｐ．  １１２７−１１６１  （２００１）参照。回復した動物におけるこの抗原のみに対するＴ−細胞応答の増強の結果は、一過性の臨床的に有意でない感染である（以下を参照）。ＣＭＶプロモーターの制御下で抗原を発現するプラスミドについて、２９３−ＴおよびＨｕｈ７．５細胞を用いた。アデノウイルスベクターについては、ＡＤ−２９３細胞株を用いた。発現は特異的抗体を用いた蛍光免疫染色およびウェスタンブロッティングにより判定した。
【０１０９】
アデノウイルスベクター
ＡＤＥＡＳＹ（登録商標）システムを用いてＨＣＶ遺伝子を発現するヒトアデノウイルス血清型５組換え体が本発明に好適に用いられる（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ）。このベクターはＥ１およびＥ３遺伝子の欠失により複製欠損とされたものである。目的遺伝子を大腸菌における組換えを介してアデノウイルスバックボーンに導入する。組換えプラスミドを次いでＡＤ−２９３細胞に形質転換し、ここで欠失したウイルスアセンブリー遺伝子が補完されてウイルス粒子が作られる。アデノウイルスもまた、ＨＣＶ治療のための魅力的なウイルスベクターである。というのはこのウイルスは肝臓において導入遺伝子を効率的に発現させることができたからである。
【０１１０】
インターロイキン−１２（免疫増強）
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）はＩＦＮ−γ産生を誘発し、Ｔｈ２細胞よりもＴｈ１細胞への分化を支持し、自然耐性と獲得免疫とを連結させる。ＤＣおよび貪食細胞が感染の際に病原体に応答してＩＬ−１２を産生する。免疫を増強し、効率的なＴｈ１−型応答を刺激するために、ＩＬ−１２を発現するプラスミドをカチオン性免疫リポソーム製剤に含める。マウスおよびヒトＩＬ−１２の両方を発現するプラスミドを、マウスおよび霊長類研究の間の一貫性を達成するために調製した。
【０１１１】
マウス接種
研究は、ＨＣＶ抗原を発現する組換えベクターを用いるＤＮＡプライム（ｐｒｉｍｅ）／アデノウイルス追加免疫を含む。マウスに０および４週目に本明細書に開示するリポソーム複合体中の２０−３０μｇのＤＮＡを接種し、組換えアデノウイルス（１０８感染単位、皮下（ｓ．ｃ．））によって、１０−１２週目に追加免疫する。この追加免疫の４週間後に、肝臓および脾臓をフローサイトメトリーにより分析して肝臓におけるＴ細胞の特徴を決定する。Ｔ細胞は肝細胞からフィコールグラジエントを用いて分離でき、標識化抗体を用いて特定の表面マーカーについて染色する。対照として、ＰＢＳ処理マウス、非リガンド化（ｕｎｌｉｇａｎｄｅｄ）リポソーム／ＤＮＡ複合体、空ベクターを担持する複合体、筋肉内（ｉ．ｍ．）（１−５０μｇ／マウス）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、および皮内（ｉ．ｄ．）（１−５０μｇ／マウス）注入された裸ＤＮＡ、およびｉ．ｍ．またはｉ．ｄ．にて複合体を接種されたマウスを含める。用量および時期を最適化し、６ヶ月の期間にわたる肝臓におけるＴ細胞の持続および復活を評価して肝臓内Ｔ細胞数およびマーカーに基づき最良のシステムを判定する。トランスフェリン受容体は樹状細胞上に発現し、複合体化したＤＮＡは受容体−媒介エンドサイトーシスによって取り込まれるので、ｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶ複合体のｉ．ｍ．および／またはｉ．ｄ．接種の結果は裸プラスミドＤＮＡよりも良好な全身的応答となると期待される。Ｔ細胞集団はＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＣＲ７の発現に基づいて同定されうる。ＩＬ−７Ｒαは短命なエフェクター細胞と機能的なメモリー細胞へと発達する細胞とを識別することが出来る有用なマーカーを提供する。これらマーカーを一次マウス研究において用いて長期免疫を確立する候補ワクチンの能力を分析する。チンパンジーにおけるＨＣＶの排除の後に肝臓におけるメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の、排除の後６ヶ月の血液と比較して肝臓において〜１０−倍高いレベルの選択的保持の証拠がある。
【０１１２】
脾臓および肝臓内Ｔ細胞の特異性をインビトロイムノアッセイによって評価する。まず、精製ＨＣＶ抗原またはオーバーラップする１８ｍｅｒペプチドを用いるエリスポットアッセイを用いてＩＦＮ−γまたはＩＬ−４を分泌する細胞を分析する。増殖アッセイはまた、免疫化マウスの脾臓から単離した細胞およびＭｉｋｒｏｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した全タンパク質を用いて行う。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスを用いる。これらマウスはＨＬＡ−Ａ２  ＭＨＣ分子を発現し、ＨＬＡ−Ａ２エピトープを提示することが出来る。これらトランスジェニックマウスをＢＡＬＢ／ｃマウスについて用いたものと同じプロトコールを用いて免疫することができるが、ＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプによって認識されるペプチドを免疫学的試験において用いることが出来る。これら分析のために、このハプロタイプに特異的なＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂについて同定されたＨＬＡ−Ａ２テトラマーおよびエピトープを用いる。肝臓由来細胞を、ＦＡＣＳ緩衝剤（カルシウムを含まないＰＢＳ中の１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）中の特異的ペプチドおよび表面マーカー（ＣＤ４、ＣＤ８）に特異的なＦＩＴＣ標識化抗体を提示するテトラマー−フィコエリトリン（ＰＥ）により３０分間室温または氷上で染色する。事象を、死細胞を排除するために７ＡＡＤ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を用いる分析についてソフトウェアＣｅｌｌｑｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を用いてＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で獲得する。非特異的バックグラウンド染色を未処理または偽接種マウス由来のＴ細胞を用いて判定する。クローン化のために、リンパ球を抗原刺激し、γ照射した同系のＡＰＣとＩＬ−２およびＩＬ−７とともに限界希釈にて共培養し、ＨＣＶ特異的増殖について試験する。
【０１１３】
Ｂ．結果
１．インビトロでのヒト肝細胞癌（Ｈｅｐ３Ｂ）細胞へのリポソーム複合体のターゲティング
Ｈｅｐ３Ｂ  ＨＣＣ細胞（５ｘ１０４）を２４ウェルディッシュに播き、哺乳類プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現する上記のようなＤＮＡプラスミド（０．０５ｕｇ／ウェル）と複合体化したリポソームによりトランスフェクトした。ｓｃＬ−ＨＣＶについて用いた比は、０．３３ｕｇ：１０ｕｇ（１４ｎｍｏｌ）：１ｕｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：ＬｉｐＡ：ＤＮＡ）であり、ｓｃＬＨＫ−ＨＣＶについては０．３３ｕｇ：７ｎｍｏｌ：１ｕｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：ＬｉｐＡ−ＨｏＫＣ：ＤＮＡ）であった。トランスフェクションの２４時間後、ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて判定した。結果を図１に平均＋ＳＤ（ｎ＝３）として示す。効率的なトランスフェクションが抗−トランスフェリン受容体一本鎖抗体フラグメント（ｓｃ）と複合体化したリポソームを用いた場合に得られ、ｓｃ／ＬｉｐＡおよびｓｃ／ＬｉｐＡ−ＨｏＫＣ複合体についてそれぞれルシフェラーゼ値は２５７，８１５ＲＬＵおよび１，１２０，６４３ＲＬＵであった（図１）。これを非修飾リピドＡ（ＬｉｐＡ）と複合体化したルシフェラーゼプラスミドについてのルシフェラーゼ値が５３８．９ＲＬＵ／μｇタンパク質であることと比較されたい。ＨｏＫＣペプチドをリポソーム複合体に組み込んだ場合のこの肝細胞株へのＤＮＡのトランスフェクション効率の上昇は、前立腺および膵臓細胞株を用いた以前の観察と一致する。
【０１１４】
２．インビトロでの初代チンパンジー肝細胞へのリポソーム複合体のターゲティング
正常肝細胞は肝細胞癌細胞と同じレベルの受容体を有さず、それゆえ、ＴｆＲｓｃＦｖ（ｓｃ）、ガラクトース（ＧＡＬ）およびＬ−３７ｐＡリガンドと結合した一連の脂質複合体を初代チンパンジー肝細胞において比較した。５万の初代チンパンジー肝細胞を２４ウェルプレートに播き、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（０．１μｇ  ＤＮＡプラスミド／ウェル）を担持し、ＨｏＫＣペプチドを有するかまたは有さない複合体によりトランスフェクトした。ｓｃ／Ｌｉｐ−ＨｏＫＣ／ＤＮＡ（レーン１−３）およびｓｃ／Ｌｉｐ／ＤＮＡ（レーン７−９）複合体は上記に開示の単純な混合方法により調製した。即ち、ＴｆＲｓｃＦｖを０．３３ｕｇ  ｓｃ：７ｎｍ  Ｌｉｐ−ＨｏＫＣおよび０．３３ｕｇ  ｓｃ：１４ｎｍｏｌ  Ｌｉｐの比にて適当なリポソーム（ＨｏＫＣを有するかまたは有さない）と混合し、混合は、手による１０回の穏やかな反転または２０−３０ＰＲＭでの１５−６０秒の回転により行い、室温で１０−１５分間維持した。ＤＮＡを次いでｓｃ／Ｌｉｐ−ＨｏＫＣまたはｓｃ／Ｌｉｐ混合物（１ｕｇ  ＤＮＡ：７ｎｍｏｌ（Ｌｉｐ−ＨｏＫＣについて）および１ｕｇ  ＤＮＡ：１４ｎｍｏｌ（Ｌｉｐについて）の比）に添加し、溶液を手による１０回の穏やかな反転または２０−３０ＰＲＭでの１５−６０秒の回転により混合し、室温で１０−１５分間維持した。非リガンド化（ｕｎｌｉｇａｎｄｅｄ）複合体も対照として同じ比にて調製し（レーン４−６および１０−１２）、同じ手順にしたがった。Ｌ−３７ｐＡリガンド（レーン１９−２１）を用いる複合体は、Ｌｉｐ−マレイミドを６．７％モル比にて含むリポソーム（Ａ、Ｄ、またはＧ）にＬ−３７ｐＡリガンドを化学的に結合させることによって形成させた。Ｌｉｐ−Ｍａｌを１４：７（ｎｍｏｌ：ｎｍｏｌ）（Ｌｉｐ：Ｌ−３７ｐＡ）の比にてＬ−３７ｐＡと混合し、１．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝剤（終濃度）を添加し、２０−３０ＲＰＭで３時間室温で回転させた。その後、ＤＮＡを１ｕｇ  ＤＮＡ：１４ｎｍｏｌ  Ｌｉｐの比にて添加し、上記のように混合し、室温で１５分間保持した。比較のために、異なる方法もＧＡＬリガンドとの複合体の形成に用いた（レーン１３−１８）。ここでは、ＤＮＡをなんらかの必要な水に添加し、上記のように混合する。リポソームＡ、Ｄ、またはＧ（ＨｏＫＣを含むかまたは含まない）をなんらかの必要な水に添加し、上記のように混合する。２つの溶液を室温で１５分間保持し、次いで一緒に添加し、上記のように混合し、室温で１５分間保持し、カチオン性リポソーム／ＤＮＡコアを形成する。ＧＡＬリガンドは、以前にアニオン性（ホスファチジルセリン：コレステロール）リポソームとモル比１：１：０．０５（ＰＳ：ｃｈｏｌ：ＧＡＬ）にて結合していた。このＰＳｃｈｏｌＧＡＬ混合物を次いであらかじめ形成されたカチオン性リポソーム／ＤＮＡ複合体に添加し、溶液を上記のように混合し、室温で１５分間保持し、カチオン性リポソーム／ＤＮＡコアをカプセル封入する。これら複合体についての成分の比は以下の通り：７ｎｍｏｌ：７ｎｍｏｌ：１ｕｇ（ＰＳｃｈｏｌＧＡＬ：Ｌｉｐ−ＨｏＫＣ：ＤＮＡ）および７ｎｍｏｌ：１４ｎｍｏｌ：１ｕｇ（ＰＳｃｈｏｌＧＡＬ：Ｌｉｐ：Ｄ��Ａ）。トランスフェクションの４８時間後、ルシフェラーゼ活性を上記のようにルシフェラーゼアッセイシステムを用いて判定した。図２は、初代チンパンジー肝細胞におけるタンパク質１μｇあたりのルシフェラーゼＲＬＵによって判定したトランスフェクション効率を示す。３つのすべての方法によって３つのすべてのリガンドを用いて形成された複合体は、これら初代チンパンジー肝臓細胞をトランスフェクトすることができた。初代チンパンジー肝細胞を用いることにより、使用した脂質にかかわりなく、ｓｃと複合体化したリポソームは、様々な方法を用いてＧＡＬ（１５，５０９ＲＬＵ）またはＬ−３７ｐＡ（１９，６６２ＲＬＵ）と複合体化した最良のリポソームと比較してほぼ１０−倍高いトランスフェクション効率（〜１５０，０００ＲＬＵ）を与えた。期待されたように、正常肝細胞上にはＴｆ受容体の数がより少ないと推測されるために、ｓｃ／リポソームの全体のトランスフェクション効率は同じ複合体をＨｅｐ３Ｂ細胞において用いた場合と比較して１６−倍まで低かった。しかし、ＨｏＫＣペプチドを含めると、ＴｆＲｓｃＦｖを用いるトランスフェクションの効率が１０−倍上昇した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を用いて以前に観察されたように、ＧＡＬおよびＬ−２７ｐＡリガンドを用いる最良のトランスフェクション効率はＨｏＫＣペプチドをＧＡＬリガンドとともに含めた場合に観察された。したがって、これらの研究は、ｓｃＬＨＫ−ＤＮＡ複合体はＤＮＡを正常肝臓細胞内に送達することにおいて高度に効率的であったこと、およびその他のリガンドも正常肝臓肝細胞をトランスフェクトするための複合体において用いることが出来ることを示す。
【０１１５】
３．インビボでの肝臓細胞へのリポソーム複合体のターゲティング
インビトロ実験に続いて、非腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスおよび特定のリポソーム複合体を用いてインビボで試験を行った。６から９週齢の動物に尾静脈を介して、４００μｌの上記に示す比にて上記のように調製したリポソーム複合体中の２０−２５μｇのＥＧＦＰを発現するＤＮＡプラスミドを、２−３回２４時間の期間にわたってｉ．ｖ．接種した。最後の接種の２４−４８時間後、肝臓、脾臓、腎臓、肺および心臓からの組織切片を液体窒素で瞬間凍結し、−７０℃で保存した。さらに、肝臓組織切片を組織学的分析のためにホルマリンで固定した。ウェスタンブロット分析のために、肝臓組織をプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）を含むＴ−ＰＥＲ組織抽出試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて抽出し、上清を細胞片を除くために遠心分離した後回収した。タンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて評価し、４０μｇの総タンパク質を、モノクローナル抗−ＧＦＰ抗体（ＢＡｂＣｏ）およびＥＣＬウェスタンブロットキット（Ｙｕ  Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３２：ｅ４８  （２００４））を用いて分析した。同じ膜を、ウェルあたり等量のタンパク質のローディングを確認するために抗−ＧＡＰＤＨ抗体で処理した。図３は、非処理マウス（ＵＴ）と比較した、リピドＡ（ｓｃＬＡ）、リピドＡおよびＨｏＫＣ（ｓｃＬＡＨＫ）、リピドＤおよびＨｏＫＣ（ｓｃＬＤＨＫ）、リピドＧおよびＨｏＫＣ（ｓｃＬＧＨＫ）と結合したＴｆＲｓｃＦｖリガンド（ｓｃ）、リピドＡと結合したガラクトース（ＧａｌＬＡ）およびリピドＡと結合したＬ−３７ｐＡ（Ｌ−３７ｐＡＬＡ）を接種した二連のマウスからの肝臓抽出物のウェスタンブロットを示す。左側のレーンは、ＧＦＰおよびＧＡＰＤＨの両方についての陽性対照（ＰＣ）を示す。すべてのリポソーム複合体は、接種されたマウスの肝臓においてＧＦＰの発現をもたらした。リピドＡを用いた場合ＨｏＫＣペプチドを含めることにより、マウスの肝臓へのＤＮＡの送達が向上した（ｓｃＬＡとｓｃＬＡＨＫとを比較されたい）。最高の発現レベルはｓｃＬＧＨＫリポソーム複合体について観察されたが、これは２匹のマウスのうち１匹のみにおけるものであり、ｓｃＬＡＨＫ複合体が、複数の（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）動物においてＧＦＰタンパク質のより一貫して強力な発現をもたらすようであった。ＧａｌＬＡおよびＬ−３７ｐＡＬＡ改変リポソームもＧＦＰの発現をもたらしたが、より低いレベルであった。
【０１１６】
総じて、このデータは、３つのすべてのリガンドが使用できるが、リポソーム中にターゲティングリガンドＴｆＲｓｃＦｖおよびＨｏＫＣペプチドを含む遺伝子送達媒体が、ガラクトースまたはＬ−３７ｐＡペプチドよりも肝臓細胞については良好であることを示す。これらの結果は、ガラクトースが肝臓細胞の標的化にしばしば用いられているために予期せぬものである（Ｗｕ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ７：ｄ７１７−７２５  （２００２）。
【０１１７】
４．  ＨＣＶに対する免疫応答を誘発させるためのＤＮＡおよびウイルスベクターの構築
当業者に周知の標準的クローニング方法を用いて、高発現プロモーター（ｐＡＧ４１０）の制御下でＨＣＶのＮＳ３からＮＳ５Ｂタンパク質を発現するＤＮＡベクターを構築した。これらＨＣＶ−特異的タンパク質を発現させるために用いたバックボーンベクターは既に臨床用途についてＦＤＡによって承認されており、現在、癌−特異的製剤を用いる患者におけるフェーズＩ臨床試験にある。発現をインビトロで２９３ＴおよびＨｕｈ７．５（肝細胞）細胞を用いて試験し、ウェスタンブロット（図４）と免疫蛍光法（データ示さず）分析との両方によってＨＣＶ抗原を特異的に発現することが示された。６ウェルディッシュ中の細胞を製造業者のプロトコールを用いてＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いてトランスフェクトした。４８時間後、細胞を特異的遺伝子発現について分析した。ウェスタンブロット分析のために、細胞を、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）を含む２５０μｌのＭ−ＰＥＲ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて溶解した。８０μｇの総タンパク質を８−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるウェスタンブロットによって分析した。タンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし、１：５００に希釈したＮＳ５Ｂに対するモノクローナル抗体、または１：５００に希釈した慢性チンパンジー血清によってプローブした。タンパク質を、抗−ヒトまたは抗−マウスＩｇＧ  ＨＲＰＯ結合体および化学発光（Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を用いて可視化した。図４は、ｐＡＧＶｅｃ  （空ベクター）によりトランスフェクトされた細胞と比較した、ＮＳ３、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂについて観察された特異的バンドを示す。これら同じ抗原のそれぞれを個別に発現するアデノウイルス組換え体も標準的クローニング方法を用いて構築した。これらウイルスベクターのそれぞれからの発現もウェスタンブロット分析によって確認した（データ示さず）。
【０１１８】
５．高発現プロモーターへとクローニングされたヒトＩＬ−２の増強した効率
ＩＬが効率的なアジュバント分子として作用するためには、それらはＴｈ−１  Ｔ細胞応答を効率的に刺激するために十分に高いレベルにて発現されなければならない。それらを高発現プロモーターの制御下に配置することは、これを達成する一つの手段である。このアプローチにより可能なＩＬの発現の高いレベルを示すために、ヒトＩＬ−２を高発現プロモーターの制御下にてｐＳＣＭＶベクターにクローニングした（その開示内容を引用により本明細書に含める、米国特許出願公開番号２００７／００６５４３２を参照）。インビボでの発現レベルを試験し、標準的ＣＭＶプロモーターからのレベルと比較した。両方の場合において、プラスミドは、本明細書において記載されるように調製されたＨｏＫＣペプチドを有さない標的化リポソームナノ複合体によって送達された。ＰＡＮＣ−１ヒト膵臓癌異種移植片腫瘍を、ＰＡＮＣ−１腫瘍組織の皮下接種により４−６週齡雌性胸腺欠損ヌードマウスにおいて誘発した。およそ３週間後、腫瘍は平均して４００−７００ｍｍ３となり、動物に６日間にわたって比（０．３３ｕｇ：１０ｕｇ：１ｕｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ：ＤＮＡ））を用いて上記のように単純な混合によって調製された、標準的ＣＭＶプロモーターまたは高発現プロモーター（４０ｕｇ  ＤＮＡ／注射）のいずれかの制御下でＩＬ−２についての遺伝子を担持するナノ免疫リポソーム複合体によるｉ．ｖ．（尾静脈）注射を６回与えた。マウスを最後の注射の２４時間後に屠殺した。腫瘍および肺組織を採取し、液体窒素で瞬間凍結し、ｈＩＬ−２に対する市販のポリクローナル抗体およびＥＣＬ検出を用いる標準的技術によるウェスタンブロット分析によってｈＩＬ−２タンパク質発現レベルについて分析した。図５に示すように、ｐｓＣＭＶ−ｈＩＬ−２プラスミドを担持する複合体を与えられた動物からの腫瘍はすべて、腫瘍における高レベルの発現を示した。一方、ｈＩＬ−２遺伝子が標準的ＣＭＶプロモーターの制御下にある腫瘍においてはｈＩＬ−２発現は明らかではなかった。
【０１１９】
６．ｓｃＬを介するｉ．ｖ．送達後のマウス組織におけるＨＣＶ  ＤＮＡ配列／発現の検出
ｓｃＬ−ｐＡＧ４１０複合体の全身的投与の後の様々な非腫瘍担持マウス組織におけるＮＳ３からＮＳ５Ｂをコードする遺伝子の存在を評価するための実験を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウス（３匹／群）に、ｓｃＬ（一本鎖トランスフェリン抗体−標的化カチオン性リポソーム）と複合体化したプラスミドｐＡＧ４１０  ＤＮＡまたは遊離プラスミドＤＮＡ（２５ｕｇ／マウス／注射）としてのプラスミドｐＡＧ４１０  ＤＮＡのいずれかを、２回（８時間間隔をあけて）ｉ．ｖ．注入した。複合体は上記のように比（０．３３ｕｇ：１０ｕｇ：１ｕｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ：ＤＮＡ））にて単純な混合によって調製した。一群のマウスには、同じ手法および同じ比にて調製した空のｐＳＣＭＶベクターを担持するｓｃＬを与えた。注射の４８時間後、動物を屠殺した。肝臓、肺、脾臓、および胸腺を収集し、液体Ｎ２で瞬間凍結した。サンプルの一部はＰＣＲのためにＤＮｅａｓｙ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを単離するために用いた。ＤＮＡ  ＰＣＲ（１ｕｇ  ＤＮＡ）を、ＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを増幅するプライマーを用い、Ｔａｑ  Ｇｏｌｄポリメラーゼを用いて別々の反応において行った。ＰＣＲ条件は以下の通りとした：５０ｕｌの総体積中、６ｎｇ  ＤＮＡ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．２ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；３００ｎＭ各プライマー；および１．２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ。増幅は反応混合物を９４℃で１０分間、次いで４０サイクルの、９４℃１５秒間および６０℃３０秒間、次いで６０℃で７分間インキュベートすることにより行った。図６は、肝臓におけるＮＳ３遺伝子についてのＰＣＲデータを示すが、シグナルの相違はＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂについて類似であった。複合体となった、および、遊離ｐＡＧ４１０を与えられたマウスの間ですべての臓器においてコピーレベルに有意差がある。肝臓（図６）と同様に、肺、脾臓および胸腺において、ｓｃＬ−ｐＡＧ４１０は強いＰＣＲバンドを有し、一方、遊離ＤＮＡによってはシグナルは検出されなかった。予測されたように、ベクター−処理マウスからはシグナルはなかった。したがって、複合体となったＨＣＶプラスミドＤＮＡのｉ．ｖ．送達の結果、肝臓およびその他の臓器において細胞による効率的な取り込みが起こった。これらの結果は、正常肝臓およびその他の正常細胞に対するＨＣＶ抗原の全身的送達のためのこのアプローチの可能性を確認し、かつ支持する。
【０１２０】
７．マウス免疫応答
マウスはＨＣＶに感染しえない。しかし、誘発されるＴ細胞応答の効力を評価するため、ＨＣＶのＮＳ３タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）を代替ウイルス攻撃モデルとして用いた。このタイプのｒＶＶモデルは当該技術分野において周知であり、Ｔ細胞応答のインビボ有効性を評価するために受け入れられている手段である。マウス（３匹／群）に０および４週目に、上記のようにｓｃＬと複合体となった、または遊離プラスミドＤＮＡとしての、ＨＣＶおよびＩＬ−１２プラスミドＤＮＡをＩ．Ｖ．接種した。ＴｆＲｓｃＦｖ／Ｌｉｐ／ＤＮＡ複合体は上記のように０．３３ｕｇ：１０ｕｇ：１ｕｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ：ＤＮＡ）の比を用いる単純な混合によって調製した。ＤＮＡを等モル量にて混合した（計５０ｕｇ／マウス／注射）。マウスを８週目に、ＨＣＶのＮＳ３タンパク質を発現する１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）のｒＶＶによって攻撃した。攻撃の５日後に、卵巣をマウスから取り出し、ＰＢＳ中でホモジナイズし、３ラウンドの凍結／融解および超音波処理に供した。タイター測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）のために、卵巣抽出物（１００ｕｌ）を１００ｕｌのトリプシンおよび１００ｕｌのＰＢＳと合わせ、３７℃で３０分間インキュベートした。希釈（１０−１から１０−６までの１０−倍）を２％ＦＢＳ／ＥＭＥＭ中で行い、２５０ｕｌを、１２−ウェルディッシュ中のＢＳＣ−１細胞の二連のウェルの感染に用いた。感染後２日目に、培地を除き、細胞を固定し、クリスタルバイオレット（２０％エタノール、２０％ホルムアルデヒド、０．３％クリスタルバイオレット）で染色した。群１にはＰＢＳを与え、群２にはｓｃＬ複合体となったｐＡＧ４１０およびＩＬ−１２プラスミドを与え、群３にはｓｃＬ複合体となった空ベクターおよびＩＬ−１２プラスミドを与え、群４には裸ＤＮＡとしてのｐＡＧ４１０およびＩＬ−１２プラスミドを与えた。図７は、各群におけるｐｆｕ／卵巣として表したｒＶＶタイターを示す。黒丸は個々のマウスをあらわし、黒棒は群あたり平均タイターを示す。ｓｃＬ  ｐＡＧ４１０／ＩＬ−１２複合体による免疫の結果、スチューデントのＴ分布を用いて評価して、ＰＢＳ群と比較して高度に有意なウイルスタイターの低下が起こった（ｐ＝０．００２）。平均タイターはＧｐ２では１０４であるのに対してＧｐ１では１０６であった。興味深いことに、ｓｃＬと複合体となったＩＬ−１２ベクターと空のバックボーンベクターのマウスへの接種もまた、ウイルスタイターの有意な低下をもたらしたが（平均タイター２ｘ１０５ｐｆｕ／卵巣）、ｐＡＧ４１０プラスミドと組み合わせた場合にみられた低下ほどは程度は高くなかった。ウイルス複製に対するこの効果はｓｃＬを用いる送達の結果である。というのは裸ＤＮＡとしてのｐＡＧ４１０およびＩＬ−１２（Ｇｐ４）による免疫は、ウイルスタイターの有意な低下をもたらさなかったからである。このデータは、ｓｃＬ複合体となったＤＮＡによる免疫がウイルス攻撃に対して保護することが出来るＴ細胞応答の誘発をもたらすこと、およびこれら免疫応答は裸ＤＮＡを用いて誘発されるものより優れていることを示す。このデータは、サイトカインを発現するプラスミドの���のｓｃＬ送達でもウイルス複製を阻害する免疫応答を誘発することができることを示す。
【０１２１】
８．ｓｃＬ複合体となったＤＮＡによる免疫の後の肝臓内Ｔ−細胞浸潤
ｓｃＬ複合体となったＤＮＡによる免疫が、肝臓指向性ウイルスによる感染の際により良好な肝臓内Ｔ細胞浸潤をもたらしたかどうかを評価するために、上記と同じ４群（上記と同一の複合体により０および４週目に免疫したもの）を、免疫の８週間後に、ＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ  ＨＣＶタンパク質を発現する非複製的アデノウイルス組換え体の３ｘ１０８の感染性粒子によって、Ｉ．Ｖ．攻撃した。攻撃の１０日後、肝臓組織を収集し、ホルマリン−固定し、当該技術分野において周知の標準的プロトコールを用いてパラフィンブロックにマウントした。切片をＨ＆Ｅ染色し、Ｔ−細胞浸潤について分析した。肝臓に浸潤するＴ−細胞の数を異なるマウス群において評価した。３匹マウス／群のそれぞれについて３つの視野をカウントした。各群についてのカウントを足して平均をとり、Ｔ細胞数／視野（ｆｏｖ）を求めた。データをスチューデントのＴ検定により分析した。ｓｃＬ  ｐＡＧ４１０／ＩＬ−１２を与えたマウスにおける平均Ｔ−細胞浸潤は有意にＰＢＳを与えたマウスにおけるものより高く、１１８．８  Ｔ細胞／ｆｏｖ対７０．２  Ｔ細胞／ｆｏｖ（ｐ＝０．０００００７）であった。これをｓｃＬ−ベクター／ＩＬ−１２を与えたマウスについての７１．５  Ｔ−細胞／ｆｏｖと比較する。裸ｐＡＧ４１０／ＩＬ−１２を与えたマウスにおいても有意により高いレベルのＴ−細胞浸潤、１０８．７５  Ｔ−細胞／ｆｏｖ（ｐ＝０．００１）がみられたが、ｓｃＬ−ｐＡＧ４１０／ＩＬ−１２によるものよりも程度は低かった。これらの観察は、ＨＣＶ抗原を発現するｓｃＬ複合体となったプラスミドによる免疫は、組換え肝臓指向性ウイルスによる感染の際に肝臓におけるより良好なＴ−細胞応答をもたらすことを示す。
【０１２２】
９．ＨＣＶ−特異的ＲＮＡ、抗原および免疫応答についての発現および試験のためのツールの開発
シンドビス発現システムを用いて、発現組換えウイルスが、ＨＣＶのコア、Ｅ１Ｅ２、およびＮＳ３タンパク質を発現するように操作された。これらタンパク質は次いでニッケルカラムを用いる精製を容易にするためにヒスチジンタグ付加される。効率的な精製が行われ、特異性はマウスモノクローナルまたはウサギポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析により判定される。慢性期血清が、ＨＣＶのＥ１Ｅ２、ＮＳ３、およびＮＳ５Ａタンパク質に対する高タイター抗体により感染したチンパンジーから同定された。この不活性化血清はいくつかのウェスタンブロットおよび免疫蛍光法アッセイに用いられ、組換えＤＮＡおよびウイルスベクターからのＨＣＶ抗原の発現の検出が成功している。Ｍｉｋｒｏｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている、ＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂタンパク質もまた、エリスポット、増殖アッセイ、およびフローサイトメトリー分析を用いるチンパンジーにおけるＨＣＶに対するＴ細胞応答の検出に用いられた。一連のオーバーラップする１８ｍｅｒペプチドもまた、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍから得られ、これらはチンパンジー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いるエリスポットアッセイでの使用が成功している１ａ  Ｈ７７遺伝子型配列に対応する。ほとんどのＨＣＶ抗原である、コア、Ｅ１Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂに対する抗体について試験するためのＥＬＩＳＡが開発された。最近の研究は、ＥＬＩＳＡを用いて得られた抗−Ｅ１Ｅ２タイターが、感染したチンパンジーにおける中和抗体タイターの良好な指標であることが判明したことを示している。ネスト化およびリアルタイムＰＣＲアッセイの両方が、血清中のＨＣＶ  ＲＮＡを検出および定量するために開発された。これらのアッセイの感度および特異性が評価され、たった４０ＲＮＡコピー／ｍＬ程度でもネスト化ＰＣＲを用いて検出可能であり、２００ＲＮＡコピー／ｍＬ（７４ＷＨＯ  ＩＵ／ｍＬ）程度でもリアルタイムＰＣＲを用いて検出可能である。これら試薬および検出システムはすべて、ＨＣＶ遺伝子型１ａ（ＨＣＶ−Ｈ）感染性クローンから転写されたＲＮＡを接種されたチンパンジーにおける感染の初期急性期の間に収集された血漿に由来するモノクローナルウイルスに対して特異的である。
【０１２３】
１０．ＨＣＶ攻撃の前の未処理（ｎａｉｖｅ）および回復したチンパンジーの予防ワクチン接種
ＨＣＶ感染の経過を変化させる糖タンパク質−特異的または非構造タンパク質−特異的免疫応答のいずれかを誘発するワクチンの能力を調べた。これらの研究は、中和抗体（ｎＡｂ）とワクチンとの両方によって誘発されるＴ細胞がチンパンジーモデルにおけるＨＣＶ感染を改変しうることを示す。
【０１２４】
ａ）エンベロープに基づくワクチンはＨＣＶ感染を改変する
ワクチン実験において使用するためのＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２タンパク質を生産するための発現および精製システムが開発された。ヒスチジンタグ付加されたＥ１Ｅ２タンパク質をシンドビス発現システムを用いて発現させ、当該技術分野においてよく確立された方法であるＧＮＬレクチンおよびニッケルカラムを用いて＞８０％純度にまで精製した。特異性および純度をＥ１およびＥ２に対するモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットおよびＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルの銀染色により評価した。２匹のチンパンジー、一方は未処理であり（Ｃｈ１６０１）、もう一方は急性ＨＣＶ感染から回復したもの（Ｃｈ１５８７）を、筋肉内送達された２５μｇのｒＥ１Ｅ２タンパク質により免疫し、１００チンパンジー感染用量（ＣＩＤ５０）のクローン性（ｃｌｏｎａｌ）ＨＣＶ（図８Ａおよび８Ｂ）により攻撃した。攻撃の結果を、ワクチン接種されていない対照動物における感染と比較した。強力かつ特異的なＴ−細胞増殖性応答に加えて、両方の動物の免疫により、Ｅ２の超可変領域（ＨＶＲ１）に対する抗体を含むＥ１Ｅ２に対する高い抗体タイターが生じた。この領域は天然分離株においてもっとも可変性であることが示されており、また、ｎＡｂエピトープを提示すると考えられている。抗体を、ビオチン化ＨＶＲ１ペプチドまたはＥ１Ｅ２を発現するワクシニアウイルス組換え体で感染したＢＳＣ−１細胞から精製されたＥ１Ｅ２タンパク質を用いて開発された全タンパク質Ｅ１Ｅ２およびＨＶＲ１ペプチドＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。両方のワクチン接種した動物においてウイルス血症が３週間遅延した。Ｃｈ１６０１において、ＨＣＶ  ＲＮＡタイターは５ｘ１０４コピー／ｍｌ未満に維持され、ＡＬＴレベルはわずかに上昇した。肝臓内サイトカインｍＲＮＡレベルの上昇は、ＨＣＶ  ＲＮＡの定量不可能なレベルまでの低下と一致した。この制御にもかかわらず、ウイルス血症は抗体タイターが低下すると再び現れ、動物は慢性的に感染した状態となり、この再発は免疫エスケープを伴わなかった。急性ＨＣＶ感染から回復するチンパンジーはｎＡｂを発達させない。一次感染において誘発された既存のメモリーＴ細胞応答に対してｎＡｂを加えると、動物を再感染から保護することができる免疫応答が生じた。Ｃｈ１５８７において、ウイルス血症は３週目の１つのサンプルにおいてのみ検出可能であり（＜１０４コピー／ｍｌ）、肝炎の証拠はなかった。
【０１２５】
ｂ）Ｔ細胞ワクチンはＨＣＶ感染を改変する
ＨＣＶ  ＮＳ抗原であるＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂのみを含む本発明の方法を用いないワクチンを構築した。回復したチンパンジー（Ｃｈ１５８８）をＮＳ３に対するＤＮＡ  ｐｒｉｍｅ／ｒＶＶ（組換えワクシニアウイルス）追加免疫レジメンで免疫した。第２の回復したチンパンジー（Ｃｈ１６０６）をＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含むワクチンで免疫した。チンパンジーを１００  ＣＩＤ５０のクローン性ＨＣＶにより攻撃した。両方の動物において、Ｔ細胞応答がワクチン接種の後に追加免疫された。両方の動物の攻撃の結果、無症候性の感染がもたらされ、注射後（ｐ．ｉ．）６週目に１（Ｃｈ１６０６）または２（Ｃｈ１５８８）週間のみ持続する低レベルウイルス血症が伴った（図９Ａ−９Ｃ）。一方、ワクチン接種されていない回復したチンパンジーはｐ．ｉ．１週目にてウイルス血症を発症し、少なくとも１４週目まで検出可能であった。
【０１２６】
未処理チンパンジー（Ｃｈ６３９４）を次いでＮＳ３−ＮＳ５ワクチンによりワクチン接種し、１００  ＣＩＤ５０のモノクローン性Ｈ７７により攻撃した。Ｔ−細胞応答を全抗原およびオーバーラップするペプチドを用いる増殖およびエリスポットアッセイを用いて試験した。Ｃｈ６３９４はすべてのワクチン抗原に対するワクチン接種の後に特異的なＴ細胞応答を起こした。攻撃により、この動物はｐ．ｉ．１週目にてウイルス血症になったが、最高のタイターは＜１０５コピー／ｍｌでありウイルス複製は即時に制御された（図９Ａ−９Ｃ）。未処理動物において、タイターは７日ごとに〜２−倍上昇したが、Ｃｈ６３９４においては、同じ期間内にタイターは３０−倍低下した。しかし、１０週目において、ウイルス制御は失われ、動物は慢性感染を発症した。この欠失はＮＳ３−特異的免疫応答（ＩＦＮ−γ−生産性Ｔ細胞頻度および増殖）の欠失を伴い、１つはＮＳ３領域におけるものであり１つはＮＳ５Ａ領域におけるものである２つのアミノ酸突然変異の発生と相関していた。エリスポットアッセイはこれら突然変異を担持するペプチドは、野生型ペプチドと比較してＣｈ６３９４からのＰＢＭＣによって認識されなくなることを示し、これらの変化が免疫エスケープ突然変異であることを示す。ＣＤ４  Ｔ細胞からのエスケープはヘルパー機能の欠失を導いた可能性があり、それによるとこの動物におけるＮＳ３特異的応答の欠失を説明することができる。これらの結果はＨＣＶに対するＴ細胞に基づくワクチンは感染を制御する能力を有することを示唆する。
【０１２７】
１１．ＨＣＶ攻撃の前の未処理チンパンジーの予防ワクチン接種
ａ）特異的Ｔ細胞応答がｉ．ｖ．リガンド−リポソームナノ複合体（ｓｃＬ−ＨＣＶ）ワクチン戦略を用いて未処理チンパンジーにおいて誘発され、攻撃後に増強される
明細書中に記載されるようなｓｃＬ−ＨＣＶナノ複合体を用いる未処理チンパンジーにおけるワクチン研究を行った。免疫応答を開始させるための注射をｓｃＬ−ＨＣＶ複合体を用いて０、４および８週目に行い、次いで組換えアデノウイルス（ｒＡｄ）追加免疫（１６週目）を行った。動物をワクチン接種するのに用いた複合体は、０．３３ｕｇ：１０ｕｇ：１ｕｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ：ＤＮＡ）の比にて、５％デキストロースを賦形剤として含め、チンパンジー重量に基づいておよそ０．１６４ｍｇＤＮＡ／Ｋｇ／注射にて作られた。調製した複合体をｉ．ｖ．注入のために２５０ｍｌの５％デキストロースバッグに注入し、動物に投与した。動物を３２週目（追加免疫後１６週目）に攻撃した。ナノ複合体の注入およびアデノウイルス追加免疫は良好に耐用され、いずれの動物においても有害な反応は起こらなかった。
【０１２８】
ワクチン接種後：エリスポット研究は、２匹のワクチン接種した動物（Ｃｈ１６１１、Ｃｈ６４０７）においてワクチン接種１６週後に強力かつ広範に反応性のＨＣＶ−特異的ＩＦＮ−γ応答を示し（図１０Ａ−１０Ｃ）、空ベクターナノ複合体および非−ｒＡｄを与えられた対照動物（Ｃｈ０２５７）においては最小または検出不可能な応答しか示されなかった。低−レベルＩＦＮ−γ特異的Ｔ細胞応答がｓｃｌＨＫ−ＨＣＶの接種の後にＣｈ１６１１およびＣｈ６４０７においてみられ、ワクチンのこのプライミング成分に対する免疫応答が示された。肝臓内ＩＦＮ−γおよびＣＤ３  ｍＲＮＡレベルの上昇も２匹のワクチン接種した動物において免疫後に観察された（図１２Ａ−１２Ｃ、１２、１６、および３２週目）。データは、０週目（ワクチン接種前）に対するｍＲＮＡレベルとして表し、内因性対照（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。１６および３２週目におけるＣＤ３  ｍＲＮＡの上昇もまた、肝臓におけるＴ細胞浸潤を示す。対照動物（Ｃｈ０２５７）についてのサイトカインの上昇は免疫後および攻撃前（３２週目）のいつの時期においてもみられなかった（図１２Ａ−１２Ｃ）。このデータは、本明細書に開示する複合体およびアプローチを用いるワクチン接種の後に肝臓および末梢血においてＴ細胞応答が誘発されたことを示し、Ｃｈ６４０７および対照Ｃｈ０２５７における（ＴｒａｎｓＳｉｇｎａｌ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ  ｋｉｔ  （Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いる）血清サイトカインの分析によって支持される。本発明者らは、最初のｓｃＬ−ＨＣＶ  ＤＮＡナノ複合体処理の２週間後、ＩＣＡＭ−１、様々なインターロイキン、ＴＧＦ−αおよびＩＦＮ−γを含むサイトカインの上方制御を、ワクチン接種したチンパンジーにおいてのみ観察し、対照動物においては観察しなかった。
【０１２９】
攻撃後：免疫したチンパンジーを、当該技術分野において周知の標準的方法を用いて、３２週目に１００感染用量のＨＣＶにより攻撃した。攻撃後、両方のワクチン接種した動物は、ウイルス複製の即時の制御を示し、これは、エリスポットアッセイにより測定したＨＣＶ−特異的Ｔ−細胞応答の上昇（図１１Ａ−１１Ｃ）および肝臓内サイトカイン応答の上昇と一致した（図１２Ａ−１２Ｃ）。攻撃の際、両方の動物は依然としてワクチン抗原（ＮＳ３−ＮＳ５Ｂ）に対して特異的な検出可能なＴ細胞応答を有していた。攻撃後およびウイルス複製に応答して、これらの応答は上昇した。対照チンパンジーからのＰＢＭＣを用いるエリスポットアッセイでは、ＨＣＶ−特異的応答は示されなかった（図１１Ａ−１１Ｃ）。未処理感染動物の急性期における検出可能な免疫応答のこの非存在は、その他の公表された観察と一致する。肝臓内ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡレベルは２匹の免疫化動物において攻撃の直後に上昇した（図１２Ａ−１２Ｃ）。Ｃｈ６４０７およびＣｈ１６１１についての３４週目（攻撃後２週目）のベースラインを超えるそれぞれ８−および１０−倍の上昇により証拠づけられる。これらの上昇は、肝臓におけるウイルス感染に対する即時の免疫応答を示す。対照動物において、肝臓内サイトカインレベルは攻撃の数週後においてのみ上昇し始め、４１週目まで免疫化動物におけるレベルと匹敵するレベルには至らなかった。
【０１３０】
ウイルスタイターを０から８週目にリアルタイムＰＣＲアッセイを用いて測定し、血清ＡＬＴレベルを０から６週目に測定した。図１３は、両方のワクチン接種した動物が、対照チンパンジーにおいて観察されたものと比較して攻撃後に有意に低いウイルスタイターを示したことを示す。さらに、タイターは、対照チンパンジーにみられるように、そしてすべての未処理動物にみられるように、最初の５週間の間は指数関数的に上昇しなかった。実際、両方のワクチン接種した動物において、ウイルスタイターは、５週目まで４ｌｏｇ１０を超えて対照動物より低い。両方のワクチン接種したチンパンジーはまた、感染の２週間後にＡＬＴ上昇を示したが対照チンパンジーは示さず、肝臓における迅速な免疫応答を示す肝臓内サイトカインデータを確認する（図１４）。予測されたように、対照動物におけるＡＬＴレベルは感染の後期まで上昇しなかった。攻撃後のすべての動物の感染は予測されたものである。というのはこれはＴ細胞ワクチンであって、中和抗体および完全排除免疫を誘発するよう設計されていないからである。ウイルスの最初の複製が以前に誘発されたＴ細胞応答を刺激するために必要とされる。このデータは、このＩ．Ｖ．ｓｃＬＨＫ−ＨＣＶワクチン戦略がウイルスによる感染によって復活するメモリーＴ細胞を誘発し、この復活応答が、ウイルス複製を迅速に制御することにおいて有効であることを示す。
【０１３１】
１２．慢性的に感染したチンパンジーにおける免疫治療薬戦略の試験
ＨＣＶ  ＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含むワクチンを構築して、Ｔ細胞免疫治療薬ワクチンが慢性的にＨＣＶ−感染したチンパンジーにおいて有効であるかどうかを判定した。裸ＤＮＡ  ｐｒｉｍｅ（ｓｃＬ−ＨＫではない）（ｉ．ｍ．）／組換えワクシニアウイルス（ｒＶＶ）追加免疫レジメンを用いて慢性的に感染したチンパンジーを処置した。このチンパンジーは３用量の裸ＤＮＡをアジュバントとしてのＣｐＧ  ｉ．ｍ．と組み合わせて送達するＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂワクチンにより免疫された後、ｒＶＶ追加免疫されたものである。ｒＶＶの接種の後、末梢血におけるＴ細胞応答は、ＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂについて１２−２０倍上昇した（図１５）。しかし、ＨＣＶ  ＲＮＡおよび肝臓酵素のレベルには影響は無かった；ＲＮＡタイターは〜１０４  ＲＮＡコピー／ｍｌのままであり、処置前レベルと同様であった。肝臓内ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α  ｍＲＮＡの分析の後、これらサイトカインのいずれの上昇もみられず、血液におけるＴ細胞活性の上昇はＨＣＶ複製部位における上昇をもたらさないことが示唆された。ウイルスを制御できないことは、肝臓においてＴ細胞が機能できないことの結果である可能性がある。
【０１３２】
４匹の異なる慢性的に感染したチンパンジーに本明細書において記載されるように単純な混合によって作られた本発明のｓｃＬ−ＨＣＶ複合体をｉ．ｖ．注入した。複合体は、ＮＳ３、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする遺伝子を担持するｐＳＣＭＶプラスミドＤＮＡをカプセル封入するもの、ＩＬ−２をコードする遺伝子を担持するｐＳＣＭＶプラスミドＤＮＡをカプセル封入するもの、または空ベクターをカプセル封入するものであった。複合体は体重に基づいて０．２ｍｇ／Ｋｇ／注射にて０．３３ｕｇ：１０ｕｇ：１ｕｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ：ＤＮＡ）の比で単純に混合することによって作られる。５％デキストロースを賦形剤として添加する。ＤＮＡを複合体の調製の前に、ＨＣＶ：ＩＬ−２についてはモル比１：１または空ベクター：ＩＬ−２については２．５：１にて混合する。３匹の動物にｓｃＬ／ＨＣＶ−ＩＬ−２をワクチン接種し、１匹には空ベクター−ＩＬ−２を担持する複合体を与えた。各動物には３回の注射を４−６週間間隔をあけて与えた。組換えアデノウイルスベクターによる追加免疫を最後のワクチン接種の４週後に行った。
【０１３３】
研究は、ＨＣＶ抗原およびＩＬ−２を発現する等モル量の組換えベクターを用いてｉ．ｖ．送達されたｓｃＬ−ＤＮＡまたはｓｃＬＨＫ−ＤＮＡ接種を含む。すべての発現された遺伝子は同じバックボーンベクター中にあるので、モル量でのＤＮＡ比に基づいて、すべての発現されたインサートが同じように送達されることが確実となる。別々のＨＣＶおよびＩＬ  ＤＮＡが等モル比のベクターインサートにて混合され、ｓｃＬまたはｓｃＬＨＫにカプセル封入される。ＤＮＡはＧＬＰ条件下で（Ａｌｄｅｖｒｏｎ、ＮＤ）内毒素−非含有調製物（＜５ＥＵ／ｍｇ  ＤＮＡ）として産生される。ＤＮＡ（〜７ｍｇ／動物／注射）はチンパンジーの重量に基づいて複合体中にて投与される（０．１７ｍｇ／ｋｇ）。この用量は６０ｋｇのヒトに投与される用量にほぼ匹敵し、未処理チンパンジーをワクチン接種するために以前に用いられた用量である。複合体を調製し、凍結乾燥し、再構成および注射のための動物の位置に運んだ。ｓｃＬ−ＨＣＶ／ＩＬ−２またはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶ／ＩＬ−２を３匹の動物に０、４、８および１２週目にｉ．ｖ．送達する。このスケジュールを、免疫系に接種に対して応答する時間を与えるために用いる。４週後にＴ−細胞応答またはＲＮＡタイターに対して効果がみられなければ、さらなる接種なしにはいずれの新しい効果もみられないと予測される。４番目（対照動物）には空ベクターおよびＩＬ−２プラスミドと複合体化したｓｃＬまたはｓｃＬＨＫを同じ時点に与えた。これにより、このサイトカインのみのＨＣＶ感染に対する効果が識別される。４用量の後にウイルス学的応答が観察されなければ、予防ワクチン研究において用いられたようにＨＣＶ抗原ＮＳ３−ＮＳ５Ｂを発現するｒＡｄ（１０１１感染単位）により追加免疫をして免疫応答およびウイルスタイターのモニタリングを続ける。肝臓指向性ウイルスベクターの使用はまた、肝臓区画へのターゲティングの目的も達成する。
【０１３４】
Ｃ．サンプリング
動物を２４週目まで研究する。サンプル収集は最初の接種の４週前に開始する；これらサンプルをベースラインおよび陰性対照として用いる。サンプリングを最後の接種の８週後まで続けることにより、処置が陽性の応答を与えるかどうかを判定する時間を確保する。研究の間にわたり、肝臓組織診をＮＩＲＣ  ＳＯＰによって規定されるＭｅｎｇｈｉｎｉ技術によって二週間に一回行い、血液を大腿静脈を介して以下に詳細に示す研究に使用するために毎週採取する。４０ｍＬの全血を偶数週（−４、−２、０、２週目など）に得て、５ｍＬの血漿を奇数週（−３、−１、１週目など）に得る。プラスミドの安定性を判定するために、１ｍＬの血液を投与前および最初の接種の１５分、１、３、８、２４、４８、および７２時間後に収集する。その他のすべての血液採取および肝臓組織診は接種の前に得る。この出血スケジュールは、非−ヒト霊長類における血液収集についてのＮＩＲＣによって作成されたガイドラインに基づいている。１ヶ月に９０ｍＬを収集し、これは許容可能な限界の範囲内である。血液をヘパリンを抗凝固剤として用いて採取する。血漿を５ｍＬおよび１ｍＬ体積から２７００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって得る。血漿サンプルを５００ｕｌアリコートに分けて−８０℃で保存する。肝臓組織診の半分をホルマリンで固定し、半分を２ｍｍの切片に切り分けて液体Ｎ２で瞬間凍結する。
【０１３５】
Ｄ．血液中のｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶ複合体の肝臓における存在および安定性の判定
本発明者らのマウスにおける予備的研究は、カプセル封入が有意に肝臓にみられる核酸の量を上昇させ、血液中に検出されうる時間を延長させることを示す。これらの知見は、チンパンジーにおけるカプセル封入されたＨＣＶ  ＮＳ３−ＮＳ５Ｂプラスミドにより確認される。注射の後どれほど長い間ＨＣＶ  ＤＮＡが循環中に存在するかを調べるために、１ｍＬの血液を、投与前および最初の注射の１５分、１、３、８、２４、４８、および７２時間後に収集する。血漿を２つのアリコートに分けて−８０℃で冷凍する。１つのアリコートをプラスミドの単離に用いる（Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｒｏｃｈｅ））。ＤＮＡを瞬間凍結した肝臓組織の１つの２ｍｍの切片から単離する（ＤＮｅａｓｙ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ））。陰性対照サンプルは接種前に採取した同じ動物からの血漿および肝臓組織である。外来性ＨＣＶプラスミドをＰＣＲによって評価する。逆転写酵素の非存在下でのＰＣＲの使用により、慢性感染に起因して存在するウイルスＲＮＡからプラスミドを識別する。さらに、ｐＳＣＭＶバックボーンに位置する１つのプライマーとＨＣＶインサートにおける１つのプライマーを用いる。したがって、外来性ＤＮＡのみが増幅される。このアプローチはｐＳＣＭＶベクター中のその他のインサートでの使用が成功している（ＩＮＤ体内分布研究についてｐ５３）。定量するために、シグナル標準を既知量のＮＳ３−ＮＳ５Ｂプラスミドを、感染していないチンパンジーからの血漿または肝臓組織に添加することにより調製し、次いで抽出を行う。ＦＤＡは用いられた動物からの多量のアーカイブしたサンプルを有している。スキャンしたゲルをＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（登録商標）画像分析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量し、プラスミドの量を標準との比較により算出する。ＤＮＡを第２のアリコートの血漿、および瞬間凍結した肝臓組織の第２の切片から単離し、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＤＮＡ抽出キットを用いるサザン分析に供する。接種の前に採取した血漿および肝臓組織を陰性対照として含める。ハイブリダイゼーションをＧｅｎｅ  Ｉｍａｇｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて行う。上記のように、サザン分析による外来性ＤＮＡの検出のためのプローブは、ベクターとインサートとの接合部をまたがる。このプローブはＩＤＴ，  Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，  ＩＡ）により合成される。この方法はまた、組織における外来性  ＤＮＡ  の分析にも用いられた。標準を上記のように調製する。サンプルを次いでアガロースゲル、ブロッティングおよびハイブリダイゼーションによって分析する。１０−から５０−倍過剰のプローブを用いることにより、すべてのバンドの飽和を確証する。スキャンしたオートラジオグラフをＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量し、プラスミドＤＮＡの量を標準との比較により算出する。この非放射方法の感度レベルが低すぎる場合は、γ３２  Ｐ−ＡＴＰによる��−末端標識を用いてもよいし、またはネスト化ＰＣＲを以前に記載されているようにして行ってもよい（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７８、９７８２−９７８９  （２００４））。血液および肝臓におけるＤＮＡを評価するために両方の方法を用いることにより、一つの方法が成功しなくても結果が確実に得られることになる。試験は三連で行い、それぞれの動物からの順次の血漿サンプルにおけるプラスミドレベルをｔ−検定を用いて１５分において観察されたレベルと統計的に比較し、経時的なＤＮＡ濃度における有意な低下を評価する。統計的比較は肝臓については行わない。というのはこの組織についての研究は、この臓器におけるＤＮＡの存在を調べるためであって、経時的安定性を調べるためではないからである。
【０１３６】
Ｅ．慢性的に感染したチンパンジーのＩ．Ｖ．接種の後のｓｃＬＨＫ−ＨＣＶ複合体に対する応答の試験
１．末梢血における免疫応答の評価
治療ワクチンを与えられた慢性的にＨＣＶ−感染したチンパンジーの末梢血における特異的Ｔ細胞活性の上昇は、肝臓におけるより高いＴ細胞活性および低下したウイルスタイターを必ずしも導くわけではない。したがって、これら動物の肝臓におけるＴ細胞浸潤およびサイトカイン応答を分析することが必須である。しかし、末梢血が、誘発された免疫応答の程度および特異性を評価するための第一のソースとして用いられ得る。肝臓組織診は貴重であり制限されており、より多くのＴ−細胞が末梢血から得られる。肝臓の研究は、末梢血における免疫応答の上昇が、肝臓におけるより大きいＴ−細胞活性と相関しているかどうかを判定するために用いられる。ＰＢＭＣを、当該技術分野において以前に記載されているようにフィコールグラジエント遠心分離を用いて２週間に１回得られる全血から単離する（Ｐｕｉｇ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２２，  ９９１−１０００  （２００４））。血漿をグラジエントの頂点から取り出し、−８０℃で１ｍＬおよび２００ｕＬアリコート中で保存する。およそ１０８のＰＢＭＣおよび１５ｍＬの血漿が４０ｍＬの全血から得られる。凍結細胞の１つのアリコート（１０７／ｍＬ）を融解し、ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋２％ヒトＡＢ血清（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で洗浄する。生細胞数を評価し、細胞をエリスポットにより試験する（Ｓｈｏｕｋｒｙ  Ｎ．Ｈ．、ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９７、１６４５−１６５５  （２００３））。各分析に用いる細胞の総数は、１つのアッセイにおいて試験する抗原の数に依存する。オーバーラップするペプチドの完全なパネルを用いて（１１ａａによりオーバーラップする１８−ｍｅｒ、ＮＩＨ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）、１ａゲノムを包含させ、それに対応させる。これらのペプチドは、チンパンジーの感染に用いたウイルスおよび、ｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶにおけるＨＣＶプラスミドに用いた配列に対応する。サンプルをスクリーニングするための３０−４５のオーバーラップするペプチドを含む１０のペプチドプールを用いる。陰性卵白アルブミンペプチド対照、陽性フィトヘマグルチニン対照および媒体対照を各アッセイに含める。サンプルを１０５細胞／ウェルを用いて三連で試験する。サンプルを全ウイルスゲノムをカバーするペプチドに対して試験する。ワクチンは抗原ＮＳ３−ＮＳ５Ｂに対する応答を刺激すると予測されるが、この刺激の結果、Ｔヘルパー応答の上昇またはＩＬ−２産生の上昇が起こりえ、これはワクチンに含まれないウイルス抗原に対する応答の増強を導く。ＰＢＭＣの前刺激およびＩＦＮγ、ＩＬ４、ＩＬ２およびＩＬ１０を産生する細胞のエリスポット分析を、１μｇ／ｍｌの各個々のペプチドおよびヒトエリスポット試験キットにて９６−ウェルプレートにおいて行う（Ｕ−Ｃｙｔｅｃｈ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）（Ｓｈｏｕｋｒｙ  Ｎ．Ｈ．、ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１９７、１６４５−１６５５  （２００３））。特異的スポット形成単位（ＳＦＵ）の数を、三連の試験ウェルの平均値から三連の対照（抗原なし）の平均値を差し引くことによって計算する。Ｔ細胞増殖アッセイを当該技術分野に��いて以前に記載されているようにしてＰＢＭＣに対して９６−ウェルプレート（１０５細胞／ウェル、三連）を用いて行う（Ｐｕｉｇ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ，  ２２，  ９９１−１０００  （２００４））。細胞を１ｕｇ／ｍＬのタンパク質（ＮＳ３、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂ）（Ｍｉｋｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはペプチドで刺激する。後の研究のためにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を抗−ヒトＣＤ４＋またはＣＤ８＋ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ）を用いて全集団から枯渇させ（Ｐｕｉｇ  Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、４４、７３６−７４５  （２００６））、特異的抗原を認識する特異的細胞タイプを判定するために試験する。これらの研究から得られるデータはＨＣＶ−特異的Ｔ細胞応答の増強の最良の指標を与える。結果を各動物についてワクチン前およびワクチン後のサンプルの間で比較する。ｔ−検定を用いてワクチン接種の後のＳＦＵの有意な上昇を評価する。末梢血に対する研究の結果を、肝臓内Ｔ細胞浸潤、サイトカイン応答およびウイルスＲＮＡレベルの変化の分析と合わせてこの治療戦略の有効性を判定する。
【０１３７】
２．血漿サイトカインレベルにおける変化の検出
未処理チンパンジーへのｓｃＬ−ＨＣＶの接種後の血清サイトカインの分析により、ワクチン接種した動物において多数のサイトカイン（ＩＣＡＭ−１、ＴＧＦ−βおよびＩＦＮ−β）の変化が示されたが対照においては示されなかった。治療ワクチン接種後の血清サイトカインのパネルにおける変化を調べ、処理前サンプルおよび対照動物と比較する。サイトカインをワクチン接種前および後に採取した１−２ｍＬの血漿についてＴｒａｎｓＳｉｇｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ  ｋｉｔを用いて分析する。感染していないチンパンジーからの正常血漿を陰性対照として含める。血清サイトカインにみられる変化（種類とレベルとの両方）を肝臓におけるｍＲＮＡレベルにおいてみられたものと比較する。血清サイトカインに対するこれらの研究をｍＲＮＡの肝臓内分析に加えて行う。ｍＲＮＡ分析を定量し、統計的に分析し、肝臓におけるサイトカインレベルの指標を提供する。末梢血における応答が肝臓において観察されたものを反映しているかを決定するためにこれらの分析を組み合わせることが重要である。サイトカインパターンにおける変化をメモリーＴ細胞の持続と相関させる。正の相関は排除に関連する特異的Ｔ細胞の存在を判定するより簡便な手段の開発に対する第一工程である。
【０１３８】
３．組織学的およびサイトカイン分析による肝臓におけるＨＣＶ−特異的応答の評価
ａ）肝臓に浸潤するＴ−細胞の存在についての試験
浸潤性Ｔ−細胞の証拠を組織学的分析およびサイトカイン応答によって肝臓において試験する。治療ワクチンを与えられた慢性的に感染したチンパンジーの末梢血におけるＨＣＶ−特異的Ｔ細胞活性の上昇は、肝臓におけるより高いＴ細胞活性およびウイルスタイターの低下を必ずしも導くわけではない。したがって、これら動物の肝臓におけるＴ細胞浸潤およびサイトカイン応答を分析することが重要である。
【０１３９】
ｂ）ホルマリン−固定した肝臓組織の分析：
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織を切片とし、以下の特異的タンパク質および細胞マーカーについて染色する：ＣＤ４；ＣＤ８；パーフォリン；ＩＦＮ−γ；ＩＬ−２；ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯおよびＣＣＲ−７。Ｔ細胞集団はＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の発現に基づいて同定することができる（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｊ．Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６６、８７７−８８４  （２００１）；  Ｓａｌｌｕｓｔｏ  Ｆ．、ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ、４０１、７０８−７１２  （１９９９）；  Ｓｅｄｅｒ  Ｒ．Ａ．  ａｎｄ  Ａｈｍｅｄ  Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４、８３５−８４２  （２００３））。肝臓切片の免疫組織学的分析を、各組織診について肝臓に存在するリンパ球の数、種類および位置を識別するために行う。切片をキシレン中で脱パラフィンし、アルコール中で水分補給し、ＰＢＳで洗浄する。抗原賦活化のために、組織を１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．０で１００℃で１０分間処理する。組織切片上の非特異的部位を５％ミルクでブロッキングした後、特異的抗体とともにインキュベーションする。感染の前（以前の保存サンプル）および処理前に同じ動物から得た肝臓組織診を、比較のために用いる。これらの研究は標識化ストレプトアビジン−ビオチン技術およびＤＡＢを用いて開発された製品により行う。６つの視野を処理前および処理後切片について分析し、陽性細胞タイプを計数する。この染色方法により、門脈または特定の肝臓細胞タイプと比較しての肝臓内の細胞の位置を評価する。統計分析をＴ細胞浸潤についてｔ−検定を用いて行う。
【０１４０】
ｃ）瞬間凍結した肝臓組織の分析：
トータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）を用いて瞬間凍結した組織の一部から単離する。ＲＮＡをＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて逆転写し、当該技術分野において以前に記載されているようにＩＦＮ−γ、ＩＬ２、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ４に対する特異的プライマープローブセットを用いてサイトカインｍＲＮＡレベルについてリアルタイムＰＣＲにより試験する（Ｍａｊｏｒ  Ｍ．Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３９、１７０９−１７２０  （２００４））。これらサイトカインレベルを内因性対照（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化し、各動物について処理前組織診におけるレベルと統計的に比較する（Ｔｈｉｍｍｅ  Ｒ．、ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ、９９、１５６６１−１５６６８  （２００２））。同時に凍結肝臓組織の小さい部分を用い、ＴｒａｎｓＳｉｇｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ  ｋｉｔ  （Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を用いて３６のサイトカインのパネルのタンパク質レベルを同時に分析する。
【０１４１】
Ｆ．毒性評価
慢性的に感染した個体における肝臓に関連する治療ワクチンの効果の研究が特に重要である。ワクチンは肝臓における免疫応答の増強に起因してウイルスタイターの低下を導きうるが、それは肝炎を悪化させ、肝臓疾患を導く可能性がある。チンパンジーからの血清および肝臓組織を毒性の指標である肝臓−特異的酵素および組織病理学的変化について分析する。血漿のアリコート（２ｍＬ）を肝臓機能に特異的な以下のマーカーのパネルについて民間試験所（ＡＮＴＥＣＨ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって毎週試験する：総ビリルビン、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、血清アルブミン、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）。接種の後＜２週間持続する正常範囲を超えるこれらマーカーのレベルの上昇は許容可能とみなす。正常範囲を超える持続的レベルは毒性を示す。これは肝臓疾患に特異的なわずかな試験の１つであるため（ＭｃＩｎｔｙｒｅ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ｒｏｓａｌｋｉ，  Ｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｉｎ：  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ＭｃＩｎｔｙｒｅ，  Ｂｅｎｈａｍｏｕ，  Ｂｉｒｃｈｅｒ，  Ｒｉｚｚｅｔｔｏ  ａｎｄ  Ｒｏｄｅｓ  （ｅｄｓ）．  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２９３−３０９．  （１９９１））、処理前および処理後のＡＬＴレベルを各動物について比較し、毒性を統計的に評価する。
【０１４２】
アポトーシスを評価するため、組織をインサイチュ細胞死検出キットであるＴＭＲ  Ｒｅｄ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて改変蛍光ＴＵＮＥＬアッセイにより染色する。このシグナルは近赤外範囲において発光し、アルゴンレーザーの下での赤血球細胞の自己蛍光により、肝臓切片におけるアポトーシスについてのシグナルとしてＦＩＴＣよりも優れている。蛍光強度および分布をＬａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＬＳＣ）を用いて評価する。これはスライドに基づく装置であり、フローサイトメーターと類似の様式で作動し、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰＩ、Ｃｙ５およびＤＡＰＩを検出する。走査設定を最適化し、バックグラウンド、陰性および陽性シグナルを測定する同じプロトコールによって、すべてのサンプルに対して適用する。ヒストグラムとして示されるデータはＣｏｍｐｕｃｙｔｅプログラムによるシグナルの統計分析および組織における陽性アポトーシスシグナルの領域のパーセンテージならびにシグナル強度の定量評価を可能とする。
【０１４３】
Ｈ＆Ｅ染色した肝臓切片を、組織病理学的変化について有資格の獣医病理学者によって評価する。処理前および処理後の切片をＩｓｈａｋスコア付けシステム（０−４スケール）を用いてランク付けして慢性肝炎について評価する（Ｉｓｈａｋ  Ｋ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２２、６９６−６９９  （１９９５））。これは肝臓組織診のランク付けのための確立された方法であり、臨床設定において広く用いられている。ランク付けは、門脈、門脈周囲および腺房内の炎症性細胞浸潤および肝臓細胞傷害および壊死の評価を含む。肝臓毒性を分析するためにこれら３つの方法を用いることにより、将来の臨床用途についての安全性を評価するためのこの臓器に対するこの治療ワクチンの効果の完全像が提供される。
【０１４４】
Ｇ．ウイルスタイターの変化のモニタリング
ｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶ治療アプローチの免疫応答および成功の最初の試験は、血液におけるＨＣＶ  ＲＮＡタイターの変化である。これらは院内のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて判定する（Ｍａｊｏｒ  Ｍ．Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７３、３３１７−３３２５  （１９９９）；  Ｍａｊｏｒ  Ｍ．Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７３、３３１７−３３２５  （１９９９））。トータルＲＮＡを処理前および処理後出血からの２００ｕＬの血清からＴｒｉＺｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および当該技術分野において以前に記載されているようにして行う（Ｍａｊｏｒ  Ｍ．Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７３、３３１７−３３２５  （１９９９）；  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７８、９７８２−９７８９  （２００４））ＲＴ  ＰＣＲを用いて単離する。ＲＮＡをレプリカウェル（ｎ＝４）に分け、ＲＮＡ濃度を一連のＨＣＶ  ＲＮＡ標準を用いて算出し、ＲＮＡコピー／ｍＬ血漿として表す。本発明者らはクリーンな制御された条件下でＨＣＶ配列を増幅する経験を非常に多く有する（Ｍａｊｏｒ  Ｍ．Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７３、３３１７−３３２５  （１９９９）；  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、７８、９７８２−９７８９  （２００４））。手順を汚染を避けるため別々の部屋で行い、すべての場合において指定されたピペットおよび試薬を用いる。すべての抽出において、感染していないチンパンジーからの陰性対照血漿を含め、抽出されたＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて用いる。処理前および処理後ＲＮＡタイターを比較してタイターにおける統計的に有意な変化を判定する。肝臓よりもむしろ血漿をウイルスＲＮＡタイターについて分析する。肝臓組織診は制限されており、血漿におけるタイターは肝臓におけるレベルの直接的な指標である。動物がウイルスの排除を示す場合のみ、肝臓をウイルスＲＮＡについて、４０ＲＮＡコピー／ｍＬ程度さえ検出するより感度の高いネスト化ＰＣＲにて試験する（Ｍａｊｏｒ  Ｍ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ３９，  １７０９−１７２０  （２００４），  Ｐｕｉｇ  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １０５，  ２５３−２６３  （２００２））。
【０１４５】
標的化治療ワクチンが、ＲＮＡタイターの低下、肝臓内Ｔ細胞、肝臓内サイトカインおよび末梢ＨＣＶ  Ｔ−細胞応答の上昇を導く場合、これは、ＨＣＶ−特異的応答が、特に対照動物と比較して肝臓において機能していることの強い指標である。肝臓内Ｔ細胞およびサイトカインレベルが上昇するが、ウイルスＲＮＡタイターが低下しない場合、これは誘発されたＴ細胞が、エスケープ突然変異またはＴ細胞機能不全によってウイルスエピトープを認識しなかったことを示唆する。ＲＮＡタイターの一過性の低下、次いで、処理前レベルへの復活は、新たに誘発されたＴ細胞応答をエスケープするためにウイルスにおいて突然変異が発生していることの指標である。これは復活前および復活後のウイルスの配列分析を介して調べる。突然変異が観察される場合、Ｔ細胞エスケープを、ＰＢＭＣおよび突然変異を含むことが判明した領域にわたる新旧のアミノ酸配列を表すペプチドを用いてインビトロで試験することが出来る。
【０１４６】
慢性的にＨＣＶ−感染したチンパンジーにおけるこれらの研究は慢性的に感染した患者において使用されうるＨＣＶ−特異的治療ワクチンの評価に必須である。ＨＣＶ−特異的Ｔ細胞応答の増強が臨床処理のために許容されないレベルへと肝臓の炎症を上昇させないことを示すことが重要である。
【０１４７】
実施例２
免疫リポソームの鼻腔内（ＩＮ）投与
ＩＮ経路を介するワクチン投与は、特定のタイプのウイルス、例えば、頭頸部の組織（これには鼻および喉が含まれる）に対して指向性を有するものに対して特に有用である。例としては呼吸器疾患を誘発するウイルスが挙げられ、呼吸器疾患にはインフルエンザのみならずＳＡＲＳおよび鳥インフルエンザも含まれる。しかし、この経路はその他のタイプのワクチンの送達にも同様に利用可能である。ＩＮにて与えられた場合に、ｓｃＬ複合体が局所組織を標的化し、トランスフェクトする能力を比較するため、非腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡをカプセル封入するｓｃＬナノ免疫リポソーム複合体（ｓｃＬＬＵＣ）、または等量の遊離の複合体化していない（裸）プラスミドＤＮＡ（ＬＵＣ）（両方の処理について１０ｕｇ／マウス／用量）を与えるか、あるいは処理をしなかった（ＣＴＬ）。実施例１におけるように、０．３３ｕｇ：１０ｕｇ：１ｕｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ：ＤＮＡ）の比にて、５％デキストロースを賦形剤として用いて、単純な混合によりｓｃＬＬＵＣ複合体を調製した。２回の用量を２４時間以内に投与した。最後の投与の４８時間後、動物にルシフェリン基質（ｉｐ投与）を〜３ｍｇ／マウスにて注入し、動物全体を、ＩＶＩＳ  １００光学イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ  ＣＡ）を用いて麻酔下で可視化した（図１６Ａ−１６Ｃ）。現れたシグナルの強度は実際の測定においては色によって示される。赤色／黄色は最も高い強度であり、トランスフェクトされたルシフェラーゼ遺伝子の最も高い発現レベルに対応し、一方、青色は最小の発現を表し、緑色は中程度の発現である。これらの発現レベル（高／中程度／最小）をカラー表示の代わりに図１６Ａ−１６Ｃおよび１７Ａ−１７Ｃに示した。図１６Ａ−１６Ｃから、ｓｃＬ複合体（ｓｃＬＬＵＣ）のＩＮ投与（パネルＣ）の結果、遊離の裸ＤＮＡ（ＬＵＣ）（パネルＢ）と比較して鼻領域におけるトランスフェクション／発現のより高いレベルがもたらされたことが明らかである。パネルＡは非処理対照を表す。ｓｃＬナノ免疫リポソーム複合体と裸ＤＮＡとの両方がトランスフェクトされる組織に直接的に投与（局所送達）された場合に、ｓｃＬナノ免疫リポソーム複合体が裸ＤＮＡ（今回用いられたような）よりもかなり良好な結果をもたらしたということは、驚くべき予期せぬことである。
【０１４８】
Ａ．静脈内投与の後に裸ＤＮＡと比較してプラスミドＤＮＡペイロードの分布および局在が増強されることの実証
ＩＶＩＳ  １００光学イメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ  ＣＡ）を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子を発現するプラスミドＤＮＡをカプセル封入するｓｃＬナノ免疫リポソーム複合体（ｓｃＬＬＵＣ）（上記のもの）、または等量の遊離の複合体化していない（裸）プラスミドＤＮＡ（ＬＵＣ）（両方の処理について２５ｕｇ／マウス／用量）をＩＶ尾静脈注射を介して与えた、非腫瘍担持ＢＡＬＢ／ｃマウスまたは非処理マウス（ＣＴＬ）を画像化した。２用量を２４時間以内に投与した。最後の投与の４８時間後、動物にルシフェリン基質（ｉｐ投与）を〜３ｍｇ／マウスにて注入し、動物全体を麻酔下で可視化した。図１７Ａ−１７Ｃに示すように、尾部における注射部位を除いては裸ＤＮＡ（パネルＢ）を与えたマウス（ＬＵＣ）においてはシグナルはみられない（口での少量はおそらく注射部位でのなめる行為による）。一方、同じ量のプラスミドＤＮＡを担持するｓｃＬ複合体の静脈内投与の後は（ｓｃＬＬＵＣ）（パネルＣ）、動物のほぼ全体にわたって中程度から高レベルのシグナルがみられた。パネルＡは非処理対照を表す。リンパ節および肝臓が位置している位置ではより強度が高い。これはおそらく、樹状細胞およびクッパー細胞が実際にトランスフェリン受容体を発現しており、そのため複合体を取り込むことができるという事実に起因する。しかし、正常の非腫瘍組織におけるこの高レベルの取り込みおよび発現は、予期せぬ驚くべきことである。
【０１４９】
実施例３
マウスモデルを用いるインビボでの肝細胞へのｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶの送達の最適化
リピドＡを用いて製剤されたｓｃＬまたはｓｃＬＨＫをマウス研究において用いる。リポソーム複合体中の２０から３０μｇのＤＮＡを２４時間かけて２−３回の接種により尾静脈を介して複数連のマウスにリポソーム複合体を介して送達する。リポソームの特定の細胞タイプへのエンドサイトーシスを追跡するために、ローダミン−ＤＯＰＥで標識したリン脂質を総脂質の０．０５モルパーセントにて用いる（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  ＡＬ）。組織サンプルをウェスタンブロット、組織学的染色により分析し、細胞の高分解能イメージングはＨＣＶ特異的タンパク質の発現について注射の２４−４８時間後にフローサイトメトリーによって行う。組織学的分析のために、組織をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ培地中に瞬間凍結するか、またはホルマリン固定する。組織をクリオスタットまたはミクロトームを用いて切片とし、特異的タンパク質または細胞マーカーについて染色する。パラフィン包埋し、ホルマリン固定した組織について、切片をキシレン中で脱パラフィンし、アルコール中で水分補給した後、ＰＢＳで洗浄する。抗原賦活化のために、組織を１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．０によりマイクロ波で１００℃で１０分間処理する。冷却および洗浄の後、内因性ペルオキシダーゼ活性のクエンチングを０．３％Ｈ２Ｏ２を用いて達成する。組織切片上の非特異的部位を次いで５％ミルクまたは正常血清でブロッキングした後、特異的抗体とともにインキュベーションする。
【０１５０】
フローサイトメトリーによる肝細胞の分析のために、フローサイトメトリー分析のためにマウスから全肝臓細胞および常在性Ｔ細胞を単離するための灌流技術が開発された。マウスを手順にわたって麻酔下で維持することにより、血圧を最初に維持する。これにより静脈の崩壊が妨げられることにより、次に行うカニューレ挿入の成功率が上昇する。マウスをイソフルランで麻酔し、ノーズ・コーンの装着によって手順の間中麻酔を維持する。腹部を切開して肝臓を露出させ、腸管をマウスの左側に移して門脈を露出させる。２４Ｇ  ＩＶ注入セットを門脈に挿入する。肝臓をあらかじめ温めておいたＬｉｖｅｒ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ；肝臓を血液から洗浄し、凝固を防止し、細胞と細胞との接着をゆるめることを開始させるよう製剤された緩衝平衡塩類溶液）により５分間３ｍｌ／分にて灌流する。あらかじめ温めておいたＬｉｖｅｒ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ；生きた肝臓細胞の解離のための条件付き（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−Ｄｉｓｐａｓｅ培地）で肝臓を３ｍｌ／にて１０−１２分間灌流する。肝臓をついでマウスから取り出し、氷上に置く。肝細胞を取り出し、１００μｍ篩に通すことにより細胞片から精製し、次いで低速遠心分離に供する。ローダミン−標識化リポソームを用いることにより、細胞をフローサイトメトリーにより直接的に分析してリポソーム／ＤＮＡ複合体のトランスフェクション効率または細胞内局在を判定することが出来る。複合体の肝細胞への取り込みを、脾臓細胞による取り込みまたは非−標的化リポプレックスの取り込みに対してフローサイトメトリーを用いて比較する。細胞を低速遠心分離によって脾臓細胞片から単離する。赤血球細胞をＡＣＫ溶解緩衝剤（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、ＭＤ）によって溶解し、洗浄後、細胞を１００μｍ細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤ、ＮＪ）に通す。さらなる組織をＤＮＡのその他の臓器への取り込みを分析するために取り出す。具体的には、腎臓、心臓および肺組織を取り出し、タンパク質抽出物をウェスタンブロットにより分析する。
【０１５１】
Ａ．インビボ有効性についてのｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶの用量最適化
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて、持続的な肝臓酵素の上昇の非存在下での良好な免疫応答を達成するための最適生物学的用量（ＯＢＤ）を決定する。対照として、遊離の（複合体化していない）プラスミド、空ベクターを担持する改変リポソームおよびＨＣＶ遺伝子を欠く非組換えアデノウイルスを用いる。群あたり５匹の動物を用いる。最も高い投与用量は約５０μｇである。マウスの群に、１、５、１０、２０、および５０μｇ／注射を含むリポソーム／ＤＮＡ複合体（実施例１に記載のように調製）を静脈内注射により与える。接種は０および４週目に行い、次いで１０週目にアデノウイルス追加免疫を行う。この追加免疫の４週後、肝臓および脾臓をフローサイトメトリーおよびインビトロ試験により分析し、上記のような免疫の際に誘発されたＴ細胞の特徴および特異性を判定する。この実験を簡略化するために、対照動物には最も高い用量のＤＮＡおよびアデノウイルスのみを与える。動物を肝臓酵素および肝臓における組織学的変化についてモニターする。ＯＢＤがいったん確立されたら、この用量を各注射について用いるが、注射の回数は４週間隔で１から５回まで変動させ、次いで最後の注射の６週後にアデノウイルス追加免疫を行う。４週間後に、肝臓および脾臓を最適応答をもたらす注射回数を判定するために上記のように分析する。
【０１５２】
Ｂ．誘発されたＴ細胞応答の交差反応性
米国において支配的なＨＣＶ遺伝子型は１ａであるが、ワクチン開発においては２以上のＨＣＶ遺伝子型からのウイルスエピトープの認識に取り組む必要がある。誘発された免疫応答の交差反応性を、遺伝子型１ｂおよび２ａからのコンセンサス配列に対応するオーバーラップするペプチドを用いてマウスにおいて評価する。１ａ  Ｈ７７ゲノム配列に対応するオーバーラップする１８ｍｅｒペプチドの完全なセットはＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍによって提供されている。この同じプログラムにより１ｂ  Ｊ４遺伝子型に対応する類似のセットのオーバーラップするペプチドが入手可能である。タイプ２ペプチドセットはＭｉｍｏｔｏｐｅｓ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）から購入した。患者集団において起こりうる交差反応性をよりよく評価するために、これら分析を上記のＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスを用いて行う。これらマウスはＨＬＡ−Ａ２  ＭＨＣ分子を発現し、ＨＬＡ−Ａ２エピトープを提示することが出来る。異なる遺伝子型を表すペプチドプールに対する応答をエリスポットアッセイを用いて評価し、免疫のために用いられる１ａ  Ｈ７７配列に対応するペプチドと並行して行う。交差反応性が観察されなければ、三価のワクチンを３つのすべての遺伝子型に対応するＤＮＡプラスミドを含むナノリポプレックスを用いて試験すべきであり、次いでそれぞれこれら３つの異なる遺伝子型に対応する３つのｒＡｄを用いる追加免疫を行う。各個々の遺伝子型に対する免疫応答を評価し、個々の遺伝子型配列を単独で用いた場合に得られる応答と比較する。
【０１５３】
Ｃ．インビボでの安全性研究
ｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶのマウスＬＤ１０は上記のように判定されるＯＢＤに基づく。ＯＢＤから出発して、徐々に増加する用量のプラスミドＤＮＡ（１００μｇまで）を、５週間毎週１回注入する。複合体における成分の比は決められているので、プラスミドＤＮＡの量を増やすことにより、複合体（実施例１のように調製）中のＴｆＲｓｃＦｖおよびＬｉｐまたはＬｉｐ−ＨＫの量も上昇する。ｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶを、１０マウス／群の雄性および雌性４−６週齡ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．またはｉ．ｄ．注入する。動物の重量を週に２回評価し、毒性（例えば、消耗）の兆候について毎日モニターする。遊離プラスミドＤＮＡまたは非リガンド化リポソーム−ＤＮＡを与えた動物を対照として用いる。短期毒性を評価するため、最後の注射の２日後にマウスの半数を屠殺する。残りの半分は最後の投与の２週後に屠殺して長期毒性を評価する。肝臓、性腺、肺、膵臓、腎臓、心臓、皮膚、脾臓、脳、腸、および骨髄を含む様々な臓器および組織を組織学的に調べる。肝臓酵素レベルも週ごとにモニターする（Ａｎｔｅｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。臓器からの組織サンプルを瞬間凍結し、ＤＮＡ抽出のために−７０℃で保存する。ＰＣＲ分析をすべての組織サンプルについて行って接種後のすべての組織におけるｓｃＬＨＫ−ＨＣＶの体内分布およびＤＮＡの持続を評価する。ＨＣＶ遺伝子に特異的なプライマーは入手可能である。
【０１５４】
ＤＮＡ／リポソーム複合体についてのＬＤ１０がいったん確立されると、以下の一工程での用量が、徐々に上昇する用量の組換えアデノウイルスと組合せて雄性および雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの処理に用いられる。１０マウスからなる各群に１または３回のｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶ  （実施例１のように調製）のｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、またはｉ．ｄ．注射／週を５週間与え、次いで徐々に上昇する用量の組換えアデノウイルス（１０８から１０９感染単位）を週に２回３週間皮下（ｓ．ｃ．）投与する。上記のように、マウスの半分を最後の投与の２日後に屠殺して短期応答を評価し、半分を２週間後に屠殺して長期応答を評価する。性腺、肺、膵臓、腎臓、心臓、皮膚、脾臓、脳、腸、および骨髄を含む臓器および組織を組織学的に分析し、肝臓組織学について特に強調する。血液を採取し、肝臓酵素をこの研究の間毎週評価する。脾臓を取り出し、Ｔ細胞応答について分析し、トレランス誘発がこれらの動物において起こっているか否かを評価する。
【０１５５】
血漿薬物動態分析および体内分布研究を雄性および雌性ヌードマウスにおいて行う。動物にはｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶ複合体（実施例１のように調製）をＯＢＤにて１回ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、またはｉ．ｄ．注射する。血液サンプルを麻酔下で心穿刺を介して、複合体投与前および複合体投与の５分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後に、抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを含むチューブ中に得る。マウスを安楽死させ、肝臓、膵臓、性腺、脾臓、腎臓、肺、心臓、リンパ節および脳を迅速に切り出し、氷冷生理食塩水ですすぎ、ドライアイスで瞬間凍結する。血液サンプルを３０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離して血漿を細胞から分離する。血漿および組織サンプルの両方を−８０℃で保存する。
【０１５６】
血漿、および組織サンプルにおけるＨＣＶプラスミド濃度を決定する。簡単に説明すると、プラスミドＤＮＡをフェノール・クロロホルム抽出法を用いて血漿サンプルから、そしてＤＮＡ抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ））を用いて組織サンプルから単離する。ＨＣＶ濃度標準を既知量のプラスミドをブランク血漿またはブランク組織サンプル中に添加することによって調製し、次いで抽出する。抽出物を次いでアガロースゲル、ブロッティングおよびハイブリダイゼーションによって分析する。ハイブリダイゼーションはＧｅｎｅ  Ｉｍａｇｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてＨＣＶ配列をプローブとして用いて行う。１０−から５０−倍過剰のプローブを用いてすべてのバンドの飽和を確実にする。オートラジオグラフをスキャンし、ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて定量し、様々なサンプルにおけるプラスミドＤＮＡの量を標準との比較により算出する。あるいは、プローブをγ３２  Ｐ−ＡＴＰにより５’−末端標識するかまたはＨＣＶに特異的なネスト化ＰＣＲを行う。血漿薬物動態パラメーターを標準的方法によって評価する（例えば、Ｇｏｋｈａｌｅ，  Ｐ．Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：  １２８９−１２９９  （１９９７）を参照）。
【０１５７】
霊長類における肝臓へのターゲティングの安全性および効率の評価
用量応答研究をアカゲザルにおいてｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶ（実施例１のように調製）およびアデノウイルス組換え体を用いて行う。特異的メモリーマーカーを担持する最良のＨＣＶ−特異的Ｔ細胞を誘発する免疫系および用量を、アカゲザルモデルにおける出発用量として用いる。アカゲザルにｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶを接種し、ｓ．ｃ．送達により１０１２感染単位までの組換えアデノウイルスにより追加免疫する。提案されるワクチン接種レジメンは０および３ヶ月目のＤＮＡプライムおよび追加免疫、次いで６ヶ月目のアデノウイルスからなる。対照群には空ベクター遊離プラスミドＤＮＡと複合体化したｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫおよび非組換えアデノウイルスを接種する。
【０１５８】
第一の研究は４群（３のワクチンおよび１の対照）を用い、群あたり動物は２匹とする。群１−３には徐々に上昇する用量のナノ複合体ｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶを与えるが、ｒＡｄ接種は上記のマウスにおける用量最適化研究から決定されたレベルに維持する。群４は対照群であり、ｓｃＬまたはｓｃＬＨＫ−空ベクターを与えた後、非組換えアデノウイルスにより追加免疫する。応答におけるプラトーが観察されると、プラトーの中央におけるｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶ用量にて残りの４匹の動物を用いて免疫研究を行い、ｒＡｄ用量を０．５ｌｏｇ１０上昇させる（２群の動物、群あたり２匹の動物、２回の上昇用量のｒＡｄ）。研究１における対照群からのデータはこれら動物についての対照データを提供する。プラトーが観察されず、最小のＡＬＴ上昇による用量上昇と比較して免疫応答が上昇すると、第二の研究を上昇用量のｓｃＬＨＫ−ＨＣＶを用いて残りの４匹の動物において行う。
【０１５９】
ワクチン接種したアカゲザルにおいて、末梢血および肝臓の両方においてエリスポット、フローサイトメトリーおよび組織学的分析を用いて特異的免疫およびメモリーＴ細胞の証拠を評価する。経皮的肝臓組織診を月に２回行う；組織サンプルの半分を培地に入れ、４分の１を液体窒素で瞬間凍結し、４分の１をホルムアルデヒドで固定する。肝臓切片の免疫組織学的分析を行って、各接種の後に２−４週間隔で肝臓に存在するリンパ球の数、種類および位置を識別する。特にこの種におけるメモリーＴ細胞サブセットの同定における有用なマーカーであると考えられるＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ２８の発現を評価する。
【０１６０】
アカゲザルのハプロタイプを決定し、末梢血において同定されたＴ細胞エピトープを用いる。テトラマーを作り、マウスＴ細胞分析について上記したようにフローサイトメトリー分析によりメモリーＴ細胞の特異性を示すのに用いる。既知のＴ細胞エピトープおよび多色フローサイトメトリー表現型により、Ｔ細胞に関連するサイトカインおよび細胞溶解分子が非常に少数の細胞を用いて評価することが出来る。血液をＡＬＴ上昇について分析し、組織をアポトーシスのマーカーについて染色して、肝臓における細胞がプライミングの際に誘発されたＨＣＶ抗原に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の作用によってアポトーシスを経ているかどうかを判定する。
【０１６１】
Ｅ．慢性チンパンジーのリポソーム／ＤＮＡ複合体による処理
ｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶ／アデノウイルスワクチンを慢性チンパンジーにおいて治療ワクチンとして用いる。４匹の慢性的に感染したチンパンジーはすべて最初は遺伝子型１ａ（Ｈ７７株）に対応する単一配列モノクローン性ウイルスにより感染されている。これらの動物は３．５−５年間慢性的に感染している。ＨＣＶはＲＮＡウイルスであり、それゆえゲノムは複製の際に突然変異を受ける。この同じモノクローン性ストックの接種後に持続的に感染している動物からのウイルスはおそらく免疫圧の結果として、感染のおよそ６ヶ月後には突然変異を蓄積している。感染の３８週後にＣｈ６４１２から単離したウイルスについての配列データが準備された。完全なコード領域の分析により９アミノ酸の変化が明らかとなり、そのなかの６つはＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ領域に位置していた。循環しているウイルスゲノムにおけるこれらの突然変異にもかかわらず、野生型配列をこれらの動物における治療ワクチンにおいて用いる。多数のよく保存されたエピトープに対応する野生型配列の使用は、ウイルスタイターの低減に有効である。主要エンドポイントとして、ウイルスＲＮＡタイターの低下を、第二のエンドポイントとしての処理前レベルと比較して、各動物の血清において評価する。上昇したＴ細胞活性を肝臓において測定し、肝臓内サイトカインｍＲＮＡレベルの上昇も測定する。処理前レベルと比較して、０．５ｌｏｇ１０を超えるＲＮＡタイターの低下および２−倍を超えるＴ細胞数またはサイトカインｍＲＮＡレベルの上昇を、有意であるとみなす。２匹の動物には治療ワクチンを接種し、２匹の動物にはベクター対照を接種する。
【０１６２】
治療ワクチンについては、ＯＢＤにてｉ．ｖ．で、３−週間隔で３回ｓｃＬ−ＨＣＶまたはｓｃＬＨＫ−ＨＣＶ（実施例１のように調製）を送達するか、または対照動物については空のＤＮＡベクターを送達する。最後のＤＮＡ接種の４週後（１３週目）、これら同じＨＣＶ抗原を発現する組換えアデノウイルス（１０１２感染単位、ｉ．ｖ．）または非組換えウイルスを投与する。動物を６ヶ月まで追跡する。研究に渡って、組織診を２週間に１回得、血液（２０−５０ｍｌ）を毎週得て、動物を血清ＡＬＴ上昇、ＨＣＶ  ＲＮＡタイターおよび肝臓内Ｔ細胞浸潤についてモニターする。ＨＣＶ  ＲＮＡタイターをＨＣＶの５’ＵＴＲおよびコア領域を標的とするプライマーおよびプローブを用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて判定する。特異的免疫およびメモリーＴ細胞の増強の証拠を末梢血と肝臓との両方において、エリスポット、フローサイトメトリーおよび組織学的分析を用いて調べる。経皮的肝臓組織診をＫｌａｔｓｋｉｎ技術によって行う；組織サンプルの半分を培地に入れ、４分の１を液体窒素で瞬間凍結し、４分の１をホルマリン固定する。
【０１６３】
Ｆ．新鮮な肝臓組織の分析
リンパ球を肝臓組織診から機械的ホモゲニゼーションによって単離し、次いで洗浄および計数を行う。細胞をＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ／ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ２８に対する抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、数をフローサイトメトリーによって判定する。事象をＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を用いて獲得し、死細胞の排除のために７ＡＡＤ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を用いる分析のためにソフトウェアＣｅｌｌｑｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を用いる。マウスおよびアカゲザル研究について記載したように、テトラマーを処理したチンパンジーからの特異的Ｔ細胞の機能の研究に用いる。
【０１６４】
チンパンジーにおいて、ＭＨＣハプロタイプはＰａｔｒ（チンパンジー（Ｐａｎ  Ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ））型として知られている。これらＰａｔｒ対立遺伝子のいくつかがチンパンジーおよび慢性動物について同定されており、これら動物のそれぞれからのＴ細胞によって認識されるＰａｔｒ対立遺伝子およびＨＣＶエピトープ配列が同定されている。これら動物における循環するウイルスは、持続的な感染の際に突然変異を組み込んでおり、それはおそらく以前に同定されたエピトープにおけるものである。Ｔ細胞エピトープの詳細な分析の後に、新しいテトラマーをフローサイトメトリー分析における使用のためにＴ細胞エピトープを用いて合成する。Ｔ細胞クローンもインビトロでのより長期の分析のために開発する。リンパ球を１００，０００のガンマ照射されたＰＢＭＣ、０．０１μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３および１００Ｕ／ｍｌの１Ｌ−２を用いてクローン化する。
【０１６５】
Ｇ．瞬間凍結した肝臓組織の分析
トータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）を用いて瞬間凍結した組織から単離する。ＲＮＡをＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて逆転写し、リアルタイムＰＣＲによって、ＩＦＮ−γ、ＣＤ３、ＣＤ８、およびＣＤ４についての特異的プライマープローブセットを用いて（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  ＣＡ）サイトカインｍＲＮＡレベルについて試験する。これらサイトカインのレベルを内因性対照（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化し、それぞれの動物についての処理前組織診におけるレベルと比較する。サイトカインｍＲＮＡレベルの２−倍を超える上昇または低下を有意であるとみなす。
【０１６６】
Ｈ．ホルマリン−固定した肝臓組織の分析
ホルマリン固定した組織をミクロトームを用いて切片とし、アポトーシスの特異的タンパク質、細胞マーカーまたはマーカーについて染色し、肝臓における細胞がワクチン接種の際に誘発されたＨＣＶ抗原に特異的なＣＴＬの作用に起因してアポトーシスを経ているかどうかを判定する。免疫組織学的分析を肝臓切片に対して行って、各組織診について肝臓に存在するリンパ球の数、タイプおよび位置を識別する。切片をキシレン中で脱パラフィンし、アルコール中で水分補給した後、ＰＢＳで洗浄する。抗原賦活化のために、組織を１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．０でマイクロ波で１００℃で１０分間処理する。組織切片上の非特異的部位を次いで５％ミルクまたは正常血清によりブロッキングした後、特異的抗体とともにインキュベーションする。感染の前に同じ動物から得られた肝臓組織診  （以前に保存されたサンプル）および処理後のものを比較のために用いる。
【０１６７】
Ｉ．フェーズＩ臨床試験に向けての正式な薬物動態および毒性学研究
毒性学研究を低い（ＯＢＤまたはＬＤ１０より１０ｘ低い）および高い（ＯＢＤまたはＬＤ１０より１０高い）用量の実施例１に記載のように調製されたこれらｓｃＬ−ＤＮＡまたはｓｃＬ−ＨＫ−ＤＮＡ複合体を用いて１つの対照群（３０匹のマウス）および２つの処理群（それぞれ３０匹のマウスであって、半数は雄性であり半数は雌性）について行う。複合体の注入を上記に決定した投与スケジュールにて１日目から開始する。各群からの１０匹のマウスを最後の注射の２日後、３週間後および６週間後に屠殺する。体重および食餌摂取を毎日モニターする。対照および処理群についての臨床病理（尿血液学、臨床化学、特に肝臓酵素）および組織病理学を評価する。以下の臓器を含める：注射部位、脳、膵臓、鼠径リンパ節、骨髄（組織およびスメア）、肝臓、腎臓、精巣／卵巣、脾臓、肺、心臓。
【０１６８】
体内分布研究：この研究には、複合体の単回注射の後４つの時点（２日間、２週間、４週間、および６週間）にて最も高い用量にて１つ対照（１０匹のマウス）および４つの処理群（それぞれ１０匹のマウス）を含める。すべての群における以下の臓器について上記のようにＤＮＡ  ＰＣＲによる分析を行う：肝臓、骨髄、膵臓、腎臓、脾臓、注射部位、精巣／卵巣、鼠径リンパ節、肺、心臓、脳。
【０１６９】
実施例４
化学的結合によって調製されたナノ免疫リポソームによるヒトにおけるウイルス抗原に対する免疫応答の誘発
本発明はまた、ウイルスタンパク質およびインターロイキンをコードする核酸分子、例えば、１以上のインターロイキンをコードする抗原遺伝子として作用するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む１以上のプラスミド、を含むリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を個体に投与することを含む、ヒト（およびその他の哺乳類および動物）においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供する。様々な標的化リガンドを含む複合体はリポソームの表面に直接的に化学的に結合したものであり得、以下に記載のように実施例１において実質的に記載したように調製される：
【０１７０】
ＭＰＢ−リポソームはＣａｍｐｂｅｌｌ  ＭＪ  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９５  Ｊｕｎ；１８（６）：１０２７−３２）によって記載されたものから改変されたエタノール注射方法によって調製される。４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート−ＤＯＰＥ（ＭＰＢ−ＤＯＰＥ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）をリポソーム製剤［リピドＡ（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ、１：１モル比）；リピドＢ（ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ、１：１モル比）；リピドＤ（ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ、１：１モル比）；およびリピドＧ（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ、１：１：１モル比）］に、総脂質の５−８％モルとなるように含める。簡単に説明すると、すべての脂質をエタノール中に可溶化し、混合し、ボルテックスしている５０−６０℃の純水にハミルトンシリンジによって注入する。溶液をさらに１０−１５分間ボルテックスする。終濃度は１−２ｍＭ総脂質である。１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５（ｐＨ７．０−８．０）を終濃度１０−２０ｍＭとなるように添加する。マレイミド基はｐＨ＞７の水溶液中では安定ではないので、リポソームは好適には水（ｐＨ５−６．５）中で調製される。ｐＨは１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ７．０−８．０を用いてｓｃＦｖ−ＳＨと連結する前に７．０−８．０に調整してよく、それによりポストコーティング反応が促進される。
【０１７１】
ｓｃＦｖ−ＳＨまたは−ＳＨ基を有するいずれかの抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’またはＭａｂ）をＭＰＢ−リポソームにタンパク質／脂質の比が約１：１から約１：１００、好適には約１：１０から約１：５０（ｗ：ｗ）、より好適には約１：２０から約１：４０、例えば１：３０となるように添加する。溶液を３０分間室温での穏やかな回転（〜２０−３０ＲＰＭ）により混合し、ｓｃＦｖ−Ｌｉｐを作る。ｓｃＦｖ−Ｌｉｐは精製せずに用いられるが、それはＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィーによって精製してもよい。ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ複合体を作るために、プラスミドＤＮＡを必要であれば水で希釈し、ｓｃＦｖ−ＬｉｐにＤＮＡ／脂質の比が約０．５：１から約１：４０（μｇ全核酸：μｇ脂質）、好適には約１：５から約１：２０（μｇ全核酸：μｇ脂質）、例えば、１：１０（μｇ全核酸：μｇ脂質）となるように添加し、混合物を５−１０秒間反転させ、より大きい体積の場合は２０−３０ＲＰＭで１−２分間回転させる。最終的な混合物を室温で１０−１５分間維持し、およそ５分後に再び５−１０秒間穏やかに反転させる。インビボでの使用のために５０％デキストロースまたは５０％スクロースを終濃度５−２０％（Ｖ：Ｖ）となるように添加し、５−１０秒間の穏やかな反転により混合し、より大きな体積の場合は２０−３０ＲＰＭで１−２分間回転させることにより混合する。ｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡは精製せずに用いられるが、それはＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィーにより精製してもよい。８０−１００％のｓｃＦｖ（または−ＳＨ基を有するいずれかの抗体）がリポソームに結合すると予測される。
【０１７２】
複合体との結合／カプセル封入の前に、ウイルス抗原およびインターロイキンをコードするプラスミドをインサート対インサートのモル比が、０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、となるように一緒に混合する。例えば、１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子のインサート、対、１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子のインサートの比が用いられる。
【０１７３】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、ＨＩＶである場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適には、以下の１以上をコードする遺伝子を含むものである：エンベロープタンパク質（Ｖａｎｎｉａｓｉｎｋａｍ，Ｔ．  ａｎｄ  Ｅｒｔｌ，  Ｈ．Ｃ．  （２００５）：  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ５：２０３−２１２．；  Ｆｅｒｒａｎｔｅｌｌｉ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｒｕｐｒｅｃｈｔ，  Ｒ．Ｍ．  （２００２）：  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ  −−  ｂａｃｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｌｅａｇｕｅｓ？  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １４：４９５−５０２．）および／またはＮｅｆタンパク質（Ｖａｎｎｉａｓｉｎｋａｍ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｅｒｔｌ，  Ｈ．Ｃ．  （２００５）：  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ５：２０３−２１２．；  Ｌｉｃｈｔｅｒｆｅｌｄ，  Ｍ．，  Ｙｕ，  Ｘ．Ｇ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｄ．，  Ａｄｄｏ，  Ｍ．Ｍ．，  Ｍａｌｅｎｆａｎｔ，  Ｊ．，  Ｐｅｒｋｉｎｓ，  Ｂ．，  Ｐａｅ，  Ｅ．，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ｍ．Ｎ．，  Ｓｔｒｉｃｋ，  Ｄ．，  Ａｌｌｅｎ，  Ｔ．Ｍ．，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｅ．Ｓ．，  Ｋｏｒｂｅｒ，  Ｂ．，  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｂ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ａｌｔｆｅｌｄ，  Ｍ．  （２００４）：  ＨＩＶ−１  Ｎｅｆ  ｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ａ  ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ  ｈｉｇｈ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．    ＡＩＤＳ，  １８：１３８３−１３９２．）；および／またはｇｐ１４０（Ｓｍｉｔｈ，  Ｓ．Ｍ．  （２００２）：  ＨＩＶ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ＡＩＤＳ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ９：１００−１１１．）。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適には、いずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１７４】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、インフルエンザである場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適には、赤血球凝集素（ＨＡ）（Ｔａｍｕｒａ，  Ｓ．，  Ｔａｎｉｍｏｔｏ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｋｕｒａｔａ，  Ｔ．  （２００５）：  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｂｒｏａｄ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ５８：１９５−２０７．；  Ｃｏｘ，  Ｍ．Ｍ．  （２００５）：  Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ７：２４−２９．；  Ｚｅ，  Ｃ．，  Ｋｕｒａｔａ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｔａｍｕｒａ，  Ｓ．  （２０００）：  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ５３：２１９−２２８．）、および／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）（Ｔａｍｕｒａ，  Ｓ．，  Ｔａｎｉｍｏｔｏ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｋｕｒａｔａ，  Ｔ．  （２００５）：  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｂｒｏａｄ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ５８：１９５−２０７．；  Ｃｏｘ，  Ｍ．Ｍ．  （２００５）：  Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ７：２４−２９．；  Ｚｅ，  Ｃ．，  Ｋｕｒａｔａ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｔａｍｕｒａ，  Ｓ．  （２０００）：  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．    Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ５３：２１９−２２８．）、および／またはヌクレオカプシド（Ｃｏｘ，  Ｍ．Ｍ．  （２００５）：  Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．    Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ７：２４−２９．）および／またはマトリックスタンパク質Ｍ２（Ｃｏｘ，  Ｍ．Ｍ．  （２００５）：  Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐ��ｕｔｉｃｓ，  ７：２４−２９．）をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適には、いずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１７５】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、ＳＡＲＳである場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適には、スパイク糖タンパク質、および／またはヌクレオカプシドおよび／または構造タンパク質Ｓ１、および／または構造タンパク質Ｍ、および／または構造タンパク質Ｎ（Ｗｅｉｓｓ，  Ｓ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｎａｖａｓ−Ｍａｒｔｉｎ，  Ｓ．  （２００５）：  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ６９：６３５−６６４．）をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適には、いずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１７６】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、鳥インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１としても称される）である場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適には、赤血球凝集素（Ｗｏｎｇ，  Ｓ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｙｕｅｎ，  Ｋ．Ｙ．  （２００６）：  Ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｃｈｅｓｔ，  １２９：１５６−１６８．；  Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，  Ｉ．，  Ｂｕｇａｒｉｎｉ，  Ｒ．，  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，  Ｋ．Ｇ．，  Ｐｏｄｄａ，  Ａ．，  Ｗｏｏｄ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｚａｍｂｏｎ，  Ｍ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｋａｔｚ，  Ｊ．Ｍ．  （２００５）：  Ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ａｎｄ  ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／９７  （Ｈ５Ｎ３）  ｖａｃｃｉｎｅ：  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  １９１：１２１０−１２１５．；  Ｔｒｅａｎｏｒ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，  Ｂ．Ｅ．，  Ｍａｓｓｅｏｕｄ，  Ｆ．，  Ｈｕ−Ｐｒｉｍｍｅｒ，  Ｊ．，  Ｂａｔｔａｇｌｉａ，  Ｒ．，  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，  Ｄ．，  Ｗｏｌｆｆ，  Ｍ．，  Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，  Ｇ．，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｄｅｒ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｋａｔｚ，  Ｊ．Ｍ．  （２００１）：  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｈ５  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ，  １９：１７３２−１７３７．）をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適には、いずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１７７】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、エボラ、マールブルグまたはフィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）のいずれかである場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適には、ＶＰ２４、および／またはＶＰ３０、および／またはＶＰ３５、および／またはＶＰ４０および／またはｓＧＰ、および／または糖タンパク質、および／または核タンパク質（Ｈａｒｔ，  Ｍ．Ｋ．  （２００３）：  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｅｆｆｏｒｔｓ  ｆｏｒ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，  ３３：５８３−５９５．；  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｊ．Ａ．，  Ｂｏｓｉｏ，  Ｃ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｈａｒｔ，  Ｍ．Ｋ．  （２００１）：  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ：  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．    Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ５８：１８２６−１８４１．）をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適には、インターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１７８】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、Ｂ型肝炎である場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適には、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）（Ｈａｎｋｅ，  Ｔ．  （２００６）：  Ｏｎ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ３６：８０６−８０９．；  Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，  Ｊ．Ｎ．  （２００６）：  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ：  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，  ｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｅｌｕｓｉｏｎｓ．    Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  １９：４５６−４５９．）、および／またはヌクレオカプシド（ＨＢｃ）（Ｍｉｃｈｅｌ，  Ｍ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｍａｎｃｉｎｉ−Ｂｏｕｒｇｉｎｅ，  Ｍ．  （２００５）：  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３４  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ１０８−Ｓ１１４．）をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適には、いずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１７９】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、西ナイルウイルス、デング熱、黄熱病、またはいずれかのフラビウイルス科（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）である場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適には、ほとんどのウイルス−中和抗体を誘発するタンパク質であるＥ−糖タンパク質（Ｓａｍｐａｔｈｋｕｍａｒ，  Ｐ．，  ”Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  Ｖｉｒｕｓ：  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，”  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｓ  ７８：１１３７−１１４４  （２００３）；  Ｋｉｎｇ，  Ｎ．Ｊ．Ｃ．，  ”Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，”  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８５：３３−４２  （２００７）参照）をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適には、いずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１８０】
上記のように調製した最終的な複合体のサイズは好適には約５０から５００（ｎｍ）の間であり、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）  ＮＡＮＯ−ＺＳのＭａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）３０００を用いる動的光散乱によって判定したゼータ電位が正のものである。このサイズは毛細血管床を効率的に通過し、標的ＡＰＣ細胞に到達するために十分に小さいものである。
【０１８１】
上記のように調製した複合体は、予防または治療ワクチンとして使用される。予防のためには、上記のように調製したリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体ナノリポプレックスワクチンは、哺乳類、例えば、ウイルス性疾患に以前に曝露されていないヒトに静脈内注入される。注射は複合体を用いて０、４および８週目になされる。対象にワクチン接種するのに用いられる複合体は好適には０．３３ｕｇ：１０ｕｇ：１ｕｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ：ＤＮＡ）の比にて作られ、５％デキストロースが賦形剤として用いられる。複合体中のＤＮＡの総量は、０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ／注射である。好適な量は０．１６４ｍｇ／ｋｇ／注射であり、これは対象の重量に基づいて７−１２ｍｇ  ＤＮＡ／注射である。調製された複合体は２５０ｍｌ  ５％デキストロースバッグにｉ．ｖ．注入のために注入されるか、またはボーラスとして、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル、経皮的、経口、内視鏡下、局所、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放インプラント、または皮下投与、あるいは浸透圧または機械的ポンプを用いる投与を介して注入される。
【０１８２】
治療用途のためには、上記のように調製したリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体ナノリポプレックスワクチンは、哺乳類、例えば、ウイルス性疾患（例えば、Ｂ型肝炎）に慢性的に感染した、または急性にウイルス性疾患（例えば、エボラ、ＳＡＲＳ、Ｈ５Ｎ１、天然痘、西ナイルウイルス）に曝露されたヒトに静脈内注入される。予防用途についてのものと同じ範囲の量のＤＮＡを含む複合体は、２５０ｍｌの５％デキストロース溶液中でｉ．ｖ．送達されるか、またはボーラスとして、０、４および８週目に３回、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル、経皮的、経口、内視鏡下、局所、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放インプラント、または皮下投与によって、あるいは浸透圧または機械的ポンプを用いる投与を介して送達される。
【０１８３】
実施例  ５
単純な混合により調製されたナノ免疫リポソーム複合体によるヒトにおけるウイルス抗原に対する免疫応答の誘発
本発明はまた、ヒト（ならびにその他の哺乳類および動物）においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、該方法は、個体に、ウイルスタンパク質およびインターロイキンをコードする核酸分子、例えば、１以上のインターロイキンをコードする抗原遺伝子として作用するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む１以上のプラスミドを含むリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を投与する工程を含む。リポソーム表面に化学的に結合していないが直接的に複合体化／結合した様々なターゲティングリガンドを含む複合体は本質的に実施例１に記載のようにして以下のように調製される：
【０１８４】
リポソーム［リピドＡ（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ、１：１モル比）；リピドＢ（ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ、１：１モル比）；リピドＤ（ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ、１：１モル比）；およびリピドＧ（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：Ｃｈｏｌ、１：１：１モル比）］は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  ＭＪ  （Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９５  Ｊｕｎ；１８（６）：１０２７−３２）によって記載された方法を改変したエタノール注射方法によって調製される。簡単に説明すると、すべての脂質がエタノール中に可溶化され、混合され、ボルテックスしている５０−６０℃の純水にハミルトンシリンジを用いて注入される。溶液をさらに１０−１５分間ボルテックスする。終濃度は１−２ｍＭ総脂質である。
【０１８５】
ＴｆＲｓｃＦｖまたはいずれかの抗体または抗体フラグメント（例えば、ｓｃｆｖ、Ｆａｂ’またはＭａｂ）−免疫リポソーム複合体は、ＴｆＲｓｃＦｖとリポソーム組成物Ａ（またはいずれかの上記のリポソーム組成物）とを、一本鎖タンパク質とリポソームおよびＤＮＡとが混合された複合体中で所定の比となるように混合することによって調製される。複合体の調製は、以下の一般的手順にしたがう。適当な量の２ｍＭリポソーム（上記のＡ−Ｈ）をなんらかの必要な水（例えば、ＤＩ水）と混合し、所望の体積とし、穏やかに１０回反転して混合するか、またはより大きい体積の場合は２０−３０ＲＰＭで１−２分間回転させる。リポソーム−水混合物に対して、適当な量のＴｆＲｓｃＦｖを添加して、所望の比とし、穏やかな反転により約５−１０秒間混合するか、またはより大きい体積の場合は、２０−３０ＲＰＭで１分間回転させる。この混合物を室温で１０−１５分間維持する（およそ５分後に再び穏やかに５−１０秒反転させる）。同時に、適当な量のＤＮＡを５−１０秒間の反転により混合し、またはより大きい体積の場合は２０−３０ＲＰＭで１−２分間回転させ、なんらかの必要な水を用いて所望の体積とする。典型的には、インビボで使用するためには、注射あたり約５μｇから約１００ｍｇのＤＮＡを提供することが望ましい。ＤＮＡ溶液をＴｆＲｓｃＦｖ−リポソーム溶液に迅速に添加し、混合物を５−１０秒間反転させるか、または、より大きい体積の場合は２０−３０ＲＰＭで１−２分間回転させる。最終混合物を室温で１０−１５分間維持し、およそ５分後に５−１０秒間再び穏やかに反転させる。インビボでの使用のためには、５０％デキストロースまたは５０％スクロースを終濃度が５−２０％（Ｖ：Ｖ）となるように添加し、５−１０秒間の穏やかな反転により混合するか、またはより大きい体積の場合は、２０−３０ＲＰＭで１−２分間回転させる。１：３０（ＴｆＲｓｃＦｖ：リポソーム、ｗ：ｗ）および１：１４（μｇＤＮＡ：ｎモル総脂質）の好適な比での具体例は以下の通りである。最終体積８００μｌ中の４０μｇのＤＮＡについては、１８３μｌの水と２８０μｌの２ｍＭリポソーム溶液を混合する。３４μｌのＴｆＲｓｃＦｖ（濃度０．４μｇ／ｍｌ）を添加する。１８３μｌの水と４０μｌの１μｇ／１μｌＤＮＡを混合する。８０μｌの５０％デキストロースを最終工程にて添加する。
【０１８６】
Ｔｆ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ複合体を以前に記載されたインビボ製剤にしたがって調製する。Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １０（１８）：２９４１−５２  （１９９９）。トランスフェリン−リポソーム−媒介全身的ｐ５３遺伝子治療と放射線照射との組合せの結果、ヒト頭頸部癌異種移植片が退縮する。最適化されたインビボ製剤による典型的な調製のために、２５ｍｌのＴｆ（５ｍｇ／ｍｌ、鉄飽和ホロ−トランスフェリン；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および５０ｍｌのＬｉｐ（２ｍＭ総脂質）＋７５ｍｌの水をポリプロピレンチューブ中で混合し、５−１５分間室温で頻繁に揺り動かしながら保持するか、またはより大きい体積のためには、２０−３０ＲＰＭで１−２分間回転させる。１２０ｍｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝剤、ｐＨ７．４中の１０μｇのプラスミドＤＮＡをチューブに添加し、すぐに徹底的に穏やかに１０回反転させることによって混合し、より大きい体積のためには２０−３０ＲＰＭで１−２分間回転させ、１０−２０分間室温で頻繁に揺り動かしながら保持する。３０μｌの５０％デキストロース溶液を次いでチューブに添加し、すぐに徹底的に穏やかに１０回反転させることによって混合するか、またはより大きい体積のためには、２０−３０ＲＰＭで１−２分間回転させ、室温で１０−１５分間保持する。最終的なＤＮＡ：脂質：Ｔｆ比は１：１０：１２．５（ｍｇ／ｎｍｏｌ／ｍｇ）である。ＨＥＰＥＳ緩衝剤を水と置換してもよい。
【０１８７】
Ａ．Ｌｉｐ−ＨｏＫＣの調製
｛Ｋ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ｝ペプチド（ＨｏＫＣ）を複合体に含める場合は、カチオン性リポソーム製剤Ａ（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ、１：１モル比）、Ｂ（ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ、１：１）、Ｇ（ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＥ：コレステロール、１：１：１）およびＨ（ＤＤＡＢ：ＤＯＰＥ：コレステロール、１：１：１）（または上記のいずれかのリポソーム製剤）を上記のようにエタノール注射方法を用いて調製する。各リポソーム製剤にはまた、ＭＰＢ−ＤＯＰＥを総脂質の５モルパーセントにて含める。ＨｏＫＣペプチドは末端システインを担持するため、ＭＰＢ−ＤＯＰＥをすべてのリポソーム組成物に含めることにより、ペプチドとリポソームとの結合を可能とする。Ｌｉｐ−ＨｏＫＣリポソームをマレイミド基を担持するカチオン性リポソーム（Ｌｉｐ−ＭＰＢ）とペプチドとの以下のようなカップリング反応を用いて調製する。０．１ｍｍｏｌのシステイン上に遊離チオール基を有するペプチドのアリコートを１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４溶液中の２ｍｍｏｌのＬｉｐ−ＭＰＢに添加し、室温で２時間回転させる（２０−３０ｒ．ｐ．ｍ．）。結果として得られるＬｉｐ−ＨｏＫＣの脂質濃度は１．４ｍＭである。
【０１８８】
リポソームがＨｏＫＣを含む場合、完全な複合体がＨｏＫＣを有さないＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＤＮＡ複合体の生産に使用されたものと同一の方法で形成される。この場合もＴｆＲｓｃＦｖまたはいずれかの抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’またはＭａｂ）をＬｉｐ−ＨｏＫＣと（１０回の穏やかな反転により、またはより大きな体積については２０−３０ＲＰＭで１−２分間回転させることにより）特定の比にて混合し、室温で１０−１５分間インキュベートする。ＤＮＡを次いでＴｆＲｓｃＦｖ−Ｌｉｐ−ＨｏＫＣ溶液に添加し、穏やかな１０回の反転により、またはより大きな体積については２０−３０ＲＰＭで１−２分間回転させることにより混合し、再び室温で１０−１５分間インキュベートし、その後、デキストロースまたはスクロースを終濃度５−２０％となるように添加し、穏やかに１０回反転させることにより、またはより大きな体積については２０−３０ＲＰＭで１分間回転させることにより混合し、室温で１０−１５分間インキュベートする。複合体中のＴｆＲｓｃＦｖ：ＬｉｐＡ−ＨｏＫＣ：ＤＮＡの比は０．３ｍｇ：７ｎｍｏｌ：１ｍｇである。
【０１８９】
複合体中へのカプセル封入の前に、ウイルス抗原およびインターロイキンをコードするプラスミドを、インサートとインサートのモル比が、０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子となるように混合する。例えば、１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子のインサート、対、１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子のインサートの比が用いられる。
【０１９０】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、ＨＩＶである場合、用いられるプラスミドＤＮＡは好適にはエンベロープタンパク質（Ｖａｎｎｉａｓｉｎｋａｍ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｅｒｔｌ，  Ｈ．Ｃ．  （２００５）：  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ５：２０３−２１２．；  Ｆｅｒｒａｎｔｅｌｌｉ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｒｕｐｒｅｃｈｔ，  Ｒ．Ｍ．  （２００２）：  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＩＶ  −−  ｂａｃｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｌｅａｇｕｅｓ？  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １４：４９５−５０２）および／またはＮｅｆタンパク質（Ｖａｎｎｉａｓｉｎｋａｍ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｅｒｔｌ，  Ｈ．Ｃ．  （２００５）：  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ５：２０３−２１２．；  Ｌｉｃｈｔｅｒｆｅｌｄ，  Ｍ．，  Ｙｕ，  Ｘ．Ｇ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｄ．，  Ａｄｄｏ，  Ｍ．Ｍ．，  Ｍａｌｅｎｆａｎｔ，  Ｊ．，  Ｐｅｒｋｉｎｓ，  Ｂ．，  Ｐａｅ，  Ｅ．，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ｍ．Ｎ．，  Ｓｔｒｉｃｋ，  Ｄ．，  Ａｌｌｅｎ，  Ｔ．Ｍ．，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｅ．Ｓ．，  Ｋｏｒｂｅｒ，  Ｂ．，  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｂ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ａｌｔｆｅｌｄ，  Ｍ．  （２００４）：  ＨＩＶ−１  Ｎｅｆ  ｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ａ  ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ  ｈｉｇｈ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．  ＡＩＤＳ，  １８：１３８３−１３９２．）；および／またはｇｐ１４０（Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ｍ．  （２００２）：ＨＩＶ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ＡＩＤＳ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ９：１００−１１１．）の１以上をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適にはいずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１９１】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、インフルエンザである場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適には赤血球凝集素（ＨＡ）（Ｔａｍｕｒａ，  Ｓ．，  Ｔａｎｉｍｏｔｏ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｋｕｒａｔａ，  Ｔ．  （２００５）：  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｂｒｏａｄ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．    Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ５８：１９５−２０７．；  Ｃｏｘ，  Ｍ．Ｍ．  （２００５）：  Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ７：２４−２９．；  Ｚｅ，  Ｃ．，  Ｋｕｒａｔａ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｔａｍｕｒａ，  Ｓ．  （２０００）：  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．    Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ５３：２１９−２２８．）、および／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）（Ｔａｍｕｒａ，  Ｓ．，  Ｔａｎｉｍｏｔｏ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｋｕｒａｔａ，  Ｔ．  （２００５）：  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｂｒｏａｄ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｂｙ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ５８：１９５−２０７．；  Ｃｏｘ，  Ｍ．Ｍ．  （２００５）：  Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ７：２４−２９．；  Ｚｅ，  Ｃ．，  Ｋｕｒａｔａ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｔａｍｕｒａ，  Ｓ．  （２０００）：  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．    Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ５３：２１９−２２８．）、および／またはヌクレオカプシド（Ｃｏｘ，  Ｍ．Ｍ．  （２００５）：  Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ７：２４−２９）および／またはマトリックスタンパク質Ｍ２（Ｃｏｘ，  Ｍ．Ｍ．  （２００５）：  Ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．    Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅ���ｔｉｃｓ，  ７：２４−２９．）をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適にはいずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１９２】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、ＳＡＲＳである場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適にはスパイク糖タンパク質、および／またはヌクレオカプシドおよび／または構造タンパク質Ｓ１、および／または構造タンパク質Ｍ、および／または構造タンパク質Ｎ（Ｗｅｉｓｓ，  Ｓ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｎａｖａｓ−Ｍａｒｔｉｎ，  Ｓ．  （２００５）：  Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．    Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，  ６９：６３５−６６４．）をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適にはいずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１９３】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、鳥インフルエンザ（Ｈ５Ｎ１としても知られる）である場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適には、赤血球凝集素（Ｗｏｎｇ，  Ｓ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｙｕｅｎ，  Ｋ．Ｙ．  （２００６）：  Ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．    Ｃｈｅｓｔ，  １２９：１５６−１６８．；  Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，  Ｉ．，  Ｂｕｇａｒｉｎｉ，  Ｒ．，  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，  Ｋ．Ｇ．，  Ｐｏｄｄａ，  Ａ．，  Ｗｏｏｄ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｚａｍｂｏｎ，  Ｍ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｋａｔｚ，  Ｊ．Ｍ．  （２００５）：  Ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ａｎｄ  ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｄｕｃｋ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／９７  （Ｈ５Ｎ３）  ｖａｃｃｉｎｅ：  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  １９１：１２１０−１２１５．；  Ｔｒｅａｎｏｒ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，  Ｂ．Ｅ．，  Ｍａｓｓｅｏｕｄ，  Ｆ．，  Ｈｕ−Ｐｒｉｍｍｅｒ，  Ｊ．，  Ｂａｔｔａｇｌｉａ，  Ｒ．，  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，  Ｄ．，  Ｗｏｌｆｆ，  Ｍ．，  Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ，  Ｇ．，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｄｅｒ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｋａｔｚ，  Ｊ．Ｍ．  （２００１）：  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｈ５  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．    Ｖａｃｃｉｎｅ，  １９：１７３２−１７３７．）をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適にはいずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１９４】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、エボラ、マールブルグまたはいずれかのフィロウイルス科である場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適には、ＶＰ２４、および／またはＶＰ３０、および／またはＶＰ３５、および／またはＶＰ４０および／またはｓＧＰ、および／または糖タンパク質、および／または核タンパク質（Ｈａｒｔ，  Ｍ．Ｋ．  （２００３）：  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｅｆｆｏｒｔｓ  ｆｏｒ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，  ３３：５８３−５９５．；  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｊ．Ａ．，  Ｂｏｓｉｏ，  Ｃ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｈａｒｔ，  Ｍ．Ｋ．  （２００１）：  Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ：  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ５８：１８２６−１８４１．）をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適にはいずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１９５】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、Ｂ型肝炎である場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適には、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）（Ｈａｎｋｅ，  Ｔ．  （２００６）：  Ｏｎ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ３６：８０６−８０９．；  Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，  Ｊ．Ｎ．  （２００６）：  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ：  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，  ｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｅｌｕｓｉｏｎｓ．    Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  １９：４５６−４５９．）、および／またはヌクレオカプシド（ＨＢｃ）（Ｍｉｃｈｅｌ，  Ｍ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｍａｎｃｉｎｉ−Ｂｏｕｒｇｉｎｅ，  Ｍ．  （２００５）：  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３４  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ１０８−Ｓ１１４．）をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適にはいずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１９６】
それに対してワクチン接種すべき疾患が、西ナイルウイルス、デング熱、黄熱病、またはいずれかのフラビウイルス科である場合、使用されるプラスミドＤＮＡは好適には、ウイルス−中和抗体のほとんどを誘発するタンパク質であるＥ−糖タンパク質（Ｓａｍｐａｔｈｋｕｍａｒ，  Ｐ．，  ”Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  Ｖｉｒｕｓ：  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，”  Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｓ  ７８：１１３７−１１４４  （２００３）；  Ｋｉｎｇ，  Ｎ．Ｊ．Ｃ．，  ”Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，”  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８５：３３−４２  （２００７）参照）をコードする遺伝子を含むものである。このＤＮＡによってコードされるタンパク質は免疫応答を誘発するための抗原として作用する。さらに、同複合体は好適にはいずれかのインターロイキン、好適にはインターロイキン２、および／またはインターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドを含む。
【０１９７】
これらの方法により調製した最終的な複合体のサイズは約５０から４００（ｎｍ）の間であり、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）３０００またはＭａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）  ＮＡＮＯ−ＺＳを用いる動的光散乱によって判定したゼータ電位が正のものである。このサイズは毛細血管床を効率的に通過し、標的ＡＰＣ細胞に到達するために十分に小さいものである。
【０１９８】
上記のように調製した複合体は、好適には予防または治療ワクチンとして使用される。予防のためには、上記のように調製したリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体ナノリポプレックスワクチンは、哺乳類、例えば、ウイルス性疾患に以前に曝露されていないヒトに静脈内注入される。静脈内注射は複合体を用いて０、４および８週目になされる。対象にワクチン接種するのに用いられる複合体は好適には１：１０：１２．５（ｍｇ／ｎｍｏｌ／ｍｇ）（ＤＮＡ：脂質：Ｔｆ）の比にて作られ、５−２１０％デキストロースまたはスクロースが賦形剤として用いられる；ＨｏＫＣが複合体の成分でない場合は０．３３ｕｇ：１０ｕｇ：１ｕｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ：ＤＮＡ）の比にて作られ、５−２０％デキストロースまたはスクロースが賦形剤として用いられる；および複合体がＨｏＫＣを含む場合は０．３ｍｇ：７ｎｍｏｌ：１ｍｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ−ＨｏＫＣ：ＤＮＡ）の比にて作られ、５％デキストロースまたはスクロースが用いられる。複合体中のＤＮＡの総量は、０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ／注射である。好適な量は０．１６４ｍｇ／ｋｇ／注射であり、これは対象の重量に基づいて７−１２ｍｇＤＮＡ／注射である。調製された複合体は２５０ｍｌ  ５％デキストロースバッグにｉ．ｖ．注入のために注入されるか、またはボーラスとして、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内  （ＩＬ）、エアロゾル、経皮的、経口、内視鏡下、局所、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放インプラント、または皮下投与、あるいは浸透圧または機械的ポンプを用いる投与を介して注入される。
【０１９９】
治療用途のためには、上記のように調製したリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体ナノリポプレックスワクチンは、哺乳類、例えば、ウイルス性疾患（例えば、Ｂ型肝炎）に慢性的に感染した、または急性にウイルス性疾患（例えば、エボラ、ＳＡＲＳ、Ｈ５Ｎ１、天然痘、西ナイルウイルス）に曝露されたヒトに注入される。予防用途についてのものと同じ範囲の量のＤＮＡを含む複合体は、２５０ｍｌの５％デキストロース溶液中でｉ．ｖ．送達されるか、またはボーラスとして、０、４および８週目に３回、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル、経皮的、経口、内視鏡下、局所、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放インプラント、または皮下  投与によって、あるいは浸透圧または機械的ポンプを用いる投与を介して送達される。
【０２００】
実施例６
化学的結合によって調製された２つのナノ免疫リポソーム複合体の共注射によるヒトにおけるウイルス抗原に対する免疫応答の誘発
本発明はまた、ヒト（ならびにその他の哺乳類および動物）においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、該方法は、個体にウイルスタンパク質およびインターロイキンをコードする核酸分子、例えば、１以上のインターロイキンをコードする抗原遺伝子として作用するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む１以上のプラスミドを含むリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を投与することを含む。リポソームの表面に直接的に化学的に結合した様々なターゲティング薬剤を含む複合体は実施例４において記載のように調製される。
【０２０１】
抗原として作用するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を担持するプラスミドＤＮＡは実施例４に記載のものと同じである。例えば、インターロイキン２、インターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを含む別々のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体は、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を担持するプラスミドＤＮＡについて用いられたものと同じ手順および比を用いて調製される。
【０２０２】
上記のように調製した最終的な複合体のサイズは約５０から５００（ｎｍ）の間であり、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）３０００またはＭａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）  ＮＡＮＯ−ＺＳを用いる動的光散乱によって判定したゼータ電位が正のものである。このサイズは毛細血管床を効率的に通過し、標的ＡＰＣ細胞に到達するために十分に小さいものである。
【０２０３】
上記のように調製した複合体は、予防または治療ワクチンとして使用される。ワクチンとして使用するために、２つの複合体はそれぞれの複合体中のプラスミドＤＮＡインサートのモル比を反映する複合体：複合体の比にて混合されて一緒にされる。したがって、２つの複合体の比は、０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む複合体の量、対、１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含む複合体の量；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む複合体の量、対、０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含む複合体の量である。例えば、１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む複合体の量、対、１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含む複合体の量の比が用いられる。ウイルスタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを含む複合体がインターロイキンをコードするプラスミドＤＮＡを含む複合体に添加され、溶液が穏やかに１０回反転されるかまたは２０−３０ＲＰＭで１分間回転されて、ヒト対象において使用するための最終的なワクチンが形成される。
【０２０４】
予防のためには、上記のように調製したリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体ナノリポプレックスワクチンは、哺乳類、例えば、ウイルス性疾患に以前に曝露されていないヒトに静脈内注入される。注射は複合体を用いて０、４および８週目になされる。対象に投与されるワクチンを形成するのに用いられるそれぞれの複合体（ウイルス遺伝子を含むものおよびインターロイキン遺伝子を含むもの）は好適には０．３３ｕｇ：１０ｕｇ：１ｕｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ：ＤＮＡ）の比にて作られ、５％デキストロースが賦形剤として用いられる。ワクチン中のＤＮＡの総量は、０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ／注射である。好適な量は０．１６４ｍｇ／ｋｇ／注射であり、これは対象の重量に基づいて７−１２ｍｇ  ＤＮＡ／注射である。調製された複合体は２５０ｍｌ  ５％デキストロースバッグにｉ．ｖ．注入のために注入されるか、またはボーラスとして、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル、経皮的、経口、内視鏡下、局所、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放インプラント、または皮下投与、あるいは浸透圧または機械的ポンプを用いる投与を介して注入される。
【０２０５】
治療用途のためには、上記のように調製したリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体ナノリポプレックスワクチンは、哺乳類、例えば、ウイルス性疾患（例えば、Ｂ型肝炎）に慢性的に感染した、または急性にウイルス性疾患（例えば、エボラ、ＳＡＲＳ、Ｈ５Ｎ１、天然痘、西ナイルウイルス）に曝露されたヒトに注入される。予防用途についてのものと同じ範囲の量のＤＮＡを含む調製された複合体は、２５０ｍｌの５％デキストロース溶液中でｉ．ｖ．送達されるか、またはボーラスとして、０、４および８週目に３回、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル、経皮的、経口、内視鏡下、局所、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放インプラント、または皮下投与によって、あるいは浸透圧または機械的ポンプを用いる投与を介して送達される。
【０２０６】
実施例７
単純な混合によって調製された２つのナノ免疫リポソーム複合体の共注射によるヒトにおけるウイルス抗原に対する免疫応答の誘発
本発明はまた、個体に、ウイルスタンパク質およびインターロイキンをコードする核酸分子、例えば、１以上のインターロイキンをコードする抗原遺伝子として作用するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む１以上のプラスミドを含むリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を同時投与することを含む、ヒトにおけるウイルス抗原に対する免疫応答の誘発方法も提供する。リポソームの表面（ＨｏＫＣペプチドを有するかまたは有さない）に化学的に結合していないが直接的に複合体化した様々なリガンドを含む複合体は実施例５に記載のように調製される。抗原として作用するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を担持するプラスミドＤＮＡは、実施例５に記載のものと同一である。いずれかのインターロイキン、例えば、インターロイキン２、インターロイキン１２および／またはインターロイキン１５をコードする遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを含む別々のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体は、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子を担持するプラスミドＤＮＡに用いられたものと同一の手順および比を用いて調製される。
【０２０７】
上記のように調製した最終的な複合体のサイズは約５０から４００（ｎｍ）の間であり、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）３０００またはＭａｌｖｅｒｎ  ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ（登録商標）  ＮＡＮＯ−ＺＳを用いる動的光散乱によって判定したゼータ電位が正のものである。このサイズは毛細血管床を効率的に通過し、標的ＡＰＣ細胞に到達するために十分に小さいものである。
【０２０８】
ワクチンとして使用するために、２つの複合体はそれぞれの複合体中のプラスミドＤＮＡインサートのモル比を反映する複合体：複合体の比にて混合されて一緒にされる。したがって、２つの複合体の比は、０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む複合体の量、対、１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含む複合体の量；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む複合体の量、対、０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含む複合体の量である。例えば、１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む複合体の量、対、１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含む複合体の量の比が用いられる。ウイルスタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを含む複合体がインターロイキンをコードするプラスミドＤＮＡを含む複合体に添加され、溶液が穏やかに１０回反転されるかまたは２０−３０ＲＰＭで１分間回転されて、ヒト対象において使用するための最終的なワクチンが形成される。
【０２０９】
上記のように調製した複合体は予防または治療ワクチンとして用いられる。予防のためには、上記のように調製したリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体ナノリポプレックスワクチンは、哺乳類、例えば、ウイルス性疾患に以前に曝露されていないヒトに注入される。静脈内注射は複合体を用いて０、４および８週目になされる。対象にワクチン接種するのに用いられる複合体は好適には１：１０：１２．５（ｍｇ／ｎｍｏｌ／ｍｇ）（ＤＮＡ：脂質：Ｔｆ）の比にて作られ、５−２０％デキストロースまたはスクロースが賦形剤として用いられる；ＨｏＫＣが複合体の成分ではない場合０．３３ｕｇ：１０ｕｇ：１ｕｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ：ＤＮＡ）の比にて作られ、５−２０％デキストロースまたはスクロースが賦形剤として用いられ、複合体がＨｏＫＣを含む場合、０．３ｍｇ：７ｎｍｏｌ：１ｍｇ（ＴｆＲｓｃＦｖ：Ｌｉｐ−ＨｏＫＣ：ＤＮＡ）の比にて作られ５％デキストロースまたはスクロースが用いられる。複合体中のＤＮＡの総量は、０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ／注射である。好適な量は０．１６４ｍｇ／ｋｇ／注射であり、これは対象の重量に基づいて７−１２ｍｇ  ＤＮＡ／注射である。調製された複合体は２５０ｍｌ  ５％デキストロースバッグにｉ．ｖ．注入のために注入されるか、またはボーラスとして、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル、経皮的、経口、内視鏡下、局所、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内（例えば、肝臓内）、徐放インプラント、または皮下投与、あるいは浸透圧または機械的ポンプを用いる投与を介して注入される。
【０２１０】
治療用途のためには、上記のように調製したリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体ナノリポプレックスワクチンは、哺乳類、例えば、ウイルス性疾患（例えば、Ｂ型肝炎）に慢性的に感染した、または急性にウイルス性疾患（例えば、エボラ、ＳＡＲＳ、Ｈ５Ｎ１、天然痘、西ナイルウイルス）に曝露されたヒトに注入される。予防用途についてのものと同じ範囲の量のＤＮＡを含む複合体は、２５０ｍｌの５％デキストロース溶液中でｉ．ｖ．送達されるか、またはボーラスとして、０、４および８週目に３回、静脈内（ＩＶ）、腫瘍内（ＩＴ）、病巣内（ＩＬ）、エアロゾル、経皮的、経口、内視鏡下、局所、筋肉内（ＩＭ）、皮内（ＩＤ）、眼内（ＩＯ）、腹腔内（ＩＰ）、経皮（ＴＤ）、鼻腔内（ＩＮ）、脳内（ＩＣ）、臓器内  （例えば、肝臓内）、徐放インプラント、または皮下投与によって、あるいは浸透圧または機械的ポンプを用いる投与を介して送達される。
【０２１１】
本明細書において言及するすべての刊行物、特許および特許出願が個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別に引用により含まれて示されているのと同じ程度に、引用により本明細書に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月22日(2014.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発するための医薬の製造におけるリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体の使用、ここで、該カチオン性リポソーム複合体は以下を含む：
（ａ）カチオン性リポソーム；
（ｂ）カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化したリガンド；
（ｃ）カチオン性リポソームに結合した１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および
（ｄ）カチオン性リポソームに結合した１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項２】
該ウイルス抗原が、インフルエンザウイルス、ＨＩＶウイルス、ＳＡＲＳウイルス、鳥インフルエンザウイルス、エボラウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび天然痘ウイルスからなる群から選択されるウイルスからのものであり、該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択され、該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される、請求項１の使用。
【請求項３】
該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として投与される請求項１の使用。
【請求項４】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１の使用。
【請求項５】
該リガンドが一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントであるか、または抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である、請求項１の使用。
【請求項６】
該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項１の使用。
【請求項７】
哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防するための医薬の製造におけるカチオン性リポソーム複合体の使用、ここで、該カチオン性リポソーム複合体は以下を含む：
（ａ）カチオン性リポソーム；
（ｂ）カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化したリガンド；
（ｃ）カチオン性リポソームに結合した１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および、
（ｄ）カチオン性リポソームに結合した１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項８】
該ウイルス性疾患が、インフルエンザ、ＨＩＶ、ＳＡＲＳ、鳥インフルエンザ、エボラ、Ｂ型肝炎および天然痘からなる群から選択され、該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択され、該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項７の使用。
【請求項９】
該複合体が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として投与される請求項７の使用。
【請求項１０】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項７の使用。
【請求項１１】
該リガンドが一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントであるか、または抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項７の使用。
【請求項１２】
該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項７の使用。
【請求項１３】
哺乳類の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に１以上のウイルスタンパク質をコードする核酸分子および／または１以上のインターロイキンを送達するための、抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）−標的化カチオン性免疫リポソーム複合体を含む組成物、ここで、該抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）−標的化カチオン性免疫リポソーム複合体は、カチオン性リポソーム、ＴｆＲｓｃＦｖ、および１以上の活性薬剤を含み、ＴｆＲｓｃＦｖはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している。
【請求項１４】
該核酸分子が１以上のウイルスタンパク質と１以上のインターロイキンとの両方をコードする請求項１３の組成物。
【請求項１５】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択され、該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項１３の組成物。
【請求項１６】
該組成物が、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、病巣内投与、皮内投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、経皮的投与、エアロゾル投与、鼻腔内投与、臓器内投与、脳内投与、局所投与、皮下投与、内視鏡下投与、徐放インプラントおよび浸透圧または機械的ポンプを介する投与からなる群から選択される経路を介して、ボーラスとしてまたは注入として肝臓、脾臓、リンパ節、腸および／または呼吸器に位置するＡＰＣに投与される請求項１３の組成物。
【請求項１７】
以下の方法によって調製されるリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体の、哺乳類においてウイルス抗原に対する免疫応答を誘発するための医薬の製造における使用：
（ａ）リガンドを調製する工程；
（ｂ）リガンドとカチオン性リポソームとを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソームを形成させる工程、ここで、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している；および
（ｃ）リガンド−標的化カチオン性リポソームを以下と混合してリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程：
１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および、
１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項１８】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項１７の使用。
【請求項１９】
該リガンドがカルボキシ末端にてシステイン部分を含む一本鎖Ｆｖフラグメントであるか、または抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項１８の使用。
【請求項２０】
該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームと結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項１７の使用。
【請求項２１】
該カチオン性リポソームが１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項１７の使用。
【請求項２２】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが１：１から１：１００（ｗ：ｗ）、または１：１０から１：５０（ｗ：ｗ）、または１：２０から１：４０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて混合される請求項１７の使用。
【請求項２３】
該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロール、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンとの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物を含む請求項１７の使用。
【請求項２４】
該核酸分子が、０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在するかまたは、１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項１７の使用。
【請求項２５】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、０．５：１から１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）、または１：５から１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の間の重量比、または１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の重量比にて存在する請求項１７の使用。
【請求項２６】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択され、該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項１７の使用。
【請求項２７】
以下の方法によって調製されるリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体の、哺乳類におけるウイルス性疾患を治療または予防するための医薬の製造における使用：
（ａ）リガンドを調製する工程；
（ｂ）リガンドとカチオン性リポソームとを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソームを形成させる工程、ここで、リガンドはカチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している；および
（ｃ）リガンド−標的化カチオン性リポソームと以下とを混合してリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体を形成させる工程：
１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子；および、
１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子。
【請求項２８】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項２７の使用。
【請求項２９】
該リガンドがカルボキシ末端にシステイン部分を含む一本鎖Ｆｖフラグメントであるか、または抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項２７の使用。
【請求項３０】
該リガンド−標的化カチオン性リポソームが、該カチオン性リポソームに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項２７の使用。
【請求項３１】
該カチオン性リポソームが１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項２７の使用。
【請求項３２】
該リガンドと該カチオン性リポソームとが、１：１から１：１００（ｗ：ｗ）または１：１０から１：５０（ｗ：ｗ）または１：２０から１：４０（ｗ：ｗ）の範囲の比にて存在する請求項２７の使用。
【請求項３３】
該カチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロール、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンとの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物を含む請求項２７の使用。
【請求項３４】
該核酸分子が、０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比、または１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項２７の使用。
【請求項３５】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームが、０．５：１から１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）、または１：５から１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）、の間の重量比、または１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の重量比にて存在する請求項２７の使用。
【請求項３６】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択され、該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項２７の使用。
【請求項３７】
以下を含む医薬組成物：
カチオン性リポソーム、リガンドおよび１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子を含む第一のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している第一のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体；および、
カチオン性リポソーム、リガンドおよび１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子を含む第二のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体であって、該リガンドが該カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している第二のリガンド−標的化カチオン性リポソーム複合体。
【請求項３８】
該核酸分子が該カチオン性リポソーム内にカプセル封入されているか、または該カチオン性リポソームの内側または外側単層に結合している請求項３７の医薬組成物。
【請求項３９】
該リガンドが、トランスフェリン、ガラクトース、Ｌ−３７ｐＡ、抗体および抗体フラグメントからなる群から選択される請求項３７の医薬組成物。
【請求項４０】
該リガンドが一本鎖Ｆｖフラグメントであるか、または抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）である請求項３７の医薬組成物。
【請求項４１】
該第一および第二のカチオン性リポソームが１以上のカチオン性脂質と１以上の中性またはヘルパー脂質との混合物を含む請求項３７の医薬組成物。
【請求項４２】
該カチオン性リポソームのそれぞれの該抗体または抗体フラグメントが１：１から１：１００（ｗ：ｗ）、または１：１０から１：５０（ｗ：ｗ）、または１：２０から１：４０（ｗ：ｗ）、の範囲の比にて存在する請求項３７の医薬組成物。
【請求項４３】
該第一および第二のカチオン性リポソームが、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロール、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェートとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンとの混合物；またはジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよび／またはコレステロールとの混合物を含む請求項３７の医薬組成物。
【請求項４４】
該核酸分子が、０．１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、１０モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子；から、１０モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、０．１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比、または１モルの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、対、１モルの１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、のモル比にて存在する請求項３７の医薬組成物。
【請求項４５】
該１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の核酸分子、該１以上のインターロイキンをコードする１以上の核酸分子、および該カチオン性リポソームがそれぞれ、０．５：１から１：４０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）、または１：５から１：２０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）、の間の重量比、または１：１０（μｇ全核酸：μｇリポソーム）の重量比にて該第一および第二のカチオン性リポソーム中に存在する請求項３７の医薬組成物。
【請求項４６】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択され、該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項３７の医薬組成物。
【請求項４７】
該複合体のそれぞれに結合したＫ［Ｋ（Ｈ）ＫＫＫ］５−Ｋ（Ｈ）ＫＫＣ（ＨｏＫＣ）（配列番号１）ペプチドを含むペプチドをさらに含む請求項３７の医薬組成物。
【請求項４８】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）と、カチオン性リポソーム、ＴｆＲｓｃＦｖ、および１以上の核酸分子を含む抗−トランスフェリン受容体一本鎖Ｆｖ（ＴｆＲｓｃＦｖ）−標的化カチオン性免疫リポソーム複合体とを接触させることを含む、哺乳類のＡＰＣに１以上の核酸分子をインビトロで送達する方法であって、該ＴｆＲｓｃＦｖが該カチオン性リポソームに化学的に結合していないが直接的に複合体化している方法。
【請求項４９】
該核酸分子が１以上のウイルスタンパク質、１以上のインターロイキン、または１以上のウイルスタンパク質と１以上のインターロイキンとの両方をコードする請求項４８の方法。
【請求項５０】
該１以上のウイルスタンパク質が、ＨＩＶウイルスタンパク質、エボラウイルスタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、ＳＡＲＳウイルスタンパク質、鳥インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスタンパク質および天然痘ウイルスタンパク質からなる群から選択され、該１以上のインターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８およびＩＬ−２３からなる群から選択される請求項４９の方法。
【外国語明細書】
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【配列表】
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