(57)【要約】      （修正有）【課題】核酸増幅技術を適用して、未知試料に関する人獣を高精度に判定するプライマーセット及びプローブの提供。【解決手段】サンプルから抽出したゲノムDNAがヒト由来であるときに判定領域を特異的に増幅することができるプライマーセットにおいて、一方のプライマーが特定な配列の塩基配列からなるプライマーセット。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルから抽出したゲノムDNAがヒト由来であるときに判定領域を特異的に増幅することができるプライマーセットにおいて、
一方のプライマーが配列番号３４の塩基配列からなることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
他方のプライマーが配列番号３３の塩基配列からなることを特徴とする請求項１記載のプライマーセット。
【請求項３】
請求項１又は２記載のプライマーセットにより増幅した判定領域を検出する人獣判定プローブであって、配列番号３７の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むことを特徴とする人獣判定プローブ。
【請求項４】
配列番号３７の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなることを特徴とする請求項３記載の人獣判定プローブ。
【請求項５】
請求項３又は４記載の人獣判定プローブを担体上に固定化してなる、マイクロアレイ。
【請求項６】
配列番号１０の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む20塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が65℃以上である、A型アレル又はO型アレル判定プローブを上記担体に固定化したことを特徴とする請求項５記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
上記A型アレル又はO型アレル判定プローブは配列番号１１〜１５のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなることを特徴とする請求項６記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
配列番号１６の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む18塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が60℃以上である、B型アレル判定プローブを上記担体に固定化したことを特徴とする請求項５記載のマイクロアレイ。
【請求項９】
上記B型アレル判定プローブは、配列番号１７〜２１のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなることを特徴とする請求項８記載のマイクロアレイ。
【請求項１０】
試料からゲノムDNAを抽出する工程と、
抽出したゲノムDNAを鋳型とし、請求項１又は２記載のプライマーセットにより判定領域を増幅する工程と、
請求項３又は４記載の人獣判定プローブと増幅核酸を接触させる工程と、
人獣判定プローブと増幅核酸とのハイブリダイズを検出し、ハイブリダイズした場合に上記ゲノムDNAがヒト由来であると判断する工程と
を含む、人獣判定方法。
【請求項１１】
上記増幅する工程では、以下（I）〜（III）のいずれかに記載されたプライマーセットによりABO式血液型におけるB型を判定するためのB型判定領域を増幅するとともに、以下（IV）に記載されたプライマーセットによりABO式血液型におけるO型を判定するためのO型判定領域を増幅し、
（I）配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、
（II）配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号３の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、
（III）配列番号４の塩基配列からなるプライマーと配列番号５の塩基配列からなるプライマーと配列番号６の塩基配列からなるプライマーと配列番号７の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、
（IV）配列番号８の塩基配列からなるプライマーと配列番号９の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、
上記接触させる工程では、増幅核酸を、配列番号１０の塩基配列を含む20塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が65℃以上であるA型アレル又はO型アレル判定プローブ及び配列番号１６の塩基配列を含む18塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が60℃以上であるB型アレル判定プローブに接触させることを特徴とする請求項１０記載の人獣判定方法。
【請求項１２】
請求項１又は２記載のプライマーセットと、請求項５乃至９いずれか一項記載のマイクロアレイとを含む、人獣判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれるゲノムDNAがヒト由来であるかヒト以外の生物由来であるかを判定する際に使用されるプライマーセット、当該プライマーセットにより増幅した判定領域を検出するためのプローブ、当該プローブを備えるマイクロアレイ、これらを使用して人獣を判定する方法並びにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液（血痕）、体液（唾液、精液等）、毛髪、骨、組織などの生体サンプルが得られ、当該生体サンプルがヒトのものであるか確かめる場合がある（人獣判定、人獣鑑別）。例えば、これら生体サンプルがヒトのものである場合、次に、ABO式血液型の判定等を行うことで個人特定等を行うことができる。
【０００３】
ABO式血液型は、通常、赤血球及び他の組織に見出されるA、B及びH抗原との抗体反応性に基づいて判定される。当該方法では、A、B、O及びAB表現型を区別するために、A型-及びB型-抗原に対するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体を利用した凝集アッセイが用いられる。この方法では、AA表現型はAO表現型から区別されず、そしてBB表現型はBO表現型から区別されない。
【０００４】
一方、ABOグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の多型について、非特許文献１では、既知のABO型の個人から単離されたcDNAの配列分析が報告されている。このABOグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の多型を利用して、ABO式血液型を判定する方法も検討されている。例えば、ABOグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子に含まれる一塩基多型を含む領域をPCRで増幅し、制限酵素で切断後、ゲル電気泳動で一塩基多型を判定するPCR-RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）法や、ゲノムDNAにおけるABOグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の全塩基配列を決定して比較するシークエンス法などが報告されている。
【０００５】
また、特許文献１には、ABOグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子のエキソン６及びエキソン７に存在する一塩基多型を効率的に識別できるプローブを設計したこと、当該プローブを備えるマイクロアレイを作製したことが開示されている。
【０００６】
さらに、非特許文献２には、ABOグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の多型を利用してABO式血液型を判定する際に人獣判定を行う技術が開示されている。具体的には、ヒトのゲノムDNAの所定の領域を特異的に増幅するプライマーセットが設計されている。このプライマーセットを利用して核酸増幅反応を行うと、鋳型となるゲノムDNAがヒト以外の生物由来であると核酸増幅反応が見られず、当該ゲノムDNAがヒト由来であると増幅断片を確認することができる。このように、増幅断片の有無によって、例えば未知試料に含まれるDNAがヒト由来であるかヒト以外の生物由来か判定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO 2009/130797
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yamamoto et al., 1990, Nature 345(17):229-233
【非特許文献２】Watanabe et al., J. Forensic Sci. January 2011, Vol. 56, No. S1, p. S182-S187
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献２等に開示された従来公知の人獣判定用のプライマーセットは、ヒトに対する特異性が十分ではなく、判定の精度が低いといった問題があった。そこで、本発明は、上述のように実情に鑑み、高精度に人獣判定を行うことができるプライマーセット、当該プライマーセットで増幅したヒト由来核酸断片を検出するためのプローブ、当該プローブを備えるマイクロアレイ、これらを使用して人獣を判定する方法並びに人獣判定用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、非特許文献２に開示された人獣判定用のプライマーセットのうち一方のプライマーを設計し直すことで判定の精度が著しく向上することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は以下を包含する。
【００１２】
（１）サンプルから抽出したゲノムDNAがヒト由来であるときに判定領域を特異的に増幅することができるプライマーセットにおいて、一方のプライマーが配列番号３４の塩基配列からなるプライマーセット。
（２）他方のプライマーが配列番号３３の塩基配列からなることを特徴とする（１）記載のプライマーセット。
（３）上記（１）又は（２）記載のプライマーセットにより増幅した判定領域を検出する人獣判定プローブであって、配列番号３７の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むことを特徴とする人獣判定プローブ。
（４）配列番号３７の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなることを特徴とする（３）記載の人獣判定プローブ。
（５）上記（３）又は（４）記載の人獣判定プローブを担体上に固定化してなる、マイクロアレイ。
（６）配列番号１０の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む20塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が65℃以上である、A型アレル又はO型アレル判定プローブを上記担体に固定化したことを特徴とする（５）記載のマイクロアレイ。
（７）上記A型アレル又はO型アレル判定プローブは配列番号１１〜１５のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなることを特徴とする（６）記載のマイクロアレイ。
（８）配列番号１６の塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む18塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が60℃以上である、B型アレル判定プローブを上記担体に固定化したことを特徴とする（５）記載のマイクロアレイ。
（９）上記B型アレル判定プローブは、配列番号１７〜２１のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的な塩基配列からなることを特徴とする（８）記載のマイクロアレイ。
（１０）試料からゲノムDNAを抽出する工程と、抽出したゲノムDNAを鋳型とし、上記（１）又は（２）記載のプライマーセットにより判定領域を増幅する工程と、上記（３）又は（４）記載の人獣判定プローブと増幅核酸を接触させる工程と、人獣判定プローブと増幅核酸とのハイブリダイズを検出し、ハイブリダイズした場合に上記ゲノムDNAがヒト由来であると判断する工程とを含む、人獣判定方法。
（１１）上記増幅する工程では、以下（I）〜（III）のいずれかに記載されたプライマーセットによりABO式血液型におけるB型を判定するためのB型判定領域を増幅するとともに、以下（IV）に記載されたプライマーセットによりABO式血液型におけるO型を判定するためのO型判定領域を増幅し、
（I）配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、
（II）配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号３の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、
（III）配列番号４の塩基配列からなるプライマーと配列番号５の塩基配列からなるプライマーと配列番号６の塩基配列からなるプライマーと配列番号７の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、
（IV）配列番号８の塩基配列からなるプライマーと配列番号９の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット、
上記接触させる工程では、増幅核酸を、配列番号１０の塩基配列を含む20塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が65℃以上であるA型アレル又はO型アレル判定プローブまたは、その相補鎖及び配列番号１６の塩基配列を含む18塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が60℃以上であるB型アレル判定プローブまたは、その相補鎖に接触させることを特徴とする（１０）記載の人獣判定方法。
（１２）上記（１）又は（２）記載のプライマーセットと、上記（５）乃至（９）いずれか記載のマイクロアレイとを含む、人獣判定用キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明においては、人獣判定のため、従来とは異なるプライマーセットによって、ヒトゲノムDNAにおける従来とは異なる領域を増幅する。すなわち、本発明に係るプライマーセットは、従来と異なる領域を増幅するように設計されている。本発明に係るプライマーセットを利用することで、未知試料に含まれる核酸について人獣判定を高精度に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明に係る人獣判定領域増幅用プライマーセット、人獣判定領域及び公知のリバースプライマーについてそれぞれゲノム上の位置を模式的に示した特性図である。
【図２】従来のプライマーセット及び本発明に係るプライマーセットを用いた場合、それぞれにおいて蛍光強度を測定した結果を示す特性図である。
【図３】ヒトゲノムDNA及びヒト以外のほ乳類由来のゲノムDNAを用いた場合、それぞれにおいて蛍光を測定した結果を示す特性図である。
【図４】実施例３で作製したチップにおけるプローブのスポット位置を模式的に示す図である。
【図５】本発明に係るプライマーセット及びABO式血液型判定用のプライマーセットを用いて同時に核酸増幅反応を行った場合、蛍光を観察した結果を示す写真である。
【図６】図５に示した各スポットの蛍光強度を数値化した結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、人獣判定に使用するヒト判定領域を特異的に増幅するプライマーセット、当該ヒト判定領域に対応する人獣判定プローブを設計している。また、本発明に係るプライマーセットやプローブを利用した人獣判定の結果、未知試料がヒト由来であることが判明したとき、その後、ABO式血液型の判定を行うこともできる。ABO式血液型の判定については、WO 2009/130797に詳細に開示されている。すなわち、ヒト由来と判定された試料について、WO 2009/130797に開示された手法を適用してABO式血液型の判定を行うことができる。なお、ABO式血液型判定の方法としては、WO 2009/130797に開示された手法に限定されず、従来公知の如何なる手法を適用しても良い。例えば、試薬の抗A血清と抗B血清とを用いて判定する方法を適用しても良い。さらに、詳細は後述するが、従来公知の手法とは異なるが、ABOグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子にに存在する一塩基多型を検出する方法を適用しても良い。
【００１６】
＜人獣判定に使用するプライマーセット＞
本発明における人獣判定領域は、Watanabe et al., J. Forensic Sci. January 2011, Vol. 56, No. S1, p. S182-S187（非特許文献２）等に記載されるように、霊長類における特異的なアルファサテライトDNAを利用している。当該文献等において記載されるように、人獣判定できるプローブとしては、当該アルファサテライトDNAに特異的にハイブリダイズできるプローブ（D17Z1と呼称される場合がある）を利用している。このD17Z1プローブの塩基配列を配列番号３７に示している。
【００１７】
本発明において、プライマーセットは、この人獣判定領域を特異的に増幅するとともに、増幅された人獣判定領域がD17Z1プローブにより高精度に検出できるように設計されたものである。ここで、人獣判定領域を特異的に増幅するとは、ヒト以外の生物由来のゲノムDNAを鋳型とした核酸増幅反応では実質的に核酸増幅が認められないが（増幅したとしても検出限界以下）、ヒト由来のゲノムDNAを鋳型として通常の条件で核酸増幅反応を行ったときに核酸断片を増幅できることを意味する。
具体的に、本発明に係る、人獣判定領域を特異的に増幅できるプライマーセットを表１に示す。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
なお、配列番号３３に示したFwプライマー（TTTTGCAGGATCTACAAGTGGA）は、Watanabe et al., J. Forensic Sci. January 2011, Vol. 56, No. S1, p. S182-S187（非特許文献２）において、人獣判定領域を増幅するためのプライマーセットを構成する一方のプライマーとして公知である。しかし、このWatanabe et al., J. Forensic Sci. January 2011, Vol. 56, No. S1, p. S182-S187（非特許文献２）においては、他方のプライマーとして配列番号３４に示したRvプライマー（TGCAGTCATCACAGAGAAGC）は開示されていない。図１に、本発明に係る人獣判定領域増幅用プライマーセット、人獣判定領域及び公知のリバースプライマーについてそれぞれゲノム上の位置を模式的に示した。
【００２０】
＜B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット＞
本発明におけるB型判定領域は、いわゆる796C/A及び803G/Cにて特定される一対の多型を含む領域を意味する。B型の場合、796C/A及び803G/CがそれぞれA及びCであり、A型及びO型の場合、796C/A及び803G/CがそれぞれC及びGである。
【００２１】
本発明において、プライマーセットは、このB型判定領域を特異的に増幅するとともに、増幅されたB型判定領域が後述するプローブにより高精度に検出できるように設計されたものである。ここで、B型判定領域を特異的に増幅するとは、ヒトゲノムDNAを鋳型として通常の条件で核酸増幅反応を行ったときに、B型判定領域を増幅することができ他の核酸断片を実質的に増幅しない（増幅したとしても検出限界以下）ことを意味する。
【００２２】
具体的に、B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセットは、以下の(I)〜（III）のいずれかに示すプライマーセットである。
【００２３】
（I）表２に示す配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号２の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット。
【表２】
2014045724.tif 000004
【００２４】
（II）表３に示す配列番号１の塩基配列からなるプライマーと配列番号３の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット。
【表３】
2014045724.tif 000005
【００２５】
（III）表４に示す配列番号４の塩基配列からなるプライマーと配列番号５の塩基配列からなるプライマーと配列番号６の塩基配列からなるプライマーと配列番号７の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット。
【表４】
2014045724.tif 000006
【００２６】
表４に示した４つのプライマーのうち、ABO_796_B_Fw及びABO_796_B_Fw-2は、5'末端から14番目の塩基がそれぞれC及びTである以外は一致している。すなわち、ABO_796_B_Fw及びABO_796_B_Fw-2は、5'末端から14番目の多型に対応したプライマー対である。また、ABO_796_B_Rv及びABO_796_B_RV-2は、5'末端から6番目の塩基がそれぞれC及びTである以外は一致している。すなわち、ABO_796_B_Rv及びABO_796_B_Rv-2は、5'末端から6番目の多型に対応したプライマー対である。
【００２７】
＜O型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット＞
本発明におけるO型判定領域は、いわゆる261G/Δにて特定される多型を含む領域を意味する。O型の場合、261G/Δが欠損しており、O型以外の場合、261G/ΔがGである。
【００２８】
本発明において、プライマーセットは、このO型判定領域を特異的に増幅するとともに、増幅されたO型判定領域が後述するプローブにより高精度に検出できるように設計されたものである。ここで、O型判定領域を特異的に増幅するとは、ヒトゲノムDNAを鋳型として通常の条件で核酸増幅反応を行ったときに、O型判定領域を増幅することができ他の核酸断片を実質的に増幅しない（増幅したとしても検出限界以下）ことを意味する。
【００２９】
具体的に、O型判定領域を特異的に増幅するプライマーセットは、表５に示す配列番号８の塩基配列からなるプライマーと配列番号９の塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである。
【００３０】
【表５】
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【００３１】
＜B型判定領域を検出するプローブ＞
上述した「B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット」を用いて増幅したB型判定領域は、本発明に係る「B型判定領域を検出するプローブ」にて高精度に検出することができる。ここで、B型判定領域は、上述したように、796C/A及び803G/Cを含む領域である。B型の遺伝子において796C/A及び803G/CはそれぞれA及びCであり、A型及びO型の遺伝子において796C/A及び803G/CはそれぞれC及びGである。言い換えると、増幅したB型判定領域に含まれる796C/A及び803G/CがそれぞれC及びGである場合、A型アレル及びO型アレルのいずれかであると判断される。また、B型判定領域に含まれる796C/A及び803G/CがそれぞれA及びCである場合、B型アレルであると判断される。
【００３２】
より詳細に、B型判定領域を検出するプローブとは、増幅したB型判定領域がA型アレル又はO型アレルであると判定するプローブ及び/又はB型判定領域がB型アレルであると判定するプローブを含む意味である。以下、前者をA型アレル又はO型アレル判定プローブと称し、後者をB型アレル判定プローブと称する。
【００３３】
A型アレル又はO型アレル判定プローブは、配列番号１０の塩基配列を含む20塩基以上の塩基配列、好ましくは22塩基の塩基配列からなり、65℃以上のTm値を有するオリゴヌクレオチドである。なお、A型アレル又はO型アレル判定プローブとしては、Tm値が69℃以下であることが好ましい。なお、Tm値の計算方法は、最近接塩基対法(Nearest Neighbor method)を用いている。このとき、オリゴDNA濃度を0.5μM、Na+濃度を50mMとしてTmを算出している。
【００３４】
より具体的にA型アレル又はO型アレル判定プローブとしては、表６に示す具体的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００３５】
【表６】
2014045724.tif 000008
【００３６】
なお、表６に記載した塩基配列に付した下線部は、5'末端側から796C/A及び803G/Cを示している。
ここで、表６に示したA型アレル又はO型アレル判定プローブの中でも、特に配列番号１４の塩基配列又は配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することが好ましい。これら配列番号１４の塩基配列又は配列番号１５の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと比較して、上述したプライマーセット(I)〜(III)のいずれを使用した場合であっても、増幅したB型判定領域に基づく蛍光を優れた蛍光強度で検出することができる。
【００３７】
一方、B型アレル判定プローブは、配列番号１６の塩基配列を含む18塩基以上の塩基配列、好ましくは18〜22塩基以上の塩基配列からなり、60℃以上のTm値を有するオリゴヌクレオチドである。なお、B型アレル判定プローブとしては、Tm値が66℃以下であることが好ましい。より具体的にB型アレル判定プローブとしては、表７に示す具体的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを挙げることができる。
【００３８】
【表７】
2014045724.tif 000009
【００３９】
なお、表７に記載した塩基配列に付した下線部は、表６と同様に、5'末端側から796C/A及び803G/Cを示している。
ここで、表７に示したB型アレル判定プローブの中でも、特に配列番号１９の塩基配列、配列番号２０の塩基配列又は配列番号２１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用することが好ましい。これら配列番号１９の塩基配列、配列番号２０の塩基配列又は配列番号２１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドと比較して、上述したプライマーセット(I)〜(III)のいずれを使用した場合であっても、増幅したB型判定領域に基づく蛍光を優れた蛍光強度で検出することができる。
【００４０】
＜O型判定領域を検出するプローブ＞
上述した「O型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット」を用いて増幅したO型判定領域は、上述したB型判定領域を検出するプローブと同様に、所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて検出することができる。ここで、O型判定領域は、上述したように、261G/Δを含む領域である。O型の遺伝子において261G/ΔはGが欠失しており、O型以外の遺伝子において261G/ΔはGが存在している。言い換えると、増幅したO型判定領域に含まれる261G/Δが欠失してい場合、O型アレルであると判断される。また、O型判定領域に含まれる261G/ΔがGである場合、O型以外のアレルであると判断される。
【００４１】
より詳細に、O型判定領域を検出するプローブとは、増幅したO型判定領域がO型アレルであると判定するプローブ及び/又はO型判定領域がO型以外のアレルであると判定するプローブを含む意味である。具体的に、「O型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット」を用いて増幅したO型判定領域については、WO 2009/130797に開示された一対のプローブによってO型アレルであるか、O型以外のアレルであるかを判定することができる。なお、これら一対のプローブは、WO 2009/130797においてO-1-20及びO-2-20として開示されている。
【００４２】
ただし、WO 2009/130797においては、これら一対のプローブを使用しているものの、O型判定領域として増幅する核酸断片の塩基長が本発明とは異なっている。すなわち、WO 2009/130797においては、上述した「O型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット」と異なるプライマーセットを使用しており、本発明とは異なるO型判定領域を利用している。
【００４３】
＜人獣判定、血液型判定方法＞
本発明はまた、未知試料がヒト由来であるかヒト以外の生物由来であるかを判定する方法に関する。ここで、未知試料とは、ゲノムDNAを含む生体試料であって、当該生体試料がヒトに由来するものか不明な試料を意味する。生体試料としては、特に制限されず、例えば、血液およびこれに由来する血液関連試料（血液、血清および血漿など）、リンパ液、汗、涙、唾液、尿、糞便、腹水および髄液等の体液、ならびに細胞、組織または臓器の破砕物および抽出液などが挙げられる。本発明においては、好ましくは、血液関連試料を用いる。
【００４４】
本発明に係る人獣判定方法では、まず、未知試料である生体試料試料からゲノムDNAを抽出する。次に、本発明に係る人獣判定方法では、抽出したゲノムDNAを鋳型とし、上述した人獣判定領域を特異的に増幅するプライマーセットを用いた核酸増幅反応を行う。仮に、未知試料がヒト由来のものである場合には、この核酸増幅反応により、上述した人獣判定領域を特異的に増幅するプライマーセットから人獣判定領域が増幅される。したがって、本発明に係る人獣判定方法では、上述した人獣判定領域を特異的に増幅するプライマーセットを用いた核酸増幅反応により人獣判定領域が増幅されたか否かを検出することで、未知試料がヒト由来の生体試料であるか、ヒト以外の生体試料であるか判断することができる。本発明に係る人獣判定方法では、上述した人獣判定用プローブにより増幅した人獣判定領域を上述した人獣判定プローブによって検出することができる。
【００４５】
なお、本発明において核酸には、DNAおよびRNAが包含され、DNAには一本鎖DNAおよび二本鎖DNAが包含される。プローブは通常核酸をさし、好ましくはDNAである。増幅核酸は、好ましくはDNAである。
【００４６】
本発明では、供試された未知試料がヒト由来の生体試料であることが判明した後、或いは、上述した人獣判定と同時に、ABO式血液型の血液型を判定することができる。本発明の方法では、生体試料由来のゲノムDNAを鋳型として、上述したプライマーセットを用いた増幅反応によってB型判定領域及び/又はO型判定領域を増幅し、得られたB型判定領域及び/又はO型判定領域と上記プローブを接触させるハイブリダイゼーション法においてプローブにハイブリダイズした核酸を測定し、その結果に基づいて血液型を判定する。
【００４７】
生体試料由来のゲノムDNAを鋳型とする増幅反応では通常、生体試料由来のゲノムDNAを鋳型として、上述したB型判定領域及び/又はO型判定領域を増幅する。このとき、「B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット」としては、上記(I)〜（III）のいずれのセットを使用しても良い。またプライマーセットとしては上記(I)〜（III）から選ばれる複数のセット（任意の２セット及び全てのセット）を使用しても良い。また、増幅反応では、B型判定領域及びO型判定領域、並びに必要に応じて他の任意の領域を同時に増幅しても良い（所謂、マルチプレックスPCR等）。具体的には、少なくとも、上述した「B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット」及び「O型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット」を使用して生体試料由来のゲノムDNAを鋳型として核酸増幅反応を行うことで、B型判定領域及びO型判定領域を同時に増幅することができる。
【００４８】
このようにして得られたB型判定領域及び/又はO型判定領域と、上述したB型判定領域を検出するプローブ及びO型判定領域を検出するプローブとを使用することで、遺伝子型、すなわちABO式血液型（AA型、AO型、BO型、AB型及びOO型）を判定することができる。
【００４９】
より具体的には、以下のように判定することができる。
先ず、上述したA型アレル又はO型アレル判定プローブ及びＢ型判定プローブに対するB型判定領域のハイブリダイズを検出する。血液型がAA型、AO型及びOO型のいずれかである場合、A型アレル又はO型アレル判定プローブへのハイブリダイズが検出され、B型アレル判定プローブへのハイブリダイズは実質的に検出されない（検出限界以下又はバックグラウンド以下）。一方、血液型がBB型の場合には、A型アレル又はO型アレル判定プローブへのハイブリダイズは実質的に検出されず、B型アレル判定プローブへのハイブリダイズが検出される。さらに、被験者の血液型がAB型及びBO型のいずれかである場合には、A型アレル又はO型アレル判定プローブ及びB型アレル判定プローブへのハイブリダイズがともに検出される。
【００５０】
また、O型判定領域についても、一対のプローブ（WO 2009/130797参照）を使用することで、被験者の血液型が、O型アレルをもつ血液型すなわちOO型、AO型及びBO型であるか、O型アレルをもたない血液型すなわちAB型、AA型及びBB型であるかを判断することができる。
【００５１】
以上のように、各種プローブとB型判定領域及び/又はO型判定領域とのハイブリダイズに基づいて血液型を判定する場合、各プローブから検出される蛍光強度を測定し、予め設定した閾値と比較することで、各プローブとB型判定領域及び/又はO型判定領域とのハイブリダイズを検出しても良い。すなわち、所定のプローブについて蛍光強度を測定し、所定の閾値を超える蛍光強度であった場合、当該プローブに対してB型判定領域及び/又はO型判定領域がハイブリダイズしたと判定することができる。閾値は、実験条件により異なり当業者であれば適宜設定できる。より詳しくは、その遺伝子型が既知であるヒトについて、プローブペアごとに核酸ハイブリダイゼーションを実施し、統計的処理を行ってそれぞれの遺伝子型について上記比の標準値を算出し、遺伝子型が未知のサンプルにおける比と当該標準値とを比較することにより、当該サンプルの遺伝子型を判定することができる。
【００５２】
なお、上述した人獣判定や血液型判定において、生体試料からゲノムDNAを抽出する抽出手段としては、特に限定されないが、前記生体試料から直接的にDNA成分を分離し、精製して回収できる手段であることが好ましい。抽出手段の具体例としては、例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなどを用いたDNA抽出法が挙げられる。
【００５３】
また、上述した人獣判定や血液型判定において、核酸増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）等を適用することができる。人獣判定領域や、B型判定領域及び/又はO型判定領域を増幅させる際には、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば核酸増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、核酸増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（DIG）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
【００５４】
またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、検出対象領域特異的プライマー、標識ヌクレオチド三燐酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三燐酸）、ヌクレオチド三燐酸および塩化マグネシウム等を含む反応系である。
【００５５】
上記のようにして得られた人獣判定領域、B型判定領域及び/又はO型判定領域とプローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、各プローブにハイブリダイズした核酸の量を、例えば標識を検出することにより測定できる。プローブにハイブリダイズした増幅核酸は、例えば、既知量のDNAを含む試料を用いて検量線を作成することにより、定量することができる。
【００５６】
上記ハイブリダイゼーション反応においては、上述した各プローブが担体上に固定化されたマイクロアレイを用い、該マイクロアレイに核酸増幅反応により得られた人獣判定領域、B型判定領域及び/又はO型判定領域を含む溶液を接触させることが好ましい。その場合、上述した各プローブは、同一の担体に固定化されていてもよいし、異なる担体に固定化されていてもよい。少なくともプローブペア同士は同一の担体に固定化されていることが好ましく、O型判定に使用する一対のプローブ（WO 2009/130797参照）、B型判定に使用するA型アレル又はO型アレル判定プローブ及びB型アレル判定プローブはともに同一の担体に固定化されていることが好ましい。各プローブとしては、それぞれの条件を満たす限り、複数種のものが担体上に固定化されていてもよい。
【００５７】
マイクロアレイにおける担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、SOI（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
【００５８】
本発明においては、担体として、好ましくは表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料と同様のものを使用できる。
【００５９】
本発明は、微細な平板状の構造を有する担体に対し好適に用いられる。形状は、長方形、正方形および円形など限定されないが、通常、1〜75mm四方のもの、好ましくは1〜10mm四方のもの、より好ましくは3〜5mm四方のものを用いる。微細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層および化学修飾基を有する担体がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。
【００６０】
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（DLC：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾基の導入や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、UV吸収がないため検出系UVに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用いてもよい。
【００６１】
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマCVD(Chemical vapor deposit）法、ECRCVD(Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit）法、ICP(Inductive coupled plasma）法、直流スパッタリング法、ECR(Electric cyclotron resonance)スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、EB(Electron beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
【００６２】
高周波プラズマCVD法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にDLC（ダイヤモンドライクカーボン）層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス1〜99体積％と残りメタンガス99〜1体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりDLC層を形成してもよい。
【００６３】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
【００６４】
レーザ蒸着法では、例えばNd:YAGレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
【００６５】
基板の表面にカーボン層を形成する場合、カーボン層の厚さは、通常、単分子層〜100μm程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは2nm〜1μm、より好ましくは5nm〜500nmである。
【００６６】
カーボン層が形成された基板の表面に化学修飾基を導入することにより、プローブを担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性エステル基が挙げられる。
【００６７】
アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することによりまたはプラズマ処理することにより実施できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。
【００６８】
カルボキシル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な化合物を反応させることにより実施できる。カルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：X-R1-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R1は炭素数10〜12の2価の炭化水素基を表す。）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、2-クロロプロピオン酸、3-クロロプロピオン酸、3-クロロアクリル酸、4-クロロ安息香酸；式：HOOC-R2-COOH（式中、R2は単結合または炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：R3-CO-R4-COOH（式中、R3は水素原子または炭素数1〜12の2価の炭化水素基、R4は炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す。）で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：X-OC-R5-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R5は単結合または炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す。）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
【００６９】
エポキシ基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。
【００７０】
ホルミル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。
【００７１】
ヒドロキシル基の導入は、例えば、前記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。
【００７２】
活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、N-ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。より具体的には、活性エステル基としては、たとえばp-ニトロフェニル基、N-ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、N-ヒドロキシスクシンイミド基が好ましく用いられる。
【００７３】
活性エステル基の導入は、例えば、前記のように導入したカルボキシル基を、シアナミドやカルボジイミド（例えば、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド)などの脱水縮合剤とN-ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、N-ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる（特開2001-139532）。
【００７４】
上述したプローブを、スポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶液を調製し、これを96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって担体上にスポッティングすることにより、プローブが担体に固定化されたマイクロアレイを製造することができる。または、スポッティング溶液をマイクロピペッターにて手動でスポッティングしてもよい。
【００７５】
スポッティング後、プローブが担体に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常−20〜100℃、好ましくは0〜90℃の温度で、通常0.5〜16時間、好ましくは1〜2時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度50〜90％の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き、担体に結合していない核酸を除去するため、洗浄液（例えば、50mM TBS/0.05% Tween20）を用いて洗浄を行うことが好ましい。
【００７６】
本発明はまた、上述したB型判定領域に対応するプローブセットを含む、ABO式血液型を判定するためのキットに関する。本発明のキットにおいてプローブは、担体上に固定化されたマイクロアレイの形態で提供されてもよい。本発明のキットは、さらに、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、検出対象領域特異的プライマー、標識ヌクレオチド三燐酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三燐酸）、ヌクレオチド三燐酸および塩化マグネシウム等を含んでいてもよい。また、本発明のキットは、上述したＢ型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット及びO型判定領域を特異的に増幅するプライマーセットのいずれか一方又は両方を含むものである。
【実施例】
【００７７】
以下、実施例を用いて本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７８】
〔実施例１〕人獣判定領域増幅用プライマーセットの評価（１）
＜チップの作製＞
人獣判定領域に特異的にハイブリダイズすることが公知のD17Z1プローブ（Watanabe et al., J. Forensic Sci. January 2011, Vol. 56, No. S1, p. S182-S187）をジーンシリコンの所定の位置にスポットし、固定化を行い、チップを作製した。なお、具体的なチップの担体基板材料、固定化に使用した試薬、固定化方法等についてはWO 2009/130797の実施例に記載した方法に準じた。
【００７９】
＜プライマーの調製＞
本実施例では、人獣判定領域を特異的に増幅する従来のプライマーセット（表８）と、本発明に係るプライマーセット（表９）を使用した。
【００８０】
【表８】
2014045724.tif 000010
【００８１】
【表９】
2014045724.tif 000011
【００８２】
表８及び９から判るように、従来のプライマーセットと本発明に係るプライマーセットとは、Rvプライマーが異なっている。
【００８３】
＜核酸増幅反応＞
以上のように調製した従来のプライマーセット、本発明のプライマーセットをそれぞれ用いてPCRを行いて、人獣判定領域を増幅した。このとき、本実施例では、鋳型としてヒトゲノムDNAを使用して、下記の反応液組成とした。
【００８４】
【表１０】
2014045724.tif 000012
【００８５】
PCRにおける温度条件を表１１に示した。
【００８６】
【表１１】
2014045724.tif 000013
【００８７】
＜ハイブリダイズ反応＞
上述の反応液組成及び反応条件でPCRを実施した後、反応液とハイブリダイズ緩衝液（3×SSC／0.3%SDS／0.4 nM Cy5標識オリゴDNA（シグマジェノシス））を２：１で混合し、この溶液を３μLとり、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せ、54℃に設定したハイブリダイズチャンバー装置（東洋鋼鈑）で１時間反応させた。
【００８８】
＜洗浄及び観察＞
ハイブリダイズ反応終了後、洗浄用ステンレスホルダーを2×SSC/0.2% SDS溶液に浸し、ハイブリカバーをはずしたチップをホルダーにセットした。上下に数回振動させた後、チップの蛍光強度を検出するまでホルダーを2×SSC溶液（室温）に浸した。
【００８９】
カバーガラスとチップとを被せた後、BIOSHOT（東洋鋼鈑）及びその制御ソフトウエア（Shot Analyzer Ver 1.133暫定版2、東洋鋼鈑）を用いてスポット径10 pix、 露光時間15 秒で蛍光強度を検出した。BIOSHOTで得られたデータの解析は、Microsoft Excel（マイクロソフト）で行った。
【００９０】
＜結果＞
従来のプライマーセットを用いた場合、本発明に係るプライマーセットを用いた場合、それぞれにおいて蛍光強度を測定した結果を図２に示す。図２に示すように、本発明に係るプライマーセットを使用した場合には、従来のプライマーセットを使用した場合と比較して、増幅した人獣判定領域とプローブとのハイブリダイズに基づく蛍光強度が非常に高い値を示した。この結果から、本発明に係るプライマーセットを使用することで、未知試料の人獣判定をより高精度に行えることが明らかとなった。
【００９１】
〔実施例２〕人獣判定領域増幅用プライマーセットの評価（２）
本実施例では、ヒト以外のほ乳類由来のゲノムDNAを用いて、実施例１と同様に本発明に係るプライマーセットを使用して核酸増幅反応を行い、ヒトのゲノムDNAを用いた場合と比較した。なお、本実施例では、ヒト以外のほ乳類としてチンパンジー、オランウータン、ミドリザル、ニホンザル及びネコのDNAを使用した。
【００９２】
本実施例では、実施例１と同様に反応液を調製し、同条件で核酸増幅反応及びハイブリダイズ反応を実施した。また、本実施例では、実施例１と同様にして蛍光強度を観察した。結果を図３に示す。
【００９３】
本実施例では、測定した蛍光強度の平均値が1000以上であるときに、検出可能と判断した。図３に示すように、本発明に係るプライマーセットを使用したときには、ヒトのゲノムDNAを使用したときのみ1000以上の蛍光強度を観測することができた。すなわち、本発明に係るプライマーセットを使用することによって、高精度に人獣判定できることが明らかとなった。
【００９４】
〔実施例３〕人獣判定領域増幅用プライマーセットの評価（３）
本実施例では、本発明に係る人獣判定領域を特異的に増幅するプライマーセットを用いた人獣判定と、ABO式血液型判定とを同時に行った。
【００９５】
本実施例では、人獣判定領域を増幅するためのプライマーセット、B型判定領域を増幅するためのプライマーセット、O型判定領域を増幅するためのプライマーセットを含むプライマーミックスを作製した（表１２）。なお、表１２に示したプライマーミックスは、B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット(I)を含んでいる。
【００９６】
【表１２】
2014045724.tif 000014
【００９７】
また、本実施例では、図４に模式的に示すスポット位置となるように、表１３に示すプローブを固定したチップを実施例１と同様にして作製した。
【００９８】
【表１３】
2014045724.tif 000015
【００９９】
なお表１２に示したプライマーミックスについては、下記表１４に示す割合で各プライマーを混合した。
【０１００】
【表１４】
2014045724.tif 000016
【０１０１】
＜核酸増幅反応＞
以上のように調製したプライマーミックスを用いてPCRを行い、人獣判定領域、B型判定領域及びO型判定領域を同時に増幅した。PCRのプレミックスの組成を表１５に示した。
【０１０２】
【表１５】
2014045724.tif 000017
【０１０３】
このプレミックスに検体DNAを１μL加え、表１６に示す温度条件で35サイクル反応させた。なお、本実施例では、検体としてBO型の検体を各3検体ずつ使用した。なお、BO型検体は、表１３に示した全てのプローブと反応し、全てのスポットから蛍光が検出される。
【０１０４】
【表１６】
2014045724.tif 000018
【０１０５】
実施例１と同様にして蛍光強度を観察した結果を図５に示す。また、図５に示した蛍光強度を数値化した結果を図６に示す。図５及び６に示すように、本発明に係る人獣判定領域を特異的に増幅するプライマーセットは、ABO式血液型判定に使用するプライマーセットと同時に使用しても、人獣判定領域を特異的に増幅することができることが明らかとなった。すなわち、本発明に係る人獣判定領域を特異的に増幅するプライマーセットを使用することによって、高精度な人獣判定とABO式血液型判定とを同時に実施できることが明らかとなった。
【０１０６】
〔参考例１〕B型判定プローブおよび増幅用プライマーの評価
＜チップの作製＞
表１７に示すA型アレル又はO型アレル判定プローブ、表１８に示すB型アレル判定プローブ、表１９に示すO型アレル判定用プローブ（WO 2009/130797）及び表２０に示す位置プローブをそれぞれジーンシリコンの所定の位置にスポットし、固定化を行い、チップを作製した。なお、具体的なチップの担体基板材料、固定化に使用した試薬、固定化方法等についてはWO 2009/130797の実施例に記載した方法に準じた。
【０１０７】
【表１７】
2014045724.tif 000019
【０１０８】
【表１８】
2014045724.tif 000020
【０１０９】
表１７及び１８に記載した塩基配列に付した下線部は、5'末端側から796C/A及び803G/Cを示している。
【０１１０】
【表１９】
2014045724.tif 000021
【０１１１】
【表２０】
2014045724.tif 000022
【０１１２】
＜プライマーの調製＞
本実施例では、B型判定領域を増幅するためのプライマーセット、O型判定領域を増幅するためのプライマーセット及び人獣判定領域を増幅するためのプライマーセットを含む、表２１〜２３に示す３種類のプライマーミックスを作製した。なお、表２１に示したプライマーミックスは、B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット(I)を含んでいる。表２２に示したプライマーミックスは、B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット(II)を含んでいる。表２３に示したプライマーミックスは、B型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット(III)を含んでいる。  
【０１１３】
【表２１】
2014045724.tif 000023
【０１１４】
【表２２】
2014045724.tif 000024
【０１１５】
【表２３】
2014045724.tif 000025
【０１１６】
なお表２１及び２２に示したプライマーミックスについては、下記表２４に示す割合で各プライマーを混合した。
【０１１７】
【表２４】
2014045724.tif 000026
【０１１８】
表２３に示したプライマーミックスについては、下記表２５に示す割合で各プライマーを混合した。
【０１１９】
【表２５】
2014045724.tif 000027
【０１２０】
＜核酸増幅反応＞
以上のように調製した３種類のプライマーミックスを用いてPCRを行い、B型判定領域及びO型判定領域を同時に増幅した。PCRのプレミックスの組成を表２６に示した（各プライマーセット分計183本）。
【０１２１】
【表２６】
2014045724.tif 000028
【０１２２】
このプレミックスに検体DNAを１μL加え、表２７に示す温度条件で35サイクル反応させた。なお、本実施例では、検体としてAA型、AB型、BB型、BO型、AO型及びOO型の検体を各3検体ずつ使用した。
【０１２３】
【表２７】
2014045724.tif 000029
【０１２４】
＜ハイブリダイズ反応＞
上述の反応液組成及び反応条件でPCRを実施した後、反応液とハイブリダイズ緩衝液（3×SSC／0.3%SDS／0.4 nM Cy5標識オリゴDNA（シグマジェノシス））を２：１で混合し、この溶液を３μLとり、ハイブリカバーの中央凸部の上に滴下して、これをチップに被せ、54℃に設定したハイブリダイズチャンバー装置（東洋鋼鈑）で１時間反応させた。
【０１２５】
＜洗浄及び観察＞
ハイブリダイズ反応終了後、洗浄用ステンレスホルダーを2×SSC/0.2% SDS溶液に浸し、ハイブリカバーをはずしたチップをホルダーにセットした。上下に数回振動させた後、チップの蛍光強度を検出するまでホルダーを2×SSC溶液（室温）に浸した。
【０１２６】
カバーガラスとチップとを被せた後、BIOSHOT（東洋鋼鈑）及びその制御ソフトウエア（Shot Analyzer Ver 1.133暫定版2、東洋鋼鈑）を用いてスポット径10 pix、 露光時間15 秒で蛍光強度を検出した。BIOSHOTで得られたデータの解析は、Microsoft Excel（マイクロソフト）で行った。
【０１２７】
＜結果１＞
先ず、チップに固定したプローブから検出された蛍光強度を指標としてプローブの評価を行った。表１７に示したA型アレル又はO型アレル判定プローブ１〜１３については、B型アレルがない検体（AA、AO及びOO型）を用いたときの蛍光強度の平均を算出し、蛍光強度平均値が1000以上のプローブを検出可能として、評価「○」とした。結果を表２８に示した。
【０１２８】
【表２８】
2014045724.tif 000030
【０１２９】
なお、表２８は、左から順に、表２１に示したプライマーミックス、表２２に示したプライマーミックス、及び表２３に示したプライマーミックスを使用したときの結果を示している。
【０１３０】
次に、チップに固定したプローブから検出された蛍光強度を指標としてプローブの評価を行った。表１８に示したB型アレル判定プローブA〜Eについては、B型アレルのみ検体（BB型）を用いたときの蛍光強度の平均を算出し、蛍光強度平均値が1000以上のプローブを検出可能として、評価「○」とした。結果を表２９に示した。
【０１３１】
【表２９】
2014045724.tif 000031
【０１３２】
なお、表２９は、表２８と同様に、左から順に、表２１に示したプライマーミックス、表２２に示したプライマーミックス、及び表２３に示したプライマーミックスを使用したときの結果を示している。
【０１３３】
＜結果２＞
上述した３種類のプライマーセットを用いて増幅したB型判定領域について、B型判定値は（B型アレル判定プローブの蛍光強度）/（A,O型アレル判定プローブとB型判定プローブの蛍光強度の平均値）から算出した値を判定値とした。この時、各種プローブを使用した場合の判定値の平均値、標準偏差及び３σを算出した。これらの算出結果を表３０〜３２に示した。表３０〜３２は、それぞれB型判定領域を特異的に増幅するプライマーセット(I)〜(III)を使用したとき（すなわち表２１〜２３のプライマーミックス）の結果を示している。また、表３０〜３２において「プローブA,O」とした欄は、A型アレル又はO型アレル判定プローブの種類（表１７に示した１３種類）を示している。表３０〜３２において「プローブB」とした欄は、B型アレル判定プローブの種類（表１８に示した６種類）を示している。
【０１３４】
【表３０】
2014045724.tif 000032
【０１３５】
【表３１】
2014045724.tif 000033
【０１３６】
【表３２】
2014045724.tif 000034
【０１３７】
そして、表３０〜３２に示した計算結果を用いて、各プローブの性能を評価するため「平均値の差」、「3σの和」、「（平均値の差）−（3σの和）」及び「差の掛け算」を算出した。計算の結果を表３３〜３５に示した。
【０１３８】
表３３〜３５における「（２）判定」の欄に、上記＜結果１＞に示した蛍光強度が1000を超えるプローブのうち「（平均値の差）−（3σの和）」の値が0を超えるものを○とし、0以下のものを×とする評価結果を示した。すなわち、この欄には、判定値の平均±３σが重複しないこと、すなわちプローブの分離精度に関する評価結果が示されている。なお、この欄において「−」は、上記＜結果１＞に示した蛍光強度が1000を満たしていないプローブセットを示している。
【０１３９】
また、表３３〜３５における「（３）判定」の欄に、上記「（２）判定」が○であったプローブセットについて、判定値の平均値の積が０．５を超えるものを○とし、０．５以下のものを×とする評価結果を示した。すなわち、この欄には、判定値の開き度合いを指標としてプローブの性能評価結果が示されている。なお、この欄におい「−」は、上記＜結果１＞に示した蛍光強度が1000を満たしていないプローブセット及び上記「（２）判定」で×となったプローブセットを示している。
【０１４０】
【表３３】
2014045724.tif 000035
【０１４１】
【表３４】
2014045724.tif 000036
【０１４２】
【表３５】
2014045724.tif 000037
【０１４３】
表３３〜３５に示すように、本実施例で設計したA型アレル又はO型アレル判定プローブ１〜１３のなかでも、配列番号１０の塩基配列（ACTACCTGGGGGGGTTC）を含む20塩基以上の塩基配列からなり、Tm値が65℃以上であるA型アレル又はO型アレル判定プローブ９〜１３は、プライマーセットで増幅したB型判定領域を高感度に検出できるものと言える。特に、A型アレル又はO型アレル判定プローブ１２及び１３は、本実施例で設計した３種類のプライマーセットで増幅した全てのB型判定領域を高感度に検出できることが明らかとなった。
【０１４４】
表３３〜３５に示すように、本実施例で設計したB型アレル判定プローブA〜Eは、プライマーセットで増幅したB型判定領域を高感度に検出できるものと言える。特に、B型アレル判定プローブC〜Eは、本実施例で設計した３種類のプライマーセットで増幅した全てのB型判定領域を高感度に検出できることが明らかとなった。
【０１４５】
〔参考例２〕O型判定領域増幅用プライマーの評価
本実施例では、WO 2009/130797で開示されたプライマーセットと、実施例１で設計したABO_261_O_Fw（配列番号８）及びABO_261_O_Rv（配列番号９）のプライマーセットとの性能を評価した。具体的に、各プライマーセットで増幅したO型判定領域を、WO 2009/130797で開示されたO型アレル判定用プローブ（実施例１の表９）で検出する際の精度を指標にして評価した。
【０１４６】
本実施例では、実施例１で行った実験において、表９に示した一対のO型アレル判定用プローブにおける蛍光強度の測定値から、判定値を算出した。判定値は（ABO_261 O Sの蛍光強度）/（ABO_261_WT_SとABO 261 O Sの蛍光強度の平均値）から算出した。実施例１と同様に「判定値の平均値」、「判定値の標準偏差」及び「３σ」を算出した。結果を表３６に示す。
【０１４７】
【表３６】
2014045724.tif 000038
【０１４８】
また、実施例１と同様に、表３６に示した計算結果を用いて、各プローブの性能を評価するため「平均値の差」、「3σの和」、「（平均値の差）−（3σの和）」及び「差の掛け算」を算出した。計算の結果を表３７に示した。
【０１４９】
【表３７】
2014045724.tif 000039
【０１５０】
表３７に示した結果から、本実施例１で設計したABO_261_O_Fw（配列番号８）及びABO_261_O_Rv（配列番号９）のプライマーセットは、従来公知のプライマーセットと比較するとO型判定領域を極めて優れた分離精度で検出できることが判る。 
【図１】
2014045724.tif 000040
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2014045724.tif 000045
【配列表】
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