(57)【要約】  データベース作成部１１が、生体内で産生される内在性ペプチドのうちペプチド配列が既知の内在性ペプチド、及び、当該内在性ペプチドの前駆体タンパク質の全長配列に基づいて、当該内在性ペプチドの部分配列を１残基以上含むペプチド配列を標的ペプチド配列として生成することにより、複数の標的ペプチド配列を含む標的ペプチド配列データベース１１１を作成する。質量分析部１２が、ペプチド試料に対して質量分析を行う。ペプチド帰属部１４が、データベース作成部１１により作成された複数の標的ペプチド配列と、質量分析部１２により得られた質量スペクトルとに基づいて、ペプチド試料に含まれる内在性ペプチドのペプチド配列を決定する。
2017047580.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内で産生される内在性ペプチドのうちペプチド配列が既知の内在性ペプチド、及び、当該内在性ペプチドの前駆体タンパク質の全長配列に基づいて、当該内在性ペプチドの部分配列を１残基以上含むペプチド配列を標的ペプチド配列として生成することにより、複数の標的ペプチド配列を含む標的ペプチド配列データベースを作成するデータベース作成ステップと、
ペプチド試料に対して質量分析を行う質量分析ステップと、
前記データベース作成ステップにより作成された複数の標的ペプチド配列と、前記質量分析ステップにより得られた質量スペクトルとに基づいて、ペプチド試料に含まれる内在性ペプチドのペプチド配列を決定するペプチド帰属ステップとを含むことを特徴とするペプチド帰属方法。
【請求項２】
生体内で産生される内在性ペプチドのうちペプチド配列が既知の内在性ペプチド、及び、当該内在性ペプチドの前駆体タンパク質の全長配列に基づいて、当該内在性ペプチドの部分配列を１残基以上含むペプチド配列を標的ペプチド配列として生成することにより、複数の標的ペプチド配列を含む標的ペプチド配列データベースを作成するデータベース作成部と、
ペプチド試料に対して質量分析を行う質量分析部と、
前記データベース作成部により作成された複数の標的ペプチド配列と、前記質量分析部により得られた質量スペクトルとに基づいて、ペプチド試料に含まれる内在性ペプチドのペプチド配列を決定するペプチド帰属部とを備えたことを特徴とするペプチド帰属システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内で産生（生成）される内在性ペプチドのペプチド配列を決定するペプチド帰属方法及びペプチド帰属システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を対象とする一般的なペプチド帰属方法として、データベース検索を用いた方法（例えば下記非特許文献１参照）や、デノボシーケンシング（de novo sequencing）を用いた方法（例えば下記非特許文献２参照）が知られている。【０００３】
データベース検索を用いた方法には、例えばマトリックスサイエンス社が提供しているマスコット（Ｍａｓｃｏｔ）などのデータベース検索法が用いられる（例えば下記非特許文献１参照）。具体的には、タンパク質データベースに収録されているタンパク質アミノ酸配列から想定される全てのペプチド断片の組み合わせが、インシリコ酵素消化（in silico digestion）により求められる。そして、求められたペプチド断片の分子量がＭＳ２プリカーサイオン質量と照合され、所定の質量許容誤差の範囲で合致したものについて理論プロダクトイオン質量が算出される。算出された理論プロダクトイオン質量はＭＳ２測定データと照合され、一致度の高いペプチドが探索される。【０００４】
一方、デノボシーケンシングでは、データベースを用いずに、測定データからアミノ酸配列が読み取られる。具体的には、ペプチドの末端から何らかの方法によりアミノ酸残基が１残基ずつ取り除かれたペプチド断片群が生成され、それらのペプチド断片群に由来するイオンピークの質量差からアミノ酸配列が読み取られる。代表的な実装としては、ＰＥＡＫＳと呼ばれるソフトウェアが広く知られている（例えば下記非特許文献２参照）。【０００５】
タンパク質を対象とした分析では、上記のようなペプチド帰属方法のいずれを用いた場合でも、分析の難易度を下げるために、しばしば消化酵素を用いてタンパク質をペプチドに断片化してから分析が行われる。このように、タンパク質を断片化して、サイズを小さくすることにより、質量分析時のイオン化が促進され、分析感度が向上する。【０００６】
この場合、消化酵素の選択は、データ解析の上でも重要となる。例えばタンパク質データベースを用いたデータベース検索では、タンパク質を特定の部位（特定の配列）で切断するような消化酵素を選択することにより、無作為に切断するような方法と比べて探索空間を小さくすることができる。その結果、検索時間や誤同定を実用的な水準に抑えつつ、ペプチド同定数を増やすことができる。また、デノボシーケンシングにおいては、ペプチド内のアミノ酸分布をシーケンシングしやすいプロダクトイオンが生成されるように、消化酵素を選択することができる。例えば、トリプシンを消化酵素として選択した場合には、イオンがＣＩＤ（衝突誘起解離）により開裂される際に、ｙ／ｂ系列イオンが特異的に生成されるため、シーケンシングが容易となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「マトリックス・サイエンス−マスコット−ＭＳ／ＭＳ・イオン・サーチ（Matrix Science -Mascot- MS/MS Ions Search）」、[online]、英国マトリックス・サイエンス社（Matrix Science Ltd.）、[平成２４年１０月２２日検索]、インターネット＜URL: http://www.matrixscience.com/cgi/search_form.pl?FORMVER=2&SEARCH=MIS＞
【非特許文献２】Bin Ma, et al. : An effective algorithm for the peptide De Novo sequencing from MS/MS spectrum. Symp. Comb. Pattern Matching 2003, 266-278
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
内在性ペプチドは、生体内で産生されるペプチドであり、体内の情報伝達や機能制御に関わる分子として血液等の体液を通して輸送される他、代謝産物として尿中に排出されるものもある。この内在性ペプチドの構造を解析すれば、新薬の開発や病気の診断などに有用な情報を得ることが可能である。しかしながら、上記のような従来のペプチド帰属方法を内在性ペプチドの分析に用いることは困難であった。【０００９】
具体的には、内在性ペプチドは、タンパク質が生体内のプロセッシング機構や代謝機構により切断されて産生される。１つのタンパク質からは、多数の異なるペプチド断片が産生され、それらのペプチド断片の中には、部分配列を共有するペプチド断片、及び、部分配列を共有しないペプチド断片が含まれ得る。プロテオーム解析では、消化酵素を用いてタンパク質が特定の部位で切断されるため、一部の検出量（イオン化効率）の高いペプチド断片の配列を決定することによりタンパク質全体を帰属可能である。【００１０】
しかし、内在性ペプチドの場合には、生体内で様々な切断機序により産生されるため、同一タンパク質由来のペプチドであっても産生量は異なる。従って、産生量やイオン化効率が低く検出されにくいペプチドに対しては、より高感度な帰属技術が求められる。また、切断機序が既知の内在性ペプチドを除いて、タンパク質からの切断部位は予め特定されていない。したがって、従来法であるタンパク質データベースを用いたデータベース検索により内在性ペプチドの構造解析を行うためには、あらゆる部位で切断されて産生されたペプチド断片を想定して探索を行う必要があり、そのため、探索空間が著しく増大する。著しい探索空間の増大は、単に検索時間の増大をもたらすだけでなく、ペプチドの同定数の低下、すなわち同定感度の低下をもたらすという問題がある。【００１１】
また、内在性ペプチドは、ペプチド内のアミノ酸の空間分布が多様であるため、プロダクトイオンの生成パターンが多様かつ複雑である。そのため、プロテオーム解析のように消化酵素の導入によりペプチド断片のアミノ酸分布が均質的になるようデザインした場合とは異なり、デノボシーケンシングによる解析も困難となる。【００１２】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、より多くの内在性ペプチドのペプチド配列を高感度で決定することができるペプチド帰属方法及びペプチド帰属システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係るペプチド帰属方法は、データベース作成ステップと、質量分析ステップと、ペプチド帰属ステップとを含む。前記データベース作成ステップでは、生体内で産生される内在性ペプチドのうちペプチド配列が既知の内在性ペプチド、及び、当該内在性ペプチドの前駆体タンパク質の全長配列に基づいて、当該内在性ペプチドの部分配列を１残基以上含むペプチド配列を標的ペプチド配列として生成することにより、複数の標的ペプチド配列を含む標的ペプチド配列データベースを作成する。前記質量分析ステップでは、ペプチド試料に対して質量分析を行う。前記ペプチド帰属ステップでは、前記データベース作成ステップにより作成された複数の標的ペプチド配列と、前記質量分析ステップにより得られた質量スペクトルとに基づいて、ペプチド試料に含まれる内在性ペプチドのペプチド配列を決定する。【００１４】
このような構成によれば、ペプチド配列が既知の内在性ペプチド、及び、当該内在性ペプチドの前駆体タンパク質の全長配列に基づいて、当該内在性ペプチドの部分配列を１残基以上含むペプチド配列のデータベースが生成される。ペプチド配列が既知の内在性ペプチドと部分配列が一部共通しているペプチド配列（標的ペプチド配列）は、従来法では帰属されない質量スペクトル中に未知の内在性ペプチドのペプチド配列として残されている可能性がある。【００１５】
したがって、標的ペプチド配列のデータベース（標的ペプチド配列データベース）を生成すれば、探索空間の増大を効果的に防止することができる。そして、当該標的ペプチド配列データベースとペプチド試料の質量分析により得られた質量スペクトルとに基づいて、ペプチド試料に含まれる標的ペプチドのペプチド配列を優先的に探索することによって、より多くの内在性ペプチドのペプチド配列を高感度で決定することができる。【００１６】
本発明に係るペプチド帰属システムは、データベース作成部と、質量分析部と、ペプチド帰属部とを備える。前記データベース作成部は、生体内で産生される内在性ペプチドのうちペプチド配列が既知の内在性ペプチド、及び、当該内在性ペプチドの前駆体タンパク質の全長配列に基づいて、当該内在性ペプチドの部分配列を１残基以上含むペプチド配列を標的ペプチド配列として生成することにより、複数の標的ペプチド配列を含む標的ペプチド配列データベースを作成する。前記質量分析部は、ペプチド試料に対して質量分析を行う。前記ペプチド帰属部は、前記データベース作成部により作成された複数の標的ペプチド配列と、前記質量分析部により得られた質量スペクトルとに基づいて、ペプチド試料に含まれる内在性ペプチドのペプチド配列を決定する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、標的ペプチド配列データベースを生成することにより探索空間の増大を効果的に防止することができ、当該標的ペプチド配列データベースとペプチド試料の質量分析により得られた質量スペクトルとに基づいて、より多くの内在性ペプチドのペプチド配列を高感度で決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の第１実施形態に係るペプチド帰属システムの構成例を示したブロック図である。
【図２】データベース作成部により標的ペプチド配列を生成する際の態様について説明するための図である。
【図３】データベース作成部による処理の流れを示したフローチャートである。
【図４】質量分析部及びピークリスト作成部による処理の流れを示したフローチャートである。
【図５】ペプチド帰属部による処理の流れを示したフローチャートである。
【図６】尿試料から得られたＭＳ２スペクトルについて実際に解析を行った結果を示す図である。
【図７】本発明の第２実施形態に係るペプチド帰属システムの構成例を示したブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜第１実施形態＞
１．第１実施形態に係るペプチド帰属システムの構成
図１は、本発明の第１実施形態に係るペプチド帰属システム１の構成例を示したブロック図である。
【００２０】
このペプチド帰属システム１は、分析対象となる試料（ペプチド試料）の中から、生体内で産生される内在性ペプチドのペプチド配列を決定するためのものであり、データベース作成部１１、質量分析部１２、ピークリスト作成部１３及びペプチド帰属部１４などを備えている。これらの各部１１〜１４の少なくとも一部は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）を含む情報処理装置により構成されている。
【００２１】
このペプチド帰属システム１は、内在性ペプチド配列データベース２に格納されている複数のペプチド配列を用いて、ペプチド試料中の内在性ペプチドのペプチド配列を決定する。内在性ペプチド配列データベース２には、ペプチド配列が既知である複数の内在性ペプチドについて、それらの内在性ペプチドのペプチド配列が格納されている。ここで、「ペプチド配列が既知」とは、公開されている内在性ペプチドの配列データベースや文献情報にペプチド配列が収録されている場合や、従来の解析法（手動解析を含む。）により高い信頼度でペプチド配列が帰属されている場合を含む概念である。
【００２２】
公開されている内在性ペプチドの配列データベースや文献情報としては、例えば尿に含まれる内在性ペプチドの配列データベースであるＭｏｓａｉｑｕｅｓ  ＤＢ（http://mosaiques-diagnostics.de/diapatpcms/mosaiquescms/front_content.php?idcat=257, Siwy et al., “Human urinary peptide database for multiple disease biomarker discovery”, Proteomics Clin. Appl., 2011, 5, 367-374）や、データベース化されていない文献（Smith, et al., “Deciphering the peptidome of urine from ovarian cancer patients and healthy controls”, Clin. Proteomics, 2014, 11(1):23）などが知られている。
【００２３】
データベース作成部１１は、内在性ペプチド配列データベース２に格納されている複数の内在性ペプチドのペプチド配列と、タンパク質配列データベース３に格納されている当該内在性ペプチドの前駆体タンパク質の全長配列に基づいて、これらの内在性ペプチドとは異なるペプチド配列を標的ペプチド配列として生成することにより、複数の標的ペプチド配列を含む標的ペプチド配列データベース１１１を作成する（データベース作成ステップ）。タンパク質配列データベース３は、内在性ペプチド配列データベース２には未登録の配列を伸長する際に参照されるタンパク質の全長配列データベースである。このとき生成される標的ペプチド配列は、内在性ペプチド配列データベース２にペプチド配列が格納されている内在性ペプチドの部分配列を１残基以上含むペプチド配列である。すなわち、データベース作成部１１により生成される標的ペプチド配列は、ペプチド配列が既知の内在性ペプチドと部分配列（あるいは全ての配列）が共通している。
【００２４】
質量分析部１２は、ペプチド試料に対して質量分析を行う（質量分析ステップ）。質量分析部１２による質量分析の方法としては、特に限定されるものではないが、例えばイオントラップ飛行時間型質量分析装置（ＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳ）を用いた方法を採用することができる。この方法を用いた場合には、例えばイオン化部、イオントラップ及びＴＯＦ  ＭＳ（いずれも図示せず）を備えたＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳを用いてペプチド試料に対する質量分析が行われる。
【００２５】
具体的には、ペプチド試料はイオン化部においてイオン化され、そのイオンがイオントラップにより捕捉される。イオントラップとしては、例えば三次元四重極型のものを用いることができるが、これに限られるものではない。イオントラップ内には、捕捉したイオンの一部が選択的に残され、そのイオンがＣＩＤ（衝突誘起解離）により開裂される。開裂されたイオンは、イオントラップからＴＯＦ  ＭＳ（飛行時間型質量分析器）に送られる。
【００２６】
ＴＯＦ  ＭＳでは、飛行空間を飛行したイオンが検出器により検出される。具体的には、飛行空間に形成された電場により加速されたイオンが、当該飛行空間を飛行する間にｍ／ｚ（質量電荷比）に応じて時間的に分離され、検出器により順次検出される。これにより、ｍ／ｚと検出器における検出強度との関係が質量スペクトルとして測定され、質量分析が実現される。ただし、ＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳに限らず、例えばイオントラップのないタンデム型飛行時間型質量分析装置（Ｔａｎｄｅｍ  ＴＯＦ（ＴＯＦ−ＴＯＦ）  ＭＳ）の他、四重極飛行時間型質量分析装置（Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳ）、四重極イオントラップ型質量分析装置（Ｑｑ−ＩＴ  ＭＳ）などのハイブリッド型の質量分析装置を用いて質量分析が行われてもよい。また、イオンの開裂方法についても、ＣＩＤに限られるものではなく、ＥＴＤ（電子移動解離）、ＥＣＤ（電子捕獲解離）などの他の開裂方法が用いられてもよい。
【００２７】
ＩＴ−ＴＯＦ  ＭＳを用いた質量分析では、イオントラップにおいてイオンを開裂させてＴＯＦ  ＭＳで質量分析を行うという一連の動作を繰り返し行うことにより、ＭＳｎ分析（ｎは２以上の整数）を行い、質量スペクトルとしてのＭＳｎスペクトルを測定することができる。
【００２８】
ピークリスト作成部１３は、質量分析部１２により得られたＭＳｎスペクトルに基づいて、そのＭＳｎスペクトルに含まれるピークを抽出したピークリスト（ＭＳｎピークリスト）を作成する。
【００２９】
ペプチド帰属部１４は、標的ペプチド配列データベース１１１に格納されている複数の標的ペプチド配列と、ピークリスト作成部１３により作成されたピークリストとに基づいて、ペプチド試料に含まれる内在性ペプチドのペプチド配列を決定する（ペプチド帰属ステップ）。ペプチド帰属部１４は、例えばＣＰＵがプログラムを実行することにより、配列推定部１４１及びプロダクトイオン照合部１４２などの機能部を含んでいる。
【００３０】
配列推定部１４１は、例えばＭＳ１ピークリスト中のＭＳ２プリカーサイオンについて、ＭＳ２プリカーサイオン質量と所定の質量許容誤差の範囲で合致するペプチド配列を標的ペプチド配列データベース１１１から探索する。配列推定部１４１により探索されたペプチド配列は、ペプチド試料に含まれる内在性ペプチドのペプチド配列の候補（ペプチド配列候補）となる。
【００３１】
プロダクトイオン照合部１４２は、配列推定部１４１で得られたペプチド配列候補に対してスコア付けを行う。ペプチド配列候補の数が十分に得られた場合には、各ペプチド配列候補のスコアの分布から統計的に有意なペプチド配列候補を求め、そのペプチド配列をペプチド試料に含まれる内在性ペプチドのペプチド配列に決定することができる。
【００３２】
２．データベース作成部による処理
図２は、データベース作成部１１により標的ペプチド配列を生成する際の態様について説明するための図である。また、図３は、データベース作成部１１による処理の流れを示したフローチャートである。
【００３３】
図２の例では、既知の全長配列を有するタンパク質（帰属タンパク質）の中に、ペプチド配列が既知の内在性ペプチドＰが含まれる場合について説明する。すなわち、この例では、内在性ペプチドＰのペプチド配列が内在性ペプチド配列データベース２に格納されているものとする。内在性ペプチド配列データベース２にペプチド配列が格納されている内在性ペプチドＰは、タンパク質に帰属されており、このタンパク質の全長配列と全長配列中の内在性ペプチドＰの配列開始残基及び配列終了残基が与えられていることが好ましい。
【００３４】
この場合、データベース作成部１１は、内在性ペプチド配列データベース２を読み込み（ステップＳ１０１）、読み込んだ各内在性ペプチドＰのペプチド配列に基づいて、標的ペプチドのペプチド配列（標的ペプチド配列）を生成する（ステップＳ１０２）。具体的には、データベース作成部１１は、内在性ペプチドＰのペプチド配列の一部（部分配列）を１残基以上残しながら、ペプチド配列を伸縮させることにより標的ペプチド配列を生成する。このとき、データベース作成部１１は、内在性ペプチドＰが含まれる帰属タンパク質の全長配列を参照しながらペプチド配列を伸縮させる。
【００３５】
データベース作成部１１は、生成した標的ペプチド配列を標的ペプチド配列データベース１１１に格納する（ステップＳ１０３）。ステップＳ１０２，Ｓ１０３の処理は、内在性ペプチド配列データベース２に格納されている全ての内在性ペプチドＰについて行われ、全ての内在性ペプチドＰについての処理が終了すると（ステップＳ１０４でＹｅｓ）、標的ペプチド配列の全てのバリエーションが標的ペプチド配列データベース１１１に格納される。
【００３６】
例えば図２に示すように、内在性ペプチドＰのペプチド配列のＮ末端側を伸長させ、Ｃ末端側を短縮させることにより、標的ペプチドＰ１のペプチド配列を生成したり、Ｃ末端側を伸長させ、Ｎ末端側を短縮させることにより、標的ペプチドＰ２のペプチド配列を生成したりすることができる。また、内在性ペプチドＰのペプチド配列のＮ末端側及びＣ末端側の両方を短縮させることにより、標的ペプチドＰ３のペプチド配列を生成したり、Ｎ末端側及びＣ末端側の両方を伸長させることにより、標的ペプチドＰ４のペプチド配列を生成したりすることもできる。ただし、図２中にＰ５，Ｐ６で示すように、内在性ペプチドＰと部分配列が共通していないペプチド配列は、標的ペプチド配列として生成されない。従って、既知ペプチドの帰属タンパク質の全長配列を非特異的に切断処理しペプチド配列を生成した場合と比較しても、さらに探索空間を小さく抑えることが可能である。なお、帰属タンパク質にアイソフォームが存在し、登録配列は一致するが伸長する配列が異なるという場合には、異なるバリエーションの標的ペプチド配列として生成され、標的ペプチド配列データベース１１１に格納される。
【００３７】
３．質量分析部及びピークリスト作成部による処理
図４は、質量分析部１２及びピークリスト作成部１３による処理の流れを示したフローチャートである。
【００３８】
質量分析部１２は、内在性ペプチドを含むペプチド試料をイオン化し、そのイオンを質量分析することによりＭＳ１スペクトルを測定する（ステップＳ２０１）。このとき、ピークリスト作成部１３は、測定されたＭＳ１スペクトルからピークを抽出することにより、ＭＳ１ピークリストを作成する（ステップＳ２０２）。
【００３９】
その後、質量分析部１２は、作成されたＭＳ１ピークリストから、ＭＳ２スペクトルの測定対象となる複数のＭＳ２プリカーサイオンを所定の方法により選択し（ステップＳ２０３）、各ＭＳ２プリカーサイオンを開裂させて質量分析を行うことによりＭＳ２スペクトルを測定する（ステップＳ２０４）。ステップＳ２０４の処理は、全てのＭＳ２プリカーサイオンについて行われ、全てのＭＳ２プリカーサイオンについての処理が終了すると（ステップＳ２０５でＹｅｓ）、ピークリスト作成部１３が、測定されたＭＳ２スペクトルからピークを抽出することにより、ＭＳ２ピークリストを作成する（ステップＳ２０６）。
【００４０】
４．ペプチド帰属部による処理
図５は、ペプチド帰属部１４による処理の流れを示したフローチャートである。
【００４１】
配列推定部１４１は、ＭＳ１ピークリスト中の各ＭＳ２プリカーサイオンについて、ＭＳ２プリカーサイオン質量と所定の質量許容誤差の範囲で合致するペプチド配列を標的ペプチド配列データベース１１１から探索する（ステップＳ３０１）。その結果、該当するペプチド配列（ペプチド配列候補）が１つ以上得られた場合には（ステップＳ３０２でＹｅｓ）、そのペプチド配列候補に対してスコア付けを行う（ステップＳ３０３）。
【００４２】
ペプチド配列候補に対してスコア付けを行う際には、例えばペプチド配列候補の主要プロダクトイオン（例えばｙ／ｂ系列イオン）の理論プロダクトイオン質量が算出され、ＭＳ２ピークリスト中の各プロダクトイオンについて、理論プロダクトイオン質量と所定の質量許容誤差の範囲で合致するペプチド配列候補が探索される。主要プロダクトイオンとは、切断されやすい部位が予め分かっているプロダクトイオンを意味しており、切断されやすい部位が予め分かっている結果、理論的なプロダクトイオン質量（理論プロダクトイオン質量）を算出することができる。
【００４３】
探索された各ペプチド配列候補については、合致したピーク強度やピーク数などを用いてスコア付けが行われる。スコア算出法としては、タンパク質データベースを用いたデータベース検索で使用されている様々なスコア算出法を採用することができる。
【００４４】
ステップＳ３０１〜Ｓ３０３の処理は、全てのＭＳ２プリカーサイオンについて行われ、全てのＭＳ２プリカーサイオンについての処理が終了すると（ステップＳ３０４でＹｅｓ）、各ペプチド配列候補のスコアに基づいてペプチド配列候補の絞り込みが行われる（ステップＳ３０５）。このとき、スコアの有意差に基づいてペプチド配列候補が一意的に絞り込まれ、そのペプチド配列が解析結果として出力される（ステップＳ３０６）。なお、ペプチド配列候補の数が少ないなどの理由で統計的な指標を算出できない場合には、例えばスコアに基づく順位付けまでの処理が行われ、その後の一意的な絞り込みはユーザに委ねてもよい。
【００４５】
５．作用効果
本実施形態では、ペプチド配列が既知の内在性ペプチドに基づいて、当該内在性ペプチドの部分配列を１残基以上含むペプチド配列のデータベース（標的ペプチド配列データベース１１１）が生成される。ペプチド配列が既知の内在性ペプチドと部分配列が一部共通しているペプチド配列（標的ペプチド配列）は、従来法では帰属されない質量スペクトル中に未知の内在性ペプチドのペプチド配列として残されている可能性がある。
【００４６】
したがって、標的ペプチド配列のデータベース（標的ペプチド配列データベース１１１）を生成すれば、探索空間の増大を効果的に防止することができる。そして、当該標的ペプチド配列データベース１１１と質量分析部１２でのペプチド試料の質量分析により得られた質量スペクトルとに基づいて、ペプチド試料に含まれる標的ペプチドのペプチド配列を優先的に探索することによって、より多くの内在性ペプチドのペプチド配列を高感度で決定することができる。
【００４７】
６．実施例
上述のＭｏｓａｉｑｕｅＤＢに収録されている内在性ペプチド及び測定データから帰属した内在性ペプチドのペプチド配列９４４個を基に、７〜８０残基長からなる標的ペプチド配列のバリエーションを９４４，３９０個生成し、標的ペプチドデータベースを作成した。
【００４８】
尿試料から質量分析部により測定された約３８ピーク（プリカーサイオン：ｍ／ｚ＝７９３〜２９４３、計７０スペクトル）のＭＳ２測定データ及びＭＳ３測定データに対して、配列推定部でペプチド配列を推定した。その結果、３５ピーク（プリカーサイオン質量が質量許容誤差の範囲で重複するもの、かつ、ペプチド配列が異なるものを除く）について、標的ペプチド配列データベースに格納されている標的ペプチド配列と質量許容誤差の範囲で合致するペプチド配列候補が得られ、各ピークから平均して約５０個（計１８００個余り）のペプチド配列候補が得られた。
【００４９】
上記配列推定部で推定されたペプチド配列候補について、ｙ／ｂ系列イオンの理論質量を算出し、解析対象ピークから得られた計７０のＭＳｎスペクトル（ｎ＝２又は３）に対してプロダクトイオンの照合を行った。そして、公知の検索エンジンであるＸ！Ｔａｎｄｅｍに類似するスコア算出法により、以下の通りスコア付けを行った。ただし、スコア付けの方法は、本実施例に限定されるものではなく、従来法としてのデータベース検索法で採用されている様々な手法を採用してもよい。
【００５０】
スコア付けは、下記式（１）及び式（２）を用いて行った。
【数１】
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【００５１】
ここで、Ｓｃｏｒｅが実際にペプチド配列候補と測定データから算出されたスコアである。Ｉｉは照合の結果合致したピークの強度、Ｎは合致したピークの総数、ＴＩＣは探索対象のＭＳ２スペクトルのトータルイオンクロマトグラム、ｎｂ及びｎｙは、それぞれプロダクトイオン照合の結果合致したｂ系列イオン及びｙ系列イオンの個数であり、ここではＮ＝ｎｂ＋ｎｙである。ペプチド配列候補のスコア分布をもとに、配列候補から統計的に有意な配列を選びだすための指標および閾値を設けることが可能である。例えばスコア分布から算出される有意確率（ｐ−ｖａｌｕｅ）や期待値（Ｅ−ｖａｌｕｅ）を指標として判別用の閾値を設定可能である。ただし、有意差の有無を判別するための指標は、上記のような指標に限定されるものではなく、本実施例においてはＥ−ｖａｌｕｅによる判別を、1位候補と下位候補とのスコア差を閾値とした判別法で代替（再現)することも可能であった。
【００５２】
図６は、尿試料から得られたＭＳ２スペクトルについて実際に解析を行った結果を示す図である。「ＵｎｉＰｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ」は、タンパク質データベースであるＵｎｉＰｒｏｔのタンパク質ＩＤである。「ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎａｍｅ」は、ＵｎｉＰｒｏｔの登録タンパク質の名称である。「Ｓｔａｒｔ」及び「Ｅｎｄ」は、ＵｎｉＰｒｏｔの登録配列中におけるペプチドの開始残基及び終了残基の位置を示している。「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」は、帰属された尿中ペプチドのアミノ酸配列である。「Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｉｏｎ  Ｍａｓｓ」は、質量分析で観測された一価のペプチドイオンの質量電荷比である。
【００５３】
評価のために尿試料から得られた１６個の高品質のＭＳ２スペクトルについて、従来法としてのタンパク質データベース検索法であるＭａｓｃｏｔやＸ！Ｔａｎｄｅｍを用いた場合には、同定閾値をそれぞれプロテオーム解析で使われている閾値に比べて大幅に緩和した値である１．０、０．１とし、偽陽性ヒットを許容したにもかかわらず、５個のペプチド配列（図６中のＡ）が同定されるにとどまった。
【００５４】
これに対して、本発明による解析の結果、上記５個のペプチド配列（図６中のＡ）だけでなく、残りの１１個のペプチド配列（図６中のＢ）も含む１６個の高品質のＭＳ２スペクトル全てからペプチド配列候補が推定された。そして、プロダクトイオン照合部によるスコア付けの結果、いずれのスペクトルについても１位候補と２位候補以下とのスコア差が１０以上あったことから、１位候補が有意な推定結果であると判別された。また、目視による検証の結果、いずれの推定結果も妥当な結果であることが認められた。
【００５５】
＜第２実施形態＞
図７は、本発明の第２実施形態に係るペプチド帰属システム１００の構成例を示したブロック図である。
【００５６】
第１実施形態では、プロダクトイオン照合部１４２が主要プロダクトイオンの照合を行う際に、ペプチド配列候補から理論プロダクトイオン質量を算出するような構成について説明した。これに対して、第２実施形態では、プロダクトイオン照合部１４２が、ペプチド配列候補の作成元となった内在性ペプチド配列データベース２にペプチド配列が格納されている内在性ペプチドのＭＳｎ測定データ（照合先データ）を用いて、解析対象となるＭＳｎ測定データ（照合元データ）との類似度を算出する。その他の構成については、第１実施形態と同様であるため、図に同一符号を付して説明を省略する。
【００５７】
ペプチド帰属システム１００には、内在性ペプチドスペクトルライブラリ２１が含まれる。内在性ペプチドスペクトルライブラリ２１には、内在性ペプチド配列データベース２にペプチド配列が格納されている各内在性ペプチドについて、質量分析を行うことにより得られたＭＳｎスペクトルが記憶されている。プロダクトイオン照合部１４２は、内在性ペプチドスペクトルライブラリ２１に記憶されているＭＳｎスペクトルを用いて、質量分析部１２で測定されたＭＳｎスペクトルとの類似度を算出する。照合先データのプリカーサイオン質量から照合元データのプリカーサイオン質量を差し引いたΔｍが質量許容誤差よりも大きい場合には、照合元データのプロダクトイオン質量からΔｍを差し引いたピークとの照合結果も類似度の算出に用いられる。また、Δｍが照合元のペプチド配列のいずれかの末端の配列（アミノ酸１個以上)の質量Δｎよりも大きい場合には、照合元のプロダクトイオン質量からΔｎを差し引いたピークとの照合結果を類似度の算出に用いてよい。
【００５８】
類似度の算出には、既知のスペクトルライブラリ検索法で利用されている様々な方法を利用することができる（例えば、Stein, S. E. & Scott, D. R.: Optimization and Testing of Mass Spectral Library Search Algorithms for Compound Identification. JASMS, 5, 859-866 (1994)）。この場合、例えば照合元データと照合先データとを照合し、質量許容誤差の範囲で合致したイオンピークについてピーク強度の積を正規化したものを類似度として用いてもよい。
【００５９】
内在性ペプチドの場合、予想できないような部位で切断されるような場合があるため、第１実施形態のように理論プロダクトイオン質量を算出するような構成の場合、理論通りにスコア付けを行うことができないおそれがある。これに対して、第２実施形態では、内在性ペプチド配列データベース２にペプチド配列が格納されている内在性ペプチドの実際のＭＳｎ測定データを用いるため、より高感度でペプチド配列を決定することができる場合がある。
【符号の説明】
【００６０】
１    ペプチド帰属システム
２    内在性ペプチド配列データベース
１１    データベース作成部
１２    質量分析部
１３    ピークリスト作成部
１４    ペプチド帰属部
２１    内在性ペプチドスペクトルライブラリ
１００    ペプチド帰属システム
１１１    標的ペプチド配列データベース
１４１    配列推定部
１４２    プロダクトイオン照合部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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