(57)【要約】【課題】急性ウイルス血症原因ウイルス(WSDV)を感染初期に高感度で且つ定量的に検出できる方法及び当該検出方法に使用するための検出試薬キットを提供する。【解決手段】WSV477遺伝子に対して設計したLAMP用プライマーを含む、LAMPにおけるWSDV検出用プライマーセット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４に示される塩基配列を有する4つのプライマーを含む、環状型等温増幅反応における急性ウイルス血症原因ウイルス検出用プライマーセット。
【請求項２】
配列番号５及び６に示される塩基配列を有する2つのプライマーをさらに含む、請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
請求項１又は２記載のプライマーセットを含む、環状型等温増幅反応における急性ウイルス血症原因ウイルス検出用試薬キット。
【請求項４】
請求項１又は２記載のプライマーセットと検体用核酸とを含有するサンプルを環状型等温増幅反応に供する工程と、
前記環状型等温増幅反応によって増幅産物が産生されたか否かを検出する工程と、
を含む、環状型等温増幅反応における急性ウイルス血症原因ウイルス検出方法。
【請求項５】
前記検体用核酸がmRNAである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記検出が定量的検出である、請求項４又は５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば環状型等温増幅反応(Loop-Mediated Isothermal Amplification：以下、「LAMP」という)法による急性ウイルス血症原因ウイルス(White spot disease virus：以下、「WSDV」という)の検出方法及び当該検出方法で使用するための検出試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
WSDVは、エビ等の甲殻類に強い病原性を有するウイルスである。海外からの当該ウイルスの伝播を防ぐべく、当該ウイルスに対する高感度で、且つ定量的な検出方法の開発が望まれている。
【０００３】
一方、従来より遺伝子の検出には、遺伝子増幅方法であるPCRが用いられてきた。しかしながら、PCRは感度が低いといった問題があった。
【０００４】
そこで、高感度な遺伝子増幅方法として、LAMP法が開発された(特許文献１及び２)。当該LAMP法は、特定の遺伝子領域を増幅するための複数のプライマー、鋳型DNA、鎖置換型DNA合成酵素、dNTP等を混合し、一定温度(65℃付近)で一定時間反応させ、反応液の濁度により増幅を検出する方法である。
【０００５】
本願発明者らは、LAMP法を用いてWSDVを検出すべく、WSDVの特定の遺伝子領域に特異的なLAMP用プライマーセットを設計し、検出を行った(特許文献３)。しかしながら、当該WSDVのLAMP用プライマーセットを使用したLAMP法は、WSDVのゲノム上の遺伝子を検出しており、不活性なウイルス(例えば、死滅したウイルスやウイルスDNAのみ)までも検出してしまう可能性があった。また、WSDVのゲノム上の遺伝子を検出するためには、ウイルス粒子の数が100個程度必要であるため、感染の極めて初期に検出することは困難であった。
このように、WSDVを感染初期に高感度で且つ定量的に検出できる方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第3313358号公報
【特許文献２】特開2001-242169号公報
【特許文献３】特開2009-183228号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上述した実情に鑑み、WSDVを感染初期に高感度で且つ定量的に検出できる方法及び当該検出方法に使用するための検出試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、WSDV感染初期に発現する初期タンパク質コード遺伝子(WSV477）のmRNAを検出するようにLAMP用プライマーセットを設計し、当該LAMP用プライマーセットをLAMPに用いることで、感染し、且つ増殖している活性のあるWSDVのみを感染初期に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、以下を包含する。
（１）配列番号１〜４に示される塩基配列を有する4つのプライマーを含む、LAMPにおけるWSDV検出用プライマーセット。
（２）配列番号５及び６に示される塩基配列を有する2つのプライマーをさらに含む、（１）記載のプライマーセット。
（３）（１）又は（２）記載のプライマーセットを含む、LAMPにおけるWSDV検出用試薬キット。
（４）（１）又は（２）記載のプライマーセットと検体用核酸とを含有するサンプルをLAMPに供する工程と、前記LAMPによって増幅産物が産生されたか否かを検出する工程とを含む、LAMPにおけるWSDV検出方法。
（５）前記検体用核酸がmRNAである、（４）記載の方法。
（６）前記検出が定量的検出である、（４）又は（５）記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、感染し、且つ増殖している活性のあるWSDVのみを感染初期に高感度で且つ定量的に検出することができる。また、本発明によれば、国内外のエビ等の甲殻類の輸入/輸出や漁業の現場において、簡便且つ迅速にWSDVの感染の有無を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明に係るLAMPにおけるWSDV検出用プライマーセットに含まれる各プライマーのWSDVゲノムDNAから転写されたmRNA(Target RNA)に対する位置を示す模式図である。
【図２】LAMPにおけるWSV069遺伝子に対するWSDV検出用プライマーセットに含まれる各プライマーのWSDVゲノムDNAから転写されたmRNA(Target RNA)に対する位置を示す模式図である。
【図３】リアルタイムWSDV-LAMP(WSV477)における検量線を示す特性図である。
【図４】リアルタイムWSDV-LAMP(WSV069)における検量線を示す特性図である。
【図５】WSDVに浸漬感染させた供試エビの血リンパからのリアルタイムLAMPによる(a)WSV069遺伝子及び(b)WSV477遺伝子の検出結果を示す特性図である。
【図６】WSDVに浸漬感染させた供試エビの心臓からのリアルタイムLAMPによる(a)WSV069遺伝子及び(b)WSV477遺伝子の検出結果を示す特性図である。
【図７】リアルタイムPCR法を用いたVP-28遺伝子の検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明に係るプライマーセットは、WSDVの感染初期に発現する初期タンパク質をコードする遺伝子(初期遺伝子)WSV477に対して設計した複数のプライマーを含む、LAMPにおけるWSDV検出用プライマーセットである。本発明に係るLAMPにおけるWSDV検出用プライマーセット(以下、「WSDV検出用プライマーセット」と称する)は、FIP(配列番号１)、BIP(配列番号２)、F3 primer(配列番号３)及びB3 primer(配列番号４)を含む。さらに、当該WSDV検出用プライマーセットは、ループプライマー(Loop Primer)と呼ばれるLF primer(配列番号５)及びLB primer(配列番号６)を含むことで、LAMPにおいて増幅時間を大幅に短縮することができる。
【００１４】
WSDVは、Nimaviridae科Whispovirus属に属するウイルスであり、二本鎖DNAウイルスである。WSDVは、またWSSV(white spot syndrome virus)とも呼ばれる。WSDVに感染すると、急性ウイルス血症(penaeid acute viremia；PAV)を発症することとなる。
【００１５】
本発明では、プライマー設計支援ソフトPrimerExplorer V4(https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)を用いて、WSDVゲノムDNA(GenBank accession number: NC_003225.1)上のWSV477遺伝子対応領域の塩基番号274708〜274949(配列番号７)に対してLAMP用のプライマーを設計することで、WSDV検出用プライマーセットを得た。
【００１６】
図１には、WSDV検出用プライマーセットに含まれる各プライマーのWSDVゲノムDNAから転写されたmRNA(Target RNA)に対するアニーリング位置を示す。パネル(A)は、FIP、BIP、F3、B3、LF及びLBプライマーのプライマー設計の概要を示す。パネル(B)は、プライマーに用いたWSDVゲノムの塩基配列を示す。また、パネル(B)において、プライマー設計に用いたDNA配列を囲みで示し、それぞれパネル(A)における以下の領域を示す；「F3 primer」：F3領域、「FIP primer」：F2領域、「Loop primer F」：FLc領域、「F1c Adaptor」：F1c領域、「B1c Adaptor」：B1c領域、「Loop primer B」：BLc領域、「BIP primer」：B2領域、「B3 primer」：B3領域。
【００１７】
下記では、図１を用いてWSDVゲノムDNAから転写されたmRNA(Target RNA)から増幅するRT-LAMPの原理を説明する。なお、LAMPの原理は、特許文献１及び栄研化学株式会社のホームページ(http://loopamp.eiken.co.jp/lamp/index.html)に詳細に説明されている。
【００１８】
ここで、「内部(内側)」、「外部(外側)」とは、WSDVゲノムDNA上の塩基番号274708〜274949の増幅標的配列の中心に対する位置を意味する。
【００１９】
図１に示すように、LAMPでは、先ず検体用核酸であるWSDVゲノムDNAから転写されたmRNAに対して、BIP(配列番号２)(「内部プライマー」に相当する)がアニーリングし、そこから逆転写酵素の作用により相補的なcDNAが合成される。ここで、BIPは、Target RNA上の「B2c領域」に相補的な「B2領域」を3'末端側に有し、且つ5'末端側にTarget RNA上の「B1c領域」を有する。
【００２０】
次いで、BIPの外側に位置するB3 primer(配列番号４)(「外部プライマー」に相当する)が相補的な配列(「B3c領域」)に対してアニーリングし、逆転写酵素の作用により、既に合成されたBIPから伸長したcDNAを剥がす一方で、B3 primerより新たなcDNAが合成される。B3 primerは、Target RNA上の「B3c領域」に相補的な「B3領域」を有する。剥がされたBIPからの一本鎖cDNAは、BIPが有する5'末端側の「B1c領域」と伸長部分の「B1領域」とが相補的であることから、自己アニーリングすることでループを形成することとなる。
【００２１】
当該ループを形成した一本鎖cDNAに、もう一方の内部プライマーであるFIP(配列番号１)がアニーリングし、そこから鎖置換型DNAポリメラーゼの作用により伸長する。FIPは、Target RNA上の「F2領域」を3'末端側に有し、且つ5'末端側にTarget RNA上の「F1領域」に相補的な「F1c領域」を有する。ここで、鎖置換型DNAポリメラーゼとは、伸長方向に二本鎖領域が存在する場合に、当該二本鎖を解離しながら、相補鎖合成を行うことができるDNA合成酵素を意味する。
【００２２】
さらに、FIPの外側に位置するF3 primer(配列番号３)が当該ループを形成した一本鎖DNAにアニーリングし、鎖置換型DNAポリメラーゼの作用により、既に合成されたFIPからの一本鎖DNAを剥がす一方で、F3 primerより伸長する。F3 primerは、Target RNA上の「F3領域」を有する。剥がされたFIPから伸長した一本鎖DNAは、両端でそれぞれ相補的な配列を有するので(すなわち、3'末端側における「B1c領域」と「B1領域」及び5'末端側における「F1領域」と「F1c領域」)、それぞれが自己アニーリングすることでループを形成することとなる。すなわち、当該剥がされたFIPから伸長した一本鎖DNAは、両端にループを形成することでダンベル型構造となる。このダンベル型構造が、LAMPにおける増幅サイクルの起点構造となる。当該ダンベル型構造を起点として、一連のLAMP増幅サイクルが行われる。
【００２３】
さらに、ループプライマーLF primer(配列番号５：図１において「Loop Primer F」)及びLB primer(配列番号６：図１において「Loop Primer B」)をプライマーセットに含むことで、DNA合成の起点を増やすことができる。当該ループプライマーは、上述のダンベル型構造の5'末端側のループの一本鎖部分に相補的な配列を有するものである。LF primerは、Target RNA上の「F1領域」と「F2領域」との間の「FL領域」に相補的な「FLc領域」を有する。一方、LB primerは、Target RNA上の「B1c領域」と「B2c領域」との間の「BLc領域」を有する。
【００２４】
なお、以上に説明したWSDV検出用プライマーセットの各プライマーは、例えば化学合成により作製することができる。さらに、WSDV検出用プライマーセットには、上述した各プライマーの配列番号で示される塩基配列において1又は数個(例えば、1〜10個、好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜3個)の塩基が欠失、置換及び/又は付加した塩基配列を有し、且つLAMPにおけるそれぞれのプライマー機能を有するプライマーを代替的に含むことができる。
【００２５】
また、WSDV検出用プライマーセットは、単独で、又はLAMPで必要な試薬と共に、LAMPにおけるWSDV検出用試薬キットとして提供することができる。LAMPで必要な試薬としては、例えば鎖置換型DNA合成酵素、dNTP、緩衝液、蒸留水等が挙げられる。また、検体用核酸がmRNAである場合、逆転写酵素を試薬キットに含めることができる。特に、下記で説明するように、本発明では、感染初期におけるWSDVを検出すべく、mRNAを検体用核酸とすることが好ましい。
【００２６】
一方、本発明に係るLAMPにおけるWSDV検出方法(以下、「本方法」と称する)では、WSDV検出用プライマーセットを用いてLAMPを行う。本方法では、先ず検体用核酸を準備する。検体用核酸は、例えば、上述のWSDVに感染しているか否かを検査すべき甲殻類、又は当該WSDVに感染しているが、感染の程度を確認すべき甲殻類から得られる核酸である。ここで、検体用核酸が由来するエビ類としては、上述したWSDVに感染するものであればいずれの種類であってよく、例えば、クルマエビ、ウシエビ、バナメイエビ、コウライエビ、シバエビ等が挙げられる。また、例えば、カニ類、ザリガニ類、動物性プランクトン等のエビ類以外の甲殻類及びそれらの幼生も上述したWSDVに感染するので、これら甲殻類から得た核酸も検体用核酸とすることができる。
【００２７】
検体用核酸は、例えば、検査対象である甲殻類から常法により抽出されたゲノムDNA等のDNAとすることができる。あるいは、検査対象より抽出したRNAを、逆転写酵素を用いたRT-PCRに供する。このようにして得られたcDNAを検体用核酸とすることができる。
【００２８】
本発明では、WSDV感染初期に発現する初期タンパク質をコードする遺伝子WSV477を検出対象として使用する。従って、WSV477遺伝子から転写されたmRNAを検体用核酸とすることで、感染初期におけるWSDVを検出することができる。従って、本発明ではmRNAを検体用核酸とすることが特に好ましい。この場合、逆転写酵素をLAMPサンプルに添加することで、逆転写酵素によるcDNAの作製と同時にLAMPを行うことができる。
【００２９】
ゲノムDNAやmRNA等の検体用核酸は、例えば検査対象の甲殻類の心臓、血リンパ、リンパ様器官、鰓、歩脚等から単離することができる。血リンパを用いる場合には非破壊検査が可能となるので、検体用核酸を血リンパから単離することが好ましい。
【００３０】
次いで、本方法では、WSDV検出用プライマーセット、検体用核酸、鎖置換型DNA合成酵素及びdNTP(並びに検体用核酸がRNAである場合には、逆転写酵素)を含有するサンプルを準備する。鎖置換型DNA合成酵素としては、例えば、BST DNA polymerase(栄研化学株式会社)、Bst DNA Polymerase, Large Fragment (New England Biolabs)、Bca BEST DNA Polymerase (TaKaRa)等が挙げられる。また、サンプル中のこれら構成成分の組成は適宜決定することができるが、例えば、サンプル25μl当たり、WSDV検出用プライマーセットに含まれる各プライマー1.0〜50pmol(好ましくは5〜40pmol)、検体用核酸10fg〜30μg(好ましくは0.1〜1μg)、鎖置換型DNA合成酵素0.5〜15U(ユニット)(好ましくは6.0〜10U)、最終濃度1.0〜10mM(好ましくは4.0〜6.0mM)のdNTPが挙げられる。また、逆転写酵素がサンプルに含まれる場合には、例えばサンプル25μl当たり逆転写酵素1.0〜10U(好ましくは4.0〜6.0U)とする。
【００３１】
さらに、本方法では、準備したサンプルをLAMPに供することで、増幅産物を産生する。LAMPの条件としては、例えば、温度60℃〜65℃(好ましくは63℃)で15〜80分(好ましくは20〜60分)が挙げられる。
【００３２】
LAMP後のサンプルを各検出手段に供することで、サンプル中の増幅産物を検出することができる。例えば、サンプルをアガロースゲル/エチジウムブロマイド電気泳動に供することにより、目視により増幅産物を検出することができる。また、サンプルを濁度計に供することで、濁度を指標として増幅産物を検出することができる。さらに、サンプルをLAMPに供する際にリアルタイム濁度測定装置を用いて、リアルタイムで濁度を測定することで、増幅産物を検出することができる。このように検出した増幅産物の有無により、WSDV感染の有無を判断することができる。
【００３３】
また、陽性対照サンプル(例えば、増幅対象の標的配列を含むプラスミドを含む)を、様々な核酸濃度でリアルタイム濁度測定装置(例えば、栄研化学株式会社製のリアルタイム濁度測定装置（LA-200）)を用いたLAMPに供する。得られた各核酸濃度サンプルの濁度を縦軸とし、当該核酸濃度を横軸とすることで、検量線を作成する。次いで、当該検量線に対して、LAMP後の検体用核酸を含むサンプルの濁度を比較することで、定量的に増幅産物(すなわち、ウイルス量)を検出することができる。
【００３４】
以上に説明した本発明によれば、高感度でWSDVを検出することができる。また、本発明ではLAMPを用いることで、増幅ステップが一定温度で一定時間であるので、変性、アニーリング及び増幅の段階のサイクルを行うPCRと比較して簡便である。さらに、mRNAを検体用核酸とすることで、cDNAの作製からLAMPによる増幅(すなわち、RT-LAMP)を1本のチューブにおいて60分以内で行うことができ、従来のRT-PCR法より優れている。
【００３５】
また、本発明によれば、初期遺伝子WSV477から転写されたmRNAを検体用核酸として使用することで、感染し、且つ増殖している活性のあるWSDVのみを感染初期に高感度で且つ定量的に検出することができる。この場合には、サンプル内にWSDV粒子が100個以下でも検出できると考えられる。
【００３６】
さらに、本発明によれば、定量的にWSDVを検出でき、感染の程度を知ることができる。このことによって、上述したWSDVの蔓延防止や急性ウイルス血症の予防に本発明は貢献することができる。従って、上述のWSDV検出用プライマーセット、WSDV検出用試薬キット及び本方法は、それぞれ急性ウイルス血症診断用プライマーセット、急性ウイルス血症診断用試薬キット、急性ウイルス血症診断方法として使用することもできる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３８】
以下の実施例において、「WSDV-LAMP(WSV477)」及び「WSDV-LAMP(WSV477)用プライマー」は、それぞれ本発明に係るWSV477遺伝子に対するLAMP反応及びLAMP用プライマーセットに相当する。
【００３９】
一方、「WSDV-LAMP(WSV069)」及び「WSDV-LAMP(WSV069)用プライマー」は、本願出願人により先に出願された特許出願(特願2011-050110号)におけるWSV069(＝ie1)遺伝子に対するLAMP反応及びLAMP用プライマーセットに相当し、参考例である。
また、双方のLAMP反応を総称して、「WSDV-LAMP」と称する場合がある。
【００４０】
リアルタイムLAMP法によるクルマエビ類WSDVのWSV477遺伝子の検出と定量
〔材料と方法〕
1. 供試エビ
平均体重12.0ｇのクルマエビにWSDVを人為感染させた個体を用いた。感染は、約1.0×106コピー/5Lの濃度のWSDV含有溶液にクルマエビを2時間浸漬することで行った。
【００４１】
浸漬後4、8、12、16、20、24、36、48及び72時間後に3尾ずつ、血リンパ及び心臓よりRNA抽出を行った。
【００４２】
2. Total RNAの抽出
2-1. 心臓サンプルからのTotal RNAの抽出
心臓サンプル約25 mgを1.5 mlエッペンドルフチューブに入れ、300μlのRNAiso Plus(Takara，Japan)を加え、よくホモジナイズし、再び700μlのRNAiso Plusを加え1 mlシリンジ(20 G針付)で20回程度攪拌し、22℃で5分間静置した。
【００４３】
次に、クロロフォルム(Wako, Japan)200μlを加え、転倒混和によって十分に混合した後、22℃で3分間静置し、さらに4℃、14,000 rpmで15分間遠心分離を行った。
【００４４】
遠心分離後、上清を新しい1.5 mlエッペンドルフチューブに移し、イソプロピルアルコール(Wako, Japan)500μlを加え、4℃で30分間静置した後、4℃、14,000 rpmで30分間遠心分離を行った。
【００４５】
遠心分離後、上清を除去し、80％エタノール(Wako, Japan)1 mlを加え、緩やかに混合した後、4℃、14,000 rpmで5分間遠心分離を行った。
【００４６】
遠心分離後、上清を除き、5分間風乾させた後、ペレットを20μlのDiethyl Pyrocarbonate(DEPC; SIGMA, Japan)処理水に溶解して、total RNA溶液とした。
【００４７】
2-2. 血リンパサンプルからのTotal RNAの抽出
血リンパサンプル約200 μlを1.5 mlエッペンドルフチューブに入れ、800μlのRNAiso Plusを加え、よくホモジナイズし、22℃で5分間静置した。
【００４８】
次に、クロロフォルム(Wako, Japan)200μlを加え、転倒混和によって十分に混合した後、22℃で3分間静置し、さらに4℃、14,000 rpmで15分間遠心分離を行った。
【００４９】
遠心分離後、上清を新しい1.5 mlエッペンドルフチューブに移し、イソプロピルアルコール(Wako, Japan)500μlを加え、転倒混和によって十分に混合した後、22℃で10分間静置した後、4℃、14,000 rpmで10分間遠心分離を行った。
【００５０】
遠心分離後、上清を除去し、75％エタノール(Wako, Japan)1 mlを加え、緩やかに混合した後、4℃、11,500 rpmで5分間遠心分離を行った。
【００５１】
遠心分離後、上清を除き、5分間風乾させた後、ペレットを20μlのDiethyl Pyrocarbonate(DEPC; SIGMA, Japan)処理水に溶解して、total RNA溶液とした。
【００５２】
3. cDNAの合成
抽出したtotal RNAをテンプレートとして、ReverTra Dash(TOYOBO, Japan)を用いて逆転写反応を行った。反応溶液を作製し、primerにOligo (dt) 20-P7を用い、42℃で20分間、99℃で5分間及び4℃で5分間の反応を、サーマルサイクラー(BIO RAD, Mycycler)を用いて行った。
【００５３】
4. WSDV-LAMP(WSV477)用検量線作成のためのプラスミドの作製
4-1. プラスミドの構築
標的遺伝子(WSV477)配列含有プラスミド溶液をテンプレートとして、プライマーF(5'-GAGTGGTGGATGGAATGT-3'(配列番号８)）及びプライマーR(5'-CCACTTGGTTGCAGTATCC-3'(配列番号９))を用い、WSDV-LAMP(WSV477)における標的遺伝子(WSV477)配列のPCRを行った。なお、プライマーF及びプライマーRは、それぞれ下記の表５に示すF3プライマー(配列番号３)及びB3プライマー(配列番号４)と同一である。
得られたPCR産物をライゲーションに用いた。
【００５４】
4-2. ベクターへのライゲーション
Tベクター(PGEM-T Easy Vector; Promega, USA)へのライゲーション反応は、下記表１に示す試薬を混合し、4℃で16時間行った。反応溶液の組成を表１に示す。
【００５５】
【表１】
2014045728.tif 000002
【００５６】
4-3. コンピテントセルへのトランスフォーメーション
トランスフォーメーションは、大腸菌DH5α(Promega，USA)を用いて行った。-80℃に保存していたコンピテントセルを氷上で融解し、ライゲーション産物2μlを加えた1.5 mlエッペンドルフチューブにコンピテントセル50μlを添加し、穏やかに混和し、氷上で20分間静置した。
【００５７】
静置後、反応液を42℃のウォーターバスで50秒加熱し、2分間氷上に静置した。次いで、SOC培地(表２)950μlを加えた後、37℃のウォーターバスで1時間半振盪培養した(185 rpm）。
【００５８】
振盪培養後、0.1％アンピシリン添加マッコンキー寒天培地(日水製薬)に得られた培養物100μlをプレーティングし、37℃で15時間培養した。
【００５９】
培養後、形成したコロニーをレッドホワイトセレクションにより選択し、インサートの確認に用いた。
【００６０】
【表２】
2014045728.tif 000003
【００６１】
4-4. コロニーPCRによるインサートの確認
マスターミックス溶液(表３)を20μlずつ0.5 mlチューブに分注し、滅菌爪楊枝を用いて生育したコロニーを少量かきとり、溶液内に懸濁させた。PCRは、T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(配列番号１０))及びSP6(5'-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3'(配列番号１１))プライマーを用い、94℃で30秒間の熱処理後、94℃で30秒の熱変性、55℃で30秒間のアニーリング及び72℃で30秒間の伸長反応の30サイクル、72℃、5分間で反応の停止並びに4℃で保存の反応をサーマルサイクラーMyCycler(BIO-RAD，USA)を用いて行った。
【００６２】
【表３】
2014045728.tif 000004
【００６３】
反応終了後、PCR産物(10μl)を、エチジウムブロマイド(終濃度：1μg/ml)を含む1.5％アガロースゲルで電気泳動し、インサートの有無及びサイズの確認を行った。
【００６４】
4-5. プラスミドDNAの抽出
大腸菌を100μg/mlのアンピシリンを含む3 mlのLB培地（表４）で16時間培養し、8,000 rpmで3分間の遠心分離により集菌した。これを、QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)を用い、マニュアルに従いプラスミド抽出を行った。250μlのBufferP1を加え、菌体ペレットを再懸濁した。250μlのBufferP2を添加した後、5、6回転倒させ完全に混和させた。350μlのBufferN3を添加した後、5、6回転倒させ完全に混和させ、13,000 rpm、4℃で10分間遠心分離した。
【００６５】
遠心分離後、上清をデカントし、ピペッティングによりスピンカラムにアプライし、13,000 rpm、4℃で1分間遠心分離した後、フロースルー液を捨てた。Buffer PB 0.5 mlを添加した後、13,000 rpm、4℃で1分間遠心分離し、フロースルー液を捨てた。Buffer PE 0.75 mlを添加した後、13,000 rpm、4℃で1分間遠心分離し、フロースルー液を捨てた。残留している洗浄バッファーを除去するために、さらに13,000 rpm、4℃で1分間遠心分離した。
【００６６】
次いで、カラムを新しい1.5 mlエッペンチューブにセットし、Buffer EBをカラムの中央にアプライし、1分間放置した後、13,000 rpm、4℃で1分間遠心分離して、得られた抽出液を精製プラスミドとした。
【００６７】
【表４】
2014045728.tif 000005
【００６８】
プラスミドのコピー数を以下の方法を基に算出し、0.5×107〜1010(copies/μl)のプラスミド溶液を作製した。
【００６９】
1μl当たりのコピー数＝DNAの量(ng)×アボガドロ数(6.022×1023）/テンプレートの長さ(bp)×109×一塩基対の平均重量(650)
【００７０】
5. WSDV-LAMP(WSV069)用検量線作成のためのプラスミドの作製
標的遺伝子(WSV069)配列含有プラスミド溶液をテンプレートとして、プライマーF(5'-CCAATATGGACTTGACGGC-3'(配列番号１２)）及びプライマーR(5'-TGGGAACCACTGTTGAGA-3'(配列番号１３))を用い、WSDV-LAMP(WSV069)における標的遺伝子(WSV069)配列のPCRを行い、得られたPCR産物をライゲーションに用いたこと以外、上記第4節と同様にして、WSDV-LAMP(WSV069)用検量線作成のためのプラスミドを作製した。
【００７１】
なお、プライマーF及びプライマーRは、それぞれ下記の表６に示すF3プライマー(配列番号１６)及びB3プライマー(配列番号１７)と同一である。
【００７２】
6. プライマーの設計
6-1. WSDV-LAMP(WSV477)用プライマーの設計
PrimerExplorer V4(https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)により、図１に示すように、WSDVのゲノムDNA(GenBank accession number: NC_003225.1)のWSV477遺伝子に対応する塩基番号274708〜274949(配列番号７)に対するLAMP用プライマーを作製した。設計したプライマーは次の表５に示す通りである。
【００７３】
【表５】
2014045728.tif 000006
【００７４】
6-2. WSDV-LAMP(WSV069)用プライマーの設計
図２には、各WSDV-LAMP(WSV069)用プライマーのWSDVゲノムDNAから転写されたmRNA(Target RNA)に対するアニーリング位置を示す。パネル(A)は、FIP、BIP、F3、B3、LF及びLBプライマーのプライマー設計の概要を示す。パネル(B)は、プライマーに用いたWSDVゲノムの塩基配列を示す。また、パネル(B)において、プライマー設計に用いたDNA配列を囲みで示し、それぞれパネル(A)における以下の領域を示す；「F3 primer」：F3領域、「FIP primer」：F2領域、「Loop primer F」：FLc領域、「F1c Adaptor」：F1c領域、「B1c Adaptor」：B1c領域、「Loop primer B」：BLc領域、「BIP primer」：B2領域、「B3 primer」：B3領域。
【００７５】
PrimerExplorer V4(https://primerexplorer.jp/lamp4.0.0/index.html)により、図２に示すように、WSDVのゲノムDNA(GenBank accession number: NC_003225.1)のWSV069遺伝子に対応する塩基番号32162〜32378(配列番号２０)に対するLAMP用プライマーを作製した。設計したプライマーは次の表６に示す通りである。
【００７６】
【表６】
2014045728.tif 000007
【００７７】
7. WSDV-LAMP
7-1. リアルタイムLAMP法
Loopampリアルタイム濁度測定装置(LA-200）を用いて、ウイルスの定量的検出を行った。
【００７８】
7-2. LAMPの反応条件
上記第1〜3節で作製したcDNA溶液をテンプレートとし、WSDV-LAMPを行った。
LAMP反応溶液を下記の表７に示す。LAMP法は、Loopamp DNA増幅試薬キット(栄研化学)を用いた。2×Reaction Mix(40 mM Tris-HCl，20 mM KCl，16 mM MgSO4，20 mM (NH4)2SO4，0.2％Tween 20，1.6 M Betaine，2.8 mM dNTPs)12.5μl、FIPプライマーとBIPプライマーをそれぞれ1.0μl(40 pmol)、F3プライマーとB3プライマーをそれぞれ1.0μl(5 pmol)、LFプライマーとLBプライマーをそれぞれ1.0μl(5 pmol)及び蒸留水4.5μlの合計23μlを混合した。
【００７９】
この混液を97℃で3分間加熱し、その後氷中で急冷し、Bst DNAポリメラーゼ(Eiken Chemical Co.Ltd., Japan)1.0μl(8U)を加えた。次いで、テンプレートcDNA溶液を1μl加えて、リアルタイム濁度測定装置(LA-200)を用い、63℃で60分間反応させた。
【００８０】
【表７】
2014045728.tif 000008
【００８１】
7-3. 検量線の作成
定量LAMPの検量線作成のため、上記第4節又は第5節で作製したプラスミドのコピー数を以下の方法を基に算出し、0.5×101〜109(copies/μl)のプラスミド溶液を作製した。
【００８２】
1μl当たりのコピー数＝OD260測定で得られたプラスミド濃度(ng/μl)/プラスミド分子量×6.02×1014(copies/μl）
【００８３】
このプラスミド溶液をテンプレートとし、上記第7-2節と同様の方法で反応液を作製し、リアルタイム濁度測定装置を用いて、定量WSDV-LAMPにおける検量線の作成を行った。
【００８４】
7-4. 感染エビからの検出
WSDVに浸漬感染させた供試エビを継時的にサンプリングし、血リンパ及び心臓からtotal RNAを抽出し、cDNAを作製した。
【００８５】
各cDNAをリアルタイム濁度測定装置(LA-200)を用いて、WSDV-LAMP(WSV477)及びWSDV-LAMP(WSV069)のいずれにおいても63℃で60分間反応させた。
【００８６】
〔結果〕
1. WSDV-LAMPにおける検出限界
図３はWSDV-LAMP(WSV477)の検量線を示し、図４はWSDV-LAMP(WSV069)の検量線を示す。
図３及び４に示すように、直線性の高い検量線が得られた。また、WSDV-LAMP(WSV069)の検出限界が102copies/μlであったのに対して、WSDV-LAMP(WSV477)の検出限界は101copies/μlであった。このように、WSDV-LAMP(WSV477)用プライマーによれば、より広い範囲で信頼性の高い検量線を得ることができた。
【００８７】
なお、図３及び４において、「NTC(non template control)」は、プラスミドの代わりにD.W.を添加したサンプルを意味する。
【００８８】
2. WSDVに浸漬感染させた供試エビの血リンパ及び心臓からのWSDV検出結果
以下において、検出率は、式：検出率(％)＝100×反応陽性個体/検査個体により算出された。
【００８９】
図５は、WSDVに浸漬感染させた供試エビの血リンパからのリアルタイムLAMPによる(a)WSV069遺伝子及び(b)WSV477遺伝子の検出結果を示す。図５及び６において、横軸はWSDV含有溶液への浸漬後の時間経過であり、縦軸は検量線に基づくWSDVのコピー数(copies/μl)である。
【００９０】
図５に示すように、WSDVに浸漬感染させた供試エビの血リンパから、WSDV-LAMP(WSV069)用プライマーにより、浸漬4時間後から検出され、検出率は51.8％であった。一方、WSDVに浸漬感染させた供試エビの血リンパから、WSDV-LAMP(WSV477)用プライマーにより、浸漬4時間後から検出され、検出率は66.6％であった。
【００９１】
また、図６は、WSDVに浸漬感染させた供試エビの心臓からのリアルタイムLAMPによる(a)WSV069遺伝子及び(b)WSV477遺伝子の検出結果を示す。
【００９２】
図６に示すように、WSDVに浸漬感染させた供試エビの心臓から、WSDV-LAMP(WSV069)用プライマーにより、浸漬16時間後から検出され、検出率は33.3％であった。一方、WSDVに浸漬感染させた供試エビの心臓から、WSDV-LAMP(WSV477)用プライマーにより、浸漬4時間後から検出され、検出率は81.5％であった。
【００９３】
以上の実験結果より、WSV477遺伝子に対するプライマーを用いることで、感染初期に、より高感度な検出が可能になった。
【００９４】
一方、従来から用いられているVP-28遺伝子をターゲットとしたリアルタイムPCR法(qPCR)を用いてウイルスを検出した結果、血リンパで2.7％及び心臓で14.8％と低い検出率であった(図７)。
【００９５】
表８に、上記の検出率についてまとめた。検出率は、WSDV-LAMP(WSV477)用プライマーを用いた心臓からの検査が最も高く81.5％であった。
【００９６】
本実施例で用いたWSV477遺伝子をターゲットとするLAMP法とVP-28遺伝子検出用qPCR法とを比べると、明らかにWSV477遺伝子をターゲットとするLAMP法の検出率が高い。このことから、LAMP法は、従来感度が高いとされていたqPCR法よりも感度が優れていることが明らかとなった。
【００９７】
心臓の摘出はクルマエビを殺してしまうのに対し、血リンパは、採取後クルマエビを生かすことができる非破壊検査用サンプルである。従って、血リンパサンプルを用いることで、優良親エビ等を検査し、採卵に供することもできる。
【００９８】
WSDV-LAMP(WSV477)用プライマーを用いた血リンパにおける検出率も66.6％と比較的高いため、現場での有用性も考慮すれば、WSDV診断最適部位を血リンパと決定した。
【００９９】
【表８】
2014045728.tif 000009
【図１】
2014045728.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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