(57)【要約】  試料に含まれると想定される糖鎖の構造、想定されるイオン価数、共通のプロダクトイオンm/zなどを分析者が入力すると、プリカーサm/z計算部（３０１）が糖鎖由来のプリカーサイオンのm/zを計算し、メソッドファイル作成部（３０５）はMRMトランジションを含むメソッドファイルを作成する。多価イオン情報ファイル作成部（３０３）は糖鎖構造の固有IDとプリカーサイオンm/z、プロダクトイオンm/zを紐付けるファイルを作成する。測定終了後、クロマトグラム作成部（３４）はMRMトランジション毎にマスクロマトグラムを作成し、ピーク面積合算部（３１１）は紐付けファイルを参照して同一糖鎖に対応する複数のMRMトランジションに対するマスクロマトグラム上のピーク面積を合算する。定量値算出部（３１２）はこの合算値に基づき各糖鎖の存在量比を定量値として求め、定量出力情報作成部（３９）はこれをグラフ化して表示部（５）に出力する。これにより、糖鎖等、多価イオンが生じ易い化合物の多成分一斉分析がLC-MSを用いて可能となる。
2017037829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＳ／ＭＳ分析が可能である質量分析装置を利用して試料中の高分子化合物を定量する定量分析方法であって、
a)分析対象である又は分析対象として想定される高分子化合物について、該化合物由来でイオン価数が相違する複数のプリカーサイオン及び共通である一つのプロダクトイオンを対象とした複数のＭＲＭ測定によってそれぞれ得られた複数のマスクロマトグラムに現れるピークの面積を合計した合算値を算出するピーク情報取得ステップと、
b)前記ピーク情報取得ステップで得られた合算値を利用して、分析対象である又は分析対象として想定される高分子化合物の定量演算を行う定量ステップと、
を有することを特徴とする高分子化合物の定量分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の高分子化合物の定量分析方法であって、
前記高分子化合物は糖鎖又は糖ペプチドであることを特徴とする高分子化合物の定量分析方法。
【請求項３】
請求項２に記載の高分子化合物の定量分析方法であって、
前記試料は糖鎖又は糖ペプチドの混合物であり、
前記ピーク情報取得ステップでは、前記試料に含まれる複数の糖鎖又は糖ペプチドの合算値を取得し、
前記定量ステップでは、前記ピーク情報取得ステップで得られた任意の糖鎖又は糖ペプチドに対する合算値と、前記試料に含まれる複数の糖鎖又は糖ペプチドの合算値を合計した合計値とに基づいて、前記任意の糖鎖又は糖ペプチドの存在量比を求め、
前記定量ステップで得られた任意の糖鎖又は糖ペプチドの存在量比を表示部の画面上にグラフ形式又は表形式で提示する定量結果提示ステップをさらに有することを特徴とする高分子化合物の定量分析方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の高分子化合物の定量分析方法であって、
前記質量分析装置の前段に液体クロマトグラフを接続した液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて試料中の高分子化合物を測定することを特徴とする高分子化合物の定量分析方法。
【請求項５】
ＭＳ／ＭＳ分析が可能である質量分析装置を用いて得られたデータに基づいて試料中の高分子化合物を定量するデータ処理装置であって、
a)分析対象である又は分析対象として想定される高分子化合物について、該化合物由来でイオン価数が相違する複数のプリカーサイオン及び共通である一つのプロダクトイオンを対象とした複数のＭＲＭ測定によってそれぞれ得られた複数のマスクロマトグラムに現れるピークの面積を合計した合算値を算出するピーク情報取得部と、
b)前記ピーク情報取得部で得られた合算値を利用して、分析対象である又は分析対象として想定される高分子化合物の定量演算を行う定量処理部と、
を備えることを特徴とするデータ処理装置。
【請求項６】
請求項５に記載のデータ処理装置であって、
前記高分子化合物は糖鎖又は糖ペプチドであることを特徴とするデータ処理装置。
【請求項７】
請求項６に記載のデータ処理装置であって、
前記試料は糖鎖又は糖ペプチドの混合物であり、
前記ピーク情報取得部は、前記試料に含まれる複数の糖鎖又は糖ペプチドの合算値を取得し、
前記定量処理部は、前記ピーク情報取得部で得られた任意の糖鎖又は糖ペプチドに対する合算値と、前記試料に含まれる複数の糖鎖又は糖ペプチドの合算値を合計した合計値とに基づいて、前記任意の糖鎖又は糖ペプチドの存在量比を求め、
前記定量処理部で得られた任意の糖鎖又は糖ペプチドの存在量比を表示部の画面上にグラフ形式又は表形式で提示する定量結果提示部、をさらに備えることを特徴とするデータ処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の糖鎖や糖ペプチドなどの高分子化合物を定量する定量分析方法及び該定量分析のためのデータ処理装置に関し、さらに詳しくは、ＭＳ／ＭＳ分析が可能な質量分析装置を用いて試料中の高分子化合物を定量する方法及びそのためのデータ処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品や農薬などの低分子化合物の定量分析には、液体クロマトグラフとタンデム四重極型質量分析装置とを組み合わせた液体クロマトグラフ質量分析装置（ＬＣ−ＭＳ）による多重反応モニタリング（ＭＲＭ＝Multiple Reaction Monitoring）測定がしばしば利用されている。ＭＲＭ測定では、２段階の質量分離器（四重極マスフィルタ）により夾雑成分の影響を排除することができるので、目的成分と保持時間が近い夾雑成分が存在し、液体クロマトグラフにおいてそれらが十分には分離できない場合であっても、高い精度で目的成分の定量分析を行うことができる。また、通常、ＬＣ−ＭＳによるＭＲＭ測定では、プリカーサイオンとプロダクトイオンとの組み合わせ（一般にＭＲＭトランジションという）を一つの測定時間範囲に複数設定することができ、１回の測定で数十種から百数十種の成分の定量を行うことができる。こうした分析手法は多成分一斉分析と呼ばれ、近年、残留農薬検査、環境水中の汚染物質検査などに広く利用されている。【０００３】
一方、糖鎖や糖ペプチドなどの高分子化合物の定量分析には、いまだに紫外吸収検出器や蛍光検出器を検出器として用いた液体クロマトグラフが頻用されている（非特許文献１、２など参照）。その理由の一つは、ＬＣ−ＭＳで一般に使用されているエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法などによるイオン源では、糖鎖や糖ペプチドなどの高分子化合物をイオン化する際に価数が１でない多価イオンが複数種類生成され易いため、低分子化合物のように、成分毎に、一つのプリカーサイオンと一つのプロダクトイオンという単純な組み合わせにはならないためである。さらに、よく知られているように糖鎖の構造には不均一性があり、試料によって検出されるイオン価数のばらつきが大きいという問題もある。こうしたことのために、糖鎖や糖ペプチドなどの高分子化合物の定量分析では、低分子化合物の定量分析とは異なり、ＬＣ−ＭＳを利用した多成分一斉分析は困難である。その結果、紫外吸収検出器や蛍光検出器を検出器とした液体クロマトグラフを用いて化合物一つ一つについて定量分析を行う必要があり、分析のスループットが低く、分析に要する時間の短縮や労力の削減が大きな課題となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−６６７０４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】マーチン・パブスト（Martin Pabst）、ほか６名、「コンパリソン・オブ・フルオレセント・ラベルズ・フォー・オリゴサッカライズ・アンド・イントロダクション・オブ・ア・ニュー・ポストラベリング・パリフィケイション・メソッド（Comparison of fluorescent labels for oligosaccharides and introduction of a new postlabeling purification method）」、アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical Biochemistry）、Vol. 384、2009年、pp.263-273
【非特許文献２】チェンジャン・ワン（Chengjian Wang）、ほか３名、「セパレイション・オブ・ワン-ポット・プロシデュア・リリースド・Ｏ-グリカンズ・アズ・1-フェニル-3-メチル-5-ピラゾロン・デリベイティブズ・バイ・ハイドロヒリック・インターアクション・アンド・リバースド-フェイズ・リキッド・クロマトグラフィ・フォロード・バイ・アイデンティフィケイション・ユージング・エレクトロスプレー・マス・スペクトロメトリー・アンド・タンデム・マス・スペクトロメトリー（Separation of one-pot procedure released O-glycans as 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives by hydrophilic interaction and reversed-phase liquid chromatography followed by identification using electrospray mass spectrometry and tandem mass spectrometry）」、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィ（Journal of Chromatography A）、Vol.1274、2013年、pp.107-117
【非特許文献３】和田（Y. Wada）、ほか２名、「ハイドロフィリック・アフィニティ・アイソレイション・アンド・マルディ・マルチプル-ステージ・タンデム・マス・スペクトロメトリー・オブ・グリコペプタイズ・フォー・グリコプロテオミクス（Hydrophilic affinity isolation and MALDI multiple-stage tandem mass spectrometry of glycopeptides for glycoproteomics）」、アナリティカル・ケミストリー（Analytical Chemistry）、Vol. 76、2004年、pp.6560-6565
【非特許文献４】チェンジャン・ワン（Chengjian Wang）、ほか４名、「ワン-ポット・ノンリダクティブ・Ｏ-グリカン・リリース・アンド・ラベリング・ウィズ・1-フェニル-3-メチル-5-ピラゾロン・フォロード・バイ・ESI-MS・アナリシス（One-pot nonreductive O-glycan release and labeling with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone followed by ESI-MS analysis）」、プロテオミクス（Proteomics）、Vol.11、2011年、pp.4229-4242
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは、例えば液体クロマトグラフとタンデム四重極型質量分析装置などのＭＳ／ＭＳ分析が可能である質量分析装置とを組み合わせた装置におけるＭＲＭ測定を利用して、糖鎖や糖ペプチドなどの高分子化合物についての多成分一斉分析を可能とすることで、それら高分子化合物の定量分析のスループットを改善することができる高分子化合物の定量分析方法及び該方法を実施するためのデータ処理装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するためになされた本発明に係る高分子化合物の定量分析方法は、ＭＳ／ＭＳ分析が可能である質量分析装置を利用して試料中の高分子化合物を定量する定量分析方法であって、
a)分析対象である又は分析対象として想定される高分子化合物について、該化合物由来でイオン価数が相違する複数のプリカーサイオン及び共通である一つのプロダクトイオンを対象とした複数のＭＲＭ測定によってそれぞれ得られた複数のマスクロマトグラムに現れるピークの面積を合計した合算値を算出するピーク情報取得ステップと、
b)前記ピーク情報取得ステップで得られた合算値を利用して、分析対象である又は分析対象として想定される高分子化合物の定量演算を行う定量ステップと、
を有することを特徴としている。【０００８】
また上記課題を解決するためになされた本発明に係る高分子化合物の定量分析のためのデータ処理装置は、上記定量分析方法を実施するための装置であり、ＭＳ／ＭＳ分析が可能である質量分析装置を用いて得られたデータに基づいて試料中の高分子化合物を定量するデータ処理装置であって、
a)分析対象である又は分析対象として想定される高分子化合物について、該化合物由来でイオン価数が相違する複数のプリカーサイオン及び共通である一つのプロダクトイオンを対象とした複数のＭＲＭ測定によってそれぞれ得られた複数のマスクロマトグラムに現れるピークの面積を合計した合算値を算出するピーク情報取得部と、
b)前記ピーク情報取得部で得られた合算値を利用して、分析対象である又は分析対象として想定される高分子化合物の定量演算を行う定量処理部と、
を備えることを特徴としている。【０００９】
本発明に係る高分子化合物の定量分析方法及びデータ処理装置において処理の対象であるデータを取得するための質量分析装置としては典型的には、コリジョンセルを挟んで前後に四重極マスフィルタを配置したタンデム四重極型質量分析装置、該タンデム四重極型質量分析装置において後段の四重極マスフィルタを飛行時間型質量分析装置に置き換えたＱ−ＴＯＦ型質量分析装置、又は、コリジョンセル及びイオンゲートを挟んで飛行時間型質量分離器を２段接続したＴＯＦ／ＴＯＦ型質量分析装置などである。また、ここで使用される質量分析装置は、多価イオンを生成し易い傾向にあるイオン源を利用したものであることが好ましい。こうしたイオン源としては例えば、上述したＥＳＩ法等のいわゆる大気圧イオン化法によるイオン源が挙げられる。【００１０】
また本発明に係る高分子化合物の定量分析方法及びデータ処理装置において、分析対象の高分子化合物は典型的には糖鎖又は糖ペプチドである。何故なら、糖鎖や糖ペプチドでは、その糖鎖や糖ペプチドの構造の相違に拘わらず、そのプリカーサイオンの開裂によって生成される共通のプロダクトイオンが既知であるからである。
例えば、Ｎ−結合型糖ペプチドや２−アミノピリジン等により標識された標識Ｎ−結合型糖鎖では、Ｎ−結合型糖鎖のコア構造（3Hex-2HexNac）に由来する、質量電荷比m/zが１３８であるプロダクトイオンを共通のプロダクトイオンとすればよい（特許文献１参照）。また、１−フェニル−３−メチル−５−ピラゾロン（1-phenyl-3-Methyl-5-pyrazolone＝ＰＭＰ）により標識されたＰＭＰ標識Ｏ−結合型糖鎖では、開裂によって優先的に脱離する完全体であるＰＭＰ由来の、質量電荷比m/zが１７５であるプロダクトイオンを共通のプロダクトイオンとすればよい。【００１１】
或る高分子化合物からイオン価数が相違する複数の多価イオンが生成される場合、所定範囲のイオン価数全てについてＭＲＭトランジションを定めＭＲＭ測定を実施することも可能ではあるが、一つの化合物当たりのＭＲＭトランジションの数が多いと、一つのＭＲＭトランジションの下でのＭＲＭ測定の時間が短くなる、又は、同じＭＲＭトランジションの下でのＭＲＭ測定の繰り返しの時間間隔が長くなる。前者は分析感度の低下に繋がるし、後者は定量精度の低下に繋がる。そこで、本発明に係るデータ処理装置では、化合物情報、イオン価数についての情報、及びプロダクトイオンについての情報を分析者が入力設定できるようにするとよい。糖鎖、糖ペプチドなどの特定の高分子化合物については、分析者は先験情報に基づき、例えばＥＳＩ法によるイオン化の際に生成されるイオンのイオン価数の範囲を或る程度推定可能であるから、そうした推定に基づく情報を入力設定することで、有意なデータが得られない無駄な測定を回避することができる。【００１２】
本発明に係る高分子化合物の定量分析方法において、ピーク情報取得ステップでは、一つの目的化合物に対する複数のＭＲＭ測定によってそれぞれ得られたマスクロマトグラムに現れる、該目的化合物由来のピーク面積を合計する。このとき、一つのＭＲＭ測定によって得られるマスクロマトグラムから求まるピーク面積は、目的化合物由来の或る一つのイオン価数のイオンの量を反映したものである。そこで、目的化合物由来のそれぞれ異なるイオン価数のイオンの量を反映した複数のピーク面積を合計することで、イオン価数に依らないイオンの量を反映した合算値を算出し、この合算値を目的化合物の定量に利用する。例えば、試料が糖鎖又は糖ペプチドの混合物である場合、試料に含まれる糖鎖又は糖ペプチドをほぼ網羅するように測定を実行し、その結果に基づいてそれぞれのピーク面積の合算値を求めることで、各糖鎖又は糖ペプチドの試料中の存在量比を算出することができる。【００１３】
こうした演算を実行するとともにその結果を出力するために、本発明に係る高分子化合物の定量分析のためのデータ処理装置では、
前記試料は糖鎖又は糖ペプチドの混合物であり、
前記ピーク情報取得部は、前記試料に含まれる複数の糖鎖又は糖ペプチドの合算値を取得し、
前記定量処理部は、前記ピーク情報取得部で得られた任意の糖鎖又は糖ペプチドに対する合算値と、前記試料に含まれる複数の糖鎖又は糖ペプチドの合算値を合計した合計値とに基づいて、前記任意の糖鎖又は糖ペプチドの存在量比を求め、
前記定量処理部で得られた任意の糖鎖又は糖ペプチドの存在量比を表示部の画面上にグラフ形式又は表形式で提示する定量結果提示部、をさらに備える構成とするとよい。【００１４】
なお、本発明に係る高分子化合物の定量分析方法及びデータ処理装置において処理対象であるデータを取得するために、上述したように、液体クロマトグラフで成分分離された化合物を含む試料を質量分析装置に導入するＬＣ−ＭＳを用いることは必須ではないものの、多成分一斉分析を行う場合、特に糖鎖のように質量が同じで構造が多様である化合物の定量を行う際にはＬＣ−ＭＳを用いてデータを取得することが好ましい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る高分子化合物の定量分析方法及び該定量分析のためのデータ処理装置によれば、イオン化の際に複数種類の多価イオンが生成され易い、糖鎖や糖ペプチドなどの高分子化合物を、ＭＳ／ＭＳ分析が可能な質量分析装置におけるＭＲＭ測定を利用して効率良く且つ精度良く定量することができる。また特に、ＬＣ−ＭＳを利用することによって、糖鎖や糖ペプチドの混合物などの試料に対する多成分一斉分析が可能となるので、それら高分子化合物の定量分析のスループットを改善し、分析に要する時間の節約と労力の削減を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施例である定量分析装置の概略構成図。
【図２】本実施例の定量分析装置における分析対象化合物とプリカーサイオン及びプロダクトイオンの紐付けの一例を示す説明図。
【図３】本実施例の定量分析装置における多価イオンであるプリカーサイオンと共通のプロダクトイオンとの組み合わせの一例を示す図。
【図４】本実施例の定量分析装置において得られる、同一糖鎖由来の複数のＭＲＭトランジションにおけるマスクロマトグラムの一例を示す図。
【図５】本実施例の定量分析装置において得られる、同一糖鎖由来の複数のＭＲＭトランジションにおけるマスクロマトグラムの別の例を示す図。
【図６】本実施例の定量分析装置における定量分析結果である糖鎖の存在量比のグラフ及び表の一例を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明に係る高分子化合物の定量分析方法及び該方法を実施するためのデータ処理装置の一実施例について、添付図面を参照して説明する。ここでは、糖鎖又は糖ペプチドの混合物を試料とし、該試料中の糖鎖又は糖ペプチドを定量する場合を例に挙げる。
図１は、本発明に係るデータ処理装置を含む、本実施例の定量分析装置の概略構成図である。
【００１８】
この定量分析装置は、液体クロマトグラフ（ＬＣ）２０及びタンデム四重極型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）２１を含む測定部２と、測定部２の動作を制御するとともに該測定部２で得られたデータを処理する制御・処理部３と、ユーザーインターフェイスである入力部４及び表示部５と、を備える。
【００１９】
図示しないが、液体クロマトグラフ２０は移動相を送給する送液ポンプ、移動相中に試料を注入するインジェクタ、試料中の成分を時間方向に分離するカラムなどを含む。一方、タンデム四重極型質量分析装置２１はそのカラムから溶出して来る液体試料中の成分をイオン化するためにＥＳＩイオン源、前段四重極マスフィルタ、コリジョンセル、後段四重極マスフィルタ、検出器などを含む。なお、タンデム四重極型質量分析装置２１はＱ−ＴＯＦ型質量分析装置等、ＭＳ／ＭＳ分析が可能である他の形態の質量分析装置でもよい。
【００２０】
通常、制御・処理部３の実体はパーソナルコンピュータ又はより高性能のワークステーション（ただし、それらは必ずしも１台であるとは限らず、相互に接続された複数台のコンピュータである場合もある）であり、インストールされた１又は複数の専用の制御・処理ソフトウエアが、該コンピュータ上で動作することで、制御・処理部３に含まれる各機能ブロックが具現化される。
【００２１】
具体的には、制御・処理部３は、既存の制御・処理ソフトウエアで具現化される機能ブロック（図１中の符号３Ａ）として、分析制御部３１と、データ収集部３２と、データ記憶部３３と、クロマトグラム作成部３４と、ピーク面積算出部３５と、を備える。また、制御・処理部３は、後述する特徴的なデータ処理を実行するために、新たに用意された制御・処理ソフトウエアで具現化される機能ブロック（図１中の符号３Ｂ）として、プリカーサm/z計算部３０１を含む測定対象設定部３００と、多価イオン情報ファイル作成部３０３、多価イオン情報ファイル記憶部３０４、メソッドファイル作成部３０５、メソッドファイル記憶部３０６を含む測定条件設定部３０２と、ピーク面積合算部３１１、定量値算出部３１２を含む多価イオン定量演算部３１０と、定量出力情報作成部３１３と、を備える。なお、図１中で符号３Ａ、３Ｂで示される機能ブロックは、一つの制御・処理ソフトウエアで具現化されるものであってもよいことは当然である。
【００２２】
測定対象である試料は例えば、Ｎ−結合型糖ペプチド混合物、標識Ｎ−結合型糖鎖混合物、ＰＭＰ標識Ｏ−結合型糖鎖混合物などである。それらはいずれも所定の前処理を経て調製されたものである。Ｎ−結合型糖ペプチドは例えば、抗体などの糖タンパク質をトリプシンなどの適宜の酵素で消化し、非特許文献３に記載の方法に準拠した方法で調製される。標識Ｎ−結合型糖鎖は例えば、糖鎖をPNGaseなどでグリカナーゼ処理したあとに２−アミノピリジンなどで標識することで調製される。ＰＭＰ標識Ｏ−結合型糖鎖は例えば、非特許文献４に記載の方法に準拠し、非還元的アルカリβ脱離とＰＭＰによる標識によって調製される。
【００２３】
上述したような試料を測定部２により測定するに先立って、分析者はキーボード等である入力部４から測定条件を入力する。まず、分析者は、試料に含まれていると想定される様々な糖鎖の構造と、その糖鎖から生成されると想定されるイオン（プリカーサイオン）のイオン価数と、糖鎖の構造に関係なく共通に現れるプロダクトイオンの質量電荷比と、を入力設定する。
具体的には、分析者が入力部４で所定の操作を行うと、測定対象設定部３００は様々な糖鎖の構造のリストを表示部５の画面上に表示する。分析者はそのリストの中から試料に含まれていると想定される複数の糖鎖構造を選択し、それぞれについて複数のイオン価数を入力する。糖鎖構造毎に質量は既知であるから、プリカーサm/z計算部３０１は、その質量と入力されたイオン価数とから、糖鎖構造毎に、該糖鎖由来のイオンの質量電荷比をプリカーサイオン質量電荷比として算出する。
【００２４】
また、測定対象設定部３００はプロダクトイオンの質量電荷比の候補リストを表示部５の画面上に表示し、分析者はそのリストから試料の種類等に応じて適宜の質量電荷比を選択する。プロダクトイオンの質量電荷比は通常、糖鎖の基幹構造に依存するから、試料中の成分がＮ−結合型糖ペプチド又は標識Ｎ−結合型糖鎖である場合には、特許文献１に開示されているように、プロダクトイオン質量電荷比としてm/z１３８を選択すればよい。これはＮ−結合型糖鎖のコア構造（3Hex-2HexNac）に由来するイオンである。また、試料中の成分がＰＭＰ標識Ｏ−結合型糖鎖である場合には、本出願人による先願である特願２０１５−８３８４６号に開示されているように、プロダクトイオン質量電荷比としてm/z１７５を選択すればよい。これは開裂によって優先的に脱離する完全体であるＰＭＰ由来のイオンである。
【００２５】
上記処理により、多数のプリカーサイオンの質量電荷比とプロダクトイオンの質量電荷比とが決まるから、一つのプリカーサイオンの質量電荷比と一つのプロダクトイオンの質量電荷比とを組み合わせた、多数のＭＲＭトランジションが決まる。図３は、多価イオンであるプリカーサイオンと共通のプロダクトイオンとの組み合わせ、つまりはＭＲＭトランジションの一例を示す図である。図３において例えば１行目は、３価イオンである質量電荷比がm/z９８６．７２２５のプリカーサイオンと、質量電荷比がm/z１３８であるプロダクトイオンとの組み合わせを示している。
【００２６】
さらに分析者は、測定条件設定部３０２により表示部５の画面上に表示される測定条件設定画面において、測定時間範囲とその測定時間範囲内に実行するＭＲＭ測定のＭＲＭトランジション等の測定条件を入力部４により入力する。通常、測定時間範囲は想定される糖鎖の既知の保持時間に基づいて適宜決められる。
【００２７】
上記のような測定条件の設定を受けてメソッドファイル作成部３０５は、試料注入を基点とする所定の開始時間から終了時間までの時間範囲に所定の１乃至複数のＭＲＭトランジションに対するＭＲＭ測定を繰り返し実行するように各部を制御するためのメソッドファイルを作成する。或る測定時間範囲に一つのＭＲＭトランジションに対するＭＲＭ測定しか設定されていなければ、その一つのＭＲＭトランジションに対するＭＲＭ測定を繰り返し実行することになる。また、或る測定時間範囲に複数のＭＲＭトランジションに対するＭＲＭ測定が設定されていれば、その複数のＭＲＭトランジションに対するＭＲＭ測定をそれぞれ１回ずつ実施するというサイクルを繰り返し実行することになる。作成されたメソッドファイルはメソッドファイル記憶部３０６に保存される。
【００２８】
また、多価イオン情報ファイル作成部３０３は、各糖鎖構造に割り当てられている固有ＩＤと、該糖鎖に由来するイオン価数の相違する複数のプリカーサイオンの質量電荷比、及び、共通のプロダクトイオンの質量電荷比、を紐付けする多価イオン情報ファイルを作成し、多価イオン情報ファイル記憶部３０４に保存する。
【００２９】
図２はこの紐付けの一例を示す説明図である。この例では、糖鎖構造を特定可能な固有ＩＤと、イオン価数が２、３、４である３種類のプリカーサイオンの質量電荷比、及びそれらプリカーサイオンに共通である一つのプロダクトイオンの質量電荷比、が紐付けされている。この場合には、この糖鎖については三種類のＭＲＭトランジションが存在していることになる。このような紐付けを行うためのファイルを作成するのは、上述したメソッドファイルでは測定時間範囲とＭＲＭトランジションとの対応付けはなされているものの、ＭＲＭトランジションと化合物（この場合には糖鎖や糖ペプチドの構造）との対応付けはなされていないためである。
【００３０】
例えば分析者から分析開始が指示されると、分析制御部３１はメソッドファイル記憶部３０６に保存されているメソッドファイル中の測定条件に従って測定部２を制御し、試料に対するＬＣ／ＭＳ分析を実施する。即ち、液体クロマトグラフ２０のカラムから順次溶出してくる成分に対し、タンデム四重極型質量分析装置２１では様々なＭＲＭトランジションに対するＭＲＭ測定が順次実施される。データ収集部３２はタンデム四重極型質量分析装置２１から得られたデータを収集し、一つのデータファイルとしてデータ記憶部３３に保存する。
【００３１】
測定が終了したあと、分析者が定量処理の実行を指示すると、クロマトグラム作成部３４は、指定されたデータファイルをデータ記憶部３３から読み出し、ＭＲＭトランジション毎に、ＭＲＭ測定で得られたデータに基づいて、時間と信号強度との関係を示すマスクロマトグラムを作成する。
【００３２】
図４、図５にはそうして作成されるマスクロマトグラムの一例を示している。この例では、マスクロマトグラムには孤立したピークが現れており、このピークが目的とする（想定した）糖鎖や糖ペプチドに由来するものであることが明らかである。しかしながら、場合によっては、複数の糖鎖由来の複数のピークが一つのマスクロマトグラム上に現れることがある。これは、例えば成分は同じで構造のみが相違する複数の糖鎖や糖ペプチドが存在するような場合である。こうした場合には、目的とする糖鎖や糖ペプチドとそれ以外の糖鎖や糖ペプチドとを識別したうえで分離する必要がある。そこで、分析者は、各マスクロマトグラムを表示部５の画面上に表示させて、画面上でピークを確認し、必要に応じて、目的とする糖鎖や糖ペプチドのピークを検出するための検出時間の許容範囲を指定する。
【００３３】
そのうえで分析者が定量処理の続行を指示すると、ピーク面積算出部３５は各マスクロマトグラムにおいて、それぞれの検出時間の許容範囲内においてピークを検出し、そのピーク面積を計算する。多価イオンではない通常の（つまり１価のみを想定した）定量分析の場合には、このピーク面積値に基づいて目的化合物の定量値が計算される。それに対し、多価イオンを想定した定量分析では、次のようなデータ処理が行われる。
【００３４】
即ち、多価イオン定量演算部３１０においてピーク面積合算部３１１は、多価イオン情報ファイル記憶部３０４から紐付け情報が格納されている多価イオン情報ファイルを読み出す。そして、その紐付け情報に基づいて、同一の糖鎖又は糖ペプチドに対応付けられている複数のＭＲＭトランジションを認識し、同一の糖鎖又は糖ペプチド毎に、その糖鎖又は糖ペプチド由来の複数のＭＲＭトランジションに対するマスクロマトグラムにおいて算出されているピーク面積を合計し、ピーク面積の合算値を算出する。
例えば図４の例では、紐付け情報に基づいて、価数３、４の二つのＭＲＭトランジションに対するマスクロマトグラムが同一の糖鎖由来であることが判明する。そこで、その二つのマスクロマトグラムにおいてそれぞれ求まるピーク面積を合計し、ピーク面積の合算値を求める。図５に示した例でも同様である。
【００３５】
このようにしてピーク面積合算部３１１は、測定実行前に分析者により設定された全ての糖鎖についてのピーク面積合算値を得る。分析者が指定したイオン価数に大きな漏れがない限り、ピーク面積合算値はその糖鎖や糖ペプチドの相対的な含有量に対応している筈である。そこで、定量値算出部３１２は、全ての糖鎖又は糖ペプチドにおけるピーク面積合算値を合計したピーク総面積値を求め、そのピーク総面積値に対する各糖鎖又は糖ペプチドにおけるピーク面積合算値の割合（％値）を、それぞれ定量値として計算する。
【００３６】
測定実行前に分析者により設定された糖鎖や糖ペプチドが試料に含まれている糖鎖や糖ペプチドを網羅しているとすれば、上述したように計算されたピーク面積合算値の割合はその糖鎖や糖ペプチドの試料中での存在量比を示している。そこで、定量出力情報作成部３１３は、各糖鎖又は糖ペプチド毎に算出した存在量比をグラフ又は表の形式に集約し、これを定量分析結果として表示部５の画面上に表示する。
【００３７】
図６は、表示部５の画面上に表示される定量分析結果の一例である。この例では、３３種類の糖鎖について存在比と標準偏差とが下の表中に数値で示され、上にはその３３種類の糖鎖の構造に対する存在比が棒グラフで示されている。分析者はこの表示を見て、試料に含まれる糖鎖や糖ペプチドの存在量比を直感的に把握することができる。もちろん、このように全ての糖鎖や糖ペプチドの存在量比を網羅的に表示するのではなく、分析者が指定した特定の糖鎖や糖ペプチドの存在量比のみを表示するようにしてもよい。また、存在量比が所定値を超える又は下回るものだけを選択して表示するようにしてもよい。
【００３８】
上記実施例の説明では、糖鎖や糖ペプチドの定量に本発明を適用していたが、その化学構造に依らず共通のプロダクトイオンが生成され得るような種類の高分子化合物の定量全般に本発明は適用可能である。また、上記実施例の定量分析装置では、液体クロマトグラフで試料中の成分を時間的に分離したあとに質量分析を実施するようにしていたが、試料に含まれる成分の数が少なく、また質量が同一で構造が相違する異なる成分が含まれていなければ、液体クロマトグラフを通すことなく試料を直接、質量分析装置に導入して質量分析することもできる。
【００３９】
また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変形、修正、追加等を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは当然である。
【符号の説明】
【００４０】
２…測定部
２０…液体クロマトグラフ
２１…タンデム四重極型質量分析装置
３…制御・処理部
３１…分析制御部
３２…データ収集部
３３…データ記憶部
３４…クロマトグラム作成部
３５…ピーク面積算出部
３００…測定対象設定部
３０１…プリカーサm/z計算部
３０２…測定条件設定部
３０３…多価イオン情報ファイル作成部
３０４…多価イオン情報ファイル記憶部
３０５…メソッドファイル作成部
３０６…メソッドファイル記憶部
３１０…多価イオン定量演算部
３１１…ピーク面積合算部
３１２…定量値算出部
３１３…定量出力情報作成部
４…入力部
５…表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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