(57)【要約】【課題】細胞内に取り込まれたことを容易に確認する。【解決手段】超音波造影機能を有する基材２の表面に、少なくとも１つの分子プローブ３〜５と、少なくとも１つの光学プローブ６とを備える造影剤１を提供する。すなわち、超音波造影可能な基材２に分子プローブ３〜５と光学プローブ６を標識することにより、超音波のみならず、リアルタイム性と分解能に優れる光に対しても感受性を有し、かつ血管より組織に移行可能なサイズの造影剤１を提供することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
超音波造影機能を有する基材の表面に、少なくとも１つの分子プローブと、少なくとも１つの光学プローブとを備える造影剤。
【請求項２】
第１の分子プローブと、第２の分子プローブに標識された光学プローブと、疾患特異的に細胞または組織に結合する第３の分子プローブとを備える請求項１に記載の造影剤。
【請求項３】
前記第３の分子プローブが、前記第１の分子プローブによって標識されている請求項２に記載の造影剤。
【請求項４】
前記第２の分子プローブと前記第３の分子プローブとがモル比１：１の割合で含有されている請求項２または請求項３に記載の造影剤。
【請求項５】
前記基材が、内部に造影機能を有する造影物質を内包した脂質膜からなる外殻を有するカプセル状造影剤である請求項１から請求項４のいずれかに記載の造影剤。
【請求項６】
前記造影物質が、超音波照射により気化する水不溶性物質である請求項５に記載の造影剤。
【請求項７】
前記造影物質が気体である請求項５に記載の造影剤。
【請求項８】
請求項２に記載の造影剤の製造方法であって、
前記第１の分子プローブを前記基材の表面に標識した第１の溶液を生成する第１の工程と、
前記第２の分子プローブに前記光学プローブを標識した第２の溶液を生成する第２の工程と、
前記第３の分子プローブに前記第１の分子プローブを標識した第３の溶液を生成する第３の工程と、
前記第２の工程で生成された第２の溶液と前記第３の工程で生成された前記第３の溶液とを混合して第４の溶液を生成する第４の工程と、
前記第１の工程で生成された第１の溶液に前記第４の工程で生成された第４の溶液を混合して反応させる第５の工程と、
該第５の工程で生成された混合液を遠心分離する第６の工程とを含む製造方法。
【請求項９】
前記第４の工程において混合される前記第２の溶液中の前記第２の分子プローブと、前記第３の溶液中の前記第３の分子プローブとがモル比１：１の割合である請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記第５の工程において、前記第１の工程において生成された前記第１の溶液を１０倍以上に希釈した後に混合する請求項８または請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の造影剤の製造キットであって、
前記第１の分子プローブを前記基材の表面に標識した第１の溶液、前記第２の分子プローブに前記光学プローブを標識した第２の溶液、および前記第３の分子プローブに前記第１の分子プローブを標識した第３の溶液を個別に分離して収容する複数の収容部と、これら収容部を接続する開閉可能な流路とを備える製造キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は造影剤とその製造方法および製造キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｘ線ＣＴ、ＭＲＩ、超音波診断装置等の画像診断モダリティが医療現場で必須のツールになって久しい。これらは生体内でのＣＴ値、スピン緩和時間、音響インピーダンスの違いをそれぞれ画像化したものであり、これら物理的性質の違いが、専ら生体の構造（かたち）を反映することから、「形態イメージング」と呼ばれる。
【０００３】
これに対し、構造的には同じ組織であっても、機能的に異なる状態にある部位の画像化を行うものを「機能イメージング」と呼ぶ。この機能イメージングの内、特に、タンパクなどの生体構成分子の存在状態の可視化を行うものが、「分子イメージング」と呼ばれることが多い。分子イメージングは発生・分化といった生命現象の解明や疾病の診断・治療への応用が期待されることから、現在最も注目を浴びている研究領域のひとつである。
【０００４】
分子イメージングでは、生体構成分子に選択性を有する構造を持つ物質である「分子プローブ」を用いることが多く、この場合には分子プローブに何らかの物理的手段で検出可能とする構造を付加し、体内での分子プローブの分布を可視化する。このような分子イメージングを早期診断に利用する動きが、近年加速している。
【０００５】
上述した形態イメージングとしての用途が、先行するＭＲＩや超音波診断装置等のモダリティにおいても、分子イメージングとして利用するための研究開発が進んでいる。さらに、超音波診断装置は、（１）リアルタイム性に優れる、（２）小型なため手術室内での使用に関する制限が少ない、（３）診断のみならず、治療用ツールとしての使用も可能、という他のモダリティにない特長を有することから、大型病院以外でも使用可能な、診断治療統合ツールとして期待されている。
【０００６】
従来、「疾患の早期診断」における分子イメージングを実現するために、超音波造影剤として液体のマイクロバブル前駆体を用いた部位特異的（site  specific）水中油型エマルジョンが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
このマイクロバブル前駆体は、気体形成性化学物質のエマルジョンが液体状態で安定であり得る。そして、超音波エネルギを与えられたときに微小気泡を生成する造影剤であって、血管より組織に移行可能なサイズの造影剤を提案している。
【０００７】
このマイクロバブル前駆体は、生体投与時にはナノサイズの液滴に超音波を照射し、相変化を生じて、マイクロバブルを生成する相変化型超音波造影剤である。超音波エネルギを与えたときに微小気泡を形成する能力のために、部位特異的になるとともに、さらに、抗体やリガンド等、生体構成分子に選択的に結合する分子プローブを付加することで、組織選択性を持たせることが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第３０１６５９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１のマイクロバブル前駆体からなる超音波造影剤は、細胞の内外のどこに存在するのか判断することができないという不都合がある。特に、細胞内に取り込まれたか否かの判断をすることができないという不都合がある。
【００１０】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞内に取り込まれたことを容易に確認することができる造影剤とその製造方法および製造キットを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、超音波造影機能を有する基材の表面に、少なくとも１つのターゲッティング用の分子プローブと、少なくとも１つの光学プローブとを備える造影剤を提供する。
上記態様においては、コンジュゲート用の第１の分子プローブと、第２の分子プローブに標識された光学プローブと、疾患特異的に細胞または組織に結合するターゲッティング用の第３の分子プローブとを備えていてもよい。
【００１２】
また、上記態様においては、前記第３の分子プローブが、前記第１の分子プローブによって標識されていてもよい。
また、上記態様においては、前記第２の分子プローブと前記第３の分子プローブとがモル比１：１の割合で含有されていてもよい。
【００１３】
また、上記態様においては、前記基材が、内部に造影機能を有する造影物質を内包した脂質膜からなる外殻を有するカプセル状造影剤であってもよい。
また、上記態様においては、前記造影物質が、超音波照射により気化する水不溶性物質であってもよい。
また、上記態様においては、前記造影物質が気体であってもよい。
【００１４】
また、本発明の他の態様は上記造影剤の製造方法であって、前記第１の分子プローブを前記基材の表面に標識した第１の溶液を生成する第１の工程と、前記第２の分子プローブに前記光学プローブを標識した第２の溶液を生成する第２の工程と、前記第３の分子プローブに前記第１の分子プローブを標識した第３の溶液を生成する第３の工程と、前記第２の工程で生成された第２の溶液と前記第３の工程で生成された前記第３の溶液とを混合して第４の溶液を生成する第４の工程と、前記第１の工程で生成された第１の溶液に前記第４の工程で生成された溶液を混合して反応させる第５の工程と、該第５の工程で生成された混合液を遠心分離する第６の工程とを含む製造方法を提供する。
【００１５】
上記態様においては、前記第４の工程において混合される前記第２の溶液中の前記第２の分子プローブと、前記第３の溶液中の前記第３の分子プローブとがモル比１：１の割合であってもよい。
【００１６】
また、上記態様においては、前記第５の工程において、前記第１の工程において生成された前記第１の溶液を１０倍以上に希釈した後に混合してもよい。
【００１７】
また、本発明の他の態様は、上記造影剤の製造キットであって、前記第１の分子プローブを前記基材の表面に標識した第１の溶液、前記第２の分子プローブに前記光学プローブを標識した第２の溶液、および前記第３の分子プローブに前記第１の分子プローブを標識した第３の溶液を個別に分離して収容する複数の収容部と、これら収容部を接続する開閉可能な流路とを備える製造キットを提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、細胞内に取り込まれたことを容易に確認することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る造影剤を示す模式的な分子構造図である。
【図２】図１の造影剤の製造方法を示すフローチャートである。
【図３】培養前、造影剤ふりかけ３０分後における図１の造影剤のＣＣＡ１高発現がん細胞に対する特異的結合性を示す（ａ）共焦点蛍光顕微鏡画像、（ｂ）明視野画像、（ｃ）重畳画像、ＣＣＡ１抗体を有しない造影剤による比較例を示す（ｄ）共焦点蛍光顕微鏡画像、（ｅ）明視野画像、（ｆ）重畳画像をそれぞれ示す図である。
【図４】培養６時間後における図１の造影剤のＣＣＡ１高発現がん細胞に対する特異的細胞内取り込みを示す（ａ）共焦点蛍光顕微鏡画像、（ｂ）明視野画像、（ｃ）重畳画像、ＣＣＡ１抗体を有しない造影剤により比較例を示す（ｄ）共焦点蛍光顕微鏡画像、（ｅ）明視野画像、（ｆ）重畳画像をそれぞれ示す図である。
【図５】培養６時間後における図１の造影剤のがん細胞に対する特異的細胞内取り込みを示すフローサイトメータ解析結果であり、（ａ）ＣＣＡ１高発現がん細胞の相変化ナノ液滴の取り込みによる蛍光量と細胞数との関係、（ｂ）（ａ）の各場合の平均蛍光量、（ｃ）内包成分の異なる相変化ナノ液滴の取り込みによる蛍光量と細胞数との関係、（ｄ）（ｃ）の各場合の平均蛍光量である。
【図６】図１の造影剤を投与した組織への超音波照射および撮像を行うための実験系を示す図である。
【図７】気相化に必要な強度の超音波の（ａ）照射前、（ｂ）照射後の超音波画像を示す図である。
【図８】比較例として、図２の製造方法とは工程順序が異なる造影剤の（ａ）製造方法を示すフローチャート、（ｂ）（ａ）の二段階目の工程を行わずＣＣＡ１抗体を有しない造影剤の共焦点顕微鏡解析結果、（ｃ）二段階目の工程も行ったＣＣＡ１抗体を有する造影剤が入っている場合の共焦点顕微鏡解析結果をそれぞれ示す図である。
【図９】図２のフローチャートの第５の工程において、（ａ）未希釈の場合の散乱、（ｂ）２０倍希釈の場合の散乱をそれぞれ示す図である。
【図１０】図１の造影剤の変形例による（ａ）培養前、（ｂ）培養後のがん細胞に対する特異的結合性を示す超音波画像である。
【図１１】培養３時間後における図１の造影剤のＨＣＴ１１６細胞に対する特異的細胞内取り込みを示す（ａ）共焦点蛍光顕微鏡画像、（ｂ）明視野画像、（ｃ）重畳画像、ＣＣＡ１抗体を有しない造影剤による比較例を示す（ｄ）共焦点蛍光顕微鏡画像、（ｅ）明視野画像、（ｆ）重畳画像をそれぞれ示す図である。
【図１２】培養３時間後における図１の造影剤のＡＧＳ細胞に対する特異的細胞内取り込みを示す（ａ）共焦点蛍光顕微鏡画像、（ｂ）明視野画像、（ｃ）重畳画像、ＣＣＡ１抗体を有しない造影剤による比較例を示す（ｄ）共焦点蛍光顕微鏡画像、（ｅ）明視野画像、（ｆ）重畳画像をそれぞれ示す図である。
【図１３】培養１２時間後における図１の造影剤のＨＣＴ１１６細胞およびＡＧＳ細胞に対する特異的細胞内取り込みを示すフローサイトメータ解析結果であり、（ａ）ＨＣＴ１１６細胞の相変化ナノ液滴の取り込みによる蛍光量と細胞数との関係、（ｂ）（ａ）の各場合の平均蛍光量、（ｃ）ＡＧＳ細胞の相変化ナノ液滴の取り込みによる蛍光量と細胞数との関係、（ｄ）（ｃ）の各場合の平均蛍光量を示す図である。
【図１４】本発明の一実施形態に係る造影剤の製造キットを模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の第１の実施形態に係る造影剤１とその製造方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る造影剤１は、図１に示されるように、超音波造影可能な基材２と、該基材２の表面に修飾された少なくとも１つの分子プローブ３〜５および少なくとも１つの光学プローブ６とを備えている。
【００２１】
基材２は、内部にパーフルオロヘキサンを内包し表面をポリエチレングリコール化したリポソームにより構成されている。パーフルオロヘキサンは水不溶性物質であり、ある閾値以上の強度で超音波を照射することにより気体へ相変化する性質を有している。すなわち、気体へ相変化することにより超音波造影機能を発揮するようになっている。
【００２２】
分子プローブ３〜５は、基材２の表面に標識されるコンジュゲート用の第１の分子プローブ３と、光学プローブ６に標識される第２の分子プローブ４と、第１の分子プローブ３を標識するターゲッティング用の第３の分子プローブ５とを含んでいる。
第１の分子プローブ３としては、例えば、ビオチンが用いられる。
第２の分子プローブ４としては、例えば、ストレプトアビジンが用いられる。
第３の分子プローブ５としては、例えば、ＣＣＡ１抗体が用いられる。
光学プローブ６としては、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ＡＦ）６４７が用いられる。
【００２３】
このように構成された本実施形態に係る造影剤１の製造方法について、以下に説明する。
本実施形態の造影剤１の製造方法は、図２に示されるように、第１の分子プローブ３を基材２の表面に標識して第１の溶液を生成する第１の工程Ｓ１と、光学プローブ６を第２の分子プローブ４に標識して第２の溶液を生成する第２の工程Ｓ２と、第３の分子プローブ５に第１の分子プローブ３を標識して第３の溶液を生成する第３の工程Ｓ３と、第２の工程で生成された第２の溶液と第３の工程で生成された第３の溶液とを混合して第４の溶液を生成する第４の工程Ｓ４と、第１の工程Ｓ１で生成された第１の溶液に、第４の工程Ｓ４で生成された第４の溶液を混合して反応させる第５の工程Ｓ５と、該第５の工程Ｓ５において生成された混合液を遠心分離する第６の工程Ｓ６とを含んでいる。
【００２４】
すなわち、第１の工程Ｓ１においては、基材２の表面にビオチン３を標識したビオチン化ナノ液滴含む第１の溶液を生成し、第２の工程Ｓ２においては、ストレプトアビジン４にＡＦ６４７  ６を標識して第２の溶液を生成し、第３の工程Ｓ３においては、ＣＣＡ１抗体５にビオチン３を標識してビオチン化ＣＣＡ１抗体を含む第３の溶液を生成することとしている。
【００２５】
そして、第４の工程Ｓ４では、第２の溶液（例えば、０．4μM）と第３の溶液（例えば、０．４μM）とを混合し、１５分間静置して複合化させることにより第４の溶液を生成する。また、第５の工程Ｓ５では、第１の溶液を希釈（例えば、２０倍に希釈）したもの（例えば、５０μL）と、第４の溶液（例えば、５０μL）とを混合し、例えば、４℃で３０分間反応させる。これにより、造影剤の基材２の表面にＣＣＡ１抗体とＡＦ６４７  ６を同時に修飾する。
さらに、第６の工程Ｓ６では、第５の工程Ｓ５において生成された混合液を、例えば、３０００Ｇで５ｍｉｎ間遠心分離することにより、本実施形態に係る造影剤１が製造される。本工程では、造影剤１上に修飾されなかった遊離の複合体を造影剤と分離し、取り除く。
【００２６】
ここで、第４の工程Ｓ４に先立って第３の工程Ｓ３を行うこと、第４の工程Ｓ４においては、第２の溶液と第３の溶液がモル比１：１で混合されること、および、第５の工程Ｓ５においては、第１の溶液を１０倍以上に希釈してから第４の溶液と混合することが重要である。
第２の溶液の濃度は、例えば、吸光測定法により概算するこができる。また、第３の溶液の濃度は、例えば、吸光測定法およびＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いて精度よく測定することができる。
【００２７】
このようにして製造された本実施形態に係る造影剤１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る造影剤１を用いて、シャーレ上に培養した大腸がんの細胞（ＤＬＤ−１）に対する特異的結合特性を調べた。
このとき、第６の工程Ｓ６で遠心分離した上清を除去し、沈殿物をＰＢＳ（例えば１００μＬ）に再懸濁させた溶液を細胞に振りかけ、３０分静置後に培養液で表面を洗浄した。
【００２８】
特異的結合特性については、共焦点蛍光顕微鏡およびフローサイトメータで確認した。
共焦点蛍光顕微鏡画像を図３（ａ）、（ｄ）、図４（ａ）、（ｄ）に、顕微鏡明視野像を図３（ｂ）、（ｅ）および図４（ｂ）、（ｅ）に、また、これらの重畳画像を、図３（ｃ）、（ｆ）、図４（ｃ）、（ｆ）にそれぞれ示す。また、フローサイトメータの解析結果を図５（ａ）〜（ｄ）に示す。
【００２９】
図５（ａ）は、（０）インタクト、（１）相変化ナノ液滴（ＰＣＮＤ）のみ、（２）ＣＣＡ１抗体なし、（３）本実施形態の造影剤１の細胞内取り込みによる蛍光量と細胞数との関係を示し、図５（ｂ）は、（ａ）の各場合の平均蛍光量を示している。また、図５（ｃ）は、（ａ）と内包成分の異なる相変化ナノ液滴を用いた場合の、（０）インタクト、（２）ＣＣＡ１抗体なし、（３）本実施形態の造影剤１の細胞内取り込みによる蛍光量と細胞数との関係を示し、図５（ｄ）は（ｃ）の各場合の平均蛍光量を示している。
【００３０】
これらの図によれば、本実施形態に係る造影剤１は、第３の分子プローブ５であるＣＣＡ１抗体が標識されているために、細胞への集積性が高いことが示された。また、本実施形態に係る造影剤１は、ナノサイズで作成できるため、培養時間が短ければ細胞表面に結合させられ、培養時間が長くなると造影剤が細胞内部に入り込む現象（インターナリゼーション）を示す。その結果、生体への投与からの経過時間によって、異なる機能をイメージングすることができる。また、その効果は、内包成分に依存しない。
【００３１】
また、本実施形態に係る造影剤１は、内部に水不溶性物質のパーフルオロヘキサンを内包している。このパーフルオロヘキサンは、ある閾値以上の強度で超音波を照射することにより気体へ相変化する物質である。ここで、抗体と色素を標識した本実施形態に係る造影剤１について、超音波用造影剤としての機能評価用に液体から気体への相変化を測定した結果の一例を図６および図７を用いて説明する。
【００３２】
図６は超音波照射および撮像を行うための実験系を示す図である。図中、符号７は水槽、符号８は集束超音波トランスデューサ、符号９は診断用超音波探蝕子、符号１０はアンプ、符号１１は波形発生装置、符号１２は超音波診断装置である。また、符号Ａは試料、符号Ｂは脱気水である。以下、実験の手順を説明する。
【００３３】
まず、水槽７に３７℃の脱気水Ｂを満たす。
そして、８％アクリルアミドゲル中にパーフルオロペンタン換算濃度０．０２ｍｇ／ｍＬになるように本実施形態に係る造影剤を含有させたファントム（試料Ａ）を水槽７内に設置し、これに向かって集束超音波トランスデューサ８を用いて３ＭＨｚのパルス超音波（デューティ比０．０１、１０００サイクル）を１秒間照射する。
【００３４】
超音波トランスデューサ８は、波形発生装置１１およびアンプ１０により駆動される。超音波トランスデューサ８から超音波を照射中のファントムＡの超音波画像を、超音波診断装置１２に接続された診断用超音波探蝕子１２を用いて取得する。
【００３５】
図７（ａ）、（ｂ）は、超音波画像上で輝度変化を生じるのに必要な超音波強度（閾値：診断用のミクロンサイズ気泡の生成に必要な超音波強度に相当）以上の超音波を照射する前後の腫瘍の超音波画像を示したものである（図７（ｂ）中の矢印参照。）。このとき、診断用の超音波は相変化の閾値を下回るように設定してあるため、診断用の超音波で得ているエコー信号は、既に気泡化したバブルからの散乱波であることを示している。
【００３６】
なお、集束超音波トランスデューサ８からの超音波照射条件を９ＭＨｚに変化させた場合も、強度やサイクル数、照射時間を最適化することで、図７と同等の結果を得ることができた。ここで示した結果から、本実施形態のような液体から気体への相変化を伴う水不溶性物質を内包した造影剤１の効果は、超音波診断像における輝度変化によって明らかである。
【００３７】
なお、本実施形態と同様の効果は低沸点水不溶性物質と高沸点水不溶性物質を組み合わせた造影剤でも同様に得られた。
また、このように、光学プローブ６とＣＣＡ１抗体等の分子プローブ５が基材２の表面に搭載されていても、気相化が可能であることが確認された。
【００３８】
また、本実施形態に係る製造方法の順序ではない場合、例えば、図８（ａ）に示すような工程順序とした場合には、図８（ｂ）、（ｃ）に示されるように、造影剤が凝集してしまい、標的分子に特異的に結合する機能を生じさせることは困難である。図８（ａ）に示す工程順序は、上述した第１の工程Ｓ１および第２の工程Ｓ２の後に、第１の溶液と第２の溶液とを混合し、生成された溶液に、ＣＣＡ１抗体にビオチンを標識してビオチン化ＣＣＡ１抗体を含む溶液を混合している。
【００３９】
図８（ｂ）は、ビオチン化相変化ナノ液滴にＡＦ６４７修飾ストレプトアビジンを修飾した溶液、図８（ｃ）は、（ｂ）の溶液にビオチン化ＣＣＡ１抗体を修飾した溶液を細胞に適用した場合の顕微鏡写真である。
【００４０】
また、第５の工程Ｓ５において、第１の工程Ｓ１で生成された第１の溶液を原液のまま使用した場合にも、図９（ａ）に示すように、造影剤が凝集してしまい、標的分子に特異的に結合する機能を生じさせることは困難である。
【００４１】
このように、本実施形態に係る造影剤１およびその製造方法によれば、造影剤１どうしの凝集を起こさず、第３の分子プローブ５によって生体（細胞）の標的分子にのみ特異的に結合させることができるという利点がある。また、生体への投与からの経過時間を利用して、生体側の異なる状態（機能）を光および超音波によってイメージングすることができるという利点もある。
【００４２】
その結果、本実施形態に係る造影剤１の蛍光イメージングを用いて、予め、細胞に対するインターナリゼーションのタイミング等、本実施形態に係る造影剤１の細胞挙動を把握しておくことが可能となる。また、リアルタイムに蛍光を観測しながら、最適な時間で超音波を照射することができる。
【００４３】
すなわち、超音波造影可能な基材２に分子プローブ３と光学プローブ６を標識することにより、超音波のみならず、リアルタイム性と分解能に優れる光に対しても感受性を有し、かつ血管より組織に移行可能なサイズの造影剤を提供することができる。そして、これにより、細胞レベルでの「疾患の早期診断」を行うことができるという利点がある。
【００４４】
また、超音波を照射して気相化するタイミングを適宜設定することが可能になる。すなわち、本実施形態に係る造影剤１を用いることによって、超音波においても様々な機能イメージングが可能になる。
【００４５】
なお、本実施形態では、造影剤１の内包物質として、超音波照射により気化する水不溶性物質であるパーフルオロヘキサンとしたが、他の水不溶性物質であっても構わないし、沸点の異なる水不溶性物質を複数組み合わせてもよい。さらに、超音波と光以外のモダリティと併せて利用できるよう、他のモダリティ感受性のある造影物質を造影剤に含有させても構わない。
分子プローブ３〜５や光学プローブ６も、本実施形態に用いたものに限定されない。
【００４６】
また、本実施形態においては、内包物質をパーフルオロヘキサンに代えて、パーフルオロブタンを含む溶液とし、外皮をポリエチレングリコールからなる脂質膜で覆ったナノサイズのバブルリポソームとしてもよい。
このように構成された造影剤１をマウスの尻尾に注射すると、ナノサイズによるＥＰＲ効果と抗体によるアクティブ結合とによって、図１０（ａ）、（ｂ）に示されるように、腫瘍組織にのみ選択的に集積させることができる。これにより、内包物質を気相化させなくても超音波イメージングを行うことができるという利点がある。
【００４７】
造影剤１の内包物質としては、空気やアルゴン、パーフルオロブタン、パーフルオロプロパン等の気体そのものであってもよい。また、外皮もポリエチレングリコールからなる脂質膜に限定されるものではなく、他の親水基を有する脂質等であっても構わない。また、インターナリゼーションの情報が不要である場合には、光学色素の標識の工程を省いてもよい。
【００４８】
また、本実施形態に係る造影剤は、癌細胞に対する組織選択性、および、細胞内部へ入り込むインターナリゼーション能を有することから、任意の癌細胞内へのデリバリー体にもなり得る。デリバリー体としての構成要件は、ターゲッティング用の分子プローブに光学活性を有するコンジュゲート用分子プローブを介して結合した基材にするなど、本実施形態に係る造影剤と同じ構成で構わない。
【００４９】
また、基材には、抗がん機能を発現し得る所望の物質を含有させることが可能である。また、治療用超音波を照射したときのみ開封する物質を含有させてもよい。このように構成されたデリバリー体は、例えば、診断・治療薬として用いてもよい。
【００５０】
次に、本発明の第２の実施形態に係る造影剤の製造方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る造影剤は、内包物質として、２種類の気体、パーフルオロヘキサンとパーフルオロペンタンとを混合比１：１で混合した気体を採用している。
このように構成された本実施形態に係る造影剤の大きさと他の製造方法による造影剤の大きさとの比較を表１に示す。表１は２つの実験例である。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
第１の工程で生成された第１の溶液に、ストレプトアビジン（ＳＡ）を単独で添加すると、サイズがかなり大きくなって凝集するが、本実施形態に係る製造方法で作成するとナノサイズを保持したまま抗体を標識することができる。水不溶性物質の混合比は本実施形態に限定されるものではない。気相化させたい条件（気泡径、気相化の持続時間、周波数応答性および超音波強度の閾値など）に応じて、内包物質やその組み合わせ、比率等を適宜設計変更することが可能である。
【００５３】
このように、本実施形態に係る製造方法により製造された造影剤は、内包する気体を変更しても、造影剤どうしの凝集を起こさず、第３の分子プローブによって生体（細胞）の標的分子にのみ特異的に結合させることができる。また、生体への投与からの経過時間を利用して、生体側の異なる状態（機能）をイメージングすることができる。
【００５４】
ここで、第３の分子プローブ５であるＣＣＡ１抗体を変更することなく、ＤＬＤ１細胞に代えて、ＨＣＴ１１６細胞およびＡＧＳ細胞に対する特異的結合特性を調べた。
具体的には、ＨＣＴ１１６細胞およびＡＧＳ細胞の培養皿に添加し、例えば１時間静置した後、培地で表面を洗浄し、例えば、３時間後に共焦点レーザ顕微鏡で特異的な細胞内取り込みを観察するとともに、１２時間の培養後にＰＢＳで洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を培養皿から剥離して、フローサイトメータ解析を行った。
【００５５】
集積結果を図１１（ａ）〜（ｆ）および図１２（ａ）〜（ｆ）に示す。図１１（ａ）〜（ｃ）、図１２（ａ）〜（ｃ）は、ＨＣＴ１１６細胞に対する特異的細胞内取り込み、図１１（ｄ）〜（ｆ）、図１２（ｄ）〜（ｆ）はＡＧＳ細胞に対する特異的細胞内取り込みを示している。また、フローサイトメータの解析結果を図１３（ａ）〜（ｄ）に示す。
【００５６】
本実施形態に係る造影剤は、ＨＣＴ１１６細胞にも集積、内部移行し、ＣＣＡ１の発現量が少ないと報告されているＡＧＳ細胞には集積しなかった。
このようにすることで、本実施形態に係る造影剤は、標識した抗体に対応する抗原にのみ特異的に結合させることができ、他の細胞と明瞭に区別することができるという利点がある。
【００５７】
また、本発明においては、図１４に示される製造キット２１により造影剤１を製造することにしてもよい。
この製造キット２１は、第１〜第３の溶液を無菌的に収容する収容部２２，２３，２４と、これら収容部２２〜２４を接続する流路２５，２６とを備えている。各流路２５，２６にはバルブ２７，２８が設けられており、バルブ２７，２８の操作によって流路２５，２６を開閉することができるようになっている。
【００５８】
第２の流路２６のバルブ２８を開いて第２の溶液と第３の溶液とを混合して第４の溶液を生成した後、第１の流路２５のバルブ２７を開いて第１の溶液と第４の溶液とを混合するとともに、製造キット全体を遠心分離機にかけることにより、無菌的に本実施形態に係る造影剤１を製造することができる。なお、バルブを開く順番は、バルブ２８の後にバルブ２７の順番のみで開くような安全装置を設けてもよい。
【符号の説明】
【００５９】
１  造影剤
２  基材
３  第１の分子プローブ
４  第２の分子プローブ
５  第３の分子プローブ
６  光学プローブ
２１  製造キット
２２〜２４  収容部
２５，２６  流路
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【図１４】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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