(57)【要約】  本発明は、尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出することを特徴とする、尿中ポドサイト数を推定する方法に関する。より具体的には以下の（１）〜（３）の工程を含む、尿中ポドサイト数の推定方法に関する。（１）被験者から採取された尿より尿沈渣を分離し、尿沈渣中のポドカリキシンを可溶化することにより尿沈渣試料液を準備する工程。（２）尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出して、尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量を算出する工程。（３）尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量を、ポドサイト１個あたりのポドカリキシン量で割ることにより、尿中ポドサイト数を算出する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出することを特徴とする、尿中ポドサイト数を推定する方法。
【請求項２】
尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量と、ポドサイト１個あたりのポドカリキシン量とを用いて、尿中ポドサイト数を算出する、請求項１に記載の尿中ポドサイト数を推定する方法。
【請求項３】
尿沈渣試料液が、被験者から採取された尿より尿沈渣を分離し、尿沈渣中のポドカリキシンを可溶化することにより得られたものである、請求項１または２に記載の尿中ポドサイト数を推定する方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、請求項１〜３のいずれか１に記載の尿中ポドサイト数を推定する方法：
（１）被験者から採取された尿より尿沈渣を分離し、尿沈渣中のポドカリキシンを可溶化することにより尿沈渣試料液を準備する工程；
（２）尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出して、尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量を算出する工程；
（３）尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量を、ポドサイト１個あたりのポドカリキシン量で割ることにより、尿中ポドサイト数を算出する工程。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１に記載の尿中ポドサイト数を推定する方法により得られた尿中ポドサイト数を指標とする、腎疾患の検査方法。
【請求項６】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出するための尿の処理方法：
（ａ）被験者から採取された尿に、緩衝液及びキレート剤を添加して混合する工程；
（ｂ）工程（ａ）により得られた溶液を遠心分離することにより、尿沈渣を分離する工程；
（ｃ）工程（ｂ）により得られた尿沈渣に、緩衝液、キレート剤、及び界面活性剤を添加して混合する工程。
【請求項７】
以下（ａ）〜（ｃ）を含む、尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出するための尿処理用試薬キット：
（ａ）緩衝液及びキレート剤を含む、処理液１；
（ｂ）緩衝液、キレート剤、及び界面活性剤を含む、処理液２；
（ｃ）抗ポドカリキシン抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出することにより尿中ポドサイト数を算出する、尿中ポドサイト数を推定する方法に関する。【０００２】
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願2015-087232号優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
透析や移植を必要とする末期腎不全（end-Stage kidney disease：ESKD）患者は世界中で増え続けている。1990〜2000年の10年間でESKD患者は43万人から106.5万人に増加したが、2008年には少なくとも165万人程度に増加している。2011年には日本の維持透析患者数は約30万人となり、人口100万人当たりの患者数は2126人であり、その数は世界第2位である。慢性腎臓病（CKD）は世界中で増え続けるESKDの予備軍であり、米国の2000年のCKD患者数は成人人口の13.07%（2561万人）と推測されている。日本の2005年のCKD患者数は成人人口の12.9%（1330万人）である。また、CKDは心血管疾患（CVD）の危険因子である。欧米のCKDにおいては、透析導入される患者数よりもCVDにより死亡する患者の方が多数であり、日本においてもCKDはCVDの危険因子である（非特許文献１）。よって、CKD患者に対してそれぞれの進行過程に合った、適切な治療をきちんと行えば、透析導入やCVDで死亡する人数を大幅に減らすことが可能であると考えられる。【０００４】
ポドカリキシンは、腎糸球体を構成するタコ足細胞（ポドサイト）の表面に存在し、濾過機能を担っている糖タンパク質である。ポドサイトは糸球体基底膜のボウマン腔側に位置し、糸球体濾過機構に重要な役割をもつ。健常人には腎臓が２個あるが、各腎臓には600000個の糸球体が存在し、１個の糸球体あたり300個のポドサイトがあるとの報告がある（非特許文献２）。ポドサイトの障害の程度を把握することは、腎疾患において極めて重要な意味を持つことから（非特許文献３）、腎障害の検査を行うために、尿中に排出されるポドカリキシンの検出が行われている。尿中ポドカリキシンを測定することによる、簡便な腎障害の検査手段が開示されている（特許文献１）。【０００５】
腎疾患の一つに糖尿病性腎症がある。糖尿病性腎症の進行には腎臓の糸球体に存在するポドサイトの消失が深く関与していると考えられている（非特許文献３）。糸球体からのポドサイト消失は、糸球体の基底膜からポドサイトが剥離脱落することが原因であり、剥離脱落したポドサイトは尿中に出現する。尿中へ脱落したポドサイトは、糖尿病性腎症において重症度の指標になる可能性がある。【０００６】
現在、尿中ポドサイトの検出は蛍光抗体法により行われている。本発明者らもポドサイトマーカーであるポドカリキシン（PCX）に対する抗体を用いて蛍光抗体法によりポドサイトを検出することに成功している（非特許文献４）。従来の蛍光抗体法では、糖尿病性腎症の患者では、尿1mLあたり0.1〜0.3個のポドサイトの出現が確認されている。またタンパク尿（ミクロアルブミン尿およびマクロアルブミン尿（以下「ミクロ〜マクロアルブミン尿」とも言う）を有する糖尿病患者において、３年間で１糸球体あたりポドサイト数が544個から475個に減少したという報告がなされている（非特許文献５）。近年、ポドサイトが糸球体から脱落する原因として、ポドサイトの核分裂異常によるという新しい考え方が提唱された（非特許文献６）。非特許文献６においては、異常核分裂をおこしたポドサイトはいずれ細胞死に陥り、細胞がバラバラになることが示唆されている。【０００７】
糸球体から脱落したポドサイト数をより正確に把握することにより、効率のよい腎疾患検査を行うことが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開WO2002/037099号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】日本腎臓学会編  CKD診療ガイドライン2012、p5,7
【非特許文献２】Vogelmann SU, Nelson WJ, Myers BD. Et al. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol 2003;285:F40-48.
【非特許文献３】Pagtalunan ME, Miller PL, Jumping-Eagle S. et al. Podocyte loss and progressive glomerular injury in type II diabetes. J Clin Invest 1997;99:342-348.
【非特許文献４】Hara M, Yanagihara T, Takada T. et al. Urinary excretion of podocytes reflects disease activity in children with glomerulonephritis. Am J Nephrol  1998;18:35-41.
【非特許文献５】White KE, Bilous RW, Marshall SM, El Nahas M, Remuzzi G, Piras G, De Cosmo S, Viberti G.  Podocyte number in normotensive type 1 diabetic patients with albuminuria. Diabetes. 2002 Oct;51(10):3083-9.
【非特許文献６】Lipias H, Romagnami P, Anders H-J. New insight into the pathology of podocyte loss Mitotic catastrophe. Am j Pathol  2013;183:1364-1374
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来の方法より正確かつ簡便に尿中ポドサイト数を推定する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、糖尿病性腎症患者から取得した尿沈渣試料中に、ポドサイトの断片が検出されることを確認し、尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量を測定し、ポドカリキシン排泄量と１ポドサイト当たりのポドカリキシン量を用いて、尿中ポドサイト数を推定し得ることに着目し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出することを特徴とする、尿中ポドサイト数を推定する方法。
２．尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量と、ポドサイト１個あたりのポドカリキシン量とを用いて、尿中ポドサイト数を算出する、前項１に記載の尿中ポドサイト数を推定する方法。
３．尿沈渣試料液が、被験者から採取された尿より尿沈渣を分離し、尿沈渣中のポドカリキシンを可溶化することにより得られたものである、前項１または２に記載の尿中ポドサイト数を推定する方法。
４．以下の工程を含む、前項１〜３のいずれか１に記載の尿中ポドサイト数を推定する方法：
（１）被験者から採取された尿より尿沈渣を分離し、尿沈渣中のポドカリキシンを可溶化することにより尿沈渣試料液を準備する工程；
（２）尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出して、尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量を算出する工程；
（３）尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量を、ポドサイト１個あたりのポドカリキシン量で割ることにより、尿中ポドサイト数を算出する工程。
５．前項１〜４のいずれか１に記載の尿中ポドサイト数を推定する方法により得られた尿中ポドサイト数を指標とする、腎疾患の検査方法。
６．以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出するための尿の処理方法：
（ａ）被験者から採取された尿に、緩衝液及びキレート剤を添加して混合する工程；
（ｂ）工程（ａ）により得られた溶液を遠心分離することにより、尿沈渣を分離する工程；
（ｃ）工程（ｂ）により得られた尿沈渣に、緩衝液、キレート剤、及び界面活性剤を添加して混合する工程。
７．以下（ａ）〜（ｃ）を含む、尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出するための尿処理用試薬キット：
（ａ）緩衝液及びキレート剤を含む、処理液１；
（ｂ）緩衝液、キレート剤、及び界面活性剤を含む、処理液２；
（ｃ）抗ポドカリキシン抗体。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出して、尿中ポドサイト数を推定することにより、従来の蛍光顕微鏡を用いた尿中ポドサイトの検出方法と比較して、容易かつ正確に尿中ポドサイト数を推定することを可能とする。また本発明の尿中ポドサイト数の推定方法により得られた尿中ポドサイト数を用いることにより、腎疾患の発症の評価、腎疾患の治療効果の評価、ポドサイト障害の程度の評価、腎疾患の予後予測をより正確に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】糖尿病性腎症患者由来の尿沈渣について、抗ポドカリキシン抗体を用いた蛍光抗体法により、ポドカリキシンを染色した顕微鏡写真図を示す。（参考例１）
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出することを特徴とする、尿中ポドサイト数を推定する方法に関する。ポドサイト（タコ足細胞）は、腎臓の糸球体上皮細胞であり、糸球体基底膜のボウマン腔側に位置し、糸球体濾過機構に重要な役割をもつ。ポドサイトの障害の程度の把握は、腎疾患の診断において極めて重要である。特に、糸球体疾患においては尿中にポドサイトが脱落していることがわかっている。よって尿中のポドサイトの有無を確認することにより腎疾患を検出することが可能であり、尿中ポドサイト数は腎疾患の重症度の指標となると考えられている。尿中、特に尿沈渣中にはポドサイトの他にポドサイト由来の断片が存在している（図１）。腎臓から脱落したポドサイトの真の総数を把握するためには、ポドサイトの断片がどのくらいの数のポドサイトに由来するかを推定しなくてはならない。腎臓から脱落して尿中に排泄されるポドサイト数（尿中ポドサイト数）を正確に把握することにより、精度よく腎疾患の診断を行うことが可能となる。
本発明の尿中ポドサイト数を推定する方法は、より具体的には以下の（１）〜（３）の工程を含む。
（１）被験者から採取された尿より尿沈渣を分離し、尿沈渣中のポドカリキシンを可溶化することにより尿沈渣試料液を準備する工程。
（２）尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出して、尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量を算出する工程。
（３）尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量を、ポドサイト１個あたりのポドカリキシン量で割ることにより、尿中ポドサイト数を算出する工程。
【００１６】
本明細書において、尿沈渣試料液は被験者から採取された尿検体から調製される。検体である尿は、いかなる被験者から得られたものであってもよいが、糖尿病または腎疾患（腎症）を罹患した患者から得られたものが好ましい。糖尿病および腎疾患の診断は、従来より公知の手段により行えばよい。尿の採取方法は問わないが、早朝尿もしくは随時尿を用いることが好ましい。また本発明の検査方法に必要な尿の量は10〜2000μL程度である。
【００１７】
本発明においては、尿沈渣試料液を準備するため、検体である尿を２種類の処理液を用いて、以下の（ａ）〜（ｄ）の４工程を含む手段により処理する。
工程（ａ）：尿のpHの調整と、尿沈渣に含まれるポドサイトおよびポドサイトの断片以外のマスキングを行う工程である。本工程は、尿のpHの調整と、尿沈渣に含まれるポドサイトおよびポドサイトの断片以外のもののマスキングが可能な処理液１を、尿に添加して混合することにより行われる。処理液１は本工程の目的を達成し得るものであればいかなるものであってもよいが、好ましくは、緩衝液にキレート剤などを添加した溶液が例示される。緩衝液、キレート剤は、本工程の目的を達成し得るものであれば特に限定されず、公知のものを用いることができる。
【００１８】
本明細書において緩衝液はいかなるものであってもよいが、グッドの緩衝液を例示することができる。グッドの緩衝液は、N-(2-アセタミド)-2-アミノエタンスルホン酸（ACES）、N-(2-アセタミド)イミノジ酢酸（ADA）、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸（BES）、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン（Bicine）、ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン（Bis-Tris）、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸（CAPS）、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸（CHES）、3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸（EPPS）、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（HEPES）、2-ヒドロキシ-3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸（HEPPSO）、2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）、3-モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS）、2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸（MOPSO）、ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)（PIPES）、ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸（POPSO）、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（TAPS）、2-ヒドロキシ-N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（TAPSO）、N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸（TES）、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]グリシン（Tricine）、2-アミノ-2-ヒドロキシメチルプロパン-1,3-ジオール（Tris）、Bis-Trisプロパン、コラミンクリド、グリシンアミド、3-[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO）、N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸（CAPSO）を例示することができ、NaOHやHClによりpHを調整して作製することができる。グッドの緩衝液は、緩衝能が大きく効率的な尿pH補正及び均一化が可能となる。
【００１９】
本明細書におけるキレート剤は、エチレンジアミン-N,N,N',N'-四酢酸（EDTA）、O,O'-ビス(2-アミノエチル)エチレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸（EGTA）、O,O'-ビス(2-アミノフェニル)エチレングリコール-N,N,N',N'-四酢酸、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン、トランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N',N'-四酢酸、ジエチル エネトリアミン-N,N,N',N'',N''-五酢酸、エチレンジアミン-N,N'-ジプロピオン酸、N-(2-ヒドロキシエチル)イミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸）、ニトリロトリス(メチルホスホン酸)、N,N,N',N'-テトラキス(2-ピリジルメチル)エチレンジアミン、トリエチレンテトラアミン-N,N,N',N'',N''',N'''-六酢酸、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、クエン酸デキストロース及びアデノシン三リン酸を例示することができるがこれらに限定されない。EDTAが尿中カルシウム及び尿中マグネシウムの高マスキング効果の理由から好ましい。
【００２０】
本明細書の処理液１において、緩衝液の濃度は、0.05M〜1M、好ましくは0.1M〜0.5Mであり、キレート剤の濃度は0.001M〜0.1M、好ましくは0.005M〜0.05Mである。処理液１には、緩衝液及びキレート剤以外に、本工程（ａ）の目的を妨げないものであればいかなるものを含めてもよいが、界面活性剤を含めることはできない。本明細書の処理液１には、保存剤、防腐剤等の添加剤を含む場合がある。防腐剤は、アジ化ナトリウムのほか、5-クロロ-2メチル-4-イソチアゾリン-3オンや2-メチル-4-イソチアゾリン-3-オン等のイソチアゾロン系の防腐剤を含むがこれに限られない。より具体的には、処理液１としては、2M TES-NaOH(pH7.0)に、0.2M EDTAを含む溶液が例示される。
【００２１】
工程（ｂ）：工程（ａ）により得られた溶液を遠心分離することにより、ポドサイトおよびポドサイトの断片を採取する工程である。本工程における遠心分離は、重力加速度(G)を500〜10000g、好ましくは800〜2500gに設定して、遠心分離機により行うことができる。本工程の目的物は、遠心分離後に得られる沈渣であり、ポドサイトおよびポドサイトの断片が含まれている。本工程においては、遠心分離後、上清を廃棄して、沈渣を回収する。得られた沈渣を、本発明において尿沈渣と称する。
【００２２】
工程（ｃ）：工程（ｂ）により得られた尿沈渣について、ポドサイトおよびポドサイトの断片に発現しているポドカリキシンの可溶化、尿沈渣のpH調整、尿沈渣に含まれるポドサイトおよびポドサイトの断片以外のものの更なるマスキングを行う工程である。本工程は、ポドサイトおよびポドサイト断片に発現しているポドカリキシンの可溶化、尿沈渣のpH調整、および、尿沈渣に含まれるポドサイトおよびポドサイトの断片以外のもののマスキングが可能な処理液２を、沈渣に添加して混合することにより行われる。処理液２は、本工程の目的を達成し得るものであればいかなるものであってもよいが、好ましくは、緩衝液にキレート剤および界面活性剤などを添加した溶液が例示される。緩衝液、キレート剤、界面活性剤は、本工程の目的を達成し得るものであれば特に限定されず、公知のものを用いることができる。
【００２３】
処理液２に含まれる緩衝液およびキレート剤の具体例は、上述の通りである。処理液２に含まれる界面活性剤は、非イオン界面活性剤、又は、陰イオン性界面活性剤、陽イオン界面活性剤、および両性界面活性剤等のイオン性界面活性剤のいずれであってもよいが、非イオン界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる：
・ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、またはポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレンエーテル化合物；
・グリセリン脂肪酸部分エステル、ソルビタン脂肪酸部分エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、またはショ糖脂肪酸部分エステルなどの多価アルコール部分エステル化合物；
・ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸部分エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸部分エステル、またはポリオキシエチレン化ひまし油などのポリオキシエチレン化多価アルコール脂肪酸エステル；
・脂肪酸ジエタノールアミド、N,N-ビス-2-ヒドロキシアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、トリエタノールアミン脂肪酸エステル、またはトリアルキルアミンオキシドなどのアミドまたはアミン化合物。
【００２４】
上記非イオン性界面活性剤のより具体的な例としては、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキシエチレンアルキル(12~14)エーテル、ポリエチレングリコールラウリルエーテルおよびジエチレングリコールモノヘキサデシルエーテルが挙げられる。このような非イオン性界面活性剤は、それぞれTween(登録商標)20(東京化成工業株式会社製)、Tween(登録商標)80(東京化成工業株式会社製)、Triton(登録商標)X-100(ロシュ・アプライド・サイエンス社製)、BT-9(日光ケミカルズ株式会社製)、Brij(登録商標)35(メルク株式会社製)、Brij(登録商標)52(メルク株式会社製)として市販されている。
【００２５】
本明細書の処理液２について、緩衝液の濃度は、0.05M〜1M、好ましくは0.1M〜0.5Mであり、キレート剤の濃度は0.001M〜0.1M、好ましくは0.005M〜0.05M、界面活性剤の濃度は、0.0001%(Vol./Vol.)〜2%(Vol./Vol.)、好ましくは0.001%(Vol./Vol.)〜1%(Vol./Vol.)である。処理液２には、緩衝液、キレート剤及び界面活性剤以外に、本工程（ｂ）の目的を妨げないものであればいかなるものを含めてもよく、例えば、保存剤や防腐剤等の添加剤を含めても良い。保存剤や防腐剤の具体例は、上述の通りである。処理液２としては、より具体的には、200mM TES-NaOH(pH7.0)に、20mM EDTAと0.2%(Vol./Vol.)TritonX-100を含む溶液が例示される。
【００２６】
工程（ｃ）：工程（ｂ）により得られた溶液を遠心分離することにより、尿沈渣のポドカリキシンを可溶化したポドカリキシン可溶化液を採取する工程である。本工程における遠心分離は、重力加速度(G)を5000〜20000g、好ましくは10000〜15000gに設定して、遠心分離機により行うことができる。本工程の目的物は、遠心分離後に得られる上清である。上清には、ポドサイトおよびポドサイト断片に由来するポドカリキシンが可溶化されて含まれている。本工程においては、遠心分離後、上清を回収する。本工程により得られた上清であるポドカリキシン可溶化液を、本発明において尿沈渣試料液と称する。尿沈渣試料液のpHは特に限定されないが、5.5〜7.0に調整することが好ましい。pHがこの範囲内であれば、検査値に誤差が少なくなる。
【００２７】
尿沈渣試料液は、具体的には次のようにして調製することができる。工程（ａ）において処理液１  100μLと尿検体900μLとを混合し、工程（ｂ）において工程（ａ）の混合液を遠心分離（1500g、4℃、5min）して、ポドサイトおよびポドサイト断片を含む尿沈渣を得る。次いで、工程（ｃ）においてポドサイトおよびポドサイト断片を含む尿沈渣と、処理液２  100μLとを混合し、工程（ｄ）において工程（ｃ）の混合液を遠心分離（15000g、4℃、5min）して、上清を採取し、ポドカリキシン可溶化液である尿沈渣試料液を得ることが可能である。
【００２８】
尿沈渣試料液からポドカリキシンを検出する方法自体は公知の方法および今後開発されるいかなる方法を用いてもよい。尿沈渣試料液のポドカリキシンの検出方法の一例として、免疫学的手法が挙げられる。免疫学的手法は、例えば、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法を含む）、電気泳動法による分離と蛍光、酵素、放射性同位元素などによる検出方法との組み合わせ（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法を含む）、酵素免疫測定吸着法（ELISA）、ドット・ブロッティング法、ラテックス凝集法（LA：Latex Agglutination-Turbidimetric Immunoassay）、イムノクロマト法などにより行うことができるが、ELISA法もしくはLA法を用いることが好ましい。定量性の観点から、ELISA法のうちサンドイッチ法を用いることが好ましい。サンドイッチ法では、抗ポドカリキシン抗体を固相化したマイクロタイタープレートに尿沈渣試料液を添加して抗原・抗体反応をさせ、さらに酵素標識した抗ポドカリキシン抗体を添加して抗原・抗体反応をさせ、洗浄後、酵素基質と反応・発色をさせ、吸光度を測定する。
【００２９】
本発明において、ポドカリキシンを検出するため用いられる抗体は、ポドカリキシンを特異的に検出可能なものであれば、いかなるものであってもよい。本発明において用いられる抗ポドカリキシン抗体は、公知のものであってもよく、また今後開発される抗体であってもよく、特に限定されない。本発明における抗ポドカリキシン抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにこれらの結合活性断片などが挙げられる。
【００３０】
尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出することにより、尿沈渣試料液中のポドカリキシン濃度または量を算出することができる。かかる尿沈渣試料液中のポドカリキシン濃度または量を、尿沈渣試料液中のポドカリキシン値と称する。尿沈渣試料液のポドカリキシン値を、尿中に安定に排泄される尿中成分の値（尿中成分値）により補正することにより、尿沈渣中のポドカリキシン排泄量を得ることができる。尿中成分としては、尿中クレアチニンが好ましい。尿中クレアチニンはクレアチニンの産生が筋肉の量に依存することから、一個体において疾患にかかわらずほぼ一定であると考えられている。尿中排泄物質の検査においては、尿量誤差を回避するため、クレアチニン1g当りの量により、目的とする尿中排泄物質の量を補正する手法が一般的に用いられており、これによりクレアチニン単位グラム当たりの尿中排泄物質を比較することが可能になる。尿中成分が尿中クレアチニンである場合の、尿沈渣中のポドカリキシン排泄量（PCX/Cre）は、以下の式により算出することができる。
＜式＞  PCX/Cre：尿沈渣中のポドカリキシン排泄量(ng/mg)＝100×尿沈渣試料液のポドカリキシン濃度(ng/mL)÷尿中クレアチニン濃度(mg/dL)
【００３１】
被験者の尿沈渣中のポドカリキシン排泄量（PCX/Cre）を用いて、被験者の尿中ポドサイト数を算出することができる。本発明により得られる被験者の尿中ポドサイト数は、尿中に細胞として存在するポドサイト由来のポドカリキシンと、細胞としてではなく断片として存在するポドサイトの断片由来のポドカリキシンから推定されるものである。よって尿中ポドサイトの推定には、ポドサイトの断片が、どの程度の数のポドサイトに由来するかを算出して、算定する必要がある。被験者の尿中ポドサイト数の算出には、１個のポドサイトに由来するポドカリキシン量を用いる。１個のポドサイトに由来するポドカリキシン量（ポドサイト１個あたりのポドカリキシン量）を算出する方法はいかなる方法によってもよいが、腎疾患患者の尿中へのポドサイト排泄量と、腎疾患患者の尿沈渣中のポドカリキシン排泄量を用いて算出することができる。１個のポドサイトに由来するポドカリキシン量は、10pg〜1000pg、好ましくは100pg〜200pgである。以下に１個のポドサイトに由来するポドカリキシン量の算出方法を具体的に例示する。なお、以下の算出方法を含めた推定方法に用いる各数値（例えば、腎疾患患者の腎臓におけるポドサイトの減少数等）は本明細書にて説明する具体的な数値に限定されるものではなく、科学の進歩に伴い、より正確な測定が可能になった場合は、当該測定により得られた測定値を各数値として用いればよい。
【００３２】
まず、腎疾患患者の尿中へのポドサイト排泄量を、腎疾患患者の腎臓におけるポドサイトの減少数に基づき算出する。上記非特許文献５より、タンパク尿（ミクロ〜マクロアルブミン尿）を有する糖尿病患者において、３年間でポドサイト数は１糸球体あたり544個から475個に減少したという報告がなされている。つまり、タンパク尿（ミクロ〜マクロアルブミン尿）を有する糖尿病患者のポドサイトは、１糸球体あたり12.68%が減少したということとなる（100×(544-475)/544=12.68）。かかる糖尿病患者における１糸球体あたりポドサイトの減少率  12.68%を用いて、腎臓からのポドサイト減少数を算出する。ここで、腎臓切除等のない健常人では、腎臓が２個存在し、各腎臓に60万の糸球体が存在し、１個の糸球体あたり300個のポドサイトがあると報告されている（非特許文献２）。よって腎臓には600000×2×300=360000000個のポドサイトがあることとなる。なお１個の糸球体あたりのポドサイトの個数は300個に限定するものではなく、科学の進歩に伴いより正確な個数が測定可能になればその値を使用すればよい。糖尿病患者の腎臓から失われたポドサイトは、360000000×0.1268=45648000個、３年間で45648000個のポドサイトが糖尿病患者の腎臓から失われた計算となる。１年間では15216000個、１日では41688個のポドサイトが腎臓から失われたと考えられ、腎臓から失われたポドサイトが尿中に排泄されたとすると、1mLあたりでは41.7個（１日の尿量が1000mLと仮定した場合）、1mgクレアチニンあたり41.7個（１日クレアチニン排泄が1gだと仮定した場合）が尿中に含まれることとなる。つまり、タンパク尿（ミクロ〜マクロアルブミン尿）を有する糖尿病患者は、尿中に41.7個のポドサイト/mg クレアチニンを排泄していると算出される。なお本明細書において、タンパク尿（ミクロ〜マクロアルブミン尿）を呈する糖尿病患者を、糖尿病性腎症患者と称することとする。
【００３３】
次に、腎疾患患者の尿沈渣中のポドカリキシン排泄量を算出する。上述のように、腎疾患患者から採取された尿検体を用いて尿沈渣試料液を得て、尿沈渣中のポドカリキシン排泄量を算出することができる。具体例として、後述する実施例により算出した、糖尿病性腎症患者（ミクロ〜マクロアルブミン尿）の尿沈渣試料液中の平均PCX/Creである6.07ng/mgを用いる。
【００３４】
腎疾患患者の尿中へのポドサイト排泄量と、腎疾患患者の尿沈渣中のポドカリキシン排泄量から、１ポドサイトに由来するポドカリキシン量を算出する。糖尿病性腎症患者（ミクロ〜マクロアルブミン尿）において1mgクレアチニンあたりの尿沈渣試料液のポドカリキシン量の平均は6.07ng、ポドサイト数は41.7個である。よって、6.07/41.7=0.146ng(=146pg)となり、１ポドサイトに由来するポドカリキシン量は146pgと算出される。
【００３５】
本発明においては、被験者の尿沈渣中のポドカリキシン排泄量と、１ポドサイトに由来するポドカリキシン量（ポドサイト１個あたりのポドカリキシン量）とを用いて、尿中ポドサイト数を算出して、被験者の尿中ポドサイト数を推定することができる。すなわち、被験者の尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量を１ポドサイトに由来するポドカリキシン量で割ることにより、被験者の尿中ポドサイト数を算出することができる。被験者の尿沈渣試料中のポドカリキシン排泄量は、尿中に安定に排泄される尿中成分の値（尿中成分値）により補正されたものであることから、本方法により算出される被験者の尿中ポドサイト数は、同様に、尿中成分値により補正された、尿中へ排泄されたポドサイト数として算出することができる。
【００３６】
被験者の尿中ポドサイト数の算出する方法の具体例を、後述する実施例にて得られた尿沈渣中のポドカリキシン排泄量（PCX/Cre）の値を用いて説明する。後述する実施例では、ミクロアルブミン尿を有する糖尿病性腎症患者の尿沈渣試料中の平均PCX/Creは3.7ng/mg、マクロアルブミン尿を有する糖尿病性腎症患者の平均PCX/Creは8.8ng/mLであった。これらのPCX/Creと、上記にて導き出されたポドサイト１個あたりのポドカリキシン量（146pg）とを用いて、尿中へ排泄されたポドサイト数を算出した結果、ミクロアルブミン尿を有する糖尿病性腎症患者では25.3個（3.7/0.146=25.3個）、マクロアルブミン尿を有する糖尿病性腎症患者では60.2個（8.8/0.146=60.2個）と算出された。
【００３７】
従来の抗ポドカリキシン抗体を用いて蛍光抗体法によれば、糖尿病性腎症では尿1mLあたり（または、1mgクレアチニンあたり）0.1〜0.3個のポドサイトが出現している（非特許文献２）。１日尿量が1000mLとすると、１日に100〜300個レベルのポドサイトが排泄される計算になる。この計算によると、１年で200(100+300/2)×365日=73000個、10年で730000個、30年で2190000個のポドサイトが糸球体から喪失する計算となる。一方、非特許文献２に記載の糸球体数およびポドサイト数を参照すると、腎切除等のない健常人では、腎臓に36億個のポドサイトを有する。蛍光抗体法の測定結果に基づき、糖尿病性腎症患者において30年間で2190000個のポドサイトが失われたとしても、ヒトの全ポドサイト数の2190000/360000000=0.06(6%)が失われたことにしかならない。かかる減少率は、腎不全の原因を説明するにはあまりにも低い値である。よって蛍光抗体法により検出される尿中ポドサイト数よりも、もっと多くのポドサイトが尿中へ出現していると考えられる。本発明の推定方法により算出される尿中ポドサイト数は、蛍光抗体法による数値よりも100〜150倍多い。本発明の推定方法により得られた尿中ポドサイト数によれば、マクロアルブミン尿の患者では10年間で60.2x1000x365x10=219730000個のポドサイトが尿中に脱落することとなる。これはヒトの全ポドサイト数360000000個の約61 %であり、腎不全の原因を説明可能な数値である。よって、本発明の推定方法により得られる尿中ポドサイト数は、腎疾患の状態をより正確に反映する指標であると考えられる。
【００３８】
すなわち本発明の推定方法は、腎疾患の検査方法に用いることができる。本発明の検査方法においては、尿沈渣試料液中のポドカリキシンの検出により算出した尿中ポドサイト数が、ある一定以上の場合は腎疾患であると判定される。また、ポドサイト数により腎疾患の重症度が判定されることも可能である。ポドサイト数が多くなるにつれて、腎疾患が重篤であると判定される。よって、本発明の検出方法は、腎疾患患者について、腎疾患の進行をモニタリングする目的として、行われてもよい。
【００３９】
本発明の推定方法は、腎疾患の検査に用いることが可能であるが、好ましくは糸球体に異常の認められる糸球体疾患の検査に用いられる。糸球体疾患としては、糖尿病性腎症、IgA腎症、ネフローゼ症候群、慢性糸球体腎炎、膜性腎症、ANCA関連腎炎、全身性エリテマトーデス（ループス腎炎）、紫斑病性腎炎、間質性腎炎、半月体形成性腎炎、巣状糸球体硬化症、腎硬化症、急性腎不全、慢性腎不全、腎アミロイドーシス、強皮症腎、シェーグレン症候群による間質性腎炎、薬剤性腎症等が例示される。
【００４０】
本発明の検査方法は、従来の健康診断等の一般的な尿検査と同時に行われてもよいし、糖尿病もしくは腎疾患の疑いのある被験者や、糖尿病もしくは腎疾患と診断された患者について別途尿を採取して行われてもよい。また本発明の検査方法は、糖尿病患者については糖尿病性腎症の発症または進行をモニタリングする目的で、行われてもよい。また、腎症の疑いがある患者についても腎症の発症または進行のモニタリングする目的で行われてもよい。
【００４１】
本発明は、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む、尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出するための尿処理用試薬キットにも及ぶ。
（ａ）緩衝液及びキレート剤を含む、処理液１。
（ｂ）緩衝液、キレート剤、及び界面活性剤を含む、処理液２。
（ｃ）抗ポドカリキシン抗体。
【実施例】
【００４２】
以下に本発明の参考例および実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。【００４３】
（参考例１）尿沈渣の蛍光抗体法によるポドカリキシン染色
下記の手順により、蛍光抗体法によりポドサイトの検出を行った。
（１）被験者から採取した尿30mLを、尿細胞保存液20mLの入っているウリキープ5D（武藤化学株式会社）に保存した。（所要時間1〜2分間）
（２）スライドグラス上に、サイトスピンにてオートスメアサンプルを作製した（所要時間10分間）。
（３）作製したオートスメアサンプルを風乾させた（所要時間1〜2時間）。
（４）風乾させたサンプルと抗ポドカリキシン抗体とを、室温で1時間静置して反応させた（所要時間1時間）。
（５）反応後、スライドグラスをPBSで3回洗浄した（所要時間5分間）
（６）スライドグラス上のサンプルと、FITC標識抗マウスIgGとを、室温で1時間静置して反応させた（所要時間1時間）
（７）反応後、スライドグラスをPBSで3回洗浄した（所要時間5分間）
（８）蛍光顕微鏡を用いて、スライドグラス上のサンプルを100倍で検鏡した。【００４４】
蛍光顕微鏡により観察した写真を、図１に示す。図１においては、中央（矢印）にポドサイトが１個認められ、大小不同のPCX陽性の破片（丸で囲んだ箇所）が散見された。【００４５】
（実施例１）尿沈渣試料液の調製
以下のようにして、被験者から採取した尿を処理し、尿沈渣試料液を調製した。
（１）尿1000μLと処理液１（2M TES-NaOH(pH7.0)、0.2M EDTA）111μLを混合した。
（２）得られた混合液について、遠心分離（1500g、4℃、5min）を行った。
（３）遠心分離後の上清を廃棄し、ペレット（沈渣）を得た。ペレットに処理液２（200mM TES-NaOH(pH7.0)、20mM EDTA、0.2%(Vol./Vol.)TritonX-100）100μLを添加し、Voltexで攪拌した。
（４）攪拌後得られた混合液について、遠心分離（15000g、4℃、5min）を行った。
（５）遠心分離後、上清を回収して、尿沈渣試料液とした。【００４６】
（実施例２）尿沈渣試料液中の尿沈渣中のポドカリキシン排泄量の測定
ポドカリキシン濃度の測定には、２種類の抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体を用いた。これらの２種類の抗体は、ヒトポドカリキシンの異なる２つのエピトープを各々認識し、それぞれ抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体ａ（以下単に「抗体ａ」と称する）と、抗ヒトポドカリキシンモノクローナル抗体ｂ（以下単に「抗体ｂ」と称する）である。本実施例では、抗体ａ固相化マイクロタイタープレート（分割型マイクロプレートGF8高：Nunc社）と、西洋ワサビPeroxidase（以下「HRP」と略す）により標識化した抗体ｂを用いた。【００４７】
まず、上述の実施例１で調製した尿沈渣試料液100μLを、抗体ａ固相化マイクロタイタープレートのウェルへ加えた。37℃で1時間静置後、ウェルから尿試料溶液をデカンテーションにより除去した。3.6mM Na2HPO4、1.4mMKH2PO4、145mM NaCl、0.05％(Vol./Vol.)Tween20を含む溶液（以下「PBS-T溶液」と略す）を、マイクロタイタープレートのウェルに200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによりPBS-T溶液の除去を行うことにより、ウェルの洗浄を行った。洗浄工程を計３回行った。その後、HRP標識化抗体ｂ溶液を、100μL/ウェルで添加した。37℃で1時間静置後、HRP標識化抗体ｂ溶液をデカンテーションにより除去した。PBS-T溶液を200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによりPBS-T溶液の除去を行うことにより、洗浄を行った。洗浄工程を計３回行った。【００４８】
その後、TMB One-Step Substrate System（Dako社）をHRP酵素反応の基質溶液として用いて、100μL/ウェルで添加し、25℃で30分間、遮光で静置した。その後、313mM H2SO4溶液を反応停止溶液として100μL/ウェルで添加し、マルチスキャンアセントとAscent Software for Multiskan（大日本製薬株式会社）を使用し、波長450nmと630nmで各ウェルの吸光度を測定した。そして、波長450nmの吸光度から波長630nmの吸光度を引いた値を測定値とした。検量線の標準品として腎臓から抽出したNativeなヒトポドカリキシンを使用し、尿沈渣試料液中のポドカリキシン濃度を導き出した。ポドカリキシン濃度を尿中クレアチニン濃度により補正した尿沈渣中のポドカリキシン排泄量を以下の式から算出した。
＜式＞  PCX/Cre：尿沈渣中のポドカリキシン排泄量(ng/mg)＝100×尿沈渣中のポドカリキシン濃度(ng/mL)÷尿中クレアチニン濃度(mg/dL)【００４９】
（実施例３）糖尿病性腎症患者の尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量の測定
尿タンパクを有する糖尿病患者32名（ミクロアルブミン尿：17名、マクロアルブミン尿：15名）から採取した尿検体を用いて、実施例１の方法により尿沈渣試料液を調製した。得られた尿沈渣試料液を用いて実施例２の方法により、各糖尿病患者由来の尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出し、ポドカリキシン排泄量を算出した。その結果を表１に示す。
【表１】
2016171216.tif 000002
【００５０】
（実施例４）被験者の尿中ポドサイト数の推定
（１）ポドサイト１個に由来するポドカリキシン量の算出
非特許文献５により、タンパク尿（ミクロ〜マクロアルブミン尿）を有する糖尿病患者において、３年間でポドサイト数は１糸球体あたり544個から475個に減少したと報告されている。本報告から、タンパク尿を有する糖尿病患者のポドサイトは、１糸球体あたり12.68%が減少したと考えられる。１糸球体あたり12.68%のポドサイト減少を、健常人の腎臓のポドサイト数（3.6億個）に当てはめると、３年間で45648000個のポドサイトが失われた計算となる（36000000×0.1268＝45648000個）。１年間では、15216000個、１日では41688個、1mLあたりでは41.7個（１日の尿量が1000mLと仮定した場合）、1mgクレアチニンあたりでは41.7個（１日のクレアチニン排泄量が1gと仮定した場合）となる。
実施例３より、タンパク尿を有する糖尿病性腎症患者の尿沈渣試料液中のポドカリキシン排泄量（PCX/Cre）の平均は、6.07ng/mg であった。タンパク尿を有する糖尿病性腎症患者において、1mgクレアチニンあたりの尿沈渣試料中のポドカリキシン量は6.07ngであり、ポドサイト数は41.7個である。よってポドサイト１個に由来するポドカリキシン量は、146pgとなる（6.07/41.7=0.146ng(146pg)）。【００５１】
（２）被験者から採取された尿中のポドサイト数の算出
実施例３で求めた、ミクロアルブミン尿を有する糖尿病性腎症患者の尿沈渣試料液中の平均PCX/Creは3.7ng/mg 、マクロアルブミン尿を有する糖尿病性腎症患者の尿沈渣試料液中の平均PCX/Creは8.8ng/mLであった。PCX/Creの結果と、上記にて導き出されたポドサイト１個あたりのポドカリキシン量（146pg）とを用いて、尿中へ排泄されたポドサイト数を算出した。その結果、ミクロアルブミン尿を有する糖尿病性腎症患者では25.3個（3.7/0.146=25.3個）、マクロアルブミン尿を有する糖尿病性腎症患者では60.2個（8.8/0.146=60.2個）と算出された。【００５２】
参考例１に示すような従来の蛍光抗体法により検出したポドサイト数は、尿1mLあたりまたは1mgクレアチンあたり、0.1-0.3個であった。よって、本発明の方法により算出される尿中ポドサイト数は、従来の蛍光抗体法により算出される尿中ポドサイト数と比べて、100-150倍多いことがわかった。本発明の方法によれば、マクロアルブミン尿を有する糖尿病性腎症患者では、10年間で219730000個のポドサイトが尿中に脱落すると推測される（60.2x1000x365x10=219730000個）。かかる10年間の尿中ポドサイト数は、ヒトの全ポドサイト数360000000個の約61 %である。本発明の推定方法によれば、従来の蛍光抗体法よりも、尿中に脱落したポドサイトの真の総数をより正確に推定することが可能となると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
従来法である蛍光抗体法による蛍光顕微鏡で検出することによる尿中ポドサイト数に比べて、本発明の推定方法により、尿沈渣試料液中のポドカリキシンを検出して算出した尿中ポドサイト数は、腎疾患の症状をより正確に反映するものである。よって本発明の推定方法により算出された尿中ポドサイト数は、腎疾患の発症、治療効果、ポドサイト障害の程度、予後予測を効率よく行うことができ、腎疾患の診断材料として好適に用いることができる。本発明の推定方法を用いた腎疾患の検査方法は、治療方針を適切に決定することができることから、患者にとっても有用である。また本発明の推定方法は、簡便かつ迅速に行うことができ有利である。
【図１】
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【国際調査報告】
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