(57)【要約】  本発明は、ベクターに搭載された遺伝子の一過的な高発現、および当該発現後のベクターの迅速な除去等を可能とする改良されたマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびその利用を提供することを課題とする。マイナス鎖RNAウイルスベクターが持つNP、P、またはL遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加することにより、導入細胞が発現するマイクロRNAに依存してベクターの発現を制御することが可能であることを見出した。特に、NP、またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した場合は、マイクロRNAに依存してベクターの発現は低下し、ベクターの除去も促進される一方、L遺伝子に付加した場合は効果が逆転した。本発明ベクターは細胞治療や再生医療における応用や癌を標的とする治療用ベクターとして有用である。
2017082174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変パラミクソウイルスベクターであって、該ウイルスのNP遺伝子、P遺伝子、またはL遺伝子が、マイクロRNAの標的配列を付加するように改変され、該マイクロRNAを発現する細胞において、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたベクターは該ベクターの発現が負に制御され、L遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたベクターは該ベクターの発現が正に制御されるベクター。
【請求項２】
少なくとも１つのエンベロープ蛋白質遺伝子を欠損する、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
NP遺伝子、P遺伝子、またはL遺伝子の翻訳領域、5’または3’非翻訳領域にマイクロRNA標的配列が付加されている、請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項１から３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
温度感受性変異を含む、請求項１から４のいずれかに記載のベクター。
【請求項６】
該温度感受性変異がP蛋白質のL511F変異を含む、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
該温度感受性変異がP蛋白質のD433A、R434A、およびK437Aを含む、請求項５または６に記載のベクター。
【請求項８】
マイクロRNA標的配列がmiR-122、miR-124、miR-126、miR-138、miR-143、miR-218、miR-302 cluster、miR-367、および、miR-372の各標的配列からなる群より選択される、請求項１から７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
転写因子遺伝子または自殺遺伝子を搭載する、請求項１から８のいずれかに記載のベクター。
【請求項１０】
パラミクソウイルスベクターの除去を促進するための方法であって、請求項１から９のいずれかに記載のベクターであって、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたベクターを用いることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれかに記載のベクターの製造方法であって、該ベクターのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードする核酸を、いずれもマイクロRNA標的配列が付加されていないNP、PおよびL遺伝子と共に発現させる工程を含む方法。
【請求項１２】
請求項１から９のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする、搭載遺伝子の発現量を制御する方法。
【請求項１３】
搭載遺伝子が転写因子をコードする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
搭載遺伝子が多能性幹細胞を誘導するリプログラミング因子をコードする、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
搭載遺伝子が自殺遺伝子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍細胞の溶解において使用される、請求項１２または１５に記載の方法。
【請求項１７】
パラミクソウイルスまたはパラミクソウイルスベクターの除去を促進する方法であって、該ウイルスまたはウイルスベクターを、請求項１から９のいずれかに記載のベクターであって、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたベクターと共感染させる工程を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１から９のいずれかに記載のベクターを含む、パラミクソウイルスまたはパラミクソウイルスベクターの除去促進剤。
【請求項１９】
改変パラミクソウイルスベクターであって、P遺伝子を2つ以上搭載するベクター。
【請求項２０】
少なくとも１つのP遺伝子がコードするP蛋白質が温度感受性である、および/またはdegronが付加されている、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
NP遺伝子、P遺伝子、またはL遺伝子の翻訳領域、5’または3’非翻訳領域にマイクロRNA標的配列が付加されている、請求項１９または２０に記載のベクター。
【請求項２２】
温度感受性および/またはdegronが付加されているP蛋白質をコードする少なくとも１つのP遺伝子と、マイクロRNA標的配列が付加されている少なくとも１つのP遺伝子とを搭載する請求項１９から２１のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする、ベクターの発現量および/または除去を制御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は改良されたマイナス鎖RNAウイルスベクターに関する。より具体的には、NP、P、および/またはL遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加するように改変されたマイナス鎖RNAウイルスベクターおよびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
センダイウイルス（SeV）ベクターなどのマイナス鎖RNAウイルスベクターは細胞質型RNAウイルスベクター（発現の全段階が細胞質で行われるベクター）であることから、in vivoで使用しても、搭載遺伝子が宿主染色体へ組み込まれて遺伝毒性を生じる心配は全くない。また、in vitroとin vivoの両方において高い遺伝子導入、発現効率が得られることや、in vitroでは長期持続発現が可能であることなど、いくつもの優れた性能を有している。そのためSeVベクターは、多能性幹細胞の作製、遺伝子治療・遺伝子ワクチン、あるいは抗体産生や機能解析への応用など遺伝子導入ベクターとして広く応用・利用されている（特許文献1、2、非特許文献1、2）。【０００３】
これまでSeVベクターのP蛋白質を欠損することによる一過性の発現（特許文献3、非特許文献3）や非複製型のベクター（特許文献4）、P蛋白質やL蛋白質への温度感受性変異挿入と温度シフトによるSeVベクターの除去（特許文献1、2）、L遺伝子の3’非翻訳領域にmiR-302aの標的配列付加やsiRNAの添加によるSeVベクターの除去（特許文献5）が報告されている。しかし、P蛋白質の欠損ベクターは搭載遺伝子の低発現と短い発現期間が課題であり（SeVベクターの高発現能力が損なわれている）、従来の温度感受性変異ベクターは除去に時間を要すること（39℃での数日間培養）が課題であった。【０００４】
実際に、SeVベクターのL遺伝子の3’非翻訳領域にマイクロRNA標的配列を付加した例はあるが（特許文献5）、SeVベクターのNP遺伝子やP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した例はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開WO2010/008054
【特許文献２】国際公開WO2012/029770
【特許文献３】国際公開WO2008/133206
【特許文献４】国際公開WO2008/007581
【特許文献５】国際公開WO2012/063817
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bitzer M, et al., J Gene Med. (2003) 5, 543-553
【非特許文献２】Griesenbach U, et al., Curr Opin Mol Ther. (2005) 7, 346-352
【非特許文献３】Abe T, et al. Exp Hematol. (2011) 39, 47-54
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、マイナス鎖RNAウイルスのNP、P、および/またはL遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加することによりベクターの発現を制御する方法、および、当該ベクターおよびその利用を提供することを課題とする。具体的には本発明は、マイナス鎖RNAウイルスのNP遺伝子および/またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加したマイナス鎖RNAウイルスベクター、該ベクターの製造方法、およびその使用を提供することを課題とする。また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスのNP遺伝子および/またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加することにより、ベクターの発現を負に制御する方法を提供する。また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスのNP遺伝子および/またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたマイナス鎖RNAウイルスベクターを使用する、ベクターの除去を促進する方法にも関する。【０００８】
また本発明は、L遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加したマイナス鎖RNAウイルスベクター、該ベクターの製造方法、およびその使用を提供することを課題とする。また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスのL遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加することにより、ベクターの発現を正に制御する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、マイナス鎖RNAウイルスベクターの遺伝子発現能力を維持しつつ、ベクターの除去速度を改善する方法の探索を行った。
マイナス鎖RNAウイルスベクターを用いて一過性発現を行うために、本発明者らは当初、P遺伝子の欠損ベクターの使用を試みた。しかし作製したベクターを細胞に導入してレポーター蛋白質の発現を調べたところ、P蛋白質を発現しないHeLa細胞ではレポーター蛋白質の発現が確認できなかった。非特許文献3においてもP遺伝子欠損ベクターからの搭載遺伝子の発現は、P遺伝子を欠失していないベクターに比べて1/10以下であることが報告されている。また特許文献4の非複製型SeVベクターは十分な遺伝子発現量を得るために、高タイター、あるいはヘルパーベクターの存在を必要とし、生産効率も低い。一方、特許文献2に記載のベクター（TS12骨格やTS15骨格）では感染細胞の培養条件を39℃で7日間培養を行うことにより、SeVベクターの除去を行っているが、37℃では除去により長い時間を必要とし、例えばiPS細胞の誘導においてはSeVベクター感染からアルカリホスファターゼ陽性のコロニーが得られるまでに28日間が経過している。また、iPS細胞は細胞増殖も速く、ベクターも除去されやすいと想定されるにも関わらずベクターがすぐに除去されないということは、HeLa細胞のような一般的な細胞株では、ベクターの除去により長い時間を必要とすると考えられる。
また本発明者らは、P蛋白質へのdegron付加によるSeVベクターの除去も試みている（国際公開WO2016/125364）。温度感受性P蛋白質にdegronを付加したベクターにおいては、特許文献2に記載のベクターよりも早いベクターの除去が実現されているが、ベクター除去を行う温度より低い温度で感染させる必要があること（37℃で除去される骨格の場合、32〜35℃で感染）が課題であった。【００１０】
このような課題に対して、本発明者らは、マイナス鎖RNAウイルスベクターのウイルス遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加することにより、ベクターの除去を促進できるのではないかと考えた。そこで本発明者らはまず、マイナス鎖RNAウイルスベクターのウイルス蛋白質の中で、マイクロRNA標的配列によるベクターの除去を促進するのに最も適していると思われたL遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加することでベクターの除去を試みた。ところがL遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加すると、マイクロRNAを発現する細胞においてベクターの発現はむしろ上昇し、L遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加することで導入遺伝子の発現やベクターの除去を効果的に制御するのは困難であった。【００１１】
そこで本発明者らは、マイナス鎖RNAウイルスのP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加する実験を行った。その結果、P遺伝子のコード領域、または5'もしくは3’非翻訳領域にマイクロRNA標的配列を付加した場合に、マイクロRNA非発現細胞におけるベクターの導入直後の導入遺伝子の発現は非常に高いレベルを達成できる一方で、マイクロRNA発現細胞においては迅速にベクターが除去されるという極めて優れた特性が発揮されることを見出した。また、L遺伝子の場合は4回繰り返しのマイクロRNA標的配列を付加しても、導入遺伝子の発現低下効果が得られなかったのに対し、P遺伝子の場合は1つのマイクロRNA標的配列で効果を発揮した。さらに、NP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加したベクターと比較しても、P遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した方が導入遺伝子の発現低下効果は大きかった。P遺伝子の5’および3’非翻訳領域を比較すると、3’側の方が導入遺伝子の発現低下効果は大きかった。【００１２】
さらに、P遺伝子を2つ搭載したベクターにおいて、一方のP蛋白質をマイクロRNA標的配列により細胞特異的に発現低下させ、他方のP蛋白質を温度感受性あるいはdegronによって発現低下させることに成功した。発現制御の特性の異なるP遺伝子を2つ搭載することにより、37℃で感染可能で、マイクロRNA標的配列および温度感受性あるいはdegronの複数のシステムにより発現制御されるベクターが得られた。【００１３】
ベクターの除去促進はiPS細胞において複数のマイクロRNAにより確認された。また、iPS細胞だけでなく、中胚葉のモデルとして血管内皮細胞、内胚葉のモデルとして肝細胞、外胚葉のモデルとして神経細胞、正常細胞のモデルとして用いたBJ細胞においてもそれぞれの細胞で特異的に発現されるマイクロRNAの標的配列を搭載したベクターが除去されることが示された。さらに、腫瘍溶解ウイルスに正常細胞で発現し、癌細胞で発現が低下するマイクロRNAの標的配列を搭載すると腫瘍溶解ウイルスが癌細胞選択的に増殖することが示された。つまり、iPS細胞の材料となる細胞でベクターに搭載した転写因子等を一過的に高発現させ、リプログラミング後に発現するマイクロRNAによりベクターを除去すること、幹細胞に転写因子等を一過的に高発現させ、分化誘導後に発現するマイクロRNAによりベクターを除去すること、腫瘍溶解ウイルスにおいて正常細胞への影響を抑えつつ癌細胞への選択性を高めることが可能となる。そのため、本発明のベクターは、再生医療や細胞治療等における細胞の形質改変、あるいは癌治療などに有用な遺伝子発現ベクターとなることが期待できる。【００１４】
また本発明は、複数のP遺伝子を搭載するよう改変された改変パラミクソウイルスベクターを提供する。本発明において、P遺伝子の発現制御はベクターの発現の制御やベクターの消失の制御に極めて有用であることが判明した。複数のP遺伝子をベクターに搭載させ、それぞれのP遺伝子の発現を制御することにより、より複雑で柔軟性に富んだベクター発現の調整やベクターの消失の制御を行うことが可能となる。特に、複数のP遺伝子を搭載するよう改変パラミクソウイルスベクターであって、少なくとも１つのP遺伝子にマイクロRNA調節配列が付加されたベクターは、iPS細胞の作製用ベクターとしてより優れた特性を発揮する。【００１５】
すなわち、本発明は、NP、P、および/またはL遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加するように改変されたマイナス鎖RNAウイルスベクター、およびその利用等に関し、より具体的には下記の発明を提供するものである。
〔１〕  改変パラミクソウイルスベクターであって、該ウイルスのNP遺伝子、P遺伝子、またはL遺伝子が、マイクロRNAの標的配列を付加するように改変され、該マイクロRNAを発現する細胞において、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたベクターは該ベクターの発現が負に制御され、L遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたベクターは該ベクターの発現が正に制御されるベクター。
〔２〕  すくなくとも１つのエンベロープ蛋白質遺伝子を欠損する、〔１〕に記載のベクター。
〔３〕  少なくともF遺伝子またはM遺伝子を欠損する、〔２〕に記載のベクター。
〔４〕  NP遺伝子、P遺伝子、またはL遺伝子の翻訳領域、5’または3’非翻訳領域にマイクロRNA標的配列が付加されている、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載のベクター。
〔５〕  パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載のベクター。
〔６〕  温度感受性変異を含む、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載のベクター。
〔７〕  該温度感受性変異がP蛋白質のL511F変異を含む、〔６〕に記載のベクター。
〔８〕  該温度感受性変異がP蛋白質のD433A、R434A、およびK437Aを含む、〔６〕または〔７〕に記載のベクター。
〔９〕  マイクロRNA標的配列がmiR-122、miR-124、miR-126、miR-138、miR-143、miR-218、miR-302 cluster、miR-367、および、miR-372の各標的配列からなる群より選択される、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載のベクター。
〔１０〕  転写因子遺伝子または自殺遺伝子を搭載する、〔１〕から〔９〕のいずれかに記載のベクター。
〔１１〕  パラミクソウイルスベクターの除去を促進するための方法であって、〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のベクターであって、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたベクターを用いることを特徴とする方法。
〔１２〕  〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のベクターの製造方法であって、該ベクターのゲノムRNAまたはその相補鎖をコードする核酸を、いずれもマイクロRNA標的配列が付加されていないNP、PおよびL遺伝子と共に発現させる工程を含む方法。
〔１３〕  〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする、搭載遺伝子の発現量を制御する方法。
〔１４〕  搭載遺伝子が転写因子をコードする、〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕  搭載遺伝子が多能性幹細胞を誘導するリプログラミング因子をコードする、〔１３〕または〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕  搭載遺伝子が自殺遺伝子である、〔１３〕に記載の方法。
〔１７〕  腫瘍細胞の溶解において使用される、〔１３〕または〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕  パラミクソウイルスまたはパラミクソウイルスベクターの除去を促進する方法であって、該ウイルスまたはウイルスベクターを、〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のベクターであって、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたベクターと共感染させる工程を含む、方法。
〔１９〕  〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のベクターを含む、パラミクソウイルスまたはパラミクソウイルスベクターの除去促進剤。
〔２０〕  改変パラミクソウイルスベクターであって、P遺伝子を2つ以上搭載するベクター。
〔２１〕  少なくとも１つのP遺伝子がコードするP蛋白質が温度感受性である、および/またはdegronが付加されている、〔２０〕に記載のベクター。
〔２２〕  NP遺伝子、P遺伝子、またはL遺伝子の翻訳領域、5’または3’非翻訳領域にマイクロRNA標的配列が付加されている、〔２０〕または〔２１〕に記載のベクター。
〔２３〕  〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のベクターである、〔２２〕に記載のベクター。
〔２４〕  温度感受性および/またはdegronが付加されているP蛋白質をコードする少なくとも１つのP遺伝子と、マイクロRNA標的配列が付加されている少なくとも１つのP遺伝子とを搭載する〔２０〕から〔２３〕のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする、ベクターの発現量および/または除去を制御する方法。【００１６】
また本発明は以下の発明にも関する。
〔２５〕  転写因子をコードする遺伝子を搭載する、〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のベクター。
〔２６〕  リプログラミング因子をコードする遺伝子を搭載する、〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のベクター。
〔２７〕  リプログラミング因子がKLF4である、〔２６〕に記載のベクター。
〔２８〕  M遺伝子を欠損する、〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のベクター。
〔２９〕  Fタンパク質の開裂部位が改変されている、〔２８〕に記載のベクター。
〔３０〕  Fタンパク質が癌特異的プロテアーゼにより開裂される、〔２９〕に記載のベクター。
〔３１〕  自殺遺伝子を搭載する、〔２８〕から〔３０〕のいずれかに記載のベクター。
〔３２〕  P遺伝子を2つ以上搭載する、〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のベクター。
〔３３〕  少なくとも１つのP遺伝子がコードするP蛋白質が温度感受性である、および/またはdegronが付加されている、〔３２〕に記載のベクター。
〔３４〕  NP遺伝子、P遺伝子、またはL遺伝子の翻訳領域、5’または3’非翻訳領域にマイクロRNA標的配列が付加されている、〔３２〕または〔３３〕に記載のベクター。
〔３５〕  すべてのP遺伝子にdegronおよび/またはマイクロRNA標的配列が付加されている、〔３２〕から〔３４〕のいずれかに記載のベクター。
〔３６〕  温度感受性および/またはdegronが付加されているP蛋白質をコードする少なくとも１つのP遺伝子と、マイクロRNA標的配列が付加されている少なくとも１つのP遺伝子とを搭載する〔３２〕から〔３５〕のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする、ベクターの発現量および/または除去を制御する方法。
〔３７〕  温度感受性および/またはdegronが付加されているP蛋白質をコードする少なくとも１つのP遺伝子と、マイクロRNA標的配列が付加されている少なくとも１つのP遺伝子とを搭載する〔３２〕から〔３５〕のいずれかに記載のベクターを用いることを特徴とする、細胞のリプログラミングにおけるリプログラミング因子遺伝子の導入のための当該ベクターの使用。
〔３８〕  細胞のリプログラミングにおける〔２６〕または〔２７〕のベクターの使用。
〔３９〕  癌治療における〔２８〕から〔３１〕のいずれかに記載のベクターの使用。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、NPあるいはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加することで、ベクターの除去を有意に促進させることが可能となる。高い遺伝子発現量と速やかなベクター除去が両立され、培養を高温で行うことなく転写因子の発現調節やiPS細胞の作製や細胞分化におけるベクター除去促進、腫瘍溶解ベクター感染時における腫瘍細胞特異的感染の向上が得られる。さらに、L遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加することで、ベクターの発現を上昇させることができる。例えばM遺伝子欠失型の腫瘍溶解ベクターにおいてマイクロRNA標的配列をL遺伝子に付加すれば、腫瘍溶解ベクター感染時におけるベクターの増殖向上が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】マイクロRNA標的配列の搭載位置を示す図である。
【図２Ａ】マイクロRNA標的配列を付加することでベクターの遺伝子発現の制御が可能なことを示す図である。DGFPやP遺伝子にmiR-302 clusterの標的配列を4回繰り返したmiR302T4を付加したベクターであるDGFPmiRTやPmiRTをHeLa細胞に感染させるとDGFPの蛍光が観察されたが、miR-302を発現するiPS細胞ではほとんど蛍光が観察されなかった。一方、L遺伝子にmiR-302T4を付加したLmiRT#1ベクターはmiR-302を発現するiPS細胞でDGFPの蛍光増大が観察された。マイクロRNA標的配列の搭載位置をL遺伝子のより3’側にずらしたLmiRT#2の蛍光はDGFPの6.5倍であった。
【図２Ｂ】図2Aの続きを示す図である。
【図３】マイクロRNA標的配列を付加することでベクターが除去されたことをSeV抗体染色により示した図である。ベクター感染22日後にSeV抗体染色を行い、PmiRTはSeV抗体陰性、LmiRT#1およびLmiRT#2はSeV抗体陽性であった。
【図４Ａ】マイクロRNA標的配列を付加する位置やベクター骨格の検討を示した図である。NP遺伝子にmiR-302T4を付加したNPmiRTはマイクロRNA標的配列を付加していないDGFPと比較して発現が抑制されたが、P遺伝子に付加した場合と比較すると弱い発現抑制であった。P遺伝子のコード領域にmiR-302T4を付加したPmiRTtagはPmiRTと同等の効果が得られた。温度感受性の強化されたTS12とTS15骨格のPmiRTにおいても同様の発現抑制効果が得られた。
【図４Ｂ】図4Aの続きを示す図である。
【図５Ａ】マイクロRNA標的配列の繰り返し数を検討した図である。P遺伝子にmiR-302の標的配列を2回繰り返したmiR302T2を付加したPmiRTx2とmiR-302の標的配列が1つであるmiR302T1を付加したPmiRTx1も発現抑制効果示した。PmiRTx2は培養時間を延長したday2でマイクロRNA標的配列の繰り返し数が4回のPmiRTと同等の発現抑制効果を示した。
【図５Ｂ】図5Aの続きを示す図である。
【図６】iPS細胞で発現する他のマイクロRNA標的配列でも効果が得られることを示した図である。P遺伝子にmiR-367の標的配列を2回繰り返したmiR367T2を付加したPmiR367T2も発現抑制効果を示した。
【図７】分化細胞で発現する他のマイクロRNA標的配列でも効果が得られることを示した図である。中胚葉系の血管内皮細胞で発現することが知られているmiR-126の標的配列（2回繰り返し）をP遺伝子に付加したPmiR126T2も発現抑制効果を示した。
【図８】温度感受性変異を含まないベクターにおいてもマイクロRNA標的配列による効果が得られることを示した図である。温度感受性変異を含まないSeVベクターのP遺伝子にmiR-302T4を付加することで、38.5℃の培養環境下で発現抑制効果を示した。
【図９】miR-372、miR-218、miR-122、またはmiR-143の標的配列を搭載するベクターの各種細胞における発現抑制効果を示した図である。iPS細胞で発現することが知られているmiR-372（A）、正常細胞で発現することが知られているmiR-143（B）、内胚葉系の肝細胞で発現することが知られているmiR-122（C）、外胚葉系の神経細胞で発現することが知られているmiR-218（D）の標的配列（２回繰り返し）を搭載するベクターの発現抑制効果を示した。
【図１０】miR-124またはmiR-138の標的配列を搭載するベクターの神経細胞の分化段階における特異的発現抑制効果を示した図である。
【図１１】マイクロRNA標的配列の各ウイルス遺伝子の5'側（ゲノムにおいては3'側）に付加した場合の効果を示した図である。NPおよびPの5'側に付与することでマイクロRNA標的配列としての機能（発現抑制効果）を発揮したが、Lの5'側付与はマイクロRNA標的配列としての細胞特異的な効果を発揮しなかった。
【図１２】マイクロRNA標的配列に導入した変異を示す図である。
【図１３】マイクロRNA標的配列への変異導入の効果を示す図である。
【図１４】マイクロRNA標的配列への変異導入の効果を示す図である。day5の蛍光シグナル比較（MetaMorphによる解析）を示す。miR367標的配列による発現抑制効果の強さはT2＞T2m1＞T1＞T2m2＞T2m3＞T2m4の順であった。
【図１５】マイクロRNA標的配列搭載ベクターの共感染の効果を示す図である。miR367標的配列搭載ベクターを共感染させることでDGFPの蛍光減弱が観察された。Day 3の結果を示す。
【図１６】マイクロRNA標的配列+HSV-TKの評価を示す図である。miR302標的配列の4回繰り返し配列をP遺伝子の3’UTRに付加したところ、day1で抑制効果が得られた（パネルA）。ガンシクロビル（GCV）添加後の細胞をパネルBに示した（SeV感染 day5、GCV添加 day3）。GCVは25〜100μg/mLで検討した。図に示される通り、HSV-TKを発現する細胞にGCVを添加することで細胞死が誘発された。この結果は、ベクター残存細胞の除去が可能なことを示している。例えば、マイクロRNAによる除去が不十分な細胞の排除を目的として自殺遺伝子をベクターに搭載させることができる。
【図１７】M遺伝子欠失型ベクターに搭載したマイクロRNA標的配列の効果を示す図である。M遺伝子欠失型ベクターの中でも転移性の癌細胞特異的に細胞融合を誘導するBioKnife型ベクター（Fタンパク質の開裂部位がuPA型に改変されたF遺伝子を搭載するベクター）のP遺伝子の3'側に正常細胞で発現するmiR-143の標的配列を搭載させた。マイクロRNA標的配列の搭載ベクターおよび非搭載ベクターは、両方とも癌細胞（PC-3）の細胞融合を誘導できるが、マイクロRNA標的配列を搭載するベクター（BioKnife/miR143T2）では、正常細胞（BJ）における発現が顕著に抑制される（AおよびB）。BJ細胞はマイクロRNA標的配列を搭載しないベクター（BioKnife）の感染により細胞傷害性を示しているが、マイクロRNA標的配列（miR143T2）を搭載することで細胞傷害性は抑制される。正常細胞で発現するマイクロRNAにより発現が抑制されるため、正常細胞の細胞傷害性を示さないことが確認された（CおよびD）。
【図１８】miR367T2ベクターを用いたiPS細胞の作製（ALP染色）を示す図である。（A）Matrigelを用いたアッセイにおけるday21のコロニーの様子を示す。miR367T2を搭載するベクターを用いた場合に大きなALP陽性コロニーが多い。（B）KLF4発現ベクターにマイクロRNA標的配列を付加しない場合（KLF4）、miR302T2またはmiR367T2を付加した場合（それぞれKLF4/miR302T2およびKLF4/miR367T2）のALP陽性コロニーの様子を示す。
【図１９】iPS細胞作製過程のベクター発現変化（DGFP）を示す図である。miR367T2のDGFP発現低下が観察された（MetaMorphによる解析）。day21において従来ベクターTSの24%に発現低下しており、早く除去されることが確認された（A）。miR302T2を用いた場合も同様であった（B）。
【図２０】P遺伝子を複数搭載するベクターによる効果を示す図である。2つ目のP遺伝子とマイクロRNA標的配列の搭載位置の例（A）。一方のP遺伝子が温度感受性のTS15由来、他方のP遺伝子にmiR367T2が付加されたPsPmiR367T2は、35℃では十分発現するが、37℃ではマイクロRNA標的配列と共に温度感受性も機能することで発現が抑制される（B）。
【図２１】P遺伝子を複数搭載し、degronが付加されたベクターによる効果を示す図である。一方のP遺伝子にdegron、他方のP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたベクター（Pd2sPmiR367T2、PddsPmiR367T2、PtetRsPmiR367T2）は、マイクロRNAを発現しない細胞では十分な発現が得られ、マイクロRNAを発現する細胞では除去された。Degronが搭載されたベクターの除去効果はdegronが搭載されていないPsPmiR367T2に比べて促進された。
【図２２】P遺伝子を複数搭載するベクターによるiPS細胞の作製を示す図である。37℃のTS12骨格とTS15骨格の2ベクターの組み合わせでは殆ど遺伝子発現が得られなかったのに対し、P遺伝子を複数搭載するベクターでは2ベクターの使用で強い遺伝子発現が得られた（A）。P遺伝子を複数搭載するベクターでは2ベクターの使用でALP陽性のiPS細胞が得られた(B)。P遺伝子を複数搭載するベクターによるiPS細胞作製過程のベクター発現変化（DGFP）を(C)に示す。Degronが搭載されたベクターの除去効果はdegronが搭載されていないPsPmiR367T2に比べて促進された。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、マイナス鎖RNAウイルスのNP、P、またはL遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたマイナス鎖RNAウイルスベクター、ベクターの製造方法、ベクターの使用、およびベクターの除去促進方法等を提供する。特に本発明は、当該ウイルスのF遺伝子またはM遺伝子を欠失したベクターであって、NP、P、またはL遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたマイナス鎖RNAウイルスベクター、ベクターの製造方法、ベクターの使用、およびベクターの除去促進方法等を提供する。ここで、「または」には、「および」の態様が包含される。すなわち、NP、P、またはL遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたとは、NP、P、またはL遺伝子のいずれかに少なくともマイクロRNA標的配列が付加されたことを言い、それ以外の遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されることを排除するものではない。例えば、NP、P、およびL遺伝子の2つ以上、またはすべての遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されていてもよく、また、それら以外の遺伝子にさらにマイクロRNA標的配列が付加されていてもよい。
【００２０】
マイナス鎖RNAウイルスベクターとは、マイナス鎖（ウイルス蛋白質をアンチセンスにコードしている鎖）のRNAをゲノムとして含むウイルスに由来するウイルスベクターである。マイナス鎖RNAはネガティブ鎖RNAとも呼ばれる。本発明においては、特に一本鎖マイナス鎖RNAウイルス（非分節型（non-segmented）マイナス鎖RNAウイルスとも言う）が例示できる。一本鎖ネガティブ鎖RNAウイルスとは、一本鎖ネガティブ鎖（すなわちマイナス鎖）RNAをゲノムに有するウイルスを言う。このようなウイルスとしては、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus, および Pneumovirus属等を含む）、ラブドウイルス（Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus, および Ephemerovirus属等を含む）、フィロウイルス（Filoviridae）などの科に属するウイルスが含まれ、分類学上モノネガウイルス目(Mononegavirales)に属している（ウイルス 第57巻 第１号、pp29-36、2007; Annu. Rev. Genet. 32, 123-162, 1998; Fields virology fourth edition, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1305-1340, 2001; Microbiol. Immunol. 43, 613-624, 1999; Field Virology, Third edition pp. 1205-1241, 1996）。
【００２１】
本発明において好ましいマイナス鎖RNAウイルスベクターとしては、パラミクソウイルスベクターおよびラブドウイルスベクターが挙げられる。本発明においてパラミクソウイルスとはパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）に属するウイルスまたはその誘導体を指す。パラミクソウイルス科は、非分節型ネガティブ鎖RNAをゲノムに持つウイルスのグループの1つで、パラミクソウイルス亜科（Paramyxovirinae）（レスピロウイルス属（パラミクソウイルス属とも言う）、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）およびニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）（ニューモウイルス属およびメタニューモウイルス属を含む）を含む。パラミクソウイルス科ウイルスに含まれるウイルスとして、具体的にはセンダイウイルス(Sendai virus)、ニューカッスル病ウイルス(Newcastle disease virus)、おたふくかぜウイルス(Mumps virus)、麻疹ウイルス(Measles virus)、RSウイルス(Respiratory syncytial virus)、牛疫ウイルス(rinderpest virus)、ジステンパーウイルス(distemper virus)、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、ヒトパラインフルエンザウイルス1, 2, 3型等が挙げられる。より具体的には、例えば Sendai virus (SeV)、human parainfluenza virus-1 (HPIV-1)、human parainfluenza virus-3 (HPIV-3)、phocine distemper virus (PDV)、canine distemper virus (CDV)、dolphin molbillivirus (DMV)、peste-des-petits-ruminants virus (PDPR)、measles virus (MeV)、rinderpest virus (RPV)、Hendra virus (Hendra)、Nipah virus (Nipah)、human parainfluenza virus-2 (HPIV-2)、simian parainfluenza virus 5 (SV5)、human parainfluenza virus-4a (HPIV-4a)、human parainfluenza virus-4b (HPIV-4b)、mumps virus (Mumps)、およびNewcastle disease virus (NDV) などが含まれる。ラブドウイルスとしては、ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)の水疱性口内炎ウイルス(Vesicular stomatitis virus)、狂犬病ウイルス(Rabies virus)等が含まれる。
【００２２】
本発明のウイルスは、好ましくはパラミクソウイルス亜科（レスピロウイルス属、ルブラウイルス属、およびモービリウイルス属を含む）に属するウイルスまたはその誘導体であり、より好ましくはレスピロウイルス属（genus Respirovirus）（パラミクソウイルス属（Paramyxovirus）とも言う）に属するウイルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウイルスによる遺伝子導入能を損なわないように、ウイルス遺伝子が改変されたウイルス、および化学修飾されたウイルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウイルス属ウイルスとしては、例えばヒトパラインフルエンザウイルス1型（HPIV-1）、ヒトパラインフルエンザウイルス3型（HPIV-3）、ウシパラインフルエンザウイルス3型（BPIV-3）、センダイウイルス(Sendai virus; マウスパラインフルエンザウイルス1型とも呼ばれる)、麻疹ウイルス、サルパラインフルエンザウイルス（SV5）、およびサルパラインフルエンザウイルス10型（SPIV-10）などが含まれる。本発明においてパラミクソウイルスは、最も好ましくはセンダイウイルスである。
【００２３】
マイナス鎖RNAウイルスは、一般に、エンベロープの内部にRNAとタンパク質からなる複合体（リボヌクレオプロテイン; RNP）を含んでいる。RNPに含まれるRNAはマイナス鎖RNAウイルスのゲノムである（−）鎖（ネガティブ鎖）の一本鎖RNAであり、この一本鎖RNAが、NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質と結合し、RNPを形成している。このRNPに含まれるRNAがウイルスゲノムの転写および複製のための鋳型となる（Lamb, R.A., and D. Kolakofsky, 1996, Paramyxoviridae: The viruses and their replication. pp.1177-1204. In Fields Virology, 3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe, and P. M. Howley et al. (ed.), Raven Press, New York, N. Y.）。
【００２４】
マイナス鎖RNAウイルスの「NP、P、M、F、HN、およびL遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン-ノイラミニダーゼ、およびラージタンパク質をコードする遺伝子のことを指す。ヌクレオキャプシド（NP）タンパク質は、ゲノムRNAに結合し、ゲノムRNAが鋳型活性を有するために不可欠なタンパク質である。一般に、NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもある。ホスホ（P）タンパク質は、RNAポリメラーゼの小サブユニットであるリン酸化タンパク質である。マトリックス（M）タンパク質は、ウイルス粒子構造を内側から維持する機能を果たす。フュージョン（F）タンパク質は、宿主細胞への侵入にかかわる膜融合タンパク質であり、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（HN）タンパク質は宿主細胞との結合にかかわるタンパク質である。ラージ（L）タンパク質は、RNAポリメラーゼの大サブユニットである。上記各遺伝子は個々の転写制御ユニットを有し、各遺伝子から単独のmRNAが転写され、タンパク質が転写される。P遺伝子からは、Pタンパク質以外に、異なるORFを利用して翻訳される非構造タンパク質（C）と、Pタンパク質mRNAを読み取り途中のRNA編集により作られるタンパク質（V）が翻訳される。例えばパラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に、3'から順に、次のように表記される。
レスピロウイルス属 N P/C/V M F HN - L
ルブラウイルス属 N P/V M F HN (SH) L
モービリウイルス属 N P/C/V M F H - L
【００２５】
例えばセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、N遺伝子については M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218、P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008、M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、F遺伝子については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131、L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。またその他のウイルスがコードするウイルス遺伝子を例示すれば、N遺伝子については、CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MeV, K01711; NDV, AF064091; PDPR, X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442; および Tupaia, AF079780、P遺伝子については、CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV-l, M74081; HPIV-3, X04721; HPIV-4a, M55975; HPIV-4b, M55976; Mumps, D86173; MeV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5, AF052755; および Tupaia, AF079780、C遺伝子については CDV, AF014953; DMV, Z47758; HPIV-1, M74081; HPIV-3, D00047; MeV, ABO16162; RPV, X68311; SeV, AB005796; および Tupaia, AF079780、M遺伝子については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV-1, S38067; HPIV-2, M62734; HPIV-3, D00130; HPIV-4a, D10241; HPIV-4b, D10242; Mumps, D86171; MeV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956; および SV5, M32248、F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN-1, M22347; HPIV-2, M60182; HPIV-3, X05303, HPIV-4a, D49821; HPIV-4b, D49822; Mumps, D86169; MeV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334; および SV5, AB021962、HN（HまたはG）遺伝子については CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV-1, U709498; HPIV-2. D000865; HPIV-3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MeV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, X74443; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433; および SV-5, S76876 、L遺伝子についてはCDV, AF014953; DMV, AJ608288; HPIV-1, AF117818; HPIV-2, X57559; HPIV-3, AB012132; Mumps, AB040874; MeV, K01711; NDV, AY049766; PDPR, AJ849636; PDV, Y09630; RPV,Z30698; およびSV-5, D13868が例示できる。但し、各ウイルスは複数の株が知られており、株の違いにより上記に例示した以外の配列からなる遺伝子も存在する。これらのいずれかの遺伝子に由来するウイルス遺伝子を持つセンダイウイルスベクターは、本発明のベクターとして有用である。また、P蛋白質に関してはその機能部位がC末端側のN結合部位、L結合部位、オリゴマー形成部位を含む領域であり（SeVの場合はP蛋白質のC末端側の320-568）（Blanchard L. et al., Virology. (2004) 319, 201-211.）、本発明のP蛋白質は少なくともこの領域を含むものが好ましい。例えば本発明のベクターは、上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列（SeVのP遺伝子に関しては例えばC末端側の配列でもよく、例えば479番目〜568番目のアミノ酸配列または320番目〜568番目のアミノ酸配列）と、90％以上、好ましくは95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上の同一性を持つ塩基配列を含む。また、本発明のベクターは、例えば上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列がコードするアミノ酸配列（SeVのP蛋白質に関しては例えばC末端側の配列でもよく、例えば479番目〜568番目のアミノ酸配列または320番目〜568番目のアミノ酸配列）と、90％以上、好ましくは95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上の同一性を持つアミノ酸��列をコードする塩基配列を含む。また、本発明のベクターは、例えば上記のいずれかのウイルス遺伝子のコード配列がコードするアミノ酸配列（SeVのP遺伝子に関しては例えばC末端側の配列でもよく、例えば479番目〜568番目のアミノ酸配列または320番目〜568番目のアミノ酸配列）において、10個以内、好ましくは9個以内、8個以内、7個以内、6個以内、5個以内、4個以内、3個以内、2個以内、または1個のアミノ酸が置換、挿入、欠失、および/または付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする塩基配列を含む。このようなベクターがコードするNP、P、および/またはL遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加するように改変されたベクターは、本発明のベクターとして好適である。
【００２６】
なお本明細書に記載した塩基配列およびアミノ酸配列などのデータベースアクセッション番号が参照された配列は、例えば本願の出願日および優先日における配列を参照するものであって、本願の出願日および優先日のいずれ時点における配列としても特定することができ、好ましくは本願の出願日における配列として特定される。各時点での配列はデータベースのリビジョンヒストリーを参照することにより特定することができる。
【００２７】
また本発明のマイナス鎖RNAウイルスは、天然株、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。例えばセンダイウイルスZ株が挙げられる（Medical Journal of Osaka University Vol.6, No.1, March 1955 p1-15）。つまり、当該ウイルスは天然から単離されたウイルスと同様の構造を持つウイルスベクターであっても、遺伝子組み換えにより人為的に改変したウイルスであってもよい。例えば、野生型ウイルスが持ついずれかの遺伝子に変異や欠損があるものであってよい。例えば、ウイルスのエンベロープ蛋白質または外殻蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子に変異または欠損を有するウイルスを好適に用いることができる。このようなウイルスベクターは、例えば感染細胞においてはゲノムを複製することはできるが、感染性ウイルス粒子を形成できないウイルスベクターである。このような伝播能欠損型のウイルスベクターは、周囲に感染を拡大する懸念がないので安全性が高い。例えば、Fおよび/またはHNなどのエンベロープ蛋白質またはスパイク蛋白質をコードする少なくとも１つの遺伝子、あるいはそれらの組み合わせが含まれていないマイナス鎖RNAウイルスを用いることができる（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。ゲノム複製に必要な蛋白質（例えば N、P、およびL蛋白質）をゲノムRNAにコードしていれば、感染細胞においてゲノムを増幅することができる。欠損型ウイルスを製造するには、例えば、欠損している遺伝子産物またはそれを相補できる蛋白質をウイルス産生細胞において外来的に供給する（WO00/70055 および WO00/70070; Li, H.-O. et al., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000)）。また、欠損するウイルス蛋白質を完全に相補することなく、非感染性のウイルス粒子（VLP）としてウイルスベクターを回収する方法も知られている（WO00/70070）。また、ウイルスベクターをRNP（例えば N、L、P蛋白質、およびゲノムRNAからなるRNP）として回収する場合は、エンベロープ蛋白質を相補することなくベクターを製造することができる。
【００２８】
また本発明のウイルスは、天然のウイルスに限定されず、例えば人工的に作製したウイルスも含まれる。例えば本発明のウイルスには、コドンを最適化するために核酸配列に変異を導入したものや、キメラウイルス（例えば同種ウイルス間のキメラ、および他種ウイルス間のキメラウイルス (例えばPIVとSeVのキメラなど) を含む）なども含まれる（J. Virol. 1995, 69, 849-855）。
【００２９】
また本発明においてN、L、P蛋白質などのウイルス蛋白質は、導入細胞において遺伝子を発現する機能を保持する限り野生型でなくてもよい。例えばタグなどのペプチドを適宜付加した改変蛋白質や、コドンを改変した蛋白質や、機能を失わないように野生型蛋白質のアミノ酸配列の一部を欠失させた蛋白質などを適宜用いることができる。本発明において、N、L、P蛋白質には、そのような改変蛋白質や欠失型蛋白質も包含される。例えば、P蛋白質はC末端の一部があれば、その他の領域はウイルスベクターの発現に必須ではない。
【００３０】
本発明においてマイナス鎖RNAウイルスベクターは、当該ウイルスに由来するゲノム核酸を有し、該核酸に導入遺伝子を組み込むことにより、該遺伝子を発現させることができるベクターである。本発明においてマイナス鎖RNAウイルスベクターには、感染ウイルス粒子の他、ウイルスコア、ウイルスゲノムとウイルス蛋白質との複合体、または非感染性ウイルス粒子などからなる複合体であって、細胞に導入することにより搭載する遺伝子を発現する能力を持つ複合体が含まれる。
【００３１】
本発明のベクターは、NP遺伝子、P遺伝子、またはL遺伝子が、マイクロRNA標的配列を付加するように改変され、それにより、NP遺伝子および/またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたベクターについては、該マイクロRNAを発現する細胞に導入した場合に、マイクロRNA標的配列を付加しない場合に比べ、該ベクターの発現が負に制御され、L遺伝子マイクロRNA標的配列が付加されたベクターについては、該マイクロRNAを発現する細胞に導入した場合に、マイクロRNA標的配列を付加しない場合に比べ、該ベクターの発現が正に制御されるベクターである。ここで、ベクターの発現とは、ベクターからの遺伝子の発現レベル（mRNAおよび/または蛋白質の発現レベル）、導入細胞内におけるベクターのゲノムのコピー数、または導入遺伝子の発現期間のいずれかまたはそれらの任意の組み合わせであってよく、好ましくは、少なくともベクターからの遺伝子の発現レベルが上記の通りに制御される。NP遺伝子および/またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたベクターは、好ましくはベクターが細胞から除去されるまでの期間も短縮する。
【００３２】
本発明においてウイルスベクターとは、例えば、当該ウイルスの（−）鎖一本鎖RNAゲノムに由来するRNA、および、当該ウイルスの（−）鎖一本鎖RNAと結合するウイルスタンパク質に由来し、当該RNAに結合する蛋白質の複合体であって、細胞に導入することで搭載遺伝子を発現するベクターである。本発明において（−）鎖一本鎖RNAと結合するタンパク質とは、該（−）鎖一本鎖RNAと直接および/または間接に結合し、該（−）鎖一本鎖RNAと複合体を形成するタンパク質のことを言う。本発明の複合体には、マイナス鎖RNAウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNAおよびそれに結合するマイナス鎖RNAウイルスに由来するタンパク質（例えばNP、P、およびLタンパク質）からなる複合体が含まれる。本発明において、「マイナス鎖RNAウイルスに由来する」とは、マイナス鎖RNAウイルスの構成物（タンパク質、RNAを含む）がそのままの状態で、または一部を改変された状態であることを意味する。例えば、マイナス鎖RNAウイルスのタンパク質またはRNAを改変して調製されたタンパク質またはRNAは、「マイナス鎖RNAウイルスに由来する」タンパク質またはRNAである。本発明のベクターは、上記特徴を有する限り、その種類は問わない。例えば、本発明のベクターは、エンベロープタンパク質（F、HN、および M タンパク質）等を有し、ウイルス粒子の構造をとるウイルスベクターであってもよい。また、ウイルスエンベロープを有さない、RNP自体であるRNPベクターであってもよい。
【００３３】
マイナス鎖RNAウイルスにおいてNP,P,Lタンパク質は、（−）鎖一本鎖RNAと結合し、ゲノムRNA複製およびタンパク質発現に不可欠な機能を果たす（以下において、場合により、NP,P,Lタンパク質を、「ゲノムRNA結合タンパク質」と称す）。NPタンパク質は、ゲノムRNAと非常に強固に結合し、ゲノムRNAに鋳型活性を付与するタンパク質である。ゲノムRNAは、NPタンパク質との結合状態においてのみRNA合成の鋳型活性を有し、NPタンパク質と結合しない状態では鋳型活性は全く有しない。Pタンパク質はRNAポリメラーゼの小サブユニットとして、Lタンパク質はRNAポリメラーゼの大サブユニットとして、ゲノムRNAに結合する。そのためマイナス鎖RNAウイルスでは、NP、P、Lタンパク質のうち一つでも欠ければ、ゲノムRNA複製は起こらない。
【００３４】
このような本発明のベクターの態様は、（ａ）NP遺伝子、P遺伝子、またはL遺伝子がマイクロRNA標的配列を付加するように改変された、マイナス鎖RNAウイルスに由来する（−）鎖一本鎖RNA、（ｂ）NPタンパク質、Pタンパク質、およびLタンパク質、からなる複合体を含むことを特徴とする。本発明のベクターは、改変された（−）鎖一本鎖RNA（ゲノムRNA）とNP、P、Lタンパク質からなる複合体（RNP）を含む、ウイルス粒子であってよい。本発明のベクターを宿主に感染させると、本発明のベクター中に含まれるNP、P、Lタンパク質の働きによって、ゲノムRNA中にコードされている遺伝子からタンパク質が発現する。NP遺伝子および/またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されたベクターは、該マイクロRNAを発現する細胞に導入した場合に、該ベクターの発現が負に制御され、細胞内のベクターゲノムの増幅が抑制され、細胞から消失しやすくなる。このようなベクターは、温度感受性変異と適宜組み合わせることで、より効果的にベクターの発現制御およびベクターの除去の制御を行うことが可能である。
【００３５】
本発明のベクターのゲノムRNAにコードされている遺伝子は、ウイルス由来の遺伝子配列そのままであってもよいが、何らかの変異が導入されていてもよい。例えば、当業者であれば、各タンパク質の機能を損なわないような軽微な変異を、公知方法によってゲノムRNA上の各遺伝子に導入することができる。例えば、PCR法やカセット変異法等により部位特異的に変異を導入したり、化学試薬やランダムヌクレオチド等によりランダム変異を導入したりすることが可能である。
【００３６】
例えば、エンベロープ蛋白質やスパイク蛋白質において弱毒化変異や温度感受性変異を含む多数の変異が知られている。これらの変異蛋白質遺伝子を有するウイルスを本発明において好適に用いることができる。本発明においては、望ましくは細胞傷害性を減弱したベクターを用い得る。ベクターの細胞傷害性は、例えばベクター感染細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出を定量することにより測定することができる。LDH放出量が少ないほど細胞傷害性は低い。例えば細胞傷害性が野生型に比べ有意に減弱化したベクターを用いることができる。細胞傷害性の減弱化の程度は、例えば、ヒト由来 HeLa細胞（ATCC CCL-2）またはサル由来 CV-1細胞（ATCC CCL 70）にMOI（感染価） 3で感染させて、35〜37℃（例えば37℃）で３日間培養した培養液中のLDH放出量が野生型に比べ有意に低下したもの、例えば20％以上、25％以上、30％以上、35％以上、40％以上、または50％以上低下したベクターを用いることができる。また細胞傷害性を低下させる変異には、温度感受性変異も含まれる。
【００３７】
また温度感受性は、ウイルス宿主の通常の温度（例えば37℃ないし38℃）におけるウイルスの増殖速度または搭載遺伝子の発現レベルを測定することにより決定することができる。変異を有さないものに比べ、ウイルスの増殖速度および/または搭載遺伝子の発現レベルが低下するほど、温度感受性は高いと判断される。
【００３８】
本発明において用いられるウイルスベクターは、好ましくは少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上のウイルス遺伝子に欠失または変異を有する。欠失と変異は、各遺伝子に対して任意に組み合わせ導入してよい。ここで変異とは、機能低下型の変異または温度感受性変異であってよく、少なくとも37℃において、野生型に比べウイルスの増殖速度または搭載するいずれかの遺伝子の発現レベルを好ましくは1/2以下、より好ましくは1/3以下、より好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下に低下させる変異である。このような改変ウイルスベクターを用いることは、特に宿主細胞における細胞傷害性を低減したり、ベクターの除去を促進したりできる点で有用であり得る。例えば本発明において好適に用いられるウイルスベクターは、少なくとも２つのウイルス遺伝子が、欠失または変異している。このようなウイルスには、少なくとも２つのウイルス遺伝子が欠失しているもの、少なくとも２つのウイルス遺伝子が変異しているもの、少なくとも１つのウイルス遺伝子が変異しており少なくとも１つのウイルス遺伝子が欠失しているものが含まれる。変異または欠失している少なくとも２つのウイルス遺伝子は、好ましくはエンベロープ構成蛋白質をコードする遺伝子である。例えば本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターは、少なくともF遺伝子またはM遺伝子を欠損していることが好ましい。例えば、F遺伝子を欠失し、Mおよび／またはHN遺伝子をさらに欠失するか、Mおよび／またはHN遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。また、本発明において用いられるベクターは、より好ましくは、少なくとも３つのウイルス遺伝子（好ましくはエンベロープ構成蛋白質をコードする少なくとも３つの遺伝子；F, HN, およびM）が、欠失または変異している。このようなウイルスベクターには、少なくとも３つの遺伝子が欠失しているもの、少なくとも３つの遺伝子が変異しているもの、少なくとも１つの遺伝子が変異しており少なくとも２つの遺伝子が欠失しているもの、少なくとも２つの遺伝子が変異しており少なくとも１つの遺伝子が欠失しているものが含まれる。より好ましい態様を挙げれば、例えばF遺伝子を欠失し、MおよびHN遺伝子をさらに欠失するか、MおよびHN遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。また例えばF遺伝子を欠失し、MあるいはHN遺伝子をさらに欠失し、残るMあるいはHN遺伝子に変異（例えば温度感受性変異）をさらに有するベクターは、本発明において好適に用いられる。このような変異型のウイルスは、公知の方法に準じて作製することが可能である。
【００３９】
例えば、M遺伝子の温度感受性変異としては、センダイウイルスM蛋白質における69位（G69）、116位（T116）、および183位（A183）からなる群より任意に選択される部位、あるいはマイナス鎖RNAウイルスM蛋白質の相当部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。M蛋白質に上記の３つの部位のいずれか、好ましくは任意の２部位の組み合わせ、さらに好ましくは３つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異M蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。
【００４０】
アミノ酸変異は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましく、例えばBLOSUM62マトリックス（Henikoff, S. and Henikoff, J. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919）の値が３以下、好ましくは２以下、より好ましくは１以下、より好ましくは０のアミノ酸に置換する。具体的には、センダイウイルスM蛋白質であれば、G69、T116、およびA183を、それぞれGlu (E)、Ala (A)、およびSer (S) へ置換することができる。他のマイナス鎖RNAウイルスM蛋白質についても、相当部位のアミノ酸をそれぞれGlu (E)、Ala (A)、およびSer (S) へ置換することができる。また、麻疹ウイルス温度感受性株 P253-505（Morikawa, Y. et al., Kitasato Arch. Exp. Med. 1991: 64; 15-30）のM蛋白質の変異と相同な変異を利用することも可能である。変異の導入は、例えばオリゴヌクレオチド等を用いて、公知の変異導入方法に従って実施すればよい。
【００４１】
また、HN遺伝子の温度感受性変異としては、例えばセンダイウイルスのHN蛋白質の262位（A262）、264位（G264）、および461位（K461）からなる群より任意に選択される部位、あるいはマイナス鎖RNAウイルスHN蛋白質の相当部位のアミノ酸置換が挙げられる（Inoue, M. et al., J.Virol. 2003, 77: 3238-3246）。３つの部位のいずれか１つ、好ましくは任意の２部位の組み合わせ、さらに好ましくは３つの部位全てのアミノ酸が他のアミノ酸に置換された変異HN蛋白質をコードするゲノムを有するウイルスは、本発明において好適に用いられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。好ましい一例を挙げれば、センダイウイルス HN蛋白質のA262、G264、およびK461を、それぞれThr (T)、Arg (R)、およびGly (G) へ置換する。他のマイナス鎖RNAウイルスM蛋白質についても、相当部位のアミノ酸をそれぞれThr (T)、Arg (R)、およびGly (G) へ置換することができる。また、例えば、ムンプスウイルスの温度感受性ワクチン株 Urabe AM9を参考に、HN蛋白質の464及び468番目のアミノ酸に変異導入することもできる（Wright, K. E. et al., Virus Res. 2000: 67; 49-57）。
【００４２】
また本発明のベクターは、P遺伝子および／またはL遺伝子に変異を有していてもよい。このような変異としては、具体的には、SeV P蛋白質の86番目のGlu（E86）の変異、SeV P蛋白質の511番目のLeu（L511）の他のアミノ酸への置換が挙げられる。他のマイナス鎖RNAウイルスP蛋白質についても相当部位の置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、86番目のアミノ酸のLysへの置換、511番目のアミノ酸のPheへの置換などが例示できる。またL蛋白質においては、SeV L蛋白質の1197番目のAsn（N1197）および／または1795番目のLys（K1795）の他のアミノ酸への置換、および他のマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相当部位の置換が挙げられ、上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、1197番目のアミノ酸のSerへの置換、1795番目のアミノ酸のGluへの置換などが例示できる。P遺伝子およびL遺伝子の変異は、持続感染性、２次粒子放出の抑制、または細胞傷害性の抑制の効果を顕著に高めることができる。さらに、エンベロープ蛋白質遺伝子の変異および／または欠損を組み合わせることで、これらの効果を劇的に上昇させることができる。またL遺伝子は、SeV L蛋白質の1214番目のTyr（Y1214）および／または1602番目のMet（M1602）の他のアミノ酸への置換、および他のマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相当部位の置換が挙げられ、上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、1214番目のアミノ酸のPheへの置換、1602番目のアミノ酸のLeuへの置換などが例示できる。以上に例示した変異は、任意に組み合わせることができる。
【００４３】
例えば、SeV M蛋白質の少なくとも69位のG、116位のT、及び183位のA、SeV HN蛋白質の少なくとも262位のA，264位のG，及び461位のK、SeV P蛋白質の少なくとも511位のL、SeV L蛋白質の少なくとも1197位のN及び1795位のKが、それぞれ他のアミノ酸に置換されており、かつF遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクター、ならびに、細胞傷害性がこれらと同様またはそれ以下、および/または温度感受性がこれらと同様またはそれ以上のF遺伝子欠損または欠失センダイウイルスベクターは特に好適である。他のマイナス鎖RNAウイルスについても、相当部位を同様に置換し、F遺伝子を欠損または欠失するベクター、ならびに、細胞傷害性がこれらと同様またはそれ以下、および/または温度感受性がこれらと同様またはそれ以上のF遺伝子欠損または欠失ベクターが好ましい。具体的な置換例を例示すれば、例えばM蛋白質についてはG69E，T116A，及びA183Sの置換を、HN蛋白質についてはA262T，G264R，及びK461Gの置換を、P蛋白質についてはL511Fの置換を、そしてL蛋白質についてはN1197S及びK1795Eの置換を挙げることができる。
【００４４】
アミノ酸変異は、所望の他のアミノ酸への置換であってよいが、好ましくは、上記と同様に側鎖の化学的性質の異なるアミノ酸への置換である。例えばアミノ酸は、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)などのグループに分類することができるが、あるアミノ酸について、そのアミノ酸が属するグループのアミノ酸以外のアミノ酸に置換することなどが挙げられる。具体的には、塩基性アミノ酸であれは、酸性または中性アミノ酸への置換、極性アミノ酸であれは非極性アミノ酸への置換、20種の天然のアミノ酸の平均分子量より大きい分子量を持つアミノ酸であれば、その平均分子量より小さいアミノ酸への置換、逆にその平均分子量より小さいアミノ酸であれば、それより大きいアミノ酸への置換などが挙げられるが、それに限定されない。
【００４５】
また、L蛋白質の変異としては、SeV L蛋白質の942位（Y942）、1361位（L1361）、および1558位（L1558）から任意に選択される部位、あるいはマイナス鎖RNAウイルスL蛋白質の相当部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換も挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、942番目のアミノ酸のHisへの置換、1361番目のアミノ酸のCysへの置換、1558番目のアミノ酸のIleへの置換などが例示できる。特に少なくとも942位または1558位が置換されたL蛋白質を好適に用いることができる。例えば1558位に加え、1361位も他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質も好適である。また、942位に加え、1558位および/または1361位も他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質も好適である。これらの変異により、L蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。
またP蛋白質の変異としては、SeV P蛋白質の433位（D433）、434位（R434）、および437位（K437）から任意に選択される部位、あるいはマイナス鎖RNAウイルスP蛋白質の相当部位のアミノ酸の他のアミノ酸への置換が挙げられる。上記と同様に、アミノ酸の置換は、側鎖の化学的性質の異なる他のアミノ酸への置換が好ましい。具体的には、433番目のアミノ酸のAla (A) への置換、434番目のアミノ酸のAla (A) への置換、437番目のアミノ酸のAla (A) への置換などが例示できる。特にこれら３つの部位全てが置換されたP蛋白質を好適に用いることができる。これらの変異により、P蛋白質の温度感受性を上昇させることができる。
【００４６】
本発明のベクターに含まれ得る温度感受性変異はWO2012/029770、WO2010/008054、WO2003/025570に詳述されている。好ましくは、P蛋白質については少なくとも433位のD、434位のR、および437位のKの3箇所が、他のアミノ酸に置換された変異P蛋白質である。加えて、L蛋白質については少なくとも1558位のLが置換された変異L蛋白質（好ましくは少なくとも1361位のLも他のアミノ酸に置換された変異L蛋白質）をコードする、F遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクター、ならびに、細胞傷害性がこれと同様またはそれ以下、および/または温度感受性がこれと同様またはそれ以上のF遺伝子を欠損または欠失するセンダイウイルスベクターも、本発明において好適に用いられる。各ウイルス蛋白質は、上記の変異以外に他のアミノ酸（例えば10以内、5以内、4以内、3以内、2以内、または1アミノ酸）に変異を有していてもよい。上記に示した変異を有するベクターは高い温度感受性を示す。
【００４７】
本発明のベクターに含まれるゲノムRNAは、エンベロープタンパク質遺伝子を全てコードしていてもよく、一部または全部のエンベロープタンパク質遺伝子をコードしていなくてもよい。ゲノムRNAにコードされるエンベロープタンパク質遺伝子（M遺伝子、F遺伝子、HN遺伝子）は野生型であってもよいが、温度感受性変異が導入されていてもよい。エンベロープタンパク質の温度感受性変異は、WO2012/029770、WO2010/008054、WO2003/025570に詳述されている。
【００４８】
ウイルスベクターを製造する際に、所望の外来性エンベロープ蛋白質をウイルス産生細胞で発現させることにより、これを含むウイルスベクターを製造することができる。このような蛋白質に特に制限はなく、哺乳動物細胞への感染能を付与する所望の接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質が用いられる。具体的には、例えば水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus; VSV）のG蛋白質（VSV-G）を挙げることができる。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよく、例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981)）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。本発明のウイルスベクターは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。
【００４９】
本発明において温度感受性とは、低温 (例えば30〜36℃) に比べ、通常の細胞培養温度（例えば37〜38℃）において有意に活性が低下することである。より好ましくは、35℃に比べ、37℃において有意に活性が低下することをいう。例えば発現ベクターの場合、温度感受性ベクターとは、低温 (例えば30〜36℃) 下での発現量に比べ、通常の細胞培養温度（例えば37〜38℃）での発現量が有意に低いことを言う。例えば温度感受性ベクターの増殖速度または遺伝子発現レベルは、35℃に比べ37℃においては、例えば2/3以下、好ましくは1/2以下、より好ましくは1/3以下、より好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下である。また温度感受性ベクターは、野生型蛋白質を持つベクターと比較して、37℃における増殖速度または遺伝子発現レベルが、例えば1/2以下、より好ましくは1/3以下、より好ましくは1/5以下、より好ましくは1/10以下、より好ましくは1/20以下である。例えばWO2012/029770、WO2010/008054に詳述のセンダイウイルスのTS 7（L蛋白質のY942H/L1361C/L1558I変異）、TS 12（P蛋白質のD433A/R434A/K437A変異）、TS 13（P蛋白質のD433A/R434A/K437A変異および L蛋白質のL1558I変異）、TS 14（P蛋白質のD433A/R434A/K437A変異および L蛋白質のL1361C）、TS 15（P蛋白質のD433A/R434A/K437A変異および L蛋白質のL1361C/L1558I）などの変異は、好ましい温度感受性変異である。
【００５０】
具体的なベクターを例示すれば、例えばM蛋白質にG69E, T116A, 及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T, G264R, 及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持つF遺伝子欠失型センダイウイルスベクター（例えばZ strain）であってよく、このベクターにさらにTS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15の変異を導入したベクターはより好ましい。具体的には、SeV18+/TSΔF（WO2010/008054、WO2003/025570）やSeV(PM)/TSΔF、および、これらにさらにTS 7、TS 12、TS 13、TS 14、またはTS 15の変異を導入したベクターにおいて、NP遺伝子、P遺伝子、またはL遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加するように改変したベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
なお「TSΔF」は、M蛋白質にG69E,T116A,及びA183Sの変異を、HN蛋白質にA262T,G264R,及びK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL蛋白質にN1197S及びK1795E変異を持ち、F遺伝子を欠失することを言う。
【００５１】
好ましくは、本発明のベクターはセンダイウイルスZ株に由来するセンダイウイルスベクターである。Z株のゲノム配列は知られており、例えばZ株由来のF遺伝子欠損型センダイウイルスベクターのゲノム配列としてはACCESSION：AB855655が挙げられる。ここでZ株に由来するとは、ベクターのゲノム中にあるセンダイウイルスゲノムの配列のうち、Z株の配列が最も高い割合を占めることを言う。すなわち、ベクターのゲノム配列のうち、非センダイウイルス性の配列（制限酵素認識部位や単なるスペーサー配列、他の種のウイルス由来の配列、導入する遺伝子の配列等）を除外し、センダイウイルスの配列だけを集めた場合に、その中でSeV Z株の配列が最も高い割合を占めることを言う。より好ましくは、Z株に由来するとは、ベクターのゲノム中にあるマイナス鎖RNAウイルス由来の配列のうち、SeV Z株の配列が最も高い割合を占めることを言う。すなわち、ベクターのゲノム配列のうち、マイナス鎖RNAウイルスからとった配列ではない配列（制限酵素認識部位や単なるスペーサー配列、マイナス鎖RNAウイルス以外のウイルス由来の配列、導入する遺伝子の配列等）を除外し、マイナス鎖RNAウイルスの配列だけを集めた場合に、その中でSeV Z株の配列が最も高い割合を占めることを言う。その割合は、好ましくは30％以上、より好ましくは40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、または99％以上である。また好ましくは、Z株に由来するセンダイウイルスベクターは、Z株ではないセンダイウイルスのゲノム配列（Z株と同じ配列を除く）を、連続して例えば1000塩基以下、500塩基以下、300塩基以下、200塩基以下、100塩基以下、50塩基以下、30塩基以下、または20塩基以下しかゲノム中に含まない。より好ましくは、Z株に由来するセンダイウイルスベクターは、Z株ではないセンダイウイルスのゲノム配列（Z株と同じ配列を除く）をゲノム中に含まない。
【００５２】
また本発明のベクターは、センダイウイルスCl.151株（Yoshida, et al. (1979) Virology, 92, 139-154）由来ではないことが好ましく、また、Cl.151株とのキメラベクターでもないことが好ましい。Cl.151株の全長遺伝子ｃDNAは既に知られている（Accession AB275416）。また本発明のベクターは、センダイウイルスNagoya株由来ではないことが好ましく、また、Nagoya株とのキメラベクターでもないことが好ましい。
【００５３】
本発明のベクターは、NP遺伝子、P遺伝子、および/またはL遺伝子が、マイクロRNAの標的配列を付加するように改変されている。ここで遺伝子にマイクロRNAの標的配列を付加するように改変するとは、該遺伝子の転写領域中に、マイクロRNAの標的配列が含まれるように改変することを言う。このような改変は、例えば、該遺伝子の転写領域中に、マイクロRNAの標的配列を挿入することによって実施できる。
【００５４】
本発明においては、付加するマイクロRNA標的配列は特に制限はなく、所望のマイクロRNAに対する標的配列を付加することができる。そのようなマイクロRNA標的配列としては、例えば特定の分化状態または未分化状態の細胞（多能性幹細胞など）で特異的に発現するマイクロRNAや、癌や所望の疾患で特異的に発現するマイクロRNAに対する標的配列が挙げられる。具体的には、例えばlet7、miR-7、miR-21、miR-106a/b、miR-122、miR-124、miR-125、miR-126、miR-138、miR-130a/b、miR-132、miR-143、miR-145、miR-155、miR-182、miR-199a、miR-217、miR-218、miR-301、miR-302 cluster、miR-367、miR-372、miR-375、および、miR-721の各標的配列が挙げられるが、それらに限定されない。ここで、miR-302 clusterには、miR302a, miR302b, miR302c, およびmiR302dが含まれる。これらのマイクロRNAに対する標的配列は、既によく知られている（Mol Cell Biol. 2008, 28, 6426-6438.）。実施例に示した通り、本発明の効果は、調べたすべてのマイクロRNAの標的配列において発揮されることが確認されており、所望のマイクロRNAの標的配列を用いてベクター発現の制御を行うことが可能である。例えばmiR-302a以外のマイクロRNAの標的配列も好適に使用できる。
【００５５】
例えば、miR-126は血管内皮細胞で発現する（PNAS. 2008, 105, 1516-1521.）。従って、miR-126の標的配列を用いることによって、血管内皮細胞特異的に発現を制御できるベクターを構築することができる。またmiR-124、miR-138、miR-218は神経細胞で発現しており（Nature Cell Biol. 2009, 11, 705-716.）、miRの発現は細胞の分化程度によって異なる（Mol Cell Biol. 2009, 29, 5290-5305）。従って、miR-124、miR-138、miR-218の標的配列を用いることによって、神経細胞特異的に細胞の分化段階に応じて発現を制御できるベクターを構築することができる。またmiR-122は肝細胞で発現している（Science 2005, 309, 1577-1581.）。従って、miR-122の標的配列を用いることによって、肝細胞特異的に発現を制御できるベクターを構築することができる。またES/iPS細胞ではmiR-302 cluster以外にもmiR-367など様々なマイクロRNAが発現している（PLoS One. 2013, 8, e73532.）。従って、miR-302 cluster以外にもmiR-367などに対する標的配列を用いることによって、ES/iPS細胞胞特異的に発現を制御できるベクターを構築することができる。またmiR-143は正常細胞で発現しており、癌細胞で発現が低下している（Oncol Rep. 2006, 16, 845-850）。従ってmiR-143の標的配列を用いることによって、癌細胞選択的に発現するベクターを構築することができる。
【００５６】
マイクロRNA標的配列とは、マイクロRNAが標的として結合する配列を言う。本発明においてマイクロRNA標的配列は、マイクロRNAの結合により発現が抑制される限り、天然のマイクロRNA標的配列やその変異体を用いることができる。またマイクロRNA標的配列は、マイクロRNAに完全に相補的な配列であってもなくてもよく、例えばマイクロRNAに対して、少なくとも10塩基、例えば11塩基以上、12塩基以上、13塩基以上、14塩基以上、15塩基以上、16塩基以上、17塩基以上、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、21塩基以上、22塩基以上の相補的な塩基を連続または非連続に含む。好ましくは、該相補的な塩基は連続しているか、あるいは数個、例えば5塩基以下、4塩基以下、3塩基以下、2塩基以下、または1塩基の対合しない塩基を有していてもよい。対合しない塩基は、マイクロRNA標的配列側および/またはマイクロRNA側に含まれていてよい。
【００５７】
マイクロRNA標的配列は、好ましくは、マイクロRNAと生理的条件下でハイブリダイズする配列である。生理的条件下とは、例えば150 mM NaCl、15 mM sodium citrate、pH 7.0、37℃ である。より好ましくは、マイクロRNA標的配列は、マイクロRNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列である。ストリンジェントな条件とは、例えば1×SSC（1×SSCは150 mM NaCl、15 mM sodium citrate、pH 7.0）または0.5×SSC、42℃の条件であり、より好ましくは1×SSCまたは0.5×SSC、45℃の条件であり、より好ましくは1×SSCまたは0.5×SSC、50℃の条件である。ハイブリダイゼーションにおいては、例えばマイクロRNA配列を含むRNAまたはマイクロRNA標的配列を含むRNAのどちらかを標識し、必要に応じて他方を膜等に固定して両者をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば 5xSSC、7%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、及び0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、例えば37℃、または45℃、または50℃で行えばよい。十分な時間（例えば3、4、5または6時間以上）インキュベートした後、上記の条件で洗浄を行い、標識した核酸がハイブリダイズしているかを検出することにより、当該条件で核酸がハイブリダイズするか否かを決定することができる。
【００５８】
あるいはマイクロRNA標的配列は、好ましくは、マイクロRNA配列の相補配列と高いホモロジーを示す。高いホモロジーとは、例えば70%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、93%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上の同一性を有する塩基配列である。塩基配列の同一性は、例えばBLASTプログラム（Altschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990）を用いて決定することができる。例えばNCBI（National Center for Biothchnology Information）のBLASTのウェブページにおいて、デフォルトのパラメータを用いて検索を行うことができる（Altschul S.F. et al., Nature Genet. 3:266-272, 1993; Madden, T.L. et al., Meth. Enzymol. 266:131-141, 1996; Altschul S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Zhang J. & Madden T.L., Genome Res. 7:649-656, 1997）。例えば２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana A et al., FEMS Microbiol Lett. 174:247-250, 1999）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。マイクロRNA配列の相補配列の塩基配列の外側のギャップは無視し、内側のギャップは例えばミスマッチと同様に扱い、アライメントにおけるマイクロRNA配列の相補配列の塩基配列全体（配列の内側に入れたギャップを加算したトータルの塩基の長さ）に対する同一性の値を計算する。
【００５９】
あるいはマイクロRNA標的配列は、好ましくは、マイクロRNA配列の相補配列に対して、1または数個の塩基を挿入、置換、および/または欠失させた配列からなる。好ましくは、マイクロRNA標的配列は、マイクロRNA配列の相補配列に対して8塩基以内、7塩基以内、6塩基以内、5塩基以内、4塩基以内、3塩基以内、2塩基以内、または1塩基の挿入、置換、および/または欠失を有する配列を含む。
【００６０】
一般に、マイクロRNA標的配列に変異を導入するほどマイクロRNAとの結合が抑制され、発現抑制効果は低下する（図13、14）。変異を適宜導入することによって抑制効果を調節することが可能である。
【００６１】
NP、P、またはL遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加する場合、付加する位置に特に制限はなく、各遺伝子の翻訳領域または非翻訳領域に付加することができる。翻訳領域に付加する場合、位置に制限はなく、N末端部位からC末端部位までのいずれかの位置に付加してよいが、例えばC末端に続けて付加することが好ましい。非翻訳領域としては、5'非翻訳領域でも3'非翻訳領域でもよいが、3'非翻訳領域が好ましい。非翻訳領域に付加する場合、その位置は任意に選択してよいが、例えばNP遺伝子および/またはP遺伝子の3'非翻訳領域にマイクロRNA標的配列を付加する場合は、付加する遺伝子の翻訳領域とE（End）配列の間であればどの位置でもよい。5'非翻訳領域に付加する場合は、例えば付加する遺伝子のS（Start）配列と翻訳開始部位との間の所望の位置に付加することができる。
【００６２】
また、L遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加する場合は、翻訳領域からなるべく離れた位置に付加する、すなわち、E配列の手前かつゲノムのトレイラー配列の近くにマイクロRNA標的配列を付加することで、ベクターの発現をより上昇させることができる。例えば翻訳領域から1塩基以上、好ましくは10塩基以上、20塩基以上、30塩基以上、40塩基以上、50塩基以上、または56塩基以上離れた位置にマイクロRNA標的配列を付加する。
【００６３】
マイクロRNA標的配列は、１コピーまたは複数コピー付加することができる。また、1種類のマイクロRNA標的配列だけでなく、複数種のマイクロRNA標的配列を付加してもよい。一例としては、例えば1種または複数種のマイクロRNA標的配列をタンデムに2個以上、例えば3個以上、4個以上、5個以上並べた配列を付加することができる。
【００６４】
P遺伝子を改変する場合、P蛋白質のコード領域中の核酸にコードされるC蛋白質の発現が阻害される場合は、ベクターからC蛋白質を別途、発現させればよい。
【００６５】
なお、P蛋白質は全長でなくても、適宜断片を用いることができる。P蛋白質として必須なのはC末端の一部だけであって、その他の領域はウイルスベクターの発現に必須ではない。P蛋白質は、具体的には、L蛋白質の結合部位とN蛋白質：RNAへの結合部位とを保持する断片であってもよい。L蛋白質の結合部位としては、例えばSeV P蛋白質の411番目〜445番目のアミノ酸配列が挙げられ、N蛋白質：RNA結合部位としては、例えばSeV P蛋白質（例えばaccession番号AAB06197.1, P04859.1, P14252.1, AAB06291.1, AAX07439.1, BAM62828.1, BAM62834.1, P04860.1, BAM62840.1, BAD74220.1, P14251.1, BAM62844.1, BAM62842.1, BAM62842.1, BAF73480.1, BAD74226.1, BAF73486.1, Q9DUE2.1, BAC79134.1, NP_056873.1, ABB00297.1等）の479番目〜568番目のアミノ酸配列が挙げられる。より具体的には、例えばSeV P蛋白質の320番目〜568番目のアミノ酸配列を含む断片は、本発明において機能的なP蛋白質として好適に用いることができる。欠失型のP蛋白質を用いることで、ベクターのサイズを小型化できると共に、宿主の免疫反応の影響も受けにくくなることが期待できる。
【００６６】
C蛋白質のコード領域を欠失するP蛋白質を用いる場合は、上述の通り、適宜C蛋白質を別途発現させてもよい。ここでC蛋白質には、C'、C、Y1、およびY2蛋白質が含まれる（Irie T. et al.,PLoS One. （2010）5:e10719.）。C蛋白質を発現させるには、C蛋白質のコード配列を適宜ベクター中に挿入すればよい。挿入位置に特に制限はないが、P蛋白質の直前（ゲノムにおけるP蛋白質のコード配列の3'側）あるいはP蛋白質の直後（ゲノムにおけるP蛋白質のコード配列の5'側）に挿入することができる。挿入にあたっては、適宜E-I-S配列を付加してよい。
【００６７】
NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した場合、ベクターを導入した細胞においてこのマイクロRNAが発現すると、それに合わせてベクターの発現は低下し、ベクターの除去が促進される。例えば、ベクターの導入時には発現していないが、ある分化状態（または未分化状態）になった時に特異的に発現するマイクロRNAの標的配列をベクターに付加しておくことにより、当該ベクターが、目的が達成された時に自動的に発現が抑制され、除去される。また、温度感受性ベクターに本発明を適用することで、より迅速なベクターの除去が可能となる。例えば本発明のベクターは、P遺伝子に温度感受性P蛋白質をコードすることが好ましい。具体的にはP蛋白質にL511F変異を含むもの、あるいは、D433A/R434A/K437A変異を有するものなどが好ましい（WO2012/029770、WO2010/008054）。L511F変異およびD433A/R434A/K437A変異を全て含んでいてもよく、他の変異をP蛋白質または他のウイルス蛋白質にさらに含んでいてもよい。例えば、温度感受性変異としてL1361C/L1558I変異を有するL蛋白質をコードするL遺伝子を好適に使用することができる。
【００６８】
除去を開始してから除去されるまでの培養期間は適宜決定してよいが、本発明のベクターを用いれば、例えば4週間以内、3週間以内、2週間以内、または1週間以内、例えば20日以内、15日以内、10日以内、5日以内、または3日以内にベクターが除去される。当該培養期間は、例えば 3日〜3週間であり、または5日〜20日、5日〜2週間である。ウイルスの除去は、レポーター遺伝子の検出や、抗体やPCRを用いたウイルスの検出により、そのレベルがウイルス非導入細胞と同等のレベル（またはウイルス導入後の最大値に比べ1/100以下、好ましくは1/500以下、1/1000以下、または1/5000以下）にまで低下したことにより確認できる。
【００６９】
温度感受性のベクター（温度感受性変異を含む蛋白質をコードするベクター）を用いた場合、ベクターの除去促進は、例えば35℃〜39℃で行うことができる。好ましくは36℃〜38.5℃、より好ましくは約37℃で行う。
【００７０】
なお、NP遺伝子および/またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加したベクターにおいては、L遺伝子にはマイクロRNA標的配列を付加しないことが好ましい。すなわち本発明は、改変センダイウイルスベクターであって、該ウイルスのNP遺伝子および/またはP遺伝子が、マイクロRNAの標的配列を付加するように改変され、該ウイルスのL遺伝子にはいかなるマイクロRNAの標的配列も付加されておらず、NP遺伝子および/またはP遺伝子に付加されたマイクロRNAを発現する細胞において、該ベクターの発現が負に制御されるベクターを提供する。当該ベクターは、好ましくはF遺伝子を欠損しているベクターである。当該ベクターは、Z株由来のベクターが好ましい。
【００７１】
また本発明のベクターは、Z株のF、M、およびHN遺伝子以外の機能的F、M、およびHN遺伝子を有しないものが好ましい。すなわち、当該ベクターがF遺伝子を欠損しておらず、機能的F遺伝子を持つ場合は、当該F遺伝子はZ株のF遺伝子であることが好ましく、当該ベクターがM遺伝子を欠損しておらず、機能的M遺伝子を持つ場合は、当該M遺伝子はZ株のF遺伝子であることが好ましく、当該ベクターがHN遺伝子を欠損しておらず、機能的HN遺伝子を持つ場合は、当該HN遺伝子はZ株のHN遺伝子であることが好ましい。また本発明のベクターは、ゲノムのリーダー配列および/またはトレイラー配列もZ株の配列であることが好ましい。
【００７２】
L遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した場合、ベクターを導入した細胞においてこのマイクロRNAが発現すると、それに合わせてベクターの発現は上昇し、ベクターのゲノム複製も亢進する。このようなベクターは、特定のマイクロRNAを発現する細胞で特異的にベクターを発現および/または拡大させるのに有用である。例えば、腫瘍で特異的に発現するマイクロRNAに対する標的配列をL遺伝子に付加したベクターは、腫瘍細胞で特異的に発現が亢進する。従って、このようなベクターに細胞傷害性の導入遺伝子を搭載させたり、あるいはベクター自身に細胞傷害効果を持たせたりすることで、腫瘍を特異的に破壊することが期待できる。
【００７３】
例えば、M遺伝子を欠失するセンダイウイルスは、導入細胞の周囲の細胞に浸潤し、細胞を溶解させることが知られている（WO00/09700）。実際、このようなベクターを腫瘍に注入することで、腫瘍細胞が溶解し、腫瘍サイズが縮小することが確認されている（WO2003/093476）。このようなベクターに本発明を適用し、腫瘍細胞内におけるベクターの発現を特異的に高めることで、周囲の非癌組織に対する傷害を防ぎつつ、腫瘍特異的に細胞を攻撃することが可能である。すなわち、M遺伝子を欠失し、L遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加するように改変され、細胞の有するマイクロRNAによって該ベクターの発現が正に制御されるベクターは、当該マイクロRNAを発現する細胞を特異的に溶解させるために有用である。
【００７４】
このようなベクターは、F遺伝子およびHN遺伝子を有しており、それにより、周囲の細胞に浸潤することができる。すなわち本発明は、M遺伝子を欠損し、L遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加するように改変されたマイナス鎖RNAウイルスベクターであって、F遺伝子およびHN遺伝子を保持するベクターに関する。このようなベクターは、感染性ウイルス粒子を形成する能力を持たないが、ベクターが導入された細胞に隣接する細胞に浸潤する能力（接触浸潤力）を有している。F蛋白質は、標的細胞で特異的に発現するプロテアーゼにより活性化されるように、適宜、F蛋白質の開裂部位が他のプロテアーゼの基質となる配列に置換されていてもよい（WO2003/093476）。
【００７５】
また、正常細胞で発現し、癌細胞では発現しないか発現が低下するマイクロRNAの標的配列をパラミクソウイルスベクターに付加すれば、癌細胞で特異的に発現し、正常細胞では発現が抑制またはベクターが消失するパラミクソウイルスベクターを作出することができる。例えば、正常細胞で発現し、癌細胞では発現しないか発現が低下するマイクロRNAの標的配列が、NP遺伝子またはP遺伝子に付加された本発明のベクターは、癌標的化ベクターとして有用である。本発明は、正常細胞で発現し、癌細胞では発現しないか発現が低下するマイクロRNAの標的配列が、NP遺伝子またはP遺伝子に付加された本発明のベクターの、癌標的化のための使用を提供する。また本発明は、正常細胞で発現し、癌細胞では発現しないか発現が低下するマイクロRNAの標的配列が、NP遺伝子またはP遺伝子に付加された本発明のベクターを用いることを特徴とする、癌の標的化方法を提供する。例えば、当該ベクターに自殺遺伝子や細胞傷害性を示す遺伝子を搭載させれば、癌細胞を死滅させることができる。自殺遺伝子としては特に制限はないが、例えばヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子（HSV-tk）を用いることができ、この場合、ガンシクロビル（GCV）を投与することにより、HSV-tkを発現する細胞を死滅させることができる。本発明は、正常細胞で発現し、癌細胞では発現しないか発現が低下するマイクロRNAの標的配列が、NP遺伝子またはP遺伝子に付加された本発明のベクターであって、自殺遺伝子および/または細胞傷害性を示す遺伝子を搭載するベクターの、癌治療のための使用を提供する。また本発明は、正常細胞で発現し、癌細胞では発現しないか発現が低下するマイクロRNAの標的配列が、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加された本発明のベクターであって、自殺遺伝子および/または細胞傷害性を示す遺伝子を搭載するベクターを用いることを特徴とする、癌の治療方法を提供する。
【００７６】
例えば本発明のベクターに搭載される自殺遺伝子としては、細胞死の誘導や細胞毒性を示す所望の薬剤のプロドラッグの変換酵素遺伝子が含まれる。プロドラッグと自殺遺伝子の組み合わせの例としては、具体的には、
・5-フルオロシトシンとシトシンデアミナーゼ
・シクロホスファミドとチトクロームP450
・フルダラビンと大腸菌PNP（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）
・CB1954とニトロレダクターゼ
・カペシタビンとカルボキシエステラーゼ
などが挙げられる。また自殺遺伝子としては、非活性型から活性型へ変換することにより細胞死の誘導や細胞毒性を示す所望の蛋白質をコードする遺伝子が挙げられ、例えば細胞死を誘導するカスパーゼをコードする遺伝子を好適に利用することができる。具体的には、所望の二量体化剤とその結合ドメインを付加したカスパーゼの組み合わせを利用することができ、二量体化剤とカスパーゼの組み合わせの一例としては、
・AP20187とiCaspase-9
を挙げることができる。
【００７７】
また、上述のM遺伝子を欠損するベクターは、粒子形成能を持たないが、F遺伝子の働きにより周囲の細胞を融合させる能力を持つ。正常細胞で発現し、癌細胞では発現しないか発現が低下するマイクロRNAの標的配列をこのベクターに付加することによって、癌細胞を融合させながら感染を拡大させ、正常細胞には感染が広がらないパラミクソウイルスベクターを取得することができる。すなわち本発明は、正常細胞で発現し、癌細胞では発現しないか発現が低下するマイクロRNAの標的配列が、NP遺伝子またはP遺伝子に付加された本発明のベクターであって、M遺伝子を欠損するベクターの、癌標的化のための使用を提供する。また本発明は、正常細胞で発現し、癌細胞では発現しないか発現が低下するマイクロRNAの標的配列が、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加された本発明のベクターを用いることを特徴とする、癌の標的化方法を提供する。また本発明は、正常細胞で発現し、癌細胞では発現しないか発現が低下するマイクロRNAの標的配列が、NP遺伝子またはP遺伝子に付加された本発明のベクターであって、M遺伝子を欠損するベクターの、癌治療のための使用を提供する。また本発明は、正常細胞で発現し、癌細胞では発現しないか発現が低下するマイクロRNAの標的配列が、NP遺伝子またはP遺伝子に付加された本発明のベクターであって、M遺伝子を欠損するベクターを用いることを特徴とする、癌の治療方法を提供する。
【００７８】
一般にパラミクソウイルスのFタンパク質は、前駆タンパク質（F0）として発現し、プロテアーゼによりF1とF2に開裂することにより融合能を発揮する。このプロテアーゼ開裂部位を、癌細胞で特異的に発現するプロテアーゼで開裂されるアミノ酸配列に改変することにより、癌細胞で特異的に細胞融合活性を発揮させることができる（WO03/093476）。Fタンパク質の開裂部位をこのように改変したM遺伝子欠損型パラミクソウイルスベクターに本発明を適用することにより、正常細胞では速やかにベクターが消失するパラミクソウイルスベクターを提供することができる。すなわち上述のM遺伝子を欠損するベクターとしては、Fタンパク質の開裂部位が癌細胞で特異的に発現するプロテアーゼで開裂されるアミノ酸配列に改変されたF遺伝子を搭載するベクターを好適に用いることができる（実施例17参照）。また当該ベクターには、上述の通り、自殺遺伝子および/または細胞傷害性を示す遺伝子を搭載させることで、抗癌効果をより高めることが可能である。
【００７９】
また本発明は、P遺伝子を複数搭載するパラミクソウイルスベクターを提供する。P遺伝子の発現やPタンパク質の活性や安定性などを低下させることによりベクター発現の制御やベクター消失の制御を行う場合、P遺伝子の初期発現量が低すぎたり、P遺伝子の発現期間が短すぎたりする可能性がある。本発明は、ベクターに複数のP遺伝子を搭載させ、それぞれのP遺伝子を抑制することによって、この問題が解決できることを見出した。
【００８０】
P遺伝子を複数搭載することで、ベクター導入直後のP遺伝子の発現を高くすることができ、結果的に搭載遺伝子の発現量を上昇させることができる。また、ベクターの搭載されているそれぞれのP遺伝子の発現を抑制する制御を行うことにより、P遺伝子の発現は抑制され、ベクターからの搭載遺伝子の発現が抑制され、ベクターの消失が促進される。複数のP遺伝子は、同じように発現抑制を行ってもよいし、異なる発現抑制を行ってもよい。例えば、２つのP遺伝子をベクターに搭載させる場合、一方は温度感受性変異を有するPタンパク質をコードさせ、他方のP遺伝子は非温度感受性Pタンパク質をコードさせ、非温度感受性Pタンパク質をコードするP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加することができる。この場合、一方のP遺伝子から発現されるPタンパク質は低温下でしか機能を発揮できないが、他方のP遺伝子から発現されるPタンパク質は低温下でなくても機能を発揮できる代わりに、マイクロRNAによる発現抑制を受ける。これにより、１つのP遺伝子しか搭載しない場合よりも複雑で柔軟性に富んだ発現制御を行うことが可能となる。
【００８１】
また、一方のP遺伝子は、degronを付加したPタンパク質をコードさせ、他方のP遺伝子はマイクロRNA標的配列を付加することもできる。この場合、一方のP遺伝子から発現されるPタンパク質はdegronによる抑制を受け、他方のP遺伝子の発現はマイクロRNAにより抑制を受ける。Degronを付加したPタンパク質は、温度感受性Pタンパク質とし、マイクロRNA標的配列を付加したP遺伝子は非温度感受性Pタンパク質としてもよい。なお、P遺伝子にdegronが付加されたとは、当該P遺伝子が、degronが付加されたP蛋白質をコードすることを言う。
【００８２】
細胞の分化やリプログラミングの誘導において、誘導後の細胞において発現するマイクロRNAの標的配列を用いて上記のベクターを構築すれば、リプログラミングが誘導された細胞で発現するマイクロRNAにより、一方のP遺伝子（マイクロRNAの標的配列を付加したP遺伝子）の発現が消失し、その後、他方のP遺伝子（温度感受性Pタンパク質やdegronを付加したPタンパク質を発現するP遺伝子）から発現するPタンパク質の活性が、温度やdegronの働きにより抑制されることで、ベクターが消失する。このような二重の調節を行うことで、初期発現レベルや発現期間をより自由に制御することが可能となる。
【００８３】
搭載するP遺伝子は、野生型に比べて発現が抑制できるように改変されていることが好ましく、例えば温度感受性変異、degronの付加、マイクロRNAの標的配列の付加などから選択される改変を有することが好ましい。これらは任意に組み合わせてもよい。好ましくは、搭載される複数のP遺伝子は、互いに全く同じにはならないように改変されていることが好ましく、degronを付加したP遺伝子と、マイクロRNAの標的配列の付加したP遺伝子を搭載するベクターや、温度感受性変異Pタンパク質をコードするP遺伝子と、マイクロRNAの標的配列の付加したP遺伝子を搭載するベクターなどは、好ましい例として挙げられる。
【００８４】
例えばパラミクソウイルスベクターにP遺伝子を複数搭載させることで、ベクターを導入した細胞を低温培養しなくても搭載遺伝子を十分なレベルで発現することができ、かつ、当該搭載遺伝子の発現により細胞に対して所定の効果が発揮された後は、細胞から迅速にベクターが除去される優れた特性を持つパラミクソウイルスベクターを取得することができる。例えばiPS細胞の誘導において、従来では、ベクターを迅速に除去するために温度感受性が比較的高いパラミクソウイルスベクター（特に温度感受性変異を有するP遺伝子を搭載するパラミクソウイルスベクター）が用いられていた。この場合、通常の培養温度（例えば37℃）で培養するとベクターが急速に除去されるため、細胞内で搭載遺伝子を発現させるために、ベクターを細胞に導入後、一定期間は低温（例えば約35℃）で培養することが必要であった。
【００８５】
パラミクソウイルスベクターにP遺伝子を複数搭載させることで、この問題を克服することができた。本発明の一態様においては、P遺伝子を複数搭載するパラミクソウイルスベクターは、搭載されるP遺伝子のうち少なくとも１つは非温度感受性のP遺伝子である。例えばP遺伝子を２つ搭載するパラミクソウイルスベクターは、２つのP遺伝子が共に非温度感受性であるか、あるいは１つのP遺伝子が温度感受性であって、他の１つのP遺伝子が非温度感受性であってよい。非温度感受性のP遺伝子の少なくとも１つには、上述の通り、マイクロRNAの標的配列を付加してもよい。他方のP遺伝子は、温度感受性および/またはdegronを付加したものとすることができる。
【００８６】
搭載させる遺伝子に特に制限はないが、iPS細胞を誘導するためのベクターであれば、適宜、１つまたは複数の所望のリプログラミング遺伝子を搭載させることができる。好適な搭載遺伝子を例示すれば、例えばKOS（KLF4、SOX2、OCT4の同時搭載）あるいはMYC遺伝子が挙げられる。P遺伝子を2つまたはそれ以上搭載するパラミクソウイルスベクターであって、KOSあるいはMYC遺伝子を搭載するベクターは、iPS細胞の効率的な誘導のために有用である。当該ベクターは、少なくとも１つの非温度感受性P遺伝子を搭載しており、当該非温度感受性P遺伝子には、マイクロRNAの標的配列が付加されていてもよい。また当該非温度感受性P遺伝子に加え、degronが付加されたP蛋白質をコードするP遺伝子を搭載していてもよい。なお、リプログラミング遺伝子は変異が導入された遺伝子であってもよい。例えばKLF4、SOX2、およびOCT4には、野生型だけでなく、リプログラミングを誘導できる限り変異型が包含される。またMYCには、cMYCおよびL-MYC、ならびにそれらの変異体が包含される。
【００８７】
なお本発明においてdegronとは蛋白質に付加することにより該蛋白質を不安定化させるポリペプチドを言い、当業者にはよく知られている。Degronには、低分子との結合によって安定化する配列、低分子との結合によって不安定化する配列、低分子の有無に関わらず不安定化する配列が挙げられる。具体的にはmTOR蛋白として知られるFKBP12由来のDD-tag（US2009/0215169）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）由来のDDG-tag（US2012/0178168）、TetR変異体（WO2007/032555）、植物由来のauxin-inducible degron（AID）システム（WO2010/125620）、分解促進配列として知られるPEST配列（WO99/54348）、CL1（WO2004/025264）、カルパイン由来配列（特開2009-136154）、NDS（特開2011-101639）などが挙げられる。FKBP12はmammalian target of rapamycin (mTOR)として知られ、rapamycinやshield1などの低分子と結合することで安定化され、除去することで不安定化し、プロテアソームによって分解される。DHFRはtrimethoprimによって安定化し、TetR変異体はdoxycyclineによって安定化する。PEST配列はPro, Glu, Ser, Thrに富む配列であり、例えばmouse ornithine decarboxylase（mODC）のC末端側422-461を付加することで不安定化させることができる。PEST配列は蛋白質の半減期を調節しているが、所望の半減期短縮配列を用いることができる（Rechsteiner M, et al., Trends Biochem. Sci. 21, 267-271, 1996）。PEST配列は例えば両端が塩基性アミノ酸（H、KまたはR）で囲まれており、(i) P、(ii) DおよびE、または(iii) SおよびEを含みユビキチン化酵素E3と結合する配列であり、例えばGENETYX（ゼネティックス社）により同定することができる。PESTと同様の効果が得られる配列としてCL1、カルパイン部分配列、NDSなどが挙げられる。AID配列は植物のユビキチンリガーゼであるTIR1とオーキシン（IAA）が結合することで不安定化される。
【００８８】
本発明においてはこれらのdegronをP蛋白質に付加することができ、好ましいdegronとしては、具体的にはmTOR degron、DHFR degron、TetR degron、PEST、およびAIDが挙げられる。なおこれらのdegronには天然の配列およびそれに由来するものが含まれる。特に好ましいdegronとしては、mTOR degron、DHFR degron、TetR degron、およびPESTが挙げられ、中でもAID配列以外のdegronが好適であり、具体的にはFKBP12 degron（DD）、DHFR degron（DDG）、TetR degron、およびmODC PESTが好ましい。PESTには天然の配列に由来するd2やその改変体であるd1やd4などが知られているが（WO99/54348）、これらはいずれもPESTに含まれ、本発明において使用することができる（実施例参照）。
【００８９】
以下に好ましいdegron配列の例を具体的に例示する。
mODC PEST配列（WO99/54348）
d2tag：mODC422-461：ACCESSION：P00860のC末端側422-461（配列番号：58）（DNA:配列番号：57）
d4tag：mODC422-461（T436A）（配列番号：59）
d1tag：mODC422-461（E428A/E430A/E431A）（配列番号：60）
また、WO99/54348に記載の他の変異体であってもよい。具体的には、WO99/54348に記載のMODC376-461、MODC376-456、およびMODC422-461 （配列番号：58）、ならびにMODC422-461 に対する変異配列であるP426A/P427A、P438A、E428A/E430A/E431A、E444A、S440A、S445A、T436A、D433A/D434A、D448A、およびそれらの組み合わせの変異を含むもの等が好適なPEST配列として例示できる。また、これらのアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失および/または付加したアミノ酸配列を含み、蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドを用いてもよい。特に好ましい配列は、MODC422-461 （配列番号：58）およびその変異体mODC422-461（T436A）（配列番号：59）である。また、P438AやS440Aなども本発明において好適に使用することができる。
【００９０】
DD-tagの配列（US2012/0178168）
DD-tag：FKBP（L106P）：ACCESSION：NP_000792の変異体（F37V/L107P）（配列番号：62）（DNA:配列番号：61）
また、US2012/0178168に記載の他の変異体であってもよい。なお、US2012/0178168ではN末端側のMetを数えずにL106Pと表記しており、この変異はNP_000792のL107Pと同位置である。
具体的には、例えばACCESSION：NP_000792の2-108（FKBP2-108）（配列番号：63）、およびその変異体が挙げられ、変異体としてはF36V、F15S、V24A、H25R、E60G、L106P、D100G、M66T、R71G、D100N、E102G、K105I（いずれもN末端側のMetを数えず2番目のアミノ酸を1とした位置を表す）、およびそれらの組み合わせの変異を含むものが挙げられる。また、これらのアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失および/または付加したアミノ酸配列を含み、蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドを用いてもよい。
【００９１】
DDG-tagの配列（US2012/0178168）
DDG-tag：DHFR（H12L/Y100I）：ACCESSION：B7MAH1 [UniParc]（配列番号：65）（DNA:配列番号：64） の変異体（R12L/G67S/Y100I）（配列番号：66）
また、US2012/0178168に記載の他の変異体であってもよい。具体的には、例えばDFHR蛋白質のアミノ酸配列（ACCESSION：B7MAH1、配列番号：64）、およびその変異体が挙げられ、変異体としてはN18T/A19V、F103L、Y100I、G121V、H12Y/Y100I、H12L/Y100I、R98H/F103S、M42T/H114R、I61F/T68S、およびそれらの組み合わせの変異を含むものが挙げられる。また、これらのアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失および/または付加したアミノ酸配列を含み、蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドを用いてもよい。なお、1アミノ酸目のMetはなくてもよい。
【００９２】
TetR-tagの配列（WO2007/032555）
TetR-tag：TetR（R28Q/D95N/L101S/G102D）：ACCESSION：NP_941292（配列番号：68）（DNA:配列番号：67） の変異体（R28Q/D95N/L101S/G102D）（配列番号：69）
また、WO2007/032555に記載の他の変異体であってもよい。具体的には、例えばTetR蛋白質のアミノ酸配列（ACCESSION：NP_941292、配列番号：68）、およびその変異体が挙げられ、変異体としてはD95N、L101S、G102D、およびそれらの組み合わせの変異を含むものが挙げられる。さらにR28Qの変異を含んでもよい。また、これらのアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失および/または付加したアミノ酸配列を含み、蛋白質を不安定化させる活性を有するポリペプチドを用いてもよい。なお、1アミノ酸目のMetはなくてもよい。
【００９３】
Degronをコードする核酸は、DNA合成により適宜作製することができる。また天然のdegron配列は、上記に示したdegron配列をコードするDNA（例えば配列番号：57、61、64、または67等を）またはその相補配列をプローブにして、ハイブリダイゼーション法をストリンジェントな条件下に行なうことにより分離することができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、本明細書に記載した洗浄液および温度条件で実施することができる。このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるポリヌクレオチドやそれがコードするポリペプチドは、通常、プローブとしたポリヌクレオチドやそれがコードするポリペプチドと、それぞれ塩基配列およびアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも70％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは少なくとも95％以上、さらに好ましくは少なくとも97％以上（例えば、98％以上または99％以上）の配列の同一性を指す。配列の同一性は、例えば、Karlin and Altschul によるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993) によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて開発されたBLAST(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)によって配列を解析する場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(www.ncbi.nlm.nih.gov.)。アミノ酸配列を改変する場合、改変するアミノ酸は好ましくは1〜数アミノ酸であり、より好ましくは1〜10、1〜8、1〜5、1〜4、1〜3、または1〜2である。
【００９４】
Degronは、適宜P蛋白質の所望の位置に付加することができ、例えばP蛋白質のN末端またはC末端に付加することができる。P蛋白質のN末端に付加する場合であって、P蛋白質のコード領域中の核酸にコードされるC蛋白質の発現が阻害される場合は、ベクターからC蛋白質を別途、発現させればよい。P蛋白質として全長P蛋白質ではなく断片を用いる場合であって、C蛋白質のコード領域を含まない断片である場合は、N末端でもC末端でも任意の位置にdegronを付加することができる。本発明においてdegronは、好ましくはP蛋白質のC末端側に付加される。Degronが付加された改変P蛋白質は周知の方法により作製することができる。具体的には、P蛋白質をコードするウイルスゲノムの配列に、読み枠が一致するようにdegronをコードする配列を挿入すればよい。
【００９５】
なお上述の通り、P蛋白質は全長でなくても、適宜断片を用いることができる。P蛋白質として必須なのはC末端の一部だけであって、その他の領域はウイルスベクターの発現に必須ではない。P蛋白質は、具体的には、L蛋白質の結合部位とN蛋白質：RNAへの結合部位とを保持する断片であってもよい。L蛋白質の結合部位としては、例えばSeV P蛋白質の411番目〜445番目のアミノ酸配列が挙げられ、N蛋白質：RNA結合部位としては、例えばSeV P蛋白質（例えばaccession番号AAB06197.1, P04859.1, P14252.1, AAB06291.1, AAX07439.1, BAM62828.1, BAM62834.1, P04860.1, BAM62840.1, BAD74220.1, P14251.1, BAM62844.1, BAM62842.1, BAM62842.1, BAF73480.1, BAD74226.1, BAF73486.1, Q9DUE2.1, BAC79134.1, NP_056873.1, ABB00297.1等）の479番目〜568番目のアミノ酸配列が挙げられる。より具体的には、例えばSeV P蛋白質の320番目〜568番目のアミノ酸配列を含む断片は、本発明において機能的なP蛋白質として好適に用いることができる。欠失型のP蛋白質を用いることで、ベクターのサイズを小型化できると共に、宿主の免疫反応の影響も受けにくくなることが期待できる。
【００９６】
C蛋白質のコード領域を欠失するP蛋白質を用いる場合は、上述の通り、適宜C蛋白質を別途発現させてもよい。ここでC蛋白質には、C'、C、Y1、およびY2蛋白質が含まれる（Irie T. et al.,PLoS One. （2010）5:e10719.）。C蛋白質を発現させるには、C蛋白質のコード配列を適宜ベクター中に挿入すればよい。挿入位置に特に制限はないが、P蛋白質の直前（ゲノムにおけるP蛋白質のコード配列の3'側）あるいはP蛋白質の直後（ゲノムにおけるP蛋白質のコード配列の5'側）に挿入することができる。挿入にあたっては、適宜E-I-S配列を付加してよい。
【００９７】
本発明においてP蛋白質にdegronが付加されたベクター、特に温度感受性P蛋白質にdegronが付加されたベクターは、具体的にはP蛋白質にD433A/R434A/K437A変異を有し（WO2012/029770、WO2010/008054）、degronがDD-tag、DDG-tag、TetR-tag、mODCのPEST配列、あるいは分解速度が異なるその変異体である（WO99/54348）。より好ましくは温度感受性変異としてL蛋白質にL1361C/L1558I変異を有している。
【００９８】
本発明において低温培養とは、36.5℃より低い温度で培養することを言う。好ましくは低温培養とは、36.4℃未満、より好ましくは36.3℃、36.2℃、36.1℃、36℃、35.9℃、35.8℃、35.7℃、35.6℃、35.5℃、35.4℃、35.3℃、35.2℃、35.1℃、より好ましくは35℃より低い温度で培養することを言う。下限は例えば30℃、好ましくは31℃、より好ましくは32℃、33℃、または34℃である。また、本発明において約37℃とは、具体的には、36.5〜37.5℃、好ましくは36.6〜37.4℃、より好ましくは36.7℃〜37.3℃を言う。
【００９９】
本発明のベクターを導入し、目的の遺伝子を発現させた後は、degronの性質に合わせて適宜ベクターを除去することができる。例えばDDやDDG、TetR変異体などのようにリガンド制御性のdegron（ligand controllable degron）を用いる場合、リガンドを添加しなければ除去を促進するが、Shield-1 などのリガンドを添加することによりベクターの発現を延長することができる。また、PEST配列などのようにリガンドがなくても機能を発揮するdegronであれば、ベクターを導入した細胞の培養を継続することによりベクターの除去を促進することができる。除去を開始してから除去されるまでの培養期間は適宜決定してよいが、本発明のベクターを用いれば、例えば4週間以内、3週間以内、2週間以内、または1週間以内、例えば20日以内、15日以内、10日以内、5日以内、または3日以内にベクターが除去される。当該培養期間は、例えば 3日〜3週間であり、または5日〜20日、5日〜2週間である。ウイルスの除去は、レポーター遺伝子の検出や、抗体やPCRを用いたウイルスの検出により、そのレベルがウイルス非導入細胞と同等のレベル（またはウイルス導入後の最大値に比べ1/100以下、好ましくは1/500以下、1/1000以下、または1/5000以下）にまで低下したことにより確認できる。
【０１００】
本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターの製造は、公知の方法を利用して行えばよい。具体的な手順として、典型的には、（ａ）マイナス鎖RNAウイルスゲノムRNA（マイナス鎖）またはその相補鎖（プラス鎖）をコードするcDNAを、ウイルス粒子形成に必要なウイルス蛋白質（NP、P、およびL）を発現する細胞で転写させる工程、（ｂ）生成したウイルスを回収する工程、により製造することができる。ウイルスとしては感染性粒子に限定されず、細胞に導入することによって遺伝子を発現する能力を保持している限り、非感染性粒子やRNPなども含まれる。ウイルスの形成に必要なウイルス蛋白質は、転写させたウイルスゲノムRNAから発現されてもよいし、ゲノムRNA以外から供給されてもよい。例えば、NP、P、およびL蛋白質をコードする発現プラスミドを細胞に導入して供給することができる。ゲノムRNAにおいてウイルスの形成に必要なウイルス遺伝子が欠損している場合は、そのウイルス遺伝子をウイルス産生細胞で別途発現させ、ウイルス形成を相補することもできる。ウイルス蛋白質やRNAゲノムを細胞内で発現させるためには、該蛋白質やゲノムRNAをコードするDNAを宿主細胞で機能する適当なプロモーターの下流に連結したベクターを宿主細胞に導入する。転写されたゲノムRNAは、ウイルス蛋白質の存在下で複製されビリオンが形成される。エンベロープ蛋白質などの遺伝子を欠損する欠損型ウイルスを製造する場合は、欠損する蛋白質またはその機能を相補できる他のウイルス蛋白質などをウイルス産生細胞において発現させることもできる。本発明においては、少なくともF遺伝子を欠失したベクターまたはF遺伝子に変異を有するベクターを好適に用いることができる。
【０１０１】
本発明のベクターに含まれるゲノムRNA（ポジティブ鎖またはネガティブ鎖）を、NP、P、およびLタンパク質の存在下で転写させることにより、本発明のRNPを製造することができる。RNPの形成は、例えばBHK-21またはLLC-MK2細胞などで行わせることができる。NP、P、およびLタンパク質の供給は、ウイルスベクターにより供給されてもよいし、それ以外にも種々の方法により行うことができる。例えば、上述の通り各遺伝子をコードする発現ベクターを細胞に導入することにより行われ得る。また、各遺伝子は宿主細胞の染色体に組み込まれていてもよい。RNPを形成させるために発現させる NP、P、およびL遺伝子は、ベクターのゲノムにコードされる NP、P、およびL遺伝子と完全に同一である必要はない。すなわち、これらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、RNPゲノムがコードするタンパク質のアミノ酸配列そのままでなくとも、ゲノムRNAと結合し、細胞内でゲノムへの転写複製活性を持つ限り、変異を導入してもよく、あるいは他のウイルスの相同遺伝子で代用してもよい。また、野生型タンパク質（野生型NP、P、および/またはLタンパク質）を発現させてもよい。
【０１０２】
エンベロープ蛋白質遺伝子の欠損ベクターの場合、細胞内でベクターを再構成させる時にF、HN、および/またはMタンパク質などのエンベロープ蛋白質を細胞で発現させれば、これらタンパク質がウイルスベクターに取り込まれ、感染性を保持するウイルスベクターを生産することができる。このようなベクターは、一度細胞に感染すると、細胞内に導入されたRNPの働きによりゲノムRNAからタンパク質を発現させることはできても、それ自身はエンベロープ蛋白質を発現できないため感染性ウイルス粒子は形成できない。そして、マイクロRNA標的配列が付加されていることにより、ベクターの発現を、そのマイクロRNAの発現に依存して制御することができる。このようなベクターは、特に転写因子遺伝子を搭載することで細胞の改変に極めて有用である。例えばマイクロRNA標的配列が付加された本発明のベクターに所望の分化因子または脱分化因子をコードする遺伝子を搭載させることで、細胞の分化や脱分化を効率的および/または特異的に誘導することが可能となる。
【０１０３】
例えば、本発明のマイナス鎖RNAウイルスの製造は、以下の従来の方法を利用して実施することができる（WO97/16539; WO97/16538; WO00/70055; WO00/70070; WO01/18223; WO03/025570； WO2005/071092; WO2006/137517; WO2007/083644; WO2008/007581; Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 及び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404; Tokusumi, T. et al. Virus Res. 2002: 86; 33-38、Li, H.-O. et al., J. Virol. 2000: 74; 6564-6569）。またウイルスの増殖方法および組み換えウイルスの製造方法については、ウイルス学実験学 各論、改訂二版（国立予防衛生研究所学友会編、丸善、1982）も参照のこと。
【０１０４】
本発明のベクターの構築において、マイクロRNA標的配列を付加したウイルス遺伝子の発現が低下している場合は、好ましくは、当該遺伝子を別途発現する細胞（ヘルパー細胞）を用いて製造を行う。例えばマイクロRNA標的配列を付加した遺伝子がP遺伝子である場合は、P蛋白質発現細胞を用いるとよい。また、そのようなベクターがF遺伝子も欠損するベクターの場合は、P蛋白質とF蛋白質を発現する細胞（PF発現細胞）を用いて製造を行えばよい。
【０１０５】
本発明のベクターは、所望の遺伝子を搭載することができる。搭載する遺伝子に特に制限はなく、所望の外来遺伝子（ベクターがもともと持っていない遺伝子）を搭載することができる。搭載する外来遺伝子の数に特に制限はなく、1個、2個、またはそれ以上搭載することができる。外来遺伝子には、適宜マイクロRNA標的配列を付加することもできる。
【０１０６】
本発明のベクターにおいて、外来遺伝子は、一般に、いずれかのウイルス遺伝子（例えばNP, P, M, F, HN, または L）の直前（ゲノムの3'側）または直後（ゲノムの5'側）に挿入することができる。外来遺伝子は、適宜センダイウイルスS（Start）配列とE（End）配列で挟まれていてよい。S配列は転写を開始させるシグナル配列であり、E配列で転写が終結する。S配列とE配列で挟まれた領域は、１つの転写単位となる。ある遺伝子のE配列と次の遺伝子のS配列の間は、適宜スペーサーとなる配列（介在配列；intervening sequence）を挿入することができる。
【０１０７】
S配列としては、センダイウイルスの所望のS配列を用いることができるが、例えば 3'-UCCCWVUUWC-5'（W= AまたはU; V= A, C, またはG）（配列番号：1）の配列を好適に用いることができる。特に 3'-UCCCAGUUUC-5'（配列番号：2）、3'-UCCCACUUAC-5'（配列番号：3）、および 3'-UCCCACUUUC-5'（配列番号：4）が好ましい。これらの配列は、プラス鎖をコードするDNA配列で表すとそれぞれ 5'-AGGGTCAAAG-3'（配列番号：5）、5'-AGGGTGAATG-3'（配列番号：6）、および 5'-AGGGTGAAAG-3'（配列番号：7）である。センダイウイルスベクターのE配列としては、例えば 3'-AUUCUUUUU-5'（プラス鎖をコードするDNAでは 5'-TAAGAAAAA-3'）が好ましい。I配列は、例えば任意の3塩基であってよく、具体的には 3'-GAA-5'（プラス鎖DNAでは 5'-CTT-3'）を用いればよい。
【０１０８】
本発明のベクターは転写因子等のリプログラミング因子をコードする遺伝子を搭載させることで、当該ベクターを多能性幹細胞作製に適用することができ、その時のベクター除去を促進することが可能である。例えばWO2012/029770、WO2010/008054においてcMYCは温度感受性のTS15ベクターに搭載されているが、これを本発明のベクターに搭載して置き換えることでKLF4、OCT4、SOX2、cMYCを用いて多能性幹細胞を作製する際のベクター除去を促進することが可能である。多能性幹細胞を作製する際に用いる転写因子はL-MYC、Glis1、Lin28、NANOGなど上記の分子以外を用いてもよい。ベクターに搭載する転写因子遺伝子は適宜改変することができる。例えば野生型cMYCにa378g、t1122c、t1125c、a1191g、および a1194g からなる群より選択される１つ以上、好ましくは２以上、３以上、４以上、または５つ全ての変異を導入することにより、ベクターから遺伝子を安定して高発現させることが可能となる（例えばWO2010/008054の配列番号：45）。
【０１０９】
本発明は、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した本発明のベクターであって、KOSあるいはMYC遺伝子を搭載するベクターの、細胞のリプログラミングのための使用、より具体的には、誘導多能性幹細胞を製造するための使用を提供する。また本発明は、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した本発明のベクターであって、KOSあるいはMYC遺伝子を搭載するベクターを用いる、誘導多能性幹細胞の製造方法を提供する。
【０１１０】
当該ベクターは、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列されていればよいが、好ましくはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されているものであり、より好ましくはP遺伝子の3'非翻訳領域（ゲノム上では翻訳領域の5'側）にマイクロRNA標的配列が付加されている。KOSあるいはMYC遺伝子の搭載位置に特に制限はないが、例えばKOS遺伝子の場合M遺伝子の上流（すなわちゲノム上においてM遺伝子の3'側、例えばP遺伝子とM遺伝子の間）に搭載されていることが好ましく、MYC遺伝子の場合L遺伝子の上流（すなわちゲノム上においてL遺伝子の3'側、例えばHN遺伝子とL遺伝子の間）に搭載されていることが好ましい。また、当該ベクターは、好ましくはF遺伝子を欠失している。P遺伝子の3'非翻訳領域にマイクロRNA標的配列が付加されており、KOSあるいはMYC遺伝子を搭載するF遺伝子欠失型パラミクソウイルスベクターは、効率的なリプログラミングの誘導のために極めて有用である。
【０１１１】
また、本発明のベクターを用いてKLF4を発現させることも好ましい。例えば、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した本発明のベクターであって、KLF4遺伝子を搭載するベクターは、iPS細胞の誘導のためのベクターとして有用である。本発明は、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した本発明のベクターであって、KLF4遺伝子を搭載するベクターの、細胞のリプログラミングのための使用、より具体的には、誘導多能性幹細胞を製造するための使用を提供する。また本発明は、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した本発明のベクターであって、KLF4遺伝子を搭載するベクターを用いる、誘導多能性幹細胞の製造方法を提供する。本発明のベクターを用いることにより、マイクロRNAの標的配列が付加されていない対照ベクターを用いた場合と比較して、多能性幹細胞のコロニーの形成を促進させることができる。ここで多能性幹細胞のコロニーの形成の促進とは、コロニーの形成効率の上昇および/またはコロニーの成長の促進であってよく、好ましくはコロニーの成長の促進である。例えばALP陽性コロニーの大きさを計測することにより、コロニーの成長が早まっているかを調べることができる。またコロニー形成の促進効果を度外視しても、本発明のベクターを用いることにより、iPS細胞誘導後に迅速にベクターを除去することが可能となる。
【０１１２】
当該ベクターは、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列されていればよいが、好ましくはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加されているものであり、より好ましくはP遺伝子の3'非翻訳領域（ゲノム上では翻訳領域の5'側）にマイクロRNA標的配列が付加されている。KLF4遺伝子の搭載位置に特に制限はないが、例えばNP遺伝子の下流（すなわちNP遺伝子とP遺伝子の間）、またはNP遺伝子の上流（すなわちリーダー配列とNP遺伝子の間）に搭載されていることが好ましい。また、当該ベクターは、好ましくはF遺伝子を欠失している。P遺伝子の3'非翻訳領域にマイクロRNA標的配列が付加されており、リーダー配列とNP遺伝子の間にKLF4遺伝子を搭載するF遺伝子欠失型パラミクソウイルスベクターは、効率的なリプログラミングの誘導のために極めて有用である。
【０１１３】
マイクロRNA標的配列としては、例えば誘導された多能性幹細胞において特異的に発現する所望のマイクロRNAの標的配列を用いることができ、具体的には、miR-302やmiR-367の標的配列を用いることができるが、それらに限定されるものではない。また標的配列は、複数コピーを用いたり、標的配列に適宜変異を導入して抑制作用を調節したりすることができる。
【０１１４】
多能性幹細胞を誘導するためのリプログラミング因子をコードする遺伝子としては、リプログラミングを誘導するため機能する遺伝子であれば特に制限はないが、ES細胞で特異的な発現または高発現を示す遺伝子、WntシグナルまたはLIFシグナルにより活性化される因子をコードする遺伝子、ES細胞の分化多能性維持に必須の遺伝子、およびそれらのファミリー遺伝子から、体細胞へ導入することにより内在性のOct3/4遺伝子及びNanog遺伝子を発現させる遺伝子や、その組み合せが挙げられる（WO2007/069666；JP5467223）。具体的に例示すれば、上記の通り、KLF4、OCT4、SOX2、cMYC、L-MYC、Glis1、Lin28、NANOGなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１１５】
本発明において多能性幹細胞とは、動物の胚盤胞期の胚の内部細胞塊より作られる幹細胞またはそれと類似した表現型を有する細胞を言う。具体的には、本発明において誘導される多能性幹細胞は、ES様細胞の指標であるアルカリホスファターゼを発現する細胞である。ここでES様細胞とは、ES細胞と類似した性質および/または形態を有する多能性幹細胞を言う。また好ましくは、多能性幹細胞は、培養することにより、細胞質に比べ核の容量の比率が高い細胞からなる扁平なコロニーを形成する。培養は、適宜フィーダーと共に培養してもよい。またMEFなどの培養細胞が数週間で増殖が停止するのに対し、多能性幹細胞は長期間の継代が可能であり、例えば3日ごとの継代で15回以上、好ましくは20回以上、25回以上、30回以上、35回以上、または40回以上継代しても、増殖性が失われないことにより確認することができる。また多能性幹細胞は、好ましくは内在性のNANOGを発現する。また多能性幹細胞は、好ましくはTERTを発現し、テロメラーゼ活性（テロメリックリピート配列を合成する活性）を示す。また多能性幹細胞は、好ましくは三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に分化する能力（例えばテラトーマ形成および／または胚様体形成において確認できる）を持つ。より好ましくは、多能性幹細胞は、胚盤胞に移植することにより生殖系列キメラを生成する。Germline transmissionが可能な多能性幹細胞は、germline-competentな多能性幹細胞と言う。これらの表現型の確認は、周知の方法により実施することができる（WO2007/69666; Ichisaka T et al., Nature 448(7151):313-7, 2007）。また本発明のベクターに分化誘導因子遺伝子を搭載させ、未分化細胞や幹細胞等に導入して所望の細胞や組織を分化させることもできる。
【０１１６】
本発明のベクターの導入により製造された細胞は、様々な組織や細胞に分化させるために有用であり、所望の試験、研究、診断、検査、治療等において用いることができる。例えば誘導した幹細胞は、幹細胞療法において利用されることが期待される。例えば患者から採取した体細胞を用いて初期化（reprogramming）を誘導し、その後、分化誘導して得られる体性幹細胞やその他の体細胞を患者に移植することができる。細胞の分化誘導の方法は特に限定されず、例えばレチノイン酸処理や、様々な増殖因子・サイトカイン処理、ホルモンによる処理により分化を誘導することができる。また得られた細胞は、所望の薬剤や化合物の効果を検出するために使用することができ、これを通して薬剤や化合物のスクリーニングを実施することが可能である。本発明は、医学的用途および非医学的用途のために用いることができ、メディカルおよび非メディカルの態様において有用である。例えば本発明は、治療、手術、および/または診断、あるいは非治療、非手術、および/または非診断の目的に用いることができる。
【０１１７】
ベクターを導入する細胞に特に制限はなく、分化した体細胞でもよく、造血幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、皮膚表皮幹細胞といった体性幹細胞や生殖幹細胞でもよい。また細胞は、例えば胚、胎児、新生児、子供、成人または老人の細胞に由来してよい。また、動物の由来は特に制限はなく、ヒトおよび非ヒト霊長類（サルなど）、マウス、ラットなどのげっ歯類、およびウシ、ブタ、ヤギなどの非げっ歯類を含む哺乳動物等が含まれる。
【０１１８】
本発明のベクターは、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した場合、ベクターからの遺伝子発現またはベクター量は、マイクロRNA標的配列を付加しなかった場合に比べ有意に低く、具体的には、例えば70％以下、好ましくは60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、あるいは、1/5以下、好ましくは1/8以下、好ましくは1/10以下、1/20以下、1/30以下、または1/50以下に低下する。また本発明のベクターは、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した場合、ベクターからのレポーター蛋白質の発現量は、マイクロRNA標的配列を付加しない場合のレポーター蛋白質の発現量に比べ有意に低く、具体的には、例えば2/3以下、好ましくは1/2以下、好ましくは1/3以下、1/5以下、1/8以下、好ましくは1/10以下、1/20以下、1/30以下、または1/50以下である。細胞は、当該マイクロRNAを発現する所望の細胞が用いられる。また、細胞において当該マイクロRNAが発現している限りベクターからの遺伝子発現の測定時期に特に制限はないが、例えばウイルスベクターの導入の24時間後、48時間後、3日後、5日後、1週間後、2週間後、または3週間後のいずれかの時点であってよい。
【０１１９】
また本発明のベクターは、L遺伝子にマイクロRNA標的配列を付加した場合、ベクターを細胞に導入後、ベクターからの遺伝子発現またはベクター量は、マイクロRNA標的配列を付加しない場合に比べ有意に高く、具体的には、例えば1.2倍以上、好ましくは1.3倍以上、好ましくは1.4倍以上、1.5倍以上、1.6倍以上、好ましくは1.7倍以上、1.8倍以上、1.9倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、または6倍以上である。細胞は、当該マイクロRNAを発現する所望の細胞が用いられる。また、細胞において当該マイクロRNAが発現している限りベクターからの遺伝子発現の測定時期に特に制限はないが、例えばウイルスベクターの導入の24時間後、48時間後、3日後、5日後、または1週間後、または2週間後のいずれかの時点であってよい。
【０１２０】
また本発明は、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加された本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターを、他のマイナス鎖RNAウイルスベクターと共感染する工程を含む、当該他のマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進する方法に関する。当該他のマイナス鎖RNAウイルスベクターは、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターと同種のマイナス鎖RNAウイルスのベクターである限り特に制限はなく、野生型マイナス鎖RNAウイルスベクターや、遺伝子欠損または遺伝子改変されたマイナス鎖RNAウイルスベクターであってもよい。本発明において、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターは、感染細胞において自身の除去を促進するだけでなく、共存する他のマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去をも促進することが期待できる。すなわち本発明のベクターは、本発明ベクター自身および当該ベクターに搭載されている遺伝子の除去を促進するために有用であるだけでなく、共存する他のマイナス鎖RNAウイルスやマイナス鎖RNAウイルスベクターならびに当該ベクターに搭載されている遺伝子の除去を促進するためにも有用である。
【０１２１】
すなわち本発明は、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加された本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターを、他のマイナス鎖RNAウイルスまたは他のマイナス鎖RNAウイルスベクターと共感染させる工程を含む、該他のマイナス鎖RNAウイルスまたは他のマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去を促進する方法を提供する。共感染は、細胞内で共存する期間があればよく、同時に感染させる必要はない。初めに他のマイナス鎖RNAウイルスまたは他のマイナス鎖RNAウイルスベクターを細胞に感染させ、それを除去する必要が生じたときに本発明のベクターを感染させることもできる。
【０１２２】
また本発明は、NP遺伝子またはP遺伝子にマイクロRNA標的配列が付加された本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターを含む、マイナス鎖RNAウイルスまたはマイナス鎖RNAウイルスベクターの除去促進剤を提供する。また本発明は、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターを含む、マイナス鎖RNAウイルスベクターで導入する遺伝子の除去促進剤を提供する。また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスベクターおよび/またはマイナス鎖RNAウイルスベクターで導入する遺伝子の除去促進における、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターの使用を提供する。また本発明は、マイナス鎖RNAウイルスベクターおよび/またはマイナス鎖RNAウイルスベクターで導入する遺伝子の除去促進剤の製造における、本発明のマイナス鎖RNAウイルスベクターの使用を提供する。本発明のベクターを用いて、本発明のベクターの搭載遺伝子の発現を制御できることに加え、他のマイナス鎖RNAウイルスベクターの搭載遺伝子の発現も制御することが可能となる。
【実施例】
【０１２３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。また、本明細書中に引用された文献およびその他の参照は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。【０１２４】
＜本発明で用いた外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターの作製＞
本発明で用いた外来遺伝子を保持するセンダイウイルスベクターの作製方法を以下に示す。尚、本発明において「18+」とはNP遺伝子の前にGOIを挿入することを表し、「(PM)」とは、P遺伝子とM遺伝子の間にGOIを挿入することを表し、「(F)」とはF遺伝子の代わり（M遺伝子とHN遺伝子の間）にGOIを挿入することを表し、「(HNL)」とは、HN遺伝子とL遺伝子の間にGOIを挿入することを表す。また、本発明においてセンダイウイルスはすべてZ株のものを用いた。また本発明において「TS」とは、M蛋白質にG69E,T116A,およびA183S の変異を、HN蛋白質にA262T,G264R, およびK461Gの変異を、P蛋白質にL511F変異を、そしてL 蛋白質にN1197SおよびK1795E変異を持つことを表し、「ΔF」とは、F遺伝子を欠失していることを表す。例えばNP遺伝子の前にGOIを挿入するF遺伝子欠失型センダイウイルスベクターはSeV18+/ΔFと記載し、TS変異を有する同ベクターはSeV18+/TSΔFと記載する。同様にNP遺伝子の前にGOIを挿入するM遺伝子を欠失し、F蛋白質のプロテアーゼ指向性が改変されたベクターはプロテアーゼ指向性がMMPタイプに改変されたベクターをSeV18+/Fct14(MMP)-HN/ΔMと記載し、プロテアーゼ指向性がuPAタイプに改変されたベクターをSeV18+/Fct14(uPA)-HN/ΔMと記載する。GOIの挿入に用いた制限酵素は特に断りがなければNotIである。また、TS12とはP蛋白に上記のTS変異に加えてD433A、R434A、およびK437Aの変異を含み、TS15とは上記のTS12変異に加えてL蛋白にL1361CおよびL1558Iの変異を含むセンダイウイルスベクターである。但しこれらは例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。【０１２５】
1）SeV18+DGFP/TSΔFベクターの構築
DasherGFP（DNA2.0社）を鋳型にNotI-DGFP-F （5’- ATAGCGGCCGCGACATGACTGCCCTGACCG -3’）（配列番号：8）およびDGFP-EIS-NotI-R （5’- TATGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTACTGATAGGTATCGAGATCGAC -3’）（配列番号：9）のプライマーを用いてPCR反応を行い、NotIで消化し、pSeV18+TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/TSΔFと称す。【０１２６】
2）SeV18+DGFPmiRT/TSΔFベクターの構築
pSeV18+DGFP/TSΔFを鋳型にEcoRI-DGFP（5’- ATATGAATTCGCGGCCGCTCGCCACCATGACTGCCCTGACCG -3’）（配列番号：10）およびDGFP-HindIII（5’- ATATAAGCTTCTATTACTGATAGGTATC -3’）（配列番号：11）のプライマーを用いてPCR反応を行い、EcoRIおよびHindIIIで消化し、EcoRI-DGFP-HindIII断片を得た。次にmiR302-1+（5’- ATATAAGCTTGGTACCTTATCACCAAAACATGGAAGCACTTACGATTCACCAAAACATGGAAGCACTTAGAGCTCATAT -3’）（配列番号：12）およびmiR302-2+（5’- ATATGAGCTCTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATAAGGTACCAAGCTTATAT -3’）（配列番号：13）をアニーリングし、HindIIIおよびSacIIで消化し、HindIII-miR302-SacII断片を得た。次にmiR302-3+（5’- ATATGAGCTCTCACCAAAACATGGAAGCACTTACGATTCACCAAAACATGGAAGCACTTAAGTATGGTACCTCTAGAATAT -3’）（配列番号：14）およびmiR302-4+（5’- ATATTCTAGAGGTACCATACTTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAGAGCTCATAT -3’）（配列番号：15）をアニーリングし、SacIIおよびXbaIで消化し、SacII-miR302-XbaI断片を得た。次にXbaI-EIS-NotI-BamHI-F（5’- ATATTCTAGAGTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCGCGGCCGCGGATCCATAT -3’）（配列番号：16）およびXbaI-EIS-NotI-BamHI-R（5’- ATATGGATCCGCGGCCGCGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTCTAGAATAT -3’）（配列番号：17）をアニーリングし、XbaIおよびBamHIで消化し、XbaI-EIS-BamHI断片を得た。次にこれらをBamHIおよびEcoRIで消化したpBlueScript II-SK+（ストラタジーン社）にクローニングし、pBS-DGFP-miR302T4を得た。次にpBS-DGFP-miR302T4をNotIで消化し、pSeV18+TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFPmiRT/TSΔFを得た。pSeV18+DGFPmiRT/TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFPmiRT/TSΔFと称す。【０１２７】
3）SeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFベクターの構築
まず、pSeV18+/PLmutTSΔFの構築を以下の通り行った。pSeV18+/TSΔFを鋳型にBamHI-P-F（5'- ATATGGATCCAGTTCACGCGGCCGCA -3'）（配列番号：41）およびXhoI-P-R（5'- ATATCTCGAGTCGGTGCAGGCCTTTA -3'）（配列番号：42）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をBamHIおよびXhoIで消化し、得られたDNA断片をpBlueScript II-SK+（ストラタジーン社）にクローニングし、pBS-Pを得た。このpBS-Pを鋳型にPmut-F1（5'- GGATCATACGGCGCGCCAAGGTACTTG -3'）（配列番号：43）、Pmut-R1（5'- CAAGTACCTTGGCGCGCCGTATGATCC -3'）（配列番号：44）、Pmut-F2（5'- CAACTAGATCCTGCAGGAGGCATCCTAC -3'）（配列番号：45）、およびPmut-R2（5'- GTAGGATGCCTCCTGCAGGATCTAGTTG -3'）（配列番号：46）のプライマーを用いてPCR反応を行い、P遺伝子の上流にAscIサイトを、P遺伝子の下流にSbfIサイトを導入し、pBS-Pmutを得た。次にpSeV18+TSΔFを鋳型にBamHI-L-F（5'- ATATGGATCCGTACGATCGCAGTCCACCAT -3'）（配列番号：47）およびXhoI-L-R（5'- ATATCTCGAGCAGCTAGCTCAACTGA -3'）（配列番号：48）のプライマーを用いてPCR反応を行った。このPCR産物をBamHIおよびXhoIで消化し、得られたDNA断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-Lを得た。このpBS-Lを鋳型にLmut-F（5'- GTGAATGGGAGGCCGGCCATAGGTC -3'）（配列番号：49）およびLmut-R（5'- GACCTATGGCCGGCCTCCCATTCAC -3'）（配列番号：50）のプライマーを用いてPCR反応を行い、L遺伝子の上流にFseIサイトを導入し、pBS-Lmutを得た。次にpSeV18+/TSΔFをSalIおよびPvuIで消化し、pBS-Lmut をPvuIおよびKpnIで消化し、pBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-LmutSeVを得た。次にpBS-LmutSeVをNheIおよびSalIで消化し、pSeV18+/TSΔFにクローニングし、pSeV18+/LmutTSΔFを得た。次にpSeV18+/LmutTSΔFをNotI、NheI、およびStuIで消化し、pBS-PmutをNotIおよびStuIで消化し、これらのDNA断片を接合し、pSeV18+/PLmutTSΔFを得た。【０１２８】
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF1603（5’- CTGCAACCCATGGAGATGAAGG -3’）（配列番号：18）およびP-miR302T4-C（5’- CCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTG -3’）（配列番号：19）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-P-miRT断片を得た。次にpSeV18+DGFPmiRT/TSΔFを鋳型にP-miR302T4-N（5’- CACTGACCAACTAGATAATAGAAGCTTGG -3’）（配列番号：20）およびP-miR302T4-SbfI-C（5’- TATACCTGCAGGCTCTAGAGGTACCATAC -3’）（配列番号：21）のプライマーを用いてPCR反応を行い、P-miRT-SbfI断片を得た。次にSeVF1603-P-miRT断片およびP-miRT-SbfI断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR302T4-SbfI-C（配列番号：21）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/PmiRT-TSΔFを得た。次にpSeV18+DGFP/TSΔFをNotIで消化し、得られたDGFP-NotI断片をpSeV18+/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFと称す。【０１２９】
4）SeV18+DGFP/LmiRT#2-TSΔFベクターの構築
pBS-DGFP-miR302T4をKpnIで消化し、pSeV18+DGFP/TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/LmiRT#2-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/LmiRT#2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/LmiRT#2-TSΔFと称す。【０１３０】
5）SeV18+DGFP/LmiRT#1-TSΔFベクターの構築
pSeV18+DGFPmiRT/TSΔFを鋳型にSeVF13201（5’- TCGTGGAACCTGTGTATGGGCC -3’）（配列番号：22）およびL-miR302T4-C（5’- GGTACCAAGCTTCTATTATTACGAGCTGTC -3’）（配列番号：23）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF13201-LmiRT断片を得た。次にpSeV18+DGFPmiRT/TSΔFを鋳型にL-miR302T4-N（5’- GACAGCTCGTAATAATAGAAGCTTGGTACC -3’）（配列番号：24）およびL-miR302T4-SacII-C（5’- ATATCCGCGGAGCTTCGATCGTTCTGCACGATAGGGACTAATTCTCTAGAGGTACCATAC -3’）（配列番号：25）のプライマーを用いてPCR反応を行い、LmiRT-SacII断片を得た。次にSeVF13201-LmiRT断片およびLmiRT-SacII断片を鋳型にSeVF13201（配列番号：22）およびL-miR302T4-SacII-C（配列番号：25）のプライマーを用いてPCR反応を行い、XhoIおよびSacIIで消化し、pSeV18+DGFP/TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/LmiRT#1-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/LmiRT#1-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/LmiRT#1-TSΔFと称す。【０１３１】
6）SeV18+DGFP/NPmiRT-TSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF426（5’- ATCTACAACATAGAGAAAGACC -3’）（配列番号：26）およびNP-miR302T4-C（5’- AGCTTCTATTATCTAGATTCCTCCTATCCC -3’）（配列番号：27）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF426-NPmiRT断片を得た。次にpSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFを鋳型にNP-miR302T4-N（5’- GGAGGAATCTAGATAATAGAAGCTTGGTAC -3’）（配列番号：28）およびmiR302T4-AscI-C（5’- ATATGCGCGCCGTATGATCATATCTCTAGAGGTACC -3’）（配列番号：29）のプライマーを用いてPCR反応を行い、NPmiRT-AscI断片を得た。次にSeVF426-NPmiRT断片およびNPmiRT-AscI断片を鋳型にSeVF426（配列番号：26）およびmiR302T4-AscI-C（配列番号：29）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SphIおよびAscIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/NPmiRT-TSΔFを得た。DGFP-NotI断片をpSeV18+/NPmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/NPmiRT-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/NPmiRT-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/NPmiRT-TSΔFと称す。【０１３２】
7）SeV18+DGFP/PmiRTtag-TSΔFベクターの構築
pSeV18+DGFP/TSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR302T4tag-C（5’- GCTTCTATTAATGTTGGTCAGTGACTCTAT -3’）（配列番号：30）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-P-miR302T4tag断片を得た。次にpSeV18+DGFP/TSΔFを鋳型にP-miR302T4tag-N（5’- GACCAACATTAATAGAAGCTTGGTACCTTA -3’）（配列番号：31）およびP-miR302T4tag-SbfI-C（5’- ATATCCTGCAGGTATTACTACTCTAGAGGTACCATAC -3’）（配列番号：32）のプライマーを用いてPCR反応を行い、P-miR302T4tag-SbfI断片を得た。次にSeVF1603-P-miR302T4tag断片およびP-miR302T4tag-SbfI断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR302T4tag-SbfI-C（配列番号：32）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiRTtag-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiRTtag-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiRTtag-TSΔFと称す。【０１３３】
8）SeV18+DGFP/PmiRTx1-TSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR302T1-C1（5’- GTACCATACTTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATAAGGTACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGAC -3’）（配列番号：33）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-PmiR302T1断片を得た。次にSeVF1603-PmiR302T1断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR302T1-C2-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGTATCTCTAGAGGTACCATACTTAAG -3’）（配列番号：34）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiRTx1-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiRTx1-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiRTx1-TSΔFと称す。【０１３４】
9）SeV18+DGFP/PmiRTx2-TSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR302T2-C1（5’- CATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGATAAGGTACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：35）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-PmiR302T2断片を得た。次にSeVF1603-PmiR302T2断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR302T2-C2-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGATCTCTAGAGGTACCATACTTAAGTGCTTCCATGTTTTGGTGAATCGTAAGTGCTTCCATGTTTTGGT -3’）（配列番号：36）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiRTx2-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiRTx2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiRTx2-TSΔFと称す。【０１３５】
10）SeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR367T2-C1（5’- CTTTAGCAATGGTGATAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：37）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-PmiR367T2断片を得た。次にSeVF1603-PmiR367T2断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR367T2-C2-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGAATTGCACTTTAGCAATGGTGAATCGAATTGCACTTTAGCAATGGTGATAATCCACC -3’）（配列番号：38）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFと称す。【０１３６】
11）SeV18+DGFP/PmiR126T2-TSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR126T2-C1（5’- GAGTAATAATGCGTAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：39）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-PmiR126T2断片を得た。次にSeVF1603-PmiR126T2断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR126T2-C2-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGTCGTACCGTGAGTAATAATGCGATCGTCGTACCGTGAGTAATAATGCGTAATCCACC -3’）（配列番号：40）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR126T2-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR126T2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR126T2-TSΔFと称す。【０１３７】
12）SeV18+DGFP/PmiRTΔFベクターの構築
pSeV18+ΔFを鋳型にBamHI-P-F（配列番号：41）およびPmut-R1（配列番号：44）のプライマーを用いてPCR反応を行い、BamHI-PmutdF断片を得た。次にpSeV18+ΔFを鋳型にPmut-F1（配列番号：43）およびPmut-R2（配列番号：46）のプライマーを用いてPCR反応を行い、PmutdF断片を得た。次にpSeV18+ΔFを鋳型にPmut-F2（配列番号：45）およびXhoI-P-R（配列番号：42）のプライマーを用いてPCR反応を行い、PmutdF-XhoI断片を得た。次にBamHI-PmutdF断片、PmutdF断片およびPmutdF-XhoI断片を鋳型にBamHI-P-F（配列番号：41）およびXhoI-P-R（配列番号：42）のプライマーを用いてPCR反応を行い、得られたDNA断片をpBlueScript II-SK+にクローニングし、pBS-PmutdFを得た。次にpBS-PmutdFをNotI、StuI、およびXhoIで消化し、3878bp断片を得た。次にpSeV18+ΔFをNotIおよびNheIで消化し、6321bp断片を得た。次にpSeV18+ΔFをNotI、StuI、およびNheIで消化し、6161bp断片を得た。次に3878bp断片、6321bp断片、および6161bp断片を接合し、pSeV18+/PmutΔFを得た。次にpSeV18+/PmutΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR302T4-C（配列番号：19）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-PdF-miRT断片を得た。次にSeVF1603-PdF-miRT断片およびP-miRT-SbfI断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR302T4-SbfI-C（配列番号：21）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+/PmutΔFにクローニングし、pSeV18+/PmiRTΔFを得た。次にDGFP-NotI断片をpSeV18+/PmiRTΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiRTΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiRTΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiRTΔFと称す。【０１３８】
13）SeV18+DGFP/PmiR372T2-TSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR372T2-C1（5’- CGACATTTGAGCGTAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：70）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-PmiR372T2断片を得た。次にSeVF1603-PmiR124T2断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR372T2-C2-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGAAAGTGCTGCGACATTTGAGCGTACGAAAGTGCTGCGACATTTGAGCGTAATCCACC -3’）（配列番号：71）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR372T2-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR372T2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR372T2-TSΔFと称す。【０１３９】
14）SeV18+DGFP/PmiR143T2-TSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR143T2-C1（5’- GCACTGTAGCTCATAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：72）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-PmiR143T2断片を得た。次にSeVF1603-PmiR143T2断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR143T2-C2-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGTGAGATGAAGCACTGTAGCTCAATCGTGAGATGAAGCACTGTAGCTCATAATCCACC -3’）（配列番号：73）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR143T2-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR143T2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR143T2-TSΔFと称す。【０１４０】
15）SeV18+DGFP/PmiR122T2-TSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR122T2-C1（5’- CAATGGTGTTTGTAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：74）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-PmiR122T2断片を得た。次にSeVF1603-PmiR122T2断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR122T2-C2-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGATCGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTAATCCACC -3’）（配列番号：75）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR122T2-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR122T2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR122T2-TSΔFと称す。【０１４１】
16）SeV18+DGFP/PmiR218T2-TSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR218T2-C1（5’- GATCTAACCATGTGTAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：76）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-PmiR218T2断片を得た。次にSeVF1603-PmiR218T2断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR218T2-C2-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGTTGTGCTTGATCTAACCATGTGATCGTTGTGCTTGATCTAACCATGTGTAATCCACC -3’）（配列番号：77）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR218T2-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR218T2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR218T2-TSΔFと称す。【０１４２】
17）SeV18+DGFP/PmiR124T2-TSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR124T2-C1（5’- CGGTGAATGCCAATAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：78）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-PmiR124T2断片を得た。次にSeVF1603-PmiR124T2断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR124T2-C2-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAATCGTAAGGCACGCGGTGAATGCCAATAATCC -3’）（配列番号：79）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR124T2-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR124T2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR124T2-TSΔFと称す。【０１４３】
18）SeV18+DGFP/PmiR138T2-TSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR138T2-C1（5’- GTGAATCAGGCCGTAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：80）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-PmiR138T2断片を得た。次にSeVF1603-PmiR138T2断片を鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびP-miR138T2-C2-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTCTCGACTAGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCGATCAGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCGTAATCCACC -3’）（配列番号：81）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR138T2-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR138T2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR138T2-TSΔFと称す。【０１４４】
19）SeV18+DGFP/PmiR367T1-TSΔFベクターの構築
pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびmiR367T1-C-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTATCGAATTGCACTTTAGCAATGGTGATAATCCACCAAGCTTCTATTATCTAGTTGGTCAGTGACTC -3’）（配列番号：82）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR367T1-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR367T1-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR367T1-TSΔFと称す。【０１４５】
20）SeV18+DGFP/miR367T1-NP-TSΔFベクターの構築
まず、pSeV18+/PLmutTSΔFver2の構築を以下の通り行った。pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF3208（5’- AGAGAACAAGACTAAGGCTACCAGGTTTGACC -3’）（配列番号：83）およびAsiSI-C（5’- AGGCGATCGCTCTTTCACCCTAAGTTTTTC -3’）（配列番号：84）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF3208-AsiSI-C断片を得た。次にpSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にAsiSI-N（5’- GAAAGAGCGATCGCCTAACACGGCGCAATG -3’）（配列番号：85）およびSeVR4246（5’- TTTGGGATCTTGGCTATGGTGAT -3’）（配列番号：86）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AsiSI-N-SeVR4246断片を得た。次にSeVF3208-AsiSI-C断片およびAsiSI-N-SeVR4246断片を鋳型にSeVF3208およびSeVR4246のプライマーを用いてPCR反応を行い、pGEM-T Easy（Promega社）にクローニングし、pGEM/P-SbfI-AsiSIを得た。次にpGEM/P-SbfI-AsiSIをStuIおよびSbfIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFをNheIおよびSbfIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFをStuIおよびNheIで消化し、3つの断片をアニーリングし、pSeV18+/PLmutTSΔFver2を得た。DGFP-NotI断片をpSeV18+/PLmutTSΔFver2にクローニングし、pSeV18+DGFP/PLmutTSΔFver2を得た。【０１４６】
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にNotI-miR367T1-NP-N（5’- ATATGCGGCCGCATCACCATTGCTAAAGTGCAATTCAGATCTTCACGATGGCCGGGTTGTTGAGC -3’）（配列番号：87）およびSeVR744（5’- CGTCTTGTCTGAACGCCTCTAAC -3’）（配列番号：88）のプライマーを用いてPCR反応を行い、pSeV18+DGFP/PLmutTSΔFver2にクローニングし、pSeV18+DGFP/miR367T1-NP-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/miR367T1-NP-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/miR367T1-NP-TSΔFと称す。【０１４７】
21）SeV18+DGFP/miR367T1-P-TSΔFベクターの構築
まず、pSeV18+/PLmutTSΔFver3の構築を以下の通り行った。pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびAscI-AsiSI-SalI-C（5’- GCCTTGCGATCGCCGATCGGTGGATGAACT -3’）（配列番号：89）のプライマーを用いてPCR反応を行い、SeVF1603-AscI-AsiSI-SalI-C断片を得た。次にpSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にAscI-AsiSI-SalI-N（5’- CCGATCGGCGATCGCAAGGCCACACCCAAC -3’）（配列番号：90）およびSeVR2231（5’- CAGAGTTTGTACCAGTTCTTCCCC -3’）（配列番号：91）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscI-AsiSI-SalI-N-SeVR2231断片を得た。次にSeVF1603-AscI-AsiSI-SalI-C断片およびAscI-AsiSI-SalI-N-SeVR2231断片を鋳型にSeVF1603およびSeVR2231のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSalIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFにクローニングし、pSeV18+/PLmutTSΔFver3を得た。【０１４８】
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にAscI-miR-N（5’- ATATGGCGCGCCAAGGTACTTGATCCGTAG -3’）（配列番号：92）およびmiR367T1-AsiSI-C（5’- ATATGCGATCGCGAATTGCACTTTAGCAATGGTGATCGATCGGTGGATGAACTTTC -3’）（配列番号：93）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびAsiSIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFver3にクローニングし、pSeV18+/miR367T1-P-TSΔFを得た。DGFP-NotI断片をpSeV18+/miR367T1-P-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/miR367T1-P-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/miR367T1-P-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/miR367T1-P-TSΔFと称す。【０１４９】
22）SeV18+DGFP/miR367T1-L-TSΔFベクターの構築
pSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にFseI-miR367T1-L-N（5’- ATATGGCCGGCCATCACCATTGCTAAAGTGCAATTCATAGGTCATGGATGGGCAGGAGTCC -3’）（配列番号：94）およびSeVR12508（5’- GAATATTTATCGAAGGTTCAGAGGTGTG -3’）（配列番号：95）のプライマーを用いてPCR反応を行い、FseIおよびNheIで消化し、pSeV18+DGFP/PLmutTSΔFver2にクローニングし、pSeV18+/miR367T1-L-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/miR367T1-L-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/miR367T1-L-TSΔFと称す。【０１５０】
23）SeV18+DGFP/PmiR367T2m1-TSΔFベクターの構築
pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびmiR367T2m1-C-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGAATTGCACTTTATCAATGGTGAATCGAATTGCACTTTATCAATGGTGATAATCCACCA -3’）（配列番号：96）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR367T2m1-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR367T2m1-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR367T2m1-TSΔFと称す。【０１５１】
24）SeV18+DGFP/PmiR367T2m2-TSΔFベクターの構築
pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびmiR367T2m2-C-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGAATTGCACTTTATTAATGGTGAATCGAATTGCACTTTATTAATGGTGATAATCCACCA -3’）（配列番号：97）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR367T2m2-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR367T2m2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR367T2m2-TSΔFと称す。【０１５２】
25）SeV18+DGFP/PmiR367T2m3-TSΔFベクターの構築
pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびmiR367T2m3-C-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGAATTGCACTTTCTTAATGGTGAATCGAATTGCACTTTCTTAATGGTGATAATCCACCA -3’）（配列番号：98）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR367T2m3-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR367T2m3-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR367T2m3-TSΔFと称す。【０１５３】
26）SeV18+DGFP/PmiR367T2m4-TSΔFベクターの構築
pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFを鋳型にSeVF1603（配列番号：18）およびmiR367T2m4-C-SbfI（5’- ATATCCTGCAGGCTCTCGACTGAATTGCACTTACTTAATGGTGAATCGAATTGCACTTACTTAATGGTGATAATCCACCA -3’）（配列番号：99）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PmiR367T2m4-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP/PmiR367T2m4-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP/PmiR367T2m4-TSΔFと称す。【０１５４】
27）SeV18+DGFP(HNL)HSV-TK/PmiR302T4-TSΔFベクターの構築
pSELECT-zeo-HSV1tk（InvivoGen社）を鋳型にNotI-HSVtk-N（5’- ATATGCGGCCGCGACGTCACCATGGCTTCTTACCCTGGAC -3’）（配列番号：100）およびHSVtk-EIS-NotI-C（5’- ATATGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTAGTTGGCCTCTCCCATCTCCC -3’）（配列番号：101）のプライマーを用いてPCR反応を行い、HSVtk-NotI断片を得た。次にpSeV18+/PmiRT-TSΔFをAscIおよびSbfIで消化し、得られたPmiR302T4断片をpSeV(HNL)AG/d2PTS15ΔF（WO2016/125364）にクローニングし、pSeV(HNL)AG/PmiR302T4-TS15ΔFを得た。次にpSeV18+/PLmutTSΔFをNheIおよびSacIで消化し、得られたL遺伝子（TS）をpSeV(HNL)AG/PmiR302T4-TS15Δにクローニングし、pSeV(HNL)AG/PmiR302T4-TSΔFを得た。次にHSVtk-NotI断片をNotIで消化し、pSeV(HNL)AG/PmiR302T4-TSΔFにクローニングし、pSeV(HNL)HSVtk/PmiR302T4-TSΔFを得た。次にpSeV18+DGFP/PmiRT-TSΔFおよびpSeV(HNL)HSVtk/PmiR302T4-TSΔFをAscIおよびSacIIで消化し、これらの断片を接合し、pSeV18+DGFP(HNL)HSV-TK/PmiR302T4-TSΔFを得た。pSeV18+DGFP(HNL)HSV-TK/PmiR302T4-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP(HNL)HSV-TK/PmiR302T4-TSΔFと称す。【０１５５】
28）SeV(PF)DGFP/TSΔM-Fct14(uPA#2)ベクターの構築
pSeV18+（WO97/16539）を鋳型にAsiSI-F-N（5’- ATATGCGATCGCAAACATGACAGCATATATCCAGAGATCACAG -3’）（配列番号：102）およびF-SwaI-C（5’- CAATTTAAATTCATCTTTTCTCAGCCATTG -3’）（配列番号：103）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AsiSI-F-SwaI断片を得た。次にpSeV18+/PLmutTSΔFを鋳型にF-SwaI-N（5’- GAAAAGATGAATTTAAATTGTGCACCCATC -3’）（配列番号：104）およびPacI-C（5’- ATATTTAATTAACCAAGCACTCACAAGGG -3’）（配列番号：105）のプライマーを用いてPCR反応を行い、F-SwaI-PacI断片を得た。次にAsiSI-F-SwaI断片および、F-SwaI-PacI断片を鋳型にAsiSI-F-NおよびPacI-Cのプライマーを用いてPCR反応を行い、AsiSIおよびPacIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFver2にクローニングし、pSeV18+/PLmutTSΔM-SwaIを得た。次にpSeV18+/PLmutTSΔM-SwaIを鋳型にAsiSI-F-NおよびF-SwaI-Cver2（5’- GTGCACATTTAAATTCATCTTTTCTCAGCC -3’）（配列番号：106）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AsiSI-F-SwaIver2断片を得た。次にpSeV18+/PLmutTSΔM-SwaIを鋳型にF-SwaI-Nver2（5’- ATGAATTTAAATGTGCACCCATCAGAGACC -3’）（配列番号：107）およびPacI-Cのプライマーを用いてPCR反応を行い、F-SwaI-PacIver2断片を得た。次にAsiSI-F-SwaIver2断片およびF-SwaI-PacIver2断片を鋳型にAsiSI-F-NおよびPacI-Cのプライマーを用いてPCR反応を行い、AsiSIおよびPacIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFver2にクローニングし、pSeV18+/PLmutTSΔM-SwaIver2を得た。次にpSeV18+/Fct14(uPA#2)dM-GFP（Gene Therapy (2009) 16, 392-403）を鋳型にAsiSI-Fct14(uPA#2)-N（5’- ATATGCGATCGCCACCATGACAGCATATAT -3’）（配列番号：108）およびFct14(uPA#2)-SwaI-C（5’- ATATATTTAAATTCAGCGGTCATCTGGATT -3’）（配列番号：109）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AsiSIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔM-SwaIver2にクローニングし、pSeV18+/TSΔM-Fct14(uPA#2)を得た。次にDasherGFPを鋳型にAsiSI-DGFP-N（5’- ATATGCGATCGCGACATGACTGCCCTGACCGAAGGTGC -3’）（配列番号：110）およびDGFP-EIS-AsiSI-C（5’- ATATGCGATCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTTACTGATAGGTATCGAGATCG -3’）（配列番号：111）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AsiSIで消化し、pSeV18+/TSΔM-Fct14(uPA#2)にクローニングし、pSeV18+(PF)DGFP/TSΔM-Fct14(uPA#2)を得た。pSeV18+(PF)DGFP/TSΔM-Fct14(uPA#2)ベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(PF)DGFP/TSΔM-Fct14(uPA#2)と称す。【０１５６】
29）SeV(PF)DGFP/PmiR143T2-TSΔM-Fct14(uPA#2)ベクターの構築
pSeV18+DGFP/PmiR143T2-TSΔFをAscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+(PF)DGFP/TSΔM-Fct14(uPA#2)にクローニングし、pSeV18+(PF)DGFP/PmiR143T2-TSΔM-Fct14(uPA#2)を得た。pSeV18+(PF)DGFP/PmiR143T2-TSΔM-Fct14(uPA#2)ベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV(PF)DGFP/PmiR143T2-TSΔM-Fct14(uPA#2)と称す。【０１５７】
30）SeV18+KLF4/PmiR367T1-TSΔFベクターの構築
pSeV18+KLF4/TSΔF（WO2010/008054）をNotIで消化し、得られたKLF4-NotI断片を pSeV18+DGFP/PmiR367T1-TSΔFにクローニングし、pSeV18+KLF4P/PmiR367T1-TSΔFを得た。pSeV18+KLF4P/PmiR367T1-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+KLF4P/PmiR367T1-TSΔFと称す。【０１５８】
31）SeV18+KLF4/PmiR367T2-TSΔFベクターの構築
KLF4-NotI断片を pSeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔFにクローニングし、pSeV18+KLF4P/PmiR367T2-TSΔFを得た。pSeV18+KLF4P/PmiR367T2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+KLF4P/PmiR367T2-TSΔFと称す。【０１５９】
32）SeV18+KLF4/PmiR367T2m2-TSΔFベクターの構築
KLF4-NotI断片を pSeV18+DGFP/PmiR367T2m2-TSΔFにクローニングし、pSeV18+KLF4P/PmiR367T2m2-TSΔFを得た。pSeV18+KLF4P/PmiR367T2m2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+KLF4P/PmiR367T2m2-TSΔFと称す。【０１６０】
33）SeV18+KLF4/PmiR302T2-TSΔFベクターの構築
KLF4-NotI断片をpSeV18+DGFP/PmiRTx2-TSΔFにクローニングし、pSeV18+KLF4P/PmiR302T2-TSΔFを得た。pSeV18+KLF4P/PmiR302T2-TSΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+KLF4P/PmiR302T2-TSΔFと称す。【０１６１】
34）SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔFベクターの構築
まず、pSeV18+/PLmutTS12ΔFの構築を以下の通り行った。pSeV18+/TS12ΔF（WO2010/008054）を鋳型にAscI-N（5’- ATTGGCGCGCCAAGGTACTTGATCCGTAG -3’）（配列番号：112）およびP-SbfI-C（5’- AATCCTGCAGGATCTAGTTGGTCAGTGAC -3’）（配列番号：113）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+/PLmutTSΔFver2にクローニングし、pSeV18+/PLmutTS12ΔFver2を得た。【０１６２】
人工遺伝子合成により合成したP遺伝子(sP)（配列番号：114）を鋳型にAsiSI-sP4Cmut-N（5’- GCGATCGCGCCACCATGGATCAAGACGCCT -3’）（配列番号：115）およびsP4Cmut-miR367T2-C1（5’- AATGGTGATAATCCACCAAGCTTCTATCTATCAATTGGTCAGGC -3’）（配列番号：116）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AsiSI-sPmiR367T2-C1断片を得た。次にAsiSI-sPmiR367T2-C1断片を鋳型にAsiSI-sP4Cmut-NおよびmiR367T2-C2ver3（5’- TCTTACTCGACTGAATTGCACTTTAGCAATGGTGAATCGAATTGCACTTTAGCAATGGTGATAATCCACC -3’）（配列番号：117）のプライマーを用いてPCR反応を行い、AsiSI-sPmiR367T2-C2断片を得た。次にAsiSI-sPmiR367T2-C2断片を鋳型にAsiSI-sP4Cmut-NおよびmiR-EIS-AsiSI-C（5’- GCGATCGCGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTCGACTGAATTGCACTT -3’）（配列番号：118）のプライマーを用いてPCR反応を行い、pGEM-T Easyにクローニングし、sPmiR367T2-AsiSIを得た。次にsPmiR367T2-AsiSIをAsiSIで消化し、pSeV18+/PLmutTS12ΔFver2にクローニングし、pSeV18+/PsPmiR367T2-TS12ΔFを得た。次にDGFP-NotI断片をpSeV18+/PsPmiR367T2-TS12ΔFにクローニングし、pSeV18+DGFP/PsPmiR367T2-TS12ΔFを得た。次にpSeV18+DGFP/PsPmiR367T2-TS12ΔFおよびpSeV(HNL)cMYC/TS15ΔF（WO2010/008054）をMluIおよびPacIで消化し、接合し、pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔFを得た。、pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔFと称す。【０１６３】
35）SeV18+DGFP(HNL)cMYC/Pd2sPmiR367T2-TS15ΔFベクターの構築
pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔFをAscIおよびPacIで消化し、pSeV18+d2AG/d2PTS15ΔF（WO2016/125364）をAscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PsPmiR367T2-TS15ΔFをSbfIおよびPacIで消化し、これらを接合し、pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/Pd2sPmiR367T2-TS15ΔFを得た。pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/Pd2sPmiR367T2-TS15ΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP(HNL)cMYC/Pd2sPmiR367T2-TS15ΔFと称す。【０１６４】
36）SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PddsPmiR367T2-TS15ΔFベクターの構築
pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔFをAscIおよびPacIで消化し、pSeV18+d2AG/PddTS15ΔF（WO2016/125364）をAscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PsPmiR367T2-TS15ΔFをSbfIおよびPacIで消化し、これらを接合し、pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PddsPmiR367T2-TS15ΔFを得た。pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PddsPmiR367T2-TS15ΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PddsPmiR367T2-TS15ΔFと称す。【０１６５】
37）SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PtetRsPmiR367T2-TS15ΔFベクターの構築
pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔFをAscIおよびPacIで消化し、pSeV18+d2AG/PtetRTS15ΔF（WO2016/125364）をAscIおよびSbfIで消化し、pSeV18+DGFP/PsPmiR367T2-TS15ΔFをSbfIおよびPacIで消化し、これらを接合し、pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PtetRsPmiR367T2-TS15ΔFを得た。pSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PtetRsPmiR367T2-TS15ΔFベクターの転写産物から作製したセンダイウイルスをSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PtetRsPmiR367T2-TS15ΔFと称す。【０１６６】
なお実施例1〜7においては、特に別途記載しない限り、マイクロRNA標的配列（miR-302標的配列）を1つ持つ配列（miR302T1）を付加したものを「miRTx1」、2回繰り返した配列（miR302T2）を付加したものを「miRTx2」（図5においてはそれぞれ「miRT(x1)」および「miRT(x2)」）と表記し、4回繰り返した配列（miR302T4）を付加したものを「miRT」と表記した。【０１６７】
[実施例1]
HeLa細胞を1x105 cells/wellで12well plateに播種し、BJ細胞由来のiPS細胞を12well plateに播種した。SeV18+DGFP/TSΔF（DGFP）、miR-302 clusterの標的配列を4回繰り返したmiR302T4を付加したベクターであるSeV18+DGFPmiRT/TSΔF（DGFPmiRT）、SeV18+DGFP/PmiRT-TSΔF（PmiRT）、SeV18+DGFP/LmiRT#1-TSΔF（LmiRT#1）、SeV18+DGFP/LmiRT#2-TSΔF（LmiRT#2）を35℃でHeLa細胞およびiPS細胞にMOI=5で感染させ、day1で蛍光顕微鏡による観察、および蛍光プレートリーダーによる測定を行った。その結果、HeLa細胞においてはDGFP、DGFPmiRT、PmiRT、LmiRT#1、LmiRT#2の蛍光が観察されたのに対し、miR-302を発現するiPS細胞においてはDGFPmiRTとPmiRTの蛍光消失が観察された。一方、L遺伝子にmiR-302T4を付加したLmiRT#1ベクターはmiR-302を発現するiPS細胞でDGFPの蛍光増大が観察された。さらにマイクロRNA標的配列の搭載位置をL遺伝子のより3’側にずらしたLmiRT#2はDGFPに比べ6.5倍の蛍光を観察した（図2）。【０１６８】
[実施例2]
iPS細胞に35℃でPmiRT、LmiRT#1、LmiRT#2を感染し、day1で蛍光発現を観察後、37℃で22日間培養した。Day22でSeV抗体染色を行うと、PmiRTはSeV抗体陰性、LmiRT#1およびLmiRT#2はSeV抗体陽性であった（図3）。【０１６９】
[実施例3]
HeLa細胞およびiPS細胞にDGFP、PmiRT、SeV18+DGFP/NPmiRT-TSΔF（NPmiRT）、SeV18+DGFP/PmiRTtag-TSΔF（PmiRTtag）、SeV18+DGFP/PmiRT-TS12ΔF（PmiRT/TS12）、SeV18+DGFP/PmiRT-TS15ΔF（PmiRT/TS15）を35℃で感染させ、day1で蛍光顕微鏡による観察、MetaMorph（Molecular Devices社）による画像解析を行った。その結果、HeLa細胞においてはDGFP、NPmiRT、PmiRT、PmiRTtag、PmiRT/TS12、PmiRT/TS15の蛍光が観察されたのに対し、iPS細胞においてはNP遺伝子にmiR-302T4を付加したNPmiRTはマイクロRNA標的配列を付加していないDGFPと比較して4割程度に発現が抑制されたが、P遺伝子に付加した場合と比較すると弱い発現抑制であった。P遺伝子のコード領域にmiR-302T4を付加したPmiRTtagはDGFPと比較して1割以下の蛍光であり、PmiRTと同等の発現抑制効果が得られた。温度感受性の強化されたTS12とTS15骨格のPmiRTにおいてもTS骨格のPmiRTと同等の発現抑制効果が得られた（図4）。【０１７０】
[実施例4]
HeLa細胞およびiPS細胞にDGFP、SeV18+DGFP/PmiRTx2-TSΔF（PmiRTx2）、SeV18+DGFP/PmiRTx1-TSΔF（PmiRTx1）を35℃で感染させ、day1およびday2で蛍光顕微鏡による観察、MetaMorphによる画像解析を行った。その結果、HeLa細胞においてはDGFP、PmiRTx2、PmiRTx1の蛍光が観察されたのに対し、iPS細胞においてはday1でDGFPと比較してPmiRTx2の蛍光が4割以下に低下し、day2でPmiRTx2の蛍光は1割以下に低下した。PmiRTx1の蛍光もday2でDGFPの3割以下への低下が観察された（図5）。P遺伝子にmiR-302の標的配列を2回繰り返したmiR302T2を付加したPmiRTx2とmiR-302の標的配列が1つであるmiR302T1を付加したPmiRTx1も発現抑制効果示した。PmiRTx2は培養時間を延長したday2でマイクロRNA標的配列の繰り返し数が4回のPmiRTと同等の発現抑制効果を示した。【０１７１】
[実施例5]
HeLa細胞およびiPS細胞にDGFP、SeV18+DGFP/PmiR367T2-TSΔF（PmiR367T2）を35℃で感染させ、day1で蛍光顕微鏡による観察を行った。PmiR367T2 はP遺伝子にmiR-367の標的配列を2回繰り返したmiR367T2を付加した。その結果、HeLa細胞においてはDGFP、PmiR367T2の蛍光が観察されたのに対し、iPS細胞においてはDGFPと比較して PmiR367T2の蛍光低下が観察された（図6）。これはiPS細胞で発現するmiR-302 cluster以外のマイクロRNA標的配列でも効果が得られることを示している。【０１７２】
[実施例6]
HeLa細胞および血管内皮細胞であるHUVECにDGFP、SeV18+DGFP/PmiR126T2-TSΔF（PmiR126T2）（P遺伝子にmiR-126の標的配列を2回繰り返したmiR126T2を付加したベクター）を35℃で感染させ、day1で蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、HeLa細胞においてはDGFP、PmiR126T2の蛍光が観察されたのに対し、HUVECにおいてはDGFPと比較して PmiR126T2の蛍光低下が観察された（図7）。これは中胚葉系の血管内皮細胞で発現するmiR-126の標的配列をP遺伝子に付加したPmiR126T2も発現抑制効果を示したということであり、分化細胞でそれぞれ細胞特異的に発現するマイクロRNAによりベクター制御が可能なことを示している。【０１７３】
[実施例7]
HeLa細胞およびiPS細胞にSeV18+DGFP/PmiRT-ΔF（PmiRTdF）を35℃および38.5℃で感染させ、day1で蛍光顕微鏡による観察を行った。温度感受性変異を含まないSeVベクターのP遺伝子にmiR-302T4を付加した。その結果、HeLa細胞においては35℃および38.5℃でPmiRTdFの蛍光が観察されたのに対し、iPS細胞においては35℃と比較して 38.5℃でPmiRTdFの蛍光低下が観察された（図8）。これは温度感受性変異を含まないベクターにおいてもマイクロRNA標的配列によりベクター制御が可能なことを示している。【０１７４】
[実施例8]
HeLa細胞およびiPS細胞にDGFP、SeV18+DGFP/PmiR372T2-TSΔF（PmiR372T2）を35℃で感染させ、day2で蛍光顕微鏡による観察を行った。PmiR372T2 はP遺伝子にmiR-372の標的配列を2回繰り返したmiR372T2を付加した。その結果、HeLa細胞においてはDGFP、PmiR372T2の蛍光が観察されたのに対し、iPS細胞においてはDGFPと比較して PmiR372T2の蛍光低下が観察された（図9A）。これはiPS細胞で発現するmiR-302 cluster以外のマイクロRNA標的配列でも効果が得られることを示している。【０１７５】
[実施例9]
HeLa細胞およびBJ細胞にDGFP、SeV18+DGFP/PmiR143T2-TSΔF（PmiR143T2）を37℃で感染させ、day2で蛍光顕微鏡による観察を行った。PmiR143T2はP遺伝子にmiR-143の標的配列を2回繰り返したmiR143T2を付加した。その結果、HeLa細胞においてはDGFP、PmiR143T2の蛍光が観察されたのに対し、BJ細胞においてはDGFPと比較して PmiR143T2の蛍光低下が観察された（図9B）。BJ細胞はがん化していない正常細胞のモデルとして用いており、これは正常細胞で発現するmiR-143の標的配列をP遺伝子に付加したPmiR143T2も発現抑制効果を示したということであり、正常細胞とがん細胞で発現が異なるマイクロRNAによりベクター制御が可能なことを示している。【０１７６】
[実施例10]
HeLa細胞およびラット肝細胞にDGFP、SeV18+DGFP/PmiR122T2-TSΔF（PmiR122T2）を37℃で感染させ、day1で蛍光顕微鏡による観察を行った。PmiR122T2はP遺伝子にmiR-122の標的配列を2回繰り返したmiR122T2を付加した。その結果、HeLa細胞においてはDGFP、PmiR122T2の蛍光が観察されたのに対し、肝細胞においてはDGFPと比較してPmiR122T2の蛍光低下が観察された（図9C）。これは内胚葉系の肝細胞で発現するmiR-122の標的配列をP遺伝子に付加したPmiR122T2も発現抑制効果を示したということであり、分化細胞でそれぞれ細胞特異的に発現するマイクロRNAによりベクター制御が可能なことを示している。【０１７７】
[実施例11]
HeLa細胞およびSH-SY5Y細胞にDGFP、SeV18+DGFP/PmiR218T2-TSΔF（PmiR218T2）を35℃で感染させ、day1で蛍光顕微鏡による観察を行った。PmiR218T2はP遺伝子にmiR-218の標的配列を2回繰り返したmiR218T2を付加した。その結果、HeLa細胞においてはDGFP、PmiR218T2の蛍光が観察されたのに対し、SH-SY5Y細胞においてはDGFPと比較して PmiR218T2の蛍光低下が観察された（図9D）。神経芽細胞腫由来であるSH-SY5Y細胞は神経細胞モデルとして用いられており、これは外胚葉系の神経細胞で発現するmiR-218の標的配列をP遺伝子に付加したPmiR218T2も発現抑制効果を示したということであり、分化細胞でそれぞれ細胞特異的に発現するマイクロRNAによりベクター制御が可能なことを示している。【０１７８】
[実施例12]
SH-SY5Y細胞および10μM レチノイン酸（RA）、10% FBS、DMEM/F12で3日間神経分化させたSH-SY5Y細胞にDGFP、SeV18+DGFP/PmiR124T2-TSΔF（PmiR124T2）、SeV18+DGFP/PmiR138T2-TSΔF（PmiR138T2）を35℃で感染させ、day3で蛍光顕微鏡による観察を行った。神経分化細胞は感染と同時に10μM RA、2%FBS、DMEM/F12に培地交換し、翌日10ng/mL BDNF、無血清のDMEM/F12に培地交換した。PmiR124T2 およびPmiR138T2はP遺伝子にmiR-124およびmiR-138の標的配列を2回繰り返したmiR124T2およびmiR138T2を付加した。その結果、分化していないSH-SY5Y細胞においてはDGFP、PmiR124T2、PmiR138T2の蛍光が観察されたのに対し、神経分化したSH-SY5Y細胞においてはDGFPと比較してPmiR124T2およびPmiR138T2の蛍光低下が観察された（図10）。これは分化した神経細胞で発現するmiR-124およびmiR-138の標的配列をP遺伝子に付加したPmiR124T2、PmiR138T2も発現抑制効果を示したということであり、分化段階の異なる細胞でそれぞれ細胞特異的に発現するマイクロRNAによりベクター制御が可能なことを示している。PmiR218T2は未分化な神経細胞モデルで、PmiR124T2およびPmiR138T2は分化した神経細胞モデルで発現抑制効果を示した。【０１７９】
[実施例13]
HeLa細胞およびiPS細胞にDGFP、SeV18+DGFP/PmiR367T1-TSΔF（PmiR367T1）、SeV18+DGFP/miR367T1-P-TSΔF（miR367T1-P）、SeV18+DGFP/miR367T1-NP-TSΔF（miR367T1-NP）、SeV18+DGFP/miR367T1-L-TSΔF（miR367T1-L）を37℃で感染させ、day5で蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果miR367T1-Lは細胞特異的な発現抑制効果を示さなかった。HeLa細胞においてはDGFP、miR367T1-NP、miR367T1-P、PmiR367T1の同程度の蛍光が観察され、iPS細胞においてはmiR367T1-NP、miR367T1-P、およびPmiR367T1の発現が抑制された（図11）。iPS細胞におけるL遺伝子の5’側に対するマイクロRNA標的配列の付加はP遺伝子の場合と異なり、細胞特異的な発現抑制効果を示さない場合があった。P遺伝子の5’側に対するmiR-367標的配列の付加は3’側と比べて弱い発現抑制効果を示した。【０１８０】
[実施例14]
HeLa細胞およびiPS細胞にDGFP、PmiR367T1、PmiR367T2、SeV18+DGFP/PmiR367T2m1-TSΔF（PmiR367T2m1）、SeV18+DGFP/PmiR367T2m2-TSΔF（PmiR367T2m2）、SeV18+DGFP/PmiR367T2m3-TSΔF（PmiR367T2m3）SeV18+DGFP/PmiR367T2m4-TSΔF（PmiR367T2m4）を37℃で感染させ、day1〜5で蛍光顕微鏡による観察を行った（図12）。その結果、day5のHeLa細胞においては同程度の蛍光発現を示したのに対し、iPS細胞ではPmiR367T2＞PmiR367T2m1＞PmiR367T1＞PmiR367T2m2＞PmiR367T2m3＞PmiR367T2m4の順で細胞特異的な発現抑制効果を示した（図13、14）。iPS細胞において1塩基の変異を導入したPmiR367T2m1はPmiR367T2に比べ、僅かに発現抑制効果が減弱した。2塩基以上の変異を導入したPmiR367T2m2、PmiR367T2m3、およびPmiR367T2m4はiPS細胞においてday2に発現上昇後、day5で発現抑制効果を示した。これはマイクロRNA標的配列の繰り返し数に加えて、標的配列に1つ以上の変異を導入することで発現抑制程度が制御可能なことを示している。【０１８１】
[実施例15]
iPS細胞にDGFP、PmiR367T2、あるいはDGFP とPmiR367T2（共感染）を37℃で感染させ、day3で蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、HeLa細胞では同程度の蛍光発現が観察されたのに対し、iPS細胞においてはDGFPと共感染させたPmiR367T2により発現抑制が観察された（図15）。これはマイクロRNA標的配列搭載ベクターと共感染させたベクターの発現も制御可能なことを示している。【０１８２】
[実施例16]
HeLa細胞およびiPS細胞にDGFPおよびSeV18+DGFP(HNL)HSV-TK/PmiR302T4-TSΔF（HSV-TK/PmiR302T4）を37℃で感染させ、day1で蛍光顕微鏡による観察を行った。次に、これらの細胞に対してday2に25〜100μg/mLガンシクロビル（GCV）を添加し、day5に蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、day1のiPS細胞においてHSV-TK/PmiR302T4の細胞特異的な発現抑制が観察された（図16A）。GCVを添加したday5のHeLa細胞において、DGFP感染細胞では100μg/mLのGCVでも影響が観察されなかったのに対し、HSV-TK/PmiR302T4を感染させた細胞は25μg/mLのGCVで全滅していた（図16B）。これはマイクロRNAによりベクターが除去されなかった細胞も自殺遺伝子を併用することで除去可能なことを示している。【０１８３】
[実施例17]
BJ細胞およびPC-3細胞にSeV(PF)DGFP/TSΔM-Fct14(uPA#2)（BioKnife）、SeV(PF)DGFP/TSΔM-PmiR143T2Fct14(uPA#2)（BioKnife/PmiR143T2）を37℃で感染させ、day2で顕微鏡および蛍光顕微鏡による観察を行った。次に、Cell Counting Kit-8（DOJINDO LABORATORIES）を用いてday3の細胞傷害性を測定した。その結果、BioKnifeおよびBioKnife/PmiR143T2を感染させたPC-3細胞では細胞融合と細胞融解が観察された（図17AおよびB）。BJ細胞はday3においてBioKnifeの感染によって細胞傷害性が観察された。それに対してBioKnife/PmiR143T2を感染させたBJ細胞では蛍光発現だけでなく細胞傷害性も抑制された（図17B〜D）。これはマイクロRNA標的配列により癌細胞に対する発現選択性を高め、正常細胞への影響を抑えつつ、癌細胞が破壊可能なことを示している。【０１８４】
[実施例18]
BJ細胞にSeV18+KLF4/TSΔF（KLF4）、SeV(PM)KOS/TS12ΔF（KOS）、およびSeV18+DGFP(HNL)cMYC/TS15ΔF（cMYC）の組み合わせ（WO2015/046229）、あるいはKLF4の代わりにSeV18+KLF4/PmiR367T1-TSΔF（KLF4-PmiR367T1）、SeV18+KLF4/PmiR367T2-TSΔF（KLF4-PmiR367T2）、SeV18+KLF4/PmiR367T2m2-TSΔF（KLF4-PmiR367T2m2）、SeV18+KLF4/PmiR302T2-TSΔF（KLF4-PmiR302T2）のうち1つを37℃で共感染させ、iPS細胞の作製を行った。Day6でマトリゲル上に播種、day21でアルカリホスファターゼ（ALP）染色、蛍光顕微鏡による観察を経時的に行った。その結果、day21でALP陽性のiPS細胞が得られた（図18）。KLF4、KLF4-PmiR367T1、KLF4-PmiR367T2、KLF4-PmiR367T2m2を比較すると、day2において蛍光発現は同程度であったが、day21において最も蛍光発現が低下していたのはKLF4-PmiR367T2であった（図19A）。KLF4、KLF4-PmiR367T2、KLF4-PmiR302T2を比較すると、day21においてKLF4-PmiR367T2およびKLF4-PmiR302T2の蛍光はKLF4に比べて20%以下であった（図19B）。Day35においてKLF4とKLF4-PmiR302T2を比較すると、KLF4-PmiR302T2はKLF4の蛍光シグナルの1/84であった。これはiPS細胞作製用のベクターにマイクロRNA標的配列を搭載することで、細胞初期化に際して発現するマイクロRNAによりベクター除去が促進されることを示している。【０１８５】
[実施例19]
HeLa細胞およびiPS細胞にDGFP、SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PsPmiR367T2-TS15ΔF（cMYC/PsPmiR367T2）、SeV18+DGFP(HNL)cMYC/Pd2sPmiR367T2-TS15ΔF（cMYC/Pd2sPmiR367T2）SeV18+DGFP(HNL)cMYC/PddsPmiR367T2-TS15ΔF（cMYC/PddsPmiR367T2）、あるいはSeV18+DGFP(HNL)cMYC/PtetRsPmiR367T2-TS15ΔF（cMYC/PtetRsPmiR367T2）を35℃あるいは37℃で感染させ（ベクター構造は図20A）、day1〜3で蛍光顕微鏡による観察を行った。その結果、day3のiPS細胞において35℃で感染させたcMYC/PsPmiR367T2は十分な発現を示したのに対し、35℃で感染させたcMYC/PsPmiR367T2は発現抑制が観察された（図20B）。Degronを付加したベクターであるcMYC/Pd2sPmiR367T2、cMYC/PddsPmiR367T2、あるいはcMYC/PtetRsPmiR367T2を37℃で感染させると、特異的マイクロRNAを発現していないHeLa細胞においては十分な発現が観察されたのに対し、特異的マイクロRNAを発現するiPS細胞においては速やかな除去が観察された（図21）。これはP遺伝子を2つ搭載し、一方を温度制御あるいはdegron制御し、他方をマイクロRNA標的配列によって制御が可能なベクターであること示している。通常、TS15骨格のベクターは37℃で感染させると十分な発現が得られないが、同時搭載するP遺伝子を37℃で発現可能な配列（TS骨格のP蛋白質）とすることにより、37℃で感染可能で、感染後の細胞改変に伴って発現が上昇するマイクロRNAによりTS骨格のP遺伝子が不活化され、degronが付加された他方のP蛋白質によりベクターが除去されるシステムが得られる。【０１８６】
[実施例20]
BJ細胞にKOSおよびcMYCの組み合わせ、あるいはcMYCの代わりにcMYC/PsPmiR367T2またはcMYC/Pd2sPmiR367T2のうち1つを37℃で感染させ、iPS細胞の作製を行った。Day6でフィーダー細胞（マウス線維芽細胞）上に播種、day21でALP染色、蛍光顕微鏡による観察を経時的に行った。その結果、day2でKOSおよびcMYCの組み合わせの蛍光発現が観察されなかったのに対し、cMYC/PsPmiR367T2あるいはcMYC/Pd2sPmiR367T2の蛍光発現が観察された（図22A）。Day21でALP陽性のiPS細胞が得られた（図22B）。KOSおよびcMYCの組み合わせではiPS細胞が得られなかったが、P遺伝子を2つ搭載したベクターではiPS細胞が得られた。そしてday21において、cMYC/PsPmiR367T2に比べdegronが付加されたcMYC/Pd2sPmiR367T2の蛍光発現低下を観察した（図22C）。これはP遺伝子を2つ搭載するベクター用いることにより、37℃で感染が可能で目的の細胞が得られた後にベクターが除去されるシステムが得られたことを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１８７】
本発明により、マイクロRNAの発現に依存してベクターの発現や除去を制御することが可能となった。本発明のベクターは、細胞の分化誘導やiPS細胞の作製において、目的を達した後に速やかにベクターの発現を低下させ、ベクターを除去するために有用である。また、腫瘍細胞に特異的なマイクロRNAにより発現が上昇するベクターを用いれば、腫瘍を標的とするベクターの導入において、腫瘍においてより特異的にベクターを発現・増殖させることが可能である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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