(57)【要約】  生体資料の解析方法は、解析対象である遺伝子の発現に応じて発光量が変動するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入した細胞を含む生体試料を生存状態で維持すること（Ｓ１）と、複数の前記細胞を含むような複数の領域を設定するとともに、前記複数の領域について、前記細胞から放射される発光を遮光状態で撮影することで静止画としての発光画像を経時的に複数取得すること（Ｓ２）と、前記複数の領域について、前記生体試料に対し光照明して撮影することで明視野の連続画像を経時的に複数取得すること（Ｓ３）と、同一の前記領域において前記発光画像及び前記連続画像のそれぞれから得られる生物学的情報を、異なる前記領域同士で比較すること（Ｓ５）とを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
解析対象である遺伝子の発現に応じて発光量が変動するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入した細胞を含む生体試料を生存状態で維持することと、
複数の前記細胞を含むような複数の領域を設定するとともに、前記複数の領域について、前記細胞から放射される発光を遮光状態で撮影することで静止画としての発光画像を経時的に複数取得することと、
前記複数の領域について、前記生体試料に対し光照明して撮影することで明視野の連続画像を経時的に複数取得することと、
同一の前記領域において前記発光画像及び前記連続画像のそれぞれから得られる生物学的情報を、異なる前記領域同士で比較することと
を含む生体試料の解析方法。
【請求項２】
前記生物学的情報は、前記細胞の運動量を示す、請求項１に記載の解析方法。
【請求項３】
前記連続画像から得られる前記生物学的情報は、運動量ベクトルの時間変化に関する主成分分析により得られる、請求項２に記載の解析方法。
【請求項４】
前記運動量は、画像相関法を用いて得られる請求項３に記載の解析方法。
【請求項５】
前記細胞は、幹細胞、心筋前駆細胞又は繊毛前駆細胞を含む、請求項１に記載の解析方法。
【請求項６】
前記生体試料は、胚様体又は細胞シートを含む、請求項１に記載の解析方法。
【請求項７】
前記生物学的情報を比較することは、前記細胞の分化の状態を判定することを含む、請求項１に記載の解析方法。
【請求項８】
前記生物学的情報を比較することは、
遺伝的変化と機能的変化とを定量的に検出することと、
前記遺伝的変化と前記機能的変化とのタイムラグを検出することと
を含む、請求項１に記載の解析方法。
【請求項９】
前記遺伝的変化は、心筋分化マーカー遺伝子、心筋に特異的に発現する遺伝子、又は心臓の分化若しくは発生に関与する遺伝子の発現の変化を含む請求項８に記載の解析方法。
【請求項１０】
前記機能的変化は、拍動細胞への分化、又は分化した拍動細胞の運動の変化を含む、請求項８に記載の解析方法。
【請求項１１】
前記遺伝的変化は、繊毛細胞分化マーカー遺伝子、繊毛細胞に特異的に発現する遺伝子、又は繊毛細胞の分化若しくは発生に関与する遺伝子の発現の変化を含む請求項８に記載の解析方法。
【請求項１２】
前記機能的変化は、繊毛細胞への分化、又は分化した繊毛細胞の運動の変化を含む、請求項８に記載の解析方法。
【請求項１３】
前記遺伝的変化を検出することは、前記発光画像に基づいて行われる、請求項８に記載の解析方法。
【請求項１４】
前記細胞は、心筋への分化能を有する細胞又は心筋細胞を含む、請求項１に記載の解析方法。
【請求項１５】
前記生体試料は、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、又はマウスの胚を含む、請求項１に記載の解析方法。
【請求項１６】
前記細胞は、繊毛細胞への分化能を有する細胞又は、繊毛細胞を含む、請求項１に記載の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発生過程や幹細胞の各種細胞への分化過程などにおいて、細胞又は組織は、形態的又は機能的な変化を伴う細胞特性の変化を起こす。このような変化のプロセスを解析する方法として、例えばＲＴ−ＰＣＲやウェスタンブロッティングなどによって、遺伝子発現を解析する方法が知られている。しかしながら、ＲＴ−ＰＣＲやウェスタンブロッティングなどの方法では、同じサンプルを用いた経時的な観察ができないという課題がある。【０００３】
同じサンプルを用いた経時的な観察を行える方法として、日本国特開２０１４−３３６１７号公報には、遺伝子の発現に伴って発光タンパク質の発現が見られるように調製された細胞を用いた技術が開示されている。また、発光タンパク質を用いた幹細胞の心筋への分化過程における遺伝子発現を解析した事例として、非特許文献「発光イメージングによる心筋分化マーカー遺伝子発現の可視化、林太朗他、再生医療（メディカルレビュー社）、２０１４年１月２７日発行、第１３巻増刊号、ｐ．３２３」が知られている。【０００４】
これらの方法では、発光画像を取得することと明視野画像を取得することとが一定時間毎に繰り返し行われる。一定時間間隔で取得された発光画像からは遺伝子発現の経時的な変化が解析され、一定時間間隔で取得された明視野画像からは形態の経時的な変化が解析される。しかしながら、このような方法では、例えば心筋細胞の拍動のような比較的速い変化を明視野画像に基づいて定量的に解析することは困難である。【０００５】
心筋の拍動のような速い変化を解析する技術として、短い時間間隔で連続的に取得された画像を用いて解析が行われる画像相関解析法のような手法が知られている。日本国特開２０１２−１９４１６８号公報、日本国特開２０１５−１９６２０号公報、及び日本国特開２０１３−１９２４６８号公報には、連続して取得された画像から心筋細胞の拍動や、遺伝子発現の変化が解析されるという技術が開示されている。しかしながら、これらの技術では、心筋細胞の拍動という機能的な変化しか解析できなかったり、遺伝子発現の変化という遺伝的な変化しか解析できなかったりする。【０００６】
幹細胞から拍動する心筋細胞への分化といったプロセスにおいては、実際には細胞内において、その変化を生じさせる遺伝子が発現し、タンパク質レベルの変化が起こった後、機能的・形態的変化が起こる。このため、遺伝子発現と機能的・形態的変化とにはタイムラグが存在すると考えられる。しかし、従来のＲＴ−ＰＣＲ又はウェスタンブロッティングといった遺伝子解析又はタンパク質解析の手法を用いて、遺伝子発現と機能的・形態的変化とのタイムラグを解析した報告はない。また、ＲＴ−ＰＣＲ又はウェスタンブロッティングを用いると、遺伝子発現と拍動細胞の運動という機能的変化を同じサンプルで定量的に検出することはできない。【０００７】
そこで、例えばレポーター遺伝子を導入することで、解析対象である遺伝子の発現に応じて発光量が変動するように構成された発光タンパク質を発現する細胞を生存状態で維持し、遺伝子発現と機能的・形態的変化とを解析することが考えられる。【０００８】
また、対象とする生体試料の異なる領域において、互いに異なる分化状態となることが考えられる。このため、対象とする生体試料の異なる領域における各々の状態を評価することが求められる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、生体試料の異なる領域における各々の状態を評価できる生体試料の解析方法を提供することを目的とする。
【００１０】
本発明の一態様によれば、生体試料の解析方法は、解析対象である遺伝子の発現に応じて発光量が変動するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入した細胞を含む生体試料を生存状態で維持することと、複数の前記細胞を含むような複数の領域を設定するとともに、前記複数の領域について、前記細胞から放射される発光を遮光状態で撮影することで静止画としての発光画像を経時的に複数取得することと、前記複数の領域について、前記生体試料に対し光照明して撮影することで明視野の連続画像を経時的に複数取得することと、同一の前記領域において前記発光画像及び前記連続画像のそれぞれから得られる生物学的情報を、異なる前記領域同士で比較することとを含む。
【００１１】
本発明によれば、生体試料の異なる領域における各々の状態を評価できる生体試料の解析方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、一実施形態に係る生体試料の解析方法の一例の概略を示す図である。
【図２】図２は、一実施形態に係る生体試料の解析を行うためのシステムの構成例の概略を示す図である。
【図３】図３は、一実施形態に係る生体試料の解析方法の一例を示すフローチャートである。
【図４】図４は、一実施形態に係る生体試料の解析方法の一例を示すフローチャートである。
【図５】図５は、一実施形態に係る撮影処理の一例を示すフローチャートである。
【図６】図６は、一実施形態に係る解析処理の一例を示すフローチャートである。
【図７】図７は、関心領域の一例を示す図である。
【図８】図８は、心筋特異的に発現するｃＴｎＴのプロモーターにルシフェラーゼを繋いだレポーターベクターを導入したマウスｉＰＳ細胞由来の胚様体が心筋に分化する過程に係る図である。
【図９】図９は、ＲＯＩ１における、時間に対する遺伝子発現量及び拍動強度の計測結果の一例を示す図である。
【図１０】図１０は、ＲＯＩ２における、時間に対する遺伝子発現量及び拍動強度の計測結果の一例を示す図である。
【図１１】図１１は、ＲＯＩ３における、時間に対する遺伝子発現量及び拍動強度の計測結果の一例を示す図である。
【図１２】図１２は、ＲＯＩ４における、時間に対する遺伝子発現量及び拍動強度の計測結果の一例を示す図である。
【図１３】図１３は、時間に対する同期性指標値の計測結果の一例を示す図である。
【図１４】図１４は、ＲＯＩ１乃至ＲＯＩ４における、ＴＢ、ＴＥ、ＴＧ及びＥ（７２）の計測結果の一例を示す図である。
【図１５】図１５は、ＴＢ−ＴＧとＴＥ−ＴＧとの関係の一例を示す図である。
【図１６】図１６は、ＴＢ−ＴＧとＥ（７２）との関係の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の一実施形態について図面を参照して説明する。本実施形態は、生体試料の解析方法に関する。本実施形態に係る方法の概略を図１に示す。
【００１４】
ステップＳ１に示すように、本方法は、解析対象である遺伝子の発現に応じて発光量が変動するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入した細胞を含む生体試料を生存状態で維持することを含む。
【００１５】
細胞は、種々の生物に由来する細胞であり得る。細胞は、例えば、多細胞生物に由来する細胞であり得る。細胞は、特に、ヒトやマウスといった哺乳類に由来する細胞であり得る。細胞は、培養細胞であってもよい。細胞は、単一の種類であってもよい。また、細胞は、複数の種類を含んでいてもよい。また、細胞は、細胞シートなど層状の構造を有していてもよい。細胞は、未分化の状態の細胞であり、分化能を有していてもよい。また、細胞は、ある程度分化しているものの、さらに分化し得る状態の、例えば前駆細胞といった細胞でもよい。前駆細胞には、例えば心筋前駆細胞や繊毛前駆細胞が含まれる。細胞は、本実施形態の実施において時間経過とともに分化が進行してもよい。細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの幹細胞でもよい。また、細胞は、幹細胞から分化した細胞でもよい。また、生体試料は、ゼブラフィッシュ、ニワトリ、マウス等の胚などの細胞でもよい。
【００１６】
解析対象である遺伝子には、例えば特定の細胞に分化したか否かを判断するために用いられる分化マーカーが含まれる。分化マーカーは、例えば特定の細胞に分化する過程で発現する遺伝子である。これらの遺伝子は、分化に関連する遺伝子であり、分化の開始前に、分化の進行途中で、又は分化の完了後に、発現が変動する。これらのマーカー遺伝子は、対象とする細胞が本来有する遺伝子であることが好ましい。また、これらのマーカー遺伝子は、解析対象とする細胞の由来生物とは異なる生物のホモログ遺伝子であってもよい。例えば、解析対象がマウス由来の細胞である場合にヒトの同等機能のマーカー遺伝子が用いられてもよいし、解析対象がヒト由来の細胞である場合にマウスの同等機能のマーカー遺伝子が用いられてもよい。
【００１７】
また、解析対象である遺伝子には、例えば心筋分化マーカーが含まれる。心筋分化マーカーは、例えば心筋分化の過程で発現する遺伝子であり、心筋細胞に分化にしたときに特異的に発現する遺伝子である。心筋分化マーカーとしては、異なる複数の遺伝子が挙げられる。心筋分化マーカー遺伝子は、例えば、ｃＴｎＴ、ＧＡＴＡ４、ＮＣＸ１などを含む。繊毛細胞分化マーカーは、例えば繊毛細胞への分化の過程で発現する遺伝子であり、例えばＦｏｘｊ１などを含む。未分化マーカー遺伝子は、例えば、幹細胞が未分化な状態において発現する遺伝子である。未分化マーカー遺伝子は、例えばＮａｎｏｇ、Ｔｃｆ３などを含む。
【００１８】
本実施形態に係る方法は、特定の細胞への分化能を有する少なくとも１つの細胞を、分化マーカー遺伝子又は未分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光する発光タンパク質で標識することを含む。本実施形態に係る方法は、さらに緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｅｉｎ；ＧＦＰ）のような蛍光タンパク質を併用することを含んでもよい。また、本実施形態に係る方法は、心筋細胞への分化能を有する細胞を、心筋分化マーカー遺伝子又は未分化マーカー遺伝子の発現に応じて発光する発光タンパク質で標識することを含む。
【００１９】
マーカー遺伝子は、例えば、その発現に依存して発光タンパク質の発現が促進されるように設計されている。例えば、細胞が有する核酸において、これらのマーカー遺伝子のための転写因子結合領域の下流に、発光タンパク質の遺伝子が配置され得る。この場合、本来マーカー遺伝子の発現を制御するための転写因子が、発光タンパク質の遺伝子の上流の転写因子結合領域に結合することで、発光タンパク質の遺伝子の発現が促進される。
【００２０】
発光タンパク質とは、照明光による光エネルギーに依存することなく、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を意味する。発光タンパク質の遺伝子を細胞内の特定の遺伝子に組み込むことでレポーター遺伝子として機能する。発光タンパク質の一例として、ルシフェラーゼが挙げられる。ルシフェラーゼは、ＡＴＰが存在する場合に、基質であるルシフェリンの酸化反応を触媒する。この反応の際、ルシフェリンが発光する。
【００２１】
ルシフェラーゼは、ホタルやバクテリアといった種々の生物に由来するものであり得る。ルシフェラーゼは、例えば、緑色の発光を生じさせるＥｍｅｒａｌｄ  Ｌｕｃルシフェラーゼ、赤色の発光を生じさせるＣＢＲルシフェラーゼ、青色の発光を生じさせるウミシイタケルシフェラーゼなどであり得る。これらルシフェラーゼの遺伝子は、市販されているものであってよい。ルシフェラーゼ遺伝子を予め含有する市販のべクターの例として、Ｅｍａｅｒａｌｄ  Ｌｕｃ  ｖｅｔｏｒ（東洋紡）、ＣＢＲ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｎａｎｏ−Ｌｕｃ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等が挙げられる。
【００２２】
解析対象である遺伝子の発現に応じて発光量が変動するように構成された発光タンパク質のレポーター遺伝子を導入した細胞とは、例えば、マーカー遺伝子の転写因子結合領域と、その下流に位置する発光タンパク質の遺伝子とを含む核酸が導入された細胞である。マーカー遺伝子の転写因子結合領域と発光タンパク質とのセットは、複数使用されていてもよい。複数使用される場合、これらの複数のセットは互いに異なるものであってもよい。
【００２３】
細胞が生存状態で維持されるとは、例えば、細胞が固定されていない状態である。好ましくは、細胞は、分化し得る状態で維持される。また、細胞は、未分化の状態に戻り得る状態で維持される。具体的には、細胞は、ＬＩＦ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ  Ｃ、Ｃｙｃｒｏｓｐｏｒｉｎｅ  Ａなどが添加された培地において培養される。あるいは、細胞は、分化が阻害される条件下で培養され、例えば、分化の阻害剤が添加された培地において培養される。
【００２４】
ステップＳ２に示すように、本実施形態に係る方法は、複数の細胞を含むような領域を複数設定することを含む。また、本方法は、その複数の領域について、細胞から放射される発光を遮光状態で撮影することで静止画としての発光画像を取得することを含む。すなわち、細胞が標識された後、細胞は生存状態で維持される。この状態で、静止画としての発光画像が取得される。この際、各々が複数の細胞を含むような複数の領域が解析領域として設定される。これら複数の領域について、それぞれ発光画像が得られる。このとき、１回の撮影で複数の領域の発光画像が取得され、取得された画像から各領域の画像が抽出されてもよい。また、複数の領域について、それぞれ個別に撮影が行われてもよい。また、複数の画像のそれぞれから１つ又は複数の領域の画像が抽出されてもよい。
【００２５】
領域の選択は、例えば、コンピューター上で実行されるプログラムを用いて行われ得る。この場合、１つの発光画像において、細胞を含む領域を円若しくは四角等で囲むことで、又はフリーハンドで囲むことで関心領域（ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ；ＲＯＩ）が指定され得る。
【００２６】
発光画像の取得条件は、例えば次のように設定される。すなわち、解析すべき遺伝子の発現が変動することを考慮して、取得すべき下限値において発光を検出できる程度の露光時間が必要である。また、発光タンパク質としてのルシフェラーゼ等の酵素反応により発生する生物発光の光量を検出できる撮像感度が必要である。また、当該撮像感度に応じてバックグラウンドと有意に区別し得る程度に比較的長い露光時間が必要である。さらに、定量性の高い解析を実行するために、できるだけ短時間で鮮明な発光画像を得るような発光イメージングシステムを使用することが好ましい。発光画像を取得するための露光時間は、例えば１乃至６０分の範囲から選ばれる。発現量の多い遺伝子解析では、数秒乃至１分の露光時間で発光画像が取得されてもよい。発現量又は発現量の変動が少ない遺伝子解析では、３０分乃至９０分の露光時間で発光画像が取得されてもよい。このように、露光時間は種々の条件に応じて適宜に選択され得る。一般に遺伝子発現量の変動は、数時間乃至数週間の長期間で経時的に比較されることが多い。したがって、例えば１０分以上の露光時間で得られた静止画でも、比較され得るのに充分に短い露光時間で得られた画像となり得る。ｂｉｎｎｉｎｇについては、１×１が好ましいが、２×２や４×４でもよい。
【００２７】
生物発光は、経時的に撮影される。その結果、複数の静止画としての発光画像が取得される。発光画像は、発光する細胞に由来する発光シグナルが検出される領域と、発光しない細胞及び細胞が存在しない部分に由来する発光シグナルが検出されない領域とを含む。これらの領域に基づいて、細胞毎又はコロニー毎の発光の状態、すなわち、遺伝子発現の状態が解析され得る。また、経時的に複数枚の発光画像が取得されることで、例えば心筋の拍動が薬剤等による刺激や心臓疾患に応じて変動するといった解析が可能になる。またマイクロウェルプレート等のマルチウェル容器や、複数のディッシュ等が併用されることで、多数の試料について発光画像の取得が行われてもよい。複数の試料の観察が並行して行われることで、化合物、増殖因子、ｓｉＲＮＡ等の添加物の有無による比較評価、また、添加物の濃度依存性の比較評価が行われ得る。さらに、複数の反応容器が用いられることで、実験の再現性の検討も可能となる。
【００２８】
撮影は、例えば、発光に応じた特定の波長を有した光のみを主に透過させる光学フィルターと、光を電気信号に変換する撮像素子と、電気信号から発光画像を作り出す画像処理手段とを含む装置を用いて行われ得る。発光画像を取得するための装置の例として発光イメージングシステムが挙げられる。発光イメージングシステムは、例えば、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社）を含む。
【００２９】
ステップＳ３に示すように、本実施形態に係る方法は、複数の領域について、生体試料に対し光照明して撮影することで連続画像を取得することを含む。生体試料に対し光照明して撮影することで得られる画像は、いわゆる明視野画像である。明視野画像とは、例えば、細胞に対して照射された照明光が、細胞で反射され又は細胞を透過して撮像素子に到達し、撮像素子がこの光を光電変換することにより得られる画像である。すなわち発光に基づくことなく、細胞の位置及び形態等が観察され得る。明視野画像は、位相差画像や微分干渉観察画像（ＤＩＣ観察画像）を含む。本方法において、明視野画像は、発光画像の取得とほぼ同じタイミングで取得され得る。あるいは、明視野画像は、発光画像の取得からは独立して、任意のタイミングで取得され得る。このような明視野画像が連続して取得されることで連続画像が取得される。連続画像は、例えばビデオレートの動画となる。
【００３０】
例えば心筋細胞の解析が行われるとき、連続画像に基づいて細胞群の拍動が解析される。拍動とは、互いに接着した細胞集団が協調して収縮と弛緩とを繰り返すことによる細胞集団単位の周期的運動をいう。拍動現象は、細胞集団に属する個々の細胞の位置が、一定の軌道上を周期的に移動することによって認識され得る。顕微鏡による観察では、拍動において個々の細胞は、典型的には一定の直線上を往復するように観察される。拍動現象は、同一の細胞集団が同一の周期で運動することと、個々の細胞が周辺の細胞と類似した方向・大きさで運動することとの２点によって、拍動以外の位置変位と明確に区別され得る。
【００３１】
撮影画像によって拍動を認識するためには、収縮及び弛緩の過程に要する時間に比べて速いフレームレートによって連続的に撮影された連続画像（動画）が必要である。各フレームにおける個々の細胞位置は、前後の時間のフレーム画像を手がかりとして、手動又は各種の画像認識手法によって決定され得る。また、個々の細胞位置が特定されずに、画像の明暗パターンの運動が例えばオプティカルフローや画像相関法などの手法によって解析されることによっても拍動が認識され得る。
【００３２】
ステップＳ４に示すように、撮影が繰り返されるか否かが判定され、ステップＳ２及びステップＳ３の撮影は経時的に行われる。すなわち、撮影は、任意の間隔で連続的に行われる。例えば、撮影は、１分から１２時間の間隔で行われ得る。また、１回の撮影の時間は任意に設定され得る。１回の撮影時間は、発光シグナルや透過光が十分に検出されるように調整され得る。
【００３３】
ステップＳ５に示すように、本実施形態に係る方法は、同一の領域において発光画像及び連続画像のそれぞれから得られる生物学的情報を、異なる領域同士で比較することを含む。
【００３４】
生物学的情報には、例えば分化状態が含まれる。複数の発光画像からは、発光量の変化が読み取られる。この発光量の変化は、例えば分化状態が識別され得る表現形式に変換される。複数の画像において、対応する関心領域（ＲＯＩ）が特定される。特定された領域について、例えばコンピューター上のプログラムを用いて発光量が数値化され、記録される。
【００３５】
選択されたーつ又は複数の領域の遺伝子の発現は、発光量の変化として解析され得る。選択された複数領域の発光量の比較が行われることで、細胞又は領域ごとの発光量変化の比較が行われてもよい。複数の異なる遺伝子の発現が解析される場合には、例えばそれぞれの遺伝子のマーカーとして赤色と緑色といった色の異なるルシフェラーゼが用いられる。各々のルシフェラーゼの発光量の比較が行われることで、各遺伝子の発現量の違いが検出され得る。また、異なるルシフェラーゼの発光量が経時的に観察されることで、各遺伝子発現の比率の変動が解析され得る。
【００３６】
連続画像から得られる生物学的情報は、細胞の運動量を示してもよい。この運動量は、画像相関法を用いて取得され得る。また、生物学的情報は、運動量ベクトルの時間変化に関する主成分分析により解析されうる。
【００３７】
また、生物学的情報を比較することは、遺伝的変化と機能的変化とを定量的に検出することと、遺伝的変化と機能的変化との時間差又はタイムラグを検出することとを含み得る。ここで、遺伝的変化は、例えば、心筋分化マーカー遺伝子、心筋に特異的に発現する遺伝子、又は心臓の分化・発生に関与する遺伝子の発現の変化によって検出され得る。また、機能的変化は、拍動細胞への分化、又は分化した拍動細胞の運動の変化を含み得る。
【００３８】
本方法は、動画としての明視野連続画像の取得を含み、この動画に基づいて、細胞の拍動といった運動解析を行うことをさらに含み得る。一般に、画像に基づいて物体の運動を解析する方法が知られている。このような運動解析の手法には様々なものがある。例えばコンピュータビジョンでしばしば用いられるオプティカルフローや、流体力学に関する解析でしばしば用いられる相関解析といった手法が知られている。相関解析では、画像の相関関数の演算から物質の流速が求められる。このような方法は、画像相関法と呼ばれている。
【００３９】
画像相関法には、同一の撮像素子に二重露光した画像の自己相関関数を演算する方法と、異なる時刻に撮影された２枚の画像の相互相関関数を演算する方法とがある。撮像素子の進歩に伴い、高速に画像を取得することが容易となったため、相互相関関数を用いることが主流となっている。
【００４０】
例えばＷｅｉｓｍａｎらは、細胞移動に伴う足場タンパク質の移動を解析するために、時空間画像相関分光法（Ｓｐａｔｉｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｉｍａｇｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＴＩＣＳ）を開発した（B. Hebert et al. (2005), "Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells", Biophys. J. 88, 3601-3614.）。例えばＳＴＩＣＳといった画像相関法によれば、画像の中の濃淡が検出されることで、細胞のような輪郭がはっきりしない画像も解析対象となり得る。この点は、特徴点等を利用するオプティカルフロー等の解析と比較して、細胞等を解析対象とすることに特に効を奏する。
【００４１】
ＳＴＩＣＳについて簡単に説明する。なお、ここで説明するＳＴＩＣＳは画像相関法の一例であり、適宜、改変が加えられてもよいし、画像間の相関を求める処理を含む別の方法が用いられてもよい。説明のため、連続画像の空間座標ｘ及びｙと時間座標ｔとを整数として取り扱う。撮影倍率又は撮影間隔から決定する比例係数との積を取ることにより、容易に試料の実際の位置又は撮影時間が取得され得る。また、ここでは画像は二次元であるものとして説明するが、本方法は、立体的な情報を持つ三次元画像に対しても、容易に拡張可能である。
【００４２】
試料は、画像の大きさをＭ×Ｍピクセルとして一定時間間隔で撮影され、動画としてのＮ枚の連続画像が取得される。このＮ枚の連続画像から時間間隔τである２枚１組の画像について画像相関演算が行われる。Ｎ枚の連続画像からは、（Ｎ−τ）組の画像について画像相関演算が行われる。次に、画像相関演算によって得られた（Ｎ−τ）枚の相関像を平均した平均画像相関像が求められる。平均画像相関像は、それぞれの相関像の対応するピクセル位置の画像データを加算して平均値を演算することで求められる。
【００４３】
以上の処理を数式で表すと次のようになる。時刻ｔに取得された座標（ｘ，ｙ）における画像の信号強度がＩ（ｘ，ｙ；ｔ）であるとき、平均画像相関像は、次式（１）で表される。
【００４４】
【数１】
2016189583.tif 000003
ここで、δＩ（ｘ、ｙ；ｔ）は、信号強度の変動値であり、次式（２）で表される。
【００４５】
【数２】
2016189583.tif 000004
【００４６】
式（１）、式（２）中の＜Ｉ（ｘ，ｙ；ｔ）＞は、Ｍ×Ｍピクセルの大きさの画像のｘ及びｙについて画像データを平均化することを示している。すなわちｘ，ｙ，ｔの関数Ｆに対して、＜Ｆ（ｘ，ｙ；ｔ）＞は次式（３）で定義される。
【００４７】
【数３】
2016189583.tif 000005
【００４８】
なお、ｘ及びｙについて、周期的境界条件、すなわち、整数ｎ及びｍについて、Ｆ（ｘ＋ｎＭ，ｙ＋ｍＭ；ｔ）＝Ｆ（ｘ，ｙ；ｔ）が成立する場合は、式（１）の分子に記載される相互相関関数はフーリエ変換を用いて高速に計算され得る。
【００４９】
また、時間とともに試料中の発現分布が移動することを鋭敏に捉えるために、解析する時間区分内で不動な成分、又は低速な成分が予め除去され得る。除去の方法の一例として、B. Hebert et al. (2005) に記載されているように各座標ごとに信号強度変化の低周波成分を除去する方法が採用され得る。また、定常成分が除去されてもよい。すなわち、移動成分Ｉｍｏｖが次式（４）に従って計算され、Ｉｍｏｖが式（１）のＩ（ｘ，ｙ；ｔ）の代わりに用いられてもよい。
【００５０】
【数４】
2016189583.tif 000006
【００５１】
次に、平均画像相関像を用いた解析方法について説明する。連続画像中の分布画像が時間とともに特定の方向へ移動しているとき、上述の方法によって得られる平均画像相関像Ｒ（ξ，η；τ）は、画像の中心から外れた位置に極大値を持つ分布画像となる。この極大値の位置を決定する方法の一つとして、ガウシアン分布を仮定して、相互相関画像に対して当てはめを行う方法がある。
【００５２】
すなわち、次式（５）で表されるガウシアンをＡ，β，ｐ，ｑ，Ｃを可変パラメータとして平均画像相関像に対して最小二乗法によって当てはめを行う。
【００５３】
【数５】
2016189583.tif 000007
【００５４】
当てはめによって得られたｐ，ｑが、時間間隔τにおける平均画像相関像の極大位置（ｐτ，ｑτ）である。したがって、時間間隔τ（＝１〜Ｎ−１）ごとに平均画像相関像の極大位置（ｐτ，ｑτ）が決定される。
【００５５】
画像中の分布の移動速度（ｖｘ，ｖｙ）は、次式（６）で表される極大位置と遅延時間の比例係数として決定される。
【００５６】
【数６】
2016189583.tif 000008
【００５７】
統計的に正確なｖｘ，ｖｙを導出するため、最小二乗法などを用いた回帰分析によって比例係数ｖｘ，ｖｙが算出されてもよい。
【００５８】
Ｍ×Ｍピクセルの全体画像に内包される、ｍ×ｍピクセルの部分領域内の画像に対して上述の解析が行われることにより、その部分領域内での局所的な移動速度が導出され得る。すなわち、ｘがｘｉからｘｉ＋ｍ−１であり、ｙがｙｉからｙｉ＋ｍ−１である部分領域Ａｉに対して画像相関が計算され、その部分領域に対する移動速度が決定され得る。多数の部分画像について局所的な移動速度が求められことによって、移動速度の分布が得られる。
【００５９】
撮影時刻が異なる複数枚の画像から、時刻ｔの直近のｎ枚の画像からなる時間区分が取り出され、上記の解析が行われることにより、時刻ｔの時点での移動速度が導出され得る。すなわち、ｔがｔｉからｔｉ＋ｎ−１である画像に対して画像相関が計算されることで、例えば、この時間区分の中央の時刻ｔ＝ｔｉ＋（ｎ−１）／２における移動速度が決定され得る。この時間区分を連続的、あるいは離散的にずらして移動速度が求められることにより、変化する移動速度が把握され、移動速度の経時的な解析が行われ得る。
【００６０】
上述の解析方法によって得られた移動速度は、画面上に表示されることによって、結果が可視化される。このことは、利用者が結果を視覚的に理解することを補助する。表示方法としては、例えば、連続画像上に速度ベクトルを表す図形が重ねて表示される方法が考えられる。速度ベクトルを表す図形としては、長さが移動速度の大きさに比例し、矢頭がベクトルの方向を示す矢印がある。また、矢印の色彩が速度の大きさに応じて変更されてもよい。
【００６１】
画像中の部分領域内で解析が行われ、局所的な移動速度が解析される場合、各部分領域の中央にベクトル表示が行われることにより、速度分布が可視化され得る。経時的な解析が行われた場合、時刻ｔの画像上に、その時刻ｔにおける速度ベクトルが重ねて表示されることによって、移動速度の経時的変化が可視化され得る。
【００６２】
上記のような運動解析によれば、例えば心筋に分化した細胞の拍動が解析され得る。すなわち、この運動解析によれば細胞の機能発現が解析され得る。本方法では、発光画像と動画である明視野連続画像とが、同一の試料について同時に取得され得る。ここで同時にとは、物理的に完全に同時にということを意味せず、生物学的に同時に、すなわち、例えば数分の差があっても同時とみなせる同時期にということを意味する。発光画像と動画である明視野連続画像とが、同一の試料について同時に取得され得るので、例えば幹細胞から心筋細胞への分化が、遺伝子発現と機能発現との両面から詳細に解析され得る。
【００６３】
なお、ここではＳＴＩＣＳについて説明したが、ＳＴＩＣＳに限らず種々の画像相関法が用いられ得るし、さらにオプティカルフローなど種々の運動解析法が用いられてもよい。
【００６４】
拍動する心臓の画像を連続的に解析するためには、対象としての心筋の運動速度の上限よりも速く撮影する連続画像取得工程と、得られた連続画像を経時的に比較して画像ごとの移動速度を演算する画像演算工程とを含む連続画像解析工程を実行することが重要である。このような連続画像解析工程を実行するための撮像素子や画像処理用ソフトウェアは、一般に入手可能である。例えば、画像処理用ソフトウェアとして、浜松ホトニクスから販売されているアクアコスモスが使用され得る。連続画像取得工程における取得されるべき画像の種類としては、ＬＥＤ等の照明光による明視野画像としての透過画像、反射画像、位相差画像、微分干渉画像等が挙げられる。明視野画像以外に、励起光を照明することで得られる蛍光画像が連続画像として解析されてもよい。また、これら明視野画像及び蛍光画像が併用されることで高速な生物学的解析の項目が増やされてもよい。連続画像取得工程における動画の撮影条件としての撮影間隔は、例えば１０乃至８００ｍｓの範囲から選ばれる。心筋の拍動を解析する場合は、撮影間隔は、例えば１００乃至２００ｍｓの範囲に設定されることが好ましい。本発明は、心筋の再生に関する遺伝学的解析に限らず、心臓の拍動の異常に関連する疾病（例えば不整脈や心筋梗塞）の遺伝学的解析にも適用され得る。
【００６５】
このような、発光画像に基づく遺伝子発現の解析と明視野画像の動画に基づく機能発現の解析とを同時に行えるシステムの概略を図２に示す。図２に示すように、この解析システム１は、図示しないハウジングに遮光状態で格納された顕微鏡１０と、例えばパーソナルコンピュータといった各種演算を行うことができる演算装置２０と、例えばキーボードやマウスといった演算装置２０にユーザによる指示を入力するための入力部２９とを備える。
【００６６】
顕微鏡１０には、光学系１２と光源１４と撮像装置１６とが設けられている。光学系１２は、種々のレンズやミラーを含む。光源１４は、明視野画像を得るために必要な任意の照明光（例えば白色光）を射出し、この光源１４から射出された光は、光学系１２を介して例えば幹細胞といった試料５０に照射される。この試料５０は、好ましくは所定の培養環境により細胞が生存可能に維持されるよう、培養チャンバ内に収容されている。撮像装置１６は、例えばＣＣＤ等による撮像素子を含み、光学系１２を介して試料５０の顕微鏡画像に係る画像信号を生成する。
【００６７】
演算装置２０は、撮影制御部２１と、画像取得部２２と、光源制御部２３と、光学系制御部２４と、静止画解析部２５と、動画解析部２６と、記録部２７とを備える。撮影制御部２１は、撮像装置１６の動作を制御する。画像取得部２２は、撮像装置１６から画像を取得し、必要な画像処理等を行う。
【００６８】
光源制御部２３は、光源１４の動作を制御する。光学系制御部２４は、光学系１２を制御する。例えば明視野画像が取得されるときは、光源１４から射出された照明光は、光学系１２を介して試料５０に照射される。また、明視野画像が取得されるときは、露光時間は比較的短くされる。一方、発光画像が取得されるときは、光源１４から射出された照明光は遮断され、試料５０は照明されない。また、発光画像が取得されるときは、露光時間は比較的長く設定される。
【００６９】
静止画解析部２５は、例えば発光画像といった静止画の解析を行う。動画解析部２６は、例えば上述の運動解析といった解析を行う。記録部２７は、例えば発光画像や動画や静止画の解析結果や運動解析の結果を記録する。
【００７０】
以上のような解析システム１は、上記したとおり発光画像と動画である明視野連続画像とを、同一の試料について同時に取得することができる。さらに、解析システム１は、取得した画像に基づいて、例えば細胞の特性について遺伝子発現と機能発現との両面から詳細に解析することができる。解析システム１は、例えば幹細胞から心筋細胞への分化を、遺伝子発現と機能発現との両面から詳細に解析することができる。このような解析システムは、幸いにも、上記発光イメージングシステムＬＶ２００において実現されている。
【００７１】
例えば、解析領域内の心筋細胞が個々に拍動しているのか、集団として同期性を持って拍動しているのかを識別することは、心筋細胞の機能的成熟をはかる上での重要な指標である。細胞集団の拍動の同期性の指標として、同じタイミングで場所ごとに決まった方向に運動する細胞の割合が挙げられる。その導出方法の一つとして、運動解析で得られたベクトルに対して主成分分析を行い、その固有値の分布を用いる方法が挙げられる。
【００７２】
解析領域内にＭ個のサブ領域があったとき、各時刻ｔｎごとに２Ｍ個の成分を持つベクトルＶｎ＝（ｖ１ｘ（ｔ），ｖ１ｙ（ｔｎ），ｖ２ｘ（ｔｎ），ｖ２ｙ（ｔｎ），．．．，ｖＭｘ（ｔｎ），ｖＭｙ（ｔｎ））が定義される。ここで、ｖｉｘ（ｔｎ）とｖｉｙ（ｔｎ）はｉ番目のサブ領域の時刻ｔｎにおける速度のｘ成分とｙ成分である。連続画像がＮ枚のフレームで構成されているとき、各行がＶｎであるような（Ｎ−１）行・２Ｍ列のデータ行列Ｖが作られ得る。Ｗ＝ＶＴＶとして定義される対称行列Ｗの固有値分解を行うことにより、データ行列Ｖの主成分分析を行い得る。主成分分析はＷの固有値分解の代わりにデータ行列Ｖに特異値分解を適用することによっても行い得る。主成分分析により、Ｎ−１と２Ｍとのうち小さい方をｓとしたとき、零でないｓ個の固有値λｉと対応する固有ベクトルｗｉとの組が得られる。以後、λｉは降順に並べられているものとする。最大の固有値λ１に対応する固有ベクトルｗ１が第一主成分である。第一主成分は、同じタイミングで生じる最大の運動を表している。以下、２番目、３番目の大きさの固有値に対応する固有ベクトルが、２番目、３番目の大きさの運動を表している。
【００７３】
第ｉ番目の固有値の比率λｉ／Σλｊを、その第ｉ主成分の寄与率と定義する。寄与率は、対応する主成分が表す運動が全運動に占める割合を示す量である。寄与率は、固有値の和によって規格化されているため、拍動の大きさや拍動している領域の大きさに左右されない性質を持つ。第一主成分の寄与率は、最も顕著な集団運動に対応していて、拍動の同期性の指標として適している。以後、同期性指標値をＥ＝λ１／Σλｊと定義する。
【００７４】
観察開始からの時間Ｔにおける解析領域Ｒの拍動強度ＢＲ（Ｔ）は、時間Ｔから開始された撮影シークエンス内に撮影された一定時間（例えば２５秒間）の連続画像から上記のように求められる。同じ撮影シークエンス内に撮影された発光画像から、時間Ｔにおける解析領域内の遺伝子発現量ＧＲ（Ｔ）が得られる。
【００７５】
心筋細胞への分化を解析し、品質のよい心筋細胞集団を選別する方法の具体的な一例を、図３乃至図６に示すフローチャートを参照して説明する。
【００７６】
図３に示すように、本方法は、レポーター遺伝子を導入することと、撮影処理と、解析処理とを含む。すなわち、図３に示すように、ステップＳ１０１において、心筋細胞への分化能を有する細胞又は心筋細胞に心筋分化マーカー遺伝子や心筋に特異的に発現する遺伝子の発現に応じて発光するように構成されたレポーター遺伝子が導入される。続いて、ステップＳ１０２において、撮影処理が行われる。撮影処理では、発光画像と、明視野画像と、連続画像とが取得される。続いて、ステップＳ１０３において、解析処理が行われる。解析処理では、撮影処理で得られた画像が解析され、品質のよい心筋細胞集団が選別される。
【００７７】
解析処理は、撮影処理が完了した後に行われなくてもよい。すなわち、解析処理は、撮影処理により、画像の取得が行われながら、順次得られた画像の解析が行われるものであってもよい。すなわち、図４に示すように、初めに、ステップＳ１１１において、心筋細胞への分化能を有する細胞又は心筋細胞に心筋分化マーカー遺伝子や心筋特異的に発現する遺伝子の発現に応じて発光するように構成されたレポーター遺伝子が導入される。続いて、ステップＳ１１２の撮影処理と、ステップＳ１１３の解析処理とが並列処理されてもよい。
【００７８】
次に、撮影処理について、図５に示すフローチャートを参照して説明する。
【００７９】
ステップＳ２０１において、発光画像が取得される。すなわち、遮光状態において、発光タンパク質の存在に基づいて発生する光が、例えば数分間の露光によって捉えられる。この露光によって、静止画としての発光画像が取得される。
【００８０】
ステップＳ２０２において、明視野画像が取得される。すなわち、観察対象である生体試料に照明光が照射され、照明光の透過光又は反射光等が捉えられることによって、静止画としての明視野画像が取得される。
【００８１】
ステップＳ２０３において、明視野画像が連続撮影される。すなわち、観察対象である生体試料に照明光が照射され、照明光の透過光又は反射光等が連続的に捉えられることによって、連続画像が取得される。この連続画像を構成する明視野画像は、例えば、１秒間に数枚から数十枚取得される。連続画像を構成する１秒当たりの明視野画像の枚数は、何枚でもよい。
【００８２】
ステップＳ２０４において、撮影を終了するか否かが判定される。すなわち、例えばステップＳ２０１乃至ステップＳ２０３による画像取得の回数が予め設定されており、その回数が繰り返されたか否かが判定される。あるいは、ユーザによる撮影終了の指示があるまでステップＳ２０１乃至ステップＳ２０３が繰り返され、ユーザによる撮影終了の指示があったときに撮影が終了されるように構成されてもよい。撮影を終了しないと判定されたとき、処理はステップＳ２０１に戻る。このようにして、例えばタイムラプスデータが取得される。一方、撮影を終了すると判定されたとき、撮影処理は終了する。
【００８３】
次に解析処理について、図６に示すフローチャートを参照して説明する。ここで示す解析処理は、一例として、幹細胞から拍動する心筋細胞へと分化していく細胞を含む生体試料の解析を行う場合であり、品質のよい心筋細胞の集団が選別される処理の例である。
【００８４】
ステップＳ３０１において、撮影されたタイムラプスデータが取得される。すなわち、撮影処理のステップＳ２０１乃至ステップＳ２０３の処理において取得された発光画像、明視野画像及び連続画像を含む各種画像データが読み出される。あるいは、図４に示すように撮影処理と解析処理とが並列処理されるときは、撮影中のデータが読み出される。
【００８５】
ステップＳ３０２において、解析領域が選択される。すなわち、ステップＳ３０１で読み出された各種画像データが示す画像において、解析対象とされる１つの関心領域（ＲＯＩ）が設定される。この関心領域（ＲＯＩ）は、１枚の画像に２つ以上設定されるか、又は複数枚に分割されて取得された画像の各々に１つ以上設定されるかによって、全体として複数設定される。ステップＳ３０２の処理では、この複数の関心領域（ＲＯＩ）の中から後述するステップＳ３０３乃至ステップＳ３０７の処理で解析される１つの領域が選択される。ステップＳ３０２乃至ステップＳ３０７の処理が繰り返されるごとに異なる領域が選択されることで全ての関心領域（ＲＯＩ）について解析が行われることになる。
【００８６】
ステップＳ３０３において、設定された解析領域の発光量の経時変化が解析される。すなわち、例えば撮影処理のステップＳ２０１で取得された発光画像の輝度が解析される。経時的に取得された複数の発光画像の輝度が解析されることで、撮影された生体試料の経時的変化が解析される。ここで、生体試料の発光がレポーター遺伝子に基づく発光タンパク質による発光であるとき、発光量は、解析対象である遺伝子の発現量を表すことになる。
【００８７】
ステップＳ３０４において、解析領域の拍動の経時変化が解析される。すなわち、例えば撮影処理のステップＳ２０３で取得された連続画像に基づいて、ＳＴＩＣＳ解析が行われることで、細胞群の拍動の解析が行われる。経時的に取得された複数の連続画像について拍動の解析が行われることで、拍動の経時変化が解析される。
【００８８】
ステップＳ３０５において、解析領域の拍動の同期性の経時変化が解析される。すなわち、ステップＳ３０４で解析された拍動の経時変化の結果に基づいて、拍動の同期性の経時変化について解析が行われる。
【００８９】
ステップＳ３０６において、解析領域の遺伝子発現量と拍動とのタイムラグが算出される。すなわち、例えば、ステップＳ３０３で解析された発光量の経時変化、すなわち、遺伝子発現量の経時変化と、ステップＳ３０４で解析された拍動の経時変化とに基づいて、遺伝子発現の増加のタイミングと拍動強度の増加のタイミングとのタイムラグが解析される。
【００９０】
ステップＳ３０７において、解析領域の遺伝子発現と拍動の同期性とのタイムラグが算出される。すなわち、ステップＳ３０３で解析された遺伝子発現の経時変化と、ステップＳ３０５で解析された細胞の拍動の同期性の経時変化とに基づいて、遺伝子発現の増加のタイミングと拍動の同期性の増加のタイミングとのタイムラグが解析される。
【００９１】
ステップＳ３０８において、解析領域の選択が終了したか否かを判定する。すなわち、ステップＳ３０２で選択される解析領域として、解析されるべき領域の全てが選択されたか否かが判定される。解析領域の選択が終了していないとき、処理はステップＳ３０２に戻る。一方、解析領域の選択が終了したと判定されたとき、すなわち、全ての関心領域について解析が終了したと判定されたとき、処理はステップＳ３０９に進む。
【００９２】
ステップＳ３０９において、解析領域間で、ステップＳ３０６で取得された遺伝子発現と拍動とのタイムラグ、及び、ステップＳ３０７で取得された遺伝子発現と拍動の同期性とのタイムラグが比較される。
【００９３】
ステップＳ３１０において、ステップＳ３０９で行われた比較の結果に基づいて、品質のよい心筋細胞集団の選別が行われる。すなわち、例えば、複数の解析領域のうち、遺伝子発現と拍動とのタイムラグ、及び、遺伝子発現と拍動の同期性とのタイムラグがともに小さいとき、心筋細胞への分化が速やかに行われるとともに細胞間の接続も良好であり、品質がよい心筋細胞集団であると判定される。
【００９４】
なお、ここでは示さなかったが、ステップＳ２０２で取得された明視野画像に基づいて、例えば細胞の形態変化についても解析されてもよい。すなわち、細胞の形態変化等のタイミングと、遺伝子発現、拍動又は拍動の同期性のタイミングとが比較されてもよい。
【００９５】
本方法によれば、例えば幹細胞における遺伝子発現を生きた細胞で観察することが可能となる。生存状態で細胞が観察されることで、細胞が分化する際の遺伝子発現の過程が観察され得る。このとき、観察に発光イメージングが用いられることで、高い定量性が実現され得る。また、幹細胞から細胞が分化する過程の遺伝子発現が長時間経時的に観察され得る。
【００９６】
本方法によれば、発光観察が行われることで、例えば胚様体のような自家蛍光が強い標本においても、定量的な解析が行われ得る。励起光を照射することによる光毒性が懸念される蛍光を用いた観察に比べて、細胞へのダメージを小さくしつつ高精度で長時間細胞が観察され得る。複数のマーカー遺伝子が用いられることで、例えば分化の各過程が識別され得る。このとき、発光が利用されることにより、蛍光が用いられる場合よりも実験系のデザインの自由度が高まる。本方法のように遺伝子発現が観察されることによって、例えば拍動のみが観察されることで心筋細胞への分化が解析される場合に比べて、より多くの情報が取得され得る。
【００９７】
本方法は、例えば心筋分化マーカー遺伝子の発現に従ってレポーター遺伝子由来の発光タンパク質の発光が増減するように調製された、心筋細胞に分化可能な細胞、一部が心筋細胞に分化した胚様体、細胞シートのような構造体、又はゼブラフィッシュ、ニワトリ、マウスなどの胚といった生体試料を対象とした解析に適用され得る。この方法において、少なくとも胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を含む幹細胞から分化した細胞が観察対象とされることで、再生医療等への応用において重要である分化に関する情報が得られる。
【００９８】
本方法は、例えば繊毛細胞分化マーカー遺伝子の発現にしたがってレポーター遺伝子由来の発光タンパク質の発光が増減するように調製された、繊毛細胞に分化可能な細胞、一部が繊毛細胞に分化した胚様体、細胞シートのような構造体、又はゼブラフィッシュ、ニワトリ、マウスなどの胚といった生体試料を対象とした解析に適用され得る。この方法において、少なくとも胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を含む幹細胞から分化した細胞が観察対象とされることで、再生医療等への応用において重要である分化に関する情報が得られる。
【００９９】
本方法では、発光画像と明視野画像と連続画像とが同時に取得される。発光画像から生体試料の遺伝的変化のデータが取得され、明視野画像から生体試料の形態的変化のデータが取得され、連続画像からＳＴＩＣＳ解析を用いて生体試料の機能的変化のデータが取得される。したがって、生体試料の経時的な遺伝的変化と形態的変化と機能的変化との関係やそれらのタイムラグが解析され得る。
【０１００】
この解析では、例えば、前記生体試料において、時間経過に伴う機能的変化としての運動解析とともに、遺伝的変化としての前記細胞や胚の心筋形成予定部位の心筋分化過程の解析が行われる。本方法は、前記生体試料における、例えば、薬剤刺激時における遺伝的変化と機能的変化とのタイムラグを解析することに用いられ得る。また、この方法は、前記生体試料に、例えば、心毒性のある薬物刺激を加えたときの遺伝的変化と機能的変化とのタイムラグを解析することに用いられ得る。このように、本方法は、例えば不整脈やＱＴ延長症候群などに代表される心臓疾患に対する薬剤のスクリーニングや、新薬の毒性評価に用いられ得る。すなわち、評価対象である薬剤を添加した際に、生体試料の任意の場所における心筋マーカー遺伝子や、薬剤によって影響を受ける可能性がある遺伝子の発現がどのように変化するかや、さらにその場所における心筋細胞の拍動がどのように変化するかが解析され得る。その結果は、評価対象である薬剤による影響が遺伝子発現と拍動とにどのように影響するのかや、拍動の同期性がどのように変化するか等の評価に用いられ得る。
【０１０１】
また、例えばゼブラフィッシュ、ニワトリ、マウスなどの胚の心臓形成予定部位における遺伝子発現と機能発現との解析は、注目する遺伝子の胚発生過程における役割の推定に効を奏する。このような解析には、例えば、心臓の形成に関与し、かつ何らかの薬剤、刺激、又は他の遺伝子の発現に影響を受けて発現量が増大若しくは低下する遺伝子の発現と、心臓の拍動の開始とのタイムラグが検出される。
【０１０２】
また、本方法は、例えば幹細胞から分化した各種細胞の品質の評価に用いられ得る。例えば、心筋細胞への効率的な分化誘導法の開発において、均一な性質の心筋細胞を効率よく取得することに利用され得る。すなわち、分化させたい幹細胞の任意に設定した複数の解析領域における心筋分化マーカー遺伝子の発現と拍動する心筋細胞の出現とのタイムラグができるだけ均一になるような、また、任意に設定した各領域における拍動の同期性が同一タイミングで上昇し、各領域の拍動が一定の水準を維持するような条件を探索することで、均一な性質の心筋細胞が効率よく取得されるようになる。また、複数の解析領域のうち、状態が良好な領域が選択され、その領域の細胞のみが以降の解析等に用いられてもよい。
【０１０３】
また、本方法は、例えば幹細胞から分化した各種細胞の品質の評価に用いられ得る。例えば、繊毛細胞への効率的な分化誘導法の開発において、均一な性質の繊毛細胞を効率よく取得することに利用され得る。すなわち、分化させたい幹細胞の任意に設定した複数の解析領域における繊毛細胞分化マーカー遺伝子の発現と繊毛運動を行う繊毛細胞の出現とのタイムラグができるだけ均一になるような条件を探索することで、均一な性質の繊毛細胞が効率よく取得されるようになる。また、複数の解析領域のうち、状態が良好な領域が選択され、その領域の細胞のみが以降の解析等に用いられてもよい。
【実施例】
【０１０４】
［マウスｉＰＳ細胞の心筋分化誘導過程における心筋特異的マーカー遺伝子（ｃＴｎＴ）発現と拍動の運動解析］
心筋特異的トロポニンＴ（ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎＴ；ｃＴｎＴ）は心筋に特異的に発現するタンパク質である。ｃＴｎＴは、心筋分化のマーカー遺伝子として利用されている。マウスｉＰＳ細胞の心筋分化誘導過程におけるｃＴｎＴ発現と拍動の運動解析とを行った。【０１０５】
（１）ｃＴｎＴ遺伝子のプロモーター領域とルシフェラーゼ遺伝子とを含む核酸が導入されたマウスｉＰＳ細胞の作製
ｃＴｎＴ遺伝子のためのプロモーター領域のクローニングを、非特許文献「Jin et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 1995 Vol.214, No.3, p1168-1174」を参考に行い、プロモーター配列を取得した。このとき、マウスゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。また、プライマーは、以下の２つを使用した。  
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ  １：ＧＣＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＧＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ  １：ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＧＡＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＡＧＣ（配列番号２）。【０１０６】
取得したｃＴｎＴ遺伝子のプロモーター配列の下流に、日本国特開２０１３−８１４５９号公報に記載のシブイロヒゲボタル由来ルシフェラーゼ変異体を繋いで、ネオマイシン耐性のベクターに挿入することで、「ｃＴｎＴ遺伝子発現特異的発光ベクター」を構築した。【０１０７】
ベクターを導入するマウスｉＰＳ細胞（ｉＰＳ-ＭＥＦ−Ｎｇ−２０Ｄ−１７、京都大学）の培養には、ＫＯ  ＤＭＥＭ培地を用いた。このｉＰＳ細胞は、マイトマイシンＣ処理で分裂を停止させたＭＥＦ細胞上で培養した。【０１０８】
Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）によるＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ法を用いて、プロトコルに従いマウスｉＰＳ細胞にｃＴｎＴ遺伝子発現特異的発光ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を一晩ＫＯ  ＤＭＥＭ培地でネオマイシン耐性フィーダー細胞とともに培養した後、抗生物質Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を終濃度２５０μｇ／ｍｌとなるよう加えたＫＯ  ＤＭＥＭ培地に培地を交換して、選択的な培養を行った。このようにして、安定発現細胞株を取得した。この細胞を以降「ｃＴｎＴ−ルシフェラーゼ発現マウスｉＰＳ細胞」と呼ぶ。【０１０９】
（２）ｃＴｎＴ−ルシフェラーゼ発現マウスｉＰＳ細胞の胚様体の形成
培養したｃＴｎＴ−ルシフェラーゼ発現マウスｉＰＳ細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシンＥＤＴＡで剥がした後、ＫＯ  ＤＭＥＭ培地を加え、３７℃インキュベーターで４時間インキュベートした。フィーダー細胞（ＭＥＦ）のみをディッシュに固着させることで、ｉＰＳ細胞のみが浮遊する状態にした。ｉＰＳ細胞が含まれた培地を遠心して細胞を回収し、１ｍｌのＩＭＤＭ培地に細胞を再懸濁した。溶液中の細胞数をセルカウンターで計測し、ＩＭＤＭ培地を加えたＬｉｐｉｄｕｒｅ−Ｃｏａｔ培養培地（９６ウェル丸底；日油株式会社）の各ウェルに細胞数が２５００個又は５０００個になるように細胞懸濁液を加え、５日間３７℃で培養し、胚様体を形成させた。【０１１０】
（３）ｃＴｎＴ−ルシフェラーゼ発現マウスｉＰＳ細胞の心筋分化過程のタイムラプス観察
形成させた胚様体をゼラチンコート処理した３５ｍｍディッシュ（ＩＭＤＭ培地、Ｄ−ルシフェリン終濃度１ｍＭ入り）に移し、３７℃で２４時間インキュベートし、ディッシュ表面に胚様体を接着させた。培地を新しいＩＭＤＭ培地（Ｄ−ルシフェリン終濃度１ｍＭ）に交換し、アクアコスモス（浜松ホトニクス株式会社）を搭載した発光顕微鏡ＬＶ２００（オリンパス株式会社）を用いて７２時間観察を行った。撮影条件は以下として、ｃＴｎＴ遺伝子の発現を観察した。ＣＣＤカメラＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス株式会社）をｂｉｎｎｉｎｇ１×１の条件で使用した。露光時間は発光撮影５分、明視野１２５ミリ秒、明視野連続画像についてはアクアコスモスのＨＤレコーディング機能を使用し、撮影間隔０．２５秒でトータル１００枚撮影、２５秒間の連続画像を取得した。これらの発光撮影、明視野撮影、明視野連続画像撮影のセットを１０分間隔で繰り返すことにより、タイムラプス観察を行った。このようにして得られたデータのうち、遺伝子発現量の経時変化観察結果である発光画像についてはアクアコスモスを用いて解析を行った。【０１１１】
（４）タイムラプス観察データの運動解析
タイムラプス観察により得られた明視野画像、明視野連続画像及び発光画像における５１２×５１２ピクセルの画像内に、半径８０ピクセルの円形の解析領域を５箇所設定した。以後、遺伝子発現が認められる領域に設定した４つの解析領域をＲＯＩ１乃至ＲＯＩ４とし、観察期間を通して遺伝子発現が認められなかった領域をｃｏｎｔｒｏｌ領域とする。画像におけるＲＯＩ１乃至ＲＯＩ４及びｃｏｎｔｒｏｌ領域の一例を図７に示す。【０１１２】
各解析領域内にサブ領域を設定した。サブ領域の大きさは３２×３２ピクセルである。各サブ領域は、相互に縦又は横に８ピクセルずつずれるように設けられている。サブ領域の各々において以下のような運動解析を行い、サブ領域内の局所的な運動を定量的に評価した。また、画像のうち解析領域に含まれない部分についてもサブ領域を設定し運動解析を行った。解析領域に含まれない部分のサブ領域は、横にサブ領域を２０ピクセルずつずれるように設けられている。解析領域に含まれない部分のサブ領域が解析領域に含まれるサブ領域よりも粗いのは、解析時間の短縮のためである。【０１１３】
各サブ領域において、連続画像の第ｎフレームが撮影された時刻をｔｎとしたときに、ｔｎとｔｎ＋１の２枚の画像について相互相関画像を計算し、そのピーク位置をガウシアンのフィッティングによって決定した。ピーク位置が（ｐ，ｑ）であったとき、そのサブ領域の時刻ｔｎにおける被写体の速度を（ｐ／Δｔ，ｑ／Δｔ）であるとした。ここで、Δｔは２枚の画像の撮影時刻の間隔ｔｎ＋１−ｔｎである。この速度値に撮像光学系の倍率と撮像素子間隔から決定するピクセル・実距離の換算係数を乗じることによって試料位置での実速度を計算することができる。【０１１４】
各サブ領域において、上記のように計算した瞬間的な速度（ｖｘ（ｔ），ｖｙ（ｔ））の１分間の変位の標準偏差をその地点・時間領域での拍動強度と定義した。拍動強度の定義としては、今回採用した定義の他にも時間領域内の速度変位の分散や大きさの最大値を代わりに用いてもよい。上記のように各サブ領域で計算された拍動強度の値を自然近傍補間法によって５１２×５１２ピクセルの画像全体に補完して拍動強度分布画像を描画した。【０１１５】
解析領域単位での拍動強度は、解析領域内のサブ領域について、その拍動強度の二乗平均平方根を計算する事によって求めることができる。解析領域の拍動強度の定義としては、今回採用した定義の他にも、サブ領域の拍動強度の二乗和、二乗平均、最大値又は中央値などの適当な代表値を用いてもよい。【０１１６】
図８に、タイムラプス観察により得られた観察開始後１２時間毎の胚様体の、明視野画像、ｃＴｎＴ遺伝子発現領域の発光画像、ＳＴＩＣＳにより解析した動きのベクトル、及び拍動強度分布について示す。【０１１７】
上述の実施形態で示したように、第ｉ番目の固有値の比率λｉ／Σλｊを、その第ｉ主成分の寄与率と定義する。寄与率は、対応する主成分が表す運動が全運動に占める割合を示す量である。第一主成分の寄与率は最も顕著な集団運動に対応していて、拍動の同期性の指標として適している。以後、同期性指標値をＥ＝λ１／Σλｊと定義する。【０１１８】
観察開始からの時間Ｔにおける解析領域Ｒの拍動強度ＢＲ（Ｔ）は、時間Ｔから開始された撮影シークエンス内に撮影された２５秒間の連続画像から上記のように求められる。同じ撮影シークエンス内に撮影された発光画像から、時間Ｔにおける解析領域内の遺伝子発現量ＧＲ（Ｔ）が得られる。【０１１９】
観察開始からの時間Ｔに対する拍動強度ＢＲ（Ｔ）と遺伝子発現量ＧＲ（Ｔ）との値を図９乃至図１２に示す。ここで、図９は、ＲＯＩ１における時間Ｔに対する拍動強度Ｂ１（Ｔ）と遺伝子発現量Ｇ１（Ｔ）との関係を示す。図１０は、ＲＯＩ２における時間Ｔに対する拍動強度Ｂ２（Ｔ）と遺伝子発現量Ｇ２（Ｔ）との関係を示す。図１１は、ＲＯＩ３における時間Ｔに対する拍動強度Ｂ３（Ｔ）と遺伝子発現量Ｇ３（Ｔ）との関係を示す。図１２は、ＲＯＩ４における時間Ｔに対する拍動強度Ｂ４（Ｔ）と遺伝子発現量Ｇ４（Ｔ）との関係を示す。各図において、横軸は、経過時間を示す。各図において、左縦軸は、発光強度、すなわち遺伝子の発現量を示す。各図において、右縦軸は、瞬間的な速度の１分間の変位の標準偏差の二乗平均平方根、すなわち拍動強度を示す。また、各図において実線は、ＲＯＩ１乃至ＲＯＩ４の何れかの発現量を示し、破線はＲＯＩ１乃至ＲＯＩ４の何れかの拍動強度を示す。また、各図において、二点鎖線はｃｏｎｔｒｏｌ領域の発現量を示し、一点鎖線はｃｏｎｔｒｏｌ領域における拍動強度を示す。【０１２０】
同様に、観察開始からの時間Ｔにおける解析領域Ｒの同期性指標値ＥＲ（Ｔ）も同様に求められる。時間Ｔに対するＥＲ（Ｔ）の値を図１３に示す。図１３において、横軸は経過時間を示し、縦軸は第１主成分の寄与率すなわち同期性指標値を示す。【０１２１】
遺伝子発現量ＧＲ（Ｔ）が、特定の条件ＣＧを満たした時間（遺伝子発現時間）がＴＧ、拍動強度ＢＲ（Ｔ）が特定の条件ＣＢを満たしたときの時間（機能発現時間）がＴＢであったとき、ＴＢ−ＴＧを条件（ＣＧ，ＣＢ）のもとでの遺伝子発現量・機能発現時間のタイムラグＴＢ―Ｇと定義する。【０１２２】
また、同期性指標値ＥＲ（Ｔ）が条件ＣＥを満たした時間（同期性発現時間）がＴＥであったとき、ＴＥ−ＴＧを条件（ＣＧ，ＣＥ）のもとでの遺伝子発現量・同期性発現時間のタイムラグＴＥ―Ｇと定義する。【０１２３】
遺伝子発現時間・機能発現時間・同期性発現時間のそれぞれに対する条件としては、例えば「全観察期間中の測定値の最大値と最小値の中間の値に達した時間」が挙げられる。また、それ以外にも最大値と最小値の間の下から１０％の値に達した時間や、変化量が最大になった時間などでもよい。また、各条件を複数回満たすときは、最初に条件を満たした時間や最後に条件を満たした時間などの制限を設ける事によって各発現時間を一意に決定することが可能である。【０１２４】
遺伝子発現の見られるＲＯＩ１からＲＯＩ４の領域の心筋細胞としての性質を比較するため、各ＲＯＩについて「全観察期間中の測定値の最大値と最小値の中間の値に最初に達した時間」という条件でＴＢ・ＴＥ・ＴＧ及び最後の観察時間Ｔ＝７２時間における同期性指標値Ｅ（７２）を求めた。その結果を図１４に示す。また、各値をもとに（ＴＢ−ＴＧ）対（ＴＥ−ＴＧ）をプロットした結果を図１５に示す。同様に、（ＴＢ−ＴＧ）に対してＥ（７２）をプロットした結果を図１６に示す。【０１２５】
（５）解析結果
図８乃至図１２をみてわかるとおり、胚様体中において、拍動強度の増加よりも前に、ｃＴｎＴの発現の増加が認められる。このように、遺伝子発現と拍動という機能を示す拍動細胞への分化とにはタイムラグが存在していることが分かる。また、ｃＴｎＴ遺伝子の発現量は部位によって異なり、分化した心筋細胞の拍動の大きさも部位によって異なることが分かる。【０１２６】
遺伝子発現量をＲＯＩ間で比較すると、図９乃至図１２より、各ＲＯＩ１乃至ＲＯＩ４において遺伝子発現量の最大値はＲＯＩ１が最も高く、次いでＲＯＩ２及びＲＯＩ３が同程度の値を示している。【０１２７】
拍動の大きさをＲＯＩ間で比較すると、図９乃至図１２より、各ＲＯＩ１乃至ＲＯＩ４において拍動強度の最大値はＲＯＩ１が最も大きく、次いでＲＯＩ３が大きいことが分かる。【０１２８】
図１３に結果を示す同期性の解析より、ＲＯＩ１乃至ＲＯＩ４の拍動細胞の同期性は、１２時間経過前後から２４時間経過の間で急激に上昇する。同期性が７０％を超えて安定した拍動の同期性を示すのはＲＯＩ３が最も早く、次いでＲＯＩ１の順となることが分かる。【０１２９】
心筋の分化過程としては、遺伝子発現の後、速やかに拍動が始まることが望ましい。また同期性についても、速やかに同期性が高まると同時に最終的に到達する同期性が高いことが望ましい。【０１３０】
図１５において左下の領域にプロットされるＲＯＩ１中の細胞は、遺伝子発現と機能発現とのタイムラグ（ＴＢ−ＴＧ）が短く、遺伝子発現と同期性発現とのタイムラグ（ＴＥ−ＴＧ）も短いことから、速やかに分化が進んだことがわかる。また、図１６において中左上の領域にプロットされるＲＯＩ１中の細胞は、（ＴＢ−ＴＧ）が短くかつ最終的な同期性Ｅ（７２）も高いことから、速やかに分化すると同時に、細胞間の接続も良好であることがわかる。また、図９乃至図１２より、ＲＯＩ１の遺伝子発現量の最大値と拍動強度の大きさは、ＲＯＩ１乃至ＲＯＩ４中最大であることが分かる。【０１３１】
以上の判断指標を用いて、ＲＯＩ１の細胞が最も品質のよい心筋細胞であることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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