(57)【要約】  本発明は、高分子物質及びゲル形成用カチオンを含有する高分子溶液を、ゲル形成用アニオンを含有するアニオン溶液と接触させ、上記高分子溶液と上記アニオン溶液との界面にゲルを形成する工程と、上記ゲルの内部で上記高分子物質を凝集させる工程と、を備える、高分子凝集体の製造方法に関する。
2017110922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子物質及びゲル形成用カチオンを含有する高分子溶液を、ゲル形成用アニオンを含有するアニオン溶液と接触させ、前記高分子溶液と前記アニオン溶液との界面にゲルを形成する工程と、
前記ゲルの内部で前記高分子物質を凝集させる工程と、を備える、高分子凝集体の製造方法。
【請求項２】
前記ゲル形成用カチオンが、多価カチオン又は水素イオンから選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記ゲル形成用アニオンが、アルギン酸イオンである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記アニオン溶液が、高分子物質の凝集促進剤を更に含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記高分子溶液が、高分子物質の溶解促進剤を更に含有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記高分子溶液及び前記アニオン溶液の溶媒が水である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記高分子物質が、タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記タンパク質が、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドである、請求項７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高分子凝集体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クモ糸はスパイダーシルクとも言われ、天然クモ糸を出発物質とし、バイオ合成技術を用いて産生されることが知られている。クモ糸タンパク質を種々の形状に成形した高分子凝集体が知られている。例えば、特許文献１には、クモ糸タンパク質を使用したフィルムが開示されている。また、特許文献２には、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドパーティクルが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００８−５０７２６０号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／６１０４３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、タンパク質は、水又はその他の溶媒に溶解しやすく、所定形状で凝固液に押し出しても凝固液に溶解してしまい、歩留まりよく繊維形状、フィルム形状等の成形物を得ることが困難であった。【０００５】
そこで、本発明は、様々な形状の高分子凝集体を容易に得ることができる、高分子凝集体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、高分子物質及びゲル形成用カチオンを含有する高分子溶液を、ゲル形成用アニオンを含有するアニオン溶液と接触させ、上記高分子溶液と上記アニオン溶液との界面にゲルを形成する工程と、上記ゲルの内部で上記高分子物質を凝集させる工程と、を備える、高分子凝集体の製造方法を提供する。【０００７】
本発明の製造方法では、ゲル形成用カチオンとゲル形成用アニオンにより、高分子溶液とアニオン溶液の界面にゲルを形成させる。これにより、形成されたゲルの内部に高分子物質を含む溶液が封入される。このとき、ゲルは透析膜のように機能し、高分子溶液及びアニオン溶液中の小分子（例えば、溶媒、塩等）はゲルを介して移動する一方で、高分子物質はゲル内部に留まり、凝集して高分子凝集体が形成される。当該製造方法では、得られる高分子凝集体の形状は、形成されるゲルの形状に依存する。ゲルは、高分子溶液とアニオン溶液の接触により形成されるため、簡便な操作で、例えば、繊維、フィルム、中空パイプ、ビーズ等の様々な形状に成形することができる。したがって、本発明の製造方法によれば、様々な形状の高分子凝集体を容易に得ることができる。【０００８】
上記ゲル形成用カチオンは、多価カチオン又は水素イオンから選択される少なくとも１種であってよい。また、上記ゲル形成用アニオンは、アルギン酸イオンであってよい。【０００９】
上記アニオン溶液は、高分子物質の凝集促進剤を更に含有することが好ましい。これにより、より短時間で、高分子凝集体を製造することができる。【００１０】
上記高分子溶液は、高分子物質の溶解促進剤を更に含有していてもよい。【００１１】
本発明の製造方法は、ゲルを介した高分子物質の移動がないことから、水系で高分子凝集体を製造することができる。したがって、上記高分子溶液及びアニオン溶液の溶媒が水であってもよい。高分子凝集体を水系で製造できることから、廃液処理等の工程を簡素化でき、また得られる高分子凝集体への非水系溶媒の混入のリスクがないため、高分子凝集体の用途を容易に広げることができるという利点もある。【００１２】
本発明の製造方法は、ゲルを透析膜のように機能させ、ゲルの内部で高分子物質を凝集させるという作用に基づくことから、高分子物質の種類は特に制限されないが、典型的には高分子物質がタンパク質であることが好適である。また、タンパク質の種類は特に制限されないが、例えば、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドであってよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、様々な形状の高分子凝集体を容易に得ることができる、高分子凝集体の製造方法の提供が可能となる。本発明の製造方法では、得られる高分子凝集体の形状は、形成されるゲルの形状に依存する。ゲルは、高分子溶液とアニオン溶液の接触により形成されるため、簡便な操作で、例えば、繊維、フィルム、中空パイプ、ビーズ等の様々な形状に成形することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】一実施形態に係る製造方法を示す説明図である。（Ａ）高分子溶液（ドープ液）をアニオン溶液（凝固液）中に押し出す工程を示す説明図である。（Ｂ）ゲルに被覆された高分子凝集体を水に浸漬し、更に凝集させる工程を示す説明図である。
【図２】一実施形態に係る製造方法を示す説明図である。
【図３】一実施形態に係る製造方法を示す説明図である。
【図４】（Ａ）一実施形態に係る製造方法を示す説明図である。（Ｂ）図４（Ａ）においてＡで囲った部分の拡大図である。
【図５】一実施形態に係る製造方法における凝固液−ゲル−ドープ液の界面を示す模式断面図である。
【図６】一実施形態に係る製造工程図である。
【図７】実施例１で得られた高分子凝集体（クモ糸タンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。（Ａ）ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。（Ｂ）ゲルが除去された高分子凝集体を示す写真である。（Ｃ）（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。（Ｄ）（Ｂ）の写真をトレースしたトレース図である。
【図８】実施例２で得られた高分子凝集体（クモ糸タンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。（Ａ）ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。（Ｂ）ゲルが除去された高分子凝集体を示す写真である。（Ｃ）（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。（Ｄ）（Ｂ）の写真をトレースしたトレース図である。
【図９】実施例３で得られた高分子凝集体（シルクタンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。（Ａ）ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。（Ｂ）（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。
【図１０】実施例４で得られた高分子凝集体（シルクタンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。（Ａ）ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。（Ｂ）（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。
【図１１】実施例６で得られた高分子凝集体（ゼラチンタンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。（Ａ）ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。（Ｂ）（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の好適な実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は適宜省略する。
【００１６】
本発明に係る高分子凝集体の製造方法は、高分子物質及びゲル形成用カチオンを含有する高分子溶液を、ゲル形成用アニオンを含有するアニオン溶液と接触させ、上記高分子溶液と上記アニオン溶液との界面にゲルを形成する工程（以下、「ゲル形成工程」ともいう。）と、上記ゲルの内部で上記高分子物質を凝集させる工程（以下、「凝集工程」ともいう。）と、を備える。
【００１７】
（高分子溶液）
原料となる高分子物質は、特に制限されることなく任意の高分子物質を用いることができる。高分子物質の具体例としては、例えば、タンパク質、核酸、脂質、及び多糖類（例えば、セルロース、デンプン等）等の生体高分子、合成樹脂（例えば、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、フェノール樹脂等）、シリコン樹脂（例えば、シリコンゴム等）、合成繊維（例えば、ナイロン、ビニロン、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート等）、及び合成ゴム（例えば、ブタジエンゴム、イソプレンゴム等）等の合成高分子が挙げられる。
【００１８】
タンパク質等の生体高分子は、特に高分子凝集体の製造工程に改良の余地があることから、本発明に係る製造方法は、タンパク質等の生体高分子に適用するのが好適である。タンパク質の種類に制限はなく、任意のタンパク質に適用できる。原料となるタンパク質は、遺伝子組換え技術により微生物等で製造したものであってもよく、合成により製造されたものであってもよく、また天然由来のタンパク質を精製したものであってもよい。
【００１９】
タンパク質としては、構造タンパク質が好ましい。構造タンパク質は、生体構造を構築する役割を有するタンパク質であり、酵素、ホルモン、抗体等の機能タンパク質とは異なる。構造タンパク質としては、天然に存在するフィブロイン、コラ−ゲン、レシリン、エラスチン及びケラチン等の天然型構造タンパク質を挙げることができる。天然に存在するフィブロインとして、昆虫及びクモ類が産生するフィブロインが知られている。本実施形態において、構造タンパク質はスパイダーシルクタンパク質を含むことが好ましい。なお、構造タンパク質の中でも、クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド（クモ糸フィブロイン）、シルクタンパク質（絹糸、絹フィブロイン等）、ゼラチン、コラーゲン及びエラスチンから選ばれる少なくとも１つであることが好ましい。これらのタンパク質は、繊維をはじめとして様々な形状に成形しやすい。
【００２０】
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ  ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ  Ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、スズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｓｉｍｉｌｌｉｍａ  ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
【００２１】
昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、ＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
【００２２】
絹糸は、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の幼虫である蚕の作る繭から得られる繊維（繭糸）である。繭糸は２本のフィブロインがニカワ質（セリシン）で覆われる形で１本になっている。フィブロインは多数のフィブリルで構成され、フィブロインの外側は４層のセリシンで覆われ、１本の繭糸が構成されている。
【００２３】
絹フィブロインは、天然若しくは家蚕の繭、又は中古若しくは廃棄のシルク生地を原料とし、フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分等を除去して精製したものである。絹フィブロインは、精製したフィブロインを凍結乾燥粉末としたものが好ましい。
【００２４】
クモ糸フィブロインはクモ類が産生するフィブロインである。クモには最大７種類の絹糸腺があり、それぞれ性質の異なるフィブロイン（スパイダーシルクタンパク質）を産生する。スパイダーシルクタンパク質は、その源泉の器官にしたがって、高い靭性を有する大瓶状スパイダータンパク質（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭａＳｐ）、高度な伸長力を有する小瓶状スパイダータンパク質（ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＭｉＳｐ）、並びに鞭状（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ（Ｆｌａｇ））、管状（ｔｕｂｕｌｉｆｏｒｍ）、集合（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）、ブドウ状（ａｃｉｎｉｆｏｒｍ）及びナシ状（ｐｙｒｉｆｏｒｍ）の各スパイダーシルクタンパク質と命名されている。
【００２５】
クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。
【００２６】
クモ類が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ−３（ａｄｆ−３）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ−４（ａｄｆ−４）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。
【００２７】
天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ  ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。
【００２８】
タンパク質は、上記天然型タンパク質に由来するポリペプチド、すなわち組換えポリペプチドであってもよい。例えば、組換えフィブロインは、いくつかの異種タンパク質生産系で産生されており、その製造方法として、トランスジェニック・ヤギ、トランスジェニック・カイコ、又は組換え植物若しくは哺乳類細胞が利用されている。
【００２９】
組換えフィブロインは、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列、あるいは天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変に相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。
【００３０】
大吐糸管しおり糸タンパク質の組換えポリペプチドは、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは４〜２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が７０％以上である。ＲＥＰは１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは５〜３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）として表すことができる。具体的には配列番号１〜３及び配列番号８、９で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をあげることができる。
【００３１】
コラーゲンの組換えポリペプチドとして、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ｏは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１０で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたものである。
【００３２】
レシリンの組換えポリペプチドとして、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１１で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＮＰ  ６１１１５７、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたものである。
【００３３】
エラスチンの組換えポリペプチドとして、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号１２で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号４で示されるアミノ酸配列が付加されたものである。
【００３４】
ケラチンの組換えポリペプチドとして、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号１３で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。
【００３５】
組換えポリペプチドは、上記フィブロインのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、組換えフィブロインであってもよい。
【００３６】
上述の組換えフィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、組換えフィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
【００３７】
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による組換えフィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００３８】
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
【００３９】
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に組換えフィブロインを精製することができる。
【００４０】
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した組換えフィブロインを回収することもできる。
【００４１】
遺伝子組み換え技術によってタンパク質を製造する方法について以下に詳述する。かかるタンパク質は、例えば、当該タンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。
【００４２】
タンパク質をコードする遺伝子の製造方法は特に制限されない。例えば、天然の構造タンパク質をコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングする方法、又は、化学的な合成によって、遺伝子を製造することができる。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した構造タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。
【００４３】
調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いても良い。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。
【００４４】
発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。
【００４５】
宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。
【００４６】
原核生物の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。
【００４７】
タンパク質をコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２−２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
【００４８】
真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。
【００４９】
酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。
【００５０】
ベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。
【００５１】
上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，６９，２１１０  （１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。
【００５２】
発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
【００５３】
タンパク質は、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該タンパク質を生成蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
【００５４】
宿主が大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、宿主の培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００５５】
炭素源としては、宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
【００５６】
窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
【００５７】
無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
【００５８】
大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５〜４０℃である。培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
【００５９】
また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００６０】
タンパク質の単離、精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。
【００６１】
また、タンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として改変フィブロインの不溶体を回収する。回収した改変フィブロインの不溶体は蛋白質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により改変フィブロインの精製標品を得ることができる。
【００６２】
タンパク質が細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該タンパク質を回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
【００６３】
ゲル形成用カチオンは、ゲル形成用アニオンと結合してゲルを形成するカチオンである。ゲル形成用カチオンは、典型的には、多価カチオン、及び水素イオン（プロトン）である。多価カチオンは、２価以上の正電荷を持つ化合物であり、例えば、２価以上の金属陽イオン、１分子中に２以上のカチオン性基を有する化合物が挙げられる。１分子中に２以上のカチオン性基を有する化合物としては、例えば、１分子中に２以上のアミノ基を有するポリアミンのイオンが挙げられる。２価以上の金属陽イオンとしては、例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋等のアルカリ土類金属イオン、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋等の遷移金属イオン、Ｚｎ２＋、Ａｌ３＋が挙げられる。
【００６４】
ゲル形成用アニオンは、ゲル形成用カチオンと結合してゲルを形成するアニオンである。ゲル形成用アニオンとしては、例えば、カラギナン、ペクチン（例えば、ＬＭペクチン等）、アラビアガム、キサンタンガム、ジェランガム、大豆多糖類及びアルギン酸（例えば、アルギン酸ナトリウム）等のアニオン性基を有する多糖類のイオン、ポリ乳酸、ポリリン酸等の酸のイオンが挙げられる。
【００６５】
ゲル形成用カチオンとゲル形成用アニオンは、任意に組み合わせて用いることができるが、ゲル形成効率に優れるという観点から、ゲル形成用カチオンが２価以上の金属陽イオンであり、かつゲル形成用アニオンがアルギン酸イオンであることが好ましく、ゲル形成用カチオンがＣａ２＋であり、かつゲル形成用アニオンがアルギン酸イオンであることがより好ましい。
【００６６】
高分子溶液（ドープ液）は、例えば、ゲル形成用カチオンを溶解させた溶媒に高分子物質を添加し、撹拌、加熱及び電場印加等の公知の方法により溶解させることで得ることができる。
【００６７】
ゲル形成用カチオンは、溶媒に溶解した際に当該ゲル形成用カチオンを生成する化合物（多価カチオン化合物）として溶媒に添加してもよい。多価カチオン化合物の具体例としては、例えば、金属ハロゲン化物（例えば、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２）、金属硝酸塩（例えば、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｍｇ（ＮＯ３）２）、金属チオシアン酸塩（例えば、Ｃａ（ＳＣＮ）２，Ｍｇ（ＳＣＮ）２）、ジアミン化合物（例えば、エチレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン）、及び多価錯塩（例えば、［Ｃｏ４（ＯＨ）６・ｅｎ６］（ＮＯ３）６）が挙げられる。
【００６８】
高分子溶液の溶媒は、水、及び緩衝液等の水系溶媒であってもよく、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）及びヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡｃ）等の有機溶媒であってもよい。高分子溶液の溶媒は、２種以上の溶媒を混合した混合溶媒であってもよい。混合溶媒は、水系溶媒と有機溶媒の混合溶媒も含む。
【００６９】
高分子溶液は、高分子物質の溶解を促進させる溶解促進剤を更に含有していてもよい。これにより、高分子溶液の調製が容易になる。溶解促進剤の具体例としては、例えば、高分子物質がタンパク質の場合、例えば、以下に示すルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩が挙げられる。ルイス塩基としては、例えば、オキソ酸イオン（硝酸イオン、過塩素酸イオン等）、金属オキソ酸イオン（過マンガン酸イオン等）、ハロゲン化物イオン、チオシアン酸イオン、シアン酸イオン等が挙げられる。ルイス酸としては、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン等の金属イオン、アンモニウムイオン等の多原子イオン、錯イオン等が挙げられる。ルイス酸とルイス塩基とからなる無機塩の具体例としては、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、硝酸リチウム、過塩素酸リチウム、及びチオシアン酸リチウム等のリチウム塩、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、過塩素酸カルシウム、及びチオシアン酸カルシウム等のカルシウム塩、塩化鉄、臭化鉄、ヨウ化鉄、硝酸鉄、過塩素酸鉄、及びチオシアン酸鉄等の鉄塩、塩化アルミニウム、臭化アルミニウム、ヨウ化アルミニウム、硝酸アルミニウム、過塩素酸アルミニウム、及びチオシアン酸アルミニウム等のアルミニウム塩、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、過塩素酸カリウム、及びチオシアン酸カリウム等のカリウム塩、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、及びチオシアン酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化亜鉛、臭化亜鉛、ヨウ化亜鉛、硝酸亜鉛、過塩素酸亜鉛、及びチオシアン酸亜鉛等の亜鉛塩、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、ヨウ化マグネシウム、硝酸マグネシウム、過塩素酸マグネシウム、及びチオシアン酸マグネシウム等のマグネシウム塩、塩化バリウム、臭化バリウム、ヨウ化バリウム、硝酸バリウム、過塩素酸バリウム、及びチオシアン酸バリウム等のバリウム塩、並びに塩化ストロンチウム、臭化ストロンチウム、ヨウ化ストロンチウム、硝酸ストロンチウム、過塩素酸ストロンチウム、及びチオシアン酸ストロンチウム等のストロンチウム塩が挙げられる。高分子物質が加硫ゴムの場合、溶解促進剤の具体例として、チオール及びアミンが挙げられる。高分子物質がセルロースの場合、溶解促進剤の具体例として、二硫化炭素及び水酸化ナトリウムが挙げられる。高分子物質が合成樹脂、例えばアクリルの場合、溶解促進剤の具体例として、チオシアン酸ナトリウムが挙げられ、ポリアミド及びポリパラフェニレンテレフタルアミドの場合、溶解促進剤の具体例として、硫酸が挙げられ、ポリ塩化ビニルの場合、溶解促進剤の具体例として、アセトン及びシクロヘキサンが挙げられる。なお、高分子物質とゲル形成用カチオンとの組み合わせによっては、ゲル形成用カチオンが高分子物質の溶解を促進させる溶解促進剤として作用することもある。
【００７０】
高分子溶液中のゲル形成用カチオンの含有量は、高分子物質、ゲル形成用カチオン、ゲル形成用アニオン、溶媒及びその他の添加物の種類等に応じて適宜設定される。例えば、高分子物質がタンパク質であり、ゲル形成用カチオンがＣａ２＋であり、かつゲル形成用アニオンがアルギン酸イオンである場合、ゲル形成用カチオンの含有量は、０．１〜５．０モル／Ｌの濃度範囲であることが好ましく、０．４〜３．０モル／Ｌの濃度範囲であることがより好ましい。
【００７１】
高分子溶液中の高分子物質の含有量は、高分子物質の種類等に応じて適宜設定される。例えば、高分子物質がタンパク質である場合、高分子物質の含有量は、高分子溶液全量を基準として、１０〜５０質量％であることが好ましく、１５〜３０質量％であることがより好ましい。
【００７２】
高分子溶液の粘度は、特に制限されないが、例えば、成形が容易になるという観点から、２５℃において５０〜２００００ｃＰであることが好ましく、２００〜８０００ｃＰであることがより好ましい。高分子溶液の粘度は、例えばＥＭＳ粘度計により測定される。
【００７３】
（アニオン溶液）
アニオン溶液（凝固液）は、例えば、上述したゲル形成用アニオンを溶媒に添加し、撹拌、加熱及び電場印加等の公知の方法により溶解させることで得ることができる。
【００７４】
ゲル形成用アニオンは、溶媒に溶解した際に当該ゲル形成用アニオンを生成する化合物（アニオン化合物）として溶媒に添加してもよい。アニオン化合物の具体例としては、例えば、アニオン性基を有する多糖類、及びその塩が挙げられる。アニオン性基を有する多糖類、及びその塩の好適な具体例としては、アルギン酸ナトリウムが挙げられる。アルギン酸ナトリウムは（ＮａＣ６Ｈ７Ｏ６）ｎ（ｎは１〜５０００）で表され、Ｎａ−ＡＬＧと略記することもある。
【００７５】
アニオン溶液の溶媒は、水、及び緩衝液等の水系溶媒であってもよく、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）及びヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡｃ）等の有機溶媒であってもよい。アニオン溶液の溶媒は、２種以上の溶媒を混合した混合溶媒であってもよい。混合溶媒は、水系溶媒と有機溶媒の混合溶媒も含む。
【００７６】
アニオン溶液の溶媒は、高分子溶液の溶媒と同じであってもよい。また、両溶媒とも水系溶媒であってもよい。高分子溶液（ドープ液）もアニオン溶液（凝固液）も水系溶媒とすることにより、高分子凝集体を水系で成形できる。これにより、得られた高分子凝集体は、生体への適用が可能となり、例えば、現在、手術縫製糸として使用されているシルク糸に換えて使用できるほか、人工血管、人工皮膚、人工骨等への適用が可能となる。
【００７７】
アニオン溶液は、高分子物質の凝集促進剤を更に含有していてもよい。これにより、高分子凝集体の製造効率を向上させることができる。高分子物質の凝集促進剤の具体例としては、例えば、高分子物質がタンパク質の場合、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、Ｋ＋等のアルカリ金属イオンが挙げられる。高分子物質がセルロースの場合、高分子物質の凝集促進剤の具体例として、エタノールが挙げられる。高分子物質が未加硫ゴムの場合、高分子物質の凝集促進剤の具体例として、ジスルフィド化合物が挙げられる。
【００７８】
アニオン溶液中のゲル形成用アニオンの含有量は、高分子物質、ゲル形成用カチオン、ゲル形成用アニオン、溶媒及びその他の添加物の種類等に応じて適宜設定される。例えば、高分子物質がタンパク質であり、ゲル形成用カチオンがＣａ２＋であり、かつゲル形成用アニオンがアルギン酸イオンである場合、ゲル形成用アニオンの含有量は、０．１〜６．０重量％の濃度範囲であることが好ましく、１．０〜２．０重量％の濃度範囲であることがより好ましい。
【００７９】
（ゲル形成工程）
ゲル形成工程では、高分子溶液をアニオン溶液と接触させ、高分子溶液とアニオン溶液との界面にゲルを形成する。高分子溶液とアニオン溶液とを接触させる際、接触面の形状を制御することにより、繊維形状、フィルム形状、中空パイプ形状、及びビーズ形状等の任意の形状のゲルを形成させることができる。
【００８０】
繊維形状の場合、例えば、高分子溶液を紡糸ノズルからアニオン溶液に連続的に押し出すことで成形できる。フィルム形状の場合、例えば、高分子溶液をスリット孔から連続的にアニオン溶液に押し出すことで成形できる。中空パイプ形状の場合、例えば、高分子溶液を中空スリット孔から、又は二重管を通じて連続的にアニオン溶液に押し出すと共に高分子溶液の内部にも高分子溶液を注入することで成形できる。ビーズ形状の場合、例えば、高分子溶液をノズルから間欠的にアニオン溶液に押し出すことで成形できる。
【００８１】
（凝集工程）
凝集工程では、ゲルの内部で高分子物質を凝集させる。凝集工程では、ゲルが透析膜のように機能し、例えば、高分子溶液に含まれる余剰のゲル形成用カチオン又は溶解促進剤がゲルを介してアニオン溶液中に抜けていくことによって、高分子物質の凝集が進むことになる。また、例えば、アニオン溶液に含まれる凝集促進剤がゲルを介して高分子溶液中に侵入することによって、高分子物質の凝集が進むことになる。凝集工程では、例えば、アニオン溶液を攪拌してもよい。これによりゲルを介した物質移動の効率が向上するため、製造効率が向上する。
【００８２】
凝集工程を実施する時間は、高分子物質、ゲル形成用カチオン、ゲル形成用アニオン、溶媒及びその他の添加物の種類等、高分子凝集体の形状及び用途等に応じて適宜設定すればよいが、通常、３分〜３時間であり、３分〜２時間であることが好ましい。
【００８３】
凝集工程の実施により、ゲルが鞘状に結合した高分子凝集体が得られる。
【００８４】
（凝集工程２）
本実施形態に係る製造方法は、凝集工程の後、ゲルが鞘状に結合した高分子凝集体を水等の溶媒に浸漬する工程（「凝集工程２」ともいう。）を更に備えていてもよい。これにより、ゲル内部から溶媒へのゲル形成用カチオン又は溶解促進剤の移動が促進され、より一層高分子凝集体を凝集させることができる。
【００８５】
凝集工程２を実施する時間は、高分子物質、ゲル形成用カチオン、ゲル形成用アニオン、溶媒及びその他の添加物の種類等、高分子凝集体の形状及び用途等に応じて適宜設定すればよいが、通常、３分〜３時間であり、３分〜２時間であることが好ましく、３分〜１時間であることがより好ましい。
【００８６】
（ゲル除去工程）
本実施形態に係る製造方法は、凝集工程又は凝集工程２の後、高分子凝集体からゲルを除去する工程（「ゲル除去工程」ともいう。）を更に備えていてもよい。高分子凝集体は、用途に応じて、ゲルが鞘状に結合した高分子凝集体のまま提供されてもよいし、ゲルが不要な場合は、ゲル除去工程によってゲルを除去した高分子凝集体として提供されてもよい。ゲルを除去する方法としては、例えば、ローラーでゲルをつぶす等の機械的手段を用いた除去方法、高分子凝集体は溶解させずゲルだけを溶解する溶液に浸漬する等の化学的方法、又は超音波若しくは熱によりゲルを除去する方法が挙げられる。
【００８７】
本実施形態に係る製造方法を図１〜図６を参照しながら更に説明する。
【００８８】
図１は、一実施形態に係る製造方法を示す説明図である。図１に示す製造方法では、繊維形状の高分子凝集体が得られる。図１（Ａ）は、高分子溶液（ドープ液）をアニオン溶液（凝固液）中に押し出す工程を示す説明図である。シリンジ９ａにドープ液１を入れ、ドープ液１をノズルから凝固液４に連続的に押し出す。ドープ液１は、ゲル形成用カチオン（例えば、Ｃａ２＋）を含む水溶液に高分子物質（例えば、クモ糸タンパク質由来のポリペプチド）を溶解したものである。凝固液４は、ゲル形成用アニオン（例えば、アルギン酸イオン）を含む水溶液である。凝固液４は容器３に入れられており、ゆっくり撹拌されている。押し出されたドープ液２は凝固液４の中で界面にゲル５を形成する。ゲル５の内部では、高分子物質（例えば、クモ糸タンパク質由来のポリペプチド）が凝集し、高分子凝集体８が形成される。押し出しにより、繊維形状のゲル５が形成されるため、得られる高分子凝集体８も繊維形状となる。
【００８９】
図１（Ｂ）は、ゲルに被覆された高分子凝集体を水に浸漬し、更に凝集させる工程を示す説明図である。水７は容器６に入れられており、ゆっくり攪拌されている。ゲル５に被覆された高分子凝集体８をゲル５ごと水７に浸漬させる。これにより高分子凝集体８は更に凝集する。これを乾燥することで強度の高い糸となる。
【００９０】
図２は、他の実施形態に係る製造方法を示す説明図である。図２に示す製造方法では、粒子形状（ビーズ形状）の高分子凝集体が得られる。シリンジ９ａにドープ液１を入れ、ドープ液１をノズルから間欠的に凝固液４に押し出す。押し出されたドープ液２は凝固液４の中で界面にゲル５を形成する。ゲル５の内部では、高分子物質が凝集し、高分子凝集体８が形成される。間欠的な押し出しにより粒子形状のゲル５が形成されるため、得られる高分子凝集体８も粒子形状となる。
【００９１】
図３は、他の実施形態に係る製造方法を示す説明図である。図３に示す製造方法では、フィルム形状の高分子凝集体が得られる。ドープ液１をスリット孔９ｂから連続的に凝固液４に押し出す。押し出されたドープ液２は、凝固液４の中でゲル５を形成する。ゲル５の内部では、高分子物質が凝集し、高分子凝集体８が形成される。押し出しによりフィルム形状のゲル５が形成されるため、得られる高分子凝集体８もフィルム形状となる。
【００９２】
図４（Ａ）は、他の実施形態に係る製造方法を示す説明図である。図４（Ｂ）は、図４（Ａ）においてＡで囲った部分の拡大図である。図４（Ａ）に示す製造方法では、中空パイプ形状又は管形状の高分子凝集体が得られる。シリンジ９ａからドープ液１をノズル先端に設けられた環状のスリット孔９ｂを通じて、管状を呈するように連続的に凝固液４に押し出す。押し出されたドープ液２は、凝固液４の中で管状のゲル５を形成する。ゲル５の内部では、高分子物質が凝集し、高分子凝集体８が形成される。押し出しにより管形状のゲル５が形成されるため、得られる高分子凝集体８も細径の中空パイプ形状又は管形状となる。
【００９３】
図５は、一実施形態に係る製造方法における凝固液−ゲル−ドープ液の界面を示す模式断面図である。図５に示す凝固液−ゲル−ドープ液の界面を示す模式断面図１０を使用し、本発明に係る製造方法により高分子凝集体が形成するメカニズムを説明する。図５では、ドープ液としてＣａ（ＳＣＮ）２及びフィブロインを含む高分子溶液を使用し、凝固液としてアルギン酸ナトリウムを含むアニオン溶液を使用している。ゲル層１２は、ドープ液に含まれるＣａ２＋（ゲル形成用カチオン）と凝固液に含まれるアルギン酸イオン（ＡＬＧｎ−：ゲル形成用アニオン）から形成される。すなわち、ドープ液層１１のＣａ２＋−フィブロインと、凝固液層１３のアルギン酸ナトリウム（Ｎａ＋−ＡＬＧｎ−）との間でイオン交換反応が起こり、Ｃａ２＋−ＡＬＧｎ−が生成することでゲル化し、ゲル層１２が形成される。ゲル層１２は、透析膜のように機能すると考えられる。この結果、低分子量のＳＣＮ−、Ｈ２Ｏ及びＮａ＋は、ゲル層１２を介して移動する一方で、高分子であるフィブロインは、ゲル内部に留まることになる。また、ゲル層１２を介したＳＣＮ−の流出により、ゲル内部でのフィブロインの溶解度が低下し、凝集が進むと考えられる。
【００９４】
図６は、一実施形態に係る製造工程図である。押し出し機２１のノズル２３からＰ方向にドープ液２２を押し出し、押し出されたドープ液２４は凝固槽２５の凝固液２６に浸漬し、生成するゲル２７を剥ぎ落とし、凝集したフィブロイン２８を水槽２９の純水３０に浸漬させてさらに凝集させ、次いで乾燥機３１を通して固化し、巻糸３２とする。このようにして一連の工程でフィブロイン糸を製造できる。フィブロイン糸は未延伸糸のままでも実用的には十分な強度を有するが、さらに延伸してもよい。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００９６】
〔実施例１〕
１．クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドの調製
＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３（ＧＩ番号：１２６３２８７）の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成委託した。その結果、配列番号５で示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。【００９７】
（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の合成
ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＴ７プロモータープライマー（配列番号１４）とＲｅｐ  Ｘｂａ  Ｉプライマー（配列番号１５）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における５’側半分の配列（以下、配列Ａと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＮｄｅ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。同様に、ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＸｂａ  Ｉ  Ｒｅｐプライマー（配列番号１６）とＴ７ターミネータープライマー（配列番号１７）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における３’側半分の配列（以下、配列Ｂと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＸｂａ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。配列Ａの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＮｄｅ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉで、配列Ｂの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＸｂａ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉでそれぞれ制限酵素処理し、ゲルの切り出しによって配列Ａ及び配列Ｂの目的ＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ及び予めＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）をライゲーション反応させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。Ｔ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片の挿入を確認した後、目的サイズ（３．６  ｋｂｐ）のバンドが得られたコロニーからプラスミドを抽出し、３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により全塩基配列を確認した。その結果、配列番号６に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の構築が確認された。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列は配列番号３で示すとおりである。【００９８】
（３）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子の合成
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列（配列番号３）における第１１５５番目のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ）に対応するコドンＧＧＣを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号７に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１（以下、単に「ＮＲＳＨ１」ともいう。）のアミノ酸配列は配列番号１で示すとおりである。【００９９】
＜タンパク質の発現＞
上記で得られたＮＲＳＨ１の遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍＬを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬと共に加え、ＯＤ６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズ（約１０１．１ｋＤａ）のバンドが観察され、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。【０１００】
＜ポリペプチドの調製＞
（Ｉ）遠沈管（５０ｍＬ）にＮＲＳＨ１のタンパク質を発現している大腸菌の菌体約４．５ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３０ｍＬを添加し、ミキサー（ＧＥ社製「ＳＩ−０２８６」、レベル１０）で菌体を分散させた後、遠心分離機（トミー精工製の「ＭＸ−３０５」）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（ＩＩ）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３０ｍＬと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を０．３ｍＬ添加し、上記ＧＥ社製のミキサー（レベル１０）で３分間分散させた。その後、超音波破砕機（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ、ＩＮＣ製「ＶＣＸ５００」）を用いて菌体を破砕し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）した。
（ＩＩＩ）遠心分離で得られた沈殿物に緩衝液ＡＩを３０ｍＬ加え、ミキサー（ＩＫＡ社製「Ｔ１８ベーシック  ウルトラタラックス」、レベル２）で３分間分散させた後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を除去した。
（ＩＶ）上清を捨てた遠沈管に７．５Ｍの尿素緩衝液Ｉ（７．５Ｍ  尿素、１０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）を加え、超音波破砕機（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ、ＩＮＣ製「ＶＣＸ５００」）（レベル７）で沈殿をよく分散させた。その後、シェイカー（タイテック社製「ＢＲ−４３ＦＬ/ＭＲ」）（２００ｒｐｍ、６０℃）で１２０分間溶解させた。溶解後のタンパク質溶液を上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００×ｇ、１０分、室温）し、上清を透析チューブ（三光純薬株式会社セルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質ＮＲＳＨ１（約１０１．１ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＣＢＢ染色）の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＮＲＳＨ１の精製度は約８５％であった。【０１０１】
２．高分子溶液（ドープ液）の調製
１Ｍ  Ｃａ（ＳＣＮ）２の純水溶液にクモ糸タンパク質（ＮＲＳＨ１）を濃度２０質量％となるよう添加し、シェーカーを使用して３時間溶解させた。その後、ゴミと泡を取り除き、ドープ液とした。ドープ液の溶液粘度は２５℃において２０８８ｃＰ（センチポアズ）であった。【０１０２】
３．アニオン溶液（凝固液）の調製
アルギン酸ナトリウム（Ｎａ−ＡＬＧ）を１．０質量％含む純水を凝固液とした。【０１０３】
４．高分子凝集体の製造
図１（Ａ）に示すように、シリンジを使用してドープ液を凝固液に押し出した。押し出しノズルの直径は０．５ｍｍ、押し出し速度は５０ｍＬ／Ｈｒとした。押し出し後、ドープを凝固液に９０分間（ゲル化浴浸漬時間）浸漬し、ゲル内に形成された高分子凝集体を得た。その後、高分子凝集体を被覆するゲルを除去し、糸条のフィブロインを得た。【０１０４】
製造条件と結果を表１及び図７に示す。図７は、実施例１で得られた高分子凝集体（クモ糸タンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。図７（Ａ）は、ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。図７（Ｂ）は、ゲルが除去された高分子凝集体を示す写真である。図７（Ｃ）は、図７（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。図７（Ｄ）は、図７（Ｂ）の写真をトレースしたトレース図である。【０１０５】
〔実施例２〕
ドープ液を、１Ｍ  ＣａＣｌ２のＤＭＳＯ溶液にクモ糸タンパク質（ＮＲＳＨ１）を濃度２０質量％となるよう添加して調製したこと、及びゲル化浴浸漬時間を３０分間に変更したこと以外は、実施例１と同様にして、高分子凝集体を製造した。【０１０６】
製造条件と結果を表１及び図８に示す。図８は、実施例２で得られた高分子凝集体（クモ糸タンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。図８（Ａ）は、ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。図８（Ｂ）は、ゲルが除去された高分子凝集体を示す写真である。図８（Ｃ）は、図８（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。図８（Ｄ）は、図８（Ｂ）の写真をトレースしたトレース図である。【０１０７】
〔実施例３〕
クモ糸タンパク質（ＮＲＳＨ１）に代えて絹糸（セリシン未除去）を使用したこと、ドープ液に含まれるＣａ（ＳＣＮ）２の濃度を５Ｍとしたこと、ゲル化浴浸漬時間を１８０分間に変更したこと、及び凝固液に浸漬した後、ＲＯ水に６０分間（ＲＯ水浸漬時間）浸漬したこと以外は、実施例１と同様にして、高分子凝集体を製造した。【０１０８】
絹糸（セリシン未除去）は、繭から蚕の蛹を取り出し、繭殻を裁断したものを用いた。【０１０９】
製造条件と結果を表１及び図９に示す。図９は、実施例３で得られた高分子凝集体（シルクタンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。図９（Ａ）は、ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。図９（Ｂ）は、図９（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。なお、実施例３の高分子凝集体は、ゲルと一体化していた。【０１１０】
〔実施例４〕
絹糸（セリシン未除去）に代えて絹糸からセリシンを除去した糸状フィブロンを使用したこと、凝固液中のアルギン酸ナトリウム濃度を２．０質量％に変更したこと、ゲル化浴浸漬時間を３０分間に変更したこと、及びＲＯ水浸漬時間を３０分間に変更したこと以外は、実施例３と同様にして、高分子凝集体を製造した。【０１１１】
絹糸からセリシンを除去した糸状フィブロインは、以下のようにして調製した。
（１）沸騰した０．５質量％マルセル石鹸水（マルセル石鹸はおろし金で細かくしたものを使用）に、浴比１：１００となるように絹糸を入れ、時々かき混ぜながら３０分間煮た。
（２）石鹸水を捨て、一度ぬるま湯ですすいだ。
（３）沸騰したお湯に、浴比１：１００となるように、（２）においてぬるま湯ですすいだ絹糸を入れ煮た。
（４）お湯を捨てた。
（５）手順（１）〜（４）をさらに２回繰り返した（計３回）。
（６）最後に脱水し、６０℃以下で乾燥させた。【０１１２】
製造条件と結果を表１及び図１０に示す。図１０は、実施例４で得られた高分子凝集体（シルクタンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。図１０（Ａ）は、ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。図１０（Ｂ）は、図１０（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。なお、実施例４の高分子凝集体は、ゲルと一体化していた。【０１１３】
〔実施例５〕
絹糸からセリシンを除去した糸状フィブロインに代えて、再生絹糸を使用したこと以外は、実施例４と同様にして、高分子凝集体を製造した。【０１１４】
再生絹糸は、以下のようにして調製した。
（１）沸騰した０．５質量％マルセル石鹸水（マルセル石鹸はおろし金で細かくしたものを使用）で絹糸を３０分間煮た。
（２）その後、沸騰したお湯で３０分間煮た。
（３）手順（１）と（２）をさらに２回繰り返した（計３回）。
（４）最後に沸騰したお湯で３０分間煮た。
（５）温度３７℃環境で一晩乾燥させた。
（６）乾燥後の絹の重さを測り、その１０倍量の９Ｍ臭化リチウム水溶液を入れ、４０℃環境で溶解させた。
（７）（６）で得られた溶解液をセルロース透析膜（ＶＩＳＫＡＳＥＳＥＬＥＳ  ＣＯＡＰ製のＳｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｔｕｂｉｎｇ、３６／３２）に入れ、純水で３〜４日間透析した。
（８）透析後の回収液を、フィルター（孔径１９７μｍと５６０μｍ）でろ過し、ゴミを取り除いた。
（９）ＢＣＡ法によりタンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度が２質量％以下になるようにＭｉｌｌｉＱで希釈した。
（１０）再生絹糸溶液を、−８０℃環境で凍結乾燥させた。厚さは１〜２ｃｍであった。
（１１）凍結乾燥後は４℃で保存した。【０１１５】
製造条件と結果を表１に示す。なお、実施例５の高分子凝集体は、ゲルと一体化していた。【０１１６】
〔実施例６〕
クモ糸タンパク質（ＮＲＳＨ１）に代えて市販のゼラチン（ＢＩＯＲＡＤ社製  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ  １７０−６５３７）を使用したこと、及びゲル化浴浸漬時間を３０分間に変更したこと以外は、実施例１と同様にして、高分子凝集体を製造した。【０１１７】
製造条件と結果を表１及び図１１に示す。図１１は、実施例６で得られた高分子凝集体（ゼラチンタンパク質が凝集し繊維状になっているもの）を示す写真、及び当該写真をトレースしたトレース図である。図１１（Ａ）は、ゲル内に形成された高分子凝集体を示す写真である。図１１（Ｂ）は、図１１（Ａ）の写真をトレースしたトレース図である。なお、実施例６の高分子凝集体は、ゲルと一体化していた。【０１１８】
【表１】
2017110922.tif 000003
【０１１９】
表１及び図７〜１１に示すとおり、タンパク質の種類に依存せず、ゲルの内部にタンパク質の凝集体が得られた。また、凝固液へのタンパク質の溶出はほとんど確認されず、凝集体を歩留まりよく得ることができた。
【符号の説明】
【０１２０】
１…高分子溶液（ドープ液）、２…押し出されたドープ液、３，６…容器、４…アニオン溶液（凝固液）、５…ゲル、７…水、８…高分子凝集体、９ａ…シリンジ、９ｂ…スリット孔、１０…凝固液−ゲル−ドープ液の界面を示す模式断面図、１１…ドープ液層、１２…ゲル層、１３…凝固液層、２１…押し出し機、２２…ドープ液、２３…ノズル、２４…押し出されたドープ液、２５…凝固槽、２６…凝固液、２７…ゲル、２８…凝集したフィブロイン、２９…水槽、３０…純水、３１…乾燥機、３２…巻糸。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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