(57)【要約】要約  ロット間の性能を揃えやすい甲状腺ホルモン類の標準液及びそれを用いた免疫測定における検量線の作成方法が開示されている。甲状腺ホルモン類標準液は、甲状腺ホルモン類と、シクロデキストリン又はその誘導体とを緩衝液中に含む。検量線の作成方法は、互いに異なる既知濃度の甲状腺ホルモン類と、シクロデキストリン又はその誘導体とを緩衝液中に含む、複数の甲状腺ホルモン類標準液を準備することと、各甲状腺ホルモン類標準液を免疫測定に供し、各甲状腺ホルモン類標準液に含まれる甲状腺ホルモン類の濃度と、免疫測定のシグナルとの関係に基づき検量線を作成することとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺ホルモン類と、シクロデキストリン又はその誘導体とを緩衝液中に含む甲状腺ホルモン類標準液。
【請求項２】
前記甲状腺ホルモン類が、トリヨードサイロニン、遊離トリヨードサイロニン、サイロキシン又は遊離サイロキシンである請求項１記載の標準液。
【請求項３】
前記シクロデキストリン又はその誘導体が、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン又はこれらのアルキル若しくはヒドロキシアルキル置換体である請求項１又は２に記載の標準液。
【請求項４】
前記シクロデキストリン又はその誘導体が、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである請求項３記載の標準液。
【請求項５】
前記シクロデキストリン又はその誘導体の濃度が、0.1重量％〜１０重量％である請求項１〜４のいずれか１項に記載の標準液。
【請求項６】
ｐＨが6.5〜10である請求項１〜５のいずれか１項に記載の標準液。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の標準液を含む、甲状腺ホルモン類測定試薬。
【請求項８】
甲状腺ホルモン類と、シクロデキストリン又はその誘導体とを緩衝液中に含む液の、甲状腺ホルモン類標準液としての使用。
【請求項９】
互いに異なる既知濃度の甲状腺ホルモン類と、シクロデキストリン又はその誘導体とを緩衝液中に含む、複数の甲状腺ホルモン類標準液を準備することと、各甲状腺ホルモン類標準液を免疫測定に供し、各甲状腺ホルモン類標準液に含まれる甲状腺ホルモン類の濃度と、免疫測定のシグナルとの関係に基づき検量線を作成することとを含む、免疫測定における検量線の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺ホルモン類の免疫測定に用いられる標準液に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリヨードサイロニン（T3)やサイロキシン(T4)のような甲状腺ホルモン類は、血液中では代謝サイクルに従って生産、分解が繰り返されている。血中のT3やT4濃度は、様々な疾患の指標となるので、臨床検査においてT3やT4の濃度が測定されている。また、血液中では、T3やT4は、大部分が結合タンパク質と結合した状態で存在し、少量が遊離状態で存在するが、細胞内に入ってその機能を発揮するのは遊離型であるので、遊離型のT3(FT3)や遊離型のT4(FT4)も測定されている。具体的には、血中FT3濃度は、甲状腺機能亢進症（上昇）並びにLow T3症候群及び甲状腺機能低下症（以上、減少）の指標として利用されている。血中T3濃度は、バセドウ病、初期の亜急性甲状腺炎及びプランマー病等（以上、上昇）並びに重症消耗性疾患、下垂体腫瘍及びシーハン症候群など（以上、減少）の指標として利用されている。また、血中FT4濃度は、甲状腺機能亢進症及びバセドウ病（以上、上昇）並びに甲状腺機能低下症（減少）の指標として利用されており、血中T4濃度は、バセドウ病、プランマー病及びホルモン不応症等（以上、上昇）並びに慢性甲状腺炎、ヨード欠乏、シーハン症候群など（以上、減少）の指標として利用されている。【０００３】
これらの甲状腺ホルモン類の血中濃度は、従来から、免疫測定により測定されている。免疫測定においては、検体とは別に、検量線作成用に、既知濃度の各甲状腺ホルモン類を含む標準液の測定が行われる。より正確な免疫測定を可能とするため、標準液には、保存安定性が要求されるが、甲状腺ホルモン類は水溶液中での安定性が低いことが問題となる。現在、甲状腺ホルモン類にとって本来の環境である血液と類似した媒体が標準液の媒体として用いられている。具体的には、活性炭処理により甲状腺ホルモン類、及びこれに類似した成分を除去した健常ヒト血清を媒体としている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平６−９４７０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来から甲状腺ホルモン類の標準液の媒体として用いられている、活性炭処理した健常ヒト血清では、原料となるヒト血清のロットにより標準液の性能（安定性、再現性）にバラつきが生じやすく、安定的に同等の品質の標準液を提供するにあたり、原料確保が困難な状況にある。【０００６】
従って、本発明の目的は、ロット間の性能を揃えやすい甲状腺ホルモン類の標準液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、シクロデキストリン又はその誘導体を甲状腺ホルモン類と共存させることにより、ヒト血清を用いることなく、甲状腺ホルモン類を長期に亘って安定に保存することができることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、甲状腺ホルモン類と、シクロデキストリン又はその誘導体とを緩衝液中に含む甲状腺ホルモン類標準液を提供する。また、本発明は、上記本発明の標準液を含む、甲状腺ホルモン類測定試薬を提供する。【０００９】
また、本発明は、甲状腺ホルモン類と、シクロデキストリン又はその誘導体とを緩衝液中に含む液の、甲状腺ホルモン類標準液としての使用を提供する。【００１０】
さらに本発明は、互いに異なる既知濃度の甲状腺ホルモン類と、シクロデキストリン又はその誘導体とを緩衝液中に含む、複数の甲状腺ホルモン類標準液を準備することと、各甲状腺ホルモン類標準液を免疫測定に供し、各甲状腺ホルモン類標準液に含まれる甲状腺ホルモン類の濃度と、免疫測定のシグナルとの関係に基づき検量線を作成することとを含む、免疫測定における検量線の作成方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ロット間の性能を揃えやすい甲状腺ホルモン類の標準液が提供された。本発明の甲状腺ホルモン類標準液は、ヒト血清を用いていないので、従来法のように原料となる血清ロットごとに性能（安定性、再現性）の差異が生じやすいという問題が起きない。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
上記の通り、本発明の甲状腺ホルモン類の標準液は、緩衝液中に甲状腺ホルモン類と、シクロデキストリン又はその誘導体とを含むものである。
【００１３】
甲状腺ホルモン類としては、Ｔ３，Ｔ４、ＦＴ３及びＦＴ４を挙げることができ、ＦＴ３及びＦＴ４が好ましい。標準液中の甲状腺ホルモン類の濃度は、標準液であるので、既知の設定濃度である。ＦＴ３の場合は、通常、50pg/mL以下、特に30pg/mL以下の濃度で数段階設定される。ＦＴ４の場合には、通常、20ng/dL以下、特に10ng/dL以下の濃度で数段階設定される。Ｔ３の場合には、通常、15ng/mL以下、特に8ng/mL以下の濃度で数段階設定される。Ｔ４の場合には、通常、50μg/dL以下、特に30μg/dL以下の濃度で数段階設定される。
【００１４】
シクロデキストリンは、特に限定されないが、β−シクロデキストリン及びγ−シクロデキストリンが好ましい。また、シクロデキストリン誘導体としては、アルキル若しくはヒドロキシアルキル置換体が好ましく、これらのアルキル基又はヒドロキシアルキル基中の炭素数は１〜６が好ましい。これらの中でも、甲状腺ホルモン類の保存安定性の観点から、ヒドロキシプロピル基で置換された、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン(HPBC)が特に好ましい。これらのシクロデキストリン又はその誘導体（以下、単に「シクロデキストリン類」とも称する）は市販もされているので、市販品を好ましく用いることができる。シクロデキストリン類は、１種類でもよいし、複数種類を組み合わせて用いることもできる。
【００１５】
シクロデキストリン類の濃度（複数種類を用いる場合にはその合計濃度）は、０．１重量％〜１０重量％が好ましく、さらに好ましくは１．０重量％〜５．０重量％である。シクロデキストリン類の濃度を０．１重量％以上とすることで、十分な安定性効果を示すことができる。一方、１０重量％以下とすることで、測定値に影響を与えることなく、ＦＴ３、ＦＴ４の免疫測定の確実な実施を可能とすることができる。
【００１６】
本発明において用いられる緩衝液は、水を溶媒とする水系緩衝液であり、特に限定されないが、ｐＨ６．５〜１０、特にｐＨ７．５〜１０、さらにｐＨ８．５〜９．５の緩衝液とすることが好ましい。このようなｐＨの範囲で緩衝能を有する緩衝液の例として、炭酸水素ナトリウム、CABS(4-(シクロヘキシルアミノ)-1-ブタンスルホン酸)、エタノールアミン、AMP（2-アミノ-2-メチル-1-プロパノール）、CAPSO（N-シクロヘキシル-2-ヒドロキシ-3-アミノプロパンスルホン酸）、メチルアミン及びCAPS （N-シクロヘキシル-3-アミノプロパンスルホン酸）等の緩衝液を挙げることができ、これらの緩衝液を使用することが好ましいが、これらに限定されるものではない。上記の緩衝液のようにｐＨ緩衝能が６．５〜１０の範囲内にない緩衝液であっても、ｐＨ調節剤を用いてｐＨ６．５〜１０の範囲内に調節することで使用することができる。例えば、MES（2-モルフォリノエタンスルホン酸一水塩）及びリン酸緩衝液のような免疫測定において常用されている他の種々の緩衝液も用いることができる。
【００１７】
本発明の標準液は、必要に応じ、ｐＨ調節剤を含んでいてもよい。ｐＨ調節剤としては、水酸化ナトリウムのような無機塩基を挙げることができ、ｐＨが６．５〜１０．０の範囲内になる適量を用いることができる。
【００１８】
本発明の標準液は、さらに、塩化ナトリウムを含んでいてもよい。塩化ナトリウムの濃度は、血液中の塩化ナトリウム濃度と同程度、すなわち、0.85重量％〜0.9重量％程度でよい。
【００１９】
本発明の標準液は、さらに、ブロッキング剤を含んでいてもよい。ブロッキング剤は、非特異吸着を防止するために免疫測定において常用されているものであり、ウシ血清アルブミン(BSA)、スキムミルク、ゼラチン等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。ブロッキング剤を含む場合、その濃度は特に限定されず、適宜設定されるが、通常１．０重量％〜３．０重量％程度、特には１．５重量％〜２．５重量％程度である。
【００２０】
本発明の標準液は、腐敗防止のため、アジ化ナトリウムのような汎用される殺菌剤を適量含んでいてもよい。
【００２１】
本発明の甲状腺ホルモン類標準液は、免疫測定において、従来の甲状腺ホルモン類標準液と全く同様に用いることができる。甲状腺ホルモン類の免疫測定自体は周知であり、そのための免疫測定キットも市販されている。本発明の標準液は、それらの市販の免疫測定キットの標準液としても利用可能である。
【００２２】
甲状腺ホルモン類の免疫測定自体は周知であり、そのための免疫測定キットも市販されているので、ここで詳しく記載する必要はないが、好ましい免疫測定方法について簡単に述べると、例えば、FT3の定量では、担体である粒子にT2（ジヨードサイロニン）を結合したT2結合粒子と、FT3を含む検体と、標識抗T3モノクローナル抗体とを反応させ、粒子を回収して、粒子に結合した標識抗T3モノクローナル抗体を測定することにより、検体中のFT3を定量することができる（下記実施例１参照）。担体粒子としては、B/F分離を容易にするために磁性粒子が好ましいが、磁性粒子に限定されるものではない。また、標識としては、アルカリフォスファターゼ等の免疫測定において標識酵素として常用されている酵素を用いることができる。標識酵素を定量するために用いる、標識酵素の基質としても、免疫測定において常用されている、化学発光基質や発色基質等を用いることができる。FT4の定量のためには、T3を結合した粒子と、FT4を含む検体と、標識抗T4モノクローナル抗体とを反応させ、粒子に結合した標識抗T4モノクローナル抗体を測定することにより、検体中のFT4を定量することができる（下記実施例２参照）。なお、これらの方法は、粒子に結合された甲状腺ホルモンと、検体中の甲状腺ホルモンとの競合に基づく競合法であるが、免疫測定方法は、競合法に限定されるものではなく、サンドイッチ法や凝集法等の他の免疫測定方法も用いることができる。
【００２３】
本発明の甲状腺ホルモン類標準液を用いて検量線を作成する場合には、まず、互いに異なる既知濃度の甲状腺ホルモン類と、シクロデキストリン又はその誘導体とを緩衝液中に含む、複数の甲状腺ホルモン類標準液を準備する。準備する甲状腺ホルモン類標準液の数は、通常、２種類以上、好ましくは４種類以上である。上限は特にないが、通常、１０種類以下である。
【００２４】
次に、各標準液を、上記のような免疫測定に供して、シグナルを測定する。例えば、上記した競合法では、標識酵素と、該酵素の基質とを反応させ、生じたシグナル（例えば、化学発光基質の場合には化学発光強度）を測定する。
【００２５】
次に、各標準液中の甲状腺ホルモン類の濃度を横軸に、測定されたシグナルを縦軸にプロットして検量線を作成することができる。
【００２６】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
実施例１    ＦＴ３の測定
実施例１−１    各種シクロデキストリン類含有標準液の安定性試験
以下の組成を有するＦＴ３標準液を調製した。
MES     10.7g/L
NaCl 8.77g/L
NaN3 1.00g/L
4N NaOH 9mL/L
シクロデキストリン類各種 0.1または1.0重量％
（ただし、甲状腺ホルモン無添加（１濃度目）の場合は含有せず）
BSA 20.0g/L
1N NaOH    適量（ｐＨが6.8になるまでの微調整用）
ＦＴ３ 0pg/mL（無添加、１濃度目）、1.95 pg/mL±20%、２濃度目）又は30pg/mL（６濃度目）（免疫測定に用いた市販のＦＴ３免疫測定キットであるルミパルスFT3-III（商品名、富士レビオ社製）に含まれるＦＴ３標準液の１濃度目〜６濃度目のうちの１濃度目、２濃度目及び６濃度目の濃度に調製）【００２８】
調製した各ＦＴ３標準液を、−８０℃または３７℃で１週間または２週間保存し、保存後の標準液中のＦＴ３を免疫測定した。測定は、市販のＦＴ３測定キットであるルミパルスFT3-III（商品名、富士レビオ社製）を用い、測定機器として市販のルミパルスG1200（商品名、富士レビオ社製）を用いて行った。なお、ルミパルスFT3-III（商品名、富士レビオ社製）を用いた免疫測定は、この商品の添付文書に記載されたとおりに行った。【００２９】
具体的には、次のように行った。まず、キットに含まれるＴ２結合フェライト粒子懸濁液２５０μＬと、調製した上記各ＦＴ３標準液３０μＬと、キットに含まれるアルカリホスファターゼ(ALP)標識抗Ｔ３モノクローナル抗体（ヒツジ）溶液５０μＬとを３７℃で２０分間反応させた。次に、フェライト粒子を磁石で集め、反応液を除去した後、粒子の洗浄を行った。次いで、基質液（AMPPD、（3-(2'-スピロアダマンタン)-4-メトキシ-4-(3''-ホスホリルオキシ）フェニル-1,2-ジオキセタン・2ナトリウム塩））200μＬを粒子に加え、３７℃で５分間反応させた。次に波長477nmに発光極大を持つ光の発光量を測定した。なお、当該測定は、単一モノクローナル抗体に対するＦＴ２とＦＴ３の競合反応を原理としており、発光量は抗体に反応するＦＴ２量と正の相関を示し、反応系中に存在するＦＴ３量と負の相関を示す。したがって、発光量が多いほどＦＴ３濃度が低いことを示す。【００３０】
１週間後の結果を下記表１−１に、２週間後の結果を表１−２に示す。なお、本明細書において、特に説明のない限り、表中の数値は、−８０℃で同期間保存した各濃度の標準液について得られた発光量を１００とした相対値で示すものとする。【００３１】
【表１−１】
2017002751.tif 000002
ＣＤ：シクロデキストリン【００３２】
【表１−２】
2017002751.tif 000003
ＣＤ：シクロデキストリン【００３３】
−８０℃保存の標準液を用いた場合との発光量の相違は、±２０％以内であることを要し、±１０％以内であることが好ましく、±５％以内であることがより好ましい。表１の結果より、ＦＴ３標準液は、いずれのシクロデキストリン類を添加しても良好な安定性を示すことが判明した。また、特にＨＰＢＣで良好な安定性を示すことが判明した。【００３４】
実施例１−２    至適ｐＨの検討
シクロデキストリン類をヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、濃度を１．０重量％、ｐＨを６．８、８．０又は９．０とした以外は、実施例１−１と同様の方法でＦＴ３標準液を調製した。【００３５】
調製した各ＦＴ３標準液を、−８０℃または３７℃で１週間保存し、保存後の標準液中のＦＴ３を免疫測定した。結果を下記表２に示す。【００３６】
【表２】
2017002751.tif 000004
【００３７】
表２の結果より、ＦＴ３標準液において、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０が至適ｐＨであることが判明した。【００３８】
実施例１−３    至適濃度の検討
シクロデキストリン類をＨＰＢＣまたはβ−シクロデキストリン、濃度を０．０２重量％、０．１重量％、０．５重量％、１．０重量％、５．０重量％、または１０．０重量％、ｐＨを８．０とした以外は、実施例１−１と同様の方法でＦＴ３標準液を調製した。【００３９】
調製した各ＦＴ３標準液を、−８０℃または３７℃で１週間保存し、保存後の標準液中のＦＴ３を免疫測定した。結果を下記表３に示す。【００４０】
【表３】
2017002751.tif 000005
ＣＤ：シクロデキストリン
Ｎ．Ｄ．：溶解不能により実施せず
*：ＦＴ３濃度    4.52 pg/mL ±20%【００４１】
表３に示すように、ＨＰＢＣを用いた場合においては５．０重量％付近が至適濃度であり、β−シクロデキストリンを用いた場合においては、０．１重量％付近が至適濃度であることが判明した。【００４２】
実施例１−４    長期保存安定性試験
以下の組成を有するＦＴ３標準液（Ａ標準液）を調製した。Ａ標準液は、従来の活性炭処理健常ヒト血清をベースとして用いた標準液である。
＜Ａ標準液＞
活性炭処理健常ヒト血清に0.1％(w/v)のアジ化ナトリウムを加え、ＦＴ３濃度が下記の濃度となるようにＴ３を添加した。
ＦＴ３ 0pg/mL（無添加、１濃度目）、1.95 pg/mL±20%、２濃度目）又は30pg/mL（６濃度目）【００４３】
一方、以下の組成を有するＦＴ３標準液（Ｂ１標準液）を調製した。Ｂ１標準液は、本発明に係る標準液である。
＜Ｂ１標準液＞
MES     10.7g/L
NaCl 8.77g/L
NaN3 1.00g/L
4N NaOH 9mL/L  (pH 8.0まで滴定)
HPBC 1.00重量％（ただし、甲状腺ホルモン無添加（１濃度目）の場合は含有しない）
BSA 20.0g/L
ＦＴ３ 0pg/mL（無添加、１濃度目）、1.95 pg/mL±20%、２濃度目）又は30pg/mL（６濃度目）【００４４】
調製した各ＦＴ３標準液を、−８０℃、１０℃又は２５℃で１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月又は５ヶ月保存し、保存後の標準液中のＦＴ３を免疫測定した。
結果を下記表４に示す。【００４５】
【表４】
2017002751.tif 000006
【００４６】
表４に示されるように、本発明のＦＴ３標準液は、従来の血清ベースの標準液と比しても、実用に耐える優れた長期保存安定性を示した。【００４７】
実施例１−５  緩衝液の検討
以下の組成を有するＦＴ３標準液（Ａ標準液）を調製した。Ａ標準液は、従来の活性炭処理健常ヒト血清をベースとして用いた標準液である。
＜Ａ標準液＞
活性炭処理健常ヒト血清に0.1％(w/v)のアジ化ナトリウムを加え、ＦＴ３濃度が下記の濃度となるようにＴ３を添加した。
ＦＴ３ 0pg/mL（無添加、１濃度目）、1.95 pg/mL±20%、２濃度目）又は30pg/mL（６濃度目）【００４８】
一方、以下の組成を有するＦＴ３標準液（Ｂ１〜Ｂ３標準液）を調製した。Ｂ１〜Ｂ３標準液は、本発明に係る標準液である。
＜Ｂ１標準液（ＭＥＳ：ｐＫａ＝６．１５）＞
MES     10.7g/L
NaCl 8.77g/L
NaN3 1.00g/L
4N NaOH   (pH 8.0まで滴定)
HPBC 1.00重量％（ただし、甲状腺ホルモン無添加（１濃度目）の場合は含有しない）
BSA 20.0g/L
ＦＴ３ 0pg/mL（無添加、１濃度目）、1.95 pg/mL±20%、２濃度目）又は30pg/mL（６濃度目）【００４９】
＜Ｂ２標準液（ＮａＨＣＯ３：ｐＫａ＝１０．３）＞
NaHCO3  8.40g/L
NaCl 8.77g/L
NaN3 1.00g/L
4N NaOH (pH 9.0まで滴定)
HPBC 2.00重量％（ただし、甲状腺ホルモン無添加（１濃度目）の場合は含有しない）
BSA 20.0g/L
ＦＴ３ 0pg/mL（無添加、１濃度目）、1.95 pg/mL±20%、２濃度目）又は30pg/mL（６濃度目）【００５０】
＜Ｂ３標準液（ＣＡＰＳ：ｐＫａ＝１０．４）＞
CAPS  22.1g/L
NaCl 8.77g/L
NaN3 1.00g/L
4N NaOH (pH 9.0まで滴定)
HPBC 2.00重量％（ただし、甲状腺ホルモン無添加（１濃度目）の場合は含有しない）
BSA 20.0g/L
ＦＴ３ 0pg/mL（無添加、１濃度目）、1.95 pg/mL±20%、２濃度目）又は30pg/mL（６濃度目）【００５１】
調製した各ＦＴ３標準液を、−８０℃、１０℃又は２５℃で６ヶ月保存し、保存後の標準液中のＦＴ３を免疫測定した。
結果を下記表５に示す。【００５２】
【表５】
2017002751.tif 000007
【００５３】
表５に示す通り、ｐＫａ値の高いＮａＨＣＯ３バッファー、ＣＡＰＳバッファーを用いてｐＨ９．０付近で標準液を調製した場合に、ｐＫａ値の低いＭＥＳを用いてｐＨ８．０付近で標準液を調製した場合と比して、高い安定性を示すことが示唆された。【００５４】
実施例２    ＦＴ４の測定
実施例２−１    各種シクロデキストリン類含有標準液の安定性試験
以下の組成を有するＦＴ４標準液を調製した。
MES     10.7g/L
NaCl 8.77g/L
NaN3 1.00g/L
4N NaOH 9mL/L
シクロデキストリン類各種 0.1または1.0重量％
（ただし、甲状腺ホルモン無添加（１濃度目）の場合は含有せず）
BSA 20.0g/L
1N NaOH    適量（ｐＨが6.8になるまでの微調整用）
ＦＴ４ 0ng/dL（無添加、１濃度目）、0.24ng/dL±20%、２濃度目）又は10ng/dL（６濃度目）（免疫測定に用いた市販のＦＴ４免疫測定キットであるルミパルスFT4-N（商品名、富士レビオ社製）に含まれるＦＴ４標準液の１濃度目〜６濃度目のうちの１濃度目、２濃度目及び６濃度目の濃度に調製）【００５５】
調製した各ＦＴ４標準液を、−８０℃又は３７℃で１週間又は２週間保存し、保存後の標準液中のＦＴ４を免疫測定した。測定は、市販のＦＴ４測定キットであるルミパルスFT4-N（商品名、富士レビオ社製）を用い、測定機器として市販のルミパルスG1200（商品名、富士レビオ社製）を用いて行った。なお、ルミパルスFT4-N（商品名、富士レビオ社製）を用いた免疫測定は、この商品の添付文書に記載されたとおりに行った。【００５６】
具体的には、次のように行った。まず、キットに含まれるＴ３結合フェライト粒子２５０μＬと、調製した上記各ＦＴ４標準液１０μＬと、キットに含まれるアルカリホスファターゼ(ALP)標識抗Ｔ４モノクローナル抗体（マウス）５０μＬとを３７℃で２０分間反応させた。次に、フェライト粒子を磁石で集め、反応液を除去した後、粒子の洗浄を行った。次いで、基質液（AMPPD、（3-(2'-スピロアダマンタン)-4-メトキシ-4-(3''-ホスホリルオキシ）フェニル-1,2-ジオキセタン・2ナトリウム塩））200μＬを粒子に加え、３７℃で５分間反応させた。次に波長477nmに発光極大を持つ光の発光量を測定した。なお、当該測定は、単一モノクローナル抗体に対するＦＴ３とＦＴ４の競合反応を原理としており、発光量は抗体に反応するＦＴ３量と正の相関を示し、反応系中に存在するＦＴ４量と負の相関を示す。したがって、発光量が多いほどＦＴ４濃度が低いことを示す。【００５７】
１週間後の結果を下記表６−１に、２週間後の結果を表６−２に示す。なお、表中の数値は、−８０℃で同期間保存した各濃度の標準液について得られた発光量を１００とした相対値で示す。【００５８】
【表６−１】
2017002751.tif 000008
ＣＤ：シクロデキストリン【００５９】
【表６−２】
2017002751.tif 000009
ＣＤ：シクロデキストリン【００６０】
−８０℃保存の標準液を用いた場合との発光量の相違は、±２０％以内であることを要し、±１０％以内であることが好ましく、±５％以内であることがより好ましい。表１の結果より、ＦＴ４標準液は、いずれのシクロデキストリン類を添加しても濃度を調整することで良好な安定性を示すことが判明した。また、特にγ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンで良好な安定性を示すことが判明した。【００６１】
実施例２−２    至適ｐＨの検討
シクロデキストリン類をヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、濃度を１．０重量％、ｐＨを６．８、８．０又は９．０とした以外は、実施例２−１と同様の方法でＦＴ４標準液を調製した。【００６２】
調製した各ＦＴ４標準液を、−８０℃または３７℃で１週間保存し、保存後の標準液中のＦＴ４を免疫測定した。結果を下記表７に示す。【００６３】
【表７】
2017002751.tif 000010
【００６４】
表７の結果より、ＦＴ４標準液において、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０が至適ｐＨであることが判明した。【００６５】
実施例２−３    至適濃度の検討
シクロデキストリン類をＨＰＢＣまたはβ−シクロデキストリン、濃度を０．０２重量％、０．１重量％、０．５重量％、１．０重量％、５．０重量％、または１０．０重量％、ｐＨを８．０とした以外は、実施例２−１と同様の方法でＦＴ４標準液を調製した。【００６６】
調製した各ＦＴ４標準液を、−８０℃または３７℃で１週間保存し、保存後の標準液中のＦＴ３を免疫測定した。結果を下記表８に示す。【００６７】
【表８】
2017002751.tif 000011
ＣＤ：シクロデキストリン
Ｎ．Ｄ．：溶解不能により実施せず
*：ＦＴ４濃度 0.57 ng/dL ± 20%【００６８】
表８に示すように、ＨＰＢＣを用いた場合においては５．０重量％付近が至適濃度であり、β−シクロデキストリンを用いた場合においては、０．５重量％付近が至適濃度であることが判明した。【００６９】
実施例２−４  長期保存安定性試験
以下の組成を有するＦＴ４標準液（Ｃ標準液）を調製した。Ｃ標準液は、従来の活性炭処理健常ヒト血清をベースとして用いた標準液である。
＜Ｃ標準液＞
活性炭処理健常ヒト血清に0.1％(w/v)のアジ化ナトリウム(NaN3)を加え、ＦＴ４濃度が下記の濃度となるようにＴ４を添加した。
ＦＴ４ 0ng/dL（無添加、１濃度目）、0.24 ng/dL±20%、２濃度目）又は10ng/dL（６濃度目）【００７０】
以下の組成を有するＦＴ４標準液（Ｄ１標準液）を調製した。Ｄ１標準液は、本発明に係る標準液である。
＜Ｄ１標準液＞
MES     10.7g/L
NaCl 8.77g/L
NaN3 1.00g/L
4N NaOH 9mL/L
HPBC 1.00重量％（ただし、甲状腺ホルモン無添加（１濃度目）の場合は含有しない）
BSA 20.0g/L
1N NaOH    適量（ｐＨが8.0になるまでの微調整用）
ＦＴ４ 0ng/dL（無添加、１濃度目）、0.24ng/dL±20%、２濃度目）又は10ng/dL（６濃度目）（免疫測定に用いた市販のＦＴ４免疫測定キットであるルミパルスFT4-N（商品名、富士レビオ社製）に含まれるＦＴ４標準液の１濃度目〜６濃度目のうちの１濃度目、２濃度目及び６濃度目の濃度に調製）【００７１】
調製した各ＦＴ４標準液を、−８０℃、１０℃又は２５℃で１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月又は５ヶ月保存し、保存後の標準液中のＦＴ４を免疫測定した。【００７２】
結果を下記表９に示す。【００７３】
【表９】
2017002751.tif 000012
【００７４】
表９に示されるように、本発明のＦＴ４標準液は、従来の血清ベースの標準液と比しても、実用に耐える優れた保存安定性を示した。【００７５】
（実施例２−５）  緩衝液組成の検討
以下の組成を有するＦＴ４標準液（Ｃ標準液）を調製した。Ｃ標準液は、従来の活性炭処理健常ヒト血清をベースとして用いた標準液である。
＜Ｃ標準液＞
活性炭処理健常ヒト血清に0.1％(w/v)のアジ化ナトリウム(NaN3)を加え、ＦＴ４濃度が下記の濃度となるようにＴ４を添加した。
ＦＴ４ 0ng/dL（無添加、１濃度目）、0.24 ng/dL±20%、２濃度目）又は10ng/dL（６濃度目）【００７６】
一方、以下の組成を有するＦＴ４標準液（Ｄ１〜Ｄ３標準液）を調製した。Ｄ１〜Ｄ３標準液は、本発明に係る標準液である。
＜Ｄ１標準液（ＭＥＳ：ｐＫａ＝６．１５）＞
MES     10.7g/L
NaCl 8.77g/L
NaN3 1.00g/L
4N NaOH (pH8.0まで滴定)
HPBC 1.00重量％（ただし、甲状腺ホルモン無添加（１濃度目）の場合は含有しない）
BSA 20.0g/L
ＦＴ４ 0ng/dL（無添加、１濃度目）、0.24ng/dL±20%、２濃度目）又は10ng/dL（６濃度目）【００７７】
＜Ｄ２標準液（ＮａＨＣＯ３：ｐＫａ＝１０．３）＞
NaHPO4  8.40g/L
NaCl 8.77g/L
NaN3 1.00g/L
4N NaOH (pH 9.0まで滴定)
HPBC 2.00重量％（ただし、甲状腺ホルモン無添加（１濃度目）の場合は含有しない）
BSA 20.0g/L
ＦＴ４ 0ng/dL（無添加、１濃度目）、0.24ng/dL±20%、２濃度目）又は10ng/dL（６濃度目）【００７８】
＜Ｄ３標準液（ＣＡＰＳ）＞
CAPS  22.1g/L
NaCl 8.77g/L
NaN3 1.00g/L
4N NaOH (pH 9.0まで滴定)
HPBC 2.00重量％（ただし、甲状腺ホルモン無添加（１濃度目）の場合は含有しない）
BSA 20.0g/L
ＦＴ４ 0ng/dL（無添加、１濃度目）、0.24ng/dL±20%、２濃度目）又は10ng/dL（６濃度目）【００７９】
調製した各ＦＴ4標準液を、−８０℃、１０℃又は２５℃で６ヶ月保存し、保存後の標準液中のＦＴ４を免疫測定した。
結果を下記表１０に示す。【００８０】
【表１０】
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【００８１】
表１０に示す通り、ｐＫａ値の高いＮａＨＣＯ３バッファー、ＣＡＰＳバッファーを用いてｐＨ９．０付近で標準液を調製した場合に、ｐＫａ値の低いＭＥＳを用いてｐＨ８．０付近で標準液を調製した場合と比して、高い安定性を示すことが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明は、甲状腺ホルモンに関連する多様な疾患を診断する上で重要な、血液サンプル中の甲状腺ホルモン類の測定の信頼性を高めるのに有用な標準液を提供するものである。
【国際調査報告】
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