(57)【要約】【課題】生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定するＮＯストレス診断方法、当該特定した生体の位置のＮＯストレスに由来する疾患を診断する方法を提案する。【解決手段】ＮＯストレスによりタンパク質中に生成されるニトロトリプトファンを検出することにより、生体の特定の位置（例えば、特定の臓器など）と、当該生体の特定の位置から産生される、あるいは当該特定の位置に由来する、等、当該生体の特定の位置に関連する特定のタンパク質との組合せにより、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定するＮＯストレス診断方法、又は、当該特定した生体の位置のＮＯストレスに由来する疾患を診断する方法、あるいはこれらの双方の診断方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検査タンパク質を認識すると共に、
ニトロトリプトファンを特異的に認識する抗体を用いて当該被検査タンパク質に含まれるニトロトリプトファンを検出することにより、
生体内において一酸化窒素ストレスが発生している位置を特定する一酸化窒素ストレス診断方法及び、当該特定した位置の一酸化窒素ストレスに由来する疾患の診断を行う方法、又は、これらの双方を行う診断方法。
【請求項２】
生体内において一酸化窒素ストレスが発生している位置の特定は、前記認識された被検査タンパク質が由来している生体内の位置を特定することによって行うことを特徴とする請求項１記載の診断方法。
【請求項３】
被検査タンパク質を認識する工程に当該被検査タンパク質を特異的に認識する抗体を用いることを特徴とする請求項１又は２記載の診断方法。
【請求項４】
被検査タンパク質を認識する工程に電気泳動法、液体クロマトグラフィー法、質量分析法の何れかを用いることを特徴とする請求項１又は２記載の診断方法。
【請求項５】
前記被検査タンパク質がコラーゲン、カゼイン、ケラチンの中のいずれかであって、前記生体内の位置が皮膚であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項６】
前記被検査タンパク質がアルブミン、フィブリノーゲン、熱ショック蛋白質Ａ１２Ｂ、Ｃ反応性タンパク質、脂肪酸結合蛋白1、アルデヒドデヒドロゲナーゼ2、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギナーゼ、グリコーゲン合成酵素、αフェトプロテイン、アシアログリコプロテイン受容体、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、HMG-CoA還元酵素、リパーゼ、アルドラーゼ、チトクロムP450、カリクレイン、補体因子5、トロンビン、ハプトグロビン、レプチン、レジスチン、アポリポ蛋白E、ビトロネクチン、フィブロネクチンの中のいずれかであって、前記生体内の位置が肝臓であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項７】
前記被検査タンパク質がアポリポ蛋白E、アポリポ蛋白L2、アポリポ蛋白L3、アポリポ蛋白L4、アポリポ蛋白L6、インシュリン、グルカゴン、レプチン、レジスチン、プロラクチン、ソマトスタチン、アドレノメデュリン、レニン、アンギオテンシノーゲン、オキシトシン、エンドテリン1、エンドテリン3、ガストリン、セクレチン、ビメンチン、トロンボモジュリン、チオレドキシン、インターロイキン1α、インターロイキン1β、インターロイキン2、インターロイキン4、インターロイキン10、インターロイキン25、アルギニンバソプレッシン、チトクロームP450、コルチコトロピン放出ホルモン、グリセロキナーゼ、ウロコルチン、プロミニン2、アスポリン、チロシンヒドロキシラーゼ、インヒビンα、プロヒビチン2、チログロブリン、アデニル酸シクラーゼ4、デスミン、トロンボスポンジン2、ネスチン、ラミニン、ニューロフィブロミン1、アネキシンA1、αフェトプロテイン、キニノゲン1、ニューロピリン1、プリオン蛋白、インターフェロンα1、インターフェロンγ、アルブミン、ジストロフィンの中のいずれかであって、前記生体内の位置が副腎であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項８】
前記被検査タンパク質がアポリポ蛋白Eであって、高血圧の発症に関わる臓器における一酸化窒素ストレス診断を行うことを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項９】
前記被検査タンパク質がフォンビルブランド因子、組織因子パスウェイインヒビター、トロンボモジュリン、キニノゲン、エンドセリン、アンギオポエチン、カドへリン5、Eセレクチン、NO合成酵素3、組織型プラスミノゲンアクチベータ、酸化LDL受容体1、トロンボスポンジン1の中のいずれかであって、前記生体内の位置が血管内皮であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項１０】
前記被検査タンパク質がClara cell protein−１６、Clara cell protein−１０、サーファクタントプロテイン−Ａ、サーファクタントプロテイン−Ｂ、サーファクタントプロテイン−C、サーファクタントプロテイン−Ｄ、シアル化糖鎖抗原−６、ムチングリコプリテイン１７−Ｑ２、ムチングリコプリテイン１７−Ｂ１の中のいずれかであって、前記生体内の位置が肺であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項１１】
前記被検査タンパク質がカルレチクリン、カドへリンH、カルジオトロフィン1、ミオシン重鎖7、心筋型トロポニン、ミオグロビンの中のいずれかであって、前記生体内の位置が心臓であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項１２】
前記被検査タンパク質がアミロイドβ、eomesodermi、アクアポリン4、エフリンB3、神経成長因子受容体、brain-specific angiogenesis inhibitor 3、モノアミンオキシダーゼB、ネスチン、グリア線維酸性蛋白質、プリオン、ニューロトロフィンの中のいずれかであって、前記生体内の位置が脳であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項１４】
前記被検査タンパク質がカドヘリン16、アクアポリン6、ウロモジュリン、meprin A、エリスロポエチンの中のいずれかであって、前記生体内の位置が腎臓であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項１５】
前記被検査タンパク質がアミラーゼ、ソマトスタチン、グルカゴン、膵リパーゼの中のいずれかであって、前記生体内の位置が膵臓であることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、生体内における一酸化窒素ストレスの診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一酸化窒素ストレスとは、一酸化窒素が生体内においてスーパーオキシドラジカルと反応することで、毒性の強いパーオキシナイトライトを形成し、細胞や臓器に対し損傷を与えることをいう。以下、本明細書において「一酸化窒素」を「ＮＯ」と表し、「一酸化窒素ストレス」を「ＮＯストレス」と表すことがある。
【０００３】
ＮＯストレスは炎症性疾患をはじめ、様々な疾患に深く関与することが知られていることから、生体内におけるＮＯストレスの検出は、様々な疾患の早期診断、リスク評価に役立つと考えられる。
【０００４】
これまでにパーオキシナイトライト修飾物であるニトロチロシンを対象とした、生体内でのＮＯストレス診断法が提案されている（特許文献１）。
【０００５】
また、ニトロチロシンを使用して生体の循環器系における血栓症疾患を診断できる可能性が提案されている（非特許文献４）。
【０００６】
しかしながら、既存のニトロチロシンを用いた検出法は、タンパク性および遊離のニトロチロシンの全量に対する定量法でしかなく、特定のタンパク質・臓器を標的にした検出・定量、すなわち臓器特異性、疾病特異性に関する情報を得ることは不可能であった。
【０００７】
現在のところ特定疾患に関連したＮＯストレスの診断方法や、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定する方法は実用化されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００２−２２８６４８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nitric Oxide 16(1): p18-28(2007)
【非特許文献２】Free Radical Biology and Medicine 50: p419-427 (2011)
【非特許文献３】Nitric Oxide 25: p176-182 (2011)
【非特許文献４】Free Radical Biology and Medicine 53: p230-236 (2012) www.elsevier.com/locate/freeradbiomed
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定するＮＯストレス診断方法、当該特定した生体の位置のＮＯストレスに由来する疾患を診断する方法は、ＮＯストレスが関与する様々な疾患において、疾患リスク評価、早期診断、予防法確立に有用であると考えられる。
【００１１】
本発明は、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定するＮＯストレス診断方法、当該特定した生体の位置のＮＯストレスに由来する疾患を診断する方法を提案することを目的にしている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者等は、ＮＯストレスによりタンパク質中に生成されるニトロトリプトファンに着目し、特定タンパク質に含まれるニトロトリプトファンを検出することにより、臓器特異的、疾患特異的なＮＯストレスを診断し、また、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定することが可能であることを見出して、臓器および疾患特異的なＮＯストレス診断方法及び、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定する方法を発明した。
【００１３】
すなわち、本発明は、生体の特定の位置（例えば、特定の臓器など）と、当該生体の特定の位置から産生される、あるいは当該特定の位置に由来する、等、当該生体の特定の位置に関連する特定のタンパク質との組合せにより、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定するＮＯストレス診断方法、又は、当該特定した生体の位置のＮＯストレスに由来する疾患を診断する方法、あるいはこれらの双方の診断方法である。
【００１４】
ここで、本発明の診断方法は、前記特定のタンパク質を特異的に認識する抗体を用いて、あるいは、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法、質量分析法などを用いることによって、前記特定のタンパク質を認識する工程と、前記ニトロトリプトファンを特異的に認識する抗体を用いて前記特定のタンパク質に含まれるニトロトリプトファンを検出する工程とを組み合わせた、免疫学的検出法に基づく診断方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、生体試料中の特定タンパク質に含まれるニトロトリプトファンを検出することにより、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定するＮＯストレス診断方法、又は、当該特定した生体の位置のＮＯストレスに由来する疾患を診断する方法、あるいはこれらの双方の診断方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】生体内のタンパク質に含まれるチロシンがほとんどニトロ化されていない場合であっても、トリプトファンのみがニトロ化されている実例が存在することの検討結果を表す図。
【図２】本発明のＮＯストレス診断方法において、被検査タンパク質の認定に特異的抗体を用いた場合の、特定の臓器に由来する特定タンパク質におけるニトロトリプトファン検出の状態を表す図であって、（ａ）はヒト膵臓タンパク質抽出物」（対照）とヒト膵臓癌由来培養細胞capan-2のタンパク質抽出物（Protein Bioscience社）についての抗ニトロトリプトファン抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を表す図、（ｂ）はヒト結腸タンパク質抽出物(対照)とヒト結腸癌由来培養細胞HT-29のタンパク質抽出物（Protein Bioscience社）についての抗ニトロトリプトファン抗体を用いた解析の結果を表す図。
【図３】被検査タンパク質の認定に当該被検査タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる場合の本発明によるＮＯストレス診断方法の概略を表す。
【図４】被検査タンパク質の認定に当該被検査タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる場合の本発明による他のＮＯストレス診断方法の概略を表す。
【図５】血清中に含まれる、ニトロトリプトファン修飾−アポリポ蛋白Eの検出例を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ＮＯストレスの原因物質であるＮＯは、生体内においてスーパーオキシドラジカルと反応し、パーオキシナイトライトを形成して様々な生体成分にニトロ化修飾を与える。
【００１８】
タンパク質に含まれるアミノ酸のうち、トリプトファンは特にニトロ化修飾を受けやすく、パーオキシナイトライトと反応してニトロトリプトファンが生成される。
【００１９】
従来技術に採用されていたチロシンも、本願発明において利用しているトリプトファンと同じくニトロ化修飾を受けるが、生体内のタンパク質に含まれるチロシンがほとんどニトロ化されていない場合であっても、トリプトファンのみがニトロ化されている実例が存在する、等、タンパク質に含まれるアミノ酸のうち、トリプトファンは特にニトロ化修飾を受けやすい。
【００２０】
図１は本願の発明者が行った検討結果（神経細胞分化（＋ＮＦＧ）及び未分化ＰＣ１２ｃｅｌｌ中に検出された６−ＮＯ２Ｔｒｐ含有タンパク質の例）を表すものである。チロシンがほとんどニトロ化されていない場合であっても、トリプトファンのみがニトロ化されていた結果が示されている。
【００２１】
本願の発明者等は、前述したように、タンパク質に含まれるアミノ酸のうち特にニトロ化修飾を受けやすく、汎用性が高い、トリプトファンとパーオキシナイトライトとの反応生成物であるニトロトリプトファンに着目した。
【００２２】
そして、生体の特定の位置に特異的なタンパク質に含有されるニトロトリプトファンを検出することにより、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定するＮＯストレス診断が可能であること、又は、当該特定した位置のＮＯストレスに由来する疾患の診断が可能であること、若しくは、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定するＮＯストレス診断及び当該特定した位置のＮＯストレスに由来する疾患の診断が可能であることを見出したものである。
【００２３】
本願発明の診断方法は、被検査タンパク質を認識すると共に、ニトロトリプトファンを特異的に認識する抗体を用いて当該被検査タンパク質に含まれるニトロトリプトファンを検出することにより、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定するＮＯストレス診断を行う、又は、当該特定した位置のＮＯストレスに由来する疾患の診断を行う、あるいはこれらの双方を行う、という免疫学的検出法である。
【００２４】
ここで、生体内においてＮＯストレスが発生している位置の特定は、前記認識された被検査タンパク質が由来している生体内の位置を特定することによって行うことができる。例えば、認識できた被検査タンパク質が生体内の特定の位置（皮膚、肝臓などの臓器や、血管内皮、肺など）で産生される特定のタンパク質や、当該特定の位置に由来する特定のタンパク質である場合、当該特定の位置にＮＯストレスが発生していたり、当該特定した位置のＮＯストレスに由来する疾患が発生していることを診断できるものである。
【００２５】
前記の被検査タンパク質を認識する工程には、当該被検査タンパク質を特異的に認識する抗体を用いることができる。また、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法、質量分析法の何れかを用いて前記の被検査タンパク質を認識することもできる。
【００２６】
本願発明が提案する診断方法は、上述したように、ＮＯストレスの原因物質であるＮＯが生体内においてスーパーオキシドラジカルと反応して形成したパーオキシナイトライトと、生体内のタンパク質に含まれるアミノ酸であるトリプトファンが反応することによって生成されたニトロトリプトファンを検出するものである。この時、当該検出されたニトロトリプトファンがいかなるタンパク質に含有されているか、このタンパク質は生体内のいかなる位置に由来するものであるかを特定しておくことにより、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定する、又は、当該特定した位置のＮＯストレスに由来する疾患の診断を行うこと、若しくは、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定するＮＯストレス診断及び当該特定した位置のＮＯストレスに由来する疾患の診断とを行うようにしているものである。
【００２７】
そこで、前述した工程で認識した被検査タンパク質により、生体内のいかなる位置においてＮＯストレスが発生しているかＮＯストレス診断し、また、当該特定した位置のＮＯストレスに由来する疾患の診断を行い、更には、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定するＮＯストレス診断及び当該特定した位置のＮＯストレスに由来する疾患の診断とを行うことができる。
【００２８】
前述した工程で認識した被検査タンパク質と、それによって行うことのできる上述したＮＯストレス診断、等との組み合わせとしては以下を例示することができる。
【００２９】
前述した工程で認識できた被検査タンパク質：コラーゲン、カゼイン又はケラチン
ＮＯストレス診断：
ＮＯストレスが発生している生体内の位置が皮膚であるとの診断及び、皮膚のＮＯストレスに由来する疾患についての診断。
【００３０】
前述した工程で認識できた被検査タンパク質：アルブミン、フィブリノーゲン、熱ショック蛋白質Ａ１２Ｂ、Ｃ反応性タンパク質、脂肪酸結合蛋白1、アルデヒドデヒドロゲナーゼ2、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルギナーゼ、グリコーゲン合成酵素、αフェトプロテイン、アシアログリコプロテイン受容体、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ、カルボキシルエステラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、HMG-CoA還元酵素、リパーゼ、アルドラーゼ、チトクロムP450、カリクレイン、補体因子5、トロンビン、ハプトグロビン、レプチン、レジスチン、アポリポ蛋白E、ビトロネクチン、フィブロネクチンの中のいずれか
ＮＯストレス診断：
ＮＯストレスが発生している生体内の位置が肝臓であるとの診断及び、肝臓のＮＯストレスに由来する疾患についての診断。
【００３１】
前述した工程で認識できた被検査タンパク質：アポリポ蛋白E、アポリポ蛋白L2、アポリポ蛋白L3、アポリポ蛋白L4、アポリポ蛋白L6、インシュリン、グルカゴン、レプチン、レジスチン、プロラクチン、ソマトスタチン、アドレノメデュリン、レニン、アンギオテンシノーゲン、オキシトシン、エンドテリン1、エンドテリン3、ガストリン、セクレチン、ビメンチン、トロンボモジュリン、チオレドキシン、インターロイキン1α、インターロイキン1β、インターロイキン2、インターロイキン4、インターロイキン10、インターロイキン25、アルギニンバソプレッシン、チトクロームP450、コルチコトロピン放出ホルモン、グリセロキナーゼ、ウロコルチン、プロミニン2、アスポリン、チロシンヒドロキシラーゼ、インヒビンα、プロヒビチン2、チログロブリン、アデニル酸シクラーゼ4、デスミン、トロンボスポンジン2、ネスチン、ラミニン、ニューロフィブロミン1、アネキシンA1、αフェトプロテイン、キニノゲン1、ニューロピリン1、プリオン蛋白、インターフェロンα1、インターフェロンγ、アルブミン、ジストロフィンの中のいずれか
ＮＯストレス診断：
前記生体内の位置が副腎であるとの診断及び、副腎のＮＯストレスに由来する疾患についての診断。
【００３２】
前述した工程で認識できた被検査タンパク質：アポリポ蛋白E
ＮＯストレス診断：
高血圧の発症に関わる臓器、例えば、肝臓や、副腎、あるいは、これらの双方における一酸化窒素ストレス診断。
【００３３】
前述した工程で認識できた被検査タンパク質：フォンビルブランド因子、組織因子パスウェイインヒビター、トロンボモジュリン、キニノゲン、エンドセリン、アンギオポエチン、カドへリン5、Eセレクチン、NO合成酵素3、組織型プラスミノゲンアクチベータ、酸化LDL受容体1、トロンボスポンジン1の中のいずれか  ＮＯストレス診断：
ＮＯストレスが発生している生体内の位置が血管内皮であるとの診断及び、血管内皮のＮＯストレスに由来する疾患についての診断。
【００３４】
前述した工程で認識できた被検査タンパク質：Clara cell protein−１６、Clara cell protein−１０、サーファクタントプロテイン−Ａ、サーファクタントプロテイン−Ｂ、サーファクタントプロテイン−C、サーファクタントプロテイン−Ｄ、シアル化糖鎖抗原−６、ムチングリコプリテイン１７−Ｑ２、ムチングリコプリテイン１７−Ｂ１の中のいずれか
ＮＯストレス診断：
ＮＯストレスが発生している生体内の位置が肺であるとの診断及び、肺のＮＯストレスに由来する疾患についての診断。
【００３５】
前述した工程で認識できた被検査タンパク質：カルレチクリン、カドへリンH、カルジオトロフィン1、ミオシン重鎖7、心筋型トロポニン、ミオグロビンの中のいずれか
ＮＯストレス診断：
ＮＯストレスが発生している生体内の位置が心臓であるとの診断及び、心臓のＮＯストレスに由来する疾患についての診断。
【００３６】
前述した工程で認識できた被検査タンパク質：アミロイドβ、eomesodermi、アクアポリン4、エフリンB3、神経成長因子受容体、brain-specific angiogenesis inhibitor 3、モノアミンオキシダーゼB、ネスチン、グリア線維酸性蛋白質、プリオン、ニューロトロフィンの中のいずれか
ＮＯストレス診断：
ＮＯストレスが発生している生体内の位置が脳神経であるとの診断及び、脳神経のＮＯストレスに由来する疾患についての診断。
【００３７】
前述した工程で認識できた被検査タンパク質：カドヘリン16、アクアポリン、ウロモジュリン、meprin A、エリスロポエチンの中のいずれか
ＮＯストレス診断：
ＮＯストレスが発生している生体内の位置が腎臓であるとの診断及び、腎臓のＮＯストレスに由来する疾患についての診断。
【００３８】
前述した工程で認識できた被検査タンパク質：アミラーゼ、ソマトスタチン、グルカゴン、膵リパーゼの中のいずれか
ＮＯストレス診断：
ＮＯストレスが発生している生体内の位置が膵臓であるとの診断及び、膵臓のＮＯストレスに由来する疾患についての診断。
【００３９】
このように、本願発明は、臓器のような生体内の各位置、あるいは各疾病に関連する特定タンパク質に含まれるニトロトリプトファンを検出することにより、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定する、又は、当該特定した位置のＮＯストレスに由来する疾患の診断を行うこと、若しくは、生体内においてＮＯストレスが発生している位置を特定するＮＯストレス診断及び当該特定した位置のＮＯストレスに由来する疾患の診断とを行うものである。
【００４０】
そこで、臓器のような生体内の特定の位置によって産生される、あるいは特定の位置に由来する特定のタンパク質、ＮＯストレスが発生している生体内の特定の位置よって産生される、あるいは特定の位置に由来する特定のタンパク質に応じて、ＮＯストレスが発生している生体内の特定の位置や疾患を特定することができる。
【００４１】
したがって、タンパク質は上述したものに限られず、免疫グロブリン、グルコース6リン酸デヒドロゲナーゼ、アルカリホスファターゼ、アミラーゼ、リゾチーム、酸ホスファターゼ、フコシダーゼ、N-アセチル-D-グルコサミニダーゼ、GOT、GTP、カルボニックアンヒドラーゼ、リパーゼ、スルファターゼ、ペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、カリクレイン、α1アンチトリプシン、α2マクログロブリン、セルロプラスミン、ハプトグロブリン、トランスフェリン、βリポ蛋白、コラーゲン、ビトロネクチン、ヘモグロビン、アミロイドA1、アディポネクチン、レプチン、キモトリプシン、アンギオテンシン1変換酵素、パラオキソナーゼ、アミロイドA4、カベオリン、ペプシノーゲン、ミオグロビン、チログロブリン、フェリチン、レニン、αフェトプロテイン、β2ミクログロブリン、アラニンアミノトランスフェラーゼ、レクチン、インヒビン、、カドへリン、チトクロームC、前立腺特異抗原、アポリポ蛋白E、ペルオキシレドキシン、ミオシン、ミオスタチン、グレリンなどを利用することもできる。
【００４２】
そして、これらの採用した特定のタンパク質に応じて、脳、脊髄、胸腺、骨髄、腎臓、膵臓、脾臓、胆嚢、心臓、口、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、筋組織、前立腺等、生体内の各位置におけるＮＯストレスの診断、これらの各位置でＮＯストレスが発生していることによる疾患について診断することができる。
【００４３】
以下、添付図面を参照して本発明の免疫学的検出法の実施例を説明する。
【実施例１】
【００４４】
図２は、本発明のＮＯストレス診断方法において、被検査タンパク質の認定に特異的抗体を用いた場合の特定バンド（特定の臓器に由来する特定タンパク質）におけるニトロトリプトファン検出の状態を表す図である。
【００４５】
図２（ａ）の試料は図中、左側がヒト膵臓タンパク質抽出物（対照）、右側がヒト膵臓癌由来培養細胞capan-2のタンパク質抽出物（Protein Bioscience社）である。図２（ｂ）の試料は図中、左側がヒト結腸タンパク質抽出物(対照)、右側がヒト結腸癌由来培養細胞HT-29のタンパク質抽出物（Protein Bioscience社）である。
【００４６】
図２（ａ）、（ｂ）は、これらについての、抗ニトロトリプトファン抗体を用いた、電気泳動法によるウェスタンブロット解析の結果を表すものである。
【００４７】
試料（対照２例の臓器抽出物（図２（ａ）、（ｂ）における左側）と、疾患２例の培養細胞抽出液（図２（ａ）、（ｂ）における右側））がスポット状に膜に添付されたものに、抗ニトロトリプトファン抗体を用いて染色したところ図２（ａ）、（ｂ）図示のようになった。
【００４８】
図２（ａ）、（ｂ）図示のように、癌細胞のみにニトロトリプトファン生成されている事が明らかである。
【００４９】
他のヒト臓器、及びそれに対応する臓器癌の培養細胞においては、ニトロトリプトファンの生成に差が見出されていないので、このように特定臓器由来のニトロトリプトファンを検出することにより、特定臓器疾患でのNOストレスを診断することができる。
【００５０】
電気泳動−LC-MSとの組み合わせにより、ニトロトリプトファン含有のタンパク質の同定も可能となる。
【実施例２】
【００５１】
図３は、被検査タンパク質の認定に当該被検査タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる場合の本発明によるＮＯストレス診断方法の概略を表すものである。
【００５２】
この実施例では、反応容器の内壁に、臓器特異的あるいは疾患特異的タンパク質に対する抗体を固相化し、ニトロトリプトファンを含有している前記タンパク質の検出に抗ニトロトリプトファン抗体を用いるサンドイッチEIA法を採用した。
【００５３】
アルブミンは肝臓において産生されるアミノ酸である。アルブミンに含まれるニトロトリプトファンを検出することにより、肝臓におけるＮＯストレスを診断することができる。
【００５４】
容器の内壁に、抗アルブミン抗体を固相化しておき、検査試料（サンプル）を添加した。
【００５５】
検査試料（サンプル）中のアルブミンは、固相化抗体と結合することにより、容器表面にトラップされる。
【００５６】
洗浄後、抗ニトロトリプトファン抗体を添加した。
【００５７】
抗ニトロトリプトファン抗体は、容器表面にトラップされたアルブミンのうち、ニトロトリプトファンを含有するもののみに結合する。
【００５８】
その後、容器表面に存在する抗ニトロトリプトファン抗体を、ホースラデッシュペルオキシダーゼ標識した二次抗体、および発色基質を用いて検出した。
【００５９】
こうして、検査試料（サンプル）中におけるニトロトリプトファン含有アルブミンのみを特異的に検出することができる。
【００６０】
このようにして、アルブミン産生臓器である、肝臓におけるＮＯストレスの診断を行うことができた。
【実施例３】
【００６１】
図４は、被検査タンパク質の認定に当該被検査タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる場合の本発明による他のＮＯストレス診断方法の概略を表すものである。
【００６２】
この実施例では、反応容器の内壁に、抗ニトロトリプトファン抗体を固相化し、ニトロトリプトファンを含有している臓器特異的あるいは疾患特異的タンパク質の検出に当該タンパク質に対する抗体を用いるサンドイッチEIA法を採用した。
【００６３】
アルブミンは肝臓において産生されるアミノ酸である。アルブミンに含まれるニトロトリプトファンを検出することにより、肝臓におけるNOストレスを診断することができる。
【００６４】
容器の内壁に、抗ニトロトリプトファン抗体を固相化しておき、検査試料（サンプル）を添加した。
【００６５】
検査試料（サンプル）中の、ニトロトリプトファン含有アルブミンは、抗ニトロトリプトファン抗体と結合することにより、容器表面にトラップされる。
【００６６】
洗浄後、抗アルブミン抗体を添加した。抗アルブミン抗体は、容器表面にトラップされたニトロトリプトファン含有蛋白質のうち、アルブミンのみに結合する。
【００６７】
容器表面に存在する抗アルブミン抗体を、ホースラデッシュペルオキシダーゼ標識した二次抗体、および発色基質を用いて検出した。
【００６８】
こうして検査試料（サンプル）中におけるニトロトリプトファン含有アルブミンのみを特異的に検出することができた。
【００６９】
すなわち、アルブミン産生臓器である、肝臓におけるＮＯストレスの診断を行うことができた。
【実施例４】
【００７０】
図５は、血清中に含まれる、ニトロトリプトファン修飾−アポリポ蛋白Eの検出例を表すものである。
【００７１】
この実施例では、高血圧の発症に関わる臓器である、肝臓および副腎におけるＮＯストレスの診断について検討を行った。
【００７２】
モデル動物としてSHR-SP (Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rat)を採用した。SHR-SPは本態性ヒト高血圧を反映するモデル動物であり、１０〜１８週齢において高血圧を自然発症、脳卒中を好発する。
【００７３】
対照としてＷistar Ｋyoto（WKY)ラットを用いた。SHR-SPはWKYラットラットより系統分離されたものであり、従来から、対照としてよく用いられているものである。
【００７４】
この実施例では、１８．５週齢のSHR-SPおよびWKYを対象に、抗アポリポ蛋白抗体および抗ニトロトリプトファン抗体を用いて、血液中のニトロトリプトファン修飾−アポリポ蛋白Eの検出を行った。
【００７５】
その結果は図５の通りであり、SHR-SPの血清中には、WKYに比べ有意に高レベルのニトロトリプトファン修飾−アポリポ蛋白Eを検出することができた。
【００７６】
アポリポ蛋白Eは肝臓で合成され脂質代謝に関連するほか、血圧制御ホルモン分泌器官である副腎でも多く合成されていることから、ニトロトリプトファン修飾−アポリポ蛋白Eの増加は、当該臓器における一酸化窒素ストレスの亢進および高血圧の発症に何らかの関わりを持つことが示唆される。
【００７７】
すなわち、この実施例での、ニトロトリプトファン修飾−アポリポ蛋白Eの検出により、アポリポ蛋白Eを産生し、高血圧の発症に関わる臓器である、肝臓および副腎におけるＮＯストレスの診断を行うことができた。
【００７８】
以上、この発明の好ましい実施形態、実施例を説明したが、本発明はこれらの実施形態、実施例に限られるものではなく、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々に変更可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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