(57)【要約】【課題】  目的の糖タンパク質の糖鎖付加部位の周辺配列を改変することにより、糖鎖構造パターンをも改変した糖タンパク質を製造すること。【解決手段】  目的の糖タンパク質のアミノ酸配列において、糖鎖付加部位の周辺配列の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養して、目的の糖タンパク質とは糖鎖構造パターンが異なる糖タンパク質を製造することを特徴とする、糖鎖構造パターンを改変した糖タンパク質の製造方法。【選択図】  図２
2014226081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の糖タンパク質のアミノ酸配列において、糖鎖付加部位の周辺配列の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養して、目的の糖タンパク質とは糖鎖構造パターンが異なる糖タンパク質を製造することを特徴とする、糖鎖構造パターンを改変した糖タンパク質の製造方法。
【請求項２】
目的の糖タンパク質がＩｇＧ、酵素またはホルモンである、請求項１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖鎖をもつタンパク質において、その糖鎖付加部位周辺配列を改変することにより、付加される糖鎖の構造パターンをも改変されたタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのタンパク質には翻訳後修飾として糖鎖付加がなされている。糖鎖付加の様式には２種類あって、タンパク質中のＮ（Ａｓｎ）−Ｘ（Ｐｒｏ以外のアミノ酸）−Ｓ（Ｓｅｒ）／Ｔ（Ｔｈｒ）という配列中のＡｓｎに糖鎖が付加される場合はＮ結合型糖鎖、タンパク質中のＳｅｒ、Ｔｈｒの水酸基を介して糖鎖が付加される場合はＯ結合型糖鎖とよぶ。一般に、Ｎ結合型糖鎖には上記のようなコンセンサス配列があるため、糖鎖付加の予測や制御が容易であるといえる。
【０００３】
糖鎖はタンパク質が適正なｆｏｌｄｉｎｇをとる際に必要であったり、当該タンパク質の分泌促進、機能発現、血中での安定化、分子間相互作用などにも関与していたりする。このような機能性糖鎖をタンパク質に効率よく付加させるために、タンパク質中にあるＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列を改変したり、これをタンパク質中に人為的に導入して、タンパク質に結合する糖鎖の数を増やすことが検討されてきている（特許文献１、２、非特許文献１参照）。
しかし、一方で、その糖鎖構造は均一ではなく、様々なグリコフォームの集団として発現される。
【０００４】
さらに、単に糖鎖の付加の有無だけでなく、タンパク質に結合する糖鎖の構造が機能発現等に重大な影響を及ぼし、特定のグリコフォームに高い活性が現れる場合があることも知られている。例えば、抗体医薬として用いられるＩｇＧ１抗体の場合、そのＦｃ領域に結合するＮ結合型糖鎖にα１，６結合したフコース（コアフコース）が存在しないグリコフォームや、ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮＡｃが存在するグリコフォームは、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）が飛躍的に増大する（非特許文献２、３参照）。
【０００５】
一般に、抗体医薬のような糖タンパク質製剤は、ＣＨＯ細胞などの動物細胞を用いて生産される場合が多い。宿主細胞を変えれば糖鎖構造も変わる可能性がある。これは細胞ごとに各糖鎖関連遺伝子の発現量が異なるからである。しかし、物質生産に適する細胞とそうでない細胞が存在するため、宿主細胞によっては生産量が低下する可能性がある。
【０００６】
目的タンパク質の糖鎖構造をさらに積極的に改変しようとするなら、宿主細胞で発現している糖転移酵素等の糖鎖関連遺伝子の発現を遺伝子破壊やｓｉＲＮＡ導入によって抑制するか、あるいは新たに糖鎖関連遺伝子を宿主細胞に導入して過剰発現させるといった工夫が必要になる。しかし、酵母、植物細胞などのようにヒト型糖鎖とは異なる糖鎖を合成する細胞を宿主とする場合には、より多くの糖鎖関連遺伝子の発現調節が必要になる。
【０００７】
抗体に関しては、その生理活性を増強するために様々なアミノ酸変異体が作製されている。例えば、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  ＩｎｃがＦｃ領域にアミノ酸変異を加えてＡＤＣＣ活性の高いＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａの変異体を作製している（非特許文献４）。また、２８６および２９８位のアミノ酸をＣｙｓへ置換した変異体も作製されている(特許文献３)。
【０００８】
また、エラープローンＰＣＲによってランダムに抗体に変異導入したところ、Ｆ２４３Ｌ変異によってＡＤＣＣ活性の増強が認められている（非特許文献１０）。この変異体の糖鎖構造を解析したところ、高いＡＤＣＣ活性の発現に関わるコアフコース含量が減少した糖鎖が結合していた。すなわち、抗体などの糖タンパク質の機能向上において、糖鎖構造を改変することは非常に有効であるといえる。
【０００９】
一方、エラープローンＰＣＲのような方法では、どこに変異が導入されるか予測できず、糖鎖構造改変に適した部位に変異が導入されるとは限らないため、糖鎖構造が改変された変異体を効率よく取得することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平５−８６０９９号公報
【特許文献２】特開２０１２−７０７１１号公報
【特許文献３】特開２００９−５５８９９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｕｓａｎ  Ｈ．  Ｓｈａｋｉｎ−Ｅｓｈｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１，  ６３６３−６３６６  （１９９６）
【非特許文献２】Ｔｏｙｏｈｉｄｅ  Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８，  ３４６６−３４７３  （２００３）
【非特許文献３】Ｐａｂｌｏ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７，  １７６−１８０（１９９９）
【非特許文献４】Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌ．  Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６，  ６５９１−６６０４  （２００１）
【非特許文献５】Ｒｅｅｄ  Ｊ．  Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．  Ｂ  ７５２，  ２３３−２４５  （２００１）
【非特許文献６】Ｅｒｎｓｔ  Ｂａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １９５，  ６３９−６４４  （１９８１）
【非特許文献７】Ｇｅｒｒｙ  Ａ．  Ｆ．  Ｎｉｃｏｌａｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８，  １３５８４−１３５９１  （１９９９）
【非特許文献８】Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３５５，  ２４５−２４８  （２００１）
【非特許文献９】Ｌａｋｓｈｍｉ  Ｋａｓｔｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３２３，  ４１５−４１９  （１９９７）
【非特許文献１０】Ｒｏｓｓ  Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２４，  ６７１−６７８  （２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、目的タンパク質の糖鎖付加部位周辺配列を改変することによって、グリコフォームのパターンをも改変し、新たな性質が付与されたタンパク質を製造することである。新たな性質とは、分泌生産性、各種機能、安定性などの向上を意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
タンパク質に存在するＮ結合型糖鎖付加部位の周辺配列を改変した場合に、糖鎖付加効率が変動することがあると知られているが（非特許文献１）、このとき糖鎖構造にどのような影響があらわれるのかは明らかではない。そこで本発明者らは、この点について詳しく解析したところ、驚くべきことに、糖鎖付加効率が変動することとは別に、糖鎖構造そのものに変化があらわれることを新たに見出し、糖タンパク質の糖鎖構造を簡便かつ効率よく改変する本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明は下記＜１＞〜＜２＞の糖タンパク質の製造方法である。
＜１＞  目的の糖タンパク質のアミノ酸配列において、糖鎖付加部位の周辺配列の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養して、目的の糖タンパク質とは糖鎖構造パターンが異なる糖タンパク質を製造することを特徴とする、糖鎖構造パターンを改変した糖タンパク質の製造方法。
【００１５】
＜２＞  目的の糖タンパク質がＩｇＧ、酵素またはホルモンである、上記＜１＞に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明者らは、タンパク質に存在するＮ結合型糖鎖付加部位の周辺配列を改変した場合に、糖鎖付加効率が変動するとともに、新たに糖鎖構造も変化することを見出した。従来、宿主細胞に組換えタンパク質を生産させる際、当該タンパク質の糖鎖構造を改変するには、糖鎖関連遺伝子の発現が異なる宿主細胞に変更するか、宿主細胞が発現している糖鎖関連遺伝子を人為的に制御する必要があった。そのため、宿主細胞を変更することで目的タンパク質の生産量が低下する恐れや、宿主細胞が発現している糖鎖関連遺伝子を人為的に制御するために多くの労苦が必要になるといった問題があった。本発明では、タンパク質側に変異を導入することで、簡便に糖鎖構造を改変することが可能で、宿主細胞側を改造するアプローチとは異なる。場合によっては、両者を組み合わせることでより効果が期待される。
【００１７】
本発明ではタンパク質に変異を導入することから、場合によっては、タンパク質の性質や分泌生産量が変化する可能性がある。しかし、変異導入の位置が限定されているため、それらの点に関して特に問題が起こりにくいと考えられ、極めて簡便に糖鎖構造を改変できる手法であるといえる。また変異導入によって、タンパク質の諸性質にとって正の効果が得られる可能性もある。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ハーセプチンのＦｃ領域Ｎ結合型糖鎖付加Ｎ３００周辺配列を改変した変異体の発現。
【図２】野生型ハーセプチン（ＮＳＴ）および変異体ＮＳＳのＦｃ領域Ｎ３００を含む糖ペプチドのマススペクトル。
【図３】野生型ハーセプチンおよび変異体のＮ３００に結合していた主なＮ結合型糖鎖の構造。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の糖タンパク質製造方法は、下記＜１＞〜＜２＞である。
＜１＞  目的の糖タンパク質のアミノ酸配列において、糖鎖付加部位の周辺配列の１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを含む形質転換体を培養して、目的の糖タンパク質とは糖鎖構造パターンが異なる糖タンパク質を製造することを特徴とする、糖鎖構造パターンを改変した糖タンパク質の製造方法。
【００２０】
＜２＞  目的の糖タンパク質がＩｇＧ、酵素またはホルモンである、上記＜１＞に記載の製造方法。
【００２１】
上記＜１＞において、糖鎖構造パターンとは、糖鎖構造の質的多様性（タンパク質のある糖鎖付加部位に結合している糖鎖の構成糖や結合様式の違い）およびそれぞれの糖鎖付加効率のパターンをさす。
【００２２】
上記＜１＞において、糖鎖付加部位の周辺配列とは、糖鎖付加部位から−１０〜＋１０位のアミノ酸配列であり、好ましくは−５〜＋５位のアミノ酸配列である。特に好ましくは、Ｎ結合型糖鎖付加部位のＡｓｎから−２、−１、＋１、＋２、＋３、＋４位である。なおこの場合、＋２のアミノ酸はＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓが好ましく、特に好ましくはＴｈｒ、Ｓｅｒである。
【００２３】
本発明においてタンパク質をコードするＤＮＡは、上記＜１＞〜＜２＞の変異を導入したタンパク質をコードする塩基配列のＤＮＡで、Ｔ４リガーゼを用いて各種組換えベクターに挿入するが、タンパク質をコードするＤＮＡの組換えベクターへの挿入法はこの方法に限定されるものではない。また、ベクター挿入時に制限酵素サイトを利用する場合は、制限酵素サイトやタグ配列によってコードされるアミノ酸もタンパク質に連結される。
【００２４】
本発明における組換えベクターは、特にその種類は限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミドやファージベクター）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００２５】
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、タンパク質をコードするＤＮＡ、およびプロモーター等の転写に必要な要素が機能的に連結されている。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。また、これらの発現ベクターはアンピシリン耐性遺伝子などの適当な選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。発現ベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II  ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  ｖｅｒ．Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられるが、本発明に用いる発現ベクターはこれらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明で用いるＤＮＡは、遺伝子導入試薬、例えばリン酸カルシウムやリポソームを利用するもの、あるいはＦｕＧｅｎｅ  ６  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（従来はＲｏｃｈｅ、現在はＰｒｏｍｅｇａ）などの非リポソーム系トランスフェクション試薬などを用いて、あるいはエレクトロポレーション法やマイクロインジェクション法などにより、宿主細胞へ導入する。
【００２７】
本発明における形質転換体として、細胞は糖鎖付加能を有する細胞、例えば、原核生物ではカンピロバクターやオリゴサッカリルトランスフェラーゼ遺伝子を導入された大腸菌など、また真核生物では、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、哺乳類由来培養細胞などが挙げられるが、遺伝子導入のしやすさ、タンパク質生産量の高さ、哺乳類型糖鎖が付加できる点などで、哺乳類由来培養細胞のうち、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞などを用いるのが特に好ましい。
【００２８】
本発明の形質転換体を用いて本発明のタンパク質を製造する方法として、形質転換体の培養、タンパク質の取得、精製などの工程が挙げられる。形質転換体の培養は、３７℃のＣＯ２インキュベーター内で、遺伝子導入後一定時間（５〜１５時間）までは１０％牛血清含有培地にて行い、その後は目的タンパク質の精製を容易にするために無血清培地に交換して継続培養する（＋９〜４８時間）。目的タンパク質の取得は、当該タンパク質が分泌タンパク質で、培地中に分泌されているようであれば、培地を回収してタンパク質源とし、これをアフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーに供して精製する。目的タンパク質が培地中に分泌されず、細胞内に蓄積している場合には、細胞を回収し、ここに細胞溶解剤を加えるとともに超音波破砕により細胞を破砕して目的タンパク質を細胞溶解剤中に放出させ、これを適当な緩衝液などで希釈するなどしたものをタンパク質源として、上記と同様にして各種クロマトグラフィーにより精製する。
【００２９】
本発明のタンパク質を製造する方法は、細胞を用いる方法に限定されるものではなく、無細胞タンパク質合成系によって製造することもできる。無細胞タンパク質合成系としては、例えば、コムギ胚芽、大腸菌、ウサギ網状赤血球、昆虫細胞などから調製したものが挙げられる。目的タンパク質をコードするＤＮＡを逆転写が可能なベクターに組み込み、これより逆転写反応によって合成したｍＲＮＡを適当な無細胞タンパク質合成系に加えて目的タンパク質を合成する。そして、その反応液より目的タンパク質を上記と同様にして精製する。
【実施例】
【００３０】
以下に記載する実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。
【００３１】
本実施例ではヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に存在するＮ結合型糖鎖付加部位の周辺配列を改変したとき、糖鎖構造へどのような影響が現れるかを調べた。ヒトＩｇＧ１抗体としては、乳がんの分子標的薬として知られている抗体医薬品ハーセプチンをモデルとして用いた。一般に、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域に存在するＮ結合型糖鎖付加部位はＮ２９７であるが、ハーセプチンの場合はＮ３００である（非特許文献５参照）。
【００３２】
まず哺乳類培養細胞におけるハーセプチンの発現ベクターを構築した。ＩｇＧ１のＨ鎖定常領域については、ヒト脾臓由来ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を鋳型として、プライマーＮＧ３９９＋、ＮＧ４００−（配列表配列番号１、２）とＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ここで増幅したＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶサイトにクローニングした（プラスミド１）。
【００３３】
つぎに、このプラスミド１からＸｈｏＩ、ＸｂａＩで切り出したヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片をｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｖｅｒ．  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＸｈｏＩ−ＸｂａＩサイトに挿入したプラスミドを作製し（プラスミド２）、これを鋳型として、プライマーＴ７、ＮＧ４１０−（配列表配列番号３、４）とＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲ増幅を行い、ここで増幅したＤＮＡ断片（ヒトＩｇＧ１のＨ鎖定常領域にＭｙｃタグ、Ｈｉｓ６タグが付加したものをコード）を予めＳａｃＩＩ−ＸｂａＩサイトを欠失させたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクターのＥｃｏＲＶサイトにクローニングした（プラスミド３）。
【００３４】
ここで作製したプラスミド３から、ＸｈｏＩ、ＭｌｕＩで切り出したＤＮＡ断片をｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＸｈｏＩ−ＭｌｕＩサイトに挿入した（プラスミド４）。一方、ハーセプチンＨ鎖の可変領域をコードするＤＮＡはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社に合成依頼し、ＮｈｅＩ−ＸｈｏＩ断片として切り出して、これをプラスミド４のＮｈｅＩ−ＸｈｏＩサイトに挿入した（プラスミド５）。
【００３５】
ＩｇＧ１のＬ鎖定常領域については、ヒト脾臓由来ｃＤＮＡを鋳型として、プライマーＮＧ４０８＋、ＮＧ４０９−（配列表配列番号５、６）とＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲ増幅を行い、ここで増幅したＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクターのＥｃｏＲＶサイトにクローニングした（プラスミド６）。
【００３６】
また、ハーセプチンＬ鎖の可変領域をコードするＤＮＡはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社に合成依頼し、ＸｂａＩ−ＢｓｉＷＩ断片として切り出して、これをプラスミド６のＸｂａＩ−ＢｓｉＷＩサイトに挿入した（プラスミド７）。これよりＸｂａＩ−ＮｏｔＩ断片（ハーセプチンＬ鎖をコード）を切り出し、プラスミド５のＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトに挿入して、野生型ハーセプチンの発現ベクターとした。
【００３７】
つぎに、ハーセプチンのＮ結合型糖鎖付加部位の周辺配列を改変したとき、糖鎖構造がどのように変化するかを調べるため、Ｎ結合型糖鎖付加Ｎ３００の＋２位のＴ３０２のＴｈｒをＳｅｒに置換した変異体（ハーセプチン変異体Ｔ３０２Ｓ）、Ｔ３０２Ｓに加えさらに＋１位のＳ３０１を他のアミノ酸Ｘに置換した一連の変異体（ハーセプチン変異体Ｓ３０１Ｘ／Ｔ３０２Ｓ）、および−１位Ｙ２９９と＋３位Ｙ３０３をそれぞれＰｈｅに置換した変異体（ハーセプチン変異体Ｙ２９９Ｆ／Ｙ３０３Ｆ、ＦＦ変異体）を作製した。
【００３８】
まず、プラスミド３より糖鎖付加部位を含む配列をコードするＳａｃＩＩ−ＸｂａＩ断片を切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクターのＳａｃＩＩ−ＸｂａＩサイトに挿入した（プラスミド８）。これを鋳型として、プライマーＮＧ２６５＋、ＮＧ２６６−（配列表配列番号７、８）とＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩで消化した後、そのまま大腸菌の形質転換に用いた。ここで得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、Ｔ３０２Ｓ変異が導入されたプラスミドを得た（プラスミド９）。
【００３９】
このプラスミド９よりＳａｃＩＩ−ＸｂａＩ断片を切り出し、これをプラスミド３のＳａｃＩＩ−ＸｂａＩ断片といれかえたプラスミドを作製した（プラスミド１０）。ここからさらにＸｈｏＩ−ＭｌｕＩ断片を切り出し、これを野生型ハーセプチン発現ベクターのＸｈｏＩ−ＭｌｕＩ断片とのせかえて、ハーセプチン変異体Ｔ３０２Ｓの発現ベクターとした。
【００４０】
ハーセプチン変異体Ｓ３０１Ｘ／Ｔ３０２Ｓの発現ベクターについては、プラスミド９を鋳型として、配列表にある各変異導入用プライマー（配列表配列番号９〜４６）の組み合わせとＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行い、上記と同様にして各変異体の発現ベクターを作製した。
【００４１】
ハーセプチン変異体Ｙ２９９Ｆ／Ｙ３０３Ｆ（ＦＦ変異体）の発現ベクターについては、プラスミド８を鋳型として、プライマーＮＧ９５２＋、ＮＧ９５４−（配列表配列番号４７、４９）とＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行い、上記と同様にしてＹ２９９Ｆ変異を導入したのち、このプラスミド（プラスミド１０）を鋳型として、プライマーＮＧ９５３＋、ＮＧ９５４−（配列表配列番号４８、４９）とＫＯＤ  ＦＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてさらにＰＣＲを行い、この場合も上記と同様にしてＹ３０３Ｆ変異を導入し、ハーセプチン変異体Ｙ２９９Ｆ／Ｙ３０３Ｆ（ＦＦ変異体）の発現ベクターを作製した。
【００４２】
それぞれの発現ベクターはＦｕＧｅｎｅ  ６  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅあるいはプロメガ）を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入した。トランスフェクション後、これらの細胞は３７℃のＣＯ２インキュベーターで一晩培養し、ここで培地交換を行って（３．５ｃｍ  ｄｉｓｈ、ＭＥＭα培地＋１０％牛血清２ｍｌをＭＥＭα培地１ｍｌに交換）、さらに一定時間培養を行った（トランスフェクションから４８時間後まで）。培養終了後、培養上清を回収して少量のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ）を添加し、４℃で２時間撹拌して培養上清中に分泌されたハーセプチンおよびその変異体をこれに吸着させ回収した。糖鎖付加効率を解析する場合は、このＰｒｏｔｅｉｎ  ＡビーズをＰＢＳ緩衝液で洗浄後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用のｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒと混合し、煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【００４３】
泳動終了後、ウェスタンブロットを行うため、ゲル中のタンパク質はブロッティング装置を用いてＰＶＤＦメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、これを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液内で室温１時間震盪してブロッキング処理を行った。つぎにこのメンブレンを一次抗体溶液（抗ｍｙｃ−ｔａｇ抗体、ＭＢＬを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で１０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。その後、メンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、二次抗体溶液（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ抗マウスＩｇＧ抗体、Ｚｙｍｅｄを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で５０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。なお場合によっては、上記一次抗体、二次抗体のかわりに、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で３０００倍希釈したもの）に浸漬させ、室温で１時間震盪した。そして、いずれの場合においてもメンブレンを３％スキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で２回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて化学発光反応を行い、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で陽性バンドを検出した。
【００４４】
通常、糖鎖付加された分子とされていない分子では分子量に違いがあり、泳動度に差がある。糖鎖付加された分子はペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）処理によりＮ結合型糖鎖を除去すると、泳動度が糖鎖付加されていないものと一致するようになる。これによってＮ結合型糖鎖の存在を確認した。
【００４５】
野生型ハーセプチンおよびハーセプチン変異体の糖鎖構造を質量分析装置で解析するために、ある程度のタンパク質量を確保する必要があるため、安定発現株を樹立した。まず発現ベクターを、ＦｕＧｅｎｅ  ６  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅあるいはプロメガ）を用いてＨＥＫ２９３細胞に導入した。トランスフェクション後、これらの細胞は３７℃のＣＯ２インキュベーターで二晩培養（３．５ｃｍ  ｄｉｓｈ、ＭＥＭα培地＋１０％牛血清、２ｍｌ）した。その後４００μｌのトリプシン処理によって細胞をディッシュよりはがし、その細胞懸濁液少量（５〜２０μｌ）を、Ｇ４１８を５００μｇ／ｍｌの濃度で含む培地（１０ｃｍ  ｄｉｓｈ、ＭＥＭα培地＋１０％牛血清、８ｍｌ）にうつして、Ｇ４１８耐性のクローンがコロニーを形成するまで培養した（〜１ヶ月）。つぎに各コロニーを単離し、１２ウェルプレートにうつして、細胞が十分に増えるまでＧ４１８含有培地で培養した。その後、培養上清中のハーセプチン（変異体）の有無、産生量をウェスタンブロットにより確認し、ハーセプチン（変異体）を安定発現するクローンを取得した。
【００４６】
各安定発現株を大量培養し（１クローンにつき、１０ｃｍ  ｄｉｓｈ、ＭＥＭα培地＋１０％牛血清、７ｍｌ、３０枚）、細胞が十分に増えた時点でＰＢＳ緩衝液を用いて細胞を２回洗浄後、無血清培地（ＭＥＭα培地、５ｍｌ）に交換してさらに２日間培養した。その後、培養上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａビーズを加えて４℃で２０時間撹拌して、培養上清中に分泌されたハーセプチン（変異体）をこれに吸着させた。このビーズを遠心で回収後、水で数回洗浄し、さらに０．５Ｍ酢酸／酢酸アンモニウム、ｐＨ３．４を０．３ｍｌ×３回加えてハーセプチン（変異体）を溶出した。この溶出液を遠心濃縮機にかけて濃縮乾固させたが、残留した酢酸アンモニウムを除くためにさらに水を加えて濃縮乾固を行った。この作業は数回繰り返した。
【００４７】
このようにして調製した抗体サンプル１０μｇにＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦ試薬（Ｗａｔｅｒｓ）を加えて変性させ、さらにトリプシン５００ｎｇを加えて３７℃で一晩消化し、ペプチド断片とした。つぎに、セルロースを用いて反応物中より糖ペプチドを精製した。この糖ペプチドの糖鎖構造を質量分析装置（島津製作所、ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴおよびＡＸＩＭＡ−ＴＯＦ２）を用いて解析した。
【００４８】
＜実施例１＞
図１にＨＥＫ２９３細胞に発現させたハーセプチンおよびその変異体のウェスタンブロットの結果を示す。野生型ハーセプチン（ＷＴ，  ＮＳＴ）の場合、その糖鎖付加部位周辺のアミノ酸配列はＹＮＳＴＹ（アミノ酸番号２９９〜３０３）であり、９割以上の分子にはＮ３００に糖鎖が付加されていた。一般に、Ｎ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列であるＡｓｎ  Ｘａａ  Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列において、三番目のアミノ酸がＴｈｒのほうがＳｅｒの場合よりも糖鎖付加効率が高くなる傾向があることが知られている（非特許文献６〜９）。ハーセプチンの場合も、このＴｈｒをＳｅｒに交換したところ（Ｔ３０２Ｓ変異体、ＮＳＳ）、糖鎖付加率が若干減少した。また同時にＸａａの位置にあるＳｅｒ（Ｓ３０１）を他のアミノ酸に置換したところ、変異体ごとにその糖鎖付加率は異なった。
【００４９】
次に、変異体の糖鎖構造の変化を調べるために質量分析装置を用いて解析した。例として、図２に野生型ハーセプチンＮＳＴおよび変異体ＮＳＳのスペクトルを示す。本解析によって検出された主な糖鎖の構造を図３に示す。比較のためにヒト血清由来ＩｇＧの糖鎖構造解析も行った。
【００５０】
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた野生型ハーセプチンの場合、その主要糖鎖として、Ｇ１Ｆ＞Ｇ０Ｆ＞Ｇ２Ｆの順に存在していた。この傾向はヒト血清由来ＩｇＧ１やＮＨＳ、ＮＮＳ変異体などでも観察された。
【００５１】
一方、ＮＳＳ変異体やＮＱＳ変異体の主要糖鎖はＧ１Ｆが最も多いが、次いでＧ２Ｆ、Ｇ０Ｆの順に多かった。この結果より、ハーセプチンがもつＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列ＮＳＴにおいて、ＴｈｒをＳｅｒに変えることによってＧ２Ｆの割合が増加することが明らかになった。言い換えれば、糖鎖付加効率が低下したにもかかわらず、ガラクトース転移量は増加している（あるいはさらにシアル酸も付加している可能性がある）。すなわち、ポリペプチド合成時にＡｓｎに糖鎖が付加するための要因と、糖鎖付加後にプロセシングを受け、さらに糖転移酵素により修飾を受けるための要因は必ずしも一致しないということが明らかになった。
【００５２】
さらに、ＮＡＳ、ＮＶＳ、ＮＤＳ、ＮＥＳ変異体の主要糖鎖では、Ｇ２Ｆの割合が最も多く、次いでＧ１Ｆ、Ｇ０Ｆの順に多かった。すなわち、ガラクトースが付加するグリコフォームが増加した。また、ヒト血清由来ＩｇＧ２やＦＦ変異体の主要糖鎖はＧ０Ｆが最も多く、次いでＧ１Ｆ、Ｇ２Ｆの順に多かった。ガラクトース残基を多く有するグライコフォームを含有する変異体は、シアル酸付加量が高くなり（シアル酸転移能の高い細胞を使用したり、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで後から付加させたりすることも可能）抗炎症活性を有する可能性がある。また、これらの変異体は、Ｇ０／Ｇ０ＦやＧ１／Ｇ１Ｆをもつグライコフォーム、つまりＧｌｃＮＡｃで終わっているグライコフォームが少ないので、血中からの消失速度が低下する（作用が持続する）効果も期待される。
【００５３】
各変異体のグライコフォーム比較のため、ガラクトース残基の数、Ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮＡｃ含有糖鎖、コアフコースの無い（Ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）糖鎖に着目して表１にまとめた。すなわち、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ０Ｂ、Ｇ０ＦＢを合わせたものをＧａｌ０、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ１Ｂ、Ｇ１ＦＢを合わせたものをＧａｌ１、Ｇ２、Ｇ２Ｆ、Ｇ２Ｂ、Ｇ２ＦＢを合わせたものをＧａｌ２として、ハイマンノースＭ５との合計を１００％として、それぞれの比率を算出した。また、それらのうち、Ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮＡｃを含有するものの合計、フコースを含まない（Ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）糖鎖を合計したものの割合を示す。
＜表１：  各ハーセプチン変異体のＮ３００に結合した糖鎖構造比較。＞
【００５４】
【表１】
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【００５５】
ガラクトース残基数以外にも、変異体によっては、ＡＤＣＣ活性の発現に関わるＢｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮＡｃ糖鎖やＡｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ糖鎖の割合も変化することが明らかになった。特にＢｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮＡｃ糖鎖については、程度の差はあるが表１に記載したいずれの変異体でもその含有量が増加しており、例えばＮＶＳ、ＮＤＳ、ＮＡＳの各変異体では野生型ハーセプチンＮＳＴに比べて５．４〜７．６倍の含有量を示した。これらのグライコフォームを野生型より多く含有する変異体は、抗体のＡＤＣＣ活性を増強する可能性がある。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の糖鎖構造パターンを改変した糖タンパク質の製造方法は、抗体をはじめとする有用タンパク質の糖鎖構造改変、およびそれに伴う機能改変や新機能が付与されたタンパク質の製造、あるいは血中安定性が増大したタンパク質の製造などに利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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