(57)【要約】      （修正有）【課題】還元型ヒトガレクチン−１の糖鎖認識ドメインが糖鎖と結合できない構造をとっている還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶の提供。【解決手段】ホモ二量体を形成している還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶であり、上記ホモ二量体の少なくとも一方の単量体の結晶構造において、特定な配列からなるアミノ酸配列を基準とした場合における第５０番目のアスパラギンから第５５番目のアラニンまでのアミノ酸残基で構成されるループが、第４０番目のアスパラギンから第４９番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸残基と第５６番目のアスパラギンから第６３番目のリジンまでのアミノ酸残基とで構成されるβシートの方向に折れ曲がっていないアポ型結晶。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホモ二量体を形成している還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶であり、
前記ホモ二量体の少なくとも一方の単量体の結晶構造において、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第５０番目のアスパラギンから第５５番目のアラニンまでのアミノ酸残基で構成されるループが、第４０番目のアスパラギンから第４９番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸残基と第５６番目のアスパラギンから第６３番目のリジンまでのアミノ酸残基とで構成されるβシートの方向に折れ曲がっていない、アポ型結晶。
【請求項２】
前記還元型ヒトガレクチン−１は、配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる、請求項１記載のアポ型結晶。
【請求項３】
硫酸アンモニウム及びβメルカプトエタノール存在下、２〜６℃において析出して形成される、請求項１又は２記載のアポ型結晶。
【請求項４】
空間群Ｐ２（１）に属し、格子定数がａ＝６８±６Å、ｂ＝５８±５Å、ｃ＝９４±９Å、α＝９０±９°、β＝９３±９°及びγ＝９０±９°である、請求項１〜３のいずれか一項記載のアポ型結晶。
【請求項５】
１．５８Åの分解能でＸ線解析できる、請求項４記載のアポ型結晶。
【請求項６】
空間群Ｐ２（１）２（１）２（１）に属し、格子定数がａ＝５８±５Å、ｂ＝１１６±１１Å、ｃ＝１１７±１１Å、α＝９０±９°、β＝９０±９°及びγ＝９０±９°である、請求項１〜３のいずれか一項記載のアポ型結晶。
【請求項７】
２．４Åの分解能でＸ線解析できる、請求項６記載のアポ型結晶。
【請求項８】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード３Ｗ５８又は３Ｗ５９に示される原子座標を有する、請求項１記載のアポ型結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖認識ドメインを有するヒトガレクチン−１は、１０種類以上あるヒト由来ガレクチンの一つであり、生体内では二量体（ホモダイマー）を形成して存在している（非特許文献１）。
【０００３】
ヒトガレクチン−１には、酸化型と還元型があり、還元型のヒトガレクチン−１は、癌細胞で特異的に発現し、糖鎖認識ドメインを介してＴ細胞の細胞膜上の糖鎖と結合することによりＴ細胞の分化や癌細胞のアポトーシス誘導に対して抑制的に働くことが知られている。例えば、癌細胞から分泌された還元型ヒトガレクチン−１の糖鎖認識ドメインがＴ細胞の細胞膜上の糖鎖と結合すると、Ｔ細胞はアポトーシスを誘導するサイトカインの分泌を停止し、癌細胞はアポトーシスを回避して増殖し続けることが報告されている（非特許文献２〜４）。
【０００４】
このため、還元型ヒトガレクチン−１の糖鎖認識ドメインに結合可能なガラクトース若しくはラクトース又はそれらの誘導体は、還元型ヒトガレクチン−１のＴ細胞の細胞膜上の糖鎖への結合を競合的に阻害し、癌細胞に対してアポトーシスを誘導することが報告され（非特許文献５）、いくつかの糖誘導体については、還元型ヒトガレクチン−１を標的とした抗癌作用を有する化合物（以下、ガレクチン−１阻害化合物）であるとして報告されている（非特許文献６及び７）。
【０００５】
一方、還元型ヒトガレクチン−１の結晶構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（以下、ＰＤＢと略すことがある。）に、５種類の野生型と５種類の変異型が報告されている（非特許文献８〜１０）。野生型の還元型ガレクチン−１の結晶構造は、そのいずれもが糖誘導体との複合体構造であり、最小１．７０Åの分解能で構造解析されたものである。変異型の還元型ガレクチン−１の結晶構造は、糖誘導体との複合体構造又はアポ型結晶構造のいずれかであり、最小１．６５Åの分解能で構造解析されたものである。
【０００６】
また、還元型ヒトガレクチン−１の構造の揺らぎを観測した実験においては、還元型ヒトガレクチン−１の糖鎖認識ドメインを構成する二次構造にはフレキシビリティがあることが報告されている（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ、２００５年、５巻、ｐ．２９〜４１
【非特許文献２】Ｎｉｓｈｉら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００８年、１８巻、ｐ．１０６５〜１０７３
【非特許文献３】Ｋａｓａｉら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６年、１１９巻、ｐ．１〜８
【非特許文献４】Ｐｅｒｉｌｌｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９８年、７６巻、ｐ．４０２〜４１２
【非特許文献５】Ｌｅｆｆｌｅｒら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８６年、２６１巻、ｐ．１０１１９
【非特許文献６】Ｉｎｇｒａｓｓｉａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、１３巻、ｐ．３５１３〜３５２７
【非特許文献７】Ｏｌｓｕｆｙｅｖａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３年、３３８巻、ｐ．１３５９〜１３６７
【非特許文献８】Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、２０１１年、７９巻、ｐ．３３９〜３４６
【非特許文献９】Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１０年、２９９巻、ｐ．９５〜１１０。Ｎｉｓｈｉら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００８年、１８巻、ｐ．１０６５〜１０７３
【非特許文献１０】Ｌｏｐｅｚ‐Ｌｕｃｅｎｄｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００４年、３４３巻、ｐ．９５７〜９７０
【非特許文献１１】Ｎｅｓｍｅｌｏｖａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０年、３９７巻、ｐ．１２０９〜１２３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、これまでに報告されたガレクチン−１阻害化合物（非特許文献６及び７）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで癌細胞の増殖を抑制するが、実験動物を用いた薬理評価においては十分な抗癌作用は認められず、そのいずれもが抗癌剤にはなり得ないものであった。
【０００９】
また、糖又は糖誘導体と還元型ヒトガレクチン−１との複合体のＸ線結晶構造解析により糖鎖認識ドメインの立体構造情報が得られているが、これらの情報からでは、抗癌剤として有用なガレクチン−１阻害化合物を見出せていないのが現状である。
【００１０】
さらに、還元型ヒトガレクチン−１の結晶化法においては、１０℃以下の低温で結晶化した例は報告されておらず、抗癌剤として有用なガレクチン−１阻害化合物を探索するには、新たな結晶化法でこれまでにない特徴を備えた還元型ヒトガレクチン−１の結晶を取得する必要があると考えられた。
【００１１】
そこで本発明は、これまでに報告されている結晶構造とは異なり、還元型ヒトガレクチン−１の糖鎖認識ドメインが糖鎖と結合できない構造をとっている還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、還元型ヒトガレクチン−１結晶の糖鎖認識ドメインの構造が、これまでに報告されている還元型ヒトガレクチン−１の結晶構造とは全く異なった特徴を有する、還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶の取得に成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、ホモ二量体を形成している還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶であり、上記ホモ二量体の少なくとも一方の単量体の結晶構造において、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第５０番目のアスパラギンから第５５番目のアラニンまでのアミノ酸残基で構成されるループが、第４０番目のアスパラギンから第４９番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸残基と第５６番目のアスパラギンから第６３番目のリジンまでのアミノ酸残基とで構成されるβシートの方向に折れ曲がっていない、アポ型結晶を提供する。
【００１４】
上記還元型ヒトガレクチン−１は、配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることが好ましい。
【００１５】
上記のアポ型結晶は、硫酸アンモニウム及びβメルカプトエタノール存在下、２〜６℃において析出して形成されたものであることが好ましいが、硫酸アンモニウム及びβメルカプトエタノール存在下、４℃において析出して形成されたものであることがより好ましい。
【００１６】
また上記のアポ型結晶は、空間群Ｐ２（１）に属し、格子定数がａ＝６８±６Å、ｂ＝５８±５Å、ｃ＝９４±９Å、α＝９０±９°、β＝９３±９°及びγ＝９０±９°であることが好ましく、少なくとも１．５８Åの分解能までのＸ線解析が可能であることがより好ましい。
【００１７】
また上記のアポ型結晶は、空間群Ｐ２（１）２（１）２（１）に属し、格子定数がａ＝５８±５Å、ｂ＝１１６±１１Å、ｃ＝１１７±１１Å、α＝９０±９°、β＝９０±９°及びγ＝９０±９°であることが好ましく、少なくとも２．４Åの分解能までのＸ線解析が可能であることがより好ましい。
【００１８】
さらに上記のアポ型結晶は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋコード３Ｗ５８又は３Ｗ５９に示される原子座標を有することがより好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶によれば、糖鎖認識ドメインがこれまで報告されている還元型ヒトガレクチン−１結晶とは全く異なり、糖鎖認識ドメインに糖鎖が結合するポケットが存在しないため、ガレクチン−１阻害化合物と還元型ヒトガレクチン−１との新たな結合様式を提供できる。また、本発明の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶から導き出される上記の結合様式は、医薬分子設計（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）を用いて、抗癌剤として有用なガレクチン−１阻害化合物の創出に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】新たに得られた還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶のリボン構造
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明のアポ型結晶は、ホモ二量体を形成している還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶であり、該ホモ二量体の少なくとも一方の単量体の結晶構造において、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第５０番目のアスパラギンから第５５番目のアラニンまでのアミノ酸残基で構成されるループが、第４０番目のアスパラギンから第４９番目のフェニルアラニンまでのアミノ酸残基と第５６番目のアスパラギンから第６３番目のリジンまでのアミノ酸残基とで構成されるβシートの方向に折れ曲がっていないことを特徴としている。
【００２２】
「還元型ヒトガレクチン−１」とは、ヒトガレクチン−１において、糖鎖に結合特異性を示すタンパク質のことをいい、酸化されると失活し、糖鎖への結合特異性を失う性質を有している。酸化失活したヒトガレクチン−１は、酸化型ヒトガレクチン−１と呼び、区別することができる。
【００２３】
上記の還元型ヒトガレクチン−１には、天然に存在する野生型ヒトガレクチン−１のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するものだけでなく、野生型ヒトガレクチン−１のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が付加・欠失・置換されたアミノ酸配列を有する変異型ヒトガレクチン−１も含まれるが、天然に存在する野生型ヒトガレクチン−１であることが好ましく、配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる野生型ヒトガレクチン−１であることがより好ましい。
【００２４】
上記の還元型ヒトガレクチン−１は、ヒト由来の組織又は細胞からの単離精製や遺伝子組換え技術を用いた生物学的製造等により、公知の方法を用いて得ることができる。
【００２５】
「ホモ二量体」とは、同一のアミノ酸配列を有する２つのタンパク質が二量体を形成していることをいう。
【００２６】
「配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第５０番目のアスパラギンから第５５番目のアラニンまでのアミノ酸残基で構成されるループが、第４０番目のアスパラギンから第４９番目までのフェニルアラニンのアミノ酸残基と第５６番目のアスパラギンから第６３番目のリジンまでのアミノ酸残基とで構成されるβシートの方向に折れ曲がっていない」とは、配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第４８番目のアルギニンから第５１番目のアラニンまでのアミノ酸残基のアルファ炭素と、第５４番目のアスパラギン酸から第５７番目のトレオニンまでのアミノ酸残基のアルファ炭素とで構成される二次構造において、ターン構造を形成していないことをいう。すなわち、第４８番目のアルギニンのアルファ炭素と第５１番目のアラニンのアルファ炭素が７Å以上の距離を隔てて位置すること、又は、第５７番目のトレオニンのアルファ炭素と第５４番目のアスパラギン酸のアルファ炭素が７Å以上の距離を隔てて位置することをいう。
【００２７】
上記の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶（以下、「本願の還元型ヒトガレクチン−１結晶」と略す場合がある。）は、これまでにＰＤＢで報告されている１０種類の還元型ヒトガレクチン−１の結晶（非特許文献８〜１０；以下、まとめて「公知の還元型ヒトガレクチン−１結晶」と略す場合がある。）とは異なり、糖鎖認識ドメインで観測されていた糖鎖の結合に使われるポケット構造を有しておらず、糖鎖認識ドメインで糖鎖と結合できない構造をとっていることを特徴と有している。
【００２８】
すなわち、本願の還元型ヒトガレクチン−１結晶と公知の還元型ヒトガレクチン−１結晶の構造を比較した場合、糖鎖認識ドメインを構成するアミノ酸残基（配列表の配列番号３に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における第４４番目のヒスチジンから第７３番目のアルギニンまでのアミノ酸残基）のアルファ炭素の原子座標を最小二乗法により重ね合わせると、平均二乗偏差（Ｒｏｏｔ  Ｍｅａｎ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ；以下、「ＲＭＳＤ」と略す。）は、公知の還元型ヒトガレクチン‐１結晶間では全ての組合せにおいて１．０Å以下であったのに対し、本願の還元型ヒトガレクチン−１結晶と公知の還元型ヒトガレクチン−１結晶との間では、３．０〜４．０Åと算出された。
【００２９】
また、両者を原子間距離で比較した場合であっても、公知の還元型ヒトガレクチン−１の結晶間では全ての組合せにおいて１．０Å以下であったのに対し、本願の還元型ヒトガレクチン−１結晶と公知の還元型ヒトガレクチン−１結晶との間では最大１１〜１３Åと算出された。なお、ＲＭＳＤとは、２つの分子の原子座標を重ね合わせて、対応する各原子座標間の距離を二乗した値の平均値の平方根で定義されるものであり、値が小さいほど２つの構造が近似することを意味している。
【００３０】
上記の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶は、以下で説明する標的タンパク質水溶液調製工程及び結晶化工程を備える方法で製造できる。
【００３１】
標的タンパク質水溶液調製工程とは、還元型ヒトガレクチン−１を緩衝水溶液に溶解し、標的タンパク質水溶液を調製する工程である。緩衝水溶液としては、例えば、トリス緩衝液やリン酸緩衝液を好ましく利用できるが、リン酸緩衝液がより好ましい。また、標的タンパク質水溶液中の還元型ヒトガレクチン−１の濃度は、０．１〜２０ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、１〜１２ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。
【００３２】
結晶化工程とは、標的タンパク質水溶液から水を取り除き、標的タンパク質の溶解度を下げて結晶を析出させ成長させる工程である。結晶化工程では、蒸気拡散法を用いることが好ましい。
【００３３】
蒸気拡散法とは、標的タンパク質水溶液を気体相のみを通して貯留槽溶液と平衡化させる方法であり、当該技術分野では周知のタンパク質結晶化法である。蒸気拡散法としては、例えば、ハンギングドロップ法やシッティングドロップ法を挙げることができる。ハンギングドロップ法は、標的タンパク質水溶液と結晶化溶液との混合液の液滴をカバーガラス上に配置し、カバーガラスを貯留槽上で反転させ、密封する方法である。シッティングドロップ法は、貯留槽内部に適切な液滴台を設置し、標的タンパク質水溶液と貯留槽溶液との混合液の液滴を液滴台上に配置し、カバーガラス等で貯留槽を密封する方法である。
【００３４】
貯留槽溶液としては、例えば、当該分野で周知の沈殿剤や緩衝水溶液が挙げられ、沈殿剤と緩衝水溶液とを組み合わせて使用してもよい。沈殿剤としては、硫酸アンモニウムやポリエチレングリコールが好ましく、硫酸アンモニウムがより好ましい。硫酸アンモニウムの濃度は、１．０〜３．０Ｍが好ましく、２．０Ｍがより好ましい。また、貯留槽溶液には、βメルカプトエタノールを加えるのが好ましく、βメルカプトエタノールの濃度は、０．５〜１０％（Ｖ／Ｖ）が好ましく、１％（Ｖ／Ｖ）がより好ましい。
【００３５】
結晶を成長させる温度は、２〜６℃が好ましく、４℃が特に好ましい。結晶を成長させる時間は１日〜１年が好ましく、４週間〜８週間がより好ましい。
【００３６】
上記の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶は、糖鎖認識ドメインに化合物が結合せずに形成された還元型ヒトガレクチン−１のホモ二量体の結晶であり、Ｘ線結晶構造解析に供した際には、少なくとも１０Å以下の分解能を与えるだけの品質を有していることが好ましい。この分解能は、４．０Å以下がより好ましく、３．４Å以下がさらに好ましく、１．６Å以下が特に好ましい。
【００３７】
なお、公知の還元型ヒトガレクチン−１結晶は、そのいずれもが糖誘導体との複合体構造であり、最小１．７０Åの分解能で構造解析されている。
【００３８】
上記の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶の第一の実施形態としては、空間群Ｐ２（１）に属し、格子定数がａ＝６８±６Å、ｂ＝５８±５Å、ｃ＝９４±９Å、α＝９０±９°、β＝９３±９°及びγ＝９０±９°であるアポ型結晶が挙げられる。これらのアポ型結晶は、少なくとも１．５８Åの分解能までのＸ線解析が可能である結晶であることが好ましく、ＰＤＢコード３Ｗ５８に示される原子座標を有する結晶であることがより好ましい。
【００３９】
上記の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶の第二の実施形態としては、空間群Ｐ２（１）２（１）２（１）に属し、格子定数がａ＝５８±５Å、ｂ＝１１６±１１Å、ｃ＝１１７±１１Å、α＝９０±９°、β＝９０±９°及びγ＝９０±９°であるアポ型結晶が挙げられる。これらのアポ型結晶は、少なくとも２．４Åの分解能までのＸ線解析が可能である結晶であることが好ましく、ＰＤＢコード３Ｗ５９に示される原子座標を有する結晶であることがより好ましい。
【００４０】
原子座標とは、結晶形態におけるタンパク質の原子に含まれる電子によるＸ線の回折により得られる個々の回折点の回折強度を数値化し、解析することによって導かれる数学的座標であって、該タンパク質の原子の位置を３次元座標として表したものをいう。
【００４１】
こうして得られた上記の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶は、高分解能でのＸ線構造解析が可能であり、還元型ヒトガレクチン−１のアミノ酸側鎖原子の座標の特定が正確に可能となる。したがって、上記の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶の構造は、糖誘導体から脱却した化合物のコンピュータースクリーニングを可能にし、癌の治療薬又は予防薬の創出に利用できる。
【００４２】
また、上記の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶は、ソーキング法において還元型ヒトガレクチン−１／ガレクチン−１阻害化合物複合体の結晶を作製することに使用できる。ソーキング法により取得した還元型ヒトガレクチン−１／ガレクチン−１阻害化合物複合体結晶は、還元型ヒトガレクチン−１の詳細な立体構造の情報とともに、還元型ヒトガレクチン−１に相互作用するガレクチン−１阻害化合物との複合体の原子座標の情報が取得できるため、医薬分子設計（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）と呼ばれる創薬手法に使用することが可能となる。
【００４３】
具体的には、還元型ヒトガレクチン−１の構造情報を解析し、疎水的な相互作用・イオン結合・水素結合を形成し得る部位やアミノ酸残基を解析することで、化合物の分子設計やスクリーニングに必要なファーマコフォアを設計することが可能となる。なお、ファーマコフォアとは、ある薬理活性を示すために必須の構造的特徴を意味し、タンパク質と化合物の相互作用に必要な複数の官能基群とそれらの空間的な位置関係を表すものである。さらに、還元型ヒトガレクチン−１のアミノ酸残基の立体的配置や水分子の三次元的な配置を規定することで、コンピューターによる還元型ヒトガレクチン−１に結合する化合物の分子設計やスクリーニングが可能となる。
【００４４】
以下に、還元型ヒトガレクチン−１に結合する化合物の分子設計方法、ファーマコフォアの設計方法及びファーマコフォアを用いたスクリーニング方法について記載する。
【００４５】
（還元型ヒトガレクチン−１に結合する化合物の分子設計方法）
上記の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶の原子座標を用いることで、還元型ガレクチン−１に結合する化合物の分子設計（活性上昇及び選択性付与等）が可能となる。また、得られた化合物の誘導最適化に活用することも可能となる。例えば、スクリーニングによって得られた還元型ヒトガレクチン−１に結合する化合物を、コンピューターによってドッキングモデル構造を予測することも可能である。このモデル構造は、化合物と近傍のアミノ酸残基との相互作用を増強させる誘導方向性を見出す上で、非常に有用である。さらに、活性には影響を与えずに、代謝や毒性等の改善を進める上で適当な方向性を提示することもできる。加えて、薬理試験や代謝試験における種差の考察や、副作用軽減を目的として標的タンパク質に対する選択性を向上させるための誘導合成を支援する上で最も有用な情報を提供できる。
【００４６】
（ファーマコフォアの設計方法）
ファーマコフォアの設計は、上記の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶の原子座標により表される３次元構造を解析し、ファーマコフォアとして使用し得る部分構造（アミノ酸残基及び構造水等）を特定する工程及び該部分構造を特性球に変換し、ファーマコフォアを発生させる工程により実施できる。なお、特性球とは、疎水性、水素結合供与体又は水素結合受容体等の種々の物理化学的性質を保持した空間的領域を意味し、例えば、脂溶性官能基、カルボニル構造、アミノ基等が挙げられる。
【００４７】
ファーマコフォアとして使用し得る部分構造を特定する工程は、目視及び／又は適切なコンピュータープログラムを使用してもよい。また、部分構造を特性球に変換し、ファーマコフォアを発生させる工程は、コンピューターシステムを用いることにより実施できる。例えば、市販のソフトウェアと該ソフトウェアを作動可能なコンピューターシステムが利用でき、ソフトウェアはＭＯＥ（ｃｃｇ社）等が挙げられる。
【００４８】
（ファーマコフォアを用いたスクリーニング方法）
設計したファーマコフォアと解析用ソフトウェアを用いて、還元型ヒトガレクチン−１に結合する化合物のスクリーニングを実施することができる。ソフトウェアはリガンドからの化学的機能の抽出及び抽出した化学的機能と類似した空間配置を取り得る化合物の検索が可能なソフトウェアであれば何を用いてもよく、例えば、解析用ソフトウェアであるＭＯＥ（ｃｃｇ社）やＳｙｂｙｌ（トライポス社）のモジュールであるＵｎｉｔｙ等を用いてもよい。この際、化合物のクラスタリングが必要であれば、Ｄａｙｌｉｇｈｔ  Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｄａｙｌｉｇｈｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，  Ｍｉｓｓｉｏｎ  Ｖｉｅｊｏ，  ＣＡ）等のプログラムを使用することが可能である。以下、ＭＯＥ（ｃｃｇ社）を使用した例を示す。
【００４９】
設計したファーマコフォアを用いて、あらかじめ準備したコンピュータースクリーニング用の化合物構造データベースを対象としてスクリーニングを実施する。ファーマコフォアの情報とある化合物の立体構造の空間配置とを比較し、該化合物がファーマコフォアの性質を満足させるものであるかどうかを計算により決定する。コンピュータースクリーニングの利点は、検索対象が理論上考え得る全ての化合物の部分集合であることが挙げられる。通常は、自社で保有する化合物のデータベース、市販化合物データベース（例えば、Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ；ＭＤＬ社）又はバーチャルコンビナトリアル合成手法等を用いて発生させた仮想化合物のデータベース、天然物由来の化合物データベース、医薬品データベース等をコンピューター検索用に変換して用いることができる。
【００５０】
また、検索式でヒットした化合物群をデータベース化し、引き続きタンパク質構造を市販のドッキングソフトウェアに適用することによってヒット率を増すこともできる。また、還元型ヒトガレクチン−１に結合する化合物は、プログラムＭＶＤ（Ｍｏｌｒｅｇｒｏ社）等を用いてコンピュータースクリーニングする際に有効なフィルターとして使用することができ、各ファーマコフォアにおいて適合するフラグメントを配置した後に各フラグメントを適当な官能基で結合させて化合物を構築すること（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ設計的使用）も可能である。上記のコンピュータースクリーニングによりヒットした化合物群は、一定の確率で還元型ヒトガレクチン−１に結合する化合物となり得る。
【００５１】
さらに、上記の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶の原子座標は、変異型ガレクチン−１の結晶構造及び化合物が結合したガレクチン−１の複合体の結晶構造を決定するための位相調整モデルとして用いることができる。原子座標は、還元型ヒトガレクチン−１及び変異型ガレクチン−１のＮＭＲ測定による溶液構造の解析にも役立てることができる。このように、上記の還元型ヒトガレクチン−１結晶及び原子座標は、還元型ヒトガレクチン−１の構造及び機能を解明するための手段を提供する。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５３】
（実施例１）還元型ヒトガレクチン−１の発現
還元型ヒトガレクチン−１の組換えタンパク質を得るために、まず、大腸菌発現ベクターを作製した。具体的には、まず、２０ｎｇ／μＬのヒトガレクチン−１  ｃＤＮＡ（ＴＯＹＯＢＯ社  クローンＦＣＣ１０１Ｃ０６）の１μＬを鋳型として、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に添付の５ｘ緩衝液を１０μＬ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液を５μＬ、５Ｍ  ＧＣ  Ｍｅｌｔを５μＬ、１０μＭのプライマーｈＧａｌ１  Ｆ  ＮｃｏＩ（５’−ＣＣＡＴＧＧＣＴＴＧＴＧＧＴＣＴＧＧＴＣＧＣ−３’；配列番号１）及びｈＧａｌ１  Ｒ  ＢａｍＨＩ（５’−ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＴＣＡＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣ−３’；配列番号２）をそれぞれ１μＬ加え、最終的に水を加え全量を４９μＬとした。その後、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＧＣ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１μＬ加えてから、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、９４℃で２分、その後、９４℃で３０秒、５８℃で３０秒及び６８℃で３０秒からなる工程を１サイクルとして３０サイクル、その後、６８℃で３分の条件で実施した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にて分画精製し、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにライゲーションした後、大腸菌ＴＯＰ１０に導入した。形質転換クローンをＬＢ培地で培養後、プラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドをｐＣＲ２．１／ｈＧａｌ１と名付けた。
【００５４】
プラスミドｐＣＲ２．１／ｈＧａｌ１を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、ヒトガレクチン−１ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動にて分画精製した。同様にプラスミドｐＥＴ−２８ｂ（Ｍｅｒｃｋ社）を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にて分画精製した。得られた各々のＤＮＡ断片とＬｉｇｅｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を混合し、２つのＤＮＡ断片を連結した。こうして得られた組換えヒトガレクチン−１発現ベクターをｐＥＴ／ｈＧａｌ１と名付けた。なお、組換えヒトガレクチン−１発現ベクターｐＥＴ／ｈＧａｌ１は、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる組換えヒトガレクチン−１を発現するベクターである。
【００５５】
構築した発現ベクターｐＥＴ／ｈＧａｌ１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入して形質転換させた。カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ；Ｋｍ、ＷＡＫＯ）耐性の形質転換した単一コロニーを２ｍＬのＬＢ（ＧＩＢＣＯ社）／Ｋｍ培地で３７℃にて８時間培養し、３０ｍＬのＬＢ（ＧＩＢＣＯ社）／Ｋｍ培地に加え、３７℃にてさらに一晩培養した。翌日、この培養液を１ＬのＬＢ（ＧＩＢＣＯ社）／Ｋｍ培地に加え、３７℃にてＯＤ６００が０．８以上になるまで培養を実施した。終濃度０．５ｍｍｏｌ／ＬとなるようＩＰＴＧ（ナカライテスク社）を培地に添加し、３７℃にて４時間タンパク質誘導を実施した。６０００×ｇ、１５分間遠心して得られた大腸菌ペレットを−２０℃にてタンパク質精製を実施するまで保存した。
【００５６】
（実施例２）還元型ヒトガレクチン−１の精製
実施例１にて得られた大腸菌ペレットにＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳ）を３０ｍＬ及び１００ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍａ社）０．３ｍＬを加え、超音波破砕（ＴＯＭＹ社）を実施した。１５，０００×ｇ、１０分間遠心することで可溶画分と不溶画分に分画した。可溶画分を回収し、０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）でろ過した後、０．５ｍＭのＤＴＴを６０μＬ加えた。５カラム容量のＰＢＳでカラムを洗浄したＬａｃｔｏｓｅ‐Ａｇａｒｏｓｅ（Ｊ‐オイルミルズ社）ゲルにサンプルを添加し、５カラム容量のＰＢＳでカラムを洗浄した。引き続き、５カラム容量のＰＢＳ／０．２Ｍラクトース溶液で還元型ヒトガレクチン−１を溶出した。
【００５７】
還元型ヒトガレクチン−１を含む溶出画分を回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＷＣＯ＝３，０００）を用いて約５ｍＬまで濃縮し、０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターでろ過した。次に、このろ液について、ゲルろ過緩衝液（２０ｍＭカリウム・ナトリウムリン酸水溶液（ｐＨ７．４）、５ｍＭラクトース）で平衡化したＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  Ｐｒｅｐ  Ｇｒａｄｅカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にて、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ  １０Ｓを用いてゲルろ過カラム精製を実施した。ゲルろ過カラム精製により得られた還元型ヒトガレクチン−１を含む溶出画分をナスフラスコに回収し、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ社）で一晩、減圧下で乾燥させた。得られた還元型ヒトガレクチン−１の粉末を回収し、結晶化に使用するまで−８０℃にて保存した。
【００５８】
得られた還元型ヒトガレクチン−１について、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにて精製度を確認した。タンパク質サンプルに２倍濃度のＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒと最終濃度０．２ＭとなるようにＤＴＴを加え、ミニプロティアンＴＧＸ  ＡｎｙＫＤゲル（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社）を用いて２００Ｖで３０分間泳動した。なお、分子量マーカーにはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社）を用いた。泳動終了後、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてゲルをＣＢＢ染色し、約１４ｋＤａに目的のバンドを確認した。なお、得られた還元型ヒトガレクチン−１のアミノ酸配列を、配列番号３に示す。
【００５９】
（実施例３）還元型ヒトガレクチン−１の結晶化
結晶化は、実施例２で得られた還元型ヒトガレクチン−１を１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭカリウム・ナトリウムリン酸水溶液（ｐＨ７．４）及び５ｍＭラクトースを含有する溶液中で行い、得られた結晶は、ハンギングドロップ法を使用して蒸気拡散法によって成長させた。
【００６０】
具体的には、以下の通りである。まず、２４ウェル培養プレートの貯留槽容器を、２．０Ｍ硫酸アンモニウム、１％（Ｖ／Ｖ）βメルカプトエタノールを含有する０．５ｍＬの沈殿剤溶液で満たした。実施例２で得られた還元型ヒトガレクチン−１を１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭカリウム・ナトリウムリン酸水溶液（ｐＨ７．４）及び５ｍＭラクトースを含有する溶液１μＬと沈殿剤１μＬとを、ガラス板上で混合してドロップを作製した。ガラス板を裏返して貯留槽容器のふたになるようにドロップを下向きにして、２４ウェル培養プレートに設置し、隙間ができないようにグリースで密封させて４℃で保管して結晶化を開始した。結晶は４週間で現れ、最終的に２種類の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶が得られた。得られた還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶を、３０％（Ｗ／Ｖ）グリセロールを添加した母液に浸した後、液体窒素中で瞬間凍結した。
【００６１】
（実施例４）  Ｘ線回折データ収集
Ｘ線回折データはＳＰｒｉｎｇ‐８（理化学研究所の播磨研究所）のＢＬ２６Ｂ２（理化学研究所の構造生物学ビームライン）で、波長１．０Åにて、ＭａｒＭｏｓａｉｃ２２５（Ｒａｙｏｎｉｘ社）のＣＣＤ検出器により収集した。Ｘ線回折データは、Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉらが発表したＨＫＬ２０００プログラム（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９７年、２７６巻、ｐ．３０７‐３２６）によって処理し、分解能が最大１．５８ÅまでのＸ線回折データを記録した。
【００６２】
実施例３で得られた２種の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶のうち、一つ目の結晶の単位格子寸法は、ａ＝６８Å、ｂ＝５８Å、ｃ＝９４Å、α＝ γ ＝９０°、β ＝ ９３°を有し、空間群はＰ２（１）であった。この結晶は、１．５８Åの分解能までのＸ線解析が可能であった。
【００６３】
もう一方の結晶の単位格子寸法は、ａ＝５８Å、ｂ＝１１６Å、ｃ＝１１７Å、α ＝ β ＝ γ ＝ ９０°を有し、空間群はＰ２（１）２（１）２（１）であった。この結晶は、２．４Åの分解能までのＸ線解析が可能であった。
【００６４】
（実施例５）  還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶の構造決定及び精密化：
実施例３で得られた還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶の構造は、実施例４で収集したＸ線回折データをもとに、還元型ヒトガレクチン−１の結晶の立体構造（ＰＤＢコード：１ＧＺＷ）をサーチモデルとして、プログラムＭｏｌｒｅｐ（ＣＣＰ４ｉ）を利用した分子置換法により決定した。ここで、分子置換法とは、類似構造を有するタンパク質構造を初期モデルとして位相角結晶構造を決定する方法であり、その具体的な手法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９８５年、１１５巻、ｐ．５５‐７７（Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｍａｎ編）等に記載されている。
【００６５】
立体構造の構築は、プログラムＲｅｆｍａｃ（ＣＣＰ４ｉ）で実施し、構造精密化は、Ｂｒｕｎｇｅｒらが発表したプログラムＣＮＳ（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ.、１９９８年、Ｄ５４巻、ｐ．９０５‐９２１）を用いた。
【００６６】
その結果、実施例３で得られた還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶の構造は、ホモ二量体を形成したアポ型結晶であった。前記ホモ二量体の結晶の両方の構造において、配列番号３に示されるアミノ酸配列を基準とした場合における、第５０番目のアスパラギンから第５５番目のアラニンのアミノ酸残基で構成されるループが、第４０番目のアスパラギンから第４９番目のフェニルアラニンのアミノ酸残基及び第５６番目のアスパラギンから第６３番目のリジンのアミノ酸残基で構成されるβシート側に折れ曲がっていない構造であった（図１）。
【００６７】
また、実施例３で得られた還元型ヒトガレクチン−１の結晶の原子座標を取得し、ＰＤＢに登録した。単位格子寸法がａ＝６８Å、ｂ＝５８Å、ｃ＝９４Å、α＝ γ ＝９０°、β ＝ ９３°を有し、空間群がＰ２（１）である一つ目の結晶の原子座標は、ＰＤＢコード３Ｗ５８に示されている。また、単位格子寸法がａ＝５８Å、ｂ＝１１６Å、ｃ＝１１７Å、α ＝ β ＝ γ ＝ ９０°を有し、空間群がＰ２（１）２（１）２（１）であるもう一方の結晶の原子座標は、ＰＤＢコード３Ｗ５９に示されている。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の還元型ヒトガレクチン−１のアポ型結晶は、医薬分子設計（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ）によって、抗癌剤として有用なガレクチン−１阻害化合物の創出に利用できる。本発明の還元型ヒトガレクチン‐１のアポ型結晶の構造を基にして得られる抗癌剤は、糖骨格から脱却した化合物となるため、公知のヒトガレクチン−１阻害化合物と比較して物性及び薬効面で優れたものになり得ると考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
配列番号１及び２：ＰＣＲプライマー
配列番号３：ヒトガレクチン−１タンパク質
【図１】
2014148468.tif 000002
【配列表】
2014148468000001.app