(57)【要約】  本発明の目的は、高効率で再現性よく、ヒト多能性幹細胞からヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞を誘導する方法の提供、並びに、ヒトPGC様細胞を特定するための細胞表面マーカーを提供することである。  本発明は、以下の工程I）及びII）：  I）ヒト多能性幹細胞を、アクチビンAおよびGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養することにより中胚葉様細胞を製造する工程、  II）工程I）で得られた中胚葉様細胞を、BMPを含む培養液中で培養する工程を含む、ヒト多能性幹細胞からヒトPGC様細胞の製造方法、並びに  さらに、III）前記工程II）で得られた細胞から、PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーが陽性である細胞を選択する工程を含む、単離されたヒトPGC様細胞の製造方法を提供することで上記課題を解決する。
2017002888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞からヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞を製造する方法であって、以下の工程I）及びII）を含む、方法：
I）ヒト多能性幹細胞を、アクチビンAおよびGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養することにより中胚葉様細胞を製造する工程、
II）工程I）で得られた中胚葉様細胞を、BMPを含む培養液中で培養する工程。
【請求項２】
前記工程I）の培養を60時間未満実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程I）の培養を42時間実施する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程I）において、培養液が線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）阻害剤をさらに含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記FGFR阻害剤が、PD173074である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程I）において、培養液がbFGFおよびBMPを含まない、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程II）において、培養液が、SCF、EGFおよびLIFから成る群より選択される少なくとも一つのサイトカインをさらに含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記多能性幹細胞が、無血清及び無フィーダー条件下で培養された多能性幹細胞である、請求項１から８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記無フィーダー条件下での培養が、ラミニン５１１またはラミニン５１１断片上での培養である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、III）前記工程II）で得られた細胞から、PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーが陽性である細胞を選択する工程を含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程III）が、INTEGRINα6 (CD49f)及びEpCAMの二重陽性細胞を選択する工程である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト多能性幹細胞が、ヒトiPS細胞である、請求項1から12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法により製造される、ヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞を含む細胞集団。
【請求項１５】
PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーが陽性である細胞を選択することを含む、ヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞の選別方法。
【請求項１６】
前記選択が、INTEGRINα6 (CD49f)及びEpCAMの二重陽性細胞を選択することによって行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
以下の（1）及び（2）を含む、ヒト多能性幹細胞からヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞への分化誘導用試薬キット：
（1）アクチビンAおよびGSK3β阻害剤を含む、ヒト多能性幹細胞から中胚葉様細胞への誘導用試薬、
（2）BMPを含む、中胚葉様細胞からヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞への誘導用試薬。
【請求項１８】
前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記（1）の誘導用試薬が、線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）阻害剤をさらに含む、請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記FGFR阻害剤が、PD173074である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記（2）の誘導用試薬が、SCF、EGFおよびLIFから成る群より選択される少なくとも一つのサイトカインをさらに含む、請求項１７から２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
さらに、（3）PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーの各々に対する抗体を含む、ヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞の単離用試薬を含む、請求項１７から２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
前記（3）の単離用試薬が、INTEGRINα6 (CD49f)に対する抗体及びEpCAMに対する抗体を含む、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から中胚葉様細胞を介して始原生殖細胞様細胞（PGC様細胞）を誘導する方法、そのための試薬キット、該方法から得た生殖細胞系列に属する細胞を該細胞集団から単離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生殖細胞系は分化全能性の基礎であり、多くの多細胞生物において遺伝情報およびエピジェネティックな情報を次世代へ伝達することで、当該生物の永続性と多様性を与える。ヒトの始原生殖細胞(PGCs)が発生し、複雑かつ多岐にわたる発生経路を経て精子または卵子を形成するという生殖細胞系で異常が生じると、その子孫における遺伝的または後天的疾患および発育障害、機能障害、不妊などの様々な発生障害が現れる。したがって、生殖細胞形成のメカニズムを理解することは、生物学のみならず疾患の理解に大変重要である。【０００３】
哺乳類における生殖細胞形成のメカニズムは、マウスにおいて多くの知見が得られており、ヒトを含むすべての動物に適用できる可能性がある重要な情報であった。しかし、多様に存在する動物種において、生殖細胞の発生に関する精緻なメカニズムでは大きな種差が存在するため、それぞれの種における正確な理解のために、各動物種での知見が必要と考えられる。【０００４】
しかし、ヒトにおける生殖細胞の発生のメカニズムに関する情報は非常に不足しており、これは、実験材料を入手することが困難であることに起因する。このように、ヒトの生殖細胞の形成のメカニズムが不明であることから、ヒト生殖細胞の欠陥に起因する疾患の診断/治療が困難となっていた。【０００５】
ヒト胚性幹細胞（hESCs）(非特許文献１)やヒト人工多能性幹細胞(hiPSCs) (非特許文献２)などのヒト多能性幹細胞（hPSCs）を用いて、インビトロでヒト生殖細胞の発生を再構成することでブレークスルーが起きると言われている。【０００６】
多能性幹細胞（PSCs）からマウス生殖細胞系への誘導とその後の発生がインビトロで再現されている(非特許文献３および非特許文献４)。すなわち、基底状態の多能性を有するマウス（ｍ）ESCs/iPSCs (非特許文献５)が、前のう胚形成（pre-gastrulation）外胚葉様細胞 (EpiLCs)に誘導され、順に、遊走性PGCsに酷似するエピジェネティックな特性およびグローバルトランスクリプション（global transcription）を有するPGC様細胞(PGCLCs)へ誘導されることが、近年の研究より明らかとされている。驚くことに、このように誘導されたPGCLCsは、精子形成や卵子形成、および子孫を生じることの両方において高い能力を有し、これら事実は共にインビトロでのヒト生殖細胞の発生の再構成のための概念的枠組みを提案し、かつ、このような再構成は実現可能であることを示唆している。【０００７】
しかし、hESCs/iPSCsは、その遺伝子発現プロファイル、エピジェネティックな特性、サイトカイン依存性、および分化能の見地からmESCs/iPSCsとは異なり、マウス外胚葉幹細胞(epiblast stem cells (EpiSCs)）に類似した、多能性状態にあると考えられている(非特許文献６および非特許文献７)。このような状態は、後のう胚形成マウス外胚葉（post-gastrulation mouse epiblast）に似ており、生殖細胞分化に対する能力が限られていることを示す（非特許文献４）。したがって、hESCs/iPSCsが、ヒト生殖細胞運命へ効率的に誘導されるかいなかは不明であるが、hESCs/iPSCsのランダムな分化が生殖細胞様細胞を低効率で産生することが多数報告されている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Thomson JA, et al., Science. 282, 1145-1147, 1998
【非特許文献２】Takahashi K, et al.，Cell. 131, 861-872, 2007
【非特許文献３】Hayashi K, et al.，Science. 338, 971-975, 2012
【非特許文献４】Hayashi K, et al.，Cell. 146, 519-532, 2011
【非特許文献５】Ying QL, et al.，Nature. 453, 519-523, 2008
【非特許文献６】Brons IG, et al Nature. 448, 191-195, 2007
【非特許文献７】Tesar PJ, et al.，Nature. 448, 196-199, 2007
【非特許文献８】Hayashi Y, et al.，Fertil Steril. 97, 1250-1259, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、高効率で高い再現性を有する、ヒト多能性幹細胞からヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞を誘導する方法を提供し、それによりin vitroにおいて、ESC及びiPSCを含む多能性幹細胞からの生殖細胞分化決定経路の機能的再構成を達成することである。本発明の別の目的は、ヒトPGC様細胞を特定するための細胞表面マーカーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ヒト多能性幹細胞からヒトPGC様細胞への分化誘導は、マウスと同様のHayashi K, et al.，Cell. 146, 519-532, 2011に記載の方法で行うことができるものと考えられた。しかし、本発明者らは、当該方法を用いたところ、死細胞が多く発生し、誘導効率が大変低いことを発見した。【００１１】
そこで、本発明者らは、より効率よくヒトPGC様細胞を誘導するという目的を達成するために、ヒト多能性幹細胞をアクチビンAおよびGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養し、中胚葉様細胞を誘導し、当該中胚葉様細胞をマウスPGC様細胞の誘導条件に供したところ、驚くべきことに、PGC様細胞の誘導効率が上がり、死細胞の発生が抑えられることを見出した。【００１２】
さらに、本発明者らは、ヒトPGC様細胞を同定するための細胞表面マーカーとして、PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子を見出し、これらの発見に基づきさらに研究を進め、本発明を完成させた。【００１３】
すなわち、本発明は以下に関する：
［１］  ヒト多能性幹細胞からヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞を製造する方法であって、以下の工程I）及びII）を含む、方法：
I）ヒト多能性幹細胞を、アクチビンAおよびGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養することにより中胚葉様細胞を製造する工程、
II）工程I）で得られた中胚葉様細胞を、BMPを含む培養液中で培養する工程。
［２］  前記工程I）の培養を60時間未満実施する、［1］に記載の方法。
［３］  前記工程I）の培養を42時間実施する、［2］記載の方法。
［４］  前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、［1］に記載の方法。
［５］  前記工程I）において、培養液が線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）阻害剤をさらに含む、［1］から［4］のいずれか1項に記載の方法。
［６］  前記FGFR阻害剤が、PD173074である、［5］に記載の方法。
［７］  前記工程I）において、培養液がbFGFおよびBMPを含まない、［1］から［6］のいずれか1項に記載の方法。
［８］  前記工程II）において、培養液が、SCF、EGFおよびLIFから成る群より選択される少なくとも一つのサイトカインをさらに含む、［1］から［7］のいずれか1項に記載の方法。
［９］  前記多能性幹細胞が、無血清及び無フィーダー条件下で培養された多能性幹細胞である、［1］から［8］のいずれか1項に記載の方法。
［１０］  前記無フィーダー条件下での培養が、ラミニン５１１またはラミニン５１１断片上での培養である、［9］に記載の方法。
［１１］  さらに、III）前記工程II）で得られた細胞から、PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーが陽性である細胞を選択する工程を含む、［1］から［10］のいずれか1項に記載の方法。
［１２］  前記工程III）が、INTEGRINα6 (CD49f)及びEpCAMの二重陽性細胞を選択する工程である、［11］に記載の方法。
［１３］  前記ヒト多能性幹細胞が、ヒトiPS細胞である、［1］から［12］のいずれか1項に記載の方法。
［１４］  ［1］から［13］のいずれか1項に記載の方法により製造される、ヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞を含む細胞集団。
［１５］  PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーが陽性である細胞を選択することを含む、ヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞の選別方法。
［１６］  前記選択が、INTEGRINα6 (CD49f)及びEpCAMの二重陽性細胞を選択することによって行われる、［15］に記載の方法。
［１７］  以下の（1）及び（2）を含む、ヒト多能性幹細胞からヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞への分化誘導用試薬キット：
（1）アクチビンAおよびGSK3β阻害剤を含む、ヒト多能性幹細胞から中胚葉様細胞への誘導用試薬、
（2）BMPを含む、中胚葉様細胞からヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞への誘導用試薬。
［１８］  前記GSK3β阻害剤が、CHIR99021である、［17］に記載のキット。
［１９］  前記（1）の誘導用試薬が、線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）阻害剤をさらに含む、［17］または［18］に記載のキット。
［２０］  前記FGFR阻害剤が、PD173074である、［19］に記載のキット。
［２１］  前記（2）の誘導用試薬が、SCF、EGFおよびLIFから成る群より選択される少なくとも一つのサイトカインをさらに含む、［17］から［20］のいずれか1項に記載のキット。
［２２］  さらに、（3）PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つの細胞表面マーカーの各々に対する抗体を含む、ヒト始原生殖細胞様（PGC様）細胞の単離用試薬を含む、［17］から［21］のいずれか1項に記載のキット。
［２３］  前記（3）の単離用試薬が、INTEGRINα6 (CD49f)に対する抗体及びEpCAMに対する抗体を含む、［22］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１４】
ヒト多能性幹細胞をアクチビンAおよびGSK3β阻害剤を含む培養液中で培養し、中胚葉様細胞を誘導した後、マウスPGC様細胞の誘導条件下で培養すると、ヒトPGC様細胞の誘導効率が上がり、死細胞の発生が抑えられるので、ヒト多能性幹細胞から高効率にかつ再現性よくヒトPGC様細胞を誘導することができる。また、本発明により同定された細胞表面マーカーを指標として、細胞集団から効率よくヒトPGC様細胞を単離精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、hiPSCsからのBTAG(+)細胞の直接誘導の結果を示す。図１Aは、 BTAG 585B1-868 hiPSCsの明視野像（左図）、およびOCT3/4、SOX2、NANOG、TRA-1-60およびSSEA-4の発現をFACS測定した結果を示す（右図）。図１Bは、hiPSCsからBTAG(+)細胞を直接誘導するスキームの概要図を示す。図１Cは、BMP4、SCF、EGFおよびLIFによって刺激されたhiPSCsの浮遊凝集の明視野像(BF)および蛍光像(AGおよびBT)を示し（左図）、サイトカインを添加しない条件下でのhiPSCsの浮遊凝集の明視野像(BF)および蛍光像(AGおよびBT)を示す（右図）。図１Dは、BMP4、SCF、EGFおよびLIFによってhiPSCsから直接誘導される間の8日目までのBTAGの発現をFACS解析した結果を示し（左図）、サイトカインを添加しない条件下でhiPSCsの8日目までのBTAGの発現をFACS解析した結果を示す（右図）。図中数字は、BTAG(+)細胞の含有率を示す。図１Eは、凝集塊毎のBTAG(+)細胞の数をプロットした結果を示す。平均を水平線で示し、25から75までの百分位数をボックスで示し、2回の結果の最大値および最小値をエラーバーで示す。図１Fは、BTAG(+)細胞の誘導時（hiPSCs、誘導2日目（day2）および誘導6日目（day6））における遺伝子発現をQ-PCRで測定した結果を示す。各遺伝子の発現量は、Arbp(attachment region binding protein)およびPpia(peptidylprolyl Isomerase A)の2つのハウスキーピング遺伝子の平均CT値からのΔCTで示す。
【図２】図２は、中胚葉様細胞（iMeLCs）を経由したhiPSCsからBTAG(+)細胞の誘導の結果を示す。図２Aは、iMeLCsを経由したBTAG(+)細胞の誘導スキームの概要図を示す。図２Bは、hiPSCs （左図）およびiMeLCs（右図）の位相差顕微鏡像を示す。図２Cは、誘導42時間目のiMeLCsにおけるOCT3/4、SOX2およびNANOGの発現をFACSで測定した結果を示す。図２Dは、BMP4、SCF、EGFおよびLIFによって刺激されたhiPSCsの浮遊凝集の各誘導日数（2日目、4日目、6日目および8日目）での明視野像(BF)および蛍光像(AGおよびBT)を示し（左図）、ならびにサイトカインを添加しない条件下でのhiPSCsの浮遊凝集の明視野像(BF)および蛍光像(AGおよびBT)を示す（右図）。図２Eは、BMP4、SCF、EGFおよびLIFによって刺激されたiMeLCsの凝集（上図）、ならびにサイトカインを添加しない条件下（下図）におけるBTAG陽性細胞をFACSで測定した結果を示す。図中数字は、BTAG(+)細胞の含有率を示す。図２Fは、BTAG(+)細胞の含有率（左図）および凝集塊毎のBTAG(+)細胞の数（右図）をプロットした結果を示す。平均を水平線で示し、25から75までの百分位数をボックスで示し、2回の結果の最大値および最小値をエラーバーで示す。図２Gは、BTAG(+)細胞の誘導時（hiPSCs、iMeLCs、誘導2日目（day2）、誘導4日目（day4）、誘導6日目（day6）および誘導8日目（day8））における遺伝子発現をQ-PCRで測定した結果を示す。各遺伝子の発現量は、ArbpおよびPpiaの2つのハウスキーピング遺伝子の平均CT値からのΔCTで示す。図２Hは、誘導4日目のBTAG(+)細胞におけるOCT3/4、SOX2およびNANOGの発現をFACSで測定した結果を示す。図２Iは、誘導8日目のBTAG(+)PGCLCs（始原生殖様細胞）（中央図eGFP）におけるBLIMP1、TFAP2C、SOX2およびSOX17の蛍光染色像（右図）を示す。右図中、破線は、中央図におけるBTAG(+)PGCLCsを示す。
【図３】図３は、BTAG(+)細胞がhPGCLCsであることの検討結果を示す。図３Aは、hiPSCs、iMeLCs、BTAG(+)細胞（iMeLCsから誘導2日目(d 2)、誘導4日目(d 4)、誘導6日目(d 6)および誘導8日目(d 8)）およびhiPSCsから直接誘導したBTAG(+)細胞（BTAG+d6）のトランスクリプトームのクラスター解析結果を示す。図３Bは、hiPSCs、iMeLCsおよびBTAG(+)細胞（iMeLCsから誘導2日目(d2 BTAG+)および誘導4日目(d4 BTAG+)）の誘導時のPCA解析結果を示す。図３Cは、cyESCs (CMK9)およびcyPGCs間で上方変化する遺伝子または下方変化する遺伝子を各細胞間の発現比較においてプロットした結果（左図）および当該遺伝子の頻度分布のグラフ（右図）を示す。図３Dは、BTAG(+)陽性細胞誘導時ならびにcyESCs (CMK9)およびcyPGCs (PGCd43、PGCd50およびPGCd51)の細胞種の遺伝子発現に基づくクラスター解析結果を示す。図３Eは、hPGCsおよびH9 ESCs間の発現変化遺伝子（DEG）をd6 BTAG(+) 細胞及びiMeLCsにおいてプロットした結果（上図）および当該遺伝子の頻度分布のグラフ（下図）を示す。図３Fは、BTAG(+)陽性細胞誘導時ならびにESCおよびPGCの遺伝子発現に基づくクラスター解析結果を示す。図３Gは、誘導前の細胞とd4 TNAP/NANOS3(+)細胞間においてlog2倍変化する遺伝子に対してiMeLCsとd4 BTAG(+)細胞間においてlog2倍変化する遺伝子をプロットした散布図（上図）、iMeLCsとd4 BTAG(+)細胞間においてlog2倍変化する遺伝子に対して誘導前の細胞とd4 TNAP/NANOS3(+)細胞間においてlog2倍変化する遺伝子プロットした散布図（下図）を示す。
【図４】図４は、hPGCLCsの誘導経路を検討した結果を示す。図４Aは、ヒト（左図）およびマウス（右図）の主要段階にある細胞間において発現上昇および下降する遺伝子の数を測定した結果を示す。図４Bは、図４Aの細胞間の遺伝子オントロジー(GO)解析の結果を示す。図４Cは、ヒト（左図）およびマウス（右図）のPGCLC間の各細胞型において高い発現を示す遺伝子の数を測定した結果を示す。図４Dは、図４Cの細胞間の遺伝子オントロジー (GO)解析の結果を示す。図４Eは、図４Cで示したヒトおよびマウスのd2 PGCLC遺伝子の重なりを示すベン図を示す。図４Fおよび図４Gは、各ヒト細胞（左図）および各マウス細胞（右図）におけるヒトd2 PGCLC遺伝子（図４F）およびマウスd2 PGCLC遺伝子（図４G）の発現をプロットした結果を示す。平均を水平線で示し、25から75までの百分位数をボックスで示し、2回の結果の最大値および最小値をエラーバーで示す。図４Hは、マウス原始多能性およびエピブラストに関連する遺伝子（左図）ならびにmesodermおよびendodermに関連する遺伝子（右図）のmESCs、mEpiLCs、mEpiSCs、hiPSCsおよびiMeLCsにおける発現のヒートマップを示す。遺伝子発現データはマイクロアレイ解析およびRNA-seqによって得られた。
【図５】図５は、hPGCLCsの表面マーカーの解析結果を示す。図５Aは、hiPSCsからiMeLCsを経由した誘導6日目の凝集塊におけるEpCAMおよびINTEGRINα6の発現をFACSで解析した結果を示す。図５Bは、hiPSCsからiMeLCsを経由した誘導8日目までの凝集塊におけるEpCAMおよびINTEGRINα6の発現をFACSで解析した結果（上図）を示す。図中Fullは、BMP4、LIF、SCFおよびEGFでの誘導結果を示し、No cytokineは、サイトカインを添加しない条件下での誘導結果を示す。下図は、各条件でのゲート（P3およびP5）におけるBTAG(+)細胞の含有率を測定した結果を示す。図５Cは、585A1 hiPSCs（BTおよびAGをノックインしていない細胞）からhPGCLCを経由した誘導6日目までの凝集塊におけるEpCAMおよびINTEGRINα6の発現をFACSで解析した結果を示す。図中Fullは、BMP4、LIF、SCFおよびEGFでの誘導結果を示し、No cytokineは、サイトカインを添加しない条件下での誘導結果を示す。図５Dは、hiPSCs、iMeLCs、iMeLCsを経由して誘導したBTAG(+)細胞(day 2、day 4、day 6およびday 8)および585A1 hiPSCsからiMeLCsを経由して誘導したEpCAMおよびINTEGRINα6の高発現細胞（6日目）のトランスクリプトームをクラスター解析した結果を示す。図５Eは、1383D2（左図）及び1383D6（右図）からFGFRiを用いて誘導したiMeLCsを経由して誘導した6日目の凝集塊におけるEpCAMおよびINTEGRINα6の発現をFACSで解析した結果を示す（上図）。中央図および下図は、201B7からFGFRiを用いず誘導したiMeLCs（中央図）またはFGFRiを用いて誘導したiMeLCs（下図）を経由して誘導した4日目の凝集塊におけるEpCAMおよびINTEGRINα6の発現をFACSで解析した結果を示す。
【図６】図６は、hPGCLCsにおけるBLIMP1の重要性を示す結果である。図６Aは、BLIMP1に対するターゲティングベクターの構築図を示す。図６Bは、hiPSCs（BLIMP1+/+細胞（1-7,または1-9）またはBTAG-/-細胞（1-7-5または1-9-6））からiMeLCsを経て誘導したhPGCLCsにおけるAGおよびBLIMP1の発現の免疫染色図を示す。下図における破線は、AG陽性細胞の位置を示す。図６Cは、野生型（左図）、BLIMP1+/-（中央図）またはBLIMP1-/-（右図）からiMeLCsを介して誘導した細胞凝集塊（2日目、4日目および6日目）における明視野像（BF）および蛍光像（AGおよびBT）を示す。図６Dは、野生型（上図）、BLIMP1+/-（中央図）またはBLIMP1-/-（下図）からiMeLCsを介して誘導した細胞凝集塊（2日目、4日目、6日目および8日目）、hiPSCsおよびiMeLCsのAG陽性細胞の含有率をFACS解析した結果を示す。図６Eは、野生型（wt）、BLIMP1+/-（het）またはBLIMP1-/-（ko）からiMeLCsを介して誘導した細胞凝集塊におけるAG陽性細胞の含有数を示す。図６Fは、野生型（wt）またはBLIMP1-/-（ko）からiMeLCsを介して誘導2日目または4日目のAG陽性細胞における各遺伝子の発現をQ-PCR測定した結果を示す。
【図７】図７は、ニューロン分化におけるBLIMP1の役割を検討した結果を示す。図７Aは、hiPSCs（野生型（wt）、BLIMP1+/-（het）またはBLIMP1-/-（ko））および当該hiPSCsからの誘導2日目および4日目のAG陽性細胞におけるトランスクリプトームのクラスター解析結果を示す。図７Bは、図７AにおけるPCA解析結果を示す。図７Cは、BLIMP1-/- hiPSCsおよび誘導2日目および4日目のAG陽性細胞において野生型と比べて発現が上昇または下降した遺伝子の数を示す。図７Dは、図７Cで示した遺伝子のオントロジー(GO)解析の結果を示す。図７Eは、図７Cの各細胞における上昇した遺伝子（左図）および下降した遺伝子（右図）の発現をプロットした結果を示す。平均を水平線で示し、25から75までの百分位数をボックスで示し、2回の結果の最大値および最小値をエラーバーで示す。図７Fは、hiPSCsとd2およびd4 hPGCLCsで発現変化があった遺伝子のうちニューロン分化に関する遺伝子の変化を示す。
【図８】図８は、BTAG-Knockin hiPSCsの作成を示す。図８Aは、TFAP2C（左図）またはBLIMP1（右図）に対するTALENのSingle-strand annealing (SSA)活性を示す。図８Bは、BLIMP1およびTFAP2C座位の模式図およびノックインストラテジーの模式図を示す。図８Cは、BLIMP1-2A-tdTomato（上図）およびTFAP2C-2A-EGFP （下図）の相同組換えの可否についてPCRでスクリーニングした結果を示す。図８Dは、585A1、585B1およびBTAG 585B1-868 hiPSCsの核型解析結果を示す。図８Eは、BLIMP1-2A-tdTomato (上２図)及びTFAP2C-2A-EGFP（下図）の蛍光染色像を示す。図８Fは、BTAG(+)細胞誘導時に、BMP4、LIF、SCFおよびEGFを用いた場合、LIFのみを用いた場合、および各濃度のKSRを用いた場合の細胞凝集あたりのBTAG(+)細胞の含有率をFACSで測定した結果を示す。
【図９】図９は、iMeLCsの誘導とその性質を解析した結果を示す。図９Aは、iMeLCsを経て誘導されたBTAG(+)細胞(day 4)または直接誘導されたBTAG(+)細胞(day 6)の明視野像、蛍光像およびFACS解析の結果を示す。図９Bは、iMeLCsの誘導時のFACS解析の結果（上図）および細胞数の計測結果（下図）を示す。図９Cは、hiPSCsからiMeLCsの誘導時の各遺伝子をQ-PCRで測定した結果を示す。
【図１０】図１０は、iMeLCの誘導方法を検討した結果を示す。図１０Aから１０Eは、hiPSCsからiMeLCの誘導時のアクチビンA(ACTA)（図１０A）、Wnt3A（図１０B）、CHIR99021（図１０C）、BMP4（図１０D）またはbFGF（図１０E）の濃度を変化させた際のBTAG(+)細胞の含有率をFACSで測定した結果を示す。図１０Fは、hiPSCsをACTAおよびCHIR99021、ACTAのみ、CHIR99021のみまたはいずれも添加せずに誘導した42時間後の細胞の位相差顕微鏡像を示す。図１０Gは、FGFR阻害剤（FGFRi）を用いた場合のBTAG(+)細胞の明視野像、蛍光像および細胞数を測定した結果を示す。図１０Hは、FGFR阻害剤（FGFRi）を用いた場合のBTAG(+)細胞の各遺伝子の発現をQ-PCRで測定した結果を示す。
【図１１】図１１は、BTAG(+)細胞誘導に必要なシグナルを検討した結果を示す。図１１Aから図１１Dは、BMP4の濃度、LDN193189の添加濃度、BMP類（BMP2、BMP4、BMP7およびBMP8a）の添加、またはBMP4、LIF、SCFおよびEGFの組み合わせを変化させた際のBTAG(+)細胞の明視野像、蛍光像およびFACS解析結果を示す。図１１Eは、BTAG(+)細胞の12日目までの各遺伝子変化を示す。
【図１２】図１２は、cyPGCsおよびcyESCsの比較、ならびにマウス多能性幹細胞およびヒト多能性幹細胞の比較結果を示す。図１２Aは、カニクイサルの生殖腺におけるOCT3/4、BLIMP1、TFAP2CおよびDDX4の発現を免疫染色法で測定した結果を示す。図１２Bは、カニクイサルの生殖腺におけるPPIA、POU5F1、NANOG、PRDM1およびTFAP2Cの発現をシングルセルQ-PCRで測定した結果を示す。図１２Cは、cyESCsの位相差顕微鏡像を示す。図１２Dは、cyESCsにおけるPPIA、POU5F1、NANOG、PRDM14、GATA4およびTの発現をシングルセルQ-PCRで測定した結果を示す。図１２Eは、 cyESCおよびcyPGCsのPCA解析結果を示す。図１２Fは、ヒト（左図）およびマウス（右図）のPGCLC誘導時におけるHOX遺伝子の発現抑制のヒートマップを示す図１２Gは、mESCs、EpiLCsおよびEpiSCsにおける遺伝子発現によるクラスター解析結果を示す。図１２Hは、図１２Gの遺伝子の４つのクラスターの発現を測定した結果を示す。
【図１３】図１３は、hPGCLCsのエピジェネティック解析結果を示す。図１３Aは、H3K9me2、H3K27me3および5mCの染色像および当該蛍光強度の細胞分布図を示す。図１３Bは、H19、MEG3、KCNQ1およびPEG10のCpGメチル化の割合を示す。図１３Cは、hPGCLC誘導時、cyESCsおよび生殖腺PGCsにおける各遺伝子の発現をRNA-seq法で解析した結果を示す。
【図１４】図１４は、BLIMP1ノックアウト細胞株の作製結果を示す。図１４Aは、BLIMP1のエクソン４をターゲティングする際のTALENのSSA活性を示す。図１４Bは、TFAP2C-2A-EGFP（上図）、BLIMP1-exon4-2A-tdTomato（中央図）の相同組換えの可否およびターゲティングベクターのPCR解析結果を示す。図１４Cは、BLIMP1-/- (ko)細胞に対するBLIMP1+/+ (wt) 細胞(左図)ならびに d2 BTAG(+)細胞 (中央図)及びd4 BTAG(+)細胞（右図）のRNA-seqによる発現比較を行った散布図を示す。図１４Dは、BLIMP1+/+ (wt)細胞、BLIMP1+/- (het) 細胞およびBLIMP1-/- (ko)細胞から誘導したhPGCLCのエピジェネティック関連遺伝子の発現変動を示す。図１４Eは、BLIMP1+/+ (wt)またはBLIMP1-/- (ko)の hiPSCsと当該細胞から誘導されたd2およびd4 hPGCLCsで発現変化があった遺伝子のうちニューロン分化に関する遺伝子の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ヒト多能性幹細胞から中胚葉様細胞を製造する方法であって、前記ヒト多能性幹細胞をアクチビンAおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ（GSK）3β阻害剤を添加した培養液中で培養する方法を提供する。
【００１７】
出発材料として使用するヒト多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己複製能」と、三つの一次胚葉すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞であればいずれでもよい。例えば、iPS細胞、ES細胞、胚性生殖（EG）細胞、胚性癌（EC）細胞などが挙げられるが、好ましくはiPS細胞又はES細胞である。
【００１８】
（1）ヒト多能性幹細胞の作製
（i）ES細胞
多能性幹細胞は自体公知の方法により取得することができる。例えば、ES細胞の作製方法としては、哺乳動物の胚盤胞ステージにおける内部細胞塊を培養する方法（Thomson JA, et al., Science. 282, 1145-1147, 1998）が挙げられるが、これらに限定されない。また、ES細胞は、所定の機関より入手でき、さらには市販品を購入することもできる。例えば、ヒトES細胞株であるH1及びH9は、ウィスコンシン大学のWiCell Instituteより入手可能であり、KhES−1、KhES−2及びKhES−3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
【００１９】
（ii）iPS細胞
iPS細胞は、体細胞に核初期化物質を導入することにより作製することができる。
【００２０】
（a）体細胞ソース
iPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、及びそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、例えば、脂肪由来間質（幹）細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
【００２１】
哺乳動物から分離した体細胞は、細胞の種類に応じて、その培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5〜20％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。核初期化物質及びiPS細胞の樹立効率改善物質と細胞との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、予め無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。
【００２２】
（b）核初期化物質
本発明において「核初期化物質」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質（群）であれば、タンパク性因子又はそれをコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。核初期化物質がタンパク性因子又はそれをコードする核酸の場合、好ましくは以下の組み合わせが例示される（以下においては、タンパク性因子の名称のみを記載する）。
（1）Oct3／4、Klf4、c−Myc
（2）Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2（ここで、Sox2はSox1、Sox3、Sox15、Sox17又はSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1、Klf2又はKlf5で置換可能である。さらに、c−MycはT58A（活性型変異体）、N−Myc又はL−Mycで置換可能である。）
（3）Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2、Fbx15、Nanog、Eras、ECAT15−2、TclI、β−catenin（活性型変異体S33Y）
（4）Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、SV40 Large T antigen（以下、SV40LT）
（5）Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、HPV16 E6
（6）Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、HPV16 E7
（7）Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、HPV16 E6、HPV16 E7
（8）Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2、TERT、Bmi1
（上記因子のさらなる情報については、WO2007／069666を参照（但し、上記（2）の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1若しくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101−106（2008）を参照）。「Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2」の組み合わせについては、Cell,126, 663−676（2006）、Cell, 131, 861−872（2007）等も参照。「Oct3／4、Klf2（又はKlf5）、c−Myc、Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197−203（2009）も参照。「Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2、hTERT、SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141−146（2008）も参照。）
（9）Oct3／4、Klf4、Sox2（Nature Biotechnology, 26, 101−106（2008）を参照）
（10）Oct3／4、Sox2、Nanog、Lin28（Science, 318, 1917−1920（2007）を参照）
（11）Oct3／4、Sox2、Nanog、Lin28、hTERT、SV40LT（Stem Cells, 26, 1998−2005（2008）を参照）
（12）Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2、Nanog、Lin28（Cell Research（2008）600−603を参照）
（13）Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2、SV40LT（Stem Cells, 26, 1998−2005（2008）も参照）
（14）Oct3／4、Klf4（Nature 454:646−650（2008）、Cell Stem Cell, 2:525−528（2008）を参照）
（15）Oct3／4、c−Myc（Nature 454:646−650（2008）を参照）
（16）Oct3／4、Sox2（Nature, 451, 141−146（2008）、WO2008／118820を参照）
（17）Oct3／4、Sox2、Nanog（WO2008／118820を参照）
（18）Oct3／4、Sox2、Lin28（WO2008／118820を参照）
（19）Oct3／4、Sox2、c−Myc、Esrrb（ここで、EsrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197−203（2009）を参照）
（20）Oct3／4、Sox2、Esrrb（Nat. Cell Biol., 11, 197−203（2009）を参照）
（21）Oct3／4、Klf4、L−Myc
（22）Oct3／4、Nanog
（23）Oct3／4
（24）Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2、Nanog、Lin28、SV40LT（Science, 324：797−801（2009）を参照）
【００２３】
上記（1）〜（24）において、Oct3／4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6などを用いることもできる。また、Sox2（又はSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18）に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7などを用いることもできる。さらにLin28に代えて他のLinファミリーのメンバー、例えばLin28bなどを用いることもできる。
【００２４】
また、上記（1）〜（24）には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記（1）〜（24）のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
【００２５】
これらの組み合わせの中で、Oct3／4、Sox2、Klf4、c−Myc、Nanog、Lin28及びSV40LTから選択される少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が、好ましい核初期化物質である。
【００２６】
とりわけ、得られるiPS細胞を治療用途に用いることを念頭においた場合、Oct3／4、Sox2及びKlf4の3因子の組み合わせ（即ち、上記（9））が好ましい。一方、iPS細胞を治療用途に用いることを念頭に置かない場合（例えば、創薬スクリーニング等の研究ツールとして用いる場合など）は、Oct3／4、Sox2、Klf4及びc−Mycの4因子のほか、Oct3／4、Klf4、c−Myc、Sox2及びLin28の5因子か、それにNanogを加えた6因子（即ち、上記（12））、さらにSV40 Large T加えた7因子（即ち、上記（24））が好ましい。
【００２７】
さらに、上記におけるc−MycをL−Mycに変更した組み合わせも、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。
【００２８】
上記の各核初期化物質のマウス及びヒトcDNA配列情報は、WO2007／069666に記載のNCBIaccession numbersを参照することにより取得することができ（Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。尚、Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg及びL−Mycのマウス及びヒトcDNA配列情報は、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。）、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
【００２９】
遺伝子名 マウス ヒト
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
L−Myc NM_008506 NM_001033081
【００３０】
核初期化物質としてタンパク性因子を用いる場合には、得られたcDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入し、該培養細胞又はその馴化培地から組換えタンパク性因子を回収することにより調製することができる。一方、核初期化物質としてタンパク性因子をコードする核酸を用いる場合、得られたcDNAを、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター等に挿入して発現ベクターを構築し、核初期化工程に供される。
【００３１】
（c）核初期化物質の体細胞への導入方法
核初期化物質の体細胞への導入は、該物質がタンパク性因子である場合、自体公知の細胞へのタンパク質導入方法を用いて実施することができる。ヒトへの臨床応用を念頭におく場合、その出発材料たるiPS細胞も遺伝子操作なしに作製されたものであることが好ましい。
【００３２】
そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（PTD）若しくは細胞透過性ペプチド（CPP）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes）、Pro−JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE）及びProVectin（IMGENEX）、脂質をベースとしたProfect−1（Targeting Systems）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetrainPeptide（Q biogene）及びChariot Kit（Active Motif）、HVJエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。核初期化物質を適当な溶媒（例えば、PBS、HEPES等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で約5〜15分程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して37℃で1ないし数時間インキュベートする。その後培地を除去して血清含有培地に交換する。
【００３３】
PTDとしては、ショウジョウバエ由来のAntP、HIV由来のTAT（Frankel, A. et al, Cell55, 1189−93（1988）；Green, M. & Loewenstein, P.M. Cell 55, 1179−88（1988））、Penetratin（Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444−50（1994））、Buforin II（Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245−50（2000））、Transportan（Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67−77（1998））、MAP（model amphipathic peptide）（Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127−39（1998））、K−FGF（Lin, Y. Z. etal. J. Biol. Chem. 270, 14255−14258（1995））、Ku70（Sawada, M. et al. Nature CellBiol. 5, 352−7（2003））、Prion（Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85−90（2002））、pVEC（Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237−44（2001））、Pep−1（Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173−6（2001））、Pep−7（Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057−65（2002））、SynBl（Rousselle, C. et al. MoI. Pharmacol. 57, 679−86（2000））、HN−I（Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551−6（2000））、HSV由来のVP22等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。PTD由来のCPPとしては、11R（Cell Stem Cell, 4:381−384（2009））や9R（Cell Stem Cell, 4:472−476（2009））等のポリアルギニンが挙げられる。
【００３４】
核初期化物質のcDNAとPTD若しくはCPP配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して、ベクターを用いて組換え発現させる。融合タンパク質を回収して導入に用いる。導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
【００３５】
マイクロインジェクションは、先端径1μm程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。
【００３６】
iPS細胞の樹立効率を重視するのであれば、核初期化物質を、タンパク性因子自体としてではなく、それをコードする核酸の形態で用いることも好ましい。該核酸はDNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA／RNAキメラであってもよく、また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。好ましくは、該核酸は二本鎖DNA、特にcDNAである。
【００３７】
核初期化物質のcDNAは、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに挿入される。発現ベクターとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクター、動物細胞発現プラスミド（例、pA1−11、pXT1、pRc／CMV、pRc／RSV、pcDNAI／Neo）などが用いられ得る。
【００３８】
用いるベクターの種類は、得られるiPS細胞の用途に応じて適宜選択することができる。例えば、アデノウイルスベクター、プラスミドベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、エピソーマルベクターなどが使用され得る。
【００３９】
発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えば、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV−TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、EF1αプロモーター、CAGプロモーター、MoMuLV LTR、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
【００４０】
発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリA付加シグナル、選択マーカー遺伝子、SV40複製起点などを含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００４１】
核初期化物質である核酸（初期化遺伝子）は、各々別個の発現ベクター上に組み込んでもよいし、1つの発現ベクターに2種類以上、好ましくは2〜3種類の遺伝子を組み込んでもよい。遺伝子導入効率の高いレトロウイルスやレンチウイルスベクターを用いる場合は前者が、プラスミド、アデノウイルス、エピソーマルベクターなどを用いる場合は後者を選択することが好ましい。さらに、2種類以上の遺伝子を組み込んだ発現ベクターと、1遺伝子のみを組み込んだ別の発現ベクターとを併用することもできる。
【００４２】
上記において複数の初期化遺伝子を1つの発現ベクターに組み込む場合、これら複数の遺伝子は、好ましくはポリシストロニック発現を可能にする配列を介して発現ベクターに組み込むことができる。ポリシストロニック発現を可能にする配列を用いることにより、1種類の発現ベクターに組み込まれている複数の遺伝子をより効率的に発現させることが可能になる。ポリシストロニック発現を可能にする配列としては、例えば、口蹄疫ウイルスの2A配列（PLoS ONE 3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007）、IRES配列（U.S.Patent No. 4,937,190）などが挙げられ、好ましくは2A配列を用いることができる。
【００４３】
核初期化物質である核酸を含む発現ベクターは、ベクターの種類に応じて、自体公知の手法により細胞に導入することができる。例えば、ウイルスベクターの場合、該核酸を含むプラスミドを適当なパッケージング細胞（例、Plat−E細胞）や相補細胞株（例、293細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段がWO2007／69666、Cell, 126, 663−676（2006）及び Cell, 131, 861−872（2007）に開示されている。ベクターとしてレンチウイルスベクターを用いる場合については、Science, 318, 1917−1920（2007）に開示がある。iPS細胞から誘導されるPGC様細胞を不妊治療や生殖細胞の遺伝子治療などの再生医療として利用する場合、初期化遺伝子の発現（再活性化）は、iPS細胞由来のPGC様細胞から再生された生殖細胞又は生殖組織における発癌リスクを高める可能性があるので、核初期化物質をコードする核酸は細胞の染色体に組み込まれず、一過的に発現することが好ましい。かかる観点からは、染色体への取込みが稀なアデノウイルスベクターの使用が好ましい。アデノウイルスベクターを用いる具体的手段は、Science, 322, 945−949（2008）に開示されている。また、アデノ随伴ウイルスベクターも染色体への取込み頻度が低く、アデノウイルスベクターと比べて細胞毒性や炎症惹起作用が低いので、別の好ましいベクターとして挙げられる。センダイウイルスベクターは染色体外で安定に存在することができ、必要に応じてsiRNAにより分解除去することができるので、同様に好ましく利用され得る。センダイウイルスベクターについては、J. Biol. Chem., 282, 27383−27391（2007）や特許第3602058号に記載のものを用いることができる。
【００４４】
レトロウイルスベクターやレンチウイルスベクターを用いる場合は、いったん導入遺伝子のサイレンシングが起こったとしても、後に再活性化される可能性があるので、例えば、Cre／loxPシステムを用いて、不要となった時点で核初期化物質をコードする核酸を切り出す方法が好ましく用いられ得る。即ち、該核酸の両端にloxP配列を配置しておき、iPS細胞が誘導された後で、プラスミドベクター若しくはアデノウイルスベクターを用いて細胞にCreリコンビナーゼを作用させ、loxP配列に挟まれた領域を切り出すことができる。また、LTR U3領域のエンハンサー−プロモーター配列は、挿入突然変異によって近傍の宿主遺伝子を上方制御する可能性があるので、当該配列を欠失、若しくはSV40などのポリアデニル化配列で置換した3’−自己不活性化（SIN）LTRを使用して、切り出されずゲノム中に残存するloxP配列より外側のLTRによる内因性遺伝子の発現制御を回避することがより好ましい。Cre−loxPシステム及びSIN LTRを用いる具体的手段は、Chang et al., Stem Cells, 27：1042−1049（2009）に開示されている。
【００４５】
一方、非ウイルスベクターであるプラスミドベクターの場合には、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。ベクターとしてプラスミドを用いる具体的手段は、例えばScience, 322, 949−953（2008）等に記載されている。
【００４６】
プラスミドベクターやアデノウイルスベクター等を用いる場合、遺伝子導入は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができる。2種以上の発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類の発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合においても、導入操作は1回以上の任意の回数（例えば、1回以上10回以下、又は1回以上5回以下など）行うことができ、好ましくは導入操作を2回以上（たとえば3回又は4回）繰り返して行うことができる。
【００４７】
尚、アデノウイルスやプラスミドを用いる場合でも、導入遺伝子が染色体に組み込まれることがあるので、結局はサザンブロットやPCRにより染色体への遺伝子挿入がないことを確認する必要がある。そのため、上記Cre−loxPシステムのように、いったん染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、該遺伝子を除去する手段を用いることは好都合であり得る。別の好ましい一実施態様においては、トランスポゾンを用いて染色体に導入遺伝子を組み込んだ後に、プラスミドベクター若しくはアデノウイルスベクターを用いて細胞に転移酵素を作用させ、導入遺伝子を完全に染色体から除去する方法が用いられ得る。好ましいトランスポゾンとしては、例えば、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBac等が挙げられる。piggyBacトランスポゾンを用いる具体的手段は、Kaji, K. et al., Nature,458：771−775（2009）、Woltjen et al., Nature, 458：766−770（2009）に開示されている。
【００４８】
別の好ましい非組込み型ベクターとして、染色体外で自律複製可能なエピソーマルベクターが挙げられる。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、Yu et al., Science, 324, 797−801（2009）に開示されている。必要に応じて、エピソーマルベクターの複製に必要なベクター要素の5’側及び3’側にloxP配列を同方向に配置したエピソーマルベクターに初期化遺伝子を挿入した発現ベクターを構築し、これを体細胞に導入することもできる。
【００４９】
該エピソーマルベクターとしては、例えば、EBV、SV40等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA−1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40 large T antigen遺伝子が挙げられる。
【００５０】
また、エピソーマル発現ベクターは、初期化遺伝子の転写を制御するプロモーターを含む。該プロモーターとしては、前記と同様のプロモーターが用いられ得る。また、エピソーマル発現ベクターは、前記と同様に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子などをさらに含有していてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００５１】
エピソーマルベクターは、例えばリポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて該ベクターを細胞に導入することができる。具体的には、例えばScience, 324: 797−801 (2009)に記載される方法を用いることができる。
【００５２】
iPS細胞から初期化遺伝子の複製に必要なベクター要素が除去されたか否かの確認は、該ベクターの一部をプローブ又はプライマーとして用い、該iPS細胞から単離したエピソーム画分を鋳型としてサザンブロット分析又はPCR分析を行い、バンドの有無又は検出バンドの長さを調べることにより実施することができる。エピソーム画分の調製は当該分野で周知の方法を用いて行えばよく、例えば、Science, 324: 797−801 (2009)に記載される方法を用いることができる。
【００５３】
核初期化物質が低分子化合物である場合、該物質の体細胞への導入は、該物質を適当な濃度で水性若しくは非水性溶媒に溶解し、ヒト又はマウスより単離した体細胞の培養に適した培地（例えば、約5〜20％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI1640培地、199培地、F12培地など）中に、核初期化物質濃度が体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるように該物質溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化物質濃度は用いる核初期化物質の種類によって異なるが、約0.1 nM〜約100 nMの範囲で適宜選択される。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
【００５４】
（d）iPS細胞の樹立効率改善物質
従来iPS細胞の樹立効率が低いために、近年、その効率を改善する物質が種々提案されている。よって前記核初期化物質に加え、これら樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をより高めることが期待できる。
【００５５】
iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸（VPA）（Nat. Biotechnol., 26（7）：795−797（2008））、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNA及びshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（登録商標）（Millipore）、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1（OriGene）等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’−azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26（7）：795−797（2008））、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX−01294（Cell Stem Cell,2：525−528（2008））等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNA及びshRNA（例、G9a siRNA（human）（Santa Cruz Biotechnology）等）等の核酸性発現阻害剤など］、L−channel calcium agonist（例えばBayk8644）（Cell Stem Cell, 3, 568−574（2008））、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNA及びshRNA（Cell Stem Cell, 3, 475−479（2008））、UTF1（Cell Stem Cell, 3, 475−479（2008））、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132−135（2008））、2i／LIF（2iはmitogen−activated protein kinase signalling及びglycogen synthase kinase−3の阻害剤、PloS Biology, 6（10）, 2237−2247（2008））等が挙げられるが、それらに限定されない。前記で核酸性の発現阻害剤はsiRNA又はshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
【００５６】
尚、前記核初期化物質の構成要素のうち、例えばSV40 large T等は、体細胞の核初期化のために必須ではなく補助的な因子であるという点において、iPS細胞の樹立効率改善物質の範疇にも含まれ得る。核初期化の機序が明らかでない現状においては、核初期化に必須の因子以外の補助的な因子について、それらを核初期化物質として位置づけるか、あるいはiPS細胞の樹立効率改善物質として位置づけるかは便宜的であってもよい。即ち、体細胞の核初期化プロセスは、体細胞への核初期化物質及びiPS細胞の樹立効率改善物質の接触によって生じる全体的事象として捉えられるので、当業者にとって両者を必ずしも明確に区別する必要性はないであろう。
【００５７】
iPS細胞の樹立効率改善物質の体細胞への接触は、該物質が（a）タンパク性因子である場合、（b）該タンパク性因子をコードする核酸である場合、あるいは（c）低分子化合物である場合に応じて、それぞれ上記したように実施することができる。
【００５８】
iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、核初期化物質と同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。一実施態様において、例えば、核初期化物質がタンパク性因子をコードする核酸であり、iPS細胞の樹立効率改善物質が化学的阻害物質である場合には、前者は遺伝子導入処理からタンパク性因子を大量発現するまでに一定期間のラグがあるのに対し、後者は速やかに細胞に作用しうることから、遺伝子導入処理から一定期間細胞を培養した後に、iPS細胞の樹立効率改善物質を培地に添加することができる。別の実施態様において、例えば、核初期化物質とiPS細胞の樹立効率改善物質とがいずれもウイルスベクターやプラスミドベクターの形態で用いられる場合には、両者を同時に細胞に導入してもよい。
【００５９】
（e）培養条件による樹立効率の改善
体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5〜10％ CO2／95〜90％大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18％以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15％以下（例、14％以下、13％以下、12％以下、11％以下など）、10％以下（例、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下など）、又は5％以下（例、4％以下、3％以下、2％以下など）である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1％以上（例、0.2％以上、0.3％以上、0.4％以上など）、0.5％以上（例、0.6％以上、0.7％以上、0.8％以上、0.9％以上など）、又は1％以上（例、1.1％以上、1.2％以上、1.3％以上、1.4％以上など）である。
【００６０】
細胞の環境において低酸素状態を創出する手法は特に制限されないが、酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーター内で細胞を培養する方法が最も容易であり、好適な例として挙げられる。酸素濃度の調節可能なCO2インキュベーターは、種々の機器メーカーから販売されている（例えば、Thermo scientific社、池本理化学工業、十慈フィールド、和研薬株式会社などのメーカー製の低酸素培養用CO2インキュベーターを用いることができる）。
【００６１】
低酸素条件下で細胞培養を開始する時期は、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されない。開始時期は、体細胞への核初期化物質の接触より前であっても、後であってもよく、該接触と同時であってもよい。例えば、体細胞に核初期化物質を接触させた直後から、あるいは接触後一定期間（例えば、1ないし10（例、2、3、4、5、6、7、8又は9）日）おいた後に低酸素条件下で培養することが好ましい。
【００６２】
低酸素条件下で細胞を培養する期間も、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度（20％）の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、例えば3日以上、5日以上、7日以上又は10日以上で、50日以下、40日以下、35日以下又は30日以下の期間等が挙げられるが、それらに限定されない。低酸素条件下での好ましい培養期間は、雰囲気中の酸素濃度によっても変動し、当業者は用いる酸素濃度に応じて適宜当該培養期間を調整することができる。また、一実施態様において、iPS細胞の候補コロニーの選択を、薬剤耐性を指標にして行う場合には、薬剤選択を開始する迄に低酸素条件から正常酸素濃度に戻すことが好ましい。
【００６３】
さらに、低酸素条件下で細胞培養を開始する好ましい時期及び好ましい培養期間は、用いられる核初期化物質の種類、正常酸素濃度条件下でのiPS細胞樹立効率などによっても変動する。
【００６４】
核初期化物質（及びiPS細胞の樹立効率改善物質）を接触させた後、例えば、10〜15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12またはDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが含まれる。
【００６５】
培養法の例としては、例えば、37℃、5％ CO2存在下にて、10％FBS含有DMEMまたはDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30〜約45日またはそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
【００６６】
あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(例えば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日またはそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
【００６７】
iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Fbx15、Nanog、Oct3／4など、好ましくはNanog又はOct3／4）の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子及び／又はレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性及び／又はレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo（β−ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする）遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF（Takahashi & Yamanaka, Cell,126, 663−676（2006））、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF（Okita etal., Nature, 448, 313−317（2007））等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861−872（2007）に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。核初期化物質としてOct3／4、Klf4及びSox2の3因子を用いた場合、樹立クローン数は減少するものの生じるコロニーのほとんどがES細胞と比較して遜色のない高品質のiPS細胞であることから、レポーター細胞を用いなくとも効率よくiPS細胞を樹立することが可能である。
【００６８】
選択されたコロニーの細胞がiPS細胞であることの確認は、上記したNanog（若しくはOct3／4）レポーター陽性（ピューロマイシン耐性、GFP陽性など）及び目視によるES細胞様コロニーの形成によっても行い得るが、より正確性を期すために、各種ES細胞特異的遺伝子の発現を解析したり、選択された細胞をマウスに移植してテラトーマ形成を確認する等の試験を実施することもできる。
【００６９】
上述の方法で得られたヒト多能性幹細胞は、フィーダー細胞や血清を用いて培養することによって多様性が生じることから、限定された培養条件で培養することが望ましい。このような無血清及び無フィーダー条件として、例えば、Nakagawa M, et al.，Sci Rep. 4, 3594, 2014に記載の方法など、細胞外基質（例えば、ラミニン5（WO2009/123349）、ラミニン５断片（例えば、Laminin-5E8（ニッピ社））およびマトリゲル（BD社））上で、無血清培地（例えば、mTeSR（Stemcell Technology社）、Essential 8（Life Technologies社）およびStemFit（味の素社））を用いて培養する方法である。
【００７０】
（2）ヒト多能性幹細胞から中胚葉様細胞への分化誘導（工程I））
本工程I)で使用する分化誘導用の基本培地としては、例えば、Neurobasal培地、Neural Progenitor Basal培地、NS−A培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、最小必須培地（MEM）、Eagle MEM培地、αMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、DMEM／F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、及びこれらの混合培地などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。好ましくは、無血清培地が使用され得る。無血清培地（SFM）とは、未処理又は未精製の血清をいずれも含まない培地を意味し、従って、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含有する培地が挙げられ得る。血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS）、ヒト血清など）の濃度は、0〜20％、好ましくは0〜5％、より好ましくは0〜2％、最も好ましくは0％（すなわち、無血清）であり得る。SFMは任意の血清代替物を含んでよく、又は含まなくてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン、組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物等）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2−メルカプトエタノール、3’−チオグリセロールあるいはこれらの均等物などを適宜含有する物質が挙げられ得る。かかる血清代替物は、例えば、WO 98／30679に記載の方法により調製できる。また、より簡便にするため、市販のものを利用できる。かかる市販の物質としては、Knockout（商標）Serum Replacement（KSR）、Chemically−defined Lipid concentrated、及びGlutamax（Invitorogen）が挙げられる。
【００７２】
培地は、自体公知のその他の添加物を含んでもよい。本発明の方法により、原腸陥入前のエピブラスト細胞と同等の中胚葉様細胞が製造される限り、添加物は特に限定されないが、例えば、成長因子（例えば、インスリンなど）、ポリアミン類（例えば、プトレシンなど）、ミネラル（例えば、セレン酸ナトリウムなど）、糖類（例えば、グルコースなど）、有機酸（例えば、ピルビン酸、乳酸など）、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸（NEAA）、L−グルタミンなど）、還元剤（例えば、2−メルカプトエタノールなど）、ビタミン類（例えば、アスコルビン酸、d−ビオチンなど）、ステロイド（例えば、［ベータ］−エストラジオール、プロゲステロンなど）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシンなど）、緩衝剤（例えば、HEPESなど）、栄養添加物（例えば、B27 supplement、N2 supplement、StemPro−Nutrient Supplementなど）を挙げることができる。各添加物は自体公知の濃度範囲で含まれることが好ましい。
【００７３】
ヒト多能性幹細胞から中胚葉様細胞への分化誘導用培地は、基本培地にアクチビンAおよびGSK-3β阻害剤を必須の添加物として含有する。
【００７４】
本分化誘導用培地におけるアクチビンAの濃度は、例えば、約5 ng／ml以上、好ましくは約10 ng／ml以上、より好ましくは約15 ng／ml以上、また、例えば、約40ng／ml以下、好ましくは約30 ng／ml以下、より好ましくは25 ng／ml以下である。
【００７５】
本発明において、GSK-3β阻害剤は、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、GSK-3β阻害剤として最初に見出されたLithium chloride (LiCl)、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK-3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK-3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。
【００７６】
本工程I)で使用されるGSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
【００７７】
培地中におけるCHIR99021の濃度は、特に限定されないが、0.1μM〜50μMが好ましく、例えば、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μMまたはこれ以上の濃度であるが特にこれらに限定されない。好ましくは、GSK-3βの阻害のために通常使用される濃度である1μMよりも高い濃度が使用され、より好ましくは、3μM以上である。
【００７８】
培地には、後のPGC様細胞への誘導工程（工程II））を考慮すると、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）及び骨形成タンパク質（BMP）が含有されていないことが好ましい。
【００７９】
培地には、さらに線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）阻害剤が含有されていることが好ましい。
【００８０】
本発明において、FGFR阻害剤とは、FGF受容体とFGFとの結合を阻害するまたは、当該結合後に起こるシグナル伝達を阻害する薬剤であれば特に限定されないが、例えば、PD173074またはBGJ398が挙げられる。
【００８１】
PD173074を用いる場合、培地中における濃度は、特に限定されないが、1nM〜50nMが好ましく、例えば、1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、16nM、17nM、18nM、19nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM 、45nM、50nMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、25nMである。
【００８２】
培地には、KSRがさらに含有されていることが好ましい。KSRは、有効濃度範囲で存在する場合に中胚葉様細胞の誘導効率を顕著に増大させる。KSRの濃度は、例えば、５％、１０％、１５％、２０％またはそれ以上が例示される。より好ましくは、１５％である。
【００８３】
この培養において、ヒト多能性幹細胞を単一細胞へと分離するにあたり、アポトーシスを抑制させる目的で、培地には、ROCK阻害剤がさらに含有されていることが好ましい。ROCK阻害剤は、Rhoキナーゼ(ROCK)の機能を抑制できるものであれば特に限定されないが、例えば、Y-27632が本発明において好適に使用され得る。
【００８４】
培地中におけるY-27632の濃度は、特に限定されないが、1μM〜50μMが好ましく、例えば、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM 、45μM、50μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、10μMである。
【００８５】
多能性幹細胞を中胚葉様細胞に誘導するために使用される培養器は、特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられ得る。培養器は細胞接着性であり得る。細胞接着性の培養器は、培養器表面の細胞への接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ECM）などの任意の細胞接着用基質でコートされたものであり得る。細胞接着用基質は、多能性幹細胞又はフィーダー細胞（用いられる場合）の接着を目的とする任意の物質であり得る。細胞接着用基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−L−リジン、ポリ−D−リジン、ポリ−L−オルニチン、ラミニン、及びフィブロネクチン並びにそれらの混合物、例えばマトリゲル、並びに溶解細胞膜調製物（lysed cell membrane preparations）が挙げられる。より好ましくは、フィブロネクチンでコートされた培養器である。
【００８６】
この培養において、ヒト多能性幹細胞を上記培養器上に播き、例えば、約104〜105細胞／cm2、好ましくは約2〜6×104細胞／cm2の細胞密度とし、1〜10％ CO2／99〜90％大気の雰囲気下、インキュベーター中で約30〜40℃、好ましくは約37℃で、60時間未満、好ましくは42時間（例えば、±2時間の誤差は許容である）培養する。
【００８７】
中胚葉様細胞への分化の事実は、例えば、中胚葉様細胞及び／又は多能性幹細胞のマーカー遺伝子の発現レベルをRT−PCRにより分析することにより確認できる。中胚葉様細胞は、以下の特性のいずれか又は両方を有する細胞として定義される：
（1）分化誘導前の多能性幹細胞に比して、T、EOMES（Eomesodermin）、EVX1（Even-Skipped Homeobox 1）、SP5（Sp5 transcription factor）、MIXL1（Mix Paired-Like Homeobox 1）および NODALから選択される少なくとも1つの遺伝子発現の上昇、
（2）分化誘導前の多能性幹細胞に比して、POU5F1(POU domain, class 5, transcription factor 1)、NANOGおよびSOX2 (SRY (Sex Determining Region Y)-Box 2)から選択される少なくとも1つの遺伝子発現の低下。
【００８８】
上述のとおり、中胚葉様細胞への分化誘導用培地は、アクチビンA及びGSK３β阻害剤を含有する。従って、本発明はまた、アクチビンA及びGSK３β阻害剤を含む、多能性幹細胞から中胚葉様細胞への分化誘導用試薬キットも提供する。これらの成分は、水又は適当な緩衝液中に溶解した形態で提供されてもよく、凍結乾燥粉末として提供され、用時適当な溶媒に溶解して用いることもできる。また、これらの成分はそれぞれ単独の試薬としてキット化されていてもよいし、互いに悪影響を与えない限り、2種以上を混合して1つの試薬として提供することもできる。
【００８９】
（3）中胚葉様細胞からヒトPGC様細胞への分化誘導（工程II））
このようにして得られた中胚葉様細胞をBMPの存在下で培養することにより、PGC様細胞へと分化誘導することができる。従って、本発明の第二の側面は、上記（2）の方法により得られた中胚葉様細胞を介して、ヒト多能性幹細胞からヒトPGC様細胞を製造する方法に関する。従って、本発明のヒト多能性幹細胞からヒトPGC様細胞への分化誘導方法は、
I）上記（2）に記載のいずれかの方法に従ってヒト多能性幹細胞から中胚葉様細胞を製造する工程；及び
II）工程I）で得られた中胚葉様細胞をBMPの存在下で培養する工程
を含む。
【００９０】
工程II）でのヒトPGC様細胞の分化誘導用の基本培地としては、工程I）で使用するために例示した基本培地が同様に好ましく使用される。
【００９１】
培地は、血清含有培地又は無血清培地（SFM）であり得る。好ましくは、無血清培地が使用され得る。そのため培地には、KSRがさらに含有されていることが好ましい。KSRは、有効濃度範囲で存在する場合に中胚葉様細胞の誘導効率を顕著に増大させる。KSRの濃度は、例えば、５％、１０％、１５％、２０％またはそれ以上が例示される。より好ましくは、１５％である。
【００９２】
中胚葉様細胞からPGC様細胞への分化誘導用培地への必須添加物として用いられるBMPは、BMP2、BMP4、またはBMP7である。より好ましいBMPは、BMP 2またはBMP 4である。BMPの濃度は、例えば、約100 ng／ml以上、約200 ng／ml以上、約300 ng／ml以上、約400 ng／ml以上である。
【００９３】
ヒトPGC様細胞への分化誘導用培地には、さらに幹細胞因子（SCF）、上皮細胞増殖因子（EGF）および白血病阻止因子（LIF）から成る群より選択される少なくとも一つのサイトカインを添加物として含有させることが好ましい。
【００９４】
SCFの濃度は、例えば、約50 ng／ml以上、約100 ng／ml以上、約200 ng／ml以上、約300 ng／ml以上であり、より好ましくは、100 ng／mlである。
【００９５】
LIFの濃度は、例えば、約300 U／ml以上、約500 U／ml以上、約800 U／ml以上、または約1000 U／ml以上である。より好ましくは1,000 U／mlである。
【００９６】
SCFの濃度は、例えば、約30 ng／ml以上、約50 ng／ml以上、約80 ng／ml以上、約100 ng／ml以上であり、より好ましくは100 ng／mlである。
【００９７】
EGFの濃度は、例えば、約10 ng／ml以上、約20 ng／ml以上、約30 ng／ml以上、約40 ng／ml以上、約50 ng／ml以上であり、より好ましくは50 ng／mlである。
【００９８】
工程II）の培養において、中胚葉様細胞を単一細胞へと分離するにあたり、アポトーシスを抑制させる目的で、培地には、ROCK阻害剤がさらに含有されていることが好ましい。ROCK阻害剤は、上述と同じものが使用される。
【００９９】
この培養において、自体公知の細胞非接着性又は低接着性培養器に中胚葉様細胞を播種し、例えば、約1〜50×103細胞／cm2、好ましくは約5〜20×103細胞／mLの細胞密度とし、1〜10％ CO2／99〜90％大気の雰囲気中、インキュベーター中で約30〜40℃、好ましくは約37℃で、約4〜10日間、好ましくは4〜8日間、より好ましくは約6日間（例えば、144±12時間、好ましくは144±6時間）培養する。
【０１００】
PGC様細胞への分化の事実は、例えば、RT−PCRなどによりBLIMP1の発現を分析することによって確認できる。さらに必要に応じて、他の遺伝子や細胞表面抗原の発現を調べることもできる。他の遺伝子の例にはTFAP2Cが挙げられる。BLIMP1−及び／又はTFAP2C−プロモーターの制御下にある蛍光タンパク質遺伝子を有する多能性幹細胞を出発物質として使用する場合には、PGC様細胞への分化の事実はFACS分析により確認できる。ヒト又は他の非マウス哺乳動物に由来するESC又はiPSCなど、多能性幹細胞が適切なトランスジェニックレポーターを有さない場合には、PGC様細胞の分化の事実は、PGC様細胞に特異的に発現する1種以上の細胞表面抗原を用いて、FACS分析などにより確認することが好ましい。細胞表面抗原として、PECAM (CD31)、INTEGRINα6 (CD49f)、INTEGRINβ3(CD61)、KIT (CD117)、EpCAM、PODOPLANINおよび TRA1-81から成る群より選択される少なくとも一つのマーカー遺伝子が例示され、好ましくはINTEGRINα6 (CD49f)及びEpCAMが例示される。
【０１０１】
PGC様細胞を単離するために、工程III）として、前記工程II）で得られた細胞から上述の細胞表面抗原が陽性である細胞を選択する工程をさらに実施することが好ましい。
【０１０２】
PGC様細胞の単離は、自体公知の方法により行うことができる。例えば、PGC様細胞の単離は、上記に記載の細胞表面抗原に対する抗体を用いて、セルソーティングを行うことにより単離しても良い。
【０１０３】
上述のとおり、好ましい実施態様において、中胚葉様細胞からPGC様細胞への分化誘導用培地は、BMPを含有する。従って、本発明は、BMPを含む、中胚葉様細胞からPGC様細胞への分化誘導用試薬キットも提供する。これらの成分は、水又は適当な緩衝液中に溶解した形態で提供されてもよく、凍結乾燥粉末として提供され、用時適当な溶媒に溶解して用いることもできる。また、これらの成分はそれぞれ単独の試薬としてキット化されていてもよいし、互いに悪影響を与えない限り、2種以上を混合して1つの試薬として提供することもできる。
【０１０４】
PGC様細胞を単離することを想定して、当該分化誘導用試薬キットには、上述の細胞表面抗原に対する抗体が含まれても良い。
【０１０５】
（4）中胚葉様細胞を介した、多能性幹細胞に由来するPGC様細胞を含む細胞集団
本発明はまた、前記工程I）及びII）により製造される、多能性幹細胞に由来するPGC様細胞を含む細胞集団も提供する。該細胞集団は、PGC様細胞の精製された集団であることが好ましく、上述の工程III）を経ることで精製された細胞集団であることが好ましい。
【０１０６】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【０１０７】
実験方法
倫理ガイドライン
すべての動物実験は京都大学および滋賀医科大学の倫理ガイドラインにしたがって実施した。hiPSCsからhPGCLCsの誘導実験は、京都大学治験審査委員会（施設内倫理委員会）によって承認された。【０１０８】
hiPSCsの培養
hiPSC株（201B7，585A1，585B1）(Takahashi K, et al.，Cell. 131, 861-872, 2007およびOkita K, et al., Stem Cells. 31, 458-466, 2013)は、マイトマイシンC（MMC）処理SNLフィーダー細胞下で、従来法[20% (v/v) Knockout Serum Replacement(KSR; Life Technologies)、1% GlutaMax (Life Technologies)、0.1 mM 非必須アミノ酸、4 ng/ml 組換えヒトbFGF (Wako)、および0.1 mM ２−メルカプトエタノールを添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM/F12; Life Technologies)] で維持培養し、続いてフィーダーフリー条件[組換えラミニン５１１(rLN511E8) (iMatrix-511，Nippi)被覆細胞培養プレート上、StemFitTM( Ajinomoto，Tokyo，Japan) 培地]に順応させた(Nakagawa M, et al.，Sci Rep. 4, 3594, 2014)。継代培養および分化誘導に際し、細胞をシングルセルに分離するためTrypLE Select (Life Technologies)と0.5mM EDTA/PBSの１：１混合溶液で処理し、10 μMのROCKインヒビター(Y-27632;Wako Pure Chemical Industries)を播種後２４時間添加した。【０１０９】
BTAGノックインレポーター株の産生
BLIMP1-p2A-tdTomato（以下、BTという）またはTFAP2C-p2A-eGFP（以下、AGという） knockin hiPSC株を単離するためのドナーベクターの構築のため、BLIMP1のホモロジーアーム[left(5-prime)arm: 1148bp;right (3-prime)arm: 1192 bp]およびTFAP2Cのホモロジーアーム [left arm: 1144 bp; right arm:1162 bp]をPCRにて増幅し、pCR2.1 vector (TOPO TA Cloning; Life Technologies)へサブクローニングした。それぞれloxP部位が隣接したPGK-Neo カセットまたは PGK-Puroカセットを有するp2A-tdTomato フラグメントまたはp2A-eGFP フラグメントをPCR増幅し、GeneArt Seamless Cloning & Assembly Kit (Life Technologies)を使用してホモロジーアームを含有した上記記載のサブクローンベクターのBLIMP1コード配列または TFAP2Cコード配列の３’末端に挿入した。次に、MC1-DT-A-polyAカセットを制限酵素 NotI/XbaI または SacI/KpnIによって、それぞれBLIMP1-p2A-tdTomatoドナーベクターまたは TFAP2C-p2A-eGFPドナーベクターの右（３’）ホモロジーアームの下流に導入した。【０１１０】
BLIMP1 および TFAP2Cのストップコドンに隣接する配列をターゲットとするTALEN配列を、GoldenGate TALEN および TAL Effector kit (Addgene，#1000000016)を使用して作製した。TALENの RVD 配列を以下に記載する；
BLIMP1-1eft (5-prime)，NN NN NG NI HD HD NG NN NG NI NI NI NN NN NG HD NI NI NI;
BLIMP1-right (3-prime)，HD NG NG NI NI NN NN NI NG HD HD NI NG NG NN NN NG NG HD;
TFAP2C-left，NN NN NI NN NI NI NT HD NI HD NI NN NN NI NI NI NG;
TFAP2C-right，NI HD NG HD NG HD HD NG NI NI HD HD NG NG NG HD NG。【０１１１】
TALEN活性は、SSAアッセイによって評価した(図8A) (Sakuma T, et al., Genes Cells.18, 315-326, 2013)。本評価におけるコントロールとして、pGL4-SSA エンプティレポータープラスミド、pGL4-SSA-HPRT1 レポータープラスミド、および TALEN ペアーターゲティング ヒト HPRT1を使用した。【０１１２】
NEPA21 type II (Nepagene)を使用して、エレクトロポーレーションにより、BLIMP1-p2A-tdTomatoドナーベクターまたはTFAP2C-p2A-eGFPドナーベクター(5μg)およびTALENプラスミド(各2.5μg each)をhiPSCs (585A1または585B1)へ導入した。約１２日後にシングルコロニーを単離し、抽出ゲノムDNAに対するPCRにより、ターゲティングインテグレーションまたはランダムインテグレーションであるかを評価した。インデル変異を除外するため、目標とされていない対立遺伝子（Non-targeted alleles）をサンガーシークエンス法によってさらにスクリーニングした。BLIMP1 および TFAP2C 遺伝子座の両方を目標とする挿入を有する株に、PGK-Neo カセットおよび PGK-Puro カセットを除去するため、Creリコンビナーゼを発現するプラスミドをトランスフェクションした。【０１１３】
内胚葉または栄養外胚葉への分化誘導
BLIMP1-p2A-tdTomato ノックイン遺伝子座または TFAP2C-p2A-eGFPノックイン遺伝子座を有するhiPSCsは、内胚葉分化を目的として、2% B27 (Life Technologies)、100 ng/mlアクチビンA(Peprotech，#120-14)、および3μM CHIR99021 (Biovision，#1677-5)を含むRPMI1640 (Wako Pure Chemical Industries)中、iMatrix-511被覆プレートに播種して培養した。また、当該iPSCsは、栄養外胚葉への分化を目的として、10 ng/ml BMP4 を含むbFGF非含有StemFitTM(HumanZyme，#HZ-1078)中、iMatrix-511 (Nippi，892001)被覆プレートに播種して培養した。【０１１４】
BLIMP1-Knockin/knockout hiPSCsの産生
BLIMP1-p2A-tdTomato; BLIMP1-/- knockin/knockout hiPSC株を単離するドナーベクターの構築を目的として、BLIMP1 exon 4 [left (5-prime)arm: 1517 bp; right (3-prime)arm: 1446 bp]に隣接するホモロジーアームをPCRで増幅し、pCR2.1 vectorへサブクローンした。LoxP部位に隣接するPGK-Neoカセットを有する2A-tdTomato-SV40 polyAフラグメントをPCRで増幅し、続いて、GeneArt Seamless Cloning & Assembly Kitを用いて、イントロン４の付加的な30 bp配列を、エクソン４アナログの代わりに挿入した。次に、MC1-DT-A-polyAカセットを、制限酵素 XhoI と SacI を用いて、右(3’末端)ホモロジーアームの下流に導入した。【０１１５】
以下に示すRVD配列を有する、BLIMP1 exon 4をターゲットとするTALEN コンストラクトを上述の方法により産生した；
left (5-prime)，HD NI HD HD NI HD NG NG HD NI NG NG NN NI HD NN NN HD; 
right (3-prime)，NI NN HD NN HD NI NG HD HD NI NN NG NG NN HD NG NG NG。【０１１６】
TALEN活性は、SSAアッセイによって評価した(図14A)。BTAG; BLIMP1+/-および BTAG; BLIMP1-/-hiPSCs株の単離を目的として、前述のドナーベクター（5μg)およびTALENプラスミド(各2.5μg )をTFAP2C-p2A-eGFP (AG)ノックインhiPSC株へ導入した。ランダムインテグレーションを伴わないターゲティングの成功は、抽出ゲノムDNAに対するPCRにより評価した。ターゲティングされていない対立遺伝子は、フレームシフトインデル変異が存在する場合（BTAG; BLIMP1-/-)または不存在の場合(BTAG; BLIMP1+/-)を想定してサンガーシークエンス法によってさらに評価した。【０１１７】
核型分類とGバンド解析
hiPSCsを100 ng/mlデメコルチン含有培地で8時間インキュベートした。アキュターゼ(Sigma-Aldrich)によって分離した後、細胞をあらかじめ温めた低張緩衝液(Genial Genetics，GGS-JL006b)で処理し、37℃で30分間インキュベートした。続いて細胞をカーノイズ溶液（メタノールと酢酸の３：１混合液）で固定し、水に浸した紙シート上のガラススライドに滴下した。DAPI染色によって蛍光された染色体を数えることによって核型を決定した。Gバンド解析は株式会社日本遺伝子研究所(Sendai，Japan)によって行われた。【０１１８】
iMeLCs および hPGCLCsの誘導
初期中胚葉様細胞(iMeLCs)は、StemFitTMで維持されたhiPSCsを、50 ng/ml アクチビンA，3 μM of CHIR99021 および 10 μM ROCK 阻害剤 (Y-27632; Wako Pure Chemical Industries)を含有するGK15培地[15% KSR， 0.1 mM NEAA， 2 mM L-glutamine，1 mM sodium pyruvate および 0.1 mM 2-メルカプトエタノールを含むGMEM (Life Technologies)] 中で、ヒトプラズマフィブロネクチン(Millipore，FC010)で被覆した12ウエルプレートに1ウエルあたり1.0-2.0x 105個播種して誘導した。1000 U/m1 LlF (Millipore，#LIF1005)，200 ng/ml BMP4，100 ng/ml SCF (R&D Systems，455-MC)，50 ng/ml EGF (R&D Systems，236-EG)、および 10μM ROCK 阻害剤を添加したGK15中で、low-cell-binding V-bottom96ウエルプレート(Thermo，81100574)に1ウエルあたり3.0 x 103個播種して誘導した。条件検討のため、iMeLCs または hPGCLC誘導のために、それぞれPD173074 (StemGent，#04-0008)または LDN193189 (StemGent，#04-0074)を添加した。このほかにも、CHIR99021に代えてWNT3A(R&D Systems，5036-WN)を、BMP4に代えてBMP2 (R&D Systems，355-BM)、BMP7 (R&D Systems，354-BP)、または BMP8A( R&D Systems，1073-BP)を使用した。【０１１９】
FACS解析
hPGCLCsを含む浮遊集合体を、0.05% Trypsin-EDTA/PBSに37℃10分間処理して分離した。FBS および0.1 % BSAを含むPBSで洗浄した後、細胞集塊を除去するために細胞懸濁液をセルストレーナー(BD Biosciences)を用いてろ過し、遠心分離した。回収した細胞をFACS buffer(PBS中0.1% BSA)に懸濁し、フローサイトメーター(ARIA III;BD Biosciences)で解析した。hPGCLCs またはhiPSCsの解析では、分離した細胞をAPC-結合抗ヒトCD326 (EpCAM)、 BV421-結合抗ヒト/マウスCD49f、 PE-結合抗-TRA-1-60、または FITC-結合抗-SSEA-4で染色した。さらに、Alexa fluor 647-結合抗-OCT3/4、Alexa Fluor 647-結合抗-NANOG または V450-結合抗-SOX2を用いた細胞内染色は、BD cytofix/Cytoferm Fixation/Permeabilization kit (BD，554714)を使用し、製造元の説明書にしたがって行った。用いた抗体を表１に示す。【０１２０】
【表１】
2017002888.tif 000003
【０１２１】
cyESCs および cyPGCsからのシングルセルcDNAの調製
cyESCs (CMK9)（カニクイザルES細胞）は、Dr.Suemori (Fujioka T, et al., Int J Dev Biol. 48, 1149-1154, 2004および;Suemori H, et al., Dev Dyn. 222, 273-279, 2001)より入手し、マウス胎児フィーダー細胞（mouse embryonic feeders (MEFs)）と共に、常法のhESC培地[20%(vol/vol) KSR(Life Technologies)、1 mM of sodium pyruvate (Life Technologies、2 mM GlutaMax (Life Technologies)、0. 1 mM 非必須アミノ酸(Life Technologies)、0. 1 mM 2-メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich)、1000 U/mL ESGRO mouse LIF( Millipore)、4 ng/ml 組換えヒト bFGF (Wako Pure Chemical Industries) を添加したDMEM/FI2 (Life Technologies)]で培養した。SC3-seq解析(Nakamura T, et al.,Nucleic Acids Res. 43, e60. 2015)を行うに際して、細胞は、CTK 溶液[0.25% トリプシン(Life Technologies)、0. 1 mg/mL of コラゲナーゼ IV (Life Technologies)、1 mM of CaCl2(Nacalai Tesque)]で処理後、37℃で約10分間、0.25% trypsin/PBS (Sigma-Aldrich)中で37℃、約10分間インキュベートした。その後、1% (vol/vol) KSR/PBS中に分散しシングルセルを得た。【０１２２】
カニクイザルにおける、卵子回収、細胞質内精子注入(ICSI)、着床前胚培養、および着床前胚の個体への移植は常法にしたがって行われた(Yamasaki J, et al., Theriogenology. 76, 33-38, 2011)。移植胚は超音波診断によってモニターし、胎生期43日、50日および51日目に帝王切開によって取り出した。胚の性別は、体細胞組織から単離したゲノムDNAの性別特異的PCRよって決定した(Wilson and Erlandsson，Biol Chem. 379, 1287-1288,1998)。生殖堤を切開し、37℃で約10分間、0.25% trypsin/PBS中でシングルセルに分離した後、ピペッティングを繰り返した。得られたシングルセルを0.1 mg/ml PVA/PBS(Sigma-Aldrich)に分散し、SC3-seq 解析に供した。【０１２３】
Q-PCR および RNA-seq解析
PCRを行うためのRNA抽出は、RNeasy Micro Kit (QIAGEN)を用いて、製造者説明にしたがって行われた。1 ngの精製全RNAを使用したｃDNAの合成と増幅、およびRNAシークエンスのためのcDNAライブラリーの構築は、Nakamura T, et al., Nucleic Acids Res. 43, e60. 2015に記載の方法により実施した。Q-PCRは、CFX384 real-time qPCR system (Bio-Rad)を使用して、Power SYBR Green PCR Master mix (Life Technologies)とともに増幅したcDNAを測定することで行われた。PPIA および ARBPの平均ΔCt値に標準化したΔCt (log2 スケール)を計算することにより、遺伝子発現レベルを評価した。用いたプライマーを表２（ヒト遺伝子）および表３（カニクイサル遺伝子）に示す。【０１２４】
【表２−１】
2017002888.tif 000004
【０１２５】
【表２−２】
2017002888.tif 000005
【０１２６】
【表３】
2017002888.tif 000006
【０１２７】
RNA-seqのマッピング読み取りおよび遺伝子発現レベルへの転換
ゲノムシークエンス[マウスGRCm38/mm10 、ヒトGRCh37/hg19、およびカニクイザル (Macaca fascicularis)MacFas5.0 ]および転写アノテーション（transcript annotation）(マウスref_GRCm38、ヒトref_GRCh37、およびカニクイザル ref_MacFas5.0 )をNCBI ftpサイト （ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Macaca_fascicularis）から得た。【０１２８】
リードトリミング（Read trimming）、マッピングおよび発現レベルの評価はすでに記載した方法にしたがって実施した(Nakamura T, et al., Nucleic Acids Res. 43, e60. 2015)。ライブラリーアダプター（library adaptor）およびpoly-Aの配列は、cut adapt-1.3によって排除した。30 bpより小さいリードは、排除した。すべての残存リードは、「範囲外検索（no-coverage-search）」オプション(Kim D, et al., Genome Biol. 14, R36, 2013)を使用して、top hat-1.4.1/bowtie1.0.1を伴ったERCC spike-in RNAs (Life Technologies)を利用してゲノム上にマッピングした。パールスクリプト（Perl script）を使用したERCC spike-in RNAsからゲノム上にマッピングされたリードを分離した後、ref_MacFas5.0転写アノテーション上に、「compatible-hits-norm」、「no-length-correction」および「library-type fr-secondstrand」オプションを使用してcufflinks-2.2.0 program (Trapnell C et al.，Nat Biotechnol. 28, 511-515, 2010)を実施し、すべてのリファレンスコピーは、不十分なアノテーションデータを修正するために転写終了部位(TTSs)から10Kb伸ばして用いた(Nakamura T, et al., Nucleic Acids Res. 43, e60. 2015)。ERCC spike-in RNA 配列上にマッピングされたすべてのリードは、細胞あたりの転写コピー数を評価するために使用した。発現レベルが全マッピングリード(RPM)にのみ標準化され、log2(RPM+1)でさらに解析した。【０１２９】
ヒト、カニクイザルおよびマウスにおける遺伝子発現の比較
カニクイザル遺伝子とヒト遺伝子とを比較するために、ゲノム座標比較（genomic coordinate comparison）によって遺伝子の１対１対応表を作成した。初めに、すべてのヒト転写アノテーション（すべてのエキソンデータを含むref_GRCh37）を、LiftOver utility(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver)を使用して、カニクイザルのゲノム座標に変換した。LiftOver (hg19ToMacFas5.over.chain and macFas5ToHg19.over.chain)に使用されたチェーンファイル（chain files）を、 http://hgdownload-test.cse.ucsc.edu/goldenPath/から得た。次に、MacFas5.0座標におけるヒトゲノムアノテーションをref_MacFas5.0と比較し、続いて、MacFas5.0転写産物を座標化するための探索を行った。ref_MacFas5.0における同一の方法を実施して、ref_MacFas5.0における転写アノテーションがLiftOverを使用してhg19座標に変換され、さらに座標化したヒト転写産物の探索を行った。全17,932遺伝子を二種類の比較を用いて同定したところ、ヒト(24，968)およびカニクイザル遺伝子(29，437)の間で確定的に一致する遺伝子が認められた。ヒトおよびマウス遺伝子(ref_GRCm38，26,556 遺伝子)において、同一の比較を実施し、15，941遺伝子が一致する遺伝子が認められた。KLF2遺伝子はref_MacFas5.0でアノテートされなかったため、ヒトKLF2の対応する領域において本遺伝子のアノテーションをref_MacFas5.0 reference gff fileに追加した。【０１３０】
トランスクリプトーム解析
特異的に発現する遺伝子を解析するために、UHC 解析 (R3.1.1のEuclidean distancesおよびWard distance機能を伴う hclust 機能)およびPCA解析(R3.1.1のprcomp 機能)を用いた。このとき、最大log2(RPM+1)値が４より小さい遺伝子は除外した。hPGCLC誘導において特異的に発現する遺伝子(DEGs)を、一方向分散分析テスト（one-way Anova test）のP値（偽陽性率< 0.01、R3.1. 1の価値関数によって計算）および二つの逐次的時点間の折りたたみ変化（fold changes）(> 2)に基づいて選抜した。野生型の試料と比較したBLIMP1-/-細胞におけるDEGsは、student t-検定のP値(<0.05)および折りたたみ変化(> 2) に基づいて選抜した。GO解析はDAVID web tool (Huang da W, et al.，Nat Protoc. 4, 44-57, 2009)を使用して実施した。ヒートマップを、R3.1.1、gplotsパッケージのheatmap.2 functionを使用して作成した。RNA-seq データとGSE30056 データ (Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array)を比較するために、mESCsのRNA-seqデータを、mESCsアレイデータの標準曲線を用いて標準化した値を算出した。【０１３１】
免疫蛍光解析
hPGCLCsの免疫蛍光染色のため、iMeLCを介してBTAG 585B1-868 hiPSCsから誘導した8日目の細胞塊中のBTAG陽性細胞を、FACSで選別した後、BTAG 585B1-868 hiPSCsと１：１の比率で混合してMASコートスライドガラス(Matsunami)に広げた。このスライドを4%パラホルムアルデヒド（PFA）で15分間固定し、PBSで3回、PBSTで1回洗浄した。室温で5分間、0.5% triton Xを含むPBSで透過処理し、PBSで3回洗浄した。次に、本スライドをブロッキング溶液(5% normal goat serum，0. 2% tween 20，1xPBS)中、室温で2時間インキュベートし、4℃で一晩ブロッキング溶液に一次抗体を添加してインキュベーションした。PBSで6回洗浄した後、二次抗体を含むブロッキング溶液および1μg/mL の DAPIで本スライドを50分間インキュベートした。PBSで6回洗浄した後、Vectashield mounting medium (Vector Laboratories)を使用して共焦点レーザー走査顕微鏡解析(Olympus FV1000)を行った。5mCの免疫蛍光染色のために、4N HCl/0.1 % Triton X中で室温10分間処理したスライドを、PBSで2回洗浄した後ブロッキング溶液で処理した。使用した一次抗体および二次抗体に記載した。【０１３２】
cyPGCsの免疫蛍光染色のために、E50 (XX)胚から切り出した生殖堤を、4% PFA / PBS中で15分間室温で固定した。組織を10% および 30% ショ糖/ PBS中に連続的に浸し、OCT化合物(Sakura)に包埋し凍結後10 umの厚さの切片とした。風乾した切片をPBSで3回洗浄し、ブロッキング溶液で1時間インキュベートした。本切片をブロッキング溶液に含まれる一次抗体と室温で2時間インキュベートした後、PBSで4回洗浄した。次に、ブロッキング溶液に含まれる二次抗体と室温で50分間インキュベートした。PBSで4回洗浄した後、Vectashield mounting medium を使用して共焦点レーザー走査顕微鏡解析を行った。用いた抗体を表４に示す。【０１３３】
【表４】
2017002888.tif 000007
【０１３４】
実施例１
二重生殖細胞系レポーターを有するhiPSCsの確立
hiPSCsから生殖細胞分化へのインビトロ誘導条件を調べるために、BLIMP1 (PRDM1としても知られる)およびTFAP2C (AP2γとしても知られる)に対するレポーターを有するhiPSC株を樹立した。BLIMP1 とTFAP2Cは、ヒトの生殖細胞で発現することが報告されているから有用と考えられた (Eckert D, et al., BMC Dev Biol. 8, 106, 2008およびPauls K, et al., Int J Cancer. 115, 470-477, 2005)。【０１３５】
このとき、hiPSCとして、末梢単核血液細胞（peripheral mononuclear blood cells）由来の男性hiPSCの二系統の独立株である 585A1 および 585B1を使用した(Okita K, et al., Stem Cells. 31, 458-466, 2013)。この細胞株を組換えラミニン511のE8フラグメント(rLN511E8)上で塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む所定の培地で培養することで、コロニー形成能を伴ったシングルセル継代培養が可能となった (Nakagawa M, et al.，Sci Rep. 4, 3594, 2014)。本条件下で培養したhiPSCsは、従来のフィーダー細胞を用いた条件下の培養よりもさらに均一な特性を示し、マウスの原始多能性に関連する遺伝子の発現が本質的にない多分化能状態の遺伝子発現特性を示した(Nakamura T, et al., Nucleic Acids Res. 43, e60. 2015)。TALEN (転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（transcription activator-like effector nucleases)）を使用して、BLIMP1-2A-tdTomato および TFAP2C-2A-EGFP 対立遺伝子（alleles）の両方を有する二重相同組換え体のiPS細胞を単離した。当該iPS細胞は、BLIMP1 およびTFAP2Cを発現させると、tdTomato および EGFPそれぞれの蛍光が細胞で認められた(図８B、図８Cおよび図８E)。二重相同組換え体の中から、ヘテロ接合体でかつ正常な核型を示す両方の組換え対立遺伝子を有する、BLIMP1-2A-tdTomato; TFAP2C-2A-EGFP 585B1-868株(以下、BTAG 585B1-868という)を用いた(図１A、図８D)。【０１３６】
hiPSCsからBTAG陽性細胞の直接誘導
最初に、前のう胚形成マウス外胚葉に酷似した過渡的状態であるmEpiLCsをmPGCLCsへ誘導する条件で(Hayashi K, et al.，Cell. 146, 519-532, 2011)、BTAG 585B1-868 hiPSCsが、hPGCLCsに直接誘導され得るかを調べた。BTAG hiPSCsをシングルセルに分離し、ROCK阻害剤存在下で、骨誘導因子4 (BMP4)、幹細胞因子（SCF）、白血病抑制因子(LIF)、および上皮成長因子(EGF) (3,000 細胞/細胞塊)などの主要なサイトカインを添加した、GMEM + 15% knockout serum replacement (KSR) (GK15)中、浮遊条件で培養した(図１B) (Watanabe K, et al., Nat Biotechnol. 25, 681-686, 2007)。【０１３７】
mEpiLCsでは、刺激2日目の早い時期にBlimp1 や他のPGC特異的遺伝子を強力に発現する(Hayashi K, et al.，Cell. 146, 519-532, 2011)のとは異なり、蛍光解剖顕微鏡下で観察すると、hiPSCの細胞塊は、サイトカイン刺激後2日目においてもBT および AGを発現せず、ゆるく結びついているようであった(図１C)。しかし、4日目において、細胞の中にBTAGを発現し始めるものがあり、6日目には強力なBTAG発現を示す細胞の集団が認められ、それは少なくとも8日目まで持続した(図１C)。FACS解析によっても同様に、刺激2日目の塊全体が、弱いBTAG陽性状態へシフトすることが示され、4日目に約15％の細胞がBTAG陽性となり、同様のメカニズムでBT および AGが上方制御された。6日目にはBTAG陽性を強く示す細胞塊(約20％)が認められ、それは少なくとも8日目まで持続していることが確認された(図１D)。しかし、誘導を通して相当数の細胞が細胞死することに留意すべきであった 。3,000細胞/塊で誘導を開始し、誘導の基本培地として10％以上のKSRを使用した場合に、BTAG陽性細胞の誘導効率は最高値を示し（図８F）、誘導6日目の細胞塊あたりのBTAG陽性細胞の平均数は約200個/細胞塊であった(図１E)。mEpiSCsとは異なり、mEpiLCsと同様に、hiPSCsは適切な条件下で比較的強力な生殖細胞形成能を示すことが、以上の知見から示唆された。
hiPSCs からBTAG陽性細胞を誘導する場合の遺伝子発現の動態を、定量的PCRによって調べた。hiPSCsは、多分化マーカー遺伝子であるPOU5F1、NANOGおよび SOX2を高または中程度のレベルで発現する一方で、KLF2、KLF4、TCL1B、TFCP2L1、ESRRB、およびDPPA3などの、マウスにおける原始的な多分化能に関連する遺伝子の発現は低い、または発現が確認できず(図１F)、Nakamura T, et al., Nucleic Acids Res. 43, e60. 2015の報告と一致した。しかし、hiPSCsは、ZFP42 およびPRDM14を比較的高いレベルで発現することに留意すべきである(図１F)。hiPSCsは、PGCs(BLIMP1， TFAP2C，NANOS3， DPPA3， DAZL、および DDX4)、神経外胚葉（PAX6 およびSOX1）、中胚葉（T，EOMES，EVX1, SP5，MIXL1, MSX2，および NODAL）並びに内胚葉（GATA4，GATA6，SOX17，および FOXA2）に関連する遺伝子が発現しない、または非常に低い発現しか認められなかった(図１F)。【０１３８】
一方、サイトカイン刺激2日目の細胞塊において、主要な多分化能遺伝子の発現は増加し、原始多能性遺伝子の発現は低く維持され、PGCs(BLIMP1 および TFAP2C)、中胚葉(T，EOMES，SP5，および NODAL)、並びに内胚葉(GATA4 および SOX17) に関連するいくつかの遺伝子は増加し始めた(図１F)。
さらに、サイトカイン刺激6日目のBTAG陽性細胞は、POU5F1 およびNANOG の発現を著しく増加させたが、SOX2にはその傾向が見えなかった (図１F)。これは、hPGCsがSOX2の発現を欠いている結果(de Jong J, et al.，J Pathol. 215, 21-30, 2008; Perrett RM, et al.，Biol Reprod. 78, 852-858, 2008)と矛盾するものはない。BLIMP1、TFAP2Cおよび NANOS3などのマウス早期PGCマーカーは、SOX17と同様に、高い発現レベルを示したが、DPPA3の発現は低く、DAZL およびDDX4などの後期PGC遺伝子は実質的な発現が確認できなかった(図１F)。BTAG陽性細胞において、マウスPGCの特定に必須なT および PRDM14 の発現量は低かった(図１F)。さらに、BTAG陽性細胞がマウスの原始多能性(KLF4，TCL1B，およびTFCP2L1)、中胚葉(EVX1 および MSX2)並びに内胚葉(GATA4)と関連する遺伝子を増加させることを見出した(図１F)。早期hPGCsの遺伝子発現特性に関する情報が欠如しているため確定は難しいが、BTAG陽性細胞が早期hPGCsに相当し得ることをこれらの知見は示唆している。これらは、hPSCが、生殖細胞運命を決定する能力を有する前/近‐のう胚形成外胚葉様の状態を表し得ることを示唆する。【０１３９】
実施例２
初期中胚葉様状態を介したBTAG陽性細胞の強力な誘導
BTAG陽性細胞はhiPSCsから直接誘導されるが、細胞塊には死細胞が相当数含まれ、得られるBTAG陽性細胞は比較的少量であった (図１E)。浮遊細胞塊形成を経た生殖細胞分化への直接的な誘導は最適な経路ではない可能性があることから、hiPSCsを、生殖細胞分化誘導のための適切な前駆体へ誘導するための条件を検討した。生殖細胞分化に先立って、BMP4 および WNT3シグナルにより誘導される中胚葉系統への誘導が活性化されるというマウスにおける知見に基づいて(Aramaki S, et al., Dev Cell. 27, 516-529, 2013およびSaitou M, et al.，Nature. 418, 293-300, 2002)、BTAG陽性細胞を誘導するための前駆体を誘導するため、種々の細胞外マトリックス(ECM)構成成分の使用と同様に、hiPSCsをBMP4，WNT3，および他のシグナリング分子に前もって接触させる効果を調べた。【０１４０】
検討した条件の中で、フィブロネクチン被覆プレート上で約2日間、アクチビンA (ACTA，50 ng/ml)およびGSK3阻害剤（CHIR99021(3μM)）を含むGK15中でhiPSCsを刺激した後、BMP4，LIF，SCF，およびEGFの添加条件下で浮遊細胞塊形成すると、強力かつ安定的にBTAG陽性細胞を産生する前駆体を誘導することを見出した(図２AからF、図９Aおよび図９B)。ACTA および CHIRで刺激すると、hiPSCsは、細胞と細胞の境界が明確な細胞へ分化し（当該細胞を初期中胚葉様細胞(iMeLCs)と称す）(図２Aおよび図２B)、サイトカイン刺激を伴う浮遊細胞塊形成において、これらの細胞は、2日目には強制的なBTAGの活性化 (約30-40%)を開始し、このBTAG陽性細胞は（4日目に約60％）少なくともサイトカイン刺激後10日目まで存続した(図２D、図２Eおよび図２F)。iMeLCsから誘導される細胞塊あたりのBTAG陽性細胞の数は、6日目において約400から1000個/細胞塊であり、hiPSCsから直接誘導されるものより著しく多く(図２F)、iMeLCs からのBTAG陽性細胞の誘導では、細胞死はほとんど認められなかった。【０１４１】
続いて、BTAG陽性細胞への誘導能を有するiMeLCsの誘導における、関連するシグナリング経路/培養条件の効果を評価した。mESCs/iPSCsからのmEpiLC誘導に対するように、BTAG陽性細胞を誘導する効率はiMeLCsの誘導時間に大きく依存し、BTAG 585B1−868hiPSCsに対しての最適時間は約42時間であった(図９B)。ACTA および CHIRによる刺激を長くすると、中胚葉の特性(T，EOMES，EVX1，SP5，MIXL1，および NODAL)および内胚葉の特性(GATA4，GATA6， SOX17， および FOXA2)がさらに増加し、BTAG陽性細胞誘導能を失った(図９Bおよび図９C)。ACTA (50 ng/ml以上)およびCHIR (3-5μM)は、BTAG陽性細胞への誘導能を有するiMeLCsの誘導に必須であったが、WNT3A(50ng/ml以上)によってCHIRは代替可能であり、WNTシグナリングはiMeLCsの誘導に必須であることが示された(図１０AからC)。一方、BMP4 および bFGFのシグナリングはiMeLCsの誘導に負に働き(図１０Dおよび図１０E)、iMeLCsの誘導において、特異的阻害剤(PD173074（FGFRi）)によってFGFレセプター(FGFR)シグナリングを阻害すると、BTAG陽性細胞などの、細胞塊内の細胞をより強力に増殖させ生存させ、細胞塊あたりのBTAG陽性細胞数が増加した (図１０Gおよび図１０H)。これらの知見より、強力なBTAG陽性細胞誘導能を有するiMeLCsの誘導には特異的シグナリング経路が必要であることが明らかとなった。iMeLCsが中胚葉および胚体内胚葉の前駆体であることを確認した。【０１４２】
次に、iMeLCsからBTAG陽性細胞の誘導に必要なシグナル経路を調べた。BMP4はBTAG陽性細胞の誘導に必須であるが、SCF、LIFおよび EGFは、細胞塊内におけるBTAG陽性細胞の誘導ではなく、維持する役割を有していた(図１１AからD)。BMP4の効果はアクチビンレセプター様キナーゼ2/3 (ALK2/3)阻害剤のLDN193189によってブロックされることから、BMP4によるシグナルがALK2/3レセプターを介していることが示された(図１１B)。以上のように、iMeLCsからのBTAG陽性細胞の誘導およびその増殖/生存には、mEpiLCsからmPGCLCsの誘導およびmPGCLCの増殖/生存に類似するシグナルを必要とすることが確認された (Hayashi K, et al.，Cell. 146, 519-532, 2011)。【０１４３】
iMeLCs を介したBTAG陽性細胞誘導における遺伝子発現の動態を、Q-PCRによって確認した。iMeLC誘導における、多分化能マーカー遺伝子(POU5F1、NANOGおよびSOX2)、原始多能性遺伝子(KLF2、KLF4、TCL1B、TFCP2L1、ESRRBおよびDPPA3)、並びにPGC関連遺伝子(BLIMP1、TFAP2C、NANOS3、DPPA3、DAZLおよびDDX4)および内胚葉関連遺伝子(GATA4およびSOX17)の発現レベルは、変化しなかったが、中胚葉の発生に関連する遺伝子は、緩やかに増加し(T、EOMES、SP5、MIXL1およびNODAL) (図２Gおよび図９C)、ACTA および CHIRによる刺激によって、hiPSCsが、初期中胚葉様/発生初期線条様状態へ誘導されることが示された。iMeLCs から誘導されたBTAG陽性細胞の遺伝子発現特性は、本質的にhiPSCsから直接誘導されたBTAG陽性細胞と同一であった。すなわち、POU5F1 および NANOG の発現は高く、SOX2は急速に減少し、初期PGCマーカーは、SOX17 およびSOX15と同様に著しく増加し(BLIMP1、TFAP2CおよびNANOS3)、後期PGC遺伝子(DAZL およびDDX4)は実質的に発現しなかった (図２Gおよび図１１E)。【０１４４】
FACSおよび免疫蛍光解析によっても、OCT4、NANOG、BLIMP1、TFAP2CおよびSOX17の発現と、BTAG陽性細胞におけるSOX2の抑制が確認された。【０１４５】
以上の結果から、hiPSCsは、初期中胚葉遺伝子が増加したiMeLCsへ誘導され、順にBTAG陽性細胞、初期hPGCsに潜在的に類似する状態に強制的に誘導されることが明らかとなった。【０１４６】
実施例３
hPGCLCsとしてのBTAG陽性細胞の転写および誘導経路の解析
BTAG陽性細胞の特性および誘導経路をさらに理解するために、Nakamura T, et al., Nucleic Acids Res. 43, e60. 2015の技術を使用して、hiPSCs、iMeLCs、iMeLCsから誘導2日目（d2）、4日目（d4）、6日目（d6）および8日目（d8）のBTAG陽性細胞、およびhiPSCsから直接誘導された6日目（d6）のBTAG陽性細胞についてグローバルトランスクリプションプロファイル、ヒトPGCsに類似すると推測される非ヒト霊長類（カニクイザル；Macaca fascicularis)の生殖腺PGCsのグローバルトランスクリプションプロファイル、およびmPGCLCs (mESCs，mEpiLCs，d2 ，d4 ，d6 mPGCLCs)の特定に関連するグローバルトランスクリプションプロファイルを以下のとおり詳細に比較した。【０１４７】
カニクイザル(cy)の生殖腺PGCsのグローバルトランスクリプションプロファイルを決定するために、E43，50，および 51のカニクイザル胚（マウスのE10.5-13.5にほぼ相当する）を単離し、生殖腺を切り出し(図１２A)、各生殖腺を単一細胞に分離した。PGCs(POUF51、NANOG、BLIMP1およびTFAP2C陽性)由来のsingle-cell cDNAsを作成し、RNA-seqによる解析を行った（図１２BからD)。【０１４８】
非監視下階層的クラスター形成（Unsupervised hierarchical clustering）(UHC)によって、BTAG陽性細胞の誘導経路に関連する細胞は、各々が独立してサブクラスターを構成するhiPSCs および iMeLCsと、ステージ依存性サブクラスターを有するd2-d8 BTAG陽性細胞の二つのクラスターに分類された(図３A)。興味深いことに、iMeL 状態を介して誘導された d4 BTAG陽性細胞は、hiPSCsから直接誘導されるd6 BTAG陽性細胞とサブクラスターを形成した(図３A)。これはhiPSCsからの直接誘導において、iMeLCsを介したBTAG陽性細胞形成に類似する経路を経てBTAG陽性細胞になることを示している。主成分析(PCA)により、PC1ネガティブなhiPSCsから、iMeLCsは、PC2とPC3軸に沿ってプロットされ、すべてがほぼ同一のPC1ポジティブであるBTAG陽性細胞は、ステージ依存的に、PC2 とPC3軸に沿ってプロットされた(図３B)。以上のように、hiPSCs およびiMeLCsは比較的似た特性を有し、BTAG陽性細胞はこれらと異なる特性を有する細胞であり、BTAG陽性細胞誘導は、細胞表現型を獲得するための指向的かつ進行性のプロセスであることが示された。【０１４９】
次に、cyPGCs とBTAG陽性細胞の遺伝子発現特性を比較した(図１２D)。cyESCs，CMK9株由来のsingle-cell cDNAsを作成し、これらのcDNAsをRNA-seq解析に供した。cyESCsに比べてcyPGCsで増加する遺伝子セットを同定し、これらの遺伝子に対するヒト相同遺伝子を決定した。UHC解析によって、d2-d8 BTAG陽性細胞がcyPGCsとともにクラスターを形成することを示した。BTAG陽性細胞とcyPGCsで共発現した遺伝子は、「酵素関連レセプタータンパク質シグナリング経路」、「幹細胞維持」、「生殖発育プロセス」および「配偶子産生」などの遺伝子オントロジー (GO)用語に関するものが多かった (図３D)。BTAG陽性細胞では発現せずcyPGCsで発現する一群の遺伝子は、「有性生殖」や「性分化」などのGO用語を有する、主として後期PGCsで発現するものから構成されていた(図３D)。さらに、cyESCs に比べてcyPGCsで上方または下方制御される遺伝子は、iMeLCsに比べてd6 BTAG陽性細胞で一般的に上方または下方制御されることが、スキャッタプロット解析から明らかとなった。しかしながら、mPGCLCが、mPGCsに非常に類似した転写プロファイルを有し、本物のPGCsとしての機能を有することが知られているにも関わらず、この傾向は、mPGCLCs と mEpiLCsとを比較した場合では、非常に弱いものであった(図３C) (Hayashi K, et al.，Science. 338, 971-975, 2012およびHayashi K, et al.，Cell. 146, 519-532, 2011)。後期PGC遺伝子に関するものを除いて、BTAG陽性細胞がcyPGCsと類似する遺伝子発現プロファイルを示すこと、および、種差が原因と考えられるが、mPGCLCsがcyPGCsとは著しく異なる全体的な遺伝子発現を示すことを、これらの知見は明示する。以上の知見より、BTAG陽性細胞は初期hPGCsに相当し、その後hPGCLCsとしての特性を示すと考えられる。【０１５０】
次に、hPGCLC誘導において細胞状態が変化する間に上方または下方制御される個々の遺伝子を調べ、mPGCLC誘導における遺伝子と比較した(図４A)。hPGCLC誘導で細胞状態が変化する間に上方または下方制御される遺伝子の数が、mPGCLC誘導の間に制御されるものの数に比べて小さかったことに注目した。iMeLC-d2 hPGCLC変化の間、991 および 601遺伝子がそれぞれ上方または下方制御され、mEpiLC-d2 mPGCLC変化の間、1,482 および 870遺伝子がそれぞれ上方または下方制御された。d2-d4 hPGCLC変化の間、235 および 126遺伝子のみがそれぞれ上方または下方制御され、d2-d4 mPGCLC変化の間、888 および 1,141遺伝子がそれぞれ上方または下方制御された(図４A)。hiPSC-iMeL変化の間に上方制御される遺伝子は、「細胞移動」や「パターン特定プロセス」などのGO用語を有するものが多く、CERI，FGF19，NODAL，KITLG，SEMA3C，MIXL1，BMP4，T，EOMES，LEFTY2，FST，および PITX2などが含まれる一方、hiPSC-iMeL変化の間に下方制御される遺伝子は、「化学ホメオスタシス」や「細胞接着」などのGO用語を有するものが多かった(図４B)。【０１５１】
iMeLC-d2 hPGCLC変化の間に上方制御される遺伝子は、hPGCLC特定に主要な役割を果たす可能性のある遺伝子(例えば、TFAP2C，PRDM1，SOX17，SOX15，KLF4，KIT，TCL1A，およびDND1) を含み(図３Dおよび図４B)、「幹細胞維持」や「細胞遊走の制御」などのGO 用語を有する遺伝子が多い。一方、下方制御されるものは、「パターン特定プロセス」や「ニューロン発達」などのGO 用語が多かった(図４B)。上述の通り、d2 および d4 hPGCLCsの間の遺伝子変化は比較的小さいものであったが、d4 hPGCLCsは「胚の形態形成」のいくつかの遺伝子を下方制御し、d6 および d8 hPGCLCsの全体的な遺伝子発現プロファイルは本質的に同一であった(図４Aおよび図４B)。【０１５２】
hPGCLC および mPGCLC誘導において、各細胞型の中で最も高いレベルで発現した遺伝子を同定した(他の3つの細胞型に比べて2倍以上) (図４C)。mPGC/PGCLC誘導のための主要な事象に、「壁側中胚葉プログラム」の急激かつ強力な活性化/その後の抑制があることを以前報告されている(Kurimoto K, et al.，Genes Dev. 22, 1617-1635, 2008、Saitou M, et al.，Nature. 418, 293-300, 2002およびYabuta Y, et al., Biol Reprod. 75, 705-716, 2006)。最大グループの遺伝子(n=756)はd2 mPGCLCsにおいて最も多く発現したもの(d2 mPGCLC遺伝子)であることを見出した。これらの遺伝子は著しく高いＰ値を示し、「胚の形態形成」や「パターン特定プロセス」などのGO用語が多く、その大多数はd4 rnPGCLCsで抑制されていた(図４Cおよび図４D)。一方、d2 hPGCLCsで最も多く発現した遺伝子(d2 hPGCLC遺伝子)は数としては比較的少なく(104個)、Ｐ値は高くなかったが「細胞組成形態形成」や「ニューロン分化」を主とするGO用語を有する遺伝子が多く、d4 および d6 hPGCLCsで徐々に抑制された(図４Cおよび図４D)。
d2 mPGCLC遺伝子のヒト相同遺伝子の多くが、hPGCLC誘導において、比較的一定した発現を示した（発現しないかまたは同レベルで発現する）。一方、d2 hPGCLC遺伝子のマウス相同遺伝子の少数のみが、d2 mPGCLCsにおける一過性の上方制御を示した(図４Eおよび図４G)。したがって、WNT5A、WNT5B、CFC1、EVX1、SNAI2および CDX2を含むが、Hox遺伝子を含まない、わずか16遺伝子が、d2 hPGCLC遺伝子およびd2 mPGCLC遺伝子において共通であった(図４Eおよび図１２F)。【０１５３】
以上の結果より、hPGCLCおよびmPGCLC誘導における転写プログラミングが示され、hPGCLC誘導においては、「壁側プログラム」の顕著な活性化/その後の抑制が認められないことが示された。【０１５４】
続いて、hPGCLC誘導の前駆状態を調べるために、hiPSCs，iMeLCs，mESCs，mEpiLCs，および mEpiSCsの関係を調べた。ヒトおよびマウス細胞間の全体的な転写状態は、種間で異なるため直接比較はできないが、内部細胞塊(ICM)/原始多能性、前のう胚形成外胚葉、中胚葉、および内胚葉形成に関連する主要な機能を有するマウスの代表的な遺伝子を選択し、これらの細胞における発現プロファイルを調べた。図４Hに示すように、ICM/原始多能性に関する遺伝子は、mESCsにおいて多く発現し、mEpiLCsでは減少し、mEpiSCsではさらに減少したが、外胚葉に関する遺伝子はmEpiLCs および mEpiSCsの両方において増加した。中胚葉および内胚葉に関する遺伝子は、mESCs および mEpiLCsでは一般に低いが、mEpiSCsではある程度増加した(図４H)。これらのデータは、mESCs，mEpiLCs および mEpiSCsが、それぞれICM/初期外胚葉、前のう胚形成外胚葉、および後のう胚形成外胚葉に似た特性を有するという考えと矛盾するものではない。【０１５５】
hiPSCsおよびiMeLCsにおけるICM/原始多能性に関連する遺伝子の発現パターンは、mEpiLCsに類似するが、mESCsには類似しなかった(図４H)。マウス前のう胚形成外胚葉に関連して選択した遺伝子の約半数が、hiPSCs および iMeLCsで強く発現したものの、残りの半数は顕著な発現を示さなかったが、これは種差が原因と考えられる。Q-PCR解析と同様に(図１F、図２Gおよび図９C)、内胚葉ではなく中胚葉形成のいくつかの遺伝子がiMeLCsで増加したが、hiPSCsでは増加しなかった(図４H)。【０１５６】
以上の結果より、本条件下で培養したhiPSCsは、種差にかかわらず、mESCs，mEpiLCs，およびmEpiSCsのうちのmEpiLCsに最も類似する特性を有し、ヒトに特異的な経路によって生殖細胞となることができると示唆された。【０１５７】
次に、hPGCLCsのエピジェネティックなプロファイルを調べた。マウス遊走PGCのように、mPGCLCsでは、mEpiLCsに比較して、ヒストン H3 リジン 9 ジメチル化(H3K9me2)レベルが減少し、ヒストン H3 リジン 27 トリメチル化(H3K27me3)レベルが増加し、DNA メチル化[5-メチルシトシン(5mC)]レベルが減少したが、ペアレントインプリント（parental imprints）は維持していた(Hayashi K, et al.，Cell. 146, 519-532, 2011およびKurimoto K, et al.，Genes Dev. 22, 1617-1635, 2008)。次に、hiPSCs およびd8 hPGCLCs間のH3K9me2，H3K27me3 および 5mCレベルを免疫蛍光解析によって比較した。d8 hPGCLCsにおけるH3K9me2レベルはhiPSCsより低かったが、H3K27me3レベルは様々であった。より高いH3K27me3レベルを示すhPGCLCsも存在したが、hiPSCsに似たH3K27me3レベルを示すものも存在した(図１３A)。さらに、d8 hPGCLCsにおける5mCレベルは、hiPSCsより低かった(図１３A)。【０１５８】
hPGCLCsによるエピジェネティックな初期化のメカニズムを解明するために、hPGCLC誘導に関連するエピジェネティックな修飾因子の発現を、生殖腺cyPGCsを参照として調べた。DNAメチレーションに含まれる分子の中で、DNMT3BはhPGCLCsにおいて急激に減少したが、DNMT1 や UHRF1の発現は維持していた。DNMT3A，DNMT3B，および UHRF1はcyPGCsにおいて減少した(図１３C)。DNAメチレーションに含まれる分子の中で、TET1は比較的一定量発現したが、他の遺伝子はhPGCLC誘導およびcyPGCsにおいて、発現がないかまたは低かった(図１３C)。H3K9me2の主要酵素であるEHMT2は、hPGCLCs および cyPGCsで抑制され、いくつかのH3K9me2デメチラーゼ(KDM1A, KDM3A，KDM3B)は発現した(図１３C)。H3K27me3に含まれる分子の中で、EZH2 および SUZ12はPGCLC誘導の間、一定の発現量を示したが、EEDはhPGCLCsにおいて抑制された。一方、cyPGCsでは、EZH2，EED，およびSUZ12が強く発現した(図１３C)。【０１５９】
実施例４
hPGCLCsの表面マーカーの探索
hiPSCsからhPGCLCsの誘導および同定を、蛍光レポーターなしで行うために、hPGCLCsを識別する表面マーカーを探索した。スクリーニングしたいくつかの表面マーカーのうち[PECAM (CD31)，INTEGRINα6 (CD49f)，INTEGRINβ3(CD61)，KIT (CD117)，EpCAM，PODOPLANIN，および TRA1-81]、EpCAM (APC-A channel) および INTEGRINα6 (Horizon V450-A channel)の組合せが、BTAG 585B1-868 hiPSCs から誘導された6日目細胞塊を、３つの別の個体群へと分離した。すなわち、高EpCAM および 高INTEGRINα6 (P3 gate)、高EpCAM および 低INTEGRINα6 (P4 gate)，低 EpCAM および 低INTEGRINα6 (P5 gate)へと分離した (図５A)。高EpCAMおよび高INTEGRINα6個体群 (P3 gate)は、BTAG陽性hPGCLCsにほぼ同一であり (高EpCAMおよび高INTEGRINα6細胞の約98.9%がBTAG陽性細胞であった; BT:PE-Texas Red-A channel; AG: FITC-A channel)。他の個体群は、実質的にBTAGが陰性/弱陽性であった(図５A)。誘導の2日目には高EpCAMおよび高INTEGRINα6個体群は識別可能であり(約37％)、BTAG陽性個体群と実質的に同一であった(高EpCAMおよび高INTEGRINα6細胞の約98%がBTAG陽性であった)。その後、少なくとも8日目まで残存した(図５B)。【０１６０】
表面マーカーを使用してhPGCLCsを単離することができるかどうかを調べるために、レポーターを含まない独立株585A1 hiPSCsを、iMeLCsを介してhPGCLCsへ誘導した。図５Cに示すように、誘導の2日目に、細胞塊に高EpCAMおよび高INTEGRINα6個体群(約21％)が出現し、この個体群は、4日目(約31％)、6日目(約32％)まで増加した。この個体群がhPGCLCsであるか否かを決定するために、誘導6日目の個体群から全RNAを抽出し、RNA-seqによってグローバルトランスクリプションプロファイルを解析した。図５Dに示すように、UHC解析は示した6日目の高EpCAMおよび高INTEGRINα6細胞は、6日目および8日目のBTAG陽性 hPGCLCsと密集することがUHC解析により示され、6日目の高EpCAMおよび高INTEGRINα6細胞はhPGCLCsであることが確認された。【０１６１】
実施例５
hPGCLC特定におけるBLIMP1の重要な機能
マウスPGCの特定に重要な転写因子であるBLIMP1のhPGCLCを特定するための役割について調べた。TALEN相同組換えストラテジーを使用して、TFAP2C-2A-EGFP対立遺伝子を有するhiPSC株を作製し(AG 585B1-17，19)、tdTomatoが発現してBLIMP1がターゲット対立遺伝子でノックアウトされるように、BLIMP1遺伝子のエクソン4をtdTomatoで入れ替えた(図６A、図１４Aおよび図１４B)。フレームシフト欠失のある他の対立遺伝子およびtdTomatoによって置換された、BLIMP対立遺伝子を一つ含むものと同様に(BLIMP1 homozygously knocked out clones: BLIMP1-/-)、BLIMP1をヘテロ接合的にターゲットしてノックアウトした数個のクローンを単離した(BTAG; BLIMP1+/-)(図６Aおよび図１４B)。【０１６２】
AG; BLIMP1+/+，BTAG; BLIMP1+/-，および BTAG; BLIMP1-/-hiPSCsをiMeLCsへ誘導し、さらにhPGCLCsへ誘導した。BTAG; BLIMP1-/- hiPSCs から誘導されたAG陽性細胞は、BLIMP1発現しないことを確認した(図６B)。図６CからEに示すように、AG; BLIMP1+/+ hiPSCsはAG陽性hPGCLCsへ強力に誘導され、hPGCLCsとして維持された(d2: 約69.3%; d4: 約52.8%; d6 : 約32.2%; d8:約32.2%)。対照的に、BTAG; BLIMP1-/- hiPSCsは、誘導2日目に比較的効率よくBTAG陽性細胞へ誘導された(約47.4%)が、BTAG陽性細胞の数は4日目に急激に減少し(約18.8%)、6日目にはこれらの細胞はほぼ消失した(約1. 6%) (図６CからE)。このことから、BLIMP1がhPGCLCsの特定/維持に必須であることが示された。マウスBlimp1の容量依存的機能の結果と同様に(Ohinata Y, et ai., Nature. 436, 207-213, 2005; Vincent SD, et al., Development. 132, 1315-1325, 2005)、BTAG; BLIMP1+/-hiPSCsは、野生型とBTAG; BLIMP1-/- hiPSCsの間の中間体表現型を示した。すなわち、BTAG陽性細胞の誘導率は2、4、6、および8日目において各々約49.6%， 約27.0%，約8 .1 %，およ約4.6%であった(図６CからE)。他の独立株BTAG; BLIMP1-/- hiPSCsを使用した場合にも同じ結果を得た。【０１６３】
hPGCLC誘導におけるBLIMP1の役割を調べるため、AG; BLIMP1+/+ および BTAG; BLIMP1-/- hiPSCsから誘導されたd2 および d4 (BT)AG陽性細胞よりRNAを抽出し、Q-PCRによって主要遺伝子の発現を解析した。この解析によって、BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞は、野生型の細胞と似て、POU5F1 およびNANOGを増加させ、SOX2を抑制すること、したがって、hPGCLCsにおける主要な多分化能遺伝子の制御が、BLIMP1に依存しないことが明らかとなった(図６F)。BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞はTFAP2Cを増加させたが、NANOS3，KLF4，TFCP2L1，およびTCL1Bなどの遺伝子の増加は抑えられた(図６F)。BLIMP1+/-; BTAG陽性細胞は、T とMIXL1を維持しなったが、EVX1 とSP5を抑制せず、EOMES と MSX2に対して効果が認められなかった(図６F)。これは、BLIMP1が中胚葉発生に関連する遺伝子に別の効果を及ぼすことを示すものである。同様に、BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞において、GATA4は抑制が抑えられたが、SOX17，GATA6，およびFOXA2には明確な効果が認められなかった(図６F)。特に、BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞はDNMT3Bを抑制しなかった(図６F)。【０１６４】
RNA-seqによって、BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞のトランスクリプトームを野生型およびBLIMP1+/- hPGCLCsと比較した。BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞はd2 hPGCLCsに類似する特性を獲得していたが、d4 PGCLC状態に向かってさらに分化が進まないことが、UHC および PCA解析により示された(図７Aおよび図７B)。BLIMP1-/-細胞における欠陥を調べるために、d2 および d4 BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞において上方または下方制御された遺伝子を、それぞれd2 および d4 PGCLCsと比較した。d2 BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞で増加した遺伝子(104 遺伝子)は、「ニューロン分化」「のう胚形成」および「胚の形態形成」というGO用語を含む遺伝子が多く、d4 BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞で増加した遺伝子 (692 遺伝子)は、より高いP値を有する同様のGO用語が多かった。これは、BLIMP1が、hPGCLCsにおいてこのような発生プログラムを抑制するために機能することを示す(図７Cおよび図７D)。対照的に、BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞で抑制された遺伝子の数はより少なく(d2およびd4で各々61 および 300 遺伝子)、アポトーシスや細胞周期に関するGO用語が多かった。これは、BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞における基本的細胞特性の誤制御を示唆する(図７Cおよび図７D)。【０１６５】
BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞で上方または下方制御される遺伝子が、hPGCLC誘導において異なる発現パターンを示し、特に、BLIMP1+/-; BTAG陽性細胞では、野生型とBLIMP1-/-細胞の中間的な遺伝子発現パターンを示した (図７E)。d2 BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞で増加した「ニューロン分化」および「胚の形態形成」と関連する遺伝子は、野生型d2 PGCLCs において、少なからず発現するかまたは発現しなかった(図７E)。これらのデータから、BLIMP1が、hPGCLC誘導において容量依存的に幅広く遺伝子の発現レベルをコントロールすることが明示された。【０１６６】
「ニューロン分化」に関連する遺伝子およびその関連GO用語は、d2 およびd4 BLIMP1-/-; BTAG陽性細胞において増加する遺伝子に非常に多かったことから(図７D)、野生型hPGCLC誘導における「ニューロン分化」の遺伝子発現の動態および本発現におけるBLIMP1欠損の影響を調べた。図７Fに示すように、「ニューロン分化」の遺伝子はいくつかの発現カテゴリーに分類され、BLIMP1-/-細胞で増加するものは、d2 hPGCLCsにおける上方制御に関する発現カテゴリー(18/39，約46%)および下方制御に関する発現カテゴリー(6/23，約26%)に多く含まれた。野生型hPGCLC誘導において発現が顕著に変化しない「ニューロン分化」に対する15遺伝子は、d2 または d4 BLIMP1-/- 細胞で増加した (図１４E)。【０１６７】
以上の結果から、BLIMP1の主要な機能は、d2 hPGCLCsにおいて増加した「ニューロン分化」遺伝子を適度なレベルに抑制することであり、また、d2 hPGCLCsで減少したこのような遺伝子を適切に抑制することであると示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１６８】
本発明の分化誘導法によれば、ヒト多能性幹細胞からヒトPGC様細胞を高効率かつ再現性よく分化誘導することができ、また、本発明の細胞表面マーカーを用いれば、ヒトPGC様細胞を効率よく単離精製することができるので、ヒト多能性幹細胞からの生殖細胞分化決定経路をインビトロで機能的に再構成することが可能となり、ヒトにおける生殖細胞の発生メカニズムの解明、並びにヒト生殖細胞の欠陥に起因する疾患の診断/治療の確立のために大いに有用である。【０１６９】
ここで述べられた特許、特許出願明細書、科学文献を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。【０１７０】
本出願は、日本で出願された特願2015-130501（出願日：2015年6月29日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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