(57)【要約】  生体由来試料中のアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のＡβ及びＡβ様ペプチドを指標とした脳内のＡβ蓄積状態を評価するバイオマーカー及びその分析方法を提供する。生体由来試料中のＡβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡβ１−３９（配列番号１）レベルの比：Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；  Ａβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡβ１−４０（配列番号２）レベルの比：Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び  Ａβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）レベルの比：ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２からなる群から選ばれる少なくとも２つの比の組み合わせからなる、脳内のＡβ蓄積状態を判断するマーカー。
2017047529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来試料中のＡβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡβ１−３９（配列番号１）レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；
Ａβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡβ１−４０（配列番号２）レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも２つの比の組み合わせからなる、脳内のＡβ蓄積状態を判断するマーカー。
【請求項２】
被験対象に由来する生体由来試料を、
Ａβ１−４２（配列番号３）と、
Ａβ１−３９（配列番号１）、Ａβ１−４０（配列番号２）、及びＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）からなる群から選ばれる少なくとも２つと
を含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中の
Ａβ１−４２と、
Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、及びＡＰＰ６６９−７１１からなる群から選ばれる前記少なくとも２つと
の各測定レベルを得る測定工程と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−３９レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−４０レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも２つの比を求める算出工程と、
前記算出された各比から数学的手法で組み合わせた合成変数を導き出す工程と、
被験対象の前記合成変数が、脳内のＡβ蓄積陰性者の前記合成変数を基準レベルとして、前記合成変数の基準レベルよりも高い場合に、被験対象の脳内Ａβの蓄積量は、前記Ａβ蓄積陰性者の脳内Ａβの蓄積量よりも多いと判断する評価工程と、
を含む脳内のＡβ蓄積状態を判断する分析方法。
【請求項３】
被験対象に対して行われた医学的介入の前後それぞれにおいて、
被験対象に由来する生体由来試料を、
Ａβ１−４２（配列番号３）と、
Ａβ１−３９（配列番号１）、Ａβ１−４０（配列番号２）、及びＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）からなる群から選ばれる少なくとも２つと
を含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中の
Ａβ１−４２と、
Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、及びＡＰＰ６６９−７１１からなる群から選ばれる前記少なくとも２つと
の各測定レベルを得る測定工程と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−３９レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−４０レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも２つの比を求める算出工程と、
前記算出された各比から数学的手法で組み合わせた合成変数を導き出す工程と、
を含む検査を行い、
医学的介入の前における被験対象の前記合成変数と、医学的介入の後における被験対象の前記合成変数との比較を行い、脳内のＡβ蓄積状態に関して前記医学的介入の有効性を判断する分析方法。
【請求項４】
被験対象に対して１回もしくは経時的に複数回にわたって、
被験対象に由来する生体由来試料を、
Ａβ１−４２（配列番号３）と、
Ａβ１−３９（配列番号１）、Ａβ１−４０（配列番号２）、及びＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）からなる群から選ばれる少なくとも２つと
を含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中の
Ａβ１−４２と、
Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、及びＡＰＰ６６９−７１１からなる群から選ばれる前記少なくとも２つと
の各測定レベルを得る測定工程と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−３９レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−４０レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも２つの比を求める算出工程と、
前記算出された各比から数学的手法で組み合わせた合成変数を導き出す工程と、
を含む検査を行い、
１回もしくは経時的複数回における被験対象の前記合成変数の値に基づいて、被験対象の脳内のＡβ蓄積状態について、将来の症状の進行予測や、認知症の発症リスクの予測を行う分析方法。
【請求項５】
前記数学的手法が、判別分析、重回帰分析、主成分回帰分析、部分最小二乗、ロジスティック回帰を用いる方法である、請求項２〜４のいずれかに記載の分析方法。
【請求項６】
前記数学的手法が、前記各比を正規化した後に、正規化された前記少なくとも２つの比の平均値又は合計値を導き出す方法である、請求項２〜４のいずれかに記載の分析方法。
【請求項７】
前記生体由来試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる、請求項２〜６のいずれかに記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳神経科学分野、及び臨床医学分野に属し、脳内のアミロイド・βペプチド（Ａβ）蓄積状態を評価するマルチプレックスサロゲート・バイオマーカー及びその分析方法に関する。より詳しくは、本発明は、アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein； ＡＰＰ）が切断されることにより生じるＡβ及びＡβ様ペプチドの生体由来試料中レベルを指標とした脳内Ａβ蓄積状態を評価するマルチプレックスサロゲート・バイオマーカー及びその分析方法に関する。本発明のバイオマーカーは、アルツハイマー病に関して、発症前診断、発症予防介入（先制治療薬投与等）対象者のスクリーニング、及び治療薬・予防薬の薬効評価等に利用するためのマーカーである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Alzheimer's disease； ＡＤ）は認知症の主な原因で、認知症全体の５０−６０％を占める。２００１年で２４００万人以上いた世界の認知症患者数は、２０４０年には８１００万人に達すると推定される（非特許文献１）。アルツハイマー病の発症にはアミロイドβ（Ａβ）が深く関わっていると考えられている。Ａβは、膜一回貫通タンパク質であるアミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）がβセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受けることによって産生される。Ａβの線維化を伴う凝集により脳内に老人斑が出現すると、これを引き金にして神経細胞内にタウタンパク質が凝集蓄積し、神経機能不全や神経細胞死が引き起こされる。この結果として、進行性の認知能力の低下が起こると考えられている。Ａβは主に４０残基（Ａβ1-40）と４２残基（Ａβ1-42）からなることが知られており、脳脊髄液（ＣＳＦ）や血液中へ移行することもわかっている。さらに近年では、Ａβ1-40とＡβ1-42とは長さの異なるＡβ様のペプチドがＣＳＦや血漿中にも存在することが報告されている（非特許文献２，３）。【０００３】
アミロイド蓄積はＡＤで脳内に生じる病態生理学的変化のうち、最も早期のイベントであると考えられており、近年の研究では、臨床症状が発現する１０年以上も前から脳内にアミロイドが蓄積され始めていることが明らかになってきている。そのため、ＡＤを早期診断するには、脳内のアミロイド蓄積を的確に検出することが重要となってくる。現在、アミロイド蓄積を検出する方法として、アミロイドPETとＣＳＦ Ａβ検査がある。アミロイドPETは、Ａβに特異的に結合するリガンド分子を用いてＡβ沈着を可視化する方法であり、例えば、Pittsburgh compound-B （PiB）を用いたPiB-PETがある。しかし、PET検査には大掛かりな設備が必要なため、一回の検査料が高額であり、また、放射線被曝といった侵襲性もあるため、ＡＤのスクリーニング方法としては適さない。一方、ＣＳＦ中のＡβ1-42濃度の低下やＡβ1-42／Ａβ1-40の濃度比の低下、総タウ値あるいはリン酸化タウ値の上昇が有用なマーカーであると報告されている（特許文献１：特開２０１０−１９８６４号公報、非特許文献４）。しかしながら、ＣＳＦの採取も侵襲性が高く、ＡＤのスクリーニング方法としては適さない。従って、スクリーニングには侵襲性が低くコストも安い血液検査が望ましい。【０００４】
そこで、血中に存在するＡβ1-42濃度がアルツハイマー病診断マーカーになりえるのではないかと期待され、多くの研究者が血中Ａβ1-42濃度とアルツハイマー病発症との間の関連性を報告しているが、一貫した結果は得られていない（非特許文献４）。【０００５】
しかし、近年、脳内アミロイド蓄積状態を反映する有望な血液マーカーとしてAPP669-711／Ａβ1-42の比が報告された（非特許文献５）。非特許文献５は、APP669-711／Ａβ1-42の比は、PiB-PETにより得られたPiB集積度と強い相関があることを示している。さらに、PiB陽性とPiB陰性の群でＲＯＣ解析した結果、APP669-711／Ａβ1-42の比は、PiB陽性者とPiB陰性者とを精度よく判別できるマーカーであることを示している。【０００６】
また、特許文献２：特開２０１３−６３９７６号公報には、可溶性Ａβモノマーを認識せず、可溶性Ａβオリゴマーのみに特異的に結合するモノクローナル抗体が開示され、前記抗体を用いたアルツハイマー病の診断法が開示されている。同号公報の［０１０４］には、被験者の試料中におけるＡβモノマーに対するＡβオリゴマーの比が、健常者と比較して高い場合に、被験者がアルツハイマー病候補であると判定される方法が開示されている。【０００７】
特許文献３：特表２０１４−５２０５２９号公報には、対象から得たサンプル中の複数のmiRNAのレベルを組み合わせてアルツハイマー病を診断する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−１９８６４号公報
【特許文献２】特開２０１３−６３９７６号公報
【特許文献３】特表２０１４−５２０５２９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Blennow K, de Leon MJ, Zetterberg H. : Alzheimer's disease.  Lancet. 2006 Jul 29; 368(9533): 387-403
【非特許文献２】Portelius E, Westman-Brinkmalm A, Zetterberg H, Blennow K. : Determination of beta-amyloid peptide signatures in cerebrospinal fluid using immunoprecipitation-mass spectrometry.  J Proteome Res. 2006 Apr; 5(4): 1010-6
【非特許文献３】Kaneko N, Yamamoto R, Sato TA, Tanaka K.：Identification and quantification of amyloid beta-related peptides in human plasma using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014;90(3):104-17.
【非特許文献４】Hampel H, Shen Y, Walsh DM, Aisen P, Shaw LM, Zetterberg H, Trojanowski JQ, Blennow K. : Biological markers of amyloid beta-related mechanisms in Alzheimer's disease.  Exp Neurol. 2010 Jun; 223(2): 334-46
【非特許文献５】Kaneko N, Nakamura A, Washimi Y, Kato T, Sakurai T, Arahata Y, Bundo M, Takeda A, Niida S, Ito K, Toba K, Tanaka K, Yanagisawa K. : Novel plasma biomarker surrogating cerebral amyloid deposition. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014;90(9):353-64.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
アルツハイマー病（ＡＤ）患者では、認知機能低下が顕在化する以前に大量のＡβが沈着していることがわかっている。アミロイド-PETはＡβ蓄積の検出に有効であるが、検査費用が高額で、検査の所要時間も長いため、多くの高齢者が容易に受診できる診断方法ではない。したがって、臨床症状が顕在化する前にＡβ蓄積の増加を検出できる簡便な分析方法が必要とされている。【００１１】
上述したように、一般的に、血液や脳脊髄液（ＣＳＦ）に存在するバイオマーカーを指標とした検査方法は、病気の発症や進行を分子レベルで簡便に検出できる有効な方法である。上記特許文献１、及び非特許文献４には、アルツハイマー病においては、ＣＳＦ中のＡβ1-42の濃度の低下が有用な診断マーカーであると報告されている。しかしながら、一方で、非特許文献４には、ＣＳＦ Ａβ1-42とは異なり、血中Ａβ1-42濃度とＡＤ発症との関連性は低いことが報告されている。【００１２】
従来より、血液中のＡβに関するこれまでの報告では、血液中のＡβ1-40及びＡβ1-42の２種類の濃度についてのみしかＡＤとの相関性が調べられていなかった。上記非特許文献５において、脳内アミロイド蓄積状態を反映する有望な血液マーカーとしてAPP669-711／Ａβ1-42の比が報告された。APP669-711／Ａβ1-42の比によって、高感度に脳内アミロイド蓄積を判定できるが、さらに精度よく判別する方法が望まれる。【００１３】
本発明の目的は、生体由来試料中のアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のＡβ及びＡβ様ペプチドを指標とした脳内のＡβ蓄積状態を評価するバイオマーカー及びその分析方法を提供することにある。特に、本発明の目的は、血液試料中のアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のＡβ及びＡβ様ペプチドを指標とした脳内のＡβ蓄積状態を評価するバイオマーカー及びその分析方法を提供することにある。より詳しくは、本発明の目的は、アルツハイマー病に関して、発症前診断、発症予防介入（先制治療薬投与等）対象者のスクリーニング、及び治療薬・予防薬の薬効評価等に利用するためのマーカー及びその分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、鋭意検討の結果、生体試料中のＡＰＰ由来のＡβ及びＡβ様ペプチドについての３つの比、Ａβ１−３９／Ａβ１−４２、Ａβ１−４０／Ａβ１−４２、及びＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２からなる群より選ばれる２以上の比を数学的手法で組み合わせた数値を算出することにより、本発明を完成するに至った。【００１５】
本明細書において、アミロイド・βペプチドの略称として「Ａβ」を用いる。すなわち、「Ａβ」とは、Ａβ１−４０、及びＡβ１−４２を含んでいる。アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）が切断されることにより生じる前記Ａβ以外のペプチドをＡβ様ペプチドと称することがある。アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）が切断されることにより生じるＡβ及びＡβ様ペプチドを、「ＡＰＰ派生型ペプチド」と称することがある。【００１６】
本発明は、以下の発明を含む。
（１）  生体由来試料中のＡβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡβ１−３９（配列番号１）レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；
Ａβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡβ１−４０（配列番号２）レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも２つの比の組み合わせからなる、脳内のＡβ蓄積状態を判断するマーカー。【００１７】
より具体的には、生体由来試料中のＡβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡβ１−３９（配列番号１）レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；
Ａβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡβ１−４０（配列番号２）レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも２つの比の数学的手法による合成変数からなる、脳内のＡβ蓄積状態を判断するマーカー。【００１８】
前記生体由来試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び体分泌液（例えば、唾液、涙、汗、鼻粘膜浸出液、及び痰）からなる群から選ばれる、上記（１）に記載のマーカー。【００１９】
（２）  被験対象に由来する生体由来試料を、
Ａβ１−４２（配列番号３）と、
Ａβ１−３９（配列番号１）、Ａβ１−４０（配列番号２）、及びＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）からなる群から選ばれる少なくとも２つと
を含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中の
Ａβ１−４２と、
Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、及びＡＰＰ６６９−７１１からなる群から選ばれる前記少なくとも２つと
の各測定レベルを得る測定工程と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−３９レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−４０レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも２つの比を求める算出工程と、
前記算出された各比から数学的手法で組み合わせた合成変数を導き出す工程と、
被験対象の前記合成変数が、脳内のＡβ蓄積陰性者の前記合成変数を基準レベルとして、前記合成変数の基準レベルよりも高い場合に、被験対象の脳内Ａβの蓄積量は、前記Ａβ蓄積陰性者の脳内Ａβの蓄積量よりも多いと判断する評価工程と、
を含む脳内のＡβ蓄積状態を判断する分析方法。【００２０】
（３）  被験対象に対して行われた医学的介入の前後それぞれにおいて、
被験対象に由来する生体由来試料を、
Ａβ１−４２（配列番号３）と、
Ａβ１−３９（配列番号１）、Ａβ１−４０（配列番号２）、及びＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）からなる群から選ばれる少なくとも２つと
を含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中の
Ａβ１−４２と、
Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、及びＡＰＰ６６９−７１１からなる群から選ばれる前記少なくとも２つと
の各測定レベルを得る測定工程と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−３９レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−４０レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも２つの比を求める算出工程と、
前記算出された各比から数学的手法で組み合わせた合成変数を導き出す工程と、
を含む検査を行い、
医学的介入の前における被験対象の前記合成変数と、医学的介入の後における被験対象の前記合成変数との比較を行い、脳内のＡβ蓄積状態に関して前記医学的介入の有効性を判断する分析方法。【００２１】
すなわち、医学的介入の前における被験対象の前記合成変数よりも、医学的介入の後における被験対象の前記合成変数が小さくなっていると、脳内のＡβ蓄積状態に関して前記医学的介入が有効であったと判断できる。【００２２】
（４）  被験対象に対して１回もしくは経時的に複数回にわたって、
被験対象に由来する生体由来試料を、
Ａβ１−４２（配列番号３）と、
Ａβ１−３９（配列番号１）、Ａβ１−４０（配列番号２）、及びＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）からなる群から選ばれる少なくとも２つと
を含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中の
Ａβ１−４２と、
Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、及びＡＰＰ６６９−７１１からなる群から選ばれる前記少なくとも２つと
の各測定レベルを得る測定工程と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−３９レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−４０レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも２つの比を求める算出工程と、
前記算出された各比から数学的手法で組み合わせた合成変数を導き出す工程と、
を含む検査を行い、
１回もしくは経時的複数回における被験対象の前記合成変数の値に基づいて、被験対象の脳内のＡβ蓄積状態について、将来の症状の進行予測や、認知症の発症リスクの予測を行う分析方法。【００２３】
すなわち、上記各工程からなる検査を１回のみ行った場合においても、合成変数の値から、アルツハイマー病の将来の症状の進行予測や、認知症の発症リスクの予測を行い得る。さらに、経時的に複数回にわたって、上記各工程からなる検査を行った場合においては、合成変数の値の変動から、アルツハイマー病の将来の症状の進行予測や、認知症の発症リスクの予測をさらに精度よく行い得る。【００２４】
（５）  前記数学的手法が、判別分析（線形判別分析、二次判別分析、正規化判別分析）、重回帰分析、主成分回帰分析（PCA）、PLS（部分最小二乗）、ロジスティック回帰、を用いる方法である、上記（２）〜（４）のいずれかに記載の分析方法。【００２５】
（６）  前記数学的手法が、前記各比を正規化した後に、正規化された前記少なくとも２つの比の平均値又は合計値を導き出す方法である、上記（２）〜（４）のいずれかに記載の分析方法。【００２６】
（７）  前記生体由来試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び体分泌液（例えば、唾液、涙、汗、鼻粘膜浸出液、及び痰）からなる群から選ばれる、上記（２）〜（６）のいずれかに記載の分析方法。【００２７】
本発明において、マーカーのレベルとは、基本的には濃度を意味するが、当業者が濃度に準じて用いる他の単位でもよい。被験対象とは、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物（ラット、イヌ、ネコなど）が含まれる。また、本発明において、生体由来試料は、由来元の被験対象（例えば、被験者）に戻すことなく破棄される。医学的介入とは、治療薬や予防薬の投与、食事療法、運動療法、学習療法、外科手術などが含まれる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、生体由来試料中のＡβ１−４２レベルに対するＡβ１−３９レベルの比：Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−４０レベルの比：Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも２つの比の組み合わせからなる、脳内のＡβ蓄積状態を判断するマーカーが提供される。また、前記マーカーの分析方法が提供される。【００２９】
被験対象の生体由来試料中における３つの比：Ａβ１−３９／Ａβ１−４２、Ａβ１−４０／Ａβ１−４２、及びＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２からなる群から選ばれる少なくとも２つの比を組み合わせることによって、前記３つの比をそれぞれ単独で用いるよりも、脳内のＡβ蓄積状態をより精度よく推定することができる。数学的手法による合成変数は、Ａβ１−３９／Ａβ１−４２、Ａβ１−４０／Ａβ１−４２、及びＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２からなる群から選ばれる少なくとも２つの比を、統計学的見地から推定された重み付けで組み合わせる、もしくは、それぞれ対等な重み付けで組み合わせることができ、前記各比から脳内のＡβ蓄積状態をより精度よく推定することができる。【００３０】
本発明は、脳内のＡβが過剰蓄積されていて認知機能障害も現れているアルツハイマー病進行段階のみならず、その前段階の軽度認知障害（ＭＣＩ）、更には脳内のＡβが過剰に蓄積されているが認知機能障害は現れていないアルツハイマー病の前臨床期段階の検出にも適用可能である。【００３１】
本発明によれば、前記生体由来試料として、血液のみならず、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、糞便、体分泌液（例えば、唾液、涙、汗、鼻粘膜浸出液、及び痰）も用い得る。そのため、アルツハイマー病の予防法ならびに先制的治療法が確立した段階においては、一般の健康診断や人間ドック等において、認知機能正常者に対しても脳内のＡβの蓄積状態を分析することによりアルツハイマー病発症前診断に有効である。【００３２】
被験対象に対して行われた医学的介入の前後において、本発明を適用すれば、アルツハイマー病の治療薬、予防薬の薬効評価、あるいはその他の処置の有効性評価を行い得る。また、本発明は、アルツハイマー病患者の経過観察にも有用である。【００３３】
被験対象に対して１回もしくは経時的に複数回にわたって、本発明を適用すれば、アルツハイマー病の将来の症状の進行予測や、認知症の発症リスクの予測を行い得る。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、実験例１において、Aβ1-39／Aβ1-42について、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図２】図２は、実験例１において、Aβ1-40／Aβ1-42について、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図３】図３は、実験例１において、APP669-711／Aβ1-42について、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図４】図４は、実験例１において、Aβ1-39／Aβ1-42についてのＲＯＣ曲線である。
【図５】図５は、実験例１において、Aβ1-40／Aβ1-42についてのＲＯＣ曲線である。
【図６】図６は、実験例１において、APP669-711／Aβ1-42についてのＲＯＣ曲線である。
【図７】図７は、実験例１において、PiB集積平均値（mcSUVR）とAβ1-39／Aβ1-42比率との散布図である。
【図８】図８は、実験例１において、PiB集積平均値（mcSUVR）とAβ1-40／Aβ1-42比率との散布図である。
【図９】図９は、実験例１において、PiB集積平均値（mcSUVR）とAPP669-711／Aβ1-42比率との散布図である。
【図１０】図１０は、実験例１において、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図１１】図１１は、実験例１において、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図１２】図１２は、実験例１において、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図１３】図１３は、実験例１において、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図１４】図１４は、実験例１において、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。
【図１５】図１５は、実験例１において、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。
【図１６】図１６は、実験例１において、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。
【図１７】図１７は、実験例１において、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。
【図１８】図１８は、実験例１において、PiB集積平均値（mcSUVR）と、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の組み合わせの判別スコアとの散布図である。
【図１９】図１９は、実験例１において、PiB集積平均値（mcSUVR）と、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせの判別スコアとの散布図である。
【図２０】図２０は、実験例１において、PiB集積平均値（mcSUVR）と、Aβ1-40/ Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせの判別スコアとの散布図である。
【図２１】図２１は、実験例１において、PiB集積平均値（mcSUVR）と、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせの判別スコアとの散布図である。
【図２２】図２２は、実験例２において、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図２３】図２３は、実験例２において、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図２４】図２４は、実験例２において、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図２５】図２５は、実験例２において、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図２６】図２６は、実験例２において、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。
【図２７】図２７は、実験例２において、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。
【図２８】図２８は、実験例２において、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。
【図２９】図２９は、実験例２において、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。
【図３０】図３０は、実験例２において、PiB集積平均値（mcSUVR）と、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreとの散布図である。
【図３１】図３１は、実験例２において、PiB集積平均値（mcSUVR）と、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreとの散布図である。
【図３２】図３２は、実験例２において、PiB集積平均値（mcSUVR）と、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreとの散布図である。
【図３３】図３３は、実験例２において、PiB集積平均値（mcSUVR）と、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreとの散布図である。
【図３４】図３４は、実験例３において、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図３５】図３５は、実験例３において、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図３６】図３６は、実験例３において、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図３７】図３７は、実験例３において、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。
【図３８】図３８は、実験例３において、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。
【図３９】図３９は、実験例３において、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。
【図４０】図４０は、実験例３において、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。
【図４１】図４１は、実験例３において、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。
【図４２】図４２は、実験例３において、PiB集積平均値（mcSUVR）と、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreとの散布図である。
【図４３】図４３は、実験例３において、PiB集積平均値（mcSUVR）と、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreとの散布図である。
【図４４】図４４は、実験例３において、PiB集積平均値（mcSUVR）と、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせのz-scoreとの散布図である。
【図４５】図４５は、実験例３において、PiB集積平均値（mcSUVR）と、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreとの散布図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
［１．被験対象］
本発明において、被験対象には、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物（ラット、イヌ、ネコなど）が含まれる。以下、ヒトの場合について主として説明するが、ヒト以外の哺乳動物の場合にも、同様である。
【００３６】
本発明の方法において、これまでの病歴を問わず、健常者と思われる者を含め、どのような者でも被験者とすることができる。健常者と思われる者の場合には、一般の健康診断や人間ドック等において、好ましくは血液検査によって脳内のＡβの蓄積状態を判断することができ、アルツハイマー病の早期発見・診断に特に有効である。また、臨床症状を調べるためのADAS-cog、MMSE、DemTect、SKT、又は時計描画テストのような認知機能検査や、核磁気共鳴画像診断(MRI)や陽電子放出断層撮影法(PET)等の画像所見の確認などにより、アルツハイマー病候補の疑いのある被験者の場合には、本発明の方法により、アルツハイマー病を、脳内アミロイド病変の有無といった根本的な観点から、より正確に診断する判断材料として用いることができる。
【００３７】
［２．生体由来試料］
本発明のマーカーは、被験者の生体由来試料において検出及び分析可能である。従って、本発明の方法においては、被験者の生体由来試料中のマーカーのレベルが分析される。
【００３８】
生体由来試料は、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、糞便、体分泌液（例えば、唾液、涙、汗、鼻粘膜浸出液、及び痰）などから選ぶことができる。これらのうち、一般の健康診断や人間ドック等におけるアルツハイマー病の診断および発症前診断には、血液が好ましい。
【００３９】
血液試料は、マーカーの発現レベルの測定工程に直接供される試料であり、全血、血漿及び血清などが含まれる。血液試料は、被験対象から採取された全血を、適宜処理することによって調製することができる。採取された全血から血液試料の調製を行う場合に行われる処理としては特に限定されず、例えば遠心分離などの臨床医学的に許容されるいかなる処理が行われてもよい。また、測定工程に供される血液試料は、その調製工程の中途段階又は調製工程の後段階において、適宜冷凍など低温下での保存が行われたものであってもよい。なお、本発明において血液試料などの生体由来試料は、由来元の被験者に戻すことなく破棄される。
【００４０】
［３．マーカー］
本発明のマーカーは、生体由来試料中のＡβ１−４２レベルに対するＡβ１−３９レベルの比：Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−４０レベルの比：Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも２つの比の数学的手法による合成変数からなる。これら少なくとも２つの比の数学的手法による合成変数からなるマーカーは、脳内のＡβ蓄積が陰性である認知機能正常者からの血漿試料中の合成変数レベルと、脳内のＡβが過剰に蓄積されている被験者からの血漿試料中の合成変数レベルとの間に有意な差が認められたものである。
【００４１】
ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）（配列番号１）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV
ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号２）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号３）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
【００４２】
アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成る。アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、βセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受け、タンパク質分解によってアミロイド・ベータペプチド（Ａβ）が産生される。ＡＰＰ６７２−７１３とＡβ１−４２とは同じペプチドを表す（配列番号３）。また、ＡＰＰ６７２−７１１とＡβ１−４０とは同じペプチドを表す（配列番号２）。
【００４３】
［４．マーカーの分析］
本発明のマーカーの分析方法は、
被験対象に由来する生体由来試料を、
Ａβ１−４２（配列番号３）と、
Ａβ１−３９（配列番号１）、Ａβ１−４０（配列番号２）、及びＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）からなる群から選ばれる少なくとも２つと
を含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中の
Ａβ１−４２と、
Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、及びＡＰＰ６６９−７１１からなる群から選ばれる前記少なくとも２つと
の各測定レベルを得る測定工程と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−３９レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２；
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−４０レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも２つの比を求める算出工程と、
前記算出された各比から数学的手法で組み合わせた合成変数を導き出す工程と、
被験対象の前記合成変数が、脳内のＡβ蓄積陰性者の前記合成変数を基準レベルとして、前記合成変数の基準レベルよりも高い場合に、被験対象の脳内Ａβの蓄積量は、前記Ａβ蓄積陰性者の脳内Ａβの蓄積量よりも多いと判断する評価工程と、
を含む。これにより、脳内のＡβ蓄積状態を判断する、あるいは判断材料として用いることができる。
【００４４】
マーカーのレベルとは、基本的には濃度を意味するが、当業者が濃度に準じて用いる他の単位、例えば、質量分析における検出イオン強度であってもよい。本発明による生体由来試料中のマーカーの分析は、測定値から導き出された前記合成変数（測定合成変数）と基準値から導き出された前記合成変数（基準合成変数）との比較によって行われる。より正確な分析のため、比較される測定値と基準値とは、同じ条件（前処理条件や保存条件など）で用意された生体由来試料に基づく値であることが好ましい。前記マーカーの基準合成変数としては、PiB-PET画像により脳内のＡβ蓄積が陰性と判断された者についての測定値から導き出された合成変数を用いることができる。あるいは、前記マーカーの基準合成変数として、PiB-PET画像により脳内のＡβ蓄積が陰性であるとされる正常者についての確立された基準合成変数を用いてもよい。
【００４５】
マーカーの測定は、好ましくは、生体分子特異的親和性に基づく検査によって行われる。生体分子特異的親和性に基づく検査は、当業者によく知られた方法であり、特に限定されないが、イムノアッセイが好ましい。具体的には、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）（サンドイッチイムノ法、競合法、及び直接吸着法を含む）、免疫沈降法、沈降反応、免疫拡散法、免疫凝集測定、補体結合反応分析、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが含まれる。イムノアッセイにおいては、生体由来試料中の上記マーカーに結合する抗体を検出する。
【００４６】
本発明において、マーカーの測定を、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ免疫グロブリン、またはアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のペプチドを認識可能な抗原結合部位を含む免疫グロブリン断片を用いて作製された抗体固定化担体を用いて行ってもよい。前記抗体固定化担体を用いた免疫沈降法により質量分析装置での試料中ペプチドの検出を行うことができる（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry； IP-MS）。
【００４７】
また、本発明において、連続的に免疫沈降（Consecutive Immunoprecipitation； cIP）を行い、その後、質量分析装置での試料中ペプチドの検出を行ってもよい（cIP-MS）。２回連続でアフィニティ精製を行うことにより、１回のアフィニティ精製だけでは排除しきれなかった夾雑物質を、２回目のアフィニティ精製によりさらに減少させることができる。このため、夾雑物質によるポリペプチドのイオン化抑制を防ぐことができ、生体試料中の微量なポリペプチドでも質量分析で高感度に計測することが可能となる。
【００４８】
被験対象の生体由来試料中における３つの比：Ａβ１−３９／Ａβ１−４２、Ａβ１−４０／Ａβ１−４２、及びＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２からなる群から選ばれる少なくとも２つの比を組み合わせることによって、前記３つの比をそれぞれ単独で用いるよりも、脳内のＡβ蓄積状態をより精度よく推定することができる。数学的手法による合成変数は、Ａβ１−３９／Ａβ１−４２、Ａβ１−４０／Ａβ１−４２、及びＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２からなる群から選ばれる少なくとも２つの比を、統計学的見地から推定された重み付けで組み合わせる、もしくは、それぞれ対等な重み付けで組み合わせることができ、前記各比から脳内のＡβ蓄積状態をより精度よく推定することができる。
【００４９】
統計学的見地から推定された重み付けで組み合わせる数学的手法として、例えば、前記３つの比から選ばれる少なくとも２つの比を用いて、判別分析、重回帰分析、主成分回帰分析、部分最小二乗、又は、ロジスティック回帰により合成変数を算出する。これを組み合わせた合成変数とするとよい。
【００５０】
対等な重み付けで組み合わせる数学的手法として、例えば、前記３つの比から選ばれる少なくとも２つの比について、前記各比を正規化し、その後に、正規化された前記少なくとも２つの比の平均値又は合計値を導き出し、導き出された平均値又は合計値を、前記少なくとも２つの比の合成変数とする。より具体的には、前記３つの比から選ばれる少なくとも２つの比について、被験対象の全症例に基づく正規化を行うか、又はコントロール群（PiB-群：PiB-PET画像により脳内のＡβ蓄積が陰性であるとされる群）に基づく正規化を行い、その後に、正規化された前記少なくとも２つの比（z-score）の平均値を算出し、これを組み合わせた合成変数とするとよい。
【００５１】
このような数学的手法を用いると、前記３つの比から選ばれる少なくとも２つの比のうちの一方の比が、他の一又は二の比よりも、かなり大きすぎる又は小さすぎる場合においても、それぞれの比を対等な重み付けで組み合わせることができ、組み合わせた合成変数を用いることにより前記各比から脳内のＡβ蓄積状態をより精度よく推定することができる。
【実施例】
【００５２】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。以下において％で示される物の量は、特に断りがない場合は、その物が固体である場合は重量基準、液体である場合は体積基準で示されている。【００５３】
［実験例１］
［１−１．血漿サンプル］
国立長寿医療研究センターにて、PiB-とPiB+のグループに分類された症例の血漿サンプル（７６検体）を用意した。
PiB-（PiB-PET画像により脳内のＡβの蓄積が陰性と判断された者）：５０例
PiB+（PiB-PET画像により脳内のＡβの蓄積が陽性と判断された者）：２６例【００５４】
脳内のＡβの蓄積についての陽性か陰性かを判断するために、被験者の脳のPiB-PET画像を取得した。大脳皮質のPiB 集積量が、非特異的な白質のPiB 集積量よりも多い、もしくは同等であった被験者は陽性と判定した。白質への非特異的な集積のみで、皮質にはほとんど集積が認められない被験者は陰性と判定した。認知機能障害は2011年に発表されたNIA-AA診断基準に準拠して判断した。【００５５】
PiB 集積平均値（mcSUVR:mean cortical Standard Uptake Value Ratio）は、皮質のPiB 集積を定量し、小脳を基準に大脳の集積比を求めた。ただし、PiB- の中で２例の欠損値があった。【００５６】
［１−２．抗体固定化ビーズの用意］
アミロイドβタンパク質（Ａβ）の３−８残基をエピトープとする抗Ａβ抗体（IgG）のクローン6E10（Covance社）を用意した。【００５７】
抗Ａβ抗体（IgG） 100 μgに対して、磁性ビーズ（Dynabeads（登録商標）M-270 Epoxy）約３．３×１０8 個を、固定化緩衝液（１Ｍ  硫酸アンモニウムを含有する０．１Ｍ リン酸緩衝液（pH7.4））中で３７℃、１６〜２４時間反応させることにより、抗Ａβ IgG固定化ビーズを作製した。【００５８】
［１−３．連続免疫沈降法(Consecutive Immunoprecipitation; cIP)］
（第１反応工程）
ヒト血漿250 μLに、安定同位体標識されたAβ1-38（SIL-Aβ1-38）を10 pMで含んでいる第一IP反応緩衝液(0.2%(w/v) DDM, 0.2%(w/v) NTM, 800mM GlcNAc, 100mM Tris-HCl, 300mM NaCl, pH7.4) 250 μLを混合させた後、氷上で５〜３０分間静置させた。SIL-Aβ1-38は、Pheと Ileの炭素原子が13Ｃで置換されているものであり、マススペクトルのシグナル強度を標準化するための内部標準として用いた。その血漿を抗Ａβ IgG固定化ビーズと混ぜて、氷上で１時間振盪させた。【００５９】
（第１洗浄工程、第１溶出工程）
その後、前記抗体ビーズを第一IP洗浄緩衝液（0.1% DDM, 0.1% NTM、50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl）100 μLで３回洗浄、50 mM 酢酸アンモニウム緩衝液50 μLで２回洗浄した後、第一IP溶出液（0.1% DDM含有する50 mM Glycine buffer (pH2.8)）により抗体ビーズに結合しているＡβ及びＡβ様ペプチド（すなわち、ＡＰＰ派生型ペプチド）を溶出させた。【００６０】
（中性化工程）
得られた溶出液を第二IP反応緩衝液(0.2%(w/v) DDM, 800mM GlcNAc, 300mM Tris-HCl, 300mM NaCl, pH7.4)と混合させて、第一精製溶液を得た。【００６１】
（第２反応工程）
得られた第一精製溶液を、別途の抗Ａβ抗体固定化ビーズと混ぜて、氷上で１時間振盪させた。【００６２】
（第２洗浄工程、第２溶出工程）
その後、抗Ａβ抗体固定化ビーズを第二洗浄緩衝液（0.1% DDM, 50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl）50 μLで５回洗浄、50 mM 酢酸アンモニウム緩衝液50 μLで２回洗浄、さらにH2O 30 μLで１回洗浄した後、第二IP溶出液（5 mM 塩酸を含有する70%(v/v) アセトニトリル） 5 μLにより抗体ビーズに結合しているＡβ及びＡβ様ペプチド（ＡＰＰ派生型ペプチド）を溶出させた。このようにして、第二精製溶液を得た。第二精製溶液を質量分析に供した。【００６３】
n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) [臨界ミセル濃度cmc: 0.009%]
n-Nonyl-β-D-thiomaltoside (NTM) [cmc: 0.116%]【００６４】
［１−４．MALDI-TOF MSによる検出］
Linear TOF用のマトリックスとして、α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)を用いた。マトリックス溶液はCHCA 1 mgを70%(v/v) アセトニトリル 1 mLで溶解することによって調製した。マトリックス添加剤として、0.4%(w/v) methanediphosphonic acid (MDPNA)を用いた。1 mg/mL CHCA溶液と0.4%(w/v) MDPNA を等量混合した後、その0.5 μLをμFocus MALDI plateTM 900 μm (Hudson Surface Technology, Inc., Fort Lee, NJ)上へ滴下し、乾固させた。【００６５】
上記の免疫沈降で得られた第二精製溶液を1 μL取り、μFocus MALDI plateTM 900 μm上のマトリックスへ滴下した。【００６６】
マススペクトルデータはAXIMA Performance (Shimadzu/KRATOS, Manchester, UK)を用いて、ポジティブイオンモードのLinear TOFで取得した。１ wellに対して400スポット、16,000ショットずつ積算した。ピークの検出限界の基準はＳ／Ｎ比３以上とした。Linear TOFのｍ／ｚ値はピークのアベレージマスで表示した。ｍ／ｚ値は外部標準としてhuman angiotensin IIとhuman ACTH fragment 18-39、bovine insulin oxidized beta-chain、bovine insulinを用いてキャリブレーションした。【００６７】
［１−５．Ａβ及びＡβ様ペプチドのピーク強度の標準化］
各マススペクトルにおいて、各Ａβ及びＡβ様ペプチド（ＡＰＰ派生型ペプチド）のシグナル強度を内部標準ペプチド（SIL-Aβ1-38）のシグナル強度で除することにより、Ａβ及びＡβ様ペプチドのシグナル強度を標準化した。その後、１検体につき４つのマススペクトルから得られる各ＡＰＰ派生型ペプチドの標準化強度（Normalized intensity）の平均値を求めて、統計解析に用いた。ここで、平均化に用いる４つのNormalized intensityの中で、中央値の0.7〜1.3倍の範囲から外れたNormalized intensityは外れ値とみなして、平均化のデータ処理から外した。検出下限に達しない（Ｓ／Ｎ＜３）、あるいは、外れ値が出て、平均化に用いるNormalized intensityのデータ数が３つ未満であった場合は検出不可とした。【００６８】
［１−６．統計］
PiB- とPiB+ との群間比較には、ｔ検定を用いて評価した。PiB- とPiB+ とを判別する性能を評価するために受信者動作特性ＲＯＣ（Receiver Operatorating Characteristic）曲線を用いて、その曲線以下の面積（ＡＵＣ：area under the curve）、感度（Sensitivity）、特異度（Specificity）、及び正診率（Accuracy）を求めた。全ての検定は両側検定で行い、有意水準をＰ＜0.05とした。各マーカー値とmcSUVRとの相関解析では、ピアソンの積率相関係数（Pearson product-moment correlation coefficient）を用いて評価した。ただし、mcSUVR で２例の欠損値があるため７４例で解析した。【００６９】
［１−７．各マーカーの群間比較］
Aβ1-42のNormalized intensityに対するAβ1-39、Aβ1-40、又はAPP669-711のNormalized intensityの比率（Aβ1-39／Aβ1-42、Aβ1-40／Aβ1-42、APP669-711／Aβ1-42）をマーカーとして、PiB- とPiB+ との群間比較を行った（図１，２，３）。ｔ検定を行ったときのＰ値はいずれもＰ＜0.001であり、PiB- に比べてPiB+ では統計学的有意に増加していることが示された。【００７０】
図１は、Aβ1-39／Aβ1-42について、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。同様に、図２は、Aβ1-40／Aβ1-42について、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。図３は、APP669-711／Aβ1-42について、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。いずれも単独マーカーについての結果である。【００７１】
箱ひげ図において、各群において、箱で示された範囲は、全検体のうち強度比順位が２５〜７５％に当たるサンプルの強度比分布範囲（四分位範囲）を表し、箱の上下に示す横線は、箱の上端及び下端から四分位範囲の１．５倍までの範囲内にあるサンプルのそれぞれ最大値及び最小値を表し、箱中の横棒は強度比の中央値を表す。以下の各箱ひげ図においても同じである。【００７２】
［１−８．各マーカーのＲＯＣ解析］
Aβ1-39／Aβ1-42、Aβ1-40／Aβ1-42、及びAPP669-711／Aβ1-42の判定性能を評価するために、PiB+ を陽性として、PiB- 群に対するPiB+ 群のＲＯＣ解析を行った（図４，５，６）。その結果、Aβ1-39／Aβ1-42が最も高いＡＵＣ＝0.898を示し、その次にAPP669-711／Aβ1-42が高いＡＵＣ＝0.894を示し、Aβ1-40／Aβ1-42はＡＵＣ＝0.828を示した。いずれのマーカーもＡＵＣが0.8以上であり、PiB- 群とPiB+ 群とを精度よく判別可能であることを示している。【００７３】
図４は、Aβ1-39／Aβ1-42についてのＲＯＣ曲線である。同様に、図５は、Aβ1-40／Aβ1-42についてのＲＯＣ曲線である。図６は、APP669-711／Aβ1-42についてのＲＯＣ曲線である。いずれも単独マーカーについての結果である。【００７４】
各マーカーのＲＯＣ曲線で、“sensitivity＋specificity−１”が最も高い値をカットオフ値に設定した。設定したカットオフ値と、その値におけるSensitivity、Specificity、及びAccuracyを表１に示す。Aβ1-39／Aβ1-42が最も高いAccuracy=0.855を示した。表１において、番号１〜３は、単独マーカーを解析したものである。【００７５】
【表１】
2017047529.tif 000003
【００７６】
［１−９．各マーカー値とmcSUVRとの相関解析］
Aβ1-39／Aβ1-42、Aβ1-40／Aβ1-42、及びAPP669-711／Aβ1-42が脳内アミロイド蓄積量を反映しているかどうかを調べるために、各指標とmcSUVRとの相関を解析した（図７，８，９、表１）。その結果、３つのマーカー全てでピアソンの積率相関係数（r）は0.4以上となり相関があることが示されたが、特にAβ1-39／Aβ1-42の相関係数（r）は0.630と最も強い相関を示した。【００７７】
Aβ1-39／Aβ1-42、Aβ1-40／Aβ1-42、及びAPP669-711／Aβ1-42は脳内アミロイド蓄積状態の判定に有用な指標となり得ることを示している。今回の７６症例に対する解析ではAβ1-39／Aβ1-42が最も優れた判定性能を示していた。【００７８】
図７は、Aβ1-39／Aβ1-42について、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-39／Aβ1-42比率を示す散布図である。同様に、図８は、Aβ1-40／Aβ1-42について、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-40／Aβ1-42比率を示す散布図である。図９は、APP669-711／Aβ1-42について、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAPP669-711／Aβ1-42比率を示す散布図である。いずれも単独マーカーについての結果である。また、図中の「○」はPiB- 群を示し、「●」はPiB+ 群を示している。以下の散布図においても同じである。【００７９】
［１−１０．判別分析を用いたマーカーの組み合わせ方法］
Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42、及びAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせ、並びに、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーの組み合わせで判別分析を行い、それぞれの判別関数ｚを得た。判別関数ｚを用いて、組み合わせるマーカー値から判別スコアを求めた。【００８０】
判別関数zを用いて、組み合わせるマーカー値から判別スコアを求め、その後に、次の統計解析を行った。【００８１】
［１−１１．判別スコアによる群間比較］
各マーカーの組み合わせで得られた判別スコアについて、PiB- とPiB+ との群間比較を行った（図１０，１１，１２，１３）。ｔ検定を行ったときのＰ値はいずれもＰ＜0.001であり、組み合わせた場合でも、PiB- に比べてPiB+ で統計学的有意に増加していることが確認された。【００８２】
図１０は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。同様に、図１１は、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。図１２は、Aβ1-40/ Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。図１３は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。【００８３】
［１−１２．判別スコアによるＲＯＣ解析］
判別スコアの判定性能を評価するために、PiB+ を陽性として、PiB- 群に対するPiB+ 群のＲＯＣ解析を行った（図１４，１５，１６，１７）。その結果、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42（図１４）、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42（図１５）、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42（図１６）の２マーカーによる組み合わせ、及び、３マーカーによる組み合わせ（図１７）は、それぞれ単独マーカーよりも高いＡＵＣであり、0.9以上を示した（図１４，１５，１６，１７、表２）。つまり、マーカーを組み合わせることにより判別性能が向上して、非常に高い精度でPiB- とPiB+ とを判別できるようになった。今回のＲＯＣ解析ではAβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせが最も高いＡＵＣを示した。【００８４】
図１４は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。同様に、図１５は、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。図１６は、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。図１７は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。【００８５】
判別スコア＞０のときPiB+ と判別し、判別スコア＜０のときPiB- と判別する。すなわち、カットオフ値を０としたときの各組み合わせにおけるSensitivity、Specificity、及びAccuracyを表２（番号：１１，１２，１３，１４）に示す。全ての組み合わせにおいて、それぞれ単独マーカーよりも高いAccuracyを示した。つまり、マーカーを組み合わせることにより正しく判定する確率が向上した。今回の解析では、３マーカーによる組み合わせが、最も高いAccuracyを示した。表２において、番号１１〜１４は、各マーカー値を用いて判別分析を行い、組み合わせたマーカーの判別スコアを解析に用いたものである。【００８６】
【表２】
2017047529.tif 000004
【００８７】
［１−１３．判別スコアによるmcSUVRとの相関解析］
組み合わせたマーカーの判別スコアが脳内アミロイド蓄積量を反映しているかどうかを調べるために、それぞれの判別スコアとmcSUVRとの相関を解析した。Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42、及びAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42、の２マーカーによる組み合わせ、並びに、３マーカーによる組み合わせは、それぞれ単独マーカーよりもピアソンの積率相関係数（r）が向上しており、PiB集積度をより良く反映する結果となった（図１８，１９，２０，２１、表２）。今回の相関解析では、３マーカーによる組み合わせが、最も高い相関係数を示した。【００８８】
図１８は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の組み合わせの判別スコアを示す散布図である。同様に、図１９は、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせの判別スコアを示す散布図である。図２０は、Aβ1-40/ Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-40/ Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせの判別スコアを示す散布図である。図２１は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについて、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせの判別スコアを示す散布図である。【００８９】
［実験例２］
［２−１．全検体の分布に基づく正規化を用いたマーカーの組み合わせ方法］
各マーカーの値を組み合わせるときに、各数値をそのまま平均したり足し算をすると、その組み合わせ値は数値の大きいマーカーからの影響が大きくなってしまう。そこで、各マーカーを同等に組み合わせるために、まず、Aβ1-39／Aβ1-42、Aβ1-40／Aβ1-42、及びAPP669-711／Aβ1-42それぞれについて、全７６症例の分布に基づく正規化を行った。正規化は、全７６症例のマーカー値の平均値（Ｘ）と標準偏差（Ｓ）を求め、各サンプルのマーカー値（ｘi）を次の式により、z-score（ｚi）へ変換した。【００９０】
ｚi＝（ｘi−Ｘ）／Ｓ【００９１】
組み合わせるマーカーのz-scoreを平均した後に、次の統計解析を行った。【００９２】
Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42、及びAβ1-40/ Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせ、並びに、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせを実施した。【００９３】
［２−２．マーカーの組み合わせによる群間比較］
各マーカーを組み合わせたz-scoreについて、PiB- とPiB+ との群間比較を行った（図２２，２３，２４，２５）。ｔ検定を行ったときのＰ値はいずれもＰ＜0.001であり、組み合わせた場合でも、PiB- に比べてPiB+ で統計学的有意に増加していることが確認された。【００９４】
図２２は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。同様に、図２３は、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。図２４は、Aβ1-40/ Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。図２５は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。【００９５】
［２−３．マーカーの組み合わせによるＲＯＣ解析］
組み合わせたマーカーの判定性能を評価するために、PiB+ を陽性として、PiB- 群に対するPiB+ 群のＲＯＣ解析を行った（図２６，２７，２８，２９）。その結果、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42（図２７）、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42（図２８）の２マーカーによる組み合わせ、及び、３マーカーによる組み合わせ（図２９）は、それぞれ単独マーカーよりも高いＡＵＣであり、0.9以上を示した（図２７，２８，２９、表３）。つまり、マーカーを組み合わせることにより判別性能が向上して、非常に高い精度でPiB- とPiB+ とを判別できるようになった。今回のＲＯＣ解析ではAβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせが最も高いＡＵＣを示した。【００９６】
図２６は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。同様に、図２７は、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。図２８は、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。図２９は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。【００９７】
各組み合わせのＲＯＣ曲線で、“sensitivity＋specificity−１”が最も高い値をカットオフ値に設定した。設定したカットオフ値と、その値におけるSensitivity、Specificity、及びAccuracyを表３（番号：２１，２２，２３，２４）に示す。全ての組み合わせにおいて、それぞれ単独マーカーよりも高いAccuracyを示した。つまり、マーカーを組み合わせることにより正しく判定する確率が向上した。今回の解析では、３マーカーによる組み合わせが、最も高いAccuracyを示した。表３において、番号２１〜２４は、各マーカー値に対して全検体の分布に基づいて正規化した後に、組み合わせるマーカーを平均した数値を解析に用いたものである。【００９８】
【表３】
2017047529.tif 000005
【００９９】
［２−４．マーカーの組み合わせによるmcSUVRとの相関解析］
組み合わせたマーカーのz-scoreが脳内アミロイド蓄積量を反映しているかどうかを調べるために、それぞれのz-scoreとmcSUVRとの相関を解析した。Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42、及びAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42、の２マーカーによる組み合わせ、並びに、３マーカーによる組み合わせは、それぞれ単独マーカーよりもピアソンの積率相関係数（r）が向上しており、PiB集積度をより良く反映する結果となった（図３０，３１，３２，３３、表３）。今回の相関解析では、３マーカーによる組み合わせが、最も高い相関係数を示した。【０１００】
図３０は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreを示す散布図である。同様に、図３１は、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreを示す散布図である。図３２は、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-40/ Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせのz-scoreを示す散布図である。図３３は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについて、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreを示す散布図である。【０１０１】
［実験例３］
［３−１．コントロール群の分布に基づく正規化を用いたマーカーの組み合わせ方法］
実施例１においては、各マーカー値を組み合わせるために、PiB- 群とPiB+ 群を全て含めた７６症例の分布に基づいて正規化を行った。この実施例３においては、コントロールとなるPiB- 群の５０症例の分布に基づく正規化を行い、組み合わせの評価を実施した。正規化は、PiB- 群５０症例のマーカー値の平均値（Ｘ）と標準偏差（Ｓ）を求め、各マーカー値（ｘi）を次の式により、z-score（ｚi）へ変換した。【０１０２】
ｚi＝（ｘi−Ｘ）／Ｓ【０１０３】
組み合わせるマーカーのz-scoreを平均した後に、次の統計解析を行った。【０１０４】
実施例１におけるのと同様に、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42、及びAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42、の２マーカーによる組み合わせ、並びに、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせを実施した。【０１０５】
［３−２．マーカーの組み合わせによる群間比較］
各マーカーを組み合わせたz-scoreについて、PiB- とPiB+ の群間比較を行った（図３４，３５，３６，３７）。t検定を行ったときのＰ値はいずれもＰ＜0.001であった。PiB- 群に基づく正規化を用いた場合でも、PiB- に比べてPiB+ で統計学的有意に増加していることが確認された。【０１０６】
図３４は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。同様に、図３５は、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。図３６は、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。図３７は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについて、PiB- とPiB+ との群間比較を示す箱ひげ図である。【０１０７】
［３−３．マーカーの組み合わせによるＲＯＣ解析］
組み合わせたマーカーの判定性能を評価するために、PiB+ を陽性として、PiB- 群に対するPiB+ 群のＲＯＣ解析を行った（図３８，３９，４０，４１）。その結果、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42（図３９）、及びAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42（図４０）の２マーカーによる組み合わせ、並びに、３マーカーによる組み合わせ（図４１）は、それぞれ単独マーカーよりも高いＡＵＣであり、0.9以上を示した（図３９，４０，４１、表４）。つまり、PiB- 群に基づく正規化を用いた場合でも、マーカーを組み合わせることにより判別性能が向上して、非常に高い精度でPiB- とPiB+ とを判別できるようになった。このＲＯＣ解析においても、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせが最も高いＡＵＣを示した。【０１０８】
図３８は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。同様に、図３９は、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。図４０は、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。図４１は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについてのＲＯＣ曲線である。【０１０９】
各組み合わせのＲＯＣ曲線で、“sensitivity＋specificity−１”が最も高い値をカットオフ値に設定した。設定したカットオフ値と、その値におけるSensitivity、Specificity、及びAccuracyを表４に示す。全ての組み合わせにおいて、それぞれ単独マーカーよりも高いAccuracyを示した。つまり、マーカーを組み合わせることにより正しく判定する確率が向上した。この解析では、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせが、最も高いAccuracyを示した。表４において、番号３１〜３４は、各マーカー値に対してPiB- 群５０症例の分布に基づいて正規化した後に、組み合わせるマーカーを平均した数値を解析に用いたものである。【０１１０】
【表４】
2017047529.tif 000006
【０１１１】
［３−４．マーカーの組み合わせによるmcSUVRとの相関解析］
組み合わせたマーカーのz-scoreが脳内アミロイド蓄積量を反映しているかどうかを調べるために、それぞれのz-scoreとmcSUVRとの相関を解析した。Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42、及びAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせ、並びに、３マーカーによる組み合わせは、それぞれ単独マーカーよりもピアソンの積率相関係数（r）が向上していた（図４２，４３，４４，４５、表４）。つまり、PiB- 群に基づく正規化を用いた場合でも、組み合わせることによりPiB集積度をより良く反映する結果となった。この相関解析では、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせが、最も高い相関係数を示した。【０１１２】
図４２は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreを示す散布図である。同様に、図４３は、Aβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-39／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreを示す散布図である。図４４は、Aβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせについて、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の２マーカーによる組み合わせのz-scoreを示す散布図である。図４５は、Aβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の３マーカーによる組み合わせについて、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAβ1-39／Aβ1-42とAβ1-40／Aβ1-42とAPP669-711／Aβ1-42の組み合わせのz-scoreを示す散布図である。【０１１３】
以上の解析結果より、マーカー単独で使用するよりも組み合わせることでPiB- とPiB+ との判別精度が向上し、PiB集積度との相関も強くなることが判明した。つまり、Aβ1-39／Aβ1-42、Aβ1-40／Aβ1-42、及びAPP669-711／Aβ1-42の血中マーカーを組み合わせることにより、各マーカーが相補的に脳内アミロイド蓄積をより精度よく検出する効果があることを示している。また、組み合わせ方法としては、各マーカーを用いた判別分析であっても、各マーカー値を正規化した後に組み合わせる方法であっても、マーカーの組み合わせによる効果が認められた。各マーカー値を正規化する方法としては、全検体を基にした正規化であってもPiB- 群を基にした正規化であっても、マーカーの組み合わせによる効果があることが示された。【０１１４】
以上例証した結果は、本発明の組み合わせマーカーは、脳内Ａβ蓄積状態を判断する血中マーカーとして有用であることを示している。また、そのことによりアルツハイマー病診断の補助ならびに発症前診断に活用することができることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成29年7月10日(2017.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来試料中のＡβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡβ１−３９（配列番号１）レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２
と、
Ａβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡβ１−４０（配列番号２）レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２（配列番号３）レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも１つの比と
の組み合わせからなる、脳内のＡβ蓄積状態を判断するマーカー。
【請求項２】
被験対象に由来する生体由来試料を、
Ａβ１−４２（配列番号３）と、
Ａβ１−３９（配列番号１）と、
Ａβ１−４０（配列番号２）、及びＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）からなる群から選ばれる少なくとも１つと
を含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中の
Ａβ１−４２と、
Ａβ１−３９と、
Ａβ１−４０、及びＡＰＰ６６９−７１１からなる群から選ばれる前記少なくとも１つと
の各測定レベルを得る測定工程と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−３９レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２
と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−４０レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも１つの比と
を求める算出工程と、
前記算出された各比から数学的手法で組み合わせた合成変数を導き出す工程と、
被験対象の前記合成変数が、脳内のＡβ蓄積陰性者の前記合成変数を基準レベルとして、前記合成変数の基準レベルよりも高い場合に、被験対象の脳内Ａβの蓄積量は、前記Ａβ蓄積陰性者の脳内Ａβの蓄積量よりも多いと判断する評価工程と、
を含む脳内のＡβ蓄積状態を判断する分析方法。
【請求項３】
被験対象に対して行われた医学的介入の前後それぞれにおいて、
被験対象に由来する生体由来試料を、
Ａβ１−４２（配列番号３）と、
Ａβ１−３９（配列番号１）と、
Ａβ１−４０（配列番号２）、及びＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）からなる群から選ばれる少なくとも１つと
を含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中の
Ａβ１−４２と、
Ａβ１−３９と、
Ａβ１−４０、及びＡＰＰ６６９−７１１からなる群から選ばれる前記少なくとも１つと
の各測定レベルを得る測定工程と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−３９レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２
と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−４０レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも１つの比と
を求める算出工程と、
前記算出された各比から数学的手法で組み合わせた合成変数を導き出す工程と、
を含む検査を行い、
医学的介入の前における被験対象の前記合成変数と、医学的介入の後における被験対象の前記合成変数との比較を行い、脳内のＡβ蓄積状態に関して前記医学的介入の有効性を判断する分析方法。
【請求項４】
被験対象に対して１回もしくは経時的に複数回にわたって、
被験対象に由来する生体由来試料を、
Ａβ１−４２（配列番号３）と、
Ａβ１−３９（配列番号１）と、
Ａβ１−４０（配列番号２）、及びＡＰＰ６６９−７１１（配列番号４）からなる群から選ばれる少なくとも１つと
を含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中の
Ａβ１−４２と、
Ａβ１−３９と、
Ａβ１−４０、及びＡＰＰ６６９−７１１からなる群から選ばれる前記少なくとも１つと
の各測定レベルを得る測定工程と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−３９レベルの比：
Ａβ１−３９／Ａβ１−４２
と、
Ａβ１−４２レベルに対するＡβ１−４０レベルの比：
Ａβ１−４０／Ａβ１−４２；  及び
Ａβ１−４２レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／Ａβ１−４２
からなる群から選ばれる少なくとも１つの比と
を求める算出工程と、
前記算出された各比から数学的手法で組み合わせた合成変数を導き出す工程と、
を含む検査を行い、
１回もしくは経時的複数回における被験対象の前記合成変数の値に基づいて、被験対象の脳内のＡβ蓄積状態について、将来の症状の進行予測や、認知症の発症リスクの予測を行う分析方法。
【請求項５】
前記数学的手法が、判別分析、重回帰分析、主成分回帰分析、部分最小二乗、ロジスティック回帰を用いる方法である、請求項２〜４のいずれかに記載の分析方法。
【請求項６】
前記数学的手法が、前記各比を正規化した後に、正規化された前記少なくとも２つの比の平均値又は合計値を導き出す方法である、請求項２〜４のいずれかに記載の分析方法。
【請求項７】
前記生体由来試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる、請求項２〜６のいずれかに記載の分析方法。
【国際調査報告】
2017047529.tif 000052
2017047529.tif 000053
2017047529.tif 000054
2017047529.tif 000055