(57)【要約】【課題】ヒト型の糖鎖をもつ有用糖タンパク質を提供すること。【解決手段】ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法であって、植物細胞に、グリコシルトランスフェラーゼの遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入することによって、形質転換植物細胞を得る工程、および得られた形質転換植物細胞を培養する工程を包含する。上記グリコシルトランスフェラーゼは、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る。上記ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質は、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、このコア糖鎖は複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを含み、そしてこの外部糖鎖は、非還元末端ガラクトースをもつ末端糖鎖部分を含み、直鎖状構造または分岐状構造をもつ。上記ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質は、フコースまたはキシロースを含まないため、ヒトに対する抗原性を示さない。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法であって、哺乳動物のグリコシルトランスフェラーゼの遺伝子および糖タンパク質をコードする遺伝子を植物細胞に導入することによって形質転換植物細胞を得る工程であって、ここで、該糖タンパク質が該植物細胞には本来存在せず、該酵素がグリコシル残基を該糖タンパク質に転移する前記工程、および得られた形質転換植物細胞を培養する工程を含む前記生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物による異種糖タンパク質の発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内の機能的タンパク質の多くは糖鎖を持つ糖タンパク質である。糖タンパク質内の糖鎖の多様性は、いくつかの重要な役割を生理学的に担っていることが明らかにされている（Ｌａｉｎ，Ｒ．Ａ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，４，７５９−７６７，１９９４）。
【０００３】
最近、糖鎖の作用が２つのカテゴリーに分けられ得ることが明確になった。１つは、糖鎖が、血液からの糖タンパク質のクリアランス、リソソーム酵素のリソソームへのターゲッティング、糖タンパク質による特定の組織および器官へのターゲッティングにおいて、細胞間接着のリガンドとして、および細菌およびウイルスの受容体として直接的な機能を有する場合である。例えば、エイズウイルス（ＨＩＶ）が標的細胞に感染する過程で、糖タンパク質の糖鎖が関与していることが示されている（Ｒａｂｅｈｉ，Ｌ．ら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，１２，７−１６，１９９５）。ＨＩＶ表面は、エンベロープタンパク質ｇｐ１２０で覆われ、ｇｐ１２０の糖鎖が標的細胞のＣＤ４に結合することでＨＩＶウイルスの感染が始まる。糖鎖のもう１つの働きは、糖鎖自体は機能的分子ではないが、タンパク質の高次構造の形成、タンパク質の溶解性、タンパク質のプロテアーゼ抵抗性、抗原性の抑制、タンパク質機能の修飾、タンパク質代謝速度の調節および細胞膜における発現量の調節などに間接的に関与する場合である。例えば、神経系に広く分布する神経細胞接着分子の接着性は糖鎖により調節されている（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５４，１３５−１６９，１９８５）。
【０００４】
真核生物では、糖タンパク質の糖鎖は、小胞体の脂質上で前駆体型糖鎖として合成される。糖鎖部分はタンパク質に転移され、次いでこのタンパク質上のいくつかの糖残基が除去され、ゴルジ体に輸送される。ゴルジ体において、過剰の糖残基が除去された後、さらなる糖残基（例えばマンノース）が付加され、そして糖鎖が伸長される（Ｎａｒｉｍａｔｓｕ，Ｈ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３８，４８９−５０４，１９９４）。
【０００５】
より詳細に述べれば、例えば、ドリコールアンカー（ｄｏｌｉｃｈｏｌ  ａｎｃｈｏｒｓ）上のＧｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２は、小胞体（ＥＲ）膜中のタンパク質に転移される（Ｍｏｒｅｍｅｎ  Ｋ．Ｗ．，Ｔｒｉｍｂｌｅ、Ｒ．Ｂ．およびＨｅｒｓｃｏｖｉｃｓ  Ａ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９９４  ４月；４（２）：１１３−２５、アスパラギン連結オリゴサッカライドプロセッシング経路のグリコシダーゼ；およびＳｔｕｒｍ，Ａ．１９９５  植物タンパク質のＮ−グリコシル化、Ｎｅｗ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，第２９ａ巻、Ｍｏｎｔｒｅｕｉｌ、Ｊ．，Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ、Ｈ．およびＶｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ、Ｊ．Ｆ．Ｇ．（編）．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ、５２１−５４１頁）。小胞体グリコシダーゼＩおよびＩＩは、３つのグルコース単位を除去する（Ｓｔｕｒｍ、Ａ．１９９５、前述；およびＫａｕｓｈａｌ  Ｇ．Ｐ．およびＥｌｂｅｉｎ  Ａ．Ｄ．，１９８９、植物における糖タンパク質プロセッシング酵素。Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １７９、Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｆ．Ｇｉｎｓｂｕｒｇ  Ｖ．（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ、４５２−４７５頁）。得られる高マンノース構造（Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）は、小胞体マンノシダーゼによりトリミングされる（Ｍｏｒｅｍｅｎ  Ｋ．Ｗ．ら、前述；およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４、６３１−６６４、１９８５；アスパラギン連結オリゴサッカライドのアセンブリ）。除去されるマンノース残基の数は、プロセッシング酵素への接近可能性における差異に従って変動する。アイソマー類であるＭａｎ８−、Ｍａｎ７−、Ｍａｎ６−およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が、小胞体マンノシダーゼおよびマンノシダーゼＩによるプロセッングの間に生産される（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ．，前述）。４つのマンノース残基がマンノシダーゼＩ（Ｍａｎ  Ｉ）によって完全に除去されるとき、産物は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２である。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃＩ）は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃからＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２へ転移し、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を生じる（Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ，Ｈ．，Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ，Ｓ．，Ｇｌｅｅｓｏｎ，Ｐ．，およびＶｅｌｌａ，Ｇ．，グリコシルトランスフェラーゼは、複合型またはＮ−アセチルガラクトサミン型のＮ−グリコシル的に連結されたオリゴサッカライドの伸長に関与する。Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ９８：Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｌ．Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ，Ｓ．，およびＦｌｅｉｓｃｈｅｒ，Ｂ．（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ．９８−１３４頁、１９８３）。マンノシダーゼＩＩ（Ｍａｎ  ＩＩ）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２から２つのマンノース残基を除去し、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を生じる（Ｋａｕｓｈ��ｌ，Ｇ．Ｐ．およびＥｌｂｅｉｎ，Ａ．Ｄ．，前述；およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ．，前述）。オリゴサッカライドＧｌｃＮＡｃＭａｎ４ＧｌｃＮＡｃ２は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃＩＩ）の基質として用いられる（Ｍｏｒｅｍｅｎ，Ｋ．Ｗ．ら、前述；Ｋａｕｓｈａｌ，Ｇ．Ｐ．およびＥｌｂｅｉｎ，Ａ．Ｄ．，前述；およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｒ．およびＫｏｒｎｆｅｌｄ，Ｓ．，前述）。図１９は、Ｎ−結合グリカンの上記の構造、ならびに小胞体およびゴルジ体中の糖鎖修飾経路に関与する酵素を要約する。図１９において、白抜きの菱形はグルコースを、白抜きの四角はＧｌｃＮＡｃを、白抜きの丸はマンノースを、黒丸はガラクトースを、そして黒四角はシアル酸をそれぞれ示す。
【０００６】
このゴルジ体における糖付加は末端部糖鎖合成と呼ばれ、このプロセスは、生物種により大きく異なる。糖鎖生合成系は、真核生物の種によって異なり、その結果糖鎖構造は種特異的であり、そして糖を付加する糖転移酵素およびゴルジ体の進化を反映している（成松久、細胞工学、１５，８０２−８１０，１９９６）。
【０００７】
アスパラギン結合型（Ｎ−結合型）糖鎖に注目すると、動物には、高マンノース型糖鎖、複合型糖鎖およびそのハイブリッド型が存在する。図１にそれらの構造を示す。一方、植物の複合型糖鎖には、動物の糖鎖にはないα１−３フコースとβ１−２キシロースが存在する（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｄ．およびＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，８４，１３０１−１３０８，１８９７、Ｋｉｍｕｒａ，Ｙ．ら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６，２１５−２２２，１９９２）。また、Ｎ結合型糖鎖としては植物糖鎖には動物糖鎖に見出されるシアル酸が存在せず、動物糖鎖に一般に存在するガラクトースも、シカモア細胞のラッカーゼの糖鎖に見出されているが（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｎ．およびＨｏｔｔａ，Ｔ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５，３８８−３９５，１９８６）、その例は少なく、またその結合型もβ１−３結合である（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １９９７  ９月  ２９，４１５（２）、１８６−１９１、植物細胞懸濁培養（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｍｙｔｉｌｌｕｓ  Ｌ．）からの分泌ペルオキシダーゼ中のヒトＬｅｗｉｓ（ａ）炭水化物モチーフの同定、Ｍｅｌｏ  ＮＳ、Ｎｉｍｔｚ  Ｍ、Ｃｏｎｔｒａｄｔ  ＨＳ、Ｆｅｖｅｒｅｉｒｏ  ＰＳ、Ｃｏｓｔａ  Ｊ；Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９９７  １２月．１２（６）１４１１−１４１７、Ｌｅｗｉｓ  ａエピトープを保持するＮ−グリカンは、植物細胞の表面で発現される。Ｆｉｔｃｈｅｔｔｅ−Ｌａｉｎｅ  ＡＣ、Ｇｏｍｏｒｄ  Ｖ、Ｃａｂａｎｅｓ  Ｍ、Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ  ＪＣ、Ｓａｉｎｔ  Ｍａｃａｒｙ  Ｍ、Ｆｏｕｃｈｅｒ  Ｂ、Ｃａｖｅｌｉｅｒ  Ｂ、Ｈａｗｅｓ  Ｃ、Ｌｅｒｏｕｇｅ  Ｐ、Ｆａｙｅ  Ｌ）。この結合は、動物で見出される結合とは異なる。
【０００８】
一般に、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）などヒト由来の有用な糖タンパク質は、ヒトに近い糖鎖構造を有する糖タンパク質を生産する動物細胞宿主で生産されている。しかし、動物細胞で生産されたＥＰＯは、本来の糖鎖構造とは異なる糖鎖構造を有し、生体内における活性が低下した（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，７８１９−７８２２，１９８９）。ホルモン、インターフェロンなどのヒト由来の他の有用タンパク質の糖鎖構造が解析され、ＥＰＯと同じグルコシル化制限をともなって工業的に生産されている。
【０００９】
近年、外来遺伝子を植物に導入する方法として、アグロバクテリウム法（Ｗｅｉｓｉｎｇ，Ｋ．ら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２２，４２１，１９８８）、エレクトロポレーション法（Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１０７２，１９８８）、金粒子法（Ｇａｓｓｅｒ，Ｃ．Ｇ．およびＦｒａｌｅｙ，Ｒ．Ｔ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２９３，１９８９）などが確立され、アルブミン（Ｓｉｊｍｏｎｓ，Ｐ．Ｃ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，２１７，１９９０）、エンケファリン（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ，Ｊ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，９２９，１９８９）、およびモノクローナル抗体（Ｂｅｎｖｅｎｕｌｏ，Ｅ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７，８６５，１９９１およびＨｉａｔｔ，Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３４２，７６，１９８９）、が植物で生産され、そしてＢ型肝炎ウイルス主要表面抗原（ＨＢｓＡｇ）（Ｍａｓｏｎ，Ｈ．Ｓ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８９，１１７４５，１９９２）、および分泌型ＩｇＡ（Ｈｉａｔｔ，Ａ．およびＭａ，Ｊ．Ｓ．Ｋ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３０７，７１，１９９２）を植物細胞中で生産し得ることも記載されている。しかし、ヒト由来の糖タンパク質を植物で発現する場合、植物は、ヒトと異なる糖鎖付加機構を有するため、生産される糖タンパク質の糖鎖は、ヒトで生産される糖鎖とは異なる構造を有し、本来の生理活性を示さず、また抗原となり得ることが指摘されている（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｉ．Ｂ．Ｈ．ら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．８，Ｎｏ．７，ｐｐ６５１−６６１，１９９８）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、哺乳動物、例えば、ヒト型の糖鎖をもつ植物が生産する組換え糖タンパク質を提供することにより、上記先行技術に関連する課題を解決することである。
【００１１】
本発明は、ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法に関する。この方法は、植物細胞に、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換細胞を得る工程、および得られた形質転換植物細胞を培養する工程を包含する。
【００１２】
本発明において、上記ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質は、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、上記コア糖鎖は、複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンから本質的になり、上記外部糖鎖は、非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含み得る。
【００１３】
本発明において、上記外部糖鎖は、直鎖状構造または分岐状構造を有し得る。
【００１４】
本発明において、上記分岐糖鎖部分は、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造であり得る。
【００１５】
本発明において、上記糖タンパク質は、フコースおよびキシロースを含まなくともよい。
【００１６】
本発明はまた、１つの局面で、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る糖鎖付加機構を備えた植物細胞に関し、この糖鎖付加機構は、コア糖鎖および外部糖鎖を含む糖鎖であって、このコア糖鎖は、複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンから本質的になり、この外部糖鎖は非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含む糖鎖を付加する。
【００１７】
本発明はまた、１つの局面で上記の方法によって得られたヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】代表的なＮ結合型糖鎖の構造を示す模式図である。
【図２】ｈＧＴのクローニングの方法の模式図である。
【図３】ｈＧＴ発現用ベクターｐＧＡｈＧＴの構築方法の模式図である。
【図４】形質転換体タバコ培養細胞のゲノムのサザン解析を示す写真である。図４（Ａ）は、ゲノムＤＮＡ（４０μｇ）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後の電気泳動を示す。左側の数字はＤＮＡ分子量マーカーの位置を表す。図４（Ｂ）は、各形質転換細胞に組み込まれた、プロモーター、ｈＧＴ、ターミネーターを含む２．２ｋｂの断片の模式図を示す。
【図５】図５は、形質転換タバコＢＹ２細胞（ＷＴ）および野生型タバコＢＹ２細胞（ＷＴ）からの免疫反応性タンパク質のウェスタンブロッティングの写真である。タンパク質を変性させ、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、そしてニトロセルロース膜に電気的に転写した。レーンの数字は、サンプルがそれぞれ以下のものに由来したことを示す：１＝ＧＴ１の細胞抽出物；２＝ＧＴ６の細胞抽出物；３＝ＧＴ８の細胞抽出物；４＝ＧＴ９の細胞抽出物；５＝野生型の細胞抽出物；６＝ＧＴ１のミクロソーム画分；７＝ＧＴ６のミクロソーム画分；８＝ＧＴ８のミクロソーム画分；９＝ＧＴ９のミクロソーム画分；および１０＝野生型のミクロソーム画分。
【図６】Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＲＣＡ120）アフィニティークロマトグラフィーを用いたガラクトシル化糖タンパク質の検出を示す電気泳動写真である。電気泳動ゲルは、銀染色により可視化した。レーン１および２は野生型ＢＹ２細胞からのタンパク質を示し、そしてレーン３および４は、形質転換ＧＴ６細胞からのタンパク質を示す。分子量はＫＤａの単位である。
【図７】Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＲＣＡ120）アフィニティークロマトグラフィーを用いたガラクトシル化糖タンパク質の検出を示すウェスタンブロッティングの写真である。電気泳動したゲルをニトロセルロース膜上へブロットした後、このブロットをレクチン（ＲＣＡ120）染色して可視化した。レーン１および２は野生型ＢＹ２細胞からのタンパク質を示し、そしてレーン３および４は、形質転換ＧＴ６細胞からのタンパク質を示す。分子量はＫＤａの単位である。
【図８】Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ（ＲＣＡ120）アフィニティークロマトグラフィーを用いたガラクトシル化糖タンパク質を、植物の複合型グリカンに存在するキシロースに特異的な抗血清でプローブしたブロッティングの写真である。レーン１および２は、ＢＹ２およびＧＴ６からの総タンパク質抽出物をそれぞれ示し、レーン３は、ＲＣＡ120アフィニティークロマトグラフィー後のＧＴ６からの糖タンパク質を示す。分子量はＫＤａの単位である。
【図９】カナマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子を有するバイナリーベクターであり、ＨＲＰ  ｃＤＮＡを有するプラスミドｐＢＩＨｍ−ＨＲＰの模式図である。
【図１０】トランスジェニック懸濁培養細胞におけるＨＲＰの産生を示す等電点電気泳動およびウエスタンブロッティングの写真である。図１０（Ａ）は等電点電気泳動の結果を示し、そして図１０（Ｂ）はウエスタンブロッティングの結果を示す。略語は以下の通りである：ＷＴ＝野生型；ＢＹ２−ＨＲＰ  １、５、および７＝ＨＲＰ遺伝子で形質転換したＢＹ２細胞のクローン番号；ならびにＧＴ６−ＨＲＰ  ４、５、および８＝ＨＲＰ遺伝子で形質転換したＧＴ６細胞のクローン番号。
【図１１】０．０２％ＴＦＡ中でアセトニトリルの濃度を０〜１５％の直線状勾配で６０分間かけて増加させ、１．２ｍｌ／分の流速で溶出したＰＡ糖鎖の逆相ＨＰＬＣパターンを示すグラフである。Ｉ〜ＸＩは、サイズ分画ＨＰＬＣにおいて溶出および精製した個々の画分を示す。励起波長および放出波長は、それぞれ、３１０ｎｍおよび３８０ｎｍであった。
【図１２】図１１におけるＰＡ鎖のサイズ分画ＨＰＬＣパターンを示すグラフである。ＰＡ糖鎖を、水−アセトニトリル混合物中で水の濃度を３０〜５０％に４０分間かけて増加させ、０．８ｍｌ／分の流速で溶出させた。励起波長および放出波長は、それぞれ、３１０ｎｍおよび３８０ｎｍであった。
【図１３】２つの標準品糖鎖ＡおよびＢと比較した、逆相ＨＰＬＣにおけるピーク−Ｋ２の溶出位置を示すグラフである。溶出条件は、図１１と同様に０．０２％ＴＦＡ中でアセトニトリルの濃度を０〜１５％の直線状勾配で６０分間かけて増加させ、１．２ｍｌ／分の流速で溶出であった。
【図１４】エクソグリコシダーゼ消化後に得られたガラクトシル化ＰＡ糖鎖のＳＦ−ＨＰＬＣプロフィールを示すグラフである。ＰＡ糖鎖を、水−アセトニトリル混合物中の水含量を３０〜５０％で２５分間かけて増加させ、０．８ｍｌ／分の流速で溶出させた。（Ａ）ＰＡ−糖鎖Ｋ−２；Ｉ．用いたガラクトシル化ＰＡ糖鎖の溶出位置；ＩＩ．Ｉのβ−ガラクトシダーゼ消化物；ＩＩＩ．ＩＩのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ消化物；ＩＶ．ＩＩＩのタチナタマメ  α−マンノシダーゼ消化物。（Ｂ）ＰＡー糖鎖Ｌ；Ｉ．用いたガラクトシル化ＰＡ糖鎖の溶出位置；ＩＩ．Ｉのβ−ガラクトシダーゼ消化物；ＩＩＩ．ＩＩのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ消化物；ＩＶ．ＩＩＩのα１−２マンノシダーゼ消化物；Ｖ．ＩＩＩのタチナタマメ  α−マンノシダーゼ消化物。
【図１５】形質転換細胞から得られたＮ結合型グリカンの推定構造を示す図である。括弧内の数字は、モル比を示す。
【図１６】糖付加ＨＲＰの検出を示す、Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ  １２０  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＲＣＡ120）アフィニティークロマトグラフィーの写真である。図１６（Ａ）は銀染色、そして図１６（Ｂ）はレクチンＲＣＡ120での染色の結果である。レクチン染色のフィルターを細片に切断し、そして緩衝液単独（ＩおよびＩＩ）または過剰なガラクトースを含有する緩衝液（ＩＩＩ）でプレインキュベートしたレクチンＲＣＡ120でプローブした。（ＩＩ）では、ＨＲＰを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前にＤｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのβ−ガラクトシダーゼで処理した。レーン１はＢＹ２−ＨＲＰからの収集画分；そしてレーン２はＧＴ６−ＨＲＰからの収集画分である。左側の数字は、タンパク質の標準品の位置およびサイズ（ＫＤａ）を示す。
【図１７】ＲＣＡ120アフィニティークロマトグラフィーの後に精製されたＨＲＰからのＰＡ糖鎖の逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１８】植物特異的な複合型グリカンの免疫検出を示すウェスタンブロッティングの写真である。精製されたＨＲＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ニトロセルロースに転写し、そしてウサギ抗ＨＲＰ（Ａ）または植物の複合型グリカンに特異的な抗血清（Ｂ）でプローブした。レーン１＝ＢＹ２−ＨＲＰからの精製ＨＲＰ；レーン２＝ＲＣＡ120アフィニティークロマトグラフィー後のＧＴ６−ＨＲＰからのガラクトシル化ＨＲＰ。分子のサイズマーカーの位置を、ＫＤａで左に示す。形質転換体ＧＴ６−ＨＲＰ細胞由来のＨＲＰ上のガラクトシル化Ｎ−グリカンは、植物Ｎ−グリカンの指標であるβ１，２キシロース残基と特異的に反応することが示された抗血清と反応しなかった。
【図１９】小胞体およびゴルジ体中の糖鎖修飾経路に関与するＮ−結合グリカンの構造および酵素。白抜き菱形はグルコースを、白抜き四角はＧｌｃＮＡｃを、白抜き丸はマンノースを、黒丸はガラクトースを、そして黒四角はシアル酸をそれぞれ示す。
【図２０】ＧＴ６細胞株中のＮ−結合グリカン類の構造、および各Ｎ−結合グリカンの比率を、同様に測定された野生型ＢＹ２細胞株それらとともに示す。白抜き四角はＧｌｃＮＡｃを、白抜き丸はマンノースを、黒丸はガラクトースを、そして黒四角はシアル酸をそれぞれ示す。
【図２１】本発明の１つの実施態様を図示する。ＧＴ６細胞株において、アイソマー類Ｍａｎ７−、Ｍａｎ６−およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が認められた。これらの高マンノース型オリゴサッカライドは、いくつかのグリカンプロセッシング酵素によって、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ  Ｔ）の基質であるように変換されるので、ＧｌｃＮＡｃ  Ｉ、Ｍａｎ  ＩおよびＭａｎ  ＩＩ  ｃＤＮＡ類の導入は、オリゴサッカライドＭａｎ７−５ＧｌｃＮＡｃ２を、ＧａｌＴの基質であり得るＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２により効率的に導き得る。
【図２２】この図もまた、本発明の１つの実施態様を示す。１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ  Ｔ）は、ＵＤＰ−ガラクトースをドナー基質として用い、そしてＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をアクセプター基質として用いる。ＵＤＰ−ガラクトースのオリゴサッカライドを産生し得る。効率的な供給は、Ｇａｌ Ｔ酵素反応を増大し、そしてより多くのガラクトシル化オリゴサッカライドを産生し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明を実施することにおいて、他に特定されない限り、当該分野で公知である、タンパク質の分離および分析法、ならびに免疫学的手法が採用され得る。これらの手法は、市販のキット、抗体、標識物質などを使用して行い得る。
【００２１】
本発明の方法は、ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法に関する。本明細書において、「ヒト型糖鎖」とは、Ｎ−アセチルグルコサミン残基と結合したガラクトース残基を有する糖鎖をいう。ヒト型糖鎖におけるガラクトース残基は糖鎖の末端であってもよいし、ガラクトース残基のさらに外側にシアル酸残基が結合していてもよい。本発明の糖タンパク質は、ヒト型糖鎖のコア糖鎖部分、分岐糖鎖部分、および末端糖鎖部分からなる１つ以上の部分において、キシロースおよびフコースの少なくとも一方が結合していないことが好ましく、ヒト型糖鎖のいずれの部分においてもキシロースおよびフコースの少なくとも一方が結合していないことがより好ましく、最も好ましくはヒト型糖鎖中にキシロースおよびフコースのいずれも含まないことがさらにより好ましい。
【００２２】
植物細胞とは、所望の任意の植物細胞であり得る。植物細胞は、培養細胞、培養組織中の細胞、培養器官中の細胞、または植物体中の細胞のいずれの形態であってもよい。好ましくは、植物細胞は、培養細胞、培養組織中の細胞、または培養器官中の細胞であり、最も好ましくは、この植物細胞は、ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質を産生する、完全な植物、またはその一部にある細胞である。本発明の生産方法に使用され得る植物種は、遺伝子導入を行い得る任意の植物種であり得る。本発明の生産方法に使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙げられる。
【００２３】
ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げられ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、ペチュニアなどを含む。
【００２４】
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
【００２５】
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
【００２６】
バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、またはＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。
【００２７】
マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシなどを含む。
【００２８】
ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、メロンなどを含む。
【００２９】
シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソなどを含む。
【００３０】
ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チューリップなどを含む。
【００３１】
アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウを含む。
【００３２】
セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、またはＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。
【００３３】
本発明の生産方法に用いられる植物は、好ましくはタバコ、トマト、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ウマゴヤシ、およびホウレンソウであり、より好ましくは、タバコ、トマト、ジャガイモ、トウモロコシ、およびダイズである。
【００３４】
本明細書において、「非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素」とは、植物細胞内の糖タンパク質のタンパク質部分の合成後、糖鎖付加の際に生じる非還元末端アセチルグルコサミン残基へガラクトース残基を転移し得る酵素である。このような酵素の例としては、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ラクトースシンターゼ、β−ガラクトシダーゼが挙げられる。このような酵素は、任意の動物種に由来し得るが、哺乳動物に由来することが好ましく、ヒトに由来することがより好ましい。
【００３５】
本明細書において、「非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子」は、この酵素をコードすることが公知のヌクレオチド配列を用いて任意の動物細胞から単離してもよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。
【００３６】
本明細書では、「遺伝子」とは、構造遺伝子部分をいう。遺伝子には、植物での発現に適切なように、プロモーター、オペレーター、およびターミネーターなどの制御配列が連結され得る。
【００３７】
本明細書において、「異種糖タンパク質」とは、本発明に用いられる植物において本来発現されない糖タンパク質をいう。異種糖タンパク質の例としては、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、ワクチン、レセプター、血清タンパク質などが挙げられる。酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、キナーゼ、グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）などが挙げられる。ホルモンおよびサイトカインの例としては、エンケファリン、インターフェロンアルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、絨毛性性腺刺激ホルモン、インターロイキン−２、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、エリスロポイエチン、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、プロラクチン、卵胞刺激ホルモンなどが挙げられる。抗体の例としては、ＩｇＧ、ｓｃＦｖなどが挙げられる。ワクチンの例としては、Ｂ型肝炎表面抗原、ロタウイルス抗原、大腸菌エンテロトキシン、マラリア抗原、狂犬病ウイルスｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓのＧタンパク質、ＨＩＶウイルス糖タンパク質（例えば、ｇｐ１２０）などが挙げられる。レセプターおよびマトリックスタンパク質の例としては、ＥＧＦレセプター、フィブロネクチン、α１−アンチトリプシン、凝固因子ＶＩＩＩなどが挙げられる。血清タンパク質の例としては、アルブミン、補体系タンパク質、プラスミノーゲン、コルチコステロイド結合グロブリン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、スロキシン結合グロブリン（Ｔｈｒｏｘｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、プロテインＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ）などが挙げられる。
【００３８】
本明細書において、「異種糖タンパク質の遺伝子」は、目的の異種糖タンパク質をコードすることが公知のヌクレオチド配列を用いて任意の細胞から単離してもよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。
【００３９】
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素および異種糖タンパク質の遺伝子は、当該分野で公知の方法により、植物細胞へ導入される。これらの遺伝子は、別々に導入してもよいし、同時に導入してもよい。植物細胞への遺伝子の導入方法の例としては、アグロバクテリウム法、エレクトロポレーション法、金粒子法などが挙げられる。
【００４０】
遺伝子が導入された植物細胞は、当該分野で公知の方法により、導入された遺伝子の発現が確認され得る。このような確認方法としては、銀染色、ウェスタンブロッティング、ノザンハイブリダイゼーション、酵素活性の検出などが挙げられる。導入された遺伝子を発現する細胞は、形質転換細胞である。
【００４１】
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素および異種糖タンパク質を発現する形質転換細胞は、ヒト型の糖鎖を有する異種糖タンパク質を発現する。つまり、このようにして得られた形質転換植物は、ヒト型の糖鎖付加機構を有する。形質転換細胞を培養することにより、ヒト型の糖タンパク質が大量に生産され得る。ヒト型の糖タンパク質は、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、このコア糖鎖は、複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンから本質的になる。得られる糖タンパク質の外部糖鎖は、非還元末端糖鎖部分を含む。外部糖鎖は、直鎖状構造をもっていても分岐状構造をもっていてもよい。分岐糖鎖部分が、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造のいずれかであり得る。形質転換細胞により生産される糖タンパク質は、好ましくは、フコースまたはキシロースを含まない。
【００４２】
得られた形質転換植物細胞は、培養細胞の状態で維持されてもよいし、特定の組織または器官へと分化させてもよいし、完全な植物体に再生させてもよい。あるいは、完全な植物体から得られる、種子、果実、葉、根、茎、花などの部分であってもよい。
【００４３】
形質転換植物細胞により生産された、ヒト型の糖鎖をもつ糖タンパク質は、植物細胞から単離または抽出されてもよい。糖タンパク質の単離方法は、当該分野で公知である。あるいは、本発明の糖タンパク質は、形質転換細胞中に含まれたままの状態で食用に供され得る。本発明の糖タンパク質は、ヒト型の糖鎖付加を有するので、抗原性を有さず、それゆえ、ヒトを含む動物への投与に適している。
【００４４】
以後、本発明を、制限ではない例示の実施例によって詳細に記載する。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）ヒトβ１−４ガラクトース転移酵素遺伝子のクローニング
β１−４ガラクトース転移酵素（ｈＧＴ）（ＥＣ２．４．１．３８）は、すでにクローン化されており、４００アミノ酸からなる一次構造が明らかにされている（Ｍａｓｒｉ，Ｋ．Ａ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５７，６５７−６６３，１９８８）。
【００４６】
（１）プライマーの作製と鋳型ＤＮＡ
Ｍａｓｒｉ．らの報告を参考にし、以下のようなプライマーを作製した。
ｈＧＴ−５Ｅｃｏ：５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＧＴＣＣＣＴ−３’（配列番号１）
ｈＧＴ−２Ｓａｌ：３’−ＴＣＧＡＴＣＧＣＡＡＡＡＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＧ−５’（配列番号２）
ｈＧＴ−７Ｓｐｅ：３’−ＡＣＧＧＧＡＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＡＴＧＡＴＣＡＴＡＡ−５’（配列番号３）
ｈＧＴ６Ｓｐｅ：５’−ＡＡＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡ−３’（配列番号４）
鋳型ＤＮＡは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入したヒトゲノムＤＮＡ、ヒト胎盤ｃＤＮＡ、ヒト腎臓ｃＤＮＡを用いた。
【００４７】
（２）ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
（ｉ）ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｈＧＴ−５ＥｃｏとｈＧＴ−７Ｓｐｅとをプライマーに用い；および（ｉｉ）ヒト胎盤ｃＤＮＡを鋳型とし、ｈＧＴ−２ＳａｌとｈＧＴ６Ｓｐｅとをプライマーに用いた、２つの組み合わせで以下の条件でＰＣＲ反応を行い、ｈＧＴをコードする領域を含む０．４ｋｂおよび０．８ｋｂの断片を得た。
（ＰＣＲ反応系）鋳型ＤＮＡ１μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰｓ（２００μＭ）４μｌ、プライマー（１０ｐｍｏｌ）、Ｔａｇポリメラーゼ（宝酒造（株））０．５μｌ（Ｔｕｂポリメラーゼの場合は０．２μｌ）に水を加えて５０μｌとした。
（ＰＣＲ反応条件）第１段階：サイクル数１、変性（９４℃）５分、アニーリング（５５℃）１分、伸長（７２℃）２分。第２段階：サイクル数３０、変性（９４℃）１分、アニーリング（５５℃）１分、伸長（７２℃）２分。第３段階：サイクル数１、変性（９４℃）１分、アニーリング（５５℃）２分、伸長（７２℃）５分。
【００４８】
得られた２つの断片を組み合わせてｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡを構築し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ＳＫ）にサブクローニングした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ＳＫ）は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入した。図２に、ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡを含むプラスミドの構築を示す。得られたｈＧＴ遺伝子の塩基配列を配列番号５に、そして推定されるアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００４９】
得られた配列は、Ｍａｓｒｉら（上述）に開示のｈＧＴ配列と比較して以下の点で異なっていた。ａ）位置５２８のＡがＧに、位置５６２のＣがＴに、位置１０４７のＡがＧにそれぞれ変わっていたがコードされるアミノ酸に変化はなかった。ｂ）位置６２２から６３０の９塩基が欠失していた。ｃ）得られた上記の０．４ｋｂおよび０．８ｋｂの断片を接続するためにプライマー作製時に位置４０５のＧをＡに、位置４０８のＴをＡにそれぞれ変換した。なお、ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡには２つの開始コドン（ＡＴＧ）があるが、本実験では、第２番目の開始コドン（位置３７）から翻訳が始まるように設計した。
【００５０】
（実施例２）ｈＧＴ遺伝子のタバコ培養細胞への導入
（１）ｈＧＴは大腸菌で活性型として発現することが報告されている（Ａｏｋｉ，  Ｄ．ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，３１７１，１９９０、およびＮａｋａｚａｗａ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１３，７４７，１９９３）。
【００５１】
ｈＧＴをタバコ培養細胞で発現するために、発現用ベクターｐＧＡｈＧＴを図３に示すように構築した。プロモーターとしては、植物細胞内で構成的に発現するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター）を用いた。選択マーカーにはカナマイシン耐性遺伝子を用いた。ｐＧＡｈＧＴをアグロバクテリウムを介してタバコ培養細胞に導入した。
【００５２】
アグロバクテリウムの形質転換は、Ｂｅｖａｎ．ら，のｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ  ｍａｔｉｎｇ法（Ｂｅｖａｎ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２，８７１１，１９８４）を用いて行った。ｐＧＡ系プラスミド（Ａｎ，Ｇ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３，２９２，１９８７）をもつ大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株（ｓｕＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９、（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）、ｈｓｄＲ１７）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．：Ｆｏｃｕｓ  ８（２）、９（１９８６））、およびヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（Ｂｅｖａｎ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２，８７１１，１９８４）をもつ大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１を、それぞれ１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイクリン、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ培地で３７℃で１晩、アグロバクテリウムＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０１株（Ｅｌｉｚａｎｂｅｔｈ，Ｅ．Ｈ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６８，１２９１，１９８６）を、５０ｍｇ／ｌのカナマイシン、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地で２８℃で２晩培養した。各培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチューブにとり集菌した後、ＬＢ培地で３回洗浄した。得られた菌体をそれぞれ１００μｌの２×ＹＴ培地に懸濁した後、３種類の菌を混合し、２×ＹＴ寒天培地に塗抹し、２８℃で培養してｐＧＡ系プラスミドを大腸菌からアグロバクテリウムに接合伝達させた。２日後、２×ＹＴ寒天培地上で一面に増殖した菌体の一部を白金耳でかきとり、５０ｍｇ／ｌのカナマイシン、１２．５ｍｇ／ｌのテトラサイクリン、２５ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。
【００５３】
タバコ培養細胞の形質転換は、Ａｎ，Ｇ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｍａｎｎｕａｌ，Ａ３，１．に記載の方法により行った。テトラサイクリン１２．５ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地で２８℃で３６時間培養したアグロバクテリウム（ｐＧＡ系のプラスミドをもつＥＨＡ１０１株）と培養４日目のタバコ培養細胞Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ．ｂｒｉｇｈｔ  ｙｅｌｌｏｗ  ２（理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター、ジーンバンク室植物細胞開発銀行のカタログ番号ＲＰＣ１より細胞株名ＢＹ−２として入手した）の懸濁液をそれぞれ１００μｌ、４ｍｌずつシャーレに入れてよく混ぜ、２５℃に暗所で静置した。２日後シャーレの中の培養液を遠心管に移して遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）により上澄みを除いた。次に新しい培地を入れて遠心分離し、細胞を１５０〜２００ｍｇ／ｌのカナマイシン、２５０ｇｍｇ／ｌのカルべニシリンの入った改変ＬＳ寒天培地のプレートに塗抹し、２５℃暗黒下で静置した。約２〜３週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているクローンを選択した。さらに２〜３週間後に、カナマイシン、カルベニシリンを加えた改変ＬＳ培地３０ｍｌに移し、継代培養を行った。約１ケ月間選択を繰り返した。得られたいくつかの耐性株の中から無作為に６つの耐性株（ＧＴ１、４、５、６、８、および９）を選択した。
【００５４】
（２）導入されたｈＧＴ遺伝子の確認
得られた耐性株についてＴ−ＤＮＡ中の、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター−ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡ−ＮＯＳターミネーターを含む２．２ｋｂの断片がタバコ培養細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれていることをサザン解析により確認した。上記の各耐性株からゲノムＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、サザン解析を行った。
【００５５】
タバコ培養細胞からの染色体ＤＮＡの調製は、渡部の方法（渡部格、「クローニングとシーケンス」、植物バイオテクノロジー実験マニュアル、農村分化社）に従って行った。まず最初に、タバコ培養細胞１０ｍｌを液体窒素で凍結し、乳鉢、乳棒を用いて、粉末状になるまで粉砕した。得られた約５ｇの粉末が融解しないうちに、遠心管（４０ｍｌ）中で６０℃に予熱した５ｍｌの２×ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ））液に入れてゆっくりよく混ぜ、６０℃で１０分間以上、時々混ぜながら保温した。クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）５ｍｌを加え、エマルジョンができるまでよく混ぜてから、遠心分離（２，８００ｒｐｍ、１５分、室温）した。上層を新しい４０ｍｌ遠心管に移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いて抽出操作を繰り返した。得られた上層に１／１０容量の１０％ＣＴＡＢを入れてよく混合した後、遠心分離操作を行った（２，８００ｒｐｍ、１５分、室温）。上層を新しい遠心管に移し、１容量の冷イソプロパノールを入れて良く混ぜ、遠心分離（４，５００ｒｐｍ、２０分、室温）した。上清液をアスピレータで除いた後、５ｍｌの１Ｍ塩化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液を入れ、５５〜６０℃で完全に溶解した。これに、５ｍｌの冷イソプロパノールを入れ、ＤＮＡが見えたら、チップの先に引っかけてエッペンドルフチューブ（８０％冷エタノール入り）に移しリンスした。さらにＤＮＡを７０％エタノールでリンスし、乾燥した沈殿を、適当量のＴＥ緩衝液に溶かし、５μｌのＲＮＡａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で１時間反応させた：２×ＣＴＡＢ液の組成；２％ＣＴＡＢ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．４Ｍ塩化ナトリウム、１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）；１０％ＣＴＡＢ液の組成；１０％ＣＴＡＢ、０．７Ｍ塩化ナトリウム。
【００５６】
サザン解析は、以下のように行った。
【００５７】
（ｉ）ＤＮＡの電気泳動およびアルカリ変性：得られた染色体ＤＮＡ４０μｇを制限酵素で完全分解した後、標準的な方法を用い、１．５％アガロースゲル電気泳動（５０Ｖ）を行った。ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、写真撮影した後、４００ｍｌの０．２５Ｍ  ＨＣｌ中で２０分間振とうした後、液を捨て、４００ｍｌの変性溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＨ）にゲルを浸し、４５分間ゆっくり振とうした。次いで液を捨て、４００ｍｌの中和溶液（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．４））を入れて１５分間ゆっくり振とうした後液を捨て、再び中和溶液を４００ｍｌ入れて１５分間ゆっくり振とうした。（ｉｉ）トランスファー：電気泳動後のＤＮＡを、２０×ＳＳＣを用いてナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）にトランスファーした。トランスファーは１２時間以上行った。プロットしたメンブレンを、室温で、１時間乾燥させた後、５分間ＵＶ固定を行った。２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ  ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム。（ｉｉｉ）ＤＮＡプローブの調製：ＤＮＡプローブの調製は、Ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造）を用いて行った。エッペンドルフチューブに次の反応液を調製し、９５℃、３分間加熱後、氷中で急冷した；鋳型ＤＮＡ  ２５ｎｇ、Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ２μｌ、水を加えて５μｌとする。１０×緩衝液、ｄＮＴＰをそれぞれ２．５μｌ、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（１．８５ＭＢｑ、５０ｍＣｉ）を５μｌ加え、Ｈ2Ｏで２４μｌにフィルアップした。Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １μｌを加え、３７℃で１０分間保温した後、ＮＡＰ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で溶出させてＤＮＡを精製した。９５℃で３分間加熱した後、氷中で急冷し、ハイブリダイゼーションブローブとした。（ｉｖ）ハイブリダイゼーション：０．０５ｍｇ／ｍｌ  ０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを、以下のプレハイブリダイゼーション溶液に加えて、上記（ｉｉ）のメンブレンを浸漬し、４２℃で２時間以上プレハイブリダイゼーションを行った。その後、（ｉｉｉ）で調製したＤＮＡプローブを加え、４２℃で１２時間以上ハイブリダイゼーションを行った：プレハイブリダイゼーション溶液の組成；５×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液を希釈して使用）、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ。１００×デンハルト溶液の組成：２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌ  ４００、２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）。（ｖ）オートラジオグラフィー：以下の順で洗浄した後、標準的な方法によりオートラジオグラフィーを行った。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間、２回、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間、１回。
【００５８】
上記で得られた耐性株のそれぞれから調製したゲノムＤＮＡのサザン分析の結果を図４に示す。図４に示されるように、ＧＴ１、６、８および９の４株についてｈＧＴ遺伝子が組み込まれていることが確認された。
【００５９】
（実施例３）ガラクトシルトランスフェラーゼ形質転換体の解析
培養５〜７日目の形質転換体（ＧＴ−１、６、８、および９）および野生型のＢＹ−２細胞の培養液からそれぞれ細胞を回収し、抽出緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；０．２５Ｍスクロース、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ  ＫＣｌ）に懸濁し、そして超音波処理により破壊（２００Ｗ；Ｋａｉｊｏ  Ｄｅｎｋｉ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）またはホモゲナイズした。細胞抽出液とミクロソーム画分を、Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，Ｔ．らの方法（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，Ｔ．およびＥｒｎｓｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｇｅｎｅ１４５，２９９−３０３，１９９４）に従って調製した。ｈＧＴタンパク質の発現は、抗ヒトガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）モノクローナル抗体（ＭＡｂ  ８６２８；１：５０００）（Ｕｅｊｉｍａ，Ｔ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５２，６１５８−６１６３，１９９２；Ｕｅｍｕｒａ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５２，６１５３−６１５７，１９９２）（創価大学成松博士より供与）を用いてウェスタンブロッティングにより検出した。次いでブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（５％スキムミルク中１：１０００；ＥＹ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）とインキュベートし、洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ発色反応は、ＰＯＤ免疫染色キット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ）を用いて実施した。
【００６０】
植物特異的複合グリカンのイムノブロット分析は、ニンジン細胞壁β−フルクトシダーゼに対して惹起されたポリクローナル抗血清および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（５％スキムミルク中１：１０００；Ｓｉｇｍａ）を用いて実施した（Ｌａｕｒｉｅｒｅ，Ｍ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０，１１８２−１１８８，１９８９）。
【００６１】
β１−４ガラクトシルトランスフェラーゼ活性は、基質として、ＵＤＰ−ガラクトースおよびピリジルアミノ標識（ＰＡ−）ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2（ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ）を用いてアッセイした（Ｍｏｒｉｔａ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０３，３３２−３３５，１９８８）。酵素反応液は、１〜１２０μｇのタンパク質、２５ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ2、２００μＭ  ＵＤＰ−ガラクトース、および１００ｎＭ  ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡを含んでいた。反応産物は、ＰＡＬＰＡＫ  Ｔｙｐｅ  ＲおよびＴｙｐｅ  Ｎカラム（Ｔａｋａｒａ社製）を製造業者の推奨する処方に従って用いてＨＰＬＣにより分析した。ＰＡ標識した標準として用いたＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、Ｇａｌ2ＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡおよびＧａｌＧｌｃＮＡｃ2Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡの２つのアイソマーは、ＴＡＫＡＲＡ  ＳＨＵＺＯおよびＨｏｎｅｎ，Ｃｏ．から購入した。
【００６２】
図５に、形質転換体および野生型由来のタンパク質のイムノブロッティングを示す。図５に示すように、分子量約５０ｋＤａのポジティブシグナルが観察された。これは、アミノ酸配列から推定される分子量（約４０ｋＤａ）より大きく、腹水から精製された、または酵母で発現されたウシガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｕｅｍｕｒａ，Ｍ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２，６１５３−６１５７，１９９２；Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（７），３３９８−３４０５，１９９６）とほぼ等しかった。細胞溶解液（図５、レーン１〜４）と比較してミクロソーム画分（図５、レーン６〜８）で観察された強い免疫反応性バンドは、ｈＧＴが細胞内に優先的に局在化していたことを示す。野生型細胞には、免疫反応性のバンドは検出されなかった。
【００６３】
形質転換体ＧＴ６および野生型ＢＹ−２のミクロソーム画分のタンパク質を、ＲＣＡ120アガロースカラム（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ）に結合させ、１５容量の１０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ６．０で洗浄した。次いで０．２Ｍラクトースで結合したタンパク質を溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した後、銀染色（Ｗａｋｏ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）（図６）またはレクチン染色した（図７）。レクチン染色には、膜ブロットをＴＴＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ＲＣＡ120（Ｈｏｎｅｎ  Ｃｏ．社製）とインキュベートし、そしてＰＯＤ免疫染色キット（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ）を用いてガラクトシル化されたグリカンを可視化した（図７）。図７に示すように、野生型のＢＹ２細胞ではＲＣＡ120の結合は観察されなかったが、ＧＴ６は、グリカン成分の非還元末端にガラクトースを持つ糖タンパク質を有していた。
【００６４】
野生型ＢＹ２細胞およびＧＴ６細胞からのタンパク質抽出物およびＲＣＡ120アフィニティークロマトグラフィーからのＧＴ６の溶出タンパク質を、複合グリカンに特異的なポリクローナル抗血清でプローブした（図８）。用いた抗血清は主に植物糖タンパク質上のβ１，２−キシロース残基に結合する（Ｌａｕｒｉｅｒｅ，Ｍ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０，１１８２−１１８８，１９８９）。図８に示すように、野生型ＢＹ２細胞（レーン１）は用いたポリクローナル抗血清と反応するいくつかの糖タンパク質を含んでいた。ＧＴ６は抗血清と反応する糖タンパク質の量が減少した（レーン２）。ＲＣＡ120アフィニティークロマトグラフィーから溶出したＧＴ６糖タンパク質は、ポリクローナル抗血清に結合せず、ガラクトシル化されたグリカンはβ１，２−キシロース残基を含んでいないことを示した（レーン３）。
【００６５】
（実施例４）ｈＧＴ導入タバコ培養細胞への西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）遺伝子の導入
上記で得られたＧＴ６株に西洋ワサビペルオキシダーゼを導入した。異なる型の植物ペルオキシダーゼの中で、西洋ワサビペルオキシダーゼ、特に中性アイソザイムＣは、いわゆるＨＲＰ（ＥＣ１．１１．１．７．）として、最もよく研究されている。ＨＲＰは、基質特異性が広く、安定性に優れることから種々の酵素反応、例えば、ウェスタンブロッティングの２次抗体などの酵素免疫法に利用されている。現在、西洋ワサビペルオキシダーゼアイソザイム遺伝子は多数クローニングされている（Ｆｕｊｉｙａｍａ，Ｋ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７３，６８１−６８７，１９８８およびＦｕｊｉｙａｍａ，Ｋ．ら，Ｇｅｎｅ，８９，１６３−１６９，１９９０）。それらのうちｐｒｘＣｌａがコードするＣｌａペルオキシダーゼ（ＣｌａＰＲＸ）は、Ｎ末端側の３０アミノ酸、Ｃ末端側の１５アミノ酸からなるエキストラペプチドを含む３５３アミノ酸からなるタンパク質として翻訳され、その後プロセッシングをうけて、３０８アミノ酸からなる成熟型酵素となることが明らかにされた（Ｆｕｊｉｙａｍａ，Ｋ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７３，６８１−６８７，１９８８）。ＣｌａＰＲＸの分子量は、４２，２００〜４４，０００であり、そのうち糖鎖が２２〜２７％を占めており、Ｎ−結合型糖鎖は８本存在することが知られている（Ｗｅｌｉｎｄｅｒ，Ｋ．Ｇ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９６，４８３−５０２，１９７９）。ＣｌａＰＲＸ遺伝子の導入は、図９に示すＨＲＰ発現用バイナリーベクターｐＢＩＨｍ−ＨＲＰを用いて行った。
【００６６】
なお、このｐＢＩＨｍ−ＨＲＰは、以下のようにして調製した。まず、ＨＲＰｃＤＮＡを保持する植物用発現ベクター３５Ｓ−ｐｒｘＣ１ａ（ＫａｗａｏｋａＡ．ら，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７８，４９−５３，１９９４）から１．９ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を切り出して調製した。このＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片は、０．８ｋｂｐのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに続く完全長の１．１ｋｂｐのｐｒｘＣ１ａｃＤＮＡ断片を含む。１．９ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片を、バイナリーベクターであるｐＢＩ１０１ＨｍＢ（Ａｋａｍａ  Ｋ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１２，７−１１，１９９２）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ部位に挿入した。ＨＰＴ遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子）の３’末端側のＢａｍＨＩ部位は破壊してある。
【００６７】
ＧＴ６株はカナマイシン耐性であるので、選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子であるｈｐｔ遺伝子（Ｇｒｉｚ，Ｌ．およびＤａｖｉｅｓ，Ｊ．、Ｇｅｎｅ，２５，１７９−１８８，１９８３）を用いた。ＨＲＰによるＧＴ６株の形質転換は、Ｒｅｍｐｅｌ．Ｄ．Ｈ．およびＮｅｌｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．の方法（Ｒｅｍｐｅｌ，Ｈ．Ｃ．およびＮｅｌｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．４：１９９−２０７，１９９５）に記載の方法により行った。同様に、コントロールのＨＲＰ形質転換体を得るために、野生型ＢＹ２細胞にＨＲＰ形質転換体を導入して、ＢＹ２−ＨＲＰ株を得た。ｈＧＴとＨＲＰの二重形質転換体ＧＴ６−ＨＲＰは、通常の形質転換体と同様の期間で取得することができた。
【００６８】
（実施例５）二重形質転換タバコ培養細胞におけるＨＲＰの発現の確認
得られた二重形質転換体ＧＴ６−ＨＲＰ、コントロールのＢＹ２−ＨＲＰ、野生型（ＷＴ）について、以下に示す方法で、ＨＲＰ活性発現について調べた。表１に示すように、ＨＲＰ遺伝子導入形質転換体は、野生株に比べて、約５倍のペルオキシダーゼ活性を示した。
【００６９】
【表１】
2014054263.tif 000002
【００７０】
野生型にＨＲＰ遺伝子を導入して得られたクローンＢＹ２−ＨＲＰは、ｈＧＴとＨＲＰの二重形質転換体ＧＴ６−ＨＲＰと同程度のペルオキシダーゼ活性を示した。
【００７１】
（ペルオキシダーゼ活性測定）
タバコ培養細胞をＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄの入ったエッペンドルフチューブに入れ、ホモジナイザー（ＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒＳ−２０３、池田理化社製）を用いて粉砕した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）により上清液を回収し、これを粗酵素液とした。１ｍｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ、１ｍｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂおよび２ｍｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃを混合し、２５℃で５分間保温した。これにＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄで適当に希釈した粗酵素液を加え、２５℃で３分間反応させた。０．５ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌを加えることにより反応を停止し、４８０ｎｍの吸光度を測定した。対照としては、酵素添加前に１Ｎ  ＨＣｌを添加した液を用いた：
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ；１ｍＭ  ο−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ；４ｍＭ  Ｈ2Ｏ2
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃ；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｄ；１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
【００７２】
次に、このペルオキシダーゼ活性の上昇が、ＨＲＰの発現によるものであるか否かを確認するために、等電点電気泳動で分離後、ゲルの活性染色を行った。等電点電気泳動は、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製のモデル１１１ミニＩＥＦセルを用いて行った。ＰＡＧＥゲルサポートフィルムの疎水面をガラスプレートに密着させた後、キャスティングトレーにのせた。調製したゲル用溶液をサポートフィルムとキャスティングトレーの間に流し込んで、蛍光灯の下４５分間光重合させた。作製したゲルに試料を塗布し、蒸留水で湿らせた泳動槽にある両グラファイト電極にゲルが接するように置き、１００Ｖ  １５分、２００Ｖ  １５分、４５０Ｖ  ６０分の条件で電気泳動を行った。ゲル用溶液（ゲル１枚分）の組成は以下の通りである：蒸留水２．７５ｍｌ、アクリルアミド（２５％Ｔ、３％Ｃ）１．０ｍｌ、２５％グリセロール１．０ｍｌ、バイオライト（４０％、ｐＨ３〜１０）０．２５ｍｌ、１０％過硫酸アンモニウム７．５μｌ、０．１％リボフラビン−５’−リン酸ナトリウム２５μｌ、ＴＥＭＥＤ  １．５μｌ。
【００７３】
ペルオキシダーゼの活性染色は、関根らの方法（関根ら，植物細胞工学、６、７１−７５、１９９４）に従って行った。図１０に示すように、ＢＹ２−ＨＲＰ株と、ＧＴ６−ＨＲＰ株において、野生株には存在しない顕著なバンドがｐＩ７．８の位置に検出された。抗ＨＲＰ抗体を用いたウェスタン解析を行った結果、同じｐＩ７．８に対応する位置にシグナルが検出され、ｈＧＴとＨＲＰの二重形質転換体ＧＴ６−ＨＲＰにおいてＨＲＰが発現していることが確認された。
【００７４】
（実施例６）形質転換細胞ＧＴ６細胞中のＮ−結合型糖鎖の構造解析
（糖鎖構造の解析方法）
形質転換細胞ＧＴ６細胞のＮ−結合型糖鎖構造を、逆相ＨＰＬＣとサイズ分画ＨＰＬＣを組み合わせて、さらに二次元ＰＡ化糖鎖マッピング、エキソグリコシダーゼ消化、イオンスプレータンデムマススペクトロメトリー（ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）により解析した。まず、細胞抽出液をアセトンで脱脂後、１００℃、１２時間ヒドラジン処理し、糖鎖部分を遊離させた。ヒドラジン分解物を、Ｎ−アセチル化し、Ｄｏｗｅｘ  ５０Ｘ２およびＤｏｗｅｘ  １Ｘ２（それぞれ、代理店室町化学工業株式会社、Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社製）により脱塩し、０．１ＮアンモニアによりＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ゲルろ過カラム（１．８×１８０ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて分画した。ピリジルアミノ化（ＰＡ化）は先に述べた通りである。ＰＡ化糖鎖を、Ｊａｓｃｏ  ８２１−ＦＰ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ付きＪａｓｃｏ８８０−ＰＵ  ＨＰＬＣ装置（日本分光社製）により、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−Ｐ及びＡｓａｈｉｐａｋ  ＮＨ２Ｐ−５０をカラムに用いて分離した。溶出位置を、自ら調製したか、あるいは購入した（Ｗａｋｏ  ＣｈｅｍｉｃａｌｓおよびＴＡＫＡＲＡ  ＳＨＵＺＯ）既知の標準品と比較した。
【００７５】
Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）あるいはマンノシダーゼ（タチナタマメ、Ｓｉｇｍａ）を用いたグリコシダーゼ消化は、Ｋｉｍｕｒａ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６（２）、２１５−２２２、１９９２で述べた方法と同様の条件下で約１ｎｍｏｌのＰＡ化糖鎖について行った。β−ガラクトシダーゼ（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ由来のα−１，２マンノシダーゼ（東北大学吉田孝博士より分与）による消化については、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中に１ｎｍｏｌのＰＡ化糖鎖を２００ｍＵ  β−ガラクトシダーゼあるいは６０μｇ  α−１，２マンノシダーゼを３７℃で加温した。酵素反応を沸騰させて停止し、消化物の一部をサイズ分画ＨＰＬＣにより解析した。生じた消化物の分子量はイオンスプレーマススペクトロメトリー（ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ）により解析し、そして／あるいはＰａｌａｃｐａｃ，Ｎ．Ｑ．ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３（１）３５−３９、１９９９およびＫｉｍｕｒａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６（２）、２１５−２２２、１９９２に示されているように標準糖鎖と比較した。
【００７６】
ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ実験は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ−ＩＩＩにより行った。ポジティブモードで、イオンスプレーの電圧を４２００Ｖにて行った。スキャンニングを０．５Ｄａ毎で行い、ｍ／ｚを２００から記録した。
【００７７】
（ＧＴ６細胞の糖鎖の解析）
ＧＴ６細胞より調製したＰＡ化糖鎖を精製し、逆相ＨＰＬＣとサイズ分画ＨＰＬＣを組み合わせて解析した。サイズ分画ＨＰＬＣのもとで、１０〜２０分の位置のフラクションＩ（図１１）には、Ｎ−結合型糖鎖は溶出しておらず、ヒドラジン分解による副産物を含む非吸着部分であることを示唆している。ＭＳ／ＭＳ解析では、ＰＡ−ＧｌｃＮＡｃに相当する３００というｍ／ｚ値を持つフラグメントイオンを検出できなかった。同様に、５０〜６０分の位置のフラクションＸＩも、サイズ分画ＨＰＬＣで溶出を示すピークを検出できなかったので、Ｎ−結合型糖鎖を含んでいないことがわかった。しかし、サイズ分画ＨＰＬＣ（図１１）におけるフラクションＩＩからＸまでの解析から、図１２に示すＡ〜Ｑを含む全部で１７のピークを回収および精製した。
【００７８】
ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析は、これらのピークのうち７つのピークがＮ−結合型糖鎖であることを示した。以下各ピークの分析結果を示す。
【００７９】
オリゴ糖−Ａ、−Ｅ、−Ｈ、−Ｉ、−Ｍ、−Ｏ、−Ｐ、及び−Ｑ（図１２）の溶出位置及び分子量は、ＰＡ化糖鎖標準品と対応せず、ＭＳ／ＭＳ解析ではＰＡ−ＧｌｃＮＡｃ及びＰＡ−ＧｌｃＮＡｃ2に相当する３００及び５０３というｍ／ｚ値を有していたが、Ｎ−結合型糖鎖一般的に認められるＭａｎＧｌｃＮＡ2（Ｍ１）或いはトリマンノースコア糖鎖Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2（Ｍ３）に相当するフラグメントイオンを検出できなかった（データ未掲載）。他のピークのオリゴ糖−Ｂ，−Ｄ及び−Ｎも、３００というｍ／ｚ値を持つフラグメントイオンを検出できなかったので、Ｎ−結合型ではなかった。そこで残りの７つのＮ−結合型糖鎖について調べた。
【００８０】
ピーク−Ｃ（ｍ／ｚ１６３７．５；モル存在比９．３％）、ピーク−Ｆ（［Ｍ＋２Ｈ］２＋  ｍ／ｚ８１９．５，［Ｍ＋Ｈ］＋  ｍ／ｚ１６３９；モル存在比１５．９％）、およびピーク−Ｇ（ｍ／ｚ１４７５．５  モル存在比１９．５％）の溶出位置と分子量はそれぞれ、高マンノース型糖鎖Ｍａｎ7ＧｌｃＮＡＣ2（アイソマーＭ７Ａ及びＭ７Ｂ）、およびＭａｎ6ＧｌｃＮＡｃ2（Ｍ６Ｂ）であった。タチナタマメ  α−マンノシダーゼで消化すると、各Ｎ−結合型糖鎖は、サイズ分画ＨＰＬＣによりＭａｎＧｌｃＮＡｃ（Ｍ１）へと分解されていることを示した（データ未掲載）。消化物のＩＳ−ＭＳ実験によりｍ／ｚ値６６５．５というイオンは、Ｍ１の計算値６６４．６６に対応していたことから、これらは対応する個々のＰＡ化糖鎖標準品と構造的に同一であることを示している。
【００８１】
ピーク−Ｊ（６．６％）は、分子量１１２１．５を有していたが、これはＭａｎ3Ｘｙｌ1ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ（Ｍ３Ｘ）の分子量計算値ｍ／ｚ１１２１．０５と同じであった。９８９．５、８２７．５、６６５．５、５０３．３及び３００に見られたフラグメントイオンの位置は、Ｍａｎ3Ｘｙｌ1ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡから逐次Ｘｙｌ、Ｍａｎ、Ｍａｎ、Ｍａｎ及びＧｌｃＮＡｃがこの順序で遊離したことと矛盾しない。タチナタマメα−マンノシダーゼで処理すると、非還元末端のマンノース残基を除去でき、２次元マッピングはＭａｎ1Ｘｙｌ1ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡの溶出位置と同じであった（データ未掲載）。
【００８２】
ピーク−Ｋ（１３．２％）のＩＳ−ＭＳ実験の解析結果は、このフラクションが２種のＮ−結合型糖鎖を含むことを示し、そのひとつは分子量が１３１４．０（１．４％）で他方が１３５４．５（１１．８％）だった。このフラクションをさらに逆相ＨＰＬＣに供し、精製し、更に解析した。分子量１３１４．０を有する糖鎖ピーク−Ｋ−１は、糖鎖標準品Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ（Ｍ５）と二次元マッピング及びｍ／ｚ測定値が同一だった。さらに、タチナタマメα−マンノシダーゼで処理すると、その分解産物の溶出位置が２次元マッピングでＭ１と同じ位置に移動したことら、４つのマンノース残基が除去されたことを示した。
【００８３】
（ＧＴ６細胞中のガラクトースが付加したＮ−結合型糖鎖）
ｍ／ｚ１３５４．５を有する糖鎖ピーク−Ｋ−２は、Ｇａｌ1ＧｌｃＮＡｃ1Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ（ＧａｌＧＮＭ３）の予想される分子量ｍ／ｚ１３５４．３とよく一致していた。質量分析の結果から、親分子から派生したと考えられるフラグメントイオンはそれぞれ、ｍ／ｚ１１９３．５がＧｌｃＮＡｃ1Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ９８９．５がＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ８２７．５がＭａｎ2ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ６６５がＭａｎＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ５０３がＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ３３６がＭａｎＧｌｃＮＡｃ、ｍ／ｚ３００がＧｌｃＮＡｃ−ＰＡそしてｍ／ｚ２０４がＧｌｃＮＡｃであった。推定されるＮ−結合型糖鎖構造から、ＧａｌＧＮＭ３の２種のアイソマーが考えられる（図１３）。すなわち、Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα６（Ｍａｎα３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮａｃβ４ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ及びＭａｎα６（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡである。精製したＰＡ化糖鎖は、糖鎖標準品Ｍａｎα６（Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃβ２Ｍａｎα３）Ｍａｎβ４ＧｌｃＮＡｃβ４ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡと同一の逆相ＨＰＬＣの溶出位置であった（図１３のＢ）。
【００８４】
糖鎖をエキソグリコシダーゼで処理し、そして糖鎖構造を確認した。Ｄ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  β−ガラクトシダーゼはＧａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃ結合特異的であるが、本酵素による消化物はＧｌｃＮＡｃ1Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡとサイズ分画ＨＰＬＣにて同一の位置に溶出した（図１４Ａ−ＩＩ）。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析からｍ／ｚ１１９２．０が得られた。これらの結果は、１つのガラクトース残基が、β１−４結合している非還元末端のＧｌｃＮＡｃから除去されたことを示している。さらにこの産物を、β１−２ＧｌｃＮＡｃ結合特異的なＤｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｋ．ら  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９３，１３５−１４７、１９８３）で消化すると、その消化物は標準品Ｍａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡとサイズ分画ＨＰＬＣにて同じ位置に溶出した（図１４Ａ−ＩＩＩ）。続いてタチナタマメα−マンノシダーゼで処理すると、標準品ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡとサイズ分画ＨＰＬＣにて同じ位置に溶出した（図１４Ａ−ＩＶ）。糖鎖構造を図１５のＫ−２に示す。
【００８５】
ピーク−Ｌ（３５．５％）は、質量分析結果から［Ｍ＋２Ｈ］２＋が８４０、［Ｍ＋Ｈ］＋が１６８０．０であり、Ｇａｌ1ＧｌｃＮＡｃ1Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ（ＧａｌＧＮＭ５）の予想される分子量ｍ／ｚ１６７８．５５とよく一致していた。質量分析の結果から、親分子から派生したと考えられるフラグメントイオンはそれぞれ、ｍ／ｚ１３１３．５がＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ１１５２がＭａｎ4ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ９８９．５がＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ８２７．５がＭａｎ2ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ６６５がＭａｎＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ５０３がＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ３３６がＭａｎＧｌｃＮＡｃ、ｍ／ｚ３００がＧｌｃＮＡｃ−ＰＡそしてｍ／ｚ２０４がＧｌｃＮＡｃであった。Ｄ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  β−ガラクトシダーゼによる消化物はＧｌｃＮＡｃ1Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡとサイズ分画ＨＰＬＣにて同一の位置に溶出した（図１４Ｂ−ＩＩ）。この結果は、１つのガラクトース残基が、β１−４結合している非還元末端のＧｌｃＮＡｃに結合していたことを示している。ガラクトースが除去されたことを、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られた分子量が［Ｍ＋２Ｈ］２＋が７５９、［Ｍ＋Ｈ］＋が１５１８．０であることにより確認した。親シグナルｍ／ｚ１５１８．０であるＧｌｃＮＡｃ1Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡから、フラグメントイオンｍ／ｚ１３１４がＭａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ１１５２がＭａｎ4ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ９９０がＭａｎ3ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ８２７．５がＭａｎ2ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ６６５．５がＭａｎ1ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ５０３がＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ、ｍ／ｚ３００がＧｌｃＮＡｃ−ＰＡとが派生していた。ＧｌｃＮＡｃ1Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡをＤｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼで消化すると、その消化物は標準品Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡとサイズ分画ＨＰＬＣにて同じ位置に溶出した（図１４Ｂ−ＩＩＩ）。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ由来のα−１，２マンノシダーゼで処理しても溶出位置が移動しなかった（図１４Ｂ−ＩＶ）。しかし、続いてタチナタマメ  α−マンノシダーゼで処理すると、標準品Ｍａｎ1ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡとサイズ分画ＨＰＬＣにて同じ位置に溶出した（図１４Ｂ−Ｖ）。このことは、非還元末端に存在する４つのマンノース残基が除去されたことを示している。これらの結果から、ＰＡ化糖鎖は、５つのいずれのマンノース残基も、α１−３結合したマンノース残基にα１−２結合していないことを示す。以上エキソグリコシダーゼ消化、２次元糖鎖マッピング、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析から導きだされる糖鎖構造は、ＧａｌＧＮＭ５で、図１５のＬに示す。
【００８６】
図２０は、ＧＴ６細胞株におけるＮ−結合グリカンの構造と各Ｎ−結合グリカンの比率に関する上記の結果を、同様に決定された野生型ＢＹ２細胞株におけるそれらとともに要約する。図２０において、白抜き四角はＧｌｃＮＡｃを、白抜き丸はマンノースを、黒丸はガラクトースを、斜線をひいた四角はキシロースを、そして点をつけた丸はフコースをそれぞれ示す。
【００８７】
ＧＴ６細胞株では、アイソマー類であるＭａｎ７−、Ｍａｎ６−およびＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２が観察された。これらの高マンノース型オリゴサッカライドは、β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）の基質であるので、ＧｌｃＮＡｃＩ、ＭａｎＩおよびＭａｎＩＩ  ｃＤＮＡの導入は、オリゴサッカライドＭａｎ７−５ＧｌｃＮＡｃ２を、ＧａｌＴの基質であり得るＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２へより効率的に導き得る（図２１）。
【００８８】
ＧｎＴ  Ｉを欠くＡ．ｔｈａｌｉａｎａ  ｃｇｌＩ変異体は、複合型Ｎ−グリカンを合成することができない（ｖｏｎ  Ｓｃｈａｅｗｅｎ，Ａ．，Ｓｔｕｒｍ，Ａ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ、Ｊ．，およびＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、ＭＪ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９３  Ａｕｇ；１０２（４）：１１０９−１１１８、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩを欠き、そしてゴルジ体で修飾される複合体Ｎ−結合グリカンを合成できない変異体Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物の単離）。このｃｇｌＩ変異体におけるヒトＧｎＴでの相補性は、哺乳動物酵素が、植物Ｎ−グリコシル化経路に寄与し得たことを示した（Ｇｏｍｅｚ、Ｌ．およびＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９４  ３月  １；９１（５）１８２９−１８３３、複合アスパラギン結合グリカンを欠くＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａの、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩをコードするヒトｃＤＮＡでの相補性）。さらに、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａから単離されたＧｎＴ  Ｉ  ｃＤＮＡは、ＣＨＯ  Ｌｅｃ１細胞のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ欠損を相補した（Ｂａｋｋｅｒ，Ｈ．，Ｌｏｍｍｅｎ，Ａ．，Ｊｏｒｄｉ，Ｗ．，Ｓｔｉｅｋｅｍａ，Ｗ．，およびＢｏｓｃｈ，Ｄ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９９  ８月  １１；２６１（３）：８２９−３２、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ  ｃＤＮＡは、ＣＨＯ  Ｌｅｃ１細胞のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ欠損を相補する）。ヒトＭａｎＩおよびＭａｎＩＩをコードするｃＤＮＡが単離され、そして配列決定された（Ｂａｕｓｅ，Ｅ．，Ｂｉｅｂｅｒｉｃｈ，Ｅ．，Ｒｏｌｆｓ，Ａ．，Ｖｏｌｋｅｒ，Ｃ．およびＳｃｈｍｉｄｔ，Ｂ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９３  １０月  １５；２１７（２）：５３５−４０、ヒト腎臓からのＭａｎ９−マンノシダーゼの分子クローニングおよび一次構造；Ｔｒｅｍｂｌａｙ，Ｌ．Ｏ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｄｙｋｅ，Ｎ．およびＨｅｒｓｃｏｖｉｃｓ，Ａ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９８８  ６月；８（６）：５８５−９５、Ｎ−グリカン成熟に関与する新規ヒトα１，２−マンノシダーゼ遺伝子の分子クローニング、染色体マッピングおよび組織特異的発現；およびＭｉｓａｇｏ．Ｍ．，Ｌｉａｏ，Ｙ．Ｆ．，Ｋｕｄｏ，Ｓ．，Ｅｔｏ，Ｓ．，Ｍａｔｔｅｉ，Ｍ．Ｇ．，Ｍｏｒｅｍｅｎ，Ｋ．Ｗ．，Ｆｕｋｕｄａ，Ｍ．Ｎ．，ヒトα−マンノシダーゼＩＩおよび従前には認識されていないα−マンノシダーゼＩＩｘアイソザイムをコードするｃＤＮＡの分子クローニングおよび発現）。ヒトＭａｎＩは、２つのアイソザイムＭａｎＩＡおよびＭａｎＩＢをもち、そしてアイソザイムのｃＤＮＡのヌクレオチド構造が示された（Ｂａｕｓｅ，Ｅ．，ら、およびＴｒｅｍｂｌａｙ，Ｌ．Ｏ．，前述）。これらのｃＤＮＡを、ＢＹ細胞株中に形質転換することにより、ヒト型糖タンパク質を産生する効率的な細胞株が得られ得る。β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）は、ＵＤＰ−ガラクトースをドナー基質として用い、そしてＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をアクセプター基質として用いる。ＵＤＰ−ガラクトースの効率的な供給はＧａｌＴ酵素反応を増大し、そしてより多くのガラクトシル化オリゴサッカライドが産生される（図２２）。
【００８９】
（実施例７）二重形質転換体ＧＴ６−ＨＲＰ細胞中のＨＲＰの糖鎖の構造解析
ＧＴ６−ＨＲＰ細胞またはコントロールのＢＹ２−ＨＲＰ細胞の７日間培養した培養液のそれぞれのホモゲナイズ物５０ｇから得た粗細胞溶解液を、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（１×１０ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけた。カラムを洗浄後、溶出したペルオキシダーゼを４０３ｎｍの吸光度で測定した。プールした画分を限外濾過（分子量カット：１０，０００、Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）により濃縮し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で透析し、そして平衡化したベンズヒドロキサミン酸−アガロースアフィニティーカラム（１×１０ｃｍ）（ＫｅｍＥｎ  Ｔｅｃ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にかけた。カラムを１５倍容量の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同じ緩衝液中に調製した０．５Ｍのホウ酸で、結合したＨＲＰを溶出した。得られたペルオキシダーゼ活性画分をプールし、透析および濃縮した。
【００９０】
形質転換細胞ＧＴ６−ＨＲＰ細胞およびＢＹ２−ＨＲＰ細胞のそれぞれから得た精製ＨＲＰを、１×１０ｃｍのＲＣＡ120−アガロースカラムにかけた。次いでカラムを、１５倍容量の１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．０）で洗浄した。結合タンパク質を、常法に従って溶出し、アッセイした。
【００９１】
β１−４結合ガラクトースに特異的であるＲＣＡ120アフィニティークロマトグラフィーから溶出された精製ＨＲＰのレクチン染色では、レクチンＲＣＡ120が、形質転換細胞ＧＴ６−ＨＲＰで産生されたＨＲＰのみを結合した。レクチンを競合するガラクトースとプレインキュベートすることによりレクチン結合は劇的に減少したので（図１６ｂＩＩＩ）、この結合は炭水化物特異的であった。Ｄ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  β−ガラクトシダーゼで精製ＨＲＰを前処理しても、ＲＣＡ120結合を阻害した。これらの結果は、ＲＣＡがＨＲＰ上のＮ結合型オリゴ糖鎖の末端β１−４結合位置にあるガラクトースに特異的に結合したことを示す。ＢＹ２−ＨＲＰ細胞中にＲＣＡ結合糖タンパク質がないことは、この細胞がＨＲＰグリカンの非還元末端にβ１−４結合ガラクトース残基を転移し得ないことを示す。
【００９２】
ＲＣＡ120を用いて精製したＨＲＰ由来のＰＡ誘導体の逆相ＨＰＬＣ（Ｊａｓｃｏ８２１−ＦＰ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒを備えたＪａｓｃｏ８８０−ＰＵ  ＨＰＬＣ装置上、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＰカラムまたはＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２Ｐカラムを用いた）は、ＧＴ６−ＨＲＰより精製されたＨＲＰタンパク質上の糖鎖が単一のピークを示した（図１７）。一方、ＢＹ２−ＨＲＰより精製されたＨＲＰ画分からは、結合タンパク質または検出可能なピークは観察されなかった。ＧＴ６−ＨＲＰから得られたピークは、サイズ分画ＨＰＬＣ上で均一であった。二次元マッピング分析および標準糖鎖との同時クロマトグラフィーは、このオリゴサッカライドがＧａｌ1ＧｌｃＮＡｃ1Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡと一致することが判明した。この構造の確認は、連続的エクソグリコシダーゼ消化によりなされた。標準糖鎖としては、先に調製された糖鎖（Ｋｉｍｕｒａ，Ｙら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６（２），２１５−２２２，１９９２）または市販（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＯｓａｋａおよびＴＡＫＡＲＡ  ＳＨＵＺＯ）の糖鎖を用いた。
【００９３】
ＰＡ糖鎖のβ−ガラクトシダーゼ（Ｄ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）消化は、標準のＧｌｃＮＡｃ1Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡの溶出位置と一致し、１つの非還元末端ＧｌｃＮＡｃにβ１−４結合した１つのガラクトース残基が除去されたことを示した。Ｄ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼでのこの消化物のさらなる消化は、Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡの溶出位置に等しい糖鎖を生じ、１つの非還元末端マンノース残基にβ１−２結合したＧｌｃＮＡｃ残基を損失したことを示した。植物におけるＮ結合型プロセッシング経路に基づけば、除去されたＧｌｃＮＡｃ残基は、β１−４マンノース残基に連結したα１−３マンノースにあると考えられる。ＧｌｃＮＡｃ残基の結合位置を確立するために、Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡ（Ｍ５）を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓａｉｔｏｉ由来α１−２マンノシダーゼとともにインキュベートした。予想されたように、溶出位置にシフトは見られず、Ｍ５が予想された構造Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃを有することが確認された。糖鎖をタチナタマメα−マンノシダーゼを用いてさらに切りそろえると、公知のＭａｎ1ＧｌｃＮＡｃ2−ＰＡの溶出位置になった。従って、この糖鎖構造は、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌ1ＧｌｃＮＡｃ1Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2）に対応する。以上の結果から、ＧＴ６細胞中に存在する糖鎖構造としては図１５に示される通りであり、二重形質転換体ＧＴ６−ＨＲＰ細胞由来のＨＲＰタンパク質の有する糖鎖構造は、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎα１−６（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ（Ｇａｌ1ＧｌｃＮＡｃ1Ｍａｎ5ＧｌｃＮＡｃ2）であることが導き出される。
【００９４】
同様に、形質転換細胞ＧＴ６−ＨＲＰ由来のＨＲＰのガラクトシル化Ｎ−グリカンは、植物のＮ−グリカンに特徴的なβ１，２キシロース残基と特異的に反応することが示されている抗血清と反応せず、植物の複合型グリカン中の抗原性を引き起こすことが示されている糖残基（キシロース残基）（Ｇａｒｃｉａ−Ｃａｓａｄｏ，Ｇ．ら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６（４）：４７１−４７７，１９９６）の１つが存在しないことを示した（図１８）。
【００９５】
（発明の効果）
本発明により、ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の生産方法；非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る糖鎖付加機構を備え、この糖鎖付加機構が、コア糖鎖および外部糖鎖を含む糖鎖であって、コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンから本質的になり、外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含む糖鎖、を付加する、植物細胞；およびこの方法によって得られたヒト型の糖鎖をもつ糖タンパク質が提供される。本発明のヒト型の糖鎖をもつ糖タンパク質は、糖付加がヒト型であるために、抗原性を有さない。それゆえ、ヒトを含む動物への投与のために有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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