(57)【要約】【課題】神経新生を促進する方法の提供。【解決手段】本記述は、概して、例えば、Ａβを認識する抗体および抗体断片を含む、Ａβ結合分子を使用する方法に関する。本記述は、Ａβ結合分子を使用して、神経新生、血管新生、シナプス活性、および／または樹状分岐を促進する方法を提供する。本記述はまた、アミロイド斑またはＡβの蓄積に関連した種々の疾病、疾患、損傷、および病態を治療する方法も提供する。いくつかの実施形態では、Ａβ結合分子は、Ａβ１−４２ペプチド、Ａβ１−４０ペプチド、およびＡβ１−４３ペプチドからなる群より選択されるペプチドに特異的に結合する。【選択図】図３
2014148543.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本記述は、概して、神経学、神経生物学、および分子生物学の分野に関する。本記述は、Ａβ結合分子を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、重要な課題である。脳卒中または脳の外傷の結果としての神経損傷、およびアルツハイマー病等の神経変性疾患は、死亡および障害の主な原因である。哺乳動物の神経系が損傷後に完全に再生することができないことは、主要な臨床的問題である。アルツハイマー病および関連疾病の生体内検出のためのいくつかの方法が報告されている一方で（例えば、非特許文献１を参照されたい）、神経新生および神経組織の再生を促進することが既知である、市販されている薬剤はない。したがって、神経再生の治療手段のための、長年の満たされていない医学的必要性の解決法を提供することが、有益であり得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｒｕｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：７７７−８９（２００８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書に記載するいくつかの実施形態は、神経新生を促進する方法を提供し、該方法は、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む。
【０００５】
本明細書に記載するいくつかの実施形態は、血管新生を促進する方法を提供し、該方法は、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む。
【０００６】
本明細書に記載するいくつかの実施形態は、シナプス密度および／または活性を促進する方法を提供し、該方法は、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む。
【０００７】
本明細書に記載するいくつかの実施形態は、対象のＣＮＳニューロンの樹状分岐を促進する方法を提供し、該方法は、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む。一実施形態では、ＣＮＳニューロンは、顆粒状ニューロンである。
【０００８】
本明細書に記載する方法のさらなる実施形態では、対象は、Ａβを蓄積している。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本明細書の記述は、異常なアミロイドの状態を治療する方法を提供し、該方法は、治療有効量のＡβ結合分子を、それを必要としている対象に投与することを含み、Ａβ結合分子は、神経新生を促進する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、Ａβ結合分子は、Ａβ１−４２ペプチド、Ａβ１−４０ペプチド、およびＡβ１−４３ペプチドからなる群より選択されるペプチドに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、Ａβ結合分子は、線維性Ａβまたはβアミロイド原線維に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、Ａβ結合分子は、びまん性βアミロイド沈着に特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、Ａβ結合分子は、Ａβのネオエピトープに特異的に結合することができる。いくつかの実施形態では、Ａβ結合分子は、βアミロイド斑に特異的に結合することができる。さらなる実施形態では、Ａβ結合分子は、Ｎ末端切断型Ａβ種、Ｃ末端切断型Ａβ種、ピログルタミン酸修飾Ａβ種、レドックス修飾Ａβ種、および二量体Ａβ種からなる群より選択される、Ａβ種に特異的に結合する。
【００１１】
上記の方法の種々の実施形態では、Ａβ結合分子は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）フレームワーク領域は、５つ以下のアミノ酸置換を除いて、ヒトである。いくつかの実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）フレームワーク領域は、５つ以下のアミノ酸置換を除いて、ヒトである。いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖可変領域は、完全にヒトである。
【００１２】
上記の方法の種々の実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、完全にヒトである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）フレームワーク領域は、５つ以下のアミノ酸置換を除いて、マウスである。いくつかの実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）フレームワーク領域は、５つ以下のアミノ酸置換を除いて、マウスである。
【００１４】
上記の方法の種々の実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化されている。
【００１５】
上記の方法の種々の実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、キメラである。
【００１６】
上記の方法の種々の実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、霊長類化されている。
【００１７】
上記の方法の特定の実施形態では、抗体またはその断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、またはＦｖ断片である。
【００１８】
上記の方法の特定の実施形態では、抗体またはその断片は、一本鎖抗体である。
【００１９】
上記の方法の特定の実施形態では、抗体またはその断片は、多価であり、少なくとも２本の重鎖および少なくとも２本の軽鎖を含む。上記の方法の特定の実施形態では、抗体またはその断片は、多特異性である。上記の方法の特定の実施形態では、抗体またはその断片は、二重特異性である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、記載される方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４２、および配列番号４３からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。一実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片のＶＨは、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４２、および配列番号４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、記載される方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４４、および配列番号４５からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。一実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片のＶＬは、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４４、および配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２２】
別の実施形態では、記載される方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）が、２０以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４２、および配列番号４３からなる群より選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【００２３】
さらに別の実施形態では、記載される方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）が、２０以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４４、および配列番号４５からなる群より選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）が、それぞれ、配列番号４および配列番号８、配列番号６および配列番号８、配列番号１０および配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６、配列番号３９および配列番号４１、配列番号４２および配列番号４４、ならびに配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【００２５】
さらなる実施形態では、記載される方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）が、それぞれ、配列番号４および配列番号８、配列番号６および配列番号８、配列番号１０および配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６、配列番号３９および配列番号４１、配列番号４２および配列番号４４、ならびに配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【００２６】
他の実施形態では、本明細書に記載する方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）が、それぞれ、各２０以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号４および配列番号８、配列番号６および配列番号８、配列番号１０および配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６、配列番号３９および配列番号４１、配列番号４２および配列番号４４、ならびに配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【００２７】
別の実施形態では、該方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）が、２つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２６、および配列番号３２からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む、抗体を提供する。一実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２６、および配列番号３２からなる群より選択される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、該方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）が、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２７、および配列番号３３からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、抗体を提供する。一実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２７、および配列番号３３からなる群より選択される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、該方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）が、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２８、および配列番号３４からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体を提供する。一実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２８、および配列番号３４からなる群より選択される。
【００３０】
特定の実施形態では、該方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）が、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４６、および配列番号４９からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む、抗体を提供する。一実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４６、および配列番号４９からなる群より選択される。
【００３１】
他の実施形態では、本明細書に記載する方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）が、２つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３６、配列番号４７、および配列番号５０からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、抗体を提供する。一実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３６、配列番号４７、および配列番号５０からなる群より選択される。
【００３２】
他の実施形態では、本明細書に記載する方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）が、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号２５、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４８、および配列番号５１からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、抗体を提供する。一実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号２５、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４８、および配列番号５１からなる群より選択される。
【００３３】
特定の実施形態では、本明細書に記載する方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号１７、１８、および１９、配列番号２０、２１、および２２、配列番号２６、２７、および２８、ならびに配列番号３２、３３、および３４からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むが、ＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つにおける１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換の例外を有する、抗体を提供する。さらなる実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片のＶＨは、配列番号１７、１８、および１９、配列番号２０、２１、および２２、配列番号２６、２７、および２８、ならびに配列番号３２、３３、および３４からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００３４】
特定の実施形態では、本明細書に記載する方法は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号２３、２４、および２５、配列番号２９、３０、および３１、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４６、４７、および４８、ならびに配列番号４９、５０、および５１からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むが、ＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つにおける１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換の例外を有する、抗体を提供する。さらなる実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片のＶＬは、配列番号２３、２４、および２５、配列番号２９、３０、および３１、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４６、４７、および４８、ならびに配列番号４９、５０、および５１からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【００３５】
特定の実施形態では、本明細書に記載する方法は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）が、ＮＩ−１０１．１０、ＮＩ−１０１．１１、ＮＩ−１０１．１２、ＮＩ−１０１．１３、ＮＩ−１０１．１２Ｆ６Ａ、ＮＩ−１０１．１３Ａ、およびＮＩ−１０１．１３Ｂからなる群より選択される、モノクローナル抗体に由来する、抗体を提供する。
【００３６】
種々の実施形態では、本明細書に記載する方法は、重鎖定常領域またはその断片を含む、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域またはその断片は、ヒトＩｇＧ１である。他の実施形態では、重鎖定常領域またはその断片は、マウスＩｇＧ２Aである。
【００３７】
種々の実施形態では、本明細書に記載する方法は、それに融合した異種ポリペプチドをさらに含む、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００３８】
種々の実施形態では、本明細書に記載する方法は、細胞毒性薬、治療薬、細胞増殖抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物反応修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体またはその断片、検出可能標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれらの薬剤のうちの任意の２つ以上の組み合わせからなる群より選択される薬剤に共役した、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、細胞毒性薬は、放射性核種、生物毒素、酵素的に活性な毒素、増殖抑制性もしくは細胞毒性治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生物反応修飾物質、またはそれらの細胞毒性薬のうちの任意の２つ以上の組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、検出可能標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、またはそれらの検出可能標識のうちの任意の２つ以上の組み合わせからなる群より選択される。
【００３９】
他の実施形態では、該方法は、異常なアミロイドの状態を治療する方法を提供し、異常なアミロイドの状態は、神経の疾病、疾患、損傷、または病態に付随する。さらなる実施形態では、神経の疾病、疾患、損傷、または病態は、脳内に存在する。
【００４０】
他の実施形態では、本明細書の記述は、有効量のＡβ結合分子を対象に投与する方法を提供し、対象は、Ａβを蓄積している。さらなる実施形態では、Ａβの蓄積は、神経の疾病、疾患、損傷、または病態に付随する。さらなる実施形態では、神経の疾病、疾患、損傷、または病態は、脳内に存在する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、該方法は、血液脳関門を通過することが可能である、Ａβ結合分子を提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本明細書の記述は、アルツハイマー病、ダウン症、頭部外傷、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、慢性ボクサー脳症、外傷性ボクサー脳症、ボクサー認知症、拳闘酔態症候群、加齢に伴うアミロイド沈着、軽度認識障害、脳アミロイド血管症、レヴィー小体認知症、血管性認知症、混合型認知症、多面的認知症、遺伝性アミロイド性脳出血オランダ型およびアイスランド型、緑内障、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、嚢胞性線維症、またはゴーシェ病、および封入体筋炎からなる群より選択される疾病、疾患、損傷、または病態を伴う対象に、Ａβ結合分子を投与する方法を提供する。一実施形態では、疾病、疾患、損傷、または病態は、アルツハイマー病である。一実施形態では、疾病、疾患、損傷、または病態は、頭部外傷である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本明細書の記述は、Ａβ結合分子を対象に投与する方法を提供し、対象は、哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本明細書の記述は、Ａβ結合分子を対象に投与する方法を提供し、Ａβ結合分子は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、非経口的投与、またはエアロゾルとして投与される。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
異常なアミロイドの状態を治療する方法であって、前記方法は、治療を必要としている対象に、治療有効量のＡβ結合分子を投与することを含み、前記Ａβ結合分子は、神経新生を促進することができる、方法。
（項目２）
神経新生を促進する方法であって、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む、方法。
（項目３）
血管新生を促進する方法であって、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む、方法。
（項目４）
シナプス密度および／または活性を促進する方法であって、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む、方法。
（項目５）
対象のＣＮＳニューロンの樹状分岐を促進する方法であって、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む、方法。
（項目６）
対象のＣＮＳニューロンの樹状突起棘密度の増加を促進する方法であって、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む、方法。
（項目７）
前記ＣＮＳニューロンは、顆粒状ニューロンである、項目５または６に記載の方法。
（項目８）
前記対象は、Ａβを蓄積している、項目１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記Ａβ結合分子は、Ａβ１−４２ペプチド、Ａβ１−４０ペプチド、およびＡβ１−４３ペプチドからなる群より選択される、ペプチドに特異的に結合することができる、項目１〜８のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記Ａβ結合分子は、線維性Ａβまたはβアミロイド原線維に特異的に結合することができる、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記Ａβ結合分子は、びまん性βアミロイド沈着に特異的に結合することができる、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記Ａβ結合分子は、Ａβのネオエピトープに特異的に結合することができる、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記Ａβ結合分子は、βアミロイド斑に特異的に結合することができる、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記Ａβ結合分子は、Ｎ末端切断型Ａβ種、Ｃ末端切断型Ａβ種、ピログルタミン酸修飾Ａβ種、レドックス修飾Ａβ種、および二量体Ａβ種からなる群より選択される、Ａβ種に特異的に結合することができる、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前記Ａβ結合分子は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片であり、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、項目１〜１４のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記ＶＨは、５つ以下のアミノ酸置換を除いて、ヒトであるフレームワーク領域を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記（ＶＬ）は、５つ以下のアミノ酸置換を除いて、ヒトであるフレームワーク領域を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記重鎖および軽鎖可変領域は、完全にヒトである、項目１５〜１７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、完全にヒトである、項目１５〜１８のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記ＶＨは、５つ以下のアミノ酸置換を除いて、マウスであるフレームワーク領域を含む、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
前記ＶＬは、５つ以下のアミノ酸置換を除いて、マウスであるフレームワーク領域を含む、項目１５または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化されている、項目１５、２０、または２１のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、キメラである、項目１５〜２１のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、霊長類化されている、項目１５、２０、または２１のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ断片である、項目１５〜２４のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、Ｆａｂ’断片である、項目１５〜２４のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、Ｆ（ａｂ）２断片である、項目１５〜２４のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、Ｆｖ断片である、項目１５〜２４のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、一本鎖抗体である、項目１５〜２４のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、多価であり、少なくとも２本の重鎖および少なくとも２本の軽鎖を含む、項目１５〜２４のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、多特異性である、項目１５〜３０のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、二重特異性である、項目１５〜３１のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４２、および配列番号４３からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１５〜３２のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＨは、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４２、および配列番号４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４４、および配列番号４５からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１５〜３４のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＬは、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４４、および配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＨは、２０以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４２、および配列番号４３からなる群より選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、項目１５〜３６のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＬは、２０以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４４、および配列番号４５からなる群より選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、項目１５〜３７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＨおよびＶＬは、それぞれ、配列番号４および配列番号８、配列番号６および配列番号８、配列番号１０および配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６、配列番号３９および配列番号４１、配列番号４２および配列番号４４、ならびに配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、項目１５〜３８のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４０）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＨおよびＶＬは、それぞれ、配列番号４および配列番号８、配列番号６および配列番号８、配列番号１０および配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６、配列番号３９および配列番号４１、配列番号４２および配列番号４４、ならびに配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断の前記ＶＨおよびＶＬは、それぞれ、各２０以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号４および配列番号８、配列番号６および配列番号８、配列番号１０および配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６、配列番号３９および配列番号４１、配列番号４２および配列番号４４、ならびに配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、項目１５〜４０のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＨは、２つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２６、および配列番号３２からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む、項目１５〜４１のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２６、および配列番号３２からなる群より選択される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＨは、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２７、および配列番号３３からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、項目１５〜４３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２７、および配列番号３３からなる群より選択される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＨは、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２８、および配列番号３４からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、項目１５〜４５のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４７）
前記ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２８、および配列番号３４からなる群より選択される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＬは、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４６、および配列番号４９からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む、項目１５〜４７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目４９）
前記ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４６、および配列番号４９からなる群より選択される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＬは、２つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３６、配列番号４７、および配列番号５０からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、項目１５〜４９のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
前記ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３６、配列番号４７、および配列番号５０からなる群より選択される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＬは、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号２５、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４８、および配列番号５１からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、項目１５〜５１のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
前記ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号２５、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４８、および配列番号５１からなる群より選択される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＨは、配列番号１７、１８、および１９、配列番号２０、２１、および２２、配列番号２６、２７、および２８、ならびに配列番号３２、３３、および３４からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むが、前記ＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つにおける１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換は例外である、項目１５〜５３のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＨは、配列番号１７、１８、および１９、配列番号２０、２１、および２２、配列番号２６、２７、および２８、ならびに配列番号３２、３３、および３４からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＬは、配列番号２３、２４、および２５、配列番号２９、３０、および３１、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４６、４７、および４８、ならびに配列番号４９、５０、および５１からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むが、前記ＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つにおける１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換は例外である、項目１５〜５５のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片の前記ＶＬは、配列番号２３、２４、および２５、配列番号２９、３０、および３１、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４６、４７、および４８、ならびに配列番号４９、５０、および５１からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記ＶＨおよびＶＬは、ＮＩ−１０１．１０、ＮＩ−１０１．１１、ＮＩ−１０１．１２、ＮＩ−１０１．１３、ＮＩ−１０１．１２Ｆ６Ａ、ＮＩ−１０１．１３Ａ、およびＮＩ−１０１．１３Ｂからなる群より選択されるモノクローナル抗体からなる、項目１５〜５７のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目５９）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、重鎖定常領域またはその断片を含む、項目１５〜５８のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
前記重鎖定常領域またはその断片は、ヒトＩｇＧ１である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記重鎖定常領域またはその断片は、マウスＩｇＧ２Ａである、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、それに融合した異種ポリペプチドをさらに含む、項目１５〜５９のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目６３）
前記抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片は、細胞毒性薬、治療薬、細胞増殖抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物反応修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体またはその断片、検出可能標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、および任意の前記薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される薬剤に共役する、項目１５〜６２のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目６４）
前記細胞毒性薬は、放射性核種、生物毒素、酵素的に活性な毒素、増殖抑制性もしくは細胞毒性治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生物反応修飾物質、または任意の前記細胞毒性薬のうちの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記検出可能標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、または任意の前記検出可能標識のうちの２つ以上の組み合わせからなる群より選択される、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
Ａβの前記蓄積は、神経の疾病、疾患、損傷、または病態に付随する、項目８〜６５のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
前記異常なアミロイドの状態は、神経の疾病、疾患、損傷、または病態に付随する、項目１または９〜６５のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目６８）
前記神経の疾病、疾患、損傷、または病態は、脳内に存在する、項目６６または項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記Ａβ結合分子は、前記血液脳関門を通過することが可能である、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
前記疾病、疾患、損傷、または病態は、アルツハイマー病、ダウン症、頭部外傷、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、慢性ボクサー脳症、外傷性ボクサー脳症、ボクサー認知症、拳闘酔態症候群、加齢に伴うアミロイド沈着、軽度認識障害、脳アミロイド血管症、レヴィー小体認知症、血管性認知症、混合型認知症、多面的認知症、遺伝性アミロイド性脳出血オランダ型およびアイスランド型、緑内障、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、嚢胞性線維症、またはゴーシェ病、および封入体筋炎からなる群より選択される、項目６６〜６９のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
前記疾病、疾患、損傷、または病態は、アルツハイマー病である、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記疾病、疾患、損傷、または病態は、頭部外傷である、項目７０に記載の方法。
（項目７３）
前記対象は、哺乳動物である、項目１〜７２のうちのいずれか１項に記載の方法。
（項目７４）
前記哺乳動物は、ヒトである、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記Ａβ結合分子は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、非経口的投与、またはエアロゾルとして投与される、項目１〜７２のうちのいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＤ様病変の進行を示す。実施例１に記載するように、３〜４ヵ月齢（Ａ）、１１〜１２ヵ月齢（Ｃ）、および１７〜１８ヵ月齢（Ｅ）の野生型（「非ｔｇ」）およびＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子導入マウスにおいて、Ｉｂａ１＋ミクログリアの数を評価した。バーの高さは、各段階における顆粒下層／顆粒細胞層（ＳＧＺ／ＧＣＬ）および門層（ｈｉｌｕｓ  ｌａｙｅｒ）のＩｂａ１＋ミクログリアの平均数を示す。野生型およびＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子導入マウスの短期記憶もまた、実施例１に記載するように、３〜４ヵ月齢（Ｂ）、１１〜１２ヵ月齢（Ｄ）、および１７〜１８ヵ月齢（Ｆ）において、Ｙ−ｍａｚｅを使用して評価した。バーの高さは、交替行動率を示す。不対ｔ検定を使用して、統計を計算した。誤差バーは、標準誤差を表す。二重アスタリスクは、ｐ＜０．０１を示し、単一アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
【図２】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける神経新生を示す。実施例２（Ａ）に記載するように、野生型（「非ｔｇ」）およびＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子導入マウスにおいて、ｐＨ−３、ＢｒｄＵ、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ、およびＢｒｄＵ／ＮｅｕＮのレベルを評価した。バーの高さは、対照と比較した際の差をパーセントで示し、誤差バーは、誤差の伝搬を表す。実施例２（Ｂ）に記載するように、野生型およびＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子導入マウスにおいて、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋樹状突起の長さおよび１細胞体当たりのＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋樹状突起の数を評価した。不対ｔ検定を使用して、統計を計算した。誤差バーは、標準誤差を表す。二重アスタリスクは、ｐ＜０．０１を示し、単一アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
【図３】実施例３に記載するように、対照抗体（「ｃｔ  ａｂ」）で処理されたＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子導入マウス、および抗Ａβ抗体（「抗Ａβ」）で処理されたＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子導入マウスにおけるＡβ（Ａ）、ＴｈｉｏＳ（Ｂ）、およびＣＡＡ（Ｃ）のレベルを示す。この分析のために、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、連続的な断面からの画像を処理し、特定かつ一定の範囲にわたるポジティブ染色の領域を評価した。不対ｔ検定を使用して、統計を計算した。誤差バーは、標準誤差を表す。アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
【図４】ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける神経新生に対するＡβ抗体の効果を示す。実施例４（Ａ）に記載するように、ＢｒｄＵ＋およびｐＨ−３＋細胞の数を、対照抗体（「ｃｔ  ａｂ」）または抗Ａβ抗体（「抗Ａβ」）で処理されたＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子導入マウスの顆粒下層／顆粒細胞層（ＳＧＺ／ＧＣＬ）内で定量化した。実施例４に記載するように、幼若ニューロン（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋細胞として特定される）（Ｂ）および成熟ニューロン（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋細胞として特定される）（Ｃ）を、対照抗体または抗Ａβ抗体で処理されたＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子導入マウスにおいて定量化した。不対ｔ検定を使用して、統計を計算した。誤差バーは、標準誤差を表す。アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
【図５】新しい顆粒状ニューロンの樹状分岐に対するＡβ抗体の効果を示す。実施例５に記載するように、顆粒下層内における１細胞体当たりのＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋樹状突起の数およびＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋樹状突起の長さ（Ｂ）を、対照抗体（「ｃｔ  ａｂ」）または抗Ａβ抗体（「抗Ａβ」）で処理されたＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子導入マウスにおいて測定した。１群当たり４０個の細胞を分析した。実施例５（Ｃ）に記載するように、海馬外部分子層（「ＯＭＬ」）内のシナプトフィジン（「ＳＹＮ」）染色のレベルを、対照抗体または抗Ａβ抗体で処理された遺伝子導入マウスにおいて測定した。バーの高さは、平均染色度を表す（Ａ〜Ｃ）。シナプトフィジン陽性シナプス前終末の数を、分子層内で数えた（Ｄ）。バーの高さは、シナプトフィジン陽性神経繊維末端の数を示す（Ｄ）。不対ｔ検定を使用して、統計を計算した。誤差バーは、標準誤差を表す。二重アスタリスクは、ｐ＜０．０１を示し、単一アスタリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
【図６】血管新生に対するＡβ抗体の効果を示す。実施例６に記載するように、対照抗体（「ｃｔ  ａｂ」）または抗Ａβ抗体（「抗Ａβ」）で処理されたＡＰＰ／ＰＳ１遺伝子導入マウスにおける血管（レクチン染色によって示される）の数の立体的評価を実施した。バーの高さは、血管数を示す。不対ｔ検定を使用して、統計を計算した。誤差バーは、標準誤差を表す。二重アスタリスクは、ｐ＜０．０１を示す。
【図７】成熟レトロウイルス標識新生ニューロンの樹状分岐に対するＡβ免疫療法の効果を示す。ＧＦＰを発現するレトロウイルスで標識した新しい成熟顆粒細胞のショール分析を実施した。このグラフは、体細胞からの距離の関数として、半径細胞体に中心がある、樹状突起と同心の半径との間の交差点の平均数を表す（１群当たりｎ＝１５細胞）。誤差バーは、標準誤差を表す。アスタリスク（＊）は、非遺伝子導入対ＡＰＰ／ＰＳ１、およびＡＰＰ／ＰＳ１対Ａβ免疫療法で処理されたＡＰＰ／ＰＳ１に対するｐ＜０．０５を示す。
【図８】成熟レトロウイルス標識新生ニューロンの脊椎密度に対するＡβ免疫療法の効果を示す。新しい成熟ニューロンの樹状突起からの高倍率セグメントを、非遺伝子導入マウス、媒体処理ＡＰＰ／ＰＳ１マウス、およびＡβ免疫療法で処理されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスから得た（Ａ）。縮尺バーは、１０μｍを表す。マッシュルーム状脊椎（Ｍｕｓｈｒｏｏｍ  ｓｐｉｎｅ）、長く薄い脊椎、太く短い脊椎の数を判定するために、４０μｍセグメントに沿って、脊椎のコンピュータを使った分類を実施した（Ｂ〜Ｄ）。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるマッシュルーム状脊椎の数は、非遺伝子導入マウスと比較して有意に減少し、Ａβ免疫療法によって有意に回復した（Ｂ）。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける長く薄い脊椎の数は、非遺伝子導入マウスと比較して有意に減少し、Ａβ免疫療法によって有意に回復した（Ｃ）。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける太く短い脊椎の数は、非遺伝子導入マウスと比較して有意に減少し、Ａβ免疫療法は、回復の傾向を示した（ｐ＝０．０７）（Ｄ）。１群当たりＮ＝５０セグメント。誤差バーは、標準誤差を表す。アスタリスク（＊）は、ｐ＜０．０５を示す。二重アスタリスク（＊＊）は、ｐ＜０．０１を示し、三重アスタリスク（＊＊＊）は、ｐ＜０．００１を示す。ボンフェローニ事後検定の後に、ＡＮＯＶＡ検定が続いた。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
Ｉ．定義
用語「１つ（ａ）または（ａｎ）」の実体は、１つ以上のその実体を意味することに留意されたい。例えば、「１つの抗体（ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、１つ以上の抗体を表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書において同じ意味で使用することができる。
【００４７】
本明細書で使用する「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、および複数の「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」を包含するよう意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直線状に結合されたモノマー（アミノ酸）からなる分子を意味する。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（複数を含む）を意味し、産物の特定の長さに言及するものではない。したがって、２つ以上のアミノ酸の鎖（複数を含む）を意味するために使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または他の任意の用語は、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれらと同じ意味で使用することができる。
【００４８】
「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解開裂、または非自然発生的アミノ酸による修飾を非制限的に含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を意味するよう意図される。ポリペプチドは、天然生物源から得るか、または組み換え技術によって産生することができるが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、化学合成によるものを含む任意の方法で生成することができる。
【００４９】
本明細書に記載するようなポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上のアミノ酸のサイズのポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、定義された３次元構造を有することができるが、必ずしもそのような構造を有するとは限らない。明確な３次元構造を伴うポリペプチドは、折り畳みと称され、明確な３次元構造を有しないポリペプチドは、むしろ多くの異なる立体構造を採用することができ、非折り畳みと称される。本明細書で使用する糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有または窒素含有側鎖を介して、タンパク質に付着させられる少なくとも１つの炭水化物部分に連結した、タンパク質を意味する。
【００５０】
「単離」ポリペプチド、またはその断片、変異体、もしくは誘導体は、その自然環境内にないポリペプチドを意図する。特定の精製レベルは必要とされない。例えば、単離ポリペプチドを、その天然または自然環境から取り去ることができる。組み換え技術によって産生されたポリペプチドおよび宿主細胞内で発現したタンパク質は単離と見なされ、任意の好適な技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組み換えポリペプチドも同様である。
【００５１】
また、本明細書に記載するポリペプチドとして、上記ポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または変異体、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。Ａβ結合分子に言及する際の「断片」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語は、対応する天然Ａβ結合分子の抗原結合特性のうちの少なくともいくつかを保持する、任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片は、本明細書の他の箇所で考察する特異的抗体断片に加えて、タンパク質分解断片および欠失断片を含む。抗体および抗体ポリペプチドの変異体は、上記のような断片、およびアミノ酸置換、欠失、または挿入によって改変されたアミノ酸配列を伴うポリペプチドも含む。変異体は、自然発生的または非自然発生的であってもよい。非自然発生的変異体は、当該技術分野で知られている突然変異誘発技術を使用して産生することができる。変異ポリペプチドは、保存または非保存アミノ酸置換、欠失、または付加を含むことができる。Ａβ結合分子、例えば、抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドでは見られないさらなる特徴を示すために変化させられたポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変異ポリペプチドはまた、本明細書において「ポリペプチド類似体」と称することもできる。本明細書で使用するＡβ結合分子もしくはその断片、抗体、または抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する、対象ポリペプチドを意味する。また、２０の標準アミノ酸のうちの１つ以上の自然発生的アミノ酸誘導体を含有するペプチドもまた、「誘導体」として含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりにすることができる。５−ヒドロキシリジンをリジンの代わりにすることができ、３−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりにすることができ、ホモセリンをセリンの代わりにすることができ、オルニチンをリジンの代わりにすることができる。
【００５２】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸および複数の核酸を包含するよう意図され、単離核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）もしくはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を意味する。ポリヌクレオチドは、従来のリン酸ジエステル結合または従来にない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含むことができる。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を意味する。「単離」核酸またはポリヌクレオチドは、その天然環境から取り去られた核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含有される抗体をコード化する組み換えポリヌクレオチドは、単離と見なされる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞内に維持される組み換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離ＲＮＡ分子としては、ポリヌクレオチドの生体内または生体外ＲＮＡ転写物が挙げられる。単離ポリヌクレオチドまたは核酸はさらに、合成的に産生されたそのような分子を含む。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーター等の調節因子であってもよく、またはそれらの調節因子を含むことができる。
【００５３】
本明細書で使用する「コード領域」は、ペプチドを構成するアミノ酸に翻訳することができるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部として考慮されることができるが、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン等は、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域は、例えば、単一ベクター上の単一ポリヌクレオチド構築物、または例えば、別個の（異なる）ベクター上の別個のポリヌクレオチド構築物中に存在することができる。さらに、いかなるベクターも、単一コード領域を含有することができるか、または２つ以上のコード領域を含むことができ、例えば、単一ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコード化することができる。さらに、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、Ａβ結合分子、抗体、またはその断片、変異体、もしくは誘導体をコード化する核酸に融合した、あるいは融合していない、異種コード領域をコード化することができる。異種コード領域は、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメイン等の特異的因子またはモチーフを含むがこれに限定されない。
【００５４】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコード化する核酸を含むポリヌクレオチドは、１つ以上のコード領域に作動可能に会合した、プロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳調節因子を含むことができる。作動可能な会合は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドに対するコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響または制御下に置く方法で、１つ以上の調節配列に会合した時のものである。２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード領域およびそれに会合したプロモーター等）は、プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコード化するｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を誘導する発現調節配列の能力を妨げない、またはＤＮＡテンプレートが転写される能力を妨げない場合、「作動可能に会合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写をもたらすことができる場合、ポリペプチドをコード化する核酸に作動可能に会合していることとなる。プロモーターは、ＤＮＡの実質的な転写を所定の細胞内にのみ誘導する、細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写調節因子、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルは、細胞特異的転写を誘導するために、ポリヌクレオチドと作動可能に会合することができる。好適なプロモーターおよび他の転写調節領域を本明細書に開示する。
【００５５】
種々の転写調節領域が、当業者に知られている。それには、サイトメガロウイルス（イントロン−Ａと併せた前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス等）からのプロモーターおよびエンハンサーセグメント等であるがこれに限定されない、脊椎動物細胞内で機能する転写調節領域が挙げられるがこれに限定されない。他の転写調節領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβグロビン等の脊椎動物遺伝子から得られるもの、ならびに真核細胞内の遺伝子発現を調節することができる他の配列が挙げられる。さらなる好適な転写調節領域としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
【００５６】
同様に、種々の翻訳調節因子が、当業者に知られている。それには、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、ならびに内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が挙げられるがこれに限定されない。
【００５７】
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
【００５８】
ポリヌクレオチドおよび核酸コード領域は、ポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドの分泌を誘導する、分泌またはシグナルペプチドをコード化する、さらなるコード領域と会合し得る。シグナル仮説に従い、哺乳動物細胞から分泌されるタンパク質は、いったん粗面小胞体にわたる成長タンパク質鎖の輸送が開始すると、成熟タンパク質から開裂される、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞から分泌されるポリペプチドは、概して、完全長または「フルレングス」ポリペプチドから開裂されてポリペプチドの分泌または「成熟」形態を産生する、ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施形態では、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、またはそれに作動可能に会合したポリペプチドの分泌を誘導する能力を保持する、その配列の機能性誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能性誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβグルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
【００５９】
特に指定のない限り、「疾患」および「疾病」という用語は、本明細書において同じ意味で使用される。
【００６０】
本明細書で使用する「Ａβ結合分子」は、抗体およびその断片に関連し、抗体模倣物、抗体の構造および／または機能を模倣する抗体の複数の部分（Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：９２１−９２９（２００７））、ホルモン、受容体、リガンド、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）等のシャペロン、ならびにカドヘリン、インテグリン、Ｃ型レクチン、および免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバー等の細胞間接着分子が挙げられるがこれに限定されない、Ａβに結合する他の非抗体分子を含むことができる。明確にすることのみを目的とし、本明細書に記載する方法の範囲を制限することなく、本明細書に記載する実施形態のほとんどは、治療薬および診断用薬の開発のためのＡβ結合分子の一実施例を表す、抗体および抗体様分子に関して考察される。
【００６１】
特別の定めのない限り、Ａβ結合分子は、Ａβ１−４２ペプチド、Ａβ１−４０ペプチド、およびＡβ１−４３ペプチド、Ｎ末端切断型Ａβ種、Ｃ末端切断型Ａβ種、ピログルタミン酸修飾Ａβ種、例えば、ピログルタミン酸Ａβ３−４２、レドックス修飾Ａβ種、Ａβ凝集体、二量体Ａβ種、オリゴマーＡβ種、線維性Ａβ、βアミロイド原線維、びまん性βアミロイド沈着、タンパク質修飾によって生成されるＡβのネオエピトープ、Ａβペプチドの凝集または切断または複合体形成、ならびにβアミロイド斑が挙げられるがこれに限定されない、Ａβの形態に結合することができる。
【００６２】
「ネオエピトープ」という用語は、ある疾病パターンに特有であり、それがなければ病的ではないタンパク質からの病的変異体である、および／または健康な状態の生理機能から逸脱している、疾患関連タンパク質内に含有されるか、もしくは該疾患関連タンパク質によって形成される、エピトープを意味する。そのような病態生理的変異体は、病的に変化した転写、病的に変化した翻訳、翻訳後修飾、病的に変化したタンパク質分解処理、変化した共局在化という意味で生理もしくは病態生理上の相互作用パートナーもしくは細胞構造を伴う病的に変化した複合体形成、または３次元もしくは４次元構造が生理学的に活性な分子の構造とは異なる、病的に変化した構造配座、例えば、凝集、オリゴマー化、もしくはフィブリル化によって形成され得る。さらに、病態生理的変異体はまた、その通常の生理環境または細胞内コンパートメントに位置しないことを特徴とすることができる。一例として、ネオエピトープは、機能的障害を明らかに経験する、またはすでに経験している、脳組織の領域における病的に顕著な構造に位置することができる。所与の構造、例えば、細胞もしくは組織、またはタンパク質が、ネオエピトープを表示するかどうかは、疾患関連タンパク質に特異的なＡβ結合分子を単離および特徴付けるための以下に記載する方法を逆にすることによって、検証することができる。それは、Ａβ結合分子、例えば、その方法によって特定される抗体を使用して、抗体に結合することに関して試料をスクリーニングし、それによって、ネオエピトープの存在を決定するということである
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において同じ意味で使用される。本明細書で使用する「抗体」という用語はまた、抗体模倣物を含む、または一本鎖抗体およびその断片を含む、抗体もしくはその特定の断片もしくは部分の構造および／もしくは機能を模倣する抗体の複数の部分を含む、抗体、消化断片、特定部分、およびその変異体を包含するよう意図され、それぞれは、少なくとも１つのＣＤＲを含有する。Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５：９２１−９２９（２００７）を参照されたい。機能性断片は、Ａβに結合する抗原結合断片を含む。例えば、Ｆａｂ（例えば、パパイン消化による）、ｆａｃｂ（例えば、プラスミン消化による）、ｐＦｃ’（例えば、ペプシンもしくはプラスミン消化による）、Ｆｄ（例えば、ペプシン消化、部分的還元、および再凝集による）、ＦｖまたはｓｃＦｖ（例えば、分子生物学技術による）断片が挙げられるがこれに限定されない、Ａβまたはその一部に結合することができる抗体断片が包含される。抗体断片はまた、例えば、ドメイン欠失抗体、二重特異性抗体、線状抗体、一本鎖抗体分子、および抗体断片から形成される多特異的抗体を含むよう意図される。
【００６３】
以下により詳細に考察するように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別することができる種々の広いクラスのポリペプチドを含む。これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの修飾された形は、本開示を考慮して、当業者にとって容易に認識できる。全ての免疫グロブリンのクラスは、明確に本明細書に記載する方法の範囲内にあるが、以下の考察は、概して、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関する。
【００６４】
抗原に特異的に結合するための十分な構造を含有する、任意の抗体または免疫グロブリン断片は、本明細書において、「抗原結合断片」または「免疫特異的断片」として同じ意味で示される。
【００６５】
当該技術分野内で使用される、および／または認められる用語の２つ以上の定義が存在する場合、本明細書で使用する用語の定義は、そうではない旨が明記されない限り、全てのそのような意味を含むよう意図される。特定の例は、重鎖および軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域内に見られる非隣接抗原結合部位を説明するための、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって説明されており、それらは参照することによって本明細書に組み込まれ、これらの定義は、相互に比較された場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲに言及するためのいずれの定義の適用も、本明細書に定義および使用される用語の範囲内にあるよう意図される。上記に挙げられる参考文献のそれぞれによって定義されるようなＣＤＲを包含する、適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表Ｉに記載する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて異なる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、特定のＣＤＲをなす残基を日常の方法で判定することができる。
【００６６】
【表１】
2014148543.tif 000003
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用できる可変ドメイン配列のための番号付け体系を定義した。当業者は、配列自体以外の任意の実験データに依存することなく、「Ｋａｂａｔ番号付け」のこの体系を任意の可変ドメイン配列に明確に割り当てることができる。本明細書で使用する「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって記載される番号付け体系を意味する。別様に特記しない限り、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体における特定のアミノ酸残基位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付け体系に従っている。
【００６７】
抗体、またはその抗原結合断片、免疫特異的断片、変異体、もしくは誘導体は、ポリクローナル、モノクローナル、多特異的、ヒト、ヒト化された、霊長類化された、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ−結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生される断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示する抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）を含むがこれに限定されない。ＳｃＦｖ分子は、当該技術分野において知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載される。免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスであってもよい。
【００６８】
一実施形態では、抗体は、五価構造を伴うＩｇＭまたはその誘導体ではない。特に、特定の用途、特に治療上の使用において、ＩｇＭは、それらの五価構造、および親和性成熟の欠如によって、しばしば非特異的交差反応、および非常に低い親和性を示すため、ＩｇＧおよび他の二価抗体、または対応するＡβ結合分子よりも有用ではない。
【００６９】
一本鎖抗体を含む抗体断片は、可変領域を、単独で、またはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体または一部と組み合わせて含むことができる。また、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとの可変領域の任意の組み合わせを同様に含む、抗原結合断片も含まれる。抗体またはその免疫特異的断片は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物由来であってもよい。抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体であってもよい。
【００７０】
別の実施形態では、可変領域は、軟骨魚類（例えば、サメ）起源であり得る。本明細書で使用する「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、かつヒト患者、ヒト免疫グロブリンライブラリ、または１つ以上のヒト免疫グロブリンの遺伝子導入動物から単離され、以下、および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ
ａｌ．による米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるような、内因性免疫グロブリンを発現しない抗体が含まれる。ヒト抗体は、例えば、結合特性を改善するために、抗体中でアミノ酸置換が行われたとしても、それでもなお「ヒト」である。
【００７１】
本明細書で使用する「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖から得られるアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその変異体もしくは断片のうちの少なくとも１つを含む。例えば、結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むことができる。別の実施形態では、ポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部を欠いている場合がある（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）。上記のように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）を、それらがアミノ酸配列において、自然発生の免疫グロブリン分子とは異なるように修飾することができることは、当業者によって理解されるであろう。
【００７２】
本明細書に開示する特定の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体において、マルチマーの１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、マルチマーの第２のポリペプチド鎖上の重鎖部分と同一である。あるいは、重鎖部分含有モノマーは、同一ではない。例えば、各モノマーは、異なる標的結合部位を含むことができ、例えば、二重特異性抗体を形成する。
【００７３】
本明細書に開示する診断および治療方法での使用のための結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子から得ることができる。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子から得られるＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ３分子から得られるヒンジ領域を含むことができる。別の実施例では、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子から、および部分的にＩｇＧ３分子から得られるヒンジ領域を含むことができる。別の実施例では、重鎖部分は、部分的にＩｇＧ１分子から、および部分的にＩｇＧ４分子から得られるキメラヒンジを含むことができる。
【００７４】
本明細書で使用する「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリン軽鎖から得られるアミノ酸配列を含む。軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインのうちの少なくとも１つを含むことができる。
【００７５】
抗体に対するペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４〜５アミノ酸であると考えられる。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは、少なくとも７、少なくとも９、または少なくとも約１５〜約３０の間のアミノ酸を含有することができる。ＣＤＲは、その第３級型の抗原ペプチドまたはポリペプチドを認識することができるため、エピトープを含むアミノ酸は、隣接している必要はなく、場合によっては、同一のペプチド鎖上にないことさえある。抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドエピトープは、Ａβの少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または約１５〜約３０の間の隣接または非隣接アミノ酸の配列を含有することができる。
【００７６】
本明細書において同じ意味で使用する「特異的に結合する」または「特異的に認識する」は、概して、Ａβ結合分子、例えば、抗体が、その抗原結合ドメインを介してＡβに結合すること、および結合が、抗原結合ドメインとＡβとの間のある程度の相補性を伴うことを意味する。本明細書で使用する「交差反応性の欠如」、「特異的」、「特異的に認識すること」、「特異的に結合すること」等の用語は、Ａβと別のエピトープとを区別するＡβ結合分子の能力を意味する。この定義に従うと、Ａβ結合分子は、それがランダムな非関連エピトープに結合し得るよりも容易にＡβに結合する場合に、Ａβに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、別のエピトープと比較して、特定のＡβ結合分子がＡβに結合する相対親和性を説明するために、本明細書で使用される。例えば、Ａβ結合分子「Ａ」は、Ａβ結合分子「Ｂ」よりもＡβに対して高い特異性を有すると見なすことができるか、またはＡβ結合分子「Ａ」は、それが別のエピトープに対して有するよりも高い特異性を伴って、Ａβに結合すると言うことができる。したがって、Ａβ結合分子は、少なくとも２倍、少なくとも５倍、１０倍以上、５０倍以上、および１００倍以上、別のエピトープよりもＡβに対して選択的結合親和性を有することができる。さらに、Ａβ結合分子、例えば、Ａβに対する抗体の相対ＫＤは、その抗体を他のリガンドまたは疾患関連タンパク質の天然対応物に結合させるためのＫＤよりも少なくとも１０分の１、少なくとも１００分の１、またはそれ以上小さくあり得る。
【００７７】
「疾患関連タンパク質特異的」および「ネオエピトープ特異的」という表現は、本明細書において、「ネオエピトープを特異的に認識すること」という用語と同じ意味で使用される。これらの用語は、疾患関連タンパク質のネオエピトープと、その野生型の形態および自然の状況における天然タンパク質とを区別するＡβ結合分子の能力を意味する。したがって、Ａβ結合分子は、少なくとも２倍、少なくとも５倍、１０倍以上、５０倍以上、および１００倍以上、天然タンパク質抗原よりもネオエピトープに対して選択的結合親和性を有することができる。さらに、Ａβ結合分子、例えば、特異的標的エピトープ、例えば、ネオエピトープに対するＡβ結合分子の相対ＫＤは、その抗体を他のリガンドまたは疾患関連タンパク質の天然対応物に結合させるためのＫＤよりも少なくとも１０分の１、少なくとも１００分の１、またはそれ以上小さくあり得る。
【００７８】
「選択的に結合する」は、Ａβ結合分子、例えば、抗体が、関連、同様、相同、または類似エピトープに結合し得るよりも容易にエピトープに特異的に結合することを意味する。したがって、所与のエピトープに「選択的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連エピトープと交差反応することはできるが、関連エピトープよりも該エピトープに結合する可能性が高くあり得る。
【００７９】
非限定的な実施例として、Ａβ結合分子、例えば、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも小さい解離定数（ＫＤ）で、該第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに選択的に結合すると見なすことができる。別の非限定的な実施例では、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも１桁小さい親和性で、第１のエピトープに結合する場合、第１の抗原に選択的に結合すると見なすことができる。別の非限定的な実施例では、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも２桁小さい親和性で、第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに選択的に結合すると見なすことができる。
【００８０】
別の非限定的な実施例では、Ａβ結合分子、例えば、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のオフ速度（ｋ（オフ））よりも小さいｋ（オフ）で、第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに選択的に結合すると見なすことができる。別の非限定的な実施例では、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のｋ（オフ）よりも少なくとも１桁小さい親和性で、第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに選択的に結合すると見なすことができる。別の非限定的な実施例では、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のｋ（オフ）よりも少なくとも２桁小さい親和性で、第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに選択的に結合すると見なすことができる。
【００８１】
Ａβ結合分子、例えば、本明細書に開示する抗体、または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×ｌ０−３秒−１、またはｌ０−３秒−１以下のオフ速度（ｋ（オフ））で、本明細書に開示する標的、またはその断片もしくは変異体に結合すると考えることができる。いくつかの実施形態では、抗体は、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、または１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１、または１０−７秒−１以下のオフ速度（ｋ（オフ））で、本明細書に開示する標的、またはその断片もしくは変異体に結合すると考えることができる。
【００８２】
Ａβ結合分子、例えば、本明細書に開示する抗体、または抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、または５×１０４Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋ（オン））で、本明細書に開示する標的、またはその断片もしくは変異体に結合すると考えることができる。いくつかの実施形態では、抗体は、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、または５×１０６Ｍ−１秒−１、または１０７Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋ（オン））で、本明細書に開示する標的、またはその断片もしくは変異体に結合すると考えることができる。
【００８３】
Ａβ結合分子、例えば、抗体は、参照抗体のエピトープへの結合をある程度まで阻止する範囲内において、該エピトープに選択的に結合する場合、参照抗体の所与のエピトープへの結合を競合的に阻害すると考えられる。競合的阻害は、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイ等、当該技術分野で既知の任意の方法によって判定することができる。抗体は、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、参照抗体の所与のエピトープへの結合を競合的に阻害すると考えることができる。
【００８４】
本明細書で使用する「親和性」という用語は、Ａβ結合分子のエピトープ結合部位、例えば、免疫グロブリン分子のＣＤＲとの個々のエピトープの結合の強度の尺度を意味する。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｐ２７−２８を参照されたい。本明細書で使用する「結合力」という用語は、抗原Ａβ結合分子の集団と抗原との間の複合体の全体の安定性、すなわち、抗原との免疫ブロブリン混合物の機能上の結合強度を意味する。例えば、ＨａｒｌｏｗのＰ２９−３４を参照されたい。結合力は、集団における個々の免疫グロブリン分子の特定のエピトープとの親和性、ならびに免疫グロブリンおよび抗原の価数の両方に関係する。例えば、二価モノクローナル抗体と、ポリマーのような高度に反復するエピトープ構造を伴う抗原との間の相互作用は、高結合力の一例であり得る。
【００８５】
Ａβ結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はまた、それらの交差反応の観点から記述または特定することができる。本明細書で使用する「交差反応性」という用語は、１つの抗原に対して特異的な抗体の、第２の抗原と反応する能力を意味し、すなわち２つの異なる抗原性物質の間の関連性の尺度である。したがって、抗体は、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合、交差反応性である。交差反応性エピトープは、概して、誘導エピトープと同一の相補性構造特徴の多くを含有し、場合によっては、元のものよりも実際には良好に適合し得る。
【００８６】
例えば、ある抗体は、それらが関連するが非同一のエピトープ、例えば、参照エピトープに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性（当該技術分野で知られており、本明細書中に記載する方法を使用して計算される）を有するエピトープに結合するいう意味で、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満の同一性（当該技術分野で知られており、本明細書中に記載する方法を使用して計算される）を有するエピトープに結合しない場合、ほとんどまたは全く交差反応性を有しないと考えることができる。抗体は、該エピトープの任意の他の類似体、オーソログ体、または相同体に結合しない場合、特定のエピトープに対して「高度に特異的」と見なすことができる。
【００８７】
Ａβ結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はまた、標的に対するそれらの結合親和性の観点から記述または特定することができる。結合親和性は、５ｘ１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５ｘ１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５ｘ１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５ｘ１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５ｘ１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５ｘ１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５ｘ１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５ｘ１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５ｘ１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５ｘ１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５ｘ１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄを伴うものを含む。
【００８８】
前述のように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元構成がよく知られている。本明細書で使用する「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ酸末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側である。
【００８９】
本明細書で使用する「ＣＨ２ドメイン」という用語は、従来の番号付けスキームを使用して、例えば、無傷重鎖の約残基２４４から残基３６０に伸びる重鎖分子の部分を含む（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔ番号付け体系；および残基２３１〜３４０、ＥＵ番号付け体系；Ｋａｂａｔ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．ｏｐ．ｃｉｔ．を参照されたい）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合しない点で独特である。むしろ、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖は、無傷天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に位置する。また、ＣＨ３ドメインがＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端まで伸び、約１０８残基を含むことも十分に裏付けられている。
【００９０】
本明細書で使用する「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに
連接する、重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は、約２５残基を含み、柔軟であり、それによって、２つのＮ末端抗原結合領域が独立して移動することを可能にする。ヒンジ領域は、３つの別々のドメインすなわち上部、中央、および下部のヒンジドメインに細分することができる（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３（１９９８））。
【００９１】
本明細書で使用する「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子の間で形成された共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができるチオール基を含む。ほとんどの自然発生のＩｇＧ分子において、ＣＨ１領域およびＣＬ領域は、ジスルフィド結合によって連結され、２本の重鎖は、Ｋａｂａｔ番号付け体系を使用して、２３９および２４２（位置２２６または２２９、ＥＵ番号付け体系）に対応する位置において、２つのジスルフィド結合によって連結される。
【００９２】
本明細書で使用する「操作された抗体」という用語は、重鎖および軽鎖のいずれかにおける、または両方における可変ドメインが、既知の特異性の抗体からの１以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換によって、および必要な場合、部分的なフレームワーク領域置換および配列変更によって改変された、抗体を意味する。ＣＤＲは、フレームワーク領域が得られる抗体と同一のクラスまたはサブクラスさえの抗体から得ることができるが、ＣＤＲは、異なるクラスの抗体から、または異なる種からの抗体から得られると想定される。既知の特異性の非ヒト抗体からの１以上の「ドナー」ＣＤＲが、ヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域に移植された、操作された抗体は、本明細書において、「ヒト化抗体」と称される。１つの可変ドメインの抗原結合能力を別のドメインに移すために、必ずしも、ＣＤＲの全てをドナー可変領域からの完全なＣＤＲで置き換える必要はない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移しさえすれば十分であり得る。
【００９３】
本明細書で考察するように、いくつかの実施形態では、記載する過程の出発物質は、ヒト化されており、またはいくつかの実施形態では、マウス化モノクローナル抗体である。つまり、好適な選択されたモノクローナル抗体は、動物抗体からの１つ以上のＣＤＲを含むことができ、抗体は、親動物抗体よりも、ヒトまたはマウスにおける免疫原性がより低くなるように修飾されている。知られているように、動物抗体は、キメラ抗体産生、ＣＤＲグラフティング（再形成を含む）、および抗体表面再処理を含む多くの方法を使用して、ヒト化することができる。概して、キメラ抗体は、ヒト抗体からの定常領域を非ヒト動物からの抗体に移すことによって作製され、ＣＤＲグラフティングは、特異的結合を提供するドメインに対応するＣＤＲ領域を、非ヒト抗体からヒト抗体フレームワークに移すことを伴う。表面再処理は、非ヒト抗体において曝露される（すなわち、抗体の外面上の）フレームワークアミノ酸を、ヒト抗体の同等の露出された残基で置換することを伴う。抗体をヒト化またはマウス化するための好適な方法は、米国特許第６，３３１，４１５  Ｂ１号、第５，２２５，５３９号、第６，３４２，５８７号、第４，８１６，５６７号、第５，６３９，６４１号、第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第４，８１６，３９７号、第５，６９３，７６１号、第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第６，３２９，５５１号、および特に、その全体が参照として本明細書に明確に組み込まれる、２００２年８月１５日出願の米国特許出願第６０／４０４，１１７号で見ることができる。
【００９４】
本明細書で使用する「適切に折り畳まれたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドを構成する機能ドメインの全てが明確に活性である、ポリペプチドを含む。本明細書で使用する「不適切に折り畳まれたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの機能ドメインのうちの少なくとも１つが活性でない、ポリペプチドを含む。一実施形態では、適切に折り畳まれたポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されたポリペプチド鎖を含み、逆に、不適切に折り畳まれたポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されないポリペプチド鎖を含む。
【００９５】
本明細書で使用する「操作された」という用語は、合成手段による（例えば、組み換え技術、生体外ペプチド合成による、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリング、またはこれらの技術のある組み合わせによる）核酸分子またはポリペプチド分子の操作を含む。
【００９６】
本明細書で使用する「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、同じ意味で使用される。これらの用語は、化学的共役または組み換え手段を含むいずれかの手段によって、２つのさらなる要素または構成成分を一緒に連接させることを意味する。「イン−フレーム融合」は、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を連接させ、元のＯＲＦの正しい翻訳リーディングフレームを維持する方法で、連続したより長いＯＲＦを形成することを意味する。したがって、組み換え融合タンパク質は、（そのセグメントが、自然において通常そのように連接されていない）元のＯＲＦによってコード化されたポリペプチドに対応する、２つ以上のセグメントを含有する、単一タンパク質である。リーディングフレームは、そのようにして、融合したセグメント全体にわたって連続した状態になるが、セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的または空間的に分離され得る。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコード化するポリヌクレオチドは、インフレームで融合できるが、「融合された」ＣＤＲが連続したポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコード化するポリヌクレオチドによって、分離され得る。
【００９７】
ポリペプチドとの関連で、「直線状配列」または「配列」は、配列において相互に隣接する残基がポリペプチドの一次構造において連続する、アミノからカルボキシル末端方向へのポリペプチドにおけるアミノ酸の順序である。
【００９８】
本明細書で使用する「発現」という用語は、核酸が、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドのような生化学物質を産生するために使用される過程を意味する。その過程は、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現および安定発現の両方が挙げられるがこれに限定されない、細胞内の遺伝子の機能的な存在の任意の現れを含む。それには、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物への核酸の転写、およびそのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含むがこれに限定されない。最終の所望の産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質、および任意の前駆体の作製を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書中で使用する遺伝子産物は、遺伝子の転写によって産生された核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡ、または転写産物から翻訳されたポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載する遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解開裂等を有するポリペプチドをさらに含む。
【００９９】
「治療」、「治療すること」、「治療する」等の用語は、本明細書において、概して、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方が、この定義によって包含され、目的は、アルツハイマー病の進行または広がり等の望まない生理的変化もしくは障害を予防する、もしくは遅延させる（低減する）こと、または病徴を改善することである。効果は、疾病もしくはその症状を完全に、もしくは部分的に予防する点で、予防的であり得、ならびに／または疾病および／もしくは該疾病に起因する副作用を部分的に、もしくは完全に治癒する点で、治療的であり得る。本明細書で使用する「治療」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾病の任意の治療を含み、（ａ）該疾病にかかりやすくあり得るが、まだそれを有すると診断されていない対象において、該疾病が生じることを予防すること、（ｂ）該疾病を阻害すること、例えば、その進行を停止もしくは遅延させること、または（ｃ）該疾病を緩和すること、例えば、該疾病の退縮をもたらすことを含む。有益な、または所望の臨床的結果としては、検出可能または検出不可能にかかわらず、症状の軽減、疾病の程度の低下、病気の安定化した（すなわち、悪化しない）状態、疾病進行の遅延または遅れ、疾病状態の軽減または緩和、および（部分的または全体的にかかわらず）寛解が挙げられるがこれに限定されない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予測される生存と比較して、生存を延長させることを意味することもできる。治療を必要とする者は、病態もしくは障害をすでに有する者、ならびに病態もしくは障害を有する傾向がある者、または病態もしくは障害の発現が予防されるべき者を含む。
【０１００】
アルツハイマー病または拳闘家認知症等の関連疾患を治療する方法は、そのような疾病の可能性の高い診断を有する対象を治療する方法を含む。アルツハイマー病および関連疾患を診断する方法は、当該技術分野で既知である。アルツハイマー病の症状は、当該技術分野で既知であり、症状を評価する方法は、当該技術分野で既知である。
【０１０１】
「対象」、または「個体」、または「動物」、または「患者」、または「哺乳動物」は、診断、予後診断、予防、または療法が望まれる任意の対象、特に、哺乳動物対象を意味する。この用語はまた、損傷、病態、疾患、または疾病の治療を必要としている哺乳動物、例えば、ヒトも包含する。
【０１０２】
ＩＩ．Ａβ結合分子を使用する方法
本記述は、概して、Ａβを認識することが可能な抗体および他のＡβ結合分子を使用するための方法に関する。本明細書に記載する一実施形態は、対象における神経新生を促進するための方法を提供し、その方法は、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む。
【０１０３】
本明細書で使用する「神経新生」という表現は、ニューロンの増加を意味する。その増加は、例えば、増殖の増加、神経分化の増加、幼若ニューロンの適切な発達および機能的神経回路網への統合の促進、ならびに／またはニューロンの生存の増加の結果であり得る。神経新生は、例えば、神経幹細胞の有糸分裂活性の増加、幼若および／もしくは成熟ニューロンの数の増加、ならびに／または機能的神経回路網への幼若ニューロンの統合の増加によって評価することができる。神経新生を増加させ、評価する方法は、本願に記載する実験において例として示される。
【０１０４】
さらに、本記述は、対象における血管新生を促進する方法に関し、その方法は、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む。
【０１０５】
本明細書で使用する「血管新生」という句は、血管の成長を意味し、例えば、血管の数および／または血管の長さもしくはサイズの増加を含み得る。血管新生を増加させ、評価する方法は、本願に記載する実験において例として示される。
【０１０６】
さらなる実施形態は、対象におけるシナプス活性を促進するための方法を提供し、その方法は、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む。
【０１０７】
本明細書に記載する方法はまた、対象における顆粒状ニューロンの樹状分岐を促進するための方法を含み、その方法は、有効量のＡβ結合分子を対象に投与することを含む。本明細書に記載する方法では、対象は、βアミロイドを蓄積し得る。βアミロイドの蓄積は、神経の疾病、疾患、損傷、または病態に関連し得る。一実施形態では、神経の疾病、疾患、損傷、または病態は、脳内に存在する。
【０１０８】
本明細書に記載する方法は、対象における異常なアミロイドの状態を治療する方法をさらに含み、その方法は、治療有効量のＡβ結合分子を、それを必要としている対象に投与することを含み、Ａβ結合分子は、神経新生を促進する。本明細書に記載する特定の実施形態では、異常なアミロイドの状態は、神経の疾病、疾患、損傷、または病態に付随する。一実施形態では、神経の疾病、疾患、損傷、または病態は、脳内に存在する。
【０１０９】
本明細書に記載する特定の実施形態では、Ａβ結合分子は、血液脳関門を通過することが可能である。さらなる実施形態では、Ａβ結合分子は、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片であり得る。
【０１１０】
本明細書に記載する方法によって治療または改善することができる神経の疾病、疾患、損傷、または病態としては、アルツハイマー病、ダウン症、頭部外傷、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、慢性ボクサー脳症、外傷性ボクサー脳症、ボクサー認知症、拳闘酔態症候群、加齢に伴うアミロイド沈着、軽度認識障害、脳アミロイド血管症、レヴィー小体認知症、血管性認知症、混合型認知症、多面的認知症、遺伝性アミロイド性脳出血オランダ型およびアイスランド型、緑内障、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、嚢胞性線維症、またはゴーシェ病、および封入体筋炎が挙げられるがこれに限定されない。一実施形態では、疾病、疾患、損傷、または病態は、アルツハイマー病である。別の実施形態では、疾病、疾患、損傷、または病態は、頭部外傷である。
【０１１１】
本明細書に記載する特定の実施形態では、対象は、哺乳動物である。本明細書に記載する一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【０１１２】
ＩＩＩ．抗体
本明細書に記載する方法で使用するためのＡβ結合分子は、Ａβ結合分子、例えば、表２および３に示す抗体ならびにその結合断片、変異体、および誘導体を含む。本明細書に記載する方法は、抗体が、ＮＩ−１０１．１０、ＮＩ−１０１．１１、ＮＩ−１０１．１２、ＮＩ−１０１．１３、ＮＩ−１０１．１２Ｆ６Ａ、ＮＩ−１０１．１３Ａ、およびＮＩ−１０１．１３Ｂからなる群より選択される参照抗体と同一のエピトープに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の使用を含む。
【０１１３】
本明細書に記載する方法で使用するための抗体はまた、抗体が、ＮＩ−１０１．１０、ＮＩ−１０１．１１、ＮＩ−１０１．１２、ＮＩ−１０１．１３、ＮＩ−１０１．１２Ｆ６Ａ、ＮＩ−１０１．１３Ａ、およびＮＩ−１０１．１３Ｂからなる群より選択される参照抗体が、Ａβに結合することを競合的に阻害する、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。
【０１１４】
本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、抗体が、ＮＩ−１０１．１０、ＮＩ−１０１．１１、ＮＩ−１０１．１２、ＮＩ−１０１．１３、ＮＩ−１０１．１２Ｆ６Ａ、ＮＩ−１０１．１３Ａ、およびＮＩ−１０１．１３Ｂからなる群より選択される抗体のドメインと同一の抗原結合ドメインを含む、抗体またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をさらに含む。
【０１１５】
本記述は、本明細書に記載する方法で使用することができる、いくつかのそのようなＡβ結合分子、例えば、抗体およびその結合断片をさらに例示し、それらは、それらの可変領域、例えば、結合ドメインにおいて、表２（ＶＨ）および表３（ＶＬ）に図示するアミノ酸配列のうちの任意の１つを含むＶＨおよび／またはＶＬ可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことを特徴とし得る。
【０１１６】
【表２】
2014148543.tif 000004
【０１１７】
【表３】
2014148543.tif 000005
上で特定された可変領域をコード化する、対応するヌクレオチド配列を以下に記載する。表２および３に図示するＶＨおよび／またはＶＬ領域の上記のアミノ酸配列のＣＤＲの例示的なセットを表４に示す。しかしながら、アミノ酸配列が、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の場合、１、２、３、またはそれ以上のアミノ酸だけ、表４に記載するアミノ酸配列とは異なるＣＤＲを、追加的または代替的に使用することができる事実を、当業者は十分に理解している。
【０１１８】
【表４−１】
2014148543.tif 000006
【０１１９】
【表４−２】
2014148543.tif 000007
一実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４２、および配列番号４３からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
【０１２０】
別の実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４４、および配列番号４５からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
【０１２１】
別の実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、配列番号４および配列番号８、配列番号６および配列番号８、配列番号１０および配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６、配列番号３９および配列番号４１、配列番号４２および配列番号４４、ならびに配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。
【０１２２】
さらなる実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、またはそれ以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４２、および配列番号４３からなる群より選択される参照アミノ酸配列と同一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
【０１２３】
さらなる実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、またはそれ以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６、配列番号４１、配列番号４４、および配列番号４５からなる群より選択される参照アミノ酸配列と同一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
【０１２４】
さらなる実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０、またはそれ以下の保存アミノ酸置換を除いて、配列番号４および配列番号８、配列番号６および配列番号８、配列番号１０および配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６、配列番号３９および配列番号４１、配列番号４２および配列番号４４、ならびに配列番号４３および配列番号４５からなる群より選択される参照アミノ酸配列と同一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）および免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる。
【０１２５】
一実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、表２および３に示すＶＨおよび／またはＶＬ領域のアミノ酸配列を含む抗体のうちの任意の１つである。あるいは、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、Ａβへの結合に対して、表２および３に図示するＶＨおよび／またはＶＬ領域を有する抗体のうちの少なくとも１つと競合する、抗体またはその抗原結合断片である。これらの抗体は、マウス抗体、ヒト化抗体、異種抗体、またはキメラヒト−マウス抗体であってもよい。ヒト化抗体、異種抗体、またはキメラヒト−マウス抗体は、治療への応用に特に有用であり得る。例えば、本明細書に記載する方法で使用するための一実施形態では、完全ヒト抗体のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域が、対応するマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域で置換される、キメラヒト−マウス抗体を使用することができる。抗体の抗原結合断片は、例えば、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）断片、およびＦ（ａｂ’）２断片であってもよい。いくつかの用途に対して、抗体の可変領域のみが必要とされ、それは、抗体を好適な試薬で処理し、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’’）２部分を生成することによって得ることができる。そのような断片は、例えば、当該技術分野で既知の方法を使用して、放射性同位体、無機分子、またはペプチド等の検出試薬に免疫グロブリンの免疫特異的部分をカップリングすることを伴う、免疫診断法に有用である。
【０１２６】
一実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、５、４、３、２、またはそれ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２６、および配列番号３２からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域１（ＶＨ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２６、および配列番号３２からなる群より選択される。
【０１２７】
別の実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、１０、９、８、７、６、５、４、またはそれ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２７、および配列番号３３からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域２（ＶＨ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２７、および配列番号３３からなる群より選択される。
【０１２８】
さらなる実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、１０、９、８、７、６、５、４、またはそれ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２８、および配列番号３４からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ重鎖相補性決定領域３（ＶＨ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２８、および配列番号３４からなる群より選択される。
【０１２９】
別の実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、１０、９、８、７、６、５、４、またはそれ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４６、および配列番号４９からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ軽鎖相補性決定領域１（ＶＬ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４６、および配列番号４９からなる群より選択される。
【０１３０】
さらなる実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、５、４、３、２、またはそれ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３６、配列番号４７、および配列番号５０からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ軽鎖相補性決定領域２（ＶＬ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号２４、配列番号３０、配列番号３６、配列番号４７、および配列番号５０からなる群より選択される。
【０１３１】
さらなる実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、１０、９、８、７、６、５、４、またはそれ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号２５、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４８、および配列番号５１からなる群より選択される参照Ｋａｂａｔ軽鎖相補性決定領域３（ＶＬ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。一実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号２５、配列番号３１、配列番号３７、配列番号４８、および配列番号５１からなる群より選択される。
【０１３２】
別の実施形態では、抗Ａβ抗体または抗原結合断片のＶＨは、配列番号１７、１８、および１９、配列番号２０、２１、および２２、配列番号２６、２７、および２８、ならびに配列番号３２、３３、および３４からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるが、ＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つにおける１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換は例外である。一実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片のＶＨは、配列番号１７、１８、および１９、配列番号２０、２１、および２２、配列番号２６、２７、および２８、ならびに配列番号３２、３３、および３４からなる群より選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０１３３】
別の実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片のＶＬは、配列番号２３、２４、および２５、配列番号２９、３０、および３１、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４６、４７、および４８、ならびに配列番号４９、５０、および５１からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含むが、ＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つにおける１つ、２つ、３つ、または４つのアミノ酸置換は例外である。一実施形態では、抗Ａβ抗体またはその抗原結合断片のＶＬは、配列番号２３、２４、および２５、配列番号２９、３０、および３１、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４６、４７、および４８、ならびに配列番号４９、５０、および５１からなる群より選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
【０１３４】
別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つ、または重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つが、本明細書に開示する抗体からの参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる抗体の使用を提供する。あるいは、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示する抗体からの参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である。したがって、本実施形態に従うと、重鎖可変領域は、上記の表４に示す群に関連したＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。表４はＫａｂａｔ系によって定義されるＶＨ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ系によって定義されるＶＨ−ＣＤＲもまた考慮され、表２および３に示すデータを使用して、当業者によって容易に識別され得る。
【０１３５】
別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域が、表４に示すＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３の群と同一のポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる抗体の使用を提供する。
【０１３６】
別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域が、表４に示すＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３の群と同一のポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるが、任意の１つのＶＨ−ＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸置換は例外である、抗体の使用を提供する。特定の実施形態では、アミノ酸置換は、保存的である。
【０１３７】
別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つ、または軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つが、本明細書に開示する抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる抗体の使用を提供する。あるいは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示する抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。したがって、本実施形態に従うと、軽鎖可変領域は、上記の表４に示すポリペプチドに関連したＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。表４はＫａｂａｔ系によって定義されるＶＬ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ系によって定義されるＶＬ−ＣＤＲもまた考慮される。
【０１３８】
別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域が、表４に示すＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３の群と同一のポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる抗体の使用を提供する。
【０１３９】
別の実施形態では、本明細書に記載する方法は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域が、表４に示すＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３の群と同一のポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるが、任意の１つのＶＬ−ＣＤＲにおける１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸置換は例外である、抗体の使用を提供する。特定の実施形態では、アミノ酸置換は、保存的である。
【０１４０】
本記述は、さらに、本明細書に記載する方法で使用するための抗体から得られる単離ポリペプチドの使用に関する。抗体は、ポリペプチド、例えば、免疫グロブリン分子から得られる特異的抗原結合領域をコード化するアミノ酸配列を含む。指定のタンパク質から「得られる」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドの起源を指す。ある特定の場合、特定の出発ポリペプチドまたはアミノ酸配列から得られるポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列と本質的に同一のアミノ酸配列、またはその一部を有し、その部分は、少なくとも１０〜２０アミノ酸、少なくとも２０〜３０アミノ酸、少なくとも３０〜５０アミノ酸からなるか、または別様に、出発配列においてその起源を有することが当業者に識別可能である。
【０１４１】
免疫グロブリンまたはそのコード化ｃＤＮＡをさらに修飾することができる。したがって、さらなる実施形態では、本明細書に記載する方法は、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ−断片、二重特異性抗体、融合抗体、標識抗体、またはそれらのうちの任意の１つの類似体を産生することのうちの任意の１つを含むことができる。対応する方法は、当業者に、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，１９８８に記載される。例えば、抗体の誘導体が、ファージ提示技術によって得られる時、ＢＩＡｃｏｒｅシステムに採用されるような表面プラズモン共鳴を使用して、本明細書に記載する抗体のうちの任意の１つのエピトープと同一のエピトープに結合するファージ抗体の効率を増加させることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５），７−１３）。キメラ抗体の産生は、例えば、国際出願第ＷＯ８９／０９６２２号に記載される。ＷＯ８９／０９６２２号に対する方法。ヒト化抗体の産生のための方法は、例えば、欧州出願第ＥＰ−Ａ１  ０  ２３９  ４００号および国際出願第ＷＯ９０／０７８６１号に記載される。利用することができるさらなる抗体源は、いわゆる異種抗体である。マウスにおけるヒト抗体等の異種抗体の産生のための一般的原理は、例えば、例えば、国際出願第ＷＯ９１／１０７４１号、第ＷＯ９４／０２６０２号、第ＷＯ９６／３４０９６号、および第ＷＯ９６／３３７３５号に記載される。上で考察したように、抗体は、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖内を含む、完全抗体以外の種々の形態で存在することができる。例えば、国際出願第ＷＯ８８／０９３４４を参照されたい。
【０１４２】
本明細書に記載する方法で使用するための抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖は、当該技術分野で既知の従来の技術を使用して、例えば、単独で、または組み合わせて、アミノ酸欠失、挿入、置換、付加、および／もしくは組み換え、ならびに／または当該技術分野で知られている任意の他の修飾を使用することによって、さらに修飾することができる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列にそのような修飾を導入するための方法は、当業者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照されたい。
【０１４３】
抗体可変領域のクローニングおよび組み換え抗体の生成のための方法は、当業者に知られており、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４７（１９９６），１−２０、Ｄｏｅｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ
１１（１９９７），１７８７−１７９２に記載される。いったん適切な遺伝物質が得られ、かつ望まれる場合、類似体をコード化するように修飾されると、最小限で、重鎖および軽鎖の可変領域をコード化するものを含むコード配列を、標準組み換え宿主細胞にトランスフェクトすることができるベクター上に含有される発現系に挿入することができる。効率的な処理のために、種々のそのような宿主細胞を使用することができ、例えば、哺乳動物細胞を使用することができる。この目的に有用な典型的な哺乳動物細胞株としては、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはＮＳＯ細胞が挙げられるがこれに限定されない。
【０１４４】
次いで、抗体または類似体の産生は、宿主細胞の成長およびコード配列の発現に適切な培養条件下で、修飾された組み換え宿主を培養することによって行われる。次いで、抗体は、培養物からそれらを単離することによって回収される。発現系は、得られる抗体が培地中に分泌されるように、シグナルペプチドを含むように設計され得るが、しかしながら、細胞内産生も可能である。
【０１４５】
抗体の修飾は、アセチル化、水酸化、メチル化、アミド化、および炭水化物または脂質部分、補因子等の付着を含む、側鎖修飾、骨格修飾、ならびにＮおよびＣ末端修飾を含む、１つ以上の構成アミノ酸における化学的および／または酵素的誘導体化を含む。同様に、本記述は、カルボキシル末端での免疫刺激リガンド等の異種分子に融合されたアミノ末端において、記載された抗体またはその何らかの断片を含む、キメラタンパク質の産生を包含する。例えば、対応する技術的詳細に関して、国際出願第ＷＯ００／３０６８０号を参照されたい。
【０１４６】
さらに、本記述は、上記のようなＡβ結合分子を含有するもの、例えば、重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）が、抗原−抗体相互作用においてより大きい変動性および主要な関与を有する領域であることがしばしば観察されているため、言及された抗体のうちの任意の１つの可変領域のＣＤＲ３領域、特に、重鎖のＣＤＲ３を含有するものを含む、本明細書に記載する方法での小ペプチドの使用を包含する。そのようなペプチドは、結合剤を産生するための組み換え手段によって容易に合成または産生され得る。そのような方法は、当業者によく知られている。ペプチドは、例えば、市販の自動ペプチド合成装置を使用して合成することができる。ペプチドは、ペプチドを発現するＤＮＡを発現ベクターに組み込み、細胞を発現ベクターで形質転換し、ペプチドを産生することによる組み換え技術によって、産生することができる。
【０１４７】
上記に従って、本記述はまた、本明細書に記載する方法における、抗原またはＡβ結合分子をコード化するポリヌクレオチドの使用に関し、抗体の場合、上記の抗体の免疫グロブリン鎖の少なくとも１つの可変領域を使用することができる。典型的には、ポリヌクレオチドによってコード化される該可変領域は、該抗体の可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。当業者は、抗体の各可変ドメイン（重鎖ＶＨおよび軽鎖ＶＬ）が、時に、４つの比較的に保存されたフレームワーク領域または「ＦＲ」が両側に配置される、相補性決定領域または「ＣＤＲ」と称される、３つの超可変領域を含み、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味することを理解している。抗体のヒトＩｇＧサブタイプの超可変領域またはＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ（１９９１）によって記載される、重鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）からのアミノ酸残基、ならびに重鎖可変ドメインにおける、３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、および９５〜１０２（Ｈ３）からのアミノ酸残基、ならびに／またはＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−９１７によって記載される、軽鎖可変ドメインにおける超可変ループ、例えば、残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける、残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、および９６〜１０１（Ｈ３）からの残基を含む。フレームワークまたはＦＲ残基は、超可変領域以外の、および超可変領域をひとまとめにする、可変ドメイン残基である。「特異的結合」という用語は、所定の抗原に対する抗体の結合を意味する。典型的には、抗体は、１０−７Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で結合し、所定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン、または任意の他の指定ポリペプチド）に結合する際の、そのＫＤよりも少なくとも２分の１少ないＫＤで所定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同じ意味で使用される。本明細書で使用する「高度に特異的な」結合は、特定の標的エピトープに対する抗体の相対ＫＤ値が、他のリガンドにその抗体を結合するためのＫＤの少なくとも１０分の１少ないことを意味する。
【０１４８】
抗原に対する抗体の親和性または結合力は、任意の好適な方法を使用して実験的に決定することができる。例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”  Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、および本明細書に記載する方法を参照されたい。抗原に対する抗体の親和性を測定するための一般的な技術としては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および表面プラズモン共鳴が挙げられる。特定の抗体−抗原相互作用の測定された親和性は、例えば、塩濃度、ｐＨ等の異なる条件下で測定される場合、異なり得る。したがって、親和性および他の抗原−結合パラメータ、例えばＫＤ、ＩＣ５０の測定は、抗体および抗原の標準溶液、および標準緩衝液で行うことができる。
【０１４９】
当業者は、上記の可変ドメインを有する抗体の可変ドメインを、所望の特異性および生物機能の他のポリペプチドまたは抗体の構築のために使用することができることを容易に理解するであろう。したがって、本記述はまた、上記の可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含み、かつ有利に、添付の実施例に記載する抗体と同一または同様の結合特性を実質的に有する、ポリペプチドおよび抗体を包含する。当業者は、本明細書に記載する可変ドメインまたはＣＤＲを使用して、抗体を、当該技術分野で既知の方法、例えば、欧州特許出願第ＥＰ  ０  ４５１  ２１６  Ａ１号および第ＥＰ  ０  ５４９  ５８１  Ａ１号に記載される方法に従って構築することができることを容易に理解するであろう。さらに、当業者は、結合親和性が、ＣＤＲ内、またはＫａｂａｔによって定義されるＣＤＲと部分的に重複する超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−９１７）内でアミノ酸置換を行うことによって強化され得ることを理解している。したがって、本記述はまた、言及されたＣＤＲのうちの１つ以上が、１つ以上または２つ以下のアミノ酸置換を含む、抗体に関する。抗体は、その免疫グロブリン鎖のうちの一方または両方において、表４に記載する可変領域の２つまたは３つ全てのＣＤＲを含むことができる。
【０１５０】
Ａβ結合分子、例えば、当業者によって既知の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、１つ以上のエフェクター機能を仲介する定常領域を含むことができる。例えば、相補体のＣ１成分の抗体定常領域への結合は、相補体系を活性化することができる。相補体の活性化は、細胞の病原体のオプソニン化および溶解において重要である。相補体の活性化はまた、炎症反応を刺激し、自己免疫過敏性にも関与し得る。さらに、抗体は、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体結合部位で、Ｆｃ領域を介して種々の細胞上の受容体に結合する。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（ε受容体）、ＩｇＡ（α受容体）、およびＩｇＭ（μ受容体）を含む、抗体の異なるクラスに特異的である、多くのＦｃ受容体が存在する。細胞表面上での抗体のＦｃ受容体への結合は、抗体で被覆された粒子の取り込みおよび破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体で被覆された標的細胞の溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエータの放出、免疫グロブリン産生の胎盤通過および制御を含む、多くの重要かつ様々な生物反応を誘発する。
【０１５１】
したがって、本明細書に記載する方法で使用するための特定の実施形態は、定常領域ドメインのうちの１つ以上の少なくとも一画分が、ほぼ同一の免疫原性の全不変抗体と比較した場合、エフェクター機能の低下、非共有的に二量体化する能力、標的部位に局在する能力の増加、血中半減期の低下、または血中半減期の増加等の所望の生化学特性を提供するために、欠失させられる、または別様に改変される、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む。例えば、本明細書に記載する診断および治療方法で使用するための特定の抗体は、免疫グロブリン重鎖と同様のポリペプチド鎖を含むが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠いている、ドメイン欠失抗体である。例えば、特定の抗体において、修飾抗体の定常領域の１つの全ドメインが欠失させられる、例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部が欠失させられる。他の実施形態では、本明細書に記載する診断および治療方法で使用するための特定の抗体は、グリコシル化を排除するために改変される、定常領域、例えば、ＩｇＧ重鎖定常領域を有し、それは、本明細書の他の箇所において、非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体または「ａｇｌｙ」抗体と称される。そのような「ａｇｌｙ」抗体は、酵素的に、ならびに定常領域において、コンセンサスグリコシル化部位を操作することによって調製され得る。理論によって束縛されないが、「ａｇｌｙ」抗体は、生体内で改善された安全性および安定性プロファイルを有し得ると考えられる。所望のエフェクター機能を有する非グリコシル化抗体を産生する方法は、例えば、国際公開第ＷＯ２００５／０１８５７２号で見られ、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
本明細書に記載する特定の抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体において、当該技術分野で既知の技術を使用して、Ｆｃ部分を変異させて、エフェクター機能を低減することができる。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点変異または他の手段による）は、循環する修飾抗体のＦｃ受容体結合を低減し、それによって特異的標的への局在化を増大することができる。他の場合において、定常領域修飾は、相補体結合を緩和し、それによって血中半減期および共役された細胞毒素の非特異的会合を低減し得る。増大する抗原特異性または抗体柔軟性による局在化の強化を可能にするジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を修飾するために、定常領域のさらなる他の修飾を使用することができる。局在化、生体内分布、および血中半減期等の修飾により得られる生理プロファイル、バイオアベイラビリティ、および他の生化学的効果は、過度の実験を行うことなく、よく知られている免疫学的技術を使用して、容易に測定および定量化され得る。
【０１５３】
抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の修飾型は、当該技術分野で既知の技術を使用して、全前駆体または親抗体から作製され得る。例示的な技術は、本明細書においてより詳細に考察される。
【０１５４】
特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体の可変領域および定常領域の両方は、完全にヒトである。完全ヒト抗体は、当該技術分野で知られており、本明細書に記載する技術を使用して、作製され得る。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体を、抗原投与に応じてそのような抗体を産生するように修飾されているが、内因性遺伝子座が無効にされている、遺伝子導入動物に抗原を投与することによって、調製することができる。そのような抗体を作製するために使用することができる例示的な技術は、米国特許第６，１５０，５８４号、第６，４５８，５９２号、第６，４２０，１４０号に記載される。他の技術も当該技術分野で知られている。同様に、完全ヒト抗体は、当該技術分野で知られている、種々の表示技術、例えば、ファージ提示、または他のウイルス表示システムによって産生され得る。
【０１５５】
抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、当該技術分野で知られている技術を使用して、作製または製造され得る。特定の実施形態では、抗体分子またはその断片は、「組み換え技術によって産生される」、すなわち、組み換えＤＮＡ技術を使用して産生される。抗体分子またはその断片を作製するための例示的な技術は、本明細書の他の箇所でより詳細に考察される。
【０１５６】
抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体はまた、例えば、共有結合が、抗体がその同種エピトープに特異的に結合することを阻止しないような、抗体への任意の型の分子の共有結合によって修飾される誘導体も含む。例えば、限定することを目的としないが、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解開裂、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合等によって修飾された抗体が挙げられる。多数の化学修飾のいずれも、特異的な化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、またはツニカマイシンの代謝合成等が挙げられるがこれに限定されない、既知の技術によって実施され得る。誘導体は、１つ以上の非古典的なアミノ酸を含み得る。
【０１５７】
特定の実施形態では、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、処置される動物、例えば、ヒトにおける有害な免疫反応を生じさせない。特定の実施形態では、Ａβ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、対象、例えば、ヒト患者から得られ、続いて、それが得られた同一の種、例えば、ヒトにおいて使用され、有害な免疫反応の発生を緩和する、または最小限に抑える。
【０１５８】
脱免疫化をもまた、抗体の免疫原性を低減するために使用することができる。本明細書で使用する「脱免疫化」という用語は、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の改変を含む（例えば、国際公開第ＷＯ９８５２９７６Ａ１号、第ＷＯ００３４３１７Ａ２号を参照されたい）。例えば、出発抗体からのＶＨおよびＶＬ配列が分析され、各Ｖ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）および配列内の他の重要な残基に関してエピトープの配置を示す。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープが、最終抗体の活性を改変する危険性が低い、代替アミノ酸置換を特定するために分析される。アミノ酸置換の組み合わせを含む様々な代替ＶＨおよびＶＬ配列が設計され、これらの配列は、続いて、本明細書に開示する診断および治療方法で使用するための様々な結合ポリペプチド、例えば、ネオエピトープ特異的抗体またはその免疫特異的断片に実質的に組み込まれ、それらは、次いで、機能に関して試験される。典型的には、１２〜２４の変異体抗体が生成および試験される。次いで、修飾ＶおよびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子は、発現ベクターにクローン化され、次のプラスミドは、全抗体の産生のために細胞株に導入される。次いで、抗体は、適切な生化学および生物アッセイで比較され、最適変異体が特定される。
【０１５９】
モノクローナル抗体を、ハイブリドーマ、組み換え、ファージ提示技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野で知られている広範な技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において既知であり、かつ、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）に教示されるハイブリドーマ技術を使用して産生され得る（該参考文献は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる）。本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、それが産生される方法ではなく、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む、単一クローンから得られる抗体を意味する。したがって、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体を、当該技術分野で知られている広範な技術を使用して調製することができる。特定の実施形態では、抗体は、本明細書に記載するように、エプスタイン・バー・ウイルスでの形質転換を介して不死化されているヒトＢ細胞から得られる。
【０１６０】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の技術によって生成され得る。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ´）２断片は、組み換え技術によって、または（Ｆａｂ断片を産生するための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ´）２断片を産生するための）ペプシン等の酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク質分解開裂によって産生され得る。Ｆ（ａｂ´）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
【０１６１】
本明細書に記載するような完全ヒト抗体は、ヒト患者の治療的処置に対して特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から得られる抗体ライブラリを使用する、上記のファージ提示法を含む、当該技術分野で知られている種々の方法によって作製することができる。また、米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９８／４６６４５号、第ＷＯ９８／５０４３３号、第ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９８／１６６５４およびＷＯ９６／３４０９６号、第ＷＯ９６／３３７３５号、および第ＷＯ９１／１０７４１を参照されたく、それらのそれぞれは、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。ヒト抗体は、例えば、症状はないが、例えば、アルツハイマー病等の疾患を発症する危険性がある対象、またはその疾患と診断されるが、異常に安定な疾病経過を伴う患者から単離され得る。
【０１６２】
別の実施形態では、所望のモノクローナル抗体をコード化するＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコード化する遺伝子に特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離および配列され得る。単離およびサブクローン化されたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの起源としての役割を果たす。いったん単離されると、ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、それは、次いで、そうでなければ免疫グロブリンを産生しない、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞等であるがこれに限定されない、原核生物または真核生物宿主細胞にトランスフェクトされる。より具体的には、単離ＤＮＡ（本明細書に記載するように合成され得る）は、参照することによって本明細書に組み込まれる、１９９５年１月２５日出願のＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号に記載されるように、製造抗体に対する定常および可変領域配列をクローン化するために使用され得る。本質的に、これは、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの転換、およびＩｇ特異的プライマーを使用したＰＣＲによる増幅を伴う。本目的のための好適なプライマーもまた、米国特許第５，６５８，５７０号に記載される。以下により詳細に考察するように、所望の抗体を発現する形質転換細胞は、免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を行うために、比較的大量に成長させることができる。
【０１６３】
一実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、１つ以上抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、１つ以上抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、１つ以上抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、１つ以上抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、１つ以上抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。対象抗体に含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子を本明細書に記載する。
【０１６４】
特定の実施形態では、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列超可変性の領域を決定するために、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列と比較することによる、当該技術分野でよく知られている方法によって、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を特定するために検査され得る。通常の組み換えＤＮＡ技術を使用して、ＣＤＲのうちの１つ以上を、フレームワーク領域内、例えば、ヒトフレームワーク領域に挿入することができる。フレームワーク領域は、自然発生的もしくはコンセンサスフレームワーク領域、またはヒトフレームワーク領域であり得る（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストに関して、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照されたい）。特定の実施形態では、フレームワーク領域とＣＤＲとの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコード化する。特定の実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、例えば、その抗原への抗体の結合を改善するために、フレームワーク領域内で行われ得る。さらに、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠いている抗体分子を生成するために、鎖内ジスルフィド結合に関与する１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行うために、そのような方法を使用することができる。ポリヌクレオチドへの他の改変は、当業者によって考慮され、かつ既知である。
【０１６５】
あるいは、一本鎖抗体の産生に関して記載される技術（米国特許第４，６９４，７７８号、Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４（１９８９））を、一本鎖抗体を産生するために適用することができる。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖断片を連結することによって形成され、一本鎖抗体をもたらす。大腸菌における機能的Ｆｖ断片の集合の技術もまた、使用され得る（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０１６６】
別の実施形態では、リンパ球は、マイクロマニピュレーションによって選択され得、可変遺伝子は、単離される。例えば、末梢血単核細胞を、免疫された哺乳動物または免疫が生まれつきある哺乳動物、例えば、ヒトから単離し、約７日間生体外で培養することができる。培養物は、スクリーニング基準を満たす特異的ＩｇＧに対してスクリーニングされ得る。陽性ウェルからの細胞を単離することができる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞を、ＦＡＣＳによって、または補体媒介性溶血プラークアッセイにおいてそれらを同定することによって、単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞は、１つの管にマイクロマニピュレーションすることができ、ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子を、抗体発現ベクターにクローン化し、発現のために細胞（例えば、真核生物または原核生物細胞）にトランスフェクトすることができる。
【０１６７】
あるいは、抗体産生細胞株は、当業者によく知られている技術を使用して、選択および培養され得る。そのような技術は、種々の実験マニュアルおよび一次出版物に記載される。この点において、以下に記載するような方法で使用するのに好適な技術は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載され、付録を含む、その全体が参照として本明細書に明確に組み込まれる。
【０１６８】
本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、抗体の合成のための当該技術分野で知られている任意の方法によって、特に、本明細書に記載するような組み換え発現技術による化学合成によって、産生することができる。
【０１６９】
一実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、１つ以上のドメインが部分的に、または完全に欠失される、合成定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定の実施形態では、適合する修飾抗体は、完全ＣＨ２ドメインが除去されている、ドメイン欠失構築物または変異体を含む（ΔＣＨ２構築物）。他の実施形態に対して、短い連結ペプチドが、可変領域に対して運動の柔軟性および自由度を提供するために、欠失ドメインと置換され得る。当業者は、そのような構築物が、抗体の異化率に対するＣＨ２ドメインの調節特性の理由から、特に有用であることを理解するであろう。ドメイン欠失構築物は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコード化するベクターを使用して得ることができる（例えば、国際公開第ＷＯ０２／０６０９５５Ａ２号および第ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２号を参照されたい）。このベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失し、ドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するように操作される。
【０１７０】
特定の実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ミニボディである。ミニボディは、当該技術分野で記載される方法を使用して作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号または国際公開第ＷＯ９４／０９８１７Ａ１号を参照されたい）。
【０１７１】
一実施形態では、本明細書に記載する方法で使用するための抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、単量体サブユニット間の会合を可能にする限り、少なくとも１つのアミノ酸の欠失または置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された範囲における単一アミノ酸の突然変異が、Ｆｃ結合を実質的に低減し、それによって、標的組織局在を増大し得る。同様に、調節されるエフェクター機能（例えば、相補体結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの一部を欠失することが望ましくあり得る。定常領域のそのような部分的欠失は、対象の定常領域ドメインに関連する所望の機能を無傷のままにする一方で、抗体の選択された特性（血中半減期等）を改善し得る。さらに、上で示唆したように、開示された抗体の定常領域は、得られる構築物の免疫原性プロファイルを強化する１つ以上のアミノ酸の突然変異または置換を通じて合成され得る。この点において、修飾抗体の構成および免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を妨害することが可能であり得る。さらに他の実施形態は、エフェクター機能等の所望の特性を強化するため、またはさらなる細胞毒素または炭水化物の付着を提供するために、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含む。そのような実施形態では、選択された定常領域ドメインから得られる特異的配列を挿入または複製することが望ましくあり得る。
【０１７２】
本記述はまた、本明細書に記載する抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含む、それから本質的になる、またはそれからなる抗体を提供し、抗体またはそれらの断片は、Ａβに免疫特異的に結合する。抗体をコード化するヌクレオチド配列に突然変異を導入するために、アミノ酸置換をもたらす部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発が挙げられるがこれに限定されない、当業者に既知の技術を使用することができる。変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３に対して、５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換をコード化することができる。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。同様の電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸が挙げられる。あるいは、飽和突然変異誘発等によって、突然変異をコード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入することができ、得られる変異体を生物学的活性に対してスクリーニングし、活性（例えば、疾患関連ポリペプチドに結合する能力）を保持する変異体を特定することができる。
【０１７３】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域にのみ、またはＣＤＲ領域にのみ、突然変異を導入することが可能である。導入された突然変異は、サイレントまたは中立ミスセンス突然変異であってもよく、例えば、抗原に結合するための抗体の能力に影響がない、またはほとんどなく、実際には、いくつかのそのような突然変異は、どんなものであれアミノ酸配列を改変しない。これらの種類の突然変異は、コドン使用度を最適化するために、またはハイブリドーマの抗体産生を改善するために有用であり得る。抗体をコード化するコドン最適化コード領域は、本明細書の他の箇所に開示される。あるいは、非中立ミスセンス突然変異は、抗原を結合する抗体の能力を改変し得る。ほとんどのサイレントおよび中立ミスセンス突然変異の位置は、フレームワーク領域内にある可能性があるが、ほとんどの非中立ミスセンス突然変異の位置は、絶対条件ではないが、ＣＤＲ内にある可能性がある。当業者は、抗原結合活性において改変なし、または結合活性において改変あり（例えば、抗原結合活性の改善または抗体特異性の変化）等の所望の特性を有する変異体分子を設計および試験することができるであろう。突然変異誘発に続き、コード化タンパク質は、定期的に発現され得、コード化タンパク質の機能的および／または生物活性（例えば、疾患関連ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに免疫特異的に結合する能力）は、本明細書に記載する技術を使用して、または当該技術分野で知られている日常の修飾技術によって決定され得る。
【０１７４】
ＩＶ．抗体をコード化するポリヌクレオチド
上に従って、本記述はまた、本明細書に記載する方法で、Ａβ結合分子、例えば、抗体をコード化するポリヌクレオチドの使用に関する。抗体の場合には、ポリヌクレオチドは、上記の抗体の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコード化し得る。上記の抗体をコード化するポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成的に産生されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、または単独で、あるいは組み合わせて、それらのポリヌクレオチドのいずれかを含む、組み換え技術によって産生されたキメラ核酸分子であり得る。ポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得る。そのようなベクターは、好適な宿主細胞において、かつ好適な条件下でそのベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子等のさらなる遺伝子を含み得る。ポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞における発現を可能にする発現制御配列に作動可能に連結され得る。該ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへのポリヌクレオチドの転写を含む。哺乳動物細胞等の真核細胞における発現を確実にする調節因子は、当業者にはよく知られている。それらは、通常、転写開始を確実にする調節配列、および随意に、転写終結および転写物の安定化を確実にするポリＡシグナル含む。さらなる調節因子としては、転写および翻訳エンハンサー、ならびに／または自然会合もしくは異種プロモーター領域が挙げられ得る。
【０１７５】
抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコード化するポリヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドからなり得る。例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコード化するポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、またはより典型的には、二本鎖、もしくは一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であり得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む、ハイブリッド分子からなり得る。さらに、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコード化するポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域からなり得る。抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体をコード化するポリヌクレオチドはまた、安定性または他の理由のために修飾された、１つ以上の修飾塩基またはＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格を含有し得る。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシン等の非通常塩基を含む。ＤＮＡおよびＲＮＡに対して種々の修飾を行うことができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された型を包含する。
【０１７６】
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分）から得られるポリペプチドの非天然変異体をコード化する単離ポリヌクレオチドは、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失がコード化タンパク質に導入されるように、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を導入することによって作製され得る。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発等の標準的な技術によって導入され得る。保存アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行われ得る。
【０１７７】
知られているように、ＲＮＡは、グアニジンイソチオシアネート抽出および沈殿、続いて遠心分離またはクロマトグラフィ等の標準的な技術によって、元のハイブリドーマ細胞から、または他の形質転換細胞から単離され得る。望まれる場合、ｍＲＮＡは、オリゴｄＴセルロースに対するクロマトグラフィ等の標準的な技術によって、全ＲＮＡから単離され得る。好適な技術は、当該技術分野においてよく知られている。
【０１７８】
一実施形態では、抗体の軽鎖および重鎖をコード化するｃＤＮＡは、よく知られている方法に従って、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用して、同時あるいは別々に行われ得る。ＰＣＲは、公開された重鎖および軽鎖ＤＮＡ、ならびにアミノ酸配列に基づいて、コンセンサス定常領域プライマーによって、またはより特異的なプライマーによって開始され得る。上で考察したように、ＰＣＲもまた、抗体軽鎖および重鎖をコード化するＤＮＡクローンを単離するために使用され得る。この場合、ライブラリは、コンセンサスプライマーまたはマウス定常領域プローブ等のより大きい相同プローブによってスクリーニングされ得る。
【０１７９】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは、当該技術分野で既知の技術を使用して、細胞から単離され、例えば、組み換えＤＮＡ技術に関する上記の参考文献において詳細に記載される標準的な、よく知られている技術に従って、制限地図化および配列され得る。当然のことながら、ＤＮＡは、単離過程または後続の分析中、任意の時点で合成され得る。
【０１８０】
一実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコード化する核酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなり、重鎖可変領域のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、または重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つは、本明細書に開示する抗体からの参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。あるいは、ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示する抗体からの参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。したがって、本実施形態によると、重鎖可変領域は、表４に示すポリペプチド配列に関したＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０１８１】
別の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコード化する核酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなり、軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つ、または軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つは、本明細書に開示する抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。あるいは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示する抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。したがって、本実施形態によると、軽鎖可変領域は、表４に示すポリペプチド配列に関したＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
【０１８２】
別の実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコード化する核酸を含む、それから本質的になる、またはそれからなり、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、表４に示すＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３の群に同一であるポリペプチド配列を有する。
【０１８３】
当該技術分野で知られているように、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチドの間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸または核酸配列を、第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列と比較することによって決定される。本明細書において考察する場合、任意の特定のポリペプチドが、もう１つのポリペプチドに少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）等であるがこれに限定されない、当該技術分野で知られている方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを使用して、決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列間で相同の最良のセグメントを見つけるために、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同アルゴリズムを使用する。特定の配列が、例えば、参照配列に９５％同一であるかどうかを決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然ながら、同一性の割合が参照ポリペプチド配列の全長にわたって算出され、参照配列におけるアミノ酸の総数の最大で５％の相同性の差が許容されるように、パラメータが設定される。
【０１８４】
【表５−１】
2014148543.tif 000008
【０１８５】
【表５−２】
2014148543.tif 000009
【０１８６】
【表６】
2014148543.tif 000010
この点において、当業者は、少なくとも軽鎖および／または重鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドが、両方の免疫グロブリン鎖または１つのみの可変ドメインをコードすることができることを容易に理解するであろう。同様に、該ポリヌクレオチドは、発現において同じプロモーターの制御下にあるか、または別々に制御し得る。原核宿主細胞で発現可能な考えられる調節要素は、例えば、大腸菌のＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ、またはｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞で発現可能な調節要素の例は、酵母のＡＯＸ１プロモーターもしくはＧＡＬ１プロモーター、哺乳類および他の動物細胞のＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＭＶエンハンサー、またはグロビンイントロンが挙げられる。転写開始を担う要素以外に、このような調節要素は、ポリヌクレオチドの下流にＳＶ４０−ポリ−Ａ部位もしくはｔｋ−ポリ−Ａ部位等の転写終止シグナルも含むことができる。さらに、使用される発現系に依存して、ポリペプチドを細胞区画に誘導する、または培地に分泌することができるリーダー配列が、ポリヌクレオチドのコード配列に追加され得、当該分野において周知である。リーダー配列は、翻訳、開始、および終止配列と共に適切な相に組み入れられ、いくつかの実施形態において、リーダー配列は、翻訳タンパク質もしくはその一部の細胞膜周辺腔または細胞外培地への分泌を誘導することができる。任意に、異種配列は、所望の特性、例えば、発現された組換え生成物の安定化または簡易化された精製を付与するＣまたはＮ末端同定ペプチドを含む、融合タンパク質をコードすることができる。これに関連して、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ
ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）等の、適切な発現ベクターが、当該分野において知られている。発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換または形質移入できるベクターの真核プロモーター系であり得るが、原核宿主における制御配列も使用され得る。ベクターが適切な宿主に組み込まれると、その宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下で維持され、所望に応じて、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体、もしくは無傷の抗体、結合断片、または他の免疫グロブリン形態の採集および精製を続いて行うことができる（Ｂｅｙｃｈｏｋ，Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（１９７９）を参照のこと）。
【０１８７】
本方法は、別の個所に記載される通り、ポリヌクレオチドの断片の使用も含む。加えて、本明細書に記載される通り、融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂ断片、および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドの使用も考慮される。
【０１８８】
ポリヌクレオチドは、当該分野に知られるあらゆる方法により生成または製造することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知の場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てることができる（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１７：２４２（１９９４）に記載される通り）が、これはつまり、抗体をコードする配列の一部（複数）を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドの加熱徐冷および連結、並びにその後のＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
【０１８９】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチド、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、適切な供給源の核酸から生成され得る。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できないが、抗体分子の配列が既知である場合、抗体をコードする核酸は、配列の３’および５’末端にハイブリダイズできる合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅により、または例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリからｃＤＮＡクローンを特定するために、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローン化することにより、適切な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、または抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞等の、新生抗原特異的抗体を発現するあらゆる組織または細胞から単離されたポリＡ＋ＲＮＡ等の核酸から生成される、ｃＤＮＡライブラリ）から化学的に合成か、または得ることができる。ＰＣＲにより生成された増幅された核酸は、次いで、当該分野に周知のいかなる方法を用いて、も複製可能クローン化ベクターにクローン化され得る。
【０１９０】
抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、そのヌクレオチド配列は、例えば、アミノ酸置換、除去、および／または挿入を形成するために異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成するように、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ等（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９８）に記載される技術を参照されたく、これらは参照によりその全体が本明細書に援用される。）のヌクレオチド配列の操作のために、当該分野において周知の方法を用いて操作され得る。
【０１９１】
Ｖ．抗体ポリペプチドの発現
Ａβ結合分子の組換え産生、特に抗体およびその模倣物の手段および方法、並びに抗体であってもなくてもよい競合Ａβ結合分子のスクリーニング方法は、当該分野に既知であり、例えば、β−アミロイドに対する抗体およびアルツハイマー病の治療／診断に関して国際特許出願第ＷＯ２００６／１０３１１６号に要約されており、その開示は、抗体工学並びに治療および診断用途の管理の本目的において、参照により本明細書に援用される。
【０１９２】
本方法は、本明細書に記載される通り、概して、ポリヌクレオチドまたはベクターを用いて細胞を遺伝子操作することを含む、抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を発現することが可能な細胞を産生するための方法も含む。本明細書に記載する方法で取得可能な細胞は、例えば、抗体とその抗原との相互作用を試験するために使用され得る。
【０１９３】
抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を提供するように単離された遺伝物質の操作後、抗体をコードするポリヌクレオチドは、通常、所望の抗体量を産生するために使用することができる宿主細胞に導入するために発現ベクターに挿入される。
【０１９４】
抗体、またはその断片、誘導体、もしくは類似体、例えば、標的分子に結合する抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現を本明細書に記載する。抗体分子、または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその一部をコードする（または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含有する）ポリヌクレオチドが得られると、抗体分子産生のためのベクターは、当該分野に周知の技法を用いて、組換えＤＮＡ技術により産生され得る。したがって、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現することによりタンパク質を調製するための方法が、本明細書に記載される。当業者に周知の方法が、抗体コード配列、並びに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、例えば、生体外組換えＤＮＡ技法、合成技法、および生体内遺伝的組換えを含む。本明細書の記載は、したがって、操作可能にプロモーターに連結される、抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。このようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８６／０５８０７号、ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／０１０３６号、および米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、抗体の可変ドメインは、重鎖または軽鎖全体の発現のためにこのようなベクターにクローン化され得る。
【０１９５】
本説明は、抗原または抗体の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む従来の遺伝子工学で、任意に本発明の抗体の他の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドと組み合わせて使用されるベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、およびバクテリオファージに関する。該ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子移入もしくは標的ベクターであり得る。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルス等のウイルス由来の発現ベクターを、標的細胞集団へのポリヌクレオチドまたはベクターの送達に使用することができる。当業者に周知の方法が、組換えウイルスベクターを構築するために使用され得るが、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載される技法を参照のこと。あるいは、ポリヌクレオチドおよびベクターは、標的細胞への送達のためにリポソームに再構築され得る。ポリヌクレオチド（例えば、免疫グロブリン鎖コード配列および発現制御配列の重および／または軽可変ドメイン）を含有するベクターは、周知の方法で宿主細胞に転送され得、それは細胞宿主の種類に依存して異なる。例えば、塩化カルシウムの形質移入が、通常、原核細胞に利用されるが、リン酸カルシウム処理または電気穿孔が、他の細胞宿主に使用され得る（上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照のこと）。
【０１９６】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、宿主細胞に導入するための、および所望の遺伝子を発現するための媒体として、本発明の方法に従い使用されるベクターを意味するように、本明細書で使用される。当業者に知られているように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスおよびレトロウイルスからなる群から容易に選択され得る。概して、本方法に適したベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローン化を促進する適切な制限部位、並びに真核および原核細胞に進入できる、および／またはそこで複製できる能力を含む。
【０１９７】
本明細書に記載する方法の目的において、多数の発現ベクター系が利用され得る。例えば、一種類のベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマ、ウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、またはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルス由来のＤＮＡ要素を利用する。他は、内部リボソーム結合部位を伴う多シストロン性系の使用を含む。加えて、ＤＮＡをそれらの染色体に組み込んだ細胞は、形質移入された宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することにより選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅等の重金属耐性に原栄養性を提供することができる。選択可能マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結するか、または同時形質転換により同じ細胞に導入されるかのいずれかであり得る。追加要素も、最適なｍＲＮＡの合成に必要であり得る。これらの要素は、シグナル配列、スプライスシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルを含むことができる。
【０１９８】
特定の実施形態において、コード可変領域遺伝子は、上述の通り、重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（ヒト等）合成と共に、発現ベクターに挿入される。一実施形態において、これは、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号に記載される）と称される、Ｂｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．の商標発現ベクターを使用して達成される。本ベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスβグロビン主要プロモーター、ＳＶ４０複製源、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子、並びにリーダー配列を含む。本ベクターは、可変及び定常領域遺伝子の組み入れ、ＣＨＯ細胞への形質移入、次いで、Ｇ４１８含有培地の選択、およびメトトレキサート増幅時に抗体の非常に高い発現レベルをもたらすことが分かった。無論、真核細胞で発現を誘発できるあらゆる発現ベクターが、本方法に使用され得る。適切なベクターの例としては、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）、並びにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。概して、免疫グロブリン重鎖および軽鎖が、例えば、ロボットシステムにより実施することができるルーチン的な実験である場合、適切に高レベルを発現するものについて、数多くの形質転換された細胞をスクリーニングする。ベクター系は、米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号にも教示されており、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される。本系は、例えば、３０ｐｇ／細胞／日より高い、高発現レベルを提供する。他の例示的なベクター系は、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０１９９】
別の実施形態において、本明細書に記載する方法で使用するための抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、２００２年１１月１８日に出願され、その全体が本明細書に援用される米国特許出願公開第２００３−０１５７６４１Ａ１号に開示されているもの等、多シストロン性構築物を用いて発現され得る。これらの新規発現系において、抗体の重鎖および軽鎖等、対象とする複数の遺伝子産物を、単一の多シストロン性構築物から産生することができる。これらの系は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有利に使用し、比較的高レベルの抗体を提供する。適合するＩＲＥＳ配列が、米国特許第６，１９３，９８０号に開示されており、これも本明細書に援用される。当業者は、このような発現系が該明細書に開示される全ての範囲の抗体を効果的に産生するように使用することができることを理解するであろう。
【０２００】
より一般的には、抗体の単量体サブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入され得る。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者に周知の、様々な技法で達成され得る。これらには、形質移入（電気泳動および電気穿孔を含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降法、外被ＤＮＡによる細胞融合、微量注入、および無傷ウイルスによる感染を含むが、これらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２（１９８８）を参照のこと。典型的には、プラスミドの宿主への導入は、電気穿孔を介する。発現構築物を抱える宿主細胞は、軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で成長し、重鎖および／軽鎖タンパク質合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、または蛍光標示式細胞分取器分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学等が挙げられる。
【０２０１】
発現ベクターは、従来の技法で宿主細胞に転移され、形質移入された細胞は、次いで、従来の技法で培養され、本明細書に記載する方法で使用するための抗体を産生する。したがって、本明細書に提供する方法は、抗体、その重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有し、作動可能に異種プロモーターに連結される、宿主細胞の使用を含む。二重鎖抗体発現の実施形態において、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、以下に詳細を記載する通り、全体の免疫グロブリン分子の発現のために、宿主細胞で同時発現され得る。
【０２０２】
本説明は、さらに、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはベクターを用いて形質転換される宿主細胞に関する。該宿主細胞は、原核または真核細胞であり得る。宿主細胞に存在するポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、または染色体外で維持されるかのいずれかであり得る。宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物、または動物もしくはヒトの細胞等、あらゆる原核または真核であり得る。真菌細胞は、例えば、サッカロマイセス属、特に出芽酵母種のものである。「原核」という用語は、抗体または対応する免疫グロブリン鎖の発現において、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を用いて形質転換または形質移入することができる全ての細菌を含むことを意味する。原核宿主は、例えば、大腸菌、ネズミチフス菌、霊菌、および枯草菌等のグラム陰性並びにグラム陽性を含むことができる。「真核」という用語は、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞、ＨＥＫ２９３、ＮＳＯおよびＣＨＯ細胞を含むものとする。組換え産生手順に利用される宿主によって、ポリヌクレオチドによりコードされる抗体または免疫グロブリン鎖は、グリコシル化され得、またはグリコシル化されないようにすることができる。抗体または対応する免疫グロブリン鎖も、最初のメチオニンアミノ酸残基を含むことができる。ポリヌクレオチドを、当業者によく知られているいかなる技法を用いても、宿主を形質転換または形質移入するために使用することができる。さらに、融合される、作動可能に連結される遺伝子を調製し、例えば、哺乳類細胞および細菌でこれらを発現させるための方法は、当該分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。本明細書に記載する遺伝子構築物および方法は、真核または原核宿主における抗体もしくは対応する免疫グロブリン鎖の発現のために利用することができる。概して、挿入されたポリヌクレオチドの効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する発現ベクターが、宿主に関連して使用される。発現ベクターは、典型的には、複製元、プロモーター、およびターミネーター、並びに形質転換された細胞の表現型の選択を提供できる特異的遺伝子を含有する。適切なＤＮＡの供給元細胞、並びに免疫グロブリン発現および分泌の宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（参照により本明細書に援用される、“Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，”Ｅｉｇｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９４）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）等の数多くの供給源から入手することができる。さらに、細胞を含む、哺乳類等の遺伝子導入動物を、抗体の大量産生に使用することができる。
【０２０３】
形質転換された宿主を、発酵槽で成長させ、当該分野に知られている技法に従い培養し、最適な細胞成長を得ることができる。発現すると、抗体全体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態は、硫酸アンモニウム沈降法、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当該分野の標準手順に従い精製することができる（Ｓｃｏｐｅｓ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと）。抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖は、次いで、成長培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から単離され得る。例えば、組換えにより発現された抗体または免疫グロブリン鎖の単離および精製は、例えば、抗体の定常領域に対して向けられるモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含むもの等、例えば、分取クロマトグラフ分離および免疫学的分離等のいかなる従来の手段でもあり得る。抗体は、例えば、薬物標的および撮像用途のために、他の部分とさらに結合され得ることは、当業者には明らかであろう。このような結合は、抗体または抗原の発現後、結合部位に化学的に実施するか、または結合産物をＤＮＡレベルで抗体または抗原中に組換えされ得る。ＤＮＡは、その後、適切な宿主系で発現し、発現タンパク質は、収集され、必要に応じて、再生される。
【０２０４】
実質的に、少なくとも約９０〜９５％均一の、または少なくとも約９８〜９９％以上均一の純粋な免疫グロブリンを、医薬用途に使用することができる。所望に応じて部分的または均一に精製されると、抗体は、次いで、治療的（体外的を含む）に、またはアッセイ手順の開発および実施に使用され得る。
【０２０５】
宿主細胞は、２つの発現ベクターを用いて同時導入することができ、第１のベクターは、重鎖由来ポリペプチドをコードし、第２のベクターは、軽鎖由来ポリペプチドをコードする。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能マーカーを含有することができる。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一ベクターが使用され得る。このような場合において、軽鎖は、重鎖の前に有利に配置され、過剰な毒性の遊離重鎖の発現を避ける（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ３２２：５２（１９８６）、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。  
【０２０６】
本明細書で使用される、「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技法を用い、少なくとも１つの異種遺伝子をコードすることにより構築されたベクターを保有する細胞を指す。組換え宿主から抗体を単離するプロセスの説明において、「細胞」および「細胞培養」という用語は、明示的に記載されない限り、抗体の供給源を表すように、互換的に使用される。つまり、「細胞」からのポリペプチドの回収は、全細胞の遠心沈降から、または培地および懸濁細胞の両方を含有する細胞培養からのいずれかを意味することができる。
【０２０７】
様々な宿主発現ベクター系を、本明細書に記載する方法で使用するための抗体分子を発現するために利用することができる。このような宿主発現系は、対象のコード配列が産生された後、精製することができる媒体を表すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列を用いて形質転換または形質移入される時、原位置で抗体分子を発現できる細胞も表す。これらは、抗体コード配列を含有する組換えバクテリアファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）、抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（例えば、サッカロマイセス、ピキア）、抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて感染された昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を用いて感染された、もしくは抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換された植物細胞系、または哺乳類細胞（例えば、メタロチオネインプロモーター）ゲノム由来、もしくは哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）由来のプロモーターを含有する組換え発現構築物を保有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）を含むが、これらに限定されない。特に全組換え抗体分子の発現における大腸菌等の細菌細胞および真核細胞は、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、ヒトのサイトメガロウイルスからの主要中間前期遺伝子プロモーター要素等のベクターと共に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳類細胞は、抗体の効率的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ４５：１０１（１９８６）、Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２（１９９０））。
【０２０８】
タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、哺乳類由来であり得るが、当業者は、そこに発現される所望の遺伝子産物に最も適する特定の宿主細胞株を決定する能力を有すると考えられる。例示的な宿主細胞株としては、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒトの子宮頸癌）、ＣＶＩ（サルの腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を伴うＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（仔ハムスターの腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスターの線維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウスの線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスターの腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウスの骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウスの骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシの内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトのリンパ球）、および２９３（ヒトの腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞株は、典型的には、商業サービスであるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、または公開文献から入手可能である。
【０２０９】
加えて、挿入された配列の発現を調節する、または所望する特定の様式で遺伝子産物を修正または処理する宿主細胞系統が選択され得る。タンパク質産物のこのような修正（例えば、グリコシル化）および処理（例えば、切断）は、そのタンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、翻訳後の処理、並びにタンパク質および遺伝子産物の修飾において、特徴的かつ特定の機構を有する。適切な細胞株または宿主系を、発現した外来タンパク質の正確な修飾および処理を確実にするように選択することができる。この目的のために、遺伝子産物の一次転写物、グリコシル化、およびリン酸化の適切な処理の細胞機構を備える真核宿主細胞が使用され得る。
【０２１０】
長期的かつ高収率の組換えタンパク質の産生において、安定した発現が使用され得る。例えば、安定的に抗体分子を発現する細胞株を操作して作成することができる。ウイルスの複製元を含有する発現ベクターを使用するよりも、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）、および選択可能マーカーにより制御されたＤＮＡを用いて、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞を富栄養培地で１〜２日間成長させた後、選択培地に切り替える。組換えプラスミドの選択可能マーカーは、選択への耐性を付与し、細胞が安定的にプラスミドをその染色体に組み込み、成長させて、次に、クローン化され、細胞株に伸長され得る増殖巣を形成することを可能にする。この方法は、抗体分子を安定的に発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。
【０２１１】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ１１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ２２：８１７  １９８０）遺伝子が、それぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ細胞において利用され得ることを含む、数多くの選択系が使用され得るが、これらに限定されない。また、抗代謝物耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として使用され得る：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：３５７（１９８０）、Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ１２：４８８−５０５、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ３：８７−９５（１９９１）、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：９２６−９３２（１９９３）、およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；、ＴＩＢ  ＴＥＣＨ１１（５）：１５５−２１５（Ｍａｙ，１９９３）；およびハイグロマイシンに対して耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ３０：１４７（１９８４）。使用され得る組換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、及びＣｈａｐｔｅｒｓ１２ａｎｄ１３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されており、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０２１２】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅により増加され得る（概説では、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能な時、宿主細胞の培養に存在する阻害物質のレベルの増大は、マーカー遺伝子のコピー数を増加する。増幅領域は抗体遺伝子に関連するため、抗体の産生も増大する（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０２１３】
生体外産生は、大量の所望のポリペプチドを得るスケールアップを可能にする。組織培養条件下での哺乳類細胞培養の技法は、当該分野において知られており、例えば、エアリフト反応器もしくは連続攪拌反応器での均一な懸濁培養、または例えば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ上、もしくはセラミックカートリッジでの固定もしくは封入細胞培養を含む。必要な場合、および／または所望する場合、本明細書に記載する、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの生合成後、または、ＨＩＣクロマトグラフィー工程前、もしくはそれに続いて、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィーもしくは（免疫）親和性クロマトグラフィー等の慣用のクロマトグラフィー法により、ポリペプチド溶液を精製することができる。
【０２１４】
本明細書に記載する方法で使用するための遺伝子コード抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、細菌、もしくは昆虫、もしくは酵母、もしくは植物細胞等の哺乳類以外の細胞でも発現され得る。核酸を容易に取り込む細菌は、大腸菌、サルモネラ菌等の腸内細菌科、枯草菌等のバチルス科、肺炎球菌、連鎖球菌、およびインフルエンザ菌の一部分を含む。細菌で発現される時、異種ポリペプチドは、典型的には、封入体の一部となることがさらに理解されるであろう。異種ポリペプチドは、単離され、精製され、その後、官能分子に組み立てられなければならない。四価形態の抗体が所望される場合、サブユニットが四価の抗体に自己組み立てされる（ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２）。
【０２１５】
細菌系において、多くの発現ベクターは、発現される抗体分子を対象とする使用に応じて有利に選択され得る。例えば、抗体分子の医薬組成物の生成のために、大量のこのようなタンパク質が産生される時、容易に精製される高レベルの融合タンパク質の発現を誘導するベクターが望ましい。このようなベクターとしては、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列がｌａｃＺコード領域を伴うフレームのベクターに個々に連結され得る、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））等が挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターも、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いた融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するために使用され得る。概して、このような融合タンパク質は可溶性で、吸収およびマトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの結合後、遊離グルタチオンの存在下での溶出により、溶解細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、クローン化標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０２１６】
原核生物に加え、真核微生物も使用され得る。出芽酵母、すなわち通常のパン酵母が真核微生物の中で通常、最も使用されるが、例えば、ピキアパストリス等の多くの他の系統が通常入手可能である。
【０２１７】
サッカロマイセスの発現のために、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２８２：３９（１９７９）、Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ７：１４１（１９７９）、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ１０：１５７（１９８０））が、通常、使用される。このプラスミドは、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ８５：１２（１９７７））等のトリプトファンで成長するための能力を欠失する酵母の突然変異系統の選択マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子を既に含有する。酵母宿主細胞ゲノムの特性としてのｔｒｐｌ欠陥の存在は、次いで、トリプトファン不在での成長により形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
【０２１８】
昆虫系において、オートグラファカルフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして典型的に使用される。ウイルスは、ヨトウガ細胞で成長する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置され得る。
【０２１９】
抗体分子が組換えにより発現されると、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にタンパク質Ａの後の特定の抗原に対する親和性、およびサイズカラムクロマトグラフィーによる）、遠心分離、溶解度差による免疫グロブリン分子精製のための当該分野に既知のあらゆる方法により、またはタンパク質精製のためのあらゆる他の標準的な技法により、精製され得る。あるいは、抗体の親和性を増大するための別の方法が米国特許第２００２／０１２３０５７  Ａ１号に開示されている。
【０２２０】
ＶＩ．融合タンパク質および共役体
本明細書に記載する方法で使用するための抗体は、さらなるドメインを含むことができ、該ドメインは、共有結合または非共有結合により連結される。連結は、当該分野に知られており、上述の方法に従う遺伝子融合に基づき実施され得、または例えば、国際特許出願第ＷＯ９４／０４６８６号に記載されるように、例えば、化学的架橋により実施され得る。抗体を含む融合タンパク質に存在する追加ドメインは、可撓性リンカー、有利にポリペプチドリンカーにより連結され得、該ポリペプチドリンカーは、該さらなるドメインのＣ末端と抗体のＮ末端との間の距離、あるいは該さらなるドメインのＮ末端と抗体のＣ末端との間の距離にまたがるだけの十分な長さの複数の親水性ペプチド結合アミノ酸を含む。治療的または診断学的活性剤は、様々な手段で抗体またはその抗原結合断片に結合され得る。これは、例えば、ペプチド結合等の共有結合の方法により治療的または診断学的活性剤に結合される抗体の可変領域を含む、単鎖融合タンパク質を含む。さらなる例としては、以下の非制限的な例示リストに含まれる共有結合的または非共有結合的に結合される、少なくとも抗原結合断片を含む分子が挙げられる。Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｐ．ＳｕＤＰ７（１９９２），５１−５２は、ＣＤ３を対象とするＦｖ領域が、可溶ＣＤ４、またはＯＶＣＡおよびＩＬ−７等の他のリガンドに結合される二特異的試薬ｊａｎｕｓｉｎを記載している。同様に、抗体の可変領域は、Ｆｖ分子に構築され、引用文献に例示されるもの等、別のリガンドに結合され得る。Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ１６６（１９９２），１９８−２０２は、ＧＰ１２０のＶ３領域における特定の配列を対象とする抗体に架橋されるＯＫＴ３からなるヘテロ共役体抗体を記載している。このようなヘテロ共役体抗体も、抗体法に含有される少なくとも可変領域を用いて構築され得る。特異的抗体のさらなる例は、Ｆａｎｇｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｓ．６８（１９９３），１８１−１９４およびＦａｎｇｅｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（１９９２），１０１−１２４により記載されるものを含む。
【０２２１】
さらなる実施形態において、Ａβ結合分子、抗体、免疫グロブリン鎖もしくはその結合断片、または抗原は、検出可能に標識される。標識剤は、直接的または間接的のいずれかで、抗体または抗原に結合され得る。間接的結合の一例は、スペーサー部分の使用である。
【０２２２】
そのため、例えば、本明細書で特定される抗体等のＡβ結合分子の生物活性は、これらが、それぞれ、疾病状態の細胞および組織の適切な表面構造を発現する細胞への薬物局在化の候補となるのに十分な親和性を有することを示唆する。この細胞への標的および結合は、治療的または診断学的活性剤の送達、および遺伝子治療／遺伝子送達に有用であり得る。抗体を伴う分子／粒子は、病的タンパク質の変異形態を発現する細胞／または組織に特異的に結合し、したがって、診断および治療に使用され得る。よって、本明細書に記載する方法に使用するためのＡβ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、標識され得（例えば、蛍光、放射能、酵素、核磁気、重金属）、生体外「免疫化学」様アッセイを含む、生体内または生体外の特異的標的を検出するために使用される。生体内で、これらは、Ａβを発現する組織、細胞、または他の物質を検出するための核医学撮像法に類似した様式で使用され得る。
【０２２３】
特定の実施形態において、抗体等の結合分子は、通常は抗体に伴わないアミノ酸配列、または１つ以上の部分を含む。例示的な修飾は、以下により詳細に記載される。例えば、単鎖ｆｖ抗体断片は、可撓性リンカー配列を含むか、または官能部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、または標識）を追加するように修飾され得る。
【０２２４】
本明細書に記載する方法に使用するためのＡβ結合分子ポリペプチド、例えば、抗体ポリペプチドは、融合タンパク質を含む、基本的にそれからなる、またはそれからなる。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位、および少なくとも１つの異種タンパク質、すなわち、性質的に自然に結合しないタンパク質を伴う免疫グロブリン抗原結合ドメインを含む、キメラ分子である。アミノ酸は、通常、融合ポリペプチドに結合される別々のタンパク質に存在することができるか、または同じタンパク質に通常存在するが、融合ポリペプチドの新しい配列に配置される。融合タンパク質は、例えば、化学合成により、またはペプチド領域が所望の関係にコードされるポリヌクレオチドを作製し、翻訳することにより作製され得る。
【０２２５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される「異種」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、比較される実体のそれとは別の異なる実体に由来することを意味する。例えば、本明細書で使用される通り、抗体、その抗原結合断片、変異体、もしくは類似体に融合される「異種ポリペプチド」は、同種の非免疫グロブリンポリペプチド、または異種の免疫グロブリンもしくは非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。
【０２２６】
本明細書の他の個所でより詳細に説明される通り、本明細書に記載する方法で使用するための結合分子、例えば、抗体、その抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ＮもしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換え的にさらに融合されるか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に共役（共有結合および非共有結合共役を含む）され得る。例えば、抗体は、検出アッセイの標識として有用な分子、および異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素等のエフェクター分子に、組換え的に融合または共役され得る。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０８４９５号、第ＷＯ９１／１４４３８号、第ＷＯ８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号、およびＥＰ第３９６，３８７号を参照のこと。
【０２２７】
本明細書に記載する方法に使用するための結合分子、例えば、抗体、その抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターにより相互に結合されるアミノ酸から構成され得、２０の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有することができる。抗体は、翻訳後プロセス等の自然なプロセスにより、または当該分野に既知の化学修飾法により修飾され得る。このような修飾は、基礎的なテキスト、より詳細なモノグラフ、並びに多数の研究文献に記載されている。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシル末端、または炭水化物等の部分上を含む抗体のあらゆる場所で起きることができる。同型の修飾が、所与の抗体のいくつかの部位において、同程度でまたは様々な程度で存在し得ることを理解されたい。また、所与の抗体は、多くの型の修飾を含有することができる。抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として分枝され得、分枝を伴う、または伴わない環式であり得る。環式、分枝、および分枝環式抗体は、翻訳後の自然過程により生じるか、または合成方法により生成され得る。修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合的結合、ヘミ部分の共有結合的結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合的結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合的結合、ホスフォチジルイノシトールの共有結合的結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、システイン形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化等のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介型のアミノ酸付加、およびユビキチン化を含む（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，（１９９３）、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ１８２：６２６−６４６（１９９０）、Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ６６３：４８−６２（１９９２）を参照のこと）。
【０２２８】
本説明は、結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を含む融合タンパク質、および異種ポリペプチドについても提供する。一実施形態において、本明細書に記載する方法に使用するための融合タンパク質は、抗体のＶＨ領域のうちのいずれか１つ以上のアミノ酸配列、または抗体もしくはその断片、または変異体のＶＬ領域のうちのいずれか１つ以上のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む、基本的にそれからなる、またはそれからなる。別の実施形態において、本明細書に開示される診断および治療方法に使用するための融合タンパク質は、抗体、またはその断片、変異体もしくは誘導体のいずれか１つ、２つ、３つのＶＨ−ＣＤＲのアミノ酸配列、いずれか１つ、２つ、３つの抗体、またはその断片、変異体もしくは誘導体のＶＬ−ＣＤＲのアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む、基本的にそれらなる、またはそれらからなる。一実施形態において、本明細書に記載する方法に使用するための融合タンパク質は、抗体、その断片、誘導体もしくは変異体のＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含み、その融合タンパク質はＡβに特異的に結合する。別の実施形態において、本明細書に記載する方法に使用するための融合タンパク質は、抗体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列、および抗体、その断片、誘導体、変異体の少なくとも１つのＶＬ領域のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。融合タンパク質のＶＨおよびＶＬ領域は、Ａβに特異的に結合する単一源抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂ断片）に対応することができる。さらに別の実施形態において、本明細書に記載する診断および治療方法に使用するための融合タンパク質は、抗体のＶＨ  ＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つ、もしくはそれ以上のアミノ酸配列、抗体、その断片もしくは変異体のＶＬ  ＣＤＲのいずれか１つ、２つ、３つ、もしくはそれ以上のアミノ酸配列、並びに異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくはそれ以上のＶＨ−ＣＤＲ（ｓ）またはＶＬ−ＣＤＲ（ｓ）は、単一源抗体（またＦｖもしくはＦａｂ断片）に対応することができる。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子が意図される。
【０２２９】
本明細書の他の個所で説明する通り、Ａβ結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、抗体またはその免疫特異的断片の安定性もしくは有効性を強化する部分が、共役され得る。例えば、一実施形態において、ＰＥＧは、Ａβ結合分子に共役されて、生体内の半減期を増大し得る。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ１６：１０６（２００１）、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）、またはＷｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ３０：５１２（２００２）。
【０２３０】
さらに、本明細書に記載する方法に使用するための抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、ペプチド等のマーカー配列に融合して、その精製または検出を促進することができる。いくつかの実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）で提供されるタグ等、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、その多くが市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載される通り、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡単な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ３７：７６７（１９８４））、および「フラグ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３１】
融合タンパク質は、当該分野で知られている方法を用いて調製され得る（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号および第５，２２５，５３８を参照のこと）。融合が行われる正確な部位は、融合タンパク質の分泌または結合特性を最適化するように、経験的に選択され得る。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、次いで、発現のために宿主細胞に形質移入される。
【０２３２】
本明細書に記載する方法に使用するための抗体は、非共役形態で使用され得るか、または例えば、分子の治療特性を改善するために、標的検出を容易にするために、または患者の治療の撮像のために、様々な分子の少なくとも１つに共役され得る。本明細書に記載する方法に使用するための抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、精製が実施される時、精製の前または後のいずれかに標識または共役され得る。
【０２３３】
特に、本明細書に記載する診断および治療方法に使用するための結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、細胞毒（放射性同位体、細胞障害性薬物、または毒素等）、治療薬、細胞分裂阻害剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、免疫活性リガンド（例えば、得られた分子結合が、Ｔ細胞等の新生細胞およびエフェクター細胞の両方に結合する、リンホカインまたは他の抗体）、またはＰＥＧに共役され得る。
【０２３４】
上述の融合タンパク質は、さらに、切断可能リンカーまたはプロテイナーゼのための切断部位をさらに含むことができる。これらのスペーサー部分は、同様に、不溶性または可溶性のいずれかであり得（Ｄｉｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３１（１９８６），１４８）、標的部位で抗原あら薬剤を解放できるように選択され得る。免疫療法の抗体および抗原に結合され得る治療薬の例としては、薬剤、放射性同位体、レクチン、および毒素が挙げられる。例えば、免疫療法用の放射性同位体的に共役された抗体または抗原の使用において、特定の同位体は、白血球分布、並びに安定性および放出のような要因に応じて選択され得る。自己免疫応答に応じて、いくつかの特定の放射体が選択され得る。概して、αおよびβ粒子放出放射性同位体が、免疫療法に使用される。２１２Ｂｉ等の短範囲で高エネルギーの放射体が使用され得る。治療目的のための抗体または抗原に結合され得る放射性同位体の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、６４Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１２Ａｔ、２１１Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、および１８８Ｒｅが挙げられるが、これらに限定されない。Ａβ結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片に結合され得る他の治療薬、並びに生体外および生体内治療プロトコルは、知られており、当業者により容易に確定され得る。適切である場合はいつでも、当業者は、タンパク質性物質自体の代わりに、上述の抗体、抗原、または対応するベクターのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを使用することができる。
【０２３５】
共役体は、共役される選択された薬剤に応じて、様々な技法を用いて組み立てられることを当業者は理解するであろう。例えば、ビオチンを伴う共役体は、例えば、結合ポリペプチドをビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等のビオチンの活性エステルと反応させることにより調製される。同様に、蛍光マーカーを伴う共役体は、結合剤、例えば、本明細書に挙げられるものの存在下で、またはフルオロセインイソチオシアネート等のイソチオシアネートと反応させることにより調製され得る。抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体の共役体は、類似体様式で調製される。
【０２３６】
本説明は、診断および治療薬に共役される、本明細書に記載する方法に使用するための抗体、その抗原結合断片、変異体もしくは誘導体をさらに包含する。抗体は、例えば、任意の治療および／または予防レジメンの有効性を決定するための臨床試験手順の一部として神経系疾患の発展または進行を監視するように、診断的に使用され得る。検出は、検出可能物質に抗体、その抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を結合することにより促進され得る。検出可能物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、様々なポジトロン放出断層撮影を用いたポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンを含む。例えば、診断として使用するための抗体に共役され得る金属イオンにおいては、米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。好適な酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み、好適な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、好適な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオロセイン、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトラジニルアミンフルオロセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンを含み、発光物質の例は、ルミノールを含み、生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含み、好適な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９Ｔｃを含む。
【０２３７】
抗体、その抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、化学発光化合物に結合することによっても検出可能に標識され得る。化学発光タグ付けされた抗体の存在は、次いで、化学反応中に生じる発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セオマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびオキサレートエステルである。
【０２３８】
抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体が検出可能に標識され得る手段の１つは、その抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を酵素に連結し、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）で連結された産物を使用することである（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，“Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ２：１−７（１９７８））、Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）、Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，（１９８０）、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。抗体に結合される酵素は、例えば、分光光度法、蛍光定量法、または視覚手段により検出され得る化学部分を産生するような様式で、発色基質等の適切な基質と反応させる。抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋わさびペリオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−グルコシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、検出は、酵素の発色基質を利用する比色法により達成することができる。検出は、また、同様に調製された標準と比較した、基質の酵素反応の進行度の視覚的比較により達成され得る。
【０２３９】
検出は、他の様々な免疫アッセイのいずれを用いても達成され得る。例えば、抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体を放射性標識することにより、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）の使用を通して抗体を検出することが可能である（例えば、参照により本明細書に援用されるＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ
ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，（Ｍａｒｃｈ，１９８６）を参照のこと）。放射性同位体は、γ計数器、シンチレーション計数器、またはオートラジオグラフィーを含む手段により検出され得るが、これらに限定されない。
【０２４０】
本明細書に記載する方法に使用するための抗体、またはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体は、１５２Ｅｕ等の蛍光放出金属、または他のランタニド系列を用いて検出可能に標識もされ得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のような、このような金属キレート基を用いて抗体に結合され得る。
【０２４１】
様々な部分を抗体、またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体に共役する技法は、当業者に知られている。
【０２４２】
ＶＩＩ．組成物および使用方法
例えば、抗体、またはその抗原結合断片、もしくは化学誘導体等の前述のＡβ結合分子、またはポリヌクレオチド、ベクター、もしくは細胞を含む組成物は、本明細書に記載する方法に使用され得る。組成物は、医薬的に許容される担体もさらに含むことができる。「化学誘導体」という用語は、通常、基幹分子の一部ではない追加の化学部分を含有する分子を記述する。このような部分は、基幹分子の可溶性、半減期、吸収等を改善することができる。あるいは、部分は、基幹分子の望まない副作用を減衰するか、または基幹分子の毒性を低減することができる。該医薬組成物は、静脈内に、筋肉内に、皮下的に、鼻腔内に、非経口的に、またはエアロゾルとして投与されるように設計され得るが、以下も参照のこと。
【０２４３】
本説明は、それぞれ、上述の１つ以上の成分、例えば、Ａβ結合分子、抗体もしくはその結合断片、抗原、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞で充填された１つ以上の容器を含む、医薬品および診断上のパックまたはキットも提供する。そのような容器と供に、医薬品もしくは生物学的産物の製造、使用または販売を規制する政府機関により規定される形態で告示が含まれ得、この告示は、ヒト投与における医薬品、使用、または販売機関による承認を反映する。加えて、あるいは代替的として、キットは、適切な診断アッセイに使用するための試薬および／または説明書を含む。組成物、例えば、キットは、当然な
がら、上で定義される通り、疾病、疾患、損傷、または病態の診断、予防、および治療に特に適している。
【０２４４】
医薬組成物は、当該分野に既知の方法に従い製剤化され得るが、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔＥｄ．（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｉｎｇｅｒ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６）を参照のこと。適切な医薬担体の例は、当該分野においてよく知られており、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水等の乳濁液、様々な種類の湿潤剤、減菌溶液等を含む。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化され得る。これらの医薬組成物は、好適な投与量で、対象に投与され得る。好適な組成物の投与は、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、非経口、鼻腔内、または皮内投与による、異なる手段により達成される。鼻内スプレー製剤等のエアロゾル製剤は、防腐剤および等張剤を伴う精製された水性または他の溶液の活性剤を含む。このような製剤は、鼻粘膜と適合するｐＨおよび等張状態に調節され得る。直腸または膣内投与用の製剤は、適切な担体と共に座剤として提供される。
【０２４５】
さらに、本方法は、例えば、薬剤を投与するために、頭骨に小さな穴を開けるか、またはＯｍｍａｙａポンプ等のポンプを使用して、標的組織に化合物を直接投与することを含むが、一態様において、Ａβ結合分子、例えば、抗体または薬剤として使用される抗体は、血液−関門を通過することができ、例えば、静脈内または経口投与等の間接的投与を可能にする。
【０２４６】
投与レジメンは、担当医師または臨床要因により決定されるであろう。医療分野において周知であるように、いかなる患者の投与量も、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、全身の健康状態、および同時に投与される他の薬剤を含む、多くの要因に依存する。典型的な用量は、例えば、０．００１〜１０００μｇの範囲であり得るが、前述の要因を特に考慮すると、この例示的範囲以下または以上が想定される。概して、投与量は、例えば、対象の体重１ｋｇあたり、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ等）の範囲であることができる。例えば、投与量は、１ｍｇ／体重ｋｇ、もしくは１０ｍｇ／体重ｋｇ、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、もしくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記の範囲の中間用量も、本明細書に記載する方法の範囲内であるものとする。対象は、このような用量を、毎日、１日おき、毎週、または経験的分析により決定されるあらゆる他のスケジュールに従いに投与され得る。例示的な治療は、例えば、少なくとも６ヶ月等の長期間にわたる複数投与量での投与を伴う。さらなる例示的な治療レジメンは、２週間に１回、もしくは１ヶ月に１回、もしくは３〜６ヶ月に１回の投与を伴う。例示的な投与量スケジュールは、連日１〜１０ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇ、１日おきに３０ｍｇ／ｋｇ、または毎週６０ｍｇ／ｋｇを含む。いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与されるが、この場合、投与される各抗体の投与量は、示される範囲内である。
【０２４７】
典型的な用量は、例えば、約．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約．０５ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約．１０ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約０．２５ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０．５ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約５ｍｇ、または約５ｍｇであり得る。典型的な用量は、例えば、約．０１ｍｇ〜約．１０ｍｇ、約．１０ｍｇ〜約．５０ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１．０ｍｇ、約１．０ｍｇ〜約１０ｍｇ、約５ｍｇ〜約５０ｍｇ、または約１０ｍｇ〜約５００ｍｇでもあり得る。
【０２４８】
非経口投与の調製物は、減菌水溶液または非水性溶液、懸濁液、および乳濁液を含む。非水性溶液溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注入可能有機エステルである。水溶性担体は、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水性溶液、乳濁液または懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲルまたは固定油を含む。静脈内ビヒクルは、液体および栄養補充物、電解質補充物（リンゲルデキストロースに基づくもの等）等を含む。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等、防腐剤及び他の添加剤も存在し得る。さらに、医薬組成物は、医薬組成物の意図する使用に応じて、ドーパミンまたは精神薬理薬物等のさらなる薬剤を含むことができる。さらに、医薬組成物も、例えば、医薬組成物が、受動免疫の抗Ａβ抗体を含む場合、ワクチンとして調製され得る。
【０２４９】
さらに、医薬組成物は、意図する医薬組成物の使用に依存して、インターロイキンまたはインターフェロン等のさらなる薬剤を含むことができる。例えば、アルツハイマー病の治療において、さらなる薬剤が、有機小分子、無機分子、抗Ａβ抗体、核酸、ペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。Ａβ結合分子と組み合わせて、他の薬剤が同時に、または続いて投与され得る。治療有効投与量または治療有効量は、症状または病態を軽減するのに十分な活性成分の量を指す。このような化合物の治療有効性および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な医薬手順、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）により決定され得る。治療作用と毒性作用との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０という比率で表すことができる。組成物における治療薬は、アルツハイマー病の場合においては、正常な行動および／または認知特性を回復するのに十分な量で存在し得る。
【０２５０】
医薬組成物は、アルツハイマー病、ダウン症、頭部外傷、拳闘家認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、慢性ボクサー脳症、外傷性ボクサー脳症、ボクサー認知症、拳闘酔態症候群、加齢に伴うアミロイド沈着、軽度認識障害、脳アミロイド血管症、レヴィー小体認知症、血管性認知症、混合型認知症、多面認知症、遺伝性アミロイド性脳出血オランダ型およびアイスランド型、緑内障、パーキンソン病、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、嚢胞性線維症、またはゴーシェ病、および封入体筋炎を含むが、これらに限定されない、神経系疾病、疾患、損傷、または病態の治療のために使用され得る。特に記載のない限り、神経変性、神経性、または精神神経性という用語は、本明細書で互換的に使用される。
【０２５１】
経過は、定期的な評価により監視され得る。ヒトにおける治療有効性の検知は、既知の方法、例えば、ＰＩＢ、ＦＤＧまたは１８Ｆ−ＦＤＤＮＰを用いた、例えば、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、位置放出断層撮影法（ＰＥＴ）、磁気共鳴断層撮影（ＭＲＩ）、および超音波検査により実施され得る。ヒトにおける治療有効性の検知は、行動性アッセイを用いても実施され得る。
【０２５２】
これらの、および他の実施形態を、説明および実施例により開示し、かつ包含する。本明細書に記載する方法に従い利用される材料、方法、使用、および化合物のいずれに関するさらなる文献も、例えば、エレクトロニクス機器を用いて、公共図書館およびデータベースから検索され得る。例えば、国立生物工学情報センタおよび／または国立衛生研究所の国立医学図書館が提供する公用データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」が使用され得る。欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）の一部である、欧州生命情報学研究所（ＥＭＢＬ）のもの等、さらなるデータベースおよびウェブアドレスは、当業者に知られており、インターネットサーチエンジンを使用して得ることもできる。遡及検索および新刊速報に有用な生物工学の特許情報の概要および特許情報の関連情報源は、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ１２（１９９４）、３５２−３６４に提供される。
【０２５３】
上記の開示は、概して、本明細書で考慮される方法を記載する。特に記載のない限り、本明細書で使用される用語は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，改訂２０００、再版２００３，ＩＳＢＮ０  １９  ８５０６７３  ２に提供される定義である。いくつかの文献が、本明細書の本編を通して引用される。引用される全ての参考資料の内容（本明細書および製造者の仕様書、説明書を通して引用される参考文献、発行された特許、公開特許出願等を含む）は、参照により本明細書に明示的に援用されるが、引用されるいずれの文書も本発明に関して先行技術であることを認めるものではない。
【０２５４】
より完全な理解は、単に例示目的で本明細書に提供される、以下の特定の実施形態を参照することにより得ることができるが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【０２５５】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するものであるが、決して本発明の範囲を制限するものと解釈されるものではない。本明細書に利用されるもの等、従来の方法のより詳細な説明は、引用される文献に見出すことができる（“Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ”Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ．  ｅｄ  ｂｙ  Ｂｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋｏｗ  （Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．２００３）も参照のこと）。
【０２５６】
本発明の実施は、特に記載のない限り、従来の技法である細胞生物学、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学を利用するが、これらは当業者の技術範囲内である。本発明の実施に有用な標準的な技法のさらなる詳細について、実施者は、細胞生物学および組織培養の標準的な教科書および概説を参照することができる。実施例に引用される参考資料も参照のこと。分子および細胞生化学の標準的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ２００１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９９）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ａｌａｎ，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）、およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｗｕ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）のような、標準的な教科書に見出すことができる。Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）；、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （��ｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９６）；Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ１９９９）、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  （Ｋａｐｌｉｔｔ＆Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ１９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ１９９７）、およびＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９８）。遺伝子操作用の試薬、クローン化ベクターおよびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、およびＣｌｏｎＴｅｃｈ等の市販業者から入手可能である。細胞培養および媒体捕集の標準的な技法は、Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９９７），１４８）、Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｋｉｔａｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７（１９９１），７３）、Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９１），３７５）、およびＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１９９０），２５１）、Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃＤＮＡ  ａｒｒａｙｓ，Ｈｅｒｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＨＡＯＳ１１（２００１），９８−１０７に概説されている。
【０２５７】
以下の実験は、抗体ＮＩ−１０１．１１に関して図示され、説明される。しかしながら、ＮＩ１０１種の他の抗体、特にＮＩ１０１．１０は、構造的に類似するため、同等の結果を提供することが予測され得る。
【０２５８】
実施例１
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡＤ様病理の進行
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）におけるスウェーデン型変異を過剰発現するトランスジェニックマウスは、変異体プレセニリン−１（ＰＳ１）の同時発現により非常に強化されるアミロイド関連欠損を発症する。（Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：９９−１０２（１９９６）、Ｈｏｌｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：９７−１００（１９９８））。二重トランスジェニックＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、アミロイド−β（Ａβ）蓄積前でも行動障害を示すが、これは３〜４ヶ月で始まり、加齢と共に悪化する。このマウスモデルでＡβ神経病理およびその関連炎症を血管新生の状態と比較するために、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスと同年齢の野生型対照を比較した。
【０２５９】
分析のために、同齢集団のＡＰＰ／ＰＳ１マウスと同年齢野生型対照を、初期（３〜４ヶ月）の、確立（１１〜１２ヶ月）された、および非常に進行（１７〜１８ヶ月）した病状の３つの異なる段階で分析した。脳解析および行動分析を各段階で実施した。行動分析は、自発的交替行動試験（Ｙ−ｍａｚｅ  ｔｅｓｔ）からなり、脳解析は、斑形成およびミクログリア数を評価するための抗体染色法を含んだ。
【０２６０】
全般的なマウスの取り扱いおよび試料の処理
本明細書に記載する全ての動物研究は、スイス獣医局（Ｓｗｉｓｓ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｃａｎｔｏｎａｌ  ｏｆｆｉｃｅ）（ライセンス番号４８／０８）の承認下で実施された。マウスは、標準的なケージを用いた動物施設で交配された。雌は、２〜４匹の群でケージに入れ、雄は、社会的ストレスを避けるため、個別のケージに入れた。マウスには、餌および飲料水を自由に摂取させ、１２時間の光周期で保持した。一般的な神経性行動および高死亡率が、概して、トランスジェニックマウスに伴った。
【０２６１】
脳解析を実施するために、マウスは過用量の麻酔（ケタミン／キシラジン）を投与され、５０ｍｌの生理食塩水、次いで、ｐＨ７．４の１００ｍｌの氷冷４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍ  ＰＢＳで経心的に灌流された。
【０２６２】
Ｉｏｓｉｆ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ２６：９７０３−９７１２（２００６））において以前に記述されたとおり、脳をさらに処理した。簡潔に述べると、脳を取り出した後、４℃で、一晩、後固定し、結果的に、２０％スクロース中で少なくとも２４時間凍結保護した。滑走式ミクロトームを用いて、３０μｍ厚さの冠状切片を８連続で切り取り、使用するまで不凍液中で、−２０℃で保存した
抗体染色法
非特異的結合を避けるために、０．２５％トリトン−Ｘ−１００（ＫＰＢＳ−Ｔ）および５％ウマおよび／またはヤギの血清を含有するリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢＳ）を用いて、室温で１時間、全ての切片をインキュベートした。抗体を同じ溶液であるが、血清の濃度を下げた（２％）もので希釈した。切片を抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ＫＰＢＳ−Ｔ中ですすいだ後、全ての切片をゼラチンでコーティングされたガラススライドに装着し、最後に、抗退色剤としてＰＶＡ−ＤＡＢＣＯを用いてカバーガラスで覆った。その後、染色は、暗所で、二次抗体を用いて、室温で２時間インキュベートされた後、間接免疫蛍光法により視覚化された。本明細書に記載する実施例に使用された二次抗体は、シアニン３−共役ロバ抗ウサギ／ラットＩｇＧ抗体、ＦＩＴＣ−共役ヤギ抗マウス／ウサギ、シアニン５−共役ロバ抗マウスＩｇＧ抗体、およびレクチン染色において、ＦＩＴＣ−共役ストレプトアビジンであった。二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＵＳＡ）から購入し、１：２００希釈で使用された。
【０２６３】
免疫染色された試料は、反転Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＥ２蛍光および光学顕微鏡を用いて検査された。陽性の細胞数を、顆粒細胞層（ＧＣＬ）において、および顆粒細胞層下部（ＳＧＺ）の領域下の一細胞径内において計数した（ＳＧＺ／ＧＣＬとして一緒に言及される）。陽性の細胞数の推定は、ｎｅｗＣＡＳＴソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、光学分離器にかけることにより行われた（Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．１４７：２２９−２６３（１９８７））。簡潔に述べると、油中において１００ｘで、モーターの付いたステージを備えるＬｅｉｃａ  ＤＭ４０００を用いて、試料領域を解剖器具の上下２〜３μｍの保護区域とともに、１５μｍの総切片厚として画定した。系統的な抽出のために、フレーム領域は、２２６μｍの歩幅で、３５９０μｍ２にセットした。６〜８つの等距離の冠状切片（２４０μｍ間隔）を動物ごとに分析した。
【０２６４】
斑形成量を評価するために、切片を６Ｅ１０抗体（１：１０００；Ｓｉｇｎｅｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＳＡ）で染色した。６Ｅ１０抗体は、プレアミロイドおよびＡβ斑の両方に結合する。選択され、かつ画定された領域における染色の陽性領域である面積率（面積％）をＩｍａｇｅＪの「測定」アプリケーション（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｕ．Ｓ．Ａ）を用いて算出した。
【０２６５】
ミクログリア数を評価するために、イオン化されたカルシウム結合アダプター分子１（「Ｉｂａ１」）（１：１０００；ウサギ抗Ｉｂａ１；Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）に対して、切片を抗体で染色した。Ｉｂａ１は、マクロファージ／ミクログリア特異的タンパク質である。斑を囲むＩｂａ１＋ミクログリアの数は、ＩｍａｇｅＪの「粒子分析」アプリケーションを用いて算出した。
【０２６６】
Ｙメイズ
自発的交替行動（Ｙメイズ）試験は、空間作業記憶を試験するために使用される行動性アッセイである。Ｙメイズ試験は、動物を致死させる１日前に実施した。試験は、Ｙメイズでの５分間のセッション中の自発的交替の数を記録することにより実施された。簡潔に述べると、５分間のセッション中、アーム選択の順序を盲検実験者により手作業で記録する一方、歩行運動は、コンピュータ補助ビデオ分析システム（ＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ）を用いてデジタル形式で記録した。交替は、重複する三連続セットにおける３つのアームへの連続した選択として定義された。交替率は、可能な交替（アーム選択の総数−２として定義される）に対する実際の交替の率×１００％として算出された。
【０２６７】
統計分析
全ての測定は、動物がどのようなものであるかを知らない観察者により実施された。本実施例および以下の実施例に記載されるデータの統計分析のために、提示された値は、試験群の平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。全てのデータの統計分析のために、対応の無いｔ検定が実施され、２つより多いの群の分析のためには、一元配置ＡＮＯＶＡの後に、フィッシャーまたはボンフェローニ事後検定を使用した。Ｓｔａｔｖｉｅｗ５．０を用いて算出が行われ、従来の統計学的有意性は、ｐ＜０．０５で設定された。
【０２６８】
３〜４ヶ月での結果
６Ｅ１０抗体染色により評価すると、斑蓄積量は、３〜４ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスでちょうど始まり、約３．５％の脳を覆っていた。斑蓄積は、主に皮質で可視化され、歯状回ではまだ可視ではなかった。しかしながら、歯状回での相違は、Ｉｂａ１染色では明らかであった。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、高い数のＩｂａ１陽性ミクログリアを示した。Ｉｂａ１陽性ミクログリアにおいて、僅かな増加が顆粒細胞層下部および顆粒細胞層（ＳＧＺ／ＧＣＬ）で観察された一方、Ｉｂａ１陽性細胞の有意な増加が門部で観察された（図１Ａ）。
【０２６９】
ＡＰＰ／ＰＳ１と野生型マウスとの間の相違は、行動分析でも観察された。以前の報告と一致して、３ヶ月の年齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、既に自発的交替行動試験において、対照より不良であった（図１Ｂ）。これらのマウスは、有意に減少した交替率を示した。アーム選択の数については、群の間で相違は検出されなかった（野生型：３１．５０±２．６、ＡＰＰ／ＰＳ１：２９．３±４．２）。
【０２７０】
１１〜１２ヶ月での結果
１１〜１２ヶ月で、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、約３１％の脳がびまん的に斑で覆われる、斑沈着の劇的な増加を示した。平均して、４．３５％の海馬領域がＡβ沈着で占められ、斑も本段階で歯状回に現れた。
【０２７１】
斑の増加は、Ｉｂａ１陽性ミクログリアの大幅な増加として定義される、著しい炎症応答を伴った。Ｉｂａ１陽性細胞における最も劇的な増加は、門部においてであったが、増加は、ＳＧＺ／ＧＣＬにおいても観察された（図１Ｃ）。
【０２７２】
ＡＤ様病理の進行段階に従い、１１〜１２ヶ月齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスも、自発的交替行動試験により測定すると、短期記憶能の障害を示した（図１Ｄ，  ｐ＜０．０５）。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、交替率の減少を示したが、アーム選択数は、トランスジェニックおよび野生型対照の間で相違はなかった（それぞれ、３０±６および３２±２）。
【０２７３】
１７〜１８ヶ月での結果
１７〜１８ヶ月で、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、約３７％の脳が斑で覆われ、動物の全身の健康状態は、大幅に障害を受けた。加えて、斑蓄積量のさらなる増加が、海馬において観察された（６．４７％の海馬領域が斑で覆われていた）。
【０２７４】
しかしながら、Ｉｂａ１陽性ミクログリア数の対応増加は、歯状回では見られなかった。以前の時間点で観察された数と同じであった。これは、ＡＰＰ／ＰＳ１における慢性炎症が脳の防衛反応を疲れさせることができるか、または小膠細胞症が１歳の年齢で既に飽和状態に達したことを示唆する。しかしながら、門部は、再び、野生型と比較して、トランスジェニックマウスにおいてＩｂａ１陽性ミクログリアの有意な高い数を示した（図１Ｅ，ｐ＜０．０１）。
【０２７５】
驚くことに、Ｙメイズでの障害は、この年齢で、もはや検出できなかった（図１Ｆ）。病理の重篤度および本年齢での対象間の大きな変動が、本段階での確証的な分析を不可能にしたのだろう。アーム選択数は、トランスジェニックおよび野生型マウスにおいて同じであった（それぞれ、２８±３および２９±２）。
【０２７６】
これらの結果は、年齢依存アミロイド沈着は、着実な増加と広範な炎症、並びに行動障害を伴う。これらの結果は、２つの主要神経領域のうちの１つである海馬の門部が、斑沈着が歯状回に達する前でも発症に反応することができることを示唆する。
【０２７７】
実施例２
血管新生は、ＡＤ様病理の進行により異なって影響される
海馬の血管新生が、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおいてＡＤ様病理の進行により影響されたかどうか、またどのように影響されたかを決定するために、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスモデルにおけるニューロンの増殖および生存を同年齢の野生型対照と比較した。
【０２７８】
総数４２匹の性別平衡された動物を使用した（３〜４ヶ月群：野生型：ｎ＝７，ＴＧ：ｎ＝８；１１〜１２ヶ月群：野生型：ｎ＝７，ＴＧ  ｎ＝７；１７〜１８ヶ月群：野生型：８，ＴＧ  ｎ＝５）。マウスは、致死１ヶ月前に、チミジン誘導体ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を２週間、１日２回、注入された。ＢｒｄＵ投与は、基本的に、Ｉｏｓｉｆ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６：９７０３−９７１２（２００６））に記載される通り、実施された。実施例１に記載するように致死させ、脳処理した後、ＢｒｄＵ可視化の調製をするために、浮動性脳切片を、６５℃で３０分間、１Ｍ  ＨＣｌで変性し、（ｐＨを中和するために）ＫＰＢＳですすいだ。ラット抗ＢｒｄＵ抗体（１：１００；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）をマウス抗ニューロン核マーカーＮｅｕＮ（１：１００，クローンＭＡＢ３７７，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＵＳＡ）、ウサギ抗星状膠細胞特異マーカーＳ１００β（１：５０００，ＳＷＡＮＴ，Ｂｅｌｌｉｎｚｏｎａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、および／または転写因子Ｚｉｆ２６８のウサギポリクローナル抗Ｃ末端（１：２５０，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）との混合物中で使用した。内皮細胞のマーカーであるビオチン化されたイソレクチンＩＢ４（１：２００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と共に幼若ニューロンを識別するために、マウス抗ポリシアル酸中和細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）（１：２０００，ＡｂＣｙｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、追加の染色を実施した。染色は実施例１に記載するように実施された。
【０２７９】
有糸分裂マーカーホスホヒストンＨ３（ｐＨ３）の染色のために、浮動性切片を３０分間、室温で、３％Ｈ２Ｏ２および１０％メタノールを含むＫＰＢＳで反応進行を停止し、（ｐＨを中和するために）ＫＰＢＳですすぎ、実施例１に記載するようにプレインキュベートした後、ウサギポリクローナル抗ｐＨ−３（１：４００，Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＵＳＡ）を用いて、４℃で一晩、インキュベートした。可視化の前に、抗ｐＨ−３抗体で処理されたスライドを脱水した。ペルオキシダーゼ技法を用いて可視化するために、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１．２００Ｊａｃｋｓｏｎ）を２時間適用した後、アビジンペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ，Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ，  Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に１．５時間インキュベートした。最後に、切片をジアミノベンジジン（０．５ｍｇ／ｍｌ）および３％過酸化水素で処理した。老マウスにおけるｐＨ−３、ＢｒｄＵ、およびＰＳＡ−ＮＣＡＭ染色等、頻繁に観察されなかった染色の定量化のために、その体軸方向に伸びる方向に、海馬全体にわたって、８番目ごとの３０μｍ切片において細胞を計数し、これらの総数を８で掛け、ＳＧＺ／ＧＣＬの絶対細胞数を得た。ＢｒｄＵ、ＮｅｕＮ、およびＳ１００βの三重染色は、アルゴンレーザー４８８、ＨｅＮＥレーザー５６８、およびＨｅＮｅレーザー６３３放射フィルターを用いた共焦点型走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ／ＳＰ２，Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して検証された。
【０２８０】
上述のＢｒｄＵ注入プロトコルを用いて、ＤＮＡ合成のマーカーを組み込む細胞は、連続した増殖細胞の混合物、および拘束された分裂終了細胞を表す。ＢｒｄＵ免疫反応性（ＢｒｄＵ＋）細胞のプールは、増殖細胞の真の推定値を表さず（概説についてはＴａｕｐｉｎ，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．５３：１９８−２１４（２００７）を参照のこと）、むしろ、注入パラダイムに対応する相対数が適用されるため、増殖も、Ｍ相有糸分裂マーカーホスホヒストンＨ３（ｐＨ−３）を用いて定量化された。神経性前駆体細胞の短期生存は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋細胞の数により評価された。最終表現型の新生細胞の成熟は、ＢｒｄＵのパンニューロンマーカーＮｅｕＮ（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋）、または星状細胞マーカーＳ１００β（ＢｒｄＵ＋／Ｓ１００β＋）との共標識により決定された。樹状長および分枝の評価は、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ染色がＤＣＸに代わり使用されたことを除き、基本的に、Ｂｒｅｕｎｉｇ  ｅｔ．ａｌ．（ＰＮＡＳ１０４：２０５５８−２０５６３（２００７））に記載されるように実施された。ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋ニューロンは、２倍のデジタルズームの６３ｘ水中対物レンズを使用して撮像された。平均して、５０〜６０の０．２５μｍのＺ系列が分析のために併合された。樹状長の測定は、ＩｍａｇｅＪ用プラグイン方式（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）の半自動ソフトウェアＮｅｕｒｏｎＪ（Ｍｅｉｊｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ５８Ａ：１６７−１７６（２００４）に記載される；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍａｇｅｓｃｉｅｎｃｅ．ｏｒｇ／ｍｅｉｊｅｒｉｎｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｎｅｕｒｏｎｊ／）を用いて実施された。共有プラットフォームＩｍａｇｅＪを介して特定の分析を続ける前に、全写真を８ビットに変換し、試験群内の同じ閾値に調節した。樹状長の評価のため、最も若年マウスの群においてｎ＝２０細胞、中年齢マウスの群においてｎ＝１６細胞、非常に老齢のマウスにおいてｎ＝１０細胞が分析された。
【０２８１】
３〜４ヶ月で、対照と比較して、増殖細胞数（ＢｒｄＵ＋細胞の数の増加、およびｐＨ−３＋細胞増加への傾向により示される）、若い新生ニューロン（増加したＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋細胞数で示される）および成熟ニューロン（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋細胞数の増加により示される）の増加が、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスで見られた（図２Ａ）。しかしながら、これらの細胞は、１１〜１２ヶ月段階で生存する、および／またはニューロンに分化するようには思われなかった。１１−１２ヶ月で、トランスジェニックマウスは、まだ、高い増殖（ｐＨ−３＋およびＢｒｄＵ＋細胞）を示したが、若いニューロン（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋細胞）および／または成熟ニューロン（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋細胞）の数において、野生型対照と相違はなかった（図２Ａ）。１７〜１８ヶ月で、病的脳は、基本的には、保護活性を示さなかった。トランスジェニックマウスにおける増殖レベル（ｐＨ−３＋細胞）は減少したが、対照動物におけるレベルとは有意に相違はなく、一方、若いニューロン数（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋細胞）は、トランスジェニックマウスにおいて有意に減少した。しかしながら、成熟の後期で（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋細胞）、２つの群の間で有意な相違は検出されなかったが、これは、おそらく、本時間点で見られた高変動、および非トランスジェニック動物の加齢のためであろう（図２Ａ）。加えて、ＢｒｄＵ＋／Ｓ１００β＋細胞数は、３ヶ月の年齢でＡＰＰ／ＰＳ１マウスと対照との間で相違はなかった（ＴＧ：６５±２３．９％対野生型：１００±３１．８％）が、これらのマーカー用の二重陽性細胞は、後に、野生型またはトランスジェニックマウスのいずれにおいても、もはや検出できなかった。
【０２８２】
幼若ニューロンは、ニューロンプロセスでも検出可能である神経性細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）を発現する。これは、新生ニューロンの免疫標識を可能にする。新生において、新しい細胞は、次の５〜６週間続くプロセスである分子層への樹状伸長を開始する（ｖａｎ  Ｐｒａａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４１５：１０３０−１０３４（２００２））。進行性Ａβ沈着が、新しく生成された顆粒細胞の形態的発展に影響するかを決定するために、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋ニューロンの高倍率共焦点画像を撮影し、無料で入手可能なソフトウェアＮｅｕｒｏｎＪを用いて分析した。病理の初期では、対照とＡＰＰ／ＰＳ１マウスとの間で相違はみられなかった（図２Ｂ）。しかしながら、確立された、および十分にびまん的な病理の後期では、存在する新しいニューロンは、一貫して、健康な対照と比較して樹状長が減少し（両群とも１１〜１２ヶ月で４０％短い、ｐ＝０．００７、および１７〜１８ヶ月で、ｐ＝０．０１）、細胞体ごとのプロセス数が減少した（１１〜１２ヶ月で３１％低い分岐、ｐ＝０．０４；１７〜１８ヶ月で相違なし）（図２Ｃ）。幼若ニューロンの年齢に関係する萎縮が、健康な対照においても認められた。この事実は、細胞体ごとのプロセス数がなぜ後期の時間点で、群の間で同じであったかを説明できる。
【０２８３】
これらのデータは、ニューロンの形態が初期に影響されないまま、増殖がＡＤのモデルにおいて初期に刺激されたことを示唆する。理論に拘束されることなく、疾病の進行性悪化は、脳のこの自己修復作用を消滅させ、新しく生成された細胞の形態を妨害する。上記に提示されるデータは、アルツハイマー病および関連疾病を、例えば、試験化合物を動物モデルに投与し、疾病の行動および物理的マーカーの交替を検出することにより調節できる化合物を特定するための方法を提供する。
【０２８４】
実施例３
ＡＤ様病理の治療としての受動免疫
ワクチンを用いたＡβに対する能動免疫（Ｓｃｈｅｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４００：１７３−１７７（１９９９）；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４０８：９８２−９８５（２０００））、および抗Ａβ抗体の慢性注入を用いた受動免疫（Ｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ６：９１６−９１９（２０００）；ＤｅＭａｔｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：８８５０−８８５５（２００１））は、異なるＡＤマウスモデルにおいて、斑蓄積量を低減し、認知力を向上することを示している。さらに、最近の研究は、ＥＦＲＨペプチドを用いたワクチン接種を用いて血管新生を刺激することを報告した（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０４：１６９１−１６９６（２００７））。
【０２８５】
上記実施形態に記載される結果は、高増殖が１１〜１２ヶ月でまだ検出されるが、神経変性の進行が、幼若のトランスジェニック動物に見られる血管新生の初期強化を無効にすることを明示する。したがって立体構造のＡβを結合できる抗体を用いた治療がＡＤ様病理の進行を退行するか、または遅延することが可能であるかを決定するために、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスを、キメラヒト−マウスモノクローナル抗体（「抗Ａβ」）で処置し、同じアイソタイプ（ＩｇＧ２；「ｃｔ  ａｂ」）の対照抗体で治療されたマウスと比較した。
【０２８６】
使用された抗Ａβ抗体は、モノクローナル抗体ＮＩ−１０１．１１の完全ヒト可変領域（２００８年１月７日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００８／００００５３号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に援用される）、およびマウスＩｇＧ２定常領域を含有するキメラモノクローナル抗体であった。ＮＩ−１０１．１１は、ヒトアルツハイマー病患者のＢ細胞から単離され、優先的に、立体構造のＡβに結合する。対照抗体は、ウシヘルペスウイルス（クローン２Ｈ６−Ｃ２、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から購入）に対して作製された。
【０２８７】
８ヶ月齢で開始して、抗Ａβ抗体（７匹のマウス）、またはアイソタイプ対照抗体（５匹のマウス）のいずれかの週単位注入（５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）で、マウスを３．５ヶ月処置した。マウス群は、性別平衡された。斑形成量、チオフラビンＳ（ＴｈｉｏＳ）、および大脳アミロイド症血管障害（ＣＡＡ）レベルをマウスにおいて評価した。斑形成量の定量化は、びまん性斑（６Ｅ１０染色）についてのものであった。圧縮斑蓄積量（ＴｈｉｏＳ）およびＣＡＡ分析をＷｉｌｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：１５９１−１５９５（２００６））に記載されるように実施した。連続切片からの画像は、選択かつ画定された領域における染色陽性面積（面積％）を測定するために、ＩｍａｇｅＪソフトウェアの「測定」アプリケーションを用いて処理した。
【０２８８】
染色結果は、抗Ａβ抗体が脳に達したことを示した。Ａβに対する抗体のＦｃ部分はマウスであるため、Ｙ３蛍光抗マウスｇＧ抗体を用いて検出することが可能である。Ｙ３蛍光抗マウスｇＧ抗体での染色は、処置された全てのマウスにおいて、斑の周囲の抗Ａβ抗体の存在を明らかにした。抗Ａβ処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、斑修飾は、一貫して、外中隔核から脳弓を通して視床の始まりまでの、脳の画定領域で見られた。これらの領域は、特に血管を多く含み、これは、抗体が脳に放出される位置である可能性があることを示唆する。
【０２８９】
抗Ａβおよび対照抗体で処置された動物は、プレアミロイドおよびＡβ斑の両方を染色する６Ｅ１０で測定した、総Ａβ蓄積量において、相違をを示さなかった（図３Ａ）。しかしながら、有心アミロイドβ沈着にのみ結合する蛍光プローブであるチオフラビンＳを用ると、抗Ａβで処置した動物は、対照抗体で処置した動物と比較して、圧縮斑に対する免疫活性の減少を示した（図３Ｂ）。
【０２９０】
いくつかの試験は、免疫療法を大脳アミロイド症血管障害（ＣＡＡ）関連出血における増加に関連付ている（Ｐｆｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９８：１３７９（２００２）；Ｒａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：６２９−６３６（２００５）；Ｗｉｌｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１４４：９５０−９６０（２００７））。抗Ａβ処置が、血管アミロイドを増加する一方で、実質アミロイドを減少させないことを示すために、ＣＡＡを、血管が多く含まれる脳の領域で定量化した。処理群と対照群との間で、有意な相違は検出されなかった（図３Ｃ）。
【０２９１】
ミクログリアは、アミロイド斑に沈着したＡβを認識する抗体によるＡβのオプソニン化により活性されることが示唆されている（Ｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：９１６−９１９（２０００））。この仮説を試験するために、Ｉｂａ１＋ミクログリアを脳の異なる領域で定量化した。対照及び処理ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、同レベルの小膠細胞症を示した（ＳＧＺ／ＧＣＬ：ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：５０．５±８．６ｖｓ．ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：５７．３±６．４細胞；門部：ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：５０．８±１４．４ｖｓ．ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：５５．９±７細胞；中隔−脳弓−視床：ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：７．４±１．０２％ｖｓ．ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：８．９±１．０６％面積）。形態学的サブタイプも評価した。分枝型および中間型形状は、静止状態のミクログリアを表し、アメーバ様および円形は、活性ミクログリアを表す。歯状回または中隔における分枝型、中間型形状、アメーバ様、または円形のＩｂａ１＋ミクログリアのパーセンテージにおいて、群間で有意な相違はなかった（データを以下の表７に示す）。さらに、活性ミクログリアの海馬および中隔領域の免疫活性（ＣＤ１１ｂ＋）の測定は、群の間で、いかなる相違も明らかにしなかった（データを以下の表７に示す；表中の値は、平均±標準誤差である）。
【０２９２】
【表７】
2014148543.tif 000011
ミクログリアは、活性化状態の変化中、その増殖速度を増加することができるが、ＳＧＺ／ＧＣＬにおけるＢｒｄＵ＋／Ｉｂａ１＋細胞数は、抗Ａβと対照抗体処理マウスとの間で相違はなかった（ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：２０．２±２．１ｖｓ．ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：２１．６±２．７）。
【０２９３】
周縁沈降仮説によると（ＤｅＭａｔｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：８８５０−８８５５（２００１））、血漿における抗体のＡβへの結合は、脳から周縁への勾配流出を誘発し、次には脳のＡβレベルを低下する結果となる。この仮説を試験するために、ＥＬＩＳＡを使用して、抗Ａβおよび対照抗体処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウス、未処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウス、および野生型マウスの血清中のＡβ４２濃度を分析した。トランスジェニックマウス間では、Ａβ４２の濃度は類似したが、対照抗体と比較して、抗Ａβ群で僅かな増加が検出された。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの全群は、野生型マウスと有意に異なった（ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：１４１３．５±９６．６ｐｇ／ｍｌ、ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：１７５３±１９３．９ｐｇ／ｍｌ、ＡＰＰ／ＰＳ１＋ＰＢＳ：１３７８±９７．３ｐｇ／ｍｌ、および野生型：３８３．８±１２５ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１）。
【０２９４】
最後に、抗Ａβおよび対照抗体で処置されたマウスの平均体重は、同じであったが（ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：２９．９±１．４ｇ対ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：３１．２４±１．８ｇ）、抗Ａβで処置された全ての動物は、実験の終了まで生存した。対照的に、対照抗体で処置された２匹のマウスは死亡した。
【０２９５】
これらの結果は、Ａβへの抗体は、脳に進入でき、圧縮斑の減少と関連することを示す。さらに、このような抗体での治療は、実質アミロイド症の増加の望まない副作用を誘発するようには思われない。
【０２９６】
実施例４
抗体治療はＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける血管新生を促進する
受動免疫が、非常に侵襲的なＡＤ様病理を示すマウスにおいて、血管新生の促進に成功するかを決定するために、さらなる実験を実施した。
【０２９７】
最高１歳の年齢まで、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、一貫して、野生型マウスと比較して増殖の増加を示した。従って、処置がこの現象を増強するかを決定するために、抗Ａβで処置された動物を検査した。有糸分裂マーカーホスホヒストン３（ｐＨ−３）を示すために、切片を染色した。しかしながら、ｐＨ−３＋およびＢｒｄＵ＋細胞数において、抗Ａβおよび対照抗体で処置されたマウスの脳のＳＧＺ／ＧＣＬ領域での相違は見られなかった（図４Ａ）。それにもかかわらず、幼若（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋）ニューロン数は、対照抗体より抗Ａβで処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスで高かった（ｐ＝０．０６；図４Ｂ）。しかしなたら、これらの結果は、おそらく、高変動の結果のため、統計的には有意ではなかった。対照的に、成熟（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋）ニューロン数は、対照抗体（ｐ＜０．０５）より抗Ａβで処置されたマウスで有意に高かった（図４Ｃ）。（ＳＧＺ／ＧＣＬにおけるＮｅｕＮ二重標識について、各動物（全ＢｒｄＵ＋細胞が考慮される老マウスを除く）から５０のＢｒｄＵ陽性細胞を分析した。）これらの結果は、抗Ａβ処置が前駆体の生存を可能にする保護の役割を果たすことが可能なことを示唆する。
【０２９８】
ＢｒｄＵ＋／Ｓ１００β＋細胞（星状細胞）数により測定されるグリア新生は、抗Ａβおよび対照抗体処置群の間で類似した（ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：５６±１２．１３対ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：４３±１２．７２）。これは、持続性炎症の存在下において、ミクログリアが増加し始めることを示唆する。したがって、Ｉｂａ１＋でもあったＢｒｄＵ＋細胞数も評価された。２つの群の間で相違は検知されなかった（ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：２０．２±２．１対ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：２１．６±２．７ＢｒｄＵ＋／Ｉｂａ１＋細胞）。
【０２９９】
海馬歯状回におけるシナプス活性は、即時初期遺伝子Ｚｉｆ２６８（またはＥｒｇ−１）の健全な発現を含む。Ｚｉｆ２６８は、シナプス活性を特徴付け、その存在は、長期記憶の形成に必要不可欠であることが示されている（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：２８９−２９６（２００１））。動物が刺激に曝露されないと（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１４２：１７−３０（２００３）；Ｂｒｕｅｌ−Ｊｕｎｇｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６：５８８８−５８９３（２００６））、Ｚｉｆ２６８は、恒常的にＧＣＬに転写されない。したがって、Ｚｉｆ２６８にも陽性であった少数のＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋細胞が識別され得た。しかしながら、Ｚｉｆ２６８＋と共にＳＧＺに新しく形成されたニューロン（ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋）の共局在は、新しい細胞がシナプス活性を有することができることを明示した。（共局在染色は、アルゴンレーザーＨｅＮＥレーザー５６８、およびＨｅＮｅレーザー６３３励起フィルターを用いた直角投影で、共焦点走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ／ＳＰ２，Ｌｅｉｃａ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて検証された。）
Ｚｉｆ２６８発現を増大させるために、４分の１のリンゴをアルミ箔に包んでケージに設置することにより、麻酔の前に１０分間、マウスを新規対象に曝した。新規対象への１０分間の曝露は、皮質および海馬にわたって、Ｚｉｆ２６８発現の増加をもたらすことが他の研究者によって示されている（Ｋｕｂｉｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅａｒｎ  Ｍｅｍ．１４：７５８−７７０（２００７））。活性刺激に曝露されないと、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＺｉｆ２６８発現は低かった。活性刺激は、ビヒクル処置されたマウス（ＰＢＳ、１００μｌ／１０ｇｍ体重、ｉ．ｐ．）と、Ａβ免疫療法処置されたマウスの両方において、ニューロン集団全体を通してＺｉｆ２６８の発現を誘発した。ＳＧＺ／ＧＣｌ内の既存のニューロンにおけるＺｉｆ２６８の発現は、ビヒクル処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスとＡβ免疫療法処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて同様であった。ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋細胞におけるＺｉｆ２６８発現の観察は、Ａβ免疫療法処理されたマウスにおける新規成熟ニューロンが機能的に統合され得ることを明示した。
【０３００】
抗Ａβおよび対照抗体で処置されたマウスは、Ｙメイズで行動的試験も行った。自発的交替行動試験は、実施例１に記載するように、マウスを致死させる１日前に実施され、マウスは、最後のＢｒｄＵ注入後、逆照明周期室に移された。同年齢の未処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスと比較して、抗Ａβおよび対照抗体処置群の両方は、改善した（ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：５９．９８±０．０３対ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：５６．２３±０．０２％交替；ＴＧ：４５．５±５．１，野生型：６２．７±４．１％交替）。
【０３０１】
これらのデータは、抗Ａβ抗体がＡＤモデルにおいて成熟ニューロンの数を増加することができ、新規ニューロンは、機能的ニューロン回路に統合され得ることを示唆した。したがって、抗Ａβ抗体は、血管新生を促進することができる。
【０３０２】
実施例５
受動免疫は、海馬の分子層において新規顆粒ニューロンの樹状分岐およびシナプス活性に影響する
ＰＳＡ−ＮＣＡＭを発現するニューロン前駆体は、まだ運命決定（生存または死）を受けるが、機能的ニューロン分化を続ける。Ｔｙｐｅ−２ａ型細胞（Ｎｅｓｔｉｎ＋）は、まだ無変化であるが、これらは機能ＧＡＢＡ（Ａ）およびグルタミン酸レセプターを発現する（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２９：１８１−１８９（２００５））。しかしながら、たった１週間後、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋神経芽細胞（クラスＣニューロン）の棘なしの樹状突起は、ＧＡＢＡ作動性接触を受け取ることができる（Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：１００７４−１００８６（２００５））。研究の１つは、ＧＡＢＡシグナル伝達を通して周囲ニューロンネットワーク活性を感知する成体血管新生の活性依存制御は、新規ニューロンの統合に影響する可能性があることを提示した（Ｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４３９：５８９−９３（２００６））。ＧＡＢＡ作動性機能は、Ａβに関連する過励起の代償機構として、ＡＤのマウスモデルにおいて変化することが近年報告された（Ｐａｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ５５：６９７−７１１（２００７））。したがって、実験は、抗体治療が、これらの細胞により好適な環境を作製することを介して、神経芽細胞の生存を調節し、よってシナプス統合を促進することが可能かどうかを決定するために実施された。
【０３０３】
最初に、樹状分枝および樹状長を、Ａβに対する抗体および対照抗体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて評価した。樹状分析のために、切片をＰＳＡ−ＮＣＡＭで染色した。細胞体当りの樹状突起は、対照と比較して抗Ａβ処置されたマウスで増加した（図５Ａ）。樹状長は、実施例２に記載するように評価した。これらの実験において、群当りｎ＝４０細胞を分析した。Ａβ−ＰＳＡ−ＮＣＡＭ＋ニューロンに対する抗体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、対照と比較してプロセスがより長いことを示した（図５Ｂ）。
【０３０４】
能動および受動Ａβ免疫は、シナプス変性を阻害することを示している（Ｂｕｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：９０９６−９１０１（２００５））。したがって、このような保護作用がＡβに対する抗体での処置の結果として見られ得ることを確認するために、シナプス前タンパク質シナプトフィジン（「ＳＹＮ」）のレベルを、顆粒ニューロンが貫通線維に向かってそれらの樹状突起に伸長する、前頭部新皮質および海馬の外側分子層（ＯＭＬ）で測定した。これらの実験において、マウスのモノクローナル抗シナプトフィジン（１：２００，Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）を使用し、実施例１に記載するように染色を実施した。シナプス小胞糖タンパク質ＳＹＮシグナルの強度を以前に記述されているように定量化した（Ｂｕｔｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５：９０９６−９１０１（２００５））およびＰｒｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２６：７２１２−７２２１（２００６））。各関心領域において、デジタルズーム２、および０．２５μｍのＺスタックを用いて、水中倍率６３ｘで共焦点画像を４枚撮影した。全ての像は、同一セッション中に撮影された。処置および対照マウス（ｎ＝５〜７）からの切片は、同等範囲の画素強度を得るために、画像を得る処理中、交互に撮影された。ＩｍａｇｅＪの「柱状図」機能を用いて像を分析した（報告値：「平均」）。
【０３０５】
Ａβ抗体で処置された二重トランスジェニックマウスのＯＭＬにおいて、有意な作用が観察され（図５Ｃ）、皮質においても、さほど大きくない増加が検出された（ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：３６．１６±５．４対ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：４５．８±４．２平均画素強度）。対照抗体で処理されたマウスは、未処理ＡＰＰ／ＰＳ１マウスに非常に類似するシナプトフィジン発現を示し（皮質：３７．９±２．２，海馬：１７．３±２．３平均画素強度）、相違はＡβ抗体での処置によるものであることを示唆した。野生型対照におけるシナプトフィジン発現は、Ａβ抗体処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの海馬以外、トランスジェニック群のそれぞれにおける発現より有意に高かった（皮質：６８±３．５，海馬：２８．９±２．２平均強度染色，ｐ＜０．０２ＡＮＯＶＡ、その後Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ
ＰＤ）。
【０３０６】
ＳＹＮ陽性ブートン数を計数することにより、同様の結果が得られた。これらの実験において、フレーム領域を２５０μｍ２にセットした１００ｘ油対物レンズ、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７１カラーデジタルカメラ、およびｎｅｗＣＡＳＴソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を備えたＬｅｉｃａ  ＤＭ４０００Ｂ顕微鏡、ｘおよびｙレベルでの２００μｍ採取間隔、および総断面厚の２．５μｍ厚分画を構成する光学解剖器具を用いて、海馬部分の分子層において、シナプトフィジン陽性シナプス前末端を両側的に計数した。結果は、Ａβ抗体処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスが歯状回の分子層において、ＳＹＮ陽性ブートン数の増加を示したことを示した（図５Ｄ）。
【０３０７】
これらのデータは、ＡＤモデルにおいて、抗Ａβ抗体での処置が樹状長を増大し、樹状分岐を促進し、シナプス密度を増大することを示唆する。
【０３０８】
実施例６
受動免疫は、歯状回における血管新生を増大する
血液−脳関門（ＢＢＢ）は、報告によれば、ＡＤにおいて破壊される。報告によれば、血管の壁に沿ったＡβの進行性沈着は、血管の虚脱、脳の低灌流、最終的にはニューロン損傷を導く（Ｚｌｏｋｏｖｉｃ，  Ｎｅｕｒｏｎ５７：１７８−２０１（２００８））。
血管新生化および血管新生は、前者が後者を刺激するため、厳密に相関している（Ｊｉｎ
ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：１１９４６−１１９５０（２００２））。これは、血管新生化が、前駆体に好適な環境を作り出す可能性があることを示唆する。
【０３０９】
ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおいて、多くのＢｒｄＵ＋細胞は、血管に近接して位置した。加えて、Ａβ抗体は、血管を介して脳に放出される。本情報を考慮して、受動免疫が血管形成に影響するかを試験するために、実験を実施した。これらの実験において、処置および対照動物で、立体解析評価、レクチン染色、およびグルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）染色を用いて、血管を検査した。Ｇｌｕｔ１は、血液−脳関門等の関門組織の内皮細胞において、高度に発現するグルコーストランスポーターである。立体解析分析は、基本的に、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．６５：３１７−３２２（２００５）に記載される通りに実施された。
【０３１０】
抗体処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回における血管枢数の推定は、単一毛細血管が２つに分枝する点の数を予測するように、計算盤を応用することにより実施した。この数の２倍が、毛細血管部分の数と等しくなる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．６５：３１７−３２２（２００５））。血管の長さは、血管とコンピュータ生成等方性仮想面間の交点を計数することにより推定された（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．１９１：２３８−２４８（１９９８））。Ｇｌｕｔ１染色は、上述の染色実験に記載される通りに、ウサギ抗マウスＧｌｕｔ１（１：５００，Ａｌｐｈａ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＵＳＡ）を用いて実施した。
【０３１１】
血管の長さの立体解析推定は、抗体処置後、増加方向への傾向を検出した（ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：０．１７±０．０３ｖｓ．ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：０．３１±０．０６，ｐ＝０．０７）。しかしながら、レクチンまたはＧｌｕｔ１染色のいずれかで評価された時に、血管における相違は明らかであった。血管に沿ったアミロイド沈着は、Ｇｌｕｔ１の発現を下方制御する。しかしながら、Ｇｌｕｔ１レベルは、対照抗体よりＡβ抗体で処置された動物で有意に高かった（ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：４２７１±５６８対ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：８８６９±１５７０，ｐ＜０．０５）。加えて、レクチンのレベルは、Ａβ抗体で処置された動物で有意に高かった（ＡＰＰ／ＰＳ１＋ｃｔ  ａｂ：５９９１±３８４対ＡＰＰ／ＰＳ１＋抗Ａβ：８９７８±７６６，ｐ＜０．０１）。図６は、レクチン染色により示される血管数の予測値を示す。
【０３１２】
さらに、ＴｈｉｏＳ＋細胞の共焦点画像は、血管の壁に沿ったＡβ沈着を示し、Ｇｌｕｔ１発現がＣＡＡの存在下で妨害されたことを明示した。ＡβのＧｌｕｔ１との共局在は、Ｇｌｕｔ１がアミロイド沈着によるエピトープ遮蔽の結果として検出不可であった可能性を排除する。
【０３１３】
これらのデータは、対照抗体よりも、Ａβ抗体で処置されたＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける血管数が実際に高く、したがって、Ａβ抗体での治療は、血管新生を増大することを示唆する。
【０３１４】
実施例７
Ａβ免疫療法は、新規成熟ニューロンにおいて樹状分枝および樹状棘密度を回復する
Ａβ免疫療法が、成熟した時に新規顆粒細胞の樹状形成に影響するかどうかを検討するために、ＧＦＰで分裂細胞を標識するために歯状回にレトロウイルス注入を受けたマウスにおいて、Ａβ免疫療法を繰り返した。
【０３１５】
注入用のレトロウイルスを作製するために、モロニー肉腫ウイルス由来で、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＭｏｌＲＧ）の制御下でＧＦＰを発現するオンコレトロウイルスベクターを使用した。リン酸カルシウム沈降法を用いて、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の同時形質移入によりウイルス溶液を調製した。４８時間後、スクロース勾配の二連続超遠心分離により調整培地を濃縮した。ウイルス粒子を減菌ＰＢＳ中で再懸濁し、小分けして、使用するまで−８０℃で保管した。ＨＥＫ２９３細胞での段階希釈によりウイルス濃度（１０８−９ｃｆｕ／ｍｌ）を決定し、感染から４８時間後、フローサイトメトリーを用いてＧＦＰ＋細胞数を計数した。新規ニューロン標識のため、ケタミン／キシラジンでマウスを完全に麻酔し、歯状回にレトロウイルスベクター（０．２μｌ／分で１．５μｌ）を片側注入した（位置座標：ブレグマから２ｍｍ後部および１．５ｍｍ側部、頭骨から２．３ｍｍ腹側）。
【０３１６】
１５匹のマウスに、受動Ａβ免疫化（５ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）（ｎ＝５ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（雄２匹；雌３匹））またはビヒクル治療（ＰＢＳ，１００μｌ／１０ｇｍ体重，ｉ．ｐ．）（ｎ＝５ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（雄２匹；雌３匹）；ｎ＝５非トランスジェニックマウス（雄２匹；雌３匹））のいずれかを開始した１ヶ月後の３ヶ月齢で、歯状回にＧＦＰ発現レトロウイルスを注入した。受動Ａβ免疫化またはビヒクル処置のいずれかの処置は、２ヶ月齢で開始され、週に１回行われ、２ヶ月間継続された。その後、同じ建物内の動物施設から５分の移送後、麻酔前に３０分間、マウスを覆いの下に配置し、経心腔的灌流を実施した。
【０３１７】
レトロウイルス注入後、２０ｘ水中対物レンズおよび２倍のデジタルズームを備えるＬｅｉｃａ  ＤＭ４０００顕微鏡（１０２４ｘ１０２４画素）を用いて、５週齢のＧＦＰ＋新規顆粒細胞（群当りｎ＝１５）の樹状の長さおよび分枝を分析した。平均して５０〜７０枚の０．５μｍステップの画像を分析用にマージした。棘密度についての高倍率画像も、６３ｘ水中対物レンズおよび６倍のデジタルズームを備えるＬｅｉｃａ  ＤＭ４０００顕微鏡（５１２ｘ５１２画素）を用いて撮影した。平均して１００〜１３０枚の０．１２０μｍステップの画像を分析用にマージした。標識されたニューロンの自己蛍光は、十分に強いため、抗ＧＦＰ染色は不要であった。オープンソースＨｕｙｇｅｎｓ遠隔マネージャー（ｈｔｔｐ：／／ｈｒｍ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）を用いて、解析度を増大し、焦点のずれたぼやけを除去し、ノイズを排除することにより画像の鮮明度を向上するために、Ｚスタックを平明化して、シグナルをフィルターした。平明化したｚスタックの３Ｄ再構成は、Ｉｍａｒｉｓ６．１（Ｂｉｔｐｌａｎｅ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて実施された。３Ｄ再構成後、前述のソフトウェアおよびそのＭａｔＬａｂエクステンション（ＩｍａｒｉｓＸＴ）を用いて、ショール（Ｓｃｈｏｌｌ）分析を行った。これらの分析において、それぞれの円が前の円から１０μｍ増加し、神経細胞体を中心とする、樹状突起と同心円との間の交点を、４０μｍ部分に沿って総樹状長および分枝密度を決定するために計数された（群当りｎ＝５０（図７）。Ｐｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｋａｉｓｅｒｍａｎ−Ａｂｒａｍｏｆ（Ａｍ．Ｊ．Ａｎａｔ．１２７：３２１−３５５（１９７０））の元の分類に従い、棘の分類（太くて丸い、長くて細い、キノコ形）も実施された（図８）。棘の密度が細胞体からの距離に比例して増加するため（Ｓｏｒｒａ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  １０：５０１−１１（２０００））、ショール分析に使用されたそれぞれのＧＦＰ＋ニューロンについて、１および２樹状部分は、それぞれ、内側および外側部分の外側分子層において分析された。
【０３１８】
ＧＦＰ＋顆粒細胞は、注入から５週間後に分析された。５週間は、新しく誕生したニューロンが成熟するのに十分な時間であると考えられた（ｖａｎ  Ｐｒａａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４１５：１０３０−１０３４（２００２）、およびＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２６：３−１１（２００６））。Ａβ免疫療法処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回（ｄｅｎｔａｔｅ  ｇｒｙｉ）よりも、ビヒクル処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの歯状回において、ＧＦＰ＋、新規、および成熟顆粒細胞の樹状分岐が有意に少なかった。Ａβ免疫療法処置ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおける樹状分岐の数は、非トランスジェニックマウスで誕生した新規ニューロンにおける樹状分岐の数と類似した。
【０３１９】
Ａβ免疫療法は、棘密度にも影響した。棘は、興奮シナプス伝達の本質部位であり、その形状および外見により分類され得る。非トランスジェニックマウスと比較して、長くて細い棘、太くて丸い棘、およびキノコ形の棘における有意な減少が、対照抗体処置マウスの全てのＧＦＰ＋細胞で観察された（図８）。Ａβ免疫療法は、この棘の損失をそれぞれの種類の棘に対して約５０％反転した（図８）。
【０３２０】
これらのデータは、抗Ａβ抗体での治療が樹状分枝を増加し、棘密度を増大させることができることを示唆する。
【０３２１】
実施例８
新規に形成されたニューロンの細胞プリオンタンパク質の存在はＡβ関連毒性を媒介する役割に対応する
Ａβオリゴマーのシナプス毒性を媒介する細胞プリオンタンパク質（ＰｒＰｃ）における役割が記載されている（Ｌａｕｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４５７：１１２８−１１３２（２００９））。ＰｒＰｃがレトロウイルス標識ＧＦＰ＋新規ニューロンに存在するかどうかを調べるために、ＰｒＰｃおよびＧＦＰの局在化を観察した。この組織学的分析において、高倍率スタック（６３ｘ  ｚ８、５１２ｘ５１２画素、０．１６ｚ−ステップ）を、ＣｏｌｏｃＩｍａｒｉｓソフトウェアを用いて分析した。このソフトウェアは、両方の蛍光チャネルにおいて陽性であるボクセルを特定的に確認し、これによって、ｚレベルのオーバーレイにより生成されるアーチファクトを劇的に削減する。ＰｒＰｃは、脳全体にわたって細胞上に遍在的に存在した。ＰｒＰｃは、既存の脳細胞、およびレトロウイルス標識ＧＦＰ＋新規誕生ニューロン上にも、等しいレベルで存在した。新規誕生ニューロンの樹状突起上のＰｒＰｃ染色は、既知の細胞分布と一致する分断的外見を有し（Ｈａｎｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｌ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．４９２：９０−１００（２００５））、分析された新規誕生ニューロンの樹状表面の約５％が、ＰｒＰｃにおいて共染色された。ＰｒＰｃは、非トランスジェニックマウスおよびＡＰＰ／ＰＳ１マウスの両方において、新規誕生ニューロンの樹状突起上に等しいレベルで存在した。これは、ＡＰＰおよびＰＳ１導入遺伝子の発現が、それぞれ、ＰｒＰｃおよびＰＤＧＦβプロモーターの制御下で、新規誕生ニューロンの樹状突起とのＰｒＰｃの共局在に影響しなかったことを示唆する。Ａβ免疫療法は、新規誕生ニューロンの樹状突起とのＰｒＰｃの共局在において、明らかな影響はなかった。
【０３２２】
これらのデータは、ＰｒＰｃが、ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの新規誕生ニューロンにおけるＡβ関連毒性を媒介するモデルと一致する。したがって、Ａβ結合化合物は、ＡβがＰｒＰｃに結合するのを遮断し、ＰｒＰｃを介するシグナル伝達および得られた毒性を調節するために使用され得る。
【０３２３】
実施例９
Ａβ免疫療法の作用はＡβ凝集結合によるものである
Ａβ免疫療法の作用が非特異的であったという可能性を排除するために、抗体治療の非トランスジェニック野生型マウスへの影響も観察した。これらの実験において、ヒトＡＰＰを発現しない、またはβアミロイド病理を持たない非トランスジェニック野生型マウスを使用した。灌流前に１０週間、これらのマウスをビヒクル（ＰＢＳ，１００μｌ／１０ｇｍ体重，ｉ．ｐ．（ｎ＝５，雄２匹、および雌３匹））または抗Ａβ（５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．（ｎ＝４，雄１匹、および雌３匹）のいずれかで、２ヶ月齢で開始して、処置した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスと違い、Ａβ免疫療法は、非トランスジェニックマウスにおいて血管新生（ＢｒｄＵ／ＮｅｕＮおよびＰＳＡ−ＮＣＡＭ）に影響しなかった。グリア新生（ＢｒｄＵ／Ｓ１００β）、増殖（ＰＣＮＡ）、および神経炎症のマーカー（ＧＦＡＰ、Ｉｂａ１、およびＣＤ１１ｂ）の歯状回における定量化は、非トランスジェニック野生型マウスの抗体とビヒクル処置との間にいかなる相違も検出しなかった。結果を表８に要約する（値は、平均±標準誤差である；ｎ＝５ビヒクル、およびｎ＝４Ａβ免疫療法；群の間で有意な相違は観察されなかった）。
【０３２４】
【表８】
2014148543.tif 000012
これらのデータは、ＩｇＧ２の非特異的作用ではなく、抗体のヒトＡβ凝集体への結合が、歯状回の血管新生にＡβ免疫療法の作用を媒介したことを示唆する。
【０３２５】
総合すると、本明細書に提供するデータは、受動免疫がアルツハイマー病および関連疾病を治療するために効果的であり得、血管新生の促進に有用であり得ることを明示する。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図２】
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【図８】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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