(57)【要約】【課題】外来の不飽和化酵素遺伝子を脂質生産微生物に導入することで、常温でも高度不飽和脂肪酸を生産する微生物を提供し、当該微生物を用いて高度不飽和脂肪酸を提供する。【解決手段】脂質生産糸状菌であるモルティエレラ・アルピナ株に、糸状菌サプロレグニア・ディクリナ由来のΔ17不飽和化酵素遺伝子を導入することで、常温でエイコサペンタエン酸を生産する菌株を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する脂質生産微生物であって、外来のΔ17不飽和化酵素遺伝子が導入された、常温で炭素数20のω3高度不飽和脂肪酸を生産し得る脂質生産微生物。
【請求項２】
内在のω3不飽和化酵素活性が欠損した、請求項１に記載の脂質生産微生物。
【請求項３】
微生物が、モルティエレラ（Mortierella）属に由来する、請求項１又は２に記載の脂質生産微生物。
【請求項４】
微生物が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）に由来する、請求項３に記載の脂質生産微生物。
【請求項５】
微生物が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ST 1358である、請求項４に記載の脂質生産微生物。
【請求項６】
Δ17不飽和化酵素遺伝子がサプロレグニア（Saprolegnia）属又はフィトフトラ（Phytophthora）属に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の脂質生産微生物。
【請求項７】
Δ17不飽和化酵素遺伝子がサプロレグニア・ディクリナ（Saprolegnia diclina）に由来する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の脂質生産微生物。
【請求項８】
Δ17不飽和化酵素遺伝子のコドンの一部が、宿主微生物で使用頻度の高いコドンに置換されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の脂質生産微生物。
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの酵素タンパク質を含む請求項８に記載の脂質生産微生物。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質、あるいは、
（ｅ）配列番号２に示される塩基配列からなる核酸と、80％以上の塩基配列同一性を示す塩基配列によってコードされ、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質
【請求項１０】
Δ17不飽和化酵素遺伝子が、宿主微生物細胞内で恒常的に活性なプロモーターの制御下にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂質生産微生物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の微生物を常温で培養し、該培養物から炭素数20のω3高度不飽和脂肪酸を生産する、高度不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項１２】
ω3高度不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質をコードする核酸
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなる核酸と、80％以上の塩基配列同一性を示す塩基配列を含み、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質をコードする核酸
（但し、配列番号１に示される塩基配列を含む核酸を除く）。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質生産微生物を用いた高度不飽和脂肪酸の生産方法に関する。詳細には、脂質生産糸状菌に外来の不飽和化酵素遺伝子を導入し、高度不飽和脂肪酸、中でも、エイコサペンタエン酸を常温で生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高度不飽和脂肪酸とは、炭素鎖長が18以上で不飽和結合数が2以上の長鎖脂肪酸であり、ω6脂肪酸のリノール酸（LA、18：2n-6）、γ-リノレン酸（GLA、18：3n-6）、アラキドン酸（ARA、20：4n-6）、ω3脂肪酸のα-リノレン酸（ALA、18：3n-3）、エイコサペンタエン酸（EPA、20：5n-3）、ドコサヘキサエン酸等が存在する。
エイコサペンタエン酸（以下、EPAともいう）は、エイコサイド（プロスタグランジン、トロンボキサン-3、ロイコトリエン-5）の前駆体であり、栄養学的に必須の脂肪酸である。EPAは、血小板凝集阻害作用、血中中性脂肪低下作用、抗動脈硬化作用、血液粘度低下作用、血圧降下作用、抗炎症作用、抗腫瘍作用等の生理作用を有し、医薬品、食品、化粧品、飼料等の様々な分野に使用される非常に有用な物質である。
【０００３】
EPAは主にイワシ、タラ等の魚類、シュワネラ・リビングストネンシス（Shewanella livingstonensis）等の海洋性低温細菌、ラビリンチュラ綱（Labyrinthulomycetes）等の藻類に多く含まれており、これらから抽出・精製する方法が知られている。しかしながら、例えば、魚油中のEPA含量は低い上に、抽出・精製法によっては魚臭が残る、心疾患の原因とされるエルカ酸の含量が多い等の問題が存在する。
【０００４】
一方、モルティエレラ（Mortierella）属に属する糸状菌がEPAを生産することも知られている（非特許文献１）。そして、モルティエレラ（Mortierella）属由来の菌を常用の培地を用いて培養してEPAを生産する方法（特許文献１）、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina、以下、「M. alpina」ともいう）寄託株を用いてEPAを生産する方法（特許文献２）、M. alpinaから単離したω3脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を酵母に導入し、EPAを始めとする高度不飽和脂肪酸を生産する方法（特許文献３）等が知られているが、いずれの方法も、約20 ℃以下の低温条件下でしかEPAを発現しないため、脂質生産性がきわめて低く、工業化にはいたっていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−１４６９７号公報
【特許文献２】特開平１１−２４３９８１号公報
【特許文献３】特開２００６−０５５１０４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Appl Microbiol Biotechnol., (1989), vol.32, p.1-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、高い脂質生産効率が得られる常温下でもEPAを生産する脂質生産微生物を提供し、当該脂質生産微生物を用いてEPAの工業的生産手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、糸状菌サプロレグニア・ディクリナ（Saprolegnia diclina、以下、「S. diclina」ともいう）由来のΔ17不飽和化酵素が、アラキドン酸やジホモ−γ−リノレン酸等の炭素数20の高度不飽和脂肪酸に対してω3不飽和化酵素と同様の活性を有し、且つこれら炭素鎖20の高度不飽和脂肪酸に対して基質特異性が高いことに着目し、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）のω3不飽和化酵素活性低下株（以下、ω3不飽和化酵素欠損変異株と記載）に、Δ17不飽和化酵素遺伝子を導入した。驚くべきことに、得られた形質転換体は、低温（12 ℃）でのEPAの生産効率が増加したばかりか、28 ℃でもEPAを生産することができることを見出した。
【０００９】
即ち、本発明は下記のとおりである：
［１］ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する脂質生産微生物であって、外来のΔ17不飽和化酵素遺伝子が導入された、常温で炭素数20のω3高度不飽和脂肪酸を生産し得る脂質生産微生物。
［２］内在のω3不飽和化酵素活性が欠損した、［１］に記載の脂質生産微生物。
［３］微生物が、モルティエレラ（Mortierella）属に属する［１］又は［２］に記載の脂質生産微生物。
［４］微生物が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）に由来する、［３］に記載の脂質生産微生物。
［５］微生物が、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）ST 1358である、［４］に記載の脂質生産微生物。
［６］Δ17不飽和化酵素遺伝子がサプロレグニア（Saprolegnia）又はフィトフトラ（Phytophthora）属に由来する［１］〜［５］のいずれか１項に記載の脂質生産微生物。
［７］Δ17不飽和化酵素遺伝子がサプロレグニア・ディクリナ（Saprolegnia diclina）に由来する［１］〜［６］のいずれか１項に記載の脂質生産微生物。
［８］Δ17不飽和化酵素遺伝子のコドンの一部が、宿主微生物で使用頻度の高いコドンに置換されている、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の脂質生産微生物。
［９］以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの酵素タンパク質を含む［８］に記載の脂質生産微生物。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質
（ｃ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質、あるいは、
（ｅ）配列番号２に示される塩基配列からなる核酸と、80％以上の塩基配列同一性を示す塩基配列によってコードされ、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質
［１０］Δ17不飽和化酵素遺伝子が、宿主微生物細胞内で恒常的に活性なプロモーターの制御下にある、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の脂質生産微生物。
［１１］［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の微生物を常温で培養し、該培養物から炭素数20のω3高度不飽和脂肪酸を生産する、高度不飽和脂肪酸の生産方法。
［１２］ω3高度不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸である、［１１］に記載の方法。
［１３］以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質をコードする核酸
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなる核酸と、80％以上の塩基配列同一性を示す塩基配列を含み、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質をコードする核酸
（但し、配列番号１に示される塩基配列を含む核酸を除く）。
［１４］［１３］に記載の核酸を含むベクター。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、モルティエレラ（Mortierella）属に属し、ω3不飽和化酵素欠損変異株であるM. alpina ST1358に、外来遺伝子であるS. diclina由来のΔ17不飽和化酵素遺伝子を導入すると、当該変異株内でのEPAの発現効率が増加したばかりか、常温でEPAを生産することができることを明らかにした。EPAは、医薬品、食品、化粧品、飼料等の様々な分野で使用される重要な高度不飽和脂肪酸であり、EPAの工業規模での生産に適用し得る本発明は、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】M. alpina 1S-4の高度不飽和脂肪酸の生合成経路を示す。
【図２】本発明で構築した形質転換バイナリーベクターの構造を示す。
【図３】M. alpina ST1358 にΔ17不飽和化酵素遺伝子を導入した形質転換体を、12 ℃又は28 ℃で1週間培養後、脂肪酸を抽出し、ガスクロマトグラフィーで分析した脂肪酸組成（％）の結果を示す。
【図４】本発明で得られた形質転換体を28 ℃で3、7、10、14日間培養して脂肪酸を抽出し、ガスクロマトグラフィーで分析した脂肪酸組成（％）及び脂肪酸生成量（mg/mL）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の詳細を説明する。
【００１３】
本発明のエイコサペンタエン酸（EPA）の生産に使用される微生物（以下、本発明の微生物ともいう）は、ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する脂質生産菌（oleaginous microorganisms）をいう。「ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路」とは、リノール酸から、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸等のω6系の高度不飽和脂肪酸を生産する代謝経路をいう（図１参照）。尚、「高度不飽和脂肪酸」とは、炭素鎖長が18以上で不飽和結合数が2以上の長鎖脂肪酸をいう。
【００１４】
本発明の微生物としては、例えば、モルティエレラ（Mortierella）属、ムコール（Mucor）属、ウンベロプシス（Umbelopsis）属等の糸状菌が挙げられる。好ましくは、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）、モルティエレラ クラミドスポラ（Mortierella chlamydospora）、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella hygrophila）、モルティエレラ・エピガマ（Mortierella epigama）、モルティエレラ・アクロトナ（Mortierella acrotona）、モルティエレラ・ミヌティシマ（Mortierella minutissima）、モルティエレラ・リギコラ（Mortierella lignicola）、ウンベロプシス・ナナ（Umbelopsis nana）、ウンベロプシス・イサベリナ（Umbelopsis isabellina）等が挙げられるが、ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する限り、これらに限定されない。
【００１５】
本発明において、好ましく使用されるモルティエレラ（Mortierella）属微生物、中でも、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）は、生来的にEPA生産能を有する、即ち、ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路の酵素群に加えて、さらにω3不飽和化酵素を有している。当該微生物ω3不飽和化酵素は低温下でしか発現しないため、常温下でのEPAの発酵生産を目的とする本発明においては、野生株を用いてもよいが、ω3不飽和化酵素を欠損した株を使用することもできる。好ましくは、M. alpina 1S-4のω3不飽和化酵素を欠損した株である、M. alpina ST1358が挙げられる。M. alpina ST1358は、菌体内でのアラキドン酸の蓄積が高い公知のM. alpina 1S-4変異株である（Biosci. Biotechnol. Biochem., (2010), vol.74, p.908-917）。本発明の微生物には、さらに、これらの変異株であって、EPA生産能を有するものも含まれる。
【００１６】
本発明は、後述の実施例に記載するように、モルティエレラ（Mortierella）属に属する菌株に、炭素鎖20の高度不飽和脂肪酸に対して高い基質特異性を示す外来のΔ17不飽和化酵素遺伝子を導入する。それにより、アラキドン酸をエイコサペンタエン酸へ変換させ、菌体中のエイコサペンタエン酸の蓄積を高めることができる。図１にM. alpina 1S-4の高度不飽和脂肪酸の生合成経路を示す。
【００１７】
ω3不飽和化酵素を欠損するとは、ω3不飽和化酵素が本来有する正常な機能が十分に発揮できない状態をいい、例えば、ω3不飽和化酵素が全く発現していない状態、ω3不飽和化酵素が本来有する正常な機能が発揮できない程度にその発現量が低下している状態、ω3不飽和化酵素遺伝子産物の機能が完全に喪失した状態、または遺伝子変異等によりω3不飽和化酵素が本来有する正常な機能が発揮できない程度にω3不飽和化酵素遺伝子産物の機能が低下した状態等をいう。
【００１８】
上述の欠損を行う方法としては、常法、例えば、メタンスルホン酸エチル (EMS)、メタンスルホン酸メチル (MMS)、N −メチル−N −ニトロ−N −ニトロソグアニジン（J. Gen. Microbiol., (1992), vol.138, p.997-1002）、5-ブロモデオキシウリジン (BrdU)、シスプラチン、マイトマイシンC 等の変異原処理、又はRNAi 法（Appl. Environ. Microbiol., (2005), vol. 71, p.5124-5128）等が挙げられる。あるいは、放射線照射、紫外線照射又は高熱処理等により突然変異を誘発させる方法等が挙げられるが、上述の性質を有する変異が生じる限り、これらの方法に限定されない。
【００１９】
本発明において「外来の」とは内在性ではなく、異種由来のものをいう。
Δ17不飽和化酵素活性とは、分子のカルボキシル末端から数えて17番目と18番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化する活性をいう。当該酵素が炭素数20の高度不飽和脂肪酸に作用すれば、メチル末端から見るとω3位が不飽和化されることになるので、ω3不飽和化酵素の機能を代替し得る。例えば、アラキドン酸からエイコサペンタエン酸への変換活性、ジホモ−γ−リノレン酸からエイコサテトラエン酸への変換活性をいう。本発明においては、炭素鎖20の高度不飽和脂肪酸に対して優先的に作用するΔ17不飽和化酵素であれば限定されない。例えば、サプロレグニア（Saprolegnia）属由来、又はフィトフトラ（Phytophthora）属由来のΔ17不飽和化酵素が挙げられる。これらの配列は、公知であり（例えば、Appl Microbiol Biotechnol. 2012 Epub）、適宜使用することができる。また、公知の配列を利用して、一般的なスクリーニング方法で、炭素鎖20の高度不飽和脂肪酸に対して基質特異性が高いΔ17不飽和化酵素遺伝子を得ることができる。本発明において、より好ましくは、サプロレグニア・ディクリナ（Saprolegnia diclina）由来のΔ17不飽和化酵素遺伝子であり、配列番号１にその塩基配列を示す。
【００２０】
本発明で使用する微生物にΔ17不飽和化酵素遺伝子を導入する際には、宿主となる微生物のコドン使用頻度を参考に、配列の至適化を行うことが望ましい。例えば、モルティエレラ（Mortierella）属に、Δ17不飽和化酵素遺伝子を導入する際には、モルティエレラ（Mortierella）属のコドン使用頻度（http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=64518）を参考に至適化を行う。
【００２１】
より具体的には、本発明で使用するΔ17不飽和化酵素としては、以下のものが挙げられる。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失及び／又は置換及び／又は挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質
（ｃ）配列番号３のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して90％以上のアミノ酸同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質
（ｄ）配列番号２に示される塩基配列の相補鎖配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされ、かつΔ17不飽和化酵素活性を有する酵素タンパク質、あるいは、
（ｅ）配列番号２に示される塩基配列からなる核酸と、80％以上の塩基配列同一性を示す塩基配列によってコードされ、かつΔ17不飽和化素活性を有する酵素タンパク質
上記（ｄ）又は（ｅ）の酵素タンパク質をコードする核酸は、モルティエレラ（Mortierella）属において使用頻度の高いコドンが維持されていることが望ましい。
【００２２】
上述（ｂ）に関し、より具体的には、（i）配列番号３に示されるアミノ酸配列中の1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号３に示されるアミノ酸配列に1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号３に示されるアミノ酸配列に1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号３に示されるアミノ酸配列中の1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜数（5、4、3もしくは2）個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、又は（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含むタンパク質が挙げられる。性質の似たアミノ酸（例えば、グリシンとアラニン、バリンとロイシンとイソロイシン、セリンとトレオニン、アスパラギン酸とグルタミン酸、アスパラギンとグルタミン、リシンとアルギニン、システインとメチオニン、フェニルアラニンとチロシン等）同士の置換等であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。
上述のようにアミノ酸が欠失、置換又は挿入されている場合、その欠失、置換、挿入の位置は、上述の酵素活性が保持される限り、特に限定されない。
【００２３】
上述（ｄ）において「ストリンジェントな条件」とは、同一性が高いヌクレオチド配列同士、例えば70、80、90、95又は99％以上の同一性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いヌクレオチド配列同士がハイブリダイズしない条件、具体的には通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である60 ℃、1 x SSC、0.1％ SDS、好ましくは、0.1 x SSC、0.1％ SDS、さらに好ましくは、68 ℃、0.1 x SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度及び温度で、1回、より好ましくは2〜3回洗浄する条件等が挙げられる。
【００２４】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]、 FASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。
【００２５】
さらに、本発明には上述の酵素タンパク質をコードする核酸、該核酸を含むベクターも含まれる。ベクターは、クローニング、遺伝子発現等目的に応じて、適宜選択して使用することができる。
プロモーターとして、モルティエレラ（Mortierella）属の場合、ヒストンプロモーター、より好ましくはHis 4.1プロモーター(Appl. Environ. Microbiol. 2000, vol.66 no.11, p.4655-4661)、これらの配列を置換、欠失、付加等改良したプロモーター等が包含されるが、遺伝子を発現させることができれば、これらに限定されない。
【００２６】
ベクターとして、モルティエレラ（Mortierella）属の場合、pD4ベクター、pDura5ベクター(Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, vol.65, no.4, p.419-425)、pDXベクター(Curr Genet., 2009, vol.55 , no.3, p.349-356)等が挙げられるが、遺伝子を発現させることができれば、これらに限定されない。
発現ベクターには、プロモーター、転写終結シグナル、形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カルボキシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、リジン等のアミノ酸要求変異を相補する遺伝子等、ウラシル、アデニン等の核酸塩基要求性変異を相補する遺伝子等）も含むことができる。ウラシル要求株の場合、マーカー遺伝子として、オロチジン−5'−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ura3遺伝子）、又はオロチジル酸ピロホスホリラーゼ遺伝子（ura5遺伝子）を使用することができる。
【００２７】
本発明では、後述の実施例に記載するように、ウラシル要求性変異を相補する遺伝子を使用することができる。特に、モルティエレラ（Mortierella）属の菌では、ウラシル要求株の5-フルオロオロチン酸（5-FOA）耐性を指標に、スクリーニングを行うことができることが公知である。
そして、ベクターを構築するための試薬類、例えば制限酵素又はライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販品を適宜用いることができる。
【００２８】
本発明で構築した形質転換バイナリーベクターの構造を図２に示す。当該ベクターは、恒常的発現プロモーターであるヒストンプロモーターの下流にΔ17不飽和化酵素をコードする核酸を連結し、ターミネーターとして、sdhBターミネーター、形質転換体の選択マーカーとして、ura5遺伝子を有する。
【００２９】
ベクターを本発明の微生物に形質転換するには、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）法、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、等自体公知の方法を使用することができる。
【００３０】
モルティエレラ（Mortierella）属での形質転換法としては、後述の実施例に記載のアグロバクテリウムを介したATMT法（Appl. Environ. Microbiol., (2009), vol.75, p.5529-5535）を行うことができる。さらに、目的の形質を安定して保持する形質転換体を得ることができれば、ATMT法の改良法等を含み、これらに限定されない。
【００３１】
本発明の微生物は、液体培地又は固体培地に接種し培養することができる。例えば、菌類の場合、菌株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた前培養液を、前記培地に接種して培養することができる。  
培地の炭素源としてはグルコース、フルクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、コーンスターチ、グリセロール、マンニトール、脂質、アルカン、アルケン等が挙げられるが、これらに限定されない。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂ダイズ、綿実カス等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、並びに、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、大豆油、ココナッツ、コーン油等の脂質を添加してもよい。また、微量栄養源として、リン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩、又はビタミン等も適宜添加することができる。
【００３２】
これらの培地成分は微生物の生育を害しない濃度であれば特に制限されない。例えば、炭素源は0.1〜40重量％、好ましくは１〜25重量％、窒素源は0.01〜10重量％、好ましくは0.1〜10重量％の濃度とすることができる。
【００３３】
モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）又はその変異株を培養する場合には、後述のCzapek培地、Czapek-dox培地、グルコース・酵母エキス（以下、「GY」ともいう）培地、SC培地等を使用することができる。また、モルティエレラ（Mortierella）属の培地等について、公知の文献（例、WO98/29558号）を参考にすることもできる。
【００３４】
本発明の微生物は、至適生育温度で培養を行う。例えば、約5〜60 ℃、好ましくは約10〜50 ℃、より好ましくは約10〜40 ℃、さらに好ましくは約20〜40 ℃、最も好ましくは約20〜30 ℃で培養することができる。本発明の常温とは、約20〜40 ℃、より好ましくは、約20〜30 ℃をいう。
モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）又はその変異株を使用する場合、約10〜40 ℃、好ましくは約20〜40 ℃、より好ましくは約20〜30 ℃で培養することができる。
【００３５】
培養期間は、2〜20日間、好ましくは2〜14日間行う。培地のpHは4〜10、好ましくはpH 6〜9であり、培養は、通気撹拌培養、振盪培養又は静置培養を行う。また、モルティエレラ（Mortierella）属の培養法等について、公知の文献（例、特開平6-153970号公報）を参考にすることもできる。
【００３６】
培養終了後、培養液を遠心分離又はろ過等、常用の分離手段により菌体を得ることができる。例えば、菌体を洗浄後、凍結乾燥、風乾等により乾燥させる。乾燥菌体から、有機溶媒等公知の手法により脂質を抽出することができる。有機溶媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等、クロロホルム-メタノール混合液、tert-ブチルメチルエーテル-メタノール系等を使用することができる。また、これらの有機溶媒を組み合わせて使用することもできる。抽出物から減圧等で有機溶媒を留去することにより、目的の脂質を抽出することができる。
【００３７】
上述の方法に代え、湿菌体を用いて脂質の抽出を行うこともできる。上述の有機溶媒、メタノール、エタノール等の水に対して相溶性の溶媒等を使用することができる。その他の手法は上述と同様である。
【００３８】
脂質の中には、各種脂肪酸が含まれるため、直接分離することもできるが、低級アルコールとのエステル誘導体として分離することが好ましい。エステル誘導体は、炭素数、二重結合の数、位置の違い等に応じて分離されるため、容易に目的のエステル誘導体を分離することができる。エステル誘導体は、特にメチルエステル誘導体が好ましい。エステル化は、塩酸、硫酸、BF3等の酸触媒、あるいは、ナトリウムメトキシド、水酸化カリウム等の塩基触媒を含む低級アルコールを使用することができる。得られた該エステル誘導体は、さらに、カラムクロマトグラフィー、低温結晶化法、尿素付加分別法、等を単独又は組み合わせて、分離することができる。脂質の精製としては、脱ガム、脱酸、脱臭、脱色、カラム処理、分子蒸留、脱ドウ等一般的な方法を適宜行うことができる。
【００３９】
得られたエステル誘導体は、アルカリで加水分解した後、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出することができる。
【００４０】
工業的な規模での生産方法として、例えば、本願の微生物をタンク中で流加培養等を行い、フィルタープレス等でろ過し、菌体を回収して乾燥させる。乾燥後、ボールミル等で破砕し、有機溶媒で脂質を抽出することができる。また、モルティエレラ（Mortierella）属からの脂質の生産法について、公知の文献（例、特開2006-219528号公報）を参考にすることもできる。
【００４１】
本発明で得られるEPAをはじめとする高度不飽和脂肪酸は、医薬品、食品、化粧品、飼料等に使用することができる。
高度不飽和脂肪酸を含有する医薬の剤型としては、散在、顆粒剤、丸剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、粘付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。
【００４２】
製剤化のために用いることができる添加剤には、例えば大豆油、サフラー油、オリーブ油、胚芽油、ひまわり油、牛脂、イワシ油等の動植物性油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール等の多価アルコール、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル等の界面活性剤、精製水、乳糖、デンプン、結晶セルロース、D−マンニトール、レシチン、アラビアガム、ソルビトール液、糖液等の賦形剤、甘味料、着色料、pH調整剤、香料等を挙げることができる。なお、液体製剤は、服用時に水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形であってもよい。また、錠剤、顆粒剤は常用の方法でコーティングしてもよい。
【００４３】
注射剤の形で投与する場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経皮、関節内、滑液嚢内、胞膜内、骨膜内、舌下、口腔内等に投与することが好ましく、特に静脈内投与又は腹腔内投与が好ましい。静脈内投与は、点滴投与、ボーラス投与のいずれであってもよい。
【００４４】
本発明で得られる高度不飽和脂肪酸を含有する食品の形態としては、例えば、サプリメント（散在、顆粒剤、ソフトカプセル、ハードカプセル、錠剤、チュアブル錠、速崩錠、シロップ、液剤等）、飲料（お茶、炭酸飲料、乳酸飲料、スポーツ飲料等）、菓子（グミ、ゼリー、ガム、チョコレート、クッキー、キャンデー等）、油、脂質食品（マヨネーズ、ドレッシング、バター、クリーム、マーガリン等）等が挙げられる。
【００４５】
上述食品には、必要に応じて各種栄養素、各種ビタミン類（ビタミンA、ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、ビタミンK等）、各種ミネラル類（マグネシウム、亜鉛、鉄、ナトリウム、カリウム、セレン等）、食物繊維、分散剤、乳化剤等の安定剤、甘味料、呈味成分（クエン酸、リンゴ酸等）、フレーバー、ローヤルゼリー、プロポリス、アガリクス等を配合することができる。
【００４６】
本発明で得られる高度不飽和脂肪酸を含有する化粧品としては、クリーム、乳液、ローション、マイクロエマルジョンエッセンス、入浴剤等が挙げられ、香料等を混合してもよい。
【００４７】
本発明で得られる高度不飽和脂肪酸を含有する飼料としては、動物又は水産養殖飼料添加物、動物代用飼料、又は動物局所軟膏等が挙げられる。
【００４８】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示にすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００４９】
試薬及び培地 
50 μg/mLアンピシリン又はカナマイシン含有LB寒天培地、Czapek-Dox寒天培地（3 % スクロース、0.2 % NaNO3、0.1 % KH2PO4、0.05 % KC1、0.05 % MgSO4・7H2O、0.001 % FeSO4・7H2O、2 % 寒天、pH 6.0）、GY培地（2 %(重量/体積) グルコース、1 % 酵母エキス）、LB-Mg寒天培地（1 % トリプトン、0.5 % 酵母エキス、85 mM NaCl、0.5 mM MgSO4・7H2O、0.5 mM NaOH、1.5 % 寒天、pH 7.0）、最少培地（MM）（10 mM K2HPO4、10 mM KH2PO4、2.5 mM NaCl、2 mM MgSO4・7H2O、0.7 mM CaCl2、9 μM FeSO4・7H2O、4 mM (NH4)2SO4、10 mM グルコース、pH 7.0）、誘導培地（IM）（MMに0. 5 %(重量/体積) グリセロール、 200 μM アセトシリンゴン、40 mM 2-(N-モルホリノ) エタンスルホン酸(MES)を加えて、pH 5.3に調製）、SC培地（5.0 g Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate (Difco）、1.7 g (NH4)2SO4、、20 gグルコース、20 g寒天、20 mgアデニン、30 mgチロシン、1.0 mgメチオニン、2.0 mgアルギニン、2.0 mgヒスチジン、4.0 mgリジン、4.0 mgトリプトファン、5.0 mgスレオニン、6.0 mgイソロイシン、6.0 mgロイシン、6.O mg/Lフェニルアラニン）、セフォタキシム、スペクチノマイシン、Nile blue A (Sigma)を使用した。制限酵素、ライゲーション用酵素等は、タカラバイオ又はNew England BioLabs製を使用した。
【実施例１】
【００５０】
Saprolegnia diclina由来Δ17不飽和化酵素遺伝子のコドン至適化
モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）1S-4由来のω3不飽和化酵素は、炭素鎖18の脂肪酸に優先的に作用し、かつ、低温培養時（12 ℃）のみ活性を発現する。そのため、M. alpina 1S-4株では、特に常温培養時（28 ℃）においては、ω3不飽和化酵素が発現していたとしても、炭素鎖20のアラキドン酸がEPAには変換されず、結果として、有意な量のアラキドン酸が蓄積する（Appl. Environ. Microbiol., (2009), vol.75, p.5529-5535）。
そこで、炭素鎖20の脂肪酸に優先的に作用するΔ17不飽和化酵素を用いて、EPAを生産することを試みた。ω3不飽和化酵素遺伝子と同じ働きをする糸状菌サプロレグニア（Saprolegnia diclina）由来のΔ17不飽和化酵素遺伝子（配列番号１）を導入するに際し、前記遺伝子をモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）のコドン使用頻度（http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=64518）を参考に至適化し、SpeI及びBamHIサイトをCDS前後に構築して全合成を行った（Life Technologies）。当該遺伝子配列を配列番号２に示す。前記遺伝子はSpMA-RQ（ampR）プラスミドにクローニングした。
【実施例２】
【００５１】
形質転換用バイナリーベクターの構築
実施例１で調製したプラスミドを、SpeI及びBamHI制限酵素で処理し、得られたΔ17不飽和化酵素遺伝子断片を、恒常的発現プロモーターであるヒストンプロモーターを含むプラスミドpBIG35（京都府立大学から提供されたpBIG2RHPH2を改変、Appl. Environ. Microbiol., (2009), vol.75, p.5529-5535に記載）に連結し、発現カセットを構築した。当該発現カセットを、さらに、ウラシル要求性のマーカー遺伝子（ura5）とタンデムに連結させ、形質転換用バイナリーベクター（pBIG35ZhΔ17m）を構築した。図２に当該ベクターの構造を示す。
【実施例３】
【００５２】
M. alpina ST1358でのΔ17不飽和化酵素遺伝子の発現
安藤らの報告に基づき（Appl. Environ. Microbiol., (2009), vol.75, p.5529-5535）、実施例２で調製した形質転換用バイナリーベクターを、アグロバクテリウムを介したATMT法でM. alpina ST1358に導入した。
M. alpina ST1358（ウラシル要求性株）を0.05 mg/mLウラシル含有Czapek-Dox寒天培地で培養して得た培養物を集菌し、Miracloth (Calbiochem)でろ過することで、M. alpina ST1358の胞子懸濁液を新たに調製した。アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens C58C1、京都府立大学から提供）に、実施例２で調製した形質転換用バイナリーベクターをエレクトロポレーションで形質転換し、LB-Mg寒天培地上で28 ℃、48時間培養した。PCR法で当該ベクターを含むアグロバクテリウムを確認した。当該ベクターを有するアグロバクテリウムを最少培地（MM）で2日間培養し、5,800×gで遠心分離し、新鮮なIMを加えて懸濁液を調製した。当該懸濁液を、8〜12時間、28 ℃でOD660が0.4から3.7になるまでロータリーシェーカーで誘導培養した。当該菌懸濁液100 μLを、等量の前記M. alpina ST1358懸濁液（108 mL-1）と混合し、ニトロセルロース膜（直径70 mm ; hardened low-ash grade 50、Whatman）を載せた共培養培地（IMと同様の組成、ただし、10 mMグルコースの代わりに5 mMグルコース及び1.5 % 寒天を含む）上に塗布し、23 ℃で2〜5日間培養した。共培養後、当該膜をウラシルフリー、50 g/mL セフォタキシム 及び 50 g/mL スペクチノマイシン、0.03 ％ Nile blue A (Sigma)を含むSC寒天培地に移し、28 ℃で5日間培養した。可視可能な真菌コロニーからの菌糸を、新鮮なウラシルフリーSC培地に移した。形質を安定して保持する形質転換体を選抜するために当該作業を3回行った。ウラシルフリーSC寒天培地で増殖することができるが、5-フルオロオロチン酸（5-FOA）を含むGY寒天培地では増殖できない形質転換体を、形質を安定して保持する形質転換体と判断した。前記形質転換体を、10 mL GY培地中（2 % グルコース、1 % 酵母エキス）、28 ℃及び12 ℃で1週間、300 rpmで好気的に培養した。
【実施例４】
【００５３】
EPAの生成
実施例３の培養液から吸引ろ過にて菌体を回収、120 ℃、3時間乾燥した。乾燥菌体に、0.5 mg/mlの濃度にて内部標準 (23:0)を含むジクロロメタン溶液1 ml、塩酸メタノール2 mlを加え、55 ℃、2時間の温浴にて脂肪酸のメチルエステル化処理を行った。その後、蒸留水1 mlとヘキサン4 mlを加え、ヘキサン層を抽出し、減圧遠心して脂肪酸メチルエステルを回収した。それぞれのサンプルをクロロホルムに溶解した。GLCは、島津社製GC-2010を用い、GLサイエンス社製キャピラリーカラムTC70 (0.25 mm x 60 m)を用い、カラム温度180 ℃、気化室温度250 ℃、検出器温度250 ℃、キャリアガスHe、メイクアップガスN2、H2流量40 mL/min、Air流量400 mL/min、スプリット比50、分析時間30 minの条件にてEPAの生産を評価した。その結果、28 ℃培養下では、総脂肪酸あたり10 %以上のEPAの蓄積が確認された。結果を図３に示す。
【実施例５】
【００５４】
脂肪酸組成及び脂肪酸生産量の経時変化
実施例３で得られた安定した形質を保持する株（＃2、＃3、＃4、＃6及び＃8）について、10 mL GY培地中（2 % グルコース、1 % 酵母エキス）、28 ℃で3、7、10、14日間300 rpmで好気的に培養し、脂肪酸組成及び脂肪酸生成量の経時変化を分析した。培養14日間で、総脂肪酸あたり35 ％、0.5 mg/mLのEPAを生産する株（＃3）を確認した。結果を図４に示す。
【００５５】
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明である。
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の方法によれば、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）を常温で培養することにより、EPAを生産することができるため、より実用的なEPA生産法を提供することができる。当該方法で得られるEPAは、医薬品、化粧品、食品、飼料等様々な分野へ適用されることから、本発明は、産業上極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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