(57)【要約】【課題】腫瘍内誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）に対する効果的なアルギニン基質となり得る組成物の提供【解決手段】  ＰＥＧ−ｂ−ポリ（Ｌ−Ａｒｇ）またはポリ（Ｌ−Ａｒｇ）−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ポリ（Ｌ−Ａｒｇ）とポリアニオン性ポリマーのポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）及びその使用。
2016167333.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリカチオン性ポリマーとポリアニオン性ポリマーを含んでなるポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）であって、
ポリカチオン性ポリマーが、式（Ｉ）
2016167333.tif 000025
式中、
Ａは、
（ｉ）水素、非置換または置換Ｃ1−Ｃ12アルキル基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ1Ｒ2ＣＨ−（ここで、Ｒ1及びＲ2は独立して、Ｃ1−Ｃ4アルコキシまたはＲ1とＲ2は一緒になって−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ−を表す。）の基を表すか、或は
（ｉｉ）式
2016167333.tif 000026
を表し、
Ｌ及びＬ’は独立して、連結基を表し
Ｙ及びＹ’は独立して、Ｈ、Ｃ1-21アルキルカルボニル、置換Ｃ1-4アルキルカルボニル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキルカルボニル、非置換もしくは置換アリールカルボニル、または非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリールカルボニルを表し、ここで、置換Ｃ1-4アルキルカルボニルの置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、カルボキシル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキル、非置換もしくは置換アリール及び非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリール、非置換もしくは置換アダマンチル、非置換もしくは置換コレステロール残基からなる群より選ばれ、これらの置換基が置換されている場合の置換基はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキルオキシ、ヒドロキシル、カルボキシル、シアノ、ニトロ、ハロゲン原子、またはモノ−もしくはジＣ1-4アルキルアミノであることができ、
ｍ及びｍ’は独立して、５〜３００の整数であり、
ｎは５〜１，０００の整数であり、
式中のｍまたはｍ’個のアミジノ基（Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）の８０％まではＨであってもよい、
で示される共重合体であり、
ポリアニオン性ポリマーはポリアニオン性多糖、ポリアニオン性ポリペプチド、ポリ（アクリル酸）、及びポリ（メタアクリル酸）からなる群より選ばれ、かつ、
前記ＰＩＣは水に溶解または分散させたとき、平均粒径がナノメートル（ｎｍ）オーダーのＰＩＣミセルの形態にある、
前記ポリイオンコンプレックス。
【請求項２】
請求項１に記載のポリイオンコンプレックスであって、Ａが（ｉ）で定義される、ポリイオンコンプレックス。
【請求項３】
請求項１に記載のポリイオンコンプレックスであって、Ａが（ｉｉ）で定義される、ポリイオンコンプレックス。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１に記載のポリイオンコンプレックスを有効成分として含む、哺乳動物組織における活性化された細胞に由来する誘導型ＮＯシンターゼの基質Ｌ−Ａｒｇを提供するための組成物。
【請求項５】
哺乳動物組織における活性化された細胞が腫瘍組織内または近傍のマクロファージである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
哺乳動物組織における活性化された細胞が心臓筋肉内の炎症に伴い活性化されたマクロファージである、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１に記載のポリイオンコンプレックスを有効成分として含む、哺乳動物組織における腫瘍を予防または治療するための組成物。
【請求項８】
式（Ｉ）
2016167333.tif 000027
式中、
Ａは、
（ｉ）水素、非置換または置換Ｃ1−Ｃ12アルキル基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ1Ｒ2ＣＨ−（ここで、Ｒ1及びＲ2は独立して、Ｃ1−Ｃ4アルコキシまたはＲ1とＲ2は一緒になって−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ−を表す。）の基を表すか、或は
（ｉｉ）式
2016167333.tif 000028
を表し、
Ｌ及びＬ’は独立して、連結基を表し
Ｙ及びＹ’は独立して、Ｈ、Ｃ1-21アルキルカルボニル、置換Ｃ1-4アルキルカルボニル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキルカルボニル、非置換もしくは置換アリールカルボニル、または非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリールカルボニルを表し、ここで、置換Ｃ1-4アルキルカルボニルの置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、カルボキシル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキル、非置換もしくは置換アリール及び非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリール、非置換もしくは置換アダマンチル、非置換もしくは置換コレステロール残基からなる群より選ばれ、これらの置換基が置換されている場合の置換基はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキルオキシ、ヒドロキシル、カルボキシル、シアノ、ニトロ、ハロゲン原子、またはモノ−もしくはジＣ1-4アルキルアミノであることができ、
ｍ及びｍ’は独立して、５〜３００の整数であり、
ｎは５〜１，０００の整数であり、
式中のｍまたはｍ’個のアミジノ基（Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）の８０％まではＨであってもよい、
で示されるブロック共重合体の製造方法であって、
式（ＩＩ）
2016167333.tif 000029
式中、
Ａは、
（ｉ）’上記式（Ｉ）の（ｉ）について定義するとおりであるか、或いは、
（ｉｉ）’式
2016167333.tif 000030
を表し、
Ｌ、Ｌ’、Ｙ、Ｙ’、ｎ、ｍ、ｍ’は上記式（Ｉ）について定義するとおりである、
で示されるブロック共重合体にＮ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンを、必要により反応非活性溶媒中で反応させてオルニチンに由来するセグメント中のδ−アミノ基をグアニジノ化する工程を含んでなる、方法。
【請求項９】
請求項８に記載のブロック共重合体の製造方法であって、式（ＩＩ）のＡが（ｉ）’で定義される、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載のブロック共重合体の製造方法であって、式（ＩＩ）のＡが（ｉｉ）で定義される、方法。
【請求項１１】
式（ＩＩＩ）
2016167333.tif 000031
式中、
Ｌ及びＬ’は独立して、連結基を表し
Ｙ及びＹ’は独立して、Ｈ、Ｃ1-21アルキルカルボニル、置換Ｃ1-4アルキルカルボニル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキルカルボニル、非置換もしくは置換アリールカルボニル、または非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリールカルボニルを表し、ここで、置換Ｃ1-4アルキルカルボニルの置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、カルボキシル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキル、非置換もしくは置換アリール及び非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリール、非置換もしくは置換アダマンチル、非置換もしくは置換コレステロール残基からなる群より選ばれ、これらの置換基が置換されている場合の置換基はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキルオキシ、ヒドロキシル、カルボキシル、シアノ、ニトロ、ハロゲン原子、またはモノ−もしくはジＣ1-4アルキルアミノであることができ、
ｍ及びｍ’は独立して、５〜３００の整数であり、
ｎは５〜１，０００の整数であり、
式中のｍまたはｍ’個のアミジノ基（Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）の８０％まではＨであってもよい、
で示される共重合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（Ｌ−アルギニン）またはポリ（Ｌ−アルギニン）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（Ｌ−アルギニン）とポリアニオン性ポリマーを含んでなるポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）、このようなＰＩＣの用途、例えば、その腫瘍組織内マクロファージの活性化に向けた使用、並びに前記ブロック共重合体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍組織にはガン細胞のみならず多くの免疫細胞が存在する。腫瘍組織形成初期段階では免疫細胞による抗ガン活性によって腫瘍組織の成長は妨げられガン細胞は体内から除去される。しかしながら、このような免疫細胞による抗ガン活性が弱められると腫瘍組織は成長を続け、腫瘍組織の転移まで生じる場合もある。ガン細胞を死滅させるためにこの腫瘍組織に存在する免疫細胞を活性化させる治療法をガン免疫療法と言い、近年注目を集めている。従来のがん免疫療法では、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の過剰投与による細胞傷害性Ｔ細胞やナチュラルキラー細胞が活性化されてきたが、ＩＬ−２は腫瘍組織へ特異的に取り込まれる機構を持たず、現状では過剰量を全身投与しているため、重篤な毒性が確認されている。また、ガン細胞が腫瘍増殖因子またはトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）というサイトカインを分泌し始めた腫瘍環境では免疫細胞の活性化は限られてしまうことも解決しなければならない課題である。
【発明の概要】
【０００３】
本発明者等は上記課題を解決すべく、活性化させるべき免疫細胞としてマクロファージに注目した。マクロファージは腫瘍組織内に非常に多く浸潤しており、一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ，ＮＯ）を産生することでガン細胞のアポトーシス（プログラム死）を誘導している。活性化したマクロファージは細胞内では、誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）を発現しており、Ｌ−アルギニンを基質とすることでＮＯを産生する。この酵素反応はＬ−アルギニン濃度を律速段階としており、腫瘍内アルギニン濃度が増加するほどＮＯ産生速度が増加するため、腫瘍組織に効率的にＬ−アルギニンをデリバリーすることでマクロファージの抗ガン活性を高めることが期待できる。
【０００４】
このような背景の下、効率的にＬ−アルギニンを腫瘍組織に伝達するためにドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術を用いてＬ−アルギニンをデリバリーする方法を検討した。
【０００５】
その結果、生分解性ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（Ｌ−アルギニン）〔ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）またはＰＥＧ−ＰＡｒｇと略記する場合あり〕を新規に合成し、これとポリアニオン性ポリマーとの静電相互作用によって作製したコアシェル型ポリイオンコンプレックスミセル（Ｐｏｌｙｉｏｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｍｉｃｅｌｌｅ，ＰＩＣ／ｍ）のナノ粒子が、効率的に腫瘍組織に集積するとともに、該共重合体はＬ−アルギニンをポリ（Ｌ−Ａｒｇ）セグメントの重合単位として有し、かつ、該共重合体がポリアニオン性ポリマーとＰＩＣミセルを形成しているにもかかわらず、遊離Ｌ−アルギニンと同様にｉＮＯＳの基質となり得、しかも、腫瘍を担持する実験哺乳動物における腫瘍体積を有意に低減することを見いだした。また、ポリ（Ｌ−アルギニン）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（Ｌ−アルギニン）〔Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）またはＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇと略記する場合あり〕のトリブロック共重合体も前記ジブロック共重合体と同様に作用することも見いだした。
【０００６】
他方、従来技術文献、ＷＯ２００８／１０４６９４には概括的にＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）を包含し得るグラフト化アミノ酸ポリマーが記載されており、特開２００６−５６８６４には概括的にＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）を包含し得る共重合体が記載されているともいえるかも知れない。しかし、具体的には（または特定の化学構造式で特定された）ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）は記載されておらず、また、かようなポリマーをどのようにして効率よく製造することができるかについてのみならず、かようなポリマーとポリアニオン性ポリマーを含んでなる組成物、さらには、かようなポリマーとポリアニオン性ポリマーポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）が水性媒体中で安定なミセルまたは高分子ミセルを形成し得ることについては何ら記載も示唆もされていないし、マクロファージの存在下で産生されるｉＮＯＳの基質となり得るＬ−Ａｒｇを提供できることは示唆すらされていない。一方、本発明を構成する系とは異なる、ポリアニオン性アミノ酸（ＰＥＧ−ｂ−ＰＡｓｐ）とポリカチオン性アミノ酸（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬｙｓ）のＰＩＣがミセルを形成することは知られている（例えば、Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２８，  ５２９４−９９（１９９５）参照）。
【０００７】
また、ポリアルギニンに関し、従来合成されていたポリ（アルギニン）セグメントを含むブロック共重合体は、ジグアニジンなどの副産物を含んでいたり、定量的なグアニジノ基置換が出来ていなかった（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓ．Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７，２４９７‐２５０２，（１９９２）参照。）。また、ポリ（アルギニン）側鎖がＺ保護基を有するブロック共重合体が報告されているが、Ｚ保護基を外す条件が厳しく、ミリグラムスケールでは行えているものの、グラムスケールで脱保護しようとするとペプチド主鎖が開裂してしまうものであった（ＥＲＩＣ  Ｐ．ＨＯＬＯＷＫＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ，６，５２‐５７，２００７））。さらに、これらの製造方法は側鎖に完全なグアニジノ基ではないものを含むために、また、分子量分布が広くあまり制御されていないために、ペプチド結合分解後のＬ−アルギニンモノマーがｉＮＯＳの基質として作用しなかったり、安定なＰＩＣミセルが形成できないといった懸念があった。くわえて、従来のＰＩＣミセルの生理条件下における安定性は低く、血中の塩濃度、ポリアニオン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）によって粒子が崩壊してしまうことが挙げられる。さらに、従来のＰＩＣミセルはタンパクや核酸を腫瘍組織にデリバリーすることを目的とした設計であったため、ナノ粒子それ自体の抗ガン活性などは確認されていなかった。
【０００８】
このような従来技術に随伴する問題点に関し、本発明によると、特定の製造方法で製造されるＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）またはＰ（Ｌ−Ａｒｇ）−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）は、分子量分布が狭く、かつ、水性媒体中で該ブロック共重合体とポリアニオン性ポリマーから形成されるＰＩＣミセルのナノ粒子は平均径が、例えば、腫瘍組織への取り込みに適する安定なナノメートル（ｎｍ）サイズであることも見いだした。
【０００９】
したがって、前述の課題を解決する手段として、限定されるものでないが、以下の本発明の各種態様が提供される。
【００１０】
（１）  ポリカチオン性ポリマーとポリアニオン性ポリマーを含んでなるポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）であって、
ポリカチオン性ポリマーが、式（Ｉ）
【化１】
2016167333.tif 000003
式中、
Ａは、
（ｉ）水素、非置換または置換Ｃ1−Ｃ12アルキル基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ1Ｒ2ＣＨ−（ここで、Ｒ1及びＲ2は独立して、Ｃ1−Ｃ4アルコキシまたはＲ1とＲ2は一緒になって−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ−を表す。）の基を表すか、或は
（ｉｉ）式
【化２】
2016167333.tif 000004
を表し、
Ｌ及びＬ’は独立して、連結基を表し
Ｙ及びＹ’は独立して、Ｈ、Ｃ1-21アルキルカルボニル、置換Ｃ1-4アルキルカルボニル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキルカルボニル、非置換もしくは置換アリールカルボニル、または非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリールカルボニルを表し、ここで、置換Ｃ1-4アルキルカルボニルの置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、カルボキシル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキル、非置換もしくは置換アリール及び非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリール、非置換もしくは置換アダマンチル、非置換もしくは置換コレステロール残基からなる群より選ばれ、これらの置換基が置換されている場合の置換基はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキルオキシ、ヒドロキシル、カルボキシル、シアノ、ニトロ、ハロゲン原子、またはモノ−もしくはジＣ1-4アルキルアミノであることができ、
ｍ及びｍ’は独立して、５〜３００の整数であり、
ｎは５〜１，０００の整数であり、
式中のｍまたはｍ’個のアミジノ基（Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）の８０％まではＨであってもよい、
で示される共重合体であり、
ポリアニオン性ポリマーはポリアニオン性多糖、ポリアニオン性ポリペプチド、ポリ（アクリル酸）及びポリ（メタアクリル酸）からなる群より選ばれ、かつ、
前記ＰＩＣは水に溶解または分散させたとき、平均粒径がナノメートル（ｎｍ）オーダーのＰＩＣミセルの形態にある、
前記ポリイオンコンプレックス。
（２）  態様（１）に記載のポリイオンコンプレックスであって、Ａが（ｉ）で定義される、ポリイオンコンプレックス。
（３）  態様（１）に記載のポリイオンコンプレックスであって、Ａが（ｉｉ）で定義される、ポリイオンコンプレックス。
（４）  態様（１）〜（３）のいずれか１に記載のポリイオンコンプレックスを有効成分として含む、哺乳動物組織における活性化された細胞に由来する誘導型ＮＯシンターゼの基質Ｌ−Ａｒｇを提供するための組成物。
（５）  哺乳動物組織における活性化された細胞が腫瘍組織内または近傍のマクロファージである、態様（４）に記載の組成物。
（６）  哺乳動物組織における活性化された細胞が心臓筋肉内の炎症に伴い活性化されたマクロファージである、態様（４）に記載の組成物。
（７）  態様（１）〜（３）のいずれか１に記載のポリイオンコンプレックスを有効成分として含む、哺乳動物組織における腫瘍を予防または治療するための組成物。
（７’）  投与を必要とする哺乳動物に、態様（１）〜（３）のいずれか１、好ましくは（２）に記載のポリイオンコンプレックスの抗腫瘍有効量を投与することを含んでなる、哺乳動物の腫瘍の予防または治療方法。
（８）  式（Ｉ）
【化３】
2016167333.tif 000005
式中、
Ａは、
（ｉ）水素、非置換または置換Ｃ1−Ｃ12アルキル基を表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基、式Ｒ1Ｒ2ＣＨ−（ここで、Ｒ1及びＲ2は独立して、Ｃ1−Ｃ4アルコキシまたはＲ1とＲ2は一緒になって−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ−もしくは−Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ−を表す。）の基を表すか、或は
（ｉｉ）式
【化４】
2016167333.tif 000006
を表し、
ＬおよびＬ’は独立して、連結基を表し
ＹおよびＹ’は独立して、Ｈ、Ｃ1-21アルキルカルボニル、置換Ｃ1-4アルキルカルボニル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキルカルボニル、非置換もしくは置換アリールカルボニル、または非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリールカルボニルを表し、ここで、置換Ｃ1-4アルキルカルボニルの置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、カルボキシル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキル、非置換もしくは置換アリール及び非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリール、非置換もしくは置換アダマンチル、非置換もしくは置換コレステロール残基からなる群より選ばれ、これらの置換基が置換されている場合の置換基はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキルオキシ、ヒドロキシル、カルボキシル、シアノ、ニトロ、ハロゲン原子、またはモノ−もしくはジＣ1-4アルキルアミノであることができ、
ｍおよびｍ’は独立して、５〜３００の整数であり、
ｎは５〜１，０００の整数であり、
式中のｍまたはｍ’個のアミジノ基（Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）の８０％まではＨであってもよい、
で示されるブロック共重合体の製造方法であって、
式（ＩＩ）
【化５】
2016167333.tif 000007
式中、
Ａは、
（ｉ）’上記式（Ｉ）の（ｉ）について定義するとおりであるか、或いは、
（ｉｉ）’式
【化６】
2016167333.tif 000008
を表し、
Ｌ、Ｌ’、Ｙ、Ｙ’、ｎ、ｍ、ｍ’は上記式（Ｉ）について定義するとおりである、
で示されるブロック共重合体にＮ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンを、必要により反応非活性溶媒中で反応させてオルニチンに由来するセグメント中のδ−アミノ基をグアニジノ化する工程を含んでなる、方法。
（９）  態様（８）に記載のブロック共重合体の製造方法であって、式（ＩＩ）のＡが（ｉ）’で定義される、方法。
（１０）  態様（８）に記載のブロック共重合体の製造方法であって、式（ＩＩ）のＡが（ｉｉ）で定義される、方法。
（１１）  式（ＩＩＩ）
【化７】
2016167333.tif 000009
式中、
ＬおよびＬ’は独立して、連結基を表し
ＹおよびＹ’は独立して、Ｈ、Ｃ1-21アルキルカルボニル、置換Ｃ1-4アルキルカルボニル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキルカルボニル、非置換もしくは置換アリールカルボニル、または非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリールカルボニルを表し、ここで、置換Ｃ1-4アルキルカルボニルの置換基は、ハロゲン原子、ヒドロキシル、カルボキシル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキル、非置換もしくは置換アリール及び非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリール、非置換もしくは置換アダマンチル、非置換もしくは置換コレステロール残基からなる群より選ばれ、これらの置換基が置換されている場合の置換基はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキルオキシ、ヒドロキシル、カルボキシル、シアノ、ニトロ、ハロゲン原子、またはモノ−もしくはジＣ1-4アルキルアミノであることができ、
ｍおよびｍ’は独立して、５〜３００の整数であり、
ｎは５〜１，０００の整数であり、
式中のｍまたはｍ’個のアミジノ基（Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）の８０％まではＨであってもよい、
で示されるブロック共重合体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に従うＰＩＣミセル、特に、式（Ｉ）で表され、Ａが（ｉ）で定義されるジブロック共重合体と、好ましくはポリアニオン性多糖、より好ましくはコンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、最も好ましくはコンドロイチン硫酸のＰＩＣミセル、血液中で単分散かつ安定なＰＩＣミセルとして存在することができる。このようなＰＩＣミセルは腫瘍内マクロファージに取り込まれることで有意にＮＯを産生することから抗ガン剤や抗ガン作用を有するタンパク、核酸等を担持していなくてもナノ粒子それ自体が抗ガンまたは抗腫瘍活性を示すため、単独で、または他の抗ガン剤と組み合わせてガン療法で用いることのできる有望な一候補物質である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＮＣＡの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルグラムである。
【図２】ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ））のサイズ分画クロマトグラム（ＳＥＣ）である。
【図３】ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ））の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルグラムである。
【図４】ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルグラムである。
【図５】ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ）の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルグラムである。
【図６】ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ2））の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルグラムである。
【図７】ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）のサイズ分画クロマトグラム（ＳＥＣ）である。
【図８】ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）（重合度ｍ＝３０）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図９】ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルグラムである。
【図１０】グアニジノ化の反応時間による置換率の変化を示すグラフである。
【図１１】ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）（重合度ｍ＝６２）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルグラムである。
【図１２】ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｄ−Ａｒｇ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルグラムである。
【図１３】ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｌｙｓ−Ｇｕａ）の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルグラムである。
【図１４】ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）とコンドロイチン硫酸ＣからなるＰＩＣミセルのＤＬＳ評価結果を示すグラフである。
【図１５】バッファ中でのポリアルギニンとｉＮＯＳ酵素の反応によるＮＯ産生評価の結果を示すグラフである。
【図１６】ＲＡＷ２６４．７マクロファージからのＮＯ産生量評価の結果を示すグラフである（＊ ｐ ＜ ０．０５，ｎ＝３）。
【図１７】Ｌ−ＰＡｒｇ−ＣＳ／ｍ静脈投与に対する担がんマウスの相対的体重変化を示すグラフである（ｎ＝４）。
【図１８】Ｌ−ＰＡｒｇ−ＣＳ／ｍ静脈投与に対する担がんマウスの腫瘍体積変化を示すグラフである（＊ ｐ ＜ ０．０５，＊＊ ｐ ＜ ０．０１，ｎ＝４）。
【図１９】ＰＯｒｎ（Ｚ）−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＯｒｎ（Ｚ）及びＰＯｒｎ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＯｒｎの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルグラムである。
【図２０】ＰＡｒｇ（Ｂｏｃ２）−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＡｒｇ（Ｂｏｃ２）及びＰＡｒｇ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＡｒｇの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルグラムである。
【図２１】ＰＩＣ（ＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ＋ＰＡＡｃまたはＰＭＮＴ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＭＮＴ／ＰＡｒｇ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＡｒｇ＋ＰＡＡｃ）のゲル化挙動を表す図に代わる写真である。
【図２２】ＰＥＧ−ｂ−ＰＡｒｇ／ＣＳおよびＰＡｒｇ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＡｒｇ／ＣＳのＨＵＶＥＣにおけるチューブ形成挙動を表す図に代わる写真である。
【図２３】心筋梗塞（ＭＩ）後４週目の心エコーグラフおよび左室駆出率（ＬＶＥＦ）測定結果を表すグラフである。
【図２４】ＭＩ後４週目のマッソン  トリクローム（Ｍａｓｓｏｎ  ｔｏｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色による心臓組織の組織学的評価結果を表す図に代わる写真である。
【発明の詳細な記述】
【００１３】
本明細書で用いる技術用語は、別に定義しない限り、当該技術分野で常用されている意味内容を表すものとして使用している。
【００１４】
＜ＰＩＣ＞
本発明のＰＩＣは、ポリカチオン性ポリマーとしての式（Ｉ）のブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）またはＰ（Ｌ−Ａｒｇ）−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ））とポリアニオン性ポリマーを含んでなるが、好ましくは、該共重合体と該ポリアニオン性ポリマー、から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）か、或いは、からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）ものである。
＜ＰＩＣミセル＞
さらに、式（Ｉ）のブロック共重合体（ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）またはＰ（Ｌ−Ａｒｇ）−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ））−とポリアニオン性ポリマーのＰＩＣは、水性媒体中で形成され、該共重合体中のポリ（Ｌ−アルギニン）（Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）とも記載する。）セグメントとポリアニオン性ポリマー間の静電相互作用を介してＰＩＣ部を形成することにより、該ＰＩＣ部をコアとし、一方、該共重合体のポリ（エチレングリコール）部をシェルとするナノサイズのポリマーミセルを形成するものと理解されている（例えば、実施例９の「ポリイオンコンプレックスミセルの調製」における、ＰＩＣミセル水溶液についてＤＬＳの測定を行った結果を参照。）。ここで、水性媒体は、純水もしくはイオン交換水、またはそれらの緩衝化溶液、水溶性有機溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等）含有水溶液等であることができる。
【００１５】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）における、連結基Ｌおよび／またはＬ’は、前記ポリイオンコンプレックスミセルの形成に悪影響を及ぼさない限り限定されない有機二価の基であることができるが、一般的に、−Ｏ−（ＣＨ2）a−ＮＨ−、−Ｏ−（ＣＨ2）a−Ｏ−、−（ＣＨ2）a−ＮＨ−、もしくは−（ＣＨ2）a−Ｏ−を表し、好ましくは−Ｏ−（ＣＨ2）aＮＨ−、−（ＣＨ2）a−ＮＨ−（ここで、ａは１〜６、好ましくは、１〜３の整数である。）を表し、これらの連結基の結合の方向性は、Ｌについては各式の構造式中の各部分の順方向性を有する。例えば、−Ｏ−（ＣＨ2）aＮＨ−を例に挙げると、−Ｏ−（ＣＨ2）部側の結合子が式（Ｉ）のメチレンに共有結合し、ＮＨ−部がカルボニル基に共有結合する。これに対し、Ｌ’の方向性は、Ｌの逆の方向性を有する。
【００１６】
Ｙは、Ｈ、Ｃ1-21アルキルカルボニル、置換Ｃ1-4アルキルカルボニル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキルカルボニル、非置換もしくは置換アリールカルボニル、または非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリールカルボニルを表す。
【００１７】
上記各基もしくは各基の部分としてのアルキルは、直鎖もしくは分岐鎖であることができ、限定されるものでないが、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ぺンチル、ヘキシル、ヘプチル、ノニル、ウンデシル、トリデシル、ヘプタデシル、ノナデシル等の中の該当するものを挙げることができる。好ましいものはＣ1-6アルキルから選ばれる。Ｃ3-7シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロぺンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルであることができる。アリールはフェニル、ナフチルであることができる。５もしくは６員ヘテロアリールは、酸素、窒素及び硫黄原子から選ばれる同一もしくは異なるヘテロ原子を１もしくは２個含む不飽和複素環式基であり、チエニル、フリル、ピラニル、ピロリル、イソキサゾール、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニルであることができ、また、これらの複素環式環はベンゾ縮合していてもよい。かような縮合環としては、例えば、イソインドリル、インドリル、キノリル、イソキノリル、キノキサリニル、キナゾリニル、フェナンスリジニルを挙げることができる。
【００１８】
置換Ｃ1-4アルキルカルボニルの置換基は、ハロゲン原子（Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、Ｉ）、ヒドロキシル、カルボキシル、非置換もしくは置換Ｃ3-7シクロアルキル、非置換もしくは置換アリール及び非置換もしくは置換５もしくは６員ヘテロアリール、非置換もしくは置換アダマンチル、非置換もしくは置換コレステロール残基からなる群より選ばれ、これらの置換基が置換されている場合の置換基はＣ1-4アルキル、Ｃ1-4アルキルオキシ、ヒドロキシル、カルボキシル、シアノ、ニトロ、ハロゲン原子、またはモノ−もしくはジＣ1-4アルキルアミノであることができる。最後の置換基は、置換Ｃ3-7シクロアルキルカルボニル、置換アリールカルボニル、または置換５もしくは６員ヘテロアリールカルボニルにも適用される。
【００１９】
以上の定義の中、コレステロール残基とは、コレステロール分子中の２２〜２７位炭素上のいずれかのＨが脱離しているか或は、２２〜２７位炭素のいずれかを含む炭化水素鎖が脱離した残基であることができる。かような残基の置換したアルキルカルボニルとしては、例えば、コール酸、ケノデオキシコール酸を挙げることができる。Ｙとして好ましいのはＣ1-6アルキルカルボニルである。
【００２０】
ｍおよびｍ’は独立して、該共重合体とアニオン性ポリマーの形成するＰＩＣミセルの水性媒体中での安定性の観点からは、好ましくは１０〜２００、より好ましくは１５〜１５０、最も好ましくは１５〜１００の整数であることができる。
【００２１】
同様に、ｎは、好ましくは２０〜８００、より好ましくは３０〜５００、最も好ましくは４０〜４００の整数であることができる。
【００２２】
式（Ｉ）中のｍおよびｍ’個アミジノ（Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ2）は独立して、一般的に８０％、好ましくは６０％まで、より好ましくは３０％まで、最も好ましくは１０％までＨであることができ、特に最も好ましくは、ｍおよびｍ’個のすべてがアミジノ基である。
【００２３】
該ポリアニオン性ポリマーは、水性媒体中において前記式（Ｉ）で表される共重合体と安定なＰＩＣを形成でき、かつ、該ＰＩＣが安定なポリマーミセルを形成するものであって、具体的なものとしては、限定されるものでないが、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリスルホン酸、ポリアニオン性多糖類、アニオン性タンパク質等からなる群から選ばれる１種またはそれ以上であり、好ましいものとしては、コンドロイチン硫酸、カラギーナン、ヘパリン、カルボキシメチルデキストラン、キサンタンガム、ヒアルロン酸、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸を挙げることができ、安定性の観点からは、特に、コンドロイチン硫酸を好ましいものとして挙げることができる。これらのポリアニオン性ポリマーの分子量は、ポリマーの種類によって最適値が異なり、限定されるものでない。しかし、ポリアクリル酸の場合、Ｍｎが、２００〜１００００００、好ましくは、５００〜１０００００、より好ましくは、１０００〜１００００であり、ポリアニオン性多糖類、例えばコンドロイチン硫酸の場合、ＭｎまたはＭｗが５００〜１００００００、好ましくは１０００〜１０００００であり、アニオン性ポリペプチド、例えば、ポリアスパラギン酸の場合、ＭｎまたはＭｗが５００〜１００００００、好ましくは１０００〜１０００００ある。これらは市販のものを、必要に応じて精製して使用することができる。
【００２４】
＜ブロック共重合体の製造＞
ＰＩＣを形成するための式（Ｉ）で示されるブロック共重合体は、本発明の目的に沿うものであれば如何なる方法によって製造される相当するＰＥＧセグメント及びＰ（Ｌ−Ａｒｇ）セグメントを含むものであってもよい。しかし、該ブロック共重合体は、分子量分布が狭く、かつ、水性媒体中で該ブロック共重合体とポリアニオン性ポリマーから形成されるＰＩＣミセルのナノ粒子の平均径が腫瘍組織への取り込みに適するサイズとし得る該ブロック共重合体であることが好ましい。かような共重合体は、上記本発明の態様（８）に従って製造できる。
予め、式（ＩＩ）
【化８】
2016167333.tif 000010
【００２５】
式中、Ａ、Ｌ、Ｙ、ｍ及びｎは、上記式（ＩＩ）について定義したのと同義である、
の前駆体である共重合体を用意し、次いで、該式中のＬ−オルニチンに由来するセグメント中のδ−アミノ基をグアニジノ化するためのグアニジノ化試薬、Ｎ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジンを用いて前記グアノジニノ化を行うことで製造することにより提供できる。このような製造は、典型的には、下記の合成スキームに従って、式（ＩＩ）で示される共重合体とトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の塩を形成しておき、適当な塩基の存在下の不活性溶媒または塩基と溶媒との性質を備えた溶媒、例えば、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド等の溶媒中でグアニジノ化を行い、
【００２６】
【化９】
2016167333.tif 000011
【００２７】
ここで、上記反応スキーム中の最初の式中のＡが、上記式（ＩＩ）の（ｉｉ）’で定義されるものに相当するときは、そこに記載されている式中のｍ’の反復単位に相当するオルニチンに由来するセグメント中のδ−アミノ基は上記ｍの反復単位のそれと同様にトリフルオロ酢酸の塩型であり、グアニジノ化後の。上記反応スキーム中の最後の式中のＡはｍ’の反復単位に相当するオルニチンに由来するセグメント中のδ−アミノ基がジＢｏｃ保護アミジノ基である。
次いで、グアニジノ化試薬に由来する部分に存在する保護基ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）を脱離することによって目的の式（Ｉ）のブロック共重合体が製造される。脱離反応は、該共重合体のペプチド結合等に悪影響を及ぼさない条件下であれば如何なる条件下で行うこともできるが、ＴＦＡを用いる条件下で行うことが好ましい。
【００２８】
【化１０】
2016167333.tif 000012
【００２９】
さらに、分子量分布の狭い本発明の共重合体を提供するためには、式（ＩＩ）で示される前駆共重合体（式（ＩＩ）のＡが（ｉ）’で表される場合を例にすると）は、下記の合成スキームに従って製造することが好ましい。
【００３０】
【化１１】
2016167333.tif 000013
【００３１】
ここで、化合物１は、市販されているか、その提供法に準じた方法で用意した、可能な限り分子量分布の狭いものを使用し、該化合物に対し、アミノ基の保護されたオルニチン酸のアミノ酸無水物をリビング開環重合させ、次いで、無水酢酸等のリビング末端修飾剤を用いて反応を停止するそれ自体公知の方法を行うことにより化合物２を製造し、さらに、ポリ（Ｌ−オルニチン）セグメントにおけるアミノ保護基を脱離する。
【００３２】
かような、化合物１を原料とする反応処理によれば、ポリ（Ｌ−オルニチン）セグメントも極めて分子量分布の狭い前駆共重合体として提供できる。
【００３３】
したがって、最終的に得られる本発明に従う、式（Ｉ）で示されるブロック共重合体は、分子量分布が１．０１〜１．２０、好ましくは、１．０１〜１．０６であるものが提供できる。
これに対し、式（ＩＩ）のＡが（ＩＩ）’で定義される場合には、上記反応スキーム中の出発原料である化合物１としては、ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＮＨ２を用い、以下，化合物２〜４のＡ部分が、それぞれ、ｍ個の反復単位に相当する反復単位であることができる。
【００３４】
こうして得られる式（ＩＩ）のＡが（ｉｉ）’で定義されるトリブロック共重合体は、次式（ＩＩＩ）
【化１２】
2016167333.tif 000014
式中、Ｌ、Ｌ’、Ｙ、Ｙ’、は、ｍ、ｍ’、ｎは上記式（ＩＩＩ）について定義したとおりである、
で表され、本発明者の知る限り、従来技術文献未載の化合物である。
【００３５】
＜ＰＩＣミセルの調製＞
本発明に従うＰＩＣミセルは、前述した式（Ｉ）で示されるブロック共重合体と前述したポリアニオン性ポリマーを、前者のアミノ基もしくはグアニジノ基の数（Ｃという）／後者のカルボキシル基及び／もしくはスルホ基の数（Ａ）の比が、０．５〜２．５０になるように調整し、緩衝化した水性溶液（ｐＨ＝７．２〜７．５）に溶解混合し、一定時間（通常、室温で３０分間以上）静置することで調製するこができる。この調製に際し、前述の式（Ｉ）のＡが（ｉ）で定義されるブロック共重合体を使用して得られるミセル水溶液について動的光散乱（ＤＬＳ）の測定を行うと、通常、平均粒径が約２０ｎｍ〜約５０ｎｍのミセル粒子を得ることができ、一方、式（Ｉ）のＡが（ｉｉ）で定義されるトリブロック共重合体または式（ＩＩＩ）で表されるトリブロック共重合体とポリアニオン性ポリマーのＰＩＣミセル水溶液についてＤＬＳ測定すると、通常、平均粒径が約 ４０ 〜７０のミセル粒子を得ることができる。
【００３６】
こうして得られるＰＩＣミセルは、遠心等の分離手段により分離でき、また、凍結乾燥することにより、乾燥組成物として保存でき、必要に応じて、水性媒体中で再構成できる。このような乾燥組成物は、必要により、生理学的に許容され得る希釈剤または賦形剤を含むＰＩＣミセルの水溶液として提供できる。このような希釈剤は、滅菌水、生理食塩水、生理学的に許容される緩衝剤を含む溶液等であることができ、賦形剤は、例えば、ソルビトール、デキストリン、ブドウ糖、マンニトール、アミノ酸（例えば、グリシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グルタミン酸等）等であることができる。
【００３７】
このような水性溶液は、その投与を必要とする哺乳動物、特に、ヒトに静脈もしくは動脈を介し、また、該水溶液もしくは乾燥組成物は腫瘍局所に直接投与することもできる。こうして、ＰＩＣミセルは腫瘍組織に集積させ得、その場で、ＮＯを発生させて抗腫瘍作用を発揮する。かような投与量は、後述する試験例またはそれに類する試験の結果を参照し、専門医により適宜決定することができる。
一方、式（ＩＩＩ）のトリブロック共重合体単独もしくは当該共重合体及び実施例１１に記載されるようにＷＯ２０１５／１１８９９３Ａに記載の、典型的には、ＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴまたはそれを包含する下記一般式で表されるトリブロク共重合体との混合物（前者のＬ−Ａｒｇ単位と後者のＴＥＭＰＯ単位の比は５〜１：１〜５であることができる。）と特定のアニオン性ポリマーのＰＩＣミセル水性溶液は、生体条件下のｐＨ及び温度３７℃以上でゲル化を起こす。したがって、当該ＰＩＣを滞留させることが望まれる生体部位（例えば、心筋、関節など）に直接投与し、炎症が関与する疾患または障害を処置にすることができる。投与の態様については、本発明者らによる特許出願に基づく、ＷＯ２０１３／１１１８０１Ａ、ＷＯ２０１３／１１１８０１Ａ、ＷＯ２０１４／１９９９８２Ａを参照できる。これらの特許文献は、引用することにより、その内容全体が本願明細書に組み込まれる。
主要事項を摘記すると、ＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴは、次の合成スキームに従い合成できる。
【化１３】
2016167333.tif 000015
このようなＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴを包含するトリブロック共重合体は、技術概念上次の一般式によって表すことができる。
【化１４】
2016167333.tif 000016
式中、
Ｌ１は、同一または異なる連結基を表し、
Ｌ２は、独立して、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ−（Ｃ１−６アルキレン）ｑ−であり、ここでｑは０または１の整数であり、そして
Ｒは、独立して、Ｒの総数ｎの少なくとも２０％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
Ｙは、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキルで置換されていてもよいフェニルチオカルボニルチオ、Ｃ１−６アルキルチオカルボニルチオ、Ｃ１−６アルキルオキシチオカルボニルチオまたはＳＨからなる群より選ばれ、
ｍは、独立して、３〜１，０００の整数であり、そして
ｎは、５〜５，０００の整数である。
上記の一般式中、好ましい態様では、各Ｌ１が独立して、単結合、−Ｓ−（ＣＨ２）ｃ−、−Ｓ−（ＣＨ２）ｃＣＯ−、−（ＣＨ２）ｃＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｃＳ−、
【化１５】
2016167333.tif 000017
からなる群より選ばれ、ここでｃは１ないし５の整数であり、但し、連結基に方向性がある場合、例えば、−Ｓ−（ＣＨ２）ｃ−であるとき、上式中の左側のＬ１は記載されている順方向で結合する、すなわち、Ｓ原子側がＣＨ２に結合子、ＣＨ２側がＯ原子に結合するが、一方、右側のＬ１はその逆方向で結合する。
Ｙが、好ましくは、Ｈであるか、または−ＳＨ、
【化１６】
2016167333.tif 000018
からなる群から選ばれ、
Ｒが、独立して、Ｒの総数ｎの好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは約１００％が２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル−４−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル−３−イル、２，２，５，５−テトラメチルピロリン−１−オキシル−３−イル及び２，４，４−トリメチル−１，３−オキサゾリジン−３−オキシル−２−イル、２，４，４−トリメチル−１，３−チアゾリジン−３−オキシル−２−イル及び２，４，４−トリメチル−イミダゾリンジン−３−オキシル−２−イルからなる群より選ばれる環状ニトロキシドラジカル化合物の残基を表し、存在する場合には、残りのＲが水素原子、ハロゲン原子またはヒドロキシ基であり、
ｍは、独立して、好ましくは、３〜１００、より好ましくは３〜５０の整数であり、そして
ｎは、好ましくは、５〜１０００、より好ましくは１０〜２００の整数である、
で表される。
【００３８】
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）またはＰ（Ｌ−Ａｒｇ）−ＰＥＧ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）ブロック共重合体それ自体は、上記の目的に加え、１）遺伝子デリバリー用のポリカチオン、２）シリカナノ粒子などの無機物ナノ粒子および金ナノ粒子などの金属ナノ粒子、そして磁性ナノ粒子の表面コーティング剤、３）バイオデバイスの表面コーティング剤、４）薬物などの細胞導入剤として、また、前記ＰＩＣミセルは上記の目的に加え、１）薬物デリバリー用のＤＤＳキャリア、２）遺伝子デリバリー用のＤＤＳキャリアとして使用できる。
【実施例】
【００３９】
以下、具体例を挙げ、本発明をより詳細に説明するが、これらに本発明を限定することを意味しない。
【実施例１】
【００４０】
Ｎδ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−オルニチン（Ｎδ−Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ（Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ）））のアミノ酸無水物（Ｎ−Ｃａｒｂｏｘｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ，ＮＣＡ）であるＬ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＮＣＡの合成
Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＮＣＡは、次の合成スキーム１に従い合成した：【００４１】
【化１７】
2016167333.tif 000019
【００４２】
Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ）（１５．０ｇ，５６．３ｍｍｏｌ）を５００ｍＬナスフラスコ反応容器に加えた。次に、反応容器中を真空にした後、窒素ガスで置換する操作を３回繰り返すことにより、反応容器内を窒素雰囲気下にした。反応容器に１５０ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を加え、Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ）を分散させて撹拌を開始した。反応容器に２５ｍＬのＴＨＦに溶解させたトリホスゲン（６．１３ｇ，２０．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器に（＋）−α−ピネン（１７．５ｍＬ，１１２．７ｍｍｏｌ）を加え、５０℃まで加熱し、１時間撹拌した。反応溶液をエバポレーターで蒸発させ、新たにＴＨＦを２００ｍＬ加え、再度エバポレーターで蒸発させることで反応溶液のプロトンを除去した。得られたオフホワイトの固形物をＴＨＦ：ヘキサン＝１：３の混合溶媒で再結晶させることで針状結晶を得た。収量は１０．５ｇであり、収率は６４％であった。得られたＬ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＮＣＡの1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを図１に示す。
【実施例２】
【００４３】
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ））ブロック共重合体の合成
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ））は、次の合成スキーム２に従い合成した：【００４４】
【化１８】
2016167333.tif 000020
【００４５】
５００ｍＬフラスコ反応容器中にα末端にメトキシ基、ω末端にアミノ基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＮＨ2、分子量１２，０００、日油株式会社）（５．０ｇ，０．４２ｍｍｏｌ）、ベンゼンを３０ｍＬ加え一晩凍結乾燥することで反応容器内の水分を除去した。次に、容器内を窒素に置換して窒素雰囲気下にし、反応溶媒としてジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）を７０ｍＬ加えて撹拌を開始した。実施例１に従って得られるＬ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＮＣＡ（３．９ｇ，１３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ３０ｍＬに溶解させて反応容器に加え、２５℃の温度で４８時間撹拌した。その後、４ｍＬの無水酢酸を加えて２時間撹拌させることでリビング末端をアセチル化した。この反応溶液を氷上で１．５Ｌのジエチルエーテルに沈殿させた。クロロホルムとジエチルエーテルによる再沈殿操作を２回繰り返して精製した後、ベンゼン凍結乾燥にて白い粉体を得た。収量は８．１ｇであり、収率は９８％であった。得られたＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ）ブロック共重合体のサイズ分画クロマトグラムおよび1Ｈ−ＮＭＲスペクトルをそれぞれ図２、３に示す。ＰＥＧをスタンダードに用いた時の分子量分布は１．０７であり、Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ））セグメントの重合度ｍ＝３０であった。
【実施例３】
【００４６】
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ）ブロック共重合体の合成
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ）は、次の合成スキーム３に従い合成した：【００４７】
【化１９】
2016167333.tif 000021
【００４８】
実施例２に従って得られるＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ））（３．０ｇ，０．１５４ｍｍｏｌ）を１００ｍＬナスフラスコ反応容器に入れ、続けてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を３０ｍＬ加えて撹拌した。ＴＦＡを加えてから１５分後、臭化水素／酢酸溶液を９ｍＬ加えて氷上で４時間撹拌した。反応後の溶液に蒸留水を４０ｍＬ加えて、１Ｌのジエチルエーテルで抽出を行った。水相のみ回収し、再び１Ｌのジエチルエーテルで抽出を行った。このエーテル抽出操作をエーテル相が中性になるまで行った。エーテル抽出後の水相を分画分子量１２−１４，０００の透析膜へ注ぎ、０．０５％  ＴＦＡ水溶液に対して２４時間透析を行い、続けて蒸留水に対して４８時間透析を行った。透析後の膜内水溶液を凍結乾燥することで白い粉体を得た。収量は２．７５ｇであり、収率は９５％であった。この時、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ）ブロック共重合体はＴＦＡ塩として回収されている。このＴＦＡ塩のＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ）を０．０１Ｎ  ＨＣｌに対して透析することでＨＣｌ塩にコンバートすることが出来る。ＴＦＡ塩のブロック共重合体はグアニジノ化反応に使用し、ＨＣｌ塩のブロック共重合体は物性評価に用いた。得られたＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ）ブロック共重合体の1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを図４、５に示す。Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ）セグメントの重合度ｍ＝３０であった。
【実施例４】
【００４９】
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ2））ブロック共重合体の合成
ＰＥＧ−ｂ−ＰＬ−ＡｒｇＢｏｃ2））は、次の合成スキーム４に従い合成した：【００５０】
【化２０】
2016167333.tif 000022
【００５１】
１００ｍＬナスフラスコ反応容器に実施例３に従って得られるＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｏｒｎ）ブロック共重合体のＴＦＡ塩（２．５ｇ，０．１３ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルピロリドン  ５０ｍＬを加えた。次に、グアニジノ化試薬としてのＮ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン〔Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−１−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｉｎｅ（ＰＣＸ（ｂｏｃ2））〕（２．４６ｇ，７．９ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１．３ｍＬ，７．９ｍｍｏｌ）を加えて、２５℃で２４時間撹拌した。反応溶液を分画分子量６−８，０００の透析膜に入れて、ＤＭＦに対して２４時間、続けてメタノールに対して２４時間透析した。透析後の溶液をエバポレーターで蒸発させ、クルードをベンゼン凍結乾燥させることで白い粉体を得た。収量は２．６５ｇであり、収率は８８％であった。得られたＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ2））ブロック共重合体の1Ｈ−ＮＭＲを図６に示す。Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ2））セグメントの重合度ｍ＝３０であり、置換度は９９％であった。
【実施例５】
【００５２】
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）ブロック共重合体の合成
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）は、次の合成スキーム５に従い合成した：【００５３】
【化２１】
2016167333.tif 000023
【００５４】
実施例４に従って得られるＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ（Ｂｏｃ2））（２．５ｇ，０．１０９ｍｍｏｌ）を１００ｍＬナスフラスコ反応容器に入れ、続けてトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を５０ｍＬ加えて室温にて２４時間撹拌した。反応後の溶液に蒸留水を５０ｍＬ加えて、１Ｌのジエチルエーテルで抽出を行った。水相のみ回収し、再び１Ｌのジエチルエーテルで抽出を行った。このエーテル抽出操作をエーテル相が中性になるまで行った。エーテル抽出後の水相を分画分子量１２−１４，０００の透析膜へ注ぎ、０．０１Ｎ  ＨＣｌ水溶液に対して２４時間透析を行い、続けて蒸留水に対して４８時間透析を行った。透析後の膜内水溶液を凍結乾燥することで白い粉体を得た。収量は１．８８ｇであり、収率は９６％であった。この時、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）ブロック共重合体はＨＣｌ塩として回収されている。得られたＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）ブロック共重合体のサイズ分画クロマトグラム、1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲのスペクトルを、それぞれ図７、８、９に示す。分子量分布は１．０３であり、Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）セグメントの重合度ｍ＝３０であり、置換度は９９％であった。【００５５】
グアニジノ基の置換率の反応時間追跡を図１０に示す。グアニジノ化試薬としてＰＣＸ（Ｂｏｃ2）を用いた場合はわずか１時間の反応時間で約８０％のアミノ基がグアニジノ基に置換され、２４時間後には９９％グアニジノ基が導入されている。一方、同じ反応条件で従来のグアニジノ化試薬であるＰＣＸ・ＨＣｌを用いる場合、２４時間後には約４０％程度しか置換されていない。また、グアニジノ化試薬にＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキサミジン〔（Ｎ−（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−１−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｉｎｅ（ＰＣＸ（ｂｏｃ））〕を用いた場合には同条件で２４時間反応させても５％程度しかグアニジノ基が置換されなかった。
【実施例６】
【００５６】
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）ブロック共重合体の合成
実施例２に従って得られるＬ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＮＣＡの量を３．９ｇから７．８ｇにした以外、実施例２から５までのスキームと同様の方法でＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）の合成を行った。この時、得られたブロック共重合体のＰ（Ｌ−Ａｒｇ）セグメントの重合度ｍ＝６２であり、グアニジノ基の置換度は９９％であった。1Ｈ−ＮＭＲを図１１に示す。
【実施例７】
【００５７】
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｄ−Ａｒｇ）ブロック共重合体の合成
Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ）の代わりに、Ｄ−Ｏｒｎ（Ｚ）を使用した以外実施例１から６までのスキームと同様の方法でＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｄ−Ａｒｇ）の合成を行った。こうして得られたブロック共重合体のＰ（Ｄ−Ａｒｇ）セグメントの重合度ｍ＝５８であり、グアニジノ基の置換度は９９％であった。1Ｈ−ＮＭＲを図１２に示す。
【実施例８】
【００５８】
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｌｙｓ−Ｇｕａ）またはＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−ｈｏｍｏＡｒｇ）ブロック共重合体の合成
Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ）の代わりに、Ｎδ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−リシン〔Ｎδ−Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（Ｌ−Ｌｙｓ（Ｚ））〕を使用した以外実施例１から６までのスキームと同様の方法でＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｌｙｓ−Ｇｕａ）の合成を行った。このブロック共重合体はＰＥＧ−ｂ−ｐｏｌｙ（Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ）ブロック共重合体のポリリジンセグメント中のε−アミノ基をグアニジノ基に置換したグアニジル置換ポリリジンまたはポリ（Ｌ−ホモアルギニン）である。こうして得られたブロック共重合体のＰ（Ｌ−Ｌｙｓ−Ｇｕａ）セグメントの重合度ｍ＝５６であり、グアニジノ基の置換度は９９％であった。1Ｈ−ＮＭＲを図１３に示す。
【実施例９】
【００５９】
ポリイオンコンプレックスミセルの調製
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）ブロック共重合体およびコンドロイチン硫酸Ｃナトリウム（ＣＳ：分子量５０，０００）をそれぞれＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）に溶解させ、濃度を２ｍｇ／ｍＬにしたＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）ポリカチオン水溶液とＣＳポリアニオン水溶液を調製した。ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）ポリカチオン水溶液とＣＳポリアニオン水溶液を任意のカチオン／アニオン比（Ｃ／Ａ  比）で混合し、ボルテックスした後、３０分静置することでＰＩＣミセル水溶液を調製した。ここで、Ｃ／Ａとは［ポリカチオン中のアミノ基またはグアニジノ基の数］／［［ポリアニオン中のカルボキシル基またはスルホ基］である。得られたＰＩＣミセル水溶液に動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行ったところ、Ｃ／Ａ＝１の時に、最も散乱強度が大きく、多分散度（ＰｄＩ）の小さなナノ粒子が得られた。この時の平均粒径は約３５ｎｍ程度である（図１４）。【００６０】
＜試験１＞
ｉＮＯＳ酵素とポリアルギニンの反応性
実施例６から９で合成したブロック共重合体の粉末をＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨバッファ（１０ｍＭ，ｐＨ７．４）にそれぞれ溶解させ、２ｍｇ／ｍＬのポリマー水溶液を調製した。調製したポリマー水溶液を１ｍｇ／ｍＬのトリプシン酵素水溶液と混合し３７℃で２４時間インキュベートした。またコントロールとして、トリプシン酵素を含んでいない単なるバッファとポリマー水溶液を同様に混合し、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベート後の混合溶液を９８℃で５分間インキュベートし、トリプシン酵素を失活させた。この混合溶液とｉＮＯＳ酵素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んだバッファを混合し、３７℃で２４時間インキュベートした後、亜硝酸イオン（ＮＯ2-）をグリース法（Ｄｏｊｉｎｄｏ，製品コードＮＫ０５）で定量した。その結果、実施例６で合成したＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）ブロック共重合体のみトリプシン処理後に有意にＮＯ産生が確認された（図１５）。このＮＯ産生量はＰＥＧホモポリマー（分子量１２，０００）とＬ−アルギニンを同濃度含んだ系と同じ程度であることがわかった。【００６１】
＜試験２＞
マクロファージ細胞からのＮＯ産生評価
ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ（Ｕ．Ｓ．Ａ．））を使用した。培地は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と抗生物質（アンピシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン）を加えているダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使用した。２４ウェルプレートに５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度でＲＡＷ２６４．７マクロファージを播種し、３７℃、５％ＣＯ2濃度で一晩インキュベートした。その後、実施例９の方法で調製したＰＩＣミセル水溶液をミセル中のアルギニン濃度が１ｍＭになる濃度でウェルに投与し、７２時間インキュベートした。その後、１０ｎｇ／ｍＬの濃度のリポ多糖（ＬＰＳ）を加えて６時間インキュベートし、マクロファージを活性化させた。インキュベート後、ウェル中の上澄み培地を回収し、試験１と同様の手順で亜硝酸イオンを定量した。その結果、実施例６で合成したＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）ブロック共重合体とコンドロイチン硫酸からなるＰＩＣミセル（Ｌ−ＰＡｒｇ−ＣＳ／ｍ，Ｃ／Ａ＝１）のみ、ＬＰＳで活性化したマクロファージから有意にＮＯ産生が確認された（図１６）。実施例７、８で合成し他ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｄ−Ａｒｇ）ブロック共重合体およびＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ｌｙｓ−Ｇｕａ）ブロック共重合体とコンドロイチン硫酸からなるＰＩＣミセル（Ｄ−ＰＡｒｇ−ＣＳ／ｍおよびＬ−ＰＬｙｓ−Ｇｕａ／ｍ）を投与してもＬＰＳで活性化したマクロファージからはＮＯの有意な産生は認められなかった。以上より、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）ブロック共重合体のみ有意にマクロファージ中のｉＮＯＳ酵素と反応してＮＯを産生することを見出した。【００６２】
＜試験３＞
担がんマウスへの抗腫瘍活性評価
実施例６で合成したＰＥＧ−ｂ−Ｐ（Ｌ−Ａｒｇ）ブロック共重合体とコンドロイチン硫酸Ｃから成るＰＩＣミセル（Ｌ−ＰＡｒｇ−ＣＳ／ｍ，Ｃ／Ａ＝１）の静脈投与による担がんマウスへの抗腫瘍活性を評価した。Ｌ−ＰＡｒｇ−ＣＳ／ｍ水溶液は実施例９の通り調製した。５週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（♂）を１群４匹に分けて、入荷から本実験終了までの期間中、室温２５℃（±１℃））、湿度５０％、１２時間明暗サイクルの条件下で飼育を行い、餌及び水は自由に摂取させた。このマウスの右後脚大腿部に１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度のＣｏｌｏｎ−２６がん細胞を１００μＬ播種した。腫瘍組織の大きさはノギスで測定し、腫瘍体積（ｍｍ3）＝［短軸（ｍｍ）］2×［長軸（ｍｍ）］×０．５２で表す。腫瘍体積の平均が１００ｍｍ3を超えた時に、下記の通りＬ−ＰＡｒｇ−ＣＳ／ｍ水溶液を投与した。
群１：生理食塩水（ＰＢＳ）１００μＬを１回投与
群２：Ｌ−ＰＡｒｇ−ＣＳ／ｍ  １００μＬを１回投与（アルギニン濃度  １６ｍｇ／ｋｇ）
群３：Ｌ−ＰＡｒｇ−ＣＳ／ｍ  １００μＬを最初に投与した日から１日おきに計２回投与（アルギニン濃度  １６ｍｇ／ｋｇ）
群４：Ｌ−ＰＡｒｇ−ＣＳ／ｍ  １００μＬを最初に投与した日から１日おきに計３回投与（アルギニン濃度  １６ｍｇ／ｋｇ）
群５：Ｌ−ＰＡｒｇ−ＣＳ／ｍ  １００μＬを最初に投与した日から１日おきに計４回投与（アルギニン濃度  １６ｍｇ／ｋｇ）【００６３】
投与後、３日おきに腫瘍体積およびマウスの体重を測定した。図１７にマウスの相対的体重変化を示す。図に示されるように、本発明で調製したＬ−ＰＡｒｇ−ＣＳ／ｍ（群２から５）はコントロール（群１）に比べて有意な体重減少は見られなかったため、ＰＩＣミセル由来の毒性はないことがわかる。また、腫瘍体積変化を図１８に示す。群２および３ではコントロールよりも有意に腫瘍成長速度が増加している。これは試験３で見られたようなＮＯ産生の増加によって腫瘍内ＮＯ濃度は増加したものの、抗腫瘍活性を示すほどではなく、逆に血管新生を促進してしまったためだと考えられる。群４ではコントロールに比べて有意差はない。群５ではコントロールに比べて有意に腫瘍成長速度が遅延している。これは試験３で見られたようなＮＯ産生量の増加によってがん細胞にアポトーシスを誘導し、その結果腫瘍の成長を抑制していると考えられる。
１．ポリ（Ｌ−Ａｒｇ）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（Ｌ−Ａｒｇ）（ＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇ）の合成
ＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇは、ポリ（Ｌ−オルニチン）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（Ｌ−オルニチン）（ＰＯｒｎ−ＰＥＧ−ＰＯｒｎ）（のグアニジニル化により製造した。
当該ＰＯｒｎ−ＰＥＧ−ＰＯｒｎはＰＥＧ（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２；Ｍｎ＝１０，０００）のα，ω−ＮＨ２基へのＮ−δ−カルボベンゾキシ−Ｌ−オルニチンのＮ−カルボン酸無水物（Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＮＣＡ）の開環重合、次いで、保護基の脱離を介して合成した。
【実施例１０】
【００６４】
ポリ（Ｌ−Ａｒｇ）−ｂ−ポリ（エチレングリコール）−ｂ−ポリ（Ｌ−Ａｒｇ）（ＰＡｒｇ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＡｒｇ）の合成
ＰＡｒｇ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＡｒｇは、ポリ（Ｌ−オルニチン）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（Ｌ−オルニチン）（ＰＯｒｎ−ｂ−ＰＥＧ−ｂ−ＰＯｒｎ）（のグアニジニル化により製造した。なお、ブロック共重合体を表示する「−ｂ−」は、以下、単に「−」と略記する。
当該ＰＯｒｎ−ＰＥＧ−ＰＯｒｎはＰＥＧ（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２；Ｍｎ＝１０，０００）のα，ω−ＮＨ２基へのＮ−δ−カルボベンゾキシ−Ｌ−オルニチンのＮ−カルボン酸無水物（Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＮＣＡ）の開環重合、次いで、保護基の脱離を介して合成した。
（１）ＰＯｒｎ−ＰＥＧ−ＰＯｒｎの合成
窒素雰囲気下の三方停止栓を備えた３００ｍＬ丸底フラスコ中で撹拌させることでＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２（２ｇ，０．２ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，２０ｍＬ）に溶解した。別の１００ｍＬフラスコ中で２０ｍＬのＤＭＦに溶解したＮδ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−オルニチン酸無水物（Ｌ−Ｏｒｎ（Ｚ）−ＮＣＡ；２ｇ，６．８５ｍｍｏｌ）をＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２溶液にＮ２パージドシリンジを用いて加えた。乾燥窒素雰囲気下の反応混合物を３０℃油浴で４８時間撹拌した。反応後、氷浴中で１５倍過剰のジエチルエーテル（６００ｍＬ）を用いて反応混合物を沈殿させ、次いで濾過した。回収したポリマーをジエチルエーテルで２度再沈殿させ、不純物を除去した。白色固体としてＰＯｒｎ（Ｚ）−ＰＥＧ−ＰＯｒｎ（Ｚ）（２．６ｇ）が得られた。該固体の１Ｈ−ＮＭＲの分析結果を図１９に示す。
得られたＰＯｒｎ（Ｚ）−ＰＥＧ−ＰＯｒｎ（Ｚ）（２．６ｇ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ，１５ｍＬ）に溶解させ、臭化水素酸（ＨＢｒ，４．５ｍＬ）を加え、氷浴中で４時間撹拌した。次に、トリエチルアミン（ＴＥＡ．１５ｍＬ）を滴下し、過剰の酸を除去した。引き続き、懸濁物蒸留水（１００ｍＬ）で希釈し、次いで、予め膨潤させた半透膜チューブ（ＭＷＣＯ＝３５００）を用い水に対して３日間透析した。さらに、連続して０．０１ＨＣｌ、蒸留水に対して透析を続け、ＴＦＡ型ＰＯｒｎ−ＰＥＧ−ＰＯｒｎをＨＣｌ型に変換した後、凍結乾燥した。ＰＯｒｎ−ＰＥＧ−ＰＯｒｎを白色粉末として得た（２．２ｇ）。該粉末の１Ｈ−ＮＭＲの分析結果を図１９に示す。
（２）ＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇの合成
ＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇは、ＰＯｒｎ−ＰＥＧ−ＰＯｒｎのＰＯｒｎセグメントの側鎖δ−アミノ基のＮ，Ｎ’−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−１Ｈ−ピラアゾール−１−カルボキサミジン（ＰＣＸ（Ｂｏｃ２））を用いるグアニジニル化、次いでＢｏｃ基の脱保護によって取得した。
簡潔には、ＰＯｒｎ−ＰＥＧ−ＰＯｒｎ（１ｇ，０．７ｍｍｏｌ）とＰＣＸ（Ｂｏｃ２）（１ｇ、３．２ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍＬ，３ｍｍｏｌ）含有Ｎ−メチルピロリドン（２０ｍＬ）に溶解し、室温で２４時間撹拌した。反応後、混合物を氷浴中で１５倍過剰のジエチルエーテル（３００ｍＬ）で沈殿させ、次いで濾過した。回収したポリマー（ＰＡｒｇ（Ｂｏｃ２）−ＰＥＧ−ＰＡｒｇ（Ｂｏｃ２））をジエチルエーテルにより２度再沈殿させ、不純物を除去した。ポリマー（１．１ ｇ）が得られ、その１Ｈ−ＮＭＲの分析結果を図２０に示す。こうして得られたＰＡｒｇ（Ｂｏｃ２）−ＰＥＧ−ＰＡｒｇ（Ｂｏｃ２）をＴＦＡ（１０ｍＬ）に溶解し、室温で８時間撹拌した。次に、ＴＥＡ（１５ｍＬ）を滴下し、過剰の酸を除去した。引き続き、懸濁物を蒸留水（１００ｍＬ）で希釈し、０．０１ＨＣｌ、次いで蒸留水に対して透析した後、凍結乾燥した。ＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇを白色粉末として０．９ｇ得た。この粉末の１Ｈ−ＮＭＲの分析結果を図２０に示す。
【参考例】
【００６５】
反応性酸素種（ＲＯＳ）捕捉性ポリマー（ＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴ）の合成
ポリ（クロロメチルスチレン）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（クロロメチルスチレン）（ＰＣＭＳ−ＰＥＧ−ＰＣＭＳ）を、スルファニル（ｓｕｌｐｈａｎｙｌ？）−ポリ（エチレングリコール）−スルファニル（ＨＳ−ＰＥＧ−ＳＨ；Ｍｎ＝１０，０００）をテローゲンとして用いるクロロメチルスチレンのラジカルテロメリゼーションによって合成した。次いで、４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１オキシル（４−ａｍｉｎｏ−ＴＥＭＰＯ）のアミノ基とＰＣＭＳ−ＰＥＧ−ＰＣＭＳブロック共重合体中のベンジルクロダイド基間の相互作用を介してクロロメチル基をＴＥＭＰＯに転化した。具体的には、ＷＯ２０１５／１１８９９３Ａ  を参照されたい。
【実施例１１】
【００６６】
ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）の調製及びゲル化
ポリカチオン性ポリマーのＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇ及びＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴをリン酸緩衝液（ｐＨ６．２，１００ｍＭ）に溶解した。ポリアニオン性ポリマーのポリ（アクリル酸）（ＰＡＡｃ）又はコンドロイチン硫酸（ＣＳ）もリン酸緩衝液（ｐＨ６．２，１００ｍＭ）に溶解した。ポリカチオン性ポリマー溶液にポリアニオン性ポリマーを加えてポリイオンコンプレックス（アニオン：カチオン比  １：１）を調製した。混合物を室温にて３０分間撹拌し、こうして形成しＰＩＣミセル粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）測定を行った。結果を下記表１に示す。
【表１】
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次に、ＰＩＣ溶液１０ｍｇ／ｍＬを遠心エバポレーターにより必要な濃度（４５〜６０ｍｇ／ｍＬ）になるまで濃縮し、こうして濃縮したＰＩＣのゲル化が生理学的条件下（３７℃）で起こった結果を図２１に示す。この結果から、上記のＰＩＣミセルは体温で効果的にゲル化することが分かる。
＜試験４＞
インビトロでの血管新生の評価
Ａｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇ／ＣＳコンプレックスの血管新生促進性を、グロース−ファクター−リデュースド  マトリゲル（ｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）チューブ検定により評価した。
簡潔には、製造業者のプロトコールに従い冷室温（４℃）でマトリゲルを夜どうし解かした。マトリゲル液（１０μＬ）をμ−スライド（μ−ｓｌｉｄｅ）（同上）に加え、３０分３７℃のインキュベーター中に維持し、重合させた。次に、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中ＨＵＶＥＣ懸濁液（５×１０３細胞／ウエル）を、Ａｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇ／ＣＳコンプレックスの存在下又は不存在下のマトリゲル層上にゆっくり加えた。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を陽性血管新生促進剤として用いた。５％ＣＯ２下３７℃にて４時間インキュベーションした後、ＤＭＥＭを慎重に取り除いた後、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）ＡＭ含有（１０μｇ／ｍＬ）新鮮ＤＭＥＭをマトリゲル層上に加えた。１５分インキュベーション後、チューブ形成を蛍光顕微鏡下で観察し、イメージジェイ（ＩｍａｇｅＪ）ソフトウエア―の血管新生解析装置プラグインにより解析した。得られた結果はＰＥＧ−ＰＡｒｇ／ＣＳ及びＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇ／ＣＳがＨＵＶＥＣ中でチューブを形成することを示した。結果を図２２に示す。なお、図中、ＰＩＣ（ｄｉ）は、上記実施例９にしたがって調製されるＰＥＧ−ＰＡｒｇジブロックコポリマーに由来するＰＩＣを意味し、ＰＩＣ（ｔｒｉ）はＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇトリブロックコポリマーに由来するＰＩＣを意味する。
図２２に示されるようにＰＥＧ−ＰＡｒｇもＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇもＨＵＶＥＣのチューブ形成を誘発することが分かる。
＜試験５＞
心筋梗塞マウスにおけるＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴ／ＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇをベースとするインジェクタブルハイドロゲルの評価
心筋梗塞（ＭＩ）マウスを心臓の左前下行枝（ＬＡＤ）の連結を誘発させた。雄７〜８週齢ＩＣＲマウス（体重３２〜３５ｇ）をチャールスリバージャパン（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ）から購入した。これらのマウスを温度（２３±１℃）、湿度（５０±５％）及び明暗（１２時間明暗周期）の制御下の筑波大学実験動物施設で飼った。これらの動物に飼料と水を自由に採ることができるようにした。すべての実験は筑波大学の動物実験用規則に従って実施した。ＬＡＤを８−０シルク縫合糸で連結した後、濃縮ＰＩＣ溶液（４０μＬ，ＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴ／ＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇ＋ＰＡＡｃ）を縫合糸部位に心臓内注入した。ＭＩ後１週目及び４週目に心エコー検査を行った。心機能は左室駆出率の測定により評価し、梗塞のサイズは組織学的評価により決定した。図２３及び２４に示されるとおり、ＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴ／ＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇをベースとするインジェクタブルゲル処置マウスは未処置マウスに比べ有意に心機能を改善した。なお、図中、Ｇｅｌ１はＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴ／ＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇ＋ＰＡＡＣ（３０ｍｇ／ｍＬ）のデータであり、Ｇｅｌ２はＰＭＮＴ−ＰＥＧ−ＰＭＮＴ／ＰＡｒｇ−ＰＥＧ−ＰＡｒｇ＋ＰＡＡＣ（６０ｍｇ／ｍＬ）のデータである。
図２４に関しては、１日間４％（ｖ／ｖ）緩衝化ホルマリンおよび２日間７０％（ｖ／ｖ）アルコールで心臓組織を固定化した後パラフィン埋め込みを行い、次いで、これらの組織の５μｍ厚薄片を調製し、マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）トリクローム染色を行った。こした生物試料の組織学的特徴を光学顕微鏡下で試験した結果である。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明に従う、ＰＩＣミセルは、限定されるものでないが、例えば、腫瘍を処置するための薬剤として使用でき、少なくとも製薬産業で利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2016167333.tif 000039
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2016167333.tif 000049
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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2016167333.tif 000057
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