(57)【要約】【課題】低コストで汎用性の高い簡便な麹菌の系統分類方法を提供すること。【解決手段】本願発明者らは、麹菌ゲノムアレイ解析を鋭意に進めた結果、麹菌株が13の系統に分類されることを明らかにした。さらに、新たに実施したゲノムアレイ解析を行なった全菌株のデータをもとに、少数のプライマーセットを用いたPCRによってゲノムの系統を簡易に判定する方法を開発することに成功した。さらに、当該系統分類によって麹菌株の醸造特性を予測可能であることを確認した。【選択図】図２
2014197989.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記プライマーセット群Aと、下記プライマーセット群B〜Fのいずれか１つとを組み合わせて用いて、麹菌ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行なうことを含む、麹菌株の系統判定方法。
プライマーセット群A：
配列番号５に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(3)）、
配列番号７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(4)）、
配列番号１１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(6)）、
配列番号１３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(7)）、及び
配列番号１５に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(8)）。
プライマーセット群B：
配列番号３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(2)）、及び
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）。
プライマーセット群C：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）、及び
配列番号１９に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２０に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(10)）。
プライマーセット群D：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）、及び
配列番号２１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(11)）。
プライマーセット群E：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）、及び
配列番号２５に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(13)）。
プライマーセット群F：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(2)）、
配列番号９に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(5)）、及び
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）。
【請求項２】
プライマーセット群A及びBを組み合わせて使用し、さらに、プライマーセット(1)、(5)及び(10)〜(13)から選択される少なくとも1対のプライマーセット（ここで、プライマーセット(12)は、配列番号２３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセットである）を組み合わせて使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
プライマーセット群A及びCを組み合わせて使用し、さらに、プライマーセット(2)、(5)及び(11)〜(13)から選択される少なくとも1対のプライマーセット（ここで、プライマーセット(12)は、配列番号２３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセットである）を組み合わせて使用する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
プライマーセット群A及びDを組み合わせて使用し、さらに、プライマーセット(2)、(5)、(10)、(12)及び(13)から選択される少なくとも1対のプライマーセット（ここで、プライマーセット(12)は、配列番号２３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセットである）を組み合わせて使用する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
プライマーセット群A及びEを組み合わせて使用し、さらに、プライマーセット(2)、(5)、(10)〜(12)から選択される少なくとも1対のプライマーセット（ここで、プライマーセット(12)は、配列番号２３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセットである）を組み合わせて使用する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
プライマーセット群A及びFを組み合わせて使用し、さらに、プライマーセット(10)〜(13)から選択される少なくとも1対のプライマーセット（ここで、プライマーセット(12)は、配列番号２３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセットである）を組み合わせて使用する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
プライマーセット(1)が、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(2)が、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(3)が、配列番号５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(4)が、配列番号７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(5)が、配列番号９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(6)が、配列番号１１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(7)が、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(8)が、配列番号１５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(9)が、配列番号１７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(10)が、配列番号１９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(11)が、配列番号２１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(12)が、配列番号２３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(13)が、配列番号２５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２６に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットである、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
増幅の有無、又は増幅の有無及び増幅産物のサイズに基づいて前記麹菌株の系統を判定する、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
以下の基準との対比により１３系統のいずれに分類されるかを判定する、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
A系統は、
プライマーセット(1)で1本増幅、
プライマーセット(2)で2本増幅、
プライマーセット(3)で増幅なし、
プライマーセット(4)で増幅なし、
プライマーセット(5)で1本増幅、
プライマーセット(6)で1本増幅、
プライマーセット(7)で1本増幅、
プライマーセット(8)で増幅なし、
プライマーセット(9)で1本増幅、
プライマーセット(10)で1本増幅、
プライマーセット(11)で1本増幅、
プライマーセット(12)で1本増幅、
プライマーセット(13)で1本増幅。
B系統は、
プライマーセット(1)で1本増幅、
プライマーセット(2)で1本増幅、
プライマーセット(3)で1本増幅、
プライマーセット(4)で増幅なし、
プライマーセット(5)で1本増幅、
プライマーセット(6)で増幅なし、
プライマーセット(7)で1本増幅、
プライマーセット(8)で増幅なし、
プライマーセット(9)で増幅なし、
プライマーセット(10)で1本増幅、
プライマーセット(11)で1本増幅、
プライマーセット(12)で1本増幅、
プライマーセット(13)で1本増幅。
Sake/Miso系統は、
プライマーセット(1)で1本増幅、
プライマーセット(2)で1本増幅、
プライマーセット(3)で増幅なし、
プライマーセット(4)で増幅なし、
プライマーセット(5)で1本増幅、
プライマーセット(6)で増幅なし、
プライマーセット(7)で1本増幅、
プライマーセット(8)で増幅なし、
プライマーセット(9)で増幅なし、
プライマーセット(10)で1本増幅、
プライマーセット(11)で増幅なし、
プライマーセット(12)で1本増幅、
プライマーセット(13)で1本増幅。
SO1系統は、
プライマーセット(1)で1本増幅、
プライマーセット(2)で1本増幅、
プライマーセット(3)で増幅なし、
プライマーセット(4)で増幅なし、
プライマーセット(5)で1本増幅、
プライマーセット(6)で増幅なし、
プライマーセット(7)で1本増幅、
プライマーセット(8)で1本増幅、
プライマーセット(9)で1本増幅、
プライマーセット(10)で1本増幅、
プライマーセット(11)で1本増幅、
プライマーセット(12)で1本増幅、
プライマーセット(13)で1本増幅。
SO2系統は、
プライマーセット(1)で1本増幅、
プライマーセット(2)で増幅なし、
プライマーセット(3)で増幅なし、
プライマーセット(4)で増幅なし、
プライマーセット(5)で1本増幅、
プライマーセット(6)で増幅なし、
プライマーセット(7)で1本増幅、
プライマーセット(8)で増幅なし、
プライマーセット(9)で1本増幅、
プライマーセット(10)で1本増幅、
プライマーセット(11)で1本増幅、
プライマーセット(12)で1本増幅、
プライマーセット(13)で1本増幅。
SO3系統は、
プライマーセット(1)で増幅なし、
プライマーセット(2)で2本増幅、
プライマーセット(3)で1本増幅、
プライマーセット(4)で増幅なし、
プライマーセット(5)で1本増幅、
プライマーセット(6)で増幅なし、
プライマーセット(7)で1本増幅、
プライマーセット(8)で1本増幅、
プライマーセット(9)で1本増幅、
プライマーセット(10)で増幅なし、
プライマーセット(11)で1本増幅、
プライマーセット(12)で増幅なし、
プライマーセット(13)で1本増幅。
SO4系統は、
プライマーセット(1)で増幅なし、
プライマーセット(2)で1本増幅、
プライマーセット(3)で1本増幅、
プライマーセット(4)で増幅なし、
プライマーセット(5)で1本増幅、
プライマーセット(6)で増幅なし、
プライマーセット(7)で1本増幅、
プライマーセット(8)で1本増幅、
プライマーセット(9)で1本増幅、
プライマーセット(10)で1本増幅、
プライマーセット(11)で増幅なし、
プライマーセット(12)で増幅なし、
プライマーセット(13)で増幅なし。
C系統は、
プライマーセット(1)で1本増幅、
プライマーセット(2)で1本増幅、
プライマーセット(3)で1本増幅、
プライマーセット(4)で増幅なし、
プライマーセット(5)で1本増幅、
プライマーセット(6)で1本増幅、
プライマーセット(7)で増幅なし、
プライマーセット(8)で1本増幅、
プライマーセット(9)で1本増幅、
プライマーセット(10)で1本増幅、
プライマーセット(11)で1本増幅、
プライマーセット(12)で1本増幅、
プライマーセット(13)で1本増幅。
RIB40-1系統は、
プライマーセット(1)で1本増幅、
プライマーセット(2)で1本増幅、
プライマーセット(3)で1本増幅、
プライマーセット(4)で600bp〜700bpのサイズで1本増幅、
プライマーセット(5)で1本増幅、
プライマーセット(6)で1本増幅、
プライマーセット(7)で1本増幅、
プライマーセット(8)で1本増幅、
プライマーセット(9)で1本増幅、
プライマーセット(10)で1本増幅、
プライマーセット(11)で1本増幅、
プライマーセット(12)で1本増幅、
プライマーセット(13)で1本増幅。
RIB40-2系統は、
プライマーセット(1)で増幅なし、
プライマーセット(2)で2本増幅、
プライマーセット(3)で1本増幅、
プライマーセット(4)で600bp〜700bpのサイズで1本増幅、
プライマーセット(5)で1本増幅、
プライマーセット(6)で1本増幅、
プライマーセット(7)で1本増幅、
プライマーセット(8)で1本増幅、
プライマーセット(9)で1本増幅、
プライマーセット(10)で1本増幅、
プライマーセット(11)で1本増幅、
プライマーセット(12)で1本増幅、
プライマーセット(13)で増幅なし。
NS1系統は、
プライマーセット(1)で1本増幅、
プライマーセット(2)で1本増幅、
プライマーセット(3)で1本増幅、
プライマーセット(4)で600bp〜700bpのサイズで1本増幅、
プライマーセット(5)で増幅なし、
プライマーセット(6)で1本増幅、
プライマーセット(7)で1本増幅、
プライマーセット(8)で1本増幅、
プライマーセット(9)で増幅なし、
プライマーセット(10)で1本増幅、
プライマーセット(11)で1本増幅、
プライマーセット(12)で1本増幅、
プライマーセット(13)で1本増幅。
NS2系統は、
プライマーセット(1)で1本増幅、
プライマーセット(2)で2本増幅、
プライマーセット(3)で1本増幅、
プライマーセット(4)で400bp〜500bpのサイズで1本増幅、
プライマーセット(5)で1本増幅、
プライマーセット(6)で1本増幅、
プライマーセット(7)で1本増幅、
プライマーセット(8)で1本増幅、
プライマーセット(9)で増幅なし、
プライマーセット(10)で1本増幅、
プライマーセット(11)で1本増幅、
プライマーセット(12)で1本増幅、
プライマーセット(13)で1本増幅。
NS3系統は、
プライマーセット(1)で1本増幅、
プライマーセット(2)で1本増幅、
プライマーセット(3)で1本増幅、
プライマーセット(4)で増幅なし、
プライマーセット(5)で1本増幅、
プライマーセット(6)で1本増幅、
プライマーセット(7)で増幅なし、
プライマーセット(8)で1本増幅、
プライマーセット(9)で増幅なし、
プライマーセット(10)で1本増幅、
プライマーセット(11)で1本増幅、
プライマーセット(12)で1本増幅、
プライマーセット(13)で1本増幅。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法により麹菌株の系統を判定し、系統に基づいて麹菌株の醸造特性を予測することを含む、麹菌株の醸造特性の予測方法。
【請求項１１】
下記プライマーセット群Aと、下記プライマーセット群B〜Eのいずれか１つとを含む、麹菌株の系統判定用プライマーセット。
プライマーセット群A：
配列番号５に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(3)）、
配列番号７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(4)）、
配列番号１１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(6)）、
配列番号１３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(7)）、及び
配列番号１５に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(8)）。
プライマーセット群B：
配列番号３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(2)）、及び
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）。
プライマーセット群C：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）、及び
配列番号１９に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２０に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(10)）。
プライマーセット群D：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）、及び
配列番号２１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(11)）。
プライマーセット群E：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）、及び
配列番号２５に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(13)）。
プライマーセット群F：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(2)）、
配列番号９に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(5)）、及び
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）。
【請求項１２】
プライマーセット群A及びBを含み、さらに、プライマーセット(1)、(5)及び(10)〜(13)から選択される少なくとも1対のプライマーセット（ここで、プライマーセット(12)は、配列番号２３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセットである）を含む、請求項１１記載のプライマーセット。
【請求項１３】
プライマーセット群A及びCを含み、さらに、プライマーセット(2)、(5)及び(11)〜(13)から選択される少なくとも1対のプライマーセット（ここで、プライマーセット(12)は、配列番号２３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセットである）を含む、請求項１１記載のプライマーセット。
【請求項１４】
プライマーセット群A及びDを含み、さらに、プライマーセット(2)、(5)、(10)、(12)及び(13)から選択される少なくとも1対のプライマーセット（ここで、プライマーセット(12)は、配列番号２３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセットである）を含む、請求項１１記載のプライマーセット。
【請求項１５】
プライマーセット群A及びEを含み、さらに、プライマーセット(2)、(5)、(10)〜(12)から選択される少なくとも1対のプライマーセット（ここで、プライマーセット(12)は、配列番号２３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセットである）を含む、請求項１１記載のプライマーセット。
【請求項１６】
プライマーセット群A及びFを含み、さらに、プライマーセット(10)〜(13)から選択される少なくとも1対のプライマーセット（ここで、プライマーセット(12)は、配列番号２３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセットである）を含む、請求項１１記載のプライマーセット。
【請求項１７】
プライマーセット(1)が、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(2)が、配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(3)が、配列番号５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(4)が、配列番号７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(5)が、配列番号９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(6)が、配列番号１１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(7)が、配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(8)が、配列番号１５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(9)が、配列番号１７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(10)が、配列番号１９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(11)が、配列番号２１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(12)が、配列番号２３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットであり、
プライマーセット(13)が、配列番号２５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２６に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセットである、請求項１１ないし１６のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項１８】
請求項１１ないし１７のいずれか１項に記載のプライマーセットを含む、麹菌株の系統判別キット。
【請求項１９】
麹菌株の醸造特性の予測用である請求項１１ないし１７のいずれか１項に記載のプライマーセット。
【請求項２０】
請求項１９記載のプライマーセットを含む、麹菌株の醸造特性の予測キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、PCRにより簡便に実施することができる麹菌株の系統判定方法及び醸造特性予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、麹菌の菌株の違いを判別する方法は、古くは形態や生化学的手法により判別する方法が報告されている。しかし、判別には熟練を要するほかに、判別そのものも不明瞭な点がある。近年、麹菌RIB40株の全ゲノム配列が明らかにされたことから（非特許文献１）、麹菌株の判別法として麹菌株の全ゲノムシーケンスによる判別法も考える事が出来る。しかし、ゲノムシーケンスによる判別は、コストが非常に高く汎用性が低い。
【０００３】
本願発明者らのグループでは、麹菌RIB40株の全ゲノム配列を元にDNAマイクロアレイ解析技術による実用麹菌株の分別及び系統解析を行なって来た。その結果、麹菌株は9つの系統に分類されると報告している（非特許文献２）。その後、野生株や新たに単離した麹菌株を含めて、さらに多くの菌株についてDNAマイクロアレイ解析を進めている。しかし、DNAマイクロアレイによる分別法についても、特殊な機器を必要とする事に加え、未だにコストも高く汎用性が低い。
【０００４】
また、本願発明者らはこれまでに、ゲノム構造が大きく異なる麹菌株間では、それらの麹菌株を用いて醸成した清酒の成分が大きく異なる事を明らかにしている（非特許文献３、４）。すなわち、ゲノムアレイ解析を行った麹菌株を使用し、米麹を作製すると共に仕込みを行い、製成酒の成分の分析を行った結果、同じ系統に属する麹菌株は、得られる清酒の成分が似ている事を明らかにした（非特許文献３、４）。しかしながら、低コストで汎用性の高い簡便な麹菌の系統分類方法は知られていないため、醸造特性の簡便な分類方法も知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nature, 2005, 438(7071), pp.1157-1161
【非特許文献２】温故知新、2011年、No.48、p.33-41
【非特許文献３】第63回日本生物工学会大会講演要旨集、p.182、2011年8月25日発行
【非特許文献４】第11回糸状菌分子生物学コンファレンス プログラム・講演要旨集、p.46、2011年10月26日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、低コストで汎用性の高い簡便な麹菌の系統分類方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、麹菌ゲノムアレイ解析を鋭意に進めた結果、麹菌株が13の系統に分類されることを明らかにした。さらに、新たに実施したゲノムアレイ解析を行なった全菌株のデータをもとに、少数のプライマーセットを用いたPCRによってゲノムの系統を簡易に判定する方法を開発することに成功し、さらに、当該系統分類によって麹菌株の醸造特性を予測可能であることを確認し、本願発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記プライマーセット群Aと、下記プライマーセット群B〜Fのいずれか１つとを組み合わせて用いて、麹菌ゲノムDNAを鋳型としてPCRを行なうことを含む、麹菌株の系統判定方法を提供する。
【０００９】
プライマーセット群A：
配列番号５に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(3)）、
配列番号７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(4)）、
配列番号１１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(6)）、
配列番号１３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(7)）、及び
配列番号１５に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(8)）。
【００１０】
プライマーセット群B：
配列番号３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(2)）、及び
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）。
【００１１】
プライマーセット群C：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）、及び
配列番号１９に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２０に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(10)）。
【００１２】
プライマーセット群D：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）、及び
配列番号２１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(11)）。
【００１３】
プライマーセット群E：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）、及び
配列番号２５に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(13)）。
【００１４】
プライマーセット群F：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(2)）、
配列番号９に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(5)）、及び
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）。
【００１５】
また、上記本発明の方法により麹菌株の系統を判定し、系統に基づいて麹菌株の醸造特性を予測することを含む、麹菌株の醸造特性の予測方法を提供する。さらに、本発明は、上記プライマーセット群Aと、上記プライマーセット群B〜Eのいずれか１つとを含む、麹菌株の系統判定用プライマーセット及び麹菌株の醸造特性の予測用プライマーセットを提供する。さらに、本発明は、上記本発明のプライマーセットを含む、麹菌株の系統判別キット及び麹菌株の醸造特性の予測キットを提供する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により、低コストで汎用性の高い簡便な麹菌の系統分類法が提供される。本発明によれば、たった数組のプライマーセットの組み合わせを用いたPCRにより、麹菌を１３の系統のいずれに分類されるかを判定することができる。この１３の系統内では醸造特性も非常に類似しており、本発明によって醸造特性の予測も可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】５５の麹菌株について、麹菌DNAチップを用いて系統解析を行なった結果を示す系統図である。
【図２】各系統の代表的な菌株について、プライマーセット(1)〜(8)を用いた場合のバンドサイズ及びバンドパターンを示す電気泳動像である。いずれもレーン左よりマーカー（1kbラダー、プロメガ社）、プライマーセット(1)〜(8)。
【図３】実施例で確立した簡易判定法の検証を行なった結果を示す電気泳動像である。図２と同じプライマーセットを使用し、RIB 207, 215, 331, 705株の系統を判定した。
【図４】図３で用いたRIB 207, 215, 331, 705株について、ゲノムアレイ解析により系統を確認した結果である。
【図５】５５の麹菌株の系統と、各菌株を用いて製造した米麹の各酵素力価及び菌体量とを示す図である。
【図６】麹菌株の系統の違いと製成酒の特性との関係を示す図である。
【図７】製麹実験により麹の醸造特性を検証した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の方法では、特定の組み合わせのプライマーセットを用いて麹菌ゲノムDNAを鋳型としたPCRを行ない、増幅の有無に基づいて、又は増幅の有無及び増幅断片のサイズに基づいて、麹菌株の系統判定を行なう。組み合わせて使用されるプライマーセット群は下記の通りである。
【００１９】
プライマーセット群A（５対のプライマーセットで構成される）：
配列番号５に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(3)）、
配列番号７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(4)）、
配列番号１１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(6)）、
配列番号１３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(7)）、及び
配列番号１５に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(8)）。
【００２０】
プライマーセット群B（２対のプライマーセットで構成される）：
配列番号３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(2)）、及び
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）。
【００２１】
プライマーセット群C（３対のプライマーセットで構成される）：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）、及び
配列番号１９に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２０に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(10)）。
【００２２】
プライマーセット群D（３対のプライマーセットで構成される）：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）、及び
配列番号２１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(11)）。
【００２３】
プライマーセット群E（３対のプライマーセットで構成される）：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）、及び
配列番号２５に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２６に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(13)）。
【００２４】
プライマーセット群F（４対のプライマーセットで構成される）：
配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(1)）、
配列番号３に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(2)）、
配列番号９に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(5)）、及び
配列番号１７に示す塩基配列をその3'側に含むフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列をその3'側に含むリバースプライマーとのセット（プライマーセット(9)）。
【００２５】
本発明では、プライマーセット群Aが必須的に用いられるプライマーセット群であり、これにプライマーセット群B〜Fのうちのいずれか1つを組み合わせて用いることで、他のプライマーを使用することなく麹菌株を１３系統のいずれかに分類することができる。もっとも、他のプライマーを使用することは差し支えなく、いかなるプライマーセット群の組み合わせを用いる場合であっても、適宜他のプライマーセットを補助的に用いることができる。例えば、プライマーセット群Aとプライマーセット群Bとを用いる場合、プライマーセット(2)〜(4)、(6)〜(9)の計7対のプライマーセットを用いてPCRを行なうことになるが、(1)〜(13)のうちの他のプライマーセット（すなわち(1)、(5)及び(10)〜(13)）から選択される１対以上のプライマーセットをさらに使用してもよい。他の組み合わせでプライマーセット群を用いる場合も同様である。また、公知のプライマーセットをさらに使用してもよい。
【００２６】
PCRのプライマーは、5'側に対象領域とハイブリダイズしない任意の付加配列を含んでいても、対象の領域に適切にハイブリダイズして特異的な増幅産物を増幅させることができることが周知である。「配列番号１に示す塩基配列をその3'側に含む」とは、当該プライマーが、配列番号１に示す塩基配列の5'側に任意の付加配列を含んだ塩基配列からなるプライマーであることを意味する。
上記した(1)〜(13)のプライマーセットとしては、それぞれ下記のものを好ましく使用することができる。これらは実施例で用いたプライマーであり、実施例中のプライマーの名称も併せて記載する。
(1)  配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（192-F/R）。
(2)  配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（089-F/R）。
(3)  配列番号５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（027-F/R）。
(4)  配列番号７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（025-F/R）。
(5)  配列番号９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（225-F/R）。
(6)  配列番号１１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（367-F/R）。
(7)  配列番号１３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（217-F/R）。
(8)  配列番号１５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１６に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（239-F/R）。
(9)  配列番号１７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１８に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（091-F/R）。
(10)  配列番号１９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２０に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（140-F/R）。
(11)  配列番号２１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２２に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（161-F/R）。
(12)  配列番号２３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２４に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（187-F/R）。
(13)  配列番号２５に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２６に示す塩基配列からなるリバースプライマーとのセット（232-F/R）。
【００２７】
本発明の方法では、麹菌株が１３の系統（A系統、B系統、Sake/Miso系統、SO1系統、SO2系統、SO3系統、SO4系統、C系統、RIB40-1系統、RIB40-2系統、NS1系統、NS2系統、NS3系統）のいずれに分類されるかを判定する。系統判定を行なう際の基準は以下の通りである。１３対のプライマーセットの全てについて、増幅の有無及び増幅断片のサイズを記載するが、１３対のプライマーセットの一部を使用すれば系統判定が可能であることは上述した通りである。
【００２８】
A系統：
プライマーセット(1)で1本増幅
プライマーセット(2)で2本増幅
プライマーセット(3)で増幅なし
プライマーセット(4)で増幅なし
プライマーセット(5)で1本増幅
プライマーセット(6)で1本増幅
プライマーセット(7)で1本増幅
プライマーセット(8)で増幅なし
プライマーセット(9)で1本増幅
プライマーセット(10)で1本増幅
プライマーセット(11)で1本増幅
プライマーセット(12)で1本増幅
プライマーセット(13)で1本増幅
【００２９】
B系統：
プライマーセット(1)で1本増幅
プライマーセット(2)で1本増幅
プライマーセット(3)で1本増幅
プライマーセット(4)で増幅なし
プライマーセット(5)で1本増幅
プライマーセット(6)で増幅なし
プライマーセット(7)で1本増幅
プライマーセット(8)で増幅なし
プライマーセット(9)で増幅なし
プライマーセット(10)で1本増幅
プライマーセット(11)で1本増幅
プライマーセット(12)で1本増幅
プライマーセット(13)で1本増幅
【００３０】
Sake/Miso系統：
プライマーセット(1)で1本増幅
プライマーセット(2)で1本増幅
プライマーセット(3)で増幅なし
プライマーセット(4)で増幅なし
プライマーセット(5)で1本増幅
プライマーセット(6)で増幅なし
プライマーセット(7)で1本増幅
プライマーセット(8)で増幅なし
プライマーセット(9)で増幅なし
プライマーセット(10)で1本増幅
プライマーセット(11)で増幅なし
プライマーセット(12)で1本増幅
プライマーセット(13)で1本増幅
【００３１】
SO1系統：
プライマーセット(1)で1本増幅
プライマーセット(2)で1本増幅
プライマーセット(3)で増幅なし
プライマーセット(4)で増幅なし
プライマーセット(5)で1本増幅
プライマーセット(6)で増幅なし
プライマーセット(7)で1本増幅
プライマーセット(8)で1本増幅
プライマーセット(9)で1本増幅
プライマーセット(10)で1本増幅
プライマーセット(11)で1本増幅
プライマーセット(12)で1本増幅
プライマーセット(13)で1本増幅
【００３２】
SO2系統：
プライマーセット(1)で1本増幅
プライマーセット(2)で増幅なし
プライマーセット(3)で増幅なし
プライマーセット(4)で増幅なし
プライマーセット(5)で1本増幅
プライマーセット(6)で増幅なし
プライマーセット(7)で1本増幅
プライマーセット(8)で増幅なし
プライマーセット(9)で1本増幅
プライマーセット(10)で1本増幅
プライマーセット(11)で1本増幅
プライマーセット(12)で1本増幅
プライマーセット(13)で1本増幅
【００３３】
SO3系統：
プライマーセット(1)で増幅なし
プライマーセット(2)で2本増幅
プライマーセット(3)で1本増幅
プライマーセット(4)で増幅なし
プライマーセット(5)で1本増幅
プライマーセット(6)で増幅なし
プライマーセット(7)で1本増幅
プライマーセット(8)で1本増幅
プライマーセット(9)で1本増幅
プライマーセット(10)で増幅なし
プライマーセット(11)で1本増幅
プライマーセット(12)で増幅なし
プライマーセット(13)で1本増幅
【００３４】
SO4系統：
プライマーセット(1)で増幅なし
プライマーセット(2)で1本増幅
プライマーセット(3)で1本増幅
プライマーセット(4)で増幅なし
プライマーセット(5)で1本増幅
プライマーセット(6)で増幅なし
プライマーセット(7)で1本増幅
プライマーセット(8)で1本増幅
プライマーセット(9)で1本増幅
プライマーセット(10)で1本増幅
プライマーセット(11)で増幅なし
プライマーセット(12)で増幅なし
プライマーセット(13)で増幅なし
【００３５】
C系統：
プライマーセット(1)で1本増幅
プライマーセット(2)で1本増幅
プライマーセット(3)で1本増幅
プライマーセット(4)で増幅なし
プライマーセット(5)で1本増幅
プライマーセット(6)で1本増幅
プライマーセット(7)で増幅なし
プライマーセット(8)で1本増幅
プライマーセット(9)で1本増幅
プライマーセット(10)で1本増幅
プライマーセット(11)で1本増幅
プライマーセット(12)で1本増幅
プライマーセット(13)で1本増幅
【００３６】
RIB40-1系統：
プライマーセット(1)で1本増幅
プライマーセット(2)で1本増幅
プライマーセット(3)で1本増幅
プライマーセット(4)で約650bp（600bp〜700bp程度）のサイズで1本増幅
プライマーセット(5)で1本増幅
プライマーセット(6)で1本増幅
プライマーセット(7)で1本増幅
プライマーセット(8)で1本増幅
プライマーセット(9)で1本増幅
プライマーセット(10)で1本増幅
プライマーセット(11)で1本増幅
プライマーセット(12)で1本増幅
プライマーセット(13)で1本増幅
【００３７】
RIB40-2系統：
プライマーセット(1)で増幅なし
プライマーセット(2)で2本増幅
プライマーセット(3)で1本増幅
プライマーセット(4)で約650bp（600bp〜700bp程度）のサイズで1本増幅
プライマーセット(5)で1本増幅
プライマーセット(6)で1本増幅
プライマーセット(7)で1本増幅
プライマーセット(8)で1本増幅
プライマーセット(9)で1本増幅
プライマーセット(10)で1本増幅
プライマーセット(11)で1本増幅
プライマーセット(12)で1本増幅
プライマーセット(13)で増幅なし
【００３８】
NS1系統：
プライマーセット(1)で1本増幅
プライマーセット(2)で1本増幅
プライマーセット(3)で1本増幅
プライマーセット(4)で約650bp（600bp〜700bp程度）のサイズで1本増幅
プライマーセット(5)で増幅なし
プライマーセット(6)で1本増幅
プライマーセット(7)で1本増幅
プライマーセット(8)で1本増幅
プライマーセット(9)で増幅なし
プライマーセット(10)で1本増幅
プライマーセット(11)で1本増幅
プライマーセット(12)で1本増幅
プライマーセット(13)で1本増幅
【００３９】
NS2系統：
プライマーセット(1)で1本増幅
プライマーセット(2)で2本増幅
プライマーセット(3)で1本増幅
プライマーセット(4)で約450bp（400bp〜500bp程度）のサイズで1本増幅
プライマーセット(5)で1本増幅
プライマーセット(6)で1本増幅
プライマーセット(7)で1本増幅
プライマーセット(8)で1本増幅
プライマーセット(9)で増幅なし
プライマーセット(10)で1本増幅
プライマーセット(11)で1本増幅
プライマーセット(12)で1本増幅
プライマーセット(13)で1本増幅
【００４０】
NS3系統：
プライマーセット(1)で1本増幅
プライマーセット(2)で1本増幅
プライマーセット(3)で1本増幅
プライマーセット(4)で増幅なし
プライマーセット(5)で1本増幅
プライマーセット(6)で1本増幅
プライマーセット(7)で増幅なし
プライマーセット(8)で1本増幅
プライマーセット(9)で増幅なし
プライマーセット(10)で1本増幅
プライマーセット(11)で1本増幅
プライマーセット(12)で1本増幅
プライマーセット(13)で1本増幅
【００４１】
上記の基準において、1本増幅、2本増幅とは、特異的増幅によるバンドが1本又は2本得られるとの意味である。非特異的増幅はカウントしない。各プライマーセットについて、目安となる増幅産物長は、下記実施例中の表１に示されている。もっとも、麹菌株の個体差や、5'側に付加配列を有するプライマーを使用する場合にはその付加配列のサイズによって、増幅産物のサイズには数bp〜数十bp程度の変動が生じ得るので、特異的増幅によるバンドのサイズは必ずしも下記表１中に記載のサイズに限定されるものではない。特異的増幅であるか否かは、当業者であれば、PCR産物の電気泳動像から適切に判断することができる。
【００４２】
麹菌ゲノムDNAを鋳型としたPCRは、麹菌細胞から抽出したゲノムDNAをPCR反応液に添加して行なってもよいし、あるいは、菌体をそのまま又は菌体から調製したライセートをPCR反応液に添加して行なってもよい。後者の場合もプライマーがアニーリングする対象はゲノムDNAであり、「麹菌ゲノムDNAを鋳型としたPCR」に包含される。麹菌からのゲノムDNAの抽出や菌体からのライセートの調製は、市販のキットを用いて常法により行なうことができる。また、PCR自体は周知の常法であり、市販のキット及び機器を用いて容易に実施可能である。PCRの反応条件の好ましい具体例は下記実施例に記載されている通りである。
【００４３】
麹菌のゲノム構造に基づいて分類された系統内では、醸造特性が非常に類似していることが公知である（非特許文献３、４）。本願発明者らにより、麹菌の系統が従来の9系統よりも多い１３の系統に分類可能であることが明らかとなったが、１３系統に分類した場合も同様に、同一系統内では麹菌株の醸造特性が非常に類似している。従って、本発明の麹菌株の系統判別法によれば、麹菌株の醸造特性を予測することも可能である。ここでいう麹菌株の醸造特性とは、その麹菌株を用いて製麹及び仕込みを行なって清酒を製造した場合の麹の性質（麹に含まれるα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、酸性カルボキシペプチダーゼ、酸性プロテアーゼ等の各種酵素の活性、麹中の菌体量など）、及び最終的に得られる清酒の成分組成（炭酸減量、酸度・アミノ酸度・エタノール濃度・日本酒度等の一般成分、香気成分、有機酸組成、アミノ酸組成など）を指す。
【００４４】
１３系統の判別を実施可能な上記したプライマーセット群の組み合わせは、麹菌株の系統判別用プライマーセットとして提供することができる。また、系統判別用プライマーセットは、PCR用の耐熱性ポリメラーゼ、PCR用バッファーのような他の試薬類等と適宜組み合わせて、麹菌株の系統判別キットとして提供することもできる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４６】
１．ゲノムアレイ解析による系統
麹菌株について、酒類総合研究所で単離保存している菌株から、以下の55菌株を使用しゲノムDNAを抽出し、麹菌DNAchipによりマイクロアレイ解析を行った。
【００４７】
[方法]
・マイクロアレイ解析に使用した菌株
A. oryzae RIB 1108, 1426, 1178, 128, 417, 807, 812, 210, 219, 333, 601, 802, 315, 640, 1187, 1313, 303, 402, 423, 915, 954, 936, 301, 306, 163, 415, 327, 1172, 319, 81, 40, 143, 及び430、並びに
A. oryzae RIBOIS 39, 57, 06, 07, 27, 56, 62, 01, 03, 08, 10, 11, 12, 17, 18, 02, 21, 22, 26, 43, 36, 及び61
【００４８】
・ゲノムDNAの抽出
DP培地により各菌株を36時間培養し、DNeasy Plant maxi キット (キアゲン社)によりゲノムDNAを抽出し、ゲノムアレイ及びPCR反応のテンプレートとした。
【００４９】
・ゲノムアレイ解析・系統解析
ゲノムDNAは、BioPrime(登録商標) DNA Labeling System (ライフテクノロジー社)により行い、マイクロアレイは麹菌DNAchip（GEO Platform GPL16184）を使用し、Affymetrix社のプロトコルに従ってハイブリダイゼーションおよび検出、解析を行った。系統樹の作成にはGenespring (アジレント社)を使用した。
【００５０】
[結果]
マイクロアレイ解析の結果、麹菌株は13の系統（A系統、B系統、Sake/Miso系統、SO1系統、SO2系統、SO3系統、SO4系統、C系統、RIB40-1系統、RIB40-2系統、NS1系統、NS2系統、NS3系統）に分離されることが明らかとなった(図1)。
【００５１】
２．菌株判定に使用するゲノム領域と簡易系統判定方法の開発
我々が独自に行った麹菌株のゲノムアレイ情報、さらにRIB128, RIB915, RIBOIS01株のゲノムシーケンス解析結果を用い、各菌株の系統で予想される遺伝子の有無、あるいはバンドサイズが異なると考えられる遺伝子を選抜した。さらにその中から、PCRによる増幅サイズが1 kbp以下で、ほぼ同じTm値のプライマーを設計可能な19遺伝子について、それぞれ1組のPCRプライマーを設計した。これらのプライマーについて54株の麹菌株のゲノムに対しPCRを行い（PCR条件は下記参照）、各系統内の全ての菌株で予想どおりかつ安定した結果が得られる13のプライマーセットを選別した（表１）。これら13対のプライマーセットの増幅結果を表２に示す。各系統の代表的な菌株について、プライマーセット(1)〜(8)を用いた場合のバンドサイズ及びバンドパターンを図２に示す。これらの結果からさらに検討を加え、全ての系統を分類できるプライマーセットの組み合わせを絞り込んだ。
【００５２】
【表１】
2014197989.tif 000003
【００５３】
【表２】
2014197989.tif 000004
【００５４】
・PCR条件
KOD -Plus-（TOYOBO社）のプロトコルに従った。PCR反応液の組成と条件を以下に示す。また、各菌株のゲノムDNAの濃度は10ng/μlに調整して用いた。
【００５５】
【表３】
2014197989.tif 000005
【００５６】
【表４】
2014197989.tif 000006
【００５７】
３．簡易判定法の検証実験
簡易判定法が目的どおりに機能するかどうかについて、RIB 207, 215, 331, 705株を用いて検証実験を行った。まず、これらの菌株により米麹を作成し、菌体から採取後ライセートを作成した。続いて表１中に示したプライマーセットの一部を用いてPCRを行ない、系統の判別を試みた。
【００５８】
[方法]
・テンプレートの調整法とPCR反応
Template DNA（ライセート）の調製およびPCRはKOD FX Neoの取扱説明書に従い下記の通りに行なった。
(1)  ワンステップ法用のBuffer A（100 mMTris-HCl（pH9.5）、1 M KCl、10 mM EDTA）を50μLずつPCRチューブに分注した。
(2)  米麹の菌糸をチップでかきとり、Buffer Aに懸濁した。
(3)  Vortex 3 min（キュートミキサー）
(4)  95℃ 10 minインキュベートした（サーマルサイクラ―）
(5)  Vortex 3 min（キュートミキサー）
(6)  12000 rpm、5 min遠心し、上清をPCR反応に供した。
【００５９】
【表５】
2014197989.tif 000007
【００６０】
【表６】
2014197989.tif 000008
【００６１】
・ゲノムアレイ解析・系統解析
ゲノムDNAは、BioPrime(登録商標) DNA Labeling System (ライフテクノロジー社)により行い、マイクロアレイは麹菌DNAchip（GEO Platform GPL16184）を使用し、Affymetrix社のプロトコルに従ってハイブリダイゼーションおよび検出、解析を行った。系統樹の作成にはGenespring (アジレント社)を使用した。
【００６２】
[結果]
PCR産物のバンドパターンより、RIB 207, 215, 331株はSake/Miso系統に、RIB705株はNS2系統に属すると判断された（図３）。さらに、これらの株のDNAを抽出し、BioPrime (invitorogen社)を用いてラベリングを行い、ゲノムアレイ解析を行ったところ、PCRによる簡易系統判別法による結果と一致した（図４）。
【００６３】
４．麹菌の醸造特性判定(1)
これまでの研究結果から、麹菌株が異なれば麹の性質や醸成された清酒の成分は異なる事を示している。そこで、アレイ解析に用いた55株を用いて製麹と小仕込みを行い、麹の品質や清酒成分について解析を行った。
【００６４】
[方法]
・製麹及び小仕込み試験
アレイ解析に用いた55株を使用し、定法により蒸した精米歩合60％の山田錦20 gに1gあたり1x106個の分生子を接種し、常法により製麹を行なった。初発の水分量は130％とした。小仕込み試験は総米100gで行なった。90％乳酸を50μL添加し、汲水にはイオン交換水を130g使用し、発酵条件は15℃とした。
【００６５】
・酵素力価、菌体量測定
キッコーマン酵素活性測定キットのプロトコルに従った。酸性プロテアーゼについては、第四回改正国税庁所定分析法注解に従って行った。菌体量は、米麹を5回以上蒸留水で洗浄し、Yatalase (TAKARA Ltd.)を使用して、菌体を加水分解し、生じたNアセチルグルコサミンを液体車とグラフィーにより定量し菌体量に換算した。
【００６６】
尚、測定に際し、各種酵素活性の値が高いことが予想されたため、希釈率を以下のように変更した。測定後、危険率5%でt検定を行い、両株で酵素力価及び菌体量に有意差があるか確認した。
α-アミラーゼ：100倍希釈
グルコアミラーゼ：4倍希釈
α-グルコシダーゼ：2倍希釈
酸性カルボキシペプチダーゼ：5倍希釈
酸性プロテアーゼ：5倍希釈
【００６７】
[結果]
結果を図５及び６に示す。麹菌株のゲノム系統と米麹の性質、得られる清酒の成分には相関があることが確認された。
【００６８】
５．麹菌の醸造特性判定(2)
上記４の結果より、同系統の麹菌株間では米麹や得られる清酒成分は類似しており、系統を判別する事により麹菌の性質を予測する事が可能と考えられた。そこで、RIBOIS01株と同じNS2系統に分類されるRIB705株について、RIBOIS01株と同時に製麹を行い、米麹の特性について測定を行った。
【００６９】
[方法]
・米麹の作製方法
A. oryzae RIB705株, RIBOIS01株を使用し、定法により蒸した精米歩合70％の日本晴10kgに、1gあたり2 x 105個の分生子を接種し、定法により製麹を行った。初発の水分量をそろえ、温度経過はほとんど一致するように調整を行った。
【００７０】
・酵素力価,菌体量測定
上記４と同様にして行なった。
【００７１】
[結果]
得られた酵素力価と菌体量を図7に示した。両者の酵素力価は一致した。以上の事から、麹菌の系統を予測すれば麹の醸造上の特性も予想できることが明らかとなった。
【図１】
2014197989.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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