(57)【要約】      （修正有）【課題】中枢神経系(CNS)への送達における制限因子である血液脳関門（BBB)を通過することのできる組成物の提供。【解決手段】血液脳関門を通過することができる融合抗体であって、第１の抗体および第２の抗体を含み、(i)該第１の抗体が、該第２の抗体のカルボキシ末端に連結している一本鎖抗体であり、かつ、(ii)該第１の抗体が、別々の部分としてのその活性と比較して平均で少なくとも約20%のその活性を保持している、融合抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(i)を(ii)と結合して含む組成物：
(i)血液から脳へと第１の受容体媒介BBB輸送系を介してBBBを通過することができる第１の部分; 
(ii)脳から血液へと第２の受容体媒介BBB輸送系を介してBBBを通過することができる第２の部分。
【請求項２】
(iii)中枢神経系成分と相互作用することが出来る第３の部分をさらに含む請求項 1の組成物。
【請求項３】
タンパク質を含む請求項 1の組成物。
【請求項４】
抗体コンストラクトを含む請求項 1の組成物。
【請求項５】
第１の部分が内在性 BBB 受容体媒介輸送系上でBBBを通過することができる請求項 1の組成物。
【請求項６】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系が、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびIGF 受容体からなる群から選択される請求項 5の組成物。
【請求項７】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系がインスリン BBB 受容体媒介輸送系である請求項 6の組成物。
【請求項８】
第２の受容体媒介BBB輸送系がFc 受容体系を含む請求項 1の組成物。
【請求項９】
第１および第２の部分が抗体構造の部分である請求項 1の組成物。
【請求項１０】
第２の部分が抗体構造のCH2-CH3 領域を含む請求項 9の組成物。
【請求項１１】
第３の部分が、抗体、抗体断片、または ScFvを含む請求項 2の組成物。
【請求項１２】
第３の部分が ScFvを含む請求項 11の組成物。
【請求項１３】
中枢神経系成分が脳障害に関係する病理学的物質を含む請求項 2の組成物。
【請求項１４】
脳障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、および多発性硬化症からなる群から選択される障害である請求項 13の組成物。
【請求項１５】
病理学的物質が、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、およびそれらの組合せからなる群から選択されるタイプのものである請求項 13の組成物。
【請求項１６】
病理学的物質がタンパク質である請求項 13の組成物。
【請求項１７】
タンパク質が、Aβアミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオンタンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、およびオリゴデンドロサイト表面抗原からなる群から選択される請求項 15の組成物。
【請求項１８】
タンパク質がAβ アミロイドである請求項 15の組成物。
【請求項１９】
第１の部分および第２の部分が抗体の部分であり、第３の部分がScFvである請求項 2の組成物。
【請求項２０】
抗体が内在性 BBB 受容体媒介輸送系に対するものである請求項 18の組成物。
【請求項２１】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系がインスリン BBB 受容体媒介輸送系である請求項 19の組成物。
【請求項２２】
インスリン BBB 受容体媒介輸送系がヒトインスリン受容体媒介輸送系である請求項 20の組成物。
【請求項２３】
ScFvが、AD のAβ アミロイドペプチドに対するScFvである請求項 19または20の組成物。
【請求項２４】
以下を含む組成物：
(i)血液から脳へとBBBを通過することができる第１の部分; 
(ii)中枢神経系成分と相互作用することが出来る第２の部分;
(iii)脳から血液へとBBBを通過することができる第３の部分、
ここで、 第１、第２および第３の部分は連結しており、第１、第２および第３の部分は同一ではなく、共通の構造を共有していない。
【請求項２５】
非天然組成物である請求項 24の組成物。
【請求項２６】
第１および第３の部分がタンパク質を含む請求項 24の組成物。
【請求項２７】
第１および第３の部分が抗体を含む請求項 24の組成物。
【請求項２８】
第１および第３の部分がmAbを含む請求項 24の組成物。
【請求項２９】
第１、第２および第３の部分が共有結合している請求項 24の組成物。
【請求項３０】
第１の部分が内在性 BBB 受容体媒介輸送系を介して血液から脳へとBBBを通過することができる、請求項 24の組成物。
【請求項３１】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系が、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびIGF 受容体からなる群から選択される請求項 30の組成物。
【請求項３２】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系がインスリン BBB 受容体媒介輸送系である請求項 31の組成物。
【請求項３３】
第２の部分が、抗体、抗体断片、またはScFvを含む請求項 24の組成物。
【請求項３４】
第３の部分がScFvを含む請求項 33の組成物。
【請求項３５】
中枢神経系成分が脳障害に関係する病理学的物質を含む請求項 24の組成物。
【請求項３６】
脳障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、および多発性硬化症からなる群から選択される障害である請求項 35の組成物。
【請求項３７】
病理学的物質が、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものである請求項 35の組成物。
【請求項３８】
病理学的物質がタンパク質である請求項 37の組成物。
【請求項３９】
タンパク質が、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、およびオリゴデンドロサイト表面抗原からなる群から選択される請求項 38の組成物。
【請求項４０】
タンパク質が Aβ アミロイドである請求項 39の組成物。
【請求項４１】
第３の部分が、受容体媒介BBB輸送系を介して脳から血液へとBBBを通過することができる構造を含む請求項 24の組成物。
【請求項４２】
受容体媒介BBB輸送系がFc 受容体系を含む請求項 41の組成物。
【請求項４３】
第３の部分が抗体構造の部分である請求項 42の組成物。
【請求項４４】
第３の部分が抗体構造のCH2-CH3 領域を含む請求項 43の組成物。
【請求項４５】
抗原に結合するScFvを含む組成物であって、
(i) ScFvは第１の免疫グロブリンに由来し、
(ii) ScFvは第２の免疫グロブリンに結合し、ここで第２の免疫グロブリンは、そのネイティブな形態から改変されている免疫グロブリンであってよく; そして、
(iii) ScFvのその抗原に対する親和性はScFvが由来する第１の免疫グロブリンのものの約 [20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120%]を超える、
組成物。
【請求項４６】
ScFvが第２の免疫グロブリンに共有結合している請求項 45の組成物。
【請求項４７】
ScFvがそのアミノ末端にて第２の免疫グロブリンに結合している請求項 45の組成物。
【請求項４８】
ScFvがそのカルボキシ末端にて第２の免疫グロブリンに結合している請求項 45の組成物。
【請求項４９】
ScFvが第２の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のカルボキシ末端に結合している請求項 45の組成物。
【請求項５０】
ScFvが第２の免疫グロブリンの重鎖のカルボキシ末端に結合している請求項49の組成物。
【請求項５１】
ScFvが第２の免疫グロブリンの重鎖のCH3 領域に結合している請求項 50の組成物。
【請求項５２】
第２の免疫グロブリンがその重鎖が切断型となるように改変されており、ここでScFvが切断型重鎖のカルボキシ末端に結合している請求項 50の組成物。
【請求項５３】
ScFvが切断型重鎖のカルボキシ末端に結合しており、ここで、該重鎖が切断型であり、そのカルボキシ末端が 、CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3 領域からなる群から選択されるネイティブな重鎖の領域に位置する請求項 52の組成物。
【請求項５４】
ScFvが第２の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のアミノ末端に結合している請求項 45の組成物。
【請求項５５】
ScFv が脳に存在する病理学的物質に対する抗体に由来するものであり、ここで病理学的物質が脳障害と関係している請求項 45の組成物。
【請求項５６】
脳障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、および多発性硬化症からなる群から選択される障害である請求項 55の組成物。
【請求項５７】
病理学的物質が、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものである請求項 55の組成物。
【請求項５８】
病理学的物質がタンパク質である請求項 57の組成物。
【請求項５９】
タンパク質が、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド (TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、およびオリゴデンドロサイト表面抗原からなる群から選択される請求項 58の組成物。
【請求項６０】
脳から血液へと BBBを横切って抗体構造を輸送することが出来る部分を含む非天然組成物。
【請求項６１】
該輸送がBBB FcRを介するものである請求項 60の組成物。
【請求項６２】
抗体構造が治療用または診断用抗体構造である請求項 60の組成物。
【請求項６３】
治療用または診断用抗体構造が病理学的物質と相互作用するものであり、病理学的物質が脳障害に関係するものである請求項 62の組成物。
【請求項６４】
脳障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、および多発性硬化症からなる群から選択される障害である請求項 63の組成物。
【請求項６５】
病理学的物質が、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものである請求項 63の組成物。
【請求項６６】
病理学的物質がタンパク質である請求項 65の組成物。
【請求項６７】
タンパク質が、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、およびオリゴデンドロサイト表面抗原からなる群から選択される請求項 66の組成物。
【請求項６８】
タンパク質がAβ アミロイドである請求項 67の組成物。
【請求項６９】
抗体構造が一本鎖 Fv 抗体 (ScFv)である請求項 60の組成物。
【請求項７０】
治療用抗体構造または診断用抗体構造が血液脳関門 (BBB)を通過することができる構造と連結している請求項 62の組成物。
【請求項７１】
治療用抗体構造または診断用抗体構造がBBBを通過することができる構造に共有結合している請求項 70の組成物。
【請求項７２】
BBBを血液から脳へと通過することができる部分をさらに含む請求項 60の組成物。
【請求項７３】
脳から血液へと BBBを横切って抗体構造を輸送することが出来る部分がFc 受容体と相互作用する請求項 60 の組成物。
【請求項７４】
BBBを通過することができる部分が内在性 BBB 受容体媒介輸送系上でBBBを横切る請求項 72の組成物。
【請求項７５】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系が、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、リポタンパク質受容体、およびIGF 受容体からなる群から選択される請求項 74の組成物。
【請求項７６】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系がインスリン BBB 受容体媒介輸送系である請求項 75の組成物。
【請求項７７】
ScFvのVH 領域が配列番号12と少なくとも [80、90、95、99%] 同一な配列を含む、ScFvを含む組成物。
【請求項７８】
ScFvのVL 領域が配列番号14と少なくとも [80、90、95、99%] 同一な配列を含む請求項 77の組成物。
【請求項７９】
ScFvがAbに連結している請求項 77の組成物。
【請求項８０】
Abが MAbである請求項 79の組成物。
【請求項８１】
ScFvがAbまたはMAbに共有結合している請求項 79または80の組成物。
【請求項８２】
ScFvがAbまたはMAbの軽鎖のカルボキシ末端に連結している請求項 79または80の組成物。
【請求項８３】
ScFvがそのアミノ末端を介してAbまたはMAbの軽鎖のカルボキシ末端に連結している請求項 82の組成物。
【請求項８４】
ScFvがそのカルボキシ末端を介してAbまたはMAbの軽鎖のカルボキシ末端に連結している請求項 82の組成物。
【請求項８５】
ScFvがAbまたはMAbの重鎖のカルボキシ末端に連結している請求項 79または80の組成物。
【請求項８６】
ScFvがそのアミノ末端を介してAbまたはMAbの重鎖のカルボキシ末端に連結している請求項 85の組成物。
【請求項８７】
ScFvがそのカルボキシ末端を介してAbまたはMAbの重鎖のカルボキシ末端に連結している請求項 85の組成物。
【請求項８８】
AbまたはMAbが内在性 BBB 受容体媒介輸送系に対するものである請求項 79または80の組成物。
【請求項８９】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系が、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、リポタンパク質受容体、および IGF 受容体からなる群から選択される請求項 88の組成物。
【請求項９０】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系がインスリン BBB 受容体媒介輸送系である請求項 89の組成物。
【請求項９１】
ScFvのVH 領域が少なくとも以下のいずれかを含む、ScFvを含む組成物: 
(i)配列番号12のアミノ酸26-35の配列と少なくとも 約 60%同一なCDR1 配列、
(ii)配列番号12のアミノ酸50-66の配列と少なくとも 約 60%同一なCDR2 配列;および、
(iii)配列番号12のアミノ酸99-103の配列と少なくとも 約 60%同一なCDR3 配列。
【請求項９２】
ScFvのVL 領域が少なくとも以下のいずれかを含む、ScFvを含む組成物:
(i)配列番号14のアミノ酸24-39の配列と少なくとも 約 60%同一なCDR1 配列;
(ii)配列番号14のアミノ酸55-61の配列と少なくとも 約 60%同一なCDR2 配列;および、
(iii)配列番号14のアミノ酸94-102の配列と少なくとも 約 60%同一なCDR3 配列。
【請求項９３】
治療用抗体構造または診断用抗体構造を含む組成物であって、治療用抗体構造または診断用抗体構造の脳における平均分布容積が、末梢投与の後、少なくとも 約 30 μL/グラム 脳を達成することが出来るものである組成物。
【請求項９４】
治療用抗体構造または診断用抗体構造が脳に存在する病理学的物質に結合することが出来、ここで病理学的物質が脳障害と関係している請求項 93の組成物。
【請求項９５】
脳障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、および多発性硬化症からなる群から選択される障害である請求項 94の組成物。
【請求項９６】
病理学的物質が、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものである請求項 94の組成物。
【請求項９７】
病理学的物質がタンパク質である請求項 96の組成物。
【請求項９８】
タンパク質が、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、およびオリゴデンドロサイト表面抗原からなる群から選択される請求項 97の組成物。
【請求項９９】
タンパク質がAβ アミロイドである請求項 98の組成物。
【請求項１００】
治療用抗体構造が一本鎖 Fv 抗体 (ScFv)である請求項 93の組成物。
【請求項１０１】
治療用抗体構造または診断用抗体構造が血液脳関門 (BBB)を通過することができる構造と連結している請求項 93の組成物。
【請求項１０２】
治療用抗体構造または診断用抗体構造がBBBを通過することができる構造に共有結合している請求項 101の組成物。
【請求項１０３】
BBBを通過することができる構造が内在性 BBB 受容体媒介輸送系上でBBBを横切る請求項 101の組成物。
【請求項１０４】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系が、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、リポタンパク質受容体、およびIGF 受容体からなる群から選択される請求項 102の組成物。
【請求項１０５】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系がインスリン BBB 受容体媒介輸送系である請求項 104の組成物。
【請求項１０６】
BBBを通過することができる構造が、血液から脳へ、および、脳から血液へとBBBを通過することができる請求項 101の組成物。
【請求項１０７】
BBBを通過することができる構造が、血液から脳へと第１の受容体媒介輸送系を介して、そして脳から血液へと第２の受容体媒介輸送系を介してBBBを通過することができる、請求項 101の組成物。
【請求項１０８】
第１の受容体媒介輸送系が、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、リポタンパク質受容体、およびIGF 受容体からなる群から選択される請求項 107の組成物。
【請求項１０９】
第１の受容体媒介輸送系がインスリン BBB 受容体媒介輸送系である請求項 108の組成物。
【請求項１１０】
第２の受容体媒介輸送系がFc-受容体媒介輸送系である請求項 107の組成物。
【請求項１１１】
BBBを通過することができる構造が抗体である請求項 101の組成物。
【請求項１１２】
BBBを通過することができる構造がmAbである請求項 111の組成物。
【請求項１１３】
第１の配列および第２の配列を含む単一の核酸配列であって、第１の配列が、第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードする第２の配列に作動可能に連結した第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードし、ここで、第１の配列がさらに軽鎖に共有結合したScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFv をコードするか、または、第２の配列がさらに重鎖に共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFvをコードする、核酸配列。
【請求項１１４】
第１の免疫グロブリンが内在性 BBB 受容体媒介輸送系に対するものである請求項 113の核酸配列。
【請求項１１５】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系が、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、リポタンパク質受容体、およびIGF 受容体からなる群から選択される請求項 114の核酸配列。
【請求項１１６】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系がインスリン BBB 受容体媒介輸送系である請求項 115の核酸配列。
【請求項１１７】
ScFvが脳に存在する病理学的物質に対するものであり、病理学的物質が脳障害に関係するものである請求項 113 または請求項 114の核酸配列。
【請求項１１８】
脳障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、および多発性硬化症からなる群から選択される障害である請求項 117の核酸配列。
【請求項１１９】
病理学的物質が、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものである請求項 117の核酸配列。
【請求項１２０】
病理学的物質がタンパク質である請求項 117の核酸配列。
【請求項１２１】
タンパク質が、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド (TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、およびオリゴデンドロサイト表面抗原からなる群から選択される請求項 120の組成物。
【請求項１２２】
タンパク質がAβ アミロイドである請求項 121の核酸配列。
【請求項１２３】
ScFvのVH 領域が配列番号12と少なくとも 80%同一な配列を含む請求項 113の核酸配列。
【請求項１２４】
ScFvのVL 領域が配列番号14と少なくとも 80%同一な配列を含む請求項 113の核酸配列。
【請求項１２５】
ScFvがAβ アミロイドに対するものである請求項 120の核酸。
【請求項１２６】
請求項 113の核酸を含むベクター。
【請求項１２７】
請求項 126のベクターを含む細胞。
【請求項１２８】
細胞が真核細胞である請求項 127の細胞。
【請求項１２９】
細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項 128の細胞。
【請求項１３０】
ScFvのVH 領域が少なくとも以下のいずれかを含む請求項 113の核酸: 
(i)配列番号12のアミノ酸26-35の配列と少なくとも 約 60%同一であるCDR1 配列
(ii)配列番号12のアミノ酸50-66の配列と少なくとも 約 60%同一であるCDR2 配列; および、
(iii)配列番号12のアミノ酸99-103の配列と少なくとも 約 60%同一であるCDR3 配列。
【請求項１３１】
ScFvのVL 領域が少なくとも以下のいずれかを含む請求項 113の核酸:
(i) 配列番号14のアミノ酸24-39の配列と少なくとも 約 60%同一であるCDR1 配列;
(ii)配列番号14のアミノ酸55-61の配列と少なくとも 約 60%同一であるCDR2 配列;および、
(iii)配列番号14のアミノ酸94-102の配列と少なくとも 約 60%同一であるCDR3 配列。
【請求項１３２】
免疫グロブリン融合タンパク質を製造する方法であって、融合タンパク質が抗体構造に融合した免疫グロブリン重鎖または抗体構造に融合した免疫グロブリン軽鎖を含み、以下の工程を含む方法：真核細胞にひとつのタンデム発現ベクターを永久に組み込む工程、ここで融合タンパク質のための遺伝子および、免疫グロブリン軽鎖のための遺伝子または免疫グロブリン重鎖のための遺伝子を含む別の遺伝子が、１片のDNAに取り込まれる、方法。
【請求項１３３】
融合タンパク質が抗体構造に融合した免疫グロブリン重鎖を含み、融合タンパク質のための遺伝子および免疫グロブリン軽鎖のための遺伝子の両方が１片のDNAに取り込まれる、請求項 132の方法。
【請求項１３４】
融合タンパク質が治療剤に融合した免疫グロブリン軽鎖を含み、融合タンパク質のための遺伝子および免疫グロブリン重鎖のための遺伝子の両方が１片のDNAに取り込まれる、請求項 132の方法。
【請求項１３５】
該永久の導入がタンデムベクターを真核細胞に永久に組み込むことによって達成される請求項 132の方法。
【請求項１３６】
該永久の導入がタンデムベクターを含む複製性エピソーム性遺伝的要素を真核細胞に導入することによって達成される請求項 132の方法。
【請求項１３７】
抗体構造がScFvである請求項 132の方法。
【請求項１３８】
選択マーカーのための１以上の遺伝子を該１片のDNAに取り込むことをさらに含む請求項 132の方法。
【請求項１３９】
１以上の増幅遺伝子を該１片のDNAに取り込むことをさらに含む請求項 132の方法。
【請求項１４０】
免疫グロブリンがIgGである請求項 132の方法。
【請求項１４１】
免疫グロブリンがMAbである請求項 132の方法。
【請求項１４２】
ScFvが脳障害に関係する病理学的物質に対するものである請求項 137の方法。
【請求項１４３】
病理学的物質が、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものである請求項 142の方法。
【請求項１４４】
病理学的物質がタンパク質である請求項 143の方法。
【請求項１４５】
免疫グロブリン融合タンパク質を発現させることをさらに含む請求項 132の方法。
【請求項１４６】
免疫グロブリン融合タンパク質を精製することをさらに含む請求項 145の方法。
【請求項１４７】
(i)血液から脳へとBBBを通過することができ;かつ、
(ii)脳から血液へとBBBを通過することができる、
分子量が約 1000 ダルトンより大きい組成物。
【請求項１４８】
さらに脳における物質と相互作用することが出来る請求項 147の組成物。
【請求項１４９】
物質が脳障害に関係する病理学的物質である請求項 148の組成物。
【請求項１５０】
脳障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、および多発性硬化症からなる群から選択される障害である請求項 149の組成物。
【請求項１５１】
病理学的物質が、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、およびそれらの組合せからなる群から選択されるタイプのものである請求項 149の組成物。
【請求項１５２】
病理学的物質がタンパク質である請求項 151の組成物。
【請求項１５３】
タンパク質が、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、およびオリゴデンドロサイト表面抗原からなる群から選択される請求項 152の組成物。
【請求項１５４】
タンパク質がAβ アミロイドである請求項 153の組成物。
【請求項１５５】
血液から脳へとBBBを通過することができる第１の構造、障害と関係する病理学的物質と相互作用することが出来る第２の構造、および脳から血液へとBBBを通過することができる第３の構造を含む、有効量の組成物を、障害に罹患している個体に投与することを含むCNS 障害の治療方法。
【請求項１５６】
第１および第３の構造が、内在性 BBB 受容体媒介輸送系に対する抗体を含む請求項 155の方法。
【請求項１５７】
第２の構造がScFvを含む請求項 155または156の方法。
【請求項１５８】
投与が、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、直腸、経頬側、鼻腔内、経皮、および吸入からなる群から選択される請求項 155の方法。
【請求項１５９】
投与が、静脈内、筋肉内、または皮下である請求項 158の方法。
【請求項１６０】
CNS 障害が凝集 CNS 障害である請求項 159の方法。
【請求項１６１】
CNS 障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症 西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、および多発性硬化症からなる群から選択される請求項 160の方法。
【請求項１６２】
CNS 障害がアルツハイマー病である請求項 161の方法。
【請求項１６３】
個体がヒトである請求項 155の方法。
【請求項１６４】
個体に約 1〜約 100 mgの用量の組成物を投与する請求項 163の方法。
【請求項１６５】
第１および第３の構造が抗体を含む請求項 155の方法。
【請求項１６６】
第２の構造がScFvを含む請求項 155の方法。
【請求項１６７】
病理学的物質が、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものである請求項 155の方法。
【請求項１６８】
障害に関係する物質がタンパク質である請求項 155の方法。
【請求項１６９】
タンパク質が、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド (TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、およびオリゴデンドロサイト表面抗原からなる群から選択される請求項 168の方法。
【請求項１７０】
タンパク質がAβ アミロイドである請求項 169の方法。
【請求項１７１】
個体の体液中の組成物のレベルを測定することを含む診断方法であって、該組成物は、血液から脳へとBBBを通過すること、脳障害に関係する病理学的物質と相互作用すること、および脳から血液へとBBBを通過することができるものであり、該組成物は個体に投与されており、該病理学的物質と相互作用したものである方法。
【請求項１７２】
脳障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、および多発性硬化症からなる群から選択される請求項 171の方法。
【請求項１７３】
脳障害がアルツハイマー病である請求項 172の方法。
【請求項１７４】
病理学的物質が、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものである請求項 171の方法。
【請求項１７５】
病理学的物質がタンパク質である請求項 174の方法。
【請求項１７６】
タンパク質が、 Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド (TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、およびオリゴデンドロサイト表面抗原からなる群から選択される請求項 175の方法。
【請求項１７７】
タンパク質がAβ アミロイドである請求項 176の方法。
【請求項１７８】
該組成物を個体に投与することをさらに含む請求項 171の方法。
【請求項１７９】
組成物が抗体を含む請求項 171の方法。
【請求項１８０】
組成物がさらにScFvを含む請求項 179の方法。
【請求項１８１】
該体液が、血液、血清、または血漿からなる群から選択される請求項 171の方法。
【請求項１８２】
個体のCNSにおいて組成物によって放射されたシグナルを検出することを含む脳障害の診断方法であって、該組成物が、血液から脳へとBBBを通過することおよび脳障害に関係する病理学的物質と相互作用することができる抗体を含む方法。
【請求項１８３】
組成物を個体に投与することをさらに含む請求項 182の方法。
【請求項１８４】
組成物が放射性医薬品または磁気医薬品である請求項 182の方法。
【請求項１８５】
組成物がシグナルを放射する物質により標識されている請求項 182の方法。
【請求項１８６】
シグナルを放射する物質が、陽電子放射体、放射性核種、および磁性物質からなる群から選択される請求項 182の方法。
【請求項１８７】
シグナルを放射する物質が陽電子放射体である請求項 186の方法。
【請求項１８８】
シグナルを放射する物質が放射性核種である請求項 186の方法。
【請求項１８９】
脳障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、および多発性硬化症からなる群から選択される請求項 182の方法。
【請求項１９０】
脳障害がアルツハイマー病である請求項 189の方法。
【請求項１９１】
病理学的物質が、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものである請求項 182の方法。
【請求項１９２】
病理学的物質がタンパク質である請求項 192の方法。
【請求項１９３】
タンパク質が、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、およびオリゴデンドロサイト表面抗原からなる群から選択される請求項 191の方法。
【請求項１９４】
タンパク質がAβ アミロイドである請求項 193の方法。
【請求項１９５】
抗体がScFvを含む請求項 182の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による支援研究に関する記述
本発明は、認可番号 R43 NS-051857 の下にアメリカ合衆国政府の支援を伴い国立衛生研究所によって成されたものである。アメリカ合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連する出願
本出願は “Agents for Blood-Brain Barrier Delivery”と題し2006年8月18日に出願された米国特許仮出願第60/822,825号の利益を主張し、その出願の内容全体が引用により含まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
神経障害は世界的に見て死亡率および能力障害の主要な原因である。幅広い進歩にも関わらず、現在の治療の選択肢はいくつかの側面において限られたままである。この限定の主要な理由の一つは、脳が分子に対し選択的接近のみを許す点において独特であることである。これは有用な保護機構である一方、多くの潜在的に有益な分子実体が中枢神経系(CNS)に対する接近手段を有さず、そのため多くの神経障害または CNS の他の状態において治療効果を発揮することができないことをも意味する。本発明は、血液脳関門を通過する能力が限られている抗体医薬に対する、CNS についての接近可能性の提供における進歩をもたらすものである。
【発明の概要】
【０００４】
発明の要旨
一つの側面において、本発明は (i) 第１の受容体媒介BBB輸送系を介して血液から脳へとBBBを通過することができる第１の部分; それと結合する(ii) 第２の受容体媒介BBB輸送系を介して脳から血液へとBBBを通過することができる第２の部分 を包含する組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物はさらに (iii) 中枢神経系構成成分と相互作用することができる第３の部分 を含有する。組成物はタンパク質、例えば、抗体コンストラクトを含有しうる。いくつかの態様において、第１の部分は内在性 BBB 受容体媒介輸送系に基づいて BBBを通過することができ、内在性 BBB 受容体はインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、または IGF 受容体である。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。いくつかの態様において、第２の受容体媒介BBB輸送系は Fc 受容体系を含む。いくつかの態様において、第１および第２の部分は抗体の部分構造であり、例えば、第２の部分は抗体構造の CH2-CH3 領域を含む。いくつかの態様において、第３の部分は抗体、抗体断片、または ScFv を含む。中枢神経系構成成分と相互作用することができる第３の部分を含有する態様において、中枢神経系構成成分は、脳障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症に関連する病理学的物質であり得る。病理学的物質は、１以上のタンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、またはそれらの組み合わせであってもよい。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、例えば、Aβアミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオンタンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝肝細胞増殖因子(HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質は Aβアミロイドである。
【０００５】
別の側面において、本発明は、第１の部分および第２の部分が抗体の一部であり、第３の部分が ScFv である、(i) 第１の受容体媒介BBB輸送系を介して血液から脳へとBBBを通過することができる第１の部分; それと結合する (ii) 第２の受容体媒介BBB輸送系を介して脳から血液へとBBBを通過することができる第２の部分; および (iii) 中枢神経系構成成分と相互作用することができる第３の部分を含有する組成物を提供する。抗体は、内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、インスリン BBB 受容体媒介輸送系、例えばヒトインスリン受容体媒介輸送系に対するものであり得る。いくつかの態様において、ScFv は AD の Aβアミロイドペプチドに対する ScFv である。
【０００６】
さらなる側面において、本発明は、融合タンパク質を含有する組成物を提供し、ここで、標的化 MAb はヒト インスリン BBB 受容体媒介輸送系に対する抗体であって、抗-Aβ ScFv に連結している。ScFv は、そのアミノ末端を介し、ser-ser リンカーによって抗体重鎖のカルボキシ末端に連結される。抗体は、ヒトへの投与に適合するのに十分なヒト配列を有するキメラ抗体であってもよい。いくつかの態様において、本発明は、重鎖-ScFv 融合タンパク質および共有結合した別個の軽鎖を有する融合 MAb を含有する組成物を提供すし、ここで、軽鎖は配列番号29 のアミノ酸 21-234 に対し少なくとも約 60%、または約 70%、または約 80%、または約 90%、または約 95%、または約 99% 同一、または実質的に 100% 同一であり、重鎖-ScFv 融合は配列番号22 のアミノ酸 20-708 に対し少なくとも約 60%、または約 70%、または約 80%、または約 90%、または約 95%、または約 99% 同一、または実質的に 100% 同一である。
【０００７】
本発明はまた、ヒトBBBインスリン受容体に対するキメラ MAb に共有結合した抗体医薬を含有する組成物も提供する。いくつかの態様において、MAb の重鎖は医薬抗体に共有結合し、融合タンパク質を形成する。抗体医薬は、本明細書に記載するいかなる抗体医薬、すなわち、BBBを横切っての輸送が望まれるいかなる抗体医薬であってもよい。いくつかの態様において、抗体医薬は、脳内の凝集タンパク質、例えば、AD における Aβアミロイドに対する抗体である。 
【０００８】
一つの側面において、本発明は、(i) 血液から脳へとBBBを通過することができる第１の部分; (ii) 中枢神経系構成成分と相互作用することができる第２の部分; および (iii) 脳から血液へとBBBを通過することができる第３の部分を含有する組成物を提供し、ここで、第１、第２および第３の部分は連結しており、第１、第２および第３の部分は同一でなく、共通の構造を共有しない。いくつかの態様において、組成物は非天然組成物である。いくつかの態様において、第１および第３の部分はタンパク質、例えば mAb などの抗体を包含する。いくつかの態様において、第１、第２および第３の部分は共有結合している。いくつかの態様において、第１の部分は、内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、または IGF 受容体媒介輸送系を介して血液から脳へとBBBを通過することができる。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。いくつかの態様において、第２の部分は抗体、抗体断片、または ScFv を包含する。第２の部分が相互作用する中枢神経系構成成分は、脳障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症に関連する病理学的物質を包含し得る。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのもの、例えば、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオンタンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子(HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原などのタンパク質である。いくつかの態様において、タンパク質は Aβ アミロイドである。いくつかの態様において、第３の部分は、受容体媒介BBB輸送系、例えば Fc 受容体系を介して脳から血液へとBBBを通過することができる構造、例えば、抗体構造の CH2-CH3 領域などの抗体構造の部分を包含する。 
【０００９】
別の側面において、本発明は抗原に結合する ScFv を含有する組成物を提供し、ここで (i) ScFv は第１の免疫グロブリン由来であり、(ii) ScFv は第２の免疫グロブリンと結合しており、ここで第２の免疫グロブリンは所望によりネイティブな形態から改変された免疫グロブリンである; さらに (iii) ScFv の抗原に対する親和性は、ScFv が由来する第１の免疫グロブリンの 約 10、 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、または 120% を超える。いくつかの態様において、ScFv は第２の免疫グロブリンに共有結合しており、例えば、そのアミノ末端において第２の免疫グロブリンに対し、またはそのカルボキシ末端において第２の免疫グロブリンに対し共有結合している。ScFv は第２の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のカルボキシ末端、例えば、第２の免疫グロブリンの重鎖のカルボキシ末端に対し結合し得る。ScFv は第２の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のアミノ末端に対しても結合し得る。いくつかの態様において、ScFv は第２の免疫グロブリンの重鎖の CH3 領域に結合している。いくつかの態様において、第２の免疫グロブリンはその重鎖が切断されるよう改変され、ScFv が切断型重鎖のカルボキシ末端に結合している。これらの態様のいくつかにおいて、ScFv は切断型重鎖のカルボキシ末端に結合しており、重鎖はそのカルボキシ末端が CH1、ヒンジ、CH2、および CH3 領域からなる群から選択されるネイティブな重鎖の領域内に位置するように切断されている。いくつかの態様において、ScFv は第２の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のアミノ末端に結合している。いくつかの態様において、ScFv は脳内に存在する病理学的物質に対する抗体に由来し、ここで、病理学的物質は脳障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症と関連する。病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのもの、例えば、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオンタンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝肝細胞増殖因子(HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原などのタンパク質であり得る。
【００１０】
ScFv 抗体医薬品(例えば、AD の Aβペプチドに対する ScFv)の場合、ScFv はそのカルボキシ末端またはアミノ末端により、標的化抗体の軽鎖(LC)または重鎖(HC)のカルボキシ末端またはアミノ末端に共有結合し得る。あらゆる適当な結合、例えば、軽鎖のカルボキシ末端と ScFv のアミノ末端、重鎖のカルボキシ末端と ScFv のアミノ末端、軽鎖のアミノ末端と ScFv のカルボキシ末端、重鎖のアミノ末端と ScFv のカルボキシ末端、軽鎖のカルボキシ末端と ScFv のカルボキシ末端、重鎖のカルボキシ末端と ScFv のカルボキシ末端、軽鎖のアミノ末端と ScFv のアミノ末端、または重鎖のアミノ末端と ScFv のアミノ末端の結合を用い得る。いくつかの態様において、結合は HC のカルボキシ末端から ScFv のアミノ末端に対するものであり、ここで ScFv の VH は VL の前に位置する。他の態様に置いて、ScFv の VL は VH の前に位置してもよい。末端のアミノ酸間の結合は必須ではなく、本発明の要求を満たすあらゆる結合を用い得ることは評価される; ペプチドの非末端アミノ酸間のそのような結合は当業者によって容易になされる。
【００１１】
いくつかの態様において、本発明は AD の Aβアミロイドペプチドに対する ScFv を利用する。驚くべき事に、ScFv のこれらの形の融合タンパク質は、通常のまたは通常よりもさらに卓越した輸送および活性を保持することが見出された。抗体融合タンパク質の Aβアミロイドペプチドに対する親和性が、元の 150 kDa のマウス MAb の Aβアミロイドペプチドに対する親和性と同じであるのは驚くべきことである、というのも、融合タンパク質は Aβアミロイドペプチドに対する元のマウス MAb に由来する ScFv で構成されているからである。一般的に、ScFv の標的抗原に対する親和性および/または結合力は、元の MAb に比べて低下している。標的抗原に対する高い結合力は、インタクトな 150 kDa MAb と抗原の間の二価の相互作用に由来する。対照的に、ScFv と抗原の相互作用は一価である。加えて、ScFv が別の抗体に融合されると、ScFv の標的抗原に対する親和性は低下することが一般に認められる。しかしながら、図 26 に示される融合抗体の設計においては、抗原と ScFv の間の二価の相互作用が回復される。当該新規な遺伝子改変抗体融合タンパク質の産生によって、(i) 高い親和性で HIR に結合し、BBB を横切って血液から脳への流入を引き起こす、(ii) 高い親和性で FcR に結合し、BBBを横切って脳から血液への流出を引き起こす、そして (iii) 高い親和性で AD の Aβアミロイドペプチドに結合し、アミロイドプラークの脱凝集を引き起こす、という三つの機能を持つ（tri-functional）分子が作り出される。
【００１２】
別の側面において、本発明はさらに、BBB をどちらの方向にも通過することができる構造を含有し、中枢神経系(CNS)において活性な抗体医薬に共有結合した融合タンパク質を提供し、ここで、血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系において活性な抗体医薬は、別々の実体としてのそれらの活性と比較して、平均で少なくとも約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、または 120% の活性を各々が保持している。いくつかの態様において、本発明は、BBB を通過することができる構造を含有し、中枢神経系(CNS)において活性な抗体医薬に共有結合した融合タンパク質を提供し、ここで、血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系において活性な抗体医薬は、別々の実体としてのそれらの活性と比較して、平均で少なくとも約 50% の活性を各々が保持している。いくつかの態様において、本発明は、BBB を通過することができる構造を含有し、中枢神経系(CNS)において活性な抗体医薬に共有結合した融合タンパク質を提供し、ここで、血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系において活性な抗体医薬は、別々の実体としてのそれらの活性と比較して、平均で少なくとも約 60% の活性を各々が保持している。いくつかの態様において、本発明は、BBB を通過することができる構造を含有し、中枢神経系(CNS)において活性な抗体医薬に共有結合した融合タンパク質を提供し、ここで、血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系において活性な抗体医薬は、別々の実体としてのそれらの活性と比較して、平均で少なくとも約 70% の活性を各々が保持している。いくつかの態様において、本発明は、BBB を通過することができる構造を含有し、中枢神経系(CNS)において活性な抗体医薬に共有結合した融合タンパク質を提供し、ここで、血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系において活性な抗体医薬は、別々の実体としてのそれらの活性と比較して、平均で少なくとも約 80% の活性を各々が保持している。いくつかの態様において、本発明は、BBB を通過することができる構造を含有し、中枢神経系(CNS)において活性な抗体医薬に共有結合した融合タンパク質を提供し、ここで、血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系において活性な抗体医薬は、別々の実体としてのそれらの活性と比較して、平均で少なくとも約 90% の活性を各々が保持している。いくつかの態様において、血液脳関門を通過することができる構造は、別々の実体としてのその活性と比較して、少なくとも約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、または 100% の活性を保持しており、中枢神経系において活性な抗体医薬は、別々の実体としてのその活性と比較して、少なくとも約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、または 100% の活性を保持している。
【００１３】
別の側面において、本発明は、BBB を横切って脳から血液へと抗体構造を輸送することが出来る部分を含む非天然組成物を提供する。いくつかの態様において、輸送は BBB FcR を介する。いくつかの態様において、抗体構造は治療用または診断用の抗体構造、例えば病理学的物質と相互作用する治療用または診断用の抗体構造であり、ここで、病理学的物質は脳障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症に関連する。病理学的物質は１以上のタンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、またはそれらの組み合わせであってもよい。いくつかの態様において、病理学的物質はタンパク質、例えば、Aβアミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオンタンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子(HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質は Aβアミロイドである。抗体構造は一本鎖 Fv 抗体(ScFv)であってもよい。治療用抗体構造または診断用抗体構造は、血液脳関門(BBB)を通過することができる構造に連結し得る。BBB を横切って脳から血液へと抗体構造を輸送することが出来る部分は、Fc 受容体と相互作用し得る。
【００１４】
組成物はさらに、血液から脳へとBBBを通過することができる部分、例えば、内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、または IGF 受容体媒介輸送系上で BBB を通過することができる部分を含有し得る。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。
【００１５】
さらに別の側面において、本発明は ScFv を含有する組成物を提供し、ここで、ScFv の VH 領域は配列番号12 と少なくとも 80、90、95、または 99% 同一の配列を含む。いくつかの態様において、ScFv の VL 領域は配列番号14 と少なくとも 80、90、95、または 99% 同一の配列を含有する。ScFv は Ab、例えば、MAb に連結し得る。Ab または MAb は内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、または IGF 受容体媒介輸送系に対するものである。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。結合は共有結合であってもよい。いくつかの態様において、ScFv は Ab または MAb の軽鎖のカルボキシ末端に連結される。いくつかの態様において、ScFv は そのアミノ末端を介して Ab または MAb の軽鎖のカルボキシ末端に連結される。いくつかの態様において、ScFv はそのカルボキシ末端を介して Ab または MAb の軽鎖のカルボキシ末端に連結される。いくつかの態様において、ScFv は Ab または MAb の 重鎖のカルボキシ末端に連結される。いくつかの態様において、ScFv はそのアミノ末端を介して Ab または MAb の重鎖のカルボキシ末端に連結される。いくつかの態様において、ScFv は そのカルボキシ末端を介して Ab または MAb の重鎖のカルボキシ末端に連結される。
【００１６】
別の側面において、本発明は、ScFv を含有する組成物を提供し、ここで、ScFv の VH 領域は、(i) 配列番号12 のアミノ酸26-35の配列と少なくとも約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の CDR1 配列; (ii) 配列番号12 のアミノ酸50-66の配列と少なくとも約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の CDR2 配列; および (iii) 配列番号12 のアミノ酸99-103の配列と少なくとも約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の CDR3 配列 を含有する。
【００１７】
別の側面において、本発明は ScFv を含有する組成物を提供し、ここで、ScFv の VL 領域は (i) 配列番号14のアミノ酸24-39の配列と少なくとも約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の CDR1 配列; (ii) 配列番号14のアミノ酸55-61の配列と少なくとも約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の CDR2 配列; および (iii) 配列番号14のアミノ酸94-102の配列と少なくとも約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の CDR3 配列 を含有する 。
【００１８】
別の側面において、本発明は治療用抗体構造または診断用抗体構造を含有する組成物を提供し、ここで、組成物は、脳内において、末梢投与の後、少なくとも約 20、30、40、50、60、70、80、80、90、または 100 uL/グラム脳 の神経治療用抗体構造または診断用抗体構造の平均分布容積を達成することができる。いくつかの態様において、治療用抗体構造または診断用抗体構造は、脳内に存在する病理学的物質に結合することができ、ここで、病理学的物質は、脳障害、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症に関連する。いくつかの態様において、病理学的物質はタンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、病理学的物質はタンパク質、例えば Aβアミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオンタンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子(HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質は Aβアミロイドである。いくつかの態様において、治療用抗体構造は一本鎖 Fv 抗体(ScFv)である。いくつかの態様において、治療用抗体構造または診断用抗体構造は、血液脳関門(BBB)を通過することができる構造、例えば、内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、または IGF 受容体媒介輸送系上で BBB を通過することができる構造に(例えば、共有結合により)連結している。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系は、インスリン BBB 受容体媒介輸送系である。いくつかの態様において、BBB を通過することができる構造は、血液から脳へ、および脳から血液へ BBB を通過することができる。これらの態様のいくつかにおいて、BBB を通過することができる構造は、第１の受容体媒介輸送系を介して血液から脳へ、そして第２の受容体媒介輸送系を介して脳から血液へ、BBB を通過することができる。第１の受容体媒介輸送系は、例えば、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、または IGF 受容体であってもよい。いくつかの態様において、第１の受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。いくつかの態様において、第２の受容体媒介輸送系は Fc-受容体媒介輸送系である。BBB を通過することができる構造は、抗体、例えば、本明細書において記載される mAb であってもよい。
【００１９】
いくつかの態様において、本発明は、血液脳関門(BBB)を通過することができる構造に共有結合した抗体医薬品を含有する組成物を提供し、ここで組成物は、末梢投与の後、脳内における抗体医薬の分布容積を平均で約 20、30、40、50、60、70、80、80、90、または 100 uL/グラム脳 よりも大きく増大させ得る。本発明はまた、ヒトBBBインスリン受容体に対するキメラ MAb に共有結合した抗体医薬を含有する組成物も提供する。本発明はさらに、BBB を通過することができる構造を含有し、中枢神経系(CNS)において活性な抗体医薬に共有結合した融合タンパク質を提供し、ここで、血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系において活性な抗体医薬は、別々の実体としてのその活性と比較して、平均で少なくとも 約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、100、110、または 120% の活性を各々が保持している。本発明はまた、１以上の本発明の組成物および医薬上許容される賦形剤を含有する医薬組成物も提供する。
【００２０】
いくつかの態様において、本発明は、血液脳関門(BBB)を通過することができる構造に共有結合した抗体医薬品を含有する組成物を提供し、ここで組成物は、末梢投与の後、脳内における抗体医薬品の分布容積を平均で少なくとも 約 20、30、40、50、60、70、80、80、90、または 100 uL/グラム脳 上昇させ得る。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明は、BBB を通過することができる構造に共有結合した抗体医薬品を含有する組成物を提供し、ここで、組成物は、末梢投与の後、脳内における抗体医薬の分布容積を平均で 20、30、40、50、60、70、80、80、90、または 100 uL/グラム脳 増大させ得、抗体医薬品は凝集したタンパク質に対する ScFv であり、BBB を通過することができる構造は、内在性 BBB 受容体媒介輸送系に対する標的化 MAb である。標的化抗体はグリコシル化または非グリコシル化であってもよい; いくつかの態様において、例えば、CHO 細胞における合成によって産生されるグリコシル化パターンにおいて、抗体はグリコシル化されている。特定の態様において、抗体医薬は抗-Aβ ScFv である。標的化 MAb は、インスリン BBB 受容体媒介輸送系に対する抗体、例えば、キメラ MAb であってもよい。標的化抗体は、ヒトへの投与に適合するのに十分なヒト配列を有するキメラ抗体であってもよい。いくつかの態様において、インスリン受容体はヒト インスリン受容体であり、抗体医薬は ScFv である。いくつかの態様において、ScFv は 配列番号16 のアミノ酸1-244 の配列と少なくとも約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の配列を含有する。ScFv は、末端間のリンカー、例えば、２つのアミノ酸リンカー ser-ser を任意に伴い、そのアミノ末端において、標的化 MAb の重鎖のカルボキシ末端に対し共有結合し得る。いくつかの態様において、標的化 MAb の重鎖は、配列番号28 のアミノ酸20-462 と少なくとも約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の配列を含有する。いくつかの態様において、標的化 MAb の重鎖は、それぞれ配列番号28 のアミノ酸 45-54、69-85、および 118-121 の配列と少なくとも約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一である CDR1、CDR2、CDR3 配列を有する VH ドメインを含有する。いくつかの態様において、標的化 MAb の重鎖は、それぞれ配列番号28 のアミノ酸20-44、55-68、86-117、122-132 の配列と少なくとも約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一である FR1、FR2、FR3、FR4 配列を有する VH ドメインを含有する。いくつかの態様において、標的化 MAb の軽鎖は 配列番号29 のアミノ酸21-234 と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の配列を含有する。いくつかの態様において、標的化 MAb の軽鎖は、それぞれ配列番号29 のアミノ酸 44-54、70-76、および 109-117 の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一である CDR1、CDR2、CDR3 配列と共に VL ドメインを含有する。いくつかの態様において、標的化 MAb の軽鎖は それぞれ配列番号29 のアミノ酸21-43、55-69、77-108、118-128 の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一である FR1、FR2、FR3、FR4 配列を有する VL ドメインを含有する。
【００２２】
さらに別の側面において、本発明は (i) 血液から脳へと BBB を通過することができ; かつ (ii) 脳から血液へと BBB を通過することができる、約 1000 ダルトンより大きな分子量の組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物はさらに脳内の物質、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症などの脳障害に関連する病理学的物質と相互作用し得る。病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、およびそれらの組合せからなる群より選択されるタイプであり得る。いくつかの態様において、病理学的物質はタンパク質、例えば Aβアミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオンタンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子(HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質は Aβアミロイドである。
【００２３】
別の側面において、本発明は、本発明のタンパク質またはペプチドをコードする核酸を提供する。特定の態様において、本発明は、第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードし、第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードする第２の配列に作動可能に連結した第１の配列を含有する単一の核酸配列を提供し、ここで、第１の配列が、軽鎖に共有結合した ScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来の ScFv をさらにコードするか、あるいは第２の配列が、重鎖に共有結合した ScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来の ScFv をさらにコードする。第１の免疫グロブリンは、内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、または IGF 受容体媒介輸送系に対するものであり得る。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。ScFv は、脳内に存在する病理学的物質に対するものであり得、ここで、病理学的物質は脳障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症に関連する。病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの態様において、病理学的物質はタンパク質、例えば、Aβアミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオンタンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子(HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、病理タンパク質は Aβアミロイドである。いくつかの態様において、ScFv の VH 領域は、配列番号12 と少なくとも 約 80、90、95、または 99% 同一の配列を含有する。いくつかの態様において、ScFv の VL 領域は、配列番号14 と少なくとも 80、90、95、または 99% 同一の配列を含有する。
【００２４】
本発明はさらに、第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードし、第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードする第２の配列に作動可能に連結した第１の配列を含有する単一の核酸配列を含有するベクターを提供し、ここで、第１の配列が、軽鎖に共有結合した ScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来の ScFv をさらにコードするか、あるいは第２の配列が、重鎖に共有結合した ScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来の ScFv をさらにコードする。
【００２５】
本発明はさらに、第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードし、第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードする第２の配列に作動可能に連結した第１の配列を含有する単一の核酸配列を含有するベクターを含有する細胞を提供し、ここで、第１の配列が、軽鎖に共有結合した ScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来の ScFv をさらにコードするか、あるいは第２の配列が、重鎖に共有結合した ScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来の ScFv をさらにコードする。いくつかの態様において、細胞は真核細胞である。いくつかの態様において、細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明は特定のヌクレオチド配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の核酸配列を提供する。例えば、いくつかの態様において、本発明は、第１の免疫グロブリンの軽鎖のいくらかまたは全てをコードし、第１の免疫グロブリンの重鎖のいくらかまたは全てをコードする第２の配列に作動可能に連結した第１の配列を含有する単一の核酸配列を提供し、ここで、第１の配列が、軽鎖に共有結合した ScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来の ScFv をさらにコードするか、あるいは第２の配列が、重鎖に共有結合した ScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来の ScFv をさらにコードし、ここで、ScFv の VH 領域は少なくとも以下の１、２、または３を含有する: (i) 配列番号12 のアミノ酸26-35 の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の CDR1 配列; (ii) 配列番号12 のアミノ酸50-66 の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の CDR2 配列; および (iii) 配列番号12 のアミノ酸99-103 の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の CDR3 配列。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明は、第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードし、第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードする第２の配列に作動可能に連結した第１の配列を含有する単一の核酸配列を提供し、ここで、第１の配列が、軽鎖に共有結合した ScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来の ScFv をさらにコードするか、あるいは第２の配列が、重鎖に共有結合した ScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来の ScFv をさらにコードし、ここで、ScFv の VL 領域は少なくとも以下の１、２、または３を含有する:
【００２８】
(i) 配列番号14 のアミノ酸24-39 の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の CDR1 配列; (ii) 配列番号14 のアミノ酸55-61 の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の CDR2 配列; および (iii) 配列番号14 のアミノ酸94-102 の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の CDR3 配列。 
【００２９】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号19 のヌクレオチド58-2127 と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の第１の配列および配列番号27 のヌクレオチド801-1442 と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または 100% 同一の第２の配列を含有する核酸を提供する。
【００３０】
いくつかの態様において、本発明は、ひとつのタンデム発現ベクターを真核細胞に永久に導入すること(例えば、組み込むこと)によって免疫グロブリン融合タンパク質を製造する方法を提供し、ここで、融合タンパク質は抗体構造に融合した免疫グロブリン重鎖または抗体構造に融合した免疫グロブリン軽鎖を含み、融合タンパク質に対応する遺伝子および、免疫グロブリン軽鎖に対応する遺伝子または免疫グロブリン重鎖に対応する遺伝子を含む他の遺伝子は、１片のDNA中に組み込まれる。融合タンパク質は、抗体構造に融合した免疫グロブリン重鎖を含有し得、ここで、融合タンパク質に対応する遺伝子および免疫グロブリン軽鎖に対応する遺伝子の両方が１片のDNA中に組み込まれる。融合タンパク質は、治療剤に融合した免疫グロブリン軽鎖を含有し得、ここで、融合タンパク質に対応する遺伝子および免疫グロブリン重鎖に対応する遺伝子の両方が１片のDNA中に組み込まれる。いくつかの態様において、永久的な導入はタンデムベクターを含有する複製性エピソーム性遺伝因子を真核細胞に導入することによって達成される。いくつかの態様において、抗体構造は ScFv である。該方法はさらに、選択マーカーに対応する１以上の遺伝子を該１片のDNA中に組み込むことを包含し得る。該方法はさらに、１以上の増幅遺伝子を該１片のDNA中に組み込むことを包含し得る。免疫グロブリンは IgG であってもよい。免疫グロブリンは MAb であってもよい。いくつかの態様において、ScFv は脳障害に関連する病理学的物質に対するものである。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものである。いくつかの態様において、病理学的物質はタンパク質である。該方法はさらに、免疫グロブリン融合タンパク質を発現させることを包含し得る。該方法はさらに、免疫グロブリン融合タンパク質を精製することを包含し得る。
【００３１】
別の側面において、本発明は、障害に罹患している個体に対し、BBB を 血液から脳へと通過することができる第１の構造、障害に関連する病理学的物質と相互作用することができる第２の構造、および、所望により、BBB を脳から血液へと通過することができる第３の構造、を含有する組成物を有効量投与することによって CNS 障害を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、第１および第３の構造(もし第３の構造が存在すれば)は抗体、例えば、本明細書において記載される内在性 BBB 受容体媒介輸送系に対する抗体を含む。いくつかの態様において、第２の構造は本明細書において記載される ScFv を含む。ScFv は障害に関連する病理学的物質に対するものであり得る。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものである。いくつかの態様において、病理学的物質はタンパク質、例えば、Aβアミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオンタンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子(HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質は Aβアミロイドである。投与方法は、末梢循環に薬剤を導入するあらゆる適切な方法、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、直腸内、経頬、鼻腔内、経皮、または吸入であり得る。いくつかの態様において、投与は静脈内、筋肉内、または皮下投与である。いくつかの態様において、CNS 障害は凝集体 CNS 障害である。いくつかの態様において、CNS 障害はアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症である。いくつかの態様において、CNS 障害はアルツハイマー病である。個体は動物、例えば、哺乳動物であり得る。いくつかの態様において、個体はヒトである。いくつかの態様において、個体は約 1 から 約 100 mg の用量の組成物を投与される。
【００３２】
別の側面において、本発明は、個体の体液中の組成物のレベルを測定することによって CNS 障害の診断、予後、または処置の評価をする方法を提供し、ここで、組成物は BBB を血液から脳へと通過することができ、脳障害に関連する病理学的物質と相互作用することができ、BBB を脳から血液へと通過することができ、ここで、組成物は個体に投与され、病理学的物質と相互作用したものである。いくつかの態様において、脳障害はアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症である。いくつかの態様において、脳障害はアルツハイマー病である。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるタイプのものである。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、例えば、Aβアミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオンタンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子(HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質は Aβアミロイドである。該方法はさらに、組成物を個体に投与することを包含し得る。組成物は抗体を包含し得、ScFv をも含有し得る。いくつかの態様において、体液は血液、血清、または血漿である。体液においてマーカーを測定する方法は周知であり、例えば、サンドウィッチに基づく ELISA を用い得る。
【００３３】
いくつかの態様において、本発明は、ある個体の CNS において組成物により放射されたシグナルを検出することによって脳障害の診断、予後、または処置の評価をする方法を提供し、ここで、組成物は BBB を血液から脳へと通過することができ、脳障害に関連する病理学的物質と相互作用することができる抗体を含有する。いくつかの態様において、該方法はさらに、組成物を個体に投与することを含有する。組成物は、シグナルを放射するよう、例えば、陽電子を放射するよう、放射性シグナルを与えるよう、または磁気シグナルを与えるよう構築され得る。いくつかの態様において、組成物は放射性医薬または磁性医薬である。いくつかの態様において、組成物はシグナルを放射する物質でラベルされる。いくつかの態様において、シグナルを放射する物質は陽電子放射体、放射性核種、および磁性物質からなる群から選択される。いくつかの態様において、シグナルを放射する物質は陽電子放射体である。いくつかの態様において、シグナルを放射する物質は放射性核種である。いくつかの態様において、脳障害はアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、および多発性硬化症からなる群から選択される。いくつかの態様において、脳障害はアルツハイマー病である。病理学的物質はタンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものであり得る。いくつかの態様において、病理学的物質はタンパク質、例えば、Aβアミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrP プリオンタンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子(HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質は Aβアミロイドである。いくつかの態様において、抗体は ScFv を含む。
【００３４】
引用による包含
本明細書において言及される全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物および特許出願が各々参照により具体的かつ個別に援用されることが示されたのと同様に、引用により同程度に本明細書に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
図面の簡単な説明
本発明の新規な特徴は、添付の請求項において詳細に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される実施態様を示す以下の詳細な説明およびその添付図面を参照することにより達成されるであろう:
【００３６】
【図１Ａ】ADの Aβペプチドに対する一本鎖Fv(ScFv)抗体をコードする原核生物発現ベクターの遺伝子操作を示す図表。ScFv は Aβに対するマウスの(m)抗体に由来し、mAβScFv と名付けられる。ScFv は、Aβペプチドに対するマウスの MAb に由来する重鎖の可変領域(VH)および軽鎖の可変領域(VL)で構成される。VH および VL はリンカーにより連結されて ScFv を形成する。VH cDNA をコードする遺伝子は、抗-Aβ抗体を分泌するマウスのハイブリドーマより単離された RNA から、マウスの VH アイソタイプに特異的なオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により産生される; PCR に続き、VH 遺伝子は T4 リガーゼを用いて pPC プラスミドに連結される。VL cDNA をコードする遺伝子は、抗-Aβ抗体を分泌するマウスのハイブリドーマより単離された RNA から、マウスの VL アイソタイプに特異的な ODN プライマーを用いる PCR により産生される; PCR に続き、VL 遺伝子は T4 リガーゼを用いて pPC プラスミドに連結される。
【図１Ｂ】IgG シグナルペプチドおよび Kozak 部位と共に mAβScFv cDNA をコードする真核生物発現プラスミドの遺伝子操作を示す図表。真核生物発現プラスミドは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびポリA(pA)転写終結配列を含有する。
【図２】キメラ HIRMAb(HC-1)の重鎖(HC)をコードする cDNA の 3’-末端に、その 5’-末端で融合される mAβScFv cDNA をコードする真核生物発現プラスミドの遺伝子操作を示す図表。Amp=アンピシリン耐性遺伝子; G418=ネオマイシン耐性遺伝子; ori=SV40 複製開始点; CMV=サイトメガロウイルスプロモーター; pA=ポリ A 転写終結配列。
【図３】融合抗体をコードする融合遺伝子の構築における中間体である、多様なコンストラクトおよび PCR 増幅された cDNA のサイズを示すエチジウムブロマイド染色のアガロースゲル、ここで、mAβScFv はそのアミノ末端で キメラ HIRMAb の重鎖のカルボキシル末端に融合している。(A) レーン 1 および 2、それぞれ、PCR 増幅された 0.4 kb mAβScFv VH cDNA および PCR 増幅された 0.4 kb mAβScFv VL cDNA。ポリA+ RNA は、抗-AβMAb を発現するマウスのハイブリドーマから単離され、表 2 に示す VH および VL 特異的 ODN プライマーを用いて逆転写および PCR 増幅された。レーン 3、1.4-0.1 kb の範囲の分子量(MW)サイズ標準。レーン 4、 23-2.0 kb の範囲の MW サイズ標準。(B)レーン 1、抗-AβMAb の VH に相当する 〜0.4 kb の期待されたバンドサイズ、および骨格ベクター(〜3.0 kb)を示す pPC-mAβ-VH の NcoI および HindIII 消化。レーン 2、ベクター骨格に相当する 〜3.5 kb の期待されたバンドサイズ、および xVH(〜0.4 kb)を示す pAP-xScFv クローニングベクターの NcoI および HindIII 消化、ここで、xVH は、元の pAP-xScFv プラスミドに含有されている関係のない ScFv の VH である(図 1A)。レーン 3 および 4 は、パネル A に示されたものと同一の MW サイズ標準である。(C) レーン 1、抗-AβMAb の VL に相当する 〜0.4 kb の期待されたバンドサイズ、および骨格ベクター(〜3.0 kb)を示す pPC-mAβ-VL の MluI および NotI 消化。レーン 2、プラスミド骨格に相当する〜3.5 kb の期待されたバンドサイズ、および xVL(〜0.4 kb)を示す p-mAβ-VH の MluI および NotI 消化、ここで xVL は、元の pAP-xScFv プラスミドに含有されている関係のない ScFv の VL である。レーン 3 および 4 は、パネル A に示されたものと同一の MW サイズ標準である。(D) レーン 1、直鎖状骨格ベクターに相当する〜5.4 kb の期待されたバンドサイズを示す、真核生物発現プラスミド pCD の XhoI-EcoRI 消化(全部で 2 レーン)。レーン 2、〜0.8 kb の期待されたバンドサイズおよび、より小さい MW サイズおよびより大きい MW サイズの主要でないバンドを示す、PCR 産生 mAβScFv cDNA の XhoI-EcoRI 消化(全部で 3 レーン)。レーン 3 および 4 は、パネル A に示されたのと同一の MW サイズ標準である。(E) レーン 1、HIRMAb-mAβScFv 融合抗体タンデム発現ベクターの操作において用いるための mAβScFv cDNA に相当する 〜0.8 kb の期待された単一のバンドを示す PCR 産物。レーン 2 および 3 は、パネル A に示されたのと同一の MW サイズ標準である。(F) それぞれ、6.5、3.6、0.5 および 0.4 kb の期待されたバンドを示す、HIRMAb-mAβScFv 融合抗体タンデムベクターの HindIII 消化 エンドヌクレアーゼマッピング。レーン 2 および 3 は、パネル A に示されたのと同一の MW サイズ標準である。
【図４】抗-AβMAb を分泌するマウスのハイブリドーマから PCR によって生成されたマウス 抗-AβMAb の VH のヌクレオチド配列(配列番号11)。配列は pPC-mAβ-VH プラスミド(図 1A) の DNA シークエンシングによって決定された。
【図５】抗-AβMAb を分泌するマウスのハイブリドーマから PCR によって生成されたマウス抗-AβMAb の VH のアミノ酸配列(配列番号12)。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号11)から推定される。下線が引かれたアミノ酸は、マウスのハイブリドーマから単離された抗-AβMAb の重鎖から得られたトリプシンペプチドのアミノ酸配列と一致した。抗-AβMAb 重鎖 VH の CDR1、CDR2、および CDR3 のアミノ酸配列は太字フォントで表されている。
【図６】抗-AβMAb を分泌するマウスのハイブリドーマから PCR によって生成されたマウス 抗-AβMAb の VL のヌクレオチド配列(配列番号13)。配列は、pPC-mAβ-VL プラスミド(図 1A)の DNA シークエンシングによって決定された。
【図７】抗-AβMAb を分泌するマウスのハイブリドーマから PCR によって生成されたマウス 抗-AβMAbの VH のアミノ酸配列(配列番号14)。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号13)から推定される。マウスのハイブリドーマに由来する抗-AβMAb の軽鎖の位置 2 においてバリン(V)残基が観察されたことを除き、推定配列のアミノ末端にある 11 アミノ酸は、ハイブリドーマが生成したマウス抗-AβMAb の軽鎖の直接アミノ酸シークエンシングを用いて観察されたアミノ酸と一致した。抗-AβMAb 軽鎖 VL の CDR1、CDR2、および CDR3 のアミノ酸配列は太字フォントで表されている。
【図８】原核生物発現プラスミドによりコードされる 抗-AβScFv cDNAのヌクレオチド配列(配列番号15)。配列は、pPC-mAβScFv プラスミド(図 1A)の DNA シークエンシングによって決定された。
【図９】原核生物発現プラスミドによりコードされ、カルボキシル末端にポリ-ヒスチジン(H)テールおよび 9E10 エピトープ(EQKLISEEDL)を包含する、抗-AβScFv cDNA のアミノ酸配列(配列番号16)。配列は、pPC-mAβScFv プラスミドの DNA シークエンシングによって決定された(図 1A)。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号15)から推定される。VH と VL を隔てる 17-アミノ酸のリンカーは下線が引かれている。
【図１０】真核生物発現プラスミドによりコードされる抗-Aβ ScFv cDNA のヌクレオチド配列(配列番号17)。配列は、pCD-mAβScFv プラスミド(図 1B)の DNA シークエンシングにより決定された。
【図１１】真核生物発現プラスミドによりコードされる抗-Aβ ScFv cDNA のアミノ酸配列(配列番号18)。カルボキシル末端におけるポリ-ヒスチジン(H)テールは除去されている。mAβScFv は 19-アミノ酸の IgG シグナルペプチドの下流にあり、シグナルペプチド配列には下線が引かれている。アミノ酸配列はヌクレオチド配列(配列番号17)から推定される。
【図１２】キメラ HIRMAb 重鎖をコードする cDNA の 3’-末端に融合した抗-Aβ ScFv cDNA で構成され、真核生物発現プラスミドによりコードされる融合遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号19)。配列は、pCD-HC-mAβScFv プラスミド(図 2)の DNA シークエンシングによって決定された。
【図１３】HC-mAβScFv 融合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号20)、ここで、抗-AβScFv は キメラ HIRMAb 重鎖(HC)のカルボキシル末端に S-S リンカーを介して結合しており、S=セリンである。HC-mAβScFv 融合タンパク質は、19-アミノ酸の IgG シグナルペプチドの下流にあり、シグナルペプチド配列には下線が引かれている。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号19)から推定される。
【図１４】キメラ HIRMAb 重鎖をコードする cDNA の 3’-末端に融合した抗-AβScFv cDNA で構成され、真核生物発現プラスミド、pCD-HC-mAβScFvプラスミド(図 2)によりコードされる、部位特異的変異誘発をされた融合遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号21)。位置 1789 における‘A’ヌクレオチドは‘G’ヌクレオチドへと変異させられている; 該部位は図中で下線が引かれている。図 15 に示される通り、当該ヌクレオチド配列の変化によって、mAbScFv の VL の第１のフレームワーク領域における I2V アミノ酸変化が生じる。
【図１５】部位特異的変異誘発をされた HC-mAβScFv 融合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号22)。mAβScFv の VL の PCR 増幅により、VL の第１のフレームワーク領域の 2 の位置においてイソロイシン(I)をコードする cDNA が産生された; 変異誘発されたヌクレオチドは図中で下線が引かれている。しかし、マウス抗-AβMAb のアミノ末端の直接アミノ酸配列解析から、当該位置においてバリン(V)が示された。当該部位におけるイソロイシン残基は部位特異的変異誘発によってバリンに変化した、そして当該変化を I2V と称する。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号21)から推定される。
【図１６】キメラ HIRMAb 重鎖 をコードする cDNA の 3’-末端に融合した抗-AβScFv cDNA で構成され、真核生物発現プラスミド、pCD-HC-mAβScFv プラスミド(図 2)にコードされる、部位特異的変異誘発をされた融合遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号23)。位置 1546-1547において‘AA’ヌクレオチドは‘GC’ヌクレオチドへと変異誘発された; 当該部位は図中で下線が引かれている。図 17 において示される通り、当該ヌクレオチド配列の変化によって、mAbScFvのVH の第２の相補性決定領域(CDR)における N497A アミノ酸変化が生じる。
【図１７】部位特異的変異誘発をされた HC-mAβScFv 融合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号24)。予測される N-結合グリコシル化部位は、抗-AβMAb の VH の CDR2 の中に見つかった; 変異誘発部位は図中で下線が引かれている。位置 497 におけるアスパラギン(N)残基がアラニン(A)残基に変化し、そして当該変化を N497A と称する。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号23)から推定される。
【図１８】キメラ HIRMAb 重鎖 をコードする cDNA の 3’-末端に融合した抗-AβScFv cDNAで構成され、真核生物発現プラスミド、pCD-HC-mAβScFv プラスミド(図 2)によってコードされる、部位特異的変異誘発をされた融合遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号25)。位置 1552-1553 において‘AG’ヌクレオチドは‘GC’ヌクレオチドへと変異誘発された; 当該部位は図中で下線が引かれている。図 19 に示される通り、当該ヌクレオチド配列の変化によって、mAbScFv の VH の第２の CDR における S499A アミノ酸変化が生じる。
【図１９】部位特異的変異誘発をされた HC-mAβScFv 融合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号26)。予測される N-結合グリコシル化部位は、抗-AβMAb の VH の CDR2 の中に見つかった; 変異誘発部位は図中で下線が引かれている。位置 499 におけるセリン(S)残基がアラニン(A)残基に変化し、そして当該変化を S499A と称する。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号25)から推定される。
【図２０】キメラ HIRMAb 軽鎖(LC)および融合タンパク質重鎖(HC)で構成されるインタクトな抗体融合タンパク質をコードするタンデムベクターのヌクレオチド配列(配列番号27)、ここで、mAβScFv はキメラ HIRMAb 重鎖に融合していた。タンデムベクターはマウス ジヒドロ葉酸還元酵素、(DHFR)をコードする。タンデムベクターの個々の発現カセットは 図 24 に示されている。5’-末端から 3’-末端へ、LC 遺伝子、HC 融合遺伝子、および DHFR 遺伝子がタンデムベクター上の３つの分離した発現カセットに含有されている; そして、これら３つの発現カセット各々のオープンリーディングフレームは図中で下線が引かれている。
【図２１】キメラ HIRMAb 重鎖が後に続き、Ab ScFv がさらに後に続く、IgG シグナルペプチドのアミノ酸配列(配列番号28)。アミノ酸配列は、図 20 のヌクレオチド配列から推定される。抗-HIRMAb 重鎖 VH の CDR1、CDR2、および CDR3 のアミノ酸配列は太字フォントで表されている。定常領域のグリコシル化部位、NST、は下線が引かれている。
【図２２】タンデムベクターにコードされる軽鎖のアミノ酸配列(配列番号29)。アミノ酸配列は図 20 のヌクレオチド配列から推定される。抗-HIRMAb 軽鎖 VL の CDR1、CDR2、および CDR3 のアミノ酸配列は太字フォントで表されている。
【図２３】タンデムベクターにコードされる DHFR のアミノ酸配列(配列番号30)。アミノ酸配列は、図 20 のヌクレオチド配列から推定される。
【図２４】抗体融合タンパク質タンデムベクターの遺伝子操作。mAβScFv をコードする cDNA は、配列番号33を生成する pCD-HC-mAβScFv-I2V プラスミドから PCR によって産生され、タンデムベクター前駆体の HpaI 部位に連結される。タンデムベクターは 図 26 に示される抗体融合タンパク質をコードする。CMV=サイトメガロウイルス; HIR-LC=抗-ヒトインスリン受容体(HIR)MAbの軽鎖(LC); HIR-HC=抗-HIRMAbの重鎖(HC); pA=ポリ A 転写終結配列 SV40=SV40プロモーター; DHFR=ジヒドロ葉酸還元酵素。
【図２５】融合抗体重鎖の 28 のドメインのアミノ酸配列: (1) シグナルペプチド、(2) キメラ HIRMAb の重鎖(HC)のフレームワーク領域(FR)1、(3) キメラ HIRMAb の HC の相補性決定領域(CDR)1、(4) キメラ HIRMAb の HC の FR2、(5) キメラ HIRMAb の HC の CDR2、(6) キメラ HIRMAb の HC の FR3、(7) キメラ HIRMAb の HC の CDR3、(8) キメラ HIRMAb の HC の FR4、(9) キメラ HIRMAb の HC の CH1 領域、(10) キメラ HIRMAb の HC のヒンジ領域、(11) キメラ HIRMAb の HC の CH2 領域; 定常領域グリコシル化部位、NST(Asn-Ser-Thr)には下線が引かれている、(12) キメラ HIRMAb の HC の CH3 領域、(13) キメラ HIRMAb の HC の CH3 領域と mAβScFv の開始点との間の Ser-Ser リンカー、(14) mAβScFv の HC の可変領域(VH)の FR1、(15) mAβScFv の VH の CDR1、(16) mAβScFv の VH の FR2、(17) mAβScFv の VH の CDR2、(18) mAβScFv の VH の FR3、(19) mAβScFv の VH の CDR3、(20) mAβScFv の VH の FR4、(21) mAβScFv の VH と 軽鎖の可変領域(VL)との間の 17 アミノ酸リンカー、(22) mAβScFv の VL の FR1 、(23) mAβScFv の VL の CDR1、(24) mAβScFv の VL の FR2、(25) mAβScFv の VL の CDR2、(26) mAβScFv の VL の FR3、(27) mAβScFv の VL の CDR3、(28) mAβScFv の VL の FR4。
【図２６】３つの機能性を有する抗体融合タンパク質: (1) キメラ HIRMAb の CDR は BBB HIR に結合し、分子が BBB を横切って血液から脳へと流入することを可能にする; (2) Fc 領域の CH2/CH3 インターフェイスは FcR 受容体に結合し、分子が BBB を横切って脳から血液へと流出することを可能にする; (3) CH3 領域に融合した mAβScFv は、AD の Aβアミロイドペプチドに結合し、AD において脳からのアミロイドの排除を引き起こす。AD における脳のアミロイドの排除において、これら３つの機能性の各々が果たす役割は  図 27 に示される。
【図２７】AD において融合タンパク質は３つの連続的な工程を介して脳からアミロイドを除去し、これら３つの連続的な工程の各々が 図 26 に示される通り抗体融合タンパク質分子の３つの分離した部分を用いる。工程 1 は、血液から脳へと BBB を横切っての融合抗体の流入であり、この流入は BBB ヒトインスリン受容体(HIR)への融合抗体の結合によって媒介される。工程 2 は、AD におけるアミロイドプラークへの融合抗体の結合であり、それはアミロイドプラークの脱凝集を促進し、そしてこのプラークへの結合は融合抗体の mAβScFv 部分によって媒介される。工程 3 は、脳から血液へと BBB を横切っての融合抗体の流出であり、この流出は、融合抗体の Fc 領域の CH2-CH3 インターフェイスで融合抗体が BBB FcR 受容体へ結合することによって媒介される。
【図２８】9E10 MAb を用いた、一本鎖Fv(ScFv)抗体の C-末端 c-myc エピトープに対するウエスタンブロット。(レーン 1): 正の対照として用いた、ストレプトアビジン(SA)と OX26 ScFv の融合タンパク質(45 kDa)。この OX26 ScFv-SA 融合タンパク質は３つのドメイン: OX26 ScFv、SA、および c-myc C-末端エピトープで構成されており、そして細菌ペレットから親和性精製された。(レーン 2): 負の対照: リポフェクタミンおよびプラスミドDNAなしでトランスフェクトされた COS 細胞による培養上清。9E10 抗-c-myc MAb は、COS 細胞によって分泌される 35-37 kDa の２つのタンパク質と交差反応している。pCD-mAβScFvでトランスフェクトされていない COS 細胞 の培地中には29 kDa 抗-AβScFv が存在しないことに注意されたい。 (レーン 3): リポフェクタミン2000 および pCD mAβScFv (図 1B)でトランスフェクトされた COS 細胞による培養上清から得られた抗-AβScFv; 抗-Aβ ScFv は 29 kDa の分子量を有し、OX26 ScFv/SA 融合タンパク質中に 16 kDa の SA 部分が存在することから、レーン 1 における OX26 ScFv-SA 融合タンパク質よりも 16 kDa サイズが小さい。
【図２９】(A) 固体の支持体上にプレーティングされている Aβ1-40 ペプチドに対する mAβScFv の結合を実証するために用いられる ELISA の仕組み。mAβScFv はアミロイドペプチドに結合し、9E10 抗-c-myc MAb はタンパク質のカルボキシル末端に融合した EQKLISEEDL エピトープ(図 9)に結合する。9E10 MAb はビオチン化されており、それによってストレプトアビジンとペルオキシダーゼの複合体を用いての検出が可能になる。pCD-mAβScFv でトランスフェクトされた COS 細胞による培養上清がアッセイにおいて高いシグナルを生成した一方、リポフェクタミン(LIPO)にのみ暴露された COS 細胞からの培地はシグナルを生成しなかった。該アッセイは、mAβScFv が Aβ1-40 ペプチドに結合することを示す。
【図３０】pCD-mAβScFv でトランスフェクトされ、mAβScFvを発現する COS 細胞による培養上清(パネル A および C)、リポフェクタミン2000にのみ暴露された COS 細胞による培養上清(パネル B)、またはマウス IgG1 アイソタイプ対照抗体(パネル D)を用いて免疫染色された、AD 剖検脳の凍結切片の免疫細胞化学。パネル A および B における拡大率を示す棒(Magnification bar)は 88 um であり; パネル C および D における拡大率を示す棒(magnification bar)は 35 um である。該アッセイは、mAβScFv が AD の Aβアミロイドプラークに結合することを示す。
【図３１】プロテインA で精製された融合抗体またはキメラHIRMAbの、クーマシーブルーで染色された、還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)。該ゲルは、キメラ HIRMAb と融合抗体の重鎖および軽鎖のサイズの隣り合わせでの比較を示す。両者は 28 kDa の同じ軽鎖で構成されている。キメラ HIRMAb の重鎖のサイズが 55 kDaである一方、融合抗体の重鎖のサイズは 82 kDaである。融合抗体の重鎖は、27 kDaの抗-AβScFvに融合したキメラHIRMAb の 55 kDaの重鎖を包含する。
【図３２】プロテインA で精製された融合抗体の、抗-ヒト IgG 一次抗体を用いるウエスタンブロッティングは、COS 細胞において発現された融合抗体がプロシングされ、予測された分子サイズを有するインタクトな状態で分泌されることを示す。該ブロットは、キメラ HIRMAb および 融合抗体の免疫活性の、隣り合わせでの比較を示す。ウエスタンブロットにおいて示された通り、両者は 28 kDa の同じ軽鎖で構成されている。キメラ HIRMAb の重鎖のサイズが 55 kDaである一方、融合抗体の重鎖のサイズは 82 kDaである。融合抗体の重鎖は、27 kDaの抗-AβScFvに融合したキメラHIRMAb の 55 kDaの重鎖を包含する。
【図３３】等電点標準、キメラ HIRMAb、ハイブリドーマにより生成されたマウス抗-Aβ抗体、および融合抗体の等電点電気泳動。
【図３４】Aβ1-40 免疫放射線アッセイ(IRMA)は、96-ウェルプレートのウェル中にプレーティングされた Aβ1-40 に対する [125I]-マウス抗-AβMAb の結合を測定する。マウス抗-AβMAb は、ハイブリドーマ培養上清から精製された、Aβに対する元のマウス MAb である。結合のコンペティターが無い場合は、全 [125I]-抗-AβMAb のおよそ 20% が Aβ1-40 に結合している。マウス抗-AβMAb および融合抗体の両者はともに Aβ1-40 に結合し、半飽和定数(half saturation constant)、KD、は有意には異ならない。Aβ1-40 に対する融合抗体の親和性は、元のマウス抗-Aβ1-40 MAb の親和性と等しい。
【図３５】競合的 ELISA によって決定される、キメラ HIRMAb および融合抗体のヒトインスリン受容体(HIR)に対する親和性、ここで、固相抗原は、CHO 細胞から産生され、親和性精製された HIR 細胞外ドメイン(ECD)である。融合抗体の HIR ECD に対する結合力、ED50=1.0±0.1 nM、は、 キメラ HIRMAbの結合力、ED50=0.53±0.02 nM に匹敵する。HIR ECD に対するアイソタイプ対照である ヒトIgG1 の結合は存在しない。
【図３６】ヒト BBB 上の HIR に対する融合タンパク質の結合。(A)単離毛細血管はヒト剖検脳から精製され、ヒト BBB HIR に対する結合のインビトロモデルとして用いられる。(B) ヒト脳毛細血管に対する[125I]-融合抗体の特異的結合が時間依存的である一方、[125I]-マウス抗-Aβ抗体の結合は時間にかかわらず一定で、かつ非特異的である。
【図３７】成体アカゲザルにおける生体内の薬物動態。[125I]-融合抗体 および [3H]-マウス抗-Aβ抗体を成体アカゲザルに静脈内注入し、血清濃度[注入用量(I.D.)/mLの％]を 3 時間の期間にわたって決定した。この期間において、[125I]-マウス抗-Aβ抗体の血液からの測定可能な排除が存在しない一方、融合抗体は血清から排除されている。
【図３８】両方の標識抗体の単回静脈内注入から 3 時間後の、アカゲザル脳における[3H]-マウス抗-Aβ抗体および[125I]-融合抗体の脳分布容積(VD)。ホモジネートおよび 血管後上清（post-vascular supernatant）両方についての VD が示される。[3H]-マウス抗-Aβ抗体についての VD、10 uL/g、は脳の血液容積に等しく、この抗体が生体内で霊長類の BBB を横切って輸送されないことを示す。[125I]-融合抗体についての VD は、脳ホモジネートおよび血管後上清（post-vascular supernatant）の両方において [3H]-マウス抗-Aβ抗体よりも >10-倍 高く、それは [125I]-融合抗体が BBB を横切って血液から脳へと輸送されることを示す。
【図３９】[125I]-融合抗体の静脈内投与から 3 時間後における、成体アカゲザルの脳のスキャンは、生体内で霊長類の血液から脳への融合抗体の広範な分布を実証する。最上部のスキャンは脳の最前部である、そして最下部のスキャンは脳の最尾部で、小脳を含む。
【図４０】成体ラットにおける、[125I]-融合抗体の脳から血液への流出。[125I]-融合抗体は定位固定ガイダンス(stereotaxic guidance)の下で皮質に注入され、BBBを横切っての脳からの融合抗体の流出は注入の 90 分後に測定された。この時点で、注入された融合抗体の 60%近くが脳から流出していた。この流出は、ヒト Fc 断片の共注入によって完全に阻止された。この事は、流出が BBB における Fc 受容体によって媒介されることを示す。
【図４１】(A) Aβプラーク脱凝集アッセイの概略。２次抗体は、融合抗体の調査のためには抗-ヒトIgG であり、マウス抗-AβMAb の調査のためには抗-マウスIgG である。(B, C) 融合抗体(B)またはマウス抗-AβMAb(C)によるインビトロでの Aβアミロイドの脱凝集。Aβ1-40 凝集体は 6 日間にわたって形成され、その後、融合抗体、ヒトIgG1(hIgG1)、またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と共に 37℃で 1 または 4 時間(B)、または マウス抗-Aβ抗体、非免疫性マウスIgG、または PBS と共に 37℃で 1 または 4 時間(C)、インキュベーションされた。並行して、Aβ1-40 ペプチドのカルボキシル末端領域に結合する抗体は、パネル A に示されるように 96 ウェルプレート中にプレーティングされた。融合抗体の抗-Aβ ScFv 部分、またはマウス抗-Aβ MAb は、Aβ1-40 のアミノ末端部分に結合する。そのため、正の ELISA シグナルは プラークが存在する場合にのみ生成される。データは、融合抗体およびマウス抗-Aβ MAb が Aβ1-40 プラークに選択的に結合すること、および、この結合が 4 時間の期間にわたって脱凝集を引き起こすこと、を示す。
【図４２】(A) 血管アミロイドプラークに対する抗体の結合を示す、[125I]-融合抗体で標識された AD 剖検脳切片のフィルムオートラジオグラフィー。 (B) AD の血管アミロイドに対する抗体の結合を示す、マウス抗-AβMAbで標識された AD 剖検脳切片の免疫細胞化学。
【図４３】HIR ELISA によって示される通り、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-Ｎ,-Ｎ’,Ｎ’’,Ｎ’’’-テトラ酢酸(DOTA) の HIRMAb に対する連結は、HIR 細胞外ドメインに対する抗体の結合を阻害しない。DOTA は放射性核種金属、例えば 111-インジウムの高親和性キレート剤であり、神経診断のための放射性医薬の生産および DOTA 連結融合抗体を用いる脳のスキャニングを可能にする。
【図４４】抗-WNV 抗体(Ab)は血液脳関門(BBB)を通過しない。しかし、それ自身がインスリン受容体(IR)に対する別の抗体である分子トロイの木馬(TH)と融合した後には、抗-WNV Ab は BBB を通過できる。TH は内在性 IR 上の輸送を介して BBB を横切る受容体-媒介輸送を経て、抗-WNV Ab を脳内へと運び、そこで Ab はウイルスを中和することができる。TH はまた BBB Fc 受容体(FcR)に対するリガンドでもあり、それが WNV の脳からの正味の排出を可能にする。
【図４５】抗-WNV VH (A)、抗-WNV VL (B)、および DIII (C)の増幅に続く PCR 反応のアガロースゲル電気泳動のエチジウムブロマイド染色。MW サイズ標準は右側に示される。VH、VL、および DIII cDNA は、それぞれ表 4、5、および 6 に示される ODN を用いて PCR によって生成された。
【図４６】pCD-WNV-ScFv から 抗-WNV ScFv を、および pCD-HC-BSA から抗-BSA 重鎖を、それぞれ一過性発現させるための COS 細胞発現プラスミドの遺伝子操作。pCD-ScFv ベクターは、中間部の 17-アミノ酸リンカーを介して VH と VL の融合を可能にする ScFv 発現ベクターである。
【図４７】以下のドメインで構成される抗-WNV-融合抗体の重鎖のアミノ酸配列:(i) IgG シグナルペプチド、(ii) HIRMAb 重鎖可変領域(VH)、(iii) ４つのサブ-ドメイン: CH1、ヒンジ、CH2、および CH3 で構成されるヒト IgG1 定常領域、(iv) HIRMAb 重鎖 と 抗-WNV ScFv を隔てるリンカー、(v) 抗-WNV ScFv 重鎖可変領域(VH)、(vi) ScFv の VH と VL を隔てる 17 アミノ酸リンカー、および (vii) 抗-WNV ScFv 軽鎖可変領域(VL)。HIRMAb および 抗-WNV 抗体の相補性決定領域(CDRs)は図中に示される。
【図４８】抗-WNV 融合抗体(BSA)発現用 CHO 細胞タンデムベクターの、３つの前駆プラスミド: 融合重鎖プラスミド、pCD-HC-BSA、軽鎖プラスミド、pCD-LC、および 野生型(wt)ジヒドロ葉酸還元酵素、(DHFR)プラスミド、pwt DHFR からの遺伝子操作。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
I.イントロダクション
II.定義
III.血液脳関門
A.輸送系
B.血液脳関門受容体媒介輸送系に結合する構造
IV.血液脳関門を横切る輸送のための物質
A. 抗体医薬品
B. 抗-Aβ 抗体
V. 組成物
VI. 核酸、ベクター、細胞、および製造
A. 核酸
B. ベクター
C. 細胞
D. 製造
VII. 方法
VIII. キット
【００３８】
略語
9E10： c-myc 癌遺伝子の10-アミノ酸エピトープに対するMAb
AD：アルツハイマー病
ALS：筋萎縮性側索硬化症
抗-mAβScFv： mAβScFvと同じ
AUC：血漿濃度曲線下面積
AUCss：定常状態 AUC
Aβ：ADのアミロイドペプチド 
Aβ1-40：AD の40 アミノ酸 Aβ アミロイドペプチド
Aβ1-43：AD の43 アミノ酸 Aβ アミロイドペプチド
BBB：血液脳関門
BGH：ウシ成長ホルモン
Boc：tert-ブチルオキシカルボニル
BRB：血液網膜関門
CDR：相補性決定領域
CED：対流により増強される拡散(convection enhanced diffusion)
CH1：IgG 定常部の第一部分
CH2：IgG 定常部の第二部分 
CH3：IgG 定常部の第三部分
CHO：チャイニーズハムスター卵巣細胞株
CLBA：競合リガンド結合アッセイ
CLss：定常状態全身クリアランス
CMV：サイトメガロウイルス
CNS：中枢神経系
COS：CV-1 起源 SV40 細胞株
CT：カルボキシル末端
Da：ダルトン
DHFR：ジヒドロ葉酸レダクターゼ
DOTA：1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,-N’,N’’,N’’’-テトラ酢酸
DPM：壊変毎分
E：WNVのエンベロープタンパク質 
ECD：細胞外ドメイン
EDC：N-メチル-N’-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド
EGF：上皮増殖因子
EGFR：EGF 受容体
ELISA：酵素結合免疫吸着測定法
FcR：Fc 受容体
FcRn：新生児 FcR
FR：フレームワーク領域
FWD：フォワード
HC：重鎖
HC-1：キメラ HIRMAbのHC
HD：ハンチントン病
HGF：肝細胞増殖因子
HIR：ヒトインスリン受容体
HIRMAb：ヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体
HIR-HC：HIRMAbの重鎖 (HC)
HIR-LC：HIRMAbの軽鎖 (LC)
HIRMAb-mAβScFv：HIRMAb および mAβScFvの融合タンパク質
HIV：ヒト免疫不全ウイルス
IC：脳内
ICC：免疫細胞化学
ICV：脳室内
ID：注入量
IEF：等電点電気泳動
IGF：インスリン様増殖因子
IgG：免疫グロブリン G
kb：キロベース
IRMA：免疫放射線測定法
LC：軽鎖
LDL：低密度リポタンパク質
MAb：モノクローナル抗体
mAβScFv：Aβペプチドに対するマウス ScFv
MRT：平均滞留時間
MS：多発性硬化症
MTH：分子トロイの木馬(molecular Trojan horse)
MTX：メトトレキサート
MW：分子量
NHS：N-ヒドロキシスクシンイミド
NK：新しいコザック(new Kozak)配列
NT：アミノ末端
NSP：新しいシグナルペプチド
nt：ヌクレオチド
ODN：オリゴデオキシヌクレオチド
orf：オープンリーディングフレーム
pA：ポリ-A シグナル
PBS：リン酸緩衝食塩水
PCR：ポリメラーゼ連鎖反応
PD：パーキンソン病
PET：陽電子放出断層撮影
PNA：ペプチド核酸
PRO：プロモーター
Prp：プリオンタンパク質
RE：制限エンドヌクレアーゼ
REV：リバース
RMT：受容体媒介輸送
RNAi：RNA 干渉
RT：逆転写酵素
SA：ストレプトアビジン
ScFv：一本鎖 Fv 抗体
ScFv-MAb：四量体 MAbおよび ScFvの融合抗体
SCLC：小細胞肺癌
SDM：部位特異的変異誘発
SDS-PAGE：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
SFM：無血清培地
SPECT：単一光子放射型コンピュータ断層撮影法
TAA：腫瘍関連抗原
TNF：腫瘍壊死因子
TRAIL：TNF-関連アポトーシス誘発リガンド 
TV：タンデムベクター
VD：分布容積
VEGF：血管内皮増殖因子
VH：重鎖の可変部
VL：軽鎖の可変部
Vss：定常状態全身分布容積
WNV：西ナイルウイルス
【００３９】
I.  イントロダクション
血液脳関門は、治療用または診断用 モノクローナル抗体を含む多くの末梢投与された物質の中枢神経系への送達における制限因子である。本発明は、組成物、例えば、医薬組成物または診断組成物などの抗体組成物のCNS へのBBBを横切っての送達において重要な３つの因子に取り組む: 1)組成物の改変、例えば、抗体を改変して血液から脳への方向のBBBを横切っての流入を可能にすること; 2)組成物の改変、例えば、抗体を改変して脳から血液への方向のBBBを横切っての流出を可能にすること; および 3) 組成物の活性の保持、例えば、抗体がいったんBBBを横切ると脳に保持されること。本発明の様々な側面が、一方または両方の方向にてBBBを横切って物質を輸送させる、および/または、構造に結合したまま脳においてその活性の一部または全部を保持させる、１以上の構造に共有結合した抗体医薬品の融合構造(例えば、融合タンパク質)を提供することによってこれらの因子に取り組む。
【００４０】
したがって、一つの側面において、本発明は、第１の部分、第２の部分および典型的には、第３の部分を含む組成物およびかかる組成物を利用する方法を提供し、ここで第１の部分は第２の部分と結合しており、血液から脳へとBBBを第１の受容体媒介BBB輸送系を介して通過することができ、第２の部分は、脳から血液へとBBBを第２の受容体媒介BBB輸送系を介して通過することができ、第３の部分は中枢神経系成分と相互作用することができ、例えば、抗体コンストラクト、例えば、ScFvである。
【００４１】
別の側面において、本発明は第１の部分、第２の部分および第３の部分を含む組成物およびかかる組成物を利用する方法を提供し、ここで第１の部分は血液から脳へとBBBを通過することができ、第２の部分は中枢神経系成分と相互作用することができ、および第３の部分は脳から血液へとBBBを通過することができ、第１、第２および第３の部分は連結しており、第１、第２および第３の部分は同一ではなく、共通の構造を共有していない。
【００４２】
別の側面において、本発明は、抗原に結合するScFvを含む組成物およびかかる組成物を利用する方法を提供し、ここでScFvは第１の免疫グロブリン由来であり、該ScFvは第２の免疫グロブリンと結合しており、第２の免疫グロブリンは所望によりそのネイティブな形態から改変された免疫グロブリンであり;その抗原に対するScFvの親和性は、ScFvが由来する第１の免疫グロブリンの約 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、または120%を超える。いくつかの態様において、本発明は中枢神経系 (CNS)中で活性である抗体医薬品に共有結合した、BBBを通過することができる構造を含む融合タンパク質を提供し、ここで、血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系において活性である抗体はそれぞれ、別々の部分としてのそれらの活性(またはそれらのそれぞれの受容体に対するそれらの結合親和性) と比較してそれらの活性(またはそれらのそれぞれの 受容体に対するそれらの結合親和性)のある割合 (例えば、10-100%、あるいは100%を超える、例えば、100-200%) を保持している。
【００４３】
別の側面において、本発明は、非天然組成物および抗体構造を脳から血液へとBBBを横切って輸送することが出来る部分を含む非天然組成物を用いる方法を提供する。したがって、本発明は例えば、血液脳関門 (BBB)を通過することができる構造に共有結合した物質および医薬上許容される賦形剤を含む、治療用組成物、例えば、 医薬組成物を提供する。いくつかの態様において、本発明は、血液脳関門を通過することができる免疫グロブリンに共有結合した治療用ScFvを含む神経障害を治療するための組成物を提供し、ここで、該組成物は神経障害を治療するのに有効な量にてBBBを通過することができる。
【００４４】
さらなる側面において、本発明は、ScFvを含む組成物を用いる方法およびかかる組成物を提供し、ここで、ScFv のVH 領域は、配列番号12と少なくとも 80、90、95、または99% 同一な配列を含む。この側面のいくつかの態様において、ScFv のVL 領域は、配列番号14と少なくとも 80、90、95、または99%同一な配列を含む。
【００４５】
さらに別の側面において、本発明は、治療用抗体構造または診断用抗体構造を含む組成物を用いる方法およびかかる組成物を提供し、ここで、組成物は、末梢投与の後に少なくとも 約 30、40、50、60、70、80、80、90、または100 uL/グラム脳の神経治療用抗体構造または診断用抗体構造の脳における平均分布容積を達成できるものである。
【００４６】
さらなる側面において、本発明は、第１の配列および第２の配列を含む単一の核酸配列を提供し、第１の配列は、第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードする第２の配列に作動可能に連結した、第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードするものであり、ここで、第１の配列はさらに軽鎖に共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFvをコードするか、または、第２の配列はさらに重鎖に共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFvをコードする。いくつかの態様において、本発明は、免疫グロブリンの軽鎖をコードする遺伝子および抗体医薬品に共有結合した標的化免疫グロブリンの重鎖から構成される融合タンパク質をコードする遺伝子を含む単一の核酸配列を提供する。いくつかの態様において、融合タンパク質の抗体医薬品は抗-Aβ ScFvである。本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターおよび該ベクターを含む細胞を提供する。
【００４７】
本発明はまた、免疫グロブリン融合タンパク質の製造方法を提供し、例えば、真核細胞にひとつのタンデム発現ベクターを永久に組み込むことによる、融合タンパク質が抗体構造に融合した免疫グロブリン重鎖または抗体構造に融合した免疫グロブリン軽鎖を含む、免疫グロブリン融合タンパク質の製造方法を提供し、ここで、融合タンパク質のための遺伝子および免疫グロブリン軽鎖のための遺伝子または免疫グロブリン重鎖のための遺伝子を含む別の遺伝子が、１片のDNAに組み込まれる。したがって、本発明は、抗体融合タンパク質を製造する方法を提供し、ここで、融合タンパク質は医薬抗体由来のScFvに融合した、標的化抗体由来の免疫グロブリン重鎖を含み、該方法は真核細胞にひとつのタンデム発現ベクターを永久に組み込むことを含み、ここで、免疫グロブリン軽鎖遺伝子および治療抗体に融合した免疫グロブリン重鎖のための遺伝子の両方が、１片のDNAに組み込まれる。
【００４８】
さらに別の側面において、本発明は、血液から脳へとBBB を通過することができ、脳から血液へとBBBを通過することができる約 1000 ダルトンを超える分子量の組成物を提供する。
【００４９】
本発明はまた、方法、例えば、治療方法および診断方法を提供する。
【００５０】
一つの側面において、本発明は、個体における神経障害の治療方法を提供し、該方法は、所望により障害のためのその他の治療法と組み合わせて、個体に有効量の１以上の本発明の組成物を末梢投与することを含む。したがって、本発明は、障害に罹患している個体に有効量の組成物を投与することによるCNS 障害の治療方法を提供し、ここで、該組成物は、血液から脳へとBBBを通過することができる第１の構造、障害に関係する病理学的物質と相互作用することができる第２の構造、および所望により、脳から血液へとBBBを通過することができる第３の構造を含む。 
【００５１】
別の側面において、本発明は、個体の体液における組成物のレベルを測定することによる診断方法を提供し、ここで、組成物は、血液から脳へとBBBを通過することができ、脳障害に関係する病理学的物質と相互作用することが出来、および脳から血液へとBBBを通過することができるものであり、該組成物は個体に投与されており、病理学的物質と相互作用したものである。
【００５２】
本発明の組成物および方法は、物質、例えば、抗体医薬品の、末梢血液から BBBを横切ってのCNSへの輸送に有用である。本発明に有用な抗体医薬品としては、ADのAβ アミロイドペプチドに対する抗体、例えば、一本鎖 Fv (ScFv) 抗-Aβ 抗体が挙げられる。いくつかの態様において、BBBを通過することができる構造は、内在性 BBB 受容体媒介輸送系に結合し、BBBを通過することができる。いくつかの態様において、BBBを通過することができる構造は、抗体、例えば、モノクローナル抗体 (MAb)、例えば、キメラ MAbである。
【００５３】
II. 定義
本明細書において用いる場合、「物質(agent)」は、生理学的または生化学的効果を含む生物における効果を生じるのに有用なあらゆる物質を含む。「治療剤」は、治療効果、即ち、障害の寛解、予防、および/または完全または部分的な治癒を導く効果をもたらすまたはもたらすよう意図された物質である。「治療効果」は、本明細書において用いる場合、障害に罹患していない個体における平均または正常状態よりも良好な状態を生み出すことも含み、即ち、超正常効果、例えば、認知、記憶、気分、または少なくとも部分的に CNSの機能に起因するその他の特性の、正常または平均状態と比較した改善を含む。「抗体治療剤」とは、 CNSにおいて治療効果をもたらす抗体である。
【００５４】
本明細書において用いる場合、「中枢神経系 (CNS)において活性な抗体」には、CNSに投与された場合に効果を有する抗体が含まれる。効果は治療効果であっても非治療効果であってもよく、例えば、診断効果または研究に有用な効果であってもよい。効果が治療効果である場合、抗体はまた治療抗体である。効果が診断効果である場合、抗体はまた診断抗体である。抗体は同時に診断および治療抗体であり得る。
【００５５】
本明細書において用いる場合、「ことができる」 (例えば、「BBBを通過することができる」)とは、構造の１以上の構造的特徴(即ち、固有の特徴)によって付与される構造 (例えば、タンパク質、抗体、化合物、または組成物)の作動上の機能的特性をいう。
【００５６】
本明細書において用いる場合、「治療」または「治療する」には、治療効果および/または予防効果を達成することが含まれる。治療効果とは、治療すべき根底にある障害または症状の根絶または寛解を意味する。例えば、神経障害を患う個体において、治療効果には、障害の進行の部分的または完全な停止、または障害の部分的または完全な回復が含まれる。また、治療効果は基礎となる症状に関連する１以上の生理学的または心理学的症状の根絶または寛解により達成され、それにより患者において改善が観察されるが、にもかかわらず、実際は患者はその症状によって依然として影響を受けることがあり得る。治療の予防効果には、症状の予防、症状の進行の遅延(例えば、神経障害の進行を遅らせること)、または症状の発生の可能性の低減が含まれる。本明細書において用いる場合、「治療する」または「治療」には予防も含まれる。
【００５７】
本明細書において用いる場合、「有効量」という語は、有益な効果または所望の結果、例えば、有益または所望の臨床結果、即ち改善された認知、記憶、気分、またはその他の所望のCNS結果のために十分な量であり得る。有効量はまた、予防効果をもたらす量でもあり、例えば、病的または望ましくない症状の出現を遅延、低減または排除する量である。CNSのかかる症状には、本明細書に記載するように認知症、神経変性疾患、最適ではない記憶または認知、気分障害、全般的CNS老化、またはその他の望ましくない症状が含まれる。有効量は１回以上の投与において投与されうる。治療の観点では、本発明の組成物の「有効量」は障害、例えば神経障害を緩和する、寛解させる、安定化する、回復させるまたは障害の進行を遅延させるのに十分な量である。「有効量」は単独で用いる場合または疾患または障害を治療するのに用いられる１以上の 物質と組み合わせて用いる場合の本発明の組成物のいずれのものであってもよい。本発明の意味における治療剤の「有効量」は患者の主治医または獣医によって決定される。かかる量は当業者によって容易に確認され、本発明にしたがって投与されると治療効果をもたらす。治療上有効量に何が含まれるかに影響を及ぼす因子としては、用いる治療剤の特定の活性、障害のタイプ (例えば、急性あるいは慢性神経障害)、障害の開始からの経過時間、および治療される個体の年齢、身体症状、その他の疾患状態の存在、および栄養状態が挙げられる。さらに、患者が受けうるその他の薬物も投与すべき治療剤の治療上有効量 の決定に影響を及ぼす。
【００５８】
本明細書において用いる場合、「対象」または「個体」は、動物、例えば、哺乳類である。いくつかの態様において、「対象」または「個体」はヒトである。いくつかの態様において、対象は神経障害に罹患している。
【００５９】
いくつかの態様において、物質は、「末梢的に投与」または「末梢投与」される。本明細書において用いる場合、これらの語は、物質、例えば治療抗体の個体へのCNSへの直接投与ではない投与のあらゆる形態をいい、即ち、物質を血液脳関門の脳ではない側と接触させることをいう。本明細書において用いる場合、「末梢投与」には、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、経皮、吸入、経頬側(transbuccal)、鼻腔内、直腸、および経口投与が含まれる。
【００６０】
本明細書において「医薬上許容される担体」または「医薬上許容される賦形剤」とは、組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生をそれ自体誘導しないあらゆる担体をいう。かかる担体は当業者に周知である。医薬上許容される担体/賦形剤についての徹底的な記載は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Gennaro、AR、ed.、20th edition、2000: Williams and Wilkins PA、USAに見ることが出来る。例示的な医薬上許容される担体には、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など;および有機酸塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの塩が含まれうる。例えば、本発明の組成物は液体形態で提供することが出来、界面活性剤、例えば、0.01-1%のポリソルベート-80、または炭水化物添加物、例えば、マンニトール、ソルビトール、またはトレハロースを含んでいても含んでいなくてもよい様々なpH (5-8)の生理食塩水に基づく水溶液中に製剤される。一般的に用いられる緩衝剤には、ヒスチジン、酢酸塩、リン酸塩またはクエン酸塩が含まれる。
【００６１】
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入に使用される方法に関わらず外来性ポリヌクレオチドを含む細胞をいい、例えば、方法としては、直接取り込み、形質導入、f-接合、または組換え宿主細胞の作成のために当該技術分野において知られたその他の方法が挙げられる。外来性ポリヌクレオチドは、組み込まれないベクター、例えば、プラスミドとして維持されてもよいし、あるいは、宿主ゲノムに組み込まれてもよい。
【００６２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という語は、本明細書において互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーをいう。即ち、ポリペプチドに関する記載はペプチドの記載およびタンパク質の記載にも同等に適用され、逆も同様である。これらの語は、天然アミノ酸ポリマー、および１以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸、例えばアミノ酸アナログであるアミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書において用いる場合、これらの語はあらゆる長さのアミノ酸鎖を包含し、全長タンパク質 (即ち、抗原)も含まれ、ここで、アミノ酸残基は共有ペプチド結合により連結している。
【００６３】
「アミノ酸」という語は、天然および非天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体をいう。天然にコードされるアミノ酸は、20の一般的なアミノ酸(アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン)およびピロリシンおよびセレノシステインである。アミノ酸アナログとは、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物をいい、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR 基に結合しているα 炭素を有する化合物であり、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。かかるアナログは改変されたR基(例えば、ノルロイシン)または改変されたペプチドバックボーンを有するが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。
【００６４】
アミノ酸は本明細書においてその一般に知られている３文字記号またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨されている１文字記号のいずれによっても称されうる。ヌクレオチドも同様に、その一般に受け入れられている１文字コードによって称されうる。
【００６５】
「核酸」という語は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチドおよびそれらの一本鎖または二本鎖形態のいずれかのポリマーをいう。特に断りのない限り、この語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと類似の様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。特に断りのない限り、この語はまた、PNA (ペプチド核酸)、アンチセンス技術において用いられるDNAのアナログ(ホスホロチオエート、ホスホロアミダート等)を含むオリゴヌクレオチドアナログもいう。特に断りのない限り、特定の核酸配列はまた黙示的に、保存的に改変されたその変異体 (例えば、これらに限定されないが、縮重コドン置換)および相補的配列ならびに明示的に示した配列も含む。具体的には、縮重コドン置換は、１以上の選択された(またはすべての)コドンの第３位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基により置換された配列を作成することにより達成されうる (Batzer et al.、Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al.、J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); および Cassol et al. (1992); Rossolini et al.、Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
【００６６】
「単離された」および「精製された」という語は、その天然環境から実質的または本質的に離れているかまたはその中に濃縮されている物質をいう。例えば、単離された核酸は、それに通常隣接する核酸またはサンプル中のその他の核酸または成分 (タンパク質、脂質等)から分離されたものでありうる。別の例において、ポリペプチドはその天然環境から実質的に離れているまたはその中に濃縮されている場合精製されている。核酸およびペプチドの精製および単離方法は当該技術分野において周知である。
【００６７】
III.血液脳関門
一つの側面において、本発明は、血液脳関門 (BBB)を通過することができる構造に共有結合した物質、例えば抗体を利用する組成物および方法を提供する。組成物および方法は、物質、例えば、抗体の、末梢血液から血液脳関門を横切ったCNSへの輸送に有用である。さらに、いくつかの側面において、本発明の組成物および方法は、CNSから血液へとBBBをさらに通過することができる構造を利用する。本明細書において用いる場合、「血液脳関門」とは、脳毛細血管内皮細胞膜内の密着結合によって形成される、末梢循環と脳および脊髄との間の障壁であって、それは分子の脳への輸送を制限する非常に堅固な障壁を形成し、分子量60 Daの尿素ほどの小さい分子さえ輸送が制限される。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門および網膜内の血液網膜関門は中枢神経系 (CNS)中の連続した毛細関門であり、本明細書においてこれらは血液脳関門またはBBBと総称する。
【００６８】
BBBは、脳およびCNSのための新規神経治療薬、診断薬、およびリサーチツールの開発における制限段階である。実質的に100%の高分子治療薬、例えば、組換えタンパク質、アンチセンス薬、遺伝子医薬、モノクローナル抗体、またはRNA 干渉 (RNAi)に基づく薬剤は、薬理学的に有意な量にてBBB を通過しない。低分子薬はBBBを通過することが出来ると一般に考えられているが、実際、BBBを横切って輸送されないためにすべての低分子薬の2%未満のみが脳において活性である。分子は薬理学的に有意な量にてBBBを通過するためには脂溶性でなければならず、分子量は400 ダルトン (Da)未満でなければならず、大部分の低分子はこれら２つの分子特性を有さない。それゆえ、非常に有力であり得る治療用、診断用、または研究用分子は薬理学的に活性な量にてBBB を横切らない。BBBを迂回するために、侵襲的経頭蓋薬物送達戦略が用いられており、例えば、脳室内 (ICV) 注入、脳内 (IC) 投与、および対流により増強される拡散 (CED)が挙げられる。脳への経頭蓋薬物送達は高価であり、侵襲的であり、ほとんど有効でない。ICV 経路は治療用タンパク質、例えば、抗体医薬品を脳の上衣表面にのみ送達し、脳実質には送達されず、これはICV 経路によって与えられる薬物に典型的である。医薬のIC 投与は脳内の薬物拡散の効率が低いため薬物を局所注射部位にしか送達しない。医薬のCEDは脳の白質路を通る流体の優先的な流れをもたらし、脱髄および星膠症を導きうる。
【００６９】
本発明はこれら高度に侵襲的で一般に満足できないBBBを迂回する方法に代わる方法であって、物質、例えば、抗体医薬品を末梢血液からBBBを横切らせ、および、いくつかの態様において、物質または改変形態の物質(例えば、抗原に結合した抗体)を脳から血液へとBBBを横切らせる方法を提供する。いかなる理論にも拘束される意図はなく、所望の物質を末梢血液から CNSへと輸送する機構を提供することは、BBBにおいて存在する 内在性 輸送系の使用に基づくと考えられる。
【００７０】
例えば、一つの側面において、本発明は、血液から脳へとBBBを通過することができ、脳から血液へとBBBを通過することができる約 1000 ダルトンより大きい分子量の組成物を提供する。
【００７１】
A.輸送系
いくつかの態様において、本発明は、BBB 受容体媒介輸送系に結合する構造を含む組成物を提供する。構造は、BBBを横切った輸送が望まれる活性物質、例えば、抗体医薬品、診断、または研究用部分、例えば、神経治療剤に結合されうる。本発明の組成物および方法は、選択された内在性 BBB 受容体媒介輸送系によって輸送することが出来、そして所望の物質、例えば、抗体に結合することが出来るあらゆる好適な構造を利用しうる。いくつかの態様において、標的化する構造自体が抗体である。いくつかの態様において 、標的化する抗体はモノクローナル抗体 (MAb)、例えば、キメラ MAbである。
【００７２】
内在性 BBB 受容体媒介輸送系
BBBはいくつかの高分子の血液から脳への輸送を可能とする特定の受容体を有していることが示されている;これらトランスポーターは本発明の組成物のためのトランスポーターとして好適である。本発明において有用な内在性 BBB 受容体媒介輸送系としては、これらに限定されないが、インスリン、トランスフェリン、インスリン-様増殖因子1および2 (IGF1およびIGF2)、レプチン、およびリポタンパク質を輸送するものが挙げられる。いくつかの態様において、本発明は、内在性 インスリン BBB 受容体媒介輸送系、例えば、ヒト 内在性 インスリン BBB 受容体媒介輸送系を介してBBBを通過することができる構造を利用する。
【００７３】
B. BBB 受容体媒介輸送系に結合する構造
物質のCNSへの送達、およびいくつかの態様においてCNSからの輸送のための１つの非侵襲的アプローチは、目的の物質を、構造、例えば、BBB上の受容体に結合する分子に結合させることである。構造はしたがってBBBを横切った物質の輸送のためのベクターとして役立つ。かかる構造は本明細書において「分子トロイの木馬(MTH)」と称される。典型的には、必須ではないが、MTHは、内在性 BBB 受容体媒介輸送系上でBBBを横断する、内在性 BBB 受容体媒介輸送系に結合することが出来る外来性ペプチドまたはペプチド模倣体部分 (例えば、MAb )である。特定の態様において、MTHは、輸送系の受容体、例えば、インスリン受容体に対する抗体であり得る。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体 (MAb)である。いくつかの態様において、MAbはキメラ MAbである。したがって血液中の抗体は通常脳から排除されるという事実に拘わらず、それらがBBB上の受容体に対する特異性を有していれば、それらは脳実質への分子の送達のための効果的な媒体となりうる。
【００７４】
したがって、抗体、特にMAbは本発明の態様において特に有用である。特定の受容体-特異的MAbは内在性リガンドを模倣し得、MTHとして機能し、特定の受容体系上での輸送を介して細胞膜障壁を横断することができる。特定の態様において、MTHは、ヒト BBB上のヒト インスリン受容体 (HIR)に対するMAbである。HIR MAbはヒト BBB HIR上の外表面のエピトープに結合し、この結合が、ヒト BBB インスリン受容体により媒介される輸送反応を介してMAbが BBBを横断することを可能とする。
【００７５】
ヒトにおける使用のためには、ヒトに投与した場合に有意に免疫原性ではない十分なヒト 配列を含むキメラ HIR Abが好ましく、例えば、約 80% ヒトおよび 約 20% マウス、または約 85% ヒトおよび約 15% マウス、または約 90% ヒトおよび約 10% マウス、または約 95% ヒトおよび5% マウス、または約 95%を超えてヒトおよび約 5%未満がマウスが挙げられる。本発明において使用するために十分なヒト配列を有するヒトBBB インスリン受容体に対するキメラ 抗体は、例えば、Coloma et al. (2000) Pharm. Res. 17: 266-274に記載されており、その内容全体を引用により本明細書に含める。より高度にヒト化された形態のHIR MAbも操作することが出来、ヒト化HIRMAbはマウス HIRMAbに匹敵する活性を有し、本発明の態様において利用できる。例えば、その内容全体を引用により本明細書に含める11/27/02出願の米国特許出願公開20040101904を参照。
【００７６】
現在の技術によると、候補 HIR Abの膨大な数の配列変異体または公知のHIR Abを容易に作成し(例えば、インビトロ)、標的抗原、例えば、ヒトインスリン受容体のECDまたはその単離されたエピトープに対する結合についてスクリーニングすることが可能である。例えば、抗体配列変異体の超ハイスループットスクリーニングのためには、例えば、Fukuda et al.  (2006) “In vitro evolution of single-chain antibodies using mRNA display， ”Nuc．  Acid Res．、34(19) (オンラインで公表)を参照されたい。また、Chen et al. (1999)、“In vitro scanning saturation mutagenesis of all the specificity determining residues in an antibody binding site，” Prot Eng、12(4): 349-356も参照されたい。インスリン受容体 ECDは、例えば、Coloma et al.  (2000) Pharm Res、17:266-274に記載のように精製することができ、HIR Abおよび公知のHIR AbのHIR Ab 配列変異体のスクリーニングに使用され得る。
【００７７】
「抗体」または「抗体コンストラクト」は、本明細書において用いられる場合、天然、人工誘導、または組換えを問わず、特異的免疫反応活性を有するあらゆる分子に対する言及を含む。一般に、必須ではないが、抗体は２つの分子を含むタンパク質であり、各分子は２つの異なるポリペプチドを有し、短い方は抗体軽鎖として機能し、長い方のポリペプチドは、抗体重鎖として機能する。通常、本明細書において用いる場合、抗体は重鎖または軽鎖からの少なくとも１つの可変部を含む。さらに、抗体は可変部の組合せを含みうる。組合せは軽鎖または重鎖の２以上の可変部を含みうる。抗体はまた、１以上の重鎖可変部と組合せて１以上の軽鎖からの可変部を含みうる。抗体は体液性応答のインビトロまたはインビボ生成によって得られる免疫グロブリン分子であり得、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む。さらに、本発明は、本明細書において記載する抗体の抗原結合性断片を含み、例えば、 Fab、Fab’、F(ab)2、およびFv 断片、１以上の CDRから構成される断片、一本鎖抗体 (例えば、一本鎖 Fv 断片 (ScFv))、ジスルフィド安定化 (dsFv) Fv 断片、ヘテロ接合体抗体 (例えば、二重特異性抗体)、pFv 断片、重鎖単量体または二量体、軽鎖単量体または二量体、および１つの重鎖 と１つの軽鎖からなる二量体が挙げられ、これらすべては「抗体」または「抗体構造」という語に包含される。かかる抗体断片は、化学的方法により、例えば、インタクトな抗体をプロテアーゼ、例えば、 ペプシンまたはパパインにより切断することにより、あるいは組換え DNA 技術により、例えば、切断型重鎖および/または軽鎖遺伝子で形質転換された宿主細胞を使用することにより産生されうる。かかる断片を作成する合成方法も考慮される。重鎖および軽鎖単量体は同様に、インタクトな抗体を還元剤、例えば、 ジチオトレイトールまたはベータメルカプトエタノールで処理することにより、または、所望の重鎖または軽鎖またはその両方をコードするDNAで形質転換された宿主細胞を使用することにより産生されうる。特定の抗原と免疫学的に反応性の抗体は、インビボまたは組換え方法、例えば、ファージまたは類似のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択により作成できる。
【００７８】
「キメラ」抗体は、異なる哺乳類の組合せに由来する抗体を含む。哺乳類は、例えば、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、またはヒトであり得る。異なる哺乳類の組合せには、ヒトおよびマウス源からの断片の組合せが含まれる。
【００７９】
いくつかの態様において、本発明の抗体はモノクローナル抗体 (MAb)であり、典型的には、ヒトモノクローナル抗体である。かかる抗体は、抗原の攻撃に応答して特異的ヒト抗体を産生するよう「操作」されたトランスジェニックマウスから得られる。この技術において、ヒト重鎖および軽鎖座位の要素が内在性重鎖および軽鎖座位の標的化された破壊を含む胚性幹細胞株由来のマウスの株に導入される。トランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成でき、マウスは、ヒト抗体-分泌ハイブリドーマの産生に利用できる。
【００８０】
本発明において使用される抗体はグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。抗体がグリコシル化される場合、抗体の機能に有意に影響を与えないあらゆるグリコシル化パターンを利用できる。グリコシル化は抗体が作られる細胞に典型的なパターンにて起こりえ、細胞タイプによって変動しうる。例えば、マウス骨髄腫細胞により産生されるモノクローナル抗体のグリコシル化 パターンは、形質移入されたチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞によって産生されるモノクローナル抗体のグリコシル化 パターンと異なりうる。いくつかの態様において、抗体は形質移入されたチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞によって産生されるパターンにてグリコシル化される。
【００８１】
したがって、いくつかの態様において、所望のレベルのヒト配列を有する遺伝子操作された HIR MAbは、BBBを横切った輸送が望ましい物質、例えば、抗体医薬品に融合され、二機能性分子である組換え融合タンパク質が作られる。組換え治療抗体/HIRMAbは、 (i)ヒト BBBを 血液から脳への方向にてBBB HIR上の輸送を介して横切る、(ii)ヒト BBBを脳から血液への方向にてBBB FcR 受容体上の輸送を介して横切る、および (iii)治療抗体の標的、例えば、AD のAβアミロイドに結合して末梢投与の後、脳に入って神経治療効果をもたらすことができるものである。
【００８２】
IV. BBBを横切る輸送のための物質
本発明は、血液からCNS および/またはCNSから血液へとBBBを横切って物質を輸送するための組成物および方法を提供する。１つの有用なクラスの物質は抗体医薬品であり、治療用および診断用抗体構造が含まれる。BBBを横切った輸送が望ましい抗体医薬品物質は、CNSへの導入のためのあらゆる好適な抗体物質であり得る。一般に、物質はBBBを横切る輸送が望ましい抗体であり、そのネイティブな形態においてはBBBを有意な量で通過しないものである。抗体物質は例えば、治療剤、診断剤、またはリサーチ剤でありうる。診断剤には、抗体放射性医薬品、例えば、 AD患者の脳におけるAβ アミロイド 負荷を画像化するための抗-Aβ 抗体が含まれる。いくつかの態様において、抗体医薬品は治療剤、例えば、AD患者の脳におけるAβ アミロイドを脱凝集させる抗体である。本発明に有用な抗体物質を表1に列挙する。
【００８３】
表1. モノクローナル抗体治療薬による脳障害の治療
【表１】
2014148510.tif 000002
【００８４】
A. 抗体医薬品 
本発明に使用される１つのタイプの物質は抗体物質である。多くの抗体物質、例えば、医薬が、脳において活性であるが(例えば、薬理学的に活性)、血液脳関門を通過しない。これら因子は本発明の組成物および方法における使用に好適であり、ADの診断または治療のためのアルツハイマー病 (AD)のAβ アミロイドペプチドに対する抗体が含まれる。いくつかの態様において、抗体は、PDの診断または治療のためのパーキンソン病 (PD)のα-シヌクレインに対するものである。いくつかの態様において、抗体は、HDの診断または治療のためのハンチントン病 (HD)のハンチンチン タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体は、スクレイピーのヒトの対応疾患の診断または治療のためのスクレイピーまたは狂牛病のPrp タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体は、西ナイル脳炎の診断または治療のための西ナイルウイルスのエンベロープ タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体は、後天性免疫不全症候群 (AIDS)の診断または治療のための、脳に感染する腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)に対するものである。いくつかの態様において、抗体は、脳傷害、脊髄傷害、または脳卒中の診断または治療のためのnogo A タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体は、脳に転移性の乳癌の診断または治療のためのHER2 タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体は、脳の原発性癌または脳の転移性癌の診断または治療のための発癌受容体 タンパク質、例えば、上皮増殖因子受容体 (EGFR) に対するものである。いくつかの態様において、抗体は、脳の原発性癌または脳の転移性癌の診断または治療のための発癌増殖因子、例えば、上皮増殖因子 (EGF)または肝細胞増殖因子 (HGF) に対するものである。いくつかの態様において、抗体は、脱髄性疾患、例えば、多発性硬化症の診断または治療のためのオリゴデンドロサイト表面抗原に対するものである。BBBを通過する融合タンパク質の前駆体として用いられるScFv形態の抗体、例えば、治療抗体を利用する本発明のいくつかの態様において特に有用なものは、元の抗体と同様に天然に二量体構造を形成するものである。本発明のいくつかの態様は、標的化抗体、例えば、HIRMAbの１つの鎖 (例えば、軽鎖または 重鎖)に融合した抗体由来のScFvから構築される融合タンパク質を提供する。典型的には、分子トロイの木馬に融合され得る抗体の分子量の範囲は、1000 ダルトンから500,000 ダルトンの範囲である。
【００８５】
B. 抗-Aβ抗体
本発明の態様における１つの特に有用な抗体医薬品は、ADの Aβ アミロイドペプチドに対する抗体である。ADの認知症は、アミロイドプラークの長年にわたる進行性の蓄積により引き起こされる。このプラークは、APPと称されるアミロイドペプチド 前駆体 タンパク質の脳内でのタンパク分解性プロセシングに由来する、Aβ1-40/43と称される40-43 アミノ酸 ペプチドであるAβ アミロイドペプチドの凝集によって形成される。
【００８６】
ADのための可能性のある治療法は脳に入ってアミロイド プラークを脱凝集させることが出来るあらゆる薬剤である。トランスジェニックマウス がAPP タンパク質の突然変異形態を発現するよう操作され、これらマウスではADのヒトと類似のアミロイド プラークが発達した。アミロイド プラークは直接大脳注射または頭蓋窓によってトランスジェニックマウスの脳に直接投与された抗-Aβ 抗体の適用により脱凝集しうる。アミロイド プラークの抗-Aβ 抗体に媒介される脱凝集の後、プラーク付近の異栄養性神経終末が治癒し始め、正常の構造を形成する。抗-Aβ 抗体は針を介して脳に直接注射しなければならない。というのは抗体はBBBを通過しないからである。それゆえ、血液中に投与された抗体はBBB の先にある脳中のプラークに接近することが出来ない。
【００８７】
ADの抗体に基づく治療法はAβ ペプチドに対する能動的または受動的免疫化を含む。能動的免疫化において、対象は、アジュバント、例えば、フロイントアジュバントと共にAβペプチドにより免疫される。トランスジェニックマウスの能動的免疫化の結果、脳におけるアミロイド 負荷が減少し、これは能動的免疫化治療において形成される血液中の抗- Aβペプチド 抗体が免疫されたマウスにおいてBBBを通過することが出来たことの証拠である。アジュバント、例えば、 フロイントアジュバントの投与は、アジュバント 投与に対する炎症応答 を介してBBB の破壊をもたらすことが周知である。ADのヒトにおける能動的免疫化は以下のいずれかの理由で有効でないと考えられる： (a) ヒトにおいて使用されるアジュバントは非毒性であり、BBBは破壊されない、または、(b)アジュバントは毒性であり、アジュバントに対する炎症応答を介してBBBの開口をもたらす。BBBの開口は脳への血清タンパク質、例えば、アルブミンの侵入を可能とし、かかるタンパク質は脳細胞に対して毒性である。受動的免疫化において、抗-Aβペプチド 抗体が脳 アミロイドを有する対象に直接に投与され、これはADと類似の脳 アミロイドを有するトランスジェニックマウスにおいて行われた。しかし、マウスに投与しなければならない抗-Aβペプチド 抗体の用量は、血液から脳への方向での抗体分子の有意な輸送の不在のために禁制的に高い。 それゆえ、ADおよび脳 アミロイドを有するトランスジェニックマウスまたはヒトの能動的または受動的 免疫化における制限因子はBBB、および、血液から脳の方向にBBBを横切る抗体 分子の輸送の不在である。
【００８８】
本明細書において用いる場合、「抗-Aβペプチド 抗体」という語には、前駆体 抗-Aβペプチド 抗体の医薬上許容される塩、多形、水和物、溶媒和物、生理活性断片、生理活性変異体および立体異性体、ならびに、抗-Aβペプチド 抗体と交差反応する代替標的に対する抗体のアゴニスト、模倣体、およびアンタゴニスト 変異体、およびそのポリペプチド融合変異体が含まれる。変異体には、抗-Aβペプチド 抗体 前駆体の配列における１以上の 欠失、置換または挿入が含まれる。標的化物質も抗体である場合、例えば、MAb、例えば、HIRMAbが用いられる場合、さらなる融合タンパク質変異体が、融合タンパク質が高い親和性にて内在性受容体、例えば、HIRに結合してヒト BBBを横切る輸送を促進する限り、抗体、例えば、HIRMAbの軽鎖または重鎖のフレームワーク領域 (FR)または相補性決定領域 (CDR)内のアミノ酸の置換により作ることが出来る。 さらなる融合タンパク質 変異体は抗体医薬品をHIRMAbから分離しているリンカー ペプチドの組成または長さを変化させることにより作ることが出来る。
【００８９】
いくつかの態様において、抗-Aβペプチド抗体は、ハイブリドーマによって産生された元のマウス 抗-Aβペプチド 抗体由来の重鎖可変部(VH)および軽鎖可変部 (VL)から構成されるScFv 抗体である。抗-Aβペプチド 抗体のVHのアミノ酸配列を配列番号12に示す。抗-Aβペプチド 抗体のVLのアミノ酸配列を配列番号14に示す。17 アミノ酸 リンカーを介してVL 抗-Aβペプチド 抗体に連結した抗-Aβペプチド 抗体のVHであって、カルボキシル 末端に9E10 抗体のエピトープおよびポリ-ヒスチジン (H) テイルを含むもののアミノ酸配列を配列番号16に示す。17 アミノ酸 リンカーを介してVL 抗-Aβペプチド 抗体に連結した抗-Aβペプチド 抗体のVHであって、9E10 抗体のエピトープをカルボキシル 末端に、19 アミノ酸 IgG シグナル ペプチドをアミノ末端に含むもののアミノ酸配列を配列番号18に示す。
【００９０】
抗-Aβペプチド ScFv 抗体のVHは、FR1、FR2、FR3、および FR4と称される4つのフレームワーク領域(FR)、および、CDR1、CDR2、およびCDR3と称される3つの相補性決定領域(CDR)から構成される。抗-Aβペプチド ScFv 抗体のVLは、FR1、FR2、FR3、およびFR4と称される4つのFR、および、CDR1、CDR2、および CDR3と称される3つのCDRから構成される。これら14のサブドメインの関係を図 25に示す。14のサブドメインのいずれにおけるアミノ酸 置換も抗-Aβペプチド 結合特性を保持したまま行うことが出来る。
【００９１】
したがって、本発明に有用な抗-Aβペプチド 抗体には、本明細書において開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも 約 60%、少なくとも 約 70%、少なくとも 約 80%、少なくとも 約 90%、少なくとも 約 95%、少なくとも 約 99%、または95%を超えるまたは99%を超える 配列同一性、例えば、100% 配列同一性を有する抗体が含まれる。
【００９２】
パーセント配列同一性は常套の方法により決定される。例えば、Altschul et al.、Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、および Henikoff and Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照されたい。簡単に説明すると、２つのアミノ酸配列はギャップ開始ペナルティ 10、ギャップ伸長ペナルティ1、およびHenikoffおよびHenikoff (前掲)の「BLOSUM62」スコアリングマトリックスを用いてアラインメントスコアが最適となるようにアラインされる。パーセント同一性が次いで以下のように計算される: ([同一マッチの総数]/[より長い配列の長さ＋２つの配列をアラインするためにより長い配列に導入されたギャップの数])(100)。
【００９３】
当業者であれば、２つのアミノ酸配列をアラインするために利用可能な多くの確立したアルゴリズムが存在することを認識している。Pearsonおよび Lipmanの「FASTA」 類似性サーチアルゴリズムは、本明細書において開示するアミノ酸配列および別のペプチドのアミノ酸配列によって共有される同一性のレベルを調べるための好適なタンパク質アラインメント方法である。FASTA アルゴリズムは、Pearson and Lipman、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)、および Pearson、Meth. Enzymol. 183:63 (1990)に記載されている。簡単に説明すると、FASTAは、クエリー配列 (例えば、配列番号21または配列番号29) およびテスト配列によって共有される領域を同定することによりまず配列類似性を特徴付け、かかる領域は、保存的アミノ酸置換、挿入または欠失を考慮せずに最高密度の同一性 (ktup 変数が1である場合)または同一性のペア(ktup=2である場合)を有する。最高密度の同一性を有する１０の領域を次いですべてのペアとなったアミノ酸の類似性をアミノ酸置換マトリックスを用いて比較することにより再スコア付けし、そして領域の末端は最高のスコアに貢献する残基のみが含まれるように「トリミング」される。(配列の長さおよび ktup 値に基づいてあらかじめ決められた式により計算される) 「カットオフ」 値よりも大きいスコアを有するいくつかの領域が存在すれば、トリミングされた最初の領域がギャップを有する適当なアラインメントの形成のためにその領域を連結させてもよいかどうかを決定するために調べられる。最後に、２つのアミノ酸配列の最高のスコアをつける領域を、アミノ酸挿入および欠失を可能とするNeedleman-Wunsch-Sellers アルゴリズム (Needleman and Wunsch、J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers、SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974))の改変を用いてアラインする。FASTA 分析のための例示的なパラメーターは以下の通り: ktup=1、ギャップ開始ペナルティ=10、ギャップ伸長ペナルティ=1、および置換マトリックス=BLOSUM62。これらパラメーターをPearson、Meth. Enzymol. 183:63 (1990)のAppendix 2 に説明されているように スコアリングマトリックスファイル(「SMATRIX」)を改変することによってFASTA プログラムに導入するとよい。
【００９４】
本発明は、本明細書において開示するアミノ酸配列と比較して保存的アミノ酸変化を有するペプチドも含む。多くのかかる変化が具体的に記載されてきた。より一般的には、例えば、配列番号22の１以上のアミノ酸置換を含む変異体を得ることが出来る。かかる変異体において、例えば、アルキルアミノ酸が抗-Aβペプチド 抗体アミノ酸配列のVHまたはVLにおけるアルキル アミノ酸を置換し、芳香族アミノ酸が抗-Aβペプチド抗体アミノ酸配列における芳香族アミノ酸を置換し、硫黄含有アミノ酸が抗-Aβペプチド抗体アミノ酸配列における硫黄含有 アミノ酸を置換し、ヒドロキシ-含有アミノ酸が抗-Aβペプチド 抗体 アミノ酸配列におけるヒドロキシ-含有アミノ酸を置換し、酸性アミノ酸が抗-Aβペプチド 抗体 アミノ酸配列における酸性アミノ酸を置換し、塩基性アミノ酸が抗-Aβペプチド 抗体 アミノ酸配列における塩基性アミノ酸を置換し、または 二塩基性 モノカルボキシルアミノ酸が抗-Aβペプチド 抗体 アミノ酸配列における二塩基性 モノカルボキシルアミノ酸を置換する。一般的なアミノ酸のなかで、例えば、「保存的アミノ酸置換」は、以下の群のいずれかに含まれるアミノ酸のなかでの置換により例示される: (1) グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、(2) フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(3) セリンおよびスレオニン、(4) アスパラギン酸およびグルタミン酸、(5) グルタミンおよびアスパラギン、および(6) リシン、アルギニンおよびヒスチジン。BLOSUM62 表は、関連するタンパク質の500 を超える群の高度に保存された領域を代表するタンパク質 配列 セグメントの約 2,000のローカル複数 アラインメントに由来するアミノ酸 置換 マトリックスである(Henikoff and Henikoff、Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89:10915 (1992))。したがって、BLOSUM62 置換頻度は、本発明のアミノ酸配列に導入しうる保存的アミノ酸置換を規定するために利用することが出来る。化学的性質 (上記のように)のみに基づいてアミノ酸置換を設計することが可能であるが、「保存的アミノ酸置換」という語は、好ましくは-1より大きいBLOSUM62 値によって表される置換をいう。例えば、置換が 0、1、2、または3のBLOSUM62 値によって特徴づけられるならばあるアミノ酸置換は保存的である。このシステムによると、好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも 1 (例えば、1、2または3)のBLOSUM62 値によって特徴づけられ、より好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも 2 (例えば、2 または3)のBLOSUM62 値によって特徴づけられる。さらに、保存的アミノ酸置換の設計において、突然変異許容予測プログラムを、作成される機能的な配列変異体の数を大幅に増やすために利用できる。タンパク質機能に対するタンパク質 配列におけるアミノ酸置換の効果を予測するための様々なプログラムが例えば、Henikoff et al.  (2006)、“Predicting the Effects of Amino Acid Substitutions on Protein Function，” Annu．  Rev． Genomics Hum.  Genet.、7:61-80に記載されている。かかるプログラムには、例えば、SIFT、PolyPhen、PANTHER PSEC、PMUT、およびTopoSNPが含まれる。これらプログラムはウェブ上に公表されているものから入手できる。
【００９５】
アミノ酸配列はさらなる残基、例えば、 さらなるN-またはC-末端アミノ酸を含んでいてもよいことが理解され、その配列が本発明の組成物および方法において機能的であるために十分なタンパク質生理活性を保持する限り、本明細書において開示される配列のいずれかに実質的に示されることになる。
【００９６】
V. 組成物
本発明の組成物は以下の１以上において有用である:血液から脳への方向にてBBBを横切って物質、例えば、抗体を輸送すること;脳から血液の方向にてBBBを横切って物質、例えば、抗体を輸送すること; および/またはBBBを横切っていったん輸送された物質、例えば、抗体の活性を保持すること。
【００９７】
血液から脳への方向にてBBBを横切って物質を輸送するのに有用な構造としては、内在性 BBB 受容体-媒介トランスポーター、例えば、インスリン トランスポーター、トランスフェリントランスポーター、レプチントランスポーター、LDL トランスポーター、およびIGF 受容体からなる群から選択されるトランスポーター上で血液脳関門を通過することができる構造が挙げられる。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体-媒介トランスポーターは、インスリン トランスポーターおよびトランスフェリントランスポーターからなる群から選択される。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体-媒介トランスポーターは、インスリン トランスポーター、例えば、ヒト インスリン トランスポーターである。したがって、組成物が抗体融合タンパク質である態様において、血液から脳への方向にてBBBを横切る輸送を媒介する抗体融合タンパク質の部分は免疫グロブリンであり、内在性 BBB 受容体媒介輸送系に対する抗体である。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系は、BBB インスリン受容体、BBB トランスフェリン受容体、BBB レプチン 受容体、BBB IGF 受容体、または BBB リポタンパク質受容体からなる群から選択される。いくつかの態様において、抗体は、内在性 インスリン BBB 受容体媒介輸送系に対する抗体である。抗体は本明細書において記載されるいずれの好適な抗体であってもよい。 BBB を通過することができる構造は、抗体、例えば、MAb、例えば、キメラ MAbでありうる。抗体は、本明細書において記載するように内在性 BBB 受容体-媒介トランスポーターに対する抗体であり得る。
【００９８】
いくつかの態様において、本発明は、CNSから血液へとBBBを横切って輸送することが出来る組成物、例えば、融合タンパク質、例えば、両方向にてBBBを横切ることが出来る組成物を提供する。したがって、いくつかの態様において、組成物はまた、CNSから血液へとBBBを通過することができる構造も含む。BBBをCNSから血液へと通過することができるあらゆる好適な構造を利用することが出来る。いくつかの態様において、本発明は、Fc 受容体を介してCNSから血液へとBBBを通過することができる構造を利用する。BBB はFc 受容体 (FcR)、および新生児 FcRまたはFcRnを発現し、この FcRが、IgG 分子の脳から血液への一方向性の 流出を媒介する。例えば、引用により本明細書に含まれる、Zhang、Y. and Pardridge、W.M. (2001): Mediated efflux of IgG molecules from brain to blood across the blood-brain barrier. J Neuroimmunol、114: 168-172、および Schlachetzki、F.、Zhu、C. and Pardridge、W.M. (2002): Expression of the neonatal Fc receptor (FcRn) at the blood-brain barrier. J Neurochem、81: 203-206を参照されたい。BBB FcRは、血液から脳へのIgG 分子の流入を媒介しない。FcR は、重鎖のFc 部分のCH2および CH3 領域の境界にてIgG 分子に結合する。例えば、引用により本明細書に含まれるMartin、W.L.、West、A.P.、Jr.、Gan、L. and Bjorkman、P.J. (2001): Crystal strucrture at 2.8 A of an FcRn/heterodimeric Fc complex: mechanism of pH-dependent binding. Mol Cell、7: 867-877を参照されたい。したがって、いくつかの態様において、重鎖のFc 部分のCH2 および CH3 領域の境界は本発明の組成物をCNSから血液へと BBBを横切って輸送しうる構造として働く。例えば、図25および26に示すような融合 抗体においてインタクトな重鎖のFc 部分のCH2およびCH3 領域の境界は、かかる構造である。
【００９９】
BBBをCNSから血液へと横切る構造、例えば、CH2 およびCH3 領域の境界は、血液からCNSへBBBを横切る構造、例えば、受容体媒介BBB輸送系、例えばHIR系に対する抗体の部分であり得ることが認識される。
【０１００】
凝集(aggregate) 疾患を治療するのに用いられる態様において、それがFcRを介する脳から血液へ戻る融合抗体の排出のためのものでなければ、タンパク質凝集からの単量体タンパク質のクリアランスはほとんどまたは全くないであろう。多くの脳疾患は脳における凝集したタンパク質の徐々の沈積によっておこされる「凝集」疾患である。ADの凝集はAβアミロイドペプチドによって形成される; PDの凝集はα-シヌクレイン および/または パーキンによって形成される; 狂牛病の凝集はPrp スクレイピー タンパク質によって形成される; HDの凝集はハンチンチン タンパク質によって形成される。これら凝集の単量体に対する抗体は、実施例および図 41においてAβ 凝集について例示するように凝集を溶解することが出来る。凝集したタンパク質の融合抗体による結合の後に、融合抗体および凝集前駆体の複合体が、図 27に示すようにBBBを横切って脳から排出されて血液へ戻る。
【０１０１】
実施例は、融合抗体が高い親和性にてHIRに結合すること、および融合抗体がBBBをこの受容体を介して横切ることを示している。しかし、融合抗体がいったん脳における凝集したタンパク質に結合すると、融合抗体は図 27に示すように脳から流出して血液に戻ることが出来なければならない。
【０１０２】
いくつかの態様において、BBBを通過することができる構造は、内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、LDL 受容体、または IGF 受容体を利用する系を利用する。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。いくつかの態様において、BBBを通過することができる構造は抗体、例えば、モノクローナル抗体 (MAb)、例えば、キメラ MAbである。抗体は、ヒトへの投与に好適な十分なヒト 配列を有するキメラ 抗体であり得る。抗体はグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい; いくつかの態様において、抗体は、例えば、CHO 細胞におけるその合成によって生産されるグリコシル化 パターンにてグリコシル化されている。構造が抗体である態様において、抗体と神経治療剤との間の共有結合は、抗体物質融合が血液脳関門を横切り、抗体医薬品物質がCNS内部でのその活性の治療的に有用な部分を保持する限り、抗体と抗体医薬品物質のいかなる好適な部分の間の結合であってもよい。特定の態様において、共有結合は標的化抗体の１以上の軽鎖と抗体医薬品物質との間のものである。
【０１０３】
いくつかの態様において、BBBを通過することができる２以上のタイプの構造、例えば、分子トロイの木馬を使用することができる。 異なる構造が単一の抗体医薬品物質、例えば、単一のScFv、例えば、抗-Aβ ScFvに共有結合していてもよいし、複数のScFv、またはそれらのあらゆる組合せに共有結合していてもよい。したがって、例えば、いくつかの態様において、それぞれのMTHに対して同じScFvが結合するか、異なるScFvが結合するか、またはScFvの組合せが結合する。したがって、抗体医薬品は血液脳関門を横切る受容体-媒介輸送を経る複数の分子トロイの木馬に融合していてもよく、例えば、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン-様増殖因子 (IGF) 受容体、または低密度リポタンパク質 (LDL) 受容体に対するモノクローナル抗体、またはインスリン、トランスフェリン、IGFまたはLDLを含む内在性 リガンドが挙げられる。吸収性-媒介輸送を介して血液脳関門を横断するリガンドも分子トロイの木馬として利用することが出来、例えば、 カチオン性タンパク質、または膜レクチンに結合するタンパク質を担持する炭水化物が挙げられる。分子トロイの木馬の分子量範囲は1000 ダルトンから 500,000 ダルトンである。
【０１０４】
BBBを通過することができる構造と抗体医薬品物質との間の共有結合は直接的(例えば、一つのペプチドの末端アミノ酸とそれが連結するもう一つのペプチドの末端アミノ酸との間のペプチド結合) または、リンカーを介した間接的なものであり得る。リンカーを用いる場合、それはいかなる好適なリンカーであってもよく、例えば、ペプチド リンカーが挙げられる。ペプチド リンカーが用いられる場合、それは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または10を超えるアミノ酸の長さであり得る。いくつかの態様において、２アミノ酸 リンカーが用いられる。いくつかの態様において、リンカーは配列 ser-serを有する。共有結合は切断可能であるが、しかしこれはいくつかの態様において系の活性には要求されない; 実際、本発明のこれらの態様の利点は、融合タンパク質は、切断されずに、いったんBBBを横切っても輸送および活性の両方について部分的または完全に活性であることである。
【０１０５】
いくつかの態様において、非共有結合を使用してもよい。MTH、例えば、MAbの高分子治療用神経保護因子との非共有結合の例は、アビジン/ストレプトアビジン-ビオチン結合である。かかるアプローチはさらにその内容全体を引用により本明細書に含める「Drug delivery of antisense oligodeoxynucleotides and peptides to tissues in vivo and to cells using avidin-biotin tecnology」という標題の米国特許出願6,287,792号に記載されている。
【０１０６】
BBBを横切って輸送される物質は、かかる輸送が一方または両方の方向にて望まれるいずれの好適な物質であってもよい。例えば、物質は、治療剤、診断剤、またはリサーチ剤でありうる。輸送のために特に有用な物質には、CNSにて活性な抗体、例えば、抗体医薬品が含まれる。
【０１０７】
CNSにて活性な抗体医薬品は、神経治療剤、例えば、脳における不溶性タンパク質を脱凝集させる抗体であり得る。いくつかの態様において、抗体医薬品は、ADの診断または治療のためのアルツハイマー病 (AD)のAβ アミロイドペプチドに対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、PDの診断または治療のためのパーキンソン病 (PD)のα-シヌクレインに対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、HDの 診断または治療のためのハンチントン病 (HD)のハンチンチン タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、スクレイピーと同等なヒト疾患の診断または治療のためのスクレイピーまたは狂牛病のPrp タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、西ナイル脳炎の診断または治療のための西ナイルウイルスのエンベロープ タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳に感染する、後天性免疫不全症候群 (AIDS)の診断または治療のための腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド (TRAIL) に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳傷害、脊髄傷害、または脳卒中の診断または治療のためのnogo A タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳に転移する乳癌の診断または治療のためのHER2 タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳の原発性癌または脳の転移性癌の診断または治療のための発癌 受容体 タンパク質、例えば、上皮増殖因子受容体 (EGFR) に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳の原発性癌または脳の転移性癌の診断または治療のための発癌 増殖因子、例えば、上皮増殖因子 (EGF) または肝細胞増殖因子 (HGF) に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脱髄性 疾患、例えば、 多発性硬化症の診断または治療のためのオリゴデンドロサイト表面抗原に対するものである。いくつかの態様において BBBを通過することができる構造と神経治療剤とはペプチド リンカーによって共有結合している。
【０１０８】
特に有用な抗体構造はScFvである。いくつかの態様において、２以上の分子の同じ治療用ScFv 物質がBBBを横切る構造に結合される。例えば、ScFvが抗体に結合している本発明の組成物において、１分子 のScFvがそれぞれ重鎖に結合しており、天然にホモ二量体構造を作る。ScFvの二量体立体配置が高い抗原結合力のために要求される場合はこれは望ましい。しかし、二量体立体配置が要求されなければ、２つの異なる抗原特異性を有する２つの異なるScFv 分子を標的化抗体の重鎖に融合させるとよい。２つのScFv 分子の間の天然 ホモ二量体構造は、図 26に示すように ScFv がIgG 分子のCH3 領域のカルボキシル 末端に融合した場合に形成される。理論に拘束されることなく、これによりAβ アミロイドペプチドに対する融合抗体の実質的に100%の結合活性の予期せぬ知見を説明しうると考えられる (例えば、図34を参照されたい)。
【０１０９】
いくつかの態様において、２以上の タイプの ScFv 物質を血液脳関門を通過することができる構造に結合させてもよい。いくつかの態様において、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または10を超える異なるScFv 物質を、血液脳関門を通過することができる構造に結合させてもよい。特定の態様において、２つの異なるScFvを内在性 BBB 受容体媒介輸送系に対する抗体に結合させる。ScFv のあらゆる組合せを利用できる。特定の複数のScFvはヘテロ二量体構造を形成することが出来、いくつかの態様において、本発明は、抗体、例えば、 HIRMAbの１つの鎖 (例えば重鎖)に融合した１つのScFv 単量体、および抗体の第二の鎖に融合した別のScFv 単量体から構築される融合タンパク質を提供する。典型的には、分子トロイの木馬に融合されうる複数の組換え ScFvの分子量範囲は1000 ダルトンから500,000 ダルトンである。
【０１１０】
血液からCNSおよびCNSから血液へとBBBを横切る組成物
一つの側面において、本発明は以下を含む組成物を提供する：(i) 第１の受容体媒介BBB輸送系を介して血液から脳へとBBBを通過することができる第１の部分;第１の部分に結合した(ii)第２の受容体媒介BBB輸送系を介して脳から血液へとBBBを通過することができる第２の部分。いくつかの態様において、組成物はさらに以下を含む：(iii) 中枢神経系成分と相互作用することができる第３の部分。組成物は、タンパク質、例えば、抗体コンストラクトを含みうる。いくつかの態様において、第１の部分は、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、リポタンパク質受容体、またはIGF 受容体である内在性 BBB 受容体媒介輸送系上でBBBを通過することができる。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。いくつかの態様において、第２の受容体媒介BBB輸送系はFc 受容体系を含む。いくつかの態様において、第１および第２の部分は抗体構造の部分であり、例えば、第２の部分は抗体構造のCH2-CH3 領域を含む。いくつかの態様において、第３の部分は、抗体、抗体 断片、またはScFvを含む。中枢神経系成分と相互作用することができる第３の部分を含む態様において、中枢神経系成分は、脳障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症に関係する病理学的物質でありうる。病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物 ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、またはそれらの組合せの１以上でありうる。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、例えば、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチン タンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド (TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質はAβ アミロイドである。
【０１１１】
いくつかの態様において、本発明は以下を含む組成物を提供する：(i)第１の受容体媒介BBB輸送系を介して血液から脳へとBBBを通過することができる第１の部分; 第１の部分と結合して、(ii)第２の受容体媒介BBB輸送系を介して脳から血液へとBBBを通過することができる第２の部分; および、 (iii)中枢神経系成分と相互作用することができる第３の部分、ここで、第１の部分および第２の部分は抗体の部分であり、第３の部分はScFvである。抗体は、内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、インスリン BBB 受容体媒介輸送系、例えば、ヒト インスリン 受容体媒介輸送系に対するものでありうる。いくつかの態様において、ScFv は、ADのAβ アミロイドペプチドに対するScFvである。
【０１１２】
いくつかの態様において、本発明は、融合タンパク質を含む組成物を提供し、ここで標的化MAbは、抗-Aβ ScFvに連結したヒト インスリン BBB 受容体媒介輸送系に対する抗体である。ScFvは、そのアミノ末端を介して抗体の重鎖のカルボキシ末端に ser-ser リンカーにより連結している。抗体は、ヒトへの投与に好適な十分なヒト 配列を有するキメラ 抗体であり得る。いくつかの態様において、本発明は、重鎖-ScFv 融合タンパク質および分離した共有結合した軽鎖を有する融合 MAbを含む組成物を提供し、ここで、軽鎖は配列番号29のアミノ酸21-234に対して少なくとも 約 60%、または約 70%、または約 80%、または約 90%、または約 95%、または約 99%同一であるか、あるいは実質的に100% 同一であり、重鎖-ScFv 融合は配列番号22のアミノ酸20-708に対して少なくとも 約 60%、または約 70%、または約 80%、または約 90%、または約 95%、または約 99% 同一であるかあるいは実質的に100%同一である。
【０１１３】
本発明はまた、ヒト BBB インスリン受容体に対するキメラ MAbに共有結合した抗体医薬品を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、MAbの重鎖は医薬抗体に共有結合しており、融合タンパク質を形成する。抗体医薬品は本明細書において記載するいずれの抗体医薬品であってもよく、即ち、BBBを横切る輸送が望ましいいずれの抗体医薬品であってもよい。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳における凝集したタンパク質、例えば、AD におけるようなAβ アミロイドに対する抗体である。
【０１１４】
両方向にてBBBを横切り、CNS 成分と相互作用することができる組成物
一つの側面において、本発明は、以下を含む組成物を提供する：(i)血液から脳へとBBBを通過することができる第１の部分; (ii)中枢神経系成分と相互作用することができる第２の部分;および、(iii)脳から血液へとBBBを通過することができる第３の部分、ここで、第１、第２および第３の部分は連結しており、第１、第２および第３の部分は同一ではなく、共通の構造を共有しない。いくつかの態様において、組成物は非天然組成物である。いくつかの態様において、第１および第３の部分は、タンパク質、例えば、抗体、例えば、mAbを含む。いくつかの態様において、第１、第２および第３の部分は共有結合している。いくつかの態様において、第１の部分は、内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、リポタンパク質受容体、またはIGF 受容体を介して血液から脳へとBBBを通過することができる。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系は、インスリン BBB 受容体媒介輸送系である。いくつかの態様において、第２の部分は、抗体、抗体断片、またはScFvを含む。第２の部分が相互作用する中枢神経系成分は、脳障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症に関係する病理学的物質を含みうる。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプものであり、例えば、タンパク質、例えば、 Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチン タンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質はAβ アミロイドである。いくつかの態様において、第３の部分は、受容体媒介BBB輸送系、例えば、 Fc 受容体系を介して脳から血液へとBBBを通過することができる構造を含み、例えば、抗体構造の部分である構造、例えば、抗体構造のCH2-CH3 領域である。
【０１１５】
免疫グロブリンに結合しており活性/親和性を保持しているScFvを含む組成物 
別の側面において、本発明は、抗原に結合するScFvを含む組成物を提供し、ここで、(i) ScFvは第１の免疫グロブリン由来であり、(ii) ScFvは第２の免疫グロブリンと結合しており、ここで、第２の免疫グロブリンは、 所望によりそのネイティブな形態から改変された免疫グロブリンであり;および (iii)その抗原に対するScFvの親和性は、ScFvが由来する第１の免疫グロブリンの約 10、 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、または120%を超える。いくつかの態様において、ScFvは第２の免疫グロブリンに共有結合しており、例えばそのアミノ末端にて第２の免疫グロブリンに、またはそのカルボキシ末端にて第２の免疫グロブリンに共有結合している。 ScFvは第２の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のカルボキシ末端に、例えば、第２の免疫グロブリンの重鎖のカルボキシ末端に結合していてよい。ScFvはまた、第２の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のアミノ末端に結合していてもよい。いくつかの態様において、ScFvは第２の免疫グロブリンの重鎖のCH3 領域に結合している。いくつかの態様において、第２の免疫グロブリンは、重鎖が切断され、ScFvが切断型重鎖のカルボキシ末端に結合するように改変されたものである。これら態様のいくつかにおいて、ScFv は切断型重鎖のカルボキシ末端に結合しており、重鎖はそのカルボキシ末端が、CH1、ヒンジ、CH2、および CH3 領域からなる群から選択されるネイティブな 重鎖の領域に位置するように切断されている。いくつかの態様において、ScFvは第２の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のアミノ末端に結合している。いくつかの態様において、ScFvは、脳に存在する病理学的物質に対する抗体に由来し、ここで、病理学的物質は、脳障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症に関係するものである。病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものであり得、例えば、タンパク質、例えば、 Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチン タンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド (TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。
【０１１６】
ScFv 抗体医薬品物質の場合(例えば、ADのAβ ペプチドに対するScFvの場合)、ScFvは、標的化抗体の軽鎖 (LC)または重鎖 (HC)のカルボキシまたはアミノ末端に、そのカルボキシまたはアミノ末端によって共有結合していてよい。あらゆる好適な結合が利用でき、例えば、軽鎖のカルボキシ末端 とScFvのアミノ末端、重鎖のカルボキシ末端とScFvのアミノ末端、軽鎖のアミノ末端とScFvのカルボキシ末端、重鎖のアミノ末端 とScFvのカルボキシ末端、軽鎖のカルボキシ末端とScFvのカルボキシ末端、重鎖のカルボキシ末端とScFvのカルボキシ末端、軽鎖のアミノ末端とScFvのアミノ末端、または重鎖のアミノ末端とScFvのアミノ末端との結合が挙げられる。いくつかの態様において、結合はHCのカルボキシ末端からScFvのアミノ末端へのものであり、ここでVHがScFvのVLに先行する。別の態様において、VLがScFvのVHに先行しうる。末端アミノ酸同士の結合は要求されず、本発明の要求を満たすあらゆる結合が利用できることが認識される;ペプチドの非末端アミノ酸間のかかる結合は当業者によって容易に達成される。
【０１１７】
いくつかの態様において、本発明は、ADのAβ アミロイドペプチドに対するScFvを利用する。驚くべきことに、ScFvのこれら形態の融合タンパク質は、通常または通常よりも大きい輸送および活性を保持していることが判明した。Aβ アミロイドペプチドに対する抗体融合タンパク質の親和性がAβ アミロイドペプチドに対する元の50 kDa マウス MAbの親和性と同じであることは驚くべきことである。というのは、融合タンパク質はAβ アミロイドペプチドに対する元のマウス MAbに由来するScFvから構成されるからである。一般に、標的抗原に対するScFvの親和性 および/または 結合力は元のMAbと比較して低下している。標的抗原に対する高い結合力は、インタクトな 150 kDa MAbおよび抗原の間の二価の相互作用に由来する。一方、ScFvと抗原との相互作用は一価である。さらに、ScFvが別の抗体と融合すると、標的抗原に対するScFv の親和性は低下することが一般に認識されている。しかし、図 26に示す融合抗体の設計においては、抗原とScFvとの二価の相互作用が回復している。この新しい遺伝子操作された 抗体融合タンパク質の生産は、以下のような三機能性分子を作り出す：(i)高い親和性にて HIRに結合し、血液から脳へのBBBを横切っての流入をもたらす、(ii)高い親和性にてFcRに結合し、脳から血液へのBBBを横切っての流出をもたらす、および (iii) ADの Aβ アミロイドペプチドに高い親和性にて結合し、アミロイド プラークの脱凝集をもたらす。
【０１１８】
驚くべきことに、本発明の多機能性 抗体融合タンパク質、例えば、三機能性 融合タンパク質は、別々の部分、例えば、 BBBを通過することができる部分、およびCNSにおいて活性な部分の活性の高い割合を保持していることが判明した。したがって、本発明はさらに、中枢神経系 (CNS)にて活性の抗体医薬品に共有結合したいずれかの方向にてBBBを通過することができる構造を含む融合タンパク質を提供し、ここで血液脳関門 を通過することができる構造および中枢神経系にて活性である抗体医薬品はそれぞれ、別々の部分としてのそれらの活性と比較して、平均で少なくとも 約 10、 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、または120%のそれらの活性を保持している。いくつかの態様において、本発明は、中枢神経系 (CNS)にて活性である抗体医薬品に共有結合したBBBを通過することができる構造を含む融合タンパク質を提供し、ここで 血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系にて活性である抗体医薬品はそれぞれ別々の部分としてのそれらの活性と比較して平均で少なくとも 約 50% のそれらの活性を保持している。いくつかの態様において、本発明は、中枢神経系 (CNS)にて活性である抗体医薬品に共有結合したBBBを通過することができる構造を含む融合タンパク質を提供し、ここで 血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系にて活性である抗体医薬品はそれぞれ別々の部分としてのそれらの活性と比較して平均で少なくとも 約 60% のそれらの活性を保持している。いくつかの態様において本発明は、中枢神経系 (CNS)にて活性である抗体医薬品に共有結合したBBBを通過することができる構造を含む融合タンパク質を提供し、ここで 血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系にて活性である抗体医薬品はそれぞれ別々の部分としてのそれらの活性と比較して平均で少なくとも 約 70% のそれらの活性を保持している。いくつかの態様において、本発明は、中枢神経系 (CNS)にて活性である抗体医薬品に共有結合したBBBを通過することができる構造を含む融合タンパク質を提供し、ここで 血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系にて活性である抗体医薬品はそれぞれ別々の部分としてのそれらの活性と比較して平均で少なくとも 約 80% のそれらの活性を保持している。いくつかの態様において、本発明は、中枢神経系 (CNS)にて活性である抗体医薬品に共有結合したBBBを通過することができる構造を含む融合タンパク質を提供し、ここで 血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系にて活性である抗体医薬品はそれぞれ別々の部分としてのそれらの活性と比較して平均で少なくとも 約 90% のそれらの活性を保持している。いくつかの態様において、血液脳関門を通過することができる構造は、別々の部分としてのその活性と比較して少なくとも 約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、または100% のその活性を保持しており、中枢神経系にて活性である抗体医薬品は、別々の部分としてのその活性と比較して少なくとも 約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、または100%のその活性を保持している。
【０１１９】
本明細書において用いる場合、「活性」には、生理学的活性 (例えば、BBBを横切る能力 および/または治療活性)、およびそれらそれぞれの 受容体または標的抗原に対する構造の結合親和性が含まれる。
【０１２０】
BBBを横切ってBBBを通過することができる構造の輸送を、構造のみおよび本発明の融合構造の部分としての構造について標準的方法によって比較することが出来る。例えば、モデル動物、例えば、哺乳類、例えば、霊長類による、融合構造、例えば、融合タンパク質の薬物動態学および脳への取り込みを用いることが出来る。かかる技術は実施例 10に示されており、これは、精製ヒトインスリン受容体に対する抗体融合タンパク質の結合を実証する。同様に、抗体医薬品の機能、例えば、抗体治療剤の治療または保護機能についての標準的モデルを、物質のみの機能および本発明の融合構造の部分としての物質の機能を比較するのに用いることが出来る。例えば、実施例 10を参照されたい。これは、マウス 抗-Aβ MAbのみおよびこのマウス 抗-AβMAb由来ScFvであって、ScFvがモデル系(Aβ ペプチド 結合)において融合タンパク質に結合しているものの活性を実証する。実施例 10、実施例 11、および実施例 12において、本発明の融合タンパク質は、その個々の成分、即ち、BBBを通過することができる構造 (ヒトインスリン受容体に対するMAb) および抗-Aβ ScFv 抗体医薬品の輸送能力および治療機能の約 50-100%を保持している。
【０１２１】
あるいは、機能アッセイを活性のマーカーとして利用できる。融合タンパク質の霊長類 BBBを横切るインビボの輸送が実施例 11においてキメラ HIRMAbと比較される。抗体融合タンパク質およびキメラ HIRMAbの血液薬物動態学、および脳への取り込みのパターンは平均してほぼ同一である。AD 脳の剖検切片におけるアミロイドに対する融合抗体の結合が、マウス 抗-Aβ MAbおよび融合タンパク質について実施例 10、実施例 13、および実施例 14において比較される。抗体のADのアミロイド プラークに対する結合は同程度である。「平均」測定は、少なくとも３つの別々の実験の平均である。
【０１２２】
抗体を脳から血液へ輸送するための組成物
別の側面において、本発明は、脳から血液へと BBBを横切って抗体構造を輸送することが出来る部分を含む非天然組成物を提供する。いくつかの態様において、輸送はBBB FcRを介する。いくつかの態様において、抗体構造は、治療用または診断用抗体構造、例えば、病理学的物質と相互作用する治療用または診断用抗体構造であり、ここで、病理学的物質は、脳障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症と関係する。病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、またはそれらの組合せの１以上であり得る。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、例えば、 Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチン タンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド (TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質はAβ アミロイドである。抗体構造は一本鎖 Fv 抗体 (ScFv)であってもよい。治療用抗体構造または診断用抗体構造は、血液脳関門 (BBB)を通過することができる構造と連結されうる。抗体構造を脳から血液へと BBBを横切って輸送することが出来る部分はFc 受容体と相互作用することが出来る。
【０１２３】
組成物はさらに、BBBを血液から脳へと通過することができる部分を含み得、例えば、 BBBを通過することができる部分は、内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、 インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、リポタンパク質受容体、またはIGF 受容体上でBBBを横切る。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。
【０１２４】
ScFv ペプチド配列を含む組成物 
さらに別の側面において、本発明はScFvを含む組成物を提供し、ここでScFv のVH 領域は、配列番号12と少なくとも 80、90、95、または99%同一な配列を含む。いくつかの態様において、ScFvのVL 領域は、配列番号14と少なくとも 80、90、95、または99%同一な配列を含む。ScFvは、Ab、例えば、MAbに連結しうる。AbまたはMAbは、内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、 インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、リポタンパク質受容体、またはIGF 受容体に対するものである。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。結合は共有結合であり得る。いくつかの態様において、ScFvは、AbまたはMAbの軽鎖のカルボキシ末端に連結している。いくつかの態様において、ScFvは、そのアミノ末端を介してAbまたはMAbの軽鎖のカルボキシ末端に連結している。いくつかの態様において、ScFvはそのカルボキシ末端を介してAbまたはMAbの軽鎖のカルボキシ末端に連結している。いくつかの態様において、ScFvは、AbまたはMAbの重鎖のカルボキシ末端に連結している。いくつかの態様において、ScFvはそのアミノ末端を介してAbまたはMAbの重鎖のカルボキシ末端に連結している。いくつかの態様において、ScFvはそのカルボキシ末端を介してAbまたはMAbの重鎖のカルボキシ末端に連結している。
【０１２５】
いくつかの態様において、本発明はScFvを含む組成物を提供し、ここでScFv のVH 領域は以下を含む： (i) 配列番号12のアミノ酸26-35の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR1 配列; (ii)配列番号12のアミノ酸50-66の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR2 配列; および(iii)配列番号12のアミノ酸99-103の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR3 配列。
【０１２６】
いくつかの態様において、本発明はScFvを含む組成物を提供し、ここでScFvのVL 領域は以下を含む (i)配列番号14のアミノ酸24-39の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR1 配列; (ii)配列番号14のアミノ酸55-61の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR2 配列;および(iii)配列番号14のアミノ酸94-102の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR3 配列。
【０１２７】
末梢投与の後に脳における抗体の分布を達成することが出来る組成物 
別の側面において、本発明は、治療用抗体構造または診断用抗体構造を含む組成物を提供し、ここで、組成物は、末梢投与の後に少なくとも 約 20、30、40、50、60、70、80、80、90、または100 uL/グラム 脳の神経治療用抗体構造または診断用抗体構造の脳における平均分布容積を達成することができるものである。いくつかの態様において、治療用抗体構造または診断用抗体構造は、脳に存在する病理学的物質に結合することができるものであり、ここで、病理学的物質は、脳障害、例えば、 アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症に関係する。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物 ポリマー、脂質、糖脂質、 低分子、またはそれらの組合せである。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、例えば、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチン タンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド (TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質はAβ アミロイドである。いくつかの態様において、治療用抗体構造は一本鎖 Fv 抗体 (ScFv)である。いくつかの態様において、治療用抗体構造または診断用抗体構造は、血液脳関門 (BBB)を通過することができる構造に連結(例えば、共有結合)しており、例えば、BBBを通過することができる構造はBBBを内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、リポタンパク質受容体、またはIGF 受容体上で横切る。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。いくつかの態様において、BBBを通過することができる構造は、血液から脳へおよび脳から血液へとBBBを通過することができる。これらの態様のいくつかにおいて、BBBを通過することができる構造は、BBBを血液から脳へと第１の受容体媒介輸送系 を介して、および脳から血液へと第２の受容体媒介輸送系を介して通過することができる。第１の受容体媒介輸送系は、例えば、 インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、リポタンパク質受容体、またはIGF 受容体であり得る。いくつかの態様において、第１の受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。いくつかの態様において、第２の受容体媒介輸送系はFc-受容体媒介輸送系である。BBBを通過することができる構造は抗体、例えば、本明細書において記載するようにmAbであり得る。
【０１２８】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、血液脳関門 (BBB)を通過することができる構造に共有結合した抗体医薬品物質を含む組成物を提供し、ここで、組成物は末梢投与の後に、抗体医薬品の脳分布容積の約 20、30、40、50、60、70、80、80、90、または100 uL/グラム 脳を超える平均上昇をもたらすことができるものである。本発明はまた、ヒト BBB インスリン受容体に対するキメラ MAbに共有結合した抗体医薬品を含む組成物を提供する。本発明はさらに、中枢神経系(CNS)にて活性である抗体医薬品に共有結合したBBBを通過することができる構造を含む融合タンパク質を提供し、ここで、血液脳関門を通過することができる構造および中枢神経系にて活性である抗体医薬品は別々の部分としてのそれらの活性と比較してそれぞれそれらの活性を平均して少なくとも 約 10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99、100、110、または120%保持する。本発明はまた、１以上の本発明の組成物および医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物も提供する。
【０１２９】
いくつかの態様において、本発明は、血液脳関門 (BBB)を通過することができる構造に共有結合した抗体医薬品物質を含む組成物を提供し、ここで組成物は、末梢投与の後、抗体医薬品物質の少なくとも 約 20、30、40、50、60、70、80、80、90、または100 uL/グラム 脳の、脳における分布容積の平均上昇をもたらすことができるものである。
【０１３０】
物質の「上昇」は、様々な個体に単独で投与した医薬抗体 (即ち、BBBを通過することができる構造に共有結合していない)の濃度と比較しての医薬抗体の脳分布容積の増加である。上昇が測定される個体は、哺乳類、例えば、ラット、または、好ましくは、霊長類、例えば、サルである。医薬抗体のレベルの上昇 の測定の例を図 38に示す。
【０１３１】
抗体医薬品物質は本明細書において記載するようないずれの好適な抗体物質でもよい。いくつかの態様において、抗体医薬品は、ADの診断または治療のためのアルツハイマー病 (AD)のAβ アミロイドペプチドに対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、PDの診断または治療のためのパーキンソン病 (PD)のα-シヌクレインに対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、HDの診断または治療のためのハンチントン病 (HD)のハンチンチン タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、スクレイピーに相当するヒト疾患の診断または治療のためのスクレイピーまたは狂牛病のPrp タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、西ナイル脳炎の診断または治療のための西ナイルウイルスのエンベロープ タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳に感染する後天性免疫不全症候群 (AIDS) の診断または治療のための腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL) に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳傷害、脊髄傷害、または脳卒中の診断または治療のためのnogo A タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳に転移する乳癌の診断または治療のためのHER2 タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳の原発性癌または脳の転移性癌の診断または治療のための発癌 受容体 タンパク質、例えば、上皮増殖因子受容体 (EGFR) に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳の原発性癌または脳の転移性癌の診断または治療のための発癌 増殖因子、例えば、上皮増殖因子 (EGF)または肝細胞増殖因子 (HGF) に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脱髄性 疾患、例えば、 多発性硬化症の診断または治療のためのオリゴデンドロサイト表面抗原に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、 ADのAβ ペプチドに対するScFvであり、配列番号22のアミノ酸 465-708の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な配列を含む。いくつかの態様において、抗体医薬品はADのAβ ペプチドに対するScFvであり、配列番号12のアミノ酸の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な配列を有するVH ドメインを含む。いくつかの態様において、抗体医薬品はAD のAβ ペプチドに対するScFvであり、配列番号14のアミノ酸の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な配列を有するVL ドメインを含む。いくつかの態様において、抗体医薬品はADのAβ ペプチドに対するScFvであり、配列番号12のアミノ酸26-35、50-66、および99-103の配列と、それぞれ少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR1、CDR2、CDR3 配列を有するVH ドメインを含む。いくつかの態様において、抗体医薬品はAD のAβ ペプチドに対するScFvであり、配列番号14のアミノ酸24-39、55-61、および94-102の配列と、それぞれ少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR1、CDR2、CDR3 配列を有するVL ドメインを含む。いくつかの態様において、抗体医薬品はADのAβ ペプチドに対するScFvであり、配列番号12のアミノ酸1-25、36-49、67-98、104-114 の配列とそれぞれ少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、���たは100%同一なFR1、FR2、FR3、FR4 配列を有するVH ドメインを含む。いくつかの態様において、抗体医薬品はADのAβ ペプチドに対するScFvであり、配列番号14のアミノ酸 1-23、40-54、62-93、103-113の配列とそれぞれ少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なFR1、FR2、FR3、FR4 配列を有するVL ドメインを含む。
【０１３２】
いくつかの態様において、本発明はBBBを通過することができる構造に共有結合した抗体医薬品物質を含む組成物を提供し、ここで、組成物は、末梢投与の後、抗体医薬品の脳分布容積を20、30、40、50、60、70、80、80、90、または100 uL/グラム 脳、平均して上昇させることが出来るものであり、ここで抗体医薬品物質は凝集したタンパク質に対するScFvであり、 BBBを通過することができる構造は内在性 BBB 受容体媒介輸送系に対する標的化MAb である。標的化抗体はグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい; いくつかの態様において、抗体はグリコシル化されており、例えば、CHO 細胞におけるその合成によって生じるグリコシル化 パターンにてグリコシル化されている。特定の態様において、抗体医薬品は 抗-Aβ ScFvである。標的化MAbは、インスリン BBB 受容体媒介輸送系に対する抗体、例えば、キメラ MAbであり得る。標的化抗体は、ヒトへの投与に好適な十分なヒト 配列を有するキメラ 抗体でありうる。いくつかの態様において、インスリン受容体はヒト インスリン受容体であり抗体医薬品はScFvである。いくつかの態様において、ScFvは、配列番号16のアミノ酸1-244の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な配列を含む。ScFvは、そのアミノ末端にて標的化MAbの重鎖のカルボキシ末端に、所望により末端間のリンカー、例えば、 ２アミノ酸 リンカー ser-serを介して共有結合していてもよい。いくつかの態様において、標的化MAbの重鎖は、配列番号28のアミノ酸20-462と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な配列を含む。いくつかの態様において、標的化MAbの重鎖は、配列番号28の アミノ酸45-54、69-85、および118-121の配列と、それぞれ少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR1、CDR2、CDR3 配列を有するVH ドメインを含む。いくつかの態様において、標的化MAbの重鎖は、配列番号28のアミノ酸20-44、55-68、86-117、122-132の配列と、それぞれ少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なFR1、FR2、FR3、FR4 配列を有するVH ドメインを含む。いくつかの態様において、標的化MAb の軽鎖は、配列番号29のアミノ酸21-234と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な配列を含む。 いくつかの態様において、標的化MAbの軽鎖は、配列番号29のアミノ酸 44-54、70-76、および109-117の配列とそれぞれ少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR1、CDR2、CDR3 配列を有するVL ドメインを含む。いくつかの態様において、標的化MAbの軽鎖は、配列番号29のアミノ酸21-43、55-69、77-108、118-128の配列とそれぞれ少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なFR1、FR2、FR3、FR4 配列を有するVL ドメインを含む。
【０１３３】
MWが約 1000 ダルトンを超えるBBBを両方向にて通過することができる組成物 
さらに別の側面において、本発明は、分子量が約 1000 ダルトンを超え、 (i)血液から脳へとBBBを通過すること; および(ii)脳から血液へとBBBを通過することができる、組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物はさらに、脳における物質、例えば、脳障害、例えば、 アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症に関係する病理学的物質と相互作用することができる。病理学的物質はタンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、およびそれらの組合せからなる群から選択されるタイプのものでありうる。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、例えば、 Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチン タンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質はAβ アミロイドである。
【０１３４】
医薬組成物 
本発明はまた、１以上の本発明の組成物および医薬上許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。医薬上許容される担体/賦形剤についての徹底的な記載は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Gennaro、AR、ed.、20th edition、2000: Williams and Wilkins PA、USA.にみることができる。本発明の医薬組成物は、あらゆる末梢経路を介する投与に好適な組成物を含み、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内注射;経口、直腸、経頬側、肺、経皮、鼻腔内、またはあらゆるその他の末梢投与の好適な経路が挙げられる。
【０１３５】
本発明の組成物は特に、注射、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、または腹腔内投与のための医薬組成物として好適である。本発明の水性組成物は有効量の本発明の組成物を含み、それは医薬上許容される担体または水性媒体に溶解または分散していてよい。「医薬上または薬理学上許容される」という語は、動物、例えば、適当にはヒトに投与した場合に、有害な、アレルギー性またはその他の望ましくない反応を生じさせない分子実体および組成物をいう。本明細書において用いる場合、「医薬上許容される担体」には、あらゆるすべての溶媒、分散媒、被覆、抗細菌および抗真菌物質、等張化剤および吸収遅延物質等が含まれる。かかる媒体および物質の医薬活性物質のための使用は当該技術分野において周知である。常套の媒体または物質が有効成分と非適合性である場合を除き、治療用組成物におけるその使用は考慮される。補助的有効成分も組成物に導入することが出来る。
【０１３６】
注射可能組成物のための例示的な医薬上許容される担体には、塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等; および有機酸塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等が含まれうる。例えば、本発明の組成物は、液体形態で提供してもよく、様々なpH (5-8)の、界面活性剤、例えば、0.01-1%のポリソルベート-80、または炭水化物添加物、例えば、マンニトール、ソルビトール、またはトレハロースを含むまたは含まない生理食塩水に基づく水溶液中に製剤される。一般的に用いられる緩衝剤には、ヒスチジン、酢酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩が含まれる。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を阻害するための保存料を含んでいてもよい。微生物の作用の予防は様々な抗細菌および抗真菌物質によりもたらされ得、例えば、パラベン、クロロブタノール; フェノール、ソルビン酸、チメロサール等が挙げられる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含めるのが好ましい。注射可能組成物の持効性吸収は、組成物において物質吸収遅延剤、例えば、ステアリン酸アルミニウム、およびゼラチンを使用することによってもたらされうる。
【０１３７】
ヒト投与のために、調製物はFDAによって要求される無菌性、発熱性、全般的安定性、および純度標準およびその他の規制当局の標準を満たす。活性化合物は一般に非経口投与のために製剤され、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、または腹腔内経路を介する注射のために製剤される。活性成分または有効成分を含む水性組成物の調製は本開示に鑑みて当業者に知られているであろう。典型的には、かかる組成物は液体溶液または懸濁液のいずれかとしての注射可能形態として調製され得;注射の前の液体の添加による溶液または懸濁液の調製における使用のために好適な固体形態も調製できる;調製物はまた乳化されていてもよい。
【０１３８】
無菌注射可能溶液は所望により上記のその他の様々な成分と共に適当な溶媒に要求される量にて活性化合物を導入することによって調製され、次いでフィルター滅菌される。一般に、分散液は様々な滅菌した有効成分を基本的分散媒を含む無菌の媒体および要求される上記のその他の成分に導入することによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌の粉末の場合は、調製方法には減圧乾燥および凍結乾燥技術が含まれ、以前にフィルター滅菌したその溶液から有効成分とさらなる所望の成分の粉末が得られる。
【０１３９】
製剤に際して、溶液は用量剤形に適合するよう、治療的に効果的な量にて投与される。製剤は様々な用量形態にて容易に投与され、例えば、上記の注射可能溶液のタイプが挙げられるが、薬物放出カプセル等も利用できる。
【０１４０】
「単位用量」という語は、対象における使用に好適な物理的に離れた単位をいい、各単位は上記の所望の応答をもたらすよう計算されたあらかじめ決められた量の治療用組成物を、その投与、即ち適当な経路および治療計画に関連して含む。投与すべき量は、治療の回数および単位用量の両方に応じて、治療すべき対象、対象の状態および望ましい保護に依存する。投与に責任のあるヒトはいずれにせよ個体対象のための適当な用量を決定する。
【０１４１】
活性の治療剤は、用量当たり約 0.0001- 1.0 ミリグラム、または約 0.001- 0.1 ミリグラム、または約 1.0- 100 ミリグラムあるいは約 0.01- 1.0 グラム等を含むように混合物中に製剤されうる。複数用量を投与してもよい。いくつかの態様において本発明の融合タンパク質の約 5-約 50 mg の用量をヒトに対する投与のための単位用量として用い、例えば、約 5-約 50 mgのAβ ScFvと HIR MAbとの融合タンパク質である。
【０１４２】
非経口投与、例えば、 静脈内または筋肉内注射のために製剤された化合物に加えて、本発明の投与のその他の方法を用いることが出来、例えば、これらに限定されないが 皮内投与 (米国特許第5,997,501; 5,848,991; および5,527,288号参照)、肺投与 (米国特許第6,361,760; 6,060,069; および6,041,775号参照)、頬側投与 (米国特許第6,375,975;および6,284,262号参照)、経皮投与 (米国特許第6,348,210; および6,322,808号参照)および経粘膜投与 (米国特許第5,656,284号参照)が挙げられる。かかる投与方法のすべては当該技術分野において周知である。本発明の鼻腔内投与を用いることも出来、例えば、経鼻用溶液または噴霧、エアロゾルまたは吸入剤による。経鼻用溶液は通常鼻腔に液滴またはスプレーとして投与するよう設計された水性溶液である。経鼻用溶液は鼻汁と多くの側面で類似となるように調製される。したがって、水性経鼻用溶液は通常等張であり、わずかに緩衝剤によりpH 5.5 - 6.5に維持される。さらに、眼用調製物に用いられるのと類似の抗微生物保存料および適当な薬物安定化剤を必要な場合製剤に含めてもよい。様々な市販の経鼻用調製物が知られており、例えば、抗生物質および抗ヒスタミンが喘息予防に用いられている。
【０１４３】
その他の投与様式に好適なさらなる製剤には、坐薬およびペッサリーが含まれる。直腸ペッサリーまたは坐薬も用いることが出来る。坐薬は様々な重量および形状の固体用量形態であり、通常、直腸または尿道への挿入のために投薬される。挿入後、坐薬は軟化し、腔液中で融解または溶解する。坐薬のため、常套の結合剤および担体としては、一般に、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる; かかる坐薬は有効成分をあらゆる好適な範囲、例えば0.5% -10%、好ましくは 1%-2%の範囲で含む混合物から形成されうる。
【０１４４】
経口製剤には通常用いられる賦形剤、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等が含まれる。かかる組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤、または散剤の形態をとる。特定の態様において、経口医薬組成物は、不活性希釈剤または吸収可能可食担体を含むか、あるいはそれらは硬または軟殻ゼラチンカプセルに封入され得、あるいはそれらは圧縮されて錠剤とされ得、あるいはそれらは食餌の食品に直接組み込まれうる。経口治療的投与のために、活性化合物は賦形剤とともに組み込まれ得、摂取可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハース等の形態で用いられ得る。かかる組成物および調製物は少なくとも 0.1%の活性化合物を含みうる。組成物および調製物のパーセンテージはもちろん、変動し得、便宜には単位重量の約 2〜約 75%の範囲あるいは約 25-60%であり得る。かかる治療的に有用な組成物における活性化合物の量は好適な用量が得られるものとする。
【０１４５】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル 等はまた以下を含んでいてもよい: 結合剤、例えば、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチン; 賦形剤、例えば、 第二リン酸カルシウム;崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸等; 滑沢剤、例えば、 ステアリン酸マグネシウム; および甘味料、例えば、 スクロース、ラクトースまたはサッカリンを添加してもよく、または香味料、例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリーフレーバーが挙げられる。用量単位形態がカプセルである場合、それは上記タイプの物質に加えて、液体担体を含んでいてもよい。様々なその他の物質が被覆としてまたはその他に用量単位の物理形態を改変するために存在しうる。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、セラック、糖またはその両方で被覆されていてもよい。シロップまたはエリキシル剤は活性化合物、甘味料としてのスクロース、保存料としてのメチレンおよびプロピル パラベン、色素および香味料、例えば、チェリーまたはオレンジフレーバーを含んでいてもよい。いくつかの態様において、経口医薬組成物は腸溶被覆されて胃の環境から有効成分を保護してもよい; 腸溶被覆方法および製剤は当該技術分野において周知である。
【０１４６】
VI. 核酸、ベクター、細胞、および製造
本発明はまた、核酸、ベクター、細胞、および生産方法を提供する。
【０１４７】
A. 核酸
いくつかの態様において、本発明は、本発明のタンパク質またはペプチドをコードする核酸を提供する。特定の態様において、本発明は、第１の配列と第２の配列を含む単一の核酸配列を提供し、第１の配列は第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードしており、第２の配列に作動可能に連結しており、第２の配列は第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードしており、第１の配列はさらに軽鎖に共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFv をコードしているか、あるいは第２の配列はさらに、重鎖に共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFvをコードしている。第１の免疫グロブリンは内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、 インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン 受容体、リポタンパク質受容体、またはIGF 受容体に対するものであり得る。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体媒介輸送系はインスリン BBB 受容体媒介輸送系である。ScFvは脳に存在する病理学的物質に対するものであり得、ここで、病理学的物質は、脳障害、例えば、 アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症と関係している。病理学的物質はタンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物 ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、またはそれらの組合せであり得る。いくつかの態様において、病理学的物質はタンパク質、例えば、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチン タンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、病理学的タンパク質はAβ アミロイドである。いくつかの態様において、ScFvのVH 領域は配列番号12と少なくとも 約 80、90、95、または99%同一な配列を含む。いくつかの態様において、ScFvのVL 領域は配列番号14と少なくとも 80、90、95、または99%同一な配列を含む。
【０１４８】
本発明者はさらに第１の配列および第２の配列を含む単一の核酸配列を含むベクターを提供し、第１の配列は第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードし、第２の配列に作動可能に連結しており、第２の配列は第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードし、第１の配列はさらに軽鎖と共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来の ScFvをコードするか、または、 第２の配列はさらに、重鎖に共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFvをコードする。
【０１４９】
本発明はさらに、第１の配列および第２の配列を含む単一の核酸配列を含むベクターを含む細胞を提供し、第１の配列は第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードし、第２の配列に作動可能に連結しており、第２の配列は第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードし、第１の配列はさらに軽鎖に共有結合したScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFv をコードしているか、または、第２の配列はさらに、重鎖に共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFvをコードしている。いくつかの態様において、細胞は真核細胞である。いくつかの態様において、細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【０１５０】
いくつかの態様において、本発明は、特定のヌクレオチド 配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な核酸配列を提供する。例えば、いくつかの態様において、本発明は、第１の配列および第２の配列を含む単一の核酸配列を提供し、第１の配列は第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードし、第２の配列に作動可能に連結しており、第２の配列は、第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードし、第１の配列がさらに軽鎖に共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFv をコードするか、または第２の配列がさらに、重鎖に共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFvをコードし、ここで、ScFvのVH 領域は以下の少なくとも１、２または３を含む: (i)配列番号12のアミノ酸26-35の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR1 配列; (ii)配列番号12のアミノ酸50-66の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR2 配列;および (iii)配列番号12のアミノ酸99-103の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR3 配列。
【０１５１】
いくつかの態様において、本発明は、第１の配列および第２の配列を含む単一の核酸配列を提供し、第１の配列は第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードし、第２の配列に作動可能に連結しており、第２の配列は第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードし、ここで第１の配列がさらに、軽鎖に共有結合したScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFv をコードするか、または、第２の配列がさらに、重鎖に共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFvをコードし、ここでScFv のVL 領域は以下の少なくとも１、２または３を含む:
【０１５２】
(i)配列番号14のアミノ酸24-39の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR1 配列; (ii)配列番号14のアミノ酸55-61の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR2 配列;および(iii) 配列番号14のアミノ酸94-102の配列と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なCDR3 配列。
【０１５３】
いくつかの態様において、本発明は、配列番号19のヌクレオチド58-2127と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な第１の配列、および、配列番号27のヌクレオチド801-1442と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な第２の配列を含む核酸を提供する。
【０１５４】
２つの核酸の配列比較のために、典型的には１つの配列は、それに対してテスト配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テストおよび参照配列はコンピュータに入力され、必要であればサブ配列組合せ(coordinate)が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォールトプログラムパラメーターを利用してもよく、代替的なパラメーターを指定してもよい。配列比較アルゴリズムは次いでプログラム パラメーターに基づいて参照配列に対するテスト配列についてのパーセント 配列 同一性を算出する。
【０１５５】
本明細書において用いる場合、「比較ウィンドウ」は、その中で配列が２つの配列が最適にアラインされた後に同じ数の連続位置の参照配列と比較されうる、20 から 600、通常は約 50 から約 200、より通常は約 100から約 150からなる群から選択される連続位置の数のいずれかのセグメントの言及を含む。比較のための配列のアラインメントの方法は当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適アラインメントは 、例えばこれらに限定されないが、Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cのローカルホモロジー アルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443のホモロジー アラインメント アルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性方法についてのサーチ、これらアルゴリズム(GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WI)のコンピュータ処理された実行、またはマニュアルアラインメントおよび目視検査によって実行することが出来る(例えば、Ausubel et al.、Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement) を参照されたい)。
【０１５６】
パーセント 配列同一性および配列類似性の決定のために好適なアルゴリズム の一例はBLASTおよびBLAST 2.0 アルゴリズムであり、これらはAltschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402、およびAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410にそれぞれ記載されている。BLAST 分析の実行のためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationから公共的に入手できる。BLAST アルゴリズム パラメーターである W、T、およびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。(ヌクレオチド 配列についての)BLASTN プログラムは デフォールトとして、ワード長 (W) 11、期待値(E)または 10、M=5、N=-4 および両鎖の比較を用いる。BLAST アルゴリズムは典型的には「低複雑性」のフィルターをオフにして行われる。BLAST アルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計分析も行う(例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  90:5873-5787を参照されたい)。BLAST アルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小の和の確率（smallest sum probability)(P(N))であり、これは２つのヌクレオチド またはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こるであろう確率の指標を提供する。例えば、核酸は、テスト核酸の参照核酸に対する比較において最小の和の確率が約 0.2未満、より好ましくは約 0.01未満、およびもっとも好ましくは約 0.001未満であれば、参照配列に類似していると考えられる。
【０１５７】
本発明は、本発明のペプチドのいずれかをコードする核酸を提供する。いくつかの態様において、本発明は、標的化免疫グロブリンの軽鎖をコードする遺伝子および融合タンパク質をコードする遺伝子を含む単一の核酸配列を提供し、ここで、融合タンパク質は、抗体医薬品に共有結合した標的化免疫グロブリンの重鎖を含む。いくつかの態様において、ペプチドは治療用ペプチドである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、凝集したタンパク質、例えば、Aβに対するものである。いくつかの態様において、抗-Aβ 抗体医薬品はScFvである。いくつかの態様において、標的化免疫グロブリンはIgGである。いくつかの態様において、標的化IgGは、MAb、例えば、キメラ MAbである。標的化抗体は、輸送系、例えば、内在性 BBB 受容体媒介輸送系、例えば、内在性 BBB 受容体-媒介インスリン 輸送系に対する抗体であり得る。いくつかの態様において、内在性 BBB 受容体-媒介インスリン輸送系はヒト 内在性 BBB 受容体-媒介インスリン輸送系であり、ここで、免疫グロブリン重鎖が共有結合している医薬は抗-Aβ ScFvである。本明細書において記載するいずれの好適なペプチド、神経治療薬 ペプチド、ScFv、抗体、モノクローナル抗体、またはキメラ 抗体も、融合タンパク質として組み合わされて核酸によりコードされ得、単一の核酸配列においてコードされうる。当該技術分野において周知のように、遺伝暗号の縮重により、好適なコドンのいずれの組合せを所望の 融合タンパク質をコードするのに用いてもよい。さらに、組換え技術に有用なその他の要素、例えば、 プロモーター、終結シグナル等も、核酸配列に含まれうる。かかる要素は当該技術分野において周知である。さらに、本明細書および請求の範囲において記載するすべての核酸配列は配列の相補鎖も含む。
【０１５８】
融合タンパク質の成分として抗-Aβ ScFvをコードするいくつかの態様において、ScFvは、配列番号18のアミノ酸20-263の配列と約 60、70,80、90、95、99、または100%同一な配列を含む。いくつかの態様において、ScFvは、配列番号12のアミノ酸1-114 の配列と約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なVH 部分の配列を含む。いくつかの態様において、ScFvは、配列番号14のアミノ酸1-113の配列と約 60、70、80、90、95、99、または100%同一なVL 部分の配列を含む。いくつかの態様において、ScFvは、配列番号16のアミノ酸115-131の配列と約 60、70,80、90、95、99、または100%同一な、VHおよびVL 部分を連結するリンカー ペプチドの配列を含む。いくつかの態様において、ScFvはそのアミノ末端にて、標的化免疫グロブリン、例えば、MAbの重鎖のカルボキシ末端に連結される。標的化MAbの重鎖は、配列番号28のアミノ酸20-462と約 60、70、80、90、95、99 または100%同一な配列を含みうる。いくつかの態様において、標的化免疫グロブリン、例えば、MAbの軽鎖は、配列番号29のアミノ酸21-234と約 60、70、80、90、95、99 または100%同一な配列を含む。核酸はさらに、MAbの重鎖および治療抗体の間のペプチド リンカーをコードする核酸配列を含みうる。いくつかの態様において、リンカーはS-Sである。核酸はさらに、シグナル ペプチドをコードする核酸配列を含み得、ここで、シグナル ペプチドは重鎖に連結される。当該技術分野において知られており、または今後開発されるあらゆる好適な シグナル ペプチドを利用することが出来る。いくつかの態様において、重鎖に結合されるシグナル ペプチドは配列番号28のアミノ酸1-19と約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、別のシグナルペプチドをコードする核酸配列を含み、ここでその別のシグナル ペプチドは軽鎖に連結される。軽鎖に連結されるシグナル ペプチドは、配列番号29のアミノ酸1-20と約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な配列を含みうる。核酸は選択マーカーをコードする核酸配列を含みうる。いくつかの態様において、選択マーカーはDHFRである。DHFRの配列は、配列番号30のアミノ酸1-187と約 60、70、80、90、95、99、または100%同一であり得る。
【０１５９】
特定の態様において、本発明は、抗体医薬品、例えば、Aβに対するScFvをコードする第１の配列を、標的化免疫グロブリン 成分をコードする第２の配列と同じオープンリーディングフレームにて含む核酸を提供する。標的化免疫グロブリン 成分は、例えば、配列番号27のヌクレオチド801-1442と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一である例えば、軽鎖または重鎖、および、配列番号27のヌクレオチド2540-3868と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な第２の配列であり得る。  いくつかの態様において、核酸はまた、配列番号27のヌクレオチド3874-4606と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一な第３の配列を含む。いくつかの態様において、核酸はさらに、第１のシグナル ペプチドをコードする第４の配列および第２のシグナル ペプチドをコードする第５の配列を含む。いくつかの態様において、第４の配列は、配列番号27のヌクレオチド741-800と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一であり、第５の配列は配列番号27のヌクレオチド2438-2539と 少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一である。いくつかの態様において、核酸はさらに、選択マーカー、例えば、 ジヒドロ葉酸レダクターゼ (DHFR)をコードする配列を含む。いくつかの態様において、DHFRをコードする配列は配列番号27のヌクレオチド 5618-5728と少なくとも 約 60、70、80、90、95、99、または100%同一である。
【０１６０】
B.ベクター
本発明はまた、ベクターを提供する。ベクターは本明細書において記載する核酸配列のいずれかを含みうる。いくつかの態様において、本発明は、すべて１つの核酸片、例えば、１片のDNAに組み込まれた、抗体医薬品、例えば、ScFvに融合した抗体 重鎖をコードする核酸、および抗体軽鎖をコードする核酸を含むひとつのタンデム発現ベクターを提供する。１つのタンデムベクターは、１以上の 選択 および/または 増幅遺伝子も含みうる。本発明の例示的なベクターを製造する方法は実施例および図 24において提供される。しかし、当該技術分野において知られるようにあらゆる好適な技術をベクターの構築に用いることが出来る。
【０１６１】
ひとつのタンデムベクターの使用は従来技術と比較していくつかの利点を有する。免疫グロブリン G (IgG) 遺伝子による真核細胞株の形質移入は一般にIgGを構成する重鎖 (HC) および軽鎖 (LC)をコードする別々のプラスミドによる細胞株の共形質移入を含む。IgG 融合タンパク質の場合、組換え治療用タンパク質をコードする遺伝子をHCまたはLC遺伝子のいずれかと融合させるとよい。しかし、この共形質移入 アプローチは、HC およびLC-融合遺伝子、またはHC-融合および LC 遺伝子の両方を均等に高度に組み込んだ細胞株を選択することを困難にする。本発明の特定の態様において使用される融合タンパク質の製造のためのアプローチは、HC-融合タンパク質 遺伝子、LC 遺伝子、選択 遺伝子、例えば neo、および増幅遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ 遺伝子を含むすべての要求される遺伝子をDNAの一本鎖の上に含むひとつのプラスミド DNAにより永久に 形質移入された細胞株の生産である。図 24において融合タンパク質 タンデムベクターの模式図に示すように、HC-融合遺伝子、LC 遺伝子、neo 遺伝子、およびDHFR 遺伝子はすべて別々であるがタンデムなプロモーターおよび別々であるがタンデムな転写終結配列の制御下にある。それゆえ、治療用タンパク質およびHCまたはLC IgG 遺伝子の融合遺伝子を含むすべての遺伝子が宿主細胞ゲノムに均等に組み込まれる。
【０１６２】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、第１の配列および第２の配列を含む単一の核酸配列を含むベクターを提供し、第１の配列は第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードし、第２の配列に作動可能に連結しており、第２の配列は第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードし、ここで第１の配列がさらに軽鎖に共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFvをコードするか、または第２の配列がさらに重鎖に共有結合したScFvの融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFvをコードする。
【０１６３】
C. 細胞
本発明はさらに、本発明の１以上のベクターを組み込んだ細胞を提供する。細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよい。いくつかの態様において、細胞は真核細胞である。いくつかの態様において、細胞はマウス 骨髄腫 ハイブリドーマ 細胞である。いくつかの態様において、細胞はチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞である。ベクターを細胞に組み込む例示的な方法を実施例に示す。しかし、当該技術分野において知られているようにあらゆる好適な技術がベクターの細胞への組込みに用いることが出来る。いくつかの態様において、本発明は、免疫グロブリン融合タンパク質を発現することが出来る細胞を提供し、ここで細胞はひとつのタンデム発現ベクターが永久に 導入された細胞であり、ここで免疫グロブリン軽鎖遺伝子および抗体医薬品に融合した免疫グロブリン重鎖のための遺伝子の両方が、１片の核酸、例えば、DNAに組み込まれている。いくつかの態様において、本発明は、免疫グロブリン 融合タンパク質を発現することが出来る細胞を提供し、ここで細胞はひとつのタンデム発現ベクターが永久に 導入された細胞であり、ここで免疫グロブリン重鎖 遺伝子および抗体医薬品に融合した免疫グロブリン軽鎖のための遺伝子の両方が１片の核酸、例えば、DNAに組み込まれている。タンデムベクターの導入は、例えば、染色体核酸への永久の組込み、または例えば、エピソームの遺伝子要素の導入によるものであり得る。
【０１６４】
したがって、いくつかの態様において、本発明はさらに、第１の配列および第２の配列を含む単一の核酸配列を含むベクターを含む細胞を提供し、第１の配列は第１の免疫グロブリンの軽鎖の一部または全部をコードし、第２の配列に作動可能に連結しており、第２の配列は第１の免疫グロブリンの重鎖の一部または全部をコードし、ここで、第１の配列がさらに軽鎖に共有結合したScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来のScFv をコードするか、または第２の配列がさらに重鎖に共有結合したScFv の融合タンパク質として発現される第２の免疫グロブリン由来 のScFvをコードする。いくつかの態様において、細胞は真核細胞である。いくつかの態様において、細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞である。
【０１６５】
D. 製造方法
さらに、本発明は製造方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、免疫グロブリン 融合タンパク質の製造方法を提供し、ここで、融合タンパク質は抗体医薬品に融合した免疫グロブリン重鎖を含み、かかる方法は永久に真核細胞にひとつのタンデム発現ベクターを導入することにより、ここで免疫グロブリン軽鎖遺伝子および抗体医薬品に融合した免疫グロブリン重鎖のための遺伝子の両方が、１片の 核酸、例えば、DNAに組み込まれる。いくつかの態様において、本発明は、免疫グロブリン 融合タンパク質の製造方法を提供し、ここで、融合タンパク質は抗体医薬品に融合した免疫グロブリン軽鎖を含み、かかる方法は 永久に真核細胞にひとつのタンデム発現ベクターを導入することにより、ここで免疫グロブリン重鎖 遺伝子および抗体医薬品に融合した免疫グロブリン軽鎖のための遺伝子の両方が、１片の 核酸、例えば、DNAに組み込まれる。いくつかの態様において、ベクターの導入は宿主細胞 ゲノムへの永久の組込みによって達成される。いくつかの態様において、ベクターの導入はベクターを含むエピソームの遺伝子 要素の宿主細胞への導入によって達成される。エピソームの遺伝子 要素は当該技術分野において周知である。いくつかの態様において、治療剤は抗体医薬品である。いくつかの態様において、１片の核酸はさらに選択マーカーのための１以上の遺伝子を含む。いくつかの態様において、１片の核酸はさらに１以上の増幅遺伝子を含む。いくつかの態様において、免疫グロブリン は、IgG、例えば、MAb、例えば、キメラ MAbである。方法はさらに、免疫グロブリン融合タンパク質を発現させること、および/または免疫グロブリン 融合タンパク質を精製することを含みうる。発現および精製を含む例示的な製造方法を実施例において示す。
【０１６６】
しかし、当該技術分野において知られているように、あらゆる好適な技術をタンパク質の製造、所望により発現、および精製に用いることが出来る。これらにはタンパク質合成の非組換え技術、例えば、Merrifieldにより最初に開発され、Stewart et al. によりSolid Phase Peptide Synthesis (1984)に記載されている手動または自動の固相合成が含まれる。化学合成はC-末端から出発してあらかじめ決められた配列にてアミノ酸を連結する。基本的な固相方法はC-末端保護された α-アミノ酸の好適な不溶性樹脂支持体へのカップリングを必要とする。合成のためのアミノ酸は、先行する残基 (または樹脂支持体)との正しいペプチド結合の形成のためにα-アミノ基の保護を必要とする。カルボキシル末端での縮合反応の完了の後、α-アミノ保護基が除去されて次の残基の付加を可能とする。いくつかのクラスのα-保護基が記載されており、Stewart et al. Solid Phase Peptide Synthesis (1984)を参照されたい。酸に不安定で、ウレタンに基づく三級-ブチルオキシカルボニル (Boc) が歴史的に好まれている。その他の保護基、および関連する化学戦略も利用でき、塩基に不安定な9-フルオレニルメチルオキシカルボニル (FMOC)が挙げられる。また、反応性アミノ酸側鎖官能基は合成が完了するまでブロッキングを必要とする。複雑な一連の機能ブロッキング基、およびその使用のための戦略および限界は Bodansky によりPeptide Synthesis (1976)に、およびStewart et al. によりSolid Phase Peptide Synthesis (1984)に概説されている。
【０１６７】
固相合成は記載されたC-末端 α-保護アミノ酸残基のカップリングにより開始される。カップリングには、活性化物質、例えば、1-ヒドロキシベンゾ-トリアゾールを伴うか伴わないジシクロヘキシカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、またはエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミドが必要である。C-末端残基のカップリングの後、α-アミノ保護基が酸に不安定な 三級-ブチルオキシカルボニル (Boc) 基の場合、ジクロロメタン中のトリフルオロ酢酸 (25%以上) によって除かれる。ジクロロメタン中のトリエチルアミン (10%)による中和工程により(塩に対して)遊離のアミンが回復する。C-末端残基が樹脂に付加された後、中間の洗浄工程を伴って、脱保護、中和およびカップリングのサイクルが繰り返されることにより保護ペプチド鎖が伸長する。各保護アミノ酸は好適な溶媒中の等モル量のカップリング試薬により過剰(3-5倍)に導入される。最後に、完全にブロックされたペプチドが樹脂支持体上にアセンブルした後、試薬の適用によりペプチドが樹脂から切断され、側鎖ブロッキング基が除かれる。無水フッ化水素が酸に不安定な三級-ブチルオキシカルボニル (Boc) 化学基を切断する。いくつかの求核スカベンジャー、例えば、ジメチルスルフィドおよびアニソールが特に側鎖官能基上の副反応を避けるために含められる。
【０１６８】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、免疫グロブリン 融合タンパク質の製造方法を提供し、ここで融合タンパク質は抗体構造に融合した免疫グロブリン重鎖または抗体構造に融合した免疫グロブリン軽鎖を含み、かかる方法は、真核細胞にひとつのタンデム発現ベクターを永久に導入すること(例えば、組み込むこと)により、ここで融合タンパク質のための遺伝子および免疫グロブリン軽鎖のための遺伝子または免疫グロブリン重鎖のための遺伝子を含む別の遺伝子が、１片のDNAに組み込まれる。融合タンパク質は、抗体構造に融合した免疫グロブリン重鎖を含み得、ここで融合タンパク質のための遺伝子および免疫グロブリン軽鎖のための遺伝子の両方が１片のDNAに組み込まれる。融合タンパク質は治療剤に融合した免疫グロブリン軽鎖を含み得、ここで、融合タンパク質のための遺伝子および免疫グロブリン重鎖のための遺伝子の両方が１片のDNAに組み込まれる。いくつかの態様において、永久に導入することは、タンデムベクターを含む複製性エピソーム性遺伝的要素を真核細胞に導入することにより達成される。いくつかの態様において、抗体構造はScFvである。方法はさらに該 １片のDNA中の選択マーカーのための１以上の 遺伝子の組込みを含みうる。方法はさらに１以上の 増幅遺伝子の該 １片のDNAへの組込みを含みうる。免疫グロブリンはIgGであり得る。免疫グロブリンはMAbでありうる。いくつかの態様において、ScFvは脳障害に関係する病理学的物質に対するものである。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択される タイプのものである。いくつかの態様において、病理学的物質はタンパク質である。方法はさらに免疫グロブリン 融合タンパク質を発現させることを含みうる。方法はさらに免疫グロブリン 融合タンパク質を精製することを含みうる。
【０１６９】
VII. 方法
本発明はまた、方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、CNSにおいて活性な抗体医薬品を有効量にてBBBを横切って輸送する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は治療、診断、またはリサーチ方法を提供する。
【０１７０】
治療方法 
本発明は、通常BBBを横切らない物質、例えば、抗体をBBBを血液から脳へと通過することができる組成物中で末梢投与することによるCNS 障害または症状の治療方法を提供する。いくつかの態様において、方法はさらに、物質、例えば、(典型的には抗原に結合している) 抗体の脳から血液への輸送を含む。凝集疾患の治療のためには、後者の工程が、タンパク質の再凝集またはその他の害をもたらすことなく、脱凝集したタンパク質が脳またはCNSから除かれるために重要であり得る。
【０１７１】
本発明の組成物は本発明の治療方法において有効であり、本明細書において記載するあらゆる好適な組成物がかかる方法に利用できる。
【０１７２】
したがって、いくつかの態様において、本発明は障害に罹患する個体に有効量の組成物を投与することによるCNS 障害の治療方法を提供し、ここで組成物は、血液から脳へとBBBを通過することができる第１の構造、障害に関係する病理学的物質と相互作用することができる第２の構造、および、所望により、脳から血液へとBBBを通過することができる第３の構造を含む。いくつかの態様において、第１および第３の構造(第３の構造が存在する場合)は、本明細書において記載するように抗体、例えば、内在性 BBB 受容体媒介輸送系に対する抗体を含む。いくつかの態様において、第２の構造は本明細書において記載するように ScFvを含む。ScFvは障害に関係する病理学的物質に対するものでありうる。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものである。 いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、例えば、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチン タンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質はAβ アミロイドである。投与方法は、物質を末梢循環へと導入するいずれの好適な方法であってもよく、例えば、経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、直腸、経頬側、鼻腔内、経皮、または吸入が挙げられる。いくつかの態様において、投与は静脈内、筋肉内、または皮下である。いくつかの態様において、CNS 障害は凝集 CNS 障害である。いくつかの態様において、CNS 障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症である。いくつかの態様において、CNS 障害はアルツハイマー病である。個体は、動物、例えば、哺乳類であり得る。いくつかの態様において、個体はヒトである。いくつかの態様において、個体は約 1から約 100 mgの用量の組成物を投与される。
【０１７３】
本発明のいくつかの態様において、方法は、目的の障害の治療または診断に有用な抗体構造を含む組成物の投与を含む。モノクローナル抗体医薬開発はCNSにおいて活性の物質の送達の開発、例えば、CNS医薬開発が、BBBを横切った送達、例えば、CNS 薬物送達における並行するプログラムの不在下で取り組まれる際に遭遇する問題を例示する。脳の十年である1990年代、およびその後における分子神経科学の進展は、モノクローナル抗体に基づく医薬のための脳における複数の標的の同定を導き、例えば、ADの診断または治療のためのアルツハイマー病 (AD)のAβ アミロイドペプチドに対する抗体医薬品; PDの診断または治療のためのパーキンソン病 (PD)のα-シヌクレインに対する抗体医薬品; HDの診断または治療のためのハンチントン病 (HD)のハンチンチン タンパク質に対する抗体医薬品;スクレイピーのヒトの対応疾患の診断または治療のためのスクレイピーまたは狂牛病のPrp タンパク質に対する抗体医薬品;西ナイル脳炎の診断または治療のための西ナイルウイルスのエンベロープ タンパク質に対する抗体医薬品;脳に感染する後天性免疫不全症候群 (AIDS) の診断または治療のための腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)に対する抗体医薬品;脳傷害、脊髄傷害、または脳卒中の診断または治療のためのnogo A タンパク質に対する抗体医薬品;脳に転移する乳癌の診断または治療のためのHER2 タンパク質に対する抗体医薬品; 脳の原発性癌または脳の転移性癌の診断または治療のための発癌 受容体 タンパク質、例えば、上皮増殖因子受容体 (EGFR)に対する抗体医薬品;脳の原発性癌または脳の転移性癌の診断または治療のための発癌 増殖因子、例えば、上皮増殖因子 (EGF)または肝細胞増殖因子 (HGF)に対する抗体医薬品; または脱髄性疾患、例えば、 多発性硬化症の診断または治療のためのオリゴデンドロサイト表面抗原に対する抗体医薬品が挙げられる。抗体がBBBを横切らないために、これらの症状のいずれにおいても抗体医薬品がヒト 疾患のための神経医薬として開発され得ていない。
【０１７４】
BBBの問題により、抗体治療薬は治療効果を達成するために脳内に直接注射しなければならない。分子が BBBを横切らないために、抗体医薬品がこれら分子の末梢(静脈内、皮下) 投与の後に、脳障害に対して有益な効果を有することは予測されない。 
【０１７５】
抗体がBBBを横切ることができれば、抗体医薬品は投与の末梢経路によって投与される脳のための薬剤として開発することが出来る。抗体医薬品、例えば、抗-Aβ ScFvのMTH、例えば、キメラ HIRMAbとの結合は、急性脳および脊髄症状、例えば、 局所脳虚血、全体的脳虚血、および脊髄傷害の治療、ならびに神経変性疾患、例えば、プリオン疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病または多発性硬化症の長期治療、脳感染、例えば、西ナイルウイルスまたはヒト免疫不全ウイルスによる感染の治療、および、脳癌、例えば、脳への転移性癌または脳の原発性癌の治療のための、動物、例えば、哺乳類、例えば、 ヒトにおけるCNSへの抗体 治療薬の非侵襲的 送達に対する新しいアプローチを与える。
【０１７６】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、CNSにおいて活性な抗体医薬品の末梢循環からBBBを横切っての有効量での輸送方法を提供し、ここで、物質はBBBを横切る構造に共有結合しており、抗体医薬品のみではBBBを横切って有効量にて輸送されない。いくつかの態様において、本発明は、末梢循環からBBBを横切って治療上有効量にて抗体医薬品を輸送する方法を提供し、ここで、抗体医薬品はBBBを横切る構造に共有結合しており、抗体医薬品のみではBBBを横切って治療上有効量にて輸送されない。
【０１７７】
本発明はまた、いくつかの態様において、有効量のBBBを通過することができる構造に共有結合した抗体医薬品、例えば、抗-凝集抗体の末梢投与によるCNS障害の治療方法を提供し、ここで抗体医薬品のみでは末梢投与された場合有効量にてBBBを通過することができない。いくつかの態様において、CNS 障害は急性障害であり、ある場合において、物質の単回投与のみを必要としうる。いくつかの態様において、CNS 障害は慢性障害であり、物質の２回以上の投与を必要とする。
【０１７８】
いくつかの態様において、有効量、例えば、治療上有効量は、脳における濃度がグラム 脳当たり少なくとも 約 0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、または100 ngを超えるものである。いくつかの態様において、例えば抗体医薬品の治療上有効量は、約 0.1-1000、または約 1-100、または約 5-50 ng/g 脳の脳 レベルが達成されるものである。いくつかの態様において、抗体医薬品はADの診断または治療のためのアルツハイマー病 (AD)のAβ アミロイドペプチドに対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、PDの診断または治療のためのパーキンソン病 (PD)のα-シヌクレインに対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、HDの診断または治療のためのハンチントン病 (HD)のハンチンチン タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、スクレイピーのヒトの対応疾患の診断または治療のためのスクレイピーまたは狂牛病のPrp タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、西ナイル脳炎の診断または治療のための西ナイルウイルスのエンベロープ タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳に感染する後天性免疫不全症候群 (AIDS) の診断または治療のための腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL) に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳傷害、脊髄傷害、または脳卒中の診断または治療のためのnogo A タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳に転移する乳癌の診断または治療のためのHER2 タンパク質に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳の原発性癌または脳の転移性癌の診断または治療のための発癌 受容体 タンパク質、例えば、上皮増殖因子受容体 (EGFR) に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脳の原発性癌または脳の転移性癌の診断または治療のための発癌 増殖因子、例えば、上皮増殖因子 (EGF) または肝細胞増殖因子 (HGF) に対するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、脱髄性疾患、例えば、多発性硬化症の診断または治療のためのオリゴデンドロサイト表面抗原に対するものである。
【０１７９】
いくつかの態様において、本発明は、治療を必要とする個体に対して有効量の抗体医薬品を末梢投与することによるCNS障害の治療方法を提供し、ここで、抗体医薬品はBBBを通過することができ、該末梢投与後の脳における抗体医薬品濃度のグラム 脳当たり少なくとも 約 0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、または100 ngを超える平均 上昇をもたらすものであり、抗体医薬品は単回投与の後約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または10を超える日数上昇レベルを保持するものである。いくつかの態様において、抗体医薬品は、単回投与の後、約 1 ng/g 脳、または約 2 ng/g 脳、または約 5 ng/g 脳を超えるレベルを、約 2、3、4、5、6、7、8、9、10、または10日を超えて保持する。いくつかの態様において、抗体医薬品は抗-Aβ ScFvである。
【０１８０】
いくつかの態様において、本発明は、治療を必要とする個体に対して有効量の本発明の組成物を末梢投与することによるCNS障害の治療方法を提供する。「末梢投与」という語は、本明細書において用いる場合、CNSへの直接投与ではないあらゆる投与方法を含み、即ち、BBBの物理的透過または破壊を伴わないものである。「末梢投与」にはこれらに限定されないが、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、経頬側、経皮、直腸、経肺 (吸入)、または経口投与が含まれる。本明細書において記載するような、本発明のあらゆる好適な組成物が利用できる。いくつかの態様において、組成物はキメラ HIR-MAbに共有結合した抗体医薬品である。いくつかの態様において、抗体医薬品は抗-Aβ ScFvである。
【０１８１】
「CNSの障害」または「CNS 障害」は本明細書において用いられる場合、最適以下の機能をもたらす脳 および/または 脊髄に影響を及ぼすあらゆる症状を含む。 いくつかの態様において、CNS 障害は、急性 CNS 障害、例えば、 脳傷害、脊髄傷害、局所脳虚血および全体的脳虚血である。障害が急性障害である態様において、組成物は１回のみ投与される。障害が急性障害である態様において、組成物は、10、15、20、30回まで、または30回を超えて投与される。いくつかの態様において、組成物は約週１回より多くない頻度で投与される。いくつかの態様において、CNS 障害は慢性障害である。いくつかの態様において、慢性障害は、慢性神経変性疾患からなる群から選択される。障害が慢性神経変性疾患であるいくつかの態様において、慢性神経変性疾患は、プリオン疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症である。いくつかの態様において、慢性障害は慢性脳感染からなる群から選択される。障害が慢性脳感染であるいくつかの態様において、慢性感染は西ナイルウイルスまたはヒト 免疫不全ウイルスである。いくつかの態様において、慢性障害は癌である。障害が癌であるいくつかの態様において、癌は、脳への転移性乳癌、脳への転移性癌または脳の原発性癌である。
【０１８２】
いくつかの態様において、本発明は、網膜の治療、または失明の治療または予防のための方法を提供する。網膜は、脳と同様に、血液網膜関門 (BRB)によって血液から保護されている。インスリン受容体がBBB およびBRBの両方で発現しており、HIRMAbはRMTを介してBRBを横切って網膜に治療薬を送達することが示された。血管内皮増殖因子 (VEGF) に対する抗体は網膜疾患において保護的であるが、抗体がBRBを横切らないために抗体を直接眼球へと注射する必要がある。いくつかの態様において、本発明の融合タンパク質が静脈内または皮下注射よりも侵襲的ではない投与経路によって網膜変性および失明の治療に用いられる。というのは HIRMAbは抗体医薬品を BRBを横切って送達し、抗体が血液区画から網膜神経細胞に曝されるからである。
【０１８３】
本明細書において記載する抗体医薬品を含む組成物はさらに改変されて病理学的物質と近接するまたは接触するように治療剤を輸送しうることが認識され、例えば、かかる近接または接触は医薬抗体の病理学的物質への結合によって達成されうる。かかる方法は病理学的物質の効果を破壊または改善することができるが周囲の構造には最小の損傷しか与えないまたは損傷を与えない組成物に対するいずれかの好適な物質のカップリングを伴い得、例えば、適当な放射性核種、毒素などである。かかるカップリング方法および好適な物質は当該技術分野において周知である。周囲の領域への損傷は、物質がさらに本明細書において記載されるようにBBBを横切ってCNSから出るように 輸送されると最小に維持されうることがさらに認識される。
【０１８４】
診断方法 
本発明はまた、診断、予後、および治療評価方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、末梢血液マーカーの測定による診断、予後、または治療の評価方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、疾患に関係するCNS 構造をイメージングすることによる診断、予後、または治療の評価方法を提供する。
【０１８５】
したがって、いくつかの態様において、本発明は、個体の体液中の組成物のレベルを測定することによる、CNS 障害の診断、予後、または治療の評価方法を提供し、ここで、組成物は、血液から脳へとBBBを通過することができ、脳障害に関係する病理学的物質と相互作用することができ、かつ脳から血液へとBBBを通過することができものであり、ここで組成物は個体に投与され、病理学的物質と相互作用したものである。いくつかの態様において、脳障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、または多発性硬化症である。いくつかの態様において、脳障害はアルツハイマー病である。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、低分子、またはそれらの組合せからなる群から選択されるタイプのものである。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、例えば、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチン タンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質はAβ アミロイドである。かかる方法はさらに組成物を個体に投与することを含みうる。組成物は抗体を含み得、またScFvも含みうる。いくつかの態様において体液は、血液、血清、または血漿である。体液中のマーカーの測定方法は周知であり、例えば、サンドウィッチに基づくELISAを利用できる。
【０１８６】
いくつかの態様において、本発明は、個体のCNSにおいて組成物により放射されるシグナルを検出することによる、脳障害の診断、予後、または治療の評価方法を提供し、ここで、組成物は、血液から脳へとBBBを通過することができ、脳障害に関係する病理学的物質と相互作用することができる抗体を含む。いくつかの態様において、かかる方法はさらに、組成物を個体に投与することを含む。組成物はシグナルを放射するように構築するとよく、例えば、陽電子を放射して放射性シグナルを与えるか、または磁気シグナルを与えるものが挙げられる。いくつかの態様において、組成物は、放射性医薬品または磁気医薬品(magnetopharmaceutical)である。いくつかの態様において、組成物はシグナルを放射する物質により標識されている。いくつかの態様において、シグナルを放射する物質は、陽電子放射体、放射性核種、および磁性物質からなる群から選択される。いくつかの態様において、シグナルを放射する物質は陽電子放射体である。いくつかの態様において、シグナルを放射する物質は放射性核種である。いくつかの態様において、脳障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌、および多発性硬化症からなる群から選択される。いくつかの態様において、脳障害はアルツハイマー病である。病理学的物質は、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、および低分子からなる群から選択されるタイプのものであり得る。いくつかの態様において、病理学的物質は、タンパク質、例えば、Aβ アミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチン タンパク質、PrP プリオン タンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子 (TNF) 関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体 (EGFR)、肝細胞増殖因子 (HGF)、またはオリゴデンドロサイト表面抗原である。いくつかの態様において、タンパク質はAβ アミロイドである。いくつかの態様において、抗体はScFvを含む。
【０１８７】
したがって、診断、予後、および治療評価方法は、抗体、例えば、陽電子放射体標識、放射標識または磁気標識されたBBBを横切って輸送されることが出来る抗体、例えば、診断 抗体と標的化物質、例えば、BBBにおける内在性受容体に対するMAbとの融合の使用を含み、次いで融合タンパク質が陽電子、磁気または放射標識され、次いで全身投与され、そして抗体診断の脳内の局在が外部からイメージングされる。融合抗体は、陽電子放出断層撮影 (PET)を用いた脳走査のために陽電子放射体により標識されていてもよく、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法 (SPECT)により検出しうる放射性核種により標識されていてもよく、またはMRIのために磁気標識されていてもよい。SPECT 走査のために、融合タンパク質は好適なキレート化剤の融合抗体との結合の後に111-インジウムにより放射標識されてもよい。１つのかかるキレート化剤は、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,-N’、N’’、N’’’-テトラ酢酸 (DOTA)である。投与は本明細書において記載されるとおりであり、イメージングは当該技術分野において周知の方法により達成できる。
【０１８８】
製剤および投与
本発明の組成物のあらゆる好適な剤形、投与経路および用量が利用できる。剤形、用量および投与経路は、単に常套の実験により当業者によって決定される。本発明の組成物、例えば、融合タンパク質は、典型的には、単回用量、例えば、約 0.01-1000 mg、または約 0.05-500 mg、または約 0.1-100 mg、または約 1-100 mg、または約 0.5-50 mg、または約 5-50 mg、または約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、25、40、45、50、60、70、80、90、または100 mgの静脈内 用量にて投与される。典型的には、急性脳疾患、例えば、 脳卒中、心停止、脊髄傷害、または脳外傷の治療のためには、より高い用量を使用でき、一方、慢性症状、例えば、 アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、狂牛病、MS、西ナイル脳炎、脳 AIDS 感染、または脳の転移性または原発性癌の治療のためには、より低い用量の、長期投与を使用できる。経口投与は、当該技術分野において知られているようにタンパク質の吸収効率および可能な代謝に応じて、静脈内または皮下投与用量よりも高い用量を必要とし得、常套の実験に基づいて上記から調整することが出来る。 
【０１８９】
静脈内または皮下投与のために、本発明の製剤は液体形態で提供してもよく、様々なpH (5-8)の、界面活性剤、例えば、0.01-1%のポリソルベート-80、または炭水化物添加剤、例えば、マンニトール、ソルビトール、またはトレハロースを含むかまたは含まない生理食塩水に基づく水溶液中に製剤される。一般に用いられる緩衝剤としては、ヒスチジン、酢酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩が挙げられる。
【０１９０】
ヒトのための用量は適当な動物データから算出することが出来る。例えば、ScFv-MAb 融合タンパク質のヒトへの投与用量は、前臨床薬物動態学研究に基づき、かかる測定は、アカゲザルにおいて行われた。インビトロ脱凝集アッセイ、図 41は、濃度250 ng/mL の抗-AβScFv/HIRMAb 融合タンパク質がアミロイド プラークの迅速な脱凝集をもたらすことを示す。アカゲザルにおける研究は、抗-AβScFv/HIRMAb 融合タンパク質の脳分布容積が100 uL/グラム 脳 (図 38)であることを示す。それゆえ、250 ng/グラム 脳の脳濃度を達成するためには、抗-AβScFv/HIRMAb 融合タンパク質の対応する血漿濃度は5 ug/mLでなければならない。 7 kgの霊長類における抗-AβScFv/HIRMAb 融合タンパク質の血液中の濃度は0.05% ID/mL (図 37)である。それゆえ、 70 kgのヒトにおける血液中の濃度は 0.005% I.D./mLであろう。ヒトにおいてI.D.=100 mgであれば、血液 レベルは5 ug/mlとなり、ヒト 脳中の抗-AβScFv/HIRMAb 融合タンパク質濃度は250 ng/gとなり、これはアミロイド プラークの迅速な脱凝集をもたらすであろう。
【０１９１】
抗体融合タンパク質は、慢性 CNS 障害、例えば、神経変性疾患、脳卒中または脳/脊髄傷害 リハビリテーション、または抑欝の治療のための長期使用のために製剤できる。長期治療は、毎日、週１回、二週間に１回の本発明の組成物の投与を伴い得、例えば、融合タンパク質は急性治療に用いられるものと類似の剤形において静脈内、筋肉内または皮下投与されうる。あるいは、組成物、例えば、融合タンパク質は生分解性 ポリマーの部分として製剤され得、毎月のスケジュールで投与されうる。
【０１９２】
組合せ療法
本発明の組成物、例えば、融合タンパク質は、組合せ療法の部分として投与されうる。組合せ療法は、治療すべきCNS 障害のその他の治療法との組合せにおける本発明の組成物の投与を含む。本発明の組成物が別のCNS 障害の方法または組成物と組合せて用いられる場合、本発明の組成物およびさらなる方法または組成物のあらゆる組合せを使用できる。したがって、例えば、本発明の組成物の使用が別のCNS 障害の治療剤との組合せにおける場合、それら２つは同時に、継続的に、重複する時期において、同様の、同一の、または異なる頻度等において投与されうる。場合によっては、本発明の組成物を１以上の別のCNS 障害の治療剤と組合せて含む組成物が用いられる。
【０１９３】
本発明の方法に利用されうる別のCNS 障害の治療剤としては、例えば、これらに限定されないが、脳卒中のための血栓溶解療法、アルツハイマー病のためのコリン作動性指向療法、パーキンソン病のためのドーパミン回復療法、遺伝性障害、癌、または感染のためのRNA 干渉療法、および癲癇のための抗-痙攣薬療法が挙げられる。これら物質についての用量、投与経路、投与計画等は当該技術分野において周知である。
【０１９４】
いくつかの態様において、組成物、例えば、抗体融合タンパク質は別の薬物療法と、同じ製剤中でまたは別々の組成物として患者に共投与される。例えば、抗体融合タンパク質はヒト 血液脳関門を横切って抗-Aβ ScFv以外の組換えタンパク質を送達するよう設計された別の融合タンパク質とともに製剤されうる。融合タンパク質は別の高分子または低分子との組合せにて製剤されうる。
【０１９５】
VIII. キット
本発明の組成物、例えば、融合タンパク質は、製剤、例えば、抗体融合タンパク質を容器中に含む、好適な包装中のキットとして提供されうる。組成物は乾燥粉末形態、固体形態 (即ち、凍結乾燥)、溶液、または懸濁液にて提供されうる。組成物がタンパク質である場合、そのタンパク質に対して、乳化剤、塩類、保存料、その他のタンパク質、核酸、プロテアーゼ阻害剤、抗生物質、香料、多糖類、粘着剤、ポリマー、ミクロフィブリル、油等が添加されていてもよい。組成物は、輸送、貯蔵 および/または消費者による使用のために包装される。輸送、貯蔵、および使用のための治療用組成物のかかる包装は当該技術分野において周知である。包装された組成物は組成物の分配および貯蔵のためのさらなる成分を含んでいてもよく、また、製剤、例えば、融合タンパク質を患者への投与に先だって溶解するための例えば、滅菌水 または好適な緩衝剤から構成される別々に包装された 希釈剤を含んでいてもよい。本発明のキットはまた、文書、例えば、使用指示書、臨床研究の結果、望ましい結果および期待される治療経過、注意および副作用に関する情報等を含んでいてもよい。キットは所望によりさらにその他の成分、例えば、手袋、ハサミ、テープ、使用済みバイアルおよびその他の廃棄物の廃棄のための器具、マスク、防腐剤、抗生物質等を含んでいてもよい。
【実施例】
【０１９６】
実施例 1
抗-Aβ ScFvをコードする真核発現プラスミドの遺伝子操作
ヒト Aβ ペプチドに対するマウス 一本鎖 抗体をコードする真核発現ベクターの遺伝子操作を図 1に示す。最終的なタンパク質発現ベクターをpCD-mAβScFvと命名した(図 1B)。このベクターは、ヒト Aβ ペプチドに対するマウス (m) モノクローナル抗体の重鎖可変部(VH)および軽鎖可変部(VL)の両方から構成される一本鎖 Fv 抗体 (ScFv)を産生するように設計した; このScFvをmAβScFvと称する。VHおよびVLは17 アミノ酸リンカーにより融合しておりScFvを形成する。pCD-mAβScFv プラスミドはヒト IgG シグナルペプチド (図 11;配列番号18のアミノ酸 残基 1-19)を有するmAβScFvをコードし、その発現は CMV プロモーターによって駆動される。pCD-mAβScFv 発現ベクターはまた、ATG メチオニン開始コドン (ATG)の前に完全なKozak 配列ドメイン (即ち、 GCCGCCACCATGG;配列番号27のヌクレオチド732-744)を含む(図 1B)。mAβScFvのVHおよびVL cDNAのいずれかのクローニングのために、ポリ A+ RNAを元のマウスハイブリドーマ細胞株から単離し、オリゴ(dT)12-18 およびSuperScript II 逆転写酵素 (Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いる逆転写 (RT)に供し、一本鎖相補的 DNA (scDNA)を形成させた。VL cDNAは、テンプレートとしてVH またはVL scDNA 、およびVL-特異的フォワード (FWD)またはリバース (REV) オリゴデオキシヌクレオチド (ODN) PCR プライマー(表 2、それぞれ配列番号1および2)を用いるポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)により産生された。VL フォワードおよびリバース ODN プライマーは、原核 ScFv 発現ベクター pAP-xScFvへの方向性 クローニングのためにそれぞれMluIおよび NotI 制限エンドヌクレアーゼ (RE) 部位を導入する(図 1A)。mAβ VH cDNAは、mAβ scDNAをテンプレートとして、およびVH-特異的フォワードおよびリバース ODN PCR プライマー(表 2、それぞれ配列番号3および4)を用いるPCRによって得た。VH フォワードおよびリバース ODN プライマーは、原核 ScFv 発現ベクター pAP-xScFv への方向性 クローニングのためにそれぞれNcoI および HindIII RE 部位を導入する(図 1A)。 PCR 反応をPfuUltra DNA ポリメラーゼ (Stratagene、La Jolla、CA)を用いて行い、PCR 産物はアガロースゲル電気泳動により分離した(図 3A)。PCR増幅された~0.4 キロベース (kb) mAβ VL cDNAおよびPCR 増幅された ~0.4 kb mAβ VH cDNAに対応する予測された主なcDNAバンドを図 3A、レーン 1および2にそれぞれ示す。VH およびVLバンドをアガロースゲルから単離し、PCR-Script Amp Cloning Kit (Stratagene) を用いてpPCR-Scriptにサブクローニングし、pPC-mAβ-VH およびpPC-mAβ-VL (図 1A)を形成させ、これをさらなる特徴決定 および DNA 配列決定に供した。 
【０１９７】
表 2.マウス 抗-Aβ 抗体 (mAβ)のVHおよびVL ドメインの逆転写 PCR クローニング、およびHIR-mAβ 融合抗体の操作において用いたオリゴデオキシヌクレオチド
VL フォワード (配列番号1): 
5’-AATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATC(G/T)TG(A/C)T(G/C)ACCCAA(A/T)CTCCA-3’
VL リバース (配列番号2): 
5’-GAAGATGGATCCAGCGGCCGCAGCATCAGC-3’
VH フォワード (配列番号3): 
5’-CAGCCGGCCATGGCGCAGGT(G/C)CAGCTGCAG(G/C)AG-3’
VH リバース (配列番号4): 
5’-CCAGGGGCCAGTGGATAGACAAGCTTGGGTGTCGTTTT-3’
ヒト IgG ペプチド シグナル FWD (配列番号5): 
5’ATCCTCGAGGCCGCCACCATGGACTGGACCTGGAGGGTGTTCTGCCTGCTTGCAGTGGCCCCCGGAGCCCACAGCCAGGTCCAGCTGCAG-3’
ヒト IgG ペプチド シグナル REV (配列番号6): 
5’CTGCAGCTGGACCTGGCTGTGGGCTCCGGGGGCCACTGCAAGCAGGCAGAACACCCTCCAGGTCCAGTCCATGGTGGCGGCCTCGAGGAT-3’
ヒト IgG ペプチド シグナル XhoI PCR FWD (配列番号7): 
5’-ATCCTCGAGGCCGCCACC-3’
ヒト IgG ペプチド シグナル EcoRI PCR REV (配列番号8): 
5’-GATGAATTCTTATAGATCTTCTTCTGA-3’
成熟 mAβ ScFv PCR FWD (配列番号9): 
5’-リン酸-CACAGGTCCAGCTGCAGCAGT-3’
成熟 mAβ ScFv PCR REV (配列番号10): 
5’-リン酸-TTACCGTTTTATTTCCAGCTTGGTC-3’
ヒト IgG ペプチド シグナル HIR FWD (配列番号31):
CGAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATTCCACCATGGACTGGACCTGGAGGGTGTTCTGCCTGCTTGCAGTGGCCCCCGGAGCCCACAGCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTTAGTGAAGATATCCTG
ヒト IgG ペプチド シグナル HIR REV (配列番号32):
CAGGATATCTTCACTAAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCAGGTCCAGACTGCTGCAGCTGAACCTGGCTGTGGGCTCCGGGGGCCACTGCAAGCAGGCAGAACACCCTCCAGGTCCAGTCCATGGTGGAATATCCAGCACAGTGGCGGCCGCTCG
【０１９８】
mAβ VHのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ図 4 (配列番号11)および5 (配列番号12)に示す。mAβ VH cDNA 配列は、数個の単離されたクローンにおいて100%確認され、それはマウス ガンマ 重鎖のコンセンサス配列と矛盾しない。mAβ VH アミノ酸配列のFR1-4およびCDR1-3 ドメイン 構造を図 25に示す。mAβ VLのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ図 6 (配列番号13)および7 (配列番号14)に示す。mAβ VH cDNA 配列は数個の単離されたクローンにおいて100%確認され、それはマウス カッパ VLについてのコンセンサス配列と矛盾しない。mAβ VL アミノ酸配列のFR1-4 および CDR1-3 ドメイン 構造を図 25に示す。
【０１９９】
抗-Aβ MAb VHのCDR1、CDR2、およびCDR3を含むアミノ酸は図 5において太字で示し、それぞれ配列番号12のアミノ酸 26-35、50-66、および99-103に対応する。抗-Aβ MAb VLのCDR1、CDR2、およびCDR3を含むアミノ酸を図 7において太字で示し、それぞれ配列番号14のアミノ酸 24-39、55-61、および94-102に対応する。
【０２００】
mAβ VHおよびVL cDNAの両方を、原核 ScFv 発現ベクター pAP-xScFvにサブクローニングして中間体 mAβ-ScFv 発現プラスミド pAP-mAβScFv (図 1A)を作成した。pPC-mAβ-VH におけるmAβ VH cDNAおよびpAP-xScFv プラスミドを NcoIおよびHindIIIで消化した。予測される~0.4 kbのmAβ-VHおよび~3.5 kbのpAP-xScFv バックボーン(図 3B、それぞれレーン 1 および2)をゲルで精製した。mAβ-VH cDNAを同じRE 部位にてpAP-xScFv バックボーンにライゲーションし、中間体 プラスミド pAP-mAβ-VH (図 1A)を形成した。pAP-mAβ-VH プラスミドを単離し、DNA 配列により特徴付け、それによりmAβ-VH について予測されるDNA 配列の100% が確認された(図 4、配列番号11)。pAP-mAβ-ScFvの操作を、mAβ-VLを MluIおよびNotI 部位にて pAP-mAβ-VH に挿入することにより完了した(図 1A)。pAP-mAβ-VH およびpPC-mAβ-VL クローンの両方をMluI およびNotIで消化した。~0.4 kb mAβ-VL cDNAおよび ~3.5 kb pAP-mAβ-VH プラスミド バックボーン (図 3C、それぞれレーン 1および2)をゲルで精製した。mAβ-VL cDNA をpAP-mAβ-VHにライゲーションし、pAP-mAβ-ScFv (図 1A)を形成した。pAP-mAβ-ScFv プラスミドを単離し、DNA 配列決定により確証した。pAP-mAβ-ScFvのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ 図 8 (配列番号15) および9 (配列番号16)に示す。pAP-mAβ-ScFvにおけるmAβ VHおよびVL cDNAに対応する領域は、図 4および6にそれぞれ示す個々の VHおよびVL遺伝子のものと100%類似である。pAP-xScFv 原核発現ベクターは、VL 領域の末端にc-myc エピトープ (図 9、アミノ酸 残基 255-265) および5-ヒスチジン (His5) タグを導入する(図 9)。
【０２０１】
mAβ-ScFv 真核発現ベクター、クローン pCD-mAβ-ScFvの操作を図 1Bに要約し、それは以下によって行った：(a) pAP-mAβ-ScFvにおける原核 PelB リーダー配列の欠失、(b)完全なKozak 配列ドメインを含むヒト IgG シグナルペプチドの挿入による pAP-mAβ-ScFv-Kの形成、(c) XhoIおよびEcoRI RE 部位を導入するためのmAβ-ScFv-K cDNAのPCR クローニング、および(d) PCRにより作成したXhoI-mAβ-ScFv-K-EcoRI cDNAの真核発現ベクター pCDへのサブクローニングによるpCD-mAβ-ScFv プラスミドの形成。PelB リーダー配列を含む原核発現ベクター pAP-mAβ-ScFvのDNA 断片を、XhoI およびPvuIIにより欠失させ、後者はmAβ-VHの第２アミノ酸に位置していた。バックボーン ベクターをゲルで精製した。並行して、人工の新しい ヒト ペプチド シグナルに対応するODN(表 2、ヒト IgG ペプチド シグナル FWD およびREV ODN、それぞれ、配列番号 5 および6)を65℃でアニーリングさせ、Qiagen PCR 抽出キット (Valencia、CA)により精製した。二本鎖 (ds) ODN をXhoI およびPvuIIで消化し、Qiagen PCR 抽出キットにより精製し、pAP-mAβ-ScFv-XhoI-PvuII ベクター中の同じRE 部位に挿入してpAP-mAβ-ScFv-K 中間体 プラスミド (図 1B)を形成した。dsODNは完全なKozak 部位およびヒト IgG シグナルペプチド (アミノ酸 残基 1-19、配列番号18)を挿入する。陽性クローンをpAP-mAβ-ScFvの欠失されたDNA 断片に存在するが、挿入されたヒト IgG シグナルペプチド 配列には存在しない部位であるEcoRIを用いたRE マッピングにより同定した。mAβ-ScFv cDNA をさらに操作して真核発現ベクター pCDへの方向性 サブクローニングのためにPCRによりXhoI およびEcoRI RE 部位を導入した(図 1B)。mAβ-ScFv cDNAのPCR クローニングをヒト IgG ペプチド シグナル XhoI PCR FWDおよびEcoRI PCR REV ODN(表 2、それぞれ配列番号 7および8)を用いて行った。REV ODNはまた、ベクターのc-myc タグの後にTAA 終止コドンを導入する(図 10)。PCR 産物およびpCD ベクターの両方をXhoIおよびEcoRIで消化した(図 3D)。~5.4 kb pCDおよび~0.8 kb mAβ-ScFv cDNA (図 3D、それぞれレーン 1および2)をゲルで精製し、同じRE 部位にてライゲーションし、pCD-mAβScFv 発現ベクターを形成した(図 1B)。pCD-mAβScFv クローンをDNA 配列決定により確証し、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列の両方をそれぞれ図 10および11 (配列番号17および18)に示す。 pCD-mAβScFv 中のmAβ VHおよびVL cDNA (VH-VL リンカーを含む)に対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は 図 8および9にそれぞれ示すpAP-mAβScFv ベクターにおける配列と100％同一である。pCD-mAβScFv ベクターはHis5 タグを有さないため(図 11)、TAA 終止コドンがc-myc エピトープの末端に続く(図 10)。pCD-mAβScFv 真核発現プラスミドは CMV プロモーターにより駆動され、ATG 開始コドンの前に完全なKozak ドメインを有し、ヒト IgG シグナルペプチドを含む。
【０２０２】
実施例 2
抗-Aβ ScFvおよびキメラ HIRMAb 重鎖の融合タンパク質をコードする真核発現プラスミドの遺伝子操作
融合抗体の重鎖をコードする真核発現ベクターの遺伝子操作を図 2に要約するように行った。融合抗体重鎖は、mAβScFvから構成され、これはそのアミノ末端にて、キメラ HIRMAbの重鎖 (HC)のカルボキシル末端に融合している;キメラ HIRMAbのHCを図 2においてHC-1と称する。融合抗体のHCをコードするこの遺伝子の操作を2 工程にて行った: (a) mAβScFv のPCR クローニング、および(b) pCD-UHCと称される(図 2) ユニバーサル HIR 重鎖 発現ベクターへのこのcDNAの挿入による、pCD-HC-mAβScFv プラスミド (図 2)の形成。pCD-UHC 発現ベクターにおいて、キメラ HIRMAb 重鎖 (HC) cDNAはCMV プロモーターによって先行され、その後にはウシ成長ホルモン (BGH) ポリアデニル化配列 (pA)が続く。pCD-UHCは、HIRMAb HC オープンリーディングフレーム (orf)の末端に目的遺伝子の挿入およびHIRMAb HC 融合タンパク質の発現のための１つのHpaI 部位を有する。成熟 mAβScFvのPCR クローニングのために、成熟 mAβ ScFv PCR FWD ODN (表 2、配列番号9) を、ヒト IgG ペプチド リーダー配列をmAβScFv cDNAから欠失させ、pCD-UHCのHIRMAb 重鎖のCH3 領域にてorfを維持するよう設計した。この結果、HIR mAβ 重鎖のCH3 領域の末端とmAβScFv cDNAとの間にSer-Ser リンカーが挿入された。成熟 mAβScFv REV PCR ODN (表 2、配列番号10)を、c-myc タグ、およびmAβScFv cDNA の末端とc-myc タグとの間のリンカー [ADAAAAGS (アミノ酸 245-252、配列番号16; 図 9)]を欠失させ、終止コドン、TAAを導入するよう設計した。両方のPCR プライマーは、HpaI 部位でのpCD-UHCへの直接のライゲーションのために5’-リン酸化した。成熟 mAβScFv cDNA のPCR クローニングをpCD-mAβScFv DNAをテンプレートとして用いて行った。PCR 産物のアガロースゲル電気泳動は、成熟 mAβScFv cDNAに対応する予測された~0.8 kbのシングルバンドを示した (レーン 1、図 3E)。操作された成熟 mAβScFvをpCD-UHC中のHpaI 部位にライゲーションして pCD-HC-mAβScFv 発現ベクターを形成した(図 2)。pCD-HC-mAβScFv クローンをDNA 配列決定により確証し、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列の両方をそれぞれ図 12 および13(配列番号19および20)に示す。HIR mAb 重鎖のCH3 領域の再構築されたカルボキシル末端のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ともにPCR クローニング 工程において導入された成熟 mAβScFv の前の2-アミノ酸リンカー (Ser-Ser)およびTAA 終止コドンを確認した(図 12および13)。
【０２０３】
実施例 3
抗-Aβ ScFvのVHのFR1のI2V 部位特異的突然変異誘発
mAβMAβの軽鎖のアミノ末端のアミノ酸 マイクロシークエンシング 分析により11 残基が確認され、ただし、軽鎖の位置 2 のアミノ酸は例外である(図 7)。PCR プライマーにより位置 2にイソロイシン (IまたはIle)が導入され、一方、ハイブリドーマにより作成された軽鎖は位置 2にバリン (VまたはVal)を含んでいた。Ile 残基は、このcDNAのPCR 増幅に用いられた縮重プライマーの使用により、mAβ VLのPCR クローニングの際におそらくは導入されたようである。位置 2におけるI 残基をV 残基に変化させるために部位特異的突然変異誘発 (SDM)を行う必要があり、このSDMはI2V 変化と称される。I2V VL 突然変異体を担持する融合抗体の重鎖をコードする新しい真核発現ベクターを構築した。SDMをQuickChange II XL SDM キット (Stratagene)および標準的プロトコールを用いて行った。SDM-ODNは目的の突然変異、即ち位置 1789における「A」の代わりに「G」を導入するよう設計された (図 12、配列番号19)。SDMのためのODNはまた、標的配列とのアニーリングのために各隣接領域において15 ヌクレオチドを含む。SDMは pCD-HC-mAβScFv クローン DNAをテンプレートとして用いてpCD-HC-mAβScFv I2Vを形成することで完了し、SDM クローンをDNA 配列決定により確証した。ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号33および34に示す。pCD-HC-mAβScFv-I2Vのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は両方、親クローン pCD-HC-mAβScFvのものと同一であり (図 12および13)、ただし、SDM-導入された突然変異、即ち、A1789G (図 14、下線を引いた「G」残基) およびI597V (図 15、下線を引いた「V」残基)は例外である。
【０２０４】
実施例 4
融合タンパク質重鎖のシグナルペプチドおよび完全なKozak 部位の遺伝子操作
融合抗体重鎖の発現を最適化するために、pCD-UHCにおけるキメラ HIRMAb 重鎖のシグナルペプチド (SP) (図 13、配列番号20のアミノ酸残基 1-19)をpCD-mAβScFvの操作において用いられた新しいペプチドシグナルで置換した(図 1Bおよび11、配列番号18のアミノ酸残基 1-19)。完全なKozak コンセンサス配列も新しい pCD-HC-mAbScFv II プラスミドの操作の前に導入した(図 2)。キメラ HIRMAb 発現ベクター、pCD-UHCのシグナルペプチド配列を、pCD マルチクローニングサイトおよびHIRMAb HC オープンリーディングフレームに位置するNotIおよびEcoRVのRE 部位で二重消化することにより欠失させた。148 bpから構成されるDNA 断片をヒト IgG ペプチド シグナルを包含する人工 dsODNによって、ヒト IgG ペプチド シグナル HIR FWD ODN (表 2、配列番号31) およびヒト IgG ペプチド シグナル HIR REV ODN (表 2、配列番号32)を用いて置換した。人工 dsODN およびpCD-UHC 発現プラスミドの両方をNotIおよびEcoRVで消化し、ゲルで精製した。新しいシグナルペプチド (NSP)によるpCD-UHCの操作を続け、NSPをpCD-UHCに同じRE 部位にてライゲーションし、pCD-UHC-NSP ベクターを形成した。完全なKozak コンセンサス配列を次いでQuickChange II XL SDM キットおよび標準的プロトコールを用いるSDMにより導入した。SDM-ODNは目的の突然変異 (即ち、GCCGCCACC) を導入するために設計し、また、標的配列とのアニーリングのために各隣接領域において15 ヌクレオチドを含む。SDMをpCD-HC-NSP DNAにおけるキメラ HIRMAb 重鎖をテンプレートとして用いることによって完了し、pCD-HC-NSP 新しいKozak (NK) ベクターを形成した。pCD-HC-NSP-NKを、SDMによってCH3 領域の後の終止コドンにHpaI RE 部位を挿入することによって融合タンパク質のためのユニバーサル HIRMAb 重鎖 発現ベクター(pCD-UHC-II、図 2)に変換した。SDM プロトコールをQuickChange II XL SDM キットおよびSDM-ODNにより完了して、HpaI RE 部位 (即ち、GTTAAC)を導入した。ODNはまた、標的配列とのアニーリングのために各隣接領域にて15 ヌクレオチドを含む。HIRMAb 融合抗体の重鎖をコードする新しい真核発現ベクターの遺伝子操作を、図 2に要約するように最適化された発現ベクター pCD-UHC-IIを用いて行った。新しい融合抗体重鎖融合遺伝子の操作は2 工程にて行った：(a) mAβScFv cDNAのPCR クローニングおよび(b)このcDNA の新しい ユニバーサル HIRMAb 重鎖 発現ベクター pCD-UHC-IIへの挿入による、pCD-HC-mAβScFv IIの形成(図 2)。mAβScFv cDNA (配列番号33)をテンプレートとしてpCD-HC-mAβScFv-I2Vおよび mAb ScFv PCR FWDおよびREV ODN(表 2、それぞれ配列番号9 および 10)を用いるPCR クローニングによって得た。操作された mAβScFv I2V cDNAをHpaI 部位にてpCD-UHC-IIにライゲーションしてpCD-HC-mAβScFv II 発現ベクター(図 2)を形成した。pCD-HC-mAβScFv II クローンをDNA 配列決定により確証し、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列の両方をそれぞれ 図 14 および15 (配列番号21 および22)に示す。HIRMAb 重鎖のCH3 領域における再構築されたカルボキシル末端のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はmAβScFv I2Vの前の2-アミノ酸リンカー (Ser-Ser) および TAA 終止コドンを確認し、これらは共にPCR クローニング 工程において導入された(図 14および15)。NSPもまた確認され、即ち、ヌクレオチド 1-57 (図 14; 配列番号21)およびアミノ酸 1-19 (図 15; 配列番号22)であった。
【０２０５】
実施例 5
抗-Aβ ScFvのVHのCDR2のN497A 部位特異的突然変異誘発
mAβScFvは、VHの第２のCDRにおいて推定可変部 N-グリコシル化 ドメインを有し、これを図 25において下線で示し、これは図 24に示すシグナルペプチドを有さないVHの位置 497のアスパラギン (NまたはAsn) 残基に対応する; mAβScFvのシグナルペプチドを含める場合は、このAsn 残基は図 15および配列番号22の位置 516に対応する。抗体可変部のグリコシル化は結合に影響を与えうるので、mAβScFvのN-グリコシル化 ドメインを配列番号21に対応するクローン pCD-HC-mAbScFv IIにおいて突然変異させ、pCD-HC-mAbScFv II-N497Aと称する新しいクローンを形成した;このクローンによって産生される融合抗体重鎖のmAβScFv 部分はアスパラギンの代わりに位置 497にアラニン (AまたはAla) 残基を発現し、このSDM をN497Aと称する。残基 N497AのSDMは標準的プロトコールおよびQuickChange II XL SDM キットにより完了した。SDM-ODNを、目的突然変異、即ち位置 1546-1547における「GC」ヌクレオチド(図 16、配列番号23) を導入し、標的配列とのアニーリングのために各隣接領域に15 ヌクレオチドが含まれるように設計した。SDMはpCD-HC-mAbScFv II クローン DNAをテンプレート (配列番号21)として用いて完了し、SDM クローンをDNA 配列決定により確証した。ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ 図 16 および17 (配列番号23 および24)に示す。pCD-HC-mAβScFv II N497Aの ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列はともに親クローン pCD-HC-mAβScFv IIのものと同一であり、ただし、SDM-導入された突然変異、即ち、1546GC1547 (図 16、下線で示す「GC」残基) および N497A (図 17、下線で示す「A」残基)は例外である。COS 細胞をpCD-HC-mAbScFv II-N497A プラスミド、およびpCD-LC プラスミドにより二重トランスフェクトし、ここでpCD-LCはHIRMAbの軽鎖をコードする真核発現プラスミドである。N497A 突然変異を有する融合抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによりCOS 細胞 培養上清から精製した。Ala-497形態の抗体融合タンパク質のAβ1-40 ペプチドに対するアフィニティーを以下の実施例 10に記載するようにして免疫放射線測定法 (IMRA)により測定した。IRMAは Aβ1-40 に対するAla-497 融合抗体のアフィニティーがKI＝182 ± 32 nMであると特徴付けられたことを示し、これは図 34および 実施例 10に示すAsn-497 融合抗体と比較して6-倍近く低下している。それゆえ、位置 497のAsn 残基をすべてのさらなる研究においてインタクトなままとした。
【０２０６】
実施例 6
抗-Aβ ScFvのVHのCDR2のS499A 部位特異的突然変異誘発
mAβScFvにおける可変部 グリコシル化 部位の突然変異についての別の戦略として、位置 499のセリン 残基 (SまたはSer)をアラニン残基へと突然変異させ、この突然変異をS499A 突然変異と称する。後者はクローン pCD-HC-mAbScFv II (配列番号21)において突然変異させてpCD-HC-mAbScFv II S499Aと称する新しいクローンを形成した。この残基のSDMは標準的プロトコール およびQuickChange II XL SDM キットにより完了した。SDM-ODNは、目的突然変異、即ち位置1552-1553に「GC」 (図 14、配列番号21)を導入し、標的配列とのアニーリングのために各隣接領域に15 ヌクレオチドを含めるように設計した。SDMをpCD-HC-mAβScFv II クローン DNAをテンプレートとして用いて完了し、SDM クローンをDNA 配列決定により確証した。ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ図 18 および19 (配列番号25および26)において示す。pCD-HC-mAβScFv II S499Aのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列はともに親 クローン pCD-HC-mAβScFv IIのものと同一であり、 ただし、SDM-導入した突然変異、即ち、1552GC1553 (図 18、下線で示す「GC」残基) およびS499A (図 19、下線で示す「A」残基)は例外である。COS 細胞をpCD-HC-mAbScFv II-S499A プラスミド、およびpCD-LC プラスミドで二重トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞による融合抗体の分泌を培地に分泌されるヒト IgGの測定によりアッセイした。融合抗体の分泌のレベルはS499A 突然変異の操作の後に変化しなかった。S499A 突然変異を有する融合抗体をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによりCOS 細胞 培養上清から精製した。Ala-499 形態の抗体融合タンパク質のAβ1-40 ペプチドに対するアフィニティーを以下の実施例 10に記載するように免疫放射線測定法 (IMRA)により測定した。IRMAはAβ1-40 に対するAla-499 融合抗体のアフィニティーはKI ＝271 ± 119 nMであることが特徴付けられたことを示し、これは図 34および実施例 10に示すSer-499 融合抗体と比較して8-倍低下している。それゆえ、位置 499の Ser 残基をすべてのさらなる研究においてインタクトなままとした。
【０２０７】
実施例 7
定常部グリコシル化 部位の部位特異的突然変異誘発を含む定常部の置換
実施例5および 6と同様に、融合抗体重鎖の定常(C)部におけるコンセンサス グリコシル化 部位の部位特異的突然変異誘発を行うことが可能である。このコンセンサス配列はCH2 領域のNST (Asn-Ser-Thr)であり、図 21および25において下線で示す。この配列のAsn またはSerまたはThr 残基のいずれかの置換はC-領域 グリコシル化をなくすことができる。C-領域 のグリコシル化の除去はHIR または標的抗原、例えば、Aβ ペプチドのいずれへの融合抗体の結合にも影響を与えないはずである。C-領域炭化水素の除去はFc 受容体(FcR)、例えば、 FcRnとも称される新生児 FcRに対するIgGの結合に影響を与えない。本実施例において用いた定常部はヒト IgG1 サブクラスからのC-領域である。このC-領域は図 25に示すヒンジ-CH1-CH2-CH3 領域を含み、配列番号28のアミノ酸残基 133-462を包含する。IgG1 C-領域はヒト IgG2、IgG3、またはIgG4のC-領域と置換可能であった。サブ-ドメイン、ヒンジ、CH1、CH2、CH3、またはCH4は、異なるIgG サブクラスの間で相互変化させることが可能であった。
【０２０８】
実施例 8
抗体融合タンパク質を発現するタンデム ベクターの遺伝子操作
融合抗体をコードする真核発現 タンデム ベクターの遺伝子操作を図 24に要約するように行った。タンデム ベクターは以下を含むいくつかの発現カセットから構成される: (a) HIRMAb 軽鎖 (LC)、(b) HIRMAb 重鎖 (HC)および(c) ジヒドロ葉酸還元酵素 (DHFR) 発現カセット。LC およびHC 遺伝子はともにCMV プロモーターによって駆動され、BGH ポリアデニル化 配列およびヒト IgG シグナルペプチドを含む。DHFR 遺伝子は SV40 プロモーター により制御され、B型肝炎 ポリアデニル化 配列を含む。3つのすべての遺伝子は完全なKozak 配列を有する。この融合遺伝子の操作は2 工程にて行った: (a) mAβScFvのPCR クローニング、および (b)このcDNAのタンデム ベクターへの挿入による融合抗体 タンデム ベクターの作成(図 24)。mAβScFv cDNAは pCD-HC-mAbScFv II (配列番号21) をテンプレートとして、そしてmAβScFv PCR FWDおよびREV ODN (表 2、それぞれ配列番号9 および10)を用いるPCR クローニングによって得た。操作した成熟 mAbScFv cDNAをタンデム ベクターのHpaI 部位にてライゲーションし、 融合抗体 タンデム ベクターを形成した(図 24)。融合抗体 タンデム ベクターをDNA 配列決定により確証し、ヌクレオチド配列を図 20 (配列番号27)に示す。 融合抗体 HC、HIRMAb LC、およびDHFR 遺伝子についての推定アミノ酸配列をそれぞれ図 21-23 (配列番号28-30)に示す。HIRMAb 重鎖のCH3 領域の再構築したカルボキシル末端のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、mAβScFvに先行する 2-アミノ酸 (Ser-Ser) リンカー、およびmAβScFv の後にあるTAA 終止コドンを確認し、両方の改変がPCR クローニング 工程において導入された(図 24)。LC 発現カセットは図 20 (配列番号27)のヌクレオチド(nt) 1-1736内に含まれ、以下から構成される：(a) CMV プロモーター、nt 1-731、(b)完全なKozak 配列、nt 732-740、(c) LC orf、nt 741-1445、および(d) BGH ポリアデニル化 配列、nt 1446-1736。HC 発現カセット は図 20 (配列番号27)のnt 1760-4904に含まれ、以下から構成される：(a) CMV プロモーター、nt 1760-2473、(b)完全なKozak 配列、nt 2474-2482、(c) HC orf、nt 2483-4609、および (d) BGH ポリアデニル化 配列、nt 4610-4904。DHFR 発現カセットは図 20 (配列番号27)のnt 4905-6671に含まれ、以下から構成される：(a) SV40 プロモーター、nt 4905-5158、(b)完全なKozak 配列、nt 5159-5167、(c) DHFR orf、nt 5168-5731、および(d) B型肝炎 ポリアデニル化 配列、nt 5732-6671。
【０２０９】
融合抗体 タンデム ベクター (図 24)をPvuIで直鎖化し、CHO DG44 細胞にエレクトロポレーションし、次いでG418 (500 ug/ml)およびヒポキサンチン-チミジン 欠損培地で3 週間選択した。陽性クローンをヒト IgG ELISAにより96 ウェルプレート中で検出し、このELISAはヒト IgG1 HCおよびヒト カッパ LCに対する２つの一次抗体を用いる。高コピー数の導入遺伝子の細胞株をMTXの600 nMまでの段階的上昇により選択した。G418/MTXで選択した細胞株を高密度に維持し、ヒト IgGの分泌を続けさせた。トランスフェクトしたCHO 細胞を限界希釈クローニングのラウンドに供し、振盪フラスコ中で10 mg/Lのレベルでヒト IgGを生産した。アフィニティー 精製の後、CHO 細胞由来融合タンパク質をSDS-PAGEおよびヒト IgG ウェスタンブロッティングで分析し、融合 重鎖および軽鎖は図 32に示すようにCOS 細胞にて産生された融合抗体について観察されたものと同一の移動を示した。
【０２１０】
実施例 9
抗体融合タンパク質の多様な構造ドメイン
融合抗体の重鎖は、図 25に示されるように28のドメインから構成される。19-アミノ酸のヒト IgG シグナルペプチドは細胞内区画からの融合抗体の分泌において切断される。ヒト IgGの定常部は以下の4つのドメインから構成される: CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3。キメラ HIRMAbの重鎖 (VH) 可変部はCH1のアミノ末端に融合している; このVHは、FR1、FR2、FR3、およびFR4と称される4つのフレームワーク領域(FR)、およびCDR1、CDR2、およびCDR3と称される3つの相補性決定領域 (CDR)から構成される。セリン-セリン (S-S) リンカーがCH3のカルボキシル末端を抗-Aβ ScFvのVHのアミノ末端と連結している; ScFv のVHおよびVLもまた、それぞれ4つのFRおよび3つのCDR 領域から構成される。抗-Aβ ScFv のVHおよびVLは17-アミノ酸リンカーによって連結している。このリンカーはヒト α-チューブリン タンパク質 (Genbank CAA25855)からのアミノ酸配列によって形成され、ヒトにおける免疫原性を低下させている。 図 25に示す重鎖は、キメラ HIRMAbの軽鎖、および別の融合抗体重鎖にヒンジ 領域におけるジスルフィド架橋を介して共有結合しており、図 26に示すヘテロ四量体構造を形成している。図 26に示す融合抗体は3機能性を有しており、そのそれぞれはADの脳におけるAβ アミロイド凝集のクリアランスにおいて特定の作用を発揮する。図 27に示すように、凝集したタンパク質の血液からのクリアランスには3つの工程が存在する。第一に、血液から脳へのBBBにて発現するHIRを介するBBBを横切る融合抗体の流入; この工程は、融合抗体のHIRMAb 部分、即ち図 26に示す分子の「頭」により媒介される。第二に、脳における凝集したタンパク質への結合およびその脱凝集; この工程は融合抗体の抗-Aβ ScFv 部分、即ち図 26に示す分子の「尾」によって媒介される。第三に、脳から血液へのBBBに発現するFcRを介するBBBを横切る融合抗体/凝集タンパク質複合体の流出; この工程は 融合抗体の定常部のCH2-CH3 部分、即ち図 26に示す分子の「中央部分(mid-section)」の結合によって媒介される。
【０２１１】
実施例 10
抗-Aβ ScFvの真核発現および特徴決定
COS-1 細胞を無血清培地で培養し、Lipofectamine-2000を用いてpCD-mAβScFv (図 1B)でトランスフェクトした。培養上清を3または7日目に取り出した。 pCD- mAβScFvおよびLipofectamine-2000 でトランスフェクトされたCOS 細胞による条件培地を10 kDa 分子量カットオフのUltra-15 (Amicon) ろ過ユニットを用いて濃縮し、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) サンプルバッファー中に還元条件下で可溶化し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE)のために15% SDS-ポリアクリルアミドゲルにアプライし、次いで9E10 MAbを用いてウェスタンブロッティングを行った。9E10 MAbはc-myc タンパク質由来のエピトープに結合し、そしてこのエピトープ、EQKLISEEDLは、抗-Aβ ScFvのカルボキシル末端に存在する(図 11)。ウェスタンブロットにおける陽性対照(図 28、レーン 1)は、OX26 ScFv/ストレプトアビジン (SA) 融合タンパク質であり、これは細菌ペレットからアフィニティー 精製したものである。OX26 ScFv/SA 融合タンパク質は以下の3つのドメインから構成される: (i) 29 kDa OX26 ScFv、(ii) 16 kDa SA 単量体、および (iii) 9E10 MAb と反応するC-末端 10-アミノ酸 c-myc エピトープ。ウェスタンブロットにおける陰性対照(図 28、レーン 2)はLipofectamine 2000に曝されたが、プラスミド DNAには曝されていないCOS 細胞からの培地である。抗-Aβ ScFvはSA ドメインを欠き、 以下から構成される(i)抗-Aβ ScFv (27 kDa)、および(ii) 9E10 MAbと反応するC-末端 10-アミノ酸 c-myc エピトープ (2 kDa)。9E10 MAbはまた、トランスフェクトされていないCOS 細胞によって分泌される35-37 kDaの2つのタンパク質とも交差反応する(図 28、レーン 2)。29 kDa 抗-Aβ ScFvは pCD- mAβScFvによってトランスフェクトされたCOS 細胞によって培地に特異的に分泌される(図 28、レーン 3)。このウェスタンブロット研究はmAβScFvはpCD-mAβScFvによってトランスフェクトされたCOS 細胞によりインタクトな状態で分泌されることを確証した。
【０２１２】
mAβScFvのAβ1-40 アミロイドペプチドに対する結合を特異的ELISAによって確証した。Aβ1-40 アミロイドペプチドを96-ウェルプレートに入れ、次いで pCD-mAβScFv プラスミドおよびLipofectamine-2000によってトランスフェクトされたCOS 細胞による条件培地を添加した。抗-Aβ ScFv は9E10 MAbによって認識されるC-末端 10-アミノ酸 c-myc エピトープを含む(図 29A)。9E10 MAbはビオチン化されており、これによりペルオキシダーゼ検出システムおよびA492の読み取りによるAβ1-40に対するsc165の結合の定量が可能となる(図 29A)。このリガンド結合アッセイは、抗-Aβ ScFvが良好にAβ1-40 アミロイドペプチドに結合するが、COS 細胞培地がLipofectamine-2000のみに曝された細胞から得られる場合はシグナルは生じないことを示した(図 29B)。
【０２１３】
抗-Aβ ScFvのADのアミロイドプラークに対する結合は、免疫細胞化学および剖検 AD ヒト 脳の切片により確証された。pCD-mAβScFvによりトランスフェクトされたCOS 細胞から得られた濃縮された培養上清を、ADのAβ プラークに対する結合についての抗-Aβ ScFvの機能的活性の試験のために用いた。凍結した AD 脳を用いて10 um 凍結切片を調製し、これを2% パラホルムアルデヒドで固定した。COS 細胞培地を抗-Aβ ScFvの9E10 エピトープに結合するマウス MAbである9E10 MAbとともにインキュベートし、混合物をAD 凍結切片に対してアプライした。この9E10 MAbは、ウェスタンブロッティングおよび結合アッセイ形式と同様に抗-Aβ ScFv のC-末端におけるc-myc エピトープに結合する (図 29A)。二次抗体はマウス IgG1である9E10 MAbに結合するビオチン化したウマ-抗-マウス IgGであった。抗-Aβ ScFvは、図 30Aおよび30Cに示すように剖検 AD 切片のアミロイドプラークを強く染色した。9E10 MAb およびlipofectamine2000 に曝されたがpCD-mAβScFvによりトランスフェクトされていないCOS 細胞による条件培地を含む陰性対照(図 30B)、または、9E10 MAbのアイソタイプ対照であるマウス IgG1 (図 30D)ではアミロイドプラークの免疫染色は観察されなかった。 Aβ リガンド 結合 アッセイおよびAD 免疫細胞化学 (図 29-30) は共に、抗-Aβ ScFv はアルツハイマー病のAβ アミロイドに強く結合すること、およびこの抗-Aβ ScFvは図 26に示すようにキメラ HIRMAbによる融合タンパク質の産生に利用できることを示した。 
【０２１４】
実施例 11
抗-Aβ ScFv/キメラ HIRMAb 融合タンパク質の真核発現および特徴決定
COS 細胞を、融合タンパク質 重鎖 発現プラスミドであるpCD-HC-mAβScFv (図 2)およびHIRMAb 軽鎖 発現プラスミドであるpCD-LCによって Lipofectamine 2000を用いて二重トランスフェクトした。4日間の培養後、培地を回収し、AβScFv/キメラ HIRMAb 融合タンパク質をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。融合抗体のプロセシングを ウェスタンブロッティングにより調べ、融合抗体の二機能性をHIRまたはAβ1-40のいずれかに対するリガンド 結合 アッセイによって調べた。融合抗体およびキメラ HIRMAbを還元条件下でSDS-PAGEに供し、ゲルをクーマシーブルーで染色した(図 31)。これらの結果は、融合抗体がSDS-PAGEで均一になるまで精製されたこと、および融合抗体とキメラ HIRMAbの両方の軽鎖 (LC) のサイズが予測されたように同一サイズであることを示す(図 31)。融合抗体の重鎖 (HC)は82 kDaであり、一方キメラ HIRMAbのHCのサイズは55 kDaである (図 31)。サイズにおける27 kDaの相違は、融合抗体のHCに対するAβScFvの融合に起因する。
【０２１５】
SDS-PAGEを繰り返し、そしてニトロセルロースへのブロッティングの後に、ブロットをヒト IgGに対する一次抗体でプローブした。抗体はキメラ HIRMAbおよび 融合抗体の両方において同一サイズの28 kDa 軽鎖を検出し(図 32)、これは ScFvが重鎖に融合していることから予測される(図 25)。キメラ HIRMAb 重鎖のサイズは予測された55 kDaであった(図 32)。融合抗体重鎖のサイズは82 kDaであり(図 32)、これは55 kDa キメラ HIRMAb 重鎖および27 kDa 抗-Aβ ScFvの和である。
【０２１６】
融合抗体、キメラ HIRMAb、およびハイブリドーマ により作られた抗-Aβ MAbの等電点 (pI)を、図 33に示すように等電点電気泳動 (IEF)により判定した。キメラ HIRMAbおよび融合タンパク質のpIはほぼ同一であり約 8.5であったが、マウス 抗-Aβ MAbのpIはより酸性であり pIは約 6.8であった。融合抗体重鎖の理論的pIは8.8であると予測され、これは図 33において実験的に観察されたpIと一致する。
【０２１７】
Aβ1-40への結合についての融合抗体のアフィニティーを、マウス ハイブリドーマにより作成された 抗-Aβ MAbの同アフィニティーと免疫放射線測定法 (IMRA)により比較した。このアッセイにおいて、Aβ1-40 を96-ウェルプレートに入れ、[125I]-マウス 抗-Aβ MAbのAβ1-40に対する結合を測定する。Aβ1-40 に対するマウス 抗-Aβ MAb 結合の解離定数、KD、は32 ± 11 nMである(図 34)。Aβ1-40に対する融合タンパク質 結合のKD は24 ± 4 nMである(図 34)。それゆえ、Aβ1-40 に対する融合抗体のアフィニティーは元の150 kDa ヘテロ四量体 マウス 抗-Aβ MAbのものと同一である。これは、ScFvの標的抗原に対するアフィニティーは一般に完全な四量体MAb 分子よりもかなり低いために、驚くべき知見であった。四量体 MAbが二価であるために、抗原に対するアフィニティーは単量体ScFvのアフィニティーにより高い。Aβ1-40 に対する融合抗体のScFv 部分の高いアフィニティーは、二量体または二価立体配置にScFv を配置する融合抗体 分子の設計に起因する(図 26)。
【０２１８】
ヒト インスリン 受容体 (HIR) 細胞外ドメイン (ECD)に対する結合についての融合抗体のアフィニティーを、HIR ECD 遺伝子により永久に トランスフェクトされたCHO 細胞による条件培地から得たアフィニティー 精製したHIR ECDを用いるELISAにより測定した。図 35に示すように、キメラ HIRMAbおよび融合抗体の両方が高いアフィニティーにてHIR ECDに結合する。結合の50% 飽和、ED50、はキメラ HIRMAb について0.53 ± 0.02 nMである。 HIRに対する融合抗体 結合のED50は1.0 ± 0.1 nMである(図 35)。それゆえ、融合抗体のHIRに対するアフィニティーは元のキメラ HIRMAbのアフィニティー の50%より大きい。BBB におけるHIR は２つのアルファおよび２つのベータ鎖から構成される ヘテロ四量体 分子である。ヒト BBBにおけるインタクトなHIRに対する[125I]-融合抗体の結合はヒト BBBのインビトロモデルとしての単離ヒト 脳 毛細血管 (図 36A)を用いる放射受容体 アッセイにより実証した。時間依存的プロセスにてヒト 脳 毛細血管に対する[125I]-融合抗体の特異的結合が存在するが、[125I]-マウス 抗-Aβ 抗体の結合は時間によらず一定であり、非特異的である(図 36B)。 
【０２１９】
実施例 12
成体 アカゲザルにおけるインビボでの抗-Aβ ScFv/キメラ HIRMAb 融合抗体の血液から脳へのBBBを横切る流入 
融合抗体を [125I]-ヨウ素およびクロラミン T で 比放射能が 19 μCi/μgとなるようヨウ素化した。並行して、マウス 抗-Aβ MAbを[3H]-N-スクシニミジルプロプリオネート(succinimidyl proprionate)で比放射能が 0.42 uCi/ugとなるようトリチウム標識した。体重10.2 kgの8 歳雌性 アカゲザルに777 μCiの [125I]-融合抗体および 888 uCiの[3H]-マウス 抗-Aβ MAbの用量を単回静脈内注射により投与した。血清を180 分の期間にわたって複数の時点で収集した。麻酔された、一晩絶食した 霊長類の血清 グルコースは180 分の研究期間にわたって一定であり、平均すると90 ± 2 mg%であり、これは融合抗体の投与は、内在性 インスリン 受容体の干渉を起こさず、糖血症対照に対して効果を有さなかったことを示す。
【０２２０】
麻酔したアカゲザルから取り出した血清を総放射能について分析し、注入量 (I.D.)/mL 血清の%として表した(図 37)。125I 放射能をガンマカウンターでカウントし、3H 放射能を液体シンチレーションカウンターでカウントした; 125I 同位体は 3H ウィンドウにて放射能を放射し、標準曲線を3H チャンネルへの125I 溢流 (spill-over)を排除するために調製した。 [3H]-マウス 抗-Aβ MAbについての血清 %I.D./mL はすべての時点で一定であり、平均すると0.25% I.D./mLであった(図 37)。[3H]-マウス 抗-Aβ MAbの一定血液濃度は、このMAbが霊長類組織によってインビボにて有意に排除されなかったことを示し、これはモノクローナル抗体の公知の長い血液平均滞留時間 (MRT)と一致する。一方、 [125I]-融合抗体についての血清 %I.D./mLは迅速に約 0.05% I.D./mL まで低下し(図 37)、これはインスリン受容体を発現する組織を介する血液からの融合抗体の迅速なクリアランスを示す。HIRMAbはげっ歯類 インスリン 受容体とは反応しないが、HIRMAbは旧世界霊長類、例えば、アカゲザルにおけるインスリン 受容体と交差反応する。
【０２２１】
[125I]-融合抗体についての血清濃度プロファイルを2-区画薬物動態 (PK) モデルと適合させ、表 3に列挙する薬物動態学パラメーターを得た。[125I]-融合抗体についてのPK パラメーターを表 3において[111In]-キメラ HIRMAbについての成体 アカゲザルにおけるPK パラメーターと比較する。融合抗体の全身クリアランス速度はキメラ HIRMAbと異ならず、これはScFvの HIRMAbの重鎖との融合が、全身 クリアランスを変化させないことを示す。キメラ HIRMAb または融合抗体の全身 クリアランスは組織の血管障壁において高量の インスリン 受容体を発現する末梢組織、例えば、肝臓または脾臓による抗体取り込みの関数である。実際、CNSは実質的に微小血管内皮が有意な量のインスリン 受容体を発現する唯一の器官である。インスリン 受容体を発現しない連続する内皮を有する毛細血管によって灌流される、器官、例えば心臓または骨格筋によるHIRMAbまたは融合抗体のクリアランス は、インスリン 受容体に対する有意な量の抗体を排除しないであろうと予測される。肝臓または脾臓の場合、これらの器官は、高分子、例えば、モノクローナル抗体に対して自由な透過性を有する類洞 毛細血管 区画によって灌流されている。HIRMAbまたは融合抗体は、肝臓または脾臓における実質細胞上のインスリン 受容体に迅速に曝され、これら器官への取り込みは静脈内注射の後のHIRMAbまたは融合抗体の血清濃度における迅速な低下を説明する(図 37)。
【０２２２】
表 3. [125H]-融合抗体および[111In]-キメラ HIRMAbについての薬物動態パラメーター
【表２】
2014148510.tif 000003
A1、A2、k1、およびk2 は、時間による血漿濃度の減衰を記載するbi-exponential 関数の切片および傾きである。
t1/21 および t1/22 はそれぞれ k1 およびk2から計算し、それぞれの指数部についての減衰曲線の半減期である。
CLss AUCss、Vss、およびMRTはそれぞれ、定常状態 クリアランス、定常状態血清濃度曲線下面積、定常状態 全身 分布容積、および平均滞留時間であり、標準的 薬物動態公式を用いてA1、A2、k1、および k2から計算する。
【０２２３】
薬物注射後180 分において、動物を安楽死させ、脳の放射能を毛細血管枯渇方法により分析した(図 38)。この方法は、脳破砕物を毛細血管 ペレットおよび血管後(post-vascular)上清に分離する。血管後上清における抗体の分布容積 (VD)が高ければ、それは、抗体がBBBを横切って脳間質および細胞内空間に入ったことの証拠である。VDはその単位がuL/グラム脳であり、脳中の抗体濃度(DPM/g)を血清中の抗体濃度(DPM/uL)で180分の最終時点にて割った比である。[3H]-マウス 抗-Aβ MAbの脳 VDは、破砕物または血管後上清において10 uL/グラム脳であり(図 38)、このVDは脳血漿容積と同じである。それゆえ、[3H]-マウス 抗-Aβ MAbの低いVDは、このMAbが、一般的なMAbと同様にBBBを横切らないことの証拠である。すなわち、マウス 抗-Aβ MAbは、マウス形態、キメラ形態、またはヒト化形態のいずれにおいても、ヒト BBBを横切らず、そしてADのアミロイド 排除治療薬として利用することが出来なかった。図 38におけるデータに示されるように抗-Aβ MAbが BBBを横切ることができないということは、この抗体治療薬がADの診断または治療のための薬物として開発され得なかったことを意味する。同様に、その他の抗-Aβ MAb 分子もBBBを横切らず、これは、ADの治療のために認可されたMAbに基づく治療薬が存在しないことの理由である。一方、融合抗体は図 38に示す高いVDによって立証されるように迅速に霊長類 BBBを横切る。融合抗体が自由にBBBを横切り、脳のすべての部分に入ることのさらなる証拠はアカゲザル 脳における放射能の3 時間脳走査である(図 39)。融合抗体の高い脳取り込みは、この分子が血液区画からBBB インスリン 受容体に結合することが出来る能力のためであり、このBBB インスリン 受容体に対する結合が、脳への受容体媒介輸送をトリガーする。融合抗体の脳への取り込みは図 39に示すように白質と比較して灰白質において高く、それは灰白質における血管密度が脳の白質におけるよりもかなり高いためである。
【０２２４】
図 38-39に示すアカゲザルにおけるインビボ 脳 取り込み、および図 35におけるHIR 結合アッセイは、融合抗体がBBBを横切って血液から脳への方向にてBBB インスリン 受容体を介して流入することができることを示す。それゆえ、融合抗体は図 27に示す模式図の工程 1を実行することが示される。融合抗体はまた、以下の実施例によって示されるように図 27における模式図の工程2および3も実行することが出来る。
【０２２５】
実施例 13
成体ラット脳におけるインビボでのFc 受容体に媒介される抗-Aβ ScFv/キメラ HIRMAb 融合タンパク質のBBBを横切る脳から血液への流出
[125I]-融合抗体 (0.3 uL 中0.03 uCi)をBrain Efflux Index 技術の標準的プロトコールにしたがって定位固定ガイダンス下の麻酔した成体ラットの脳の皮質に注射した。例えば、引用により本明細書に組み込まれるZhang, Y. and Pardridge, W.M. (2001): Mediated efflux of IgG molecules from brain to blood across the blood-brain barrier. J Neuroimmunol, 114: 168-172を参照。以下の定位固定座標を用いて融合抗体を脳の頭頂部皮質のpar2 領域に注射した:十字縫合の0.2 mm 前側;十字縫合から5.5 mm 側方; 硬膜表面から4.5 mmの深さ。この領域を脳脊髄液 (CSF) 流路から取り出し、放射能の脳からの経時的な流出はBBBを脳から血液へ横切る流出を介してのみ起こりうる。[125I]-融合抗体のラット脳からの流出速度を次の90 分にわたって追跡した。この時間の間に[125I]-融合抗体の注入量の50%を超える量が脳から流出した(図 40)。一方、その他の高分子は約 10 時間の半減期にてラット脳から流出する。IgG 分子の脳からの迅速な流出はFcRnとも称される新生児形態のFcRを含むBBB Fc 受容体 (FcR)によって媒介される。BBB FcRはIgGの脳から血液への非対称な流出を媒介するが、IgGの血液から脳への流入は媒介しない。[125I]-融合抗体の脳からの流出はBBB FcRによって媒介される。というのは、流出はヒト Fc 断片により完全にブロックされるからである(図 40)。これらの観察は、ラット BBB FcRがヒト Fc 断片のいずれかの形態のヒト Fc、すなわち図 25に示す融合抗体のCH2-CH3-領域を含むヒト 配列を認識することを示す。げっ歯類 FcRは高いアフィニティーにてヒト IgGに結合することが知られている。例えば、引用により本明細書に組み込まれるOber, R.J., Radu, C.G., Ghetie, V. and Ward, E.S. (2001): Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. Int Immunol, 13: 1551-1559を参照。
【０２２６】
図 40に示すラットにおけるインビボ脳流出は、融合抗体が脳から血液への方向にてBBB Fc 受容体を介してBBBを横切って流出することができることを示す。それゆえ、融合抗体は図 27に示す模式図における工程 3を実行することが示される。融合抗体はまた、以下の実施例に示すように、図 27における模式図の工程 2も実行することが出来る。
【０２２７】
実施例 14
抗-Aβ ScFv/キメラ HIRMAb 融合抗体によるAβ プラークの脱凝集
Aβ プラークはAβ1-40 ペプチドを環状振盪機にて37℃で6 日間インキュベートすることによって形成し、プラークを遠心分離によって回収した。Aβ1-40 ペプチドのカルボキシル末端 (CT)に対する抗体を図 41A に示すように96-ウェルディッシュに入れた。並行して、Aβプラークを1または4 時間37℃で、図 41Bに示すように融合抗体、ヒト IgG1 (hIgG1)、またはリン酸緩衝食塩水 (PBS)のいずれかと、あるいは図 41Cに示すようにマウス 抗-Aβ MAb、マウス IgG (mIgG)、または PBSとインキュベートした。Aβ 凝集/融合抗体、またはAβ 凝集/マウス 抗-Aβ MAb複合体を次いで様々な用量で(10、30、100 uL、これらは100、300、1000 ng/mLに匹敵) 図 41Aに示すように固定化抗-CT 抗体に添加した。融合抗体の抗-Aβ ScFv 部分、またはマウス 抗-Aβ MAbは、アミノ末端 (NT)近くのAβ1-40 ペプチド上のエピトープに結合する。それゆえ、プラークが存在すると、抗-CT 抗体、プラーク、融合抗体、およびELISAによるプラークに対する抗-Aβ 抗体 結合の検出のためのペルオキシダーゼと結合した二次抗体の間に複合体が形成される。図 41Bおよび41Cにおける研究に用いた二次抗体はそれぞれ抗-ヒトおよび抗-マウス IgGであった。図 41における研究は、(a)融合抗体がAβ プラークに選択的に結合すること、(b) Aβ プラークの融合抗体との4 時間のインキュベーションはほぼ完全に Aβ プラークを用量依存的プロセスにて脱凝集させること、および (c) 融合抗体の抗-Aβ プラーク 脱凝集特性は元のマウス 抗-Aβ MAbの抗-Aβ プラーク 脱凝集特性と同程度に高いかまたはそれよりも高いことをを示す。
【０２２８】
図 41に示すAβ アミロイドプラークの脱凝集、および図 29、30、および34に示すAβ 結合データは、融合抗体が AD のAβ プラークに結合し、このプラークを脱凝集させることができることを示す。それゆえ、融合抗体は図 27に示す模式図の工程 2を実行することが示される。
【０２２９】
実施例 15
抗-Aβ ScFv/キメラ HIRMAb 融合タンパク質はアルツハイマー病におけるアミロイドプラークに結合する
融合抗体を125-ヨウ素およびクロラミン Tで放射標識し、[125I]-融合タンパク質を剖検 アルツハイマー病 (AD) 脳のミクロトーム 切片に2 時間適用した。スライドを洗浄し、暗室で乳濁液により被覆した。暗黒中での1-2 週間の曝露の後、スライドを現像し、固定し、洗浄し、光学顕微鏡により明視野にて撮影した (図 42A)。並行して、AD 脳の切片を、ハイブリドーマにより作成された マウス 抗-Aβ MAbによりペルオキシダーゼ 免疫細胞化学を用いて免疫染色した (図 42B)。並行する免疫細胞化学および乳濁液オートラジオグラフィーの光学顕微鏡は、融合タンパク質 放射性医薬品のADの血管アミロイドプラークへの結合を示し、この結合は、免疫細胞化学 および Aβに対するマウス 抗体により観察されたものと一致する(図 42)。
【０２３０】
融合タンパク質はADを有すると疑われるヒトまたは ADのAβ アミロイドの脳における沈着が疑われるヒトの脳におけるアミロイドのイメージングのための抗体 放射性医薬品として利用できた。融合抗体は、陽電子放出断層撮影 (PET)を用いる脳走査のための陽電子放射体により標識でき、または単一光子放射型コンピュータ断層撮影法 (SPECT)により検出されうる放射性核種により標識できる。SPECT 走査のために、融合抗体の好適なキレート化剤との結合の後、融合タンパク質は111-インジウムにより放射標識するとよい。かかるキレート化剤の１つは、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,-N’,N’’,N’’’-テトラ酢酸(DOTA)である。HIRMAbをDOTAと結合させた。DOTAはParish Chemical Company (Oren、UT)から得、16.2 mgのDOTAを0.81 mlの水に溶解し、80 μlの1 M NaOHを添加してpHを5.45にした。このpHはモノクローナル抗体当たりおよそ 2-10のDOTA キレーター 分子を付加することが示されている。この溶液を4℃に冷却し、240 μlを取り出し (4.4 mg)、2.33 mg のスルホ-NHSに添加し、ここでNHS はPierce Chemical Companyから得た N-ヒドロキシスクシンイミドである。次いで、8 μl (0.21 mg)の N-メチル-N’-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドヒドロクロリド(EDC、Sigmaから)を添加し、4℃で撹拌した。pHを0.2 M Na2HPO4 (pH=9.2)により7.3に調整した。NHS-DOTAを次いで8 mg のモノクローナル抗体に添加し、一晩室温でインキュベートし、次いでDOTA 結合抗体のゲルろ過による精製を行った。HIRMAbのHIRに対するアフィニティーを実施例 10に記載のようにELISAで測定した。DOTA 結合抗体のHIRに対するアフィニティーは図 43に示すように非結合抗体と有意に異なっていない。DOTA-結合融合抗体を、111-インジウムによる放射標識および標準的 外部検出放射-イメージング方法を用いる脳における標的抗原のイメージングのために調製することが出来る。
【０２３１】
実施例 16
IgG 融合タンパク質の製造方法
真核細胞株の免疫グロブリン G (IgG) 遺伝子によるトランスフェクションは 一般にIgGを構成する重鎖 (HC)および軽鎖 (LC)をコードする別々のプラスミドによる細胞株の共トランスフェクションを伴う。IgG 融合タンパク質の場合、組換え 治療用タンパク質をコードする遺伝子をHCまたはLC遺伝子のいずれかと融合させることができる。しかしこの共トランスフェクションアプローチは、HCおよび LC-融合遺伝子またはHC-融合およびLC 遺伝子の両方の同等に高い組込みを有する細胞株を選択することを困難にする。融合タンパク質の製造のための好ましいアプローチは、DNAの一本鎖上に必要なすべての遺伝子、例えば、 HC-融合タンパク質遺伝子、LC遺伝子、選択遺伝子、例えば、neo、および増幅遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子を含む単一のプラスミド DNAにより永久に トランスフェクトされた細胞株の生産である。図 24における融合タンパク質 タンデム ベクターの模式図に示すように、HC-融合遺伝子、LC遺伝子、neo遺伝子、および DHFR遺伝子はすべて別々であるがタンデムなプロモーターおよび別々であるがタンデムな転写終結配列の制御下にある。それゆえ、治療用タンパク質 の融合遺伝子およびHCまたはLC IgG遺伝子を含むすべての遺伝子が同等に宿主細胞 ゲノムに組み込まれる。
【０２３２】
実施例 17
BBBを横切る融合抗体によるパーキンソン病の治療
パーキンソン病 (PD)の神経変性は、α-シヌクレインおよびパーキンタンパク質に由来するレビー小体と称されるタンパク質 凝集の徐々の蓄積によってもたらされる。したがって、PD患者の、タンパク質、例えば、 α-シヌクレイン、またはパーキンに対する能動免疫が提案されている。PDの能動免疫はおそらくはADの能動免疫におけるものと同一の困難に遭遇しうる。BBBが破壊されなければ、免疫プログラムによって作成された血液中の抗-α-シヌクレイン、または 抗-パーキン抗体はBBBを横切らず、脳におけるタンパク質凝集に接近することが出来ない。あるいは、能動免疫プログラムにおいて投与されるアジュバントがBBBの破壊をもたらすと、毒性の副作用が生じる。α-シヌクレインまたはパーキンに対する一連のモノクローナル抗体が作成され得、レビー小体を脱凝集する抗体はScFvの産生のために選択されうる。キメラ HIRMAbおよび抗-α-シヌクレイン ScFvの融合抗体がPDの治療のために産生できる。
【０２３３】
実施例 18
BBBを横切る融合抗体によるハンチントン病の治療
ハンチントン病 (HD)の神経変性は、ハンチンチン タンパク質に由来するタンパク質 凝集の徐々の蓄積によってもたらされる。HD患者の、ハンチンチン タンパク質に対する能動免疫が提案されている。HDのハンチンチン タンパク質に対する能動免疫はおそらくはADの能動免疫におけるものと同一の困難に遭遇しうる。BBBが破壊されなければ、免疫プログラムによって作成された血液中の抗-ハンチンチン 抗体はBBBを横切らず、脳におけるハンチンチン凝集に接近することが出来ない。あるいは、能動免疫プログラムにおいて投与されるアジュバントがBBBの破壊をもたらすと、毒性の副作用が生じる。ハンチンチン タンパク質に対する一連のモノクローナル抗体が作成され得、ハンチンチン 凝集を脱凝集する抗体はScFvの産生のために選択されうる。キメラ HIRMAbおよび抗-ハンチンチン ScFvの融合抗体がHDの治療のために産生できる。
【０２３４】
実施例 19
BBBを横切る融合抗体による狂牛病の治療
狂牛病の神経変性は、プリオン タンパク質 (Prp)に由来するタンパク質 凝集の徐々の蓄積によってもたらされる。狂牛病患者の、prp タンパク質に対する能動免疫が提案されている。狂牛病患者のPrp タンパク質に対する能動免疫はおそらくはADの能動免疫におけるものと同一の困難に遭遇しうる。BBBが破壊されなければ、免疫プログラムによって作成された血液中の抗-prp 抗体はBBBを横切らず、脳におけるprp 凝集に接近することが出来ない。あるいは、能動免疫プログラムにおいて投与されるアジュバントがBBBの破壊をもたらすと、毒性の副作用が生じる。prp タンパク質に対する一連のモノクローナル抗体が作成され得、prp アミロイド凝集を脱凝集する抗体はScFvの産生のために選択されうる。キメラ HIRMAbおよび抗-prp ScFvの融合抗体が狂牛病の治療のために産生できる。
【０２３５】
実施例 20
BBBを横切る融合抗体による西ナイル脳炎の治療
西ナイルウイルスは脳に感染し、重篤な脳炎を引き起こす。ウイルスのエンベロープタンパク質に対する抗体はウイルス複製をブロックする。例えば、引用により本明細書に組み込まれる、Chung, K.M., et al. (2006): “Antibodies against West Nile Virus (WNV) nonstructural protein NS1 prevent lethal infection through Fc gamma receptor-dependent and -independent mechanisms，”  J Virol, 80: 1340-1351を参照。しかし、かかる抗体は図 44に示すように抗体がBBBを横切らないために西ナイルウイルス 感染の脳炎を治療するために利用することが出来なかった。西ナイルウイルス エンベロープ (E) タンパク質に対するモノクローナル抗体は細胞のWNV 感染の中和において部分的には有効である。キメラ HIRMAbおよび抗-エンベロープ 抗体 の融合抗体が西ナイルウイルス 脳炎の治療のために生産できる。図 44に示すように、融合抗体はまずBBB インスリン 受容体に結合して脳への輸送をトリガーし、次いで脳においてハイブリッド 分子の抗-WNV 抗体 部分がBBBの先にある脳におけるWNV を中和する。
【０２３６】
WNVのE タンパク質に対するE16 MAbのVHをコードする合成遺伝子をPCRにより生産した (図 45A)。VH遺伝子はE16 MAb VH (Genbank DQ083997)の配列に基づいて設計された一連の8つのオリゴデオキシヌクレオチド (ODN)から構築し、注文合成し、VHを生産するODN の配列を表 4、および配列番号34、35、36、37、38、39、40、41、および42に示す。配列は各ODNの5’-および3’-末端にてクロスハイブリダイズする交互のフォワードおよびリバース ODNが存在するように設計した。必要な場合コドンの第３番目を置換して安定なヘアピンループのTm を低下させる。オーバーラップするODNは75-88 ヌクレオチド(nt)であり各末端で24 ntがオーバーラップする。合成VH遺伝子は、VHを図 46においてpCD-pScFvと称する一本鎖 Fv (ScFv) 発現ベクターにサブクローニングするために適当な制限エンドヌクレアーゼ (RE) 部位を含むよう設計した。 E16 MAbのVHは、電気泳動の後のアガロースゲルの臭化エチジウム染色によって立証されるようにPCR によってクローニングした(図 45A)。
【０２３７】
PCRで作成した抗-WNV VH cDNA (図 45A)を、大量調製した(maxi-prepped) pCR-Scriptにサブクローニングし、T7およびT3 配列決定 プライマーを用いた両方向でのDNA 配列決定に供した。結果はVH遺伝子のクローニングが成功したことを示し、そのヌクレオチド配列を配列番号43に示す。抗-WNV VHの推定アミノ酸配列を配列番号44に示す。
【０２３８】
並行して、E16 抗-WNV MAb のVL をコードする遺伝子をPCRにより生産した(図 45B)。VL遺伝子はE16 MAb VL (Genbank DQ083998)の配列に基づいて設計された一連の8つのODNから構築した。注文合成した合成ODNの配列を表 5、および配列番号45、46、47、48、49、50、51、および52に示す。合成 VL遺伝子は、図 46に示すpCD-ScFv 発現ベクターへのサブクローニングのために5’-および3’-末端にてRE (HindIII、NotI)を含むよう設計する。E16 MAbのVLを、電気泳動の後のアガロースゲルの臭化エチジウム染色によって立証するようにPCR によってクローニングした(図 45B)。
【０２３９】
PCRで作成した抗-WNV VL cDNA(図 45B)を大量調製した(maxi-prepped)pCR-Scriptにサブクローニングし、 T7 およびT3 配列決定 プライマーを用いて両方向にてDNA 配列決定した。結果はVL遺伝子のクローニングが成功したことを示し、そのヌクレオチド配列を配列番号53に示す。抗-WNV VHの推定アミノ酸配列を配列番号54に示す。
【０２４０】
抗-WNV 抗体のVHおよびVLをコードする遺伝子を操作すれば、ScFv 抗体をコードする新しいcDNAの操作が可能となり、それによりVHおよびVLが共通のペプチド リンカーを介して１つのポリペプチドを形成した。宿主細胞における抗-WNV ScFvの発現を可能にするために、発現プラスミドを操作し、pCD-ScFvと命名した。pCD-ScFv ベクターをAfeI および HindIIIで開裂させると非関連VH遺伝子が放出される(図 46)。PCRにより作成したVH (図 45A)をHindIIIで消化し、次いで、T4 リガーゼを用いて、pCD-ScFv ベクター中の真核 シグナルペプチドおよびVHおよびVL を連結する17 アミノ酸リンカー とインフレームにてpCD-ScFv にライゲーションした(図 46)。新しい pCD-ScFv、およびPCRにより作成されたVLを、HindIIIおよびNotIで消化し、VLをT4 リガーゼによりベクターに挿入して抗-WNV ScFv 発現ベクターであるpCD-WNV-ScFvを生産する(図 46)。 pCD-ScFv プラスミドにおけるサブクローニングは、9E10 MAb のc-myc エピトープをScFvのカルボキシル末端に配置する; このエピトープは以下の10-アミノ酸配列から構成される: EQKLISEEDL。この配列の存在および9E10 抗-c-myc マウス MAbの入手可能性により、抗-WNV ScFvのウェスタンブロッティングによる検出が可能となる。pCD-ScFv 発現プラスミドはまた、c-myc エピトープの後に6-ヒスチジン タグもコードし、この (His)6は、COS 細胞における発現の後に固定化金属 アフィニティー クロマトグラフィーによる精製を可能とする。抗-WNV ScFVのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号55 および配列番号56に示す。
【０２４１】
抗-WNV 抗体の生理活性を評価するために、抗-WNV 抗体のエピトープを含むWNVのE タンパク質の部分の生産が必要であった。このエピトープはウイルス E タンパク質 (Genbank NC001563)のアミノ酸 296-401の間のDIII 領域内に含まれる。DIII遺伝子はPCRによって生産され、設計および注文合成された一連の8つのODNから構築され、DIII遺伝子を生産するODNの配列を表 6、および配列番号57、58、59、60、61、62、63、および64に示す。配列を、各ODNの5’-および3’-末端にてクロスハイブリダイズする交互のフォワードおよびリバース ODNが存在するよう設計した。PCRにより作成されたDIII (図 45C)を大量調製された(maxi-prepped)pCR-Scriptにサブクローニングし、T7およびT3 配列決定 プライマーを用いた両方向でのDNA 配列決定に供した。結果はDIII遺伝子のクローニングが成功したことを示し、そのヌクレオチド配列を配列番号65に示す。DIII タンパク質の推定アミノ酸配列を配列番号66に示す。
【０２４２】
合成 DIII遺伝子を、DIIIのpCD-DIIIと称される真核発現ベクターへのサブクローニングのために、好適な制限エンドヌクレアーゼ (RE) 部位を含むように設計する。pCD-DIIIの操作のために、pCD-ScFv (図 46) をNotIおよびEcoRIで消化し、ゲルで精製し、c-myc コード配列を放出させる。並行して、以下の配列を有する人工 リンカーを生産する: 5’-GCGGCCGCTGGATCCCATCATCACCATCATCAT TAAGAATTC-3’、そしてこのリンカーをNotI および EcoRIで処理し、開環した pCD-ScFvにライゲーションしてpCD-ScFvIIと称される中間体 プラスミドを生産する。後者をゲルで精製し、AfeIおよびNotIで消化し、NotI-消化した DIII PCR産物 (図 45C)を中間体 プラスミドにライゲーションし、pCD-DIIIを作成する。
【０２４３】
pCD-ScFvをテンプレートとして用い、ScFvのみを増幅し、シグナルペプチドを増幅しないプライマーを用いるPCRによって作成されたWNV ScFv cDNAを、pCD-UHCにサブクローニングして図 46に示すようにpCD-HC-BSAを生産する。pCD-UHCは、ヒト IgG シグナルペプチドの影響下でキメラ HIRMAbの重鎖 (HC)をコードし、これを HpaIで直鎖化する(図 46)。この部位はHC オープンリーディングフレームのすぐ 3’-末端に位置しており、抗-WNV ScFvのアミノ末端の、HIRMAbのヒト IgG1 定常部のCH3 ドメインのカルボキシル末端への融合を可能とする。最終的な重鎖融合タンパク質を図 46に示す pCD-HC-BSA ベクターで発現させ、これは図 47に示すタンパク質をコードする。 HC 抗-WNV 融合 重鎖のアミノ酸配列を配列番号67に示す。融合 重鎖は図 47に示すように以下のドメインから構成される:
・19 アミノ酸 ヒト IgG シグナルペプチド
・キメラ HIRMAbのVH
・CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3 領域から構成されるヒト IgG1 C-領域
・Ser-Ser リンカー
・WNV MAb のVH 
・17 アミノ酸リンカー
・WNV MAbのVL。
【０２４４】
BBBを横切り、かつWNVを中和するインタクトな融合抗体は図 47に示す2つの重鎖および図 26に示す構造と類似の2つの軽鎖から構成されるヘテロ四量体 分子である。融合抗体の製造のための、真核宿主細胞の永久のトランスフェクションのために、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) DG44 細胞を融合重鎖 (HC) および HIRMAb 軽鎖 (LC)をコードする別々の発現プラスミドにより永久に トランスフェクトしてもよい。さらに、CHO 細胞をジヒドロ葉酸還元酵素 (DHFR) 遺伝子によりトランスフェクトすることが必要であり、これによりメトトレキサート (MTX)による増幅を介して高生産性細胞株の単離が可能となる。商業価値が高く、WNV BSAに対する市場の要求を満たしうる高生産性 CHO 株を単離するためには、タンデム ベクター (TV)と称される１片の DNAの上にすべての3つの遺伝子 (HC、LC、DHFR)を含めることが必要である。WNV 融合抗体を発現するTV を TV-BSAと称し、図 48に示す。TV-BSAを以下の3つの前駆体発現プラスミドから操作する:図 46に示すHC 融合遺伝子であるpCD-HC、HIRMAb LC 発現プラスミドであるpCD-LC、および野生型 (wt) マウス DHFR をコードするpwtDHFR。TV-BSAはトランスフェクトされた CHO 株のG418による最初の選択のためにネオマイシン耐性遺伝子 (neo)もコードする。3つの遺伝子の発現カセットは以下を含む:
HC カセットは、サイトメガロウイルス (CMV) プロモーター、次いで、 HC 融合遺伝子 (HIRMAb HCの3’-末端に融合したScFvを含む)、次いで、ウシ成長ホルモン (BGH) ポリA 終結配列から構成される
LC カセットは、 CMV プロモーター、次いで LC遺伝子、次いでBGH ポリA 終結配列から構成される
DHFR カセットは、サル ウイルス (SV)40 プロモーター、次いでマウス DHFR、次いで B型肝炎 ウイルス (HBV) ポリA 終結配列から構成される。
【０２４５】
TV-BSAの遺伝子操作の出発点は、図 48に示すようにpCD-HC-BSAである。pCD-HC-BSAの部位特異的突然変異誘発 (SDM)を行い、製造業者の指示に従ってODN プライマーとともにStratagene QuickChange キットを用いてクローン pCD-HC-BSAのBGH ポリA+ 部位の末端にAfeI 部位を導入する。pCD-HC-BSA-AfeIと称する中間体 プラスミドをNruIで消化し、アルカリホスファターゼで処理して再閉環(reclosing)を阻止する。 LC 発現カセットがNruIおよびAfeIでの二重消化によりpCD-LC ベクターから放出され、ゲルで精製した。LC カセットをpCD-HC-WNV-AfeIに NruI 部位にてサブクローニングし、pCD-HC-LC 中間体 プラスミドを形成する(図 48)。 SV40 プロモーターの影響下にあるDHFR 発現カセットを、SmaI-SalI 消化によってpwtDHFR プラスミドから単離し、Qiagen gel 抽出キットを用いてゲルで精製する。SalI末端をT4 DNA ポリメラーゼで埋めて平滑にする。wtDHFR 発現カセットを pCD-HC-LCに AfeI 部位にてライゲーションし、TV-BSAを形成する(図 48)。 AfeI-SDMおよび中間体陽性クローンの両方の同定、ならびにそれらの方向の確認を、制限エンドヌクレアーゼ マッピングおよびDNA 配列決定によって行う。
【０２４６】
TV-BSAの遺伝子操作およびDNA 配列決定による確証に続いて、CHO 細胞をエレクトロポレーションにより永久に トランスフェクトすることができる。MTXによる増幅、および希釈性クローニングの後、高生産性細胞株を単離し、WNVに対する融合抗体の大量生産のためにバイオリアクターにて増殖させることができる。この融合抗体は、BBBを横切り、 WNVを中和するよう操作された最初のモノクローナル抗体治療薬であろう。BBBを横切る能力がなければ、抗-WNV MAbはBBBの先にあるWNVに接近することができない。BBBによって提供される脳の保護領域の中で、WNVは脳炎が重篤な疾病および死亡をもたらすまで脳内で複製することが出来る。
【０２４７】
表 4.抗-WNV VHの産生のためのオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)
1) FWD-1 (75-mer) 配列番号35
CAGGTaCAGCTGCAGCAGTCTGGATCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTaCAGATATCCTGCAAGGCTACT
2) REV-1 (87-mer) 配列番号36
CTCAAGGCCATGTCCAGGtCTCTGCTTTACCCACTCAATCCAGTAGTCACTGAATGTGTAGCCAGTAGCCTTGCAGGATATCTGtAC
3) FWD-2 (87-mer) 配列番号37
CAGAGaCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTTATGTGGAACTGGTAGAACTAGATACAATGAGAAGTTAAAaGCaATG
4) REV-2 (88-mer) 配列番号38
CAGATGTCAGGCTGCTtAGTTGCATGAAGGCTGTGTTGGAGGATGTATCTGCAGTGAATGTGGCCATtGCtTTTAACTTC
TCATTGTA
5) FWD-3 (87-mer) 配列番号39
TGCAACTaAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCaGCaGTCTATTACTGTGCAAGATCGGCaTCATATGGTGATTACGCTGACTACTGGG
6) REV-3 (77-mer) 配列番号40
TTCAAGCTTGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCATGGCCCCAGTAGTCAGCGTAATCACCAT
7) 5’-PCR FWD (24-mer) 配列番号41
5’-リン酸-CAGGTaCAGCTGCAGCAGTCTGGA
8) 3’-PCR-REV (24-mer) 配列番号42
TTCAAGCTTGGGTGTCGTTTTGGC
小文字は安定なヘアピンループのTmを 30-46℃に低下させるために置換されたコドンの第３番目のヌクレオチドを示す。オーバーラップする ODNは 76-88 ntの長さであり、24 ntが両方の末端でオーバーラップしている。すべてのODNはリバース試験により再確認し、ここで cDNAはODNから構築され、前者が翻訳される。翻訳されたタンパク質は予測されたものと同一であった。
【０２４８】
表 5.抗-WNV VLの産生のためのオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)
1) 165-LV-FWD-1 (76-mer) 配列番号45
TACAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGACATaGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCA
2) 165-LV-REV-1 (88-mer) 配列番号46
GCAGTACTCACATCCTGACTGGCCTTGCAtGTtATGCTGACtCTGTCTCCTACTGATGTGGACATGAATTTGTGAGACTGGGTCATCA
3) 165-LV-FWD-2 (88-mer) 配列番号47
GGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCaTGGTATCAACAAAAACCtGGGCAATCTCCTAAACTACTCATTTCCTGGGCATCCACa
4) 165-LV-REV-2(88-mer) 配列番号48
TGGTGAGAGTATAATCTGTCCCAGATCCACTGCCaGTGAAGCGATCgGGtACTCCtGTGTGCCGtGTGGATGCCCAGGAAATGAGTAG
5) 165-LV-FWD-3 (88-mer) 配列番号49
CTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGtAGTGTGCAGGCTGAAGACCTaGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATACCACTCCCCT
6) 165-LV-REV-3(78-mer) 配列番号50
GATGCGGCCGCAGCgTCAGCTTTCAGCTCCAGtTTGGTtCCAGCACCGAACGTGAGGGGAGTGGTATAATGTTGCTGA
【０２４９】
表 5 (続き)
7) 5’-PCR 165-VL-F 配列番号51
TACAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTC
8) 3’-PCR 165-VL-R 配列番号52
GATGCGGCCGCAGCgTCAGCTTTC
小文字は安定なヘアピンループのTmを 30-46℃に低下させるために置換されたコドンの第３番目のヌクレオチドを示す。オーバーラップする ODNは 76-88 ntの長さであり、24 ntが両方の末端でオーバーラップしている。すべてのODNはリバース試験により再確認し、ここで cDNAはODNから構築され、前者が翻訳される。翻訳されたタンパク質は予測されたものと同一であった。
【０２５０】
表 6. WNV E タンパク質のDIIIの産生のためのオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)
1) DIII-FWD-1 (68-MER) 配列番号57
CAGCTGAAGGGAACAACATATGGAGTCTGCTCAAAAGCTTT
CAAATTCGCTAGGACTCCCGCTGACAC
2) DIII-REV-1 (80-MER) 配列番号58
TGCAGGGACCGTCTGTTCCAGTATATTGCAGTTCCAACACC
ACAGTTCCATGTCCAGTGTCAGCGGGAGTCCTAGCGAAT
3) DIII-FWD-2 (80-MER) 配列番号59
ATACTGGAACAGACGGTCCCTGCAAAGTGCCCATTTCTTCC
GTAGCTTCCCTGAATGACCTCACACCTGTTGGAAGACTG
4) DIII-REV-2 (80-MER) 配列番号60
TCAATCAAAACCTTCGAGTTGGCTGTGGCTACAGACACAAA
TGGATTCACGGTCACCAGTCTTCCAACAGGTGTGAGGTC
5) DIII-FWD-3 (80-MER) 配列番号61
AGCCAACTCGAAGGTTTTGATTGAACTCGAACCCCCGTTTG
GTGACTCTTACATCGTGGTGGGAAGAGGAGAACAGCAGA
6) DIII-REV-3 (70-MER) 配列番号62
GTAGCGGCCGCAGCATCAGCTCCAGATTTGTGCCAGTGATG
GTTTATCTGCTGTTCTCCTCTTCCCACCA
7) 5’-PCR DIII-FWD (25-MER) 配列番号63
CAGCTGAAGGGAACAACATATGGAG
8) 5’-PCR DIII-REV (24-MER) 配列番号64
GTAGCGGCCGCAGCATCAGCTCCAG
【０２５１】
実施例 21
BBBを横切る抗体によるneuro-AIDSの治療
ヒト 免疫不全 ウイルス (HIV)は後天性免疫不全症候群 (AIDS)を引き起こし、HIVは脳に感染して認知症およびneuro-AIDSのその他の症候をもたらす。腫瘍壊死因子 (TNF)-関連アポトーシス誘発リガンド (TRAIL) はneuro-AIDS における神経細胞死を誘発し、抗-TRAIL 抗体の投与は、BBB 破壊をもたらすリポ多糖の全身投与の後、HIV-感染した脳における神経細胞アポトーシスを阻害する。しかし、血清 タンパク質は脳に対して毒性であるためBBBの破壊は抗体の脳への投与のための安全な方法ではない。キメラ HIRMAb および 抗-TRAIL ScFv 抗体の融合抗体をneuro-AIDSの治療のために生産できる。脳のAIDS 感染の治療はまた、抗-炭化水素、または抗-グリカン抗体を使用してもよい。マンソン住血吸虫の炭化水素部分に対するモノクローナル抗体はHIV 増殖の強力な阻害剤である。キメラ HIRMAbおよび 抗-グリカン 抗体の融合抗体を脳のHIV-1 感染を含む脳のウイルス 感染の治療のために生産することが出来る。
【０２５２】
実施例 22
BBBを横切る融合抗体による脳または脊髄損傷または脳卒中の治療
脳損傷、脊髄損傷、または脳卒中の後の損傷を受けた脳の回復は、脳における天然 タンパク質であるnogo-Aにより阻害される。モノクローナル抗体によるnogo-Aの阻害は脳傷害の後の機能の回復を促進する。例えば、引用により本明細書に組み込まれるBuchli, A.D. and Schwab, M.E. (2005): Inhibition of Nogo: a key strategy to increase regeneration, plasticity and functional recovery of the lesioned central nervous system. Ann Med, 37: 556-567を参照。BBBは損傷の後に脳が治癒する際に破壊され、全身投与された抗-nogo-A 抗体はこの時間窓の間に脳に透過する可能性がある。 しかし、BBB 破壊の期間の後にBBBは閉じ、この時間の間にも脳における内在性 nogo-Aを阻害し続ける必要がある。キメラ HIRMAbおよび抗-nogoA 抗体の融合抗体を、脳損傷、脊髄損傷、または脳卒中からの回復期間の治療のために生産することができる。
【０２５３】
実施例 23
BBBを横切る融合抗体による脳に転移する癌の治療
HER2-陽性乳癌細胞の増殖はHER2に対するモノクローナル抗体によって阻害される。乳癌はしばしば脳に転移し、脳において乳癌細胞はBBBの先に滞留する。この設定において、抗体はBBBを通過しないために、抗-HER2 抗体は脳における乳癌の増殖を阻害することができない。例えば、引用により本明細書に組み込まれるDuchnowska, R. and Szczylik, C. (2005): Central nervous system metastases in breast cancer patients administered trastuzumab. Cancer Treat Rev, 31: 312-318を参照。キメラ HIRMAbおよび抗-HER2 抗体の融合抗体を脳の転移性乳癌の治療のために生産することが出来る。その他の上皮癌、例えば、小細胞肺癌 (SCLC)は、糖脂質またはガングリオシドである腫瘍関連抗原(TAA)を発現する。TAA 糖脂質に対するモノクローナル抗体はアポトーシスを誘発し、SCLCの細胞増殖を抑制する。キメラ HIRMAb および抗-糖脂質抗体の融合抗体を脳の転移性癌の治療のために生産することが出来る。
【０２５４】
実施例 24
BBBを横切る融合抗体による脳癌の治療
脳癌細胞の増殖は、特定の栄養因子、例えば、 上皮増殖因子 (EGF) または肝細胞増殖因子 (HGF)によって刺激される。EGF または HGFの阻害は脳癌のための治療戦略であり、これら増殖因子は増殖因子-特異的モノクローナル抗体によって阻害される。しかし、抗体は脳癌においてインタクトであるBBBを通過しない。その結果、抗-栄養因子抗体の全身投与は頭蓋内脳癌の増殖を抑制しない。例えば、引用により本明細書に組み込まれるSampson, J.H., et al. (2000): Unarmed, tumor-specific monoclonal antibody effectively treats brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A, 97: 7503-7508を参照。キメラ HIRMAb および抗-増殖因子 抗体の融合抗体を脳癌の治療のために生産することが出来る。
【０２５５】
実施例 25
BBBを横切る融合抗体による多発性硬化症の治療
多発性硬化症 (MS)は、脳におけるミエリンの欠損に関連する。MSの治療法は、再ミエリン化を増加させることを目的とし、これはオリゴデンドロサイト表面抗原に対するモノクローナル抗体により促進されうる。例えば、引用により本明細書に組み込まれるWarrington, A.E., et al. (2000): Human monoclonal antibodies reactive to oligodendrocytes promote remyelination in a model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A, 97: 6820-6825を参照。BBBはMSにおいて破壊されている可能性があるが、この破壊は断続的である。キメラ HIRMAbおよび抗-ヒト オリゴデンドロサイト表面抗原抗体の融合抗体をMSの治療のために生産することが出来る。
【０２５６】
実施例 26
血液から脳への方向にて優先的にBBBを横切る融合抗体による脳疾患の治療
脳の凝集疾患、例えば、 アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、または狂牛病の治療において、BBB FcR を介するBBB を横切る流出を介して、凝集したタンパク質の脳からの排出が意図される(図 27)。しかし、その他の脳疾患、例えば、実施例 20-25に教示のものの場合は、抗体治療薬の脳における滞留時間を延長することが意図される。この場合、融合抗体の脳からの流出は、図 25および26に示すCH1、CH2、およびCH3を含む領域にみられる、BBB FcR 流出系の結合部位である融合抗体の部分を排除することによって最小化することができる。この場合、融合抗体の重鎖をコードする遺伝子を、重鎖のCH1、CH2、またはCH3 領域のいずれかまたはすべての部分を排除するように操作するとよい。ScFv タンパク質は図 25-26に示すようにCH3 領域のカルボキシル末端に融合させることができ、あるいは、ScFv タンパク質は重鎖のヒンジ、CH1、またはCH2 領域のカルボキシル末端に融合させることもできる。
【０２５７】
実施例 27
融合抗体-Aβ 複合体の測定に基づく血液検査によるアルツハイマー病の診断
融合抗体のAD患者への投与は、図 27に示すように脳から血液への融合抗体とAβ ペプチドとの間の複合体の流出に続いて、かかる複合体の血液中での形成を導くと予測される。かかる複合体はAD、またはAD前状態、例えば、 軽度認知機能障害に特異的な脳におけるアミロイド 発達を有する患者においてはより多量に形成されるはずである。ADを引き起こす脳におけるアミロイドは、症候の発症の前に何年も蓄積することが知られている。それゆえ、融合抗体の投与の後の融合抗体とAβとの間の複合体の形成の増加は活動性ADの検出のみならず、ADの後での発達のリスクにある個体の検出をも導きうる。ヒト 血液における融合抗体-Aβ 複合体は、標準的方法を用いるサンドウィッチに基づく ELISAにより定量することが可能である。 アッセイのかかる態様の１つにおいて、抗-Aβ 抗体をプレートに入れ、次いで融合抗体-Aβ複合体を捕捉する。融合抗体はAβのアミノ末端部分に結合するので、捕捉抗体は、図 42Aに示し、実施例 14に記載される脱凝集 アッセイにおいて用いたものと同様にAβのカルボキシル末端 部分に対して結合が起こるように選択するとよい。サンドウィッチ アッセイにおける二次抗体は、図 42A、および実施例 14に示すように抗-ヒト IgG 抗体とすればよい。
【０２５８】
実施例 28
融合抗体放射性医薬品による脳癌の治療
脳癌は特定の表面抗原を正常脳と比較して過剰発現し、脳癌の放射線療法の１つのアプローチは、放射性核種と結合したMAb 治療薬、例えば、 211At-標識化抗-テネイシン MAbの投与である。例えば、引用により本明細書に組み込まれるMcLendon R.E. et al. (1999): Radiotoxicity of systemically administered 211At-labeled human/mouse chimeric monoclonal antibody: a long-term survival study with histologic analysis. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 45: 491-499を参照。MAb 治療薬のBBBを横切る輸送を促進するために、キメラ HIRMAbおよび脳腫瘍関連抗原に対するMAbから構成される放射性核種-結合融合抗体を生産することが出来る。正常脳の放射線への曝露は非放射性の放射性核種、例えば、 10Bとの融合抗体の結合により排除することができる。10B-標識化融合抗体の投与、および正常脳からの抗体の流出の後、脳腫瘍を選択的に低エネルギー熱中性子で照射することができ、これは脳癌の局所アルファ線照射をもたらす。例えば、引用により本明細書に組み込まれるBarth, R.F. et al. (1999): Boron neutron capture therapy of brain tumors: an emerging therapeutic modality. Neurosurg. 44: 433-451を参照。
【０２５９】
本発明の好ましい態様を本明細書において示し記載してきたが、本明細書において記載する本発明の態様に対する様々な改変が本発明の実施において行うことが出来ることを理解されたい。以下の請求の範囲は本発明の範囲を規定する意図であり、これら請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれに包含される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月3日(2014.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液脳関門(BBB)を通過することができる融合抗体であって、第１の抗体および第２の抗体を含み、
(i)該第１の抗体が、該第２の抗体のカルボキシ末端に連結している一本鎖抗体であり、かつ、
(ii)該第１の抗体が、別々の部分としてのその活性と比較して平均で少なくとも約20%のその活性を保持している、融合抗体。
【請求項２】
BBBの内在性受容体に結合することによって血液から脳へとBBBを通過することができる、請求項１の融合抗体。
【請求項３】
インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、およびインスリン様増殖因子(IGF)受容体からなる群より選択されるBBBの内在性受容体に結合することによって血液から脳へとBBBを通過することができる、請求項１の融合抗体。
【請求項４】
インスリン受容体に結合することによって血液から脳へとBBBを通過することができる、請求項１の融合抗体。
【請求項５】
Fc受容体に結合することによって脳から血液へとBBBを通過することを可能にするFc領域を含む、請求項１の融合抗体。
【請求項６】
脳障害に関連する病理学的物質と相互作用することができる、請求項１の融合抗体。
【請求項７】
病理学的物質が、タンパク質、核酸、炭水化物、炭水化物ポリマー、脂質、糖脂質、低分子およびそれらの組合せからなる群より選択されるタイプのものである、請求項６の融合抗体。
【請求項８】
病理学的物質がタンパク質である、請求項６の融合抗体。
【請求項９】
タンパク質が、Aβアミロイド、α-シヌクレイン、ハンチンチンタンパク質、PrPプリオンタンパク質、西ナイルエンベロープタンパク質、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)、Nogo A、HER2、上皮増殖因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子(HGF)またはオリゴデンドロサイト表面抗原である、請求項８の融合抗体。
【請求項１０】
タンパク質がAβアミロイドである、請求項８の融合抗体。
【請求項１１】
脳障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ウシ海綿状脳症、西ナイルウイルス脳炎、Neuro-AIDS、脳傷害、脊髄傷害、脳の転移性癌、脳の転移性乳癌、脳の原発性癌または多発性硬化症である、請求項６の融合抗体。
【請求項１２】
第１の抗体がアミロイドβ(Aβ)ペプチドに結合することができるものである、請求項１の融合抗体。
【請求項１３】
第１の抗体のその抗原に対する解離定数が 100 nM 未満である、請求項１の融合抗体。
【請求項１４】
第１の抗体がそのアミノ末端において第２の抗体の重鎖のカルボキシ末端に融合している、請求項１の融合抗体。
【請求項１５】
第１の抗体がそのアミノ末端において第２の抗体の軽鎖のカルボキシ末端に融合している、請求項１の融合抗体。
【請求項１６】
第２の抗体がモノクローナル抗体(MAb)である、請求項１の融合抗体。
【請求項１７】
第２の抗体がBBB受容体に結合することができるものである、請求項１の融合抗体。
【請求項１８】
第２の抗体がCH2領域、CH3領域およびVH領域を含むものである、請求項１の融合抗体。
【請求項１９】
第１の抗体が該CH3領域のカルボキシル末端に共有結合している、請求項１８の融合抗体。
【請求項２０】
該VH領域が、インビボで又は組換え方法により生成される抗体に由来するものである、請求項１８の融合抗体。
【請求項２１】
組換え方法がファージまたはベクター中における組換え抗体のライブラリーの選択を含む、請求項１８の融合抗体。
【請求項２２】
第１の抗体がインビボで又は組換え方法により生成されるものである、請求項１８の融合抗体。
【請求項２３】
組換え方法がファージまたはベクター中における組換え抗体のライブラリーの選択を含む、請求項２２の融合抗体。
【請求項２４】
第１の抗体がVH領域およびVL領域を含むものである、請求項１の融合抗体。
【請求項２５】
第１の抗体が一本鎖Fab、Fab'、F(ab)2またはFv抗体である、請求項２４の融合抗体。 
【請求項２６】
第１の抗体が一本鎖Fv(ScFv)抗体である、請求項２５の融合抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
【図１Ａ】ADの Aβペプチドに対する一本鎖Fv(ScFv)抗体をコードする原核生物発現ベクターの遺伝子操作を示す図表。ScFv は Aβに対するマウスの(m)抗体に由来し、mAβScFv と名付けられる。ScFv は、Aβペプチドに対するマウスの MAb に由来する重鎖の可変領域(VH)および軽鎖の可変領域(VL)で構成される。VH および VL はリンカーにより連結されて ScFv を形成する。VH cDNA をコードする遺伝子は、抗-Aβ抗体を分泌するマウスのハイブリドーマより単離された RNA から、マウスの VH アイソタイプに特異的なオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により産生される; PCR に続き、VH 遺伝子は T4 リガーゼを用いて pPC プラスミドに連結される。VL cDNA をコードする遺伝子は、抗-Aβ抗体を分泌するマウスのハイブリドーマより単離された RNA から、マウスの VL アイソタイプに特異的な ODN プライマーを用いる PCR により産生される; PCR に続き、VL 遺伝子は T4 リガーゼを用いて pPC プラスミドに連結される。
【図１Ｂ】IgG シグナルペプチドおよび Kozak 部位と共に mAβScFv cDNA をコードする真核生物発現プラスミドの遺伝子操作を示す図表。真核生物発現プラスミドは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびポリA(pA)転写終結配列を含有する。
【図２】キメラ HIRMAb(HC-1)の重鎖(HC)をコードする cDNA の 3’-末端に、その 5’-末端で融合される mAβScFv cDNA をコードする真核生物発現プラスミドの遺伝子操作を示す図表。Amp=アンピシリン耐性遺伝子; G418=ネオマイシン耐性遺伝子; ori=SV40 複製開始点; CMV=サイトメガロウイルスプロモーター; pA=ポリ A 転写終結配列。
【図３】融合抗体をコードする融合遺伝子の構築における中間体である、多様なコンストラクトおよび PCR 増幅された cDNA のサイズを示すエチジウムブロマイド染色のアガロースゲル、ここで、mAβScFv はそのアミノ末端で キメラ HIRMAb の重鎖のカルボキシル末端に融合している。(A) レーン 1 および 2、それぞれ、PCR 増幅された 0.4 kb mAβScFv VH cDNA および PCR 増幅された 0.4 kb mAβScFv VL cDNA。ポリA+ RNA は、抗-AβMAb を発現するマウスのハイブリドーマから単離され、表 2 に示す VH および VL 特異的 ODN プライマーを用いて逆転写および PCR 増幅された。レーン 3、1.4-0.1 kb の範囲の分子量(MW)サイズ標準。レーン 4、 23-2.0 kb の範囲の MW サイズ標準。(B)レーン 1、抗-AβMAb の VH に相当する 〜0.4 kb の期待されたバンドサイズ、および骨格ベクター(〜3.0 kb)を示す pPC-mAβ-VH の NcoI および HindIII 消化。レーン 2、ベクター骨格に相当する 〜3.5 kb の期待されたバンドサイズ、および xVH(〜0.4 kb)を示す pAP-xScFv クローニングベクターの NcoI および HindIII 消化、ここで、xVH は、元の pAP-xScFv プラスミドに含有されている関係のない ScFv の VH である(図 1A)。レーン 3 および 4 は、パネル A に示されたものと同一の MW サイズ標準である。(C) レーン 1、抗-AβMAb の VL に相当する 〜0.4 kb の期待されたバンドサイズ、および骨格ベクター(〜3.0 kb)を示す pPC-mAβ-VL の MluI および NotI 消化。レーン 2、プラスミド骨格に相当する〜3.5 kb の期待されたバンドサイズ、および xVL(〜0.4 kb)を示す p-mAβ-VH の MluI および NotI 消化、ここで xVL は、元の pAP-xScFv プラスミドに含有されている関係のない ScFv の VL である。レーン 3 および 4 は、パネル A に示されたものと同一の MW サイズ標準である。(D) レーン 1、直鎖状骨格ベクターに相当する〜5.4 kb の期待されたバンドサイズを示す、真核生物発現プラスミド pCD の XhoI-EcoRI 消化(全部で 2 レーン)。レーン 2、〜0.8 kb の期待されたバンドサイズおよび、より小さい MW サイズおよびより大きい MW サイズの主要でないバンドを示す、PCR 産生 mAβScFv cDNA の XhoI-EcoRI 消化(全部で 3 レーン)。レーン 3 および 4 は、パネル A に示されたのと同一の MW サイズ標準である。(E) レーン 1、HIRMAb-mAβScFv 融合抗体タンデム発現ベクターの操作において用いるための mAβScFv cDNA に相当する 〜0.8 kb の期待された単一のバンドを示す PCR 産物。レーン 2 および 3 は、パネル A に示されたのと同一の MW サイズ標準である。(F) それぞれ、6.5、3.6、0.5 および 0.4 kb の期待されたバンドを示す、HIRMAb-mAβScFv 融合抗体タンデムベクターの HindIII 消化 エンドヌクレアーゼマッピング。レーン 2 および 3 は、パネル A に示されたのと同一の MW サイズ標準である。
【図４】抗-AβMAb を分泌するマウスのハイブリドーマから PCR によって生成されたマウス 抗-AβMAb の VH のヌクレオチド配列(配列番号11)。配列は pPC-mAβ-VH プラスミド(図 1A) の DNA シークエンシングによって決定された。
【図５】抗-AβMAb を分泌するマウスのハイブリドーマから PCR によって生成されたマウス抗-AβMAb の VH のアミノ酸配列(配列番号12)。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号11)から推定される。下線が引かれたアミノ酸は、マウスのハイブリドーマから単離された抗-AβMAb の重鎖から得られたトリプシンペプチドのアミノ酸配列と一致した。抗-AβMAb 重鎖 VH の CDR1、CDR2、および CDR3 のアミノ酸配列は太字フォントで表されている。
【図６】抗-AβMAb を分泌するマウスのハイブリドーマから PCR によって生成されたマウス 抗-AβMAb の VL のヌクレオチド配列(配列番号13)。配列は、pPC-mAβ-VL プラスミド(図 1A)の DNA シークエンシングによって決定された。
【図７】抗-AβMAb を分泌するマウスのハイブリドーマから PCR によって生成されたマウス 抗-AβMAbの VL のアミノ酸配列(配列番号14)。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号13)から推定される。マウスのハイブリドーマに由来する抗-AβMAb の軽鎖の位置 2 においてバリン(V)残基が観察されたことを除き、推定配列のアミノ末端にある 11 アミノ酸は、ハイブリドーマが生成したマウス抗-AβMAb の軽鎖の直接アミノ酸シークエンシングを用いて観察されたアミノ酸と一致した。抗-AβMAb 軽鎖 VL の CDR1、CDR2、および CDR3 のアミノ酸配列は太字フォントで表されている。
【図８】原核生物発現プラスミドによりコードされる 抗-AβScFv cDNAのヌクレオチド配列(配列番号15)。配列は、pPC-mAβScFv プラスミド(図 1A)の DNA シークエンシングによって決定された。
【図９】原核生物発現プラスミドによりコードされ、カルボキシル末端にポリ-ヒスチジン(H)テールおよび 9E10 エピトープ(EQKLISEEDL)(配列番号66)を包含する、抗-AβScFv cDNA のアミノ酸配列(配列番号16)。配列は、pPC-mAβScFv プラスミドの DNA シークエンシングによって決定された(図 1A)。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号15)から推定される。VH と VL を隔てる 17-アミノ酸のリンカーは下線が引かれている。
【図１０】真核生物発現プラスミドによりコードされる抗-Aβ ScFv cDNA のヌクレオチド配列(配列番号17)。配列は、pCD-mAβScFv プラスミド(図 1B)の DNA シークエンシングにより決定された。
【図１１】真核生物発現プラスミドによりコードされる抗-Aβ ScFv cDNA のアミノ酸配列(配列番号18)。カルボキシル末端におけるポリ-ヒスチジン(H)テールは除去されている。mAβScFv は 19-アミノ酸の IgG シグナルペプチドの下流にあり、シグナルペプチド配列には下線が引かれている。アミノ酸配列はヌクレオチド配列(配列番号17)から推定される。
【図１２】キメラ HIRMAb 重鎖をコードする cDNA の 3’-末端に融合した抗-Aβ ScFv cDNA で構成され、真核生物発現プラスミドによりコードされる融合遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号19)。配列は、pCD-HC-mAβScFv プラスミド(図 2)の DNA シークエンシングによって決定された。
【図１３】HC-mAβScFv 融合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号20)、ここで、抗-AβScFv は キメラ HIRMAb 重鎖(HC)のカルボキシル末端に S-S リンカーを介して結合しており、S=セリンである。HC-mAβScFv 融合タンパク質は、19-アミノ酸の IgG シグナルペプチドの下流にあり、シグナルペプチド配列には下線が引かれている。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号19)から推定される。
【図１４】キメラ HIRMAb 重鎖をコードする cDNA の 3’-末端に融合した抗-AβScFv cDNA で構成され、真核生物発現プラスミド、pCD-HC-mAβScFvプラスミド(図 2)によりコードされる、部位特異的変異誘発をされた融合遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号21)。位置 1789 における‘A’ヌクレオチドは‘G’ヌクレオチドへと変異させられている; 該部位は図中で下線が引かれている。図 15 に示される通り、当該ヌクレオチド配列の変化によって、mAbScFv の VL の第１のフレームワーク領域における I2V アミノ酸変化が生じる。
【図１５】部位特異的変異誘発をされた HC-mAβScFv 融合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号22)。mAβScFv の VL の PCR 増幅により、VL の第１のフレームワーク領域の 2 の位置においてイソロイシン(I)をコードする cDNA が産生された; 変異誘発されたヌクレオチドは図中で下線が引かれている。しかし、マウス抗-AβMAb のアミノ末端の直接アミノ酸配列解析から、当該位置においてバリン(V)が示された。当該部位におけるイソロイシン残基は部位特異的変異誘発によってバリンに変化した、そして当該変化を I2V と称する。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号21)から推定される。
【図１６】キメラ HIRMAb 重鎖 をコードする cDNA の 3’-末端に融合した抗-AβScFv cDNA で構成され、真核生物発現プラスミド、pCD-HC-mAβScFv プラスミド(図 2)にコードされる、部位特異的変異誘発をされた融合遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号23)。位置 1546-1547において‘AA’ヌクレオチドは‘GC’ヌクレオチドへと変異誘発された; 当該部位は図中で下線が引かれている。図 17 において示される通り、当該ヌクレオチド配列の変化によって、mAbScFvのVH の第２の相補性決定領域(CDR)における N497A アミノ酸変化が生じる。
【図１７】部位特異的変異誘発をされた HC-mAβScFv 融合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号24)。予測される N-結合グリコシル化部位は、抗-AβMAb の VH の CDR2 の中に見つかった; 変異誘発部位は図中で下線が引かれている。位置 497 におけるアスパラギン(N)残基がアラニン(A)残基に変化し、そして当該変化を N497A と称する。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号23)から推定される。
【図１８】キメラ HIRMAb 重鎖 をコードする cDNA の 3’-末端に融合した抗-AβScFv cDNAで構成され、真核生物発現プラスミド、pCD-HC-mAβScFv プラスミド(図 2)によってコードされる、部位特異的変異誘発をされた融合遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号25)。位置 1552-1553 において‘AG’ヌクレオチドは‘GC’ヌクレオチドへと変異誘発された; 当該部位は図中で下線が引かれている。図 19 に示される通り、当該ヌクレオチド配列の変化によって、mAbScFv の VH の第２の CDR における S499A アミノ酸変化が生じる。
【図１９】部位特異的変異誘発をされた HC-mAβScFv 融合タンパク質のアミノ酸配列(配列番号26)。予測される N-結合グリコシル化部位は、抗-AβMAb の VH の CDR2 の中に見つかった; 変異誘発部位は図中で下線が引かれている。位置 499 におけるセリン(S)残基がアラニン(A)残基に変化し、そして当該変化を S499A と称する。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列(配列番号25)から推定される。
【図２０】キメラ HIRMAb 軽鎖(LC)および融合タンパク質重鎖(HC)で構成されるインタクトな抗体融合タンパク質をコードするタンデムベクターのヌクレオチド配列(配列番号27)、ここで、mAβScFv はキメラ HIRMAb 重鎖に融合していた。タンデムベクターはマウス ジヒドロ葉酸還元酵素、(DHFR)をコードする。タンデムベクターの個々の発現カセットは 図 24 に示されている。5’-末端から 3’-末端へ、LC 遺伝子、HC 融合遺伝子、および DHFR 遺伝子がタンデムベクター上の３つの分離した発現カセットに含有されている; そして、これら３つの発現カセット各々のオープンリーディングフレームは図中で下線が引かれている。
【図２１】キメラ HIRMAb 重鎖が後に続き、Ab ScFv がさらに後に続く、IgG シグナルペプチドのアミノ酸配列(配列番号28)。アミノ酸配列は、図 20 のヌクレオチド配列から推定される。抗-HIRMAb 重鎖 VH の CDR1、CDR2、および CDR3 のアミノ酸配列は太字フォントで表されている。定常領域のグリコシル化部位、NST、は下線が引かれている。
【図２２】タンデムベクターにコードされる軽鎖のアミノ酸配列(配列番号29)。アミノ酸配列は図 20 のヌクレオチド配列から推定される。抗-HIRMAb 軽鎖 VL の CDR1、CDR2、および CDR3 のアミノ酸配列は太字フォントで表されている。
【図２３】タンデムベクターにコードされる DHFR のアミノ酸配列(配列番号30)。アミノ酸配列は、図 20 のヌクレオチド配列から推定される。
【図２４】抗体融合タンパク質タンデムベクターの遺伝子操作。mAβScFv をコードする cDNA は、pCD-HC-mAβScFv-I2V プラスミドから PCR によって産生され、タンデムベクター前駆体の HpaI 部位に連結される。タンデムベクターは 図 26 に示される抗体融合タンパク質をコードする。CMV=サイトメガロウイルス; HIR-LC=抗-ヒトインスリン受容体(HIR)MAbの軽鎖(LC); HIR-HC=抗-HIRMAbの重鎖(HC); pA=ポリ A 転写終結配列 SV40=SV40プロモーター; DHFR=ジヒドロ葉酸還元酵素。
【図２５】融合抗体重鎖の 28 のドメインのアミノ酸配列 配列番号22: (1) シグナルペプチド、(2) キメラ HIRMAb の重鎖(HC)のフレームワーク領域(FR)1、(3) キメラ HIRMAb の HC の相補性決定領域(CDR)1、(4) キメラ HIRMAb の HC の FR2、(5) キメラ HIRMAb の HC の CDR2、(6) キメラ HIRMAb の HC の FR3、(7) キメラ HIRMAb の HC の CDR3、(8) キメラ HIRMAb の HC の FR4、(9) キメラ HIRMAb の HC の CH1 領域、(10) キメラ HIRMAb の HC のヒンジ領域、(11) キメラ HIRMAb の HC の CH2 領域; 定常領域グリコシル化部位、NST(Asn-Ser-Thr)には下線が引かれている、(12) キメラ HIRMAb の HC の CH3 領域、(13) キメラ HIRMAb の HC の CH3 領域と mAβScFv の開始点との間の Ser-Ser リンカー、(14) mAβScFv の HC の可変領域(VH)の FR1、(15) mAβScFv の VH の CDR1、(16) mAβScFv の VH の FR2、(17) mAβScFv の VH の CDR2、(18) mAβScFv の VH の FR3、(19) mAβScFv の VH の CDR3、(20) mAβScFv の VH の FR4、(21) mAβScFv の VH と 軽鎖の可変領域(VL)との間の 17 アミノ酸リンカー、(22) mAβScFv の VL の FR1 、(23) mAβScFv の VL の CDR1、(24) mAβScFv の VL の FR2、(25) mAβScFv の VL の CDR2、(26) mAβScFv の VL の FR3、(27) mAβScFv の VL の CDR3、(28) mAβScFv の VL の FR4。
【図２６】３つの機能性を有する抗体融合タンパク質: (1) キメラ HIRMAb の CDR は BBB HIR に結合し、分子が BBB を横切って血液から脳へと流入することを可能にする; (2) Fc 領域の CH2/CH3 インターフェイスは FcR 受容体に結合し、分子が BBB を横切って脳から血液へと流出することを可能にする; (3) CH3 領域に融合した mAβScFv は、AD の Aβアミロイドペプチドに結合し、AD において脳からのアミロイドの排除を引き起こす。AD における脳のアミロイドの排除において、これら３つの機能性の各々が果たす役割は  図 27 に示される。
【図２７】AD において融合タンパク質は３つの連続的な工程を介して脳からアミロイドを除去し、これら３つの連続的な工程の各々が 図 26 に示される通り抗体融合タンパク質分子の３つの分離した部分を用いる。工程 1 は、血液から脳へと BBB を横切っての融合抗体の流入であり、この流入は BBB ヒトインスリン受容体(HIR)への融合抗体の結合によって媒介される。工程 2 は、AD におけるアミロイドプラークへの融合抗体の結合であり、それはアミロイドプラークの脱凝集を促進し、そしてこのプラークへの結合は融合抗体の mAβScFv 部分によって媒介される。工程 3 は、脳から血液へと BBB を横切っての融合抗体の流出であり、この流出は、融合抗体の Fc 領域の CH2-CH3 インターフェイスで融合抗体が BBB FcR 受容体へ結合することによって媒介される。
【図２８】9E10 MAb を用いた、一本鎖Fv(ScFv)抗体の C-末端 c-myc エピトープに対するウエスタンブロット。(レーン 1): 正の対照として用いた、ストレプトアビジン(SA)と OX26 ScFv の融合タンパク質(45 kDa)。この OX26 ScFv-SA 融合タンパク質は３つのドメイン: OX26 ScFv、SA、および c-myc C-末端エピトープで構成されており、そして細菌ペレットから親和性精製された。(レーン 2): 負の対照: リポフェクタミンおよびプラスミドDNAなしでトランスフェクトされた COS 細胞による培養上清。9E10 抗-c-myc MAb は、COS 細胞によって分泌される 35-37 kDa の２つのタンパク質と交差反応している。pCD-mAβScFvでトランスフェクトされていない COS 細胞 の培地中には29 kDa 抗-AβScFv が存在しないことに注意されたい。 (レーン 3): リポフェクタミン2000 および pCD mAβScFv (図 1B)でトランスフェクトされた COS 細胞による培養上清から得られた抗-AβScFv; 抗-Aβ ScFv は 29 kDa の分子量を有し、OX26 ScFv/SA 融合タンパク質中に 16 kDa の SA 部分が存在することから、レーン 1 における OX26 ScFv-SA 融合タンパク質よりも 16 kDa サイズが小さい。
【図２９】(A) 固体の支持体上にプレーティングされている Aβ1-40 ペプチドに対する mAβScFv の結合を実証するために用いられる ELISA の仕組み。mAβScFv はアミロイドペプチドに結合し、9E10 抗-c-myc MAb はタンパク質のカルボキシル末端に融合した EQKLISEEDL(配列番号66) エピトープ(図 9)に結合する。9E10 MAb はビオチン化されており、それによってストレプトアビジンとペルオキシダーゼの複合体を用いての検出が可能になる。pCD-mAβScFv でトランスフェクトされた COS 細胞による培養上清がアッセイにおいて高いシグナルを生成した一方、リポフェクタミン(LIPO)にのみ暴露された COS 細胞からの培地はシグナルを生成しなかった。該アッセイは、mAβScFv が Aβ1-40 ペプチドに結合することを示す。
【図３０】pCD-mAβScFv でトランスフェクトされ、mAβScFvを発現する COS 細胞による培養上清(パネル A および C)、リポフェクタミン2000にのみ暴露された COS 細胞による培養上清(パネル B)、またはマウス IgG1 アイソタイプ対照抗体(パネル D)を用いて免疫染色された、AD 剖検脳の凍結切片の免疫細胞化学。パネル A および B における拡大率を示す棒(Magnification bar)は 88 um であり; パネル C および D における拡大率を示す棒(magnification bar)は 35 um である。該アッセイは、mAβScFv が AD の Aβアミロイドプラークに結合することを示す。
【図３１】プロテインA で精製された融合抗体またはキメラHIRMAbの、クーマシーブルーで染色された、還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)。該ゲルは、キメラ HIRMAb と融合抗体の重鎖および軽鎖のサイズの隣り合わせでの比較を示す。両者は 28 kDa の同じ軽鎖で構成されている。キメラ HIRMAb の重鎖のサイズが 55 kDaである一方、融合抗体の重鎖のサイズは 82 kDaである。融合抗体の重鎖は、27 kDaの抗-AβScFvに融合したキメラHIRMAb の 55 kDaの重鎖を包含する。
【図３２】プロテインA で精製された融合抗体の、抗-ヒト IgG 一次抗体を用いるウエスタンブロッティングは、COS 細胞において発現された融合抗体がプロシングされ、予測された分子サイズを有するインタクトな状態で分泌されることを示す。該ブロットは、キメラ HIRMAb および 融合抗体の免疫活性の、隣り合わせでの比較を示す。ウエスタンブロットにおいて示された通り、両者は 28 kDa の同じ軽鎖で構成されている。キメラ HIRMAb の重鎖のサイズが 55 kDaである一方、融合抗体の重鎖のサイズは 82 kDaである。融合抗体の重鎖は、27 kDaの抗-AβScFvに融合したキメラHIRMAb の 55 kDaの重鎖を包含する。
【図３３】等電点標準、キメラ HIRMAb、ハイブリドーマにより生成されたマウス抗-Aβ抗体、および融合抗体の等電点電気泳動。
【図３４】Aβ1-40 免疫放射線アッセイ(IRMA)は、96-ウェルプレートのウェル中にプレーティングされた Aβ1-40 に対する [125I]-マウス抗-AβMAb の結合を測定する。マウス抗-AβMAb は、ハイブリドーマ培養上清から精製された、Aβに対する元のマウス MAb である。結合のコンペティターが無い場合は、全 [125I]-抗-AβMAb のおよそ 20% が Aβ1-40 に結合している。マウス抗-AβMAb および融合抗体の両者はともに Aβ1-40 に結合し、半飽和定数(half saturation constant)、KD、は有意には異ならない。Aβ1-40 に対する融合抗体の親和性は、元のマウス抗-Aβ1-40 MAb の親和性と等しい。
【図３５】競合的 ELISA によって決定される、キメラ HIRMAb および融合抗体のヒトインスリン受容体(HIR)に対する親和性、ここで、固相抗原は、CHO 細胞から産生され、親和性精製された HIR 細胞外ドメイン(ECD)である。融合抗体の HIR ECD に対する結合力、ED50=1.0±0.1 nM、は、 キメラ HIRMAbの結合力、ED50=0.53±0.02 nM に匹敵する。HIR ECD に対するアイソタイプ対照である ヒトIgG1 の結合は存在しない。
【図３６】ヒト BBB 上の HIR に対する融合タンパク質の結合。(A)単離毛細血管はヒト剖検脳から精製され、ヒト BBB HIR に対する結合のインビトロモデルとして用いられる。(B) ヒト脳毛細血管に対する[125I]-融合抗体の特異的結合が時間依存的である一方、[125I]-マウス抗-Aβ抗体の結合は時間にかかわらず一定で、かつ非特異的である。
【図３７】成体アカゲザルにおける生体内の薬物動態。[125I]-融合抗体 および [3H]-マウス抗-Aβ抗体を成体アカゲザルに静脈内注入し、血清濃度[注入用量(I.D.)/mLの％]を 3 時間の期間にわたって決定した。この期間において、[125I]-マウス抗-Aβ抗体の血液からの測定可能な排除が存在しない一方、融合抗体は血清から排除されている。
【図３８】両方の標識抗体の単回静脈内注入から 3 時間後の、アカゲザル脳における[3H]-マウス抗-Aβ抗体および[125I]-融合抗体の脳分布容積(VD)。ホモジネートおよび 血管後上清（post-vascular supernatant）両方についての VD が示される。[3H]-マウス抗-Aβ抗体についての VD、10 uL/g、は脳の血液容積に等しく、この抗体が生体内で霊長類の BBB を横切って輸送されないことを示す。[125I]-融合抗体についての VD は、脳ホモジネートおよび血管後上清（post-vascular supernatant）の両方において [3H]-マウス抗-Aβ抗体よりも >10-倍 高く、それは [125I]-融合抗体が BBB を横切って血液から脳へと輸送されることを示す。
【図３９】[125I]-融合抗体の静脈内投与から 3 時間後における、成体アカゲザルの脳のスキャンは、生体内で霊長類の血液から脳への融合抗体の広範な分布を実証する。最上部のスキャンは脳の最前部である、そして最下部のスキャンは脳の最尾部で、小脳を含む。
【図４０】成体ラットにおける、[125I]-融合抗体の脳から血液への流出。[125I]-融合抗体は定位固定ガイダンス(stereotaxic guidance)の下で皮質に注入され、BBBを横切っての脳からの融合抗体の流出は注入の 90 分後に測定された。この時点で、注入された融合抗体の 60%近くが脳から流出していた。この流出は、ヒト Fc 断片の共注入によって完全に阻止された。この事は、流出が BBB における Fc 受容体によって媒介されることを示す。
【図４１】(A) Aβプラーク脱凝集アッセイの概略。２次抗体は、融合抗体の調査のためには抗-ヒトIgG であり、マウス抗-AβMAb の調査のためには抗-マウスIgG である。(B, C) 融合抗体(B)またはマウス抗-AβMAb(C)によるインビトロでの Aβアミロイドの脱凝集。Aβ1-40 凝集体は 6 日間にわたって形成され、その後、融合抗体、ヒトIgG1(hIgG1)、またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と共に 37℃で 1 または 4 時間(B)、または マウス抗-Aβ抗体、非免疫性マウスIgG、または PBS と共に 37℃で 1 または 4 時間(C)、インキュベーションされた。並行して、Aβ1-40 ペプチドのカルボキシル末端領域に結合する抗体は、パネル A に示されるように 96 ウェルプレート中にプレーティングされた。融合抗体の抗-Aβ ScFv 部分、またはマウス抗-Aβ MAb は、Aβ1-40 のアミノ末端部分に結合する。そのため、正の ELISA シグナルは プラークが存在する場合にのみ生成される。データは、融合抗体およびマウス抗-Aβ MAb が Aβ1-40 プラークに選択的に結合すること、および、この結合が 4 時間の期間にわたって脱凝集を引き起こすこと、を示す。
【図４２】(A) 血管アミロイドプラークに対する抗体の結合を示す、[125I]-融合抗体で標識された AD 剖検脳切片のフィルムオートラジオグラフィー。 (B) AD の血管アミロイドに対する抗体の結合を示す、マウス抗-AβMAbで標識された AD 剖検脳切片の免疫細胞化学。
【図４３】HIR ELISA によって示される通り、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-Ｎ,-Ｎ’,Ｎ’’,Ｎ’’’-テトラ酢酸(DOTA) の HIRMAb に対する連結は、HIR 細胞外ドメインに対する抗体の結合を阻害しない。DOTA は放射性核種金属、例えば 111-インジウムの高親和性キレート剤であり、神経診断のための放射性医薬の生産および DOTA 連結融合抗体を用いる脳のスキャニングを可能にする。
【図４４】抗-WNV 抗体(Ab)は血液脳関門(BBB)を通過しない。しかし、それ自身がインスリン受容体(IR)に対する別の抗体である分子トロイの木馬(TH)と融合した後には、抗-WNV Ab は BBB を通過できる。TH は内在性 IR 上の輸送を介して BBB を横切る受容体-媒介輸送を経て、抗-WNV Ab を脳内へと運び、そこで Ab はウイルスを中和することができる。TH はまた BBB Fc 受容体(FcR)に対するリガンドでもあり、それが WNV の脳からの正味の排出を可能にする。
【図４５】抗-WNV VH (A)、抗-WNV VL (B)、および DIII (C)の増幅に続く PCR 反応のアガロースゲル電気泳動のエチジウムブロマイド染色。MW サイズ標準は右側に示される。VH、VL、および DIII cDNA は、それぞれ表 4、5、および 6 に示される ODN を用いて PCR によって生成された。
【図４６】pCD-WNV-ScFv から 抗-WNV ScFv を、および pCD-HC-BSA から抗-BSA 重鎖を、それぞれ一過性発現させるための COS 細胞発現プラスミドの遺伝子操作。pCD-ScFv ベクターは、中間部の 17-アミノ酸リンカーを介して VH と VL の融合を可能にする ScFv 発現ベクターである。6xHisタグは、配列番号68 として開示される。
【図４７】以下のドメインで構成される抗-WNV-融合抗体の重鎖のアミノ酸配列(配列番号65):(i) IgG シグナルペプチド、(ii) HIRMAb 重鎖可変領域(VH)、(iii) ４つのサブ-ドメイン: CH1、ヒンジ、CH2、および CH3 で構成されるヒト IgG1 定常領域、(iv) HIRMAb 重鎖 と 抗-WNV ScFv を隔てるリンカー、(v) 抗-WNV ScFv 重鎖可変領域(VH)、(vi) ScFv の VH と VL を隔てる 17 アミノ酸リンカー、および (vii) 抗-WNV ScFv 軽鎖可変領域(VL)。HIRMAb および 抗-WNV 抗体の相補性決定領域(CDRs)は図中に示される。
【図４８】抗-WNV 融合抗体(BSA)発現用 CHO 細胞タンデムベクターの、３つの前駆プラスミド: 融合重鎖プラスミド、pCD-HC-BSA、軽鎖プラスミド、pCD-LC、および 野生型(wt)ジヒドロ葉酸還元酵素、(DHFR)プラスミド、pwt DHFR からの遺伝子操作。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
mAβ VHおよびVL cDNAの両方を、原核 ScFv 発現ベクター pAP-xScFvにサブクローニングして中間体 mAβ-ScFv 発現プラスミド pAP-mAβScFv (図 1A)を作成した。pPC-mAβ-VH におけるmAβ VH cDNAおよびpAP-xScFv プラスミドを NcoIおよびHindIIIで消化した。予測される~0.4 kbのmAβ-VHおよび~3.5 kbのpAP-xScFv バックボーン(図 3B、それぞれレーン 1 および2)をゲルで精製した。mAβ-VH cDNAを同じRE 部位にてpAP-xScFv バックボーンにライゲーションし、中間体 プラスミド pAP-mAβ-VH (図 1A)を形成した。pAP-mAβ-VH プラスミドを単離し、DNA 配列により特徴付け、それによりmAβ-VH について予測されるDNA 配列の100% が確認された(図 4、配列番号11)。pAP-mAβ-ScFvの操作を、mAβ-VLを MluIおよびNotI 部位にて pAP-mAβ-VH に挿入することにより完了した(図 1A)。pAP-mAβ-VH およびpPC-mAβ-VL クローンの両方をMluI およびNotIで消化した。~0.4 kb mAβ-VL cDNAおよび ~3.5 kb pAP-mAβ-VH プラスミド バックボーン (図 3C、それぞれレーン 1および2)をゲルで精製した。mAβ-VL cDNA をpAP-mAβ-VHにライゲーションし、pAP-mAβ-ScFv (図 1A)を形成した。pAP-mAβ-ScFv プラスミドを単離し、DNA 配列決定により確証した。pAP-mAβ-ScFvのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ 図 8 (配列番号15) および9 (配列番号16)に示す。pAP-mAβ-ScFvにおけるmAβ VHおよびVL cDNAに対応する領域は、図 4および6にそれぞれ示す個々の VHおよびVL遺伝子のものと100%類似である。pAP-xScFv 原核発現ベクターは、VL 領域の末端にc-myc エピトープ (図 9、アミノ酸 残基 255-265) および5-ヒスチジン (His5) タグ（配列番号69）を導入する(図 9)。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
mAβ-ScFv 真核発現ベクター、クローン pCD-mAβ-ScFvの操作を図 1Bに要約し、それは以下によって行った：(a) pAP-mAβ-ScFvにおける原核 PelB リーダー配列の欠失、(b)完全なKozak 配列ドメインを含むヒト IgG シグナルペプチドの挿入による pAP-mAβ-ScFv-Kの形成、(c) XhoIおよびEcoRI RE 部位を導入するためのmAβ-ScFv-K cDNAのPCR クローニング、および(d) PCRにより作成したXhoI-mAβ-ScFv-K-EcoRI cDNAの真核発現ベクター pCDへのサブクローニングによるpCD-mAβ-ScFv プラスミドの形成。PelB リーダー配列を含む原核発現ベクター pAP-mAβ-ScFvのDNA 断片を、XhoI およびPvuIIにより欠失させ、後者はmAβ-VHの第２アミノ酸に位置していた。バックボーン ベクターをゲルで精製した。並行して、人工の新しい ヒト ペプチド シグナルに対応するODN(表 2、ヒト IgG ペプチド シグナル FWD およびREV ODN、それぞれ、配列番号 5 および6)を65℃でアニーリングさせ、Qiagen PCR 抽出キット (Valencia、CA)により精製した。二本鎖 (ds) ODN をXhoI およびPvuIIで消化し、Qiagen PCR 抽出キットにより精製し、pAP-mAβ-ScFv-XhoI-PvuII ベクター中の同じRE 部位に挿入してpAP-mAβ-ScFv-K 中間体 プラスミド (図 1B)を形成した。dsODNは完全なKozak 部位およびヒト IgG シグナルペプチド (アミノ酸 残基 1-19、配列番号18)を挿入する。陽性クローンをpAP-mAβ-ScFvの欠失されたDNA 断片に存在するが、挿入されたヒト IgG シグナルペプチド 配列には存在しない部位であるEcoRIを用いたRE マッピングにより同定した。mAβ-ScFv cDNA をさらに操作して真核発現ベクター pCDへの方向性 サブクローニングのためにPCRによりXhoI およびEcoRI RE 部位を導入した(図 1B)。mAβ-ScFv cDNAのPCR クローニングをヒト IgG ペプチド シグナル XhoI PCR FWDおよびEcoRI PCR REV ODN(表 2、それぞれ配列番号 7および8)を用いて行った。REV ODNはまた、ベクターのc-myc タグの後にTAA 終止コドンを導入する(図 10)。PCR 産物およびpCD ベクターの両方をXhoIおよびEcoRIで消化した(図 3D)。~5.4 kb pCDおよび~0.8 kb mAβ-ScFv cDNA (図 3D、それぞれレーン 1および2)をゲルで精製し、同じRE 部位にてライゲーションし、pCD-mAβScFv 発現ベクターを形成した(図 1B)。pCD-mAβScFv クローンをDNA 配列決定により確証し、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列の両方をそれぞれ図 10および11 (配列番号17および18)に示す。 pCD-mAβScFv 中のmAβ VHおよびVL cDNA (VH-VL リンカーを含む)に対応するヌクレオチドおよびアミノ酸配列は 図 8および9にそれぞれ示すpAP-mAβScFv ベクターにおける配列と100％同一である。pCD-mAβScFv ベクターはHis5 タグ（配列番号69）を有さないため(図 11)、TAA 終止コドンがc-myc エピトープの末端に続く(図 10)。pCD-mAβScFv 真核発現プラスミドは CMV プロモーターにより駆動され、ATG 開始コドンの前に完全なKozak ドメインを有し、ヒト IgG シグナルペプチドを含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
実施例 3
抗-Aβ ScFvのVHのFR1のI2V 部位特異的突然変異誘発
mAβMAβの軽鎖のアミノ末端のアミノ酸 マイクロシークエンシング 分析により11 残基が確認され、ただし、軽鎖の位置 2 のアミノ酸は例外である(図 7)。PCR プライマーにより位置 2にイソロイシン (IまたはIle)が導入され、一方、ハイブリドーマにより作成された軽鎖は位置 2にバリン (VまたはVal)を含んでいた。Ile 残基は、このcDNAのPCR 増幅に用いられた縮重プライマーの使用により、mAβ VLのPCR クローニングの際におそらくは導入されたようである。位置 2におけるI 残基をV 残基に変化させるために部位特異的突然変異誘発 (SDM)を行う必要があり、このSDMはI2V 変化と称される。I2V VL 突然変異体を担持する融合抗体の重鎖をコードする新しい真核発現ベクターを構築した。SDMをQuickChange II XL SDM キット (Stratagene)および標準的プロトコールを用いて行った。SDM-ODNは目的の突然変異、即ち位置 1789における「A」の代わりに「G」を導入するよう設計された (図 12、配列番号19)。SDMのためのODNはまた、標的配列とのアニーリングのために各隣接領域において15 ヌクレオチドを含む。SDMは pCD-HC-mAβScFv クローン DNAをテンプレートとして用いてpCD-HC-mAβScFv I2Vを形成することで完了し、SDM クローンをDNA 配列決定により確証した。ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ配列番号21および22に示す。pCD-HC-mAβScFv-I2Vのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列は両方、親クローン pCD-HC-mAβScFvのものと同一であり (図 12および13)、ただし、SDM-導入された突然変異、即ち、A1789G (図 14、下線を引いた「G」残基) およびI597V (図 15、下線を引いた「V」残基)は例外である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
実施例 4
融合タンパク質重鎖のシグナルペプチドおよび完全なKozak 部位の遺伝子操作
融合抗体重鎖の発現を最適化するために、pCD-UHCにおけるキメラ HIRMAb 重鎖のシグナルペプチド (SP) (図 13、配列番号20のアミノ酸残基 1-19)をpCD-mAβScFvの操作において用いられた新しいペプチドシグナルで置換した(図 1Bおよび11、配列番号18のアミノ酸残基 1-19)。完全なKozak コンセンサス配列も新しい pCD-HC-mAbScFv II プラスミドの操作の前に導入した(図 2)。キメラ HIRMAb 発現ベクター、pCD-UHCのシグナルペプチド配列を、pCD マルチクローニングサイトおよびHIRMAb HC オープンリーディングフレームに位置するNotIおよびEcoRVのRE 部位で二重消化することにより欠失させた。148 bpから構成されるDNA 断片をヒト IgG ペプチド シグナルを包含する人工 dsODNによって、ヒト IgG ペプチド シグナル HIR FWD ODN (表 2、配列番号31) およびヒト IgG ペプチド シグナル HIR REV ODN (表 2、配列番号32)を用いて置換した。人工 dsODN およびpCD-UHC 発現プラスミドの両方をNotIおよびEcoRVで消化し、ゲルで精製した。新しいシグナルペプチド (NSP)によるpCD-UHCの操作を続け、NSPをpCD-UHCに同じRE 部位にてライゲーションし、pCD-UHC-NSP ベクターを形成した。完全なKozak コンセンサス配列を次いでQuickChange II XL SDM キットおよび標準的プロトコールを用いるSDMにより導入した。SDM-ODNは目的の突然変異 (即ち、GCCGCCACC) を導入するために設計し、また、標的配列とのアニーリングのために各隣接領域において15 ヌクレオチドを含む。SDMをpCD-HC-NSP DNAにおけるキメラ HIRMAb 重鎖をテンプレートとして用いることによって完了し、pCD-HC-NSP 新しいKozak (NK) ベクターを形成した。pCD-HC-NSP-NKを、SDMによってCH3 領域の後の終止コドンにHpaI RE 部位を挿入することによって融合タンパク質のためのユニバーサル HIRMAb 重鎖 発現ベクター(pCD-UHC-II、図 2)に変換した。SDM プロトコールをQuickChange II XL SDM キットおよびSDM-ODNにより完了して、HpaI RE 部位 (即ち、GTTAAC)を導入した。ODNはまた、標的配列とのアニーリングのために各隣接領域にて15 ヌクレオチドを含む。HIRMAb 融合抗体の重鎖をコードする新しい真核発現ベクターの遺伝子操作を、図 2に要約するように最適化された発現ベクター pCD-UHC-IIを用いて行った。新しい融合抗体重鎖融合遺伝子の操作は2 工程にて行った：(a) mAβScFv cDNAのPCR クローニングおよび(b)このcDNA の新しい ユニバーサル HIRMAb 重鎖 発現ベクター pCD-UHC-IIへの挿入による、pCD-HC-mAβScFv IIの形成(図 2)。mAβScFv cDNAをテンプレートとしてpCD-HC-mAβScFv-I2V(配列番号21)および mAb ScFv PCR FWDおよびREV ODN(表 2、それぞれ配列番号9 および 10)を用いるPCR クローニングによって得た。操作された mAβScFv I2V cDNAをHpaI 部位にてpCD-UHC-IIにライゲーションしてpCD-HC-mAβScFv II 発現ベクター(図 2)を形成した。pCD-HC-mAβScFv II クローンをDNA 配列決定により確証し、ヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列の両方をそれぞれ 図 14 および15 (配列番号21 および22)に示す。HIRMAb 重鎖のCH3 領域における再構築されたカルボキシル末端のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はmAβScFv I2Vの前の2-アミノ酸リンカー (Ser-Ser) および TAA 終止コドンを確認し、これらは共にPCR クローニング 工程において導入された(図 14および15)。NSPもまた確認され、即ち、ヌクレオチド 1-57 (図 14; 配列番号21)およびアミノ酸 1-19 (図 15; 配列番号22)であった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１１】
実施例 10
抗-Aβ ScFvの真核発現および特徴決定
COS-1 細胞を無血清培地で培養し、Lipofectamine-2000を用いてpCD-mAβScFv (図 1B)でトランスフェクトした。培養上清を3または7日目に取り出した。 pCD- mAβScFvおよびLipofectamine-2000 でトランスフェクトされたCOS 細胞による条件培地を10 kDa 分子量カットオフのUltra-15 (Amicon) ろ過ユニットを用いて濃縮し、ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) サンプルバッファー中に還元条件下で可溶化し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (PAGE)のために15% SDS-ポリアクリルアミドゲルにアプライし、次いで9E10 MAbを用いてウェスタンブロッティングを行った。9E10 MAbはc-myc タンパク質由来のエピトープに結合し、そしてこのエピトープ、EQKLISEEDL(配列番号66)は、抗-Aβ ScFvのカルボキシル末端に存在する(図 11)。ウェスタンブロットにおける陽性対照(図 28、レーン 1)は、OX26 ScFv/ストレプトアビジン (SA) 融合タンパク質であり、これは細菌ペレットからアフィニティー 精製したものである。OX26 ScFv/SA 融合タンパク質は以下の3つのドメインから構成される: (i) 29 kDa OX26 ScFv、(ii) 16 kDa SA 単量体、および (iii) 9E10 MAb と反応するC-末端 10-アミノ酸 c-myc エピトープ。ウェスタンブロットにおける陰性対照(図 28、レーン 2)はLipofectamine 2000に曝されたが、プラスミド DNAには曝されていないCOS 細胞からの培地である。抗-Aβ ScFvはSA ドメインを欠き、 以下から構成される(i)抗-Aβ ScFv (27 kDa)、および(ii) 9E10 MAbと反応するC-末端 10-アミノ酸 c-myc エピトープ (2 kDa)。9E10 MAbはまた、トランスフェクトされていないCOS 細胞によって分泌される35-37 kDaの2つのタンパク質とも交差反応する(図 28、レーン 2)。29 kDa 抗-Aβ ScFvは pCD- mAβScFvによってトランスフェクトされたCOS 細胞によって培地に特異的に分泌される(図 28、レーン 3)。このウェスタンブロット研究はmAβScFvはpCD-mAβScFvによってトランスフェクトされたCOS 細胞によりインタクトな状態で分泌されることを確証した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
WNVのE タンパク質に対するE16 MAbのVHをコードする合成遺伝子をPCRにより生産した (図 45A)。VH遺伝子はE16 MAb VH (Genbank DQ083997)の配列に基づいて設計された一連の8つのオリゴデオキシヌクレオチド (ODN)から構築し、注文合成し、VHを生産するODN の配列を表 4、および配列番号33-40に示す。配列は各ODNの5’-および3’-末端にてクロスハイブリダイズする交互のフォワードおよびリバース ODNが存在するように設計した。必要な場合コドンの第３番目を置換して安定なヘアピンループのTm を低下させる。オーバーラップするODNは75-88 ヌクレオチド(nt)であり各末端で24 ntがオーバーラップする。合成VH遺伝子は、VHを図 46においてpCD-pScFvと称する一本鎖 Fv (ScFv) 発現ベクターにサブクローニングするために適当な制限エンドヌクレアーゼ (RE) 部位を含むよう設計した。 E16 MAbのVHは、電気泳動の後のアガロースゲルの臭化エチジウム染色によって立証されるようにPCR によってクローニングした(図 45A)。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３７】
PCRで作成した抗-WNV VH cDNA (図 45A)を、大量調製した(maxi-prepped) pCR-Scriptにサブクローニングし、T7およびT3 配列決定 プライマーを用いた両方向でのDNA 配列決定に供した。結果はVH遺伝子のクローニングが成功したことを示し、そのヌクレオチド配列を配列番号41に示す。抗-WNV VHの推定アミノ酸配列を配列番号42および図47に示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
並行して、E16 抗-WNV MAb のVL をコードする遺伝子をPCRにより生産した(図 45B)。VL遺伝子はE16 MAb VL (Genbank DQ083998)の配列に基づいて設計された一連の8つのODNから構築した。注文合成した合成ODNの配列を表 5、および配列番号43-50に示す。合成 VL遺伝子は、図 46に示すpCD-ScFv 発現ベクターへのサブクローニングのために5’-および3’-末端にてRE (HindIII、NotI)を含むよう設計する。E16 MAbのVLを、電気泳動の後のアガロースゲルの臭化エチジウム染色によって立証するようにPCR によってクローニングした(図 45B)。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
PCRで作成した抗-WNV VL cDNA(図 45B)を大量調製した(maxi-prepped)pCR-Scriptにサブクローニングし、 T7 およびT3 配列決定 プライマーを用いて両方向にてDNA 配列決定した。結果はVL遺伝子のクローニングが成功したことを示し、そのヌクレオチド配列を配列番号51に示す。抗-WNV VHの推定アミノ酸配列を配列番号52に示す。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４０】
抗-WNV 抗体のVHおよびVLをコードする遺伝子を操作すれば、ScFv 抗体をコードする新しいcDNAの操作が可能となり、それによりVHおよびVLが共通のペプチド リンカーを介して１つのポリペプチドを形成した。宿主細胞における抗-WNV ScFvの発現を可能にするために、発現プラスミドを操作し、pCD-ScFvと命名した。pCD-ScFv ベクターをAfeI および HindIIIで開裂させると非関連VH遺伝子が放出される(図 46)。PCRにより作成したVH (図 45A)をHindIIIで消化し、次いで、T4 リガーゼを用いて、pCD-ScFv ベクター中の真核 シグナルペプチドおよびVHおよびVL を連結する17 アミノ酸リンカー とインフレームにてpCD-ScFv にライゲーションした(図 46)。新しい pCD-ScFv、およびPCRにより作成されたVLを、HindIIIおよびNotIで消化し、VLをT4 リガーゼによりベクターに挿入して抗-WNV ScFv 発現ベクターであるpCD-WNV-ScFvを生産する(図 46)。 pCD-ScFv プラスミドにおけるサブクローニングは、9E10 MAb のc-myc エピトープをScFvのカルボキシル末端に配置する; このエピトープは以下の10-アミノ酸配列から構成される: EQKLISEEDL(配列番号66)。この配列の存在および9E10 抗-c-myc マウス MAbの入手可能性により、抗-WNV ScFvのウェスタンブロッティングによる検出が可能となる。pCD-ScFv 発現プラスミドはまた、c-myc エピトープの後に6-ヒスチジン タグもコードし、この (His)6(配列番号68)は、COS 細胞における発現の後に固定化金属 アフィニティー クロマトグラフィーによる精製を可能とする。抗-WNV ScFVのヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号53 および配列番号54に示す。アミノ酸配列については図47を参照されたい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
抗-WNV 抗体の生理活性を評価するために、抗-WNV 抗体のエピトープを含むWNVのE タンパク質の部分の生産が必要であった。このエピトープはウイルス E タンパク質 (Genbank NC001563)のアミノ酸 296-401の間のDIII 領域内に含まれる。DIII遺伝子はPCRによって生産され、設計および注文合成された一連の8つのODNから構築され、DIII遺伝子を生産するODNの配列を表 6、および配列番号55-62に示す。配列を、各ODNの5’-および3’-末端にてクロスハイブリダイズする交互のフォワードおよびリバース ODNが存在するよう設計した。PCRにより作成されたDIII (図 45C)を大量調製された(maxi-prepped)pCR-Scriptにサブクローニングし、T7およびT3 配列決定 プライマーを用いた両方向でのDNA 配列決定に供した。結果はDIII遺伝子のクローニングが成功したことを示し、そのヌクレオチド配列を配列番号63に示す。DIII タンパク質の推定アミノ酸配列を配列番号64に示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４２】
合成 DIII遺伝子を、DIIIのpCD-DIIIと称される真核発現ベクターへのサブクローニングのために、好適な制限エンドヌクレアーゼ (RE) 部位を含むように設計する。pCD-DIIIの操作のために、pCD-ScFv (図 46) をNotIおよびEcoRIで消化し、ゲルで精製し、c-myc コード配列を放出させる。並行して、以下の配列を有する人工 リンカーを生産する: 5’-GCGGCCGCTGGATCCCATCATCACCATCATCAT TAAGAATTC-3’(配列番号67)、そしてこのリンカーをNotI および EcoRIで処理し、開環した pCD-ScFvにライゲーションしてpCD-ScFvIIと称される中間体 プラスミドを生産する。後者をゲルで精製し、AfeIおよびNotIで消化し、NotI-消化した DIII PCR産物 (図 45C)を中間体 プラスミドにライゲーションし、pCD-DIIIを作成する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４３】
pCD-ScFvをテンプレートとして用い、ScFvのみを増幅し、シグナルペプチドを増幅しないプライマーを用いるPCRによって作成されたWNV ScFv cDNAを、pCD-UHCにサブクローニングして図 46に示すようにpCD-HC-BSAを生産する。pCD-UHCは、ヒト IgG シグナルペプチドの影響下でキメラ HIRMAbの重鎖 (HC)をコードし、これを HpaIで直鎖化する(図 46)。この部位はHC オープンリーディングフレームのすぐ 3’-末端に位置しており、抗-WNV ScFvのアミノ末端の、HIRMAbのヒト IgG1 定常部のCH3 ドメインのカルボキシル末端への融合を可能とする。最終的な重鎖融合タンパク質を図 46に示す pCD-HC-BSA ベクターで発現させ、これは図 47に示すタンパク質をコードする。 HC 抗-WNV 融合 重鎖のアミノ酸配列を配列番号65に示す。融合 重鎖は図 47に示すように以下のドメインから構成される:
・19 アミノ酸 ヒト IgG シグナルペプチド
・キメラ HIRMAbのVH
・CH1、ヒンジ、CH2、およびCH3 領域から構成されるヒト IgG1 C-領域
・Ser-Ser リンカー
・WNV MAb のVH 
・17 アミノ酸リンカー
・WNV MAbのVL。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４７】
表 4.抗-WNV VHの産生のためのオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)
1) FWD-1 (75-mer) 配列番号33
CAGGTaCAGCTGCAGCAGTCTGGATCTGAGCTGATGAAGCCTGGGGCCTCAGTaCAGATATCCTGCAAGGCTACT
2) REV-1 (87-mer) 配列番号34
CTCAAGGCCATGTCCAGGtCTCTGCTTTACCCACTCAATCCAGTAGTCACTGAATGTGTAGCCAGTAGCCTTGCAGGATATCTGtAC
3) FWD-2 (87-mer) 配列番号35
CAGAGaCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGAGATATTTTATGTGGAACTGGTAGAACTAGATACAATGAGAAGTTAAAaGCaATG
4) REV-2 (88-mer) 配列番号36
CAGATGTCAGGCTGCTtAGTTGCATGAAGGCTGTGTTGGAGGATGTATCTGCAGTGAATGTGGCCATtGCtTTTAACTTC
TCATTGTA
5) FWD-3 (87-mer) 配列番号37
TGCAACTaAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCaGCaGTCTATTACTGTGCAAGATCGGCaTCATATGGTGATTACGCTGACTACTGGG
6) REV-3 (77-mer) 配列番号38
TTCAAGCTTGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCCATGGCCCCAGTAGTCAGCGTAATCACCAT
7) 5’-PCR FWD (24-mer) 配列番号39
5’-リン酸-CAGGTaCAGCTGCAGCAGTCTGGA
8) 3’-PCR-REV (24-mer) 配列番号40
TTCAAGCTTGGGTGTCGTTTTGGC
小文字は安定なヘアピンループのTmを 30-46℃に低下させるために置換されたコドンの第３番目のヌクレオチドを示す。オーバーラップする ODNは 76-88 ntの長さであり、24 ntが両方の末端でオーバーラップしている。すべてのODNはリバース試験により再確認し、ここで cDNAはODNから構築され、前者が翻訳される。翻訳されたタンパク質は予測されたものと同一であった。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４８】
表 5.抗-WNV VLの産生のためのオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)
1) 165-LV-FWD-1 (76-mer) 配列番号43
TACAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTCAGAAGCACGCGTAGATATCGACATaGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCA
2) 165-LV-REV-1 (88-mer) 配列番号44
GCAGTACTCACATCCTGACTGGCCTTGCAtGTtATGCTGACtCTGTCTCCTACTGATGTGGACATGAATTTGTGAGACTGGGTCATCA
3) 165-LV-FWD-2 (88-mer) 配列番号45
GGCCAGTCAGGATGTGAGTACTGCTGTAGCaTGGTATCAACAAAAACCtGGGCAATCTCCTAAACTACTCATTTCCTGGGCATCCACa
4) 165-LV-REV-2(88-mer) 配列番号46
TGGTGAGAGTATAATCTGTCCCAGATCCACTGCCaGTGAAGCGATCgGGtACTCCtGTGTGCCGtGTGGATGCCCAGGAAATGAGTAG
5) 165-LV-FWD-3 (88-mer) 配列番号47
CTGGGACAGATTATACTCTCACCATCAGtAGTGTGCAGGCTGAAGACCTaGCACTTTATTACTGTCAGCAACATTATACCACTCCCCT
6) 165-LV-REV-3(78-mer) 配列番号48
GATGCGGCCGCAGCgTCAGCTTTCAGCTCCAGtTTGGTtCCAGCACCGAACGTGAGGGGAGTGGTATAATGTTGCTGA
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４９】
表 5 (続き)
7) 5’-PCR 165-VL-F 配列番号49
TACAAGCTTGAAGAAGGTGAATTTTC
8) 3’-PCR 165-VL-R 配列番号50
GATGCGGCCGCAGCgTCAGCTTTC
小文字は安定なヘアピンループのTmを 30-46℃に低下させるために置換されたコドンの第３番目のヌクレオチドを示す。オーバーラップする ODNは 76-88 ntの長さであり、24 ntが両方の末端でオーバーラップしている。すべてのODNはリバース試験により再確認し、ここで cDNAはODNから構築され、前者が翻訳される。翻訳されたタンパク質は予測されたものと同一であった。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５０】
表 6. WNV E タンパク質のDIIIの産生のためのオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)
1) DIII-FWD-1 (68-MER) 配列番号55
CAGCTGAAGGGAACAACATATGGAGTCTGCTCAAAAGCTTT
CAAATTCGCTAGGACTCCCGCTGACAC
2) DIII-REV-1 (80-MER) 配列番号56
TGCAGGGACCGTCTGTTCCAGTATATTGCAGTTCCAACACC
ACAGTTCCATGTCCAGTGTCAGCGGGAGTCCTAGCGAAT
3) DIII-FWD-2 (80-MER) 配列番号57
ATACTGGAACAGACGGTCCCTGCAAAGTGCCCATTTCTTCC
GTAGCTTCCCTGAATGACCTCACACCTGTTGGAAGACTG
4) DIII-REV-2 (80-MER) 配列番号58
TCAATCAAAACCTTCGAGTTGGCTGTGGCTACAGACACAAA
TGGATTCACGGTCACCAGTCTTCCAACAGGTGTGAGGTC
5) DIII-FWD-3 (80-MER) 配列番号59
AGCCAACTCGAAGGTTTTGATTGAACTCGAACCCCCGTTTG
GTGACTCTTACATCGTGGTGGGAAGAGGAGAACAGCAGA
6) DIII-REV-3 (70-MER) 配列番号60
GTAGCGGCCGCAGCATCAGCTCCAGATTTGTGCCAGTGATG
GTTTATCTGCTGTTCTCCTCTTCCCACCA
7) 5’-PCR DIII-FWD (25-MER) 配列番号61
CAGCTGAAGGGAACAACATATGGAG
8) 5’-PCR DIII-REV (24-MER) 配列番号62
GTAGCGGCCGCAGCATCAGCTCCAG
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４７】
2014148510.tif 000053
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４８】
2014148510.tif 000054
【外国語明細書】
2014148510.tif 000055
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【配列表】
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