(57)【要約】【課題】植物組織からのカルス及び増殖細胞の安定した誘導方法及びこれを用いた新規遺伝子発現系を得ることを目的とする。【解決手段】植物の組織片を培地で培養し、当該組織片からカルスを誘導するステップと、前記誘導されたカルスを有する組織片を新鮮な培地に移植するステップとを有し、前記にて増殖能力を獲得したカルスを組織片から分離することを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の組織片を培地で培養し、当該組織片からカルスを誘導するステップと、
前記誘導されたカルスを有する組織片を新鮮な培地に移植するステップとを有し、
前記にて増殖能力を獲得したカルスを組織片から分離することを特徴とするカルスの誘導方法。
【請求項２】
請求項１記載の誘導方法にて得られたカルスを植物ホルモンを添加した固定培地にて増殖、又は、植物ホルモンを添加した液体培地にて懸濁培養し増殖することを特徴とする誘導細胞の増殖方法。
【請求項３】
請求項２にて得られた誘導細胞に目的遺伝子を導入及び発現させることを特徴とする形質転換細胞の作出方法。
【請求項４】
前記組織片は、イネ科タケ亜科に属するタケ又はササであることを特徴とする請求項１記載のカルスの誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物組織からのカルス誘導及びこのカルスを増殖して得られる誘導細胞並びにこのような誘導細胞を用いた遺伝子発現系に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまで様々な植物種でカルス培養を用いて、不定芽や不定胚形成などの植物体再生や、培養変異を利用した育種、二次代謝産物の産生などの研究がなされてきた。
カルス培養には、地域的あるいは季節的な制約を受けることなく一定の環境下で安定した細胞増殖や分化を得ることができるという利点があり、植物体よりも生長速度が速く、目的の植物種の増殖効率が高い。
また、細胞増殖方法として液体懸濁培養方法があり、懸濁培養では、培養液中の成分と細胞が迅速に接触し、同調的な細胞分裂が期待できる。
さらに、細胞増殖が速いという利点があり、植物ホルモンや阻害剤などの影響を評価したりするなどの生長特性解析や、複雑な生理学的研究、分子生物学的研究を行うことに適している。
また、形質転換等により代謝を調節し、特定の二次代謝産物を高度に蓄積させることも可能であることから、組換え細胞を大量培養することによって、有用物質の安定生産を行うことが可能となる。
【０００３】
一方、タケは古くから日本人の生活に馴染みの深い植物である。
タケの種類は多く、少なくとも８８属１１６２種が確認されている。
その中でも代表的なものは、日本固有のマダケ属マダケ（Phyllostachysbambusoides Seib. Et Zucc）やハチク（P. nigra Munro var. Henonis.）、食用として中国から入ってきたモウソウチク（P. pubescens Mazel ex Houz.）がある。
一般的な樹木は１０〜１００年で成木となるのに対し、数年で成熟する高い生長能力、特徴的な代謝能力を有しているタケは有用な植物であると考えられる。
近年、タケは未利用のバイオマス資源として注目されており、他の樹木と比較し、いくつかの利点が挙げられる。
まず、１点目として生長が早いことが挙げられる。
タケノコが出る時期には一晩で１ｍ以上も伸長することもあり、２ヶ月程度の生長期間に１０ｍ以上も生長できる高い生長能力を有している。
２点目に、成熟が早いことが挙げられる。
一般的な樹木は、植栽後の若い時期は生長が速いが、その後は生長速度が低減していき、少なくとも１０年生以上にならなければ利用価値は無く、例えば、広葉樹林をバイオマス原料生産目的で伐採する場合には、３０年生前後が良いとされている。
それに対し、タケは短期間に生長を終え、１年目は含水量が多く組織や材質は完熟していないが、２年目以降、５年目以内には利用が可能となる。
３点目として、再植栽が不要であることが挙げられる。タケは無性繁殖であるため、毎年播種する必要はなく、生長量に見合った伐採を行うことで、常に一定のバイオマス原料を確保することができる。
本発明者はこれまでに、タケ植物の組織からカルスの誘導、液体懸濁培養方法について提案している（非特許文献１〜３）。
本発明は、さらに安定したカルスの誘導方法及び増殖方法を検討したものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Shinjiro Ogita (2005) Callus and Cell Suspension Culture of Bamboo Plant, Phyllostachys nigra. Plant Biotechnology, 22(2), 119-125
【非特許文献２】Shinjiro Ogita, Shinya Ohki, and Yasuo Kato Uptake of carbohydrates by suspension cultured cells of Bamboo plants In: Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology:Advances and Topical Issues (1st Edition, Volume 5), Teixeira da Silva JA (Ed), Global Science Books, Isleworth, UK, pp 240-244, 2008 (Print ISBN 978-4-903313-12-2)
【非特許文献３】Shinjiro Ogita, Harutsugu Kashiwagi and Yasuo Kato (2008) In vitro node culture of seedlings in bamboo plant, Phyllostachys meyeri McClure. Plant Biotechnology, 25(4), 381-385
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は植物組織からのカルス及び増殖細胞の安定した誘導方法及びこれを用いた新規遺伝子発現系を得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係るカルスの誘導方法は植物の組織片を培地で培養し、当該組織片からカルスを誘導するステップと、前記誘導されたカルスを有する組織片を新鮮な培地に移植するステップとを有し、前記にて増殖能力を獲得したカルスを組織片から分離することを特徴とする。
これにより、得られたカルスを植物ホルモンを添加した固定培地にて増殖、又は、植物ホルモンを添加した液体培地にて懸濁培養し増殖することができる。
また、得られた誘導細胞に目的遺伝子を導入し、発現させることもできる。
ここで、本発明に用いることができる植物としては、従来から検討されているタバコ、シロイヌナズナ、イネ等の草本植物やポプラ等の木本植物等の各種植物の組織片を対象にすることができる。
その中でも上記にて説明したイネ科タケ亜科に属するタケ又はササは成長が早く、新規遺伝子の導入及び発現系に優れる。
その中でもタケノコ組織や竹枝の節を用いるのが好ましい。
【発明の効果】
【０００７】
従来の植物組織からのカルスの誘導にあっては、誘導過程において褐色化し、分離増殖ができない場合も多く発生したが、本発明にあっては培地でカルスを一次誘導させた後に、新しい培地に移植し二次誘導させる方法を採用したことにより、植物の組織片からカルスを分離させた後にも安定した増殖能力を確保することができる。
これにより、増殖可能な優れた培養細胞が得られ、新規遺伝子を導入し発現させることもできるので普遍的なバイオリソースとなり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ハチク（Phyllostachys nigra）タケノコからのカルス誘導例を示す。
【図２】各種タケ・ササにおけるタケノコからのカルス誘導例を示す。
【図３】ハチク節培養２週目の様子を示す。
【図４】各種タケ・ササにおける節培養組織からのカルス誘導例を示す。
【図５】カルスの増殖における植物ホルモンの影響を調査した結果を示す。Ａは（２，４−Ｄ），Ｂは（Ｐｉｃｌｏｒａｍ），Ｃは（２，４，５−Ｔ），Ｄは植物ホルモン無添加である。
【図６】実施例３における培養２１日目のカルスの状況を示す。Ａは３μＭの（２，４−Ｄ），Ｂは１０μＭのＰｉｃｌｏｒａｍ，Ｃは１０μＭの（２，４，５−Ｔ），Ｄは植物ホルモン無添加のものを示す。
【図７】ＫＨ２ＰＯ４の濃度を改変した培地での増殖試験結果を示す。ａは１／２ＭＳ（ＫＨ２ＰＯ４，８５ｍｇ／ｌ）に３μＭ（２，４−Ｄ）を添加したもの，ｂ，ｃ，ｄは１０μＭの（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）であった１／２ＭＳベースにしてＫＨ２ＰＯ４の濃度を順に１７０ｍｇ／ｌ，３４０ｍｇ／ｌ，６８０ｍｇ／ｌに改変したものである。ｅ，ｆ，ｇは１０μＭの（Ｐｉｃｌｏｒａｍ），ＭＳベースにてＫＨ２ＰＯ４の濃度を順に１７０ｍｇ／ｌ，３４０ｍｇ／ｌ，６８０ｍｇ／ｌに改変したものである。
【図８】ハチクカルスの液体懸濁培養結果を示す。●印は植物ホルモンとして１０μＭ（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）を用い、ＭＳベースにＫＨ２ＰＯ４の濃度を６８０ｍｇ／ｌに改変したもの，□印は植物ホルモンとして３μＭの（２，４−Ｄ）を用い、１／２ＭＳベースのものである。
【図９】ＭＳ培地の組成表を示す。
【図１０】ＧＵＳの発現結果を示す。表中「２，４−Ｄ３」とは３μＭの植物ホルモン（２，４−Ｄ）を意味し、「ＭＳ  Ｐ６８０  ｐｉｃ１０」とはＭＳ培地をベースにＫＨ２ＰＯ４濃度を６８０ｍｇ／ｌに改変し、植物ホルモンとして１０μＭ（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）を用いたことを意味する。
【図１１】ＡｃＧＦＰ１のゲノムＰＣＲ結果を示す。
【図１２】ｍＣｈｅｒｒｙのゲノムＰＣＲ結果を示す。
【図１３】Ｒ４−ｍＣｈｅｒｒｙゲノムＰＣＲ結果を示す。
【図１４】ＡｃＧＦＰ１のＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。
【図１５】ｍＣｈｅｒｒｙのＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、増殖可能な培養細胞を得る方法を具体例に基づいて説明する。
【実施例１】
【００１０】
（タケノコ組織からのカルス誘導）
イネ科タケ亜科に属するタケ、ササ植物の組織より培養細胞を誘導する方法。
材料として２０−３０ｃｍのハチクタケノコ、すなわち「若筍」を採取し、皮をはいだ後に滅菌処理を行った。
一例として「中性洗剤を滴下した流水中で３０分間洗浄した。
その後７０％エタノールで２０分間、次いで２％  ＮａＣｌＯ（Ｔｗｅｅｎ  ２０  滴下）で６０分間浸漬処理した。
最後に滅菌水で３回すすいだ。」
基本培地にはＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  Ｓｋｏｏｇ，１９６２）と無機塩類濃度のみを１／２に改変した１／２ＭＳ培地の二種類を用いた。
図９にＭＳ培地の組織表示を示す。
培地には、植物ホルモンとしてオーキシンである2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)、4-amino-3,5,6-trichloropyridine-2- carboxylic acid (Picloram)、2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T)、サイトカイニンである６−ベンジルアデニン（ＢＡ）０、１、３、１０、３０μＭを添加し、ｐＨを０．２Ｎおよび１ＮのＨＣｌまたはＮａＯＨで５．７に調整した。
調整済み培地にＧｅｌｌａｎ  ｇｕｍを０．３％（３ｇ／Ｌ）加え、オートクレーブにて１２１℃で２０分間滅菌処理をした。
その後、クリーンベンチ内でシャーレに２０ｍｌずつ分注した。
滅菌した筍は、メスを用いて滅菌シャーレ上で約１−３ｃｍに切り出し、ピンセットを用いて２から４つずつシャーレに植え付けた（各条件１０個）。
また、移植の際には、適宜褐色化した筍片を切除しながら分割し、新鮮培地に植えつけた。
２５℃、特に望ましくは暗所で培養を行い、カルスの誘導を促した。
約２−４週間後、図１の表に示すように切断面周辺からカルスが誘導され始めた。
すべての筍片と１次増殖したカルスをおよそ４週間毎に上記新鮮な培地に移植を繰り返すと、図１の表の２次カルス誘導の欄に示すように２−６か月後には２次的に増殖するカルスを誘導できるものとできないものがあった。
図１の表，２次カルス誘導にて良好。
分離増殖可能とは筍片から分離したカルスに増殖能力が有効に有していたことを意味する。
ＭＳ培地と１／２ＭＳ培地では大きな差が認められなかったが、添加した植物ホルモンにより差があった。
植物ホルモンとしては（２，４−Ｄ）と（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）がよく、その濃度は１〜１０μＭがよく、好ましくは３〜１０μＭであった。
そこで、次にＭＳ培地と１／２ＭＳ培地を用いて各種タケ又はササにおけるタケノコの組織片を用いて実施例１と同様の培養実験を行った。
その結果を図２の表に示す。
これにより、各種のタケ、ササにおいて同様の結果が得られ、本発明に係るカルス誘導方法は汎用性があることが認められた。
【実施例２】
【００１１】
（節培養組織からのカルス誘導）
材料として、温室内において鉢植え栽培しているハチク当年生の竹稈（直径：約２ｍｍ）より腋芽を一つ含むように切り出した１−２ｃｍの節を培養に供した。
一例として「中性洗剤を数滴滴下した蒸留水により採取した節を１０分間洗浄し、次いで７０％エタノールに５分間浸漬した後、Ｔｗｅｅｎ  ２０  を数滴加えた２％次亜塩素酸ナトリウム溶液に５分間浸漬して滅菌処理を行った。」その後クリーンベンチ内にて、０．１％ＰＰＭ入り滅菌水で１０分間すすぎ、滅菌後の節はクリーンベンチ内で培地、特に望ましくは液体培地１／２ＭＳ培地（ホルモン無添加）に植えつけた。
このものを２５℃、暗所、または光量子８０−１００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１  、１６時間日長条件おいて培養を行い、シュートの伸長を促した。
図３に培養２週目のシュートの様子を示す。
この節組織を用いて実施例１に従って、Ｐｉｃｌｏｒａｍ１０μＭを添加したＭＳ改変培地（ＫＨ２ＰＯ４を６８０ｍｇ／Ｌ）にて培養を行ったところ、多くのタケ・ササにおいて、特に良好にシュート伸長した節培養組織から良好に増殖するカルスを得ることができた。
その結果を図４の表に示す。
図４の表に示すように節を用いた場合にシュートの伸長を促した後にカルス誘導したことにより分離増殖可能なカルスが得られた。
【実施例３】
【００１２】
（カルスおよび懸濁培養細胞の効率的増殖）
基本培地にはＭＳ培地または無機塩類濃度のみを１／２に改変した１／２ＭＳ培地を用いた。
培地には、植物ホルモンとしてオーキシンである2,4-dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)、4-amino-3,5,6-trichloropyridine-2- carboxylic acid (Picloram)、2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T)を０、３、５、１０μＭを添加し、ｐＨを０．２Ｎおよび１ＮのＨＣｌまたはＮａＯＨで５．７に調整した。
調整済み培地にＧｅｌｌａｎ  ｇｕｍを０．３％（３ｇ／Ｌ）加え、オートクレーブにて１２１℃で２０分間滅菌処理をした。
その後、クリーンベンチ内でシャーレに２０ｍｌずつ分注した。
各固体培地に約５０ｍｇのハチクカルスを３個ずつ２枚のシャーレに植え付け、培養１４、２８日目にカルスの重量を測定し、増殖の評価を行った。
その結果を図５のグラフに示し、２１日目のカルスの状況を図６の写真に示す。
図５において、Ａは植物ホルモン（２，４−Ｄ）、Ｂは（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）、Ｃは（２，４，５−Ｔ）を添加したものであり、Ｄは植物ホルモンを添加しなかった結果である（ｎ＝６）。
３つの棒グラフのうち、左側のホワイトはホルモンの濃度が３μＭ，中央のグレーが５μＭ，右側の黒が１０μＭである。
また、培地は１／２ＭＳ培地である。
図６の写真のうち、Ａは３μＭの（２，４−Ｄ），Ｂは１０μＭのＰｉｃｌｏｒａｍ，Ｃは１０μＭの（２，４，５−Ｔ），Ｄは無添加のものを示す。
また、バーの長さは１ｃｍを示す。
この結果、ハチクカルスの増殖にはオーキシンの添加が有効であり、最も効果が大きかったのは、Ｐｉｃｌｏｒａｍ  １０μＭである。
次いでこのホルモン条件にて基本培地の改変を行った。
増殖制御因子としてＫＨ２ＰＯ４濃度に着目し、このものを８５、１７０、３４０、６８０ｍｇ／ｌに改変した１／２ＭＳ（通常は８５ｍｇ／ｌ）およびＭＳ培地を調整（通常は１７０ｍｇ／ｌ）、約５０  ｍｇのＨ４カルスを３個ずつ２枚のシャーレに植え付け、同様に増殖の評価を行った。
その結果を図７のグラフに示す。
ａは１／２ＭＳ，ＫＨ２ＰＯ４  ８５ｍｇ／ｌ，３μＭ（２，４−Ｄ）、ｂは１／２ＭＳベースの１０μＭ（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）でＫＨ２ＰＯ４  １７０ｍｇ／ｌ、ｃはｂにおいてＫＨ２ＰＯ４  ３４０ｍｇ／ｌ、ｄはｂにおいてＫＨ２ＰＯ４  ６８０ｍｇ／ｌである。
また、ｅ，ｆ，ｇはＭＳベースに１０μＭ（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）を添加し、ＫＨ２ＰＯ４を順に１７０，３４０，６８０ｍｇ／ｌに改変したものである。
これにより、ＭＳのＫＨ２ＰＯ４濃度を６８０ｍｇ／ｌと通常の４倍まで高めることでハチクカルスは旺盛に増殖することが分かった。
この条件は液体懸濁培養にも有効であり、その結果を図８のグラフに示す。
図８のグラフ中、□印は１／２ＭＳ，植物ホルモン３μＭ（２，４−Ｄ）、●印はＭＳのＫＨ２ＰＯ４  ６８０ｍｇ／ｌ改変，植物ホルモン１０μＭ（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）の結果である。
従来の１／２ＭＳ培地と比較してＳＣＶ（sedimented cell volume）細胞沈降量あたりで培養液の８０％と２倍程度の増殖性が認められた。
この条件は、他のタケ・ササカルス、すなわちマダケ（Phyllostachys bambusoides）、ホウライチク（Bambusa multiplex）、ホウライコマチ（Bambusa glaucescens f. Horaikomachi）、キョチク（Dendrocalamus giganteus）、ブランデシー（Dendrocalamus brandisii）、チシマザサ（Sasa kurilensis）でも有効であることを確認できた。
【実施例４】
【００１３】
次にパーティクルガン法により形質転換の検討をした。
（導入遺伝子の確認）
パーティクルガン法はＤＮＡコーティングした金粒子等を植物細胞に撃ち込むことで細胞内に遺伝子を導入する方法で、全ての植物種に用いることができる。
金粒子が直接核の中に撃ち込まれるか、もしくは、核の極めて近くに撃ち込まれた場合に、金粒子の表面から遊離したＤＮＡがゲノムＤＮＡに組み込まれる。
ゲノムＤＮＡに組み込まれなかった場合においても、核内で導入遺伝子から一時的に転写が起こるため、導入遺伝子の発現効率を調べることが可能である。
ＧＵＳ遺伝子の一過的発現を指標とした遺伝子導入条件の検討を行った。
１／２ＭＳ，３μＭの（２，４−Ｄ）固体培地で２１日間培養した増殖性が高いカルスを材料としたとき、ＧＵＳが発現した細胞は１シャーレあたり４個だったのに対し、ＭＳ，ＫＨ２ＰＯ４濃度６８０ｍｇ／ｌ，１０μＭの（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）固体培地で培養したカルスでは１シャーレあたり２８個であった。
次に、ＭＳ，ＫＨ２ＰＯ４濃度６８０ｍｇ／ｌ，１０μＭの（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）液体培地で１１、１３日間培養した懸濁細胞を材料とし、遺伝子導入距離を６、９ｃｍに設定し、遺伝子導入を行った。
その結果、遺伝子導入距離は６ｃｍの方が遺伝子導入効率は高く、平均２２２個、最大３３９個の細胞でＧＵＳの発現が確認され、９ｃｍでは平均３８個であった（図１０）。
ＧＵＳ遺伝子による一過性遺伝子発現の実験から、カルス、懸濁細胞共に６ｃｍの遺伝子導入距離が適していることが明らかとなり、上記培地で培養した細胞において遺伝子導入効率が高い結果となった。
これは、ＭＳ，ＫＨ２ＰＯ４濃度６８０ｍｇ／ｌ，１０μＭの（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）培地で培養した細胞は分裂頻度が高く、細胞壁の構造が薄く変化し、遺伝子導入に適した細胞であったと考えられる。
また、分裂頻度が高いことにより、効率的に形質転換細胞の増殖が起こることが予想された。
（蛍光タンパク質遺伝子発現の顕微鏡解析）
ＡｃＧＦＰ１、ｍＣｈｅｒｒｙを導入した細胞を蛍光実体顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡にて観察を行い、それぞれ、ＡｃＧＦＰ１の緑色蛍光ｍＣｈｅｒｒｙの赤色蛍光が確認できたので、安定的な遺伝子発現が確認された。
また、Ｒ４−ｍＣｈｅｒｒｙを導入した細胞においても赤色蛍光が確認された。
供試材料の適用範囲をみるために、マダケＭ４細胞、無菌的に培養しているハチクのシュート、暗条件での培養にて白化させたモウハイチクのシュートを材料とし、ハチク懸濁細胞と同様の方法を用いて遺伝子の導入を行った。
その結果、マダケＭ４  細胞において一過性の発現を確認した。
また、ハチクのシュート、モウハイチクの白化シュートにおいても一過性の発現を確認することができた。
このことから、今回の遺伝子導入条件はハチク懸濁細胞だけでなく、他のタケ細胞や組織に適用が可能であることが示唆された。
（ＰＣＲによる遺伝子導入および発現解析）
増殖量、蛍光強度がそれぞれ違うＡｃＧＦＰ１およびｍＣｈｅｒｒｙ導入ハチク細胞株をランダムに４株選抜し、材料とした。
ゲノムＰＣＲの結果、それぞれの株で、４４６ｂｐに設計したＡｃＧＦＰ１プライマー、４５９ｂｐに設計したｍＣｈｅｒｒｙプライマーおよび７１３ｂｐに設計したＨｙｇプライマーに対してそれぞれＡｃＧＦＰ１領域、ｍＣｈｅｒｒｙ領域、ＨＰＴ領域の増幅産物を確認することができた（図１１，１２）。
また、Ｒ４−ｍＣｈｅｒｒｙ導入ハチク細胞株においてランダムに８株を選抜し、ゲノムＰＣＲの材料とした。
ｍＡＬＳ遺伝子の導入確認はＰＣＲにて目的の領域を増幅後、ＭｆｅＩで処理することにより行った。
制限酵素処理後に、全ての株において１９０ｂｐの断片が確認された（図１３Ａ）。
ｍＣｈｅｒｒｙ領域の増幅産物も全ての株において確認することができた（図１３Ｂ）。
ＲＴ−ＰＣＲの結果、逆転写の際に用いたｔｏｔａｌ  ＲＮＡにはＤＮＡがコンタミしていないことが確認され、すべての株において、ＡｃＧＦＰ１  領域、ｍＣｈｅｒｒｙ領域、ＨＰＴ領域の増幅産物を確認することができた（図１４，１５）。
このことから、全ての細胞株において導入遺伝子の転写が安定的に行われていることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図９】
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【図１０】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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