(57)【要約】  肺疾患の治療剤および／または予防剤、ならびにそのスクリーニング方法を提供する。  Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤を有効成分として含有する肺疾患の治療剤および／または予防剤、ならびにそのスクリーニング方法である。
2017002928.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤を有効成分とする、肺疾患治療剤および/または予防剤。
【請求項２】
Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤が、核酸オリゴ、およびＡｒｉｄ５Ａ抗体からなる群より選ばれる１種以上の物質である、請求項１記載の肺疾患治療剤および/または予防剤。
【請求項３】
核酸オリゴが、天然および非天然のＲＮＡまたはＤＮＡからなるオリゴである請求項２記載の肺疾患治療剤および/または予防剤。
【請求項４】
肺疾患が、肺線維症である、請求項１〜３のいずれか１項記載の肺疾患治療剤および/または予防剤
【請求項５】
肺疾患の治療および/または予防に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現に対する影響を検出する工程、および
（ｂ）被験物質を用いない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現を減少させる物質を選択する工程、
とを含んでなる方法。
【請求項６】
肺疾患の治療および/または予防に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）被験物質を、実験動物に投与する工程、
（ｂ）該Ａｒｉｄ５Ａの発現に対する影響についてＰＣＲにて測定する工程、および
（ｃ）被験物質を実験動物に投与しない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現を減少させる物質を選択する工程、
とを含んでなる方法。
【請求項７】
肺疾患の治療および/または予防に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）被験物質のＡｒｉｄ５Ａの機能に対する影響を検出する工程、および
（ｂ）被験物質を用いない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの機能を減少させる物質を選択する工程、
とを含んでなる方法。
【請求項８】
請求項７に記載の肺疾患の治療および/または予防に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該Ａｒｉｄ５Ａの機能がＩＬ−６ｍＲＮＡの安定化である方法。
【請求項９】
肺疾患が、肺線維症である請求項５〜８のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な肺疾患治療剤および／またはそのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺疾患としては、ウイルス、細菌等に起因する急性炎症による急性気管支炎、好酸球による気道炎症によって主に発症する慢性の気管支喘息、肺胞上皮の炎症に起因して肺構造障害が生じる間質性肺炎、喫煙等の種々の原因により肺に慢性炎症が生じ、肺胞壁の破壊、気管支粘液腺の肥大等が起き、その結果息切れ、咳嗽、喀痰等が増加する病気とされている慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ：  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ）等、多くの炎症性肺疾患が知られている。【０００３】
上記炎症性肺疾患の病態形成として、まず初期段階において遊離された走化性因子と呼ばれる情報伝達分子が、好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ等の炎症性細胞の局所への遊走を促し、遊走した炎症性細胞が障害性の酵素やラジカルを遊離して組織を障害すると同時にサイトカイン等を放出することによってさらなる炎症性細胞の遊走および活性化をもたらすことが知られている。このような炎症が気道で発症した場合、浸潤した炎症性細胞は気管支および肺の組織を障害し、最終的には各疾患に特徴的な呼吸流量や酸素交換能の低下といった呼吸機能の障害を引き起こすことになる。さらに肺構造と肺機能が著しく阻害され、最終的には線維化、蜂巣肺を生ずる難治性の疾患へと進行していくものも多い。【０００４】
このような炎症性肺疾患の治療には、抗炎症作用を有する薬剤が使用されており、すでに軽度〜中等度の気管支喘息では副腎皮質ステロイドが著効することが知られている（非特許文献１参照）。また、間質性肺炎の治療においても、その急性増悪時に副腎皮質ステロイドが用いられ、必要に応じて免疫抑制剤も併用されている。さらに進行すると、低酸素血症が必発するので、在宅酸素療法を含む酸素療法が必要となる。副腎皮質ステロイドはＣＯＰＤの増悪を予防することも報告されているが、ＣＯＰＤの病態に対する効果は限定的である（非特許文献２参照）。肺線維症に対してもステロイド療法が行われているが、病変が残存することが多く、ステロイド剤の副作用や減量・中止による急性増悪もしばしば見られ、臨床において決して満足できるものではないため、新たな治療薬の開発が望まれている。【０００５】
ＡＴリッチインターラクティブドメイン５Ａ（ＡＴ  Ｒｉｃｈ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ５Ａ、以下Ａｒｉｄ５Ａと略す）はＩＬ−６ｍＲＮＡの安定化タンパク質として報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＧＩＮＡ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ，２００６
【非特許文献２】Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９９，３４０（２５），１９４８〜１９５３
【非特許文献３】ＰＮＡＳ，１１０，２３，９４０４−９４１４（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、Ａｒｉｄ５Ａと肺疾患との関係は知られていなかった。
本発明は、より有効な肺疾患治療剤、並びにそのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、具体的には以下を含む。
〔１〕Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤を有効成分とする、肺疾患治療剤および／または予防剤である。
〔２〕Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤が、核酸オリゴ、およびＡｒｉｄ５Ａ抗体からなる群より選ばれる１種以上の物質である、〔１〕記載の肺疾患治療剤および／または予防剤である。
〔３〕核酸オリゴが、天然および非天然のＲＮＡまたはＤＮＡからなるオリゴである、〔２〕記載の肺疾患治療剤および／または予防剤である。
〔４〕肺疾患が、肺線維症である、〔１〕〜〔３〕のいずれか記載の肺疾患治療剤および／または予防剤である。
〔５〕肺疾患の治療および／または予防に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現に対する影響を検出する工程、および
（ｂ）被験物質を用いない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現を減少させる物質を選択する工程、
とを含んでなる方法である。
〔６〕肺疾患の治療および／または予防に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）被験物質を、実験動物に投与する工程、
（ｂ）該Ａｒｉｄ５Ａの発現に対する影響についてＰＣＲにて測定する工程、および
（ｃ）被験物質を実験動物に投与しない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの発現を減少させる物質を選択する工程、
とを含んでなる方法である。
〔７〕肺疾患の治療および／または予防に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該方法は、
（ａ）被験物質のＡｒｉｄ５Ａの機能に対する影響を検出する工程、および
（ｂ）被験物質を用いない場合と比較して、Ａｒｉｄ５Ａの機能を減少させる物質を選択する工程、
とを含んでなる方法である。
〔８〕〔７〕に記載の肺疾患の治療および／または予防に有用な候補物質のスクリーニング方法であって、該Ａｒｉｄ５Ａの機能がＩＬ−６ｍＲＮＡの安定化である方法である。
〔９〕肺疾患が、肺線維症である、〔５〕〜〔８〕のいずれか記載のスクリーニング方法である。
〔１０〕Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤を投与することを含んでなる、肺疾患の治療および／または予防方法である。
〔１１〕肺疾患の治療および／または予防に使用するためのＡｒｉｄ５Ａ阻害剤である。
〔１２〕肺疾患の治療剤および／または予防剤の製造のためのＡｒｉｄ５Ａ阻害剤の使用である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の肺疾患治療剤により、肺疾患の高い治療効果が奏される。また、本発明により高い治療効果を示す治療剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ａｒｉｄ５Ａ欠損マウスの作製：(Ａ)上：野生型Ａｒｉｄ５Ａアレル、中：ターゲッティングベクター、下：予想変異アレル。ＤＮＡ結合ドメインの主要部分は、両端をｌｏｘｐ配列で挟んだＮｅｏ−ｃａｓｓｅｔｔｅで置換されている。（Ｂ）サザンブロッティング解析による遺伝子型解析；野生型(+/+)、ヘテロ接合型(+/-)。
【図２】ブレオマイシンを気管内に注入し、肺障害を誘導した後におけるＡｒｉｄ５Ａ欠損マウスおよび野生型マウスの生存率を示すグラフである。
【図３】ブレオマイシンを気管に注入後７日目の、Ａｒｉｄ５Ａ欠損マウスおよび野生型マウスにおける肺の写真を示す図である。
【図４】ブレオマイシンを気管に注入後７日目の、Ａｒｉｄ５Ａ欠損マウスおよび野生型マウスにおける肺組織切片のヘマトキシリン−エオジン染色像を示す図である。
【図５】ブレオマイシンを気管に注入後７日目の、Ａｒｉｄ５Ａ欠損マウスおよび野生型マウスにおける肺洗浄液中のＩＬ６、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ量を示す図である。
【図６】マクロファージ細胞株におけるＡｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって定量したグラフである。
【図７】マクロファージ細胞株の培養上清中のＩＬ−６の濃度をＥＬＩＳＡ法により特定したグラフである。
【図８】マクロファージ細胞株の培養上清中のＴＮＦ−αの濃度をＥＬＩＳＡ法により特定したグラフである。
【図９】腹腔マクロファージにおけるＡｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡの発現を示したグラフである。
【図１０】腹腔マクロファージにおけるＩＬ−６のｍＲＮＡの発現を示したグラフである。
【図１１】腹腔マクロファージにおけるＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、肺疾患の治療剤、並びにそのスクリーニング方法に関する。
【００１２】
本発明における「Ａｒｉｄ５Ａ」とは、ＡＴリッチインターラクティブドメイン５Ａ（ＡＴ  Ｒｉｃｈ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ５Ａ、以下Ａｒｉｄ５Ａと略す）のことであり、ＩＬ−６ｍＲＮＡの安定化タンパク質として報告されている。例えばヒトＡｒｉｄ５Ａとしては、各種アイソフォームも含まれる（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ９９７６４６．１、ＸＰ００６７１２２６６．１、ＸＰ００６７１２２６５．１、ＸＰ００５２６３９１８．１、ＸＰ００５２６３９１３．１、ＸＰ００５２６３９１７．１など）。また、マウスＡｒｉｄ５Ａについても同様に、各種アイソフォームも含まれる（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ００１６５６７６．１、ＮＰ００１６５６７７．１、ＮＰ００１２７７６５５．１、ＮＰ００１２７７６５６．１、ＮＰ６６６１０８．２など）。
【００１３】
本発明における「Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤」とは、Ａｒｉｄ５Ａの発現を阻害する物質および／またはＡｒｉｄ５Ａの機能を阻害する物質のことをいう。Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤は、Ａｒｉｄ５Ａの発現自体を直接阻害する物質でもよいし、Ａｒｉｄ５Ａにより影響を受ける分子（ＩＬ−６ｍＲＮＡ等）に結合してＡｒｉｄ５Ａの生物学的機能を間接的に阻害する物質でもよいが、好ましくは、Ａｒｉｄ５Ａと競合的にＩＬ−６ｍＲＮＡと結合することによりＩＬ−６ｍＲＮＡの安定化を阻害する物質が挙げられる。例えばヒトＩＬ−６ｍＲＮＡとしては、各種アイソフォームも含まれる（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ０００６００．３、ＸＭ００５２４９７４５．２など）。また、マウスＩＬ−６ｍＲＮＡについても同様に、各種アイソフォームも含まれる（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ０３１１６８．１など）。
【００１４】
本発明におけるＡｒｉｄ５Ａ阻害剤としては、例えば、抗Ａｒｉｄ５Ａ抗体、核酸オリゴ、クロルプロマジンなどの低分子物質などが挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明のＡｒｉｄ５Ａ阻害剤の好ましい例として、ｓｉＲＮＡが挙げられる。
【００１５】
Ａｒｉｄ５Ａの発現阻害は、例えばＡｒｉｄ５Ａ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）効果を利用することによって実現可能である。ＲＮＡ干渉は、ＲＮＡを利用して遺伝子の発現を抑制する方法として報告された方法（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１６，  ９４８−９５８（２００２））であり、標的遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖ＲＮＡを細胞に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。具体的には、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子の発現に対するＲＮＡ干渉効果を示すｓｉＲＮＡやアンチセンス核酸を使用して、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子の発現阻害が可能である。
【００１６】
本発明における「核酸オリゴ」は、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子もしくはタンパク質の機能を制御する核酸のオリゴマーを意味し、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、核酸アプタマーが含まれる。
【００１７】
本発明における核酸オリゴとして好ましくは、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを挙げることができる。ｓｉＲＮＡは、細胞で毒性を示さない範囲の短鎖からなる二重鎖ＲＮＡを意味し、例えば１５〜４９塩基対と、好適には１５〜３５塩基対と、さらに好適には２１〜３０塩基対とすることが出来る。また、ｓｈＲＮＡは、一本鎖のＲＮＡがヘアピン構造を介して二重鎖を構成しているＲＮＡである。
【００１８】
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の相同性を有する。
【００１９】
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合した二重鎖ＲＮＡの部分は、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。本発明においてはｄｓＲＮＡにおけるＲＮＡ同士が対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、バルジおよびミスマッチの両方が含まれていてもよい。
【００２０】
また、本発明における「アンチセンス核酸」は、Ａｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンス核酸である。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、ＲＮＡ二重鎖認識によるＲＮａｓｅ活性による分解、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらの中でも、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。
【００２１】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、Ａｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であるものと考えられる。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域に相補的な配列も使用しうる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。アンチセンス核酸は標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンスＲＮＡの長さは、特に制限されない。
【００２２】
本発明における「デコイ核酸」はＡｒｉｄ５Ａが認識するＩＬ−６のｍＲＮＡ配列と相同性がある核酸オリゴである。ＩＬ−６のｍＲＮＡ配列の代わりにＡｒｉｄ５Ａに結合し、Ａｒｉｄ５Ａの機能を阻害する。
【００２３】
本発明における「抗Ａｒｉｄ５Ａ抗体」は、公知の手段を用いてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体はＡｒｉｄ５Ａと結合することにより、Ａｒｉｄ５Ａの機能発現を阻害する。
【００２４】
抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、Ａｒｉｄ５Ａを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング方法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００２５】
具体的には、抗Ａｒｉｄ５Ａ抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の抗原として使用されるヒトＡｒｉｄ５Ａは公知の文献に開示されたＡｒｉｄ５Ａ遺伝子／アミノ酸配列を用いることによって得られる。
【００２６】
Ａｒｉｄ５Ａの遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または、培養上清中から目的のＡｒｉｄ５Ａタンパク質を公知の方法で精製し、この精製Ａｒｉｄ５Ａタンパク質を感作抗原として用いればよい。また、化学合成によって作製したＡｒｉｄ５Ａタンパク質も感作抗原として用いても良い。また、Ａｒｉｄ５Ａタンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質を感作抗原として用いてもよい。
【００２７】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
【００２８】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射することにより行なわれる。具体的には。感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバンド、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
【００２９】
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００３０】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１５４８−１５５０（１９７９））等が適宜使用される。
【００３１】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルシュタインらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３，３−４６（１９８１））等に準じて行なうことができる。
【００３２】
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００３３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００３４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、３７℃程度に加熱したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１，０００〜６，０００程度のＰＥＧ溶液を通常、３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
【００３５】
当該ハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングが行なわれる。
【００３６】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏで所望の抗原タンパク質または抗原発現細胞で感作し、感作Ｂリンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、所望の抗原または抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原または抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２２７等を参照）。
【００３７】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００３８】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得する方法としては、当該ハイブリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００３９】
本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｗ．  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ  ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ  ＬＴＤ，  １９９０参照）。
【００４０】
具体的には、目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイブリドーマから、抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用してｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することが出来る。
【００４１】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等を用いて行なうことができる。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５’‐Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ。Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，  ２９１９−２９３２）を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
【００４２】
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。
【００４３】
本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００４４】
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト（Ｈｕｍａｎ）抗体等を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【００４５】
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
【００４６】
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。
【００４７】
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ；ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９参照）。
【００４８】
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
【００４９】
キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体Ｃ領域が使用される。ヒト抗体Ｃ領域としては、Ｃγが挙げられ、例えばＣγ１、Ｃγ２、Ｃγ３またはＣγ４を使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
【００５０】
キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来のＣ領域からなり、ヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
【００５１】
また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｖＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列の適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８等の各号を参考にすることができる。
【００５２】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させたＤＮＡあるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
【００５３】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）等のウィルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）等の哺乳類細胞由来のプロモーターエンハンサーを用いればよい。
【００５４】
例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８−１１４）、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）に従えば容易に実施することができる。
【００５５】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることが出来る。ｌａｃＺプロモーターを使用する場合、Ｗａｒｄらの方法（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーターを使用する場合、Ｂｅｔｔｅｒらの方法（Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）に従えばよい。
【００５６】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅ１Ｂシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９−４３８３）を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォールド（ｒｅｆｏｌｄ）して使用する（例えば、ＷＯ９６／３０３９４を参照）。
【００５７】
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
【００５８】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
【００５９】
真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、または真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、Ｈｅｌａ、Ｖｅｒｏなど、（２）両性類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは（３）昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５などが知られている。植物細胞としては、ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ・ｎｉｇｅｒ）などが知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌が知られている。
【００６０】
これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔内へ移すことにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにて抗体を産生してもよい。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。
【００６１】
哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシなどを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒｍ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、昆虫としては、カイコを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。
【００６２】
これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、動物または植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調整する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから得られるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
【００６３】
また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Ｍａｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍに感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Ｊｕｌｉａｎ，Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
【００６４】
上記のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４−１１５２３参照）。
【００６５】
前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティークロマトグラフィーにより行なうことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。プロテインＡカラムに用いる担体として、例えば、ＨｙｐｅｒＤ、ＰＯＲＯＳ、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。
【００６６】
例えば、上記アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーにとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に適用しうる。また、逆相ＨＰＬＣ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣ）を用いてもよい。
【００６７】
上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定またはＥＬＩＳＡ等により行なうことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、ＰＢＳ（−）で適当に希釈した後、２８０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌを１．３５０Ｄとして算出する。また、ＥＬＩＳＡによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、０．１Ｍ重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１μｇ／ｍｌに希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＴＡＧ製）１００μｌを９６穴プレート（Ｎｕｎｃ製）に加え、４℃で一晩インキュベーションし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体または抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒトＩｇＧ（ＣＡＰＰＥＬ製）１００μｌを添加し、室温にて１時間インキュベーションする。
【００６８】
洗浄後、５，０００倍アルカリフォスフォターゼ標識ヒトＩｇＧ（Ｂｉｏ  Ｓｏｕｒｃｅ製）１００μｌ加え、室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加え、インキュベーションの後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  Ｍｏｄｅｌ  ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。
【００６９】
本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、放射性物質、トキシン等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよい。このようなコンジュゲート抗体は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれらのコンジュゲート抗体も包含される。
【００７０】
本発明の抗体には、Ａｒｉｄ５Ａに結合する限り、ＩｇＧに代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはＩｇＭに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、または、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。
【００７１】
さらに、本発明の抗体は、Ａｒｉｄ５Ａに結合する限り、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいうが、当該エピトープは異なる分子中に存在していてもよいし、同一の分子中に存在していてもよい。すなわち本発明において、二重特異性抗体はＡｒｉｄ５Ａの異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することもできる。また、一方の認識部位がＡｒｉｄ５Ａを認識し、他方の認識部位がＡｒｉｄ５Ａ以外の抗原を認識する二重特異性抗体とすることも可能である。
【００７２】
二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれがＨ鎖とＬ鎖を有する抗体の１／２分子であっても良いし、Ｈ鎖のみからなる抗体の１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
【００７３】
本発明の抗体は、Ａｒｉｄ５Ａに結合する限り、低分子化抗体であってもよい。低分子化抗体は、全長抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、例えばｗｈｏｌｅ  ＩｇＧ等）の一部分が欠損している抗体断片を含む。Ａｒｉｄ５Ａに結合する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のいずれか、または両方を含んでいることが好ましい。ＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列は、付加、欠失および／または置換を含むことができる。さらにＡｒｉｄ５Ａに結合する限り、ＶＨおよびＶＬのいずれか、または両方の一部を欠損させることもできる。また、抗体断片はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、ダイアボディー（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃ（Ｆｖ）２（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  （Ｆｖ）２）などを挙げることができる。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の抗体に含まれる。
【００７４】
抗体断片は、抗体を酵素で消化して生成させることができる。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知である。あるいは、これら抗体断片をコードするＤＮＡを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Ｃｏ  Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ  Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ  Ａ．Ｈ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ  Ａ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４９７−５１５、Ｌａｍｏｙｉ  Ｅ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ  Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ  Ｒ．Ｅ．＆  Ｗａｌｋｅｒ  Ｂ．Ｗ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７）。
【００７５】
消化酵素は、抗体を特定の位置で切断し、次のような特定の構造の抗体断片を与える。一方、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる：
パパイン消化：Ｆａｂ；
ペプシン消化：Ｆ（ａｂ'）２またはＦ（ａｂ'）；
プラスミン消化：Ｆａｃｂ。
【００７６】
ｓｃＦｖは、抗体のＶＨとＶＬとを連結することにより得られる。ｓｃＦｖにおいて、ＶＨとＶＬは、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ  Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＶＨおよびＶＬは、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの抗体由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から２５残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。
【００７７】
Ｖ領域は、たとえば上記のようなＰＣＲ法によって連結することができる。ＰＣＲ法によるＶ領域の連結のために、抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列、および抗体のＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ配列の全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡが鋳型として利用される。増幅すべきＤＮＡの両端の配列に対応する配列を有するプライマーを用いたＰＣＲ法によって、Ｈ鎖とＬ鎖のＶ領域をコードするＤＮＡがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡを用意する。ペプチドリンカーをコードするＤＮＡもＰＣＲを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの５'側に、別に合成された各Ｖ領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［ＶＨ  ＤＮＡ］、［ペプチドリンカーＤＮＡ］、［ＶＬ  ＤＮＡ］の各ＤＮＡと、アセンブリーＰＣＲ用のプライマーを利用してＰＣＲ反応を行う。アセンブリーＰＣＲ用のプライマーは、［ＶＨ  ＤＮＡ］の５'側にアニールするプライマーと、［ＶＬ  ＤＮＡ］の３'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーＰＣＲ用プライマーとは、合成すべきｓｃＦｖの全長配列をコードするＤＮＡを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーＤＮＡ］には各Ｖ領域ＤＮＡと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのＤＮＡが連結され、さらにアセンブリーＰＣＲ用のプライマーによって、最終的にｓｃＦｖの全長が増幅産物として生成される。一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを発現させることにより、該ｓｃＦｖが取得できる。
【００７８】
ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の低分子化抗体を指す（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０，６４４４−６４４８、ＥＰ４０４０９７、ＷＯ９３／１１１６１）。ダイアボディーは、２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中でＶＬおよびＶＨがリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおける当該ポリペプチド鎖のリンカーは、一般に、同一鎖中のＶＬとＶＨが互いに結合できない程度に十分短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、２〜１２残基が好ましく、さらに３〜１０残基が好ましく、特には５残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされるＶＬとＶＨとは、ｓｃＦｖを形成できず、別のポリペプチド鎖間で２つのＦｖを形成するように二量体化する。その結果、ダイアボディーは２つの抗原結合部位を有することとなる。
【００７９】
ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つのＶＨおよび２つのＶＬをリンカーで結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Ｈｕｄｓｏｎ Ｐ．Ｊ．＆  Ｋｏｒｔｔ  Ａ．Ａ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９９）２３１，１７７−１８９）。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えば、２つのｓｃＦｖをリンカーで結ぶことによって作製できる。あるいは、一本鎖ポリペプチドのＮ末端側を基点として２つのＶＨおよび２つのＶＬをリンカーで、
［ＶＨ］−［リンカー］−［ＶＬ］−［リンカー］−［ＶＨ］−［リンカー］−［ＶＬ］
の順に結ぶことによっても作製できる。なお２つのＶＨと２つのＶＬの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］−［リンカー］−［VH］−［リンカー］−［VH］−［リンカー］−［VL］
［VH］−［リンカー］−［VL］−［リンカー］−［VL］−［リンカー］−［VH］
［VH］−［リンカー］−［VH］−［リンカー］−［VL］−［リンカー］−［VL］
［VL］−［リンカー］−［VL］−［リンカー］−［VH］−［リンカー］−［VH］
［VL］−［リンカー］−［VH］−［リンカー］−［VL］−［リンカー］−［VH］
複数のリンカーは、同じ種類のリンカーであってもよいし、異なる種類のリンカーであってもよい。
【００８０】
抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９６）９，２９９−３０５に開示されるリンカー）等を用いることができる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、１から１００アミノ酸、好ましくは３から５０アミノ酸、更に好ましくは５から３０アミノ酸、特に好ましくは１２から１８アミノ酸（例えば、１５アミノ酸）である。ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、ｓｃＦｖの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。
【００８１】
あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用してＶ領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-ＢＳＯＣＯＥＳ）などを用いることが可能である。
【００８２】
本発明における肺疾患の治療剤または予防剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容しうる材料が添加されていてもよい。製剤上許容しうるとは、それ自体は上記の肺疾患の治療効果を有する材料であってもよいし、当該治療効果を有さない材料であってもよく、上記治療剤とともに投与可能な製剤上許容される材料を意味する。また、治療効果を有さない材料であって、Ａｒｉｄ５Ａ阻害剤と併用することによって相乗的効果もしくは相加的な安定化効果を有する材料であってもよい。
【００８３】
製剤上許容される材料としては、例えば滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤等を挙げることができる。
【００８４】
本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル等のＨＬＢ６〜１８を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
【００８５】
また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。
【００８６】
本発明における薬剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０、４０、６０または８０などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート２０および８０が特に好ましい。また、ポロキサマー（プルロニックＦ−６８（登録商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好ましい。
【００８７】
本発明において緩衝剤としては、リン酸、クエン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、グルコン酸、カプリル酸、デオキシコール酸、サリチル酸、トリエタノールアミン、フマル酸等、他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
【００８８】
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製してもよい。緩衝液の濃度は一般には１〜５００ｍＭであり、好ましくは５〜１００ｍＭであり、さらに好ましくは１０〜２０ｍＭである。
【００８９】
また、本発明における薬剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖および単糖等の糖類や炭水化物、糖アルコールを含んでいてもよい。
【００９０】
本発明において、多糖および単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、スクロース、トレハロース、ラフィノース等を挙げることができる。
【００９１】
本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール等を挙げることができる。
【００９２】
注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。
【００９３】
また、必要に応じ、マイクロカプセル(ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム(リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル等)としたりすることもできる("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明に適用し得る(Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167-277; Langer,Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556;EP第133,988号)。
使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
本発明のＡｒｉｄ５Ａ阻害剤をヒトや他の動物の医薬として使用する場合には、これらの物質自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。製剤化する場合には、上記に記載の製剤上許容される材料を添加しても良い。
【００９５】
本発明におけるすべての薬剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的または非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇから１００ｍｇの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり０．１〜１，０００ｍｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇの投与量を選ぶことができる。好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗Ａｒｉｄ５Ａ抗体の場合には、血中にフリーの抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重１ｋｇあたり１ヶ月（４週間）に０．１ｍｇから４０ｍｇ、好ましくは１ｍｇから２０ｍｇを１回から数回に分けて、例えば２回／週、１回／週、１回／２週、１回／４週などの投与スケジュールで点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与スケジュールは、投与後の状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら２回／週あるいは１回／週から１回／２週、１回／３週、１回／４週のように投与間隔を延ばしていくなど調整することも可能である。
【００９６】
本発明において、肺疾患とは、肺および呼吸器に関わる疾患を広く含むものであり、例えば、急性気管支炎、細菌性肺炎、肺膿瘍、肺結核、非結核性肺抗酸菌症、肺真菌症、肺寄生虫症、日和見感染（ニューモシスチス肺炎、サイトメガロウイルス肺炎）、誤嚥性肺炎、かぜ症候群、インフルエンザ等の感染性呼吸器疾患；反省閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、びまん性汎細気管支炎等の気道閉塞性疾患；気管支喘息、過敏性肺炎、好酸球肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス証、薬剤性肺炎、好酸球性多発血管炎性肉芽腫症等のアレルギー性肺疾患；突発性間質性肺炎、放射線肺炎、サルコイドーシス、突発性器質化肺炎、膠原病肺等の間質性肺疾患；肺癌、転移性肺腫瘍、肺の良性腫瘍、縦隔腫瘍等の腫瘍性肺疾患；肺血栓塞栓症、肺動脈性肺高血圧症、肺水腫等の肺血管性病変；胸膜炎、膿胸、胸膜腫瘍、気胸等の胸膜疾患；急性呼吸不全（ＡＲＤＳ）、慢性呼吸不全等の呼吸不全等をいう。
【００９７】
また、本発明の肺疾患治療剤および/または予防剤は、上記肺疾患の起因に限定されない肺線維症の治療にも有用な薬剤を提供するものである。肺線維症とは、肺胞壁におけるびまん性線維増殖を特徴とし、乾性咳嗽や労作時呼吸困難を主症状とする疾患であり、狭義には間質性肺炎の終末病態を指すが、広義には狭義の肺線維症と間質性肺炎との併存状態を意味する。
【００９８】
本発明は、Ａｒｉｄ５Ａの発現および/または機能を抑制することによる肺疾患を治療または予防する医薬組成物のスクリーニング方法に関する。
【００９９】
本発明のスクリーニング方法は、まず被験物質のＡｒｉｄ５Ａの発現および/または機能に対する影響を検出することを含む。Ａｒｉｄ５Ａの機能としては例えば、ＩＬ−６ｍＲＮＡのステムループに特異的に結合し、ＩＬ−６ｍＲＮＡを特異的に破壊するＲｅｇｎａｓｅ−１の作用を拮抗的に阻害することにより、ＩＬ−６ｍＲＮＡの安定化に寄与することが挙げられる。したがって、Ａｒｉｄ５Ａの発現および／または機能に対する影響としては例えば、Ａｒｉｄ５Ａの発現を抑制すること、Ａｒｉｄ５Ａに結合することによりＡｒｉｄ５Ａの機能を阻害すること、Ａｒｉｄ５Ａと競合的にＩＬ−６ｍＲＮＡと結合することによりＡｒｉｄ５Ａの機能を阻害すること等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
また、被験物質を用いない場合と比較して、該発現および/または機能を減少させる物質を選択する工程を含む。
【０１００】
本発明のスクリーニング方法の第一の態様においては、まずＡｒｉｄ５Ａに被験物質を接触させる。
【０１０１】
本発明の方法に使用されるヒト由来のＡｒｉｄ５Ａのアミノ酸配列は既述の通りである。本発明の方法に使用されるＡｒｉｄ５Ａには、上記の公知のＡｒｉｄ５Ａと機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、Ａｒｉｄ５Ａの変異体、アレル、バリアント、ホモログ、Ａｒｉｄ５Ａの部分ペプチド、または他のタンパク質との融合タンパク質などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０２】
本発明におけるＡｒｉｄ５Ａの変異体としては、既述のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなる天然由来のタンパク質であって、既述のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることができる。また、既述の塩基配列からなるＤＮＡとストリジェントな条件下でハイブリダイズする天然由来のＤＮＡよりコードされるタンパク質であって、既述のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、Ａｒｉｄ５Ａの変異体として挙げることができる。
【０１０３】
本発明において、変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、３０アミノ酸以内であり、好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは５アミノ酸以内（例えば、３アミノ酸以内）であると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えば、アミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸配列による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することは既に知られている。
【０１０４】
本発明において「機能的に同等」とは、対象となるタンパク質が、Ａｒｉｄ５Ａと同等の生物学的機能や生化学的機能を有することを指す。Ａｒｉｄ５ＡはＩＬ−６ｍＲＮＡのステムループに特異的に結合し、ＩＬ−６ｍＲＮＡを特異的に破壊するＲｅｇｎａｓｅ−１の作用を拮抗的に阻害することにより、ＩＬ−６ｍＲＮＡの安定化に寄与する。本発明において、Ａｒｉｄ５Ａの生物学的機能や生化学的機能としてはＩＬ−６ｍＲＮＡの安定化を挙げることができる。
【０１０５】
目的のタンパク質と「機能的に同等なタンパク質」をコードするＤＮＡを調製するために、当業者に良く知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、Ａｒｉｄ５Ａの塩基配列もしくはその一部をプローブとして、またＡｒｉｄ５Ａに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ａｒｉｄ５Ａと高い相同性を有するＤＮＡを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により単離しうるＡｒｉｄ５Ａと同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。
【０１０６】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションを指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用いることにより、より相同性の高いＤＮＡの単離を期待することができる。これにより単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、目的タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＳＡ  ８７：２２６４−２２６８，１９９０，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，ｅｔ  ａｌ：  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００，ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０，ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【０１０７】
本発明の方法に使用されるＡｒｉｄ５Ａの由来となる生物種としては、特定の生物種に限定されるものではない。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫などが挙げられる。
【０１０８】
第一の態様に用いられるＡｒｉｄ５Ａの状態としては、特に制限はなく、例えば精製された状態、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発現した状態などであってもよい。
【０１０９】
Ａｒｉｄ５Ａの精製は周知の方法で行うことができる。また、Ａｒｉｄ５Ａが発現している細胞としては、内在性のＡｒｉｄ５Ａを発現している細胞、または外来性のＡｒｉｄ５Ａを発現している細胞が挙げられる。上記内在性のＡｒｉｄ５Ａを発現している細胞としては、動物の組織由来の細胞、培養細胞などを挙げることができるが、これに限定されるものではない。上記培養細胞としては、特に制限はなく、例えば、市販のものを用いることが可能である。内在性のＡｒｉｄ５Ａを発現している細胞が由来する生物種としては、特に制限はなく、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ウシ、酵母、昆虫などが挙げられる。また、上記外来性のＡｒｉｄ５Ａを発現している細胞は、例えば、Ａｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡを含むベクターを細胞に導入することで作製できる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクタミン法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。また、上記外来性のＡｒｉｄ５Ａを有する細胞は、例えばＡｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡを、相同組み替えを利用した遺伝子導入法により、染色体へ挿入することで作製することができる。このような外来性のＡｒｉｄ５Ａが導入される細胞が由来する生物種としては、哺乳類に限定されず、外来タンパク質を細胞内に発現させる技術が確立されている生物種であればよい。
【０１１０】
また、Ａｒｉｄ５Ａが発現している細胞抽出液は、例えば試験管内転写翻訳系に含まれる細胞抽出液に、Ａｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡを含むベクターを添加したものを挙げることができる。該試験管内転写翻訳系としては、特に制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キットなどを使用することが可能である。
【０１１１】
本発明における「被験物質」は、特に限定されるものではなく、例えば天然化合物、有機化合物、無機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド等の単一物質、並びに化合物ライブラリー、核酸ライブラリー、ペプチドライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験物質は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を挙げることができる。また、上記被験物質に加えて、これらの被験物質を複数種混合した混合物も含まれる。
【０１１２】
また、本発明において「接触」は、Ａｒｉｄ５Ａの状態に応じて行う。例えば、Ａｒｉｄ５Ａが精製された状態であれば、精製標品に被験物質を添加することにより行うことができる。また、細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被験物質を添加することにより、若しくは実験動物に直接投与することにより、行うことができる。被験物質がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターをＡｒｉｄ５Ａが発現している細胞へ導入する、または該ベクターをＡｒｉｄ５Ａが発現している細胞抽出液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた２ハイブリッド法を利用することも可能である。
【０１１３】
第一の態様では、次いで、Ａｒｉｄ５Ａの発現および/または機能を測定する。Ａｒｉｄ５Ａの機能としては、ＩＬ−６ｍＲＮＡの安定化を挙げることができる。具体的にはＡｒｉｄ５Ａと被験物質を共存させ、ＩＬ−６ｍＲＮＡの分解抑制効果を測定すること等により間接的にＡｒｉｄ５Ａの機能を測定することができる。次いで被験物質を接触させない場合と比較して、上記発現および/または機能を低下もしくは増加させた被験物質を選択する。なお、被験物質を実験動物に投与した場合には、脾臓等の組織を摘出し、マクロファージ等の特定の細胞におけるＡｒｉｄ５Ａの発現および/または機能、ＩＬ−６ｍＲＮＡの発現量等を測定する。発現量の測定はＰＣＲ（polymerase chain reaction）やＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription- polymerase chain reaction）,リアルタイムＰＣＲなどの増幅を基にした技術やハイブリダイゼーションを基にした技術、および/または他の検出技術など適宜選択できる。本願における「ＰＣＲ」はＰＣＲおよびそれから派生した増幅を基にした技術による各種ＤＮＡ、ＲＮＡ等の測定方法が含まれる。Ａｒｉｄ５ＡはＩＬ−６のｍＲＮＡの安定化に寄与するタンパクであるため、細胞内でＡｒｉｄ５Ａの発現が阻害されると、ＩＬ−６のｍＲＮＡの発現は抑制されるが、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現には影響がないことが知られている。そこで、被験物質について、ＩＬ−６のｍＲＮＡの発現には影響を与えるがＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現には影響を与えないことを確認することで、Ａｒｉｄ５Ａの発現に影響を与える物質、即ち、結果的に肺疾患を治療または予防する効果を有する物質をスクリーニングすることも可能である。選択された被験物質には、Ａｒｉｄ５Ａの発現および/または機能を低下させる物質が含まれ、Ａｒｉｄ５Ａの発現および/または機能を抑制することによって、結果的に肺疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【０１１４】
第二の態様では、まずＡｒｉｄ５Ａに被験物質を接触させ、次いでＡｒｉｄ５Ａと被験物質との結合を検出する。検出方法としては、特に制限はない。Ａｒｉｄ５Ａと被験物質との結合は、例えば、Ａｒｉｄ５Ａに結合した被験物質に付された標識（例えば、放射標識や蛍光標識など定量的測定が可能な標識）によって検出することができる。また、Ａｒｉｄ５Ａに標識剤を結合することもできる。被験物質またはＡｒｉｄ５Ａを樹脂やチップなどに固定化して結合を検出することもできる。Ａｒｉｄ５Ａへの被験物質の結合により生じるＡｒｉｄ５Ａの機能変化を指標に検出することもできる。
本態様では、次いで、Ａｒｉｄ５Ａと結合する被験物質を選択する。選択された物質にはＡｒｉｄ５Ａの発現または機能を減少させる物質が含まれ、Ａｒｉｄ５Ａの発現または機能を抑制することによって、結果的に肺疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【０１１５】
本発明のスクリーニング法の第三の態様としては、まずＡｒｉｄ５Ａを発現する細胞に被験物質を接触させ、次いでＡｒｉｄ５Ａの発現レベルを測定する。Ａｒｉｄ５Ａの発現レベルの測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば該遺伝子のｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、またはＲＴ−ＰＣＲ法を実施することによって該遺伝子の転写レベルの測定を行うことができる。さらに、ＤＮＡアレイ技術を用いて、該遺伝子の発現レベルを測定することも可能である。
【０１１６】
また、該遺伝子からコードされるＡｒｉｄ５Ａを含む画分を定法に従って回収し、該Ａｒｉｄ５Ａの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこともできる。また、Ａｒｉｄ５Ａに対する抗体を用いて、ウェスタンブロッディング法を実施し、Ａｒｉｄ５Ａの発現を検出することにより、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。Ａｒｉｄ５Ａに対する抗体については、上記に記載したものを用いることができる。
【０１１７】
第三の態様では、次いで被験物質を接触させていない場合と比較して、該Ａｒｉｄ５Ａの発現レベルを減少させた被験物質を選択する。選択された物質には、Ａｒｉｄ５Ａの発現を減少させる物質が含まれ、Ａｒｉｄ５Ａの発現を抑制することによって、結果的に肺疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。なお、Ａｒｉｄ５ＡはＩＬ−６のｍＲＮＡの安定化に寄与するタンパクであるため、細胞内でＡｒｉｄ５Ａの発現が阻害されると、ＩＬ−６のｍＲＮＡの発現は抑制されるが、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現には影響がないことが知られている。そこで、被験物質について、ＩＬ−６のｍＲＮＡの発現には影響を与えるがＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現には影響を与えないことを確認することで、Ａｒｉｄ５Ａの発現に影響を与える物質、即ち、結果的に肺疾患を治療または予防する効果を有する物質をスクリーニングすることも可能である。
【０１１８】
本発明のスクリーニング法の第四の態様としては、まずＡｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液を提供する。
第四の態様において、「機能的に結合した」とは、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子のプロモーター領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。
【０１１９】
上記レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。また、上記レポーター遺伝子には、Ａｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡもまた含まれる。
Ａｒｉｄ５ＡをコードするＤＮＡのプロモーター領域の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合したＤＮＡを有する細胞または細胞抽出液は、上述の方法にて調製することが可能である。
【０１２０】
第四の態様では、次いで上記細胞または上記細胞抽出液に被験物質を接触させる。次いで、該細胞または該細胞抽出液における上記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。
【０１２１】
レポーター遺伝子の発現レベルは、使用するレポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、β-グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【０１２２】
また、Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子をレポーターとする場合、該遺伝子の発現レベルの測定は、上述した方法で行うことができる。
【０１２３】
第四の態様においては、次いで被験物質を接触させていない場合と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルを減少または増加させた被験物質を選択する。選択された物質にはＡｒｉｄ５Ａの発現を減少させる物質が含まれ、Ａｒｉｄ５Ａの発現を抑制することによって、結果的に肺疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【０１２４】
第五の態様においては、まずＩＬ−６ｍＲＮＡに被験物質を接触させ、次いでＩＬ−６ｍＲＮＡと被験物質との結合を検出する。検出方法としては、特に制限はない。ＩＬ−６ｍＲＮＡと被験物質との結合は、例えば、ＩＬ−６ｍＲＮＡに結合した被験物質に付された標識（例えば、放射標識や蛍光標識など定量的測定が可能な標識）によって検出することができる。また、ＩＬ−６ｍＲＮＡに標識剤を結合することもできる。被験物質またはＩＬ−６ｍＲＮＡを樹脂やチップなどに固定化して結合を検出することもできる。ＩＬ−６ｍＲＮＡへの被験物質の結合により生じるＩＬ−６ｍＲＮＡの活性変化を指標に検出することもできる。
本態様では、次いで、ＩＬ−６ｍＲＮＡと結合する被験物質を選択する。選択された物質にはＡｒｉｄ５Ａの発現および/または機能を減少させる物質が含まれ、Ａｒｉｄ５Ａの発現または機能を抑制することによって、結果的に肺疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【０１２５】
第六の態様においては、まずＩＬ−６ｍＲＮＡに被験物質を接触させ、さらにＡｒｉｄ５Ａを接触させ、次いで、Ａｒｉｄ５Ａの機能を測定する。Ａｒｉｄ５Ａの機能としては、上述のような形で測定することができる。次いで被験物質を接触させない場合と比較して、上記機能を低下もしくは増加させた被験物質を選択する。選択された被験物質には、Ａｒｉｄ５Ａ機能を低下させる物質が含まれ、Ａｒｉｄ５Ａの機能を抑制することによって、結果的に肺疾患を治療または予防する効果を示すものと考えられる。
【実施例】
【０１２６】
実施例１．Ａｒｉｄ５Ａノックアウトマウスの作製（図１）
ＣＬＥＡ社からＣ５７ＢＬ／６野生型マウス（６−８週）を入手し、Ａｒｉｄ５Ａノックアウトマウス(Ｎｏ．ＣＤＢ０６０２Ｋ:www.cdb.riken.jp/arg/mutant%20mice%20list.html)をwww.cdb.riken.jp/arg/Methods.htmlの方法により作製した。Ａｒｉｄ５Ａ遺伝子のＤＮＡ結合ドメインの主要部分を、両端をｌｏｘＰ配列で挟んだＮｅｏ−ｃａｓｓｅｔｔｅによって置換するように構築したターゲッティングベクターを、ＴＴ２株ＥＳ細胞にエレクトロポレーション法により導入した。相同的組み換えによる遺伝子破壊は、Ａｒｉｄ５Ａの遺伝子の３’ＵＴＲに対するプローブを使用したサザンブロッティング法により確認し、得られた変異ＥＳ細胞を用いてキメラマウスを作製した。変異アレルのジャームライントランスミッションの確認は、キメラマウスをＣ５７ＢＬマウスと交配して得られた次世代のマウスのゲノムＤＮＡを用いた、サザンブロッティング解析およびゲノムＰＣＲ（プライマー１：５’−ＡＴＡＣＴＴＴＣＴＣＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡ−３’；プライマー２：５’−ＴＧＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧ−３’）により行った。ヘテロ接合型の変異マウスは特定病原体のフリーの環境下で飼育し、Ｃ５７ＢＬマウスと５回の戻し交配を行った。【０１２７】
実施例２：Ａｒｉｄ５Ａノックアウトマウスにおける肺障害の誘導（肺疾患モデル）
８〜９週齢のＡｒｉｄ５Ａノックアウトマウス（Ａｒｉｄ５Ａ-/-）および野生型マウス（それぞれ体重２０-２５g）に対し、トリブロモエタノール（アバチン）を４０ｎｇ／匹、腹腔内投与して麻酔を行った。その後、ブレオマイシン（ＢＬＭ）を２ｍｇ／ｋｇの用量で気管内に注入した。【０１２８】
（生存率）
上記マウスについて４週間にわたって生存率を観察した。
その結果、野生型マウスは徐々に生存率が低下し、３週間後には全て死亡した。それに対し、Ａｒｉｄ５Ａノックアウトマウスでは肺障害が殆ど起こらず、４週間後の生存率は８０％であった（図２）。【０１２９】
（肺組織の観察）
上記マウスについて、ＢＬＭの気管内注入３日後および７日後に、１０％中性リン酸緩衝ホルマリン液を気管内投与し、肺組織を固定後摘出した。ＢＬＭ投与７日後のＡｒｉｄ５Ａノックアウトマウスおよび野生型マウスの肺組織写真を図３に示す。さらに、摘出した肺組織をパラフィン包埋し、厚さ６μｍの切片を作成し、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った（図４）。
その結果、野生型マウスの肺はＢＬＭの気管内注入により炎症を起こして萎縮し、好中球の集積が見られたのに対して（図３ｂ、図４ｂ）、Ａｒｉｄ５Ａノックアウトマウスの肺の状態は正常と変わらなかった（図３ａ、図４ａ）。【０１３０】
（肺洗浄液の調製と解析）
肺胞における炎症細胞の集積を評価するために、ＢＬＭの気管内注入７日後の肺洗浄液（ＢＡＬ  ｆｌｕｉｄ）を回収した。具体的には、気管挿管を行い、１．５ｍＬの無菌生理食塩水を注入後、２回に分けて洗浄液を回収した。この操作を１匹のマウス当たり合計３回行った。回収できた肺洗浄液の量は、注入量に対して平均約９０％であった。この洗浄液の回収率は、マウスの処理条件や種類（野生型およびＡｒｉｄ５Ａノックアウトマウス）によらずほぼ一定であった。回収した肺洗浄液を３００ｘｇ、１０分遠心して細胞を回収し、血球計算版を用いて計数した。白血球分率は細胞標品に基づいて評価した。即ち、スライドはサイトスピン（トミー精工社、東京、日本）により調製し、ディフ・クイック（国際試薬社製）で染色した。また、肺洗浄液中のＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＦＮγ量を測定した（図５）。
その結果、図５に示す通り、野生型マウスでは、ＢＬＭの気管内注入７日後の肺洗浄液中に検出されるＩＬ−６の濃度は約１５０ｐｇ／ｍＬであったのに対して、Ａｒｉｄ５Ａノックアウトマウスでは約３０ｐｇ／ｍＬであった。なお、ＴＮFαおよびＩＦＮγは、野生型マウス、Ａｒｉｄ５Ａノックアウトマウス共に検出されなかった。【０１３１】
実施例３：Ａｒｉｄ５ＡのｓｉＲＮＡによるＩＬ−６の発現制御
マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７に、Ａｒｉｄ５ＡのｓｉＲＮＡ（ SASI_Mm02_00341523  (sigma)）またはコントロールのｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）をエレクトロポレーション法にて導入した。２４時間の培養後、細胞をＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）で２４時間刺激し、得られた細胞からＲＮＡを抽出した。Ａｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって定量した（図６）。また、それぞれの培養上清中のＩＬ−６およびＴＮＦ−αの濃度をＥＬＩＳＡ法によって定量した（図７および８）。図６に示す通り、ＲＡＷ２６４．７にＡｒｉｄ５ＡのｓｉＲＮＡを導入したことにより、Ａｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡ発現レベルが顕著に低下した。また、図７および図８に示す通り、Ａｒｉｄ５ＡのｓｉＲＮＡを導入した細胞においては、ＬＰＳ刺激によって産生されるＩＬ−６の量が減少したのに対して、ＴＮＦ−αの量には変化がなかった。【０１３２】
実施例４：肺疾患の治療に有用な候補物質のスクリーニング方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）の腹腔マクロファージを、被験物質（２０μＭ）存在下または非存在下において、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）で刺激した。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、上記刺激した腹腔マクロファージにおけるＡｒｉｄ５Ａ、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αのｍＲＮＡの相対発現レベルを測定した。Ａｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡについては、ＬＰＳ刺激２時間後、ＩＬ−６のｍＲＮＡおよびＴＮＦ−αのｍＲＮＡついては、ＬＰＳ刺激２時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後の発現レベルを測定した。被験物質として、クロルプロマジン（ＣＰＺ）を使用した結果を図９〜１１に示す。【０１３３】
図９に示す通り、ＣＰＺ存在下でＬＰＳ刺激した腹腔マクロファージにおいては、ＣＰＺ非存在下の場合と比較して、ＬＰＳ刺激２時間後において、Ａｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡの発現が顕著に抑制された。また、図１０に示す通り、ＣＰＺ存在下でＬＰＳ刺激した腹腔マクロファージにおいては、ＣＰＺ非存在下の場合と比較して、ＬＰＳ刺激２時間後、６時間後において、ＩＬ−６のｍＲＮＡの発現が顕著に抑制された。一方、図１１に示す通り、ＣＰＺは、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡの発現に対しては何らの影響も与えなかった。【０１３４】
この結果より、ＣＰＺは、Ａｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡの発現自体を阻害する物質であることがわかった。また、ＣＰＺは、Ａｒｉｄ５Ａにより影響を受けるＩＬ−６のｍＲＮＡの発現も阻害する物質であり、かつ、Ａｒｉｄ５Ａにより影響を受けないことが知られているＴＮＦ−αのｍＲＮＡには何ら影響を与えない物質であった。このことから、ＣＰＺはＩＬ−６のｍＲＮＡの安定化を特異的に阻害する物質であり、ＩＬ−６等の炎症性サイトカインが関与するおよびまたは肺疾患の治療に有効であることが示唆された。このように、細胞内のＡｒｉｄ５ＡのｍＲＮＡの発現を阻害する物質をスクリーニングすることにより、およびまたは肺疾患の治療に有効である物質を得ることが可能であるし、また、ＩＬ−６のｍＲＮＡの発現を阻害するが、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡには何ら影響を与えない物質をスクリーニングすることによっても、Ａｒｉｄ５Ａの作用を阻害する物質を効率的にスクリーニングすることが可能であると思われる。これらの方法によって、およびまたは肺疾患の治療に有効である物質を効率よくスクリーニングすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１３５】
本発明により、肺疾患の高い治療効果および予防効果を有する医薬組成物が提供される。また、本発明により高い治療効果を示す肺疾患治療剤および／または予防剤のスクリーニング方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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