(57)【要約】ヒト２型線維芽細胞増殖因子受容体（ｈＦＧＦＲ２）を標的とする、医薬組成物または診断組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の性質（ｉ）乃至（ｉｉｉ）を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片：
（ｉ）非変性型のヒト２型線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈＦＧＦＲ２）ＩＩＩｃに特異的に結合する；
（ｉｉ）非変性型のヒト１型線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈＦＧＦＲ１）、非変性型のヒト３型線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈＦＧＦＲ３）、及び、非変性型のヒト４型線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈＦＧＦＲ４）には特異的に結合しない；
（ｉｉｉ）ホルマリンで固定した標本中の変性型ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに特異的に結合する。
【請求項２】
非変性型のヒト２型線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈＦＧＦＲ２）ＩＩＩｂ、及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号３０（図２０）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３１（図２０）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３２（図２０）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号３３（図２０）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３４（図２０）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３５（図２０）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含むことからなる軽鎖からなる、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号３０（図２０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３１（図２０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３２（図２０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号３３（図２０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３４（図２０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３５（図２０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含むことからなる軽鎖からなる、請求項３に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
下記（ｉ）乃至（ｉｖ）のいずれか一つに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むことからなる、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片：
（ｉ）配列番号８（図１５Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、および、配列番号１０（図１５Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号８（図１５Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列、および、配列番号１０（図１５Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号８（図１５Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列、および、配列番号１０（図１５Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号８（図１５Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、および、配列番号１０（図１５Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列。
【請求項６】
配列番号２１（図１８Ｂ）に示される重鎖のアミノ酸配列、および、配列番号２３（図１８Ｄ）に示される軽鎖のアミノ酸配列を含むことからなる、請求項１乃至５のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
請求項３乃至６に記載の抗体又はその抗原結合断片が認識するｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及び／又はｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ上の部位に結合するか、又は、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及び／又はｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂへの結合において、請求項３乃至６に記載の抗体又はその抗原結合断片と競合する、請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
非変性型のヒト２型線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈＦＧＦＲ２）ＩＩＩｂ、及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂには結合しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
配列番号２４（図１９）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２５（図１９）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２６（図１９）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号２７（図１９）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２８（図１９）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２９（図１９）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含むことからなる軽鎖からなる、請求項１又は８に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
配列番号２４（図１９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２５（図１９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２６（図１９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号２７（図１９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２８（図１９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２９（図１９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含むことからなる軽鎖からなる、請求項９に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
下記（ｉ）乃至（ｉｖ）のいずれか一つに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むことからなる、請求項１又は８に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片：
（ｉ）配列番号３（図１４Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、および、配列番号６（図１４Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号３（１４Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列、および、配列番号６（図１４Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号３（図１４Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列、および、配列番号６（図１４Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号３（図１４Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、および、配列番号６（図１４Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列。
【請求項１２】
配列番号１５（図１７Ｂ）に示される重鎖のアミノ酸配列、および、配列番号１９（図１７Ｄ）に示される軽鎖のアミノ酸配列を含むことからなる、請求項１、８乃至１１のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
請求項９乃至１２に記載の抗体又はその抗原結合断片が認識するｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ上の部位に結合するか、又は、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃへの結合において、請求項９乃至１２に記載の抗体又はその抗原結合断片と競合する、請求項１又は８に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載のポリヌクレオチド又は請求項１５に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１７】
下記の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、請求項１、２又は８に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
（ｉ）請求項１６に記載の細胞を培養する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の培養物からモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を回収する工程。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法により得られるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１９】
請求項１乃至７および１８のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む組成物。
【請求項２０】
請求項１乃至７および１８のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本（以下、単に「標本」という。）中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出又は測定方法に使用される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
該標本が、脱パラフィン処理された後に、加熱処理により賦活化処理される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
加熱処理が、９０乃至１００℃、ｐＨ８乃至１０で行われることを特徴とする、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１乃至７および１８のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片又は請求項１９に記載の組成物と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出又は測定方法に使用される、請求項１９乃至２２のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項２４】
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出又は測定方法が、被検標本においてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出若しくは測定されたか、又は、被検標本におけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出若しくは測定されなかったか、又は、被検標本におけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の検査又は診断方法に使用される、請求項１９乃至２４に記載の組成物。
【請求項２６】
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の検査又は診断方法が、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出又は測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する抗体若しくはその結合断片を投与する工程を含むｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の治療又は予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する抗体若しくはその結合断片を投与する工程を含むｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の治療又は予防方法には適していないと判定することを含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患がｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性癌である、請求項２５又は２６に記載の組成物。
【請求項２８】
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載の被験者に投与される、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物：
（ｉ）請求項１９乃至２３又は請求項２５のいずれか一つに記載の組成物を用いてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出又は測定された被検標本の由来する被験者；
（ｉｉ）請求項２４に記載の組成物を用いたｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出又は測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者；
（ｉｉｉ）請求項２６又は２７に記載の組成物を用いて、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の治療又は予防に適していると判定された被験者。
【請求項２９】
下記の工程（ｉ）、又は（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出または測定方法：
（ｉ）請求項１乃至７および１８のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体または該抗体の抗原結合断片又は請求項１９に記載の組成物と被検標本を接触させる工程、
（ｉｉ）該被検標本においてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出もしくは測定されたか、または該被検標本におけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出もしくは測定されなかったか、また被検標本におけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程。  
【請求項３０】
下記の工程（ｉ）、又は（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ｈＦＧＦＲ２に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合断片を含む医薬組成物を投与する個体の同定方法：
（ｉ）請求項１乃至７および１８のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合断片又は請求項１９に記載の組成物と個体由来のサンプルを接触させる工程、
（ｉｉ）該個体由来のサンプルにおいてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出もしくは測定されたか、または該個体由来のサンプルにおけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該個体を陽性と判定し、該個体由来のサンプルにおいてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出もしくは測定されなかったか、または該個体由来のサンプルにおけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該個体を陰性と判定する工程。
【請求項３１】
下記の工程（ｉ）乃至（ｉｉｉ）を含むことからなる、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定する方法：
（ｉ）請求項１乃至７および１８のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合断片を含む組成物と被検標本を接触させ、被検標本中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂとｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定する工程；
（ｉｉ）ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する抗体または該抗体の抗原結合断片を含む組成物と被検標本を接触させ、被検標本中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを検出または測定する工程；
（ｉｉｉ）（ｉ）の検出または測定の結果と（ｉｉ）の検出または測定の結果を比較することにより、あるいは（ｉ）の検出または測定の結果から（ｉｉ）の検出または測定の結果を差し引くことにより、該サンプル中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定の結果または値を得る工程。
【請求項３２】
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の検査または診断方法に使用される、請求項２９乃至３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患を罹患しているもしくはそのリスクがある個体の同定方法に使用される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２８の（ｉ）乃至（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載の被験者に対し、ｈＦＧＦＲ２に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の治療方法。
【請求項３５】
請求項１乃至７および１８のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合断片を含有する、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患を検査又は診断するためのキット。
【請求項３６】
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患がｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性癌である、請求項３２乃至３４に記載の方法又は請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
請求項１、８乃至１３および１８のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む組成物。
【請求項３８】
請求項１、８乃至１３および１８のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその結合断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本（以下、単に「標本」という。）中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出又は測定方法に使用される、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
該標本が、脱パラフィン処理された後に、酵素処理により賦活化される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
酵素処理が、２０乃至３８℃での蛋白質分解酵素の反応であることを特徴とする、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項１、８乃至１３および１８のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片又は請求項３７に記載の組成物と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出又は測定方法に使用される、請求項３７乃至４０に記載の組成物。
【請求項４２】
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出又は測定方法が、被検標本においてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃが検出若しくは測定されたか、又は、被検標本におけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃが検出若しくは測定されなかったか、又は、被検標本におけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患の検査又は診断方法に使用される、請求項３７乃至４２のいずれか一つに記載の組成物。
【請求項４４】
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患の検査又は診断方法が、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出又は測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患の治療又は予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患の治療又は予防方法には適していないと判定することを含む、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患がｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性癌である、請求項４３又は４４に記載の組成物。
【請求項４６】
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載の被験者に投与される、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物：
（ｉ）請求項３７乃至４１及び４３のいずれか一つに記載の組成物を用いてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃが検出又は測定された被検標本の由来する被験者；
（ｉｉ）請求項４２に記載の組成物を用いたｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出又は測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者；
（ｉｉｉ）請求項４４又は４５に記載の組成物を用いて、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患の治療又は予防に適していると判定された被験者。
【請求項４７】
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患がｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性癌である、請求項４６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗体、該抗体の機能断片、該抗体の修飾体、該抗体の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド、該ヌクレオチドが挿入されたベクター、該ヌクレオチド又はベクターが導入された細胞、該細胞を培養する工程を含む該抗体の製造方法、医薬組成物、診断用又は検査用組成物、キット等に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）はＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）シグナルを介して、胚形成、組織ホメオスタシスおよび代謝に重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献１）。ヒトでは、２２のＦＧＦ（ＦＧＦ１乃至１４、および、ＦＧＦ１６乃至２３）およびチロシンキナーゼドメインを有する４つのＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ１乃至４：以下まとめて「ＦＧＦＲｓ」と呼ぶ）が存在する。ＦＧＦＲｓは、２つあるいは３つの免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＤ１乃至３）から成るリガンド結合部位を含む細胞外領域、１回膜貫通領域、およびチロシンキナーゼドメインを含む細胞内領域から構成されている。ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３には、ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃと呼ばれる各２つのスプライシングバリアントが存在する。これらのアイソフォームはＩｇＤ３の後半において約５０のアミノ酸配列が異なっており、異なる組織分布およびリガンド特異性を示す。一般に、ＩＩＩｂアイソフォームは上皮細胞で発現し、ＩＩＩｃは間葉系細胞で表現することが知られている。ＦＧＦｓがＦＧＦＲｓに結合すると、多数のシグナル経路の活性化を誘導する（非特許文献１）。その結果、ＦＧＦｓおよびそれらに対応するレセプターは、増殖、分化、運動および生存を含む幅広い細胞機能を制御する。【０００３】
ＦＧＦＲｓの異常な活性化は、特定のヒトの悪性腫瘍に関わることが知られている（非特許文献１及び２）。特にＦＧＦＲ２シグナル異常と癌との関連性に関しては、ＦＧＦＲ２とそのリガンドの過剰発現、受容体の変異や遺伝子増幅、およびアイソフォームのスイッチングなどの知見がある（非特許文献２、３、４、５、６及び７）。【０００４】
以上より、ＦＧＦＲ２が癌に対する優れた治療標的となる可能性が示唆されており、実際にＦＧＦＲ２に対するモノクローナル抗体が取得され、臨床試験が実施されている（非特許文献８、９、１０及び１１）。【０００５】
これらのことから、ＦＧＦＲ２およびそのスプライシングバリアントの発現を検出できる方法の提供は、癌などＦＧＦＲ２に関わる疾患、ＦＧＦＲ２発現の検査または診断に有用である。【０００６】
ヒトＦＧＦＲ２を認識するモノクローナル抗体は多数知られているが、免疫組織染色への適用が可能とされるものは少なく、さらにホルマリンで固定した変性型ＦＧＦＲ２認識による免疫組織染色が可能とされる抗体としては僅かにクローン１Ｇ３等（非特許文献１２）が知られているに過ぎず他のＦＧＦＲファミリーへのクロス認識およびヒトＦＧＦＲ２スプライシングバリアントＩＩＩｂまたはＩＩＩｃへの選択的認識については知られていなかった。【０００７】
また、ホルマリンで固定した変性型ヒトＦＧＦＲ２のスプライシングバリアントＩＩＩｂを選択的に認識するモノクローナル抗体は報告されているが（特許文献１）、変性型ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを選択的に認識するモノクローナル抗体は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際出願公開  ＷＯ２０１３／１５４２０６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】エスワラクマル他（Ｅｓｗａｒａｋｕｍａｒ，  Ｖ．Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・サイトカイン・グロース・ファクター・レビュー（Ｊ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．）、２００５年４月刊、１６巻（２号）、１３９乃至１４９頁、２００５年２月１日電子公表、レビュー（Ｒｅｖｉｅｗ）
【非特許文献２】ターナー及びグローセ（Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｎ．  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｅ，  Ｒ．）、ネイチャー・レビュー・オブ・キャンサー（Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ）、２０１０年２月刊、１０巻（２号）、１１６乃至１２９頁、レビュー（Ｒｅｖｉｅｗ）
【非特許文献３】イーストン他（Ｅａｓｔｏｎ，  Ｄ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００７年６月２８日刊、４４７巻（７１４８号）、１０８７乃至１０９３頁
【非特許文献４】ハンター他（Ｈｕｎｔｅｒ  ＤＪ，  ｅｔ  ａｌ．）、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．）、２００７年７月刊、３９巻（７号）、８７０乃至８７４頁、２００７年５月２７日電子公表
【非特許文献５】カトウ及びカトウ（Ｋａｔｏｈ，  Ｙ．  ａｎｄ  Ｋａｔｏｈ，  Ｍ．）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・モレキュラー・メディシン（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．）、２００９年３月刊、２３巻（３号）、３０７乃至３１１頁、レビュー（Review）
【非特許文献６】チャファー（Ｃｈａｆｆｅｒ，  Ｃ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．）、ディファレンシエーション（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、２００７年１１月刊、７５.巻（９号）、８３１乃至８４２頁、２００７年８月１４日電子公表、レビュー（Ｒｅｖｉｅｗ）
【非特許文献７】カーステンズ他（Ｃａｒｓｔｅｎｓ，  Ｒ．Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．）オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、１９９７年１２月１８日刊、１５巻（２５号）、３０５９乃至３０６５頁
【非特許文献８】ツァオ他（Ｚｈａｏ，  Ｗ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．）、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、２０１０年１２月１日刊、 １６巻（２３号）、５７５０乃至５７５８頁、２０１０年７月２９日電子公表
【非特許文献９】バイ他（Ｂａｉ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．）、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、 ２０１０年１０月１日刊、７０巻（１９号）、７６３０乃至７６３９頁、２０１０年８月１３日電子公表
【非特許文献１０】クリニカルトライアルズ・ドット・ガブ（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ.ｇｏｖ）、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ.ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１８８１２１７、２０１３年６月１３日電子公表
【非特許文献１１】クリニカルトライアルズ・ドット・ガブ（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ.ｇｏｖ）、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ.ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２３６８９５１、２０１５年２月１６日電子公表
【非特許文献１２】ヴァーミューレン他（Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．）ピーロス・ワン（ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ）、２０１３年公表、８巻（１合）、ｅ５３３５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の一つの課題は、ＦＧＦＲ２に対する抗体を提供することである。【００１１】
本発明の他の一つの課題は抗ＦＧＦＲ２抗体を含有する診断又は検査用組成物等を提供することである。【００１２】
また、本発明の課題には、該抗体が有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド、該ヌクレオチドが挿入されたベクター、該ヌクレオチド又はベクターが導入された細胞、該細胞を培養する工程を含む該抗体の製造方法等が含まれる。【００１３】
さらに、本発明の他の一つの課題は、医薬組成物及び治療方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは上記課題を解決するために鋭意、検討を行い、新規な抗ＦＧＦＲ２抗体を創出し、該抗体を用いてＦＧＦＲ２を検出することができることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、
（１）
以下の性質（ｉ）乃至（ｉｉｉ）を有するモノクローナル抗体又はその抗原結合断片：
（ｉ）非変性型のヒト２型線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈＦＧＦＲ２）ＩＩＩｃに特異的に結合する；
（ｉｉ）非変性型のヒト１型線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈＦＧＦＲ１）、非変性型のヒト３型線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈＦＧＦＲ３）、及び、非変性型のヒト４型線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈＦＧＦＲ４）には特異的に結合しない；
（ｉｉｉ）ホルマリンで固定した標本中の変性型ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに特異的に結合する、
（２）
非変性型のヒト２型線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈＦＧＦＲ２）ＩＩＩｂ、及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する、（１）に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
（３）
配列番号３０（図２０）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３１（図２０）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３２（図２０）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号３３（図２０）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３４（図２０）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３５（図２０）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含むことからなる軽鎖からなる、（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
（４）
配列番号３０（図２０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３１（図２０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号３２（図２０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号３３（図２０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３４（図２０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号３５（図２０）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含むことからなる軽鎖からなる、（３）に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
（５）
下記（ｉ）乃至（ｉｖ）のいずれか一つに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むことからなる、（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片：
（ｉ）配列番号８（図１５Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、および、配列番号１０（図１５Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号８（図１５Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列、および、配列番号１０（図１５Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号８（図１５Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列、および、配列番号１０（図１５Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号８（図１５Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、および、配列番号１０（図１５Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、【００１５】
（６）
配列番号２１（図１８Ｂ）に示される重鎖のアミノ酸配列、および、配列番号２３（図１８Ｄ）に示される軽鎖のアミノ酸配列を含むことからなる、（１）乃至（５）のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
（７）
（３）乃至（６）に記載の抗体又はその抗原結合断片が認識するｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及び／又はｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ上の部位に結合するか、又は、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及び／又はｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂへの結合において、（３）乃至（６）に記載の抗体又はその抗原結合断片と競合する、（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
（８）
非変性型のヒト２型線維芽細胞増殖因子受容体（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｈＦＧＦＲ２）ＩＩＩｂ、及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂには結合しない、（１）に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
（９）
配列番号２４（図１９）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２５（図１９）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２６（図１９）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号２７（図１９）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２８（図１９）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２９（図１９）に示されるアミノ酸配列もしくは該アミノ酸配列において１個又は２個のアミノ酸が置換されてなるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含むことからなる軽鎖からなる、（１）又は（８）に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
（１０）
配列番号２４（図１９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２５（図１９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２及び配列番号２６（図１９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含むことからなる重鎖、並びに、配列番号２７（図１９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２８（図１９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２及び配列番号２９（図１９）に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含むことからなる軽鎖からなる、（９）に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、【００１６】
（１１）
下記（ｉ）乃至（ｉｖ）のいずれか一つに記載の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含むことからなる、（１）又は（８）に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片：
（ｉ）配列番号３（図１４Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列、および、配列番号６（図１４Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号３（１４Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列、および、配列番号６（図１４Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列と９５％以上同一のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号３（図１４Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列、および、配列番号６（図１４Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されてなるアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号３（図１４Ｂ）に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、および、配列番号６（図１４Ｄ）に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドが有するヌクレオチド配列にコードされるアミノ酸配列、
（１２）
配列番号１５（図１７Ｂ）に示される重鎖のアミノ酸配列、および、配列番号１９（図１７Ｄ）に示される軽鎖のアミノ酸配列を含むことからなる、（１）、  （８）乃至（１１）のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
（１３）
（９）乃至（１２）に記載の抗体又はその抗原結合断片が認識するｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ上の部位に結合するか、又は、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃへの結合において、（９）乃至（１２）に記載の抗体又はその抗原結合断片と競合する、（１）又は（８）に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
（１４）
（１）乃至（１３）のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド、
（１５）
（１４）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター、【００１７】
（１６）
（１４）に記載のポリヌクレオチド又は（１５）に記載のベクターを含む細胞、
（１７）
下記の工程（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、（１）、（２）又は（８）に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
（ｉ）（１６）に記載の細胞を培養する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の培養物からモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を回収する工程、
（１８）
（１７）に記載の方法により得られるモノクローナル抗体又はその抗原結合断片、
（１９）
（１）乃至（７）および（１８）のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む組成物、
（２０）
（１）乃至（７）および（１８）のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本（以下、単に「標本」という。）中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出又は測定方法に使用される、（１９）に記載の組成物、【００１８】
（２１）
該標本が、脱パラフィン処理された後に、加熱処理により賦活化処理される、（２０）に記載の組成物、
（２２）
加熱処理が、９０乃至１００℃、ｐＨ８乃至１０で行われることを特徴とする、（２１）に記載の組成物、
（２３）
（１）乃至（７）および（１８）のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片又は（１９）に記載の組成物と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出又は測定方法に使用される、（１９）乃至（２２）のいずれか一つに記載の組成物、
（２４）
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出又は測定方法が、被検標本においてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出若しくは測定されたか、又は、被検標本におけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出若しくは測定されなかったか、又は、被検標本におけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、（２３）に記載の組成物、
（２５）
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の検査又は診断方法に使用される、（１９）乃至（２４）に記載の組成物、【００１９】
（２６）
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の検査又は診断方法が、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出又は測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する抗体若しくはその結合断片を投与する工程を含むｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の治療又は予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する抗体若しくはその結合断片を投与する工程を含むｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の治療又は予防方法には適していないと判定することを含む、（２５）に記載の組成物、
（２７）
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患がｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性癌である、（２５）又は（２６）に記載の組成物、
（２８）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載の被験者に投与される、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物：
（ｉ）（１９）乃至（２３）又は（２５）のいずれか一つに記載の組成物を用いてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出又は測定された被検標本の由来する被験者；
（ｉｉ）（２４）に記載の組成物を用いたｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出又は測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者；
（ｉｉｉ）（２６）又は（２７）に記載の組成物を用いて、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の治療又は予防に適していると判定された被験者、
（２９）
下記の工程（ｉ）、又は（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出または測定方法：
（ｉ）（１）乃至（７）および（１８）のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体または該抗体の抗原結合断片又は（１９）乃至（２２）に記載の組成物と被検標本を接触させる工程、
（ｉｉ）該被検標本においてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出もしくは測定されたか、または該被検標本におけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、該被検標本においてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出もしくは測定されなかったか、また該被検標本におけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程、  
（３０）
下記の工程（ｉ）、又は（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、ｈＦＧＦＲ２に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合断片を含む医薬組成物を投与する個体の同定方法：
（ｉ）（１）乃至（７）および（１８）のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合断片又は（１９）乃至（２２）に記載の組成物と個体由来のサンプルを接触させる工程、
（ｉｉ）該個体由来のサンプルにおいてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出もしくは測定されたか、または該個体由来のサンプルにおけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより高い場合、該個体を陽性と判定し、該個体由来のサンプルにおいてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂが検出もしくは測定されなかったか、また該個体由来のサンプルにおけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの発現レベルもしくは発現量が事前に決定された基準と同等かまたはそれより低い場合、該個体を陰性と判定する工程、【００２０】
（３１）
下記の工程（ｉ）乃至（ｉｉｉ）を含むことからなる、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定する方法：
（ｉ）（１）乃至（７）および（１８）のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合断片を含む組成物と被検標本を接触させ、被検標本中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂとｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定する工程；
（ｉｉ）ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する抗体または該抗体の抗原結合断片を含む組成物と被検標本を接触させ、被検標本中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを検出または測定する工程；
（ｉｉｉ）（ｉ）の検出または測定の結果と（ｉｉ）の検出または測定の結果を比較することにより、あるいは（ｉ）の検出または測定の結果から（ｉｉ）の検出または測定の結果を差し引くことにより、該サンプル中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定の結果または値を得る工程、
（３２）
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の検査または診断方法に使用される、（２９）乃至（３１）に記載の方法、
（３３）
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患を罹患しているもしくはそのリスクがある個体の同定方法に使用される、（３０）に記載の方法、  
（３４）
（２８）の（ｉ）乃至（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載の被験者に対し、ｈＦＧＦＲ２に特異的に結合する抗体もしくは該抗体の抗原結合断片を含む医薬組成物を投与することを含む、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の治療方法、
（３５）
（１）乃至（７）および（１８）のいずれか一つに記載の抗体または該抗体の抗原結合断片を含有する、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患を検査又は診断するためのキット、【００２１】
（３６）
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患がｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性癌である、（３２）乃至（３４）に記載の方法又は（３５）に記載のキット、
（３７）
（１）、（８）乃至（１３）および（１８）のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む組成物、
（３８）
（１）、（８）乃至（１３）および（１８）のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体又はその結合断片を含み、パラフィン包埋処理した後脱パラフィン処理した組織標本（以下、単に「標本」という。）中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出又は測定方法に使用される、（３７）に記載の組成物、
（３９）
該標本が、脱パラフィン処理された後に、酵素処理により賦活化される、（３８）に記載の組成物、
（４０）
酵素処理が、２０乃至３８℃での蛋白質分解酵素の反応であることを特徴とする、（３９）に記載の組成物、【００２２】
（４１）
（１）、（８）乃至（１３）および（１８）のいずれか一つに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合断片又は（３７）に記載の組成物と被検標本を接触させる工程を含む、標本中のｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出又は測定方法に使用される、（３７）乃至（４０）に記載の組成物、
（４２）
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出又は測定方法が、被検標本においてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃが検出若しくは測定されたか、又は、被検標本におけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより高い場合、該被検標本を陽性と判定し、被検標本においてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃが検出若しくは測定されなかったか、又は、被検標本におけるｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの発現レベル若しくは発現量が事前に決定された基準と同等か又はそれより低い場合、該被検標本を陰性と判定する工程を含む、（４１）に記載の組成物、
（４３）
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患の検査又は診断方法に使用される、（３７）乃至（４２）のいずれか一つに記載の組成物、
（４４）
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患の検査又は診断方法が、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出又は測定において、陽性と判定された被検標本が由来する被験者は、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患の治療又は予防方法に適していると判定し、陰性と判定された被検標本が由来する被験者は、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患の治療又は予防方法には適していないと判定することを含む、（４３）に記載の組成物、
（４５）
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患がｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性癌である、（４３）又は（４４）に記載の組成物、【００２３】
（４６）
下記（ｉ）乃至（ｉｉｉ）のいずれか一つに記載の被験者に投与される、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物：
（ｉ）（３７）乃至（４０）及び（４３）のいずれか一つに記載の組成物を用いてｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃが検出又は測定された被検標本の由来する被験者；
（ｉｉ）（４２）に記載の組成物を用いたｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出又は測定において陽性と判定された被検標本の由来する被験者；
（ｉｉｉ）（４４）又は（４５）に記載の組成物を用いて、ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合断片を投与する工程を含むｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患の治療又は予防に適していると判定された被験者、及び、
（４７）
ｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患がｈＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性癌である、（４６）に記載の医薬組成物、等に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８、およびＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の非変性型ヒトＦＧＦＲファミリー分子に対する結合活性をフローサイトメトリー法により検証した図である。縦軸はフローサイトメトリー法により測定された平均蛍光強度の相対値を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体（１８６０１）を用いて免疫染色を実施した図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体（１８６０１）を用いて免疫染色を実施した図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体（１８６０１）を用いて免疫染色を実施した図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＦＧＦＲ４分子を強制発現させた２９３α細胞ブロック及び空ベクターを導入した２９３α細胞ブロックに対し、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体（１８６０１）を用いて免疫染色を実施した図である。
【図３】図３は、（Ａ）ＳＮＵ―１６、（Ｂ）ＮＣＩ−Ｈ７１６、および（Ｃ）ＫＡＴＯＩＩＩ細胞ブロックに対し、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体（１８６０１）を用いて免疫染色を実施した図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８を用いて免疫染色を実施した図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８を用いて免疫染色を実施した図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８を用いて免疫染色を実施した図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＦＧＦＲ４分子を強制発現させた２９３α細胞ブロック及び空ベクターを導入した２９３α細胞ブロックに対し、ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８を用いて免疫染色を実施した図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８を用いて免疫染色を実施した図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８を用いて免疫染色を実施した図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８を用いて免疫染色を実施した図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＦＧＦＲ４分子を強制発現させた２９３α細胞ブロック及び空ベクターを導入した２９３α細胞ブロックに対し、マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８を用いて免疫染色を実施した図である。
【図６】図６は、（Ａ）ＳＮＵ―１６、（Ｂ）ＮＣＩ−Ｈ７１６、および（Ｃ）ＫＡＴＯＩＩＩ細胞ブロックに対し、ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８を用いて免疫染色を実施した図である。
【図７】図７は、（Ａ）ＳＮＵ―１６、（Ｂ）ＮＣＩ−Ｈ７１６、および（Ｃ）ＫＡＴＯＩＩＩ細胞ブロックに対し、マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８を用いて免疫染色を実施した図である。
【図８】図８は、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞のゼノグラフト腫瘍サンプルに対し、ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８を用いて免疫染色を実施した図である（上段：低倍率、下段：上□部位高倍率）。
【図９Ａ】図９Ａは、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３を用いて免疫染色を実施した図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３を用いて免疫染色を実施した図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３を用いて免疫染色を実施した図である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＦＧＦＲ４分子を強制発現させた２９３α細胞ブロック及び空ベクターを導入した２９３α細胞ブロックに対し、ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３を用いて免疫染色を実施した図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３を用いて免疫染色を実施した図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３を用いて免疫染色を実施した図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３を用いて免疫染色を実施した図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ＦＧＦＲ４分子を強制発現させた２９３α細胞ブロック及び空ベクターを導入した２９３α細胞ブロックに対し、マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３を用いて免疫染色を実施した図である。
【図１１】図１１は、（Ａ）ＳＮＵ―１６、（Ｂ）ＮＣＩ−Ｈ７１６、および（Ｃ）ＫＡＴＯＩＩＩ細胞ブロックに対し、ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３を用いて免疫染色を実施した図である。
【図１２】図１２は、（Ａ）ＳＮＵ―１６、（Ｂ）ＮＣＩ−Ｈ７１６、および（Ｃ）ＫＡＴＯＩＩＩ細胞ブロックに対し、マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３を用いて免疫染色を実施した図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体（ａｂ５８２０１）を用いて免疫染色を実施した図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体（ａｂ５８２０１）を用いて免疫染色を実施した図である。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ又はＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ分子を強制発現させた２９３α細胞ブロックに対し、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体（ａｂ５８２０１）を用いて免疫染色を実施した図である。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ＦＧＦＲ４分子を強制発現させた２９３α細胞ブロック及び空ベクターを導入した２９３α細胞ブロックに対し、市販の抗ＦＧＦＲ２抗体（ａｂ５８２０１）を用いて免疫染色を実施した図である。
【図１４Ａ】図１４Ａはラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂはラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃはラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄはラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａはラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂはラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃはラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄはラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図１６】図１６はヒトκ鎖分泌シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片のヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａはマウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド番号２６乃至１４１１）を含むヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂはマウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖のアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃはマウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド番号２６乃至７２４）を含むヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ｄはマウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａはマウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド番号２６乃至１４２３）を含むヌクレオチド配列（配列番号２０）を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ｂはマウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖のアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。
【図１８Ｃ】図１８Ｃはマウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド番号２６乃至７２４）を含むヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す。
【図１８Ｄ】図１８Ｄはマウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２３）を示す。
【図１９】図１９はラット抗ヒトＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８のＣＤＲＨ１〜３及びＣＤＲＬ１〜３のアミノ酸配列（配列番号２４〜２９）を示す。
【図２０】図２０はラット抗ヒトＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３のＣＤＲＨ１〜３及びＣＤＲＬ１〜３のアミノ酸配列（配列番号３０〜３５）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１．定義
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。本発明の「ＦＧＦＲ２遺伝子」としては、例えば、ＦＧＦＲ２蛋白質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等をあげることができる。
【００２６】
本発明において、「ヌクレオチド」と「核酸」は同義であり、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー等も「ヌクレオチド」の意味に含まれる。かかるヌクレオチドは一本鎖、二本鎖又は三本以上の鎖からなるヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本以上の鎖の会合体も「ヌクレオチド」の意味に含まれる。
【００２７】
本発明において、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「蛋白質」は同義である。
【００２８】
本発明において、「抗原」を「免疫原」の意味に用いることがある。
【００２９】
本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、組換え細胞及び微生物等も含まれる。
【００３０】
本発明においては、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４等を認識する抗体を、それぞれ「抗ＦＧＦＲ２抗体」、「抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ抗体」、「抗ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ抗体」、「抗ＦＧＦＲ３抗体」及び「抗ＦＧＦＲ４抗体」等と表記することがある。かかる抗体には、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等が含まれる。
【００３１】
本発明における「抗体の機能断片」とは、元の抗体が奏する機能の少なくとも一部を奏する抗体断片を意味する。「抗体の機能断片」としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、一本鎖免疫グロブリン等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。かかる抗体の機能断片は、抗体蛋白質の全長分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって得られたものに加え、組換え遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された組換え蛋白質であってもよい。
【００３２】
本発明において、抗体が結合する「部位」、すなわち抗体が認識する「部位」とは、抗体が結合又は認識する抗原上の部分ペプチド又は部分高次構造を意味する。本発明においては、かかる部位のことをエピトープ、抗体の結合部位とも呼ぶ。本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体が結合又は認識するＦＧＦＲ２蛋白質上の部位としては、ＦＧＦＲ２蛋白質上の部分ペプチド又は部分高次構造等を例示することができる。
【００３３】
抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、通常、それぞれ３ヶ所に分離している。本発明においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
【００３４】
本発明において、「抗体変異体」とは、元の抗体が有するアミノ酸配列においてアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入（以下、「変異」と総称する）してなるアミノ酸配列を有し、且つ本発明のＦＧＦＲ２蛋白質に結合するポリペプチドを意味する。かかる抗体変異体における変異アミノ酸の数は、１乃至２個、１乃至３個、１乃至４個、１乃至５個、１乃至６個、１乃至７個、１乃至８個、１乃至９個、１乃至１０個、１乃至１２個、１乃至１５個、１乃至２０個、１乃至２５個、１乃至３０個、１乃至４０個又は１乃至５０個である。かかる抗体変異体も本発明の「抗体」に包含される。
【００３５】
本発明において、「１乃至数個」における「数個」とは、３乃至１０個を指す。
【００３６】
本発明の抗体が奏する活性・性質としては、例えば、生物的活性、理化学的性質等を挙げることができ、具体的には、各種生物活性、抗原やエピトープに対する結合活性、製造や保存時における安定性、熱安定性等をあげることができる。
【００３７】
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、５×ＳＳＣを含む溶液中で６５℃にてハイブリダイゼーションを行い、ついで２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、０．５×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、ならびに、０．２×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳを含む水溶液中で６５℃にて２０分間、それぞれ洗浄する条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることを意味する。ＳＳＣとは１５０ｍＭＮａＣｌ−１５ｍＭクエン酸ナトリウムの水溶液であり、ｎ×ＳＳＣはｎ倍濃度のＳＳＣを意味する。
【００３８】
本発明において「細胞傷害」とは、何らかの形で、細胞に病理的な変化をもたらすことを指し、直接的な外傷にとどまらず、ＤＮＡの切断や塩基の二量体の形成、染色体の切断、細胞分裂装置の損傷、各種酵素活性の低下などあらゆる細胞の構造や機能上の損傷を意味する。
【００３９】
本発明において「細胞傷害活性」とは上記細胞傷害を引き起こすことを意味する。本発明において「抗体依存性細胞傷害活性」とは、「ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＡＤＣＣ）活性」を指し、ＮＫ細胞が抗体を介して腫瘍細胞等の標的細胞を傷害する作用活性を意味する。
【００４０】
本発明において「抗体依存性細胞媒介食活性」とは、「ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ（ＡＤＣＰ）活性」を指し、単球やマクロファージ細胞が抗体を介して腫瘍細胞等の標的細胞を貪食する作用活性を意味する。「抗体依存的貪食作用活性」ともいう。
【００４１】
本発明において「補体依存性細胞傷害作用活性」とは、「ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＣＤＣ）活性」を指し、補体が抗体を介して腫瘍細胞等の標的細胞を傷害する作用活性を意味する。
【００４２】
本発明において「癌」と「腫瘍」は同じ意味で用いられる。
【００４３】
本発明において「免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＨＣ）」とは組織標本中の抗原を検出する組織学的（組織化学的）手法を意味し、「免疫抗体法」と同義であり、「免疫染色（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）」も同じ意味に用いられる。
【００４４】
本発明において「変性型」ＦＧＦＲとは、ホルマリンで固定した標本中のＦＧＦＲ分子を意味する。ホルマリンで固定した後にパラフィン処理及び脱パラフィン処理した標本中のＦＧＦＲ分子も「変性型」ＦＧＦＲという。
【００４５】
本発明において「非変性型」ＦＧＦＲとは、ホルマリンで固定していないサンプル中のＦＧＦＲを意味する。ホルマリンで固定していない標本中のＦＧＦＲ分子も「非変性型」ＦＧＦＲという。
２．抗原蛋白質
（２−１）特性
ＦＧＦＲｓは線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）に結合する受容体蛋白質である。本発明において、ＦＧＦＲｓは脊椎動物由来、好適には哺乳動物由来であり、より好適にはヒト由来である。ヒトＦＧＦ及びＦＧＦＲｓは、２２のＦＧＦ（ＦＧＦ１乃至１４、および、ＦＧＦ１６乃至２３）、ならびにチロシンキナーゼドメインを有する４つのＦＧＦＲ（ＦＧＦＲ１乃至４）にそれぞれ分類される。ＦＧＦＲｓは、２つあるいは３つの免疫グロブリン様ドメイン（ＩｇＤ１乃至３）から成るリガンド結合部位を含む細胞外領域、１回膜貫通領域、およびチロシンキナーゼドメインを含む細胞内領域から構成されている。このうち、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３には、ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃと呼ばれる各２つのスプライシングバリアントが存在する。これらのアイソフォームはＩｇＤ３の後半において約５０のアミノ酸配列が異なっており、異なる組織分布およびリガンド特異性を示す。ＦＧＦＲｓは次のような活性を有する：（１）ＦＧＦに結合する；（２）かかる結合によりＦＧＦＲｓは二量体化する；（３）かかる二量体化によりＦＧＦＲｓの特定のチロシン残基がリン酸化される；（４）かかるリン酸化によりＦＧＦＲ基質２α（ＦＲＳ２α）等のアダプター蛋白質のリクルートが促進される；（５）該ＦＧＦＲｓを発現している細胞又は組織にＦＧＦ刺激によるシグナルを伝達するか又はシグナル伝達を活性化する。
本発明においてＦＧＦＲ２蛋白質は以下の性質を有する。
（ｉ）ＦＧＦに結合する。
ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ蛋白質は、通常、ＦＧＦ１、ＦＧＦ３、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ１０，ＦＧＦ２２及びＦＧＦ２３からなる群より選択される１又は２以上に結合するが、他のＦＧＦに結合してもよく、変異型の場合は前記群に含まれるＦＧＦであっても結合しないことがある。
【００４６】
ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ蛋白質は、通常、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ６、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３からなる群より選択される１又は２以上に結合する。他のＦＧＦに結合してもよく、変異型の場合は前記群に含まれるＦＧＦであっても結合しないことがある。
（ｉｉ）ＦＧＦＲ２発現細胞又は組織内にＦＧＦ刺激により生じるシグナルを伝達する。
【００４７】
ＦＧＦ刺激により生じるシグナル伝達としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＦＧＦＲ２自己リン酸化、ＦＧＦＲ基質のリクルート及びその促進、それらを介したＭＡＰＫ，ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）等のシグナル経路の活性化等をあげることができる。ＦＧＦＲ基質としては、ＦＧＦＲ基質２α（ＦＲＳ２α）等を例示することができる。
【００４８】
かかるシグナル伝達の活性化及びその抑制を評価するための試験方法は、特に限定されものではなく、公知の方法から任意に選択することができるが、例えば、ＥＲＫシグナル伝達を評価する系そして、後述のＥｌｋ１ルシフェラーゼレポーターアッセイをあげることができる。
（ｉｉｉ）本発明においてＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ蛋白質は、次の（ａ）乃至（ｄ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列（以下、「ＦＧＲ２ＩＩＩｂアミノ酸配列」という）を含んでなるか、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるか、またはＦＧＦＲ２ＩＩＩｂアミノ酸配列からなる：
（ａ）データベース上で公表されているＮＰ＿０７５２５９のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＮＰ＿０７５２５９のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列と８０％以上、８２％以上、８４％以上、８６％以上、８８％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を示し且つＦＧＦ結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｃ）ＮＰ＿０７５２５９のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列において１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３５個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなり且つＦＧＦ結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列；及び、
（ｄ）ＮＰ＿０７５２５９のアミノ酸配列に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの有するヌクレオチド配列によりコードされ、且つ、ＦＧＦ結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列。
【００４９】
（ｂ）乃至（ｄ）記載のいずれか一つに記載のポリペプチドは、ＦＧＦ結合活性に加え、ＦＧＦＲ２の有する他の活性を有していてもよい。
【００５０】
本発明においてＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ蛋白質は、次の（ａ）乃至（ｄ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列（以下、「ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃアミノ酸配列」という）を含んでなるか、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃアミノ酸配列を含むアミノ酸配列からなるか、またはＦＧＦＲ２ＩＩＩｃアミノ酸配列からなる：
（ａ）データベース上で公表されているＮＰ＿０００１３２に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）ＮＰ＿０００１３２に示されるアミノ酸配列と８０％以上、８２％以上、８４％以上、８６％以上、８８％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上又は９９％以上の配列同一性を示し且つＦＧＦ結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列；
（ｃ）ＮＰ＿０００１３２に示されるアミノ酸配列において１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３５個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなり且つＦＧＦ結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列；及び、
（ｄ）ＮＰ＿０００１３２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの有するヌクレオチド配列によりコードされ、且つ、ＦＧＦ結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列。
【００５１】
（ｂ）乃至（ｄ）記載のいずれか一つに記載のポリペプチドは、ＦＧＦ結合活性に加え、ＦＧＦＲ２の有する他の活性を有していてもよい。
（ｉｖ）本発明のＦＧＦＲ２蛋白質は、脊椎動物、好適には哺乳動物、より好適にはマウス、ラット等のげっ歯類及びヒト、より一層好適にはヒト、ラット又はマウスの、ＦＧＦＲ２を発現している細胞、組織又は癌組織、かかる組織由来の細胞、かかる細胞の培養物等より得ることができる。
ＦＧＦＲ２を高発現している正常組織には、脳、大腸、甲状腺、子宮、胆嚢、皮膚等を例示することができる。ＦＧＦＲ２を高発現している癌には、胃癌、乳癌など遺伝子増幅が見られるもの、および、膵臓癌、卵巣癌など過剰発現がみられるものがある。ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを高発現している培養細胞株としては、胃癌細胞株、乳癌細胞株等を例示することができる。ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを高発現している培養細胞株としては、大腸（盲腸）細胞癌を例示することができる。ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを発現している癌組織としては、子宮頚癌、非小細胞肺癌等を例示することができ、このうち子宮頚癌では高発現している。
【００５２】
本発明のＦＧＦＲ２蛋白質は天然型（非組換型）及び組換え型のいずれであってもよい。また、担体やタグなど他のペプチドや蛋白質との融合物もＦＧＦＲ２蛋白質の意味に含まれる。さらに、ＰＥＧ等のポリマー付加を含む化学修飾、及び／又は、糖鎖修飾を含む生物学的修飾がなされたものもＦＧＦＲ２蛋白質の意味に含まれる。また、ＦＧＦＲ２蛋白質断片も本発明のＦＧＦＲ２蛋白質の意味に含まれる。ＦＧＦＲ２蛋白質断片のうち上記（ｉ）及び／又は（ｉｉ）記載の性質を具備したものをＦＧＦＲ２蛋白質機能断片と呼ぶ。
（２−２）抗原遺伝子
本発明においてＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ遺伝子は、次の（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（以下、「ＦＧＦＲ２遺伝子配列」という）を含んでなるか、ＦＧＦＲ２遺伝子配列を含むヌクレオチド配列からなるか、またはＦＧＦＲ２遺伝子配列からなる：
（ａ）ＮＰ＿０７５２５９に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ＮＰ＿０７５２５９に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つＦＧＦ結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び
（ｃ）ＮＰ＿０７５２５９に示されるアミノ酸配列において１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるアミノ酸配列をコードし且つＦＧＦ結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【００５３】
（ｂ）又は（ｃ）記載のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＦＧＦ結合活性に加え、ＦＧＦＲ２の有する他の活性を有していてもよい。
【００５４】
本発明においてＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ遺伝子は、次の（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（以下、「ＦＧＦＲ２遺伝子配列」という）を含んでなるか、ＦＧＦＲ２遺伝子配列を含むヌクレオチド配列からなるか、またはＦＧＦＲ２遺伝子配列からなる：
（ａ）ＮＰ＿０００１３２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ＮＰ＿０００１３２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つＦＧＦ結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；及び
（ｃ）ＮＰ＿０００１３２に示されるアミノ酸配列において１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるアミノ酸配列をコードし且つＦＧＦ結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【００５５】
（ｂ）又は（ｃ）記載のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＦＧＦ結合活性に加え、ＦＧＦＲ２の有する他の活性を有していてもよい。
ＦＧＦＲ２遺伝子の発現及び発現量の測定は、ＦＧＦＲ２遺伝子の転写産物及びＦＧＦＲ２蛋白質のいずれを指標としてもよく、前者はＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット・ハイブリダーゼーション法等により、後者はＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：以下、「ＥＬＩＳＡ」という)、ウエスタンブロッティング法、免疫組織染色法等の免疫アッセイ法等により、それぞれ測定することができる。
（２−３）抗原蛋白質の調製
本発明のＦＧＦＲ２蛋白質は、動物組織（体液を含む）、該組織由来の細胞もしくは該細胞培養物からの精製及び単離、遺伝子組換え、インビトロ翻訳、化学合成等により調製することができる。
（２−３−１）非組換型ＦＧＦＲ２の精製、単離
非組換型ＦＧＦＲ２蛋白質は、ＦＧＦＲ２を発現している細胞、正常組織もしく癌組織またはそれらに由来する細胞より精製、単離することができる。ＦＧＦＲ２を発現している正常組織、癌組織、癌細胞としては（２−１）の（ｉｖ）記載のものを例示することができるが、非組換型ＦＧＦＲ２蛋白質の由来はそれらに限定されるものではない。
【００５６】
かかる組織、細胞、細胞培養物等からの精製・単離は当業者に周知の分画、クロマトグラフィー等の手法を組み合わせることにより行うことができる。かかる手法には、塩析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、順相又は逆相クロマトグラフィー等が含まれるが、それらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィー用のカラムは、抗ＦＧＦＲ２モノクローナル抗体を架橋したアフィニティーゲルを作製して充填することにより作製することができる。かかるカラムにＦＧＦＲ２蛋白質を含有する粗画分又は部分精製画分を添加し、次いで滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で非特異的吸着物を除去した後、溶出用緩衝液を添加することによりＦＧＦＲ２蛋白質を選択的に回収することができる。ＦＧＦＲ２蛋白質含有溶液は、ゲルろ過やＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ等の濃縮装置でバッファー交換及び／又は濃縮することができる。
（２−３−２）組換型ＦＧＦＲ２蛋白質の調製
本発明のＦＧＦＲ２蛋白質は、組換型としても調製することができる。すなわち、ＦＧＦＲ２蛋白質又はＦＧＦＲ２蛋白質断片のアミノ酸配列をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し、かかる細胞の培養物からＦＧＦＲ２蛋白質を回収することができる。例えば、ＦＧＦＲ２遺伝子又はその断片を発現ベクターに挿入し、次いで、原核又は真核の宿主細胞に該組換えベクターを導入して得られる組換え細胞を保温すれば、該細胞にＦＧＦＲ２蛋白質を発現させることができる。発現形態としては、分泌発現、細胞内可溶発現、インクルージョンボディー法など公知の形態を用いることができる。また、アミノ末端（Ｎ末）及び／又はカルボキシ末端（Ｃ末）が天然型と同一の分子のみならず、分泌シグナル、細胞内局在化シグナル、アフィニティー精製用タグ、パートナーペプチドとの融合蛋白質として発現させることもできる。かかる組換え細胞培養物からのＦＧＦＲ２蛋白質の精製、単離は、（２−３−１）記載の非組換型ＦＧＦＲ２蛋白質の精製、単離に記載の分画、クロマトグラフィー等の操作を適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００５７】
ＦＧＦＲ２遺伝子又はその断片は、当業者に周知の方法により調製することができる。
【００５８】
例えば、ＦＧＦＲ２を発現している細胞や組織等から調製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、当該配列を特異的に増幅し得る一組のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」という：Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐ．４８７−４８９）、ＦＧＦＲ２を発現している細胞や組織等から調製したｍＲＮＡ画分を鋳型とし、当該配列を逆転写し得るプライマー及び当該配列を特異的に増幅し得る一組のプライマーを用いた逆転写ＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ」という）、免疫アッセイを利用した発現クローニング、精製ＦＧＦＲ２蛋白質の部分アミノ酸配列を利用したｃＤＮＡクローニング等をあげることができる。
（２−３−３）インビトロ翻訳
本発明のＦＧＦＲ２蛋白質はインビトロ翻訳によっても調製することができる。かかる翻訳法としては、転写及び翻訳に必要な酵素、基質並びにエネルギー物質を含む無細胞翻訳系を利用した方法であれば特に限定されるものではないが、例えば、ロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）を利用する方法をあげることができる。
（２−３−４）化学合成
本発明のＦＧＦＲ２蛋白質は化学合成によっても調製することができる。化学合成法としては、例えば、Ｆｍｏｃ合成法、Ｂｏｃ合成法などのペプチド固相合成法をあげることができる。
【００５９】
３．抗体
（３−１）抗体の分類
本発明の抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれであってもよい。本発明のモノクローナル抗体としては、非ヒト動物由来の抗体（非ヒト動物抗体）、ヒト由来の抗体（ヒト抗体）、キメラ化抗体（「キメラ抗体」ともいう）、ヒト化抗体等をあげることができる。
【００６０】
非ヒト動物抗体としては、哺乳類、鳥類等の脊椎動物に由来する抗体等をあげることができる。哺乳類由来の抗体としては、マウス抗体、ラット抗体等げっ歯類由来の抗体等をあげることができる。鳥類由来の抗体としては、ニワトリ抗体等をあげることができる。抗ヒトＦＧＦＲ２ラットモノクローナル抗体としては、ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３、ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８等をあげることができる。
【００６１】
キメラ化抗体としては、非ヒト動物抗体由来の可変領域とヒト抗体（ヒト免疫グロブリン）定常領域とを結合してなる抗体等をあげることができるが、それに限定されるものではなく、例えば、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３（重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号７又は図１５Ａに、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号８又は図１５Ｂに、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号９又は図１５Ｃに、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１０又は図１５Ｄに、それぞれ記載されている。）の定常領域をマウス抗体の定常領域で置き換えて得られたマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３（重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号２０又は図１８Ａのヌクレオチド番号２６乃至１４２３に、重鎖のアミノ酸配列は配列番号２１又は図１８Ｂに、軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号２２又は図１８Ｃのヌクレオチド番号２６乃至７２４に、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号２３又は図１８Ｄに、それぞれ記載されている。）、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８（重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号２又は図１４Ａに、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３又は図１４Ｂに、軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号５又は図１４Ｃに、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６又は図１４Ｄに、それぞれ記載されている。）の定常領域をマウス抗体の定常領域で置き換えて得られたマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８（重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号１４又は図１７Ａのヌクレオチド番号２６乃至１４１１に、重鎖のアミノ酸配列は配列番号１５又は図１７Ｂに、軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号１８又は図１７Ｃのヌクレオチド番号２６乃至７２４に、軽鎖のアミノ酸配列は配列番号１９又は図１７Ｄに、それぞれ記載されている。）等を挙げることができる。
【００６２】
ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体の可変領域中のＣＤＲをヒト抗体（ヒト免疫グロブリンの可変領域）に移植したもの、ＣＤＲに加え非ヒト動物抗体のフレームワーク領域の配列も一部ヒト抗体に移植したもの、それらのいずれかの非ヒト動物抗体由来の１つ又は２つ以上のアミノ酸をヒト型のアミノ酸で置換したもの等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
【００６３】
ヒト抗体としては、本発明の抗原を認識する抗体であれば特に限定されるものではないが、本発明の抗体のＣＤＲを有する抗体と同一の部位に結合するヒト抗体、前述のＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体もしくはそのキメラ化抗体又はＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８若しくはそのキメラ化抗体とＦＧＦＲ２上で同一の部位に結合するヒト抗体等を例示することができる。
【００６４】
本発明における抗体は、ＦＧＦＲ２に結合する活性を有していれば、複数の異なる抗体に由来する部分から構成される抗体であってもよく、例えば、複数の異なる抗体間で重鎖及び／又は軽鎖を交換したもの、重鎖及び／又は軽鎖の全長を交換したもの、可変領域のみ又は定常領域のみを交換したもの、ＣＤＲの全部又は一部のみを交換したもの等をあげることができる。キメラ化抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、異なる本発明の抗体に由来してもよい。ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３並びにＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３は、２種又はそれ以上の本発明の抗体に由来してもよい。ヒト抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域中のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３並びにＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３は、２種又はそれ以上の本発明の抗体が有するＣＤＲの組合せであってもよい。
【００６５】
本発明のモノクローナル抗体のアイソタイプは特に限定されるものではないが、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等のＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等をあげることができ、好適にはＩｇＧおよびＩｇＭを挙げることができる。モノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスは、例えば、オクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、Ｒａｄｉｏ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（以下、「ＲＩＡ」という）法等で決定することができる、市販の同定用のキット（マウスタイパーキット：バイオラッド社製、ＲＡＴ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＩＳＯＴＹＰＩＮＧ  ＴＥＳＴ  ＫＩＴ：ｓｅｒｏｔｅｃ社等）も利用することができる。
（３−２）抗体の結合特異性
本発明の抗体はＦＧＦＲ２蛋白質を認識する。言い換えれば、本発明の抗体はＦＧＦＲ２蛋白質に結合する。かかる抗体は「抗ＦＧＦＲ２抗体」と表記される。また、本発明の好適な抗体はＦＧＦＲ２蛋白質を特異的に認識する。言い換えれば、本発明の好適な抗体はＦＧＦＲ２蛋白質に特異的に結合する。さらに、本発明の、より好適な抗体はＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ蛋白質及び／又はＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ蛋白質に特異的に結合し、より一層好適な抗体はＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ蛋白質及び／又はＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ蛋白質の有する免疫グロブリン様ドメイン（以下、「Ｉｇ様ドメイン」という）に特異的に結合する。かかるＩｇ様ドメインとしては、Ｉｇ様ドメイン２、Ｉｇ様ドメイン３等を例示することができる。
【００６６】
ある態様において、好適には抗体は、ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ蛋白質及びヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ蛋白質に特異的に結合する。
【００６７】
別のある態様において、好適な抗体は、ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ蛋白質に特異的に結合するが、ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ蛋白質には結合しない。
【００６８】
また、ある態様において、好適な抗体は、非変性型のヒトＦＧＦＲ２及び、ホルマリンで固定した標本中の変性型ＦＧＦＲ２の両方に特異的に結合する。より好適な抗体は、非変性型のヒトＦＧＦＲ１（ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃ蛋白質）、ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃ蛋白質）及びＦＧＦＲ４、並びに、ホルマリンで固定した標本中の変性型ヒトＦＧＦＲ１（ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃ蛋白質）、ＦＧＦＲ３（ＩＩＩｂ及びＩＩＩｃ蛋白質）及びＦＧＦＲ４には特異的に結合しない。例えば、非変性型ＦＧＦＲファミリー分子に対する結合特異性は実施例３に記載の方法で、変性型ＦＧＦＲファミリー分子に対する結合特異性は実施例４に記載の方法で、それぞれ評価することができる。
【００６９】
従って、本発明のより一層好適な抗体としては、例えば、
（Ａ）非変性型及び変性型のヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ並びにヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合するが、非変性型及び変性型のヒトＦＧＦＲ１、ヒトＦＧＦＲ３及びヒトＦＧＦＲ４には特異的に結合しない抗体；
（Ｂ）非変性型及び変性型のヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに特異的に結合するが、非変性型及び変性型のヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂには特異的に結合せず、且つ、非変性型及び変性型のヒトＦＧＦＲ１、ヒトＦＧＦＲ３及びヒトＦＧＦＲ４には特異的に結合しない抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【００７０】
本発明において「特異的な認識」、すなわち「特異的な結合」とは、非特異的な吸着ではない結合を意味する。結合が特異的であるか否かの判定基準としては、例えば、解離定数（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｉｔａｎｔ：以下、「ＫＤという」）をあげることができる。本発明の好適な抗体のＦＧＦＲ２蛋白質に対するＫＤ値は１×１０−５Ｍ以下、５×１０−６Ｍ以下、２×１０−６Ｍ以下または１×１０−６Ｍ以下、より好適には５×１０−７Ｍ以下、２×１０−７Ｍ以下または１×１０−７Ｍ以下、より一層好適には５×１０−８Ｍ以下、２×１０−８Ｍ以下または１×１０−８Ｍ以下、さらにより一層好適には５×１０−９Ｍ以下、２×１０−９Ｍ以下または１×１０−９Ｍ以下、最適には５×１０−１０Ｍ以下、２×１０−１０Ｍ以下または１×１０−１０Ｍ以下である。
【００７１】
本発明において「選択的」は「特異的」と同義である。
【００７２】
本発明における抗原と抗体の結合は、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（以下、「ＳＰＲ」という）解析法等により測定または判定することができる。ＳＰＲ解析に用いる機器としては、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ（ＧＥヘルスケア社製）、ＰｒｏｔｅＯｎＴＭ（ＢｉｏＲａｄ社製）、ＳＰＲ−ＮａｖｉＴＭ（ＢｉｏＮａｖｉｓ社製）、ＳｐｒｅｅｔａＴＭ（Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、ＳＰＲｉ−ＰｌｅｘＩＩＴＭ（ホリバ社製）、Ａｕｔｏｌａｂ  ＳＰＲＴＭ（Ｍｅｔｒｏｈｍ社製）等を例示することができる。細胞表面上の発現している抗原と抗体との結合は、フローサートメトリー法、Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ法等により測定することができる。
（３−３）モノクローナル抗体
本発明はモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体には、ラット抗体、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、魚類抗体等の非ヒト動物由来のモノクローナル抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの機能断片、それらの修飾体等が含まれる。このうち、ラットモノクローナル抗体の例としては、ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３、ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８等をあげることができる。
【００７３】
ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３は実施例１に記載の方法により得られた抗ヒトＦＧＦＲ２ラットモノクローナル抗体である。その重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号７（図１５Ａ）に、アミノ酸配列は配列番号８（図１５Ｂ）に記載されている。その軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号９（図１５Ｃ）に、アミノ酸配列は配列番号１０（図１５Ｄ）に記載されている。そのＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は配列番号３０（図２０）に、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列番号３１（図２０）に、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列番号３２（図２０）に、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は配列番号３３（図２０）に、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列番号３４（図２０）に、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列番号３５（図２０）にそれぞれ記載されている。
ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８は実施例１に記載の方法により得られた抗ヒトＦＧＦＲ２ラットモノクローナル抗体である。その重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号２（図１４Ａ）に、アミノ酸配列は配列番号３（図１４Ｂ）に記載されている。その軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列番号５（図１４Ｃ）に、アミノ酸配列は配列番号６（図１４Ｄ）に記載されている。そのＣＤＲＨ１のアミノ酸配列は配列番号２４（図１９）に、ＣＤＲＨ２のアミノ酸配列は配列番号２５（図１９）に、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列は配列番号２６（図１９）に、ＣＤＲＬ１のアミノ酸配列は配列番号２７（図１９）に、ＣＤＲＬ２のアミノ酸配列は配列番号２８（図１９）に、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列は配列番号２９（図１９）にそれぞれ記載されている。
【００７４】
本発明の抗体変異体には、好適には、蛋白質の分解もしくは酸化に対する感受性の低下、生物活性の改善、抗原結合能の改善、又は理化学的性質もしくは機能的性質の付与等がなされている。そのような抗体変異体の例として、抗体の有するアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換されてなるアミノ酸配列を有する抗体をあげることができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。
【００７５】
好適なアミノ酸グループは、以下のとおりである：酸性グループ＝アスパギン酸、グルタミン酸；塩基性グループ＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；非極性グループ＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および非帯電極性ファミリー＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。他の好適なアミノ酸グループは次のとおりである：脂肪族ヒドロキシグループ＝セリン及びスレオニン；アミド含有グループ＝アスパラギン及びグルタミン；脂肪族グループ＝アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン；並びに芳香族グループ＝フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン。かかる抗体変異体におけるアミノ酸置換は、元の抗体が有する抗原結合活性を低下させない範囲で行うのが好ましい。
【００７６】
蛋白質中に含まれるアスパラギン酸は、そのＣ末側に連結するアミノ酸が小さい側鎖を有する場合は異性化によりイソアスパラギン酸に変換され易く、一方で、アスパラギンの場合は脱アミド化によりアスパラギン酸に変換され易く、さらに異性化によりイソアスパラギン酸に変換される可能性がある。そのような異性化や脱アミド化が進めば、蛋白質の安定性に影響が生じ得る。そこで、かかる異性化や脱アミド化を回避するために、蛋白質中のアスパラギン酸やアスパラギンあるいはそれらに隣接するアミノ酸等を他のアミノ酸で置換することができる。かかるアミノ酸置換がなされた抗体変異体は、元の抗体が有する抗原結合活性を保持していることが好ましい。
【００７７】
本発明の抗体が有するアミノ酸配列において保守的アミノ酸置換がなされたアミノ酸配列を有する抗体変異体、ならびに、本発明の抗体のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３のいずれかのアミノ酸配列において保守的アミノ酸変異がなされたアミノ酸配列を有する該ＣＤＲを含むマウス抗体、ラット抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等も本発明に包含される。
【００７８】
本発明の抗体由来のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３のいずれか１つ又は２つ以上のアミノ酸配列において１乃至数個、好適には１乃至３個、より好適には１又は２個、最適には１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を含む抗体の変異体であって、且つヒトＦＧＦＲ２に結合するものは、本発明の抗体の変異体に包含される。
また、複数の抗体に由来するＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３およびＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を有する抗体も、抗体変異体に含まれる。そのような変異体の例として、ＣＤＲＨ３のみある抗体に由来し、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２ならびにＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３は別の抗体に由来する抗体変異体をあげることができる。
本発明においては抗体変異体も「抗体」に包含される。
本発明の抗体の定常領域としては、とくに限定されるものではないが、ヒトの疾患を治療または予防するための本発明の抗体としては、好適にはヒト抗体のものが使用される。ヒト抗体の重鎖定常領域としては、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃμ、Ｃδ、Ｃα１、Ｃα２、Ｃε等をあげることができる。ヒト抗体の軽鎖定常領域としては、例えば、Ｃκ、Ｃλ等をあげることができる。
（３−４）抗体の機能断片
本発明は一つの態様として、本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体の機能断片を提供する。抗体の機能断片とは、該抗体の有する機能の少なくとも一部を保持する断片を意味する。かかる抗体の機能としては、一般的には、抗原結合活性をあげることができる。
【００７９】
抗体の機能断片としては、該抗体の有する活性の少なくとも一部を保持している該抗体の断片であれば特に限定されないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。リンカー部分を保有するｓｃＦｖのように、本発明の抗体の断片以外の部分を含む分子も、本発明の抗体の機能断片の意味に包含される。
【００８０】
抗体蛋白質のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸が１乃至数個又はそれ以上を欠失してなり、且つ該抗体の有する機能の少なくとも一部を保持している分子も、抗体の機能断片の意味に包含される。例えば、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失することが知られており（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，７０５：１２９−１３４（１９９５））、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６０：７５−８３（２００７））。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用など）には影響を及ぼさない。そのような抗体の機能断片の修飾体も、本発明の抗体もしくはその機能断片、又はその修飾体（後述）に包含される。
【００８１】
本発明の抗体又はその機能断片は、少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。多特異性抗体は、２種類の異なる抗原に結合する二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）に限定されず、３種以上の異なる抗原に対して特異性を有する抗体も本発明の「多特異性抗体」の意味に包含される。
【００８２】
本発明の多特異性抗体は、全長抗体又はその機能断片であってもよい（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできる。また、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを２種類以上融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、得ることができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７−５３９）。多特異的抗体も同様の方法により調製することができる。
【００８３】
本発明の抗体の一つの態様は、一本鎖抗体（以下、「ｓｃＦｖ」という）である。ｓｃＦｖは、抗体の重鎖Ｖ領域と軽鎖Ｖ領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９−３１５（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６−１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖを二重特異性抗体として使用することができる。さらに３つ以上のｓｃＦｖよりＭｕｌｔｉｓｃＦｖも多特異性抗体として使用することができる。
【００８４】
本発明には、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）が含まれる（Ｌｅｅ，Ｈ−Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１−７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１−４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であってもよい。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ  Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９−３５，Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６−８）。これらの抗体も、本発明における抗体の機能性断片の意味に包含される。
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、又は重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域のアミノ酸配列と８０％以上、８２％以上、８４％以上、８６％以上、８８％以上、９０％以上、９２％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上又は９９％以上同一なアミノ酸配列を含む重鎖または軽鎖を含み、且つｈＦＧＦＲ２に結合する抗体又はその機能断片も、本発明に包含される。かかる配列同一性は、好適には９４％以上、より好適には９６％以上、より一層好適には９８％以上、最適には９９％以上である。
二種類のアミノ酸配列間の同一性あるいは相同性は、Ｂｌａｓｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．２．２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈaｆｆｅｒ，  Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ，  Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ，  Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ，  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７），「Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Ｂｌａｓｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍは、例えば、インターネットでhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/にアクセスすることによっても使用することができる。
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、又は重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域のアミノ酸配列において１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３５個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるアミノ酸配列を含む重鎖または軽鎖を含み、且つｈＦＧＦＲ２に結合する抗体又はその機能断片も、本発明に包含される。かかるアミノ酸変異は好適には置換であり、変異されるアミノ酸の個数は好適には１乃至５個、より好適には１乃至４個、より一層好適には１乃至３個、さらにより一層好適には１乃至２個、最適には１個である。
【００８５】
本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、又は重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチドの有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む重鎖または軽鎖を含み、且つｈＦＧＦＲ２に結合する抗体又はその機能断片も、本発明に包含される。
（３−５）エピトープに結合する抗体
本発明の提供する抗体と「同一の部位に結合する抗体」も本発明の抗体に含まれる。ある抗体と「同一の部位に結合する抗体」とは、該抗体が認識する抗原分子上の部位に結合する他の抗体を意味する。第一抗体が結合する抗原分子上の部分ペプチド又は部分立体構造に第二抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体は同一の部位に結合すると判定することができる。また、第一抗体の抗原に対する結合に対して第二抗体が競合する、すなわち、第二抗体が第一抗体と抗原の結合を妨げることを確認することによって、具体的な結合部位のペプチド配列又は立体構造が決定されていなくても、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合すると判定することができる。さらに、第一抗体と第二抗体が同一の部位に結合し、且つ第一抗体が抗腫瘍活性など本発明の抗体の一つの態様に特徴的な効果を有する場合、第二抗体も同様の活性を有する蓋然性は極めて高い。従って、第一の抗ＦＧＦＲ２抗体の結合する部位に第二の抗ＦＧＦＲ２抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体がＦＧＦＲ２蛋白質上の同一の部位に結合すると判定することができる。また、第一の抗ＦＧＦＲ２抗体のＦＧＦＲ２蛋白質への結合に対して第二の抗ＦＧＦＲ２抗体が競合することを確認できれば、第一抗体と第二抗体がＦＧＦＲ２蛋白質上の同一の部位に結合する抗体と判定することができる。
【００８６】
本発明のモノクローナル抗体が認識するＦＧＦＲ２蛋白質上の部位に結合する抗体も本発明に含まれる。
【００８７】
抗体の結合部位は、免疫アッセイ法など当業者に周知の方法により決定することができる。例えば、抗原のアミノ酸配列をＣ末またはＮ末から適宜削ってなる一連のペプチドを作製し、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドへの抗体の反応性を検討することにより、結合部位を決定することができる。抗原断片ペプチドは、遺伝子組換、ペプチド合成等の技術を用いて調製することができる。
【００８８】
抗体が抗原の部分高次構造に結合又は認識している場合、かかる抗体の結合部位は、Ｘ線構造解析を用いて、当該抗体に隣接する抗原上のアミノ酸残基を特定することにより決定することができる。例えば、抗体又はその断片および抗原又はその断片を結合させて結晶化し、構造解析を行うことにより、抗体と相互作用距離を有する抗原上のアミノ酸残基を特定することができる。相互作用距離は８Å以下であり、好適には６Å以下であり、より好適には４Å以下である。そのような抗体との相互作用距離を有するアミノ酸残基は１つまたはそれ以上で抗体の抗原結合部位（エピトープ）を構成し得る。かかるアミノ酸残基が２つ以上の場合、各アミノ酸は一次配列上で互いに隣接していなくてもよい。
（３−６）抗体の修飾体
本発明は、抗体又はその機能断片の修飾体を提供する。本発明の抗体又はその機能断片の修飾体とは、本発明の抗体又はその機能断片に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ−結合またはＯ−結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ−結合またはＯ−結合への糖鎖付加、Ｎ末またはＣ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによりＮ末にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体または抗原の検出または単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。このような本発明の抗体又はその機能断片の修飾物は、元の本発明の抗体又はその機能断片の安定性および血中滞留性の改善、抗原性の低減、かかる抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
【００８９】
化学的修飾体に含まれる化学部分としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーを例示することができる。
【００９０】
生物学的な修飾体としては、酵素処理や細胞処理等により修飾が施されたもの、遺伝子組換えによりタグ等他のペプチドが付加された融合体、ならびに内因性又は外来性の糖鎖修飾酵素を発現する細胞を宿主として調製されたもの等をあげることができる。
【００９１】
かかる修飾は、抗体またはその機能断片における任意の位置に、または所望の位置において施されてもよく、１つ又は２つ以上の位置に同一又は２種以上の異なる修飾がなされてもよい。
【００９２】
本発明において「抗体断片の修飾体」は「抗体の修飾体の断片」をもその意味に含むものである。
本発明においては抗体の修飾体、その機能断片の修飾体を、単に「抗体」、「抗体の機能断片」と呼ぶことがある。
４．抗体の製造方法
（４−１）ハイブリドーマを用いる方法
本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体は、コーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  （１９７５）２５６，ｐ．４９５−４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｐ．３６５−３６７，Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、ＦＧＦＲ２蛋白質又はその可溶型フォームで免疫した動物の脾臓より抗ＦＧＦＲ２抗体の産生細胞を単離し、該細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、かかるハイブリドーマの培養物からモノクローナル抗体を取得することができる。
（４−１−１）抗原の調製
抗ＦＧＦＲ２抗体を作製するための抗原は、本発明の他の部分に記載された天然型または組換え型のＦＧＦＲ２蛋白質の調製法等に従って、取得することができる。そのようにして調製し得る抗原としては、ＦＧＦＲ２蛋白質若しくはその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列を含むことからなるＦＧＦＲ２蛋白質断片、またはそれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体等（以下、まとめて「ＦＧＦＲ２抗原」とよぶ）を挙げることができる。
【００９３】
組換え型ＦＧＦＲ２抗原は、ＦＧＦＲ２抗原の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる遺伝子を宿主細胞に導入し、該細胞の培養物から該抗原を回収することにより、調製することができる。かかる組換型抗原は、免疫グロブリンのＦｃ領域など他の蛋白質との融合蛋白質であってもよい。また、ＦＧＦＲ２抗原のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる遺伝子をイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）翻訳系により無細胞系において得られるＦＧＦＲ２抗原も組換え型ＦＧＦＲ２抗原に含まれる。非組換型ＦＧＦＲ２抗原は、（２−１）の（ｉｖ）に記載された、ＦＧＦＲ２を発現している正常組織、癌組織、癌細胞、癌細胞の培養物等から精製、単離することができる。
（４−１−２）抗ＦＧＦＲ２モノクローナル抗体の製造
（ａ）抗原の精製
前記（２−３）記載のＦＧＦＲ２蛋白質の調製法に準ずる。
（ｂ）抗体産生細胞を調製する工程
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
【００９４】
また、実際に使用するマウス及びラットの系統は特に制限はなく、マウスの場合には、例えば、Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、Ｒ  ＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、ラットの場合には、例えば、Ｗｉｓｔａｒ、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｑｕｅ、Ｄａｗｅｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。
【００９５】
これらのマウス及びラットは例えば日本クレア、日本チャ−ルスリバー、等実験動物飼育販売業者より入手することができる。
【００９６】
このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスではＢＡＬＢ／ｃ系統が、ラットではＷｉｓｔａｒ及びＬｏｗ系統が被免疫動物として特に好ましい。
【００９７】
また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。
【００９８】
なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは５乃至１２週齢、さらに好ましくは６乃至８週齢である。
【００９９】
ＦＧＦＲ２蛋白質で動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ，  Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｃ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｓｐｉｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等の方法を用いることができる。
【０１００】
抗体価の測定法としては、例えば、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法等の免疫アッセイを挙げることができるが、それらの方法に限定されるものではない。
【０１０１】
免疫された動物から分離された脾臓細胞又はリンパ球に由来する抗体産生細胞は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５，；Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７７）６，ｐ．５１１，；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７），２６６，ｐ．５５０，；Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９７７）２６６，ｐ．４９５，）等の公知の方法に従って調製することができる。
【０１０２】
脾臓細胞の場合には、脾臓を細切して細胞をステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）等に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。
（ｃ）ミエローマを調製する工程
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の限定はなく、公知の細胞株から適宜選択して用いることができるが、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｉｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株、すなわちマウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−ＡＮＳ／１（ＮＳ１）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕｌ（Ｐ３Ｕｌ）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＷ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）等を用いるのが好ましい。これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ）等から入手することができる。
【０１０３】
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下「ＦＢＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％  ＦＢＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合させる工程
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で実施することができる。例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブロドーマ群を選別する工程
細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，ｐ．５５０）が用いられる。この方法は、アミノプテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
（ｆ）単一細胞クローンを得る工程（クローニング）
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えば、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができるが（例えば、Ｂａｒｂａｒａ，  Ｂ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｓｔａｎｌｅｙ，  Ｍ．Ｓ．：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）参照）、好適には限界希釈法である。
（ｇ）ハイブリドーマの培養工程、ハイブリドーマを移植した動物の飼育工程
選択されたハイブリドーマを培養することにより、モノクローナル抗体を産生することができるが、好適には所望のハイブリドーマをクローニングしてから抗体の産生に供する。
【０１０４】
かかるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、該ハイブリドーマの培養物から回収することができる。また、該モノクローナル抗体遺伝子が導入された細胞の培養物から組換え抗体として回収することもできる。さらに、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｊ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド−マを増殖させることにより、その腹水から回収することもできる。
（ｈ）モノクローナル抗体の生物活性の測定工程・判定工程
各種生物試験を目的に応じて選択し、適用することができる。
（４−２）細胞免疫法
天然型のＦＧＦＲ２蛋白質を発現する細胞、組換え型ＦＧＦＲ２蛋白質またはその断片を発現する細胞等を免疫原として使用することにより、前記のハイブリドーマ法により抗ＦＧＦＲ２抗体を調製することができる。
【０１０５】
天然型のＦＧＦＲ２蛋白質を発現する細胞としては、ＦＧＦＲ２を発現している細胞、ＦＧＦＲ２を発現している組織又は癌に由来する細胞株、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂからＦＧＦＲ２ＩＩＩｃへのスイッチングが見られる癌組織に由来する細胞株等を例示することができる。ＦＧＦＲ２を高発現している癌には、胃癌、乳癌など遺伝子増幅が見られるもの、および、膵臓癌、卵巣癌など過剰発現がみられるものがある。ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを高発現している培養細胞株としては、胃癌細胞株、乳癌細胞株等を例示することができる。ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを高発現している培養細胞株としては、大腸（盲腸）細胞癌を例示することができる。ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂからＦＧＦＲ２ＩＩＩｃへのスイッチングが見られる癌組織としては、前立腺癌、膀胱癌、乳癌等を例示することができる。ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを発現している癌組織としては、子宮頚癌、非小細胞肺癌等を例示することができ、このうち子宮頚癌では高発現している。また、ＦＧＦＲ２を高発現している正常組織としては、脳、大腸、甲状腺、子宮、胆嚢、皮膚等を例示することができる。
ＦＧＦＲ２を発現している細胞は、1×１０５乃至1×１０９個、好適には1×１０6乃至1×１０8個、より好適には０．５乃至２×１０7個、より一層好適には１×１０７個を１回の免疫に用いるが、ＦＧＦＲ２蛋白質の発現量に応じて免疫に供する細胞数を変えることができる。かかる免疫源は、一般的には腹腔内に投与するが、皮内等に投与することもできる。ハイブリドーマの作製手法としては（４−１−２）記載の方法を適用することができる。
（４−３）遺伝子組換え
本発明の抗体は、その重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド（重鎖ヌクレオチド）及びその軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド（軽鎖ヌクレオチド）、又は、かかる重鎖ヌクレオチドが挿入されたベクター及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されたベクターを宿主細胞に導入し、該細胞を培養した後その培養物からかかる抗体を回収することにより調製することができる。一つのベクターに重鎖ヌクレオチド及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されていてもよい。
【０１０６】
宿主細胞としては、原核細胞又は真核細胞を用いることができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。
【０１０７】
動物細胞としては、例えば、哺乳類由来の細胞、すなわち、サル由来のＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，  Ｙ．  Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）、マウスＮＳ０細胞株（ＥＣＡＣＣ）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、そのジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（ＣＨＯｄｈｆｒ−：Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）、ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ニワトリ等鳥類由来の細胞、昆虫由来の細胞等を挙げることができる。
【０１０８】
真核微生物としては、例えば、酵母等をあげることができる。
【０１０９】
原核細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等をあげることができる。
【０１１０】
本発明の抗体（各種動物由来のモノクローナル抗体、ラット抗体、マウス抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等）を分泌させるためのシグナルペプチドとしては、当該抗体と同種、同タイプ及び同サブタイプの抗体の分泌シグナル、ならびに、当該抗体自体の分泌シグナルに限定されるものではなく、他のタイプもしくはサブタイプの抗体の分泌シグナル、または、他の真核生物種もしくは原核生物由来の蛋白質の分泌シグナルであれば、任意のものを選択して利用することができる。
（４−４）ヒト化抗体のデザイン法および調製法
ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体のＣＤＲのみがヒト由来の抗体に組込まれ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２−５２５参照）、ＣＤＲ移植法によりＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（ＷＯ９０／０７８６１号、ＵＳ６９７２３２３号公報参照）、それらのいずれかにおける非ヒト動物抗体の１つまたは２つ以上のアミノ酸がヒト型のアミノ酸で置換されてなる抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
（４−５）ヒト抗体の調製法
本発明の抗体としては、さらに、ヒト抗体を挙げることができる。抗ＦＧＦＲ２ヒト抗体とは、ヒト由来の抗体のアミノ酸配列からなる抗ＦＧＦＲ２抗体を意味する。抗ＦＧＦＲ２ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒトゲノムＤＮＡ断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３−１４３，；  Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２−７２７等を参照。）によって取得することができる。
【０１１１】
ヒト抗体産生動物は、具体的には、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された組換え動物、それらの動物同士を掛け合わせることにより作り出された組換え動物のいずれであってもよい。
【０１１２】
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
【０１１３】
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７−４３１等参照。）も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５−１１１６）を用いることができる。抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５−１１１６等）。
（４−６）抗体の機能断片の調製法
一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。
【０１１４】
可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２乃至１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【０１１５】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
【０１１６】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを用いて、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を常法に従って調製することができ、また、その宿主細胞を培養することにより、常法に従ってかかる培養物から該ｓｃＦｖを回収することができる。
【０１１７】
その他の抗体の機能断片も、前記の方法に準じて該機能断片をコードする遺伝子を取得して細胞に導入し、該細胞の培養物から該機能断片を回収することにより、得ることができる。
【０１１８】
本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックス−ターン−へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
【０１１９】
本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗ＦＧＦＲ２抗体の混合物、すなわちポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体としては、例えば、ＣＤＲの一部又は全部が異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体は、異なる抗体の産生細胞を混合培養し、該培養物から回収することができる（ＷＯ２００４／０６１１０４号）。また、別個に調製した抗体を混合することも可能である。さらに、ポリクローナル抗体の一つの態様である抗血清は、動物を所望の抗原で免疫し、定法に従って、該動物から血清を回収することにより調製することができる。
【０１２０】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
【０１２１】
本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７−１１４６）。
（４−７）抗体の精製
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。
【０１２２】
例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）等）が、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。
【０１２４】
これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【０１２５】
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、抗原カラム等をあげることができる。
【０１２６】
プロテインＡカラムとしては、例えば、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ（ポール社製、，ＰＯＲＯＳ（アプライドシステムズ社製），Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられる。
【０１２７】
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
(４−８)抗体をコードするヌクレオチド・組換ベクター・組換細胞
本発明は、本発明の抗体もしくはその機能断片またはその修飾体をコードするヌクレオチド（「抗体遺伝子」という）、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子又はベクターが導入された細胞（「抗体遺伝子導入細胞」という）、その他本発明の抗体もしくは機能断片またはその修飾体を産生する細胞（「抗体産生細胞」という）をも提供する。
【０１２８】
本発明の抗体遺伝子は、好適には、次の（ａ）乃至（ｅ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列（以下、「抗体遺伝子配列」という）を含んでなるか、抗体遺伝子配列を含むヌクレオチド配列からなるか、または抗体遺伝子配列からなる：
（ａ）ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体若しくはそのマウスキメラ化抗体又はラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８抗体若しくはそのマウスキメラ化抗体の重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の組合せ；
（ｂ）上記（ａ）に記載のいずれかの抗体のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３を含む重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列とＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の組合せ；
（ｃ）上記（ａ）に記載のいずれかの抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖アミノ酸配列コードするヌクレオチド配列の組合せ；
（ｄ）（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列からなるヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし且つＦＧＦＲ２に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および、
（ｅ）（ａ）乃至（ｃ）のいずれか一つに記載のアミノ酸配列において１乃至５０個、１乃至４５個、１乃至４０個、１乃至３０個、１乃至２５個、１乃至２０個、１乃至１５個、１乃至１０個、１乃至８個、１乃至６個、１乃至５個、１乃至４個、１乃至３個、１若しくは２個、または１個のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入してなるアミノ酸配列をコードし且つＦＧＦＲ２に結合する抗体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【０１２９】
ただし、本発明の抗体遺伝子は、上記（ａ）乃至（ｅ）に記載のものに限定されない。
【０１３０】
本発明は、（４−３）記載のように、本発明の抗体遺伝子導入細胞を培養する工程、および、その培養物から抗体もしくはその機能断片またはその修飾体を回収する工程、を含む、抗体もしくはその機能断片またはその修飾体の製造方法をも提供する。かかる製造方法により得られた抗体もしくはその機能断片またはその修飾体も、本発明に含まれる。
５．診断用組成物
本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体もしくはその機能断片またはその修飾体を含む検査用または診断用組成物（以下、まとめて「診断用組成物」という）を提供する。
【０１３１】
本発明の診断用組成物は、癌などＦＧＦＲ２に関わる疾患、ＦＧＦＲ２発現の検査または診断に有用である。本発明において検査または診断には、例えば、罹患リスクの判定又は測定、罹患の有無の判定、進行や増悪化の程度の測定、抗ＦＧＦＲ２抗体等の医薬組成物による薬物治療の効果の測定又は判定、薬物治療以外の治療の効果の測定又は判定、再発リスクの測定、再発の有無の判定等が含まれるが、検査または診断であればそれらに限定されるものではない。
【０１３２】
本発明の診断用組成物は、本発明の抗体もしくはその機能断片またはその修飾体、それらを含む組成物、それらを含む医薬組成物を投与する個体の同定に有用である。
【０１３３】
かかる診断用組成物には、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調節剤、塩類、安定化剤、防腐剤、顕色剤、増感剤、凝集防止剤等を含有せしめることができる。
【０１３４】
本発明は癌などＦＧＦＲ２に関わる疾患の検査方法または診断方法、該疾患の診断用組成物を調製するための本発明の抗体の使用、該疾患の検査または診断のための本発明の抗体の使用、をも提供する。本発明の抗体を含む検査または診断用キットも本発明に含まれる。
【０１３５】
本発明の抗体を含む検査または診断の方法としてはサンドウィッチＥＬＩＳＡが望ましいが、通常のＥＬＩＳＡ法やＲＩＡ法、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）法、ドットブロット法、オクタロニー法、ＣＩＥ（Ｃｏｕｎｔｅｒｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）、ＦＣＭ（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）などの抗体を利用した検出方法が利用可能である。抗体の標識法としてはビオチンのほか、ＨＲＰ、アルカリフォスファターゼ、ＦＩＴＣなどの発蛍光団、放射性同位元素などのラベルなど生化学的解析に実施可能な標識法が利用できる。酵素標識を利用した検出にはＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ρ−ＮＰＰ（ρ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＯＰＤ（ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（３−Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）などの発色基質やＱｕａｎｔａＢｌｕTM  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）蛍光基質のほか、化学発光基質を用いることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被検試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、組織ホモジネート上清、組織切片等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
【０１３６】
本発明の抗体を含む検査または診断用のサンドウィッチＥＬＩＳＡキットには、ＦＧＦＲ２蛋白質標準液、発色試薬、希釈用緩衝液、固相用抗体、検出用抗体、ならびに洗浄液等が含まれてよい。抗原に結合した抗体量を測定する方法としては、吸光法、蛍光法、発光法、ＲＩ（Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ）法等が好適に適用され、測定には、吸光プレートリーダー、蛍光プレートリーダー、発光プレートリーダー、ＲＩ液体シンチレーションカウンター等が好適に使用される。
【０１３７】
前記の免疫組織学的試験だけでなく、試料中の細胞、組織または臓器若しくはその一部から、常法に従って可溶性蛋白を調製し、当該可溶性蛋白に標識化抗体を反応させることにより可溶性蛋白中のＦＧＦＲ２の存否を確認するウェスタンブロッティング法やドットブロット法においても用いることができる。
【０１３８】
本発明は免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＨＣ）の分析に有用な抗体、その機能断片およびその修飾体、ならびにそれらを含む組成物を提供する。かかる組成物も本発明の「診断用組成物」に包含される。
【０１３９】
免疫組織化学は、組織切片を抗原に結合する抗体（一次抗体）を反応させ、抗原に結合した一次抗体を検出する手法であれば特に限定されない。
【０１４０】
組織切片は、好適にはホルマリン固定後にパラフィン処理する。パラフィン処理した組織切片を脱パラフィン処理した後、抗原賦活処理および非特異的反応抑制処理を行う。抗原賦活処理（以下、単に「賦活化」と呼ぶことがある。）の方法としては、加熱処理、酵素処理等を例示することができる。
【０１４１】
加熱処理の条件としては、通常、温度８０乃至１１０℃、ｐＨ７乃至１２、処理時間１乃至３００分の範囲が好適であり、９０乃至１００℃、ｐＨ８乃至１０、処理時間２０乃至６０分がより好適である。ｐＨの調整には緩衝液、より好適にはＥＤＴＡを含む緩衝液（例えば、１ｍＭのＥＤＴＡを含有する１０ｍＭトリス緩衝液を挙げることがそれに限定されない）等を使用することができる。市販の緩衝液として、Ｂｏｎｄ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製：ｐＨ９、ＥＤＴＡ含有）を例示することができる。加熱処理による賦活化は、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体、マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体、それらに似た構造及び／又は結合特異性を有する抗体を用いた抗原の検出に好適に使用され得る。
【０１４２】
酵素処理の条件としては、通常、温度１０乃至５０℃、処理時間１乃至１２０分の範囲が好適であり、温度２０乃至３８℃、処理時間５乃至１０分の範囲がより好適である。酵素としては、蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）であれば得に限定されず、プロテイナーゼ、トリプシン等のペプチダーゼ等を使用することができる。市販のプロテイナーゼとしては、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＩＨＣ）（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＤＡＫＯ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ＲＴＵ（ＤＡＫＯ社製）等を例示することができる。酵素処理による賦活化は、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８抗体、マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８抗体、それらに似た構造及び／又は結合特異性を有する抗体を用いた抗原の検出に好適に使用され得る。
【０１４３】
非特異的反応抑制処理としては、発色に使用する酵素と同様または類似の触媒活性を有する内因性の酵素を不活性化する方法が通常用いられる。ペルオキシダーゼ反応により発色させる場合、予め組織中に存在する内因性のペルオキシダーゼをＨ２Ｏ２等で阻害することが好ましい。Ｈ２Ｏ２の溶媒は水、メタノール等を使用することができ、Ｈ２Ｏ２の濃度は０．１乃至３％、好適には０．３乃至３％である。Ｈ２Ｏ２溶液にはアジ化ナトリウムを添加することができる。また、血清やカゼインによりブロッキングする方法も非特異的反応抑制処理として使用することができる。血清やカゼインは、一次抗体反応の前に組織を処理することができるが、１次抗体を希釈する溶媒に含有せしめることもできる。
一次抗体の反応条件は特に限定されないが、温度２０乃至５０℃、好適には２５乃至４２℃、より好適には３７℃である。反応時間は５分乃至一昼夜、好適には１０分乃至６時間、より好適には３０分乃至２時間である。
一次抗体の検出には、好適には、可視化することができ且つ一次抗体に結合する抗体（二次抗体）を用いることができる。二次抗体の可視化法としては、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼ等の酵素を二次抗体に結合させるか、または二次抗体にビオチン等を付加して前記酵素を結合させたストレプトアビジン等と結合させ、それらの酵素に対応する発色基質を反応させる方法を好適に使用することができる。酵素を二次抗体に結合させる方法としては、デキストリンポリマーやアミノ酸ポリマーに前記酵素と二次抗体を多数結合させた試薬を用いる方法（ポリマー法）を例示することができる。ビオチン化二次抗体およびペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジンを反応させる方法（ＬＳＡＢ法）では、発色基質としてＤＡＢ等を用いることができる。また、蛍光色素などで標識された二次抗体を使用することもできる。蛍光標識二次抗体で処理した場合、処理後に蛍光顕微鏡を用いて陽性細胞を検出する。
【０１４４】
スメア法では、摘出細胞をガラスに塗布または遠心分離機で分離し、細胞成分と液性成分に分け、細胞成分について免疫染色を行う。すなわち、細胞成分をスライドガラス上に塗布し、エタノール液または１０％ホルマリン液などで固定した後、組織切片と同様の免疫染色を行うことができる。
【０１４５】
凍結包埋法では、摘出組織をＯＣＴコンパウンド等での包埋後に液体窒素等で急速凍結し、クリオスタットで薄切することでスライド標本を作製する。この標本を１０％ホルマリンやエタノール液などで固定した後、組織切片と同様の免疫染色を行うことができる。
【０１４６】
免疫組織化学に係る操作は、反応液、反応条件、洗浄回数等をプログラムして自動免疫染色装置に組み込み、自動化して行なうことができる。
【０１４７】
画像診断の場合は、薬学的に許容可能な放射性核種や発光体を抗体にラベルし、被験者に該抗体を投与し、PET/CTなどの画像診断技術を使用して画像を取り、ＦＧＦＲ２の存在を判定又は検査することができる。
【０１４８】
本発明の診断用組成物に含まれる抗体、その機能断片またはその修飾体は、好適にはＦＧＦＲ２に結合する抗体、すなわちＦＧＦＲ２選択性を有する抗体、その機能断片またはその修飾体であり、より好適にはヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂおよびヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの両方に選択性を有する抗体、その機能断片またはその修飾体である。本発明の診断用組成物の別の態様において、より好適な抗体、その機能断片またはその修飾体は、ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに選択性を有する。
ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂおよびヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの両方に選択性を有する抗体としては、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３を含む重鎖、ならびに、軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでなる抗体、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体の重鎖および軽鎖を含んでなる抗体等を例示することができる。かかる抗体としては、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体、マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
【０１４９】
ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ選択性を有する抗体としては、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８抗体の重鎖のＣＤＲＨ１乃至ＣＤＲＨ３を含む重鎖、ならびに、軽鎖のＣＤＲＬ１乃至ＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んでなる抗体、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８抗体の重鎖および軽鎖を含んでなる抗体等を例示することができる。かかる抗体としては、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８抗体、マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８抗体等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
【０１５０】
本発明の一つの好適な態様において、診断用組成物は、ＦＧＦＲ２検出用または測定用であり、より好適にはヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ及び／又はヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出用または測定用であり、より一層好適にはヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂおよびヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ、あるいはヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出用または測定用である。
【０１５１】
本発明は被検サンプル中のヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定する方法を提供する。
また、（ｉ）被検サンプル中のヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂとヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定し、（ｉｉ）該サンプル中のヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを検出または測定し、（ｉｉｉ）（ｉ）の検出または測定の結果と（ｉｉ）の検出または測定の結果を比較することにより、あるいは（ｉ）の検出または測定の結果から（ｉｉ）の検出または測定の結果を差し引くことにより、該サンプル中のヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定することができる。かかるヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの検出または測定方法も本発明に包含される。
上記（ｉ）に使用されるヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂとヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定する抗体もしくはその抗原結合断片又は組成物として、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体もしくはマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体、又はそれらを含む組成物が挙げられるが、それらに限定されるものではない。該組成物は他の抗体を含んでいても良い。
上記（ｉｉ）に使用されるヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを検出または測定する抗体もしくはその抗原結合断片又は組成物として、ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合断片（例えば、ラットＦＲ２−１０抗体もしくはそのキメラ化抗体（ＷＯ２０１３／１５４２０６））又はそれらを含む組成物が挙げられる。
【０１５２】
本発明は被検サンプル中のヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを検出または測定する方法を提供する。
また、（ｉ）被検サンプル中のヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂとヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定し、（ｉｉ）該サンプル中のヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ検出または測定し、（ｉｉｉ）（ｉ）の検出または測定の結果と（ｉｉ）の検出または測定の結果を比較することにより、あるいは（ｉ）の検出または測定の結果から（ｉｉ）の検出または測定の結果を差し引くことにより、該サンプル中のヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂを検出または測定することができる。かかるヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂの検出または測定方法も本発明に包含される。
上記（ｉ）に使用されるヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂとヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定する抗体もしくはその抗原結合断片又は組成物として、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体もしくはマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体、又はそれらを含む組成物が挙げられるが、それらに限定されるものではない。該組成物は他の抗体を含んでいても良い。
上記（ｉｉ）に使用されるヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを検出または測定する抗体もしくはその抗原結合断片又は組成物として、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８抗体もしくはマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８抗体又はそれらを含む組成物が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
これらの検出または測定方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。かかる測定方法および診断用組成物は、ヒトＦＧＦＲ２陽性癌、好適にはヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ及び／又はヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性癌、より好適にはヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃあるいはヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂおよびヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性癌の診断用または検査用としても本発明に含まれる。
【０１５３】
本発明の医薬組成物が投与される個体を同定する方法も本発明に包含される。かかる同定方法においては、該個体由来サンプル中のヒトＦＧＦＲ２を測定し、該サンプル中に、ヒトＦＧＦＲ２が検出されたか、または、健常個体由来サンプル中に検出されたヒトＦＧＦＲ２の量と比較してより多くのヒトＦＧＦＲ２が検出された場合に、該個体を陽性と判定することができる。かかる同定方法において、好適にはヒトＦＧＦＲ２は、ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ及び／又はヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃであり、より好適にはヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ及びヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ、あるいはヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃである。
当該方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。
また、かかる同定方法の好適な一態様において、該個体は癌に罹患しているかまたはそのリスクがある。
さらに、本発明の医薬組成物は、その一態様において、かかる同定方法において陽性と判定された個体に投与され得る。
６．医薬組成物
本発明は抗ＦＧＦＲ２抗体もしくはその機能断片またはその修飾体（ＷＯ２０１３／１５４２０６、ＷＯ２０１５／０５３４０７等）を含む医薬組成物を提供する。
【０１５４】
ヒトＦＧＦＲ２に特異的に結合する医薬組成物用の抗体としては、ＨｕＧＡＬ−ＦＲ２１  ＭＡｂ、ＢＡＹ−１１７９４７０、ＢＡＹ−１１８７９８２、ＦＧＦＲ２／ＦＧＦＲ４  ｄｕａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＷＯ２０１３／１５４２０６記載の抗体（ｈＦＲ２−１４＿Ｈ１９／Ｌ１、ｈＦＲ２−１４＿Ｈ１２／Ｌ１を含む）等を例示することができ、それらの抗体はヒトＦＧＦＲ２陽性疾患の治療又は予防に好適に使用され得る。ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに特異的に結合する医薬組成物用の抗体として、とりわけヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに特異的に結合する医薬組成物用の抗体としては、ＷＯ２０１３／１５４２０６記載の抗体（ｈＦＲ２−１４＿Ｈ１９／Ｌ１、ｈＦＲ２−１４＿Ｈ１２／Ｌ１を含む）等を例示することができ、それらの抗体はヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ陽性疾患、とりわけヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ及びヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ陽性疾患の治療又は予防に好適に使用され得る。
【０１５５】
本発明の医薬組成物は、ＦＧＦＲ２もしくはそのリガンドの過剰発現またはＦＧＦＲ２の変異もしくは遺伝子増幅によるＦＧＦＲ２シグナル異常又は亢進、または、ＦＧＦＲ２のアイソフォームのスイッチングにより惹起されるか又は増悪化される各種疾患（以下、「ＦＧＦＲ２に関わる疾患」という）、とりわけ各種癌の治療又は予防に有用である。
【０１５６】
かかる治療又は予防の対象となる癌の惹起又は増悪化の原因としては、ＦＧＦＲ２遺伝子のイントロン内の一塩基置換（ＳＮＰ）、ＦＧＦＲ２の高発現、ＦＧＦＲ２を恒常的に活性化するミスセンス変異、ＦＧＦＲ２遺伝子の増幅又は過剰発現、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂからＦＧＦＲ２ＩＩＩｃへのスイッチング等を例示することができる。
かかる癌種としては、例えば、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、非小細胞肺癌などの肺癌、胃癌、前立腺癌、腎癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、食道癌、膀胱癌、子宮頚癌、血液癌、リンパ腫、悪性黒色腫等をあげることができ、好適にはＦＧＦＲ２蛋白質を発現しているそれらの癌をあげることができる。
【０１５７】
本発明において、疾患の治療または予防には、かかる疾患、好適にはＦＧＦＲ２蛋白質を発現している個体におけるかかる疾患の発症の予防、増悪化又は進行の抑制又は阻害、かかる疾患に罹患した個体が呈する一つ又は二つ以上の症状の軽減、増悪化若しくは進行の抑制または寛解、二次性疾患の治療又は予防等が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【０１５８】
本発明の医薬組成物には、治療または予防に有効な量の抗ＦＧＦＲ２抗体又は該抗体の機能断片と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含有せしめることができる。
【０１５９】
「治療または予防に有効な量」とは、特定の疾患、投与形態および投与径路につき治療又は予防効果を奏する量を意味し、「薬理学的に有効な量」と同義である。
【０１６０】
本発明の医薬組成物には、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、該組成物又はそれに含まれる抗体の安定性、溶解性、徐放性、吸収性、浸透性、剤型、強度、性状、形状等を変化させたり、維持したり、保持したりするための物質（以下、「製剤用の物質」という）を含有せしめることができる。製剤用の物質としては、薬理学的に許容される物質であれば特に限定されるものではない。例えば、非毒性又は低毒性であることは、製剤用の物質が好適に具備する性質である。
【０１６１】
製剤用の物質として、例えば、アミノ酸類、抗菌剤、抗酸化剤、緩衝剤、充填剤、キレート剤、錯化剤、増量剤、単糖類、二糖類、炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、親水ポリマー、防腐剤、溶媒、糖アルコール、懸濁剤、界面活性剤、安定化増強剤、弾性増強剤、輸送剤、希釈剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤等を挙げることができ、それらの物質の添加量は、抗ＦＧＦＲ２抗体もしくはその機能断片またはその修飾体の重量に対して０．００１乃至１０００倍、好適には０．０１乃至１００倍、より好適には０．１乃至１０倍である。
【０１６２】
抗ＦＧＦＲ２抗体もしくはその機能断片またはその修飾体をリポソーム中に含有せしめたイムノリポソーム、抗体とリポソームとが結合してなる抗体修飾体（米国特許第６２１４３８８号等）を含有する医薬組成物も、本発明の医薬組成物に含まれる。
【０１６３】
賦形剤や担体は、通常液体又は固体であり、注射用の水、生理食塩水、人工脳脊髄液、その他の、経口投与又は非経口投与用の製剤に用いられる物質であれば特に限定されない。生理食塩水としては、中性のもの、血清アルブミンを含むもの等をあげることができる。
【０１６４】
緩衝剤としては、医薬組成物の最終ｐＨが７．０乃至８．５になるように調製されたＴｒｉｓバッファー、同じく４．０乃至５．５になるように調製された酢酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたクエン酸バッファー、同じく５．０乃至８．０になるように調製されたヒスチジンバッファー等を例示することができる。
【０１６５】
本発明の医薬組成物は、固体、液体、懸濁液等である。凍結乾燥製剤をあげることができる。凍結乾燥製剤を成型するには、スクロース等の賦形剤を用いることができる。
【０１６６】
本発明の医薬組成物の投与径路としては、経腸投与、局所投与及び非経口投与のいずれでもよく、例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、骨内投与、関節内投与等をあげることができる。
【０１６７】
かかる医薬組成物の組成は、投与方法、抗体のＦＧＦＲ２蛋白質結合親和性等に応じて決定することができる。本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体もしくはその機能断片またはその修飾体のＦＧＦＲ２蛋白質に対する親和性が高いほど（ＫＤ値が低いほど）、少ない投与量でその薬効を発揮し得る。
【０１６８】
本発明の抗ＦＧＦＲ２抗体の投与量は、薬理学的に有効な量であれば限定されず、個体の種、疾患の種類、症状、性別、年齢、持病、該抗体のＦＧＦＲ２蛋白質結合親和性又はその生物活性、その他の要素に応じて適宜決定することができるが、通常、０．０１乃至１０００ｍｇ／ｋｇ、好適には０．１乃至１００ｍｇ／ｋｇを、１乃至１８０日間に１回、又は１日２回若しくは３回以上投与することができる。
【０１６９】
医薬組成物の形態としては、注射剤（凍結乾燥製剤、点滴剤を含む）、坐剤、経鼻型吸収製剤、経皮型吸収製剤、舌下剤、カプセル、錠剤、軟膏剤、顆粒剤、エアーゾル剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、生体埋め込み型製剤等を例示することができる。
【０１７０】
抗ＦＧＦＲ２抗体もしくはその機能断片またはその修飾体を有効成分として含む医薬組成物は他の医薬と同時にあるいは個々に投与することができる。例えば、他の医薬を投与した後に抗ＦＧＦＲ２抗体又は該抗体の機能断片を有効成分として含む医薬組成物を投与するか、かかる医薬組成物を投与した後に、他の医薬を投与するか、または、当該医薬組成物と他の医薬とを同時に投与してもよい。他の医薬としては、化学療法剤、放射線療法など各種抗癌剤等をあげることができる。それらをまとめて本発明の抗体と「他の薬剤との併用」と呼び、本発明の抗体、その機能断片またはその修飾体に加えてさらなる薬剤を含む医薬組成物も本発明に含まれる。
【０１７１】
本発明は癌などＦＧＦＲに関わる疾患の治療方法または予防方法、該疾患の治療用または予防用医薬組成物を調製するための本発明の抗体の使用、該疾患の治療または予防のための本発明の抗体の使用、をも提供する。本発明の抗体を含む治療用または予防用キットも本発明に含まれる。
７．試薬・キット
本発明の抗体もしくはその機能断片またはその修飾体は、試薬及びキットとしても有用である。かかる試薬及びキットは、上述の検査又は診断用、研究用およびその他の用途で使用される。
【実施例】
【０１７２】
以下、実施例において本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。【０１７３】
なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年発刊）に記載の方法及びその他の当業者が使用する実験書に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って行った。
実施例１．ラット抗ヒトＦＧＦＲ２抗体の作製
１）−１  免疫
免疫にはＷＫＹ/Ｉｚｍラットの雌（日本エスエルシー社）を使用した。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＦＧＦＲ２β(ＩＩＩc)/Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭ社製）抗原蛋白とＦｒｅｕｎｄ‘ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ （和光純薬社製）を混合したものを尾根部に投与したラットのリンパ節および脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
１）−２  ハイブリドーマ作製
リンパ節細胞あるいは脾臓細胞とマウスミエローマＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞(ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１)とをＬＦ３０１−Ｃｅｌｌ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｕｎｉｔ（ＢＥＸ社製）を用いて電気細胞融合し、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清用いて抗ＦＧＦＲ２抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
１）−３  抗原結合性抗体スクリーニング用発現ベクターの構築
１）−３−１  ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂおよびｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ）の構築
ヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｂバリアント蛋白質（アイソフォーム２：ＮＰ＿０７５２５９：１〜８２２番目のアミノ酸）およびヒトＦＧＦＲ２ＩＩＩｃバリアント蛋白質（アイソフォーム１：ＮＰ＿０００１３２：１〜８２１番目のアミノ酸）をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０ベクターにクローニングし、それぞれのバリアント蛋白質を発現するベクターｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂおよびｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを構築した。
１）−３−２  ヒトＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ、ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ、ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、およびヒトＦＧＦＲ４発現ベクターの構築
ヒトＦＧＦＲ１ＩＩＩｃバリアント蛋白質（アイソフォーム１：ＮＰ＿０７５５９８：１〜８２２番目のアミノ酸）、ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｂバリアント蛋白質（アイソフォーム３：ＮＰ＿００１１５６６８５：１〜８０８番目のアミノ酸）、ヒトＦＧＦＲ３ＩＩＩｃバリアント蛋白質（アイソフォーム１：ＮＰ＿０００１３３：１〜８０６番目のアミノ酸）、およびヒトＦＧＦＲ４蛋白質（アイソフォーム１：ＮＰ＿００２００２：１〜８０２番目のアミノ酸）をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０ベクターにクローニングし、それぞれのバリアント蛋白質を発現するベクターｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、およびｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ４を構築した。
１）−３−３  ヒトＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ）の構築
ヒトＦＧＦＲ１ＩＩＩｂバリアント蛋白質（アイソフォーム２：ＮＰ＿０５６９３４の１〜３１０番目のアミノ酸、および３５９〜８２０番目のアミノ酸の間に、ＦＧＦＲ１のＩＩＩｂドメイン：ＡＡＢ１９５０２のアミノ酸配列を挿入したもの）をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０ベクターにクローニングし、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂを構築した。
１）−４  Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ法による抗体スクリーニング
１）−４−１  Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ用抗原遺伝子発現細胞の調製
ＨＥＫ２９３細胞を１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中７．５×１０５細胞／ｍｌになるよう調製した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃもしくはコントロールとしてｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０を導入し、９６−ｗｅｌｌハーフエリア  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に５０μｌずつ分注し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡに使用した。
１）−４−２  Ｃｅｌｌ−ＥＬＩＳＡ
実施例１）−４−１で調製した発現ベクター導入ＨＥＫ２９３細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃまたはｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０導入ＨＥＫ２９３細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄後、５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｔ  ＩｇＧ−Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔ（ＳＩＧＭＡ社製）を加えて、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳで６回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５Ｍ  クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ  リン酸水素２ナトリウム・１２水  ｐＨ４．５）にｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社製）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を２５μｌ／ウェルで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ  ＨＣｌを２５μｌ／ウェルを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するＦＧＦＲ２に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールのｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０導入ＨＥＫ２９３細胞と比較し、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ発現ベクター導入ＨＥＫ２９３細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ＦＧＦＲ２抗体産生陽性として選択した。
１）−５  フローサイトメトリーによる抗体スクリーニング
１）−５−１  フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５×１０４細胞／ｃｍ２になるよう２２５平方ｃｍフラスコ（住友ベークライト社製）に播種し、１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％  ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃおよびｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂとコントロールとしてｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０をそれぞれＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて導入し、３７℃、５％  ＣＯ２の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で処理し、１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
１）−５−２  フローサイトメトリー解析
実施例１）−４のＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃおよびｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂに対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例１）−５−１で調製したＨＥＫ２９３Ｔ細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄した後、５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ−Ｒａｔ  ＩｇＧ  ＦＩＴＣ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳで３回洗浄した後、２μｇ／ｍｌ  ７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を含む５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行った。７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のＦＩＴＣ蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃまたはｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマ、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８をＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ特異的結合抗体産生ハイブリドーマとして、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３をＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの両方に結合する抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
１）−６  抗体のアイソタイプ決定
抗ＦＧＦＲ２抗体産生ハイブリドーマが産生するラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８、ＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３のアイソタイプは、Ｒａｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｔｅｓｔ  ｋｉｔ（ｓｅｒｏｔｅｃ社製）により決定された。その結果、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８のアイソタイプはＩｇＧ２ｂ、κ鎖、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３のアイソタイプはＩｇＧ１、κ鎖であることが確認された。
１）−７  モノクローナル抗体の調製
ラット抗ヒトＦＧＦＲ２モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。【０１７４】
まず、ＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８の抗体産生ハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ−ＨＹ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅで十分量まで増殖させた後、Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を２０％添加したＨｙｂｒｉｄｏｍａ  ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に培地交換し、７日間培養した。本培養上清を回収し０．４５μｍのフィルターを通して滅菌した。 
抗体はＨｉｔｒａｐ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、添付マニュアルの記載に従って精製した。回収した培養上清をカラムに添加し、結合バッファー（０．０２Ｍ  リン酸ナトリウム  ｐＨ７．０）で洗浄後、０．１Ｍグリシン  ｐＨ２．７で溶出した。溶出された抗体溶液を中和後、ＰＤ−１０  ＳＸ  Ｇ−２５（Ｍ）  ３０ＳＴカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）でＰＢＳにバッファー置換し、Ａｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ４  ｃｅｎｔｒｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、）で濃縮した。
抗体の濃度は、ＧｅｎｅＳｐｅｃＩ  （日立社製）で、吸光度（Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍ）を測定することにより求めた。具体的には、抗体液の吸光度（Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍ）のピーク面積を測定し、次式で濃度を算出した。抗体サンプル濃度（ｍｇ／ｍｌ）＝（抗体サンプルのピーク面積）／（標準品（ヒトＩｇＧ１）のピーク面積）×標準品の濃度（ｍｇ／ｍｌ）×サンプルの希釈倍率。また、得られた抗体に含まれるエンドトキシン濃度をＴｈｅ  Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳ  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  （日本チャールス・リバー株式会社）を使用して測定し、１ＥＵ／ｍｇ以下であることを確認して以下の実験に使用した。
実施例２．ラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８及びラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３のクローニング
２）−１  ラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８のクローニング
２）−１−１  ラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８産生ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
ラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するため、ラット抗体２ｎｄ＿＃２８産生ハイブリドーマよりＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。
２）−１−２  ｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）の合成
ｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）の合成は実施例２）−１−１で調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの１μｇを用い、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。
２）−１−３  ５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによるラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
ラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ  （Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）、及び、
５’−ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣ−３’（ＲＧ２ＡＲ３ ：配列番号１）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＧ２ＡＲ３はデータベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した。
このプライマーの組み合わせと、実施例２）−１−２で合成したｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによりラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。【０１７５】
５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲで増幅した重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした重鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
シークエンスプライマーは、データベースのラット重鎖の定常領域の配列から設計した
５’−ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣ−３’（ＲＧ２ＡＲ３：配列番号１）の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びＮＵＰ  （Ｎｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）を用いた。
シークエンス解析は遺伝子配列解析装置（「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」あるいは「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」）を用いて実施し、シークエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。
決定されたラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号２（図１４Ａ）に示し、アミノ酸配列を配列番号３（図１４Ｂ）に示した。
２）−１−４  ５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによるラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
ラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ  （Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）及び、
５’−ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ−３’（ＲＫＲ５：配列番号４）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＫＲ５はデータベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した。【０１７６】
このプライマーの組み合わせと、実施例２）−１−２で合成したｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）を鋳型とした５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによりラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマニュアルに従い、タッチダウンＰＣＲプログラムで実施した。
５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲで増幅した軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製後、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングし、クローニングした軽鎖の可変領域を含むｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
シークエンスプライマーは、データベースのラット軽鎖の定常領域の配列から設計した
５’−ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＣＴＧＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＴＣ−３’（ＲＫＲ５：配列番号４）の配列を有するオリゴヌクレオチド、及びＮＵＰ  （Ｎｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ：ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔに付属）を用いた。
シークエンス解析は遺伝子配列解析装置（「ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」あるいは「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ｘｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ」）を用いて実施し、シークエンス反応は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いた。【０１７７】
決定されたラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号５（図１４Ｃ）に示し、アミノ酸配列を配列番号６（図１４Ｄ）に示した。
２）−２  ラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３のクローニング
２）−２−１  ラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３産生ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
ラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の可変領域を含むｃＤＮＡを増幅するため、ラット抗体２ｎｄ＿＃２３産生ハイブリドーマより実施例２）−１−１と同様の方法でｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。
２）−２−２  ｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）の合成
ｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）の合成は実施例２）−２−１で調製したｔｏｔａｌ  ＲＮＡの１μｇを用い、実施例２）−１−２と同様の方法で実施した。
２）−２−３  ５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによるラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
実施例２）−２−２で合成したｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）を鋳型として用いて、実施例２）−１−３と同様の方法でラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖可変領域を含むｃＤＮＡを増幅してヌクレオチド配列を決定した。
決定されたラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号７（図１５Ａ）に示し、アミノ酸配列を配列番号８（図１５Ｂ）に示した。
２）−２−４  ５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによるラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡの増幅と配列の決定
実施例２）−２−２で合成したｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ）を鋳型として用いて、実施例２）−１−４と同様の方法でラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡを増幅して配列を決定した。【０１７８】
決定されたラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号９（図１５Ｃ）に示し、アミノ酸配列を配列番号１０（図１５Ｄ）に示した。
実施例３．マウスＩｇＧ１キメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８及びマウスＩｇＧ１キメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３の作製
３）−１  発現ベクターｐＣＭＡ−ＬＫの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号１１（図１６）に示すヒトκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。
ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを鋳型として、下記プライマーセットでＰＣＲを行い、得られた約３．８ｋｂのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりＣＭＶプロモーターの下流にシグナル配列、及びヒトκ鎖定常領域を持つ、発現ベクターｐＣＭＡ−ＬＫを構築した。
プライマーセット
５’−ＴＡＴＡＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣ−３’（３．３−Ｆ１：配列番号１２）
５’−ＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＣＧＡＣＧＴＴＧ−３’（３．３−Ｒ１：配列番号１３）
３）−２  マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８重鎖発現ベクターの構築
配列番号１４に示すマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＳｃｒｉｐｔ社  遺伝子合成サービス）。合成したＤＮＡ断片をテンプレートとして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）と下記のプライマーセットでマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を増幅し、発現ベクターｐＣＭＡ−ＬＫを制限酵素ＸｂａＩおよびＰｍｅＩで消化してκ鎖分泌シグナルおよびヒトκ鎖定常領域を取り除いた箇所にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて挿入することによりキメラ２ｎｄ＿＃２８重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ  /２ｎｄ＿＃２８Ｈ」と命名した。
プライマーセット
５’−  ＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣ−３’（ＣＭ−ｉｎｆ−Ｆ：配列番号１６）
５’−  ＡＧＴＴＡＧＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣ  −３’（ＣＭ−ｉｎｆ−Ｒ：配列番号１７）
マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８重鎖のアミノ酸配列を配列番号１５に示した。
３）−３  マウスキメラ化２ｎｄ＿＃０２８軽鎖発現ベクターの構築
配列番号１８に示すマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＳｃｒｉｐｔ社  人工遺伝子合成サービス）。実施例３）−２と同様の方法によりキメラ２ｎｄ＿＃２８軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ  /２ｎｄ＿＃２８Ｌ」と命名した。【０１７９】
マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８軽鎖のアミノ酸配列を配列番号１９に示した。
３）−４  マウスキメラ化２ｎｄ＿＃０２３重鎖発現ベクターの構築
配列番号２０に示すマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＳｃｒｉｐｔ社  人工遺伝子合成サービス）。実施例３）−２と同様の方法によりマウスキメラ化２ｎｄ＿＃２３重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ  /２ｎｄ＿＃２３Ｈ」と命名した。【０１８０】
マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３重鎖のアミノ酸配列を配列番号２１に示した。
３）−５  マウスキメラ化２ｎｄ＿＃０２３軽鎖発現ベクターの構築
配列番号２２に示すマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３軽鎖をコードする配列を含むＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＳｃｒｉｐｔ社  人工遺伝子合成サービス）。実施例３）−２と同様の方法によりマウスキメラ化２ｎｄ＿＃０２３軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ  /２ｎｄ＿＃２３Ｌ」と命名した。【０１８１】
マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２３に示した。
３）−６  マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の生産
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ  Ｆｅｒｎｂａｃｈ  Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ  Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して２．０×１０６細胞／ｍｌに調製したのちに、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで１時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２４７６５）１．８ｍｇをＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２０ｍｌに溶解し、次にＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ（ＴａＫａＲａ社）を用いて調製したＨ鎖発現ベクター（０．２４ｍｇ）及びＬ鎖発現ベクター（０．３６ｍｇ）を２０ｍｌのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ混合液２０ｍｌに、発現ベクター／Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ混合液２０ｍｌを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで４時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に６００ｍｌのＥＸ−ＣＥＬＬ  ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍｌのＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）、及び３０ｍｌのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｃａｐｓｕｌｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  （Ａｄｖａｎｔｅｃ  ＃ＣＣＳ−０４５−Ｅ１Ｈ）でろ過した。
ｐＣＭＡ  /２ｎｄ＿＃２８ＨとｐＣＭＡ  /２ｎｄ＿＃２８Ｌとの組合せによって取得されたラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８のキメラ化抗体を「マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８」と命名し、ｐＣＭＡ  /２ｎｄ＿＃２３ＨとｐＣＭＡ  /２ｎｄ＿＃２３Ｌとの組合せによって取得されたラット抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３のキメラ化抗体を「マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３」と命名した。
３）−７  マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の精製
実施例３）−６で得られた培養上清を、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィー（４−６℃下）１段階工程で精製した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後のバッファー置換工程は４−６℃下で実施した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）が充填されたカラムにアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）への液置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ＵＦ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４℃下）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を５ｍｇ／ｍｌに調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ−Ｐｌｕｓ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。
３）−８  マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８のフローサイトメトリー解析によるＦＧＦＲファミリー分子への結合解析
３）−８−１  フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中７．５ｘ１０５細胞／ｍｌになるよう調製した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、実施例１）−３−１、１）−３−２、および１）−３−３で構築したＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、およびＦＧＦＲ４の発現ベクター、または空ベクター、すなわち、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ４、およびｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０を導入し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養した。翌日、発現ベクター導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で処理し、１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで細胞を洗浄した後、５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
３）−８−２  
実施例３）−７で調製したマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の非変性型ＦＧＦＲファミリー分子に対する結合特異性をフローサイトメトリー法により確認した。実施例３）−８−１で調製したＨＥＫ２９３Ｔ細胞懸濁液を遠心し、上清を除去した後、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０−ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ４、またはｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のそれぞれに対し、５μｇ／ｍｌに調製した陰性コントロールマウスＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ社製）、またはマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８、マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄した後、５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ-Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｇｏａｔ  ＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を加えて懸濁し、４℃で１時間静置した。５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳで３回洗浄した後、２μｇ／ｍｌ  ７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を含む５％  ＦＢＳ含有ＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＣ５００：ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ社製）で検出を行った。データ解析はＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）で行った。７−ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のＦＩＴＣの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した（図１）。コントロールであるｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の蛍光強度ヒストグラムに対し、マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞特異的に結合を示し、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂまたは他のＦＧＦＲファミリー発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への結合は認められなかった。また、ＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂまたはＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞特異的に結合を示し、他のＦＧＦＲファミリー発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への結合は認められなかった。
実施例４．免疫染色
４）−１  免疫染色用サンプルの調製
４）−１−１  ＦＧＦＲファミリー分子発現細胞株の調製
インテグリンαｖおよびインテグリンβ３発現ベクターをＨＥＫ２９３細胞内に安定形質移入した細胞株２９３α細胞を１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中６×１０６細胞／２２５ｃｍ２フラスコ（住友ベークライト社製）となるように調製し、３７℃、５％  ＣＯ２で一晩培養した。実施例１）−３−１、１）−３−２、および１）−３−３で構築したＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、およびＦＧＦＲ４の発現ベクター、または空ベクター、すなわち、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ１ＩＩＩｃ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ３ＩＩＩｃ、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０―ＦＧＦＲ４、およびｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０をＦｕＧＥＮＥ６（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて導入し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で二晩培養した。得られた細胞をＴｒｙｐＬＥｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて回収し、遠心してペレットにした後、ＰＢＳで1回洗浄し、遠心して得られたペレットを２０％中性緩衝ホルマリンで固定した。
４）−１−２  ＦＧＦＲ２発現癌細胞株の調製
１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩで培養したヒト胃癌株ＳＮＵ−１６およびヒト大腸癌株ＮＣＩ−Ｈ７１６（ＡＴＣＣより購入）をそれぞれ回収し、遠心してペレットにした後、２０％中性緩衝ホルマリンで固定した。１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで培養したヒト胃癌株ＫＡＴＯＩＩＩ（ＡＴＣＣより購入）を回収し、遠心してペレットにした後、２０％中性緩衝ホルマリンで固定した。
４）−１−３  ＦＧＦＲ２発現癌細胞株ゼノグラフトモデル腫瘍サンプルの作製
５×１０６細胞のＳＮＵ−１６を５０％マトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）で懸濁し、ヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎｌｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ、日本チャールス・リバーより購入）の腋窩部皮下に移植した。移植２０日後に腫瘍を回収し、マイルドホルム（和光純薬工業株式会社製）で固定した。
３×１０5細胞のＫＡＴＯＩＩＩを１００％マトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製）で懸濁し、ＳＣＩＤマウス（ＣＢ１７／ｌｃｒ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＣｒｌＣｒｌｊ、日本チャールス・リバーより購入）の腋窩部皮下に移植した。移植３０日後に腫瘍を回収し、マイルドホルム（和光純薬工業株式会社製）で固定した。
２．５×１０６細胞のＮＣＩ−Ｈ７１６を１００％マトリゲル（日本ＢＤより購入）で懸濁し、ヌードマウス（ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎｌｎｕ／ＣｒｌＣｒｌｊ、日本チャールス・リバーより購入）の腋窩部皮下に移植した。移植２１日後に腫瘍を回収し、マイルドホルム（和光純薬工業株式会社製）で固定した。
４）−２  パラフィン包埋、薄切
パラフィン包埋、薄切は一般的な手法であり、用いる器具や機器は特に制限はない。【０１８２】
実施例４）−１−１、４）−１−２で調製した細胞は１５ｍＬチューブに回収し、１５００ｒｐｍで５分遠心し上清を除去した。細胞ペレットに２０％中性緩衝ホルマリン（和光純薬工業社製）３ｍＬを重層し、室温で３０分間以上静置して固定した。その後クロロホルム５ｍＬを添加し、直ちに１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、直ちにホルマリン層を除去した後、ホルマリン層とクロロホルム層の間に形成された細胞ペレットを回収した。細胞ペレットをナイロンメッシュ袋に入れ、組織標本用のカセット（ユニカセットスタンダード、サクラファインテックジャパン株式会社製）に入れ、カセットごとエタノールに浸してクロロホルムを洗い流した。実施例４）−１−３で作製したゼノグラフト組織は、マイルドホルム（和光純薬から購入）で固定後、切り出し面をトリミングしカセットに入れた。【０１８３】
細胞ペレットおよびゼノグラフト組織は、通常の方法でパラフィン包埋した。
自動固定包埋装置（ティシュー・テックＶＩＰ５ジュニア：サクラファインテックジャパン株式会社製）を用いて脱水、脱脂、パラフィン浸透させた。自動固定包埋装置よりカセットを取り出し、パラフィン包埋ブロック作製装置（ティシュー・テックＴＥＣプラス：サクラファインテックジャパン株式会社製）のパラフィン槽に移した。同装置にセットした包埋皿に融解したパラフィンを少量流し込み、この包埋皿のパラフィン内に、パラフィン槽から出したカセット容器内、あるいはナイロンメッシュ内の細胞ペレットあるいは組織をピンセットで取り出してセットした。次いで包埋皿の上に包埋枠としてカセットを乗せて、上から融解パラフィンを流し込み、細胞あるいは組織と一体となった包埋枠を含む包埋皿を冷却部上に置いて冷却した。パラフィンが固まったら包埋皿より取り出し、包埋ブロックとして薄切に供した。薄切は、上記で作製した包埋ブロックを、ミクロトーム（ＩＶＳ−４１０：サクラファインテックジャパン株式会社製）で厚さ３μｍに薄切した。薄切した切片を剥離防止スライドグラス（プラチナ：松浪硝子工業株式会社製）に貼った。５０℃のパラフィン伸展器（サクラファインテックジャパン株式会社製）上で一晩乾燥させ、スライドケースに収容し、デシケータ内で保管した。
４）−３  染色
４）−３−１  市販抗体１８６０１（Ａｎｔｉ-Ｈｕｍａｎ  Ｋ-ｓａｍ Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｙ、株式会社免疫生物研究所製）を用いた染色
染色作業は、自動染色装置（ディスカバリー  Ｕｌｔｒａ：Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実施した。染色過程の反応温度は３７℃で、それ以外の場合のみ記載した。脱パラフィンはＥＺバッファー（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、６８℃で４分間のインキュベートを３回液を換えて実施し、その後ＥＺバッファーで洗浄した。ＣＣ１バッファー（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製)、９５℃で４回液を換えて計５２分間実施した。リアクションバッファー（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）で４回洗浄した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ（ＤＡＫＯ社製）を加え、１６分間インキュベートし、リアクションバッファーで３回洗浄した。１８６０１をディスカバリー専用抗体希釈液（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）で５μｇ／ｍＬに希釈し、１時間反応させた。リアクションバッファーで３回洗浄後、インヒビターＣＭ（クロモマップキット：Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を８分間反応させた後、リアクションバッファーで２回洗浄した。ＵＭａｐ  ａｎｔｉ−Ｒｂ  ＨＲＰ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を３２分間反応させ、リアクションバッファーで４回洗浄した。ＤＡＢ  ＣＭ（クロモマップキット：Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を４分反応させた後Ｈ２Ｏ２ＣＭ（クロモマップキット：Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、８分間反応させ、リアクションバッファーで１回洗浄した。Ｃｏｐｐｅｒ−ＣＭ（クロモマップキット：Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を４分間反応させ、リアクションバッファーで１回洗浄した。ヘマトキシリン核染色試薬ＩＩ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を４分間反応させ、リアクションバッファーで２回洗浄した。Ｂｌｕｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（炭酸リチウム試薬，Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を４分間反応させ、リアクションバッファーで１回洗浄した。
４）−３−２  ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８抗体を用いた染色
脱パラフィンは定法に従い、１００％キシレンを４槽、１００％エタノールを３槽それぞれ５分間ずつ通した後、イオン交換水で洗浄した。その後の染色作業は自動染色装置（ダコ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ４８：ＤＡＫＯ社製）を用いて実施した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ（ＤＡＫＯ社製）で１回洗浄した後、ＤＡＫＯ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ  ＲＴＵ（ＤＡＫＯ社製）で室温にて６分間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで３回洗浄した。Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ  ３％  Ｈ２Ｏ２（ＤＡＫＯ社製）を加え５分間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで２回洗浄した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ（ＤＡＫＯ社製）を加え、３０分間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８をＤＡＫＯ  ＲＥＡＬ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔで１５μｇ／ｍＬに希釈し、１時間反応させた。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで３回洗浄後、Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ  ｓｉｍｐｌｅｓｔａｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ＭＡＸ−ＰＲＯ（Ｒａｔ）＃４１４３１１（ニチレイバイオサイエンス社製）を加え３０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで２回洗浄した。【０１８４】
ＤＡＫＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍを加え計１０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎを加え５分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ及びイオン交換水で計３回洗浄した。
４）−３−３  マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８抗体を用いた染色
染色作業は自動染色装置（ＬＥＩＣＡ  ＢＯＮＤ−ＩＩＩ：Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実施した。脱パラフィンは７２℃に加熱した後、Ｂｏｎｄ  Ｄｅｗａｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え３０秒インキュベートし、エタノールを加え、Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で４回洗浄した。２００倍希釈したＥｎｚｙｍｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（ＩＨＣ）（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え、３７℃で５分インキュベートした。Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで７回洗浄し、マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８を１５μｇ／ｍＬに希釈し、３０分反応させた。【０１８５】
Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで３回洗浄し、Ｐｏｓｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ試薬（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え８分間インキュベートした。
Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで４回洗浄し、Ｐｒｉｍａｒｙ試薬（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え８分間インキュベートした。Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで４回洗浄し、Ｐｅｒｏｘｙｉｄｅ  Ｂｌｏｃｋ試薬（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え５分間インキュベートした。Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ及びイオン交換水で計４回洗浄し、ＤＡＢ試薬（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え１０分間インキュベートした。イオン交換水で４回洗浄し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え５分間インキュベートした後、イオン交換水及びＢｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで計４回洗浄した。
４）−３−４  ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体を用いた染色
染色作業は自動染色装置（ＬＥＩＣＡ  ＢＯＮＤ−ＩＩＩ：Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実施した。脱パラフィンは７２℃に加熱した後、Ｂｏｎｄ  Ｄｅｗａｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え３０秒インキュベートし、エタノールを加え、Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で４回洗浄した。Ｂｏｎｄ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え、１００℃で２０分（ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３）または４０分（マウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３）インキュベートした。Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで７回洗浄し、抗体を１５μｇ／ｍＬに希釈し、３０分反応させた。【０１８６】
Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで３回洗浄し、Ｐｏｓｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ試薬（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え８分間インキュベートした。
Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで４回洗浄し、Ｐｒｉｍａｒｙ試薬（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え８分間インキュベートした。Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで４回洗浄し、Ｐｅｒｏｘｙｉｄｅ  Ｂｌｏｃｋ試薬（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え５分間インキュベートした。Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ及びイオン交換水で計４回洗浄し、ＤＡＢ試薬（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え１０分間インキュベートした。イオン交換水で４回洗浄し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え５分間インキュベートした後、イオン交換水及びＢｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで計４回洗浄した。
４）−３−５  ａｂ５８２０１抗体（Ａｎｔｉ−ＦＧＦＲ２抗体、アブカム株式会社）を用いた染色
染色作業は自動染色装置（ＬＥＩＣＡ  ＢＯＮＤ−ＩＩＩ：Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実施した。脱パラフィンは７２℃に加熱した後、Ｂｏｎｄ  Ｄｅｗａｘ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え３０秒インキュベートし、エタノールを加え、Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で４回洗浄した。Ｂｏｎｄ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ２（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え、１００℃で２０分インキュベートした。Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで７回洗浄し、ａｂ５８２０１を２μｇ／ｍＬに希釈し、３０分反応させた。【０１８７】
Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで３回洗浄し、Ｐｏｓｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ試薬（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え８分間インキュベートした。
Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで４回洗浄し、Ｐｒｉｍａｒｙ試薬（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え８分間インキュベートした。Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで４回洗浄し、Ｐｅｒｏｘｙｉｄｅ  Ｂｌｏｃｋ試薬（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え５分間インキュベートした。Ｂｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ及びイオン交換水で計４回洗浄し、ＤＡＢ試薬（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え１０分間インキュベートした。イオン交換水で４回洗浄し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｂｏｎｄポリマーシステム／ライカＩＨＣ  Ｒｅｆｉｎｅキット、Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え５分間インキュベートした後、イオン交換水及びＢｏｎｄ  Ｗａｓｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎで計４回洗浄した。
４）−４  染色標本の評価：変性型ＦＧＦＲファミリー分子に対する結合特異性
４）−３で染色完了した標本はエタノール系列で脱水、キシレン系列で透徹後、封入剤とともにカバーグラスで封入した。光学顕微鏡で観察し、陽性反応産物である褐色の染色を評価した。【０１８８】
市販抗体1８６０１は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、またはＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを強制発現させた細胞に陽性染色を認める一方、他のＦＧＦＲファミリーである、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ、同ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ、同ＩＩＩｃ及びＦＧＦＲ４を強制発現させた細胞並びに空ベクター導入細胞に陽性染色は認められなかった（図２Ａ〜２Ｄ）。さらに、ＳＮＵ−１６細胞（図３−（Ａ））、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞（図３−（Ｃ））およびＮＣＩ−Ｈ７１６細胞（図３−（Ｂ））のブロックに対して多くの細胞で明瞭な陽性染色が見られたことから、これらの細胞株はＦＧＦＲ２蛋白質を発現していることが確認された。【０１８９】
図４Ａ〜４Ｄ並びに図５Ａ〜５Ｄに示すとおり、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃを強制発現させた細胞ブロックの一部の細胞にのみ非常に強い染色が認められ、その他の強制発現細胞、または空ベクター導入細胞に陽性染色は認められなかった。従って、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃの特異的染色が可能と判断された。また、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ蛋白の発現が確認されているＮＣＩ−Ｈ７１６細胞（図６−（Ｂ）、図７−（Ｂ））では多くの細胞で明瞭な陽性染色が見られたが、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ蛋白を発現していないＳＮＵ−１６細胞（図６−（Ａ）、図７−（Ａ））、ＫＡＴＯＩＩＩ細胞（図６−（Ｃ）、図７−（Ｃ））に陽性染色は認められなかった。これらの結果より、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ蛋白内因性癌細胞にも陽性反応を示すことが確認された。さらに、図８に示すとおり、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８は、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞ゼノグラフト腫瘍では多くの細胞で明瞭な陽性染色が見られた。これらのことから、ゼノグラフト腫瘍においても、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８はＦＧＦＲ２ＩＩＩｃに反応することが確認された。【０１９０】
また、図９Ａ〜９Ｄ並びに図１０Ａ〜１０Ｄに示すとおり、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体は、他のＦＧＦＲファミリーである、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ、同ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ、同ＩＩＩｃ及びＦＧＦＲ４を強制発現させた細胞に陽性染色は認められなかった。従って、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３抗体は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂ、またはＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ特異的な染色が可能と判断された。また、図１１、図１２に示すとおり、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３は、ＦＧＦＲ２蛋白の発現が確認されているＳＮＵ−１６細胞、ＮＣＩ−Ｈ７１６細胞、およびＫＡＴＯＩＩＩ細胞において多くの細胞で明瞭な陽性染色が見られた。これらの結果より、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３は、ＦＧＦＲ２ＩＩＩｂまたはＦＧＦＲ２ＩＩＩｃ蛋白内因性癌細胞にも陽性反応を示すことが確認された。【０１９１】
市販の１８６０１はポリクローナル抗体であり、ロットにより染色にばらつきが見られた。一方、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２８及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８は組換えモノクローナル抗体であることから、バラつきの少ない染色が可能であり、特にラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３はバラつきが少なかった。また、染色状態について、１８６０１は、ラットＦＲ２−２ｎｄ＿♯０２３及びマウスキメラ化ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３に較べて、陽性像のコントラストが低く、Ｓ／Ｎ比が悪かった。【０１９２】
他方、図１３Ａ〜１３Ｄに示すとおり、ａｂ５８２０１は、他のＦＧＦＲファミリーである、ＦＧＦＲ１ＩＩＩｂ、同ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３ＩＩＩｂ及び同ＩＩＩｃを強制発現させた細胞に対して多くの細胞で明瞭な陽性染色が見られたことから、ＦＧＦＲ２のみの発現解析には不適格であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１９３】
本発明の提供する抗体を用いることにより各種癌の検査または診断が可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【０１９４】
配列番号１：プライマーＲＧ２ＡＲ３のヌクレオチド配列
配列番号２：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（図１４Ａ）。
配列番号３：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１４Ｂ）。
配列番号４：プライマーＲＫＲ５のヌクレオチド配列
配列番号５：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（図１４Ｃ）。
配列番号６：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１４Ｄ）。
配列番号７：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（図１５Ａ）。
配列番号８：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１５Ｂ）。
配列番号９：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列（図１５Ｃ）。
配列番号１０：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列（図１５Ｄ）。
配列番号１１：ヒトκ鎖分泌シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（図３５）。
配列番号１２：プライマー３．３−Ｆ１のヌクレオチド配列
配列番号１３：プライマー３．３−Ｒ１のヌクレオチド配列
配列番号１４：マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド番号２６乃至１１４１）を含むヌクレオチド配列（図１７Ａ）。
配列番号１５：マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖のアミノ酸配列（図１７Ｂ）。
配列番号１６：プライマーＣＭ−ｉｎｆ−Ｆのヌクレオチド配列
配列番号１７：プライマーＣＭ−ｉｎｆ−Ｒのヌクレオチド配列
配列番号１８：マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド番号２６乃至７２４）を含むヌクレオチド配列（図１７Ｃ）。
配列番号１９：マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖のアミノ酸配列（図１７Ｄ）。
配列番号２０：マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド番号２６乃至１４２３）を含むヌクレオチド配列（図１８Ａ）。
配列番号２１：マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖のアミノ酸配列（図１８Ｂ）。
配列番号２２：マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖をコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド番号２６乃至７２４）を含むヌクレオチド配列（図１８Ｃ）。
配列番号２３：マウスキメラ化抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖のアミノ酸配列（図１８Ｄ）。
配列番号２４：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図１９）
配列番号２５：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図１９）
配列番号２６：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図１９）
配列番号２７：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図１９）
配列番号２８：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図１９）
配列番号２９：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２８の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図１９）
配列番号３０：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図２０）
配列番号３１：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図２０）
配列番号３２：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図２０）
配列番号３３：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列（図２０）
配列番号３４：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列（図２０）
配列番号３５：ラット抗ＦＧＦＲ２抗体ＦＲ２−２ｎｄ＿＃０２３の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列（図２０）
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
2016171107.tif 000041
【図１７Ａ】
2016171107.tif 000042
【図１７Ｂ】
2016171107.tif 000043
【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
2016171107.tif 000045
【図１８Ａ】
2016171107.tif 000046
【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
2016171107.tif 000049
【図１９】
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【図２０】
2016171107.tif 000051
【配列表】
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【国際調査報告】
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