(57)【要約】【課題】ゲル内に細胞を内包化させた状態、又は、ゲル上から細胞がゲル内に移動した状態、つまり細胞が三次元環境中で培養されている状態で目的の細胞を分離できる装置及び細胞分離方法を提供する。【解決手段】細胞を内包した光分解性ゲルを有する培養部１１と、  前記培養部１１に光を照射する照射部１３と、を備え、前記照射部１３は、光源と、該光源からの光を前記培養部１１の特定の領域にのみ照射させる照射領域調整部１４を有することを特徴とする細胞分離装置５０。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を内包した光分解性ゲルを有する培養部と、
前記培養部に光を照射する照射部と、を備え、
前記照射部は、光源と、該光源からの光を前記培養部の特定の領域にのみ照射させる照射領域調整部を有することを特徴とする細胞分離装置。
【請求項２】
前記光分解性ゲルは、光分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られたものである請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
前記光分解性架橋剤は、直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有する分岐鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基と、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する請求項２に記載の細胞分離装置。
【請求項４】
前記活性エステル基が、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体である請求項３に記載の細胞分離装置。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコールにおけるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある請求項３又は４に記載の細胞分離装置
【請求項６】
前記ポリエチレングリコールの分岐鎖が４分岐又は８分岐である請求項３〜５のいずれか一項に記載の細胞分離装置。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールが、ネオペンチル骨格を有する請求項３〜６のいずれか一項に記載の細胞分離装置。
【請求項８】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、塩基性多糖類、タンパク質、及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項２〜７のいずれか一項に記載の細胞分離装置。
【請求項９】
光分解性ゲルに細胞を内包させて、細胞含有光分解性ゲルを得る工程Ａと、
前記細胞含有光分解性ゲルの特定領域に光照射して、特定領域内のゲルを分解する工程Ｂと、
前記特定領域内の細胞と、該特定領域以外の領域内の細胞と、を分離する工程Ｃと、
を有することを特徴とする細胞分離方法。
【請求項１０】
前記光分解性ゲルは、光分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られたものである請求項９に記載の細胞分離方法。
【請求項１１】
前記光分解性架橋剤は、直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有する分岐鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基と、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する請求項１０に記載の細胞分離方法。
【請求項１２】
前記活性エステル基が、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体である請求項１１に記載の細胞分離方法。
【請求項１３】
前記ポリエチレングリコールにおけるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある請求項１１又は１２に記載の細胞分離方法。
【請求項１４】
前記ポリエチレングリコールの分岐鎖が４分岐又は８分岐である請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の細胞分離方法。
【請求項１５】
前記ポリエチレングリコールが、ネオペンチル骨格を有する請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の細胞分離方法。
【請求項１６】
前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つである請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の細胞分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離装置及び細胞分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで基礎医学実験では細胞集団に対する遺伝子やタンパクに関する解析などが行われてきた。
しかし、同一細胞株の中でも隣接細胞との距離や培養ディッシュ表面の弾性や凹凸の違いにより、個々の細胞が異なる性質を示すことが明らかとなってきた。
【０００３】
従来の細胞分離技術としては、フローサイトメーターや磁気ビーズ用いた分離法が利用されている。しかしながら、これらの方法で細胞を分離する際には、細胞をトリプシンで処理して剥した上で、抗体や磁気ビーズでラベルする必要があり、細胞へのダメージや変異の誘導などの有害事象が懸念される。
また、レーザーを用いて局所的に細胞を殺すことで細胞を選抜する方法も知られているがこの方法を用いても細胞を剥離・回収するためにはトリプシン処理を必要とする。
【０００４】
これに対して、流路の高さを調節したマイクロ流路チップを用いて、がん細胞をその他の細胞と分離するがん細胞自動分離装置及びがん細胞自動分離方法が提案されている（例えば特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−２３９４４９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方、生体内で細胞はミクロスケールで規則正しい三次元構造を形成し、近接する細胞や細胞間基質(ＥＣＭ)、血管増殖因子などの液性因子との相互作用を通して細胞機能を発現・維持している。従って、二次元平面上で培養される細胞は生体内と大きく異なる挙動を示している。生体内の三次元環境下で発現している機能を反映した細胞の分離には、三次元環境下で細胞を培養し、細胞の形態変化など特定の性質を示す細胞を分離する必要があるが、既存の技術では困難である。
特定の性質を示す単細胞を分離する技術として、特許文献１に記載の細胞自動分離装置は、未だ改善の余地があった。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ゲル内に細胞を内包化させた状態、又は、ゲル上から細胞がゲル内に移動した状態、つまり細胞が三次元環境中で培養されている状態で目的の細胞を分離できる装置及び細胞分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明者らは鋭意検討し、光分解性ゲルを用いることにより、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は以下の通りである。
［１］細胞を内包した光分解性ゲルを有する培養部と、
前記培養部に光を照射する照射部と、を備え、
前記照射部は、光源と、該光源からの光を前記培養部の特定の領域にのみ照射させる照射領域調整部を有することを特徴とする細胞分離装置。
［２］前記光分解性ゲルは、光分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られたものである［１］に記載の細胞分離装置。
［３］前記光分解性架橋剤は、直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有する分岐鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基と、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する［２］に記載の細胞分離装置。
［４］前記活性エステル基が、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体である［３］に記載の細胞分離装置。
［５］前記ポリエチレングリコールにおけるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある［３］又は［４］に記載の細胞分離装置
［６］前記ポリエチレングリコールの分岐鎖が４分岐又は８分岐である［３］〜［５］のいずれか一つに記載の細胞分離装置。
［７］前記ポリエチレングリコールが、ネオペンチル骨格を有する［３］〜［６］のいずれか一つに記載の細胞分離装置。
［８］前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、塩基性多糖類、タンパク質、及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つである［２］〜［７］のいずれか一つに記載の細胞分離装置。
【０００９】
［９］光分解性ゲルに細胞を内包させて、細胞含有光分解性ゲルを得る工程Ａと、
前記細胞含有光分解性ゲルの特定領域に光照射して、特定領域内のゲルを分解する工程Ｂと、
前記特定領域内の細胞と、該特定領域以外の領域内の細胞と、を分離する工程Ｃと、
を有することを特徴とする細胞分離方法。
［１０］前記光分解性ゲルは、光分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られたものである［９］に記載の細胞分離方法。
［１１］前記光分解性架橋剤は、直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有する分岐鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基と、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する［１０］に記載の細胞分離方法。
［１２］前記活性エステル基が、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体である［１１］に記載の細胞分離方法。
［１３］前記ポリエチレングリコールにおけるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある［１１］又は［１２］に記載の細胞分離方法。
［１４］前記ポリエチレングリコールの分岐鎖が４分岐又は８分岐である［１１］〜［１３］のいずれか一つに記載の細胞分離方法。
［１５］前記ポリエチレングリコールが、ネオペンチル骨格を有する［１１］〜［１４］のいずれか一つに記載の細胞分離方法。
［１６］前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、及びこれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一つである［１１］〜［１５］のいずれか一つに記載の細胞分離方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細胞が三次元環境中で培養されている状態で目的の細胞を分離できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の細胞分離方法の一例を示す説明図である。
【図２】本発明に用いられる光分解性架橋剤の模式図である。
【図３】光分解性架橋剤の構造の説明図である。
【図４】光分解性ゲルの生成反応を示す図である。
【図５】光分解性ゲルの分解反応を示す図である。
【図６】本発明の細胞分離装置の一例を示す構成図である。
【図７】実施例の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
［細胞分離方法］
本発明の細胞分離方法は、光分解性ゲルに細胞を内包させて、細胞含有光分解性ゲルを得る工程Ａと、
前記細胞含有光分解性ゲルの特定領域に光照射して、特定領域内のゲルを分解する工程Ｂと、
前記特定領域内の細胞と、該特定領域以外の領域内の細胞と、を分離する工程Ｃと、
を有する。
【００１３】
幹細胞は、組織形成の大本になる細胞であり、胚性幹細胞や人工多能性幹細胞などの全能性を有する細胞や間葉系幹細胞などの体性幹細胞の再生治療への応用が検討されている。このような組織由来の幹細胞を医療応用するためには、骨髄や肝臓などの組織から実際に幹細胞を分離したり、分化誘導した細胞を理想的には非標識で分離する必要がある。特許文献１に記すような浮遊細胞による細胞分離方法では、多種ある幹細胞の一部の特徴による分離しかできず、培養状態下の表現型による標的細胞の選別は困難である。特に三次元培養条件下で細胞を分離することができれば、その細胞の高次機能を発現した状態で細胞を分離することが可能となり、分離した細胞を再生医療へ応用することができるようになる。
本発明は、係る幹細胞や分化細胞の単離に好適に用いられる。以下、図１を参照しながら、各工程について具体的に説明する。
【００１４】
工程Ａは、光分解性ゲルに細胞を内包させて、細胞含有光分解性ゲルを得る工程である。本発明に用いられる光分解性ゲルは、光分解性を有するものであれば特に限定されないが、光分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られたものが好ましい。
【００１５】
光分解性架橋剤は、直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有する分岐鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置された光分解性のベンジル基と、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有することが好ましい。
係る光分解性架橋剤としては、例えば、下記式一般式（１）で表される化合物が挙げられる。
【００１６】
【化１】
2014226089.tif 000003
【００１７】
前記一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｚ、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚ、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。
Ｚは、光分解性のベンジル基を表し、前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する。
複数のＡ１は、連結基を表し、それぞれ独立に単結合、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
該アルキル基中の１個又は非隣接の２個以上の−ＣＨ２−はそれぞれ独立して−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、又はシクロへキシレン基によって置換されていてもよい。
ｐは０、又は１以上の整数を表し、ｐが１以上の場合、複数存在するＲ２及びＲ４は同一でも異なっていてもよい。Ｒ１〜Ｒ４のうち少なくとも２つ以上のＲがＺを含み、１つ以上のＲが−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚであることとする。
【００１８】
前記一般式（１）で表される光分解性架橋剤が含むポリエチレングリコール分岐鎖のエチレングリコールの平均繰り返し数ｎは、２０から５００の範囲にあり、３０から２５０の範囲にあることがより好ましく、４０から１２５の範囲にあることがさらに好ましい。
エチレングリコールの繰り返し数を上記範囲に設定することで、ゲルの水に対する溶解度を高めることができ、製造時および使用時において扱いの容易で、状態の均一な光分解性ゲルを得ることができる。
【００１９】
前記一般式（１）において、Ｚは光分解性のベンジル基である。前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する。
係るベンジル基としては、下記一般式（２）又は（３）で表される基が好ましい。
【００２０】
【化２】
2014226089.tif 000004
【００２１】
前記一般式（２）〜（３）中、Ｂ１は、−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−で表される基を表し、ｍは、０〜５の整数を表し、５が好ましい。
＊は、エチレングリコールの酸素原子との結合位置を表す。
Ｒ５は、水素又は炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し、炭素数１〜６の直鎖状のアルキル基がより好ましく、メチル基が特に好ましい。Ｒ６は、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルコキシ基を表し、炭素数１〜６の直鎖状のアルコキシ基がより好ましく、メトキシ基が特に好ましい。Ｒ７は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基を表し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体が好ましく、下記一般式（４）で表される誘導体がより好ましい。
【００２２】
【化３】
2014226089.tif 000005
【００２３】
前記一般式（４）中、＊は、ベンゼン環の炭素原子との結合位置を表す。ｑは１〜１０の整数を表し、１〜６が好ましく、２〜５がより好ましく、３が特に好ましい。
【００２４】
前記一般式（１）で表される化合物において、ｐが０の場合、該化合物は、具体的には下記一般式（５）で表される化合物であることが好ましい。
【００２５】
【化４】
2014226089.tif 000006
【００２６】
前記一般式（５）中、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。
前記一般式（１）で表される化合物において、ｐが１以上の場合、該化合物は、具体的には下記一般式（６）〜（８）で表される化合物であることが好ましい。
【００２７】
【化５】
2014226089.tif 000007
【００２８】
前記一般式（６）〜（８）中、ｎ、Ｚ、Ａ１、Ｒ２、Ｒ４、及びｐは前記一般式（１）におけるものと同様である。）
【００２９】
ｐが１の場合、前記一般式（１）で表される化合物は、具体的には下記一般式（９）で表される化合物であることが好ましい。
【００３０】
【化６】
2014226089.tif 000008
【００３１】
前記一般式（９）中、Ｚ、Ａ１、及びＲ１〜Ｒ４は前記一般式（１）におけるものと同様である。）
前記一般式（９）で表される化合物は、具体的には下記一般式（１０）又は（１１）で表される化合物であることが好ましい。
【００３２】
【化７】
2014226089.tif 000009
【００３３】
前記一般式（１０）〜（１１）中、ｎ、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。）
【００３４】
前記一般式（１）で表される化合物は、具体的には下記一般式（１２）で表される化合物であることが好ましい。
【００３５】
【化８】
2014226089.tif 000010
【００３６】
前記一般式（１２）中、ｎ、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。ｐ１は１以上の整数を表す。）
【００３７】
前記一般式（１２）で表される化合物は、具体的には下記一般式（１３）又は（１４）で表される化合物であることが好ましい。
【００３８】
【化９】
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【００３９】
前記一般式（１３）〜（１４）中、ｎ、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。）
４分岐又は８分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）は合成しやすく、また、入手も容易であることから、前記一般式（１）で表される化合物において、ポリエチレングリコールの分岐鎖が４分岐又は８分岐であることが好ましい、
即ち、本発明に用いられる光分解性架橋剤としては、下記一般式（１５）又は（１６）で表される化合物がより好ましい。
【００４０】
【化１０】
2014226089.tif 000012
【００４１】
前記一般式（１５）〜（１６）中、ｎ、Ｂ１、Ｒ５〜Ｒ６、及びｑは、前記一般式（２）〜（４）におけるものと同様である。）
【００４２】
前記一般式（１５）〜（１６）で表される化合物において、具体的には下記式（１７）又は（１８）で表される化合物であることが更に好ましい。
【００４３】
【化１１】
2014226089.tif 000013
【００４４】
また、前記ポリエチレングリコールが、ネオペンチル骨格を有するものが好ましく、前記式（１７）、前記式（１８）で表される化合物が特に好ましい。
【００４５】
図２に、前記式（１７）で表される化合物の模式図を示す。図２に示されるように、光分解性架橋剤１は、分岐鎖状のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる主鎖２と、この主鎖２及び分岐鎖の両末端側に配置された光分解性のニトロベンジル基を含む基３と、ニトロベンジル基を含む基３の末端側に配置された活性エステル基４とからなり、４分岐のポリエチレングリコールの分岐鎖を有し、ポリエチレングリコールの分岐鎖が中心にネオペンチル骨格を有する。
図２および図３（ａ）〜（ｄ）に示すように、主鎖２はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ニトロベンジル基を含む基３は、アミド結合部５（―ＮＨＣＯ―）を介して主鎖２に結合している。
【００４６】
本発明に用いられる光分解性ゲルは、上述した光分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られたものであることが好ましい。
高分子化合物は、ポリエチレングリコール、塩基性多糖類、タンパク質、及びこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも一つであることが好ましい。
高分子化合物としては、分岐型のポリエチレングリコールもしくはその誘導体、またはタンパク質としてゼラチンがより好ましい。
【００４７】
ポリエチレングリコールは細胞との相互作用が少なく、しかも高分子化合物自体が水に可溶であるために好ましい。なかでも、分岐型のポリエチレングリコールまたはその誘導体を用いると、網目構造が形成されやすく、ゲル化が進行しやすくなるため好ましい。分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）の分岐数は３以上が好ましい。特に、４分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）は入手しやすいため好適である。
ポリエチレングリコール（または誘導体）は、末端にアミノ基を有することが望ましい。
ポリエチレングリコール（または誘導体）の分子量は１万から４万の範囲にあることが好ましい。
【００４８】
ゼラチンの主成分であるコラーゲンは多細胞生物（動物）の細胞外基質の主成分であることから、細胞の足場タンパク質として好ましく、また、細胞の増殖、分化を促す場合があるために好ましい。用いられるゼラチンの種類は特に制限されないが、ウシ、又はブタ皮由来原料を酸処理して得られたｔｙｐｅＡゼラチンが好ましい。
ゼラチンの強度は特に制限されないが、２００〜４００ブルームが好ましく、２５０〜３５０ブルームがより好ましい。
【００４９】
塩基性多糖類としては、キトサンが好ましい。
【００５０】
高分子化合物と光分解性架橋剤とを混合すると、高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基は、光分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋される。
前記アミノ基は光分解性架橋剤の活性エステル基とアミド結合を形成し、前記ヒドロキシル基は活性エステル基とエステル結合を形成する。これによって、網目構造が形成され、ゲル化が進行し、光分解性ゲルが生成する。
本発明では、架橋反応を促進させるための添加剤は特に必要ないため、高分子化合物と光分解性架橋剤とを混合するだけで架橋反応が起こり、ゲル化が進行する。また、反応時の温度は常温でよいが、高分子化合物としてゼラチンを用いる場合は、反応前溶液のゲル化を避けるなどを目的として加温してもよい。
また、本発明における架橋反応は溶存酸素の影響を受けないため、薄膜状のゲルの形成が容易である。
【００５１】
高分子化合物に対する光分解性架橋剤の添加量（光分解性架橋剤／高分子化合物）はゲル化する範囲で自由に設定することができるが、強度の高いゲルを調製するためには高分子化合物のアミノ基と光分解性架橋剤の活性エステル基のモル比で１：１程度であることが好ましい。高分子化合物と光分解性架橋剤との混合比は、例えば４分岐型のアミノ末端ポリエチレングリコール（またはその誘導体）を高分子化合物として用い、４分岐型の光分解性架橋剤を用いる場合は、モル比（高分子化合物：光分解性架橋剤）で４：１から１：４の範囲が好ましく、モル比で２：１から１：２の範囲がより好ましい。
高分子化合物の使用量は、例えば４分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）の場合、光分解性ゲル中に２．５重量％以上含有されるように設定することができ、ゼラチンの場合、光分解性ゲル中に１．０重量％以上含有されるように設定することができる。
【００５２】
光分解性ゲルに細胞を内包させるに際し、光分解性ゲルは、液体培地を含有することが好ましい。
前記工程Ａにおいて、分別対象となる細胞は、特に限定されず、例えば、生体組織をパパイン緩衝液で処理して単一細胞としたものが好適に用いられる。
その他、目的に応じて、動物由来の細胞（例えばヒト細胞）、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を使用できる。
具体例としては、例えば、造血幹細胞、骨髄系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞などの体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞がある。
また、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞等）等の白血球や、血小板、赤血球、血管内皮細胞、リンパ系幹細胞、赤芽球、骨髄芽球、単芽球、巨核芽球および巨核球等の血液細胞、内皮系細胞、上皮系細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞等のほか、研究用に樹立された各種株化細胞も本発明の対象となり得る。
【００５３】
工程Ａについて、図４を参照しながら具体的に説明する。
図４（ａ）は、光分解性架橋剤１の末端側に配置された活性エステル基４と高分子化合物のアミノ基６とが縮合して架橋される反応を示すものである。
図４（ｂ）は、光分解性架橋剤１と高分子化合物７とを反応させることによって、光分解性ゲル１０を生成させる反応を模式的に示すものである。
高分子化合物７は、末端にアミノ基６を有する４分岐型のポリエチレングリコール誘導体である。
高分子化合物７と、光分解性架橋剤１と、上述した細胞と、を混合すると、高分子化合物７のアミノ基６は、光分解性架橋剤１の活性エステル基４と縮合して架橋される。
これによって、高分子化合物７は、光分解性架橋剤１を介して他の高分子化合物７と結合し、網目構造を有する光分解性ゲル１０が生成し、細胞は、光分解性ゲル１０に内包される。
【００５４】
また、図４（ｃ）は、光分解性架橋剤１と高分子化合物２７とを反応させることによって、光分解性ゲル２０を生成させる反応を模式的に示すものである。
高分子化合物２７は、ゼラチンに含まれ、分子内にアミノ基を有するコラーゲンである。
高分子化合物２７と、光分解性架橋剤１と、上述した細胞と、を混合すると、高分子化合物２７のアミノ基１６は、光分解性架橋剤１の活性エステル基４と縮合して架橋される。
これによって、高分子化合物２７は、光分解性架橋剤１を介して他の高分子化合物２７と結合し、網目構造を有する光分解性ゲル２０が生成し、細胞は、光分解性ゲル２０に内包される。
【００５５】
本発明において、このようにして光分解性ゲルに内包させた細胞を培養することが好ましい。光分解性ゲル中の細胞は、３次元環境下で培養された状態であり、一般的な培養ディッシュ上での培養と比べて、生体内で発現している機能を保持していると考えられる。また、光分解性ゲル中の細胞は、３次元的に他の細胞と分離された状態にあるため、培養により、クローン化した細胞塊が光分解性ゲル中に形成される。
【００５６】
工程Ｂは、前記細胞含有光分解性ゲルの特定領域に光照射して、特定領域内のゲルを分解する工程である。工程Ｂについて、図５を参照しながら具体的に説明する。
本発明に用いられる光分解性ゲルは、光の照射により光分解性架橋剤１が分解されることによって、分解される。
図５（ａ）は、光分解性架橋剤のニトロベンジル基の分解を示すものである。ニトロベンジル基を含む基３は、例えば波長３３０〜３８０ｎｍの紫外線などの光の照射により、破線位置で分解可能である。
ニトロベンジル基を含む基３は、アミド結合部５のアミノ基との間の結合が切断され、ニトロベンジル基３’となる。なお、ニトロベンジル基の構造によっては、前記光照射によりニトロベンジル基を含む基３と活性エステル基４との結合が切断されることもある。
図５（ｂ）と図５（ｃ）は、それぞれ光分解性ゲル１０と２０が、光の照射により分解される様子を模式的に示すものである。光分解性ゲルが分解されることにより、光分解性ゲルは水に溶解する。
工程Ｂにおいて、このような、分解メカニズムを示す細胞含有光分解性ゲルの特定領域に光照射して、特定領域内のゲルを分解する。つまり、光分解性ゲル内の三次元環境下で培養されている細胞のうち、特定の形態を有する細胞周辺に限定した形で光を照射することで、特定の形態を有する細胞を三次元培養系から分離することができる。例えば、組織を形成する細胞のうち、ごく僅かにしか存在しない幹細胞様の形態を示す細胞を含有する光分解性ゲルに対して、三次元培養系における増殖能や浸潤能を指標に分離する細胞を選定し、選定された細胞に選択的に光照射することにより、幹細胞含有光分解性ゲルのみが分解される。
【００５７】
工程Ｃは、前記特定領域内の細胞と、該特定領域以外の領域内の細胞と、を分離する工程である。前記工程Ｂにおいてゲルに内包されていた細胞は、ゲルの分解により、ゲルから分離する。ゲルから分離した細胞は、培地中に浮遊するため、例えば培地を回収するのみの操作により容易に回収される。
【００５８】
このようにして回収された細胞は、マイクロアレイ解析や表面マーカー解析といった一般的な分子生物学的な分析を行うことができる。これにより、三次元培養系の形態情報と分子生物学的な情報を比較することで、細胞の形態と機能の関係を調べることが可能となる。細胞の形態と機能の関係が明らかになることで、特定の機能を有する細胞を三次元培養系の形態情報を元に非破壊かつ非標識で分離することが可能となる。このような分離方法はｉＰＳ細胞や体性幹細胞などの幹細胞から三次元培養系で分化させた細胞群の中から特定の機能を有する細胞を分離する手法としても利用できる。
【００５９】
［細胞分離装置］
本発明の細胞分離装置は、細胞を内包した光分解性ゲルを有する培養部と、前記培養部に光を照射する照射部と、を備え、前記照射部は、光源と、該光源からの光を前記培養部の特定の領域にのみ照射させる照射領域調整部を有する。
図６を参照しながら、本発明の細胞分離装置の好ましい形態について説明する。
図６に示すように、本実施形態の細胞分離装置５０は、細胞を内包した光分解性ゲルを有する培養部１１と、培養部１１を保持する保持台１２と、培養部１１に光を照射する照射部１３を備えている。
照射部１３は、光源（図示略）と、培養部１１の特定の領域にのみ光照射する照射領域調整部１４（微小パターン光照射ユニット）と、パソコンなどの制御部１５とを有する。
照射領域調整部１４は、所定のパターン１６をなす光１８を培養部１１に照射することができる。パターン１６は表示装置１７に表示される。
【００６０】
照射領域調整部１４は、例えばＤＭＤ（デジタルマイクロミラーデバイス（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を備えている。ＤＭＤは複数のマイクロミラーを有し、各マイクロミラーは、制御部１５からの信号により独立に角度を設定できるようにされ、光源からの光を反射することによって、前記信号に応じたパターンの光を培養部１１に照射できるようになっている。
照射領域調整部１４は、レンズ、ミラー、レンズを経て、培養部１１の特定の領域に光１８を照射できる。
光源としては、光分解性架橋剤を分解させ得るものが選択され、例えば紫外線、可視光等の光を照射できるもの（例えば紫外線ランプ、可視光ランプ等）が使用できる。
光の波長域は、例えば２００〜１０００ｎｍを例示できる。特に３００〜６００ｎｍ、なかでも３５０〜４００ｎｍは好適である。照射エネルギーは、通常は０．０１〜１０００Ｊ／ｃｍ２、好ましくは０．１〜１００Ｊ／ｃｍ２、より好ましくは１〜１０Ｊ／ｃｍ２である。
なお、光を細胞培養基材の一部領域にのみ照射させるための構成としては、ＤＭＤに限らず、液晶シャッターアレイ、光空間変調素子、所定形状のフォトマスク等も採用できる。
【００６１】
本発明の細胞分離装置は、上述した本発明の細胞分離方法に好適に用いられる。
【実施例】
【００６２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６３】
［光分解性架橋剤の合成］
以下は、光分解性架橋剤（４ａｒｍＰＥＧ−ＰＬ−ＮＨＳ）の合成方法である。
Ｎ,Ｎ−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）洗浄した３−（１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ（６６ ｇ）のＤＭＳＯ（１３０ ｍＬ）溶液に４−｛４−［１−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ｝ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（２．７ ｇ）を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。濾過後、濾取物をＤＭＳＯで洗浄し、減圧下、全量が約１３０ ｍＬになるまでＤＭＳＯを留去した。得られた残留物にＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＰＴＥ−１００ＨＳ（ＮＯＦ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、９．６ ｇ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてＴＨＦを留去後、残渣を氷冷したエーテルにゆっくり滴下し、数時間〜３日間静置後、析出物を濾取した。析出物を少量のＴＨＦに溶解させ、氷冷したエーテルにゆっくり滴下し、１〜２４時間静置後、析出物を濾取した（２回繰り返す）。減圧下、乾燥させた析出物をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＭｅＯＨ）で分離精製し、得られた化合物のＴＨＦ溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてＴＨＦを留去後、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を加えて希釈した。得られたＣＨ２Ｃｌ２溶液を５％塩酸水溶液および飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下溶媒を留去し、少量のＴＨＦに溶解させた残渣をエーテルにゆっくり滴下し、１〜２４時間時間静置後、析出物を濾取した（２回繰り返す）。析出物を減圧下乾燥後、下記式（１７）で表される目的化合物の光分解性架橋剤を９．８０ ｇ得た。
【００６４】
【化１２】
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【００６５】
得られた目的化合物についてＮＭＲによる分析を行い、目的の化合物が得られたことを確認した。以下にＮＭＲによる分析結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）：１．３５ （ｍ, ２Ｈ）， １．５３ （ｄ, Ｊ ＝ ７．０９ Ｈｚ, ３Ｈ）， １．６０ （ｍ, ４Ｈ）， ２．１８ （ｂｒ ｔ, Ｊ ＝ ７．２１ Ｈｚ， ２Ｈ）, ２．２８ （ｔｔ, Ｊ ＝ ７．３３， ５．９８ Ｈｚ， ２Ｈ）, ２．８５ （ｂｒ ｓ, ４Ｈ）, ２．８８ （ｔ, Ｊ ＝ ７．３３ Ｈｚ， ２Ｈ）, ３．４１ （ｓ, ２Ｈ）, ３．４３ （ｔ, Ｊ ＝ ７．２１ Ｈｚ， ２Ｈ）, ３．４７‐３．８３  （ｍ，  Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）, ３．９４ （ｓ, ３Ｈ）, ４．１５ （ｔ, Ｊ ＝ ５．９８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．４９ （ｄｑ, Ｊ ＝ ７．５７, ７．０９ Ｈｚ， １Ｈ）, ６．３９ （ｂｒ ｄ, Ｊ ＝ ７．５７ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９１ （ｓ, １Ｈ）, ７．５６ （ｓ, １Ｈ）.
【００６６】
［細胞含有光分解性ゲルの製造］
ゼラチン（ＴｙｐｅＡ、３００ブルーム、ブタ皮由来）を３００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ ７．０) と液体培地（ＦＢＳなし、抗生物質なし）の体積比１：１の混合液に溶解し、  １．２５％，２．５％, ５．０％のゼラチン溶液を得た。これらゼラチン溶液それぞれに、緑色蛍光ＧＦＰ発現安定株ＲＧＭ−ＧＦＰ及び赤色蛍光ＫＯ発現安定株ＲＧＫ−ＫＯを計２．０×１０６個／ｍＬの濃度で懸濁させ、２種細胞混合溶液を作製した。
この２種細胞混合溶液１５μＬに、上記光分解性架橋剤（４ａｒｍＰＥＧ−ＰＬ−ＮＨＳ）の溶解液（１０ｍＭ  クエン酸、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）１５μＬを加え、３７℃３０分間インキュベートした。光分解性架橋剤とゼラチンの混合比は、光分解性架橋剤の活性エステル基／ゼラチンのアミノ基のモル比で０, ０．２,０．４, ０．６の細胞含有光分解性ゲルを作製した。
細胞含有光分解性ゲル中の細胞生存率の評価はＬＩＶＥ  ＤＥＡＤ染色を用いて行った。また、細胞含有光分解性ゲルに、ＵＶ照射(３６５ｎｍ, ２６３ｍＷ／ｃｍ２)を行い細胞分離が可能であるか検討を行った。
【００６７】
最も低架橋密度である１．２５％ゼラチン溶液 (光分解性架橋剤／ゼラチン＝０．２ｗ／ｖｏｌ％)の条件下においてもゲルの作製が可能であった。また、１．２５％ゼラチン溶液を用いたゲル中の細胞生存率は、光分解性架橋剤とゼラチンの混合比に依存し、光分解性架橋剤の活性エステル基／ゼラチンのアミノ基のモル比で０．２〜０．６の範囲で７４〜９２％であり低毒性であることが確認された。
また、１．２５％ゼラチン溶液を用いた細胞含有光分解性ゲルに２分間のＵＶ照射を行い、３７℃で３０分間インキュベートした。結果を図７に示す。図７に示すように、ＵＶ照射により、単一細胞の分離が確認された。また、ＵＶ照射部位外の細胞はゲル内に固定されたままであった。
【００６８】
以上の結果より、本発明によれば、細胞が三次元環境中で培養されている状態で、ゲルを用いた局所光分解により単一細胞の分離が可能であることが明らかである。
【００６９】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。
【符号の説明】
【００７１】
１…光分解性架橋剤、２…主鎖、３，３’…ニトロベンジル基を含む基、４…活性エステル基、５…アミド結合部、６，１６…アミノ基、７，２７…高分子化合物、１０，２０…光分解性ゲル、１１…培養部、１２…保持台、１３…照射部、１４…調整部、１５…制御部、１６…パターン、１７…表示装置、１８…光、５０…細胞分離装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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