(57)【要約】【課題】細胞の増殖能を簡便かつ迅速に評価する方法の提供。【解決手段】細胞の硬度を指標として細胞の増殖能を評価する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の硬度を指標として、細胞の増殖能を評価する方法。
【請求項２】
細胞の硬度が、細胞のヤング率またはバネ定数により評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞のヤング率またはバネ定数が、細胞に一定の機械的変形を生じさせた場合に機械的変形に対して細胞が示す垂直応力または剪断応力を測定することにより求められる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞の垂直応力または剪断応力が、走査型プローブ顕微鏡により測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞が、細菌、酵母および動物細胞から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
物質と接触させた細胞の硬度を指標として、物質の生理活性を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の増殖能の評価方法に関し、具体的には、細胞の硬度を指標とする細胞の増殖能の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の増殖能の評価は、細胞を経時的に計数し、増殖曲線を作成することにより行っていた。しかし、この方法では死細胞も含めて計数してしまう可能性があるために、その後、ＭＴＴ試験やＢｒｄＵの取り込み試験のような、生きた細胞の代謝活性を利用して細胞の増殖能を評価する方法が確立された。
【０００３】
例えば、ＭＴＴ試験は、細胞のＭＴＴや類似の色素（ＸＴＴ、ＭＴＳ、ＷＳＴなど）を紫色のホルマザン色素へと還元する能力を利用した比色定量法である（Mosmann T., “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay”, Journal of immunological methods, (1983) 65(1-2): 55-63）。この方法によれば、色素の還元能力は生細胞のみが有するために、培養細胞の生存率や増殖率を正確に評価することができる。一方でこの方法の問題点は、経時的な細胞数のモニタリングが必要であるために長時間の培養が不可欠であり、かつ、十分な感度を得るためには十分量の細胞数が必要であることである。このため、菌体数が少ない場合には、事前のさらなる長時間の培養が不可欠である。また、試験の性質上、測定対象の細胞は単離されている必要もある。また、ＢｒｄＵの取り込み試験による方法は、ＤＮＡ合成時のＤＮＡへのＢｒｄＵの取り込みの量を測定することによって、細胞の増殖能を評価する方法であるが、経時的な細胞数のモニタリングが必要である。
【０００４】
このように、細胞の性質を生物学的な特徴に基づいて評価する方法では、菌体の単離や長時間の培養が必要となることが多い。
【０００５】
ところが、現実には、試料に複数種の細胞が含まれている場合や、含まれる細胞の濃度が希薄である場合がある。このような場合であっても、細胞を単離せずに、かつ迅速に、その測定試料中の細胞の増殖能を評価できる方法論の確立が強く望まれていた。
【０００６】
一方で、これまでに物理化学的な特徴に基づいた細胞の性質の評価も試みられている。しかし、このような細胞の物理化学的な性質が、細胞の増殖能などの性質を評価する有効なツールとなることについては、ほとんど知られていない（特許文献１〜４および非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２６１９２３号公報
【特許文献２】特開２０００−３００２９０号公報
【特許文献３】特表２００２−５１００４９号公報
【特許文献４】特開２００６−５５１６１号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yan W., et. al., Bioresouce Technology (2010) 101: 2867-2871
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、細胞の増殖能を簡便かつ迅速に評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、細胞表面に一定の機械的変形を与えたときに発生する応力が細胞の増殖（細胞の増殖段階）と相関すること、および、細胞表面に一定の機械的変形を与えたときに発生する応力を測定することにより、細胞の増殖段階を評価することができ、また、増殖能を簡便かつ迅速に評価できることを見出した。本発明は、このような知見に基づくものである。
【００１１】
すなわち、本発明では以下の発明が提供される。
（１）細胞の硬度を指標として、細胞の増殖能を評価する方法。
（２）細胞の硬度が、細胞のヤング率またはバネ定数により評価される、上記（１）に記載の方法。
（３）細胞のヤング率またはバネ定数が、細胞に一定の機械的変形を生じさせた場合に機械的変形に対して細胞が示す垂直応力または剪断応力を測定することにより求められる、上記（２）に記載の方法。
（４）細胞の垂直応力または剪断応力が、走査型プローブ顕微鏡により測定される、上記（３）に記載の方法。
（５）細胞が、細菌、酵母および動物細胞から選択される、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）物質と接触させた細胞の硬度を指標として、物質の生理活性を評価する方法。
【００１２】
本発明では、測定対象となる細胞の硬度を指標として、簡便かつ迅速に細胞の増殖能を評価することができる。細胞の単離が不要なため、細胞の混合物をそのまま測定に供することもでき、細胞の存在環境下における増殖能を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、大腸菌Escherichia coliの硬度と増殖曲線との関係を示す図である。
【図２】図２は、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus subsp. aureusの硬度と増殖曲線との関係を示す図である。
【発明の具体的な説明】
【００１４】
本発明によれば、対象となる細胞の硬度を指標として、細胞の増殖能を簡便かつ迅速に評価する方法が提供される。
【００１５】
本発明では、細胞が少なくとも１つ存在すれば、細胞の増殖能を評価することができる。従って、細胞濃度が十分に得られない試料を測定する際（例えば、吸光度による分析が困難な場合等）に好適に用いられ得る。
【００１６】
本発明において測定対象となる細胞としては、細菌などの原核生物、真菌などの真核生物、および古細菌の細胞が挙げられ、単細胞生物であれば細胞壁の有無に関わらずいずれの細胞でも測定対象とすることができる。また、本発明では、動物や植物などの多細胞生物の細胞であっても、測定に用いることができる。なお、本明細書において「細胞」は、単細胞生物自体を意味するものとして用いられることがある。
【００１７】
本発明の測定対象となる細菌としては、細菌であれば特に限定されないが、例えば、ナイセリア属（Neisseria）、ブランハメラ属（Branhamella）、ヘモフィルス属（Haemophilus）、ボルデテラ属（Bordetella）、エシェリキア属（Escherichia）、シトロバクター属（Citrobacter）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、クレブシエラ属（Klebsiella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、セラチア属（Serratia）、ハフニア属（Hafnia）、プロテウス属（Proteus）、モルガネラ属（Morganella）、プロビデンシア属（Providencia）、エルシニア属（Yersinia）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ビブリオ属（Vibrio）、エロモナス属（Aeromonas）、シュードモナス属（Pseudomonas）、キサントモナス属（Xanthomonas）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、ブルセラ属（Brucella）、レジオネラ属（Legionella）、ベイロネラ属（Veillonella）、バクテロイデス属（Bacteroides）およびフゾバクテリウム属（Fusobacterium）などのグラム陰性菌；ならびに、ブドウ球菌属（Staphylococcus）、レンサ球菌属（Streptococcus）、腸球菌属（Enterococcus）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、バシラス属（Bacillus）、リステリア属（Listeria）、ペプトコッカス属（Peptococcus）、ペプトストレプトコッカス属（Peptostreptococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、ユーバクテリウム属（Eubacterium）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、エンテロコッカス属（Enterococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）およびストレプトコッカス属（Streptococcus）などのグラム陽性菌が挙げられる。測定対象としては、ブドウ球菌属、リステリア属、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、エンテロコッカス属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、ロイコノストック属およびストレプトコッカス属、ビブリオ属、サルモネラ属、エシェリキア属、カンポロバクター属、アンフィバシラス属、バシラス属、クロストリジウム属およびスポロサルシナ属の細菌が好ましく、黄色ブドウ球菌；リステリア菌；乳酸菌；腸炎ビブリオ；サルモネラ菌；大腸菌；カンピロバクター；ならびにアンフィバシラス属、バシラス属、クロストリジウム属およびスポロサルシナ属などの芽胞形成菌が好ましく用いられ得る。中でも、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus、特にStaphylococcus aureus subsp. aureus、大腸菌Escherichia coli、およびバシラス属の芽胞形成菌である枯草菌Bacillus subtilisが好ましく用いられ得る。
【００１８】
本発明の測定対象となる真菌としては、担子菌門（Basidiomycota）、子嚢菌門（Ascomycota）、ツボカビ門（Chytridiomycota）、ネオカリマスティクス菌門（Neocallimastigomycota）、コウマクノウキン門（Blastocladiomycota）、微胞子虫門（Microsporidia）、グロムス門（Glomeromycota）、ケカビ亜門（Mucoromycotina）、ハエカビ亜門（Entomophthoromycotina）、トリモチカビ亜門（Zoopagomycotina）、キックセラ亜門（Kickxellmycotina）などの真菌が挙げられる。測定対象としては担子菌門または子嚢菌門に属する酵母が好ましく、酵母としては、例えば、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、カンジダ属（Candida）、トルロプシス属（Torulopsis）、ザイゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）、スキゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）、ピチア属（Pichia）、ヤロウィア属（Yarrowia）、ハンセヌラ属（Hansenula）、クルイウェロマイセス属（Kluyeromyces）、デバリオマイセス属（Debaryomyces）、ゲオトリクム属（Geotrichum）、ウィッケルハミア属（Wickerhamia）、フェロマイセス属（Fellomyces）などの子嚢菌門に属する酵母および、スポロボロマイセス属（Sporobolomyces）などの担子菌門に属する酵母が好ましく用いられ得る。サッカロマイセス属の出芽酵母であるSaccharomyces cerevisiaeおよびSaccharomyces pastrianus、ならびにスキゾサッカロマイセス属の分裂酵母であるSchizosaccharomyces pombeが好ましく用いられ、Saccharomyces pastrianusがより好ましく用いられ得る。
【００１９】
測定対象の細胞は、単離して培養した細胞だけでなく、溶液中等に混入した細胞や細胞の混合物であってもよい。本発明では、少なくとも１つの細胞を測定できれば細胞の増殖能の評価が可能であるため、評価したい細胞を必ずしも単離する必要はなく、当該細胞の存在する環境下での細胞の増殖能を評価することが可能である。また、本発明の測定対象となる細胞は、当該細胞の増殖に適した培養条件下で培養してから測定に用いることもできる。各細胞の増殖に適した培養条件は、当業者であれば適宜決めることができる。細胞は、当該細胞の存在環境下から採取したものを直接測定に用いる場合も、当該細胞の増殖に適した培養条件下で培養してから測定に用いる場合も、適宜固定してから測定に用いることができる。生きた細胞を測定する固定法としては特に限定されないが、風乾固定が挙げられ、微生物の測定に用いることができる。動物細胞を測定する場合には、液相で測定することが可能であり、固定は不要である。
【００２０】
本明細書では、細胞の「硬度」とは、細胞のひずみまたは機械的変形と応力との関係から評価される細胞の硬さを意味する。すなわち、細胞の「硬度」が高いとは、細胞がひずみまたは機械的変形に対して大きな応力を発生することを意味し、細胞の「硬度」が低いとは、細胞がひずみまたは機械的変形に対して小さな応力を発生することを意味する。本発明によれば、本発明で指標とする細胞の硬度は、下記に詳述するヤング率Ｅ（単位：Ｎ／ｍ２）またはバネ定数（単位：Ｎ／ｍ）により評価することができる。
【００２１】
ヤング率Ｅまたはバネ定数ｋは、応力とひずみまたは機械的変形量との関係を測定できる方法であれば特に限定されないが、走査型プローブ顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＳＰＭ）を用いた測定法やナノインデンテーション法などの測定方法により測定することができる。
【００２２】
ヤング率Ｅ（単位：Ｎ／ｍ２）は、一般的に、
【数１】
2014045667.tif 000002
として表すことができる｛ここで、応力σは、単位面積当たりの力（Ｎ／ｍ２またはＰａ）であり、ひずみεは、応力σによる変形の単位長さ当りの伸縮量である｝。ヤング率Ｅと応力σおよびひずみεとの上記関係式によれば、細胞のヤング率は、細胞に一定のひずみεを与えたときに細胞が発生する応力を測定することにより、または、細胞に一定の力を加えたときに発生する細胞のひずみεを測定することにより求めることができる。
【００２３】
細胞のひずみεは、例えば、応力σを負荷した際の細胞の厚みの変化（Ｌ０−Ｌ）を無負荷時の細胞の厚み（Ｌ０）で除して、ε＝（Ｌ０−Ｌ）／Ｌ０として求めることができる。応力の無負荷時の細胞の厚みＬ０に経時変化がほとんど見られないときには、細胞のひずみεと細胞の厚みの変化量（Ｌ０−Ｌ）は比例関係となる。従って、応力の無負荷時の細胞の厚みＬ０に経時変化がほとんど見られないときには、本発明では、(i) 一定の応力σを負荷した際の細胞の厚み（Ｌ）若しくは厚みの変化量（Ｌ０−Ｌ）、または、(ii) 細胞の厚み（Ｌ）若しくは厚みの変化量（Ｌ０−Ｌ）を一定にするために要する応力σを硬度の指標として用いても細胞の増殖能を評価することができる。厚みの変化量（Ｌ０−Ｌ）を一定にして応力Ｆを測定する場合には、厚みの変化量は、例えば、１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の値、若しくは、２５ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の値、または、５０ｎｍとすることができる。
【００２４】
バネ定数ｋ（単位：Ｎ／ｍ）は、一般的に、
【数２】
2014045667.tif 000003
として表すことができる｛ここで、応力Ｆは、機械的変形量（ｘ−ｘ０）（単位：ｍ）を発生させるために必要な力（単位：Ｎ）である｝。バネ定数ｋは、機械的変形量（ｘ−ｘ０）を一定にして応力Ｆを測定して求めてもよいし、応力Ｆを一定にして機械的変形量（ｘ−ｘ０）を測定して求めてもよい。応力Ｆまたは機械的変形量（ｘ−ｘ０）が一定値であれば、バネ定数ｋは、測定対象となる応力Ｆに比例し、測定対象となる機械的変形量（ｘ−ｘ０）に反比例するので、測定対象となる応力Ｆまたは機械的変形量（ｘ−ｘ０）そのものを硬度の指標として用いて細胞の増殖能を評価してもよい。機械的変形量（ｘ−ｘ０）を一定にして応力Ｆを測定する場合には、機械的変形量は、例えば、１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の値、若しくは、２５ｎｍ〜１００ｎｍの範囲の値、または、５０ｎｍとすることができる。
【００２５】
上記ヤング率Ｅとバネ定数ｋとは、細胞の厚みや形状が一定である場合には、単位面積当りのバネ定数ｋがヤング率Ｅに比例する。上述のように、本発明では、細胞の硬度として細胞のヤング率Ｅまたはバネ定数ｋのいずれを測定して評価してもよい。
【００２６】
細胞の「応力」（以下、「表面応力」ということがあり、ヤング率を測定する場合には単位面積当りの応力（Ｎ／ｍ２）を意味し、バネ定数を測定する場合には応力（Ｎ）を意味する。）には、細胞表面に対して垂直方向に作用する「垂直応力」と、細胞表面に対して平行に作用する「剪断応力」が存在する。本発明では、垂直応力および剪断応力のいずれもが測定対象の応力である。細胞の垂直応力は、例えば、ＳＰＭを用いて測定する場合には、カンチレバーにより細胞表面に垂直方向にひずみまたは機械的変形を生じさせたときに発生する応力を測定することにより求めることができる。また、細胞の剪断応力は、例えば、ＳＰＭを用いて測定する場合には、カンチレバーにより細胞表面に水平方向にひずみまたは機械的変形を生じさせたときに発生する応力を測定することにより求めることができる。表面応力は、気相および液相のいずれでも測定することが可能であるが、気相か液相かの選択は、上述のように、細胞が気相での測定に適しているか否かにより判断することができる。通常は、微生物は、気相でも液相でも測定が可能であると考えられるが、動物細胞は、気相での測定には適さないことが多く、液相での測定が推奨される。
【００２７】
本発明の細胞の増殖能の評価法では、細胞の硬度（例えば、ヤング率若しくはバネ定数）が低い場合には、特に、細胞が増殖の準備中である、すなわち、細胞が増殖を活発化させる可能性が高いと評価することができ、細胞の硬度が高いほど細胞の増殖能が低いと評価することができる。なお、ヤング率Ｅの算出式によれば、ヤング率Ｅが大きくなるとは、応力σが大きくなるか、ひずみεが小さくなることを意味し、また、バネ定数ｋの算出式によれば、バネ定数ｋが大きくなるとは、応力Ｆが大きくなるか、機械的変形量（ｘ−ｘ０）が小さくなることを意味する。例えば、本発明の細胞の増殖能の評価法では、細胞に一定の力を加えたときの細胞のひずみεまたは機械的変形量（ｘ−ｘ０）が大きい場合には、細胞が増殖の準備中である、すなわち、細胞が増殖を活発化させる可能性が高いと評価することができ、小さい場合には、細胞の増殖能が低いと評価することができる。また、細胞に一定のひずみεまたは機械的変形（ｘ−ｘ０）を加えたときにそれに対して細胞が示す応力が小さい場合には、細胞が増殖の準備中である、すなわち、細胞が増殖を活発化させる可能性が高いと評価することができ、大きい場合には、細胞の増殖能が低いと評価することができる。この際、細胞毎に増殖曲線と硬度の経時変化との対応関係を予め決定しておけば、決定された対応関係に基づいて細胞の硬度から、より正確に該細胞の増殖段階を評価することが可能である。
【００２８】
本発明では、細胞の硬度に閾値を設けて、硬度が閾値以下である場合には、細胞は増殖能が高いと判定し、閾値以上である場合には、細胞は増殖能が低いと判定することもできる。同様に、細胞に一定のひずみεや機械的変形（ｘ−ｘ０）を加えたときの応力や細胞に一定の力を加えたときの機械的変形量（ｘ−ｘ０）やひずみεについても、閾値を設けて、細胞の増殖能を評価することができる。例えば、バネ定数ｋの閾値は、機械的変形量および細胞により異なるが、例えば、細胞が微生物である場合は、例えば、０．０８〜０．１２（Ｎ／ｍ）の範囲の値、例えば、０．０８（Ｎ／ｍ）、０．１（Ｎ／ｍ）または０．１２（Ｎ／ｍ）とすることができる。
【００２９】
本発明によれば、培養開始直後の細胞の硬度と、培養が進んで細胞がほとんど増殖しなくなった段階での細胞の硬度とは、同等程度である。従って、対象となる細胞が既に決まっている場合には、予め細胞の培養開始直後の細胞の硬度を調べておき、この硬度と対象となる細胞の硬度とを比較することにより、対象となる細胞の増殖能を評価してもよい。
【００３０】
本発明の細胞の増殖能の評価方法は、細胞の増殖段階（活発な細胞分裂が起こるまでの「誘導期」、続いて細胞数の増加が指数関数的に起こる「対数増殖期」、および増殖が停止した後の「定常期」からなる増殖段階であり、発育相（growth phase）とも呼ばれる）の判定方法と捉えることもできる。すなわち、本発明によれば、細胞の硬度が低い場合には、細胞の増殖段階が誘導期であると判定することができ、細胞の硬度が高い場合には、細胞の増殖段階が定常期であると判定することができる。この際、細胞の硬度と増殖曲線との相関を予め調べておけば、この硬度と対象となる細胞の硬度とを比較することにより、より正確な増殖段階の判定が可能となる。また、適宜硬度の閾値を定めて、閾値より低い硬度を示す細胞を誘導期の細胞と判定し、また、他の閾値を定めて、閾値より高い硬度を示す細胞を定常期の細胞と判定することができる。また、誘導期でも定常期でもない細胞を対数増殖期の細胞と判定してもよい。細胞の増殖段階は、細胞の今後の増殖活性を予測する上で重要である。例えば、細胞が誘導期であることが分かれば、細胞は今後活発に増殖すると予測することができ、また、細胞が定常期にあれば、細胞は増殖をしない可能性が高いと予測することができる。
【００３１】
本発明によれば、増殖の活発さによって細胞の硬度が変化する。従って、本発明では、硬度を指標として、細胞に接触させた物質の生理活性および培地の栄養特性を評価することができる。具体的には、接触させた物質によって細胞の増殖能が増大する（または増殖を活発化させる可能性が大きい）ほど硬度は低下し、増殖能が低下するほど硬度は増大する。従って、本発明では、接触させた結果、硬度が低下した場合には、接触させた物質または培地が細胞の増殖能を活発化させる物質または培地であると評価することができ、硬度が増大した場合には、接触させた物質または培地が細胞の増殖能を低下させる物質または培地であると評価することができる。
【００３２】
本発明では、細胞が存在する環境下における細胞の増殖能を評価することができる。従って、本発明は、例えば、水や飲食品等に細胞が存在した場合に、その細胞がその存在環境下において増殖するものか否かを評価する場合に利用することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００３４】
実施例１：供試微生物試料の調製
１−１．供試細胞株
供試微生物株として、枯草菌Bacillus subtilis NBRC13719T株、大腸菌Escherichia coli IFO3301株、黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus subsp. aureus NBRC100910株および酵母Saccharomyces pastorianus RIB2010株の継代培養株（定常期）を用いた。また、動物細胞株として、正常ＳＤラット肝細胞であるｒｔＮＨｅｐｓ細胞（商標）（タカラバイオ社製）を用いた。
【００３５】
１−２．培養条件
酵母Saccharomyces pastorianus RIB2010株は、ＹＭ培地（Ｄｉｆｃｏ社製、製品番号：２７１１２０）を用いて２５℃で４８時間培養した。その他の供試微生物株は、肉汁培地（Ｄｉｆｃｏ社製、製品番号：２３４０００）を用いて３５℃で１２時間または２４時間培養した。また、動物細胞は、φ５ｍｍカバーグラス上で、肝細胞基本培地（タカラバイオ社製）を用いて５％ＣＯ２存在下で３７℃で１日間、３日間、または７日間培養した。
【００３６】
１−３．測定用試料の調製
培養後は、供試微生物株および動物細胞は、測定のために以下のように固定した。すなわち、供試微生物株は、遠心分離（５，０００ｒｐｍ）により培地を除去して菌体を回収し、純水で１回洗浄を行ったのちに、純水に懸濁した。気相で測定する場合には、供試微生物株では、その純水懸濁液をスライドグラス上に滴下し、風乾固定を行った。細胞を生きた状態で測定するため、風乾固定後の試料は、直ちに測定に用いた。
【００３７】
液相で測定する場合には、供試微生物株では、孔径０．２μｍまたは０．４μｍのポリカーボネート製のニュークリポアフィルター（野村マイクロサイエンス社）で供試微生物株の純水懸濁液を集菌し、その後、フィルターをＳＰＭの試料用チャンバーの大きさに合わせてカットしてチャンバーにいれ、その後、チャンバーを純水で満たした。
【００３８】
動物細胞を測定する場合には、細胞が接着したカバーグラスを培養液で満たしたチャンバーにいれた。
【００３９】
１−４．試料測定用の走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）
気相での細胞の計測には、ナノサーチ顕微鏡ＳＦＴ−３５００（島津製作所社製）を用い、液相での細胞の計測には、走査型プローブ顕微鏡ＳＰＭ−９６００（島津製作所社製）を用いた。いずれの場合も、カンチレバーとしては、２（Ｎ／ｍ）のバネ定数を有するオリンパス社製のプローブ（製品番号：OMCL-AC240TS）を用いた。
【００４０】
実施例２：機械的変形に対する供試細胞株の垂直応力の測定
本実施例では、ＳＰＭカンチレバーを細胞試料に接触させ、一定距離押し込んだときにカンチレバーが受ける垂直応力を測定した。
【００４１】
まず、気相で供試細胞株試料の垂直応力を測定した。具体的には、スライドグラス上の細胞に対し、上からＳＰＭカンチレバーを接触させ下に５０ｎｍ押し込んだときにカンチレバーが受ける応力を垂直応力（ｎＮ）として測定し、硬度の指標としてバネ定数（Ｎ／ｍ）を求めた。
【００４２】
結果は、表１に示される通りであった。
【００４３】
【表１】
2014045667.tif 000004
【００４４】
表１に示されるように、測定した４種の供試細胞株の垂直応力から求められるバネ定数ｋはいずれも、培養開始１２時間後よりも、２４時間後で上昇していた。すなわち、いずれの供試細胞株も、細胞が増殖すると共に細胞はよりバネ定数ｋ（あるいは垂直応力）を増大させる傾向を示した。このことから、測定されたバネ定数は細胞採取時のバネ定数を反映していること、並びに、培養に伴うバネ定数ｋ（あるいは垂直応力）の増加は、細胞壁の有無によらないこと、および、広い生物種における共通した現象であることが示唆された。
【００４５】
実施例３：機械的変形に対する供試細胞株の剪断応力の測定
本実施例では、機械的変形に対して動物細胞が示す応力を測定するため、液相において剪断応力の測定を行った。
【００４６】
動物細胞は、微生物とは異なり気相では測定ができないため、液相で剪断応力を測定した。微生物株の測定では、カンチレバーをフィルター面に対して垂直（下）に押し込むことにより細胞からの応力を測定したが、カバーグラス上で培養した動物細胞に対しては、カンチレバーを下に押し込むことができないため（カバーグラスのひずみが測定に影響するため）、カンチレバーを細胞に接触させ水平方向に５０ｎｍ移動させたときにカンチレバーにかかる応力を剪断応力（ｎＮ）として測定し、硬度の指標としてバネ定数ｋ（Ｎ／ｍ）を求めた。参考として、実施例２において気相で測定した供試微生物株についても、液相で測定した。
【００４７】
結果は、表２（動物細胞株）および表３（微生物株）に示される通りであった。
【００４８】
【表２】
2014045667.tif 000005
【００４９】
【表３】
2014045667.tif 000006
【００５０】
表３に示されるように、実施例２の供試微生物株について測定方法を変えた場合であっても、実施例２と同様にバネ定数ｋ（あるいは剪断応力）は培養時間の経過に伴い増すことが明らかとなった。また、表２に示されるように、動物細胞は、培養時間が経過すると共にそのバネ定数ｋ（あるいは剪断応力）を増していくことが分かった。このことから、培養時間の経過に伴い細胞の応力が増す現象は、細菌や真菌のみならず、動物細胞にも共通した現象であることが明らかとなった。
【００５１】
培養時間の経過と共に細胞のバネ定数ｋが増す現象が動物細胞においても確認されたことから、この現象は、高等動物から単細胞生物の細胞に至るまで広く共通して見られる現象であると考えられる。
【００５２】
実施例４：一定の機械的変形に対する細胞の硬度の変化と細胞の増殖との関係
実施例２および３では、細胞の培養時間の経過と共に細胞の硬度が増すことが明らかとなった。本実施例では、細胞の硬度と細胞の増殖との関係を調べた。
【００５３】
供試細胞株としては、実施例１に記載のE. coliおよびS. aureusを用い、実施例１の条件で培養した。培養開始直後（０時間）、３時間後、６時間後、９時間後、１２時間後、１５時間後、１８時間後、２１時間後および２４時間後に細胞を採取し、風乾固定した後に、実施例２と同様の条件で気相で細胞のバネ定数ｋを硬度の指標として測定した（図１および２）。同時に、採取した細胞の生菌数を測定した。生菌数は、平板塗布法により１ｍＬ当りの生菌数として求めた（図１および２）。
【００５４】
E. coliおよびS. aureusにおける結果は、それぞれ図１および２に示される通りであった。すなわち、E. coliでは、培養開始直後〜３時間後はバネ定数ｋが急激に低下し、その後は、生菌数の増加に伴って細胞のバネ定数ｋが増す傾向を示すことが明らかとなった（図１）。S. aureusでも同様の結果が確認された（図２）。すなわち、いずれの細胞においても、細胞のバネ定数ｋは、定常期では高く、誘導期で低くなる傾向が確認された。このように、細胞の硬度と細胞の増殖段階は相関を示し、機械的変形に対して細胞が示す硬度を指標として、試料中の細胞の増殖段階を評価することが可能であることが示唆された。
【００５５】
細胞増殖がほとんど停止した培養開始２４時間後では、細胞のバネ定数ｋは、培養開始直後に匹敵する値となった（図１および２）。なお、培養開始直後の細胞は、増殖が開始される前の状態（増殖が停止した状態）であると考えられ、また、培養開始２４時間後は、菌の増殖曲線を考慮すれば、増殖がほぼ停止した状態であると考えられる。
【００５６】
一方、培養開始直後〜３時間後の細胞では、バネ定数ｋが急激に低下した。また、必ずしも、バネ定数ｋの低下は細胞の増殖速度とは関連しておらず、むしろ、細胞のバネ定数ｋは、細胞増殖が実際に開始される前の段階で特に低い値を示した。
【００５７】
バネ定数ｋは、細胞の硬度（または硬さ）の一つの指標である。本実施例では、硬度の指標であるバネ定数を測定することにより、細胞の増殖能や増殖段階を評価することが可能であることが示された。また、本実施例によれば、細胞の硬度を指標として、細胞が存在する環境下における細胞の増殖能を予測または評価することが可能であることが示された。
【図１】
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【図２】
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