(57)【要約】【課題】曲げ強度やヤング率や伸び率が高い値を示し、温度変化に対応して温度感受性を示すことができ、成形特性に優れ、かつ医薬品成分や生理活性物質を内包でき試料の環境温度に応答して徐放し得るバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を提供する。【解決手段】バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、酢酸菌が生成しゲル状、薄膜状、フィルム状、シート状、平板状、多孔質状、球状、ビーズ状、粉末状、繊維状、円盤状及び／又は塊状である形状に成形したバクテリアセルロースを、含有している。また、バクテリアセルロースが、グラフト加工反応により温度感受性を示すグラフトモノマーで、グラフト加工されてなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸菌が生成しゲル状、薄膜状、フィルム状、シート状、平板状、多孔質状、球状、ビーズ状、粉末状、繊維状、円盤状及び／又は塊状である形状に成形したバクテリアセルロースを、含有していることを特徴とするバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体。
【請求項２】
前記バクテリアセルロースが、グラフト加工反応により温度感受性を示すグラフトモノマーで、グラフト加工されてなることを特徴とする請求項１に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体。
【請求項３】
医薬品成分及び／又は生理活性物質を内包することを特徴とする請求項１〜２の何れかに記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体。
【請求項４】
前記医薬品成分及び／又は生理活性物質を試料の環境温度に応じて徐放することを特徴とする請求項３に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体。
【請求項５】
前記グラフト加工反応により温度感受性を示すグラフトモノマーが、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及び／又はその末端アミド基を置換したＮ−イソプロピルアクリルアミド誘導体モノマーであることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体。
【請求項６】
前記酢酸菌が、Acetobacter属酢酸菌、Asaia属酢酸菌、Gluconacetobacter属酢酸菌、又はEnterobacter属酢酸菌であることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体。
【請求項７】
前記酢酸菌が柿菌であることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体。
【請求項８】
請求項１〜７の何れかに記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、含有することを特徴とする製剤。
【請求項９】
酢酸菌を培養してバクテリアセルロースを生成させる工程と、
ゲル状、薄膜状、フィルム状、シート状、平板状、多孔質状、球状、ビーズ状、粉末状、繊維状、円盤状及び／又は塊状である形状の前記バクテリアセルロースにする工程と、
グラフト加工反応により温度感受性を示すグラフトモノマーを含有する組成液中で、前記形状にした前記バクテリアセルロースをグラフト加工してなる、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を得る工程とを、
有することを特徴とするバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の製造方法。
【請求項１０】
前記グラフト加工してなる、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、さらに、生理活性物質及び／又は医薬品成分が含まれた溶液及び／又は懸濁液に浸漬した後、乾燥させる工程により、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体に生理活性物質及び／又は医薬品成分を内包せしめ、徐放製剤であるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を製造することを特徴とする請求項９に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の製造方法。
【請求項１１】
前記グラフト加工してなる、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、３０℃以下で前記溶液及び／又は懸濁液に浸漬することを特徴とする請求項１０に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の製造方法。
【請求項１２】
前記酢酸菌を、培地中で、振盪培養又は回転培養若しくは撹拌培養して、前記バクテリアセルロースを、綿毛状、膜状、シート状、ビーズ状若しくは球状で、及び／又はゲル状に生成させた後、前記形状の前記バクテリアセルロース及び／又は前記バクテリアセルロース複合体を、ポリオレフィン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリアミド樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリイミド、及びポリフッ素化オレフィン樹脂から選ばれる何れかのフィルム又は平板上に拡げて、乾燥させて、前記形状にすることを特徴とする請求項９〜１１の何れかに記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の製造方法。
【請求項１３】
酢酸菌の培養により生成した綿毛状、膜状、シート状、ビーズ状若しくは球状で、及び／又はゲル状のバクテリアセルロースであり、
又は前記バクテリアセルロースをゲル状、薄膜状、フィルム状、シート状、平板状、多孔質状、球状、ビーズ状、粉末状、繊維状、円盤状及び／又は塊状である形状にして、グラフト加工反応により温度感受性を示すグラフトモノマーで、グラフト加工されてなるグラフト加工バクテリアセルロースであり、
ポリオレフィン膜、ポリスチレン膜、ポリエステル膜、ポリアミド膜、ポリビニルアルコール膜、ポリイミド膜、及びポリテトラフルオロエチレン膜から選ばれる何れかの試料表面に拡げて、乾燥させて、ゲル状、薄膜状、フィルム状、シート状、平板状、多孔質状、球状、ビーズ状、粉末状、繊維状、円盤状及び／又は塊状である形状にしたものであって、
請求項１に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を製造するための原料であることを特徴とするバクテリアセルロース成分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリアセルロース(bacterial cellulose：BC)に医薬品成分や生理活性物質を内包でき試料の環境温度に応答して徐放できるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、地球上に極めて多量存在する天然高分子物質である。セルロースは、キチンやキトサンと同様に、様々な生物で生産されるバイオマスであり、今後の応用が期待されている。植物に由来するセルロースは、植物細胞の細胞壁および繊維を構成する主要な成分である。また、植物に由来するセルロースと同一物質であるが、微生物である酢酸菌を培養する過程で産生して生成され、超微細な繊維構造を持つ天然高分子であるバクテリアセルロースは、ナノスケールオーダーの超微細なサイズを有するセルロースミクロフィブリルである。
【０００３】
このようなバクテリアセルロースを生成する代表的な酢酸菌として、食酢を醸造する際に用いられるアセトバクター・アセチ(Acetobacter aceti)や、それとは別種のアセトバクター・キシリナス(Acetobacter xylinus)が、知られている。酢酸菌は、培養の際に炭素源としてグルコース等の糖類を必要とし、酢酸菌培養過程でバクテリアセルロースを生成する。
【０００４】
酢酸菌培養過程で生成されるバクテリアセルロースは、超微細なセルロースミクロフィブリルから構成され、平均繊維径が４０〜６０ｎｍのものである。これに対して、植物由来、例えば広葉樹パルプ由来のセルロース繊維は、平均繊維径が約３０μｍである。このようにバクテリアセルロースは、繊維径が植物由来のセルロースに比べて１／１００未満であり、比表面積が極めて大きいため、日用品や、医薬・医療器等の医用材料や、食品添加物材料のような各種産業資材として有効利用が可能であり、近年特に関心が寄せられている。
【０００５】
バクテリアセルロースと植物由来で和紙に用いられるセルロースとを混合して抄紙する技法で製造できる和紙は、そのセルロース強度を向上させることができる。バクテリアセルロースと非セルロース系の様々な有機高分子とを配合（複合ともいう）することにより、その有機高分子に様々な機能を付与することができる。例えば、有機高分子繊維の表面を、架橋型のバクテリアセルロースで被覆することにより、有機高分子繊維の肌触り等の風合感を改善することが可能であり、産業用や日用の繊維素材として利用できる技術が開示されている（特許文献１）。また、植物由来のセルロースにバクテリアセルロースを配合することで、その強度を高め疎水性に優れた高機能化素材のバクテリアセルロースを含有する紙が開示されている（特許文献２）。
【０００６】
細胞培地中で培養する特殊な培養過程で生成するゲル膜状のバクテリアセルロースを洗浄、乾燥することで、不織布状の内部構造を有し、高い強度とヤング率とを持つシートを製造する技術が、開示されている（非特許文献１）。
【０００７】
また、バクテリアセルロースを含有する高力学強度シートをスピーカーの振動板として利用する技術が、開示されている（特許文献３）。さらに、ゲル状のバクテリアセルロース中に含まれる水分を有機溶媒に置換させることで、高い強度のシート状構造物を得る方法が、開示されている（特許文献４）。
【０００８】
さらに、酢酸菌が生成するバクテリアセルロースは、生体適合性が高く、保水性に優れ、無害であり、生体あるいは環境に対して安全な有用生物資源である。そのためこのバクテリアセルロースは、人工皮膚基材や美容パック成分や食品素材などに応用できる生体高分子であるとして着目されている。また医用分野等の先端分野での新しい技術に利用して、医療に用いることが期待されている。バクテリアセルロースは、細胞を経済的に付着・増殖させるための、いわゆる細胞足場材として用いた場合、有用細胞を効率的に増殖させて細胞を付着させる機能を持つことから、コンドロサイト（軟骨生産細胞）の細胞足場材として有望視されている。未処理未加工のバクテリアセルロースであっても軟骨生産細胞を効果的に成長する機能を有することが報告されている（非特許文献２）。
【０００９】
酢酸菌を培養する際、酢酸菌を含む培地を機械的に撹拌することにより製造できるバクテリアセルロースの構造が解明された。酢酸菌の培養過程で得られる微細なバクテリアセルロースフィブリルは、培地を撹拌せずに酢酸菌で生成するバクテリアセルロースとその形態・構造上の差が認められないが、分子重合度と結晶化度が低下し、バクテリアセルロースのヤング率、含水率、溶液濃度が低下すると、報告されている（非特許文献３）。
【００１０】
ハイドロキシアパタイトを充填したゲル状のバクテリアセルロースの製造方法が開示されている（非特許文献４）。それによると、ゲル状のバクテリアセルロースを室温の２０％メタノール水溶液に２４時間浸漬し、塩化カルシウム溶液とリン酸ナトリウム溶液に出し入れする工程を数回繰り返し浸漬した後、５０℃で乾燥してγ線で殺菌してなるセルロース・ハイドロキシアパタイトのナノファイバーが骨細胞を効率よく付着・増殖することが、確かめられている。
【００１１】
酢酸菌の培地にエアレーションと撹拌を同時に行って得られたバクテリアセルロースの顕微鏡観察と理化学特性の解明が、報告されている（非特許文献５）
【００１２】
酢酸菌の培養過程で製造されるゲル状のバクテリアセルロースを洗浄・乾燥して得られ、不織布状構造を有するバクテリアセルロース薄膜シートは、剛直で強度やヤング率が非常に高いという優れた特性を持つが、切断に至るまでの伸びが極めて低いため、硬くて脆い。さらに、バクテリアセルロースは、曲げやせん断に対して非常に弱いうえ、熱可塑性を示さない。そのため、その用途が極めて限られるという使用上の問題があった。バクテリアセルロースを各種産業分野特に医用・医薬分野で広く応用して利用するには、このような物理的な諸特性を改善すべき課題があった。
【００１３】
例えば、各種産業資材として注目される物質に、試料環境の温度変化に対応して異なる溶解挙動を示す温度感受性の高分子がある。温度感受性の高分子としてポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ、単に高分子と記載することもある）は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを重合させて簡便に形成したものである。
【００１４】
ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）は、室温では、ガラス状態にあり、下限臨界溶液温度（Lower Critical Solution temperature：ＬＣＳＴ）が３２℃の高分子である。３２℃以上の温度でその高分子の側鎖の疎水性部分であるイソプロピル基が、高分子の分子内又は分子間で疎水結合を形成する。その結果、高分子鎖が凝集し、高分子鎖が水に分散するため、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが白濁して、水不溶性になる。一方、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは、３２℃未満の温度でその高分子側鎖の親水性部分であるアミド基と水分子とが相互作用し水に溶解し、すなわち水溶解性になる。
【００１５】
このようにポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは、３２℃前後で水に対する溶解挙動が変化するため、温度感受性を必要とする様々な応用面での産業資材として広く利用されている。このポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのガラス転移温度は、測定方法により若干異なるが、１３０℃であるとされている（非特許文献６）。
【００１６】
しかし、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを重合させたゲル状のポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは、乾燥固化しても、ゲル状態を保持したままであり固体状態にならない上、熱可塑性が無いため、成形特性に欠けるため、その用途特に医用材料や医薬材料としての用途が、極めて限られてしまう。そのため、各種産業分野特に医用・医薬分野で広く応用して利用するには、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは、分子量が高い他の物質と複合しなければならず、その理化学特性を改善すべき課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特開平３−４０８７２号公報
【特許文献２】特開平７―１１９０６７号公報
【特許文献３】特開平８−０４９１８８号公報
【特許文献４】特開２００８−１２７５１０号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】繊維学会誌、1996年、第152巻第3号、p.108-115
【非特許文献２】バイオマテリアルズ(Biomaterials)、2005年、第26巻、p.419-431
【非特許文献３】セルロース(Cellolose)、1998年、第5巻、p. 187-200
【非特許文献４】インターナショナル ジャーナル オブ バイオマテリアルズ(International Journal of Biomaterials)、2011年、ID 175362、p.8
【非特許文献５】ジャパン ソサエティ フォー バイオサイエンス, バイオテクノロジー アンド アグロケミストリー(Japan Society forBioscience, Tiotechnology, and Agrochemistry)、 バイオサイエンス,バイオテクノロジー, アンド バイオケミストリー(Bioscience, Biotechnology,and Biochemistry)、1997年、第61巻第2号、p.219-224
【非特許文献６】マクロモレキュールズ(Macromolecules)、1969年、第2巻、p.272-277
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、前記の課題を解決するためになされたもので、曲げ強度やヤング率や伸び率が高い値を示し、温度変化に対応して温度感受性を示すことができ成形特性に優れ、かつ医薬品成分や生理活性物質を内包でき試料の環境温度に応答して徐放し得るバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体、及びその製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、酢酸菌培養時に生成されるバクテリアセルロースに、重合の結果、温度感受性を示すグラフトモノマーで、グラフト加工することにより、温度感受性機能を持ち、充分な物理的強度を示し、徐放性のような生物的・化学的な特性を有するバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体が得られることを見出し、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
前記の目的を達成するためになされた特許請求の範囲の請求項１に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、酢酸菌が生成しゲル状、薄膜状、フィルム状、シート状、平板状、多孔質状（ポーラス状ともいう）、球状、ビーズ状、粉末状、繊維状、円盤状及び／又は塊状である形状に成形したバクテリアセルロースを、含有していることを特徴とする。
【００２１】
請求項２に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、請求項１に記載されたもので、前記バクテリアセルロースが、グラフト加工反応により温度感受性を示すグラフトモノマーで、グラフト加工されてなることを特徴とする。
【００２２】
請求項３に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、請求項１〜２の何れかに記載されたもので、医薬品成分及び／又は生理活性物質を内包することを特徴とする。
【００２３】
請求項４に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、請求項３に記載されたもので、前記医薬品成分及び／又は生理活性物質を試料の環境温度に応じて徐放することを特徴とする。
【００２４】
請求項５に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、請求項１〜４の何れかに記載されたもので、前記グラフト加工反応により温度感受性を示すグラフトモノマーが、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及び／又はその末端アミド基を置換したＮ−イソプロピルアクリルアミド誘導体モノマーであることを特徴とする。
【００２５】
請求項６に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、請求項１〜５の何れかに記載されたもので、前記酢酸菌が、アセトバクター属(Acetobacter属)酢酸菌、アサイア属(Asaia属)酢酸菌、グルコンアセトバクター属(Gluconacetobacter属)酢酸菌、又はエンテロバクター属(Enterobacter属)酢酸菌であることを特徴とする。
【００２６】
請求項７に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、請求項１〜６の何れかに記載されたもので、前記酢酸菌が、グルコンアセトバクター キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）に属する柿菌であることを特徴とする。
【００２７】
請求項８に記載の製剤は、請求項１〜７の何れかに記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、含有することを特徴とする。
【００２８】
請求項９に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の製造方法は、酢酸菌を培養してバクテリアセルロースを生成させる工程と、ゲル状、薄膜状、フィルム状、シート状、平板状、多孔質状、球状、ビーズ状、粉末状、繊維状、円盤状及び／又は塊状である形状の前記バクテリアセルロースにする工程と、グラフト加工反応により温度感受性を示すグラフトモノマーを含有する組成液中で、前記形状にした前記バクテリアセルロースをグラフト加工してなる、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を得る工程とを、有することを特徴とする。
【００２９】
請求項１０に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の製造方法は、請求項９に記載されたもので、前記グラフト加工してなる、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、さらに、生理活性物質及び／又は医薬品成分が含まれた溶液及び／又は懸濁液に浸漬した後、乾燥させる工程により、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体に生理活性物質及び／又は医薬品成分を内包せしめ、徐放製剤であるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を製造することを特徴とする。
【００３０】
請求項１１に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の製造方法は、請求項１０に記載されたもので、前記グラフト加工してなる、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、３０℃以下で前記溶液及び／又は懸濁液に浸漬することを特徴とする。
前記グラフト加工してなる、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、５℃以下で前記溶液及び／又は懸濁液に浸漬すると、一層好ましい。
【００３１】
請求項１２に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の製造方法は、請求項９〜１１の何れかに記載されたもので、前記酢酸菌を、培地中で、振盪培養又は回転培養若しくは撹拌培養して、前記バクテリアセルロースを、綿毛状、膜状、シート状、ビーズ状若しくは球状で、及び／又はゲル状に生成させた後、前記形状の前記バクテリアセルロース及び／又は前記バクテリアセルロース複合体を、ポリオレフィン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリアミド樹脂、ポリビニルアルコール樹脂、ポリイミド、及びポリフッ素化オレフィン樹脂から選ばれる何れかのフィルム又は平板上に拡げて、乾燥させて、前記形状にすることを特徴とする。
【００３２】
請求項１３に記載のバクテリアセルロース成分は、酢酸菌の培養により生成した綿毛状、膜状、シート状、ビーズ状若しくは球状で、及び／又はゲル状のバクテリアセルロースであり、又は前記バクテリアセルロースをゲル状、薄膜状、フィルム状、シート状、平板状、多孔質状、球状、ビーズ状、粉末状、繊維状、円盤状及び／又は塊状である形状にして、グラフト加工反応により温度感受性を示すグラフトモノマーで、グラフト加工されてなるグラフト加工バクテリアセルロースであり、ポリオレフィン膜、ポリスチレン膜、ポリエステル膜、ポリアミド膜、ポリビニルアルコール膜、ポリイミド膜、及びポリテトラフルオロエチレン膜から選ばれる何れかの試料表面に拡げて、乾燥させて、ゲル状、薄膜状、フィルム状、シート状、平板状、多孔質状、球状、ビーズ状、粉末状、繊維状、円盤状及び／又は塊状である形状にしたものであって、請求項１に記載のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を製造するための原料であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、剛直で曲げ強度やヤング率や伸び率が高く丈夫であって固形状に調製でき十分な物理的強度を示し、成形特性に優れているうえ、試料環境の温度に感応して異なる物性を示すことができ、内包し得る医薬品成分や生理活性物質を温度変化に応じて徐放量の制御が可能である。
【００３４】
このバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、酢酸菌の培養過程で生成されるバクテリアセルロースに、簡便かつ穏やかな条件下、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等を重合させ、バクテリアセルロースにグラフト加工を施し、その結果、バクテリアセルロースにポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドのような温度感受性高分子を複合させることで簡易に得ることができる。
【００３５】
このバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、繊維径を４０〜６０ｎｍとするミクロフィブリルであってその厚さを数ｎｍ程度とする超微細なセルロース繊維であるバクテリアセルロースから構成されている。酢酸菌から生成されるバクテリアセルロースは、樹木から生成され木材の主要な構成成分であるセルロースと化学成分が同一であるが、セルロースの繊維径に比べて、２桁以下の極めて微細径のミクロナノファイバーであるという特長がある。
【００３６】
このバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、バクテリアセルロースの繊維径が微細径であるうえ、生分解性素材であって生体適合性が高く、保水性に優れているため、人工皮膚基材のような医用材料や、徐放製剤のような医薬材料や、美容パック材料、食品素材など各種産業分野での産業資材として、利用・活用ができる。
【００３７】
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体中のバクテリアセルロースとして、酢酸菌を培養する過程で製造できるゲル状のバクテリアセルロースを、薄膜状、フィルム状、シート状、平板状、多孔質状であるポーラス状、球状、ビーズ状、粉末状、繊維状、円盤状、又は塊状等の形状が異なるバクテリアセルロースにして用いる。それを、温度感受性樹脂形成用グラフトモノマー例えばＮ−イソプロピルアクリルアミドやその官能基を改変したＮ−イソプロピルアクリルアミドで重合加工例えばグラフト加工すると様々な形状で温度感受性を持つバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体が、製造できる。
【００３８】
これらバクテリアセルロースの各種形状は、ゲル状のバクテリアセルロースのまま用いたり、それを粉砕したり、基質膜に拡げて乾燥し又は凍結乾燥するなど乾燥方法を変えたりして、均質かつ歩留り良く、簡便に調製することができる。
【００３９】
なお、酢酸菌が生成し前記のように成形したバクテリアセルロースの形状と構造は、本発明におけるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体が内包する生理活性物質及び／又は医薬品成分の徐放挙動に影響を及ぼすので、使用用途により細胞培地の種類、菌種、培地量、回転速度を適宜調整することで適宜制御できる。
【００４０】
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、バクテリアセルロースをＮ−イソプロピルアクリルアミドのように、重合反応後、温度感受性を発現するグラフトモノマーでグラフト加工しても、微細なバクテリアセルロースナノファイバーの繊維径が殆ど変化しない。そのため、バクテリアセルロースの繊維内あるいは繊維間にグラフトモノマーが拡散し易く、グラフト加工が効率的かつ確実に行われる。
【００４１】
さらに、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、バクテリアセルロースが生体高分子であり、石炭・石油、化石等の枯渇原料を用いないで製造できるエコロジー素材であり生分解性を有するという特長を持つため、様々な産業分野で利用でき、環境に負荷をかけない循環社会の形成に役立つ。バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、乳化剤や食感改良剤として食品に、添加して用いることができる。
【００４２】
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、温度に対応して異なる物性を示す温度感受性（温度感応性あるいは感温性ともいう）機能を持つため、様々な剤型の製剤にして、試料の環境温度が変化したときに、所定の温度におけるスイッチング基剤として利用できる。
【００４３】
そのバクテリアセルロースのミクロナノファイバーに、重合反応後、温度感受性を発現するグラフトモノマーでグラフト加工してなるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、それに医薬品成分や生理活性物質を内包させて医薬品として用いたり、温度刺激応答高分子として用いたりすることができる。例えばこのバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、温度感受性を有するポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドであってアセチルサリチル酸のような医薬品成分や生理活性物質を包含させることにより、徐放製剤として用いることができる。この場合、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を水溶液に浸漬した場合、試料の環境温度が３２℃以上のときバクテリアセルロースにグラフト加工されたポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが水に不溶化するため内包された医薬品成分や生理活性物質の放出量が減少する。一方、試料の環境温度が３２℃未満のときポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが水に可溶化するため内包された医薬品成分や生理活性物質の放出量が増加する。このようにして、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体である試料の環境温度に応じ、その複合体に内包された医薬品成分や生理活性物質の放出量を制御することができる。
【００４４】
そのため、このバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、特にドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）製剤とするため医薬品成分や生理活性物質の徐放担体として、生体に投与される徐放製剤に利用できる。また、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を生体内に埋め込んで使用する最先端のドラッグデリバリーシステム製剤として利用する場合、この複合体に医薬品成分や生理活性物質と、その放出量を温度、ｐＨ、光、磁場等の外部刺激因子で調整できる放出量調整成分とを共存させて内包させておき、生体内へ外部刺激因子を与えることで、生体外からその放出量を自在に制御することが可能である。外部刺激因子の中でも、温度は最も簡単に制御し易く安全性の高い物理刺激である。
【００４５】
また、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、バクテリアセルロースが生体適合性に優れているため、医療分野において人工血管、医療用軟膏、ろ過膜として用いることができ、また各種産業分野において汎用プラスチックや機能性プラスチックの代替品となる複合素材として、広範に用いることができる。
【００４６】
本発明のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の製造方法によれば、酢酸菌の培養過程で生成されるバクテリアセルロースから、簡便かつ穏和な反応条件で、高品質のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、歩留り良く、また再現性良く、簡易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明を適用するバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体に用いられるバクテリアセルロースの培養状態を経時的に示す外観写真である。
【図２】本発明を適用するバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体に用いられる形状が異なるバクテリアセルロースを示す外観写真である。
【図３】本発明を適用するバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体に用いられる形状が異なるバクテリアセルロースを示す電子顕微鏡写真である。
【図４】本発明を適用するバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体に用いられる形状が異なるバクテリアセルロースを示す光学顕微鏡写真である。
【図５】本発明を適用するバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体と本発明適用外の複合体とを徐放製剤として用いたときの経過時間と薬物の徐放量との相関を示す図である。
【図６】本発明を適用するバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を徐放製剤として用いたときの経過時間と薬物の徐放量との相関を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以下、本発明の形態を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。
【００４９】
本発明のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、バクテリアセルロースが、重合反応後、温度感受性を発現するグラフトモノマーでグラフト加工されることにより、温度感受性樹脂で複合化されて複合体になっている。
【００５０】
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を調製するのに用いられるバクテリアセルロースは、酢酸菌を培養する過程で、ゲル状のバクテリアセルロースとして培地中に生成される。
【００５１】
バクテリアセルロースを生成する酢酸菌の種類は、特に制限はないが、Acetobacter科の一種でありナタデココ生産菌であるグルコンアセトバクターキシリナス（Gluconacetobacter xylinus）のほか、Acetobacter属、Asaia属、Gluconacetobacter属、Enterobacter属などが好ましく適用できる。中でも、グルコンアセトバクターキシリナス（Gluconacetobacter xylinus）に属する柿菌が次のような諸特性を持つため最も好ましく利用できる。すなわち、柿菌は、セルロースの生産性が高く、培養時の培地のｐＨが低い時でもセルロースを効率的に生産する。さらに、培地のｐＨが低い状態でも培養が可能である。耐酸性が強く他の菌による汚染が少ない。また静置培養ではなくでも、振盪培養やジャーファーメンターによる培養でも、バクテリアセルロースを生産することが可能である。
【００５２】
酢酸菌の菌種やそれに応じた培地や培養条件は、酢酸菌が生育しバクテリアセルロースを生成できるものであれば、特に、限定されないが、例えば以下の方法が挙げられる。
(1)酢酸菌が柿菌の場合
主要成分がグルコース、抽出イースト、ポリペプトン、リン酸ナトリウム、シュウ酸の成分組成からなりｐＨ６．３０のＳＨ(Schramm and Hestrin)培地８０ｍＬ中で、１００ｍＬ容三角フラスコにて１２０回転／分の条件下、２週間培養。
(2)酢酸菌が柿菌の場合
ＳＨ培地８０ｍＬ中で、１００ｍＬ容三角フラスコにて１２０回転／分の条件下、２週間培養。
(3)酢酸菌が柿菌の場合
内堀廃シロップ（原液のＢｒｉｘ糖度は７２％）、酸度２０％の酢であるＳＶ２０、ＫＨ２ＰＯ４、ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４、Ｐ１Ｇおよびエタノールの成分組成からなるＳＨ培地１００ｍＬ中で、３００ｍＬ容三角フラスコにて１２０回転／分の条件下、１週間培養。
培地の種類、菌種、培地量、回転速度を適宜調整してもよい。
【００５３】
酢酸菌を培地中で培養する初期段階では、酢酸菌から超微細でかつ三次元の網目状でリボン状のミクロフィブリル繊維が菌体外に排出される。回転培養容器を機械的に回転する装置を用いて回転しながら、前記のように(1)柿菌をＳＨ培地で２週間培養したり、(2)柿菌をＳＨ培地で２週間培養したり、(3)柿菌をＳＨ培地で１週間培養したりすると、培地中に球状のバクテリアセルロースが生成される。この際、振盪培養又は撹拌培養であってもよい。
【００５４】
酢酸菌培養の過程で培地中に球状のバクテリアセルロースが生成する過程を、詳細に説明する。酢酸菌培養培地の容器を回転培養方式により回転させながら撹拌すると、培地中のバクテリアセルロースは、次第に塊状形状に成りながらコロコロと培地内で転がる。遂にはミクロフィブリルが次第に絡み合いながら微細なゲル状でマリモ形状（ビーズ状）又は球状のバクテリアセルロースが生成される。
【００５５】
酢酸菌の培養初期の過程では培地の濁りが急激に上昇し菌体量が増加するため、培地中に球状のバクテリアセルロースを製造するには、適当量の菌量を加えることが好ましい。ＳＨ培地以外にも、酢酸菌の炭素源として食品加工残渣を用いた未滅菌状態の培地を用いると、球形の径が非常に小さい球状のバクテリアセルロースが生産できる。更に、回転培養を行うために用いる培地の成分に拠ってもバクテリアセルロースの形状が異なる。
【００５６】
なお、酢酸菌培養時、振盪培養機により、培地を継続して一定の回転速度で回転させる場合、液体培地自体を回転する操作が球状のバクテリアセルロースを調製するための必要条件である。培養時、ＳＨ培地のような綺麗な培地を使い、かつ回転培養を行うと歪みの少ない綺麗な大きめの球状のバクテリアセルロースが製造できる。炭素源の種類を変えることで、球回転培養を採用しても球状にならず、綿毛状になってしまう。
【００５７】
このとき、培養日数、培養容器の大きさ、培地量および回転速度条件を適正に制御することにより繊維径が３０〜２００ｎｍな綺麗で大きめの球状に成長させることが可能である。さらに、培養日数は１〜７日（更には３日〜５日がより好ましい）が好ましく、培養容器の大きさはいずれの容量でも生成可能であるが、１００〜５００ｍｌがより好ましく、培地量は培養容器の容量に対して３０〜８０％が好ましく、回転速度は１００〜２５０ｒｐｍが好ましい。
【００５８】
このような球状でゲル状のバクテリアセルロースを用い、乾燥方法、成形方法を変えることで、ゲル状の他、薄膜状、フィルム状、シート状、平板状、多孔質状、球状、ビーズ状、粉末状、繊維状、円盤状及び／又は塊状のように異なる様々な形状のバクテリアセルロースを、製造することができる。
【００５９】
１０〜１００μｍ程度の薄膜状、１００〜５００μｍ程度のフィルム状、５００μｍ〜２０００ｍｍ程度のシート状、又は２０００〜５０００ｍｍ程度の平板状のバクテリアセルロースを調製するには、ゲル状のバクテリアセルロースを、高分子製やガラス製の膜や板やシャーレの表面上に拡げ、乾燥固化することが好ましい。それらの厚さは、ゲル状のバクテリアセルロースの量や繰返し乾燥する回数やゲル状のバクテリアセルロースの大きさ等に拠る。そのような高分子膜や高分子板を成す高分子として、ポリエチレン（ＰＥ）やポリプロピレン（ＰＰ）のようなポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）のようなポリエステル、ナイロン（ナイロンは登録商標）例えばナイロン６６のようなポリアミド、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリイミド膜（ＰＩ）のようなポリイミド、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）が挙げられる。
【００６０】
こうした多様な形状を持つバクテリアセルロースを、重合反応後、温度感受性を発現するグラフトモノマー例えばＮ−イソプロピルアクリルアミドで、グラフト加工して、その重合によりバクテリアセルロース内に温度感受性高分子を形成させて複合化すると、バクテリアセルロース複合体が、得られる。このバクテリアセルロース複合体に、医薬品成分や生理活性物質を内包させると、環境温度の違いで複合体に内包された医薬品成分や生理活性物質の徐放量が制御できる温度刺激応答性のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体が、製造できる。
【００６１】
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を調製するのに用いられるグラフトモノマーとして、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）が好ましいが、それと共に又はそれに代えてＮ−イソプロピルアクリルアミドをベースにしてその末端アミド基を置換して官能基化したＮ−イソプロピルアクリルアミド誘導体を用いてもよい。具体的には、官能基化したＮ−イソプロピルアクリルアミド誘導体として、その末端アミド基を置換したものが挙げられる。より具体的には、その末端アミド基を、カルボキシル含有基で置換したカルボン酸類縁体や、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドで置換したＮＨＳエステル類縁体や、アミノ含有基で置換したアミン類縁体や、マレイミド基で置換して官能基化させた類縁体が挙げられる。
【００６２】
本発明のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の製造方法は、重合の結果、温度感受性を示すグラフトモノマーを、溶媒例えば水に溶解し、必要に応じて重合開始剤、界面活性剤を加えてなるグラフト加工用の組成液に、様々な形状に調製したバクテリアセルロースを添加し、必要に応じ所望のグラフト重合が開始する温度に加熱することにより、グラフトモノマーがバクテリアセルロース中で重合して温度感受性重合物となり、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体が、作製されるというものである。
【００６３】
グラフト加工によりバクテリアセルロースに、重合の結果、温度感受性を示すグラフトモノマーでグラフト加工することで製造できる温度感受性のバクテリアセルロース複合体にする工程の好ましい条件は、以下の通りである。
グラフトモノマーの濃度は、バクテリアセルロースの重量に対する濃度(on weight of fiber：ｏｗｆ)で、２０〜９００％ｏｗｆである。グラフトモノマーとグラフト加工用組成液との量比、即ち浴比は、１：１０〜１：５０が好ましい。浴比が１：５０を超えると、グラフト加工用組成液中でのグラフトモノマー濃度が相対的に低くなり、グラフト加工が効率的に実施できない。
【００６４】
グラフトモノマーを均一に分散させるために、グラフト加工用組成液に、１〜４ｇ／Ｌの界面活性剤例えば非イオン界面活性剤を、添加することが好ましい。
【００６５】
グラフト加工用組成液に、重合開始剤を添加しておくことが好ましい。重合開始剤は、グラフトモノマーを重合させるためにグラフト加工用組成液に添加して使用するものである。重合開始剤は、グラフト加工用組成液中の生体高分子タンパク質に作用すると、生体高分子タンパク質分子にグラフト反応の拠点となるラジカルを発生させる働きがある。
この重合開始剤として、例えば過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウムが挙げられる。これら重合開始剤の中でも、生体高分子タンパク質の機械的な特性を低下させることなく、グラフト加工が実施できる、過硫酸アンモニウムが好ましく用いられる。過硫酸アンモニウムを重合開始剤として用いるための好ましい濃度は、バクテリアセルロースの重量に対する濃度(on weight of fiber：ｏｗｆ)で１〜４％ｏｗｆである。それの濃度がこの範囲よりも低いとグラフト加工効率が低下し、濃度がこの範囲よりも高いとグラフト加工効率が改善できるが重合開始剤の影響でバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体が着色してしまうという問題を生じる。
【００６６】
グラフト加工の際、グラフト加工を効率的に行うためには、グラフト加工用組成液を、１０〜２０分間かけて、室温から７５〜８０℃に昇温し、７５〜８５℃で６０〜９０分間保持して行うことが好ましい。
【００６７】
グラフト加工用組成液のｐＨは、通常２〜４の範囲である。バクテリアセルロース繊維に対するグラフト重合反応を安定して行わせ、グラフト効果、特にグラフト効率を向上させるためには、グラフト加工用組成液のｐＨは３前後に調整しておくことが好ましい。ｐＨ調整は、硫酸、蟻酸、塩酸等の酸の希釈溶液、好ましくは蟻酸の希釈溶液の添加により行う。
【００６８】
グラフト重合反応後、反応させたバクテリアセルロース繊維を、洗浄、乾燥することで、精製したバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、製造することができる。
【００６９】
グラフト加工の際、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の形成用のグラフトモノマーとしてＮ−イソプロピルアクリルアミドのみ又は主成分に用いて、バクテリアセルロースをグラフト加工処理することで、環境温度の差で高い精度で温度応答性を有するバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、製造することができる。グラフト加工で、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドがバクテリアセルロース中に浸透しそこで重合し、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドとなる。このようにして得られたバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、その中に充填したリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの理化学特性が発現し、その結果、温度感受性を示す。
【００７０】
ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの分子側鎖には親水性部分と疎水性部分がある。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの下限臨界溶液温度が３２℃となる。３２℃以上の温度ではポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド側鎖の疎水性部分であるイソプロピル基の存在により分子内、分子間で疎水結合が強まり、高分子鎖が凝集し水に対して溶解しなくなる結果、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは、特徴的な水溶解挙動を示すことになる。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは、下限臨界溶液温度以上では、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの高分子鎖が凝集するため、水中に分散した高分子鎖のせいで白濁して懸濁している。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは、下限臨界溶液温度未満では、高分子鎖が水分子と相互作用し結合して水和し、水中で溶解し、無色透明の水溶液となっている。この相転移現象は温度に依存して可逆的であるため、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは、多くの分野で温度刺激応答性高分子として注目されている。それは、所定の温度で刺激に応答するように、材料特性を調整できるからである。このことから、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、温度感受性樹脂がポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドであると、所望の温度例えば体温での刺激に応答する点で広く利用できる。また、温度感受性樹脂形成用グラフトモノマーとしてＮ−イソプロピルアクリルアミドと共に又はそれに代えて官能基化Ｎ−イソプロピルアクリルアミドと用いた場合でも、高分子素材であるバクテリアセルロースにグラフト加工することで所望される温度応答性の素材が製造できる。
【００７１】
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体に、医薬品成分や生理活性物質を内包させるための好ましい条件は、以下の通りである。
バクテリアセルロース複合体を、温度感受性樹脂である例えばポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの下限臨界溶液温度、３０℃以下、好ましくは５〜１０℃に調整した医薬品成分や生理活性物質の水溶液、懸濁液又は溶媒に浸漬した後、例えば室温で、乾燥することにより、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を徐放製剤として製造することができる。試料の乾燥は、前記のような高分子膜、フィルムシャーレ表面で行われてもよい。かくして得られたバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、試料の環境温度に応じて、そこに内包された医薬品成分や生理活性物質の放出量を、制御することができる。
【００７２】
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体に内包された医薬品成分や生理活性物質は、生体の生理的機能の発現に影響を及ぼすものであれば限定されない。例えば、インドメタシン、ビタミンＣ、アセチルサリチル酸のような低分子量の医薬品成分や生理活性物質であってもよく、インターロイキン、インターフェロン、リンホトキン等のサイトカインのような高分子量の医薬品成分や生理活性物質であってもよい。何れであっても同様にバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体に内包できる。
【００７３】
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体へ効率的に医薬品成分や生理活性物質を内包するには、医薬品成分や生理活性物質を含む水溶液又はアルコール等の溶媒の温度を、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが水に対して溶解し易くなる３２℃以下、望ましくは１０℃以下にするとよい。このようにして製造された医薬品成分や生理活性物質を内包したバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、試料の環境温度が３２℃以上ではその複合体からの医薬品成分や生理活性物質の放出が止み又は放出量が抑制され、３２℃未満では医薬品成分や生理活性物質の放出量が増加するという特異的な温度刺激応答性の機能を示す。
【００７４】
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、水や各種媒体に溶解又は懸濁させた製剤にしてもよく、予め賦形剤や基剤に含有させておく製剤にしてもよい。その剤型は、液剤、懸濁剤、乳剤であってもよく、散剤、軟膏剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、クリーム剤であってもよい。
【００７５】
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の製造方法によれば、得られたこの複合体は、酢酸菌を培養する過程で製造でき形状が異なるバクテリアセルロースを用いて、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドでグラフト加工することができ、その結果製造できる複合体の形状、あるいは医薬品成分や生理活性物質の包含量に差により温度刺激応答性を制御することが可能である。
【００７６】
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の製造方法によれば、形状が異なるゲル状のバクテリアセルロースは、酢酸菌を培養する条件を変えることによっても製造できる。酢酸菌の培養時、培地中又は培地表面にゲル状のバクテリアセルロースが製造されることが一般的である。ゲル状のバクテリアセルロースは、培養容器の容積、培地量、および細胞培養時のスタラーチップ使用による回転速度、又は培養条件により、所望の通り製造できる。スタラーチップを用いず、すなわち細胞培養液を回転しない静置状態で酢酸菌の培養を行うと、培地表面に透明なゲル状のバクテリアセルロース膜が生成することが一般的である。スタラーチップを用いて培地を回転させながら酢酸菌の培養を行うと培養日数が増すにつれて培地中に球状又は綿毛状のバクテリアセルロースが次第に集合し、培養日数が経過するとバクテリアセルロースが相互に集合し、最終的には球状でかつゲル状のバクテリアセルロースとなる。このような細胞培養過程が初期状態、途中の状態、あるいは平衡状態かの違いにより、ゲル状のバクテリアセルロースを製造することができる。このゲル状のバクテリアセルロースを用いると、ゲル状のみならず、薄膜状、多孔質状、ビーズ状、粉末状、繊維状、平板状、塊状状等様々な形状のバクテリアセルロースが製造できる。それを用いたバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体も、その形状に倣って様々な形状にすることができる。
【００７７】
そのバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、水や各種媒体に溶解又は懸濁させ、賦形剤や基剤と混練して、所望の剤型の製剤に調製してもよい。
【実施例】
【００７８】
以下に、本発明のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体及びその製造方法の実施例、及び本発明を適用外の比較例について、説明する。
【００７９】
実施例および比較例で用いた酢酸菌の培養、バクテリアセルロースへのアセチルサリチル酸を内包させたバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の調製、及び徐放試験の詳細は、下記の通りである。
【００８０】
（酢酸菌の培養）
グルコンアセトバクターキシリナス（Gluconacetobacter xylinus）に属する柿菌を培養することでゲル状のバクテリアセルロースを調製した。
なお、酢酸菌を培養する際に用いた培地は、炭素源である２０ｇ／Ｌグルコース（純正化学(株)製）、培地の栄養分を補うため５．０ｇ／Ｌ酵母粉末（Ｂｅｃｔｏｎ社製）、５．０ｇ／Ｌポリペプトン（日本製薬(株)製）、６．８ｇ／Ｌリン酸二水素ナトリウム・１２水和物、１．１５ｇ／Ｌクエン酸（和光純薬工業(株)製）を添加したＳＨ培地を用いた。この際、ｐＨメーターで培地のｐＨを６．０に調製を行った。調製した培地は、３００ｍＬ容三角フラスコに１００ｍＬ添加してから、オートクレーブＳＸ−５００（(株)トミー精工製、商品名）にて１２１℃、１５分間の滅菌処理を施した。その後、スクリーニングしたバクテリアセルロース生産菌を植菌した。なお、菌株の植菌方法としては、試験管にて１週間ごとに継代培養を行っているものを使用した場合と、回転培養を行った後の培地を１ｍＬ分取し培地に添加し植菌した場合との何れかを、この酢酸菌の植菌方法として用いた。
【００８１】
（ゲル状のバクテリアセルロースに医薬品成分及び／又は生理活性物質を内包させる一般的方法）
医薬品成分及び／又は生理活性物質としてアセチルサリチル酸を用いた例で、説明する。ゲル状のバクテリアセルロースを、１．１Ｍアセチルサリチル酸を溶解した５℃のエタノール水溶液に、２４時間浸漬・静置させた。アセチルサリチル酸を溶解した５℃のエタノール水溶液からゲル状のバクテリアセルロースを取り出し、５℃〜１０℃の冷蔵庫内で乾燥させた。その後、試料表面に付着したアセチルサリチル酸を取り除くために、蒸留水５００ｍｌの入った容器内に入れて、４５℃で１時間放置した後、室温で乾燥し、アセチルサリチル酸を包含する膜状のバクテリアセルロースを得た。なお、アセチルサリチル酸以外の医薬品成分や生理活性物質を内包させる場合も、同様にすればよい。
【００８２】
また、上記記載のゲル状のバクテリアセルロースを用いる代わりに、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドでグラフト加工したバクテリアセルロースを用い１．１Ｍアセチルサリチル酸を溶解した５℃のエタノール水溶液に浸漬すると、アセチルサリチル酸を内包する、バクテリアセルロースを含有した温度感受性複合体を、製造することができる。
【００８３】
（実施例１：酢酸菌培養による球状のバクテリアセルロースの調製、及び観察）
３００ｍＬ容量の三角フラスコに１００ｍＬのＳＨ培地を加え、継代培養の酢酸菌としてグルコンアセトバクターキシリナス（Gluconacetobacter xylinus）に属する柿菌を植菌し、２５℃で培養容器を、振盪培養機（トーマス科学器機(株)製）により、回転速度１２０ｒｐｍで撹拌し、培養日数を変えながら酢酸菌を４日間培養した。この際、培養時間と培地内に生ずるバクテリアセルロースの形態上の変化との関係を目視で観察した。得られた観察結果を表１に示す。
【００８４】
【表１】
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【００８５】
（実施例２：酢酸菌培養による球状のバクテリアセルロースの調製、及び撮影）
１００ｍＬ容量の三角フラスコに３０ｍＬのＳＨ培地を加え、実施例１と同様に継代培養の酢酸菌として実施例１と同様、柿菌を植菌し、２５℃で培養容器を、振盪培養機（トーマス科学器機(株)製）により、回転速度１５０ｒｐｍで撹拌し、培養日数を変えながら酢酸菌を７日間培養した。培地に生ずるバクテリアセルロースの形態・形状を明らかにするため、経時的に写真撮影した。撮影画像を、図１に示す。
【００８６】
表１及び図１から明らかな所見は次の通りである。
酢酸菌の培養を開始すると、培養１日目の初期段階では微細な繊維状のバクテリアセルロースであるタンポポ綿毛状物が培養液中に浮遊し始めるが、この段階では、球状でも塊状のバクテリアセルロースではない。培養２日目以降、タンポポ綿毛状の放射状のバクテリアセルロースが培地に数多く生産された。培養３日以降となると、放射状のバクテリアセルロースが増え始め、振盪培養機（トーマス科学器機(株)製）により培地に回転する作用が働き、培地の中を自由に浮遊しながら転がり始め、培養液中に浮遊する。その後、放射状のバクテリアセルロースの繊維同士が絡み合って結合し始め、次第に大きな球状の塊になって行く。それに伴い繊維状のバクテリアセルロースの数は次第に減少する。
【００８７】
（実施例３：酢酸菌培養による球状でかつ、ゲル状のバクテリアセルロースの調製）
下記に示す３種類の酢酸菌を培養する過程で、球状かつゲル状のバクテリアセルロースを製造した。酢酸菌を培養する過程では、振盪培養機（トーマス科学器機(株)製）を用いて、細胞培地が入った細胞培養用のフラスコを回転速度１２０ｒｐｍで継続して回転させ、５日間細胞培養を行うと何れの場合にも、回転フラスコ内で、半透明で球状のバクテリアセルロースを製造することができた。
［実施例３−方法１］  柿菌を８０ｍＬのＳＨ培地で２週間培養した。なお、１００ｍＬ容三角フラスコで培地を、１２０ｒｐｍにて継続的に回転させた。
［実施例３−方法２］  柿菌を８０ｍＬのＳＨ培地で２週間培養した。なお、１５０ｍＬ容三角フラスコで培地を１２０ｒｐｍにて継続的に回転させた。
［実施例３−方法３］  炭素源としてグルコースとフラクトースをおよそ１：１の割合で含む異性化糖を用い、柿菌を１００ｍＬのＳＨ培地で１週間培養した。なお、３００ｍＬ容三角フラスコで培地を１２０ｒｐｍにて継続的に回転させた。
得られた半透明で球状のバクテリアセルロースは、２％ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)水溶液に一晩浸漬させた後、脱イオン水に浸漬させ直し、三角フラスコに球状のバクテリアセルロースと脱イオン水とが入った状態で８０℃、３０分間以上煮沸を行い、さらに脱イオン水による洗浄作業を繰り返した。脱イオン水を用いた加熱洗浄を繰り返すことにより球状のバクテリアセルロースの精製を行った。
【００８８】
（実施例４：酢酸菌培養による形状の異なるバクテリアセルロースの調製）
酢酸菌の培養時、培地に生ずるゲル状でシート状のバクテリアセルロース、又は実施例３−方法１で製造した含水率９８％の球状でかつゲル状のバクテリアセルロースを下記に示す諸条件で乾燥固化させると、形状が異なる種々のバクテリアセルロースを製造することができた。
【００８９】
［実施例４−方法１：薄膜状のバクテリアセルロースの調製］
酢酸菌を培養することにより培地内に生成する含水率９８％のゲル状でシート状のバクテリアセルロースを各種の高分子膜や板状の高分子表面上に拡げ、室温で１昼夜かけて乾燥固化すると、ミクロフィブリルが相互に絡み合い和紙の形状で機械的強度に優れた不織布状のバクテリアセルロースが、製造できた。さらに詳しく説明すると、前記実施例３−方法２で調製した酢酸菌の培養液からゲル状のバクテリアセルロースを培地からピンセットで静かに取り出し、各種高分子膜（例えばポリスチレン板）表面に拡げて室温で乾燥固化させることにより、和紙の形状で機械的強度に優れた膜状のバクテリアセルロースが、製造できた。
【００９０】
［実施例４−方法２：多孔質状のバクテリアセルロースの調製］
前記実施例３−方法２で調製した酢酸菌の培養時、培地に生ずる含水率９８％のゲル状でシート状で和紙の形状のバクテリアセルロースをすり鉢で機械的に擂り潰したゲル状のバクテリアセルロースを、一旦、−１５℃で凍結させた後、減圧乾燥すると、多孔質状態の多孔質状のバクテリアセルロースが、製造できた。
【００９１】
［実施例４−方法３：球状のバクテリアセルロースの調製］
前記実施例３−方法１で調製した酢酸菌の培地から、ピンセットで静かに取り出してなる含水率９８％の球状でゲル状のバクテリアセルロースをそのまま使用した。
【００９２】
［実施例４−方法４：円盤状のバクテリアセルロースの調製］
前記実施例３−方法１で調製した酢酸菌の培地から取り出した含水率９８％の球状でかつ、ゲル状のバクテリアセルロースを高分子膜(例えばＰＰ、ＰＥＴ、ＰＶＡ、ＰＩ膜、又はＰＴＦＥ)の表面に拡げて室温で乾燥固化すると、円盤状で膜状のバクテリアセルロースが、製造できた。球状又はビーズ状でゲル状のバクテリアセルロースの繊維径は１〜９ｍｍ程度であり、円盤状で膜状のバクテリアセルロースの厚さは６０〜１００μｍであった。
【００９３】
（実施例５：酢酸菌培養による形状の異なるバクテリアセルロースの調製、及び撮影）
前記の通り又は前記と同様にして調製した形状が異なるバクテリアセルロースを撮影した。その撮影画像を、図２〜４に示す。
図２(ａ)及び(ｂ)は何れも実施例３−方法３で調製した酢酸菌である柿菌の培地中に生成した球状でゲル状のバクテリアセルロースを培養容器ごと撮影した写真であり、(ａ)が７日目で(ｂ)が２週間後のものである。  また、同図(ｃ)は実施例４−方法４で作成し凍結乾燥させた多孔質状のバクテリアセルロースを撮影した写真である。
図２(ｄ)は、前記実施例４−方法４で調製した酢酸菌の培養液から球状でゲル状のバクテリアセルロースを、アセチルサリチル酸のメタノール溶液に浸漬してから取り出し、膜状のポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥと記載することもある）表面に拡げて室温で乾燥固化させることにより、形成したバクテリアセルロースである。
図３(ａ)は、実施例４−方法１中、ゲル状のバクテリアセルロースを取り出しＰＴＦＥ表面で乾燥固化させたこと以外は同様にして調製した平板状のバクテリアセルロースの走査電子顕微鏡写真である。
図３(ｂ)は、実施例４−方法１中、ゲル状のバクテリアセルロースを取り出し、１００％メタノールに２日間浸漬させた後、縫い針先に刺して空中放置の状態で乾燥固化させたこと以外は同様にして調製したバクテリアセルロースの走査電子顕微鏡写真である。
図４(ａ)は、実施例４−方法１中、ゲル状のバクテリアセルロースを取り出しＰＴＦＥ板表面で乾燥固化させたこと以外は同様にして調製した平板状のバクテリアセルロースの光学顕微鏡写真（スケールバーは５ｍｍ）である。
図４(ｂ)は、実施４−方法１で作成し凍結乾燥させた多孔質状のバクテリアセルロースを撮影した光学顕微鏡写真（倍率は図４(ａ)と同じ）である。
【００９４】
（実施例６：バクテリアセルロースへのグラフト加工）
[実施例６−方法１：ゲル状のバクテリアセルロースのグラフト加工]
反応容器に、前記実施例３−方法３で調製したゲル状のバクテリアセルロース（濃度５％、５０ｍｇ）と、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド(以下ＮＩＰＡＭと略記)組成液（ＮＩＰＡＭ ０．３５９ｇ、及び水１６ｍＬ）、重合開始剤として過硫酸アンモニウム（以下ＡＰＳと略記、４０ｍｇ）とを含む組成液中、８５℃で２時間加熱することによってグラフト加工されてなるポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下ＰＮＩＰＡＭと略記）で複合化されているゲル状のバクテリアセルロース（ＢＣゲル／ＰＮＩＰＡＭ）であるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、作製した。
【００９５】
[実施例６−方法２：フィルム状のバクテリアセルロースのグラフト加工]
前記実施例３−方法３中、ゲル状のバクテリアセルロースを取り出しポリスチレン製シャーレ表面で、室温下、乾燥固化させたこと以外は同様にして、不透明なフィルム状のバクテリアセルロースを調製した。その後、１０５℃で乾燥した。得られたフィルム状のバクテリアセルロースを、４０ｍＬの水、非イオン界面活性剤（商品名  ＨＣ，第一工業製薬株製）溶液（濃度２ｇ／Ｌ）、ＮＩＰＡＭ ０．３１ｇ、ＡＰＳ（濃度４％ｏｗｆ）を含みｐＨ３．０に調整された組成液に入れて、８５℃で２時間加熱処理して、グラフト加工した。次に非イオン界面活性剤溶液（濃度２ｇ／Ｌ）で８５℃、３０分間処理したところ、フィルム状のバクテリアセルロース（ＢＣ／ＰＮＩＰＡＭ）であるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を作製した。グラフト加工前後の試料重量からグラフト加工率を求めたところ重量比で８００％であった。
【００９６】
（実施例７：徐放製剤であるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の調製）
実施例３−方法３のようにして酢酸菌である柿菌を培養したゲル状のバクテリアセルロースを乾燥して得た膜状のバクテリアセルロースと、実施例３−方法３のようにして酢酸菌である柿菌を培養し擂り潰したゲル状のバクテリアセルロースを用いて、下記の方法でＮＩＰＡＭを用いグラフト加工を行い、ＰＮＩＰＡＭを含有するゲル状のバクテリアセルロース複合体であるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を作製した。具体的には、０．７６９ｇのＮＩＰＡＭ、１３０ｍｇのＡＰＳを含む２４ｍＬの組成液（水溶液ともいう）に、５０ｍｇの膜状のバクテリアセルロース又は５０ｍｇの擂り潰したゲル状のバクテリアセルロースを入れ、室温から８５℃まで４０分間かけて温度を上昇させ、８５℃で合計２時間処加熱理してグラフト加工することにより、これらバクテリアセルロースにＮＩＰＡＭが浸透してグラフト加工の結果、ＰＮＩＰＡＭで重合したバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を作製した。グラフト加工前後の試料重量からグラフト加工率を求めたところ８００％であった。
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、５℃に保温した１．１ｍｏｌ／Ｌのアセチルサリチル酸エタノール溶液に１０時間浸漬することで、その複合物にアセチルサリチル酸を内包させ、その後、ポリスチレン膜の上に拡げて室温で乾燥させた。このようにして、アセチルサリチル酸を内包しつつＰＮＩＰＡＭで内部を充填したゲル状のバクテリアセルロースであるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、徐放製剤として、製造した。
なお、アセチルサリチル酸の水又はエタノールに対する溶解限界濃度は、ｐＨ３．５においてそれぞれ３．３ｍｇ／ｍＬおよび２００ｍｇ／ｍＬであった。
【００９７】
（比較例１：ＰＮＩＰＡＭの調製）
０．５ｇのＮＩＰＡＭ、８ｍｇのＡＰＳを含み希薄蟻酸水溶液を添加してｐＨ３に調整した水溶液２０ｍＬを加えてなるグラフト加工溶液をガラス製のビーカーに入れ、室温から８５℃まで４０分間かけて温度を上昇させ、８５℃で合計４時間加熱処理すると、水溶液中でＮＩＰＡＭが透明の沈殿物となって、ビーカーの底に堆積した。これを、４０℃に加熱した水溶液に浸漬すると、１０秒後に白濁して温度感受性を示すようになった。ビーカーの底の沈殿物は、ＦＴＩＲスペクトル測定によりＮＩＰＡＭが重合してなるＰＮＩＰＡＭであるものと検証できた。このようにして合成したＰＮＩＰＡＭは、ガラス板に拡げて、１０５℃に調整した恒温恒室の乾燥機で３時間乾燥しても、固形物にならず、粘性に富む液粘稠な液状の沈殿物のままであった。従って、白濁でゲル状のＰＮＩＰＡＭを乾燥固化しても製膜性が劣悪であった。ＰＮＩＰＡＭ単独の膜あるいは成形物を製造することは極めて困難であることがわかった。
【００９８】
（実施例９：バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の調製）
前記実施例４−方法２のようにして調製した多孔質状のバクテリアセルロースに、ＮＩＰＡＭを用いてグラフト加工を行った。４０ｍＬの水、１ｇ／Ｌ  非イオン界面活性剤（商品名  ＨＣ，第一工業製薬株製）を含む組成液（水溶液ともいう）に、１．５ｇ含水状態の多孔質状のバクテリアセルロースを加え、０．６８ｇのＮＩＰＡＭ、２４０ｍｇのＡＰＳを加えｐＨが３となるように調整した組成液を、８５℃で２時間加熱してグラフト加工することにより、多孔質状のバクテリアセルロースにＮＩＰＡＭが入り込みその結果製造できる、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を作製した。
【００９９】
（実施例１０：バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体によるアセチルサリチル酸の徐放製剤調製、及び徐放試験）
実施例４−方法１のようにして酢酸菌培養で生成したゲル状シートを擂り潰し、得られたゲル状の無定形バクテリアセルロースを、ポリスチレン膜上で乾燥固化させると、白色状の多孔質状のバクテリアセルロースを、調製した。一方、細胞培養で生成したゲル状シートをポリスチレン膜上で乾燥固化させると、フィルム状のバクテリアセルロースが得られた。これら２種類の形状のバクテリアセルロース試料に、下記の方法でＮＩＰＡＭ溶解水溶液と重合開始剤ＡＰＳとの水溶液中で加熱を施すことで、グラフト加工を行い、ＰＮＩＰＡＭを含有するバクテリアセルロース複合体を作製した。このＰＮＩＰＡＭ含有バクテリアセルロース複合体を含む水溶液を、下限臨界溶液温度（以下ＬＣＳＴと略記）未満の５℃に設定してＰＮＩＰＡＭを溶解状態にした後、５℃のアセチルサリチル酸のエタノール溶液に浸漬してアセチルサリチル酸を、ＰＮＩＰＡＭ含有クテリアセルロース複合体に浸透させ、徐放製剤であるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を作製した。
【０１００】
[実施例１０−方法１：ゲル状のバクテリアセルロースのグラフト加工及び徐放製剤化]
具体的には、ゲル状の無定形バクテリアセルロースでバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を作製した例で説明する。
０．３５９ｇのＮＩＰＡＭ、４０ｍｇのＡＰＳを含む１６ｍＬの水溶液に、５％の含水率を有する１５ｇのゲル状の無定形バクテリアセルロースを入れて８５℃で２時間グラフト加工した。
次に、こうしてなるＰＮＩＰＡＭを含有するバクテリアセルロース複合体を５℃の７ｍＬの１．１１ｍｏｌ／Ｌのアセチルサリチル酸のエタノール溶液に２０時間浸漬した後、エタノールから取り出し、５℃の冷蔵庫に入れて１昼夜放置して水分を蒸発させた。それを水に入れてゲル表面に付着したアセチルサリチル酸を水に溶解して、ドラッグデリバリーシステム（以下ＤＤＳと略記）担体の徐放製剤であるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を製造した。
このバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、感温性機能を有するＰＮＩＰＡＭをスイッチング基剤として利用した場合には、機械的な特性に優れたバクテリアセルロースとＰＮＩＰＡＭとの複合材料にすることで耐久性に優れたＤＤＳ基材となっていることが確認された。
【０１０１】
[実施例１０−方法２：フィルム状のバクテリアセルロースのグラフト加工及び徐放製剤化]
ゲル状の無定形バクテリアセルロースに代え、フィルム状のバクテリアセルロースを用いたこと以外は、前記方法２と同様にしてＤＤＳ担体となり徐放製剤である別なバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を製造した。グラフト加工前後の試料重量からグラフト加工率を求めたところ重量比で８００％であった。
【０１０２】
[実施例１０−試験１：徐放試験]
（アセチルサリチル酸の徐放試験用の検量線作成）
アセチルサリチル酸は、メスフラスコを用いて緩衝液に溶解させて、アセチルサリチル酸濃度が、０.０、 ４.２、 ８.４、 ２１.０、 ４２.０ｍｇ／Ｌとなるようにアセチルサリチル酸水溶液を調製した。その水溶液を石英セルに入れ、紫外可視分光光度計SHIMADZU UV2550（(株)島津製作所製、商品名）を用いて、アセチルサリチル酸の吸収波長である２０６．９ｎｍで水溶液の吸光度を測定した。所定濃度とアセチルサリチル酸の吸光度との関係をプロットし、検量線を作成した。
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体から放出されるアセチルサリチル酸量を次のようにして評価した。実施例に記載した方法でアセチルサリチル酸を包含させたバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を緩衝液に浸漬し、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体から所定時間ごとに徐放するアセチルサリチル酸量を紫外可視分光高度計により吸光度の変化から求めた。続いて、この吸光度の値を上記記載の検量線に適用して徐放時間と徐放したアセチルサリチル酸量との関係を求めた。
【０１０３】
（徐放試験における徐放条件と徐放量の測定）  バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体から放出するアセチルサリチル酸量を求める徐放試験は、上記記載の通り実施した。ここでは、測定容器の温度を制御できる恒温槽を用いて、２０℃および４０℃に調整して行った。７００ｍＬの緩衝液（ｐＨ７．０）の入った測定容器内に作製した試料を入れ、経時的に試料から徐放（放出ともいう）するアセチルサリチル酸量を分光分析的に求めた。すなわち、測定開始後、１０、２０、３０、６０、９０、１５０、２１０、２７０、３３０、３９０、５１０、６３０、７５０分間後、および２４時間（１４４０分間）後、３ｍｌのサンプル溶液を採取し、紫外可視分光光度計ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ２５５０（(株)島津製作所製、商品名）を用いて吸光度を測定し、予め作成しておいた検量線から、各時間におけるブレンド試料から溶液に溶出したアセチルサリチル酸濃度（ｍｇ／Ｌ）を求めた。分光光度計測定後は、容器内の体積を一定に保つために、採取し吸光度を測定した溶液を容器内へと再び戻した。
これにより、アセチルサリチル酸を含むバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を、緩衝水溶液に入れたときのＬＣＳＴが３２℃以上である４０℃と、ＬＣＳＴが３２℃未満である室温２０℃における徐放材としての機能を評価した。
【０１０４】
（徐放試験結果）
バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体の徐放試験の結果を、図５に纏めて示す。図５中、「GelBC/PNIPAM-40℃」及び「GelBC/PNIPAM-20℃」は、ゲル状のバクテリアセルロースをＮＩＰＡＭでグラフト加工してなるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体にアセチルサリチル酸を含有させ４０℃又は２０℃で徐放試験を行ったアセチルサリチル酸濃度（ｍｇ／Ｌ）の結果を意味する。また、「FilmBC/PNIPAM800%-40℃」及び「FilmBC/PNIPAM800%-20℃」は、フィルム状のバクテリアセルロースをＮＩＰＡＭでグラフト加工したフィルム状でバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体（グラフト加工率８００％）にアセチルサリチル酸を含有させ４０℃又は２０℃で徐放試験を行ったアセチルサリチル酸濃度（ｍｇ／Ｌ）の結果を意味する。
なお、比較のためフィルム状のバクテリアセルロースをＮＩＰＡＭでグラフト加工することなくアセチルサリチル酸を含有させた比較用の試料を用い４０℃又は２０℃で同様に徐放試験を行ったアセチルサリチル酸濃度（ｍｇ／Ｌ）の結果を、図５に「FilmBC-40℃」及び「FilmBC-20℃」で示す。
【０１０５】
図５から明らかな通り、ゲル状のバクテリアセルロースをＮＩＰＡＭでグラフト加工してなるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体「GelBC/PNIPAM-20℃」では、徐放１００分間以内でアセチルサリチル酸の放出量は急激に増大し、徐放時間２００分間で急激な放出が頭打ちとなりその以降の徐放時間の経過と共にアセチルサリチル酸の放出が次第に１４４０分間まで増大した。一方、「GelBC/PNIPAM-40℃」では、徐放１００分間以内でアセチルサリチル酸の放出量が次第に増大し、その後の徐放時間の経過と共にアセチルサリチル酸の放出量が次第に増大した。試料からのアセチルサリチル酸徐放量は、温度感受性複合体「GelBC/PNIPAM-20℃」が、「GelBC/PNIPAM-40℃」より常に大きな値となった。
フィルム状のバクテリアセルロース由来のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体「FilmBC/PNIPAM800%-20℃」及び「FilmBC/PNIPAM800%-40℃」の徐放挙動も、同様の傾向を示した。
【０１０６】
このようにバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、試料の環境温度が２０℃であると温度感受性複合体に含有されるアセチルサリチル酸の放出量が増加し、環境温度が４０℃になると含有されるアセチルサリチル酸の放出量が減少する。従って、試料環境の温度の違いによる温度感応性を利用することにより、例えば静脈注射手法で体内に留置することで徐放性を示す徐放製剤として使用できる。
【０１０７】
一方、フィルム状のバクテリアセルロースをアセチルサリチル酸のメタノール溶液に浸漬して乾燥させただけでは、図５中「FilmBC-40℃」及び「FilmBC-20℃」で示す通り、フィルム状のバクテリアセルロースにアセチルサリチル酸を内包させても内包量が少なく、かつ試料からの徐放量も微量であり、本発明で意図する効率的な温度感受性製剤にはならなかった。
【０１０８】
（実施例１１：バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体からのアセチルサリチル酸の徐放量と徐放時間との相関性）
実施例１０における徐放試験のデータに基づき、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体から徐放されたアセチルサリチル酸の徐放量と徐放時間との関係を、プロットした。ヒトに投与又は塗布する際の有効期間を勘案し、徐放時間１４４０分間後（２４時間後）の徐放量を基準に、徐放量の相対値を換算した。図６(ａ)・(ｂ)は、それぞれ「GelBC/PNIPAM-20℃」及び「GelBC/PNIPAM-40℃」と、「FilmBC/PNIPAM800%-20℃」及び「FilmBC/PNIPAM800%-40℃」とのアセチルサリチル酸量を意味する。すなわち徐放時間１４４０分間後のアセチルサリチル酸の徐放量を１００％とした時に、各徐放時間での徐放量を、相対百分率（％）で表示したものである。
図６(ａ)から明らかな通り、「GelBC/PNIPAM-20℃」の徐放挙動は、２０℃下、徐放時間１２５分間で総アセチルサリチル酸の８０％が放出された後、ほぼ平衡状態に達した。一方、「GelBC/PNIPAM-40℃」の徐放挙動は、４０℃下、徐放時間１２５分間で総アセチルサリチル酸の６０％が放出され引き続き徐放し続けた。
また、図６(ｂ)から明らかな通り、「FilmBC/PNIPAM800%-20℃」の徐放挙動は、２０℃で行うと徐放時間１５０分間で総アセチルサリチル酸の８０％は放出された後、平衡状態に達した。一方、「FilmBC/PNIPAM800%-40℃」の徐放挙動は、徐放時間６００分間で総アセチルサリチル酸の８０％は放出され引き続き徐放し続けた。
【０１０９】
（実施例１２: Ｎ−イソプロピルアクリルアミド誘導体を用いて製造した温度感受性複合体の徐放挙動）
実施例１０−方法１で用いたＮ−イソプロピルアクリルアミドの代わりに、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの末端アミド基をカルボキシル含有基で置換したＮ−イソプロピルアクリルアミド誘導体モノマーを用いたこと以外は、実施例１０−方法１と同様にして、バクテリアセルロースへのグラフト加工を行った。実施例１−試験１、徐放実験の記載方法に準じて実験を行ったところ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの末端アミド基を置換したＮ−イソプロピルアクリルアミド誘導体モノマーを用いてグラフト加工してなるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体のアセチルサルチル酸の徐放挙動は、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを用いてなるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体のアセチルサルチル酸の徐放挙動と類似した結果が得られた。
【０１１０】
（実施例１３：バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体によるビタミンＣの徐放製剤調製、及び徐放試験）
実施例１０で用いたアセチルサリチル酸の代わりにビタミンＣ（Ｌ-アスコルビン酸）を用いたこと以外は、実施例１０と同様にして、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体によるビタミンＣの徐放製剤を調製した。徐放試験は、吸光度波長を２４５．３ｎｍに設定した以外は、実施例１０と同様にした。なお、ビタミンＣの水又はエタノールに対する溶解限界濃度は、それぞれ３３０ｍｇ／ｍＬおよび２０ｍｇ／ｍＬであった。徐放試験の結果、実施例１０と同様な傾向であった。
【０１１１】
（実施例１４：バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体によるインドメタシンの徐放製剤調製、及び徐放試験）
実施例１０で用いたアセチルサリチル酸の代わりにインドメタシンを用いたこと以外は、実施例１０と同様にして、バクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体によるビタミンＣの徐放製剤を調製した。徐放試験は、吸光度波長を２７１．７ｎｍに設定した以外は、実施例１０と同様にした。なお、ビタミンＣの水又はエタノールに対する溶解限界濃度は、それぞれ３．０７ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ７．０）及び５０ｍｇ／ｍＬであった。徐放試験の結果、実施例１０と同様な傾向であった。
【０１１２】
（比較例２及び実施例１５：ＮＩＰＡＭによるグラフト加工率比較）
ＮＩＰＡＭによるバクテリアセルロースとセルロースへのグラフト加工率を比較した。
先ず、銅アンモニア水溶液であるシュバイツァー試薬を以下のようにして調製した。１ｇ硫酸銅（II）五水和物を１００ｍｌ三角フラスコにとり、そこへ濃アンモニア水１０ｍｌを加え振り混ぜて溶解させた。さらに２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液４ｍＬを加え振り混ぜると、目的とする透明で深青色のシュバイツァー試薬（[Cu(NH3)4](OH)2）が調製された。
粒度が４００ｍｅｓｈのセルロース粉末（和光純薬工業(株)製、製品番号034-22221）を、前記シュバイツァー試薬に完全に溶解させた後、ガラス板上に拡げた。アセトン−酢酸（４：１vol/vol）に接触することで、セルロースを凝固させ、セルロース中の金属酢体を除去した。続いて、グリセリン−水（７：１３vol/vol）に２日間浸漬し、室温で乾燥させ、セルロース膜を調製した。セルロース膜の膜厚は１０〜３０μｍであった。
得られたセルロース膜と、実施例４−方法１により得られ超微細なナノファイバー(NF)から構成される膜状のバクテリアセルロースとの各基材に対して、実施例６−方法２に準じてＮＩＰＡＭを用いてグラフト加工を行った。グラフト加工条件は、セルロース膜と膜状のバクテリアセルロースとの夫々の５０ｍｇに、ＮＩＰＡＭ水溶液（ＮＩＰＡＭ ０．３５９ｇ、及び水１６ｍＬ）と４０ｍｇ ＡＰＳを入れ、５℃で２時間加熱しグラフト加工を行うというものである。これにより、比較例２のグラフト加工したセルロース膜と、実施例１３のグラフト加工したナノファイバーであるバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体とを得た。グラフト加工時間毎のそれらのグラフト加工率を、まとめて表２に示す。
【０１１３】
【表２】
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【０１１４】
表２から明らかなように、膜状のバクテリアセルロース及びセルロース膜に対してＮＩＰＡＭでグラフト加工すると、グラフト加工率は、膜状のバクテリアセルロースの場合の方がバクテリアセルロース由来では無いセルロース膜の場合よりも、２倍以上高い値であった。このことは、繊維径が微細で比表面積が大きなセルロースナノファイバーから構成されている膜状のバクテリアセルロースには、そこへＮＩＰＡＭが効率的に浸透し、かつ効果的にグラフト加工が実施できることを示唆する。すなわち、膜状のバクテリアセルロースの繊維表面・内部や繊維間でグラフト加工が効率的かつ確実に進行することを示している。一方、セルロース膜は、均質な膜構造を有するが繊維構造を有さず、その比表面積が小さいため、ＮＩＰＡＭが十分に浸透できず、グラフト加工が効率的に進行しないことを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明のバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体は、生分解性素材であり生体適合性が高く、保水性に優れており、試料に各種機能性成分を内包させることができる。ドラッグデリバリーシステム用の徐放製剤として医薬品成分及び／又は生理活性物質を内包させることができるため、人工血管基材、人工皮膚基材、ろ過膜、医療器用素材のような医用材料、美容パック成分のような美容材料、食品添加物のような食品素材に応用することが可能であり、様々な産業分野に応用することができる。
【０１１６】
それの製造方法は、簡易に各種産業分野に適した形状に合わせてバクテリアセルロースを含有する温度感受性複合体を製造するのに、使用される。
【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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