(57)【要約】【課題】  本発明は、α−１，４グルカンに作用し、ＣＤを受容体としてα−１，４グルカンをα−１，６転移することにより、分岐ＣＤを従来の工程より簡素な工程で製造することが出来る新規α−グルカン転移酵素とそれらの製造方法並びに用途を提供することを課題とするものである。【解決手段】  本発明は、重合度が４以上のα−１，４グルカンに作用して重合度２以上のα−１，４グルカンを生成し、生成した重合度２以上のα−１，４グルカンをα−、β−及びγ−サイクロデキストリンのグルコース残基にα−１，６転移する活性を有する新規α−グルカン転移酵素と当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換微生物、当該酵素の製造方法、当該酵素を用いた分岐ＣＤの製造方法並びに用途を提供することによって上記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
重合度が４以上のα−１，４グルカンに作用してそれよりも重合度が小さい重合度２以上のα−１，４グルカンを生成し、生成した重合度２以上のα−１，４グルカンをα−、β−及びγ−サイクロデキストリンのグルコース残基にα−１，６転移する活性を有するα−グルカン転移酵素。
【請求項２】
下記の（１）乃至（３）に示す部分アミノ酸配列を有する請求項１記載のα−グルカン転移酵素：
（１）Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ；
（２）Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；
（３）Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ。
【請求項３】
配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列か、該アミノ酸配列において、α−グルカン転移酵素の活性を保持する範囲で１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する請求項１又は２に記載のα−グルカン転移酵素。
【請求項４】
バチルス属、アノキシバチルス属、及びサーモアナエロバクター属のいずれかの微生物に由来する請求項１乃至３のいずれかに記載のα−グルカン転移酵素。
【請求項５】
バチルス属微生物がバチルス・アシディセラー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｃｅｌｅｒ）、アノキシバチルス属微生物がアノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）、及びサーモアナエロバクター属微生物がサーモアナエロバクター・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ）である請求項４記載のα−グルカン転移酵素。
【請求項６】
バチルス・アシディセラーが、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６）又はその変異株である請求項５記載のα−グルカン転移酵素。
【請求項７】
下記＜ａ＞乃至＜ｃ＞のいずれかの理化学的性質を有する請求項１乃至６のいずれかに記載のα−グルカン転移酵素：
＜ａ＞
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、１６０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、２０分間反応の条件下で、５５℃；
（３）至適ｐＨ
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、４０℃、２０分間反応の条件下で６．０；
（４）温度安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で５０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ５．０乃至９．０で安定；
＜ｂ＞
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、１６０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、６０℃；
（３）至適ｐＨ
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、５０℃、３０分間反応の条件下で７．５；
（４）温度安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で７０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．５乃至１０．５で安定；
＜ｃ＞
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、１００，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、２０分間反応の条件下で、１００℃；
（３）至適ｐＨ
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、６０℃、２０分間反応の条件下で６．５；
（４）温度安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で８５℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．０乃至１１．０で安定。
【請求項８】
請求項３記載のα−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
配列表における配列番号４乃至６のいずれかで示される塩基配列か、該塩基配列において、コードする酵素の活性を保持する範囲で１個又は２個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列、又はそれらに相補的な塩基配列を有する請求項８記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
遺伝子コードの縮重に基づき、コードするアミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号４乃至６のいずれかで示される塩基配列における塩基の１個又は２個以上を他の塩基で置換した請求項８又は９記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項８乃至１０のいずれかに記載のＤＮＡと、自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡ。
【請求項１２】
請求項１１記載の組換えＤＮＡを適宜の宿主微生物に導入してなる形質転換微生物。
【請求項１３】
請求項１乃至７のいずれかに記載のα−グルカン転移酵素の産生能を有するバチルス属、アノキシバチルス属、サーモアナエロバクター属のいずれかの微生物を栄養培地で培養して得られる培養物から、請求項１乃至７のいずれかに記載のα−グルカン転移酵素を採取することを特徴とするα−グルカン転移酵素の製造方法。
【請求項１４】
バチルス属微生物が、バチルス・アシディセラー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｃｅｌｅｒ）  Ｒ６１（独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６）又はこれらの変異株であり、アノキシバチルス属微生物が、アノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）  ＮＢＲＣ１５３１７又はその変異株であり、サーモアナエロバクター属微生物が、サーモアナエロバクター・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ）  ＡＴＣＣ３５０４７又はその変異株である請求項１３記載のα−グルカン転移酵素の製造方法。
【請求項１５】
請求項１２記載の形質転換微生物を培養し、培養物から組換え型α−グルカン転移酵素を採取することを特徴とする組換え型α−グルカン転移酵素の製造方法。
【請求項１６】
重合度４以上のα−１，４グルカンとサイクロデキストリンとを含んでなる糖液に、請求項１乃至７のいずれかに記載のα−グルカン転移酵素を作用させて、分岐サイクロデキストリンを生成せしめる工程と、これを採取する工程とを含んでなる分岐サイクロデキストリン又はこれを含有する糖質の製造方法。
【請求項１７】
重合度４以上のα−１，４グルカンとサイクロデキストリンとを含んでなる糖液を重合度が４以上のα−１，４グルカンに澱粉枝切り酵素及びサイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼを作用させてサイクロデキストリンを生成せしめることを特徴とする請求項１６項記載の分岐サイクロデキストリン又はこれを含有する糖質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規α−グルカン転移酵素とその製造方法並びに用途、さらには、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡに関し、詳細には、重合度が４以上のα−１，４グルカンに作用し、α−、β−及びγ−サイクロデキストリンのグルコース残基に重合度２以上のα−１，４グルカンをα−１，６転移する活性を有するα−グルカン転移酵素とその製造方法、α−グルカン転移酵素を産生する微生物、当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡと形質転換微生物、並びに当該酵素を用いる分岐サイクロデキストリン又はこれを含む糖質の製造方法及びそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイクロデキストリン（以下、「ＣＤ」と略称する）は、６乃至１２個のグルコースがα−１，４グルコシド結合で環状に結合した非還元性のオリゴ糖で、特にグルコース６、７及び８個より成るα−、β−及びγ−ＣＤが良く知られている。ＣＤは、環の外周は親水性であり、環の内側の空洞は疎水性である両性物質であって、その疎水性空洞に各種の分子等を安定に包み込む包接機能を有している。
【０００３】
このため、ＣＤを用いれば揮発性物質の不揮発化や、不快臭のマスキング等が可能であることから、ＣＤは、医薬品、食品、化粧品等の幅広い分野で利用されている。しかしながら、α−ＣＤ及びβ−ＣＤは低温における溶解性が低い（数％以下）という欠点を有している。この欠点を改善するため、分岐サイクロデキストリン（以下、「分岐ＣＤ」と略称する）が開発された。分岐ＣＤは、ＣＤ分子中のグルコース残基にα−１，６結合でグルコシル基，マルトシル基，マルトオリゴシル基などが結合した構造をしており、水への溶解性が非常に良好であるなど、分岐を有さない本来のＣＤには見られない特徴を有している。
【０００４】
従来の分岐ＣＤの工業的な製法としては、マルトースとＣＤの高濃度溶液に枝切り酵素であるプルラナーゼを作用させ、加水分解反応の逆反応である縮合反応を利用してマルトースをα−１，６結合で結合させたマルトシル分岐ＣＤを合成する方法が知られている（特許文献１及び２を参照）。縮合反応を利用したマルトシル分岐ＣＤの製造方法の具体的な工程については、例えば、非特許文献１に記載されているもの（図１を参照）がある。図１に示されるように、縮合反応によりマルトシル分岐ＣＤを製造する場合には、反応の効率を上げるために、ＣＤと、ＣＤに対して４乃至５倍重量のマルトースを含有する混合液を原料として調製しなくてはならない。従って、澱粉懸濁液にサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（以下、ＣＧＴａｓｅと略称する）を作用させてＣＤを生成させ、さらにプルラナーゼを作用させてマルトシル分岐ＣＤを製造するためには、図１における分画後のマルトースをＣＤとマルトースの混合液に添加しているように、別途、外部からマルトースを添加する工程が必須のものとなる。さらに、プルラナーゼによる縮合反応後の糖液はマルトシル分岐ＣＤ以外に大量のマルトースを含むので、製品とするためにクロマトグラフィーによりマルトースを除去する工程も必須のものとなっている。これら２つの工程が必須であるために、マルトシル分岐ＣＤの製造工程は煩雑なものとならざるを得ないという欠点があった。斯かる状況下において、より簡素な工程にて分岐ＣＤを製造できる方法及びその方法に用いることが出来る酵素が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特公昭６１−７０９９６号公報
【特許文献２】特公昭６１−９２５９２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】「オリゴ糖の製法開発と食品への応用」、５７頁、シーエムシー出版（２０１２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、α−１，４グルカンに作用し、ＣＤを受容体としてα−１，４グルカンをα−１，６転移することにより、分岐ＣＤを従来の工程より簡素な工程で製造することが出来る新規α−グルカン転移酵素とそれらの製造方法並びに用途を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決するために、澱粉や比較的低重合度のマルトデキストリンに作用し、ＣＤに対してα−１，４グルカンをα−１，６転移する新規な酵素を想定し、目的とする酵素を産生する微生物を広く検索してきた。その結果、土壌から単離した微生物、バチルス・アシディセラー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｉｃｅｌｅｒ）  Ｒ６１株が、重合度が４以上のα−１，４グルカンに作用し、α−、β−及びγ−ＣＤのグルコース残基に重合度２以上のα−１，４グルカンをα−１，６転移する活性を有する新規なα−グルカン転移酵素を菌体外に産生することを見出した。さらに、他の微生物にも同様の酵素活性が存在するか否かを広く検討した結果、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びサーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属微生物も本酵素を産生することが判明した。既知のα−グルカン転移酵素である、ブランチング酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）、ＣＧＴａｓｅ（ＥＣ  ２．４．１．１９）において、ＣＤにα−１，４グルカンをα−１，６転移する酵素は出願人の知る限り知られておらず、本α−グルカン転移酵素は新規のものであると考えられた。
【０００９】
さらに本発明者等は、これらの新規なα−グルカン転移酵素を利用すると、マルトースを添加する工程及びマルトースをクロマトグラフィーにて除去する工程を行うことなく、例えば図２に示すような、従来より簡素な工程で澱粉液化液から分岐ＣＤを製造できることを見出し本発明を完成した。なお、本α−グルカン転移酵素により生成する分岐ＣＤはマルトシル分岐のもの以外も含んでいるが、それらの分岐ＣＤもマルトシル分岐ＣＤと同様に水への溶解性が非常に良好であり同等のものとして用いることが出来る。
【００１０】
すなわち、重合度が４以上のα−１，４グルカンに作用してそれよりも重合度が小さい重合度２以上のα−１，４グルカンを生成し、生成した重合度２以上のα−１，４グルカンをα−、β−及びγ−サイクロデキストリンのグルコース残基にα−１，６転移する活性を有する新規α−グルカン転移酵素と当該酵素をコードするＤＮＡとこれを含んでなる組換えＤＮＡ及び形質転換微生物、当該酵素の製造方法、当該酵素を用いた分岐ＣＤの製造方法並びに用途を提供することによって上記課題を解決するものである。
【００１１】
バチルス・アシディセラー  Ｒ６１株、アノキシバチルス属及びサーモアナエロバクター属由来のα−グルカン転移酵素は、下記（１）乃至（３）に示す部分アミノ酸配列を共通して有していた。従って、本発明は下記（１）乃至（３）に示す部分アミノ酸配列を有するα−グルカン転移酵素を提供することで上記の課題を解決するものである。
（１）Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ；
（２）Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；
（３）Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ；
【００１２】
さらに、本発明は、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列、及び該アミノ酸配列において、α−グルカン転移酵素の活性を保持する範囲で１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する、α−グルカン転移酵素を提供することで上記課題を解決するものである。
【００１３】
また、本発明は、バチルス属、アノキシバチルス属、及びサーモアナエロバクター属のいずれかの微生物に由来するα−グルカン転移酵素、好ましくは、バチルス属微生物がバチルス・アシディセラー、アノキシバチルス属微生物がアノキシバチルス・フラビサーマス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｉｔｈｅｒｍｕｓ）、及びサーモアナエロバクター属微生物がサーモアナエロバクター・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒｏｃｋｉｉ）であるα−グルカン転移酵素、さらに好ましくは、バチルス・アシディセラーが、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６）又はその変異株であるα−グルカン転移酵素を提供することで上記の課題を解決するものである。
【００１４】
また、本発明は、下記＜ａ＞乃至＜ｃ＞のいずれかの理化学的性質を有するα−グルカン転移酵素を提供することで上記の課題を解決するものである。
＜ａ＞
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、１６０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、２０分間反応の条件下で、５５℃；
（３）至適ｐＨ
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、４０℃、２０分間反応の条件下で６．０；
（４）温度安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で５０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ５．０乃至９．０で安定；
＜ｂ＞
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、１６０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、６０℃；
（３）至適ｐＨ
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、５０℃、３０分間反応の条件下で７．５；
（４）温度安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で７０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．５乃至１０．５で安定；
＜ｃ＞
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、１００，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、２０分間反応の条件下で、１００℃；
（３）至適ｐＨ
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、６０℃、２０分間反応の条件下で６．５；
（４）温度安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で８５℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．０乃至１１．０で安定。
【００１５】
本発明は、α−グルカン転移酵素をα−１，４グルカンとＣＤの混合液に作用させることにより分岐ＣＤを製造する方法を提供することでも上記の課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、α−１，４グルカンをグルコシル供与体としα−、β−及び／又はγ−ＣＤを受容体とする分子間転移反応により分岐ＣＤを製造でき、従来の縮合反応を利用した分岐ＣＤの工業的製造時に必須であった、マルトースを添加する工程や、反応後の糖液からマルトースをクロマトグラフィーにて除去する工程を必要とせず、澱粉懸濁液からより少ない工程数で分岐ＣＤを製造することができる。従って、本発明の酵素を用いれば、分岐α−ＣＤ、分岐β−ＣＤ及び／又は分岐γ−ＣＤをより簡素な工程にて製造でき、さらに、縮合反応と異なり高い酵素作用量を必要としないことから、分岐ＣＤ製造のコストを下げることができ、より安価に分岐ＣＤを市場に供給することが可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明でいうα−グルカンとは、グルコースを構成糖とし、グルコースがα結合で重合したもので、重合度２以上のオリゴ糖及び多糖を意味し、α−１，４結合とα−１，６結合から構成される澱粉質構造を有するα−グルカンを意味する。本発明でいうα−グルカン転移酵素とは、重合度が４以上のα−１，４グルカンに作用して重合度２以上のα−１，４グルカンを生成し、生成した重合度２以上のα−１，４グルカンをα−、β−及びγ−サイクロデキストリンのグルコース残基にα−１，６転移する活性を有するものを意味している。なお、本発明のα−グルカン転移酵素が生成し、転移するα−１，４グルカンとしては、重合度が２乃至１２のものが大部分である。また、本酵素の作用するα−１，４グルカンは、重合度が４以上のものであれば良いが、通常、重合度が２０，０００以下のものである。
【００１８】
本発明のα−グルカン転移酵素の酵素活性は、次のようにして測定することができる。可溶性澱粉を濃度２ｗ／ｖ％となるよう２ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ基質液とし、その基質液２ｍｌに酵素液２ｍｌを加えて、４０℃で２０分間反応させた後、ソモギー銅液を加え反応を停止させ、還元力をソモギー・ネルソン法にて測定する。対照として、あらかじめ１００℃で１０分間加熱することにより失活させた酵素液を用いて同様に測定する。酵素活性１単位は、上記の測定条件下において、１分間に１μモルのグルコースに相当する還元力を増加させる酵素量と定義する。なお、酵素によっては、反応温度、反応時間を適宜変更することもできる。また、本活性測定法を用いることで、バチルス属、アノキシバチルス属、及びサーモアナエロバクター属のいずれかの微生物又は他の属んぽ微生物から本発明のα−グルカン転移酵素を探索することも可能である。
【００１９】
本発明のα−グルカン転移酵素は、下記（１）乃至（３）に示す部分アミノ酸配列を有する：
（１）Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ；
（２）Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ；
（３）Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ。
【００２０】
本発明のα−グルカン転移酵素は、通常、所定のアミノ酸配列を有しており、その例としては、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列か、又はそれらに相同的なアミノ酸配列が挙げられる。配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有する変異体酵素としては、重合度が４以上のα−１，４グルカンに作用し、重合度が２以上のα−１，４グルカンをα−、β−及びγ−ＣＤのグルコース残基にα−１，６転移する活性を保持する範囲で、配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列において１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられる。欠失、置換若しくは付加するアミノ酸の個数は、通常、１乃至４０個、望ましくは、１乃至２０個、さらに望ましくは、１乃至１０個が好適である。
【００２１】
本発明のα−グルカン転移酵素はその給源によって制限されないものの、好ましい給源として微生物が挙げられ、とりわけ、本発明者らが土壌より単離した微生物Ｒ６１株又はその酵素高産生変異株が好適に用いられる。以下、本発明のα−グルカン転移酵素の産生能を有する微生物Ｒ６１株の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版センター、１９８５年）に準じて行った。
【００２２】
＜Ａ：細胞形態＞
（１）肉汁寒天培養、２７℃
通常０．８乃至１．０μｍの幅を持つ菌糸状を有す。運動性なし。鞭毛なし。胞子連鎖形成あり。非抗酸性。グラム陽性。
【００２３】
＜Ｂ：培養性質＞
（１）  肉汁寒天平板培養、２７℃
形状：  円形  大きさは３日間で２．５乃至３ｍｍ。
周縁：  波状
隆起：  円錐状
光沢：  鈍光
表面：  平滑
色調：  不透明、淡い黄色
【００２４】
＜Ｃ：生理学的性質＞
澱粉の加水分解：  陽性
ゼラチンの液化：  陽性
色素の生成：  可溶性色素の生成はない
ウレアーゼ：  陰性
オキシダーゼ：  陽性
カタラーゼ：  陽性
硝酸塩の還元：  陽性
炭水化物の利用：  Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、スクロース
生育の範囲：  ｐＨ５．０乃至８．３、温度  １５乃至４１℃
酸素に対する態度：  好気性
細胞壁型：  ＩＩＩＣ型
１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列：  バチルス・アシディセラーＣＢＤ１１９と９９．７％の相同性を示す。
【００２５】
以上の菌学的性質に基づき、『バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー』（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第４巻（１９８９年）、及び、『リボソーマルデータベース』（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）を参考にして、微生物Ｒ６１株と公知菌との異同をそれぞれ検討した。その結果、微生物Ｒ６１株は、バチルス・アシディセラーに分類される微生物であることが判明した。本発明者等は、本菌株を新規微生物バチルス・アシディセラー  Ｒ６１と命名し、平成２３年１０月２６日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センターに寄託し、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６として受託された。本発明のα−グルカン転移酵素産生能を有する微生物には、上記菌株はもとより、上記菌株に突然変異を誘発し、選抜して得られる酵素高産生変異株なども包含される。突然変異の誘発には、公知の物理的及び化学的突然変異原が利用でき、例えば、工業用糖質酵素ハンドブック（１９９９年８月２０日、株式会社講談社発行）の７及び８頁に記載される、紫外線、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルフォネートが利用できる。
【００２６】
また、上記の菌株以外に、アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７又はその酵素高産生変異株、サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７又はその酵素高産生変異株も同様に、本発明のα−グルカン転移酵素の給源として用いることが出来る。
【００２７】
本発明のα−グルカン転移酵素の具体例としては、例えば、下記＜ａ＞乃至＜ｃ＞のいずれかの理化学的性質を有するα−グルカン転移酵素が挙げられる：
＜ａ＞
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、１６０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、２０分間反応の条件下で、５５℃；
（３）至適ｐＨ
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、４０℃、２０分間反応の条件下で６．０；
（４）温度安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で５０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ５．０乃至９．０で安定；
＜ｂ＞
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、１６０，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下で、６０℃；
（３）至適ｐＨ
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、５０℃、３０分間反応の条件下で７．５；
（４）温度安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で７０℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．５乃至１０．５で安定；
＜ｃ＞
（１）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法において、１００，０００±１０，０００ダルトン；
（２）至適温度
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、２０分間反応の条件下で、１００℃；
（３）至適ｐＨ
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、６０℃、２０分間反応の条件下で６．５；
（４）温度安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、６０分間保持の条件下で８５℃まで安定；及び
（５）ｐＨ安定性
１ｍＭ  塩化カルシウム存在下、４℃、２４時間保持の条件下でｐＨ４．０乃至１１．０で安定。
【００２８】
本発明のＤＮＡは、通常、所定の塩基配列を有しており、例えば、配列表における配列番号４乃至６のいずれかで示される塩基配列か、又はそれに相同的な塩基配列が挙げられる。配列表における配列番号４乃至６のいずれかで示される塩基配列に相同的な塩基配列を有する変異体ＤＮＡとしては、コードする酵素の活性を保持する範囲で、配列番号４乃至６のいずれかで示される塩基配列において１個又は２個以上の塩基が欠失、置換若しくは付加した塩基配列を有するものが挙げられる。欠失、置換若しくは付加する塩基の個数としては、通常、１乃至１２０個、望ましくは、１乃至６０個、さらに望ましくは、１乃至３０個が好適である。また、遺伝子コードの縮重に基づき、そのコードする酵素のアミノ酸配列を変えることなく塩基の１個又は２個以上を他の塩基に置換したものも当然、本発明のＤＮＡに包含される。
【００２９】
本発明のＤＮＡを、自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えＤＮＡとすることも有利に実施できる。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターとからなり、ＤＮＡが入手できれば、常法の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７などのプラスミドベクターやλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５などのファージベクターが挙げられる。この内、本発明のＤＮＡを大腸菌で発現させるには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、λｇｔ・λＣ及びλｇｔ・λＢが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５が好適である。ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。ＤＮＡを斯かるベクターに挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、まず、ＤＮＡを含む遺伝子ＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子ＤＮＡ及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ  ３ＡＩ、Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｂａｍ  ＨＩ、Ｓａｌ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結するのが容易である。必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜宿主に導入して形質転換微生物とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
【００３０】
このようにして得られる組換えＤＮＡは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母をはじめとする適宜の宿主微生物に導入することができる。形質転換微生物を取得するには、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、グルコース重合度が４以上のα−１，４グルカンを含む栄養培地で培養し、培養液をα−１，４グルカンとＣＤに作用させ分岐ＣＤを生成するものを選択すればよい。
【００３１】
本発明のα−グルカン転移酵素産生能を有する形質転換微生物も含めた微生物の培養に用いる培地は、微生物が生育でき、本発明のα−グルカン転移酵素を産生しうる栄養培地であればよく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、微生物が生育に利用できる物であればよく、例えば、植物由来の澱粉やフィトグリコーゲン、動物や微生物由来のグリコーゲンやプルラン、また、これらの部分分解物やグルコース、フラクトース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、糖蜜などの糖質、また、クエン酸、コハク酸などの有機酸も使用することができる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の種類により適宜選択できる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物及び、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物を適宜用いることができる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などの塩類を適宜用いることができる。更に、必要に応じて、アミノ酸、ビタミンなども適宜用いることができる。
【００３２】
培養は、通常、温度１５乃至４１℃、好ましくは２０乃至３７℃、ｐＨ５乃至１０、好ましくは５乃至８．３の範囲から選ばれる条件で好気的に行われる。但し、サーモアナエロバクター属微生物の培養は、嫌気的に行われる。培養時間は当該微生物が増殖し得る時間であればよく、好ましくは１０時間乃至１５０時間である。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５乃至２０ｐｐｍが好ましく、例えば、通気量を調節したり、攪拌したり、通気に酸素を追加したり、また、ファーメンター内の圧力を高めるなどの手段が採用される。また、培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよい。
【００３３】
このようにして微生物を培養した後、α−グルカン転移酵素を含む培養液を回収する。α−グルカン転移酵素の酵素活性は、主に培養物の除菌液に認められ、除菌液を粗酵素液として採取することも、培養物全体を粗酵素液として用いることもできる。培養物から菌体を除去するには公知の固液分離法が採用される。例えば、培養物そのものを遠心分離する方法、あるいは、プレコートフィルターなどを用いて濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などの膜濾過により分離する方法などが適宜採用される。除菌液はそのまま粗酵素液として用いることができるものの、一般的には濃縮して用いられる。濃縮法としては、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、減圧濃縮、平膜、中空膜などの膜濃縮法などを採用することができる。
【００３４】
更に、α−グルカン転移酵素活性を有する除菌液及びその濃縮液を用いて、α−グルカン転移酵素を公知の方法により固定化して用いることもできる。この際、例えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共有結合法・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを適宜採用できる。
【００３５】
本発明のα−グルカン転移酵素は、粗酵素液をそのまま又は濃縮して用いることができるものの、必要に応じて、公知の方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。例えば、培養液の除菌液を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析した後、斯界において汎用されている陰イオン又は陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、調製用電気泳動などの方法によって、さらに分離・精製して利用することもできる。
【００３６】
本発明のα−グルカン転移酵素を、分岐ＣＤの製造に用いると、従来の縮合反応で製造する場合に必須であった、マルトースの添加する工程や、反応後の糖液からマルトースをクロマトグラフィーにて除去する工程を必要とせず、澱粉懸濁液からより少ない工程数で分岐ＣＤを製造することができる。さらに、本発明のα−グルカン転移酵素は分子間転移により分岐ＣＤを生成するので、縮合反応と異なり高い酵素作用量を必要としない。従って、本発明のα−グルカン転移酵素を用いると従来より低コストで分岐ＣＤを製造することができる。
【００３７】
本発明のα−グルカン転移酵素を用いて分岐ＣＤを製造するための原料基質は、澱粉質とＣＤの混合物である。この混合物は、公知の方法で得られた各種ＣＤの混合物又は単離したα−、β−及び／又はγ−ＣＤに澱粉質を混合することにより調製できる。また、澱粉質にＣＧＴａｓｅを作用させて混合物を調製することも随意である。
【００３８】
本発明でいう澱粉質とは、澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどや、それらをアミラーゼ又は酸などによって部分的に加水分解して得られるアミロデキストリン、マルトデキストリン、及びマルトオリゴ糖などの澱粉部分分解物などを意味する。アミラーゼで分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック・オブ・アミレーシズ・アンド・リレーテッド・エンザイム（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ａｍｙｌａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）（１９８８年）パーガモン・プレス社（東京）に記載されている、α−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）、マルトテトラオース生成アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６０）、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９８）、ＣＧＴａｓｅ（ＥＣ  ２．４．１．１９）などのアミラーゼを用いて澱粉、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲンなどを分解して得られる部分分解物を用いることができる。さらには、部分分解物を調製する際、プルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４１）、イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）などの澱粉枝切り酵素を作用させることも随意である。
【００３９】
澱粉としては、例えば、とうもろこし、小麦、米など由来の地上澱粉であっても、また、馬鈴薯、さつまいも、タピオカなど由来の地下澱粉であっても使用することができ、好ましくは、これら澱粉を糊化及び／又は液化して用いるのが好適である。澱粉の糊化・液化の方法自体は、公知の方法を採用することができる。
【００４０】
例えば、公知の方法で調製したβ−ＣＤを１％（ｗ／ｖ）、及びアミロースを４％（ｗ／ｖ）含む原料基質に本発明のα−グルカン転移酵素を作用させることにより、分岐β−ＣＤを含有する糖化液を得ることができる。更に例えば、濃度１５％（ｗ／ｖ）の液化澱粉にＣＧＴａｓｅと澱粉枝切り酵素を同時に作用させることにより、各種ＣＤとアミロースを含む糖化液とし、この糖化液に更に本発明のα−グルカン転移酵素を作用させることにより、アミロースを供与体基質、α−、β−及びγ−ＣＤを受容体として反応させ、分岐ＣＤを含有する糖化液を得ることができる。前者の方法では、添加する供与体基質とＣＤの比率を変えることで、未反応のＣＤに対する分岐ＣＤの比率を制御できる。後者の方法では、基質の濃度を調整し、ＣＤとアミロースの比率を変えることで、未反応のＣＤに対する分岐ＣＤの比率を制御できる。
【００４１】
上記反応に用いられるＣＧＴａｓｅとしては、その起源や由来に特段の制限はなく、天然の酵素であっても、遺伝子組換えによって得られる酵素であっても良く、例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クレブシーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、ジオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する細菌由来のＣＧＴａｓｅが適宜選択される。
【００４２】
また、上記の反応によって得られた反応液は、そのまま分岐ＣＤ製品とすることもできる。また、必要に応じて、反応液に、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ及びα−グルコシダーゼから選ばれる１種又は２種以上を作用させて、分岐ＣＤを構成する側鎖部分又は分岐ＣＤに混在するデキストリンを加水分解し、更に糖化液に含まれるマルトオリゴ糖又は上記酵素消化後に生成するグルコースをはじめとする分解物をクロマトグラフィーにより除去することにより、分岐ＣＤ含量をさらに高めることもできる。更には、含有する還元性糖質を水素添加することにより還元力を消失させた分岐ＣＤ含有物を調製することも有利に実施できる。
【００４３】
分岐ＣＤを含有する糖質液はさらに精製して用いることもできる。精製方法としては、公知の方法を適宜選択することが出来る。例えば、イオン交換クロマトグラフィーを採用する場合、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーを有利に用いることができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である
【００４４】
このようにして得られた分岐ＣＤ含有糖質は溶液のまま利用できるものの、保存に有利で、且つ、用途によっては利用しやすいように、乾燥し、粉末品とするのが望ましい。乾燥には、通常、凍結乾燥、或いは噴霧乾燥やドラム乾燥などの方法を用いることができる。乾燥物は、必要に応じて、粉砕し粉末化することも、篩別又は造粒して、特定の粒度の範囲に整えることも有利に実施できる。
【００４５】
本発明のα−グルカン転移酵素を用いて得られる分岐ＣＤ含有糖質は、シラップ又は粉末の形態で甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬部外品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００４６】
以下、実験により本発明を詳細に説明する。
【００４７】
＜実験１：バチルス・アシディセラー  Ｒ６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６）由来α−グルカン転移酵素の生産＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製造）１．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）０．５ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『酵母エキスＳ』、日本製薬株式会社製造）０．１ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸第二鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・５水和物０．００１ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．３ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、ｐＨ６．８に調整後、５００ｍｌ容三角フラスコ１本に３０ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６）を１白金耳接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００４８】
次に、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製）１．７ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ミースト顆粒Ｓ』、アサヒフード＆ヘルスケア株式会社製）１．５ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸第二鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・５水和物０．００１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、ｐＨ７．０に調整後、５００ｍｌ容三角フラスコ１０本に３０ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌した後、冷却し、種培養液を三角フラスコ１本につき約０．３ｍｌ接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清（約２９０ｍＬ）を得た。得られた培養上清のα−グルカン転移酵素活性を測定したところ、該酵素活性を約３．５単位／ｍｌ含んでいた。
【００４９】
＜実験２：バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素の精製＞
実験１で得た培養上清（総活性約１，０２０単位）を１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、粗酵素液約３００ｍｌを得た。粗酵素液のα−グルカン転移酵素活性は約３．０単位／ｍｌであった（総活性約９００単位）。この粗酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール  ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１８０ｍｌ）に供した。α−グルカン転移酵素は、１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したカラムに吸着した。そして、塩化ナトリウム濃度０Ｍから０．５Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、塩化ナトリウム濃度約０．０８Ｍ付近に溶出した画分にα−グルカン転移酵素活性が認められた。この画分を回収し、終濃度１Ｍとなるように硫安を添加後、遠心分離して不溶物を除き、アマシャム  ファルマシア  バイオテク  ＡＢ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）社製『リソース  フェニル（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＰＨＥ）』疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量６ｍｌ）に供した。バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素は、１Ｍ硫安及び１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したカラムに吸着した。そして、硫安濃度１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．０８Ｍ付近に溶出した画分にα−グルカン転移酵素活性が認められた。この画分を回収し、これを１ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した。精製の各工程におけるα−グルカン転移酵素活性、全蛋白質、α−グルカン転移酵素の比活性及び収率を表１に示す。なお、精製の各工程における蛋白量は、牛血清アルブミンを標準蛋白としたＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。
【００５０】
【表１】
2014054221.tif 000002
【００５１】
得られたα−グルカン転移酵素標品を８乃至１６ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【００５２】
＜実験３：バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素の性質＞
＜実験３−１：分子量＞
実験２の方法で得たα−グルカン転移酵素精製標品をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ  バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）と比較して分子量を測定したところ、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素の分子量は１６０，０００±１０，０００ダルトンであることが判明した。
【００５３】
＜実験３−２：酵素反応の至適ｐＨ及び至適温度＞
実験２の方法で得たα−グルカン転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼすｐＨ、温度の影響を本酵素の活性測定方法に準じて測定した。これらの結果を図１（至適ｐＨ）及び図２（至適温度）に示した。バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素の至適ｐＨは４０℃、２０分間反応の条件下でｐＨ６．０であり、至適温度はｐＨ６．０、２０分間反応の条件下で５５℃であることが判明した。
【００５４】
＜実験３−３：酵素のｐＨ安定性及び温度安定性＞
実験２の方法で得たα−グルカン転移酵素精製標品を用いて、本酵素のｐＨ安定性及び温度安定性を調べた。ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの１００ｍＭ緩衝液中で４℃、２４時間保持した後、ｐＨを６．０に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ６．０）を塩化カルシウム非存在下または１ｍＭ存在下で各温度に６０分間保持し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を図３（ｐＨ安定性）及び図４（温度安定性）に示した。図３から明らかなように、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素は、ｐＨ５．０乃至９．０の範囲で安定であることが判明した。また、図４から明らかなように、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素は、塩化カルシウム非存在下で３０℃まで、塩化カルシウム１ｍＭ存在下で５０℃まで安定であることが判明し、カルシウムイオンによって本酵素の温度安定性が向上することがわかった。
【００５５】
＜実験３−４：酵素活性に及ぼす金属塩の影響＞
実験２の方法で得たα−グルカン転移酵素精製標品を用いて、酵素活性に及ぼす金属塩の影響を濃度１ｍＭの各種金属塩存在下で活性測定の方法に準じて調べた。結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
2014054221.tif 000003
【００５７】
表２の結果から明らかなように、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素の活性は、Ｃｕ２＋及びＨｇ２＋イオンで著しく阻害され、Ａｌ３＋、Ｐｂ２＋及びＺｎ２＋イオンで阻害されることも判明した。また、金属イオンのキレート剤であるＥＤＴＡによっても著しく阻害されることも判明した。一方、Ｃａ２＋及びＳｒ２＋イオンで活性化されることが判明した。
【００５８】
＜実験３−５：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実験２の方法で得たα−グルカン転移酵素精製標品を用いて、本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー  モデル４９２ＨＴ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号７で示されるアミノ酸配列、すなわち、Ａｌａ―Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ；
を有していることが判明した。
【００５９】
＜実験３−６：部分アミノ酸配列＞
実験１の方法で得た培養上清に、最終濃度８０％飽和となるように硫安を添加し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。生成した塩析沈殿物を遠心分離（１３，５００ｒｐｍ、２０分間）にて回収し、これを１ｍＭ塩化カルシウムを含む５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、粗酵素液として約１００ｍｌを得た。この粗酵素液から実験２記載の方法に準じてα−グルカン転移酵素の精製を行った。得られたα−グルカン転移酵素標品を５乃至２０ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、３本の蛋白バンドが検出された。これらのバンドの分子量は大きいものから順に１６０，０００±１０，０００ダルトン、１００，０００±５，０００ダルトン、６０，０００±５，０００ダルトンであった。以後、これら３本のバンドに対応する蛋白質を分子量の大きいものから順にＰ１、Ｐ２、Ｐ３と呼称する。Ｐ１乃至Ｐ３のＮ末端アミノ酸配列をそれぞれ、プロテインシーケンサー  モデル４９２ＨＴ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、
Ｐ１：Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ；
Ｐ２：Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ；
Ｐ３：Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ；
を有していることが判明した。Ｐ１とＰ３のＮ末端アミノ酸配列が全く同一であること、Ｐ１の分子量がＰ２とＰ３の分子量の和と一致すること、精製操作を行ってもこれら蛋白質が全く分離しないことから、Ｐ１が完全長のα−グルカン転移酵素であり、Ｐ２とＰ３はα−グルカン転移酵素が断片化したものと推定した。すなわち、Ｐ２のＮ末端アミノ酸配列がα−グルカン転移酵素の内部アミノ酸配列を指し示すものと判断した。
【００６０】
＜実験４：バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換微生物の調製＞
α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡをバチルス・アシディセラー  Ｒ６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６）からクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の決定、及び形質転換微生物の調製を行った。
【００６１】
＜実験４−１：染色体ＤＮＡの調製＞
１０ｇ／ｌトリプトン（商品名『Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ』、Ｄｉｆｃｏ社販売）、５ｇ／ｌ酵母エキス（商品名『Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ』、Ｄｉｆｃｏ社販売）、１０ｇ／ｌ食塩及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６）を接種し、２７℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。
【００６２】
遠心分離により培養物から採取した菌体をＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に浮遊させ、リゾチームを０．０５％（ｗ／ｖ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。処理物を−８０℃で１時間凍結後、ＴＳＳ緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて６０℃に加温し、ＴＥＳ緩衝液／フェノール混液を加え、氷水中で冷却しながら１０分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に２倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体ＤＮＡを採取し、ＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解後、リボヌクレアーゼとプロテイナーゼをそれぞれ７．５μｇと１２５μｇ加え、３７℃で１時間保持して反応させた。反応物にクロロホルム／イソアミルアルコール混液を加えて染色体ＤＮＡを抽出し、冷エタノールを加え、精製した染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【００６３】
＜実験４−２：ＰＣＲによる部分ＤＮＡ断片のクローニング及び塩基配列の決定＞
α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡのクローニングを行うに先立ち、まず、その部分ＤＮＡ断片のＰＣＲ−クローニングを行った。α−グルカン転移酵素のＮ末端アミノ酸配列である配列表における配列番号７で表されるアミノ酸配列における第３乃至第８番目及び第７乃至第１２番目のアミノ酸配列に基づき、配列表における配列番号８及び９で示される２種のセンスプライマーＦ１及びＦ２を合成した。また、当該酵素の内部アミノ酸配列である配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列における第６乃至第１１番目及び第５乃至第１０番目のアミノ酸配列に基づき、配列表における配列番号１１及び１２で示される２種のアンチセンスプライマーＲ１及びＲ２を合成した。センスプライマーＦ１とアンチセンスプライマーＲ１の組合せで、実験４−１で得た染色体ＤＮＡを鋳型として１回目のＰＣＲを常法に従い行った。次いで、得られたＰＣＲ産物を鋳型としてセンスプライマーＦ２とアンチセンスプライマーＲ２の組合せで２回目のＰＣＲを行ったところ、約１，７００塩基対のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片が認められた。ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を、プラスミド（商品名「ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃａｍ  ＳＫ（＋）」、ストラタジーン社販売）の制限酵素ＳｒｆＩ部位に挿入した後、通常のコンピテントセル法により大腸菌コンピテントセル（商品名『ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｋａｎ’』、ストラタジーン社製）を形質転換した。得られた形質転換微生物から通常のアルカリ−ＳＤＳ法により組換えＤＮＡを抽出し、目的とする約１，７００塩基対の挿入ＤＮＡ断片を有する組換えＤＮＡを保持する形質転換微生物を選択した。次いで、この組換えＤＮＡの塩基配列を、通常のジデオキシ法により分析したところ、当該組換えＤＮＡは、配列表における配列番号１３で示される鎖長１，７０６塩基対の塩基配列を有するＤＮＡを含んでいた。
【００６４】
上記のα−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡの一部と推察されたＤＮＡ断片が制限酵素Ｓｐｅ  Ｉにて切断されないことを予め確認した後、実験４−１で得たゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓｐｅ  Ｉにて消化し、消化物をセルフライゲーションさせて環状化ゲノムを得た。α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡの一部と推定されるＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、配列表における配列番号１４及び１５で示されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを合成し、上記環状化ゲノムを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、約７，０００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が得られた。
【００６５】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列を、直接、常法のジデオキシ法により解読したところ、本ＤＮＡ断片中に目的遺伝子全長が存在していることがわかり、α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡの塩基配列及びこれにコードされる当該酵素のアミノ酸配列を決定した。その結果、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６）由来α−グルカン転移酵素は、配列表における配列番号１で示される１，４７２残基のアミノ酸配列からなり、且つ、当該酵素をコードするＤＮＡは、配列表における配列番号４で示される鎖長４，４１９ｂｐの塩基配列を有することが判明した。配列表における配列番号４に併記したアミノ酸配列における第１乃至３５番目のアミノ酸配列は、当該酵素の分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該酵素の分泌前の前駆体は、配列表における配列番号４に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号４に示す塩基配列にコードされていることが判明した。なお、配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列から第１乃至３５番目の分泌シグナル配列を除いて算出される分子量は１６４，４４３であり、この値は実験３−１で求めたバチルス・アシディセラー  Ｒ６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６）由来α−グルカン転移酵素の分子量、１６０，０００±１０，０００ダルトンとよく一致するものであった。
【００６６】
＜実験５：発現用組換えＤＮＡ、ｐＲＳＥＴＡ−Ｒ６１の作製とその形質転換微生物ＳＥＴＡＲ６１による組換え型α−グルカン転移酵素の産生＞
α−グルカン転移酵素遺伝子を発現用ベクターに挿入し、組換え型α−グルカン転移酵素の大腸菌における発現を検討した。
【００６７】
＜実験５−１：発現用組換えＤＮＡ、ｐＲＳＥＴＡ−Ｒ６１の作製及び形質転換微生物ＳＥＴＡＲ６１の調製＞
α−グルカン転移酵素遺伝子を発現用ベクターに組込むに際し、配列表における配列番号１６及び１７で示されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを合成し、これらの組合せでＰＣＲを行いα−グルカン転移酵素遺伝子を増幅した。常法により、制限酵素Ｓａｃ  Ｉ及びＫｐｎ  Ｉで消化した発現用ベクターｐＲＳＥＴ  Ａ（インビトロジェン社製）に、上記で増幅したＤＮＡを組込んで得られた組換えＤＮＡを『ｐＲＳＥＴＡ−Ｒ６１』と命名した。ｐＲＳＥＴＡ−Ｒ６１を用いて大腸菌コンピテントセル（商品名『ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｋａｎ’』、ストラタジーン社製）を形質転換し、得られた形質転換微生物からｐＲＳＥＴＡ−Ｒ６１を調製し、発現用宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換して形質転換微生物『ＳＥＴＡＲ６１』を調製した。
【００６８】
＜実験５−２：形質転換微生物ＳＥＴＡＲ６１による組換え型α−グルカン転移酵素の産生＞
形質転換微生物ＳＥＴＡＲ６１を、５００ｍｌ容の三角フラスコに１００ｍｌずつ入れたＴＢ培地（トリプトン  １．２％、酵母エキス  ２．４％、グリセリン  ０．４％、リン酸２水素１カリウム  １７ｍＭ、リン酸水素２カリウム  ７２ｍＭ、ｐＨ６．８、アンピシリン  ８０μｇ／ｍｌ含有）に植菌し、２７℃で２４時間培養した。得られた培養物を、常法に従い、遠心分離して培養上清と菌体とに分離して回収した。菌体については、超音波破砕法により細胞からの全抽出物を調製した。超音波破砕法は、菌体を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモジナイザー（モデルＵＨ−６００、株式会社エスエムテー製）で細胞破砕することによって行い、その破砕物を全細胞抽出物とした。
【００６９】
このようにして調製した培養上清と全細胞抽出物とについて、それぞれのα−グルカン転移酵素活性を測定した。なお、対照としてプラスミドｐＲＳＥＴ  Ａを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を上述の形質転換微生物の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と全細胞抽出物を調製し、同様にα−グルカン転移酵素活性を測定した。その結果、形質転換微生物ＳＥＴＡＲ６１の全細胞抽出物にのみ当該酵素活性が認められ、形質転換微生物ＳＥＴＡＲ６１はα−グルカン転移酵素を細胞内に産生することが判明した。
【００７０】
形質転換微生物ＳＥＴＡＲ６１の全細胞抽出物を、実験２の方法に準じて精製し、さらにこの精製酵素標品を実験３の方法に準じて分析した。その結果、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は約１６０，０００±１０，０００ダルトン、至適温度は、ｐＨ６．０、２０分間反応の条件下で約５５℃、至適ｐＨは４０℃、２０分間反応の条件下で約６．０、温度安定性は、各温度に６０分間保持する条件下で、塩化カルシウム非存在下で３０℃まで、１ｍＭ塩化カルシウム存在下で約５０℃まで安定であり、ｐＨ安定性は、各ｐＨに４℃で２４時間保持する条件下で５．０乃至９．０の範囲で安定であった。これらの理化学的性質は、実験３に示された方法で調製された当該酵素のそれと実質的に同一であった。以上の結果は、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素は、組換えＤＮＡ技術によって良好に製造できることを示している。
【００７１】
＜実験６：各種糖質への作用＞
各種糖質を用いて、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素の基質特異性を調べた。マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトール、α−、β−又はγ−ＣＤ、アミロース、可溶性澱粉、プルラン又はデキストランを含む水溶液を調製し、これらの基質溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）と最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験２の方法で得たα−グルカン転移酵素精製標品を基質固形物１グラム当りそれぞれ１単位ずつ加え、基質濃度を２ｗ／ｖ％になるように調整し、これを４０℃で２４時間作用させた。酵素反応前後の反応液をシリカゲル薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略す）法で分析し、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無又は強さの程度を確認した。詳細には、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素の分解作用により生成するオリゴ糖量により評価した。ＴＬＣは、展開溶媒としてｎ−ブタノール、ピリジン、水混液（容量比６：４：１）を、また、薄層プレートとしてメルク社製『キーゼルゲル６０』（アルミプレート、１０×２０ｃｍ）を用い、２回展開後、硫酸−メタノール法にて分離した糖質を発色させる方法で実施した。さらに、作用した糖質の反応液の組成を高速液体クロマトグラフィー法（以下、ＨＰＬＣと略称する。）で調べ、分解物を同定した。なお、ＨＰＬＣは、カラムに『ＭＣＩｇｅｌ  ＣＫ０４ＳＳ』（株式会社三菱化学製）を２本連結したものを用い、溶離液に水を用いて、カラム温度８０℃、流速０．４ｍｌ／分の条件で行い、検出は示差屈折計ＲＩＤ−１０Ａ（株式会社島津製作所製）を用いて行った。結果を表３に示す。なお、ＴＬＣ法又はＨＰＬＣで認められた基質以上の重合度を有する糖質を転移糖とした。
【００７２】
【表３】
2014054221.tif 000004
【００７３】
表３の結果から明らかなように、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素は、試験した糖質のうち、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースなどの一連のマルトオリゴ糖によく作用し、試験した糖質より低重合度のマルトオリゴ糖を生成した。また、マルトトリオースがα−１，６結合したプルランにも作用し、マルトトリオースを生成した。さらに、アミロース及び可溶性澱粉などのα−１，４結合したグルコースが主たる構成糖である多糖にもバチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素はよく作用し、主にマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースなどを生成した。これらの結果より、本酵素はグルコース重合度が４以上のグルカンに作用し、α−１，４グルコシド結合及びα−１，６グルコシド結合の両方を加水分解することが判明した。基質特異性からバチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素はアミロプルラナーゼに属する酵素と推定された。一方、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースなどの一連のマルトオリゴ糖からは加水分解物の他に、より重合度の高い糖転移生成物も認められた。なお、アミロース及び可溶性澱粉からも、高重合度の糖転移生成物の生成が考えられた。
【００７４】
＜実験７：受容体特異性＞
アミロースを供与体、各種糖質を受容体として用いて、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素の受容体特異性を調べた。なお、実験６において本酵素反応の供与体及び受容体となったマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオースなどの一連のマルトオリゴ糖及びマルトテトライトールについては本試験から除外した。自身が供与体とはならないマルトース、マルトトリオース、マルチトール、マルトトリイトール、α−、β−又はγ−ＣＤを含む水溶液を調製した。これらの基質溶液に、供与体として最終濃度１ｗ／ｖ％のアミロース（商品名『アミロース  ＥＸ−Ｉ』、株式会社林原製）、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験２の方法で得たα−グルカン転移酵素精製標品をアミロース固形物１グラム当り２単位を加え、供与体濃度を０．５ｗ／ｖ％になるように調整し、これを４０℃で４８時間作用させた。酵素反応前後の反応液は、ＣＤ以外の糖質が受容体の場合についてはβ−アミラーゼ消化を、ＣＤが受容体の場合についてはグルコアミラーゼ消化を行い、反応液中の直鎖α−１，４グルカンを分解して糖転移物の生成を容易に確認できるようにした後、組成をＨＰＬＣで調べ、糖転移物の有無を確認した。なお、β−アミラーゼ消化はβ−アミラーゼ（大豆由来、ナガセケムテックス株式会社製）をアミロース固形物１グラム当り１０単位を加え、アミロース濃度を０．５ｗ／ｖ％になるように調整し、これを５０℃、ｐＨ５．０で４８時間作用させた。また、グルコアミラーゼ消化はグルコアミラーゼ（リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）由来、生化学工業株式会社製）をアミロース固形物１グラム当り１００単位を加え、アミロース濃度を０．５ｗ／ｖ％になるように調整し、これを５０℃、ｐＨ５．０で４８時間作用させた。ＨＰＬＣは、実験６に記載の条件を用いて行った。結果を表４に示す。
【００７５】
【表４】
2014054221.tif 000005
【００７６】
表４の結果から明らかなように、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素は、試験した糖質のうち、マルトトリオースと、α−、β−及びγ−ＣＤを受容体として糖転移物を生成することがわかった。従って、グルコース重合度が７以上のＣＤが、本酵素による転移反応の受容体となることが判明した。また、グルコース重合度が３以上のα−１，４グルカン、糖アルコールの場合はマルトテトライトール以上の重合度を持つグリコシルソルビトールも受容体となることがわかった。
【００７７】
＜実験８：各種ＣＤへの糖転移＞
＜実験８−１：β−ＣＤ又はγ−ＣＤへの糖転移＞
最終濃度１ｗ／ｖ％のβ−ＣＤ又はγ−ＣＤと、最終濃度４ｗ／ｖ％のアミロース（商品名『アミロース  ＥＸ−Ｉ』、株式会社林原製）水溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験２の方法で得たα−グルカン転移酵素精製標品を、アミロース固形分１グラム当り０．５単位加え、５０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。なお、対照として、ＣＤを含まないアミロースのみでの酵素反応も行い、合計３種類の「酵素反応物」を得た。３種類の酵素反応物のそれぞれ一部に、トランスグルコシダーゼ（トランスグルコシダーゼＬ「アマノ」天野エンザイム株式会社製、以下「ＴＧ」という）を固形物１グラム当り１，０００単位添加して５０℃、ｐＨ５．０で２４時間反応させた。反応後、約１００℃で１０分間、熱処理して反応を停止させたものを「ＴＧ消化物」とした。本操作を行うと、直鎖α−１，４グルカンがグルコースに分解されるので、グルコース、ＣＤ及びグルコシル分岐が１つ以上導入された分岐ＣＤが残存することとなる。さらに、合計３種類の酵素反応液のそれぞれ一部を用いてアルカリ処理物を調製した。上述の酵素反応物８ｍｌに水酸化ナトリウムを添加してｐＨを１２に調整し、９８℃で１時間保持することにより還元糖を分解した。不溶物を濾過して除去した後、三菱化学製カチオン交換樹脂『ダイヤイオンＳＫ−１Ｂ』とオルガノ製アニオン交換樹脂『ＩＲＡ４１１Ｓ』を用いて脱色、脱塩し、精密濾過した後、エバポレーターで乾固し、８ｍｌの水に溶解させたものを「アルカリ処理物」とした。アルカリ処理では、還元糖が分解されるので、環状構造を有するような非還元性糖質のみが残存することとなる。以上、３種類の酵素反応物、これらからそれぞれ調製したＴＧ消化物及びアルカリ処理物、合計９種類のサンプルを実験６に記載の条件にてＨＰＬＣを用いて分析した。溶出パターンを図７乃至９に示す。
【００７８】
バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素をアミロースのみに作用させた場合（図７−ロ）、低分子マルトオリゴ糖が生成した。ＴＧ消化物（図７−ハ）において全てグルコースにまで分解されたこと、及びアルカリ処理物（図７−ニ）において全ての糖質が分解されたことから、本酵素はアミロースから環状糖質を生成しないことが判明した。次に、アミロースとβ−ＣＤの混合基質に作用させた場合（図８−ロ）、溶出時間が６０乃至１００分の間に転移糖と考えられる複数のピークが観察された。ＴＧ消化物では、転移糖（以下、「転移糖Ａ」とする）が観察された（図８−ハ）。アルカリ処理物では、β−ＣＤの他に、溶出時間が８０．３分以前に一連の非還元性糖質が認められた（図８−ニ）。そこで、溶出時間６６．６分、７４．１分及び８０．３分の転移糖をそれぞれ、転移糖Ｂ、Ｃ及びＤと名付けた。
【００７９】
一方、アミロースとγ−ＣＤの混合基質に作用させた場合（図９−ロ）は、反応前（図９−イ）と比較して新たな溶出時間のピークは認められなかったが、ＴＧ消化物（図９−ハ）では、溶出時間５２．８分に転移糖（以下「転移糖Ｅ」とする）が認められた。また、アルカリ処理物（図９−ニ）中の主な転移糖として、溶出時間４２．０分、４５．７分及び４８．３分の転移糖が認められ、それぞれ転移糖Ｆ、Ｇ及びＨと名付けた。
【００８０】
＜実験８−２：転移糖の単離＞
転移糖Ａ乃至Ｈの単離を試みた。α−グルカン転移酵素をβ−ＣＤ、又はγ−ＣＤとアミロースの混合物に作用させた反応物から調製したＴＧ消化物又はアルカリ処理物を、それぞれ１回に５０μｌで１００回に分けて、実験６に記載の条件でＨＰＬＣカラムに供して精製し、いずれも純度９７％以上の転移糖Ａ乃至Ｈを固形物として１０ｍｇ以上得た。
【００８１】
＜実験８−３：転移糖の構造解析＞
＜実験８−３−１：質量分析＞
実験８−２で得られた転移糖Ａ乃至Ｈについて、質量分析装置『ＬＣＱ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ』（サーモエレクトロン社製）を用いて質量分析した。結果を表５にまとめた。
【００８２】
【表５】
2014054221.tif 000006
【００８３】
表５の結果から、転移糖Ａ乃至Ｈは、グルコース残基数８乃至１２個の分岐ＣＤであることが判明した。
【００８４】
＜実験８−３−２：プルラナーゼによる分解試験＞
実験８−２で得られた転移糖Ａ乃至Ｈについて、プルラナーゼによる分解試験を行った。各転移糖を最終濃度０．５ｗ／ｖ％でプルラナーゼ（株式会社林原製）を固形物１グラム当り２００単位添加して、５０℃、ｐＨ６．０にて９６時間反応させた。１００℃で１０分間保持して反応を停止した後、実験６に記載の条件にてＨＰＬＣで分析し、生成物を調べたところ、転移糖Ａ及びＥは分解されず、転移糖Ｂは等モルのマルトテトラオースとβ−ＣＤに、転移糖Ｃは等モルのマルトトリオースとβ−ＣＤに、転移糖Ｄは等モルのマルトースとβ−ＣＤに、転移糖Ｆは等モルのマルトテトラオースとγ−ＣＤに、転移糖Ｇは等モルのマルトトリオースとγ−ＣＤに、転移糖Ｈは等モルのマルトースとγ−ＣＤに、それぞれ分解された。即ち、転移糖Ｂ乃至Ｄ及びＦ乃至Ｈは、マルトオリゴ糖分子と、β−ＣＤ、又はγ−ＣＤ分子がα−１，６グルコシド結合した構造を有することが判明した。
【００８５】
以上の結果から、転移糖Ｂ、Ｃ、Ｄはそれぞれ、６−α−マルトテトラオシル−β−ＣＤ、６−α−マルトトリオシル−β−ＣＤ、６−α−マルトシル−β−ＣＤであることが判明した。また、転移糖Ｆ、Ｇ、Ｈはそれぞれ、６−α−マルトテトラオシル−γ−ＣＤ、６−α−マルトトリオシル−γ−ＣＤ、６−α−マルトシル−γ−ＣＤであることが判明した。
【００８６】
また、転移糖Ａ及びＥと、和光純薬工業株式会社から購入した標準試薬分岐ＣＤのＨＰＬＣによる分析における溶出時間を比較すると、転移糖Ａは６−α−グルコシル−β−ＣＤと、転移糖Ｅは６−α−グルコシル−γ−ＣＤと溶出時間がそれぞれ一致した。本結果と実験８−３−１で行った質量分析の結果から、転移糖Ａ及びＥは、それぞれ、６−α−グルコシル−β−ＣＤ及び６−α−グルコシル−γ−ＣＤであることが判明した。
【００８７】
なお、図８−ハにおいて、７３．６分及び７７．３分に溶出されるマイナー成分は、β−ＣＤを構成するグルコース残基の内、２残基に対してグルコシル分岐を有する転移糖を含むと考えられる。同様に、図９−ハにおいて、４２．８分に溶出されるマイナー成分は、γ−ＣＤを構成するグルコース残基の内、２残基に対してグルコシル分岐を有する転移糖を含むと考えられる。
【００８８】
以上の結果から、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素
は、β−及びγ−ＣＤの１個以上のグルコース残基に対して、重合度２以上のα−１，４グルカンをα−１，６グリコシル転移することが明らかとなった。
【００８９】
＜実験８−４：α−ＣＤへの糖転移＞
最終濃度４ｗ／ｖ％のα−ＣＤと最終濃度４ｗ／ｖ％のマルトペンタオース水溶液に、最終濃度２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験２の方法で得たα−グルカン転移酵素精製標品を、マルトペンタオース固形分１グラム当り２単位加え、５０℃、ｐＨ６．０で４８時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。なお、α−グルカン転移酵素を作用させていない反応物を対照とするために、以下同様に処理した。こうして得た反応物を実験８−１、２及び３と同様の方法にて分析した。その結果、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素は、α−ＣＤに対しても、β−及びγ−ＣＤと同様に、１個以上のグルコース残基に対して、重合度２以上のα−１，４グルカンをα−１，６グリコシル転移することが明らかとなった。
【００９０】
＜実験９：澱粉部分分解物からの分岐ＣＤの調製＞
最終濃度約１０ｗ／ｖ％の澱粉部分分解物（商品名「パインデックス＃１００」、松谷化学工業株式会社製）水溶液に、最終濃度１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）及び最終濃度２ｍＭの塩化カルシウムを加えた。これに、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原製）を基質固形物１グラム当り４単位及びイソアミラーゼ（株式会社林原製）を基質固形物１グラム当り１０００単位加え、５０℃で２４時間反応させた後、１００℃に加熱し３０分保持して反応を停止させた。次いで、この反応液に、実験２の方法で得たα−グルカン転移酵素精製標品を固形物１グラム当り２．０単位加え、５０℃、４８時間作用させた後、反応液を１００℃に加熱し３０分間保持し、反応物Ａとした。反応物Ａを実験８−１と同様にしてＴＧ消化物を調製し、実験６記載の条件でＨＰＬＣにて分析した。また、対照として市販分岐ＣＤ製品（イソエリート４０Ｐ、塩水港精糖株式会社製）で同様に、ＴＧ消化物の調製及びＨＰＬＣによる分析を行った。その結果、糖組成に占めるＣＤ及び分岐ＣＤの総含量は、反応物Ａで３３．８％、市販分岐ＣＤ製品で３２．６％であり、同等であった。また、分岐ＣＤ含量のみについて比較した場合でも、反応物Ａで１４．４％、市販分岐ＣＤ製品で１５．８％となっており、反応物Ａと市販分岐ＣＤ製品は同等のものであった。
【００９１】
以上の結果より、本酵素を利用することで、従来の分岐ＣＤの製造において必須であった、マルトースを添加する工程及びマルトースを除去する工程を行うことなく、従来品と同等の分岐ＣＤを図２に示すような簡素な工程にて製造できることが判明した。また、従来の縮合反応を利用する製造方法では、効率を上げるために酵素作用量を高くしなければならないが、本酵素は分子間転移反応にて分岐ＣＤを製造できるので、必要とする酵素作用量は縮合反応に比べ、少なくて良い。これらのことから、本酵素を分岐ＣＤ製造に利用することで、工程の簡素化及び使用する酵素量の減少により、製造コストを下げることが可能であると考えられる。
【００９２】
＜実験１０：他起源細菌からのα−グルカン転移酵素の検索＞
実験４−２で得られたα−グルカン転移酵素と同様の酵素が他の細菌にも存在しているかを調査するために、ＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列の相同性検索を行った。その結果、アノキシバチルス属やサーモアナエロバクター属に高い相同性を示すアミノ酸配列が幅広く存在することがわかった。よって、これらの属に属する微生物は、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素と同様の活性を有する酵素を産生している可能性が考えられた。そこで、自社で保有するアノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７及びサーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７からα−グルカン転移酵素の検出を試みた。
【００９３】
＜実験１１：アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７由来α−グルカン転移酵素＞
＜実験１１−１：アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７由来α−グルカン転移酵素の生産＞
酵母抽出物（商品名『ポリペプトン』、日本製薬株式会社製造）１．０ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『イースト・エキストラクト』、ベクトン・ディッキンソン社製造）０．２ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．１ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、ｐＨ７．０に調整後、５００ｍｌ容三角フラスコ１本に５０ｍｌ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７を１白金耳接種し、５０℃、２３０ｒｐｍで１６時間回転振盪培養したものを種培養とした。
【００９４】
プルラン（株式会社林原製）０．７ｗ／ｖ％、カゼイン分解物（商品名『トリプトン』、ベクトン・ディッキンソン社製造）１．３ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『イースト・エキストラクト』、ベクトン・ディッキンソン社製造）０．２ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．１ｗ／ｖ％、酢酸アンモニウム０．１ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、ｐＨ７．０に調整後、５００ｍｌ容三角フラスコ１００本に１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却した。次いで、種培養液を三角フラスコ１本につき約１．０ｍｌ接種し、５０℃、２３０ｒｐｍで６６時間回転振盪培養した。培養後、培養液を遠心分離（１１，０００ｒｐｍ、２０分間）して菌体を除き、培養上清（約８，０００ｍＬ）を得た。得られた培養上清のα−グルカン転移酵素活性を測定したところ、該酵素活性を約０．０３単位／ｍｌ含んでいた。
【００９５】
＜実験１１−２：アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７由来α−グルカン転移酵素の精製＞
実験１１−１で得た培養上清（総活性約２４０単位）に８０％飽和になるように硫安を添加、溶解し、４℃、２４時間放置することにより塩析した。沈殿した塩析物を遠心分離（１０，５００ｒｐｍ、２０分間）にて回収し、これを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解後、同緩衝液に対して透析し、遠心分離して不溶物を除き、粗酵素液を９１ｍｌ得た。粗酵素液のα−グルカン転移酵素活性は約２．２単位／ｍｌであった（総活性約２００単位）。この粗酵素液を東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール  ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１８０ｍｌ）に供し、実験２と同様にして、α−グルカン転移酵素活性画分を回収した。回収した画分に、終濃度１．５Ｍとなるように硫安を添加後、遠心分離して不溶物を除き、東ソー株式会社製『Ｐｈｅｎｙｌ−トヨパール  ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル容量１７ｍｌ）に供した。α−グルカン転移酵素は、１．５Ｍ硫安を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したカラムに吸着した。そして、硫安濃度１．５Ｍから０Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、硫安濃度約０．６５Ｍ付近に溶出した画分にα−グルカン転移酵素活性が認められた。この画分を回収し、１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析した後、和光純薬社製『ハイドロキシアパタイト・ファストフロー』ゲルを用いた群特異的アフィニティーカラムクロマトグラフィー（ゲル容量８．６ｍｌ）に供した。α−グルカン転移酵素は、１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したカラムに吸着した。そして、リン酸濃度０．０１Ｍから０．３Ｍのリニアグラジエントで溶出させたところ、リン酸濃度約０．０３Ｍ付近に溶出した画分にα−グルカン転移酵素活性が認められた。この画分を回収し、これを０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に対して透析した後、０．２ｍｌまで濃縮し、ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社製『スーパーローズ１２』ゲルを用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ゲル容量２４ｍｌ）に供した。α−グルカン転移酵素は、０．４Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したカラムを通過し、溶出液量１０．５ｍｌ付近に溶出した。この画分を回収し、これを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。各精製の各工程におけるα−グルカン転移酵素活性、全蛋白質、α−グルカン転移酵素の比活性及び収率を表６に示す。なお、精製の各工程における蛋白量は、牛血清アルブミンを標準蛋白としたＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。
【００９６】
【表６】
2014054221.tif 000007
【００９７】
得られたα−グルカン転移酵素標品を８乃至１６ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【００９８】
＜実験１１−３：アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７由来α−グルカン転移酵素の性質＞
実験１１−２で得られたα−グルカン転移酵素標品の分子量、至適ｐＨ、至適温度、ｐＨ安定性及び温度安定性を実験３と同様の方法にて調べた。その結果、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は約１６０，０００±１０，０００ダルトン、至適温度は、ｐＨ６．０、３０分間反応の条件下６０℃、至適ｐＨは５０℃、３０分間反応の条件下で７．５、温度安定性は、各温度に６０分間保持する条件下で、１ｍＭ塩化カルシウム存在下で約７０℃まで安定であり、ｐＨ安定性は、各ｐＨに４℃で２４時間保持する条件下で４．６乃至１０．７の範囲で安定であった。また、アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７由来α−グルカン転移酵素の基質特異性及び受容体特異性はバチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素と良く一致した。
【００９９】
＜実験１１−３−４：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実験１１−２の方法で得たα−グルカン転移酵素標品を用いて、本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、実験３−６と同様にして分析したところ、配列表における配列番号１８で示されるアミノ酸配列、すなわち、Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ；
を有していることが判明した。
【０１００】
＜実験１１−４：α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換微生物の調製＞
α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡをアノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７からクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、酵素をコードするＤＮＡの塩基配列の決定、及び形質転換微生物の調製を行った。
【０１０１】
＜実験１１−４−１：染色体ＤＮＡの調製＞
１０ｇ／ｌトリプトン（商品名『Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ』、Ｄｉｆｃｏ社販売）、５ｇ／ｌ酵母エキス（商品名『Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ』、Ｄｉｆｃｏ社販売）、１０ｇ／ｌ食塩及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌し、冷却して、アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７を接種し、５０℃、２３０ｒｐｍで２４時間回転振盪培養した。
【０１０２】
遠心分離により培養物から採取した菌体から実験４−２と同様にして染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。こうして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【０１０３】
＜実験１１−４−２：ＰＣＲによる部分ＤＮＡ断片のクローニング及び塩基配列の決定＞
α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡのクローニングを行うに先立ち、まず、その部分ＤＮＡ断片のＰＣＲ−クローニングを行った。α−グルカン転移酵素のＮ末端アミノ酸配列である配列表における配列番号１８で表されるアミノ酸配列における第１乃至第５番目及び第７乃至第１１番目のアミノ酸配列に基づき、配列表における配列番号１９及び２０で示される２種のセンスプライマーＦ１０１及びＦ１０２を合成した。また、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素の内部アミノ酸配列、すなわち、配列表における配列番号１で示されるアミノ酸配列における第８２０乃至第８２４番目及び第１，２９６乃至第１，３０１番目のアミノ酸配列に基づき、配列表における配列番号２１及び２２で示される２種のアンチセンスプライマーＲ１０１及びＲ１０２を合成した。センスプライマーＦ１０１とアンチセンスプライマーＲ１０２の組合せで、実験１１−４−１で得た染色体ＤＮＡを鋳型として１回目のＰＣＲを常法に従い行った。次いで、得られたＰＣＲ産物を鋳型としてセンスプライマーＦ１０２とアンチセンスプライマーＲ１０１の組合せで２回目のＰＣＲを行ったところ、約２，３００塩基対のＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片が認められた。得られた断片を用いて、実験４−２の方法に準じて塩基配列を分析したところ、当該ＤＮＡは、配列表における配列番号２３で示される鎖長２，３３３塩基対の塩基配列を有した。
【０１０４】
上記のα−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡの一部と推察されたＤＮＡ断片が制限酵素Ｓｐｅ  Ｉにて切断されないことを予め確認した後、実験１１−４−１で得た染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓｐｅ  Ｉにて消化し、消化物をセルフライゲーションさせて環状化ゲノムを得た。α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡの一部と推定されるＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、配列表における配列番号２４及び２５で示されるセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして合成し、上記環状化ゲノムを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、約８，５００ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。
【０１０５】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列を、直接、常法のジデオキシ法により解読したところ、本ＤＮＡ断片中に目的遺伝子全長が存在していることがわかり、α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡの塩基配列及びこれにコードされる当該酵素のアミノ酸配列を決定した。その結果、アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７由来α−グルカン転移酵素は、配列表における配列番号２で示される１，９２１残基のアミノ酸配列からなり、且つ、当該酵素をコードするＤＮＡは、配列表における配列番号５で示される鎖長５，７６３ｂｐの塩基配列を有することが判明した。また、配列表における配列番号５に併記したアミノ酸配列における第１乃至３０番目のアミノ酸配列は、当該酵素の分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該酵素の分泌前の前駆体は、配列表における配列番号５に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号５に示す塩基配列にコードされていることが判明した。
【０１０６】
＜実験１１−５：発現用組換えＤＮＡ、ｐＲＳＥＴＡ−ＡＦ６１の作製とその形質転換微生物ＳＥＴＡＡＦ６１による組換え型α−グルカン転移酵素の産生＞
アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７由来α−グルカン転移酵素遺伝子を発現用ベクターに挿入し、組換え型α−グルカン転移酵素の大腸菌における発現を検討した。
【０１０７】
＜実験１１−５−１：発現用組換えＤＮＡ、ｐＲＳＥＴＡ−ＡＦ６１の作製及び形質転換微生物ＳＥＴＡＡＦ６１の調製＞
α−グルカン転移酵素遺伝子を発現用ベクターに組込むに際し、配列表における配列番号２６及び２７で示されるセンスプライマーとアンチセンスプライマーを合成し、これらの組合せでＰＣＲを行いα−グルカン転移酵素遺伝子を増幅した。常法により、制限酵素Ｎｄｅ  Ｉ及びＫｐｎ  Ｉで消化した発現用ベクターｐＲＳＥＴ  Ａ（インビトロジェン社製）に、上記で増幅したＤＮＡを組込んで得られた組換えＤＮＡを『ｐＲＳＥＴＡ−ＡＦ６１』と命名した。ｐＲＳＥＴＡ−ＡＦ６１を用いて、実験５−２と同様に操作し、形質転換微生物『ＳＥＴＡＡＦ６１』を調製した。
【０１０８】
＜実験１１−５−２：形質転換微生物ＳＥＴＡＡＦ６１による組換え型α−グルカン転移酵素の産生＞
形質転換微生物ＳＥＴＡＡＦ６１について実験５−２と同様の操作にて培養上清と全細胞抽出物調製した。それぞれのα−グルカン転移酵素活性を測定した。なお、対照としてプラスミドｐＲＳＥＴ  Ａを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いて、上述の形質転換微生物の場合と同一条件で調製した培養上清と全細胞抽出物のα−グルカン転移酵素活性を測定した。その結果、実験５−２と同様に形質転換微生物ＳＥＴＡＡＦ６１は、α−グルカン転移酵素を細胞内に産生することが判明した。
【０１０９】
得られた全細胞抽出物を、実験１１−２に示した方法に準じて精製し、さらにこの精製酵素標品を実験１１−３に示した方法に準じて分析した。その結果、実験１１−２の方法で調製された当該酵素の理化学的性質と実質的に同一であった。以上の結果は、アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７由来α−グルカン転移酵素は、組換えＤＮＡ技術によって良好に製造できることを示している。
【０１１０】
＜実験１１−７：ＣＤへの糖転移＞
最終濃度４．４ｗ／ｖ％のα−、β−又はγ−ＣＤと最終濃度４．４ｗ／ｖ％のマルトペンタオース水溶液に、最終濃度５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験１１−５−２で得たα−グルカン転移酵素精製標品を、マルトペンタオース固形分１グラム当り２単位加え、６０℃、ｐＨ６．０で７２時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。また、α−グルカン転移酵素を添加していないものを対照として用意した。こうして得た酵素反応物を実験８と同様にして分析した結果、アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７由来α−グルカン転移酵素は、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６）由来α−グルカン転移酵素と同様の作用を有し、α−、β−及びγ−ＣＤに対して、重合度２以上のマルトオリゴ糖のα−１，６グリコシル転移を触媒することが判明した。
【０１１１】
＜実験１２：サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来α−グルカン転移酵素＞
＜実験１２−１：サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡのクローニング及びこれを含む組換えＤＮＡと形質転換微生物の調製＞
嫌気性好熱細菌であるサーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７は、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１やアノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７と異なり、好気培養を行うことが不可能であるため、サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７の染色体ＤＮＡからバチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素と相同性の高いアミノ酸配列をコードするＤＮＡをクローニングし、自律複製可能な組換えＤＮＡの作製、大腸菌を宿主とした組み換え酵素を調製することにより、α−グルカン転移酵素の検出を試みた。
【０１１２】
＜実験１２−１−１：染色体ＤＮＡの調製＞
炭素源として０．５ｗ／ｖ％グルコースに代えて０．５ｗ／ｖ％トレハロースを用いたこと以外は全て『ＡＴＣＣ  カタログ・オブ・バクテリア・アンド・バクテリオファージズ、第１８版』（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション発行、１９９２年）、４５２乃至４５６頁に記載のサーモアナエロビウム・ブロッキイ培地の調製法に従って、培地を１００ｍｌ容耐圧ボトルに１００ｍｌ調製した後、サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７を接種し、６０℃、２４時間培養した。
【０１１３】
遠心分離により培養物から採取した菌体から実験４−２と同様にして染色体ＤＮＡを含む沈殿を採取した。こうして得た精製染色体ＤＮＡを濃度約１ｍｇ／ｍｌになるようにＳＳＣ緩衝液（ｐＨ７．１）に溶解し、−８０℃で凍結した。
【０１１４】
＜実験１２−１−２：ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅及び塩基配列の決定＞
α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡのクローニングを行うために、プライマーの合成を行った。プライマーの塩基配列はサーモアナエロバクター・ブロッキイに属する細菌のうち、染色体ＤＮＡの全塩基配列が明らかにされているサーモアナエロバクター・ブロッキイ  サブスピーシーズ・フィンニイ  Ａｋｏ−１の配列を参考にした。バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素と相同性を示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡをサーモアナエロバクター・ブロッキイ  サブスピーシーズ・フィンニイ  Ａｋｏ−１の染色体ＤＮＡ上で特定した後、α−グルカン転移酵素遺伝子全域を増幅するため、配列表における配列番号２８及び２９で示されるセンスプライマーＴＦＡ及びアンチセンスプライマーＴＲＡを合成し、これらの組合せで、実験１２−１−１で得た染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを常法に従い行った。その結果、約５，０００塩基対のＤＮＡ断片が得られた。
【０１１５】
得られたＤＮＡ断片の塩基配列を、直接、常法のジデオキシ法により解読したところ、本ＤＮＡ断片中にα−グルカン転移酵素遺伝子全長が存在していることがわかり、α−グルカン転移酵素をコードするＤＮＡの塩基配列及びこれにコードされる当該酵素のアミノ酸配列を決定した。その結果、サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来α−グルカン転移酵素は、配列表における配列番号３で示される１，６７４残基のアミノ酸配列からなり、且つ、当該酵素をコードするＤＮＡは、配列表における配列番号６で示される鎖長５，０２５ｂｐの塩基配列を有することが判明した。また、配列表における配列番号６に併記したアミノ酸配列における第１乃至３１番目のアミノ酸配列は、当該酵素の分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該酵素の分泌前の前駆体は、配列表における配列番号６に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号６に示す塩基配列にコードされていることが判明した。なお、配列表における配列番号３で示されるアミノ酸配列から第１乃至３１番目の分泌シグナル配列を除いて算出される分子量は１８３，７５３であった。サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来のα−グルカン転移酵素遺伝子は、プライマー合成の参考にしたサーモアナエロバクター・ブロッキイ  サブスピーシーズ・フィンニイ  Ａｋｏ−１の対応する遺伝子と完全に一致し、従ってその遺伝子から転写・翻訳されるアミノ酸配列も完全に一致していた。
【０１１６】
＜実験１２−２：発現用組換えＤＮＡ、ｐＲＳＥＴＡ−ＴＢ６１の作製とその形質転換微生物ＳＥＴＡＴＢ６１による組換え型α−グルカン転移酵素の産生＞
サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来α−グルカン転移酵素遺伝子を発現用ベクターに挿入し、組換え型α−グルカン転移酵素の大腸菌における発現を検討した。
【０１１７】
＜実験１２−２−１：発現用組換えＤＮＡ、ｐＲＳＥＴＡ−ＴＢ６１の作製及び形質転換微生物ＳＥＴＡＴＢ６１の調製＞
α−グルカン転移酵素遺伝子を発現用ベクターに組込むに際し、配列表における配列番号３０及び３１で示される塩基配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを合成し、これらの組合せでＰＣＲを行いα−グルカン転移酵素遺伝子を増幅した。常法により、制限酵素Ｘｈｏ  Ｉ及びＥｃｏ  ＲＩで消化した発現用ベクターｐＲＳＥＴ  Ａ（インビトロジェン社製）に、上記で増幅したＤＮＡを組込んで得られた組換えＤＮＡを『ｐＲＳＥＴＡ−ＴＢ６１』と命名した。ｐＲＳＥＴＡ−ＴＢ６１を用いて大腸菌コンピテントセル（商品名『ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ  Ｋａｎ’』、ストラタジーン社製）を形質転換し、得られた形質転換微生物からｐＲＳＥＴＡ−ＴＢ６１を調製し、発現用宿主大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換して形質転換微生物『ＳＥＴＡＴＢ６１』を調製した。
【０１１８】
＜実験１２−２−２：形質転換微生物ＳＥＴＡＴＢ６１による組換え型α−グルカン転移酵素の産生＞
形質転換微生物ＳＥＴＡＴＢ６１について実験５−２と同様の操作にて培養上清と全細胞抽出物を調製した。それぞれのα−グルカン転移酵素活性を測定した。なお、対照としてプラスミドｐＲＳＥＴ  Ａを保持する大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を上述の形質転換微生物の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と全細胞抽出物を調製し、同様にα−グルカン転移酵素活性を測定した。その結果、実験５−２同様に形質転換微生物ＳＥＴＡＴＢ６１の全細胞抽出液にのみα−グルカン転移酵素活性が認められ、形質転換微生物ＳＥＴＡＴＢ６１はα−グルカン転移酵素を細胞内に産生することが判明した。
【０１１９】
＜実験１２−３：組換え型サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来α−グルカン転移酵素の精製＞
実験１２−２−２で得た全細胞抽出物を８５℃、１時間の熱処理に供した後、遠心分離（１０，５００ｒｐｍ、２０分間）により上清を回収した。この熱処理抽出液上清（総活性約５７単位）について、実験１１−２と同様の操作を行い、粗酵素液を１０ｍｌ得た。粗酵素液中のα−グルカン転移酵素活性を測定したところ、該酵素活性を約４．６単位／ｍｌ含んでいた（総活性約４６単位）。この粗酵素液を実験１１−２と同様にして、東ソー株式会社製『ＤＥＡＥ−トヨパール  ６５０Ｓ』ゲルを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、東ソー株式会社製『Ｐｈｅｎｙｌ−トヨパール  ６５０Ｍ』ゲルを用いた疎水カラムクロマトグラフィー、ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社製『スーパーローズ１２』ゲルを用いたゲルろ過カラムクロマトグラフィーに供し、α−グルカン転移酵素活性画分を回収した。この活性画分を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析した。精製の各工程におけるα−グルカン転移酵素活性、α−グルカン転移酵素の比活性及び収率を表７に示す。なお、精製の各工程における蛋白量は、牛血清アルブミンを標準蛋白としたＢｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。
【０１２０】
【表７】
2014054221.tif 000008
【０１２１】
得られたα−グルカン転移酵素標品を８乃至１６ｗ／ｖ％濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一であり、純度の高い標品であった。
【０１２２】
＜実験１２−４：Ｎ末端アミノ酸配列＞
実験１２−３の方法で得た精製α−グルカン転移酵素標品を用いて、本酵素のＮ末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサー  モデル４９２ＨＴ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて分析したところ、配列表における配列番号３２で示されるアミノ酸配列、すなわち、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅを有していることが判明した。
【０１２３】
＜実験１２−５：組換え型サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来α−グルカン転移酵素の性質＞
組換え型サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来α−グルカン転移酵素の分子量、至適ｐＨ、至適温度、ｐＨ安定性及び温度安定性を実験３と同様の方法にて調べた。なお、至適温度は、１ｍＭ塩化カルシウム存在下、ｐＨ６．０、２０分間反応の条件下で、至適ｐＨは、１ｍＭ塩化カルシウム存在下、６０℃、２０分間反応の条件下で測定した。その結果、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量は１００，０００±１０，０００ダルトン、至適温度は、ｐＨ６．０、２０分間反応の条件下１００℃、至適ｐＨは６０℃、２０分間反応の条件下で６．５、温度安定性は、各温度に６０分間保持する条件下で、１ｍＭ塩化カルシウム存在下で８５℃まで安定であり、ｐＨ安定性は、各ｐＨに４℃で２４時間保持する条件下で４．１乃至１０．７の範囲で安定であった。また、組換え型サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来α−グルカン転移酵素の基質特異性及び受容体特異性はバチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素と良く一致した。
【０１２４】
＜実験１２−６：ＣＤへの糖転移＞
最終濃度４．４ｗ／ｖ％のα−、β−又はγ−ＣＤと最終濃度４．４ｗ／ｖ％のマルトペンタオース水溶液に、最終濃度５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）及び最終濃度１ｍＭ塩化カルシウムを加えた後、実験１２−３で得たα−グルカン転移酵素精製標品を、マルトペンタオース固形分１グラム当り２単位加え、６０℃、ｐＨ６．０で７２時間作用させ、１００℃で１０分間保持して反応を停止した。また、α−グルカン転移酵素を添加していないものを対照とした。こうして得た酵素反応物を実験８と同様にして分析した。その結果、組換え型サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来α−グルカン転移酵素は、バチルス・アシディセラー  Ｒ６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６）由来α−グルカン転移酵素と同様の作用を有し、α−ＣＤ、β−ＣＤ及びγ−ＣＤに対して、重合度２以上のマルトオリゴ糖のα−１，６グリコシル転移を触媒することが判明した。
【０１２５】
＜実験１３：α−グルカン転移酵素のアミノ酸配列における共通配列＞
バチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素、アノキシバチルス・フラビサーマス  ＮＢＲＣ１５３１７由来α−グルカン転移酵素、サーモアナエロバクター・ブロッキイ  ＡＴＣＣ３５０４７由来α−グルカン転移酵素のアミノ酸配列の比較を行った。その結果、これらの３種の酵素においてはα−アミラーゼファミリー（ＧＨ１３）に保存される４つの領域以外に、配列表における配列番号１で示されるバチルス・アシディセラー  Ｒ６１由来α−グルカン転移酵素のアミノ酸配列における残基番号３８４−３８９、８１０−８１５、８１９−８２４の３箇所がよく保存されていた。これらの配列はα−アミラーゼ、ＣＧＴａｓｅ、プルラナーゼ、ネオプルラナーゼ、枝作り酵素などのアミノ酸配列には存在しない。従って、これらの配列は、本発明のα−グルカン転移酵素の特徴的な配列である。
【０１２６】
以下、実施例により、さらに具体的に本発明を説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０１２７】
＜α−グルカン転移酵素の製造＞
バチルス・アシディセラー  Ｒ６１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１４３６）を実験１の方法に準じて、種培養した。続いて、容量３０Ｌのファーメンターに、澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃４』、松谷化学工業株式会社製）１．７ｗ／ｖ％、酵母抽出物（商品名『ミースト顆粒Ｓ』、アサヒフード＆ヘルスケア株式会社製）１．５ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム・２水和物０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５ｗ／ｖ％、硫酸第二鉄・７水和物０．００１ｗ／ｖ％、硫酸マンガン・５水和物０．００１ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地をｐＨ７．０に調整後、約２０Ｌ入れて、加熱滅菌、冷却して温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、温度２７℃、ｐＨ５．５乃至８．０に保ちつつ、２４時間通気培養した。培養後、ＳＦ膜を用いて除菌濾過し、３．７単位／ｍｌの本発明のα−グルカン転移酵素を含む培養濾液を約１８Ｌ得た。更に、その濾液をＵＦ膜濃縮し、３．８単位／ｍｌのα−グルカン転移酵素を含む濃縮酵素液約１Ｌを回収した。本品は、分岐ＣＤの製造に有利に利用できる。
【実施例２】
【０１２８】
＜澱粉部分分解物を用いた分岐ＣＤの調製＞
市販の澱粉部分分解物（商品名「パインデックス＃１００」、松谷化学工業株式会社製）を濃度約１５％（ｗ／ｖ）水溶液とし、終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加え、ｐＨ５．５に調整した。これに、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原製）を基質固形物１グラム当り４単位及びイソアミラーゼ（株式会社林原製）を７５０単位を加え、５０℃で２４時間反応させた後、９０℃に加熱し３０分保持して反応を停止させた。次いで、この反応液に、実施例１の方法で調製したα−グルカン転移酵素の濃縮粗酵素液を固形物１グラム当り１．０単位加え、５０℃、４８時間作用させた。さらに、市販のα−アミラーゼ剤（商品名「ネオスピターゼＰＫ２」、ナガセケムテックス株式会社製）を基質固形物１グラム当り５単位を加え、８０℃で１時間反応させた後、反応液を９０℃に加熱し、１０分間保持した。冷却後、珪藻土濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度３０質量％の分岐ＣＤ含有溶液を固形物当り収率約９０％で得た。実験８−１と同様にして調製した本品のＴＧ消化物の糖組成を調べた。その結果、α−ＣＤ  ４．１％、β−ＣＤ  ７．７％、グルコシルβ−ＣＤ  ８．１％、γ−ＣＤ  ２．１％、グルコシルγ−ＣＤ  ２．３％が検出され、本品に含有するβ−ＣＤ及びγ−ＣＤの半分程度に分岐が導入されていた。本品は、各種ＣＤだけでなく、分岐β−ＣＤ及び分岐γ−ＣＤを含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例３】
【０１２９】
＜タピオカ澱粉を用いた分岐ＣＤの調製＞
１５質量％タピオカ澱粉液化液（加水分解率３．６％）に、最終濃度０．３質量％となるように亜硫酸水素ナトリウムを、また、最終濃度１ｍＭとなるように塩化カルシウムを加えた後、５０℃に冷却した。この液化溶液に、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来ＣＧＴａｓｅ（株式会社林原製）を基質固形物１グラム当り８単位及びイソアミラーゼ（株式会社林原製）を７５０単位を加え、５０℃で２４時間反応させた後、９０℃に加熱し３０分保持して反応を停止させた。次いで、この反応液に、実施例１の方法で調製したα−グルカン転移酵素の濃縮粗酵素液を固形物１グラム当り１．０単位加え、５０℃、４８時間作用させた。さらに、市販のα−アミラーゼ剤（商品名「ネオスピターゼＰＫ２」、ナガセケムテックス株式会社製）を基質固形物１グラム当り５単位を加え、８０℃で１時間反応させた後、反応液を９０℃に加熱し、１０分間保持した。冷却後、珪藻土濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度５０質量％の分岐ＣＤ溶液を固形物当り収率約９０％で得た。実験８−１に記載した条件で調製した本品のＴＧ消化物の糖組成を調べた結果、α−ＣＤ  ３．９％、β−ＣＤ  ８．１％、グルコシルβ−ＣＤ  ８．１％、γ−ＣＤ  １．７％、グルコシルγ−ＣＤ  ２．１％が検出され、本品に含有するβ−ＣＤ及びγ−ＣＤの半分程度に分岐が導入されていた。そのため、本品を５℃で３週間保存してもＣＤ類の結晶は認められなかった。本品は、各種ＣＤだけでなく、分岐β−ＣＤ及び分岐γ−ＣＤを含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例４】
【０１３０】
＜分岐ＣＤ含有粉末の調製＞
実施例３の方法で得た分岐ＣＤ含有シラップを、常法に従って、水素添加して還元性糖質を糖アルコール化し、精製し、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、分岐ＣＤ含有粉末を固形物当り収率約９０％で得た。本品は、ＣＤ類及び分岐ＣＤ類以外にマルチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトール、及びその他の糖アルコールを含有しており、実質的に還元力を示さず、アミノカルボニル反応を起こしにくく、低還元性で、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【実施例５】
【０１３１】
＜分岐ＣＤ高含有粉末の調製＞
実施例３において、α−グルカン転移酵素を用いた分岐ＣＤ生成反応後、市販のα−アミラーゼ剤（商品名「ネオスピターゼＰＫ２」、ナガセケムテックス株式会社製）を基質固形物１グラム当り５単位及びβ−アミラーゼ（大豆由来、ナガセケムテックス株式会社製）固形物１グラム当り５単位添加して５５℃、２４時間反応させ、さらに、反応液を９０℃に加熱し、１０分間保持した。冷却後、珪藻土濾過して得られる濾液を常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度３０質量％の分岐ＣＤ溶液を固形物当り収率約９０％で得た。この分岐ＣＤ含有シラップを原糖液とし、分岐ＣＤ及びＣＤの含量を高めるため、塩型強酸性カチオン交換樹脂（アンバーライトＣＲ−１３１０、Ｎａ型、オルガノ株式会社製）を用いるカラムクロマトグラフィーを行なって、分岐ＣＤ及びＣＤ高含有画分を採取し、精製、濃縮し、噴霧乾燥して、分岐ＣＤ及びＣＤ高含有粉末を固形物当り収率約４０％で得た。本品は、α−ＣＤ  ８．１％、β−ＣＤ  １６．３％、グリコシルβ−ＣＤ  ２１．０％、γ−ＣＤ  ３．５％、グリコシルγ−ＣＤ  ５．１％を含んでいる分岐ＣＤ及びＣＤ高含有粉末であって、還元性が比較的低く、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性、を有し、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【産業上の利用可能性】
【０１３２】
本発明のα−グルカン転移酵素は、澱粉質にＣＤ共存下で作用させることにより、従来の縮合反応による分岐ＣＤの製造法より簡素な工程で分岐ＣＤを製造することができる。分岐ＣＤの製造方法を提供する本発明は、飲食物、化粧品、医薬品など種々の利用分野に貢献することとなり、その産業的意義はきわめて大きい。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】従来の工業的な分岐ＣＤの製造工程を示す図である。
【図２】本発明のα−グルカン転移酵素を利用した分岐ＣＤの製造工程の１例を示す図である。
【図３】バチルス・アシディセラー  Ｒ６１株由来α−グルカン転移酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図４】バチルス・アシディセラー  Ｒ６１株由来α−グルカン転移酵素の至適温度を示す図である。
【図５】バチルス・アシディセラー  Ｒ６１株由来α−グルカン転移酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図６】バチルス・アシディセラー  Ｒ６１株由来α−グルカン転移酵素の温度安定性を示す図である。
【図７】アミロースを基質にした場合のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図８】アミロースとβ−ＣＤの混合物を基質にした場合のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図９】アミロースとγ−ＣＤの混合物を基質にした場合のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【符号の説明】
【０１３４】
図６において、
●：カルシウムイオン非存在下
○：１ｍＭカルシウムイオン存在下
図７乃至９において、
イ：反応前
ロ：酵素反応物
ハ：ＴＧ消化物
ニ：アルカリ処理物
１：マルトテトラオースの溶出位置
２：マルトトリオースの溶出位置
３：マルトースの溶出位置
４：グルコースの溶出位置
５：β−ＣＤの溶出位置
６：γ−ＣＤの溶出位置
Ａ乃至Ｈ：転移糖Ａ乃至Ｈの溶出位置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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