(57)【要約】【課題】侵襲性のより小さい方法で採取したサンプルにおいて、前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別できる方法及びキットの提供。【解決手段】本発明は、対象者の血液サンプルにおいてタウ蛋白とアルブミンとの複合体(タウ蛋白-アルブミン複合体)を定量することを特徴とする、前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症の鑑別方法を提供する。本発明はまた、タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な少なくとも１種の物質を含んでなることを特徴とする前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症の鑑別用キットを提供する。【選択図】図１
2014142310.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象者の血液サンプルにおいてタウ蛋白とアルブミンとの複合体(タウ蛋白-アルブミン複合体)を定量することを特徴とする前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別する方法。
【請求項２】
タウ蛋白-アルブミン複合体の定量が、タウ蛋白に結合可能な物質又はアルブミンに結合可能な物質を介して支持体上に不動化されたタウ蛋白-アルブミン複合体を定量することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タウ蛋白-アルブミン複合体の定量が抗アルブミン抗体を用いて行われる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
タウ蛋白-アルブミン複合体の定量が抗タウ蛋白抗体を用いて行われる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な少なくとも１種の物質を含んでなることを特徴とする前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症との鑑別用キット。
【請求項６】
タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な少なくとも１種の物質がタウ蛋白に結合可能な物質及び/又はアルブミンに結合可能な物質である請求項５に記載のキット。
【請求項７】
支持体を更に含み、該支持体にタウ蛋白に結合可能な物質又はアルブミンに結合可能な物質が固定されている請求項６に記載のキット。
【請求項８】
アルブミンに結合可能な物質が抗アルブミン抗体である請求項６又は７に記載のキット。
【請求項９】
タウ蛋白に結合可能な物質が抗タウ蛋白抗体である請求項６〜８のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別する方法及びキットに関する。より具体的には、本発明は、対象者の血液サンプル中のタウ蛋白と結合したアルブミン(タウ蛋白-アルブミン複合体)を定量することを特徴とする前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別する方法及びそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症は、変性疾患(約80％)と脳血管障害(約20％)とに分類され、変性疾患(約80％)の内訳はアルツハイマー型認知症(アルツハイマー病：約50％)、前頭側頭型認知症(約15％)及びレビー小体病(約15％)である。
アルツハイマー型認知症では、主に、側頭葉内側や頭頂葉の萎縮が目立つ一方、前頭側頭型認知症では前頭葉や側頭葉前方の萎縮が目立つ。
前頭側頭型認知症は、性格変化と社交性の消失が初期からみられ、アルツハイマー型認知症において初期からみられる記憶障害・見当識障害は目立たない。進行に伴い、自制力低下(粗暴、短絡、相手の話を聞かず一方的にしゃべる)、感情鈍麻、異常行動(浪費、過食・異食、収集、窃盗、徘徊、他人の家に勝手に上がり込む)などがはっきりし、人格変化(無欲・無関心)、感情の荒廃が高度になる。
【０００３】
前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症との鑑別は、治療方針決定のために重要である。しかし、前頭側頭型認知症は、アルツハイマー型認知症と臨床症状の一部が重複しており、鑑別が難しい。従来、鑑別は、特定の薬剤を用いる画像診断(例えば、ピッツバーグ大学により開発されたアミロイドβ蛋白の凝集体を描写する薬剤「PiB」を用いるPiB-PET)や複数のバイオマーカーの組合せについての髄液検査(特許文献１)が必要であった。
しかし、PiB-PET画像診断は、大型で高価な装置を必要とし、費用も非常に高額である。また、髄液検査は、髄液採取時の侵襲性が大きく、患者の心理的及び身体的負担が大きい。いずれもスクリーニングには適さず、また日常的に簡単に行えるものでない。
【０００４】
タウ蛋白は常に神経細胞内で生成されて細胞外に排出される(非特許文献１)。このタウ蛋白が、前頭側頭型認知症患者及びアルツハイマー型認知症患者では、脳内に蓄積することが知られている。
血液中のタウ蛋白を検出・定量することにより、アルツハイマー型認知症を検出する試みは既になされている(特許文献２及び３)が、前頭側頭型認知症に関しては報告例はない。特許文献１においても、前頭側頭型認知症患者の脳内での存在量が健常人に比べて増加していることが示されているに過ぎず、しかも前頭側頭型認知症の検出には他の２種以上のマーカーと組み合わせる必要があると報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表2002-519702号公報
【特許文献２】特開2002-40023号公報
【特許文献３】国際公開WO2004/016655
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Neuroscience, 2011, 31: 13110-7
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
よって、侵襲性のより小さい方法で採取したサンプルにおいて、前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別できる方法及びキットの開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、対象者の血液サンプルにおいてタウ蛋白とアルブミンとの複合体(タウ蛋白-アルブミン複合体)を定量することを特徴とする前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症とを鑑別する方法を提供する。
本発明はまた、タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な少なくとも１種の物質を含んでなることを特徴とする前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症との鑑別用キットを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
サンプルとして、採取時の侵襲性が小さい血液サンプルを用いるため、サンプル採取が容易であり、被検者の負担を軽減できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一形態におけるタウ蛋白-アルブミン複合体の定量原理を説明する図である。
【図２】実施例における測定データを説明する統計学的グラフ(箱ひげ図)である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜前頭側頭型認知症の検出方法＞
本発明の前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症との鑑別方法は、対象者の血液サンプルにおいてタウ蛋白とアルブミンとの複合体(タウ蛋白-アルブミン複合体)を定量することを特徴とする。
本発明は、前頭側頭型認知症患者の血液サンプル中のタウ蛋白-アルブミン複合体の量がアルツハイマー型認知症患者と比較して有意に少ないという新たな知見に基づく。
【００１２】
「対象者」は、認知症を発症している患者、とりわけその認知症が前頭側頭型であるかアルツハイマー型であるかの鑑別を要する認知症患者である。
「血液サンプル」は、全血サンプル、血清サンプル又は血漿サンプルである。
「タウ蛋白」は、本発明に関しては、ヒト脳内に存在し得る６種類のアイソフォーム(タウ-352(0N3R)、タウ-381(1N3R)、タウ-383(0N4R)、タウ-410(2N3R)、タウ-412(1N4R)、タウ-441(2N4R))をいい、非リン酸化形態及びリン酸化形態のいずれも含む。前記６種類のアイソフォームの代表的なアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１〜６として配列表に示す。なお、本明細書において、タウ蛋白のアミノ酸位置に言及する場合には、タウ-441のアミノ酸配列(配列番号６)中の位置で示す。
「アルブミン」は、本発明に関しては、血清アルブミンをいう。ヒト(血清)アルブミンの代表的なアミノ酸配列を配列番号７として配列表に示す。
【００１３】
血液サンプル中のタウ蛋白-アルブミン複合体は、イムノアッセイ、電気泳動法、クロマトグラフィー、色素結合法、質量分析法及びこれらの組合せなど種々の方法により定量することができる。
定量に際して、複合体を形成していないタウ蛋白及びアルブミンが除去されている場合又は複合体と(例えば位置的に)明確に分離されている場合には、タウ蛋白-アルブミン複合体の定量に、タウ蛋白又はアルブミンの定量法を使用してもよい。
【００１４】
タウ蛋白-アルブミン複合体の定量は、少なくとも１種の「タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質」を用いて行うことができる。ここで、「タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質」には、タウ蛋白-アルブミン複合体に結合する一方で、複合体を形成していないタウ蛋白及びアルブミンには結合しない物質のみならず、アルブミンと複合体を形成していないタウ蛋白とも結合し得る「タウ蛋白に結合可能な物質」、及びタウ蛋白と複合体を形成していないアルブミンとも結合し得る「アルブミンに結合可能な物質」も含まれる。「タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質」は、代表的には、抗体、アプタマー、ペプチドである。
【００１５】
定量は、好ましくは、タウ蛋白-アルブミン複合体を支持体上に不動化した状態で行う。不動化は、タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質が固定された支持体を用いて行うことができる。この場合、定量にも、タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質を用いてよい。定量に用いるタウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質は、不動化に用いたタウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質と異なることが好ましい。
定量はまた、タウ蛋白-アルブミン複合体を、(例えば、そのサイズや分子量等に応じて特定の位置に移動させることにより)試料中の他の物質から分離した後、タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質を用いて行うことができる。
【００１６】
定量はイムノアッセイにより行うことができる。
イムノアッセイでは、好ましくは、タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質として、アルブミンに対する抗体(抗アルブミン抗体)及び/又はタウ蛋白に対する抗体(抗タウ蛋白抗体)を使用する。イムノアッセイの前に、電気泳動やクロマトグラフィーにより、タウ蛋白-アルブミン複合体を、複合体を形成していないタウ蛋白及びアルブミンから分離させてもよい。好ましいイムノアッセイは、抗アルブミン抗体及び抗タウ蛋白抗体を用い、その一方(好ましくは抗タウ蛋白抗体)をタウ蛋白-アルブミン複合体の支持体上への不動化に使用し、他方(好ましくは抗アルブミン抗体)を複合体の検出に使用するサンドイッチ法である。
【００１７】
本発明において、「抗体」とは、完全抗体及びその抗原結合部位を有するフラグメント(単鎖抗体(scFv)、Fab抗体、F(ab')2抗体、Fab'抗体を含む)をいう。抗体は、既知の抗体であってもよいし、新たに作製された抗体であってもよい。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよいが、モノクローナルであることが好ましい。抗体は、(特に対象者由来の)タウ蛋白-アルブミン複合体、タウ蛋白又はアルブミンに特異的に結合することが好ましいが、定量系における当該物質の検出に影響を与えない限り、交差反応性は許容され得る。
【００１８】
特定の蛋白又はペプチドに結合する抗体を作製する方法は、当該分野において公知である。簡潔には、そのような抗体は、当該蛋白又はペプチドを、単独で又は適切なキャリア(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、ジフテリア毒素、破傷風毒素)に結合させて、必要に応じてアジュバント(例えば、完全若しくは不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム又はリン酸化アルミニウム(ミョウバン))と共に、１回又はそれ以上(皮下、静脈内、腹腔内などに)投与した動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ラクダ、ニワトリ、ダチョウなど抗体産生に使用できる動物)の血清から、例えばアフィニティークロマトグラフィーのような精製法を用いて精製することにより(例えば、免疫グロブリン画分又は精製抗体として)取得することができる。精製することなく、全血清(抗血清)をそのまま用いてもよい。
【００１９】
モノクローナル抗体を作製する方法もまた当該分野において公知である(例えば、Kohler and Milstein(Nature, 256:495-497, 1975；Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane編, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。簡潔には、当該蛋白又はペプチドで免疫した動物の脾臓細胞(Ｂ細胞)を、細胞融合法により適切な骨髄腫細胞と融合して不死化細胞(ハイブリドーマ)を作製し、所望の結合能を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択する。このハイブリドーマを、インビトロ又はインビボ(例えば、マウス腹腔内)で増殖させて産生抗体を取得してもよい。
【００２０】
抗アルブミン抗体は、対象哺乳動物のアルブミンを認識する一方で、(例えばブロッキング剤などの他の試剤中に含まれ得る)その他の哺乳動物のアルブミンを認識しないことが好ましい。より好ましくは、抗アルブミン抗体は、ヒトアルブミンを認識するが、ウシ、ウサギ、ヤギ及び/又はヒツジのアルブミンを認識しない抗体である。このような抗ヒトアルブミン抗体は、標識又は非標識の抗ヒト血清アルブミン-マウスモノクローナル抗体又は抗ヒト血清アルブミン-ウサギ(ヤギ、ヒツジなど)ポリクローナル抗体若しくは血清として国内外の供給業者から入手可能であり、又は上記の方法で容易に作製することができる。
【００２１】
抗タウ蛋白抗体は、タウ蛋白のアミノ酸２〜16位、16〜26位、60〜72位、83〜120位、118〜131位、121〜128位、121〜129位、131〜140位、154〜168位、155〜221位、156〜175位、159〜163位、193〜198位、194〜198位、195〜205位、197〜202位、208〜265位、218〜225位、307〜407位、315〜352位を認識する抗体が知られている(例えば、特開2002-40023号公報)。これら抗体は、国内外の供給業者から入手可能であり、また上記の方法によって(例えば、タウ蛋白又は上記のようなエピトープを有するフラグメントを用いて)容易に取得することができる。好ましくは、抗タウ蛋白抗体は、タウ蛋白のアミノ酸１〜44位間、アミノ酸102〜275位間又はアミノ酸307〜441位間(より好ましくはアミノ酸１〜44位間又はアミノ酸307〜441位間、より好ましくはアミノ酸１〜44位間)のエピトープを認識する抗体(より好ましくはモノクローナル抗体)である。
【００２２】
抗体は、検出可能な標識が付されていることが好ましい。抗体の標識は、当該分野で公知であり、使用する検出手段に応じて適宜選択できる。例えば、標識には、酵素、放射性同位体、蛍光物質、発色物質、発光物質などが使用できる。酵素としては、例えばペルオキシダーゼ(特にHRP)、β-ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ(特にアルカリホスファターゼ)、ルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼなどが挙げられる。放射性同位体としては、例えば、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、125Ｉ、131Ｉが挙げられる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Cy2、Cy3などが挙げられる。発色物質としては、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)などが挙げられる。発光物質としては、ルミノール、ルシフェリンなどが挙げられる。
【００２３】
不動化されたタウ蛋白-アルブミン複合体はまた、アルブミン又はタウ蛋白に特異的に結合し得るアプタマー又はペプチドを用いて定量することも可能である。
アプタマーは、特定の標的を認識する一本鎖核酸(DNA、RNA又は核酸アナログ(例えばLNA))である。特定の標的に特異的に結合し得るアプタマーを作製する方法は、当該分野において公知である。簡潔には、ランダムな塩基配列(例えば30〜150塩基)を有する核酸群を作製し、この中から対象の標的を特異的に認識するものを、例えばSELEX法などのスクリーニング法により選定する。
【００２４】
アルブミンに特異的に結合し得るペプチドは、例えば、WO96/14416[特表平10-509311号公報]やWO2009/016043[特表2010-534486号公報]に記載のような細菌由来のアルブミン結合性ドメインを含むものや、WO2008/096158[特表2010-518062号公報]に記載のような抗アルブミン抗体由来の可変ドメインを含むものである。
アルブミンに特異的に結合し得るアプタマー又はペプチドは、検出可能な標識が付されていることが好ましい。例えば、標識には、上記のような放射性同位体、蛍光物質、発色物質、化学発光物質などが用いられる。核酸標識法は当該分野で公知である。
【００２５】
標識からのシグナルの測定は、分光光度計、蛍光光度計、CCDカメラ、CMOSカメラ、フォトダイオード、光電子増倍管などから適宜選択したものを、必要に応じて光源及び/又はフィルターと共に使用して行うことができる。
【００２６】
タウ蛋白に結合可能な物質を介して不動化されたタウ蛋白-アルブミン複合体の定量は、当該分野において公知のアルブミン定量法により行うこともできる。
例えば、色素結合法では、アルブミンと反応して発色するか又は色調が変化する試剤を使用する。このような試剤としては、例えば、ブロムクレゾールグリーン(BCG)やブロムクレゾールパープル(BCP)が挙げられる。
【００２７】
タウ蛋白-アルブミン複合体の定量を、上記のような色素結合法、イムノアッセイ(特にサンドイッチ法)、アプタマーを用いる方法などにより行う場合、特に、当該方法を実施するためのキット(後述)を用いて行う場合には、簡便かつ安価で、比較的迅速な検出が可能になる。このため、本発明の方法は、臨床検査用の設備・機器の充実した病院や検査機関のみならず、診療所や医院においても比較的容易に実施できる。
【００２８】
後述する実施例から明らかなように、前頭側頭型認知症患者からの血液サンプル中のタウ蛋白-アルブミン複合体量は、アルツハイマー型認知症患者からの血液サンプル中の量より低い傾向がある。よって、血液サンプル中のタウ蛋白-アルブミン複合体量は、前頭側頭型認知症とアルツハイマー型認知症との鑑別の指標として有用である。
【００２９】
具体的には、本発明の方法は、例えば下記のように実施する。
本実施形態では、血液サンプル中のタウ蛋白-アルブミン複合体を不動化するために、タウ蛋白に結合可能な物質が固定された支持体を用いる。
血液サンプルは、予め、希釈剤(例えば緩衝液)で希釈してもよい。緩衝液は、当該分野において公知のものから適宜選択するが、例えば、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸-クエン酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酢酸緩衝液などである。緩衝液は、必要に応じて、NaCl、界面活性剤(例えば、Tween 20、Triton X-100)及び/又は防腐剤(例えば、アジ化ナトリウム)を含んでいてもよい。緩衝液の具体例は、PBS、PBS-T、TBS又はTBS-Tである。
【００３０】
血液サンプルを、支持体と、該サンプル中のタウ蛋白-アルブミン複合体が支持体上のタウ蛋白に結合可能な物質と結合するに適切な条件(例えば、温度：20℃〜40℃、より好ましくは25〜38℃；時間：５〜120分間、より好ましくは10〜90分間、より好ましくは30〜60分間)下に接触させる(インキュベーション)。
【００３１】
インキュベーション後、支持体上に不動化されなかった物質を除去するために、洗浄液(例えば、上記のような緩衝液)で、支持体を１回以上洗浄する。
この時点で、サンプル中でタウ蛋白に結合していないアルブミンは除去され、タウ蛋白-アルブミン複合体のみが支持体上に不動化される。よって、支持体上に不動化されたアルブミンの量は、血液サンプル中のタウ蛋白-アルブミン複合体の量を反映する。
【００３２】
支持体上に不動化されたアルブミンは、BCG法、BCP法、BCP改良法のような色素結合法を用いて定量することができる。
【００３３】
或いは、支持体上に不動化されたアルブミンは、イムノアッセイにより、例えば下記のように定量することができる(図１)。
標識抗アルブミン抗体を、タウ蛋白-アルブミン複合体が不動化された支持体と、抗アルブミン抗体とアルブミンとの結合に適切な条件(例えば、温度：20℃〜40℃、より好ましくは25〜38℃；時間：５〜120分間、より好ましくは10〜60分間)下に接触させる。
支持体を洗浄液(例えば、上記のような緩衝液)で１回以上洗浄することにより未結合の抗アルブミン抗体を除去する。
抗アルブミン抗体に付された標識に応じた方法により、標識からのシグナルを定量する。例えば、必要に応じて光源及び/又はフィルターと共に、マイクロプレートリーダーを用いて測光する。
【００３４】
支持体上に不動化されたタウ蛋白-アルブミン複合体を定量する前、間又は後に、使用する定量方法に応じて、ブランク及び標準物質(標準溶液)を用いて標準曲線(検量線)を作成してもよい。
【００３５】
上記の実施形態では、支持体上に不動化したタウ蛋白-アルブミン複合体を色素結合法又はサンドイッチ法により定量する方法について具体的に説明したが、サンプル中のタウ蛋白-アルブミン複合体は、他の方法(例えばウェスタンブロッティングなど)によっても定量可能であることは言うまでもない。
また、上記のイムノアッセイを用いる形態では、抗アルブミン抗体及び/又は抗タウ蛋白抗体を使用する形態を説明したが、タウ蛋白-アルブミン複合体に対する抗体が開発されれば、そのような抗体を、抗アルブミン抗体及び/又は抗タウ蛋白抗体に代えて使用できることは当業者であれば容易に認識できる。
【００３６】
対象者の血液サンプル中のタウ蛋白-アルブミン複合体の測定値が、所定の閾値を下回っているとき、当該対象者は、前頭側頭型認知症である蓋然性が高いと判断でき、測定値が閾値を上回っているとき、当該対象者はアルツハイマー型認知症である蓋然性が高いと判断できる。
閾値(カットオフ値)は、統計学的に有意な数の、前頭側頭型認知症であると確定診断された患者及びアルツハイマー型認知症であると確定診断された患者についての測定データに基づいて決定できる。
【００３７】
＜アルツハイマー病の検出キット＞
本発明のアルツハイマー病の検出キットは、タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な少なくとも１種の物質を含んでなることを特徴とする。
本キットは、上述した本発明の方法の実施に適切である。
【００３８】
タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な少なくとも１種の物質は、タウ蛋白に結合可能な少なくとも１種の物質及び/又はアルブミンに結合可能な少なくとも１種の物質であり得る。
アルブミンに結合可能な物質は、例えば、アルブミンと反応して発色するか又は色調が変化する試剤(例えば、BCGやBCP)、上記のような抗アルブミン抗体、上記のようなアルブミンに特異的に結合し得るアプタマー、上記のようなアルブミンに特異的に結合し得るペプチドであり得、好ましくは抗アルブミン抗体である。
タウ蛋白に結合可能な物質は、例えば、上記のような抗タウ蛋白抗体、上記のようなタウ蛋白に特異的に結合し得るアプタマーであり得、好ましくは抗タウ蛋白抗体である。
タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質は、溶液形態で提供されてもよいし、蛋白又はペプチドである場合には、凍結乾燥形態で提供されてもよい。
【００３９】
タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質はまた、必要であれば、上記のような標識が付されていてもよい。或いは、タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質は、(ストレプト)アビジン-ビオチンのような結合対の一方のパートナー(例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン)が付着されており、他方のパートナー(例えば、(ストレプト)アビジン、抗ジゴキシゲニン抗体)が付着した標識と結合可能にされていてもよい。
キットに含まれる、タウ蛋白-アルブミン複合体に結合可能な物質は、好ましくは１種又は２種であり、より好ましくは２種(特に、タウ蛋白に結合可能な物質とアルブミンに結合可能な物質の組合せ)である。
【００４０】
本発明のキットは、好ましくは、上記のようなタウ蛋白に結合可能な物質又はアルブミンに結合可能な物質(より好ましくは、タウ蛋白に結合可能な物質)が固定された支持体を更に含んでなる。タウ蛋白に結合可能な物質は、好ましくは、上記のような抗タウ蛋白抗体である。アルブミンに結合可能な物質は、好ましくは、上記のような抗アルブミン抗体である。
支持体の形態は、当該分野において公知のものから適宜選択でき、例えば、マイクロタイタープレート、チューブ、キャピラリチューブ、ビーズ、粒子、濾紙、フィルター、膜、ディスク、スティック、ストリップ、スライドグラス、チップなどであり得る。
【００４１】
支持体の材料は、当該分野において公知のものをいずれも使用でき、例えば、ガラス、樹脂(例えば、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリプロピレン、ポリビニルブチレート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、レーヨン)、セルロース及びその誘導体(例えば、ニトロセルロース)などであり得る。
支持体へのタウ蛋白又はアルブミンに結合可能な物質の固定は、物理的吸着、共有結合若しくは非共有結合(イオン結合、静電結合、疎水性相互作用など)のいずれであってもよい。
【００４２】
支持体は非特異的吸着を防止するためにブロッキング処理されていることが好ましい。ブロッキング剤は、当該分野において公知のものをいずれも使用できるが、例えば対象の哺乳動物以外の哺乳動物の血清アルブミン(対象がヒトである場合、例えばウシ血清アルブミン(BSA))、脱脂粉乳、カゼインなどであり得る。
タウ蛋白又はアルブミンに結合可能な物質が固定され、ブロッキング処理された支持体の表面は、水溶性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースのようなセルロースエステル)又は非還元多糖類(例えば、スクロース、トレハロース、ラフィノース)などでコーティングされていてもよい。このようなコーティングにより、支持体上のタウ蛋白又はアルブミンに結合可能な物質を含む固相は非常に安定化し、長期間の保存に適する。
【００４３】
本発明のキットは、必要に応じて、標識シグナル生成剤(例えば発色剤)及び/又は反応停止液を更に含んでいてもよい。
標識シグナル生成剤は、標識に応じて公知のものから適宜選択できる。例えば、標識がペルオキシダーゼである場合には、TMB、DAB、o-フェニレンジアミン(OPD)、2,2-アジノ-ジ-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン(ADHP)などであり得、アルカリホスファターゼである場合には、p-ニトロフェニルリン酸(pNPP)、4-メチルウンベリフェリルリン酸(4-MUP)などであり得る。
反応停止液は、例えば、硫酸又は水酸化ナトリウムであり得る。
【００４４】
本発明のキットはまた、標準曲線(検量線)作成用の標準溶液、任意に標準溶液希釈剤を含んでいてもよい。
本発明のキットはまた、希釈剤や洗浄液(例えば、上記のような緩衝液)、インキュベーションの間に支持体をシールするシーリング材(例えば、支持体がプレートである場合、プレートシール)などを含んでいてもよい。
【実施例】
【００４５】
いずれもインフォームドコンセントが得られた21例の前頭側頭型認知症(FTD)患者(63〜81歳の男性８人、女性13人)及び27例のアルツハイマー型認知症(AD)患者(60〜80歳の男性９人、女性18人)から血清を採取した。FTD患者の確定診断はThe Lund and Manheshter groupsによるFTDの臨床診断基準によった。AD患者の確定診断は神経心理学的診断及び画像診断、その他認知症を来す疾患の除外診断によった。
【００４６】
個々の血清サンプルをトリス緩衝液で300倍に希釈した。
この希釈溶液を、抗タウ蛋白モノクローナル抗体(Anti-Human Tau MAB (Clone 376720)；R&D Systems))を固定した96穴マイクロプレートにウェルあたり100μl投入し、37℃で１時間保温した。その後、未結合のものを洗い流すため、トリス緩衝液/Tween 20にて４回洗浄し、30000倍希釈の抗ヒトアルブミンポリクローナルHRP結合抗体を投入し、37℃で１時間保温した。再度、未結合のものを洗い流すため、トリス緩衝液/Tween 20にて４回洗浄した。
【００４７】
その後、TMB(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)/H2O2溶液を各ウェルに投入して発色反応を開始させ、15分後にTMB stop solutionを添加して発色反応を停止させた。
マイクロプレートリーダーにて450nmのフィルターを用いて0.1秒間測光して、吸光度を求めた。
結果を、図２に箱ひげ図として示す。結果は、同一サンプルについて独立して行った２回の測定データの平均として示す。
独立した２群のｔ検定により、差は95％の信頼区間で前頭側頭型認知症群とアルツハイマー型認知症群との間で有意であった(p<0.013)。
タウ蛋白に結合したアルブミンの血中量は、FTD患者群においてAD患者群より有意に少なく、FTDとADとの鑑別に利用できることが判明した。
【００４８】
上記の実施形態及び実施例は、本発明の理解を容易にするために例示として記載されたものであって、本発明は本明細書又は添付図面に記載された具体的形態及び例のみに限定されるものではない。本明細書に記載された具体的な構成、手段及び方法は、本発明の要旨を逸脱することなく、当該分野において公知の他の多くのものと置換可能である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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