(57)【要約】      （修正有）【課題】タンパク質の配向を制御しながら高効率で担体へ固定化可能なオリゴペプチドの提供。【解決手段】少なくとも、Ｎ末端側のアミノ酸残基がシステインであり、Ｃ末端側の２アミノ酸残基がシステイン−グリシンである、５から８アミノ酸残基からなるオリゴペプチド、および、該オリゴペプチドを付加した、オリゴペプチド付加タンパク質。オリゴペプチド付加タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、タンパク質吸着剤、および、吸着剤を用いた、タンパク質の精製方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
５から８アミノ酸残基からなる、タンパク質を不溶性担体に固定化させるためのオリゴペプチドであって、
少なくとも、Ｎ末端側のアミノ酸残基がシステインであり、Ｃ末端側の２アミノ酸残基がシステイン−グリシンである、前記オリゴペプチド。
【請求項２】
配列番号１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のオリゴペプチド。
【請求項３】
タンパク質のＮ末端側もしくはＣ末端側に請求項１または２に記載のオリゴペプチドを付加した、オリゴペプチド付加タンパク質。
【請求項４】
タンパク質がＦｃ結合性タンパク質である、請求項３に記載のオリゴペプチド付加タンパク質。
【請求項５】
配列番号１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、請求項４に記載のオリゴペプチド付加タンパク質。
【請求項６】
請求項３から５のいずれかに記載のオリゴペプチド付加タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、タンパク質吸着剤。
【請求項７】
請求項６に記載の吸着剤を用いた、タンパク質の精製方法。
【請求項８】
請求項３から５のいずれかに記載のオリゴペプチド付加タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターにより、宿主を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０記載の形質転換体を培養し、得られた培養液からオリゴペプチド付加タンパク質を回収する、オリゴペプチド付加タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を高効率に不溶性担体へ固定化させるためのオリゴペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーは混合物の中から目的物質を分離するために広く用いられており、電荷の違いに基づいて分離するイオン交換クロマトグラフィーや、疎水性の違いに基づいて分離する疎水性相互作用クロマトグラフィーや、分子の大きさに基づいて分離するゲルろ過クロマトグラフィーなどがある。クロマトグラフィーのうち、アフィニティークロマトグラフィーは、目的物質に対し特異的に結合可能な物質（以下、リガンドという）を不溶性担体に固定化することで得られる吸着クロマトグラフィーであり、１ステップで高純度な精製を可能としている。
【０００３】
アフィニティークロマトグラフィーは、特に抗体（免疫グロブリン）を主成分とした医薬品（抗体医薬）の精製に用いられており、プロテインＡをリガンドとした吸着剤を用いたアフィニティークロマトグラフィーが多用されている。一方で、抗体のＦｃ領域に結合する一群のタンパク質分子であるＦｃ受容体やＦｃ領域への結合能を有したＦｃ受容体の部分領域（以下、合わせてＦｃ結合性タンパク質という）もプロテインＡと同様、抗体を特異的に吸着可能なリガンドとして用いることができる（特許文献１）。
【０００４】
タンパク質をリガンドとして担体に固定化する際、当該リガンド表面に存在する反応性の高いアミノ酸側鎖（例えば、リジン残基が有するε−アミノ基）を、担体に導入した活性官能基（例えば、エポキシ基やＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ基））と共有結合させることにより担体に固定化する方法が一般的に用いられている。しかしながら、リガンド中にリジン残基が複数存在する場合は、担体に対して当該リガンドがランダムに固定化されることになる。つまり、当該リガンドが有する目的物質との結合領域の一部、または全領域が担体に固定化されてしまう可能性があり、結果として、固定化したリガンドが当該目的物質と結合できなくなる問題を有していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１２６４３６号公報
【特許文献２】特開２０１１−２０６０４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述した問題を解決するため、ε−アミノ基より反応性の高いチオール基を有したアミノ酸であるシステインを、タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に導入することで反応の選択性を上げる（配向を制御する）ことが考えられる。しかしながら、チオール基を用いて不溶性担体にタンパク質を固定化させたときの、前記タンパク質の固定化率は必ずしも十分とはいえなかった。
【０００７】
本発明の課題は、タンパク質の配向を制御しながら高効率で不溶性担体へ固定化可能なオリゴペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｎ末端側のアミノ酸残基がシステインであり、Ｃ末端側の２アミノ酸残基がシステイン−グリシンである、５から８アミノ酸残基からなるオリゴペプチドをタンパク質に付加することで、当該タンパク質の配向を制御した状態で高効率に不溶性担体へ固定化できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち本発明の第一の態様は、
５から８アミノ酸残基からなる、タンパク質を不溶性担体に固定化させるためのオリゴペプチドであって、
少なくとも、Ｎ末端側のアミノ酸残基がシステインであり、Ｃ末端側の２アミノ酸残基がシステイン−グリシンである、前記オリゴペプチドである。
【００１０】
また本発明の第二の態様は、配列番号１４、１８、２２、２６、３０、３４、３８、４２、４６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、前記第一の態様に記載のオリゴペプチドである。
【００１１】
また本発明の第三の態様は、タンパク質のＮ末端側もしくはＣ末端側に前記第一または第二の態様に記載のオリゴペプチドを付加した、オリゴペプチド付加タンパク質である。
【００１２】
また本発明の第四の態様は、タンパク質がＦｃ結合性タンパク質である、前記第三の態様に記載のオリゴペプチド付加タンパク質である。
【００１３】
また本発明の第五の態様は、配列番号１６、２０、２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、前記第四の態様に記載のオリゴペプチド付加タンパク質である。
【００１４】
また本発明の第六の態様は、前記第三から第五の態様のいずれかに記載のオリゴペプチド付加タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、タンパク質吸着剤である。
【００１５】
また本発明の第七の態様は、前記第六の態様に記載の吸着剤を用いた、タンパク質の精製方法である。
【００１６】
また本発明の第八の態様は、前記第三から第五の態様のいずれかに記載のオリゴペプチド付加タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００１７】
また本発明の第九の態様は、前記第八の態様に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。
【００１８】
また本発明の第十の態様は、前記第九の態様に記載の発現ベクターにより、宿主を形質転換して得られる形質転換体である。
【００１９】
また本発明の第十一の態様は、前記第十の態様に記載の形質転換体を培養し、得られた培養液からオリゴペプチド付加タンパク質を回収する、オリゴペプチド付加タンパク質の製造方法である。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２１】
本発明は、タンパク質を不溶性担体に固定化させるためのオリゴペプチドとして、Ｎ末端側のアミノ酸残基がシステイン（Ｃ）であり、Ｃ末端側の２アミノ酸残基がシステイン−グリシン（ＣＧ）である、５から８アミノ酸残基からなるオリゴペプチドを用いることを特徴としている。本発明のオリゴペプチドの一例として、ＣＴＲＣＧ（配列番号１４）、ＣＫＴＣＧ（配列番号１８）、ＣＲＮＤＴＣＧ（配列番号２２）、ＣＲＳＤＰＣＧ（配列番号２６）、ＣＬＧＥＳＶＣＧ（配列番号３０）、ＣＩＥＧＥＰＣＧ（配列番号３４）、ＣＨＮＧＫＣＧ（配列番号３８）、ＣＧＳＧＫＣＧ（配列番号４２）、ＣＤＧＧＫＣＧ（配列番号４６）があげられる。
【００２２】
本発明のオリゴペプチドを付加させるタンパク質としては、アフィニティクロマトグラフィー用リガンドとして使用可能なタンパク質であれば特に限定はなく、一例として、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合性タンパク質といった免疫グロブリン（抗体）精製用リガンドとして使用可能なタンパク質があげられる。以降、前記タンパク質のうち、Ｆｃ結合性タンパク質について詳細に説明する。
【００２３】
本明細書においてヒトＦｃ結合性タンパク質は、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号７に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目までの領域）を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域を構成するタンパク質（ポリペプチド）のうち、少なくとも抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該ヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、があげられる。
【００２４】
前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報（特許文献２）に開示のヒトＦｃ結合性タンパク質や、配列番号５６に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸残基を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４２）のうち少なくともいずれか１つの置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１２−２７０３７５号）があげられる。
（１）配列番号５６の３７番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（２）配列番号５６の３８番目のプロリンがセリンに置換
（３）配列番号５６の５３番目のロイシンがグルタミンに置換
（４）配列番号５６の６２番目のグルタミン酸がバリンに置換
（５）配列番号５６の６３番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（６）配列番号５６の６６番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７）配列番号５６の６７番目のセリンがプロリンに置換
（８）配列番号５６の６９番目のアラニンがバリンまたはスレオニンに置換
（９）配列番号５６の７１番目のセリンがスレオニンまたはロイシンに置換
（１０）配列番号５６の７８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１１）配列番号５６の８１番目のイソロイシンがバリンに置換
（１２）配列番号５６の８４番目のセリンがスレオニンに置換
（１３）配列番号５６の８８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号５６の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号５６の１１９番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１６）配列番号５６の１２７番目のバリンがアラニンに置換
（１７）配列番号５６の１４６番目のアルギニンがリジンに置換
（１８）配列番号５６の１４７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号５６の１５１番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２０）配列番号５６の１７８番目のスレオニンがアラニンに置換
（２１）配列番号５６の１９１番目のアルギニンがリジンに置換
（２２）配列番号５６の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（２３）配列番号５６の２００番目のロイシンがメチオニンに置換
（２４）配列番号５６の２１３番目のスレオニンがアラニンに置換
（２５）配列番号５６の２１６番目のバリンがアラニンに置換
（２６）配列番号５６の２２１番目のロイシンがアルギニンに置換
（２７）配列番号５６の２２９番目のセリンがアスパラギンに置換
（２８）配列番号５６の２３６番目のイソロイシンがリジンに置換
（２９）配列番号５６の２４４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（３０）配列番号５６の２５３番目のスレオニンがアラニンに置換
（３１）配列番号５６の２９０番目のアルギニンがグルタミンに置換
（３２）配列番号５６の２９３番目のリジンがアスパラギンに置換
（３３）配列番号５６の２９７番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３４）配列番号５６の３０６番目のプロリンがスレオニンに置換
（３５）配列番号５６の３４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（３６）配列番号５６の４５番目のグルタミンがリジンに置換
（３７）配列番号５６の８２番目のグルタミンがプロリンに置換
（３８）配列番号５６の１７７番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（３９）配列番号５６の２１３番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号５６の２４２番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４１）配列番号５６の２５３番目のスレオニンがセリンに置換
（４２）配列番号５６の２７１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
Ｎ末端側またはＣ末端側に本発明のオリゴペプチドを付加したタンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドという）の作製方法として、
（Ｉ）Ｎ末端側またはＣ末端側に本発明のオリゴペプチドを付加したタンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）本発明のオリゴペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ法などのＤＮＡ増幅法を用いた遺伝子工学的手法により、タンパク質をコードするポリヌクレオチドに付加する方法、
が例示できる。なおアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の場合、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるよう変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ等）を利用することができる。また、前記（Ｉ）または（ＩＩ）の方法で本発明のポリヌクレオチドを作製する際、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加してもよく、宿主が大腸菌の場合は、前記シグナルペプチドとしてＰｅｌＢ（配列番号１）、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、形質転換効率が向上する点で、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いることが好ましい。なお、当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクター例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータを例示することができる。前記方法により作製した本発明のポリヌクレオチドを挿入した（本発明のポリヌクレオチドを含む）発現ベクターで宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。
【００２６】
Ｎ末端側またはＣ末端側に本発明のオリゴペプチドを付加したタンパク質（以下、本発明のオリゴペプチド付加タンパク質という）を製造する際には、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主（形質転換体）を培養することで製造することができる。具体的には、当該形質転換体を培養し、その培養物から本発明のオリゴペプチド付加タンパク質を回収すればよい。なお本明細書において培養物とは、培養された形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明の形質転換体を用いてタンパク質を製造するには、当該形質転換体の宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげることができる。なお、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターの導入の有無によって選択的に形質転換体を増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養するとよい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらに、グリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは、宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。発現ベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のオリゴペプチド付加タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、本発明のオリゴペプチド付加タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。
【００２７】
本発明の形質転換体の培養液から、本発明のオリゴペプチド付加タンパク質を回収するには、当該タンパク質の発現の形態により適宜回収方法を選択すればよい。培養液の培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作などによって分離し、得られる培養上清から本発明のオリゴペプチド付加タンパク質を回収すればよい。一方、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕し、本発明のオリゴペプチド付加タンパク質を回収すればよい。
【００２８】
抽出した本発明のオリゴペプチド付加タンパク質を含む溶液から当該タンパク質を分離精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のオリゴペプチド付加タンパク質を高純度に調製することができる。
【００２９】
本発明のオリゴペプチド付加タンパク質を不溶性担体に固定化することで、本発明のタンパク質吸着剤（以下、単に本発明の吸着剤という）を作製することができる。本発明の吸着剤の作製に用いる不溶性担体は特に限定はないが、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質ゲル、またはポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子ゲルが好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー社製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ社製）等のセルロースゲルがあげられる。担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。
【００３０】
本発明のオリゴペプチド付加タンパク質を不溶性担体に固定化する際は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、マレイミド基、トレシル基、ホルミル基ハロアセトアミド等の活性基を介して担体と共有結合により固定化すればよい。活性基を有した担体は、市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件にて担体表面に活性基を導入し調製してもよい。活性基を有した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（サーモサイエンティフィック社製）を例示することができる。
【００３１】
担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。
【００３２】
担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物として、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。
【００３３】
前述した化合物で担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸が例示できる。
【００３４】
担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としてはＮ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、（Ｎ−［α―マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル）、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボニル−［６−アミノヘキサン酸］）、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボン酸）、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが例示できる。
【００３５】
担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸―Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルが例示できる。
【００３６】
また担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω―アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω―アルケニル部位をハロゲン化することで活性基を導入してもよい。ω―アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルが例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドが例示できる。
【００３７】
担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面にあるカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法もある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールが例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。
【００３８】
担体への活性基導入量は担体１ｍＬあたり１ｎｍｏｌから１ｍｍｏｌが好ましく、より好ましくは１μｍｏｌから１００μｍｏｌである。
【００３９】
本発明のオリゴペプチド付加タンパク質を不溶性担体に固定化させる際は、前記タンパク質を緩衝液に溶解し、担体の活性基と反応させればよく、緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示することができる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃の範囲の中から活性基の反応性や本発明のタンパク質の安定性を考慮の上適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。
【００４０】
本発明の吸着剤を用いたタンパク質の精製方法に特に制限はないが、空カラムに本発明の吸着剤を充填して得られるカラムを用いたクロマトグラフィーによる精製方法が目的物質を高純度に精製できる点で好ましい。本発明の吸着剤により精製する、目的物質を含む溶液としては、目的物質を生産する宿主の培養液や、当該培養液を遠心分離等により宿主細胞を除去した培養上清を例示できる。カラムの大きさ（本発明の吸着剤の充填量）は精製原料の処理量を考慮の上、適宜決定すればよい。
【００４１】
本発明の吸着剤を充填したカラムに目的物質を含む溶液を添加する際は、送液量を考慮しポンプ等の送液手段を用いて添加すればよい。なお、本発明の吸着剤を充填したカラムは、抗体を添加する前に、あらかじめ適切な緩衝液を用いて平衡化すると、抗体をより高純度に精製できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお、緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ５から８である。前記吸着剤に吸着させた目的物質を溶出させるには、前記吸着剤に固定化されたタンパク質と目的物質との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化または塩濃度変化などが例示できる。目的物質が抗体の場合、緩衝液によるｐＨ変化が例示でき、用いる緩衝液はクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示することができる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ３から６、より好ましくはｐＨ３．３から４．０である。
【発明の効果】
【００４２】
本発明は、タンパク質を不溶性担体に固定化させるためのオリゴペプチドとして、Ｎ末端側のアミノ酸残基がシステインであり、Ｃ末端側の２アミノ酸残基がシステイン−グリシンである、５から８アミノ酸残基からなるオリゴペプチドを用いることを特徴としている。本発明により、前記タンパク質の配向を制御しながら高効率に担体へ固定化させることができる。さらにタンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に本発明のオリゴペプチドを付加することで、前記タンパク質の生産量が向上するという新たな効果も有している。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】Ｆｃ結合性タンパク質に付加させるオリゴペプチドの違いによる、不溶性担体への固定化率の違いを評価した結果を示す図。
【図２】各Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルの性能評価結果を示す図。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明のオリゴペプチドをＦｃ結合性タンパク質に付加させた場合の実施例を用いて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例１  発現ベクターの作製
以下に示す方法で、ＰｅｌＢシグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ、配列番号１）をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターｐＴｒｃ９９ａ（ＧＥヘルスケア社製）に挿入することで、発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌを作製した。
（１）配列番号２（５’−ＣＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣ−３’）および配列番号３（５’−ＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを等量混合し、９５℃で５分間加熱後、１５℃になるまで１分間で１℃毎に温度を下げることで、二本鎖オリゴヌクレオチドＰｅｌＢｐ１を調製した。なお、ＰｅｌＢｐ１は使用時まで１５℃で保持した。
（２）（１）で調製したＰｅｌＢｐ１を、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩで消化した発現ベクターｐＴｒｃ９９ａに、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウム（和光純薬社製）を含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌを抽出した。
（４）（３）で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌのうち、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ライフサイエンス社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号４（５’−ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ−３’）または配列番号５（５’−ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ−３’）に記載のオリゴヌクレオチドのいずれかをシークエンス用プライマーとして使用した。
【００４６】
ヌクレオチド配列の解析の結果、設計通りであることを確認した。
【００４７】
比較例１  システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製（その１）
配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のＣ末端側にシステインタグ（アミノ酸配列：ＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ６８−ＣＧ）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入することで、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ発現ベクターを作製した。なおＦｃＲｍ６８は、配列番号６に記載のアミノ酸配列中、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃ（特開２０１１−２０６０４６号公報、特許文献２）のうち、
配列番号６の３７番目のスレオニンがイソロイシンに、
配列番号６の６３番目のバリンがグルタミン酸に、
配列番号６の６９番目のアラニンがバリンに、
配列番号６の７１番目のセリンがロイシンに、
配列番号６の８４番目のセリンがスレオニンに、
配列番号６の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、
配列番号６の２９２番目のプロリンがリジンに、
配列番号６の２９３番目のグルタミン酸がリジンに、
配列番号６の２９７番目のグルタミンがリジンに、
配列番号６の３０１番目のヒスチジンがリジンに、
配列番号６の３０４番目のプロリンがリジンに、
それぞれ置換したＦｃ結合性タンパク質である。またＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃのアミノ酸配列は、配列番号７に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列において１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、当該領域において６０箇所置換が生じている（特開２０１１−２０６０４６号公報、特許文献２）。
（１）配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８をコードするポリヌクレオチドである、配列番号９に記載の配列からなるポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号１０（５’−ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣ−３’）および配列番号１１（５’−ＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを得た。
【００４８】
【表１】
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（２）得られたＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例１に記載の発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌにライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウムを添加したＬＢ培地で培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ＦｃＲｍ６８−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧを抽出した。
（４）（３）で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧのうち、ＦｃＲｍ６８をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、実施例１（４）と同様の方法でヌクレオチド配列を解析した。
【００４９】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１２に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１３に、それぞれ示す。なお配列番号１２において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３００番目のグリシンまでがシステインタグのアミノ酸配列である。また配列番号１２において、ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までの領域）は、配列番号７に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。
【００５０】
実施例２  本発明のオリゴペプチドを付加したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製（その１）
配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のＣ末端側に配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（アミノ酸配列：ＣＴＲＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ６８−Ｔ１）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入することで、ＦｃＲｍ６８−Ｔ１発現ベクターを作製した。
（１）比較例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧを鋳型とし、配列番号１０および配列番号１５（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＡＣＧＧＧＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＣＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８−Ｔ１をコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）ＦｃＲｍ６８−Ｔ１をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌにライゲーションし、これを用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウムを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８−Ｔ１をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ１を得た。
（４）実施例１（４）と同様の方法でヌクレオチド配列を解析した。
【００５１】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ１により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１６に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７に、それぞれ示す。なお配列番号１６において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３０３番目のグリシンまでが配列番号１４に記載のオリゴペプチドのアミノ酸配列である。
【００５２】
実施例３  本発明のオリゴペプチドを付加したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製（その２）
配列番号１０および配列番号１９（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＣＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した他は、実施例２と同様の方法により、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のＣ末端側に配列番号１８に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（アミノ酸配列：ＣＫＴＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ６８−Ｔ２）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入し、ＦｃＲｍ６８−Ｔ２発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ２を作製した。その後、実施例１（４）に記載の方法でヌクレオチド配列の解析を行なった。
【００５３】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ２により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２０に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２１に、それぞれ示す。なお配列番号２０において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３０３番目のグリシンまでが配列番号１８に記載のオリゴペプチドのアミノ酸配列である。
【００５４】
実施例４  本発明のオリゴペプチドを付加したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製（その３）
配列番号１０および配列番号２３（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した他は、実施例２と同様の方法により、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のＣ末端側に配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（アミノ酸配列：ＣＲＮＤＴＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ６８−Ｔ３）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入し、ＦｃＲｍ６８−Ｔ３発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ３を作製した。その後、実施例１（４）に記載の方法でヌクレオチド配列の解析を行なった。
【００５５】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ３により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２４に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２５に、それぞれ示す。なお配列番号２４において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３０５番目のグリシンまでが配列番号２２に記載のオリゴペプチドのアミノ酸配列である。
【００５６】
実施例５  本発明のオリゴペプチドを付加したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製（その４）
配列番号１０および配列番号２７（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＣＧＧＡＴＣＧＣＴＣＣＧＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した他は、実施例２と同様の方法により、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のＣ末端側に配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（アミノ酸配列：ＣＲＳＤＰＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ６８−Ｔ４）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入し、ＦｃＲｍ６８−Ｔ４発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ４を作製した。その後、実施例１（４）に記載の方法でヌクレオチド配列の解析を行なった。
【００５７】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ４により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２８に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２９に、それぞれ示す。なお配列番号２８において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３０５番目のグリシンまでが配列番号２６に記載のオリゴペプチドのアミノ酸配列である。
【００５８】
実施例６  本発明のオリゴペプチドを付加したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製（その５）
配列番号１０および配列番号３１（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＣＡＣＧＣＴＴＴＣＧＣＣＣＡＧＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した他は、実施例２と同様の方法により、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のＣ末端側に配列番号３０に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（アミノ酸配列：ＣＬＧＥＳＶＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ６８−Ｔ５）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入し、ＦｃＲｍ６８−Ｔ５発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ５を作製した。その後、実施例１（４）に記載の方法でヌクレオチド配列の解析を行なった。
【００５９】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ５により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３２に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３３に、それぞれ示す。なお配列番号３２において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３０６番目のグリシンまでが配列番号３０に記載のオリゴペプチドのアミノ酸配列である。
【００６０】
実施例７  本発明のオリゴペプチドを付加したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製（その６）
配列番号１０および配列番号３５（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＣＧＧＴＴＣＧＣＣＴＴＣＡＡＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した他は、実施例２と同様の方法により、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のＣ末端側に配列番号３４に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（アミノ酸配列：ＣＩＥＧＥＰＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ６８−Ｔ６）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入し、ＦｃＲｍ６８−Ｔ６発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ６を作製した。その後、実施例１（４）に記載の方法でヌクレオチド配列の解析を行なった。
【００６１】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ６により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３６に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３７に、それぞれ示す。なお配列番号３６において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３０６番目のグリシンまでが配列番号３４に記載のオリゴペプチドのアミノ酸配列である。
【００６２】
実施例８  本発明のオリゴペプチドを付加したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製（その７）
配列番号１０および配列番号３９（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＴＴＴＧＣＣＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した他は、実施例２と同様の方法により、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のＣ末端側に配列番号３８に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（アミノ酸配列：ＣＨＮＧＫＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ６８−Ｔ７）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入し、ＦｃＲｍ６８−Ｔ７発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ７を作製した。その後、実施例１（４）に記載の方法でヌクレオチド配列の解析を行なった。
【００６３】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ７により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４０に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４１に、それぞれ示す。なお配列番号４０において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３０５番目のグリシンまでが配列番号３８に記載のオリゴペプチドのアミノ酸配列である。
【００６４】
実施例９  本発明のオリゴペプチドを付加したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製（その８）
配列番号１０および配列番号４３（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＴＴＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した他は、実施例２と同様の方法により、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のＣ末端側に配列番号４２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（アミノ酸配列：ＣＧＳＧＫＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ６８−Ｔ８）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入し、ＦｃＲｍ６８−Ｔ８発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ８を作製した。その後、実施例１（４）に記載の方法でヌクレオチド配列の解析を行なった。
【００６５】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ８により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４４に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４５に、それぞれ示す。なお配列番号４４において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３０５番目のグリシンまでが配列番号４２に記載のオリゴペプチドのアミノ酸配列である。
【００６６】
実施例１０  本発明のオリゴペプチドを付加したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製（その９）
配列番号１０および配列番号４７（５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＴＴＴＧＣＣＧＣＣＡＴＣＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した他は、実施例２と同様の方法により、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のＣ末端側に配列番号４６に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（アミノ酸配列：ＣＤＧＧＫＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ６８−Ｔ９）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入し、ＦｃＲｍ６８−Ｔ９発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ９を作製した。その後、実施例１（４）に記載の方法でヌクレオチド配列の解析を行なった。
【００６７】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ９により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４８に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４９に、それぞれ示す。なお配列番号４８において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３０５番目のグリシンまでが配列番号４６に記載のオリゴペプチドのアミノ酸配列である。
【００６８】
実施例１１  Ｆｃ結合性タンパク質の生産性評価（その１）
（１）比較例１および実施例２から１０で作製した発現ベクターにより大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウムを添加した２ＹＴ液体培地に接種後、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウムを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地に前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中のＦｃ結合性タンパク質の濃度を、下記に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて抗体結合活性を測定し、既知濃度のＦｃ結合性タンパク質における値と比較して測定した。
（５−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ  ＭＩＬＫ（ＢＤ社製）を含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（５−２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、調製したＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（５−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−ＦｃγＲＩ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（５−４）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬに希釈したＨｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識のＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（５−５）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（６）ＥＬＩＳＡ法によって濃度既知の精製Ｆｃ結合性タンパク質を用いた検量線から、培養後のＦｃ結合性タンパク質の濃度測定を行ない、培養終了時の菌体量として測定した６００ｎｍの吸光度で培養後のＦｃ結合性タンパク質の濃度を除することで、菌体あたりのＦｃ結合性タンパク質の生産性を算出した。
【００６９】
結果を表２に示す。実施例２から１０で作製した発現ベクターをＦｃ結合性タンパク質発現ベクターとして用いることで、比較例１で作製した発現ベクターと比較し、生産性が向上することが確認された。つまり、本発明のオリゴペプチドをタンパク質に付加させることで、前記タンパク質の生産性が向上することがわかる。
【００７０】
【表２】
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実施例１２  Ｆｃ結合性タンパク質の調製
（１）比較例１（ｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−ＣＧ）、実施例４（ｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ３）および実施例８（ｐＴｒｃＦｃＲｍ６８−Ｔ７）に記載の発現ベクターにより形質転換された大腸菌Ｗ３１１０株を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを添加した２×ＹＴ液体培地１００ｍＬに接種し、５００ｍＬフラスコにて３０℃で一晩振とう培養し、前培養液を調製した。
（２）３５ｇ／Ｌのグリセロール、５０ｇ／Ｌの酵母エキス、３ｇ／Ｌのリン酸三ナトリウム十二水和物、９ｇ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム十二水和物、１ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンナトリウムを含む０．６Ｌの液体培地に、（１）の前培養液３０ｍＬを接種後、１Ｌ発酵槽を用いて、培養液温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、培養を開始した。なおｐＨ制御には、酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水を、それぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで行ない、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。
（３）培養開始から約５時間後に温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。
（４）培養開始から約２９時間後に培養を停止し、培養液を８０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。
（５）回収した菌体を０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）６０ｍＬに懸濁し、菌体を破砕した。菌体破砕は超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約５分間、約１７０Ｗの出力で処理した。
（６）破砕処理液を４℃、１５分間、１２０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。
（７）回収した破砕処理液の上清を、１０ｍＬゲル量のＩｇＧセファロースカラム（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、１５０ｍＭの塩化ナトリウムおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）でＦｃ結合性タンパク質を含む画分を溶出した。溶出した画分に含まれるＦｃ結合性タンパク質の純度をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により確認した結果、単一バンドであることを確認した。
（８）ＩｇＧセファロースカラムで精製したＦｃ結合性タンパク質をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１０Ｋ（ミリポア社製）により濃縮後、０．２Ｍの硫酸ナトリウムと１ｍＭのＥＤＴＡと０．２ｍＭの〔２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ〕ｐｈｏｓｐｈｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＣＥＰ）とを含んだ２０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）への緩衝液交換を行なった。
（９）濃縮したＦｃ結合性タンパク質を含む画分を２８０ｎｍの吸光度にて測定し、Ｆｃ結合性タンパク質として１０ｍｇ／ｍＬとなるよう濃度調製した。
【００７１】
実施例１３  Ｆｃ結合性タンパク質の不溶性担体への固定化率評価
（１）不溶性担体であるトヨパール（東ソー社製）の水酸基に１，２−エタンジオールジグリシジルエーテル、トリスアミノエチルアミン、ヨード酢酸を順次反応させてヨードアセトアミドトヨパールゲルを調製した。
（２）実施例１２で調製した各Ｆｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６８−ＣＧ、ＦｃＲｍ６８−Ｔ３およびＦｃＲｍ６８−Ｔ７）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液と、１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８．５）とを、それぞれ表３に示す割合で混合して反応液を調製した。
【００７２】
【表３】
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（３）（１）で作製したヨードアセトアミドトヨパールゲル３０μＬをスピンカラム（バイオラッド社製）に充填したカラムに（２）で調製した反応液をアプライし、２５℃で２時間反応させることでＦｃ結合性タンパク質をヨードアセトアミドトヨパールゲルに固定化した。
（３）反応終了後、遠心操作により反応残渣を回収し、５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて洗浄することで、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルを調製した。
（４）反応残渣及び洗浄のクエン酸緩衝液に含まれるタンパク質量を、吸光度計（日立製作所製）で測定した２８０ｎｍの吸収度から算出し、算出したタンパク質量を反応に供したタンパク質量から差し引くことで、ヨードアセトアミドトヨパールへのＦｃ結合性タンパク質固定化量を計算した。また、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ、ＦｃＲｍ６８−Ｔ３およびＦｃＲｍ６８−Ｔ７の固定化されたタンパク質量を反応に供したタンパク質量で除することで固定化率を算出した。
【００７３】
結果、ＦｃＲｍ６８−ＣＧ（比較例１）はゲル１ｍＬ当たり２０．１ｍｇ固定化されており、固定化率は６７％であった。一方、ＦｃＲｍ６８−Ｔ３（実施例４）はゲル１ｍＬ当たり１９．３ｍｇ固定化されており、固定化率は９６％であった。またＦｃＲｍ６８−Ｔ７（実施例８）はゲル１ｍＬ当たり１９．１ｍｇ固定化されており、固定化率は９５％であった。固定化率の結果をまとめたものを図１に示す。以上の結果から、本発明のオリゴペプチドをタンパク質に付加することにより、固定化率が向上することがわかる。
【００７４】
実施例１４  Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルの性能評価
（１）実施例１３で作製したＦｃ結合性タンパク質固定化ゲルをそれぞれスピンカラム（バイオラッド社製）に充填した。
（２）５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を１５０μＬ添加することでゲルを平衡化後、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈したヒトポリクローナル抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）を１０ｍｇとなるよう添加し、室温で１２０分間振とうした。
（３）１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液で十分洗浄することで未吸着のヒト抗体をカラムから溶出させた後、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をカラムに添加することでゲルに吸着したヒト抗体を溶出させた。
（４）溶出液の中の抗体濃度を２８０ｎｍの吸光度を測定することで算出した。なお、１ｍｇ／ｍｌの抗体溶液の２８０ｎｍにおける吸光度（光路長：１０ｍｍ）を１．４として算出している。
【００７５】
各ゲル１ｍＬ当たりの抗体吸着量を算出した結果を図２に示す。ＦｃＲｍ６８−ＣＧ（比較例１）、ＦｃＲｍ６８−Ｔ３（実施例４）、ＦｃＲｍ６８−Ｔ７（実施例８）はいずれも同様の抗体吸着量を示していることから、本発明のオリゴペプチドを利用して不溶性担体に固定化させても、抗体（免疫グロブリン）吸着剤としての性能に影響しないことが確認された。
【００７６】
比較例２  システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製（その２）
配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｃのＣ末端側にシステインタグ（アミノ酸配列：ＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ７２ｃ−ＣＧ）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入することで、ＦｃＲｍ７２ｃ−ＣＧ発現ベクターを作製した。なおＦｃＲｍ７２ｃは、配列番号８に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列のうち、
配列番号８の４９番目のグルタミンがプロリンに、
配列番号８の１４４番目のアスパラギンがアスパラギン酸に、
配列番号８の１８０番目のスレオニンがセリンに、
配列番号８の２０９番目のグルタミンがアルギニンに、
配列番号８の２３８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、
それぞれアミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質である。
（１）配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｃをコードするポリヌクレオチドである、配列番号５１に記載の配列からなるポリヌクレオチドを鋳型とし、配列番号１０および配列番号１１に記載のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｃ−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）得られたＦｃＲｍ７２ｃ−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した実施例１に記載の発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌにライゲーションし、そのライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンナトリウムを添加したＬＢ培地で培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ＦｃＲｍ７２ｃ−ＣＧをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ７２ｃ−ＣＧを抽出した。
（４）で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ７２ｃ−ＣＧのうち、ＦｃＲｍ７２ｃをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、実施例１（４）と同様の方法でヌクレオチド配列を解析した。
【００７７】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ７２ｃ−ＣＧにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号５２に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５３に、それぞれ示す。なお配列番号５２において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチド、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｃのアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３００番目のグリシンまでがシステインタグである。なお配列番号５２において、ＦｃＲｍ７２ｃのアミノ酸配列（２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までの領域）は、配列番号７に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。
【００７８】
実施例１５  本発明のオリゴペプチドを付加したＦｃ結合性タンパク質発現ベクターの作製（その１０）
比較例２で作製した発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ７２ｃ−ＣＧを鋳型とし、配列番号１０および配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した他は、実施例２と同様の方法により、配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｃのＣ末端側に配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（アミノ酸配列：ＣＲＮＤＴＣＧ）を付加したポリペプチド（ＦｃＲｍ７２ｃ−Ｔ３）をコードするポリヌクレオチドを、実施例１で作製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌに挿入し、ＦｃＲｍ７２ｃ−Ｔ３発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ７２ｃ−Ｔ３を作製した。その後、実施例１（４）に記載の方法でヌクレオチド配列の解析を行なった。
【００７９】
発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ７２ｃ−Ｔ３により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号５４に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５５に、それぞれ示す。なお配列番号５４において、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチドのアミノ酸配列、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｃのアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３０５番目のグリシンまでが配列番号２２に記載のオリゴペプチドのアミノ酸配列である。
【００８０】
実施例１６  Ｆｃ結合性タンパク質の生産性評価（その２）
比較例２（ｐＴｒｃＦｃＲｍ７２ｃ−ＣＧ）および実施例１５（ｐＴｒｃＦｃＲｍ７２ｃ−Ｔ３）に記載の発現ベクターにより大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換後、実施例１１と同様の方法により、Ｆｃ結合性タンパク質の生産性を評価した。
【００８１】
結果を表４に示す。実施例１５で作製した発現ベクターをＦｃ結合性タンパク質発現ベクターとして用いることで、比較例２で作製した発現ベクターと比較し、生産性が向上することが確認された。つまり実施例１１の結果と同様、本発明のオリゴペプチドをタンパク質に付加させることで、前記タンパク質の生産性が向上することがわかる。
【００８２】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明のオリゴペプチドは、タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させることで前記タンパク質を不溶性担体表面に効率良く固定化することができる。そのため、固定化タンパク質を用いた吸着剤やセンサーチップ等に利用することができる。また本発明のオリゴペプチドは、前記タンパク質の生産性向上にも有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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