(57)【要約】      （修正有）【課題】効率的にアスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造を製造する方法を提供。【解決手段】マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼが触媒するオリゴ糖合成反応により、α−マンノース１−リン酸と、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはキトビオースを出発材料として、アスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンまたはマンノシル−β−１，４−キトビオースをワンステップで簡便に製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の酵素学的性質を有するオリゴ糖合成酵素マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼ：
ａ）作用
α−マンノース１−リン酸と、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはキトビオースに作用して、アスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンまたはマンノシル−β−１，４−キトビオースを生成する；
ｂ）基質特異性
α−マンノース１−リン酸と、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはキトビオースに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ５．５；
ｄ）温度安定性
ｐＨ５．５の条件下で、６０℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ４．５−１０．５で安定。
【請求項２】
α−マンノース１−リン酸と、Ｎ−アセチルグルコサミンと、請求項１に記載のオリゴ糖合成酵素マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うステップと、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンを回収するステップを含むことを特徴とするアスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造の製造方法。
【請求項３】
α−マンノース１−リン酸と、キトビオースと、請求項１に記載のオリゴ糖合成酵素マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うステップと、マンノシル−β−１，４−キトビオースを回収するステップを含むことを特徴とするアスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造の製造方法。
【請求項４】
前記溶液は、ｐＨ５．０〜７．０であることを特徴とする請求項２または３に記載のアスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規に発見したオリゴ糖合成酵素マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼおよび前記酵素が触媒するオリゴ糖合成反応を用いた、アスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンおよびマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、マンノシル−β−１，４−キトビオースという）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質が有する糖鎖の生体認識（細胞接着・抗原抗体反応・情報伝達・ウイルス感染など）への重要性については近年注目が集まるところである。糖鎖は、核酸、タンパク質に次ぐ第三の鎖といわれ、近年急速にその機能解明が進められている。その中で、アスパラギン結合型糖鎖は、タンパク質などに結合し、細胞分化、老化、免疫応答といった生命現象や、癌、ウイルス感染、炎症などの疾患に深く関与していることが知られている。さらに、分子レベルでの糖鎖機能の解明、さらには糖鎖を利用した創薬への応用が期待されている。
【０００３】
しかし、生体内での発現量が微量な糖鎖試料の調製は現在有機合成法に頼らざるを得ず、その困難さが糖鎖工学研究分野や糖鎖再生医療の進展を妨げている。例えば、アスパラギン結合型３糖は、従来は、有機合成法による煩雑な多段階反応で製造されており（引用文献１）、効率的な大量調製が困難であるため、非常に高額であるという問題点があった。そのため、糖鎖の簡便な製造法の確立は急務となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４７７８３１５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は上記問題点に鑑み、効率的にアスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造を製造することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を達成するため鋭意検討した結果、新規に発見したマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼが触媒するオリゴ糖合成反応を用いて、高価なアスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンおよびマンノシル−β−１，４−キトビオースをワンステップで製造することができ、反応系のスケールアップによる大量調製も可能であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の酵素学的性質を有するオリゴ糖合成酵素マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼである：
ａ）作用
α−マンノース１−リン酸と、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルグルコサミノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、キトビオースという）に作用して、アスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンまたはマンノシル−β−１，４−キトビオースを生成する；
ｂ）基質特異性
α−マンノース１−リン酸と、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはキトビオースに作用する；
ｃ）至適ｐＨ
３０℃の条件下で、ｐＨ５．５；
ｄ）温度安定性
ｐＨ５．５の条件下で、６０℃まで安定；
ｅ）ｐＨ安定性
４℃、２４時間の条件下で、ｐＨ４．５−１０．５で安定。
【０００８】
また、本発明のアスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造の製造方法は、α−マンノース１−リン酸と、Ｎ−アセチルグルコサミンと、前記オリゴ糖合成酵素マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うステップと、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンを回収するステップを含むことを特徴とする。
【０００９】
また、本発明のアスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造の製造方法は、α−マンノース１−リン酸と、キトビオースと、前記オリゴ糖合成酵素マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うステップと、マンノシル−β−１，４−キトビオースを回収するステップを含むことを特徴とする。
【００１０】
また、前記アスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造の製造方法は、前記溶液が、ｐＨ５．０〜７．０であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼが触媒するオリゴ糖合成反応により、α−マンノース１−リン酸と、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはキトビオースを出発材料として、アスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンまたはマンノシル−β−１，４−キトビオースをワンステップで簡便に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の方法によれば、加リン酸分解反応の逆反応であるオリゴ糖合成反応により、アスパラギン結合型糖鎖のコア構造を選択的に製造できる。
【００１３】
具体的には、α−マンノース１−リン酸と、Ｎ−アセチルグルコサミンと、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うことにより、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンを製造することができる。
【化１】
2014045704.tif 000002
【００１４】
また、α−マンノース１−リン酸と、キトビオースと、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼを含む溶液中でオリゴ糖合成反応を行うことにより、マンノシル−β−１，４−キトビオースを製造することができる。
【化２】
2014045704.tif 000003
【００１５】
反応液中でのマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼの濃度は特に限定されないが、０．７６〜７６μＭ、好ましくは、１．５〜３．８μＭで使用し得る。
【００１６】
マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼの３０℃における至適ｐＨは５．５付近であることから、前記溶液は、ｐＨ５．０〜７．０であることが好ましく、特にｐＨ５．５が好ましい。前記溶液としては、特に限定されるものではないが、酢酸緩衝溶液が好適である。
【００１７】
また、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼのｐＨ５．５における温度安定性は６０℃までであることから、オリゴ糖合成反応は、３０〜６０℃で行うことが好ましく、特に、３０℃が好ましい。
【００１８】
また、反応時間は、特に限定されるものではないが、３０〜６０分が好ましく、特に、６０分が好ましい。
【００１９】
上記オリゴ糖合成反応により製造されたアスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンおよびマンノシル−β−１，４−キトビオースは、カラムクロマトグラフィーや結晶化等の公知の方法により単離することが可能であるが、高速液体クロマトグラフィーが好適である。
【００２０】
なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の思想を逸脱しない範囲で種々の変形実施が可能である。
【００２１】
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）のゲノム情報を基に、ＢＴ１０３３遺伝子に対するフォーワードプライマー（配列番号３）およびリバースプライマー（配列番号４）を設計し、合成した。ＢＴ１０３３遺伝子の塩基配列を配列番号２に、またこの塩基配列にコードされているアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００２３】
バクテロイデス・シータイオタオミクロンのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマー及びＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用い、９５℃に２分間保持したのち、９５℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、６８℃で１分３０秒間のサイクルを４５回繰り返してＰＣＲ反応を行い、最後に６８℃に５分間保持した。その結果、９８５ｂｐの増幅断片が得られた。このＰＣＲで増幅されるＤＮＡ断片は、５’末端にＮｄｅＩサイトを、３’末端にＸｈｏＩサイトをそれぞれ有するＢＴ１０３３をコードするＤＮＡである。
【００２４】
得られた増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩで消化後、同様に処理した市販の遺伝子発現用プラスミドｐＥＴ−２４ａ（ノバジェン社製）に高効率ライゲーション試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて連結した。さらに、ライゲーション反応液を用いて大腸菌コンピテントセルＤＨ５α（ＴＯＹＯＢＯ製）を形質転換し、Ｃ末端に６残基のヒスチジンからなるＨｉｓタグが付加されたＢＴ１０３３をコードするＤＮＡを含む発現ベクターｐＥＴ−２４ａを回収した。
【００２５】
この発現ベクターｐＥＴ−２４ａを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＨａｎａｈａｎらの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８３年、第１６６巻、第５５７−５８０頁）に従って形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地２００ｍＬに植菌し、ＩＰＴＧ濃度を０．１ｍＭとして誘導培養を１８℃で２４時間行った。培養液から遠心分離で回収した菌体を１０ｍＬの５００ｍＭ塩化ナトリウムおよび１０％グリセロールを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．５に懸濁し、超音波処理により破砕した後、遠心分離後によって粗酵素液を得た。組換えタンパク質の精製は、Ｈｉｓタグタンパク質精製用カラムＨｉｓＴｒａｐＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を用いたカラムクロマトグラフィーにより行った。得られた精製酵素溶液を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ７．０に対して透析を行い、遠心式フィルターユニットアミコンウルトラ−１５（ミリポア社製）を用いた限外濾過によって濃縮することで、３．６ｍＬの精製酵素標品を調製した。
【実施例２】
【００２６】
得られた精製酵素標品を用い、以下に示す方法によって本タンパク質を新規酵素マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼと同定し、アスパラギン結合型糖タンパク質のコア糖鎖構造マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンおよびマンノシル−β−１，４−キトビオースを生成した。
【００２７】
５０ｍＭ糖供与体（α−マンノース１−リン酸）、５０ｍＭ糖受容体（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはキトビオース）、精製酵素（それぞれ１．５、３．８μＭ）を含む４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中で酵素反応を３０℃、１時間行った。各反応液をアンバーライトＭＢ３（オルガノ社製）で脱塩後、ショウデックスアサヒパック  ＮＨ２Ｐ−５０  ４Ｅカラムによる７５％アセトニトリルを溶媒とした高速液体クロマトグラフィーにより、それぞれ二糖画分（図１Ａ）および三糖画分（図２Ａ）を単離した。精製後の収量は共に２ｍｇであった。それぞれの生成物をＮＭＲにより分析したところ、マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンおよびマンノシル−β−１，４−キトビオースであることを確認した。
【００２８】
４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中、２ｍＭのα−マンノース１−リン酸および糖受容体を用いて、合成反応時に生成するリン酸をモリブデンブルー法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４６、１６２、４２１−４２８）により定量した。上記条件下に毎分１μモルのリン酸を生成する活性を１ユニットと定義した。その結果、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびキトビオースを糖受容体としたときの活性はそれぞれ２０および１．９ユニット／ｍｇであった。
【００２９】
マンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼの３０℃における至適ｐＨは５．５付近であり（図３Ａ）、安定ｐＨ範囲は４℃，２４時間の条件下でｐＨ４．５−１０．５であった（図３Ｂ）。本酵素のｐＨ５．５における安定性は６０℃までであった（図３Ｃ）。本酵素を用いたオリゴ糖合成反応は、ｐＨ５．０〜７．０、３０〜６０℃が好ましいことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
以上のように本発明は、医療創薬産業およびオリゴ糖製造業で利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】実施例２のマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンのクロマトグラムである。
【図１Ｂ】実施例２のマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンの収率を示す図である。
【図２Ａ】実施例２のマンノシル−β−１，４−キトビオースのクロマトグラムである。
【図２Ｂ】実施例２のマンノシル−β−１，４−キトビオースの収率を示す図である。
【図３Ａ】実施例１で調製したマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼの至適ｐＨを示す図である。
【図３Ｂ】実施例１で調製したマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼのｐＨ安定性を示す図である。
【図３Ｃ】実施例１で調製したマンノシル−β−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミンホスホリラーゼの温度安定性を示す図である。
【図１Ａ】
2014045704.tif 000004
【図１Ｂ】
2014045704.tif 000005
【図２Ａ】
2014045704.tif 000006
【図２Ｂ】
2014045704.tif 000007
【図３Ａ】
2014045704.tif 000008
【図３Ｂ】
2014045704.tif 000009
【図３Ｃ】
2014045704.tif 000010
【配列表】
2014045704000001.app