(57)【要約】【課題】光刺激しながら標本を観察する場合であっても所望の画像を取得する。【解決手段】観察用のレーザ光を発生する観察用レーザ光源ユニット１１と、観察用のレーザ光を標本Ｓ上で走査させる観察用走査装置１３と、刺激用のレーザ光を発生する刺激用レーザ光源ユニット１５と、観察用走査装置１３によりレーザ光が走査された標本Ｓからの蛍光を受光して光強度信号を出力する受光回路３１と、レーザ光源ユニット１１，１３の両方がＯＦＦ状態で受光回路３１から出力される光強度信号を基準値として記憶する記憶部３６を有し、観察用走査装置１３によるレーザ光の所定の走査間隔ごとに、レーザ光源ユニット１１，１５の両方がＯＦＦの場合に基準値を更新するとともに、観察用走査装置１３によるレーザ光の走査ごとに蛍光を受光した受光回路３１からの光強度信号を基準値に基づいて補正する信号補正部３５とを備える走査型レーザ顕微鏡装置１００を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標本に照射する観察用のレーザ光を発生する観察用光源と、
該観察用光源から発せられた観察用のレーザ光を標本上で走査させる走査部と、
標本を光刺激する刺激用のレーザ光を発生する刺激用光源と、
前記走査部によりレーザ光が走査された標本からの光を受光し、受光した光の輝度に相当する光強度信号を出力する受光回路と、
前記観察用光源および前記刺激用光源がＯＦＦされている状態で前記受光回路から出力される光強度信号を基準値として記憶する記憶部を有し、前記走査部による観察用のレーザ光の所定の走査間隔ごとに、前記観察用光源および前記刺激用光源がＯＦＦされている場合に基準値を更新する基準値設定部と、
前記走査部による観察用のレーザ光の走査ごとに、該観察用のレーザ光が照射された前記標本からの光を受光した前記受光回路から出力される光強度信号を前記記憶部に記憶されている基準値に基づいて補正する信号補正部とを備える走査型レーザ顕微鏡装置。
【請求項２】
前記基準値設定部が、前記走査部による１つの走査ライン中に複数回にわたり光強度信号を取得して前記記憶部に記憶し、該記憶部に記憶している光強度信号を前記走査部による１つまたは複数の走査ライン単位または光強度信号を画像化して得られる画像の１つまたは複数のフレーム単位で平均化した平均値を前記基準値とする請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型レーザ顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、スキャナにより標本上でレーザ光を走査することによって標本において発生する蛍光を受光回路により受光して光強度信号に変換し、得られた光強度信号を画像生成部により処理して標本の画像情報を取得する走査型レーザ顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
特許文献１に記載の走査型レーザ顕微鏡は、光が入射していない状態の受光回路から出力される光強度信号に基づく画像の明るさ、すなわち、黒レベルが安定した画像を取得するため、標本からの光が受光回路に入射しないスキャナの帰線区間を利用し、帰線区間中に入射光量がゼロの状態で受光回路から出力される出力信号に基づいて画像の黒レベルの補正量を算出し、算出した補正量に基づいて光強度信号を補正することとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２３４５００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特許文献１に記載の走査型レーザ顕微鏡では、標本に光刺激を与えながら観察する場合は、標本からの刺激用のレーザ光の反射光の影響が含まれてしまうため、画像の黒レベルの検出を正しく行うことができない。そのため、特許文献１に記載の走査型レーザ顕微鏡は、そのような場合に黒レベルの補正量を正確に算出することがでず、所望の画像を得られないという不都合がある。
【０００６】
本発明は、光刺激を与えながら標本を観察する場合であっても標本の所望の画像を取得することができる走査型レーザ顕微鏡装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、標本に照射する観察用のレーザ光を発生する観察用光源と、該観察用光源から発せられた観察用のレーザ光を標本上で走査させる走査部と、標本を光刺激する刺激用のレーザ光を発生する刺激用光源と、前記走査部によりレーザ光が走査された標本からの光を受光し、受光した光の輝度に相当する光強度信号を出力する受光回路と、前記観察用光源および前記刺激用光源がＯＦＦされている状態で前記受光回路から出力される光強度信号を基準値として記憶する記憶部を有し、前記走査部による観察用のレーザ光の所定の走査間隔ごとに、前記観察用光源および前記刺激用光源がＯＦＦされている場合に基準値を更新する基準値設定部と、前記走査部による観察用のレーザ光の走査ごとに、該観察用のレーザ光が照射された前記標本からの光を受光した前記受光回路から出力される光強度信号を前記記憶部に記憶されている基準値に基づいて補正する信号補正部とを備える走査型レーザ顕微鏡装置を提供する。
【０００８】
本発明によれば、観察用光源から発せられた観察用のレーザ光が走査部により標本上で走査され、標本からの光が受光回路により受光されて光強度信号が出力されることで、この光強度信号を画像化することにより標本の画像を生成することができる。また、刺激用光源から発せられた刺激用のレーザ光が標本に照射されることで、その照射位置において標本を光刺激することができる。したがって、標本を光刺激してその反応を画像上で観察することができる。
【０００９】
また、観察用光源および刺激用光源がＯＦＦされている状態で受光回路から出力される光強度信号は、光が入射していない状態の受光回路から出力される光強度信号に基づく明るさ、すなわち、黒レベルに相当する。したがって、信号補正部により、走査部による観察用のレーザ光の走査ごとに、観察用のレーザ光が照射された標本からの光に基づく光強度信号を基準値設定部の記憶部に記憶されている光強度信号の基準値に基づいて補正することで、黒レベルが安定した標本の画像を生成することができる。また、基準値設定部により、走査部による観察用のレーザ光の所定の走査間隔ごとに基準値を更新することで、適切な基準値に基づいて光強度信号を補正し、常に黒レベルが安定した標本の画像を生成することができる。
【００１０】
この場合において、観察用光源がＯＦＦされていても刺激用光源がＯＮされていると、受光回路から出力される光強度信号には標本からの刺激用のレーザ光の反射光の影響が含まれてしまい、光強度信号の基準値が不正確となり、光強度信号が精度よく補正されない。これに対し、本発明は、基準値設定部が、観察用光源がＯＦＦされていても刺激用光源がＯＮされている場合は基準値を更新しないので、刺激用のレーザ光の反射光等の影響を受けずに安定した基準値に基づいて光強度信号を精度よく補正することができる。したがって、光刺激を与えながら標本を観察する場合であっても標本の所望の画像を取得することができる。
【００１１】
上記発明においては、前記基準値設定部が、前記走査部による１つの走査ライン中に複数回にわたり光強度信号を取得して前記記憶部に記憶し、該記憶部に記憶している光強度信号を前記走査部による１つまたは複数の走査ライン単位または光強度信号を画像化して得られる画像の１つまたは複数のフレーム単位で平均化した平均値を前記基準値とすることとしてもよい。
このように構成することで、黒レベルのばらつき成分を抑制して光強度信号を精度よく補正することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、光刺激を与えながら標本を観察する場合であっても標本の所望の画像を取得することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の一実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図２】図１の受光回路の構成を示すブロック図である。
【図３】観察スキャンの帰線期間中に標本を光刺激した場合の黒レベルの変化を示すタイミングチャートである。
【図４】標本の観察中に標本を光刺激した場合の黒レベルの変化を示すタイミングチャートである。
【図５】本発明の一実施形態の第１変形例に係る走査型レーザ顕微鏡装置を示す概略構成図である。
【図６】本発明の一実施形態の第２変形例に係る受光回路の構成を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡装置について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡装置１００は、図１に示すように、標本Ｓを観察する観察光学系１と、標本Ｓを光刺激する刺激光学系３と、観察光学系１の光路と刺激光学系３の光路とを合成する第１ＤＭ（ダイクロイックミラー）５と、標本Ｓからの蛍光または反射光を集光する対物レンズ（図示略）と、対物レンズにより集光された蛍光または反射光を検出する検出光学系７と、これら観察光学系１、刺激光学系３および検出光学系７を制御する制御ユニット（制御部）９とを備えている。
【００１５】
観察光学系１は、標本Ｓに照射する観察用のレーザ光を発生する観察用レーザ光源ユニット（観察用光源）１１と、観察用レーザ光源ユニット１１から発せられたレーザ光を標本Ｓ上で２次元的に走査させる観察用走査装置（走査部）１３とを備えている。
観察用レーザ光源ユニット１１は、制御ユニット９からの指示によりＯＮ／ＯＦＦが切り替えられるようになっている。
【００１６】
観察用走査装置１３は、互いに交差する所定の揺動軸（図示略）回りに揺動可能な一対のガルバノミラー（図示略）を備えており、制御ユニット９により設定される振り角および振り速度に従ってガルバノミラーの揺動角度を変化させながらレーザ光を反射することができるようになっている。これにより、観察用走査装置１３は、観察用レーザ光源ユニット１１からのレーザ光を偏向して、標本Ｓ上で２次元的に走査させることができるようになっている。また、観察用走査装置１３は、ガルバノミラーの揺動角度に基づきレーザ光の走査位置を示す走査位置情報を制御ユニット９に送るようになっている。
【００１７】
刺激光学系３は、標本Ｓを光刺激する刺激用のレーザ光を発生する刺激用レーザ光源ユニット（刺激用光源）１５と、刺激用レーザ光源ユニット１５から発せられた刺激用のレーザ光を標本Ｓ上で２次元的に走査させる刺激用走査装置（走査部）１７とを備えている。
刺激用レーザ光源ユニット１５は、制御ユニット９からの指示によりＯＮ／ＯＦＦが切り替えられるようになっている。
【００１８】
刺激用走査装置１７は、観察用走査装置１３と同様に、互いに交差する所定の揺動軸（図示略）回りに揺動可能な一対のガルバノミラー（図示略）を備えており、制御ユニット９により設定される振り角および振り速度に従ってガルバノミラーの揺動角度を変化させながらレーザ光を反射することができるようになっている。これにより、刺激用走査装置１７は、刺激用レーザ光源ユニット１５からの刺激用のレーザ光を偏向して、標本Ｓ上で２次元的に走査させることができるようになっている。また、刺激用走査装置１７は、ガルバノミラーの揺動角度に基づきレーザ光の走査位置を示す走査位置情報を制御ユニット９に送るようになっている。
【００１９】
第１ＤＭ５は、観察用走査装置１３からの観察用のレーザ光を前記対物レンズに向けて反射する一方、刺激用走査装置１７からの刺激用のレーザ光を透過させて対物レンズに入射させるようになっている。第１ＤＭ５により反射されたレーザ光および第１ＤＭ５を透過したレーザ光は、それぞれ対物レンズにより標本Ｓに照射されるようになっている。
【００２０】
検出光学系７は、対物レンズにより集光された蛍光または反射光の光路を波長に応じて分岐する第２ＤＭ（ダイクロイックミラー）２１と、第２ＤＭ２１により分岐された一方の光路の蛍光または反射光を検出する第１検出ユニット（ｃｈ１）２３と、第２ＤＭ２１により分岐された他方の光路の蛍光または反射光を検出する第２検出ユニット（ｃｈ２）２５とを備えている。
【００２１】
第２ＤＭ２１は、一方の波長帯域の蛍光または反射光を第１検出ユニット２３に向けて反射する一方、他方の波長帯域の蛍光または反射光を透過させて第２検出ユニット２５に入射させるようになっている。
【００２２】
第１検出ユニット２３は、第２ＤＭ２１により反射された蛍光または反射光を受光し、受光した蛍光または反射光の輝度に相当する光強度信号を出力する受光回路３１と、光が入射していない状態の受光回路３１から出力される光強度信号に基づく明るさ、すなわち、黒レベルを検出する黒レベル検出部３３と、受光回路３１から出力された光強度信号を補正する補正部（基準値設定部、信号補正部）３５とを備えている。
【００２３】
受光回路３１は、図２に示すように、蛍光または反射光を受光して光量を測定し、光強度信号に光電変換する光電子増倍管（ＰＭＴ）４１と、ＤＡＣ（ＤＡ  Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）４３と、第１のＯＰ−ＡＭＰ（演算増幅器）４５と、第２のＯＰ−ＡＭＰ４７と、ＡＤＣ(ＡＤ  ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ）４９とを備えている。
【００２４】
この受光回路３１は、制御ユニット９の制御により、ＤＡＣ４３から第１のＯＰ−ＡＭＰ４５を介して高電圧に増幅した電圧を光電子増倍管４１に印加して感度を設定することができるようになっている。また、受光回路３１は、光電子増倍管４１から出力される光強度信号を第２のＯＰ−ＡＭＰ４７を介してＡＤＣ４９によりデジタル信号に変換して出力するようになっている。受光回路３１から出力された光強度信号は、黒レベル検出部３３および補正部３５に送られるようになっている。
【００２５】
黒レベル検出部３３は、観察用レーザ光源ユニット１１がＯＮ状態かＯＦＦ状態かを読み取ることができるようになっている。また、黒レベル検出部３３は、観察用レーザ光源ユニット１１がＯＦＦされている状態で受光回路３１から出力される光強度信号に基づいて黒レベルを検出するようになっている。黒レベル検出部３３により検出された黒レベルの光強度信号は補正部３５に送られるようになっている。
【００２６】
補正部３５は、刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＮ状態かＯＦＦ状態かを読み取ることができるようになっている。また、補正部３５は、記憶部３６を有しており、黒レベル検出部３３から送られてくる黒レベルの光強度信号に基づいて、観察用レーザ光源ユニット１１および刺激用レーザ光源ユニット１５の両方がＯＦＦされている状態で受光回路３１から出力される光強度信号を基準値として記憶部３６に記憶させるようになっている。
【００２７】
この補正部３５は、観察用走査装置１３によるレーザ光の所定の走査間隔ごとに、観察用レーザ光源ユニット１１および刺激用レーザ光源ユニット１５の両方がＯＦＦされている場合に基準値を更新するようになっている。すなわち、補正部３５は、観察用レーザ光源ユニット１１がＯＦＦされていても刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＮされている場合は、基準値を更新せずに、前回更新した基準値を新たな基準値として採用するようになっている。また、本実施形態においては、補正部３５は、所定の走査間隔として、例えば、観察用走査装置１３によりレーザ光を１回走査するごとに基準値を更新するようになっている。
【００２８】
また、補正部３５は、観察用走査装置１３によるレーザ光の走査ごとに、標本Ｓからの蛍光を受光した受光回路３１から出力される光強度信号を記憶部３６に記憶している基準値に基づいて補正するようになっている。本実施形態においては、補正部３５は、例えば、光強度信号から輝度値を減算する補正を行うようになっている。補正部３５により補正された光強度信号は制御ユニット９に送られるようになっている。
第２検出ユニット２５は、第１検出ユニット２３と同様の構成を備えているので説明を省略する。
【００２９】
制御ユニット９は、観察用レーザ光源ユニット１１および刺激用レーザ光源ユニット１５のＯＮ／ＯＦＦの切り替え、観察用走査装置１３および刺激用走査装置１７の各ガルバノミラーの振り角および振り速度の設定、および、検出ユニット２３，２５の受光回路３１の感度の設定を行うようになっている。また、制御ユニット９は、補正部３５から送られてくる光強度信号を観察用走査装置１３または刺激用走査装置１７から送られてくる走査位置情報に対応する画素ごとに積算して標本Ｓの画像を生成するようになっている。
【００３０】
このように構成された走査型レーザ顕微鏡装置１００の作用を説明する。
本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡装置１００により、光刺激を与えながら標本Ｓを観察する場合について説明する。
まず、標本Ｓを画像上で観察するには、制御ユニット９により観察用レーザ光源ユニット１１をＯＮして観察用のレーザ光を発生させる。
【００３１】
観察用レーザ光源ユニット１１から発せられたレーザ光は、観察用走査装置１３により偏向されて第１ＤＭ５により反射され、対物レンズにより標本Ｓに照射される。これにより、観察用走査装置１３の各ガルバノミラーの揺動角度に応じて、観察用のレーザ光が標本Ｓ上で２次元的に走査される。
【００３２】
観察用のレーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて蛍光が発生すると、その蛍光は対物レンズにより集光され、第２ＤＭ２１により波長に応じて第１検出ユニット２３または第２検出ユニット２５に入射される。例えば、第１検出ユニット２３に入射した蛍光は受光回路３１により受光される。
【００３３】
受光回路３１により蛍光が受光されると、蛍光の輝度に相当する光強度信号が黒レベル検出部３３および補正部３５を介して制御ユニット９に送られる。制御ユニット９においては、補正部３５を介して送られてくる光強度信号が観察用走査装置１３から送られてくる走査位置情報に対応する画素ごとに積算されて、標本Ｓの画像が生成される。これにより、生成した画像をモニタ（図示略）等に表示させることで、画像上で標本Ｓを観察することができる。
【００３４】
次に、標本Ｓに光刺激を与えるには、制御ユニット９により刺激用レーザ光源ユニット１５をＯＮして刺激用のレーザ光を発生させる。刺激用レーザ光源ユニット１５から発せられたレーザ光は、刺激用走査装置１７により偏向されて第１ＤＭ５を透過し、対物レンズにより標本Ｓに照射される。これにより、刺激用走査装置１７の各ガルバノミラーの揺動角度に応じて刺激用のレーザ光が標本Ｓ上で２次元的に走査され、刺激用のレーザ光の照射位置において標本Ｓが光刺激される。
【００３５】
このようにして、観察光学系１により観察用のレーザ光を照射して標本Ｓの画像を取得するとともに、刺激光学系３により刺激用のレーザ光を照射して標本Ｓを光刺激することで、光刺激による標本Ｓの反応を画像上で観察することができる。
なお、刺激用のレーザ光が照射された標本Ｓからの反射光を検出ユニット２３，２５により検出し、制御ユニット９により画像を生成してもよい。
【００３６】
次に、検出ユニット２３，２５における光強度信号の補正について説明する。
図３に示すように、例えば、標本Ｓ上で観察用のレーザ光が走査（観察スキャン）される観察期間と観察期間の間の期間、すなわち、観察用のレーザ光の走査線が次の走査ラインの開始位置に移動させられる帰線期間では、制御ユニット９により観察用レーザ光源ユニット１１がＯＦＦされる。
【００３７】
本実施形態においては、黒レベル検出部３３により、帰線期間毎に観察用レーザ光源ユニット１１のＯＦＦ状態が読み取られ、観察用レーザ光源ユニット１１がＯＦＦされている状態で受光回路３１から出力される光強度信号に基づいて黒レベルが検出される。検出された黒レベルの光強度信号は補正部３５に送られる。
【００３８】
補正部３５においては、刺激用レーザ光源ユニット１５のＯＦＦ状態が読み取られると、黒レベル検出部３３から送られてくる黒レベルの光強度信号に基づいて、観察用レーザ光源ユニット１１および刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＦＦされている状態で受光回路３１から出力される光強度信号が基準値として記憶部３６に記憶される。
【００３９】
また、補正部３５により、観察用走査装置１３によるレーザ光の走査ごとに、標本Ｓからの蛍光を受光した受光回路３１から出力される光強度信号が記憶部３６に記憶されている基準値、すなわち、黒レベルの光強度信号に基づいて補正されて制御ユニット９に送られる。そして、制御ユニット９により、補正された光強度信号に基づいて標本Ｓの画像が生成される。
【００４０】
例えば、図３に示すように、観察用レーザ光源ユニット１１および刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＦＦされている状態で黒レベル検出部３３により検出された黒レベルが１００とすると、補正部３５により基準値１００が記憶される。そして、次の観察期間において受光回路３１から出力された光強度信号の輝度平均が２９００とすると、その光強度信号は補正部３５により輝度平均２９００から基準値１００が減算されて制御ユニット９に送られる。これにより、制御ユニット９において、輝度平均２８００に補正された光強度信号に基づいて標本Ｓの画像が生成される。
なお、図３中では、説明簡略化の為に、ピクセル単位の輝度ではなく輝度平均値で表しているが、輝度平均値に限定されるものではない。
【００４１】
したがって、一般的に画像の黒レベルは光電変換素子やオペアンプの出力の温度依存性によって変動するが、補正部３５によって標本Ｓからの蛍光を受光して得られる光強度信号から黒レベルの光強度信号を減算することで、黒レベルが安定した標本Ｓの画像を取得することができる。また、補正部３５により、観察用走査装置１３によりレーザ光が１回走査されるごとに基準値が更新され、適切な基準値に基づいて光強度信号を補正し、常に黒レベルが安定した標本Ｓの画像を生成することができる。
【００４２】
この場合において、観察用レーザ光源ユニット１１がＯＦＦされていても刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＮされていると、受光回路３１から出力される光強度信号には標本Ｓからの刺激用レーザ光の反射光の影響が含まれてしまい、光強度信号の基準値が不正確となる。
【００４３】
これに対し、本実施形態においては、補正部３５が、観察用走査装置１３によるレーザ光の所定の走査間隔ごとに、観察用レーザ光源ユニット１１および刺激用レーザ光源ユニット１５の両方がＯＦＦされている場合に基準値を更新する。すなわち、補正部３５は、観察用レーザ光源ユニット１１がＯＦＦされていても刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＮされている場合は基準値を更新せずに、前回更新した基準値を新たな基準値として採用する。
【００４４】
すなわち、例えば、図３に示すように、帰線期間中に刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＮされて標本Ｓに光刺激が与えられると、黒レベル検出部３３により過剰の黒レベル（例えば、４０９５超）が検出される。この値をそのまま基準値にしてしまうと、次の観察期間において得られた光強度信号（例えば、輝度平均が２９５０）をこの基準値で補正しても、補正後の値がアンダーフローとなる。したがって、光強度信号を精度よく補正することができない。
【００４５】
これに対し、本実施形態においては、補正部３５により前回更新した基準値１００が新たな基準値として採用され、輝度平均２９５０の光強度信号が基準値１００で減算される。これにより、制御ユニット９において、輝度平均２８５０に補正された光強度信号に基づいて標本Ｓの画像を生成することができる。
【００４６】
以上説明したように、本実施形態に係る走査型レーザ顕微鏡装置１００によれば、観察用レーザ光源ユニット１１および刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＦＦされている場合にのみ基準値を更新して黒レベルの変動成分を除去することで、刺激用のレーザ光の反射光等の影響を受けずに安定した基準値に基づいて光強度信号を精度よく補正することができる。したがって、光刺激を与えながら標本Ｓを観察する場合であっても標本Ｓの所望の画像を取得することができる。
なお、本実施形態においては、第１検出ユニット２３により蛍光を受光した場合を例示して説明したが、第２検出ユニット２５により蛍光を受光する場合も同様である。
【００４７】
本実施形態においては、帰線期間中に標本Ｓを光刺激した場合を例示して説明したが、例えば、図４に示すように、ユーザが刺激ボタン（図示略）等を操作することにより、観察期間中に刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＮされて標本Ｓが光刺激されるような場合がある。この場合も、補正部３５が、観察用走査装置１３によるレーザ光の１回の走査ごとに、観察用レーザ光源ユニット１１および刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＦＦされている場合にのみ基準値を更新することで、安定した基準値に基づいて光強度信号を精度よく補正することができる。
【００４８】
例えば、図４に示すように、観察期間中に標本Ｓが光刺激されることにより受光回路３１から平均輝度が４０００，３９００の光強度信号が出力され、その間の帰線期間中も刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＮされていることにより黒レベル検出部３３によって４０９５超の黒レベルが検出されたとする。この場合、補正部３５により、基準値は更新されずに、前回更新した基準値１００が新たな基準値として採用される。
なお、このように処理するのは共焦点（内部ＰＭＴ）の場合であり、非共焦点（外部ＰＭＴ）の場合はこのような処理をする必要がない。
また、図４中では、説明簡略化の為に、ピクセル単位の輝度ではなく輝度平均値で表しているが、輝度平均値に限定されるものではない。
【００４９】
本実施形態においては以下のように変形することができる。
本実施形態においては、受光回路３１と黒レベル検出部３３と補正部３５とにより検出ユニット２３，２５を構成することとしたが、例えば、第１変形例としては、図５に示すように、受光回路３１Ａ，３１Ｂを独立させ、制御ユニット９が、レーザ光源ユニット１１，１５および走査装置１３，１７を制御する制御部１０９とともに、黒レベル検出部３３Ａ，３３Ｂと、補正部３５Ａ，３５Ｂとを備えることとしてもよい。
【００５０】
また、本実施形態においては、観察用走査装置１３により観察用のレーザ光を走査する度に基準値を更新することとしたが、例えば、第２変形例としては、補正部３５が、観察用走査装置１３による１つの走査ライン中に複数回にわたり光強度信号を取得して記憶部３６に記憶し、記憶部３６に記憶している光強度信号を観察用走査装置１３による１つまたは複数の走査ライン単位（数回分のＨＤ（水平同期信号）の帰線期間単位）で平均化した平均値を基準値とすることとしてもよい。また、記憶部３６に記憶している光強度信号を画像の１つまたは複数のフレーム単位（ＶＤ（垂直同期信号）の帰線期間単位）で平均化した平均値を基準値とすることとしてもよい。
このようにすることで、黒レベルのばらつき成分を抑制して光強度信号を精度よく補正することができる。
【００５１】
この場合、刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＮのときは、黒レベルの光強度信号を含めないようにして平均化の処理を行うこととすればよい。また、観察用走査装置１３により最初に走査を開始するときは、基準値としてデフォルト値を用いることとすればよい。
【００５２】
また、本実施形態においては、単ｃｈの光電子増倍管４１を例示して説明したが、第３変形例としては、図６に示すように、３２ｃｈの光電子増倍管１４１を採用することとしてもよい。３２ｃｈの光電子増倍管はセルごとに独立してＨＶを調節することができないため、倍率可変ＯＰ−ＡＭＰ１４７により回路ゲインの可変幅を大きく取る必要があり、その結果、従来の走査型レーザ顕微鏡装置では回路系の温度ドリフトの影響が顕著に現れる。
【００５３】
これに対し、本変形例によれば、観察用レーザ光源ユニット１１および刺激用レーザ光源ユニット１５がＯＦＦされている場合にのみ基準値を更新して、黒レベルの変動成分を除去することで、長時間にわたり輝度を安定にする、すなわち、輝度のばらつきを小さくすることができる。
【符号の説明】
【００５４】
１１    観察用レーザ光源ユニット（観察用光源）
１３    観察用走査装置
１５    刺激用レーザ光源ユニット（刺激用光源）
３１，３１Ａ，３１Ｂ    受光回路
３５，３５Ａ，３５Ｂ    補正部（基準値設定部、信号補正部）
３６    記憶部
１００    走査型レーザ顕微鏡装置
Ｓ    標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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