(57)【要約】【課題】オルニチン及びエクオールの製造方法、高濃度のオルニチン及びエクオールを含む発酵組成物の製造方法を提供することを課題とする。また、当該方法により得られるオルニチン及びエクオール、並びにこれらを高濃度に含む組成物を提供することを課題とする。【解決手段】イソフラボン類及びデキストリンを含む培地でアドレクロウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株の培養を試みた。その結果、当該培地にオルニチンおよびエクオールを高濃度に得ることができた。培養液をろ過後、清澄なろ液をスプレードライ装置にて乾燥し、発酵組成物の粉末を得た。分析の結果、この粉末中にはエクオール5.0重量%、オルニチン11.8重量%、シトルリン 1.69重量%が含まれていた。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、Ｌ‐オルニチン及びエクオールの製造方法；
（１）イソフラボン類及びデキストリンを含む培地で嫌気性微生物を培養する工程、及び
（２）工程（１）において得られるＬ‐オルニチン及びエクオールを回収する工程。
【請求項２】
嫌気性微生物の培養を、水素を含む1種類以上の気体からなる気相下で発酵させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
デキストリンが、βシクロデキストリン、βシクロデキストリン誘導体及びγシクロデキストリンからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
嫌気性微生物がコーリオバクテリウム（Coriobacterium）属、アドレクラウチア（Adlercreutzia）属、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属、アトポビウム（Atopobium）属、コリンゼラ（Collinsella）属、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属、デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属、エガセラ（Eggerthella）属、エンテロハブダス（Enterorhabdus）属、ゴードニバクター（Gordonibacter）属、オルセネラ（Olsenella）属、パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属、スラッキア（Slackia）属、又はラクトコッカス(Lactococcus)属のいずれかに分類される菌である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
嫌気性微生物がアサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）、あるいはアドレクロウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
嫌気性微生物がアドレクロウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法によって得られるＬ‐オルニチン及びエクオールのいずれか一方又は両方。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法によって得られるＬ‐オルニチン及びエクオールを含む組成物。
【請求項９】
エクオールを１〜５０重量％含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｌ‐オルニチンを２〜５０重量％含む、請求項８又は９に記載の組成物。
【請求項１１】
乾燥処理された、請求項８〜１０のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オルニチン及びエクオールの製造方法、高濃度のオルニチン及びエクオールを含む発酵組成物の製造方法に関する。また本発明は、当該方法により得られるオルニチン及び/又はエクオール、並びにこれらを高濃度に含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
オルニチンは、肝臓疲労ひいては全身疲労の回復を促進し、特に飲酒後の疲労を抑える効果があるといわれている。また細胞分裂を促進し、新陳代謝を活性化する効果も言われており、近年サプリメントとして注目されている。一方、エクオールは、イソフラボンの一種ダイゼインから腸内細菌の作用により生成する化合物で、イソフラボンの代謝産物の中で最もエストロゲン活性が高いことが知られている。また、エクオールは抗酸化作用を有するため、イソフラボン類を摂取することにより、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、高コレステロール血症、心疾患、更年期障害などに対して予防効果があることが明らかとなっている。
オルニチン及びエクオールを含む組成物は、エクオールの持つ種々の予防効果をさらに活性化することが期待できる。またオルニチン及びエクオールを含む組成物は、上述のオルニチン、エクオールの両方の生理作用を有することが期待される。
オルニチン及びエクオールを含む組成物については、これらを含む大豆胚軸発酵物に関する報告がある（特許文献１）。しかし特許文献１で報告された発酵物では、それぞれの濃度が低いという課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO2007/066655
【特許文献２】特開2012-135217
【特許文献３】特開2012-135219
【特許文献４】特開2012-135218
【特許文献５】WO2012/033150
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、オルニチン及びエクオールの製造方法、高濃度のオルニチン及びエクオールを含む発酵組成物の製造方法を提供することを課題とする。また本発明は、当該方法により得られるオルニチン及び/又はエクオール、並びにこれらを高濃度に含む組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。本発明者らは、イソフラボン類及びデキストリンを含む培地でアドレクロウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株の培養を試みた。その結果、当該培地中にオルニチンおよびエクオールを高濃度に見出すことに成功した。本発明はこのような知見に基づくものであり、以下の〔１〕〜〔１１〕を提供するものである。
〔１〕以下の工程を含む、Ｌ‐オルニチン及びエクオールの製造方法；
（１）イソフラボン類及びデキストリンを含む培地で嫌気性微生物を培養する工程、及び
（２）工程（１）において得られるＬ‐オルニチン及びエクオールを回収する工程。
〔２〕嫌気性微生物の培養を、水素を含む1種類以上の気体からなる気相下で発酵させることを特徴とする、〔１〕に記載の方法。
〔３〕デキストリンが、βシクロデキストリン、βシクロデキストリン誘導体及びγシクロデキストリンからなる群より選択される、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕嫌気性微生物がコーリオバクテリウム（Coriobacterium）属、アドレクラウチア（Adlercreutzia）属、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属、アトポビウム（Atopobium）属、コリンゼラ（Collinsella）属、クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属、デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属、エガセラ（Eggerthella）属、エンテロハブダス（Enterorhabdus）属、ゴードニバクター（Gordonibacter）属、オルセネラ（Olsenella）属、パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属、スラッキア（Slackia）属、又はラクトコッカス(Lactococcus)属のいずれかに分類される菌である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕嫌気性微生物がアサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）、あるいはアドレクロウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）である、〔４〕に記載の方法。
〔６〕嫌気性微生物がアドレクロウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株である、〔５〕に記載の方法。
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法によって得られるＬ‐オルニチン及びエクオールのいずれか一方又は両方。
〔８〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法によって得られるＬ‐オルニチン及びエクオールを含む組成物。
〔９〕エクオールを１〜５０重量％含む、〔８〕に記載の組成物。
〔１０〕Ｌ‐オルニチンを２〜５０重量％含む、〔８〕又は〔９〕に記載の組成物。
〔１１〕乾燥処理された、〔８〕〜〔１０〕のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、オルニチンおよびエクオールの製造方法、並びに高濃度のオルニチンおよびエクオールを含む発酵組成物の製造方法などが提供された。本発明を使用することにより、オルニチンとエクオールの両方を高濃度に含む組成物を、生物学的手法により取得することができる。
また本発明の方法では、従来技術よりも高濃度にオルニチンとエクオールを製造することができる。例えばWO2007/066655では、粉末状大豆胚軸発酵物100gあたり632.0mgのエクオール、1.06gのオルニチンが生成されたことが報告されている。つまりWO2007/066655では、粉末状大豆胚軸発酵物中のエクオール及びオルニチンの割合はそれぞれ、0.632重量%、1.06重量%に過ぎない。これに対し本発明の方法によると、乾燥粉末試料中にエクオール及びオルニチンをそれぞれ5.0重量%、11.8重量%含有する。すなわち本発明の方法によると、従来技術よりも約10倍量のエクオール及びオルニチンを製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、以下の工程を含む、オルニチン及びエクオールの製造方法に関する。
（１）イソフラボン類及びデキストリンを含む培地で嫌気性微生物を培養する工程、及び
（２）工程（１）において得られるオルニチン及びエクオールを回収する工程
本発明において好ましいオルニチンはＬ‐オルニチンである。
【０００８】
本発明のイソフラボン類は、主に大豆、クズ、レッドクローバー、カンゾウなどのマメ科から得ることできる。本発明におけるイソフラボン類は、アグリコンやその配糖体、マロニル化及びアセチル化等の任意のこれらの誘導体を含む。
アグリコンの例として、ダイゼイン、6-ヒドロキシダイゼイン、ジヒドロキシダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、ビオカニンＡ、フォルモネチン、及びクメストロールなどを挙げることができるがこれらに限定されない。
また配糖体の例として、ゲニスチン、グリシチン、ダイジン、プエラリンなどを挙げることができるがこれらに限定されない。
本発明において好適なイソフラボン類としては、ダイゼイン、6-ヒドロキシダイゼイン及びジヒドロキシダイゼイン、並びにこれらの配糖体を挙げることができる。
【０００９】
イソフラボン類はそのままか、β-グルコシダーゼ等の酵素あるいは微生物を作用させ、イソフラボンアグリコンに変換したものを使用することもできる。イソフラボンアグリコンは、例えば、大豆胚芽に麹菌を加え発酵させ、得られた発酵大豆胚芽から抽出することによって得ることができる。
【００１０】
本発明においては、培地に含まれるイソフラボン類は必ずしも生成された純品である必要はない。培地から回収されるエクオールやオルニチンの使用目的や用途などに応じて、イソフラボン類の種類、形態、精製度等を任意に選択することができる。
【００１１】
例えば、化粧品向けのオルニチンやエクオールを製造する場合には、例えば、大豆や葛等から天然抽出し、精製された高純度品であるイソブラボン類（例えば、ダイゼイン）を使用することが好ましい。
【００１２】
一方、食品向けのオルニチンやエクオールを製造する場合には、例えば、大豆や葛等から天然抽出した高精製品であって、イソフラボンアグリコン（例えば、ダイゼイン）を使用することが好ましい。
【００１３】
更に、飼料向けのオルニチンやエクオールを製造する場合には、安価に製造することが重要であるために、イソフラボン源として、例えば大豆胚軸等を使用することが好ましい。
【００１４】
市販されているイソフラボン類としては、例えば、フジッコ社製イソフラボンP40、P10などを用いることができるがこれらに限定されない。更に、イソフラポンアグリコンとして例えば「AglyMaX-30」 (ニチモウバイオテックス社製)を用いることができるがこれに限定されない。
【００１５】
培養するイソフラボン類の量や濃度は特に限定されない。培養液の量や製造しようとするオルニチンやエクオールの量に応じて適宜設定することができる。
【００１６】
本発明の方法においては、デキストリンを含む培地中で嫌気性微生物を培養する。デキストリンは特に限定されるものではないが、β−シクロデキストリン（シクロヘプタミロード）、β−シクロデキストリン誘導体またはγ−シクロデキストリンなどを例示することができる。β−シクロデキストリン誘導体としては以下のものを例示することができるがこれらに限定されない。
・グルコシル−β−シクロデキストリン（６−O−α−D−Glucosy−β−cyclodextrin）
・マルトシル−β−シクロデキストリン（６−O−α−D−Maltosy−β−cyclodextrin）
・ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（Hydroxypropy−β−cyclodextrin）
・メチル−β−シクロデキストリン（Methyl−β−cyclodextrin）
・ポリ−β−シクロデキストリン（Poly−β−cyclodextrin）
培地中へのデキストリンの添加量は、例えば培地中のイソフラボン類の0.5モル〜5モル倍、好ましくは1.0モル〜3モル倍とすることができるがこれらに限定されない。
【００１７】
本発明においては、上述のイソフラボン類及びデキストリンを含む培地において、嫌気性微生物を培養する。本発明においてオルニチン及びエクオールの製造に用いられる嫌気性微生物は、３７℃付近（例えば３０〜４２℃）の温度でオルニチン及びエクオールの生産能を有する嫌気性微生物である限り特に限定されないが、コーリオバクテリアセアエ（Coriobacteriaceae）科に分類される菌、ストレプトコッカセアエ（Streptococcaceae）科に分類される菌、又はこれらの類縁菌を、オルニチン及びエクオールの生産能を有するものとして例示することができる。
【００１８】
また、以下の群から選択される属に分類される微生物を、オルニチン及びエクオールの生産能を有するものとして例示することができる。
・コーリオバクテリウム（Coriobacterium）属
・アドレクラウチア（Adlercreutzia）属
・アサッカロバクター（Asaccharobacter）属
・アトポビウム（Atopobium）属
・コリンゼラ（Collinsella）属
・クリプトバクテリウム（Cryptobacterium）属
・デニトロバクテリウム（Denitrobacterium）属
・エガセラ（Eggerthella）属
・エンテロハブダス（Enterorhabdus）属
・ゴードニバクター（Gordonibacter）属
・オルセネラ（Olsenella）属
・パラエゲセエラ（Paraeggerthella）属
・スラッキア（Slackia）属
・ラクトコッカス(Lactococcus)属
【００１９】
したがって、これらの属に分類された微生物から選択され、イソフラボン類及びデキストリンを利用して嫌気発酵によってオルニチン及びエクオールを生成する微生物は、本発明における好ましい微生物である。中でも、アサッカロバクター（Asaccharobacter）属に属する微生物は、本発明におけるオルニチン及びエクオールの産生能を有する微生物として好ましい。微生物がオルニチンやエクオールを生成することは、培養物中のダイゼイン、ジヒドロダイゼイン、オルニチン、エクオールなどを定量することにより確認することができる。これらの定量は、当業者であれば、例えばWO2012/033150、特開2012-135217、特開2012-135218、特開2012-135219などの記載に基づき行うことができる。これらの定量方法の一例を以下に示す。
例えば、培養液に酢酸エチルを加えて、激しく攪拌した後遠心し、酢酸エチル層を取り出す。必要に応じて同培養液に同様の操作を数回行い、それら酢酸エチル層を合わせてエクオール抽出液を得ることができる。この抽出液をエバポレーターで減圧下に濃縮、乾固し、メタノールに溶解させる。これをポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜などの膜を使用して濾過し、不溶物を除去したものを高速液体クロマトグラフィー測定サンプルとすることができる。高速液体クロマトグラフィーの条件は例えば以下のものを例示することができるがこれに限定されない。
［高速液体クロマトグラフィー条件］
カラム：Phenomenox Luna ５ｕＣ１８、２．０mm×１５０mm（島津ジーエルシー）
移動相：水／メタノール［５５：４５，ｖ／ｖ］
流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
保持時間：ジヒドロダイゼインが１３．８分、ダイゼインが１９．６分、グリシテインが２２．５分、エクオールが２５．６分、ゲニステインが３５．０分。
オルニチンは一般的なのHPLCによるアミノ酸分析法で定量することもできる。例えば、新生化学実験講座Ｉ,p.p.30〜40（日本生化学学会編, 東京化同人,1990）に示されている。
【００２０】
より具体的には、たとえば以下の微生物を、本発明におけるオルニチン及びエクオールの産生能を有する微生物として利用することができる。
・Adlercreutzia equolifaciens DSM 19450
・Enterorhabdus mucosicola DSM 19490
・Slackia isoflavoniconvertens HE8（DSM 22006）
・Slackia sp. TM-30 FERM AP-20729号
・Eggerthella sp. KCCM-10490
・Asaccharobacter celatus DSM 18785
・Lactococcus garvieae DSM 6783
【００２１】
特に以下に記載する微生物のいずれか又はこれらの菌と同様の種としての性質を有する類縁の菌をより好ましい嫌気性微生物として挙げることができる。
・アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）DSM 18785株
・アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株
・スラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Slackia isoflavoniconvertens）DSM 22006株
【００２２】
上記嫌気性微生物は、その寄託番号に示された寄託機関から入手することができる。各受託番号は、当該嫌気性微生物が、それぞれ次の寄託機関に寄託されていることを示す。
FERM  特許生物寄託センター；International Patent Organism Depositary (IPOD) 
http://unit.aist.go.jp/pod/ci/index.html
DSM   German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) 
http://www.dsmz.de/
KCCM  Korean Culture Center of Microorganisms
【００２３】
本発明においては、オルニチン及びエクオールの生産能を有する嫌気性微生物は、オルニチンやエクオールの生産に適した条件でイソフラボン類と接触させられ、デキストリンを含む培地中で培養される。本発明におけるオルニチン及びエクオールの生産に適した条件とは、オルニチン及びエクオールの生成活性を持つ嫌気性微生物の生存と活動が維持される条件を言う。より具体的には、嫌気性微生物の生存が可能な気相条件（嫌気性条件）が維持され、当該嫌気性微生物の活性と増殖を支持するための栄養素が与えられることを言う。嫌気性微生物の生存に適した種々の培地組成が公知である。したがって、先に示したオルニチン及びエクオールの生産能を有する嫌気性微生物について、当業者は、適切な培地組成を選択することができる。たとえば、Difco社製のＢＨＩ培地や、実施例において用いた日水製薬社製のGAMブイヨン培地等を使用することができるがこれらに限定されない。
【００２４】
たとえば、本発明で用いられる培地には、水溶性の有機物を炭素源として加えることができる。水溶性の有機物として、以下の化合物を挙げることができる。
ソルボース
フラクトース
グルコース
メタノール
吉草酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、ギ酸など有機酸類
【００２５】
炭素源としての培地に加える有機物の濃度は、効率的に培地中の嫌気性微生物を発育させるために適宜調節することができる。一般的には、0.1〜10wt/vol%の範囲から添加量を選択することによって、過不足を避けることができる。
【００２６】
上記の炭素源に加えて、培地には、窒素源が加えられる。本発明において、窒素原としては通常の発酵に用いうる各種の窒素化合物を用いることができる。好ましい無機窒素源は、アンモニウム塩、及び硝酸塩である。より好ましい無機窒素源は、硫安、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、硝酸カリウム及び硝酸ソーダである。
一方、好ましい有機窒素源はアミノ酸類、酵母エキス、ペプトン類（例えばポリペプトンNなど）、肉エキス、肝臓エキス、消化血清末などである。より好ましい有機窒素源はアルギニン、システイン、シトルリン、リジン、酵母エキス、ペプトン類（例えばポリペプトンNなど）である。
【００２７】
さらに、炭素源や窒素源に加えて、嫌気性微生物の培養に適した他の有機物あるいは無機物を培地に加えることもできる。たとえば、ビタミンなどの補因子や各種の塩類等の無機化合物を培地に加えることによって、嫌気性微生物の増殖や活性を増強できる場合もある。たとえば無機化合物、ビタミン類、動植物由来の微生物増殖補助因子として以下のものを挙げることができる。
無機化合物                      ビタミン類
リン酸二水素カリウム            ビオチン
硫酸マグネシウム                葉酸
硫酸マンガン                    ピリドキシン
塩化ナトリウム                  チアミン
塩化コバルト                    リボフラビン
塩化カルシウム                  ニコチン酸
硫酸亜鉛                        パントテン酸
硫酸銅                          ビタミンB12
明ばん                          チオオクト酸
モリブデン酸ソーダ              p-アミノ安息香酸
塩化カリウム
ホウ酸等
塩化ニッケル
タングステン酸ナトリウム
セレン酸ナトリウム
硫酸第一鉄アンモニウム
【００２８】
これらの無機化合物やビタミン類、あるいは増殖補助因子を添加して培養液を製造する方法は公知である。培地は、液体、半固体、あるいは固体とすることができる。本発明のオルニチン及びエクオールの製造方法において、好ましい培地の形態は、液体培地である。
【００２９】
本発明において、嫌気性微生物は、公知の微生物の培養方法にしたがって培養することができる。工業的な製造には、培地や基質ガスを連続的に供給することができ、かつ培養物を回収するための機構を備えた連続培養システム (continuous fermentation system)が好適である。
【００３０】
嫌気性微生物の培養においては、連続培養システム内への酸素の混入を防ぐことが必要である。培養器は通常用いられる培養槽がそのまま利用できる。嫌気性微生物の培養にも利用することができる培養タンクが市販されている。培養槽内に混入する酸素を、窒素などの不活性気体あるいは基質ガスなどで置換することにより、嫌気的な雰囲気を作ることができる。
【００３１】
たとえば、嫌気培養ジャー(anaerobic jar)を、嫌気性微生物を培養するためのバイオリアクターとすることができる。嫌気培養ジャーは、金属、ガラス、あるいは合成樹脂製の気密容器で構成され、内部を大気中の酸素から遮断することができる。さらに、嫌気培養ジャーは、嫌気培養ジャー内部の空間や培養液中に含まれる分子状酸素を除去するための機構を備えることができる。たとえば、嫌気培養ジャー内部を吸引する真空ポンプを接続して吸引し、酸素以外の気体を供給することで、内部を嫌気状態に維持することができる。
【００３２】
本発明においては、培養槽に付加的な機能を与えることができる。たとえば、通常使用される撹はん混合槽のほか、気泡塔型、ドラフトチューブ型の培養槽も利用できる。液体培地に吹き込まれる混合気体によって微生物は遊離分散され、微生物と培地を十分に接触させることができる。また、バイオトリックリングフィルター（biotrickling filter）のように通気性の高いスラグ、その他セラミック系の無機充てん物、あるいはポリプロピレン等の有機合成物質の充てん層に、水分を滴らせながら微生物を生息させ、そこにガスを通気しながら培養することもできる。さらに、使用する微生物は常法によりカラギーナンゲル、アルギン酸ゲル、アクリルアミドゲル、キチン、セルロース、寒天などに固定化して用いることもできる。
【００３３】
培養槽の形状によっては、培地を十分に撹はんするため、撹はん機等を利用することもできる。培養槽内の培養物を攪拌することによって、培地成分や基質ガスを嫌気性微生物に接触させる機会を増やして、オルニチン及びエクオールの生成効率を最適化することができる。また基質ガスをナノバブルとして供給することもできる。
【００３４】
微生物の十分な生育のため、培養物のpHは3.0〜8.0が好ましく、4.5〜7.5（例えば6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5）がより好ましい。また、オルニチン及びエクオールの回収量を増加させるため、培養槽の温度は特に制限されるものではないが、37℃を好ましい温度として挙げることができる。
発酵時間は、オルニチン及びエクオールの生成量、イソフラボン類の残存量等に応じて適宜設定できる。例えば８〜120時間、好ましくは12〜72時間、特に好ましくは16〜60時間を例示することができるがこれらに限定されない。
【００３５】
効率よくオルニチン及びエクオールを回収するため、培養槽に供給される新鮮な培地の量は、培養槽内の培養物における希釈率が時間当たり0.04〜2/hrが好ましい。より好ましい希釈率は0.08〜1/hrである。
【００３６】
本発明においては、嫌気性微生物の培養を、水素を含む1種類以上の気体からなる気相下で行うことが好ましい。水素濃度は特に限定されない。
【００３７】
本発明においては、気相を構成する気体の組み合わせは特に制限されるものではなく、水素の他に二酸化炭素、窒素等から選択される１種類以上の気体を構成成分として用いることが可能である。また、効率よくオルニチン及びエクオールを回収するためには、気相を構成する混合気体の培養槽への通気量は0.01〜2.0 V/V/Mガス量/液量/分であることが好ましい。
【００３８】
本発明において、嫌気性微生物を培養する際の加圧条件は、当該微生物が生育できる条件であれば特に限定されるものではない。好ましい加圧条件としては、0.02〜0.2MPaの範囲を挙げることができるがこれに限定されない。
【００３９】
本発明においては、培養生成液からオルニチン及びエクオールを回収する。本発明においては、培養生成液から菌体を除いたものを培養組成物として取得することができる。すなわち本発明は、以下の工程を含む、オルニチン及びエクオールを含む発酵組成物の製造方法も提供する。
（１）イソフラボン類及びデキストリンを含む培地で嫌気性微生物を培養する工程、及び
（２）工程（１）において得られる培養生成液から菌体を除去し、オルニチン及びエクオールを含む発酵組成物を取得する工程
このようにして得られる組成物には、オルニチン及びエクオールの他に、原料であるイソフラボン類に由来する物質など培養に使用した様々な物質が含まれる。
また本発明においては、培養生成液から純度の高いオルニチンやエクオールを取得することもできる。従って本発明は、本発明の方法によって製造されるオルニチンを提供する。また本発明は、本発明の方法によって製造されるエクオールを提供する。さらに本発明は、本発明の方法によって製造されるオルニチン及びエクオールを提供する。また本発明は、本発明の方法によって製造されるオルニチン及びエクオールを含む組成物を提供する。
【００４０】
当業者は、生成した嫌気性微生物と培養生成液を分離するため、公知の方法を用いることができる。好ましい分離の方法は、ろ過性能、濃縮性能を有するホローファイバー型限外ろ過あるいは精密ろ過膜を利用する方法である。また、微生物と該生成液の分離に十分なろ過速度を得るためには、使用する微生物に応じて適当な分画分子量の膜を選択すれば良い。
【００４１】
本発明においては、培養槽から限外ろ過膜を通して分離された培養液からオルニチンやエクオールを精製することができる。具体的には、エクオールの場合、培養液から菌体を除き、上清を、例えば三菱化学製吸着樹脂HP-20などの樹脂に吸着させ、水洗後メタノールやエタノールで溶出させる。溶出液を濃縮、晶析することで精製エクオールを得ることができる。必要に応じてシリカゲルクロマトグラフィーあるいは再結晶を行うことでさらに精製できる。オルニチンについては上清を陽イオン交換樹脂に通して吸着させ、アンモニア水溶出することで精製できる。また必要に応じて再結晶を行うことでさらに精製できる。
【００４２】
本発明の製造方法によって得られる培養精製液には、高濃度のオルニチン及びエクオールが含まれる。培養液中のオルニチンやエクオールの含量は、使用するオルニチン及びエクオールの生産菌や発酵条件等によって異なるが、通常、オルニチンについては培養液1.0リットル当たり少なくとも2〜40g、好ましくは3〜30g、より好ましくは5〜20g、エクオールについては培養液1.0リットル当たり少なくとも0.5〜10g、好ましくは1〜6g、より好ましくは2〜6g含まれる。
【００４３】
従って本発明は、本発明の製造方法によって得られるオルニチン及びエクオールを含む組成物を提供する。本発明の製造方法により得られるオルニチン及びエクオールは、必要に応じて乾燥処理に供して乾燥固形物状にして使用することができる。本発明においては、発酵培養物の保存安定性を向上させるため、加熱乾燥処理あるいは噴霧乾燥処理により固形状にしておくことが望ましい。加熱乾燥処理あるいは噴霧乾燥処理は、例えばスプレードライ装置を使用して行うことができる。加熱乾燥処理もしくは噴霧乾燥処理された発酵培養物は、必要に応じて粉末化処理に供してもよい。
【００４４】
本発明の組成物は、乾燥粉末中、エクオールを１〜５０重量％含むことができる。例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％から選択される２点の質量パーセント濃度を下限（「〜以上、又は、〜より高い）及び上限（〜以下、又は、〜より低い）とする濃度範囲により示される質量パーセント濃度であることが好ましい。
また本発明の組成物は、乾燥粉末中、オルニチンを２〜５０重量％含むことができる。例えば、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％から選択される２点の質量パーセント濃度を下限（「〜以上、又は、〜より高い）及び上限（〜以下、又は、〜より低い）とする濃度範囲により示される質量パーセント濃度であることが好ましい。
なお本発明の方法によって得られる組成物には、エクオールやオルニチンの他に、シトルリンが含まれていてもよい。シトルリンは、本発明の方法によって得られる組成物の乾燥粉末中、例えば、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％から選択される２点の質量パーセント濃度を下限（「〜以上、又は、〜より高い）及び上限（〜以下、又は、〜より低い）とする濃度範囲により示される質量パーセント濃度であることが好ましい。
【００４５】
さらに本発明の組成物は、原料であるイソフラボン類に由来する物質を含んでいてもよい。このような物質として、
ダイジン、マロニルダイジン、アセチルダイジン、ダイゼイン、ジハイドロダイゼ、イン等のダイゼイン類、
ゲニスチン、マロニルゲニスチン、アセチルゲニスチン、ゲニステイン、ジハイドロゲニステイン等のゲニステイン類、
グリシチン、マロニルグリシチン、アセチルグリシチン、グリシティン、ジハイドログリシティン等のグリシティン類
などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４６】
本発明の製造方法により得られるオルニチン及び/又はエクオール、あるいはこれらを含む組成物は、医薬品、飲食物、化粧料等の素材として提供することができる。
本発明の製造方法により得られるオルニチン及び/又はエクオール、あるいはこれらを含む組成物を医薬品として提供する場合、その剤型は、予防または治療しようとする疾患や医薬品の使用形態、投与経路等に応じて選択することができる。例えば錠剤、被覆錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、浸剤、煎剤、チンキ剤等が挙げられる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に対して必要に応じて充填剤、増量剤、賦形剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、この医薬製剤中に着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させてもよい。
本発明の製造方法により得られるオルニチン及び/又はエクオール、あるいはこれらを含む組成物は、乳癌、前立腺癌、骨粗しょう症、心疾患、更年期障害の予防や治療のために使用することができる。
【００４７】
本発明の製造方法により得られるオルニチン及び/又はエクオール、あるいはこれらを含む組成物を飲食物として提供する場合、一般の食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等として使用できる。食品の形態としては、本発明の方法によって得られるオルニチン、エクオール、あるいはこれらを含む組成物を含む清涼飲料、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、グミ、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、アイスクリーム、アイスキャンデー、パン、ケーキ、シュークリーム、ハム、ミートソース、カレー、シチュー、チーズ、バター、ドレッシング等を例示することができる。
【００４８】
本発明の組成物には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、及びこれら加水分解物、バターなどが挙げられる。糖質としては糖類、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂、パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラルなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができ、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。
【００４９】
これらの食品中のオルニチン及び/又はエクオール、あるいはこれらを含む組成物の配合割合は、食品の種類、オルニチン及び/又はエクオールの含量、摂取対象者の年齢や性別、期待される効果等に応じて、適宜設定することができる。一例として、食品100gに対して0.01-100g、好ましくはO.1-10g、更に好ましくはO.5-5gとなる割合を挙げることができるがこれらに限定されない。オルニチン及び/又はエクオールを含む組成物を含む食品の一日当たりの摂取量については、組成物中のオルニチン及び/又はエクオールの含量、摂取者の年齢や体重、摂取回数等によって異なるが、例えば成人1日当たり、O.1-10gに相当する組成物の量を挙げることができる。
【００５０】
また本発明の製造方法により得られるオルニチン及び/又はエクオール、あるいはこれらを含む組成物を化粧料素材として提供する場合、当該組成物等を水溶液、ローション、スプレー液、懸濁液および乳化液などの液状、粉末、顆粒およびブロック状などの固体状、クリームおよびペーストなどの半固体状、ゲル状等の各種所望の形態の化粧料に調製することができる。このような化粧料は、洗顔料、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック・マスク等の基礎化粧品、ファンデーション、口紅等のメーキャップ化粧品、口腔化粧品、芳香化粧品、毛髪化粧品、ボディ化粧品等の各種化粧料として有用である。本発明の製造方法により得られるオルニチン及び/又はエクオール、あるいはこれらを含む組成物を含有する化粧料は、美白用化粧料、ニキピ改善用化粧料として使用される。
本発明の組成物等は、必要に応じて、瓶、袋、缶、スプレー缶、噴霧容器、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。
【００５１】
本発明の製造方法により得られるオルニチン及び/又はエクオール、あるいはこれらを含む組成物を含有する化粧料において、化粧料中の組成物の配合割合は特に限定されない。該化粧料の種類、オルニチン及びエクオールの含量等に応じて、適宜設定することができるが、一例を示せば、化粧料100gに対して、組成物(乾燥重量換算)が総量で0.01-10g、好ましくは0.1-5gとなる割合を挙げることができるがこれらに限定されない。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕
GAMブイヨン培地（日水製薬製）5.9 gとL-アルギニン塩酸塩1.2 gを純水100 mLに溶かし、窒素ガスを通じながら10 mLずつ嫌気性菌培養用18 mm試験管（三紳工業製）に分注し、ブチルゴム栓、プラスチックキャップをして115℃、15分間滅菌した。
この培地に-80℃で凍結保存していたアドレクロウチア・エクオリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）DSM 19450株を植菌し、無菌フィルターを通した水素ガスで気相を2分間以上置換した後（水素の分圧パーセント濃度 100％）、37℃、250 spmで16時間振とう培養を行い、種培養液を調製した。
オートマチックシステムリサーチ社製2L容ミニジャーに表１に示すようなエクオール生産培地1.0Lを調製後、115℃、15分間オートクレーブ滅菌し、室温まで冷却した。これに上記種培養液20 mLを植菌し、水素/N2〔2：98〕ガスを0.1 L/minで通気しながら37℃、500 rpm、0.05 MPaで培養を行った。48時間後、培養液を取り出し、高速液体クロマトグラフィーによりエクオールを定量したところ、2.95 g/Lのエクオールが生成していた。
培養終了後、105℃、1分加熱殺菌し、冷却後、遠心分離にて菌体および不溶物を除去した。この上清をさらにスペクトラム社製MFろ過膜（0.2 μm、ポリエーテルサルホン、MiniKrosサンプルモジュール）によりろ過を行い、清澄なろ液約900 mLを得た。これをスプレードライ装置にて乾燥し、粉末47 gを得た（熱風温度165℃、排風温度95〜100℃、アトマイザー回転数26000 rpm）。分析の結果、この粉末中にはエクオール5.0重量%、オルニチン11.8重量%、シトルリン 1.69重量%が含まれていた。
【００５３】
【表１】
2014054234.tif 000002
pH 7.1
酵母エキス：極東製薬製
ポリペプトンN：日本製薬製
AglyMax：ニチモウバイオテックス製イソフラボン
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明により、高濃度のオルニチン及びエクオールを含む組成物の製造方法、当該方法により得られる高濃度のオルニチン及びエクオールを含む組成物などが提供された。このような組成物は、更年期障害（更年期不定愁訴、骨粗繋症、高脂血症）、骨粗繋症、前立腺肥大、メタボリックシンドローム等の疾患や症状の予防及び/又は改善などに有用である。