(57)【要約】ナノポアを用いた生体試料分析装置であって、溶媒を収容した第１のチャンバーと、生体試料が通過するナノポアを有する基板と、前記基板を介して前記第１のチャンバーと隣接する位置に配置され、溶媒を収容した第２のチャンバーと、前記第１のチャンバーに設けられた第１電極と、前記第２のチャンバーに設けられた第２電極と、ナノポアを通過する前記生体試料を検出する検出部と、前記第１のチャンバー内の溶媒を攪拌する攪拌部とを有することを特徴とする生体試料分析装置。
2017090087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノポアを用いた生体試料分析装置であって、
溶媒を収容した第１のチャンバーと、
生体試料が通過するナノポアを有する基板と、
前記基板を介して前記第１のチャンバーと隣接する位置に配置され、溶媒を収容した第２のチャンバーと、
前記第１のチャンバーから前記第２のチャンバーに前記生体試料を誘導する生体試料誘導部と、
ナノポアを通過する前記生体試料を検出する検出部と、
前記第１のチャンバー内の溶媒を攪拌する攪拌部と
を有することを特徴とする生体試料分析装置。
【請求項２】
前記検出部による検出結果に基づいて、前記攪拌部を制御する制御部を有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項３】
前記検出部は、
前記ナノポアを通過する前記生体試料の通過頻度を計測する計測部を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の生体試料分析装置。
【請求項４】
前記攪拌部は、
前記第２のチャンバーに設けられた加熱部を有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項５】
前記攪拌部は、
前記第１のチャンバーに設けられた冷却部を有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項６】
前記攪拌部を、以下に式により制御することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
５＜ＲａＬ＜１７１０
但し、
2017090087.tif 000004
ここで、パラメータは以下の通りである。
ｇ：重力加速度
β：体膨張係数
V：動粘性係数
α：熱拡散率
Ｌ：高温部と低温部の距離
Ｔ１：  第１のチャンバー内の溶液温度
Ｔ２：  第２のチャンバー内の溶液温度
【請求項７】
前記制御部は、
前記検出部の検出結果を基に、前記攪拌部により攪拌するタイミングを制御することを特徴とする請求項２に記載の生体試料分析装置。
【請求項８】
前記制御部は、
前記生体試料が前記ナノポアを通過する頻度が所定の値以下の場合に、前記攪拌部により攪拌することを特徴とする請求項７に記載の生体試料分析装置。
【請求項９】
前記第２のチャンバーの内側底面の外周が丸みをおびていることを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１０】
前記溶媒の融点が０℃未満であることを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１１】
前記基板の温度を測定する第１の温度センサーを有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１２】
前記第１の温度センサーは、前記第１のチャンバーの上面の温度を測定する請求項１１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１３】
前記加熱部の温度を測定する第２のセンサーを備えることを特徴とする請求項４に記載の生体試料分析装置。
【請求項１４】
前記第１のチャンバーの上面の温度を測定する第２のセンサーを備える請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１５】
ナノポアを用いた生体試料分析方法であって、
溶媒を収容した第１のチャンバーから、生体試料が通過可能なナノポアを通過して前記第１のチャンバーと隣接する位置に配置され溶媒を収容した第２のチャンバーに生体試料を誘導する生体試料誘導ステップと、
前記ナノポアを通過する前記生体試料を検出する検出ステップと、
前記第１のチャンバー内の溶媒を攪拌する攪拌ステップと
を有することを特徴とする生体試料分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料分析装置及び生体試料分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料、例えば核酸塩基配列の解析は、遺伝的疾患の原因遺伝子の検出、薬剤の有効性・副作用の評価、ガン疾患等に関連する遺伝子変異の検出等を目的として、近年非常に需要が大きくなってきている。核酸塩基配列は、キャピラリー電気泳動を行い蛍光検出装置（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製3500 Genetic Analyzer）や平板上に固定した核酸を蛍光検出する装置（イルミナ社製HiSeq2500）などを用いて解析されている。【０００３】
従来から使用されているこれらの技術においては、蛍光検出を行うための高価な光学機能を有した装置を用いる必要がある。【０００４】
より安価な検出法として、核酸塩基配列を電気的に検出する試みが行われている。例えば、1〜60nmの薄膜に透過電子顕微鏡などで数nmの穴(ナノポア)を作製し、その薄膜の両側に電解質溶液を満たした液槽を設け、それぞれの液槽に電極を設けて電極間に電圧をかけると、ナノポアを通してイオン電流が流れる。イオン電流は一次近似としてナノポアの断面積に比例する。DNAがナノポアを通過する際に、DNAがナノポアを封鎖し、有効断面積が減少するため、イオン電流が減少する。この減少量を封鎖電流と呼ぶ。封鎖電流の大きさを元に、DNAの1本鎖と2本鎖との差異や、塩基の種類を判別する方法などがある。封鎖電流で判別するのは、DNAに限らない。例えばRNA、ペプチド、タンパク質、細胞などの生体試料の判別に用いられる。DNAは負に帯電している為、正の電極の方へナノポアを経由して通過する。ここで、各液槽は薄膜とナノポアによって隔たれているためナノポア近傍に電界の分布が偏り、ナノポア近傍にいるDNAが引き寄せられる。したがって、ナノポアより遠い位置にあるDNAなどを効率的にナノポア通過させる必要がある。【０００５】
生体試料分析技術として、特表2014-519823号公報（以下、「特許文献１」と称する。）がある。特許文献１には、「適切な検出器が存在する膜に分析物を結合させることによる超低濃度分析物送達を実証した。これにより、検出に必要とされる分析物の量は数桁下がる。」と記載されている。【０００６】
また、US2013/0264206（以下、「特許文献２」と称する。）がある。特許文献２によれば、追加した電極により電界の偏りを和らげて生体分子を誘導することが記載されている。また、非特許文献1には、ナノポア近傍に導電性薄膜を用意し、レーザー照射を行い、プラズモンを発生させることにより、DNAがナノポアを通過する効率を上げる手法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2014-519823号公報
【特許文献２】米国特許US2013/0264206号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Francesca Nicoli, Nano Lett. 2014, 14, ｐ．6917-6925．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１の技術を用いてDNAの塩基配列を解析する場合、コレステロールなどの疎水リンカーを試料であるDNAに付与する前処理工程などが必要になる。従って、計測前の準備に時間と手間が増えてしまう。さらに、疎水リンカーを付与する工程の効率も必ずしも高くない為、試料として用意したDNA全てにこのリンカーが付与されるわけではない。つまり、リンカーが付与されなかったDNAはナノポア近傍に引き寄せられず選別されてしまう。さらに、薄膜上に捉えたDNA全てを捉えるには密に複数のナノポアを用意する必要がある。その場合、ナノポアを有する薄膜の強度を維持する必要性や、複数のナノポア同様に検出の為の複数の電極などを密に配置するという制限が生まれ製造の難易度が上がる。【００１０】
特許文献２の技術を用いてDNAの塩基配列を解析する場合、分析物であるDNAを誘導する為に電極を検出以外に設けているが、溶液槽にあるDNAを捕捉する場合は複数の電極を用意しなければならない。その為、DNAを誘導する為の電極を含めたナノポア近傍が複雑になり製造の難易度が上がる。さらに、複数の電極からの発熱によりナノポア近傍の温度上昇が顕著になることも考えられ、分析物であるDNAなどのブラウン運動が大きくなり、検出対象の振動によって検出時のノイズが大きくなってしまう。【００１１】
非特許文献１の技術を用いてDNAの塩基配列を解析する場合、プラズモンを発生させる構造体やレーザー照射が必要になる。プラズモン発生の為の構造体はナノポア同様にナノメートルサイズの構造体を製造するだけでは無く、ナノポアと構造体を近接させて製造するには高額な電子線描画装置や非常に高い製造技術が求められるという課題がある。更に、レーザー照射するため、レーザーやレンズなどの光学系部品が必要になり、安価な検出法としてのナノポアシーケンサの特徴を失ってしまう。さらに、レーザー照射によるプラズモン励起を行うため、特許文献２同様に溶液槽の温度上昇が顕著になり、分析物であるDNAなどのブラウン運動が大きくなり検出時のノイズが大きくなってしまうと言う課題もある。【００１２】
その他、液槽であるcis槽trans槽に各々流路などを連結し、ポンプまたはオリフィスなどを用いて液槽内の溶液を攪拌することも可能である。しかしながら、可動する機構を設けることにより、液漏れによる信頼性の低下の懸念やメンテナンスの必要性が生まれてしまうという課題が生じる。【００１３】
本発明は、ナノポアを用いた生体試料分析技術において、ナノポアを通過する生体試料の通過頻度を高めることである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一観点によれば、ナノポアを用いた生体試料分析装置であって、溶媒を収容した第１のチャンバーと、生体試料が通過するナノポアを有する基板と、前記基板を介して前記第１のチャンバーと隣接する位置に配置され、溶媒を収容した第２のチャンバーと、前記第１のチャンバーから前記第２のチャンバーに前記生体試料を誘導する生体試料誘導部と、ナノポアを通過する前記生体試料を検出する検出部と、前記第１のチャンバー内の溶媒を攪拌する攪拌部と、を有することを特徴とする生体試料分析装置が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ナノポアを用いた生体試料分析技術において、ナノポアを通過する生体試料の通過頻度を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の第１の実施の形態による生体試料分析装置の一構成例を示す図である。
【図２】本発明の第２の実施の形態による生体試料分析装置の一構成例を示す図である。
【図３】生体試料分析技術における数値流体力学解析結果の一例を示す図である。
【図４】図２の変形例による生体試料分析装置の一構成例を示す図である。
【図５】本発明の第３の実施の形態による生体試料分析装置の一構成例を示す図である。
【図６】本発明の第３の実施の形態による処理の流れの一例を示すフローチャート図である。
【図７】本実施の形態による計測制御部の一構成例を示す機能ブロック図である。
【図８】電圧印加手段への印加電圧と、通過頻度と、加熱用電極への印加電圧との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下に、本発明の実施の形態による生体試料分析技術について、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１８】
本実施の形態による生体試料分析技術は、特に、DNA、RNAなどの核酸の分析を行う技術に関するものであり、効率よくナノポアに生体ポリマを通過させる技術に関する。
【００１９】
より詳細には、例えば、ナノポアシーケンサによる核酸配列決定のために、核酸がナノポアを高頻度に通過する技術法に関し、より具体的には、ナノポアシーケンサによる核酸配列決定の為の試料溶液槽の攪拌技術であって、溶液槽内に温度差を作ることにより対流を発生させ、核酸をナノポア近傍に引き寄せるものである。
【００２０】
（第１の実施の形態）
まず、本発明の第１の実施の形態について説明する。
【００２１】
（核酸分子計測の説明）
図１は、本発明の実施の形態による生体試料分析装置の一構成例を示す図であり、例示的に、ナノポア基板、及びナノポア基板を配置した観察容器の断面構成を示す。
【００２２】
図１に示すように、生体試料分析のための観察容器（チャンバー部）１０１は、ナノポア１０２を有するナノポア基板（基板）１０３を隔てて２つの閉じられた空間、すなわち試料導入区画１０４と試料流出区画１０５とを有している。試料導入区画１０４と試料流出区画１０５とは隣接する位置に対向配置されている。但し、試料導入区画１０４と試料流出区画１０５とは、ナノポア１０２で連通している。試料導入区画１０４及び試料流出区画１０５は、両区画にそれぞれ連結された流入路１０６、１０７を介して導入される液体１１０、１１１で満たされる。液体１１０、１１１は、試料導入区画１０４及び試料流出区画１０５に連結された流出路１０８、１０９から流出する。流入路１０６、１０７は、ナノポア基板１０３を挟んで隣接（対向）する位置に設けられてもよいが、この配置に限定されない。流出路１０８、１０９は、ナノポア基板１０３を挟んで隣接（対向）する位置に設けられてもよいが、この配置に限定されない。
【００２３】
液体（溶媒）１１０は、分析対象となる生体試料１１３を含む試料溶液であることが好ましい。液体１１０は、電荷の担い手となるイオンを好ましくは大量に含む（以下、「イオン液体」と称する。）。液体１１０は、生体試料以外には、イオン液体のみを含むことが好ましい。イオン液体としては、電離度の高い電解質を溶解した水溶液が好ましく、塩類溶液、例えば塩化カリウム水溶液などを好適に使用できる。液体（溶媒）１１０の融点は０度未満であっても良い。
【００２４】
生体試料１１３は、イオン液体中で電荷を有するものであることが好ましい。生体試料１１３は、典型的には核酸分子であるが、これに限定されず、ペプチドやタンパク質といった生体試料でも良い。
【００２５】
試料導入区画１０４と試料流出区画１０５には、例えば、ナノポア１０２を挟んで対向するように配置された電極１１４、１１５が設けられる。本実施形態において、電極１１４、１１５に対しては電圧印加手段１１６が備えられている。電極１１４、１１５に対する電圧印加により、電荷をもつ生体試料１１３が試料導入区画１０４からナノポア１０２を通過し、試料流出区画１０５へと移る。電極１１４、１１５および電圧印加手段１１６は、電荷をもつ生体試料１１３が試料導入区画１０４からナノポア１０２を通過し、試料流出区画１０５へと移るようにする生体試料誘導部を構成する。これらは、封鎖電流検出部（検出部）を構成する。以下、封鎖電流検出部（検出部）１１４、１１５とも称する。
【００２６】
核酸分子がナノポアを通過する際に、ナノポア１０２内のイオンの流れを塞ぐため、電流の減少（封鎖電流）が生じる。この封鎖電流の大きさとその封鎖電流の継続時間を、公知の封鎖電流検出部（検出部）１１４、１１５により計測することにより、ナノポア１０２を通過する個々の核酸分子の長さを検出することが可能である。また、核酸分子を構成する個々の塩基の種類の判別も可能となる。
【００２７】
図１では、上部を試料導入区画、下部を試料流出区画としたが、下部を試料導入区画、上部を試料流出区画とし、ナノポア１０２を抜けてくる生体試料１１３を検出するようにしてもよい。
【００２８】
本実施の形態では、さらに、試料導入区画１０４内の液体１１０を攪拌する攪拌部１１８を備える。攪拌部１１８は、試料導入区画１０４内の液体１１０を必要に応じて攪拌することで、ナノポア１０２を通過する生体試料１１３の通過頻度を高めることができる。
【００２９】
以下に、容器およびナノポアについて説明する。
【００３０】
（容器の説明）
本実施の形態において用いる容器は、チャンバー部１０１とその内部に配置されているナノポア基板１０３を有する。ナノポア基板１０３は、基材と、基材に面して形成された薄膜と、薄膜に設けられた、試料である核酸分子導入区画と核酸分子流出区画とを連通するナノポア１０２を有し、チャンバー部１０１の試料導入区画１０４と試料流出区画１０５との間に配置される。ナノポア基板１０３は、絶縁層を有してもよい。ナノポア基板１０３は、固体基板であることが好ましい。試料流出区画１０５である第２のチャンバーの内側底面の外周が丸みをおびているようにしても良い。
【００３１】
ナノポア基板１０３は、電気的絶縁体の材料、例えば無機材料及び有機材料（高分子材料を含む）から形成することができる。ナノポア基板１０３を構成する電気的絶縁体材料の例としては、シリコン（ケイ素）、ケイ素化合物、ガラス、石英、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、ポリスチレン、ポリプロピレン等が挙げられる。ケイ素化合物としては、窒化ケイ素、酸化ケイ素、炭化ケイ素等、酸窒化ケイ素が挙げられる。特に基板の支持部を構成するベース（基材）は、これらの任意の材料から作製することができるが、例えばケイ素又はケイ素化合物であってよい。
【００３２】
ナノポア基板１０３のサイズ及び厚さは、ナノポア１０２を設けることができるものであれば特に限定されるものではない。ナノポア基板１０３は、当技術分野で公知の方法により作製することが可能であり、あるいは、市販品として入手することも可能である。例えば、ナノポア基板１０３は、フォトリソグラフィ又は電子線リソグラフィ、及びエッチング、レーザーブレーション、射出成形、鋳造、分子線エピタキシー、化学蒸着（CVD）、誘電破壊、電子線若しくは収束イオンビームなどの技術を用いて作製することができる。ナノポア基板１０３は、表面への標的外の分子の吸着を避けるために、コーティングしてもよい。
【００３３】
ナノポア基板１０３は、少なくとも１つのナノポア１０２を有する。ナノポア１０２は、具体的には薄膜に設けられるが、場合によって、ベース（基材）、絶縁体に同時に設けてもよい。本実施の形態において「ナノポア」及び「ポア」とは、ナノメートル（nm）サイズ（すなわち、1nm以上、1μm未満の直径）の孔であり、ナノポア基板１０３を貫通して試料導入区画と試料流出区画とを連通する孔である。
【００３４】
ナノポア基板１０３は、ナノポア１０２を設けるための薄膜を有することが好ましい。すなわち、ナノサイズの孔を形成するのに適した材料及び厚さの薄膜を基板上に形成することによって、ナノポア１０２を簡便かつ効率的に基板１０３に設けることができる。ナノポア形成の面から、薄膜の材料は、例えばグラフェン、酸化ケイ素（SiO2）、窒化ケイ素（SiN）、酸窒化ケイ素（SiON）、金属酸化物、金属ケイ酸塩などが好ましい。また薄膜（及び場合によっては基板全体）は、実質的に透明であってもよい。ここで「実質的に透明」とは、外部光をおよそ50％以上、好ましくは80％以上透過できることを意味する。また薄膜は、単層であっても複層であってもよい。薄膜の厚みは、0.1nm〜200nm、好ましくは0.1nm〜50nm、より好ましくは0.1nm〜20nmである。薄膜は、当技術分野で公知の技術により、例えば減圧化学気相成長（LPCVD）により、基板上に形成することができる。
【００３５】
薄膜上には、絶縁層を設けても良い。絶縁層の厚みは好ましくは5nm〜50nmである。絶縁層には任意の絶縁体材料を使用できるが、例えばケイ素又はケイ素化合物（窒化ケイ素、酸化ケイ素など）を使用することが好ましい。本実施の形態においてナノポア又はポアの「開口部」とは、ナノポア又はポアが試料溶液と接する部分のナノポア又はポアの開口円を指す。生体高分子の分析の際には、試料溶液中の生体高分子やイオンなどは一方の開口部からナノポア１０２に進入し、同じ又は反対側の開口部からナノポア１０２外に出る。
【００３６】
（ナノポアの説明）
ナノポア１０２のサイズは、分析対象の生体高分子の種類によって適切なサイズを選択することができる。ナノポア１０２は、均一な直径を有していてもよいが、部位により異なる直径を有してもよい。ナノポア１０２は、1μm以上の直径を有するポアと連結していてもよい。
【００３７】
ナノポア基板１０３の薄膜に設けるナノポア１０２は、最小直径部、すなわち当該ナノポア１０２の有する最も小さい直径が、直径100nm以下、例えば1nm〜100nm、好ましくは1nm〜50nm、例えば1nm〜10nmであり、具体的には1nm以上5nm以下、3nm以上5nm以下などであることが好ましい。
【００３８】
ssDNA（1本鎖DNA）の直径は約1.5nmであり、ssDNAを分析するためのナノポア直径の適切な範囲は1.5nm〜10nm程度、好ましくは1.5nm〜2.5nm程度である。dsDNA（2本鎖DNA）の直径は約2.6nmであり、dsDNAを分析するためのナノポア直径の適切な範囲は3nm〜10nm程度、好ましくは3nm〜5nm程度である。他の生体高分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、糖鎖などを分析対象とする場合も同様に、生体高分子の外径寸法に応じたナノポア直径を選択することができる。
【００３９】
ナノポア１０２の深さ（長さ）は、基板１０３又は基板１０３の薄膜の厚さを調整することにより調整することができる。ナノポア１０２の深さは、分析対象の生体高分子を構成するモノマー単位とすることが好ましい。例えば生体高分子として核酸を選択する場合には、ナノポア１０２の深さは、塩基1個以下の大きさ、例えば約0.3nm以下とすることが好ましい。ナノポア１０２の形状は、基本的には円形であるが、楕円形や多角形とすることも可能である。
【００４０】
ナノポア１０２は、基板１０３に少なくとも1つ設けることができ、複数のナノポア１０２を設ける場合に、規則的に配列してもよい。ナノポア１０２は、当技術分野で公知の方法により、例えば透過型電子顕微鏡（TEM）の電子ビームを照射することにより、ナノリソグラフィー技術又はイオンビームリソグラフィ技術などを使用することにより形成することができる。絶縁破壊によって基板にナノポア１０２を形成してもよい。
【００４１】
チャンバー部１０１は、試料導入区画１０４及び試料流出区画１０５、ナノポア基板１０３、電極１１４、１１５、並びに生体試料１１３をナノポア１０２に通過させるための電極等を有する。好適な例では、チャンバー部１０１は、試料導入区画１０４及び試料流出区画１０５、試料導入区画１０４に設けた第１の電極１１４、試料流出区画１０５に設けた第２の電極１１５、第１、第２の電極に対する電圧印加手段１１６等を有する。試料導入区画１０４に設けた第１の電極１１４、試料流出区画１０５に設けた第２の電極１１５の間には、電流計が配置されていてもよい。第１の電極１１４と第２の電極１１５の間の電流は、試料のナノポア通過速度を決定する点で適宜定めればよく、例えば、試料を含まないイオン液体を用いた場合、DNAであれば100mV〜300mV程度が好ましいが、この値に限定されない。
【００４２】
電極は、金属、例えば白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウムなどの白金族、金、銀、銅、アルミニウム、ニッケルなど；グラファイト、例えばグラフェン（単層又は複層のいずれでもよい）、タングステン、タンタルなどから作製することができる。
【００４３】
電圧印加によってナノポア１０２を通過する生体試料（核酸分子）１１３は、励起光によってラマン光を発するが、ナノポア近傍に導電性薄膜を用意し近接場を発生させ増強してもよい。封鎖電流だけでなく、ラマン光から得られる情報を加味して塩基判定精度を高くすることも可能である。ナノポア近傍に設置する導電性薄膜は、薄膜の定義から明らかな通り、平面状に形成する。導電性薄膜の厚さは、採用する材料に応じて、0.1nm〜10nm、好ましくは0.1nm〜7nmとする。導電性薄膜の厚さが小さいほど、発生する近接場を限定することができ、高分解能かつ高感度での解析が可能となる。また導電性薄膜の大きさは特に限定されるものではなく、使用する固体基板及びナノポアの大きさ、使用する励起光の波長などに応じて適宜選択することができる。なお、導電性薄膜が平面状でなく、屈曲などが存在すると、その屈曲部において近接場が誘起され光エネルギーが漏出し、標的外の場所においてラマン散乱光を発生させる。すなわち背景光が増大し、S/Nが低下する。そのため、導電性薄膜は平面状であることが好ましく、換言すると断面形状は屈曲のない直線状であることが好ましい。導電性薄膜を平面状に形成することは、背景光の低減、S/N比の増大に効果があるだけではなく、薄膜の均一性や作製における再現性などの観点からも好ましい。
【００４４】
（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態について説明する。本実施の形態においては、第１の実施の形態における攪拌部１１８として、図２に示すような構成を用いている。
【００４５】
すなわち、本実施の形態では、対流を利用し生体試料１１３の入った液体１１０の攪拌を行う攪拌部１１８の一例として、生体試料１１３である核酸分子を高頻度にナノポア１０２を通過させるために、試料導入区画１０５の上面に設けた加熱部２０１を加熱することによって試料導入区画１０４内の溶液を対流させるものである。加熱部２０１は、例えば、試料導入区画１０４の試料流出区画１０５とは反対側の面に設けると良い。
【００４６】
加熱部２０１により、生体試料１１３の入った液体１１０を加熱することによって、試料導入区画１０４内の温度が上昇し、核酸分子のブラウン運動が大きくなり、生体試料１１３の通過頻度が増す。
【００４７】
但し、加熱することによって試料導入区画１０４内の温度が上昇し、核酸分子のブラウン運動が大きくなり、ナノポア１０２を通過する封鎖電流計測のノイズとなり阻害要因となる場合は、冷却部２０２により冷却することにより試料導入区画１０４内に温度差を作り、緩やかな対流であるベナール対流を発生させてもよい。尚、ベナール対流とは、水平な液層を下から加熱または上から冷やして上下の温度勾配を与えたとき、温度勾配がある臨界値を超えると、液層はほぼ正6角形の細胞状の渦領域に分れて、中心部では上向き、周辺部では下向きの流れが生じる現象である。この現象を支配する無次元数としてレイリー数RaLが導入され、RaLが臨界値Racをわずかに超えた状態では4〜6角形のほぼ同じ大きさの細胞状の渦領域が一面に現われるが、RaLが増すと細胞状の渦領域は1列に連なって平行な帯状の構造をつくる。この帯状構造は交互に逆回転するロール状の渦からなり、RaLがRacの10倍程度になるまでは安定に保たれるが、それ以上になると崩壊して対流は乱流状態になることが知られ、レイリー数RaLが1710以上の時に、ベナールセルを形成し、対流が発生する。 
【００４８】
【数１】
2017090087.tif 000003
【００４９】
ここで、パラメータは以下の通りである。
ｇ：重力加速度
β：体膨張係数
V：動粘性係数
α：熱拡散率
Ｌ：高温部（Ｔ１）と低温部（Ｔ２）の距離
【００５０】
例えば、図２の構成において溶媒として水を使用し、Ｌ＝1mm、温度差10Ｋとした時、RaL=2604となりベナールセルを形成した対流が発生し、試料導入区画１０４の試料が攪拌することができる。冷却部２０２を温度２５℃固定で温度制御を行った場合の数値流体力学解（Computational Fluid Dynamics）を実施した結果（CD-adapco社製解析ソフトSTAR-CCM+使用）を図３に示す。図３に示すように温度差がおよそ１０℃近辺からベナールセルが形成され試料導入区画１０４内の溶液が攪拌されていることが分かる。温度差の拡大と共にベナールセルの形成が活発になり、解析上温度差が１７℃近辺で乱流となり活発な攪拌が行われる。したがって、加熱部２０１と冷却部２０２とは攪拌機構として動作することがわかる。尚、図３の右列のデータは、線積分畳み込み法（Line Integral Convolution LIC)を用いて流線を描写したものである。
【００５１】
温度差のみで対流が発生するこの現象を利用すると良い。生体試料１１３である分子の振動が熱に依存するブラウン運動が計測に影響する場合、振動を軽減する為に低温で対流を起こして生体試料１１３の攪拌を行うことも可能である。電荷供給源として、塩化カリウム、塩化リチウムなどを選択し水を溶媒として封鎖電流計測が一般的に実施されるが、この溶液条件では0℃以下では氷結してしまう。例えば、エタノール、アセトンなどのような凝固点の低い溶媒を使用し0℃以下の低い温度で温度差を作ることにより、ブラウン運動が抑制され、ノイズが低減した計測を行ってもよい。
【００５２】
図２では加熱部２０１を、ナノポア基板１０３の下に配置したが例えば試料導入区画１０４の側面に配置してもよい。つまり、温度差によって対流が発生し試料が対流によってナノポア１０２近傍に移動する位置に加熱部２０１を配置すればよい。例えば、図４に示すように、加熱部４０１を試料流出区画１０５の下方に設けて、試料流出区画１０５内の温度を上昇させることによって、試料導入区画１０４の底部を過熱させ、試料導入区画１０４の上部と底部で温度差を作り対流を生み出してもよい。正しく温度差を制御し、対流を制御するために対流を発生させたい槽の上部や下部に温度センサーを設けてもよい。さらに、加熱部２０１や冷却部２０２に正しく温度制御が行われているか温度センサーを設けてもよい。例えば、冷却部２０２はペルチェ素子などを用いて冷却してもよいが、冷却の為の機器を用意せず、容器を架設した室温の状態とし、この室温状態を温度センサーで検出した値に対して適切な温度差が生まれるように、加熱部２０１で加熱を行ってもよい。また、容器の隅の箇所を湾曲させるなどによって、攪拌の効率を上げてもよい。
【００５３】
（第３の実施の形態）
本発明の第３の実施の形態では、計測中に常時対流を用いて生体試料の攪拌を行うのではなく、生体試料の通過効率を計測し、通過頻度が減少した際に生体試料を含んだ溶液の攪拌を行うことができる計測容器を用いる。
【００５４】
図５は、本実施の形態における計測装置５００の一構成例を示す図である。
【００５５】
第２の実施の形態では、液体に熱を加えて対流を発生させている。一方、本実施の形態では、計測中の生体試料１１３に余分な熱や力が加わり、生体試料１１３自体の振動や、速い対流によりナノポア１０２に生体試料１１３が取り込まれないなどといったことが原因となり計測に影響を与える場合に、その影響を低減させることが可能である。
【００５６】
生体試料１１３の計測を行いながら、例えば、ある一定時間内での生体試料１１３のナノポア１０２の通過頻度も、例えば電気的な信号値として計測する。そして、通過頻度が期待する通過頻度（しきい値ｆｔｈ）以下の場合に攪拌動作を行う。攪拌動作として、一例として図５に示すような構成の場合は、加熱部４０１と冷却部２０２との温度制御を行い、温度差による対流によって攪拌を行ってもよい。攪拌を目的とした加熱を行った際の余熱によるブラウン運動が測定に影響を与える場合は、攪拌後に冷却機構を用いて溶液をいったん冷却したのちに測定を開始してもよい。このように、本実施の形態では、生体試料誘導部（１１４、１１５、１１６）と、攪拌部（例えば、２０２，４０１）とを有し、これらを独立して制御することができるようにすることで、生体試料１１３を効果的に検出することができる。
【００５７】
図５に示す例では、計測制御部６０１は、通過頻度を計測する計測部６０１ａと、通過頻度に基づいて温度制御を行う制御部６０１ｂとを設けている。
【００５８】
図６は、本実施の形態による処理の流れの一例を示すフローチャート図である。図７は、処理を行う処理部の一構成例を示す機能ブロック図である。図８は、制御の様子の一例を示す図である。
【００５９】
図７に示すように、本実施の形態による計測制御部６０１は、例えば、条件設定部６０１−１と、生体試料（核酸分子）計測部６０１−２と、生体試料（核酸分子）通過頻度計測部６０１−３と、比較部６０１−４と、攪拌指示部６０１−５と、頻度改善判定部６０１−６と、を有する。尚、封鎖電流検出部（検出部）１１４、１１５は、例えば、計測部６０１ａ、又は、生体試料（核酸分子）計測部６０１−２を含んでいても良い。また、封鎖電流の計測以外の方法や封鎖電流にその他の方法を加味した方法により、生体試料を検出しても良い。
【００６０】
図６に示すように、まず、条件設定部６０１−１が、計測条件を設定する（ステップＳ１）が、一般に生体試料１１３の検出条件として、例えばDNAなどの各種塩基の封鎖信号値の判別条件だけでなく、攪拌の為の条件等をメモリなどに設定する。
【００６１】
ここで、攪拌の為の条件設定とは、例えば、攪拌を開始する為のトリガーとなる通過頻度の閾値ｆｔｈの設定である。ある一定時間に通過する生体試料１１３の頻度が低下した場合に攪拌を開始する。通過頻度は、例えば生体試料１１３がナノポア１０２を通過しない状態の電流値から、生体試料１１３がナノポア１０２に進入しポアが封鎖され電流値が小さくなり、生体試料１１３がナノポア１０２を通り抜け元の電流値に戻ることによって通過したことを検知し、時間当たりの頻度を得てカウントする。
【００６２】
測定時間の経過とともに、生体試料１１３の絶対数は減少する為、通過頻度の閾値ｆｔｈは、測定時間と共に変化する様な条件を与えてもよい。複数のナノポア１０２を持った計測容器の場合、多くのナノポア１０２が測定中に攪拌動作に移るのは、計測に影響を与える場合は好ましくない為、計測中のナノポア数の割合を閾値としてもよい。ナノポア１０２に生体試料１１３や溶液中の夾雑物が詰まり、常に電流値が一定で封鎖された状態を示し、計測が不可能になった場合に、攪拌部１１８（加熱部４０１、冷却部２０２等を用いても良い）による攪拌を行い、ナノポア１０２の詰まりを解消してもよく、複数のナノポア１０２の内で計測中のナノポア数の割合を閾値としてもよい。また、攪拌動作に移る前に生体試料１１３であるDNAがナノポア１０２を通過している途中で、読み取っている塩基長が長く（例えば20kbp以上）計測の最中である場合は、続けて計測を行うような設定を行ってもよい。
【００６３】
更に、攪拌の条件として対流の強さを設定してもよい。例えば、加熱部２０１や冷却部２０２の温度を各々設定してもよい。設定する温度差を大きくすることにより乱流を発生させ短時間で攪拌してもよく、計測に影響を与えない程度の緩い対流を起こす条件を設定してもよい。これらの温度の設定は、溶媒の種類や容器の形状によって対流の条件が変わる為、各々の条件を考慮した設定を行う。
【００６４】
ステップＳ３において、生体試料計測部６０１−２が、生体試料に関する各種の計測を行う。また、ステップＳ４において、生体試料通過頻度計測部６０１−３が、ナノポア１０２を通過する生体試料１１３の頻度ｆを計測する。生体試料計測部６０１−２と生体試料通過頻度計測部６０１−３とは、一体であっても良い。
【００６５】
ステップＳ５において、比較部６０１−４が、測定したｆとｆｔｈとの比較を行う。そして、ｆ＞ｆｔｈの場合には（Ｙｅｓ）、ステップＳ３に戻る。ｆ＜＝ｆｔｈの場合には（Ｎｏ）、ステップＳ６に進み、頻度改善判定部６０１−６が、前回の攪拌によりｆの改善効果があったか否かを判定する。ステップＳ６において、Ｙｅｓの場合には、ステップＳ７に進み、攪拌指示部６０１−５が攪拌部１１８に対して攪拌動作を指示し、ステップＳ３に戻る。ステップＳ６でＮｏの場合には、処理を終了する（ステップＳ８）。
【００６６】
図８に示すように、あるタイミングｔ０で、（ａ）の電極１１４、１１５間の電圧印加手段１１６に電圧を印加すると、生体試料１１３の透過頻度ｆが上がる。そして、ある期間が経過すると（ｔ１）、ナノポアにおける試料の詰まりに起因する透過頻度ｆの低下が見られる（破線参照）。例えば、複数あるナノポアにおいて測定したｆが、設定済みのしきい値ｆｔｈよりも低下すると、そのタイミング又はその後のタイミングｔ２で、例えば、攪拌を行う。この例では、加熱用電圧Ｖｈを印加する。
【００６７】
すると、液体に対流が発生し、矢印ＡＲ１で示すように、通過頻度ｆの改善が見られる。このような制御を、例えば継続的に行うことで、効率良く、生体試料１１３をナノポア１０２から効率良く透過させることができ、生体試料の計測をスムーズに行うことができる。
【００６８】
条件設定部６０１−１においては、攪拌後においても、通過頻度が改善しなかった場合において、再度攪拌する回数等の条件を設定するとよい。条件の設定後に計測と共に通過頻度を測定し、通過頻度が低下した時に攪拌を行う動作を繰り返す処理を行うが、所望の通過頻度が攪拌を繰返しても得られない場合に、計測を終了してもよい。ここで示した設定条件は一例であり、これらに限定されない。
【００６９】
尚、攪拌を生じさせるための動作として温度差による対流を起因とする例を上記で示したが、これに限定されない。つまり計測時に攪拌動作が伴う時、計測データに悪影響を与える場合に計測動作と攪拌動作を分離して行う場合に適用可能である。
【００７０】
例えば、容器内に別途電極を追加することにより生体試料１１３を捕捉する電界の偏りを和らげ、ナノポア近傍に生体試料１１３を誘導するように試料導入区画１０４内の溶液を攪拌する手段や、ナノポア近傍に近接場を設け、レーザー照射により溶液を攪拌する手段や、直接、試料導入区画１０４内の溶液をポンプ、オリフィス、攪拌子、ピペット動作などにより溶液を動かすことによって生体試料１１３を攪拌する手段を用いても良い。
【００７１】
本発明の生体試料捕捉技術は、下記に示す効果を有する。
【００７２】
温度制御による液槽内に含まれる生体試料のナノポア通過効率向上は、生体試料に対し特別な反応工程を必要としない為、解析者の作業負担を軽減させる効果がある。
【００７３】
更に、液槽内全ての生体試料をナノポア近傍に運ぶことが可能である為、液槽中の溶媒内に試料が選別されることなくナノポアから離れた位置にある試料を引き寄せ、積極的にナノポアを通過させることが可能になる。
【００７４】
例えば、臨床検体である生体試料を様々な角度から複数の検査を行う場合、各検査に試料を分けて用いる為、十分な試料量を確保する必要が有る。しかし、小児や重症患者から例えば血液などの試料を多く採血するのは困難な場合もあるが、そのような課題を解決することができる。
【００７５】
また、液槽外からの温度管理も可能であるため、電極設置やナノポア配置間隔において制限が無く、通過効率の為に精密な加工を必要としない。
【００７６】
また、温度差で対流を発生させる為、検出時における試料のブラウン運動による検出時ノイズを低減することが可能になる。
【００７７】
処理および制御は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）やＧＰＵ（Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）によるソフトウェア処理、ＡＳＩＣ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ）やＦＰＧＡ（Ｆｉｅｌｄ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｇａｔｅ  Ａｒｒａｙ）によるハードウェア処理によって実現することができる。
【００７８】
上記の実施の形態において、添付図面に図示されている構成等については、これらに限定されるものではなく、本発明の効果を発揮する範囲内で適宜変更することが可能である。その他、本発明の目的の範囲を逸脱しない限りにおいて適宜変更して実施することが可能である。
【００７９】
また、本発明の各構成要素は、任意に取捨選択することができ、取捨選択した構成を具備する発明も本発明に含まれるものである。
【符号の説明】
【００８０】
１０１  観察容器（チャンバー部）
１０２  ナノポア
１０３  ナノポア基板（基板）
１０４  試料導入区画（第１のチャンバー）
１０５  試料流出区画（第２のチャンバー）
１０６、１０７  流入路
１０８、１０９  流出路
１１０、１１１  液体
１１３  生体試料
１１６  電圧印加手段（生体試料誘導部）
１１４、１１５  電極（生体試料誘導部）、検出部（封鎖電流検出部）
１１８  攪拌部
２０１  加熱部
２０２  冷却部
４０１  加熱部
４０３ａ、４０３ｂ、４０３ｃ、４０３ｄ  温度センサー
５００  計測装置
６０１  計測制御部
６０１−１  条件設定部
６０１−２  生体試料（核酸分子）計測部
６０１−３  生体試料（核酸分子）通過頻度計測部
６０１−４  比較部
６０１−５  攪拌指示部
６０１−６  頻度改善判定部【００８１】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2017090087.tif 000005
【図２】
2017090087.tif 000006
【図３】
2017090087.tif 000007
【図４】
2017090087.tif 000008
【図５】
2017090087.tif 000009
【図６】
2017090087.tif 000010
【図７】
2017090087.tif 000011
【図８】
2017090087.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成28年4月11日(2016.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノポアを用いた生体試料分析装置であって、
溶媒を収容した第１のチャンバーと、
生体試料が通過するナノポアを有する基板と、
前記基板を介して前記第１のチャンバーと隣接する位置に配置され、溶媒を収容した第２のチャンバーと、
前記第１のチャンバーから前記第２のチャンバーに前記生体試料を誘導する生体試料誘導部と、
ナノポアを通過する前記生体試料を検出する検出部と、を有し、
前記生体試料誘導部は、
前記第１のチャンバー内の溶媒をベナール対流によって生体試料をナノポアに誘導することを特徴とする生体試料分析装置。
【請求項２】
前記検出部による検出結果に基づいて、前記ベナール対流による生体試料のナノポアへの誘導を制御する制御部を有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項３】
前記検出部は、
前記ナノポアを通過する前記生体試料の通過頻度を計測する計測部を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の生体試料分析装置。
【請求項４】
前記第１のチャンバー上部と第１のチャンバー下部に温度差を作る加熱部を有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項５】
前記第１のチャンバー上部と第１のチャンバー下部に温度差を作る冷却部を有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項６】
前記ベナール対流による生体試料のナノポアへの誘導は、以下に式により制御することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
５＜ＲａＬ＜１７１０
但し、
2017090087.tif 000013
ここで、パラメータは以下の通りである。
ｇ：重力加速度
β：体膨張係数
Ｖ：動粘性係数
α：熱拡散率
Ｌ：加熱部と冷却部の距離
Ｔ１：第１のチャンバー上部の溶液温度
Ｔ２：第１のチャンバー下部の溶液温度
【請求項７】
前記制御部は、
前記検出部の検出結果を基に、前記ベナール対流によって生体試料がナノポアへ誘導するタイミングを制御することを特徴とする請求項２に記載の生体試料分析装置。
【請求項８】
前記制御部は、
前記生体試料が前記ナノポアを通過する頻度が所定の値以下の場合に、前記ベナール対流によって生体試料がナノポアへ誘導することを特徴とする請求項７に記載の生体試料分析装置。
【請求項９】
前記第２のチャンバーの内側底面の外周が丸みをおびていることを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１０】
前記溶媒の融点が０℃未満であることを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１１】
前記第１のチャンバーの上部の温度を測定する第１の温度センサーを有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１２】
前記第１のチャンバーの下部の温度を測定する第２の温度センサーを有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
ナノポアを用いた生体試料分析方法であって、
溶媒を収容した第１のチャンバーから、生体試料が通過可能なナノポアを通過して前記第１のチャンバーと隣接する位置に配置され溶媒を収容した第２のチャンバーに生体試料を誘導する生体試料誘導ステップと、
前記ナノポアを通過する前記生体試料を検出する検出ステップと、を有し、
前記生体試料誘導ステップは、
前記第１のチャンバー内の溶媒をベナール対流によって生体試料をナノポアに誘導することを特徴とする生体試料分析方法。
【手続補正書】
【提出日】平成30年4月27日(2018.4.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノポアを用いた生体試料分析装置であって、
溶媒を収容した第１のチャンバーと、
生体試料が通過するナノポアを有する基板と、
前記基板を介して前記第１のチャンバーと隣接する位置に配置され、溶媒を収容した第２のチャンバーと、
前記第１のチャンバーから前記第２のチャンバーに前記生体試料を誘導する生体試料誘導部と、
ナノポアを通過する前記生体試料を検出する検出部と、を有し、
前記生体試料誘導部は、
前記第１のチャンバー内の溶媒をベナール対流によって生体試料をナノポアに誘導することを特徴とする生体試料分析装置。
【請求項２】
前記検出部による検出結果に基づいて、前記ベナール対流による生体試料のナノポアへの誘導を制御する制御部を有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項３】
前記検出部は、
前記ナノポアを通過する前記生体試料の通過頻度を計測する計測部を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の生体試料分析装置。
【請求項４】
前記第１のチャンバー上部と第１のチャンバー下部に温度差を作る加熱部を有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項５】
前記第１のチャンバー上部と第１のチャンバー下部に温度差を作る冷却部を有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項６】
前記ベナール対流による生体試料のナノポアへの誘導は、以下に式により制御することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
５＜ＲａＬ＜１７１０
但し、
2017090087.tif 000014
ここで、パラメータは以下の通りである。
ｇ：重力加速度
β：体膨張係数
Ｖ：動粘性係数
α：熱拡散率
Ｌ：加熱部と冷却部の距離
Ｔ１：  第１のチャンバー上部の溶液温度
Ｔ２：  第１のチャンバー下部の溶液温度
【請求項７】
前記制御部は、
前記検出部の検出結果を基に、前記ベナール対流によって生体試料がナノポアへ誘導するタイミングを制御することを特徴とする請求項２に記載の生体試料分析装置。
【請求項８】
前記制御部は、
前記生体試料が前記ナノポアを通過する頻度が所定の値以下の場合に、前記ベナール対流によって生体試料がナノポアへ誘導することを特徴とする請求項７に記載の生体試料分析装置。
【請求項９】
前記第２のチャンバーの内側底面の外周が丸みをおびていることを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１０】
前記溶媒の融点が０℃未満であることを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１１】
前記第１のチャンバーの上部の温度を測定する第１の温度センサーを有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１２】
前記第１のチャンバーの下部の温度を測定する第２の温度センサーを有することを特徴とする請求項１に記載の生体試料分析装置。
【請求項１３】
ナノポアを用いた生体試料分析方法であって、
溶媒を収容した第１のチャンバーから、生体試料が通過可能なナノポアを通過して前記第１のチャンバーと隣接する位置に配置され溶媒を収容した第２のチャンバーに生体試料を誘導する生体試料誘導ステップと、
前記ナノポアを通過する前記生体試料を検出する検出ステップと、を有し、
前記生体試料誘導ステップは、
前記第１のチャンバー内の溶媒をベナール対流によって生体試料をナノポアに誘導することを特徴とする生体試料分析方法。
【国際調査報告】
2017090087.tif 000015
2017090087.tif 000016
2017090087.tif 000017
2017090087.tif 000018