(57)【要約】      （修正有）【課題】ロドコッカス属細菌の遺伝子操作を効率的に進めるために、形質転換効率の向上したロドコッカス属細菌を提供すること。【解決手段】外来ＤＮＡの切断に関与する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させたロドコッカス属細菌。前記タンパク質が特定のアミノ酸配列を有する５種類のヌクレアーゼ、または該タンパク質のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含むタンパク質。あるいは該タンパク質と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させたロドコッカス属細菌。
【請求項２】
外来ＤＮＡの切断に関与する前記タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｏ）のいずれかのタンパク質である、請求項１記載のロドコッカス属細菌。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｇ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｈ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｉ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｊ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｋ）配列番号８で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｌ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｍ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｎ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｏ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項３】
外来ＤＮＡの切断に関与する前記タンパク質をコードする遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｏ）又はそのオーソログである、請求項１又は２記載のロドコッカス属細菌。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列と相同性が６０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）配列番号３で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｅ）配列番号３で示される塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｆ）配列番号３記載の塩基配列と相同性が６０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｇ）配列番号５で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｈ）配列番号５で示される塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｉ）配列番号５記載の塩基配列と相同性が６０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｊ）配列番号７で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｋ）配列番号７で示される塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｌ）配列番号７記載の塩基配列と相同性が６０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｍ）配列番号９で示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｎ）配列番号９で示される塩基配列に相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
（ｏ）配列番号９記載の塩基配列と相同性が６０％以上の塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項４】
ロドコッカス属細菌が、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株又はその変異株である、請求項１〜３のいずれか記載のロドコッカス属細菌。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のロドコッカス属細菌を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項６】
外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質をコードする遺伝子が欠失又は不活性化されたロドコッカス属細菌を作製する工程と、得られたロドコッカス属細菌を形質転換する工程とを含む、ロドコッカス属細菌の形質転換体の製造方法。
【請求項７】
外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させることを特徴とする、ロドコッカス属細菌の形質転換効率を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質をコードする遺伝子が欠失又は不活性化されたロドコッカス属細菌、及び当該細菌を利用した形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ロドコッカス属細菌はその菌体の物理的強度が強く、また、酵素を細胞内に多量に蓄積する能力を有することから、産業的に有用な微生物触媒として知られており、ニトリル化合物の酵素的水和又は酵素的加水分解によるアミド又は酸の生産等に利用されている（特許文献１及び２）。
【０００３】
例えば、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株（Ｊ１菌）は、アクリルアミドの工業的生産に使用されており、これまでに、当該微生物触媒の有する酵素活性を、遺伝子組換え技術により向上させる試みがなされている（特許文献３〜５）。
【０００４】
また、ロドコッカス属細菌の遺伝子操作を効率的に進めるために、宿主−ベクター系の開発が進められており、新規なプラスミドの探索（特許文献６〜８及び１６）やベクターの開発（特許文献９〜１１及び非特許文献１）も行われている。
【０００５】
ロドコッカス属細菌の形質転換方法としては電気パルス法（特許文献１２〜１４）やプロトプラスト法（非特許文献２及び３）が用いられ、これまでにロドコッカス  ロドクロウスＡＴＣＣ１２６７４をはじめとして多くの形質転換体が得られている。
【０００６】
本発明者らは、形質転換対象となるロドコッカス属細菌とは異なるロドコッカス属細菌又はその類縁菌から調製したプラスミドを用いることにより、形質転換対象へのプラスミドの形質転換効率が向上することを見出している（特許文献１５）。また、本発明者らはＪ１菌にＧＣＣＧＧＣを認識配列とするＩＩ型制限酵素（ＲｒｈＪ１Ｉ）を見出し、当該制限酵素に対応する修飾酵素を使用したプラスミドの修飾又は当該遺伝子の欠失により、形質転換効率が向上することを見出している（特許文献１７、特許文献１８）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平２−４７０号公報
【特許文献２】特開平３−２５１１９２号公報
【特許文献３】特開平４−２１１３７９号公報
【特許文献４】特開平６−２５２９６号公報
【特許文献５】特開平６−３０３９７１号公報
【特許文献６】特開平４−１４８６８５号公報
【特許文献７】特開平４−３３０２８７号公報
【特許文献８】特開平７−２５５４８４号公報
【特許文献９】特開平５−６４５８９号公報
【特許文献１０】特開平８−５６６６９号公報
【特許文献１１】米国特許４９２００５４号公報
【特許文献１２】特開平１０−２４８５７８号公報
【特許文献１３】特開平９−２８３８０号公報
【特許文献１４】特開平５−６８５６６号公報
【特許文献１５】特開２００５−０９５０４１号公報
【特許文献１６】特開２００６−０５０９６７号公報
【特許文献１７】特開２００７−２２８９３４号公報
【特許文献１８】特開２０１３−００５７９２号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７０，６３８−６４５（１９８８）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９８；３８（２）：１０１−６．
【非特許文献３】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８８  Ｆｅｂ；１７０（２）：６３８−４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、このような手法によるロドコッカス属細菌の形質転換は煩雑であり、簡便に形質転換を行うことは困難であった。
【００１０】
従って、本発明の主な目的は、ロドコッカス属細菌において、より簡便にかつ高い効率で形質転換を達成できる形質転換方法が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、菌体内の外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質の活性を欠失又は不活性化することにより、高効率にロドコッカス属細菌を形質転換できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質をコードする遺伝子が欠失又は不活性化されたロドコッカス属細菌に関し、より詳細には以下の通りである。
【００１３】
外来ＤＮＡの切断に関与する機能を有する前記タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｏ）のいずれかのタンパク質である、前記のロドコッカス属細菌。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｃ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｄ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｇ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｈ）配列番号６で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｉ）配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｊ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｋ）配列番号８で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｌ）配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｍ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｎ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｏ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質の活性が不活性化したロドコッカス属細菌、及びその形質転換体が提供される。本発明により提供されるロドコッカス属細菌の形質転換効率は、従来のロドコッカス属細菌よりも大幅に向上したものであり、これにより簡便かつ高効率にロドコッカス属細菌の遺伝子操作を行うことができる。本発明により、導入したＤＮＡの効果によりロドコッカス属細菌に新たな性質を付与し、産業上有用な微生物触媒等の開発が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ロドコッカス属細菌のゲノム上から所定の領域を欠失させる方法の一例（接合伝達による遺伝子欠失法）を説明するための模式図である。
【図２】プラスミドｐＫ１９ｍｏｂＳａｃＢ１の構造を示す模式図である。
【図３】ＲｒｈＪ１ＩＩＩのアミノ酸配列ホモロジーを示す図である。
【図４】ＲｒｈＪ１ＩＶのアミノ酸配列ホモロジーを示す図である。
【図５】ＲｒｈＪ１Ｖのアミノ酸配列ホモロジーを示す図である。
【図６】ＲｒｈＪ１ＶＩのアミノ酸配列ホモロジーを示す図である。
【図７】ＲｒｈＪ１ＶＩＩのアミノ酸配列ホモロジーを示す図である。
【図８】プラスミドｐＫ４の構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（１）外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質をコードする遺伝子が欠失又は不活性化されたロドコッカス属細菌
本発明に係る外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質をコードする遺伝子が欠失又は不活性化されたロドコッカス属細菌（以下、「本発明のロドコッカス属細菌」ということがある）とは、外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質の活性を有するロドコッカス属細菌において、当該外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質をコードする遺伝子が欠失又は不活性化したロドコッカス属細菌である。
【００１７】
（１−１）ロドコッカス属細菌
本発明で用いられるロドコッカス属細菌（対象微生物）は、外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質の活性を（酵素活性）有するロドコッカス属細菌であり、その種類は特には限定はされない。例えば、ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）、ロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス  ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｉｄｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス  オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス  ジョスティ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊｏｓｔｉｉ）、ロドコッカス  エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ロドコッカス  ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）、ロドコッカス  イムテケンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｍｔｅｃｈｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス  チンシェギー(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｑｉｎｇｓｈｅｎｇｉｉ) 、ロドコッカス  エスピー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）等が好ましく挙げられる。これらの中でもロドコッカス  ロドクロウスがさらに好ましい。
【００１８】
ロドコッカス  ロドクロウスとしては、例えば、ＡＴＣＣ９９９株、ＡＴＣＣ１２６７４株、ＡＴＣＣ１７８９５株、ＡＴＣＣ１５９９８株、ＡＴＣＣ３３２７５株、ＡＴＣＣ１８４、ＡＴＣＣ４００１株、ＡＴＣＣ４２７３株、ＡＴＣＣ４２７６株、ＡＴＣＣ９３５６株、ＡＴＣＣ１２４８３株、ＡＴＣＣ１４３４１株、ＡＴＣＣ１４３４７株、ＡＴＣＣ１４３５０株、ＡＴＣＣ１５９０５株、ＡＴＣＣ１５９９８株、ＡＴＣＣ１７０４１株、ＡＴＣＣ１９１４９株、ＡＴＣＣ１９１５０株、ＡＴＣＣ２１１９７株、ＡＴＣＣ２１２４３株、ＡＴＣＣ２９６７０株、ＡＴＣＣ２９６７２株、ＡＴＣＣ２９６７５株、ＡＴＣＣ３３２５８株、ＡＴＣＣ１３８０８株、ＡＴＣＣ１７０４３株、ＡＴＣＣ１９０６７株、ＡＴＣＣ２１９９９株、ＡＴＣＣ２１２９１株、ＡＴＣＣ２１７８５株、ＡＴＣＣ２１９２４株、ＩＦＯ１４８９４株、ＩＦＯ３３３８株、ＮＣＩＭＢ１１２１５株、ＮＣＩＭＢ１１２１６株、ＪＣＭ３２０２株のほか、ＮＣＩＭＢ４１１６４（国際公開第０５／０５４４５６号）、Ｊ１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４７８）、Ｍ８（ＳＵ１７３１８１４）、Ｍ３３（ＶＫＭ  Ａｃ−１５１５Ｄ）等が好ましく挙げられ、ロドコッカス  ロドクロウスＪ１がさらに好ましい。
【００１９】
ロドコッカス  エリスロポリスとしては、ロドコッカス  エリスロポリスＰＲ４、ロドコッカス  エリスロポリスＳＫ１２１等が好ましい。ロドコッカス  ピリジノボランスとしては、ロドコッカス  ピリジノボランスＡＫ３７等が好ましい。ロドコッカス  オパカスとしては、ロドコッカス  オパカスＢ４，ロドコッカス  オパカスＭ２１３等が好ましい。ロドコッカス  ジョスティとしては、ロドコッカス  ジョスティＲＨＡ１等が好ましい。ロドコッカス  エクイとしては、ロドコッカス  エクイＡＴＣＣ３３７３７、ロドコッカス  エクイ１０３Ｓ等が好ましい。ロドコッカス  ルーバーとしては、ロドコッカス  ルーバーＢＫＳ  ２０−３８等が好ましい。ロドコッカス  イムテケンシスとしては、ロドコッカス  イムテケンシスＲＫＪ３００等が好ましい。ロドコッカス  チンシェギーとしては、ロドコッカス  チンシェギーＢＫＳ２０−４０等が好ましい。ロドコッカス  エスピーとしては、例えばロドコッカス  エスピーＰ１４、ロドコッカス  エスピーＡＷ２５Ｍ０９、ロドコッカス  エスピーＪＶＨ１等が好ましい。
【００２０】
（１−２）外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質をコードする遺伝子
本発明において不活性化させる対象となる、外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質としては、例えば、ヌクレアーゼが挙げられる。ヌクアーゼの種類は特には限定されないが、例えば、ＲｒｈＪ１ＩＩＩ、ＲｒｈＪ１ＩＶ、ＲｒｈＪ１Ｖ、ＲｒｈＪ１ＶＩ、ＲｒｈＪ１ＶＩＩ等を挙げることができる。これらの酵素は、いずれもロドコッカス  ロドクロウスＪ−１株から単離されたヌクレアーゼであり、それぞれ配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
本発明において不活性化させる対象となる、外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質としては、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列だけでなく、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつニッキング酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
【００２２】
より詳細には、（ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列において、数個、例えば１〜２０個（好ましくは１〜１０個、よろい好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列の数個、例えば１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列に数個、例えば、１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列に数個、例えば１〜２０個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｖ）上記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかを組み合わせたアミノ酸配列が挙げられる。
【００２３】
また、本発明において不活性化させる対象となる、外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質としては、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質であって、ニッキング酵素活性を有するタンパク質も含まれる。
【００２４】
これらのタンパク質は、Ｊ１菌の以外のロドコッカス属細菌の複数の株においても、ヌクレアーゼとアノテーションされており、且つ、前記Ｊ１菌のヌクレアーゼと高いホモロジーを有するタンパク質をコードしている。これらも各株における外来ＤＮＡの切断に関与していると推測される。図３〜７に各株のヌクレアーゼホモログのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【００２５】
また、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７及び配列番号９に示される塩基配列によりコードされている。従って、本発明において、欠失又は不活性化させる対象となる遺伝子は、これらの遺伝子に加えて、形質転換の対象となるロドコッカス属細菌が有するヌクレアーゼ遺伝子のオーソログ、又はそのヌクレアーゼの認識するＤＮＡ配列と同じＤＮＡ配列を認識するヌクレアーゼの遺伝子が好ましい。
【００２６】
Ｊ１菌以外のロドコッカス属細菌については、上記Ｊ１菌のＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子、ＲｒｈＪ１ＩＶヌクレアーゼ遺伝子、ＲｒｈＪ１Ｖヌクレアーゼ遺伝子、ＲｒｈＪ１ＶＩヌクレアーゼ遺伝子、又はＲｒｈＪ１ＶＩＩヌクレアーゼ遺伝子に対応するオーソログを欠失又は不活性化させることができる。
【００２７】
ここで、「オーソログ」とは、異なる生物に存在する相同な機能を有するタンパクをコードする類縁遺伝子であって、たとえばＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子の場合であれば、そのオーソログは、Ｊ１菌以外の生物においてＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ活性を有するタンパクをコードする類縁遺伝子である。
【００２８】
上記したＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子、ＲｒｈＪ１ＩＶヌクレアーゼ遺伝子、ＲｒｈＪ１Ｖヌクレアーゼ遺伝子、ＲｒｈＪ１ＶＩヌクレアーゼ遺伝子、及びＲｒｈＪ１ＶＩＩヌクレアーゼ遺伝子のオーソログは、それぞれＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ遺伝子、ＲｒｈＪ１ＩＶヌクレアーゼ遺伝子、ＲｒｈＪ１Ｖヌクレアーゼ遺伝子、ＲｒｈＪ１ＶＩヌクレアーゼ遺伝子、及びＲｒｈＪ１ＶＩＩヌクレアーゼ遺伝子と高い配列相同性を有する。それゆえ、上記配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７及び配列番号９の塩基配列を有する遺伝子に加えて、これらの配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、さらに特に好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有するＤＮＡも本発明のヌクレアーゼ遺伝子に含まれる。
【００２９】
また、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７及び配列番号９に記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、これがそれぞれＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ、ＲｒｈＪ１ＩＶヌクレアーゼ、ＲｒｈＪ１Ｖヌクレアーゼ、ＲｒｈＪ１ＶＩヌクレアーゼ又はＲｒｈＪ１ＶＩＩヌクレアーゼのようなヌクレアーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、本発明のヌクレアーゼ遺伝子に含まれる。
【００３０】
なお、ストリンジェントな条件としては、例えばＤＮＡを固定したナイロン膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコールを含む溶液中で６５℃にて２０時間プローブとともに保温してハイブリダイゼーションを行う条件を挙げることができるが、これに限定されるわけではない。当業者であれば、このような緩衝液の塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、ハイブリダイゼーションの条件を設定することができる。ここで、本明細書において「％」とは、「ｗ／ｖ」を示す。
【００３１】
（１−３）外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質をコードする遺伝子が欠失又は不活性化されたロドコッカス属細菌
本発明に係るロドコッカス属細菌は、上述したようなヌクレアーゼ遺伝子のうち１つが欠失又は不活性化されたものであっても良いし、複数のヌクレアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されたものであってもよい。
【００３２】
なお、「欠失」とは、ヌクレアーゼ遺伝子の一部又は全部が欠失し、その結果として当該遺伝子がコードするタンパクのヌクレアーゼ活性の一部又は全部が失われることを意味する。また、「不活性化」とは、ヌクレアーゼ遺伝子の欠失以外の理由（例えば、後述する調節領域の修飾など）により、当該遺伝子がコードするタンパクのヌクレアーゼ活性の一部又は全部が失われることを意味する。
【００３３】
ここで、「ヌクレアーゼ活性」とは、ＤＮＡを切断する活性を意味する。切断するＤＮＡは二本鎖ＤＮＡでも一本鎖ＤＮＡでも良く、また切断する場所は内部でも末端から順次切断するものも含まれる。さらに、本発明のヌクレアーゼ活性には、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断するｎｉｃｋｉｎｇ活性を含む。
【００３４】
本発明のロドコッカス属細菌のヌクレアーゼ活性の測定方法としては、例えば、該ヌクレアーゼをＤＮＡと接触させ、接触後のＤＮＡの分子量又はＤＮＡ断片数を測定することにより評価することができる。当業者であれば、基質ＤＮＡ、接触時の酵素量、温度、溶液組成又は接触時間などの条件を設定することができる。ＤＮＡの分子量は、例えばアガロースゲル電気泳動によって測定することができる。接触前のＤＮＡの分子量と接触後のＤＮＡの分子量、又は接触前のＤＮＡの断片数と接触後のＤＮＡの断片数を比較することで、ヌクレアーゼ活性を評価することができる。
【００３５】
（２）外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質をコードする遺伝子が欠失又は不活性化されたロドコッカス属細菌の製造
（２−１）外来ＤＮＡの切断に関与するタンパク質をコードする遺伝子の欠失又は不活性化
本発明のロドコッカス属細菌は、本来有するヌクレアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されたものである。ここで、遺伝子（標的遺伝子）の欠失又は不活性化とは、当該遺伝子がコードするタンパク質のヌクレアーゼ活性の一部又は全部を失わせるような、対象微生物のゲノムＤＮＡにコードされるヌクレアーゼ遺伝子の一部又は全部の欠失、置換、付加；プロモーター配列の一部又は全部の欠失、置換、付加；発現調節に関連する遺伝子の一部又は全部の欠失、置換、付加等が挙げられる。これらの欠失、置換、付加等された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。
【００３６】
例えば、上記対象ロドコッカス属細菌がロドコッカス  ロドクロウスＪ１株の場合は、ヌクレアーゼ遺伝子ＲｒｈＪ１ＩＩＩ、ＲｒｈＪ１ＩＶ、ＲｒｈＪ１Ｖ、ＲｒｈＪ１ＶＩ及びＲｒｈＪ１ＶＩＩを有しているため、標的遺伝子としては、これらのいずれか一つでもよいし、複数でもよい。複数の場合は、その組み合わせ又は数は限定されない。
【００３７】
ヌクレアーゼ遺伝子を特異的に欠失又は不活性化する手法としては、特に限定されず、公知の遺伝子組換技術を使用することができる。
【００３８】
上記のとおり、ヌクレアーゼ遺伝子の欠失又は不活性化は、目的とするヌクレアーゼ遺伝子をゲノムから削除する、目的とするヌクレアーゼ遺伝子内に他のＤＮＡ断片を挿入する、又は当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与えることにより達成される。
【００３９】
本発明に係るロドコッカス属細菌は、目的とするヌクレアーゼ遺伝子を計画的に欠失又は不活性化したものであってもよいし、遺伝子にランダムに変異を与えた結果、上述したヌクレアーゼ遺伝子を欠失又は不活性化したものであってもよい。
【００４０】
ヌクレアーゼ遺伝子を欠失又は不活性化する方法としては、例えば、相同組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を利用する方法が挙げられる。
【００４１】
具体的には、標的遺伝子の塩基配列中に薬剤耐性マーカー遺伝子等を相同組換えにより挿入し、標的遺伝子が機能発現しない状態にする、又は（標的遺伝子を当該遺伝子の一部又は全部を含まない配列に置換することにより）標的遺伝子自体を欠失させて、その発現そのものを阻害する方法である。
【００４２】
（２−２）接合伝達による遺伝子欠失法
以下にヌクレアーゼ遺伝子を欠失又は不活性化する方法の一例として、接合伝達による遺伝子欠失法について図１を参照して説明する。本方法はすなわち、ドナー微生物からヌクレアーゼ活性を有するレシピエント微生物（ロドコッカス属細菌）への接合伝達を利用した形質転換方法を用いることを含む、ヌクレアーゼ遺伝子の欠失又は不活性化方法であって、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含むものである。
【００４３】
（ａ）レシピエント微生物として、前述接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性が強化されたロドコッカス属細菌を作製する工程；
（ｂ）ドナー微生物として、下記（ｉ）〜（ｖ）：
（ｉ）レシピエント微生物中のヌクレアーゼ遺伝子（標的遺伝子）とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該耐性遺伝子を欠失又は不活性化させた配列、
（ｉｉ）当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、
（ｉｉｉ）当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、
（ｉｖ）レシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子、及び、
（ｖ）レシピエント微生物に対する致死遺伝子
を含む、遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程；
（ｃ）工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程；並びに
（ｄ）工程（ｃ）で作製された形質転換体を、前述致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
【００４４】
上記欠失又は不活性化方法において用いるレシピエント微生物としては、ヌクレアーゼ遺伝子を有するロドコッカス属細菌であれば限定されない。ロドコッカス属細菌等の具体例については、前述と同様のものが挙げられる。
【００４５】
一方、ドナー微生物としては、上記レシピエント微生物と接合伝達可能な微生物であれば限定はされない。例えば、大腸菌が好ましい。
【００４６】
・工程（ａ）
工程（ａ）では、接合伝達に供するレシピエント微生物として、接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤への耐性を強化したロドコッカス属細菌を作製する。「薬剤への耐性を強化する」とは、レシピエント微生物が薬剤耐性を有していない場合には、薬剤耐性を付与することをいい、レシピエント微生物が薬剤耐性の乏しい場合には、当該耐性をより強くすることをいう。
【００４７】
接合伝達法を使用する場合、レシピエント微生物となるロドコッカス属細菌には薬剤耐性マーカーが必要である。よって、薬剤耐性を有していないロドコッカス属細菌、又は薬剤耐性の乏しいロドコッカス属細菌をレシピエント微生物として使用する場合、薬剤選択可能な程度の十分な薬剤耐性を有する株の作製が必要となる。ここで、薬剤としては、接合伝達法を使用することを考慮し、接合伝達に供するドナー微生物が感受性を示す薬剤が好ましい。当該薬剤としては、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、トリメトプリム、ゲンタマイシン、ナルジクス酸、カルベニシン、チオストレプトン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が好ましく、クロラムフェニコール、アンピシリンがより好ましい。
【００４８】
上述のように薬剤耐性を強化したレシピエント微生物を作製する方法としては、特に限定はされない。例えば、自然変異誘発法、紫外線照射や変異誘発剤を用いる突然変異誘発法、ＥＺ−ＴＮ５（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）のようなランダム変異導入ツール等を用いることにより、本来レシピエントが持たない薬剤耐性遺伝子を人為的に当該微生物ゲノム上に導入する方法、あらかじめ遺伝子改変用プラスミドとは別の、抗生物質耐性獲得用のプラスミドを導入する方法等が好ましい。これらの中でも自然変異誘発法がより好ましい。
【００４９】
自然変異誘発法は、所望の薬剤を含有する培地中で対象とする微生物を継代培養等することにより、もともとは当該培地中で生育不可又は困難な微生物に自然変異を誘発させて、より高濃度の薬剤を含有する当該培地中でも生育し得る株を取得する方法である。どの程度まで薬剤耐性を強化するかは、使用するレシピエント微生物、ドナー微生物、選択する薬剤により異なるが、レシピエント微生物の生育が抑制されない、且つ、ドナー微生物の生育が阻害される薬剤濃度を選ぶことが好ましい。例えば、レシピエント微生物としてロドコッカス属細菌を、ドナー微生物として大腸菌を、選択用薬剤としてクロラムフェニコールを用いる場合、自然突然変異によりクロラムフェニコール１〜２００ｍｇ／Ｌ，好ましくは１０〜１００ｍｇ／Ｌを含有する培地において生育可能なレシピエント微生物（クロラムフェニコール耐性強化株）を得ることが望ましい。
【００５０】
・工程（ｂ）
工程（ｂ）では、接合伝達に供するドナー微生物として、所定の遺伝子改変用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する。遺伝子改変用プラスミド、すなわちレシピエント微生物中のヌクレアーゼ遺伝子を改変するためのプラスミドＤＮＡとしては、前述の（ｉ）〜（ｖ）の構成（遺伝子・塩基配列）を含むものを用いる。
【００５１】
ここで、前述（ｉ）の配列は、改変の対象とするレシピエント微生物中のヌクレアーゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該ヌクレアーゼ遺伝子を欠失又は不活性化させた配列である。当該配列の作製は、レシピエント微生物のゲノムから、ヌクレアーゼ遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列の単離（クローニング）、遺伝子ライブラリ作製やＰＣＲ等の公知技術を用いて行うことができる。
【００５２】
なお、ヌクレアーゼ遺伝子の周辺の塩基配列としては、限定はされない。例えば、当該遺伝子に加え、発現調節に関連する遺伝子の上流及び下流の相同領域が両端からそれぞれ１００〜３０００ｂｐの塩基配列を含む配列であることが好ましい。より好ましくは５００〜２０００ｂｐの塩基配列を含む配列である。単離した塩基配列を用いて、前述（ｉ）を作製する方法は特に限定されず、ＰＣＲ法や制限酵素を用いた標的遺伝子部分の切除もしくは置換等の公知技術を用いて行うことができる。
【００５３】
前述（ｉｉ）の接合伝達開始領域は、使用するドナー微生物中において接合伝達の開始点となる塩基配列を含む領域であれば、限定はされない。例えば、プラスミドＰＲ４由来のｏｒｉＴが好ましい。
【００５４】
前述（ｉｉｉ）の複製開始領域は、使用するドナー微生物中において前述遺伝子改変用プラスミドの自己複製起点として機能し得る塩基配列を含む領域であれば、限定はされない。例えば、ｏｒｉＶが好ましい。
【００５５】
前述（ｉｖ）の薬剤耐性遺伝子は、前述工程（ａ）で作製した、接合伝達に供するレシピエント微生物が感受性を示す薬剤に対する耐性遺伝子であれば、限定はされない。例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、トリメトプリム耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、ナルジクス酸耐性遺伝子、カルベニシン耐性遺伝子、チオストレプトン耐性遺伝子等が好ましく挙げられる。
【００５６】
前述（ｖ）の致死遺伝子は、レシピエント微生物のゲノム上に導入された場合に、当該微生物を死に至らしめる作用を有し得る遺伝子であれば、限定はされない。例えば、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓL遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子等が挙げられるが、ｓａｃＢ遺伝子が好ましい。ｓａｃＢ遺伝子は、当該遺伝子を保有し発現する微生物（例えばロドコッカス属細菌）をスクロース含有培地で培養した場合に、スクロースを基質とし当該微生物に対して致死作用を有する有害物質を産生する酵素（レバンスクラーゼ）をコードする遺伝子である。
【００５７】
接合伝達に用いる前述遺伝子改変用プラスミドは、如何なるベクターをベースとして構築されたものであってもよく、限定はされない。例えば、レシピエント微生物がロドコッカス属細菌の場合は、ｐＫ１９ｍｏｂベクター（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｌ，ｖｏｌ．４５，ｐ．６９−７３（１９９４））等を用いることが好ましい。
【００５８】
前述遺伝子改変用プラスミドにおける（ｉ）〜（ｖ）の構成は、例えば、上流から順に、前述（ｉ）の配列、前述（ｉｖ）の耐性遺伝子、前述（ｖ）の致死遺伝子、前述（ｉｉ）の接合伝達開始領域、前述（ｉｉｉ）の複製開始領域の順で配されていることが好ましい。前述（ｉ）〜（ｖ）の構成を含む遺伝子改変用プラスミドの構築は、公知の遺伝子組換え技術を用いて実施することができる。
【００５９】
上述の各構成を有する遺伝子改変用プラスミドをドナー微生物内に導入して形質転換し、接合伝達に供するドナー微生物を作製する。その際、形質転換の方法としては、微生物の形質転換方法として公知の方法を用いることができる。例えば大腸菌をドナー微生物とする場合は、エレクトロポレーション法やカルシウム法等を用いることができる。
【００６０】
・工程（ｃ）
工程（ｃ）では、工程（ｂ）で作製されたドナー微生物から工程（ａ）で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行う。通常は、ドナー微生物及びレシピエント微生物のそれぞれの細胞懸濁液を混合し、適当なプレート培地（ＬＢ培地等）上に均一に広げて、両微生物の接合を行わせる。
【００６１】
当該接合においては、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドがレシピエント微生物内に移動し、レシピエント微生物のゲノムと上記プラスミドとの相同配列で二重交叉が起こり当該ゲノム中のヌクレアーゼ遺伝子が欠失される。この接合により、レシピエント微生物の形質転換体が作製される。すなわち、当該形質転換体は、ドナー微生物中の遺伝子改変用プラスミドの一部が相同組換えによりレシピエント微生物のゲノム上に導入されたものである。
【００６２】
所望の形質転換体であるかどうかの確認は、レシピエント微生物自体の薬剤耐性、及び前述遺伝子改変用プラスミド由来の薬剤耐性を利用して行うことができる。具体的には、両薬剤を含む培地（例えば、カナマイシン及びクロラムフェニコール含有培地等）において上記接合後の微生物を培養することにより、所望の形質転換体を選択することができる。
【００６３】
・工程（ｄ）
工程（ｄ）では、工程（ｃ）で作製されたレシピエント微生物の形質転換体（形質転換微生物）を、前述遺伝子改変用プラスミド由来の致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養（継代培養）する。致死遺伝子が機能し得る培養条件としては、限定はされないが、例えば致死遺伝子がｓａｃＢ遺伝子の場合は、スクロース含有培地を用いた培養が好ましく挙げられる。
【００６４】
当該培養においては、上記致死遺伝子を有する形質転換微生物は生育困難であるため、継代培養により、自然誘発的に、当該微生物のゲノム上から相同組換えにより上記致死遺伝子を含む塩基配列領域が除かれた（脱落した）形質転換微生物を得ることができる。
【００６５】
ただし、当該得られた微生物の中には、レシピエント微生物中のヌクレアーゼ遺伝子が、当初の目的通り欠失又は不活性化しているものと、そうでないもの（上記脱落の際の相同組換えにより元のヌクレアーゼ遺伝子の機能が復活したもの）が含まれている。
【００６６】
よって、通常は、当該得られた微生物のゲノムＤＮＡを抽出し、例えばＰＣＲ法などによりヌクレアーゼ遺伝子が、当初の目的どおり欠失していることを確認し、所望の形質転換微生物を選択することがより好ましい。
【００６７】
（３）ヌクレアーゼ遺伝子が欠失又は不活性化されたロドコッカス属細菌の形質転換方法
本発明のロドコッカス属細菌に導入するためのプラスミドは、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌で複製増殖可能なＤＮＡ領域を有するプラスミドであれば良い。
【００６８】
例えば、ロドコッカス属細菌で複製増殖可能なＤＮＡ領域としては、プラスミドｐＡＮ１２，ｐＮＣ９０３，ｐＦＡＪ２６００，ｐＲＣ１０，ｐＲＣ２０，ｐＲＣ００１，ｐＲＣ００２，ｐＲＣ００３又はｐＲＣ００４等に含まれる複製増殖可能なＤＮＡ領域が挙げられる。好ましくは、プラスミドｐＲＣ００１，ｐＲＣ００２，ｐＲＣ００３又はｐＲＣ００４に含まれる複製増殖可能なＤＮＡ領域が挙げられる。プラスミドｐＲＣ００１，ｐＲＣ００２，ｐＲＣ００３又はｐＲＣ００４は、各々ロドコッカス  ロドクロウスＡＴＣＣ４２７６，ＡＴＣＣ１４３４９，ＡＴＣＣ１４３４８，ＩＦＯ３３３８株由来のプラスミドであり、特開平２−８４１９８号公報、特開平４−１４８６８５号公報、特開平５−６４５８９号公報、特開平５−６８５６６号公報に記載されている。
【００６９】
また、上記ｐＲＣ００４を含むベクターであるｐＳＪ０２３（特開平１０−３３７１８５号）及びｐＳＪ０３４も使用することができる。
【００７０】
当該プラスミドは、アルカリ−ＳＤＳ法で調製したものが使用でき、好ましくは不純物の少ない高純度なＤＮＡを使用する。ベクターを高純度に精製する方法としては、密度勾配遠心法、市販精製キットを使用することができる。密度勾配遠心法は、例えばＣｓＣｌやＣＦ３ＣＯＯＣｓを使用して、１０００００Ｇで２〜４８時間遠心した後、目的とするＤＮＡのバンドを抽出することにより、ベクターを精製することができる。
【００７１】
プラスミドの調製に使用する宿主は、特に限定されず、例えば、大腸菌（エシェリヒア  コリ）、枯草菌（バチルス  ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、放線菌などの細菌、酵母、カビ、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが挙げられる。プラスミドの調製の好ましい宿主は大腸菌である。
【００７２】
形質転換に使用する宿主細菌は、上記２の方法で調製したヌクレアーゼ欠失又は不活性化ロドコッカス属細菌である。宿主細菌は培養液を洗浄してそのまま使用したり、又は細胞壁の構造を変化させたりすることにより、プラスミドＤＮＡの導入効率を高めることが可能である。細胞壁の構造を変化させる方法としては、培養時にグリシン、ペニシリンＧ又はイソニコチン酸ヒドラジドで処理する方法が好ましい。また、培養液の１０％から２０％のショ糖を添加して培養する方法も用いることができる。このようにして調製した宿主細菌はコンピテントセルと呼ばれる。
【００７３】
以上のように調製したプラスミドＤＮＡと宿主細菌を使用して形質転換を行う。形質転換手法は、当業者に公知の形質転換手法であれば特に限定されず、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を利用することができる。
【００７４】
例えば、電気パルス法を使用し、適量のプラスミドＤＮＡとコンピテントセルを混合してキュベットに入れ、電気パルスを印加する。電気パルスの印加条件は、電圧として１０〜２５ＫＶ／ｃｍ、好ましくは２０ＫＶ／ｃｍ、抵抗値として５０〜４００Ω、好ましくは１００−２００Ωを使用する。電気パルスを印加した後、３７℃で数分ヒートショックを行い、その後、適当な培地を適量加え、約３０℃にて数時間培養を行う。この培養を行うことにより、上述のように薬剤添加によって変化した細胞壁が正常な構造に回復すると共に、プラスミド由来の薬剤耐性遺伝子の発現が起こる。この培養時間は、１時間以上が好ましく、１２時間以上がより好ましい。
【００７５】
形質転換を確認するためのマーカー薬剤又は選択培地の薬剤としては、形質転換体の取得が可能であり、かつ、宿主細菌と形質転換体を区別することができるものであれば特に制限されないが、例えばカナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、トリメトプリム、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が挙げられる。
【００７６】
薬剤の濃度は、形質転換体を効率よく取得するためには、選択培地に対して必要最少量とすることが好ましい。この濃度は、各種濃度の薬剤を含む寒天培地に宿主細菌をプレートし、コロニーの生育の有無を調べることによって設定することができる。例えば、プラスミドＤＮＡとしてｐＫ１、ｐＫ２、ｐＫ３、ｐＫ４、ｐＳＪ０２３、ｐＳＪ００２などを使用する場合には、カナマイシン濃度は１〜１００μｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜５０μｇ／ｍＬである。
【００７７】
なお、形質転換効率は、例えば、形質転換に用いたベクター量あたりの形質転換体コロニー数（ｃｆｕ）（＝ｃｆｕ／μｇ）あるいは形質転換に用いた宿主の量あたりの形質転換体量などにより算出することができる。
【００７８】
本発明のロドコッカス属細菌は形質転換効率が野生型に比較して顕著に高く、簡便かつ高効率に目的遺伝子を導入することができる。これにより、ロドコッカス属細菌に新たな性質を付与し、産業上有用な微生物触媒等を開発することが可能になる。
【実施例】
【００７９】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８０】
［実施例１］
ＲｒｈＪ１ＩＩＩ，ＲｒｈＪ１ＩＶ，ＲｒｈＪ１Ｖ，ＲｒｈＪ１ＶＩ，及びＲｒｈＪ１ＶＩＩ欠失用プラスミドの作製
（１）接合伝達プラスミドベクター（ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１）の作製
ｐＤＮＲ−１ｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）中のｓａｃＢ遺伝子を、ＮｓｐＶ切断サイトを付加したプライマーＳＡＣ−０１（配列番号１１）及びＳＡＣ−０２（配列番号１２）を使用したＰＣＲにより増幅し、約１．９ｋｂのｓａｃＢ遺伝子断片を得た。増幅条件は以下の通りである。
反応液組成：                                              
滅菌水                                               ２２μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）   ２５μＬ
１０μＭ  ＳＡＣ−０１（配列番号１１）                 １μＬ
１０μＭ  ＳＡＣ−０２（配列番号１２）                 １μＬ
ｐＤＮＲ−１ｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）（１００倍希釈） １μＬ  
総量                                           ５０μＬ
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒及び７２℃：１０秒の反応を３０サイクル
プライマー：
ＳＡＣ−０１：５‘−ＧＧＴＴＣＧＡＡＴＡＣＣＴＧＣＣＧＴＴＣＡＣＴＡＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧ−３’（配列番号１１）
ＳＡＣ−０２：５‘−ＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＧＧＣＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧ−３’（配列番号１２）。
【００８１】
ＰＣＲ産物の２μＬを０．７％アガロースゲル電気泳動に供して増幅を確認した後、反応液をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  ＧｅｌＢａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【００８２】
精製したｓａｃＢ遺伝子断片、及びｐＫ１９ｍｏｂを制限酵素ＮｓｐＶ（タカラバイオ社製）で消化後、それぞれの切断断片をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔで精製した。
ｓａｃＢのＮｓｐＶ切断断片とｐＫ１９ｍｏｂのＮｓｐＶ切断断片を、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。反応条件は以下の通りである。
反応液組成：                                                   
ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ（タカラバイオ社製）     ５μＬ
ｓａｃＢ／ＮｓｐＶ切断断片                                     ４μＬ
ｐＫ１９ｍｏｂ／ＮｓｐＶ切断断片                        １μＬ
総量                                                  １０μＬ
反応：
１６℃，１時間。
【００８３】
上記ライゲーション産物の全量を、後述の方法で調製した大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル２００μＬに加え、０℃で３０分放置した。続いて、前述コンピテントセルに４２℃で４５秒間ヒートショックを与え、０℃で２分間冷却した。その後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコース、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を１ｍＬ添加し、３７℃にて１時間振盪培養した。培養後の培養液を２００μＬずつ、ＬＢ  Ｋｍ寒天培地（カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ，２％寒天を含有するＬＢ培地（１％バクトトリプトン、１％ＮａＣｌ，０．５％バクトイーストエキス））に塗布し、３７℃で一晩培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニー複数個を、１．５ｍＬのＬＢ  Ｋｍ培地（カナマイシン５０ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養した。得られた培養液を集菌後、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされているＰＣＲ増幅産物の塩基配列と方向を解析した。ＳａｃＢ遺伝子が正方向に導入されたプラスミドベクターをｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１と命名した。図２にｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１の構造を示す。
【００８４】
なお、大腸菌ＪＭ１０９株のコンピテントセルは以下の方法で調製した。
【００８５】
大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍＬに接種し、３７℃で５時間好気的に前培養した。次に、前培養液０．４ｍＬをＳＯＢ培地４０ｍＬ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，２．５ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。得られた培養物を遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．０），２００ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２，４０ｍＭ  ＭｎＣｌ２）を１３ｍＬ加え、０℃で１０分間放置し、再度遠心分離（３，７００×ｇ，１０分間、４℃）して上清を除いた。得られた大腸菌菌体を冷ＴＦ溶液３．２ｍＬに懸濁し、０．２２ｍＬのジメチルスルホキシドを加え、０℃で１０分間放置した後、液体窒素を用いて凍結したものをコンピテントセルとした。
【００８６】
（２）Ｊ１株染色体ＤＮＡの調製
ロドコッカス  ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｊ１株を１００ｍＬのＭＹＫ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％バクトモルトエキス、０．２％Ｋ２ＨＰＯ４，０．２％ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０）中、３０℃にて７２時間振盪培養した。
【００８７】
培養後、集菌し、集菌された菌体をＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１Ｍ  ＥＤＴＡ，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））４ｍＬに懸濁した。懸濁液に４０ｍｇのリゾチームを加えて、３７℃で１〜２時間振盪したのち、−２０℃で凍結した。
【００８８】
次に、１０ｍＬのＴｒｉｓ−ＳＤＳ液（１％ＳＤＳ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を穏やかに振盪しながら加え、さらにプロテイナーゼＫ（メルク社）を１０μＬ（終濃度１０ｍｇ／ｍＬ）加えて３７℃で１時間振盪した。
【００８９】
次に、等量のＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））飽和フェノールを加え、撹拌した後遠心した。遠心後、上層をとり２倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でＤＮＡを巻きとり、９０％，８０％，７０％のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
【００９０】
次に、ＤＮＡを３ｍＬのＴＥ緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼＡ溶液（１００℃，１５分間の加熱処理済）を１０μｇ／ｍＬになるよう加え、３７℃で３０分間振盪した。さらに、プロテイナーゼＫを加え３７℃で３０分間振盪した後、等量のＴＥ飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
【００９１】
上層についてこの操作を２回繰り返した後、同量のクロロホルム（４％イソアミルアルコール含有）を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に２倍量のエタノールを加え、ガラス棒でＤＮＡを巻きとり回収し、Ｊ１株染色体ＤＮＡ溶液を得た。この染色体ＤＮＡは、配列番号１に示すＲｒｈＪ１ＩＩＩ遺伝子、配列番号３に示すＲｒｈＪ１ＩＶ遺伝子、配列番号５に示すＲｒｈＪ１Ｖ遺伝子、配列番号７に示すＲｒｈＪ１ＶＩ遺伝子、及び配列番号９に示すＲｒｈＪ１ＶＩＩ遺伝子を有している。
【００９２】
（３）ＲｒｈＪ１ＩＩＩ遺伝子欠失用プラスミドの構築
ＲｒｈＪ１ＩＩＩ遺伝子を含む断片のクローニング
Ｊ−１株のＲｒｈＪ１ＩＩＩ遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
【００９３】
図３はロドコッカス属細菌の産生するエンドヌクレアーゼのアミノ酸ホモロジー解析結果を示す。図３中、特に保存されている２つの領域を選んで配列番号１３及び配列番号１４のデジェネレイトプライマーを設計し、実施例１（２）で調製したＪ−１株染色体ＤＮＡを鋳型としてデジェネレイトＰＣＲを以下の条件で実施した。その結果、約０．３ｋｂのバンドの増幅が確認された。
反応液組成                                              
鋳型ＤＮＡ（Ｊ−１染色体ＤＮＡ）                 １μＬ
１０×Ｅｘ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）            １０μＬ
１５０μＭプライマーＤＧ−０１（配列番号１３）   １μＬ
１５０μＭプライマーＤＧ−０２（配列番号１４)           １μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                                    ８μＬ
ＤＭＳＯ                                       １０μＬ
滅菌水                                         １８μＬ
ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）        １μＬ
総量                                           ５０μＬ
温度サイクル：９４℃３０秒、６５℃３０秒及び７２℃１分の反応を３０サイクル
プライマー
ＤＧ−０１：５‘−ＧＧＩＡＧ（Ａ／Ｇ）ＴＧＣＴＴ（Ａ／Ｇ）ＴＧＧＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＧＧＩＡＧＧ−３’（配列番号１３）
ＤＧ−０２：５‘−ＣＣＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＡＣＴＧＩＣＣＧＣＴ（Ｔ／Ｃ）ＡＡＧＴＡ−３’（配列番号１４）。
【００９４】
次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをＰＣＲで使用したプライマーを用いて実施した。その結果、配列番号１５に示す配列が得られ、ホモロジー検索の結果、前述のエンドヌクレアーゼとの相同性が認められた。
【００９５】
ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
ＡｐａＬＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｓｅＹＩ，ＣｌａＩ，ＥｃｏＮＩ，ＥｃｏＴ１４Ｉ，ＫｐｎＩ，ＭｌｕＩ，ＮｃｏＩ，ＮｏｔＩ，ＰｖｕＩＩ，ＳａｌＩ，ＸｂａＩそれぞれで消化したＪ１菌ゲノムＤＮＡに対し、後述の方法で調製したＲｒｈＪ１ＩＩＩのプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、ＢｓｅＹＩ−ＥｃｏＮＩで二重消化した断片から、約５．９ｋｂの単一シグナルが得られた。
【００９６】
なお、プローブは以下のようにして調製した。
【００９７】
実施例１（３）で調製したＰＣＲ産物をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物に対してＡｌｋＰｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を用い、添付のマニュアルにしたがってラベリングを行い、プローブとした。
【００９８】
コロニーハイブリダイゼーション
Ｊ−１染色体ＤＮＡを制限酵素ＢｓｅＹＩ−ＥｃｏＮＩで分解して０．７％アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルからＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）を使用して約５．９ｋｂの断片を回収した。得られた断片は、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ＜Ｂｌｕｎｔ  Ｅｎｄ＞（タカラバイオ社）を用い、添付のマニュアルにしたがって両末端を平滑化した。平滑化後のＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ＞（タカラバイオ社製）を用いて連結した。反応条件は以下の通りである。
【００９９】
反応液組成：
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ（タカラバイオ社製）     ５μＬ
Ｊ−１染色体ＤＮＡ／平滑化断片                          ４μＬ
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）／ＥｃｏＲＶ切断断片     １μＬ
総量                                                  １０μＬ
反応：１６℃，１時間。
【０１００】
上記ライゲーション産物の全量で大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセルを形質転換し、ＬＢ  ＡＩＸプレート（１００μｇ／Ｌアンピシリン、１００μＭ  ＩＰＴＧ，５０μｇ／Ｌ  Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地）によるカラーセレクションを行った。プレート上に生育した白色の組換コロニーを新しいＬＢ  ＡＩＸプレートに、プレート１枚に付き９４個、プレート１０枚分単離した。各プレートにはインサートを含まないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）で形質転換したＪＭ１０９株を２コロニー／プレート植菌した。コロニー単離したプレートを３７℃で一晩放置した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）膜にコロニーを写し取り、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションで調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【０１０１】
検出されたコロニーを培養して得られた培養液を集菌後、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーＤＮＡシーケンサーＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされている染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果、配列番号１６に示される塩基配列が得られた。配列番号１６に示される塩基配列中に、配列番号１に示す３９３ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１），及び配列番号１７に示す３８４ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ２）を見出した。このＯＲＦ１及びＯＲＦ２のコードするアミノ酸配列は、図３中に示したＡ〜Ｄのロドコッカス属細菌由来エンドヌクレアーゼに対して６８〜９４％の相同性を持っていることから、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２はエンドヌクレアーゼをコードしていることが推定されたため、ＯＲＦ１及びＯＲＦ２のコードするエンドヌクレアーゼをそれぞれＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ（１ｓｔ）及びＲｒｈＪ１ＩＩＩヌクレアーゼ（２ｎｄ）と命名した。また、本実施例で得られたＯＲＦ１及びＯＲＦ２を含むプラスミドをｐＢＲｒｈＪ１ＩＩＩと命名した。
【０１０２】
ＲｒｈＪ１ＩＩＩ遺伝子周辺配列のクローニング
ＲｒｈＪ１ＩＩＩ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてＰＣＲを行った。
反応液組成：                                              
鋳型ＤＮＡ（ｐＢＲｒｈＪ１ＩＩＩ）                 １μＬ
１０μＭプライマーＪＭ６４（配列番号１８）                １μＬ
１０μＭプライマーＪＭ６５（配列番号１９）                １μＬ
滅菌水                                           ２２μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）      ２５μＬ  
総量                                             ５０μＬ
温度サイクル：
９８℃１０秒、５５℃５秒及び７２℃１０秒の反応を３０サイクル
プライマー：
ＪＭ６４：５‘−ＧＧｔｃｔａｇａＡＣＡＡＧＡＴＣＴＡＣＣＧＧＧＡＣＧＣＣ−３’（配列番号１８）
ＪＭ６５：５‘−ＧＣａｃｔａｇｔＧＧＡＣＧＴＧＣＴＴＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧ−３’（配列番号１９）
同様にプライマーＪＭ６６（配列番号２０）、ＪＭ６７（配列番号２１）を使用し、上記と同じ条件でＰＣＲを実施した。
【０１０３】
ＪＭ６６：５‘−ＧＣａｃｔａｇｔＣＡＧＣＧＧＴＧＡＴＣＡＣＧＡＡＧＡＣＣＡＣＴ−３’（配列番号２０）
ＪＭ６７：５‘−ｇｃｃｃｔｇｃａｇｇＣＴＴＣＣＣＧＴＣＧＣＣＡＴＣＧＴＧＣＣＧＧＡ−３’（配列番号２１）
ＰＣＲ終了後、各反応液２μＬを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ約２ｋｂｐのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  ＧｅｌＢａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）で精製した。
【０１０４】
次に上記で増幅した２つのＰＣＲ断片を連結するため、以下の条件でＡｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲを行った。
反応液組成：                                                   
鋳型ＤＮＡ１（ＪＭ６４とＪＭ６５の増幅産物）              ０．５μＬ
鋳型ＤＮＡ２（ＪＭ６６とＪＭ６７の増幅産物）              ０．５μＬ
プライマーＪＭ６４（配列番号１８）                 １    μＬ
プライマーＪＭ６７（配列番号２１）                 １    μＬ
滅菌水                                           ２２    μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）      ２５    μＬ  
総量                                             ５０    μＬ
温度サイクル：
９８℃１０秒、５５℃５秒及び７２℃２０秒の反応を３０サイクル。
【０１０５】
ＰＣＲ終了後、約４ｋｂｐの増幅産物を０．７％アガロース電気泳動で確認し、Ｍｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｂｌｕｎｔ  Ｅｎｄ）（タカラバイオ社製）を使用してｐＵＣ１１８に連結した。このようにして得たプラスミドをｐＵＣ１１８／ΔＲｒｈＪ１ＩＩＩと命名した。
【０１０６】
続いて、上記プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲｒｈＪ１ＩＩＩ及びプラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１を制限酵素ＸｂａＩ及びＳｓｅ８３８７Ｉで切断した。
反応液組成１：                                                   
プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲｒｈＪ１ＩＩＩ            ２０μＬ
ＸｂａＩ（タカラバイオ社製）                            １μＬ
Ｓｓｅ８３８７Ｉ（タカラバイオ社製）                    １μＬ
１０×Ｍ  Ｂｕｆｆｅｒ（酵素に添付）                    ５μＬ
１０×ＢＳＡ（酵素に添付）                              ５μＬ
滅菌水                                         １８μＬ  
総量                                           ５０μＬ
反応液組成２：                                          
プラスミドｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１        ５    μＬ
ＸｂａＩ（タカラバイオ社製）              ０．５μＬ
Ｓｓｅ８３８７Ｉ（タカラバイオ社製）      ０．５μＬ
１０×Ｍ  Ｂｕｆｆｅｒ（酵素に添付）      ２    μＬ
１０×ＢＳＡ（酵素に添付）                ２    μＬ
滅菌水                           １０    μＬ  
総量                             ２０    μＬ
反応：  ３７℃，２．５時間。
【０１０７】
反応終了後、プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲｒｈＪ１ＩＩＩについては反応液の全量を０．７％アガロースゲル電気泳動に供して約４ｋｂの断片を切り出し、ＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ｂａｎｄ  ａｎｄ  ＧｅｌＢａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）で回収してΔＲｒｈＪ１ＩＩＩ／ＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉとした。
【０１０８】
プラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１については、反応液に２μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、５０μＬの９９．５％エタノールを加えてよく混和し、−２０℃で１時間冷却した。冷却後の溶液を１５，０００ｒｐｍ，４℃，１０分遠心して上清を除去し、減圧乾燥にて溶媒を除去した。その後、乾燥させたペレットに５０μＬの滅菌水を加えて再度溶解させ、ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１／ＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉのベクター溶液を得た。
【０１０９】
次に回収したΔＲｒｈＪ１ＩＩＩ／ＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７ＩとベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１／ＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉを連結した。
反応液組成：                                                   
Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｍｉｇｈｔｙ  ｍｉｘ（タカラバイオ社製）     ５μＬ
ΔＲｒｈＪ１ＩＩＩ／ＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ          ４μＬ
ｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１／ＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７Ｉ           １μＬ
総量                                                  １０μＬ
反応：  １６℃，１時間
反応終了後、（１）と同様にして大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、ＲｒｈＪ１ＩＩＩ遺伝子欠失プラスミドを得た。本プラスミドをｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＩＩＩと名付けた。
【０１１０】
（４）ＲｒｈＪ１ＩＶ遺伝子欠失用プラスミドの構築
・ＲｒｈＪ１ＩＶ遺伝子を含む断片のクローニング
Ｊ−１株のＲｒｈＪ１ＩＶ遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
【０１１１】
図４はロドコッカス属細菌の産生するエンドヌクレアーゼのアミノ酸ホモロジー解析結果を示す。図４中、特に保存されている２つの領域を選んで配列番号２２及び配列番号２３のデジェネレイトプライマーを設計し、実施例１（２）で調製したＪ−１株染色体ＤＮＡを鋳型として実施例１（３）と同様にデジェネレイトＰＣＲを実施した。その結果、約０．６ｋｂのバンドの増幅が確認された。
プライマー
ＤＧ−０３：５‘−ｔｇｇｇｃ（ｃ／ｇ）ｃｇ（ｇ／ｃ）ａｃ（ｃ／ｇ）ｔａｃｃｔ（ｃ／ｇ）ａａｇｇｇｃａｔｇ−3’（配列番号２２）
ＤＧ−０４：５‘−ｇｃｃ（ｇ／ｃ）ａｇｇｃｃｇｔｇｃｔｃｃｔｔ（ｇ／ｃ）ａｇ（ｇ／ｃ）ａｇ−3’（配列番号２３）。
【０１１２】
次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをＰＣＲで使用したプライマーを用いて実施した。その結果、配列番号２４に示す配列が得られ、ホモロジー検索の結果、前述のエンドヌクレアーゼとの相同性が認められた。
【０１１３】
・ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
ＡｐａＩ，ＡｐａＬＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｃｌＩ，ＣｌａＩ，Ｅｃｏ５２Ｉ，ＫｐｎＩ，ＮｃｏＩ，ＮｏｔＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＸｂａＩそれぞれで消化したＪ−１染色体ＤＮＡに対し、上記デジェネレイトＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を用い、実施例１（３）と同様の方法で調製したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、ＢｃｌＩで消化した断片から、約６．３ｋｂの単一シグナルが得られた。
【０１１４】
・コロニーハイブリダイゼーション
Ｊ−１染色体ＤＮＡを制限酵素ＢｃｌＩで分解し、実施例１（３）と同様に約６．４ｋｂの断片を回収してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクターのＢａｍＨサイトに連結した。
【０１１５】
ここで得られた形質転換体９４０個に対し、実施例１（４）で得られたプローブを用いて実施例１（３）と同様にコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【０１１６】
検出されたコロニーから実施例１（３）と同様に組換えプラスミドを回収し、プラスミド中にクローニングされている染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果、配列番号２５に示される塩基配列が得られた。配列番号２５に示される塩基配列中に、配列番号３に示す９３９ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ３）を見出した。このＯＲＦ３のコードするアミノ酸配列は、図４中に示したＡ〜Ｅのロドコッカス属細菌由来エンドヌクレアーゼに対して５５〜９９％の相同性を持っていることから、ＯＲＦ３はエンドヌクレアーゼをコードしていることが推定されたため、ＯＲＦ３のコードするエンドヌクレアーゼをＲｒｈＪ１ＩＶヌクレアーゼと命名した。また、本実施例で得られたＯＲＦ３を含むプラスミドをｐＢＲｒｈＪ１ＩＶと命名した。
【０１１７】
ＲｒｈＪ１ＩＶ遺伝子周辺配列のクローニング
ＲｒｈＪ１ＩＶ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてＰＣＲを行った。
反応液組成：                                              
鋳型ＤＮＡ（ｐＢＲｒｈＪ１ＩＶ）                   １μＬ
１０μＭプライマーＪＭ７２（配列番号２６）                １μＬ
１０μＭプライマーＪＭ７３（配列番号２７）                １μＬ
滅菌水                                           ２２μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）      ２５μＬ  
総量                                             ５０μＬ
温度サイクル：
９８℃１０秒、５５℃５秒及び７２℃２０秒の反応を３０サイクル
プライマー：
ＪＭ７２：５‘−ＣＣｔｃｔａｇａＡＡＧＡＴＣＡＧＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＧＡＣＡＴＧＴＣＣＴ−３’（配列番号２６）
ＪＭ７３：５‘−ＧＧｃｃｔｇｃａｇｇＡＴＣＧＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＧＴＡＣＴＣＧＡＡＣＡＴ−３’（配列番号２７）。
【０１１８】
ＰＣＲ終了後、実施例１（３）と同様にして約３．９ｋｂのＰＣＲ断片を検出し、実施例１（３）と同様にしてプラスミドベクターｐＵＣ１１８に連結した。ここで得られたプラスミドをｐＵＣ１１８／ＲｒｈＪ１ＩＶと名づけた。
【０１１９】
次に、ＲｒｈＪ１ＩＶ遺伝子の上流域と下流域のみを含む配列を取得するため、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてＰＣＲを行った。
反応液組成：                                                      
鋳型ＤＮＡ（プラスミドｐＵＣ１１８／ＲｒｈＪ１ＩＶ）    １μＬ
プライマーＪＭ８４（配列番号２８）                        １μＬ
プライマーＪＭ８５（配列番号２９）                        １μＬ
滅菌水                                                  ２２μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）      ２５μＬ
総量                                                    ５０μＬ
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒及び７２℃：３０秒の反応を３０サイクル
プライマー：
ＪＭ８４：５‘−ＧＧＡＡＧＧＴＣＣＧＣＧＴＡＧＣＧＣＣＧＴＣＧＣＧ−３’（配列番号２８）
ＪＭ８５：５‘−ＣＴＡＣＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＣＣＴＡＡＣＧＴＣＧＣ−３’（配列番号２９）。
【０１２０】
ＰＣＲ終了後、反応液２μＬを０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、約６ｋｂｐのＰＣＲ産物の検出を行った。ＰＣＲ産物を確認した後、反応液２μＬを用いてＪＭ１０９株を形質転換し、ＲｒｈＪ１ＩＶ遺伝子の上流域と下流域のみを含むプラスミドを得た。このプラスミドをｐＵＣ１１８／ΔＲｒｈＪ１ＩＶと命名した。
【０１２１】
続いて、上記プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲｒｈＪ１ＩＶとプラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１を用いて、実施例１（３）と同様にしてプラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１のＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７ＩサイトにＲｒｈＪ１ＩＶ欠失用断片を連結し、得られたＲｒｈＪ１ＩＶ欠失用プラスミドをｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＩＶと命名した。
【０１２２】
（５）ＲｒｈＪ１Ｖ遺伝子欠失用プラスミドの構築
・ＲｒｈＪ１Ｖ遺伝子を含む断片のクローニング
Ｊ−１株のＲｒｈＪ１Ｖ遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
【０１２３】
図５はロドコッカス属細菌の産生するエンドヌクレアーゼのアミノ酸ホモロジー解析結果を示す。図５中、特に保存されている２つの領域を選んで配列番号３０及び配列番号３１のデジェネレイトプライマーを設計し、実施例１（２）で調製したＪ−１株染色体ＤＮＡを鋳型として実施例１（３）と同様にデジェネレイトＰＣＲを実施した。その結果、約０．５ｋｂのバンドの増幅が確認された。
【０１２４】
プライマー
ＤＧ−０５：５‘−ａａｇｃｇ（ｇ／ｃ）ｃｇ（ｇ／ｃ）ｇｔ（ｃ／ｇ）ｃｔ（ｃ／ｇ）ｃｔ（ｃ／ｇ）ｃｔ（ｃ／ｇ）ａａｃ−３’（配列番号３０）
ＤＧ−０６：５‘−ａａ（ｇ／ｃ）ｇｃ（ｇ／ｃ）ｇｃｇｃｃｃｔｃｇｃｃ（ｃ／ｇ）ａｇｇｔａ（ｃ／ｇ）ｇｇ−３’（配列番号３１）。
【０１２５】
次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをＰＣＲで使用したプライマーを用いて実施した。その結果、配列番号３２に示す配列が得られ、ホモロジー検索の結果、前述のエンドヌクレアーゼとの相同性が認められた。
【０１２６】
・ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
ＡｐａＩ，ＡｐａＬＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｃｌＩ，ＢｂｖＣＩ，ＣｌａＩ，Ｅｃｏ５２Ｉ，ＫｐｎＩ，ＮｃｏＩ，ＮｏｔＩ，ＮｓｐＶ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＸｂａＩそれぞれで消化したＪ−１染色体ＤＮＡに対し、上記デジェネレイトＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を用い、実施例１（３）と同様の方法で調製したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、ＢｂｖＣＩ，ＮｓｐＶの２種酵素で二重消化した断片から、約６．１ｋｂの単一シグナルが得られた。
【０１２７】
・コロニーハイブリダイゼーション
Ｊ−１染色体ＤＮＡを制限酵素ＢｂｖＣＩ−ＮｓｐＶで分解し、実施例１（３）と同様に約６．１ｋｂの断片を回収した後、実施例１（３）と同様に末端の平滑化を行い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＥｃｏＲＶサイトに連結して実施例１（３）と同様に大腸菌ＪＭ１０９の形質転換体を得た。
【０１２８】
ここで得られた形質転換体９４０個に対し、実施例１（５）で得られたプローブを用いて実施例１（３）と同様にコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【０１２９】
検出されたコロニーから実施例１（３）と同様に組換えプラスミドを回収し、プラスミド中にクローニングされている染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果、配列番号３３に示される塩基配列が得られた。配列番号３３に示される塩基配列中に、配列番号５に示す１１５５ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ４）を見出した。このＯＲＦ４のコードするアミノ酸配列は、図５中に示したＡ〜Ｅのロドコッカス属細菌由来エンドヌクレアーゼに対して７１〜９９％の相同性を持っていることから、ＯＲＦ４はエンドヌクレアーゼをコードしていることが推定されたため、ＯＲＦ４のコードするエンドヌクレアーゼをＲｒｈＪ１Ｖヌクレアーゼと命名した。また、本実施例で得られたＯＲＦ４を含むプラスミドをｐＢＲｒｈＪ１Ｖと命名した。
【０１３０】
・ＲｒｈＪ１Ｖ遺伝子周辺配列のクローニング
ＲｒｈＪ１Ｖ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてＰＣＲを行った。
反応液組成：                                              
鋳型ＤＮＡ（ｐＢＲｒｈＪ１Ｖ）                            １μＬ
１０μＭプライマーＪＭ７６（配列番号３４）                １μＬ
１０μＭプライマーＪＭ７７（配列番号３５）                １μＬ
滅菌水                                           ２２μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）      ２５μＬ  
総量                                             ５０μＬ
温度サイクル：  ９８℃１０秒、５５℃５秒及び７２℃４０秒の反応を３０サイクル
プライマー：
ＪＭ７６：５‘−ＣＣｔｃｔａｇａＧＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＡＧＧＣＧＡＧＡＴ−３’（配列番号３４）
ＪＭ７７：５‘−ＧＧａａｇｃｔｔＴＡＣＣＴＧＴＣＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＣ−３’（配列番３５）。
【０１３１】
ＰＣＲ終了後、実施例１（３）と同様にして約４．１ｋｂのＰＣＲ断片を検出し、実施例１（３）と同様にしてプラスミドベクターｐＵＣ１１８に連結した。ここで得られたプラスミドをｐＵＣ１１８／ＲｒｈＪ１Ｖと名づけた。
【０１３２】
次に、ＲｒｈＪ１ＩＶ遺伝子の上流域と下流域のみを含む配列を取得するため、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてＰＣＲを行った。
反応液組成：                                                      
鋳型ＤＮＡ（プラスミドｐＵＣ１１８／ＲｒｈＪ１Ｖ）      １μＬ
プライマーＪＭ８８（配列番号３６）                        １μＬ
プライマーＪＭ８９（配列番号３７）                        １μＬ
滅菌水                                                  ２２μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）      ２５μＬ
総量                                                    ５０μＬ
温度サイクル：  ９８℃：１０秒、５５℃：５秒及び７２℃：３０秒の反応を３０サイクル
プライマー：
ＪＭ８８：５‘−ＣＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＧＣＣＧＴＴＣＴＧＣＧＧＧＧ−３’（配列番号３６）
ＪＭ８９：５‘−ＣＧＧＣＣＣＧＡＣＴＣＧＴＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣ−３’（配列番号３７）。
【０１３３】
ＰＣＲ終了後、実施例１（４）と同様にしてＪＭ１０９株を形質転換し、ＲｒｈＪ１Ｖ遺伝子の上流域と下流域のみを含むプラスミドを得た。このプラスミドをｐＵＣ１１８／ΔＲｒｈＪ１Ｖと命名した。
【０１３４】
続いて、上記プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲｒｈＪ１ＶとプラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１を用いて、実施例１（３）と同様にしてプラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１のＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトにＲｒｈＪ１Ｖ欠失用断片を連結し、得られたＲｒｈＪ１Ｖ欠失用プラスミドをｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１Ｖと命名した。
【０１３５】
（６）ＲｒｈＪ１ＶＩ遺伝子欠失用プラスミドの構築
・ＲｒｈＪ１ＶＩ遺伝子を含む断片のクローニング
Ｊ−１株のＲｒｈＪ１ＶＩ遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
【０１３６】
図６はロドコッカス属細菌の産生するエンドヌクレアーゼのアミノ酸ホモロジー解析結果を示す。図６中、特に保存されている２つの領域を選んで配列番号３８及び配列番号３９のデジェネレイトプライマーを設計し、実施例１（２）で調製したＪ−１株染色体ＤＮＡを鋳型としてデジェネレイトＰＣＲを以下の条件で実施した。その結果、約１．０ｋｂのバンドの増幅が確認された。
反応液組成                                              
鋳型ＤＮＡ（Ｊ−１染色体ＤＮＡ）                 １μＬ
１０×Ｅｘ  Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社）            １０μＬ
１５０μＭプライマーＤＧ−０７（配列番号３８）   １μＬ
１５０μＭプライマーＤＧ−０８（配列番号３９)           １μＬ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ                                    ８μＬ
ＤＭＳＯ                                       １０μＬ
滅菌水                                         １８μＬ
ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）        １μＬ
総量                                           ５０μＬ
温度サイクル：９４℃３０秒、６５℃３０秒及び７２℃１分の反応を３０サイクル
プライマー
ＤＧ−０７：５‘−ａａｇａｔｇｇｃ（ｃ／ｇ）ａａｃｃｔ（ｃ／ｇ）ｇａｃｇｇｃ−３’（配列番号３８）
ＤＧ−０８：５‘−ａａ（ｇ／ｃ）ｇｔ（ｃ／ｇ）ｃｇｇｔｇｃｃａｇｃｃ（ｇ／ｃ）ａｇｇｔａ−３’（配列番号３９）。
【０１３７】
次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをＰＣＲで使用したプライマーを用いて実施した。その結果、配列番号４０に示す配列が得られ、ホモロジー検索の結果、前述のエンドヌクレアーゼとの相同性が認められた。
【０１３８】
・ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
ＡｐａＩ，ＡｐａＬＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，Ｅｃｏ５２Ｉ，ＫｐｎＩ，ＭｌｕＩ，ＮｃｏＩ，ＮｏｔＩ，ＮｓｉＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＸｂａＩそれぞれで消化したＪ−１染色体ＤＮＡに対し、上記デジェネレイトＰＣＲ産物を使用して実施例１（３）と同様の方法で調製したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、ＢａｍＨＩ，ＮｓｉＩの両酵素で二重消化した断片から、約０．７ｋｂの単一シグナルが得られた。
【０１３９】
・コロニーハイブリダイゼーション
Ｊ−１染色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ−ＮｓｉＩで二重消化して、実施例１（３）と同様にして約６．４ｋｂの断片を回収した。回収したＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩサイトに連結した後、大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体９４０個に対し、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションで調製したプローブを用いて、実施例１（３）と同様にコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【０１４０】
検出されたコロニーから実施例１（３）と同様に組換えプラスミドを回収し、プラスミド中にクローニングされている染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果、配列番号４１に示される塩基配列が得られた。配列番号４１に示される塩基配列中に、配列番号７に示す１００８ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ５）を見出した。このＯＲＦ５のコードするアミノ酸配列は、図６中に示したＡ〜Ｅのロドコッカス属細菌由来エンドヌクレアーゼに対して６２〜８３％の相同性を持っていることから、ＯＲＦ５はエンドヌクレアーゼをコードしていることが推定されたため、ＯＲＦ５のコードするエンドヌクレアーゼをＲｒｈＪ１ＶＩヌクレアーゼと命名した。また、本実施例で得られたＯＲＦ５を含むプラスミドをｐＢＲｒｈＪ１ＶＩと命名した。
【０１４１】
・ＲｒｈＪ１ＶＩ遺伝子周辺配列のクローニング
ＲｒｈＪ１ＶＩ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてＰＣＲを行った。
反応液組成：                                              
鋳型ＤＮＡ（ｐＢＲｒｈＪ１ＶＩ）                   １μＬ
１０μＭプライマーＪＭ６８（配列番号４２）                １μＬ
１０μＭプライマーＪＭ６９（配列番号４３）                １μＬ
滅菌水                                           ２２μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）      ２５μＬ  
総量                                             ５０μＬ
温度サイクル：
９８℃１０秒、５５℃５秒及び７２℃１０秒の反応を３０サイクル
プライマー：
ＪＭ６８：５‘−ＧＣｇｇａｔｃｃＧＴＴＡＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＣＣＧＴＴＧ−３’（配列番号４２）
ＪＭ６９：５‘−ｇｃａｃｔａｇｔＧＧＣＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣＡＣＴＧＡＧ−３’（配列番号４３）。
【０１４２】
同様にプライマーＪＭ７０（配列番号４４），ＪＭ７１（配列番号４５）を使用し、上記と同じ条件でＰＣＲを実施した。
【０１４３】
ＪＭ７０：５‘−ＧＣａｃｔａｇｔＡＧＧＧＡＣＧＡＴＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧＧ−３’（配列番号４４）
ＪＭ７１：５‘−ＧＣｃｃｔｇｃａｇｇＴＣＧＡＣＴＡＣＡＴＣＧＧＡＣＡＧＡＣＣ−３’（配列番号４５）。
【０１４４】
ＰＣＲ終了後、実施例１（３）と同様に各ＰＣＲ産物の検出、精製を行った。
【０１４５】
次に上記で増幅した２つのＰＣＲ断片を連結するため、以下の条件でＡｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲを行った。
反応液組成：                                                   
鋳型ＤＮＡ１（ＪＭ６８とＪＭ６９の増幅産物）              ０．５μＬ
鋳型ＤＮＡ２（ＪＭ７０とＪＭ７１の増幅産物）              ０．５μＬ
プライマーＪＭ６８（配列番号４２）                 １    μＬ
プライマーＪＭ７１（配列番号４３）                 １    μＬ
滅菌水                                           ２２    μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）      ２５    μＬ  
総量                                             ５０    μＬ
温度サイクル：
９８℃１０秒、５５℃５秒及び７２℃４０秒の反応を３０サイクル。
【０１４６】
ＰＣＲ終了後、実施例１（３）と同様にして約４ｋｂｐの増幅産物を検出し、ｐＵＣ１１８に連結した。このようにして得たプラスミドをｐＵＣ１１８／ΔＲｒｈＪ１ＶＩと命名した。
【０１４７】
続いて、上記プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲｒｈＪ１ＶＩ及びプラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１を用いて、実施例１（３）と同様にしてプラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１のＢａｍＨＩ−Ｓｓｅ８３８７ＩサイトにＲｒｈＪ１ＶＩ遺伝子欠失断片を連結した。本プラスミドをｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＶＩと名付けた。
【０１４８】
（７）ＲｒｈＪ１ＶＩＩ欠失用プラスミドの作製
・ＲｒｈＪ１ＶＩＩ遺伝子を含む断片のクローニング
Ｊ−１株のＲｒｈＪ１ＶＩＩ遺伝子をＰＣＲで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
【０１４９】
図７はロドコッカス属細菌の産生する推定エンドヌクレアーゼのアミノ酸ホモロジー解析結果を示す。図７中、特に保存されている２つの領域を選んで配列番号４６及び配列番号４７のデジェネレイトプライマーを設計し、実施例１（２）で調製したＪ−１株染色体ＤＮＡを鋳型として実施例１（３）と同様にデジェネレイトＰＣＲを実施した。その結果、約０．３ｋｂのバンドの増幅が確認された。
プライマー
ＤＧ−０９：５‘−ａｔｇｇｔ（ｃ／ｇ）ｇａｇｃａｇｃｃ（ｇ／ｃ）ｇｃ（ｃ／ｇ）ａａｇｇｔ（ｃ／ｇ）ａｔｇ−３’（配列番号４６）
ＤＧ−１０：５‘−ｃｔｇ（ｃ／ｇ）ｃｇｃａｔｃｔｇｃｔｃ（ｇ／ｃ）ａｇｃｔｇ−３’（配列番号４７）。
【０１５０】
次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをＰＣＲで使用したプライマーを用いて実施した。その結果、配列番号４８に示す配列が得られ、ホモロジー検索の結果、前述の推定エンドヌクレアーゼとの相同性が認められた。
【０１５１】
・ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
ＡｐａＩ，ＡｐａＬＩ，ＢａｍＨＩ，ＣｌａＩ，Ｅｃｏ５２Ｉ，ＫｐｎＩ，ＮｃｏＩ，ＮｏｔＩ，ＮｓｐＶ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＸｂａＩそれぞれで消化したＪ−１染色体ＤＮＡに対し、上記デジェネレイトＰＣＲで得られたＰＣＲ産物を用い、実施例１（３）と同様の方法で調製したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、ＣｌａＩ，ＮｏｔＩの２種酵素で二重消化した断片から、約７．８ｋｂの単一シグナルが得られた。
【０１５２】
・コロニーハイブリダイゼーション
Ｊ−１染色体ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩ−ＮｏｔＩで分解し、実施例１（３）と同様に約７．８ｋｂの断片を回収して実施例１（３）と同様にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＣｌａＩ−ＮｏｔＩサイトに連結して実施例１（３）と同様に大腸菌ＪＭ１０９の形質転換体を得た。
【０１５３】
ここで得られた形質転換体９４０個に対し、実施例１（６）で得られたプローブを用いて実施例１（３）と同様にコロニーハイブリダイゼーションを行った。
【０１５４】
検出されたコロニーから実施例１（３）と同様に組換えプラスミドを回収し、プラスミド中にクローニングされている染色体ＤＮＡ断片の塩基配列を解析した。その結果、配列番号４９に示される塩基配列が得られた。配列番号４９に示される塩基配列中に、配列番号９に示す５８５ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ６）を見出した。このＯＲＦ５のコードするアミノ酸配列は、図７中に示したＡ〜Ｅのロドコッカス属細菌由来推定エンドヌクレアーゼに対して６９〜９５％の相同性を持っていることから、ＯＲＦ６はエンドヌクレアーゼをコードしていることが推定されたため、ＯＲＦ６のコードするエンドヌクレアーゼをＲｒｈＪ１ＶＩＩヌクレアーゼと命名した。また、本実施例で得られたＯＲＦ６を含むプラスミドをｐＢＲｒｈＪ１ＶＩＩと命名した。
【０１５５】
・ＲｒｈＪ１ＶＩＩ遺伝子周辺配列のクローニング
ＲｒｈＪ１ＶＩＩ遺伝子の上流域と下流域を含んだ配列を取得するため、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてＰＣＲを行った。
反応液組成：                                              
鋳型ＤＮＡ（ｐＢＲｒｈＪ１ＶＩＩ）                 １μＬ
１０μＭプライマーＪＭ８２（配列番号５０）                １μＬ
１０μＭプライマーＪＭ８３（配列番号５１）                １μＬ
滅菌水                                           ２２μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）      ２５μＬ  
総量                                             ５０μＬ
温度サイクル：
９８℃１０秒、５５℃５秒及び７２℃４０秒の反応を３０サイクル
プライマー：
ＪＭ８２：５‘−ａａｔｃｔａｇａＡＣＧＣＣＧＧＴＧＣＡＣＣＴＣＧＡＣＣＴ−３’（配列番号５０）
ＪＭ８３：５‘−ｔｔｃｃｔｇｃａｇｇＡＡＴＣＴＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＣＧＡ−３’（配列番５１）。
【０１５６】
ＰＣＲ終了後、実施例１（３）と同様にして約３．５ｋｂのＰＣＲ断片を検出し、実施例１（３）と同様にしてプラスミドベクターｐＵＣ１１８に連結した。ここで得られたプラスミドをｐＵＣ１１８／ＲｒｈＪ１ＶＩＩと名づけた。
【０１５７】
次に、ＲｒｈＪ１ＩＶＩＩ遺伝子の上流域と下流域のみを含む配列を取得するため、以下に示す反応液組成及びプライマーを用いてＰＣＲを行った。
反応液組成：                                            
鋳型ＤＮＡ（プラスミドｐＵＣ１１８／ＲｒｈＪ１ＶＩＩ）    １μＬ
プライマーＪＭ９４（配列番号５２）                 １μＬ
プライマーＪＭ１１９（配列番号５３）                      １μＬ
滅菌水                                           ２２μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）      ２５μＬ
総量                                             ５０μＬ
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒及び７２℃：３０秒の反応を３０サイクル
プライマー：
ＪＭ９４：５‘−ＡＧＧＣＧＧＧＡＧＧＣＴＣＣＡＴＴＣＴＣＣＣＴＴＴＣ−３’（配列番号５２）
ＪＭ１１９：５‘−ＡＴＧＧＡＧＣＣＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＴＡＣＧＣＣＣＣ−３’（配列番号５３）。
【０１５８】
ＰＣＲ終了後、実施例１（４）と同様にしてＪＭ１０９株を形質転換し、ＲｒｈＪ１ＶＩＩ遺伝子の上流域と下流域のみを含むプラスミドを得た。このプラスミドをｐＵＣ１１８／ΔＲｒｈＪ１ＶＩＩと命名した。
【０１５９】
続いて、上記プラスミドｐＵＣ１１８／ΔＲｒｈＪ１ＶＩＩとプラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１を用いて、実施例１（３）と同様にしてプラスミドベクターｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ１のＸｂａＩ−Ｓｓｅ８３８７ＩサイトにＲｒｈＪ１ＶＩＩ欠失用断片を連結し、得られたＲｒｈＪ１ＶＩＩ欠失用プラスミドをｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＶＩＩと命名した。
【０１６０】
［実施例２］
薬剤耐性を有するＪ１株の作製
接合伝達に使用するドナーは、遺伝子欠失株のセレクションに薬剤耐性が必要である。そこで、種々の薬剤耐性株の取得を試み、クロラムフェニコール耐性を有するＪ１株の変異株を下記の方法で取得した。
【０１６１】
２ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含んだＭＹＫプレート（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％マルツエキス、０．２％ＫＨ２ＰＯ４，０．２％Ｋ２ＨＰＯ４，２％寒天）にＪ１株をストリークし、コロニーが生育するまで３０℃で保温した。約２週間後、生育してきたクロラムフェニコール耐性株を、再度２ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールプレートにストリークして、３０℃で保温した。
【０１６２】
次に、２ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールプレートから生育したコロニーを、５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールプレートにストリークし、耐性株が出現するまで３０℃で保温した。以下、同様の操作をクロラムフェニコール濃度１０ｍｇ／Ｌに高めて繰り返し、１０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール濃度で生育するクロラムフェニコール耐性株（Ｊ１−Ｃｍ株）を得た。
【０１６３】
［実施例３］
接合伝達によるヌクレアーゼ遺伝子の欠失
（１）ドナーの調製
乾熱滅菌した試験管に大腸菌Ｓ１７−１λｐｉｒのコンピテントセル各２０μＬにプラスミドｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＩＩＩ，ｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＩＶ，ｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１Ｖ，ｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＶＩ，又はｐＫ１９ΔＲｒｈＪ１ＶＩＩ  各１μＬを加え、氷上で３０分静置した。４２℃で３０秒ヒートショック後、ＳＯＣ培地を１８０μＬ添加し、３７℃で1時間振とう培養を行った。その後、ＬＢ  Ｋｍプレートに塗布し、３７℃で一晩静置した。
【０１６４】
翌日、各プレートに生育したコロニーをＬＢ培地各１ｍＬで回収し、遠心分離により菌体を回収し、遠心上清を除去した。同様の操作をもう一度繰り返し、最後に０．５ｍＬのＬＢ培地を添加し、各菌体懸濁液を調製した。この各菌体懸濁液をドナー溶液とした。
【０１６５】
（２）レシピエントの調製
Ｊ１−Ｃｍ株をＭＹＫプレートにストリークし、３０℃で２日生育させた。生育したコロニーを実施例３（１）と同様の方法で回収、洗浄し、レシピエントとなる菌体懸濁液を調製した。
【０１６６】
（３）接合伝達
実施例３（１）で調製したドナー溶液と、（２）で調製したレシピエント溶液を各１００μＬ混合し、抗生物質を含まないＭＹＫプレートに塗布し、３０℃で一晩静置した。
【０１６７】
翌日、生育したコロニーを１ｍＬのＬＢ培地で回収し、１００μＬを、カナマイシン１０ｍｇ／Ｌ，クロラムフェニコール１０ｍｇ／Ｌを含むＭＹＫプレートに塗布した。塗布したプレートを組換菌コロニーが出現するまで３０℃で１週間保温した。
【０１６８】
１週間後、各プレート上に出現したコロニーの各１つをそれぞれ＃ＲｒｈＪ１ＩＩＩ，＃ＲｒｈＪ１ＩＶ，＃ＲｒｈＪ１Ｖ，＃ＲｒｈＪ１ＶＩ，及び＃ＲｒｈＪ１ＶＩＩと命名し、以後の実験に使用した。
（４）ヌクレアーゼ遺伝子の欠失
接合伝達により得られた各組換菌＃ＲｒｈＪ１ＩＩＩ，＃ＲｒｈＪ１ＩＶ，＃ＲｒｈＪ１Ｖ，＃ＲｒｈＪ１ＶＩ，及び＃ＲｒｈＪ１ＶＩＩは、それぞれゲノム上のＲｒｈＪ１ＩＩＩ遺伝子、ＲｒｈＪ１ＩＶ遺伝子、ＲｒｈＪ１Ｖ遺伝子、ＲｒｈＪ１ＶＩ遺伝子、又はＲｒｈＪ１ＶＩＩ遺伝子の領域に相同組換えにより各プラスミドが挿入されているが、各々の遺伝子を欠失するには２段階の相同組換えが必要である。そこで次に、ｓａｃＢ遺伝子を利用した選抜を実施した。
【０１６９】
１０％ショ糖を含んだＭＹＫプレートを作製し、各組換菌＃ＲｒｈＪ１ＩＩＩ，＃ＲｒｈＪ１ＩＶ，＃ＲｒｈＪ１Ｖ，＃ＲｒｈＪ１ＶＩ，及び＃ＲｒｈＪ１ＶＩＩのコロニーを滅菌水に懸濁した液を適度に希釈して塗布し、３０℃で静置した。各プレートに生育したコロニーの１４個についてコロニーＰＣＲし、ＰＣＲ断片のサイズを電気泳動で調べた。
反応液組成：                                                   
１０μＭ  Ｆｏｒｗａｒｄプライマー                 ０．１μＬ
１０μＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー                 ０．１μＬ
滅菌水                                             ４．８μＬ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ（タカラバイオ社製）        ５    μＬ  
総量                                             １０    μＬ
温度サイクル：
９８℃：１０秒、５５℃：５秒及び７２℃：２０秒の反応を３０サイクル
使用したプライマーセットは以下の通りである。
ＲｒｈＪ１ＩＩＩ遺伝子欠失確認用：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＪＭ６４（配列番号１８）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＪＭ６７（配列番号１９）
ＲｒｈＪ１ＩＶ遺伝子欠失確認用：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＪＭ７２（配列番号２６）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＪＭ７３（配列番号２７）
ＲｒｈＪ１Ｖ遺伝子欠失確認用：
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＪＭ７６（配列番号３４）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＪＭ７７（配列番号３５）
ＲｒｈＪ１ＶＩ遺伝子欠失確認用
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＪＭ６８（配列番号４２）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＪＭ７１（配列番号４３）
ＲｒｈＪ１ＶＩＩ遺伝子欠失確認用
Ｆｏｒｗａｒｄプライマー：ＪＭ８２（配列番号５０）
Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：ＪＭ８３（配列番号５１）。
【０１７０】
その結果、各プレートの複数のコロニーで、それぞれＲｒｈＪ１ＩＩＩ遺伝子、ＲｒｈＪ１ＩＶ遺伝子、ＲｒｈＪ１Ｖ遺伝子、ＲｒｈＪ１ＶＩ遺伝子、又はＲｒｈＪ１ＶＩＩ遺伝子が欠失していることが確認された。得られた各ヌクレアーゼ遺伝子の欠失株をそれぞれΔＲｒｈＪ１ＩＩＩ，ΔＲｒｈＪ１ＩＶ，ΔＲｒｈＪ１Ｖ，ΔＲｒｈＪ１ＶＩ，及びΔＲｒｈＪ１ＶＩＩと命名した。
［実施例４］
形質転換効率の評価
（１）ΔＲｒｈＪ１ＩＩＩ，ΔＲｒｈＪ１ＩＶ，ΔＲｒｈＪ１Ｖ，ΔＲｒｈＪ１ＶＩ，ΔＲｒｈＪ１ＶＩＩ，及びＪ１株の培養・コンピテントセルの作製
ＭＹＫＧ培地（０．５％ポリペプトン、０．３％バクトイーストエキス、０．３％マルツエキス、０．２％ＫＨ２ＰＯ４，０．２％Ｋ２ＨＰＯ４，１％グルコース）をΦ２４ｍｍ×１６５ｍｍ試験管に１０ｍＬずつ分注し、各試験管にΔＲｒｈＪ１ＩＩＩ，ΔＲｒｈＪ１ＩＶ，ΔＲｒｈＪ１Ｖ，ΔＲｒｈＪ１ＶＩ，ΔＲｒｈＪ１ＶＩＩ及び対照とするＪ１株のコロニーをそれぞれ植菌した。３０℃，３５０ｒｐｍで１日培養した後、得られた培養液各３ｍＬをＭＹＫＧ−２０％Ｓｕｃｒｏｓｅ培地（５００ｍＬ三角フラスコ中の１００ｍＬ）に植菌し、３０℃、２３０ｒｐｍで２０時間培養した。得られた培養液を全量５０ｍＬ容のチューブに移し、遠心分離（５０００ｒｐｍ，１０分間、４℃）により各菌体を回収した。回収した各菌体を１０ｍＬのＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４，１０％スクロース、ｐＨ８．３；以降ＥＢと省略することがある）で２回洗浄した後、菌濃度が同一となるように、それぞれＥＢに懸濁し、−８０℃で凍結してコンピテントセルとした。
【０１７１】
（２）プラスミドｐＫ４の調製
形質転換効率を評価するために使用するプラスミドｐＫ４（図８）を下記の方法で調製した。大腸菌ＳＣＳ１１０株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）及びＪＭ１０９株のコンピテントセルは実施例１（１）に記載の方法で調製した。
【０１７２】
大腸菌ＳＣＳ１１０株及びＪＭ１０９株のコンピテントセル各１００μＬに対してプラスミドｐＫ４を各２μＬ加え、実施例１（１）に記載の方法で形質転換した。形質転換後の各培養液をＬＢ  Ｋｍ寒天培地（カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ，寒天２％を含有するＬＢ培地）に塗布し、３７℃で一晩培養した。寒天培地上に出現した各形質転換体のコロニーを２ｍＬ  ＬＢ  Ｋｍ液体培地に植菌し、３７℃，１８０ｒｐｍにて一晩振盪培養した。培養後の各培養液全量からＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを回収し、それぞれを形質転換効率評価用プラスミドとした。
【０１７３】
（３）ΔＲｒｈＪ１ＩＩＩ，ΔＲｒｈＪ１ＩＶ，ΔＲｒｈＪ１Ｖ，ΔＲｒｈＪ１ＶＩ，ΔＲｒｈＪ１ＶＩＩへの形質転換
実施例４（１）にて調製した各コンピテントセル１０μＬに対してプラスミドｐＫ４を各２μＬ加え、滅菌水で全量を各２０μＬに調製した後氷上で２０分間放置した。続いて、当該コンピテントセルの全量をギャップ１ｍｍのエレクトロポレーション用キュベットに移し、印加条件１．５ｋＶ，４００Ω，２５μＦにてエレクトロポレーションした。その後、氷上で１０分間放置し、続いて３７℃で１０分間放置した。各キュベットにＭＹＫ液体培地各０．５ｍＬを加えてよく混和し、懸濁液を全量Φ１０×１０５ｍｍワッセルマン試験管に移して３０℃，１８０ｒｐｍで一晩振盪し、復帰培養を行った。復帰培養後の培養液全量をＭＹＫ寒天培地（１０ｍｇ／Ｌカナマイシン含有）に塗布し、３０℃で３日間培養した。寒天培地上に出現したコロニー数を数えて算出した形質転換効率を表１に示す。
【０１７４】
形質転換効率は以下の式で算出した。
【０１７５】
形質転換効率＝出現コロニー数÷{添加ＤＮＡ（プラスミド）量［μｇ］}
【０１７６】
【表１】
2014226090.tif 000002
【０１７７】
表１に示されるように、ヌクレアーゼを欠失させたΔＲｒｈＪ１ＩＩＩ，ΔＲｒｈＪ１ＩＶ，ΔＲｒｈＪ１Ｖ，ΔＲｒｈＪ１ＶＩ，及びΔＲｒｈＪ１ＶＩＩは野生型（Ｊ１）に比較して、有意に高い形質転換効率を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明により、ロドコッカス属細菌の形質転換方法が提供される。本発明に係る形質転換方法により得られたロドコッカス属細菌の形質転換体は、導入したＤＮＡの効果により新たな性質を付与することが可能であるため、産業上有用な微生物触媒等の開発に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１７９】
配列番号１１：プライマーＳＡＣ−０１
配列番号１２：プライマーＳＡＣ−０２
配列番号１３：プライマーＤＧ−０１
配列番号１４：プライマーＤＧ−０２
配列番号１８：プライマーＪＭ６４
配列番号１９：プライマーＪＭ６５
配列番号２０：プライマーＪＭ６６
配列番号２１：プライマーＪＭ６７
配列番号２２：プライマーＤＧ−０３
配列番号２３：プライマーＤＧ−０４
配列番号２６：プライマーＪＭ７２
配列番号２７：プライマーＪＭ７３
配列番号２８：プライマーＪＭ８４
配列番号２９：プライマーＪＭ８５
配列番号３０：プライマーＤＧ−０５
配列番号３１：プライマーＤＧ−０６
配列番号３４：プライマーＪＭ７６
配列番号３５：プライマーＪＭ７７
配列番号３６：プライマーＪＭ８８
配列番号３７：プライマーＪＭ８９
配列番号３８：プライマーＤＧ−０７
配列番号３９：プライマーＤＧ−０８
配列番号４２：プライマーＪＭ６８
配列番号４３：プライマーＪＭ６９
配列番号４４：プライマーＪＭ７０
配列番号４５：プライマーＪＭ７１
配列番号４６：プライマーＤＧ−０９
配列番号４７：プライマーＤＧ−１０
配列番号５０：プライマーＪＭ８２
配列番号５１：プライマーＪＭ８３
配列番号５２：プライマーＪＭ９４
配列番号５３：プライマーＪＭ１１９
【図１】
2014226090.tif 000003
【図２】
2014226090.tif 000004
【図３】
2014226090.tif 000005
【図４】
2014226090.tif 000006
【図５】
2014226090.tif 000007
【図６】
2014226090.tif 000008
【図７】
2014226090.tif 000009
【図８】
2014226090.tif 000010
【配列表】
2014226090000001.app