(57)【要約】  合成高分子系の粒子であるにも拘らず非特異吸着が発生しにくく、且つ機械的強度が高く、リガンドを結合した場合の動的結合容量が大きい多孔質粒子及びその製造方法を提供すること。  以下の工程１及び２を含む、多孔質粒子の製造方法。  （工程１）ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体を、水系溶媒に溶解させ、重合体溶液を調製する工程  （工程２）前記重合体溶液を、非水系溶媒に分散させＷ／Ｏエマルションを形成する工程【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程１及び２を含む、多孔質粒子の製造方法。
（工程１）ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体を、水系溶媒に溶解させ、重合体溶液を調製する工程
（工程２）前記重合体溶液を、非水系溶媒に分散させＷ／Ｏエマルションを形成する工程
【請求項２】
前記エチレン−ビニルアルコール共重合体として、下記式（１）で表されるエチレン由来の繰り返し単位を、共重合体中の全繰り返し単位に対し、０モル％超５０モル％以下有するエチレン−ビニルアルコール共重合体を用いる、請求項１に記載の製造方法。
【化１】
2017090658.tif 000009
【請求項３】
以下の工程３をさらに含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
（工程３）前記Ｗ／Ｏエマルションを冷却し、多孔質粒子を形成させる工程
【請求項４】
以下の工程４をさらに含む、請求項３に記載の製造方法。
（工程４）工程３で形成された多孔質粒子を化学架橋する工程
【請求項５】
前記水系溶媒が、スルホキシド系溶媒のうち水と混和するもの、ポリオール系溶媒のうち水と混和するもの、アルコール系溶媒のうち水と混和するもの及びアミド系溶媒のうち水と混和するものから選ばれる１種若しくは２種以上と水とを含む混合溶媒、又は水である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体に由来する多孔質粒子であって、空隙率が７５％以上である、多孔質粒子。
【請求項７】
前記エチレン−ビニルアルコール共重合体が、下記式（１）で表されるエチレン由来の繰り返し単位を、共重合体中の全繰り返し単位に対し、０モル％超５０モル％以下有するエチレン−ビニルアルコール共重合体である、請求項６に記載の多孔質粒子。
【化２】
2017090658.tif 000010
【請求項８】
化学架橋構造を有する、請求項６又は７に記載の多孔質粒子。
【請求項９】
下記式（２）で表されるビニルアルコール由来の繰り返し単位を有する、請求項６〜８のいずれか１項に記載の多孔質粒子。
【化３】
2017090658.tif 000011
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか１項に記載の多孔質粒子にリガンドが結合された、担体。
【請求項１１】
前記リガンドが、イムノグロブリン結合ドメインを含むタンパク質である、請求項１０に記載の担体。
【請求項１２】
標的物質の分離用である、請求項１０又は１１に記載の担体。
【請求項１３】
体液灌流吸着用である、請求項１０又は１１に記載の担体。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の担体がカラム容器に充填された、カラム。
【請求項１５】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の担体を用いることを特徴とする、標的物質の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔質粒子の製造方法、多孔質粒子、担体、カラム、及び標的物質の分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清、血漿、細胞培養液、尿等の生体試料から、タンパク質や抗体等の標的物質を分離することには困難が伴い、効率的に分離する技術が求められている。【０００３】
例えば、生体試料から標的物質を選択的に分離する目的として、合成高分子で構成される有機系多孔質粒子を支持体とし、これにリガンドを結合した担体が使用されている。【０００４】
合成高分子で構成される有機系多孔質粒子を支持体とした担体として、ポリアクリルアミドゲル、ポリアクリレートゲル、ポリスチレン、エチレン−ビニルアルコール共重合体等を用いたものが開発されているが（特許文献１及び２）、合成高分子系の多孔質粒子は、非特異吸着が起こり易いという欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−２２４３６０号公報
【特許文献２】特開２０１２−２１４５５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特に、非特異吸着を抑えつつ、リガンドを結合した場合の動的結合容量を満足させることは容易ではなく、これらに加えて充分な機械的強度も備えたものとすることは特に困難とされていた。【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、合成高分子系の粒子であるにも拘らず非特異吸着が発生しにくく、且つ機械的強度が高く、リガンドを結合した場合の動的結合容量が大きい多孔質粒子及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らは鋭意検討した結果、（工程１）ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体を、水系溶媒に溶解させ、重合体溶液を調製する工程、及び（工程２）前記重合体溶液を、非水系溶媒に分散させＷ／Ｏエマルションを形成する工程を含む方法で製造することによって、合成高分子系の粒子であるにも拘らず非特異吸着が発生しにくく、且つ機械的強度が高く、リガンドを結合した場合の動的結合容量が大きい多孔質粒子が得られることを見出し、本発明を完成した。
また、ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体に由来し、且つ空隙率が７５％以上である多孔質粒子が、合成高分子系の粒子であるにも拘らず非特異吸着が発生しにくく、且つ機械的強度が高く、リガンドを結合した場合の動的結合容量が大きいことを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１５〕を提供するものである。【００１０】
〔１〕  以下の工程１及び２を含む、多孔質粒子の製造方法（以下、「本発明の多孔質粒子の製造方法」とも称する）。
（工程１）ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体を、水系溶媒に溶解させ、重合体溶液を調製する工程
（工程２）前記重合体溶液を、非水系溶媒に分散させＷ／Ｏエマルションを形成する工程【００１１】
〔２〕  前記エチレン−ビニルアルコール共重合体として、下記式（１）で表されるエチレン由来の繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（１）」とも称する）を、共重合体中の全繰り返し単位に対し、０モル％超５０モル％以下有するエチレン−ビニルアルコール共重合体を用いる、前記〔１〕に記載の製造方法。【００１２】
【化１】
2017090658.tif 000002
【００１３】
〔３〕  以下の工程３をさらに含む、前記〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法。
（工程３）前記Ｗ／Ｏエマルションを冷却し、多孔質粒子を形成させる工程
〔４〕  以下の工程４をさらに含む、前記〔３〕に記載の製造方法。
（工程４）工程３で形成された多孔質粒子を化学架橋する工程
〔５〕  前記水系溶媒が、スルホキシド系溶媒のうち水と混和するもの、ポリオール系溶媒のうち水と混和するもの、アルコール系溶媒のうち水と混和するもの及びアミド系溶媒のうち水と混和するものから選ばれる１種若しくは２種以上と水とを含む混合溶媒、又は水である、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の製造方法。【００１４】
〔６〕  ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体に由来する多孔質粒子であって、空隙率が７５％以上である、多孔質粒子（以下、「本発明の多孔質粒子」とも称する）。
〔７〕  前記エチレン−ビニルアルコール共重合体が、繰り返し単位（１）を、共重合体中の全繰り返し単位に対し、０モル％超５０モル％以下有するエチレン−ビニルアルコール共重合体である、前記〔６〕に記載の多孔質粒子。
〔８〕  化学架橋構造を有する、前記〔６〕又は〔７〕に記載の多孔質粒子。
〔９〕  下記式（２）で表されるビニルアルコール由来の繰り返し単位（以下、「繰り返し単位（２）」とも称する）を有する、前記〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の多孔質粒子。【００１５】
【化２】
2017090658.tif 000003
【００１６】
〔１０〕  前記〔６〕〜〔９〕のいずれかに記載の多孔質粒子にリガンドが結合された、担体（以下、「本発明の担体」とも称する）。
〔１１〕  前記リガンドが、イムノグロブリン結合ドメインを含むタンパク質である、前記〔１０〕に記載の担体。
〔１２〕  標的物質の分離用である、前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の担体。
〔１３〕  体液灌流吸着用である、前記〔１０〕又は〔１１〕に記載の担体。【００１７】
〔１４〕  前記〔１０〕〜〔１３〕のいずれかに記載の担体がカラム容器に充填された、カラム（以下、「本発明のカラム」とも称する）。
〔１５〕  前記〔１０〕〜〔１３〕のいずれかに記載の担体を用いることを特徴とする、標的物質の分離方法（以下、「本発明の標的物質の分離方法」とも称する）。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の多孔質粒子の製造方法によれば、合成高分子系の粒子であるにも拘らず非特異吸着が発生しにくく、且つ機械的強度が高く、リガンドを結合した場合の動的結合容量が大きい多孔質粒子を、簡便且つ容易に製造できる。
本発明の多孔質粒子は、合成高分子系の粒子であるにも拘らず非特異吸着が発生しにくく、且つ機械的強度が高く、リガンドを結合した場合の動的結合容量が大きい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】調製例１で得た粒子Ａ〜Ｃ及び担体Ａの粉末Ｘ線回折のピークを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
〔多孔質粒子〕
本発明の多孔質粒子は、ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体に由来し、且つ空隙率が７５％以上の多孔質粒子である。
【００２１】
（空隙率）
本発明の多孔質粒子の空隙率は、７５％以上である。空隙率を７５％以上とすることによって、リガンドを結合させた場合における動的結合容量を飛躍的に増大させることができる。
空隙率としては、リガンドを結合させた場合における動的結合容量及び標的物質捕捉性能の観点から、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上であり、また、機械的強度の観点から、好ましくは１００％未満、より好ましくは９５％以下である。特に、空隙率を８０％以上とすることによって、リガンドを結合させた場合における動的結合容量が著しく改善される。
空隙率は、多孔質粒子をカラム容器に充填し、基準物質を流すことによって算出することができる。具体的には実施例と同様にして測定すればよい。
【００２２】
本発明の多孔質粒子としては、機械的強度、リガンドを結合させた場合における動的結合容量の観点から、結晶構造を有するものが好ましい。結晶構造の有無はＸ線回折等により確認できる。また、本明細書において、多孔質粒子とは、表面に多数の細孔（ポア）を有する粒子のことをいう。
【００２３】
ここで、本発明で用いるビニルアルコール重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体について詳細に説明する。
上記ビニルアルコール重合体は、下記式（２）で表されるビニルアルコール由来の繰り返し単位で構成される重合体を意味する。
【００２４】
【化３】
2017090658.tif 000004
【００２５】
また、上記エチレン−ビニルアルコール共重合体とは、下記式（１）で表されるエチレン由来の繰り返し単位と繰り返し単位（２）で構成される重合体を意味する。なお、エチレン−ビニルアルコール共重合体は、ランダム共重合体、ブロック共重合体、グラフト共重合体等いずれの共重合体でもこれらの混合物でもよい。
【００２６】
【化４】
2017090658.tif 000005
【００２７】
本発明で用いるエチレン−ビニルアルコール共重合体において、繰り返し単位（１）の含有量は、エチレン−ビニルアルコール共重合体中の全繰り返し単位に対し、０モル％超であるが、リガンドを結合させた場合における動的結合容量の観点から、エチレン−ビニルアルコール共重合体中の全繰り返し単位に対し、好ましくは１モル％超、より好ましくは５モル％超、さらに好ましくは１０モル％以上、特に好ましくは１５モル％以上であり、また、非特異吸着量、排除限界分子量、リガンドを結合させた場合における動的結合容量の観点から、好ましくは５０モル％以下、より好ましくは４５モル％以下、さらに好ましくは４０モル％以下、さらに好ましくは３５モル％以下、特に好ましくは３０モル％以下である。
また、エチレン−ビニルアルコール共重合体は、繰り返し単位（１）の他に、繰り返し単位（２）を有するものであるが、繰り返し単位（２）の含有量は、繰り返し単位（１）以外の残余である。
繰り返し単位（１）、（２）の含有量は、例えば、エチレン−ビニルアルコール共重合体をＮＭＲ測定することにより算出できる。
【００２８】
（けん化度）
本発明で用いるビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体のけん化度は、非特異吸着量の観点から、好ましくは９０モル％以上、より好ましくは９２モル％以上、さらに好ましくは９５モル％以上、特に好ましくは９８モル％以上である。なお、上限については１００モル％以下であればよいが、好ましくは９９．９モル％以下である。
本明細書において、けん化度は、ＪＩＳ  Ｋ６７２６によって測定できる。
【００２９】
（重合度）
本発明で用いるビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体の重合度は、機械的強度の観点から、好ましくは５０以上、より好ましくは１００以上であり、また、水系溶媒に溶解させて重合体溶液を調製する場合に溶液の粘性を抑えることができ、粒子化が容易になる点で、好ましくは１０００未満、より好ましくは５００未満である。
本明細書において重合度は、粘度平均重合度を意味し、ＪＩＳ  Ｋ６７２６に従って算出できる。
【００３０】
本発明の多孔質粒子の原料として、ビニルアルコール重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体に加えて他の重合体（ポリビニルピロリドン等）やそのモノマーを組み合わせて使用してもよい。ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体に由来するポリマー部の含有量は、多孔質粒子に含まれる全繰り返し単位に対して、好ましくは８５〜１００質量％、より好ましくは９０〜１００質量％、さらに好ましくは９５〜１００質量％、特に好ましくは９９〜１００質量％である。
多孔質粒子の原料重合体としては、結晶構造が形成されやすくなり機械的強度が向上する点、リガンドを結合して担体として使用するのに適した排除限界分子量となる点、リガンドを結合させた場合における動的結合容量及び標的物質捕捉性能が改善する点等から、繰り返し単位（１）及び（２）で構成されるもの、つまり、エチレン−ビニルアルコール共重合体が特に好ましい。
【００３１】
ビニルアルコール重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体は、市販品でも、常法に従い合成したものでもよい。ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体は、一般的には酢酸ビニルモノマーを重合させた後、又は酢酸ビニルモノマーとエチレンとを共重合させた後、けん化することで製造される。
【００３２】
（化学架橋構造）
本発明の多孔質粒子としては、化学架橋構造を有するものが好ましい。これによって、機械的強度、耐圧性が向上し、例えば、リガンドを結合して用いた場合に、より高流速での使用が可能となる。
化学架橋構造としては、多孔質粒子に含まれる２つ以上の繰り返し単位（２）中のヒドロキシ基の残基が化学架橋されているものが好ましく、多孔質粒子に含まれる２つ以上の繰り返し単位（２）中のヒドロキシ基の残基が、単結合又は２価以上の連結基で化学架橋されているものがより好ましい。この場合、多孔質粒子は、繰り返し単位（２）と、繰り返し単位（２）が化学架橋された構造との両者を含んでいてもよい（多孔質粒子に含まれる繰り返し単位（２）のうち一部が化学架橋されていても全部が化学架橋されていてもよい）。
【００３３】
上記単結合又は２価以上の連結基としては、架橋剤由来のものが挙げられる。また、２価以上の連結基としては、２〜４価の連結基が好ましく、機械的強度等の観点から、４価の連結基が特に好ましい。
架橋剤としては、アルデヒド化合物、エポキシ化合物、Ｎ−メチロール化合物、ジカルボン酸、ハロゲン化合物、イソシアネート化合物等が挙げられ、アルデヒド化合物、エポキシ化合物、Ｎ−メチロール化合物が好ましく、反応制御が容易な点で、アルデヒド化合物が好ましい。
アルデヒド化合物の具体例としては、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、クロトンアルデヒド、ベンズアルデヒド等のモノアルデヒド化合物；グリオキザール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、アジポアルデヒド、シトルアルデヒド、フタルアルデヒド、イソフタルアルデヒド、マレアルデヒド、グルタルアルデヒド、テレフタルアルデヒド等のジアルデヒド化合物；ジアルデヒドデンプン、ポリアクロレイン等のポリアルデヒド化合物等が挙げられる。これらの中でも、機械的強度等の観点から、ジアルデヒド化合物が好ましく、安全性が高い点で、グルタルアルデヒドが特に好ましい。
エポキシ化合物の具体例としては、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテル、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル等の二官能性ビスエポキシド類；グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル等の３官能以上のポリエポキシド類；エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、エピフルオロヒドリン、エピヨードヒドリン等のエピハロヒドリン類；グリシドール等が挙げられる。
Ｎ−メチロール化合物の具体例としては、ジメチロール尿素、ジメチロールエチレン尿素、ジメチロールプロピレン尿素、ジメチロールウロン、ジメチロールトリアゾン、ジメチロール−４−メトキシ−５，５−ジメチルプロピレン尿素、ジメチロールジヒドロキシエチレン尿素、ジメチロールアルキルカーバメート、メチル化ジメチロールジメトキシエチレン尿素、１，３−ジメチル−４，５−ジヒドロキシエチレン尿素、トリメチロールメラミン、ヘキサメチロールメラミン、メチル化トリメチロールメラミン、メチル化ヘキサメチロールメラミン等が挙げられる。
【００３４】
（反応性官能基）
本発明の多孔質粒子としては、リガンドと結合可能な反応性官能基を有するものが好ましい。斯かる態様の多孔質粒子は、リガンドを結合させるのみで担体として使用でき、支持体として有用である。
リガンドと結合可能な反応性官能基としては、カルボキシ基、ホルミル基、アミノ基、マレイミド基、活性エステル基、エポキシ基が好ましい。これらの中でも、温和な条件でリガンドとの反応が進行する点で、エポキシ基が特に好ましい。
【００３５】
（分配係数Ｋａｖ、排除限界分子量）
本発明の多孔質粒子のＫａｖは、リガンドを結合させた場合における動的結合容量の観点から、好ましくは０．２以上、より好ましくは０．４以上、さらに好ましくは０．５以上、特に好ましくは０．６以上であり、また、非特異吸着量、リガンドを結合させた場合における動的結合容量の観点から、好ましくは０．９以下、より好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。
本発明の多孔質粒子の排除限界分子量は、非特異吸着量やリガンドを結合した場合の動的結合容量の観点から、好ましくは５００ＫＤａ以上、より好ましくは１０００ＫＤａ以上、さらに好ましくは１００００ＫＤａ以上、さらに好ましくは５００００ＫＤａ以上、さらに好ましくは７５０００ＫＤａ以上、特に好ましくは１０万ＫＤａ以上であり、また、非特異吸着量やリガンドを結合させた場合における標的物質捕捉性能の観点から、好ましくは１００万ＫＤａ以下、より好ましくは７５万ＫＤａ以下、特に好ましくは５０万ＫＤａ以下である。
分配係数Ｋａｖ、排除限界分子量は、多孔質粒子をカラム容器に充填し、基準物質を流すことによって算出されるＫａｖ、排除限界分子量を意味し、具体的には実施例と同様にして測定すればよい。
【００３６】
（かさ密度）
本発明の多孔質粒子のかさ密度は、機械的強度及びリガンド結合量等の観点から、好ましくは０．００５ｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．０１ｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは０．０５ｇ／ｍＬ以上であり、また、リガンドを結合させた場合における動的結合容量及び標的物質捕捉性能の観点から、好ましくは１ｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．５ｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは０．３ｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは０．１４ｇ／ｍＬ以下である。特に、かさ密度を０．１４ｇ／ｍＬ以下とすることによって、リガンドを結合した場合の動的結合容量が著しく改善される。
かさ密度は、多孔質粒子の充填層の体積あたりの重量を意味し、具体的には実施例と同様にして測定すればよい。
【００３７】
（比表面積）
本発明の多孔質粒子の比表面積は、非特異吸着量、機械的強度、リガンドを結合させた場合における動的結合容量の観点から、好ましくは５０ｍ2／ｇ以上、より好ましくは７０ｍ2／ｇ以上、さらに好ましくは８０ｍ2／ｇ以上、特に好ましくは９０ｍ2／ｇ以上であり、また、機械的強度の観点から、好ましくは１５０ｍ2／ｇ以下である。
本発明における比表面積とは、水銀ポロシメーターにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の有する表面積を、多孔質粒子の乾燥質量で除した値を意味する。
【００３８】
（平均粒子径）
本発明の多孔質粒子の平均粒子径としては、１０〜１０００μｍが好ましい。平均粒子径を１０μｍ以上とすることにより、リガンドを結合し標的物質の分離に使用した場合における背圧の上昇が抑えられ、高流速でも利用しやすくなる。一方、粒子径を１０００μｍ以下とすることにより、標的物質の分離等において、粒子内部の細孔まで効率的に利用することができる。
平均粒子径は、ＩＳＯ  １３３２０及びＪＩＳ  Ｚ  ８８２５−１に準じたレーザー回折法で測定した体積平均粒子径を意味する。具体的には、レーザー散乱回折法粒度分布測定装置（例えば、ＬＳ  １３  ３２０（（株）ベックマン・コールター等）により粒径分布を測定し、Ｆｌｕｉｄ  Ｒ．Ｉ．  Ｒｅａｌ  １．３３３、Ｓａｍｐｌｅ  Ｒ．Ｉ．Ｒｅａｌ  １．５４  Ｉｍａｇｉｎａｒｙ  ０等を光学モデルとして使用し、体積基準の粒度分布を測定して求められる平均粒子径のことをいう。
【００３９】
本発明の多孔質粒子は、上記化学架橋構造や反応性官能基が導入されたものでもよいが、斯様な場合においても、上記多孔質粒子としては、繰り返し単位（２）を有していてよい。
【００４０】
そして、本発明の多孔質粒子は、合成高分子系の粒子であるにも拘らず宿主細胞に含まれるＨＣＰ（Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）やＤＮＡ等の生体由来不純物等に対して吸着量低減に優れ、優れた防汚性を有する。また、機械的強度が高く、リガンドを結合させた場合における標的物質の動的結合容量が大きい。
【００４１】
〔担体〕
本発明の担体は、本発明の多孔質粒子にリガンドが結合されたものである。なお、本発明の担体は、粒状である。本発明の担体としては、非特異吸着量、機械的強度、動的結合容量の観点から、結晶構造を有するものが好ましい。結晶構造の有無はＸ線回折等により確認できる。
また、リガンドの多孔質粒子への結合は、直接的な結合でもリンカー等を介した間接的な結合でもよい。
本発明の担体は、本発明の多孔質粒子を使用すること以外は、リガンドを共有結合法に従って多孔質粒子へ結合させる等の常法に従い製造することができる。リガンドを結合させる手法としては、プロセスが簡便な点で、上述の反応性官能基をそのままリガンドとの結合部位として利用する手法が好ましい。その他に、反応性官能基がエポキシ基である場合には、多孔質粒子に含まれるエポキシ基を開環して生成するアルコール性水酸基をトシル基などで活性化してからリガンドを結合させる方法や、多孔質粒子に含まれるエポキシ基、或いは当該エポキシ基の開環により生成する開環エポキシ基からさらにリンカーを伸ばしてから、当該リンカーを介してリガンドを結合させる方法が挙げられる。
リガンドの結合条件は、反応性官能基の含有量やリガンドの種類に応じて適宜選択すればよい。リガンドがタンパク質である場合は、タンパク質のＮ末端のアミノ基、タンパク質に含まれるリジン残基のε−アミノ基、システイン残基のメルカプト基等がエポキシ基等の反応性官能基との反応点になりうる。タンパク質を結合させる場合、例えば、タンパク質の等電点に近いバッファー類の水溶液を用い、必要に応じて塩化ナトリウムや硫酸ナトリウムなどの塩を添加し、タンパク質と多孔質粒子を混合しながら、０〜４０℃で１〜４８時間反応させることで、反応性官能基にタンパク質を結合させることができる。
なお、リガンドを結合させた後、担体に残存する反応性官能基に親水化処理（ブロッキング処理）をしてもよい。当該反応性官能基に対する処理は、公知の方法に従って行えばよく、具体的な手法としては、メルカプトエタノール、チオグリセロール等のメルカプト基を含むアルコールを、担体に残存する反応性官能基に反応させる手法等が挙げられる。
【００４２】
（リガンド）
本発明の多孔質粒子に結合されるリガンドとしては、標的物質に対して適度なアフィニティを有するものであれば、その種類は特に限定されない。リガンドの具体例としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパク、アビジン、ストレプトアビジン、レクチン、これらの機能性変異体等のタンパク質；アミノ酸；インシュリン等のペプチド；モノクローナル抗体等の抗体；抗原；酵素；ホルモン；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；ヌクレオチド；ヌクレオシド；ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド等の糖又は多糖；イミノジ酢酸、合成色素、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオン、ビオチンやその誘導体のような低分子化合物を用いることができる。上記に例示したリガンドはその全体を用いてもよいが、酵素処理等によって得られるそのフラグメントを用いてもよい。また、人工的に合成されたペプチドやペプチド誘導体、リコンビナントであってもよい。
【００４３】
イムノグロブリンの分離又は精製に好適なリガンドとしては、イムノグロブリン結合ドメインを含むタンパク質が挙げられる。イムノグロブリン結合ドメインとしては、プロテインＡのイムノグロブリン結合ドメイン、プロテインＧのイムノグロブリン結合ドメイン及びプロテインＬのイムノグロブリン結合ドメインから選ばれる１種又は２種以上のイムノグロブリン結合ドメインが好ましい。なお、リガンドは、複数の同一又は異なる種類のイムノグロブリン結合ドメインを有していてもよい。
このようなリガンドの中では、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ及びそれらの機能性変異体から選ばれる１種又は２種以上が好ましく、プロテインＡ、プロテインＧ及びプロテインＬから選ばれる１種又は２種以上がより好ましく、プロテインＡが特に好ましい。
【００４４】
リガンドの結合量は、リガンドの種類、標的物質の種類などによって、適宜調節されるが、プロテインＡのようなイムノグロブリン結合ドメインを含むタンパク質をリガンドとして結合する場合、粒子１ｇ当たり、好ましくは１０〜２００ｍｇ、より好ましくは２５〜１００ｍｇである。イムノグロブリン結合ドメインを含むタンパク質をリガンドとして結合する場合、粒子１ｇ当たりのリガンドの結合量が１０ｍｇ以上であると動的結合容量に優れたものとなる。一方、２００ｍｇ以下であると、結合した抗体等の解離のために使用する解離液の量が適切な量となる。
【００４５】
そして、本発明の担体は、非特異吸着量低減に優れる。また、機械的強度が高く、標的物質の動的結合容量が大きい。
本発明の担体は、標的物質分離用の担体として有用である。また、本発明の担体は、体液灌流吸着用の担体として有用である。特にアフィニティ型担体として有用である。
【００４６】
標的物質としては、例えば、抗原；モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の抗体；細胞（正常細胞、及び大腸がん細胞、血中循環がん細胞等のがん細胞）；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、多糖、脂質、ビタミン等の生体関連物質が挙げられ、創薬ターゲットとなる薬物、ビオチン等の低分子化合物でもよい。なお、標的物質は、蛍光物質などにより標識化されたものでもよい。
【００４７】
〔カラム〕
本発明のカラムは、本発明の担体がカラム容器に充填されたものである。
本発明のカラムは、標的物質の検出又は分離、体液灌流吸着に使用することができる。特に、アフィニティクロマトグラフィーへの使用や全血潅流型体外循環用カラムとしての使用等に適する。
なお、体液としては、全血、血清、血漿、血液成分、各種血球、血小板等の血液組成成分の他、尿、精液、母乳、汗、間質液、間質性リンパ液、骨髄液、組織液、唾液、胃液、関節液、胸水、胆汁、腹水、羊水等が挙げられる。
【００４８】
〔標的物質の分離方法〕
本発明の標的物質の分離方法は、本発明の担体を用いることを特徴とするものである。
【００４９】
本発明の標的物質の分離方法は、本発明の担体を用いる以外は常法にしたがって行えばよい。例えば、本発明の担体と標的物質を含む試料とを混合するなどして接触させる工程（接触工程）、及び標的物質を捕捉した担体を試料から分離する工程（分離工程）を含む方法が挙げられる。なお、当該分離工程の後に、リガンドと標的物質を解離させる工程を含んでいてもよい。
なお、試料は、標的物質を含むもの又は標的物質を含む可能性があるものであればよい。例えば、体液、菌体液、細胞培養の培地、細胞培養上清、組織細胞の破砕液、標的物質を含有するバッファー溶液等が挙げられる。
【００５０】
そして、本発明の分離方法によれば、標的物質を選択的且つ効率的に分離することができる。
【００５１】
〔多孔質粒子の製造方法〕
本発明の多孔質粒子を製造する方法としては、例えば、以下の工程１及び２を含む方法が挙げられる。
（工程１）ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体を、水系溶媒に溶解させ、重合体溶液を調製する工程
（工程２）前記重合体溶液を、非水系溶媒に分散させＷ／Ｏエマルションを形成する工程
【００５２】
（工程１）
工程１は、ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体（ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体を総称して「原料重合体α」ともいう）を、水系溶媒に溶解させ、重合体溶液を調製する工程である。ビニルアルコール重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体としては、上記で説明した本発明の多孔質粒子を誘導するものを用いればよい。なお、工程１において、本発明の多孔質粒子の原料として、ビニルアルコール重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体に加えて他の重合体（ポリビニルピロリドン等）やそのモノマーを組み合わせて使用してもよい。ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体の使用量は、多孔質粒子に繰り返し単位を与える化合物全量に対して、好ましくは８５〜１００質量％、より好ましくは９０〜１００質量％、さらに好ましくは９５〜１００質量％、特に好ましくは９９〜１００質量％である。
工程１としては、エチレン−ビニルアルコール共重合体を、水系溶媒に溶解させ、重合体溶液を調製する工程が好ましい。エチレン−ビニルアルコール共重合体を用いることによって、リガンドを結合させた場合における動的結合容量及び標的物質捕捉性能が改善する。また、リガンドを結合して担体として使用するのに適した排除限界分子量となり、且つ結晶構造が形成されやすくなり機械的強度が向上する。
【００５３】
工程１で使用する原料重合体αの使用量（ポリマー濃度）は、原料重合体αと水系溶媒との合計使用量に対し、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、特に好ましくは３質量％以上であり、また、好ましくは２５質量％以下、より好ましくは１５質量％以下、特に好ましくは１０質量％以下である。原料重合体αの使用量を３質量％以上とすることにより粒子化しやすくなり、一方、原料重合体αの使用量を１５質量％以下とすることにより、充分な大きさの細孔サイズを確保しやすくなる。また、原料重合体αの使用量を１０質量％以下とすることによって、多孔質粒子にリガンドを結合した場合の動的結合容量が著しく改善される。
【００５４】
本明細書において、水系溶媒は、水、水と混和する溶媒及びこれらを含む混合溶媒を包含する概念をいう。
水系溶媒としては、例えば、水；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒のうち水と混和するもの；エチレングリコール等のポリオール系溶媒のうち水と混和するもの；イソプロパノール等のアルコール系溶媒のうち水と混和するもの；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒のうち水と混和するものが挙げられる。これらは１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
これらの中でも、結晶化速度の観点から、スルホキシド系溶媒のうち水と混和するもの、ポリオール系溶媒のうち水と混和するもの、アルコール系溶媒のうち水と混和するもの及びアミド系溶媒のうち水と混和するものから選ばれる１種又は２種以上（以下、「溶媒ａ」とも称する）と水とを含む混合溶媒、水が好ましく、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、イソプロパノール及びジメチルホルムアミドから選ばれる１種又は２種以上と水とを含む混合溶媒、水がより好ましく、ジメチルスルホキシドと水とを含む混合溶媒が特に好ましい。
溶媒ａと水とを含む混合溶媒を使用する場合、溶媒ａの使用量は、混合溶媒全量に対して、好ましくは４０質量％以上、より好ましくは４５質量％以上、さらに好ましくは５０質量％以上であり、また、好ましくは９０質量％未満、より好ましくは８０質量％未満、さらに好ましくは７０質量％未満である。
【００５５】
工程１で原料重合体αを溶解させる温度は、原料重合体αの結晶部を容易に離解させる点から、好ましくは７０℃以上、より好ましくは８０℃以上、特に好ましくは９０℃以上であり、また、好ましくは１００℃以下である。
また、工程１で原料重合体αを溶解させる時間は特に限定されないが、通常０．１〜２４時間程度である。
【００５６】
（工程２）
工程２は、前記重合体溶液を、非水系溶媒に分散させＷ／Ｏエマルションを形成する工程である。Ｗ／Ｏエマルションを形成させることによって、結晶構造が得られやすくなり、機械的強度を改善できる。また、リガンドを結合させた場合における動的結合容量を大きくでき、また、非特異吸着量も低減できる。
【００５７】
非水系溶媒は、重合体溶液を分散させＷ／Ｏエマルションを形成できるものであれば特に限定されないが、水と混和しない非水系溶媒が通常使用される。
非水系溶媒としては、例えば、脂肪族炭化水素系溶媒、芳香族炭化水素系溶媒、脂環式炭化水素系溶媒、ハロゲン化炭化水素系溶媒等の炭化水素系溶媒が挙げられる。これらは１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。具体的には、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、イソオクタン、ノナン、メチルシクロヘキサン、灯油、流動パラフィン、ベンゼン、トルエン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、ジクロロメタン、オルトジクロロベンゼン、パラジクロロベンゼン、メタジクロロベンゼン等が挙げられる。
非水系溶媒の使用量は、重合体溶液１００質量部に対して、通常３０〜２００質量部程度、好ましくは５０〜１５０質量部である。
【００５８】
工程２は、分散剤の存在下で行ってもよい。分散剤としては、例えば、各種界面活性剤；ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリオキシアルキレン類；ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルエチルエーテル等のポリビニルエーテル類；ポリ２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ポリラウリル（メタ）アクリレート、ポリステアリル（メタ）アクリレート等のポリアルキル（メタ）アクリレート類；ポリビニルピロリドン、ポリ（メタ）アクリルアミド等の水系溶媒に可溶な高分子分散剤；ポリビニルバーサテート、ポリビニル２−エチルヘキサノエート等の高級脂肪酸ビニルエステルのポリマーをはじめとする、非水系溶媒に可溶な高分子分散剤が挙げられる。これらは１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
これらの中でも、界面活性剤が好ましく、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等のノニオン性界面活性剤がより好ましい。
分散剤の使用量は、非水系溶媒１００質量部に対して、通常１〜３０質量部程度、好ましくは５〜２０質量部である。
【００５９】
また、Ｗ／Ｏエマルションを形成させる手法は特に限定されないが、重合体溶液と非水系溶媒を混合・攪拌することによってＷ／Ｏエマルションを形成させるのが好ましい。これにより、特殊な設備を用いることなく簡便にＷ／Ｏエマルションを形成させることができる。
【００６０】
工程２の分散温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常２〜９５℃、好ましくは２５〜９０℃である。また、分散時間は特に限定されないが、通常０．１〜２時間であり、好ましくは０．５〜１時間である。
【００６１】
（工程３）
本発明の多孔質粒子の製造方法としては、（工程３）工程２で形成されたＷ／Ｏエマルションを冷却し、多孔質粒子を形成させる工程をさらに含む方法が好ましい。工程３における冷却により、Ｗ／Ｏエマルションの結晶化が促進され、多孔質粒子の機械的強度が向上する。また、得られる多孔質粒子の細孔が所望のサイズに形成されやすくなる。
【００６２】
工程３における冷却は、工程２における分散温度よりも相対的に低い温度とすればよいが、冷却温度としては、結晶化促進の観点から、好ましくは０℃以上であり、また、結晶化速度及び粒子化の観点から、好ましくは２０℃以下、より好ましくは１０℃以下、特に好ましくは５℃以下である。
また、冷却時間は特に限定されないが、通常０．５〜１２時間程度であり、好ましくは１〜５時間である。
【００６３】
また、粒子の機械的強度の観点から、上記冷却の後、２０℃超４０℃以下の温度範囲に系内を加温するのが好ましい。加温時間は、通常０．５〜３時間程度であり、好ましくは１〜２時間である。
【００６４】
（工程４）
本発明の多孔質粒子の製造方法としては、（工程４）工程３で形成された多孔質粒子を化学架橋する工程をさらに含む方法が好ましい。工程４により、得られる多孔質粒子の機械的強度がさらに向上する。
化学架橋は、公知の方法（例えば、特開２００５−１７１０４０号公報参照）に従い、架橋剤を使用するなどして行えばよい。
架橋剤としては、化学架橋構造を与えるものとして前述した架橋剤を使用すればよい。
架橋剤の使用量は、工程３で得られた多孔質粒子１００質量部（粒子乾燥質量）に対して、通常２５〜３００質量部程度、好ましくは５０〜１５０質量部である。
【００６５】
架橋剤としてアルデヒド化合物を使用する場合、化学架橋は酸触媒存在下で行うのが好ましい。酸触媒としては、塩酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸；シュウ酸、酢酸等の有機酸が挙げられるが、無機酸が好ましく、硫酸が特に好ましい。なお、酸触媒は１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
酸触媒の使用量は、機械的強度の観点から、アルデヒド化合物１００質量部に対して、通常１〜２００質量部、好ましくは１０〜１００質量部である。
【００６６】
工程４は、溶媒存在下で行うのが好ましい。当該溶媒としては、原料重合体αを溶解させずに架橋剤を溶解させる溶媒が好ましい。具体的には、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、グリセリン等のアルコール系溶媒；これらの混合溶媒等が挙げられる。これらの中でも、産業上の利用が容易であることから、水、エタノール、これらの混合溶媒が好ましい。
溶媒の使用量は、工程３で得られた多孔質粒子１００質量部（粒子乾燥質量）に対して、通常５００〜５０００質量部程度、好ましくは１０００〜４０００質量部である。
【００６７】
工程４の反応温度は、通常４０〜７０℃である。また、工程４の反応時間は特に限定されないが、通常３〜２４時間程度である。
【００６８】
（工程５）
本発明の多孔質粒子の製造方法は、（工程５）工程４で化学架橋された多孔質粒子と、ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体とを接触させる工程をさらに含んでいてもよい。工程４で架橋剤としてアルデヒド化合物を使用した場合には、工程５により、ビニルアルコール重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体に含まれる繰り返し単位（２）中のヒドロキシ基と、多孔質粒子の残存ホルミル基とが反応するため、多孔質粒子の残存ホルミル基をブロッキングすることができる。
上記ビニルアルコール重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体としては、本発明において原料重合体として用いられるビニルアルコール重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体と同様のものが挙げられる。また、ビニルアルコール重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体の使用量は、工程４で化学架橋された多孔質粒子１００質量部（粒子乾燥質量）に対して、通常５〜７５質量部程度、好ましくは１０〜５０質量部である。
工程５は、酸触媒、溶媒存在下で行うのが好ましい。当該酸触媒、溶媒としては、工程４における酸触媒、溶媒と同様のものが挙げられる。
工程５の反応温度は、通常４０〜７０℃である。また、工程５の反応時間は特に限定されないが、通常１〜２４時間程度である。
【００６９】
（工程６）
本発明の多孔質粒子の製造方法は、（工程６）工程３で形成された多孔質粒子、工程４で化学架橋された多孔質粒子、又は工程５でブロッキングが施された多孔質粒子（工程６において、これらを「多孔質粒子Ｚ」と総称する）に、リガンドと結合可能な反応性官能基を導入する工程をさらに含んでいてもよい。
【００７０】
反応性官能基の導入は常法に従い行えばよいが、反応性官能基としてエポキシ基を導入する場合、その手法としては、多孔質粒子Ｚと、エポキシ化合物とを接触させる手法が好ましい。ここで使用するエポキシ化合物は、原料重合体に含まれる繰り返し単位（２）中のヒドロキシ基と反応する官能基（エポキシ基、ハロゲン原子等）に加えて、更にエポキシ基を１個以上有する化合物である。このようなエポキシ化合物としては、例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、エピフルオロヒドリン、エピヨードヒドリン等のエピハロヒドリン；エチレングリコールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、レゾルシノールジグリシジルエーテル、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル等の二官能性ビスエポキシド類；グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル等の３官能以上のエポキシ化合物が挙げられる。これらは１種を単独で用いても２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００７１】
工程６は、必要に応じて塩化ナトリウムや硫酸ナトリウムなどの塩の存在下で行ってもよい。また、工程６は、溶媒存在下で行うのが好ましい。当該溶媒としては、工程４における溶媒と同様のものが挙げられる。
工程６の反応温度は、通常２０〜３７℃である。また、工程６の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜１２時間程度である。
【００７２】
なお、上記工程３〜６において、各生成物の単離は、必要に応じて、ろ過、洗浄、乾燥、再結晶、再沈殿、透析、遠心分離、各種溶媒による抽出、中和、クロマトグラフィー等の通常の手段を適宜組み合わせて行えばよい。
【００７３】
そして、本発明の多孔質粒子の製造方法によれば、合成高分子系の粒子であるにも拘らず非特異吸着が発生しにくく、担体の支持体原料又は支持体として有用な本発明の多孔質粒子を簡便且つ容易に製造できる。また、この製法で得られる多孔質粒子は、機械的強度が高く、リガンドを結合した場合の動的結合容量も大きい。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００７５】
（合成例１  エチレン−ビニルアルコール共重合体の合成）
高圧オートクレーブに酢酸ビニル１００質量部、メタノール５０質量部を仕込み、６０℃に昇温した後３０分間窒素バブリングにより系中を窒素置換した。アゾビスイソブチロニトリルをメタノールに溶解し、濃度０．４質量％の重合開始剤のメタノール溶液（重合開始剤溶液）を調製した後、窒素ガスをバブリングすることによって窒素置換を行った。反応釜のエチレン置換を十分に行った後、反応釜内温を６０℃に調整し、重合開始剤溶液６７質量部を注入し、重合を開始した。重合中は反応釜のエチレン圧力を１．５７ＭＰａに、重合温度を６０℃に維持した。６時間後に冷却して重合を停止した。反応釜を開放して脱エチレンした後、窒素ガスをバブリングしてエチレンを除去した。次いで減圧下に未反応酢酸ビニルを除去した後、共重合体のメタノール溶液とした。
１０質量％に調整した該共重合体溶液にモル比（ＮａＯＨのモル数／ポリ酢酸ビニルのモル数）０．０５のＮａＯＨメタノール溶液（１０質量％）を添加して４０℃に維持し、けん化反応を２時間実施した。重合後に未反応酢酸ビニル単量体を除去して得られた共重合体のメタノール溶液をノルマルヘキサンに投入して共重合体を沈殿させ、回収した共重合体をアセトンで溶解する再沈精製を３回行った後、６０℃で減圧乾燥して共重合体の精製物を得た。
得られたエチレン−ビニルアルコール共重合体において、エチレン由来の繰り返し単位（１）とビニルアルコール由来の繰り返し単位（２）とのモル比をプロトンＮＭＲにより測定したところ、１５：８５であった。また、ＪＩＳ  Ｋ６７２６に従って算出した重合度は４００であり、ＪＩＳ  Ｋ６７２６により測定したけん化度は９９モル％であった。【００７６】
（合成例２  エチレン−ビニルアルコール共重合体の合成）
重合中の反応釜のエチレン圧力を０．６０ＭＰａに変更したこと以外は、合成例１と同様にしてエチレン−ビニルアルコール共重合体を合成した。
得られたエチレン−ビニルアルコール共重合体において、エチレン由来の繰り返し単位（１）とビニルアルコール由来の繰り返し単位（２）とのモル比をプロトンＮＭＲにより測定したところ、５：９５であった。また、ＪＩＳ  Ｋ６７２６に従って算出した重合度は４００であり、ＪＩＳ  Ｋ６７２６により測定したけん化度は９９モル％であった。【００７７】
（調製例１  プロテインＡ結合多孔質粒子の調製）
＜粒子調製＞
合成例１で得られたエチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業社製）８２７質量部及び蒸留水５０２質量部をバッフル付き７Ｌセパラブルフラスコに投入し、１００ｒｐｍで撹拌しながら９５℃で０．５時間加温することでエチレン−ビニルアルコール共重合体を溶解させた。この溶液を、エチレン−ビニルアルコール共重合体溶液Ｌとする。なお、この溶液中のエチレン−ビニルアルコール共重合体の濃度は７質量％である。
次いで、この共重合体溶液Ｌを８０℃まで冷却し、これに別途調製したＳＰＡＮ−８０（東京化成工業製）１４３質量部及びイソオクタン（和光純薬工業社製）１２８７質量部からなる溶液を加え、１２５ｒｐｍで撹拌することでＷ／Ｏエマルションを調製した。Ｗ／Ｏエマルションを３０〜５０分程度かけて０℃付近に冷却し、２〜４時間程度保持し、その後常温に昇温させ１時間撹拌を続けることにより共重合体を球形にした。その後、反応溶液を、４０００質量部のエタノールにて撹拌下で洗浄し、吸引濾過により粒子層を回収した。この多孔質粒子を「粒子Ａ」とする。【００７８】
＜架橋反応＞
回収した粒子Ａ１００質量部（粒子乾燥質量換算）をエタノール２３９９質量部に分散し、次いで、４７質量％硫酸水溶液４３質量部及び２０質量％グルタルアルデヒド水溶液（和光純薬工業製）５００質量部を加え、６０℃で６〜９時間程度架橋反応を実施した。その後、５０００質量部の水にて洗浄し、吸引濾過により粒子層を回収した。このグルタルアルデヒドで架橋を施した多孔質粒子を「粒子Ｂ」とする。【００７９】
＜ブロッキング＞
粒子Ｂ１００質量部（粒子乾燥質量換算）を水２６００質量部に分散させ、そこに、４７質量％硫酸水溶液１１質量部、及び合成例１で得たエチレン−ビニルアルコール共重合体の５質量％水溶液４００質量部を加えた後、５０℃に加熱し、１〜３時間程度反応させた。その後、ヌッチェで濾過し、水で洗浄し、粒子を回収した。このブロッキングを施した多孔質粒子を「粒子Ｃ」とする。【００８０】
＜エポキシ基導入＞
硫酸ナトリウム１００質量部、リン酸二水素ナトリウム２４質量部、及び５０質量％の水酸化ナトリウム水溶液３６質量部を、水１８７６質量部に加え、エポキシ基導入用バッファーを調製した。このエポキシ基導入用バッファー４７５０質量部に、粒子Ｃ１００質量部（粒子乾燥質量換算）、及びエチレングリコールジグリシジルエーテル（和光純薬工業製）１５００質量部を加え、室温で２時間反応させた。その後、ヌッチェで濾過し、水で洗浄し、エポキシ基導入多孔質粒子を回収した。このエポキシ基導入多孔質粒子を「粒子Ｄ」とする。【００８１】
＜プロテインＡ固定化＞
エポキシ基導入多孔質粒子Ｄ１００質量部（粒子乾燥質量換算）と、４８．６８ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ（国際公開第２０１５／０８０１７４号の実施例に記載の方法により作製）の溶液（溶媒：リン酸バッファー）６００質量部と、１Ｍのクエン酸バッファー（ｐＨ１２）８１００質量部とを混合し、２５℃で５時間転倒混和することによって、プロテインＡをエポキシ基導入多孔質粒子Ｄに結合させた。生成した粒子を濾過した後、１Ｍチオグリセロール水溶液７５００質量部と混合し２５℃で１２時間反応させた。次いで、０．１Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ７．６）１５０００質量部、０．５ＭのＮａＯＨ水溶液１５０００質量部及び０．１Ｍのクエン酸バッファー（ｐＨ３．２）１５０００質量部で粒子を洗浄することによって、目的とするプロテインＡ結合多孔質粒子を得た。このプロテインＡ結合多孔質粒子を「担体Ａ」とする。【００８２】
（調製例２  プロテインＡ結合多孔質粒子の調製）
＜粒子調製＞の工程で用いたエチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部を、合成例２で得られたエチレン−ビニルアルコール共重合体（エチレン由来の繰り返し単位（１）とビニルアルコール由来の繰り返し単位（２）とのモル比＝５：９５）８５質量部に変更し、且つ＜ブロッキング＞の工程で用いたエチレン−ビニルアルコール共重合体を、合成例２で得られたエチレン−ビニルアルコール共重合体に変更したこと以外は、調製例１と同様の手順でプロテインＡ結合多孔質粒子を調製した。なお、＜粒子調製＞の工程におけるエチレン−ビニルアルコール共重合体溶液中のエチレン−ビニルアルコール共重合体の濃度は６質量％である。
調製例２において得られたブロッキングが施された多孔質粒子を「粒子Ｅ」とする。また、調製例２において得られたプロテインＡ結合多孔質粒子を「担体Ｂ」とする。【００８３】
（調製例３  プロテインＡ結合多孔質粒子の調製）
＜粒子調製＞の工程で用いたエチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部を、エチレン由来の繰り返し単位（１）とビニルアルコール由来の繰り返し単位（２）とのモル比が２７：７３のエチレン−ビニルアルコール共重合体（クラレ社製エバールＬ１７１Ｂ）８５質量部に変更し、且つ＜ブロッキング＞の工程で用いたエチレン−ビニルアルコール共重合体を、クラレ社製エバールＬ１７１Ｂに変更したこと以外は、調製例１と同様の手順でプロテインＡ結合多孔質粒子を調製した。なお、＜粒子調製＞の工程におけるエチレン−ビニルアルコール共重合体溶液中のエチレン−ビニルアルコール共重合体の濃度は６質量％である。
調製例３において得られたブロッキングが施された多孔質粒子を「粒子Ｆ」とする。また、調製例３において得られたプロテインＡ結合多孔質粒子を「担体Ｃ」とする。【００８４】
（調製例４  プロテインＡ結合多孔質粒子の調製）
＜粒子調製＞の工程で用いたエチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部を、エチレン由来の繰り返し単位（１）とビニルアルコール由来の繰り返し単位（２）とのモル比が３８：６２のエチレン−ビニルアルコール共重合体（クラレ社製エバールＨ１７１Ｂ）８５質量部に変更し、且つ＜ブロッキング＞の工程で用いたエチレン−ビニルアルコール共重合体を、クラレ社製エバールＨ１７１Ｂに変更したこと以外は、調製例１と同様の手順でプロテインＡ結合多孔質粒子を調製した。なお、＜粒子調製＞の工程におけるエチレン−ビニルアルコール共重合体溶液中のエチレン−ビニルアルコール共重合体の濃度は６質量％である。
調製例４において得られたブロッキングが施された多孔質粒子を「粒子Ｇ」とする。また、調製例４において得られたプロテインＡ結合多孔質粒子を「担体Ｄ」とする。【００８５】
（調製例５  プロテインＡ結合多孔質粒子の調製）
＜粒子調製＞の工程で用いたエチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部を、エチレン由来の繰り返し単位（１）とビニルアルコール由来の繰り返し単位（２）とのモル比が４４：５６のエチレン−ビニルアルコール共重合体（クラレ社製エバールＧ１５６Ｂ）８５質量部に変更し、且つ＜ブロッキング＞の工程で用いたエチレン−ビニルアルコール共重合体を、クラレ社製エバールＧ１５６Ｂに変更したこと以外は、調製例１と同様の手順でプロテインＡ結合多孔質粒子を調製した。なお、＜粒子調製＞の工程におけるエチレン−ビニルアルコール共重合体溶液中のエチレン−ビニルアルコール共重合体の濃度は６質量％である。
調製例５において得られたブロッキングが施された多孔質粒子を「粒子Ｈ」とする。また、調製例５において得られたプロテインＡ結合多孔質粒子を「担体Ｅ」とする。【００８６】
（調製例６  プロテインＡ結合多孔質粒子の調製）
＜粒子調製＞の工程で用いたエチレン−ビニルアルコール共重合体１００質量部を、ポリビニルアルコール（日本酢ビ・ポバール社製  ＪＦ−０４、けん化度：９８％）８５質量部に変更し、且つ＜ブロッキング＞の工程で用いたエチレン−ビニルアルコール共重合体を、日本酢ビ・ポバール社製  ＪＦ−０４に変更したこと以外は、調製例１と同様の手順でプロテインＡ結合多孔質粒子を調製した。なお、＜粒子調製＞の工程におけるポリビニルアルコール溶液中のポリビニルアルコールの濃度は６質量％である。
調製例６において得られたブロッキングが施された多孔質粒子を「粒子Ｉ」とする。また、調製例６において得られたプロテインＡ結合多孔質粒子を「担体Ｆ」とする。【００８７】
（比較調製例１  プロテインＡ結合多孔質粒子の調製）
メタクリレートを原料とするプロテインＡ結合多孔質粒子を以下のように調製した。
純水４０９０質量部に、ポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）８．５質量部、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）２．１３質量部及び炭酸ナトリウム４．２６質量部を添加し、一晩撹拌して水溶液（Ｓ−１）を調製した。
水溶液（Ｓ−１）３０質量部を別に抜き取っておき、残りの水溶液（Ｓ−１）に亜硝酸ナトリウム２．１３質量部を溶解して、水溶液（Ｓ−２）を調製した。
次に、グリセリンジメタクリレート（新中村化学工業社製）１２５質量部、グリシジルメタクリレート（三菱レーヨン社製）１７．９質量部及びグリセロールモノメタクリレート（日本油脂社製）３５．９質量部を、２−オクタノン（東洋合成社製）８６．４質量部及びアセトフェノン（和光純薬工業社製）２５３質量部の混液に溶解させ、単量体溶液を調製した。なお、この単量体全量中、グリセリンジメタクリレートは７０質量％であり、グリシジルメタクリレートは１０質量％であり、グリセロールモノメタクリレートは２０質量％である。
次いで、抜き取っておいた水溶液（Ｓ−１）３０質量部に２，２'−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）２．２質量部を添加して分散し、開始剤分散液とした。
次に、準備した水溶液（Ｓ−２）及び単量体溶液をバッフル付きの７Ｌセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、攪拌翼、及び冷却管を装着して温水バスにセットし、窒素雰囲気下、２２０ｒｐｍで撹拌を開始した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、８５℃に到達したところで、上記開始剤分散液を添加し、８５℃に温度を保持しつつ、５時間攪拌を行った。次いで、反応液を冷却した後、かかる反応液をヌッチェで濾過し、純水とイソプロピルアルコールで洗浄した。洗浄した粒子をポリビンに移し、水に分散してデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。以上の操作により水に分散した１２．５質量％の多孔質粒子（粒子乾燥質量１２３ｇ）を得た。この多孔質粒子を「粒子Ｊ」とする。【００８８】
ここで、粒子Ｊのエポキシ基含有量を測定した。すなわち、重合で使用したエポキシ基含有モノマー量より計算されるエポキシ基モル数が２．００ｍｍｏｌとなるように、濃度約１０質量％の粒子Ｊの水分散体（濃度既知）をポリエチレンボトルに測り取り、これに濃度３８質量％の塩化カルシウム水溶液２５ｍＬ及び２規定の塩酸２．００ｍＬを加えて、７５℃で１５０分間攪拌することによりエポキシ基を開環し、冷却後、２規定の水酸化ナトリウム水溶液２．５０ｍＬで中和し、さらにｐＨメーターでｐＨをモニターしながら０．１規定の塩酸で逆滴定することにより測定した。測定の結果、粒子Ｊのエポキシ基含有量は０．４７ｍｍｏｌ／ｇであった。【００８９】
次に、プロテインＡ０．１質量部を０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）２５質量部に分散させ、この分散液と粒子乾燥質量換算で１質量部の粒子Ｊとを混合し、１０℃で２４時間転倒混和することで、プロテインＡを粒子Ｊに結合させた。生成した粒子を濾過した後、１Ｍチオグリセロール２５質量部と混合し３０℃で４時間反応させ、残余のエポキシ基を開環し、ＰＢＳ／０．５質量％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、ＰＢＳで更に洗浄した。得られた多孔質粒子を「担体Ｇ」とする。【００９０】
（比較調製例２  プロテインＡ結合粒子の調製）
エチレン由来の繰り返し単位（１）とビニルアルコール由来の繰り返し単位（２）とのモル比が２７：７３のエチレン−ビニルアルコール共重合体（クラレ社製エバールＬ１７１Ｂ）１００質量部を、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業社製）１５７０質量部に撹拌しながら溶解し、重合体溶液を調製した。なお、この溶液中のエチレン−ビニルアルコール共重合体の濃度は６質量％である。
次に、上記重合体溶液を、内径１５０μｍのノズルより吐出し凝固水中に滴状に落下させ、重合体粒子を得た。
次いで、得られた重合体粒子に、調製例１の＜架橋反応＞、＜ブロッキング＞、＜エポキシ基導入＞、＜プロテインＡ固定化＞と同様の処理を行った。なお、＜ブロッキング＞の工程は、水２６００質量部をジメチルスルホキシド２６００質量部に、合成例１で得たエチレン−ビニルアルコール共重合体の５質量％水溶液４００質量部をクラレ社製エバールＬ１７１Ｂの５質量％ジメチルスルホキシド溶液４００質量部に、それぞれ変更して実施した。
比較調製例２において得られたブロッキングが施された粒子を「粒子Ｋ」とする。また、比較調製例２において得られたプロテインＡ結合粒子を「担体Ｈ」とする。【００９１】
（試験例１  Ｘ線回折）
調製例１で得た粒子Ａを水に分散させてスラリーを得て、このスラリーをｔ−ブチルアルコール溶液で置換後、冷凍庫で３０分凍結させ、真空乾燥機で３時間乾燥させ、乾燥粒子粉末を得た。この乾燥粒子粉末を乳鉢と乳棒を使ってすり潰し、Ｘ線回折装置ＳｍａｒｔＬａｂ（Ｒｉｇａｋｕ社製）を使用し、粉末Ｘ線回折パターンを確認した。調製例１で作製した粒子Ｂ〜Ｃ及び担体Ａについても同様にして粉末Ｘ線回折パターンを確認した。これらの粉末Ｘ線回折パターンを図１に示す。
図１に示すように、粒子Ａ〜Ｃ及び担体Ａいずれも、ビニルアルコールの結晶構造に由来する２θ＝１９．４°付近にピークを有することが確認された（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００４，３７，１９２１−１９２７参照）。【００９２】
（試験例２  分配係数Ｋａｖ及び排除限界分子量）
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおける下記の各マーカー分子溶出体積（ｍＬ）より、調製例１で得た粒子Ｃの分配係数Ｋａｖを測定した。また、測定したＫａｖを使用し、排除限界分子量を測定した。カラム容器は容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）であり、マーカー（１）〜（６）は２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）に溶解して使用した。
マーカー（１）：ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（シグマアルドリッチ社製、ＭＷ：２，２６０  ｋＤａ）
マーカー（２）：Ｃａｒｂｏｎｉｃ  Ａｎｈｙｄｒａｓｅ（シグマアルドリッチ社製、Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｓｓ：２９  ｋＤａ）
マーカー（３）：Ａｌｂｕｍｉｎ（シグマアルドリッチ社製、Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｓｓ：６６  ｋＤａ）
マーカー（４）：β−ａｍｙｌａｓｅ（シグマアルドリッチ社製、Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｓｓ：２００  ｋＤａ）
マーカー（５）：Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（シグマアルドリッチ社製、Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｓｓ：６６９  ｋＤａ）
マーカー（６）：Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社製  ＨＧＧ−１０００）
マーカー（７）：０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製）
分配係数Ｋａｖは次式で求めた。
Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖｏ）／（Ｖｔ−Ｖｏ）
Ｖｅは、各マーカーの溶出体積である。
Ｖｏは、ポリスチレンスルホン酸ナトリウムの溶出体積である。
Ｖｔは、カラム容器に粒子Ｃを充填した際に、粒子の充填層が占める体積（粒子層体積）である。
各マーカーの分子量の対数｛ｌｎ（分子量）（ＭＷ）｝を横軸、Ｋａｖを縦軸にプロットし、直線性を示す部分から下記の式の傾きと切片を求めた。求めた傾きと切片より、Ｋａｖが０となる分子量を算出し、排除限界分子量とした。
Ｋａｖ＝（傾き）×ｌｎ（ＭＷ）  ＋  （切片）
調製例２〜６及び比較調製例２で作製した粒子Ｅ〜Ｉ及びＫについても同様にしてＫａｖ及び排除限界分子量を測定した。試験例２の結果を表２に示す。【００９３】
（試験例３  空隙率）
調製例１で得た粒子Ｃの空隙率を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、試験例２と同様のカラムに充填して、以下の式で算出した。
空隙率［％］＝（Ｖｉ−Ｖｏ）／（ＣＶ−Ｖｏ）×１００
Ｖｉは、試験例２で塩化ナトリウム水溶液を通液した際の溶出体積である。
Ｖｏは、試験例２で記載したとおりである。
ＣＶは、カラムボリュームであり、カラムの直径とカラムの高さから求めた値である。
調製例２〜６及び比較調製例１〜２で作製した粒子Ｅ〜Ｋについても同様にして空隙率を測定した。試験例３の結果を表２に示す。【００９４】
（試験例４  かさ密度）
調製例１で得た粒子Ｃを水に分散させてスラリーを得て、このスラリーをメスシリンダーに投入し、投入量を秤量した。メスフラスコを静置し、重力によりスラリーを完全に沈降させ、沈降体積を求め、かさ密度を以下の式で算出した。
かさ密度＝投入スラリー量［ｇ］×固形分濃度［質量％］／沈降体積［ｍＬ］
なお、固形分濃度は以下のように求めた。上記スラリーをアルミ皿上に投入し、２００℃のホットプレートで加熱することで、水分を完全に除去した。アルミ皿上に残った固形分の質量をスラリーの質量で除し、１００をかけ、固形分濃度［質量％］とした。
調製例２〜６及び比較調製例１〜２で作製した粒子Ｅ〜Ｋについても同様にしてかさ密度を測定した。試験例４の結果を表２に示す。【００９５】
（試験例５  比表面積）
調製例１で得た粒子Ｃの比表面積を、水銀ポロシメーター（島津製作所社製  オートポアＩＶ９５２０）を用いて１０ｎｍ−５０００ｎｍの測定範囲で算出した。
調製例２〜６及び比較調製例１〜２で作製した粒子Ｅ〜Ｋについても同様にして比表面積を測定した。試験例５の結果を表２に示す。【００９６】
（試験例６  非特異吸着性の評価）
容量１ｍＬ（５ｍｍφ×５０ｍｍ長）のカラム容器に、調製例１で得た担体Ａを充填高さ約５ｃｍで充填した。得られたカラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓに接続し、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化させた。
次いで、モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを含有するＣＨＯ細胞培養上清を流速０．２ｍＬ／分にてカラムに通液した。
次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、及び２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を、それぞれ５カラム容量、流速０．２ｍＬ／分にてカラムに順次通液した。
その後、１００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）を、流速０．２ｍＬ／分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、波長２８０ｎｍのＵＶの吸光度が１００ｍＡｕの溶出フラクションを回収した。
そして、分光光度計を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）を測定した。また、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，３Ｇを用い、回収したフラクション中に含有されるＨｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を測定した。さらにＨＣＰの濃度を抗体濃度で除することにより、単位抗体量当たりのＨＣＰ量を算出し、以下の評価基準に従い非特異吸着性を評価した。
・非特異吸着性評価基準
ＡＡ：２０００ｐｐｍ／ＩｇＧ以下
Ａ：２０００ｐｐｍ／ＩｇＧ超３０００ｐｐｍ／ＩｇＧ以下
Ｂ：３０００ｐｐｍ／ＩｇＧ超４０００ｐｐｍ／ＩｇＧ以下
Ｃ：４０００ｐｐｍ／ＩｇＧ超
調製例２〜６及び比較調製例１〜２で作製した担体Ｂ〜Ｈについても同様にして、ＨＣＰを定量し、非特異吸着性を評価した。試験例６の結果を表３に示す。【００９７】
（試験例７  動的結合容量（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＤＢＣ）の測定）
ＧＥヘルスケア社製クロマトグラフィー装置ＡＫＴＡ  ｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトポリクローナルＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社製  ＨＧＧ−１０００）に対する調製例１で得た担体ＡのＤＢＣを測定した。カラム容器として容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のカラム容器を、タンパク質として２０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）に５．３ｍｇ／ｍＬの濃度でタンパク質を溶解したものを、それぞれ使用し、吸光度モニターで溶出液中のヒトポリクローナルＩｇＧの濃度が１０％ブレークスルー（破過）したときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを算出し、以下の評価基準に従いＤＢＣを評価した。
・ＤＢＣ評価基準
ＡＡ：５５ｍｇ／ｍＬ以上７５ｍｇ／ｍＬ未満
Ａ：４５ｍｇ／ｍＬ以上５５ｍｇ／ｍＬ未満
Ｂ：２５ｍｇ／ｍＬ以上４５ｍｇ／ｍＬ未満
Ｃ：２５ｍｇ／ｍＬ未満
調製例２〜６及び比較調製例１〜２で作製した担体Ｂ〜Ｈについても同様にしてＤＢＣを測定した。試験例７の結果を表３に示す。【００９８】
（試験例８  機械的強度の評価（測定可能線流速））
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ａｖａｎｔを用いて、１６ｍｍφ×１５０ｍｍのカラム容器に線流速３００ｃｍ／ｈｒで超純水を通液し、調製例１で得た担体Ａを充填高さが約１０ｃｍになるように充填した。１分間ごとに線流速を１００ｃｍ／ｈｒずつ上昇させ、カラムにかかる圧力が２ＭＰａを超えない最大の流速を測定可能線流速として測定した。
・機械的強度評価基準
Ａ：測定可能線流速が２０００ｃｍ／ｈｒ以上
Ｂ：測定可能線流速が１０００ｃｍ／ｈｒ以上２０００ｃｍ／ｈｒ未満
Ｃ：測定可能線流速が１０００ｃｍ／ｈｒ未満
調製例２〜６及び比較調製例１〜２で作製した担体Ｂ〜Ｈについても同様にして測定可能線流速を測定した。試験例８の結果を表３に示す。【００９９】
【表１】
2017090658.tif 000006
【０１００】
【表２】
2017090658.tif 000007
【０１０１】
【表３】
2017090658.tif 000008
【０１０２】
表１〜３に示すとおり、メタクリレート系ポリマーを原料重合体とした場合（比較調製例１）は、非特異吸着量が多く、また、機械的強度に劣るものとなった。
また、Ｏ／Ｗエマルションを形成させることで空隙率が６２％の多孔質粒子を調製し、これを用いた場合（比較調製例２）は、動的結合容量が小さかった。
これに対し、ビニルアルコール重合体及びエチレン−ビニルアルコール共重合体から選ばれる１種以上の重合体に由来する空隙率７５％以上の多孔質粒子を用いた場合（調製例１〜６）は、非特異吸着量が少なく、動的結合容量が大きく、優れた機械的強度を示した。特に、エチレン−ビニルアルコール共重合体を水系溶媒に溶解させて重合体溶液を調製し、この重合体溶液を、非水系溶媒に分散させＷ／Ｏエマルションを形成させて得た多孔質粒子を用いた場合（調製例１〜５）は、動的結合容量が殊更大きくなった。
【図１】
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【国際調査報告】
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2017090658.tif 000014
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