(57)【要約】開示されているのは、プリン塩基又はプリン塩基を有する重合体を含有する抗氷核活性剤、該抗氷核活性剤及び水を含有する不凍性液体、該抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む生物材料の抗氷核活性を向上させる方法、並びに該抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む生物材料の保存方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリン塩基、又はプリン塩基を有する重合体を含有する抗氷核活性剤。
【請求項２】
前記プリン塩基が、アデニン、プリン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、テオブロミン、カフェイン、尿酸、イソグアニン、及びテオフィリンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物である、請求項１に記載の抗氷核活性剤。
【請求項３】
前記プリン塩基が、アデニン、尿酸又はカフェインである、請求項１又は２に記載の抗氷核活性剤。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤、及び水を含有する不凍性液体。
【請求項５】
前記抗氷核活性剤を０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ含有する、請求項４に記載の不凍性液体。
【請求項６】
請求項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む、生物材料の抗氷核活性を向上させる方法。
【請求項７】
請求項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む、生物材料の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗氷核活性剤及び不凍性液体に関する。さらに、本発明は、生物材料の抗氷核活性を向上させる方法、及び生物材料の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水の中には異物が入っていることから、その異物が氷の核となり、水は０℃で凝固する。このような異物は、氷核活性物質と言われており、代表的な氷核活性物質としては、シュードモナス属の細菌、ヨウ化銀等が知られている。一方、純水は、異物が存在しないことから、氷の核が生成できず、凝固点（０℃）よりも低い、例えば−３９℃の温度まで冷却しても、凝固（固体化）しないことがある。このような現象は、一般に「過冷却現象」と言われている。【０００３】
このような過冷却現象を促進する抗氷核活性剤（過冷却促進剤）が、これまでに幾つか報告されており、抗氷核活性剤は、氷点下であっても凍らない水を作ることができる。その結果、凍結による膨張が起こらなくなるため、植物又は動物の細胞が破壊されずに保存でき、一旦凍った場合でも、微小な氷核ができ、微小な氷結晶形成が生じることから、食品、生体材料（臓器保存）等の分野での応用が期待されている。【０００４】
例えば、香辛料の成分であるオイゲノール（非特許文献１参照）等の低分子化合物；バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)由来の多糖（非特許文献２参照）等の高分子化合物が抗氷核活性を示すことが報告されている。【０００５】
しかしながら、これらの抗氷核活性剤は、氷核活性物質であるシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)等の細菌に対して抗氷核活性を示すものの、ヨウ化銀に対して抗氷核活性は低く、また、これらの抗氷核活性剤は、安全性の問題から、食品、生体材料分野等での利用が困難となっていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】H.Kawahara et al, J. Antibact. Antifung. Agents, 1996, Vol. 24, pp.95-100
【非特許文献２】Y.Yamashita et al, Biosci. Biotech. Biochem., 2002, Vol. 66, pp.948-954
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、氷核活性物質に対して幅広く抗氷核活性作用を示し、食品、生物材料等の分野への応用が可能である抗氷核活性剤及び不凍性液体を提供することを目的とする。さらに、当該抗氷核活性剤を用いた、生物材料の抗氷核活性を向上させる方法、及び生物材料の保存方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、プリン塩基及びプリン塩基を有する重合体が、上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、下記の抗氷核活性剤、不凍性液等を提供することにある。【００１０】
項１．
プリン塩基、又はプリン塩基を有する重合体を含有する抗氷核活性剤。
項２．
前記プリン塩基が、アデニン、プリン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、テオブロミン、カフェイン、尿酸、イソグアニン、及びテオフィリンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物である、項１に記載の抗氷核活性剤。
項３．
前記プリン塩基が、アデニン、尿酸又はカフェインである、項１又は２に記載の抗氷核活性剤。
項４．
項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤、及び水を含有する不凍性液体。
項５．
前記抗氷核活性剤を０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ含有する、項４に記載の不凍性液体。
項６．
項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む、生物材料の抗氷核活性を向上させる方法。
項７．
項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を食品に接触させる工程を含む、食品の抗氷核活性を向上させる方法。
項８．
項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む、生物材料の保存方法。
項９．
項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を食品に接触させる工程を含む、食品の保存方法。
項１０．
プリン塩基、又はプリン塩基を有する重合体の抗氷核活性剤としての使用。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、氷核活性物質に対して幅広く抗氷核活性作用を示し、食品、生物材料等の分野への応用が可能である抗氷核活性剤及び不凍性液体を提供できる。また、本発明の抗氷核活性剤を利用することで、食品、生物材料等の長期低温保存が可能となることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、核氷核活性剤（アデニン）の濃度の影響を示した図である。
【図２】図２は、核氷核活性剤（アデニン）の塩基数の影響を示した図である。
【図３】図３は、Ｖａｌｉの小滴凍結法についての写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．抗氷核活性剤
本発明の抗氷核活性剤は、プリン塩基、又はプリン塩基を有する重合体を含有する。なお、本明細書中において、「含有する」なる表現については、「含有する」、「実質的にのみからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。抗氷核活性剤とは、氷核の発生を抑制する剤（過冷却を促進する剤）を意味している。
【００１４】
プリン塩基
プリン塩基としては、プリン骨格を有する化合物であればよく、特に限定はない。一般に、プリン塩基とは、プリン及びプリン核の任意の位置が置換されてなるプリン化合物（誘導体）を総称するものである。
【００１５】
主なプリン塩基としては、例えば、アデニン、プリン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、テオブロミン、カフェイン、尿酸、イソグアニン、テオフィリン等が挙げられる。
【００１６】
なお、本明細書において、プリン塩基としては、上記アデニン、プリン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、テオブロミン、カフェイン、尿酸、イソグアニン、及びテオフィリンだけでなく、これら化合物と類似の化学構造を有する化合物（以下、「プリン塩基誘導体」ということもある）も包含されている。プリン塩基誘導体としては、例えば、上記した主なプリン塩基の水素原子が、炭素数１〜６等のアルキル基に置き換わった化合物；プリン塩基の水素原子が、炭素数３〜８等のシクロアルキル基に置き換わった化合物；プリン塩基化合物の水素原子又はメチル基が、アリール基に置き換わった化合物；特開２０００−６３８１８号公報に記載のヘテロ環化合物等のプリン塩基誘導体が挙げられる。
【００１７】
これらの中でも、プリン塩基としては、アデニン、アデニンの誘導体、カフェイン、カフェインの誘導体、尿酸、及び尿酸の誘導体が好ましく、アデニン及びアデニンの誘導体がより好ましい。
【００１８】
本明細書中において示される各基は、具体的に以下のとおりである。
【００１９】
「アルキル基」としては、特に制限はなく、例えば、炭素数１〜６の直鎖状アルキル基又は炭素数３〜６の分岐鎖状アルキル基が挙げられる。具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、２−メチルブチル基、１−メチルブチル基、ネオペンチル基、１，２−ジメチルプロピル基、１，１−ジメチルプロピル基、ｎ−ヘキシル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基、１−エチルブチル基、１，１，２−トリメチルプロピル基、１−エチル−２−メチルプロピル基等が挙げられる。該アルキル基としては、好ましくは炭素数１〜６の直鎖状アルキル基であり、より好ましくはメチル基、エチル基、及びｎ−ブチル基である。該アルキル基は、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、シアノ基、ニトロ基、シクロアルキル基（例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等）、アリール基（例えば、フェニル基、ナフチル基等）等の置換基を１〜６個有していてもよい。
【００２０】
なお、本明細書において、「ｎ−」はnormal、「ｓ−」はsecondary(sec−)、及び「ｔ−」はtertiary(tert−)を意味する。
【００２１】
「シクロアルキル基」としては、特に制限はなく、例えば、炭素数３〜８のシクロアルキル基が挙げられ、具体的には、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。該シクロアルキル基としては、好ましくは炭素数３〜７シクロアルキル基であり、より好ましくは炭素数５〜７シクロアルキル基であり、特に好ましくはシクロヘキシル基である。該シクロアルキル基は、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、シアノ基、ニトロ基、アルキル基（例えば、炭素数１〜６のアルキル基）、アリール基（例えば、フェニル基、ナフチル基等）等の置換基を１〜６個有していてもよい。
【００２２】
「アリール基」としては、特に制限はなく、例えば、単環式又は二環式以上のアリール基が挙げられ、具体的には、フェニル基、ナフチル基、アンスラニル基、フェナンスリル基等が挙げられる。アリール基としては、好ましくは単環式又は二環式のアリール基であり、より好ましくはフェニル基である。該アリール基は、例えば、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、シアノ基、ニトロ基、アルキル基（例えば、炭素数１〜６のアルキル基）、シクロアルキル基（例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等）、アリール基（例えば、フェニル基、ナフチル基等）等の置換基を１〜６個有していてもよい。
【００２３】
プリン塩基は、１種単独で使用することができ、又は２種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００２４】
プリン塩基は、市販品を使用することができ、市販品がない場合は、公知の製造方法に従い製造することができる。例えば、アデニンのアミノ基（−ＮＨ２）をジメチルアミノ基（−ＮＭｅ２）に変換した化合物は、アデニンとメチル化剤（例えば、ヨウ化メチル等）とを反応させることにより製造することができる。
【００２５】
プリン塩基を有する重合体
プリン塩基を有する重合体は、上記プリン塩基を繰り返し単位として有する重合体を意味し、プリン塩基は重合体に側鎖として存在する。重合体１分子当たりのプリン塩基の個数は、好ましくは３〜２１個、より好ましくは６〜１８個、特に好ましくは９〜１５個である。重合体における主鎖としては、プリン塩基が結合できる構造を有する化合物であれば特に制限なく使用できる。プリン塩基を有する重合体としては、好ましくはポリヌクレオチドであり、より好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。重合体におけるプリン塩基としては、アデニン及びアデニンの誘導体が好ましく、重合体のプリン塩基が全てアデニン及びアデニンの誘導体であることが特に好ましい。プリン塩基を有する重合体としては、ポリデオキシアデニル酸が特に好ましい。
【００２６】
以下の記載では、特に断りがない限り本発明の抗氷核活性剤は固体であるものとして説明するが、本発明の抗氷核活性剤は固体に限定されない。すなわち、本発明の抗氷核活性剤は、液体及び固体のいずれの形態も含むものとする。例えば、本発明の抗氷核活性剤が固体である場合、生物材料（例えば、食品（例えば、魚介類；野菜等の植物；牛肉、豚肉、鶏肉等の食用肉；豆腐、ヨーグルト等のタンパク質変性した加工品；飲料）、生体材料（例えば、植物又は動物の細胞（組織）；人間又は動物の血液；人間又は動物の臓器又はその一部））に対して固体を接触させることで、該生物材料の水分で溶解し、抗氷核活性剤として利用することができる。また、本発明の抗氷核活性剤が液体である場合、上記生物材料に対して液体を接触（例えば、噴霧又は滴下）させることで、該生物材料の抗氷核活性剤として利用することができる。
【００２７】
本発明の抗氷核活性剤は、さらにその他の成分を含有することができる。その他の成分としては、特に限定はなく、例えば、公知の抗氷核活性剤（例えば、特開２０１０−１２１０５２号公報に記載の抗氷核活性剤）、水、エタノール等が挙げられる。
【００２８】
本発明の抗氷核活性剤を製剤化する場合、その剤形としては、特に限定はなく、例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、クリーム、軟膏等の剤形が挙げられる。
【００２９】
２．不凍性液体
本発明の不凍性液体は、上記プリン塩基又はプリン塩基を有する重合体（抗氷核活性剤）、及び水を含有している。不凍性液体とは、氷の凝固点（０℃）において凍らない液体を意味する。
【００３０】
プリン塩基又はプリン塩基を有する重合体（抗氷核活性剤）の含有量としては、特に限定はなく、通常、不凍性液体中に、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００３１】
なお、水は、純水であってもよく、又は、水道水であってもよい。水中には、氷核活性物質が含有していてもよい。
【００３２】
氷核活性物質としては、特に限定はなく、例えば、シュードモナス属細菌、ヨウ化銀、フルオレン−９−オン、フェナジン、メタアルデヒト等が挙げられる。中でも、好ましい氷核活性物質は、シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、及びヨウ化銀である。
【００３３】
氷核活性物質は、不凍性液体中に１種単独で含まれていてもよく、又は２種以上含まれていてもよい。
【００３４】
氷核活性物質の含有量としては、特に限定はなく、通常、不凍性液体中に、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬの範囲であり、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
【００３５】
不凍性液体中の抗氷核活性剤と氷核活性物質との割合は、重量比で、通常、１：１０〜１：２００であり、好ましくは１：１０〜１：１００であり、より好ましくは１：１０〜１：２０である。
【００３６】
本発明の不凍性液体中に、生物材料（例えば、食品（魚介類；野菜等の植物；牛肉、豚肉、鶏肉等の食用肉；豆腐、ヨーグルト等のタンパク質変性した加工品；飲料）、生体材料（植物又は動物の細胞（組織）；人間又は動物の臓器又はその一部））を浸漬し、又は本発明の不凍性液体を、上記生物材料に噴霧又は滴下し、次いで冷却することにより、通常０℃以下、特に約０℃〜−１５℃の温度範囲で生物材料が凍結（破壊）せずに、又は一旦凍った場合でも、微小な氷核ができ、微小な氷結晶形成が生じることから、長期低温保存が可能である。
【００３７】
３．生物材料の抗氷核活性を向上させる方法
本発明の生物材料の抗氷核活性を向上させる方法は、上記抗氷核活性剤（過冷却促進剤）又は不凍性液体を生物材料に接触させる工程を含んでいる。
【００３８】
生物材料は、上記１及び２で説明した生物材料と同じである。
【００３９】
接触とは、上記抗氷核活性剤（過冷却促進剤）が固体である場合、この固体を生物材料に接触させる（均一に振りかける）ことで、該生物材料の水分で溶解し、抗氷核活性を示す。また、上記抗氷核活性剤（過冷却促進剤）が液体である場合又は不凍性液体を使用する場合、上記生物材料に対して液体を接触（例えば、噴霧又は滴下）させることで、該生物材料の抗氷核活性剤として利用することができる。
【００４０】
４．食品の抗氷核活性を向上させる方法
本発明の食品の抗氷核活性を向上させる方法は、上記抗氷核活性剤（過冷却促進剤）又は不凍性液体を食品に接触させる工程を含んでいる。
【００４１】
食品は、上記１及び２で説明した食品と同じである。接触とは、上記３で説明したとおりである。
【００４２】
５．生物材料の保存方法
本発明の生物材料の保存方法は、上記抗氷核活性剤（過冷却促進剤）又は不凍性液体を生物材料に接触させる工程を含んでいる。
【００４３】
生物材料は、上記１及び２で説明した食品と同じである。接触とは、上記３で説明したとおりである。
【００４４】
６．食品の保存方法
本発明の食品の保存方法は、上記抗氷核活性剤（過冷却促進剤）又は不凍性液体を食品に接触させる工程を含んでいる。
【００４５】
食品は、上記１及び２で説明した食品と同じである。接触とは、上記３で説明したとおりである。
【００４６】
７．用途
本発明の抗氷核活性剤（過冷却促進剤）は、食品、飲料等の品質保持剤（食品保存剤、飲料保存剤）等の食品分野；細胞保存剤、血液保存剤、臓器保存剤等の医療分野；化粧品分野；霜害防除剤、塗料等の環境分野等に広く適用することができる。
【００４７】
本発明の抗氷核活性剤は溶液に添加し、不凍性液体として使用することができる。この不凍性液体は、食品保存液、飲料保存液、細胞保存液、臓器保存液、霜害防除剤、霜付着阻害剤等として使用できる。
【００４８】
また、プリン塩基を有する重合体（抗氷核活性剤）はターゲットの分子量を考慮して重合体の大きさを調整することが可能であるため、デザイン性に優れる。プリン塩基を有する重合体（抗氷核活性剤）は、臓器保存などの生物材料が比較的大きい用途に特に有効である。
【００４９】
食品保存剤（食品保存液）
本発明の食品保存剤（食品保存液）が使用できる食品としては、特に限定はなく、例えば、野菜、魚、肉（鶏肉、豚肉、牛肉等）等の生鮮食品；ジュース、豆腐、高野豆腐等の加工食品等が挙げられる。
【００５０】
本発明の食品保存剤（食品保存液）を使用することで保存（鮮度保持）が可能であり、これら食品を輸出入、輸送等する際、凍結保存から過冷却保存へと変換することが可能であることから、電力エネルギー等の削減が可能となる。
【００５１】
細胞保存剤（細胞保存液）
本発明の細胞保存剤（細胞保存液）が使用できる細胞としては、植物、動物等の細胞であれば特に限定はなく、例えば、ヒト細胞、精子、卵子等が挙げられる。
【００５２】
本発明の細胞保存剤（細胞保存液）を使用することで細胞が破壊されずに保存が可能となる。
【００５３】
血液保存剤（血液保存液）
本発明の血液保存剤（血液保存液）が使用できる血液は、ヒト及び動物（ヒトを除く）の血液であれば特に限定はなく、例えば、全血、血漿、血清等が挙げられる。さらに、本発明の血液保存剤（血液保存液）は、血液成分である白血球、赤血球、血漿、血小板等にも使用できる。
【００５４】
臓器保存剤（臓器保存液）
本発明の臓器保存剤（臓器保存液）が使用できる臓器としては、ヒト及び動物（ヒトを除く）の臓器又はその一部であれば特に限定はない。
【００５５】
本発明の臓器保存剤（臓器保存液）を、臓器移植時に取り出した臓器の保存液；臓器の長期保管する際の保存液等に利用することができる。
【００５６】
霜害防除剤（霜害防除液）
本発明の霜害防除剤（霜害防除液）は、コンピューター、車のエンジン等の冷却液；冷凍庫等の着霜防止剤；車窓ガラスの曇り防止剤；トンネル結露防止剤等に利用することもできる。
【００５７】
本発明の抗氷核活性剤又は不凍性液体は、塗料等に混ぜて使用することができる。本発明の抗氷核活性剤を含有する塗料を用いて被覆（コーティング）された金属、樹脂等の対象物は、霜害を防除又は霜の付着を防止することができる。
【実施例】
【００５８】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００５９】
実施例１
抗氷核活性剤であるアデニン（和光純薬株式会社製）を濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように超純水（Milli-Q(商標)超純水製造装置、ミリポア株式会社製）で溶解させて水溶液を調製した。【００６０】
実施例２〜７
アデニンを表１に記載の抗氷核活性剤に代えた以外は実施例１と同様の方法で、それぞれの液体を調製した。【００６１】
試験例１．各プリン塩基の抗氷核活性能（過冷却促進能）の評価
下記表１に記載のプリン塩基を含有する抗氷核活性剤（実施例１〜７）に関して、下記の方法によって抗氷核活性能（過冷却促進能）を評価した。【００６２】
ヨウ化銀（和光純薬株式会社製）の濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように、超純水にヨウ化銀を溶解させた水溶液を９００μＬ用意した。【００６３】
それぞれの評価用サンプルは、実施例１〜７の水溶液１００μＬとヨウ化銀を溶解させた水溶液９００μＬを混合することによって調製した。また、ブランクサンプルは、超純水１００μＬとヨウ化銀を溶解させた水溶液９００μＬを混合することによって調製した。【００６４】
抗氷核活性能（過冷却促進能）は、Ｖａｌｉの小滴凍結法によって測定した。詳しくは、Ｖａｌｉの小滴凍結法（図３）に従い、コールドプレート冷却装置（COOLACE CCA-1000 EYELA社製）の銅版の上にアルミニウムのフィルムを置き、アセトン及びクロロホルム（アセトン：クロロホルム＝１：２の溶液）で希釈したシリコンオイル懸濁液をコーティングし、その表面に各評価用サンプル及びブランクサンプルを１０μＬずつ３０箇所に滴下し、毎分１．０℃の速度で温度を低下させて、３０個の小滴の５０％が凍結する温度をＴ50とする。【００６５】
各サンプルの上記小滴凍結時の温度をＳａｍｐｌｅＴ50とし、ブランクサンプルの上記小滴凍結時の温度をＢｌａｎｋＴ50とする。そして、抗氷核活性値ΔＴ50（℃）は、下記式によって求めた。
式：ΔＴ50（℃）＝ＢｌａｎｋＴ50−ＳａｍｐｌｅＴ50【００６６】
実施例１〜７の抗氷核活性剤について評価した結果を下記表１に示す。なお、結果の値は、３回の試験結果の平均値である。【００６７】
【表１】
2016167284.tif 000002
【００６８】
＜評価結果＞
実施例１〜７のプリン塩基の全てが、抗氷核活性値が０よりも高く、抗氷核活性を示すことがわかった。【００６９】
中でも、アデニン（実施例１）は、抗氷核活性値が一番高く、最も優れた抗氷核活性能を示した。そこで、次に、アデニンの濃度の影響を下記試験例２で調べた。【００７０】
実施例８〜１４
アデニンを濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ（実施例８）、０．２ｍｇ／ｍＬ（実施例９）、０．３ｍｇ／ｍＬ（実施例１０）、０．４ｍｇ／ｍＬ（実施例１１）、０．５ｍｇ／ｍＬ（実施例１２）、３．０ｍｇ／ｍＬ（実施例１３）、６．０ｍｇ／ｍＬ（実施例１４）となるように超純水で溶解させて水溶液を調製した。【００７１】
試験例２．プリン塩基の濃度の影響
実施例１の抗氷核活性剤（アデニン）について、その濃度が抗氷核活性に与える影響を調べた。【００７２】
ヨウ化銀の濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように、超純水にヨウ化銀を溶解させた水溶液を９００μＬ用意した。【００７３】
それぞれの評価用サンプルは、実施例１及び８〜１４の水溶液１００μＬとヨウ化銀を溶解させた水溶液９００μＬを混合することによって調製した。また、ブランクサンプルは、超純水１００μＬとヨウ化銀を溶解させた水溶液９００μＬを混合することによって調製した。【００７４】
抗氷核活性能（過冷却促進能）は、上記試験例１に示したＶａｌｉの小滴凍結法によって測定した。実施例１及び８〜１４の抗氷核活性剤について評価した結果を表２及び図１に示す。なお、結果の値は、３回の試験結果の平均値である。【００７５】
【表２】
2016167284.tif 000003
【００７６】
＜評価結果＞
アデニンの濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ〜６．０ｍｇ／ｍＬの範囲において、全て抗氷核活性能を有することが分かった。中でも、アデニンの濃度が１．０ｍｇ／ｍＬの場合に、最も優れた抗氷核活性値（９．２℃）を示した。【００７７】
試験例３．氷核活性物質の種類の影響
氷核活性物質であるヨウ化銀を、シュードモナス細菌であるシュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)に代えた以外は試験例１と同様の方法で、実施例１の評価用サンプルを調製した。上記試験例１と同様の試験方法で、抗氷核活性能（過冷却促進能）を測定した結果、アデニンを含有する抗氷核活性剤は、ヨウ化銀以外に、シュードモナス・フルオレッセンスに対しても、抗氷核活性能（１．０℃）を示した。【００７８】
試験例４．生物材料に対する抗氷核活性試験
牛レバー（縦１ｍｍ×横１ｍｍ×高さ１ｍｍ）の上に、実施例１（アデニン）の抗氷核活性剤の水溶液を超純水で１０倍希釈した水溶液（終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）を１０μＬ滴下した。ブランクサンプルとしては超純水を使用した。【００７９】
抗氷核活性能（過冷却促進能）は、上記試験例１に示したＶａｌｉの小滴凍結法と同様の方法で測定した。なお、結果の値は、３回の試験結果の平均値である。【００８０】
その結果、牛レバーに対する抗氷核活性剤（アデニン）の抗氷核活性値は、０．９℃であった。【００８１】
試験例５．生物材料に対する抗氷核活性試験
実施例１（アデニン）の抗氷核活性剤を、実施例５（カフェイン）の抗氷核活性剤に代えた以外は、試験例４と同様に抗氷活性試験を行った。【００８２】
その結果、牛レバーに対する抗氷核活性剤（カフェイン）の抗氷核活性値は、０．７℃であった。【００８３】
実施例１５〜１７
６塩基（実施例１５）、９塩基（実施例１６）、１２塩基（実施例１７）のポリデオキシアデニル酸を濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるようにＴＥ緩衝液に溶解させて水溶液を調製した。【００８４】
試験例６．プリン塩基の塩基数の影響
アデニンを有する重合体（ポリデオキシアデニル酸）について、その塩基数が抗氷核活性に与える影響を調べた。【００８５】
ヨウ化銀の濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるように、超純水にヨウ化銀を溶解させた水溶液を９００μＬ用意した。【００８６】
それぞれの評価用サンプルは、実施例１５〜１７の水溶液１００μＬとヨウ化銀を溶解させた水溶液９００μＬを混合することによって調製した。また、ブランクサンプルは、超純水１００μＬとヨウ化銀を溶解させた水溶液９００μＬを混合することによって調製した。【００８７】
抗氷核活性能（過冷却促進能）は、上記試験例１に示したＶａｌｉの小滴凍結法によって測定した。実施例１５〜１７の抗氷核活性剤について評価した結果を表３及び図２に示す。なお、結果の値は、３回の試験結果の平均値である。【００８８】
【表３】
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【００８９】
＜評価結果＞
ポリデオキシアデニル酸の塩基数が６、９、１２塩基と増大するにつれて、抗氷核活性値が増加した。この結果から、氷核活性物質が大きな場合にも、氷核活性を制御できるようになることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の抗氷核活性剤は、冷凍食品の品質保持剤等の食品分野；霜害防除剤等の環境分野；細胞保存剤、血液保存剤、臓器保存剤等の医療分野等に広く適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年10月13日(2016.10.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プリン塩基を有する重合体を含有する抗氷核活性剤。
【請求項２】
前記プリン塩基が、アデニン、プリン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、テオブロミン、カフェイン、尿酸、イソグアニン、及びテオフィリンからなる群から選択される少なくとも１種の化合物である、請求項１に記載の抗氷核活性剤。
【請求項３】
前記プリン塩基が、アデニン、尿酸又はカフェインである、請求項１又は２に記載の抗氷核活性剤。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤、及び水を含有する不凍性液体。
【請求項５】
前記抗氷核活性剤を０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ含有する、請求項４に記載の不凍性液体。
【請求項６】
請求項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む、生物材料の抗氷核活性を向上させる方法。
【請求項７】
請求項１〜３の何れか一項に記載の抗氷核活性剤を生物材料に接触させる工程を含む、生物材料の保存方法。
【国際調査報告】
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