(57)【要約】  本発明は同一の容器内において細胞個々の計測を実現する単一細胞遺伝子発現解析において個々の遺伝子発現計測値を規格化する手法である。具体的には、試料である細胞群を個々の細胞に分離し、個々の細胞の生体物質を捕捉領域に捕捉し、捕捉した生体物質に起因する物理量を計測する分析方法であって、細胞群の分離に先立って、物理量の規格化基準となる既知物質を捕捉領域に捕捉させる規格化工程を備える。
2017056251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料である細胞群を個々の細胞に分離し、該個々の細胞の生体物質を捕捉領域に捕捉し、捕捉した前記生体物質に起因する物理量を計測する分析方法であって、
前記細胞群の分離に先立って、前記物理量の規格化基準となる既知物質を前記捕捉領域に捕捉させる規格化工程を備える、分析方法。
【請求項２】
請求項１記載の分析方法であって、
前記生体物質が１種類以上の塩基配列を有する物質であり、
前記既知物質が１種類以上の塩基配列を有する既知の物質である、
分析方法。
【請求項３】
請求項１記載の分析方法であって、
細胞を捕捉する複数の細胞捕捉領域を備えるアレイデバイスを用い、
前記アレイデバイスは、
前記細胞捕捉領域に対応して前記捕捉領域を複数備え、
前記捕捉領域は、前記細胞捕捉領域に捕捉された前記細胞に起因する核酸を捕捉する核酸捕捉領域として構成され、
前記アレイデバイスに対して、前記細胞群を含む溶液を供給する第１の工程、
前記細胞群を個々の細胞に分離して前記細胞捕捉領域に捕捉させる第２の工程、
前記細胞捕捉領域に捕捉された前記細胞に起因する核酸を前記核酸捕捉領域に捕捉させる第３の工程を備え、
前記第１の工程の前に、
前記規格化工程を備える、
分析方法。
【請求項４】
請求項３記載の分析方法であって、
前記規格化工程は、
前記アレイデバイスを溶液槽に載置する第１規格化工程、
前記既知物質を含む溶液を流路より前記溶液槽に供給する第２規格化工程、
前記既知物質を前記核酸捕捉領域に捕捉させる第３規格化工程、
前記溶液槽および前記流路を洗浄する第４規格化工程、
を備える、
分析方法。
【請求項５】
請求項４記載の分析方法であって、
前記既知物質を含む溶液は、
液滴の形状を有する内容物を包含し、該液滴は前記既知物質を含む、
分析方法。
【請求項６】
請求項５記載の分析方法であって、
前記第３規格化工程は、
前記液滴の形状を有する内容物を前記細胞捕捉領域に捕捉させる工程、
前記細胞捕捉領域に捕捉させた前記内容物から前記既知物質を取り出す工程、
取り出した前記既知物質を前記核酸捕捉領域に捕捉させる工程、
を備える、
分析方法。
【請求項７】
請求項６記載の分析方法であって、
前記内容物の径の平均値は、前記細胞の径の平均値の90〜100％である、
分析方法。
【請求項８】
細胞を捕捉する複数の細胞捕捉領域と、捕捉された前記細胞に起因する核酸を捕捉する複数の核酸捕捉領域を備える分析用デバイスにおいて、
前記細胞捕捉部と前記核酸捕捉部は１対１に配置されており、
前記核酸捕捉部には、既知の物質が予め捕捉されてなる、分析用デバイス。
【請求項９】
請求項８記載の分析用デバイスであって、
前記細胞捕捉部と前記核酸捕捉部は２次元アレイ状に配置されている、
分析用デバイス。
【請求項１０】
請求項８記載の分析用デバイスであって、
前記既知の物質が１種類以上の塩基配列を有する物質である、
分析用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一の細胞を解析する技術において、サンプルデータを規格化する技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
再生医療、遺伝子を用いた診断、あるいは生命現象の基本的な理解のため、組織の平均としての遺伝子の発現量ばかりでなく、組織を構成する１つ１つの細胞の中味を定量的に分析することが重要視され始めている。このような個々の細胞の特性を１つずつ解析することを単一細胞解析と呼んでいる（例えば特許文献１参照）。【０００３】
従来の解析では、生体組織からサンプリングした多数の細胞（103〜106個以上の細胞）から、１種類のサンプルとしてDNAやRNAや蛋白質を抽出して解析を行うため（以後「バルク解析」という）、サンプル中の平均的な解析情報を得ていた。これに対し、単一細胞解析は少数の細胞の特異的な振る舞いを検出可能であり、がん研究やiPSC(人工多能性幹細胞：induced pluripotent stem cells)の研究に重要な技術と考えられる。【０００４】
単一細胞中の生体分子の量が極めて微量であるため、単一細胞解析は、これまで細胞膜上の蛋白質など一部の生体分子を対象とする解析にしか用いられてこなかった。しかし近年では、技術の発展により単一細胞中の微量な生体分子を定量評価できるようになりつつある。例えば、単一細胞中の微量なmRNAを逆転写することによってcDNAに変え、PCR（polymerase chain reaction）増幅を用いて核酸増幅した後、大規模DNAシーケンサを用いて増幅産物の塩基配列を決定し、シーケンシング結果を集計することによって増幅後のDNA配列数を計上することによって、mRNA分子数を推定する方法が用いられ始めている。【０００５】
上記に示したように単一細胞に由来する微量の生体分子を解析対象として扱う技術は大きな進展が見られている。ここで「個々の細胞の特性を１つずつ解析する」という目的をさらに吟味すると、「計測した個々の細胞のデータを互いに比較可能である」という前提となる要求が存在することが自明である。なぜならば個々の細胞計測値の相互比較によって特定細胞の特徴量や共通性の抽出が可能となるからであり、相互比較の実行においては個々の細胞由来のデータを規格化する技術が必要である。【０００６】
従来のバルク解析による遺伝子発現比較では計測値の規格化技術として、試料間の遺伝子発現プロファイルが概ね等しいものと仮定して計測値を補正する、グローバルノーマライゼーション方法や、外来の既知遺伝子配列を分析対象の核酸試料に添加する遺伝子スパイク法、等が用いられている。グローバルノーマライゼーションは数学的に規格化する手法であるため計測の実施において簡便であるが、遺伝子発現プロファイルが概ね等しいと仮定する前提のために正確性に難点がある。特に単一細胞解析は多様性を有する個々の細胞の個性を把握する目的で実施される解析技術であり、グローバルノーマライゼーション法の適用は推奨されない。【０００７】
一方、遺伝子スパイク法は正確な相互比較を実現する手段として認識されており、添加する既知遺伝子配列を共通化することによって異なる研究機関で作製した計測値を相互比較可能とする国際コンソーシアム（ERCC：External RNA Control Consortium）も設立されている。単一細胞解析においても遺伝子スパイク法を用いた規格化を実施した例が報告されており（非特許文献１）、その有効性が示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開公報WO/2014/020657
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．５（２００６）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．７（２００９），ｐｐ．５０３
【非特許文献３】Ｊ. Ｂｉｏｓｃｉ. Ｂｉｏｅｎｇ., ｖｏｌ．１１９, ｎｏ.４(２０１５), ｐｐ.492.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
たとえば、ほぼ全てのmRNAをcDNAに変え、ビーズ上に保持したcDNAライブラリー（全てのcDNAを含んだcDNA集合体）を作製して、定量分析に利用する方法が考案されている。そこでは、cDNAライブラリーを繰り返し利用することで試料分割による微量発現遺伝子の計測ミスを取り除き、１細胞中に含まれる複数遺伝子の発現量を正確に計測できることが示されている（非特許文献２）。【００１１】
また、発明者らを含むグル―プは、低コストな遺伝子発現解析を実現するために、ビーズの代わりに多孔質メンブレンなどを利用してcDNAライブラリーを作製することによって、遺伝子発現の２次元分布を得て、多数の細胞の単一細胞遺伝子発現解析を同時に実現できる２次元デバイスを開発した（特許文献１）。この２次元デバイスは、同一の反応容器内において多数の単一細胞解析を平行して実施することができる（特許文献１の図１０参照）。同一容器内での単一細胞解析は、非特許文献１のような細胞個々に反応溶液を調製して分析する手法と比較して、解析試行間の差を小さくできるため、より正確な生体分子比較の実現に有効である。尚、ここで述べた同一容器内は連続する空間を有する容器であり、共通して試薬の供給が可能な容器を含む。【００１２】
発明者らは、さらに個々の細胞間の比較や試行間の比較の正確性を向上させることを目標として、遺伝子スパイク法の利用を検討した。しかし、従来の遺伝子スパイク法は、個別の反応容器にそれぞれ一定量の外来遺伝子を添加することによってなされている。このため、同一反応溶液内で平行して単一細胞解析を行う、発明者らの２次元デバイスへの単純な適用は困難であった。【００１３】
本発明の課題は、同一容器内に並列する細胞捕捉領域に存在する核酸捕捉領域に対し、ばらつきを低減するように既知塩基配列で構成された外来遺伝子を添加することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決する本発明の一側面は、試料である細胞群を個々の細胞に分離し、個々の細胞の生体物質を捕捉領域に捕捉し、捕捉した前記生体物質に起因する物理量を計測する分析方法であって、細胞群の分離に先立って、物理量の規格化基準となる既知物質を捕捉領域に捕捉させる規格化工程を備える、分析方法である。【００１５】
本発明の典型的な例では、生体物質が１種類以上の塩基配列を有する物質であり、既知物質が１種類以上の塩基配列を有する既知の物質である。【００１６】
本発明のより好ましい具体例では、既知物質を含む溶液は、液滴の形状を有する内容物（疑似細胞）を包含し、液滴は既知物質を含むように構成される。【００１７】
本発明の他の一側面は、細胞を捕捉する複数の細胞捕捉領域と、捕捉された細胞に起因する核酸を捕捉する複数の核酸捕捉領域を備える分析用デバイスである。このデバイスは、細胞捕捉部と核酸捕捉部は１対１に配置されており、核酸捕捉部には、既知の物質が予め捕捉されている。【００１８】
本発明の典型的な例では、既知の物質が１種類以上の塩基配列を有する物質である。
【発明の効果】
【００１９】
同一容器内に並列する核酸捕捉領域に添加される、既知塩基配列である外来遺伝子の均一性を向上することができる。これにより、それらの外来遺伝子の出現数、頻度を指標とした細胞捕捉領域間のデータ規格化が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施例における反応セルの三面図
【図２】比較例となる外来遺伝子を用いた規格化工程の流れ図
【図３】本発明の実施例における外来遺伝子を用いた規格化工程の流れ図
【図４】本発明の実施例１における外来遺伝子を用いた規格化工程の詳細を示す拡大斜視図
【図５】本発明の実施例２における液滴を用いた規格化工程の詳細を示す拡大斜視図
【図６】本発明の実施例であるアレイデバイスの断面図
【発明を実施するための形態】
【００２１】
実施の形態について、図面を用いて詳細に説明する。ただし、本発明は以下に示す実施の形態の記載内容に限定して解釈されるものではない。本発明の思想ないし趣旨から逸脱しない範囲で、その具体的構成を変更し得ることは当業者であれば容易に理解される。
【００２２】
以下に説明する発明の構成において、同一部分又は同様な機能を有する部分には同一の符号を異なる図面間で共通して用い、重複する説明は省略することがある。
【００２３】
本明細書等における「第１」、「第２」、「第３」などの表記は、構成要素を識別するために付するものであり、必ずしも、数または順序を限定するものではない。また、構成要素の識別のための番号は文脈毎に用いられ、一つの文脈で用いた番号が、他の文脈で必ずしも同一の構成を示すとは限らない。また、ある番号で識別された構成要素が、他の番号で識別された構成要素の機能を兼ねることを妨げるものではない。
【００２４】
図面等において示す各構成の位置、大きさ、形状、範囲などは、発明の理解を容易にするため、実際の位置、大きさ、形状、範囲などを表していない場合がある。このため、本発明は、必ずしも、図面等に開示された位置、大きさ、形状、範囲などに限定されない。
【００２５】
発明者らは細胞２次元デバイスへの外来遺伝子添加方法について鋭意検討し、試料である細胞添加工程の前に外来遺伝子を反応槽に添加する手法を考案した。より詳細には２次元デバイス上に並列する細胞捕捉領域に存在する核酸捕捉領域に対し均一に既知塩基配列で構成された外来遺伝子を添加する技術である。
【００２６】
以下では本発明の理解を促進するため、まず初めに発現解析法及び遺伝子スパイク法を説明する。さらに遺伝子スパイク法を発明者らの２次元デバイスに適用するにあたっての課題について具体例を挙げて説明する。その後に、本発明に係る遺伝子スパイク法を実施する装置の具体的な構成について説明する。
【００２７】
従来の遺伝子発現解析法は分析対象である試料を個別の容器に添加し、それら空間的に隔離された容器を用いてcDNA合成、遺伝子増幅等の操作を行っている。近年の超並列シーケンサの発展により大量のデータ取得が可能となったため、複数の試料をそれぞれ個別の遺伝子タグで標識することによって識別可能とし、標識後の複数試料を混合し同一容器を用いてシーケンス反応以降の工程を実施する場合もある。その場合においても核酸の抽出からタグ配列による標識までの工程は、それぞれ空間を異にする容器を用いて行われている。つまり、従来技術の遺伝子スパイク法は試料が個別容器に存在する段階で外来遺伝子を添加することによって試料間の規格化が実現している。
【００２８】
以下の本発明の実施例では、同一容器内での複数細胞の単一細胞解析において外来遺伝子を添加することによって試料間の規格化を実現する例を説明する。
【実施例１】
【００２９】
最初に、我々の２次元デバイスを用いた遺伝子解析工程について説明する。【００３０】
＜１．反応セルの構造＞
図１は、遺伝子解析に用いる反応セルの構成を示す三面図である。溶液槽101に設置されたアレイデバイス102は並列した細胞捕捉領域103を持ち、且つ各細胞捕捉領域103の下方には各細胞由来の核酸を捕捉する核酸捕捉領域104を有している。このアレイデバイスは、２次元アレイデバイス、あるいは、並列アレイデバイスとも称すべきものである。【００３１】
細胞捕捉領域103に捕捉された個々の細胞105は、アレイデバイス102上で細胞膜が破壊され、細胞破壊によって細胞外に放出される核酸分子は細胞捕捉領域103直下の核酸捕捉領域104で捕捉されるため、個々の細胞由来の核酸分子はアレイデバイス上の捕捉位置によって区別可能となる。また、個々の核酸捕捉領域104に個別の識別タグを導入することにより、核酸捕捉領域104で捕捉した核酸分子に核酸捕捉領域104の位置に対応した識別タグの導入が可能である。個々の細胞由来の核酸分子をアレイデバイス102から剥離すると、それらの核酸分子はアレイデバイス上の位置情報を失うが、核酸分子に識別タグを導入した後は、識別タグを指標として各核酸分子はその由来細胞との紐付けが可能であり、これらアレイデバイス102を用いて調製を行った核酸分子は、定量PCRやシーケンサ等の既知遺伝子分析装置にて単一細胞解析を実施可能である。上記識別タグについては、例えば前掲の特許文献１に記載がある。【００３２】
図１(a)に細胞アレイデバイスの断面図を示す。細胞のインレット106、試薬のインレット107、上部アウトレット108、及び下部アウトレット109が溶液槽101に接続されている。本実施例ではアレイデバイス102は半導体プロセスを用いて作製したものを用いている。細胞インレット106から下部アウトレット109への溶液の流れを用いて、細胞インレット106からから注入される細胞105を正方格子状に配列させるために、1辺15μmの正方形の領域のみ細胞が吸引されるように細胞捕捉領域103のアレイが形成されている。【００３３】
ここで用いたアレイデバイス102は、シリコン基板110上に厚さ10μmのSiO2層を形成し、ドライエッチングを用いて、直径0.3μmの貫通孔111により核酸捕捉部104を形成し、その後、シリコン基板110を薄層化後、リソグラフィによって50μm周期の格子112を形成した。このようにして得られた核酸捕捉領域104の貫通孔111内壁には、シランカップリング処理によってDNAプローブを固定することが可能である。【００３４】
図１の(c)にB−B’での横断面図を示しており、異なるハッチングは異なる細胞認識用タグ配列が固定されていることを示している。また、図１(b)にA−A’での横断面図を示している。貫通孔111が露出している部分113は細胞が1つずつ収納されるような大きさのパタニングを行っている。【００３５】
＜２．解析工程＞
図１の反応セルを用いることによってアレイデバイス102の上に細胞105を1つ1つ固定し、貫通孔111の内部を溶液で満たすことができる。溶液槽101により、アレイデバイス102の周囲が溶液で満たされるようになっている。アレイデバイス102の上下の内側に、透明（ITO）電極がスパッタリングによって形成された上蓋（上部電極）114及び下蓋（下部電極）115が配置され、反応溶液で満たすための上部反応領域116及び下部反応領域117を形成する。電極を透明にしている理由は、細胞を光学顕微鏡で観察できるようにするためであり、今回使用したITO透明電極は400〜900nmの波長範囲で40％以上の透過特性を有する。【００３６】
＜２-１．mRNAの抽出と捕捉＞
インレット106からバッファ液を注入し、上部アウトレット108及び下部アウトレット109から排出して内部を溶液で満たす。次に反応セルを振とうしながら細胞流路（インレット106）から細胞群を反応セル内に流入させる。細胞105は正に帯電した部分に捕獲されるが、もちろん細胞が1個入るような容器又は区画を用いて細胞を捕獲してもよい。【００３７】
次いで温度によりゲル状態と液体状態を相変化する低融点アガロースゲル（SeaPrep Agarose; 2％のときゲル化温度19℃、融点45℃）に細胞溶解試薬を混和した溶液を用いてシート上での細胞の位置を固定した状態で細胞膜及び細胞組織を破壊してmRNAを抽出する。【００３８】
4％SeaPrep Agarose（Cambrex Bio Science Rockland, Inc.）溶液250μLとLysis Solution 495μL（TaqMan MicroRNA Cell-to-CT Kit; Applied Biosystems Inc.）とDNase I 5μLを40℃にてよく混和する。次にアレイデバイスの温度を4℃に設定し、反応領域116及び117の溶液を抜いてから、インレット107から上記細胞溶解試薬溶液を注入する。【００３９】
アレイデバイス102上の溶液がゲル化したことを確認し、アレイデバイス102の温度を20℃まで上げて、8分間反応させた後、Stopping Solution（DNaseを失活させる溶液）50μLをゲルの上に添加し、5分間反応させ、4℃に冷却する。【００４０】
次に、分子量60万の0.03％PEO（ポリエチレンオキシド）と分子量100万の0.03％PVP（ポリビニルピロリドン）、及び0.1％Tween 20を含む10mM Tris Buffer（pH 8.0）0.5mLを加える。このとき上部電極114と下部電極115間の距離は2mmとし、アレイデバイス102上部及び下部の空隙（反応領域116及び117）は前記Tris bufferで完全に満たされている。シート及び溶液温度を4℃に維持したまま、上部電極114を陰極（GND）、下部電極115を陽極として、+5Vを2分間印加し、負電荷を持つmRNAを細胞内部から117の方向へ電気泳動する。（電気泳動条件はDC電圧印加の代わりにオンレベル10V、オフレベル0V、周波数100kHz、デューティー50％のパルス電気泳動を用いてもよい）。【００４１】
この過程でmRNAはアレイデバイス102中の貫通孔111に固定されたDNAプローブのオリゴ(dT)部分にほとんどトラップされる。【００４２】
＜２-２．洗浄＞
次にインレット107から上記Tris bufferを導入し、アウトレット108から排出することによって、アレイデバイス上部の領域116中の溶液を交換しながら、溶液及びアレイデバイスの温度を35℃まで上げてアガロースゲルを溶解させて、必要のない細胞組織とアガロースを洗浄し、除去する。【００４３】
＜２-３．逆転写反応、cDNAライブラリー形成＞
0.1％Tween20を含む10mM Tris Buffer（pH=8.0）585μLと10mM dNTP 40μLと5xRT Buffer（SuperScript III, Invitrogen社）225μLと0.1M DTT 40μLとRNaseOUT（Invitrogen社）40μLとSuperscript III（逆転写酵素, Invitrogen社）40μLを混和し、アレイデバイス102を満たしている溶液をアウトレット108及び109から排出し、直ちに逆転写酵素を含む上記溶液をインレット107から注入する。【００４４】
その後、溶液とアレイデバイス102を50℃に上げて、50分間保つことによって逆転写反応を完了させ、mRNAに対して相補的な配列を持つ1st cDNA鎖を合成した。【００４５】
以上の操作から、細胞ごとに多くの細孔の表面に固定されたcDNAをライブラリーとして得ることができる。これはいわば1細胞cDNAライブラリーシートというべきものであり、これまでの多くの細胞から得られる平均化されたcDNAライブラリーとは根本的に異なるものである。【００４６】
＜２-４．洗浄＞
1st cDNA鎖を合成した後、85℃にて1.5分保ち逆転写酵素を失活させ、4℃に冷却後、RNase及び0.1％Tween20を含む10mM Tris Buffer（pH = 8.0）10mLをインレット107から注入し、アウトレット108及び109から排出することによって、RNAを分解し、同量のアルカリ変性剤を同様に流して細孔内の残存物及び分解物を除去・洗浄する。【００４７】
＜２-５．2nd cDNA鎖合成＞
続いて、滅菌水690μLと10xEx Taq Buffer（TaKaRa Bio社）100μLと2.5mM dNTP Mix 100μLと各10μM PCR増幅用プライマーMix100μLとEx Taq Hot start version（TaKaRa Bio社）10μLを混和し、アレイデバイス102を満たしている溶液をアウトレット108及び109から排出し、直ちにDNA合成酵素を含む上記溶液をインレット107から注入する。【００４８】
その後、溶液とアレイデバイス102を95℃3分間→44℃2分間→72℃6分間の反応を行い、1st cDNA鎖を鋳型としてプライマーをアニールさせた後、相補鎖伸長反応を行い、2nd cDNA鎖を合成させる。【００４９】
＜２-６．PCR増幅工程＞
続いて、滅菌水495μLと10x High Fidelity PCR Buffer（Invitrogen）100μLと2.5 mM dNTP mix 100μLと50mM MgSO4 40μLと10μM PCR増幅用プライマー100μLとPlatinum Taq Polymerase High Fidelity（Invitrogen社）15μLを混和し、シートを満たしている溶液をアウトレット108及び109から排出し、直ちに上記溶液をインレット107から注入する。【００５０】
その後、溶液とアレイデバイスを30秒間94℃に保ち、94℃30秒間→55℃30秒間→68℃30秒間の3段階工程を40サイクル繰り返し、最後に68℃3分間保った後、4℃に冷却してPCR増幅工程を行う。増幅工程終了後、アレイデバイス102の貫通孔111内部及び外部の溶液中に蓄積されたPCR増幅産物溶液を回収する。【００５１】
＜２-７．精製および解析＞
この溶液中に含まれる余剰のPCR増幅用プライマーや酵素などの残留試薬を除去する目的で、PCR Purification Kit（QIAGEN社）を用いて精製する。この溶液をemPCR増幅又はブリッジ増幅適用後、各社（例えばLife Technologies（Solid/Ion Torrent）、Illumina（High Seq）、Roche 454）の次世代シーケンサに適用して配列を解析する。【００５２】
＜３．規格化の検討＞
上記２次元アレイデバイスは、同一溶液内において複数の細胞を、個々の単一細胞に分離して並列解析を実現する。従来の単一細胞解析は個々の細胞を個別の容器・空間で行うために解析細胞数と同数の容器・空間を必要とし、多くの試薬を用いるため高コストであった。また、細胞個々に反応試薬を調製するため、試薬の分注誤差が発生することも問題であった。本アレイデバイスはそれらの課題を解決し、低コストで均質な分析の実現に有効な手段である。発明者らは均質な分析の実現についてさらに検討を行いより正確な比較解析を実現する手段として遺伝子スパイク法の実装を試みた。先に述べたように従来遺伝子解析手法における遺伝子スパイク法は検査対象試料である核酸溶液に既知の外来遺伝子を混合する手法である。【００５３】
図２に非特許文献１の方式を、発明者らの視点で模式的に示す。非特許文献１を詳細に分析すると、まず細胞を個別化し（S201）、個々の細胞を個別の反応容器に取り分け、その後、核酸抽出することによって（S202）、各細胞由来の核酸分子を空間的に隔離している。そして、それら個別の反応容器に既知遺伝子配列を添加することによって（S203）、遺伝子解析段階（S204）で、遺伝子スパイク法による規格化を実現している。個別の反応容器内の試料が単一細胞由来の核酸試料となっているが、規格化実施の手法としてはバルク解析と同一の技術であった。【００５４】
一方発明者らの並列アレイデバイス102の解析工程では、デバイスに添加する試料は複数の細胞を含む溶液であり、この溶液に対し外来遺伝子を添加しても単一細胞解析における個々の核酸分子群への外来遺伝子の添加は実現されない。発明者らの並列アレイデバイスにおいて遺伝子スパイク法を実現するためには各細胞の核酸分子が捕捉される個々の核酸捕捉領域104に均一な外来遺伝子の添加が要求される。つまり、従来技術のように独立した容器内の分析試料への外来遺伝子の添加ではなく、試料溶液とは独立した工程として外来遺伝子の添加が必要である。また、アレイデバイス102上の位置に関わらず、どの核酸捕捉領域104にも均一な外来遺伝子を添加することが重要である。【００５５】
外来遺伝子の添加工程の順序としてi) 細胞溶液と同時、ii) 細胞溶液添加前、iii)細胞溶液添加後に分け、それぞれ効果と課題を検討した。【００５６】
細胞溶液同時添加は外来遺伝子添加のタイミングとして従来法の遺伝子スパイク法と類似するが、溶液に含まれる試料が細胞である点が異なっている。アレイデバイス102を用いた計測では、溶液槽101に添加された試料溶液から個々の細胞が細胞捕捉領域103に捕捉され、細胞破壊によって遊離する個々の細胞由来の核酸分子が細胞捕捉領域103下部の核酸捕捉領域104に捕捉されることは先に述べたとおりである。これら外来遺伝子には核酸捕捉領域104に固定化されている核酸分子または核酸誘導体分子の塩基配列と一部相同性を有する構造とすることにより、溶液中の核酸分子は核酸捕捉領域104に捕捉される
アレイデバイス102への細胞捕捉は溶液流等の物理的な力が用いられ、細胞105を捕捉する前後で細胞捕捉領域103への物理的力が変化することによって細胞捕捉領域103には規定数、単一細胞解析ではひとつの細胞が捕捉される。試料溶液添加から細胞105が捕捉されるまでの時間を考えると、個々の細胞捕捉領域103が細胞105を捕捉するまでの解放状態の時間は各細胞捕捉領域103で異なっており、全細胞捕捉領域で同時の細胞捕捉は実現が困難である。本アレイデバイスへの細胞溶液添加と同時に、遺伝子スパイク法のために外来遺伝子を添加した場合、添加した核酸分子は細胞捕捉後よりも細胞捕捉前の、細胞捕捉領域103が開放状態の場合に、より多く細胞捕捉領域103下部の核酸捕捉領域104に到達する。つまり、開放持続時間が異なる細胞捕捉領域103の下部の核酸捕捉領域104では異なる量の外来遺伝子が捕捉され、その結果本来の規格化の基準として正確性が保証されない。つまり、従来のスパイク法を模擬して試料溶液へ外来遺伝子を添加してもスパイク法の目的である各細胞の企画化に十分な効果を期待できないことになる。【００５７】
次にii)細胞溶液添加前について検討を行った。検査対象の細胞105を含まない溶液に塩基配列既知の外来遺伝子を添加し、アレイデバイス102が設置された溶液槽101に本溶液の注入を行う。【００５８】
遺伝子スパイク法は計測値の規格化を目的とするため、アレイデバイス102の各核酸捕捉領域104に均一な分子数の外来遺伝子が捕捉されることが望ましい。細胞溶液添加前に外来遺伝子を導入した場合、細胞捕捉領域103および核酸捕捉領域104への外来遺伝子を含む溶液流を阻害する要因が存在しないため、細胞同時添加よりも核酸捕捉領域104への核酸分子捕捉の均一性は向上する。【００５９】
外来遺伝子捕捉工程が終了した後、アレイデバイス102に細胞105を添加する工程に先立って、アレイデバイス102が存在する溶液漕101を核酸分子を含まない溶液で洗浄することが重要である。洗浄工程を実施することなく細胞溶液を添加した場合、溶液漕101に残存する外来遺伝子と細胞溶液が混合することとなり、先に述べた細胞と外来遺伝子の同時添加で見られた不具合発生の要因となるためである。つまりアレイデバイス102を有する溶液漕101に対し、外来遺伝子を含む溶液の添加、外来遺伝子の洗浄、細胞を含む溶液の添加という一連の工程によって外来遺伝子を用いた規格化が可能となる。【００６０】
次にiii)細胞溶液添加後について検討する。細胞105を含む溶液を添加した段階では、細胞捕捉領域103には、個々の細胞105が細胞形状を保ったまま捕捉された状態である。外来遺伝子を導入する段階としては大きく分けて以下の2種類である。ひとつは細胞105が形状を保った段階での外来遺伝子の添加、もうひとつは細胞105を破壊し細胞由来の核酸が核酸捕捉領域104に捕捉された後の段階である。細胞形状を保ったままの段階で外来遺伝子を添加した場合、外来遺伝子の核酸捕捉領域104への到達は個々の細胞破砕時期の影響を受ける。より詳しくは早く破砕された細胞の下部にある核酸捕捉領域104には外来遺伝子が早期に到達し、破砕が遅れた細胞下部の核酸捕捉領域104への外来遺伝子の到達は遅延する。【００６１】
この外来遺伝子到達時間の違いは外来遺伝子を用いた規格化に不適である。細胞破砕の後に外来遺伝子を添加した場合にはさきに述べたような外来遺伝子の到達時間の差異は発生しないために規格化の目的には適している。ただし、ここで核酸捕捉領域104で発生する事象を詳細に検討すると、細胞破砕によって細胞より抽出された核酸分子が捕捉された核酸捕捉領域104に外来遺伝子捕捉の処理を行うことになる。【００６２】
一般に核酸の捕捉は塩基配列の相補性を持って成され、その結合は可逆性を有しているために一度結合した核酸分子は遊離し得る。つまり、核酸捕捉領域104に捕捉された個々の細胞に由来する核酸分子は外来遺伝子の捕捉処理を追加することで遊離することが想定される。単一細胞解析はひとつの細胞に由来する微量な生体分子を計測することを目的としており、規格化を実現するために本来の細胞由来の核酸分子の検出力が低下することは避けるべきである。【００６３】
＜４．規格化工程＞
図３に以上＜３．規格化の検討＞の検討を踏まえて提案される単一細胞並列解析デバイスの遺伝子規格化工程のフローを示す。実施される装置構成は図１に示した例を用いるが、これに限るものではない。【００６４】
まず、検査対象の細胞105を含まない溶液に、塩基配列既知の外来遺伝子を添加して規格化溶液（外来遺伝子溶液）を作成し、アレイデバイス102が設置された溶液槽101に規格化溶液の注入を行う（S301）。【００６５】
このために、インレット106から規格化溶液を注入し、上部アウトレット108及び下部アウトレット109から排出して、溶液漕101内部を規格化溶液で満たす。先述のように、これら外来遺伝子は、核酸捕捉部104に固定化される核酸分子または核酸誘導体分子の塩基配列と一部相同性を有する構造とすることにより、溶液中の核酸分子は核酸捕捉部104に捕捉される。遺伝子スパイク法は計測値の規格化を目的とするため、アレイデバイス102の各核酸捕捉部104に均一な分子数の外来遺伝子が捕捉されることが望ましい。【００６６】
外来遺伝子捕捉工程が終了した後、アレイデバイス102に細胞105を添加する工程に先立って、アレイデバイス102が存在する溶液漕101を、核酸分子を含まない溶液で洗浄する（S302）。このために、例えばインレット106から核酸分子を含まない緩衝液を注入し、インレット106内部および溶液漕101内部を十分洗浄する。インレット106を洗浄することなく、同じくインレット106から細胞溶液を添加した場合、インレット106内に残存する外来遺伝子と細胞溶液が混合することとなり、先に述べた細胞と外来遺伝子の同時添加で見られた不具合発生の要因となるためである。【００６７】
この後、インレット106から細胞群を含む試料溶液を溶液漕101に注入し（S303）、並列アレイデバイスを用いた個別細胞タグの付与工程（S304）を実施する。これらの処理については、＜２．解析工程＞で説明したものと同様である。【００６８】
図４に上記処理の詳細を示す。図４は、図１の細胞捕捉領域103と核酸捕捉領域104の部分の拡大斜視図を示している。図４(a)のように、単一細胞並列解析デバイス102は、細胞捕捉領域103、核酸捕捉領域104を２次元アレイ状に有している。この状態で、溶液槽101に外来遺伝子（スパイク）を含む溶液を加えることにより、核酸捕捉領域104に理想的には均一な外来遺伝子を与えることができる。すなわち、図４(b)に示すように、核酸捕捉領域104は、規格化処理を受けた核酸捕捉領域104Nになったともいえる。その後、図４(c)に示すように、通常の遺伝子分析処理と同様に、細胞捕捉領域103に個々の細胞105を捕捉し、分析する。【００６９】
上記の説明から明らかなように、本実施例では、試料である細胞群を個々の細胞に分離して個別細胞の生体物質を分離または計測する際に、細胞群の分離に先立って、規格化基準となる既知物質の添加工程と既知物質の除去工程を実施している。【００７０】
以上のように、規格化工程として、細胞溶液添加前に外来遺伝子の添加工程を実施することにより、各核酸捕捉領域104へできるだけ均一な外来遺伝子の導入を実現する。各細胞由来の遺伝子発現計測値は、各細胞捕捉領域104で示される外来遺伝子の計測値を参照することによって規格化することができる。したがって、細胞間の遺伝子発現の比較や、異なるデバイス上で計測された試験との比較が可能となる。【００７１】
なお、以上の実施例１では、PCR増幅工程を有する分析方法を説明した。ただし、本発明の実施形態はこれに限定されるものではなく、試料となる核酸分子とともに基準となる物質が核酸捕捉部に捕捉され、両者を測定することにより複数の核酸捕捉部由来のデータが正規化されればよく、分析方法は公知の種々の手法を使用することができる。
【実施例２】
【００７２】
次に、外来遺伝子スパイク法による規格化を実現する手段として、さらに検討を行った例について以下に述べる。【００７３】
外来遺伝子添加工程として、外来遺伝子の添加、外来遺伝子の洗浄、細胞試料の添加というフローは実施例１と同一であるが、より均質な外来遺伝子の添加と十分な洗浄を達成する手段として、規格化溶液を細胞と類似する大きさの液滴(スパイク液滴）として作製し、アレイデバイス槽に添加する。つまり、アレイデバイスへの細胞捕捉の前段階として、スパイク液滴を、既知の外来遺伝子を含む擬似細胞として機能させ、これを細胞捕捉領域103に捕捉することによって、核酸捕捉領域104への均一な外来遺伝子の導入を実現する。【００７４】
具体的な処理方法としては、＜２．解析工程＞で説明した解析工程の前に、図３の外来遺伝子溶液の添加工程S301として上記＜２-１．mRNAの抽出と捕捉＞と等価な処理を、外来遺伝子溶液の洗浄工程S302として上記＜２-２．洗浄＞と等価な処理を行う。ただし、これらの工程において、細胞流路（インレット106）からは、分析対象試料となる細胞の代わりに、スパイク液滴（疑似細胞）を注入して処理を行う。すなわち、試料細胞の破壊、核酸の捕捉のプロセスの前に、既知の物質を含むスパイク液滴（疑似細胞）の破壊、物質の捕捉のプロセスを備えることにより、試料細胞由来の核酸から得られる測定値を正規化していることになる。【００７５】
図５に上記処理の詳細を示す。図５は、図１の細胞捕捉領域103と核酸捕捉領域104の部分の拡大斜視図を示している。図５(a)のように、単一細胞並列解析デバイス102は、細胞捕捉領域103、核酸捕捉領域104を２次元アレイ状に有している。【００７６】
この状態で、溶液槽101に外来遺伝子（スパイク）を含むスパイク液滴（擬似細胞）501を加え、細胞捕捉領域103に液滴501を捕捉する。核酸捕捉領域104への外来遺伝子の捕捉は細胞由来核酸の捕捉と同様に実施することができる。サイズの揃った液滴501を捕捉し、捕捉させた液滴から外来遺伝子を取り出し、取り出した外来遺伝子を核酸捕捉領域に捕捉させることで、図3の溶液添加よりもより均一な外来遺伝子の添加が期待できる。この結果、図５(c)に示すように、核酸捕捉領域104は、規格化処理を受けた核酸捕捉領域104Nになる。その後、図５(c)に示すように、通常の遺伝子分析処理と同様に、細胞捕捉領域103に個々の細胞105を捕捉し、分析する。【００７７】
以上のように、スパイク液滴501は理想的には、試料細胞の場合と同様に細胞捕捉領域103にひとつずつ捕捉される。そのため、細胞捕捉領域103下部の核酸捕捉領域104に導入される外来遺伝子はひとつの液滴501に由来する分子数に限定され、核酸捕捉部への外来遺伝子の導入の均一性が向上する。【００７８】
スパイク液滴501の大きさは、一つの細胞捕捉領域103に２以上の液滴501が捕捉されることを避けるためには、細胞捕捉領域103の短辺の50％（半分）以上の径を持てばよい。より好ましくは90〜100％の大きさの径が理想的である。また、試料とされる細胞105との比較では、理想的には検査対象となる細胞105と同じ大きさがよい。検査対象細胞やスパイク液滴は、細胞捕捉領域103の短辺の大きさの90〜100％の大きさを持つことが好ましい。これらの値は試料の平均値を用いて測定してよい。【００７９】
本実施例で利用する細胞サイズの液滴形成技術は、非特許文献３を含め多くの先行研究がなされている。サイズの均一な液滴、つまり外来遺伝子の内容量が均一化された擬似細胞を個々の細胞捕捉領域に捕捉することにより、各核酸捕捉領域104にはひとつの擬似細胞由来の外来遺伝子の捕捉が実現される。実施例１に示した規格化溶液の添加ではデバイスの形状や溶液の流れ方によって核酸捕捉領域104への外来遺伝子の均一な捕捉が困難となる場合も想定されるが、外来遺伝子を含む液滴を用いることでより、均一な外来遺伝子の核酸捕捉領域104への導入が達成される。【００８０】
その後、＜２．解析工程＞で説明した分析処理を行うことで、外来遺伝子による規格化が可能となる。
【実施例３】
【００８１】
実施例１および２では、同一の反応セルにおいて、アレイデバイスに対して規格化処理を行った後、引き続き＜２．解析工程＞で説明した処理を行う例を示した。【００８２】
他の実用的な例としては、規格化処理と＜２．解析工程＞で説明した処理を、別個に行うことも可能である。すなわち、アレイデバイス102に予め規格化処理を行って販売し、購入した者が、溶液槽101に組み込んで反応セルを構成し、引き続き＜２．解析工程＞で説明した処理を行うものである。【００８３】
図６に実施例３のアレイデバイス102の例の断面図を示す。平面形状などは図１に示したものと同様であり、２次元アレイ構成となっている。核酸捕捉部104Nは、予め実施例１または２で説明した規格化処理がなされており、外来遺伝子が捕捉済みの状態となっているため、その後の解析工程では、アレイデバイス102に捕捉済みの外来遺伝子を用いてデータの規格化が可能となる。【００８４】
以上説明した本発明の実施例により、２次元デバイス上に並列する細胞捕捉領域に存在する核酸捕捉領域に既知塩基配列である外来遺伝子を均一に添加することにより、それらの外来遺伝子の出現数、頻度を指標とした細胞捕捉領域間のデータ規格化が可能となる。また、複数の2次元デバイスによって得られた遺伝子発現解析データの比較も本技術を用いたデータ規格化により達成される。【００８５】
本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることが可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることが可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の実施例の構成の追加・削除・置換をすることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
各種の遺伝子解析に利用可能である。
【符号の説明】
【００８７】
溶液槽101、アレイデバイス102、細胞捕捉領域103、核酸捕捉部104、細胞105、スパイク液滴（疑似細胞）501
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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