(57)【要約】本発明は、生体適合性の免疫アジュバントの改善を提供する。より詳細には、本発明により、平均粒径約４０ｎｍより大きく約１８００ｎｍ未満のリン酸カルシウム、好ましくはヒドロキシアパタイトを含む、免疫アジュバント、およびこの免疫アジュバントを含む医薬、この免疫アジュバントを含むワクチンが提供される。桿状のＨＡｐは、球状のＨＡｐよりもインビトロでより強いインフラマソーム依存性のＩＬ−１β産生を誘導した。しかしながら、球状および桿状のＨＡｐは、ＷＴマウスにおいて同等な抗体応答を誘発した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒径約４０ｎｍより大きく約１８００ｎｍ未満のリン酸カルシウムを含む、免疫アジュバント。
【請求項２】
前記リン酸カルシウムの平均粒径は、約１００〜約４００ｎｍである、請求項１に記載の免疫アジュバント。
【請求項３】
前記リン酸カルシウムはヒドロキシアパタイトである、請求項１に記載の免疫アジュバント。
【請求項４】
前記リン酸カルシウムは桿状である、請求項１に記載の免疫アジュバント。
【請求項５】
リン酸カルシウムを含み、該リン酸カルシウムは桿状である免疫アジュバント。
【請求項６】
ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を必要としない免疫アジュバントとして使用するための請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫アジュバント。
【請求項７】
前記免疫アジュバントはＴｈ２型応答を増強するものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫アジュバント。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫アジュバントを含む医薬。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫アジュバントを含むワクチン。
【請求項１０】
免疫アジュバントとして使用するための、平均粒径約４０ｎｍより大きく約１８００ｎｍ未満のリン酸カルシウム。
【請求項１１】
免疫アジュバントとして使用するための、桿状であるリン酸カルシウム。
【請求項１２】
平均粒径約４０ｎｍより大きく約１８００ｎｍ未満のリン酸カルシウムを含む、免疫アジュバントを含むワクチンの有効量を被験体に投与する工程を包含する、該ワクチンを必要とする疾患の予防または治療のための方法。
【請求項１３】
桿状であるリン酸カルシウムを含む、免疫アジュバントを含むワクチンの有効量を被験体に投与する工程を包含する、該ワクチンを必要とする疾患の予防または治療のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫アジュバントに関する。より特定すると本発明は、ヒドロキシアパタイト等のリン酸カルシウムを免疫アジュバントとして使用する際の改善に関する。
【背景技術】
【０００２】
リン酸カルシウムは骨および歯などのヒトの身体における硬組織の天然成分であり、リン酸カルシウムで構成されるヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）は、歯科インプラント材料または骨生成に使用される（非特許文献１、２）。ＨＡｐインプラントは、溶液媒介性プロセス（生理溶液中のインプラントの溶解度）（非特許文献３）または細胞媒介性プロセスのいずれかによって再吸収され得る。特に、マクロファージはＨＡｐ結晶を分解する能力を有しており（非特許文献４）、ＨＡｐが生分解性材料であることを実証している。【０００３】
ワクチンは、我々が感染するのを防ぐ最も有効な薬剤であり、ワクチンアジュバントは一部のワクチンの有効性を改善するのに使用される。ワクチンアジュバントは、異なるタイプの化合物（例えば、微生物産物、エマルション、粒子またはリポソーム（非特許文献５〜７））により分類される。リン酸カルシウム（ＣＰ）は、商業化ベースに乗ったヒト用ワクチンアジュバントの一つであり、確立した安全性プロファイルを有する（非特許文献８）。ＣＰは、ジフテリアおよび破傷風トキソイドを含む種々のワクチン有効性を改善することが示された（非特許文献９、１０）。ＣＰは、非毒性である他の粒子アジュバントを超えるいくつかの利点を有しており、ＩｇＥの誘導を伴わない高いアジュバント活性を有する（非特許文献８、１１）。【０００４】
リン酸カルシウムではないいくつかの異なるタイプの粒子アジュバントの研究では、粒子サイズ、表面形態、表面電荷および表面積が、アジュバント活性に影響を与える重要なパラメータであることが報告されている（非特許文献１２、１３）。さらに、それらの炎症促進性活性はそれらの物理的特性により大きく変化していることも報告されており、その法則性は見出されていないどころか予測不可能であることが示されている。変形性関節症（ＯＡ）の滑膜に見られる赤血球凝集素（ＨＡ）凝集の形態に似ている桿状または針状のヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）結晶は、球状のものよりもマクロファージにおいてＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を介したより高いＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の産生を誘導する。これは、関節におけるＨＡｐ結晶の異所性の析出が、ＯＡに密接に関連する炎症を誘導することを示唆している（非特許文献１４）。しかしながら、アジュバント活性との関係は報告されていない。ＣＰで構成されるＨＡｐのナノ粒子は様々な研究でアジュバント活性を有することが報告されている（非特許文献１１、１５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】FURUHASHI.,  K.,  et  al.,  Evaluation  of  Adhesion  between  Material  and  Epithelium  using  a  Three-dimensional  Human  Epidermal  Model.  Nano  Biomedicine,  2012.  4(2):  p.  76-84.
【非特許文献２】HATAKEYAMA.,  W.,  et  al.,  Bone-regeneration  Trial  of  Rat  Critical-size  Calvarial  Defects  using  Nano-apatite/collagen  Composites.  Nano  Biomedicine,  2013.  5(2):  p.  95-103.
【非特許文献３】JARCHO,  M.,  Calcium  Phosphate  Ceramics  as  Hard  Tissue  Prosthetics.
【非特許文献４】Kwong  C.  H.,  et  al.,  Solubilization  of  hydroxyapatite  crystals  by  murine  bone  cells,  macrophages  and  fibroblasts.  Biomaterials.,  1989.  10:  p.  579-84.
【非特許文献５】Tritto,  E.,  F.  Mosca,  and  E.  De  Gregorio,  Mechanism  of  action  of  licensed  vaccine  adjuvants.  Vaccine,  2009.  27(25-26):  p.  3331-4.
【非特許文献６】Brito,  L.A.,  P.  Malyala,  and  D.T.  O'Hagan,  Vaccine  adjuvant  formulations:  a  pharmaceutical  perspective.  Semin  Immunol,  2013.  25(2):  p.  130-45.
【非特許文献７】Hedayat,  M.,  K.  Takeda,  and  N.  Rezaei,  Prophylactic  and  therapeutic  implications  of  toll-like  receptor  ligands.  Med  Res  Rev,  2012.  32(2):  p.  294-325.
【非特許文献８】TCHAVDAR  L,  V.,  Aluminium  Phosphate  but  Not  Calcium  Phosphate  Stimulates  the  Specific  IgE  Response  in  Guinea  Pigs  to  Tetanus  Toxoid.  Allergy,  1978.  33:  p.  155-9.
【非特許文献９】Aggerbeck,  H.  and  I.  Heron,  Adjuvanticity  of  aluminium  hydroxide  and  calcium  phosphate  in  diphtheria-tetanus  vaccines-I.  Vaccine,  1995.  13(14):  p.  1360-5.
【非特許文献１０】Aggerbeck,  H.,  C.  Fenger,  and  I.  Heron,  Booster  vaccination  against  diphtheria  and  tetanus  in  man.  Comparison  of  calcium  phosphate  and  aluminium  hydroxide  as  adjuvants-II.  Vaccine,  1995.  13(14):  p.  1366-74.
【非特許文献１１】HE,  Q.,  et  al.,  Calcium  Phosphate  Nanoparticle  Adjuvant.  CLINICAL  AND  DIAGNOSTIC  LABORATORY  IMMUNOLOGY,  2000.  7(6):  p.  899.
【非特許文献１２】Kuroda,  E.,  C.  Coban,  and  K.J.  Ishii,  Particulate  Adjuvant  and  Innate  Immunity:  Past  Achievements,  Present  Findings,  and  Future  Prospects.  International  Reviews  of  Immunology,  2013.  32(2):  p.  209-220.
【非特許文献１３】Jiang,  D.,  et  al.,  Structure  and  adsorption  properties  of  commercial  calcium  phosphate  adjuvant.  Vaccine,  2004.  23(5):  p.  693-8.
【非特許文献１４】Jin,  C.,  et  al.,  NLRP3  inflammasome  plays  a  critical  role  in  the  pathogenesis  of  hydroxyapatite-associated  arthropathy.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A,  2011.  108(36):  p.  14867-72.
【非特許文献１５】He,  Q.,  et  al.,  Calcium  Phosphate  Nanoparticles  Induce  Mucosal  Immunity  and  Protection  against  Herpes  Simplex  Virus  Type  2.  Clinical  and  Vaccine  Immunology,  2002.  9(5):  p.  1021-1024.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、抗原による免疫化後の抗体応答におけるＨＡｐのサイズまたは形状の役割を試験し、直径（平均粒径）が約４０ｎｍより大きく約１８００ｎｍ未満、好ましくは約１００〜約４００ｎｍの範囲にあるＨＡｐは、これより小さいまたは大きいものと比べて顕著に高い抗体応答をもたらすことを見出し、本発明を完成させた。アジュバント活性に最適なサイズまたは形状が不明であり、その予測も類推も不可能である当該分野における事情を考慮すると、このような特定のサイズでアジュバント活性がきわめて高いことは予想できなかったことである。特に、異なるサイズのオボアルブミン（ＯＶＡ）コンジュゲート化ポリスチレンビーズ（約２０ｎｍ、約４０ｎｍ、約１００ｎｍおよび約５００ｎｍ、ならびに約１μｍおよび約２μｍ）により誘導された免疫応答の比較において、約４０ｎｍが、最も強いＯＶＡ特異的抗体応答を誘導した（Fifis,  T.,  et  al.,  Size-Dependent  Immunogenicity:  Therapeutic  and  Protective  Properties  of  Nano-Vaccines  against  Tumors.  The  Journal  of  Immunology,  2004.  173(5):  p.  3148-3154.）ことを考慮すると、現時点で判明している情報からはむしろ予想外の結果であるといえる。【０００７】
本発明において、球状および桿状のＨＡｐの間を比較すると、桿状のＨＡｐは、球状のＨＡｐよりもインビトロでより強いインフラマソーム依存性のＩＬ−１β産生を誘導した。しかしながら、球状および桿状のＨＡｐは、ＷＴマウスにおいて同等な抗体応答を誘発した。同様に、Ｎｌｒｐ３−／−マウス、Ａｓｃ−／−マウスまたはＣａｓｐａｓｅ  １−／−マウスも、ＨＡｐアジュバント化ワクチン接種に匹敵するレベルの抗体応答をもたらした。まとめると、本発明者らの結果は、形状よりもサイズがより重要な特性であり、ＮＬＲＰ３インフラマソームを介したＩＬ−１βの産生は、マウスにおけるＨＡｐのアジュバント活性に不必要であることを実証した。【０００８】
したがって、本発明は以下を提供する。
（１）平均粒径約４０ｎｍより大きく約１８００ｎｍ未満のリン酸カルシウムを含む、免疫アジュバント。
（２）前記リン酸カルシウムの平均粒径は、約１００〜約４００ｎｍである、項目１に記載の免疫アジュバント。
（３）前記リン酸カルシウムはヒドロキシアパタイトである、項目１または２に記載の免疫アジュバント。
（４）前記リン酸カルシウムは桿状である、項目１〜３のいずれか１項に記載の免疫アジュバント。
（５）リン酸カルシウムを含み、該リン酸カルシウムは桿状である免疫アジュバント。
（６）ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を必要としない免疫アジュバントとして使用するための項目１〜５のいずれか一項に記載の免疫アジュバント。
（７）前記免疫アジュバントはＴｈ２型応答を増強するものである、項目１〜６のいずれか一項に記載の免疫アジュバント。
（８）項目１〜７のいずれか一項に記載の免疫アジュバントを含む医薬。
（９）項目１〜７のいずれか一項に記載の免疫アジュバントを含むワクチン。
（１０）免疫アジュバントとして使用するための、平均粒径約４０ｎｍより大きく約１８００ｎｍ未満のリン酸カルシウム。
（１１）免疫アジュバントとして使用するための、桿状であるリン酸カルシウム。
（１１Ａ）項目１〜７のいずれかまたは複数の特徴を備える、項目１０または１１に記載のリン酸カルシウム。
（１２）平均粒径約４０ｎｍより大きく約１８００ｎｍ未満のリン酸カルシウムを含む、免疫アジュバントを含むワクチンの有効量を被験体に投与する工程を包含する、該ワクチンを必要とする疾患の予防または治療のための方法。
（１３）桿状であるリン酸カルシウムを含む、免疫アジュバントを含むワクチンの有効量を被験体に投与する工程を包含する、該ワクチンを必要とする疾患の予防または治療のための方法。
（１３Ａ）項目１〜７のいずれかまたは複数の特徴を備える、項目１２または１３に記載の方法。【０００９】
本発明において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の粒子は、高い抗体応答を誘導した（例えば、図２Ａ〜２Ｃ）。また、理論に束縛されることを望まないが、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラス分析により、ＨＡｐがＩｇＧ２ｃよりもＩｇＧ１の産生を誘導したことも明らかになり、これはＨＡｐがＴｈ２偏向性免疫応答を生じる傾向を有することも見出された。加えて、不活化スプリットワクチン（ＳＶ）＋約１００〜約４００ｎｍのヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）粒子による免疫化により、高いウイルス中和力価を示したことも実証された。したがって、本発明において、中和能力もまたこの特定の範囲の粒子を使用することにより増強されたことが実証されている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、種々のサイズの球状ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）を示す。（Ａ）Ｓ４０、（Ｂ）Ｓ１００、（Ｃ）Ｓ１７０、（Ｄ）Ｓ４００、（Ｅ）Ｓ１８００および（Ｆ）Ｓ５０００の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。それぞれの記号については表１を参照のこと。左が低倍率、右が高倍率のＨＡｐの拡大ＳＥＭ写真である。左または右の写真はそれぞれ、（Ａ−Ｄ）１０，０００倍または４０，０００倍；（Ｅ）２，０００倍または４０，０００倍；（Ｆ）１，０００倍または１０，０００倍の倍率で撮影された。
【図２−１】図２−１および図２−２は、数百ナノメートルのＨＡｐが高い抗体応答を誘導することを示す。０日目および１４日目に、マウス（ｎ＝５）を、１μｇの不活化スプリットワクチン（ＳＶ）単独でまたはアジュバントとともにｉ．ｄ．により免疫化した。１４日目（白抜き）および２８日目（黒塗り）における血清中の抗原特異的（Ａ）全ＩｇＧ、（Ｂ）ＩｇＧ１および（Ｃ）ＩｇＧ２ｃ力価をＥＬＩＳＡにより測定した。Ａ〜Ｃの縦軸は抗ＳＶ力価を示す。（Ｄ）２８日目における血清中のウイルス中和力価をマイクロ中和アッセイにより測定した。結果は３回の独立した実験の代表を表している。Ａｌｕｍはアラムを示し、Ｓ４０、Ｓ１００、Ｓ１７０、Ｓ４００、Ｓ１８００およびＳ５０００の各粒子の説明は表１に示される形状を有する（Ｓは球状（Ｓｐｈｅｒｅ）を意味する。）。Ｄの縦軸は中和力価を示す。Ａ〜Ｄの横軸の数値は使用した量（ｍｇ）を示す。中央値およびＳＥＭを各群について示す。統計学的有意性を、Ｄｕｎｎｅｔ多重比較検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１として示す。
【図２−２】図２−１および図２−２は、数百ナノメートルのＨＡｐが高い抗体応答を誘導することを示す。０日目および１４日目に、マウス（ｎ＝５）を、１μｇの不活化スプリットワクチン（ＳＶ）単独でまたはアジュバントとともにｉ．ｄ．により免疫化した。１４日目（白抜き）および２８日目（黒塗り）における血清中の抗原特異的（Ａ）全ＩｇＧ、（Ｂ）ＩｇＧ１および（Ｃ）ＩｇＧ２ｃ力価をＥＬＩＳＡにより測定した。Ａ〜Ｃの縦軸は抗ＳＶ力価を示す。（Ｄ）２８日目における血清中のウイルス中和力価をマイクロ中和アッセイにより測定した。結果は３回の独立した実験の代表を表している。Ａｌｕｍはアラムを示し、Ｓ４０、Ｓ１００、Ｓ１７０、Ｓ４００、Ｓ１８００およびＳ５０００の各粒子の説明は表１に示される形状を有する（Ｓは球状（Ｓｐｈｅｒｅ）を意味する。）。Ｄの縦軸は中和力価を示す。Ａ〜Ｄの横軸の数値は使用した量（ｍｇ）を示す。中央値およびＳＥＭを各群について示す。統計学的有意性を、Ｄｕｎｎｅｔ多重比較検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１として示す。
【図３】図３は、種々のサイズの桿状ＨＡｐを示す。（Ａ）Ｒ１２０、（Ｂ）Ｒ１６０および（Ｃ）Ｒ２５０の走査型電子顕微鏡写真を示す（Ｒは桿状（Ｒｏｄ）を意味する。）。それぞれの記号については表１を参照のこと。左または右の写真はそれぞれ、１０，０００倍または４０，０００倍の倍率で撮影されており、バーが各々に相当する長さをいう。
【図４−１】図４−１および図４−２は、桿状ＨＡｐもまたアジュバント活性を有することを示す。０日目および１４日目に、マウス（ｎ＝５）を、１μｇのＳＶ単独でまたはアジュバントとともにｉ．ｄ．により免疫化した。１４日目（白抜き）および２８日目（黒塗り）における血清中の抗原特異的（Ａ）全ＩｇＧ、（Ｂ）ＩｇＧ１および（Ｃ）ＩｇＧ２力価をＥＬＩＳＡにより測定した。縦軸は抗ＳＶ力価を示す。（Ｄ）２８日目における血清中のウイルス中和力価をマイクロ中和アッセイにより測定した。結果は３回の独立した実験の代表を表している。Ｒ１２０、Ｒ１６０およびＲ２５０はそれぞれ表１を参照のこと。Ｄについて、縦軸は中和力価を示す。Ａ〜Ｄについて横軸の数値は使用した量（ｍｇ）を示す。中央値およびＳＥＭを各群について示す。統計学的有意性を、Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｄｕｎｎｅｔ多重比較検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１として示す。
【図４−２】図４−１および図４−２は、桿状ＨＡｐもまたアジュバント活性を有することを示す。０日目および１４日目に、マウス（ｎ＝５）を、１μｇのＳＶ単独でまたはアジュバントとともにｉ．ｄ．により免疫化した。１４日目（白抜き）および２８日目（黒塗り）における血清中の抗原特異的（Ａ）全ＩｇＧ、（Ｂ）ＩｇＧ１および（Ｃ）ＩｇＧ２力価をＥＬＩＳＡにより測定した。縦軸は抗ＳＶ力価を示す。（Ｄ）２８日目における血清中のウイルス中和力価をマイクロ中和アッセイにより測定した。結果は３回の独立した実験の代表を表している。Ｒ１２０、Ｒ１６０およびＲ２５０はそれぞれ表１を参照のこと。Ｄについて、縦軸は中和力価を示す。Ａ〜Ｄについて横軸の数値は使用した量（ｍｇ）を示す。中央値およびＳＥＭを各群について示す。統計学的有意性を、Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｄｕｎｎｅｔ多重比較検定における＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１として示す。
【図５】図５は、数百ナノメートルのＨＡｐが、インビトロでマクロファージにおけるインフラマソームを介したＩＬ−１β産生を誘導することを示す。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスまたは（Ｂ）Ｃａｓｐａｓｅ１−／−マウスから調製された腹腔マクロファージを５０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（白抜きはリポポリサッカリド（ＬＰＳ）なし、黒塗りはＬＰＳ有を示す。）で１５時間プライミングし、その後、示された濃度で８時間ＨＡｐまたはアラムで刺激した。培養上清に分泌されたＩＬ−１βをＥＬＩＳＡにより測定した。結果は３回の独立した実験の代表を表している。縦軸はＩＬ−１βの濃度を示し、横軸は使用した量（ｍｇ）を示す。また、左から４つは球状および右から３〜５番目は桿状のもの、右から２番目はアラムを指し、右端は何もなしを示す。中央値およびＳＥＭを各群について示す。刺激していない群と比較した統計学的有意性を、Ｄｕｎｎｅｔ多重比較検定における＊＊＊Ｐ＜０．００１として示す。
【図６】図６は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化が、ＨＡｐのアジュバント活性に必要ないことを示す。０日目および１４日目に、（Ａ）Ｎｌｒｐ３−／−マウス（Ｂ）Ａｓｃ−／−マウスまたは（Ｃ）Ｃａｓｐａｓｅ１−／−マウス（ｎ＝３〜６）を、１０μｇのＯＶＡ単独でまたはアジュバントともにｉ．ｄ．により免疫化した。Ｓ１７０およびＲ１６０をマウスあたり５ｍｇ使用した。１４日目（白抜き）および２８日目（黒塗り）における血清中の抗原特異的全ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより測定した。縦軸は抗ＯＶＡ力価を示す。Ｓ１７０、Ｒ１６０はそれぞれ表１に示す形状を有する。Ａｌｕｍはアラムを示す。結果は２回の独立した実験の代表を表している。中央値およびＳＥＭを各群について示す。統計学的有意性を、Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定により決定した。
【図７】図７は、（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスまたは（Ｂ）Ｃａｓｐａｓｅ１−／−マウスから調製された腹腔マクロファージを、５０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで１５時間プライミングし、その後、示された濃度で８時間ＨＡｐまたはアラムで刺激した。培養上清中に分泌された腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）をＥＬＩＳＡにより測定した。結果は３回の独立した実験の代表を表している。縦軸はＴＮＦαの濃度を示す。横軸は使用した量（ｍｇ）を示す。また、左から４つは球状および右から３〜５番目は桿状のもの、右から２番目はアラムを指し、右端は何もなしを示す。中央値およびＳＥＭを各群について示す。刺激していない群と比較した統計学的有意性を、Ｄｕｎｎｅｔ多重比較検定により決定した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１３】
本明細書で使用される「リン酸カルシウム」としては、具体的には、ヒドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、リン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、メタリン酸カルシウム（Ｃａ（ＰＯ３）２）、フッ化アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２）、塩化アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｃｌ２）等が挙げられる。これらのリン酸カルシウムは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらのリン酸カルシウムの中でも、アジュバント特性、吸着性、生体適合性、移植用細胞の保持・増殖性等にも優れているという観点から、好ましくはヒドロキシアパタイトが使用されるが本発明はこれに限定されるものではない。
【００１４】
また、これらのリン酸カルシウム等の無機化合物は、焼結処理に供された焼結物であることが好ましい。上記無機化合物の焼結物を使用することにより、耐熱性や化学的安定性を備えさせることが可能になる。
【００１５】
ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ：Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）は化学式Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２で示される塩基性リン酸カルシウムで、天然には骨や歯の主成分として、また鉱石として存在し、高い生体親和性を示すことが知られている。種々の方法により合成されており、バイオマテリアルをはじめとする様々な分野で活用されている。その製造法としては、溶液法（湿式法）があり、中性もしくはアルカリ性の水溶液中でカルシウムイオンとリン酸イオンを室温で反応させることにより合成する方法である。代表的なものとして中和反応によるものと塩と塩の反応によるものがある。上記手法で合成されたＨＡｐはアモルファスであり、使用目的によっては十分な安定性が担保できないため、さらに焼成することで結晶性を高めることが好ましくありうる。
【００１６】
ヒドロキシアパタイトは、球状であっても桿状であってもよい。そのような製品の例としては、ソフセラから販売されているＳＨＡｐ（焼成ヒドロキシアパタイトナノ粒子）があり、これらは、例えば、球状または桿状（ロッド状）として販売されている。
【００１７】
本明細書において「平均粒径」とは、本発明のリン酸カルシウムまたは免疫アジュバントについていうときの粒子の直径の平均であり、平均粒径は、本明細書では、以下のように測定された数値を使用する。なお、本明細書では「直径」といったときは特に断らない限り「平均粒径」を指す。本明細書の平均粒径の測定には、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いる。平均粒径算出の詳細な手順は以下の通りである。
・対象となるヒドロキシアパタイト粒子をＳＥＭを用いて４０，０００倍で９視野撮影する。
・上記で撮影した画像中、画像１枚あたり１２点、合計１０８点のヒドロキシアパタイト粒子の長径を計測する。
・得られた１０８点の長径の算術平均をとって、平均粒径とする。
【００１８】
本明細書において「球状」および「略球状」とは、交換可能に用いられ、ヒドロキシアパタイトについていうとき、対象となる粒子の最も短い径と最も長い径との比率がおよそ２未満のものを指し、完全な球状のほか、球状からある程度外れたものも含まれる。「球状」および「略球状」のヒドロキシアパタイトは、通常プラスマイナスが混在する。当該分野では、「略球状」とも称されるが、本発明の目的では「球状」も「略球状」も同義で用いられる。
【００１９】
本明細書において「桿状」（ロッド状＝ｒｏｄ）とは、ヒドロキシアパタイトについていうとき、いわゆる棒状のもののほか、球状ではないものを指し、対象となる粒子の最も短い径と最も長い径との比率がおよそ２以上のものを指す。「桿状」のヒドロキシアパタイトは、通常プラス（側面）とマイナス（断面）と分かれている。理論に束縛されることを望まないが、桿状の断面（ｃ面）は、リン酸イオン由来の酸素原子が多く露出し、桿状の側面（ａ面）は、カルシウム原子が多く露出していることが説明されており、それぞれの原子（イオン）由来の電荷により、桿状および略球状におけるプラスマイナスの分布の相違が生じると考えられる（KAWASAKI  et  al.,  European  Journal  of  Biochemistry  152,  361-371(1985)）。また、これもまた理論に束縛されることを望まないが、ナノ粒子故に完全に分散しているものではないが、ゼータ電位は、球状に比べ桿状がよりプラス寄りの値を示す傾向にあり、これも表面に露出した電荷の局在化と面積比で説明がつくことから、±の傾向も説明され得る。
【００２０】
本明細書において「（免疫）アジュバント」とは、ラテン語の「助ける」という意味をもつ'adjuvare'という言葉を語源に持ち、ワクチンと一緒に投与して、その効果（免疫原性）を増強する目的で使用される物質（因子）の総称である。有効な免疫（ワクチン効果）の獲得のためにアジュバントによる自然免疫活性化が必須であることが判明している。アジュバントは、任意の免疫応答を増強し得るが、細胞型免疫（Ｔｈ１型免疫）および液性免疫（Ｔｈ２型免疫）のいずれかに偏向して増強することもあり、両方を増強することもありうる。
【００２１】
（リン酸カルシウム粒子の製造および粒径制御）
本発明の粒子は、市販のものを用いることもできるが、以下のようなナノ粒子を製造する工程によって生産することができる（例えば、日本国特開2010-235686参照）。以下に、ナノ粒子の一例であるヒドロキシアパタイト粒子を例にしてナノ粒子製造工程について説明するが、ナノ粒子製造工程はこれに限定されない。
【００２２】
上記ナノ粒子製造工程は、「一次粒子生成工程」および／または「焼結工程」を含んでいることが好ましい。また、上記工程以外に、「除去工程」および／または「混合工程」を含んでいることが更に好ましい。なお、上記４つの工程は、「Ａ．一次粒子生成工程」→「Ｂ．混合工程」→「Ｃ．焼結工程」→「Ｄ．除去工程」の順で行われることが好ましい。
【００２３】
以下の説明においては、上記４つの工程を全て含んだ場合のナノ粒子製造工程について説明するが、これに限定されない。
【００２４】
（Ａ．一次粒子生成工程）
ここで「一次粒子」とは、焼結工程の前に、ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）などのリン酸カルシウムによって形成された粒子のことを意味する。すなわち、ヒドロキシアパタイト粒子の製造工程において、初めて形成された粒子のことを意味する。また狭義には単結晶粒子のことを意味する。なお本明細書において「一次粒子」とは、非晶質（アモルファス）の状態のもの、およびその後に焼結を行った焼結体の状態のものをも含む。
【００２５】
これに対して「二次粒子」とは、複数の「一次粒子」同士が、物理的結合（例えば、融着など）または化学的結合（例えば、イオン結合または共有結合など）によって結合した状態の粒子を意味する。このとき、結合し合う一次粒子の個数、結合後の形状などは特に限定されない。
【００２６】
また特に「単結晶一次粒子」とは、ヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウムの単結晶からなる一次粒子、または、当該単結晶からなる一次粒子がイオン的相互作用によって集合化した粒子塊のことを意味する。なお「イオン的相互作用によって集合化した粒子塊」とは、水もしくは有機溶媒を含む媒体にて分散させた場合にイオン的相互作用で自己集合する粒子塊であって、焼結によって粒子間が溶融して多結晶化した二次粒子を含まない。
【００２７】
一次粒子生成工程は、上記一次粒子を生成することができる工程であればよく、特に限定されない。例えば、ｐＨをアルカリ性（例えば、ｐＨ１２．０）に調整したＣａ（ＮＯ３）２水溶液に対して、ｐＨをアルカリ性（例えば、ｐＨ１２．０）に調整した（ＮＨ４）２ＨＰＯ４水溶液を、高温（例えば、８０℃）にて徐々に添加すればよい。
【００２８】
一次粒子生成工程によって生成された一次粒子の状態（例えば、粒子径、粒度分布）が、ヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム粒子の状態（粒子径、粒度分布）に反映される。したがって、粒子径が微細（ナノサイズ）でかつ粒子径が均一な（粒度分布が狭い）ヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム粒子を製造しようとすれば、当該一次粒子生成工程において粒子径が微細（ナノサイズ）でかつ粒子径が均一な（粒度分布が狭い）一次粒子を生成しておくことが好ましい。
【００２９】
一次粒子の粒子径としては特に限定されないが、平均粒径が約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍであることが好ましく、約１０ｎｍ〜約７００ｎｍであることがより好ましく、約２０ｎｍ〜約６００ｎｍであることが更に好ましく、約２５ｎｍ〜約５００ｎｍであることが尚更に好ましく、初めから最終的に所望される平均粒径（例えば、約１００ｎｍ〜約４００ｎｍの間）としてもよい。もちろん、最終的に所望される平均粒径（例えば、約１００ｎｍ〜約４００ｎｍの間）に変更可能であれば、これらに限定されない。また一次粒子からなる一次粒子群の粒子径の変動係数は、約２０％以下であることが好ましく、約１８％以下であることがさらに好ましく、約１５％以下であることが最も好ましい。なお一次粒子の粒子径および変動係数は、動的光散乱法または電子顕微鏡を用いて、少なくとも約１００個以上の一次粒子について粒子径を測定し、当該測定結果に基づいて計算すればよい。なお「変動係数」は、標準偏差÷平均粒径×１００（％）で計算することができる粒子間の粒子径のバラツキを示す値である。
【００３０】
上記のような微細（ナノサイズ）でかつ粒子径が均一な（粒度分布が狭い）一次粒子を作製する方法については、特に限定されるものではないが、例えば、日本国特開２００２−１３７９１０号公報に記載された方法を利用することができる。つまり、界面活性剤／水／オイル系エマルジョン相にカルシウム溶液およびリン酸溶液を可溶化して混合させ、界面活性剤の曇点以上で反応させることによっても、一次粒子を合成することができる。また、このとき上記界面活性剤の官能基および親水性／疎水性比の割合を変えることによって、一次粒子の大きさを制御することができる。しかしながら、一次粒子の作製方法は、当該作製方法に限定されない。
【００３１】
上記一次粒子を製造する原理を簡単に説明すれば、以下の通りである。界面活性剤／水／オイル系エマルジョン相にカルシウム溶液およびリン酸溶液を混合し、反応させてハイドロキシアパタイ卜微粒子を合成する方法においては、界面活性剤のミセルの中でヒドロキシアパタイトの核が成長し、結晶成長する。このとき反応温度を界面活性剤の曇点以上に設定することにより、ミセルの熱力学的安定性を制御することができる。すなわち界面活性剤の曇点以上に反応温度を上げることによって、界面活性剤のミセルを形成する能力を下げることができる。その結果、ミセルという枠の中で制限を受けていたヒドロキシアパタイトの結晶成長の駆動力が、ミセルの枠を維持しようとする駆動力よりも大きくなる。そして、そのメカニズムを利用して結晶の形態（例えば、形や大きさなど）を制御することができる。
【００３２】
界面活性剤によってミセルを作る場合には、界面活性剤の官能基（親水性部位）および当該界面活性剤の親水性／疎水性比が重要であり、これらが異なれば、ミセルの安定性、および曇点も異なる。また界面活性剤の曇点は、界面活性剤の種類によって異なる。したがって、界面活性剤の種類を適宜変更することにより、ミセルの安定性および曇点を変更することが可能となり、これによって、ヒドロキシアパタイト微粒子の大きさを制御することができる。
【００３３】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【００３４】
（ヒドロキシアパタイトのワクチンアジュバントとしての使用）
１つの局面において、本発明は、直径約４０ｎｍより大きく約１８００ｎｍ未満のリン酸カルシウムを含む、免疫アジュバントを提供する。理論に束縛されることを望まないが、本明細書の実施例において記載されているように、直径約４０ｎｍより大きく約１８００ｎｍ未満のリン酸カルシウム、例えば、約１００〜約４００ｎｍの粒子は、これより小さい（約４０ｎｍ）およびこれより大きい（約１．８μｍまたは約５μｍ）サイズの粒子よりも高い抗体応答を誘導した（例えば、図２Ａ〜２Ｃ）ことが見出されたからである。また、理論に束縛されることを望まないが、ＩｇＧサブクラス分析により、ヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）がＩｇＧ２ｃよりもＩｇＧ１の産生を誘導したことも明らかになり、これはＨＡｐがＴｈ２偏向性免疫応答を生じる傾向を有することも見出されているが、本発明はこれに限定されない。加えて、不活化スプリットワクチン（ＳＶ）を約１００〜約４００ｎｍのヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）粒子とともに用いた場合の免疫化は、これより小さい（約４０ｎｍ）およびこれより大きい（約１．８μｍまたは約５μｍ）サイズの粒子を用いた場合よりも、より高いウイルス中和力価を示したことも示されており、中和能力もまたこの特定の範囲の粒子を使用することにより増強されたことが実証されている。
【００３５】
アラムまたはシリカなどの種々の粒子は、ワクチン抗原と共投与された場合にアジュバントとして作用することが知られており、そのアジュバント活性が、サイズ、形状および表面電荷などの粒子の物理化学的特性により強く影響されることが報告されているが、必要とされる特性およびそのアジュバント活性との関係は解明は進んでいなかった。したがって、本発明のリン酸カルシウムで構成されるヒドロキシアパタイト粒子（ＨＡｐ）を用いて、特定のサイズにより、マウスにおいてアジュバントとして機能することが示されたことは、驚くべき成果であるとして注目されるべきである。
【００３６】
本発明の実施形態では、本発明の免疫アジュバントで使用されるリン酸カルシウムの直径の下限は、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍであり得、本発明の免疫アジュバントで使用されるリン酸カルシウムの直径の上限は、約１８００ｎｍ、約１７００ｎｍ、約１６００ｎｍ、約１５００ｎｍ、約１４００ｎｍ、約１３００ｎｍ、約１２００ｎｍ、約１１００ｎｍ、約１０００ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９００ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８００ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４００ｎｍであり得、これらの上限および下限は任意の組合せの範囲が本発明において企図される。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明の免疫アジュバントで使用されるリン酸カルシウムの直径は、約１００〜約４００ｎｍである。さらに特定すると、好ましい実施形態では、約１００〜約４００ｎｍ、より好ましくは約１００〜約２５０ｎｍ、約１２０〜約２５０ｎｍ、約１２０〜約１７０ｎｍ、約１００〜約１７０ｎｍ等、約１６０〜約１７０ｎｍの直径のものが有利であり得、例えば、約１２０〜約２５０ｎｍの桿状のものも有利であり得る。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明の免疫アジュバントで使用されるリン酸カルシウムはヒドロキシアパタイトである。より好ましくは、本発明の免疫アジュバントで使用される前記リン酸カルシウムは約１００〜約４００ｎｍの直径のヒドロキシアパタイトである。
【００３９】
このようなヒドロキシアパタイトの直径の制御については、本明細書に記載されるような手法および他の公知の手法を用いて実現することができる。
【００４０】
１つの好ましい実施形態では、本発明の免疫アジュバントで使用されるリン酸カルシウムは桿状である。理論に束縛されることを望まないが、実施例で示されているように、桿状ＨＡｐは、球状ＨＡｐよりも高いインターロイキン１β（ＩＬ−１β）の産生を誘導することが見出されたからである。
【００４１】
１つの好ましい実施形態では、本発明の免疫アジュバントはＮＬＲＰ３(NOD-like  receptor  family,  pyrin  domain  containing  3)インフラマソーム活性化を必要としない免疫アジュバントとして使用される。
【００４２】
１つの好ましい実施形態では、本発明の免疫アジュバントはＴｈ２型（偏向性）免疫応答を生じさせるまたは増強する免疫アジュバントとして使用される。さらなる実施形態では、本発明の免疫アジュバントはリン酸カルシウムとしてヒドロキシアパタイトを用いてＴｈ２型（偏向性）免疫応答を生じさせるまたは増強する免疫アジュバントとして使用される。Ｔｈ２型免疫は、液性免疫に関与しこれにより抗体産生が増強される。
【００４３】
１つの局面において、本発明は、本発明の免疫アジュバントを含む医薬を提供する。本発明の免疫アジュバントとともに含まれる成分としては、免疫原性の増強が必要または望ましい任意の成分が含まれる。このような医薬としては、代表的にはワクチンが挙げられ、例えば、弱毒化生ワクチン（ＬＡＩＶ）、不活化全粒子ワクチン（ＷＶ）、不活化スプリットワクチン（ＳＶ）、サブユニットワクチン（ＳＵ）、トキソイドワクチン、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチン等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００４４】
本発明において使用され得るワクチンの対象としては、インフルエンザウイルス、日本脳炎、ジフテリア・百日咳・破傷風・ポリオ混合（ＤＰＴＰ）、ジフテリア・百日咳・破傷風混合（ＤＰＴ）、ジフテリア・破傷風混合（ＤＴ）、麻疹、風疹、ポリオ、ＢＣＧ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、狂犬病、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、肺炎球菌、ワイル病秋やみ、水痘、流行性耳下腺炎、黄熱、ロタウイルス、ｂ型インフルエンザ菌、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ノロウイルス、単純ヘルペスウイルス等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００４５】
本発明において使用され得るワクチンの対象の被験体としては、任意の哺乳動物を挙げることができ、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）または霊長類（ヒト等）であり、より好ましくは霊長類、さらに好ましくはヒトである。
【００４６】
本発明の医薬またはワクチンは、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、または筋肉内の経路を介しての注射；ガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）；点鼻薬等の形態での粘膜経路を介する方法等により投与され得る。例えば、本発明の医薬またはワクチンは、皮下または筋肉内、好ましくは皮下に注射される。
【００４７】
別の実施形態において、本発明の医薬またはワクチンは、針無注射器により皮下に投与される。針無注射器は、好ましくは圧力注射器である。針無注射器としては、シマジェット(島津製作所)、ツインジェクターＥＺＩＩ（日本ケミカルリサーチ）、シリジェット（キーストン）、ＺＥＮＥＯ(クロスジェクト)等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００４８】
良好な免疫応答を誘導するため、本発明の医薬またはワクチンは、一定の間隔をあけて複数回投与することが好ましい。回数は、免疫応答の強さをモニターしながら適宜設定することができるが、通常単回でもよく、あるいは２〜１０回、好ましくは２〜６回、より好ましくは２〜４回、最も好ましくは３回であるがこれらに限定されない。
【００４９】
投与頻度は、通常３日〜３ヶ月に１回、好ましくは１〜４週間に１回、より好ましくは１．５〜３週間に１回、最も好ましくは２週間に１回である。例えば、本発明の医薬またはワクチンは２週間隔で３回、対象哺乳動物に対して投与されてもよい。
【００５０】
したがって、本発明はまた、本発明の医薬またはワクチンを用いる、対象となる疾患の治療または予防のための方法を提供する。
【００５１】
本明細書において、範囲を示す「Ｘ〜Ｙ」は「Ｘ以上、Ｙ以下」を意味する。また「約」は特に断らない限り、その有効数字を示す。直径の場合は、測定値の１５％の誤差が許容されるため、約１００ｎｍといった場合は８５ｎｍ〜１１５ｎｍの範囲を示す。したがって、測定値の１５％の誤差が許容されることを前提としているため「約」がない場合でも１００ｎｍといった場合は８５ｎｍ〜１１５ｎｍの範囲を示すと理解される。
【００５２】
なお、本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００５３】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００５４】
本実施例において、本発明者らは、サイズおよび形状が望ましく制御されるヒドロキシアパタイト粒子（以下、本明細書において「ＨＡｐ」と省略することがある。）のユニークな合成方法の開発の実証例を提供する。いくつかの異なるサイズおよび形状にしたＨＡｐを使用することによって、本発明者らは必要とされる物理化学的特性およびマウスにおけるＨＡｐのアジュバント活性との関係を試験した。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ、和光純薬、ナカライテスク等）の同等品でも代用可能である。【００５５】
（材料および方法）
（マウス）
６週齢雌性Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスをＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎから購入した。Ｎｌｒｐ３−／−マウス、Ａｓｃ−／−マウスおよびＣａｓｐａｓｅ１−／−マウスは以前に記載されている（Onishi,  M.,  et  al.,  Hydroxypropyl-beta-Cyclodextrin  Spikes  Local  Inflammation  That  Induces  Th2  Cell  and  T  Follicular  Helper  Cell  Responses  to  the  Coadministered  Antigen.  J  Immunol,  2015.）。すべての動物実験を、医薬基盤・健康・栄養研究所の動物施設についての機関ガイドラインに従って行った。【００５６】
（抗原、抗体、アジュバントおよびペプチド）
オボアルブミン（ＯＶＡ）を生化学工業（日本）から購入した。Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）株由来のスプリットＨＡワクチンは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）より提供された。水酸化アルミニウム（アラム）をＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。ＩＬ−１βおよびＴＮＦαについてのサイトカインＥＬＩＳＡキットをＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。【００５７】
（ヒドロキシアパタイト粒子（ＨＡｐ））
ＨＡｐの調製は以前に記載されており（Okada,  M.  and  T.  Furuzono,  Nano-Sized  Ceramic  Particles  of  Hydroxyapatite  Calcined  with  an  Anti-Sintering  Agent.  Journal  of  Nanoscience  and  Nanotechnology,  2007.  7(3):  p.  848-851.、Okada,  M.  and  T.  Furuzono,  Calcination  of  Rod-like  Hydroxyapatite  Nanocrystals  with  an  Anti-sintering  Agent  Surrounding  the  Crystals.  Journal  of  Nanoparticle  Research,  2006.  9(5):  p.  807-815.）一部改変を行った。簡潔には、以前の方法により合成されたＨＡｐを、滅菌前ガラスアンプ中で、３００℃で２時間の乾熱処理により滅菌した。アンプルを密封した後、乾熱処理を再度繰り返した。【００５８】
また、ヒドロキシアパタイトは、ソフセラ社（東京、日本）から市販されているものを利用することができる。上記製法の他、以下の製造例によっても製造し得る。【００５９】
（製造例）
１．低結晶性ヒドロキシアパタイト粒子の調製
球状形態の低結晶性ヒドロキシアパタイト粒子を以下に示す湿式法で調製した。なお、Ｃａ（ＮＯ3）2・４Ｈ2Ｏおよび（ＮＨ4）2ＨＰＯ4は、ナカライテスク株式会社製のものを用い、２５％アンモニア水は和光純薬工業株式会社製のものを用い、純水としてＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｗａｔｅｒを使用した。【００６０】
先ず、２５％アンモニア水でｐＨを１２に調整したＣａ（ＮＯ3）2水溶液（４２ｍＮ、８０ｍＬ）を、冷却管および半月状撹拌翼を接続した１Ｌフラスコに注ぎいれ、室温に保った。このフラスコに、アンモニア水でｐＨを１２に調整した(ＮＨ4）2ＨＰＯ4水溶液（１００ｍＮ、２００ｍＬ）を室温にて添加し、１０時間反応させた。次に、得られた反応物を遠心分離により分離洗浄することにより、低結晶性ヒドロキシアパタイト粒子を得た。【００６１】
２．高結晶性ヒドロキシアパタイト粒子の調製
上記で得られた低結晶性ヒドロキシアパタイト粒子を、次に示す方法によって焼成することで高結晶性ヒドロキシアパタイトナノ粒子を作製した。
まず、融着防止剤として、０．５ｇのポリアクリル酸（ＡＬＤＲＩＣＨ社製、重量平均分子量１５，０００ｇ／ｍｏｌ）を含むｐＨ７．０の水溶液（以下、水溶液Ａ）１００ｍＬに、０．５ｇの低結晶性ヒドロキシアパタイトナノ粒子を分散させることで、同粒子表面にポリアクリル酸を吸着させた。次に、上記で調製した分散液に、水酸化カルシウム〔Ｃａ（ＯＨ）2〕飽和水溶液５００ｍＬを添加することで、同粒子表面にポリアクリル酸カルシウムを析出させた。結果として生じる沈澱物を回収し、減圧下８０℃にて乾燥させることで、混合粒子を取得した。【００６２】
上記混合粒子をルツボに入れ、焼結温度８００℃にて一時間焼結を行なった。この際、ポリアクリル酸カルシウムは熱分解し、酸化カルシウム〔ＣａＯ〕となった。【００６３】
次に、上記で調製した水溶液Ａ５００ｍＬに得られた焼結体を懸濁し、遠心分離により分離洗浄し、更に蒸留水に懸濁し、同様に遠心分離により分離洗浄を行なうことによって、融着防止剤および硝酸アンモニウムを除去し、高結晶性ヒドロキシアパタイトナノ粒子を回収した。【００６４】
得られた高結晶性ヒドロキシアパタイトナノ粒子を走査型電子顕微鏡にて観察して平均粒径を測定した結果、同平均粒径は４８ｎｍであった。なお、走査型電子顕微鏡は、日本電子株式会社製、モデル名ＪＳＭ−６３０１Ｆを用いて、倍率９０，０００倍で観察を行った。【００６５】
（走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析）
ＨＡｐのサイズおよび形状をＳＥＭ（ＪＳＭ−６３０１Ｆ；  ＪＥＯＬ  Ｌｔｄ．，  Ｊａｐａｎ，  Ｔｏｋｙｏ）により観察した。【００６６】
（免疫化）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊを２週間の間隔（０日および１４日）で２回ｉ．ｄ．（尾基底部）により免疫化した。抗原特異的ＥＬＩＳＡのために、血液サンプルを１４日目および２８日目に採取した。ワクチン接種の間および出血の間、マウスをケタミンで麻酔した。抗原をロードしたアラムまたはＨＡｐを免疫化前に１時間以上回転した。アラムを免疫化のために０．６７ｍｇ／マウスで使用した。【００６７】
（Ａｂ力価）
ＥＬＩＳＡのために、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中で、スプリットＨＡワクチン化群およびＷＶワクチン化群に関しては１μｇ／ｍＬのスプリットＨＡで、ＯＶＡワクチン化群に関しては１０μｇ／ｍＬのＯＶＡで、およびＨＢワクチン化群に関しては１μｇ／ｍＬのＨＢで、９６ウェルプレートをコーティングした。ウェルを１％ＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でブロックし、免疫化マウス由来の希釈された血清を抗原でコーティングされたプレート上でインキュベートした。洗浄後、ヤギ抗マウス全ＩｇＧコンジュゲート化セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ１コンジュゲート化ＨＲＰまたはヤギ抗マウスＩｇＧ２ｃコンジュゲート化ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｈｅｃｈ）を添加し、１時間室温でインキュベートした。さらに洗浄した後、プレートを３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で３０分間インキュベートし、反応を１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で停止させ、次いで、吸光度を測定した。Ａｂ力価を計算した。０．２の吸光度（ＯＤ）を陽性サンプルのカットオフ値として設定した。【００６８】
（ウイルス中和力価）
免疫化マウスの血清をＲＤＥ  ＩＩ（Ｄｅｎｋａ−Ｓｅｉｋｅｎ）と混合し、３７℃で一晩インキュベートした。５６℃で１時間さらにインキュベートした後、１０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、０．２％ウシアルブミンおよび１０μｇ／ｍＬトリプシンを含有するＭＥＭ培地中の系列希釈した血清と最終感染力価が１００  ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスとを３０分間３７℃でインキュベートした。その後、これらをメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞に添加した。３７℃で５％ＣＯ２と共にインキュベーションした４日後、ＭＤＣＫ細胞を１０分間室温で１０％ホルマリンで固定した。細胞をナフトールブルーブラック溶液（ナフトールブルーブラック０．５ｇ、酢酸ナトリウム０．５ｇ、酢酸４５ｍＬおよび蒸留水４５５ｍＬ）で３０分間室温で染色した。染色した細胞を水で十分に洗浄して、その後乾燥させた。次いで、０．１Ｍ  ＮａＯＨを細胞に添加し、マイクロプレートリーダーにおいてプレートを６３０ｎｍで読み取った。ウイルス中和力価を陽性コントロールおよび陰性コントロールの平均よりも高い吸光度を与えた最大希釈率により決定した。【００６９】
（マクロファージのインビトロでの刺激）
マクロファージの調製のために、マウスを３ｍＬの４％（ｗ／ｖ）チオグリコレート（ＳＩＧＭＡ）溶液をｉ．ｐ．で注射した。４日後マクロファージを腹腔から回収し、９６ウェルプレート上に蒔いた。マクロファージを５０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで１５時間プライミングし、８時間アジュバントで刺激した。上清中のＩＬ−１βまたはＴＮＦαをＥＬＩＳＡにより測定した。【００７０】
（統計学的分析）
群の間の統計学的有意性（Ｐ＜０．０５）をＤｕｎｎｅｔ多重比較検定またはｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定によって決定した。【００７１】
（実施例１：数百ナノメートルのＨＡｐは、他の大きいＨＡｐまたは小さいＨＡｐよりも優れたアジュバント活性を有する。）
本実施例では、本発明者らは、数百ナノメートルのＨＡｐは、他の大きいＨＡｐまたは小さいＨＡｐよりも優れたアジュバント活性を有するかどうかを調べた。基本的な実験手順は（材料および方法）に記載の通りに行った。【００７２】
ＨＡｐの粒子サイズとアジュバント活性との間の関係を調べるために、本発明者らは、まず、平均で約４０ｎｍ（Ｓ４０）、約１００ｎｍ（Ｓ１００）、約１７０ｎｍ（Ｓ１７０）、約４００ｎｍ（Ｓ４００）、約１．８μｍ（Ｓ１８００）および約５μｍ（Ｓ５０００）を含むナノメートル〜マイクロメートルの範囲のサイズを有する球状のＨＡｐを調製した（表１および図１Ａ〜１Ｆ）。【００７３】
（表１）
ＨＡｐサイズを、４０，０００倍の倍率でＳＥＭで撮影した写真上の１０８点のＨＡｐの長径の平均値（平均粒径）により決定した。形状、サイズおよび標準偏差（ＳＤ）を各ＨＡｐについて示した。したがって、表１中「サイズ」との表記は「平均粒径」を指す。【００７４】
【表１】
2017047095.tif 000002
【００７５】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、インフルエンザスプリットＨＡワクチン（ＳＶ）＋３種の異なる用量（０．２ｍｇ、１ｍｇまたは５ｍｇ）の上記ＨＡｐで２回免疫化し、抗原特異的抗体応答を試験した。約１００〜約４００ｎｍの粒子は、これより小さい（約４０ｎｍ）およびこれより大きい（約１．８μｍまたは約５μｍ）サイズの粒子よりも高い抗体応答を誘導した（図２Ａ〜２Ｃ）。ＩｇＧサブクラス分析により、ＨＡｐがＩｇＧ２ｃよりもＩｇＧ１の産生を誘導したことも明らかになり、これはＨＡｐがＴｈ２偏向性免疫応答を生じさせたことを示唆している（図２Ｂ、２Ｃ）。さらに、ＳＶ＋約１００〜約４００ｎｍの粒子による免疫化は、より高いウイルス中和力価を示した（図２Ｄ）。これらの結果は、数百ナノメートルのサイズの球状ＨＡｐが、他の大きいＨＡｐまたは小さいＨＡｐよりも優れたアジュバント活性を有することを実証した。【００７６】
以上から、平均粒径約４０ｎｍより大きく約１８００ｎｍ未満、好ましくは約１００〜約４００ｎｍのリン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト等）が免疫アジュバントとして優れた活性を有していることが実証された。【００７７】
（実施例２：桿状ＨＡｐもまたアジュバント活性を有する。）
本実施例では、本発明者らは、ヒドロキシアパタイトの形状の相違が免疫原性能等に与える影響について試験した。そこで、本実施例では、桿状のものを使用して実施例１で調べた球状のものとの相違を比較した。使用したヒドロキシアパタイトの形状を変更したこと以外は、実施例１に記載の手法に準じて（材料および方法）に記載の通りに行った。【００７８】
本発明者らは、約１２０ｎｍ（Ｒ１２０）、約１６０ｎｍ（Ｒ１６０）、および約２５０ｎｍ（ｒ２５０）のサイズのＨＡｐを含む桿状ＨＡｐもまた調製した（図３、表１）。【００７９】
球状ＨＡｐと同様に、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＳＶ＋上記桿状のＨＡｐで２回免疫化し、抗原特異的抗体応答を決定した。これらの桿状ＨＡｐは、ＳＶ単独での免疫化よりも顕著に高い全ＩｇＧ、ＩｇＧ１（図４Ａ〜４Ｃ）、およびウイルス中和力価（図４Ｄ）も誘導し、これは、桿状のＨＡｐもアジュバント活性を示し、ＳＶワクチンに対するＴｈ２型応答を誘導したことを示唆している。まとめると、ワクチンアジュバントとしてのＨＡｐの最適なサイズは、数百ナノメートルであり、球状および桿状の両方がＳＶワクチンに対して同様のアジュバント活性を有している。【００８０】
したがって、アジュバント活性については、形状はサイズの大小ほどアジュバント活性には影響しないことが分かった。【００８１】
（実施例３：桿状ＨＡｐは、マクロファージにおいてより高いＩＬ−１βの産生を誘導する。）
本実施例では、桿状ヒドロキシアパタイトについて、マクロファージにおいてより高いＩＬ−１βの産生の能力について更に試験した。本実施例もまた、（材料および方法）に記載の通りに行った。【００８２】
いくつかの報告では、シリカまたはアラムなどの粒子がマクロファージおよび樹状細胞を刺激して、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を介してＩＬ−１βを産生させることが実証された。さらに、最近の報告では、桿状または針状のＨＡｐ結晶が、ＮＬＲＰ３インフラマソーム依存的な態様でマクロファージからのＩＬ−１βおよびＩＬ−１８などの炎症促進性サイトカインの強い分泌を刺激し、他方で、球状ＨＡｐ結晶は、これらのサイトカインの誘導に対して最小限の影響をもたらすことが示された（Jin,  C.,  et  al.,  NLRP3  inflammasome  plays  a  critical  role  in  the  pathogenesis  of  hydroxyapatite-associated  arthropathy.  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A,  2011.  108(36):  p.  14867-72.）。したがって、ＨＡｐがＩＬ−１βを産生する能力を試験するために、リポ多糖（ＬＰＳ）プライミングを伴って、チオグリコレート誘導性腹腔マクロファージを球状または桿状のＨＡｐで刺激した。報告されたように桿状ＨＡｐは、球状ＨＡｐよりも高いＩＬ−１βの産生を誘導した（図５Ａ）。さらに、より弱いアジュバント活性を示した大きいＨＡｐ（Ｓ５０００）（図２−１および図２−２）は、顕著なＩＬ−１β産生を誘導しなかった。本発明者らは、Ｃａｓｐａｓｅ１−／−マウス由来の腹腔マクロファージを使用することによって、ＩＬ−１β産生におけるインフラマソームの関与をさらに試験した。Ｃａｓｐａｓｅ１は、ｐｒｏ−ＩＬ−１βを切断して成熟形態にするインフラマソームの必須構成成分である。アラムにおいて観察されるように、ＨＡｐがＩＬ−１βを誘導する能力は、Ｃａｓｐａｓｅ１に完全に依存的であり（図５Ｂ）、他方で、ＬＰＳにより誘導されるＴＮＦα産生は、Ｃａｓｐａｓｅ１欠損により影響されなかった（図７Ａ−Ｂ）。これは、ＨＡｐがインフラマソーム依存的な態様でＩＬ−１β産生を誘導することを示している。【００８３】
（実施例４：ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は、ＨＡｐのアジュバント活性に要求されない。）
次に本実施例では、本発明者らは、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は、ＨＡｐのアジュバント活性に要求されないことを実証するために試験を行った。本実施例もまた、（材料および方法）に記載の通りに行った。【００８４】
最後に本発明者らは、Ｎｌｒｐ３−／−マウス、Ａｓｃ−／−マウスまたはＣａｓｐａｓｅ１−／−マウスを免疫化することによって、インビボでのＨＡｐのアジュバント活性のためのＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化の必要性を調べた。この実験に関して、本発明者らは、球状および桿状のＨＡｐの各々の代表としてＳ１７０およびＲ１６０を選択した。Ｎｌｒｐ３、ＡｓｃまたはＣａｓｐａｓｅ１を欠いているマウスを、ＯＶＡが負荷充填（ｌｏａｄ）されたＳ１７０、Ｒ１６０、またはアラムで二回ｉ．ｄ．により免疫化し、ＯＶＡ特異的抗体応答を試験した。本発明者らが試験したすべてのノックアウトマウスは、Ｃａｓｐａｓｅ１の非存在下においてインビトロでマクロファージからのＩＬ−１βを完全に抑制するにもかかわらず（図５Ａ、５Ｂ）、同じ量のＯＶＡ特異的抗体力価を示した（図６Ａ〜６Ｃ）。これらの結果は、ＨＡｐのアジュバント活性が、インビボでのＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化に依存しないことを実証した。【００８５】
（考察）
アラムなどの代謝できないアジュバントは長期間保持され、注射部位における硬化を引き起こす場合がある。したがって、代謝できないアジュバントは、注射部位における潜在的な安全性および反応源性の問題を有する。骨または歯の主な構成成分であるＨＡｐは、生体適合性材料であると予測される。実際、ＨＡｐは、酸性または塩基性媒体中で可溶化され（JARCHO,  M.,  Calcium  Phosphate  Ceramics  as  Hard  Tissue  Prosthetics.）、マクロファージにより分解されることが示された。【００８６】
粒子サイズは、アジュバント活性に重要である（Oyewumi,  M.O.,  A.  Kumar,  and  Z.  Cui,  Nano-microparticles  as  immune  adjuvants:  correlating  particle  sizes  and  the  resultant  immune  responses.  Expert  Rev  Vaccines,  2010.  9(9):  p.  1095-107.、Yan,  S.,  W.  Gu,  and  Z.P.  Xu,  Re-considering  how  particle  size  and  other  properties  of  antigen-adjuvant  complexes  impact  on  the  immune  responses.  J  Colloid  Interface  Sci,  2013.  395:  p.  1-10.）。例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が捕捉されたポリ（ｄ，ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロ粒子またはＢ型肝炎表面抗原がロードされたポリ乳酸（ＰＬＡ）マイクロ粒子は、ナノ粒子よりも高い血清ＩｇＧ抗体応答を誘導する（Gutierro.,  I.,  et  al.,  Size  dependent  immune  response  after  subcutaneous,  oral  and  intranasal  administration  of  BSA  loaded  nanospheres.  Vaccine,  2002.  21:  p.  67-77.、Kanchan,  V.  and  A.K.  Panda,  Interactions  of  antigen-loaded  polylactide  particles  with  macrophages  and  their  correlation  with  the  immune  response.  Biomaterials,  2007.  28(35):  p.  5344-5357.）。反対に、破傷風トキソイドがロードされたスルホブチル化ポリ（ビニルアルコール）グラフトＰＬＧＡナノ粒子は、そのマイクロ粒子よりも高い抗体応答をもたらす（Jung,  T.,  et  al.,  Tetanus  toxoid  loaded  nanoparticles  from  sulfobutylated  poly(vinyl  alcohol)-graft-poly(lactide-co-glycolide):  evaluation  of  antibody  response  after  oral  and  nasal  application  in  mice.  Pharm  Res,  2001.  18(3):  p.  352-60.）。異なるサイズのオボアルブミン（ＯＶＡ）コンジュゲート化ポリスチレンビーズ（約２０ｎｍ、約４０ｎｍ、約１００ｎｍおよび約５００ｎｍ、ならびに約１μｍおよび約２μｍ）により誘導された免疫応答の比較において、約４０ｎｍが、最も強いＯＶＡ特異的抗体応答を誘導した（Fifis,  T.,  et  al.,  Size-Dependent  Immunogenicity:  Therapeutic  and  Protective  Properties  of  Nano-Vaccines  against  Tumors.  The  Journal  of  Immunology,  2004.  173(5):  p.  3148-3154.）。これらの報告は、アジュバントとして各粒子について最適なサイズの範囲が存在するように思われることを示唆した。本発明者らの研究において、約４０ｎｍ〜約５μｍに及ぶ異なるサイズのＨＡｐをアジュバント活性について比較した（図２−１および図２−２）。本発明者らの知見は、約１００〜約４００ｎｍがＨＡｐのアジュバント活性の最適なサイズ範囲であることを実証した。しかしながら、形状はアジュバント活性に必須ではない（図４−１および図４−２）。【００８７】
粒子アジュバントの作用メカニズムは、デポー効果、抗原提示細胞への抗原の取り込み、および自然免疫の活性化と考えられる。いくつかの報告では、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は、アラムのアジュバント活性に必須であることを実証した（Eisenbarth,  S.C.,  et  al.,  Crucial  role  for  the  Nalp3  inflammasome  in  the  immunostimulatory  properties  of  aluminium  adjuvants.  Nature,  2008.  453(7198):  p.  1122-6.、Li,  H.,  et  al.,  Cutting  Edge:  Inflammasome  Activation  by  Alum  and  Alum's  Adjuvant  Effect  Are  Mediated  by  NLRP3.  The  Journal  of  Immunology,  2008.  181(1):  p.  17-21.）。他の粒子アジュバントもまたインビトロでＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化するため、ＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化がアジュバント活性に必要であると考えられる。しかしながら、他の報告では、アラムを含む粒子のアジュバント活性は、ＮＬＲＰ３インフラマソームに依存しないことが示された（Coban,  C.,  et  al.,  Immunogenicity  of  whole-parasite  vaccines  against  Plasmodium  falciparum  involves  malarial  hemozoin  and  host  TLR9.  Cell  Host  Microbe,  2010.  7(1):  p.  50-61.、McKee,  A.S.,  et  al.,  Alum  induces  innate  immune  responses  through  macrophage  and  mast  cell  sensors,  but  these  sensors  are  not  required  for  alum  to  act  as  an  adjuvant  for  specific  immunity.  J  Immunol,  2009.  183(7):  p.  4403-14.、Franchi,  L.  and  G.  Nunez,  The  Nlrp3  inflammasome  is  critical  for  aluminium  hydroxide-mediated  IL-1beta  secretion  but  dispensable  for  adjuvant  activity.  Eur  J  Immunol,  2008.  38(8):  p.  2085-9.）。したがって、本発明者らは、ＨＡｐのアジュバント活性におけるＮＬＲＰ３インフラマソームの関与を試験した。ＨＡｐに誘導される炎症促進性サイトカインＩＬ−１βの産生が、インビトロでＣａｓｐａｓｅ１の非存在下で完全に抑制されたとしても、インビボではＮＬＲＰ３インフラマソーム構成成分であるＮｌｒｐ３、ＡｓｃまたはＣａｓｐａｓｅ１の非存在下で顕著な抗体応答をもたらした（図５、６）。注目すべきは、アラムのアジュバント活性は、本実施例においてＮｌｒｐ３、ＡｓｃまたはＣａｓｐａｓｅ１が存在しないことにより影響されなかったことである。これらの結果は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化は、ＨＡｐおよびアラムの両方の粒子のアジュバント活性に必要とされないことを明らかにした。【００８８】
まとめると、本実施例の結果は、サイズ範囲は、インビボで粒子のアジュバント活性に影響を与え、制御する主要な因子であることを示した。自然免疫シグナル伝達は、通常、適応免疫応答の誘導に必須であるが、本実施例の結果は、ＮＬＲＰ３インフラマソーム依存性ＩＬ−１β産生は、アラムおよびＨＡｐなどの粒子アジュバントの絶対条件ではないことを示した。これらの知見は、さらなる粒子アジュバントの開発を設計するために重要な意味を与える。【００８９】
（参考文献一覧：なお、これらの一覧にある文献は、本発明に対する先行技術であることを認める趣旨で掲載するものではない。）
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以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は2015年９月17日に日本国に出願した特願2015-183631に対して優先権を主張するものであり、その内容はその全体が本明細書において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【００９１】
本発明は、製薬産業において産業上の利用可能性を見出す。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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