(57)【要約】  アルコール溶媒およびアルコール溶媒中にて二次構造が誘起され、かつ、複数の固定化官能基を有する短鎖ペプチドを含むアルコール溶液を準備する工程と、固定化官能基と反応する反応性基を有するスペーサーが結合された担体とアルコール溶液とを接触させて、短鎖ペプチドをスペーサーに固定化する工程とを備える、短鎖ペプチドの二次構造が保持される短鎖ペプチド固定化担体の製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール溶媒および前記アルコール溶媒中にて二次構造が誘起され、かつ、複数の固定化官能基を有する短鎖ペプチドを含むアルコール溶液を準備する工程と、
前記固定化官能基と反応する反応性基を有するスペーサーが結合された担体と前記アルコール溶液とを接触させて、前記短鎖ペプチドを前記スペーサーに固定化する工程と
を備える、短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
【請求項２】
前記短鎖ペプチドが３４残基以下である、請求項１に記載の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
【請求項３】
前記短鎖ペプチドと前記スペーサーとが共有結合を介して固定化される、請求項１または２に記載の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
【請求項４】
前記スペーサーの分子量が１００００以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
【請求項５】
前記固定化官能基がチオール基およびアミノ基からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
【請求項６】
前記固定化官能基が前記短鎖ペプチドの少なくとも一方の末端に位置する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
【請求項７】
前記短鎖ペプチドが、前記固定化官能基を有するアミノ酸残基が複数含まれ、かつ、前記固定化官能基を有するアミノ酸残基の間に固定化官能基を有しないアミノ酸残基を少なくとも１つ含む部分構造を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
【請求項８】
担体と、前記担体上に結合されたスペーサーと、前記スペーサー上に配置され、かつ、二次構造が保持されている短鎖ペプチドとを有する短鎖ペプチド固定化担体。
【請求項９】
前記担体と前記スペーサーとが共有結合によって結合されている、請求項８に記載の短鎖ペプチド固定化担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短鎖ペプチド固定化担体の製造方法および短鎖ペプチド固定化担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗体医薬の開発が活況を呈している。ヒト免疫機能を使う抗体医薬は高い効能が期待できるうえ、副作用も比較的少ないため、今後の医療の中心とみられているからである。抗体医薬の開発・実用化に欠かせない技術が抗体の連続・大量・高速の精製技術である。抗体の精製のために、現在最も一般的に利用されている方法はプロテインＡをリガンドとして用いたアフィニティクロマトグラフィー法である。【０００３】
しかし、プロテインＡは、遺伝子工学的方法を用いて製造されるため、製造工程が煩雑であり、プロテインＡそのものをアフィニティクロマトグラフィー用リガンドとして用いると、結果的に高コストになるという問題があった。【０００４】
このような問題に対しては、プロテインＡのＩｇＧ（Immunoglobulin G；イムノグロブリンＧ）と相互作用をする部分のアミノ酸配列に基づいて、長さが概ね５０残基以下の短鎖ペプチドを用いることが検討されてきた（例えば、非特許文献１）。【０００５】
一方、短鎖ペプチドを担体上に固定化する方法としては、例えば、特許文献１に記載された、基板上に二次元微細薄膜を形成する方法が挙げられる。この方法は、薄膜を形成するための有機分子材料として、少なくともペプチド鎖を有し、そのペプチド鎖が、（１）４〜５０のアミノ酸残基で構成される、（２）少なくとも親水性アミノ酸残基および疎水性アミノ酸残基を有する、および（３）基材上に吸着され得、吸着された際にはβ−シート構造を形成し得るアミノ酸配列を有する、の３条件をいずれも具備することを特徴とする有機分子材料を用意する工程と、ペプチド鎖がα−へリックスまたはランダムコイル構造を保ち得る濃度でその有機分子材料を含み且つ有機分子材料が個々に遊離して分散した状態の溶液を調製する工程と、溶液を基材の表面に供給し、溶液中の有機分子材料を基材上に吸着させるとともに基材上に吸着した際の有機分子材料のペプチド鎖がそれぞれβ−シートを形成してなる単分子膜を基材上に設ける工程とを含むことを特徴とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１０−００１２３８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Braisted, A. C.、外1名、「Minimizing a binding domain from protein A」、米国科学アカデミー紀要、米国科学アカデミー、1996年6月、第93巻、第12号、ｐ．5688-5692
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、本発明者が検討した限りでは、特許文献１に記載の方法では、溶液中で短鎖ペプチドに誘起させた二次構造を保持したまま担体に固定化することが困難であった。意図的に誘起形成した二次構造をそのまま固定化できないことで、固定化により短鎖ペプチドの二次構造が変化し、抗原抗体反応等の立体構造を利用した結合能が低下したり、失われたりすることが問題となる。また、単分子層形成が必要であり、コストが高く、実用に耐えなかった。【０００９】
そこで、本発明は、短鎖ペプチドの二次構造が保持される短鎖ペプチド固定化担体の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、アルコール溶媒およびアルコール溶媒中にて二次構造が誘起され、かつ、複数の固定化官能基を有する短鎖ペプチドを含むアルコール溶液を準備する工程と、固定化官能基と反応する反応性基を有するスペーサーが結合された担体とアルコール溶液とを接触させて、短鎖ペプチドをスペーサーに固定化する工程とを備えることにより、短鎖ペプチドを、二次構造を保持したまま、担体に固定化することができることを知得し、本発明を完成させるに至った。本発明では、抗原抗体反応が可能な短鎖ペプチド固定化担体を得ることができ、高い結合性を有する担体を得ることが出来る。また、反応性基を有するスペーサーを利用することで、単分子層形成が不要であり、低コスト化が可能となる。【００１１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）を提供する。
（１）アルコール溶媒およびアルコール溶媒中にて二次構造が誘起され、かつ、複数の固定化官能基を有する短鎖ペプチドを含むアルコール溶液を準備する工程と、
固定化官能基と反応する反応性基を有するスペーサーが結合された担体とアルコール溶液とを接触させて、短鎖ペプチドをスペーサーに固定化する工程と
を備える、短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
（２）短鎖ペプチドが３４残基以下である、上記（１）に記載の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
（３）短鎖ペプチドとスペーサーとが共有結合を介して固定化される、上記（１）または（２）に記載の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
（４）スペーサーの分子量が１００００以下である、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
（５）固定化官能基がチオール基およびアミノ基からなる群から選択される少なくとも１種である、上記（１）〜（４）のいずれか１つに記載の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
（６）固定化官能基が短鎖ペプチドの少なくとも一方の末端に位置する、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
（７）短鎖ペプチドが、固定化官能基を有するアミノ酸残基が複数含まれ、かつ、固定化官能基を有するアミノ酸残基の間に固定化官能基を有しないアミノ酸残基を少なくとも１つ含む部分構造を有する、上記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法。
（８）担体と、担体上に結合されたスペーサーと、スペーサー上に配置され、かつ、二次構造が保持されている短鎖ペプチドとを有する短鎖ペプチド固定化担体。
（９）担体とスペーサーとが共有結合によって結合されている、上記（８）に記載の短鎖ペプチド固定化担体。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、水系溶媒中でも短鎖ペプチドの二次構造が保持される短鎖ペプチド固定化担体の製造方法を提供することができる。【００１３】
また、本発明によれば、水系溶媒中でも短鎖ペプチドの二次構造が保持された短鎖ペプチド固定化担体を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」という場合がある。）について説明する。
【００１５】
［短鎖ペプチド固定化担体の製造方法］
本発明の短鎖ペプチド固定化担体の製造方法は、アルコール溶媒およびアルコール溶媒中にて二次構造が誘起され、かつ、複数の固定化官能基を有する短鎖ペプチドを含むアルコール溶液を準備する工程（以下「工程Ａ」という。）と、固定化官能基と反応する反応性基を有するスペーサーが結合された担体とアルコール溶液とを接触させて、短鎖ペプチドをスペーサーに固定化する工程（以下「工程Ｂ」という。）とを備えることを特徴とする。
【００１６】
〈用語の説明〉
まず、本発明において用いられる用語について説明する。
【００１７】
１．短鎖ペプチド
（１）短鎖ペプチドの定義
「短鎖ペプチド」とは、アミノ酸残基数が約５０残基以下であるペプチドをいう。ただし、複数のドメインが結合した融合ペプチドにあっては、アミノ酸残基の総数が約５０残基以下である融合ペプチドをいう。
【００１８】
（２）本発明の短鎖ペプチド
本発明において用いる短鎖ペプチド（以下「本発明の短鎖ペプチド」という場合がある。）は、アルコール溶媒中で二次構造が誘起され、かつ、複数の固定化官能基を有する。
【００１９】
本発明の短鎖ペプチドは、アルコール溶媒中で二次構造が誘起される。ここで、「二次構造」は、短鎖ペプチド主鎖の部分的な立体構造をいい、例えば、αヘリックス、βシート、βターン、３１０ヘリックス、πヘリックス、および２．２７リボン等の構造を含む。また、「アルコール溶媒中で二次構造が誘起される」とは、アルコール溶媒中での二次構造含有率が、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid；４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸））緩衝液、トリス緩衝液、またはリン酸緩衝液等のｐＨが５〜９の中性付近かつ１０〜３０℃である水系溶媒中での二次構造含有率の１．５倍以上となることをいう。アルコール溶媒中での二次構造含有率は、水系溶媒中での二次構造含有率の２倍以上が好ましく、３倍以上がより好ましい。ここで、二次構造含有率は、ＣＤ（circular dichroism；円偏光二色性）により算出することができる。例えば、円二色性分散計（Ｊ−８２０，日本分光社製）を用いてＣＤスペクトルを測定し、得られたＣＤスペクトルを基にタンパク質二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ−４８０，日本分光社製）を用いて二次構造を解析して得られる。
【００２０】
本発明の短鎖ペプチドのアミノ酸残基数は、５０残基以下であれば特に制限されない。アルコール溶媒への溶解性の観点から、本発明の短鎖ペプチドのアミノ酸残基数は、好ましくは３４残基以下であり、より好ましくは３０残基以下であり、さらに好ましくは２５残基以下であり、いっそう好ましくは２０残基以下である。また、二次構造を誘起する観点から、本発明の短鎖ペプチドのアミノ酸残基数は、好ましくは５残基以上であり、より好ましくは７残基以上であり、さらに好ましくは１０残基以上である。さらに、本発明の短鎖ペプチドのアミノ酸残基数は、好ましくは５〜５０残基の範囲内であり、より好ましくは５〜３４残基の範囲内であり、さらに好ましくは７〜３０残基の範囲内であり、いっそう好ましくは７〜２５残基の範囲内であり、よりいっそう好ましくは１０〜２０残基の範囲内である。
【００２１】
なお、本発明において、数値範囲を「〜」を用いて表した場合には、その数値範囲の両端をその数値範囲に含むものとする。例えば、「５〜５０」という数値範囲には、下限である「５」および上限である「５０」を含む。
【００２２】
本発明の短鎖ペプチドの分子量は、特に限定されない。
抗原性の観点から、本発明の短鎖ペプチドの分子量は、アミノ酸残基の分子量の合計で、好ましくは５０００以下であり、より好ましくは３５００以下であり、さらに好ましくは３０００以下である。また、二次構造を誘起する観点から、本発明の短鎖ペプチドの分子量は、アミノ酸残基の分子量の合計で、好ましくは５００以上であり、より好ましくは６００以上であり、さらに好ましくは８００以上である。さらに、抗原性を発現せず、二次構造を誘起する観点から、本発明の短鎖ペプチドの分子量は、好ましくは５００〜５０００であり、より好ましくは６００〜３５００であり、さらに好ましくは８００〜３０００である。
【００２３】
本発明の短鎖ペプチドを構成するアミノ酸残基は、天然アミノ酸に由来するアミノ酸残基のみを含むものであってもよいし、さらに、非天然アミノ酸に由来するアミノ酸残基を含んでもよい。天然アミノ酸および非天然アミノ酸については後述する。
【００２４】
本発明の短鎖ペプチドが有する複数個の固定化官能基（以下「本発明の短鎖ペプチドの固定化官能基」という場合がある。）は、スペーサーが持つ官能基と反応性を有するものであれば特に限定されない。
本発明の短鎖ペプチドの固定化官能基としては、例えば、アミノ基（アミド結合形成）、カルボキシル基、水酸基、およびチオール基などが挙げられる。ここで、反応性とは、本発明の短鎖ペプチドの固定化官能基とスペーサーが持つ官能基とが反応して共有結合を形成する性質をいう。上記共有結合は、特に限定されないが、安定な結合を形成するものが好ましい。上記共有結合としては、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合（アミド結合）、ホスホジエステル結合、グリコシド結合、ジアゾ結合、チオエーテル結合、オレフィン結合、エポキシ結合、およびクリックケミストリーの反応の結果得られる結合等が挙げられる。これらの共有結合の中でも、結合安定性の観点から、ペプチド結合、チオエーテル結合、オレフィン結合、およびクリックケミストリーの反応の結果得られる結合から選択されるものが好ましい。
本発明の短鎖ペプチドの固定化官能基としては、例えば、チオール基、アミノ基、カルボキシ基、ヒドロキシ基、リン酸エステル基、エポキシ基、グリシジル基、アジド基、およびアルキニル基等が挙げられる。本発明の短鎖ペプチドの固定化官能基としては、チオール基およびアミノ基からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
なお、本発明の短鎖ペプチドの固定化官能基の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上を組み合わせてもよい。
【００２５】
本発明の短鎖ペプチドにおける固定化官能基を有するアミノ酸残基の位置は、特に限定されない。例えば、本発明の短鎖ペプチドは、固定化官能基を有するアミノ酸残基が、本発明の短鎖ペプチドのペプチド鎖の、Ｎ末端側またはＣ末端側の一方に集中して配置された構造であってもよいし、Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に分散して配置された構造であってもよい。
【００２６】
Ｎ末端側に集中して配置された構造の短鎖ペプチドの非限定的な一例としては、配列番号１で示されるペプチドのＮ末端にリシン残基（Ｋ）を３個結合した「ＫＫＫＥＱＱＮＡＦＹ」を挙げることができる。また、Ｃ末端側に集中して配置された構造の短鎖ペプチドの非限定的な一例としては、配列番号１で示されるペプチドのＣ末端にリシン残基（Ｋ）を３個結合した「ＥＱＱＮＡＦＹＫＫＫ」を挙げることができる。さらに、Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に分散して配置された構造の短鎖ペプチドの非限定的な一例としては、配列番号１で示されるペプチドのＮ末端およびＣ末端にリシン残基（Ｋ）を３個ずつ結合した「ＫＫＫＥＱＱＮＡＦＹＫＫＫ」を挙げることができる。この場合、固定化官能基は、リシン残基の側鎖のεアミノ基およびＮ末端のアミノ基である。
【００２７】
また、短鎖ペプチドは、固定化官能基を有するアミノ酸残基の間に、固定化官能基を有しないアミノ酸残基を少なくとも１つ含む部分構造を有するものであってもよい。
固定化官能基を有するアミノ酸残基の間に、固定化官能基を有しないアミノ酸残基を少なくとも１つ含む部分構造を有する短鎖ペプチドの非限定的な一例としては、固定化官能基を有するアミノ酸残基としてリシン残基（Ｋ）を採用し、固定化官能基を有しないアミノ酸残基を少なくとも１つ含む部分構造として配列番号１で示されるペプチド「ＥＱＱＮＡＦＹ」を採用した、「ＫＥＱＱＮＡＦＹＫＥＱＱＮＡＦＹＫ」を挙げることができる。ここで、固定化官能基は、リシン残基の側鎖のεアミノ基およびＮ末端のアミノ基である。
【００２８】
本発明の短鎖ペプチドとしては、抗体結合性を有する短鎖ペプチドが好ましい。
ここで、抗体結合性とは、抗体または抗体誘導体と、ある親和性をもって結合する性質をいう。抗体または抗体誘導体との結合は、抗原抗体反応による結合が好ましく、結合する部位としては、抗体または抗体誘導体の定常領域（Ｆｃ領域、ＣＬ領域、ＣＨ領域）が好ましい。
【００２９】
「抗体」とは、免疫グロブリンまたはその類縁体、フラグメントもしくは融合体をいう。ここで、類縁体とは、免疫グロブリンの構造または機能が少なくとも部分的に保持された、天然の、または人工的に作製された、タンパク質またはタンパク質コンジュゲートをいう。また、フラグメントとは、酵素的な処理または遺伝子工学的な設計によって作製された、免疫グロブリンの部分構造を有するタンパク質をいう。また、融合体とは、各種サイトカインまたはサイトカイン受容体等の生物活性を有するタンパク質の機能部分を、免疫グロブリンの全体または一部と遺伝子工学的に融合させて作製したタンパク質をいう。また、抗体としては、モノクローナル抗体または免疫グロブリンのＦｃ領域を有する融合体が好ましく、モノクローナル抗体がより好ましい。なお、本発明において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ（Immunoglobulin G，免疫グロブリンＧ）、ＩｇＭ（Immunoglobulin M，免疫グロブリンＭ）、ＩｇＡ（Immunoglobulin A，免疫グロブリンＡ）、ＩｇＤ（Immunoglobulin D，免疫グロブリンＤ）およびＩｇＥ（Immunoglobulin E，免疫グロブリンＥ）の５種類のクラス（アイソタイプ）のいずれでもよいが、ＩｇＧまたはＩｇＭが好ましく、ＩｇＧがより好ましい。
【００３０】
「抗体誘導体」とは、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＦａｂ領域とを融合させたキメラ抗体、ヒト免疫グロブリンのいくつかのＦｃ領域と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのいくつかのＦｖ領域とを融合させたキメラ抗体、ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ（相補性決定領域）部分を除いた残余の部分と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンＣＤＲ部分とを融合させたヒト型化抗体、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＦｃ領域とヒト免疫グロブリンのＦａｂ領域とを融合させたキメラ抗体、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのいくつかのＦｃ領域とヒト免疫グロブリンのいくつかのＦｖ領域とを融合させたキメラ抗体、ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ部分を除いた残余の部分と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＣＤＲ部分とを融合させた非ヒト哺乳動物化抗体、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＦｃ領域と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＦａｂ領域とを融合させたキメラ抗体、非ヒト哺乳動物グロブリンのいくつかのＦｃ領域と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのいくつかのＦｖ領域とを融合させたキメラ抗体、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＣＤＲ（相補性決定領域）部分を除いた残余の部分と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンＣＤＲ部分とを融合させた非ヒト哺乳動物型抗体、およびこれらの化学的修飾を加えたタンパク質であって、Ｆｃ領域を保持するタンパク質をいう。
【００３１】
本発明の短鎖ペプチドは、抗体結合ドメインと、スペーサー結合ドメインとからなる構造、または、さらにドメイン間を連結するリンカーを含む構造であることが好ましい。また、本発明の短鎖ペプチドは、抗体結合ドメインを複数有する融合ペプチドであってもよい。抗体結合性を有する本発明の短鎖ペプチドを、二次構造を保ったまま固定化することによって、抗体吸着剤および抗体保持担体等が低コストで実現できるようになる。
なお、ドメインおよびスペーサーについては後述する。
【００３２】
上記抗体結合ドメインのアミノ酸配列は、抗体結合性を有し、かつ、抗体または抗体誘導体に結合しうるものであれば特に限定されない。上記抗体結合ドメインのアミノ酸配列としては、表１に示す配列番号１〜３８のアミノ酸配列の少なくとも１つと、８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるものが好ましく、８７％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるものがより好ましく、９０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるものがさらに好ましく、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるものがいっそう好ましく、配列番号１〜３８のアミノ酸配列からなる群から選択されるものが特に好ましい。
【００３３】
ここで、２つのアミノ酸配列の配列相同性は、次のようにして求める。
（ａ）２つのアミノ酸配列のアラインメントを行う
一致（マッチ）は＋１、不一致（ミスマッチ）は−１、ギャップは−１のスコアを与え、アラインメント・スコアが最大となるようにアラインメントを行う。
（ｂ）配列相同性を計算する
得られたアラインメントに基づいて、次式により配列相同性を計算する。
配列相同性［％］＝（一致ポジション数／全ポジション数）×１００［％］
全ポジション数はアラインメントの長さであり、一致ポジション数はアミノ酸の種類が一致するポジションの数である。
ここで、アミノ酸残基の種類が一致するか否かの判断は、そのアミノ酸残基の元になるアミノ酸の側鎖（アミノ酸側鎖）の構造が同一であるか否かによるものとする。なお、エナンチオマーの関係にあるアミノ酸の側鎖の構造は同一ではない。
（ｃ）配列相同性の計算例
例えば、次のアミノ酸配列を考える。
配列Ａ  ＥＱＱＮＡＦＹ
配列Ｂ  ＫＥＱＱＳＡＦＹ
これを、上記した条件の下でアラインメントすると、次のようになる。ここで、配列Ａ、Ｂ間でアミノ酸（残基）の種類が一致する箇所には、見やすくするため、ホモロジー・ストリング「｜」を付けている。また、「−」はギャップである。
配列Ａ  −ＥＱＱＮＡＦＹ
｜｜｜  ｜｜｜
配列Ｂ  ＫＥＱＱＳＡＦＹ
このアラインメントのスコアは、一致（＋１）×６＋不一致（−１）×１＋ギャップ（−１）×１＝４である。
この例では、全ポジション数は８であり、一致ポジション数は６であるから、上記式に従って算出した配列相同性は、６／８×１００＝７５．０％である。
【００３４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列（EQQNAFY）と８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列（EGQNAFY）、配列番号７で示されるアミノ酸配列（EQNAFY）、配列番号１０で示されるアミノ酸配列（EQQSAFY）などが挙げられる。
配列番号２で示されるアミノ酸配列（EQQNAFYEILH）と８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列（EQQNAFYEILHL）、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（EQQSAFYEILH）などが挙げられる。
配列番号３で示されるアミノ酸配列（EQQNAFYEILHL）と８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列としては、例えは、配列番号２で示されるアミノ酸配列（EQQNAFYEILH）などが挙げられる。
配列番号４で示されるアミノ酸配列（EGQNAFY）と８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列（EQQNAFY）、配列番号７で示されるアミノ酸配列（EQNAFY）、配列番号１０で示されるアミノ酸配列（EQQSAFY)などが挙げられる。
配列番号５で示されるアミノ酸配列（EGQNAFYEILH）と８５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列（EQQNAFYEILH）、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（EQQSAFYEILH）などが挙げられる。
配列番号６で示されるアミノ酸配列（EGQNAFYEILHL）と配列相同性８５％以上を有するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列（EQQNAFYEILHL）などが挙げられる。
配列番号７で示されるアミノ酸配列（EQNAFY）と配列相同性８５%以上を有するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列（EQQNAFY）、配列番号４で示されるアミノ酸配列（EGQNAFY）などが挙げられる。
配列番号８で示されるアミノ酸配列（EQNAFYEILH）と配列相同性８５％以上を有するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列（EQQNAFYEILH）、配列番号５で示されるアミノ酸配列（EGQNAFYEILH）、配列番号９で示されるアミノ酸配列（EQNAFYEILHL）などが挙げられる。
配列番号９で示されるアミノ酸配列（EQNAFYEILHL）と配列相同性８５％以上を有するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列（EQQNAFYEILHL）、配列番号６で示されるアミノ酸配列（EGQNAFYEILHL）、配列番号８で示されるアミノ酸配列（EQNAFYEILH）などが挙げられる。
配列番号１０で示されるアミノ酸配列（EQQSAFY）と配列相同性８５％以上を有するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列（EQQNAFY）、配列番号１３で示されるアミノ酸配列（DQQSAFY）などが挙げられる。
配列番号１１で示されるアミノ酸配列（EQQSAFYEILH）と配列相同性８５％以上を有するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列（EQQNAFYEILH）、配列番号１２で示されるアミノ酸配列（EQQSAFYEILHL）、配列番号１４で示されるアミノ酸配列（DQQSAFYEILH）などが挙げられる。
配列番号１２で示されるアミノ酸配列（EQQSAFYEILHL）と配列相同性８５％以上を有するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号３で示されるアミノ酸配列（EQQNAFYEILHL）、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（EQQSAFYEILH）、配列番号１５で示されるアミノ酸配列（DQQSAFYEILHL）などが挙げられる。
配列番号１３で示されるアミノ酸配列（DQQSAFY）と配列相同性８５％以上を有するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１０で示されるアミノ酸配列（EQQSAFY）などが挙げられる。
【００３５】
【表１】
2016167143.tif 000002
【００３６】
（３）アミノ酸残基／アミノ酸
３．１）アミノ酸残基
「アミノ酸残基」の用語は、ＩＵＰＡＣ（International Union of Pure and Applied Chemistry；国際純正・応用化学連合）ゴールド・ブックの定義に従う。すなわち、２個以上のアミノ酸が分子間でペプチド結合することによってペプチドを形成した時の、アミノ酸分子がペプチド結合の際に脱水された残りの部分をアミノ酸残基という。したがって、ペプチド鎖を構成するユニットはアミノ酸残基である。また、ペプチド鎖では、Ｃ末端のアミノ酸残基をＣ端残基といい、Ｎ末端のアミノ酸残基をＮ端残基という。アミノ酸残基はその由来するアミノ酸の種類が同じであれば同じ種類のアミノ酸残基として取り扱う。
【００３７】
３．２）アミノ酸
「アミノ酸」とは、特に断らない限り、分子中にアミノ基（−ＮＨ２）またはイミノ基とカルボキシル基とを有する有機化合物であって、２個以上がペプチド結合することによってペプチドを形成しうるものをいう。
【００３８】
アミノ酸の名称、略号は、原則として、国際純正・応用化学連合と国際生化学・分子生物学連合による共同命名委員会（INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY and INTERNATIONAL UNION OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN)）で採用された名称、略号等を用いて表す。表２には、１文字略号および３文字略号が公式に認められたα−アミノ酸の名称および略号（１文字略号、３文字略号）を示す。なお、任意のアミノ酸を表す“Xaa”は、表２に示すアミノ酸以外のアミノ酸を表す場合にも用いることができる。
【００３９】
【表２】
2016167143.tif 000003
【００４０】
本発明においては、天然アミノ酸のみならず、非天然アミノ酸に由来するアミノ酸残基もペプチド鎖を構成するユニットとして用いることができる。本発明の短鎖ペプチドは、天然アミノ酸のみによって構成されてもよいし、非天然アミノ酸のみによって構成されてもよいし、天然アミノ酸および非天然アミノ酸の両方を含んでもよい。天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含む場合の天然アミノ酸と非天然アミノ酸との比率（モル比率）は特に限定されない。
【００４１】
３．２．１）天然アミノ酸
「天然アミノ酸」とは、天然でｍＲＮＡ（messenger RNA；伝令ＲＮＡ；RNA=ribonucleotide）上にコード化されているアミノ酸をいう。天然アミノ酸とは、具体的には、グリシン（Gly）、Ｌ−アラニン（Ala）、Ｌ−アルギニン（Arg）、Ｌ−アスパラギン（Asn）、Ｌ−アスパラギン酸（Asp）、Ｌ−システイン（Cys）、Ｌ−グルタミン（Gln）、Ｌ−グルタミン酸（Glu）、Ｌ−ヒスチジン（His）、Ｌ−イソロイシン（Ile）、Ｌ−ロイシン（Leu）、Ｌ−リシン（Lys）、Ｌ−メチオニン（Met）、Ｌ−フェニルアラニン（Phe）、Ｌ−プロリン（Pro）、Ｌ−セリン（Ser）、Ｌ−トレオニン（Thr）、Ｌ−トリプトファン（Trp）、Ｌ−チロシン（Tyr）、Ｌ−バリン（Val）、Ｌ−ピロリシン（Pyl）およびＬ−セレノシステイン（Sec）の２２種類のアミノ酸をいう。
なお、これらのアミノ酸（グリシンを除く。）のエナンチオマーは、天然アミノ酸には含まれない。
【００４２】
３．２．２）非天然アミノ酸
「非天然アミノ酸」とは、天然ではｍＲＮＡ（messenger RNA；伝令ＲＮＡ；RNA=ribonucleotide）上にコード化されていないアミノ酸をいう。非天然アミノ酸は、特に限定されないが、例えば、Ｄ−アラニン（D-Ala）、Ｄ−アルギニン（D-Arg）、Ｄ−アスパラギン（D-Asn）、Ｄ−アスパラギン酸（D-Asp）、Ｄ−システイン（D-Cys）、Ｄ−グルタミン（D-Gln）、Ｄ−グルタミン酸（D-Glu）、Ｄ−ヒスチジン（D-His）、Ｄ−イソロイシン（D-Ile）、Ｄ−ロイシン（D-Leu）、Ｄ−リシン（D-Lys）、Ｄ−メチオニン（D-Met）、Ｄ−フェニルアラニン（D-Phe）、Ｄ−プロリン（D-Pro）、Ｄ−セリン（D-Ser）、Ｄ−トレオニン（D-Thr）、Ｄ−トリプトファン（D-Trp）、Ｄ−チロシン（D-Tyr）、Ｄ−バリン（D-Val）、Ｄ−ピロリシン（D-Pyl）およびＤ−セレノシステイン（D-Sec）等の、天然アミノ酸（グリシンを除く。）のエナンチオマー；２−アミノアジピン酸（Aad）、２−アミノ酪酸（Abu）、２−アミノヘプタン酸（Ahe）、２−アミノイソ酪酸（Aib）、２−アミノピメリン酸（Apm）、２，４−ジアミノ酪酸（Dbu）、２，２’−ジアミノピメリン酸（Dpm）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Dpr）、アローヒドロキシリシン（aHyl）、アローイソロイシン（aIle）、ノルバリン（Nva）、ノルロイシン（Nle）、オルニチン（Orn）、デスモシン（Des）、イソデスモシン（Ide）等の非天然α−アミノ酸；６−Ｎ−メチルリシン（MeLys）、３−ヒドロキシプロリン（3Hyp）、４−ヒドロキシプロリン（4Hyp）、β−アラニン（bAla）、３−アミノイソ酪酸（bAib）、３−アミノアジピン酸（bAad）、４−アミノ酪酸（4Abu）、６−アミノカプロン酸（Acp）などが挙げられる。
なお、各非天然アミノ酸の名称の後の括弧内の記号は、それぞれの非天然アミノ酸を示す略号の一例である。
【００４３】
（４）ペプチド／融合ペプチド
４．１）ペプチド
「ペプチド」の用語は、ＩＵＰＡＣ（International Union of Pure and Applied Chemistry；国際純正・応用化学連合）ゴールド・ブックの定義に従う。すなわち、２個以上のアミノ酸が分子間でペプチド結合することによって得られるアミド化合物である。
【００４４】
特に明示しない限り、ペプチドのアミノ酸配列（「一次構造」ともいう。）は、左端から右端にかけてＮ末端からＣ末端となるようにアミノ酸残基を一次元に並べて表す。
【００４５】
本発明においては、ペプチド鎖のＮ末端のアミノ基およびＣ末端のカルボキシル基は、修飾されていてもよい。Ｎ末端のアミノ基の修飾としては、例えば、アセチル化およびＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）化などが挙げられ、Ｃ末端のカルボキシル基の修飾としては、例えば、アミド化およびエステル化などが挙げられる。
【００４６】
４．２）融合ペプチド
「融合ペプチド」とは、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を有するペプチド（「ドメイン」に該当する）が２個以上、直接、またはリンカーを介して、連結することにより構成されている高分子化合物をいう。
上記リンカーは、上記ドメイン間を連結することができるものであれば特に限定されない。上記リンカーとしては、例えば、ペプチド鎖からなるペプチドリンカー、ポリエチレングリコール鎖からなるＰＥＧ（polyethylene glycol；ポリエチレングリコール）リンカー、ジスルフィド結合（ＳＳ結合）、チオエーテル結合、オレフィン結合、クリックケミストリーの反応の結果得られる結合、およびこれらのうち２つ以上の組合せ等が挙げられる。
【００４７】
４．２．１）ドメイン
「ドメイン」とは、タンパク質（融合タンパク質を含む。）またはペプチド（融合ペプチドを含む。）の、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能（以下、単に「機能」という場合がある。）を発現しうる、１個以上、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上、さらに好ましくは４個以上、かつ、数百個以下のアミノ酸残基によって構成される部分または領域をいう。
ドメインは、その機能によって、例えば、抗体結合ドメイン、およびスペーサー結合ドメインなどに分けることができる。
【００４８】
４．２．１．１）抗体結合ドメイン
抗体結合ドメインは、抗体結合性を有するペプチドから構成されるドメインである。
抗体結合性は、上述した通りである。
【００４９】
４．２．１．２）スペーサー結合ドメイン
スペーサー結合ドメインは、抗体結合ドメイン以外の部分であって、スペーサーに結合する固定化官能基を有するアミノ酸残基を含むドメインである。
スペーサー結合ドメインとしては、ドメインあたり、固定化官能基を少なくとも側鎖に１個以上有するアミノ酸残基を１個以上、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上、さらに好ましくは３個以上、いっそう好ましくは４個以上、含むものが好ましい。ここで、固定化官能基を有するアミノ酸残基としては、リシン残基（Ｋ）、オルニチン残基、ジアミノ酪酸残基、ジアミノプロピオン酸残基、およびホモリシン残基等の側鎖にアミノ基を持つアミノ酸残基、システイン残基（Ｃ）、およびホモシステイン残基等の側鎖にチオール基を持つアミノ酸残基、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、およびチロシン（Ｙ）等の側鎖にヒドロキシ基を持つアミノ酸残基、などが挙げられる。これらの固定化官能基のいずれかと、スペーサーの官能基とのカップリング反応により、リガンドである短鎖ペプチドがスペーサーと結合する。スペーサーの官能基がカルボキシル基である場合は、カルボキシル基と反応性を有するアミノ基を持つリシン残基（Ｋ）、オルニチン残基、ジアミノ酪酸残基、ホモリシン残基、またはジアミノプロピオン酸残基が好ましく、リシン残基（Ｋ）が経済性の観点から特に好ましい。
また、本発明の短鎖ペプチドは、複数のスペーサー結合ドメインを含んでいてもよい。
【００５０】
４．２．２）リンカー
「リンカー」とは、融合ペプチドにおいて、ドメインの相互間を連結する分子鎖または結合である。
上記分子鎖としては、例えば、アミノ酸またはペプチドからなるペプチドリンカー、エチレングリコールまたはポリエチレングリコールからなるＰＥＧ（polyethylene glycol；ポリエチレングリコール）リンカー等が挙げられる。リンカーは２種類以上を組み合わせて用いてもよく、例えば、ペプチドおよびＰＥＧをともに含んでいてもよい。
また、上記結合としては、例えば、ジスルフィド結合（ＳＳ結合）、チオエーテル結合、オレフィン結合、クリックケミストリーの反応の結果得られる結合等が挙げられる。
【００５１】
上記ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基の数は、１個以上であれば特に限定されないが、好ましくは１〜２０個であり、より好ましくは１〜１０個であり、さらに好ましくは１〜５個である。
また、上記ＰＥＧリンカーを構成するエチレングリコール単位の数は、１個以上であれば特に限定されないが、好ましくは１〜２４個、より好ましくは１〜１２個、さらに好ましくは４〜８個である。
ここで、上記リンカーに含むことができるアミノ酸残基の種類は、特に制限されないが、例えば、ＩｇＧ抗体との相互作用が少ないＧｌｙ、ＡｌａおよびＳｅｒ等が挙げられる。また、上記リンカーは、固定化官能基を有するアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【００５２】
２．アルコール溶媒
本発明において用いるアルコール溶媒（単に「本発明のアルコール溶媒」という場合がある。）はアルコールを含む溶媒であれば特に限定されない。
上記アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、２−プロパノール（ＩＰＡ，イソプロピルアルコール）、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ）、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ，トリフルオロエタノール）、および１，１，１，３，３，３-−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ，ヘキサフルオロイソプロピルアルコール）などが挙げられる。
ペプチド溶解性の観点から、上記アルコールは、メタノール、エタノール、およびＩＰＡからなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい。
また、上記アルコールは、１種類を単独で、または２種類以上を組み合わせて使用することができる。
なお、短鎖ペプチドに二次構造を誘起させる際のアルコール溶媒と、短鎖ペプチドを担体に固定化する際のアルコール溶媒とは、同種のアルコール溶媒であってもよいし、異種のアルコール溶媒であってもよい。例えば、メタノール中に短時間浸漬して短鎖ペプチドに二次構造を誘起させ、担体に吸着させ、イソプロピルアルコール中に長時間浸漬して短鎖ペプチドをスペーサーに結合させてもよい。
【００５３】
本発明のアルコール溶媒中のアルコール含有量は、特に限定されないが、二次構造形成の観点から、好ましくは２０％（ｖ／ｖ）以上であり、より好ましくは５０％（ｖ／ｖ）以上であり、さらに好ましくは７０％（ｖ／ｖ）以上であり、いっそう好ましくは９５％（ｖ／ｖ）以上である。
本発明のアルコール溶媒中のアルコール以外の溶媒は二次構造形成を阻害しない溶媒ならば、特に限定されない。上記アルコール以外の溶媒としては、ペプチド溶解性の観点から、好ましくは純水および緩衝液から選択される少なくとも１種であり、より好ましくは純水である。上記緩衝液としては、例えば、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸））緩衝液、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）緩衝液、およびリン酸緩衝液等が挙げられる。
【００５４】
３．リガンド／抗体結合性リガンド
「リガンド」は、特定の物質と、ある親和性をもって、結合する分子をいう。このような分子は、タンパク質、ペプチド、または低分子量化合物等であり得る。
「抗体結合性リガンド」は、抗体結合性を有するリガンド、すなわち、抗体または抗体誘導体と、ある親和性をもって結合するリガンドをいう。抗体結合性リガンドは、抗体または抗体誘導体と、特異的な分子間の親和力が働く抗原抗体反応によって結合するものが好ましい。抗体または抗体誘導体の抗体結合性リガンドが結合する部位としては、定常領域（Ｆｃ領域、ＣＬ領域（軽鎖の定常領域）またはＣＨ領域（重鎖の定常領域））が好ましい。
【００５５】
本発明において用いるリガンド（以下、単に「本発明のリガンド」という場合がある。）は、上述した本発明の短鎖ペプチドである。本発明のリガンドとしては、本発明の短鎖ペプチドの中でも、抗体結合性を有する短鎖ペプチドを用いることが好ましい。
【００５６】
４．スペーサー
「スペーサー」とは、担体とリガンドとの間に介在する化合物である。
本発明において用いるスペーサー（以下、単に「本発明のスペーサー」という場合がある。）は、本発明の短鎖ペプチドが有する固定化官能基と反応する反応性基を有するものであり、本発明の短鎖ペプチドとの間で共有結合を形成する官能基を有することが好ましい。
上記官能基としては、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、ジアゾ基、クロロアセチル基、オレフィン基、グリシジル基、カルベン基、水酸基、およびホルミル基等が挙げられる。結合安定性の観点から、上記官能基としては、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、クロロアセチル基およびグリシジル基からなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、カルボキシル基およびグリシジル基からなる群から選択される少なくとも１種がさらに好ましい。
本発明のスペーサーとしては、多官能カルボン酸が好ましく、ポリアクリル酸が殊に好ましい。ポリアクリル酸の末端にはアミノ基等の官能基が付加されていてもよい。
【００５７】
本発明のスペーサーの長さは、特に限定されないが、アルコール溶媒にて短鎖ペプチドの二次構造が変化する部位を含んだ位置で、多点で共有結合することができるように、二次構造を誘起した短鎖ペプチドの見かけの長さよりも長いことが好ましい。
【００５８】
本発明のスペーサーの分子量は特に限定されない。本発明のスペーサーの分子量は、質量平均分子量で、好ましくは１００００以下であり、より好ましくは９０００以下であり、さらに好ましくは５０００以下であり、いっそう好ましくは３０００以下である。
また、本発明のスペーサーの分子量は、質量平均分子量で、好ましくは３００以上であり、より好ましくは５００以上であり、さらに好ましくは９００以上であり、いっそう好ましくは１５００以上である。さらに、本発明のスペーサーの分子量は、質量平均分子量で、好ましくは３００〜１００００の範囲内であり、より好ましくは９００〜９０００の範囲内であり、さらに好ましくは９００〜５０００の範囲内であり、いっそう好ましくは１５００〜３０００の範囲内である。
本発明のスペーサーの分子量が小さすぎると、短鎖ペプチドとの結合点が少なくなり、短鎖ペプチドの二次構造を保持することが困難になる。また、本発明のスペーサーの分子量が大き過ぎると、担体に本発明のスペーサーを多量に結合することが困難になる。
【００５９】
スペーサーは後述する担体に結合されているが、担体上の官能基に直接、または担体上の官能基との間に、アミド結合、マレイミド結合、エステル結合、エーテル結合、エポキシ結合、またはオレフィン結合等の共有結合を介して結合することが好ましく、結合力の高いアミド結合またはエポキシ結合がより好ましい。
【００６０】
５．担体
担体は、リガンドを担持する基材である。
本発明において用いる担体としては、水不溶性担体が好ましい。
水不溶性担体としては、例えば、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストラン、架橋プルラン等の多糖類、アクリレート系重合体、スチレン系重合体などの有機担体、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、ならびにこれらの組合せによって得られる、有機−有機、および有機−無機等の複合担体などが挙げられる。
水不溶性担体としては、アルカリ耐性の観点から、多糖類またはアクリレート系重合体がより好ましく、アガロースまたはセルロース等の多糖類がさらに好ましい。
水不溶性担体として用いることができる市販品としては、例えば、多孔質セルロースゲルであるセルファイン（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）  ＧＣＬ２０００（ＪＮＣ社製）セルファインＭＡＸ（Ｃｅｌｌｆｉｎｅ  ＭＡＸ）  ＣＭＪＮＣ社製）、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドとを共有結合で架橋したセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）  Ｓ−１０００  ＳＦ（ＧＥヘルスケア社製）、アクリレート系の担体であるトヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）（東ソー社製）、トヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）  ＡＦ−Ｃａｒｂｏｘｙ−６５０  （東ソー社製）、トヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）  ＧｉｇａＣａｐ  ＣＭ−６５０  （東ソー社製）、アガロース系の架橋担体であるセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）  ＣＬ４Ｂ（ＧＥヘルスケア社製）、エポキシ基で活性化されたポリメタクリルアミドであるオイパーギット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）  Ｃ２５０Ｌ（シグマアルドリッチ社製）、およびカルボキシルメチルデキストランを金膜表面にコートしたセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）などが挙げられる。ただし、本発明における水不溶性担体は、これらの担体または活性化担体にのみ限定されるものではない。また、本発明に用いる水不溶性担体は、本吸着材料の使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが好ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、特に限定されるものではないが、ビーズ状、繊維状、膜状、中空糸状など、いずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
【００６１】
〈工程Ａ／工程Ｂ〉
工程Ａおよび工程Ｂの手順について説明する。
【００６２】
１．工程Ａの手順
工程Ａにおいて、上述した短鎖ペプチドを含むアルコール溶液を準備する手順は特に制限されず、例えば、所定の短鎖ペプチドをアルコール溶液に添加して、所定時間静置する方法などが挙げられる。
アルコール溶液中における短鎖ペプチドの濃度は特に制限されず、使用される短鎖ペプチドの種類によって異なってよいが、アルコール溶液全質量に対して、好ましくは０．００００００１〜５質量％であり、より好ましくは０．００００１〜１質量％であり、さらに好ましくは０．００１〜１質量％である。
また、上記アルコール溶液のｐＨは、特に限定されないが、ｐＨ４〜１２の範囲内とすることが好ましい。
また、上記アルコール溶液を調製する際の温度は、特に制限されないが、２〜５０℃で実施することが好ましい。
【００６３】
２．工程Ｂの手順
工程Ｂにおいて、上述したスペーサーが結合された担体と、上記アルコール溶液とを接触させる方法は特に制限されず、例えば、アルコール溶液中に上記スペーサーが結合された担体を添加する方法が挙げられる。
なお、スペーサーが結合された担体とアルコール溶液とを接触させる際には、必要に応じて、短鎖ペプチド中の固定化官能基とスペーサー中の反応性基との反応を促進させる化合物を存在させてもよい。例えば、固定化官能基と反応性基との反応が脱水縮合反応である場合、上記化合物としてはいわゆる脱水縮合剤（例えば、（１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド））などを使用することが好ましい。このような脱水縮合剤を使用する際には、先に脱水縮合剤とスペーサーが結合された担体とを接触させた後、アルコール溶液と接触させてもよい。また、例えば、ジスルフィド結合の場合には過酸化水素やヨウ素のような酸化剤を使用することが好ましい。また、例えば、グリコシド結合の場合には、酸を存在させることが好ましい。短鎖ペプチド中の固定化官能基とスペーサー中の反応性基との反応は、アミノカップリング反応によりアミノ基とカルボキシル基との間でアミド結合を形成するものが好ましい。さらに、必要に応じて、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、ジアザビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、メチルイミダゾール、ジメチルアニリン、トリエチルアミンおよびピリジンからなる群から選択される少なくとも１種の塩基を添加してもよい。
担体に固定化する短鎖ペプチドの密度は特に限定されないが、０．１ｍｍｏｌ〜１０００ｍｍｏｌ／充填剤１Ｌが好ましく、０．１ｍｍｏｌ〜５００ｍｍｏｌ／充填剤１Ｌがより好ましく、１ｍｍｏｌ〜１００ｍｍｏｌ／充填剤１Ｌがさらに好ましい。この範囲内であると、短鎖ペプチドの使用量と抗体精製性能のバランスがよく、より低コストで、効率よく抗体を精製することができる。
【００６４】
［短鎖ペプチド固定化担体］
本発明の製造方法により、担体と、担体上に結合されたスペーサーと、スペーサー上に配置され、かつ、二次構造が保持されている短鎖ペプチドとを有する短鎖ペプチド固定化担体を製造することができる。
短鎖ペプチドとして抗体結合性を有する短鎖ペプチドを用いると、本発明の短鎖ペプチド固定化担体は、抗体結合性に優れたアフィニティクロマトグラフィー用担体として利用することができる。また、本発明の短鎖ペプチド固定化担体は、抗原性およびコストの点で、プロテインＡに比べて有利なアフィニティクロマトグラフィー用担体である。
【００６５】
以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６６】
［ペプチドの合成］
全自動ペプチド合成装置（ＰＳＳＭ−８、島津製作所社製）を用いて、表３に示す短鎖ペプチドを合成した。【００６７】
【表３】
2016167143.tif 000004
【００６８】
表３中、固定化官能基数は、リシン残基の側鎖にあるアミノ基（εアミノ基）およびＮ末端アミノ基（αアミノ基）の合計である。【００６９】
また、表３に記載した短鎖ペプチド１〜８のＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液中およびメタノール（ＭｅＯＨ）中の二次構造含有率を表４に示す。【００７０】
【表４】
2016167143.tif 000005
【００７１】
短鎖ペプチド１〜８のＨＥＰＥＳ緩衝液中またはメタノール（ＭｅＯＨ）中の二次構造含有率は、各短鎖ペプチドのＨＥＰＥＳ溶液またはメタノール溶液でのＣＤ（circular dichroism；円偏光二色性）スペクトルを、円二色性分散計Ｊ−８２０（日本分光社製）にて測定し、得られたＣＤスペクトルを基にタンパク質二次構造解析プログラムＪＷＳＳＥ−４８０（日本分光社製）を用いて二次構造を解析して得られた。なお、表４中、短鎖ペプチド１〜８は、それぞれ、表３に記載した短鎖ペプチド１〜８である。また、「ＨＥＰＥＳ中」はＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸））−ＨＣｌ（塩酸）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ｐＨ７．４、２５℃）中の二次構造含有率を、「ＭｅＯＨ中」はメタノール（純度９９．５質量％）中の二次構造含有率を表す。【００７２】
短鎖ペプチド１〜８のいずれも、メタノール（ＭｅＯＨ）中の二次構造含有率がＨＥＰＥＳ中の二次構造含有率の２倍以上から４倍以上であり、１．５倍以上であったことから、アルコール溶媒中で二次構造が誘起される短鎖ペプチドである。【００７３】
［実施例１］
（１）スペーサーの固定
市販のＣＭ５センサーチップ（カルボキシメチルデキストラン導入タイプ、ＧＥヘルスケア社製）に、０．４７ＭのＥＤＣ（１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、和光純薬工業（株）製）および０．３５ＭのＮＨＳ（N-hydroxysuccinimide；Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド，和光純薬工業（株）製）を含むＤＭＳＯ（Dimethysulfoxide；ジメチルスルホキシド，和光純薬工業（株）製）溶液５０μＬを添加し、室温にて１時間活性化した。
ＤＭＳＯにて洗浄した後、アミノ基末端ポリアクリル酸（質量平均分子量（Ｍｗ）：３１２０）（以下「ポリアクリル酸１」という場合がある。）を、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）／ＤＢＵ（1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene；ジアザビシクロウンデセン）（８５：１５ｖｏｌ％）溶液に溶解して、５０ｍＭ溶液を調整し、その溶液をセンサーチップに２０μＬ添加し、２時間室温にて反応させた。
その後、ＤＭＳＯにて洗浄後、エタノールアミン溶液によってブロッキング処理を施して、スペーサー固定化担体（以下「担体Ａ」という場合がある。）を得た。【００７４】
（２）リガンドの固定
表面プラズモン共鳴装置（Ｂｉａｃｏｒｅ３０００，ＧＥヘルスケア社製）に、「（１）スペーサーの固定」で得られた担体Ａをセットし、ＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance；表面プラズモン共鳴）用ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸））−ＨＣｌ（塩酸）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ｐＨ７．４）を１０μＬ／ｍｉｎの流速で安定させ、０．２ＭのＥＤＣ（１−エチル―３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）と０．０４ＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）混合水溶液を７０μＬ添加した。その後、メタノール（固定化溶媒に該当する。）にて４μＭに希釈した短鎖ペプチド１の試料液１０μＬを担体試料に供給し、その後、エタノールアミン溶液によってブロッキング処理を施し、水酸化ナトリウム水溶液にて洗浄して、固定化を行った。同様の手順で、担体ＡにＨＥＰＥＳ緩衝液にて４μＭに希釈した短鎖ペプチド１の試料液を用いて、別流路に固定した。得られた固定化担体を、以下「固定化担体Ａ」という。【００７５】
（３）抗体結合性改善率の評価
「（２）リガンドの固定」で製造した固体化担体Ａに、１０〜３０００ｎＭのヒトＩｇＧ抗体を１０分間添加し、ＨＥＰＥＳ緩衝液中での２５℃での解離を測定し、結合反応曲線から抗体の結合速度Ｋｏｎ［ｎＭ／ｓ］および解離速度Ｋｏｆｆ［１／ｓ］を算出し、さらに、メタノールとＨＥＰＥＳ緩衝液それぞれにて固定化した際の短鎖ペプチド１とヒトＩｇＧ抗体の結合反応における解離定数Ｋｄ［ｎＭ］を算出した。ＨＥＰＥＳ緩衝液にて固定化した際の解離定数Ｋｄ［ｎＭ］に対する、メタノールにて固定化した際の解離定数Ｋｄ［ｎＭ］を抗体結合性改善率とし、以下の抗体結合性改善率の評価基準に基づいて評価し、その結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に示す。【００７６】
（抗体結合性改善率の評価基準）
解離定数（Ｋｄ）の改善率が１０倍超・・・・・・・・・・Ａ
解離定数（Ｋｄ）の改善率が３倍超、１０倍以下・・・・・Ｂ
解離定数（Ｋｄ）の改善率が２倍超、３倍以下・・・・・・Ｃ
解離定数（Ｋｄ）の改善率が１倍超、２倍以下・・・・・・Ｄ
解離定数（Ｋｄ）の改善率が１倍以下・・・・・・・・・・Ｅ【００７７】
評価Ａ、ＢおよびＣは本固定化による改善効果が十分であることを表し、評価ＤおよびＥは十分な改善効果が見られないことを表す。十分な改善効果を示すリガンド固定化状態を用いることにより、抗体と特異的に結合することが出来、より効率的に抗体を精製することが可能となり、抗体の精製コストをより低減することができる。【００７８】
さらに、フィッティングソフトウェア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１，ＧＥヘルスケア社製）を用いてフィッティングを行い、それぞれのペプチドの各溶液でのＣＤ（circular dichroism；円偏光二色性）スペクトルを測定し、二次構造含有率を算出した。算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に示す。【００７９】
［実施例２］
（１）短鎖ペプチド１に代えて短鎖ペプチド２を用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｂを得た。
（２）固定化担体Ｂを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００８０】
［実施例３］
（１）短鎖ペプチド１に代えて短鎖ペプチド３を用いた点、およびスペーサーとして、ポリアクリル酸１（アミノ基末端ポリ（アクリル酸）、Ｍｗ：３１２０）ＤＭＳＯ／ＤＢＵ（1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene；ジアザビシクロウンデセン）（８５：１５ｖｏｌ％）溶液に代えてポリアクリル酸２（アミノ基末端ポリ（アクリル酸）、Ｍｗ：１３５０）ＤＭＳＯ／ＤＢＵ（1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene；ジアザビシクロウンデセン）（９４：６ｖｏｌ％）溶液を用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｃを得た。
（２）固定化担体Ｃを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００８１】
［実施例４］
（１）短鎖ペプチド１に代えて短鎖ペプチド３を用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｄを得た。
（２）固定化担体Ｄを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００８２】
［実施例５］
（１）短鎖ペプチド１に代えて短鎖ペプチド３を用いた点、およびスペーサーとして、ポリアクリル酸１（アミノ基末端ポリ（アクリル酸）、Ｍｗ：３１２０）ＤＭＳＯ／ＤＢＵ（1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene；ジアザビシクロウンデセン）（８５：１５ｖｏｌ％）溶液に代えてポリアクリル酸３（アミノ基末端ポリ（アクリル酸）、Ｍｗ：８４００）ＤＭＳＯ／ＤＢＵ（1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene；ジアザビシクロウンデセン）（６８：３２ｖｏｌ％）溶液を用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｅを得た。
（２）固定化担体Ｅを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００８３】
［実施例６］
（１）短鎖ペプチド１に代えて短鎖ペプチド３を用いた点、およびリガンドを固定する際の固定化溶媒として、メタノール（ＭｅＯＨ）に代えてイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｆを得た。
（２）固定化担体Ｆを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００８４】
［実施例７］
（１）短鎖ペプチド１に代えて短鎖ペプチド３を用いた点、およびリガンドを固定する際の固定化溶媒として、メタノール（ＭｅＯＨ）に代えてエタノール（ＥｔＯＨ）を用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｇを得た。
（２）固定化担体Ｇを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００８５】
［実施例８］
（１）短鎖ペプチド１に代えて短鎖ペプチド４を用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｈを得た。
（２）固定化担体Ｈを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００８６】
［実施例９］
（１）短鎖ペプチド１に代えて短鎖ペプチド５を用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｉを得た。
（２）固定化担体Ｉを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００８７】
［実施例１０］
（１）短鎖ペプチド１に代えて短鎖ペプチド６を用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｊを得た。
（２）固定化担体Ｊを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００８８】
［実施例１１］
（１）短鎖ペプチド１に代えて短鎖ペプチド７を用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｋを得た。
（２）固定化担体Ｋを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００８９】
［実施例１２］
（１）短鎖ペプチド１に代えて短鎖ペプチド８を用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｌを得た。
（２）固定化担体Ｌを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００９０】
［比較例１］
（１）リガンドを固定する際の固定化溶媒として、メタノール（ＭｅＯＨ）に代えてＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）を用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｍを得た。さらに、スペーサーの固定操作を行わず、ＣＭ５センサーチップを用いた点、およびメタノールに代えてＨＥＰＥＳを用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｍ２を得た。
（２）固定化担体Ｍおよび固定化担体Ｍ２を用いて、固定化担体Ｍの固定化担体Ｍ２に対する抗体結合性改善率を評価し、また、固定化担体Ｍを用いて、実施例１と同様にして二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００９１】
［比較例２］
（１）スペーサーの固定操作を行わず、ＣＭ５センサーチップを用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｎを得た。
（２）固定化担体Ｎを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００９２】
［比較例３］
（１）短鎖ペプチド１に代えて短鎖ペプチド３を用いた点、およびスペーサーの固定操作を行わず、ＣＭ５センサーチップを用いた点を除いて、実施例１と同様にして固定化担体Ｏを得た。
（２）固定化担体Ｏを用いて、実施例１と同様にして抗体結合性改善率を評価し、さらに、二次構造含有率を算出した。抗体結合性改善率の評価結果を表５の「抗体結合性改善率」の欄に、算出した二次構造含有率を表５の「二次構造含有率」の欄に、それぞれ示す。【００９３】
【表５】
2016167143.tif 000006
【００９４】
表５中、短鎖ペプチド１〜８は、それぞれ、表３に記載した短鎖ペプチド１〜８を示す。
また、表５中、固定化溶媒の欄のＭｅＯＨはメタノールを、ＥｔＯＨはエタノールを、ＩＰＡはイソプロピルアルコールを、ＨＥＰＥＳは４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸を、それぞれ表す。
また、表５中、ポリアクリル酸１はアミノ基末端ポリ（アクリル酸）（Ｍｗ：３１２０）を、ポリアクリル酸２はアミノ基末端ポリ（アクリル酸）（Ｍｗ：１３５０）を、ポリアクリル酸３はアミノ基末端ポリ（アクリル酸）（Ｍｗ：８４００）を、それぞれ表す。【００９５】
実施例１〜１２の固定化担体は、抗体結合性改善率の評価が高く、抗体結合性が優れていた。これは、アルコール溶媒中で誘起した二次構造を保ったまま、短鎖ペプチドを担体に固定化することができたためであると考えられる。
一方、比較例１〜３の固定化担体は、抗体結合性改善率の評価が低く、抗体結合性が実施例１〜１２に比べて劣っていた。これは、アルコール溶媒中で誘起した二次構造を保ったまま、短鎖ペプチドを担体に固定化することができなかったためであると考えられる。
【配列表】
2016167143000001.app
【国際調査報告】
2016167143.tif 000007
2016167143.tif 000008
2016167143.tif 000009
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