(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便な手段で且つ高い抽出効率で有機酸を抽出する方法の提供。【解決手段】有機酸の製造方法であって、１．発酵により有機酸を生産し、ｐＨが１〜５である有機酸含有粗液を得る工程、及び２．工程１で得られた有機酸含有粗液から有機酸を含む抽出液を得る工程、を含み、工程２が、（ｉ）工程１で得られた有機酸含有粗液から有機抽出媒体により有機酸を抽出して抽出液（ｉ）を得る工程、前記抽出液（ｉ）から水により有機酸を抽出して抽出液（ｉｉ）を得る工程、および、少なくとも一の、コアレッサーを用いる液滴凝集工程を含むことを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸の製造方法であって、
１．発酵により有機酸を生産し、ｐＨが１〜５である有機酸含有粗液を得る工程、及び
２．工程１で得られた有機酸含有粗液から有機酸を含む抽出液を得る工程、
を含み、
工程２が、少なくとも一の、コアレッサーを用いる液滴凝集工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記工程２が、
（ｉ）工程１で得られた有機酸含有粗液から有機抽出媒体により有機酸を抽出して抽出液（ｉ）を得る工程、
を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程２が、
（ｉｉ）前記抽出液（ｉ）から水により有機酸を抽出して抽出液（ｉｉ）を得る工程、
をさらに含む請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程（ｉ）における前記抽出が、乳化抽出により行わる、請求項２又は３記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉｉ）における前記抽出が、乳化抽出により行われる、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｉ）において、前記抽出後の、前記有機酸含有祖液と前記有機抽出媒体との混合物が、コアレッサーを用いる液滴凝集工程に付される、請求項２〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｉｉ）において、前記抽出後の、該抽出液（ｉ）と該水との混合物が、コアレッサーを用いる液滴凝集工程に付される、請求項３〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
有機抽出媒体がエステル化合物を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記エステル化合物が、炭素数１０〜３０のジエステル化合物である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記ジエステル化合物が、フマル酸ビス（２−エチルヘキシル）、セバシン酸ビス（２−エチルヘキシル）、イタコン酸ビス（２−エチルヘキシル）、アゼライン酸ビス（２−エチルヘキシル）、及びマレイン酸ビス（２−エチルヘキシル）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
有機抽出媒体がアルキルアミン化合物をさらに含む、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルキルアミン化合物が、炭素数１５〜３９のトリアルキルアミンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記トリアルキルアミンが、トリヘキシルアミン、トリオクチルアミン、トリデシルアミン、及びトリドデシルアミンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉ）が、０〜４０℃で行われる、請求項２〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｉｉ）が、６０〜９０℃で行われる、請求項３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸の製造方法に関し、詳細には発酵により産出された有機酸を培養液から効率的に抽出する工程を含む、有機酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機酸、例えば乳酸、コハク酸等は、医薬、農薬、化粧品等の種々の用途において使用されている。有機酸の製造方法としては、発酵法が古くから用いられている。一般に、有機酸生産菌は生産される有機酸による発酵阻害があるので、発酵液にアルカリを加えてｐＨを中性付近に調整しながら発酵を行うことが多い。その場合、有機酸は中和剤の塩として回収される。例えば、乳酸は、乳酸アンモニウムとして、鉱酸とアルキル化アミンにより抽出される（特許文献１）。しかし、このような中和操作は煩雑であるし、有機酸塩から有機酸に戻す工程も必要となるため、製造コストが高い。
【０００３】
そこで、酸性条件下で発酵を行うことができる耐酸性を付与された菌、例えば耐酸性微生物を宿主とした形質転換体、を用いて発酵を行うことが提案されている（特許文献２）。この場合、有機酸は、酸の形態で回収することができる。該回収方法としては、例えば、非水混和性アミンと非水混和性有機酸の混合物で抽出する方法（特許文献３）、含酸素飽和複素環式化合物で抽出する方法（特許文献４）、水と共沸する溶媒で抽出する方法（特許文献５）が知られている。第１の方法では、抽出と逆抽出を同じ温度にするために非水混和性有機酸の使用を要する。さらに、該有機酸とアミンの混合割合が限定された範囲でなければならず、且つ、該範囲を、製造される有機酸に応じて変更しなければならないので、実際的ではない。第２番目の方法では、含酸素飽和複素環式化合物として、テトラヒドロフラン等が使用されているが、このような親水性溶剤では発酵液に含まれる有機酸以外の親水性物質も抽出されてしまう。第３番目の方法では、水と共沸する溶剤として、例えばメタノール、エタノール等の低級アルコールが使用されるが、精製工程で、これらの抽出用アルコールを大量に除去しなければならず、エステル化の問題もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１０−５３９９１１
【特許文献２】国際公開２０１１／０２１６２９号
【特許文献３】特公昭５９−４０３７５号公報
【特許文献４】特開平８−３３７５２号公報
【特許文献５】国際公開２００７／１１４０１７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本出願は上記諸問題が無く、有機酸を効率的に回収することができる方法、特に、簡便な手段を用いて高い効率で有機酸抽出液を得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
即ち、本発明は、下記［１］〜［１５］に記載する有機酸の製造方法である：
［１］有機酸の製造方法であって、
１．発酵により有機酸を生産し、ｐＨが１〜５である有機酸含有粗液を得る工程、及び
２．工程１で得られた有機酸含有粗液から有機酸を含む抽出液を得る工程、
を含み、
工程２が、少なくとも一の、コアレッサーを用いる液滴凝集工程を含むことを特徴とする方法。
［２］前記工程２が、
（ｉ）工程１で得られた有機酸含有粗液から有機抽出媒体により有機酸を抽出して抽出液（ｉ）を得る工程、
を含む上記［１］記載の方法。
［３］前記工程２が、
（ｉｉ）前記抽出液（ｉ）から水により有機酸を抽出して抽出液（ｉｉ）を得る工程、
をさらに含む上記［２］記載の方法。
［４］工程（ｉ）における前記抽出が、乳化抽出により行わる、上記［２］又は［３］記載の方法。
［５］工程（ｉｉ）における前記抽出が、乳化抽出により行われる、上記［３］又は［４］記載の方法。
［６］前記工程（ｉ）において、前記抽出後の、前記有機酸含有祖液と前記有機抽出媒体との混合物が、コアレッサーを用いる液滴凝集工程に付される、上記［２］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記工程（ｉｉ）において、前記抽出後の、該抽出液（ｉ）と該水との混合物が、コアレッサーを用いる液滴凝集工程に付される、上記［３］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］有機抽出媒体がエステル化合物を含む、上記［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］前記エステル化合物が、炭素数１０〜３０のジエステル化合物である、上記［８］記載の方法。
［１０］前記ジエステル化合物が、フマル酸ビス（２−エチルヘキシル）、セバシン酸ビス（２−エチルヘキシル）、イタコン酸ビス（２−エチルヘキシル）、アゼライン酸ビス（２−エチルヘキシル）、及びマレイン酸ビス（２−エチルヘキシル）からなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記［９］に記載の方法。
［１１］有機抽出媒体がアルキルアミン化合物をさらに含む、上記［２］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］前記アルキルアミン化合物が、炭素数１５〜３９のトリアルキルアミンである、上記［１１］に記載の方法。
［１３］前記トリアルキルアミンが、トリヘキシルアミン、トリオクチルアミン、トリデシルアミン、及びトリドデシルアミンからなる群より選ばれる少なくとも１種である、上記［１２］に記載の方法。
［１４］工程（ｉ）が、０〜４０℃で行われる、上記［２］〜［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］工程（ｉｉ）が、６０〜９０℃で行われる、上記［３］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法によれば、抽出工程後の相分離を、比較的簡便な手段によって効率的に行うことができる。さらに、乳化状の液も問題なく分離できるので、乳化抽出と組み合わせることで、全体として抽出時間を短縮することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明において「発酵」とは、微生物に目的化合物（有機酸）を生産させることを意味する。
本発明において、「有機酸」はカルボキシル基を有する有機化合物であればよく、例えば乳酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、グルタル酸、および、アジピン酸等が挙げられる。なかでも、広い用途を有する点で、乳酸が好ましい。これらの有機酸は、Ｄ体、Ｌ体、ＤＬ体のいずれであってもよく、また、オリゴマー、即ち、重合度２〜１５程度のポリマー、を形成していても良い。
【０００９】
工程１の発酵は、微生物により有機酸が生産されれば、該有機酸のみが生産されるホモ型発酵であっても、該有機酸以外にエタノール等が生産されるヘテロ型であってもよい。
【００１０】
微生物は、野生型及び遺伝子組み換え型のいずれのものであってもよい。野生型微生物としては、例えば、ストレプトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属、及びラクトバチルス属等の乳酸発酵菌；アネロビオスピリリウム属、及びコリネバクテリウム属等のコハク酸発酵菌が挙げられる。
遺伝子組換え型微生物としては、遺伝子組換え乳酸生産酵母が挙げられ、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）を宿主とし、乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ該宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している、形質転換体（特許文献２）、サッカロミセス属の酵母等の耐酸性微生物を宿主とし、該耐酸性微生物に乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を導入した形質転換体（特開２００１−２０４４６４号公報）、及び乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が導入され、かつピルビン酸脱炭酸酵素１をコードする遺伝子を欠失または失活させたサッカロミセス・セレビシエ（出芽酵母）（特開２００８−４８７２６号公報）等が挙げられる。これらのうち、ｐＨを中性付近に調整することを必要とせずに高い生産性で乳酸を生産できる点で、シゾサッカロミセス・ポンベを宿主とし、乳酸脱水素酵素遺伝子が組み込まれ、かつ該宿主のピルビン酸脱炭酸酵素をコードする遺伝子群の一部が欠失または失活している、形質転換体が好ましい。
【００１１】
発酵に用いる発酵液は、特に限定されず、目的とする有機酸の生産に適するＮａ、Ｋ等の基本的無機塩類、及び炭素源を含めばよい。また必要に応じて、窒素源、及びアミノ酸等の成分を含んでいてもよい。発酵液は、天然、合成または半合成発酵液のいずれであってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖が挙げられる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等の無機酸または有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、カザミノ酸、イーストエキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウム等が挙げられる。さらには、プロテオリピドなどの発酵促進因子などを配合することができる。
【００１２】
好ましくは、糖としてグルコースを用いる。発酵初期の発酵液（１００質量％）中のグルコース濃度は１質量％以上が好ましく、１〜２５質量％がより好ましく、２〜１６質量％がさらに好ましい。発酵によりグルコース濃度が低下するため、必要によりグルコースを添加して発酵を継続することが好ましい。発酵終期のグルコース濃度は１質量％以下となってもよい。また、有機酸を分離しながら発酵液を循環させて連続的に発酵を行う場合には上記グルコース濃度を維持することが好ましい。グルコース濃度を２質量％以上とすることにより、有機酸の生産性がより向上する。また、発酵液中のグルコースを１６質量％以下とすることにより、有機酸の生産効率がより向上する。
【００１３】
また、生産性を高くするために、高密度発酵を行うことが好ましい。高密度発酵では、発酵液中の形質転換体の初発菌体濃度を乾燥菌体重量換算値で表して０．１〜５０ｇ／Ｌとすることが好ましく、０．２〜４０ｇ／Ｌとすることがより好ましい。初発菌体濃度を高くすることにより短時間で高い生産性を達成できる。また、初発菌体濃度があまりに高すぎると菌体の凝集や精製効率の低下などの問題が生じるおそれがある。なお、後述の実施例等で示す菌体濃度は、日本分光社製可視紫外分光器Ｖ５５０によって測定した波長６６０ｎｍの光の吸光度（ＯＤ６６０）から換算した値である。６６０ｎｍにおけるＯＤ＝１は、酵母乾燥重量の０．２ｇ／Ｌ、湿重量の０．８ｇ／Ｌに相当する。
【００１４】
発酵には公知の酵母発酵方法を用いることができ、例えば循環発酵、攪拌発酵等により行うことができる。発酵温度は、２３〜３７℃であることが好ましい。また、発酵時間は適宜決定することができる。発酵は、回分発酵であってもよく、連続発酵であってもよい。例えば、回分発酵で発酵を行った後、菌体を発酵液から分離して、有機酸を含む発酵液を取得することができる。また、連続発酵法では、例えば、発酵中の発酵槽から発酵液の一部を抜き出し、抜き出した発酵液から有機酸を分離するとともに、有機酸を分離した残りの発酵液にグルコースや新たな発酵液を加えて発酵槽に戻すことを繰り返して、連続的に発酵する方法が挙げられる。連続発酵を行うことにより、有機酸の生産性がより向上する。
【００１５】
生産された有機酸を含む有機酸含有粗液は、ｐＨが１〜５であり、好ましくは１．５〜４、特に好ましくは１．５〜３．５である。本発明の有機酸の製造方法では、発酵液への有機酸の蓄積によりｐＨが低くなっても、ｐＨ調整を行わずに有機酸を生産する。すなわち、発酵液のｐＨが低くなった後も、そのまま発酵を継続する連続発酵により有機酸を製造する。有機酸の生産性を高くするために、発酵液のｐＨが３．５以下になった後であっても、さらに発酵を継続することが好ましい。特に、上述のシゾサッカロミセス・ポンベの形質転換体は、耐酸性が優れているため、生産された有機酸を含む発酵液のｐＨを調整することなく発酵を継続することができる。
【００１６】
工程２では、工程１で得られる、有機酸を含む有機酸含有粗液を抽出媒体と接触させて抽出操作を行った後、少なくとも一の液滴凝集工程を経て、該有機酸を含む抽出液を得る。ここで、「液滴凝集」とは、小さい液滴として分散されている水相もしくは油相を、より大きな液滴へと凝集させることを意味する。一般に培養液は、界面活性剤として作用し易いイオン性の物質を含むため、抽出媒体及びその量等に応じて、水中油滴型もしくは油中水滴型の乳化物、もしくは一部乳化された混合物を形成し易く、その後の相分離が困難となる場合が多い。該乳化物もしくは混合物を液滴凝集工程に付することによって、相分離が促進され、迅速に抽出液を得ることができる。
【００１７】
液滴凝集手段としては、コアレッサーを用いる。コアレッサーは、媒体もしくはメディアと呼ばれる、複数の多孔質膜、織布又は不織布を備える。該メディアは円筒状、平膜状、又はスパイラル状の形状であってよく、プリーツを有していてもよい。一般的には、円筒形状のメディアが、縦置きもしくは横置きされた円筒形状の処理容器の中央に配置される。該円筒形状のメディアの内側から外側に向かって、上記乳化物もしくは混合物等の被処理液が通液される間に、該液中の分散された小さい液滴が次第に凝集されていく。被処理液の通液方法は限定されず、圧送もしくは重力による方法のいずれであってもよく、バッチ処理であっても連続処理であってもよい。
【００１８】
上記多孔質膜としてはポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂系、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル樹脂系もしくはポリプロピレン等のポリオレフィン樹脂系の多孔質膜等が挙げられる。織布又は不織布を構成する繊維としては、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系繊維、ポリヘキサメチレンアジパミド等のポリアミド系繊維、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素系樹脂繊維、ポリエチレン等のポリオレフィン系繊維、ガラスファイバー等が挙げられる。これらは、ポリオール、ポリカルボン酸等を用いた親水化処理、又は、フッ素樹脂、シリコーン樹脂等を用いた撥水性表面処理が施されていてもよい。市販されているコアレッサーとして、例えばアクアセップ（商標、日本ポール株式会社製）、フェーズセップ（商標、日本ポール株式会社製）、ユーテックＦＳ（商標、旭化成せんい株式会社製）などが挙げられる。
【００１９】
コアレッサーの前に、被処理液中の固形分を除去するために、被処理液をプレフィルターに通してもよい。また、コアレッサーで処理する前もしくは後に、静置分離もしくは遠心分離、解乳化剤の使用、油水分離フィルター処理等の通常の相分離工程を組み合わせてもよい。好ましくは、コアレッサーの後に、水相もしくは油相のいずれか一方のみを透過させる油水分離フィルターもしくはセパレーターを用いる。該油水分離フィルターとしては、ポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂系、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン等の塩素化樹脂系、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル樹脂系の膜、上記コアレッサーについて述べたような繊維の不織布からなるフィルターが挙げられ、これらは、親水性もしくは撥水性表面処理されていてよい。
【００２０】
前記工程２は、下記工程（ｉ）：
（ｉ）工程１で得られた有機酸含有粗液から有機抽出媒体により有機酸を抽出して、抽出液（ｉ）を得る工程、
を含む。
【００２１】
有機酸含有粗液は、そのまま抽出に付することもできるが、好ましくは、抽出に先立ち、遠心分離またはろ過等の菌体分離処理により菌体を分離する。遠心分離の条件の例としては、１０００〜５０００Ｇにおいて、１０〜１５分が挙げられる。またろ過の条件としては、公称目開きが０．１〜２μｍのろ過膜の使用が挙げられる。有機酸含有粗液の典型的な組成としては例えば、有機酸を５０〜１２０ｇ／Ｌ、糖を０．５〜２０ｇ／Ｌ、エタノールを１〜２０ｇ／Ｌ含む。
【００２２】
有機抽出媒体としては、エステル化合物が好ましく、炭素数４〜４０の脂肪族エステル及び芳香族エステルから選ばれる少なくとも一種がより好ましい。炭素数が前記範囲内のものであれば、適度な極性と沸点を備えるので、抽出効率及び後工程での除去がし易い。該エステル化合物の常圧における沸点としては、２５０℃以上が好ましい。該沸点の上限は特に限定されないが、一般的には４００℃以下である。ただし常圧における沸点が無く分解点のみが存在する場合には、分解点が２５０℃以上であることが好ましい。さらに好ましくは、炭素数１０〜３０のジエステル化合物、特に脂肪族ジエステル化合物が使用される。また脂肪族ジエステル化合物のうち、末端アルキル鎖の炭素数は４〜１０が好ましく、６〜１０がより好ましい。脂肪族ジエステル化合物としては、例えばアジピン酸ジエチル、アジピン酸ジイソノニル、アジピン酸ジイソウンデシル、アジピン酸ビス（２−エチルヘキシル）、ピメリン酸ジエチル、ピメリン酸ジデシル、ノナン酸ジエチル、ノナン酸ジオクチル、セバシン酸ジオクチル、セバシン酸ビス（２−エチルヘキシル）、セバシン酸ジブチル、アゼライン酸ビス（２−エチルヘキシル）、アゼライン酸ジヘキシル、ドデカン二酸ビス（２−エチルヘキシル）、フマル酸ジブチル、フマル酸ジノニル、フマル酸ビス（２−エチルヘキシル）、マレイン酸ジヘキシル、マレイン酸ビス（２−エチルヘキシル）、イタコン酸ジプロピル、及びイタコン酸ビス（２−エチルヘキシル）が挙げられる。これらのうち、フマル酸ビス（２−エチルヘキシル）、セバシン酸ビス（２−エチルヘキシル）、イタコン酸ビス（２−エチルヘキシル）、アゼライン酸ビス（２−エチルヘキシル）、及びマレイン酸ビス（２−エチルヘキシル）からなる群より選ばれる少なくとも１種が最も好ましい。
【００２３】
より好ましくは、該有機抽出媒体はアルキルアミン化合物を含む。該アルキルアミン化合物としては、炭素数３〜１５のアルキル基を２つもしくは３つ有するジアルキルアミン化合物もしくはトリアルキルアミン化合物が好ましい。かかるアルキルアミン化合物であれば、上記エステル化合物との相溶性が良く、目的とする有機酸の該エステル化合物への抽出効率を高める一方、後述の、水による抽出をさらに行う場合にも、該有機酸の抽出を妨げることがない。該アルキルアミン化合物の常圧における沸点としては、２５０℃以上が好ましい。該沸点の上限は特に限定されないが、一般的には４００℃以下である。ただし常圧における沸点が無く分解点のみが存在する場合には、分解点が２５０℃以上であることが好ましい。より好ましくは、炭素数１５〜３９のトリアルキルアミンが使用され、例えば、ジブチルウンデシルアミン、トリペンチルアミン、ジペンチルウンデシルアミン、トリヘキシルアミン、トリオクチルアミン、トリノニルアミン、トリウンデシルアミン、トリデシルアミン、及びトリドデシルアミンが挙げられる。これらのうち、トリヘキシルアミン、トリオクチルアミン、トリデシルアミン、及びトリドデシルアミンからなる群より選ばれる少なくとも１種が最も好ましい。
【００２４】
エステル化合物とアルキルアミン化合物とを用いる場合、その混合割合は、アルキルアミン化合物／エステル化合物の体積比が、０．６／１〜９／１、好ましくは１／１〜３／１である。該範囲であれば、抽出効率を高くすることができる。
【００２５】
抽出は、有機酸含有粗液と有機抽出媒体とを、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは０〜３０℃で、有機酸含有粗液と有機抽出媒体とを混合・接触させて行う。有機酸含有粗液／有機抽出媒体の体積比は、後続の工程に依存して異なるが、概して０．０１／１〜０．２／１または５／１〜１００／１が好ましく、０．０１／１〜０．１／１または１０／１〜１００／１がより好ましい。特に後続工程でコアレッサーを用いる場合には、油水比（Ｏ／Ｗ）を大きくするか、または、水油比（Ｗ／Ｏ）を上記範囲内で大きくすることが、分離性能を好適に維持するために好ましい。これは油水比（または水油比）を略等しくすると分離が不充分になる可能性があるためである。
【００２６】
抽出時間は、混合・接触効率に依存するが、通常、１分〜１０分でよい。抽出は、回分操作で行ってもよく、連続操作で行ってもよい。抽出効率が高く、操作に必要なエネルギーが低く抑えやすいことから連続操作が好ましい。回分操作としては、振とう操作、撹拌操作等が挙げられる。連続操作としては、棚段塔や充填塔等の塔を用い、併流抽出または向流抽出を行うことができる。また抽出塔を用いた連続操作において、塔内の撹拌操作を行ってもよい。抽出効率を高くし装置を小型化しやすいことから充填塔を用い向流抽出を行うことが好ましい。
【００２７】
より好ましくは、工程（ｉ）における抽出が、有機酸含有祖液と有機抽出媒体とを乳化して、乳化抽出により行われる。一般に、液液抽出を行う際には乳化を避けるように操作する。なぜなら、乳化させると、後に解乳化させるのが困難となり、また、系の粘度が上昇して機械的負荷が大きくなる場合があるからである。そのため、培養液のように乳化し易い液液系については、例えばＲＴＬ抽出機（グラエッサー抽出機）等を用いて穏やかな相分散を行うのが通常である。これに対して、本発明では意図的に系を乳化させて、顕著に短い時間で抽出平衡に到達させて、抽出効率を高める。ここで、「乳化抽出」は、粗液と抽出媒体とが、乳化して実質的に一相の乳化相を形成している状態で、該粗液から抽出媒体へと有機酸を移動されることを意味する。粗液層と抽出媒体層の界面付近でのみ乳化しており、粗液相及び抽出媒体相を含めて実質的に３相（層）で存在する場合を含まない。
【００２８】
乳化抽出には、公知の乳化手段もしくは動力式抽出手段を広く使用することができ、回分操作で行っても、連続操作で行ってもよい。例えば、乳化機、高圧乳化機（ホモジェナイザー）、真空乳化機、プロペラもしくはタービン型攪拌機、高速剪断ミキサー、ヘンシェルミキサー、各種ラインミキサー、撹拌式抽出機、及び脈動式・振動式抽出装置等を使用することができる。該乳化抽出は、抽出効率が高く、操作に必要なエネルギーが低く抑えやすいことから連続操作が好ましく、例えば、ラインミキサー、ミキサーセトラー抽出装置等の撹拌式抽出機を用いて行うことができる。なお、乳化に際し、乳化剤を添加する必要はない。
【００２９】
乳化抽出を行う場合の抽出時間は、即ち、抽出平衡に達する時間は、０．０１秒〜３０分でよく、好ましくは０．５秒〜５分である。その他、乳化抽出温度等は、上述したのと同じであってよい。
【００３０】
該有機抽出媒体による抽出における分配係数は、対象とする有機酸及び抽出媒体に依存するが、０．２以上、好ましくは０．３以上であり、抽出率は２０％以上、より好ましくは２５％以上である。一方、発酵培地に含まれる炭素源、例えばグルコース、発酵で精製される有機物（例えばエタノール）の抽出率は、２０％以下が好ましく、より好ましくは１５％以下である。アルキルアミン化合物も用いる場合には、分配係数が１．０以上、好ましくは１．４以上であり、抽出率は５０％以上、より好ましくは６０％以上であり、発酵培地に含まれる炭素源、及び発酵で精製される有機物（例えばエタノール）の抽出率は１０％以下が好ましく、より好ましくは５％以下である。
【００３１】
乳化するか否かに係わらず、工程（ｉ）において、抽出操作後に得られる有機酸含有祖液と有機抽出媒体との混合物、乳化する場合には乳化物を、コアレッサーを用いる液滴凝集工程に付して、抽出液（ｉ）を得ることが好ましい。コアレッサーの使用により、乳化抽出しない場合であっても相分離を促進することができることは云うまでもないが、乳化抽出と組み合わせると、より効果的である。なお、コアレッサーを使用しないで相分離もしくは解乳化する場合には、静置分離、遠心分離、電界を印加する方法、超音波法、解乳化剤の添加、又はこれらの組み合わせを用いてよい。
【００３２】
好ましくは、前記工程２は、
（ｉｉ）前記抽出液（ｉ）から水により有機酸を抽出し、抽出液（ｉｉ）を得る工程、
をさらに含む。
【００３３】
工程（ｉｉ）において、水は、最終的に得られる有機酸の純度を高くしやすいことから、塩類を含まないことが好ましく、イオン交換水、蒸留水、純水等が好ましい。抽出液（ｉ）／水の体積比は、後続の工程に依存して異なるが、概して０．０１／１〜０．２／１または５／１〜１００／１が好ましく、０．０１／１〜０．１／１または１０／１〜１００／１がより好ましい。後続の工程でコアレッサーを用いる場合には、上記範囲内で油水比（Ｏ／Ｗ）を大きくするか、または、水油比（Ｗ／Ｏ）を大きくすることが、分離性能を好適に維持するために好ましい。これは油水比（または水油比）を略等しくすると分離が不充分になる可能性があるためである。
【００３４】
工程（ｉｉ）における抽出も、乳化抽出により行ってよい。これにより、乳化を行わずに抽出する場合の抽出時間が、３時間〜６時間であるのに対し、０．０１秒〜３０分に短縮される。工程（ｉｉ）における抽出温度は、好ましくは６０〜９０℃、より好ましくは７０〜９０℃である。抽出手段については、工程（ｉ）に関して述べたのと同様である。
【００３５】
水による抽出における分配係数は、対象とする有機酸にも依存するが、０．１５以上が好ましく、より好ましくは０．２以上、であり、抽出率は１５％以上が好ましく、より好ましくは１７％以上である。
【００３６】
工程（ｉｉ）において、抽出後、特に乳化抽出後、コアレッサーを用いる液滴凝集工程に付して、抽出液（ｉｉ）を得ることが好ましいこと、及びコアレッサーを使用しない場合の相分離手段については、抽出液（ｉ）について述べたのと同様である。
【００３７】
工程（ｉｉ）は、工程（ｉ）と連続的に行うことが好ましいが、バッチ式で行ってもよい。工程（ｉｉ）で得られる抽出液（ｉｉ）から、減圧蒸留等によって水を除くことによって、有機酸を得ることができる。その際、抽出液（ｉｉ）を、公知の方法、例えば活性炭処理等に付して精製してもよい。
【００３８】
以下、実施例および比較例を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
［実施例１］
下記方法に従い、表１に示す各時間、乳化抽出して各抽出液（ｉ）を得た。
＜乳酸含有粗液の調製＞
特許文献２（ＷＯ２０１１／０２１６２９）に記載された方法で、形質転換体（ＡＳＰ２７８２）を得た。該形質転換体をＤ１２液体培地（グルコース１２％）に植菌して、温度３２℃、振盪速度１００ｒｐｍの条件下で２０時間発酵させたところ、乳酸濃度８５．７ｇ／Ｌの発酵液（ｐＨ２．３）が得られた。該発酵液を、遠心分離（１２０００Ｇ、５分間）に付し、上澄みを乳酸含有粗液として得た。
【００４０】
＜抽出液（ｉ）＞
得られた乳酸含有粗液と、エステル化合物（アゼライン酸−２−エチルへキシル）と、トリオクチルアミンとを、体積比１８：１：１で混合した。得られた混合液の３０Ｌを、ホモジェナイザー（アズワン社製ホモジナイザーＴ−５０Ｄ、設定値１０，０００ｒｐｍ）を用いて、１分間乳化抽出に付して均一な乳化液（ｉ）を得た。該乳化液（ｉ）を、液温を２５℃に保ちながらコアレッサーエレメント（ポール社製アクアセップ）に２０分間通液して、有機相と水相に分けた。該水相を除去して、抽出液（ｉ）を得た。該抽出液（ｉ）には白濁が全く認められず、十分な相分離が達成されていた。該抽出液（ｉ）中の乳酸濃度を、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００；カラム：東ソー社製、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＡｐａｋ−Ａ）によって測定したところ、抽出率は６１．９％、抽出分配係数は１．６２であった。また、同じくＨＰＬＣ法によって求めたグルコース、及びエタノールの抽出率は、夫々、４．２１％と１９．６％であった。
【００４１】
［参考例１］
実施例１と同様にして得た乳化液（ｉ）を分取し、遠心分離処理（５０００Ｇ、２０分間）し、白濁の無い抽出液を得た。得られた有機相に含まれる乳酸濃度をＨＰＬＣ法によって測定したところ、抽出率は５２．１％、抽出分配係数は１．０９であった。
なおここでの抽出率とは、（Ａ）有機層に抽出された目的物の質量を、（Ｂ）試験前の粗液中に存在した目的物の質量で、除した値（（Ａ）／（Ｂ））である。また分配係数とは、有機層中の目的物の質量を、水層中の目的物の質量で除した値である。
【００４２】
［実施例２］
実施例１と同様にして抽出液（ｉ）を得た。これにイオン交換水（抽出液／イオン交換水＝９／１（体積比））を加えて実施例１と同様に乳化処理を行い乳化液（ｉｉ）を得た。該乳化液（ｉｉ）を、液温を８０℃に保ちながらコアレッサーエレメント（ポール社製アクアセップ）に２０分間通液して、有機相と水相に分けた。該水相を除去して、抽出液（ｉｉ）（白濁の無い有機相）を得た。該抽出液（ｉｉ）中の乳酸濃度を、ＨＰＬＣ法によって測定したところ、抽出率は５９．９％、抽出分配係数は１．４９であった。
なお、ここでの抽出率とは、（Ｃ）水層に抽出された目的物の質量を、（Ｄ）試験前の有機層中に存在した目的物の質量で、除した値（（Ｃ）／（Ｄ））である。また分配係数とは、水層中の目的物の質量を、有機層中の目的物の質量で除した値である。  
【００４３】
実施例１に示すように、コアレッサーを用いたことで、従来使用されている遠心分離法に対する比で乳酸の抽出率（回収率）が約１９％上回った。また遠心分離法を用いる場合に、多量の液を連続的に処理するためには、大型の装置が必要である。これに対しコアレッサーを用いることで多量の液を送液動力（ポンプの動力）のみで、安定に分離処理することができる。また実施例２に示す逆抽出も同様に安定した処理が可能である。回収率が向上することで、廃水処理時のＣＯＤやＢＯＤを低下させることができ、廃水処理コストを抑制することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の有機酸の製造方法によれば、培養液中の成分をほとんど含まない抽出液を、簡便な手段で且つ高い抽出率で得ることができる。