(57)【要約】【課題】ハイブリダイゼーションを利用する標的核酸の検出において、高い精度で標的核酸を高感度に検出できる、標的核酸の検出方法の提供。【解決手段】標的核酸と捕捉プローブとをハイブリダイズさせる工程の後に、捕捉プローブ又は支持体に付着した標的核酸以外の核酸を除去するための洗浄工程を有し、前記洗浄工程において、標的核酸と捕捉プローブとがハイブリダイズして形成された複合体に光照射して、捕捉プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる、検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に含まれる標的核酸と、支持体に固定された捕捉プローブとをハイブリダイズさせる工程を含む標的核酸の検出方法であって、
捕捉プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されており、
標的核酸と捕捉プローブとをハイブリダイズさせる工程の後に、検体に含まれる標的核酸以外の核酸であって捕捉プローブ又は支持体に付着した核酸を除去するための洗浄工程を有し、
該洗浄工程において、標的核酸と捕捉プローブとがハイブリダイズして形成された複合体に光照射して、光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させることを特徴とする、
検出方法。
【請求項２】
標的核酸の変異の有無を測定する、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
標的核酸の遺伝子多型を測定する、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
光反応性基が３−シアノビニルカルバゾール基、ｐ−カルバモイルビニルフェノール基、４，５’，８−トリメチルソラレン基又はＮ３−メチル−５−シアノビニルウラシル基のいずれかである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、支持体に固定化された捕捉プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを利用した標的核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの生体高分子の機能については、様々な方法で調べることができる。主なものとしては、核酸についてはノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用して各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。蛋白質については、ウエスタンブロッティングに代表されるような、タンパク質−タンパク質間の反応を利用しタンパク質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
特に、遺伝子診断や病原菌の特定、あるいは一塩基多型の検出等、調べたい標的核酸を検出する目的では、核酸からなる捕捉プローブが用いられる。近年、多数の捕捉プローブを支持体に固定したＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイを用いて、複数種の標的核酸の同時検出に使用されている。具体的には、支持体に固定化された捕捉プローブと標的核酸とを接触させ、捕捉プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションの有無による相補性を調べることにより標的核酸の配列や存在量を調べることができる。標的核酸のハイブリダイゼーションは、例えば、標的核酸に標識体を導入し、捕捉プローブとの接触後に、その標識体のシグナルを検出する方法が一般的に用いられている。
【０００４】
標的核酸を効率的に検出するツールとして、光反応性基を導入した捕捉プローブを用いる方法が知られている（特許文献１）。この方法は、光反応性基を導入した捕捉プローブと標的核酸とをハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした捕捉プローブと標的核酸に光照射を行って、両者間で共有結合（架橋）を形成させ、共有結合を形成していない標的核酸以外の核酸を洗浄によって除去した後、ハイブリダイズした捕捉プローブと標的核酸に再び光照射を行って共有結合を開裂させることにより、標的核酸を効率的に検出している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２５４２７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来、光反応性基を導入した捕捉プローブ固定化支持体上で、ハイブリダイゼーション法を用いて標的核酸を検出する場合、検出感度を向上させるために、ハイブリダイゼーション時に光照射を行い、捕捉プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させていた。しかし、ハイブリダイゼーション時に光照射による共有結合形成を行うと、捕捉プローブと標的核酸以外の核酸、たとえば一塩基多型など相同性の高い配列を有する核酸とがクロスハイブリダイゼーション（非特異付着）した鎖間に共有結合が導入されてしまい、検出精度（Ｓ／Ｎ比）が低下するという新たな課題が見つかった。
【０００７】
本発明の目的は、光反応性基を導入した捕捉プローブと、標的核酸以外の核酸とのクロスハイブリダイゼーション等を抑制し、目的とする標的核酸とのハイブリダイゼーションを選択的に行わせることで、高精度かつ高感度で標的核酸を検出できる、標的核酸の検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、捕捉プローブと標的核酸との間で共有結合を形成させるに当たり、標的核酸と光反応性基を導入した捕捉プローブとをハイブリダイズさせる工程においては光照射による共有結合の形成は行わず、その後に、捕捉プローブ又は支持体に付着した標的核酸以外の核酸を除去するための洗浄工程を有し、当該洗浄工程において、標的核酸と捕捉プローブとがハイブリダイズして形成された複合体に光照射して、光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させることにより、高精度かつ高感度で標的核酸を検出することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）検体に含まれる標的核酸と、支持体に固定された捕捉プローブとをハイブリダイズさせる工程を含む標的核酸の検出方法であって、捕捉プローブの核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されており、標的核酸と捕捉プローブとをハイブリダイズさせる工程の後に、検体に含まれる標的核酸以外の核酸であって捕捉プローブ又は支持体に付着した核酸を除去するための洗浄工程を有し、該洗浄工程において、標的核酸と捕捉プローブとがハイブリダイズして形成された複合体に光照射して、光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させることを特徴とする、検出方法。
（２）標的核酸の変異の有無を測定する、（１）に記載の検出方法。
（３）標的核酸の遺伝子多型を測定する、（１）または（２）に記載の検出方法。
（４）光反応性基が３−シアノビニルカルバゾール基、ｐ−カルバモイルビニルフェノール基、４，５’，８−トリメチルソラレン基又はＮ３−メチル−５−シアノビニルウラシル基である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の検出方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、標的核酸以外の核酸とのクロスハイブリダイゼーション等を抑制して、標的核酸とのハイブリダイゼーションを選択的に行わせることが可能となる。その結果、高精度かつ高感度で標的核酸を検出することができる。
【００１１】
本発明の方法は、例えば、標的核酸以外の核酸とのクロスハイブリダイゼーションの影響を受けやすい遺伝子の変異や多型の検出、ｍｉＲＮＡの検出等の高感度が要求される微量サンプルの検出において特に有効である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の検出方法に供せられる標的核酸としては、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの標的核酸を含む検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、ぬぐい液、各種組織液等の体液や、各種組織、パラフィン包埋検体（ＦＦＰＥ）及びその切片、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる標的核酸は、血液や細胞から常法により抽出した検体核酸であってもよく、検体から抽出したＤＮＡやＲＮＡなどを用いることができる。ＤＮＡとしては、染色体ＤＮＡ，ウイルスＤＮＡ，細菌、カビ等のＤＮＡ、ＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡ，それらの一部である断片などを用いることができるがこれらに限定されるものではない。ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ，リボソームＲＮＡ，マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などのｓｍａｌｌ  ＲＮＡやそれらの一部である断片などを用いることができるがこれらに限定されるものではない。また、化学的に合成したＤＮＡ、あるいはＲＮＡ等も標的核酸として用いることができる。
【００１３】
前記検体核酸には、測定の対象とする標的核酸以外の核酸成分（非標的核酸）も含まれていることがある。これら非標的核酸は、標的核酸との性状の差を考慮して除去してもかまわないし、除去せずに被検物質として用いてもよい。
【００１４】
標的核酸は、該標的核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよく、この場合、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を標的核酸とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。
【００１５】
本発明の方法は、検体中の標的核酸の有無、ウイルスの遺伝子型、細菌の種及び株、カビの種及び株等を区別した検出に用いることができる。
【００１６】
本発明の方法は、検体中の標的核酸の変異の有無の検出に好ましく用いることができる。標的核酸の変異とは、標的核酸の鎖長が長い、たとえば、ゲノムＤＮＡ中の遺伝子配列の欠落・重複・融合、転写産物の欠落・重複・融合や、標的核酸の鎖長が短い、たとえば、ｍｉＲＮＡのファミリー配列の検出等が挙げられる。
【００１７】
具体的には、本発明の方法は、検体中の遺伝子多型の検出に特に好ましく用いることができる。遺伝子多型とは、ゲノムＤＮＡおよびその転写物であるＲＮＡのＳＮＰ（一塩基多型）の検出等が挙げられる。
【００１８】
本発明の方法には、標的核酸をそのまま適用することも可能であるし、標的核酸の断片化処理物を適用することも可能である。標的核酸の長さは、捕捉プローブがハイブリダイズすれば特に制限はないが、標的核酸が長い場合（１５００塩基以上、特に４０００塩基以上の場合）には、断片化処理により、後述するように適切な長さに断片化した断片化処理物を適用することが好ましい。断片化処理物は、生じた核酸断片から特定の核酸断片を選択する必要はなく、断片化処理物をそのまま本発明の方法に供することができ、それによって検出感度を高めることが可能である。
【００１９】
断片化のために標的核酸を切断する方法としては、超音波を照射して切断する方法、酵素で切断する方法、制限酵素で切断する方法、ネブライザーを用いる方法、酸やアルカリで切断する方法などを用いることができる。超音波で切断する方法の場合、標的核酸に照射する超音波の出力強度と照射時間を制御することにより、所望の長さに切断することが可能である。
【００２０】
標的核酸には標識体を結合させることができる。本発明において、使用できる標識体としては、タンパク質結合性物質、蛍光色素、りん光色素、放射線同位体など、標識に用いる公知の物質を用いることができる。タンパク質結合性物質の例としてビオチンが挙げられる。ビオチンはアビジン又はストレプトアビジンと結合することができる。アビジン又はストレプトアビジンに蛍光色素が結合したもの、アルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素が結合したものを用いることができる。アルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼを用いる場合には、それぞれの基質を添加し、基質と酵素が反応した結果、発光反応が生じる。発光反応は、プレートリーダーやＣＣＤカメラなどを用いて検出する。
【００２１】
標識体として、測定が簡便で、信号が検出しやすい蛍光色素を用いてもよい。具体的には、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７、オイスター、ＢＯＤＩＰＹ系色素、フィコエリスリンなどの公知の蛍光色素が挙げられる。蛍光色素の検出は、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナや蛍光分光光度計などにより行うことができる。
【００２２】
また、標識体として発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（ＣｄＳｅ）、カドミウムテルル（ＣｄＴｅ）、インジウムガリウムリン（ＩｎＧａＰ）、カルコパイライト系微粒子、シリコン（Ｓｉ）、などが挙げられる。
【００２３】
本発明は、標識体を結合した標的核酸を用いた場合、標識体の信号強度を測定することにより標的核酸の定量に適用することができる。なお、標的核酸の定量を行えば、必然的に標的核酸の検出が行われることになるので、本発明の「検出方法」は定量を伴う場合も包含する。
【００２４】
検出されたシグナルは、ノイズと比較される。具体的には、捕捉プローブとハイブリダイズした標的核酸のシグナル値（Ｓ）と、捕捉プローブに付着した標的核酸以外の核酸のシグナル値（ノイズ値（Ｎ））を比較し、前者の数値とノイズ値の比をＳ／Ｎ比とし、本発明では検出精度をＳ／Ｎ比で表す。Ｓ／Ｎ比の値が大きいほど検出精度が高いことを表し、Ｓ／Ｎ比の値が小さく０に近づくほど検出精度が低いことを表す。
【００２５】
本発明において、支持体は、スライドガラス、メンブレン、ビーズ等を用いることができる。支持体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。複数の捕捉プローブを支持体に固定したマイクロアレイを用いることにより、複数種類の標的核酸を一斉に検出することができる。
【００２６】
本発明において、捕捉プローブとしては、具体的にはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
【００２７】
特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう捕捉プローブに該当する。本発明に用いる捕捉プローブは、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られたものでもよい。捕捉プローブとして、特に好ましいものは、核酸である。この核酸の中でも、オリゴ核酸と呼ばれる、長さが２００塩基までの核酸は、合成機で容易に人工的に合成が可能である。
【００２８】
捕捉プローブは、標的核酸配列と相補的な配列を含んでいれば良く、どの領域を選択しても良い。また、標的核酸の異なる領域とハイブリダイズする複数種類の捕捉プローブを用いることもできる。
【００２９】
標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡである場合、センス鎖、アンチセンス鎖のいずれかの鎖に対して相補的な配列を捕捉プローブとして選択することができる。
【００３０】
検体核酸に含まれる、異なる標的核酸を区別して検出する場合は、例えば、患者に感染しているウイルスの型を区別して検出するなど、検体核酸に含まれうる核酸配列の中から、特異性が高い配列領域を選択することが好ましい。
【００３１】
標的核酸中の一塩基の変異の検出に用いることのできる捕捉プローブの設計について、Cheeらの方法（特表平9-507121号公報）を用いることができる。具体的には、変異が疑われる塩基を、捕捉プローブの中央付近に配した捕捉プローブを用い、変異が疑われる塩基部分にＡを配した捕捉プローブと、変異が疑われる塩基部分にＴを配した捕捉プローブと、変異が疑われる塩基部分にＧを配した捕捉プローブと、変異が疑われる塩基部分にＣを配した捕捉プローブとを捕捉プローブセットとして用いることができる。さらに、複数の変異を検出する場合においては、捕捉プローブセット間でＴｍ値が近くなるような配列を選択することが、より好ましい。捕捉プローブ配列の長さを調整するといった方法を用いることができる。
【００３２】
本発明で用いる捕捉プローブは、核酸分子中の少なくとも一つの核酸塩基が光反応性基に置換されている。
【００３３】
ここで、光反応性基とは、特定の波長の光が照射されることにより、有機合成反応における反応性が活性化される有機基（光反応性部位）である。プローブ中の核酸塩基が光反応性基に置換された後のプローブは、置換前の核酸塩基と同様に標的核酸とハイブリダイズして複合体を形成することが可能である。核酸塩基が光反応性基に置換されている捕捉プローブ及び／又は検出プローブと標的核酸とがハイブリダイズして形成された複合体に、当該光反応性基の光反応性部位を活性化し得る波長の光を照射すると、当該光反応性部位が活性化され、当該光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合が形成される。
【００３４】
このような光反応性基として、３−シアノビニルカルバゾール基［Ｙｏｓｈｉｎａｇａ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ., Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０:３２２７−３２３０（２００８）］、ｐ−カルバモイルビニルフェノール基［Ｔａｋｅｈｉｒｏ Ａｍｉ ｅｔ ａｌ., Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５:２５８３−２５８６（２００７）］、４，５’，８−トリメチルソラレン基［Ａｋｉｏ Ｋｏｂｏｒｉ ｅｔ ａｌ., Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８:２７２−２７３（２００９）］、又は、Ｎ３−メチル−５−シアノビニルウラシル基［Ｋｅｎｚｏ Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ., Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ:３１７７−３１７９（２００５）］等が挙げられるが、好ましくは、３−シアノビニルカルバゾール基である。
【００３５】
光反応性基として、３−シアノビニルカルバゾール基を用いるときは、捕捉プローブ中の当該塩基の５’側にプリン塩基を隣接するように設計することが好ましい。
【００３６】
核酸塩基が光反応性基に置換されている捕捉プローブは、例えば、公知のオリゴヌクレオチド合成機やペプチド合成装置を用いて、光反応性基を塩基にもつ光反応性塩基誘導体を用いて製造することができる。例えば、光反応性基として、３−シアノビニルカルバゾール基を用いるときは、特開２０１２−１２１８９９号公報に示されているアミダイトを原料として、公知のオリゴヌクレオチド合成機を用いて、ホスホロアミダイト法により、製造することができる。また、光反応性基として、ｐ−カルバモイルビニルフェノール基を用いるときは、文献［Ｙｏｓｈｉｎａｇａ Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １５:１２９９−１３０１（２００５）］に示されているアミダイトを原料として、公知のオリゴヌクレオチド合成機を用いて、ホスホロアミダイト法により、製造することができる。また、光反応性基として、４，５’，８−トリメチルソラレン基を用いるときは、文献［Ａｋｉｏ Ｋｏｂｏｒｉ ｅｔ ａｌ., Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８:２７２−２７３（２００９）］に示されているアミダイトを原料として、公知のオリゴヌクレオチド合成機を用いて、ホスホロアミダイト法により、製造することができる。また、光反応性基として、Ｎ３−メチル−５−シアノビニルウラシル基を用いるときは、文献［Ｋｅｎｚｏ Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ., Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ:３１７７−３１７９（２００５）］に示されているアミダイトを原料として、公知のオリゴヌクレオチド合成機を用いて、ホスホロアミダイト法により、製造することができる。
【００３７】
支持体に捕捉プローブを固定化する方法としては、支持体上面部でオリゴ核酸を合成する方法と、あらかじめ合成しておいたオリゴ核酸を支持体上面部へ滴下し固定する方法が知られており、いずれも適用できる。前者の方法には、Ｒｏｎａｌｄらの方法（米国特許第５７０５６１０号明細書）、Ｍｉｃｈｅｌらの方法（米国特許第６１４２２６６号明細書）、Ｆｒａｎｃｅｓｃｏらの方法（米国特許第７０３７６５９号明細書）がある。これらの方法ではＤＮＡ合成反応時に有機溶媒を用いるため、支持体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましい。例えば、特表平１０−５０３８４１号公報に記載の方法を用いて作製した凹凸構造を有したガラス製支持体を用いることができる。特にＦｒａｎｃｅｓｃｏらの方法においては、支持体の裏面から光を照射し、ＤＮＡ合成を制御するため、支持体は透光性を有する材質であることが好ましい。後者の方法には、廣田らの方法（特許第３９２２４５４号）やガラスキャピラリーを用いる方法が挙げられる。ガラスキャピラリーの一例としては、自作したガラスキャピラリーやマイクロピペット（（株）マイクロサポート社製；ＭＰ−００５）などの市販製品を用いることができるが、これらの方法に限定されるものではない。
【００３８】
生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（ Ｂｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３： ２３０３ （１９７６））等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法［（Ｆａｖａｌｏｒｏ ｅｔ.ａｌ., Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５: ７１８ (１９８０）］等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【００３９】
標的核酸と捕捉プローブとをハイブリダイズさせる工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常３０〜７０℃程度で１分間〜十数時間程度である。
【００４０】
本発明は、標的核酸と捕捉プローブとをハイブリダイズさせる工程の後に、検体に含まれる標的核酸以外の核酸であって捕捉プローブ又は支持体に付着した核酸を除去するための洗浄工程を有し、当該洗浄工程において、標的核酸と捕捉プローブとがハイブリダイズして形成された複合体に光照射して、光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させることを特徴とする、検出方法である。
【００４１】
本発明における洗浄工程は、ハイブリダイゼーション工程後の前記支持体と洗浄液とを接触させ、ノイズの原因となりうる標的核酸以外の核酸を捕捉プローブ又は支持体から除去する工程である。本発明において、洗浄工程は、ハイブリダイゼーション工程後の前記支持体に前記洗浄液を接触させた時から、支持体から洗浄液を除去するまでの間を意味する。
【００４２】
洗浄工程で用いる洗浄液としては、ハイブリダイゼーション工程後の洗浄に一般に用いられているものをそのまま使用することができ、核酸の構造を損なわない液体であれば特に限定されない。例えば、リン酸塩、炭酸塩、アミン塩、酢酸塩など緩衝機能を有する塩、具体的にはこれらの対カチオンがナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン等である塩を含む水溶液を好ましく用いることができる。また、これら水溶液に、添加物として、有機溶媒が添加されていてもよく、その際の有機溶媒としては、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトン、エタノール、メタノール、１，４−ジオキサン、１−プロパノール、２−プロパノール、トリオキサン、又はこれらの二種類以上の混合物が挙げられ、ホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドが好ましく用いられる。さらに、これら水溶液に、添加物として、界面活性剤が添加されていてもよい。添加される界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレアート、または、これらの二種類以上の混合物が挙げられる。
【００４３】
洗浄工程では、洗浄液の温度は、２５〜８０℃の範囲の温度を好ましく使用することができる。
【００４４】
洗浄液を用いる洗浄の方法としては、前記洗浄液が入った容器にハイブリダイゼーション工程後の前記支持体を加え、任意の時間後に支持体を取り出して支持体を乾燥させる方法、ハイブリダイゼーション工程後の前記支持体に前記洗浄液を送液ポンプ等で任意の流速で任意の時間添加・接触させた後、支持体を乾燥させる方法等が挙げられる。
【００４５】
本発明では、標的核酸と捕捉プローブとのハイブリダイゼーション工程の後の洗浄工程において、標的核酸と捕捉プローブとがハイブリダイズして形成された複合体に光照射を行い、捕捉プローブ中の光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させる。光照射は、洗浄工程において、ハイブリダイゼーション工程後の前記支持体に前記洗浄液が接触している間に行う。例えば、光照射は、洗浄工程の開始と同時に開始させ、洗浄工程の終了と同時に終了させることができるし、洗浄工程のうちの任意の時間だけ行うことができる。また、光照射は、洗浄工程の間、連続的に又は断続的に行うことができる。
【００４６】
光照射は、使用する光反応性基に応じて、これが活性化される波長を含む光で行うことができる。例えば、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を用いるときは、波長３４０〜３８０ｎｍの光を用いることができる。光照射させる装置としては、前記波長を含む光を照射することができる、トランスイルミネーター、ブラックライト、ＵＶ−ＬＥＤ、ＵＶレーザー等を使用することができる。
【実施例】
【００４７】
以下に実施例を示して本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４８】
（核酸の調製）
以下の実施例、比較例に用いた核酸を表１に示す。
【００４９】
標的核酸としては、配列番号１で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡ「Ｔ−０１」を用いた。Ｔ−０１は、５’末端をＣｙ３（登録商標）標識した合成ＤＮＡで、オペロン社にて合成した。
【００５０】
標的核酸以外の核酸としては、配列番号２、３、４、５で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡ「Ｍ−０１」、「Ｍ−０２」、「Ｍ−０３」、「Ｍ−０４」を用いた。Ｍ−０１及びＭ−０２は、Ｔ−０１と一塩基のみ異なる塩基配列を有し、Ｍ−０３は、Ｔ−０１と二塩基異なる塩基配列を有し、Ｍ−０４は、Ｔ−０１と三塩基異なる塩基配列を有する。Ｍ−０１、Ｍ−０３は、５’末端をＦＩＴＣ標識した合成ＤＮＡで、オペロン社にて合成した。Ｍ−０２、Ｍ−０４は、５’末端をＣｙ５（登録商標）標識した合成ＤＮＡで、オペロン社にて合成した。
【００５１】
捕捉プローブ「Ｃ−０１」は、配列番号６で示される塩基配列の１８番目の塩基「Ｔ」の代わりに、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を導入し、５’末端をビオチン標識した合成ＤＮＡであり、つくばオリゴサービス社にて合成した。
【００５２】
捕捉プローブ「Ｃ−０２」は、配列番号７で示される塩基配列の１１番目の塩基「Ｔ」の代わりに、光反応性基として３−シアノビニルカルバゾール基を導入し、５’末端をビオチン標識した合成ＤＮＡであり、つくばオリゴサービス社にて合成した。
【００５３】
捕捉プローブ「Ｃ−０３」は、配列番号６で示される塩基配列を有し、５’末端をビオチン標識した合成ＤＮＡであり、オペロン社にて合成した。
【００５４】
【表１】
2014187934.tif 000002
【００５５】
表１において、塩基配列中の「Ｋ」は、光反応性基として、３−シアノビニルカルバゾール基を導入したものを示す。
【００５６】
［実施例１］
実施例１では、支持体に固定した捕捉プローブＣ−０１と、標的核酸Ｔ−０１、標的核酸以外の核酸Ｍ−０１及びＭ−０２とを接触させ、Ｃ−０１と、標的核酸Ｔ−０１とをハイブリダイズさせる工程の後に、Ｃ−０１又は支持体に付着した標的核酸以外の核酸（Ｍ−０１及びＭ−０２）を除去するための洗浄工程を有し、前期洗浄工程において、Ｔ−０１とＣ−０１とがハイブリダイズして形成された複合体に光照射して、光反応性基と標的核酸中の核酸塩基との間で共有結合を形成させて、Ｔ−０１を検出した。
【００５７】
（捕捉プローブ固定ビーズの作製）
アビジンコートビーズ（サーモサイエンティフィック社製）に、捕捉プローブとしてＣ−０１を固定したものを用いた。
【００５８】
（ハイブリダイゼーション工程）
Ｔ−０１（１００μＭ）と、Ｍ−０１（１００μＭ）と、Ｍ−０２（１００μＭ）とをそれぞれ１μＬずつ混合し、１０ｍＭリン酸バッファー（１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で希釈し、トータル液量２００μＬとした。インキュベーター（設定温度３７℃）内の「オムニフィット」（株式会社アイシスの登録商標）ガラスカラム（内径３ｍｍ、両末端に２μｍのステンレスフリッツのカラム栓）に、Ｃ−０１を固定したビーズを入れ、上記混合溶液（２００μＬ）を加えた後、５分間攪拌して、Ｃ−０１とＴ−０１のハイブリダイゼーションを行った後、溶液をろ過した。
【００５９】
（洗浄工程）
上記インキュベーター内において、上記ビーズに５０％ＤＭＳＯ水溶液（２００μＬ）を１分間に４０μＬの速度で添加し始めると同時に、Ｃ−０１とＴ−０１とがハイブリダイゼーションした複合体にブラックライトで３６５ｎｍの光を５分間照射し、Ｃ−０１とＴ−０１との間で共有結合を形成させ、その後溶液をろ過し、上記ビーズを純水（１００μＬ）で洗浄した。
【００６０】
（検出）
Ｔ−０１（１００μＭ）と、Ｍ−０１（１００μＭ）と、Ｍ−０２（１００μＭ）とをそれぞれ１μＬずつ混合し、１０ｍＭリン酸バッファー（１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で希釈し、トータル液量２００μＬとした溶液に、５０％ＤＭＳＯ水溶液（１００μＬ）を添加した溶液（Ａ液）と、ハイブリダイゼーション工程及び洗浄工程で得られたろ液（Ｂ液）の蛍光を測定した。Ａ液及びＢ液のＣｙ３、Ｃｙ５及びＦＩＴＣの蛍光強度を比較し、その比からＴ−０１の捕捉率、Ｍ−０１及びＭ−０２の付着率、及びＳ／Ｎ比を求めた。その結果を表２に示した。
【００６１】
［実施例２］
実施例１において、捕捉プローブにＣ−０１の代わりにＣ−０２を用いたこと以外には、実施例１と同様の操作を行い、Ｔ−０１の捕捉率、Ｍ−０１及びＭ−０２の付着率、及びＳ／Ｎ比を求めた。その結果を表２に示した。
【００６２】
［実施例３］
実施例１において、標的以外の核酸にＭ−０１及びＭ−０２の代わりにＭ−０３及びＭ−０４を用いたこと以外には、実施例１と同様の操作を行い、Ｔ−０１の捕捉率、Ｍ−０３及びＭ−０４の付着率、及びＳ／Ｎ比を求めた。その結果を表２に示した。
【００６３】
［実施例４］
実施例２において、標的以外の核酸にＭ−０１及びＭ−０２の代わりにＭ−０３及びＭ−０４を用いたこと以外には、実施例１と同様の操作を行い、Ｔ−０１の捕捉率、Ｍ−０３及びＭ−０４の付着率、及びＳ／Ｎ比を求めた。その結果を表２に示した。
【００６４】
［比較例１］
実施例１において、ハイブリダイゼーション工程時にＣ−０１とＴ−０１とがハイブリダイゼーションした複合体にブラックライトで３６５ｎｍの光を５分間照射し、Ｃ−０１とＴ−０１との間で共有結合を形成させ、洗浄工程時にＣ−０１とＴ−０１とがハイブリダイゼーションした複合体に光照射を行わなかったこと以外は、実施例１と同様の操作を行い、Ｔ−０１の捕捉率、Ｍ−０１及びＭ−０２の付着率、及びＳ／Ｎ比を求めた。その結果を表２に示した。
【００６５】
［比較例２］
実施例２において、ハイブリダイゼーション工程時にＣ−０２とＴ−０１とがハイブリダイゼーションした複合体にブラックライトで３６５ｎｍの光を５分間照射し、Ｃ−０２とＴ−０１との間で共有結合を形成させ、洗浄工程時にＣ−０２とＴ−０１とがハイブリダイゼーションした複合体に光照射を行わなかったこと以外は、実施例２と同様の操作を行い、Ｔ−０１の捕捉率、Ｍ−０１及びＭ−０２の付着率、及びＳ／Ｎ比を求めた。その結果を表２に示した。
【００６６】
［比較例３］
実施例３において、ハイブリダイゼーション工程時にＣ−０１とＴ−０１とがハイブリダイゼーションした複合体にブラックライトで３６５ｎｍの光を５分間照射し、Ｃ−０１とＴ−０１との間で共有結合を形成させ、洗浄工程時にＣ−０１とＴ−０１とがハイブリダイゼーションした複合体に光照射を行わなかったこと以外は、実施例３と同様の操作を行い、Ｔ−０１の捕捉率、Ｍ−０３及びＭ−０４の付着率、及びＳ／Ｎ比を求めた。その結果を表２に示した。
【００６７】
［比較例４］
実施例４において、ハイブリダイゼーション工程時にＣ−０２とＴ−０１とがハイブリダイゼーションした複合体にブラックライトで３６５ｎｍの光を５分間照射し、Ｃ−０２とＴ−０１との間で共有結合を形成させ、洗浄工程時にＣ−０２とＴ−０１とがハイブリダイゼーションした複合体に光照射を行わなかったこと以外は、実施例４と同様の操作を行い、Ｔ−０１の捕捉率、Ｍ−０３及びＭ−０４の付着率、及びＳ／Ｎ比を求めた。その結果を表２に示した。
【００６８】
［比較例５］
比較例５では、支持体に固定した捕捉プローブＣ−０３と、標的核酸Ｔ−０１、標的核酸以外の核酸Ｍ−０１及びＭ−０２とを接触させ、Ｃ−０３と、標的核酸Ｔ−０１とをハイブリダイズさせる工程の後に、Ｃ−０３又は支持体に付着した標的核酸以外の核酸（Ｍ−０１及びＭ−０２）を除去するための洗浄工程を行った後、Ｔ−０１を検出した。
【００６９】
（捕捉プローブ固定ビーズの作製）
アビジンコートビーズ（サーモサイエンティフィック社製）に、捕捉プローブとしてＣ−０３を固定したものを用いた。
【００７０】
（ハイブリダイゼーション工程）
Ｔ−０１（１００μＭ）と、Ｍ−０１（１００μＭ）と、Ｍ−０２（１００μＭ）とをそれぞれ１μＬずつ混合し、１０ｍＭリン酸バッファー（１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で希釈し、トータル液量２００μＬとした。インキュベーター（設定温度３７℃）内の「オムニフィット」（株式会社アイシスの登録商標）ガラスカラム（内径３ｍｍ、両末端に２μｍのステンレスフリッツのカラム栓）に、Ｃ−０３を固定したビーズを入れ、上記混合溶液（２００μＬ）を加えた後、５分間攪拌して、Ｃ−０１とＴ−０１のハイブリダイゼーションを行った後、溶液をろ過した。
【００７１】
（洗浄工程）
上記インキュベーター内において、上記ビーズに５０％ＤＭＳＯ水溶液（２００μＬ）を１分間に４０μＬの速度で添加した後、溶液をろ過し、上記ビーズを純水（１００μＬ）で洗浄した。
【００７２】
（検出）
Ｔ−０１（１００μＭ）と、Ｍ−０１（１００μＭ）と、Ｍ−０２（１００μＭ）とをそれぞれ１μＬずつ混合し、１０ｍＭリン酸バッファー（１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有）で希釈し、トータル液量２００μＬとした溶液に、５０％ＤＭＳＯ水溶液（１００μＬ）を添加した溶液（Ｃ液）と、ハイブリダイゼーション工程及び洗浄工程で得られたろ液（Ｄ液）の蛍光を測定した。Ｃ液及びＤ液のＣｙ３、Ｃｙ５及びＦＩＴＣの蛍光強度を比較し、その比からＴ−０１の捕捉率、Ｍ−０１及びＭ−０２の付着率、及びＳ／Ｎ比を求めた。その結果を表２に示した。
【００７３】
［比較例６］
比較例５において、標的以外の核酸にＭ−０１及びＭ−０２の代わりにＭ−０３及びＭ−０４を用いたこと以外には、比較例５と同様の操作を行い、Ｔ−０１の捕捉率、Ｍ−０３及びＭ−０４の付着率、及びＳ／Ｎ比（検出精度）を求めた。
【００７４】
以上の結果を表２に示した。
【００７５】
【表２】
2014187934.tif 000003
【００７６】
実施例１、実施例２の結果から、洗浄工程において、標的核酸と光反応性基を導入した捕捉プローブとがハイブリダイズして形成される複合体に対して光照射して捕捉プローブ（Ｃ−０１）と標的核酸（Ｔ−０１）との間で共有結合させることにより、標的核酸（Ｔ−０１）は捕捉したが、標的以外の核酸（Ｍ−０１、Ｍ−０２）はほとんど付着しなかった。Ｍ−０１、Ｍ−０２は、Ｔ−０１の塩基配列の一塩基のみ異なる塩基配列を有しているが、これらの標的以外の核酸が混在する場合でも、標的核酸（Ｔ−０１）を精度良く検出できた。また、実施例２のように、鎖長が短い捕捉プローブ（Ｃ−０２）を用いた場合も、同様の結果が得られた。一方、比較例１、比較例２の結果から、ハイブリダイゼーション工程において光照射した場合は、標的核酸（Ｔ−０１）は捕捉できたが、Ｍ−０１、Ｍ−０２の付着も確認され、標的核酸（Ｔ−０１）の検出精度（Ｓ／Ｎ比）は低いものであった。特に、比較例１では、Ｓ／Ｎ比が０に近く、標的核酸（Ｔ−０１）の検出精度は極めて低いものであった。さらに、比較例５の結果から、光反応性基を含まない捕捉プローブ（Ｃ−０３）を用いた場合は、標的核酸（Ｔ−０１）の捕捉率は低く、検出精度も極めて低いものであった。
【００７７】
実施例３、実施例４の結果から、洗浄工程において、標的核酸と光反応性基を導入した捕捉プローブとがハイブリダイズして形成される複合体に対して光照射して捕捉プローブ（Ｃ−０１）と標的核酸（Ｔ−０１）との間で共有結合させることにより、標的核酸（Ｔ−０１）は捕捉できたが、標的以外の核酸（Ｍ−０３、Ｍ−０４）はほとんど付着しなかった。Ｍ−０３は、Ｔ−０１の塩基配列と二箇所の塩基が異なる塩基配列を有し、Ｍ−０４は、Ｔ−０１の塩基配列と三箇所の塩基が異なる塩基配列を有しているが、これらの標的以外の核酸が混在する場合でも、標的核酸（Ｔ−０１）を精度良く検出できた。また、実施例４では、鎖長が短い捕捉プローブ（Ｃ−０２）を用いたことにより、Ｍ−０３、Ｍ−０４はまったく付着しなかった。一方、比較例３、比較例４の結果から、ハイブリダイゼーション工程において光照射した場合、標的核酸（Ｔ−０１）は捕捉できたが、Ｍ−０３、Ｍ−０４の付着も同様に確認され、標的核酸（Ｔ−０１）の検出精度は低いものであった。特に、比較例３では、Ｓ／Ｎ比が０に近く、Ｔ−０１の検出精度は極めて低いものであった。さらに、比較例６の結果から、光反応性基を含まない捕捉プローブ（Ｃ−０３）を用いた場合は、標的核酸（Ｔ−０１）の捕捉率は低く、検出精度も極めて低いものであった。
【００７８】
以上のように、洗浄工程において、標的核酸と光反応性基を導入した捕捉プローブとがハイブリダイズして形成される複合体に対して光照射して捕捉プローブと標的核酸との間で共有結合させることにより、標的核酸以外の核酸の付着率が大幅に減少し、標的核酸のみを高精度かつ高感度で検出することができた。
【配列表フリーテキスト】
【００７９】
配列番号１：合成ＤＮＡ（５’末端にＣｙ３標識）
配列番号２：合成ＤＮＡ（５’末端にＦＩＴＣ標識）
配列番号３：合成ＤＮＡ（５’末端にＣｙ５標識）
配列番号４：合成ＤＮＡ（５’末端にＦＩＴＣ標識）
配列番号５：合成ＤＮＡ（５’末端にＣｙ５標識）
配列番号６：合成ＤＮＡ（５’末端ビオチン化）
配列番号７：合成ＤＮＡ（５’末端ビオチン化）
【配列表】
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