(57)【要約】【課題】バチルス属細菌を迅速、特異的に、かつ高感度に検出する方法の提供。【解決手段】微生物を含む試料から抽出されたＤＮＡを鋳型とし、バチルス属細菌の１６ＳｒＤＮＡの特定の領域と特異的にハイブリダイズするフォワードプライマーと、バチルス属細菌の１６ＳｒＤＮＡの特定の領域と特異的にハイブリダイズするリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、バチルス属の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、バチルス属細菌の検出方法。
【請求項２】
微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、バチルス属細菌の検出方法。
【請求項３】
微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ３−１）配列番号５で表される塩基配列、
（Ｆ３−２）配列番号５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ３−３）配列番号５で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ３−４）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ３−１）配列番号６で表される塩基配列、
（Ｒ３−２）配列番号６で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ３−３）配列番号６で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ３−４）配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、バチルス属細菌の検出方法。
【請求項４】
微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ４−１）配列番号７で表される塩基配列、
（Ｆ４−２）配列番号７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ４−３）配列番号７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ４−４）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ４−１）配列番号８で表される塩基配列、
（Ｒ４−２）配列番号８で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ４−３）配列番号８で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ４−４）配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、バチルス属細菌の検出方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のバチルス属細菌の検出方法を用いることを特徴とする活性汚泥の分解処理性能評価方法。
【請求項６】
微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子において、微生物間で共通に保存されている部分を増幅するためのユニバーサルプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲによって得られた増幅産物の量と、前記バチルス属細菌の検出方法を用いて得られた増幅産物の量を比較することにより、活性汚泥中のバチルス属細菌の割合を算出する工程を有する請求項５に記載の活性汚泥の分解処理性能評価方法。
【請求項７】
（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするバチルス属細菌検出用プライマー。
【請求項８】
（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするバチルス属細菌検出用プライマー。
【請求項９】
（Ｆ３−１）配列番号５で表される塩基配列、
（Ｆ３−２）配列番号５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ３−３）配列番号５で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ３−４）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ３−１）配列番号６で表される塩基配列、
（Ｒ３−２）配列番号６で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ３−３）配列番号６で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ３−４）配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするバチルス属細菌検出用プライマー。
【請求項１０】
（Ｆ４−１）配列番号７で表される塩基配列、
（Ｆ４−２）配列番号７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ４−３）配列番号７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ４−４）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ４−１）配列番号８で表される塩基配列、
（Ｒ４−２）配列番号８で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ４−３）配列番号８で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ４−４）配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするバチルス属細菌検出用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルス属細菌を特異的に検出し得るプライマー、当該プライマーを用いてバチルス属細菌を検出する方法、及び当該検出方法を用いた活性汚泥の分解処理性能評価方法に関する。  
【背景技術】
【０００２】
洗濯排水等の有機系廃棄物は、界面活性剤、柔軟剤等の人工有機物の他、皮脂やタンパク質等の人体由来成分が含まれており、これらを分解除去するためには、複数の微生物が関与していることが知られている。
【０００３】
一方、バチルス属細菌に属する細菌の多くは、食物の腐敗をもたらし、人体に危険な毒素を生産する細菌として知られている。
そのため、食物中のバチルス属細菌を早期に検出する方法として、バチルス属細菌の１６ＳｒＤＮＡの特定の領域と特異的にハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲによりバチルス属細菌を検出する方法が提案されている（非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｋａｎｏ．Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．，（２００４) ｖｏｌ．６７，ｐｐ．１２７１−１２７７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、非特許文献１には、洗濯排水等の排水処理槽中の活性汚泥に生息するバチルス属細菌の検出については何ら記載がなく、活性汚泥における、排水等有機系廃棄物の分解処理性能評価方法に用いられるバチルス属細菌の検出方法としては改良の余地があった。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、活性汚泥における、排水等有機系廃棄物の分解処理性能評価方法に好適に用いられ、バチルス属細菌を迅速、特異的に、かつ高感度に検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、洗濯排水等の排水分解処理にバチルス属細菌が関与していることを見出した。そして、かかるバチルス属細菌に特異的な塩基配列を見出し、当該塩基配列を特異的に検出可能なプライマーを設計し、当該プライマーを用いて、検査対象である試料中のＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、バチルス属細菌を迅速かつ特異的に検出し得ることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有するバチルス属細菌の検出方法、活性汚泥の分解処理性能評価方法、及びバチルス属細菌検出用プライマーを提供するものである。
（１）微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、バチルス属細菌の検出方法。
【０００８】
（２）微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、バチルス属細菌の検出方法。
【０００９】
（３）微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ３−１）配列番号５で表される塩基配列、
（Ｆ３−２）配列番号５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ３−３）配列番号５で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ３−４）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ３−１）配列番号６で表される塩基配列、
（Ｒ３−２）配列番号６で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ３−３）配列番号６で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ３−４）配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、バチルス属細菌の検出方法。
【００１０】
（４）微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、
（Ｆ４−１）配列番号７で表される塩基配列、
（Ｆ４−２）配列番号７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ４−３）配列番号７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ４−４）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ４−１）配列番号８で表される塩基配列、
（Ｒ４−２）配列番号８で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ４−３）配列番号８で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ４−４）配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、を用いてＰＣＲを行うことを特徴とする、バチルス属細菌の検出方法。
【００１１】
（５）前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載のバチルス属細菌の検出方法を用いることを特徴とする活性汚泥の分解処理性能評価方法。
（６）微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子において微生物間で共通に保存されている部分を増幅するためのユニバーサルプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲによって得られた増幅産物の量と、前記バチルス属細菌の検出方法を用いて得られた増幅産物の量を比較することにより、活性汚泥中のバチルス属細菌の割合を算出する工程を有する（５）に記載の活性汚泥の分解処理性能評価方法。
【００１２】
（７）（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２）配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするバチルス属細菌検出用プライマー。
【００１３】
（８）（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするバチルス属細菌検出用プライマー。
【００１４】
（９）（Ｆ３−１）配列番号５で表される塩基配列、
（Ｆ３−２）配列番号５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ３−３）配列番号５で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ３−４）配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ３−１）配列番号６で表される塩基配列、
（Ｒ３−２）配列番号６で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ３−３）配列番号６で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ３−４）配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするバチルス属細菌検出用プライマー。
【００１５】
（１０）（Ｆ４−１）配列番号７で表される塩基配列、
（Ｆ４−２）配列番号７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ４−３）配列番号７で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｆ４−４）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｒ４−１）配列番号８で表される塩基配列、
（Ｒ４−２）配列番号８で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ４−３）配列番号８で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、又は
（Ｒ４−４）配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、からなることを特徴とするバチルス属細菌検出用プライマー。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のバチルス属細菌検出用プライマー、及びこれを用いたバチルス属細菌の検出方法により、試料中のバチルス属細菌を迅速かつ特異的に検出でき、これらを活性汚泥における、排水等有機系廃棄物の分解処理性能評価方法に好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、実施例１における、活性汚泥から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
【図２】図２は、比較例１における、大腸菌から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物の電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
【図３】図３は、実施例２における、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いたバチルス属細菌の検出結果である。
【図４】図４は、実施例２における、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いたバチルス属細菌の検出結果である。
【図５】図５は、実施例３における、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いたバチルス属細菌の検出結果である。
【図６】図６は、実施例３における、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いたバチルス属細菌の検出結果である。
【図７】図７は、実施例３における、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いたバチルス属細菌の検出結果である。
【図８】図８は、実施例３における、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いたバチルス属細菌の検出結果である。
【図９】図９は、実施例３における、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いたバチルス属細菌の検出結果である。
【図１０】図１０は、実施例３における、次世代シーケンサーを用いた菌叢解析の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜バチルス属細菌の検出方法＞
［第１実施形態］
本実施形態のバチルス属細菌の検出方法（以下、本実施形態の検出方法ということがある。）は、バチルス属細菌の１６ＳリボゾームＲＮＡのＤＮＡ（以下、１６ＳｒＤＮＡという。）配列に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いて、微生物を含む試料中の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする。
当該試料中にバチルス属細菌が存在していた場合には、ＰＣＲによってプライマー設計から期待される大きさのＰＣＲ産物が得られる。
本実施形態においては、バチルス属細菌の１６ＳｒＤＮＡと特異的にハイブリダイズするプライマーをバチルス属細菌検出用プライマーとして用いることにより、バチルス属細菌を迅速かつ特異的に、検出することができる。
【００１９】
実施例で後述するように、本発明者は、洗濯排水生物処理槽における活性汚泥である洗濯排水馴致汚泥中に生育する微生物の同定を試みたところ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＧＤ０７０６及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｉｃｈｉｎｏｔｙｉが活性汚泥において主に働いている菌（キー微生物）であることを見出した。
【００２０】
バチルス属細菌の１６ＳｒＤＮＡと特異的にハイブリダイズするプライマーを設計するために、本発明者は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＧＤ０７０６の１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ(ＮＣＢＩ（米国立生物工学情報センター）のアクセッション番号：ＤＱ０８４５４０．１（配列番号９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｉｃｈｉｎｏｔｙｉの１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＫＣ０１９１８９．１（配列番号１０）の遺伝子配列情報を取得した。
【００２１】
ＰＣＲ産物の塩基対長が２００〜５００となるようにＰＣＲのフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計することによって、ＰＣＲ効率を高め、ＰＣＲ産物の検出を比較的容易に行うことができる。
また、Ｔｍ（融解温度）値が５７℃〜６１℃となるようにフォワードプライマー及びリバースプライマーを設計することによって、バチルス属細菌を特異的に検出することができる。
そこで、Ｐｒｉｍｅｒ−ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／）を用いて、上述したＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＧＤ０７０６の１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ(ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＤＱ０８４５４０．１（配列番号９）)、及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｉｃｈｉｎｏｔｙｉの１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＮ８９９５６０）（配列番号１０））、それぞれの配列の中から、Ｔｍが５７℃〜６１℃で、互いの距離が２００〜５００塩基長程度となる２つの領域を選択し、それらの領域と特異的にハイブリダイズし得るプライマーを、バチルス属細菌の検出用プライマーとして設計した。
フォワードプライマー及びリバースプライマー間の距離（プライマー部分を含む。）は４１３塩基長であった。
【００２２】
本実施形態においては、多種多様な細菌の中からバチルス属細菌のみを特異的に迅速に検出することが重要である。このため、バチルス属細菌の検出用プライマー中のバチルス属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域は、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡの塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が高い塩基配列であることが好ましい。
【００２３】
本実施形態の検出方法は、微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＧＤ０７０６の１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅ、又は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｉｃｈｉｎｏｔｙｉの１６Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅと特異的にハイブリダイズするリバースプライマーとを用いてＰＣＲを行うことを特徴とする。
【００２４】
フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ１−１）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｆ１−２）配列番号１で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ１−３）配列番号１で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ１−４）配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００２５】
リバースプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｒ１−１）〜（Ｒ１−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｒ１−１）配列番号２で表される塩基配列、
（Ｒ１−２配列番号２で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ１−３）配列番号２で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｒ１−４）配列番号２で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００２６】
尚、本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＣｌｏｎｉｎｇーＡ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１重量％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。
尚、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００２７】
より特異性に優れているため、フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、前記（Ｆ１−１）〜（Ｆ１−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号１で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号１で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。
同様に、リバースプライマーとして用いられるプライマーは、前記（Ｒ１−１）〜（Ｒ１−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号２で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号２で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。
配列番号１で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、４１３塩基対長のＰＣＲ産物が得られる。
【００２８】
フォワードプライマーとして用いられるプライマー及びリバースプライマーとして用いられるプライマーは、いずれも、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域の５’端側に、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡとはハイブリダイズしないその他の塩基配列からなる領域を有していてもよい。当該その他の塩基配列としては、例えば、制限酵素認識配列等、ＰＣＲプライマーに一般的に付加される塩基配列が挙げられる。
【００２９】
本実施形態の検出方法に供される微生物を含む試料は、特に限定されるものではないが、バチルス属細菌が含まれていることが期待される、又はそのおそれのある試料であることが好ましく、バチルス属細菌が含まれていることが期待される又はそのおそれのある試料であることがより好ましい。
【００３０】
本発明者は、洗濯排水生物処理槽における活性汚泥である洗濯排水馴致汚泥中のキー微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＧＤ０７０６及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｉｃｈｉｎｏｔｙｉであることを見出した。かかる知見から検査対象となる試料としては、本実施形態においては、活性汚泥を検査対象とすることが好ましく、洗濯排水馴致汚泥を検査対象とすることがより好ましい。
尚、検査対象である試料からのＤＮＡの抽出及び精製は、分子生物学の分野で公知の手法の中から適宜選択して用いることができる。
【００３１】
本実施形態の検出方法は、特定のバチルス属細菌の検出用プライマーを用いる以外は、常法により実施することができる。すなわち、ＰＣＲに用いるポリメラーゼ、反応用バッファー、ｄＮＴＰ等の各種試薬は、当該技術分野で使用されている公知の試薬等を通常の態様で使用することができる。また、ＰＣＲの温度サイクル条件は、使用するポリメラーゼの特性及び用いるプライマーのＴｍ値等を考慮して適宜決定される。
【００３２】
また、ＰＣＲ産物の検出も、分子生物学の分野で公知の手法の中から適宜選択して用いることができる。代表的な検出方法としては、ＰＣＲ後に標的塩基配列である１６ＳｒＤＮＡが増幅したか否かを評価するエンドポイントアッセイと、１６ＳｒＤＮＡの増幅を経時的（リアルタイム）に測定するリアルタイムアッセイが挙げられる。
【００３３】
エンドポイントアッセイとしては、標的塩基配列である１６ＳｒＤＮＡの増幅を電気泳動により評価する方法が挙げられる。この方法は、１６ＳｒＤＮＡの増幅産物及び核酸分子量マーカーに対して、電気泳動を行い、両者の泳動度を対比することにより、所定の分子量を有する標的塩基配列が増幅された否かを評価する方法である。
電気泳動による検出に用いる試薬としては、二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発する臭化エチジウムやサイバーグリーンが好ましい。
【００３４】
リアルタイムアッセイとしては、リアルタイムＰＣＲ装置を用いた評価方法が挙げられる。リアルタイムＰＣＲは、段階希釈した既知量のＤＮＡをスタンダードとして用い、ＰＣＲによるスタンダードＤＮＡ及び標的塩基配列である１６ＳｒＤＮＡの増幅を経時的に測定し、スタンダードＤＮＡの増幅が指数関数的に起きる分子数の範囲内で、核酸試料中に存在する標的塩基配列の分子数を定量する方法である。
本実施形態の検出方法においては、既知量のＤＮＡをスタンダードとして用いずともよい。例えば、当該検出方法を用いて活性汚泥の分解処理性能を評価する場合、活性汚泥が混入されている汚泥浄化槽中の汚泥を逐次サンプリングして、各時期における活性汚泥中のバチルス属細菌数を相対的に比較すれば足りるからである。
活性汚泥中のバチルス属細菌数を相対的に比較する方法としては、微生物を含む試料中のＤＮＡを鋳型とし、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子において微生物間で共通に保存されている部分を増幅するためのユニバーサルプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲによって得られた増幅産物の量と、本実施形態のバチルス属細菌の検出方法を用いて得られた増幅産物の量を比較することにより、活性汚泥中のバチルス属細菌の割合を算出する工程を有する方法が挙げられる。
該工程において用いられるユニバーサルプライマーセットとしては、配列番号１５で示されるオリゴヌクレオチドと配列番号１６で示されるオリゴヌクレオチドのセットが好ましい。
このようなＰＣＲを用いた工程を有することにより、活性汚泥中に存在する各微生物を単離せずとも、迅速に活性汚泥中のバチルス属細菌の割合を算出できる。
【００３５】
リアルタイムＰＣＲにおける定量方法としては、蛍光色素を用いた方法が挙げられ、具体的には、二本鎖ＤＮＡに特異的にインターカレートして蛍光を発するサイバーグリーン等の色素を用いる方法と、増幅するＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法が挙げられる。
後者の方法に用いられるプローブは、標的塩基配列である１６ＳｒＤＮＡの一部にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドの両端を、それぞれ蛍光物質及び消光物質で修飾したものである。かかるプローブにおいては、蛍光物質と消光物質は近接しているため、蛍光物質の有する蛍光シグナルを発する機能が、消光物質によって妨げられている。
リアルタイムＰＣＲにおいて、バチルス属細菌の検出用プライマーが標的塩基配列である１６ＳｒＤＮＡにアニールする条件下で、プローブは１６ＳｒＤＮＡにハイブリダイズする。続いて、伸長反応の過程で、例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブは分解される。その結果、プローブに修飾されていた蛍光物質及び消光物質は、相互に空間的に分離され、蛍光物質は蛍光シグナルを発することができる。かかる蛍光シグナルは、増幅された標的塩基配列の分子数に比例する。本実施形態の検出方法において、リアルタイムＰＣＲを行った場合の反応時間は約１時間である。
【００３６】
蛍光物質としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８等が挙げられる。
また、消光物質としては、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−ローダミン）、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）等が挙げられる。
【００３７】
プローブとして用いられるオリゴヌクレオチドの塩基配列としては、バチルス属細菌の１６ＳｒＤＮＡを認識し得るもの、又は１６ＳｒＤＮＡにハイブリダイズし得るものであれば特に限定されない。
かかるプローブを用いることにより、１６ＳｒＤＮＡの増幅をより特異的に検出することができる。
【００３８】
更に、実施例において後述するように、本実施形態の検出方法によれば、約７０００倍の希釈系列を作製しても測定可能であることが確認されている。このように、本実施形態の検出方法は、バチルス属細菌を迅速、特異的に、かつ高感度に検出することができる。
【００３９】
［第２実施形態］
本実施形態の検出方法は、第１実施形態の検出方法に用いたバチルス属細菌検出用プライマーとは、別のプライマーを用いて、微生物を含む試料中の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことを特徴とする。設定したプライマーの配列以外は、第１実施形態の検出方法と同様であるため、その説明を省略する。
【００４０】
即ち、フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｆ２−１）〜（Ｆ２−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ２−１）配列番号３で表される塩基配列、
（Ｆ２−２）配列番号３で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ２−３）配列番号３で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ２−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００４１】
また、リバースプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｒ２−１）〜（Ｒ２−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｒ２−１）配列番号４で表される塩基配列、
（Ｒ２−２）配列番号４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ２−３）配列番号４で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｒ２−４）配列番号４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００４２】
より特異性に優れているため、フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、前記（Ｆ２−１）〜（Ｆ２−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号３で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号３で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。
同様に、リバースプライマーとして用いられるプライマーは、前記（Ｒ２−１）〜（Ｒ２−４）の塩基配列を３’末端に有していることが好ましく、配列番号４で表される塩基配列を３’末端に有していることがより好ましく、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡとハイブリダイズする領域が配列番号４で表される塩基配列のみであることがさらに好ましい。
配列番号３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、４１４塩基対長のＰＣＲ産物が得られる。
【００４３】
また、別の実施形態として、以下のフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせが挙げられる。
フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｆ３−１）〜（Ｆ３−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ３−１）配列番号５で表される塩基配列、
（Ｆ３−２）配列番号５で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ３−３）配列番号５で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ３−４）配列番号３で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００４４】
また、リバースプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｒ３−１）〜（Ｒ３−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｒ３−１）配列番号６で表される塩基配列、
（Ｒ３−２）配列番号６で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ３−３）配列番号６で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｒ３−４）配列番号６で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
配列番号５で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、４６５塩基対長のＰＣＲ産物が得られる。
【００４５】
また、別の実施形態として、以下のフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせも挙げられる。
フォワードプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｆ４−１）〜（Ｆ４−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｆ４−１）配列番号７で表される塩基配列、
（Ｆ４−２）配列番号７で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｆ４−３）配列番号７で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｆ４−４）配列番号７で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
【００４６】
また、リバースプライマーとして用いられるプライマーは、具体的には、下記の（Ｒ４−１）〜（Ｒ４−４）のいずれかの塩基配列を含む。
（Ｒ４−１）配列番号８で表される塩基配列、
（Ｒ４−２）配列番号８で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列、
（Ｒ４−３）配列番号８で表される塩基配列と相同性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である塩基配列、又は
（Ｒ４−４）配列番号８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列。
配列番号７で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８で表される塩基配列からなるリバースプライマーとを用いて、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った場合、２８２塩基対長のＰＣＲ産物が得られる。
【００４７】
第１の実施形態と同様、本実施形態の検出方法により、バチルス属細菌を迅速、特異的に、かつ高感度に検出することができる。このため、当該方法を用いることにより、活性汚泥の分解処理性能を評価できる。
【実施例】
【００４８】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
［菌叢解析］
洗濯排水の汚泥浄化槽から活性汚泥を採取し、微生物ＤＮＡ抽出キット（Ｅｘｔｒａｐ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ  Ｐｌｕｓ  ｖｅｒ．２、日鉄住金環境社製）を使い、マニュアルに従い汚泥サンプルからＤＮＡ試料を抽出した。
次いで、抽出したＤＮＡ試料から、標的とする微生物のＤＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子など）をＰＣＲにより増幅し、増幅したＤＮＡ断片をプラスミドに挿入した。このプラスミドを大腸菌に形質転換して培養し、得られたコロニー群の中からランダムに４４コロニーを選択し、選択したコロニーから抽出したプラスミドＤＮＡの塩基配列を解析した。
解析した塩基配列を国際塩基配列データベースと照合し、解析した各塩基配列を有する微生物が、どの微生物種に近縁であるか、相同性検索を行った。結果を表１に示す。表１中の数値は、４４コロニーから同定された微生物の内訳を示す。
【００５０】
【表１】
2014197997.tif 000002
【００５１】
真核生物由来の２コロニーを除く４２コロニーから抽出した遺伝子中、１４コロニーから抽出した遺伝子がバチルス属由来の遺伝子であったことから、活性汚泥中の細菌のうち、バチルス属細菌の存在するおおよその割合は、３３．３％と算出された。同定された微生物中、界面活性剤を分解する能力があること、排水処理汚泥には多数存在することなどから、バチルス属を優占種とした。
【００５２】
［実施例１］
洗濯排水の汚泥浄化槽中の活性汚泥から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として、バチルス属細菌遺伝子の増幅を試みた。
具体的には、鋳型ＤＮＡに、２μＬのバッファー（タカラバイオ社製）、１．６μＬのｄＮＴＰ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ；タカラバイオ社製）、最終濃度５００ｐＭのフォワードプライマー、最終濃度５００ｐＭのリバースプライマー、及び０．１μＬのＴａｋａｒａ  Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ)ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を添加し、さらに適量の水を添加して２０μＬの反応溶液を調製した。当該反応溶液をＰＣＲ装置（Ｏｐｅｎ ＰＣＲ, ｈｔｔｐ：／／ｏｐｅｎｐｃｒ．ｏｒｇ／）にセットし、９５℃で１０分間の変性工程後、１サイクルが９５℃で６０秒間、６０℃で６０秒間、７２℃で６０秒間を３０サイクル行い、その後７２℃で６０秒間の伸長工程を行い、４℃で保存する温度条件で、ＰＣＲを行った。
【００５３】
ＰＣＲ後の各反応液を、４％のＮｕＳｉｅｖｅ ３：１（タカラバイオ社製）アガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った後、当該アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した。図１に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
図１中、レーン１はフォワードプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン２はフォワードプライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン３はフォワードプライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン２’はフォワードプライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１１で表される塩基配列からなる（配列番号４で表される塩基配列の３’末端２塩基を削除したもの）プライマーを用いた反応溶液；レーン３’はフォワードプライマーとして配列番号１２で表される塩基配列からなる（配列番号５で表される塩基配列の３’末端２塩基を削除したもの）プライマーと、リバースプライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン４はフォワードプライマーとして配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン５は非特許文献１に記載のフォワードプライマーとして配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン６はレーン５の反応液の組成から鋳型ＤＮＡを除いて反応させた反応溶液；レーン７は、Ｎａｋａｎｏ． Ｓ， ｅｔ．ａｌ．， Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．， （２００４） ｖｏｌ．６７，ｐｐ．１２７１−１２７７．に記載されているＰＣＲプライマーを用いた反応溶液；レーン８はネガティブコントロール（テンプレートＤＮＡの代わりにミリポア水を用いたもの)；レーン９はタカラバイオ社のＢａｃｔｅｒｉａ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ＰＣＲ Ｋｉｔを用いた反応液を、それぞれアプライしたレーンである。
尚、左端のレーンはＤＮＡラダーマーカー（ＢＣ−ＤＭＯ１２−Ｒ５００；バイオメディカルサイエンス社製）ある。
【００５４】
図１に示すように、本発明のバチルス属細菌検出用プライマーを用いたレーン１に４１３塩基対長付近に１本のバンドが検出され、レーン２に４１４塩基対長付近に１本のバンドが検出され、レーン３に４６５塩基対長付近に１本のバンドが検出され、レーン２’に４１４塩基対長付近に１本のバンドが検出され、レーン３’に４６５塩基対長付近に１本のバンドが検出され、レーン４に２８２塩基対長付近に１本のバンドが検出された。
一方で、鋳型ＤＮＡと対応するプライマーを用いていないレーン６では全くバンドは検出されなかったことから、このレーンではＰＣＲ産物が得られないことが確認された。更に、レーン７においてはバンドがスメアであった。
この結果、本発明の検出方法によれば、バチルス属細菌を精度よく検出できることが確認された。
【００５５】
［比較例１］
大腸菌から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として、大腸菌遺伝子の増幅を試みた。
具体的には、鋳型ＤＮＡ１μＬに、２μＬのバッファー（タカラバイオ社製）、２μＬのｄＮＴＰ（２ｍＭ  ｅａｃｈ；タカラバイオ社製）、１．２μＬ  ２５ｍＭのＭｇＳＯ４、１μＬ  １０μＭのフォワードプライマー、１μＬ  １０μＭのリバースプライマー、及び０．４μＬのＴａｋａｒａ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（１ｕｎｉｔ／μＬ)ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を添加し、さらに適量の水を添加して２０μＬの反応溶液を調製した。当該反応溶液をＰＣＲ装置（Ｏｐｅｎ ＰＣＲ, ｈｔｔｐ：／／ｏｐｅｎｐｃｒ．ｏｒｇ／）にセットし、９４℃で１２０秒間の変性工程後、１サイクルが９８℃で１０秒間、６８℃で３０秒間を３０サイクル行い、その後６８℃で６０秒間の伸長工程を行い、４℃で保存する温度条件で、ＰＣＲを行った。図２に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
図２中、レーン１はフォワードプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン２はフォワードプライマーとして配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン３はフォワードプライマーとして配列番号５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン４はフォワードプライマーとして配列番号７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン５はフォワードプライマーとして配列番号１３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン６はレーン１の反応液の組成から鋳型ＤＮＡを除いて反応させた反応溶液；レーン７はレーン５の反応液の組成において、大腸菌ＤＮＡの代わりに洗濯排水の汚泥浄化槽中の活性汚泥から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型として反応させた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。
尚、レーン左端は１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡ライフサイエン社製））である。
【００５６】
図２に示すように、大腸菌から抽出された染色体ＤＮＡを鋳型とし、本発明のバチルス属細菌検出用プライマーを用いてＰＣＲを行った場合、ＰＣＲ産物が得られないことが確認された。
この結果、本発明の検出方法によれば、バチルス属細菌を特異的に検出できることが確認された。
【００５７】
［実施例２］
バチルス属細菌の検出系を、定量ＰＣＲを用いて構築した。定量ＰＣＲ試薬として、ライトサイクラー ファストスタートＤＮＡマスターＰＬＵＳ ＳＹＢＲグリーンＩ（ロッシュアプライドサイエンス社製）を用いた。
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１で示されるオリゴヌクレオチドを用い、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号２で示されるオリゴヌクレオチドを用いたプライマーセット１；Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号３で示されるオリゴヌクレオチドを用い、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドを用いたプライマーセット２；Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドを用い、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドを用いたプライマーセット３；Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号７で示されるオリゴヌクレオチドを用い、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号８で示されるオリゴヌクレオチドを用いたプライマーセット４；Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１３で示されるオリゴヌクレオチドを用い、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１４で示されるオリゴヌクレオチドを用いたプライマーセット５；Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒとして、配列番号１３で示されるオリゴヌクレオチドを用い、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１４で示されるオリゴヌクレオチドを用いたプライマーセット５；Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒとして、配列番号１５で示されるオリゴヌクレオチドを用い、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号１６で示されるオリゴヌクレオチドを用いたプライマーセット６（以下、ユニバーサルプライマーセットという。）を準備した。
尚、ユニバーサルプライマーセットは、１６ＳｒＤＮＡ遺伝子において、微生物（特に細菌）間で共通に保存されている部分を増幅するためのプライマーセットである。
【００５８】
上記定量ＰＣＲ試薬と、上記プライマーセットと、バチルス属細菌が存在することが確認されている汚泥由来の遺伝子又はバチルス属細菌が殆ど存在しないことが確認されている汚泥由来の遺伝子と、の混合溶液２０μｌを作製した。
定量ＰＣＲ装置として、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｃａｒｏｕｓｅｌ−Ｂａｓｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ（ロッシュアプライドサイエンス社製）を使用し、９８℃の初期ｄｅｎａｔｕｒｅ  １２０秒の後、９８℃１０秒、６０℃１０秒、６８℃３０秒の３ステップ反応を４０サイクル行った。
【００５９】
定量ＰＣＲ装置を用いた測定結果を図３及び図４に示す。図３は、鋳型としてバチルス属細菌が存在することが確認されている汚泥由来の遺伝子を用いた場合の測定結果であり、図４は、鋳型としてバチルス属細菌が殆ど存在しないことが確認されている汚泥由来の遺伝子を用いた場合の測定結果である。図３及び図４中の増幅曲線は、ＰＣＲサイクル数を横軸とし、遺伝子増幅量である蛍光強度を縦軸としたものである。
バチルス属細菌が存在することが確認されている汚泥由来の遺伝子を用いた場合、図３中の各増幅曲線が線形性を示す部分（例えば、縦軸の蛍光強度が１を示す部分）において、ユニバーサルプライマーセット（図３中のＵｎｉｖｅｒｓａｌ）を含有する反応液の立ち上がりが最も早く、次いでプライマーセット１〜５を含有する反応液の立ち上がりが確認された。
一方、バチルス属細菌が殆ど存在しないことが確認されている汚泥由来の遺伝子を用いた場合、図４中の各増幅曲線が線形性を示す部分（例えば、縦軸の蛍光強度が１を示す部分）において、ユニバーサルプライマーセット（図４中のＵｎｉｖｅｒｓａｌ）を含有する反応液の立ち上がりは、図３と同様だったが、プライマーセット１〜５を含有する反応液においては３０サイクルを超えてやっと立ち上がりが確認された。
【００６０】
［実施例３］
バチルス属細菌が存在することが確認されている汚泥由来の遺伝子として、１倍,３倍,９倍,２７倍,８１倍,２４３倍,７２９倍,２１８７倍,６５６１倍,１９６８３倍に希釈した汚泥由来の遺伝子をそれぞれ用いた以外は、実施例２と同様の方法にて、定量ＰＣＲを行った。次いで、各プライマーセットにおいて、各増幅曲線の接線と、縦軸との交点をプロットしたグラフを作成した。図５〜図９中、横軸は活性汚泥由来ＤＮＡ相対量を示し、縦軸は蛍光強度を示す。図５は、ユニバーサルプライマーセットを用いた場合のグラフであり、図６は、プライマーセット１を用いた場合のグラフであり、図７は、プライマーセット２を用いた場合のグラフであり、図８は、プライマーセット３を用いた場合のグラフであり、図９は、プライマーセット３を用いた場合のグラフである。
図６〜９に示すように、全てのプロットが直線上に乗ることが示された。即ち、本発明の検出方法によれば、約２００００倍の検出感度を有することが確認された。
【００６１】
更に、一定の活性汚泥由来ＤＮＡ相対量における、ユニバーサルプライマーセットを用いた場合の蛍光強度と、プライマーセット１〜３のいずれかを用いた場合の蛍光強度の比を算出した。例えば、一定の活性汚泥由来ＤＮＡが１の場合において、ユニバーサルプライマーセットを用いた場合の蛍光強度は１．８×１０−４であり、プライマーセット１を用いた場合の蛍光強度が２．６×１０−５である。これらの値と、各プライマーセットを用いて得られた増幅産物の大きさの違いを考慮した補正係数を用いると、プライマーセット１を用いた場合の蛍光強度とユニバーサルプライマーセットを用いた場合の蛍光強度の比は、０．１４（１４％）と算出される。この値は、次世代シーケンサーを用いて行った菌叢解析（北海道システムサイエンス社に依頼した。）における活性汚泥中のバチルス属細菌の存在割合（１４９７リード総数中、２１０リード数がバチルス属細菌由来の遺伝子であった。図１０に同定された微生物を示す。）と同じ値であった。
【００６２】
この結果から、本発明によれば、活性汚泥中の各細菌を単離せずとも、活性汚泥中のバチルス属細菌の割合を迅速に測定できることが確認された。
以上の結果から、バチルス属細菌検出用プライマーを用いた本発明の検出方法により、バチルス属細菌を迅速に、特異的かつ高感度に検出できることが確認された。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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