(57)【要約】【課題】バイオセンサの保管状態においてメディエータが還元されるのを防止することができる技術を提供することを目的とする。【解決手段】バイオセンサ１００の反応層１０６の構成として、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層１０６ａと、メディエータ等を含む試薬層１０６ｃとの間に界面活性剤を含む中間層１０６ｂを設ける。これにより、メディエータが酸素原子の二重結合を有する親水性高分子と接触するのを防止することができるため、バイオセンサ１００の保管状態においてメディエータが還元されるのを防止することができる。【選択図】図２
2014089096.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、
スリットが形成されて、前記スリットが前記作用極および前記対極の先端側に配置されて前記電極層の前記一方面に積層されるスペーサ層と、
前記電極層および前記スリットにより形成されて試料が供給されるキャビティと、
前記キャビティに連通する空気穴が形成されて前記キャビティを被覆して前記スペーサ層に積層されるカバー層と、
前記キャビティに露出する前記作用極および前記対極の先端側に設けられた反応層とを備えるバイオセンサにおいて、
前記反応層は、
前記電極層上に設けられ、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層と、
前記親水層上に設けられ、界面活性剤を含む層、水溶性ゲル化剤を含む層、両親媒性高分子を含む層、および前記親水層の表面が撥水処理されて形成された撥水層のうちの少なくとも１つを含む中間層と、
前記中間層上に設けられ、測定対象物質と反応する酵素およびメディエータを含む試薬層と
を備えることを特徴とするバイオセンサ。
【請求項２】
前記試薬層は、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記試薬層は、
前記酵素および前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層と、
前記メディエータおよび前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層と
を備えることを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記酵素層上に前記メディエータ層が積層されていることを特徴とする請求項３に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項２ないし４のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は、少なくともカルボキシメチルセルロースを含むことを特徴とする請求項１ないし５のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記界面活性剤が、ジ（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ−４−ノニルフェニルエーテル（ｎ≒７．５）、ソルビタンモノラウラート、ソルビタンモノオレエート、コール酸ナトリウム、レシチンのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１ないし６のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記水溶性ゲル化剤が、カラギーナンおよびアルギン酸ナトリウムのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１ないし７のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記両親媒性高分子が、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールのうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１ないし８のいずれかに記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記撥水層は、前記親水層の表面が、フッ素系ガスを用いて生成されたプラズマによりエッチングされて形成されていることを特徴とする請求項１ないし９のいずれかに記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、キャビティを形成するためのスリットが形成されて電極層に積層されるスペーサ層と、キャビティに連通する空気穴が形成されてスペーサ層に積層されるカバー層と、作用極および対極に設けられた反応層とを備えるバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
図１１の従来のバイオセンサに示すように、作用極５０１および対極５０２を含む電極系と、測定対象物質と特異的に反応する酵素を含む反応層５０３とを有するバイオセンサ５００を用いて、試料に含まれる測定対象物質と反応層５０３とが反応することで生成される還元物質を作用極５０１と対極５０２との間に電圧を印加して酸化することにより得られる酸化電流を計測することで測定対象物質の定量を行う物質の測定方法が知られている（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
図１１に示すバイオセンサ５００は、試料に含まれるグルコースを定量するためのセンサであって、ポリエチレンテレフタレートやポリイミドなどの絶縁性基板に電極が設けられて形成された電極層５０４と、カバー層５０６と、電極層５０４とカバー層５０６とに挟まれて配置されるスペーサ層５０５とが積層されて形成される。また、スペーサ層５０５には、試料が供給されるキャビティ５０７を形成するためのスリットが設けられており、電極層５０４にスペーサ層５０５を介してカバー層５０６が積層されて接着されることで、電極層５０４と、スペーサ層５０５のスリットの部分と、カバー層５０６とにより試料が供給されるキャビティ５０７が形成される。そして、スリットの開口部分によりバイオセンサ５００の側面に形成される試料導入口からキャビティ５０７に試料が供給される。また、カバー層５０６には、毛細管現象による試料のキャビティ５０７への供給を円滑に行うために、キャビティ５０７の終端部と連通する空気穴５０６ａが形成されている。
【０００４】
また、電極層５０４には、作用極５０１および対極５０２が設けられ、これらの電極５０１，５０２にそれぞれ電気接続される電極パターンが設けられることにより電極層５０４に電極系が形成されている。また、作用極５０１および対極５０２上には反応層５０３が設けられており、作用極５０１および対極５０２は、それぞれバイオセンサ５００に形成されたキャビティ５０７に露出するように電極層５０４に設けられている。
【０００５】
したがって、液体から成る試料がキャビティ５０７に試料導入口から供給されると、キャビティ５０７に露出する各電極５０１，５０２と反応層５０３とが試料に接触すると共に、反応層５０３が試料に溶解する。
【０００６】
また、作用極５０１および対極５０２上に設けられた反応層５０３は、電極層５０４上に設けられ、親水性高分子であるカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む親水層５０３ａと、親水層５０３ａに積層され、試料に含まれるグルコースと特異的に反応するグルコースオキシダーゼ（酵素）およびメディエータ（電子受容体）としてのフェリシアン化カリウムを含む試薬層５０３ｂとにより形成されている。そして、電極層５０４上に設けられた親水層５０３ａにより、各電極５０１，５０２が保護されると共に、試薬層５０３ｂの剥離が防止されている。
【０００７】
また、フェリシアン化カリウムが試料に溶解することで電離したフェリシアン化イオンは、グルコースがグルコースオキシダーゼと反応してグルコノラクトンに酸化される際に放出される電子によりフェロシアン化イオン（フェリシアン化イオンの還元体）に還元される。したがって、バイオセンサ５００に形成されたキャビティ５０７にグルコースを含む試料が試料導入口から供給されると、試料に含まれるグルコースの濃度に応じた量だけフェロシアン化イオンが生成される。
【０００８】
このよう構成されたバイオセンサ５００では、酵素反応の結果生じたメディエータの還元体を作用極５０１上で酸化することにより得られる酸化電流が、試料中のグルコース濃度に依存した大きさとなるため、この酸化電流を計測することにより試料に含まれるグルコースの定量を行うことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−２８１２０２号公報（段落００１７，００１８、図２など）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、血液試料には赤血球などの血球が含まれており、上記した酸化電流の大きさは、血液試料中の血球の容積の割合を示すヘマトクリット値の大きさに影響されることが知られている。この酸化電流への影響は、血球が作用極や対極の表面等に付着することに起因する。そこで、上記したバイオセンサ５００では、電極層５０４に設けられ、親水性高分子であるＣＭＣを含む親水層５０３ａにより、血液試料が濾過されて血球の電極層方向への移動が抑制されることで、ヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響の低減が図られている。
【００１１】
ところが、ＣＭＣなどの親水性高分子は、試薬層５０３ｂに含まれるメディエータを還元することが知られている。したがって、例えばバイオセンサ５００が保管された状態において、親水層に含まれる親水性高分子によりメディエータが還元されると、上記した酸化電流を計測する際に、親水性高分子により還元されたメディエータが酸化することによる酸化電流もバックグランド電流として、計測対象である酸化電流と一緒に計測されるので、測定精度が劣化する。そこで、バイオセンサ５００では、親水性高分子を含む親水層５０３ａと、メディエータを含む試薬層５０３ｂとが分離された状態で積層されることにより、親水層５０３ａに含まれる親水性高分子と、試薬層５０３ｂに含まれるメディエータとの反応が防止されている。
【００１２】
しかしながら、上記したように、親水層５０３ａおよび試薬層５０３ｂが分離された状態で積層されていても、親水層５０３ａおよび試薬層５０３ｂが接触する界面から、親水性高分子とメディエータとの反応が徐々に進むことにより、酸化電流の測定精度が劣化するので、劣化防止の改善策が求められていた。
【００１３】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、保管状態においてメディエータが還元されるのを防止することができる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記した目的を達成するために、本発明のバイオセンサは、絶縁性基板の一方面に作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層と、スリットが形成されて、前記スリットが前記作用極および前記対極の先端側に配置されて前記電極層の前記一方面に積層されるスペーサ層と、前記電極層および前記スリットにより形成されて試料が供給されるキャビティと、前記キャビティに連通する空気穴が形成されて前記キャビティを被覆して前記スペーサ層に積層されるカバー層と、前記キャビティに露出する前記作用極および前記対極の先端側に設けられた反応層とを備えるバイオセンサにおいて、前記反応層は、前記電極層上に設けられ、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層と、前記親水層上に設けられ、界面活性剤を含む層、水溶性ゲル化剤を含む層、両親媒性高分子を含む層、および前記親水層の表面が撥水処理されて形成された撥水層のうちの少なくとも１つを含む中間層と、前記中間層上に設けられ、測定対象物質と反応する酵素およびメディエータを含む試薬層とを備えることを特徴としている。
【００１５】
このような構成によれば、作用極および対極を含む電極系が設けられた電極層上に酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層が設けられている。一般的に、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は血液試料に含まれる血球の移動を阻止する効果が高い。すなわち、例えば、血液試料がキャビティに供給されると、当該親水層により血液試料が濾過されて血球の移動が阻止され、血球を除く成分（例えば、グルコース）が電極層の各電極に接触する。このように、親水層の親水性高分子により血液試料の血球が電極層の各電極に向かって移動するのが防止されるため、血液試料のヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響を低減することができる。
【００１６】
また、親水性高分子が酸素原子の二重結合を有する場合、酸素原子の二重結合を有する官能基がメディエータに対して求核攻撃することによりメディエータが還元されると考えられる。したがって、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層上に試薬層を配置すると、保管状態において、両層の接触界面で、親水性高分子によるメディエータの還元反応が徐々に進み、上記したように、バイオセンサにおける酸化電流の測定精度が劣化するという問題が生じる。
【００１７】
しかしながら、上記した構成によれば、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層とメディエータ等を含む試薬層との間に、界面活性剤を含む層、水溶性ゲル化剤を含む層、両親媒性高分子を含む層、および親水層の表面が撥水処理されて形成された撥水層のうちの少なくとも１つを含む中間層が配置されるため、当該中間層により、親水層の親水性高分子と試薬層のメディエータとが接触するのを防止することができ、これにより、メディエータが還元されるのを防止することができる。
【００１８】
したがって、メディエータの還元防止とヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響低減を両立することが可能となり、正確で信頼性の高いバイオセンサを提供することができる。
【００１９】
また、前記試薬層は、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子をさらに含んでいてもよい。このように構成することにより、メディエータの周囲が、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子、すなわち、メディエータが還元されにくい親水性高分子により囲まれた状態になるため、親水層に含まれる酸素原子の二重結合を有する親水性高分子と試薬層のメディエータとの接触を防止する効果がさらに向上する。
【００２０】
また、親水性高分子が増粘剤として機能することにより、試薬層と中間層との接着強度が増加するため、外部応力等により試薬層が中間層から剥離するのを防止することができる。
【００２１】
また、前記試薬層は、前記酵素および前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層と、前記メディエータおよび前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層とを備えていてもよい。このように構成することにより、酵素およびメディエータが分離された状態となるため、保管状態においてメディエータが酵素により還元されるのを防止することができる。
【００２２】
また、前記酵素層上に前記メディエータ層が積層されていることが好ましい。このようにすると、親水層の親水性高分子とメディエータとがさらに離れて配置されることになるため、メディエータの還元防止効果がさらに向上する。また、中間層および親水層中の酵素の移動度は、メディエータの移動度より小さいので、電極近傍での酵素・メディエータ量が、メディエータの上に酵素が配置された場合より多くなり、センサの応答性と測定精度が向上する。
【００２３】
また、前記酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールのうちの少なくとも１つを含む構成であってもよい。このように構成することにより、試薬層に含まれるメディエータが還元されるのを防止することができるとともに、試薬層が中間層から剥離するのを防止することができるため、実用的な構成のバイオセンサを提供することができる。
【００２４】
また、前記酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は、少なくともカルボキシメチルセルロースを含む構成であってもよい。このように構成することにより、親水層上に設けられる中間層が剥離するのを防止することができる。また、バイオセンサのキャビティに、例えば血液試料が供給された場合に、親水層の親水性高分子により血液試料が濾過されて血球の各電極への移動が阻止されるので、血液試料のヘマトクリット値の差異に伴う酸化電流の測定精度への影響を低減することができる。
【００２５】
また、前記界面活性剤が、ジ（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ−４−ノニルフェニルエーテル（ｎ≒７．５）、ソルビタンモノラウラート、ソルビタンモノオレエート、コール酸ナトリウム、レシチンのうちの少なくとも１つを含む構成であってもよい。このように構成することにより、中間層上に設けられた試薬層のメディエータが親水層の親水性高分子と接触するのを防止することができ、これにより、メディエータが親水層の親水性高分子により還元されるのを防止することができる。
【００２６】
また、前記水溶性ゲル化剤が、カラギーナンおよびアルギン酸ナトリウムのうちの少なくとも１つを含む構成であってもよい。このように構成することにより、中間層上に設けられた試薬層のメディエータが親水層の親水性高分子と接触するのを防止することができ、これにより、メディエータが親水層の親水性高分子により還元されるのを防止することができる。
【００２７】
また、前記両親媒性高分子が、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールのうちの少なくとも１つを含む構成であってもよい。このように構成することにより、中間層上に設けられた試薬層のメディエータが親水層の親水性高分子と接触するのを防止することができ、これにより、メディエータが親水層の親水性高分子により還元されるのを防止することができる。
【００２８】
また、前記撥水層は、前記親水層の表面が、フッ素系ガスを用いて生成されたプラズマによりエッチングされて形成されていてもよい。このように構成することにより、中間層上に設けられた試薬層のメディエータが親水層の親水性高分子と接触するのを防止することができ、これにより、メディエータが親水層の親水性高分子により還元されるのを防止することができる。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層と、メディエータ等を含む試薬層との間に中間層を設けるため、メディエータが酸素原子の二重結合を有する親水性高分子と接触するのを防止することができ、これにより、保管状態において、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子によりメディエータが還元されるのを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサを示す図であって、（ａ）は分解斜視図、（ｂ）は斜視図である。
【図２】図１のバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。
【図３】図１のバイオセンサの製造方法を示す図であって、（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ異なる工程を示す。
【図４】図１のバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。
【図５】本発明の第２実施形態にかかるバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。
【図６】本発明の第３実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であって、（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ異なる工程を示す。
【図７】図６の製造方法により製造されたバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。
【図８】本発明の第４実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であって、（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ異なる工程を示す。
【図９】図８の製造方法により製造されたバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。
【図１０】本発明の第５実施形態にかかるバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。
【図１１】従来のバイオセンサを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
＜第１実施形態＞
本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサおよびこのバイオセンサの製造方法について図１〜図４を参照して説明する。なお、図１は本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサを示す図であって、（ａ）は分解斜視図、（ｂ）は斜視図である。図２は図１のバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。図３は本発明の第１実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であって、（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ異なる工程を示す。
【００３２】
（バイオセンサの構成および製造方法）
本実施形態にかかるバイオセンサ１００は、作用極１０１および対極１０２を含む電極系と、メディエータおよび測定対象物質と反応する酵素を含む反応層１０６とを有し、測定器（図示省略）に装着されて使用されるものである。具体的には、バイオセンサ１００が測定器の所定の位置に装着された状態で、当該バイオセンサの先端側に設けられたキャビティ１０３に血液などの試料が供給される。供給された試料はキャビティ１０３内に設けられた反応層１０６と接触するとともに、試料と反応層１０６とが反応し、反応層１０６に含まれる物質が還元された還元物質が生成される。
【００３３】
例えば、試料が血液である場合、血液中のグルコースと反応層１０６に含まれるグルコースオキシターゼ（酵素）とが反応し、グルコースが酸化された反応物質であるグルコノラクトンが生成される。その際に放出された電子により、反応層１０６に含まれるフェリシアン化カリウム（メディエータ）が電離したフェリシアン化イオンが還元され、フェロシアン化カリウム（還元物質：フェリシアン化カリウムの還元体）が生成される。
【００３４】
そして、バイオセンサ１００において、作用極１０１および対極１０２との間に電圧を印加することにより、この反応により生成された還元物質を酸化し、その際に得られる酸化電流を計測する。この酸化電流は、例えば、試料が血液である場合、その血液に含まれるグルコースの濃度に依存した値となるため、上記した各反応を経て得られた酸化電流をバイオセンサ１００で計測することにより、試料に含まれる測定対象物質（例えば、試料が血液である場合のグルコース）の定量を行うことができる。
【００３５】
より具体的には、バイオセンサ１００は、図１および図２に示すように、絶縁基板の一方面に作用極１０１および対極１０２を含む電極系が設けられた電極層１１０と、スリット１０４が形成されて、該スリット１０４が作用極１０１および対極１０２の先端側に配置されて電極層１１０の一方面に積層されるスペーサ層１２０と、電極層１１０およびスペーサ層１２０のスリット１０４により形成されて試料が供給されるキャビティ１０３と、該キャビティ１０３に連通する空気穴１０５が形成されてキャビティ１０３を被覆してスペーサ層１２０に積層されるカバー層１３０と、キャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に設けられた反応層１０６とを備え、電極層１１０およびカバー層１３０に挟まれて配置されるスペーサ層１２０とが、試料導入口１０３ａが設けられる先端側が揃った状態で積層されて接着されることにより形成される。そして、バイオセンサ１００は、その後端側から測定器の所定の挿入口に挿入されることで測定器に装着される。
【００３６】
電極層１１０は、ポリエチレンテレフタレート、セラミック、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料などの絶縁材料からなる絶縁性基板により形成される。また、電極層１１０を形成する絶縁基板の一方面に、白金、金、パラジウムなどの貴金属やカーボン、銅、アルミニウム、チタン、ＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ  Ｔｉｎ  Ｏｘｉｄｅ：酸化インジウム錫）、ＺｎＯ（Ｚｉｎｃ  Ｏｘｉｄｅ：酸化亜鉛）などの導電性物質からなる導電層が、スクリーン印刷やスパッタリング蒸着法により形成される。そして、絶縁性基板の一方面に形成された導電層に、レーザ加工やフォトリソグラフィによるパターン形成が施されることにより、作用極１０１および対極１０２と、バイオセンサ１００が測定器に装着されたときに、作用極１０１および対極１０２のそれぞれと測定器とを電気的に接続する電極パターン１０１ａ，１０２ａとを含む電極系が形成される。
【００３７】
また、作用極１０１および対極１０２は、それぞれの先端が、キャビティ１０３に露出するように配置される。また、作用極１０１および対極１０２それぞれの後端側の電極パターン１０１ａ，１０２ａは、試料導入口１０３ａと反対側の電極層１１０の端縁であって、スペーサ層１２０が積層されない電極層１１０の端縁まで延伸されて形成される。
【００３８】
次に、上記したようにして形成された電極層１１０にスペーサ層１２０が積層される。スペーサ層１２０は、ポリエチレンテレフタレート、セラミック、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料などの絶縁材料からなる絶縁性基板により形成され、基板の先端縁部のほぼ中央にキャビティ１０３を形成するためのスリット１０４が形成されている。そして、スリット１０４が、作用極１０１および対極１０２の先端側に配置されて、スペーサ層１２０が電極層１１０の一方面を部分的に被覆して積層されることにより、電極層１１０およびスリット１０４により試料が供給されるキャビティ１０３が形成される。
【００３９】
続いて、キャビティ１０３部分がプラズマにより洗浄処理された後に、反応層１０６が形成される。なお、プラズマ洗浄工程において使用されるプラズマは、酸素プラズマ、窒素プラズマ、アルゴンプラズマなど、プラズマによる金属活性化処理において使用される種々のプラズマを使用することができ、減圧プラズマであっても大気圧プラズマであってもよい。
【００４０】
反応層１０６は、図３（ａ）〜（ｃ）に示すように、カバー層１３０がスペーサ層１２０に積層される前に、キャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などの酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含有する試薬２０１と、ジ（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウムなどの界面活性剤を含有する試薬２０２と、メディエータ、酵素、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子などを含有する試薬２０３とを順番に滴下することにより形成される。また、キャビティ１０４への血液などの試料の供給を円滑にするために、界面活性剤やリン脂質などの親水化剤がキャビティ１０３内壁に塗布される。
【００４１】
具体的には、反応層１０６は、電極層１１０上に設けられ、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層１０６ａと、親水層１０６ａ上に設けられ、試薬層１０６ｃに含まれるメディエータが親水層１０６ａの親水性高分子に接触するのを防止するための界面活性剤を含む中間層１０６ｂと、中間層１０６ｂ上に設けられ、測定対象物質と反応する酵素、メディエータ（電子受容体）、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む試薬層１０６ｃとを備え、次のように形成される。
【００４２】
すなわち、図３（ａ）に示すように、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子としてＣＭＣを含有する試薬２０１が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥されることにより親水層１０６ａが形成される（親水層形成工程）。次に、図３（ｂ）に示すように、界面活性剤としてジ（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウムを含有する試薬２０２が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥されることにより中間層１０６ｂが形成される（中間層形成工程）。なお、この実施形態における試薬２０２は、界面活性剤をアセトンやイソプロピルアルコール、あるいはクロロホルムに溶解させたものであり、中間層１０６ｂは、界面活性剤を０．０１〜５ｗｔ％含有した溶液が０．５μＬ滴下されることにより形成される。
【００４３】
続いて、図３（ｃ）に示すように、メディエータ（例えば、フェリシアン化カリウム）、酵素（例えば、グルコースデヒトロゲナーゼ）、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子（例えば、メチルセルロース）を含有する試薬２０３が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥されることにより試薬層１０６ｃが形成され（試薬層形成工程）、これらの各工程により反応層１０６が形成される。この場合、試薬２０３中に含まれる酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子はなくてもかまわない。また、試薬２０３中に、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子の代わりに、またはこの親水性高分子とともに両親媒性高分子を含有させる構成であってもよい。
【００４４】
なお、酵素としては、上記したグルコースデヒドロゲナーゼの他、グルコースオキシターゼ、乳酸オキシターゼ、コレステロールオキシターゼ、アルコールオキシターゼ、ザルコシンオキシターゼ、フルクトシルアミンオキシターゼ、ピルビン酸オキシターゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールエステラーゼ、クレアチニナーゼ、クレアチナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができ、これらの酵素を測定対象物質（グルコース、乳酸、コレステロール、アルコール、ザルコシン、フルクトシルアミン、ピルビン酸、ヒドロキシ酪酸）に応じて選択することで種々のセンサを形成することができる。
【００４５】
例えば、グルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼを用いれば血液試料中のグルコースを検出するグルコースセンサを形成でき、アルコールオキシダーゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼを用いれば血液試料中のエタノールを検出するアルコールセンサを形成でき、乳酸オキシダーゼを用いれば血液試料中の乳酸を検出する乳酸センサを形成でき、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとの混合物を用いれば総コレステロールセンサを形成できる。
【００４６】
また、メディエータとしては、上記したフェリシアン化カリウムの他、フェロセン、フェロセン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、オスミウム錯体、ルテニウム錯体などを用いることができる。
【００４７】
また、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子として、カルボニル基、アシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホ基、スルホニル基、スルホキシド基、トシル基、ニトロ基、ニトロソ基、エステル基、ケト基、ケテン基などを有するポリマーを用いることができる。
【００４８】
また、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子としては、上記したメチルセルロースの他、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどを用いることができる。なお、試薬２０３に、酵素およびメディエータ等と一緒に混合される酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は増粘剤として機能する。また、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は、それぞれ、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４９】
また、界面活性剤としては、上記したジ（２−エチルヘキシル）スルホこはく酸ナトリウム（エーロゾルＯＴ：和光純薬工業株式会社）の他、ポリエチレングリコールモノ−４−ノニルフェニルエーテル（ｎ≒７．５）（Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ−２１０：ローヌ・プーラン社）、ソルビタンモノラウラート（Ｓｐａｎ２０：東京化成工業株式会社）、ソルビタンモノオレエート（Ｓｐａｎ８０：東京化成工業株式会社）、コール酸ナトリウム、レシチンなどを用いることができる。
【００５０】
また、親水化剤としては、ポリエチレングリコールモノ−４−オクチルフェニルエーテル（ｎ≒１０）（ＴｒｉｔｏｎＸ１００：シグマアルドリッチ社製）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ２０：東京化成工業社製）、ビス（２−エチルヘキシル）スルホコハク酸ナトリウムなどの界面活性剤、レシチンなどのリン脂質を用いることができる。また、親水化剤は、上記したようにキャビティ１０３に塗布する以外に、試薬２０３に混合してキャビティ１０３に滴下したり、試薬層１０６ｃが形成された後にキャビティ１０４に滴下してもよい。また、カバー層１３０のスペーサ層側の面に塗布してもよい。また、試料に含まれるイオン濃度のばらつきを低減するために、リン酸などの緩衝剤を設けてもよい。
【００５１】
次に、反応層１０６がキャビティ１０３に形成された後に、ポリエチレンテレフタレート、セラミック、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料などの絶縁材料からなる絶縁性基板により形成されたカバー層１３０が、スペーサ層１２０に積層されることにより、バイオセンサ１００が形成される。図１（ａ），（ｂ）に示すように、カバー層１３０には、スペーサ層１２０に積層されたときにキャビティ１０３と連通する空気穴１０５が形成されており、カバー層１３０は、キャビティ１０３を被覆してスペーサ層１２０に積層される。
【００５２】
なお、この実施形態では、バイオセンサ１００は、血液中のグルコースの定量を行うことを目的に形成されており、測定対象物質としてのグルコースと特異的に反応する酵素としてＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）を補酵素とするＧＤＨ（グルコースデヒドロゲナーゼ）（以下、ＦＡＤ−ＧＤＨと表記する）を含み、測定対象物であるグルコースとＦＡＤ−ＧＤＨとの反応により生成される電子により還元されて還元物質と成るメディエータとしてフェリシアン化カリウムを含む反応層１０６がキャビティ１０３に露出する作用極１０１および対極１０２の先端側に設けられている。
【００５３】
このように構成されたバイオセンサ１００では、上記したように、先端の試料導入口１０３ａに血液から成る試料を接触させることにより、毛細管現象により試料が空気穴１０５に向かって吸引されてキャビティ１０３に試料が供給される。そして、キャビティ１０３に供給された試料に反応層１０６（試薬層１０６ｃ）が溶解することにより、試料中の測定対象物質であるグルコースとＦＡＤ−ＧＤＨとの酵素反応により電子が放出され、放出された電子によりフェリシアン化イオンが還元されて還元物質であるフェロシアン化イオンが生成される。そして、反応層１０６が試料に溶解することによる酸化還元反応により生成された還元物質を、バイオセンサ１００の作用極１０１と対極１０２との間に電圧（例えば０．３Ｖ）を印加して電気化学的に酸化することにより、作用極１０１と対極１０２との間に流れる酸化電流を計測することで試料中のグルコースの定量が測定器において行われる。なお、バイオセンサ１００の作用極１０１と対極１０２との間に電圧が印加された後、３〜５秒後の電流値が酸化電流として計測される。
【００５４】
（バックグランド電流の比較例）
図４はバイオセンサの保管期間とバックグランド電流との関係を示す図であり、横軸が保管期間（ｈ）を示し、縦軸がバックグランド電流の大きさ（μＡ）を示す。また、同図中の◆は、試薬層１０６ｃと親水層１０６ａとの間に中間層１０６ｂが設けられていない従来のバイオセンサのバックグランド電流を示し、同図中の■は、本実施形態のバイオセンサ１００のバックグランド電流を示す。なお、バックグランド電流の測定は、バックグランド電流測定用の試料をキャビティ１０３に供給した後、通常の手順と同様に酸化電流を計測することにより行った。
【００５５】
図４に示すように、バイオセンサの保管期間が長くなるのに伴い、従来のバイオセンサでは経時的にバックグランド電流が増大するのに対して、本実施形態のバイオセンサ１００ではバックグランド電流の増大が抑制されている。
【００５６】
したがって、本実施形態では、作用極１０１および対極１０２を含む電極系が設けられた電極層１１０上に酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層１０６ａが設けられるが、一般的に、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子は血液試料に含まれる血球の移動を阻止する効果を有し、例えば、血液試料がキャビティに供給されると、当該親水層１０６ａにより血液試料が濾過されて血球の移動が阻止され、血球を除く成分（例えば、グルコース）が電極層１１０の各電極１０１，１０２に接触することから、血液試料のヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響を低減することができる。
【００５７】
ところで、親水性高分子が酸素原子の二重結合を有する場合、酸素原子の二重結合を有する官能基がメディエータに対して求核攻撃することによりメディエータが還元されると考えられる。そのため、親水層１０６ａ上に試薬層１０６ｃを配置すると、保管状態において、両層１０６ａ，１０６ｃの接触界面でこのメディエータの還元反応が徐々に進み、バイオセンサ１００における酸化電流の測定精度が劣化するおそれがある。
【００５８】
そこで、本実施形態では、酸素原子の二重結合を有する親水性高分子を含む親水層１０６ａとメディエータ等を含む試薬層１０６ｃとの間に、中間層１０６ｂとして、界面活性剤を含む層を設けることにより、バイオセンサ１００の保管状態において、メディエータが試薬層１０６ｃ中の水分と一緒に染み出して、親水層１０６ａの親水性高分子と接触するのを防止することができるように構成した。このように構成することにより、バイオセンサ１００の保管状態において、メディエータが、親水層１０６ａに含まれる酸素原子の二重結合を有する親水性高分子（ＣＭＣ）により還元されるのを防止することができるとともに、ＣＭＣによるメディエータの還元に伴うバックグラウンド電流の増加を抑制することができる。
【００５９】
また、試薬層１０６ｃは、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含んでいるため、メディエータの周囲が、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子、すなわち、メディエータが還元されにくい親水性高分子により囲まれた状態になる。そのため、親水層１０６ａの親水性高分子と試薬層１０６ｃのメディエータとの接触を防止する効果がさらに向上する。
【００６０】
また、親水層１０６ａおよび試薬層１０６ｃの各親水性高分子が増粘剤として機能することにより、反応層１０６を構成する各層１０６ａ，１０６ｂ，１０６ｃ間の接着強度が増加するため、各層１０６ａ，１０６ｂ，１０６ｃそれぞれの接着面での外部応力等による剥離を防止することができる。
【００６１】
以上のように、本実施形態の構成により、ＣＭＣによるメディエータの還元に伴うバックグラウンド電流増加の抑制とヘマトクリット値の差異に伴う測定精度への影響低減を両立することが可能となるため、正確で信頼性の高いバイオセンサ１００を提供することができる。
【００６２】
＜第２実施形態＞
本発明の第２実施形態にかかるバイオセンサについて図２および図５を参照して説明する。なお、図５は第２実施形態にかかるバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。
【００６３】
この実施形態が上記した第１実施形態と異なるのは、バイオセンサ１００の中間層１０６ｂが、両親媒性高分子を含有している点である。
【００６４】
この場合、中間層１０６ｂは、両親媒性高分子を０．０１〜５ｗｔ％の割合で、アセトンやイソプロピルアルコール、あるいは、クロロホルムなどに溶解させた試薬が所定量（例えば、０．５μＬ）、キャビティ１０３に滴下・乾燥されることにより形成される。
【００６５】
なお、両親媒性高分子として、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールなどを用いることができる。また、これらの両親媒性高分子を、それぞれ２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６６】
また、この実施形態におけるバイオセンサ１００の保管期間とバックグラウンド電流との関係については、図５に示すように、第１実施形態と同様、バックグラウンド電流の増大が抑制されている。なお、図５に示すバックグラウンド電流は、上記した第１実施形態のバックグラウンド電流と同じ条件で計測されたものである。
【００６７】
したがって、本実施形態によれば、中間層１０６ｂを両親媒性高分子で構成した場合であっても、保管状態において、試薬層１０６ｃのメディエータが親水層１０６ａの親水性高分子（ＣＭＣ）に接触するのを防止することができるため、ＣＭＣによるメディエータの還元に伴うバックグラウンド電流の増加を抑制することができる。
【００６８】
＜第３実施形態＞
本発明の第３実施形態にかかるバイオセンサについて図２、図６、図７を参照して説明する。なお、図６は第３実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であり、（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ異なる工程を示す。図７は第３実施形態にかかるバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。なお、図６（ａ）は、第１実施形態のバイオセンサの製造方法を示した図３（ａ）と同じ工程であり、図６（ｄ）は図３（ｃ）と同じ工程である。
【００６９】
この実施形態が図２を参照して説明した第１実施形態と異なるところは、中間層１０６ｂが水溶性ゲル化剤を含有している点である。
【００７０】
この実施形態では、バイオセンサ１００の中間層１０６ｂは次のように形成される。まず、第１実施形態と同じ要領で親水層１０６ａが形成される（図６（ａ）参照）。次に、図６（ｂ）に示すように、カチオンと混合されるとゲル化する水溶性ゲル化剤を含有する試薬２０４が滴下装置２００からキャビティ１０３に所定量滴下されて乾燥される。
【００７１】
続いて、図６（ｃ）に示すように、カチオンを含有する試薬２０５が滴下装置２００から所定量滴下されることにより水溶性ゲル化剤がゲル化されて中間層１０６ｂが形成される。最後に、第１実施形態と同じ要領で試薬層１０６ｃが形成される（図６（ｄ）参照）。
【００７２】
なお、水溶性ゲル化剤としては、カラギーナンやアルギン酸化合物を用いることができ、カチオンを含有した試薬２０５としては、フェリシアン化化合物、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等のイオン性物質のうちのいずれかを溶かした水溶液を用いることができる。また、これらの水溶性ゲル化剤を、それぞれ２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
【００７３】
また、この実施形態におけるバイオセンサ１００の保管期間とバックグラウンド電流との関係については、図７に示すように、第１実施形態と同様、バックグラウンド電流の増大が抑制されている。なお、図７に示すバックグラウンド電流は、上記した第１実施形態のバックグラウンド電流と同じ条件で計測されたものである。
【００７４】
したがって、本実施形態によれば、中間層１０６ｂを水溶性ゲル化剤で構成した場合であっても、保管状態において、試薬層１０６ｃのメディエータが親水層１０６ａの親水性高分子（ＣＭＣ）に接触するのを防止することができるため、ＣＭＣによるメディエータの還元に伴うバックグラウンド電流の増加を抑制することができる。
【００７５】
＜第４実施形態＞
本発明の第４実施形態にかかるバイオセンサについて図２、図８、図９を参照して説明する。なお、図８は第４実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を示す図であり、（ａ）〜（ｃ）はそれぞれ異なる工程を示す。図９は第４実施形態にかかるバイオセンサの保管期間とバックグラウンド電流との関係を示す図である。なお、図８（ａ）は、第１実施形態のバイオセンサの製造方法を示した図３（ａ）と同じ工程であり、図８（ｃ）は図３（ｃ）と同じ工程である。
【００７６】
この実施形態が図２を参照して説明した第１実施形態と異なるところは、中間層１０６ｂが、親水層１０６ａの表面が撥水処理されて形成された撥水層で形成されている点である。
【００７７】
この実施形態では、バイオセンサ１００の中間層１０６ｂは、次のように形成される。まず、第１実施形態と同じ要領で親水層１０６ａが形成される（図８（ａ）参照）。次に、図８（ｂ）に示すように、親水層１０６ａの表面がフッ素系ガス（例えば、ＣＨＦ３ガスやＣＦ４ガス）を用いて生成されたプラズマによりエッチングされることで、親水層１０６ａの表面がフッ素コーティングされ、撥水層が形成される。最後に、第１実施形態と同じ要領で試薬層１０６ｃが形成される（図８（ｃ）参照）。なお、撥水処理については、上記したフッ素系ガスのプラズマエッチングに限らず、親水層１０６ａ上に撥水剤を滴下するなど、種々の撥水処理を用いることができる。
【００７８】
また、この実施形態におけるバイオセンサ１００の保管期間とバックグラウンド電流との関係については、図９に示すように、第１実施形態と同様、バックグラウンド電流の増大が抑制されている。なお、図９に示すバックグラウンド電流は、上記した第１実施形態のバックグラウンド電流と同じ条件で計測されたものである。
【００７９】
したがって、本実施形態によれば、中間層１０６ｂを撥水層で構成した場合であっても、保管状態において、試薬層１０６ｃのメディエータが親水層１０６ａの親水性高分子（ＣＭＣ）に接触するのを防止することができるため、ＣＭＣによるメディエータの還元に伴うバックグラウンド電流の増加を抑制することができる。
【００８０】
＜第５実施形態＞
本発明の第５実施形態にかかるバイオセンサについて図１０を参照して説明する。なお、図１０は第５実施形態にかかるバイオセンサのキャビティ部分の横断面図である。
【００８１】
この実施形態にかかるバイオセンサ１００ａが、図２を用いて説明した第１実施形態のバイオセンサ１００と異なるところは、図１０に示すように、試薬層１０６ｃが、メディエータおよび酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含むメディエータ層１０６ｃ１と、酵素および酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を含む酵素層１０６ｃ２とで構成され、かつ、酵素層１０６ｃ２上にメディエータ層１０６ｃ１が積層されている点である。その他の構成は第１実施形態と同じであるため、同一符号を付すことにより説明を省略する。なお、メディエータ層１０６ｃ１および酵素層１０６ｃ２それぞれに含まれる酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子は、上記した第１実施形態を同じものを用いることができる。また、試薬層１０６ｃを構成するメディエータ層１０６ｃ１および酵素層１０６ｃ２の積層される順番は、逆であってもかまわない。
【００８２】
このように構成することにより、酵素およびメディエータが分離された状態となるため、保管状態においてメディエータが酵素により還元されるのを防止することができる。また、酵素層１０６ｃ２上に前記メディエータ層１０６ｃ１が積層されることにより、親水層１０６ａの親水性高分子とメディエータとがさらに離れて配置されることになるため、メディエータの還元防止効果がさらに向上する。また、中間層１０６ｂおよび親水層１０６ａ中の酵素の移動度は、メディエータの移動度より小さいので、電極１０１，１０２近傍での酵素・メディエータ量が、メディエータの上に酵素が配置された場合より多くなり、センサの応答性と測定精度が向上する。
【００８３】
なお、本発明は上記した各実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて、上記したもの以外に種々の変更を行なうことが可能である。
【００８４】
例えば、上記した各実施形態では、中間層１０６ｂが界面活性剤を含む層、両親媒性高分子を含む層、水溶性ゲル化剤を含む層、撥水層の内のいずれか一つの層で形成されているが、例えば、界面活性剤を含む層上に水溶性ゲル化剤を含む層を積層するなど、多層構造として中間層１０６ｂを形成してもよい。また、界面活性剤、両親媒性高分子、水溶性ゲル化剤のうちの２つ、あるいは全てが混合された試薬を親水層１０６ａ上に滴下することにより、中間層１０６ｂを形成してもよい。
【００８５】
また、酸素原子の二重結合を有さない親水性高分子を、複数種類組み合わせて試薬層１０６ｃに適切に混合することにより、血液試料中の血球の移動を効果的に阻止したり、酵素層およびメディエータ層の拡散、混合が低減されてメディエータの還元を防止する防止効果を向上することができる。
【００８６】
また、上記したバイオセンサ１００の反応層１０６に含まれる酵素およびメディエータの組合せを変更することによりエタノールセンサや乳酸センサなどを形成してもよい。
【００８７】
また、上記した各実施形態では、バイオセンサ１００は、作用極１０１および対極１０２を有する二極電極構造に形成されているが、参照極をさらに設けることによりバイオセンサ１００を三極電極構造に形成してもよい。この場合、対極１０２を接地して電圧出力部により参照極に参照電位を印加した状態で、作用極１０１に対極１０２を基準とする所定電位を印加すればよい。
【００８８】
また、上記した実施形態では、作用極１０１と対極１０２との間に所定電圧を印加することにより、作用極１０１と対極１０２との間に流れる電流を監視することで、キャビティ１０３に血液試料が供給されたことが検出されるが、キャビティ１０３に試料が供給されたことを検知するための検知用電極をさらに設けてもよい。この場合、対極１０２と検知用電極との間に所定電圧を印加することにより、対極１０２と検知用電極との間に流れる電流を監視することで、キャビティ１０３に試料が供給されたことを検出すればよい。
【００８９】
また、バイオセンサ１００，１００ａを形成する電極層１１０、スペーサ層１２０およびカバー層１３０のうち、少なくともカバー層１３０は、キャビティ１０３に血液試料が供給されたことを視認できるように透明な部材で形成するのが望ましい。
【００９０】
また、本発明は、種々のバイオセンサに適用することができる。
【符号の説明】
【００９１】
１００，１００ａ  バイオセンサ
１０１  作用極
１０２  対極
１０３  キャビティ
１０４  スリット
１０５  空気穴
１０６  反応層
１０６ａ  親水層
１０６ｂ  中間層
１０６ｃ  試薬層
１０６ｃ１  メディエータ層
１０６ｃ２  酵素層
１１０  電極層
１２０  スぺーサ層
１３０  カバー層
【図１】
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【図２】
2014089096.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2014089096.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
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