(57)【要約】      （修正有）【課題】従来に比して高感度に或いは広範囲な波長領域において酸化ストレス度の測定が可能な酸化ストレス度測定用試薬、及び該酸化ストレス度測定用試薬を用いた酸化ストレス度の測定方法を提供する。【解決手段】下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む酸化ストレス度測定用試薬、及び該酸化ストレス度測定用試薬を用いた酸化ストレス度の測定方法。一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、水素原子、エチル基、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、又はフェニル基を表す。但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つは、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、又はフェニル基を表す。2014142335.tif 000007【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む酸化ストレス度測定用試薬。
【化１】
2014142335.tif 000006
［一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、水素原子、エチル基、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、又はフェニル基を表す。但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つは、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、又はフェニル基を表す。］
【請求項２】
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基である請求項１に記載の酸化ストレス度測定用試薬。
【請求項３】
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが、２−ヒドロキシエチル基である請求項１に記載の酸化ストレス度測定用試薬。
【請求項４】
前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが、フェニル基である請求項１に記載の酸化ストレス度測定用試薬。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の酸化ストレス度測定用試薬を用いて生体試料の酸化ストレス度を測定することを含む酸化ストレス度の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレス度測定用試薬及び酸化ストレス度の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内における酸化ストレスが各種の疾病や老化に関連することが知られてきており、生体内における酸化ストレスの状態を把握すべく、種々の方法が提案されている。例えば、血液などの生体試料中のフリーラジカルを酸化ストレスのマーカーとして用いることが提案されている。
【０００３】
特許文献１には、被験者から採取した血液中のフリーラジカルの状態を、被験者の酸化ストレス度を測定することで分析する分析装置が開示されている。該分析装置では、酸化ストレス度の測定法の一つとして、生体内にて生じた血中のヒドロキペルオキシド（ＲＯＯＨ）を酸化ストレスのマーカーとして用い、その濃度を呈色反応にて計測するｄ−ＲＯＭテスト（Reactive Oxygen Metabolites）が適用されている。特許文献１は、このｄ−ＲＯＭテストを行なう際に用いる呈色試薬として、Ｎ，Ｎ−パラエチルフェニレンジアミンを開示する。
【０００４】
また、特許文献２には、Ｎ，Ｎ−パラエチルフェニレンジアミン及びその４箇所の配位官能基として−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−Ｈ、又はハロゲン原子を有する化合物を呈色試薬として使用すること、及び該呈色試薬を用いたフリーラジカルの測定方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２５７９０９号公報
【特許文献２】欧州特許第０７８３６９２Ｂ１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１及び２に開示されるＮ，Ｎ−パラエチルフェニレンジアミン等では、感度又は測定波長領域のいずれの観点からも吸収特性が十分ではない。本発明は、上記の実情に鑑みなされたものであり、従来に比して高感度に或いは広範囲な波長領域において酸化ストレス度の測定が可能な酸化ストレス度測定用試薬、及び該酸化ストレス度測定用試薬を用いた酸化ストレス度の測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下の通りである。
＜１＞  下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む酸化ストレス度測定用試薬。
【０００８】
【化１】
2014142335.tif 000002
【０００９】
一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、水素原子、エチル基、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、又はフェニル基を表す。但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つは、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、又はフェニル基を表す。
【００１０】
＜２＞前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基である＜１＞に記載の酸化ストレス度測定用試薬。
＜３＞  前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが、２−ヒドロキシエチル基である＜１＞に記載の酸化ストレス度測定用試薬。
＜４＞  前記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが、フェニル基である＜１＞に記載の酸化ストレス度測定用試薬。
【００１１】
＜５＞  ＜１＞から＜４＞のいずれか１項に記載の酸化ストレス度測定用試薬として用いて生体試料中の酸化ストレス度を測定する酸化ストレス度の測定方法。
＜６＞  ＜１＞から＜４＞のいずれか１項に記載の酸化ストレス度測定用試薬を製造するための前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩。
＜７＞  前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と緩衝液とを混合することを含む＜１＞から＜４＞のいずれか１項に記載の酸化ストレス度測定用試薬の製造方法。
＜８＞  ＜１＞から＜４＞のいずれか１項に記載の酸化ストレス度測定用試薬の製造における前記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の使用。
＜９＞  ＜１＞から＜４＞のいずれか１項に記載の酸化ストレス度測定用試薬の酸化ストレス度の測定方法における使用。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来に比して高感度に或いは広範囲な波長領域において酸化ストレス度の測定が可能な酸化ストレス度測定用試薬、及び該酸化ストレス度測定用試薬を用いた酸化ストレス度の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１にて測定した吸収スペクトルを示す図である。
【図２】実施例２にて行なった試験Ａの結果を示す図である。
【図３】実施例２にて行なった試験Ｂの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について説明する。
本発明において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本明細書において、組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
【００１５】
＜酸化ストレス度測定用試薬＞
本発明の酸化ストレス度測定用試薬は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を含む。該一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は発色色素として機能する。下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、酸化ストレス度測定用試薬の製造において使用しうる。なお、以下の説明では、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を、適宜「特定発色色素」と総称する場合がある。
本発明の酸化ストレス度測定用試薬は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩自体、及び、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と緩衝液とを少なくとも含有する組成物の双方を含む。
本発明の酸化ストレス度測定用試薬は、下記一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩と緩衝液とを混合することを含む製造方法により製造してもよい。
本発明の酸化ストレス度測定用試薬は、酸化ストレス度の測定方法において使用しうる。本発明の酸化ストレス度測定用試薬を適用しうる酸化ストレス度の測定方法の詳細については後記する。
【００１６】
【化２】
2014142335.tif 000003
【００１７】
一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、水素原子、エチル基、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基（例えば、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基が挙げられ、２−ヒドロキシエチル基が好ましい。）、又はフェニル基を表す。
【００１８】
一般式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つは、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、又はフェニル基を表し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち２つ以上が、各々独立に、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、又はフェニル基を表してもよい。
【００１９】
また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち２つ以上が、各々独立に、イソプロピル基、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基、又はフェニル基を表す場合、同一の基が２つ以上であってもよいし、各々異なる２つ以上の基であってもよい。
【００２０】
特定発色色素の好ましい態様の一つには、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基である態様（以下、この態様の特定発色色素を「特定発色色素Ａ」と称する場合がある。）が含まれる。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基である特定発色色素Ａは、酸化ストレス度測定用試薬として用いられている従来公知の化合物に比較して、より高感度でシャープな吸収を示す。このため、特定発色色素Ａを選択することにより、より高精度な酸化ストレス度測定を行なうことが可能となる。
【００２１】
特定発色色素の他の好ましい態様の一つには、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つがフェニル基である態様（以下、この態様の特定発色色素を「特定発色色素Ｂ」と称する場合がある。）が含まれる。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つがフェニル基である場合、呈色した特定発色色素Ｂは、その分子構造によって異同はあるが、４２０ｎｍ〜８００ｎｍの広範囲な波長領域に吸収波長を有する。
【００２２】
このため、例えば、酸化ストレス度測定の生体試料として血液を用いる場合であれば、タンパク質などの血清成分の存在に起因する干渉による影響を受けない長波長側の波長領域（例えば、６００ｎｍ以上の領域）にも吸収波長を有する特定発色色素Ｂを選択することにより、より高精度な酸化ストレス度測定が可能になる。
【００２３】
また、測定感度は測定装置の種類などにより変動が生じる場合があるが、特定発色色素Ｂは広範囲な波長領域に吸収波長を有することから、測定装置に起因する感度変動を受けにくいという利点がある。特に、測定光源としてＬＥＤ（light emitting diode）が用いられる場合、ＬＥＤのロット間差に起因して測定感度が変動する場合があるが、かかる場合においても特定発色色素Ｂを用いることにより、より高精度な酸化ストレス測定が可能になる。
【００２４】
また、特定発色色素は、特定発色色素Ａ及びＢの両方の特徴を備える態様、即ち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つがフェニル基であり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうち少なくとも１つが炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基である態様であってもよい。この場合、一般式（Ｉ）で表される化合物において、フェニル基が結合する窒素原子と、炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基が結合する窒素原子とは、同一であってもよく、異なっていてもよい。
【００２５】
特定発色色素が、一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３又はＲ４として上述した置換基のうちフェニル基以外の置換基をＲ１、Ｒ２、Ｒ３又はＲ４に有する化合物である場合には、当該一般式（Ｉ）で表される化合物の塩であってもよい。
特定発色色素が一般式（Ｉ）で表される化合物の塩である場合、該塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩、シュウ酸塩などが挙げられる。
【００２６】
本発明における特定発色色素としては、試料液を調製する際における溶媒への溶解性の観点から、一般式（Ｉ）で表される化合物の塩であることがより好ましい。
【００２７】
一般式（Ｉ）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４としては、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が水素原子又はイソプロピル基であり、Ｒ３が水素原子、エチル基又は炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基であり、Ｒ４が炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基又はフェニル基である態様が含まれるが、本発明における特定発色色素はこれらに限定されない。
また、特定発色色素の他の例としては、一般式（Ｉ）において、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がエチル基又は炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基であり、Ｒ４が炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基である化合物の塩酸塩、硫酸塩又はシュウ酸塩が含まれるが、本発明における特定発色色素はこれらに限定されない。
【００２８】
特定発色色素の具体例を以下に示すが、本発明における特定発色色素はこれらに限定されない。
【００２９】
【化３】
2014142335.tif 000004
【００３０】
＜酸化ストレス度の測定方法＞
本発明の酸化ストレス度の測定方法（以下、適宜、「本発明の測定方法」と称する。）は、既述の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその塩（特定発色色素）を含む酸化ストレス度測定用試薬を用いて生体試料中の酸化ストレス度を測定する方法である。本発明の測定方法は、生体試料中のヒドロペルオキシド（Ｒ−ＯＯＨ）濃度を呈色反応で計測し、生体内の酸化ストレス度を総合的に評価する方法である。
【００３１】
本発明の測定方法において、計測対象となるヒドロペルオキシド（Ｒ−ＯＯＨ）とは、活性酸素やフリーラジカルによって酸化反応を受けた脂質、タンパク質、アミノ酸、核酸等の総称であり、酸化ストレス度のマーカーとなる。本発明の測定方法において用いられる生体試料は、血液、血漿等の血液由来物、尿などを含む。
【００３２】
本発明の測定方法は、下記第１の反応及び第２の反応により発色させた試料液の吸光度を、分光光度計を用いて測定して、得られた測定値からヒドロペルオキシド（Ｒ−ＯＯＨ）濃度を算出する方法であることが好ましい。
第１の反応：
遷移金属塩及び特定発色色素が溶解され、かつ所定のｐＨに調整された緩衝液中に生体試料を混合して試料液を得ること、得られた試料液中に、該遷移金属塩に由来する遷移金属イオンを触媒として、生体試料中に含まれるヒドロペルオキシド（Ｒ−ＯＯＨ）を分解して、アルコキシラジカル（Ｒ−Ｏ）及びヒドロペルオキシラジカル（Ｒ−ＯＯ）からなるフリーラジカルを生成させること、を含む反応。
第２の反応：
第１の反応において試料液中に生成したアルコキシラジカル（Ｒ−Ｏ）及びヒドロペルオキシラジカル（Ｒ−ＯＯ）からなるフリーラジカルにより、試料液に含有される特定発色色素を発色させる反応。
【００３３】
前記緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−マレイン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝液、及びＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液などが挙げられ、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、又はＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝液が好ましく、酢酸緩衝液が更に好ましい。
【００３４】
前記緩衝液のｐＨとしては、３．６〜５．６が好ましく、４．６〜５．４がより好ましい。前記緩衝液の濃度としては、１００ｍＭ〜４００ｍＭが好ましく、２００ｍＭ〜４００ｍＭがより好ましい。
【００３５】
前記遷移金属塩としては、例えば、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸銅（Ｉ）などが挙げられ、硫酸鉄（ＩＩ）が好ましい。前記緩衝液における遷移金属塩の濃度としては、０．０６ｍＭ〜０．０００５ｍＭが好ましく、０．０３ｍＭ〜０．００１ｍＭがより好ましい。
【００３６】
前記緩衝液における特定発色色素の濃度としては、０．４ｍＭ〜８ｍＭが好ましく、０．８ｍＭ〜６．４ｍＭがより好ましい。
【００３７】
測定は、通常２０℃〜４０℃の温度範囲内にて行なうことが好ましい。
【００３８】
本発明の測定方法に適用しうる測定装置としては、本発明の測定方法が実施可能な装置であれば特に限定されない。そのような測定装置としては、例えば、特開２００９−２５７９０９号公報に記載される測定装置を用いてもよい。また、測定装置としては、本発明の測定方法を実施可能な市販品を用いてもよい。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明する。しかしながら、本発明はそれらに何ら限定されるものではない。
【００４０】
［実施例１］
表１に示す各化合物を発色色素とし、発色色素毎に下記処方Ａの試料液を調製した。調製した各試料液中にて発色色素と過酸化水素とを反応させて、発色色素を発色させた。
発色後の各試料液とは別個に、下記処方の試料液から過酸化水素のみを除いた試料液を各々作製し、これらを発色前の試料液とした。
発色後及び発色前の各試料液について、光度計（製品名：分光光度計Ｖ-５５０、日本分光社製）を用いて吸収スペクトルを測定し、それらの差スペクトルを求め、図１に示した。なお、図１において、白三角は発色色素（１）、白丸は発色色素（２）、太線は発色色素（３）、細線は発色色素（４）及び、「×」は比較発色色素をそれぞれ用いた場合の結果を示す。
【００４１】
−処方Ａ−
・酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）                  ３００ｍＭ
・ＦｅＳＯ４                               ０．０３ｍＭ
・発色色素（表１に示す各発色色素）          ３．２ｍＭ
・過酸化水素                            ０．００３質量％
【００４２】
【表１】
2014142335.tif 000005
【００４３】
表１中、実施例１に用いた発色色素（１）〜（４）は、本発明の酸化ストレス度測定用試薬に係る特定発色色素であり、発色色素（１）及び（２）は特定発色色素Ａに包含され、発色色素（３）及び（４）は特定発色色素Ｂに包含される。比較発色色素は、従来公知の発色色素である。なお、発色色素（１）及び（２）は硫酸塩として使用した。
【００４４】
図１に示される結果から、以下のことが分かる。
２−ヒドロキシエチル基を置換基として有する発色色素（１）及び（２）は、比較発色色素の対比において、吸収波長はほぼ同じであるがよりシャープであり、かつ感度が著しく高いことが分かる。
フェニル基を置換基として有する発色色素（３）及び（４）は、比較発色色素との対比において、より広範囲な領域に吸収波長を有しており、従来よりも長波長側における測定が可能であることが分かる。
以上より、本発明に係る特定発色色素を含む酸化ストレス度測定用試薬を用いることにより、より高精度な酸化ストレス度の測定が可能となることが分かる。
【００４５】
［実施例２］
表１に示す各化合物を発色色素とし、発色色素毎に下記処方Ｂの試料液を調製した。調製した各試料液中にて発色色素とｔ−ブチルペルオキシド（ｔ−ＢｕＯＯＨ）とを反応させて発色色素を発色させた。
発色後の各試料液について、下記の比較試験Ａ又はＢを行い、各発色色素の反応性を比較した。
−比較試験Ａ−
発色色素（１）、発色色素（２）、又は比較発色色素を含む発色後の各試料液について、光度計（製品名：分光光度計Ｖ-５５０、日本分光製）を用いて、波長５１０ｎｍにおける吸光度を測定し、各発色色素の反応性を比較した。発色試験Ａの結果を図２に示す。図２における「×」は発色色素（１）を用いた場合の結果を示し、「白丸」は発色色素（２）を用いた場合の結果を示し、「白四角」は比較発色色素を用いた場合の結果を示す。
−比較試験Ｂ−
発色色素（３）、発色色素（４）、又は比較発色色素を含む発色後の各試料液について、光度計（製品名：分光光度計Ｖ-５５０、日本分光社製）を用いて、波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、各発色色素の反応性を比較した。発色試験Ｂの結果を図３に示す。図３における「×」は発色色素（３）を用いた場合の結果を示し、「白丸」は発色色素（４）を用いた場合の結果を示し、「白四角」は比較発色色素を用いた場合の結果を示す。
【００４６】
−処方Ｂ−
・酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）                            ３００ｍＭ
・ＦｅＳＯ４                                         ０．０３ｍＭ
・発色色素（表１に示す各発色色素）                    ３．２ｍＭ
・ｔ−ＢｕＯＯＨ            図２又は図３に示す各測定濃度（質量％）に調整
【００４７】
図２及び図３に示される結果から、以下のことが分かる。
図２に示されるように、２−ヒドロキシエチル基を置換基として有する発色色素（１）及び（２）は、ピーク波長（５１０ｎｍ）で比較した場合、いずれのｔ−ＢｕＯＯＨ濃度においても、比較発色色素に比して反応性が高いことが分かる。
図３に示されるように、フェニル基を置換基として有する発色色素（３）及び（４）は、波長６６０ｎｍであっても比較発色色素に比して反応性が著しく高く、従来は測定が困難であった長波長側の波長領域においても、酸化ストレス度測定が可能であることが分かる。
【００４８】
以上の通り、本発明によれば、従来に比して高感度に或いは広範囲な波長領域において酸化ストレス度の測定が可能な酸化ストレス度測定用試薬、及び該酸化ストレス度測定用試薬を用いた酸化ストレス度の測定方法を提供できることが明らかになった。
【図１】
2014142335.tif 000008
【図２】
2014142335.tif 000009
【図３】
2014142335.tif 000010