(57)【要約】【課題】  ヒトＮｏｔｃｈ４に対して中和活性を有し得る抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片、および、これらを有効成分として含む医薬組成物を提供する。【解決手段】  本発明者らは、ヒトＮｏｔｃｈ４に対して高い中和活性及び結合親和性を有する、マウス抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体を取得し、当該マウス抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を特定した。これにより、重鎖及び軽鎖の可変領域に前記マウス抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体のＣＤＲ配列を含むヒト化抗体の作製が可能となった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、以下の（i）〜（vii）のいずれかから選ばれる抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片：
（i）前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体、
（ii）前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体、
（iii）前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体、
（iv）前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む抗体、
（v）前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号５１のアミノ酸配列を含む抗体、
（vi）前記重鎖の可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体、および
（vii）前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項３】
請求項１に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項４】
請求項１に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項５】
請求項１に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項６】
請求項１に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号５１のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項７】
請求項１に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項８】
請求項１に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記重鎖の定常領域、および、前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来の配列を含む、
抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項１０】
請求項９に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記重鎖の定常領域がヒトＩｇＧの定常領域を含む、
抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項１１】
請求項１０に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧの定常領域が、ヒトＩｇＧ２の定常領域である、
抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧ２の定常領域が、Ｖ２３４Ａおよび／またはＧ２３７Ａの変異を有する、
抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項１３】
請求項９に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記重鎖の定常領域のカルボキシ末端のリシン残基が人為的に除去されている、
抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項１４】
請求項９に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
前記軽鎖の定常領域がヒトＩｇκの定常領域を含む、
抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片を含む、
医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の医薬組成物であって、
製薬学的に許容される担体をさらに含む、
医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の医薬組成物であって、
非小細胞肺がんの治療のために用いられる、
医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１５または１６に記載の医薬組成物であって、
甲状腺がんの治療のために用いられる、
医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１５または１６に記載の医薬組成物であって、
前立腺がんの治療のために用いられる、
医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１５または１６に記載の医薬組成物であって、
肝細胞がんの治療のために用いられる、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＮｏｔｃｈ４に対して結合する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎｏｔｃｈは様々な組織細胞の運命決定に寄与している分子であり、初期発生時期、胎生期、出生後の各段階で分化、増殖、生存、などに関与することが示されている。Ｎｏｔｃｈファミリーとしては、Ｎｏｔｃｈ１，Ｎｏｔｃｈ２，Ｎｏｔｃｈ３，Ｎｏｔｃｈ４の４種類のレセプターと、Ｊａｇｇｅｄ１，Ｊａｇｇｅｄ２，ＤＬＬ１，ＤＬＬ３，ＤＬＬ４の５種類のリガンドが報告されている。隣接する細胞上に発現するＮｏｔｃｈレセプターとＮｏｔｃｈリガンドが結合することで、レセプターの細胞外ドメイン下部に存在するＮＲＲドメインがＴＡＣＥによって切断され、それによる細胞内ドメインの構造変化により、細胞内ドメインはγｓｅｃｒｅｔａｓｅによって切断される。この結果形成されるＮｏｔｃｈ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ（ＮＩＣ）ドメインは核内に移行し、転写因子ＣＳＬとヘテロダイマーを形成して、ＨｅｓファミリーやＨｅｙファミリーなど標的分子を発現誘導する。これら下流分子が更に様々な遺伝子を発現誘導し、結果としてＮｏｔｃｈシグナルは幹細胞や前駆細胞の維持、分化、細胞周期休止、細胞運命決定等に寄与している（非特許文献１）。【０００３】
Ｎｏｔｃｈは腫瘍形成にも関与していることが知られている。ｔ（７；９）クロモゾーム転座によるＮｏｔｃｈ１変異が、ｐｒｅ−Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｔ−ＡＬＬ）の発症に関係していることが最初に報告された。また、自然腫瘍発症モデルであるＭｏｕｓｅ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＴＶ）のゲノム挿入部位はＩｎｔ３（Ｎｏｔｃｈ４細胞内ドメイン）であることが報告されており、Ｉｎｔ３を強制発現させたトランスジェニックマウスでは、乳がんや唾液腺がんなどの上皮細胞がんを引き起こすことが報告されている（非特許文献２）。Ｎｏｔｃｈ４は、ヒトにおいても、乳がん（非特許文献３）、メラノーマ（非特許文献４）、胃がん（非特許文献５）、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）（非特許文献６）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）（非特許文献７）、神経膠腫（非特許文献８）、肝細胞がん（非特許文献９）、肺がん（非特許文献１０）、腎がん（非特許文献１１）、カポジ肉腫（非特許文献１２）などの発癌、進行または転移に関与していることが報告されている。【０００４】
Ｎｏｔｃｈシグナルは腫瘍内血管新生にも寄与している。血管内皮細胞にはＮｏｔｃｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとして、Ｎｏｔｃｈ１，Ｎｏｔｃｈ４が発現しており、Ｌｉｇａｎｄとしては、ＤＬＬ４、Ｊａｇｇｅｄ１の発現が確認されている。新生血管の先端に位置するＴｉｐ  ｃｅｌｌはＶＥＧＦ刺激でＤＬＬ４を高発現し、隣接するＳｔａｌｋ細胞のＮｏｔｃｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒにシグナルを入れることで、血管伸長が起きる。一方で、Ｊａｇｇｅｄ１はＤＬＬ４とＮｏｔｃｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒを取り合い、ＤＬＬ４のＮｏｔｃｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとの結合を阻害する。Ｊａｇｇｅｄ１からのシグナルはＤＬＬ４に比較して弱いため、Ｊａｇｇｅｄ１との結合によりＮｏｔｃｈシグナルは抑制される。この二つのリガンドの空間的に異なる発現パターンによってＮｏｔｃｈシグナルの強弱が調整され、血管新生がコントロールされている（非特許文献１３）。【０００５】
ＤＬＬ４阻害抗体については作製報告がなされており、ＤＬＬ４阻害抗体を用いてＤＬＬ４からのシグナルを阻害すると、腫瘍内部において血流のない未熟な血管形成が更新し、腫瘍増殖阻害が誘導される。これはＶＥＧＦ阻害剤が血管内皮細胞の増殖を阻害し、血管形成を抑制するという現象とは全く異なり、Ｎｏｔｃｈシグナルは新たな血管新生阻害剤の標的として注目されている（非特許文献１４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒａｄｔｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５，２４７−５３．
【非特許文献２】Ｊｈａｐｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ６，３４５−５５
【非特許文献３】Ｎａｇａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ３４，６９−８０
【非特許文献４】Ｈａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７０，１０３４０−５０
【非特許文献５】Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４０１，１６５−７４
【非特許文献６】Ｎｗａｂｏ  Ｋａｍｄｊｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｂｌｏｏｄ  １１８，３８０−９
【非特許文献７】Ｎｗａｂｏ  Ｋａｍｄｊｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２，ｅ７３
【非特許文献８】Ｄｅｌｌ’Ａｌｂａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １６，２０４−１６
【非特許文献９】Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ  Ｐａｎｃｒｅａｔ  Ｄｉｓ  Ｉｎｔ.  １２，２８６−９４
【非特許文献１０】Ｊｕｓｔｉｌｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７，ｅ３５０４０
【非特許文献１１】Ｂｏｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｓｕｒｇ.  ４４，２０３１−６
【非特許文献１２】Ｃｕｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４,６３３３−４４
【非特許文献１３】Ｂｅｎｅｄｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ  １３７，１１２４−３５
【非特許文献１４】Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｎａｔｕｒｅ  ４４４，１０８３−７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒトＮｏｔｃｈ４に対して中和活性を有し得る抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片、および、これらを有効成分として含む医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトＮｏｔｃｈ４に対して高い中和活性及び結合親和性を有する、マウス抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体を取得することに成功した。そして、本発明者らは、当該マウス抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ：  ＣＤＲ）の配列を特定することにより、重鎖及び軽鎖の可変領域に前記マウス抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体のＣＤＲ配列を含むヒト化抗体の作製を可能とし、本発明を完成するに到った。【０００９】
すなわち本発明は、一実施形態において、次の発明に関する。
（１）抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、
（ａ）配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１７または配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；および、
（ｆ）配列番号２２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む、
抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００１０】
（２）（１）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、以下の(i)~(vii)のいずれかから選ばれる抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片：
（i）前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体、
（ii）前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体、
（iii）前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体、
（iv）前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む抗体、
（v）前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号５１のアミノ酸配列を含む抗体、
（vi）前記重鎖の可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体、および
（vii）前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体。【００１１】
（３）（２）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００１２】
（４）（２）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００１３】
（５）（２）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００１４】
（６）（２）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００１５】
（７）（２）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号５１のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００１６】
（８）（２）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００１７】
（９）（２）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００１８】
（１０）（１）〜（９）のいずれか一つに記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記重鎖の定常領域、および、前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来の配列を含む、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００１９】
（１１）（１０）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、重鎖の定常領域がヒトＩｇＧの定常領域を含む、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００２０】
（１２）（１１）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記ヒトＩｇＧの定常領域が、ヒトＩｇＧ２の定常領域である、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００２１】
（１３）（１２）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記ヒトＩｇＧ２の定常領域が、Ｖ２３４Ａおよび／またはＧ２３７Ａの変異を有する、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００２２】
（１４）（１０）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記重鎖の定常領域のカルボキシ末端のリシン残基が人為的に除去されている、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００２３】
（１５）（１０）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記軽鎖の定常領域がヒトＩｇκの定常領域を含む、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００２４】
（１６）（１）〜（１５）のいずれか一つに記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片を含む、医薬組成物。【００２５】
（１７）（１６）に記載の医薬組成物であって、製薬学的に許容される担体をさらに含む、医薬組成物。【００２６】
（１８）（１７）に記載の医薬組成物であって、非小細胞肺がんの治療のために用いられる、医薬組成物。【００２７】
（１９）（１７）に記載の医薬組成物であって、甲状腺がんの治療のために用いられる、医薬組成物。【００２８】
（２０）（１７）に記載の医薬組成物であって、前立腺がんの治療のために用いられる、医薬組成物。【００２９】
（２１）（１７）に記載の医薬組成物であって、肝細胞がんの治療のために用いられる、医薬組成物。【００３０】
また、本発明は、別の一実施形態において、次の発明に関する。
（１’）抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、以下の(i)~(vii)のいずれかから選ばれる抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片：
（i）前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体、
（ii）前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体、
（iii）前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体、
（iv）前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む抗体、
（v）前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号５１のアミノ酸配列を含む抗体、
（vi）前記重鎖の可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体、および
（vii）前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体。【００３１】
（２’）（１’）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００３２】
（３’）（１’）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００３３】
（４’）（１’）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００３４】
（５’）（１’）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００３５】
（６’）（１’）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号５１のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００３６】
（７’）（１’）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００３７】
（８’）（１’）に記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００３８】
（９’）（１’）〜（８’）のいずれか一つに記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記重鎖の定常領域、および、前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来の配列を含む、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００３９】
（１０’）（９’）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、重鎖の定常領域がヒトＩｇＧの定常領域を含む、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００４０】
（１１’）（１０’）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記ヒトＩｇＧの定常領域が、ヒトＩｇＧ２の定常領域である、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００４１】
（１２’）（１１’）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記ヒトＩｇＧ２の定常領域が、Ｖ２３４Ａおよび／またはＧ２３７Ａの変異を有する、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００４２】
（１３’）（９’）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記重鎖の定常領域のカルボキシ末端のリシン残基が人為的に除去されている、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００４３】
（１４’）（９’）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記軽鎖の定常領域がヒトＩｇκの定常領域を含む、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００４４】
（１５’）（１’）〜（１４’）のいずれか一つに記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片を含む、医薬組成物。【００４５】
（１６’）（１５’）に記載の医薬組成物であって、製薬学的に許容される担体をさらに含む、医薬組成物。【００４６】
（１７’）（１６’）に記載の医薬組成物であって、非小細胞肺がんの治療のために用いられる、医薬組成物。【００４７】
（１８’）（１６’）に記載の医薬組成物であって、甲状腺がんの治療のために用いられる、医薬組成物。【００４８】
（１９’）（１６’）に記載の医薬組成物であって、前立腺がんの治療のために用いられる、医薬組成物。【００４９】
（２０’）（１６’）に記載の医薬組成物であって、肝細胞がんの治療のために用いられる、医薬組成物。【００５０】
さらに、本発明は、別の一実施形態において、次の発明に関する。
（１”）抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００５１】
（２”）抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００５２】
（３”）抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００５３】
（４”）抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４９のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００５４】
（５”）抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号５１のアミノ酸配列を含む抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００５５】
（６”）抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３９のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４５のアミノ酸配列を含む抗体またはそのNotch4結合断片。【００５６】
（７”）抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片は重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖の可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖の可変領域が配列番号４７のアミノ酸配列を含む抗体またはそのNotch4結合断片。【００５７】
（８”）（１”）〜（７”）のいずれか一つに記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記重鎖の定常領域、および、前記軽鎖の定常領域がヒト抗体由来の配列を含む、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００５８】
（９”）（８”）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、重鎖の定常領域がヒトＩｇＧの定常領域を含む、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００５９】
（１０”）（９”）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記ヒトＩｇＧの定常領域が、ヒトＩｇＧ２の定常領域である、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００６０】
（１１”）（１０”）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記ヒトＩｇＧ２の定常領域が、Ｖ２３４Ａおよび／またはＧ２３７Ａの変異を有する、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００６１】
（１２”）（１０”）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記重鎖の定常領域のカルボキシ末端のリシン残基が人為的に除去されている、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００６２】
（１３”）（８”）に記載の抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片であって、前記軽鎖の定常領域がヒトＩｇκの定常領域を含む、抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片。【００６３】
（１４”）（１”）〜（１３”）のいずれか一つに記載の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体またはそのＮｏｔｃｈ４結合断片を含む、医薬組成物。【００６４】
（１５”）（１４”）に記載の医薬組成物であって、製薬学的に許容される担体をさらに含む、医薬組成物。【００６５】
（１６”）（１５”）に記載の医薬組成物であって、非小細胞肺がんの治療のために用いられる、医薬組成物。【００６６】
（１７”）（１５”）に記載の医薬組成物であって、甲状腺がんの治療のために用いられる、医薬組成物。【００６７】
（１８”）（１５”）に記載の医薬組成物であって、前立腺がんの治療のために用いられる、医薬組成物。【００６８】
（１９”）（１５”）に記載の医薬組成物であって、肝細胞がんの治療のために用いられる、医薬組成物。【００６９】
上記に挙げた本発明の特徴の一又は複数を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、抗体Ｂの濃度とＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（％）の値との関係を示す。
【図２】図２は、Ｃａｌｕ６皮下移植モデルにおける抗体Ｂの抗腫瘍効果および血液灌流抑制効果を示す。図２ＡはＣａｌｕ６皮下移植モデルにおいて、Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧを１０ｍｇ／ｋｇ、又は、抗体Ｂを１、３又は１０ｍｇ／ｋｇで尾静脈投与したそれぞれの群における比腫瘍体積（ＲＴＶ）の変化を示す（Ｎ＝８，平均±標準誤差）。図２Ｂは、投与試験終了時（Ｄａｙ  ８）に採材した腫瘍のＨｏｅｃｈｓｔの蛍光面積を定量した結果を示す（Ｎ＝８  平均±標準誤差）（＊Ｐ＜０．０５  ｖｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ投与群（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定））。
【図３】図３は、Ｃａｌｕ６マウス皮下移植モデルにおける抗体Ｂとシスプラチンの併用による抗腫瘍効果を示す。コントロール（無処置）群、抗体Ｂ投与群（週２回尾静脈投与）、シスプラチン投与群（１回尾静脈投与）、抗体Ｂ（週２回尾静脈投与）＋シスプラチン（１回尾静脈投与）併用群の比腫瘍体積（ＲＴＶ）変化（Ｎ＝４、平均±標準誤差）（＊：Ｐ＜０．０５対コントロール群（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ，Ｄａｙ８，Ｄａｙ２４）、＃：Ｐ＜０．０５  シスプラチン１０ｍｇ／ｋｇ投与群対抗体Ｂ＋シスプラチン併用群（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、Ｄａｙ３６））。
【図４】図４は、ＦＴＣ２３８ヒト甲状腺癌細胞株皮下移植モデルにおける抗体Ｂとレンバチニブメシル酸塩の併用による抗腫瘍効果を示す。コントロール（無処置）群、抗体Ｂ投与群（週２回尾静脈投与）、レンバチニブメシル酸塩投与群（１日１回経口投与）、抗体Ｂ（週２回尾静脈投与）＋レンバチニブメシル酸塩（１日１回経口投与）併用群の比腫瘍体積（ＲＴＶ）変化（Ｎ＝５、平均±標準誤差）（＊：Ｐ＜０．０５ｖｓコントロール群（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ，Ｄａｙ１３）、＃：Ｐ＜０．０５単剤投与群ｖｓ抗体Ｂ＋レンバチニブメシル酸塩併用群（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ，Ｄａｙ１３））。
【図５】図５は、ＤＵ１４５ヒト前立腺癌細胞株皮下移植モデルにおける抗体Ｂとパクリタキセルの併用による抗腫瘍効果を示す。コントロール（無処置）群、抗体Ｂ投与群（週２回尾静脈投与）、パクリタキセル投与群（１日１回５日間尾静脈投与）、抗体Ｂ（週２回尾静脈投与）＋パクリタキセル（１日１回５日間尾静脈投与）併用群の腫瘍体積（ＴＶ）変化（Ｎ＝４、平均±標準誤差）（＊：Ｐ＜０．０５ｖｓコントロール群（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、Ｄａｙ５７）、＃：Ｐ＜０．０５単剤投与群ｖｓ抗体Ｂ＋パクリタキセル併用群（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ、Ｄａｙ５７）。
【図６】図６は、ヒト患者由来肝細胞癌皮下移植モデルにおける抗体Ｂとレンバチニブメシル酸塩の併用による抗腫瘍効果を示す。コントロール（３ｍＭ  ＨＣｌ投与）群、レンバチニブメシル酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ）投与群、ソラフェニブトシル酸塩（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群、抗体Ｂ（０.５ｍｇ／個体）＋レンバチニブメシル酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ）併用群の腫瘍体積（ＴＶ）変化（Ｎ＝１０、平均±標準誤差）（＊：Ｐ＜０．０５ｖｓコントロール群。ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ、Ｄａｙ１３）。
【図７】図７は、抗体Ｂの濃度と、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（％）の値との関係を示す。グラフは、独立した３試験の結果の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す）。
【図８】図８は、オーバーレイ表示した抗体ＢとヒトＮｏｔｃｈのＮＲＲドメインの相互作用のセンサーグラムを示す。（Ａ）ヒトＮｏｔｃｈ１−ＮＲＲ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ、（Ｂ）ヒトＮｏｔｃｈ２−ＮＲＲ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ、（Ｃ）ヒトＮｏｔｃｈ３−ＮＲＲ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ、（Ｄ）ヒトＮｏｔｃｈ４−ＮＲＲ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
本明細書において、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも１つの抗原認識部位を介して、糖質、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、タンパク質等の標的に特異的に結合可能な免疫グロブリン分子を指してよい。抗体は、完全体のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を指してよい。
【００７２】
抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ又はＩｇＭ（又はこれらのサブクラス）等の任意のクラスであってよく、特定のクラスに限定されない。重鎖（Ｈ鎖と呼ぶこともある）の定常領域の抗体アミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスに分類される。５つの主な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２というサブクラス（アイソタイプ）にさらに細分化され得る。異なるクラスの免疫グロブリンの対応する重鎖の定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれている。また、抗体の軽鎖（Ｌ鎖と呼ぶこともある）の種類にはλ鎖及びκ鎖が存在する。
【００７３】
一態様において、本発明の抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体は、ＩｇＧ抗体であってよく、例えば、ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ２抗体等であってよい。また、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片は、場合により、単量体、二量体又は多量体の形態であってよい。
【００７４】
本明細書において、抗体の抗原結合断片は、当該抗体の機能的、構造的断片であって、当該抗体が結合可能な抗原に対する結合性を保持しているものであれば特に限定されない。抗体の抗原結合断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１本鎖（ＳｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、及び、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の修飾構造体等が挙げられる。
【００７５】
抗体の抗原結合断片は、例えば、完全な抗体のタンパク質消化を介して得ることができ、又は組換え宿主細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞等の真核生物、又は、大腸菌等の原核生物）により直接産生させてもよい。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させることによってＦ（ａｂ’）２断片を形成させてもよい。また、Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆ（ａｂ’）２分子の組み立てを促進するロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成させてもよい。また、ｓｃＦｖを化学合成技術で生産する場合には、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖを遺伝子組換え技術で生産する場合には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、適切な宿主細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞等の真核生物、又は、大腸菌等の原核生物）に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の周知の操作により作製してもよい。その結果生じるｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を使用して単離してもよい。
【００７６】
抗体の可変領域は、抗体軽鎖の可変領域及び／又は抗体重鎖の可変領域を意味してよく、抗体の定常領域は、抗体軽鎖の定常領域及び／又は抗体重鎖の定常領域を意味してよい。重鎖及び軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られる３つのＣＤＲにより連結される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより、近傍に保持されており、他方の鎖におけるＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するための技術としては、限定はされないが、例えば、（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ５ｔｈ  ｅｄ．，  １９９１，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ）；及び（２）抗原−抗体複合体の結晶構造学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３：９２７−９４８）が挙げられる。これらのアプローチや、他のアプローチを組合せて用いてもよい。
【００７７】
「特異的に結合する」という用語は、当該技術分野において当業者に周知の用語であり、抗体等の、抗原やエピトープに対する特異的な結合を決定するための方法も周知である。例えば、特異的にＮｏｔｃｈ４のエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片は、他のエピトープ又は非エピトープ部分に結合するよりも、より大きな親和性、結合活性で、より迅速に、及び／又は、より長時間持続して、このＮｏｔｃｈ４エピトープに結合可能であると理解される。しかしながら、第１の標的に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、第２の標的に特異的に結合することを排除しない。
【００７８】
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体のポピュレーションから得られる抗体を意味してよい。すなわち、そのポピュレーションに含まれる個々の抗体は、若干存在し得る可能性のある天然の突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対するものであり、非常に特異的である。さらに、異なる抗原や異なるエピトープを標的とする典型的なポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープを標的とするものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体ポピュレーションから得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして限定的に解されるべきではない。
【００７９】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ等）の抗体、又は、それらの抗原結合断片であってよい。キメラ抗体は、例えば、非ヒト（例えば、マウス又はラット）抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に導入した抗体であり、例えば、可変領域は非ヒト抗体由来、定常領域はヒト抗体由来となっている抗体を指してよい。ヒト化抗体は、例えば、非ヒト抗体の超可変領域（相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ））ともいう）をヒト抗体に導入した抗体であり、例えば、ＣＤＲは非ヒト抗体由来、それ以外の抗体領域はヒト抗体由来となっている抗体を指してよい。ただし、本発明において、キメラ抗体とヒト化抗体の境界は必ずしも明確である必要はなく、キメラ抗体ともヒト化抗体とも呼びうるような状態であってもよい。
【００８０】
言うまでもなく、上記に例示したキメラ抗体又はヒト化抗体を、当該抗体の機能を保持させたまま（あるいは、当該抗体の機能を付加、向上させるために）適宜改変（例えば、抗体の修飾、又は、抗体のアミノ酸配列の部分的な置換、付加、欠失）した抗体も、本発明の抗体に含まれる。より具体的には、標的に結合した抗体の抗体依存性細胞障害活性（（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ：ＡＤＣＣ）活性））を高めるために、ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）技術により改変した抗体や、抗体の補体依存性細胞傷害活性（（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）活性）を高めるために、ＣＯＭＰＬＥＧＥＮＴ（登録商標）技術により改変した抗体、あるいは、これらの技術を併用して改変した抗体も、本発明の範囲に含まれる。また、抗体産生細胞により産生される抗体の不均一性を減少させるため、重鎖のカルボキシ末端（Ｃ末端）に位置するリシン（Ｌｙｓ）を遺伝子改変等の人為的方法によって欠失させた抗体も、本発明の範囲に含まれる。さらに、本発明の抗体のＣＤＲ配列を有する抗体結合部位と共に、異なる抗原に結合する抗原結合部位を併せ持つ二重特異性抗体（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ(２０１２)，ｍＡｂｓ  ４, １８２−９７）も本発明の範囲に含まれる。
【００８１】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片は、所望により、修飾してもよい。本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片の修飾は、（ａ）例えばシート又はヘリックスコンホメーション等の、修飾領域におけるアミノ酸配列の三次元的な構造；（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性の状態；又は、（ｃ）側鎖の容積の維持に対する修飾の効果、を変化させる修飾であってもよく、あるいはこれらの変化が明白に観察されないような修飾であってもよい。
【００８２】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片の修飾は、例えば、構成するアミノ酸残基の置換、欠失、付加等によって達成してよい。
【００８３】
本明細書において、アミノ酸とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体及び誘導体といった、非天然アミノ酸も含まれる。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体、アミノ酸誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等、生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；及び当業者に公知のアミノ酸の特性を有する、化学的に合成された化合物等が挙げられることを当然に理解する。非天然アミノ酸の例としては、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニン等）、Ｄ−アミノ酸（Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸等）、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン等）、側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）等が挙げられる。
【００８４】
天然に存在するアミノ酸残基は、例えば、一般的な側鎖特性に基づいて、次のグループに分類され得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００８５】
抗体又はその抗原結合断片を構成するアミノ酸配列の非保存的置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を他のグループに属するアミノ酸と交換することにより行ってもよい。より保存的な置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を同一グループの他のアミノ酸と交換することにより行ってもよい。同様に、アミノ酸配列の欠失又は置換を適宜行ってもよい。
【００８６】
抗体又はその抗原結合断片を構成するアミノ酸の修飾としては、例えば、糖によるグリコシル化、アセチル化又はリン酸化等の翻訳後修飾であってもよい。抗体は、その定常領域における保存された位置でグリコシル化され得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ−結合型又はＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、及び、アスパラギン−Ｘ−システイン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する糖質部分を酵素的に付加するための認識配列である。これらのトリペプチド配列のいずれかが抗体又はその抗原結合断片に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が存在する。Ｏ−結合型グリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又は、キシロースのいずれかの、ヒドロキシアミノ酸（例えば、セリン又はスレオニン）への結合であってよく、場合により、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリシンへの結合であってもよい。グリコシル化の条件（グリコシル化を、生物学的手法を用いて行う場合には、例えば、宿主細胞や細胞培地の種類、ｐＨ等）を、当業者は目的に応じて適宜、選択することができる。
【００８７】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片は、さらに、当業者に公知の技術常識に基づいて、その他の修飾方法により、単独又は組み合わせて、修飾されてよい。
【００８８】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片は、当業者に周知の方法によって産生されてよい。例えば、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片を産生するハイブリドーマを用いて抗体を産生させてよく、もしくは、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターを、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等に導入することによって抗体を産生させてもよい。
【００８９】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片は、当業者に公知の方法に従って、単離又は精製されたものであってよい。ここで、「単離された」または「精製された」は、自然の状態から、人為的に単離されたか、精製されたことを意味する。分子または組成物が自然に発生したものである場合、それが変化したかもしくは本来の環境から除去されたか、またはその両方であるとき、それは「単離された」かまたは「精製された」である。単離又は精製の方法の例としては、電気泳動的、分子生物学的、免疫学的又はクロマトグラフィー的手法等が挙げられ、具体的には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、又は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、あるいは、等電点電気泳動等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９０】
抗体又はその抗原結合断片の、抗原への結合特性（例えば、結合親和性および種交差反応性）を測定する方法は、当該技術分野において当業者に公知の方法を用いてよい。例えば、結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー、ＫｉｎＥｘＡバイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫測定法（ＩＧＥＮ社）、フローサイトメトリー、蛍光消光、蛍光転移、酵母ディスプレイ、及び/又は、免疫染色を使用して測定してよいが、これらに限定されない。抗体又はその抗原結合断片の、Ｎｏｔｃｈ４とそのリガンドの結合に対する中和活性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー、ＥＬＩＳＡ、及び/又は、フローサイトメトリーを使用して測定してよいが、これらに限定されない。抗体又はその抗原結合断片の、Ｎｏｔｃｈ４がそのリガンドの結合によりヒト生体内で誘導する、シグナル伝達や、細胞の分子発現応答もしくは機能性変化に対する中和活性は、例えば次のような方法で測定してよいが、これらに限定されない：（ｉ）レポーターアッセイによる、Ｎｏｔｃｈシグナル下流分子の発現変動の検出、（ｉｉ）ウェスタン・ブロット法による、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）やγセクレターゼによるＮｏｔｃｈ４の切断の検出、（ｉｉｉ）免疫細胞染色による、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣ）の核内移行の検出、（ｉｖ）Ｎｏｔｃｈ４を発現する血管内皮細胞などの正常細胞またはがん細胞を用いた細胞機能性評価。
【００９１】
本発明は、一態様において、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片を含む、医薬組成物であってよい。
【００９２】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、水性または乾燥製剤の形において、さらに、製薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／又は、安定剤を含んでよい。許容される担体、賦形剤、または安定剤には、例えば生理食塩水；リン酸、クエン酸、およびその他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；アミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリン類を含む、単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール類；ナトリウムのような、塩を形成する対イオン；またはTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）、もしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００９３】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、例えば、マイクロカプセル内、コロイド性薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、またはナノカプセル）内、またはマクロエマルション内に封入されてよい。抗体の投与を必要とするいずれの疾患にも適した放出特性を有する製剤において、抗体の持続放出投与が望まれる場合には、抗体のマイクロカプセル化が意図され得る。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸類、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩との共重合体、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）のような、分解性の乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される、注射用ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【００９４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。これは無菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【００９５】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、非小細胞肺がん、甲状腺がん、前立腺がんまたは肝細胞がんの治療に有用である可能性がある。すなわち、本発明は他の態様において、治療上有効量の、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片を対象に投与する工程を含む、非小細胞肺がん、甲状腺がん、前立腺がんまたは肝細胞がんの治療方法であってよい。また、本発明は他の態様において、非小細胞肺がん、甲状腺がん、前立腺がんまたは肝細胞がんの治療薬を製造するための、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片の使用であってもよい。
【００９６】
非小細胞肺がん、甲状腺がん、前立腺がんまたは肝細胞がんの治療のために用いられる、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片は、Ｎｏｔｃｈ４の細胞外ドメインを認識する抗体であることが好ましい。例えば、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１で示されるヒトＮｏｔｃｈ４のアミノ酸配列における、２４〜１４４７位のいずれかの部位に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であってよい。なお、配列番号１で示されるヒトＮｏｔｃｈ４のアミノ酸配列において、１〜２３位はシグナル配列、１４４８〜２００３位は膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインである。
【００９７】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片は、治療法において単独か、又は、その他の薬剤又は組成物と併用して用いることができる。例えば本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片は、別の抗癌剤と同時又は異時に投与されてよい。このような併用療法には、併用投与（同じかまたは別々の製剤に２以上の薬剤が含まれる）および分離投与（例えば同時にまたは連続的に）が含まれる。２以上の薬剤を別々に投与する場合、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片の投与は、付随する治療法に先立つか、または続いて行われてよい。本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片と併用されてよい抗癌剤は、例えば非小細胞肺がん、甲状腺がん、前立腺がんまたは肝細胞がんの治療に有効である抗癌剤であってよい。そのような抗癌剤としては、例えばシスプラチン、レンバチニブ、パクリタキセルを挙げることができるが、これらに限定されない。併用療法に用いる医薬組成物の例としては、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片およびシスプラチンを含有する医薬組成物、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片およびレンバチニブを含有する医薬組成物、ならびに本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片およびパクリタキセルを含有する医薬組成物を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を投与する対象は限定されず、例えば、哺乳動物（ヒト、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、イヌ、ネコ、ラット、マウス等）に対して本発明を用いることができる。しかし、好ましくない場合には、ヒトを対象から除くこともできる。
【００９９】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ４抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物の対象への投与方法（投与経路、投与量、１日の投与回数、投与のタイミング、等）は限定されず、対象の健康状態、疾患の程度、併用する薬剤の種類等に応じて、当業者（例えば、医師）が適宜決定することができる。
【０１００】
技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、あらゆる態様の任意の一又は複数を、適宜組み合わせて、本発明を実施してよいことを当業者は理解する。さらに、技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、好ましい又は有利なあらゆる態様を、適宜組み合わせて、本発明を実施することが好ましいであろうことを当業者は理解する。
【０１０１】
本明細書中に引用される文献は、参照により、それらのすべての開示が、明確に本明細書に援用されているとみなされるべきであって、当業者は、本明細書の文脈に従って、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、それらの文献における関連する開示内容を、本明細書の一部として援用して理解できる。
【０１０２】
本明細書中に引用される文献は、本出願の出願日前の関連技術の開示のみを目的として提供され、本発明者らが、先行発明又は任意の他の理由によって、かかる開示に先行する権利を持たないことを自認するものとして解釈されてはならない。これらの文献のすべての記述は、本出願人が入手可能であった情報に基づいており、これらの記述内容が正確であるという自認を何ら構成しない。
【０１０３】
本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【０１０４】
本明細書において用いられる「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記載された事項（部材、ステップ、要素又は数字等）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素又は数字等）が存在することを排除しない。「かならる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」及び／又は「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語で記載される態様を包含する。
【０１０５】
本明細書において用いられる「中和活性」という用語は、Ｎｏｔｃｈ４とそのリガンドの結合を阻害する活性、および／または、Ｎｏｔｃｈ４がそのリガンドの結合によりヒト生体内で誘導する、シグナル伝達や、細胞の分子発現応答もしくは機能性変化を阻害する活性を意味する。
【０１０６】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【０１０７】
第１の、第２の等の用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はこれらの用語自身によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第１の要素を第２の要素と記し、同様に、第２の要素は第１の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【０１０８】
本明細書において、成分含有量や数値範囲等を示すのに用いられる数値は、特に明示がない限り、用語「約」で修飾されているものと理解されるべきである。例えば、「４℃」とは、特に明示がない限り、「約４℃」を意味するものと理解され、その程度を、当業者は技術常識と本明細書の文意に従って、合理的に理解できることは当然である。
【０１０９】
文脈上明白に他の意味を示す場合を除き、本明細書及び請求の範囲で使用される場合、単数形で表される各態様は、技術的に矛盾しない限り、複数形であってもよいことが理解され、逆もまた真である。
【０１１０】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。関連技術分野の当業者は、本発明の精神又は範囲を変更させることなく、様々な改変、付加、欠失、置換等を伴って本発明を実施できる。
【実施例】
【０１１１】
実施例１：抗ヒトＮｏｔｃｈ４モノクローナル抗体の作製【０１１２】
マウス抗ヒトＮｏｔｃｈ４モノクローナル抗体の作製
ヒトＮｏｔｃｈ４（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００４５４８．３）（配列番号１）に対するモノクローナル抗体を作製するため、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）およびヒスチジンタグを融合した、ヒトＮｏｔｃｈ４の３つのＥＧＦリピートおよびネガティブ制御領域（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎ：ＮＲＲ）（配列番号１の１０４６〜１４４５位）（以下、「ヒトＮｏｔｃｈ４  ３ＥＧＦ−ＮＲＲ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ」という）をＢａｌｂ／ｃマウスに免疫した。【０１１３】
ヒトＮｏｔｃｈ４  ３ＥＧＦ−ＮＲＲ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質は以下の工程により調製した：第一に、ｐｃＤＮＡ３．１−ヒトＮｏｔｃｈ４  ３ＥＧＦ−ＮＲＲ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ発現ベクターを構築した。ヒトＮｏｔｃｈ４の３つのＥＧＦリピートおよびＮＲＲはＰＣＲによって増幅され、Ｉｇκシグナル配列、ＳＥＡＰ、およびヒスチジンタグをコードしたＤＮＡ配列を有するｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のＳｆｉＩ／ＮｏｔＩサイトにサブクローニングした。次に、ｐｃＤＮＡ３．１−ヒトＮｏｔｃｈ４  ３ＥＧＦ−ＮＲＲ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓ発現ベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１  （ＴＡＫＡＲＡ）によってＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へ形質移入した。６日間のインキュベーション（５％ＣＯ２、３７°Ｃ）の後、培養上清を回収した。ヒトＮｏｔｃｈ４  ３ＥＧＦ−ＮＲＲ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質を、Ｐｒｏｔｉｎｏカラム（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて精製した。【０１１４】
２０μｇの前記ヒトＮｏｔｃｈ４  ３ＥＧＦ−ＮＲＲ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質を、同量のＧＥＲＢＵアジュバント（ＧＥＲＢＵ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ）と混合し、Ｂａｌｂ／ｃマウスの足蹠へ皮下注射した。３回の追加的な注射を、３、７、および１０日目に投与した。翌日、マウスを屠殺し（ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ）、末梢リンパ節を回収した。そして、それぞれの末梢リンパ節の半分を、ＳＣＩＤマウスに移植した。リンパ節細胞は、それぞれのリンパ節の残りの半分から調製し、ＧｅｎｏｍｅＯＮＥ−ＣＦ（Ｉｓｈｉｈａｒａ  Ｓａｎｇｙｏ  Ｋａｉｓｈａ，Ｌｔｄ．）の存在下で、Ｐ３Ｕ１  ミエローマ細胞と５：１の割合で融合させた。前記融合細胞は、９６ウェルプラスチックプレートで培養した。７日間のインキュベーション（５％ＣＯ２、３７°Ｃ）の後、培養上清を回収した。【０１１５】
１０μｇのヒトＮｏｔｃｈ４  ３ＥＧＦ−ＮＲＲ−ＳＥＡＰ−Ｈｉｓタンパク質を、前記リンパ節被移植ＳＣＩＤマウスに対して、移植当日、および、移植６日後に静脈内投与した。最終免疫の３日後、末梢リンパ節細胞を回収し、前述のとおり融合させ、培養した。【０１１６】
上述の工程によって、８クローンのマウスモノクローナル抗体を得た。これらの中から、Ｎｏｔｃｈ４特異的シグナル阻害活性、マウスＮｏｔｃｈ４及びヒトＮｏｔｃｈ４への結合活性を基準に、最も好ましいリード抗体（６−３−Ａ６）を選択した。【０１１７】
マウス抗ヒトＮｏｔｃｈ４モノクローナル抗体（６−３−Ａ６）の配列解析
クローン６−３−Ａ６の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、５’−ＲＡＣＥ（５’−ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法によって増幅させた。前記ハイブリドーマから、ＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＤＮａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ，  ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｓｅｔ）で処理した。ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、前記全ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製した。ａｄ２９Ｓ（ACATCACTCCGT  （配列番号２））及びａｄ２９ＡＳ（ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT  （配列番号３））のアニーリングによって得られた５’アダプターを前記ｃＤＮＡに付加した。得られたｃＤＮＡを、５’フォワードプライマー（５’−ＰＣＲ４  ｐｒｉｍｅｒ，  AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG  （配列番号４）)及び３’リバースプライマー（マウスＩｇＧ１重鎖の増幅にはGCCAGTGGATAGACTGATGG  （配列番号５）を用い、マウスＩｇκ軽鎖の増幅にはGATGGATACAGTTGGTGCAGC  （配列番号６）を用いた）によって増幅した。前記増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入した。遺伝子配列を、ＡＢＩ３１３０ＸＬを用いて解析した。本解析によって同定された遺伝子配列にコードされたアミノ酸配列を以下の表に示す。【０１１８】
表１  マウス抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体のアミノ酸配列（６−３−Ａ６）
2016167306.tif 000002
【０１１９】
表２  マウス抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体の核酸配列（６−３−Ａ６）
2016167306.tif 000003
【０１２０】
キメラ抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体およびヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体の調製
オーバーラップエクステンションＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）により、重鎖として、６−３−Ａ６の重鎖可変領域の遺伝子配列およびＶ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有するヒトＩｇＧ２の定常領域の遺伝子配列を結合させ、軽鎖として、６−３−Ａ６の軽鎖可変領域の遺伝子配列およびヒトＩｇκの定常領域の遺伝子配列を結合させ、キメラ抗体をコードするＤＮＡ配列を調製した。ここでいう、「Ｖ２３４Ａ」とは、２３４位のバリンがアラニンに置換された変異を、「Ｇ２３７Ａ」とは、２３７位のグリシンがアラニンに置換された変異を表す。結果として得られた配列を、発現ベクター（重鎖についてｐＥＥ６．４、軽鎖についてｐＥＥ１２．４，Ｌｏｎｚａ）に挿入した。キメラ抗体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を以下の表に示した。【０１２１】
表３  キメラ抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体のアミノ酸配列
2016167306.tif 000004
【０１２２】
表４  キメラ抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体の核酸配列
2016167306.tif 000005
2016167306.tif 000006
【０１２３】
マウス抗体６−３−Ａ６のＣＤＲを、ヒト抗体の可変領域へ移植することにより、抗体をヒト化した。前記ＣＤＲは、まず、マウス抗体６−３−Ａ６のアミノ酸配列をＫａｂａｔの番号付システム（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）に従い、Ａｂｙｓｉｓソフトフェア（ＵＣＬからのライセンス）を用いて番号付けし、この番号を基に、ＣＤＲの同定のためのＫａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）、または、ＡｂＭの定義法（ＡｂＭ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って決定した。６−３−Ａ６のＣＤＲのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を以下の表に示した。【０１２４】
表５  ６−３−Ａ６のＣＤＲのアミノ酸配列
2016167306.tif 000007
【０１２５】
表６  ６−３−Ａ６のＣＤＲの核酸配列
2016167306.tif 000008
【０１２６】
６−３−Ａ６のフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）に対する高い相同性を基に、ヒト抗体のＦＲ；軽鎖についてＩＧＫＶ１−２７＊１またはＩＧＫＶ３−１５＊１、およびＪＫ１、重鎖についてＩＧＨＶ３−６４＊０１およびＪＨ４を、ヒト化抗体のＦＲとして選択した。その後、マウス６−３−Ａ６の３Ｄ構造予測モデルを用いて、ＣＤＲのアミノ酸と相互作用するＦＲにおけるアミノ酸を予測し、ＣＤＲとともに移植した。Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有し、Ｃ末端リシン残基を有する、または、有しないヒトＩｇＧ２の定常領域、および、ヒトＩｇκを、それぞれ重鎖および軽鎖の定常領域として用いた。ＨＫ１、ＨＫ２、およびＨＫ３は、Ｋａｂａｔの定義方法によって決定されたＣＤＲを移植したヒト化抗体の重鎖として設計され、ＨＡ１およびＨＡ２は、ＡｂＭの定義方法によって決定されたＣＤＲを移植されたヒト化抗体の重鎖として設計され、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ５は、ＩＧＫＶ１−２７＊１およびＪＫ１を用いるヒト化抗体の軽鎖として設計され、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ６は、ＩＧＫＶ３−１５＊１およびＪＫ１を用いるヒト化抗体の軽鎖として設計された。以下の表は、ヒト化抗体の可変領域、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有し、Ｃ末端リシン残基を有する、または、有しないヒトＩｇＧ２の定常領域、および、ヒトＩｇκのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。【０１２７】
表７
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体重鎖（ＨＫ１）の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000009
【０１２８】
表８
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体重鎖（ＨＫ２）の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000010
【０１２９】
表９
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体重鎖（ＨＫ３）の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000011
【０１３０】
表１０
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体重鎖（ＨＡ１）の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000012
【０１３１】
表１１
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体重鎖（ＨＡ２）の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000013
【０１３２】
表１２
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体軽鎖（Ｌ１）の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000014
【０１３３】
表１３
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体軽鎖（Ｌ２）の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000015
【０１３４】
表１４
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体軽鎖（Ｌ３）の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000016
【０１３５】
表１５
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体軽鎖（Ｌ４）の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000017
【０１３６】
表１６
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体軽鎖（Ｌ５）の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000018
【０１３７】
表１７
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体軽鎖（Ｌ６）の可変領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000019
【０１３８】
表１８
Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有し、Ｃ末端リシンを有するヒトＩｇＧ２の定常領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000020
【０１３９】
表１９
Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有し、Ｃ末端リシンを有しないヒトＩｇＧ２の定常領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000021
【０１４０】
表２０
ヒトＩｇκの定常領域のアミノ酸配列および核酸配列
2016167306.tif 000022
【０１４１】
これらのヒト化抗体の可変領域の遺伝子配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．によって合成し、Ｃ末端リシンを有するまたは有しないヒトＩｇＧ２の定常領域、または、ヒトＩｇκの定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むｐｃＤＮＡ３．３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入した。抗体を産生するため、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、前記発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ形質移入した。上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。【０１４２】
ヒト化抗体の全長（可変領域＋定常領域）の遺伝子配列を同様に最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．によって完全に合成し、重鎖はｐＥＥ６．４へ、軽鎖はｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）へ挿入した。抗体を産生するため、これらの発現ベクターを上記のように用いた。ヒト化抗体の最適化されたヌクレオチド配列を以下の表に示した。【０１４３】
表２１
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体重鎖の最適化された核酸配列（ＨＫ２可変領域、および、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有し、Ｃ末端リシンを有しないヒトＩｇＧ２定常領域）
2016167306.tif 000023
【０１４４】
表２２
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体重鎖の最適化された核酸配列（ＨＫ３可変領域、および、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有し、Ｃ末端リシンを有しないヒトＩｇＧ２定常領域）
2016167306.tif 000024
【０１４５】
表２３
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体重鎖の最適化された核酸配列（ＨＡ２可変領域、および、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有し、Ｃ末端リシンを有しないヒトＩｇＧ２定常領域）
2016167306.tif 000025
【０１４６】
表２４
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体軽鎖の最適化された核酸配列（Ｌ３可変領域、および、ヒトＩｇκ定常領域）
2016167306.tif 000026
【０１４７】
表２５
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体軽鎖の最適化された核酸配列（Ｌ４可変領域、および、ヒトＩｇκ定常領域）
2016167306.tif 000027
【０１４８】
表２６
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体軽鎖の最適化された核酸配列（Ｌ５可変領域、および、ヒトＩｇκ定常領域）
2016167306.tif 000028
【０１４９】
表２７
ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体軽鎖の最適化された核酸配列（Ｌ６可変領域、および、ヒトＩｇκ定常領域）
2016167306.tif 000029
【０１５０】
以下の実施例においては、実施例１において特定された抗体６−３−Ａ６のＣＤＲのアミノ酸配列を含む抗体を用いて実験を行った。
以下の実施例において用いた特定の抗体を、便宜的に“抗体Ａ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａ）”、“抗体Ｂ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂ）”、“抗体Ｃ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃ）”、“抗体Ｄ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄ）”、“抗体Ｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅ）”、“抗体Ｆ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆ）”及び“抗体Ｇ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｇ）”と呼ぶ。
抗体Ａは、重鎖可変領域が実施例１に記載のＨＫ２の重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域が実施例１に記載のＬ３の軽鎖可変領域を含む。
抗体Ｂは、重鎖可変領域が実施例１に記載のＨＫ３の重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域が実施例１に記載のＬ３の軽鎖可変領域を含む。
抗体Ｃは、重鎖可変領域が実施例１に記載のＨＫ２の重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域が実施例１に記載のＬ４の軽鎖可変領域を含む。
抗体Ｄは、重鎖可変領域が実施例１に記載のＨＫ３の重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域が実施例１に記載のＬ５の軽鎖可変領域を含む。
抗体Ｅは、重鎖可変領域が実施例１に記載のＨＫ２の重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域が実施例１に記載のＬ６の軽鎖可変領域を含む。
抗体Ｆは、重鎖可変領域が実施例１に記載のＨＡ２の重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域が実施例１に記載のＬ３の軽鎖可変領域を含む。
抗体Ｇは、重鎖可変領域が実施例１に記載のＨＫ３の重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域が実施例１に記載のＬ４の軽鎖可変領域を含む。
なお、抗体Ａ〜Ｇにおいては、一般的なヒト抗体の重鎖のＣ末端に位置するリシン（Ｌｙｓ）が欠失している。【０１５１】
実施例２：抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体の中和活性【０１５２】
抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体（抗体Ｂ）の中和活性を、Ｎｏｔｃｈ４−ＧＡＬ４  ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて評価した。本実験は、Ｎｏｔｃｈ４の細胞内ドメインの一部をＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインに置換した改変遺伝子およびＧＡＬ４  ＵＡＳとＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ２ＣＰの融合遺伝子発現ベクターを導入したｂ．ｅｎｄ３細胞株（以下、「レポーター細胞」という）に、ＮｏｔｃｈリガンドであるＤＬＬ４で刺激を加えた時のルシフェラーゼ活性を評価することで、Ｎｏｔｃｈ４特異的なシグナル伝達を評価する実験系である。【０１５３】
リコンビナントヒトＤＬＬ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１５０６−Ｄ４−０５０／ＣＦ）をＰＢＳで溶解し、１０μｇ／ｍＬの溶液（以下、ＤＬＬ４溶液）を調製した。平底９６ウェルホワイトプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，６５５０８３）にＤＬＬ４溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌ（５００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、無刺激ウェルには、ＰＢＳを５０μＬ／ｗｅｌｌずつそれぞれ分注し、４℃で一晩静置することで、９６ウェルホワイトプレートにＤＬＬ４を固相化した。レポーター細胞を、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン含有Ｄ−ＭＥＭ培養液に懸濁し、１×１０＾５／ｍＬの細胞浮遊液を調製した。ＤＬＬ４を固相化した各ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、細胞浮遊液を５０μＬ／ｗｅｌｌ（５，０００個／ｗｅｌｌ）ずつ播種した。抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体希釈液（最終濃度：０、０．０００６４、０．００３２、０．０１６、０．０８、０．４、２、１０μｇ／ｍＬ）またはＨｕｍａｎ  ＩｇＧ２  κ（ＳＩＧＭＡ，Ｉ５４０４，最終濃度：１０μｇ／ｍＬ）を５０μＬずつそれぞれ添加し、３７℃で２２時間培養した。レポーター細胞のルシフェラーゼ活性をＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｅ２５１０）を用いて以下の通りに評価した。【０１５４】
培養後の各ウェルにＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ溶液を１００μＬずつ添加・攪拌後、室温で３０分間静置し、発光をマルチラベルプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０２−００２０，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。測定した発光値から以下の式によりＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（％）を算出した。【０１５５】
Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（％）＝（検体ウェルの発光強度−無刺激ウェルの発光強度平均値）／（コントロールウェルの発光強度平均値−無刺激ウェルの発光強度平均値）【０１５６】
抗体Ｂの濃度と、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（％）の値との関係を、図１に示す。図１のグラフは、独立した３試験の結果の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す）。ＩＣ５０は０．０１１μｇ／ｍＬ（９５％ＣＩ；０．００３６−０．０３４）であった。【０１５７】
次に、抗体Ｂを含む複数の抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体（抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃ、抗体Ｄ、抗体Ｅ、抗体Ｆ及び抗体Ｇ）について同様の実験を行い、抗体の中和活性を測定した。【０１５８】
リコンビナントヒトＤＬＬ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  １５０６−Ｄ４−０５０／ＣＦ）をＰＢＳで溶解し，１０μｇ／ｍＬの溶液（以下、ＤＬＬ４溶液）を調製した。平底９６ウェルホワイトプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，６５５０８３）にＤＬＬ４溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌ（５００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、無刺激ウェルには、ＰＢＳを５０μＬ／ｗｅｌｌずつそれぞれ分注し、４℃で一晩静置することで、９６ウェルホワイトプレートにＤＬＬ４を固相化した。レポーター細胞を、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン含有Ｄ−ＭＥＭ培養液に懸濁し、１×１０＾５／ｍＬの細胞浮遊液を調製した。ＤＬＬ４を固相化した各ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、細胞浮遊液を５０μＬ／ｗｅｌｌ（５，０００個／ｗｅｌｌ）ずつ播種した。それぞれの抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体希釈液（最終濃度：０、１０μｇ／ｍＬ）またはＨｕｍａｎ  ＩｇＧ２  κ（ＳＩＧＭＡ、Ｉ５４０４、最終濃度：１０μｇ／ｍＬ）を５０μＬずつそれぞれ添加し、３７℃で２２時間培養した。レポーター細胞のルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ  ｌｕｃ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｅ２９４０）を用いて以下の通りに評価した。【０１５９】
培養後の各ウェルにＤｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液を１００μＬずつ添加・攪拌後、室温で２０分間静置し、ホタルルシフェラーゼの発光をマルチラベルプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０２−００２０，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。また、次に各ウェルにＤｕａｌ−Ｇｌｏ  Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液を１００μＬずつ添加・攪拌後、室温で２０分間静置し、ウミシイタケルシフェラーゼ発光をマルチラベルプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０２−００２０，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。発光値の比から各ウェルのＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ホタルルシフェラーゼ／ウミシイタケルシフェラーゼ）を算出した。さらに、それぞれの算出値から、下記の式を用いて、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（％）を算出し、それぞれの抗体のＮｏｔｃｈ４シグナル阻害活性を評価した。【０１６０】
Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（％）＝（検体ウェルのＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅの平均値−無刺激ウェルのＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅの平均値）／（コントロールウェルのＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅの平均値−無刺激ウェルのＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅの平均値）【０１６１】
各抗体のＮｏｔｃｈ４シグナル阻害活性（１０μｇ／ｍｌ濃度で試験実施）を下記の表２８に記載する。【０１６２】
下記の表において、例えば「ＨＫ２Ｌ３（Ｌｙｓ−）」との記載は、実験に用いたヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体の重鎖可変領域が実施例１におけるヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体重鎖ＨＫ２の重鎖可変領域であり、軽鎖可変領域が実施例１におけるヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体軽鎖Ｌ３の軽鎖可変領域であり、一般的なヒト抗体の重鎖のＣ末端に位置するリシン（Ｌｙｓ）が本抗体においては欠失していることを意味する。【０１６３】
表２８
2016167306.tif 000030
【０１６４】
実施例３：ヒト化抗Ｎｏｔｃｈ４抗体の組換えＮｏｔｃｈ４−ＮＲＲドメインタンパク質への結合の動態解析【０１６５】
ヒト、カニクイザル、マウスおよびラットのＮｏｔｃｈ４−ＮＲＲドメインと抗体Ｂとの相互作用の動態解析を、ＢＩＡＣＯＲＥを用いて実施した。抗体Ｂは、抗体Ｂをトランスフェクトされた安定ＣＨＯ細胞株の培養上清から、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製された。ヒト、サル、マウス及びラットのＮｏｔｃｈ４−ＮＲＲドメインは、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）と、１０ｘヒスチジンタグとの融合タンパク質として調製された。これらのタンパク質の遺伝子は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中で、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３を用いて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞へトランスフェクトされた。これらの細胞は、Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中で培養された。簡潔には、細胞は７．５ｘ１０７細胞／２５．５ｍＬに希釈され、０日目にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３試薬によりトランスフェクトされた。トランスフェクションの約１６時間後、１５０ｕＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  １及び１．５  ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ２がそれぞれのフラスコに加えられた。上清は４日目に回収された。これらの抗原は、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製された。相互作用は下記の通りに分析された。精製された抗体ＢはＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定された抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体によって捕捉された。精製されたＮｏｔｃｈ４−ＮＲＲ融合タンパク質は、８通りの異なる濃度でセンサーチップに注入され、それらの相互作用及び解離を、製造業者の説明書に従って観察した。【０１６６】
表２９  算出された抗体Ｂの動態パラメータ
2016167306.tif 000031
【０１６７】
さらなる抗Ｎｏｔｃｈ４阻害ヒト化抗体の動態解析を、下記の通りに実施した。ヒトＮｏｔｃｈ４−ＮＲＲドメインＦｃ融合タンパク質を、ＣＨＯ細胞株を用いて発現させた。培養上清中の抗原を、ＣＭ５センサーチップに固定された、ヒトＮｏｔｃｈ４の異なるエピトープを認識する、抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体によって捕捉した。そして、ヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体を、様々な濃度でセンサーチップに注入した。その相互作用と解離定数を、製造業者の説明書に従って算出した。その結果を表３０に示す。【０１６８】
下記の表において、例えば「ＨＫ２Ｌ３（Ｌｙｓ−）」との記載は、実験に用いたヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体の重鎖可変領域が実施例１におけるヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体重鎖ＨＫ２の重鎖可変領域であり、軽鎖可変領域が実施例１におけるヒト化抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体軽鎖Ｌ３の軽鎖可変領域であり、一般的なヒト抗体の重鎖のＣ末端に位置するリシン（Ｌｙｓ）が本抗体においては欠失していることを意味する。「（Ｌｙｓ−）」との記載がないものは、ヒト抗体の重鎖のＣ末端に位置するＬｙｓが欠失していないことを意味する。【０１６９】
表３０
ヒト化抗Ｎｏｔｃｈ４阻害抗体の、ヒトＮｏｔｃｈ４−ＮＲＲ融合タンパク質に対する、算出された動態パラメータ
2016167306.tif 000032
【０１７０】
上記表３０と同様の実験をさらに多くの抗体で行った実験結果を表３１に示す。【０１７１】
表３１
2016167306.tif 000033
【０１７２】
実施例４：抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体を用いたインビボ薬理試験（Ｃａｌｕ６皮下移植モデルにおける抗体Ｂの抗腫瘍効果および血液灌流抑制効果）【０１７３】
１０％ＦＢＳ、ＭＥＭ非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＥＭＥＭ培養液で培養したヒト非小細胞肺癌細胞株Ｃａｌｕ６（ＡＴＣＣ  ｎｕｍｂｅｒ  ＨＴＢ−５６）をＥＭＥＭ培養液にて１．６ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調製し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＣＯＲＮＩＮＧ  Ｃａｔ＃３５４２３４）と１：１で混合し８．０ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。６週齢のヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ、雌、日本チャールズリバー）の右後背部皮下に０．１ｍＬの用量で移植した。移植から２８日後に電子デジタルノギス（デジマチックＴＭキャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積ＴＶ（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を算出した。【０１７４】
ＴＶ（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２【０１７５】
投与初日の腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値がほぼ等しくなるように群分けを行った。抗体Ｂは投与直前にｖｅｈｉｃｌｅ液（２５ｍＭ  Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、２５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ５．３））と生理食塩水が１：９となるように希釈し、０．１，０．３，１．０ｍｇ／ｍＬの評価検体（それぞれ１，３，１０ｍｇ／ｋｇ投与群）を得た。評価検体は０．２ｍＬ／２０ｇマウス体重の投与量で週２回（群分けの日をｄａｙ１としてｄａｙ１、ｄａｙ４）尾静脈注射にて投与した。コントロール群にはＣｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ  Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，  ｗｈｏｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃａｔ＃  ００９−０００−００３）  １１．６ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで１．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．２ｍＬ／２０ｇマウス体重で尾静脈注射にて投与した（投与容量  １０ｍｇ／ｋｇ）。実験は１群８匹で行った。Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ群、抗体Ｂ投与群それぞれに対し、比腫瘍体積ＲＴＶ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を以下の式で算出し、図２Ａに示した。【０１７６】
ＲＴＶ＝測定日の腫瘍体積／投与開始日の腫瘍体積【０１７７】
Ｃａｌｕ６皮下移植モデルにおいて、抗体Ｂは有意な抗腫瘍効果を全ての用量で示した。【０１７８】
腫瘍の血液灌流は尾静脈注射した蛍光色素（Ｈｏｅｃｈｓｔ）による血管周辺の細胞の核染色による蛍光を定量することで評価した（Ｆｕｎａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，１０５（１０），１３３４−４２．）。試験最終日の腫瘍径測定後にＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２  １０ｍｇ／ｍＬ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ＃Ｈ３５７０）をＰＢＳで２倍希釈し、希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２  ５．０ｍｇ／ｍＬを０．１ｍＬ／ｈｅａｄで尾静脈注射した。Ｈｏｅｃｈｓｔを注射して５分後にマウスを頚椎脱臼で安楽死させ、採取した腫瘍をＯＣＴ  コンパウンド（サクラファインテックジャパン  Ｃａｔ＃４５８３）に包埋して凍結ブロックを作製した。【０１７９】
凍結切片の腫瘍血管を抗ＣＤ３１抗体（ＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｃａｔ＃５５３３７２）で免疫蛍光染色し、ＢＩＯＲＥＶＯ蛍光顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ、ＢＺ−９０００）で腫瘍血管のホットスポットのＨｏｅｃｈｓｔ蛍光を１腫瘍片あたり５ヶ所撮影した。Ｈｏｅｃｈｓｔ陽性面積を画像解析ソフト（Ｌｕｍｉｎａ  Ｖｉｓｉｏｎ  ｖｅｒ  ２．２．２、三谷商事）で定量し、各腫瘍片の平均を算出し、図２Ｂに示した。【０１８０】
Ｃａｌｕ６皮下移植モデルにおいて、抗体Ｂは有意な血液灌流抑制作用を全ての用量で示した。【０１８１】
実施例５：Ｃａｌｕ６皮下移植モデルにおける抗体Ｂとシスプラチンとの併用【０１８２】
１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＥＭＥＭ培養液で培養したヒト非小細胞肺癌細胞株Ｃａｌｕ６（ＡＴＣＣ  ｎｕｍｂｅｒ  ＨＴＢ−５６）をＥＭＥＭ培養液にて１．２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ/ｍＬ濃度に調製し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（ＣＯＲＮＩＮＧ  Ｃａｔ＃３５４２３４）と１：１で混合し６．０ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。７週齢のヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ、雌、日本チャールズリバー）の右後背部皮下に０．１ｍＬの用量で移植した。移植から２７日後に電子デジタルノギス（デジマチックＴＭキャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積ＴＶ（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を算出した。【０１８３】
腫瘍体積ＴＶ（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２【０１８４】
投与初日の腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値がほぼ等しくなるように群分けを行った。抗体Ｂは投与直前に１０．３４ｍｇ／ｍＬ溶液（ｖｅｈｉｃｌｅ：２５ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、２００ｍＭ  Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ８０（ｐＨ５．５））をＰＢＳで希釈し、２．５ ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、０．２ｍＬ（５００μｇ）／ｈｅａｄの投与量で週２回５週間静脈注射にて投与した。シスプラチンは１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与初日に１回尾静脈投与した。実験は１群４匹で行った。コントロール（無処置）群、抗体Ｂ投与群、シスプラチン投与群、抗体Ｂ＋シスプラチン併用群それぞれに対し、比腫瘍体積ＲＴＶ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を以下の式で算出し、図３に示した。【０１８５】
ＲＴＶ＝測定日の腫瘍体積／投与開始日の腫瘍体積【０１８６】
Ｃａｌｕ６皮下移植モデルにおいて、抗体Ｂとシスプラチンの併用はシスプラチン単剤と比較して有意に優れた抗腫瘍効果を示した。【０１８７】
実施例６：ＦＴＣ２３８皮下移植モデルにおける抗体Ｂとレンバチニブメシル酸塩との併用【０１８８】
１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２（１：１）培養液で培養したヒト甲状腺癌細胞株ＦＴＣ２３８（大日本住友製薬より購入）をＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２（１：１）培養液にて１．２ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調製し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（ＣＯＲＮＩＮＧ  Ｃａｔ#３５４２３４）と１：１で混合し６．０ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。７週齢のヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ、雌、日本チャールズリバー）の右脇腹皮下に０．１ｍＬの用量で移植した。移植から８日後に電子デジタルノギス（デジマチックＴＭキャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積ＴＶ（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を算出した。【０１８９】
腫瘍体積ＴＶ（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２【０１９０】
投与初日の腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値がほぼ等しくなるように群分けを行った。抗体Ｂは投与直前に１０．８ｍｇ／ｍＬ  抗体Ｂ（ｖｅｈｉｃｌｅ：２５ｍＭ  Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、２５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅ（ｐＨ５．３））をｖｅｈｉｃｌｅ液で希釈し、２．５ｍｇ／ｍＬ  抗体Ｂを調製し、０．２ｍＬ（５００μｇ）／ｈｅａｄの投与量で週２回２週間尾静脈注射にて投与した。レンバチニブメシル酸塩は１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回、１２日間経口投与した。実験は１群５匹で行った。コントロール（無処置）群、抗体Ｂ投与群、レンバチニブメシル酸塩投与群、抗体Ｂ＋レンバチニブメシル酸塩併用群それぞれに対し、比腫瘍体積ＲＴＶ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を以下の式で算出し、図４に示した。【０１９１】
ＲＴＶ＝測定日の腫瘍体積／投与開始日の腫瘍体積【０１９２】
ＦＴＣ２３８皮下移植モデルにおいて、抗体Ｂとレンバチニブメシル酸塩の併用は抗体Ｂ単剤、あるいはレンバチニブメシル酸塩単剤投与と比較して有意に優れた抗腫瘍効果を示した。【０１９３】
実施例７：ＤＵ１４５皮下移植モデルにおけるマウス抗体６−３−Ａ６とパクリタキセルとの併用【０１９４】
１０％ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液で培養したヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ ｎｕｍｂｅｒ  ＨＴＢ−８１）をＲＰＭＩ１６４０培養液にて６．０ｘ１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度に調製した。６週齢のヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ、雌、日本チャールズリバー）の右脇腹皮下に０．１ｍＬの用量で移植した。移植から２４日後に電子デジタルノギス（デジマチックＴＭキャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積ＴＶ（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を算出した。【０１９５】
腫瘍体積ＴＶ（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２【０１９６】
投与初日の腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値がほぼ等しくなるように群分けを行った。６−３−Ａ６は投与直前に５．１１ｍｇ/ｍＬ  ６−３−Ａ６（ｖｅｈｉｃｌｅ：ＰＢＳ）をＰＢＳで希釈し、２．５ｍｇ／ｍＬ  ６−３−Ａ６を調製し、０．２ｍＬ（５００μｇ）／ｈｅａｄの投与量で週２回、４週間尾静脈注射にて投与した。パクリタキセルは２０ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回、５日間尾静脈投与した。実験は１群４匹で行った。コントロール（無処置）群、６−３−Ａ６投与群、パクリタキセル投与群、６−３−Ａ６＋パクリタキセル併用群それぞれの腫瘍体積ＴＶを図５に示した。【０１９７】
ＤＵ１４５皮下移植モデルにおいて、６−３−Ａ６とパクリタキセルの併用は６−３−Ａ６単剤またはパクリタキセル単剤と比較して有意に優れた抗腫瘍効果を示した。【０１９８】
実施例８：ヒト患者由来肝細胞癌皮下移植モデルにおける抗体Ｂとレンバチニブメシル酸塩の併用【０１９９】
抗体Ｂの肝細胞がん（ＨＣＣ）に対する抗腫瘍効果を調べるため、ＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標。Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）患者由来皮下移植モデルである、ＬＩ００５０を用いた。ＬＩ００５０は、女性ＨＣＣ患者の癌組織を移植されたモデルマウスであり、ソレフェニブ耐性であることが報告されている（国際公開公報ＷＯ２０１５／０３１６０４）。
ＬＩ００５０ストックマウスから腫瘍断片を採取し、直径２−４ｍｍの断片をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右側腹部の皮下に移植し、腫瘍を成長させた。ノギスを用いて腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積ＴＶ（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を算出した。【０２００】
腫瘍体積ＴＶ（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２【０２０１】
平均腫瘍体積が約１９２ｍｍ３に達した時点で治療を開始した。投与初日の腫瘍体積をもとに腫瘍体積の平均値がほぼ等しくなるように群分けを行った。各群は１０匹のマウスから構成され、群分けの日をＤａｙ０とした。Ｄａｙ０からＤａｙ１３まで、各群のマウスは１日１回、処置を受けた。（ｉ）コントロール（３ｍＭ  ＨＣｌ投与）群、（ｉｉ）レンバチニブメシル酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ）投与群、（ｉｉｉ）ソラフェニブトシル酸塩（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群、および（ｉｖ）レンバチニブメシル酸塩（１０ｍｇ／ｋｇ）＋抗体Ｂ（０.５ｍｇ／個体）併用群それぞれの腫瘍体積ＴＶを図６に示す。【０２０２】
抗体Ｂとレンバチニブメシル酸塩の併用はコントロール群と比較して有意に優れた抗腫瘍効果を示した。【０２０３】
実施例９：抗ヒトＮｏｔｃｈ４ポリクローナル抗体と抗体Ｂのシグナル阻害活性の比較【０２０４】
次に、Ｎｏｔｃｈ４−ＧＡＬ４  ルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて、ポリクローナル抗ヒトＮｏｔｃｈ４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＳＣ８６４３，以下、Ｎ−１７）と抗体Ｂのシグナル阻害活性を比較した。【０２０５】
Ｎ−１７に含有するアジ化ナトリウムを除去するため、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，６６３３３）を用いて、４℃で８時間ＰＢＳにて透析した。透析したＮ−１７溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＦＣ５０３０９６）を用いて濃縮した後、微量分光光度計（Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ，Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて濃度を測定した。【０２０６】
リコンビナントヒトＤＬＬ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１５０６−Ｄ４−０５０／ＣＦ）をＰＢＳで溶解し、１０μｇ／ｍＬの溶液（以下、ＤＬＬ４溶液）を調製した。平底９６ウェルホワイトプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，６５５０８３）にＤＬＬ４溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌ（５００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、無刺激ウェルには、ＰＢＳを５０μＬ／ｗｅｌｌずつそれぞれ分注し、４℃で一晩静置することで、９６ウェルホワイトプレートにＤＬＬ４を固相化した。レポーター細胞を、１０％Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン含有Ｄ−ＭＥＭ培養液に懸濁し、１×１０＾５／ｍＬの細胞浮遊液を調製した。ＤＬＬ４を固相化した各ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、細胞浮遊液を５０μＬ／ｗｅｌｌ（５，０００個／ｗｅｌｌ）ずつ播種した。透析・濃縮後、培養液で希釈したＮ−１７希釈液、または抗体Ｂの希釈液（最終濃度：０、０．０１、０．１、１、１０μｇ／ｍＬ）を５０μＬずつそれぞれ添加し、３７℃で２２時間培養した。レポーター細胞のルシフェラーゼ活性をＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｅ２５１０）を用いて以下の通りに評価した。【０２０７】
培養後の各ウェルにＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ溶液を１００μＬずつ添加・攪拌後、室温で３０分間静置し、発光をマルチラベルプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０２−００２０，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。測定した発光値から以下の式によりＲｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅを算出した。【０２０８】
Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（％）＝（検体ウェルの発光強度−無刺激ウェルの発光強度平均値）／（コントロールウェルの発光強度平均値−無刺激ウェルの発光強度平均値）【０２０９】
抗体Ｂの濃度と、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（％）の値との関係を、図７に示す。図７のグラフは、独立した３試験の結果の平均値を示し、エラーバーはその標準偏差を示す）。抗体Ｂにおいてシグナル阻害活性が確認されたが、Ｎ−１７には検討した濃度範囲におけるＮ−１７のＮｏｔｃｈ４シグナル阻害活性は認められなかった。【０２１０】
実施例１０：抗体Ｂのリコンビナント可溶型ヒトＮｏｔｃｈＮＲＲドメインへの結合における速度論解析【０２１１】
ヒトＮｏｔｃｈのアイソタイプ（Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３およびＮｏｔｃｈ４）のＮＲＲドメインと抗体Ｂとの相互作用について、ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００を用いた速度論解析を行った。抗体Ｂは、抗体ＢのＣＨＯ安定発現細胞株の培養上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、ＣａｐｔｏＱ陰イオン交換クロマトグラフィーおよびＵＮＯｓｐｈｅｒｅＳ陽イオン交換クロマトグラフィーを順次用いて精製した。ヒトＮｏｔｃｈ１ＮＲＲドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．０１７６１７；配列１３０７−１７３３位）、ヒトＮｏｔｃｈ２ＮＲＲドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．０２４４０８；配列１２３９−１６５０位）、ヒトＮｏｔｃｈ３ＮＲＲドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．０００４３５；配列１２４６−１６４１位）およびヒトＮｏｔｃｈ４ＮＲＲドメイン（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００４５４８．３；配列１０４６−１４４５位）について、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグおよびヒスチジンタグ（ｘ１０）との融合タンパク質を作成した後、ＨｉｓＴｒａｐＴＭ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア）を用いて精製した。抗体ＢとヒトＮｏｔｃｈの各アイソタイプのＮＲＲドメインの相互作用を、以下の方法で測定した。精製した抗体ＢをＣＭ５センサーチップ（ＧＥヘルスケア）に固定した抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体で捕捉し、精製したヒトＮｏｔｃｈの各アイソタイプのＮＲＲドメインをそれぞれ６つの異なる濃度でセンサーチップに注入し、抗体との相互作用と解離を操作説明書の指示に従って測定した。【０２１２】
オーバーレイ表示した相互作用センサーグラムと算出された動態パラメータをそれぞれ図８と表３２に示す。【０２１３】
表３２
抗体ＢとヒトＮｏｔｃｈ４−ＮＲＲ融合タンパク質との相互作用の算出された動態パラメータ
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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