(57)【要約】【課題】血液の精製処理（前処理）を行うことなく、より迅速に血液から直接、ＤＮＡ検出剤を用いた融解曲線解析によって塩基多型の検出を行う方法を提供することである。【解決手段】ＤＮＡ検出剤、２種類以上のアレル特異的プライマーに加え、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することで、血液の精製処理（前処理）を行うことなく、直接、血液を反応溶液に添加するだけで、変異あるいは塩基多型を検出することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に含まれるＤＮＡの変異または塩基多型を検出する方法であって、以下の（１）から（４）の工程を含む方法。
（１）以下の（ａ）から（ｃ）を含む組成物を調製する工程
（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）ＤＮＡ検出剤
（ｃ）アレル特異的プライマー
（２）血液試料からゲノム抽出を行うことなく試料を（１）に記載の組成物に添加して反応液とする工程
（３）（２）に記載の反応液中で増幅反応を行う工程
（４）（３）で増幅したＤＮＡの変異または塩基多型を検出する工程
【請求項２】
ＤＮＡ検出剤がインターカレーターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
血液がＰＣＲ反応混合物の全体積の０．０１〜５体積％である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
血液がＰＣＲ反応混合物の全体積の１〜５体積％である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
２種類以上のアレル特異的プライマーを含む、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
２種類以上のアレル特異的プライマーが、異なるＴｍ値の増幅産物を与えるように設計された請求項１−５に記載の方法。
【請求項７】
２種類以上のアレル特異的プライマーのうち、少なくとも一つがＧＣテールを付加したプライマーである、請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
２種類以上のアレル特異的プライマーが、それぞれに長さの異なるＧＣテールを付加したプライマーである請求項１−７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
２種類以上のアレル特異的プライマーにより与えられる増幅産物のＴｍ値の差異によって、変異あるいは塩基多型を検出する請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｆｘ、Ｖｅｎｔ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ、Ｔｇｏ、Ｐｗｏ、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐからなる群から選ばれるＤＮＡポリメラーゼである請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（ＫＯＤ）由来である請求項１−１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
血液試料からゲノム抽出を行うことなく、試料に含まれるＤＮＡを増幅し、その変異または塩基多型を検出するためのキットであって、以下の（ａ）から（ｃ）を含む組成物を含むキット。
（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）ＤＮＡ検出剤
（ｃ）アレル特異的プライマー
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、融解曲線解析を用いた核酸配列の変異または、多型の検出方法に関する。本発明は、研究のみならず、臨床診断としての遺伝子病の診断、塩基多型解析等に際して有用である。
【背景技術】
【０００２】
本発明において、核酸配列の変異及び塩基多型とは、野生型とは異なる塩基配列を有することをいう。一般に頻度が１％未満のものを変異、１％以上のものを多型と呼び分けることがあるが、ここでは厳密な使い分けを意図するものではない。この塩基多型は、病気の罹りやすさや薬物代謝などに影響を及ぼすことが知られており、疾病の遺伝子マーカーや、投与薬物の効果、副作用を予測するマーカーとして利用されている。それゆえ、これらの塩基多型や変異の解明は、臨床的に重要であり、種々の検出方法が開発されてきた。
【０００３】
従来の核酸配列分析技術としては、例えば核酸配列決定法（シークエンシング法）、ＴａｑＭａｎプローブ法（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  第６巻、第９８６頁（１９９６））、制限酵素切断長多型（ＲＦＬＰ）法（Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  第７２巻、第１２６２頁（１９８３））、アレル特異的プライマー（ＡＳＰ）法（ＷＯ  ０１／０４２４９８）、アレル特異的オリゴプローブ（ＡＳＯ）法（Ｎａｔｕｒｅ  第３２４巻、第１６３頁（１９８６））、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第２２４巻、第３６７頁（１９９７））、Ｉｎｖａｄｅｒ法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  第１７巻、第２９２頁（１９９９）、Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ／  ｐｒｉｍｅｒ（ＱＰ）法（特許第３４３７８１６号）などが知られている。
【０００４】
検出を簡便化するために、ＴａｑＭａｎプローブ法やＡＳＯ法、ＱＰ法のようにワンチューブで変異多型が検出できる方法が開発されている（特許文献１、非特許文献２および非特許文献３）。しかし、これらのほとんどが、蛍光修飾されたオリゴヌクレオチドを必要とする。
【０００５】
一方、蛍光修飾されたオリゴヌクレオチドを必要としない方法として、Ｇｅｒｍｅｒらは一方のアレル特異的プライマーに非相補的配列（２６塩基対のＧＣテール）を付加することで増幅産物のＴｍ値に差異を生じさせ多型を検出する方法を報告している（非特許文献３）。また、Ｇｅｒｍｅｒらは融解曲線解析において、それぞれのアレル特異的プライマーにより増幅された増幅産物のピーク比のバランスを揃えるために、それぞれのアレル特異的プライマーに異なる長さの非相補的配列であるＧＣテールを付加する方法を発明している（特許文献２、非特許文献４）。これらの方法では、蛍光修飾されたオリゴヌクレオチドを使用することなく、インターカレーターを用いた融解曲線解析にて検出が可能である。
しかしながら、かかる発明は、検出の簡便化が進められているものの、増幅前に精製等の前処理を行ったゲノムＤＮＡを用いて検出を行う必要性がある。そのため、操作の簡便性と迅速性に問題が残されていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３４３７８１６号
【特許文献２】特許第４３５１２１７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第６巻、第９８６−９９４頁（１９９６）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ、第３２４巻、第１６３−１６６頁  （１９８６）
【非特許文献３】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第９巻、第７２−７８頁（１９９９）
【非特許文献４】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第３９巻、第８８５−８９３頁（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
塩基多型の検出は、疾病の遺伝子マーカーや、投与薬物の効果、副作用を予測するマーカーとして臨床的に重要である。そのため、多サンプルの処理が必要なこれらの産業用途では、反応時間の短縮、安価、汎用機器での使用が可能であることが強く望まれている。そのため、本発明が解決しようとする課題は、血液の精製処理（前処理）を行うことなく、より迅速に血液から直接、インターカレーターなどのＤＮＡ検出剤を用いた融解曲線解析によって塩基多型の検出を行う方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、ＤＮＡ検出剤、アレル特異的プライマーに加え、ファミリーＢに属するＤＮＡ  ポリメラーゼを使用することで、血液の精製処理（前処理）を行うことなく、直接、血液を反応溶液に添加するだけで、変異あるいは塩基多型を検出することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
従来のＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを代表とするファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼを用いた検出では、血液の前処理が必要であり、血液をそのまま添加しただけでは、塩基多型の検出が困難であった。また、希釈した血液を使用した場合、鋳型量の減少を伴うため、塩基多型の検出を困難にしていた。これに対し、本発明では、新たにファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用したことにより、血液の希釈を行うことなく、血液から直接、変異あるいは塩基多型の検出が可能となった。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［１］試料に含まれるＤＮＡの変異または塩基多型を検出する方法であって、以下の（１）から（４）の工程を含む方法。
（１）以下の（ａ）から（ｃ）を含む組成物を調製する工程
（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）ＤＮＡ検出剤
（ｃ）アレル特異的プライマー
（２）血液試料からゲノム抽出を行うことなく試料を（１）に記載の組成物に添加して反応液とする工程
（３）（２）に記載の反応液中で増幅反応を行う工程
（４）（３）で増幅したＤＮＡの変異または塩基多型を検出する工程
［２］ＤＮＡ検出剤がインターカレーターである、［１］に記載の方法。
［３］血液がＰＣＲ反応混合物の全体積の０．０１〜５体積％である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］血液がＰＣＲ反応混合物の全体積の１〜５体積％である、［１］または［２］に記載の方法。
［５］２種類以上のアレル特異的プライマーを含む、［１］−［４］のいずれかに記載の方法。
［６］２種類以上のアレル特異的プライマーが、異なるＴｍ値の増幅産物を与えるように設計された  ［１］−［５］に記載の方法。
［７］２種類以上のアレル特異的プライマーのうち、少なくとも一つがＧＣテールを付加したプライマーである、［１］−［６］のいずれかに記載の方法。
［８］２種類以上のアレル特異的プライマーが、それぞれに長さの異なるＧＣテールを付加したプライマーである［１］−［７］のいずれかに記載の方法。
［９］２種類以上のアレル特異的プライマーにより与えられる増幅産物のＴｍ値の差異によって、変異あるいは塩基多型を検出する［１］−［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｆｘ、Ｖｅｎｔ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ、Ｔｇｏ、Ｐｗｏ、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐからなる群から選ばれるＤＮＡポリメラーゼである［１］−［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ（ＫＯＤ）由来である［１］−［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］血液試料からゲノム抽出を行うことなく、試料に含まれるＤＮＡを増幅し、その変異または塩基多型を検出するためのキットであって、以下の（ａ）から（ｃ）を含む組成物を含むキット。
（ａ）ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）ＤＮＡ検出剤
（ｃ）アレル特異的プライマー
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、血液の精製処理（前処理）をすることなく、ＤＮＡ検出剤を用いた融解曲線解析による変異あるいは塩基多型の検出を可能とした。これにより、従来よりも、より短時間で、迅速に変異あるいは塩基多型の検出が可能となった。本発明は、研究分野での応用に始め、診断用途などにおいても広く使用することができる。また、短時間で検出が可能になったことから、特に多サンプルの処理が必要な産業用途での利用が多いに期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において、添加割合の異なる血液からＡＬＤＨ２  ＳＮＰを検出した結果を示す図である。
【図２】実施例２において、ＧＣテールおよび、増幅長が異なるプライマー設計をした場合の血液から直接ＡＬＤＨ２  ＳＮＰを検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明におけるＤＮＡ検出剤を用いた血液から直接塩基多型を検出する方法は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ検出剤、アレル特異的プライマーを用いることを特徴とする。
【００１４】
上記のファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｆｘ、Ｖｅｎｔ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ、Ｔｇｏ、Ｐｗｏなどが挙げられ、現在市場にて、ＫＯＤ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＤＮＡ  ポリメラーゼ、ＭｉｇｈｔｙＡｍｐ（登録商標）  ＤＮＡ  ポリメラーゼなどが購入できる。本発明において使用する酵素は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼであればよく、上記のＤＮＡポリメラーゼに特に限定されるものではないが、なかでもＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼが特に好ましい。
【００１５】
本発明で使用するＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する変異体であってもよく、特に限定されない。該変異体は、公知の技術方法による特定部位への変異導入により改変されたものであってもよい。
【００１６】
本発明に用いるＤＮＡ検出剤は特に限定されず、ＤＮＡ表面のリン酸基に結合する色素や塩基間にインターカレートする色素（インターカレーター）などが挙げられるが、インターカレーターを用いることが好ましい。
インターカレーターとは、二本鎖ＤＮＡに挿入（インターカレート）することによって、可逆的な、非共有結合的な様式で核酸と結合し、それによって核酸の存在および量を示す任意の分子を指す。一般に、インターカレーターは、二本鎖ＤＮＡに挿入して蛍光を発する色素である。
【００１７】
多数のインターカレーターが当技術分野で公知である。例えば、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、シアニン色素（例えば、ＴＯＴＯ、ＹＯＹＯ、ＢＯＢＯおよびＰＯＰＯ）、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＥＲ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＬＣ  Ｇｅｅｎ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、ヨウ化プロピジウム、Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ、７−アミノ−アクチノマイシン  Ｄ、ＣｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ、ＳＹＴＯ−９，  ＳＹＴＯ−１０、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１４、ＳＹＴＯ−８２、ＦＵＮ−１などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００１８】
本発明において、アレル特異的プライマーは２種類以上を用いることが好ましい。
本発明における２種類以上のアレル特異的プライマーは、インターカレーターを用いた融解曲線解析による変異あるいは塩基多型の検出に利用される。詳しくは、特定の塩基多型部位を含むＤＮＡが増幅されたか否かによって、その核酸試料中に含まれる塩基多型を検出する方法であり、特定の塩基多型部位を含むＤＮＡを含む血液試料に、共通プライマー（フォワードプライマーに相当）とおよび、２種類以上の塩基多型検出用アレル特異的プライマー（リバースプライマーに相当）を同時に用いて、増幅反応を行い、融解曲線解析により多型を検出する方法である。
【００１９】
塩基多型を検出する２種類以上のアレル特異的プライマーは、標的鋳型に相補的配列が認められる場合のみ、共通フォワードプライマーの間で、標的核酸を鋳型として増幅される。つまり、第一の塩基多型に相補的なアレル特異的プライマーと、第二の塩基多型に相補的なアレル特異的プライマー、共通プライマーの３種類を混合し、第一の塩基多型のみを含むホモ体を鋳型としＰＣＲ増幅を行った場合、第一の塩基多型に相補的なアレル特異的プライマーによる増幅のみが認められる。同様に、第二の塩基多型のみを含むホモ体を鋳型とした場合は、第二の塩基多型に相補的なアレル特異的プライマーによる増幅のみが認められる。また、第一の塩基多型と第二の塩基多型の両者を含むヘテロ体を鋳型とした場合、それぞれに相補的なアレル特異的プライマーつまり、第一の塩基多型に相補的なアレル特異的プライマーによる増幅と、第二の塩基多型に相補的なアレル特異的プライマーによる増幅の両者が認められる。つまり、アレル特異的プライマーを用いることで、塩基多型を識別し、塩基多型特異的な増幅を可能としている。
【００２０】
また、本発明における２種類以上のアレル特異的プライマーは、Ｔｍ値が異なるようにすることを特徴としている。これにより、増幅産物のＴｍ値に差異が生じ、インターカレーターを用いた融解曲線解析を実施した場合に、ピークが分かれることになる。つまり、アレル特異的プライマーにより増幅した増幅産物を識別し、検出することを可能としている。
【００２１】
すなわち本発明における２種類以上のアレル特異的プライマーは、アレル特異的プライマーとして塩基多型を識別し増幅する側面と、各アレル特異的プライマーにより増幅された増幅産物のＴｍ値が異なるようにすることで、融解曲線解析を実施した際に、Ｔｍ値の差異によりピークが分かれ、塩基多型を識別し検出する側面の両者を併せ持っている。
【００２２】
本発明におけるプライマーの長さとしては、標的核酸と相補的な配列は、好ましくは１３〜３５塩基であり、より好ましくは１６塩基以上であり、また、３０塩基以下が好ましい。一方、Ｔｍ値に差異を生じさせるために、アレル特異的プライマーの５’末端にＤＮＡと完全には相補的でない配列を２〜４０塩基付加することが望ましく、より好ましくは３０塩基以下、さらに好ましくは２０塩基以下、より好ましくは、１５塩基以下である。１種類のアレル特異的プライマーにのみＤＮＡと完全に相補的でない配列を付加することで、増幅産物のＴｍ値に差異を生じさせてもよいが、増幅効率のバランスを揃えるために、より好ましくは、Ｔｍ値の異なる、ＤＮＡと完全に相補的でない配列を複数のアレル特異的プライマーに付加することが好ましい。
【００２３】
また、付加するＤＮＡと完全には相補的でない配列は、特に限定されるものではないが、より少ない塩基数でＴｍ値に差異を生じさせるために、グアニン（Ｇ）あるいはシトシン（Ｃ）塩基を含むＧＣテールであることが望ましい。このプライマーの５’末端に付加するＧＣテールは、グアニン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）塩基の合計量が６０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上である。ＧＣテールは、１種類のアレル特異的プライマーにのみ付加しても構わないが、より好ましくは増幅効率のバランスを維持したまま、複数のアレル特異的プライマーで増幅した増幅産物のＴｍ値に差異を生じさせるために、複数のアレル特異的プライマーに長さの異なるＧＣテールを付加することが望ましい。このＧＣテールの長さの差は、５塩基以上が好ましく、より好ましくは１０塩基以上また、１５塩基以下である。
【００２４】
またさらに、増幅鎖長については、より少ない塩基数でＴｍ値に差異が生じさせるために、３００ｂｐ以下が好ましく、より好ましくは、２００ｂｐ以下、特に好ましくは、１００ｂｐ以下である。
【００２５】
本発明における２種類以上のアレル特異的プライマーの特徴は、各アレル特異的プライマーにより増幅された増幅産物のＴｍ値に差異を生じさせることにある。この各増幅産物のＴｍ値は、各リアルタイムＰＣＲ装置、解析ソフトウェアにより求められる。また、増幅産物に融解温度は、市販のプライマー設計プログラム、または公共機関等が提供するオンラインのプログラム、例えばＯｌｉｇｏ  ＣａｌｃｕｌａｔｏｒのＢａｓｉｃ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌ＃ｈｅｌｐｔｈｅｒｍｏ）などを利用することで、容易に推測することができる。すなわち、本発明におけるアレル特異的プライマーおよび、共通プライマーは、各アレル特異的プライマーにより増幅された増幅産物のＴｍ値の差異が、１℃以上、好ましくは３℃以上、より好ましくは５℃以上になるように設計すればよい。
【００２６】
本発明におけるアレル特異的プライマーは、３’末端から３番目以内の塩基が塩基多型部位の予想される各ヌクレオチドに対応していることが好ましい、より好ましくは、３’末端より２番目の塩基が塩基多型部位であることが望ましい。
さらには、上記プライマーの３’末端より３番目から５’末端までの少なくとも１つの塩基が、ハイブリダイズする鎖の塩基と相補的でない塩基（ミスマッチ塩基）に置換されていることが好ましく、より好ましくは相補的でない塩基は３’末端から３〜７番目に有するよう設計されていることである。また、特に好ましくは、相補的でない塩基は３’末端から３番目に有するように設計されていることである。また、プライマー中の該相補的でない塩基は各プライマーにおいて異なる塩基とすることもできる。
【００２７】
本発明の最大の特徴は、血液からゲノム抽出（前処理）を行うことなく直接、変異および塩基多型を検出することにある。この血液のＰＣＲ反応液における添加割合は、ＰＣＲ反応液に対し０．０１体積％以上、好ましくは０．１体積％以上、より好ましくは、１体積％以上である。また前記添加割合の上限は、５体積％以下であることが好ましい。血液は、直接ＰＣＲ反応液に添加しても構わないが、適宜希釈し、ＰＣＲ反応液に添加しても構わない。また、ＰＣＲに添加する血液の形態は、特に制限されず、例えば、採取した血液をそのまま使用してもよいし、凍結保存した血液を凍解して使用することもできる。また、例えば、溶血した血液、未溶血の血液、抗凝固血液、凝固画分を含む血液等のいずれであってもよい。  
【実施例】
【００２８】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２９】
実施例１：血液から直接、ＡＬＤＨ２  ＳＮＰの検出（血液添加量）
本実施例においては、塩基多型を検出する特定遺伝子としてヒトゲノム配列のアルデヒド脱水素酵素遺伝子（Ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２：ＡＬＤＨ２、４８７  Ｇ→Ａ）として知られている配列部分を選択した。
本実施例では、ＰＣＲ反応液における血液試料の添加割合を様々に設定し、ＡＬＤＨ２  ＳＮＰの検出を行った例である。プライマーとして、配列番号１で表される共通プライマー＃１と、配列番号２および３で表されるアレル特異的プライマーを用い、増幅を行った。
Ｇ特異的プライマー＃１（配列番号２）は、［Ｇ］を検出するためのオリゴヌクレオチドで３’末端から２番目に［Ｇ］に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチを有し、Ａ特異的プライマー＃１（配列番号３）は、［Ａ］を検出するためのオリゴヌクレオチドで３’末端から２番目に［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチを有するものとした。
また、Ｇ特異的プライマーによる増幅産物とＡ特異的プライマーによる増幅産物のＴｍ値に差異が生じるように、Ｇ特異的プライマー＃１（配列番号２）に１４塩基のＧＣテールを、Ａ特異的プライマー＃１（配列番号３）には、６塩基のＧＣテールを付加した。さらに、Ｔｍ値の差異が生じるように、Ｔｍ値計算プログラムのＢａｓｉｃ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌ＃ｈｅｌｐｔｈｅｒｍｏ）を用いて増幅産物のＴｍ値を予測し、共通プライマー＃１（配列番号１）の位置を決定した。
【００３０】
【表１】
2014187904.tif 000002
【００３１】
本実施例では、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、ＰＣＲバッファーは、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）に添付のものを使用した。また、インターカレーターは、１／３０，０００倍希釈のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  を使用し、ＰＣＲ反応液を調製した。続いて、血液の添加割合が、ＰＣＲ反応液の５％、２％、１％、０．５％、０．１％となるように上記ＰＣＲ反応組成に添加した。前記ＰＣＲ反応液ついて、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて、表３に示す下記条件にてＰＣＲ反応による増幅、融解曲線解析による検出を実施した。
【００３２】
【表２】
2014187904.tif 000003
【００３３】
【表３】
2014187904.tif 000004
【００３４】
また、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ用いることの有意性をファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた試薬と比較を実施した。具体的には、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  検出系リアルタイムＰＣＲ試薬であるＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ）を使い、上記と同様のプライマー、鋳型を用いた。ＰＣＲ反応条件は、以下の表４および表５に示すとおりである。
【００３５】
【表４】
2014187904.tif 000005
【００３６】
【表５】
2014187904.tif 000006
【００３７】
これらの結果を図１に示す。図１は、各血液添加量において、ＰＣＲを実施し、融解曲線解析を実施した結果である。従来のファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼを使用した検出では、血液からのゲノム精製（前処理）を行わないと塩基多型の検出ができなかった。一方、本発明におけるファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することで、血液を０．１体積％〜５体積％になるようにＰＣＲ反応液に添加するだけで、各遺伝子型の検出が可能であった。すなわち、本発明は、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを使用することで、上記のプライマー設計方法において、インターカレーターを用い、血液から直接、塩基多型を検出できることが確認された。
【００３８】
実施例２：血液から直接、ＡＬＤＨ２  ＳＮＰの検出（片方にＧＣテールを付加した場合と増幅長が与える影響）
本実施例は、塩基多型を検出する特定遺伝子としてヒトゲノム配列のアルデヒド脱水素酵素遺伝子（Ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２：ＡＬＤＨ２、４８７  Ｇ→Ａ）として知られている配列部分を選択し、実施例１とは異なるプライマーセットにて、ＡＬＤＨ２  ＳＮＰの検出を行った例である。
まず、１つ目のプライマーセット（表６）は、片方のアレル特異的プライマーにのみＧＣテールを付加した場合である。共通プライマー＃１（配列番号１）、Ｇ特異的プライマー＃１（配列番号２）は、実施例１と同様にし、Ａ特異的プライマー＃２（配列番号４）のみ、ＧＣテールの付加のないアレル特異的プライマーとした。このＡ特異的プライマー＃２（配列番号４）は、［Ａ］を検出するためのオリゴヌクレオチドで３’末端から２番目に［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列、および３番目に人為的ミスマッチを有するものとした。
【００３９】
【表６】
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【００４０】
次に２つ目のプライマーセット（表７）は、増幅長が異なるように設計した場合である。アレル特異的プライマーについては、Ｇ特異的プライマー＃１（配列番号２）と、Ａ特異的プライマー＃２（配列番号４）を使用した。一方、共通プライマー＃２（配列番号５）については、鋳型核酸とアニーリングする位置を変更し、増幅長が長くなるように設計した。この共通プライマー＃２（配列番号５）は、Ｔｍ値計算プログラムのＢａｓｉｃ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂａｓｉｃ．ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ．ｅｄｕ／ｂｉｏｔｏｏｌｓ／ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍｌ＃ｈｅｌｐｔｈｅｒｍｏ）を用いて増幅産物のＴｍ値を予測し、Ｇ特異的増幅産物とＡ特異的増幅産物のＴｍ値の差異が３℃になるようにした。
【００４１】
【表７】
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【００４２】
本実施例では、実施例１と同様に、インターカレーターとして１／３０，０００倍希釈のＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼとして、ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＴＯＹＯＢＯ）を使用し、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム）を用いて、表２と表３に示すＰＣＲ条件にて、ＰＣＲ反応による増幅、融解曲線解析による検出を実施した。本実施例では、血液の添加割合は、ＰＣＲ反応液に対して０．５％となるように上記ＰＣＲ反応組成に添加した。
これらの結果を図２に示す。図２は、ＧＣテールおよび、増幅長が異なるプライマー設計をした場合の血液から直接ＡＬＤＨ２  ＳＮＰを検出した結果を示す図である。アレル特異的プライマーの片方にのみＧＣテールを付加した場合でも、増幅長を長くした場合でも、血液を直接添加するのみで、各遺伝型の検出が可能であった。すなわち、ＧＣテールの付加の方法や、増幅長に関わらず、増幅産物のＴｍ値に差異が生じるようにプライマー設計をすることで、インターカレーターを用い、血液から直接、塩基多型を検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明により、血液の精製処理（前処理）を行うことなく、ＤＮＡ検出剤を用いた融解曲線解析により、変異あるいは塩基多型の検出が可能となった。そのため、より短時間、より安価で変異あるいは塩基多型の検出が可能である。血液から直接、変異あるいは塩基多型の検出方法は、研究用途での応用に始め、遺伝子診断用途などにおいても広く利用することができる。また、短時間で検出可能であることから、特に多サンプルの処理が必要な産業用途における利用が多いに期待できる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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