(57)【要約】【課題】  特別な装置を使用せずに短時間で沈降させることができ且つ、タンパク質を吸着する粒子を、安価で簡便に製造する方法を提供する。【解決手段】  平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを溶解した反応液に、平均粒子径が１から４０μｍの酸化ジルコニウム粒子を分散させる第一の工程；その反応液にポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの貧溶媒を加えて、酸化ジルコニウム粒子表面に平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを析出させる第二の工程；によって、ポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子を製造する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンで被覆された酸化ジルコニウム粒子であって、
ポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの平均分子量が４００００以下であることを特徴とする、ポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子。
【請求項２】
酸化ジルコニウム粒子が、ジルコニア又はイットリウム添加ジルコニアの焼結体粒子である、請求項１に記載のポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子。
【請求項３】
酸化ジルコニウム粒子の平均粒子径が１から４０μｍである、請求項１または２に記載のポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子。
【請求項４】
平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを溶解した反応液に、酸化ジルコニウム粒子を分散させる第一の工程；
その反応液にポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの貧溶媒を加えて、酸化ジルコニウム粒子表面に平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを析出させる第二の工程；
を有することを特徴とする、ポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子の製造方法。
【請求項５】
平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端に
カルボキシル基を有するポリスチレンを溶解した反応液に、酸化ジルコニウム粒子を分散
させる第一の工程；
その反応液にポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの貧溶媒を加えて、酸化ジルコニウム粒子表面に平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを析出させる第二の工程；
の二つの工程を有する方法で製造されることを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載のポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を粒子表面に吸着可能な、ポリスチレン類で表面が被覆された酸化ジルコニウム粒子およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
粒子に低分子化合物、核酸、タンパク質、糖鎖または細胞等の物質を結合させ、それら粒子上の物質と、核酸、蛋白質、抗原または糖鎖等の標的物質とを、結合、吸着または反応させることによって診断、分析、抽出、精製または反応を行なうシステムが種々提案されている。
【０００３】
例えば市販のマイクロビーズへタンパク質を固定化し、このマイクロビーズをカップや９６穴プレートに入れ、抗体抗原反応を利用した診断を行なう手法が提案されている。これらの代表例として抗原と抗体との反応を利用した免疫測定装置が特許文献１に提案されている。このような測定方法においては、まず定量したい物質（以下「抗原」という）に対する抗体を吸着または化学結合により固定化するとともに（以下この抗体を固定化した単体を「抗体固定化担体」という）、この固定化された抗体とは異なる抗原のエピトープを認識する抗体にラジオアイソトープや酵素等による標識をした物（以下この標識された抗体を「標識抗体」という）を準備する。
【０００４】
次にこれらの抗体固定化担体および標識抗体の二つを含む溶液に、被検液を加えて、この被検液に含まれる抗原と標識抗体を結合させた状態で抗体固定化担体に捕捉させる。ここで、抗体固定化担体に補捉された標識抗体−抗原の結合物の量は、被検液中に含まれる抗原の濃度に比例する。ここで抗体固定化担体に補捉されなかった標識抗体を分離し、固定化された標識抗体を標識方法に応じた分析手法で分析することにより、目的とする抗原の濃度が分析できる。抗体固定化担体の分離方法は、抗体固定化担体を時間をかけて遠心装置にかける工程、あるいは磁性粒子を含むマイクロビーズを抗体固定化担体として磁場をかける工程を追加して強制的に沈降させる、あるいは密度の高い酸化ジルコニウム粒子を抗体固定化担体として沈降させる等の方法（特許文献２）がとられ、その後に上澄み液を除去する方法が行われる。この手法の一つの課題は抗体固定化担体に補捉されなかった標識抗体をいかにして洗浄して除去するかということであり、固定化抗体を沈降させ分離洗浄する方法が利用されている。
【０００５】
タンパク質を固定化するための、酸化ジルコニウム粒子のポリマーによる被覆は、特許文献２のように間接的に被覆する方法が開示されている。また特許文献３のように硫酸バリウム粒子へ直接ポリスチレンを被覆した樹脂粒子の製造方法が開示されている。しかしながら分子量４００００以下のポリスチレン類を直接、酸化ジルコニウム粒子へ被覆した例は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１−１７２７５５号公報
【特許文献２】国際公開２００７／１２６１５１号パンフレット
【特許文献３】特開平４−００５２１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この手法の一つの課題として、抗原抗体反応により標識抗体が結合した抗体固定化担体をいかにして分離するかということがあり、抗体固定化担体を沈降させ分離洗浄する方法が利用されている。しかしながら、通常使用されるマイクロビーズは樹脂基材やシリカ等の比重の軽い材質から成るものが多く、沈降する時間を要すため、遠心装置にかける工程を追加して強制的に沈降させる必要があった。またこれらの欠点を補う目的で磁性粒子を含むマイクロビーズもあるが、これらの磁性粒子もまた粒子の沈降には、磁場をかける装置および工程が必要である。また、比重の重い酸化ジルコニウム粒子をポリマーにより被覆させる場合は、その製造工程において高価なシランカップリング剤を使用した上、ポリマーの重合反応を行なうため、製造原価が高くなり、工程数が増えるという問題がある。また、被覆ポリマーは適当なポリマーを選択しなければ樹脂粒子同士の凝集がおこり、本発明の目的である診断、分析、抽出、精製または反応に再現性、感度、効率の点で適用できない。
【０００８】
これらの問題点を克服するため本発明の課題としては、特別な装置を使用せずに短時間で沈降させることができ且つ、タンパク質を吸着する粒子を製造すること、またその粒子の安価で簡便な製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成させるに至った。即ち本発明は、以下のとおりである。
【００１０】
（１）ポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンで被覆された酸化ジルコニウム粒子であって、ポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの平均分子量が４００００以下であることを特徴とする、ポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子。
【００１１】
（２）酸化ジルコニウム粒子が、ジルコニア又はイットリウム添加ジルコニアの焼結体粒子である、（１）に記載のポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子。
【００１２】
（３）酸化ジルコニウム粒子の平均粒子径が１から４０μｍである、（１）または（２）に記載のポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子。
【００１３】
（４）平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを溶解した反応液に、酸化ジルコニウム粒子を分散させる第一の工程；その反応液にポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの貧溶媒を加えて、酸化ジルコニウム粒子表面に平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを析出させる第二の工程；を有することを特徴とする、ポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子の製造方法。
【００１４】
（５）平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを溶解した反応液に、酸化ジルコニウム粒子を分散させる第一の工程；その反応液にポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンの貧溶媒を加えて、酸化ジルコニウム粒子表面に平均分子量が４００００以下のポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを析出させる第二の工程；の二つの工程を有する方法で製造されることを特徴とする、（１）から（３）のいずれかに記載のポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】
本発明において被覆に用いられるポリスチレン、ポリスチレンコポリマー、または末端にカルボキシル基を有するポリスチレンを、以下、ポリスチレン類とする。ポリスチレンコポリマーとしては、ポリ（スチレン−メタクリル酸）コポリマー、ポリ（スチレン−アクリル酸）コポリマー、ポリ（スチレン−スチレンスルホン酸）コポリマー、ポリ（スチレン−ビニル安息香酸）コポリマー等のポリスチレンコポリマーが例示できる。また末端にカルボキシル基を有するポリスチレンとしては、ポリスチレンの片末端にカルボキシル基を有するポリスチレン及び両末端にカルボキシル基を有するポリスチレンが例示できる。前述のポリスチレン類の中では、ポリスチレンが好ましい。なお、末端にカルボキシル基を有するポリスチレンやポリスチレンコポリマーは、自身が持つ負荷電により、酸化ジルコニウム粒子への付着性が向上し、酸化ジルコニウム粒子へ均一に被覆しやすくなる。
【００１７】
本発明における被覆させるポリスチレン類の平均分子量は４００００以下である。本発明において、平均分子量はサイズ排除クロマトグラフィー法（ＳＥＣ）で求めた値である。本発明において、平均分子量は、好ましくは１０００から４００００であり、さらに好ましくは１０００から３８０００であり、とりわけ１００００から３８０００が好ましい。最も好ましくは３５０００から３８０００である。ポリマー鎖が長くなると樹脂粒子同士の凝集が起こり目的の診断、分析、抽出、精製または反応などの処理に適した酸化ジルコニウム粒子には不向きとなるからである。本発明の粒子は粒子同士の凝集が全く無い方が好ましいが、わずかに凝集していても、本発明の目的には適応しうるものである。
【００１８】
本発明におけるポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子は、酸化ジルコニウム粒子を被覆するポリスチレン類で完全に被覆されていても、部分的に被覆されていても本発明の目的には適応しうるものである。
【００１９】
本発明に用いられる酸化ジルコニウム粒子は、ジルコニアまたはイットリウム添加ジルコニアの焼結体粒子が好ましい。未焼結の酸化ジルコニウム粒子は崩れやすいため、ポリスチレン類を被覆するとき、またはタンパク質を固定化する際に攪拌すると粒子自体が崩れる恐れがあるためである。
【００２０】
また、本発明に用いられる酸化ジルコニウム粒子の平均粒子径は、１μｍから４０μｍが好ましい。より好ましくは１μｍから２０μｍである。さらに好ましくは１μｍから１０μｍである。これ以上粒子のサイズが小さくなると自然沈降の速度が低下する。逆に粒子の大きさが大きくなると体積あたりの表面積が小さくなり診断または分析のシグナル・感度の低下、抽出、精製、または反応効率の低下をもたらす。
【００２１】
さらに本発明に用いられる酸化ジルコニウム粒子の形状は特に制限はないが、好ましくは球形または無定形の粒子である。均質な球形の粒子を使用した場合は、診断または分析のシグナル・感度の再現性、抽出、精製、または反応効率の再現性の点で好ましい。また無定形の粒子を使用した場合は、単位体積あたりの表面積が大きくなり、診断または分析のシグナル・感度の向上、抽出、精製、または反応効率の向上の点で好ましい。
【００２２】
本発明のポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子は、平均分子量４００００以下のポリスチレン類を溶解した反応液に酸化ジルコニウム粒子を分散させる第一の工程；その反応液に当該ポリスチレン類の貧溶媒を加えて、酸化ジルコニウム粒子表面に当該ポリスチレン類を析出させる第二の工程；の二つの工程を有する製造方法によって製造することができる。
【００２３】
第一の工程は、平均分子量４００００以下のポリスチレン類を溶解した反応液に酸化ジルコニウム粒子を分散させる工程である。この工程で使用する溶媒はポリスチレン類を溶解できる溶媒であれば種類を問わないが、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、アセトン、トルエン、キシレン、ベンゼン、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、クロロホルム、トリクロロエチレン、アセトニトリル、イソプロピルエーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルケトン等が例示できる。より好ましくはＴＨＦが好ましい。また分散させる方法は超音波分散、ホモジナイズ、攪拌が例示できる。
【００２４】
本発明の第一の工程で用いられる、ポリスチレン類／酸化ジルコニウム粒子の比率は、１／１０（ｇ／ｇ）以下が好ましい。ポリスチレン類の量が多くなるとポリスチレン類で被覆された粒子同士の凝集が起こりやすくなり、目的の診断、分析、抽出、精製または反応などの処理に適したジルコニア粒子には不向きとなるからである。またポリスチレン類で被覆された酸化ジルコニウム粒子の比重が軽くなり自然沈降の速度が低下する。
【００２５】
第二の工程は、当該ポリスチレン類の貧溶媒を加えて、酸化ジルコニウム粒子表面に当該ポリスチレン類を析出させる工程である。この工程で使用する貧溶媒としてはポリスチレン類を析出させることができる溶媒であれば種類を問わないが、水、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどのアルコール類、ヘキサン等が例示できる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によって、特別な装置を使用せずに短時間で沈降させることができ、且つ、タンパク質を吸着しうるポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子、及びその製造方法を提供することができる。またその製造は二工程で可能であるため、安価で簡便な製造方法である。
【００２７】
したがって本発明の粒子に低分子化合物、核酸、タンパク質、糖鎖または細胞等の物質を結合させ、それら粒子上の物質と、核酸、蛋白質、抗原または糖鎖等の標的物質とを、結合、吸着または反応させることによって診断、分析、抽出、精製するシステムへ利用できる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１  
第一の工程として、ＴＨＦ１０ｍＬにポリスチレン（Ｍｗ＝３５０００、シグマアルドリッチ製、２００ｍｇ）を加え、６０分間撹拌溶解した。これに酸化ジルコニウム粒子（φ１５μｍ、２．５ｇ）を加え、３０分間撹拌した。第二の工程として撹拌しながらヘキサン３０ｍＬを加え、デカンテーションにより上澄み液を取り除いた。さらにヘキサン３０ｍＬを加え撹拌したのち、懸濁液をガラスフィルターでろ過した。残渣をヘキサンでよく洗浄したのち乾燥し、凝集していないポリスチレン被覆酸化ジルコニウム粒子を得た。
【００３０】
実施例２から４および１１
実施例１の第一の工程で使用するポリスチレンの種類を換えた（実施例２；ポリスチレン（Ｍｗ＝１０１０）、実施例３；ポリスチレン（Ｍｗ＝９４９０）、実施例４；ポリスチレン（Ｍｗ＝１５４００）、実施例１１；ポリスチレン（Ｍｗ＝３７２００）いずれも東ソー製）他は実施例１と同様に行ない、ポリスチレン被覆酸化ジルコニウム粒子を得た。実施例２から４の粒子は凝集していない粒子が得られた。実施例１１の粒子はわずかに凝集していたが、本発明の目的には適応しうるものであった。
【００３１】
実施例５
実施例１の第一の工程で使用する酸化ジルコニウム粒子の粒径をφ３０μｍ（２．５ｇ）とし、使用するポリスチレン（Ｍｗ＝３５０００、シグマアルドリッチ製）の量を１２０ｍｇに変更した他は実施例１と同様に行ない、凝集していないポリスチレン被覆酸化ジルコニウム粒子を得た。
【００３２】
実施例６、８から１０、１２
実施例５の第一の工程で使用する酸化ジルコニウム粒子をＡＳＴＲＯＮ製ＺＣＯ−６Ｅ（無定形、平均粒径６μｍ、２．５ｇ）とし、ポリスチレンの種類を換えた（実施例６；ポリスチレン（Ｍｗ＝３５０００）、実施例８；ポリスチレン（Ｍｗ＝１０１０）、実施例９；ポリスチレン（Ｍｗ＝９４９０）、実施例１０；ポリスチレン（Ｍｗ＝１５４００）、実施例１２；ポリスチレン（Ｍｗ＝３７２００）、いずれも東ソー製）他は実施例５と同様に行ない、凝集していないポリスチレン被覆酸化ジルコニウム粒子を得た。実施例６、実施例８、実施例９、実施例１０および実施例１２の粒子についてはＴＧ−ＤＴＡ分析（常温から７００℃まで１０℃／ｍｉｎで昇温）をおこない、被覆していない粒子と比較して、それぞれ実施例６（１ｗｔ％）、実施例８（３ｗｔ％）、実施例９（４ｗｔ％）、実施例１０（２ｗｔ％）、実施例１２（４ｗｔ％）の重量減少が見られた。
【００３３】
実施例７
実施例１の第一の工程で使用する酸化ジルコニウム粒子をＡＳＴＲＯＮ製ＺＣＯ−６Ｅ（無定形、平均粒径６μｍ、２．５ｇ）に変更した他は実施例１と同様の操作を行ない、凝集していないポリスチレン被覆酸化ジルコニウム粒子を得た。
【００３４】
実施例１３から１８
実施例１の第一の工程で使用する酸化ジルコニウム粒子をニイミ産業製ＮＺ−１０（球状、平均粒径１１μｍ、２．５ｇ）とし、ポリスチレンの種類と量を換えた（実施例１３；ポリスチレン（Ｍｗ＝１０１０）使用量６０ｍｇ、実施例１４；ポリスチレン（Ｍｗ＝１０２００）使用量６０ｍｇ、実施例１５；ポリスチレン（Ｍｗ＝１７４００）使用量６０ｍｇ、実施例１６；ポリスチレン（Ｍｗ＝３５０００）使用量６０ｍｇ、実施例１７；ポリスチレン（Ｍｗ＝３５０００）使用量１２０ｍｇ、実施例１８；ポリスチレン（Ｍｗ＝３７９００）使用量６０ｍｇ、実施例１３から１５および実施例１８のポリスチレンは東ソー製、実施例１６および１７のポリスチレンはシグマアルドリッチ製）他は実施例１と同様にして、凝集していない、または本発明の目的に適用しうる程度のわずかな凝集を有したポリスチレン被覆酸化ジルコニウム粒子を得た。
【００３５】
実施例の結果をまとめた表を表１に示す。
【００３６】
【表１】
2014142329.tif 000002
比較例１から４
実施例１の第一の工程で使用するポリスチレンの種類を換えた（比較例１；ポリスチレン（Ｍｗ＝５００００、シグマアルドリッチ製）、比較例２；ポリスチレン（Ｍｗ＝９８９００、東ソー製）、比較例３；ポリスチレン（Ｍｗ＝１９２０００、シグマアルドリッチ製）、比較例４；ポリスチレン（Ｍｗ＝２８００００、シグマアルドリッチ製））他は実施例１と同様の操作で作製した。しかしながら第二の工程でヘキサンを加えると、ポリスチレンと酸化ジルコニウム粒子が凝集した。
【００３７】
比較例５
実施例５において、被覆するポリスチレンの種類を換えた（Ｍｗ＝２８００００、シグマアルドリッチ製）他は実施例５と同様の操作を行なった。しかしながら第二の工程でヘキサンを加えるとポリスチレンと一部の酸化ジルコニウム粒子が凝集した。
【００３８】
比較例６および７
実施例５において第一の工程で使用する酸化ジルコニウム粒子をＡＳＴＲＯＮ製ＺＣＯ−６Ｅ（無定形、平均粒径６μｍ、２．５ｇ）とし、被覆するポリスチレンの種類を換えた（比較例７；ポリスチレン（Ｍｗ＝５００００、シグマアルドリッチ製）、比較例８；ポリスチレン（Ｍｗ＝９８９００、東ソー製））他は実施例５と同様の操作を行なった。しかしながら第二の工程でヘキサンを加えるとポリスチレン被覆した酸化ジルコニウム粒子が凝集した。
【００３９】
比較例の結果をまとめた表を表２に示す。
【００４０】
【表２】
2014142329.tif 000003
実施例１から１２および比較例１から７より明らかなように、本発明の製造方法によって、平均分子量が４００００以下のポリスチレン類を被覆させることにより、本発明の目的に合ったポリスチレン類被覆酸化ジルコニウム粒子を得ることができる。