(57)【要約】      （修正有）【課題】観察対象を効率的且つ効果的にイオン液体で浸漬し、真空下でも収縮、変形のない試料画像を提供する。【解決手段】観察対象の内部にイオン液体を注入し、イオン液体で置換する。観察対象表面にイオン液体を塗布する手法や、観察対象全体をイオン液体に浸す手法に比べて、観察対象表面に付着するイオン液体の量を減少させることができる。このため、観察対象表面からイオン液体を除去する過程での観察対象の形態変化や、損傷が生じる機会を減少させつつ、観察対象の表面および内部に導電性を付加できるので、荷電粒子線観察装置により観察対象を効率的且つ効果的に観察することが可能となる。【選択図】図１０
2014190892.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象に荷電粒子線を照射することにより得られる信号を検出して観察対象の画像を取得する試料観察方法であって、
観察対象にイオン液体を含む溶液を注入することを特徴とする試料観察方法。
【請求項２】
請求項１記載の試料観察方法において、
観察対象の表面と内部にイオン液体を含む溶液を浸透させることを特徴とする試料観察方法。
【請求項３】
請求項２記載の試料観察方法において、
イオン液体を含む溶液が表面と内部に浸透した観察対象に荷電粒子線を照射して観察することを特徴とする試料観察方法。
【請求項４】
観察対象に荷電粒子線を照射することにより得られる信号を検出して観察対象の画像を取得する試料観察方法の試料前処理方法であって、
観察対象にイオン液体を含む溶液を注入することを特徴とする試料前処理方法。
【請求項５】
請求項４記載の試料前処理方法において、
観察対象の表面と内部にイオン液体を含む溶液を浸透させることを特徴とする試料前処理方法。
【請求項６】
請求項４記載の試料前処理方法において、
観察対象の画像を取得した後に、さらに、観察対象にイオン液体を含む溶液を注入することを特徴とする試料前処理方法。
【請求項７】
観察対象を載置するステージと、
観察対象に荷電粒子線を照射する電子光学系と、
荷電粒子線の照射により得られる信号を検出する検出器と、
信号に基づいて生成された観察対象の画像を表示する表示装置と、備え、
観察対象にイオン液体を含む溶液を注入する注入機構を備える荷電粒子線装置。
【請求項８】
請求項７記載の荷電粒子線装置において、
前記表示装置に、観察対象にイオン液体を含む溶液を注入する過程を表示できることを特徴とする荷電粒子線装置。
【請求項９】
請求項７記載の荷電粒子線装置において、
前記注入機構が、観察対象にイオン液体を含む溶液を注入できる微細管を備えることを特徴とする荷電粒子線装置。
【請求項１０】
請求項９記載の荷電粒子線装置において、
前記微細管に、目盛りが設けられていることを特徴とする荷電粒子線装置。
【請求項１１】
請求項７記載の荷電粒子線装置において、
前記注入機構が、イオン液体を含む溶液を付着させた状態で観察対象に突き刺すことができる針を備えることを特徴とする荷電粒子線装置。
【請求項１２】
請求項７記載の荷電粒子線装置において、
前記注入機構が、観察対象にイオン液体を含む溶液を注入できる溝が設けられた針を備えることを特徴とする荷電粒子線装置。
【請求項１３】
請求項７記載の荷電粒子線装置において、
前記注入機構により観察対象に注入されるイオン液体を含む溶液の量を制御する注入量制御装置を備えることを特徴とする荷電粒子線装置。
【請求項１４】
請求項７記載の荷電粒子線装置において、
観察対象にイオン液体を含む溶液を注入する過程を観察できる光学観察装置を備えることを特徴とする荷電粒子線装置。
【請求項１５】
請求項７記載の荷電粒子線装置において、
前記ステージの材質が吸水性を有することを特徴とする荷電粒子線装置。
【請求項１６】
請求項７記載の荷電粒子線装置において、
試料室の内部で動かすことができるプローブを備えることを特徴とする荷電粒子線装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン液体に浸漬した観察対象を荷電粒子線装置で観察することに関する。
【背景技術】
【０００２】
乾燥により変形が生じる試料を電子顕微鏡試料室内の真空環境に暴露すると原形を留めないほどに、乾燥し、収縮してしまう。すなわち、湿潤環境から試料を取り出し、さらには電子顕微鏡試料室内の真空環境下に試料を持ち込む過程に置いて、試料が収縮や変形することが避けられないために、乾燥に弱い試料を電子顕微鏡観察することは困難であった。
【０００３】
そこで、液体中にて試料を電子顕微鏡観察する手法として、イオン液体を用いる手法が研究されている。特許文献１では、導電性を有し、真空中でも蒸発しないイオン液体の特性を利用し、非導電性試料に導電性を与え、原形のまま電子顕微鏡下で観察できることが記載されている。特に、イオン液体で水分を含む試料を浸漬しその後真空下で水分を除去する方法が記載されている。
【０００４】
特許文献１の発明以後、イオン液体を用いた生物試料の観察方法が研究されてきた。例えば、特許文献２では、特定のイオン液体を用いてイオン液体の生体試料への浸透性への浸透性を高める点が開示されている。実施例としてワカメ、ほうれん草の茎、綿布、毛髪、マウスの骨、赤血球、ミュータンス菌の観察例が示されている。また、このイオン液体を水などの極性溶媒に溶かし液状媒体とし、この液状媒体を試料に含浸、塗布、噴霧する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／０８３７５６号（米国特許出願公開第２００９／０１７３８８２号明細書）
【特許文献２】特開２０１１−１３７８０７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】北爪智哉、淵上寿雄、沢田英夫、伊藤敏幸、イオン液体  −常識を翻す不思議な塩−、コロナ社、Ｐ２、２００５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明者が、イオン液体を用いた電子顕微鏡観察について鋭意検討した結果、次の知見を得るに至った。
【０００８】
特許文献１では、イオン液体が真空中でも蒸発しないことを利用し、生体試料を原形のまま電子顕微鏡下で観察できることが示されているが、生体試料をイオン液体中に含浸させると、浸透圧の変化に伴い試料内部の水分が脱水され、試料の形態が破壊されてしまう問題があった。例えば、浸透圧の変化に弱い生物試料をイオン液体中に投入すると、浸透圧差により水生生物内の水分が失われ、イオン液体中であっても、水生生物が干からびてしまう。さらに、イオン液体に水分を含む試料を浸漬し、その後真空下で水分を除去したしても、試料表面をイオン液体が覆ってしまうため、試料表面の観察ができなくなる問題があった。例えば、水やアルコールなどの溶媒で希釈したイオン液体中に、試料をイオン液体中に含浸させた場合であっても、溶媒の揮発に伴い試料表面にイオン液体が残留してしまい、試料の表面を覆ってしまうために、電子顕微鏡観察の障害になっていた。
【０００９】
特許文献２では、イオン液体を水などの極性溶媒に溶かし液状媒体とし、この液状媒体を試料に含浸、塗布、噴霧する方法が記載されている。試料にイオン液体を含む液状媒体を含浸、塗布、噴霧すると、試料表面に過剰なイオン液体が残留してしまう問題がある。特許文献２では、濾紙や紙製ウエスによる拭き取りにより、過剰なイオン液体を除去する手法が記載されているが、濾紙や紙製ウエスによる拭き取りは試料に損傷を与える問題がある。特に、節足動物などの関節部が多い生物試料に対し、濾紙や紙製ウエスを用いて拭き取りを行うと、脚などが関節から外れてしまう問題がある。さらに、拭き取れなかったイオン液体が試料の表面を覆ってしまうため、試料表面の観察ができなくなる問題がある。
【００１０】
さらに、特許文献１と特許文献２では、イオン液体を試料表面にのみ接触させ、試料表面だけの導電処理だけを行うために、試料内部の導電性が得られない問題がある。試料内部までイオン液体が浸透せず、試料内部の導電性が得られない場合、電子顕微鏡の電子ビームが試料内部まで侵入する高加速電圧での観察において、帯電現象が生じることがある。さらに、イオン液体が試料内部まで浸透していない試料を解剖した場合、試料を解剖後に試料内部の導電処理を再度行う必要があるなどの問題がある。
【００１１】
本発明の目的は、観察対象を効率的且つ効果的にイオン液体で浸漬することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、観察対象の内部にイオン液体を注入し、イオン液体で置換することに関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、観察対象表面にイオン液体を塗布する手法や、観察対象全体をイオン液体に浸す手法に比べて、観察対象表面に付着するイオン液体の量を減少させることができる。このため、観察対象表面からイオン液体を除去する過程での観察対象の形態変化や、損傷が生じる機会を減少させつつ、観察対象の表面および内部に導電性を付加できるので、荷電粒子線観察装置により観察対象を効率的且つ効果的に観察することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１の電子顕微鏡の装置構成図である。
【図２】実施例１の電子顕微鏡の試料室内の構成図である。
【図３】実施例１の注射器の説明図である。
【図４】実施例１の注射針の先端部の説明図である。
【図５】実施例１における、試料にイオン液体を注入するための針の先端部の説明図である。
【図６】実施例１の試料観察方法の手順を示した説明図である。
【図７】実施例１における、注射針を用いて、ヨコエビにイオン液体を注入している状態の光学顕微鏡画像である。
【図８】実施例１における、イオン液体を注入した時に、注射針の刺口から過剰なイオン液体が漏れ出した場合の説明図である。
【図９】実施例１における、イオン液体を注入後のヨコエビの電子顕微鏡画像である。
【図１０】実施例２における、電子顕微鏡にイオン液体を注入するシステムを搭載した装置の説明図である。
【図１１】実施例２における、電子顕微鏡にイオン液体を注入するシステムを搭載した装置における試料室内の構成図である。
【図１２】実施例２における、注射針を用いて試料にイオン液体を注入している状態の説明図である。
【図１３】イオン液体注入用プローブを用いて、固い試料にイオン液体注入用の孔を穿孔している状態を示した説明図である。
【図１４】イオン液体注入用プローブの先端部分をイオン液体の液滴に接触させることで、イオン液体注入用プローブにイオン液体を付着させている状態を示した説明図である。
【図１５】固い試料に穿孔したイオン液体注入用の孔にイオン液体を注入している状態を示した説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
実施例では、観察対象に荷電粒子線を照射することにより得られる信号を検出して観察対象の画像を取得する試料観察方法において、観察対象にイオン液体を含む溶液を注入することを開示する。
【００１６】
また、実施例では、観察対象の表面と内部にイオン液体を含む溶液を浸透させることを開示する。また、イオン液体を含む溶液が表面と内部に浸透した観察対象に荷電粒子線を照射して観察することを開示する。
【００１７】
また、実施例では、観察対象に荷電粒子線を照射することにより得られる信号を検出して観察対象の画像を取得する試料観察方法の試料前処理方法において、観察対象にイオン液体を含む溶液を注入することを開示する。
【００１８】
また、実施例では、観察対象の表面と内部にイオン液体を含む溶液を浸透させることを開示する。
【００１９】
また、実施例では、観察対象の画像を取得した後に、さらに、観察対象にイオン液体を含む溶液を注入することを開示する。
【００２０】
また、実施例では、観察対象を載置するステージと、観察対象に荷電粒子線を照射する電子光学系と、荷電粒子線の照射により得られる信号を検出する検出器と、信号に基づいて生成された観察対象の画像を表示する表示装置と、備え、観察対象にイオン液体を含む溶液を注入する注入機構を備える荷電粒子線装置を開示する。
【００２１】
また、実施例では、表示装置に、観察対象にイオン液体を含む溶液を注入する過程を表示できることを開示する。
【００２２】
また、実施例では、注入機構が、観察対象にイオン液体を含む溶液を注入できる微細管を備えることを開示する。また、微細管に、目盛りが設けられていることを開示する。
【００２３】
また、実施例では、注入機構が、イオン液体を含む溶液を付着させた状態で観察対象に突き刺すことができる針を備えることを開示する。
【００２４】
また、実施例では、注入機構が、観察対象にイオン液体を含む溶液を注入できる溝が設けられた針を備えることを開示する。
【００２５】
また、実施例では、注入機構により観察対象に注入されるイオン液体を含む溶液の量を制御する注入量制御装置を備えることを開示する。
【００２６】
また、実施例では、観察対象にイオン液体を含む溶液を注入する過程を観察できる光学観察装置を備えることを開示する。
【００２７】
また、実施例では、ステージの材質が吸水性を有することを開示する。
【００２８】
また、実施例では、試料室の内部で動かすことができるプローブを備えることを開示する。
【００２９】
以下、上記およびその他の本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。なお、図面はもっぱら発明の理解のために用いるものであり、権利範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３０】
図１には、本実施例にかかる電子顕微鏡の装置構成を示す。本実施例の電子顕微鏡は、走査電子顕微鏡である。電子線を発生する電子銃１、電子線を集束するレンズ系と電子線が試料上を走査するように偏向する偏向器とを含む電子光学系２、電子光学系を制御する制御部３、二次電子を検出する二次電子検出器４、反射電子を検出する反射電子検出器５、検出器からの信号に基づいて試料の画像を生成する画像生成部６、撮像した画像を表示するディスプレイ等の表示部７、走査電子顕微鏡の各機能を操作するマウスや操作卓等の操作部８、モーターステージを制御するステージ制御部９、電子源や電子光学系を内部に有するカラムを真空排気する真空ポンプ１０を備える。この真空ポンプ１０によって試料室を低真空または高真空に排気しても良いし、別の真空ポンプによって試料室を排気しても良い。通常、電子顕微鏡の試料室は真空状態に保たれているので、試料は真空状態の下で観察される。なお、上記の制御部３、ステージ制御部９、画像生成部６は、専用の回路基板によってハードとして構成されていてもよいし、電子顕微鏡に接続されたコンピュータ１１で実行されるプログラムによって構成されてもよい。ステージがモーターステージの場合は、ステージ制御部９が必要であるが、手動ステージの場合にはステージ制御部は不要である。
【００３１】
なお、本実施例では走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を例にあげて説明するが、これに限定されるものではない。走査透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）やイオン顕微鏡などの荷電粒子線を用いた試料観察装置等による観察に適用可能である。
【００３２】
図２には、本実施例にかかる電子顕微鏡の試料室内の構成を示す。試料室１２の内部システムは、電子顕微鏡の対物レンズ１３、対物レンズ１３からイオン液体を含浸させた試料１４に照射される電子ビーム１５、イオン液体を含浸させた試料１４からの二次電子信号１６を検出する二次電子検出器４、イオン液体を含浸させた試料１４からの反射電子信号１７を検出する反射電子検出器５から構成される。試料に電子ビームを照射することにより得られる信号である二次電子や反射電子等を総称して二次粒子ということもある。イオン液体を含浸させた試料１４は、電子顕微鏡用の試料台１８の上に乗せてある。図２の試料台１８は、直径１５ｍｍ、高さ６ｍｍの円筒形の形状である。ただし、必ずしも円筒形の形状である必要はなく、試料１４の大きさに応じて試料台１８の大きさを変えてよい。試料台１８の材質としはアルミニウムが一般的であるが、試料台上の余分なイオン液体を除去する効果を得るために、吸水性の材質、例えばカーボン製の試料台を使用することも可能である。また、一般的なアルミニウム材質の試料台においても、試料台上の余分なイオン液体を除去する効果を得るために、試料台の上に吸水加工を施してよい。例えば、濾紙を貼ることや、フィルターを載せることや、導電性ペーストなど吸水効果を持つ素材を試料台に乗せる手法が考えられる。試料台１８は、手動あるいはモーターによりＸ軸およびＹ軸の駆動が可能な試料ステージ１９に設置される。試料ステージが、Ｒ軸、Ｚ軸およびＴ軸にも可動であると、試料を様々な角度から観察することができる。
【００３３】
次に、試料１４にイオン液体を注入するための注射器について説明する。図３の注射器は、注射筒２０と注射針２１から構成される。注射器は、注射針２１を注射筒２０に差し込んで接続するものでも、注射針２１と注射筒２０が一体型のものでも良い。図４は、注射針の先端部を拡大した説明図である。注射針２１を試料１４にどの程度の深さまで刺したかを見極めるために、注射針２１には目盛２２が付いていることが望ましい。注射針２０の材質は、金属でも、プラスチックでもよい。注射針２１は、一般的な医療用注射針の最小規格（外径０．３ｍｍ）よりも細いことが望ましく、外径１０μｍから外径１００μｍが望ましいが、試料の大きさや、観察目的などの性質に応じて、これよりも細く、あるいは太くできる。例えば、一個の細胞内にイオン液体を注入する場合には、外径１０μｍよりも細いことが必要であるが、昆虫などの一個の生物体内にイオン液体を注入する場合には、外径１００μｍよりも太いことが望ましい。注射針２１の材質は金属に限らず、例えば、ガラスや樹脂を使用しても良い。注射筒２０は、微量用のものが望ましく、最小単位が０．１ｍｌ以下であることが望ましい。
【００３４】
ここでは、イオン液体の注入に注射器を用いたが、試料１４へのイオン液体の注入法はこれに限定されるものではない。例えば、パスツールピペットのようにガラス管の先を長く細く引き伸ばし、金属製の注射針を使用しないで、試料に刺すことができるようにしたピペットを使用しても良い。微量のイオン液体を注入することを目的として、マイクロピペットを使用しても良く、マイクロピペットに注射針や、パスツールピペットなどの刺針を組み合わせても良い。注射筒２０の代わりにスポイドや駒込ピペットを使用しても良い。ジェット・インジェクターに代表される圧縮空気を用いて薬剤を注入する装置を用いて、注射針を用いずにイオン液体を試料に注入しても良い。
【００３５】
イオン液体の注入量を機械的に制御するシステムとして、先端部に注射針を接続したカテーテル、シリコン製チューブ、ゴム製チューブ、ビニール製チューブ、プラスチック製チューブなどの注入チューブなどの注入器具に、モーター駆動式の送液ポンプや、注入量を計測するためのセンサを組み合わせて用いても良い。
【００３６】
注射針の直径より小さな領域にイオン液体を注入する方法として、先端部にイオン液体を付着させた針を試料に突き刺すことにより、試料内部にイオン液体を注入しても良い。針の材質は、どのような素材を用いても良く、例えば、金属製、プラスチック製、または木製の針などが考えられる。親水性のイオン液体を用いる場合には、針にイオンスパッタや塗膜処理や界面加工などの親水化処理を行っても良い。疎水性のイオン液体を用いる場合には、塗膜処理や界面加工などの疎水化処理を行っても良い。針の形状は円錐形である必要はなく、図５の針先端部の説明図のようにイオン液体を効率よく注入するための溝２３を作っても良い。溝２３は直線的である必要はなく、針の円筒や円錐の面に沿って螺旋状の溝を設けてもよい。溝２３は１本である必要はなく、複数あっても良い。
【００３７】
注射器や針などの注入機を用いない方法として、イオン液体を染み込ませたガーゼ、紙、樹脂、綿、布、多孔質材料などを試料内に埋め込み、試料内にイオン液体を浸透させても良い。
【００３８】
次に、試料１４にイオン液体を注入して、電子顕微鏡で観察する手順を説明する。図６は、本実施例により、ヨコエビの電子顕微鏡画像を得る手順を示した説明図である。本実施例はヨコエビに限定されず、導電性がなく、乾燥に弱い観察対象に対して有効である。観察対象としては、例えば、エビなどの甲殻類や、ワムシやアメーバなどの動物プランクトン、藍藻や緑藻などの植物プランクトン、カビや細菌などの微生物、水生無脊椎動物、節足動物、昆虫類、線虫類、ギョウチュウ、ヒル、ミミズなどの小動物、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類などの動物や動物の組織、コケなどの乾燥に弱い植物、花や葉などの植物組織、植物細胞や動物細胞を培養した培養細胞や培養組織、ホルマリンやエタノールなどの固定液で標本化された生物組織、果実、豆腐、寒天、ゼリー、ゼラチン、コンニャクなどの食品のように乾燥により変形が生じるものが考えられる。乾燥には耐性があるものの導電性がない試料を観察対象としても良く、例えば、電子顕微鏡観察用にグルタールアルデヒドなどで標本化された生物組織、米や麺類、菓子などの加工食品や加工食品の標本、麻、綿、ナイロン、ビニロン、ポリエステルなどの繊維、糸や生地、木材、紙、岩石、粘土、セメント、コンクリート、陶器、多孔質セラミック、多孔質ガラス、多孔質樹脂が考えられる。他には、錠剤やカプセル薬などの医薬品、砂糖、塩、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などの水に可溶性の試料を観察対象としても良い。プリント基板、電子部品を実装したプリント基板などの、部分的に導電性がない試料を観察対象としても良い。
【００３９】
最初にエタノール溶液中に保存していたヨコエビを、水中に入れ、エタノールを水で置換する。本実施例のヨコエビは、濃度９０％以上のエタノール溶液中に４ヶ月間保存していたものであるが、採取直後の試料を用いてもかまわない。水で置換することにより、エタノール溶液中では半透明であったヨコエビの体色が、白色に変化する。本実施例では、ヨコエビを水に浸した時間は６０分であったが、体色の変化が確認されれば、もっと短い時間でも良い。次に、水中からヨコエビを引き上げ、電子顕微鏡用の試料台に乗せ、余分な水分を濾紙などで吸引する。以上のステップは、採取直後のヨコエビを使う場合など、試料の内部に予め水が含まれている場合には省略可能である。
【００４０】
余分な水分を吸い取った後、試料が乾燥する前に手早く少量のイオン液体を、注射器を用いてヨコエビの内部に注入する。図７は、本実施例の手法を用いてイオン液体を注入中のヨコエビを光学顕微鏡により撮影したに光学顕微鏡画像２４である。注射針２１により、ヨコエビの腹部２５にイオン液体を注入している。
【００４１】
ヨコエビの場合では、イオン液体を注入することにより、体色が白色から透明に変更するため、注入量の過不足を判断することができる。具体的には、イオン液体注入部以外の体色が白色から、透明に変化すれば、イオン液体がヨコエビ全体に浸透したと判断できる。
【００４２】
イオン液体に着色料や蛍光を発する塗料を含ませることにより、試料中のイオン液体の浸透過程を目視、光学顕微鏡、または蛍光顕微鏡下で観察し、試料に対するイオン液体の注入量の過不足を観察し、注入量を調整しても良い。
【００４３】
なお、イオン液体が観察対象に浸透したかの判断はこれに限られることなく、例えば、観察対象の重量から判断しても良い。注入するイオン液体の量は、試料の含水量と同程度が望ましいが、過剰なイオン液体は注射針の刺口から漏れ出すので、試料と同程度の体積であれば、試料の含水量よりも多くても、少なくてもよい。
【００４４】
図８に示すように、試料１４に注射針２１を刺し、イオン液体を注入した時に、刺口２６から過剰なイオン液体２７が漏れ出すことがあるが、試料台１８の素材がカーボンなど吸水性の素材であれば、過剰なイオン液体２７を試料台１８が吸収する。試料１４の表面や、試料１４の開口部からイオン液体が漏れ出た場合にも、試料台１８がイオン液体を吸収する効果が得られる。また、一般的なアルミニウム材質の試料台に濾紙やフィルターを載せることや、導電性ペーストなど吸水効果を持つ素材を張り付けて、過剰なイオン液体を吸収する効果を得ても良い。
【００４５】
試料１４にイオン液体を注入した後に、イオン液体を注入した試料１４を図１の走査電子顕微鏡で観察する。試料１４と試料１４を設置した試料台１８は、図２の電子顕微鏡の試料室１２の試料ステージ１８に取り付けられる。
【００４６】
なお、ここでのイオン液体は、イオン（陽イオン、陰イオン）から構成される融点が低い塩のことである。非特許文献１によれば、イオン液体、またはイオン性液体と称される塩は、より正確には常温イオン液体のことであり、蒸気圧がほとんど無く、難燃性、イオン性であるが低粘性、高い分解電圧を持つ特徴を持ち、空気中で安定、常温常圧下で液体の塩のこととされており、有機塩のなかに、このような性質を持つ塩が存在する。
【００４７】
イオン液体としては、例えば、イミダゾリウム塩類・ピリジニウム塩類などのアンモニウム系、ホスホニウム系イオン、無系イオンなどの陽イオンを持つものと、臭化物イオンやトリフラートなどのハロゲン系、テトラフェニルボレートなどのホウ素系、ヘキサフルオロホスフェートなどのリン系などの陰イオンを組み合わせたものが考えられる。一般にイオン液体は有機イオンを含む塩であるが、室温で溶融する塩であれば無機イオンだけから構成される塩でも良い。
【００４８】
本実施例ではＣ8Ｈ15Ｎ2ＢＦ4の化学式を有する親水性のイオン液体を使用した。ヨコエビの場合は親水性のイオン液体を使用したが、試料が疎水性の特徴を持つ場合には、疎水性のイオン液体を使用しても良い。ヨコエビの場合、最適なイオン液体の濃度は１００％であったが、試料の性質の違い、例えば浸透圧の違いによって、イオン液体を水で希釈してもよい。水以外の溶媒を用いて良く、溶媒としては、例えばエタノール、メタノール、グリセリン、アセトン、ヘキサン、エーテル、ホルムアルデヒドを含むホルマリンが考えられる。前述したように、着色料や、蛍光を発する塗料をイオン液体に含ませても良い。
【００４９】
ヨコエビは導電性がないため、従来、電子顕微鏡観察するためには、イオンスパッタや真空蒸着による金属コーティングによって、試料表面の導電処理を行う必要があった。しかし、本実施例の方法においては、試料内部に注入したイオン液体が試料表面、あるいは表層まで浸透すれば、イオン液体による導電効果が得られるため、イオンスパッタや真空蒸着による試料表面の導電処理を行う必要はない。したがって、試料内部に注入したイオン液体が試料表面、あるいは表層まで浸透した後に、速やかに、試料１４を走査電子顕微鏡で観察することができる。
【００５０】
試料１４の試料表面、あるいは表層にまでイオン液体が浸透していない場合には、走査電子顕微鏡で観察中に帯電現象が生じる場合がある。この場合は、観察を一時的に中断し、イオン液体を試料１４の内部に追加注入するか、イオン液体が試料表面に浸透するまで観察を中断する。イオン液体が試料表面に浸透すれば、帯電現象は軽減する。試料内部のイオン液体の量が少ない場合には、帯電現象だけでなく、試料１４に凹みが生じることがあるが、この場合も、イオン液体を試料１４に追加注入することで形態の復元を行うことができる。
【００５１】
イオン液体を過剰注入したことによって試料内部から表面にイオン液体が滲み出すことがあり、さらに注射針の刺孔からイオン液体が漏れることによって、試料の表面がイオン液体によって汚れる場合がある。濾紙や紙製ウエスによる拭き取りも可能ではあるが、試料表面に付着した液滴状のイオン液体をブロアーなどで吹き飛ばして除去すれば、試料に損傷を与えることがない。多量のイオン液体が試料表面に付着してしまった場合は、水やアルコールなどの溶媒で試料表面に付着したいイオン液体を洗い流すと良い。
【００５２】
ヨコエビなどの非導電性試料の観察において、低い加速電圧、例えば加速電圧１ｋＶで観察し、帯電現象を軽減する手法もあるが、本実施例の方法を用いれば、加速電圧の設定に制限はなく、低い加速電圧でも高い加速電圧でも試料を観察できる。一般的には、高い加速電圧の方が、電子顕微鏡の分解能が高いため、高倍率での測定が可能である。高い加速電圧、例えば加速電圧１５ｋＶ以上で生物試料を観察する場合、電子ビームが試料の内部に侵入し、試料表面の導電処理を行っても、試料内部の導電性がないために帯電現象が生じることがある。しかしながら、本実施例の方法では、試料内部から、試料表面、あるいは表層までイオン液体が浸透しているために、試料表層から内部まで試料全体にわたって導電性が確保される。したがって、本実施例の方法を用いることにより、加速電圧１５ｋＶ以上の高い加速電圧での生物試料の観察が可能になる。
【００５３】
ヨコエビなどの生物試料の場合、観察に先立って、実体顕微鏡下で、針やピンセットを用いて、体全体の向きや、脚や、触覚の向きを整えても良い。電子顕微鏡の試料室内に、プローブが設置されている場合には、プローブを使用して電子顕微鏡の観察途中に体全体の向きや、脚や、触覚の向きを整えることも可能である。このようにして、イオン液体注入後のヨコエビの頭部を走査電子顕微鏡で観察した例が、図９のヨコエビ頭部の電子顕微鏡画像２８である。図９は、図２の二次電子検出器４で観察したものである。５０倍の低倍率で撮影した画像であるが、電子顕微鏡は、生物顕微鏡や実体顕微鏡などの光学顕微鏡と比較して焦点深度が深いために、光学顕微鏡よりも立体的な画像を得ることができる。ヨコエビの種類を同定するためには、図９のヨコエビの口器２９の構造を詳細に観察する必要があるため、さらに高倍率で電子顕微鏡の観察を行っても良い。
【００５４】
試料１４を解体し、内部構造を電子顕微鏡で観察しても良い。解剖例として、例えば、ヨコエビの脚や、口の構造を分解し、個別に観察することが考えられる。剖出した試料内部は、イオン液体の浸透により導電性が得られているため、解剖後にイオンスパッタや真空蒸着による金属コーティングによる試料内部の導電処理を行う必要はない。試料１４は大気中で１年程度、条件が良ければ１年以上保管が可能であるので、何度でも繰り返し電子顕微鏡で観察することが可能である。試料１４からイオン液体が流出し、試料に凹みが生じた場合には、イオン液体を再注入しても良い。
【００５５】
本実施例ではヨコエビを例に、電子顕微鏡の観察手法を説明したが、他の試料においても同様の手順で観察を行うことが可能である。
【実施例２】
【００５６】
生体組織の切片やプランクトンなどの微細な試料の内部にイオン液体を注入する場合、注射器を用いた目視でのイオン液体注入作業は困難な場合がある。この場合、顕微鏡観察を行いながら、イオン液体の注入を行えばよい。ここでは、走査電子顕微鏡の観察下で、微細な試料の内部にイオン液体を注入する場合の実施例を説明する。本実施例では、注入作業の観察に使用する顕微鏡として、走査電子顕微鏡を例に説明するが、本実施例はこれに限定されるものではなく、走査透過電子顕微鏡（ＳＴＥＭ）やイオン顕微鏡などの荷電粒子線を用いた試料観察装置等による観察に適用可能である。さらに、実体顕微鏡などの光学顕微鏡、あるいは可視光や赤外光を用いたＴＶカメラ、ＣＣＤカメラなどの光学カメラなどの光学観察装置を用いて、イオン液体の注入作業を行ってよい。なお、走査電子顕微鏡の試料室に入る大きさであれば、試料の大きさに上限はない。以下、実施例１との相違点を中心に説明する。
【００５７】
図１０には、本実施例にかかる、電子顕微鏡にイオン液体を注入するシステムを搭載した装置の構成を示す。本実施例のイオン液体を注入するシステムは、試料にイオン液体を注入するための注射針２１、注射針２１を試料に刺すために動かすための注射針駆動部３０、イオン液体を注射針２１に送る送液ポンプ３１、注射針２１と送液ポンプ３１を繋ぐ送液チューブ３２、送液ポンプ３１にイオン液体を供給するイオン液体タンク３３から構成される。イオン液体タンク３３の内部はイオン液体で満たされている。
【００５８】
イオン液体の送液ポンプ３１は、注射針２１にイオン液体を送るためのものである。注射針２１の内部にはイオン液体３４が入っているが、イオン液体３４が真空環境下の電子顕微鏡試料室の内部に飛散することを防止するために、イオン液体の送液ポンプ３１により単位時間当たりのイオン液体送液量を制御してイオン液体の供給量を制御する。イオン液体供給量の制御には、イオン液体注入制御コンピュータ３６が用いても良い。送液ポンプ３１は、例えば、チューブポンプやチュービングポンプのように、単位時間当たりの送液量を調整できるものが望ましい。送液量は１ｍｌ／１分よりも小さいことが望ましい。
【００５９】
次に、電子顕微鏡に搭載されているプローブ３５について説明する。本実施例における、電子顕微鏡にイオン液体を注入するシステムを搭載した装置には、注射針を刺すことが困難な固い試料に孔を削孔したり、注射針を刺すときに試料を固定したり、試料を動かしたりすることを目的として、プローブ３５が搭載されている。ただし、注射針のみで、試料にイオン液体を注入できれば、プローブ３５は必ずしも必須ではない。
【００６０】
本実施例の装置は、イオン液体の注入作業を制御、表示、および操作するための装置を含む。この装置は、注射針２１とプローブ３５の動きや、イオン液体の注入量を制御するためのイオン液体注入制御コンピュータ３６、注射針２１とプローブ３５の動きや位置、およびイオン液体の注入量を表示するためのイオン液体注入表示モニタ３７、注射針２１とプローブ３５の動きや、イオン液体の注入量を操作するための、イオン液体注入操作部３８などから構成される。ただし、イオン液体の注入作業を制御、表示、および操作する機能を、電子顕微鏡に付属する装置で代用しても良い。具体的には、撮像した画像を表示するディスプレイ等の表示部７、走査電子顕微鏡の各機能を操作するマウスや操作卓等の操作部８、およびコンピュータ１１を用いても良い。
【００６１】
次に、大気圧下および真空環境下で、試料室の内部を可視光あるいは赤外光で観察する光学観察装置３９について説明する。電子顕微鏡は、大気圧の環境下では画像を表示することができないために、大気圧環境での試料室の状態を観察するための光学観察装置３９が付属している。光学観察装置３９は、試料や注射針などの観察対象物を拡大して観察できる機能を有するカメラである。なお、この光学観察装置３９を用いずともイオン液体の注入は可能である。
【００６２】
次に、図１１を用いて、試料室１２の内部の注射針について具体的に説明する。注射針２１は、イオン液体３４を試料の内部に注入するためのものである。注射針２１は、一般的な医療用注射針の最小規格（外径０．３ｍｍ）よりも細いことが望ましく、外径１０μｍから外径１００μｍが望ましいが、試料の大きさや、観察目的などの性質に応じて、これよりも細く、あるいは太くできる。注射針２１を試料にどの程度の深さまで刺したかを見極めるために、注射針２１には図４に示す目盛２２が付いていることが望ましい。注射針２１の材質としては、金属、プラスチック、ガラスなどが考えられるが、プラスチックやガラスなどの非導電性素材は電子顕微鏡での観察中に帯電現象を起こし、像障害の原因となる可能性があるため、金属などの導電性素材を使用することが望ましい。ただし、導電性素材であれば、金属である必要はない。注射針２１の針先は傷みやすいため、注射針２１と注射針駆動装置３０の間に注射針ソケット部４０を設け、注射針２１を交換できるようにしている。
【００６３】
注射針２１は、注射針駆動部３０によって動かすことが可能である。注射針駆動部３０は、注射針２１を、Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸、Ｒ軸、およびＴ軸に動かせる。注射針の動きは、図１０のイオン液体注入操作部３８を使用して操作する。注射針の操作にはマウスのほか、ジョイスティックなどの入力装置を使用しても良い。試料１４と注射針２１の位置確認には、二次電子画像あるいは反射電子画像を使用するか、光学観察装置３９を使用する。
【００６４】
次に、図１１を用いて、試料室１２の内部のプローブシステムについて具体的に説明する。プローブシステムは、イオン液体を試料内部に打ち込むためのイオン液体注入用プローブ４１、イオン液体注入用プローブ４１を、Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸、Ｒ軸、およびＴ軸に動かすことが可能なイオン液体注入用プローブ駆動部４２、試料を固定する試料固定用プローブ４３、試料固定用プローブ４３を、Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸、Ｒ軸、およびＴ軸に動かすことが可能な試料固定用プローブ駆動部４４から構成される。
【００６５】
図１１のイオン液体注入用プローブ４１は、試料に穿孔し、試料の内部にイオン液体を注入するために用いる。イオン液体注入用プローブ４１は、イオン液体注入用プローブ駆動部４２によって、Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸、Ｒ軸、およびＴ軸に動かすことが可能である。なお、プローブ自体をドリルのように回転できるとなお良い。イオン液体注入用プローブ駆動部４２の操作には、マウスのほか、ジョイスティックなどの入力装置を使用しても良い。試料１４とイオン液体注入用プローブ４１の相対位置の確認には、二次電子画像あるいは反射電子画像を使用するか、光学観察装置３９を使用する。イオン液体注入用プローブ４１にイオン液体を効率的に付着させるために、イオン液体注入用プローブ４１に、図５の溝２３を設けても良い。溝２３は直線的である必要はなく、針の円筒や円錐の面に沿って螺旋状としてもよい。溝２３は１本である必要はなく、複数あっても良い。
【００６６】
図１１の試料固定用プローブ４３は、注射針２１やイオン液体注入用プローブ４１を使用して試料１４にイオン液体を注入する時に、試料１４を保持するために使用する。試料１４は、試料台１８にカーボンテープやカーボンペーストで固定されているが、注射針２１やイオン液体注入用プローブ４１を試料１４に刺す時に、試料台１８から外れることがあるためである。ただし、試料１４を試料台１８に強固に固定できれば、試料固定用プローブ４３は使用しなくても良い。また、試料固定用プローブ４３は１本でも複数本でも良い。試料固定用プローブ４３は、試料固定用プローブ駆動部４４によって、Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸、Ｒ軸、およびＴ軸に動かすことが可能である。試料固定用プローブ４３の動きは、図１０のイオン液体注入操作部３８を使用して操作する。試料固定用プローブ４３の操作にはマウスのほか、ジョイスティックなどの入力装置を使用しても良い。試料１４と試料固定用プローブ４３の相対位置の確認には、二次電子画像あるいは反射電子画像を使用するか、光学観察装置３９を使用する。
【００６７】
図１１の光学観察装置３９は、可視光あるいは赤外光により、試料１４、注射針２１、イオン液体注入用プローブ４１、または試料固定用プローブ４３の位置確認を行うためのものである。デジタルマイクロスコープなどのようにモニタに描画できるものでも、実体顕微鏡のように直接観察できるものでも良い。甲殻類などの水生生物などのように大気中でも速やかに乾燥し、変形してしまう試料に対しては、電子顕微鏡試料室１２を大気圧にした状態で、光学観察装置３９を使用してイオン液体の注入を行っても良い。
【００６８】
次に、注射針２１を用いて、試料にイオン液体を注入して、電子顕微鏡で観察する手順を説明する。図１２は、イオン液体を注入中の電子顕微鏡試料室１２の内部を示した説明図である。イオン液体を注入した試料１４は、試料台１８の上に固定されている。さらに、注射針２１を刺す時に試料１４が動かないように、試料固定用プローブ４３により試料１４を保持している。ただし、試料１４と試料台１８が強固に固定されていれば、試料固定用プローブ４３を使用する必要はない。注射針２１は、注入孔４５から試料１４の内部に挿入している。注射針２１の内部にはイオン液体３４が入っている。
【００６９】
試料が乾燥している状態であれば、高真空雰囲気中、例えば試料室１２の圧力が１Ｐａ以下の状態でイオン液体の注入を行うことができる。この場合、試料と注射針２１を二次電子像で観察することができる。図１０のイオン液体注入制御モニタ３７に表示された電子顕微鏡画像を見ながら、イオン液体注入操作部３８を用いることで、注射針を試料の任意の位置に移動する、刺す、抜くなどの操作が行える。イオン液体注入制御モニタ３７にステレオグラムの機能があれば、奥行き方向の位置感覚が得られるため便利である。注射針２１の操作は、マウスだけでなく、ジョイスティックを用いることもできる。ジョイスティックに、試料に注射針２１が触れた時の感覚が伝わるような圧力感知機能があると、操作性が向上する。
【００７０】
試料に注射針を突き刺した場合に、試料が動いてしまう時には、図１１の試料固定用プローブ４３を試料に突き刺すことや、押し当てることにより試料を保持する。注射針２１を操作するためのジョイスティックと、プローブを操作するためのジョイスティックとが別個にあれば、両手を用いて注射針２１と試料固定用プローブ４３を同時に動かすことが可能である。試料の表面が固いために、注射針が刺さり難いときには、試料固定用プローブ４３か、図１１のイオン液体注入用プローブ４１で試料の表面を崩すと良い。
【００７１】
図１２のように試料の形状がブロック状である場合には、試料の中心部まで注射針２１を挿入することが望ましい。ただし、イオン液体が浸透し難い試料や、試料の表面付近を観察したい場合、例えば、動物の粘膜を観察するときには、観察位置の直下にイオン液体を注入することが望ましい。このとき、図４に示すように、注射針に目盛を設けておけば、イオン液体注入中に、試料に注射針２１を刺した深さを電子顕微鏡観察で確認することが可能である。
【００７２】
図１０のイオン液体注入制御モニタ３７に表示された電子顕微鏡画像により、試料に注射針２１が刺さったことが確認できた後に、イオン液体の注入を行う。イオン液体の注入量は、送液ポンプ３１で入力するか、イオン液体注入操作部３８を用いて入力する。注入量を決める専用のコントローラーがあっても良い。注入量の入力においては、時間当たりの送液量と送液時間の組み合わせ、または全送液量が入力できることが望ましい。時間当たりの送液量の入力だけを行い、イオン液体を試料に送り続けた場合、試料内部に過剰なイオン液体が流入する恐れがあるため、短時間のイオン液体の送液を繰り返し行える機構を備えている方が安全である。
【００７３】
イオン液体の注入を終了するタイミングは、二次電子画像あるいは反射電子画像を観察することによって判断する。例えば、イオン液体注入前と比較して、チャージアップ現象が軽減すれば、イオン液体の注入を停止しても良い。観察中に試料に凹みが生じるなどの変形が生じた場合には、イオン液体の注入を継続する。予め測定しておいた試料の重量と、試料の性質からイオン液体の注入量を決めても良い。
【００７４】
試料が水分を含んでいる場合には、低真空雰囲気中、例えば試料室内部の圧力が１〜５０００Ｐａの状態で、試料を少しずつ乾燥させながら、少量ずつイオン液体を注入すると、試料の体積を変化させずに試料内部の水分をイオン液体に置換することができる。このとき、試料ステージ１９に試料を冷却する機能があれば、試料を冷却することにより試料の乾燥を遅くすることができるため、試料の堆積変化を小さくすることが可能である。大気圧中でも乾燥による収縮が生じる試料に対しては、大気圧に設定した試料室１２のなかで、大気圧条件下でイオン液体の注入を行っても良い。水分を含む試料の場合、イオン液体の注入量は、注入量は試料の含有水分と同量が望ましい。ただし、イオン液体の注入量は、試料の大きさや、空隙の大きさ、浸透圧、または試料室内の圧力によっても異なるため、低真空雰囲気（１〜５０００Ｐａ）でも画像を得ることができる反射電子像などの電子顕微鏡画像や、図１１の光学観察装置３９で観察しながら、少しずつイオン液体を注入することが望ましい。
【００７５】
試料にイオン液体を注入した後に、イオン液体を注入した試料１４を走査電子顕微鏡で観察する。試料の形態を観察したい場合には、二次電子検出器４を使用し、試料の組成分布を観察したい場合には、反射電子検出器５を使用する。
【００７６】
イオン液体の注入前は、試料の帯電現象を軽減するために、低加速電圧、例えば加速電圧３ｋＶ以下での電子顕微鏡観察を行うことが必要であるが、イオン液体注入後は、高加速電圧での二次電子像および反射電子像による観察、あるいはその他の検出器を用いた電子顕微鏡観察が可能である。一般的に、高加速電圧、例えば加速電圧１５ｋＶ以上の方が、低加速電圧中よりも分解能が高いために、高い加速電圧を使用することにより、より高解像度の観察が可能になる。また、高加速電圧（１５ｋＶ以上）を使用すると細胞が透けて見えるために、細胞の内部の核などを観察できる場合がある。
【００７７】
金コロイド法などの免疫染色を行った試料の場合には、高真空雰囲気下、例えば１Ｐａ未満の真空度で、反射電子信号を用いて観察を行う。電子顕微鏡の前処理手法における免疫染色は金粒子などの重元素に抗体を結合させる手法であるが、反射電子信号を用いると、金の存在部位だけを高コントラストで見ることができる。
【００７８】
イオン液体注入用プローブ４１と、試料固定用プローブ４３を用いて、試料を解体し、内部構造を電子顕微鏡で観察しても良い。例えば、生体組織の粘膜細胞層を除去して、内部の結合組織を剖出させたり、試料の断面を作成したり、試料の向きを変えたりするなどの操作が考えられる。剖出した試料内部は、イオン液体の浸透により導電性が得られているため、解剖後にイオンスパッタや真空蒸着による金属コーティングによる試料内部の導電処理を行う必要はなく、電子顕微鏡館試料室内で解剖しながら試料を観察することができる。
【００７９】
試料１４の試料表面、あるいは表層にまでイオン液体が浸透していない場合には、走査電子顕微鏡での観察中に帯電現象が生じる場合がある。この場合は、観察を一時的に中断し、イオン液体を試料１４に追加注入する。試料内部のイオン液体の量が少ない場合には、帯電現象だけでなく、試料１４に凹みが生じることがあるが、この場合もイオン液体を試料１４に追加注入することにより形態の復元を行うことができる。
【００８０】
本実施例では生体組織を例に、電子顕微鏡の観察手法を説明したが、他の試料においても同様の手順で観察を行うことが可能である。
【実施例３】
【００８１】
次に、試料の表面が固く、注射針を刺すことが困難な試料の内部にイオン液体を注入する方法を説明する。
【００８２】
本実施例の手法で用いる装置は、実施例２における、電子顕微鏡にイオン液体を注入するシステムを搭載した装置と同一である。
【００８３】
本実施例では、イオン液体注入用プローブ４１を用いて試料に穿孔し、図１１のイオン液体注入用プローブ４１の先端部分にイオン液体を付着させた後に、イオン液体を付着させたイオン液体注入用プローブ４１を孔内に挿入し、試料にイオン液体を注入する。以下、実施例１および２との相違点を中心に説明する。
【００８４】
図１３は、イオン液体注入用プローブ４１を用いて、固い試料４６にイオン液体注入用の孔を穿孔している状態を示した説明図である。本実施例での固い試料は岩石である。穿孔は、イオン液体注入用プローブ４１を押しつけて孔や亀裂を作るか、あるいはイオン液体注入用プローブ４１により試料の表面を削って試料内部を露出させることで実施する。
【００８５】
穿孔時に固い試料４６が試料台１８から脱落することを防止するために、試料固定用プローブ４３で試料を保持するが、試料４６を試料台１８に強固に固定できれば、試料固定用プローブ４３は使用しなくても良い。
【００８６】
穿孔を行う位置は、試料にイオン液体が浸透する距離によって異なる。最初に、任意の観察位置４７から離れた場所で、穿孔とイオン液体注入を行い、イオン液体の浸透距離を確かめると安全である。
【００８７】
図１４は、固い試料４６にイオン液体注入用の注入孔４８を穿孔した後に、イオン液体注入用プローブ４１の先端部分をイオン液体の液滴４９に接触させることにより、イオン液体注入用プローブ４１にイオン液体を付着させている状態である。予め、固い試料４６の近くに、図１４のイオン液体の液的４９のようにイオン液体源を作製しておくと便利である。イオン液体注入用プローブ４１の先端部分には、図５の針先端部の説明図のようにイオン液体を効率よく吸着させるための溝２３を作っても良い。溝２３は直線的である必要はなく、針の円筒や円錐の面に沿った螺旋状でもよい。溝２３は１本である必要はなく、複数あっても良い。イオン液体注入用プローブ４１とイオン液体の液滴４９の位置確認には、二次電子画像あるいは反射電子画像を使用するか、光学観察装置３９を使用する。
【００８８】
図１５は、固い試料４６のイオン液体注入用の注入孔４８にイオン液体を注入している状態を示した説明図である。イオン液体注入用の注入孔４８に、イオン液体注入用プローブ４１の先端部に付着したイオン液体が接触し、イオン液体が注入孔４８の内部に浸透していけば、観察位置４７を含めた注入孔４８の周囲の導電処理が完了する。また、イオン液体が注入孔４８の内部に浸透していけば、イオン液体注入用プローブ４１を注入孔４８の内部まで挿入する必要はない。
【００８９】
イオン液体を注入する過程については、帯電現象の有無を確認するために、電子顕微鏡の二次電子画像あるいは反射電子画像を使用することが望ましい。イオン液体注入前と比較して、観察位置４７の帯電現象が軽減すれば、イオン液体の注入操作は終了である。観察位置４７の帯電現象が軽減しない場合には、注入孔４８に繰り返し、イオン液体を注入するか、観察位置４７に近接して新たな孔を穿孔し、孔にイオン液体を注入する作業を繰り返し行うことにより、観察位置４７の導電処理を実施する。
【００９０】
導電処理後は、電子顕微鏡で観察を実施する。岩石の電子顕微鏡観察は、目的に応じて、二次電子信号と反射電子信号を使い分ける。岩石中の結晶形態や、破断面の形状などを観察する場合には二次電子信号を用いる。岩石中の結晶分布など、組成分布を観察したい場合には反射電子信号を用いる。高倍率での観察を行いたい場合には、高加速電圧、例えば加速電圧１５ｋＶ以上で観察すると良い。
【００９１】
イオン液体の注入前は、試料の帯電現象を軽減するために、低加速電圧、例えば加速電圧３ｋＶ以下での電子顕微鏡観察を行うことが必要であるが、イオン液体注入後は高加速電圧での二次電子像および反射電子像による観察、あるいはその他の検出器を用いた電子顕微鏡観察が可能である。一般的に、高加速電圧、例えば加速電圧１５ｋＶ以上の方が、低加速電圧中よりも分解能が高いために、高い加速電圧を使用することで、より高解像度の観察が可能になる。
【００９２】
本実施例では、岩石を例に説明したが、これに限られず、導電性がない試料を観察対象としても良い。例えば、電子顕微鏡観察用にグルタールアルデヒドなどで標本化された生物組織、米や麺類、菓子などの加工食品や加工食品の標本、麻、綿、ナイロン、ビニロン、ポリエステルなどの繊維、糸や生地、木材、紙、岩石、粘土、セメント、コンクリート、陶器、多孔質セラミック、多孔質ガラス、多孔質樹脂などが考えられる。他には、錠剤やカプセル薬などの医薬品、砂糖、塩、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）などの水に可溶性の試料を観察対象としても良い。プリント基板、電子部品を実装したプリント基板などの、部分的に導電性がない試料を観察対象としても良い。
【００９３】
イオン液体としては、例えば、イミダゾリウム塩類・ピリジニウム塩類などのアンモニウム系、ホスホニウム系イオン、無系イオンなどの陽イオンを持つものと、臭化物イオンやトリフラートなどのハロゲン系、テトラフェニルボレートなどのホウ素系、ヘキサフルオロホスフェートなどのリン系などの陰イオンを組み合わせたものが考えられる。一般にイオン液体は有機イオンを含む塩であるが、室温で溶融する塩であれば無機イオンだけから構成される塩でも良い。不純物として、イオン液体以外の溶媒、例えばエタノール、メタノール、グリセリン、アセトン、ヘキサン、エーテル、ホルムアルデヒドを含むホルマリンを含有しても良いが、真空中での突沸を防止するために溶媒は含有しないほうが望ましい。
【符号の説明】
【００９４】
１    電子銃 
２    電子光学系
３    制御部 
４    二次電子検出器
５    反射電子検出器 
６    画像生成部 
７    表示部
８    操作部
９    ステージ制御部
１０  真空ポンプ
１１  コンピュータ
１２  試料室
１３  対物レンズ
１４  試料
１５  電子ビーム
１６  二次電子信号
１７  反射電子信号
１８  試料台
１９  試料ステージ
２０  注射筒
２１  注射針
２２  目盛
２３  溝
２４  光学顕微鏡画像
２５  ヨコエビの腹部
２６  刺口
２７  過剰なイオン液体
２８  ヨコエビ頭部の電子顕微画像
２９  ヨコエビの口器
３０  注射針駆動部
３１  送液ポンプ
３２  送液チューブ
３３  イオン液体タンク
３４  イオン液体
３５  プローブ
３６  イオン液体注入制御コンピュータ
３７  イオン液体注入制御モニタ
３８  イオン液体注入操作部
３９  光学観察装置
４０  注射針ソケット部
４１  イオン液体注入用プローブ
４２  イオン液体注入用プローブ駆動部
４３  試料固定用プローブ
４４  試料固定用プローブ駆動部
４５  注入孔
４６  固い試料
４７  観察位置
４８  注入孔
４９  イオン液体の液滴
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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