(57)【要約】  本発明は、造血幹細胞を増幅する技術を開発することを目的とする。  少なくとも１種類のＨＤＧＦ物質を用いることによって造血幹細胞を増幅させることができる。
2016167276.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類のＨＤＧＦ物質を含む、造血幹細胞の増幅誘導剤。
【請求項２】
ＨＤＧＦ物質が、以下：
(a)配列番号１の３０位〜２０８位のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)配列番号１に示されるアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(c)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が１箇所又は数箇所で欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
(d)配列番号２に示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとの間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
から選択される、請求項１に記載の増幅誘導剤。
【請求項３】
ＨＤＧＦ物質が、配列番号１、配列番号３〜配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有する、請求項１に記載の増幅誘導剤。
【請求項４】
ＨＤＧＦ物質が、配列番号１、配列番号３〜配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の増幅誘導剤。
【請求項５】
ステムセルファクター（ＳＣＦ）、flk-2／flt-3 リガンド（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも一つのサイトカインをさらに含有してなる、請求項１〜４のいずれかに記載の増幅誘導剤。
【請求項６】
少なくともトロンボポエチンを含有する、請求項５に記載の増幅誘導剤。
【請求項７】
造血機能低下又は造血機能障害のために生じる疾患の治療のために対象へ投与される、請求項１〜６のいずれかに記載の増幅誘導剤。
【請求項８】
造血機能低下又は造血機能障害を有する対象に対する移植治療のための生体材料を調製するために使用される、請求項１〜６のいずれかに記載の増幅誘導剤。
【請求項９】
試薬、培地又は培養基材に使用されることを特徴とする、請求項８に記載の増幅誘導剤。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかの増幅誘導剤を、生体外において、造血幹細胞を含む試料と接触させる工程を含む、造血幹細胞の増幅方法。
【請求項１１】
造血幹細胞を含む試料が、生体から採取した骨髄、末梢血、又は、臍帯血に由来する試料である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１の方法を用いて、生体外で造血幹細胞を増幅させる工程を含む、造血幹細胞含有生物材料の製造方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法により製造された造血幹細胞含有生物材料。
【請求項１４】
移植治療に用いるための、請求項１３の造血幹細胞含有生物材料。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれかの増幅誘導剤を、生体外において、造血幹細胞を含む試料と接触させて、造血幹細胞を増幅する工程、
増幅された造血幹細胞を、成熟血液細胞へ分化誘導する工程、
を含む、成熟血液細胞含有生物材料の製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の製造方法により製造された成熟血液細胞含有生物材料。
【請求項１７】
移植医療に用いるための、請求項１６の成熟血液細胞含有生物材料。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれかの増幅誘導剤を、生体外において、造血幹細胞を含む試料と接触させて、造血幹細胞を増幅する工程、
前記増幅誘導剤との接触前又は接触後に、遺伝子治療用の遺伝子を造血幹細胞に導入する工程、
を含む、造血幹細胞含有生物材料の製造方法。
【請求項１９】
遺伝子治療用遺伝子が、アデノシンデアミナーゼ欠損症の治療のためのＡＤＡ遺伝子、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症の治療のためのγc鎖遺伝子、慢性肉芽腫症の治療のためのgp91-phox遺伝子、ゴーシェ病の治療のためのグルコセレブロシダーゼ遺伝子、及び、血友病の治療のための第VIII因子の遺伝子または第IX因子の遺伝子、からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１８又は１９の方法により製造された造血幹細胞含有生物材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞を増幅する技術に関する。特に本発明は、造血幹細胞の増幅（Expansion）を誘導する物質及びその使用、造血幹細胞を増幅する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞は、全ての血球に分化可能な細胞であると同時に、生体内において自ら自己複製し、一生涯に亘って血球を供給する細胞である。そのため、白血病、再生不良性貧血など、正常な血液を作ることが困難になった患者においては、患者の造血幹細胞を正常な造血幹細胞に置き換える造血幹細胞移植による治療が劇的な成果をあげている。しかしながら、生体における造血幹細胞の増幅メカニズムには不明な点が多く、ドナーから採取した組織中の造血幹細胞を移植に耐えられる形で増幅することが困難であるという問題がある。【０００３】
造血幹細胞のソースには、骨髄、末梢血及び臍帯血の３種類があり、このような造血幹細胞の移植は、それぞれ骨髄移植、末梢血幹細胞移植及び臍帯血移植と呼ばれている。骨髄移植や末梢血幹細胞移植には主要組織適合抗原（human leukocyte antigen：ＨＬＡ）の完全一致や移植片対宿主病（graft versus host disease：ＧＶＨＤ）、組織採取におけるドナーの負担の問題がある。一方で、臍帯血移植には造血幹細胞数が少ないため生着不全が他のソースに比べて多く、特に成人への適用が困難という欠点があるが、組織が出産時の臍の緒から入手できるためドナーへの負担が少ないこと、必ずしもＨＬＡ完全一致の必要性がないことなどの利点がある。臍帯血移植では、実際にＨＬＡ抗原の４遺伝子座（Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤＲ）合計８抗原のうち、４〜６抗原一致でも移植に用いることが可能であることからドナーを見出すことが比較的容易である。【０００４】
したがって、生体外で造血幹細胞数を増やすことができれば、患者自身の骨髄や末梢血などから少量の造血幹細胞を採取することで自家移植ができるようになる。また、ドナーの骨髄から少量の造血幹細胞を採取することで移植ができるようになり、ドナーのリスクが減少する。さらに、臍帯血中の造血幹細胞の含有量を増やすことで、臍帯血移植が成人へ利用可能となる。このように造血幹細胞を生体外で増幅することができれば、現在の造血幹細胞移植における問題を解決することができる。そのため、造血幹細胞を増幅させる薬剤や増幅方法の開発が待望され、様々な研究がなされているが、生体内における造血幹細胞の増幅を誘導している因子の同定には至っていない。【０００５】
これまでに知られている造血幹細胞の生体外増幅の試みとしては、幹細胞因子（Stem cell Factor、以下、「ＳＣＦ」と略称する）やトロンボポイエチン（以下、「ＴＰＯ」と略称する）、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（FMS-like tyrosine kinase 3 Ligand、以下、「ｆｌｔ３Ｌ」と略称する）、インターロイキン−６（以下、「ＩＬ−６」と略称する）、顆粒球コロニー刺激因子（Granulocyte Colony stimulating Factor、以下、「ＧＣＳＦ」と略称する）などのサイトカインや増殖因子の存在下で臍帯血由来造血幹細胞を培養することにより、造血幹細胞の増幅が試みられてきたが、十分な造血幹細胞の増幅はできていない。また、非特許文献１には、各種サイトカインの存在下で銅キレート化合物などの低分子化合物を添加することによる造血幹細胞の増幅方法が報告されているが、これらの方法は主に造血前駆細胞の増幅を目的としたものであり、移植直後の造血の回復には寄与するものの、長期的に血球を産生する造血幹細胞を増幅することはできていない。非特許文献２には、他の低分子化合物ハイドロカーボンアンタゴニストが各種サイトカイン存在下において、２次移植にも耐える造血幹細胞を増幅させることが報告されたが、増幅するための培養期間が２１日間と長く、さらに、２次移植では骨髄の再構築に関するデータが示されていないため、長期に亘って造血能を有しているかは不明である。さらに、生体内に存在しない化合物の添加で引き起こされる現象であるため、生体内での造血幹細胞の増幅を模しているかについて疑問がある。【０００６】
支持細胞を用いた共培養系による増幅方法も報告されている（非特許文献３）。しかし、支持細胞由来の未知の物質・因子による影響が不明であること、移植時での支持細胞の混入の危険性があるなどの問題点がある。【０００７】
また、生体内における血球回復を目的とした方法として、Ｇ−ＣＳＦの投与が知られている。しかしながら、その効果は顆粒球に限定されており、血小板や赤血球など全ての血球の回復を促す効果はない。【０００８】
肝ガン細胞由来成長因子（hepatoma derived growth factor、以下「ＨＤＧＦ」と称する）は、ヒト肝細胞癌由来細胞株であるＨｕＨ−７の培養上清からマウスＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞の増殖（proliferation）を指標に精製されたタンパクである（非特許文献４）。ＨＤＧＦは、アミノ酸２４０個からなる酸性タンパクで、Ｎ−グリコシル化された部位（N-glycosylation site）を分子内に２つ含んでいることが報告されている。ＨＤＧＦは、培養細胞上清中に存在するが、そのＮ末端配列には分泌に必要なシグナル配列を有していないことから、分泌シグナル非依存経路により分泌されていると推定される。【０００９】
現在までにＨＤＧＦは、ヒト以外に、マウス、ラット、ウシからそのｃＤＮＡがクローニングされている。ヒト型およびマウス型との間のホモロジーは遺伝子レベルで８８％、アミノ酸レベルでも８８％であり、種族間で良く保存されており、特に細胞内移行に必須とされているＨＡＴＨ領域のアミノ酸は完全に一致している（非特許文献５）。このように、高等脊椎動物のＨＤＧＦはそのアミノ酸配列が系統樹的に離れた種間でも高い相同性を持っている。また、ＨＤＧＦには数種類のアイソフォームが存在するが、それらの相同性は９０％以上であることが知られている。またゲノム配列解析から、多くの生物種にＨＤＧＦがコードされる遺伝子が見出されている。【００１０】
ＨＤＧＦには、これまでに線維芽細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、胎生期肝細胞に対する増殖活性が報告されているが（非特許文献６）、造血幹細胞又は造血前駆細胞の増幅に関する報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Peled T, Gluckman E, Hasson N, Adi S, Assor H, Yudin D et al. Chelatable cellular copper modulates differentiation and self-renewal of cord blood-derived hematopoietic progenitor cells. Exp Hematol 2005; 33: 1092-1100.
【非特許文献２】Boitano AE, Wang J, Romeo R, et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 2010;329(5997):1345-1348.
【非特許文献３】Amsellem S, Pflumio F, Bardinet D, Izac B, Charneau P, Romeo PH, et al. Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells by direct delivery of the HOXB4 homeoprotein. Nat Med. 2003;9:1423-7.
【非特許文献４】Nakamura, H., Izumoto, Y., Kambe, H., Kuroda, T., Mori, T., Kawamura, K., Yamamoto, H., and Kishimoto, T. (1994) J. Biol. Chem. 269, 25143-25149
【非特許文献５】Izumoto Y, Kuroda T, Harada H, Kishimoto T, Nakamura H.  Hepatoma-derived growth factor belongs to a gene family in mice showing significant homology in the amino terminus. (1997) Biochem Biophys Res Commun.238(1):26-32.
【非特許文献６】Enomoto H, Yoshida K, Kishima Y, Kinoshita T, Yamamoto M, Everett AD, Miyajima A, Nakamura H. Hepatoma-derived growth factor is highly expressed in developing liver and promotes fetal hepatocyte proliferation. (2002) Hepatology. 36(6):1519-27
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明が解決しようとする課題は、造血幹細胞を増幅する技術を開発することである。特に、造血幹細胞の増幅を誘導する生体内因子を見出し、当該因子を用いて生体内及び生体外で造血幹細胞の増幅を誘導することを、本発明の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ヒト造血幹細胞の増幅を誘導する生体内因子を精力的に探索したところ、ＨＤＧＦが造血幹細胞の増幅を誘導すること、当該増幅された細胞を移植したマウスにおいて全ての種類の血液細胞へ分化したこと、当該増幅された細胞がマウスに対する２次移植においても生着・増幅したことを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成させた。【００１４】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）  少なくとも１種類のＨＤＧＦ物質を含む、造血幹細胞の増幅誘導剤。
（２）  ＨＤＧＦ物質が、以下：
(a)配列番号１の３０位〜２０８位のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)配列番号１に示されるアミノ酸配列と６０％以上のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(c)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が１箇所又は数箇所で欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
(d)配列番号２に示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとの間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
から選択される、（１）に記載の増幅誘導剤。
（３）  ＨＤＧＦ物質が、配列番号１、配列番号３〜配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含有する、（１）に記載の増幅誘導剤。
（４）  ＨＤＧＦ物質が、配列番号１、配列番号３〜配列番号１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（１）に記載の増幅誘導剤。
（５）  ステムセルファクター（ＳＣＦ）、flk-2／flt-3 リガンド（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びＩＬ−６からなる群から選択される少なくとも一つのサイトカインをさらに含有してなる、（１）〜（４）のいずれかに記載の増幅誘導剤。
（６）  少なくともトロンボポエチンを含有する、（５）に記載の増幅誘導剤。
（７）  造血機能低下又は造血機能障害のために生じる疾患の治療のために対象へ投与される、（１）〜（６）のいずれかに記載の増幅誘導剤。
（８）  造血機能低下又は造血機能障害を有する対象に対する移植治療のための生体材料を調製するために使用される、（１）〜（６）のいずれかに記載の増幅誘導剤。
（９）  試薬、培地又は培養基材に使用されることを特徴とする、（８）に記載の増幅誘導剤。
（１０）  （１）〜（６）のいずれかの増幅誘導剤を、生体外において、造血幹細胞を含む試料と接触させる工程を含む、造血幹細胞の増幅方法。
（１１）  造血幹細胞を含む試料が、生体から採取した骨髄、末梢血、又は、臍帯血に由来する試料である、（１０）に記載の方法。
（１２）  （１０）又は（１１）の方法を用いて、生体外で造血幹細胞を増幅させる工程を含む、造血幹細胞含有生物材料の製造方法。
（１３）  （１２）に記載の方法により製造された造血幹細胞含有生物材料。
（１４）  移植治療に用いるための、（１３）の造血幹細胞含有生物材料。
（１５）  （１）〜（６）のいずれかの増幅誘導剤を、生体外において、造血幹細胞を含む試料と接触させて、造血幹細胞を増幅する工程、増幅された造血幹細胞を、成熟血液細胞へ分化誘導する工程、を含む、成熟血液細胞含有生物材料の製造方法。
（１６）  （１５）に記載の製造方法により製造された成熟血液細胞含有生物材料。
（１７）  移植医療に用いるための、（１６）の成熟血液細胞含有生物材料。
（１８）  （１）〜（６）のいずれかの増幅誘導剤を、生体外において、造血幹細胞を含む試料と接触させて、造血幹細胞を増幅する工程、前記増幅誘導剤との接触前又は接触後に、遺伝子治療用の遺伝子を造血幹細胞に導入する工程、を含む、造血幹細胞含有生物材料の製造方法。
（１９）  遺伝子治療用遺伝子が、アデノシンデアミナーゼ欠損症の治療のためのＡＤＡ遺伝子、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症の治療のためのγc鎖遺伝子、慢性肉芽腫症の治療のためのgp91-phox遺伝子、ゴーシェ病の治療のためのグルコセレブロシダーゼ遺伝子、及び、血友病の治療のための第VIII因子の遺伝子または第IX因子の遺伝子、からなる群から選択される、（１８）に記載の方法。
（２０）  （１８）又は（１９）の方法により製造された造血幹細胞含有生物材料。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ＨＤＧＦ物質を利用することにより、生体外及び生体内において造血幹細胞を増幅させることができる。【００１６】
本発明を生体外で適用する場合、長期骨髄再構築能を有した長期造血幹細胞を増幅できることから、増幅された細胞は造血幹細胞移植用の細胞として利用できる。特に、臍帯血中の造血幹細胞に対してこのような増幅効果が確認されており、成人に対する臍帯血移植を可能とすることが期待される。また、本発明により増幅された造血幹細胞は、各種血液細胞へ分化する機能を保持するため、特定の血液細胞の移植のための材料としても有用である。増幅操作においては、管理された環境下で、無菌的且つ不純物が少ない品質で作製したＨＤＧＦを使用することができるため、移植における安全性が高い。また、従来知られた方法よりも短期間で造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞を増幅できる。【００１７】
本発明によれば造血幹細胞を増幅できることから、造血前駆細胞や特定の血液細胞、例えば赤血球や血小板などの血液細胞を大量に生産することも可能である。【００１８】
また、ＨＤＧＦを有効成分とする薬剤の投与やＨＤＧＦ遺伝子発現増強により、生体内のＨＤＧＦを増加させることで、すべての血球の産生が促されることから、造血幹細胞移植を必要とする患者を、薬剤により治療できることが期待される。さらに、このような薬剤は、制がん剤投与後の血球回復等に応用でき、貧血・感染・血小板減少による臓器不全を防ぐことができるだけでなく、特に入手・使用期限・感染（細菌・原虫・ウイルスなど）・アナフィラキシー等の免疫性副作用などの問題を抱えた血小板輸血などの必要性がなくなることが期待される。【００１９】
造血幹細胞は全ての血球に分化する多分化能を有し、さらに生体内において自己複製する。１個の細胞から自己も含め全ての造血前駆細胞、成熟血液細胞が作られることから、造血幹細胞が分化・増殖する段階で遺伝子に変異が起こり癌化しないように巧妙かつ複雑な制御機構が存在すると考えられる。また、その制御機構は、炎症時などの緊急な状況下においても対応できるものと考えられる。そのため、生体内に存在しない化合物を用いて刺激を与える方法が従来提案されているが、このような方法による刺激は、生体内において対応できない刺激となり、造血幹細胞の巧妙な制御機構を乱すことが考えられ、癌化などの危険性が危惧された。ＨＤＧＦは、生体内に存在する因子であり、その造血幹細胞の増幅作用は生体作用として適切と考えられるもので、本明細書に示すように、ＨＤＧＦを用いたことによる異常な増幅は認められなかった。すなわち、本発明の増幅誘導剤は、造血幹細胞の制御機構を乱すことなく、造血幹細胞を増幅させることができると推測される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ｈＨＤＧＦａのアミノ酸配列およびそれをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図２】図２は、ヒトＣＤ３４陽性細胞の増幅におけるｈＨＤＧＦの用量依存反応を示す図である。横軸は、ｈＨＤＧＦの濃度(ng/ml)を、縦軸は初期ヒトＣＤ３４陽性細胞数（1×104 cells/ml）を基準とした増幅倍数を示す。
【図３】図３は、ヒトＣＤ３４陽性細胞の増幅アッセイにおけるＨＤＧＦ及び各種サイトカインの作用を示すグラフである。グラフの横軸は、添加したサイトカイン等を示し、ＨはｈＨＤＧＦ、ＴはｈＴＰＯ、ＳはｈＳＣＦ、ＦはｈＦｌｔ３−Ｌをそれぞれ示し、併記されている場合それらが同時に添加されたことを示す（Ｎｏｎｅ：添加なし）。縦軸は、初期ヒトＣＤ３４陽性細胞数（播種細胞数1×10４cells/ml）を基準にした培養７日後の増幅倍数を示す。
【図４】図４は、無培養（ＵＣ）並びにｈＨＤＧＦ（Ｈ）及びｈＴＰＯ（Ｔ）の存在下で培養したＣＤ３４陽性細胞に関するＦＡＣＳ解析結果である（Ａ：未処理のヒトＣＤ３４陽性細胞、Ｂ：ｈＨＤＧＦ存在下３日間培養した細胞、Ｃ：ｈＴＰＯ存在下５日間培養した細胞、Ｄ：ｈＨＤＧＦ及びｈＴＰＯの共存下５日間培養した細胞）。横軸はヒトＣＤ３４の発現量（ＰＢ−ＣＤ３４−Ａ）、縦軸はヒトＣＤ３８の発現量（ＦＩＴＣ−ＣＤ３８−Ａ）をそれぞれ示す。
【図５】図５は、各種条件で処理したヒトＣＤ３４陽性細胞のＮＯＧマウスへの移植試験において、移植２３週間後の骨髄におけるヒトＣＤ３４（横軸：ＡＰＣ−ＣＤ３４−Ａ）及びヒトＣＤ３８（縦軸：ＰＥ−ＣＤ３８−Ａ）のＦＡＣＳ解析結果について、個体別に縦に並べて示したものである。左側から順に、Ａ列：ＵＣ群（無培養群）、Ｂ列：Ｈ群(ｈＨＤＧＦ単独／3日間培養群)、Ｃ列：Ｔ群(ｈＴＰＯ単独／5日間培養群)、Ｄ列：ＨＴ群(ｈＨＤＧＦ＋ｈＴＰＯ／5日間培養群)の結果を示す。個体数は５であるが、Ｈ群は実験途中で１匹死亡例があり、個体数は４であった。
【図６】図６は、各種条件で処理したヒトＣＤ３４陽性細胞のＮＯＧマウスへの移植試験において、移植２３週間後の骨髄におけるヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞の絶対数平均値（縦軸）を示すグラフである。横軸において、ＵＣは無培養群、ＨはｈＨＤＧＦ単独／３日間培養群、ＴはｈＴＰＯ単独／５日間培養群、ＨＴはｈＨＤＧＦ＋ｈＴＰＯ／５日間培養群を示す。
【図７】図７は、無培養（ＵＣ）並びにｈＨＤＧＦ及びｈＴＰＯの存在下（ＨＴ）培養したヒトＣＤ３４陽性細胞のＦＡＣＳ解析結果（Ａ：未処理のＣＤ３４陽性細胞、Ｂ：ｈＨＤＧＦ及びｈＴＰＯの共存下５日間培養した細胞）を示す。横軸はＣＤ３４の発現量（ＰＢ−ＣＤ３４−Ａ）、縦軸はＣＤ３８の発現量（ＦＩＴＣ−ＣＤ３８−Ａ）をそれぞれ示す。
【図８】図８は、各条件で処理したヒトＣＤ３４陽性細胞のＮＯＧマウスへの移植試験において、一次移植２４週間後の多分化能解析において、各種血液細胞の表面マーカーを用いたＦＡＣＳ解析結果である（ＵＣ：無培養群、ＨＴ：ｈＨＤＧＦ／ｈＴＰＯ共存群）。縦軸は目的とする抗原マーカーの発現レベル、横軸に対象となるマーカーの発現レベルを示す。ＣＤ４５（縦軸：ＦＩＴＣ−ＣＤ４５−Ａ、横軸：ＰＢ−ｈＣＤ４５−Ａ）、ＣＤ３３（縦軸：ＰＥ−Ｃｙ５−ＣＤ１９−Ａ、横軸：ＰＥ−ＣＤ３３−Ａ）、ＣＤ１９・ＣＤ３（縦軸：ＰＥ−Ｃｙ５−ＣＤ１９−Ａ、横軸：ＡＰＣ−ＣＤ３−Ａ）、ＣＤ２３５ａ（縦軸：ＰＢ−ｈＣＤ４５−Ａ、横軸：ＰＥ−ＣＤ２３５ａ−Ａ）、Erythrocyte（縦軸：ＡＰＣ−ＴＥＲ１１９−Ａ、横軸：ＦＩＴＣ−ＣＤ２３５ａ−Ａ）、Platelet（縦軸：ＳＳＣ−Ａ、横軸：ＡＰＣ−ＣＤ４１−Ａ）。
【図９】図９は、各条件で処理したヒトＣＤ３４陽性細胞のＮＯＧマウスへの移植試験において、一次移植２４週間後の各個体から採取した骨髄細胞のヒトＣＤ３４（横軸：ＡＰＣ−ＣＤ３４−Ａ）及びヒトＣＤ３８（縦軸：ＰＥ−ＣＤ３８−Ａ）のＦＡＣＳ解析結果を示す。ＵＣは無培養群（ｎ＝５）、ＨＴはｈＨＤＧＦ／ｈＴＰＯ共存群（ｎ＝８）である。
【図１０】図１０は、各条件で処理したヒトＣＤ３４陽性細胞のＮＯＧマウスへの移植試験において、二次移植２０週間後の多分化能解析のため、各種ヒト血液細胞の表面マーカーを用いたＦＡＣＳ解析結果である（ＵＣ：無培養群、ＨＴ：ｈＨＤＧＦ／ｈＴＰＯ共存群）。縦軸は目的とする表面マーカーの発現レベル、横軸に対象となるマーカーの発現レベルをそれぞれ示す。ＣＤ４５（縦軸：ＦＩＴＣ−ｍＣＤ４５−Ａ、横軸：ＰＢ−ｈＣＤ４５−Ａ）、ＣＤ１９・ＣＤ３３（縦軸：ＰＥ−Ｃｙ５−ＣＤ１９−Ａ、横軸：ＰＥ−ＣＤ３３−Ａ）、ＣＤ３（縦軸：ＰＥ−Ｃｙ５−ＣＤ１９−Ａ、横軸：ＡＰＣ−ＣＤ３−Ａ）、ＣＤ２３５ａ（縦軸：ＰＢ−ｈＣＤ４５−Ａ、横軸：ＰＥ−ＣＤ２３５ａ−Ａ）、Erythrocyte（縦軸：ＡＰＣ−ＴＥＲ１１９−Ａ、横軸：ＦＩＴＣ−ＣＤ２３５ａ−Ａ）、Platelet（縦軸：ＳＳＣ−Ａ、横軸：ＡＰＣ−ｈＣＤ４１−Ａ）。
【図１１】図１１は、各条件で処理したヒトＣＤ３４陽性細胞のＮＯＧマウスへの移植試験において、二次移植２０週間後の各個体から採取した骨髄細胞のヒトＣＤ３４（横軸：ＡＰＣ−ＣＤ３４−Ａ）及びヒトＣＤ３８（縦軸：ＰＥ−ＣＤ３８−Ａ）のＦＡＣＳ解析結果を示す。ＵＣは無培養群（ｎ＝５）、ＨＴはｈＨＤＧＦ／ｈＴＰＯ共存群（ｎ＝８）である。
【図１２】図１２は、ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を移植したＮＯＧマウスに対して、各濃度のＨＤＧＦを投与し、移植４週間後の末梢血中の全白血球（ヒトＣＤ４５陽性細胞＋マウスＣＤ４５陽性細胞）に対するヒトＣＤ４５陽性細胞の割合の平均値（縦軸）のグラフである。
【図１３】図１３は、ｈＨＤＧＦａの配列中の各種ｈＨＤＧＦａトランケイト体の領域を示す図である。
【図１４】図１４は、各種ｈＨＤＧＦａトランケイト体体存在下５日間培養後におけるＣＤ３４＋細胞中のＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の総細胞数およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞絶対数を示すグラフである。ＵＮは無培養群、ＴＰＯはｈＴＰＯ単独添加群、ＨＴはｈＨＤＧＦａ全長及びｈＴＰＯ添加群、Ｈ１−２０８＋ＴはＨ１−２０８及びｈＴＰＯ添加群、、Ｈ３０−２４０＋ＴはＨ３０−２４０及びｈＴＰＯ添加群、Ｈ３０−２０８＋ＴはＨ３０−２０８及びｈＴＰＯ添加群、Ｈ４−２４０＋ＴはＨ４−２４０及びｈＴＰＯ添加群、Ｈ１−２３０＋ＴはＨ１−２３０及びｈＴＰＯ添加群、並びに、Ｈ１−１５０＋ＴはＨ１−１５０及びｈＴＰＯ添加群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明においては、少なくとも１つのＨＤＧＦ物質を用いて造血幹細胞を増幅させる。１つの態様において本発明は、少なくとも1種類のＨＤＧＦ物質を含む、造血幹細胞の増幅誘導剤を提供する。本発明の増幅誘導剤は、造血幹細胞を増幅させるために使用される、ＨＤＧＦ物質、又は、ＨＤＧＦ物質を含有する薬剤、試薬等である。生体外で使用される場合、本発明の増幅誘導剤は、造血幹細胞を含む試料の培養において用いられる、ＨＤＧＦ物質を含む試薬、添加剤、培地、培養基材等の形態で提供される。また、生体内に適用される場合、本発明の増幅誘導剤は、造血機能低下又は機能障害を伴う疾患の治療に用いられる、ＨＤＧＦ物質を有効成分として含有する医薬の形態で提供される。
【００２２】
さらに、本発明の増幅誘導剤は、造血関連細胞の研究用の試薬として提供されても良い。例えば、造血幹細胞や造血前駆細胞の分化や増幅を調節する因子を解明する際、造血幹細胞や造血前駆細胞と目的の因子を共存させて培養した時のコロニー形成細胞の種類、細胞表面分化マーカーや発現遺伝子の変化を解析することにより、実施することができる。
【００２３】
＜造血幹細胞＞
「造血幹細胞」とは、全ての血液細胞に分化できる多分化能を有し、且つ、自己複製（self-renewal）できる細胞である。ここで、自己複製とは、細胞分裂により自らと同じ機能・性質を有する細胞を産生することをいう。すなわち、造血幹細胞の自己複製により産生された細胞は、全ての血液細胞への多分化能及び自己複製能を有する。このような機能を有するため、造血幹細胞は、骨髄が破壊された動物に移植等した際、骨髄を再構築し、継続的に全ての血液細胞を産生する能力を有している。
【００２４】
造血幹細胞の分化とは、長期造血幹細胞が短期造血幹細胞へ、短期造血幹細胞が多能性造血前駆細胞へ、多能性造血前駆細胞が単能性造血前駆細胞へ、単能性造血前駆細胞が特有の機能を有する細胞、すなわち赤血球、白血球、巨核球などの成熟血液細胞に変換していくことをいう。これら一連の造血幹細胞の分化に関連した細胞において、自己複製能を有するのは、長期及び短期造血幹細胞に限られ、多能性造血前駆細胞より下流の細胞は、分化に伴う細胞分裂能は有するものの、自己複製能は有しないとされている。移植治療等においては、移植受容者の体内で、移植された細胞が継続的に機能することが重要であり、そのためには、自己複製能を有する造血幹細胞を多く含む細胞が移植されることが重要である。
【００２５】
造血幹細胞の分化過程において、特定の細胞表面抗原の発現パターンが変動することが知られている。ＣＤ３４陽性細胞とは、ＣＤ（cluster of differentiation）３４抗原を細胞表面上に発現している細胞のことをいう。この抗原は造血幹細胞及び造血前駆細胞のマーカーであり、分化するに従って発現量が減少する。すなわち、ＣＤ３４陽性細胞とは、特別な限定がある場合を除き、造血幹細胞及び造血前駆細胞を含む細胞集団を意味する。また、ＣＤ３８陰性とは、ＣＤ３８抗原を細胞表面上に発現していないことをいう。この抗原は造血幹細胞が分化するに従って発現量が増大するため、未分化な造血幹細胞には通常発現していない。
【００２６】
ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞とは、細胞表面上に、ＣＤ３４抗原を発現しているが、ＣＤ３８抗原を発現していない細胞集団のことをいう。ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞はＣＤ３４陽性細胞よりも造血幹細胞の含有率が高い細胞集団である。
【００２７】
造血幹細胞にはヒエラルキーがあり、その造血維持能力により、短期造血幹細胞と長期造血幹細胞に分類される。短期造血幹細胞とは、in vitro又は１次移植では骨髄を再構築することができるが、２次移植ではこの能力を維持できない。一方で、長期造血幹細胞とは、２次移植においても骨髄を再構築する能力（長期骨髄再構築能）を有する造血幹細胞である。本発明では、特に言及しない限り、造血幹細胞とは、短期造血幹細胞、長期造血幹細胞を含む細胞集団のことをいう。
【００２８】
本発明において、造血幹細胞の「増幅」(Expansion)とは、通常生体外で、造血幹細胞を含む細胞集団に対してある処理を施すことで、当該細胞集団に含まれる造血幹細胞数が増加することを意味する。このような造血幹細胞の増幅は、当該細胞集団に含まれる少なくとも一部の造血幹細胞から同一の性質を有する造血幹細胞の自己複製が誘導されることなどにより達成されうる。造血幹細胞は、生体内において自己複製することが知られているが、この自己複製を誘導する特定の因子は同定されておらず、生体外において造血幹細胞を生体内と同様の自己複製を誘導し、増幅することは困難であった。造血幹細胞は、分化に従い下流の細胞へと変換されていくため、自己複製し、増幅しなければ、同種の細胞は減少、又は、消失する。しかしながら、本発明の増幅誘導剤により、造血幹細胞を増幅させることが可能となり、生体外においても、造血幹細胞の細胞数を一定以上に維持、又は、増加させることができる。
【００２９】
造血幹細胞の自己複製は、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性の細胞数の増加を指標として測定することができる。生体内での自己複製は、細胞を動物に移植し、一定期間経過後に、当該動物から採取した骨髄中に含まれる移植に由来するＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞数を測定することで確認することができる。
【００３０】
生体外においては、ある処理の前に比べて、処理後において、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性の細胞数が増加した場合、造血幹細胞の自己複製が誘導されたとみなすことができるが、さらに公知の方法によって造血幹細胞の多分化能を調べたり、得られた細胞の少なくとも一部に対して同処理を繰り返し、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞数の変動を確認することにより、増幅した細胞の造血幹細胞としての機能を確認することができる。
【００３１】
造血幹細胞の分化の多能性は、得られた細胞（ＣＤ３４陽性細胞集団又は、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞集団）に対して、少なくとも２種類以上の異なる造血前駆細胞又はそれらから派生する血液細胞への分化誘導処理を施し、所望の造血前駆細胞又は血液細胞への分化を確認することで測定することができる。
【００３２】
ヒトの細胞の造血幹細胞としての機能を確認する方法には、免疫不全マウスへ移植する方法がよく用いられている。最近、ヒト造血幹細胞を移植するとほぼすべてのヒト成熟血液細胞を産生することができる免疫不全マウス（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/Jic ：以下、「ＮＯＧマウス」、Blood (2012), 100(9):113-1124）を公益財団法人実験動物中央研究所が開発した。対象となる細胞又は組織をこのマウスに移植することにより、移植された細胞の骨髄への移行・生着能、多分化能、骨髄再構築能を測定することが可能である。さらに、一度移植が成立した免疫不全マウスの骨髄を採取し、別のNOGマウスに再度移植（２次移植）することによって、移植した細胞の自己複製能および長期骨髄再構築能の測定が可能である。この方法により、造血幹細胞としての機能が確認された細胞/組織は、実際の造血幹細胞移植への適用に適した細胞／組織であるといえる。
【００３３】
造血前駆細胞には、多能性造血前駆細胞と単能性造血前駆細胞がある。多能性造血前駆細胞とは、全ての血液細胞に分化できる多分化能を有した細胞であるが、自己複製できない細胞である。このため、血液細胞を一時的に産生することができるが、細胞が全て分化してしまうと造血前駆細胞が枯渇してしまい、破壊された骨髄を再構築することができない。
【００３４】
単能性造血前駆細胞とは、特定の、単一又は複数の血液細胞に分化できるが、自己複製能を持たない細胞である。例えば単能性造血前駆細胞には、顆粒球・マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、赤芽球系前駆細胞である赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）及び混合コロニー形成細胞（ＣＦＵ-Ｍｉｘ）などがある。
【００３５】
機能的な方法による造血前駆細胞の測定法としてコロニー法（例えば、Ueda T. et al, J.Clin. Invest. (2000) 105:101013-1021）が古くから用いられている。コロニー法により測定される最も未熟なコロニーは赤血球と白血球が混在した混合コロニー（以下、CFU-Mix と略称する）である。造血前駆細胞には自己複製作用がないことから、例えば、CFU-Mix が対照群に比し増加しているというように、コロニー法において造血前駆細胞の増加が確認された場合、造血幹細胞に作用し、造血前駆細胞を増加させたことを示すことになる。
【００３６】
本発明において、成熟血液細胞とは、造血幹細胞から造血前駆細胞を経て形成される成熟した細胞集団のことをいう。赤血球、好中球、単球、好酸球、好塩基球、マクロファージ、血小板、マスト細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞などがあり、造血幹細胞又は当該成熟血液細胞の上流に位置する造血前駆細胞を分化させて得ることができる。また、これら成熟血液細胞は、公知の方法を用いて細胞に発現している特異的なマーカーによって判別することができる。例えば、単球、マクロファージ及び顆粒球系のマーカーとしてＣＤ３３、巨核球系・血小板マーカーとしてＣＤ４１、赤血球系マーカーとしてＣＤ２３５ａ、Ｂ細胞系マーカーとしてＣＤ１９、Ｔ細胞系マーカーとしてＣＤ３などが知られている。
【００３７】
＜ＨＤＧＦ物質＞
本発明においてＨＤＧＦ物質とは、配列番号１に示されるヒトＨＤＧＦa（ｈＨＤＧＦa）のアミノ酸配列と一定以上の配列類似性を有するポリペプチド（以下、「ＨＤＧＦペプチド」）を含み、且つ、造血幹細胞の増幅を誘導する活性を有する物質である。ＨＤＧＦ物質におけるＨＤＧＦaのアミノ酸配列との配列類似性は、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく、９０％以上であることがよりさらに好ましく、９５％以上であることが最も好ましい。ＨＤＧＦペプチドには、ｈＨＤＧＦaの他、その類縁体であって、造血幹細胞の増幅を誘導する活性を有するポリペプチドが含まれる。また、ＨＤＧＦ物質には、ＨＤＧＦペプチド自体、その修飾体などが含まれる。
【００３８】
ｈＨＤＧＦaとは、２４０アミノ酸からなるタンパク質（アミノ酸配列を配列番号１、それをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号２に示す）であり、ヘパリン結合能を有し、線維芽細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞、胎生期肝細胞等の多様な細胞の増殖を刺激する活性を有することが知られている。そのアミノ酸配列において、Ｎ末端側の１位〜１００位の領域であるＨＡＴＨ（homologus to amino-terminus HDGF）ドメインは、ヘパリン結合に関与していると考えられており、全てのＨＲＰ（HDGF-related protein）ファミリータンパク質において保存されている。このＨＡＴＨドメインには、ＰＷＷＰモチーフ（２４位〜２７位）及びＮＬＳ（nuclear localization signal）配列（７５位〜８０位）が含まれる。また、配列番号１のアミノ酸配列において、１５５位〜１７０位の領域は、bipartite NLS配列と呼ばれる。ＰＷＷＰモチーフは、分化・増殖に関与する核タンパク質に多く見られる構造であり、タンパク質―タンパク質相互作用に関与すると考えられている。NLS配列とbipartite NLS配列は、タンパク質の核移行に関与する配列と考えられている。また、天然のｈＨＤＧＦには、ｈＨＤＧＦａとは別に２つのアイソフォーム（ｈＨＤＧＦｂ（配列番号３）及びｈＨＤＧＦｃ（配列番号４）が存在するが、配列番号１の１位〜２９位は、ｈＨＤＧＦａに特異的な配列であり、３０位〜２４０位の領域は全てのアイソフォームにおいて共通した配列である。すなわち、ＨＡＴＨドメインにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の３０位〜１００位の領域は、特に保存された配列である。
【００３９】
本発明においてｈＨＤＧＦａの類縁体としては、(a)配列番号１に示されるアミノ酸配列と６０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）のアミノ酸配列類似性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド、(b)配列番号１に示されるアミノ酸配列において１又は複数個（好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下、さらにより好ましくは１個、２個又は３個）のアミノ酸が１箇所又は数箇所（好ましくは５箇所以下、より好ましくは３箇所以下、さらに好ましくは２箇所以下、さらにより好ましくは１箇所）で欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、(c)配列番号２に示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとの間で、ストリンジェントな条件下においてハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドを挙げることができ、これらの類縁体であって、造血幹細胞の増幅を誘導する活性を有するポリペプチドは、本発明のＨＤＧＦペプチドとして用いることができる。
【００４０】
本発明のＨＤＧＦペプチドとして用いられるｈＨＤＧＦａ類縁体において、配列番号１のアミノ酸配列から変更される部位としては、特に限定されないが、上述したｈＨＤＧＦａの機能に関与すると考えられるドメイン、モチーフ等が保存されることが好ましい。このような類縁体としては、配列番号１のアミノ酸配列において、３０位〜１００位の領域、及び、１５５位〜１７０位に相当するアミノ酸配列（より好ましくは３０位〜２０８位に想到するアミノ酸配列）が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは１００％、の配列同一性で保存されており、それ以外の領域においてアミノ酸配列が変更された類縁体を例示することができる。配列番号１のアミノ酸配列に対してアミノ酸が置換又は付加される場合、置換又は付加により追加されるアミノ酸は、自然界に存在するアミノ酸であってもよく、人工的に合成されたアミノ酸であっても良いが、好ましくは自然界に存在するアミノ酸である。また、アミノ酸の「置換」の場合には、元のアミノ酸と同様の性質を有するアミノ酸への置換が好ましく、その例としては例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換、などの置換が挙げられる。
【００４１】
本明細書の実施例７では、図１３に示すｈＨＤＧＦａの６種類のトランケイト体（Ｈ１−２０８：配列番号１の１位〜２０８位のアミノ酸配列、Ｈ３０−２４０：配列番号１の３０位〜２４０位のアミノ酸配列、Ｈ３０−２０８：配列番号１の３０位〜２０８位のアミノ酸配列、Ｈ４−２４０：配列番号１の４位〜２４０位のアミノ酸配列、Ｈ１−２３０：配列番号１の１位〜２３０位のアミノ酸配列、及び、Ｈ１−１５０：配列番号１の１位〜１５０位のアミノ酸配列）について、造血幹細胞に対する増幅活性を検討した結果、Ｈ１−１５０以外の全てにおいて増幅活性を保持することが確認された。このことから、ｈＨＤＧＦａの増幅活性において重要な領域は、配列番号１の３０位〜２０８位のアミノ酸配列であることが示唆されたことから、ｈＨＤＧＦａの類縁体は、当該領域の配列相同性が高く保存されているものが好ましく、より好ましくは当該領域のアミノ酸配列が８０％以上保存されたもの、さらに好ましくは当該領域のアミノ酸配列が９０％以上保存されたものであり、さらにより好ましくは当該領域のアミノ酸配列が９５％以上保存されたものであり、最も好ましくは当該領域のアミノ酸配列が完全に保存されているものである。本発明のＨＤＧＦ類縁体として好ましいものは、配列番号１の３０位〜２０８位のアミノ酸配列を含む物質であり、さらに好ましくは、配列番号１の１位〜２０８位のアミノ酸配列、３０位〜２４０位のアミノ酸配列、３０位〜２０８位のアミノ酸配列、４位〜２４０位のアミノ酸配列、又は、１位〜２３０位のアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００４２】
本発明で用いられるＨＤＧＦペプチドの産生元は、特に限定されず、例えば、ＨＤＧＦペプチドを発現する細胞の培養上清または抽出物、或いは公知の遺伝子組換えの手法により産生されたものなどを採用することができる。具体的には、ＨＤＧＦペプチドをコードする遺伝子を、大腸菌や酵母のような微生物、又は、昆虫細胞や動物細胞において遺伝子導入・発現させた遺伝子産物、或いは、コムギ胚芽等の無細胞系において遺伝子導入・発現させた遺伝子産物から分離したペプチドなどを用いることができる。本発明で用いるＨＤＧＦペプチドは、糖鎖の有無に関わらず用いることができる。糖鎖を有するＨＤＧＦペプチドは、例えばＣＨＯ細胞のような動物細胞において発現させることで作製することができる。また、糖鎖を有しないペプチドは、大腸菌に発現させることで作製できる。
【００４３】
本発明で用いるＨＤＧＦペプチドは、天然に存在するペプチドであっても良く、天然のＨＤＧＦペプチドａの構造を元に人工的にデザインされたペプチドであっても良い。天然に存在するＨＤＧＦペプチドとしては、ヒト由来のｈＨＤＧＦａ、ｈＨＤＧＦｂ、ｈＨＤＧＦｃに限定されず、たとえばマウス（配列番号５）、ウシＨＤＧＦ（配列番号６）、ブタＨＤＧＦ（配列番号７）、ニワトリＨＤＧＦ（配列番号８）、ヤギＨＤＧＦ（配列番号９）、ヒツジＨＤＧＦ（配列番号１０）など、他の動物に由来するものであってもよい。しかし、ヒト又はヒト由来の細胞に使用する場合には、ヒト由来のＨＤＧＦペプチド またはヒトＨＤＧＦペプチドの構造を一部改変したペプチドを用いることが好ましい。
【００４４】
本発明のＨＤＧＦ物質には、ＨＤＧＦペプチドの修飾体を含む。本発明において、ＨＤＧＦペプチドの修飾体とは、当該ペプチドに含まれるアミノ酸の一部が化学修飾を受けることにより、ＨＤＧＦペプチドのアミノ酸配列を含み、それ以外の化学構造が付加された物質であり、且つ、造血幹細胞の増幅を誘導する活性を有する物質を意味する。このような修飾体としては、ＨＤＧＦペプチドを含む融合タンパク質、低分子又は高分子化合物のコンジュゲート体などを挙げることができる。
【００４５】
本発明において、ＨＤＧＦペプチドの修飾体が、ＨＤＧＦペプチドを含む融合タンパク質である場合、ＨＤＧＦペプチド部分のみが配列番号１のアミノ酸配列と所望の配列相同性を保持すればよく、付加ペプチド部分は、当該配列相同性において考慮されない。付加ペプチドとしては、修飾体が所望の活性を保持する限り、どのようなものを選択しても良いが、通常、付加ペプチド自身が生物活性を有しないものである。付加ペプチドの代表的なものとしては、ＩｇＧ又はそのＦｃ断片、アルブミン等を挙げることができる。ＨＤＧＦの融合タンパク質において、付加ペプチドは、ＨＤＧＦペプチドのＮ末端、Ｃ末端又はそれらの両方に付加していても良い。
【００４６】
本発明において、ＨＤＧＦペプチドの修飾体が、化合物の付加により修飾されている場合、当該付加する化合物は、修飾の目的に応じて所望の性質のものを適宜選択することができる。例えば、ペプチドの血中半減期を延長する場合、ポリエチレングリコールや糖類のような水溶性高分子を選択することができる。ＨＤＧＦペプチドがプロテアーゼによる分解を受ける場合、当該切断を受ける部位のアミノ酸に対して低分子化合物による修飾を加えることで、分解に対する耐性を付与することができる。ＨＤＧＦペプチド中の修飾されるアミノ酸としては、所望の機能を保持する限り特に限定されないが、上述したＨＤＧＦａの機能に関与すると考えられるドメイン、モチーフ等に対応する領域以外のアミノ酸が修飾されることが好ましい。このような修飾体としては、配列番号１のアミノ酸配列において、３０位〜１００位の領域、及び、１５５位〜１７０位の領域に相当する領域以外のアミノ酸が修飾されていることが好ましく、より好ましくはＮ末端、Ｃ末端、又は、その両方である。
【００４７】
＜生体外における使用＞
本発明の一態様として、本発明の増幅誘導剤を、生体外において造血幹細胞と接触させることを特徴とする、造血幹細胞を増幅させる方法、当該増幅方法を含む、増幅された造血幹細胞含有生物材料の製造方法、当該製造方法により製造された造血幹細胞含有生物材料など、を提供する。このような方法及び生物材料は、造血幹細胞の移植治療又は再生医療を進める上で、非常に有効である。
【００４８】
このような、生体外での増幅に使用される場合、本発明の増幅誘導剤は、少なくとも一種類のＨＤＧＦ物質を組成の一部に含有する試薬、添加剤、培地等、又は、ＨＤＧＦ物質が表面に固定化された培養容器等の基材など、研究、培養又は製造の現場に応じた様々な形態で提供されうる。造血幹細胞を増幅させる際の培養における培地中のＨＤＧＦ物質の濃度としては、造血幹細胞の増幅が誘導される濃度であれば特に限定されず、様々な濃度を採用することができる。ＨＤＧＦ物質濃度の下限として、好ましくは、約０．１ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは約１ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ以上である。また、ＨＤＧＦ物質濃度の上限として、好ましくは約１０００ｎｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは約５００ｎｇ／ｍＬ以下である。
【００４９】
このような増幅における培養条件は、培地中にＨＤＧＦ物質を含むことを除き、通常の造血幹細胞の培養条件を適用できる。
【００５０】
本発明の方法に用いる培地は、通常の細胞培養に用いられる培地や造血細胞の培養のために調製された培地など、特に限定されずに利用することができる。一般的な細胞培養に用いられる培地の代表的なものとしては、ＩＭＥＭ（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）、αＭＥＭ（alpha Modified Eagle's Minimum Essential Medium）、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、ハムＦ１２培地（Ham's Nutrient Mixture F12）、マッコイ５Ａ培地（McCoy's 5A Medium）、ＥＭＥＭ（Eagle's Minimum Essential Medium）、ＲＰＭＩ１６４０培地などを例示することができる。また、造血細胞の培養に適した無血清培地の代表的なものとしては、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ （シグマアルドリッチ社製）、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ ＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ロンザ社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ロンザ社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ ２０（ロンザ社製）、ＨＰＧＭ（ロンザ社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、などを例示することができる。また、目的に応じて、無血清条件で培養しても良く、ＦＢＳのような血清又は、Knockout Serum Replacement(Gibco社）のような血清代替物を添加した条件を採用しても良い。
【００５１】
造血幹細胞の増幅のための培養期間としては、特に限定されない。培養時間の下限としては、１時間以上、好ましくは約５時間以上、より好ましくは約１２時間以上、さらに好ましくは約２４時間以上、さらにより好ましくは約４８時間以上である。上限としては、約１５日以下、好ましくは約１２日以下、より好ましくは約１０日以下、さらにより好ましくは約７日以下である。
【００５２】
本発明の増幅誘導方法には、ＨＤＧＦ物質を単独で用いることができるが、増幅誘導効率を向上させる観点から造血幹細胞の増殖及び／又は分化を促進する働きを有する種々のサイトカイン、増殖因子、化学物質、タンパク、ペプチド、抗体などの成分が共存していてもよい。本発明においてＨＤＧＦ物質と共存させるサイトカインの例としては、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、ＩＬ−３７、ＩＬ−３８、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５または７（Ａｎｇｐｔ２、３、５、７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、flk-2／flt-3 リガンド（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体複合体、あるいは、ＩＬ−６と可溶性ＩＬ−６受容体との融合タンパク（Ｈｙｐｅｒ  ＩＬ−６）等があるが、これらに限定されるわけではない。また、遺伝子組換え技術によりこれらのサイトカインのアミノ酸配列を人為的に改変されたものを共存させることもできる。上記のサイトカインの中で好ましくは、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）などが挙げられ、より好ましくは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）が挙げられる。サイトカインを培養時に共存させた際の培地中の濃度の下限としては、好ましくは約０．１ｎｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは約１ｎｇ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬ以上である。また、培地中の濃度の上限としては、約１０００ｎｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは約５００ｎｇ／ｍＬ以下である。
【００５３】
また、本発明においてＨＤＧＦ物質と共存させることができる化学物質の例としては、ハイドロカーボンアンタゴ二スト、銅キレート剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ＤＮＡメチル化阻害剤、レチノイン酸受容体阻害剤、アルデヒド脱水素酵素阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害剤、プロスタグランジンＥ２、トロンボポエチン受容体作動薬であるエルトロンボパグ(Eltronbopag)などが挙げられる。その他、上記サイトカインの受容体に結合しアゴニストおよびアンタゴ二スト作用を示す化学物質、タンパク、ペプチド、抗体等を用いることもできる。以上の化学物質あるいはサイトカインは、培地中に添加するだけでなく、培養容器の基板や担体表面上に固定化しても良い。
【００５４】
本発明の増幅方法に用いられる造血幹細胞は、その由来を特に限定されず、様々な由来の細胞を採用することができる。造血幹細胞の由来としては、例えば、骨髄、臍帯血、又は末梢血などの生体組織に由来するもの、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞から血液細胞への分化誘導の過程で出現する造血幹細胞を含む細胞培養物などが挙げられる。特に、造血幹細胞移植を目的とする場合には、増幅前に、造血幹細胞に障害や異常が無いことが確認されていることが好ましい。これらの組織又は試料をそのまま本発明の増幅方法に適用してもよく、造血幹細胞が豊富に含まれる細胞集団を選択して適用することもできる。このような細胞集団は、常法に従い、例えば、細胞表面の抗原を指標として、ＣＤ３４陽性細胞又はＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞を、磁気ビーズ又はセルソーターなどを用いて分取することで選択することができる。
【００５５】
造血幹細胞を含んだ造血幹細胞ソース（骨髄細胞、臍帯血、末梢血）をＨＤＧＦ物質存在下、またはＨＤＧＦ物質とサイトカインの共存下で培養した結果、ＨＤＧＦ物質やサイトカインに反応しない細胞や死細胞が多く存在している場合、総細胞数が培養前に比較して増加しないことがある。このような場合であっても、ＣＤ３４陽性細胞又はＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の細胞数が増加していれば、造血幹細胞が増幅したことを示すこととなる。
【００５６】
本発明において増幅誘導後の細胞集団は、培養中の造血幹細胞の自己複製で生じた造血幹細胞、造血前駆細胞、及び／又は、成熟血液細胞を含む細胞集団である。ここで含まれる造血前駆細胞及び成熟血液細胞は、造血幹細胞ソースに混入していた細胞、または、造血幹細胞の分化で生じた細胞が含まれうる。
【００５７】
本発明の増幅誘導剤を用いて培養した後の細胞集団は、増幅した造血幹細胞と分化した造血幹細胞が混在した細胞集団となる。造血幹細胞が、培養前に比較して増幅することは、必ずしもこれらの細胞数が増加することを意味するものではなく、当該造血幹細胞に由来する細胞の数が増加することである。培養液中の造血幹細胞の分化が進行し、造血前駆細胞や成熟血液細胞等へ変換されることによって、造血幹細胞の細胞数が、維持又は減少する場合があるが、このような場合であっても、造血幹細胞が増幅されなければ、造血幹細胞はいずれ消失することになる。そのため、造血幹細胞自体が継続的に存在し続けることは、造血幹細胞が増幅したことを示すものである。
【００５８】
また、本発明において増幅された造血幹細胞は、実施例において２次移植においても骨髄再構築能を有しており、本発明の増幅誘導剤により造血幹細胞移植に適切な性質を有する細胞が増幅されることが確認された。本発明の増幅誘導剤を用いて、臍帯血等の幹細胞ソース中に移植に適切な造血幹細胞を含むか否かを判定し、移植に適した幹細胞ソースであることを予め確認することが可能となる。
【００５９】
本発明の方法により増幅された造血幹細胞は、移植用細胞として用いることができる。該造血幹細胞は長期骨髄再構築能を有する長期造血幹細胞を含むため、細胞移植治療用の材料として提供することができる。移植用細胞は、そのまま移植しても良いし、細胞表面の抗原を指標として、磁気ビーズ又はセルソーターなどを用いて分取した後、移植してもよい。また、増幅した造血幹細胞は、造血幹細胞ソースと同一の個体に移植しても良いし、別の個体に移植しても良い。すなわち、本発明の方法により増幅された造血幹細胞は、従来の骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血移植と同様に治療用の移植片として用いることができる。例えば、対象がヒトの場合、大量化学療法を受ける固形癌患者、放射線療法等により骨髄抑制が予想される患者において、施術前に骨髄又は末梢血を採取しておき、そこに含まれる造血幹細胞を生体外で増幅させ、施術後に患者に戻すことによって、造血障害を早期に回復させることができる。
【００６０】
また、本発明は、細胞を含む生物材料の少なくとも一部をＨＤＧＦ物質存在下で培養する工程、及び、当該培養細胞中の造血幹細胞の増幅を確認する工程を含む、造血幹細胞含有生物材料の同定方法を提供する。造血幹細胞は、ＣＤ３４陽性細胞、特にＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性細胞の細胞集団に多く含まれるが、これらの細胞表面マーカーはあくまでも指標であり、実際に造血幹細胞として機能することは、その多分化能と自己複製能を確認しなければ、造血幹細胞として確定することができない。特に自己複製能は、骨髄の再構築に必須であり、造血幹細胞移植に用いる上で重要な特性である。例えば、多能性造血前駆細胞では、多分化能は保持していても自己複製できないため、一時的な造血能の回復は認めても、長期的には造血障害が再発することとなる。本発明の増幅誘導剤は、造血幹細胞の自己複製を誘導することで、造血幹細胞を増幅させるため、細胞の有する自己複製能を確認するための試薬としても有用である。また、本明細書の実施例において、ＨＤＧＦ物質処理によりＣＤ３４陽性細胞の増幅が確認された細胞が、NOGマウスを用いた造血幹細胞移植試験において、二次移植でも骨髄を再構築したことから、長期造血幹細胞であることが確認された。
【００６１】
また、造血幹細胞は全ての血液細胞へ分化することが可能であるため、造血幹細胞を生体外で各種造血前駆細胞や種々の成熟血液細胞に分化させた後、これらの造血前駆細胞や成熟血液細胞の補充が必要な患者に移植することができる。これにより、特定の成熟血液細胞が欠乏している患者の造血障害の改善を図ることができる。 すなわち、本発明は、本発明の増幅誘導剤を用いて生体外において増幅された造血幹細胞に対して、分化誘導を施す工程を含む、造血前駆細胞又は成熟血液細胞の製造方法、当該方法により製造された造血前駆細胞又は成熟血液細胞を含有する生物材料など、を提供する。造血前駆細胞及び成熟血液細胞は、自己複製能を有しないため、従来の移植治療においては、必要量を生体内から採取する必要があったが、本発明においてその上流にある造血幹細胞を生体外で増幅させることが可能となったため、少量の造血幹細胞ソースから、所望の造血前駆細胞又は成熟血液細胞の必要量を、生体外で作製することが可能となる。具体的には、当該因子により増幅させた造血幹細胞をＳＣＦ，ＦＬ，ＴＰＯ等の因子および支持細胞存在下において培養して分化を誘導することにより造血前駆細胞を取得できる。さらに、誘導した造血前駆細胞培養系に各種血球への成熟に必須の因子を添加することにより血液細胞を取得できる。添加する因子は、顆粒球ではＧ−ＣＳＦ、赤血球ではＥＰＯ、血小板ではＴＰＯなどである。また、ＩＬ−６やＩＬ−１１等の増強因子を添加することによりその作用を増強することもできる
【００６２】
＜治療対象＞
本発明の造血幹細胞増幅誘導剤を利用した治療（作製された細胞を用いた移植治療又は、増幅誘導剤を医薬として生体へ投与する治療）の対象としては、例えば、造血障害又は造血細胞や血液細胞の機能低下もしくは機能障害のために生じる症状を呈する疾患に罹患した個体、何らかの疾患の治療の結果前記症状を呈する個体などが挙げられる。このような疾患としては、例えば、造血機能障害を伴う疾患、造血機能低下を伴う疾患、造血細胞減少を伴う疾患、造血細胞増大を伴う疾患、免疫細胞減少を伴う疾患、免疫細胞増大を伴う疾患、自己免疫を伴う疾患などが挙げられる。
【００６３】
具体的な疾患としては、例えば、白血病、骨髄増殖性疾患、悪性リンパ腫、形質細胞性腫瘍、固形腫瘍、再生不良性貧血、赤芽球癆PRCA、発作性夜間ヘモグロビン尿症PNH、先天性代謝異常、慢性活動性EBV感染症、血球貪食症候群HPS、先天性造血障害、Ｆａｎｃｏｎｉ症候群、慢性肝障害、腎不全、重症感染症、骨髄障害性血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＳＴＥ、蛇咬症、溶血性尿毒症性症候群、脾機能亢進症、Ｂａｒｎａｒｄ−Ｓｏｕｌｉｅｒ症候群、Ｇｌａｎｚｍａｎｎ’ｓ血小板無力症、尿毒症、慢性肉芽腫症、重症複合型免疫不全症候群、アデノシンデアミナ−ゼ（ＡＤＡ）欠損症、無ガンマグロブリン血症、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、Ｃｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）等の免疫不全症候群、Ｃ３欠損症、サラセミア、酵素欠損による溶血性貧血、鎌状赤血球症等の先天性貧血、Ｇａｕｃｈｅｒ病、ムコ多糖症等のリソゾーム蓄積症、副腎白質変性症などが挙げられる。
【００６４】
白血病としては、例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、成人Ｔ細胞性ＡＴＬ、慢性リンパ性白血病などが挙げられ、悪性リンパ腫としては、例えば、濾胞性リンパ腫、アグレッシブリンパ腫、ホジキンリンパ腫などが挙げられ、形質細胞性腫瘍としては、例えば、多発性骨髄腫などが挙げられる。
また、手術時若しくは保存血の大量輸血患者、大量の出血を伴う患者、抗血小板抗体を有する患者に対して、細胞移植又は造血幹細胞増幅誘導剤の生体内への投与を行うことで、不足した血液細胞を補充することができる。特定の血液細胞が不足している場合には、本発明により増幅された造血幹細胞から所望の細胞へ分化誘導された血液細胞のみを移植しても良いが、長期間にわたって血液細胞の不足が懸念される状況では、造血幹細胞の移植又は造血幹細胞増幅誘導剤の生体への投与が好ましい。
【００６５】
また、このような症状・疾患に罹患していない個体から予め骨髄や末梢血を採取し、本発明の増幅方法により増幅された造血幹細胞を保存しておくことにより、実際に疾患に罹患した際、免疫拒絶の心配が無い、自己由来の細胞の移植を受けることが可能となる。
【００６６】
本発明により増幅される造血幹細胞は、遺伝子治療用の細胞として再生医療に用いることができる。遺伝子治療は、本発明の方法により増幅した造血幹細胞に治療用の遺伝子を導入する、又は、予め遺伝子を導入した造血幹細胞を増幅させることにより得られる、治療用遺伝子が導入され、且つ、増幅された造血幹細胞を、個体に移植することによって行われる。この際、導入される治療用の遺伝子は、対象となる疾患に応じて適切なものを選択すればよく、特に限定されないが、例えば、ホルモン、サイトカイン、受容体、酵素、ポリペプチドなどの遺伝子を例示することができる。造血幹細胞に対する遺伝子導入を利用した遺伝子治療は、先天性遺伝子疾患の治療に適用することができ、その事例としては、例えば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症に対するＡＤＡ遺伝子の導入（BlaeseRM et al. Science. 1995;270(5235):475-480）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（Ｘ−ＳＣＩＤ）におけるγc鎖遺伝子の導入（Hacen-Bay-Abina S et al., N Engl J Med. 2002;346:1185-1193）、慢性肉芽腫症（日本の患者の多くはgp91-phox欠損であり、この遺伝子を導入）、ゴーシェ病におけるグルコセレブロシダーゼ遺伝子の導入、血友病の治療などの治療を挙げることができる。その他、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、デコイＲＮＡ、リボザイムなど疾患遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ遺伝子も有効である。
【００６７】
＜医薬としての使用（生体内の使用）＞
別の態様において、本発明の増幅誘導剤は、ＨＤＧＦ物質を有効成分として含有する医薬として提供される。ＨＤＧＦ物質は、生体へ投与されることで、投与対象の体内に存在する造血幹細胞を増幅させることができるため、投与対象が保有する造血幹細胞の機能が正常であれば、それがＨＤＧＦ物質により増幅されることで造血障害等の症状を回復、緩和又は治療することができる。
【００６８】
本発明の医薬として使用される増幅誘導剤は、上述した治療対象における疾患・症状の治療又は軽減のために投与される。また、本発明の増幅誘導剤を、造血幹細胞移植を受けた患者に投与すると、移植造血幹細胞の生着を促し、赤血球、血小板、及び白血球を含む全ての血球の回復を促進する。さらに、制癌剤や放射線治療を受けた患者に本発明の増幅誘導剤を投与すると、早期の造血機能回復が期待できる。
【００６９】
１つの観点において、本発明は、造血機能低下又は造血機能障害のために生じる疾患の治療方法であって、少なくとも１種類のＨＤＧＦ物質を含む対象に投与することを含む。また別の観点において、本発明は、造血機能低下又は造血機能障害のために生じる疾患の治療薬の製造における、少なくとも１種類のＨＤＧＦ物質の使用に関する。さらに別の観点において、本発明は、造血機能低下又は造血機能障害のために生じる疾患の治療における、少なくとも１種類のＨＤＧＦ物質の使用に関する。さらにまた、本発明は、造血機能低下又は造血機能障害のために生じる疾患を治療するための医薬組成物であって、少なくとも１種類のＨＤＧＦ物質を含む医薬組成物に関する。
【００７０】
本発明の医薬において、増幅誘導剤は、様々なサイトカインや化学物質と併用して投与することができる。併用されるサイトカイン又は化学物質は、その症状、患者の年齢等により適宜選択することができる。これらのサイトカインや化学物質は、ＨＤＧＦ物質と同じ製剤内に配合されても良く、ＨＤＧＦ物質とは異なる製剤として、同時又は異なる時間に投与されても良い。このように、本発明の医薬と併用されるサイトカインとしては、例えば、好ましくは、ＨＤＧＦ物質による造血幹細胞の増幅作用を増強又は安定化させる作用を有するものが好ましく、例えばＳＣＦ、ｆｌｔ３L、ＴＰＯ、ＥＰＯ、ＩＬ−６等を例示することができる。
【００７１】
本発明の医薬の有効成分として用い得る物質は、上述したＨＤＧＦ物質の薬学的に許容される塩であってもよい。すなわち、本発明においては、上述したＨＤＧＦ物質の、無機酸、例えば塩酸、硫酸、リン酸、又は有機酸、例えばギ酸、酢酸、酪酸、コハク酸、クエン酸等の酸付加塩を、有効成分として使用することもできる。あるいは、本発明においては、上述したＨＤＧＦ物質の、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム等の金属塩、有機塩基による塩の形態を有効成分として使用することもできる。また、本発明に係る医薬組成物は、その有効成分に係る物質の遊離形としても、又はその薬学上に許容し得る塩であってもよい。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、ＨＤＧＦ物質またはその薬学上許容される塩を有効成分として含み、さらに通常の製剤化の際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤、希釈剤などを用いて調製される。製剤用の担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、オリーブ油、ゴマ油、カカオバター、エチレングリコールなどやその他常用されるものをあげることができる。
【００７３】
経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などが用いられる。このような固体組成物においては、少なくともひとつの有効成分が少なくともひとつの不活性な希釈剤、例えば、乳糖、マンニトール、ブドウ糖、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合される。組成物は、常法にしたがって不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、グルタミン酸又はアスパラギン酸のような溶解補助剤を含んでいてもよい。錠剤又は丸剤は、必要によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートなどの糖衣や胃溶性又は腸溶性物質のフィルムで被覆してもよいし、２つ以上の層で被覆してもよい。さらに、ゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも含まれる。
【００７４】
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤などを含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、エタノールなどを含んでいてもよい。この組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤などを含んでいてもよい。
【００７５】
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤が含まれる。水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、注射用水及び注射用生理食塩液が含まれる。非水性の溶液剤、懸濁剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベート８０（登録商標）などが含まれる。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、乳糖）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）などを含んでいてもよい。これらは、例えば、精密ろ過膜によるろ過滅菌、高圧蒸気滅菌のような加熱滅菌、あるいは、殺菌剤の配合などの通常の滅菌方法によって無菌化することが可能である。注射剤は溶液製剤であっても、使用前に溶解再構成するために凍結乾燥したものであってもよい。凍結乾燥のための賦形剤としては例えばマンニトール、ブドウ糖などの糖アルコールや糖類を使用することが出来る。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、医薬に一般に使用されている投与方法、例えば、経口投与方法、又は、経粘膜投与、静脈内投与、筋肉内投与もしくは皮下投与等の非経口投与方法によって投与するのが好ましい。有効成分が抗体やタンパク質である場合には通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。
【００７７】
有効成分がペプチド性物質の場合、消化管内で分解を受けにくい製剤、例えば活性成分であるペプチドをリボゾーム中に包容したマイクロカプセル剤として経口投与することも可能である。また、直腸、鼻内、舌下、経皮、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内などの消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法も可能である。この場合は坐剤、点鼻スプレー、吸入薬、舌下錠、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤といった形態で個体に投与することができる。
【００７８】
本発明に係る医薬組成物の有効成分として用い得る物質の投与量は、原疾患の種類、個体（対象）の年齢、体重、症状の程度及び投与経路などによっても異なるが、ヒトに注射投与して用いる場合にはＨＤＧＦ物質 のタンパク質量として、例えば、１日量の下限は約０．０００２μｇ／ｋｇであり、好ましくは約０．００２μｇ／ｋｇであり、より好ましくは約０．０２μｇ／ｋｇである。また、この場合の1日量の上限は、約２００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは約２０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは、約２ｍｇ／ｋｇである。
【００７９】
また、本発明の医薬組成物は、他の活性物質と併用又は同一薬剤中に配合してもよい。併用される他の活性物質としては、コロニー刺激因子、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキンまたはサイトカイン受容体アゴニストもしくはアンタゴニスト、可溶性受容体、受容体アゴニストもしくはアンタゴニスト抗体、あるいは１個またはそれ以上の前記作用物質と同じ機構で作用する化学物質及びペプチド等を例示することができる。
【００８０】
また、本発明の治療剤を遺伝子治療に用いる場合にはウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、更に好ましくはアデノウイルスベクター、又は化学合成リポソーム、ウイルスエンベロープ、若しくはウイルスエンベロープと合成リポソームの複合体等公知の遺伝子治療に適した媒体に、宿主細胞内で機能するようなプロモーター配列、例えばサイトメガロウイルスプロモーター(ＣＭＶ  ｐｒｏｐｏｔｅｒ)等、の下流に、ＨＤＧＦ物質ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を組み込んだものを用いることができる。ＨＤＧＦペプチドをコードする遺伝子としては、配列番号１乃至１０の何れかのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子を用いればよい。具体的な遺伝子治療の方法については、例えば、実験医学（１２巻，３０３頁，１９９４年）に記載の方法又はそれに引用されている文献の方法等を用いればよい。
【実施例】
【００８１】
以下、具体的な実験例により本発明を詳細に説明する。しかしながら、下記の実験例に示されたものは、本発明の実施形態の一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書において、特に記載しない限り、濃度などは重量基準であり、数値範囲はその端点を含むものとして記載される。また、本実施例において、ＨＤＧＦと記載する場合、特に言及が無い限り、ｈＨＤＧＦａを意味するものとする。【００８２】
＜実施例１＞  ヒトＣＤ３４陽性細胞の増幅試験
造血幹細胞を増幅させる因子を探索するため、様々な生物サンプルを用いて検討したところ、ＣＯＳ−１細胞にＲＥＬＡ（v-rel avian reticuloendotheliosis viral oncogene homolog A)遺伝子を導入した細胞培養上清に、ヒトＣＤ３４陽性細胞に対する強い増幅活性が認められた。その培養上清をクロマト精製して質量分析した結果、ｈＨＤＧＦａが活性本体である可能性が示唆された。【００８３】
ＨＤＧＦ物質の造血幹細胞に対する増幅活性を確かめるため、本実施例では、ＨＤＧＦ物質として、コムギ胚芽発現リコンビナントｈＨＤＧＦａタンパク質を用いて、ヒトＣＤ３４陽性細胞に対する増幅作用を確認した。【００８４】
精製ｈＨＤＧＦａは、ＧＳＴタグ付コムギ胚芽発現ｈＨＤＧＦａタンパク質（Abnova社、PreScissionプロテアーゼの切断認識配列を含む）溶液に、PreScissionプロテアーゼ（ＧＥヘルスケア社）を反応させて、得られた切断反応液をGSTrapカラム（ＧＥヘルスケア社）に通液し、切断されたＧＳＴタグ断片、PreScissionプロテアーゼとｈＨＤＧＦａを分離することによって調製した。【００８５】
ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞（ロンザ社）を２０％ＦＣＳ（GIBCO社）、１％ＢＳＡ（SIGMA社）含有αＭＥＭ（GIBCO社）培地を用いて、細胞製品に添付されたプロトコールに従い調製した。調製した細胞は上記培地に浮遊させ、４℃、７２時間以上保管した。その後、ｈＳＣＦ(最終濃度100 ng/ml、R&D社)、ｈＦｌｔ３−Ｌ(最終濃度100 ng/ml、R&D社)、ｈＩＬ−６(最終濃度10 ng/ml、R&D社)及びｈＧＭ−ＣＳＦ(最終濃度10 ng/ml、R&D社)を全て含有する上記培地を用いて1×104cells/0.9ml に調製し、４８ウェル培養プレート（ファルコン社）の各ウェルに270 μl 加えた。０．１％ＢＳＡ（SIGMA社）含有ＰＢＳ（−）（SIGMA社）を用いて各種濃度（0 ng/ml, 5 ng/ml, 50 ng/ml, 500 ng/ml, 5000ng/ml）に調製したｈＨＤＧＦａ溶液３０μｌを各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７日間培養した。培養後トリパンブルー（GIBCO社）染色し、血球計算盤で生細胞数をカウントした（図２）。その結果、ｈＨＤＧＦａは0.5 ng/ml〜500 ng/ml（最終濃度）の範囲において濃度依存的にＣＤ３４陽性細胞を増幅したことが判明した。【００８６】
＜実施例２＞  ＣＤ３４陽性細胞およびコロニー増幅アッセイ
ＨＤＧＦ物質として大腸菌発現リコンビナントｈＨＤＧＦａタンパク質を用いて、ＣＤ３４陽性細胞の増幅作用および造血前駆細胞コロニーの増幅作用を検討した。【００８７】
（１）大腸菌発現リコンビナントｈＨＤＧＦaタンパク質の調製
ｈＨＤＧＦａのｃＤＮＡをpTWIN1ベクター（ニュー・イングランド・バイオラボ社）に挿入した発現ベクター（pTWIN1-HDGF-Intein）で形質転換した大腸菌から、Intein-hHDGFa発現大腸菌を取得した。次に、Intein-hHDGFa発現大腸菌を培養した後、大腸菌を溶解し溶解液からChitin樹脂によりIntein-hHDGFaを捕捉して洗浄した後、ＤＴＴ存在下においてInteinタグを自己開裂させ精製リコンビナントｈＨＤＧＦａタンパク質を調製した。実験２および実験３においては、このように調製した精製リコンビナントｈＨＤＧＦａタンパク質をＨＤＧＦ物質として使用した。【００８８】
（２）ＣＤ３４陽性細胞増幅アッセイ
実験１と同様に調製したヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞（ロンザ社）を、無血清培地（StemPro-34, GIBCO社）によって1x10４ cells/ml の濃度の細胞浮遊液に調製し、４８ウェル培養プレート（ファルコン社）の各ウェルに300 μl 加えた。次に、ｈＨＤＧＦａ（最終濃度  25 ng/ml）、ｈＳＣＦ，ｈＦｌｔ３Ｌ（ＦＬ），ｈＴＰＯ（全て最終濃度  100 ng/ml 、R&D 社製）およびそれらの各組み合わせたものをそれぞれが最終濃度の１００倍になるように調整した混合液を作製し、３μl/ml添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件にてインキュベーターで培養した。培養７日後に細胞数を血球計算盤によりカウントし、一部をコロニーアッセイに供した。サンプルの添加量は全体の１／１００であるため、体積増加分を無視し、初期細胞濃度は1x10４ cells /mlとして初期ＣＤ３４陽性細胞（input）に対する培養後におけるＣＤ３４陽性細胞の増幅倍数を算出した。結果を図３に示す。【００８９】
サイトカイン非存在（None）、ｈＳＣＦ単独（Ｓ）、ｈＦＬ単独（Ｆ）、ｈＴＰＯ単独（Ｔ）、ｈＳＣＦ＋ｈＦＬ（ＳＦ）、ｈＳＣＦ＋ｈＴＰＯ（ＳＴ）、ｈＦＬ＋ｈＴＰＯ（ＦＴ）、ｈＳＣＦ＋ＦＬ＋ｈＴＰＯ（ＳＦＴ）、ｈＨＤＧＦ単独（Ｈ）、ｈＨＤＧＦａ＋ｈＳＣＦ（ＨＳ）、ｈＨＤＧＦａ＋ｈＦＬ（ＨＦ）、ｈＨＤＧＦａ＋ｈＴＰＯ（ＨＴ）、ｈＨＤＧＦａ＋ｈＳＣＦ＋ｈＦＬ（ＨＳＦ）、ｈＨＤＧＦａ＋ｈＳＣＦ＋ｈＴＰＯ（ＨＳＴ）、ｈＨＤＧＦａ＋ｈＦＬ＋ｈＴＰＯ（ＨＦＴ）、ｈＨＤＧＦａ＋ｈＳＣＦ＋ｈＦＬ＋ｈＴＰＯ（ＨＳＦＴ）の組み合わせによるヒトＣＤ３４陽性細胞の増幅に及ぼす影響を検討したところ、サイトカイン非存在下では、培養7日後においてＣＤ３４陽性細胞が検出されず、細胞の生存維持にはサイトカインが必要であることが確認された。また、各種サイトカインとその組み合わせではＣＤ３４陽性細胞の増幅が確認された。特に、ｈＨＤＧＦａについては、ＨＦ，ＨＴ，ＨＳ，ＨＳＦ，ＨＦＴ，ＨＳＴ，ＨＳＦＴの増幅倍数が、それぞれ対応するＦ，Ｔ，Ｓ，ＳＦ，ＦＴ，ＳＴ，ＳＦＴの増幅倍数より高かったことから、ｈＨＤＧＦａは、ＳＣＦ、ＦＬ，ＴＰＯのいずれか１種以上のサイトカインとの共存下でＣＤ３４陽性細胞の増幅を促進すると考えられる。【００９０】
（３）コロニー増幅アッセイ
次に、それぞれの条件で培養した細胞のコロニー形成能を検討するため、１．０％（最終濃度）メチルセルロース（stem cell technology社）、ｈＳＣＦ (100 ng/ml、R&D社)、ｈＧＭ−ＣＳＦ（100 ng/ml、R&D社）、ｈＴＰＯ(50 ng/ml、R&D社)、ｈＩＬ３(100 ng/ml、R&D社)、ｈＥＰＯ（5U/ml、協和発酵キリン社）、ｈＧ−ＣＳＦ (100 ng/ml、協和発酵キリン社)、３０％ＦＣＳ(HyClone社)、１％ＢＳＡ(SIGMA社)、及びＩＭＤＭ(Invitorogen社)を含むカクテルに、上記の細胞増幅アッセイにおける培養7日後の各ウェル（inputとしては培養前の初期細胞）から採取した細胞を播種し、ボルテックスで良く撹拌後、２０分間静置し、35 mm培養ディッシュ（ファルコン社）に1ml 入れて、５％  ＣＯ２、３７℃の条件でインキュベーターにおいて１７日間培養後、顕微鏡下で各コロニー数（CFU-Miｘ、BFU-E、CFU-GM）をカウントした。また、各群における全コロニー数に対するCFU-Mixの比率（以下、Ｍｉｘ率）を算出した。結果を表１に示す。【００９１】
コロニーアッセイにおいては、造血前駆細胞のコロニーとして最も未熟なCFU-Mix、より分化が進んだBFU-E及びCFU-GMの３種類が検出される。造血細胞の分化過程では、細胞分裂を伴って分化が進行するため、分化が進むほど細胞数やコロニー数が増加する。造血幹細胞を増幅させる因子の活性という観点では、分化を進行させてしまうことは造血幹細胞自体を減少させることとなり望ましくなく、造血幹細胞を増幅しつつも、できるだけ未熟な状態を維持することが重要である。そのため、Ｍｉｘ率が高いことが重要となる。【００９２】
表１の結果から明らかなように、培養前の初期細胞からは各種コロニーの形成が確認されたのに対して、サイトカイン非存在下で培養した細胞（None）では、コロニーが確認できなかった。このため、造血幹細胞や造血前駆細胞のようにコロニー形成能を有する細胞を維持するためには何らかのサイトカインが必要であることが確認された。サイトカインに関して、ＳＣＦやｈＦｌｔ３−Ｌの存在下で培養した細胞は、形成されるコロニー数は多いもののＭｉｘ率は高くなく、培養中に分化が進行するものと考えられる。一方で、ＨＤＧＦやＴＰＯの存在下で培養した場合、Ｍｉｘ率が高い傾向が見られた。ＨＤＧＦ単独では、コロニー形成数はあまり多くないもののＭｉｘ率が６０％と高かった。また、ＨＴ，ＨＳＴ，ＨＦＴ，ＨＳＦＴでは、Inputやそれぞれに対応するＴ，ＳＴ，ＦＴ，ＳＦＴに比し大幅にCFU-Mix 数が増幅し、Ｍｉｘ率も増加した。この結果は、CFU-Mixは自己複製能を有していないことから、ｈＨＤＧＦａはCFU-Mix より未熟な細胞である造血幹細胞および造血前駆細胞を増幅したことが示唆された。また、この実験では、ｈＴＰＯについてもｈＨＤＧＦａと類似の活性が認められ、特にそれらを共存させたＨＴではＭｉｘ率が７７％と非常に高かったため、以降の実施例ではｈＨＤＧＦａとｈＴＰＯの作用について検討を進めた。【００９３】
【表１】
2016167276.tif 000003
【００９４】
＜実施例３＞  造血幹細胞増幅率の測定
本実験では、ヒト臍帯血から分離した造血幹細胞に対する、ｈＨＤＧＦａ及びｈＴＰＯの増幅作用を検討した。【００９５】
（１）ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞の調製
インフォームドコンセントの得られた新鮮ヒト臍帯血にシリカ懸濁液（ＩＢＬ社）を１０％（Ｖ／Ｖ）になるよう加え緩やかに攪拌し３７℃にて約１時間インキュベーションした。比重１．０７７のlymphoprep（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ社）に重層後、１６００ｒｐｍで３０分間の比重遠心により単核球画分を得た。次に、Direct CD34 progenitor Cell Isolation Kit およびMACS Separation columns（ミルテニー社）を用いてＣＤ３４陽性細胞を取得した。【００９６】
（２）造血幹細胞の増幅と移植用細胞の調製
上記で取得したヒトＣＤ３４陽性細胞を無血清培地であるStemPro-34（GIBCO社）によって1x105 cells/ml の濃度に調製した。調製した細胞は一部を同培地で２倍希釈後無培養（uncultured:ＵＣ）群への移植用細胞浮遊液とした。残りの細胞浮遊液は、２４ウェルプレート（ファルコン社）に８００μl 加えた後、ＨＤＧＦ物質として実施例２で調製した大腸菌発現ｈＨＤＧＦａ（最終濃度２５０ng/ml）、ｈＴＰＯ（最終濃度１００ng/ml）又はその両方を加えた。ｈＨＤＧＦ単独添加群（Ｈ）は培養３日間、ｈＴＰＯ単独添加群（Ｔ）およびｈＴＰＯ＋ｈＨＤＧＦａ添加群（ＨＴ）は５日間、５％ＣＯ２、３７℃の条件にてインキュベーターで培養した。培養後、実験１と同様に細胞数をカウントした後、細胞をすべて回収し、同無血清培地で３回洗浄後、最終的に１．６ｍｌの無血清培地に浮遊させ、各培養群（Ｈ群、Ｔ群及びＨＴ群）への移植用細胞とした。調製後の細胞については、一部をフローサイトメーター（ミルテニー社、MACSQuant）による抗原解析に供した。調製した移植用細胞のヒトＣＤ３４及びヒトＣＤ３８の抗原解析結果を図４に、総細胞数及びヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞絶対数を表２に示す。Ｈ群およびＨＴ群では総細胞数はＵＣ群より少なかったが、ヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞数はＵＣ群より多かったため、造血幹細胞が増幅したと考えられる。【００９７】
【表２】
2016167276.tif 000004
【００９８】
（３）免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）への移植
免疫不全マウス（ＮＯＧマウス：公益財団法人実験動物中央研究所）に対して、４時間間隔で２回、ガンマセル40 イグザクターシステム（Best Theratronics社）を用いて、１回あたり１．２Ｇｙのγ線を照射し、骨髄を破壊した。２回目の照射後、上記で調製した移植用細胞浮遊液２００μｌを、各群（ＵＣ群、Ｈ群、Ｔ群及びＨＴ群：各群５匹）のマウスに尾静脈から投与した。投与した細胞数は培養前のヒトＣＤ３４陽性細胞換算で1x104 cells/マウスとした。【００９９】
（４）移植マウスにおけるヒト由来細胞の解析
移植２３週後に当該マウスを麻酔下において採血後、安楽死させ、左右の大腿骨から骨髄細胞を採取した。採取した骨髄細胞における各種ヒト血球細胞を検出するため、ヒトＣＤ４５抗体（Pacific Blue、バイオレジェンド）、マウスＣＤ４５抗体（FITC、バイオレジェンド）、ヒトＣＤ３抗体（APC、バイオレジェンド）、ヒトＣＤ１９抗体（PE-Cy5、バイオレジェンド）、ヒトＣＤ３３抗体（PE、バイオレジェンド）、ヒトＣＤ２３５ａ抗体（PE、バイオレジェンド）、ヒトＣＤ３４抗体（APC、バイオレジェンド）、ヒトＣＤ３８抗体（PE、バイオレジェンド）にて染色した。骨髄内赤血球の検出には、TER119抗体（APC、バイオレジェンド）、ヒトＣＤ２３５ａ抗体（FITC、バイオレジェンド）にて染色した。染色後、骨髄細胞はファームライス（BD社）で溶血し、０．５％ＢＳＡ（SIGMA社）含有ＰＢＳ（−）（SIGMA社）で洗浄した後、上記フローサイトメーターを用いて抗原解析を行った。末梢血については、ヒト血小板検出のためヒトＣＤ４１抗体（APC、バイオレジェンド）を用いて染色した後、ライジングソリューション（BD社）を用いて溶血・固定後、フローサイトメーターで測定した。ヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞のFACS解析結果を図５、図６及び表３に示す。【０１００】
（５）造血幹細胞の骨髄再構築能及び増幅の判定
骨髄再構築能の判定においては、移植された細胞に由来する各種血球が検出され、さらに造血幹細胞画分であるヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞が認められた場合に移植した細胞に骨髄再構築能を有する細胞が存在していたと判定した。また、造血幹細胞の増幅の判定は、移植２３週以上経過後のマウス骨髄において、各培養群におけるヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞数が、ＵＣ群のヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞の絶対数より増加していた場合に、増幅活性があったと判定した。また、造血幹細胞の増幅率は、各培養群のヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞の絶対数／ＵＣ群のヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞の絶対数、によって算出した。【０１０１】
骨髄再構築能の検討の結果、移植２３週間後においてＵＣ群およびＨＴ群ではすべてのマウスに、Ｈ群では４匹中２匹（飼育期間中に１匹死亡）に、ヒト由来のＴ細胞（ヒトＣＤ３陽性細胞）、Ｂ細胞（ヒトＣＤ１９陽性細胞）、顆粒球・単球（ヒトＣＤ３３陽性細胞）、赤芽球（ヒトＣＤ２３５ａ陽性ＣＤ４５陰性細胞）、赤血球（ヒトＣＤ２３５ａ陽性細胞）、血小板（ヒトＣＤ４１陽性）が検出され、多分化能が認められた。一方、Ｔ群ではすべてのマウスにおいて多分化能は認められなかった。【０１０２】
また、表３及び図６の結果より、骨髄細胞におけるヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞数の絶対数を算出したところ、ＵＣ群では0.51 x103 cells、Ｈ群では1.73x103cells、Ｔ群では０、ＨＴ群では2.14 x103 cellsであり、増幅率は、Ｈ群で約３．４倍、ＨＴ群で約４．２倍であったのに対し、Ｔ群では増幅は確認されなかった。以上から、ｈＴＰＯ単独培養ではヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性の造血幹細胞数が減少したが、ｈＨＤＧＦａが存在するｈＨＤＧＦａ単独培養及びｈＨＤＧＦａ＋ｈＴＰＯ共存下培養ではヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性の造血幹細胞数は増幅した。【０１０３】
この結果から、ＨＤＧＦ存在下で培養したヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞は、骨髄再構築能を有すること、及び、当該培養によって移植に耐えうる造血幹細胞が増幅されたことが確認された。【０１０４】
【表３】
2016167276.tif 000005
【０１０５】
＜実施例４＞  長期造血幹細胞増幅の検討
造血幹細胞には長期および短期造血幹細胞が存在し、臨床上最も重要な造血幹細胞は長期造血幹細胞である。そのため、ｈＨＤＧＦ及びｈＴＰＯ存在下で増幅させた造血幹細胞（以下、「ＨＴ増幅ヒト造血幹細胞」という）を二次移植することで、増幅された細胞における長期造血幹細胞の増幅について検討した。【０１０６】
（１）１次移植試験
１次移植は実施例３と同様の方法で、無培養群（ＵＣ群）及びｈＨＤＧＦａ+ｈＴＰＯ／５日間培養群（ＨＴ群）の２群で行った。調製した移植用細胞の抗原解析結果を図７及び表４に示す。ＨＴ群移植用細胞において、ＵＣ群移植用細胞と比較して、総細胞数は１．２５倍に、ヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞数は約３倍に増幅した。【０１０７】
【表４】
2016167276.tif 000006
【０１０８】
このように調製したＵＣ群移植用細胞及びＨＴ群移植用細胞を、放射線照射したＮＯＧマウス（各群８匹）に移植した。移植２４週間後において、各群のマウス大腿骨から骨髄細胞を採取し、半分を二次移植用細胞とし、残りの半分を解析に用いた。各群から採取した骨髄細胞をｈＣＤ４５、ｈＣＤ３３、ｈＣＤ１９、ｈＣＤ３、ｈＣＤ２３５ａ、ｍＣＤ４５、ｍＣＤ２３５ａに対する抗体により標識した。また、各群のマウスから末梢血を採取し、ｈＣＤ４１及びｍＣＤ４１に対する抗体を用いて標識した。【０１０９】
このように各種抗体で標識した細胞を、実験３（４）と同様の方法で、フローサイトメーターにより解析した。その結果を図８及び表５に示す。【０１１０】
【表５】
2016167276.tif 000007
【０１１１】
表５において、マウス骨髄細胞中の全白血球（ヒトCD45陽性細胞＋マウスCD45陽性細胞）におけるヒトＣＤ４５陽性細胞の割合（％ｈＣＤ４５＋）、ヒトＣＤ３３陽性細胞の割合（％ｈＣＤ３３＋）、ヒトＣＤ１９陽性細胞の割合（％ｈＣＤ１９＋）、ヒトＣＤ３陽性細胞の割合（％ｈＣＤ３＋）は、下記の式によって算出した。
・ヒトＣＤ４５陽性細胞の割合（％ｈＣＤ４５＋）
＝hCD45陽性細胞の割合数/(hCD45陽性細胞の割合  +  mCD45陽性細胞の割合)×１００
・ヒトＣＤ３３陽性細胞の割合（％ｈＣＤ３３＋）
＝hCD33陽性細胞の割合 /(hCD45陽性細胞の割合  +  mCD45陽性細胞の割合)×１００
・ヒトＣＤ１９陽性細胞の割合（％ｈＣＤ１９＋）
＝hCD19陽性細胞の割合/(hCD45陽性細胞の割合  +  mCD45陽性細胞の割合)×１００
・ヒトＣＤ３陽性細胞の割合（％ｈＣＤ３＋）
＝hCD3陽性細胞の割合/(hCD45陽性細胞の割合  +  mCD45陽性細胞の割合)×１００【０１１２】
また、％ヒト赤血球および％ヒト血小板は、下記の計算式によって算出した。各割合の算出には％Ｔ（Total）を用いた。
・マウス骨髄細胞中の全赤血球におけるヒト赤血球の割合（％ヒト赤血球）
＝ヒト赤血球の割合/(ヒト赤血球の割合  +  マウス赤血球の割合)×１００
・マウス末梢血中の全血小板におけるヒト血小板の割合（％ヒト血小板）
＝ヒト血小板の割合/(ヒト血小板の割合  +  マウス血小板の割合)×１００【０１１３】
ＨＴ群、ＵＣ群のすべてのマウスの骨髄細胞にヒトのＴ細胞（hCD3陽性細胞）、Ｂ細胞（hCD19陽性細胞）、顆粒球・単球（hCD33陽性細胞）、赤芽球（hCD235a陽性hCD45陰性細胞）、赤血球（hCD235a 陽性細胞）が検出された。また、末梢血を解析した結果、ヒト血小板(hCD41陽性）が検出された。すなわち、ＵＣ群、ＨＴ群ともに、一次移植では、全てのマウスにおいて、多分化能が認められた。【０１１４】
各群の骨髄細胞におけるヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞を解析した（結果を図９及び表６に示す）ところ、ＨＴ群、ＵＣ群のいずれのマウスの骨髄細胞にもヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞が存在していたが、ＨＴ群のヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞の増幅率の平均は約６倍であった。すなわち、ＨＤＧＦ及びＴＰＯの共存下で処理したヒト造血幹細胞は、未熟な状態のまま２４週間マウス骨髄中で生存し、且つ、増幅したことが再現された。【０１１５】
【表６】
2016167276.tif 000008
【０１１６】
（２）二次移植試験
上記一次移植２４週後のマウス骨髄から得た細胞の半分を、一次移植と同様にγ線照射したＮＯＧマウスに尾静脈より投与することによって、二次移植を実施した。ＵＣ群及びＨＴ群由来の骨髄細胞を二次移植した群を、それぞれＵＣ−２群及びＨＴ−２群とした。二次移植後２０週間以上経過したＮＯＧマウスの末梢血および骨髄細胞を上記同様に解析し、骨髄再構築能の判定、造血幹細胞増幅率の測定は実施例３と同様に行った。多分化能解析の結果を図１０及び表７に、造血幹細胞の増幅については図１１及び表８にそれぞれ示す。なお、表７の各項目は、上記（１）と同様にして算出した。【０１１７】
【表７】
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【０１１８】
多分化能解析の結果、ＵＣ−２群のすべてのマウスにおいてヒト造血細胞が認められたものの、特定の細胞が欠如した偏った造血を示すマウスがいるなど、すべてのマウスに多分化能は認められなかった。一方、ＨＴ−２群では全てのマウスにおいて各種ヒト血球が検出され、多分化能が確認された。【０１１９】
造血幹細胞画分であるヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞を解析した結果（図１１、表８）、ＵＣ−２群において検出できたのは５匹中３匹であったが、ＨＴ−２群ではすべてのマウスにおいて検出された。また表８より、ＵＣ−２群およびＨＴ−２群のヒトＣＤ３４陽性ヒトＣＤ３８陰性細胞の絶対数を比較したところ、その平均値はそれぞれ0.99x103 cells、30.27x103cells であり、両者において劇的な差が認められ、増幅率は約３０倍であった。この結果は、ＨＤＧＦ及びＴＰＯ存在下での培養により、二次移植においても骨髄再構築能を維持するヒト長期造血幹細胞が増幅したことを示す。【０１２０】
この実験では、一次移植と二次移植を合せてほぼ１年に亘る異種移植実験において、ＨＴ増幅ヒト造血幹細胞は１次移植のみならず２次移植においても骨髄を再構築できた。これは、増幅された細胞が長期造血能を有する長期造血幹細胞であり、臨床応用可能な造血幹細胞であることを示唆している。現時点において、長期造血幹細胞をこれほど増幅した例はない。【０１２１】
【表８】
2016167276.tif 000010
【０１２２】
＜実施例５＞  ヒト造血幹細胞移植マウスにおけるリコンビナントｈＨＤＧＦａタンパク質投与の影響
ＨＤＧＦ物質を投与した動物の体内における、造血幹細胞への作用を検討した。ＨＤＧＦ物質としては、動物細胞発現リコンビナントｈＨＤＧＦａタンパク質を用いた。【０１２３】
（１）動物細胞発現リコンビナントｈＨＤＧＦａタンパク質の調製
ｈＨＤＧＦａのｃＤＮＡをpEXPR-IBA17ベクター（IBA GmbH社）に挿入し、ｈＨＤＧＦａの発現ベクターを作製した。この発現ベクターをExpi293F細胞（ライフテクノロジーズ社）にトランスフェクションし、当該細胞製品に添付されたプロトコールに記載された条件下において培養し、Strep-tag II-ＨＤＧＦ発現培養上清を取得した。得られた培養上清を1 mol/L Tris-HClでpH 8.0にあわせ、培養上清に含まれるbiotinを卵白アビジンにより不活化し、StrepTrap HPカラム(ＧＥヘルスケア社)で補足して洗浄した後、2.5 mM D-desthibiotinを含むバッファーでStrep-tagII-ｈＨＤＧＦａタンパク質を溶出させた。【０１２４】
（２）ヒト造血幹細胞移植マウスへのｈＨＤＧＦａの投与およびその解析
ヒト臍帯血より分離したＣＤ３４陽性細胞を1x104cells/マウスの用量で、γ線照射したＮＯＧマウスに尾静脈より投与して移植し、各マウスの体重を測定後、各群の平均体重がほぼ同程度になるように４群に群分けした（１群あたり５匹）。移植翌日より連続５日間、マウス当たり１０μｇ、１μｇ、０．１μｇの用量のｈＨＤＧＦａ（０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳにより濃度調整、コントロール群には媒体のみ投与）を皮下投与した。移植４週間後に、麻酔下において当該マウスの尾静脈より採血し、ヒトＣＤ４５抗体（Pacific Blue、バイオレジェンド）、マウスＣＤ４５抗体（FITC、バイオレジェンド）、ヒトＣＤ３抗体（APC、バイオレジェンド）、ヒトＣＤ１９抗体（PE-Cy5、バイオレジェンド）、ヒトＣＤ３３抗体（PE、バイオレジェンド）、ヒトＣＤ４１抗体（APC、バイオレジェンド）によって染色した。染色後、ヒト白血球の検出には末梢血をファームライス（BD）で溶血し、０．５％ＢＳＡ（SIGMA）・２ｍＭ ＥＤＴＡ(GIBCO社)含有ＰＢＳ（−）（SIGMA）溶液で1回洗浄した。洗浄後０．４５μｍのメッシュ（Falcon）を通し、フローサイトメーター（ミルテニー社、MACSQuant）を用いて抗原解析を行った。マウス末梢血の全白血球におけるヒトＣＤ４５陽性細胞の割合（キメラ率）はｈＣＤ４５の割合／(ｈＣＤ４５の割合＋ｍＣＤ４５の割合)×１００によって求めた。血小板の検出には、末梢血にLysing Solution（BD社）を加え約1時間固定後、FACS Buffer で１回洗浄し、０．４５μｍのメッシュ（ファルコン社）を通した後、フローサイトメーター（ミルテニー社、MACSQuant）を用いて解析した。結果を図１２及び表９に示す。【０１２５】
移植４週間後における各群マウス末梢血中のヒトＣＤ４５陽性細胞（白血球）の割合（キメラ率）および各種ヒト血球の検出をフローサイトメトリーにより測定した結果、コントロール群のキメラ率は1.77％であったのに対し、ＨＤＧＦ投与群においては、0.1 μg群では3.14％（コントロール群の1.77倍）、1μg群では2.75％（コントロール群の1.55倍）、10μg群では3.56％（コントロール群の2.01倍）であった。また、コントロール群では５匹中２匹に、0.1μg群では５匹中５匹、１μg群では５匹中４匹、10μg群では５匹中５匹に、ヒト血小板が検出された。今回ＨＤＧＦ物質を投与した全てのマウスにおいてヒト白血球の早期回復が認められた。また、血小板の早期回復についても、投与群全てにおいて、コントロール群に比較して、良好な結果が認められた。これは、ＨＤＧＦ物質の投与が移植初期の造血回復に寄与することを示唆している。【０１２６】
【表９】
2016167276.tif 000011
【０１２７】
＜実施例６＞  ＨＤＧＦ＋ＴＰＯ存在下培養期間の検討
実施例３において示された、ＨＤＧＦ＋ＴＰＯ存在下で増幅させたＣＤ３４陽性細胞の骨髄再構築作用について、ＨＤＧＦ＋ＴＰＯ存在下の培養期間による影響を検討した。【０１２８】
（１）実験方法
移植用細胞は、実施例３（１）及び（２）と同様に調製した。ＨＤＧＦの最終濃度は、100μｇ／ｍｌを採用し、ＨＤＧＦ及びＴＰＯ添加後の培養日数を変えた３群、すなわち３日間培養群（３ｄ群）、５日間培養群（５ｄ群）、及び、７日間培養群（７ｄ群）を作製した。また、実施例３におけるＵＣ群を０ｄ群とした。【０１２９】
前記の通り調製した移植用細胞（０ｄ群、３ｄ群、５ｄ群及び７ｄ群）は、実施例３（３）と同様の方法により、ＮＯＧマウスへ移植した。【０１３０】
移植１２週後に、実施例３（４）と同様の方法により、移植されたマウスの末梢血及び骨髄の各種細胞におけるヒト細胞（移植されたヒトＣＤ３４陽性細胞に由来する細胞）の割合を解析した。【０１３１】
（２）結果
移植１２週後のマウスから採取した骨髄細胞において、０ｄ群でｈＣＤ４５＋細胞が検出されたのは5匹中4匹であったが、他の群ではすべてのマウスにおいてｈＣＤ４５＋細胞が検出された。０ｄ群、３ｄ群、５ｄ群、７ｄ群の骨髄内ｈＣＤ４５＋細胞キメラ率の平均値はそれぞれ26.15%、70.34%、76.93%、 40.82%で、０ｄ群が最も低く、５ｄ群が最も高かった。【０１３２】
多分化能を検討したところ、ｈＣＤ３３＋細胞（骨髄球）、ｈＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）は０ｄ群で5匹中4匹、他の群はすべてのマウスにおいて検出された。また、ｈＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）については、それぞれ５匹中1匹（０ｄ群）、５匹中２匹（３ｄ群）、５匹中２匹（５ｄ群）、５匹中０匹（７ｄ群）に、ヒトＣＤ２３５ａ＋細胞（赤芽球）はそれぞれ5匹中3匹（０ｄ群）、5匹中5匹（３ｄ群）、5匹中5匹（５ｄ群）、5匹中2匹（７ｄ群）に、ヒト赤血球についてはそれぞれ5匹中2匹（０ｄ群）、5匹中5匹（３ｄ群）、5匹中5匹（５ｄ群）、5匹中5匹（７ｄ群）に検出された。【０１３３】
移植１２週後のマウスから採取した末梢血中のヒト血小板については、それぞれ5匹中2匹（０ｄ群）、5匹中5匹（３ｄ群）、5匹中5匹（５ｄ群）、5匹中5匹（７ｄ群）に検出された。【０１３４】
造血幹細胞画分であるヒトＣＤ３４＋ｈＣＤ３８−細胞の絶対数について解析したところ、それぞれ7.10 x103cells（０ｄ群）、14.96 x103 cells（３ｄ群、増幅倍数：2.1）、24.98 x103 cells（５ｄ群、増幅倍数：3.52）、22.58x103 cells（７ｄ群、増幅倍数： 3.19）であった。【０１３５】
今回の解析の結果、すべての群でＴ細胞の検出頻度が低かったが、Ｔ細胞の分化誘導には時間がかかるため移植１２週間後では短かった可能性が考えられた。また、赤血球、血小板では０ｄ群ではいずれも5匹中2匹にしか検出されなかったが、これは生着した造血幹細胞数が少なかったことによる造血回復遅延によるものと思われた。in vitroにおけるヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞数の増加については、０ｄ群に比し３ｄ群、５ｄ群、７ｄ群において増加したが、最も多かったのは５ｄ群であった。ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞数において０ｄ群と３ｄ群では差がないように見えるが、総細胞数は培養３日目では減少していた。これは、０ｄにおけるヒトＣＤ３４＋細胞にはＨＤＧＦ＋ＴＰＯに反応しない細胞や死細胞が含まれていたことを示唆するものであり、０ｄ群と３ｄ群の結果はヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の中にも反応しない細胞や死細胞が含まれていたことによると思われた（実際に反応するｈＣＤ３４＋ｈＣＤ３８−細胞は赤点線と想定している）。以上から、in vitroにおけるヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞数増幅とin vivoでの骨髄内ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞絶対数との間に相関があり、ＨＴによる造血幹細胞増幅の最適な培養期間は５日間であることが明らかとなった。【０１３６】
＜実施例７＞  各種ｈＨＤＧＦａトランケイト体のin vitro活性評価
（１）各種ｈＨＤＧＦａトランケイト体の作製
ｈＨＤＧＦの増幅活性に必須の配列に関する情報を入手するため、ｈＨＤＧＦａの各種トランケイト体６種類（Ｈ１−２０８、Ｈ３０−２４０、Ｈ３０−２０８、Ｈ４−２４０、Ｈ１−２３０及びＨ１−１５０、構造を図１３に示す）を作製し、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞増幅アッセイを実施した。【０１３７】
（２）実験方法
ヒト臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を無血清培地（StemPro-34, GIBCO）によって、細胞濃度は1x105 cells/mL及びｈＴＰＯ（R&D製）の最終濃度が100 ng/mL、になるように調製した。調製した細胞浮遊液を４８ウェルプレート（ファルコン）に300 μL加えた後、全長ｈＨＤＧＦａ及び各種ｈＨＤＧＦトランケイト体を50 μg/mLに調製した溶液を、それぞれ各ウェルに3μL添加し、５日間、５％ＣＯ２、３７℃インキュベーターで培養した。培養後、一部を採取しトリパンブルーで染色後、生細胞数を血球計算盤（C-Chip、Digital Bio）によりカウントした。次に細胞をすべて回収し、抗ヒトＣＤ３４抗体（APC、バイオレジェンド）及び抗ヒトＣＤ３８抗体（FITC、バイオレジェンド）で染色後、フローサイトメーター（MACSQuant、ミルテニー）を用いて抗原を解析した。死細胞除去はＰＩ（ヨウ化プロピジウム）を用いた。【０１３８】
最終的なデータは増幅倍数（fold expansion）で表示するため、総細胞数およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞絶対数の算出は1ml換算で算出（総細胞数＝１mL x細胞濃度、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞絶対数＝ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の割合（%）x 総細胞数）した。【０１３９】
（３）結果
上記試験の結果、Ｈ１−１５０以外のトランケイト体すべてにおいて、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の増幅が認められた（図１４）。評価の結果、Ｈ３０−２０８やＨ３０−２４０が活性を有していたことから、アイソフォーム共通（コア）配列（Ｈ３０−２４０）、中でも３０位〜２０８位の領域が存在すれば活性を発現できることが示唆された。核移行配列が欠失したＨ１−１５０では活性が認められなかったことから、活性発現には核移行配列が必須であると思われた。以上から、ｈＨＤＧＦａの３０位〜２０８位の配列を有するペプチドはＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞増幅活性を有することが示唆され、この配列がＨＤＧＦの活性発現に重要であると思われた。【０１４０】
以上から、ＨＤＧＦ物質は、造血幹細胞、特に長期造血幹細胞の増幅を誘導する因子であり、生体外における造血幹細胞の増幅のみならず、生体内へ投与することで体内の造血幹細胞の増幅を誘導・促進することが示され、本発明の造血幹細胞増幅誘導剤の多様な有用性が確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明におけるＨＤＧＦ物質は、生体外において造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞の増幅を誘導できる。ＨＤＧＦ物質を利用して増幅または遺伝子導入された細胞は、造血機能不全または免疫機能障害を伴う疾患の移植治療の細胞材料として期待される。また、造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞の増幅誘導作用を有するため、造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞の減少を伴う疾患に対する医薬品としての応用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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