(57)【要約】【課題】皮膚のバリア機能調節作用を有する化粧料原料等を探索するスクリーニング系の構築を課題とする。【解決手段】皮膚外部より刺激を与えることにより皮膚細胞等のＦＡＴＰ４遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質を見出すことができ、皮膚の外部刺激による損傷とＦＡＴＰ４の遺伝子との関係を初めて明らかとすることができた。この新たな知見により、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現を増進する作用を有するか物質か否かを判定することにより、皮膚のバリア機能調節剤をスクリーニングする系を構築した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
表皮バリア機能調節剤のスクリーニング方法であって、以下の工程を有する方法。
（１）皮膚細胞及び／又は皮膚組織と被験物質とを一定時間接触させる工程
（２）（１）の工程の後、前記皮膚細胞及び／又は皮膚組織におけるＦＡＴＰ４の遺伝子の発現の増進作用の有無を検出する工程
（３）ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現が増進していた場合に、当該被験物質を表皮バリア機能調節剤と同定する工程
【請求項２】
前記（１）の工程が、ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現を抑制させる作用を有する皮膚細胞損傷物質の存在下で皮膚細胞と被験物質を一定時間接触させる工程である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
皮膚細胞損傷物質がＳＤＳである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
表皮バリア機能調節剤のスクリーニング方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｄ）の１次スクリーニング工程と（１）〜（３）の２次スクリーニング工程を含み、（ｄ）の工程および（３）の工程の両方で表皮バリア機能調節剤候補物質と判定された物質を表皮バリア機能調節剤と決定する前記スクリーニング方法。
（ａ）皮膚細胞及び／又は皮膚組織と被験物質とをＦＡＴＰ４遺伝子の発現を抑制させる作用を有する皮膚細胞損傷物質存在下で一定時間接触させる工程
（ｂ）（ａ）の工程の後、前記皮膚細胞及び／又は皮膚組織の生存率を測定する工程
（ｃ）（ｂ）で測定した生存率を、被験物質を添加しない場合の生存率と比較する工程
（ｄ）（ｃ）の工程において（ｂ）で測定した細胞生存率の方が高い場合に当該被験物質を表皮バリア機能調節剤候補物質であると同定する工程
（１）皮膚細胞及び／又は皮膚組織と被験物質とを一定時間接触させる工程
（２）（１）の工程の後、前記皮膚細胞及び／又は皮膚組織におけるＦＡＴＰ４の遺伝子の発現の増進作用の有無を検出する工程
（３）ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現が増進していた場合に、当該被験物質を表皮バリア機能調節候補物質と同定する工程
【請求項５】
（１）の被験物質が、（ｄ）の工程で同定された表皮バリア機能調節剤候補物質である、請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記（１）の工程が、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現を抑制させる作用を有する皮膚細胞損傷物質の存在下で皮膚細胞及び／又は皮膚組織と被験物質とを一定時間接触させる工程である請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
皮膚細胞損傷物質がＳＤＳである請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮バリア機能調節剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の角質層は角質細胞と角質細胞間脂質のラメラ構造からなる。角質細胞間脂質の主成分はセラミド、脂肪酸、コレステロール、コレステロール硫酸から成り、水分と油分を交互に積み重ねることで肌の水分を保持し、外的刺激から肌を保護している。したがって、細胞間脂質により整然としたラメラ構造を形成する角質層は、皮膚外部からの刺激を受けても、防御する機能を有する。一方、細胞間脂質が少なく、ラメラ構造に乱れがある角質層は、皮膚外部からの刺激に対する防御機能が低いことから、外部刺激物質の影響を受け、角質層内部の水分が蒸散するなど、ダメージを受けやすくなる。
ところで、角質層に急性刺激が与えられた場合、皮膚のバリア機能が崩壊するが、このとき正常な皮膚であれば、角化細胞の分化とともに脂肪酸合成酵素の発現が多くなり、脂肪酸がバリア機能回復を行うことが知られている（非特許文献１）。
また、脂肪酸の細胞外からの取り込みに作用する脂肪酸輸送たんぱく質（ＦＡＴＰ／Fatty-Acid Transport Protein）の分子種と局在の点から検討すれば、皮膚にはＦＡＴＰ４が存在することが知られている（非特許文献２）。そして、野生型マウスと比べFATP4を欠損させたマウスは、凹凸のない硬い皮膚に覆われており（非特許文献３）、FATP4を欠損させたマウスは表皮の分化がうまくいかず正常な水分保持能を有さないことが知られている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Dermatoendocrinol 2011 Apr3(2)53-61 Epub 2011 Apr 1.
【非特許文献２】J Biol Chem. 2008 Jan 25;283(4):1773-7.Epub 2007 Nov 16
【非特許文献３】PNAS 2003 Apr 29 100(9)5274-9 Epub 2003 Apr 15
【非特許文献４】Dev Biol 2010 Aug 15 344(2)707-19 Epub 2010 Jun 1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、前記背景技術の下では、ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現と、皮膚の損傷との関係は未だ不明であり、実際にＦＡＴＰ４遺伝子の増進作用に着目した皮膚のバリア機能の調節をする皮膚外用剤、医薬品、化粧料は存在していない。
本発明者らは、皮膚に存在するＦＡＴＰ４の遺伝子の発現に着目し、皮膚の外部刺激による損傷とＦＡＴＰ４の遺伝子との関係を明らかとすることができれば、皮膚のバリア機能調節作用を有する化粧料原料等を探索するスクリーニング系を構築できるのではないかと考え、鋭意検討を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
その結果、驚くべきことに、皮膚外部より刺激を与えることにより皮膚細胞等のＦＡＴＰ４遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質を見出すことができ、皮膚の外部刺激による損傷とＦＡＴＰ４の遺伝子との関係を初めて明らかとすることができた。この新たな知見により、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現を増進する作用を有するか物質か否かを判定することにより、皮膚のバリア機能調節剤をスクリーニングする系を構築することに初めて成功した。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
〔１〕表皮バリア機能調節剤のスクリーニング方法であって、以下の工程を有する方法。
（１）皮膚細胞及び／又は皮膚組織と被験物質とを一定時間接触させる工程
（２）（１）の工程の後、前記皮膚細胞及び／又は皮膚組織におけるＦＡＴＰ４の遺伝子の発現の増進作用の有無を検出する工程
（３）ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現が増進していた場合に、当該被験物質を表皮バリア機能調節剤と同定する工程
〔２〕前記（１）の工程が、ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現を抑制させる作用を有する皮膚細胞損傷物質の存在下で皮膚細胞と被験物質を一定時間接触させる工程である前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕皮膚細胞損傷物質がＳＤＳである前記〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕表皮バリア機能調節剤のスクリーニング方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｄ）の１次スクリーニング工程と（１）〜（３）の２次スクリーニング工程を含み、（ｄ）の工程および（３）の工程の両方で表皮バリア機能調節剤候補物質と判定された物質を表皮バリア機能調節剤と決定する前記スクリーニング方法。
（ａ）皮膚細胞及び／又は皮膚組織と被験物質とをＦＡＴＰ４遺伝子の発現を抑制させる作用を有する皮膚細胞損傷物質存在下で一定時間接触させる工程
（ｂ）（ａ）の工程の後、前記皮膚細胞及び／又は皮膚組織の生存率を測定する工程
（ｃ）（ｂ）で測定した生存率を、被験物質を添加しない場合の生存率と比較する工程
（ｄ）（ｃ）の工程において（ｂ）で測定した細胞生存率の方が高い場合に当該被験物質を表皮バリア機能調節剤候補物質であると同定する工程
（１）皮膚細胞及び／又は皮膚組織と被験物質とを一定時間接触させる工程
（２）（１）の工程の後、前記皮膚細胞及び／又は皮膚組織におけるＦＡＴＰ４の遺伝子の発現の増進作用の有無を検出する工程
（３）ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現が増進していた場合に、当該被験物質を表皮バリア機能調節候補物質と同定する工程
〔５〕（１）の被験物質が、（ｄ）の工程で同定された表皮バリア機能調節剤候補物質である、前記〔４〕に記載のスクリーニング方法。
〔６〕前記（１）の工程が、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現を抑制させる作用を有する皮膚細胞損傷物質の存在下で皮膚細胞及び／又は皮膚組織と被験物質とを一定時間接触させる工程である前記〔４〕または〔５〕に記載の方法。
〔７〕皮膚細胞損傷物質がＳＤＳである前記〔４〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、外部刺激等による皮膚のバリア機能損傷時のFATP4の評価が可能になった。
また、本発明によれば、ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現増進有無を検出するという工程を含むスクリーニング方法により、簡便かつ確実に皮膚のバリア機能調節剤を評価し、選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】皮膚角化細胞とＳＤＳを接触させることによりＦＡＴＰ４遺伝子の発現が無添加のものに対して有意に低下することを確認した結果である。(実施例１)
【図２】皮膚角化細胞とＳＤＳを接触させることにより低下するＦＡＴＰ４遺伝子の発現について、各種のサンプル物質の添加による影響を調べた結果である。(実施例２)
【図３】皮膚角化細胞とＳＤＳを接触させることにより低下する細胞生存率について、各種のサンプル物質の添加による影響を調べた結果である。(実施例３)
【図４】クルクミンのＦＡＴＰ４遺伝子の発現増進作用におけるクルクミンの添加濃度による効果を調べた結果である。（実施例４）
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、皮膚細胞及び／又は皮膚組織におけるＦＡＴＰ４の遺伝子の発現増進作用を有するがどうかを手がかりに被験物質をスクリーニングし、当該作用を有する物質を表皮バリア機能調節剤として同定することを含む、スクリーニング方法を提供する。
すなわち、以下の工程（１）〜（３）を含む方法である。
（１）皮膚細胞及び／又は皮膚組織と被験物質とを一定時間接触させる工程
（２）（１）の工程の後、前記皮膚細胞及び／又は皮膚組織におけるＦＡＴＰ４の遺伝子の発現の増進作用の有無を検出する工程
（３）ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現が増進していた場合に、当該被験物質を表皮バリア機能調節剤と同定する工程
以下、本明細書では皮膚細胞及び／又は皮膚組織を省略して皮膚細胞等ということがある。
【０００９】
本発明の別の実施態様としては、前記スクリーニング方法を別のスクリーニング方法と組み合わせて行う方法が挙げられる。すなわち、以下の工程（ａ）〜（ｄ）の１次スクリーニング工程（細胞生存率によるスクリーニング工程）と（１）〜（３）の２次スクリーニング工程（ＦＡＴＰ４の遺伝子発現をみるスクリーニング工程）を有する方法である。具体的には、以下の工程（ａ）〜（ｄ）の１次スクリーニング工程と（１）〜（３）の２次スクリーニング工程を含み、（ｄ）の工程および（３）の工程の両方で表皮バリア機能調節剤候補物質と判定された物質を表皮バリア機能調節剤と決定する前記スクリーニング方法である。（ａ）皮膚細胞及び／又は皮膚組織と被験物質とをＦＡＴＰ４遺伝子の発現を抑制させる作用を有する皮膚細胞損傷物質存在下で一定時間接触させる工程
（ｂ）（ａ）の工程の後、前記皮膚細胞及び／又は皮膚組織の生存率を測定する工程
（ｃ）（ｂ）で測定した生存率を、被験物質を添加しない場合の生存率と比較する工程
（ｄ）（ｃ）の工程において（ｂ）で測定した細胞生存率の方が高い場合に当該被験物質を表皮バリア機能調節剤候補物質であると判定する工程
（１）皮膚細胞及び／又は皮膚組織と被験物質とを一定時間接触させる工程
（２）（１）の工程の後、前記皮膚細胞及び／又は皮膚組織におけるＦＡＴＰ４の遺伝子の発現の増進作用の有無を検出する工程
（３）ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現が増進していた場合に、当該被験物質を表皮バリア機能調節剤候補物質と判定する工程
【００１０】
また、ここで、１次スクリーニングと２次スクリーニングの順序は、特に問わないが、スクリーニング工程の作業効率を考慮すれば、細胞生存率によるスクリーニングを先に行い、その結果選択されたものについてＦＡＴＰ４の遺伝子発現をみるスクリーニングの順序で行うことが望ましい。
すなわち、以下の工程（ａ）〜（ｄ）の１次スクリーニング工程と（１）〜（３）の２次スクリーニング工程を含み、（ｄ）の工程で表皮バリア機能調節剤候補物質と判定された物質を（１）の工程において被験物質としてスクリーニングする方法である。具体的には、以下の方法である。
（ａ）皮膚細胞及び／又は皮膚組織と被験物質とをＦＡＴＰ４遺伝子の発現を抑制させる作用を有する皮膚細胞損傷物質存在下で一定時間接触させる工程
（ｂ）（ａ）の工程の後、前記皮膚細胞及び／又は皮膚組織の生存率を測定する工程
（ｃ）（ｂ）で測定した生存率を、被験物質を添加しない場合の生存率と比較する工程
（ｄ）（ｃ）の工程において（ｂ）で測定した細胞生存率の方が高い場合に当該被験物質を表皮バリア機能調節剤候補物質であると判定する工程
（１）皮膚細胞及び／又は皮膚組織と（ｄ）の工程で判定された表皮バリア機能調節剤候補物質とを一定時間接触させる工程
（２）（１）の工程の後、前記皮膚細胞及び／又は皮膚組織におけるＦＡＴＰ４の遺伝子の発現の増進作用の有無を検出する工程
（３）ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現が増進していた場合に、当該表皮バリア機能調節剤候補物質を表皮バリア機能調節剤と判定する工程
【００１１】
本発明のさらに別の実施態様としては、前記（１）の工程が、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現を抑制させる作用を有する皮膚細胞損傷物質の存在下で皮膚細胞等と被験物質を一定時間接触させる工程である場合が挙げられる。このような皮膚細胞損傷物質を共存させることで、皮膚への損傷が起こり、皮膚細胞等におけるＦＡＴＰ４の遺伝子の発現が抑制された状態を作り出すことができる。そして、このような状態においてＦＡＴＰ４の遺伝子の発現を増進するかどうかを調べることにより、確実に皮膚の表皮バリア機能調節作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
【００１２】
上記（１）の工程および（ａ）の工程において、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現を抑制する作用を有する皮膚細胞損傷物質の存在下で皮膚細胞等と被験物質を一定時間接触させるとは、皮膚細胞損傷物質と皮膚細胞等と被験物質とを同時に接触させる工程が挙げられる。なお、「同時」には、厳密な意味での同時以外に、接触の順序に時間差を伴う場合もあり、皮膚細胞損傷物質を皮膚細胞等とをあらかじめ接触させておいてから、次に、これらに被験物質を添加するという２段階の工程も挙げられる。
【００１３】
上記（１）の工程および（ａ）の工程において、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現を抑制する作用を有する皮膚細胞損傷物質を共存させることは、両工程を通して、皮膚の損傷が起こり、そのような状態において、細胞の生存率低下が抑制され、すなわち、細胞損傷が軽減されるような作用を有する物質を選択することができ（１次スクリーニング）、さらに、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現を増進し、表皮バリア機能調節作用を有する物質を選択することができ（２次スクリーニング）、皮膚表皮とってより有効な化粧料原料を選択することにつながる。
【００１４】
本発明におけるＦＡＴＰ４遺伝子の発現を抑制させる作用を有する皮膚細胞損傷物質とは、皮膚細胞あるいは皮膚組織を損傷させる作用を有する物質であればいずれでもよく、一般に、過酸化水素等の酸化物質やＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）等の界面活性剤が挙げられ、このうちでもＳＤＳが望ましい。
皮膚細胞損傷物質の添加量は、細胞生存率が７０％〜８０％前後となる量が好ましい。
【００１５】
一般的に、遺伝子の「発現」という用語は、その遺伝子の翻訳産物すなわちタンパク質の産生のことを指すが、より広義には、その遺伝子の転写産物すなわちｍＲＮＡの産生のことを指すこともある。本明細書では、「発現」と言えば特にことわりがない限りタンパク質のレベルにおける発現とｍＲＮＡのレベルにおける発現の両方を指すものとする。タンパク質のレベルにおける発現量増加はその遺伝子の機能を遂行する最終産物の増加を反映し、ｍＲＮＡのレベルにおける発現量増加はその遺伝子の活性化に伴う直接的な結果を反映する。一般的にｍＲＮＡ発現の増加はタンパク質発現の増加につながると推定することが通常であるが、マイクロＲＮＡによるタンパク質翻訳への影響などにより、ｍＲＮＡ発現とタンパク質発現の増加は必ずしも相関しないことがある。例えば転写後制御のためにｍＲＮＡがすぐには翻訳されない場合、または産生されるタンパク質が迅速な分解や翻訳後修飾等の理由で検出を逃れる場合など、ｍＲＮＡ発現の上昇が検出されてもタンパク質発現の上昇は検出されないことはあり得る。いずれにせよ、ｍＲＮＡ発現の上昇がその遺伝子の機能の亢進の基礎となり得ることに変わりはない。逆に、例えば薬剤の投与が翻訳メカニズムやタンパク質安定化に対して作用する場合などにおいて、ｍＲＮＡ発現は上昇しないがタンパク質発現だけが上昇するということも起こり得る。
本発明では後述する実施例のように、ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現増進は、ｍＲＮＡ量の増加として表れる場合に発現増進であると判断した。
【００１６】
特定のタンパク質の発現を検出または定量するための種々の方法は、当業者にはよく知られており、例えばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色などが挙げられる。当業者は、個々のタンパク質の特性に合わせて、適切な検出方法または定量方法を選択または設計できる。特定のｍＲＮＡの発現を検出または定量するための種々の方法も、当業者にはよく知られており、例えばノザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイなどが挙げられる。各遺伝子に特異的なプローブおよびプライマーを併用するＴａｑＭａｎ系によるＲＴ−ＰＣＲは、感度、定量性、特異性において優れており、好ましい。
【００１７】
皮膚細胞及び皮膚組織は判定の対象となる被験体に由来するものであるとよく、被験体の生物種としては、ヒト、ブタ、サル、チンパンジー、イヌ、ウシ、ウサギ、ラット、マウス、モルモットなどの哺乳動物を挙げることができる。
【００１８】
本発明の方法により、ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現増進作用の有無を判定するためには、皮膚生検試料、あるいはそこから得られる培養皮膚細胞、培養皮膚組織、などを用いることができる。
【００１９】
皮膚細胞としては、表皮角化細胞、皮膚線維芽細胞、ランゲルハンス細胞、色素細胞（メラノサイト）、悪性黒色腫細胞（メラノーマ）などを挙げることができる。皮膚細胞は国内ではヒューマンサイエンス研究資源バンク、理化学研究所細胞銀行、海外ではｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから供給される。またＣｌｏｎｔｅｃｈ社、クラボウ社、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社から入手できる。また、公知の方法により皮膚から採取することができる（分子生物学研究のための新細胞培養実験法，ｐ５７−７１，羊土社，１９９９）。
【００２０】
皮膚組織としては、皮膚の角層、表皮、真皮などを挙げることができる。皮膚組織は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ社、Ｓｕｐｅｒ Ｂｉｏ Ｃｈｉｐｓ社から購入できる。また、公知の方法により皮膚から採取することができる（Ａｃｔａ．Ｄｅｒｍ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．，８５，３８９−３９３，２００５）。三次元皮膚モデルはクラボウ社、ＴＯＹＯＢＯ社などから市販されており、これらを使用することが出来る。また、公知の方法[Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１０４（１）,１０７−１１２,１９９５]により作製することもできる。
【００２１】
本発明のスクリーニング方法に提供される被験物質は、いかなる物質であってもよく、タンパク質、ペプチド、ビタミン、ホルモン、多糖、オリゴ糖、単糖、低分子化合物、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等）、脂質、上記以外の天然化合物、合成化合物、植物抽出物、植物抽出物の分画物、それらの混合物などを挙げることができる。
【００２２】
皮膚細胞及び皮膚組織については、前述の通りである。
被験物質と皮膚細胞及び／又は皮膚組織との接触は、いかなる方法によってもよい。例えば、被験物質を皮膚細胞及び／又は皮膚組織の培養液に添加する方法、被験物質を塗布又は固定した培養容器又は培養シート上で皮膚細胞及び／又は皮膚組織を培養する方法などを挙げることができる。
【００２３】
皮膚細胞及び／又は皮膚組織の培養時間は、特に限定されない。皮膚細胞及び／又は皮膚組織における特定のタンパク質の発現及び／又はその遺伝子発現に対する被験物質の効果の有無が確認できる程度の時間であればよい。
例えば、皮膚細胞としてヒト表皮角化細胞を用いた場合には、１〜４８時間が適当であり、１〜２４時間がさらに好ましく、１〜３時間がよりいっそう好ましい。ここで、「皮膚細胞及び／又は皮膚組織を培養する」とは、皮膚細胞及び／又は皮膚組織を生育・増殖させることを言う。これには、単離した皮膚細胞及び／又は皮膚組織を生育・増殖させることの他、皮膚細胞や皮膚組織を有する生体自体を生存させること、飼育すること、養うことなども含まれる。
【００２４】
比較の対照となる皮膚細胞及び／又は皮膚組織は、被験物質を接触させる前の皮膚細胞及び／又は皮膚組織であってもよい。被験物質を接触させないこと以外は同様の処理を行った皮膚細胞及び／又は皮膚組織であってもよい。
【００２５】
本発明の一つの例として、被験物質を接触させたヒトの皮膚において、ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現量が対照と比較して増加しており、被験物質がＦＡＴＰ４の遺伝子の発現を増進させる効果があると評価できた場合には、この被験物質は、表皮バリア機能調節剤としての効果がある物質と同定することができる。
【実施例】
【００２６】
〔実施例１〕ＳＤＳ添加による、ヒト皮膚角化細胞のＦＡＴＰ４遺伝子発現に対する影響確認試験
一般にヒト皮膚角化細胞に対して刺激物質として知られているＳＤＳを細胞に添加することにより、皮膚を損傷させ、その場合にＦＡＴＰ４遺伝子の発現に対してどのような影響を与えるかを調べた。
【００２７】
１．試験に用いた材料
細胞：ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａｔ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ｋｒｅｂｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇｓｚｅｎｔｒｕｍ製（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０６：７６１−７７１（１９８８）
マルチプレート６Ｆ：ＭＳ−８００６０、住友ベークライト製
Ｄ−ＭＥＭ培地：１１９９５−０７３、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製
Ｄ−ＰＢＳ培地：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅｓ、１４１９０−２５０、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ製
ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）：１９１−０７１４５、和光純薬工業製
クロロホルム：０３８−０２６０６、和光純薬工業製
２−プロパノール：１６８−２１６７５、和光純薬工業製
エタノール：０５９−０７８９５、和光純薬工業製
ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水：Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  Ｗａｔｅｒ（ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ）、１０９７７−０１５、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ製
【００２８】
２．試験方法
（１）細胞の培養
ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａｔ）をマルチプレート６Ｆに４ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 にて播種し、ＦＢＳ１０％とＰｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％を添加したＤ−ＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で、２４時間前培養を行った。培養後のマルチプレートをＤ−ＰＢＳ培地により洗浄し、Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％およびＳＤＳ０．２％を添加したＤ−ＭＥＭ培地で培養した。培養時間は、３０分、６０分、１８０分とした。
（２）ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出
上記（１）の細胞培養後、マルチプレートをＤ−ＰＢＳ培地で洗浄し、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、１５５９６−０１８）にて細胞を溶解し回収した。回収した細胞溶解液は−８０℃で保存し、１週間以内にｔｏｔａｌＲＮＡ抽出を行った。
ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出は、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔマニュアルに従って行った。すなわち、室温にて５分間静置したのち、クロロホルム２００μＬを加えて１５秒間激しく混合した後、室温で３分間静置した。その後、１３，０００ｒｐｍ、５分間、４°Ｃで遠心分離した上清を回収し、２−プロパノール５００μＬを加えて室温で１０分間置き、１３，０００ｒｐｍ、１０分間、４°Ｃで遠心分離してペレットを回収した。このペレットに７０ｖｏｌ％エタノールを１ｍｌ添加し、再び１０，０００ｒｐｍ、４°Ｃ、５分で遠心分離してペレットを回収し、風乾した。これにＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水２０μＬを添加して溶解したものをｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液として以下の試験に用いた。
（３）ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成は、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ、ＲＲ０３６Ａ）のマニュアルに従って行った。すなわち、５ｘ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）：ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液：ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水が１：１：３の割合（体積割合）になるように混合し、サーマルサクラーにて３７℃、１５分で逆転写、８５℃、５秒で逆転写酵素の熱失活を行った後、４℃にて冷却した。
（４）ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現量の測定
ＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）ＩＩ  （Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ、ＲＲ８２０Ａ）のマニュアルに従って行った。ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（２ｘ）に対し、ＰＣＲ  Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（終濃度０．４μＭ）、ＰＣＲ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（終濃度０．４μＭ）を含む等量のＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ水を加え調整した。その後、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、以下の条件にて初期変性、ＰＣＲ反応、融解曲線分析および冷却を行い、ＰＣＲ増幅産物の生成量（ｍＲＮＡ量）の検出を行った。
初期変性：９５℃、３０秒
ＰＣＲ反応：９５℃で５秒、６０℃で３０秒を４０サイクル
融解曲線分析：９５℃で５秒、６０℃で１分
冷却：５０℃、３０秒
ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現量はＡｃｔｉｎ遺伝子の発現量で標準化を行った。
培養時間３０分のコントロール（無添加の細胞）のＦＡＴＰ４遺伝子発現量を基準として、ＦＡＴＰ４遺伝子発現量の相対比を算出した。
（５）データ解析
ｃｏｎｔｒｏｌに対する分散性をＦ検定にて確認後、等分散性と仮定できる場合Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定を行い、等分散性と仮定できない場合にはＷｅｌｃｈのｔ検定を用いて行った。有意水準は＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１とした。以下の試験についても同様である。
【００２９】
３．試験結果
結果を図１に示す。
図１によれば、ＳＤＳ添加により皮膚角化細胞におけるＦＡＴＰ４の遺伝子の発現は、無添加の場合に比べて優位に低下し、かつ経時的に低下したことが確認された。したがって、皮膚角化細胞はＳＤＳのような皮膚刺激物質にさらされることにより、ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現が低下・抑制されることがわかった。以下、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現が抑制されるような皮膚への刺激が起きる環境下で皮膚バリア機能調節剤のスクリーニングを行った。
【００３０】
〔実施例２〕皮膚バリア機能調節剤のスクリーニング
実施例１より、皮膚に対する刺激によってＦＡＴＰ４の遺伝子の発現が低下することが確認された。したがって、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現を手がかりに、同遺伝子の発現低下を抑制あるいは発現を増進するような物質を探すことにより、皮膚バリア機能調節剤を取得することにつながると考え、以下のスクリーニングを行った。
【００３１】
１．試験に用いた材料
実施例１と同じ。
【００３２】
２．試験方法
（１）細胞の培養
ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａｔ）をマルチプレート６Ｆに４ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 にて播種し、ＦＢＳ１０％とＰｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％を添加したＤ−ＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で、２４時間前培養を行った。培養後のマルチプレートをＤ−ＰＢＳ培地により洗浄し、Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％およびＳＤＳ０．２％を添加したＤ−ＭＥＭ培地に、各サンプルを１μｇ／ｍＬ培地となるように添加して培養した。サンプルは、アスパラギン、グルコース、ガラクトース、クルクミンを用いた。
サンプルが水溶性物質の場合はあらかじめＤ−ＰＢＳ培地に溶解した。サンプルが脂溶性物質の場合はあらかじめＤＭＳＯに溶解し、ＤＭＳＯの培地中の溶媒量は０．１％となるようにして添加した。培養時間は、１８０分とした。
（２）ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出
実施例１と同じ
（３）ｃＤＮＡの合成
実施例１と同じ
（４）ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現量の測定
実施例１と同様に測定した。サンプルを添加せずにＳＤＳのみ添加したときのＦＡＴＰ４遺伝子発現量を基準として、ＳＤＳとサンプル添加時のＦＡＴＰ４遺伝子発現量の相対比を算出した。
【００３３】
３．試験結果
結果を図２に示す。
本図によれば、アスパラギン、グルコース、ガラクトースを添加した場合は、皮膚刺激物質であるＳＤＳによるＦＡＴＰ遺伝子の発現の低下抑制あるいは発現を増進することができず、ＳＤＳのみを添加した場合（コントロール）と同じ程度であった。一方、クルクミンを添加した場合は、ＳＤＳによるＦＡＴＰ４遺伝子の発現の低下抑制あるいは発現を増進することできるがわかった。
【００３４】
〔実施例３〕  ヒト皮膚角化細胞における細胞保護作用の検討
皮膚に対する刺激によって細胞生存率の低下が見られるが、この低下を抑制する効果のある物質を探すことにより、皮膚の細胞保護作用を有する物質を取得することにつながると考え、以下のスクリーニングを行った。
【００３５】
１．試験に用いた材料
臭化３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム：３４１−０１８２３、和光純薬工業製
２−プロパノール：１６３−０４８４６、和光純薬工業製
９６ウェルマイクロプレート：Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）９６ウェルマイクロプレート（３５３０７２、ＢＤ製）
なお、実施例１と共通のものは省略した。
【００３６】
２．試験方法
ヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａｔ）を、９６ウェルマイクロプレートに４ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 となるように細胞を播種し、ＦＢＳ１０％とＰｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％を添加したＤ−ＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で、２４時間前培養を行った。その後、Ｄ−ＰＢＳ培地を用いて洗浄し、Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％およびＳＤＳ０．２％を添加したＤ−ＭＥＭ培地に、各サンプルを濃度が１μｇ／ｍＬとなるように添加し培養した。
サンプルの種類およびサンプルの溶解は実施例１と同じである。培養終了後、上清を取り除いた細胞に、Ｄ−ＰＢＳで５ｍｇ／ｍＬに溶解した臭化３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムを２０分の１量添加したＤ−ＭＥＭ１００μＬを添加し、３時間インキュベートした。培養液を除去して、２−プロパノール１００μＬを各ｗｅｌｌに添加し、マイクロプレートシェーカーにて３０分間撹拌してホルマザンを溶解し、５７０ｎｍと６３０ｎｍの吸光度を測定しその吸光度差を求め、以下の式により細胞生存率（％）を算出した。ＳＤＳもサンプルも添加しないで培養したものをコントロールとした。
細胞生存率（％）＝サンプル添加時の吸光度差  ／コントロールの吸光度差  ×１００
【００３７】
３．試験結果
結果を図３に示す。図３よりアスパラギン、グルコース、ガラクトース、またはクルクミンを添加することによりＳＤＳによる細胞生存率の低下を有意に抑制することができた。
本結果と実施例２の結果より、アスパラギン、グルコース、ガラクトースにはＳＤＳによる細胞生存率低下を抑制する機能はあるが、ＳＤＳによるＦＡＴＰ４遺伝子の発現低下を抑制、または、発現を増進したりする作用はないと考えられる。このことから、ＳＤＳによる細胞生存率の低下を抑制できるかどうかを調べ（１次スクリーニング）、当該作用を有する物質において、ＳＤＳによるＦＡＴＰ４遺伝子の発現低下を抑制あるいは発現増進作用のある物質を調べれば（２次スクリーニング）、ＳＤＳ等による刺激から細胞を保護する作用があり、かつ、皮膚バリア調節機能のある、皮膚に対して極めて有効な物質をスクリーニングすることができる。
【００３８】
〔実施例４〕クルクミン処理によるＦＡＴＰ４遺伝子の発現検討
１．試験方法
（１）細胞の培養
細胞はヒト皮膚角化細胞（ＨａＣａｔ）を用いた。ＨａＣａｔをマルチプレート６Ｆに４ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2 にて播種し、Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で、２４時間前培養を行った。その後、Ｄ−ＰＢＳ培地を用いて洗浄し、Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ  ｓｔｒｅｐｔｍｙｓｉｎ１％を添加したＤ−ＭＥＭ培地に、クルクミン濃度が０．０１μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬとなるようにし培養した。クルクミンの溶解にはＤＭＳＯを用い、ＤＭＳＯの培地中の溶媒量は０．１％とした。培養時間は３時間とした。
（２）ｔｏｔａｌＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの合成、ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現量の測定、データ解析の各方法については、実施例１と同じである。
【００３９】
２．試験結果
結果を図４に示す。図４によればクルクミンの添加濃度が高くなるにつれ、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現が増進されることがわかった。本実施例および実施例２より、クルクミンは、皮膚刺激物質であるＳＤＳの非存在下および存在下のいずれの場合も、ＦＡＴＰ４遺伝子の発現を増進することができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明によれば、ＦＡＴＰ４の遺伝子の発現増進有無を検出するという工程を含むスクリーニング方法により、簡便かつ確実に皮膚のバリア機能調節剤を選択することができる。このようなスクリーニング方法により得られた皮膚のバリア機能調節剤は、皮膚外用剤および化粧料の原料として非常に有用性が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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