(57)【要約】【課題】魚類に生殖腺刺激物質を投与する場合でも少量で機能させ、養殖業の種苗生産で魚類の成熟を制御することを課題とする。【解決手段】魚類の生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドからなる組成物を投与することにより、効率的に生体内に吸収させることにより性成熟を誘導する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
経口または経腸投与した魚類の生殖腺刺激物質を消化管内から血中に移行させる組成物であって、成分として該生殖腺刺激物質および細胞膜透過性ペプチドを含有することを特徴とする組成物。
【請求項２】
生殖腺刺激物質がGnRHまたはGnRHaである請求項１の組成物。
【請求項３】
細胞膜透過性ペプチドが、（ａ）ないし（ｆ）のペプチドを含有する請求項１又は２の組成物。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは2個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列からなる、ペプチド。
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｄ）（ｃ）のアミノ酸配列において、１もしくは2個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列からなる、ペプチド。
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｆ）（ｅ）のアミノ酸配列において、１もしくは2個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列からなる、ペプチド。
【請求項４】
前記（ｂ）（ｄ）又は（ｆ）における置換が、前記（ａ）（ｃ）又は（ｅ）のアミノ酸配列において、Ｎ末端から3番目のアミノ酸の疎水性インデックスからＮ末端から2番目のアミノ酸の疎水性インデックスを差し引いた値がゼロまたはマイナスの値となるような置換である、請求項３の組成物。
【請求項５】
前記（ｂ）（ｄ）又は（ｆ）における置換が、前記（ａ）（ｃ）又は（ｅ）のアミノ酸配列において、Ｎ端から2番目のアミノ酸から5番目のアミノ残基までの疎水性インデックスの標準偏差が4.0以下であるような置換である、請求項３又は４の組成物。
【請求項６】
魚類が魚食性魚類である、請求項１ないし５の組成物。
【請求項７】
魚食性魚類がサバ亜目魚類である、請求項６の組成物。
【請求項８】
サバ亜目魚類がサバ科魚類である、請求項７の組成物。
【請求項９】
魚食性魚類が成魚の体長で30cm以上の魚種である、請求項６ないし８の組成物。
【請求項１０】
請求項１ないし９の組成物を含む、飼料。
【請求項１１】
請求項１ないし１０の組成物または飼料の経口または経腸投与を特徴とする魚類の産卵誘導方法。
【請求項１２】
水温を調節するものである、請求項１１の産卵誘導方法。
【請求項１３】
日照の調節するものである、請求項１１又は１２の産卵誘導方法。
【請求項１４】
魚体重 1kg あたり 5mg 以下の生殖腺刺激物質を経口または経腸投与することによる魚類の産卵誘導方法。
【請求項１５】
生殖腺刺激物質の経口または経腸投与の際に、生殖腺刺激物質と共に細胞透過性ペプチドを投与する、請求項１４の産卵誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜透過性ペプチド及び細胞膜透過性ペプチドを用いた飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類において生理活性物質を経口投与し、そのまま魚類の体内で機能させる試みはこれまでいくつかなされてきた。特許文献１には、魚類成長ホルモン様作用を示すポリペプチドが経口投与でも機能することが記載されている。特許文献２には、魚類において生殖腺刺激物質は経口投与でも機能することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ９８−４２７４８号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１４−１４８６０３号公報
【０００４】
養殖業での種苗生産においては生殖腺刺激物質により魚類の成熟を人工的に制御することが重要である。しかし特許文献２の技術を利用しようとする場合、相対的に多量の生殖腺刺激物質を用いなければならず、経済性に問題があった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、魚類に生殖腺刺激物質を経口投与する場合でも少量で機能させ、養殖業の種苗生産で魚類の成熟を制御することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は上記の課題を解決するため種々研究した結果、細胞膜透過性ペプチドの一部の配列を利用し、生殖刺激物質と共に用いることにより効果を高めることができることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
本発明は、経口または経腸投与した魚類の生殖腺刺激物質を消化管内から血中に移行させるものであって、成分として該生殖腺刺激物質および細胞膜透過性ペプチドを含有す
ことを特徴とする組成物を提供することを要旨とする。【０００８】
本発明は以下の構成を有する。
（１）経口または経腸投与した魚類の生殖腺刺激物質を消化管内から血中に移行させる組成物であって、成分として該生殖腺刺激物質および細胞膜透過性ペプチドを含有することを特徴とする組成物。
（２）生殖腺刺激物質がGnRHまたはGnRHaである（１）の組成物。
（３）細胞膜透過性ペプチドが、（ａ）ないし（ｆ）のペプチドを含有する（１）又は（２）の組成物。
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１もしくは2個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列からなる、ペプチド。
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｄ）（ｃ）のアミノ酸配列において、１もしくは2個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列からなる、ペプチド。
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｆ）（ｅ）のアミノ酸配列において、１もしくは2個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列からなる、ペプチド。
（４）前記（ｂ）（ｄ）又は（ｆ）における置換が、前記（ａ）（ｃ）又は（ｅ）のアミノ酸配列において、Ｎ末端から3番目のアミノ酸の疎水性インデックスからＮ末端から2番目のアミノ酸の疎水性インデックスを差し引いた値がゼロまたはマイナスの値となるような置換である、（３）の組成物。
（５）前記（ｂ）（ｄ）又は（ｆ）における置換が、前記（ａ）（ｃ）又は（ｅ）のアミノ酸配列において、Ｎ端から2番目のアミノ酸から5番目のアミノ残基までの疎水性インデックスの標準偏差が4.0以下であるような置換である、（３）又は（４）の組成物。
（６）魚類が魚食性魚類である、（１）ないし（５）の組成物。
（７）魚食性魚類がサバ亜目魚類である、（６）の組成物。
（８）サバ亜目魚類がサバ科魚類である、（７）の組成物。
（９）魚食性魚類が成魚の体長で30cm以上の魚種である、（６）ないし（８）の組成物。
（１０）（１）ないし（９）の組成物を含む、飼料。
（１１）（１）ないし（１０）の組成物または飼料の経口または経腸投与を特徴とする魚類の産卵誘導方法。
（１２）水温を調節するものである、（１１）の産卵誘導方法。
（１３）日照の調節するものである、（１１）又は（１２）の産卵誘導方法。
（１４）魚体重 1kg あたり 5mg 以下の生殖腺刺激物質を経口または経腸投与することによる魚類の産卵誘導方法。
（１５）生殖腺刺激物質の経口または経腸投与の際に、生殖腺刺激物質と共に細胞透過性ペプチドを投与する、（１４）の産卵誘導方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の組成物又は飼料を用いること、又は本発明の方法により、魚類に生殖腺刺激物質を単独で経口投与するよりも少量で機能させることができる。本発明の組成物、飼料又は方法を用いて養殖業において魚類の成熟による産卵を制御することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において産卵の誘導とは、魚類において産卵を促すことをいう。産卵は排卵、放卵という段階を踏んで行われる。排卵は成魚の雌の卵巣に卵母細胞が形成され、卵巣の濾胞組織から剥離する現象をいう。放卵はそれを対外へ排出する現象で、交尾あるいは受精を伴い、自発的に行われる放卵を産卵という。魚類では卵巣に蓄積された卵がなんらかの刺激により体外に放出されることがあるが、産卵の準備が十分に整っていない場合にもこのような現象はみられる。そのような場合、受精して孵化仔魚が得られるような産卵とは区別される。一般的に水温の変化や日照時間の変化により刺激されて体内でホルモンが合成されることにより、卵の成熟が促進される。卵の成熟は雌の体内から卵巣卵を採取し、卵径を測定したり、セラ液で処理した卵の核を観察することによっても判断することができる。
【００１１】
本発明において生殖腺刺激物質とは、魚類において産卵を誘発する効果のあるものであり、例えば生殖ホルモンを含む。具体的には性腺刺激ホルモン放出ホルモンGnRH（Gonadotropin releasing hormone）、黄体化ホルモンLH（Luteinizing hormone）、卵胞刺激ホルモン FSH（Follicle Stimulating Hormone）、E2（Estradiol9）、DHP（17α,20β-dihydroxy-4-prognen-3-one）をいうが、これらに限定されない。
【００１２】
本発明において生殖ホルモンはこれを高濃度に含む視床下部抽出物、脳下垂体抽出物及びこれらの精製品の他、化学的な手法で人工的に合成されたものを用いることができる。化学的に合成するためには目的の分子を合成することができるかぎりいずれの方法を用いてもよいが、例えばペプチドホルモンの場合にはペプチドシンセサイザーを用いることができる。ペプチドホルモンとは、ホルモンの作用をするペプチドをいう。生殖ホルモンを使用するには化学的に合成したものを使用してもよいし、遺伝子工学的な手法により菌体等により生産させたものを使用してもよい。遺伝子工学的手法とは、遺伝子を人工的に操作する技術を指し、遺伝子導入や遺伝子組換えなどの技術で生物に遺伝子操作を行う手法をいう。
【００１３】
また菌に生殖ホルモンを産生させる方法を用いて、ペプチドホルモンを菌体内に含有させた菌体をそのまま使用してもよい。用いる菌は遺伝子工学的手法により菌体内でペプチドホルモンを生産することができればよく、例えば大腸菌、枯草菌、乳酸菌、酵母、放線菌、ラン藻があるがこれらに限定されない。菌体に産生させる方法を用いた場合、ペプチドホルモンが含まれる限り得られる培養物、培養液、培養後に回収される菌体、菌体を乾燥して得られる乾燥菌体、培養物または培養液を精製して得られる精製物、および精製物を乾燥して得られる乾燥精製物のいずれを使用してもよい。藻類に産生させる方法を用いて、生殖ホルモンを含有させた藻体であってもよい。係る方法の場合、得られる培養物、培養液、培養後に回収される藻体、該藻体を乾燥して得られる乾燥藻体、培養物または培養液を精製して得られる藻体精製物、および藻体精製物を乾燥して得られる乾燥藻体精製物のいずれを使用してもよい。培養細胞に産生させる方法を用いて、生殖ホルモンを含有させた細胞を使用してもよい。用いる細胞は目的の生殖ホルモンを産生することができればなんでもよいが、人、マウス、ラット、モルモット、魚、昆虫由来の細胞が例示されるが、これらに限定されない。係る方法の場合、得られる細胞、培養液、培養後に回収される細胞精製物、および細胞精製物を乾燥して得られる乾燥培養細胞精製物のいずれを使用してもよい。本発明において生殖ホルモンは、特定の由来、製法により得られる１種を単独で用いてもよいし、由来、製法の異なる２種以上を組み合わせてもよい。
【００１４】
本発明でペプチドとは、アミノ酸残基のポリマーをいう。アミノ酸残基はすべて天然アミノ酸残基であることが好ましいが、1個又は複数個のアミノ酸類似体またはアミノ酸模倣体等の非天然アミノ酸残基が含まれていてもよい。また、すべてのアミノ酸残基が非天然アミノ酸残基であってもよい。
【００１５】
本発明でアミノ酸とは、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体をいう。アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸又はＤ−アミノ酸のいずれであってもよい。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、及び細胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、及びＯ−ホスホセリン）をいう。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾されたＲ基又は修飾された骨格を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をいう。アミノ酸模倣体とは、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様の機能を有する化合物をいう。アミノ酸は本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）の推奨する、一般に公知の３文字表記又は1文字表記により記載される。各アミノ酸については、疎水性の指標として疎水性インデックスを用いる。疎水性インデックスの値に小数点以下第二位があるときにはこれを四捨五入し、小数点以下第一位までの値とする。具体的なアミノ酸の疎水性インデックスとしては、アルギニン-4.5、リジン3.9、アスパラギン酸-3.5、アスパラギン-3.5、グルタミン酸-3.5、グルタミン-3.5、ヒスチジン-3.2、プロリン-1.6、チロシン-1.3、トリプトファン-0.9、セリン-0.8、トレオニン-0.7、グリシン-0.4、アラニン1.8、メチオニン1.9、システイン2.5、フェニルアラニン2.8、ロイシン3.8、バリン4.2、イソロイシン4.5を用いる。（Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol., 157, 105-132(1982)）
【００１６】
塩基性側鎖を有するアミノ酸はリジン、アルギニン、ヒスチジンからなり、酸性側鎖を有するアミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸からなり、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸はグリジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインなどを含み、疎水性側鎖を有するアミノ酸はアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンなどを含み、分岐側鎖を有するアミノ酸はトレオニン、バリン、ロイシン、イソロイシンからなり、ならびに、芳香族側鎖を有するアミノ酸はチロシン、トリプトファン、フェニルアラニン、ヒスチジンからなる。ペプチド配列内のこれらの相互に性質が類似したアミノ酸残基を置換すると、元のペプチドの特性を保持したままアミノ酸残基を変えることができることが知られている。このことは「保存的置換」をいわれ、当業者には周知である。以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるとして当技術分野で知られている。（Creighton, Proteins 1984）。
１）  アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）
２）  アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）
３）  アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）
４）  アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）
５）  イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）  フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）  セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）  システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
【００１７】
アミノ酸残基の置換、付加及び／又は挿入によりペプチドの改変を行う場合には、改変ペプチドが元のペプチドの特性を保持するかぎりＬ-アミノ酸のほか、Ｄ−アミノ酸、又はアミノ酸類似体若しくはアミノ酸模倣体等の非天然アミノ酸等により改変を行ってもよい。ペプチドの生体内での安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、又はアミノ酸類似体若しくはアミノ酸模倣体等の非天然アミノ酸を導入することは、当業者において周知である。改変ペプチドが元のペプチドの特性を保持していれば、ペプチドはＤ−アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体若しくはアミノ酸模倣体等の非天然アミノ酸残基を含んでいてもよい。
【００１８】
元のペプチドの特性が保持される限りペプチドに他の物質を連結してもよい。ペプチドに連結可能な他の物質として、他のペプチド、脂質、糖もしくは糖鎖、アセチル基、天然もしくは合成のポリマー等が挙げられるが、これらに限定されない。また、元のペプチドの特性が保持されていれば、ペプチドに糖鎖付加、側鎖酸化、及びリン酸化等の修飾を行ってもよい。
【００１９】
本発明は、元のペプチドが保存的置換により改変されたペプチドを有効成分として含むことができる。改変ペプチドが元のペプチドの特性を保持する限り、非保存的な改変を含む。ここで、ペプチドの特性とは、ペプチドの期待される生理活性をいう。例えば、ペプチドがGnRHである場合には、改変ペプチドが元のペプチドの産卵誘導活性を保持する限り、改変の種類及び改変されるアミノ酸残基の数は限定されない。
【００２０】
GnRHは１０アミノ酸からなるペプチドホルモンであり、哺乳類型である配列番号４のアミノ酸配列の他にタイ型、サケ型、ニワトリII型等が知られている。本発明では生殖腺を刺激する生理活性があるかぎりどれを用いてもよいが、魚類の成熟促進に一般的に用いられているため哺乳類型を用いることが好ましい。また、GnRHには哺乳類型GnRHの6番目のグリシンをD型アラニンに置換してエンドペプチダーゼによる分解を受けにくくしたもの、10番目のGlyをN-エチルアミドと置換することで生理活性を増大させたもの、及びこれらの両方の修飾を施したものなどの改変GnRHを含む。生理活性が存在するかぎりいずれを用いてもよいが、特にペプチダーゼからの分解を受けにくく、生理活性も強い 両方の修飾を施した改変GnRHであるGnRHaを用いることが好ましい。
【００２１】
本発明において細胞膜透過性ペプチドとは、細胞と共存した場合に細胞膜を通過して細胞内に移行するペプチドをいう。細胞膜透過性ペプチドは、化学的手法あるいは遺伝子工学的手法でタンパク質と結合させて使用してもよいし、ペプチドのまま使用してもよい。アルギニンが連なったオリゴアルギニン、ＨＩＶ−１ウイルス由来のペプチドＴａｔ、ショウジョウバエ由来ペプチドであるペネトラチンなどが例示されるが、細胞と共存した場合に細胞膜を通過して細胞内に移行する特性のあるペプチドであればよく、これらに限定されない。
【００２２】
本発明においてペネトラチンとは、ショウジョウバエに由来する、配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドでエネルギー非依存的な機構により生体膜を透過する活性を有するものをいう。
本発明において疎水性ペネトラチンとは、ペネトラチンを構成するアミノ酸残基のうち1個又は2個のアミノ酸残基を疎水性インデックスの数値がより高いアミノ酸残基へ置き換え、疎水性を増加させたペプチドをいう。疎水性ペネトラチンのうち、N2イソロイシン型ペネトラチンとは、ペネトラチンのＮ末端から2アミノ酸残基目のグルタミンをイソロイシンに置換して疎水性を増加させた配列番号２のアミノ酸配列のペプチドをいう。また本発明において親水性ペネトラチンとは、ペネトラチンを構成するアミノ酸残基のうち1個又は2個のアミノ酸残基を疎水性インデックスの数値がより低いアミノ酸残基へ置き換え親水性を増加させたペプチドをいう。親水性ペネトラチンのうち、N3,5アラニン型ペネトラチンとは、ペネトラチンＮ末端から3アミノ酸残基目と5アミノ酸残基目の双方のイソロイシンをアラニンに置換して親水性を増加させた配列番号３のアミノ酸配列のペプチドをいう。
【００２３】
細胞膜透過性ペプチドとしてペネトラチン又は改変ペネトラチンを用いるときは、ペネトラチン又は改変ペネトラチンと同一のアミノ酸配列を有するペプチドを用いることが出来る他、各アミノ酸配列において、１もしくは2個のアミノ酸が欠失、置換または付加された配列からなる、ペプチドを用いることができる。置換は、保存的置換であることが好ましい。特に魚類で作用させるためには、置換は、各アミノ酸配列において、Ｎ末端から3番目のアミノ酸の疎水性インデックスからＮ末端から2番目のアミノ酸の疎水性インデックスを差し引いた値がゼロまたはマイナスの値となるような置換又は各アミノ酸配列において、Ｎ端から2番目のアミノ酸から5番目のアミノ残基までの疎水性インデックスの標準偏差が4.0以下であるような置換であることが好ましい。
【００２４】
魚の生活周期はほぼ1日24時間単位であるから、生殖腺刺激物質の投与量は1日24時間（day）を基本とする。生殖腺刺激物質の作用は通常は血中濃度に比例し、血液量は魚体重に比例する。そのため、生殖腺刺激物質の投与量は魚体重（BW）1kgあたりの数値として計算を行う。本発明によって魚に産卵を促すためには、生殖腺刺激物質の投与量は0.01mg/kgBW/day以上が好ましく、よい卵質の卵を得るためには、0.1mg/kgBW/day 以上が好ましく、より強力に産卵誘導するためには 1mg/kgBW/day 以上が特に好ましい。上限は魚に副作用が出なければ特に制限はないが、経済的理由により通常は 100mg/kgBW/day 以下で行い、10mg/kgBW/day 以下が特に好ましい。
【００２５】
本発明によれば、魚体重 1kg あたり 5mg 以下の生殖腺刺激物質を経口または経腸投与することによる魚類の産卵誘導方法を提供することができる。生殖腺刺激物質を魚体重 1kg あたり 5mg 以下とするためには、本発明の細胞膜透過性ペプチドを用いればよい。細胞膜透過性ペプチドは、生殖腺刺激物質の経口または経腸投与の際に、生殖腺刺激物質と共に投与することができる。
【００２６】
本発明により生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドを投与する場合は、所定の投与量を1日1回で投与してもよいし、１日数回に分けて投与してもよい。魚の食事周期が日の出後又は日の入り前の１日１回又は日の出後及び日の入り前の１日２回であることから、１日１回又は２回で行うことが好ましい。投与は１日行えば、産卵を誘導することができるが、2日間連続して行ってもよい。3日連続して行えば、それだけ多くの産卵が誘導される。
【００２７】
経口投与は、生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドを水溶液にして直接投与してもよく、飼料に混合して投与してもよい。直接投与する場合は溶媒として用いるものは水でもよいが、投与物質によってはｐＨに不安定なため緩衝液を用いることが望ましく、特に生体に無害なためリン酸緩衝液を用いることが好ましい。また投与したものが口から流れ出ることを防ぐため、同時にキタンサンガムやカラギーナン、グアーガム等の増粘剤を用いることもできるが、経済的理由からグアーガムが好ましい。ペプチドホルモンを飼料にまぜる場合は、ペプチドの分解を防ぐためペプチダーゼの活性が少ない状態の飼料に混ぜるほうが好ましい。飼料中のペプチダーゼは、加熱処理、酸処理、アルカリ処理、乾燥処理、加圧処理などにより活性を少なくすることができる。投与用の溶液または飼料を作成するのは、ペプチドは安定性に問題があるため用時調製が好ましいが、低温保存したものを用いることもできる。保管温度としては、10℃以下が好ましく、-４℃以下がさらに好ましく、-20℃以下がさらにそれよりも好ましく、-80℃以下が最も好ましい。冷凍保存した溶液を投与に用いる場合には、その分解をできるだけ抑制するために溶解後すぐに投与することが好ましい。
【００２８】
また、経口投与は直接魚の口部分から注射器を用いて行ってもよい。直接注射器を用いて口部または食道部に注射器解放部の先端を差し入れて投与してもよいが、注射器解放部にカニューレを連結してその先端が魚の食道または胃に達するようにして、投与物が直接食道または胃へ達するように投与してもよい。注射器に連結したカニューレを胃まで挿入して投与すると、定まった量を確実に魚に投与することができるため好ましい。カニューレの材質は耐久性、柔軟性が維持されていればなんでもよいが、耐久性、柔軟性、経済性からポリエチレン製が好ましい。
【００２９】
注射器を用いて経口投与をするときには麻酔を利用すると、魚に確実に投与物を与えることができる。麻酔は魚を一時的に鎮静化させ、後に正常な状態に回復するのであればなんでもよい。薬剤、針、電気ショック、炭酸ガス等、魚を一時的に鎮静化させることができるのであればなんでもよいが、例えば薬剤を用いた麻酔としては2-フェノキシエタノールを用いることが好ましい。2-フェノキシエタノール500ppmの水または海水の入った水槽を用意して魚を投入し、鎮静化したらすぐに水槽から取り出す。投与後すぐに海水または水の入っている水槽に戻し、麻酔から回復することを確認する。できるだけ魚に負担をかけないため魚を水から出している時間はできるだけ短いことが望ましく、30秒以内が好ましい。
【００３０】
経腸投与は、直接魚の肛門部分から注射器を行ってもよい。注射器に連結したカニューレ又は注射器を直接魚の肛門部分から挿管し、魚の腸部分へ直接投与物を挿入する。この場合、投与時に麻酔を使用してもよい。消化管とは、口より肛門までの食物の通路をいう。これには口腔、食道、胃、腸管が含まれる。麻酔は魚を一時的に鎮静化することができればなんでもよいが、薬剤、針、電気、炭酸ガス等を使用することができる。
【００３１】
生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドを飼料に混ぜて経口投与する場合には、飼料の栄養は過不足なく与える。好ましくはタンパク質含量が5重量%以上、さらに好ましくは10重量%以上、特に好ましくは15重量%以上の餌を与えるとよい。特に、生餌では、原料となる素材のタンパク質含量が5重量%以上、さらに好ましくは10重量%以上、特に好ましくは15重量%以上の餌を与えるとよい。また、配合飼料では、飼料全体のタンパク質含量が5重量%以上、さらに好ましくは15重量%以上、特に好ましくは25重量%以上、最も好ましくは 35%重量%以上の餌を与えるとよい。餌に含まれるタンパク含量が少なすぎる場合は、経口投与された生殖腺刺激物質が消化管に含まれるペプチダーゼによる分解を受けやすく、産卵の誘導率に影響が出る。また、成長不良を引き起こして産卵行動が見られなくなる。一方で餌に含まれるタンパク質含量が多すぎる場合は、餌に含まれるタンパク質が消化器官のペプチダーゼを誘導し、経口投与された生殖腺刺激物質が分解を受けやすく、産卵の誘導率に影響が出る。また、相対的にカロリー不足となり、産卵行動が見られなくなる。これを避けるためにはタンパク質含量が90重量%以下、好ましくは80重量%以下、さらに好ましくは70重量%以下、特に好ましくは60重量%以下の餌を与えるとよい。魚の成長は生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドを混ぜた飼料と混ぜない飼料との両方を投与して調節してもよい。この場合は、両飼料の合計で、タンパク質、脂質、ビタミンなどの各栄養成分が過不足なく与えられることが好ましい。
【００３２】
本発明において飼料は形態を限定されない。例えば魚をまるのままあるいは切り刻んで使用する生餌、生餌と粘結剤を含む粉末飼料を混合成型するモイストペレット、乾燥原料を用いた固形飼料であるドライペレット等があるが、その形態に限定されず魚に嗜好性があり、餌と認識して体内に取り込むものであればよい。ここで飼料に用いる魚はイワシ、アジ、サバ、イカナゴ、オキアミが含まれるが、魚の嗜好性が得られるのであればよく、これらに限定されない。魚を原料として含まなくても、餌と認識して体内に取り込むものであればよく、投与する組成物を内部に含むカプセル、固形物でもよい。カプセルや固形物は体内で崩壊するものが好ましい。植物性または動物性のタンパク質やデンプンを加熱して生成されるゲル状のものでもよい。植物性タンパク質としては大豆タンパク質、小麦タンパク質、動物性タンパク質としては、魚肉、鶏肉、豚肉、牛肉、羊肉、ゼラチン、デンプンとしては小麦デンプン、コーンデンプン、馬鈴薯デンプン、薩摩芋デンプンが例示されるが、ゲル化すればよくこれらに限定されない。また、ゲル化する特性を有するかぎり他の物質との混合物でもよい。
【００３３】
生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドを飼料に混合する方法としては、飼料を製造時に飼料原料と混合して飼料を製造してもよい。また、生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドを含有する液体を飼料に染み込ませてもよいし、飼料内部に注入してもよい。多層構造の飼料の場合、内側の層に注入してもよいし、飼料製造時に内側の層の原料のみに添加して飼料を製造してもよい。内側の層のみに生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドを含むようにすると、確実に生体内へ生殖腺刺激物質を取り込ませることができる。
【００３４】
生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドは同じ溶液に溶解させて投与してもよいし、別々の溶液を作成して投与してもよい。生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドが同時に同じ消化管内に存在するのであればそれぞれ別々に投与してもよいし同時に投与してもよい。また、飼料で投与する場合同一の飼料に含まれるように飼料を作成してもよいし、別々の飼料に含むように飼料を作成してもよい。投与する場合も生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドが同時に同じ消化管に存在するようにするかぎり、同時に投与してもよいし、別々に投与してもよい。生殖腺刺激物質はその効果が発揮できる最適な量を投与する必要があるが、経済的な理由から使用量はできるだけ少なくすることが望まれているため、例えばGnRHaの場合魚体重1 kgあたり5mg以下が好ましく、3mg以下がさらに好ましく、2mg以下が最も好ましい。細胞膜透過性ペプチドは生殖腺刺激物の細胞内への吸収を促進するために充分な量を投与する必要があるが、経済的な理由からその使用量を抑える必要がある。例えばペネトラチンを生殖腺刺激物質と投与する場合には質量として生殖腺刺激物質の5倍量を使用することが好ましく、4倍量がさらに好ましく、3倍量がもっとも好ましい。
【００３５】
産卵誘導を行う時は、同時に生育温度を適宜調節することが好ましい。魚種により生育温度は様々に異なるが、生育可能な温度帯の上限付近あるいは下限付近ではストレスにより産卵が誘導されにくい。このため、生育可能な温度の中央値付近で誘導することが好ましい。水温の調節は、生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドの経口投与と同時か、生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドの経口投与に先立って、ゴマサバ及びマサバなど春産卵のサバ科魚種であれば18℃〜21℃、スマ、カツオ、マグロなど夏産卵のサバ科魚種であれば24〜27℃、メカジキなど夏産卵のメカジキ科及びマカジキ科であれば 18〜22℃で誘導することが好ましい。また、水温の調節は産卵誘導の１日前から２００日前の間に行うことが好ましく、特に３日前から９０日前の間に行うことが好ましい。水温の調節は、ヒーター、クーラーまたはこれらの組み合わせを用いて行うことができる。調節にあたっては、設定温度から±2℃の範囲で、好ましくは±1℃の範囲で、さらに好ましくは±0.5℃の範囲で調節するとよい。設定温度は、生育可能な温度の中央値付近で変えることもできるが、魚への環境刺激を低減するために、生殖腺刺激物質と細胞膜透過性ペプチドの経口投与中は同じ温度で継続して飼育することが好ましい。
【００３６】
本発明によれば、産卵の誘導は陸上水槽での飼育下でも行うことができる。陸上水槽は、飼育水の循環型、かけ流し型などいずれの形式を用いることができる。本発明により、陸上水槽の飼育下で産卵を誘導できる魚種として、スマ、ゴマサバ、マサバ、カツオ、クロマグロ、キハダ、コシナガが例示される。
【００３７】
本発明の魚食性魚類の魚とは、主に魚類を主食とする魚類のことをいいサバ亜目魚類に代表される。魚食性魚類は、餌となる多くの魚のタンパク質を分解する必要があり、酵素の活性、食物の胃腸滞留時間、腸内細菌などで消化を調節している。通常ペプチドを経口投与しても、このシステムのなかでタンパク質と同様に消化され分解してしまうため、ペプチドの十分な生理活性を予想することは難しい。しかし本発明ではペプチド性の生理活性物質を細胞膜透過性ペプチドと共存させて経口投与すると、驚くべきことに単独で投与する場合比較して高い効果が認められた。
【００３８】
本発明のサバ亜目魚類に属する魚としては、サバ科魚類の他、マカジキ科やメカジキ科、タチウオ科に属する魚が知られ、それぞれマカジキやメカジキ、タチウオ等が例示される。サバ科魚類に属する魚としては、マサバ、ゴマサバ、グルクマ、スマ、サワラ、ハガツオ、カツオ、ソウダガツオと、クロマグロ、大西洋クロマグロ、ミナミマグロ、キハダ、ビンナガ、メバチ、コシナガなどのマグロ類が例示される。本発明に用いるには、魚食性の高いサバ亜目魚類が好ましく、回遊性の高いサバ科魚類がさらに好ましい。回遊性の高いサバ科魚類としてマサバ、ゴマサバ、カツオ、クロマグロ、大西洋クロマグロ、ミナミマグロが例示される。
【００３９】
本発明において成魚とは、生殖可能なほど成長した魚のことをいい、体長が、マサバ・ゴマサバであれば25cm以上、スマであれば40cm以上、カツオであれば42cm以上、クロマグロであれば115cm以上、メカジキであれば140cm以上の個体をいう。これを体重に換算すると、マサバ・ゴマサバであれば、300g以上、スマであれば1,400g以上、カツオであれば1,500g以上、クロマグロであれば30kg以上、メカジキであれば70kg以上の個体となる。
【００４０】
本発明において、体長とは、頭部の先端から下尾骨（尾鰭を支える骨）の後端までの長さをいう。通常は尾側については尾鰭を左右に曲げて、折れ曲がるところを目印にしてそこから頭部の先端までを測定して体長とする。
【００４１】
採卵は、成熟した雌から腹部を絞って採卵してもよいし、腹部を切り開いて採卵してもよい。また、自然産卵をしたものを回収してもよい。精子は成熟した雄から腹部を絞って採取したものを人工授精に使用することができるが、冷凍保存したものを使用してもよい。卵の成熟は、産卵誘導をした雌の成魚からサンプリングを行い、顕微鏡で観察することによって確認することができる。自然産卵の場合、排水する部分に採卵用ネットを設置し、そのネットを用いて産卵された卵を回収する。ネットは卵を回収することができるものであれば、目合いのサイズ、材質はなんでもよいが、目合いが細かすぎると排水を阻害してしまい、粗すぎると卵を回収することができない。そのため目合いは1mm以下、好ましくは800μｍ以下、さらに好ましくは500μｍ以下が望ましい。
【００４２】
本発明において水温を調節するには、クーラー、ヒーター、ボイラー、日照、ソーラーシステム等により水温を加温、冷却することによって行われるが、水温を適切に調節することができればよく、これらに限定されない。また、生簀を適切な水温の環境へ移動させることも含まれる。
【００４３】
本発明において日照時間を調節するには、魚を屋外又は屋内施設で飼育しタイマーまたは手動により電灯の照度を調節すること、又はシートにより遮光することにより行うことができる。日照時間の調節は24時間周期で昼夜を繰り返して行うが、誘導時には昼夜の時間比率をそれぞれの魚種の産卵期に対応する日照時間に調節して適切な昼夜の比率になるように飼育する。産卵期は例えばクロマグロについては5から7月、ゴマサバについては1から4月であるため、それぞれの期間の対応する地域における日照時間に調節することが好ましい。
【００４４】
本発明において、卵質とは卵が受精して孵化する能力をいう。卵質は浮上卵率、受精卵率と孵化率によって評価することができる。浮上卵率、受精卵率と孵化率は以下のように求める。精子による処理を行った卵を1L海水中に懸濁し、そのうちの2ml分を12穴プレートに移し卵数を計測する。3回計測した平均値に500を乗じた数を全卵数とする。次に、全卵数測定用に用いた2ml中の卵のうち、水面に5分以内に浮上した卵の数を浮上卵数、浮上した卵のうち顕微鏡観察にて卵割が確認された卵の数を受精卵数、2日後までに孵化した仔魚の数を孵化仔魚数とする。さらに、浮上卵率（= 浮上卵数/全卵数×100）と受精卵率（= 受精卵数/全卵数×100）、および孵化率（=孵化仔魚数/全卵数）のように計算して求める。浮上卵率、受精卵率、および孵化率は高いほどよい卵質であると評価することができる。
【００４５】
本発明の特定の実施形態は、ここで以下の実施例を通して、より詳細に記載される。実
施例は、本発明の選択された実施形態の記載をより十分にサポートすることを目的とする
ものであり、決して本発明の範囲に限定するように考えられるべきではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１    ゴマサバの産卵誘導
ゴマサバは千葉県館山湾にて釣獲された個体（555±51 g）を用いた。雌雄それぞれ4尾ずつ、合計8尾をFRP製1t水槽に収容した。試験区としては、魚体重1 kgあたり1.2 mgのGnRHaを投与したGnRHa1.2区、魚体重1 kgあたり1.2 mgのGnRHaとペネトラチン4.6 mg を投与したGnRHa1.2+P区、魚体重1 kgあたり1.2 mgのGnRHaとN2イソロイシン型ペネトラチン4.6 mgを投与したGnRHa1.2+SP区、魚体重1 kgあたり6.0 mgのGnRHaを投与したGnRHa6.0区の計4区を設けた。
投与の際は、200から500 ppmの2-フェノキシエタノール（和光純薬）中で麻酔したゴマサバの口から、2 mlのリン酸緩衝バッファー（NaCl 137mM、KCl 2.7mM、Na2HPO4 10mM、KH2PO4 1.76mM）中でグアーガム（最終濃度1%）と各種ホルモンを混合した溶液を、注射器によりカニューレを用いて注入した。
産卵された卵を回収するため、飼育水面の高さに調節した排水管を水槽壁面に設け、そこからの排水を採卵用ネットで受けた。回収した卵は1L海水中に懸濁し、そのうちの2ml分を12穴プレートに移し卵数を計測した。3回計測した平均値に500を乗じた数を産卵数とした。採卵と計測は、実験期間中毎日実施した。次に、産卵数測定用に用いた2ml中の卵のうち、水面に5分以内に浮上した卵の数を浮上卵数、2日後までに孵化した仔魚の数を孵化仔魚数として測定した。試験期間中の産卵数、浮上卵数、および孵化数を表１に示す。
【表１】
2017090722.tif 000002
【００４７】
実施例２    ゴマサバのGnRHa血中動態
実験は2014年6月15日から18日にかけて実施した。ゴマサバは千葉県館山湾にて釣獲された個体6尾（429±42.7 g）を用い、FRP製1t水槽に収容した。試験区としては、魚体重1 kgあたり1.2 mgのGnRHaを投与したGnRHa1.2区、魚体重1 kgあたり1.2 mgのGnRHaとペネトラチン4.6 mgを投与したGnRHa1.2+P区、魚体重1 kgあたり1.2 mgのGnRHaとN3,5アラニン型ペネトラチン4.6 mgを投与したGnRHa1.2+HP区、魚体重1 kgあたり1.2 mgのGnRHaとN2イソロイシン型ペネトラチン4.6 mgを投与したGnRHa1.2+SP区、魚体重1 kgあたり6.0 mgのGnRHaを投与したGnRHa6.0区、何も投与しなかった未投与区の計6区を設けた。【００４８】
投与の際は、2 mlのリン酸緩衝バッファーPBS（NaCl 137mM、KCl 2.7mM、Na2HPO4 10mM、KH2PO4 1.76mM）中でグアーガム（最終濃度1%）と各種ホルモンを混合し、注射器に充填して、ゴマサバの口からカニューレを用いて注入した。注入後0.5、1、2、3時間が経過した後に採血し、時間分解蛍光測定法（DELFIA）を用いて血中のGnRHa 濃度を測定した。採血はヘパリン処理した注射器で尾部より行い、4℃下16,000×gで10分間遠心分離して血漿を得た。血漿より、逆相抽出カラムstrata-X（島津GLC株式会社）を用いて夾雑物を除去し、80%（v/v）アセトニトリル水溶液に溶出したものをGnRHaの測定に用いた。【００４９】
GnRHaの測定は以下の手順で実施した。GnRHaを50 ng/mlの濃度で溶解した0.1 M 炭酸ナトリウムバッファー（pH 9.3）を、NuncフルオロヌンクプレートC96クリアマキシソープ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）の各ウェルに100 μlずつ加え、室温で24 時間静置した。その後、各ウェルにPBST（NaCl 137 mM、KCl 2.7 mM、Na2HPO4 10 mM、KH2PO4 1.76 mM、0.05% Tween20）を200 μlずつ加え、洗浄した。洗浄を3回繰り返した後、ブロッキング用バッファー（BSA 0.1%、Na2HPO4 0.05 M、sucrose 3.0％、NaN3 0.05%）を200 μlずつ加え、37℃で1 時間静置することでブロッキングを行った。GnRHa固相化とブロッキング済みのプレートをPBSTによって3 回洗浄した後、DELIFIAバッファー（Tris 6.055 g/L、NaCl 6 g/L、BSA 1 g/L、NaN3 0.5 g/L、Tween-40 0.1 g/L、DTPA 7.867 mg/L、pH 7.75）によって希釈した標準溶液および血漿由来サンプルを各ウェルに50μlずつ加えた。続いて、DELFIAバッファーで40,000倍に希釈した抗GnRHaヤギポリクローナル抗体（Agrisera）を各ウェルに50 μlずつ添加し、37℃で2 時間反応させた。PBSTで3 回洗浄した後、二次抗体として、DELFIAバッファーに500 ng/mlの濃度で溶解したユーロピウム標識抗体ウサギIgGヤギポリクローナル抗体 （PerkinElmer）を各ウェルに50μlずつ添加し、37℃で1 時間反応した。PBSTで3 回洗浄した後、エンハンサー試薬（PerkinElmer）を各ウェルに100 μlずつ添加し、室温で30分間振盪することで、ユーロピウム蛍光強度の増幅を行った。各ウェルの蛍光強度をマイクロプレートリーダーInfinite 200F Pro（Tecan）を用いて測定し、得られた値より試料中のGnRHa濃度を算出した。
【表２】
2017090722.tif 000003
細胞膜はリン脂質2重膜により構成されているので、細胞膜を透過するためにはその分子の疎水性が重要であると考えられる。ペネトラチンよりも疎水性ペネトラチンの方が他の共存するタンパク質を細胞膜を通過させ細胞内に移行させる活性が高く、また親水性ペネトラチンはペネトラチンよりも活性が低いことが予想された。確かに疎水性ペネトラチンはペネトラチンよりも高い活性が確認されたが、驚くべきことに親水性ペネトラチンであっても活性は維持され、投与後3時間の共存させた生殖ホルモンの血中濃度にあっては親水性ペネトラチンの効果がペネトラチンの効果を上回る効果が見られた。N2イソロイシン型ペネトラチンおよびN3,5アラニン型ペネトラチンはいずれもペネトラチンから改変したものであるが、特に活性の増強に関係のあると考えられる部位は改変しているＮ末端部分である。Ｎ末端から2番目と3番目のアミノ酸の疎水性インデックスを比較すると、元のペネトラチンがGln-3.5、Ile4.5に対し、N2イソロイシン型ペネトラチンGln-3.5、Ala1.8、N3,5アラニン型ペネトラチンIle4.5、Ile4.5となり、その2番目と3番目の疎水性インデックスの差が持続的な効果に関係があると考えられる。またペネトラチンの活性に関係が強いと考えられるＮ端から2番目のアミノ酸から5番目のアミノ残基までの疎水性インデックスについて、標準偏差を計算したところ、ペネトラチンは4.1に対し、N3,5アラニン型ペネトラチン2.75、N2イソロイシン型ペネトラチン3.64となった。このことからＮ端から2番目のアミノ酸から5番目のアミノ残基までの疎水性インデックスの値の標準偏差が小さくなることが持続的な効果に影響すると考えられた。
【配列表】
2017090722000001.app
【国際調査報告】
2017090722.tif 000004
2017090722.tif 000005
2017090722.tif 000006
2017090722.tif 000007