(57)【要約】【課題】  フィーカリバクテリウム属細菌を効果的に増殖させることができ、もって、腸内炎症等の疾患の予防や治療に寄与しうる物質および方法を提供する。【解決手段】  １−ケストースを有効成分とするフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤。本発明によれば、生体外および生体内のいずれにおいても、フィーカリバクテリウム属細菌を効果的に増殖させることができる。特に、副作用や安全性をほとんど懸念することなく、簡便かつ効果的に、ヒトや動物の体内のフィーカリバクテリウム属細菌を増加させることができる。また、ヒトや動物の体内のフィーカリバクテリウム属細菌を増加させることにより、腸内炎症の予防ないし治療をすることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−ケストースを有効成分とするフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖剤。
【請求項２】
腸内炎症の予防または治療に用いられることを特徴とする、請求項１に記載のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖剤。
【請求項３】
腸内炎症が炎症性腸疾患である、請求項２に記載のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖剤。
【請求項４】
炎症性腸疾患がクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項３に記載のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖剤。
【請求項５】
１−ケストースを有効成分とするフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖用食品組成物。
【請求項６】
ヒトまたは動物に１−ケストースを摂取させることにより前記ヒトまたは動物の腸内におけるフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の数を増加させる工程を有する、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の増殖方法。
【請求項７】
フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌を含む培地に１−ケストースを添加して培養する工程を有する、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の増殖方法。
【請求項８】
腸内炎症を罹患している、または、罹患する可能性があるヒトもしくは動物に、１−ケストースを摂取させることにより、前記ヒトもしくは動物の腸内におけるフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の数を増加させる工程を有する、腸内炎症の治療または予防方法。
【請求項９】
腸内炎症の治療または予防用医薬品を製造するための１−ケストースの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１−ケストースを有効成分とするフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤、フィーカリバクテリウム属細菌増殖用食品組成物、フィーカリバクテリウム属細菌の増殖方法、腸内炎症の治療または予防方法、および、腸内炎症の治療または予防用医薬品を製造するための１−ケストースの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィーカリバクテリウム属細菌は腸内の粘液層に常在する偏性嫌気性桿菌であり、ヒトにおける保有率および保有数はともに高く、腸内細菌叢の主要な構成菌種である。近年の研究において、フィーカリバクテリウム属細菌は、腸内の細胞にエネルギーを供給する作用や腸内環境を良好に保つ作用、強い抗炎症作用などの、好ましい生理機能を有することが示されている（非特許文献１）。さらに、抗炎症作用に関しては、フィーカリバクテリウム属細菌やその培養上清を腸炎モデル動物や培養細胞に投与することにより、炎症状態を予防または改善できることが報告されている（非特許文献２、３）。【０００３】
一方で、疾患の予防や治療ないし健康増進を目的として、非特許文献１および２に記載されているようなフィーカリバクテリウム属細菌そのものを生体に投与する方法では、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のような問題点がある。（ｉ）経口投与においては胃酸や胆汁、消化液の作用を受けて、大多数の菌が腸内に到達する前に死滅してしまう。（ｉｉ）一般に、外来の菌は腸内に定着し難く、大多数が消化管を素通りしてしまうため、効果が一過性と考えられる。（ｉｉｉ）フィーカリバクテリウム属細菌は食経験の歴史が無いため、安全性の点で懸念がある、（ｉｖ）フィーカリバクテリウム属細菌は偏性嫌気性であるため、生菌のまま医薬品や食品に配合するためには、特殊な加工や保存条件を必要とする。【０００４】
そこで、上記（ｉ）〜（ｉｖ）の問題点を解決すべく、生体に内在するフィーカリバクテリウム属細菌を増加させることが試みられており、例えば、特許文献１には、ポリデキストロースまたは水溶性トウモロコシ繊維を含む組成物を摂取することによりフィーカリバクテリウム属細菌を増加させる方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−５３２７１０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｙｕａｎ  Ｇａｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｖｏｌ．２０１４、Ａｒｔ．ＩＤ ８７２７２５、２０１４年３月２７日
【非特許文献２】Ｍｉｑｕｅｌ Ｓ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１６（３）、第２５５〜２６１頁、２０１３年６月
【非特許文献３】Ｘｉｎｙｕｎ Ｑｉｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ａｎｄ Ｃｏｌｉｔｉｓ、Ｖｏｌ．７、Ｉｓｓｕｅ１１、ｅ５５８〜ｅ５６８、２０１３年１２月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、フィーカリバクテリウム属細菌の数を十分に増加させることができる物質ないし方法は未だ十分に提供されておらず、そのような物質ないし方法の開発が求められていた。本発明は係る課題を解決するためになされたものであって、フィーカリバクテリウム属細菌を効果的に増殖させることができ、もって、腸内炎症等の疾患の予防や治療に寄与しうる物質および方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、１−ケストースが、生体外および生体内のいずれにおいても、フィーカリバクテリウム属細菌の数を顕著に増加させることを見出した。そこで、この知見に基づいて、下記の各発明を完成した。【０００９】
（１）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤は、１−ケストースを有効成分とする。【００１０】
（２）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤は、腸内炎症の予防または治療に用いることができる。【００１１】
（３）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤は、腸内炎症のうち、特に、炎症性腸疾患の予防または治療に好適に用いることができる。【００１２】
（４）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤は、炎症性腸疾患のうち、特に、クローン病または潰瘍性大腸炎の予防または治療に好適に用いることができる。【００１３】
（５）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌増殖用食品組成物は、１−ケストースを有効成分とする。【００１４】
（６）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌の増殖方法の第１の態様は、ヒトまたは動物に１−ケストースを摂取させることにより前記ヒトまたは動物の体内におけるフィーカリバクテリウム 属細菌の数を増加させる工程を有する。【００１５】
（７）本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌の増殖方法の第２の態様は、フィーカリバクテリウム属細菌を含む培地に１−ケストースを添加して培養する工程を有する。【００１６】
（８）本発明に係る腸内炎症の治療または予防方法は、腸内炎症を罹患している、または、罹患する可能性があるヒトもしくは動物に、１−ケストースを摂取させることにより、前記ヒトもしくは動物の体内におけるフィーカリバクテリウム属細菌の数を増加させる工程を有する。【００１７】
（９）本発明に係る１−ケストースの使用は、腸内炎症の治療または予防用医薬品を製造するための１−ケストースの使用である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、生体外および生体内のいずれにおいても、フィーカリバクテリウム属細菌を効果的に増殖させることができる。【００１９】
また、１−ケストースは、タマネギやニンニク、大麦、ライ麦などの野菜や穀物にも含まれているオリゴ糖の一種であり、古来より食経験を有する物質であることや、変異原性試験、急性毒性試験、亜慢性毒性試験および慢性毒性試験のいずれにおいても毒性が認められていないことから、安全性は極めて高いといえる（食品と開発、Ｖｏｌ．４９、Ｎｏ．１２、第９頁、２０１４年）。また、１−ケストースは、水溶性が高く、砂糖に似た良好な甘味質を有するため、そのまま、あるいは甘味料等の調味料として、日常的に簡便に摂取することができるほか、様々な食品や医薬品等に容易に配合することができる。【００２０】
したがって、本発明によれば、副作用や安全性をほとんど懸念することなく、簡便かつ効果的に、ヒトや動物の体内のフィーカリバクテリウム属細菌を増加させることができる。また、本発明によれば、ヒトや動物の体内のフィーカリバクテリウム属細菌を増加させることにより、腸内炎症の予防ないし治療をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】各種のオリゴ糖を用いて培養したフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィーＡＴＣＣ２７７６８株の培地の濁度（ＯＤ値）と培養時間との関係を示す折れ線グラフである。
【図２】各種のオリゴ糖を用いて、７２時間培養したフィーカリバクテリウム  プラウスニッツィーＡＴＣＣ２７７６８株の培地の濁度（ＯＤ値）を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明に係るフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤、フィーカリバクテリウム属細菌増殖用食品組成物、フィーカリバクテリウム属細菌の増殖方法、腸内炎症の治療または予防方法、および、腸内炎症の治療または予防用医薬品を製造するための１−ケストースの使用について詳細に説明する。
【００２３】
本発明において、「フィーカリバクテリウム属細菌」は、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物をいう。フィーカリバクテリウム属に属する微生物としては、フィーカリバクテリウム プラウスニッツィー（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）を挙げることができる。
【００２４】
「１−ケストース」は、１分子のグルコースと２分子のフルクトースからなる三糖類のオリゴ糖である。１−ケストースは、スクロースを基質として、特開昭５８−２０１９８０号公報に開示されているような酵素による酵素反応を行うことにより作ることができる。具体的には、まず、β−フルクトフラノシダーゼをスクロース溶液に添加し、３７℃〜５０℃で２０時間程度静置することにより酵素反応を行って、１−ケストース含有反応液を得る。この１−ケストース含有反応液を、特開２０００−２３２８７８号公報で開示されているようなクロマト分離法に供することよって、１−ケストースと他の糖（ブドウ糖、果糖、ショ糖、４糖以上のオリゴ糖）とを分離して精製し、高純度１−ケストース溶液を得る。続いて、この高純度１−ケストース溶液を濃縮した後、特公平６−７００７５号公報に開示されているような結晶化法で結晶化することにより、１−ケストースを結晶として得ることができる。
【００２５】
また、１−ケストースは市販のフラクトオリゴ糖に含まれているため、これをそのまま、あるいは、フラクトオリゴ糖から上述の方法により１−ケストースを分離精製して用いてもよい。すなわち、本発明の１−ケストースとして、１−ケストースを含有するオリゴ糖などの１−ケストース含有組成物を用いてもよい。１−ケストース含有組成物を用いる場合、１−ケストースの純度は８０質量％以上であることが好ましく、８５質量％以上であることがより好ましく、９０質量％以上であることがさらに好ましい。なお、本発明において、特定のオリゴ糖の「純度」とは、糖の総量を１００％とした場合の、当該オリゴ糖の質量％をいう。
【００２６】
１−ケストースは、ヒトや動物に摂取させることにより用いる。１−ケストースの摂取量（投与量）としては、例えば、０．０１〜０．３４ｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．０１〜０．３０ｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０１〜０．２４ｇ／ｋｇ体重などを挙げることができる。係る摂取量は、１日１回に限らず、複数回に分割して摂取してもよい。    
【００２７】
１−ケストースは、後述する実施例２に示すように、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）においてフィーカリバクテリウム属細菌の数を増加させるという機能を有する。このことから、ヒトや動物に摂取させる方法としては、フィーカリバクテリウム属細菌の生息場所である腸内に到達させる方法であればよい。そのような方法として、具体的には、１−ケストースを、そのまま、あるいは飲食物や医薬品の形態で、ヒトまたは動物に経口摂取させる方法を挙げることができる。その他、１−ケストースを肛門から直接あるいは挿入したチューブを経由して投与する方法、１−ケストースを経腸栄養剤に添加して、これを、胃や小腸などの消化管に挿入したチューブを経由して経腸栄養法により投与する方法などを挙げることができる。
【００２８】
一方、１−ケストースは、後述する実施例１に示すように、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）においてフィーカリバクテリウム属細菌の数を増加させるために用いることもできる。この場合は、例えば、フィーカリバクテリウム属細菌を含む培地に１−ケストースを添加して、嫌気環境下にて３７℃で所定の時間静置培養する方法を挙げることができる。
【００２９】
上述したとおり、フィーカリバクテリウム属細菌は、菌体やその培養上清の投与によって、炎症状態を予防または改善できることが示されている。すなわち、非特許文献２には、２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＴＮＢＳ）で誘導した腸炎モデルマウスにフィーカリバクテリウム プラウスニッツィー Ａ２−１６５株やその培養上清を投与することにより、腸炎を抑制できることが記載されている。また、非特許文献３には、ヒト末梢血単核球細胞の培地にフィーカリバクテリウム プラウスニッツィー（ＡＴＣＣ２７７６６）やその培養上清を添加することにより、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β１およびＩＬ−１２ｐ７０といった抗炎症性サイトカインの産生を促進し、制御性Ｔ細胞の分化を促進できることが示されている。さらに、非特許文献３には、ＴＮＢＳで誘導した腸炎モデルラットにフィーカリバクテリウム プラウスニッツィー（ＡＴＣＣ２７７６６）やその培養上清を経口投与することにより、抗炎症性サイトカインの産生促進および制御性Ｔ細胞の分化促進の他、腸粘膜上に見られる炎症組織の治癒を促進できることも示されている。
【００３０】
従って、１−ケストースをヒトや動物に摂取させてその体内ないし腸内においてフィーカリバクテリウム属細菌の数を増加させることにより、腸内炎症を予防または治療することができる。また、１−ケストースは、腸内炎症の治療または予防用医薬品を製造するために使用することができる。
【００３１】
ここで、本発明において、「腸内炎症」とは、腸管において炎症が生じている状態をいい、疾患に至っている状態も含む。腸内炎症から至る疾患としては、炎症性腸疾患が挙げられる。炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎とクローン病とを指すとして、狭義に解釈する立場と、腸管のあらゆる炎症性疾患を指すとして、広義に解釈する立場とがある（最新内科学大系〈プログレス８〉、消化器疾患、ｐｐ３２０、１９９７年、中山書店）。本発明において炎症性腸疾患という場合は、後者の、腸管におけるあらゆる炎症性疾患を意味する。本発明は、腸内炎症のうち、特に、アレルギーを除くものの予防または治療に好適に用いることができる。
【００３２】
本発明のフィーカリバクテリウム属細菌増殖剤の具体的な態様としては、例えば、医薬品や医薬部外品、食品添加物、サプリメントなどの健康食品などを挙げることができる。
【００３３】
１−ケストースを含有する医薬品や医薬部外品、サプリメントの剤型は特に限定されず、投与方法に適した剤型を適宜選択することができる。例えば、経口投与の場合には、散剤、錠剤、糖衣剤、カプセル剤、顆粒剤、ドライシロップ剤、液剤、シロップ剤、ドロップ剤、ドリンク剤等の固形または液状の剤型にすることができる。
【００３４】
上記各剤型の医薬品や医薬部外品、サプリメントは、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、散剤であれば、１−ケストース８００ｇおよび乳糖２００ｇをよく混合した後、９０％エタノール３００ｍＬを添加して湿潤させる。続いて、湿潤粉末を造粒した後、６０℃で１６時間通風乾燥し、その後、整粒して、適当な細かさの散剤１０００ｇ（１−ケストース含有量８００ｍｇ／１ｇ）を得ることができる。また、錠剤であれば、１−ケストース３００ｇ、粉末還元水飴３８０ｇ、コメデンプン１８０ｇおよびデキストリン１００ｇをよく混合した後、９０％エタノール３００ｍＬを添加して湿潤させる。続いて、湿潤粉末を押し出し造粒した後、６０℃で１６時間通風乾燥して顆粒を得る。その後、この顆粒を８５０μｍの篩を用いて整粒し、続いて顆粒４７０ｇにショ糖脂肪酸エステル５０ｇを添加して混合した後、ロータリー打錠機（６Ｂ−２、菊水製作所製）を用いて打錠し、直径８ｍｍ、重量２００ｍｇの錠剤５０００錠（１−ケストース含有量６０ｍｇ／１錠）を得ることができる。
【００３５】
本発明のフィーカリバクテリウム属細菌増殖用食品組成物の具体的な態様としては、例えば、飲料、乳製品、食用に供する顆粒、ペースト、調味料、レトルト食品、ベビーフード、発酵食品、保存食、水産加工品、食肉加工品、穀物加工品などの加工食品、食品添加物、健康食品、動物飼料などを挙げることができる。
【００３６】
１−ケストースは、各種の飲食品や食品添加物、動物飼料の通常の製造過程で、添加して用いることができる。１−ケストースの甘味度は３０で、その味質・物性・加工性はショ糖に近いことから、各種飲食物の製造過程において、砂糖の一部または全部を１−ケストースに置き換えるなどして、砂糖と同様に扱って各種の飲食品や食品添加物、動物飼料を製造することができる。
【００３７】
以下、本発明について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。また、本実施例においては、所定の純度で特定のオリゴ糖を含有する組成物を、当該オリゴ糖の名称で記載する。
【実施例】
【００３８】
＜実施例１＞生体外でのフィーカリバクテリウム属細菌増殖作用の検討
下記の組成の液体培地を無菌的に調製した。各種オリゴ糖としては、１−ケストース（純度９９質量％；物産フードサイエンス社）、ニストース（純度９８質量％；和光純薬社）、キシロオリゴ糖（純度９８質量％；物産フードサイエンス社）、ラフィノース（純度９８質量％；明治フードマテリア社）またはラクトスクロース（純度８９質量％；塩水港精糖社）を用いた。また、コントロールとして、下記の組成のうちオリゴ糖を含まない液体培地を同様に調製した。
《液体培地の組成／１Ｌあたり》（最終ｐＨ：ｐＨ７．０）
カゼイン分解物１５．０ｇ、酵母抽出物５．０ｇ、Ｌ−シスチン０．５ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、チオグリコール酸０．５ｇ、トリプトファン２５ｍｇ、ヘミン（Ｈｅｍｉｎ）適量、ビタミンＫ１適量、各種オリゴ糖５．０ｇ。【００３９】
コンフルエントまで前培養したフィーカリバクテリウム プラウスニッツィー ＡＴＣＣ２７７６８株を、６６０ｎｍでの濁度が０．０５〜０．０６のＯＤ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）値となるように、調製した液体培地に接種した。これを嫌気環境下にて３７℃で静置培養し、２４時間後、４８時間後および７２時間後に、分光光度計を用いて６６０ｎｍでの濁度（ＯＤ値）を測定した。その結果を表１に示す。また、ＯＤ値と培養時間との関係を図１の折れ線グラフに示す。また、培養時間７２時間のＯＤ値を図２の棒グラフに示す。【００４０】
【表１】
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【００４１】
表１、図１および図２に示すように、ＯＤ値は、コントロールの液体培地では、０時間で０．０６２、２４時間で０．１７３、４８時間で０．１１３、７２時間で０．１６６であった。これに対して、１−ケストースを添加した液体培地では、０時間で０．０６３、２４時間で０．３４５、４８時間で０．８８５、７２時間で１．８０３であった。一方、ニストースを添加した液体培地では、０時間で０．０６３、２４時間で０．２９０、４８時間で０．４４３、７２時間で０．３０５であった。また、キシロオリゴ糖を添加した液体培地では、０時間で０．０６９、２４時間で０．２７１、４８時間で０．２３４、７２時間で０．２９４であった。また、ラフィノースを添加した液体培地では、０時間で０．０５２、２４時間で０．２５１、４８時間で０．１９１、７２時間で０．２４６であった。また、ラクトスクロースを添加した液体培地では、０時間で０．０５５、２４時間で０．２９８、４８時間で０．４４８、７２時間で０．２９５であった。
すなわち、１−ケストースを添加した液体培地では、オリゴ糖を添加していない液体培地（コントロールの液体培地）ならびに他のオリゴ糖（ニストース、キシロオリゴ糖、ラフィノースおよびラクトスクロース）を添加した液体培地と比較して、２４時間、４８時間および７２時間のいずれの培養時間においてもＯＤ値が顕著に大きかった。【００４２】
培地の濁度（ＯＤ値）は微生物数の大小を反映する。従って、上記の結果から、２４時間、４８時間および７２時間のいずれの培養時間においても、１−ケストースを添加した液体培地におけるフィーカリバクテリウム プラウスニッツィー ＡＴＣＣ２７７６８株の菌数は、オリゴ糖を添加していない液体培地ならびに他のオリゴ糖を添加した液体培地における菌数と比較して、顕著に大きいことが明らかになった。この結果から、１−ケストースは、生体外において、フィーカリバクテリウム属細菌を増殖させる作用が顕著に大きいことが明らかになった。【００４３】
＜実施例２＞生体内でのフィーカリバクテリウム属細菌増殖作用の検討
６か月〜６歳の乳幼児５８名を２９名ずつ２つの群に分け、１−ケストース群およびマルトース群とした。１−ケストース群には１−ケストース（純度９８質量％以上；物産フードサイエンス社）を、マルトース群にはマルトース（純度９２質量％以上；「サンマルト−Ｓ」粉末品；三和澱粉工業社）を、試験期間中、毎日経口摂取させた。試験期間は１２週間とした。１−ケストースまたはマルトースの１日の摂取量は、１歳未満が１ｇ（目安摂取量；０．１２１ｇ／ｋｇ体重／日）、１?３歳が２ｇ（目安摂取量；０．１６９ｇ／ｋｇ体重／日）、４?６歳が３ｇ（目安摂取量；０．１７０ｇ／ｋｇ体重／日）とした。試験期間の開始時（０週）、６週間経過時（６週）および１２週間経過時（１２週）に糞便を回収した。【００４４】
なお、上記の目安摂取量は、「厚生労働省  平成２２年乳幼児身体発育調査」に掲載の年齢別体重データに基づいて算出した。すなわち、本実施例２の試験参加者の年齢（月齢）に該当する体重データの最小値と最大値とから、男女別に中央値を求め、中央値の平均値を算出した。続いて、中央値の平均値について、男女の平均値を算出し、これを目安体重とした。目安体重は、１歳未満が８．２６ｋｇ、１〜３歳が１１．８５ｋｇ、４〜６歳が１７．６２ｋｇであった。１−ケストースまたはマルトースの１日の摂取量を、この目安体重で除した値を目安摂取量とした。【００４５】
回収した糞便中のフィーカリバクテリウム属細菌の菌数を、リアルタイムＰＣＲ法により定量した。具体的には、まず、ゲノム抽出用試薬「Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｎ Ｓｏｉｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｍｏ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と「Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｒｏｃｈｅ社）とを用いて、糞便からゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として、フィーカリバクテリウム属細菌に特異的なプライマー（配列は以下に示す）、リアルタイムＰＣＲ試薬「ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）およびリアルタイムＰＣＲ装置「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてリアルタイムＰＣＲを行い、糞便１ｇあたりのフィーカリバクテリウム属細菌の菌数（個）を定量した。検出範囲は１０５個／ｇ以上であり、検出範囲以下の検体に対しては、１０２．５個／ｇの数値を代入した。検量線は、純粋培養して顕微鏡下で計数したフィーカリバクテリウム プラウスニッツィー ＡＴＣＣ２７７６８株から同様の方法にて抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、同条件でリアルタイムＰＣＲを行った結果を基に作製したものを用いた。
《フィーカリバクテリウム属細菌に特異的なプライマーの配列》
フォワードプライマー；ＣＣＡＴＧＡＡＴＴＧＣＣＴＴＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴ（配列番号１）
リバースプライマー；ＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＧＴＣＡＧＴＴＧＧＴ（配列番号２）【００４６】
求めた菌数は、各群ごとに平均値を算出した。また、６週および１２週の菌数の平均値について、０週の菌数の平均値に対してウィルコクソンの符号順位検定により有意差検定を行い、ｐ値を求めた。その結果を表２に示す。【００４７】
【表２】
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【００４８】
表２に示すように、１−ケストース群の菌数は、０週で３．７×１０６個／糞便１ｇであったのに対して、６週では１．４×１０７個／糞便１ｇ、１２週では３．５×１０７個／糞便１ｇであった。すなわち、０週と比較した菌数は、６週では、有意差は無いものの３．５倍以上に増加し、１２週では９倍以上に有意に増加した。
一方、マルトース群の菌数は、０週で７．６×１０６個／糞便１ｇであったのに対して、６週では５．８×１０６個／糞便１ｇ、１２週では１．３×１０７個／糞便１ｇであった。すなわち、０週と比較した菌数は、６週ではわずかに減少し、１２週ではやや増加したものの、有意差は無かった。【００４９】
以上のとおり、フィーカリバクテリウム属細菌の菌数は、マルトース群では増加しなかったのに対して、１−ケストース群では顕著に増加したことが示された。この結果から、１−ケストースは、生体内において、フィーカリバクテリウム属細菌を増殖させる作用が顕著に大きいことが明らかになった。
【図１】
2017159647.tif 000005
【図２】
2017159647.tif 000006
【配列表】
2017159647000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成29年9月19日(2017.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−ケストースを有効成分とするフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖剤。
【請求項２】
腸内炎症の予防または治療に用いられることを特徴とする、請求項１に記載のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖剤。
【請求項３】
腸内炎症が炎症性腸疾患である、請求項２に記載のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖剤。
【請求項４】
炎症性腸疾患がクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項３に記載のフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖剤。
【請求項５】
１−ケストースを有効成分とするフィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌増殖用食品組成物。
【請求項６】
フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌を含む培地に１−ケストースを添加して培養する工程を有する、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌の増殖方法。
【国際調査報告】
2017159647.tif 000007
2017159647.tif 000008
2017159647.tif 000009
2017159647.tif 000010
2017159647.tif 000011
2017159647.tif 000012