(57)【要約】  ４種すべてのデングウイルス血清型に対する中和抗体応答を単回投与にて誘導し、一定量以上のウイルス血症を生じない安全性の高いデングワクチンを見出した。薬効（中和抗体応答）と安全性（ウイルス血症）の成績が共に優れる４価デングウイルス製剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５との相同性が９５％以上あり、該親株の４８３位、５６８位、１６６３位のいずれかのアミノ酸が完全に変異しており、さらに以下の（１）〜（４）のいずれか一つ以上の変異を有する弱毒化血清型１デングウイルス；
（１）Ｋ４８２Ｅ又はＫ４８２Ｅ／Ｋ
（２）Ｋ４８４Ｒ又はＫ４８４Ｒ／Ｋ
（３）Ｉ／Ｔ２３５３Ｔ
（４）Ａ２３６４Ｔ、又はＡ２３６４Ｔ／Ａ
【請求項２】
配列番号１で示される親株０３１３５のアミノ配列との相同性が９７％以上ある、請求項１に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
【請求項３】
配列番号１で示される親株０３１３５のアミノ配列との相同性が９９％以上ある、請求項１に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
【請求項４】
４８３位、５６８位、及び１６６３位のアミノ酸が完全に変異している、請求項１〜３のいずれか一項に記載の弱毒化血清型１ウイルス。
【請求項５】
４８３位の変異がＥ４８３Ｋである、請求項４に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
【請求項６】
５６８位の変異がＫ５６８Ｒである、請求項４に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
【請求項７】
１６６３位の変異がＮ１６６３Ｋである、請求項４に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
【請求項８】
４８３位の変異がＥ４８３Ｋであり、５６８位の変異がＫ５６８Ｒであり、１６６３位の変異がＮ１６６３Ｋである、請求項４に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
【請求項９】
前記（１）〜（４）のすべての変異を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
【請求項１０】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５との相同性が９５％以上あり、該親株の１４３位、４００位、１１０２位、１３０８位、１６５４位のいずれかのアミノ酸が完全に変異しており、さらに以下の（５）又は（６）の変異を有する弱毒化血清型２デングウイルス；
（５）Ｐ２３４７Ｌ又はＰ２３４７Ｐ／Ｌ
（６）Ｔ２８２８Ｍ又はＴ２８２８Ｔ／Ｍ
【請求項１１】
配列番号２で示される親株９９３４５のアミノ配列との相同性が９７％以上ある、請求項２に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
【請求項１２】
配列番号２で示される親株９９３４５のアミノ配列との相同性が９９％以上ある、請求項２に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
【請求項１３】
１４３位、４００位、１１０２位、１３０８位、及び１６５４位のアミノ酸が完全に変異している、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
【請求項１４】
１４３位の変異がＤ１４３Ｎである、請求項１３に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
【請求項１５】
４００位の変異がＴ４００Ｋである、請求項１３に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
【請求項１６】
１１０２位の変異がＤ１１０２Ｎである、請求項１３に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
【請求項１７】
１３０８位の変異がＬ１３０８Ｆである、請求項１３に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
【請求項１８】
１６５４位の変異がＥ１６５４Ｋである、請求項１３に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
【請求項１９】
１４３位の変異がＤ１４３Ｎであり、４００位の変異がＴ４００Ｋであり、１１０２位の変異がＤ１１０２Ｎであり、１３０８位の変異がＬ１３０８Ｆであり、１６５４位の変異がＥ１６５４Ｋである、請求項１３に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
【請求項２０】
前記（５）及び（６）の変異を有する、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
【請求項２１】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２との相同性が９５％以上あり、該親株の２０９位、５８２位、１２１１位、１５６３位のいずれかのアミノ酸が完全に変異しており、さらに以下の（７）〜（１０）のいずれか一つ以上の変異を有する弱毒化血清型３デングウイルス；
（７）Ｋ／Ｒ６７１Ｋ
（８）Ａ６８７Ｖ
（９）Ｔ７６４Ｉ／Ｔ
（１０）Ａ１２３７Ｔ
【請求項２２】
配列番号３で示される親株１６５６２のアミノ配列との相同性が９７％以上ある、請求項２１に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
【請求項２３】
配列番号２で示される親株１６５６２のアミノ配列との相同性が９９％以上ある、請求項２１に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
【請求項２４】
２０９位、５８２位、１２１１位、１５６３位、及び１６５４位のアミノ酸が完全に変異している請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
【請求項２５】
２０９位の変異がＩ２０９Ｌである、請求項２４に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
【請求項２６】
５８２位の変異がＳ５８２Ｇである、請求項２４に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
【請求項２７】
１２１１位の変異がＦ１２１１Ｌである、請求項２４に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
【請求項２８】
１５６３位の変異がＱ１５６３Ｋである、請求項２４に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
【請求項２９】
２０９位の変異がＩ２０９Ｌであり、５８２位の変異がＳ５８２Ｇであり、１２１１位の変異がＦ１２１１Ｌであり、１５６３位の変異がＱ１５６３Ｋである、請求項２４に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
【請求項３０】
前記（７）〜（１０）のすべての変異を有する、請求項２１〜２９に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
【請求項３１】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６との相同性が９５％以上あり、該親株の２１８７位又は２３５４位のアミノ酸が完全に変異しており、さらに、６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、又は２５０８位に変異を有さない、弱毒化血清型４デングウイルス。
【請求項３２】
配列番号４で示される親株１０３６のアミノ配列との相同性が９７％以上ある、請求項３１に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
【請求項３３】
配列番号４で示される親株１０３６のアミノ配列との相同性が９７％以上ある、請求項３１に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
【請求項３４】
２１８７位、及び２３５４位のアミノ酸が完全に変異している、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
【請求項３５】
２１８７位の変異がＬ２１８７Ｆである、請求項３４に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
【請求項３６】
２３５４位の変異がＦ／Ｌ２３５４Ｓである、請求項３４に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
【請求項３７】
２１８７位の変異がＬ２１８７Ｆであり、２３５４位の変異がＦ／Ｌ２３５４Ｓである、請求項３４に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
【請求項３８】
６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、及び２５０８位に変異を有さない、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
【請求項３９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の弱毒化血清型１デングウイルス、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型２デングウイルス、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の弱毒化血清型３デングウイルス、及び請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の弱毒化血清型４デングウイルスよりなる群から選ばれる１つ以上の弱毒赤デングウイルスを抗原として含む、弱毒化デングウイルスワクチン。
【請求項４０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の弱毒化血清型１デングウイルス、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型２デングウイルス、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の弱毒化血清型３デングウイルス、及び請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の弱毒化血清型４デングウイルスを抗原として含む、弱毒化４価デングウイルスワクチン。
【請求項４１】
血清型１、２、３及び４のデングウイルス抗原の混合比率が、１：１：１：１、５：３：５：３、又は５：３：３：３である、請求項３９又は４０に記載の弱毒化デングウイルスワクチン。
【請求項４２】
血清型１、２、３及び４のデングウイルスの各抗原量が、１〜７ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅである、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の弱毒化デングウイルスワクチン。
【請求項４３】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５をイヌ初代腎（ＰＤＫ）細胞で１５〜２５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにアフリカミドリザル腎（Ｖｅｒｏ）細胞で継代することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の弱毒化血清型１デングウイルスの製造方法。
【請求項４４】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５をＰＤＫ細胞で１５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の弱毒化血清型１デングウイルスの製造方法。
【請求項４５】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５をＰＤＫ細胞で２０〜３５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型２デングウイルスの製造方法。
【請求項４６】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５をＰＤＫ細胞で２５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型２デングウイルスの製造方法。
【請求項４７】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２をミドリザル初代腎（ＰＧＭＫ）細胞で２０〜３０継代、ＰＤＫ細胞で２〜５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型３デングウイルスの製造方法。
【請求項４８】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２をＰＧＭＫ細胞で３０継代、ＰＤＫ細胞で４継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項２０〜３０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型３デングウイルスの製造方法。
【請求項４９】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６をＰＤＫ細胞で３５〜４５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項２４〜３０に記載の弱毒化血清型４デングウイルスの製造方法。
【請求項５０】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６をＰＤＫ細胞で４０継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の弱毒化血清型４デングウイルスの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は弱毒化デングウイルスを含むデングワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
デングウイルス感染症は、特定の感染症としては世界三大感染症（エイズ、マラリア、結核）に次いで発症者が多く、世界規模で蔓延している。【０００３】
デングウイルスは、フラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスであり、抗原性で区別される４種の血清型が存在する。ある種の血清型のデングウイルスに感染すると、獲得免疫により同じ血清型のデングウイルスにはおよそ生涯にわたって再感染することはないとされるものの、一方で異なる血清型のウイルスに対する交差保護は長くても１２週間程度しか続かないため、２回以上のデングウイルス感染が生じうる。特に、死に至ることがある重篤な病態である「デング出血熱」や「デングショック症候群」は、２回目以降の感染時に起こりやすいことが知られている。【０００４】
デングウイルス感染症には確立された治療法はなく、予防法も限定的である。その他、感染対策としてはデングウイルスの宿主である蚊の駆除や環境整備、個人レベルの対策として忌避剤の使用や適切な服装についての指導に頼っているのが現状である。しかし、これらは費用面や効果面で十分とはいえず、幅広い年齢層への接種が可能で、且つ優れた有効性を示すワクチンによる感染防止又は発症予防が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】欧州特許第1159968号
【特許文献２】特許第5197362号
【特許文献３】特許第5075120号
【特許文献４】国際公開特許WO2007/141259
【特許文献５】国際公開特許WO2000/057910
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Safety and immunogenicity of tetravalent live-attenuated dengue vaccines in Thai adult volunteers: role of serotype concentration, ratio, and multiple doses, Am. J. Trop MedImmune Hyg., 2002; 66(3):264-72.
【非特許文献２】Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates, Expert Rev Vaccines., 2013; 12(8):933-53.
【非特許文献３】Efficacy of a tetravalent chimeric dengue vaccine (DENVax) in Cynomolgus macaques., Am J Trop Med Hyg., 2011; 84(6):978-87.
【非特許文献４】Recombinant, live-attenuated tetravalent dengue virus vaccine formulations induce a balanced, broad, and protective neutralizing antibody response against each of the four serotypes in rhesus monkeys., J Virol, 2005; 79(9):5516-28.
【非特許文献５】Evaluation of Interferences between Dengue Vaccine Serotypes in a Monkey Model, Am J Trop Med Hyg., 2009; 80(2):302-11.
【非特許文献６】Protection of Rhesus monkeys against dengue virus challenge after tetravalent live attenuated dengue virus vaccination., J Infect Dis., 2006; 193(12):1658-65.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述の通り、初感染とは異なる血清型による２回目以降の感染により症状が重篤化するリスクが高いと考えられていることから、同時に４種すべての血清型のデングウイルスへの防御能を賦与しうる４価ワクチンが望まれている。しかしながら数十年に渡るワクチン開発への取り組みがなされたにもかかわらず、４種すべての血清型に対して優れた有効性を示すワクチンは存在しない。【０００８】
デングウイルスゲノムは、Ｃタンパク質、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質などの構造タンパク質と、ウイルス粒子を構成せず複製時に働く７つの非構造（ＮＳ）タンパク質をコードしている。よって、他のウイルスや特定の血清型のデングウイルスをバックボーンとする遺伝子組換えキメラ生ワクチン、又は、不活化全粒子ワクチンやサブユニットワクチン、DNAワクチンなどは、デング由来コンポーネントを欠いており、デングウイルスの自然感染により生体内に生じる様々な免疫抗原の内の一部を提示するにすぎない。【０００９】
一方で、自然宿主とは異なる細胞にて継代馴化して宿主細胞域変異を獲得した弱毒化生ワクチンは、麻疹、風疹、おたふくかぜ、ポリオ等で実績があるように、自然感染時と同様の免疫応答を誘導しうることから、デングウイルス感染症においても高い有効性を期待しうる。【００１０】
現在開発中であることが報告されている又は上市されたデングワクチンは、複数回投与することで４種全ての血清型のデングウイルスに対する中和抗体を誘導させることが可能であるが、４種すべての血清型に対する中和抗体が獲得されるまでに期間を要し、流行地域ではその期間中に自然感染するリスクがあり、単回投与により４種すべての血清型に対する防御免疫を賦与しうるワクチンがより有用性が高いと言える。【００１１】
デングウイルスワクチンの調製にあたって、各血清型の株及び用量の混合組成の選定は容易ではない。単価で投与した場合に高い中和抗体を誘導可能であっても、４価混合し投与すると各血清型のデングウイルスに対する中和抗体レベルが均一とならない（干渉作用）問題がある。また、不十分な中和活性（交差反応、結合）抗体による抗体依存性感染増強（ADE；Antibody-Dependent Enhancement）の問題もある。【００１２】
既承認薬又は臨床段階にある主要な開発品は、SanofiのChimeriVax-DEN（Dengvaxia（商標名））、TakedaのDENVax（商標名）及びButantanのTetraVax（商標名）の３つであり、いずれも遺伝子組み換えキメラ生ワクチンである。SanofiのDengvaxiaは、黄熱ワクチン株YF-17Dをバックボーンとする遺伝子組換えキメラ生ワクチンであり、メキシコ、ブラジル及びフィリピンの３ヶ国で９歳から４５歳を対象に６箇月間隔３回接種の用法で承認されている。【００１３】
DengvaxiaのPhase３試験は、東南アジア５ヶ国において、２歳から１５歳の年齢層の約１万人、及び南米５ヶ国にて９〜１６歳の年齢層の約２万人を被験者とし実施された。その結果、有効性は６割程度に留まり、特に血清型２に対する有効性は約４割と低く十分ではなかった。また、デング既存免疫がない被験者に対する有効性は約４割であった。さらに、Phase３試験の長期フォローアップ及びタイにおけるPhase2b試験の長期フォローアップでの結果では、３年目の時点で９歳未満の年齢層での入院リスクが非接種群に対して1.6倍と高くなっており、特に５歳以下では約５倍と高くなっていた。この点がVaccine Enhancementではないかと問題視されている。有効性が低い原因としては、デング由来コンポーネントの不足や流行株の変異などが考察されている。よって、デング由来コンポーネントをすべて含み、かつ、積極的なクローニングを行っておらずウイルスの亜集団（quasispecies）を含む、継代馴化生ワクチンであればより高い効果が期待できる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、薬効と安全性の成績が共に優れる弱毒化４価デング生ウイルスワクチンを見出した。また、単回投与であっても、複数回投与であっても、薬効と安全性の成績が優れる弱毒化４価デング生ウイルスワクチンを見出した。【００１５】
野生型のデングウイルス（血清型１〜４）を、イヌ初代腎（ＰＤＫ；Ｐｒｉｍａｒｙ Ｄｏｇ Ｋｉｄｎｅｙ）細胞やミドリザル初代腎（ＰＧＭＫ；Ｐｒｉｍａｒｙ Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｎｋｅｙ Ｋｉｄｎｅｙ）細胞で継代して得た弱毒株が知られている。本発明は、さらに、アフリカミドリザル腎（Ｖｅｒｏ）細胞で継代することによって得られる弱毒化デングウイルス、及び、それらをバンク化した生ウイルスを抗原として含む弱毒化デングウイルスワクチンを提供する。【００１６】
したがって、本発明は以下を含む。
[１] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５との相同性が９５％以上あり、該親株の４８３位、５６８位、１６６３位のいずれかのアミノ酸が完全に変異しており、さらに以下の（１）〜（４）のいずれか一つ以上の変異を有する弱毒化血清型１デングウイルス；
（１）Ｋ４８２Ｅ又はＫ４８２Ｅ／Ｋ
（２）Ｋ４８４Ｒ又はＫ４８４Ｒ／Ｋ
（３）Ｉ／Ｔ２３５３Ｔ
（４）Ａ２３６４Ｔ、又はＡ２３６４Ｔ／Ａ
[２] 配列番号１で示される親株０３１３５のアミノ酸配列との相同性が９７％以上ある、[１]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[３] 配列番号１で示される親株０３１３５のアミノ酸配列との相同性が９９％以上ある、[１]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[４] ４８３位、５６８位、及び１６６３位のアミノ酸が完全に変異している[１]〜[３]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[５] ４８３位の変異がＥ４８３Ｋである、[４]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[６] ５６８位の変異がＫ５６８Ｒである、[４]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[７] １６６３位の変異がＮ１６６３Ｋである、[４]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[８] ４８３位の変異がＥ４８３Ｋであり、５６８位の変異がＫ５６８Ｒであり、１６６３位の変異がＮ１６６３Ｋである、[４]に記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[９] 前記（１）〜（４）のすべての変異を有する、[１]〜[８]のいずれかに記載の弱毒化血清型１デングウイルス。
[１０] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５との相同性が９５％以上あり、該親株の１４３位、４００位、１１０２位、１３０８位、１６５４位のいずれかのアミノ酸が完全に変異しており、さらに以下の（５）又は（６）の変異を有する弱毒化血清型２デングウイルス；
（５）Ｐ２３４７Ｌ又はＰ２３４７Ｐ／Ｌ
（６）Ｔ２８２８Ｍ又はＴ２８２８Ｔ／Ｍ
[１１] 配列番号２で示される親株９９３４５のアミノ酸配列との相同性が９７％以上ある、[１０]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１２] 配列番号３で示される親株９９３４５のアミノ酸配列との相同性が９９％以上ある、[１０]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１３] １４３位、４００位、１１０２位、１３０８位、及び１６５４位のアミノ酸が完全に変異している[１０]〜[１２]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１４] １４３位の変異がＤ１４３Ｎである、[１３]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１５] ４００位の変異がＴ４００Ｋである、[１３]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１６] １１０２位の変異がＤ１１０２Ｎである、[１３]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１７] １３０８位の変異がＬ１３０８Ｆである、[１３]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１８] １６５４位の変異がＥ１６５４Ｋである、[１３]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[１９] １４３位の変異がＤ１４３Ｎであり、４００位の変異がＴ４００Ｋであり、１１０２位の変異がＤ１１０２Ｎであり、１３０８位の変異がＬ１３０８Ｆであり、１６５４位の変異がＥ１６５４Ｋである、[１３]に記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[２０] 前記（５）及び（６）の変異を有する、[１０]〜[１９]のいずれかに記載の弱毒化血清型２デングウイルス。
[２１] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２との相同性が９５％以上あり、該親株の２０９位、５８２位、１２１１位、１５６３位のいずれかのアミノ酸が完全に変異しており、さらに以下の（７）〜（１０）のいずれか一つ以上の変異を有する弱毒化血清型３デングウイルス；
（７）Ｋ／Ｒ６７１Ｋ
（８）Ａ６８７Ｖ
（９）Ｔ７６４Ｉ／Ｔ
（１０）Ａ１２３７Ｔ
[２２] 配列番号３で示される親株１６５６２のアミノ酸配列との相同性が９７％以上ある、[２１]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２３] 配列番号３で示される親株１６５６２のアミノ酸配列との相同性が９９％以上ある、[２１]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２４] ２０９位、５８２位、１２１１位、１５６３位、及び１６５４位のアミノ酸が完全に変異している[２１]〜[２３]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２５] ２０９位の変異がＩ２０９Ｌである、[２４]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２６] ５８２位の変異がＳ５８２Ｇである、[２４]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２７] １２１１位の変異がＦ１２１１Ｌである、[２４]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２８] １５６３位の変異がＱ１５６３Ｋである、[２４]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[２９] ２０９位の変異がＩ２０９Ｌであり、５８２位の変異がＳ５８２Ｇであり、１２１１位の変異がＦ１２１１Ｌであり、１５６３位の変異がＱ１５６３Ｋである、[２４]に記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[３０] 前記（７）〜（１０）のすべての変異を有する、[２１]〜[２９]のいずれかに記載の弱毒化血清型３デングウイルス。
[３１] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６との相同性が９５％以上あり、該親株の２１８７位又は２３５４位のアミノ酸が完全に変異しており、さらに、６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、又は２５０８位に変異を有さない弱毒化血清型４デングウイルス。
[３２] 配列番号４で示される親株１０３６のアミノ酸配列との相同性が９７％以上ある、[３１]に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３３] 配列番号４で示される親株１０３６のアミノ酸配列との相同性が９９％以上ある、[３１]に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３４] ２１８７位、及び２３５４位のアミノ酸が完全に変異している[３１]〜[３３]に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３５] ２１８７位の変異がＬ２１８７Ｆである、[３４]に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３６] ２３５４位の変異がＦ／Ｌ２３５４Ｓである、[３４]に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３７] ２１８７位の変異がＬ２１８７Ｆであり、２３５４位の変異がＦ／Ｌ２３５４Ｓである、[３４]に記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３８] ６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、及び２５０８位に変異を有さない、［３１]〜[３７]のいずれかに記載の弱毒化血清型４デングウイルス。
[３９] [１]〜[９]のいずれかに記載の弱毒化血清型１デングウイルス、[１０]〜[２０] のいずれかに記載の弱毒化血清型２デングウイルス、[２１]〜[３０]のいずれかに記載の弱毒化血清型３デングウイルス、及び[３１]〜[３８]のいずれかに記載の弱毒化血清型４デングウイルスよりなる群から選ばれる１つ以上の弱毒化デングウイルスを抗原として含む、弱毒化デングウイルスワクチン。
[４０] [１]〜[９] のいずれかに記載の弱毒化血清型１デングウイルス、[１０]〜[２０]のいずれかに記載の弱毒化血清型２デングウイルス、[２１]〜[３０]のいずれかに記載の弱毒化血清型３デングウイルス、及び[３１]〜[３８]のいずれかに記載の弱毒化血清型４デングウイルスを抗原として含む、弱毒化４価デングウイルスワクチン。
[４１] 血清型１、２、３及び４のデングウイルス抗原の混合比率が、１：１：１：１、５：３：５：３、又は５：３：３：３である、[３９]又は［４０］に記載の弱毒化デングウイルスワクチン。
[４２] 血清型１、２、３及び４のデングウイルスの各抗原量が、１〜７ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅである、[３９]〜［４１］のいずれかに記載の弱毒化デングウイルスワクチン。
[４３]次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５をイヌ初代腎（ＰＤＫ）細胞で１５〜２５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにアフリカミドリザル腎（Ｖｅｒｏ）細胞で継代することを含む、[１]〜[９]に記載の弱毒化血清型１デングウイルスの製造方法。
[４４] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５をＰＤＫ細胞で１５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[１]〜[９]に記載の弱毒化血清型１デングウイルスの製造方法。
[４５] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５をＰＤＫ細胞で２０〜３５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[１０]〜[２０]に記載の弱毒化血清型２デングウイルスの製造方法。
[４６] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５をＰＤＫ細胞で２５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[１０]〜[２０]に記載の弱毒化血清型２デングウイルスの製造方法。
[４７] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２をミドリザル初代腎（ＰＧＭＫ）細胞で２０〜３０継代、ＰＤＫ細胞で２〜５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[２１]〜[３０]に記載の弱毒化血清型３デングウイルスの製造方法。
[４８] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２をＰＧＭＫ細胞で３０継代、ＰＤＫ細胞で４継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[２１]〜[３０]に記載の弱毒化血清型３デングウイルスの製造方法。
[４９] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６をＰＤＫ細胞で３５〜４５継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[３１]〜[３８]に記載の弱毒化血清型４デングウイルスの製造方法。
[５０] 次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６をＰＤＫ細胞で４０継代して弱毒株とし、前記弱毒株をさらにＶｅｒｏ細胞で継代することを含む、[３１]〜[３８]に記載の弱毒化血清型４デングウイルスの製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明は、４種すべてのデングウイルス血清型に対する中和抗体応答を単回投与であっても誘導でき、上市されている他の弱毒生ウイルスワクチンと同等レベルの安全性（忍容性）を有するデングワクチンを提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、中和抗体価の長期推移（血清型１）を示す。
【図２】図２は、中和抗体価の長期推移（血清型２）を示す。
【図３】図３は、中和抗体価の長期推移（血清型３）を示す。
【図４】図４は、中和抗体価の長期推移（血清型４）を示す。
【図５】図５は、中和抗体価の長期推移と接種回数非依存性（血清型１）を示す。
【図６】図６は、中和抗体価の長期推移と接種回数非依存性（血清型２）を示す。
【図７】図７は、中和抗体価の長期推移と接種回数非依存性（血清型３）を示す。
【図８】図８は、中和抗体価の長期推移と接種回数非依存性（血清型４）を示す。
【図９】図９は、中和抗体応答の抗原量非依存性（血清型１）を示す。
【図１０】図１０は、中和抗体応答の抗原量非依存性（血清型２）を示す。
【図１１】図１１は、中和抗体応答の抗原量非依存性（血清型３）を示す。
【図１２】図１２は、中和抗体応答の抗原量非依存性（血清型４）を示す。
【図１３】図１３は、４価デングワクチンの作製フローを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明によれば、４種すべてのデングウイルス血清型に対する中和抗体応答を単回投与であっても誘導することが可能であり、上市されている他の弱毒生ウイルスワクチンと同等レベルの安全性（忍容性）を有するデングワクチンが提供される。
【００２０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２１】
本発明は、臨床分離された野生型デングウイルス（親株）をＰＤＫ細胞、又はＰＧＭＫ細胞とＰＤＫ細胞で継代することによって得られた弱毒株を、さらにVero細胞で継代して得られる弱毒化デングウイルスに関するものであり、デングワクチン用として用いられるシード株（VMS（Virus Master Seed）、VWS（Virus Working Seed）等）や製品相当継代株（GLP試験用バルク（Pre-CTM：Pre-Clinical Trial Material）等）、及びそれらを用いて作製されるデングワクチンが含まれる。本発明では、親株、弱毒株、シード株、製品相当継代株のアミノ酸配列を比較検討することにより、親株と弱毒株が識別できる部位及び弱毒株とシード株、製品相当継代株が識別できる部位を特定している。
【００２２】
本発明の弱毒化血清型１デングウイルスは、臨床分離株である親株０３１３５（配列番号１）を、イヌ初代腎（ＰＤＫ）細胞にて１５〜２５継代して作出された弱毒株１を、さらにVero細胞で継代することにより得られる。弱毒株１は継代に伴って、親株０３１３５に対して、４８３位のグルタミン酸、５６８位のリジン、１６６３位のアスパラギンのいずれか又はすべてが完全に他のアミノ酸に変異しており、好ましくは、Ｅ４８３Ｋ、Ｋ５６８Ｒ、Ｎ１６６３Ｋの変異を有する本発明の弱毒化血清型１デングウイルスは、さらにVero細胞で継代することにより、上記変異に加えて、４８２位、４８４位、２３５３位、２３６４位のいずれか一つ以上にも変異を有しており、弱毒株１と遺伝的に識別可能である。
【００２３】
本発明の弱毒化血清型２デングウイルスは、臨床分離株である親株９９３４５（配列番号２）を、ＰＤＫ細胞にて２０〜３５継代して作出された弱毒株２を、さらにVero細胞で継代することにより得られる。弱毒株２は継代に伴って、親株９９３４５に対して、１４３位のアスパラギン酸、４００位のトレオニン、１１０２位のアスパラギン酸、１３０８位のロイシン、１６５４位のグルタミン酸のいずれか又はすべてが完全に他のアミノ酸に変異しており、好ましくは、Ｄ１４３Ｎ、Ｔ４００Ｋ、Ｄ１１０２Ｎ、Ｌ１３０８Ｆ、Ｅ１６５４Ｋの変異を有する。本発明の弱毒化血清型２デングウイルスは、さらにVero細胞で継代することにより、２３４７位又は２８２８位にも変異を有しており、弱毒株２と遺伝的に識別可能である。
【００２４】
本発明の弱毒化血清型３デングウイルスは、臨床分離株である親株１６５６２（配列番号３）を、ＰＧＭＫ細胞で２０〜３０継代し、さらにＰＤＫ細胞にて２〜５継代して作出された弱毒株３を、さらにVero細胞で継代することにより得られる。弱毒株３は、親株１６５６２に対して、２０９位のイソロイシン、５８２位のセリン、１２１１位のフェニルアラニン、１５６３位のグルタミンのいずれか又はすべてが完全に他のアミノ酸に変異しており、好ましくは、Ｉ２０９Ｌ、Ｓ５８２Ｇ、Ｆ１２１１Ｌ、Ｑ１５６３Ｋの変異を有する。本発明の弱毒化血清型３デングウイルスは、さらにVero細胞で継代することにより、６７１位、６８７位、７６４位、１２３７位のいずれか一つ以上にも変異を有しており、弱毒株３と遺伝的に識別可能である。
【００２５】
本発明の弱毒化血清型４デングウイルスは、臨床分離株である親株１０３６（配列番号４）を、ＰＤＫ細胞にて３５〜４５継代して作出された弱毒株４を、さらにVero細胞で継代することにより得られる。弱毒株４は、親株１０３６に対して、２１８７位のロイシン、２３５４位のフェニルアラニン／ロイシン（混合アミノ酸）のどちらか又は両方が完全に他のアミノ酸に変異しており、好ましくは、Ｌ２１８７Ｆ、Ｆ／Ｌ２３５４Ｓの変異を有する。本発明の弱毒化血清型４デングウイルスは、６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、又は２５０８位に変異を有さず、弱毒株４と遺伝的に識別可能である。
【００２６】
本発明には、上記の各血清型のデングウイルスを抗原として含むワクチンも含まれる。血清型１〜４それぞれの単価ワクチンであっても良く、いずれかの血清型の組合せでも良く、４価ワクチンであっても良い。４価ワクチンの場合、血清型１、２、３、及び４の抗原混合比率は任意であってよいが、特に１：１：１：１、５：３：５：３、５：３：３：３が好ましい。本発明のデングウイルスワクチンをプライミングワクチンとし、他のワクチンをブースターとして組み合わせてもよい。また、他のフラビウイルスワクチンと混合しても良く、他の感染症などのワクチンと混合して用いても良い。
【００２７】
ワクチンの剤型は適時選択し得る。液状製剤であっても良く、粉末製剤であってもよく、凍結乾燥製剤であっても良い。
【００２８】
親株１６５６２と親株１０３６は、特許文献１に開示されており、また、フランスのCNCM（Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes）に、それぞれI-2482、I-2483として寄託されている。また、親株０３１３５はＧｅｎＢａｎｋにＡＤＪ１８２９５.１として部分配列が登録されており、親株９９３４５はＧｅｎＢａｎｋにＡＤＪ１８２９４.１として部分配列が登録されている。本発明の弱毒化デングウイルス（血清型１〜４）は、米国のATCC（American Type Culture Collection; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 USA）にそれぞれ寄託番号PTA-123506、PTA-123505、PTA-123507、PTA-123508として寄託されている。
【００２９】
本発明では、デングウイルスの塩基配列を次世代シーケンサーを用いて解析している。次世代シーケンサーとは、第２世代シーケンサーとも呼ばれ、例えばIllumina社のSBSシーケンサーの場合、数百万本以上のDNA断片の塩基配列を同時並行的に決定することができる。原理は、基本的にはキャピラリー電気泳動を用いた従来のサンガー法と類似しており、DNA断片をテンプレートとし１塩基ずつ再合成する時の蛍光強度を検出し塩基配列を決定するものである。サンガー法では１〜９６本のDNA断片を同時処理するのに対し、次世代シーケンサーではサンガー法でのキャピラリーに相当する「クラスター」を形成させることで、数百万本以上のDNA断片に対して大量並列処理を行うところに違いがある。これによりシーケンス解析のスピードは飛躍的に向上し、大きなゲノム領域を対象とする研究や高いリード数が要求される低頻度変異の研究や亜集団（quasispecies）の研究ができるようになった。
【００３０】
次世代シーケンサーを用いた塩基配列解析により、ウイルスの亜集団の研究が可能である。混合塩基がある場合にその混合比を得られ、亜集団を確認できることが大きな特徴である。本明細書では、その塩基配列をアミノ酸配列に変換して表記しており、例えば、弱毒株の第４８４部位はリジンが３０%、アルギニンが７０%などのように示される。
【００３１】
本明細書では、親株や弱毒株などとの比較において変異がある部位は、Ｋ４８２Ｅ、Ｋ４８２Ｅ／Ｋなどのように記載する。ここで、「Ｋ４８２Ｅ」とは４８２位のリジンがグルタミン酸に変異していることを意味する。「Ｋ４８２Ｅ／Ｋ」とは、リジンであった４８２位に、変異の結果、グルタミン酸に変異したものとリジンに変異したものの両方が混在していることを意味する。
【００３２】
デングウイルスゲノムはＣタンパク質、Ｍタンパク質、Ｅタンパク質といった構造タンパク質、そしてウイルス粒子を構成せず複製時に働く７つの非構造（ＮＳ）タンパク質をコードしている。デングウイルスゲノムからは、１本のポリタンパク質が翻訳された後、それぞれの構造タンパク質及び非構造タンパク質にプロセシングを受ける。本明細書では、アミノ酸配列中の位置を数える上で、ポリタンパク質の開始コドンを起点としている。
【００３３】
次世代シーケンサーで測定する際には、まずデングウイルスからＲＮＡを抽出し、Ｒａｎｄｏｍプライマーによる逆転写、二本鎖化、アダプター配列付加、増幅を経て、ＳＢＳシーケンサーで短鎖配列の集合データを得る。親株のデータからアセンブラーＶｅｌｖｅｔによりコンティグを作成し、デングウイルスに相同で最も長いコンティグを得る。当該コンティグと相同性の高い遺伝子バンク上の配列をアライメントし、５’末端及び／又は３’末端の配列を補いリシーケンス解析の参照配列とする。リシーケンス解析では、マッパーＢＷＡを用いてシーケンスデータを参照配列にマッピングし、ウイルスゲノム配列を混合塩基も加味して決定する。得られたウイルスゲノム配列から混合アミノ酸を加味してアミノ酸配列を得る。なお、混合アミノ酸には、混合比として全体の１０%以上存在するアミノ酸のみを含めるものとする。
【００３４】
次世代シーケンサーの機種は、MiSeqやHiSeq（共にIllumina社製）などが知られているが、その他の機種であっても構わない。
【００３５】
デングウイルスの弱毒特性は、プラークサイズアッセイや増殖温度感受性試験、動物実験などにより確認することができるが、これに限定されない。プラークサイズアッセイでは、例えばアカゲザル由来のＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用い、プラークの直径を測定し、親株と比較して直径が小さければ弱毒特性が確認される。デングウイルスの増殖温度感受性試験では、例えばVero細胞を用い、培養温度を変化させ、親株と比較して高温増殖能が減じていれば弱毒特性が確認される。
【００３６】
デングウイルスの薬効・安全性試験は、ＮＨＰ（Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ）や一部の遺伝子組換え免疫欠損マウスを用いて行われる。ＮＨＰの代表例はカニクイザルである。
【００３７】
中和抗体価測定は、プラークを指標とするＰＲＮＴ（Ｐｌａｑｕｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｔｅｓｔ）法やウイルス由来タンパク質を抗体で標識するＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ＰＲＮＴ又はＦＲＮＴ（Ｆｏｃｕｓ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｔｅｒ）法が用いられる。
【００３８】
血中ウイルス量の測定は、直接的にプラークサイズアッセイを用いるか、間接的にウイルスゲノム断片を検出するＲＴ−ｑＰＣＲ（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が主に用いるがこれに限定されない。
【００３９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
（１）弱毒株の作製
タイ国マヒドン大学にて、新規のワクチン候補となる弱毒化デングウイルス（血清型１、血清型２、血清型３及び血清型４）が次の手順で作出された。血清型１の弱毒化デングウイルスは、臨床分離株である０３１３５を親株として、イヌ初代腎（ＰＤＫ）細胞にて１５継代することで作出された。血清型２の弱毒化デングウイルスは、臨床分離株である９９３４５を親株として、ＰＤＫ細胞にて２５継代することで作出された。血清型３の弱毒化デングウイルスは、臨床分離株である１６５６２を親株として、初代ミドリザル腎（ＰＧＭＫ）細胞にて３０継代し、さらにＰＤＫ細胞にて４継代することで作出された。血清型４の弱毒化デングウイルスは、臨床分離株である１０３６を親株として、ＰＤＫ細胞にて４０継代することで作出された。なお、血清型１の弱毒化デングウイルスはVero細胞でさらに３継代された。これらの弱毒化デングウイルスを、それぞれ弱毒株１〜４と称する。【００４１】
（２）ＰｒｅＶＭＳの作製
ＶＭＳ（Ｖｉｒｕｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｓｅｅｄ）の作製にあたって、まず、ｐｒｅＶＭＳシードを作製した。ｐｒｅＶＭＳシードは、弱毒株１〜４をVero細胞にてそれぞれ２継代、３継代、３継代、２継代することで得た。以下に各血清型のＰｒｅＶＭＳシードの具体的な作製方法について記載する。【００４２】
（i）血清型１ＰｒｅＶＭＳシード（ＰｒｅＶＭＳ１）
１継代目は、Multiplicity of Infection（MOI）0.001にて弱毒株１を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養１２日後に培養容器ごと２回凍結融解した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。安定剤として上清の２０％量のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum；ウシ胎児血清）を添加後、重曹によりｐＨを調整し、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、感染価は１.６×１０７ＰＦＵ／ｍＬであった。【００４３】
２継代目は、弱毒株１を１継代したウイルスをMOI0.001にて接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養９日後に培養上清を回収した。培養上清に安定剤として２０％終濃度となるようＦＢＳを添加後、重曹によりｐＨを調整し、一時的に凍結保存した。融解後、０.２μｍ無菌ろ過し、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＰｒｅＶＭＳ１の感染価は５.１×１０６ＰＦＵ／ｍＬであった。【００４４】
（ii）血清型２ＰｒｅＶＭＳシード（ＰｒｅＶＭＳ２）
１継代目は、MOI0.001にて弱毒株２を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、ＭＥＭ＋２％培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養１０日後に培養容器ごと２回凍結融解した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。安定剤として２０％終濃度となるようＦＢＳを添加後、重曹によりｐＨを調整し、０．２μｍ無菌ろ過し、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、感染価は２．７×１０５ＰＦＵ／ｍＬであった。【００４５】
２継代目は、弱毒株２を１継代したウイルスをMOI0.001にて接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、ＭＥＭ＋２％培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養１１日後に培養容器ごと２回凍結融解した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として上清の２０％量のＦＢＳを添加し、重曹によりｐＨを調整した後、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、感染価は１.１×１０４ＰＦＵ／ｍＬであった。【００４６】
３継代目は、弱毒株２を２継代したウイルスをMOI0.001にて接種し、３７℃で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、ＭＥＭ＋２％培地を添加し、３７℃で密栓培養し、培養６日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として上清の２０％量のＦＢＳを添加し、重曹によりｐＨを調整した後、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＰｒｅＶＭＳ２の感染価は７.１×１０４ＰＦＵ／ｍＬであった。【００４７】
（iii）血清型３ＰｒｅＶＭＳシード（ＰｒｅＶＭＳ３）
１継代目は、MOI0.001にて弱毒株３を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養１０日後に培養上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として培養上清の２０％量のＦＢＳを添加し、重曹によりｐＨを調整した後、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、感染価は９.８×１０４ＰＦＵ／ｍＬであった。【００４８】
２継代目は、弱毒株３を1継代したウイルスをMOI0.001にて接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養７日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として上清の２０％量のＦＢＳを添加し、重曹によりｐＨを調整した後、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、感染価は１.３×１０５ＰＦＵ／ｍＬであった。【００４９】
３継代目は、弱毒株３を２継代したウイルスをMOI0.001にて接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５％ＣＯ２下で培養し、培養７日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として上清の２０％量のＦＢＳを添加後、重曹によりｐＨを調整し、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＰｒｅＶＭＳ３の感染価は３.７×１０５ＰＦＵ／ｍＬであった。【００５０】
（iv）血清型４ＰｒｅＶＭＳシード（ＰｒｅＶＭＳ４）
１継代目は、MOI0.001にて弱毒株４を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養７日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（１５００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として２０％終濃度となるようにＦＢＳを添加し、重曹によりｐＨを調整した後、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、感染価は１.９×１０７ＰＦＵ／ｍＬであった。【００５１】
２継代目は、弱毒株４を１継代したウイルスをMOI0.001にて接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５％ＣＯ２下で培養し、培養５日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（２０００ｒｐｍ・５分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。０.２μｍ無菌ろ過後、安定剤として２０％終濃度となるようにＦＢＳを添加後、重曹によりｐＨを調整し、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＰｒｅＶＭＳ４の感染価は５.５×１０７ＰＦＵ／ｍＬであった。【００５２】
（３）ＶＭＳの作製
ＰｒｅＶＭＳをさらに１継代し、ウイルスバンクの最上流となるＶＭＳ１、ＶＭＳ２、ＶＭＳ３及びＶＭＳ４を作製した。以下に各血清型のＶＭＳの具体的な作製方法について記載する。【００５３】
（i）ＶＭＳ１
MOI0.01にてＰｒｅＶＭＳ１を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養７日後に培養容器ごと２回凍結融解した。それから、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。安定剤として２０％終濃度となるようにＦＢＳを添加及び０．２％終濃度となるように重曹を添加し、０.２μｍ無菌ろ過後、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＶＭＳ１の感染価は１.４９×１０６ＰＦＵ／ｍＬであった。【００５４】
（ii）ＶＭＳ２
MOI0.001にてＰｒｅＶＭＳ２を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養８日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（１８００ｒｐｍ・１０分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収し、０．２μｍ無菌ろ過した。安定剤として上清の０．２５８倍量のＦＢＳ及び０.０３４４５倍量の重曹を添加し、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＶＭＳ２の感染価は２.０７×１０５ＰＦＵ／ｍＬであった。【００５５】
（iii）ＶＭＳ３
MOI0.01にてＰｒｅＶＭＳ３を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養６日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。安定剤として２０％終濃度となるようにＦＢＳを添加及び０．２％終濃度となるように重曹を添加し、０.２μｍ無菌ろ過後、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＶＭＳ３の感染価は６.４９×１０４ＰＦＵ／ｍＬであった。【００５６】
（iv）ＶＭＳ４
MOI0.01にてＰｒｅＶＭＳ４を接種し、３７℃・５％ＣＯ２下で９０分間ウイルスをVero細胞に吸着させた。この後、無血清培地を添加し、３７℃・５%ＣＯ２下で培養し、培養６日後に培養上清を回収した。それから、遠心分離（３０００ｒｐｍ・１０分間）にて細胞及び細胞残滓を沈殿させ、上清を回収した。安定剤として２０％終濃度となるようにＦＢＳを添加及び０.２％終濃度となるように重曹を添加し、０.２μｍ無菌ろ過後、−６０℃以下で保存した。プラークアッセイで測定した結果、ＶＭＳ４の感染価は９.３９×１０６ＰＦＵ／ｍＬであった。【００５７】
（４）Ｐｒｅ−ＣＴＭの作製
続いて、ＧＬＰ試験用バルク（以下、「Ｐｒｅ−ＣＴＭ」；Pre-Clinical Trial Material）を作製した。血清型１は、ＶＭＳ１をＶｅｒｏ細胞で４継代することで、Ｐｒｅ−ＣＴＭ１を得た。血清型２〜４は、ＶＭＳ２〜４をそれぞれＶｅｒｏ細胞で２継代し、Ｖｉｒｕｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｅｅｄ（ＶＷＳ）を作製した。さらにＶＷＳ２〜４をそれぞれＶｅｒｏ細胞で２継代（ＶＭＳから数えて合計４継代）し、Ｐｒｅ−ＣＴＭ２〜４を得た。ＶＭＳから３継代目までは、培養上清を遠心分離後、その上清に安定剤として２０％終濃度となるようにＦＢＳを添加し、０.２％終濃度となるように重曹を添加した。０.２μｍ無菌ろ過後、−６０℃以下で保存した。最終継代となる４継代時は、培養上清に０.２％終濃度となるように重曹を添加し、清澄ろ過及び０.２μｍ無菌ろ過の後、中空糸膜を用いて濃縮した。濃縮液を０.２μｍ無菌ろ過した後、−６０℃以下で保存した。なお、本実施例ではＶＷＳ１を作製せずにＰｒｅ−ＣＴＭ１を作製しているが、ＶＭＳ１をＶｅｒｏ細胞で２継代してＶＷＳ１を作製した後、さらにＶｅｒｏ細胞で２継代してＰｒｅ−ＣＴＭ１としても良い。【００５８】
（５）配列決定
ウイルスゲノム配列を下記の方法で調べた。各血清型の親株、弱毒株、ＶＭＳ、Ｐｒｅ−ＣＴＭのそれぞれからＲＮＡを抽出し、Ｒａｎｄｏｍプライマーによる逆転写、二本鎖化、アダプター配列付加、増幅を経て、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＳＢＳシーケンサーで短鎖配列の集合データを得た。親株のデータからアセンブラーＶｅｌｖｅｔによりコンティグを作成し、デングウイルスに相同で最も長いコンティグを得た。当該コンティグと相同性の高い遺伝子バンク上の配列をアライメントし、５’末端及び／又は３’末端の配列を補いリシーケンス解析の参照配列とした。リシーケンス解析では、マッパーＢＷＡを用いてシーケンスデータを参照配列にマッピングし、ウイルスゲノム配列を混合塩基も加味して決定した（配列番号１７〜２０に親株１〜４、配列番号２１〜２４に弱毒株１〜４、配列番号２５〜２８にＶＭＳ１〜４、配列番号２９〜３２にＰｒｅ−ＣＴＭ１〜４の塩基配列をそれぞれ示す）。得たウイルスゲノム配列から混合アミノ酸を加味してアミノ酸配列を得た（配列番号１〜４に親株１〜４、配列番号５〜８に弱毒株１〜４、配列番号９〜１２にＶＭＳ１〜４、配列番号１３〜１６にＰｒｅ−ＣＴＭ１〜４のアミノ酸配列をそれぞれ示す）。なお、混合アミノ酸を表記する場合には、混合比として全体の１０%以上存在するアミノ酸のみを表記した。また、アミノ酸配列を比較する際は、各部位の各アミノ酸を比較する時にその各混合比が１０%以上乖離していることを閾値とし、差異の有無を判定した。例えば、親株の５０位が「アラニン９５%、グリシン５%」、弱毒株の５０位は「アラニン８５%、グリシン１４%、プロリン１%」という解析結果を得た場合、親株のアミノ酸表記はＡ（アラニンのみ）、弱毒株のアミノ酸表記はＡ／Ｇ（アラニンとグリシンの混合アミノ酸）となる。この部位において、親株と弱毒株のアラニンの混合比を比較すると１０%以上（１０%）の乖離があるため、親株と弱毒株で「差異あり」の判定となる。グリシンについては９%の差異しか認められないが、最低１種類のアミノ酸で差異が認められれば「差異あり」の判定としている。一方、親株の１００位が「アラニン９４%、グリシン６%」、弱毒株の１００位は「アラニン８５%、グリシン１５%」という場合にも、親株のアミノ酸表記はＡ、弱毒株のアミノ酸表記はＡ／Ｇとなる。しかし、この部位のアラニンとグリシンの混合比をそれぞれ比較すると、共に１０%未満（９%）であるため、「差異なし」の判定となる。【００５９】
（６）アミノ酸配列比較
親株と弱毒株の配列を比較し、アミノ酸の完全変異が生じている部位を確認した（表１〜４）。なお、混合アミノ酸が存在する親株の部位については、弱毒株の同部位において当該親株の混合アミノ酸に含まれない他のアミノ酸に変異している場合に完全変異しているものとみなした。【００６０】
【表１】
2017090762.tif 000002
【００６１】
【表２】
2017090762.tif 000003
【００６２】
【表３】
2017090762.tif 000004
【００６３】
【表４】
2017090762.tif 000005
【００６４】
次に、弱毒株、ＶＭＳ、Ｐｒｅ−ＣＴＭの配列を比較し、弱毒株に対してＶＭＳ及びＰｒｅ−ＣＴＭを識別できる部位を確認した（表５〜８）。【００６５】
【表５】
2017090762.tif 000006
【００６６】
【表６】
2017090762.tif 000007
【００６７】
【表７】
2017090762.tif 000008
【００６８】
【表８】
2017090762.tif 000009
【００６９】
これにより、血清型１のＶＭＳ及びＰｒｅ−ＣＴＭは、親株０３１３５に対して４８３位のグルタミン酸がリジンに、５６８位のリジンがアルギニンに、１６６３位のアスパラギンがリジンに完全変異しており、これらの部位において弱毒株と同じ変異であることが確認された。さらに、４８２位のリジンがグルタミン酸／リジンの混合アミノ酸に、４８４位のリジンがアルギニン／リジンの混合アミノ酸に、２３５３位のイソロイシン／トレオニンの混合アミノ酸がトレオニンに、２３６４位のアラニンがトレオニン／アラニンの混合アミノ酸に変異しており、これらの部位において弱毒株との違いが確認された。【００７０】
血清型２のＶＭＳ及びＰｒｅ−ＣＴＭは、親株９９３４５に対して１４３位のアスパラギン酸がアスパラギンに、４００位のトレオニンがリジンに、１１０２位のアスパラギン酸がアスパラギンに、１３０８位のロイシンがフェニルアラニンに、１６５４位のグルタミン酸がリジンに完全変異しており、これらの部位において弱毒株と同じ変異であることが確認された。さらに２３４７位のプロリンがプロリン／ロイシンの混合アミノ酸に、２８２８位のトレオニンが、トレオニン／メチオニンの混合アミノ酸に変異しており、これらの部位において弱毒株との違いが確認された。【００７１】
血清型３のＶＭＳ及びＰｒｅ−ＣＴＭは、親株１６５６２に対して２０９位のイソロイシンがロイシンに、５８２位のセリンがグリシンに、１２１１位のフェニルアラニンがロイシンに、１５６３位のグルタミンがリジンに完全変異しており、これらの部位において弱毒株と同じ変異であることが確認された。さらに、６７１位のリジン／アルギニンの混合アミノ酸がリジンに、６８７位のアラニンがバリンに、７６４位のトレオニンがイソロイシン／トレオニンの混合アミノ酸に、１２３７位のアラニンがトレオニンに変異しており、これらの部位において弱毒株との違いが確認された。【００７２】
血清型４のＶＭＳ及びＰｒｅ−ＣＴＭは、親株１０３６に対して２１８７位のロイシンがフェニルアラニンに、２３５４位のフェニルアラニン／ロイシンの混合アミノ酸がセリンに完全変異しており、これらの部位において弱毒株と同じ変異であることが確認された。さらに６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、２５０８位が変異しておらず、これらの部位において弱毒株との違いが確認された。【００７３】
（７）ＶＭＳの試験管内弱毒特性
ＶＭＳの試験管内弱毒特性を確認するために、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いたプラークサイズアッセイを行った。プラークの直径を測定し、測定結果により表９のように区分した。【００７４】
【表９】
2017090762.tif 000010
【００７５】
その結果、ＶＭＳ１、ＶＭＳ２、ＶＭＳ３及びＶＭＳ４のプラークサイズの分布は、それぞれの親株に対して小さく、弱毒特性を示すことを確認した（表１０）。【００７６】
【表１０】
2017090762.tif 000011
【００７７】
（８）ＶＭＳの増殖温度感受性試験
ＶＭＳ１、ＶＭＳ２及びＶＭＳ４については３５℃及び３９℃、ＶＭＳ３については３５℃及び３８℃で、それぞれ一定日数の間Vero細胞で培養し、低温培養時と高温培養時での増殖量の差を確認した。その結果、それぞれの親株と比較して、ＶＭＳ１、ＶＭＳ２、ＶＭＳ３及びＶＭＳ４すべてにおいて増殖温度感受性が高く、弱毒特性を示すことを確認した（表１１）。【００７８】
【表１１】
2017090762.tif 000012
【実施例２】
【００７９】
１．カニクイザルを用いた４価デングウイルス製剤の薬効・安全性評価試験１
デングウイルス感受性実験動物は、ＮＨＰ（Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ）や一部の遺伝子組換え免疫欠損マウスに限られるため、ＮＨＰであるカニクイザルを用いて、薬効（中和抗体応答）及び安全性（ウイルス血症）の評価を実施した。なお、中和抗体応答はワクチン開発上の主要評価項目の一つであり、ウイルス血症はヒトでの病原性及び症状の重篤化に起因する要素の一つである。【００８０】
（１）４価デングウイルス製剤（５５５５製剤）の調製
実際のワクチン投与時に近い反応を観察するため、ＶＭＳ１、ＶＭＳ２、ＶＭＳ３及びＶＭＳ４をVero細胞で４継代した後（ＶＭＳＶＰ１、ＶＭＳＶＰ２、ＶＭＳＶＰ３、ＶＭＳＶＰ４）、４価デングウイルス製剤を調製した。その際、各ＶＭＳＶＰの投与量が、５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬ、１.０ｍＬ／ｄｏｓｅとなるように調製した（５５５５製剤）。この５５５５製剤を３頭のカニクイザルの前腕部皮下に麻酔下で投与した（５５５５群）。投与時をＤａｙ０とし、Ｄａｙ０、１、２、３、４、６、８、１０、１４、３０、６０に麻酔下で採血を実施した。【００８１】
（２）Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ＰＲＮＴ法による中和抗体価測定
Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ＰＲＮＴ（Ｐｌａｑｕｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｔｅｓｔ）法により、Ｄａｙ０、１４、３０、６０の採血で得た血清中の中和抗体価を測定した。その結果、全３個体、４種すべての血清型についてＤａｙ１４以降で中和抗体が陽転しており、少なくともＤａｙ６０までの間は陽性を維持していた（陽転基準は１０ＰＲＮＴ５０以上；表１２及び表１３）。【００８２】
【表１２】
2017090762.tif 000013
【００８３】
【表１３】
2017090762.tif 000014
【００８４】
（３）ＲＴ−ｑＰＣＲ法による血中ゲノム量測定
ＲＴ−ｑＰＣＲ（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、Ｄａｙ１、２、３、４、６、８、１０、１４に採取した血清中のウイルスゲノム量を測定したところ、全３個体について全て定量限界未満であった（定量限界：１型は５００、２型、３型及び４型は１０００；単位はｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ／ｍＬ ｓｅｒｕｍ）。【００８５】
上記結果より、良好な薬効及び安全性が確認された。
【実施例３】
【００８６】
１．カニクイザルを用いた４価デングウイルス製剤の薬効・安全性評価試験２
血清型別に異なる配合量（混合用量）を調製した４価デングウイルス製剤の薬効・安全性への影響を確認する目的で、以下の実験を行った。【００８７】
（１）４価デングウイルス製剤（５３５３製剤、５３３３製剤）の調製
ＶＭＳＶＰ１及びＶＭＳＶＰ２、ＶＭＳＶＰ３、ＶＭＳＶＰ４のそれぞれの含有量を５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅとした製剤（５３５３製剤）と、ＶＭＳＶＰ１の含有量を５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、ＶＭＳＶＰ２、ＶＭＳＶＰ３及びＶＭＳＶＰ４の含有量を３ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅとした製剤（５３３３製剤）を調製し、カニクイザル３頭を用いて中和抗体応答及びウイルス血症を評価した（それぞれ５３５３群、５３３３群）。【００８８】
（２）Immunospot ＰＲＮＴ法による中和抗体価測定
中和抗体応答について、５３５３群の一頭が４型に対してのみＤａｙ１４では陽転していなかったことを除き、５３５３群及び５３３３群共にＤａｙ１４以後で中和抗体が陽転しており、Ｄａｙ６０までの間、陽転が維持されていた（表６〜表９）。また、Ｄａｙ１４に４型の陽転が認められなかった５３５３群の一頭についても、Ｄａｙ３０以後は陽転しており、その後Ｄａｙ６０まで陽転が維持されていた（表１４〜１７）。【００８９】
【表１４】
2017090762.tif 000015
【００９０】
【表１５】
2017090762.tif 000016
【００９１】
【表１６】
2017090762.tif 000017
【００９２】
【表１７】
2017090762.tif 000018
【００９３】
（３）ＲＴ−ｑＰＣＲ法による血中ゲノム量測定
Ｄａｙ４にて５３３３群の一頭のみから、血清型１及び血清型４についてわずかに定量限界を上回るウイルスゲノムが検出された（それぞれ１６３２、２８０８ｇｅｎｏｍｅ／ｍＬ）が、５３３３群及び５３５３群の他の個体については定量限界未満であった。また、Ｄａｙ４にてウイルスゲノムが検出された一頭についても、血清型１の親株及び血清型４の親株をそれぞれ等量単価接種した場合の個体別ピークウイルス量の幾何平均（それぞれ７５００１（２１８６４〜５９２６５０）、９８５３（３００６〜３２３１５）ｇｅｎｏｍｅ／ｍＬ、Ｎ＝３）に比して、低い値であった。【００９４】
上記結果より、５３５３製剤及び５３３３製剤は、５５５５製剤と同等の薬効・安全性が示され、製剤中における血清型別のウイルス配合量の違いによっては、薬効・安全性に大きな影響はないことが確認された。
【実施例４】
【００９５】
５５５５製剤、５３５３製剤及び５３３３製剤とは異なる弱毒化デングウイルス由来のデングウイルスを含む製剤についても評価する目的で以下の実験を行った。【００９６】
（１）弱毒株２Ｂ及び弱毒株４Ｂの作製
上述の実施例１（１）弱毒株の作製において、血清型２の臨床分離株９９３４５を親株として、ＰＤＫ細胞で３５継代して作出した弱毒化デングウイルスを弱毒株２Ｂと称する。また、血清型４の臨床分離株１０３６を親株として、ＰＤＫ細胞にて４５継代して作出した弱毒化デングウイルスを弱毒株４Ｂと称する。【００９７】
（２）ＬＡＶＶＰ２Ｂ及びＬＡＶＶＰ４Ｂの作製
弱毒株２Ｂ及び弱毒株４ＢをVero細胞で継代し、それぞれＬＡＶＶＰ２Ｂ（Ｌｉｖｅ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｒｏ Ｐａｓｓａｇｅｄ ２Ｂ）及びＬＡＶＶＰ４Ｂを得た。【００９８】
（３）ＶＭＳＶＰ１２３ＬＡＶＶＰ４及びＶＭＳＶＰ１３ＬＡＶＶＰ２４の調製
ＶＭＳＶＰ１、ＶＭＳＶＰ２、ＶＭＳＶＰ３及びＬＡＶＶＰ４Ｂによる４価デングウイルス製剤（各５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ；「ＶＭＳＶＰ１２３ＬＡＶＶＰ４」と呼称）及びＶＭＳＶＰ１、ＬＡＶＶＰ２Ｂ、ＶＭＳＶＰ３及びＬＡＶＶＰ４Ｂによる４価デングウイルス製剤（各５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ；「ＶＭＳＶＰ１３ＬＡＶＶＰ２４」と呼称）を調製し、カニクイザル各３頭を用いて中和抗体応答及びウイルス血症を評価した（それぞれＶＭＳＶＰ１２３ＬＡＶＶＰ４群、ＶＭＳＶＰ１３ＬＡＶＶＰ２４群）。【００９９】
（４）ＰＲＮＴ法による中和抗体価測定
ＰＲＮＴ法により、ＶＭＳＶＰ１２３ＬＡＶＶＰ４群及びＶＭＳＶＰ１３ＬＡＶＶＰ２４群の中和抗体価を測定した。その結果、両製剤とも５５５５製剤と同等の中和抗体応答を誘導した（表１８及び表１９）。【０１００】
【表１８】
2017090762.tif 000019
【０１０１】
【表１９】
2017090762.tif 000020
【０１０２】
（５）ＲＴ−ｑＰＣＲ法による血中ゲノム量測定
ウイルス血症については、ＶＭＳＶＰ１２３ＬＡＶＶＰ４群から比較的高い量の４型のウイルスゲノムがＤａｙ１にて検出（１００６６ｇｅｎｏｍｅ／ｍＬ、ＧＭＴ、Ｎ＝３）されており、ＶＭＳＶＰ１３ＬＡＶＶＰ２４群から比較的高い量の４型のウイルスゲノムと、定量限界をわずかながら上回る量の１型及び２型のウイルスゲノムがＤａｙ１にて検出（それぞれ１２３４０、５４７、１３３７ｇｅｎｏｍｅ／ｍＬ、ＧＭＴ、Ｎ＝３）された。これらのことから、ＶＭＳＶＰはＬＡＶＶＰに比して高度に弱毒化されていることが示唆された。【０１０３】
興味深いことに、ＶＭＳＶＰ１３ＬＡＶＶＰ２４群の２頭より、Ｄａｙ１にて血清型１のウイルスゲノムがわずかながらも検出されており、ＶＭＳＶＰによる４価デングウイルス製剤の組み合わせの素性の良さを示唆していると考えられた。
【実施例５】
【０１０４】
（１）４価デングウイルス製剤（５５５５製剤）の中和抗体価長期観察試験
良好な薬効・安全性を示したＶＭＳＶＰ１、ＶＭＳＶＰ２、ＶＭＳＶＰ３及びＶＭＳＶＰ４を用いて調製した４価デングウイルス製剤（５５５５製剤）について、中和抗体価の長期評価を行う目的で、全６頭のカニクイザル（ＩＤ Ｎｏ.１〜６）に５５５５製剤を単回接種し、接種月をＭｏｎｔｈ０とし、Ｍｏｎｔｈ１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２３、２５と、２年以上に渡り中和抗体価（Ｆｏｃｕｓ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｔｅｒ５０；以下「ＦＲＮＴ５０」）を測定した。【０１０５】
その結果、Ｍｏｎｔｈ１より全ての個体で中和抗体の陽転（ＦＲＮＴ５０＞１０）が認められた。また、中和抗体価の幾何平均値は１〜４型いずれに対しても１００以上であった。中和抗体価はその後２年以上に渡り同程度に維持されており、下降のトレンドは認められなかった（図１〜図４）。【０１０６】
このことから、４価デングウイルス製剤（５５５５製剤）は、少なくとも２年以上は薬効が認められ、また下降のトレンドが認められないことから、より長期にわたって中和抗体価が維持されると期待される。【０１０７】
（２）接種回数及び接種間隔の検討
４価デングウイルス製剤（５５５５製剤）の接種回数と接種間隔の評価を行う目的で、１箇月間隔２回接種、６箇月間隔２回接種のスケジュールで、カニクイザル６頭に本製剤を接種した。【０１０８】
その結果、１箇月間隔２回接種、６箇月間隔２回接種のいずれの場合でも、中和抗体価は単回接種の場合とほぼ同程度に上昇し、また、２回接種以降で中和抗体価に大きな変化は認められなかった。したがって、本デングウイルス弱毒株を含むワクチンは１回の接種により中和抗体応答を十分に誘導し得ることが示唆された。（図５〜図８；図５〜図８は、各５ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅの４価デングウイルス製剤を、カニクイザルに単回接種（Ｎ＝６）、１箇月間隔２回接種（Ｎ＝６）及び６箇月間隔２回接種（Ｎ＝６）したときの中和抗体価の幾何平均値を示した。垂直バーは±ＳＤを示す。）【０１０９】
（３）投与用量試験
さらに異なる用量での反応性を確認する目的で、各５ｌｏｇ１０、各３ｌｏｇ１０、各２ｌｏｇ１０及び各１ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅの４価デングウイルス製剤を調製し、カニクイザルに単回接種した。接種週をＷｅｅｋ０とし、Ｗｅｅｋ２及びＷｅｅｋ５の中和抗体価を測定した。【０１１０】
その結果、Ｗｅｅｋ２において全個体の中和抗体が陽転し、またＷｅｅｋ５においても陽性が維持されていた。したがって、各１ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅという低抗原量からの中和抗体応答が確認できた。（図９〜図１２；図９〜図１２は、各５ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ（Ｎ＝１）、各３ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ（Ｎ＝３）、各２ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ（Ｎ＝３）、各１ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ（Ｎ＝３）の４価デングウイルス製剤を、カニクイザルに単回接種したときのＷｅｅｋ０、Ｗｅｅｋ２及びＷｅｅｋ５の中和抗体価の幾何平均値を示した。垂直バーは±ＳＤを示す。）
【実施例６】
【０１１１】
（１）ＧＬＰ薬効試験
実施例１で調製したＰｒｅ−ＣＴＭを４価混合し、５５５５Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ、４４４４Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ、３３３３Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅの４価デングワクチン製剤を調製した。調製した４価デングワクチン製剤又は媒体をカニクイザルに皮下単回接種し、中和抗体誘導能及びチャレンジウイルス（親株）に対する防御能を評価した。【０１１２】
中和抗体価はＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔ ＰＲＮＴ法で得た。５５５５Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ接種群（Ｎ＝２４）、４４４４Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ接種群（Ｎ＝２４）、３３３３Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ接種群（Ｎ＝２４）のすべての個体でＤａｙ１４より中和抗体陽転が認められた（表２０〜２８）。一方、媒体接種群では中和抗体陽転は認められなかった（表２９、３０）【０１１３】
チャレンジウイルス（親株）に対する防御能評価のため、各群を６頭ずつ均等にさらに群分けし、Ｄａｙ６０にそれぞれの血清型の単価親株を皮下チャレンジした。チャレンジ量は、血清型ごとにそれぞれ５Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、５Ｌｏｇ１０PＦＵ／ｄｏｓｅ、６Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、５Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅとした。チャレンジ１、２、３、４、６，８，１０、１４日後に血清中のウイルスゲノム量を測定したところ、媒体接種群（各Ｎ＝３）ではウイルスゲノムが多く検出されたが（表３１）、ワクチン接種群ではいずれの群においてもウイルスゲノムは検出されなかった。【０１１４】
【表２０】
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【０１１５】
【表２１】
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【０１１６】
【表２２】
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【０１１７】
【表２３】
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【０１１８】
【表２４】
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【０１１９】
【表２５】
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【０１２０】
【表２６】
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【０１２１】
【表２７】
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【０１２２】
【表２８】
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【０１２３】
【表２９】
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【０１２４】
【表３０】
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【０１２５】
【表３１】
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【実施例７】
【０１２６】
（１）サル神経毒力試験
ＶＭＳを被験物質としてＷＨＯ ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９７８、２０１３）に従ったサル神経毒力試験を実施した。１群あたり１２頭のカニクイザルを割り当て、ＶＭＳの各血清型それぞれ５Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ、５Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅ、５Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ、５Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅと、参照ウイルスとしてＹｅｌｌｏｗ Ｆｅｖｅｒ １７Ｄ ５Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｄｏｓｅを頭蓋内に投与した。投与後、３０日間の臨床スコアリング及び３０日経過時点で脳組織及び脊髄に限って剖検を実施した。その結果、神経毒性に関する問題のある臨床的及び組織病理学的所見は認められなかった。
【実施例８】
【０１２７】
（１）ＧＬＰ反復投与毒性試験
実施例１で調製したＰｒｅ−ＣＴＭを４価混合し、７７７７Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ（５ｍＬ）、５５５５Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅ（０．５ｍＬ）の４価デングワクチン製剤を調製した。４価デングワクチン製剤又は媒体をそれぞれ雌雄６頭ずつのカニクイザルの皮下に４週間隔で３回投与する反復投与毒性試験を実施した。被験物質の毒性及び可逆性を評価する目的で、カニクイザルの半数は最終投与３日後、残り半数は最終投与２８日後に剖検した。【０１２８】
評価項目は、一般状態（Clinical signs）、行動・神経機能（general behavior and neurobehavioral function）、局所反応（skin reaction）、体重（body weight）、摂餌量（food consumption）、体温（body temperature）、眼科的検査（ophthalmology）、心電図（electrocardiography）、呼吸数（respiratory rate）、尿検査（urinalysis）、血液学的検査（hematology）、血液生化学的検査（blood chemistry）、剖検（necropsy）、器官重量（organ weights）、病理組織学的検査（histopathology）、精巣細胞数評価（quantitative examination of testes）とした。【０１２９】
反復毒性試験の投与期間及び回復期間中に死亡した個体は、いずれの投与群においても認められなかった。また、投与期間及び回復期間中に、一般状態、行動・神経機能、局所反応、体重、摂餌量、体温、眼科的検査、心電図、呼吸数、尿検査、剖検、器官重量、精巣細胞数評価において、被験物質に関連する変化は雌雄共にいずれの投与群においても認められなかった。【０１３０】
血液学的には被験物質投与により白血球、好中球、リンパ球、単球、好塩基球、大型非染色細胞の個数増加が一部個体で見受けられたものの、接種部位の炎症又は免疫応答に起因する二次的な変化であり、毒性学的に有意なものではないと考えられた。病理組織学的には接種部位のみにおいて血管周囲に炎症性細胞浸潤が極小程度から中程度見受けられたものの、それらは３回目の投与から４週のうちに回復又は回復傾向を示した。【０１３１】
以上より、７７７７Ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅが当該試験におけるｎｏ−ｏｂｓｅｒｖｅｄ−ａｄｖｅｒｓｅ−ｅｆｆｅｃｔ ｌｅｖｅｌと結論付けられた。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明は、デングウイルスを用いたワクチンとして利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年9月25日(2017.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号１のアミノ酸配列を有する血清型１デングウイルス親株０３１３５との相同性が９９％以上あり、該親株の４８３位のグルタミン酸、５６８位のリジン、１６６３位のアスパラギンが、それぞれリジン、アルギニン、リジンに変異しており、さらに以下の（１）〜（４）のすべての変異を有する弱毒化血清型１デングウイルス；
（１）Ｋ４８２Ｅ又はＫ４８２Ｅ／Ｋ
（２）Ｋ４８４Ｒ又はＫ４８４Ｒ／Ｋ
（３）Ｉ／Ｔ２３５３Ｔ
（４）Ａ２３６４Ｔ、又はＡ２３６４Ｔ／Ａ
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号２のアミノ酸配列を有する血清型２デングウイルス親株９９３４５との相同性が９９％以上あり、該親株の１４３位のアスパラギン酸、４００位のトレオニン、１１０２位のアスパラギン酸、１３０８位のロイシン、１６５４位のグルタミン酸が、それぞれアスパラギン、リジン、アスパラギン、フェニルアラニン、リジンに変異しており、さらに以下の（５）及び（６）の変異を有する弱毒化血清型２デングウイルス；
（５）Ｐ２３４７Ｌ又はＰ２３４７Ｐ／Ｌ
（６）Ｔ２８２８Ｍ又はＴ２８２８Ｔ／Ｍ
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
（削除）
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号３のアミノ酸配列を有する血清型３デングウイルス親株１６５６２との相同性が９９％以上あり、該親株の２０９位のイソロイシン、５８２位のセリン、１２１１位のフェニルアラニン、１５６３位のグルタミンが、それぞれロイシン、グリシン、ロイシン、リジンに変異しており、さらに以下の（７）〜（１０）のすべての変異を有する弱毒化血清型３デングウイルス；
（７）Ｋ／Ｒ６７１Ｋ
（８）Ａ６８７Ｖ
（９）Ｔ７６４Ｉ／Ｔ
（１０）Ａ１２３７Ｔ
【請求項２２】
（削除）
【請求項２３】
（削除）
【請求項２４】
（削除）
【請求項２５】
（削除）
【請求項２６】
（削除）
【請求項２７】
（削除）
【請求項２８】
（削除）
【請求項２９】
（削除）
【請求項３０】
（削除）
【請求項３１】
次世代シーケンサーを用いて解析した配列番号４のアミノ酸配列を有する血清型４デングウイルス親株１０３６との相同性が９９％以上あり、該親株の２１８７位のロイシン、２３５４位のフェニルアラニン／ロイシンが、それぞれフェニルアラニン、セリンに変異しており、さらに、６２４位、７４２位、１６２８位、２２８６位、２４８２位、及び２５０８位に変異を有さない、弱毒化血清型４デングウイルス。
【請求項３２】
（削除）
【請求項３３】
（削除）
【請求項３４】
（削除）
【請求項３５】
（削除）
【請求項３６】
（削除）
【請求項３７】
（削除）
【請求項３８】
（削除）
【請求項３９】
（削除）
【請求項４０】
請求項１、１０、２１及び３１のいずれかに記載の弱毒化血清型１〜４デングウイルスを抗原として含む、弱毒化４価デングウイルスワクチン。
【請求項４１】
血清型１、２、３及び４のデングウイルス抗原の混合比率が、１：１：１：１、５：３：５：３、又は５：３：３：３である、請求項４０に記載の弱毒化デングウイルスワクチン。
【請求項４２】
血清型１、２、３及び４のデングウイルスの各抗原量が、１〜７ｌｏｇ１０ＦＦＵ／ｄｏｓｅである、請求項４０又は４１に記載の弱毒化デングウイルスワクチン。
【請求項４３】
（削除）
【請求項４４】
（削除）
【請求項４５】
（削除）
【請求項４６】
（削除）
【請求項４７】
（削除）
【請求項４８】
（削除）
【請求項４９】
（削除）
【請求項５０】
（削除）
【請求項５１】
配列番号９のアミノ酸配列を有する弱毒化血清型１デングウイルス、配列番号１０のアミノ酸配列を有する弱毒化血清型２デングウイルス、配列番号１１のアミノ酸配列を有する弱毒化血清型３デングウイルス、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する弱毒化血清型４デングウイルスを抗原として含む、弱毒化４価デングウイルスワクチン。
【請求項５２】
配列番号１３のアミノ酸配列を有する弱毒化血清型１デングウイルス、配列番号１４のアミノ酸配列を有する弱毒化血清型２デングウイルス、配列番号１５のアミノ酸配列を有する弱毒化血清型３デングウイルス、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する弱毒化血清型４デングウイルスを抗原として含む、弱毒化４価デングウイルスワクチン。
【国際調査報告】
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