(57)【要約】本発明は、単子葉植物細胞の有する二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含み、該二本鎖DNAと該複合体との接触が、該単子葉植物細胞への該複合体をコードする核酸の導入により行われる、方法を提供する。さらに、当該方法に使用するための、単子葉植物細胞の有する二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単子葉植物細胞の有する二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含み、該二本鎖DNAと該複合体との接触が、該単子葉植物細胞に該複合体をコードする核酸を導入し、該単子葉植物細胞を培養して該複合体を細胞内で発現させることにより行われる、方法。
【請求項２】
前記培養工程の少なくとも一部が、該単子葉植物細胞の至適培養温度よりも低温で行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
前記核酸配列認識モジュールが、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の反対鎖の切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
標的化された部位の１以上のヌクレオチドを欠失させる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記デアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記シチジンデアミナーゼがヤツメウナギ由来のPmCDA1である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
核酸配列認識モジュール及び核酸塩基変換酵素をコードする核酸配列が、被子植物もしくは単子葉植物のコドン使用に最適化されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
核酸配列認識モジュール及び核酸塩基変換酵素の両末端に核移行シグナルが付加されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
単子葉植物が、イネ、コムギ、又はトウモロコシである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
単子葉植物がイネである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
単子葉植物細胞の有する二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体であって、標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する、該単子葉植物細胞で機能する核酸改変酵素複合体。
【請求項１５】
核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムであり、核酸塩基変換酵素がシチジンデアミナーゼである、請求項１４記載の核酸改変酵素複合体。
【請求項１６】
核酸配列認識モジュール及び核酸塩基変換酵素の両末端に核移行シグナルが付加されている、請求項１４又は請求項１５記載の核酸改変酵素複合体。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の核酸改変酵素複合体をコードする核酸。
【請求項１８】
核酸配列認識モジュール及び核酸塩基変換酵素をコードする核酸配列が、被子植物もしくは単子葉植物のコドン使用に最適化されている、請求項１７記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNAの二重鎖切断を伴わずに（無切断もしくは一本鎖切断で）、単子葉植物ゲノムの特定領域内の核酸塩基の改変を可能とする、ゲノム配列の改変方法、及びそれに用いる核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素との複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
単子葉植物とは、被子植物のうち、1枚の子葉を持つことで特徴づけられる植物の一群であり、イネ、コムギ、トウモロコシの三大穀物はこれに分類される。そのため、単子葉植物の分子育種は従来よりさかんに研究されてきたが、単子葉植物はアグロバクテリウムの宿主でないため、植物の形質転換法として最も一般的なアグロバクテリウム法が長らく利用できず、直接導入法が用いられてきた。1990年代半ばになって、細胞分裂の盛んな細胞にアグロバクテリウムを感染させることにより、効率よくイネを形質転換できることが報告されて以来、遺伝子導入による単子葉植物の分子育種は大きく進展した。【０００３】
一方、近年、様々な生物種において目的の遺伝子・ゲノム領域を改変する技術として、ゲノム編集が注目されている。従来、ゲノム編集の手法としては、配列非依存的なDNA切断能を有する分子と配列認識能を有する分子とを組み合わせた人工ヌクレアーゼを利用する方法が提案されている（非特許文献１）。
例えば、ジンクフィンガーDNA結合ドメインと非特異的なDNA切断ドメインとを連結した、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を用い、宿主の植物細胞または昆虫細胞にDNA中の標的遺伝子座において組換えを行う方法（特許文献１）、植物病原菌キサントモナス属が有するDNA結合モジュールである転写活性化因子様（TAL）エフェクターと、DNAエンドヌクレアーゼとを連結したTALENを用いて、特定のヌクレオチド配列内又はそれに隣接する部位で、標的遺伝子を切断・修飾する方法（特許文献２）、あるいは、真正細菌や古細菌が持つ獲得免疫システムで機能するDNA配列CRISPR（Clustered Regularly interspaced short palindromic repeats）と、CRISPRとともに重要な働きを持つヌクレアーゼCas（CRISPR-associated）タンパク質ファミリーとを組み合わせたCRISPR-Cas9システムを利用する方法（特許文献３）などが報告されている。また最近、CRISPR-Casシステムの新たなエンドヌクレアーゼとしてCpf1が報告された（非特許文献２）。さらには、35個のアミノ酸からなり1個の核酸塩基を認識するPPRモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されたPPRタンパク質と、ヌクレアーゼとを連結した人工ヌクレアーゼを用い、該特定配列の近傍で標的遺伝子を切断する方法（特許文献４）も報告されている。【０００４】
しかし、これらのゲノム編集技術は、基本的にヌクレアーゼによるDNA二重鎖切断（double-stranded DNA breaks : DSB）を前提としているが、DSBは想定外のゲノム改変を伴うため、強い細胞毒性や染色体の転位などの副作用があり、生存細胞数が極めて少なかったり、細胞種によっては、そもそも遺伝子改変自体が困難であるといった課題があった。【０００５】
上記の課題に対し、本発明者らは、脱アミノ化反応を触媒するデアミナーゼを用い、これとDNA配列認識能のある分子とを連結させた複合体を宿主細胞に導入することにより、酵母や大腸菌を含む種々の生物種において、DSBを伴うことなく、特定のDNA配列を含む領域における核酸塩基変換によるゲノム配列の改変に成功したことを報告している（特許文献５）。【０００６】
しかし、単子葉植物のような高等植物にこの方法を適用する場合、変異導入効率をさらに向上させるために、導入する分子複合体の構成や導入後の植物細胞の培養条件等をより好適化することが望まれる。また、酵母や原核生物では、デアミナーゼの使用から予測されるとおり変異様式は主として塩基置換であり、挿入／欠失変異の頻度は低いことから、異なる様式の変異が効率よく導入される技術の開発も望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第4968498号公報
【特許文献２】特表2013-513389号公報
【特許文献３】特表2010-519929号公報
【特許文献４】特開2013-128413号公報
【特許文献５】国際公開第2015/133554号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kelvin M Esvelt, Harris H Wang (2013) Genome-scale engineering for systems and synthetic biology, Molecular Systems Biology 9: 641
【非特許文献２】Bernd Zetsche et al. (2015) Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System, Cell 163: 759-771
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の第１の目的は、DSBを伴わずに、即ち、二本鎖DNAを無切断もしくは一本鎖切断により、単子葉植物のゲノム遺伝子の特定配列の核酸塩基を効率よく改変し得る、新規なゲノム編集の手法、並びにそのために使用される、より好適化された核酸配列認識モジュール及び核酸塩基変換酵素の複合体を提供することである。また、本発明の第２の目的は、デアミナーゼを用いたDSBを伴わないゲノム編集において、塩基置換とは異なる様式で効率よく宿主細胞に変異を導入し得る手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記第１の目的を達成すべく、まず、人工ヌクレアーゼとしてのCRISPR/Cas9システムについてイネ用に最適化されたターゲッティングベクターpZH_OsU6gRNA_MMCas9（Plant Mol Biol (2015) 88:561-572）と、デアミナーゼとを組み合わせた（図１Ｂ参照）。即ち、上記ターゲッティングベクター中のイネのコドン使用に最適化されたCas9コード配列（OsCas9）に、標的DNAの両方もしくは一方の鎖の切断能を失活させる変異を導入するとともに、該コード配列に、植物のコドン使用に最適化されたシチジンデアミナーゼコード配列（AtPmCDA）を融合させた。さらに、植物細胞は酵母などに比べて細胞サイズが大きいため、細胞質で合成されたCas9/デアミナーゼ融合タンパク質の核への移行効率が低下するのではないかとの仮説の下、Cas9の上流だけでなく、デアミナーゼの両末端にもそれぞれ核移行シグナル（NLS）を付加した。この改良型ベクターをイネカルスに導入した結果、標的ヌクレオチド配列内の目的の塩基を首尾よく他の塩基に置換することができた。さらに、驚くべきことに、標的DNAの一方の鎖の切断能を失活させた（ニッカーゼ活性を有する）Cas9（D10A）を用いた場合、デアミナーゼにより脱アミノ化される塩基を中心とした領域における欠失変異が主として生じることが明らかとなった。
また、本発明者らは、変異導入株の選抜工程において、通常使用される培養温度よりも低温で、遺伝子導入されたイネカルスを培養したところ、変異導入効率をさらに向上させることに成功した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］単子葉植物細胞の有する二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する工程を含み、該二本鎖DNAと該複合体との接触が、該単子葉植物細胞に該複合体をコードする核酸を導入し、該単子葉植物細胞を培養して該複合体を細胞内で発現させることにより行われる、方法。
［２］前記培養工程の少なくとも一部が、該単子葉植物細胞の至適培養温度よりも低温で行われることを特徴とする、上記［１］記載の方法。
［３］前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、上記［１］又は［２］記載の方法。
［４］前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、上記［１］又は［２］記載の方法。
［５］前記核酸配列認識モジュールが、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の反対鎖の切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、上記［４］記載の方法。
［６］標的化された部位の１以上のヌクレオチドを欠失させる、上記［５］記載の方法。
［７］前記核酸塩基変換酵素がデアミナーゼである、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記デアミナーゼがシチジンデアミナーゼである、上記［７］記載の方法。
［９］前記シチジンデアミナーゼがヤツメウナギ由来のPmCDA1である、上記［８］記載の方法。
［１０］核酸配列認識モジュール及び核酸塩基変換酵素をコードする核酸配列が、被子植物もしくは単子葉植物のコドン使用に最適化されている、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］核酸配列認識モジュール及び核酸塩基変換酵素の両末端に核移行シグナルが付加されている、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］単子葉植物が、イネ、コムギ、又はトウモロコシである、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］単子葉植物がイネである、上記［１２］記載の方法。
［１４］単子葉植物細胞の有する二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体であって、標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に１以上のヌクレオチドを挿入する、該単子葉植物細胞で機能する核酸改変酵素複合体。
［１５］核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムであり、核酸塩基変換酵素がシチジンデアミナーゼである、上記［１４］記載の核酸改変酵素複合体。
［１６］核酸配列認識モジュール及び核酸塩基変換酵素の両末端に核移行シグナルが付加されている、上記［１４］又は［１５］記載の核酸改変酵素複合体。
［１７］上記［１４］〜「１６」のいずれかに記載の核酸改変酵素複合体をコードする核酸。
［１８］核酸配列認識モジュール及び核酸塩基変換酵素をコードする核酸配列が、被子植物もしくは単子葉植物のコドン使用に最適化されている、上記［１７］記載の核酸。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のゲノム編集技術によれば、DNA二重鎖切断を伴わないため、安全性に優れており、かつ高い変異導入効率で単子葉植物の遺伝子改変が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例で使用したベクタープラスミドの構造を模式的に示した図である。Ａ：Target-AID評価用ベクター。B:Target-AIDベクター。
【図２】2種のTarget-AID評価用ベクターを導入したイネカルスにおけるEGFPの発現を示す図である。
【図３】pRIT3-mEGFPと2409とを導入して得られた二重形質転換体のPCR解析により、mEGFP及びhpt遺伝子の組込みを確認した結果を示す図である。
【図４】pRIT3-mEGFPと2409とを導入して得られた二重形質転換クローンNo. 6におけるEGFP発現を示す図である。
【図５】pRIT3-mEGFPと2409とを導入して得られた二重形質転換クローンNo. 3におけるEGFP発現を示す図である。
【図６】pRIT3-mEGFPと2409とを導入して得られた2種の二重形質転換クローン（Ａ及びＢ）における標的ヌクレオチド配列近傍のシークエンス解析結果を示す図である。
【図７】pRIT3-mEGFPと2409とを導入して得られた二重形質転換クローンNo. 39における標的ヌクレオチド配列近傍のシークエンス解析結果を示す図である。
【図８】pRIT3-mEGFPと2408とを導入して得られた二重形質転換クローンNo. 1における標的ヌクレオチド配列近傍のシークエンス解析結果を示す図である。
【図９】pRIT3-mEGFPと2408とを導入して得られた二重形質転換クローンNo. 2における標的ヌクレオチド配列近傍のシークエンス解析結果を示す図である。
【図１０】pRIT3-mEGFPと2408とを導入して得られた二重形質転換クローンNo. 4における標的ヌクレオチド配列近傍のシークエンス解析結果を示す図である。
【図１１】pRIT3-mEGFPと2408とを導入して得られた二重形質転換クローンNo. 1のサブクローンNo. 1D（GFPシグナル陰性）における標的ヌクレオチド配列近傍のシークエンス解析結果を示す図である。
【図１２】イネカルスに対するImazamoxの有効濃度評価の結果を示す図である。上段はImazamox添加培地へイネカルスを置床した当日、下段は28日間培養後の写真である。
【図１３】Imazamox耐性付与試験に用いた、野生型ALS及び変異型ALS A96Vの発現ベクターの模式図である。
【図１４】Target-AIDによるイネALS A96V改変の標的配列を示す図である。
【図１５】Target-AIDによるイネALS遺伝子の改変を示す図である。
【図１６】Target-AIDによるイネALS A96V改変カルスから再分化したT0植物体の写真である。
【図１７】Target-AIDによるイネALS A96V改変カルスから再分化したT0植物体が、元のカルストと同じALS遺伝子改変を保持していることを示す図である。
【図１８】Target-AIDによる複数遺伝子の同時改変を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、単子葉植物細胞内の改変しようとする二本鎖DNAを切断することなく、該二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列及びその近傍のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換等することにより、該二本鎖DNAの該標的化された部位を改変する方法（以下、「本発明の方法」ともいう）を提供する。当該方法は、該二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とが結合した複合体を、宿主単子葉植物細胞内で該二本鎖DNAと接触させることにより、該標的化された部位、即ち、標的ヌクレオチド配列及びその近傍のヌクレオチドを、他のヌクレオチドに変換等する工程を含むことを特徴とする。
【００１５】
本発明の方法に用いることのできる単子葉植物は特に制限はないが、例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ等の穀物類や、ユリ等の園芸植物であり、より好ましくはイネ、コムギ、トウモロコシであり、特に好ましくはイネである。
【００１６】
本発明において、二本鎖DNAの「改変」とは、DNA鎖上のあるヌクレオチド（例えば、dC）が、他のヌクレオチド（例えば、dT、dA又はdG）に変換されるか、欠失すること、あるいはDNA鎖上のあるヌクレオチド間にヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列が挿入されることを意味する。ここで、改変される二本鎖DNAは、宿主細胞内に存在する二本鎖DNAであれば特に制限されないが、好ましくはゲノムDNA、特に核ゲノムDNAである。また、二本鎖DNAの「標的化された部位」とは、核酸配列認識モジュールが特異的に認識して結合する「標的ヌクレオチド配列」の全部もしくは一部、又はそれと該標的ヌクレオチド配列の近傍（5’上流及び3’下流のいずれか一方又は両方）を意味する。また、「標的ヌクレオチド配列」とは、二本鎖DNA中の核酸配列認識モジュールが結合する配列を意味する。
【００１７】
本発明において「核酸配列認識モジュール」とは、DNA鎖上の特定のヌクレオチド配列（即ち、標的ヌクレオチド配列）を特異的に認識して結合する能力を有する分子又は分子複合体を意味する。核酸配列認識モジュールが標的ヌクレオチド配列に結合することにより、該モジュールに連結された核酸塩基変換酵素が二本鎖DNAの標的化された部位に特異的に作用することを可能にする。
【００１８】
本発明において「核酸塩基変換酵素」とは、DNA塩基のプリン又はピリミジン環上の置換基を他の基又は原子に変換する反応を触媒することにより、DNA鎖を切断することなく、標的のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換し得る酵素を意味する。
【００１９】
本発明において「核酸改変酵素複合体」とは、上記核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とが連結された複合体を含んでなる、特定のヌクレオチド配列認識能が付与された核酸塩基変換酵素活性を有する分子複合体を意味する。ここで「複合体」は複数の分子で構成されるものだけでなく、融合タンパク質のように、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とを単一の分子内に有するものも包含される。
【００２０】
本発明の方法に用いられる核酸塩基変換酵素は、上記反応を触媒し得るものであれば特に制限はなく、例えば、アミノ基をカルボニル基に変換する脱アミノ化反応を触媒する、核酸／ヌクレオチドデアミナーゼスーパーファミリーに属するデアミナーゼが挙げられる。好ましくは、シトシン又は5-メチルシトシンをそれぞれウラシル又はチミンに変換し得るシチジンデアミナーゼ、アデニンをヒポキサンチンに変換し得るアデノシンデアミナーゼ、グアニンをキサンチンに変換し得るグアノシンデアミナーゼ等が挙げられる。シチジンデアミナーゼとして、より好ましくは、脊椎動物の獲得免疫においてイムノグロブリン遺伝子に変異を導入する酵素である活性化誘導シチジンデアミナーゼ（以下、AIDともいう）などが挙げられる。
【００２１】
核酸塩基変換酵素の由来は特に制限されないが、例えば、シチジンデアミナーゼであれば、ヤツメウナギ由来のPmCDA1（Petromyzon marinus cytosine deaminase 1）、脊椎動物（例、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、チンパンジー等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、アフリカツメガエル等の両生類、ゼブラフィッシュ、アユ、ブチナマズ等の魚類など）由来のAID（Activation-induced cytidine deaminase; AICDA）を用いることができる。
【００２２】
本発明の核酸改変酵素複合体の核酸配列認識モジュールにより認識される、二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列は、該モジュールが特異的に結合し得る限り特に制限されず、二本鎖DNA中の任意の配列であってよい。標的ヌクレオチド配列の長さは、核酸配列認識モジュールが特異的に結合するのに十分であればよく、単子葉植物のゲノムサイズに応じて、例えば12ヌクレオチド以上、好ましくは15ヌクレオチド以上、より好ましくは18ヌクレオチド以上である。長さの上限は特に制限されないが、好ましくは25ヌクレオチド以下、より好ましくは22ヌクレオチド以下である。
【００２３】
本発明の核酸改変酵素複合体の核酸配列認識モジュールとしては、例えば、Casの少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム（CRISPR-変異Cas）、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフ等の他、制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等のDNAと特異的に結合し得るタンパク質のDNA結合ドメインを含み、DNA二重鎖切断能を有しないフラグメント等が用いられ得るが、これらに限定されない。好ましくは、CRISPR-変異Cas、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター、PPRモチーフ等が挙げられる。
【００２４】
ジンクフィンガーモチーフは、Cys2His2型の異なるジンクフィンガーユニット（1フィンガーが約3塩基を認識する）を3〜6個連結させたものであり、9〜18塩基の標的ヌクレオチド配列を認識することができる。ジンクフィンガーモチーフは、Modular assembly法（Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141）、OPEN法（Mol Cell (2008) 31: 294-301）、CoDA法（Nat Methods (2011) 8: 67-69）、大腸菌one-hybrid法（Nat Biotechnol (2008) 26:695-701）等の公知の手法により作製することができる。ジンクフィンガーモチーフの作製の詳細については、上記特許文献１を参照することができる。
【００２５】
TALエフェクターは、約34アミノ酸を単位としたモジュールの繰り返し構造を有しており、1つのモジュールの12および13番目のアミノ酸残基（RVDと呼ばれる）によって、結合安定性と塩基特異性が決定される。各モジュールは独立性が高いので、モジュールを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なTALエフェクターを作製することが可能である。TALエフェクターは、オープンリソースを利用した作製方法（REAL法(Curr Protoc Mol Biol (2012) Chapter 12: Unit 12.15)、FLASH法(Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465)、Golden Gate法(Nucleic Acids Res (2011) 39： e82)等）が確立されており、比較的簡便に標的ヌクレオチド配列に対するTALエフェクターを設計することができる。TALエフェクターの作製の詳細については、上記特許文献２を参照することができる。
【００２６】
PPRモチーフは、35アミノ酸からなり1つの核酸塩基を認識するPPRモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されており、各モチーフの1、4及びii（-2）番目のアミノ酸のみで標的塩基を認識する。モチーフ構成に依存性はなく、両脇のモチーフからの干渉はないので、TALエフェクター同様、PPRモチーフを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なPPRタンパク質を作製することが可能である。PPRモチーフの作製の詳細については、上記特許文献４を参照することができる。
【００２７】
また、制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等のフラグメントを用いる場合、これらのタンパク質のDNA結合ドメインは周知であるので、該ドメインを含み、且つDNA二重鎖切断能を有しない断片を容易に設計し、構築することができる。
【００２８】
上記いずれかの核酸配列認識モジュールは、上記核酸塩基変換酵素との融合タンパク質として提供することもできるし、あるいは、SH3ドメイン、PDZドメイン、GKドメイン、GBドメイン等のタンパク質結合ドメインとそれらの結合パートナーとを、核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とにそれぞれ融合させ、該ドメインとその結合パートナーとの相互作用を介してタンパク質複合体として提供してもよい。あるいは、核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とにそれぞれインテイン（intein）を融合させ、各タンパク質合成後のライゲーションにより、両者を連結することもできる。
【００２９】
核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とが結合した複合体（融合タンパク質を含む）を含んでなる本発明の核酸改変酵素複合体と、二本鎖DNAとの接触は、目的の二本鎖DNA（例、核ゲノムDNA）を有する単子葉植物細胞に、該複合体をコードする核酸を導入することにより実施される。
従って、核酸配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素とは、それらの融合タンパク質をコードする核酸として、あるいは、結合ドメインやインテイン等を利用してタンパク質に翻訳後、宿主細胞内で複合体を形成し得るような形態で、それらをそれぞれコードする核酸として調製される。ここで核酸は、DNAであってもRNAであってもよいが、好ましくはDNAである。DNAの場合は、好ましくは二本鎖DNAであり、宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に配置した発現ベクターの形態で提供される。
核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とが結合した本発明の複合体は、DNA二重鎖切断（DSB）を伴わないため、毒性の低いゲノム編集が可能であり、本発明の遺伝子改変方法は、広く単子葉植物全般に適用することができる。
【００３０】
ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター、PPRモチーフ等の核酸配列認識モジュールをコードするDNAは、各モジュールについて上記したいずれかの方法により取得することができる。制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等の配列認識モジュールをコードするDNAは、例えば、それらのcDNA配列情報に基づいて、当該タンパク質の所望の部分（DNA結合ドメインを含む部分）をコードする領域をカバーするようにオリゴDNAプライマーを合成し、当該タンパク質を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。
核酸塩基変換酵素をコードするDNAも、同様に、使用する酵素のcDNA配列情報をもとにオリゴDNAプライマーを合成し、当該酵素を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。例えば、ヤツメウナギのPmCDA1をコードするDNAは、NCBIデータベースに登録されているcDNA配列（accession No. EF094822）をもとに、CDSの上流及び下流に対して適当なプライマーを設計し、ヤツメウナギ由来mRNAからRT-PCR法によりクローニングできる。また、ヒトAIDをコードするDNAは、NCBIデータベースに登録されているcDNA配列（accession No. AB040431）をもとに、CDSの上流及び下流に対して適当なプライマーを設計し、例えばヒトリンパ節由来mRNAからRT-PCR法によりクローニングできる。他の脊椎動物由来のAIDホモログも、公知のcDNA配列情報（例えば、ブタ（accession No. CU582981）、ウシ（accession No. NM_110138682）、イヌ（accession No. NM_001003380）、チンパンジー（accession No. NM_001071809）、ニワトリ（accession No. NM_001243222）、アフリカツメガエル（accession No. NM_001095712）、ゼブラフィッシュ（accession No. AAI62573）、アユ（accession No. AB619797）、ブチナマズ（accession No. NM_001200185）等）をもとに、上記と同様にしてクローニングすることができる。
クローン化されたDNAは、そのまま、または所望により制限酵素で消化するか、適当なリンカー及び/又は核移行シグナル（目的の二本鎖DNAがミトコンドリアや葉緑体DNAの場合は、各オルガネラ移行シグナル）を付加した後に、核酸配列認識モジュールをコードするDNAとライゲーションして、融合タンパク質をコードするDNAを調製することができる。好ましい実施態様においては、核酸配列認識モジュールをコードするDNAと、核酸塩基変換酵素をコードするDNAの双方の両末端に核移行シグナル等のオルガネラ移行シグナルをコードするDNA配列が付加されることが望ましい。単子葉植物細胞は酵母細胞に比べてサイズが大きいため、タンパク質が合成される細胞質と核との距離が大きくなる。そのため、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素との複合体のような分子量の大きなタンパク質分子を核に効率よく輸送するには、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素の双方に核移行シグナルが付加されていることが好ましい。核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とを融合タンパク質として発現させる場合、融合タンパク質の両末端と、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素との間に核移行シグナルを付加することができる。核移行シグナルとしては、単子葉植物で機能するものであれば特に制限はないが、例えばSV40由来の核移行シグナル(PKKKRKV; 配列番号６)が挙げられる。
あるいは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAと、核酸塩基変換酵素をコードするDNAに、それぞれ結合ドメインもしくはその結合パートナーをコードするDNAを融合させるか、両DNAに分離インテインをコードするDNAを融合させることにより、核酸配列認識変換モジュールと核酸塩基変換酵素とが宿主細胞内で翻訳された後に複合体を形成できるようにしてもよい。これらの場合も、所望により一方もしくは両方のDNAの適当な位置に、リンカー及び/又は核移行シグナルを連結することができる。
【００３１】
核酸配列認識モジュールをコードするDNA、核酸塩基変換酵素をコードするDNAは、化学的にDNA鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴDNA短鎖を、PCR法やGibson Assembly法を利用して接続することにより、その全長をコードするDNAを構築することも可能である。化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで全長DNAを構築することの利点は、該DNAを導入する宿主に合わせて使用コドンをCDS全長にわたり設計できる点にある。異種DNAの発現に際し、そのDNA配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに変換することで、タンパク質発現量の増大が期待できる。使用する宿主におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（公財）かずさDNA研究所のホームページに公開されている遺伝暗号使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html）を用いることができ、または各宿主におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよい。入手したデータと導入しようとするDNA配列を参照し、該DNA配列に用いられているコドンの中で宿主において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに変換すればよい。例えば、宿主細胞がイネ細胞の場合、イネ等の単子葉植物、あるいはシロイヌナズナ等の被子植物一般のコドン使用に最適化された核酸配列認識モジュール及び／又は核酸塩基変換酵素コード配列を使用することができる。例えば、被子植物での発現に適したコドン使用を有するPmCDA1 DNAとして、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するDNAが挙げられる。
【００３２】
核酸配列認識モジュール及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、該DNAを、単子葉植物細胞で機能し得るプロモーターを含むベクター中の該プロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
単子葉植物細胞で複製可能なベクターとしては、単子葉植物細胞で機能する複製起点（例、Tiプラスミド、Riプラスミドのori等）を有するものであれば特に制限はないが、大腸菌の複製起点（例、ColE1 ori等）も有していることが好ましい。遺伝子導入法としてアグロバクテリウム法を用いる場合、Tiプラスミド、Riプラスミドの病原性遺伝子を除いたT-DNA断片（境界配列RB及びLBを含む）をさらに含む必要があり、例えば、pBIN193由来のpBI101、pBI121（クロンテック）やこれをバックボーンとする改良型ベクター（例、pRI909、pRI910、pRI101、pRI201（タカラバイオ）等）が挙げられるが、これらに限定されない。
プロモーターとしては、単子葉植物細胞で機能し得るプロモーターであればいかなるものでもよい。DSBを伴う従来法では毒性のために宿主細胞の生存率が著しく低下する場合があるので、誘導プロモーター（例、傷害、サリチル酸処理で誘導されるPR1α遺伝子プロモーター、乾燥、低温、アブシジン酸処理で誘導されるrd29A遺伝子プロモーター、ジクロロミド処理で誘導されるGST-27遺伝子プロモーター等）を使用して誘導開始までに細胞数を増やしておくことが望ましいが、本発明の核酸改変酵素複合体を発現させても十分な細胞増殖が得られるので、構成プロモーターも制限なく使用することができる。構成プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sプロモーター、CaMV19Sプロモーター、ノパリン合成酵素（NOS）プロモーター、パセリ由来ユビキチンプロモーター（Pcubi4-2）等が挙げられる。これらのプロモーター又はその断片をタンデムに繋げたもの（例、2x35S）を用いることもできる。
【００３３】
発現ベクターは、所望によりターミネーター（例、NOSターミネーター、エンドウrbcS3Aターミネーター、熱ショックタンパク質（HSP）17.3ターミネーター等）、翻訳エンハンサー（例、イネ由来アルコールデヒドロゲナーゼ5’非翻訳領域（Os ADH-5’UTR）、CaMVやタバコモザイクウイルス（TMV）由来Ω配列等）、3’調節領域（例、イネ由来アクチン遺伝子（Act1）3’UTR等）、ポリA付加シグナル、薬剤耐性遺伝子（例、G418耐性遺伝子（nPtII）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（hpt）等）の選択マーカーなどを含有することができる。
【００３４】
核酸配列認識モジュール及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするRNAは、例えば、上記した核酸配列認識モジュール及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNAをコードするベクターを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてmRNAに転写することにより調製することができる。
【００３５】
核酸配列認識モジュール及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNAを含む発現ベクターを宿主単子葉植物細胞に導入し、当該宿主細胞を培養することによって、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素との複合体を細胞内で発現させることができる。
【００３６】
宿主となる単子葉植物細胞としては、例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ等の穀物、ユリ等の花卉園芸植物などから調製した懸濁培養細胞、カルス、プロトプラスト、葉切片、根切片、種子（未熟胚等）などが用いられる。
【００３７】
単子葉植物細胞は、半数体（一倍体）であってもよいし、倍数体（例、二倍体、三倍体、四倍体など）であってもよい。従来の変異導入手法では、原則として相同染色体の一本にのみしか変異が導入されず、ヘテロな遺伝子型になるため、優性変異でなければ所望の形質は発現せず、ホモ化するには手間と時間がかかり、不都合が多かった。これに対し、本発明によれば、ゲノム内の相同染色体上の対立遺伝子すべてに変異を導入することができる可能性があるので、劣性変異であっても当代で所望の形質を発現させることができ、従来法の問題点を克服し得る。
【００３８】
発現ベクターの導入は、単子葉植物の種類に応じ、適当な組織（例、カルス、根、葉、種子、生長点等）に対し、公知の方法（例えば、アグロバクテリウム法、PEG法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等）に従って実施することができる。例えば、イネの場合、通常、アグロバクテリウム法、ウイスカー直接導入法等が用いられるが、これらに限定されない。例えば、アグロバクテリウム法の場合、イネ種子から常法に従ってカルスを誘導し、アグロバクテリウム発現用ベクターのT-DNA断片中に核酸配列認識モジュール及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNAの発現カセットを組み込んだものを導入したアグロバクテリウムに、該カルスを感染させ、3日後に除菌する。一方、ウイスカー直接導入法の場合、発現ベクターをポリオルニチンと混合して複合体とした後、チタン酸カリウム製ウイスカーとともに、イネカルスに添加して混合した後、超音波処理を行う。
コムギやトウモロコシの場合は、例えば、未熟種子から採取した未熟胚を植物材料として、同様にアグロバクテリウム法を用いて、発現ベクターを導入することができる。
PEG法やエレクトロポレーション法を用いる場合は、適当な細胞・組織から常法に従ってプロトプラストを調製し、これに発現ベクターを導入する。パーティクルガン法の場合は、カルスや、未熟胚、茎頂や腋芽に存在する生長点等に、金微粒子に吸着させた発現ベクターを、パーティクルガンを用いて導入することができる。
パーティクルガン法やアグロバクテリウム法では、遺伝子導入がキメラとなる場合が多いので、生殖系列（germ line）の細胞に高頻度に上記核酸が導入されるような試料細胞を、形質転換のために使用する必要がある。例えば、胚、胚軸切片、胚形成カルス（embryogenic callus）、単離した生長点等が挙げられる。
【００３９】
ベクターを導入した単子葉植物細胞の培養は、その種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。培養に使用される培地としては固形培地（例、寒天培地、アガロース培地、ゲランガム培地等）が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、などを含有することが好ましい。例えば、基礎培地としてN6培地、MS培地、LS培地、B5培地などが用いられる。培地には、適宜、植物生長物質（例、オーキシン類、サイトカイニン類等）などを添加してもよい。培地のpHは好ましくは約5〜約8である。培養温度は、単子葉植物細胞の種類に応じて、通常約20℃〜約35℃の範囲内で適宜選択することができる。例えば、イネカルスの場合、通常28〜33℃、好ましくは30〜33℃で培養することができる。
以上のようにして、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素との複合体、即ち核酸改変酵素複合体を細胞内で発現させることができる。
【００４０】
導入した核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とを安定に発現する形質転換体の選択は、導入された発現ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子（例、nptII、hpt等の薬剤耐性遺伝子）に対応する薬剤を添加した培地上で単子葉植物細胞を培養し、薬剤耐性コロニーを選抜することにより行うことができる。選択培養の期間は特に制限されないが、通常3-6週間程度で薬剤耐性コロニーが出現する。
目的とする変異導入が可視化できる場合、例えば、該変異導入により単子葉植物細胞に薬剤耐性が付与されたり、色素の産生能に変化が生じたりする場合には、選択マーカーを用いた一次スクリーニングを行うことなく、目的とする変異導入による形質の変化を指標として、該変異導入株を直接選択することもできる。
【００４１】
形質転換体は、その培養に適した自体公知の方法により継代培養することができる。例えば、上記形質転換体の選択培養に用いられたのと同様の方法を使用することができる。ここで、形質転換体を通常よりも低温（例えば、イネカルスの場合、20-26℃、好ましくは、約25℃）で培養することにより、変異導入効率を上昇させることができる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、1つの解釈として、本発明における好ましい核酸塩基変換酵素の1つであるPmCDA1は、変温動物であるヤツメウナギ由来であるため、PmCDA1の酵素活性の至適温度が、通常の酵素の至適温度である約37℃よりも低い可能性があり、そのため、低温培養することにより酵素活性が増大することが考えられる。従って、本発明の好ましい一実施態様において、核酸塩基変換酵素としてPmCDA1を用いるとともに、核酸配列認識モジュール／PmCDA1複合体をコードする核酸を導入した単子葉植物細胞を低温で培養する。
【００４２】
また、形質転換体を通常よりも高密度条件（例えば、イネカルスの場合、カルス同士が接するほどの密度とすることで、培地との接触が限定され、細胞がストレスを受けるような条件）で培養することによっても、変異導入効率を上昇させることができる。
【００４３】
形質転換体の標的二本鎖DNAに首尾よく変異が導入されているか否かの確認は、変異導入により表現型の変化が可視化できる場合には、表現型を調べることにより行うこともできるが、最終的な確認は標的ヌクレオチド配列を含む標的DNA領域をゲノムPCRにより増幅し、増幅断片の塩基配列を決定することにより行うのが好ましい。1つの形質転換体クローンであっても、細胞によって変異導入様式が異なる場合があるので、例えば植物材料としてカルスを用いる場合には、例えば、形質転換カルスを液体培地中に懸濁して、固形培地上に再播種し、形成されるサブクローンについて変異導入様式を確認する操作を繰り返して、均一な変異導入様式を有するクローンを得ることができる。
変異導入が確認された形質転換体クローンは、自体公知の再分化法により、植物体に再分化させることができる。ヘテロ接合性に変異が導入されている場合、得られた植物体を自家受粉させて得られるR1植物を、さらに自家受粉させてR2植物を得ることにより、ホモ接合性に変異導入された植物体を得ることができる。
【００４４】
細胞内に導入された発現ベクターから、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素との複合体が発現すると、該核酸配列認識モジュールが目的の二本鎖DNA（例、ゲノムDNA）内の標的ヌクレオチド配列を特異的に認識して結合し、該核酸配列認識モジュールに連結された核酸塩基変換酵素の作用により、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部又はそれらの近傍）のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖で塩基変換が起こり、二本鎖DNA内にミスマッチが生じる（例えば、PmCDA1やAIDなどのシチジンデアミナーゼを核酸塩基変換酵素として用いた場合、標的化された部位のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖上のシトシンがウラシルに変換され、U:GもしくはG:Uミスマッチを生じる）。このミスマッチが正しく修復されずに、反対鎖の塩基が、変換した鎖の塩基と対形成するように修復されたり（上記の例では、T-AもしくはA-T）、修復の際にさらに他のヌクレオチドに置換（例えば、U→A、G）、あるいは1ないし数十塩基の欠失もしくは挿入を生じることにより、種々の変異が導入される。
【００４５】
ジンクフィンガーモチーフは、標的ヌクレオチド配列に特異的に結合するジンクフィンガーの作製効率が高くなく、また、結合特異性の高いジンクフィンガーの選別が煩雑なため、実際に機能するジンクフィンガーモチーフを多数作製するのは容易ではない。TALエフェクターやPPRモチーフは、ジンクフィンガーモチーフに比べて標的核酸配列認識の自由度が高いが、標的ヌクレオチド配列に応じて巨大なタンパク質をその都度設計し、構築する必要があるので、効率面で問題が残る。
これに対し、CRISPR-Casシステムは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドRNAにより目的の二本鎖DNAの配列を認識するので、標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴDNAを合成するだけで、任意の配列を標的化することができる。
従って、本発明のより好ましい実施態様においては、核酸配列認識モジュールとして、Casエフェクタータンパク質の少なくとも１つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム（CRISPR-変異Cas）が用いられる。
【００４６】
CRISPR-変異Casを用いた本発明の核酸配列認識モジュールは、標的ヌクレオチド配列と相補的な配列を含むCRISPR-RNA（crRNA）と、必要に応じて変異Casエフェクタータンパク質のリクルートに必要なtrans-activating RNA（tracrRNA）と（tracrRNAが必要な場合は、crRNAとのキメラRNAとして提供され得る）、変異Casエフェクタータンパク質との複合体として提供される。変異Casエフェクタータンパク質と組み合わせて核酸配列認識モジュールを構成する、crRNA単独あるいはcrRNAとtracrRNAとのキメラRNAからなるRNA分子を「ガイドRNA」と総称する。
【００４７】
本発明で使用されるCasエフェクタータンパク質は、ガイドRNAと複合体を形成して、目的遺伝子中の標的ヌクレオチド配列とそれに隣接するprotospacer adjacent motif（PAM）を認識し結合し得る限り、特に制限はないが、好ましくはCas9又はCpf1である。Cas9としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9（SpCas9; PAM配列NGG(NはA、G、T又はC。以下同じ)）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のCas9（StCas9; PAM配列NNAGAAW）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のCas9（MmCas9; PAM配列NNNNGATT）等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくはPAMによる制約が少ないSpCas9である（実質2塩基であり、理論上ゲノム上のほぼどこでも標的化することができる）。また、Cpf1としては、例えば、フランシセラ・ノヴィシダ（Francisella novicida）由来のCpf1（FnCpf1; PAM配列NTT）、アシダミノコッカス sp.（Acidaminococcus sp.）由来のCpf1（AsCpf1;PAM配列NTTT）、ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）由来のCpf1（LbCpf1; PAM配列NTTT）等が挙げられるが、それらに限定されない。本発明で用いられる変異Casエフェクタータンパク質（変異Casと略記する場合がある）としては、Casエフェクタータンパク質の二本鎖DNAの両方の鎖の切断能が失活したものと、一方の鎖の切断能のみを失活したニッカーゼ活性を有するものの、いずれも使用可能である。例えば、SpCas9の場合、10番目のAsp残基がAla残基に変換した、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の反対鎖の切断能を欠く（従って、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖に対するニッカーゼ活性を有する）D10A変異体、あるいは、840番目のHis残基がAla残基で変換した、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の切断能を欠く（従って、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の反対鎖に対するニッカーゼ活性を有する）H840A変異体、さらにはその二重変異体（dCas9）を用いることができる。また、FnCpf1の場合、917番目のAsp残基がAla残基（D917A）に、あるいは1006番目のGlu残基がAla残基（E1006A）に変換した、両方の鎖の切断能を欠く変異体を用いることができる。二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖の切断能を欠く限り、他の変異Casも同様に用いることができる。
【００４８】
核酸塩基変換酵素は、上記ジンクフィンガー等との連結様式と同様の手法により、変異Casとの複合体として提供される。あるいは、核酸塩基変換酵素と変異Casとを、RNA aptamerであるMS2F6、PP7等とそれらとの結合タンパク質によるRNA scaffoldを利用して結合させることも出来る。ガイドRNA中のターゲッティング配列が標的ヌクレオチド配列と相補鎖を形成し、ガイドRNA中の他の領域（即ち、crRNA中のターゲッティング配列以外の配列、あるいはcrRNAに続くtracrRNAに変異CasがリクルートされてPAMを認識するが、一方あるいは両方のDNAを切断することができず、変異Casに連結された核酸塩基変換酵素の作用により、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）で塩基変換が起こり、二本鎖DNA内にミスマッチが生じる。このミスマッチが正しく修復されずに、反対鎖の塩基が、変換した鎖の塩基と対形成するように修復されたり、修復の際にさらに他のヌクレオチドに変換、あるいは1ないし数十塩基の欠失もしくは挿入を生じることにより、種々の変異が導入される。
【００４９】
CRISPR-変異Casを核酸配列認識モジュールとして用いる場合でも、ジンクフィンガー等を核酸配列認識モジュールとして用いる場合と同様に、核酸配列認識モジュールと核酸塩基変換酵素とは、それらをコードする核酸（好ましくはDNA）の形態で、目的の二本鎖DNAを有する単子葉植物細胞に導入される。
Casエフェクタータンパク質（例、Cas9、Cpf1）をコードするDNAは、核酸塩基変換酵素をコードするDNAについて上記したのと同様の方法により、該酵素を産生する細胞からクローニングすることができる。また、変異Casは、クローン化されたCasをコードするDNAに、自体公知の部位特異的変異誘発法を用いて、DNA切断活性に重要な部位のアミノ酸残基（例えば、SpCas9の場合、10番目のAsp残基や840番目のHis残基、FnCpf1の場合、917番目のAsp残基や1006番目のGlu残基等が挙げられるが、これらに限定されない）を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。
あるいは変異CasをコードするDNAは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAや核酸塩基変換酵素をコードするDNAについて上記したのと同様の方法により、化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで、用いる宿主単子葉植物細胞での発現に適したコドン使用を有するDNAとして構築することもできる。例えば、イネでの発現に適したコドン使用を有するSpCas9 DNAとして、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を有するDNAが挙げられる。
【００５０】
変異CasをコードするDNAと、核酸塩基変換酵素をコードするDNAとは、融合タンパク質として発現するように連結してもよいし、結合ドメインやインテイン等を用いて別々に発現させ、タンパク質間相互作用やタンパク質ライゲーションを介して宿主細胞内で複合体を形成するように設計してもよい。いずれの場合でも、変異CasをコードするDNAと、核酸塩基変換酵素をコードするDNAとは、それぞれの両末端に、単子葉植物細胞で機能し得る核移行シグナル（NLS）をコードする配列（例、SV40由来NLSコード配列；配列番号５）が付加されていることが望ましい。変異Casと核酸塩基変換酵素とが、融合タンパク質として発現される場合、一方のタンパク質のC末端と他方のタンパク質のN末端に付加されるNLSとして、1つのNLS配列を共有することができる。真核細胞に対してCRISPR-Cas技術を適用する場合、Casエフェクタータンパク質の核移行の効率を改善するために、NLSを付加することは常套手段であるが、本発明によると、変異Casを核酸塩基変換酵素との複合体として発現させるため、分子量が大きくなり、本発明者らが先に報告した酵母細胞と比べてサイズの大きな単子葉植物細胞を宿主として用いる場合には、該複合体の核移行の効率が低下する可能性がある。そこで、本発明者らは、該複合体の核移行効率を改善するために、変異Casエフェクタータンパク質と核酸塩基変換酵素の各両末端にNLSを付加することを発想し、これにより単子葉植物細胞でも、本発明のゲノム編集技術を用いて、高い変異導入効率を得ることに成功した。
【００５１】
得られた変異Cas及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNAは、上記と同様の発現ベクターのプロモーター、例えば、CaMV35Sプロモーター、CaMV19Sプロモーター、NOSプロモーター、Pcubi4-2プロモーター、2x35Sプロモーター等の下流に挿入することができる。発現ベクターには、上述のように、所望によりターミネーター（例、NOSターミネーター、エンドウrbcS3Aターミネーター、熱ショックタンパク質（HSP）17.3ターミネーター等）、翻訳エンハンサー（例、イネ由来アルコールデヒドロゲナーゼ5’非翻訳領域（Os ADH-5’UTR）、CaMVやタバコモザイクウイルス（TMV）由来Ω配列等）、3’調節領域（例、イネ由来アクチン遺伝子（Act1）3’UTR等）、ポリA付加シグナル、薬剤耐性遺伝子（例、G418耐性遺伝子（nPtII）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（hpt）等）の選択マーカーなどを含有することができる。好ましい実施態様においては、単子葉植物細胞での翻訳効率を高めるために、Os ADH-5’UTRをプロモーターと変異Cas及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNAとの間に挿入することができる。
【００５２】
一方、ガイドRNAをコードするDNAは、標的ヌクレオチド配列の「標的鎖（targeted strand）」に対して相補的なヌクレオチド配列（「ターゲッティング配列（targeting sequence）」ともいう）を含むcrRNA配列（例えば、Casエフェクタータンパク質としてFnCpf1をリクルートする場合、ターゲッティング配列の5’側にAAUUUCUACUGUUGUAGAU（配列番号７；下線部の配列同士が塩基対を形成しステム-ループ構造をとる）を含むcrRNAを用いることができる）のコード配列、あるいは、crRNAコード配列と必要に応じて既知のtracrRNAコード配列（例えば、Casエフェクタータンパク質としてCas9をリクルートする場合のtracrRNAコード配列として、gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtggtgctttt; 配列番号８）とを連結したオリゴDNA配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することができる。
ここで「標的鎖」とは、標的ヌクレオチド配列のcrRNAとハイブリッド形成する方の鎖を意味し、その反対鎖で標的鎖とcrRNAとのハイブリッド形成により一本鎖状になる鎖を「非標的鎖（non-targeted strand）」と呼ぶこととする。また、核酸塩基変換反応は通常、一本鎖状になった非標的鎖上で起こる場合が多いと推定されるので、標的ヌクレオチド配列を片方の鎖で表現する場合（例えばPAM配列を表記する場合や、標的ヌクレオチド配列とPAMとの位置関係を表す場合等）、非標的鎖の配列で代表させるものとする。
【００５３】
ターゲッティング配列の長さは、標的ヌクレオチド配列に対して特異的に結合し得る限り特に制限はないが、例えば15〜30ヌクレオチド、好ましくは18〜25ヌクレオチドである。標的ヌクレオチド配列の選択は、該配列の3’側（Cas9の場合）もしくは5’側（Cpf1の場合）に隣接するPAMの存在により制限されるが、酵母等の知見によれば、CRISPR-変異Cas9とシチジンデアミナーゼとを組み合わせた本発明のシステムにおいては、標的ヌクレオチド配列の長さに拘わらず、その5’端から3’方向に7ヌクレオチド以内の位置にあるCが置換され易いという規則性があるので、標的ヌクレオチド配列（その相補鎖であるターゲッティング配列）の長さを適宜選択することにより、変異を導入できる塩基の部位をシフトさせることができる。これにより、PAM（SpCas9においてはNGG）による制約を少なくとも部分的に解除することができ、変異導入の自由度がさらに高くなる。
【００５４】
ターゲッティング配列の設計は、例えば、Casエフェクタータンパク質としてCas9を用いる場合、公開のガイドRNA設計ウェブサイト（CRISPR Design Tool、CRISPRdirect等）を用いて、目的遺伝子のCDS配列の中からPAM（例えば、SpCas9の場合、NGG）を3’側に隣接する20mer配列をリストアップし、その5’端から3’方向に7ヌクレオチド以内のCをTに変換した場合に、目的遺伝子がコードするタンパク質にアミノ酸変化を生じるような配列を選択することにより行うことができる。さらに、ターゲッティング配列の長さを、例えば18〜25ヌクレオチドの範囲で変化させた場合に、同様に、その5’端から3’方向に7ヌクレオチド以内にTへの塩基変換によりアミノ酸変化を生じるCが存在する配列を選択する。これらの候補の中から、目的の単子葉植物ゲノム中のオフターゲットサイト数が少ない候補配列をターゲッティング配列として用いることができる。使用するガイドRNA設計ソフトウェアに単子葉植物ゲノムのオフターゲットサイトを検索する機能がない場合、例えば、候補配列の3’側の8〜12ヌクレオチド（標的ヌクレオチド配列の識別能の高いseed配列）について、宿主となる単子葉植物ゲノムに対してBlast検索をかけることにより、オフターゲットサイトを検索することができる。
【００５５】
ガイドRNAをコードするDNAも、上記と同様の発現ベクターに挿入することができるが、プロモーターとしては、pol III系のプロモーター（例、SNR6、SNR52、SCR1、RPR1、U3、U6、H1プロモーター等）及びターミネーター（例、ポリT配列（T6配列等））を用いることが好ましい。例えば、宿主細胞がイネ細胞の場合、イネ由来のU6又はU3プロモーター、より好ましくはU6プロモーターが使用され得る。pol III系プロモーターを用いる場合、4つ以上Tが連続するヌクレオチド配列をターゲッティング配列に選ばないようにすべきである。
【００５６】
ガイドRNA（crRNA又はcrRNA-tracrRNAキメラ）をコードするDNAは、標的ヌクレオチド配列の標的鎖に対して相補的な配列と、既知のtracrRNA配列（Cas9をリクルートする場合）又はcrRNAのダイレクトリピート配列（Cpf1をリクルートする場合）とを連結したオリゴRNA配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することができる。
【００５７】
変異Cas及び/又は核酸塩基変換酵素をコードするDNA、ガイドRNA（crRNA又はcrRNA-tracrRNAキメラ）をコードするDNAは、宿主単子葉植物細胞に応じて、上記と同様の方法により細胞に導入することができる。変異Cas及び核酸塩基変換酵素を安定に発現する形質転換体の選択、選抜された形質転換体の維持培養も、上記と同様にして行うことができる。
【００５８】
従来型の人工ヌクレアーゼでは、DNA二重鎖切断（DSB）を伴うため、ゲノム内の配列を標的とすると染色体の無秩序な切断（オフターゲット切断）によると思われる増殖阻害と細胞死とが引き起こされる。本発明では、変異導入をDNA切断ではなくDNA塩基上の置換基の変換反応（特に脱アミノ化反応）によって行うため、毒性の大幅な軽減が実現できる。
尚、本発明の二本鎖DNAの改変では、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）以外で、該二本鎖DNAの切断が生じることを妨げない。しかしながら、本発明の最大の利点の1つが、オフターゲット切断による毒性を回避することであることを考慮すれば、好ましい一実施態様においては、本発明の二本鎖DNAの改変は、選択された二本鎖DNAの標的化された部位のみならず、それ以外の部位でのDNA鎖切断も伴わない。
【００５９】
後述の実施例で示されるとおり、変異Casとして、二本鎖DNAのうちの一方の鎖のみを切断し得るニッカーゼ（nickase）活性を有するCas9を用いた場合と、両方の鎖を切断できない変異Cas9を用いた場合とでは、変異導入様式の傾向が顕著に異なる。変異Casとして、ガイドRNAと相補鎖を形成する鎖の反対鎖（非標的鎖）の切断能を欠く（従って、標的鎖に対するニッカーゼ活性を有する）D10A変異体を用いると、塩基置換よりも1ないし20ヌクレオチド程度の欠失変異が導入される傾向が強い。欠失は、Casによる切断部位（PAMの上流2-3ヌクレオチド）よりも、塩基置換部位（標的ヌクレオチド配列の5’末端から3’方向に7ヌクレオチド以内）を中心とした領域に生じる場合が多い。また、当該欠失と同時に、1ないし数ヌクレオチドの挿入を伴う場合もある。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、非標的鎖上の塩基置換を受けたヌクレオチドを除去修復する際に、単子葉植物では、周辺の塩基もまとめて除去しながら、反対鎖（標的鎖）を鋳型として伸長反応を行うことが考えられる。その際、標的鎖にニックが入っていると、標的鎖でも除去修復機構が働き、両方の鎖でヌクレオチドの脱落が起こった状態となって、正常な伸長反応を行えないまま無理にライゲーションが起こることで、結果として欠失変異を生じやすいと推測される。
一方、両方の鎖を切断できない変異Cas9を用いた場合は、変異導入様式は、出芽酵母や大腸菌等の場合と同様、塩基置換が主であった。但し、出芽酵母の場合よりも変異導入部位の範囲は若干広く、標的ヌクレオチド配列の5’末端よりも上流（例えば、PAM配列の上流21ヌクレオチド）にまで及ぶ。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、上記の仮説に基づけば、標的鎖にニックが入っていないため、標的鎖を鋳型とした伸長反応が正常に進み、結果として塩基置換が主な変異となるものと考えられる。同様に、標的鎖の切断能を欠く（従って、非標的鎖に対するニッカーゼ活性を有する）H840A変異体を用いた場合でも、反対鎖である標的鎖を鋳型とした伸長反応が正常に進むため、変異導入様式としては塩基置換が主となることが推定される。
従って、変異CasのDNA鎖切断能を適宜選択することにより、二本鎖DNAの特定のヌクレオチド又はヌクレオチド領域にピンポイントに塩基置換を導入したり、あるいは塩基置換部位を中心として約20ヌクレオチド以内の欠失変異を導入したりすることが可能となり、目的に応じて使い分けることもできる。
【００６０】
本発明者らはまた、近接する複数の標的ヌクレオチド配列に対して配列認識モジュールを作製し、同時に用いることにより、単独のヌクレオチド配列を標的とするよりも、変異導入効率が大幅に上昇することを、出芽酵母を用いて確認しており、単子葉植物細胞においても同様の効果が期待できる。その効果は、両標的ヌクレオチド配列の一部が重複するような場合から、両者が600bp程度離れている場合でも同様に変異誘導が実現する。また、標的ヌクレオチド配列が同じ方向（標的鎖が同一鎖）である場合と、対向する（二本鎖DNAの両方の鎖が標的鎖となる）場合のどちらでも起こり得る。
また、全く異なる位置の複数のDNA領域を標的として改変することも可能である。従って、本発明の好ましい一実施態様においては、異なる標的ヌクレオチド配列（１つの目的遺伝子内であってもよいし、異なる２以上の目的遺伝子内にあってもよい。）とそれぞれ特異的に結合する、２種以上の核酸配列認識モジュールを用いることができる。この場合、これらの核酸配列認識モジュールの各々１つと、核酸塩基変換酵素とが、核酸改変酵素複合体を形成する。ここで核酸塩基変換酵素は共通のものを使用することができる。例えば、核酸配列認識モジュールとしてCRISPR-Casシステムを用いる場合、Casエフェクタータンパク質と核酸塩基変換酵素との複合体（融合タンパク質を含む）は共通のものを用い、ガイドRNA（crRNA又はcrRNA-tracrRNAキメラ）として、異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ相補鎖を形成する2以上のcrRNA、あるいは2以上のcrRNAの各々と、tracrRNAとのキメラRNAを2種以上作製して用いることができる。一方、核酸配列認識モジュールとしてジンクフィンガーモチーフやTALエフェクターなどを用いる場合には、例えば、異なる標的ヌクレオチドと特異的に結合する各核酸配列認識モジュールに、核酸塩基変換酵素を融合させることができる。
【００６１】
本発明の核酸改変酵素複合体を宿主細胞内で発現させるためには、上述のように該核酸改変酵素複合体をコードするDNAを含む発現ベクターを単子葉植物細胞に導入するが、効率よく変異を導入するためには、一定期間以上、一定レベル以上の核酸改変酵素複合体の発現が維持されるのが望ましい。かかる観点からは、該発現ベクターが宿主ゲノムに組み込まれることが確実であるが、核酸改変酵素複合体の持続的発現はオフターゲット切断のリスクを増大させるので、首尾よく変異導入が達成された後は、速やかに除去されることが好ましい。宿主ゲノムに組み込まれたDNAを除去するための手段としては、Cre-loxP系を用いる方法やトランスポゾンを用いる方法等が挙げられる。
【００６２】
あるいは、所望の時期に核酸塩基変換反応が起こり、標的化された部位の改変が固定されるのに必要な期間だけ、一過的に本発明の核酸改変酵素複合体を宿主細胞内で発現させることにより、オフターゲット切断のリスクを回避しつつ宿主ゲノムの編集を効率よく実現することができる。核酸塩基変換反応が起こり、標的化された部位の改変が固定されるのに必要な期間は、宿主細胞の種類や培養条件等によっても異なるが、少なくとも数世代の細胞分裂を経る必要があるため、2-3日程度は必要であると考えられる。当業者は、使用する培養条件等に基づいて、好適な発現誘導期間を適宜決定することができる。本発明の核酸改変酵素複合体をコードする核酸の発現誘導期間は、宿主細胞に副作用を生じさせず、かつ宿主細胞の再分化能が維持される範囲で、上記「標的された部位の改変が固定されるのに必要な期間」を超えて延長されてもよい。
【００６３】
本発明の核酸改変酵素複合体を、所望の時期に所望の期間、一過的に発現させる手段としては、該核酸改変酵素複合体をコードする核酸（CRISPR-Casシステムにおいては、ガイドRNAをコードするDNAと、変異Cas及び核酸塩基置換酵素をコードするDNA）を、発現期間を制御可能な形態で含むコンストラクト（発現ベクター）を作製し、単子葉植物細胞に導入する方法が挙げられる。「発現期間を制御可能な形態」としては、具体的には、本発明の核酸改変酵素複合体をコードするDNAを、誘導性の調節領域の制御下においたものが挙げられる。「誘導性の調節領域」は特に制限されないが、例えば、上述の誘導プロモーター（例、PR1α遺伝子プロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、GST-27遺伝子プロモーター等）が挙げられる。
【００６４】
以下に、本発明を実施例により説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６５】
1. ベクター構築
(1) Target-AID評価用ベクターの構築
図１Ａに示す構造を有するpRIT3-EGFP（EGFP ORFを有する；配列番号９）とpRIT3-mEGFP（EGFP開始コドンの直後に終始コドンがある；配列番号１０）を、常法により作製した。
(2) Target-AIDベクターの構築
図１Ｂに示す構造を有するTarget-AIDベクター2408（dCas9をコードする；配列番号１１）と2409（D10A変異体をコードする；配列番号１２）は、pZH_OsU6gRNA_MMCas9（Plant Mol Biol (2015) 88:561-572）のOS Opt. Cas9を、H840A及びD10A二重変異又はD10A変異のみを有する変異Cas9をコードするDNAに置換し、その下流に、両末端にSV40由来の核移行シグナル（NLS）をコードする配列が付加された、シロイヌナズナのコドン使用に最適化したPmCDA1をコードするDNAを融合させることにより作製した。【００６６】
2. Target-AIDおよび評価用ベクターのアグロバクテリウム菌への導入
Target-AIDベクターである2408と2409 (図１Ｂ)、評価用ベクターであるpRIT3-EGFPとpRIT3-mEGFP (図１Ａ)は、エレクトロポレーション (Bio Rad 社MicroPulserエレクトロポレーションシステム) によりアグロバクテリウム菌 (Agrobacterium tumefaciens EHA101株) へ導入した。
まず、下記の手順にてアグロバクテリウム菌のコンピテントセル作製を行った。
アグロバクテリウム菌株をYEB寒天培地 (Beef Extract 5g/L, Yeast Extract 1g/L, Bacto Pepton 1g/L, Sucrose 5g/L, MgSO4 2mM, Bacto Agar 12g (1.2%)) に塗布し、28℃・暗所で2日間培養した。得られたシングルコロニーをYEB液体培地5mLに植菌後、28℃・暗所で12時間振とう培養し、懸濁液200μLを200mLのYEB液体培地に加え28℃・暗所で振とう培養し、OD600=0.2-0.4に増殖させた。次いで菌体を遠心して (3000rpm、4℃・10分間)集菌し、20mLの10mM HEPES (pH8.0) に懸濁、遠心を2-3回繰り返した。遠心により回収した菌体を滅菌10%グリセロール水溶液2mLに懸濁し、コンピテントセルとした。次に、以降に記す手順にて各ベクターをアグロバクテリウムへ導入した。各ベクターを1μg/μL濃度で滅菌水に溶解し、上記のアグロバクテリウム菌懸濁液50μLに混合し、マイクロパルサーキュベット (0.1cmギャップ, BioRad社) に移し、エレクトロポレーション (2.2kV, 5.8ms) を行った。次いで、この液に800μLのYEB液体培地を加えて28℃・暗所で2時間振とう培養し100mg/L スペクチノマイシンを含むYEB寒天培地に塗布し28℃・暗所で36〜48時間培養した。得られた菌コロニーを100mg/L スペクチノマイシンを含むYEB液体培地5mLで増殖させグリセロール (最終濃度35%) ストックとして微小管に分注し、-80℃で保存した。【００６７】
3. イネ培養細胞へのTarget-AID評価用ベクターの導入
イネの形質転換は、基本的にTeradaらの手法（Terada, R., Urawa, H., Inagaki, Y., Tsugane, K., and Iida, S. (2002) Efficient gene targeting by homologous recombination in rice. Nat. Biotechnol. 20, 1030-1034）に従って行った。【００６８】
3-1. 形質転換用のイネカルスの準備
イネ (Oryza sativa.L Japonica品種；日本晴) の種子約100粒の籾を取り除き、70％エタノール中にて１分間振とうした後、2.5％次亜塩素酸ナトリウムに20-30分間浸漬して滅菌した。その後、滅菌水ですすぎ2N6培地 (N6培地用混合塩 (Sigma-Aldrich社) 4.0g/L, Casamino acid 300mg/L, Myo-inocitol 100mg/L, Nicotinic acid 0.5mg/L, Pyridoxine HCl 0.5mg/L, Thiamine HCl 0.5mg/L, L-Proline 2878mg/L, Sucrose30.0g/L, 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 2mg/L, Gelrite 4.0g/L, pH5.8) の上に置床し、暗所・31.5℃にて3週間培養し、胚盤細胞由来の脱分化細胞塊 (カルス)を誘導した。その後、1ヶ月ごとに細胞分裂活性の高いカルスを選抜して継代培養し、培養開始から4ヶ月経ったカルスを形質転換に用いた。【００６９】
3-2. 形質転換用のアグロバクテリウム菌の準備
Target-AID評価用ベクターを導入した各アグロバクテリウム菌液を氷上で溶解し、うち300μLを100mg/L スペクチノマイシンを加えたAB培地 (NH4Cl 1g/L, MgSO4・7H2 0 3g/L, KCl 0.15g/L, CaCl2・2H2O 0.012 g/L, FeSO4・7H2O 0.0025g/L, K2HPO4 3g/L, NaH2PO4・H2O 1.15g/L, Sucrose 5.5g/L, Agarose 6.0g/L, pH7.2) に塗布し、28℃・暗所で3日間培養した。その後、増殖したアグロバクテリウム菌を40mg/LのAcetosyringone (3',5'-Dimethoxy-4'-hydroxy-acetophenone) を加えたAAI液体培地 (MgSO4・7H2O 5g/L, CaCl2・2H2O 1.5g/L, NaH2PO4・H2O 1.5g/L, KCl 29.5g/L, MnSO4・4H2O 10g/L, ZnSO4・7H2O 2g/L, H3BO3 3g/L, KI 0.75g/L, Na2MoO4・2H2O 0.25g/L, CoCl2・6H2O 25mg/L, CuSO4・5H2O 25mg/L, FeSO4・7H2O 13.9g/L, Na2 EDTA 18.7g/L, Myo-inocitol 100mg/L, Thiamine HCl 0.01g/L, Nicotinic acid 1mg/L, Pyridoxine HCl 1mg/L) に懸濁して25℃で2時間振とう培養した。この懸濁液を40mg/mlのAcetosyringoneを含むAAI液体培地で希釈しOD600=0.008とした懸濁液120mlを調製した。【００７０】
3-3. イネカルスへのpRIT3-EGFP, pRIT3-mEGFP導入 (アグロバクテリウム菌接種、共存培養、除菌、イネ組み換え体カルス選抜)
イネカルス約5gを滅菌したガラスビーカーに集め、各ベクターを導入したアグロバクテリウム菌懸濁液(先述)を加え、3-5分間振とうしながら接種を行った。懸濁液をステンレスメッシュ (目地開き1.5 mm)で濾過し、余分なアグロバクテリウム菌を除去した。次いで、2N6共存培地 (N6培地用混合塩(Sigma社製) 4.0g/L,Casamino acid 300mg/L, Myo-inocitol 100mg/L, Nicotinic acid 0.5mg/L, Pyridoxine HCl 0.5mg/L, Thiamine HCl 0.5mg/L, Sucrose 30.0g/L, Glucose 10g/L, 2,4-D 2mg/L, Gelrite 4.0g/L, Acetosyringone 40mg/L, pH5.2) の上に滅菌濾紙を敷き、その上にカルスをピンセットで等間隔に並べ、25℃暗所で3日間共存培養した。その後、共存培養後のカルスからアグロバクテリウム菌を除菌するため、カルスを500mlのビーカーに集めて、除菌液1 (Vancomycin 200mg/L, Tween20 20μl/Lを含む滅菌水) 300mlを用いて攪拌しながら30分間洗浄した。その後、カルスをステンレスメッシュに集め、ペーパータオルでカルス周辺の水分を取り除いた後、除菌液2 (Vancomycin 200mg/L, Tween20 20μl/Lを含む滅菌水) 300ml を用いて同様の除菌操作を4回繰り返した。次いで除菌後のカルスを2N6NU培地 (N6培地用混合塩[Sigma社製] 4.0g/L, Casamino acid 300mg/L, Myo-inocitol 100mg/L, Nicotinic acid 0.5mg/L, Pyridoxine HCl 0.5mg/L, Thiamine HCl 0.5mg/L, L-Proline 2878mg/L, Sucrose 30.0g/L, 2,4-D 2mg/L, Gelrite 4.0g/L, Vancomycin 100mg/L, Meropenem 25mg/L, pH5.8)で5日間養生培養した。その後、パロモマイシン (Paromomycin) 50mg/Lを含む選抜培地 2N6SEPa50 (N6培地用混合塩[Sigma社製] 4.0g/L, Casamino acid 300mg/L, Myo-inocitol 100mg/L, Nicotinic acid 0.5mg/L, Pyridoxine HCl 0.5mg/L, Thiamine HCl 0.5mg/L, L-Proline 2878mg/L, Sucrose30.0g/L, 2,4-D 2mg/L, Agarose 8.0g/L, Vancomycin 100mg/L, Meropenem 25mg/L, pH5.8)の上に等間隔に並べ、31.5℃の暗所で約6週間培養した。その結果、複数系統のパロモマイシン耐性カルスを選抜できた。【００７１】
3-4. pRIT3-EGFP, pRIT3-mEGFPを導入したイネカルスの解析
pRIT3-EGFPを導入し、パロモマイシン耐性を示したカルスから任意で96系統を選び、以降の解析に用いた。各系統のカルスの一部から自動核酸抽出装置（クラボウ株式会社PX-80）によってゲノムDNAを抽出し、プライマーセット”SbfI-p35S-F”（配列番号１３）と“EGFP-NotI-R” （配列番号１４）(表１)を用いたPCR解析を行った結果、pRIT3-EGFP由来の1238bpのDNA断片が検出され、遺伝子組換え体と確認できた。次いで、これについて実体蛍光顕微鏡を用いた観察を行った結果、すべてにEGFPシグナルが検出された(図２)。pRIT3-mEGFPを導入したカルスについても同様の解析を行い、PCR解析により遺伝子組換え体と確認された。これらについて実体蛍光顕微鏡での観察を行った結果、EGFPシグナルは一切検出されなかった (図２)。【００７２】
【表１】
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【００７３】
3-5. イネカルスへのpRIT3-mEGFPと2408、またはpRIT3-mEGFPと2409の同時導入 (アグロバクテリウム菌接種、共存培養、除菌、イネ組み換え体カルス選抜)
基本操作は3-3.に準じた。pRIT3-mEGFPをもつアグロバクテリウムの菌液と2408または2409を持つアグロバクテリウムの菌液を等量ずつ混合し、イネカルス約30gに接種した。以降養生培養までの操作は上記に準ずる。選抜培養にはハイグロマイシン (Hygromycin) 40mg/L、パロモマイシン (Paromomycin) 50mg/Lを含む2N6SEH40Pa50培地を用いた。約6週間の選抜培養後、ハイグロマイシンとパロモマイシンに耐性を示すカルスが複数系統確認でき、pRIT3-mEGFPと2408を導入した場合は14系統、 pRIT3-mEGFPと2409を導入した場合では56系統が得られた。【００７４】
3-6. pRIT3-mEGFPと2408、またはpRIT3-mEGFPと2409を導入したイネカルスの解析
選抜された各系統のカルスからゲノムDNAを抽出し、プライマーセット“SbfI-p35S-F”と“EGFP-NotI-R”、および”Hmr-F”（配列番号１５）と“Hmr 2408 R-1”（配列番号１６）(表1)を用いたPCR解析を行った結果、pRIT3-mEGFPと2408が組み込まれた二重形質転換体は269系統、pRIT3-mEGFPと2409が組み込まれたものは264系統であった (表２, 図３)。【００７５】
【表２】
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【００７６】
次いで、全ての二重形質転換体カルスについて実体蛍光顕微鏡を用いた観察を行った結果、pRIT3-mEGFPと2409が組み込まれた2系統 (No. 6, 3)にてEGFPの発現を確認した (図４，５)。これらカルスでのTarget-AIDによるゲノム配列改変を確認するため、各系統にてEGFPを発現するカルスからゲノムDNAを抽出し、プライマーセット“SbfI-p35S-F” と“EGFP-NotI-R” (表1)を用いたPCR産物をMonoFas DNA精製キットI (ジーエルサイエンス社)にて精製して、pCR4 Blunt TOPO ベクター(ThermoFisher社) SbfI-NotIサイト間へクローニングした。合計111クローンについてDNAシークエンサー で塩基配列を解読した結果、一部にTarget-AIDによる塩基配列改変を確認した (表３，図６Ａ，Ｂ)。ニッカーゼ型の2409では、短い欠失変異（1-20ヌクレオチド）を生じる頻度が高かったが、塩基置換のみも起こり得た（図７）。【００７７】
【表３】
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【００７８】
一方、両方の鎖の切断能を欠くCas9（2408）を用いた場合、変異導入様式としては塩基置換が主であり（図８，９，１０）、塩基置換を生じる領域は出芽酵母の場合よりも広く、標的ヌクレオチド配列外（PAM配列の上流21ヌクレオチド）まで確認された（図１０）。尚、GFPシグナル陰性細胞では、標的ヌクレオチド配列及びその近傍に変異は導入されていなかった（図１１）。【００７９】
4. イネの内在性遺伝子ALS (Acetolactate synthase)の改変
これまでに、Target-AIDによる外来レポーター遺伝子の改変に成功したため、次に、イネ内在性遺伝子の改変を実施した。対象としてALS (Acetolactate synthase)遺伝子を選び、遺伝子配列内の標的塩基置換を介して、96番目のアミノ酸がアラニン (A)からバリン(V)に変化した変異型ALS 遺伝子(ALS A96V)の創出を試みた。他種植物での先行報告から、ALS A96Vを発現するイネの植物体およびカルスは除草剤 (Imazamox)への耐性を獲得すると予測されるが、先行例は無い。また、無菌培養条件下のイネ植物体およびカルスに対するImazamoxの効果を試験した例も無い。従って、本実施例ではまず、予備的研究として、無菌培養条件におけるイネの種子およびカルスに対するImazamoxの有効濃度検定（下記4-1, 4-2）、ALS A96VによるImazamoxへの耐性獲得を確認（下記4-3）した上で、Target-AIDによるALS A96V改変を実施した（下記4-4）。【００８０】
4-1. 無菌培養条件における、イネ植物体に対するImazamox有効濃度の検証
1/2 MS固形培地（MS mix（Sigma）、シュクロース15.0g/L、Gelrite（和光純薬）4.0g/L、pH5.8）をもとに、Imazamox 濃度が異なる9段階（0mg/L, 0.5mg/L, 1mg/L, 2mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 10mg/L, 20mg/L, 30mg/L）の培地を作製した。続いて、イネ (Oryza sativa.L Japonica品種；日本晴) の種子の籾を取り除き、70％エタノール中にて１分間振とうした後、2.5％次亜塩素酸ナトリウムに20-30分間浸透しながら浸漬して滅菌した。滅菌した種子は、処理区ごとに24粒ずつ置床し、25℃、11時間明（8000lux）/13時間暗で7日間培養し、発芽状況を観察した。その結果、Imazamox を含まない1/2 MS 培地では24粒中23粒の種子が発芽して順調な成長を示したのに対し、Imazamoxを0.5mg/Lまたはそれ以上の濃度で添加した培地では、全ての種子にて胚基部での褐変化が確認され、子葉鞘は白化し、5mm程度まで伸長したに留まった（表４）。
以上より、イネ植物体の無菌培養条件におけるImazamox の有効濃度は0.5mg/Lと判断した。【００８１】
【表４】
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【００８２】
4-2. 無菌培養条件における、イネカルスに対するImazamox有効濃度の検証
2N6固形培地（先述）をもとに、Imazamox 濃度が異なる4段階（0mg/L, 30mg/L, 50mg/L, 70mg/L）の培地を作製した。イネ種子の胚盤部からカルスを誘導し（先述）、Imazamoxを添加した2N6固形培地に置床し、31.5℃、終日暗で28日間培養し、カルスの増殖状況を確認した。その結果、Imazamox 70mg/Lを添加した培地ではカルスはある程度肥大化したが、分裂増殖は阻害されていたのに対し、50mg/L以下の濃度ではカルスの分裂増殖が認められた（図１２）。
以上より、イネカルスに対するImazamox の有効濃度は70mg/Lと判断した。【００８３】
4-3. 変異型ALS 遺伝子 (ALS A96V)によるイネカルスへのImazamox耐性の付与
変異型ALS A96VによるイネカルスへのImazamox耐性付与を評価するため、pRIT4-ALS WT、およびpRIT4-ALS A96Vを構築した（図１３）。pRIT4はイネ形質転換用バイナリーベクターであり、植物用ポジティブマーカー遺伝子としてHygromycin phosphotransferase （hpt）を持つ。pRIT4-ALS WTは、野生型イネ(Oryza sativa.L Japonica品種；日本晴)から抽出したゲノムDNAをもとに、ALS遺伝子とそのプロモーターと転写終止領域をPCRクローニングにより単離し、pRIT4に組み込んだものである。pRIT4-ALS A96Vは、PCRを介した部位特異的変異導入法により、人為的にA96V変異を導入したALS遺伝子を作製し、pRIT4に組み込んだものである。これら2種類のベクターは、アグロバクテリウム菌EHA101系統に導入（先述）し、イネ種子胚盤由来のカルスに形質転換（先述）した。その後、カルスはハイグロマイシン (Hygromycin) 40mg/Lを添加した選抜培地 （2N6SEH50；N6培地用混合塩[Sigma社製] 4.0g/L, Casamino acid 1000mg/L, Myo-inocitol 100mg/L, Nicotinic acid 0.5mg/L, Pyridoxine HCl 0.5mg/L, Thiamine HCl 0.5mg/L, L-Proline 2878mg/L, Sucrose 30.0g/L, 2,4-D 2mg/L, Gelrite 4.0g/L, Vancomycin 100mg/L, Meropenem 25mg/L, pH5.8）の上に等間隔に並べ、31.5℃の暗所で約4週間培養した。その結果、pRIT4-ALS WTを導入したカルスを169系統、pRIT4-ALS A96Vを導入したカルスを263系統得た（表５）。以降の工程では、これらカルスは系統ごとに個別培養した。2N6SEH50培地上で増殖した各カルス系統は、2N6SEH40にImazamox 70mg/Lを添加した選抜培地（2N6SEH40IMZ70）に継代し、31.5℃の暗所で約6週間培養した。その結果、pRIT4-ALS WTを導入したカルスのうち、Imazamox 70mg/Lに耐性を示したカルスは6系統（3.6%）だったのに対して、pRIT4-ALS A96Vを導入した場合は、261系統（99.2%）が耐性を示した（表５）。
以上から、変異型ALS A96VによるイネカルスへのImazamox耐性付与を確認できた。【００８４】
【表５】
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【００８５】
4-4. Target-AIDによるALS A96V改変
Target-AIDベクター1476（dCas-AID）および1477（nCas-AID）は、イネゲノム中のALS遺伝子への標的塩基置換（C287T）を経て、ALS A96Vに改変するデザインとした（図１４）。1476、1477はアグロバクテリウム菌EHA101系統に導入（先述）し、イネ種子胚由来のカルス約8gへの形質転換（先述）に用いた。アグロバクテリウム菌の接種、除菌を経たカルスは、2N6NU培地で14日間養生培養した後、ハイグロマイシン (Hygromycin) 40mg/Lを添加した選抜培地 （2N6SEH40）の上に等間隔に並べ、31.5℃の暗所で約3週間培養した。次いで同培地に継代し、25℃の暗所で約10週間培養し、1476を導入したカルスを155系統、1477を導入したカルスを203系統得た。以降の工程では、系統ごとに個別培養した。各系統のカルスを2つに分け、ハイグロマイシン (Hygromycin) 50mg/Lを添加した培地 （2N6SEH50）とImazamox 70mg/Lを加えた培地（2N6SEH50IMZ70）に継代し、31.5℃の暗所で約6週間選抜培養した。2N6SEH50上で培養した結果全系統のカルスが増殖したのに対し、2N6SEH50IMZ70上で培養した場合に増殖が認められたのは、1476を導入したカルスでは3系統、1477を導入したカルスでは6系統であった。これら9系統のカルスにおけるALS遺伝子配列を確認するため、ゲノムDNAを抽出し、プライマーセット“ALS cloning-F”（配列番号１７）と“ALS cloning-R”（配列番号１８）を用いたPCRによりDNA断片を増幅しながらSbfIおよびNotI認識サイトを付加した。得られたPCR産物はMonoFas DNA精製キットI (ジーエルサイエンス社)にて精製して、pDONRZeo（Thermo Fisher Scientific社）を改変したクローニング用ベクターのSbfI-NotIサイト間へクローニングした。得られたプラスミドクローンについて、プライマー“ALS F-1”（配列番号１９）を用いてDNAシークエンサー（ABI, 3130XL）で塩基配列を解析した。使用したプライマー配列を表１に示す。
その結果、1477を導入しImazamox耐性を示した6系統のうち、4系統にてALS遺伝子でのA96V変異が導入されていた。うち3系統では、A96V変異を生じる標的塩基の置換（C287T）が確認された（図１５Ｂ）。残り1系統ではC287T に加え、アミノ酸配列が変化しないC285Tも確認された（図１５Ｃ）。これらはいずれも、ベクター1477の標的配列内におけるCからTへの塩基置換である。また、これらの系統について、ALS遺伝子およびそのプロモーターと転写終止領域のゲノム配列を確認したが、C285TおよびC287T以外の変異は確認されなかった。従って、Target-AIDによるイネ内在性ALS伝子の改変と、それによる除草剤耐性の付与に成功したと判断した。なお、ALS遺伝子へのA96V変異導入に成功した4系統のうち3系統について、T0植物体の再分化に成功した（図１６）。得られたT0植物体について、“ALS cloning-F”と“ALS cloning-R”を用いたPCRにより増幅したDNA断片を“ALS F-1”を用いてダイレクトシークエンスした結果、全てのT0植物体で由来となったカルスと同じ変異（C287TまたはC285T/ C287T）が確認された（図１７）。【００８６】
5. Target-AIDによる複数遺伝子の同時改変
Target-AIDベクター2455（dCas-AID）は、pRIT3-mEGFP上のmEGFP遺伝子およびイネ内性のALS遺伝子を同時改変するために作製されたもので、それぞれ2408/2409および1476/1477と同じgRNAを発現する。pRIT3-mEGFPを導入したカルス約17gに上述の方法で2455を導入し、124系統の二重形質転換系統を得た。これらについて実体蛍光顕微鏡による観察を行った結果、3系統にEGFPの発現が確認された。さらに、この3系統のカルスを2N6SEH40IMZ70培地へ継代し、31.5℃の暗所で約6週間培養した結果、いずれもImazamox耐性を示し、活発に増殖した。3系統のカルスからゲノムDNAを抽出し、プライマーセット“SbfI-p35S-F”と“EGFP-NotI-R”、または“ALS Cloning-F”と“ALS Cloning-R”を用いたPCRにより、mEGFP遺伝子領域およびALS遺伝子領域を増幅した。得られたPCR産物はMonoFas DNA精製キットI (ジーエルサイエンス社)にて精製し、ダイレクトシークエンスに供した。その結果、1系統にてmEGFP遺伝子とALS遺伝子の双方にTarget-AIDによる標的塩基置換が確認できた（図１８）。mEGFP遺伝子の開始コドン直後に設定された終止コドン（TAG）がチロシンに対応するTATに改変され、さらに直後のGTGがメチオニンに対応するATGに改変されていた（図１８Ａ）。ALS遺伝子では、C287Tが確認された（図１８Ｂ）。
以上より、Target-AIDによりイネゲノム中の複数標的配列を同時改変可能であることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明により、DNA二重鎖切断も伴わずに、安全に任意の単子葉植物に部位特異的変異を導入することが可能となる。こうして得られる遺伝子改変単子葉植物は、イネ等の主要穀物をはじめとする単子葉植物の分子育種に極めて有用である。【００８８】
本出願は、日本で出願された特願２０１５−２３２３７９（出願日：２０１５年１１月２７日）及び特願２０１６−１３４６１３（出願日：２０１６年７月６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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