(57)【要約】  角膜上皮障害、ドライアイ、角膜知覚低下等の角膜障害の予防又は治療剤を提供することを課題とし、該課題を、アンジオポエチン様タンパク質７を有効成分として用いることにより解決する。
2016167363.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンジオポエチン様タンパク質７を含有する、角膜障害の予防又は治療剤。
【請求項２】
前記角膜障害が角膜上皮障害、ドライアイ、及び角膜知覚低下からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
アンジオポエチン様タンパク質７を含有する、角膜組織修復促進剤。
【請求項４】
前記角膜組織が角膜上皮、及び角膜神経からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３に記載の剤。
【請求項５】
アンジオポエチン様タンパク質７を含有する、眼神経突起形成促進剤。
【請求項６】
前記眼神経が角膜神経である、請求項５に記載の剤。
【請求項７】
アンジオポエチン様タンパク質７を含有する、眼科組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角膜上皮障害、ドライアイ、角膜知覚低下等の角膜障害の予防又は治療剤に関する。さらには、角膜組織修復促進剤、及び眼神経突起形成促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
角膜組織は、種々の要因、例えば涙液の減少、角膜知覚の低下、糖尿病、微生物感染等の内的要因；  薬剤、外傷、コンタクトレンズ、光等の外的要因等によって損傷を受ける。これによって起こる角膜障害は、重度の場合は失明に至ることもあり、また軽度の場合であっても損傷部位に微生物が感染することにより、重症化することがある。このため、角膜障害に対しては適切な治療を施すこと、或いは内的要因を取り除くことによって予防を図ることが肝要である。【０００３】
ドライアイは、涙液の量が減少したり涙液の質が変化したりすることにより、角膜障害に繋がる疾患である。近年、ＶＤＴ作業の増加、コンタクトレンズ装用者の増加等に伴ってドライアイ患者が増加しており、その患者数は潜在的患者も含めると約８００万人にものぼるといわれている。【０００４】
レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）、レーザー角膜切削形成術（レーシック；ＬＡＳＩＫ）、レーザー上皮角膜曲率形成術（ラセック；ＬＡＳＥＫ）、角膜移植等の角膜手術後には、角膜神経が切断されるため、通常約３週間から１年間、角膜知覚の低下症状が起きるといわれている。角膜知覚の低下は、涙液分泌の低下を招き、これにより角膜障害が起こり、最終的には涙腺障害を引き起こし、これらが悪循環することが知られている（非特許文献１）。【０００５】
一方、アンジオポエチン様タンパク質（ＡＮＧＰＴＬ）は、アンジオポエチンに構造的に類似するタンパク質として知られており、ヒトにおいては現在までに７種類が同定されている。その１つであるＡＮＧＰＴＬ７は、眼組織において、角膜実質、ボーマン膜、強膜、シュレム管内皮、繊維柱帯、及び視神経の篩板に発現していることが報告されている。ＡＮＧＰＴＬ７は、その機能として、角膜の透明性維持に関与していること（非特許文献２）、腫瘍成長抑制及び血管新生抑制（非特許文献３）に関与していること、角膜への血管侵入を抑制していること（非特許文献４）等が報告されている。【０００６】
しかし、ＡＮＧＰＴＬ７の、角膜上皮障害、ドライアイ、角膜知覚低下等の角膜障害に対する効果については全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Mathers WD, Why the eye becomes dry: a cornea and lacrimal gland feedback model. CLAO J. Vol. 26, No.3 159-165 (2000)
【非特許文献２】Ron Peek, B. Elske van Gelderen, Marcel Bruinenberg, Aize Kijlstra, Molecular Cloning of a New Angiopoietinlike Factor from the Human Cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol. 39, No. 10 1782-1788 (1998)
【非特許文献３】John Kuchtey, Maria E. Ka¨llberg, Kirk N. Gelatt, Tommy Rinkoski, Andra´s M. Koma`romy, Rachel W. Kuchtey, Angiopoietin-like 7 Secretion Is Induced by Glaucoma Stimuli and Its Concentration Is Elevated in Glaucomatous Aqueous Humor. Ophthalmology & Visual Science, Vol. 49, No. 8 3438-3448 (2008)
【非特許文献４】Tetsuya Toyono, Tomohiko Usui, Seiichi Yokoo, Yukako Taketani, Suguru Nakagawa, Masahiko Kuroda, Satoru Yamagami, Shiro Amano, Angiopoietin-Like 7 Is an Anti-Angiogenic Protein Required to Prevent Vascularization of the Cornea. PLoS ONE 10(1): e0116838. doi:10.1371/journal.pone.0116838
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、角膜上皮障害、ドライアイ、角膜知覚低下等の角膜障害の予防又は治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、アンジオポエチン様タンパク質７が角膜組織修復促進作用、及び眼神経突起形成促進作用を有すること、さらには角膜上皮障害、ドライアイ、角膜知覚低下等の角膜障害の予防又は治療に有用であることを見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。【００１０】
即ち、本発明は、下記の態様を包含する。【００１１】
項１．  アンジオポエチン様タンパク質７を含有する、角膜障害の予防又は治療剤。【００１２】
項1-1．  角膜障害の予防又は治療剤としての使用のための、アンジオポエチン様タンパク質７。【００１３】
項1-2．  アンジオポエチン様タンパク質を患者に投与することを含む、角膜障害の予防又は治療方法。【００１４】
項1-3．  角膜障害の予防又は治療剤の製造のための、アンジオポエチン様タンパク質の使用。【００１５】
項２．  前記角膜障害が角膜上皮障害、ドライアイ、及び角膜知覚低下からなる群より選択される少なくとも１種である、項１及び項1-1〜1-3のいずれかに記載の剤。【００１６】
項３．  アンジオポエチン様タンパク質７を含有する、角膜組織修復促進剤。【００１７】
項3-1．  角膜組織修復促進剤としての使用のための、アンジオポエチン様タンパク質７。【００１８】
項3-2．  アンジオポエチン様タンパク質を患者に投与することを含む、角角膜組織修復促進方法。【００１９】
項3-3．  角膜組織修復促進剤の製造のための、アンジオポエチン様タンパク質の使用。【００２０】
項４．  前記角膜組織が角膜上皮、及び角膜神経からなる群より選択される少なくとも１種である、項３及び項3-1〜3-3のいずれかに記載の剤。【００２１】
項５．  アンジオポエチン様タンパク質７を含有する、眼神経突起形成促進剤。【００２２】
項5-1．  眼神経突起形成促進剤としての使用のための、アンジオポエチン様タンパク質７。【００２３】
項5-2．  アンジオポエチン様タンパク質を患者に投与することを含む、眼神経突起形成促進方法。【００２４】
項5-3．  眼神経突起形成促進剤の製造のための、アンジオポエチン様タンパク質の使用。【００２５】
項６．  前記眼神経が角膜神経である、項５及び項5-1〜5-3のいずれかに記載の剤。【００２６】
項７．  アンジオポエチン様タンパク質７を含有する、眼科組成物。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、アンジオポエチン様タンパク質７を有効成分として用いることによって、角膜上皮障害、ドライアイ、角膜知覚低下等の角膜障害の予防又は治療剤を提供することができる。また、アンジオポエチン様タンパク質７の機能（角膜組織修復促進作用、及び眼神経突起形成促進作用）に基づいて、その他種々の疾患の予防又は治療剤を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】角膜上皮剥離直後、及び角膜上皮剥離２４時間後における、眼球のフルオレセイン染色像を示す（試験例１）。
【図２】上段は、試験例２の概略を示す。下段（写真）は、角膜上皮剥離５日後の角膜の、抗β３チューブリン抗体による免疫染色像を示す（試験例２）。
【図３】試験例３の概略を示す（試験例３）。
【図４】Ａδ細胞について、全細胞数中に占める神経突起形成細胞の比率（％）を示す（試験例４）。図中、＊はコントロール群に対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図５】Ａα・Ａβ・Ａδ細胞について、全細胞数中に占める神経突起形成細胞の比率（％）を示す（試験例４）。図中、＊はコントロール群に対する有意差（ｐ＜０．０５）を示す。
【図６】Ａδ細胞について、全細胞数を示す（試験例４）。
【図７】Ａα・Ａβ・Ａδ細胞について、全細胞数を示す（試験例４）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、アンジオポエチン様タンパク質７（本明細書において、「ＡＮＧＰＴＬ７」と略記することもある）を含有する、角膜障害の予防又は治療剤、角膜組織修復促進剤、眼神経突起形成促進剤、又は眼科組成物（本明細書において、これらを総称して「本発明の剤」と示すこともある）に関する。以下、これについて説明する。
【００３０】
ＡＮＧＰＴＬ７（Angiopoietin-like protein又はAngiopoietin-related protein）は、その名称のとおり、アンジオポエチンに類似するタンパク質（ＡＮＧＰＴＬ、ヒトではこれまでＡＮＧＰＴＬ１〜７の７種が同定されている）の１種であり、角膜等の眼組織において発現するタンパク質である。ＡＮＧＰＴＬ７としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類由来のＡＮＧＰＴＬ７を採用することができる。中でも、投与対象の生物種由来のＡＮＧＰＴＬ７が好ましい。
【００３１】
種々の生物種由来ＡＮＧＰＴＬ７のアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、ヒトＡＮＧＰＴＬ７としては配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence： NP_066969.1）が挙げられ、マウスＡＮＧＰＴＬ７としては配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence： NP_001034643.1）等が挙げられる。
【００３２】
ＡＮＧＰＴＬ７として、好ましくは、下記（ａ）に記載するタンパク質及び下記（ｂ）に記載するタンパク質：
（ａ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ角膜組織修復促進作用及び／又は眼神経突起形成促進作用を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。
【００３３】
アミノ酸配列の『同一性』とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（ＫａｒｌｉｎＳ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ．“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｇｅｎｅｒａｌ ｓｃｏｒｉｎｇｓｃｈｅｍｅｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８７：２２６４−２２６８（１９９０）、ＫａｒｌｉｎＳ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ．”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”ＮａｔｌＡｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９０：５８７３−７（１９９３））を用いて決定できる。このようなＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ ｏｆ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照すればよい。
【００３４】
上記（ｂ）において、同一性は、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％
以上であり、よりさらに好ましくは９８％以上である。
【００３５】
角膜組織修復促進作用の有無は、後述の試験例１または試験例２に記載の方法に従って判定することができる。また、眼神経突起形成促進作用の有無は、後述の試験例３に記載の方法に従って判定することができる。
【００３６】
上記（ｂ）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（ｂ’）配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列に対して１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つ角膜組織修復促進作用及び／又は眼神経突起形成促進作用を有するタンパク質が挙げられ、
上記（ｂ’）において、複数個とは、例えば２〜５０個であり、好ましくは２〜３０個であり、より好ましくは２〜１５個であり、よりさらに好ましくは２〜１０個であり、よりさらに好ましくは２〜５個であり、よりさらに好ましくは２又は３個である。
【００３７】
上記（ｂ）及び（ｂ’）に記載されるタンパク質において、変異は、保存的置換であることが好ましい。保存的置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。
【００３８】
例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
【００３９】
上記（ｂ）に記載されるタンパク質において、配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列に対して置換、欠失、付加、又は挿入がある場合、その部位はＡＮＧＰＴＬ７のリガンドとしての機能が損なわれないような部位であることが望ましい。
【００４０】
ＡＮＧＰＴＬ７は、角膜組織修復促進作用及び／又は眼神経突起形成促進作用を有する限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
【００４１】
ＡＮＧＰＴＬ７は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
【００４２】
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００４３】
ＡＮＧＰＴＬ７は、Ｃ末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
【００４４】
さらに、ＡＮＧＰＴＬ７には、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。
【００４５】
ＡＮＧＰＴＬ７は、角膜組織修復促進作用及び／又は眼神経突起形成促進作用を有する限りにおいて、公知のタンパク質タグが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグ等が挙げられる。
【００４６】
ＡＮＧＰＴＬ７は、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；  酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；  アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；  カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
【００４７】
ＡＮＧＰＴＬ７は、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
【００４８】
ＡＮＧＰＴＬ７は、公知の方法に従って、例えば化学合成、哺乳動物の細胞又は組織（眼組織等）からの精製、ＡＮＧＰＴＬ７をコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体からの精製等によって得ることができる。形質転換体からの精製により得る場合、形質転換体としては、ＡＮＧＰＴＬ７をコードするポリヌクレオチドからＡＮＧＰＴＬ７を発現させることができる細胞である限り特に限定されず、大腸菌などの細菌、昆虫細胞、哺乳類細胞等の種々の細胞を利用することができる。
【００４９】
ＡＮＧＰＴＬ７は、生体内において糖鎖が結合した糖タンパク質として存在していると考えられていることから、より生体内に近い状態のＡＮＧＰＴＬ７を得るという観点から、形質転換体は、好ましくは糖鎖修飾が行われる細胞、具体的には昆虫細胞、動物細胞等であることができる。
【００５０】
昆虫細胞としては、例えば、Ｓｆ細胞、ＭＧ１細胞、High FiveTM細胞、ＢｍＮ細胞などが用いられる。Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。
【００５１】
動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ−７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
【００５２】
本発明の剤は、ＡＮＧＰＴＬ７のみからなるものであってもよいし、必要に応じて薬学的に許容される添加剤（本明細書において、単に「添加剤」と示すこともある）を含む組成物であることもできる。
【００５３】
本発明の剤の投与対象としては、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）が挙げられる。
【００５４】
本発明の剤の投与経路は、特に限定されない。例えば、経口投与、経管栄養、注腸投与等の経腸投与；  経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、眼局所投与（例えば点眼投与、硝子体内投与、結膜下投与、テノン嚢下投与等）等の非経口投与等を採用することができる。これらの中でも、本発明の効果をより確実に発揮できるという観点からは、好ましくは非経口投与が挙げられ、より好ましくは眼局所投与が挙げられる。
【００５５】
本発明の剤は、投与経路に適した剤形を採ることができる。経口投与に適した剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などが挙げられ、非経口投与に適した剤形としては、例えば、眼科組成物（眼局所適用剤：点眼剤、眼軟膏、洗眼剤等）、注射剤、貼付剤、ローション剤、クリーム剤などが挙げられる。これらは当該分野で汎用されている通常の技術を用い、調製することができる。また、ＡＮＧＰＴＬ７は、これらの製剤の他に眼内インプラント用製剤やマイクロスフェアー等のＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）化された製剤にすることもできる。
【００５６】
添加剤としては、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、及びキレート剤等が挙げられる。これらは、投与経路、剤形等に応じて適宜選択することができる。
【００５７】
例えば、ＡＮＧＰＴＬ７を有効成分として含有する眼科組成物（眼局所適用剤：点眼剤、眼軟膏、洗眼剤等）を調製する場合、安定剤（例えば、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなど）、溶解補助剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、乳化剤（例えば、ポリビニルピロリドン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０など）、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、イプシロンアミノカプロン酸など）、粘稠剤（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなど）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル類、エデト酸ナトリウム、ホウ酸など）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなど）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸など）、清涼化剤（例えば、ｌ−メントール、ｄ−カンフル、ｄ−ボルネオール、ハッカ油など）、軟膏基剤（白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン、植物油（オリーブ油、椿油、落花生油など）など）などを添加剤として加えることができる。これら添加剤の添加量は、添加する添加剤の種類、用途などによって異なるが、添加剤の目的を達成し得る濃度を添加すればよい。
【００５８】
本発明の剤を点眼剤、眼軟膏剤等の眼科組成物とする場合、製剤分野で通常用いられている方法に従って製造すればよく、例えば第１５改正日本薬局方、製剤総則、点眼剤の項および眼軟膏剤の項に記載された方法に基づき製造することができる。
【００５９】
本発明の剤の投与量は、対象となる疾患により異なり、一概には言えないが、効果を発揮させる標的組織中のＡＮＧＰＴＬ７濃度が、例えば０．００１ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは０．０１ｎＭ〜１００μＭとなるように設定することができる。
【００６０】
本発明の剤を成人の眼に局所的に使用する場合には、例えば０．０１ｎＭ〜１０００μＭ、好ましくは０．１ｎＭ〜１０００μＭのＡＮＧＰＴＬ７を含有する眼科組成物を、１日あたり１〜８回、好ましくは１〜５回に適用するのがよい。適用量については、ＡＮＧＰＴＬ７濃度及び剤形に応じて適宜設定することができる。
【００６１】
ＡＮＧＰＴＬ７は、角膜障害の予防又は治療に有用である。
【００６２】
角膜障害とは、種々の要因により角膜組織が損傷を受けた状態にある疾患をいう。
【００６３】
角膜障害は、好ましくは角膜上皮障害、ドライアイ、角膜知覚低下等であることができる。
【００６４】
角膜上皮障害とは角膜上皮細胞増殖能が抑制されたり、上皮脱落が亢進すると上皮恒常性のバランスが崩れ発症する疾患である。また、角膜上皮障害とは、角膜潰瘍、角膜上皮剥離、糖尿病性角膜症、乾性角結膜炎、慢性表層角膜炎、点状表層角膜症、角膜糜爛、遷延性角膜上皮欠損などの内因性疾患、薬剤性、外傷、コンタクトレンズ装着等による外因性疾患、または物理的もしくは化学的障害によって、角膜上皮が損傷を受けることを意味する。
【００６５】
ドライアイとは、様々な要因による涙液および角結膜上皮の慢性疾患であり、眼不快感や視機能異常を伴う疾患である。涙液の異常としては、涙液量が減少する量的異常と涙液の性質や涙液を保持する能力が変化する質的異常とがある。また、ドライアイとしては、例えば涙液減少症；涙液蒸発亢進型ドライアイ；シェーグレン症候群；スティーブンス−ジョンソン症候群；角膜上皮糜爛、眼瞼縁炎、眼類天疱瘡、春季カタル、アレルギー性結膜炎、ビタミンＡ欠乏症などに伴うドライアイなどが挙げられる。
【００６６】
角膜知覚低下としては、角膜上皮障害、ドライアイ、神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、神経栄養性角膜症、糖尿病性角膜症、角結膜炎（流行性角結膜炎、単純ヘルペス角膜炎）、円錐角膜、角膜変性症等の疾患や、白内障手術、硝子体手術やＰＲＫ、ＬＡＳＩＫ、ＬＡＳＥＫまたは角膜移植手術などの角膜手術に伴う角膜知覚低下が挙げられる。角膜知覚の低下およびその改善は、コシュ・ボネ（Cochet-Bonnet aesthesiometer）角膜知覚計等の知覚計を用いて常法に従って測定することができる。
【００６７】
ドライアイ患者では涙液機能の低下が、角膜知覚の低下をもたらし、この角膜知覚低下がさらなる涙液機能の低下を導くことが知られている。この悪循環が、ドライアイ症状を亢進させ、さらには角膜上皮障害を引き起こすことが報告されている。例えば、Mathersの論文（CLAO J. 2000, 26, 159.）には、涙腺と角膜は、疾病の発症において密接に一体化したものであり、涙腺の疾病は眼表面に影響し、眼表面の疾病は涙腺に影響する「corneal lacrimal gland feedback model」が記載されている。そして、角膜知覚低下が涙液分泌低下を招き、次いで角膜上皮障害へと導き、その結果として、涙腺障害を引き起こし、これらが悪循環することが示されている（特に161頁、右カラムの39〜45行目）。Angらの論文（Curr Opin Ophthalmol. 2001, 12, 318.）には、点状表層角膜症等の角膜上皮障害の主な原因が角膜知覚の低下であり、その結果として涙腺へのフィードバックが低下し、涙液の産生が減少することが述べられている。また、Xuらの論文（Cornea 1996, 15, 235.）には、涙液の減少が角膜上皮の形態学的変化を引き起こし、角膜知覚の低下を引き起こすことが述べられている（例えば238頁、右カラムの44〜47行目）。一方、Fujishimaらの論文（Cornea 1996, 15, 368.）では、アルドース還元酵素阻害薬を用いた研究において、涙液動態の改善が角膜知覚の改善の結果であることが示唆されている。このように、角膜上皮障害、ドライアイ、角膜知覚低下は、密接に関連しており、それぞれが他の疾患の原因となっていると考えられている。ＡＮＧＰＴＬ７は、角膜組織修復促進作用及び／又は眼神経突起形成促進作用に基づいて、角膜組織の修復と角膜知覚の低下の改善の双方を行うことができるので、上記疾患を効率的に予防又は治療することが期待できる。
【００６８】
角膜組織修復とは、角膜障害の改善、好ましくは治癒をもたらすことをいう。
【００６９】
また、眼神経突起形成とは、眼神経細胞の細胞体から出る突起（樹状突起および軸索）が生成および／または伸長することをいう。
【００７０】
角膜組織は、角膜中の組織であれば特に限定されず、好ましくは角膜上皮、及び角膜神経（本明細書中において、三叉神経と記載することもある）であることができる。また、眼神経は、眼組織に存在する神経であれば特に限定されず、例えば角膜神経、網膜神経、動眼神経、毛様体神経節を始めとする様々な神経を包含する。これらの中でも、好ましくは角膜神経が挙げられる。
【００７１】
角膜神経とは、知覚神経である三叉神経の支配を受け角膜周囲に形成される輪状神経叢、角膜実質に網目状に分布する実質内神経叢、ボーマン膜直下で形成される上皮下神経叢、ボーマン膜を貫通したところで形成される基底細胞神経叢および神経線維をいう。
【実施例】
【００７２】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００７３】
試験例１：角膜外傷後の角膜組織修復に対するＡＮＧＰＴＬ７の効果
1-1．使用動物
体重約２０ｇの雄性のC57BL/6マウスを用いた。飼育は温度２４±４℃、湿度５５±１５％の条件で行なった。【００７４】
1-2．被験物質
マウス由来組換えアンジオポエチン様タンパク質７（R&D Systems、４９６０−ＡＮ−０２５/ＣＦ）（ 以下、ｒｍＡＮＧＰＴＬ７と記載する）を使用した。【００７５】
1-3．試験方法
マウスをｒｍＡＮＧＰＴＬ７投与群５眼、コントロール（ＰＢＳ投与）群４眼に群分けした。各マウスに、５％ケタミン及び２％キシラジン等量混合液の筋肉注射による全身麻酔及び塩酸オキシブプロカインによる点眼局所麻酔を施した。７０％エタノール５μＬを角膜に滴下後ただちにスパーテルで角膜上皮を鈍的に剥離した。フルオレセイン染色を行い、角膜上皮剥離直後及び角膜上皮剥離２４時間後にスリットランプで観察した。被験物質は角膜上皮剥離した直後に結膜下注射により投与（５００μｇ／ｍＬ となるようにＰＢＳに溶解したものを５μＬずつ上下の結膜下に投与）した。コントロール群は生理食塩水を同様に結膜下投与した。【００７６】
1-4．試験結果
図１の上段は角膜上皮剥離直後の観察像を示し、図１の下段は角膜上皮剥離２４時間後の観察像を示す。図１の左側はコントロール群の観察像を示し、図１の右側は被験物質（ＡＮＧＰＴＬ７）投与群の観察像を示す。観察像中、黄色、黄緑色、及び緑色の部分は角膜上皮が剥離した部分を示し、青色の部分は角膜上皮が剥離していない部分、或いは角膜上皮剥離後に修復した部分を示す。【００７７】
角膜上皮剥離直後は角膜全体にわたって角膜上皮が剥離していた（図１の上段）。角膜上皮剥離２４時間後は、コントロール群及び被験物質投与群の両方において、角膜上皮が修復されていたが、被験物質投与群の方がより修復部分（青色部分）の面積が大きかった（図１の下段）。【００７８】
以上の結果より、ＡＮＧＰＴＬ７は、角膜組織修復促進作用を有することが明らかにされた。【００７９】
試験例２：角膜外傷後の角膜神経修復（角膜中心部）に対するＡＮＧＰＴＬ７
2-1．使用動物
体重約２０ｇの雄性のC57BL/6マウスを用いた。飼育は温度２４±４℃、湿度５５±１５％の条件で行なった。【００８０】
2-2．被験物質
マウス由来組換えＡＮＧＰＴＬ７（R&D Systems、４９６０−ＡＮ−０２５/ＣＦ）（以下、ｒｍＡＮＧＰＴＬ７と記載する）を使用した。【００８１】
2-3．試験方法
試験例１と同様に角膜上皮を剥離し、被験物質は角膜上皮剥離直後に結膜下注射により投与（５００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解したものを５μＬずつ上下の結膜下に投与）した。コントロール群は生理食塩水を同様に結膜下投与した。角膜上皮剥離５日後に頸椎脱臼で死亡させ、眼球を摘出した。眼球をザンボニ固定液に浸漬し、室温下で１０分から１５分間振盪させた後、ザンボニ固定液を生理食塩液に置き換えた。図２の上段に示すように、赤道部で眼球を半分に分割し、角膜を含む前眼部を採取し、水晶体と虹彩を除去した。組織片を再度ザンボニ固定液浸漬し、室温下で４５分間振盪することにより追加固定した後、ザンボニ固定液をＰＢＳに置き換えた。【００８２】
免疫染色は、抗β３チューブリン抗体を用いて行った。固定した組織片をブロッキングバッファー（５％正常ヤギ血清、２％スキムミルク、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳ）中で室温下２時間ブロッキングした。一次抗体（抗β３チューブリン抗体、ａｂ１８２０７、アブカム）をブロッキングバッファーで５００分の１に希釈し、この一次抗体希釈液中で組織片を４℃で終夜反応させた。一次抗体反応後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳで組織片を洗浄（９０分間×３回）した。二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ａ１１０３４、ライフテクノロジーズ）をブロッキングバッファーで２００分の１に希釈し、この二次抗体希釈液中で組織片を室温下２時間反応させた。二次抗体反応後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳで組織片を洗浄（９０分間×３回）し、さらにＰＢＳで洗浄（４５分間×３回）した。組織片をスライドガラスに貼付し、退色防止剤（ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて封入し、共焦点顕微鏡（カールツァイス）下で観察した。また、染色された細胞像は共焦点顕微鏡からコンピュータに画像として取り込んだ。図２の上段に示すように、観察は、角膜の中心から角膜の中間までの領域（領域Ａ）の４か所において行った。【００８３】
2-4．試験結果
観察結果を図２の下段に示す。図２中、無処置群は角膜上皮剥離を行っていない角膜の免疫染色画像である。図２の下段に示されるように、領域Ａについては、コントロール群及びｒｍＡＮＧＰＴＬ７投与群の両方神経線維が確認されたが、ｒｍＡＮＧＰＴＬ７投与群の方が線維の数が明らかに多かった。【００８４】
以上の結果より、ＡＮＧＰＴＬ７は、角膜神経修復促進作用を有することが明らかとなった。【００８５】
試験例３：角膜外傷後の角膜神経修復（角膜周辺部）に対するＡＮＧＰＴＬ７
3-1．使用動物
体重約２０ｇの雄性のC57BL/6マウスを用いる。飼育は温度２４±４℃、湿度５５±１５％の条件で行う。【００８６】
3-2．被験物質
マウス由来組換えＡＮＧＰＴＬ７（R&D Systems、４９６０−ＡＮ−０２５/ＣＦ）（ 以下、ｒｍＡＮＧＰＴＬ７と記載する）を使用する。【００８７】
3-3．試験方法
試験例１と同様に角膜上皮を剥離し、被験物質は角膜上皮剥離直後に結膜下注射により投与（５００μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解したものを５μＬずつ上下の結膜下に投与）する。コントロール群は生理食塩水を同様に結膜下投与する。角膜上皮剥離５日後に頸椎脱臼で死亡させ、眼球を摘出する。眼球をザンボニ固定液に浸漬し、室温下で１０分から１５分間振盪させた後、ザンボニ固定液を生理食塩液に置き換える。図３の上段に示すように、赤道部で眼球を半分に分割し、角膜を含む前眼部を採取し、水晶体と虹彩を除去する。組織片を再度ザンボニ固定液浸漬し、室温下で４５分間振盪することにより追加固定した後、ザンボニ固定液をＰＢＳに置き換える。【００８８】
免疫染色は、抗β３チューブリン抗体を用いて行う。固定した組織片をブロッキングバッファー（５％正常ヤギ血清、２％スキムミルク、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳ）中で室温下２時間ブロッキングする。一次抗体（抗β３チューブリン抗体、ａｂ１８２０７、アブカム）をブロッキングバッファーで５００分の１に希釈し、この一次抗体希釈液中で組織片を４℃で終夜反応させる。一次抗体反応後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳで組織片を洗浄（９０分間×３回）する。二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ４８８ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ａ１１０３４、ライフテクノロジーズ）をブロッキングバッファーで２００分の１に希釈し、この二次抗体希釈液中で組織片を室温下２時間反応さる。二次抗体反応後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳで組織片を洗浄（９０分間×３回）し、さらにＰＢＳで洗浄（４５分間×３回）する。組織片をスライドガラスに貼付し、退色防止剤（ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にて封入し、共焦点顕微鏡（カールツァイス）下で観察する。また、染色された細胞像は共焦点顕微鏡からコンピュータに画像として取り込む。図３に示すように、観察は、角膜の中心から角膜の中間までの領域（領域Ｂ）の８か所において行う。【００８９】
コントロール群及びｒｍＡＮＧＰＴＬ７投与群の両方神経線維を比較し、ｒｍＡＮＧＰＴＬ７投与群の方が線維の数が多ければ、ＡＮＧＰＴＬ７が角膜神経修復促進作用を有することを確認できる。【００９０】
試験例４：三叉神経細胞の神経突起形成に対するＡＮＧＰＴＬ７の効果
4-1．使用動物
日本エスエルシーより購入したＳＤ系幼若ラット（生後７日目、雌雄）を使用した。【００９１】
4-2．被験物質
マウス由来組換えアンジオポエチン様タンパク質７（R&D Systems、４９６０−ＡＮ−０２５/ＣＦ；以下、ｒｍＡＮＧＰＴＬ７と記載する）を使用した。【００９２】
4-3．試験方法
4-3-1．細胞培養
ラット三叉神経細胞の単離はChanらの報告に従って行った（Kwan Y. Chan and Richard H. Haschke. Exp. Eye Res. 41: 687-699, 1985）。すなわち、ラットを二酸化炭素ガスによって死亡させた後、該ラットから三叉神経節を切り出した。切り出した三叉神経節をＨａｎｋｓ’  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄後、３ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ）溶液中でハサミで細かく細断し、該溶液中で３７℃、３０分間処理した。処理後、１２０×ｇで５分間遠心分離して上清を除いた。沈殿物に対して神経細胞分散液セット（ＤＳファーマバイオメディカル）の酵素液を添加し、３７℃、４０分間処理した。処理後、１２０×ｇで５分間遠心分離して上清を除いた。その後は神経細胞分散液セットに添付のプロトコールに従い、分散液及び除去液で処理した。処理後、１２０×ｇで５分間遠心分離して上清を除いた後、９．３％ＢＳＡ溶液３ｍＬに再懸濁させた。該懸濁液を室温で１２０×ｇで３０分間遠心分離して上清を除いた後、培養液２ｍＬに再懸濁させた。該懸濁液中の細胞数をカウントし、細胞を、ポリリジン／ラミニンコーティング済みの８ウェルチャンバースライド（ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー）上に約２．５×１０３細胞／ウェルとなるよう播種し、同時に培養液中にｒｍＡＮＧＰＴＬ７（最終濃度０．１ｎＭ、１ｎＭ、又は１０ｎＭ）、陽性対照としてＧｌｉａｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ）（最終濃度０．１ｎＭ）、コントロールとしてＰＢＳをそれぞれ添加した後、２４時間培養した。【００９３】
培養液は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ＭｅｄｉｕｍにＢ２７サプリメント（ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社）（最終濃度２％（ｖ／ｖ））及びＬ−グルタミン（ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社）（最終濃度１ｍＭ）を含むものを用いた。培養条件は、二酸化炭素濃度５％、空気濃度９５％、湿度１００％、温度３７℃とした。【００９４】
4-3-2．染色
播種後２４時間培養した後のラット三叉神経細胞を、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド液に、室温にて２０分浸して固定した。三叉神経のＡα・Ａβ・Ａδの細胞体及び神経突起を構成するニューロフィラメントを特異的に認識する抗ニューロフィラメント２００抗体（ＭＡＢ５４４６、ミリポア）、並びに三叉神経細胞のＡδ・ｃの細胞体を認識する抗サブスタンスＰ抗体（２００６４、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ）のダブル染色を行い、物理的刺激に寄与する角膜知覚神経であるＡδの細胞体を検出できるようにした。蛍光標識した二次抗体を反応させ、蛍光顕微鏡（オリンパス）下で観察した。また、染色された細胞像は蛍光顕微鏡からコンピュータに画像として取り込んだ。【００９５】
4-3-3．画像解析
培養ラット三叉神経細胞の神経突起形成の程度を評価するために、コンピュータに取り込んだ染色細胞の画像において、細胞体直径及び神経突起長を画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＪ  Ｖｅｒ．１．４７, Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を用いて計測した。細胞体直径の２倍以上の長さの神経突起を有する細胞を神経突起形成細胞として、その細胞数の全細胞数に占める比率（％）を算出した(Otori Y, Wei JY, Barnstable CJ. Invest. Ophthalmol Vis Sci (1998) 39, 972-981)。【００９６】
4-3-4．統計学的解析
統計学的処理はＪＭＰ（Ｖｅｒ．１０．０２、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｊａｐａｎ株式会社）を用いて、コントロール群に対するダネット多重比較検定にて検討し、Ｐ値が０．０５以下の時を有意とした。【００９７】
4-4．試験結果
図４及び５は、全細胞数中に占める神経突起形成細胞の比率（％）を示すグラフであり、図６及び７は、計測した細胞数を示すグラフである。図４及び６はＡδ細胞のみの計測結果で、図５及び７はＡα・Ａβ・Ａδ細胞の計測結果である。【００９８】
陽性対照である０．１ｎＭ  ＧＤＮＦを添加した群は、Ａδ細胞のみを計測した場合及びＡα・Ａβ・Ａδ細胞を計測した場合の両方において、コントロール群に比べて有意に神経突起形成細胞の比率が高かった（図４及び５）。一方、１ｎＭ又は１０ｎＭ  ｒｍＡＮＧＰＴＬ７を添加した群は、Ａδ細胞のみを計測した場合及びＡα・Ａβ・Ａδ細胞を計測した場合の両方において、コントロール群に比べて、有意に神経突起形成細胞の比率が高かった（図４及び５）。０．１ｎＭ  ｒｍＡＮＧＰＴＬ７を添加した群は、Ａα・Ａβ・Ａδ細胞を計測した場合については、コントロール群に対して有意に神経突起形成細胞の比率が高く、Ａδ細胞のみを計測した場合についてもコントロール群に対して神経突起形成細胞の比率が高い傾向であった（図４及び５）。なお、計測した全細胞数は、Ａδ細胞のみを計測した場合及びＡα・Ａβ・Ａδ細胞を計測した場合の両方において、各群間で有意差が無かったことから、神経突起形成細胞の比率の各群間の差が細胞数の変化に起因するものでは無いことが示唆された（図６及び７）。【００９９】
以上の結果より、ＡＮＧＰＴＬ７は、三叉神経細胞の神経突起形成促進作用を有することが明らかにされた。
【図１】
2016167363.tif 000003
【図２】
2016167363.tif 000004
【図３】
2016167363.tif 000005
【図４】
2016167363.tif 000006
【図５】
2016167363.tif 000007
【図６】
2016167363.tif 000008
【図７】
2016167363.tif 000009
【配列表】
2016167363000001.app
【国際調査報告】
2016167363.tif 000010
2016167363.tif 000011
2016167363.tif 000012