(57)【要約】【課題】従来のルミノメーター又は分光光度計を用いて、マイクロスライドでの発光測定を簡便に実現できるデバイスを提供する。【解決手段】ルミノメーターまたは分光光度計のサンプルディッシュ用光検出部にサンプルディッシュの替わりに載置して用いる発光測定デバイスであって、前記発光測定デバイスは、複数チャンネルのマイクロスライドをスライド可能に保持し、スライドすることによって複数チャンネルから選択した１つのチャンネル毎の発光を分光し、チャンネル内のサンプルから出た発光を迅速かつ高感度で測定することを特徴とする発光測定デバイス。【選択図】図１
2014038005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルミノメーターまたは分光光度計のディッシュ用光検出部にサンプルディッシュの替わりに載置する発光測定デバイスであって、
前記発光測定デバイスは、複数チャンネルのマイクロスライドをスライド可能に保持し、
前記マイクロスライドをスライドさせることによって複数チャンネルから選択した１つのチャンネル毎の発光を分光し、チャンネル内のサンプルから出た発光を迅速かつ高感度で測定できるようにしたことを特徴とする発光測定デバイス。
【請求項２】
前記発光測定デバイスは、前記マイクロスライドの上部にマイクロスライドの各チャンネル間の光干渉を遮断するキャップを被せてあることを特徴とする請求項１記載の発光測定デバイス。
【請求項３】
前記発光測定デバイスは、複数の光学フィルターを装着したフィルターホルダーをスライド可能に保持しており、
前記フィルターホルダーをスライドすることよって選択された光学フィルターを透過した光によってチャンネル内のサンプルから出た発光を迅速かつ高感度で測定することを特徴とする請求項１または２記載の発光測定デバイス。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項記載の発光測定デバイスを用い、ルミノメーターまたは分光光度計のサンプルディッシュ用光検出部にサンプルディッシュの替わりに前記発光測定デバイスを載置し、複数チャンネルのマイクロスライドの各チャンネル内のサンプルから出た発光を迅速かつ高感度で測定することを特徴とする発光測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体由来の体液や環境サンプル中におけるホルモンやホルモン様化学物質のバイオ分析を行う際に便利に使える発光測定デバイスに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体由来の体液や環境サンプル中におけるホルモンやホルモン様化学物質のバイオ分析のために様々なバイオアッセイ技術が開発されている。例えば、（１）レポータージーンアッセイ(reporter-gene assay)、（２）ツーハイブリットアッセイ(two-hybrid assay)、（３）酵素結合免疫吸着法(enzyme-linked immunosorbent assay)、放射免疫アッセイ（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）等を取り上げられる（非特許文献１、２参照）。
また、その他のバイオアッセイとして、「分子プローブ」を用いるアッセイ法が広く使われている。より具体的なアッセイ法としては、細胞内での蛋白質−蛋白質相互作用を発色でイメージングする方法であり、（１）蛍光蛋白質間蛍光共鳴エネルギー転移を利用したフレート法（ＦＲＥＴ）（非特許文献３参照）や（２）蛍光蛋白質や発光蛋白質を２分割し、その蛋白質断片間の再結合による発光回復を特徴とする２分子型相補法(2-molecule-format protein complementation assay(ＰＣＡ))等が開発されていた（非特許文献４参照）。
また本発明者らによって蛋白質組継ぎ反応を用いたアッセイ法が開発された(protein splicing assay (PSA))（非特許文献５参照）。最近、本発明者らによって（１）一分子型生物発光プローブ(integrated-molecule-format bioluminescent probe；又は簡単にsingle-chain probe)が開発され、単一分子内蛋白質−蛋白質間の相互作用が検出できるようになった（非特許文献６、特許文献１参照）。更にその派生手法として（２）発光酵素の遺伝子配列を円順列置換(circular permutation)したことを特徴とする生物発光プローブも開発された（非特許文献７、特許文献２参照）。更に、本発明者らにより（３）発光酵素に人為的な歪みをかけることによって起こる酵素活性の相違を指標とした分子歪みセンサー(molecular tension-indexed bioluminescent probe)が開発された（非特許文献８、特許文献３参照）。更に最近では、レポータージーンアッセイと一分子型生物発光プローブを合体した多重認識型生物発光プローブ(multiple recognition-type bioluminescent probe)を開発した（非特許文献９、特許文献４参照）。このプローブは、一つの検量物質に対して２回センシングすることを特徴とする。更に２色の一分子型生物発光プローブを組み合わせることによって「マルチカラー生物発光イメージングプローブセット」を開発した（特許文献５参照）。このプローブは、検体の多面的な生理活性の多色イメージングできることを特徴とする。
【０００３】
前記バイオアッセイは、その発光信号によって、（１）蛍光タンパク質を用いる方式と、（２）化学発光（ルシフェラーゼなどからの生物発光を含む）を用いる手法の２種類に大別される。蛍光タンパク質を利用する場合には、自己蛍光が酷いためバックグラウンドが非常に高くなることに加え、外部光源が必要である。従って蛍光を測定するためには精密な分光フィルターを取り付ける必要があり、比較的大型の発光検出器（例、蛍光顕微鏡等）が必要であるなど（非特許文献５参照）、簡易診断やオンサイト分析に不向きであった。
一方、化学発光的な手法の場合は、前述した問題はないが、蛍光に比べて極めて弱光であり、基質共存下のみで光る問題点があった。特に、化学発光の一種である生物発光の場合には「酵素」に依存するため、塩濃度、温度、ｐＨ、重金属イオンの濃度等によっても発光強度が容易に変動する問題がある。この点においては蛍光を基盤とした手法においても同様な問題点がある。従って、適切なプロトコルの基で、有能な発光測定装置を用いて前述した様々な問題点を軽減することは急務の課題であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００８／０８４８６９号公報
【特許文献２】米国特許公開２００９−０２６９７８１号公報
【特許文献３】特開２０１１−０６７１９０号公報
【特許文献４】国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０８０４１９
【特許文献５】米国特許公開２００９−０１２３９５４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】S.B.Kim,H.Tao,andY.Umezawa eds.,“Cellular and Biomolecular Recognition”,Edited byR.Jelinek,p.299.((2009)(Wiley-VCH,Darmstadt)).
【非特許文献２】W.Liand N.B.Caberoy,Applied Microbiology and Biotechnology 85(4),909(2010)
【非特許文献３】A.Miyawaki,T.Nagai,andH.Mizuno,Curr.Opin.Chem.Biol. 7(5),557(2003).
【非特許文献４】S.W.Michnick,P.H.Ear,C.Landry etal.,Meth. Enzymol.470,335(2010).
【非特許文献５】S.B.Kim,T.Ozawa,S.Watanabe etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 101(32),11542 (2004).
【非特許文献６】S.B.Kim,Y.Otani,Y.Umezawa etal.,Anal.Chem.79(13),4820(2007).
【非特許文献７】S.B.Kim,M.Sato,andH.Tao,Bioconjugate Chem.19(12),2480(2008).
【非特許文献８】S.B.Kim,M.Sato,andH.Tao,Bioconjugate Chem.20(12),2324(2009).
【非特許文献９】S.B.Kim,Y.Takenaka,andM.Torimura,Bioconjugate Chem.22(9),1835(2011).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の発光測定デバイスは、大まかに分けて２つに大別される。一つはルミノメーター型装置、もう一つはマイクロプレート型装置である。ルミノメーター型装置は、感度はいいがサンプル処理能が悪い。一方、マイクロプレート型装置は、サンプル処理能はよいが感度が悪かった。この両方の短所を解決し高い感度と使用上の便利性、分光能を持ち合わせた新規発光測定装置が強く求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、高感度・高速（高サンプル処理能）でバイオアッセイ（例、レポータージーンアッセイ、ツーハイブリットアッセイ、一分子型生物発光プローブなど）が遂行できる新規発光検出デバイスに関するものである。
前記問題点を解決するために、まずバイオアッセイ中、光子(photon)の効率的な収光のためにカスタムメイドで発光測定デバイスを開発し、その優位性を従来のバイオアッセイの実施例を持って証明した。この新規発光測定デバイスには、マイクロスライド、可変式スライドホルダー、可変式光学フィルターホルダー、光学フィルター、ミラー状のキャップ、ミラー状のスタンドで構成されている。従来のルミノメーター(GloMax20/20n、プロメガ社製）や従来の分光光度計（AB-1850、ATTO社製）のような測定機のディッシュ（すなわち、シャーレ）載置箇所（感光部）にディッシュの替わりに簡便に取り付けて使えるように設計されている。このデバイスは２つの可変式ホルダーを噛み合わせる形態であり、内装がミラー状で下部に集光されやすい独特なデザインを持つため、高いサンプル処理能と高感度、高い分光能を実現できた。この発光デバイスの利点を示す実施例の一つとして、本デバイスを用いて細胞内アポトーシス（細胞死）の可視化に成功した。ヒト唾液中のストレスホルモン計測にも成功している。また、一つの検体から性ホルモンによるアゴニストやアンタゴニスト的活性のマルチカラーイメージングに成功した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ルミノメーターまたは分光光度計のディッシュ用光検出部にディッシュの替わりに載置する発光測定デバイスであって、前記発光測定デバイスは、複数チャンネルのマイクロスライドをスライド可能に保持し、前記マイクロスライドをスライドさせることによって複数チャンネルから選択した１つのチャンネル毎の発光を分光し、チャンネル内の検体から出た発光を迅速かつ高感度で測定できるようにしたことを特徴とする発光測定デバイスである。
また、本発明は、前記発光測定デバイスにおいて、前記発光測定デバイスは、前記マイクロスライドの上部にマイクロスライドの各チャンネル間の光干渉を遮断するキャップを被せてあることを特徴とする。
また、本発明は、前記発光測定デバイスにおいて、前記発光測定デバイスは、複数の光学フィルターを装着したフィルターホルダーをスライド可能に保持しており、前記フィルターホルダーをスライドすることによって選択された光学フィルターを透過した光によってチャンネル内の検体から出た発光を迅速かつ高感度で測定することを特徴とする。
また、本発明は、前記発光測定デバイスを用い、ルミノメーターまたは分光光度計のディッシュ用光検出部にサンプルディッシュの替わりに前記発光測定デバイスを載置し、複数チャンネルのマイクロスライドの各チャンネル内の検体から出た発光を迅速かつ高感度で測定することを特徴とする発光測定法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の発光測定デバイスの特徴は、ルミノメーターや分光光度計のサンプルディッシュ載置箇所にディッシュの替わりに簡便に取り付けるだけでマイクロスライド内多数検体に対する発光測定が実現できるという、従来にない簡便で、高感度、高サンプル処理能、高集光能設計にある。そのため、使用者側からすると、従来の発光計測装置にない利便性を提供する。使用者側の幅広いニーズに答えて、許容範囲の広い光学フィルターの組み合わせと可変式仕様、簡便な試料の取り付けと可変式仕様を採用している。また、従来の代表的なバイオアッセイであるレポータージーンアッセイやツーハイブリットアッセイ等に最適に利用できる。簡便に従来の発光検出器を取り付けられることから、使用者側にアッセイ時間の短縮、高感度測定によるサンプル量の少量化、光学フィルターの取り付けによって三色発光の観察ができる点などの利点を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の発光測定デバイスの一実施例の測面図。
【図２】図１で示した実施例の平面図。
【図３】図１で示した実施例の断面図。
【図４】本発明の発光測定デバイスを用いて測定した測定例１を説明する図。（Ａ）は本発光デバイスを従来のルミノメーターに装着した写真。下図は本実験で使われた分子プローブの構造を表す。（Ｂ）は毒性評価の概念図。毒性物質によってプローブの分解が起こり一時的に発光値が増加する。（Ｃ）は本発光測定デバイスで測定した化学物質の毒性評価。化学物質の「毒性」によって発光値の増加が認められた。ＳＰは分泌シグナル(Secretion Peptide)を示す。ＡＬｕｃは本発明者の人工発光遺伝子(ArtificialLuciferase)を示す。ＭＬＳは細胞膜局在化シグナル(Membrane LocalizationSignal)を意味する。
【図５】本発明の発光測定デバイスを用いて発光スペクトルの測定による化学物質の有害性評価を示す測定例２の説明図。（Ａ）本測定デバイスを従来のスペクトルメーターに装着した写真。下図は本実験で使われた分子プローブの構造を表す。（Ｂ）実際の測定結果を示すスペクトル。
【図６】本発明の発光測定デバイスを用いて測定した測定例３を説明する図。一分子型生物発光プローブと本発明の発光測定デバイスを用いたストレスホルモン活性の可視化イメージング。（Ａ）は当該一分子型生物発光プローブの遺伝子構造。（Ｂ）はこの一分子型生物発光プローブの作動原理。（Ｃ）はリガンドに応答した発光イメージング。ストレスホルモン無し（vehicle；左３チャンネル）に比べて、ストレスホルモン有り（右３チャンネル）の場合、より強く発光した。
【図７】発光測定デバイスを用いたストレスホルモンの測定。（Ａ）本実施例で用いた生物発光プローブの遺伝子構造（上段）と作動原理（下段）。ストレスホルモン(cortisol)有りの条件で分子構造が折り畳まれて発光する。（Ｂ）ミラーキャップありなしの条件で発光集光能の比較。ミラーキャップを付けた方がより強い発光値を示したことから、ミラーキャップの良さを示している。（Ｃ）同じサンプルに対して、発光デバイス有り無しでの標準偏差（ＳＤ）の比較。同じサンプルであっても発光デバイス有りの方が１／３以下の少ない標準偏差（ＳＤ）を示したことから、発光デバイスによる精度の増加を示している。（Ｄ）本マイクロスライドの発光イメージ。ストレスホルモン有り（右三チャンネル）の場合により強く発光した。
【図８】マルチカラー可視化プローブの開発と本発明の発光測定デバイスを用いた測定例５を説明する図。（Ａ）はマルチカラープローブの作動原理。女性ホルモンの性質によって異なる分子構造の変化が起こる。その程度が赤色と緑色発光で現れる。（Ｂ）は生物発光測定デバイスの写真。マイクロスライドに培養した細胞からの多色発光を効率よく測定できる。多色の発光はミラーキャップによって反射され下部の光学フィルターを通して光検出部に至る。（Ｃ）はこの発光測定デバイスを用いた、化学物質の女性ホルモン活性の測定。本来の女性ホルモン作用は緑色で表した。実際も緑色である（５４０ｎｍ）が出る。一方、女性ホルモン妨害作用（アンタゴニスト）は赤色で示した。実際も赤色である（６４０ｎｍ）が出る。図中で用いた略語：Ｅ2，女性ホルモン；ＯＨＴ，乳がん抗がん剤(4-hydroxytamoxifen)；ＰＣＢ，工業用材(polychlorinatedbiphenyl)；ＤＤＴ，殺虫剤(o,p’-dichlorodiphenyltrichloroethane)
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の発光測定デバイスは、従来のルミノメーターや分光器にディッシュの替わりに簡便に取り付けて発光計測に用いる装置に関するものであり、以下のようなバイオアッセイへの応用が想定できる。レポータージーンアッセイ(reporter-gene assay)、ツーハイブリットアッセイ(two-hybrid assay)、タンパク質相補法(protein complementation assay)、インテインを介したタンパク質スプライシング法(intein-mediated protein splicing assay)、一分子型生物発光プローブ法(single-chain probe-based assay)、二分子型生物発光プローブ法(two-molecule-format bioluminescent probe-based assay)を行う際に利用できる。
例えば、レポータージーンアッセイを行う際、市販の６チャンネルのマイクロスライド(ibidi社製)上のレポーター発現ベクターを持つ細胞を培養しリガンド刺激を行う。その後、基質を添加することによって細胞を発光させ、本発光測定デバイスを用いて集光測定すればよい。
また、一分子型生物発光プローブを用いる場合、市販の６チャンネルのマイクロスライド(ibidi社製)上の細胞を培養し一分子型生物発光プローブを発現させ、当該細胞にリガンド刺激を行う。リガンド刺激後、基質を添加することによって細胞を発光させ、本発光計測デバイスを用いて集光測定すればよい。
【００１２】
本発明の発光測定デバイスを用いたスクリーニングについて以下に説明する。
リガンド活性の測定は、通常の生物発光アッセイに準じて実施すればよく、特に制限なく従来のプロトコルが適用できる。
生物発光強度を測定するためには、従来のルミノメーター(例、GloMax 20/20n；Promega)が一般的に利用されてきたので、このようなルミノメーターに本発光測定デバイスを搭載して使用できる。市販のマイクロスライド上で培養された細胞を生細胞のままデバイスに載せて測定してもよいし、ライセートバッファーをかけることによって細胞溶解液(lysate)を作り、基質と混合した後デバイスに載せて発光値を測定してもよい。
６チャンネルマイクロスライド上に培養された細胞を対象に通常のリガンド活性計測をする場合には、既製のスペクトルメーター(例えば、AB-1850；ATTO)に本発光測定デバイスを搭載して使うことができる。リガンド共存下で、発現された発光プローブはリガンド依存的に発光するため、前記スペクトルメーターに付けた本発光測定デバイスを用いることによって多様な色の発光を、瞬時にまたは経時的に測定することができる。
【００１３】
これらのバイオアッセイの対象となる被検物質には、例えば、有機または無機の化合物（特に低分子量の化合物）、生物活性を持つホルモンやホルモン様化学物質、生理活性を持つ重金属イオン、ペプチド等が含まれる。これらの物質は、機能や構造が既知のものであっても未知のものであってもよい。また、「コンビナトリアルケミカルライブラリー」は、目的物質を効率的に特定するための被検物質群として有効な手段である。コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第６００４６１７号；５９８５３６５号を参照）。さらには、市販のライブラリー（例えば、米国ComGenex社製、ロシアAsinex社製、米国Tripos,Inc.社製、ロシアChemStar,Ltd社製、米国3D Pharmaceuticals社製、Martek Biosciences社製などのライブラリー）を使用することもできる。また、コンビナトリアルケミカルライブラリーを、本プローブを発現する細胞の集団に適用することによって、いわゆる「ハイスループットスクリーニング」を実施することもできる。
【００１４】
次に、本明細書で用いる用語、概念について説明する。
本発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。なお、用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はJ.Sambrook,E.F.Fritsch&T.Maniatis, “Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd edition)”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989);D.M.Glover et al.ed.,“DNA Cloning”,2nd ed.,Vol.1to4,(The Practical Approach Series),IRL Press,Oxford University Press(1995);Ausubel,F.M. et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y,1995；日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸ＩＩＩ（組換えＤＮＡ技術）」、東京化学同人（１９９２）；R.Wu ed.,“Methods in Enzymology”,Vol.68(Recombinant DNA), Academic Press,New York(1980)；R.Wu et al. ed.,“Methods in Enzymology”,Vol.100(Recombinant DNA,Part B)&101(Recombinant DNA, Part C),Academic Press,New York(1983)；R.Wu et al. ed.,“Methods in Enzymology”, Vol.153(Recombinant DNA,Part D),154(Recombinant DNA,Part E)&155(Recombinant DNA,Part F),Academic Press,New York(1987)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法またはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。また、本発明で使用する各種タンパク質やペプチド、あるいはそれらをコードするＤＮＡについては、既存のデータベース
（ＵＲＬ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/等）
から入手することができる。
なお、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は参照して本明細書の記載として組み入れるものとする。
【実施例】
【００１５】
図１〜３は、本発明の新規発光測定デバイスの一実施例を示す図であり、図１が測面図、図２が平面図、図３は断面図である。
市販の細胞培養や顕微鏡観察用のマイクロスライド（６チャンネル、ibidi社製）がフィットするようにマイクロスライドホルダーを、例えばアルミで加工した。このマイクロスライドホルダーがはめられるように例えばプラスチック材でプラットフォームを製作した。このマイクロスライドホルダーが一定間隔毎にプラットフォームを滑り止るようにスライドホルダーの横または下に一定間隔で溝を作り、この溝に係合するようにプラットフォームに係合部材（例えばスプリングボール等）をとりつけた。
細胞培養用のマイクロスライドの上部には蜂の巣のようなキャップを被らせることによって、マイクロスライドの各チャンネル間の光干渉を遮断した。このキャップの表面は光反射ができるように鏡状に表面加工を施した。なおキャップは、マイクロスライドの各チャンネル間の光干渉を遮断できる形状であればよく、蜂の巣の形状に限定されない。
プラットフォームの下部には３つの光学フィルターを入れるフィルターホルダー（例えば金属製）を取り付け、３つの光学フィルターのそれぞれに対応する位置にスライド式に滑り止るように加工した。
フィルターホルダーの下には例えば金属製の支持台を設けて、上部の重さに耐えるようにした。またその内部は丸く穴を空けてからその表面は鏡状にメッキ加工をした。これによって上部から来る発光が光損失なく下部の検出部まで通るように配慮した。本発明の発光測定デバイスのこの支持台部分をルミノメーター又は分光光度計のディッシュ載置箇所に載置すれば、従来のルミノメーター又は分光光度計を用いてマイクロスライドによる測定が簡便に実現できる。
図では、６チャンネルのマイクロスライドを採用しているが、同様な概念でチャンネル数を増やすことによってより多くのサンプル測定が可能である。
【００１６】
（測定例１）
本発明の発光測定デバイスを用いて、細胞死誘発化学物質（ＳＴＳ）の毒性を測定した（図４参照）。まず市販の細胞培養用のマイクロスライド(ibidi社製)にサル腎臓由来のＣＯＳ−７細胞を植え、マイクロスライド面積の９割が細胞に埋まるまで細胞を培養した。その細胞に生物発光プローブをコードするプラスミドを遺伝子導入し、更に２４時間培養した。前記マイクロスライドに培養した細胞にＳＴＳ(最終濃度：１μＭ)有り無しの条件で１０分間刺激を行った（図４の(Ｂ)参照）。
発光測定は以下の手順で行った。マイクロスライドを１回ＨＢＳＳバッファーで洗浄し、基質入りのＨＢＳＳバッファー１００μＬをマイクロスライドの各チャンネルに同時に導入して、直ちに前記発光測定デバイスに固定した。このデバイスにミラーキャップを被らせたのち、このデバイスを従来のルミノメーター(GloMax20/20n;Promega)に搭載した。発光値を、各チャンネルと各フィルターを交換しながら測定した（３秒間集光、ｎ＝３、図４の(Ｃ)参照）。
前記ＳＴＳによって活性化されたＣａｓｐａｓｅ−３によって膜に局在する発光プローブが分解され、発光強度を増した（図４の(Ｂ)参照）。その結果、発光強度が７.５割程度増加しており、青色、黄色、赤色領域の光を効率よく分別できた上、非常に小さいエラーバーを示したことから、当該計測デバイスはＳＴＳの細胞毒性を高速で精度よく測定する上で便利であることが確認できた。
【００１７】
（測定例２）
本発明の発光測定デバイスを用いて、細胞死誘発化学物質(STS)の毒性を発光スペクトルの変化を基に測定した（図５参照）。まず市販の細胞培養用のマイクロスライド(ibidi社製)にサル腎臓由来のＣＯＳ−７細胞を植え、マイクロスライド面積の９割が細胞に埋まるまで細胞を培養した。その細胞に生物発光プローブをコードするプラスミドを遺伝子導入し、更に２４時間培養した。前記マイクロスライドに培養した細胞にＳＴＳ（最終濃度：１μＭ）有り無しの条件で１０分間刺激を行った。
発光測定は以下の手順で行った。マイクロスライドを１回ＨＢＳＳバッファーで洗浄したのち、基質入りのＨＢＳＳバッファー１００μＬをスライドの各チャンネルに同時に入れ、前記測定デバイスに装着した。このデバイスにミラーキャップを被らせたのち、このデバイスを更に従来のスペクトルメーター(AB-1850；ATTO)に挿入した（図５(Ａ)参照）。各チャンネルからの発光スペクトルをそれぞれ測定した（２分間集光、ｎ＝３、図５(Ｂ)参照）。
その結果、１μＭ  ＳＴＳなしに比べてＳＴＳ刺激ありの場合、全波長における発光強度の増加が認められた。スペクトルの最高発光強度（λmax）は５８０ｎｍであった。全光量の約２６％がいわゆる「Optical window」に該当する６００ｎｍ以上の光であった。この結果は、このプローブや装置を用いて動物イメージングをする際、優れた組織透過性が見込まれることを意味する。
【００１８】
（測定例３）
本発明の発光測定デバイスと一分子型生物発光プローブを用いて、試料内男性ホルモンや女性ホルモン様化学物質の濃度を測定した（図６参照）。まずアフリカ緑サル腎臓由来のＣＯＳ−７細胞を６−チャンネルのマイクロスライド（２.５×７.５ｃｍ，μ−ｓｌｉｄｅ  ＶＩ0.4；ibidi社製）に蒔き９０％の底体積を被るまで培養した。このスライド上の細胞に図４(Ａ)で示すような一分子型生物発光プローブを、遺伝子導入用脂質試薬(TransIT-LT1)を用いて導入し１６時間培養した。この発光プローブは図４(Ｂ)のような原理でリガンドに応答し発光することが分かっている。その後、左３チャンネルはコントロール、右３チャンネルはストレスホルモンで２０分間刺激した後、培地を除き１回ＨＢＳＳバッファーで洗浄し以下の組成の溶解・アッセイ兼用バッファーに基質(coelenterazine)を導入して当該発光デバイスに移して発光強度を測定した。同様にこのスライドを同時にＬＡＳ−４０００に映してその発光イメージを測定した（図６(Ｃ)参照）。このときのバッファー組成は以下のバッファーの６：４混合溶液であった：（ｉ）ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｕｆｆｅｒ  ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ  ２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７.６），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０），１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０（ＴＷ−８０），１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，ａｎｄ  ０.１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ  （ＳＤＳ）；（ｉｉ）ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｂｕｆｆｅｒ  ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ  ａｎ  ＨＢＳＳ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｗａｋｏ），０.０１％  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  （ＰＥＧ，ＭＷ：９２），０.１ｐｐｍ  ｏｆ  Ｆｅ2+，ａｎｄ  ０.１ｐｐｍ  ｏｆ  Ａｓ3+．
その結果、左３チャンネルに比べて、右３チャンネルの発光強度が２倍以上高かった。この結果は、ストレスホルモンであるコチゾールの濃度を本発光デバイスやＬＡＳ−４０００などで測定できることを意味する。
【００１９】
（測定例４）
本発明の発光測定デバイスを用いて、ストレスホルモンを測定した（図７参照）。まずアフリカ緑サル腎臓由来のＣＯＳ−７細胞を６−チャンネルのマイクロスライド（２.５×７.５ｃｍ，μ−ｓｌｉｄｅ ＶＩ0.4；ibidi社製）に蒔き９０％の底体積を被るまで培養した。このスライド上の細胞に図７(Ａ)で示すような一分子型生物発光プローブを、遺伝子導入用脂質試薬(TransIT-LT1)を用いて導入し１６時間培養した。このマイクロスライドに左３チャンネルにはそれぞれコントロール溶液入りの培地で刺激した。一方、右の３チャンネルにはストレスホルモンの標準溶液(１０-5 Ｍ)を投与し２０分間インキュベートした。その後、マイクロスライド内の溶液を全部除去しＨＢＳＳバッファーで一回洗浄した。その後、Promega社が提供するライシス溶液を用いて細胞溶解液を作成し、同じPromega社が提供するｎＣＴＺ入りのアッセイ溶液を添加した。このスライドを本発明の発光測定デバイスに搭載し、この発光測定デバイスは更にルミノメーター(GloMax 20/20n，Promega社製)に乗せてミラーキャップの有り無しの条件で発光値を測定した。
その結果、同じサンプルにも関わらず、ミラーキャップの無い条件に比べて、ミラーキャップのあった場合に２８％(ストレスホルモン有り)から４２％(ストレスホルモン無し)の発光値の増加が認められた（図７(Ｂ)）。この結果は、ミラーキャップによって効率的な集光ができたことを意味する。
また同じ発光サンプルに対して、ストレスホルモンを測定する際、発光デバイス有りの条件が無いまま発光値を測定した場合に比べて、標準偏差（ＳＤ）が少ないことが図７(Ｃ)の結果解析で確認できた。具体的には、同じサンプルでも発光デバイスを付けて測定した場合に標準偏差（ＳＤ）が１／３以下の高い精度（２８％(ストレスホルモン有り)から２９％(ストレスホルモン無し)）で測定できた。図７(Ｄ)は、ＬＡＳ−４０００で撮った本マイクロスライドの発光イメージを示している。
【００２０】
（測定例５）
性ホルモン様化学物質の特徴は、海藻類の大量発生、魚のメス化、男性不妊と深く関わっていると思われ、内分泌かく乱物質(所謂、環境ホルモン)の中でも特に注目されている類である。
本測定例では、女性ホルモン受容体(ER LBD)を骨格に２つの色（緑と赤）を発する生物発光酵素断片を繋げることによって、マルチカラーイメージングプローブを開発し、本発明の発光測定デバイスで２つの色の違いを寸時に測定した（図８参照）。このプローブの特徴は、女性ホルモン様化学物質のアゴニスト(agonist)的活性とアンタゴニスト(antagonist)的妨害活性を２色で分別するように設計されているものであり、本発明者が以前開発したコメツキムシ由来の発光酵素(CBLuc)を骨格にしているプローブである（図８(Ａ)参照）。
この発光測定デバイスは３つまでの光学フィルターを搭載できることから３色の発光分別が可能であるため、プローブがホルモン様化学物質に応じて示す多様な色変化を寸時に測定できる利点がある。
このデバイスの利点を用いて、代表的な女性ホルモンと化学物質のホルモン様活性を測定した。まずＣＯＳ−７細胞をマイクロスライドに培養しマルチカラーイメージングプローブを細胞に導入した。導入２４時間後、マイクロスライド内各チャンネルの培地を女性ホルモンや化学物質入りの培地に交換して更に２０分間培養した。培地を除去し、基質入りのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ試薬５５μＬを各チャンネルに導入して２分間インキュベーションした。その後、マイクロスライドを本発光デバイスに固定してから従来のルミノメーター(GloMax 20/20n，Promega社製）に搭載し、青、緑、赤色を通す光学フィルター下でスライドの各チャンネルを５秒間集光した。
その結果、本来の女性ホルモン(Ｅ2)に対して緑色優勢の発光(Ｓ／Ｎ比＝５)が認められ、女性ホルモン抗がん剤(ＯＨＴ)に対しては、赤色優勢の発光信号(Ｓ／Ｎ比＝４)が観察された。代表的な環境ホルモンのＰＣＢとＤＤＴに対しては、緑色発光が１.５倍のＳ／Ｎ比で観察されたことから女性ホルモン様作用が認められた。特にＤＤＴはＰＣＢより女性ホルモン様作用が強いことが分かった。
【図１】
2014038005.tif 000003
【図２】
2014038005.tif 000004
【図３】
2014038005.tif 000005
【図４】
2014038005.tif 000006
【図５】
2014038005.tif 000007
【図６】
2014038005.tif 000008
【図７】
2014038005.tif 000009
【図８】
2014038005.tif 000010