(57)【要約】【課題】細胞担体として適切な含水率、適度な水溶性、および複雑かつ微細な三次元構造を構築することが可能な強度とを併せ持ち、さらに、光照射以外の方法でも分解可能な光および加水分解性ゲルを製造できる光および加水分解性架橋剤を提供する。【解決手段】直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有する分岐鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖２と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置されたエステル結合８０及び該エステル結合８０の末端に配置された光分解性のベンジル基３と、を含み、  前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基４、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有することを特徴とする光および加水分解性架橋剤１。【選択図】図１
2014226088.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有する分岐鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置されたエステル結合及び該エステル結合の末端に配置された光分解性のベンジル基と、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有することを特徴とする光および加水分解性架橋剤。
【請求項２】
前記活性エステル基がＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である請求項１記載の光および加水分解性架橋剤。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコール分岐鎖におけるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある請求項１又は２に記載の光および加水分解性架橋剤。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコールの分岐鎖が４分岐又は８分岐である請求項１〜３のいずれか１項に記載の光および加水分解性架橋剤。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコールが、ネオペンチル骨格を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の光および加水分解性架橋剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の光および加水分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られ、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光および加水分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されていることを特徴とする光および加水分解性ゲル。
【請求項７】
請求項６に記載の光および加水分解性ゲルであって、前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つである光および加水分解性ゲル。
【請求項８】
前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である請求項６又は７に記載の光および加水分解性ゲル。
【請求項９】
前記高分子化合物が、ゼラチンである請求項６又は７に記載の光および加水分解性ゲル。
【請求項１０】
請求項６〜９のうちいずれか１項に記載の光および加水分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されていることを特徴とする細胞培養器具。
【請求項１１】
前記細胞培養基材の少なくとも表面が、ポリスチレンまたは細胞接着性材料からなる請求項１０に記載の細胞培養器具。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の細胞培養器具と、該細胞培養器具に光を照射する照射部を備え、
前記照射部は、光源と、前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部を有することを特徴とする細胞配列・分別装置。
【請求項１３】
請求項１０又は１１に記載の細胞培養器具を使用し、該細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光および加水分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞とそれ以外の領域にある細胞とを分別することを特徴とする細胞分別方法。
【請求項１４】
請求項１０又は１１に記載の細胞培養器具を使用し、該細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光および加水分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列することを特徴とする細胞配列方法。
【請求項１５】
請求項６〜９のいずれか１項に記載の光および加水分解性ゲルを用い、以下の工程を含むことを特徴とする組織体形成方法。
（Ｉ）前記光および加水分解性ゲルを形成する工程
（ＩＩ）光照射によって前記光および加水分解性ゲルの構造を規定する工程
（ＩＩＩ）前記光および加水分解性ゲルに細胞を播種する工程
（ＩＶ）細胞を培養する工程
（Ｖ）前記光および加水分解性ゲルを加水分解する工程
【請求項１６】
請求項６〜９のいずれか１項に記載の光および加水分解性ゲルを用い、以下の工程を含むことを特徴とする組織体形成方法。
（Ｉ）細胞を内包させた前記光および加水分解性ゲルを形成する工程
（ＩＩ）光照射によって前記光および加水分解性ゲルの構造を規定する工程
（ＩＩＩ）細胞を培養する工程
（ＩＶ）前記光および加水分解性ゲルを加水分解する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、材料工学の分野に属し、特に、複雑且つ微細な三次元組織体の製造に用いることができる光および加水分解性架橋剤と、これを用いた、光および加水分解性ゲル、細胞培養器具、細胞配列・分別装置、細胞配列方法、細胞分別方法、並びに、組織体形成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、再生医療では細胞シートや細胞懸濁液を用いた細胞移植が主流である。今後は血管や神経といった複雑な構造を有する組織体や、肝組織、腎組織といったより大きな組織体や臓器を、体外で人工的に加工して移植するＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅを用いた再生医療が重要となってくると考えられ、その三次元構造は必然的に複雑な構造となる。そのため、複雑且つ微細な三次元構造を有する人工的な組織体の形成、形成方法等の開発が求められている。
【０００３】
細胞培養方法の一つとして、ハイドロゲルを利用した方法が挙げられる。ハイドロゲルは、高い含水率、力学的性質の調整が容易、栄養素の拡散性に優れる等の細胞の担体として優れた特性を有している（非特許文献１）。
ハイドロゲルは、光分解性の基を分子内に組み込むことで光分解性が付与され、光による加工が可能な光分解性ゲルが開発されている。光分解性ゲルとしては、例えばポリエチレングリコールを主鎖とし、ニトロベンジル基を分子内に有するものがある（特許文献１及び非特許文献４）。このような構成を持った高分子モノマーから形成されるハイドロゲルの物性は、光照射によって時間的・空間的に制御可能であり（非特許文献３及び４）、光分解は生細胞との適合性が高い（非特許文献２及び５）。
しかし、これまでに報告されている光分解性ゲルは、ラジカル重合を利用してゲル化されるため、酸素の存在下で重合すると酸素の影響を受けて劣化することがある。また、ラジカルが細胞や生理活性物質にダメージを与えてしまう、また、主鎖として使用できる高分子化合物が、ラジカル重合できるモノマーの重合物に限定されるため、その利用が限定されてしまっている等の問題があった。
発明者らは、ラジカル重合を利用せず、高分子化合物と混合するだけで架橋反応が起こり、光分解性ゲルを形成可能な光分解性架橋剤の開発を行ってきた（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１０８０８７号公報
【特許文献２】特開２０１２−８０８４４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｄｒｕｒｙ， Ｊ． Ｌ． ａｎｄ Ｍｏｏｎｅｙ， Ｄ． Ｊ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ （２００３） Ｖｏｌ．２４， ｐｐ.４３３７−４３５１.
【非特許文献２】Ｋｌｏｘｉｎ， Ａ． Ｍ． ｅｔ.ａｌ．, Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００９） Ｖｏｌ．３２４， ｐｐ.５９−６３．
【非特許文献３】Ｋｌｏｘｉｎ， Ａ． Ｍ． ｅｔ.ａｌ．, Ａｄｖ． Ｍａｔｅｒ． （２０１０） Ｖｏｌ．２２, ｐｐ.６１−６６．
【非特許文献４】Ｗｏｎｇ， Ｄ． Ｙ． ｅｔ.ａｌ．, Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （２０１０） Ｖｏｌ．４３， ｐｐ.２８２４−２８３１．
【非特許文献５】Ｋｌｏｘｉｎ, Ａ． Ｍ．ｅｔ.ａｌ．, Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ（２０１０） Ｖｏｌ．３１, ｐｐ.１−８.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の、ラジカル重合反応を用いずに重合可能な光分解性のゲルでは、ゲルが溶媒を吸収して膨潤することで崩れてしまい、意図した構造が構築できないことがある。またゲルの強度が低く、生体構造を再現するような複雑な三次元構造の作製が難しいという問題がある。ゲルの強度を容易に高める方法としては、ゲルを構成する化合物の濃度を上げてもよいが、濃度を上げるとゲルの含水率が下がってしまう。または、ゲルの強度を高めるために、ポリマーを構成する化合物の分子量を下げることでもゲルの強度を高めることができるが（価数を一定とした場合）、ゲルの水に対する溶解度が低下してしまい、製造時および使用時において扱いにくく、またゲルの状態が不均一になりやすい。
【０００７】
また一方で、人工的に加工した組織体を生体内に移植する際には、異物反応を低減するために人工的に合成された化合物ができるだけ除去されていることが好ましい。しかし、光によってのみ分解されるゲルでは、複雑な構造を有する組織体からゲルを完全に取り除くことが難しいという問題がある。光の吸収や焦点深度の問題で光分解では１ｍｍ以上の厚いゲルを分解することが難しく、また、細胞を播種・培養した後では細胞が光を吸収・散乱してしまうので組織体の内部の材料を分解することは難しい。
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞担体として適切な含水率、適度な水溶性、および複雑かつ微細な三次元構造を構築することが可能な強度とを併せ持ち、さらに、光照射以外の方法でも分解可能な光分解性ゲルを製造できる光分解性架橋剤の提供を課題とする。
また、前記光分解性架橋剤を有する光分解性ゲル、該光分解性ゲルを有する細胞培養器具、該細胞培養器具を使用する細胞配列・分別装置、並びに該細胞培養器具を用いる細胞配列法、及び細胞分別方法、並びに該光分解性ゲルを用いた組織体形成方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは鋭意検討し、光分解性架橋剤の分岐数を高めることでゲルの強度を高められ、上記課題が解決されることを見出し、さらに、架橋剤中にエステル結合を配置させることで、加水分解によって架橋剤が分解可能であることを見出し、本発明を完成させた。すなわち本発明は以下の通りである。
［１］直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有する分岐鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置されたエステル結合及び該エステル結合の末端に配置された光分解性のベンジル基と、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有することを特徴とする光および加水分解性架橋剤。
［２］前記活性エステル基がＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの誘導体である［１］に記載の光および加水分解性架橋剤。
［３］前記ポリエチレングリコール分岐鎖におけるエチレングリコールの平均繰り返し数が２０から５００の範囲にある［１］又は［２］に記載の光および加水分解性架橋剤。
［４］前記ポリエチレングリコールの分岐鎖が４分岐又は８分岐である［１］〜［３］のいずれか一つに記載の光および加水分解性架橋剤。
［５］前記ポリエチレングリコールが、ネオペンチル骨格を有する［１］〜［４］のいずれか一つに記載の光および加水分解性架橋剤。
［６］［１］〜［５］のいずれか一つに記載の光および加水分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基又はヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られ、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光および加水分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されていることを特徴とする光および加水分解性ゲル。
［７］［６］に記載の光および加水分解性ゲルであって、前記高分子化合物が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つである光および加水分解性ゲル。
［８］前記高分子化合物が、分岐型のポリエチレングリコール誘導体である［６］又は［７］に記載の光および加水分解性ゲル。
［９］前記高分子化合物が、ゼラチンである［６］又は［７］に記載の光および加水分解性ゲル。
［１０］［６］〜［９］のいずれか一つに記載の光および加水分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されていることを特徴とする細胞培養器具。
［１１］前記細胞培養基材の少なくとも表面が、ポリスチレンまたは細胞接着性材料からなる［１０］に記載の細胞培養器具。
［１２］［１０］又は［１１］に記載の細胞培養器具と、該細胞培養器具に光を照射する照射部を備え、
前記照射部は、光源と、前記光源からの光を該細胞培養器具の表面の任意の一部領域にのみ照射させる照射領域調整部を有することを特徴とする細胞配列・分別装置。
［１３］［１０］又は［１１］に記載の細胞培養器具を使用し、該細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光および加水分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞とそれ以外の領域にある細胞とを分別することを特徴とする細胞分別方法。
［１４］［１０］又は［１１］に記載の細胞培養器具を使用し、該細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光および加水分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域に細胞を配列することを特徴とする細胞配列方法。
［１５］［６］〜［９］のいずれか一つに記載の光および加水分解性ゲルを用い、以下の工程を含むことを特徴とする組織体形成方法。
（Ｉ）前記光および加水分解性ゲルを形成する工程
（ＩＩ）光照射によって前記光および加水分解性ゲルの構造を規定する工程
（ＩＩＩ）前記光および加水分解性ゲルに細胞を播種する工程
（ＩＶ）細胞を培養する工程
（Ｖ）前記光および加水分解性ゲルを加水分解する工程
［１６］［６］〜［９］のいずれか一つに記載の光および加水分解性ゲルを用い、以下の工程を含むことを特徴とする組織体形成方法。
（Ｉ）細胞を内包させた前記光および加水分解性ゲルを形成する工程
（ＩＩ）光照射によって前記光および加水分解性ゲルの構造を規定する工程
（ＩＩＩ）細胞を培養する工程
（ＩＶ）前記光および加水分解性ゲルを加水分解する工程
【発明の効果】
【００１０】
本発明の光および加水分解性架橋剤によれば、細胞担体として適切な含水率、適度な水溶性、および複雑かつ微細な三次元構造を構築することが可能な強度とを併せ持った光および加水分解性ゲルの製造が実現される。したがって、本発明の光および加水分解性架橋剤によれば、複雑かつ微細な三次元構造を有し、生体移植に好適なマテリアルフリーの組織体の形成及びより生体環境に近く信頼度の高い細胞アッセイ系が実現される。したがって本発明は、再生医療技術の発展および新規の医薬品開発に資する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の光および加水分解性架橋剤の模式図である。
【図２】本発明の光および加水分解性架橋剤の構造の説明図である。
【図３】本発明の光および加水分解性ゲルの生成反応を示す図である。
【図４】本発明の光および加水分解性ゲルの分解反応を示す図である。
【図５】本発明の光および加水分解性ゲルの加水分解反応を示す図である。
【図６】本発明の細胞配列・分別装置の一例を示す構成図である。
【図７】本発明の細胞配列方法の一例を示す模式図である。
【図８】本発明の細胞分別方法の一例を示す模式図である。
【図９】本発明の組織体形成方法の一例を示す模式図である。
【図１０】本発明の組織体形成方法の一例を示す模式図である。
【図１１】本発明の光および加水分解性架橋剤の合成の一例を示す説明図である。
【図１２】本発明の光および加水分解性架橋剤の合成の一例を示す説明図である。
【図１３】本発明の光および加水分解性架橋剤の合成の一例を示す説明図である。
【図１４】本発明の光および加水分解性ゲルの加水分解反応の様子である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
《光および加水分解性架橋剤》
直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有する分岐鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置されたエステル結合及び該エステル結合の末端に配置された光分解性のベンジル基と、を含み、
前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する化合物である。
前記光および加水分解性架橋剤としては、例えば、下記式一般式（１）で表される化合物が挙げられる。
【００１３】
【化１】
2014226088.tif 000003
【００１４】
前記一般式（１）中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立して水素原子、Ｚ、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚ、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表す。
Ｚは、−Ｃ（＝Ｏ）−とその末端に配置された光分解性のベンジル基を表し、該−Ｃ（＝Ｏ）−は、前記（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ鎖の末端の酸素原子とともにエステル結合を形成している。前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する。
複数のＡ１は、連結基を表し、それぞれ独立に単結合、又は炭素原子数１〜２０の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基を表し、
該アルキル基中の１個又は非隣接の２個以上の−ＣＨ２−はそれぞれ独立して−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、又はシクロへキシレン基によって置換されていてもよい。
ｐは０、又は１以上の整数を表し、ｐが１以上の場合、複数存在するＲ２及びＲ４は同一でも異なっていてもよい。Ｒ１〜Ｒ４のうち少なくとも２つ以上のＲがＺを含み、１つ以上のＲが−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｚであることとする。
【００１５】
本発明の光および加水分解性架橋剤が、３分岐以上の分岐鎖を有している場合、該分岐鎖の分岐末端に配置された活性エステル基と、該活性エステル基と反応する高分子化合物との間に形成される架橋点（架橋剤１分子あたり）が十分に多く、本発明の光および加水分解性架橋剤を用いれば、適度な強度を持った光および加水分解性ゲルを得ることができる。また、本発明の光および加水分解性架橋剤は、光分解性のニトロベンジル基を含む基を有していることから、伝統的なフォトリソグラフィーや近年の二光子励起加工法に代表されるような、光による微細加工技術を適応可能であり、本発明の光および加水分解性架橋剤を用いれば、光照射によってゲルの微細な加工が可能な光および加水分解性ゲルを得ることができる。したがって、本発明の光および加水分解性架橋剤を用いれば、複雑且つ微細な三次元構造を有するゲルを構築することが可能である。
【００１６】
前記一般式（１）で表される光および加水分解性架橋剤が含むポリエチレングリコール分岐鎖のエチレングリコールの平均繰り返し数ｎは、２０から５００の範囲にあり、３０から２５０の範囲にあることがより好ましく４０から１２５の範囲にあることがさらに好ましい。
エチレングリコールの繰り返し数を上記範囲に設定することで、ゲルの水に対する溶解度を高めることができ、製造時および使用時において扱いの容易で、状態の均一な光および加水分解性ゲルを得ることができる。
【００１７】
前記一般式（１）において、Ｚは−Ｃ（＝Ｏ）−とその末端に配置された光分解性のベンジル基である。前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する。
係るベンジル基としては、下記一般式（２）又は（３）で表される基が好ましい。
【００１８】
【化２】
2014226088.tif 000004
【００１９】
前記一般式（２）〜（３）中、Ｂ１は、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−で表される基を表し、ｍは、０〜５の整数を表し、５が好ましい。
＊は、エチレングリコールの酸素原子との結合位置を表す。
Ｒ５は、水素もしくは炭素数１〜６の直鎖状又は分岐鎖状のアルキル基を表し、炭素数１〜６の直鎖状のアルキル基がより好ましく、メチル基が特に好ましい。Ｒ６は、炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキル基、又は炭素数１〜６の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルコキシ基を表し、炭素数１〜６の直鎖状のアルコキシ基がより好ましく、メトキシ基が特に好ましい。Ｒ７は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基を表し、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド誘導体が好ましく、下記一般式（４）で表される誘導体がより好ましい。
【００２０】
【化３】
2014226088.tif 000005
【００２１】
前記一般式（４）中、＊は、ベンゼン環の炭素原子との結合位置を表す。ｑは１〜１０の整数を表し、１〜６が好ましく、２〜５がより好ましく、３が特に好ましい。
【００２２】
前記一般式（２）〜（３）中のＢ１に示されるように、本発明の光および加水分解性架橋剤において、分岐鎖状のポリエチレングリコールにおける該分岐鎖の末端には、エステル結合が配置されるため、架橋剤が加水分解によって分解される。
【００２３】
前記一般式（１）で表される化合物において、ｐが０の場合、該化合物は、具体的には下記一般式（５）で表される化合物であることが好ましい。
【００２４】
【化４】
2014226088.tif 000006
【００２５】
前記一般式（５）中、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。
【００２６】
前記一般式（５）で表される化合物は、具体的には下記一般式（３０）で表される化合物であることが好ましい。
【００２７】
【化５】
2014226088.tif 000007
【００２８】
前記一般式（３０）中、Ｂ１、Ｒ５〜Ｒ６、及びｑは、前記一般式（２）〜（４）におけるものと同様である。
【００２９】
前記一般式（３０）で表される化合物は、具体的には下記式（３１）で表される化合物であることが好ましい。
【００３０】
【化６】
2014226088.tif 000008
【００３１】
前記一般式（１）で表される化合物において、ｐが１以上の場合、該化合物は、具体的には下記一般式（６）〜（８）で表される化合物であることが好ましい。
【００３２】
【化７】
2014226088.tif 000009
【００３３】
前記一般式（６）〜（８）中、ｎ、Ｚ、Ａ１、Ｒ１〜Ｒ４、及びｐは前記一般式（１）におけるものと同様である。
【００３４】
ｐが１の場合、前記一般式（１）で表される化合物は、具体的には下記一般式（９）で表される化合物であることが好ましい。
【００３５】
【化８】
2014226088.tif 000010
【００３６】
前記一般式（９）中、Ｚ、Ａ１、及びＲ１〜Ｒ４は前記一般式（１）におけるものと同様である。）
前記一般式（９）で表される化合物は、具体的には下記一般式（１０）又は（１１）で表される化合物であることが好ましい。
【００３７】
【化９】
2014226088.tif 000011
【００３８】
前記一般式（１０）〜（１１）中、ｎ、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。）
【００３９】
前記一般式（１）で表される化合物は、具体的には下記一般式（１２）で表される化合物であることが好ましい。
【００４０】
【化１０】
2014226088.tif 000012
【００４１】
前記一般式（１２）中、Ｚ、は前記一般式（１）におけるものと同様である。ｐ１は１以上の整数を表す。
【００４２】
前記一般式（１２）で表される化合物は、具体的には下記一般式（１３）又は（１４）で表される化合物であることが好ましい。
【００４３】
【化１１】
2014226088.tif 000013
【００４４】
前記一般式（１３）〜（１４）中、ｎ、Ｚは前記一般式（１）におけるものと同様である。
４分岐又は８分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）は合成しやすく、また、入手も容易であることから、前記一般式（１）で表される化合物において、ポリエチレングリコールの分岐鎖が４分岐又は８分岐であることが好ましい。
即ち、本発明の光および加水分解性架橋剤としては、下記一般式（１５）又は（１６）で表される化合物がより好ましい。
【００４５】
【化１２】
2014226088.tif 000014
【００４６】
前記一般式（１５）〜（１６）中、Ｂ１、Ｒ５〜Ｒ６、及びｑは、前記一般式（２）〜（４）におけるものと同様である。
【００４７】
前記一般式（１５）又は（１６）で表される化合物において、具体的には下記式（１７）又は（１８）で表される化合物であることが更に好ましい。
【００４８】
【化１３】
2014226088.tif 000015
【００４９】
これらの中でも、前記ポリエチレングリコールが、ネオペンチル骨格を有するものが好ましく、式（１７）および（１８）で表される化合物がより好ましい。
【００５０】
図１に、前記式（１７）で表される化合物の模式図を示す。図１および図２（ａ）〜（ｄ）に示されるように、光および加水分解性架橋剤１は、分岐鎖状のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる主鎖２と、この主鎖２の末端側に配置されたエステル結合８０及び該エステル結合８０の末端に配置された光分解性のニトロベンジル基を含む基３と、ニトロベンジル基を含む基３の末端側に配置された活性エステル基４とからなり、４分岐のポリエチレングリコールの分岐鎖を有し、ポリエチレングリコールの分岐鎖が中心にネオペンチル骨格を有する。
図１および図２（ａ）〜（ｄ）に示すように、主鎖２はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ニトロベンジル基を含む基３は、アミド結合部５（―ＮＨＣＯ―）とエステル結合８０を介して主鎖２に結合している。
【００５１】
《光および加水分解性架橋剤の合成》
前記一般式（１）で表される化合物の製造方法について説明する。
前記一般式（１）で表される化合物は、直鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖又は３分岐以上の分岐鎖を有する分岐鎖状のポリエチレングリコールからなる主鎖と、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置されたエステル結合及び該エステル結合の末端に配置された光分解性のベンジル基と、を含み、前記ベンジル基は、アミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基、及び、一つまたは複数のニトロ基をベンゼン環に有する化合物である。以下に、前記分岐末端に配置されたエステル結合及び該エステル結合の末端に前記光分解性のベンジル基を配置し、前記ベンジル基に活性エステル基を配置する反応を説明する。
【００５２】
【化１４】
2014226088.tif 000016
【００５３】
式中Ｂ１、Ｒ５〜Ｒ６、及びｑは、前記一般式（２）〜（４）におけるものと同様である。Ｒ７ａはアミノ基又はヒドロキシル基に対する反応性を有する活性エステル基を表す。
【００５４】
一般式（１−ｃ）で表される基は、一般式（１−ａ）で表される基と、一般式（１−ａ）で表される化合物に対して１．０〜２．０倍モル量の一般式（１９）で表される化合物とを、溶媒中、０〜２００℃の温度で数１０分〜２４時間処理し、溶媒を除去後、一般式（１−ｂ）で表される化合物を析出させ、精製後、一般式（１−ｂ）で表される化合物に対して、１．０〜２．０倍モル量の一般式（２０）で表される化合物とを、触媒の存在下、溶媒中、０〜２００℃の温度で数１０分〜２４時間処理し、単離することにより得られる。前記触媒としては、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）が好ましい。
【００５５】
上記一般式（１−ａ）で表される基は、下記一般式（２１）であることが好ましい。
【００５６】
【化１５】
2014226088.tif 000017
【００５７】
前記一般式（２１）中、ｎ及びｍは前記一般式（１）〜（３）におけるものと同様である。
【００５８】
上記一般式（１−ｃ）で表される基は、下記一般式（２２）であることが好ましい。
【００５９】
【化１６】
2014226088.tif 000018
【００６０】
前記一般式（２２）中、ｎ、Ｂ１、Ｒ５〜Ｒ６、及びｑは、前記一般式（１）〜（４）におけるものと同様である。
【００６１】
《光および加水分解性ゲル》
本発明の光および加水分解性ゲルは、本発明の光および加水分解性架橋剤と、分子内に合計２以上のアミノ基またはヒドロキシル基を有する高分子化合物と、を反応させて得られ、前記高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基が、前記光および加水分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋されていることを特徴とする光および加水分解性ゲルである。
高分子化合物は、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００６２】
高分子化合物としては、分岐型のポリエチレングリコールもしくはその誘導体、またはタンパク質としてゼラチンがより好ましい。
【００６３】
ポリエチレングリコールは細胞との相互作用が少なく、しかも高分子化合物自体が水に可溶であるために好ましい。なかでも、分岐型のポリエチレングリコールまたはその誘導体を用いると、網目構造が形成されやすく、ゲル化が進行しやすくなるため好ましい。分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）の分岐数は３以上が好ましい。特に、４分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）は入手しやすいため好適である。
ポリエチレングリコール（または誘導体）は、末端にアミノ基を有することが望ましい。
ポリエチレングリコール（または誘導体）の分子量は１万から４万の範囲にあることが好ましい。
【００６４】
ゼラチンの主成分であるコラーゲンは多細胞生物（動物）の細胞外基質の主成分であることから、細胞の足場タンパク質として好ましく、また、細胞の増殖、分化を促す場合があるために好ましい。用いられるゼラチンの種類は特に制限されないが、ウシ、又はブタ皮由来原料を酸処理して得られたｔｙｐｅＡゼラチンが好ましい。
ゼラチンの強度は特に制限されないが、２００〜４００ブルームが好ましく、２５０〜３５０ブルームがより好ましい。
【００６５】
塩基性多糖類としては、キトサンが好ましい。
【００６６】
高分子化合物と光および加水分解性架橋剤とを混合すると、高分子化合物のアミノ基またはヒドロキシル基は、光および加水分解性架橋剤の活性エステル基と縮合して架橋される。
前記アミノ基は光および加水分解性架橋剤の活性エステル基とアミド結合を形成し、前記ヒドロキシル基は活性エステル基とエステル結合を形成する。これによって、網目構造が形成され、ゲル化が進行し、光および加水分解性ゲルが生成する。
本発明では、架橋反応を促進させるための添加剤は特に必要ないため、高分子化合物と光および加水分解性ゲルとを混合するだけで架橋反応が起こり、ゲル化が進行する。また、反応時の温度は常温でよい。
また、本発明における架橋反応は溶存酸素の影響を受けないため、薄膜状のゲルの形成が容易である。
【００６７】
高分子化合物に対する光および加水分解性架橋剤の添加量（光および加水分解性架橋剤／高分子化合物）はゲル化する範囲で自由に設定することができるが、強度の高いゲルを調製するためには高分子化合物のアミノ基と光および加水分解性架橋剤の活性エステル基のモル比で１：1程度であることが好ましい。高分子化合物と光および加水分解性架橋剤との混合比は、例えば４分岐型のアミノ末端ポリエチレングリコール（またはその誘導体）を高分子化合物として用い、４分岐型の光および加水分解性架橋剤を用いる場合は、モル比（高分子化合物：光および加水分解性架橋剤）で４：１から１：４の範囲が好ましく、モル比で２：１から１：２の範囲がより好ましい。
高分子化合物の使用量は、例えば４分岐型のポリエチレングリコール（または誘導体）の場合、光および加水分解性ゲル中に２．５重量％以上含有されるように設定することが好ましく、ゼラチンの場合、光および加水分解性ゲル中に１．０重量％以上含有されるように設定することが好ましい。
【００６８】
図３（ａ）は、光および加水分解性架橋剤１の末端側に配置された活性エステル基４と高分子化合物のアミノ基８とが縮合してアミド結合９を形成し、架橋される反応を示すものである。
【００６９】
図３（ｂ）は、光および加水分解性架橋剤と高分子化合物６とを反応させることによって、光および加水分解性ゲル１０を生成させる反応を模式的に示すものである。
高分子化合物６は、末端にアミノ基８を有する４分岐型のポリエチレングリコール誘導体である。
高分子化合物６と光および加水分解性架橋剤１とを混合すると、高分子化合物６のアミノ基は、光および加水分解性架橋剤１の活性エステル基４と縮合して架橋される。
これによって、高分子化合物６は、光および加水分解性架橋剤１を介して他の高分子化合物６と結合し、網目構造を有する光および加水分解性ゲル１０が生成する。
【００７０】
図３（ｃ）は、光および加水分解性架橋剤と高分子化合物７とを反応させることによって、光および加水分解性ゲル１０’を生成させる反応を模式的に示すものである。
高分子化合物７は、分子内にアミノ基８を有するゼラチンである。
高分子化合物７と光および加水分解性架橋剤１とを混合すると、高分子化合物７のアミノ基は、光および加水分解性架橋剤１の活性エステル基４と縮合して架橋される。
これによって、高分子化合物７は、光および加水分解性架橋剤１を介して他の高分子化合物７と結合し、網目構造を有する光および加水分解性ゲル１０’が生成する。
【００７１】
本発明の光および加水分解性ゲルは、光の照射により光および加水分解性架橋剤１が分解されることによって、分解される。
図４（ａ）は、光および加水分解性架橋剤のニトロベンジル基の分解を示すものである。ニトロベンジル基を含む基３は、例えば波長３３０〜３８０ｎｍの紫外線などの光の照射により、破線位置で分解可能である。
ニトロベンジル基を含む基３は、アミド結合部５のアミノ基との間の結合が切断され、ニトロベンジル基３’となる。なお、ニトロベンジル基の構造によっては、前記光照射によりニトロベンジル基を含む基３と活性エステル基４との結合が切断されることもある。
図４（ｂ）と図４（ｃ）は、それぞれ光および加水分解性ゲル１０と１０’が、光の照射により分解される様子を模式的に示すものである。光および加水分解性ゲルが分解されることにより、光および加水分解性ゲルは水に溶解する。
【００７２】
本発明の光および加水分解性ゲルは、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置されたエステル結合が加水分解することで、光および加水分解性架橋剤１が分解されることによっても、分解される。
図５（ａ）は、前記主鎖の末端及び前記分岐鎖の末端に配置されたエステル結合８０の加水分解を示すものである。エステル結合８０は、加水分解により、破線位置で分解可能である。エステル結合８０は結合が切断され、ヒドロキシ基８０ａとカルボキシル基８０ｂとなる。
図５（ｂ）と図５（ｃ）は、それぞれ光および加水分解性ゲル１０と１０’が、エステル結合の加水分解によって分解される様子を模式的に示すものである。光および加水分解性ゲルが分解されることにより、光および加水分解性ゲルは水に溶解する。
【００７３】
本発明によれば、前記構造を有する光および加水分解性架橋剤を用いるので、高分子化合物と混合するだけで架橋反応が起こり、ゲル化が進行する。
ラジカル重合を利用してゲル化される従来の光応答性ゲルおよび光分解性ゲルの製造工程は、重合の際に酸素が存在すると重合反応を阻害し、ゲル化が進行しない。この現象は特に薄膜状のゲルを調製する際に顕著になる。一方、本発明の光および加水分解性架橋剤では、架橋反応時に酸素の影響を全く受けないため、このような重合反応阻害は起こらない。
ラジカル重合反応を利用する場合も無酸素雰囲気条件で反応を行えば薄膜状のゲルを調製することが可能となるかもしれないが、その場合には無酸素条件下で重合反応を行わせるための設備が必要となり、製造工程が複雑になる。
一方、本発明の光および加水分解性架橋剤を用いると、無酸素雰囲気条件が必要ないため、薄膜状のゲルの製造工程が簡略であり、効率的かつ低コストで光および加水分解性ゲルを調製できる。
また、本発明では、架橋反応にラジカル重合を利用しないため、ラジカルによってダメージを受けやすい物質を混合した状態で光および加水分解性ゲルを調製することが可能となる。従って、光および加水分解性ゲルを広範な用途、例えば細胞や生理活性物質を固定化する用途にも使用できる。また、ラジカル重合に対応できないモノマーの重合物も高分子化合物として使用できることから、高分子化合物の選択範囲が広いという利点もある。
【００７４】
本発明の光および加水分解性ゲルは、適度な強度、及び光および加水分解性を有しているため、伝統的なフォトリソグラフィーや近年の二光子励起加工法に代表されるような、光による微細加工技術を適応可能である。また、本発明の光および加水分解性ゲルは、適度な強度を有しつつ細胞担体として適切な含水率を実現できる。したがって、本発明の光および加水分解性ゲルは、複雑且つ微細な三次元構造を有する細胞担体として使用可能である。さらに本発明の光および加水分解性ゲルは、加水分解によっても分解可能であるため、光が照射されにくい領域のゲルも分解が可能である。また、本発明の光および加水分解性ゲルは光照射による細胞への影響を考慮せずに分解が可能である。本発明の光および加水分解性ゲルは細胞からゲルを容易に取り除くことができる。
【００７５】
《細胞培養器具》
本発明の細胞培養器具は、本発明の光および加水分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されていることを特徴とする細胞培養器具である。
光および加水分解性ゲル層の厚さは、１００ｎｍ〜１００μｍが好ましく、３００ｎｍ〜３０μｍがさらに好ましく、１０００ｎｍ〜１０μｍが特に好ましい。
【００７６】
細胞培養基材の構成材料としては、特に制限されず、プラスチック、ガラス、改質ガラス、金属等を挙げることができる。
プラスチックとして好適なものとしては、ポリスチレン系樹脂、アクリル系樹脂（例えばポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ））、ポリビニルピリジン系樹脂（ポリ（４−ビニルピリジン）、４−ビニルピリジン−スチレン共重合体等）、シリコーン系樹脂（例えばポリジメチルシロキサン樹脂）、ポリオレフィン系樹脂（例えばポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリメチルペンテン樹脂）、ポリエステル樹脂（ポリエチレンテレフタレート樹脂（ＰＥＴ））、ポリカーボネート系樹脂、エポキシ系樹脂等がある。
細胞培養基材は、細胞培養に一般的に用いられる細胞培養ディッシュもしくはマイクロプレートと同様の構造の基材が好ましい。 
細胞培養基材は、少なくとも表面が、ポリスチレンまたは細胞接着性材料からなることが好ましい。
【００７７】
細胞接着性材料としては、細胞接着性タンパク質又は細胞接着性ペプチドが好ましい。細胞接着性タンパク質は、ファイブロネクチン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニンからなる群から選択された少なくとも１つであることがより好ましく、ゼラチンが特に好ましい。細胞接着性ペプチドは、アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸というアミノ酸配列（ＲＧＤ配列）を有することが好ましい。
【００７８】
本発明の細胞培養器具は、本発明の光および加水分解性ゲルからなる層が、細胞培養基材の表面に形成されていることを特徴とする細胞培養器具である。本発明の光および加水分解性ゲルは、複雑且つ微細な三次元構造を構築可能な細胞担体として好適な材料である。本発明の光および加水分解性ゲルのみを用いても細胞培養、及び加工を行うことは可能であるが、本発明の光および加水分解性ゲルを細胞培養基材表面に形成させることで、細胞培養、及びゲルの加工がより容易となる。
【００７９】
《細胞配列・分別装置》
図６は、本発明の細胞配列・分別装置の一例であって、細胞培養器具１１を保持する保持台１２と、細胞培養器具１１に光を照射する照射部１３を備えている。
照射部１３は、光源（図示略）と、細胞培養器具１１の任意の一部領域にのみ光照射する照射領域調整部１４と、パソコンなどの制御部１５とを有する。
照射領域調整部１４は、所定のパターン１６をなす光を細胞培養器具１１に照射することができる。パターン１６は表示装置１７に表示される。
【００８０】
照射領域調整部１４は、例えばＤＭＤ（デジタルマイクロミラーデバイス（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ  Ｄｅｖｉｃｅ））とを備えている。ＤＭＤは複数のマイクロミラーを有し、各マイクロミラーは、制御部１５からの信号により独立に角度を設定できるようにされ、光源からの光を反射することによって、前記信号に応じたパターンの光１８を細胞培養器具１１に照射できるようになっている。
照射領域調整部１４は、レンズ１９、ミラー２０、レンズ２１を経て、細胞培養器具１１の任意の領域に光１８を照射できる。細胞培養器具１１の任意形状の一部領域にのみ光１８を照射することもできるし、全領域に光１８を照射することもできる。
光源としては、光および加水分解性架橋剤を分解させ得るものが選択され、例えば紫外線、可視光等の光を照射できるもの（例えば紫外線ランプ、可視光ランプ等）が使用できる。
光の波長域は、例えば２００〜１０００ｎｍを例示できる。特に３００〜６００ｎｍ、なかでも３５０〜４００ｎｍは好適である。照射エネルギーは、通常は０．０１〜１０００Ｊ／ｃｍ２、好ましくは０．１〜１００Ｊ／ｃｍ２、より好ましくは１〜１０Ｊ／ｃｍ２である。
なお、光を細胞培養基材の一部領域にのみ照射させるための構成としては、ＤＭＤに限らず、液晶シャッターアレイ、光空間変調素子、所定形状のフォトマスク等も採用できる。
【００８１】
図６に示す細胞配列・分別装置は、後述のように、光が照射される一部領域に細胞を配列する細胞配列装置としても使用できるし、前記光照射領域にある細胞とそれ以外の領域にある細胞とを分別する分別装置としても使用できる。
【００８２】
本発明の光および加水分解性ゲルは、光照射により複雑且つ微細な三次元構造を構築可能でかつ細胞担体として使用可能な材料である。そのため、本発明の細胞配列・分別装置は、光による微細な加工技術と細胞培養技術とを組み合わせることで、三次元的で且つ精度の高い細胞配列、細胞培養、及び細胞分別を実現できる。また、細胞配列、細胞培養及び細胞分別を同時に行うことが可能であるため、三次元的な細胞状態を把握しつつ細胞を分別および配列させることが可能である。
【００８３】
《細胞配列および分別方法》
次に、本発明の細胞培養器具を使用し、該細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光および加水分解性ゲルを選択的に分解することによって、前記一部領域の細胞とそれ以外の領域にある細胞とを分別することを特徴とする細胞分別方法、及び、前記一部領域に細胞を配列することを特徴とする細胞配列方法について説明する。
【００８４】
本発明において分別対象となる細胞は、特に限定されず、目的に応じて、動物由来の細胞（例えばヒト細胞）、植物由来の細胞、微生物由来の細胞等を使用できる。
具体例としては、例えば、造血幹細胞、骨髄系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞などの体性幹細胞や胚性幹細胞、人工多能性幹細胞がある。
また、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞等）等の白血球や、血小板、赤血球、血管内皮細胞、リンパ系幹細胞、赤芽球、骨髄芽球、単芽球、巨核芽球および巨核球等の血液細胞、内皮系細胞、上皮系細胞、肝実質細胞、膵ラ島細胞等のほか、研究用に樹立された各種株化細胞も本発明の対象となり得る。
【００８５】
なお、本発明において、細胞が付着する（接着する）とは、例えば、培地や緩衝液等による洗浄等の一定の物理的刺激によってもその位置から移動しなくなることである。例えば、培地や緩衝液等の流れによる所定の剪断応力（例えば０．１〜１０Ｎ／ｍ２）の洗浄操作により移動しない状態を「接着状態」（付着状態）とすることができる。
【００８６】
本発明の細胞配列および分別方法は、細胞培養器具の一部領域にのみ光を照射することにより前記一部領域の光および加水分解性ゲルを選択的に分解する方法であり、同時に、光および加水分解性ゲルが加工されることを伴う。光および加水分解性ゲル層の縦横方向（ＸＹ軸方向）に着目した場合、光および加水分解性ゲルが選択的に分解されることで、光および加水分解性ゲルが２次元的に加工される。光および加水分解性ゲル層の厚さ方向（Ｚ軸方向）に着目した場合、光および加水分解性ゲルが三次元的に加工される。
光を照射した部分に含まれる光および加水分解性ゲル層は、全てのゲルを分解させてもよいし、すべてのゲルを分解させないで、Ｚ軸方向への分解深度を任意に変化させることが可能である。
【００８７】
（細胞配列方法）
以下、図７（ａ）を参照しつつ、第１の例の細胞配列方法を詳しく説明する。図７（ａ）は細胞培養器具３０の模式図である。
【００８８】
細胞培養基材３１の表面に光および加水分解性ゲル層３２を形成する。細胞培養基材３１の表面は細胞接着性が低い材料、例えばガラス、シリコーン樹脂等であることが好ましい。光および加水分解性ゲル層は、細胞接着性が高いことが好ましく、光および加水分解性ゲル層に含まれる本発明の光および加水分解性架橋剤と架橋される高分子化合物が、前記細胞接着性タンパク質であることが好ましい。
光および加水分解性ゲル層３２は、光および加水分解性ゲルと前記細胞接着性材料とを混合した混合材料であってもよい。
【００８９】
細胞培養器具３０の光および加水分解性ゲル層３２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光および加水分解性ゲル層３２を分解させる。この領域Ａ１の光および加水分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材３１表面から除去され、光および加水分解性ゲル層３２は三次元的に加工される。
細胞培養器具３０に細胞３４を播種すると、光および加水分解性ゲル層３２の表面３３及び光照射によって新たに形成された光および加水分解性ゲル層表面３３’にのみ細胞３４は付着する。
光および加水分解性ゲル層３２の表面３３、３３’に付着しなかった細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具３０から除去することができる。これによって、三次元的に加工された光および加水分解性ゲル層３２上に細胞３４を選択的に配列することができる。
【００９０】
さらに、光および加水分解性ゲル層３２が加水分解されることで、配列された細胞３４を細胞培養器具３０から分離させることができる。
【００９１】
以下、図７（ｂ）を参照しつつ、第２の例の細胞配列方法を詳しく説明する。図７（ｂ）は細胞培養器具４０の模式図である。
細胞培養基材４１の表面に光および加水分解性ゲル層４２を形成する。細胞培養基材４１の表面は細胞接着性が高い材料、例えばポリスチレンであることが好ましい。細胞培養基材４１の表面が細胞接着性材料を含まない場合は、細胞培養基材４１上に、細胞接着性材料からなるコート層を形成させてもよい。
光および加水分解性ゲル層４２は細胞接着性が低いことが好ましく、光および加水分解性ゲル層４２に含まれる本発明の光および加水分解性架橋剤と架橋される高分子化合物は、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、細胞接着性の低いタンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群から選択された少なくとも１つであることが好ましく、分岐型のポリエチレングリコール誘導体が特に好ましい。
【００９２】
細胞培養器具４０の光および加水分解性ゲル層４２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光および加水分解性ゲル層４２を分解させる。この領域Ａ１の光および加水分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材４１表面から除去される。
細胞培養器具４０に細胞３４を播種すると、光および加水分解性ゲル層４２が失われた領域Ａ１の細胞培養基材４１の表面にのみ細胞３４は付着する。
細胞培養基材４１表面に付着しなかった細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具３０から除去することができる。これによって、領域Ａ１に細胞３４を選択的に配列することができる。
【００９３】
さらに、光および加水分解性ゲル層４２が加水分解されることで、細胞培養器具４０に細胞３４のみを配列させることができる。
【００９４】
（細胞分別方法）
次に、図８（ａ）を参照しつつ、第１の例の細胞分別方法を詳しく説明する。図８（ａ）は細胞培養器具５０の模式図である。
【００９５】
細胞培養基材５１の表面に光および加水分解性ゲル層３２を形成する。
細胞培養基材５１の材料は特に制限されず、前記の材料を用いることができる。光および加水分解性ゲル層３２は、細胞接着性が高いことが好ましく、光および加水分解性ゲル層３２に含まれる本発明の光および加水分解性架橋剤と架橋される高分子化合物が、前記細胞接着性タンパク質であることが好ましい。
光および加水分解性ゲル層３２は、光および加水分解性ゲルと前記細胞接着性材料とを混合した混合材料であってもよい。
【００９６】
光および加水分解性ゲル層３２が細胞接着性材料を含まない場合は、光および加水分解性ゲル層３２上に、光および加水分解性ゲルと細胞接着性タンパクとを含むコート層を形成させてもよい。
【００９７】
細胞培養器具５０に細胞３４を播種すると、光および加水分解性ゲル層３２表面に細胞３４が付着する。
【００９８】
細胞培養器具５０の光および加水分解性ゲル層３２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光および加水分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１の表面から除去され、光および加水分解性ゲル層３２は三次元的に加工される。また、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルに付着した細胞３４も細胞培養基材５１から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具５０から選択的に除去することができる。
これによって、領域Ａ１の細胞３４と、それ以外の細胞３４を分別することができる。
【００９９】
さらに、光および加水分解性ゲル層３２が加水分解されることで、細胞培養器具５０上に残された細胞３４を細胞培養器具５０から分離することができる。
【０１００】
以下、図８（ｂ）を参照しつつ、第２の例の細胞分別方法を詳しく説明する。図８（ｂ）は細胞培養器具６０の模式図である。
【０１０１】
細胞培養基材５１の表面に、細胞３４を内包した光および加水分解性ゲル層６２を形成する。
細胞培養基材５１の材料は特に制限されず、前記の材料を用いることができる。光および加水分解性ゲル層６２に含まれる本発明の光および加水分解性架橋剤と架橋される高分子化合物は、分子内に合計２以上のアミノ基またはヒドロキシル基を有する高分子化合物であれば特に制限されず、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、塩基性多糖類、タンパク質、およびこれらのうちいずれかの誘導体からなる群から選択された少なくとも１つであることが好ましく、分岐型のポリエチレングリコール誘導体又はゼラチンであることがより好ましい。
【０１０２】
細胞培養器具６０の光および加水分解性ゲル層６２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光および加水分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１表面から除去され、光および加水分解性ゲル層６２は三次元的に加工される。また、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルに内包された細胞３４も細胞培養基材５１から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具６０から選択的に除去することができる。
これによって、領域Ａ１の細胞３４と、それ以外の細胞３４を分別することができる。
【０１０３】
さらに、光および加水分解性ゲル層３２が加水分解されることで、細胞培養器具６０上に残された細胞３４を細胞培養器具６０から分離することができる。
【０１０４】
上記細胞配列方法および細胞分別方法によれば、細胞培養器具１１の領域Ａ１にのみ光を照射するので、光照射による細胞３４への悪影響を極力抑えることができる。また細胞へ光照射をせずに、細胞培養器具から光および加水分解性ゲルを取り除くことができる。このため、細胞３４の細胞外マトリックスや膜タンパク質が損なわれるのを防止し、器官特異的機能を維持することができる。このため、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。
また、領域Ａ１にのみの光照射によって細胞３４の分別を行うため、目的の細胞を精度よく分別することができる。
【０１０５】
さらに、本発明の光および加水分解性ゲルは、複雑かつ微細な三次元構造を構築可能な細胞担体として好適な材料であるから、本発明の細胞配列方法および細胞分別方法によれば、三次元的で且つ精度の高い細胞配列、及び細胞分別を実現できる。
【０１０６】
《組織体形成方法》
本発明における組織体とは、細胞が三次元的に集合した状態を指し、細胞間に本発明の光および加水分解性ゲルを含んでもよい。前記細胞は本発明の光および加水分解性ゲルを用いて任意の期間培養され、増殖させたり、所望の組織を形成したり、所望の状態に分化されることが好ましい。
【０１０７】
本発明の組織体形成方法は光および加水分解性ゲルを形成する工程を含む。光および加水分解性ゲルの厚さは、ゲルに内包させた細胞が、Ｚ軸方向に少なくとも２細胞以上が配列可能であって、三次元組織体が形成可能な厚みである１０μｍ以上であることが好ましい。より具体的には、２０μｍ〜１０００μｍが好ましく、５０μｍ〜３００μｍがさらに好ましい。
【０１０８】
なお、以下の組織体形成方法の説明では、本発明の細胞培養器具を用いる場合を説明するが、本発明の組織体形成方法は本発明の光および加水分解性ゲルを用いていればよく、本発明の細胞培養器具を用いずに実施してもよい。
【０１０９】
次に、光および加水分解性ゲルを用い、以下の工程
（Ｉ）前記光および加水分解性ゲルを形成する工程
（ＩＩ）光照射によって前記光および加水分解性ゲルの構造を規定する工程
（ＩＩＩ）前記光および加水分解性ゲルに細胞を播種する工程
（ＩＶ）細胞を培養する工程
（Ｖ）前記光および加水分解性ゲルを加水分解する工程
を含むことを特徴とする組織体形成方法について説明する。
【０１１０】
上記（Ｉ）〜（ＩＶ）の工程の順番は、適宜入れ替えてもよく、また前記工程のうちの任意の工程を２回以上行ってもよい。
【０１１１】
以下、図９（ａ）を参照しつつ、第１の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図９（ａ）は細胞培養器具３０の模式図である。
細胞培養基材３１および光および加水分解性ゲル層３２は、第１の例の細胞配列法と同様の構成を用いることができる。
【０１１２】
細胞培養器具３０の光および加水分解性ゲル層３２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光および加水分解性ゲル層３２を分解させる。この領域Ａ１の光および加水分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材３１表面から除去され、光および加水分解性ゲル層３２は三次元的に加工される。
細胞培養器具３０に細胞３４を播種すると、光および加水分解性ゲル層３２の表面３３及び光照射によって新たに形成された光および加水分解性ゲル層表面３３’にのみ細胞３４は付着する。
光および加水分解性ゲル層３２の表面３３、３３に付着しなかった細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具３０から除去することができる。これによって、三次元的に加工された光および加水分解性ゲル層３２上に細胞３４を選択的に配列することができる。
その後、細胞３４を培養すると、細胞３４は加工された光および加水分解性ゲル層３２を足場として増殖でき、細胞培養器具３０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
組織体を形成した後に、光および加水分解性ゲル層３２を加水分解によって分解させ、光および加水分解性ゲル層３２を組織体から完全に取り除くことができる。
【０１１３】
以下、図９（ｂ）を参照しつつ、第２の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図９（ｂ）は細胞培養器具４０の模式図である。
細胞培養基材４１の表面に光および加水分解性ゲル層４２を形成する。
細胞培養基材４１および光および加水分解性ゲル層４２は、第２の例の細胞配列法と同様の構成を用いることができる。
【０１１４】
細胞は基質への接着依存性の増殖を示さないものが好ましく、例えば腫瘍細胞、血球系細胞、各種幹細胞等が挙げられる。
【０１１５】
細胞培養器具４０の光および加水分解性ゲル層４２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光および加水分解性ゲル層４２を分解させる。この領域Ａ１の光および加水分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材４１表面から除去され、光および加水分解性ゲル層４２は三次元的に加工される。
細胞培養器具４０に細胞３４を播種すると、光および加水分解性ゲル層４２が失われた領域Ａ１の細胞培養基材４１表面にのみ細胞３４は付着する。
細胞培養基材４１表面に付着しなかった細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具３０から除去することができる。これによって、領域Ａ１に細胞３４を選択的に配列することができる。
その後、細胞３４を培養すると、細胞３４は加工された光および加水分解性ゲル層４２に規定された形状で増殖でき、細胞培養器具４０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
組織体を形成した後に、光および加水分解性ゲル層４２を加水分解によって分解させ、光および加水分解性ゲル層４２を組織体から完全に取り除くことができる。
【０１１６】
以下、図９（ｃ）を参照しつつ、第３の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図９（ｃ）は細胞培養器具５０の模式図である。
まず、細胞培養基材５１の表面に光および加水分解性ゲル層３２を形成する。
細胞培養基材５１および光および加水分解性ゲル層３２は、第１の例の細胞分別法と同様の構成を用いることができる。この場合、光および加水分解性ゲル層３２上に、光および加水分解性ゲルと細胞接着性タンパクとを含むコート層を形成させることは適さない。
【０１１７】
細胞培養器具５０に細胞３４を播種すると光および加水分解性ゲル層３２表面に細胞３４が付着する。
細胞培養器具５０の光および加水分解性ゲル層３２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光および加水分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１表面から除去され、光および加水分解性ゲル層３２は三次元的に加工される。また、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルに付着した細胞３４も細胞培養基材５１表面から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具５０から選択的に除去することができる。
これによって、領域Ａ１の細胞３４と、それ以外の細胞３４を分別する。
その後、細胞３４を培養すると、細胞３４は加工された光および加水分解性ゲル層３２を足場として増殖でき、細胞培養器具５０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
組織体を形成した後に、光および加水分解性ゲル層３２を加水分解によって分解させ、光および加水分解性ゲル層３２を組織体から完全に取り除くことができる。
【０１１８】
以下、図９（ｄ）を参照しつつ、第４の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図９（ｄ）は細胞培養器具５０の模式図である。
まず、細胞培養基材５１の表面に光および加水分解性ゲル層３２を形成する。
細胞培養基材５１および光および加水分解性ゲル層３２は、第１の例の細胞分別法と同様の構成を用いることができる。この場合、光および加水分解性ゲル層３２上に、光および加水分解性ゲルと細胞接着性タンパクとを含むコート層を形成させることは適さない。
【０１１９】
細胞培養器具５０に細胞３４を播種すると、光および加水分解性ゲル層３２表面に細胞３４が付着する。
その後、細胞３４を培養し、細胞培養器具５０上に細胞層を形成することができる。
さらに、細胞培養器具５０の光および加水分解性ゲル層３２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光および加水分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１表面から除去され、光および加水分解性ゲル層３２は三次元的に加工される。また、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルに付着した細胞３４も細胞培養基材５１表面から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具５０から選択的に除去することができる。
これによって、細胞培養器具５０上の細胞層から細胞を選択的に除去することができる。
また、細胞３４を加工後のゲル上でさらに培養させることで、細胞３４は加工された光および加水分解性ゲル層３２を足場として増殖でき、細胞培養器具５０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
組織体を形成した後に、光および加水分解性ゲル層３２を加水分解によって分解させ、光および加水分解性ゲル層３２を組織体から完全に取り除くことができる。
【０１２０】
次に、光および加水分解性ゲルを用い、以下の工程
（Ｉ）細胞を内包させた前記光および加水分解性ゲルを形成する工程
（ＩＩ）光照射によって前記光および加水分解性ゲルの構造を規定する工程
（ＩＩＩ）細胞を培養する工程
（ＩＶ）前記光および加水分解性ゲルを加水分解する工程
を含むことを特徴とする組織体形成方法について説明する。
【０１２１】
上記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の工程の順番は、適宜入れ替えてもよく、また前記工程のうちの任意の工程を２回以上行ってもよい。
【０１２２】
細胞培養基材５１および光および加水分解性ゲル層６２は、第２の例の細胞分別法と同様の構成を用いることができる。
【０１２３】
以下、図１０（ａ）を参照しつつ、第５の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図１０（ａ）は細胞培養器具６０の模式図である。
細胞培養基材５１の表面に、細胞３４を内包した光および加水分解性ゲル層６２を形成する。
【０１２４】
細胞培養器具６０の光および加水分解性ゲル層６２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光および加水分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１表面から除去され、光および加水分解性ゲル層６２は三次元的に加工され、また、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルに内包された細胞３４も細胞培養基材５１表面から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具６０から選択的に除去することができる。
これによって、領域Ａ１の細胞３４と、それ以外の細胞３４を分別する。
その後、細胞３４を培養すると、細胞３４は加工された光および加水分解性ゲル層６２に規定された形状で増殖でき、細胞培養器具６０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
組織体を形成した後に、光および加水分解性ゲル層６２を加水分解によって分解させ、光および加水分解性ゲル層６２を組織体から完全に取り除くことができる。
【０１２５】
以下、図１０（ｂ）を参照しつつ、第６の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図１０（ｂ）は細胞培養器具６０の模式図である。
細胞培養基材５１の表面に、細胞３４が内包された光および加水分解性ゲル層６２を形成する。
その後、細胞３４を培養し、細胞培養器具６０上に三次元的に細胞塊を形成することができる。
細胞培養器具６０の光および加水分解性ゲル層６２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光および加水分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１表面から除去され、光および加水分解性ゲル層６２は三次元的に加工され、また、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルに内包された細胞３４も細胞培養基材５１表面から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具６０から選択的に除去することができる。
これによって、領域Ａ１の細胞３４と、それ以外の細胞３４が分別され、細胞培養器具６０上に三次元的に形成された細胞塊から細胞を取り除くことができる。その後、細胞３４を培養すると、細胞３４は加工された光および加水分解性ゲル層６２に規定された形状で増殖でき、細胞培養器具６０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
組織体を形成した後に、光および加水分解性ゲル層６２を加水分解によって分解させ、光および加水分解性ゲル層６２を組織体から完全に取り除くことができる。
【０１２６】
以下、図１０（ｃ）を参照しつつ、第７の例の組織体形成方法を詳しく説明する。図１０（ｃ）は細胞培養器具６０の模式図である。
細胞培養基材５１の表面に、細胞３４が内包された光および加水分解性ゲル層６２を形成する。
【０１２７】
細胞培養器具６０の光および加水分解性ゲル層６２の一部である領域Ａ１に、フォトマスク３５を通して光を照射し、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルを分解させる。この領域Ａ１の光および加水分解性ゲルは可溶化し、洗浄により細胞培養基材５１表面から除去され、光および加水分解性ゲル層６２は三次元的に加工される。また、領域Ａ１の光および加水分解性ゲルに内包された細胞３４も細胞培養基材５１表面から剥離する。
剥離した細胞３４は、培地や緩衝液等により洗浄すること等によって細胞培養器具６０から選択的に除去することができる。
これによって、領域Ａ１の細胞３４と、それ以外の細胞３４を分別する。
その後、光照射により露出した細胞培養基材５１上又は光および加水分解性ゲル層６２上に、細胞３４とは別の種類の細胞３４’を内包した光および加水分解性ゲル層７２をさらに形成してもよい。光および加水分解性ゲル層６２及び７２は、例えば領域Ａ１とは異なる領域Ｂ１へ、フォトマスク３５を通して光照射することにより再度加工することができる。
その後、細胞３４、３４’を培養すると、細胞３４、３４’は加工された光および加水分解性ゲル層６２、７２に規定された形状で増殖でき、細胞培養器具６０上で、三次元的に組織体を形成することができる。
組織体を形成した後に、光および加水分解性ゲル層６２を加水分解によって分解させ、光および加水分解性ゲル層６２を組織体から完全に取り除くことができる。
【０１２８】
本発明の光および加水分解性ゲルは、複雑かつ微細な三次元構造を構築可能な細胞担体として好適な材料であるから、本発明の組織体形成方法によれば、複雑かつ微細な三次元構造を有し、生体移植に好適なマテリアルフリーの組織体を形成可能である。また、より生体環境に近く信頼度の高い細胞アッセイ系が実現される。
【実施例】
【０１２９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０１３０】
［光および加水分解性架橋剤の合成］
（実施例１）
以下は、光および加水分解性架橋剤（ＮＨＳ−ＰＣＨ−２ａｒｍＰＥＧ）の合成方法である。
Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）洗浄した３−（１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ（１２ ｇ）のＤＭＳＯ（２４ ｍＬ）溶液に４−｛４−［１−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ｝ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（０．５ ｇ）を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。濾過後、濾取物をＤＭＳＯで洗浄し、減圧下、全量が約２４ｍＬになるまでＤＭＳＯを留去した。得られた残留物にＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＤＥ−０３４ＣＳ （ＮＯＦ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ， Ｍｗ ３，４００、１．１ ｇ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてＴＨＦを留去後、残渣を氷冷したエーテルにゆっくり滴下し、数〜２４時間静置後、析出物を濾取した。析出物を少量のＴＨＦに溶解させた析出物を氷冷したエーテルにゆっくり滴下、１〜２４時間静置後、析出物を濾取した（２回繰り返す）。減圧下、乾燥させた析出物をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＭｅＯＨ）で分離精製し、得られた化合物のＴＨＦ溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてＴＨＦを留去後、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を加えて希釈した。得られたＣＨ２Ｃｌ２溶液を飽和食塩水で洗浄（２回繰り返す）後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下溶媒を留去し、少量のＴＨＦに溶解させた残渣をエーテルにゆっくり滴下し、１〜２４時間時間静置後、析出物を濾取した（２回繰り返す）。析出物を減圧下乾燥後、目的化合物の光および加水分解性架橋剤を０．８２ ｇ得た。
上記の過程と、得られた化合物を図１１に示す。
得られた目的化合物についてＮＭＲによる分析を行い、目的の化合物が得られたことを確認した。以下にＮＭＲによる分析結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）： １．５３ （ｄ, Ｊ ＝ ６．９７ Ｈｚ， ３Ｈ）, ２．２８ （ｔｔ, Ｊ ＝ ７．３３, ６．０４ Ｈｚ， ２Ｈ）, ２．４７ （ｔ, Ｊ ＝ ６．５７ Ｈｚ， ２Ｈ）, ２．６７ （ｄｔ, Ｊ ＝ １３．７３, ６．５７ Ｈｚ， ２Ｈ）, ２．８５ （ｂｒ ｓ, ４Ｈ）, ２．８７ （ｔ, ７．３３ Ｈｚ， ２Ｈ）, ３．４５−３．８３ （ｍ， （Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）， ３．９７ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１５（ｔ， Ｊ ＝ ６．０４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．５３ （ｑｄ， Ｊ ＝ ６．９７， ６．６１ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．５０ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ６．６１ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９５ （ｓ, １Ｈ）, ７．５８ （ｓ， １Ｈ）．
【０１３１】
（実施例２）
以下は、光および加水分解性架橋剤（ＮＨＳ−ＰＣＨ−４ａｒｍＰＥＧ）の合成方法である。
Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）洗浄した３−（１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ（１２  ｇ）のＤＭＳＯ（２４  ｍＬ）溶液に４−［４−［１−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｎｉｔｒｏｒｈｅｎｏｘｙ］ｂｕｔａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（０．５ｇ）を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。濾過後、濾取物をＤＭＳＯで洗浄し、減圧下、全量が約２４ｍＬになるまでＤＭＳＯを留去した。得られた残留物にＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−１００ＣＳ（ＮＯＦ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ、１．０ｇ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。反応混合物から減圧下にて、ＴＨＦを留去後、残渣を氷冷したエーテルにゆっくり滴下し、数〜２４時間静置後、析出物を濾取した。析出物を少量のＴＨＦに溶解させた析出物を氷冷したエーテルにゆっくり滴下、１〜２４時間静置後、析出物を濾取した（２回繰り返す）。減圧下、乾燥させた析出物をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（ＭｅＯＨ）で分離精製し、得られた化合物のＴＨＦ溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル） カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてＴＨＦを留去後、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を加えて希釈した。得られたＣＨ２Ｃｌ２溶液を飽和食塩水で洗浄（２回繰り返す）後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下溶媒を留去し、少量のＴＨＦに溶解させた残渣をエーテルにゆっくり滴下し、１〜２４時間時間静置後、析出物を濾取した（２回繰り返す）。析出物を減圧下乾燥後、目的化合物の光および加水分解性架橋剤を０．９４g得た。
上記の過程と、得られた化合物を図１２に示す。
得られた目的化合物についてＮＭＲによる分析を行い、目的の化合物が得られたことを確認した。以下にＮＭＲによる分析結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）： １．５３ （ｄ， Ｊ ＝ ６．９３ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．２８ （ｔｔ， Ｊ ＝ ７．３３， ６．００ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．５５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６８ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．５７， ６．５５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８５ （ｂｒ ｓ， ４Ｈ）， ２．８８ （ｔ， ７．３３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ３．４５−３．８４ （ｍ， Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）， ３．９７ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１５（ｔ， Ｊ ＝ ６．００ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．５４ （ｑｄ， Ｊ ＝ ６．９３， ６．５０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．５０ （ｂｒ ｄ， Ｊ ＝ ６．５０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９６ （ｓ， １Ｈ）， ７．５８ （ｓ， １Ｈ）．
【０１３２】
（実施例３）
以下は、光および加水分解性架橋剤（ＮＨＳ−ＰＣＨ−８ａｒｍＰＥＧ）の合成方法である。
Ｎ，Ｎ−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）洗浄した３−（１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ（１６ ｇ）のＤＭＳＯ（３２ ｍＬ）溶液に４−｛４−［１−（９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２−ｍｅｔｈｏｘｙ−５−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｘｙ｝ｂｕｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ（０．６７ ｇ）を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。濾過後、濾取物をＤＭＳＯで洗浄し、減圧下、全量が約２４ｍＬになるまでＤＭＳＯを留去した。得られた残留物に８ａｒｍ ＰＥＧ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｓｕｃｃｉｎａｔｅ （ｔｒｉｐｅｎｔａｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ） （ＪＥＮＫＥＭ ＴＳＣＨＮＯＬＯＧＹ、１．０９ ｇ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてＴＨＦを留去後、残渣を氷冷したエーテルにゆっくり滴下し、数〜２４時間静置後、デカンテーションにより上澄みを除去し得た沈殿物質をＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０（ＭｅＯＨ）で分離精製し、得られた化合物の少量のＴＨＦ溶液に溶解後、エーテルにゆっくり滴下し、室温から氷冷下で数〜２４時間静置後、デカンテーションにより析出物を得た。乾燥後、析出物のＴＨＦ溶液にＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル） カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加え、室温〜還流条件下で数十分〜２４時間攪拌した。反応混合物から減圧下にてＴＨＦを留去後、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を加えて希釈した。得られたＣＨ２Ｃｌ２溶液を飽和食塩水で洗浄（２回繰り返す）後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下溶媒を留去し、少量のＴＨＦに溶解させた残渣をエーテルにゆっくり滴下し、室温から氷冷下で１時間〜４日間静置後、デカンテーションにより上澄みを除去し沈殿物を得た（３回繰り返す）。沈殿物を減圧下乾燥し、目的化合物の光および加水分解性架橋剤を１．１６ｇ得た。
上記の過程と、得られた化合物を図１３に示す。
得られた目的化合物についてＮＭＲによる分析を行い、目的の化合物が得られたことを確認した。以下にＮＭＲによる分析結果を示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ, ＣＤＣｌ３）: １．５３ （ｄ， Ｊ ＝ ６．９３ Ｈｚ，３Ｈ）， ２．２８ （ｔｔ， Ｊ ＝ ７．３３， ６．０９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４８ （ｔ， Ｊ ＝ ６．５７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６８ （ｄｔ， Ｊ ＝ １４．２９， ６．５７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８５ （ｂｒ ｓ， ４Ｈ）， ２．８７ （ｔ， ７．３３ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．２９−３．８４ （ｍ， ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ）， ３．９７ （ｓ， ３Ｈ）， ４．１５（ｔ， Ｊ ＝ ６．０９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ５．５４ （ｑｕｉｎ， Ｊ ＝ ６．９２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．５０ （ｂｒ ｍ， １Ｈ）， ６．９６ （ｓ， １Ｈ）， ７．５８ （ｓ， １Ｈ）．
【０１３３】
［光および加水分解性ゲルの製造］
（ａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ溶液）
ａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ（ＭＷ＝１０,０００）（ＰＴＥ−１００ＰＡ、日油株式会社製）  １０ｍＭ  （１０．８ｗ／ｖ％）
溶媒（リン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）：０．３Ｍ  ＨＥＰＥＳ＝１：１、ｐＨ７）
上記の分量で、ＰＥＧと溶媒を混合し、ａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ溶液を得た。
【０１３４】
（光および加水分解性架橋剤溶液ａ）
ＮＨＳ−ＰＣＨ−２ａｒｍＰＥＧ（実施例１で合成）  ２０ｍＭ  （９．１ｗ／ｖ％）
溶媒（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭフタル酸  水溶液、ｐＨ４）
（光および加水分解性架橋剤溶液ｂ）
ＮＨＳ−ＰＣＨ−４ａｒｍＰＥＧ（実施例２で合成）  １０ｍＭ  （１２．１ｗ／ｖ％）
溶媒（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭフタル酸  水溶液、ｐＨ４）
（光および加水分解性架橋剤溶液ｃ）
ＮＨＳ−ＰＣＨ−８ａｒｍＰＥＧ（実施例３で合成）  ５ｍＭ  （６．５ｗ／ｖ％）
溶媒（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭフタル酸  水溶液、ｐＨ４）
【０１３５】
（光および加水分解性ゲル溶液）
（実施例４）
上記のａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ溶液と光および加水分解性架橋剤溶液ａを等量で混合し、実施例４のポリエチレングリコールベースの光および加水分解性ゲル溶液を得た。
（実施例５）
上記のａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ溶液と光および加水分解性架橋剤溶液ｂを等量で混合し、実施例５のポリエチレングリコールベースの光および加水分解性ゲル溶液を得た。
（実施例６）
上記のａｍｉｎｏ−４ａｒｍ ＰＥＧ溶液と光および加水分解性架橋剤溶液ｃを等量で混合し、実施例６のポリエチレングリコールベースの光および加水分解性ゲル溶液を得た。
【０１３６】
［光および加水分解性ゲルの加水分解］
実施例４〜６で作製した光および加水分解性ゲル溶液を用いて、本発明の光および加水分解性ゲルの加水分解実験を行った。分解バッファーは、蒸留水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｐｈｏｓｐａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＤＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の３種を用いた。光および加水分解性ゲル溶液と分解バッファーとを１：１の容積比で混合し、混合液を７０μＬずつ各マイクロチューブに分配した。３７℃のインキュベーター内にアルミ箔による遮光条件化で１時間静置し、その後、５日後まで２４時間毎に作製した光および加水分解性ゲルの形状観察を行った。
光および加水分解性ゲルと分解バッファーの条件を示す。
（実施例７）：光および加水分解性架橋剤溶液ａ（実施例４で作製）、蒸留水
（実施例８）：光および加水分解性架橋剤溶液ａ（実施例４で作製）、ＤＰＢＳ
（実施例９）：光および加水分解性架橋剤溶液ａ（実施例４で作製）、ＤＭＥＭ
（実施例１０）：光および加水分解性架橋剤溶液ｂ（実施例５で作製）、蒸留水
（実施例１１）：光および加水分解性架橋剤溶液ｂ（実施例５で作製）、ＤＰＢＳ
（実施例１２）：光および加水分解性架橋剤溶液ｂ（実施例５で作製）、ＤＭＥＭ
（実施例１３）：光および加水分解性架橋剤溶液ｃ（実施例６で作製）、蒸留水
（実施例１４）：光および加水分解性架橋剤溶液ｃ（実施例６で作製）、ＤＰＢＳ
（実施例１５）：光および加水分解性架橋剤溶液ｃ（実施例６で作製）、ＤＭＥＭ
加水分解実験開始から、１日後、３日後、５日後のゲルの様子を図１４に示す。
図１４中、破線で囲んだ部分は、ゲルが加水分解されたことを示す。
また、実施例７〜１５の結果を表１に示す。
【０１３７】
【表１】
2014226088.tif 000019
【０１３８】
実施例８、１２のゲルは３日後に、実施例９ゲルは１日後に、実施例１５のゲルは５日後にそれぞれ加水分解された。実施例７、１０、１１、１３および１４のゲルでは加水分解されるまでに５日より多い日数を要し、実施例７、１１は約７日後、実施例１４は約１４日後、実施例１０、１３は、約１か月後加水分解された。
【０１３９】
以上の結果より、本発明の光および加水分解性架橋剤を用いた本発明の光および加水分解性ゲルは、反応条件に応じて良好に加水分解されることが明らかとなった。また、反応条件および架橋剤の分岐鎖数を変化させることで、ゲルが加水分解されるまでの時間を制御することが可能である。本発明の光および加水分解性架橋剤を用いた本発明の光および加水分解性ゲルは、複雑且つ微細な三次元組織体の形成に好適であり、さらに、三次元組織体形成後に所望のタイミングで分解させることが可能である。したがって、本発明の光および加水分解性ゲルを用いることで、マテリアルフリーの組織体を形成可能であり、本発明の光および加水分解性ゲルは非常に有用性の高い組織工学材料である。
【０１４０】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて有用である。
【符号の説明】
【０１４２】
１…光および加水分解性架橋剤、２…主鎖、３…ニトロベンジル基を含む基、４…活性エステル基、５…アミド結合部、６…高分子化合物、７…高分子化合物、８…アミノ基、９…架橋剤と高分子化合物間のアミド結合、１０…光および加水分解性ゲル、１１・３０・４０・５０・６０…細胞培養器具、３１・４１・５１…細胞培養基材、３２・４２・６２・７２…光および加水分解性ゲル層、３３…光および加水分解性ゲル層の表面、３４…細胞、３５…フォトマスク、８０…エステル結合、８０ａ…ヒドロキシ基、８０ｂ…カルボキシル基、Ａ１・Ｂ１…光が照射される一部領域。
【図１】
2014226088.tif 000020
【図２】
2014226088.tif 000021
【図３】
2014226088.tif 000022
【図４】
2014226088.tif 000023
【図５】
2014226088.tif 000024
【図６】
2014226088.tif 000025
【図７】
2014226088.tif 000026
【図８】
2014226088.tif 000027
【図９】
2014226088.tif 000028
【図１０】
2014226088.tif 000029
【図１１】
2014226088.tif 000030
【図１２】
2014226088.tif 000031
【図１３】
2014226088.tif 000032
【図１４】
2014226088.tif 000033