(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、微生物を用いた効率的なＬ−ホモアミノ酸の製造法を提供することにある。【解決手段】  本発明によれば、Nostoc punctiforme PCC73102由来のNpun_F2464又は該蛋白質のホモログ蛋白質を生産する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いたＬ−ホモアミノ酸の製造法、及び、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを生産、蓄積する能力を有する該微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンを生成、蓄積させ、該培養物中からＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンを採取することを特徴とするＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンの製造法を提供することができる。【選択図】図１
2014045756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［１］〜［３］からなる群より選ばれる蛋白質を生産する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源および式(Ｉ)
【化１】
2014045756.tif 000013
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは同一または異なって水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、アミノ基、置換基を有していてもよい低級アルキル基を表す〕で表されるＬ−アミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に式(ＩＩ)
【化２】
2014045756.tif 000014
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは前記と同義である〕で表されるＬ−ホモアミノ酸を生成、蓄積させ、該媒体から該Ｌ−ホモアミノ酸を採取することを特徴とするＬ−ホモアミノ酸の製造法。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性と同一の活性を有する蛋白質
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性と同一の活性を有する蛋白質
【請求項２】
微生物が、親株に比べ式(ＩＩＩ)
【化３】
2014045756.tif 000015
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは前記と同義である〕で表される化合物を式(ＩＶ)
【化４】
2014045756.tif 000016
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは前記と同義である〕で表される化合物に変換する活性が増強した微生物である、請求項１記載の製造法。
【請求項３】
微生物が、親株に比べ式(ＩＶ)
【化４】
2014045756.tif 000017
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは前記と同義である〕で表される化合物を式(Ｖ)
【化５】
2014045756.tif 000018
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは前記と同義である〕で表される化合物に変換する活性が増強された微生物である、請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eが、同一または異なって水素原子、ハロゲン原子、水酸基である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを生産、蓄積する能力を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンを生成、蓄積させ、該培養物からＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンを採取することを特徴とするＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンの製造法。
【請求項６】
微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求項１〜５のいずれか1項に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−ホモアミノ酸の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホモアミノ酸は医薬の合成原料として重要な化合物である。例えば、Ｌ−ホモフェニルアラニンは、アンジオテンシン合成酵素(ACE)阻害薬の合成原料として用いられている。Ｌ−ホモフェニルアラニンの製造法に関しては、DL-ホモフェニルアラニンをジアステレオマー塩として光学分割する方法（特許文献１、特許文献２）、アミノ酸アミノトランスフェラーゼを用いて、2-オキソ-4-フェニル酪酸にアミノ基を転移させる方法（特許文献３）、Ｌ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼを用いて、2-オキソ-4-フェニル酪酸を還元的にアミノ化する方法（非特許文献１）、5-ベンジルメチルヒダントインにヒダントインナーゼ系（ヒダントインヒドロラーゼとN-カルバミルアミノ酸ヒドロラーゼから成る）を作用させる方法（特許文献４、特許文献５）、及び、化学合成法（特許文献６）が知られている。
しかしながら、これらの従来の方法は、いずれも化学合成原料を必要とするため、効率的と環境面から最善の方法とは言えない。
一方、安価なグルコースから2-オキソ-4-フェニル酪酸を合成する生合成経路が報告されている（非特許文献２）。該生合成経路は、人為的に変異させたシェリヒア・コリ由来の変異型ＬｅｕＡを有することを特徴とする。
Nostoc punctiformePCC73102株由来のNpun_F2464は、該菌株のゲノム配列決定により明らかになった機能未知の蛋白質である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６３−０６３６４６号
【特許文献２】特開昭６３−１４５２５６号
【特許文献３】米国特許第６, １４６, ８５９号
【特許文献４】特登録０２７２８４６５号
【特許文献５】特開平６−３４３４８３号
【特許文献６】特開平１０−２８７６３２号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】J. Org. Chem.(1990), Vol.55, p5567-5571.
【非特許文献２】ACS. Chem. Biol.(2012) , Vol.7(4), p689-697.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、微生物を用いた効率的なＬ−ホモアミノ酸の製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下の（１）〜（６）に関する。
（１）以下の［１］〜［３］からなる群より選ばれる蛋白質を生産する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源および式(Ｉ)
【０００７】
【化１】
2014045756.tif 000003
【０００８】
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは、好ましくは、同一または異なって水素原子、ハロゲン原子、水酸基、ニトロ基、アミノ基、置換基を有していてもよい低級アルキル基であり、より好ましくは、同一または異なって水素原子、ハロゲン原子、水酸基であり、さらに好ましくは、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eが水素原子、R1cが水酸基並びにR1a、R1b、R1d及びR1eが水素原子、R1aがハロゲン原子並びにR1b、R1c、R1d及びR1eが水素原子、R1bがハロゲン原子並びにR1a、R1c、R1d及びR1eが水素原子、又は、R1cがハロゲン原子並びにR1a、R1b、R1d及びR1eが水素原子であり、最も好ましくは、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eが水素原子、R1cが水酸基並びにR1a、R1b、R1d及びR1eが水素原子、R1bがハロゲン原子並びにR1a、R1c、R1d及びR1eが水素原子、又は、R1cがハロゲン原子並びにR1a、R1b、R1d及びR1eが水素原子を表す。また、前記のハロゲン原子は、好ましくは、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素からなる群より選ばれるハロゲン原子、より好ましくは、フッ素又は塩素、最も好ましくは、フッ素である。〕で表されるＬ−アミノ酸（以下、化合物Ｉともいう。）を水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に式(ＩＩ)
【０００９】
【化２】
2014045756.tif 000004
【００１０】
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは前記と同義である〕で表されるＬ−ホモアミノ酸（以下、化合物ＩＩともいう。）を生成、蓄積させ、該媒体から該Ｌ−ホモアミノ酸を採取することを特徴とするＬ−ホモアミノ酸の製造法。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性と同一の活性を有する蛋白質
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性と同一の活性を有する蛋白質
（２）微生物が、親株に比べ式(ＩＩＩ)
【００１１】
【化３】
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【００１２】
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは前記と同義である〕で表される化合物（以下、化合物ＩＩＩという。）を式(ＩＶ)
【００１３】
【化４】
2014045756.tif 000006
【００１４】
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは前記と同義である〕で表される化合物（以下、化合物ＩＶという。）に変換する活性（以下、化合物ＩＩＩ変換活性という。）が増強した微生物である、上記（１）記載の製造法。
（３）微生物が、親株に比べ化合物ＩＶを式(Ｖ)
【００１５】
【化５】
2014045756.tif 000007
【００１６】
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは前記と同義である〕で表される化合物（以下、化合物Ｖという。）に変換する活性（以下、化合物ＩＶ変換活性という。）が増強された微生物である、上記（１）または（２）記載の製造法。
（４）R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eが、同一または異なって水素原子、ハロゲン原子、水酸基である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造法。
（５）Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを生産、蓄積する能力を有する上記（１）〜（３）のいずれかに記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンを生成、蓄積させ、該培養物からＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンを採取することを特徴とするＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンの製造法。
（６）微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、Nostoc punctiforme PCC73102由来のNpun_F2464又は該蛋白質のホモログ蛋白質を生産する微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用いたＬ−ホモアミノ酸の製造法、及び、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを生産、蓄積する能力を有する該微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンを生成、蓄積させ、該培養物中からＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンを採取することを特徴とするＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンの製造法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｌ−フェニルアラニンからＬ−ホモフェニルアラニンへの生合成経路を示した説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．本発明の製造法に用いられる微生物
本発明の製造法で用いられる微生物としては、以下の（１）〜（４）のいずれかに記載の微生物をあげることができる。
（１）以下の［１］〜［３］からなる群より選ばれる蛋白質を生産する微生物
本発明の製造法に用いられる微生物としては、以下の［１］〜［３］からなる群より選ばれる蛋白質、
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性と同一の活性を有する蛋白質、及び、
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性と同一の活性を有する蛋白質、
を生産する微生物を挙げることができる。
配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性とは、式（ＶＩ）
【００２０】
【化６】
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【００２１】
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは前記と同義である〕で表される化合物（以下、化合物ＶＩという。）を式(ＶＩＩ)
【００２２】
【化７】
2014045756.tif 000009
【００２３】
〔式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eは前記と同義である〕で表される化合物（以下、化合物ＶＩＩという。）に変換する活性（以下、化合物ＶＩ変換活性という。）をいう。
上記において、１〜２０個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、化合物ＶＩ変換活性を有する蛋白質は、後述の部位特異的変異導入法を用いて、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ又は配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。
欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数は、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個である。
【００２４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されていてもよい。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどが挙げられる。
【００２５】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)] やFASTA [Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990) ］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法はよく知られている。
配列番号２で表されるアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、化合物ＶＩ変換活性を有する蛋白質であることは、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製し、培地で培養し、培養物を超音波等で処理したあと、該処理物に化合物ＶＩを加え、合成された化合物ＶＩＩの量をＨＰＬＣで測定することにより確認することができる。
上記の［１］〜［３］からなる群より選ばれる蛋白質を生産する微生物としては、該蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換した微生物を挙げることができる。
該微生物としては、該蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、染色体ＤＮＡ上において該ＤＮＡを保有させた微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に該ＤＮＡを保有させた微生物を挙げることができる。
親株の染色体ＤＮＡ上において該ＤＮＡを保有させた微生物、およびプラスミドＤＮＡとして染色体ＤＮＡ外に該ＤＮＡを保有させた微生物であることは、例えば、微生物が元来保有する、染色体ＤＮＡ上に存在する該遺伝子を増幅することはできないが、形質転換により導入された該ＤＮＡは増幅可能なプライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅産物を確認する方法、および該ＤＮＡの転写量をノーザン・ブロッティングにより、または該蛋白質の生産量をウェスタン・ブロッティングにより、親株と比較する方法等により確認することができる。
上記の［１］〜［３］からなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡとしては、具体的には以下の［４］〜［７］からなる群より選ばれるＤＮＡ、
［４］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［６］配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、化合物ＶＩ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び、
［７］配列番号１で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ化合物ＶＩ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
を挙げることができる。
【００２６】
上記でいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。
【００２７】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(1996)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
【００２８】
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などをあげることができる。
【００２９】
上記のストリンジェントな条件とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、および20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で42℃で一晩、インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００３０】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて、上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
本明細書において親株とは、遺伝子改変、および形質転換等の対象となる元株のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元株は宿主株ともいう。
【００３１】
本発明で用いられる微生物は、いずれの微生物であってもよいが、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌、さらに好ましくはエシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター(Enterobacter)属、パントエア(Pantoea)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、セラチア(Serratia)属、エルビニア(Erwinia)属、サルモネア(Salmonella)属およびモルガネラ(Morganella)属からなる群より選ばれる属に属する微生物、特に好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、最も好ましくはエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）をあげることができる。
エシェリヒア・コリとしては、エシェリヒア・コリK-12株、B株、W株およびB/r株からなる群より選ばれる野生株またはその変異株を、好ましくは、エシェリヒア・コリXL1-Blue、エシェリヒア・コリXL2-Blue、エシェリヒア・コリDH1、エシェリヒア・コリMC1000、エシェリヒア・コリATCC 12435、エシェリヒア・コリW1485、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリHB101、エシェリヒア・コリNo.49、エシェリヒア・コリW3110、エシェリヒア・コリNY49、エシェリヒア・コリMP347、エシェリヒア・コリNM522、エシェリヒア・コリBL21、エシェリヒア・コリME8415、エシェリヒア・コリATCC9637等を挙げることができる。
（２）親株に比べ、化合物ＩＩＩ変換活性が増強した微生物  
本発明の製造法で用いられる微生物としては、上記（１）の微生物を親株として、該親株に比べ、化合物ＩＩＩ変換活性が増強した微生物を挙げることができる。
親株に比べ、化合物ＩＩＩ変換活性が増強した微生物としては、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上に存在する化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物、及びｉｉ）親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、並びに（ｂ）該蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物を挙げることができる。
化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、具体的には以下の［８］〜［１０］からなる群より選ばれる蛋白質、
［８］配列番号４、６又は８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［９］配列番号４、６又は８で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質、及び、
［１０］配列番号４、６又は８で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質、
を挙げることができる。
【００３２】
配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質が化合物ＩＩＩ変換活性を有することは、非特許文献２に記載されている。
上記において、１〜２０個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質は、上記１（１）と同様の方法により取得することができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数及び位置等は上記１（１）と同様である。
配列番号４、６又は８で表されるアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質であることは、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製し、培地で培養し、培養物を超音波等で処理したあと、該処理物に化合物ＩＩＩを加え、合成された化合物ＩＶの量をＨＰＬＣで測定することにより確認することができる。
化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、該活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の［１１］〜［１４］からなる群より選ばれるＤＮＡ、
［１１］上記［８］〜［１０］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１２］配列番号３、５又は７で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［１３］配列番号３、５又は７で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び、
［１４］配列番号３、５又は７で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
を挙げることがでる。
【００３３】
上記でいう「ハイブリダイズする」との記載並びにＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法及び条件は、上記１（１）と同様である。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて、上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号３、５または７で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
（３）親株に比べ、化合物ＩＶ変換活性が増強した微生物
本発明の製造法で用いられる微生物としては、上記（１）または（２）の微生物を親株として、化合物ＩＶ変換活性が増強した微生物を挙げることができる。
親株に比べ、化合物ＩＶ変換活性が増強した微生物としては、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上に存在する化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物、及びｉｉ）親株に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物、並びに（ｂ）該蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、親株よりも該遺伝子のコピー数が増大した微生物を挙げることができる。
化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質としては、該活性を有する蛋白質であればいずれでもよいが、具体的には以下の［１５］〜［１７］からなる群より選ばれる蛋白質、
［１５］配列番号１０又は１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［１６］配列番号１０又は１２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質、及び、
［１７］配列番号１０又は１２で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質、
を挙げることができる。
【００３４】
配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質が化合物ＩＶ変換活性を有することは、非特許文献２に記載されている。
上記において、１〜２０個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質は、上記１（１）と同様の方法により取得することができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸残基の数及び位置等は上記１（１）と同様である。
配列番号１０又は１２で表されるアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質であることは、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製し、培地で培養し、培養物を超音波等で処理したあと、該処理物に化合物ＩＶを加え、合成された化合物Ｖの量をＨＰＬＣで測定することにより確認することができる。
化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡとしては、該活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであればいずれでもよいが、具体的には以下の［１８］〜［２１］からなる群より選ばれるＤＮＡ、
［１８］上記［１５］〜［１７］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ、
［１９］配列番号９又は１１で表される塩基配列を有するＤＮＡ、
［２０］配列番号９又は１１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び、
［２１］配列番号９又は１１で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
を挙げることがでる。
【００３５】
上記でいう「ハイブリダイズする」との記載並びにＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法及び条件は、上記１（１）と同様である。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えばBLASTやFASTA等を用いて、上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号９または１１で表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡを挙げることができる。
（４）Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを生産、蓄積する能力を有する微生物
本発明の製造法で用いられる微生物としては、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを生産、蓄積する能力を有する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の微生物を挙げることができる。
Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを生産、蓄積する能力とは、本発明に用いる微生物を培地に培養したときに、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを培養物から回収できる程度に生産、蓄積する能力をいう。
【００３６】
当該能力を有する微生物は、親株が当該性質を元来有している場合はその性質が強化された微生物であってもよく、親株が当該性質を有していない場合は、当該性質を人工的に付与した微生物をあげることができる。
当該微生物としては、Ｌ−フェニルアラニン生産株としてATCC13281およびATCC21699など、Ｌ−チロシン生産株としてATCC21652などを挙げることができる。
２．本発明の製造法で用いられる微生物の造成法
（１）上記１（１）の微生物の造成法
上記１（１）の微生物は、［１］〜［３］からなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することで造成することができる。
【００３７】
上記１（１）の［１］〜［３］からなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、配列番号１で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはノストック属に属する微生物、より好ましくはNostoc punctiforme PCC7310の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ  [PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
【００３８】
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する微生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により該蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci.,  USA, 74, 5463 (1977)]または3700 ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【００３９】
上記のベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）およびpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci.,  USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
【００４０】
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
【００４１】
上記方法で取得することができるＤＮＡとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡ、又は配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
上記の方法で得られる該ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
【００４２】
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで、例えば、上記１（１）のエシェリヒア属に属する微生物を形質転換することにより、上記１（１）の［１］〜［３］からなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換した微生物を取得することができる。
【００４３】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、該蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
原核生物を宿主細胞として用いる場合は、該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４４】
発現ベクターとしては、例えば、宿主細胞にエシェリヒア・コリを用いる場合、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669(1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pTK31[APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY、 2007、 Vol. 73、No. 20、p.6378-6385] pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。
【００４５】
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよいが、例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また親株としてバチルス属に属する微生物を用いる場合、バチルス・サチルスで機能するＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等も用いることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４６】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
該蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば後述する pSTV_F2464をあげることができる。
また、上記の方法で得られる該ＤＮＡを、相同組換え法を用いることで、親株の染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことによっても、上記１（１）の［１］〜［３］からなる群より選ばれる蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換した微生物を取得することができる。
相同組換え法により親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域と置換する方法としては、導入したい宿主細胞内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができ、エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6641-6645(2000)］をあげることができる。
【００４７】
さらに、変異体ＤＮＡと共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラーゼによって大腸菌がシュークロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異rpsL遺伝子を有する大腸菌に野生型rpsL遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法[Mol. Microbiol., 55, 137(2005), Biosci. Biotechnol. Biochem., 71, 2905 (2007)]等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が上記の方法で調製した遺伝子に置換された株を取得することができる。
【００４８】
また上記の方法に限らず、微生物の染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることができる。
上記の方法で取得した微生物が、化合物ＶＩ変換活性を有する微生物であることは、上記１（１）の方法を用いて確認することができる。
（２）上記１（２）の微生物の造成法
上記１（２）の微生物のうち、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上に存在する化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、上記２（１）の方法で造成される微生物を親株として、該親株の化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより造成することができる。
突然変異処理法としては、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる方法（微生物実験マニュアル、１９８６年、１３１頁、講談社サイエンティフィック社）、紫外線照射法等をあげることができる。
【００４９】
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードする遺伝子と、上記２（１）の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。
【００５０】
化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、上記１（２）に従い、該ＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等の方法により取得することができる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとしては、例えば、配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は配列番号５又は７で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
【００５１】
上記方法により取得した微生物が目的の微生物であることは、上記１（２）の方法を用いて確認することができる。
上記１（２）の微生物のうち、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上に存在する化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、上記２（１）の方法で造成される微生物を親株として、該親株の化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質の遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより造成することができる。
突然変異処理法は、上記１（１）の方法をあげることができる。
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、親株が有する化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側200bp、好ましくは100bpの塩基配列を有するＤＮＡを試験管内における変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記２（１）の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。
【００５２】
また、親株の化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株より化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。
そのようなプロモーターとしては、親株としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、エシェリヒア・コリで機能するtrpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを、親株としてバチルス属に属する微生物を用いる場合、バチルス・サチルスで機能するＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターなどの人為的に造成したプロモーターもあげることができる。
上記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、上記１（２）の方法で確認することができる。
上記１（２）の微生物のうち、（ｂ）化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。
【００５３】
化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、上記１（２）に従い、該ＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはノストック属又はエシェリヒア属に属する微生物、より好ましくはNostoc punctiforme PCC7310又はエシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等の方法により取得することができる。
【００５４】
上記のようにして取得されるＤＮＡとしては、例えば、Nostoc punctiforme PCC7310の染色体ＤＮＡを鋳型とした場合は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ又は配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡを、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型とした場合は、配列番号６又は８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ又は配列番号５又は７で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００５５】
上記の方法で得られる化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
【００５６】
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで、上記２（１）の方法で造成される微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、Ｌ−アスパラギン排出活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００５７】
原核生物を宿主細胞として用いる場合は、該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、宿主細胞にエシェリヒア・コリを用いる場合、上記２（１）の発現ベクターをあげることができる。
【００５８】
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、上記２（１）のプロモーターをあげることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００５９】
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば後述するpSTV_F2458を挙げることができる。
また、上記の方法で得られる化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを、上記２（１）の相同組換え法を用いることで、染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことによっても、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
上記の方法で取得した微生物が、親株よりも化合物ＩＩＩ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物であることは、上記１（２）の方法を用いて確認することができる。
（３）上記１（３）の微生物の造成法
上記１（３）の微生物のうち、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上に存在する化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉ）親株の微生物に比べ、該蛋白質の比活性が増強した微生物は、例えば、上記２（１）または（２）の方法で造成される微生物を親株として、該親株の化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質の比活性を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。
突然変異処理法としては、上記２（２）の方法を挙げることができる。
【００６０】
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法としては、化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡに、試験管内における変異剤を用いた変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードする遺伝子と、上記２（１）の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。
【００６１】
化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、上記１（２）に従い、該ＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、より好ましくはエシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等の方法により取得することができる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ又は配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
【００６２】
上記方法により取得した微生物が目的の微生物であることは、上記１（３）の方法を用いて確認することができる。
上記１（３）の微生物のうち、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上に存在する化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を改変することにより得られる、ｉｉ）親株の微生物に比べ、該遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物は、例えば、上記２（１）または（２）の方法で造成される微生物を親株として、該親株の化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質の遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量を、通常の突然変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法等を用いて、増強させることにより得ることができる。
突然変異処理法は、上記１（１）の方法をあげることができる。
組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法は、親株が有する化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域およびプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側200bp、好ましくは100bpの塩基配列を有するＤＮＡを試験管内における変異処理、またはエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子と、上記２（１）の相同組換え法を用いて置換する方法をあげることができる。
【００６３】
また、親株の化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株より化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。
そのようなプロモーターとしては、親株としてエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合、上記２（２）のプロモーターを挙げることができる。
上記方法にて取得した微生物が、親株に比べ、化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量または該蛋白質の生産量が増大した微生物であることは、上記１（３）の方法で確認することができる。
上記１（３）の微生物のうち、（ｂ）化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡで親株の微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物は、以下の方法で取得することができる。
【００６４】
化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば、上記１（３）に従い、該ＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはノストック属又はエシェリヒア属に属する微生物、より好ましくはNostoc punctiforme PCC7310又はエシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等の方法により取得することができる。
【００６５】
上記のようにして取得されるＤＮＡとしては、例えば、Nostoc punctiforme PCC7310の染色体ＤＮＡを鋳型とした場合は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ又は配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡを、エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡを鋳型とした場合は、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ又は配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００６６】
上記の方法で得られる化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、生産率が向上した形質転換体を取得することができる。
【００６７】
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡで、上記２（１）または（２）の方法で造成される微生物を形質転換することにより、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能または染色体中への組込が可能で、化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００６８】
原核生物を宿主細胞として用いる場合は、該ＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、該ＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、宿主細胞にエシェリヒア・コリを用いる場合、上記２（１）の発現ベクターをあげることができる。
【００６９】
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、上記２（１）のプロモーターをあげることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００７０】
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば後述するpSTV_F2457を挙げることができる。
また、上記の方法で得られる化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを、上記２（１）の相同組換え法を用いることで、染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことによっても、親株よりも該蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物を取得することができる。
上記の方法で取得した微生物が、親株よりも化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のコピー数が増大した微生物であることは、上記１（３）の方法を用いて確認することができる。
（４）上記１（４）の微生物の造成法
上記１（４）の、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを生産、蓄積する能力を有する、上記１（１）〜（３）のいずれかに記載の微生物としては、該能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、自然界から分離された株自身が該能力を有する場合は該株そのもの、公知の方法により所望の該Ｌ−アミノ酸を生産、蓄積する能力を、上記１（１）〜（３）のいずれかに記載の微生物に人為的に付与した微生物などをあげることができる。
【００７１】
当該公知の方法としては、
（ａ）アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除する方法、
（ｂ）アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化または遮断する方法、および
（ｅ）野生型株に比べ、アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、などをあげることができ、上記公知の方法は単独または組み合わせて用いることができる。
【００７２】
上記（ａ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763(1972)およびAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに、上記（ｂ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)およびJ. Bacteriol., 110, 761-763(1972)などに、上記（ｃ）については、例えばAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)およびAgric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)などに、上記（ｄ）については、例えばAppl. Environ. Micribiol., 38, 181-190(1979)およびAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778(1978)などに、上記（ｅ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 36, 1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)およびAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生産、蓄積する能力を有する微生物を調製することができる。
【００７３】
さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか、または組み合わせた方法によるアミノ酸を生産、蓄積する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996)  section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology, 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田  浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生産、蓄積する能力を有する微生物の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、WO97/15673、特開昭56-18596、特開昭56-144092および特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することによりアミノ酸を生産、蓄積する能力を有する微生物を調製することができる。
【００７４】
上記方法によって調整することができる、Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、フェニルアラニン生合成系の酵素をコードするＤＮＡで形質転換したエシェリヒア・コリを挙げることができる(特開平５−３４４８８１、特開平５−２３６９４７)。
さらに、具体例としては、Ｌ−フェニルアラニン生産株としてATCC13281およびATCC21699など、Ｌ−チロシン生産株としてATCC21652などを挙げることができる。
【００７５】
なお、上記のATCC番号で表される菌株は、American Type Culture Collection（米国）から入手することができる。
３．本発明のＬ−ホモアミノ酸の製造法
（１）微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いるＬ−ホモアミノ酸の製造法
本発明のＬ−ホモアミノ酸の製造法としては、上記２（１）〜（４）の方法で造成できる微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源およびＬ−アミノ酸である化合物Ｉを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中にＬ−ホモアミノ酸である化合物ＩＩを生成、蓄積させ、該媒体から該Ｌ−ホモアミノ酸を採取することを特徴とするＬ−ホモアミノ酸の製造法を挙げることができる。
【００７６】
該製造法に用いられる微生物の培養物は、上記２（１）〜（４）の方法で造成できる微生物を、以下の方法により培養することにより取得することができる。
本発明の製造法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩など使用する微生物の増殖に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、例えばグルコース、糖蜜、フラクトース、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類などをあげることができる。
【００７７】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、アミン等の窒素化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、ペプトン、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００７８】
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
さらに必要に応じて培養する微生物が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸）を添加することができる。
【００７９】
培養は、振とう培養や深部通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は20〜50℃、好ましくは20〜30℃、より好ましくは25〜30℃である。培地のｐＨは５〜１１の範囲で、好ましくは６〜９の中性付近の範囲に維持して培養を行う。培地のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、ｐＨ緩衝液などを用いて行う。
【００８０】
培養時間は、5時間〜６日間、好ましくは16時間〜3日間である。
また、該製造法に用いられる微生物の培養物の処理物としては、上記の培養物の濃縮物、該培養物の乾燥物、該培養物を遠心分離、または濾過等して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、および該菌体の固定化物などの酵素源として該培養物と同様の機能を保持する生菌体を含んでいるもの、並びに該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、および当該処理した菌体から得られる粗酵素抽出物などをあげることができる。
【００８１】
該製造法において、基質として用いるＬ−アミノ酸である化合物Ｉは、0.1〜500g/L、好ましくは0.2〜200g/Lの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
酵素源として用いる微生物の培養物または該培養物の処理物の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いる該Ｌ−アミノ酸1mgあたり湿菌体重量として5〜1000mg、好ましくは10〜400mg添加する。
水性媒体としては、Ｌ−ホモアミノ酸である化合物ＩＩの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。加えて酵素源に使用する微生物または形質転換体の培養物の培養上清も水性媒体として用いることもできる。
【００８２】
Ｌ−ホモアミノ酸である化合物ＩＩの生成反応は水性媒体中、pH5〜11、好ましくはpH6〜10、20〜50℃、好ましくは25〜45℃の条件で2〜150時間、好ましくは6〜120時間行う。
該水性媒体中からのＬ−ホモアミノ酸である化合物ＩＩの採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内に該Ｌ−ホモアミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、該Ｌ−ホモアミノ酸である化合物ＩＩを採取することができる。
該製造法において、基質として用いられるＬ−アミノ酸である化合物Ｉ及び生成されるＬ−ホモアミノ酸である化合物ＩＩは、以下の方法により分析および定量することができる。
ＨＰＬＣを用いる場合には、上記の水性媒体を13000回転で30分遠心分離して得られる遠心上清を、Inertosil  ODS-3  4.6 x 150 mm（GL sciences Inc.、4.6 x 150 mm）を用いて分析、定量することができる。移動相には、終濃度が0.1%であるトリフルオロ酢酸を含む水の移動相Ａ、終濃度が0.1%であるトリフルオロ酢酸を含むメタノールの移動相Ｂを用いることができる。移動相の流速は1.0mL/min、移動相Ａと移動相Ｂの混合比は、0〜15分は75:25から65:35の勾配、15〜16分は65:35から10:90の勾配、16〜18分は10:90の一定で、18〜19分は10:90から75:25の勾配、19〜25分は75:25の一定に変化させることができる。カラム温度は50℃、220nmの紫外線吸収を測定することができる。
ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いる場合には、ＨＰＬＣの分離カラムにInertosil  ODS-3  4.6 x 150 mm（GL sciences Inc.、4.6 x 150 mm）を用い、ＥＳＩ−ＭＳとしてLC/MS/MS 3200Q TRAP (エービーサイエックス社)を組み合わせたシステムによって試料を分析することができる。移動相の条件は、上記のＨＰＬＣ解析に用いた条件と同一の条件を用いることができる。
（２）発酵法によるＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−チロシンの製造法
本発明のＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−チロシンの製造法としては、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−チロシンを生産、蓄積する能力を有する上記２（４）の方法で造成できる微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンを生成、蓄積させ、該培養物中からＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンを採取することを特徴とするＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンの製造法を挙げることができる。
【００８３】
Ｌ−ホモフェニルアラニンとは、Ｌ−ホモアミノ酸である化合物ＩＩにおいて、式中、R1a、R1b、R1c、R1d及びR1eが水素原子で表されるＬ−ホモアミノ酸をいう。
Ｌ−ホモチロシンとは、Ｌ−ホモアミノ酸である化合物ＩＩにおいて、式中、R1cが水酸基並びにR1a、R1b、R1d及びR1eが水素原子で表されるＬ−ホモアミノ酸をいう。
該微生物の培養方法は上記３（１）に記載の培養方法を挙げることができる。
該培養物中からのＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンの採取は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンを採取することができる。
該製造法において、基質として用いられるＬ−フェニルアラニン又はＬ−チロシン及び生成されるＬ−ホモフェニルアラニン又はＬ−ホモチロシンは、上記３（１）の方法を用いて、分析および定量することができる。
【００８４】
以下に本願発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８５】
化合物ＶＩ変換活性、化合物ＩＩＩ変換活性及び化合物ＩＶ変換活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換した形質転換体の造成
（１）W3110/pTrc_F2464-F2458/pSTV_F2457の造成
Nostoc punctiformePCC73102株（以下、PCC73102株という。）の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１３及び１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲによって得られた増幅産物をNcoI及びBamHIで切断し、NcoI及びBamHIで切断した発現ベクターpTrc99A（インビトロジェン社製）に連結することにより、配列番号１で表される塩基配列を有する発現プラスミドpTrc99A_F2464を得た。
【００８６】
PCC73102株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１５及び１６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲによって得られた増幅産物をBamHI及びHindIIIで切断し、BamHI及びHindIIIで切断したpTrc99A_F2464に連結することにより、配列番号１及び３で表される塩基配列を有する発現プラスミドpTrc_F2464-F2458を得た。
PCC73102株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１７及び１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲによって得られた増幅産物(以下、F2457-BP断片という。)をBamHI及びPstIで切断し、BamHI及びPstIで切断したpTrc99Aに連結することにより、発現プラスミドpTrc99A-F2457を得た。
発現プラスミドpTrc99A-F2457のＤＮＡを鋳型として、配列番号１９及び１８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲによって得られた増幅産物をSacIおよびPstIで切断し、SacIおよびPstIで切断したpSTV29（タカラバイオ社製）に連結することにより、配列番号９で表される塩基配列を有する発現プラスミドpSTV-F2457を得た。
上記で得られた発現プラスミドpTrc_F2464-F2458及びpSTV-F2457でエシェリヒア・コリW3110株を形質転換し、W3110/pTrc_F2464-F2458/pSTV_F2457を得た。
（２）W3110/pTrc_F2464-F2457/pSTV_F2458の造成
上記と同様の方法により、配列番号１、３及び９で表される塩基配列を有するＤＮＡの並び方を変更した以下の発現系を構築した。
上記のF2457-BP断片をBamHI及びPstIで切断し、BamHI及びPstIで切断したpTrc99A_F2464に連結することにより、配列番号１及び９で表される塩基配列を有する発現プラスミドpTrc99A_F2464-F2457を得た。
PCC73102株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２０及び２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲによって得られた増幅産物（以下、F2458-EK断片という。）をEcoRI及びKpnIで切断し、EcoRI及びKpnIで切断したpTrc99Aに連結することにより、発現プラスミドpTrc99A-F2458-2を得た。
発現プラスミドpTrc99A-F2458-2のＤＮＡを鋳型として、配列番号１９及び２１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲによって得られた増幅産物をSacIおよびKpnIで切断し、SacIおよびKpnIで切断したpSTV29に連結することにより、配列番号３で表される塩基配列を有する発現プラスミドpSTV-F2458を得た。
上記で得られた発現プラスミドpTrc_F2464-F2457及びpSTV-F2458でエシェリヒア・コリW3110株を形質転換し、W3110/pTrc_F2464-F2457/pSTV_F2458を得た。
（３）W3110/pTrc_F2457-F2464/pSTV_F2458の造成
PCC73102株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２２及び２３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲによって得られた増幅産物をNcoI及びEcoRIで切断し、NcoI及びEcoRIで切断した発現ベクターpTrc99Aに連結することにより、配列番号９で表される塩基配列を有する発現プラスミドpTrc99A_F2457-2を得た。
【００８７】
PCC73102株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２４及び１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲによって得られた増幅産物（以下、F2464-KB断片という。）をKpnI及びBamHIで切断し、KpnI及びBamHIで切断したpTrc99A_F2457-2に連結することにより、配列番号１及び９で表される塩基配列を有する発現プラスミドpTrc_F2457-F2464を得た。
上記で得られた発現プラスミドpTrc_F2457-F2464及びpSTV-F2458でエシェリヒア・コリW3110株を形質転換し、W3110/pTrc_F2457-F2464/pSTV_F2458を得た。
（４）W3110/pTrc_F2457-F2458/pSTV_F2464の造成
上記のF2458-EK断片をEcoRI及びKpnIで切断し、EcoRI及びKpnIで切断したpTrc99A_F2457-2に連結することにより、配列番号３及び９で表される塩基配列を有する発現プラスミドpTrc_F2457-F2458を得た。
PCC73102株の染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２５及び１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いて、ＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲによって得られた増幅産物をNcoI及びBamHIで切断し、NcoI及びBamHIで切断したpTrc99Aに連結することにより、発現プラスミドpTrc99A-F2464-2を得た。
発現プラスミドpTrc99A-F2464-2のＤＮＡを鋳型として、配列番号１９及び１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行った。該ＰＣＲによって得られた増幅産物をSacIおよびBamHIで切断し、SacIおよびBamHIで切断したpSTV29に連結することにより、配列番号１で表される塩基配列を有する発現プラスミドpSTV-F2464を得た。
上記で得られた発現プラスミドpTrc_F2457-F2458及びpSTV-F2464でエシェリヒア・コリW3110株を形質転換し、W3110/pTrc_F2457-F2458/pSTV_F2464を得た。
（５）W3110/pTrc_F2458-F2464/pSTV_F2457の造成
上記で得られたF2458-EK断片をEcoRI及びKpnIで切断し、EcoRI及びKpnIで切断したpTrc99Aに連結することにより、配列番号３で表される塩基配列を有する発現プラスミドpTrc99A_F2458-2を得た。
上記で得られたF2464-KB断片をKpnI及びBamHIで切断し、KpnI及びBamHIで切断したpTrc99A_F2458-2に連結することにより、配列番号１および３で表される塩基配列を有する発現プラスミドpTrc_F2458-F2464を得た。
上記で得られた発現プラスミドpTrc_F2458-F2464及びpSTV-F2457でエシェリヒア・コリW3110株を形質転換し、W3110/pTrc_F2458-F2464/pSTV_F2457を得た。
【実施例２】
【００８８】
基質を添加したＬ−ホモアミノ酸の製造（Ｉ）
上記操作で得られた形質転換体のうち、W3110/pTrc_F2464-F2458/pSTV_F2457、W3110/pTrc_F2458-F2464/pSTV_F2457、W3110/pTrc_F2464-F2457/pSTV_F2458、W3110/pTrc_F2457-F2464/pSTV_F2458、W3110/pTrc_F2457-F2458/pSTV_F2464をLBプレート上で30℃にて一晩培養し、LB培地5mLが入った太型試験管に植菌して、30℃で12時間、振盪培養した。必要に応じて、100mg/Lのアンピシリン、25mg/Lのクロラムフェニコールを添加した。試験管生産培地［グルコース  20g/L、硫酸マグネシウム７水和物  2g/L、カザミノ酸 5g/L、硫酸アンモニウム  2g/L、クエン酸 1g/L、リン酸二水素カリウム 14 g/L、リン酸水素二カリウム 16g/L、チアミン塩酸塩 10mg/L、硫酸第一鉄七水和物  50 mg/L、硫酸マンガン五水和物  10 mg/L、1g/L L-フェニルアラニン、水酸化ナトリウム溶液によりpH7.2に調整後、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が5mL入った太型試験管に0.1mL植菌し、30℃で６時間培養した後、終濃度が1mMになるように IPTGを添加して、30℃で48時間、振盪培養した。
培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のＬ−ホモフェニルアラニン濃度をHPLCにて定量した。Ｌ−ホモフェニルアラニンの検出、定量は、波長220nmのＵＶ吸収分析により行った。結果を表１に示す。
【００８９】
【表１】
2014045756.tif 000010
【実施例３】
【００９０】
発酵法によるＬ−ホモアミノ酸の製造
実施例1で得られた形質転換体W3110/pTrc_F2464-F2458/pSTV_F2457およびW3110/pTrc_F2457-F2458/pSTV_F2464を、Ｌ−フェニルアラニン生産能を付与するプラスミド；pMW219_Ptrp-pheA(330)-aroG(P150I)(特開平５−３４４８８１、特開平５−２３６９４７)を用いて形質転換することにより、W3110/pTrc_F2464-F2458/pSTV_F2457/pMW219_Ptrp-pheA(330)-aroG(P150I)およびW3110/pTrc_F2457-F2458/pSTV_F2464/pMW219_Ptrp-pheA(330)-aroG(P150I)を得た。上記操作で得られた形質転換体のうち、W3110/pTrc_F2457-F2458/pSTV_F2464/pMW219_Ptrp-pheA(330)-aroG(P150I)およびW3110/pTrc_F2457-F2458/pSTV_F2464/pMW219_Ptrp-pheA(330)-aroG(P150I) をLBプレート上で30℃にて一晩培養し、LB培地5mLが入った太型試験管に植菌して、30℃で12時間、振盪培養した。必要に応じて、100mg/Lのアンピシリン、25mg/Lのクロラムフェニコール、50mg/Lのカナマイシンを添加した。Ｌ−フェニルアラニンを含まない試験管生産培地［グルコース  20g/L、硫酸マグネシウム７水和物  2g/L、カザミノ酸 5g/L、硫酸アンモニウム  2g/L、クエン酸 1g/L、リン酸二水素カリウム 14 g/L、リン酸水素二カリウム 16g/L、チアミン塩酸塩 10mg/L、硫酸第一鉄七水和物  50 mg/L、硫酸マンガン五水和物  10 mg/L、水酸化ナトリウム溶液によりpH7.2に調整後、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が5mL入った太型試験管に0.1mL植菌し、30℃で６時間培養した後、終濃度が1mMになるように IPTGを添加して、30℃で48時間、振盪培養した。
培養終了後、培養液を適当に希釈した後、遠心し、その上清のＬ−ホモフェニルアラニン濃度をHPLCにて定量した。Ｌ−ホモフェニルアラニンの検出、定量は、波長220nmのＵＶ吸収分析により行った。結果を表２に示す。
【００９１】
【表２】
2014045756.tif 000011
【実施例４】
【００９２】
基質を添加したＬ−ホモアミノ酸の製造（ＩＩ）
実施例１で得られた形質転換体のうち、W3110/pTrc_F2464-F2458/pSTV_F2457をLBプレート上で30℃にて一晩培養し、LB培地5mLが入った太型試験管に植菌して、30℃で12時間、振盪培養した。必要に応じて、100mg/Lのアンピシリン、25mg/Lのクロラムフェニコールを添加した。1g/Lのm-フルオロ−DL-フェニルアラニン、p-フルオロ−DL-フェニルアラニン、Ｌ−チロシンを添加した試験管生産培地［グルコース  20g/L、硫酸マグネシウム７水和物  2g/L、カザミノ酸 5g/L、硫酸アンモニウム  2g/L、クエン酸 1g/L、リン酸二水素カリウム 14 g/L、リン酸水素二カリウム 16g/L、チアミン塩酸塩 10mg/L、硫酸第一鉄七水和物  50 mg/L、硫酸マンガン五水和物  10 mg/L、1 g/L L-フェニルアラニン誘導体、水酸化ナトリウム溶液によりpH7.2に調整後、グルコースおよび硫酸マグネシウム７水和物水溶液は別途オートクレーブし、冷却した後混合］が5mL入った太型試験管に0.1mL植菌し、30℃で６時間培養した後、終濃度が1mMになるように IPTGを添加して、30℃で48時間、振盪培養した。生成物の構造は、HPLCおよびHPLC-ESI-MSを用いて解析することで確認した。HPLC分析は、実施例４と同様もしくは類似の方法により行った。結果を表３に示す。
【００９３】
【表３】
2014045756.tif 000012
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明により、Ｌ−ホモアミノ酸を効率よく製造することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００９５】
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
2014045756.tif 000019
【配列表】
2014045756000001.app