(57)【要約】本発明は、ｍｉＲＮＡ阻害剤（合成Ｔｏｕｇｈ  Ｄｅｃｏｙ，  Ｓ−ＴｕＤ）の改良に関する。本発明は、ＲＮＡまたはその類縁体を含むｍｉＲＮＡ阻害複合体であって、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は、少なくとも１つの二本鎖構造およびｍｉＲＮＡ結合配列を含み、該ｍｉＲＮＡ結合配列の２つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の２つの鎖に一本ずつ結合しており、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は少なくとも１つの架橋核酸を含む、ｍｉＲＮＡ阻害複合体を提供する。
2017047097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡまたはその類縁体を含むｍｉＲＮＡ阻害複合体であって、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は、少なくとも１つの二本鎖構造およびｍｉＲＮＡ結合配列を含み、該ｍｉＲＮＡ結合配列の２つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の２つの鎖に一本ずつ結合しており、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は少なくとも１つの架橋核酸（ＢＮＡ）を含む、ｍｉＲＮＡ阻害複合体。
【請求項２】
前記ＢＮＡは２’位側で酸素および炭素からなる群より選択される少なくとも1つの原子を介し、４’位側で炭素と炭素および窒素からなる群より選択される少なくとも１つ原子を介して架橋されたＢＮＡを含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ＢＮＡは
【化１】
2017047097.tif 000025
（式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルケニル基、置換または非置換のシクロアルキル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアラルキル基、置換または非置換のアシル基、置換または非置換のスルホニル基、置換または非置換のシリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、ｍは、０〜２の整数であり、Ｂａｓｅは、アデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、およびメチルシトシニル基からなる群より選択される基を示し、ｎは、１〜３の整数であり、ｑは０または１の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
前記ＢＮＡは、
【化２】
2017047097.tif 000026
（式中、Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、Ｂａｓｅは、アデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、およびメチルシトシニル基からなる群より選択される基を示し、ｍは、０〜２の整数であり、ｎは、１〜３の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
前記ＢＮＡは、
【化３】
2017047097.tif 000027
または２’，４’メタノ架橋核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記ＢＮＡはＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）である、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
前記ＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖および前記ｍｉＲＮＡ結合配列の相補鎖の少なくとも一つの鎖に含まれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
前記ＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖に含まれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
前記ＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の両方の鎖に含まれる、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
前記ＢＮＡは２つ以上含まれる、請求項１に記載の複合体。
【請求項１１】
前記ＢＮＡは４つ以上含まれる、請求項１に記載の複合体。
【請求項１２】
前記ＢＮＡは６つ以上含まれる、請求項１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記複合体は、前記二本鎖構造を２つ以上含み、該二本鎖構造の第１の二本鎖構造の片端の２つの鎖にｍｉＲＮＡ結合配列を含む鎖がそれぞれ１本ずつ結合しており、該２つ以上の二本鎖構造に挟まれるように、該鎖のそれぞれの他端が、該２つ以上の二本鎖構造の第２の二本鎖構造の２つの鎖にそれぞれ結合している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１４】
前記ｍｉＲＮＡ結合配列を含む２つの鎖の末端が、リンカーを介して結合している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１５】
前記リンカーの長さは１〜５塩基長である、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１６】
前記二本鎖の構造は、少なくとも６塩基長である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
前記二本鎖の構造は、少なくとも８塩基長である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１８】
前記二本鎖の構造は、少なくとも１０塩基長である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１９】
前記二本鎖の構造は、少なくとも１５塩基長である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２０】
前記二本鎖の構造は、少なくとも１８塩基長である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２１】
前記二本鎖の構造は、５０塩基長以下である、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２２】
２から５つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２３】
２つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む、請求項２２に記載の複合体。
【請求項２４】
請求項１３に記載の複合体であって、以下
【化４】
2017047097.tif 000028
に示された構造を含み、該構造のＩおよびＩＩは二本鎖構造であって、該構造のａおよびｂにそれぞれ１つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む複合体。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の複合体を構成するＲＮＡまたはその類縁体。
【請求項２６】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の複合体または請求項２５に記載のＲＮＡまたはその類縁体を製造する方法であって、
Ａ）化学合成により、リボ核酸およびＢＮＡを用いて、目的とするＲＮＡまたはその類縁体の一本鎖の保護体およびその相補体の保護体を合成する工程；
Ｂ）生成した該一本鎖の保護体およびその相補体をそれぞれ脱保護する工程；ならびに
必要に応じてＣ）脱保護した該一本鎖のそれぞれを二本鎖形成条件に配置して二本鎖を形成する工程
を包含する方法。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の複合体を含む医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、構造強化されたｍｉＲＮＡ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロRNA（miRNA）は内在性に発現される小さな（約20〜24ヌクレオチド）調節性の非コードRNAであって、RNA誘導サイレンシング複合体（RNA-induced  silencing  complex;RISC）の成分として転写後レベルで数多くの標的遺伝子の発現を調節している。あるmiRNAとmRNA中にあるその標的配列とが完全に相補的である場合は、miRNAはそのmRNAの切断を誘導し、mRNAレベルの急速な減少を引き起こす。
さらに最近本発明者らの一部は、miRNAを効率的に阻害するためのmiRNA阻害体、該阻害体を細胞内で発現させるためのベクター、該ベクターの構築方法、および該阻害体またはベクターを利用したmiRNAの阻害方法を開発した（特許第4936343号公報＝特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第4936343号公報
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
従来の特許文献１に記載されるｍｉＲＮＡ阻害剤（合成Ｔｏｕｇｈ  Ｄｅｃｏｙ，  Ｓ−ＴｕＤ）は低濃度でｍｉＲＮＡの活性を阻害する核酸として注目されているが、その構造の特性上２本鎖化した後の物性には改良の余地がある。本発明者らは、鋭意工夫することにより、２本鎖を強固にする方法として２本鎖領域をハイブリダイゼーション能力が向上する修飾核酸に部分置換する方法を採用することにより、Ｓ−ＴｕＤの安定的な大量生産及び物性試験法を確立し本発明を完成させた。【０００５】
したがって、本発明は以下を提供する。
（１）ＲＮＡまたはその類縁体を含むｍｉＲＮＡ阻害複合体であって、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は、少なくとも１つの二本鎖構造およびｍｉＲＮＡ結合配列を含み、該ｍｉＲＮＡ結合配列の２つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の２つの鎖に一本ずつ結合しており、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は少なくとも１つの架橋核酸（ＢＮＡ）を含む、ｍｉＲＮＡ阻害複合体。
（２）前記ＢＮＡは２’位側で酸素および炭素からなる群より選択される少なくとも1つの原子を介し、４’位側で炭素と炭素および窒素からなる群より選択される少なくとも１つ原子を介して架橋されたＢＮＡを含む、項目１に記載の複合体。
（３）前記ＢＮＡは【０００６】
【化１】
2017047097.tif 000003
【０００７】
（式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルケニル基、置換または非置換のシクロアルキル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアラルキル基、置換または非置換のアシル基、置換または非置換のスルホニル基、置換または非置換のシリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、ｍは、０〜２の整数であり、Ｂａｓｅは、アデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、およびメチルシトシニル基からなる群より選択される基を示し、ｎは、１〜３の整数であり、ｑは０または１の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む、項目１〜２のいずれか一項に記載の複合体。
（４）前記ＢＮＡは、【０００８】
【化２】
2017047097.tif 000004
【０００９】
（式中、Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、Ｂａｓｅは、アデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、およびメチルシトシニル基からなる群より選択される基を示し、ｍは、０〜２の整数であり、ｎは、１〜３の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
（５）前記ＢＮＡは、【００１０】
【化３】
2017047097.tif 000005
【００１１】
または２’，４’メタノ架橋核酸（ＬＮＡ）を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
（６）前記ＢＮＡはＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）である、項目１〜５のいずれか一項に記載の複合体。
（７）前記ＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖および前記ｍｉＲＮＡ結合配列の相補鎖の少なくとも一つの鎖に含まれる、項目１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
（８）前記ＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖に含まれる、項目１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
（９）前記ＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の両方の鎖に含まれる、項目１〜８のいずれか一項に記載の複合体。
（１０）前記ＢＮＡは２つ以上含まれる、項目１〜９のいずれか一項に記載の複合体。
（１１）前記ＢＮＡは４つ以上含まれる、項目１〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
（１２）前記ＢＮＡは６つ以上含まれる、項目１〜１１のいずれか一項に記載の複合体。
（１３）前記複合体は、前記二本鎖構造を２つ以上含み、該二本鎖構造の第１の二本鎖構造の片端の２つの鎖にｍｉＲＮＡ結合配列を含む鎖がそれぞれ１本ずつ結合しており、該２つ以上の二本鎖構造に挟まれるように、該鎖のそれぞれの他端が、該２つ以上の二本鎖構造の第２の二本鎖構造の２つの鎖にそれぞれ結合している、項目１〜１２のいずれか一項に記載の複合体。
（１４）前記ｍｉＲＮＡ結合配列を含む２つの鎖の末端が、リンカーを介して結合している、項目１〜１３のいずれか一項に記載の複合体。
（１５）前記リンカーの長さは１〜５塩基長である、項目１４に記載の複合体。
（１６）前記二本鎖の構造は、少なくとも６塩基長である、項目１〜１５のいずれか一項に記載の複合体。
（１７）前記二本鎖の構造は、少なくとも８塩基長である、項目１〜１６のいずれか一項に記載の複合体。
（１８）前記二本鎖の構造は、少なくとも１０塩基長である、項目１〜１７のいずれか一項に記載の複合体。
（１９）前記二本鎖の構造は、少なくとも１５塩基長である、項目１〜１８のいずれか一項に記載の複合体。
（２０）前記二本鎖の構造は、少なくとも１８塩基長である、項目１〜１９のいずれか一項に記載の複合体。
（２１）前記二本鎖の構造は、５０塩基長以下である、項目１〜２０のいずれか一項に記載の複合体。
（２２）２から５つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む、項目１〜２１のいずれか一項に記載の複合体。
（２３）２つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の複合体。
（２４）項目１〜２３のいずれか一項に記載の複合体であって、以下【００１２】
【化４】
2017047097.tif 000006
【００１３】
に示された構造を含み、該構造のＩおよびＩＩは二本鎖構造であって、該構造のａおよびｂにそれぞれ１つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む複合体。
（２４Ａ）前記二本鎖構造は各鎖の端部が互いに結合し一本鎖核酸の形態である、項目１〜２４のいずれか一項に記載の複合体。
（２４Ｂ）直鎖状一本鎖RNAまたはその類縁体から構成される、項目１〜２４または２４Ａのいずれか一項に記載の複合体。
（２４Ｃ）前記複合体は、前記二本鎖構造の片端の2つの鎖に、miRNA結合配列を含む２つの鎖の末端が、それぞれ１〜５塩基のリンカーを介して１本ずつ結合しており、二本鎖または四本鎖から選択される第２の多重鎖構造を含み、該二本鎖構造と該第２の多重鎖構造とに挟まれるように、該miRNA結合配列を含む２つの鎖のそれぞれの他端が、該第２の多重鎖構造の片端の2つの鎖に、それぞれ１〜５塩基のリンカーを介して結合している、項目１〜２４、２４Ａまたは２４Ｂのいずれか一項に記載の複合体。
miRNA阻害複合体であって、該miRNA結合配列を含む２つの鎖は、それぞれの鎖がmiRNA結合配列を含み、miRNA結合配列を含む鎖が２つあるものである
（２４Ｄ）前記ｍｉＲＮＡ結合配列を含む２つの鎖は、それぞれの鎖がｍｉＲＮＡ結合配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合配列を含む鎖が２つある、項目１〜２４、２４Ａ、２４Ｂまたは２４Ｃのいずれか一項に記載の複合体。
（２５）項目１〜２４、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃまたは２４Ｄのいずれか一項に記載の複合体を構成するＲＮＡまたはその類縁体。
（２６）項目１〜２４、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃまたは２４Ｄのいずれか一項に記載の複合体または項目２５に記載のＲＮＡまたはその類縁体を製造する方法であって、
Ａ）化学合成により、リボ核酸およびＢＮＡを用いて、目的とするＲＮＡまたはその類縁体の一本鎖の保護体およびその相補体の保護体を合成する工程；
Ｂ）生成した該一本鎖の保護体およびその相補体をそれぞれ脱保護する工程；ならびに
必要に応じてＣ）脱保護した該一本鎖のそれぞれを二本鎖形成条件に配置して二本鎖を形成する工程
を包含する方法。
（２７）項目１〜２４、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃまたは２４Ｄのいずれか一項に記載の複合体を含む医薬。
（２７Ａ）医薬として使用するための、項目１〜２４、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃまたは２４Ｄのいずれか一項に記載の複合体。
（２７Ｂ）項目１〜２４、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃまたは２４Ｄのいずれか一項に記載の複合体をそれを必要とする被験者に投与する工程を包含する、疾患または障害の治療または予防の方法。【００１４】
なお上記の各項において、同一の項を引用する各項に記載の発明の２つまたはそれ以上を任意に組み合わせた発明は、それらに引用される上位の項に記載の発明において、既に意図されている。また、本明細書に記載した任意の発明要素およびその任意の組み合わせは、本明細書において意図されている。また、それらの発明において、本明細書に記載の任意の要素またはその任意の組み合わせを除外した発明も、本明細書に意図されている。また本明細書は、明細書中に例えば好ましいとしてある特定の態様を記載した場合、それを開示するのみならず、その態様を含むより上位の本明細書に開示された発明から、その態様を除外した発明も開示するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の改良型Ｓ−ＴｕＤは、そのｍｉＲＮＡ阻害活性が従来型のＳ−ＴｕＤに比べて、安定しており予想外にも精製せず医薬品グレードに不純物が減少していることが見出された。２本鎖を強固にすることで、活性が同等なＳＴＥＭ領域短鎖化Ｓ−ＴｕＤとしてコストダウンが可能になる。また、本発明の改良型Ｓ−ＴｕＤは、従来型のＳ−ＴｕＤに比べて生物学的活性も顕著に改善していた。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１Ａは従来型Ｓ−ＴｕＤおよび本発明の部分置換型Ｓ−ＴｕＤの模式図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、従来型S-TuDの逆相HPLC（RP-HPLC）分析（C18の逆相イオン対HPLC、XBridgeカラムのもの）により分析したS鎖、AS鎖、2本鎖の比較を示す。
【図２Ａ】図２Ａは用いたオリゴヌクレオチドの構造を示す。最上段はオリジナルオリゴヌクレオチドを示し、二段目以降が修飾オリゴヌクレオチドである。上から(1)C,U  :  2'-F-C,  2'-F-U、(2)T  :  BNA-T（片側の鎖に４か所ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）のTを入れたもの）、(3)T  :  BNA-T（両方の鎖に２か所ずつＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）のTを入れたもの）、(4)T  :  BNA-T  A  :BNA-A（両方の鎖に４か所ずつＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）のTおよびAを対合するように入れたもの）、(5)T  :  BNA-T  A  :BNA-A（10塩基）（（４）をステムIについて１０ｂｐまで短縮したもの）を示す。本明細書において用いた配列は、特に示していない場合は２’−ＯＣＨ３（２’−ＯＭｅ）体を示す。フルオロ体（２’−F体）は、二重下線で表す。LNAは、存在する場合は斜体二重下線で示す。修飾核酸（ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ））は小文字で示す。ホスホロチオエート構造は下線で示す。以下同様である。
【図２Ｂ】図２Ｂは用いたオリゴヌクレオチドの構造を示す。示される配列は以下のとおりである：(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10；(1)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT4；(2)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S8-BT6；(3)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S8-BT4；(4)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S6-BT6；(5)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S6-BT4。
【図３】図３は、psiCHECK2-UT（上）およびpsiCHECK2-miRT（下）の構造を示す。
【図４−１】図４−１は、使用したオリゴの構造を示す。
【図４−２】図４−２は、図４−１のオリゴのmiR-199a-3pレポーターアッセイの結果を示す。バーはコントロールレポーター活性とmiR-199a-3pレポーター阻害活性の比を示す。S-TuDの阻害効果が高いほどバーは高くなる。
【図５】図５は、各種修飾S-TuD199a-3pの濃度依存性を示す。細胞はHeLaS3-miR199aを用いた。
【図６】図６は、MBS領域への置換実験において、使用されたS-TuD（S-TuD199a-3p）の構造を示す。上段はオリジナルのS-TuD199a-3p-1_18-pfの構造を示す。2段目からは本発明の修飾S-TuDである(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(22)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(24)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-3-MBSB2  (非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。修飾核酸（ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ））は小文字で示す。
【図７】図７は、MBS領域への置換実験において、使用されたS-TuDの構造を示す。上から順番に、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(1)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(2)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(3)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS3(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。下線は、ホスホロチオエート構造を示す。
【図８−１】図８−１および図８−２は、MBS領域の一部ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した結果を示す。図８−１および図８−２に示されるように、オリジナルのS-TuDに比較し３倍以上の阻害活性向上が見られる構造体を得ることができた。MBS領域の非シード領域にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）を一部挿入することが重要であった。
【図８−２】図８−１および図８−２は、MBS領域の一部ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した結果を示す。図８−１および図８−２に示されるように、オリジナルのS-TuDに比較し３倍以上の阻害活性向上が見られる構造体を得ることができた。MBS領域の非シード領域にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）を一部挿入することが重要であった。
【図９】図９は、Short  type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した場合（18）の結果を、濃度依存性試験を行った結果を示す。ひし形は、S-TuD  NC2（配列番号５７および５８）を示し、四角はオリジナルを示し、三角は(18)を示す。Short  type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した場合（18）はＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾の全くないオリジナル(Long  type非修飾）の8倍弱程度効果が高かった。
【図１０】図１０は、STEM領域短鎖化＋MBS領域へのＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）挿入効果確認実験において使用したS-TuDの構造を示す。上段にS-TuD199a-3pのオリジナル構造を示す。2段目以降は、それぞれ、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10、(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。
【図１１−１】図１１−１および図１１−２は、個々のS-TuD  100ｐMおよび300ｐMでの結果（3xT199a-3p/UT(%)）を示す。図１１−１は、100ｐＭでの結果での結果を示す。Short  typeについてＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾の影響を検討した。オリジナルタイプとLong  typeのStem-ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾(16)を比較に加えた。Short  type-ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾無(1)’と比べて、stem部分にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾を入れた(6)’は大きく効果が増強した。さらにSeed相当部位にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾をいれた(17)は効果を増強しなかった。しかし非seed相当部位にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾をいれた(18)はさらに効果が増強し、(16)と同等以上になった。Short  typeにおいてはMBS内のＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾部位によっては増強効果があることが分かった。
【図１１−２】図１１−１および図１１−２は、個々のS-TuD  100ｐMおよび300ｐMでの結果（3xT199a-3p/UT(%)）を示す。図１１−２は、300ｐＭでの結果を示す。Short  typeについてＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾の影響を検討した。オリジナルタイプとLong  typeのStem-ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾(16)を比較に加えた。Short  type-ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾無(1)’と比べて、stem部分にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾を入れた(6)’は大きく効果が増強した。さらにSeed相当部位にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾をいれた(17)は効果を増強しなかった。しかし非seed相当部位にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾をいれた(18)はさらに効果が増強し、(16)と同等以上になった。Short  typeにおいてはMBS内のＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾部位によっては増強効果があることが分かった。
【図１２】図１２は、血清中の安定性実験において使用した修飾S-TuDの構造を示す。上段はオリジナル構造である。2段目からはそれぞれ、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(23)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(1)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(2)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）および(23)-(3)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS3(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。
【図１３】図１３は、血清中の安定性実験において使用した修飾S-TuDの構造を示す。上から、(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10、(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）および(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。
【図１４】図１４は、マウス血清処理後の電気泳動図を示す。0h、48h、72h、96hは37℃マウス血清中で処理した時間を示す。上段左からオリジナル構造、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(23)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、を示し、下段は左から(23)-(1)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(2)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）および(23)-(3)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS3(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。
【図１５】図１５は、電気泳動図を示す。上段左から(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10、(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6を示し、下段左から(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）および(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。
【図１６】図１６は、実施例で使用したルシフェラーゼレポーターベクターの模式図を示す。
【図１７】図１７は、ルシフェラーゼレポーターベクターで使用されたpsiCHECK2-T200c-3p-s、psiCHECK2-T200c-3p-a、psiCHECK2-T199a-3px3-s、psiCHECK2-T199a-3px3-a、psiCHECK2-T21-5p-s、psiCHECK2-T21-5p-aの配列情報を示す。これらの配列（配列番号７５〜８０）はいずれも修飾のないDNAである。
【図１８】図１８は、実施例で使用されたS-TuD-NC2の配列を示す。
【図１９】図１９は、普遍性の確認実験で使用したmiR-200cのS-TuD構造を示す。上からそれぞれ、(41)S-TuD-200c-1_22-pf、(42)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6、(43)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(44)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(45)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。
【図２０】図２０は、マウス血清処理後の電気泳動図を示す。0h、24h、48h、72hは37℃マウス血清中で処理した時間を示す。左から、(41)S-TuD-200c-1_22-pf、(42)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6、(44)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2、(45)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2、(46)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6を示し、数字はそれぞれ時間を示す。
【図２１−１】図２１−１および図２１−２は、miR-200cでmiR199a-3pと同様のレポーターアッセイを行った結果を示す。図２１−１は３ｐMの結果を示す。バーはコントロールレポーター活性とmiR-199a-3pレポーター阻害活性の比を示す。S-TuDの阻害効果が高いほどバーは高くなる。
【図２１−２】図２１−１および図２１−２は、miR-200cでmiR199a-3pと同様のレポーターアッセイを行った結果を示す。図２１−２は１０ｐＭの結果を示す。バーはコントロールレポーター活性とmiR-199a-3pレポーター阻害活性の比を示す。S-TuDの阻害効果が高いほどバーは高くなる。
【図２２】図２２は、miR-200cで同様のレポーターアッセイの濃度依存性を示した結果である。ひし形は、S-TuD  NC2を示し、四角はオリジナルを示し、三角は(45)を示す。Short  type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した場合(45)はＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾の全くないoriginal（41）の2倍弱程度効果が高かった。0.1-10pMの投与では、S-TuDがチューブに非特異的に吸着する可能性も考え、担体としてS-TuD  NC2を30pM添加したものも解析したが、添加の効果は見られなかった。
【図２３】図２３は、普遍性の確認実験で使用したmiR-21のS-TuD構造を示す。上からそれぞれ、(51)S-TuD-21-1_17-10mut、(52)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6、(53)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1、(54)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6、(55)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1を示す。
【図２４】図２４は、マウス血清処理後の電気泳動図を示す。0h、24h、48h、72hは37℃マウス血清中で処理した時間を示す。左から、(51)S-TuD-21-1_17-10mut、(52)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6、(53)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1、(54)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6、(55)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1を示し、数字はそれぞれ時間を示す。
【図２５−１】図２５−１および図２５−２は、miR-21で同様のレポーターアッセイを行った結果を示す。図２５−１は100ｐＭの結果を示す。バーはコントロールレポーター活性とmiR-199a-3pレポーター阻害活性の比を示す。S-TuDの阻害効果が高いほどバーは高くなる。
【図２５−２】図２５−１および図２５−２は、miR-21で同様のレポーターアッセイを行った結果を示す。図２５−２は300ｐＭの結果を示す。バーはコントロールレポーター活性とmiR-199a-3pレポーター阻害活性の比を示す。S-TuDの阻害効果が高いほどバーは高くなる。
【図２６】図２６は、miR-21で同様のレポーターアッセイの濃度依存性を示した結果である。Original  51番（四角）と比較してstem部分およびMBS部分をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した53番（三角）では10倍近く効果が増大していた。Short  typeにおいてもMBS部分を修飾した55番（×）はOriginal  51番と比較して３倍以上効果が増大していたが、long  type53番と比較すると2/3倍程度であった。ひし形はコントロールを示す。
【図２７】図２７は、インビボ実験で使用したS-TuDの構造を示す。上から、(51)S-TuD-21-1_17-10mut、（53）S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1および(55)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1を示す。
【図２８】図２８は、腎臓でのmiR-21量をRT-PCR法で測定した結果を示す。マウスへ各S-TuDを1mg/kgで眼窩静脈に投与して（ｎ＝３）、24hr後に腎臓を採取し、RT-PCR法で(S-TuDと結合していないと考えられるフリーの）miR-21量を定量した。左からPBS、51、53および55の修飾S-TuDを使用した結果を示す。
【図２９】図２９は、マウス三匹の腎臓内のmiR-21の平均値を示す。miR-21量が最も少ないのが５３、それに５５が続く。original  S-TuDではほとんどmiR-21の減少が見られないが、５３、および程度はやや落ちるものの５５でも、低下が検出される。
【図３０】図３０は、本発明のｍｉＲＮＡ阻害複合体の典型的構造を示し、ここでは、MBSを含む２本のRNA鎖が、２つの二本鎖構造に挟まれるように、２つの二本鎖構造の各鎖にそれぞれ結合している形態が示される。
【図３１】図３１もまた、本発明のｍｉＲＮＡ阻害複合体の典型的構造を示し、ここでは、典型例として、＃１２〜＃１６が示される。ここでは、MBSを含む２本のRNA鎖は、二本鎖構造の対合しているそれぞれの鎖に結合しているので、RNA鎖の方向は互いに反対方向となっている。
【図３２】図３２は、実施例７で使用した配列例を示す。使用した配列は、上段から、オリジナル、（５）S-Tud199a-3p-1_18-pf-U4BNA_SI-8；(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10；(2)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT8；(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6；(7)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-LT6；(8)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT12を示す。
【図３３−１】図３３−１および図３３−２は、実施例７のアッセイ結果を示す。図３３−１の８サンプルは１００ｐＭでの結果を示す。それぞれの左端はコントロールであり、左から２〜８番目はそれぞれのサンプルの結果を示す。
【図３３−２】図３３−１および図３３−２は、実施例７のアッセイ結果を示す。図３３−２の８サンプルは３００ｐＭでの結果を示す。それぞれの左端はコントロールであり、左から２〜８番目はそれぞれのサンプルの結果を示す。
【図３４】図３４は、実施例８で使用した配列例を示す。上段からオリジナル、（6）’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6；(1)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT4；(2)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S8-BT6；(3)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S8-BT4；(4)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S6-BT6；(5)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S6-BT4を示す。
【図３５−１】図３５−１および図３５−２は、実施例８のアッセイ結果を示す。図３５−１の８サンプルは１ｎＭでの結果を示す。それぞれの左端はコントロールであり、左から２〜８番目はそれぞれのサンプルの結果を示す。
【図３５−２】図３５−１および図３５−２は、実施例８のアッセイ結果を示す。図３５−２の８サンプルは３ｎＭでの結果を示す。それぞれの左端はコントロールであり、左から２〜８番目はそれぞれのサンプルの結果を示す。
【図３６】図３６は、実施例９で使用した配列例を示す。上段からオリジナル、（４）S-TUD-miR-199a-1_18-pf＿U4BNA-ds；(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10；(2)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT8；(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6；(1)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT4を示す。
【図３７−１】図３７−１および図３７−２は、実施例９のアッセイ結果を示す。図３７−１の８サンプルは１００ｐＭでの結果を示す。それぞれの左端はコントロールであり、左から２〜８番目はそれぞれのサンプルの結果を示す。
【図３７−２】図３７−１および図３７−２は、実施例９のアッセイ結果を示す。図３７−２の８サンプルは３００ｐＭでの結果を示す。それぞれの左端はコントロールであり、左から２〜８番目はそれぞれのサンプルの結果を示す。
【図３８】図３８は、STEM領域の一部塩基を2本鎖形成能が上昇するタイプのヌクレオチド種（ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ））に変更し、物性評価を実施した結果（ＨＰＬＣ純度分析）を示す。上段はオリジナルのものであり、下段は、本発明の（１）’で行った結果を示す。
【図３９−１】図３９−１および図３９−２は、STEM  I領域を10bpまで削った場合は、オリジナルなS-TuDと同様の2’-O-メチル体のみの場合の2本鎖形成能を示す。図３９−１は、上からそれぞれ（１）、（２）”の結果を示す。
【図３９−２】図３９−１および図３９−２は、STEM  I領域を10bpまで削った場合は、オリジナルなS-TuDと同様の2’-O-メチル体のみの場合の2本鎖形成能を示す。図３９−２は、上からそれぞれ（１）”、（３）”の結果を示す。
【図４０】図４０は図３９−１および図３９−２の続きであり、上からそれぞれ（４）”、（５）”の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１８】
（miRNA阻害複合体）
本発明は、miRNAを効率的かつ特異的に阻害することができるmiRNA阻害複合体の改良型に関する。本発明のmiRNA阻害複合体は、少なくとも１つの二本鎖構造およびmiRNA結合配列（MBS）を含み、ｍｉＲＮＡ結合配列の２つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の2つの鎖に（通常、それぞれ一本ずつ）結合しており、そのうえで、ｍｉＲＮＡ阻害複合体は少なくとも１つの架橋核酸（ＢＮＡ）を含むことを特徴とするものである。本発明の阻害複合体は「S-TuD」と称することもある。なお本発明においては、この二本鎖構造を「第一の」二本鎖構造と呼ぶことで、本発明の複合体に含まれ得るさらなる二本鎖構造と区別できるようにすることがある。本発明の複合体は、一本鎖（すなわち共有結合で結合した１分子）であってもなくてもよく、例えば一本鎖、二本鎖、またはそれ以上の複数の鎖で構成されていてよい。例えば二本鎖構造の片端の2つの鎖に、MBSを含むRNA鎖が、それぞれ一本ずつ結合した、二本鎖RNAからなる複合体は、複合体中に少なくとも１つの架橋核酸（ＢＮＡ、例えば、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ））を含む限り、本発明に含まれる。また、例えば二本鎖構造の片端の2つの鎖に、少なくとも1つのMBSを含む一本のRNA鎖が結合していてもよい。この場合、MBSを含むRNA鎖により、二本鎖構造の片端の2つの鎖はつながれることになる。二本鎖構造の2つの鎖をつなぐRNAには、MBSが少なくとも１つ含まれているが、例えば2つ、3つ、またはそれ以上含まれていてもよい。二本鎖構造は、ステムループまたはヘアピンを含む。すなわち、二本鎖構造は、ステムループまたはヘアピンに含まれる二本鎖構造であってもよい。
【００１９】
また、本発明において「seed領域」とはmiRNAの配列のうち、miRNAの活性に必要な5’末端から2-8塩基程度の領域を指し、「stem領域」とは二本鎖構造の領域を指す。「original（オリジナル）」とは、従来型の「All  2'−OMe  RNAタイプ」、すなわちすべて2'−OMe  RNAで構成されるタイプを指し、特許文献１等に記載されるものが例示される。
【００２０】
本発明においてmiRNA阻害複合体は、二本鎖構造を持つ、少なくとも1本のRNAまたはその類縁体を含む構造体であってよい。該複合体は、好ましくはRNAまたはその類縁体を含む分子を1分子または2分子含む。
【００２１】
本発明において「miRNA結合配列（MBS）」とは、miRNAに結合する配列を言う。MBSは、miRNAに結合できるように、miRNAに相補的な部分を少なくとも含んでいる。特許文献１に示す通り、MBSは、miRNAに完全に相補的な配列であってもなくてもよい。例えばMBSは、miRNAが標的とする天然のRNAの配列であってもよい。MBSは、例えばmiRNAに対して、少なくとも10塩基、例えば11塩基以上、12塩基以上、13塩基以上、14塩基以上、15塩基以上、16塩基以上、17塩基以上、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、21塩基以上、22塩基以上、23塩基以上、または24塩基以上の相補的な塩基を連続または非連続に含む。好ましくは、該相補的な塩基は連続しているか、あるいは3箇所以下、2箇所以下、好ましくは1箇所のギャップを有する。ギャップは、MBS側および/またはmiRNA側の不対合（バルジ）であってよく、１箇所のギャップについても、片方の鎖のみにバルジ塩基があるものであってもよく、両方の鎖に不対合の塩基を有していてもよい。好ましくは、少なくともMBS側に不対合塩基を含むように設計する。バルジおよびミスマッチの塩基数は、それぞれ１箇所のバルジおよびミスマッチあたり、片鎖あたり例えば6塩基以下、好ましくは5塩基以下、4塩基以下、3塩基以下、2塩基以下、または1塩基である。本発明において、バルジを形成し得るMBSは、完全に相補的な配列からなるMBSよりも高いmiRNA阻害効果を示した（特許文献１）。従って、より高いmiRNA阻害効果を得るためには、バルジを形成するようにMBSを設計することが好ましい。例えば、MBSの3’末端から10番目および/または11番目の塩基が、miRNAと相補的になっていないか、あるいは10番目と11番目の間に余計な塩基を含むMBS（あるいは、miRNA中の標的配列（MBSとハイブリダイズする配列）の5’末端から10番目および/または11番目の塩基がMBSと相補的な塩基となっていないか、あるいは10番目と11番目のヌクレオチドの間に不対合の塩基を含むMBS）は、分解を受けにくく、高い活性が期待できる。この場合、例えばmiRNAの5’末端から10番目および11番目を含む塩基が不対合となるようにMBSを設計してもよく、例えば9〜11番目、10〜12番目、または9〜12番目が不対合となるようにMBSを設計してもよい。また、miRNA側には不対合となる塩基はないが、MBS側に、3’末端から10番目と11番目の間（あるいは、miRNA中の標的配列（MBSとハイブリダイズする配列）の5’末端から10番目および11番目に相当する部位の間）に不対合となる塩基を有していてもよい。不対合となる塩基は、miRNA側および/またはMBS側に存在してよいが、好ましくは少なくともMBS側に存在する。各鎖で不対合になるヌクレオチドの数は適宜調整することができるが、例えば1〜6ヌクレオチドであり、好ましくは1〜5ヌクレオチドであり、より好ましくは3〜5、例えば3、4または5ヌクレオチドである。
【００２２】
また、miRNAのターゲットの認識には、miRNAの5’端から2〜7番目あるいは3〜8番目の塩基（seed領域と呼ばれる）がマッチすることが重要であることが知られている（Jackson  AL  et  al.,  RNA  12(7):1179-1187,  2006;  Lewis  BP  et  al.,  Cell  120:  15-20,  2005;  Brennecke  et  al.  PLoS  BIOLOGY  3,  0404-0418,  2005;  Lewis  et  al.  Cell  115,  787-798,2003;  Kiriakidou  et  al.  Genes  &  Development  18,  1165-1178,  2004）。実際、本発明のmiRNA阻害RNAは、seed領域しかマッチしておらず、他の領域とは低い相補性しか有さないMBSを持つものであっても、miRNAを効果的に阻害できることが示された（特許文献１）。本発明におけるMBSとしては、miRNAのseed領域（miRNAの5’端から2〜7番目および/または3〜8番目の塩基）が完全に相補的であるものが好ましい。この場合、G:U対（U:G対）も相補的とみなしてよいが、好ましくはG:C（C:G）およびA:U（U:A）のみを相補的とみなす。また本発明におけるMBSとしては、miRNAのseed領域（miRNAの5’端から2〜7番目および/または3〜8番目の塩基）が完全に相補的であって、miRNAに対して、少なくとも8塩基、より好ましくは9塩基、より好ましくは10塩基の相補的な塩基を連続して含むものが好ましい。さらに本発明におけるMBSは、miRNAに対して、合計11塩基以上、より好ましくは12塩基以上、より好ましくは13塩基以上の相補的な塩基を含むことが好ましい。
【００２３】
MBSは、好ましくは、miRNA配列と生理的条件下でハイブリダイズする配列である。生理的条件下とは、例えば150  mM  NaCl、15  mM  クエン酸ナトリウム、pH  7.0、37℃である。より好ましくは、MBSは、miRNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列である。ストリンジェントな条件とは、例えば1×SSC（1×SSCは150  mM  NaCl、15  mM  クエン酸ナトリウム、pH  7.0）または0.5×SSC、42℃の条件であり、より好ましくは1×SSCまたは0.5×SSC、45℃の条件であり、より好ましくは1×SSCまたは0.5×SSC、50℃の条件である。ハイブリダイゼーションにおいては、例えばmiRNA配列を含むRNAまたはMBSを含むRNAのどちらかを標識し、他方を膜に固定して、両者をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば5xSSC、7%(W/V)SDS、100μg/ml変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、及び0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、例えば37℃、または45℃、または50℃で行えばよい。十分な時間（例えば3、4、5または6時間以上）インキュベートした後、上記の条件で洗浄を行い、標識した核酸がハイブリダイズしているかを検出することにより、当該条件で核酸がハイブリダイズするか否かを決定することができる。
【００２４】
あるいはMBSは、好ましくは、miRNA配列の相補配列と高いホモロジーを示す。高いホモロジーとは、例えば70%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、93%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上の同一性を有する塩基配列である。塩基配列の同一性は、例えばBLASTプログラム（Altschul,  S.F.  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  215:  403-410,  1990）を用いて決定することができる。例えばNCBI（National  Center  for  Biotechnology  Information）のBLASTのウェブページにおいて、デフォルトのパラメータを用いて検索を行うことができる（Altschul  S.F.  et  al.,  Nature  Genet.  3:266-272,  1993;  Madden,  T.L.  et  al.,  Meth.  Enzymol.  266:131-141,  1996;  Altschul  S.F.  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  25:3389-3402,  1997;  Zhang  J.  &  Madden  T.L.,  Genome  Res.  7:649-656,  1997）。例えば２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana  A  et  al.,  FEMS  Microbiol  Lett.  174:247-250,  1999）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。miRNA配列の塩基配列の外側のギャップは無視し、内側のギャップは例えばミスマッチと同様に扱い、アライメントにおけるmiRNA配列の塩基配列全体（配列の内側に入れたギャップを加算したトータルの塩基の長さ）に対する同一性の値を計算する。但し、特許文献１に示した通り、MBSとmiRNAとのミスマッチはmiRNAの阻害活性を上昇させ得る。従って、例えばアライメントの内側においてmiRNA配列に挿入したギャップは無視して同一性を算出することが好ましい。
【００２５】
あるいはMBSは、好ましくは、miRNA配列の相補配列に対して、1または数個の塩基を挿入、置換、および/または欠失させた配列からなる。好ましくは、MBSは、miRNA配列の相補配列に対して8塩基以内、7塩基以内、6塩基以内、5塩基以内、4塩基以内、3塩基以内、2塩基以内、または1塩基の挿入、置換、および/または欠失を有する配列からなる。より好ましくは、MBSは、miRNA配列の相補配列に対して8塩基以内、7塩基以内、6塩基以内、5塩基以内、4塩基以内、3塩基以内、2塩基以内、または1塩基の挿入を有する配列からなる。本発明において、MBSは、miRNA配列と完全に相補的な配列よりも、ミスマッチを有する配列の方がmiRNAの阻害活性が高いことが示された。これはMBSが完全に相補的であると、miRNAを含むRISCにより切断を受け、それによりmiRNA阻害RNAの発現レベルが低下することに起因すると考えられる。特に、MBSがmiRNAとハイブリダイズしたときに、MBSの3’末端から10番目および/または11番目の塩基が不対合となる（あるいは、MBSとハイブリダイズするmiRNA側の標的配列の5’末端から10番目および/または11番目の塩基がMBSとハイブリダイズさせたときに不対合となる）か、あるいは10番目と11番目のヌクレオチドの間に不対合の塩基を含むように設計したMBSは高い活性が期待できる。このような不対合は、例えばMBS側のバルジであってよく、バルジを形成する塩基は1〜6塩基、好ましくは1〜5塩基、より好ましくは3〜5塩基（例えば3、4または5塩基）である。MBSは、RNAからなっていてもよく、あるいは核酸類塩体を含んだり、または核酸類塩体からなっていてもよい。特にMBSの切断される部位（MBSの3’末端から10番目および/または11番目の塩基等）を、切断が起こらないように核酸類塩体することで、miRNA阻害効果の上昇が期待できる。また、ホスホチオエートや2"-O-メチルなどのバックボーンや糖を有する核酸を用いることも好適である（Krutzfeldt,  J.  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  35:  2885-2892;  Davis,  S.  et  al.,  2006,  Nucleic  Acids  Res.  34:  2294-2304）。
【００２６】
本発明のmiRNA阻害複合体が標的とするmiRNAに特に制限はない。miRNA構造をとるものであれば、植物、線虫、脊椎動物等のいかなる種由来のものにも適用可能である。miRNAの配列は、ヒト、マウス、ニワトリ、ゼブラフィシュ、シロイヌナズナをはじめとする数多くの生物において、非常に多数が知られている（miRBase::Sequencesのウェブページを参照：microrna.sanger.ac.uk/sequences/）。例えば、マウス、ラット、ヤギ等の含む哺乳動物、サルを含む霊長類、およびヒトのmiRNAを標的とすることができる。例えば、miR21（Lagos-Quintana  M  et  al.,  Science.  294:853-858,  2001;  Mourelatos  Z  et  al.,  Genes  Dev.  16:720-728,  2002;  Michael  MZ  et  al.,  Mol  Cancer  Res.  1:882-891,  2003;  Dostie  J  et  al.  RNA.  9:180-186,  2003）、miR140（Lagos-Quintana  M  et  al.,  Curr  Biol.  12:735-739,  2002;  Cai  X  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  102:5570-5575,  2005）、miR1995（Lagos-Quintana  M  et  al.,  RNA.  9:175-179,  2003;  Landgraf  P  et  al.,  Cell.  129:1401-1414,  2007）、miR16（Lagos-Quintana  M  et  al.,  Science.  294:853-858,  2001;  Mourelatos  Z  et  al.,  Genes  Dev.  16:720-728,  2002;  Lim  LP  et  al.,  Science.  299:1540,  2003;  Calin  GA  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  99:15524-15529,  2002;  Michael  MZ  et  al.,  Mol  Cancer  Res.  1:882-891,  2003）、miR497（Bentwich  I  et  al.,  Nat  Genet.  37:  766-770,  2005;  Landgraf  P  et  al.,  Cell.  129:1401-1414,  2007）等が例示できるが、これらに限定されない。
【００２７】
１つの実施形態では、本発明のmiRNA阻害複合体は、第１の二本鎖構造に加え第２の二本鎖構造をさらに含み、第１の二本鎖構造の一端にある２つの鎖に、MBSを含むRNA鎖がそれぞれ１本ずつ結合する構造となっており、第１の二本鎖構造と第２の二本鎖構造の間に挟まれるように、該RNA鎖のそれぞれの他端が、該第２の二本鎖構造の一端にある2つの鎖にそれぞれ結合しているmiRNA阻害複合体に関する。二本鎖構造は2本鎖であってもよく、あるいはG-quadruplex（G-クアドルプレックス）のような4本鎖であってもよい。例えば本発明は、第１の二本鎖構造に加え第２の二本鎖構造をさらに含み、第１の二本鎖構造においてMBSが結合している方の末端の２つの鎖は、MBSを含むRNA鎖がそれぞれ１本ずつ結合する構造となっており、第１の二本鎖構造と第２の二本鎖構造の間に挟まれるように、該RNA鎖のそれぞれの他端が、該第２の二本鎖構造の2つの鎖にそれぞれ結合しているmiRNA阻害複合体に関する。当該RNA複合体は、例えば少なくとも２つの二本鎖構造を有し、該２つの二本鎖構造を構成する4つのRNA鎖のそれぞれが、残る3つのいずれの鎖も介することなく、MBSを含むRNAに結合している構造を有している。このようなmiRNA阻害複合体をより分かりやすく言えば、MBSを含む２本のRNA鎖が、２つの二本鎖構造に挟まれるように、２つの二本鎖構造の各鎖にそれぞれ結合しているmiRNA阻害複合体である（図３０）。すなわち図３０の構造を持つRNA複合体であって、二本鎖構造IおよびIIにRNA鎖aおよびbが挟まれており、該aおよびbにそれぞれ１つ以上のMBSを含むRNAは、本発明に含まれる。MBSを含む２本のRNA鎖は、二本鎖構造の対合しているそれぞれの鎖に結合しているので、RNA鎖の方向は互いに反対方向となる（図３１、#12〜#16）。このように二本鎖の各鎖にそれぞれMBSを付加することにより、より高いmiRNA阻害活性を発揮させることが可能となる。
【００２８】
２つの二本鎖構造に挟まれるように存在するMBSを含む2本のRNA鎖には、それぞれ１つ以上のMBSが含まれている。それらのMBSは同じ配列であってもよく、違っていてもよい。また同じmiRNAを標的とするものであってもよく、異なる標的miRNAに結合する配列であってもよい。例えば、１つの鎖に2つ以上、例えば2、3、4、または5個のMBSが含まれていてよい（図３１、#12〜#16）。例えば、2つの二本鎖構造に挟まれた各鎖に1つまたは2つのMBSを含んでよい。例えば、本発明のmiRNA阻害複合体は、トータルで2つのMBSを含むものであってよく、それら2つのMBSは、同一の配列、または同一のmiRNAに結合する配列であってよい。
【００２９】
本発明のmiRNA阻害複合体に含まれる二本鎖の対合するそれぞれの鎖は、通常、上述の通り別々のRNA分子であるが、二本鎖の一方または両方の末端がつながっており、直鎖状または環状となっていてもよい。なお直鎖状とは環状に対する言葉であって、末端を有していることを意味するに過ぎず、当然のことながら、二次構造を形成していないことを意味するものではない。直鎖状一本鎖RNAにより構成されるmiRNA阻害複合体は、例えば一回のRNA合成により作製し得る。例えば、２つの二本鎖構造を含む場合、第２の二本鎖構造の一端（MBSが結合していない側）の２つの鎖をループにより連結して全体を一本鎖とすることができる。二本鎖をつなぐ配列中には、1つまたはそれ以上のMBSが含まれていてよい（例えば、図３１、#13、#14、#16）。配列をなるべくコンパクトにするには、二本鎖を短いループにより連結させることができる。例えば1〜10塩基、好ましくは1〜8塩基、2〜6塩基、3〜5塩基、例えば4塩基の配列で二本鎖を結合させることができる。配列は特に制限はない。例えば  5’-GUCA-3’  が挙げられる。例えば本発明は、図３１#13の構造を持つRNAであって、二本鎖構造IおよびIIにRNA鎖aおよびbが挟まれており、二本鎖構造IIはヘアピン（またはステム・ループ）を形成しており、該aおよびbにそれぞれ１つ以上のMBSを含むRNAが含まれる。
【００３０】
本発明のmiRNA阻害複合体に含まれる二本鎖構造は、配列に特に制限はなく任意の塩基長のものであり得る。好ましい実施形態については、以下に別途詳述する。二本鎖構造を形成する塩基対の配列は、miRNA阻害複合体の中で特異的かつ安定に二本鎖を形成できるように適宜設計することができる。例えば、同じ塩基が長く（例えば8塩基以上、好ましくは7塩基以上、より好ましくは5塩基以上、より好ましくは4塩基以上、より好ましくは3塩基以上）連続するホモポリメリックな配列は避けることが好ましい。また、二塩基繰り返し配列や3〜4塩基繰り返し配列などの、数塩基の配列がタンデムに繰り返す配列も避けることが好ましい。二本鎖部分のGC含量は適宜調整してよいが、例えば12％〜85％、好ましくは15％〜80％、20％〜75％、25％〜73％、32％〜72％、35％〜70％、37％〜68％、または40％〜65％である。一例を挙げれば、特許文献１に示されているステムIおよびステムIIの配列を例示することができるが、それらに限定されるものではない。4本鎖としてはG-quadruplexが挙げられ、具体的にはGGG-loop-GGG-loop-GGG-loop-GGGという配列とすることができる。ここでloopの配列は適宜選択することができ、例えば3つのループを共に1塩基（例えばM(AまたはC)）としたり、共に3塩基としたりすることができる。
【００３１】
MBSと二本鎖構造は、直接連結させてもよいし、他の配列を介して連結させてもよい。例えば、適当なリンカーまたはスペーサー配列を介して、MBSを二本鎖構造の端に結合させることができる。MBSを二本鎖部分に直接繋げても有意な阻害活性を得ることができるが、リンカー（またはスペーサーとも言う）を付加することにより、miRNAに対する阻害効果がより上昇する（特許文献１参照）。MBS配列と二本鎖構造との間のリンカーまたはスペーサー配列は、MBSがRISCに存在するmiRNAへのアクセシビリティーを増加させる可能性がある。リンカーまたはスペーサーの長さは適宜調整してよいが、例えば1〜10塩基、好ましくは1〜9塩基、1〜8塩基、1〜7塩基、1〜6塩基、1〜5塩基、1〜4塩基、または1〜3塩基である。例えば、2つ以上のMBSをつなげる場合であっても、リンカーまたはスペーサーを介して連結させるとよい。リンカーまたはスペーサーの配列は特に制限はないが、例えばAおよび/またはCからなる配列、あるいはAおよび/またはCをその他の塩基よりも多く含む配列とすることができる。またリンカーまたはスペーサー配列は、向かい合ったリンカーまたはスペーサー配列や、MBSとの間で安定な塩基対を形成しないよう配慮することが好ましい。一例を挙げれば、AAC、CAA、ACC、CCA、またはそれらのいずれかを含む配列等を例示できる。MBSに両側に付加する一対のリンカーまたはスペーサー配列は、インバートした配列（鏡像配列）にしてもよい。例えばMBSの5’側にAAC、3’側にCAAを付加することができる。
【００３２】
本発明のmiRNA阻害複合体を構成する核酸は本発明の特定の修飾核酸で修飾されていることが特徴であるが、特定の修飾核酸以外の修飾核酸を含んでいてもよい。例えば核酸を構成するヌクレオチドは、本発明の特定の修飾核酸のほか、天然のヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、人工のヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。また本発明のmiRNA阻害複合体に含まれる核酸は、本発明の特定の修飾核酸を含む限り、その特定の修飾核酸以外は、RNAからなっていてもよく、またはRNA・DNAキメラであってよく、あるいはその他の核酸類縁体を含んでもよく、それらの任意のものを組み合わせて含んでよい。核酸には、本発明の特定の修飾核酸を含む限り、リン酸ジエステル結合により結合しているもののみならず、アミド結合やその他のバックボーンを有するもの（ペプチド核酸(PNA)等）が含まれる。核酸類縁体には、例えば天然および人工の核酸が含まれ、核酸誘導体、核酸アナログ、核酸派生体等であってよい。そのような核酸類縁体は当該分野において周知であり、例えばホスホロチオエート、ホスホアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2"-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）が含まれるが、これらに限定されない。PNAの骨格には、アミノエチルグリシン、ポリアミド、ポリエチル、ポリチオアミド、ポリスルフィナミド、ポリスルホンアミド、またはそれらの組み合わせからなる骨格を含んでよい（Krutzfeldt,  J.  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  35:  2885-2892;  Davis,  S.  et  al.,  2006,  Nucleic  Acids  Res.  34:  2294-2304;  Boutla,  A.  et  al.,  2003),  Nucleic  Acids  Res.  31:  4973-4980;  Hutvagner,  G.  et  al.,  2004,  PLoS  Biol.  2:  E98;  Chan,  J.A.  et  al.,  2005,  Cancer  Res.  65:  6029-6033;  Esau,  C.  et  al.,  2004,  J.  Biol.  Chem.  279:  52361-52365;  Esau,  C.  et  al.,  2006,  Cell  Metab.  3:  87-98）。
【００３３】
（本発明で使用される架橋核酸（ＢＮＡ））
本発明の特徴の一つに、特定の修飾核酸として安定化型核酸、すなわち、二本鎖形成が促進される修飾核酸が含まれることが特徴であり、例えば広義の架橋核酸（ＢＮＡ）を含めている点がある。
【００３４】
本明細書において「架橋核酸（ＢＮＡ）」（BNAはBicyclic  Nucleic  AcidおよびBridged  Mucleic  Acidの両方を意味する。「架橋型核酸」、「二環式核酸」あるいは「架橋／二環式核酸」ともいう。）とは、核酸の２’位と４’位との間が連結され（架橋）され、環構造が２つ（二環式）となっている任意の修飾された核酸をいう。
【００３５】
１つの例示的な実施形態では、本発明で用いられる安定化型核酸（すなわち、二本鎖形成が促進される修飾核酸）としては、架橋核酸を使用することができる。例えば、特許4731324号、Pradeep  S.  Pallan  et  al.,  Chem  Commun  (Camb).  2012  August  25;  48(66):  8195-8197.  doi:10.1039/c2cc32286bに記載される架橋核酸を用いることができ、これらには、Locked核酸（LNA）、2"-O,4"-C-エチレン架橋核酸(2"-O,4"-C-ethylene  bridged  nucleic  acid(ENA))などのエチレン核酸、その他の架橋核酸(BNA)、ヘキシトール核酸（hexitol  nucleic  acid;  HNA）、モルホリノ核酸、トリシクロ-DNA（tcDNA）、ポリエーテル核酸（米国特許第5,908,845号）、シクロヘキセン核酸（CeNA）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３６】
本明細書において「置換」とは、架橋核酸（ＢＮＡ）等の有機化合物のある特定の水素原子をほかの原子あるいは原子団で置き換えることをいう。
【００３７】
本明細書において「置換基」とは、架橋核酸（ＢＮＡ）等の化学構造中で、他のものを置換した原子または官能基をいう。
【００３８】
本発明における置換基としては、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、アシル、アシルアミノ、チオカルボキシ、アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルまたは置換されたスルフィニルが挙げられるがそれらに限定されない。置換基は、すべてが水素以外の置換基を有していても良い。
【００３９】
本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の１または２以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えるか、または二重結合もしくは三重結合とすることをいう。水素原子を１つ除去して１価の置換基に置換するかまたは単結合と一緒にして二重結合とすることも可能であり、そして水素原子を２つ除去して２価の置換基に置換するか、または単結合と一緒にして三重結合とすることも可能である。
【００４０】
本明細書において「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１１アルキルまたはＣ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルキルまたはＣ１〜Ｃ２０置換されたアルキルであり得る。ここで、たとえばＣ１〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味する。本明細書において「置換アルキル」とは、本明細書に規定する置換基によってアルキルのＨが置換されたアルキルをいう。具体的には、これらに限定されるものではないが、ＣＨ３ＯＣＨ２−、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２−、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、ＨＯＣＨ２−、ＨＯＣＨ２ＣＨ２−、ＨＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、ＮＣＣＨ２−、ＮＣＣＨ２ＣＨ２−、ＮＣＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、ＦＣＨ２−、ＦＣＨ２ＣＨ２−、ＦＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、Ｈ２ＮＣＨ２−、Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２−、Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、ＨＯＯＣＣＨ２−、ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２−、ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられる。
【００４１】
本明細書において「アルキレン」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が二つ失われて生ずる２価の基をいい、一般に−ＣｎＨ２ｎ−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキレンは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換アルキレン」とは、上述の置換基によってアルキレンのＨが置換されたアルキレンをいう。これらの具体例は、Ｃ１アルキレン、Ｃ１〜Ｃ２アルキレン、Ｃ１〜Ｃ３アルキレン、Ｃ１〜Ｃ４アルキレン、Ｃ１〜Ｃ５アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ１〜Ｃ７アルキレン、Ｃ１〜Ｃ８アルキレン、Ｃ１〜Ｃ９アルキレン、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ１１アルキレンまたはＣ１〜Ｃ２０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ２置換アルキレン、Ｃ１〜Ｃ３置換アルキレン、Ｃ１〜Ｃ４置換アルキレン、Ｃ１〜Ｃ５置換アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキレン、Ｃ１〜Ｃ７置換アルキレン、Ｃ１〜Ｃ８置換アルキレン、Ｃ１〜Ｃ９置換アルキレン、Ｃ１〜Ｃ１０置換アルキレン、Ｃ１〜Ｃ１１置換アルキレンまたはＣ１〜Ｃ２０置換アルキレンであり得る。ここで、たとえばＣ１〜Ｃ１０アルキレンとは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキレンを意味する。また、たとえば、Ｃ１〜Ｃ１０置換アルキレンとは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレンであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。本明細書において「アルキレン」は、酸素原子および硫黄原子から選択される原子を１またはそれ以上含んでいてもよい。
【００４２】
本明細書において「シクロアルキル」とは、環式構造を有するアルキルをいう。「置換シクロアルキル」とは、上述の置換基によってシクロアルキルのＨが置換されたシクロアルキルをいう。具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１１シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ４置換シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ５置換シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６置換シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７置換シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８置換シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ９置換シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０置換シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１１置換シクロアルキルまたはＣ３〜Ｃ２０置換シクロアルキルであり得る。
【００４３】
本明細書において「アルケニル」とは、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−１−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換アルケニル」とは、上述の置換基によってアルケニルのＨが置換されたアルケニルをいう。具体例としては、Ｃ２〜Ｃ３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ９アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１１アルケニルまたはＣ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ９置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０置換アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１１置換アルケニルまたはＣ２〜Ｃ２０置換アルケニルであり得る。ここで、たとえばＣ２〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルケニルを意味する。また、たとえば、Ｃ２〜Ｃ１０置換アルケニルとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
【００４４】
本明細書において「アリール」とは、芳香族炭化水素の環に結合する水素原子が１個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、炭素環基に包含される。ベンゼンからはフェニル基（Ｃ６Ｈ５−）、トルエンからはトリル基（ＣＨ３Ｃ６Ｈ４−）、キシレンからはキシリル基（（ＣＨ３）２Ｃ６Ｈ３−）、ナフタレンからはナフチル基（Ｃ１０Ｈ８−）が誘導される。
【００４５】
本明細書において「アラルキル」とは、アルキル基の水素原子の1個がアリール基で置換されているアルキル基を意味する。アラルキル基の具体例は、ベンジル基、フェネチル基（フェニルエチル基）、１−ナフチルエチルなどであり得る。
【００４６】
本明細書において「アシル」とは、カルボン酸からＯＨを除いてできる１価の基をいう。アシル基の代表例としては、アセチル（ＣＨ３ＣＯ−）、ベンゾイル（Ｃ６Ｈ５ＣＯ−）などが挙げられる。「置換アシル」とは、アシルの水素を上述の置換基で置換したものをいう。
【００４７】
本明細書において「スルホニル」とは、特性基である−ＳＯ２−を含むものを総称したものをいう。「置換スルホニル」とは、上述の置換基で置換されたスルホニルを意味する。
【００４８】
本明細書において「シリル」とは、一般にＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３−で表される基である（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基からなる群から選択される）。これらの具体例は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリｎ−プロピルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基であり得る。
【００４９】
本明細書において「機能性分子ユニット置換基」とは、標識分子（例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位原子を含む分子種等）、ＤＮＡやＲＮＡ切断活性分子、細胞内や核内移行シグナルペプチド等を含む基を指す。
【００５０】
１つの実施形態では、前記ＢＮＡは２’位側で酸素および炭素からなる群より選択される少なくとも1つの原子を介し、４’位側で炭素と炭素および窒素からなる群より選択さ
れる少なくとも１つ原子を介して架橋されたＢＮＡであり得る。
【００５１】
代表的な実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、
【００５２】
【化５】
2017047097.tif 000007
【００５３】
（式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルケニル基、置換または非置換のシクロアルキル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアラルキル基、置換または非置換のアシル基、置換または非置換のスルホニル基、置換または非置換のシリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、たとえば、これに限定されないが、置換または非置換のフェノキシアセチル基、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルケニル基、炭素数６〜１４のアリール基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、メタンスルホニル基やｐ−トルエンスルホニル基などの低級脂肪族あるいは芳香族スルホニル基又はアセチル基などの炭素数１〜５の脂肪族アシル基やベンゾイル基などの芳香族アシル基が挙げられ、ｎは、１〜３の整数であり、ｑは０または１の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸である。
【００５４】
Ｂａｓｅは、プリン−９−イル基、２−オキソ−ピリミジン−１−イル基、またはその誘導体であり、たとえば、これに限定されないが、特許4731324号に例示されており、本発明では代表的に、６−アミノプリン−９−イル（即ち、アデニニル）、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル（即ち、グアニニル）、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル、２，６−ジメトキシプリン−９−イル、２，６−ジクロロプリン−９−イル、６−メルカプトプリン−９−イル、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、シトシニル）、２−オキソ−４−アミノ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、ウラシリル）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、チミニル）、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル（即ち、５−メチルシトシニル）、９−β−Ｄ−リボフラノシルヒポキサンチニル（即ち、イノシニル）およびそれらの誘導体を挙げることができ、好ましくは、アデニニル、チミニル、グアニニル、ウラシリル、イノシニル、シトシニルおよび５−メチルシトシニルならびにこれらの誘導体を挙げることができる。
【００５５】
別の代表的な実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、
【００５６】
【化６】
2017047097.tif 000008
【００５７】
（式中、Ｒ３は、水素原子、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルケニル基、置換または非置換のシクロアルキル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアラルキル基、置換または非置換のアシル基、置換または非置換のスルホニル基、置換または非置換のシリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、たとえば、これに限定されないが、フェノキシアセチル基、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルケニル基、炭素数６〜１４のアリール基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、メタンスルホニル基やｐ−トルエンスルホニル基などの低級脂肪族あるいは芳香族スルホニル基又はアセチル基などの炭素数１〜５の脂肪族アシル基やベンゾイル基などの芳香族アシル基が挙げられ、ｍは、０〜２の整数であり、ｎは、１〜３の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む。Ｂａｓｅは、ＢＮＡ−１で説明したものと同様であり、好ましくは、アデニニル、グアニニル、チミニル、ウラシニル、イノシニル、シトシニルおよび５−メチルシトシニル、ならびにそれらの誘導体であり得る。
【００５８】
別の代表的な実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、
【００５９】
【化７】
2017047097.tif 000009
【００６０】
（式中、Ｒ２およびＲ２’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルケニル基、置換または非置換のシクロアルキル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアラルキル基、置換または非置換のアシル基、置換または非置換のスルホニル基、置換または非置換のシリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、たとえば、これに限定されないが、メチル基、Ｏ−メトキシエチル基が挙げられ、Ｂａｓｅは、ＢＮＡ−１で説明したものと同様であり、好ましくは、アデニニル、グアニニル、チミニル、ウラシニル、イノシニル、シトシニル、５−メチルシトシニルおよびそれらの誘導体であり得る。ここで、ｎは、１〜３の整数であるが、Ｒ２またはＲ２’のどちらかは水素ではない。）
架橋鎖に分岐を持つＢＮＡは、これに限定されるものではないが、たとえばＢＮＡ（ｃＥｔ）
【００６１】
【化８】
2017047097.tif 000010
【００６２】
（ｃＥｔ：２’，４’−ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｅｔｈｙｌ）が挙げられる。ＢＮＡ（ｃＥｔ）は従来のＬＮＡと同様の熱的安定性およびミスマッチ識別を有するものの、ヌクレアーゼに対する安定性が向上していることが知られている。
【００６３】
代表的な実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、
【００６４】
【化９】
2017047097.tif 000011
【００６５】
であってもよく（本明細書において特に断らない限り「ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）」と表示するが、「２’，４’−ＢＮＡＮＣ」と表示されることもある。）、ここでは、Ｂａｓｅは上述と同じ定義であり、好ましくはアデニニル、チミニル、グアニニル、ウラシリル、イノシニル、シトシニルおよび５−メチルシトシニルからなる群より選択される。
【００６６】
本明細書において「保護基」とは、特定の化学反応から官能基を保護するために使用される基をさす。本明細書において、保護基は、「ＰＧ」と表されることもある。
【００６７】
好ましくは、ＢＮＡとしては、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）またはＬＮＡが使用され、より好ましくはＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）が使用される。
【００６８】
好ましい実施形態では、ｍは０であり、ｎは１である。
【００６９】
したがって、ｍｉＲＮＡに使用される場合は、一般式（ＢＮＡ−１）、（ＢＮＡ−２）、（ＢＮＡ−３）、ＢＮＡ（ｃＥｔ）又はＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）で表されるヌクレオシドの単位構造の１種以上を１または２個以上含有するＤＮＡオリゴヌクレオチド又はＲＮＡオリゴヌクレオチドとしてのオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩であり得る。ここで、但し、オリゴヌクレオチド中の各ヌクレオシド間の結合形態は、天然核酸と同じリン酸ジエステル結合［−ＯＰ（Ｏ２−）Ｏ−］以外にホスホロチオアート結合［−ＯＰ（Ｏ）（Ｓ−）Ｏ−］を１又は２個以上含有していてもよく、また、前記の構造の１種以上を２個以上含有する場合は、当該構造間でＢａｓｅは同一または異なることができる。
【００７０】
本発明の一種である人工核酸ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）を含有するＤＮＡ若しくはＲＮＡオリゴヌクレオチド類縁体は下記のような優れた特性を有する。相補なＲＮＡ鎖に対する二重鎖形成能が非常に高いからである。
【００７１】
（１）ＤＮＡオリゴヌクレオチド中にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）ユニットを１個導入する毎に（１修飾当たり）Ｔｍ値が３〜６℃上昇する。しかも、相補なＤＮＡ鎖に対する二重鎖形成能の上昇（向上）はほとんどない。この特性は、相補なＲＮＡ鎖に対する結合親和性においてはＢＮＡ修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチド同様、飛躍的なＴｍ値の上昇（二重鎖形成能の格段の向上）がある一方で、相補なＤＮＡ鎖に対する二重鎖形成能においてはＢＮＡ修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドでは未修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドと比べて向上が観察される（１修飾当たりＴｍ値が２〜４℃上昇）のとは対照的に、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドでは殆ど結合親和性の向上は認められない。従って、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドはＲＮＡ鎖への選択的結合親和性に極めて優れている。
（２）また、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡ鎖に対する三重鎖形成能にも卓越している。
【００７２】
ＤＮＡオリゴヌクレオチド中にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）ユニットを１個導入すると二本鎖ＤＮＡ鎖に対する三重鎖形成においてＴｍ値が７〜１２℃上昇する。また、三重鎖形成には塩基配列を厳密に識別し、ターゲット配列にのみ結合するという配列選択性が必要とされるが、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドのマッチ配列とミスマッチ配列とに対するＴｍ値の差は２５℃以上あり、天然型ＤＮＡオリゴヌクレオチドを上回る優れた配列選択性を有している。ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）の場合ヌクレアーゼ耐性が抜群である。
【００７３】
ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾オリゴヌクレオチドは天然ＤＮＡオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ耐性が高いが、Ｓ−オリゴ（ホスホロチオアート型オリゴヌクレオチド）よりはるかに低い。本発明のＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾オリゴヌクレオチドはBNA修飾オリゴヌクレオチドはもとより、ヌクレアーゼ耐性の優れていることで高く評価されているＳ−オリゴよりもヌクレアーゼ耐性に優れており、生体内での分解が強く抵抗する特性を有している。
【００７４】
（３）本発明の人工核酸ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）分子中に含まれるＮ−Ｏ結合は還元試薬により緩和な条件下で選択的に開裂することができ、ＮＨ基とＯＨ基が遊離する。このＮＨ基やＯＨ基を足掛かりに別機能性分子を結合させることで、オリゴヌクレオチド類縁体調製の前後を問わず、様々な複合体（コンジュゲート体）を得ることが容易である。別機能性分子としては、蛍光分子や化学発光分子や放射性同位原子を含む分子種などの標識用分子、様々なＤＮＡ（ＲＮＡ）切断活性分子、細胞内や核内移行シグナルペプチド類等々、が可能である。
【００７５】
（４）使用されるＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）を様々な形態で修飾したＤＮＡやＲＮＡオリゴヌクレオチド類縁体は、アンチセンス法、アンチジーン法、デコイ法、遺伝子相同組み換え法、ＲＮＡ干渉法などによる遺伝子医薬品創製の高機能性素材としてのみならず、モレキュラービーコンやＤＮＡチップなどの遺伝子診断法の基材として、また、遺伝子機能解析解明等の研究用試薬の開発素材として、極めて有用性が高い。
【００７６】
本発明の化合物（ＢＮＡ−１）及びその塩のうち、好適な化合物としては、（５）Ｒ３が、水素原子、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルケニル基、炭素数６〜１４のアリール基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、メタンスルホニル基やｐ−トルエンスルホニル基などの低級脂肪族あるいは芳香族スルホニル基又はアセチル基などの炭素数１〜５の脂肪族アシル基やフェノキシアセチル基およびベンゾイル基などの芳香族アシル基である化合物およびその塩、また、Ｒ３の機能性分子ユニット置換基が、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドであるものを挙げることができ、（６）Ｂａｓｅが、前述のとおりであり、好ましくはアデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、メチルシトシニル基あるいはそれらの誘導体である。
【００７７】
本発明のヌクレオシド類縁体及びオリゴヌクレオチド類縁体は、実施例に記載の方法および本分野の従来技術に基づいて合成できる。
＜１＞ヌクレオシド類縁体の合成
（（ＢＮＡ−１）及び（ＢＮＡ−２））
一般式（ＢＮＡ−１）及び（ＢＮＡ−２）で表される化合物は、実施例に記載の方法および本分野の従来技術に基づいて合成できる。反応条件、保護基導入試薬、反応試薬は、具体的には実施例に記載の方法を参考にすることができるが、これに限定されず、本分野の技術常識に基づき使用可能な反応条件、試薬を適宜採用することができる。例えば、特開２０００−２９７０９７号公報、特開平１０−３０４８８９号公報に記載の方法を参考にすることができる。また、一般式（ＢＮＡ−１）及び（ＢＮＡ−２）におけるＢａｓｅとして種々の天然、非天然の核酸塩基およびその他の芳香族複素環や芳香族炭化水素環を有する場合についても、特開平１０−３０４８８９号公報に記載の方法を参考にして、本発明化合物の原料を合成することができる。
【００７８】
（ヌクレオシド類縁体の一般合成例）
【００７９】
【化１０】
2017047097.tif 000012
【００８０】
（１）化合物Ａ−２の合成
化合物Ａ−１
【００８１】
【化１１】
2017047097.tif 000013
【００８２】
（式中、ＰＧ１〜ＰＧ４は、独立して本明細書に記載の保護基であり、Ｂａｓｅは、本明細書に記載の核酸塩基であり、たとえばアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルである）の溶液（たとえばＴＨＦ溶液３．５ｍｌ）に適切な温度（たとえば氷冷下）で、適切な試薬（たとえば４０％メチルアミン水溶液（０．１１ｍｌ，１．５０ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば３時間）撹拌する。反応溶液の溶媒を留去後、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄する。有機層を適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥し、溶媒留去後、（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により）精製し、化合物Ａ−２を得る（たとえば４５ｍｇ，９９％，白色固体）。
（２）化合物Ａ−３の合成
（たとえば窒素気流下、）化合物Ａ−２（たとえば１４６ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばピリジン溶液（１．５ｍｌ））に適切な温度（たとえば氷冷下）、ＰＧ５Ｘ（式中、ＰＧ５は、本明細書に記載の保護基であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり、たとえば塩化メチルスルホニル（４５．１ｍｌ，０．５９ｍｍｏｌ）である）を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１時間）撹拌する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば飽和重曹水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物Ａ−３を得る。化合物Ａ−３は精製せずに次の反応に用いることもできる。
（３）化合物Ａ−４の合成
化合物Ａ−３（たとえば１７０ｍｇ）の溶液（たとえば水−エタノール溶液（１：２，６ｍｌ））に、適切な温度（たとえば室温）で適切な試薬（たとえば１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．７０ｍｌ，０．７０ｍｍｏｌ））を加え、適切な時間（たとえば１時間）撹拌することにより、２’位に（ＣＲ１Ｒ１’）ｍｚＯＨを導入する（Ｒ１およびＲ１’は、本明細書に記載の置換基である）。（たとえば１０％塩酸水溶液で）中和後、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出する。有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１５：１）により）精製し、化合物Ａ−４を得る（たとえば１３９ｍｇ，９５％（２段階），白色固体）。
（４）化合物Ａ−５の合成
（たとえば窒素気流下、）化合物Ａ−４（たとえば０．８０ｇ，１．２８ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばエタノール溶液（１０ｍｌ））に、適切な試薬（たとえば２０％水酸化パラジウム−炭素粉末（０．６０ｇ）、シクロヘキセン（５．２ｍｌ，５１ｍｍｏｌ））を加え、適切な時間（たとえば５時間）、適切な温度条件（たとえば加熱還流）で撹拌することにより、ＰＧ２およびＰＧ３を除去する。ＰＧ２を除去する工程とＰＧ３を除去する工程は、同一の工程であっても、別々の工程であってもよい。反応溶液を濾過後、溶媒を減圧留去する。得られた粗生成物Ａ−５は、精製せずに次の反応に用いることができる。
（５）化合物Ａ−６の合成
（たとえば窒素気流下、）化合物Ａ−５（たとえば０．４６ｇ）の溶液（たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（１０ｍｌ））に、ＰＧ６Ｘ（式中、ＰＧ６は、本明細書に記載の保護基であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり、たとえば１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（０．４５ｍｌ，１．４１ｍｍｏｌ）である）、塩基（たとえばイミダゾール（０．３８ｇ，５．６３ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば５時間）撹拌することによりＰＧ６を導入する。反応液を適切な有機溶媒（たとえばエーテル）で抽出し、有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄した後、適切な乾燥剤（たとえば硫酸マグネシウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→１：１）により）精製し、化合物Ａ−６を得る（たとえば０．６０ｇ，６８％（２段階），白色固体）。
（６）化合物Ａ−７の合成
（たとえば窒素気流下、）化合物Ａ−６（たとえば２００ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばピリジン溶液（３ｍｌ））に適切な温度（たとえば氷冷下）、ＰＧ５Ｘ（式中、ＰＧ５は、本明細書に記載の保護基であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり、たとえば無水トリフルオロメタンスルホン酸（０．１５ｍｌ，０．８８ｍｍｏｌ））、塩基（たとえば４−（ジメチルアミノ）ピリジン（７ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば７．５時間）撹拌する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえばジクロロメタン）で抽出する。有機層を（たとえば飽和重曹水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物Ａ−７を得る。得られるＡ−７は精製せず、次の反応に用いることができる。
（７）化合物Ａ−８の合成
化合物Ａ−７の２’位のヒドロキシ基にアミノ基を導入した化合物Ａ−８を合成する。その合成法は、これに限定されるものではないが、たとえば以下のようなものである。（たとえば窒素気流下、）化合物Ａ−７（たとえば０．２９ｇ）の溶液（たとえばアセトニトリル溶液（３ｍｌ））に、適切な温度（たとえば室温）で適切な試薬（たとえばＮ−ヒドロキシフタルイミド（６７ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（６１（１，０．４１ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１２時間）撹拌する。反応溶液を適切な有機溶媒（たとえばジクロロメタン）で抽出し、有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）により）精製し、化合物Ａ−７’を得る。得られた化合物Ａ−７’（１．１６ｇ，１．４０ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばエタノール溶液（３５ｍｌ））に、適切な試薬（たとえばヒドラジン−水和物（０．１２ｍｌ，２．３８ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１０分間）撹拌する。反応溶液の溶媒を留去後、濾過し、濾液を適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出する。有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥し、溶媒を減圧留去し、得られたＡ−８は精製せず、次の反応に用いることができる。
（８）化合物Ａ−９の合成
（たとえば窒素気流下）化合物Ａ−８（０．９３ｇ）の溶液（たとえば塩化メチレン溶液（１５ｍｌ））に適切な温度（たとえば氷冷下）、適切な試薬（たとえば飽和重曹水（４．０ｍｌ，４．２ｍｍｏｌ））、ＰＧ７Ｘ（式中、ＰＧ７は、本明細書に記載の保護基であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり、たとえばクロロギ酸ベンジル（０．３０ｍｌ，２．１ｍｍｏｌ）である）を加え、適切な時間（たとえば１時間）撹拌する。反応を（たとえば飽和重曹水を加えて）クエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出する。有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄し、適切な乾燥剤（たとえば硫酸マグネシウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）により）精製し、化合物Ａ−９を得る（たとえば０．９２ｇ，９４％（２段階），白色固体）。
（９）化合物Ａ−１０の合成
（たとえば窒素気流下、）塩基（たとえば水素化ナトリウム（６０％  ｉｎ  ｏｉｌ，０．５５ｇ，１３．７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン懸濁液（２５ｍｌ））に適切な温度（たとえば氷冷下）、化合物Ａ−９（たとえば３．８１ｇ，４．５７ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばテトラヒドロフラン溶液（１５ｍｌ））を滴下し、適切な時間（たとえば１時間）撹拌後、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば５時間）撹拌することによりＯＰＧ４を除去するとともに２’位と４’位を架橋する。ＯＰＧ４を除去する工程と２’位と４’位を架橋する工程は同一の工程であっても、異なる工程であってもよい。（たとえば飽和シュウ酸水溶液で）中和後、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出する。有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝１００：１）により）精製し、化合物Ａ−１０を得る（たとえば２．８７ｇ，９５％，白色固体）。
（１０）化合物Ａ−１１の合成
（たとえば窒素気流下、）化合物Ａ−１０（たとえば０．３５ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）の溶液（たとえば塩化メチレン溶液（１０ｍｌ））に適切な温度（たとえば氷冷下）、適切な試薬（たとえば１Ｍ三塩化ホウ素ヘキサン溶液（５．２９ｍｌ，５．２９ｍｍｏｌ））を加え、適切な時間（たとえば１時間）撹拌する。（たとえば反応溶液に飽和重曹水を加えることにより）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄した後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５０：１）により）精製し、化合物Ａ−１１を得る（たとえば０．２７ｇ，９６％，白色固体）。
（１１）化合物Ａ−１２の合成
化合物Ａ−１１（０．１９ｇ，０．３６ｍｍｏｌ）の溶液（たとえば１Ｍ  ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム−メタノール溶液（３．６ｍｌ））に、適切な温度（たとえば室温）にて適切な試薬（たとえば２０％ホルムアルデヒド水溶液（０．０６ｍｌ，０．４０ｍｍｏｌ））を加え、適切な時間（たとえば１０分間）撹拌する。さらに、適切な温度（たとえば氷冷下）において適切な試薬（たとえばシアン化水素化ホウ素ナトリウム（４５ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ））を加えて置換基Ｒ３（Ｒ３は、本明細書に記載の置換基である）によりアミノ基を置換する。適切な時間（たとえば１時間）撹拌する。反応溶液を適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、（たとえば水、飽和重曹水、飽和食塩水）で洗浄し、有機層を適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）にて）精製し、化合物Ａ−１２を得る（たとえば０．１９ｇ，１００％，白色固体）。
（１２）化合物Ａ−１３の合成
化合物Ａ−１２（４６ｍｇ，０．０８５ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばテトラヒドロフラン溶液（２ｍｌ））に適切な試薬（たとえばフッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム（１Ｍ  テトラヒドロフラン中，０．１７ｍｌ，０．１７ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば５分間）撹拌する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝１５：１により）精製し、化合物Ａ−１３を得る（たとえば２５ｍｇ，１００％，白色固体）。
（１３）化合物Ａ−１４の合成
化合物Ａ−１３（たとえば０．１６ｇ，０．５４ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばピリジン溶液（１０ｍｌ））に適切な試薬（たとえば塩化４，４’−ジメトキシトリチル（たとえば０．２２ｇ，０．６４ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１２時間）撹拌する。反応液に（たとえば飽和重曹水を加え、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミン含有ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：２→酢酸エチル：メタノール＝３０：１）にて）精製し、化合物Ａ−１４を得る（たとえば０．３０ｇ，９３％，白色固体）。
（１４）化合物Ａ−１５の合成
化合物Ａ−１４（たとえば０．１７ｇ，０．２８ｍｍｏｌ）及び適切な試薬（たとえば４，５−ジシアノイミダゾール（４０ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ））の溶液（たとえばアセトニトリル溶液（６ｍｌ））に、適切な試薬（たとえば２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト（０．１３ｍｌ，０．４２ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば４時間）撹拌することにより３’位のヒドロキシ基をＰ（Ｏ）（ＯＰＧ９）（ＯＰＧ１０）（ＰＧ９およびＰＧ１０は、それぞれ独立して本明細書に記載の保護基である）により修飾する。（たとえば反応液に飽和重曹水を加えて）クエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出する。有機層を（たとえば飽和重曹水、水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥し、溶媒を減圧留去する。得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミン含有ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）、ついで再沈澱（酢酸エチル−ヘキサン）により）精製し、化合物Ａ−１５を得る（たとえば０．２０ｇ，８８％，白色固体）。
【００８３】
（ＢＮＡ−３）
一般式ＢＮＡ−３で表される化合物は、実施例に記載の方法および本分野の従来技術に基づいて合成できる。反応条件、保護基導入試薬、反応試薬は、具体的には実施例に記載の方法を参考にすることができるが、これに限定されず、本分野の技術常識に基づき使用可能な反応条件、試薬を適宜採用することができる。例えば、J.Org.Chem.2010,75,1569-1581に記載の方法を参考にすることができる。また、一般式（ＢＮＡ−３）におけるＢａｓｅとして種々の天然、非天然の核酸塩基およびその他の芳香族複素環や芳香族炭化水素環を有する場合についても、J.Org.Chem.2010,75,1569-1581に記載の方法を参考にして、本発明化合物の原料を合成することができる。
ＢＮＡ−３の一般合成例
【００８４】
【化１２】
2017047097.tif 000014
【００８５】
（１）化合物Ｂ−２の合成
化合物Ｂ−１
【００８６】
【化１３】
2017047097.tif 000015
【００８７】
（式中、ＰＧ１〜ＰＧ４は、独立して本明細書に記載の保護基であり、Ｒ２およびＲ２’は、本明細書に記載の置換基であり、Ｂａｓｅは、本明細書に記載の核酸塩基であり、たとえばアデニニル基、チミニル基、グアニニル基、またはメチルシトシニル基である）の溶液に（たとえば窒素気流下、）適切な温度で、適切な試薬（たとえば炭酸カリウム）を加え、適切な温度で適切な時間撹拌する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば飽和食塩水で）洗浄する。有機層を適切な乾燥剤（たとえば硫酸ナトリウム）で乾燥し、溶媒留去後、（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより）精製し、化合物Ｂ−２を得る。
【００８８】
（２）化合物Ｂ−３の合成
（たとえば窒素気流下、）化合物Ｂ−２の溶液に適切な温度（たとえば室温）、適切な試薬（たとえば２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン（ＤＤＱ）である）を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１２時間）撹拌する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物Ｂ−３を得る。
【００８９】
（３）化合物Ｂ−４の合成
（たとえば窒素気流下、）化合物Ｂ−３の溶液に適切な温度（たとえば氷冷下）、適切な試薬（たとえばトリエチルアミン三フッ化水素酸塩）を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１２時間）撹拌する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物Ｂ−４を得る。
【００９０】
（４）化合物Ｂ−５の合成
（たとえば窒素気流下、）化合物Ｂ−４の溶液に適切な温度（たとえば室温）、ＰＧ５Ｘ（式中、ＰＧ５は、本明細書に記載の保護基であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり、たとえば塩化ジメトキシトリチルである）を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１２時間）撹拌する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物Ｂ−５を得る。
【００９１】
（５）化合物Ｂ−６の合成
（たとえば窒素気流下、）化合物Ｂ−５の溶液に適切な温度（たとえば室温）、適切な試薬（たとえば２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロアミダイト）を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば４時間）撹拌することにより３’位のヒドロキシ基をＰ（Ｏ）（ＯＰＧ６）（ＯＰＧ７）（ＰＧ６およびＰＧ７は、それぞれ独立して本明細書に記載の保護基である）により修飾する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物Ｂ−６を得る。
【００９２】
＜２＞オリゴヌクレオチド類縁体の合成
本発明のヌクレオシド類縁体を含むオリゴヌクレオチド類縁体は、公知のＤＮＡシンセサイザーを用いて種々合成することができる。次いで、得られるオリゴヌクレオチド類縁体を、逆相カラムを用いて精製し、生成物の純度を逆相ＨＰＬＣやＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析することにより、精製オリゴヌクレオチド類縁体の生成を確認できる。本発明のヌクレオシド類縁体は、オリゴヌクレオチド類縁体の中に１個以上存在させることができる。また、オリゴヌクレオチド類縁体の２カ所以上の位置に、１又は２以上の天然ヌクレオチドを介して隔離された状態で存在させてもよい。本発明によれば、本発明のヌクレオシド類縁体を必要な位置に必要な数（長さ）で導入したオリゴヌクレオチド類縁体を合成することができる。オリゴヌクレオチド類縁体全体の長さとしてヌクレオチド単位が２〜５０、好ましくは８〜３０個である。
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、ヌクレアーゼに対して分解されにくく、生体への投与後、長く生体内に存在することができる。そして、例えば、センスＲＮＡと二重鎖を形成して病因となる生体内成分（タンパク質）のｍＲＮＡへの転写を阻害する。また、感染したウイルスの増殖を阻害すると考えられる。
【００９３】
これらのことから、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤とはじめとした遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品としての有用性が期待される。即ち、本発明によれば、安定で優れたアンチセンスもしくはアンチジーン活性、又は特定遺伝子の検出薬若しくは増幅開始の為のプライマーとして優れた活性を有する、オリゴヌクレオチド類縁体及びその製造中間体であるヌクレオシド類縁体が提供される。
【００９４】
本発明のヌクレオシド類縁体の一つである２’，４’−ＢＮＡＮＣモノマーを様々な形態で修飾したＤＮＡやＲＮＡオリゴヌクレオチド類縁体（オリゴヌクレオチド類縁体）は、各種の生理・生物活性物質類、医薬品類の材料、ＲＮＡ干渉法やデコイ法用などの二重鎖オリゴヌクレオチドの機能性材料、ｃＤＮＡなど一本鎖核酸を標的とするＤＮＡチップ、モレキュラービーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）などの機能性素材、様々なアンチセンス法（リボザイム、ＤＮＡザイムを含む）、アンチジーン法や遺伝子相同組み換え法用途への機能性素材、蛍光や発光物質との組合せによる生体微量成分の高感度分析用材料や遺伝子機能解析解明等の研究用試薬の開発素材として有用である。
【００９５】
本発明のヌクレオシド類縁体やオリゴヌクレオチド類縁体は、例えば緩衝剤および／または安定剤等の慣用の助剤を配合して非経口投与用製剤とすることができる。また、局所用の製剤としては、慣用の医薬用担体を配合して軟膏、クリーム、液剤、または膏薬等に調剤できる。
【００９６】
（Ｓ−ＴｕＤを構成するオリゴヌクレオチドの一般合成例）
本発明で使用されるＳ−ＴｕＤを構成するオリゴヌクレオチドは、合成機（たとえばｎＳ−８ＩＩ  合成機もしくは、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成機）で合成する。細孔ガラス質固相担体（たとえば２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ  ＣＰＧ  Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）と、標準的な保護基を有する２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡホスホロアミダイト、（たとえば、これに限定するものではないが、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイルアデノシン−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチルシチジン−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリルグアノシン−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホロアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチルウリジン−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホロアミダイト（以上シグマアルドリッチ社製）、並びに、２’，４’−ＢＮＡＮＣ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−アミノメチレン架橋核酸）チミジンホスホロアミダイト、すなわち２’−Ｏ，４’−Ｃ−アミノメチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホロアミダイト、２’，４’−ＢＮＡＮＣアデノシンホスホロアミダイト、すなわち２’−Ｏ，４’−Ｃ−アミノメチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホロアミダイト（以上ＢＮＡ社製）、並びに、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボ核酸）チミジンホスホロアミダイト、すなわち２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホロアミダイト（エキシコン社製）が挙げられる）をオリゴヌクレオチド合成に使用する。ホスホロアミダイトは全て、適切な溶媒（たとえばアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ））中、適切な濃度（たとえば０．１Ｍ）で使用する。２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ＢＮＡ及びＬＮＡについては適切な連結／再利用時間（たとえば１５分）を使用する。活性剤は、たとえば、これに限定されるものではないが、５−ベンジルメルカプト−テトラゾール（０．２５Ｍ、和光純薬社製）であり、ＰＯ−酸化については、たとえば、これに限定されるものではないが、ヨウ素／水／ピリジンを使用する。ＰＳ−チオエート化については、たとえば、これに限定されるものではないが、市販のオリゴヌクレオチド自動合成機用硫化試薬（すなわちＥＩＤＴＨ、ＤＤＴＴ、ＰＡＤＳ、Ｂｅｕｃａｇｅ試薬など）を適切な試薬（たとえばピリジン）とともに使用する。
【００９７】
（脱保護の一般例（ヌクレオ塩基脱保護の一般例））
合成が完了した後、合成担体を適切な容器（たとえばガラスボトル）に移す。オリゴヌクレオチドを、担体１ｇに対して１５ｍＬの、４０％メチルアミン水溶液と３３％メチルアミンエタノール溶液の等量混合物を用いて、適切な温度（たとえば４５℃）で適切な時間（たとえば１３時間）、塩基とリン酸基を脱保護して担体から切断する。塩基を脱保護する工程とリン酸基を脱保護する工程は、同一であっても、異なっていてもよい。その後、エタノールアンモニア混合物を濾過して、適切な容器（たとえば新しい２５０ｍＬのボトル）に入れる。担体を（たとえば２×４０ｍＬのエタノール／水（１：１  ｖ／ｖ）で）洗浄する。その後、（たとえばロータリーエバポレーター（ｒｏｔｏ−ｖａｐ）を用いて）溶媒を留去し乾固する。
【００９８】
（ＨＰＬＣ精製の一般例）
オリゴヌクレオチドを、ＨＰＬＣ（たとえばＳｏｕｒｃｅ  １５  ＲＰＣゲルカラムでの逆相イオンペアＨＰＬＣ）で精製する。緩衝液は、たとえば、これに限定されるものではないが、５％  ＣＨ３ＣＮ、０．１Ｍ  トリエチルアミン酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）（緩衝液Ａ）と９０％  ＣＨ３ＣＮ、０．１Ｍ  トリエチルアミン酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）（緩衝液Ｂ）である。５’末端に保護基（たとえばジメトキシトリチル基）が保持された状態で全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし次の精製に供する。その後オリゴヌクレオチドプールを、ＨＰＬＣ（たとえばＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｑの陰イオンペアＨＰＬＣ）で精製する。溶液及び緩衝液は、たとえばこれに限定されるものではないが、０．６％のトリフルオロ酢酸（溶液Ａ）、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（緩衝液Ｃ）と２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の２Ｍ塩化ナトリウム（緩衝液Ｄ）である。５’末端の保護基を脱離させた後、完全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩後凍結乾燥する。化合物を、最終的に、たとえばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳと変性ポリアクリルアミドゲルで分析する。
【００９９】
（２本鎖化の一般例）
精製の完了した１本鎖オリゴヌクレオチドを適切な溶媒（たとえば蒸留水）にて溶解後、（たとえば紫外分光光度計を用い吸光度測定することにより）オリゴヌクレオチド濃度を決定する。決定された濃度を用い相補鎖をそれぞれ等モル濃度になるように混合し適切な温度（たとえば９５℃）で適切な時間（たとえば１０分）加熱後徐冷し２本鎖形成させる。２本鎖形成はたとえば非変性ゲル電気泳動にて確認する。
【０１００】
また、核酸は末端に結合体を含んでよい。結合体としては、例えば親油性物質、テルペン、タンパク質結合物質、ビタミン、炭水化物、レチノイド、およびペプチド等が挙げられる。
【０１０１】
（ＲＮＡの一本鎖他特殊形態）
本発明のmiRNA阻害複合体は直鎖状の一本鎖核酸により構成されるように設計することができる（図３１）。本発明は特に、MBSの全てがある二本鎖構造（図３１のステムI）の片側（図３１においては右側）に集中しており、該二本鎖構造の各鎖は、その側で閉じた構造となっており（すなわちMBSを含む配列によりつながっており）、該二本鎖構造の反対側に一本鎖RNAの両端があるような複合体に関する（図３１）。MBSを含む配列中には、さらなる二本鎖構造（図３１のステムIIやIIIなど）を含んでもよい。一本鎖RNAの長さは適宜決めてよいが、例えば500塩基内、好ましくは450塩基以内、420塩基以内、400塩基以内、380塩基以内、360塩基以内、340塩基以内、320塩基以内、300塩基以内、280塩基以内、260塩基以内、240塩基以内、220塩基以内、200塩基以内、180塩基以内、160塩基以内、140塩基以内、120塩基以内、100塩基以内、または80塩基以内である。例えば２つの二本鎖構造と２つのMBSを持つ複合体を形成する一本鎖RNAの長さは、例えば60〜300塩基、好ましくは70〜250塩基、80〜200塩基、90〜180塩基、または100〜150塩基である。第一の二本鎖構造（一本鎖RNAの両端に近い二本鎖構造）は、例えば15〜30bp、好ましくは16〜28bp、好ましくは17〜25bp、好ましくは17〜24bp、例えば17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、または24bpとすることができ、第二の二本鎖構造（MBSを含む配列中に含まれるさらなる二本鎖構造）は、全体をコンパクトにするために、第一の二本鎖構造の長さよりも短くしてもよく、例えば4bp〜20bpであり、例えば5bp〜15bp、5bp〜12bp、5bp〜10bp、6bp〜9bp、または7bp〜8bpとしてよい。
【０１０２】
また本発明は、本発明のmiRNA阻害複合体を構成するRNA（ここでRNAとしては、天然のRNAおよび核酸類縁体を含む）であって、ＢＮＡを含むＲＮＡに関する。miRNA阻害RNA複合体が1分子のRNAにより構成されている場合は、そのRNAの分子内アニーリングにより、また2本以上のRNA分子により構成されている場合は、それらのRNAをアニールさせることにより、本発明の複合体を構築することができる。これらのRNAは適宜合成することができる。例えば、RNAの化学合成により所望のRNAを製造することができる。
【０１０３】
少なくとも１つのMBSをコードする核酸は、2つ以上のMBSを含んでもよく、また二本鎖構造を形成し得る１対またはそれ以上の相補配列のセットを一続きの配列中に含んでいてもよい。例えば、当該核酸としては少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列と、該一対の相補配列の両端にそれぞれ少なくとも１つのMBSを含む核酸が例示できる。このような核酸は、具体的には、2つのMBSの間に、ステムを形成し得る一対の相補配列を含んでいる核酸である。このステムは、上記第二の二本鎖構造に相当する。あるいは第二の二本鎖構造に代えてG-quadruplexを形成する配列を含んでもよい。
【０１０４】
また当該核酸は、2つのMBSの間に二本鎖構造を形成し得る１対の相補配列を含む構造単位を、2個以上含んでいてもよい。その構造単位は複数入れ子状に含むことができ、1対のMBSの間にある二本鎖構造を形成し得る１対の相補配列の間に、さらに1対のMBSとその間に二本鎖構造を形成し得る１対の相補配列を含む配列を含むことができる（図３１の#15や#16等）。複数含まれているMBSの配列は同一であっても異なっていてもよい。
【０１０５】
このような核酸を上記の1対の相補配列の間に挿入すると、第一の二本鎖構造を形成する一対の相補配列の間に、MBS−第二の二本鎖構造を形成する配列−MBSの構造を持つ配列が挿入された構造を持つ核酸が得られる。具体的には、例えばMBS−第二の二本鎖構造を形成する一対の相補配列−MBSの構造を持つ配列が挿入された構造を持つ核酸である。2つの二本鎖構造とその間の一対の対向する一本鎖（それぞれにMBSを含む）からなる核酸は、コンパクトでかつ十分なmiRNA阻害活性を示す。
【０１０６】
二本鎖構造を形成し得る１対の相補配列とMBSは、適宜リンカーやスペーサーを介して連結させることができる。リンカーやスペーサーの長さは明細書に記載した通りである。また、相補配列はリンカーやスペーサーを介して連結してよく、二本鎖を形成したときに、当該リンカーやスペーサーはループとなり、二本鎖を合わせてステムループを形成する。ループの長さも適宜調整してよく、詳細は明細書に記載した通りである。あるいは二本鎖に代えてG-quadruplexを形成する配列を適宜用いることができる。
【０１０７】
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【０１０８】
1つの局面において、本発明は、ＲＮＡまたはその類縁体を含むｍｉＲＮＡ阻害複合体であって、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は、少なくとも１つの二本鎖構造およびｍｉＲＮＡ結合配列を含み、該ｍｉＲＮＡ結合配列の２つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の２つの鎖に一本ずつ結合しており、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は少なくとも１つの架橋核酸（ＢＮＡ）を含む、ｍｉＲＮＡ阻害複合体を提供する。このような複合体は、別名Ｓ−ＴｕＤと呼ばれ、本発明は、さらにこれを改良したものであり、改良型Ｓ−ＴｕＤまたは修飾Ｓ−ＴｕＤともいう。この改良型Ｓ−ＴｕＤ（ｍｉＲＮＡ阻害複合体）は少なくとも１つの架橋核酸（ＢＮＡ）を含む。このようなＢＮＡを含ませることによって、本発明のｍｉＲＮＡ阻害複合体は、安定性を向上させ、精製過程の不純物の発生も抑えられ、さらには驚くべきことに生物学的活性も上昇していたことから、理想的な核酸医薬の原料または医薬そのものとして使用されることが理解される。
【０１０９】
１つの好ましい実施形態では、前記ＢＮＡは２’位側で酸素および炭素からなる群より選択される少なくとも1つの原子を介し、４’位側で炭素と炭素および窒素からなる群より選択される少なくとも１つ原子を介して架橋されたＢＮＡを含む。理論に束縛されることを望まないが、オリゴヌクレオチドの合成も容易に行うことができ、しかもＲＮＡ二本鎖の形成促進が促進されることから、好ましいＢＮＡとして使用される。
【０１１０】
１つの好ましい実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、
【０１１１】
【化１４】
2017047097.tif 000016
【０１１２】
（式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、ｍは、０〜２の整数であり、Ｂａｓｅは、アデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、メチルシトシニル基あるいはそれらの誘導体を示し、ｎは、１〜３の整数であり、ｑは０または１の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む。
【０１１３】
好ましい実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、
【０１１４】
【化１５】
2017047097.tif 000017
【０１１５】
（式中、Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、Ｂａｓｅは、アデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、メチルシトシニル基あるいはそれらの誘導体を示し、ｍは、０〜２の整数であり、ｎは、１〜３の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む。
【０１１６】
さらに好ましくは、本発明で使用されるＢＮＡは、
【０１１７】
【化１６】
2017047097.tif 000018
【０１１８】
または２’，４’メタノ架橋核酸（ＬＮＡ）を含む。
【０１１９】
特に、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）が好ましい。理論に束縛されることを望まないが、この特定の核酸を用いることで、安定性が増し、二本鎖の形成が促進され、さらには、生物学的活性の向上も観察されたからである。
【０１２０】
別の実施形態では、ｃＥｔを用いることができる。
【０１２１】
【化１７】
2017047097.tif 000019
【０１２２】
理論に束縛されることを望まないが、ＢＮＡ（ｃＥｔ）は従来のＬＮＡと同様の熱的安定性およびミスマッチ識別を有するものの、ヌクレアーゼに対する安定性が向上するからである。
【０１２３】
１つの実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖および前記ｍｉＲＮＡ結合配列の相補鎖の少なくとも一つの鎖に含まれる。
【０１２４】
別の実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖に含まれる。別の実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の両方の鎖に含まれる。
【０１２５】
１つの実施形態では、本発明の複合体では「二本鎖構造」が1つ以上、あるいは複数含みうるものであり、特許文献１または実施例と同様のＳ−ＴｕＤ構造であってもよい。例えば、二本鎖構造は、直列であれば３つや４つでも連続して含まれることが可能であり、このような実施形態も本発明に包含されることが理解される。
【０１２６】
１つの実施形態では、本発明の複合体は、前記二本鎖構造を２つ以上含み、該二本鎖構造の第１の二本鎖構造の片端の２つの鎖にｍｉＲＮＡ結合配列を含む鎖がそれぞれ１本ずつ結合しており、該２つ以上の二本鎖構造に挟まれるように、該鎖のそれぞれの他端が、該２つ以上の二本鎖構造の第２の二本鎖構造の２つの鎖にそれぞれ結合している。好ましくは、本発明の複合体は、前記二本鎖構造の片端の2つの鎖に、miRNA結合配列を含む２つの鎖の末端が、それぞれ１〜５塩基のリンカーを介して１本ずつ結合しており、二本鎖または四本鎖から選択される第２の多重鎖構造を含み、該二本鎖構造と該第２の多重鎖構造とに挟まれるように、該miRNA結合配列を含む２つの鎖のそれぞれの他端が、該第２の多重鎖構造の片端の2つの鎖に、それぞれ１〜５塩基のリンカーを介して結合していることが好ましいが、これに限定されない。あるいは、本発明の複合体に含まれるｍｉＲＮＡ結合配列を含む２つの鎖は、それぞれの鎖がｍｉＲＮＡ結合配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合配列を含む鎖が２つあることが有利でありうるが、本発明はこれに限定されない。
【０１２７】
別の実施形態では、本発明では、ｍｉＲＮＡ結合配列を含む２つの鎖の末端が、リンカーを介して結合している。好ましい実施形態では、本発明は、前記リンカーの長さは１〜１０塩基長であり、より好ましくは、１〜９塩基長であり、さらに好ましくは、１〜８塩基長であり、さらに好ましくは、１〜７塩基長であり、さらに好ましくは１〜５塩基長であり、４塩基長、３塩基長、２塩基長、１塩基長であってもよい。
【０１２８】
本発明のmiRNA阻害複合体における二本鎖構造の長さは、上述のように任意の長さでよいが、好ましくは4塩基対以上の長さを有する。特に、本発明のRNA複合体に含まれる二本鎖構造の少なくとも１つ（すなわち第一の二本鎖構造）は、RNA複合体の核外輸送に重要な機能を持つ。この二本鎖の鎖長は、例えば10〜50、15〜50塩基対であってよく、好ましくは10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、または45塩基、あるいはそれらのいずれか以上であり、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、または18塩基、あるいはそれらのいずれか以下である。より好ましい態様では、二本鎖構造の塩基対の長さは、例えば10〜30、15〜30、好ましくは16〜28、好ましくは17〜25、好ましくは17〜24、例えば17、18、19、20、21、22、23、または24である。20bpを超えても高い活性を発揮することはできるが、20bpを超えるdsRNAは、細胞質においてDicerによる切断の潜在的な標的となり得ることから、それを避けるために、本発明の複合体に含まれる二本鎖構造は20bp以下、例えば19bp以下、または18bp以下とすることができる。miRNA阻害複合体に含まれる二本鎖構造については、以下の好ましい実施形態においてさらに述べる。例えば5bp〜15bp、5bp〜12bp、5bp〜10bp、6bp〜9bp、7bp〜8bp、10bp〜12bpとしてよい。
【０１２９】
本発明の複合体中二本鎖の構造は、その下限の長さは、特に、活性が保持される限り限定されないが、少なくとも４塩基長、少なくとも５塩基長、少なくとも６塩基長、少なくとも７塩基長、少なくとも８塩基長であり、好ましくは、少なくとも９塩基長であり、さらに好ましくは少なくとも１０塩基長である。二本鎖は２つ以上ある場合は、それらの塩基長は同じであっても異なっていてもよい。また、１０塩基長で二本鎖の十分な形成が確認され、十分な効果があることが示されているが、場合によっては、例えば、少なくとも１１塩基長、少なくとも１２塩基長、少なくとも１３塩基長、少なくとも１４塩基長、少なくとも１５塩基長、少なくとも１６塩基長、少なくとも１７塩基長、少なくとも１８塩基長であってもよい。
【０１３０】
本発明の複合体中二本鎖の構造は、その上限の長さは、特に、活性が保持される限り限定されないが、例えば、１００塩基長以下、９０塩基長以下、８０塩基長以下、７０塩基長以下、６０塩基長以下、５０塩基長以下等であり得る。
【０１３１】
本発明のmiRNA阻害複合体に第二またはそれ以上の二本鎖構造が含まれる場合においては、これらの二本鎖構造の配列やその長さに特に制限はない。これらの二本鎖構造は、例えばmiRNA阻害複合体全体をコンパクトにするために、第一の二本鎖構造の長さよりも短くしてもよい。各二本鎖の鎖長は適宜調整してよいが、例えば4bp〜20bpであり、例えば5bp〜15bp、5bp〜12bp、5bp〜10bp、6bp〜9bp、または7bp〜8bpとしてよい。
【０１３２】
本発明では、ＢＮＡは１個あれば、その効果を奏することが期待されるが、好ましくは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上含んでいてもよい。ただし、６個程度で十分な効果を奏し、それ以上含めても効果が増加しない場合もあるため、６個前後（例えば、４〜８個、４〜６個等）含めることで十分であり得る。
【０１３３】
また、本発明の複合体は、従来の複合体よりも強い活性を有する（低濃度で作用する）ことが分かった。限定するものではないが、例えば、本発明の複合体は、従来の複合体よりも約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、９倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約２０倍以上、約２５倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約７５倍以上、約１００倍以上の効果を奏し得る。したがって、例えば、本発明の複合体は、１０ｎＭ以下で作用し、５ｎＭ以下で作用し、３ｎＭ以下で作用し、１ｎＭ以下で作用し、５００ｐＭ以下で作用し、３００ｐＭ以下で作用し、１００ｐＭ以下で作用し、５０ｐＭ以下で作用し、３０ｐＭ以下で作用し、１０ｐＭ以下で作用し、５ｐＭ以下で作用し、３ｐＭ以下で作用し、１ｐＭ以下で作用するという顕著な効果を奏する。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明の複合体は、２から５つのｍｉＲＮＡ結合配列を含み、好ましくは２つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む。
【０１３５】
本発明の複合体は、
【０１３６】
【化１８】
2017047097.tif 000020
【０１３７】
に示された構造を含み、該構造のＩおよびＩＩは二本鎖構造であって、該構造のａおよびｂにそれぞれ１つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む構造をとり得る。
【０１３８】
別の局面において、本発明は、本発明の複合体を構成する各々のRNAまたはその類縁体（すなわち、各々の一本鎖）を提供し、これらの各々のRNAまたはその類縁体も本発明の範囲内にある。一本鎖の場合の好ましい実施形態は、二本鎖構造におけるものと実質的に同様であり、同様の好ましい実施形態を採用することができる。
【０１３９】
別の局面において、本発明は、本発明の複合体を製造する方法であって、Ａ）化学合成により、リボ核酸およびＢＮＡを用いて、目的とするＲＮＡまたはその類縁体の一本鎖の保護体およびその相補体の保護体を合成する工程；Ｂ）生成した該一本鎖の保護体およびその相補体をそれぞれ脱保護する工程；ならびにＣ）脱保護した該一本鎖のそれぞれを二本鎖形成条件に配置して二本鎖を形成する工程を包含する方法を提供する。
【０１４０】
さらなる局面において、本発明は、本発明のＲＮＡまたはその類縁体を製造する方法であって、Ａ）化学合成により、リボ核酸およびＢＮＡを用いて、目的とするＲＮＡまたはその類縁体の一本鎖の保護体およびその相補体の保護体を合成する工程；およびＢ）生成した該一本鎖の保護体およびその相補体をそれぞれ脱保護する工程を包含する方法を提供する。
【０１４１】
このような方法については、本明細書において別の節において詳述しており、実施例においても実証例を記載しており、これらを参考にして当業者は種々の複合体、ＲＮＡまたはその類縁体を製造することができることが理解される。
【０１４２】
（医薬および治療・予防法）
別の局面において、本発明は、本発明の複合体を含む医薬を提供する。
【０１４３】
１つの「実施形態では、本発明のmiRNA阻害複合体、または該複合体を構成するRNA（ここでRNAとしては、天然のRNAおよび類縁体を含む）は、miRNAを阻害するための組成物とすることができる。本発明の組成物は、標的miRNAを特異的かつ効率的に阻害できるので、miRNAの阻害を介した遺伝子の機能制御に有用である。本発明の組成物は、必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。それらには、通常核酸の懸濁に用いられる所望の溶液が挙げられ、例えば蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が例示できる。また植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。また本発明の組成物は、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などを担体として組み合わせることもできる。本発明の組成物は、所望の試薬として、または医薬組成物として使用できる。また本発明は、本発明の組成物、本発明のmiRNA阻害複合体、または該複合体を構成するRNAまたはその類縁体の、miRNAを阻害するための使用を提供する。また本発明は、それらのいずれかを含むmiRNA阻害剤を提供する。
さらなる局面において、本発明は、有効量の本発明の複合体またはそれを含む医薬をそれを必要とする被験体に投与する工程を包含する、疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。本発明は、限定されないが、例えば、すでに臨床開発が進んでいるHCV治療薬や腎臓の線維化治療剤としての利用等に応用することができる。
【０１４４】
本発明の医薬は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の医薬と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
【０１４５】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の核酸を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（50mol）付加物（polyoxyethylene（50mol）adduct  of  hydrogenated  castoroil））〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
【０１４６】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【０１４７】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。
【０１４８】
本発明の医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
【０１４９】
細胞への導入はin  vitro、ex  vivoまたはin  vivoで行うことができる。細胞を介して投与する場合は、適当な培養細胞または接種対象動物から採取した細胞などに導入する。核酸の導入としては、リン酸カルシウム共沈殿法、リポフェクション、DEAEデキストラン法、注射針等により直接DNA溶液を組織に注入する方法、ジーンガンによる導入などが挙げられる。投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、投与対象動物、投与部位、投与回数などに応じて適宜調整してよく、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができる。投与対象は、好ましくは哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む）である。具体的には、ヒト、サル等の非ヒト霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、およびその他の哺乳動物が含まれる。
【０１５０】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
【０１５１】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１５２】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
【実施例】
【０１５３】
以下、本発明のヌクレオシド類縁体及びオリゴヌクレオチド類縁体を下記の合成スキームに従って、合成した。これらの合成は実施例において更に詳しく説明する。また、合成したオリゴヌクレオチド類縁体の特性を実験例によって測定した。なお、実施例中、特に断らない限り、Ｌｏｎｇ  ＴｙｐｅとはオリジナルのS-TuD（配列番号１〜２）と同じSTEM左側18bp  右側10bpのものを指し、Short  typeとは、STEM左側10bp  右側10bpのものを指す。【０１５４】
（製造例）
（オリゴヌクレオチドの合成）
オリゴヌクレオチドは、nS-8II合成機もしくはＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成機で合成した。市販の細孔ガラス質固相担体（２’-O-メチル-ＲＮＡ  CPG  Link  Technologies社製）と、標準的な保護基を有する２’-O-メチル-ＲＮＡホスホロアミダイト、すなわち、５’-Ｏ-ジメトキシトリチルＮ６-ベンゾイルアデノシン-2'-O-メチル-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-Ｎ４-アセチルシチジン-2'-O-メチル-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-Ｎ２-イソブチリルグアノシン-2'-O-メチル-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、および５’-Ｏ-ジメトキシトリチルウリジン-2'-O-メチル-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピルホスホロアミダイト（以上シグマアルドリッチ社製）、並びに、2’,4’-BNANC(2’-O,4’-C-アミノメチレン架橋核酸)チミジンホスホロアミダイト、すなわち2’-O,4’-C-アミノメチレン-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-チミジン-N,N'-ジイソプロピルホスホロアミダイト、2’,4’-BNANCアデノシンホスホロアミダイト、すなわち2’-O,4’-C-アミノメチレン-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-Ｎ６-ベンゾイルアデノシン-N,N'-ジイソプロピルホスホロアミダイト（以上BNA社製）、並びに、LNA（Locked  nucleic  acid）（2’-O,4’-C-メチレンリボ核酸）チミジンホスホロアミダイト、すなわち2’-O,4’-C-メチレン-５’-Ｏ-ジメトキシトリチルチミジン-N,N'-ジイソプロピルホスホロアミダイト(エキシコン社製)をオリゴヌクレオチド合成に使用した。ホスホロアミダイトは全て、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中、０．１Ｍの濃度で使用した。2’-O-メチルRNA、BNA及びLNAについては１5分の連結／再利用時間を使用した。活性剤は、５-ベンジルメルカプト-テトラゾール（０．２５Ｍ、和光純薬社製）であり、ＰＯ-酸化については、ヨウ素／水／ピリジンを使用した。ＰS-ホスホロチオエート化については、市販のオリゴヌクレオチド自動合成機用硫化試薬（すなわちEIDTH、DDTT、PADS、Beucage試薬など）をピリジンとともに使用した。【０１５５】
脱保護Ｉ（ヌクレオ塩基脱保護）
合成が完了した後、合成担体をガラスボトルに移した。オリゴヌクレオチドを、担体１ｇに対して１５ｍLの、４０％メチルアミン水溶液と３３％メチルアミンエタノール溶液の等量混合物を用いて、４５℃で１３時間、塩基とリン酸基を同時に脱保護しながら担体から切断した。その後、エタノールアンモニア混合物を濾過して、新しい２５０ｍＬのボトルに入れた。担体を２×４０ｍＬのエタノール／水（１：１ｖ／ｖ）で洗浄した。その後、ロータリーエバポレーター（ｒｏｔｏ-ｖａｐ）で溶媒留去し乾固した。【０１５６】
（ＨＰＬＣ精製）
オリゴヌクレオチドを、Source  15  RPCゲルカラムでの逆相イオンペアＨＰＬＣで精製した。緩衝液は、５％  ＣＨ３ＣＮ、0.1Mトリエチルアミン酢酸緩衝液（pH7.0）（緩衝液Ａ）と９０％  ＣＨ３ＣＮ、0.1Mトリエチルアミン酢酸緩衝液（pH7.0）（緩衝液Ｂ）であった。５’末端にジメトキシトリチル基が保持された状態で全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし次の精製に供した。その後オリゴヌクレオチドプールを、Source30Qの陰イオンペアＨＰＬＣで精製した。溶液及び緩衝液は、０．６％のトリフルオロ酢酸（溶液A）、２０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）（緩衝液C）と２０mMリン酸ナトリウム緩衝液中の2M塩化ナトリウム（緩衝液D）であった。溶液Aを用い、ジメトキシトリチル基を脱離させた後、完全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩後凍結乾燥した。化合物は、最終的に、MALDI-TOF/MSと変性ポリアクリルアミドゲルで分析した。【０１５７】
（２本鎖化)
精製の完了した１本鎖オリゴヌクレオチドを蒸留水にて溶解後、紫外吸光光度分析計を用い吸光度測定しオリゴヌクレオチド濃度を決定した。決定された濃度を用い相補鎖をそれぞれ等モル濃度になるように混合し、95℃で１０分加熱後徐冷し２本鎖形成させた。２本鎖形成は非変性ゲル電気泳動にて確認した。
（HeLaS3-miR199a細胞の作製および培養）
HeLaS3細胞は10%ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM中、37℃で培養した。HeLaS3細胞を6ウェルプレートに１ウェルあたり1x105細胞（1x105  cells  per  well）でまき、24時間後にpLSP-miR199aウイルスベクター(<1x104  TU)を、8μg/mlのポリブレンの存在下で導入し、トランスダクションの24時間後からピューロマイシン（Puromycin）(1ug/ml)で選択した。1週間の選択の後、培地からピューロマイシン（Puromycin）を除去し、miR-199aレポーターを保持するHeLaS3細胞としてHeLaS3-miR199a細胞を得た。【０１５８】
（ルシフェラーゼアッセイ）
HeLaS3-miR199a細胞およびHCT-116細胞を、10%ウシ胎児血清（foetal  bovine  serum）(FBS)を含むDMEM中、それぞれ１ウェルあたり1x105細胞（1.0x105  cells  per  well）で導入の前日に24ウェルプレートにまき、Lipofectamine  2000  (LifeTechnologies)および100ngのレポータープラスミド(psiCHECKTM-2,psiCHECK2-T199a-3px3,psiCHECK2-T200c-3pまたはpsiCHECK2-T21-5p)（図１６および図１７を参照）および各種S-TuDをトリプリケートでトランスフェクトした。全てのアッセイはトランスフェクションの48時間後にdual  luciferase  assay(Promega)によりGLOMAXTM(Promega)で実施した。【０１５９】
（実施例１：構造強化試験）
本発明者らが開発したmiRNA阻害剤（合成Tough  Decoy,S-TuD）は低濃度でmiRNAの活性を阻害する核酸として注目されているが、その構造の特性上2本鎖化した後の物性が安定しない。そこで、本実施例では、S-TuDの安定的な大量生産及び物性試験法の確立を容易にするために、2本鎖を強固にする方法として2本鎖領域をハイブリダイゼーション能力が向上する修飾核酸に部分置換したものを使用し、miRNA阻害活性を従来型のS-TuDと比較した（図１Ａ）。【０１６０】
従来型S-TuDで逆相HPLC分析をした結果を図１Ｂに示す。図１Ｂは、従来型S-TuDの逆相HPLC（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析（C18の逆相イオン対HPLC、XBridgeカラムのもの）により分析したS鎖、AS鎖、2本鎖の比較を示す。【０１６１】
本実施例では、以下の修飾核酸を使用した。【０１６２】
【化１９】
2017047097.tif 000021
【０１６３】
２‘−Ｏ−メチルＲＮＡ【０１６４】
【化２０】
2017047097.tif 000022
【０１６５】
【化２１】
2017047097.tif 000023
【０１６６】
２’−Ｏ−メチルＲＮＡはＳ−ＴｕＤの基本構造に使用し、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）を修飾核酸として使用した。ＬＮＡについても同様に使用可能である。【０１６７】
(物性の改善実験)
STEM領域の一部塩基を2本鎖形成能が上昇するタイプのヌクレオチド種（ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ））に変更し、物性評価を実施した。結果を図３８に示す。その結果、図１ＢのピークAが減少し、2本鎖の逆相HPLC純度分析精度が向上した。【０１６８】
逆相HPLC純度分析のプロトコールは以下のとおりである。HPLC分析のカラムにはXBridgeC18  2.5μm  4.6nn  x  75mm  を用い、溶離液にはAとして5%アセトニトリル／0.1Mトリエチルアミン−酢酸緩衝液(pH7)を、Bとして90%アセトニトリル／0.1Mトリエチルアミン−酢酸緩衝液(pH7)を用いた。分析中のカラム温度は20℃で、流速は1mL/min、溶離液の濃度はA:B=100:0からA:B=75:25まで30分間かけて徐々に変化させた。検出はUV(260nm)の吸収により確認した。【０１６９】
用いたオリゴヌクレオチドの構造を図２Aおよび図２Bに示す。合成は、上記オリゴヌクレオチドの合成したものを使用した。(1)C,U:  2'-F-C,  2'-F-U、(2)T  :  BNA-T、(3)T  :  BNA-T、(4)T  :  BNA-T  A  :  BNA-A、(5)T  :  BNA-T  A  :BNA-A（10塩基）が使用された。図２Bに示される配列は以下のとおりである：(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10；(1)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT4；(2)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S8-BT6；(3)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S8-BT4；(4)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S6-BT6；(5)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S6-BT4。【０１７０】
またSTEM  I領域を10bpまで削った場合は、オリジナルなS-TuDと同様の2’-O-メチル体のみの場合、図３９−１、図３９−２および図４０に示すように、両方の鎖が一部1本鎖として残ってしまうのに対し、BNAで置換した場合は2本鎖形成能が向上した。【０１７１】
また、STEM  I領域または両方のSTEM領域を８bpまで削っても、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化した場合は、図３９−１、図３９−２および図４０に示すように2本鎖形成が見られた。【０１７２】
この物性改善が活性にどう影響するか、in  vitroのmiR-199a阻害アッセイで確認した。【０１７３】
miR-199a阻害アッセイのプロトコールは以下のとおりである。【０１７４】
以下の実験1と実験2でウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）とホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）の比を取ることにより標的miRNAの活性を測定した。【０１７５】
（実験１）
miR199a_3p及び5pを内在性に僅かにしか発現しないHeLaS3細胞（Landgraf,  P.  et  al.  (2007)  Cell,  129,  1401-1414）を10%ウシ胎児血清（foetal  bovine  serum）(FBS)を含むDMEM中、37℃で培養した。HeLaS3細胞を6ウェルプレートに１ウェルあたり1x105細胞（1x105  cells  per  well）でまき、24時間後にpLSP-miR199aウイルスベクター(<1x104  TU)を、8μg/mlのポリブレンの存在下で導入し、トランスダクションの24時間後からピューロマイシン（Puromycin）(1ug/ml)で選択した。1週間の選択の後、培地からピューロマイシン（Puromycin）を除去し、miR-199aレポーターを保持するHeLaS3細胞としてHeLaS3-miR199a細胞を得た。【０１７６】
（実験２）
psiCHECK2-miRT（プロメガ社、XhoI-NotIサイトに、例えば、miR-199a-3pのような標的miRNAと相補な配列を挿入して作成；全体構造は図３に示す。）、図２に示された、合成S-TuD修飾体を用いて細胞（HeLaS3-miR199a）をトランスフェクションした。【０１７７】
その後、トランスフェクションした細胞から発現するウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）とホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）がそれぞれの特異的な基質と反応することで生じる化学発光シグナルをルミノメーターで測定し、測定されたシグナルについてウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）とホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）の比をとった。結果を図４−１、図４−２、および図５に示す。図４−１および図４−２の結果から、(2)〜(4)の分子の効果を見ると、Ｔを十分に置換すれば、BNAはTだけでも十分であると思われる。ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）を入れるとStem  Iの長さを短くできるようであるが、若干活性が下がるようであった。より短くするには、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）等のBNA量を増やす必要があるのではないかと考えられる。【０１７８】
次に、実験1のコントロールレポーターの値で、実験2のmiR-199aレポーターの値を正規化したデータを作成した。図5に示す。図5に示されるように、S-TuDのmiR-199a阻害活性の強さがそのままルシフェラーゼ活性の高さになる。またS-TuD濃度は10-30-100-300-1000-3000pMの6点で行った。【０１７９】
図９からもわかるように、MBS領域修飾による更なるmiRNA阻害活性の向上が見られた。STEM領域の長さはオリジナルと同一で一部をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した結果、オリジナルのS-TuDに比べ最大10倍程度阻害活性が向上した。このことは物性改善が活性そのものにも良い影響を与えることを示している。またSTEM  Iを10bpまで削った場合も最大3倍以上の活性向上が確認された。【０１８０】
以上のように、2本鎖を強固にすることで、活性が同等なSTEM領域短鎖化S-TuDも達成することができるとしてコストダウンが可能になった。【０１８１】
（実施例２：MBS領域への置換)
本実施例ではMBS領域等種々の位置においてＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した場合の影響を確認した。実施例１と同じレポーターアッセイ系を用いた。使用した配列は、図１０、１２および１３に示す。【０１８２】
（使用した構造）
本実施例では、まず、挿入部位の最適化のために、種々の構造の物を用いてＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した場合の影響を確認した、使用したS-TuDの構造は図６〜７に示す。オリジナルのS-TuD199a-3p、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(22)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(24)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-3-MBSB2  (非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。修飾核酸（ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ））、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(1)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化及びMBS領域をホスホロチオエート化）、(23)-(2)  S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化及びSTEM領域をホスホロチオエート化）、(23)-(3)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS3(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化及び全配列ホスホロチオエート化）が使用された。【０１８３】
（アッセイ手順）
実施例１と同じレポーターアッセイを用いた。【０１８４】
（結果）
本実施例で得られた構造体について、MBS領域の一部ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した結果を図８−１および図８−２に示す。図８−１および図８−２に示されるように、オリジナルのS-TuDに比較し最大10倍程度の阻害活性向上が見られる構造体を得ることができた。MBS領域の非シード領域にBNAを一部挿入することが重要であった。【０１８５】
Long  type（Stem1=18,  Stem2=10)のStemをBNA化した場合（16）、そのMBSの非seed領域の相補配列にさらにBNA修飾を入れても抑制効果は増強しなかった(23）。この（16）のMBSのseed領域の相補配列にさらにBNA修飾を入れると抑制効果はやや減弱した（22）。Short  type  （Stem1=10,  Stem2=10)のStemをBNA化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにBNA修飾した場合（18）、そのlong  type(23）とほぼ同程度にまで効果が増強された。PS修飾をStem構造に入れると大きく阻害効果が減弱し(23-2)、MBSに入れる(23-1)とさらに減弱した。両者に入れる(23-3)と阻害効果は消失した。バックボーンのホスホロチオエート化は活性にとってマイナスであったが、BNAの効果は保持されていた。【０１８６】
次に、Short  type  （Stem1=10,  Stem2=10)のStemをBNA化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにBNA修飾した場合（18）の濃度依存性についてみた結果を図９に示す。図９に示されるように、Short  type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをBNA化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにBNA修飾した場合（18）はBNA修飾の全くないoriginal(Long  type非修飾）の10倍弱程度効果が高かった。【０１８７】
以上から、2本鎖形成が促進される修飾核酸（Bridged  Nucleic  Acid=BNA,  Locked  Nucleic  Acid=LNA、2本鎖化形成促進する修飾核酸であれば構造を問わない）をSTEM領域に含んだS-TuDが本発明で提供され、これらのS-TuDが顕著な構造安定性および効果の向上効果を有することが確認された。また、STEM領域の一部をBNAに置換した、最小10merまで短鎖化されたSTEM  I領域を有するS-TuDことで、より効果が増強されることが実証された。加えて、MBSのmiRNA非シード領域に一部BNA置換したS-TuDも同様の効果が奏されることが実証された。【０１８８】
このような技術が提供されたことから、従来型で達成し得なかった安定的な物性評価が可能になり、逆相HPLC分析で純度分析が可能になった。また、このような安定化は複数のmiRNAターゲットで確認され普遍的に効果が示されることが確認された。従来型と同じ構造のSTEM領域の一部をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）もしくはLNA等の広義のBNAに置換すると、miRNA阻害活性がオリジナルS-TuDに比べ最大5倍程度向上していた。この効果は、複数のmiRNAターゲットで確認されており、普遍的に効果が示されることが確認された。【０１８９】
また、最小10merまで短鎖化されたSTEM  Iを持つS-TuDは両方のSTEMを一部BNA化することでオリジナルS-TuDに比べ最大3倍程度活性向上することも確認された。この効果も、複数のmiRNAターゲットで確認されており、普遍的に効果が示されることが確認された。【０１９０】
本発明の従来のS-TuDに比べ血清中での安定性が向上していることも確認された。したがって、本発明のS-TuDは、安定な医薬品として提供可能であることから、がんなどmiRNAの過剰発現が病因となる場合の治療薬として利用され、そして、もちろんmiRNA関連の研究試薬としての活用し得ることが期待される。【０１９１】
（実施例３：STEM領域短鎖化＋MBS領域へのBNA挿入効果確認）
次に本実施例では、実施例１〜２の結果を受け、STEM領域短鎖化＋MBS領域へのBNA挿入効果確認を行った。【０１９２】
(使用した構造)
本実施例において使用したS-TuDの構造を図１０に示す。S-TuD199a-3pのオリジナル配列、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10、(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を使用した。【０１９３】
（実験方法）
実験方法は、実施例１〜２に記載されているレポーターアッセイの方法と同様の手法で発現を確認した。【０１９４】
（結果）
個々のS-TuD  100ｐMおよび300ｐMでの結果を図１１−１および図１１−２に示す。図１１−１および図１１−２に示されるように、Short  typeについてBNA修飾の影響を検討した。オリジナルタイプとLong  typeのStem-BNA修飾(16)を比較に加えた。Short  type-BNA修飾無(1)’と比べて、stem部分にBNA修飾を入れた(6)’は大きく効果が増強した。さらにSeed相当部位にBNA修飾をいれた(17)は効果を増強しなかった。しかし非seed相当部位にBNA修飾を入れた(18)はさらに効果が増強し、(16)と同等以上になった。Short  typeにおいてはMBS内のBNA修飾部位によっては増強効果があることが分かった。【０１９５】
（実施例４：血清中の安定性）
次に、本実施例では、マウス血清を用いて血清中の安定性を確認した。【０１９６】
（血清安定性の確認実験）
オリジナルのS-TuDと比較して、血清安定性が向上することを血清安定性試験により確認した。以下にプロトコールを示す。実験は、2μg  S-TuD／100%  20μlマウス血清の条件で、37℃中で0h、48h、72h、96h処理した。【０１９７】
（構造）
使用した修飾S-TuDの構造は、図１２〜１３及び図１９に示す。すなわち、オリジナル構造、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(23)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(1)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(2)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）および(23)-(3)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS3(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10、(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）および(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(41)S-TuD-200c-1_22-pf、(42)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6、(43)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(44)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(45)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）である。【０１９８】
（結果）
結果を図１４〜図１５及び図２０に示す。図１４〜１５及び図２０で示されるように、MBS領域の一部ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した結果血清安定性の向上が見られた。【０１９９】
マウス血清中での安定性についてみたところ、Long  type  S-TuDは未修飾でもヌクレアーゼ耐性を示したが、時間が経つにつれてスメアが多くなっていた。これは若干の分解をうけているためではないかと考えられる。Stem部分をBNA修飾するとこのスメアは消え、完全な耐性を獲得した。ここにさらにMBS-BNA修飾を入れても更なる効果は見られなかった。【０２００】
また、Short  type  S-TuDについてみたところ、Short  type  S-TuDは未修飾ではかなり分解を受けていたが、若干のヌクレアーゼ耐性を示した。Stem部分をBNA修飾すると完全な耐性を獲得した。ここにさらにMBS-BNA修飾を入れても更なる効果は見られなかった。【０２０１】
さらに普遍性を検討したところ、図２０で示されるようにS-TuD-200c-1_22-pfのＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）置換体もS-TuD199aの場合と同様な、血清中での安定性の向上を確認することが出来た。【０２０２】
以上から、S-TuD199a、S-TuD200cともにBNA修飾を加えることによりメインバンド上部のスメアが消え、安定性が増強していた。この効果はSTEM部分だけBNA修飾するよりも、Stem部分、MBS部分の両方にBNA修飾したものでより増強していた。特にS-TuD199aのshort  type((1)’(6)’(17)(18))において安定性増強効果は顕著でshort  typeにはBNA修飾は必須であると考えられる。S-TuD200cでは未修飾のlong  type(41)においてメインバンドが出現せず、スメアが見られた。S-TuD199aではメインバンドが見られたことから二次構造が関係しているものと推定される。また全ての結果でメインバンドの上部にはっきりとバンドが出ているのは血清タンパク質との非特異的結合と考えられる。【０２０３】
（実施例５：普遍性の実験）
本実施例では、普遍性を確認するために２種類のmiRNAを標的として同種の実験を行った。【０２０４】
（普遍性の確認実験）
実施例１におけるmiR-199aに代えて、miR-200c、miR-21に置換したものを用いて同様にレポーターアッセイ実験を行った。具体的には以下のとおりである。【０２０５】
レポーターアッセイに使用したコンストラクトがmiR-200c、miR-21に置換されただけで、アッセイ方法は実施例１等と同一である。【０２０６】
（使用した構造）
miR-200cのための構造は、図19に示す。miR-21のための構造は図23に示す。miR-200cには(41)S-TuD-200c-1_22-pf、(42)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6、(43)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(44)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(45)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を使用した。miR-21には、(51)S-TuD-21-1_17-10mut、(52)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6、(53)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1、(54)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6、(55)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1を使用した。【０２０７】
（結果）
次に、普遍性の確認を確認した。普遍性は、miR-199a以外にmiR-200c、miR-21についても実施例１と同様の実験を行った。図２０には血清耐性を示す電気泳動の結果を示す。miR-200cでの結果をグラフ化したものを図２１−１および図２１−２（miR-200c）に示す。レポーターアッセイの結果を示す図２１−１および図２１−２に示されるように、Long  type（Stem1=18,Stem2=10)のStemをBNA化した場合（42）、そのMBSの非seed領域の相補配列にさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾を入れても抑制効果は増強しなかった(44）。この42MBSのseed領域の相補配列にさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾を入れると抑制効果は減弱した（43）。Short  type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した場合（45）、そのlong  type(44）とほぼ同程度にまで効果が増強された。また、図２２に示されるように、Short  type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにBNA修飾した場合(45)はＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾の全くないoriginal（41）の2倍弱程度効果が高かった。0.1-10pMの投与では、S-TuDがチューブに非特異的に吸着する可能性も考え、担体としてS-TuD  NC2を30pM添加したものも解析したが、添加の効果は見られなかった。【０２０８】
以上から、Short  type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾したタイプは、Long  typeのいずれのものと比べても、活性は劣らないことが分かった。また、このShort  type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾したタイプは、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）非修飾のoriginalと比べ、標的miR-199aでは阻害活性が１０倍程度、また標的miR-200cでは２倍程度上昇した。【０２０９】
このように、miR-199a以外にmiR-200cについても同程度の結果が確認された。【０２１０】
miR-21で同様の効果を確認したところ、同様の効果が示された。結果を図２４〜図２６に示す。図２４は、マウス血清処理後の電気泳動図を示す。S-TuD21の場合は、未修飾のlong  type(51)においてメインバンドが出現せず、スメアが見られた。修飾を行ったS-TuD(52-55)についてははっきりとしたメインバンドが得られたことから血清中での安定性の向上が確認された。なお全ての結果でメインバンドの上部にはっきりとバンドが出ているのは血清タンパク質との非特異的結合と考えられる。miR-21でのレポーターアッセイの結果をグラフ化したものを図２５−１および図２５−２（miR-21）に示す。S-TuD21（Original；51）と比較してstem部分をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した（52）では若干の効果増大が見られた。さらにMBSの非シード領域部分を修飾した53番では10倍近く効果が増大していた。Short  typeにおいてもMBSの非シード領域部分を修飾した（55）はOriginal（51）と比較して３倍以上効果が増大していたが、long  type（53）と比較すると若干弱かった。また、図２６で示すように濃度依存性を検討したところ、Original（51）と比較してstem部分およびMBSの非シード領域部分をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した（53）では10倍近く効果が増大していた。Short  typeにおいてもMBSの非シード領域部分を修飾した（55）はOriginal（51）と比較して３倍以上効果が増大していたが、long  type（53）と比較すると2/3倍程度であった。【０２１１】
（阻害効果の強さの考察）
199a、200c、21全てにおいてlong  typeかつBNA修飾をStem部分とMBSの非seed相当部位の両方にいれたもの（Aと略す）が最も効果が高かった。Short  typeのStem,MBS-BNA修飾型はAよりは効果が下がるが、originalよりは阻害効果が大きく高くなっていた。ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾long  typeの増強程度は199a、21では従来型の10倍弱程度活性が高くなっていた。ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾short  typeの増強程度は199a、21では従来型の3-8倍程度活性が高くなっていた。200cで増強程度が低いのはmiR-200cの発現量・活性が低いためか、すでにpMレベルで阻害効果が出ているので、差が出にくいのではないかと考えられる。【０２１２】
以上から、Long  typeであれshort  typeであれ、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾はStem部分とMBSの非seed相当部位の両方にいれることが効果、安定性の両面から推奨される。とくにshort  typeでは、stem部分のＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化は望ましいと考えられる。またLong  typeのMBSの非seed相当部位のＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）の効果の程度にはmiRNAの種類により大きく違う。またstemの長さについては、in  vitroの結果ではlong  typeの方がshort  typeよりも少し効果が高いようであった。【０２１３】
（実施例６：インビボ実験）
次に、本実施例では、本発明のS-TuDが臨床応用できるかを確認した。【０２１４】
（構造）
使用した構造を図２７に示す。(51)S-TuD-21-1_17-10mut、（53）S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1および(55)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1が使用された。【０２１５】
（プロトコール）
マウス（C57BL/6  6週齢  オス  ）へ各S-TuDを1mg/kgで眼窩静脈に単回投与して（ｎ＝３）、24hr後にサクリファイスして腎臓を採取し、RT-PCR法で(S-TuDと結合していないと考えられるフリーの）miR-21量を定量した。【０２１６】
（結果）
結果を図２８〜２９に示す。【０２１７】
図２８に示されるように、腎臓でのmiR-21量をRT-PCR法で測定したところ、最も阻害活性の高いのは５３、それに５５が続いた。図２９に示されるように、マウス三匹の腎臓内のmiR-21の平均値を測定したところ、original  S-TuDではほとんどmiR-21の減少が見られないが、５３、および程度はやや落ちるものの５５でも、低下が検出される。【０２１８】
なお、miR-122の阻害剤（LNA-ASO）はHCV治療薬としてPIIまで進んでいることが知られている。また本件実施試験に含まれているmiR-21の阻害剤（LNA-ASO）は、Regulus社により腎臓の線維化を抑える治療薬として非臨床試験およびPhaseIが完了し、現在PhaseIIまで進んでいる。以上から、本実施例の結果は、本発明のS-TuDが医薬として利用可能であることを示すin  vivoのデータと評価されるべきである。【０２１９】
（実施例７：各種架橋型核酸の比較試験）
次に本実施例では、実施例１〜７の結果を受け、STEM領域へ2本鎖化形成能が高い修飾塩基置換を行うことがmiRNA阻害の活性を向上させることを確認するため、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）と同位置に架橋構造が異なるLocked核酸（LNA；２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンリボ核酸）置換を行い、活性を比較した。
配列構造は図３２に示す。【０２２０】
S-TuD基本構造はSTEM  Iを10bpに削った10-MBS-10タイプ（(5)で示される。）
アッセイ方法としては、実施例１等で使用したmiR199aのルシフェラーゼレポーターアッセイと同じ手法を用いた。【０２２１】
（結果）
結果を図３３−１および図３３−２に示す。ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）とLNAは同等の効果があり、構造普遍性を確認した。また10bpのSTEM領域に6カ所のＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）置換を実施しても活性は4ヵ所の置換と同等であった。【０２２２】
（実施例８：STEM領域の短鎖化試験）
次に本実施例では、STEM領域の短鎖化を行い、活性を比較した。【０２２３】
用いた配列は図３４に示す。【０２２４】
アッセイ方法としては、実施例1等で使用したmiR199aのルシフェラーゼレポーターアッセイと同様の手法を用いた。【０２２５】
以下に、本実施例で使用した配列におけるＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）の数およびStem長の関係を示す。【０２２６】
【表１】
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【０２２７】
（結果）
結果を図３５−１および図３５−２に示す。STEM領域を8bp以下にすると活性が5分の1以下に減少した。ただし6bpでも濃度依存的に活性上昇がみられることから、STEM領域は10bp以上あった方が望ましく、また図32の結果と合わせて考えるとSTEM長10bp以下の場合はBNA置換が望ましいことが確認された。【０２２８】
（実施例９:STEM領域の短鎖化と架橋型核酸置換の活性相関試験
本実施例では、STEM領域短鎖化と架橋型核酸置換の組み合わせを、オリジナルのS-TuD（STEM  I18bp  STEM  II  10bp）とオリジナルのS-TuDにSTEM  I及びIIそれぞれにBNA置換したS-TuDを比較して総合的に評価した。
使用した配列の構造は図36に示す。アッセイ方法としては実施例1等において示したmiR199aのルシフェラーゼレポーターアッセイと同様の手法を用いた。【０２２９】
（結果）
結果を図３７−１および図３７−２に示す。S-TuDのmiRNA阻害活性は、オリジナルを１とすると、オリジナルのS-TuDにSTEM  I及びIIそれぞれにBNA置換したS-TuDが３倍以上、STEM  Iを10bpに短鎖化してＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）置換したS-TuDが約３倍の活性向上となった。このことによりSTEMの2本鎖形成を強固にすることがS-TuDのmiRNA阻害活性に大きな役割を果たすことが示された。【０２３０】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。【０２３１】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は2015年9月18日に出願された日本国出願特願2015-185365号に対して優先権主張をするものであり、その内容は、その全体が本願において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０２３２】
本発明は核酸医薬等を用いる製薬産業および試薬産業において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０２３３】
配列番号１：図２Aのオリジナルセンス配列（図４−１も同じ）
配列番号２：図２Aのオリジナルアンチセンス配列
配列番号３：図２A（１）のセンス配列
配列番号４：図２A（１）のアンチセンス配列
配列番号５：図２A（２）のセンス配列
配列番号６：図２A（２）のアンチセンス配列
配列番号７：図２A（３）のセンス配列
配列番号８：図２A（３）のアンチセンス配列
配列番号９：図２A（４）のセンス配列
配列番号１０：図２A（４）のアンチセンス配列
配列番号１１：図２A（５）のセンス配列
配列番号１２：図２A（５）のアンチセンス配列
配列番号１３：図６(16)のセンス配列
配列番号１４：図６(16)のアンチセンス配列
配列番号１５：図６(22)のセンス配列
配列番号１６：図６(22)のアンチセンス配列
配列番号１７：図６(23)のセンス配列
配列番号１８：図６(23)のアンチセンス配列
配列番号１９：図６(24)のセンス配列
配列番号２０：図６(24)のアンチセンス配列
配列番号２１：図７(17)のセンス配列
配列番号２２：図７(17)のアンチセンス配列
配列番号２３：図７(18)のセンス配列
配列番号２４：図７(18)のアンチセンス配列
配列番号２５：図７(23)-(1)のセンス配列
配列番号２６：図７(23)-(1)のアンチセンス配列
配列番号２７：図７(23)-(2)のセンス配列
配列番号２８：図７(23)-(2)のアンチセンス配列
配列番号２９：図７(23)-(3)のセンス配列
配列番号３０：図７(23)-(3)のアンチセンス配列
配列番号３１：図１０(1)’のセンス配列
配列番号３２：図１０(1)’のアンチセンス配列
配列番号３３：図１０(6)’のセンス配列
配列番号３４：図１０(6)’のアンチセンス配列
配列番号３５：図１２(23)のセンス配列
配列番号３６：図１２(23)のアンチセンス配列
配列番号３７：図１９(41)のセンス配列
配列番号３８：図１９(41)のアンチセンス配列
配列番号３９：図１９(42)のセンス配列
配列番号４０：図１９(42)のアンチセンス配列
配列番号４１：図１９(43)のセンス配列
配列番号４２：図１９(43)のアンチセンス配列
配列番号４３：図１９(44)のセンス配列
配列番号４４：図１９(44)のアンチセンス配列
配列番号４５：図１９(45)のセンス配列
配列番号４６：図１９(45)のアンチセンス配列
配列番号４７：図２３(51)のセンス配列
配列番号４８：図２３(51)のアンチセンス配列
配列番号４９：図２３(52)のセンス配列
配列番号５０：図２３(52)のアンチセンス配列
配列番号５１：図２３(53)のセンス配列
配列番号５２：図２３(53)のアンチセンス配列
配列番号５３：図２３(54)のセンス配列
配列番号５４：図２３(54)のアンチセンス配列
配列番号５５：図２３(55)のセンス配列
配列番号５６：図２３(55)のアンチセンス配列
配列番号５７：S-TuD  NC2（図１８、図２２）のセンス配列
配列番号５８：S-TuD  NC2（図１８、図２２）のアンチセンス配列
配列番号５９：図３２（２）’のセンス配列
配列番号６０：図３２（２）’のアンチセンス配列
配列番号６１：図３２（７）’のセンス配列
配列番号６２：図３２（７）’のアンチセンス配列
配列番号６３：図３２（８）’のセンス配列
配列番号６４：図３２（８）’のアンチセンス配列
配列番号６５：図３４（１）”のセンス配列
配列番号６６：図３４（１）”のアンチセンス配列
配列番号６７：図３４（２）”のセンス配列
配列番号６８：図３４（２）”のアンチセンス配列
配列番号６９：図３４（３）”のセンス配列
配列番号７０：図３４（３）”のアンチセンス配列
配列番号７１：図３４（４）”のセンス配列
配列番号７２：図３４（４）”のアンチセンス配列
配列番号７３：図３４（５）”のセンス配列
配列番号７４：図３４（５）”のアンチセンス配列
配列番号７５：図１７のpsiCHECK2-T200c-3p-s（センス配列）
配列番号７６：図１７のpsiCHECK2-T200c-3p-a（アンチセンス配列）
配列番号７７：図１７のpsiCHECK2-T199a-3px3-s（センス配列）
配列番号７８：図１７のpsiCHECK2-T199a-3px3-a（アンチセンス配列）
配列番号７９：図１７のpsiCHECK2-T21-5p-s（センス配列）
配列番号８０：図１７のpsiCHECK2-T21-5p-a（アンチセンス配列）
【図１Ａ】
2017047097.tif 000029
【図１Ｂ】
2017047097.tif 000030
【図２Ａ】
2017047097.tif 000031
【図２Ｂ】
2017047097.tif 000032
【図３】
2017047097.tif 000033
【図４−１】
2017047097.tif 000034
【図４−２】
2017047097.tif 000035
【図５】
2017047097.tif 000036
【図６】
2017047097.tif 000037
【図７】
2017047097.tif 000038
【図８−１】
2017047097.tif 000039
【図８−２】
2017047097.tif 000040
【図９】
2017047097.tif 000041
【図１０】
2017047097.tif 000042
【図１１−１】
2017047097.tif 000043
【図１１−２】
2017047097.tif 000044
【図１２】
2017047097.tif 000045
【図１３】
2017047097.tif 000046
【図１４】
2017047097.tif 000047
【図１５】
2017047097.tif 000048
【図１６】
2017047097.tif 000049
【図１７】
2017047097.tif 000050
【図１８】
2017047097.tif 000051
【図１９】
2017047097.tif 000052
【図２０】
2017047097.tif 000053
【図２１−１】
2017047097.tif 000054
【図２１−２】
2017047097.tif 000055
【図２２】
2017047097.tif 000056
【図２３】
2017047097.tif 000057
【図２４】
2017047097.tif 000058
【図２５−１】
2017047097.tif 000059
【図２５−２】
2017047097.tif 000060
【図２６】
2017047097.tif 000061
【図２７】
2017047097.tif 000062
【図２８】
2017047097.tif 000063
【図２９】
2017047097.tif 000064
【図３０】
2017047097.tif 000065
【図３１】
2017047097.tif 000066
【図３２】
2017047097.tif 000067
【図３３−１】
2017047097.tif 000068
【図３３−２】
2017047097.tif 000069
【図３４】
2017047097.tif 000070
【図３５−１】
2017047097.tif 000071
【図３５−２】
2017047097.tif 000072
【図３６】
2017047097.tif 000073
【図３７−１】
2017047097.tif 000074
【図３７−２】
2017047097.tif 000075
【図３８】
2017047097.tif 000076
【図３９−１】
2017047097.tif 000077
【図３９−２】
2017047097.tif 000078
【図４０】
2017047097.tif 000079
【配列表】
2017047097000001.app
【国際調査報告】
2017047097.tif 000080
2017047097.tif 000081
2017047097.tif 000082
2017047097.tif 000083