(57)【要約】      （修正有）【課題】グルタチオンの前駆体として働く）γ−グルタミルシステイン（γＧＣ）と、このジペプチドの誘導体であるγＧＣ及びビス−γＧＣとの過剰生産に適した原核微生物株、更にこれらの化合物を調製するための方法の提供。【解決手段】親株から作製することができる、γＧＣと、その誘導体であるビス−γＧＣ及びγＧＣを過剰生産することが可能な大腸菌又はパントエアアナナティス種等の原核微生物株であって、その親株と比較して細胞グルタチオンシンセターゼ活性が低下しており、かつ、細胞グルタチオンシンセターゼ活性が同様に低下している株よりも大幅に増加している細胞γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する菌株、及び、該菌株を用いたγ−グルタミルシステイン、ビス−γ−グルタミルシスチンおよびγ−グルタミルシスチンの製造方法。【選択図】図１
2014226136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親株から作製することができる、γ−グルタミルシステイン、ビス−γ−グルタミルシスチン、およびγ−グルタミルシスチンを過剰生産することが可能な原核微生物株であって、該親株と比較して細胞グルタチオンシンセターゼ活性が低下しており、かつ細胞グルタチオンシンセターゼ活性が同様に低下している株よりも大幅に増加している細胞γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する、原核微生物株。
【請求項２】
本発明による菌株におけるグルタチオンシンセターゼ活性が非常に低下しており、該活性が対応する野生型株のグルタチオンシンセターゼ活性の最大でも５０％である、請求項１に記載の微生物株。
【請求項３】
細胞γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性が、細胞グルタチオンシンセターゼ活性が同様に低下している株の少なくとも約５倍である、請求項１または２に記載の微生物株。
【請求項４】
親株が大腸菌またはパントエア  アナナティス種のメンバーである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物株。
【請求項５】
親株が、γ−グルタミルシステインの生合成経路を有し、対応する親株と比較してＬ−システイン生合成能が上昇している微生物株である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物株。
【請求項６】
γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性上昇が、ｇｓｈＡ遺伝子もしくはｇｓｈＡホモログのコピー数を増加させることにより、またはｇｓｈＡの発現増加をもたらすプロモーターを用いることにより達成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物株。
【請求項７】
ｇｓｈＡまたはｇｓｈＡホモログのコピー数が、プロモーターの制御下においてプラスミドベクターにクローニングすることにより増加されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物株。
【請求項８】
ＧｓｈＡが、４９４位にあるアミノ酸アラニンがバリンまたはロイシンと置換されているタンパク質配列（Ａ４９４ＶまたはＡ４９４Ｌ）、あるいは４９５位にあるアミノ酸セリンがトレオニンと置換されているタンパク質配列（Ｓ４９５Ｔ）を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物株。
【請求項９】
ｇｓｈＡ遺伝子の天然開始コドンＴＴＧがＡＴＧに置換されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物株。
【請求項１０】
γ−グルタミルシステイン（γＧＣ）と、このジペプチドの誘導体であるγ−グルタミルシスチンおよびビス−γ−グルタミルシスチンとを過剰生産するための方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物株を発酵培地中で培養し、該培地から該細胞を除去し、該培養培地から目的生成物を精製する、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、γ−グルタミルシステイン（γＧＣ）と、このジペプチドの誘導体であるγ−グルタミルシスチン(γ-glutamylcysteine)およびビス−γ−グルタミルシスチンとの過剰生産に適した原核(prokaryotic)微生物株、さらにこれらの化合物を調製するための方法に関する。
【０００２】
γ−グルタミルシステインは、原核生物および真核生物の細胞でアミノ酸であるＬ−システインとＬ−グルタミン酸との連結により形成されるジペプチドである。
【０００３】
ビス−γ−グルタミルシスチンは、γ−グルタミルシステイン２分子の酸化により形成されるジスルフィドである。この反応は可逆的であり、これはビス−γ−グルタミルシスチンが（例えば、酵素的または化学的）還元により変換され、γ−グルタミルシステインに戻る可能性があることを意味する。
【０００４】
γ−グルタミルシスチンは、γ−グルタミルシステイン１分子とＬ−システイン１分子との酸化により形成されるジスルフィドである。この反応は可逆的であり、これはγ−グルタミルシスチンが（例えば、化学的）還元により変換され、γ−グルタミルシステインとＬ−システインに戻る可能性があることを意味する。
【０００５】
チオール化合物であるγ−グルタミルシステインは、数多くの生物においてグルタチオンの前駆体として働く。グルタチオン生合成の第１段階は、ＡＴＰ依存性酵素であるγ−グルタミルシステインシンセターゼによるＬ−システインのα−アミノ基とＬ−グルタミン酸のγ−カルボキシ基とのγ−ペプチド結合による連結である。さらに、この反応はグルタチオン生合成の制限段階でもあり、これはγ−グルタミルシステインシンセターゼ酵素がグルタチオンにより阻害されるためである。グルタチオン生合成の第２段階は、グルタチオンをもたらす、Ｌ−グリシンとγ−グルタミルシステインとの反応であり、この反応ではＬ−グリシンがγ−グルタミルシステインのシステイニル官能基にα−ペプチド結合を介して連結される。同様にＡＴＰ依存的なこの反応はグルタチオンシンセターゼ酵素によって触媒される。
【０００６】
グルタチオンは、その抗酸化特性から細胞で重要な役割を果たし、数多くの細胞プロセスに還元剤、補基質および補因子として関与する。しかしながら、グルタチオン欠乏生物も知られており、この生物ではグルタチオン前駆体であるγ−グルタミルシステインがグルタチオンの生物学的役割を引き受ける。Halobacterium halobiumなどの好塩性古細菌の代表的なものが公知の例である(Sundquist and Fahey, 1989, J. Biol. Chem. 264: 719-725)。
【０００７】
さらに、文献には様々な種の異なるグルタチオン欠乏微生物株が記載されており、例えば、サッカロミセス  セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(Grant et al., 1997, Mol. Biol. Cell. 8: 1699-1707)、シネコシスティス属種(Synechocystis sp.)(Cameron and Pakrasi, 2011, Plant Signal. Behav. 6: 89-92)または大腸菌(Eschericha coli)(Fuchs and Warner, 1975, J. Bacteriol. 124: 140-148)がある。これらの菌株は、グルタチオンシンセターゼをコードする対応遺伝子（例えば、大腸菌およびシネコシスティス属種の場合にはｇｓｈＢまたはＳ．セレビシエの場合にはｇｓｈ２）に突然変異または欠失を有する。グルタチオンシンセターゼ活性の修飾または喪失により、これらの菌株はもはやグルタチオンを合成することができないか、または限られた程度までしかグルタチオンを合成することができない。その結果として、細胞のγ−グルタミルシステインレベルは上昇する。これらの変異株は生存できるが、これは存在するγ−グルタミルシステインの生成促進および濃度上昇によりグルタチオン特有の数多くの機能が引き継がれるためである。しかしながら、それらの変異株は、対応する野生型株と比較して活性酸素種および重金属イオンに対する感受性が増大していることを特徴とする場合が多く、その結果、それらの増殖は部分的に障害を受ける(Cameron and Pakrasi, 2011  Plant Signal. Behav. 6: 89-92; Helbig et al., 2008, J. Bacteriol. 190: 5439-5454)。
【０００８】
活性酸素種、重金属イオンおよび生体異物の解毒は、多くの生物でも、ヒトでも、とりわけ、グルタチオンを介して、頻繁に行われる(Grant et al., Mol. Biol. Cell. 8: 1699-1707)。さらに、低グルタチオンレベルは、多くの場合、症状であり、および／または自閉症、パーキンソン病、嚢胞性繊維症、ＨＩＶ、癌または統合失調症などの様々な疾患の基盤である(Wu et al., 2004, J. Nutr. 134: 489-492)。そのため、細胞内グルタチオンレベルを一定に維持することに、またはそらにはそれを上昇させるために、大きな関心が寄せられている。γ−グルタミルシステインは細胞のグルタチオンレベルを上昇させるための有望な物質として既に試験に成功している(Anderson and Meister, 1983, P.N.A.S. 80: 707-711).
【０００９】
ＷＯ２００６１０２７２２号公報には、γ−グルタミルシステインを調製するための酵素的方法が記載されており、その方法は、固定化γ−グルタミルシステイントランスペプチダーゼを利用するシステイン誘導体とγ−グルタミル供与体との反応に基づくものである。
【００１０】
微生物のγ−グルタミルシステイン生産者は、主として、サッカロミセス目(Saccharomycetales)の真菌株、例えば、サッカロミセス  セレビシエまたはカンジダ  ユチリス(Candida utilis)であるが、それらの菌株は主にグルタチオンの生産に使用されている。そのような菌株は、例えば、ＷＯ２０１０１１６８３３Ａ１号公報、ＵＳ７３７１５５７Ｂ２号公報およびＵＳ２００５０７４８３５Ａ１号公報に開示されている。とりわけ、ＥＰ２２５１４１３Ａ１号公報、ＵＳ７５６９３６０Ｂ２号公報、ＵＳ２００４２１４３０８Ａ１号公報、ＵＳ２００３１２４６８４Ａ１号公報、ＵＳ７４１０７９０Ｂ２号公報およびＥＰ１４８９１７３Ｂ１号公報には、各段に高いγ−グルタミルシステイン生産能力を有する同じ目の他の真菌株が記載されている。これらの真菌株は、様々な菌株固有の特性、例えば、セルレニンまたはニトロソグアニジンの耐性あるいはパントテン酸要求性の他に、共通した特徴として、グルタチオンシンセターゼ活性が低下している。
【００１１】
さらに、ＵＳ２００５０４２３２８Ａ１号公報には、グルタチオンシンセターゼ活性が低下しており、かつｇｓｈ１発現が上昇している（ｇｓｈ１はγ−グルタミルシステインシンセターゼをコードする）Ｃ．ユチリス株でのγ−グルタミルシステインの細胞内富化が記載されている。
【００１２】
真菌のγＧＣ生産システムの欠点は、比較的低いγ−グルタミルシステイン収量と、さらにγ−グルタミルシステインの細胞内蓄積であり、そのため、γ−グルタミルシステインについて考えられる後処理として真菌細胞の破壊が必要であると思われる。
【００１３】
ＵＳ２０１００２０３５９２Ａ１号公報には、γ−グルタミルシステインの原核生物生産者として、様々な大腸菌株が記載されており、それらの総てはｇｓｈＡ発現が上昇している。さらに、これらの菌株は、対応する親株と比較して、グルタチオンシンセターゼ活性が正常であるか、または上昇している。培養培地へのγ−グルタミルシステインの分泌は、真菌のシステムとは対照的に、これらの菌株によって可能である。これらの菌株での最大収量は２６２ｍｇ／ｌであるが、それでは実用的な方法を確立するには不十分である。
【発明の概要】
【００１４】
γ−グルタミルシステインと、その誘導体であるビス−γ−グルタミルシスチンおよびγ−グルタミルシスチンという有望な生物活性化合物を過剰生産することが可能であり、さらに、培養培地へのこれらの化合物の分泌がｇ／ｌスケールで可能な微生物株は未だ存在していない。
【００１５】
よって、本発明の目的は、γ−グルタミルシステインと、その誘導体であるビス−γ−グルタミルシスチンおよびγ−グルタミルシスチンを過剰生産することが可能であり、さらに、培養培地中へのこれらの化合物の細胞外蓄積を可能にする微生物株を提供することである。
【００１６】
その目的は原核微生物株によって達成され、該原核微生物株は親株から作製され得るものであり、該親株と比較して細胞グルタチオンシンセターゼ活性が低下しており、かつ、細胞グルタチオンシンセターゼ活性が同様に低下している株よりも大幅に増加している細胞γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨの制限および機能地図を示す。
【図２】図２は、ｐｇｓｈＡｐ−ｇｓｈＡＴＴＧの制限および機能地図を示す。
【図３】図３は、ｐｔｕｆＢの制限および機能地図を示す。
【図４】図４は、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧの制限および機能地図を示す。
【図５】図５は、ｐｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ２０４０の制限および機能地図を示す。
【図６】図６は、ｐｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ１４の制限および機能地図を示す。
【図７】図７は、ｐｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ１４−ｓｅｒＡ２０４０の制限および機能地図を示す。
【図８】図８は、ｐｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ２０４０−ｏｒｆ３０６の制限および機能地図を示す。
【図９】図９は、ｐｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ１４−ｏｒｆ３０６の制限および機能地図を示す。
【図１０】図１０は、ｐｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ１４−ｓｅｒＡ２０４０−ｏｒｆ３０６の制限および機能地図を示す。
【図１１】図１１は、Ａ）未処理の（酸化）サンプルおよびＢ）ＤＴＴ処理した（還元）サンプルのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【発明の具体的説明】
【００１８】
本発明による菌株におけるグルタチオンシンセターゼ活性は、好ましくは、非常に低下しており、該活性が対応する野生型株のグルタチオンシンセターゼ活性の最大でも５０％である。
【００１９】
好ましくは、グルタチオンシンセターゼ活性修飾前の野生型のグルタチオンシンセターゼ活性の最大でも２５％を示す原核微生物株である。菌株のグルタチオンシンセターゼ活性の低下とは、特に好ましくは、この菌株にグルタチオンシンセターゼ活性が存在しないことを意味することと理解される。
【００２０】
本発明による菌株におけるγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性は、好ましくは、グルタチオンシンセターゼ活性が同様に低下している株よりも少なくとも約５倍高い。
【００２１】
特に好ましくは、グルタチオンシンセターゼ活性とγ−グルタミルシステインシンセターゼ活性との両方が上記のように修飾されている本発明による微生物株である。
【００２２】
ＤＮＡ同一性の程度は、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/のサイトで見つけることができる「nucleotide blast」プログラムにより確認され、このプログラムはblastnアルゴリズムに基づくものである。２つ以上のヌクレオチド配列のアラインメントでは、アルゴリズムパラメーターとしてデフォルトパラメーターが使用された。デフォルトの一般的なパラメーターは、Max target sequences = 100; Short queries = “Automatically adjust parameters for short input sequences”; Expect Threshold = 10; Word size = 28; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0である。対応するデフォルトのスコアリングパラメーターは、Match/Mismatch Scores = 1,-2; Gap Costs = Linearである。
【００２３】
タンパク質配列の比較には、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/のサイトにある「protein blast」プログラムが使用される。このプログラムは、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムに基づくものである。２つ以上のタンパク質配列のアラインメントでは、アルゴリズムパラメーターとしてデフォルトパラメーターが使用された。デフォルトの一般的なパラメーターは、Max target sequences = 100; Short queries = “Automatically adjust parameters for short input sequences”; Expect Threshold = 10; Word size = 3; Automatically adjust parameters for short input sequences = 0である。デフォルトのスコアリングパラメーターは、Template = BLOSUM62; Gap Costs = Existence: 11 Extension: 1; Compositional adjustments = Conditional compositional score template adjustment)である。
【００２４】
発酵により培養することができる、γ−グルタミルシステインの生合成経路を有する総ての原核微生物株は、原則として、本発明による微生物株の作製のための親株として好適である。そのような微生物は、真正細菌(Bacteria)（以前はEubacteria）または古細菌(Archaea)（以前はArchaebacteria）のドメインに属し得る。
【００２５】
これらの生物は、好ましくは、真正細菌(bacteria)の系統発生群の代表的なものである。特に好ましくは、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)の微生物(microorgansims)であり、特に、大腸菌およびパントエア  アナナティス (Pantoea ananatis)種である。
【００２６】
γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性は、実施例９に記載のとおり、経時的なγ−グルタミルシステインの生成に基づいて測定される。
【００２７】
グルタチオンシンセターゼ活性は、ピルビン酸キナーゼ結合酵素試験を用いることによってＡＤＰの生成速度により決定され、この試験では、Ｌ−グリシンおよびＬ−γ−グルタミル−Ｌ−α−アミノ酪酸を基質として反応させる(Kim et al., 2003, J. Biochem. Mol. Biol. 36: 326-331)。
【００２８】
本発明による微生物の作製に好適な親株は、好ましくは、γ−グルタミルシステインの生合成経路を有し、さらに、対応する親株と比較してＬ−システイン生合成能が上昇している原核微生物株である。Ｌ−システイン生合成能の上昇はγ−グルタミルシステインの生成に有利であるが、この理由は、γ−グルタミルシステインの高生産のためには、γ−グルタミルシステイン前駆体としてのＬ−システインの十分な量の供給が制限されていてはならないからである。「Ｌ−システイン生合成能の上昇」とは、本発明によれば、Ｌ−システインまたはその誘導体であるＬ−シスチンおよびチアゾリジンを、対応する野生型株、親株または非修飾株よりも多く生産する微生物株の能力を意味することと理解される。これは、一般には、培地中でのＬ−システイン、Ｌ−シスチンおよび／またはチアゾリジンの富化として現れる。従って、関連微生物株の発酵中または発酵終了時に、培地で少なくとも０．５ｇ／ｌの「総システイン」（Ｌ−システイン＋Ｌ−シスチン＋チアゾリジン）が検出されるならば、Ｌ−システイン生合成能の上昇が存在することになり、これは当業者には知られている。
【００２９】
Ｌ−システイン生合成能が上昇している本発明による微生物の作製のための潜在的親株は、例えば、ＵＳ２００４００３８３５２Ａ１号公報、ＵＳ２００９００５３７７８号公報、ＥＰ１５２８１０８Ａ１号公報、ＥＰ２３４５６６７Ａ２号公報またはＥＰ２１３８５８５号公報に開示されている。
【００３０】
さらに、遺伝子または論点の遺伝子の変異体（対立遺伝子）は、アミノ酸であるＬ−システイン、および／あるいはＬ−セリンまたはＯ−アセチルセリンの前駆体の過剰生産のためのそれらの使用を導いた先行技術から既に分かっている：
・ＥＰ０６２０８５３Ｂ１号公報、ＥＰ１４９６１１１Ｂ１号公報およびＥＰ０９３１８３３Ａ２号公報に記載されているｓｅｒＡ対立遺伝子：
これらのｓｅｒＡ対立遺伝子は３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子であり、Ｌ−セリンによるフィードバック阻害の低減を受けている。このように、３−ヒドロキシピルビン酸の生成は細胞のセリンレベルから大きく切り離されており、そのため、Ｌ−システインへの大量の流れをよくすることが可能である。
【００３１】
・ＷＯ９７１５６７３号公報、Nakamori S. et al., 1998, Env. Microbiol 64: 1607-1611またはTakagi H. et al., FEBS Lett. 452: 323-327に記載されているｃｙｓＥ対立遺伝子：
これらのｃｙｓＥ対立遺伝子はセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であり、Ｌ−システインによるフィードバック阻害の低減を受けている。このように、Ｏ−アセチルセリンおよびＬ−システインの生成は細胞内のＬ−システインレベルから大きく切り離されている。
【００３２】
・ＥＰ８８５９６２Ａ１号公報に記載されている排出遺伝子：
ＥＰ８８５９６２Ａ１号公報に記載されているｏｒｆ３０６は、長年にわたり何度も引用されている。ｏｒｆ３０６、またはｏｒｆ２９９、ｙｄｅＤおよびｅａｍＡとも呼ばれる遺伝子のＤＮＡ配列は、現在、受託番号ＮＣ＿００４４３１またはＮＣ＿００７７７９のもとで寄託されている。ｏｒｆ３０６（ｏｒｆ２９９、ｅａｍＡまたはｙｄｅＤ）は排出系をコードする遺伝子であり、抗生物質およびその他の毒性物質の排除に適しており、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチルセリンおよび／またはチアゾリジン誘導体の過剰生産をもたらす（Ohtsu I. et al., 2010, J. Biol. Chem. 285; 17479 - 17489；ＥＰ８８５９６２号公報およびＥＰ１２３３０６７Ｂ１号公報）。
【００３３】
・ＤＥ１９９４９５７９Ｃ１号公報に記載されているｃｙｓＢ：
ｃｙｓＢ遺伝子は、システイン代謝の中心的な調節因子をコードする遺伝子であり、とりわけ、システイン生合成での硫化物の供給において、決定的な役割を果たす。
【００３４】
本発明による微生物株はまた、好ましくは、上述の遺伝子または対立遺伝子のうちの１種以上を発現することがある。特に好ましくは、ｃｙｓＥまたはｓｅｒＡの記載した対立遺伝子のうちの１種と、さらにｏｒｆ３０６とを使用することである。この場合、ｃｙｓＥおよびｓｅｒＡの対立遺伝子とｏｒｆ３０６は、本発明による微生物株において個別にまたは一緒に発現され得る。本発明による微生物株は、特に好ましくは、実施例において発明として提示される遺伝子改変、表４において発明としてみなされているものを有する。
【００３５】
発明の微生物株は、標準的な分子生物学技術を用いて作製することができる。
【００３６】
γ−グルタミルシステインシンセターゼ（ＧｓｈＡ）の細胞活性は、例えば、ｇｓｈＡ遺伝子もしくはｇｓｈＡホモログ（相同体）のコピー数を増加させることにより、またはｇｓｈＡ遺伝子もしくはｇｓｈＡホモログの発現増加をもたらす好適なプロモーターを用いることにより増加させることができる。
【００３７】
大腸菌のｇｓｈＡ遺伝子はγ−グルタミルシステインシンセターゼ（ＧｓｈＡ）酵素をコードする。ｇｓｈＡ遺伝子は配列番号１で示される。ＧｓｈＡ遺伝子産物（ＧｓｈＡ）は配列番号２で示される。本発明の文脈において、ｇｓｈＡ相同遺伝子とは、配列番号１との配列同一性が３０％を超えるものである。ｇｓｈＡホモログは、特に好ましくは、配列番号１に対して７０％を超える配列同一性を有するものである。
【００３８】
ＧｓｈＡホモログは、配列番号２との配列同一性が３０％を超えているタンパク質である。ＧｓｈＡホモログは、特に好ましくは、配列番号２に対して７０％を超える配列同一性を有するものである。
【００３９】
微生物におけるｇｓｈＡ遺伝子またはｇｓｈＡホモログのコピー数の増加は、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。従って、ｇｓｈＡまたはｇｓｈＡホモログは、例えば、１細胞あたりのコピー数が多いプラスミドベクター（例えば、大腸菌の場合、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ誘導体、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＡＣＹＣ１８４誘導体）にクローニングし、微生物に導入することができる。あるいは、ｇｓｈＡ遺伝子またはｇｓｈＡホモログの、微生物株染色体への組込みを繰り返し行ってもよい。組込み方法として、溶原性バクテリオファージ、組込み型プラスミドまたは相同組換えによる組込みを用いる既知システムを利用してよい(Hamilton et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 4617-4622; Datsenko and Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645)。
【００４０】
好ましくは、プロモーターの制御下でのプラスミドベクターへのｇｓｈＡまたはｇｓｈＡホモログのクローニングによるコピー数の増加である。特に好ましくは、ｐＡＣＹＣ誘導体、例えば、ｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨ（ブダペスト条約に基づき、German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(83124 Braunschweig, Inhoffenstraβe 7B)に１９９５年０８月１８日付けで番号ＤＳＭ  １０１７２のもとで寄託された）へのｇｓｈＡまたはｇｓｈＡホモログのクローニングによる大腸菌でのコピー数の増加である。
【００４１】
コピー数の増加とは、好ましくは、約１０倍の増加を意味することと理解される。
【００４２】
ｇｓｈＡ遺伝子またはｇｓｈＡホモログは、例えば、完全遺伝子をカバーする特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による特異的増幅と、プラスミドＤＮＡ断片とのその後の連結により、プラスミドベクターにクローニングされる。
【００４３】
前記遺伝子の天然プロモーターおよび／またはオペレーター領域は、プラスミドにコードされている遺伝子の発現の制御領域として役目を果たすことができる。
【００４４】
ｇｓｈＡまたはｇｓｈＡホモログの発現率もまた、他のプロモーターを用いて増加させることができる。関連プロモーター系、例えば、大腸菌におけるｇａｐＡ遺伝子のＧＡＰＤＨ構成性プロモーターあるいはｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、λ、ａｒａまたはｔｅｔ誘導性プロモーターは当業者に公知である(Markides S.C., 1996, Microbiol. Rev. 60: 512-538)。そのような構築物は、プラスミドまたは染色体に導入して、それ自体が公知である方法で使用することができる。
【００４５】
さらに、細胞のＧｓｈＡ活性の増加は、翻訳開始シグナル、例えば、リボソーム結合部位、またはシャイン  ダルガーノ配列を、各構築物の最適化配列中に存在させること、あるいは「コドン使用頻度」によるレアコドンを使用頻度の高いコドンと置換することにより達成することができる。
【００４６】
細胞のＧｓｈＡ活性はまた、突然変異（単一または複数のヌクレオチドの置換、挿入または欠失）をｇｓｈＡ遺伝子またはｇｓｈＡホモログのリーディングフレームに導入し、その結果として、ＧｓｈＡまたはＧｓｈＡホモログの比活性の増加をもたらすことによっても増加させることができる。ｇｓｈＡ遺伝子の希少な開始コドンＴＴＧを、例えば、通常の開始コドンＡＴＧと置換することにより、大腸菌では、ｇｓｈＡの発現増加だけでなく、ＧｓｈＡの総細胞活性の増加ももたらされる(Kwak et al., 1998, J. Biochem. Mol. Biol. 31:  254-257)。
【００４７】
また、タンパク質レベルでの、アラニン４９４のバリンまたはロイシンとの置換（Ａ４９４ＶまたはＡ４９４Ｌ）、あるいは４９５位にあるセリンのトレオニンとの置換（Ｓ４９５Ｔ）を含むｇｓｈＡの部位特異的突然変異によっても、大腸菌で細胞ＧｓｈＡ活性の増加がもたらされる(Kwak et al., 1998, J. Biochem. Mol. Biol. 31: 254-257)。そのような対立遺伝子は、好ましくは、本発明によるｇｓｈＡホモログである。
【００４８】
微生物株においてグルタチオンシンセターゼ活性を低下させるための方法も先行技術から分かっている。細胞グルタチオンシンセターゼ活性は、例えば、突然変異（単一または複数のヌクレオチドの置換、挿入または欠失）をｇｓｈＢ遺伝子またはｇｓｈＢホモログのリーディングフレームに導入し、その結果として、ＧｓｈＢまたはＧｓｈＢホモログの比活性の低下をもたらすことによって、低下させることができる。そのようなｇｓｈＢ対立遺伝子を作製するための方法は当業者に公知である。ｇｓｈＢ遺伝子の対立遺伝子は、例えば、出発材料としてｇｓｈＢ野生型遺伝子のＤＮＡを用い、非特異的または定方向突然変異誘発により作製することができる。そのような対立遺伝子の例は、野生型酵素と比較してＧｓｈＢ活性が低下しているＧｓｈＢ変異体をコードするものであり、例えば、Kato et al. (1988, J. Biol. Chem. 263: 11646-11651)に記載されている。
【００４９】
ｇｓｈＢ遺伝子またはｇｓｈＢ遺伝子のプロモーター領域内での非特異的突然変異は、例えば、とりわけ、ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸などの化学薬品により、および／または物理的方法により、および／またはある特定条件下で実施されるＰＣＲ反応により引き起こすことができる。ＤＮＡ断片内の特定の位置に突然変異を導入するための方法は公知である。例えば、ｇｓｈＢ遺伝子およびそのプロモーター領域を含んでなるＤＮＡ断片内の一つ以上の塩基を、プライマーとして好適なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって置換することができる。さらに、遺伝子合成によってｇｓｈＢ遺伝子全体または新たなｇｓｈＢ対立遺伝子を作製することも可能である。
【００５０】
一般的には、ｇｓｈＢ対立遺伝子が最初にin vitroで作製され、その後、細胞の染色体に挿入され、それによって、本来存在するｇｓｈＢ野生型遺伝子が置き換えられ、その結果、ｇｓｈＢ変異株が生じる。ｇｓｈＢ対立遺伝子は、公知の標準的な方法により、ｇｓｈＢ野生型遺伝子の代わりに宿主細胞の染色体に挿入することができる。これは、例えば、相同組換え機構による遺伝子への染色体突然変異の導入に関して、Link et al. (1997, J. Bacteriol. 179: 6228-37)に記載されている方法により行うことができる。ｇｓｈＢ遺伝子全体またはその一部の染色体欠失は、例えば、Datsenko and Wanner (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97: 6640-5)により記載されている方法によるΛ−Ｒｅｄリコンビナーゼシステムの利用によって可能である。また、ｇｓｈＢ対立遺伝子は、Ｐ１ファージによる形質導入または接合によってｇｓｈＢ突然変異を有する菌株からｇｓｈＢ野生型株へと移入させることもでき、この場合、染色体内のｇｓｈＢ野生型遺伝子は対応するｇｓｈＢ対立遺伝子に置き換えられる。
【００５１】
さらに、細胞のグルタチオンシンセターゼ活性は、発現調節に必要な少なくとも一つのエレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位）を単一または複数のヌクレオチドの置換、挿入または欠失により突然変異させることによっても低下させることができる。
【００５２】
大腸菌のｇｓｈＢ遺伝子はグルタチオンシンセターゼ酵素をコードする。ｇｓｈＢ遺伝子は配列番号３により示される。ＧｓｈＢ遺伝子産物（ＧｓｈＢ）は配列番号４により示される。本発明の文脈において、ｇｓｈＢ相同遺伝子とは、配列番号３との配列同一性が３０％を超えるものである。特に好ましくは、配列番号３に対して７０％を超える配列同一性である。ＧｓｈＢホモログは、配列番号４との配列同一性が３０％を超えているタンパク質である。ＧｓｈＢホモログは、特に好ましくは、配列番号４に対して７０％を超える配列同一性を有するものである。
【００５３】
本発明さらに、γ−グルタミルシステイン（γＧＣ）と、このジペプチドの誘導体であるγ−グルタミルシスチンおよびビス−γ−グルタミルシスチンを過剰生産するための方法に関し、この方法では、本発明による微生物株を発酵培地中で培養し、該培地から該細胞を除去し、該培養培地から目的生成物を精製する。
【００５４】
本発明による方法に必要な微生物は、工業規模で当業者に公知の慣行発酵方法によりバイオリアクター（発酵槽）中で培養される（発酵させられる）。
【００５５】
発酵は、好ましくは、従来のバイオリアクター、例えば、撹拌槽、気泡塔型発酵槽またはエアリフト型発酵槽で行われる。特にこの好ましくは、撹拌槽型発酵槽である。この場合の工業規模とは、発酵槽の大きさが少なくとも２ｌであることを意味することと理解される。好ましくは容量が５ｌより大きい発酵槽であり、特に好ましくは、５０ｌを超える容量の発酵槽である。
【００５６】
γ−グルタミルシステイン生産用の細胞は好気増殖条件下で培養され、その場合、発酵中の酸素含有量は最大でも５０％飽和に調整される。培養物中の酸素飽和度はガスの供給および撹拌装置の速度によって自動調節される。
【００５７】
炭素源としては、好ましくは糖、糖アルコール、有機酸または糖含有植物加水分解物である。本発明による方法では、特に好ましくは、炭素源として、グルコース、フルクトース、ラクトース、グリセロールまたはこれらの化合物のうちの２種以上を含んでなるそれらの混合物を使用することである。
【００５８】
生産段階中の発酵槽の炭素源含有量が１０ｇ／ｌを越えないるように、培養物に炭素源が添加されることが好ましい。最大濃度は２ｇ／ｌであることが好ましい。
【００５９】
本発明による方法では、好ましくは、窒素源として、アンモニア、アンモニウム塩またはタンパク質加水分解物を使用することである。ｐＨを安定させるための調整手段としてアンモニアを使用する場合には、この窒素源が発酵中に通常添加される。
【００６０】
さらなる培地添加物として、リン、塩素、ナトリウム、マグネシウム、窒素、カリウム、カルシウム、鉄各元素の塩、ならびに、痕跡量、すなわち、μＭ濃度量の、モリブデン、ホウ素、コバルト、マンガン、亜鉛およびニッケル各元素の塩を添加することができる。
【００６１】
さらに、有機酸（例えば、酢酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−システイン）およびビタミン（例えば、Ｂ１、Ｂ６）を培地に添加することができる。
【００６２】
Ｌ−グルタミン酸は、この場合、酸としてそのまま使用するか、あるいはその塩のうちの一形態、例えば、グルタミン酸のカリウムまたはナトリウム塩として、単独でまたは混合物として使用することができる。好ましくは、グルタミン酸カリウムの使用である。
【００６３】
使用する複合栄養源は、例えば、酵母抽出物、コーンスティープリカー、脱脂大豆または麦芽抽出物であってよい。
【００６４】
大腸菌などの中温性微生物のインキュベーション温度は、好ましくは、１５〜４５℃、特に好ましくは、３０〜３７℃である。
【００６５】
本発明の発酵方法の生産段階は、培養ブロスでγ−グルタミルシステイン、ビス−γ−グルタミルシスチンまたはγ−グルタミルシスチンが初めて検出された時点から始まる。この段階は、一般に、生産発酵槽への前培養物接種から約８〜１２時間後に始まる。
【００６６】
微生物は、記載される方法に従ってバッチ法またはフェドバッチ法により発酵させられ、少なくとも４８時間の増殖期の後に、γ−グルタミルシステインと、それから誘導される化合物γ−グルタミルシスチンおよびビス−γ−グルタミルシスチンを発酵培地中に高効率で分泌する。
【００６７】
本発明の文脈において、γ−グルタミルシステインの過剰生産とは、好ましくは、γ−グルタミルシステインまたはその誘導体であるγ−グルタミルシスチンおよびビス−γ−グルタミルシスチンを、対応する野生型株、親株または非修飾株よりも多く生産する微生物株の能力を意味することと理解される。これは、一般には、培地中でのγ−グルタミルシステイン、γ−グルタミルシスチンおよび／またはビス−γ−グルタミルシスチンの富化として現れる。従って、関連微生物株の発酵終了時に、培地で「総γ−グルタミルシステイン」（γ−グルタミルシステイン＋γ−グルタミルシスチン＋ビス−γ−グルタミルシスチン）が少なくとも０．２ｇ／ｌの収量で検出されるならば、γ−グルタミルシステインの過剰生産が起こっていることになる。培地での「総γ−グルタミルシステイン」の収量は、好ましくは、例えば、表３および表４に記載される本発明の微生物で達成され得るように、３〜２３ｇ／ｌの範囲内である。実利的な方法の確立に関しては、培地での「総γ−グルタミルシステイン」の収量が１０〜２３ｇ／ｌの範囲内であることが特に好ましい。
【００６８】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００６９】
実施例１：大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）における遺伝子ｇｓｈＢの欠失（グルタチオンシンセターゼ(gutathione synthetase)の不活性化）
Datsenko and Wanner (Datsenko and Wanner, 2000, P.N.A.S. 97: 6640-6645)によって開発された「Λ−Ｒｅｄ法」に従い、大腸菌において酵素グルタチオンシンセターゼ（ＧｓｈＢ）をコードする遺伝子ｇｓｈＢを、大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）において欠失させた。カナマイシン耐性(resistence)マーカー（ｋａｎＲ）をコードするＤＮＡ断片を、プライマーｇｓｈＢ−ｄｅｌ−ｆｏｒ（配列番号５）およびｇｓｈＢ−ｄｅｌ−ｒｅｖ（配列番号６）を用いて増幅した。
【００７０】
プライマーｇｓｈＢ−ｄｅｌ−ｆｏｒは、ｇｓｈＢ遺伝子の５’末端と相同な、３０ヌクレオチドからなる配列と、プラスミドｐＫＤ１３（Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ＣＧＳＣ）番号７６３３）上の２つのＦＲＴ部位（ＦＬＰ認識ターゲット）のうちの一方をコードするＤＮＡ配列と相補的な、２０ヌクレオチドを含んでなる配列をコードする。プライマーｇｓｈＢ−ｄｅｌ−ｒｅｖは、ｇｓｈＢ遺伝子の３’末端と相同な、３０ヌクレオチドからなる配列と、プラスミドｐＫＤ１３上のもう一方のＦＲＴ部位をコードするＤＮＡ配列と相補的な、２０ヌクレオチドを含んでなる配列をコードする。
【００７１】
増幅したＰＣＲ産物を、ＵＳ５９７２６６３Ａ号公報の実施例２に記載のとおり、エレクトロポレーションによって大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）に導入した。形質転換されたｇｓｈＢ欠損細胞を、５０ｍｇ／ｌカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上で選択した。マーカー遺伝子（カナマイシン耐性、ｋａｎＲ）をＦＬＰリコンビナーゼ酵素で除去した。この酵素はプラスミドｐＣＰ２０（ＣＧＳＣ番号７６２９）上にコードされていた。プラスミドｐＣＰ２０は、「複製起点」（ｏｒｉ）が温度感受性であるため、形質転換後に大腸菌細胞を４３℃でインキュベートすることにより再び除去することができる。このようにして作製される大腸菌ｇｓｈＢ欠失株をＷ３１１０ΔｇｓｈＢと呼称する。
【００７２】
実施例２：自身のプロモーターを含むｇｓｈＡ遺伝子の増幅
大腸菌におけるｇｓｈＡ遺伝子のプロモーター配列は知られている(Watanabe et al., 1986, Nucleic Acids Res. 14: 4393-4400)。大腸菌のｇｓｈＡ遺伝子とｇｓｈＡプロモーター（ｇｓｈＡｐ）をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。ｇｓｈＡ遺伝子のプロモーター配列をコードするＤＮＡ断片を、プライマーｇｓｈＡｐ−ｇｓｈＡ−ｆｏｒ（配列番号７）およびｇｓｈＡｐ−ｇｓｈＡ−ｒｅｖ（配列番号８）を用いて増幅した。大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）の染色体ＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
【００７３】
およそ１．９ｋｂの大きさのＰＣＲ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｄ）を製造業者の説明書に従って使用してアガロースゲルから単離した。次に、精製したＰＣＲ断片を制限酵素ＸｂａＩで消化し、−２０℃で保存した。
【００７４】
実施例３：ｇｓｈＡ遺伝子の増幅および突然変異誘発
Ａ．ｇｓｈＡ遺伝子の増幅
大腸菌のｇｓｈＡ遺伝子をＰＣＲによって増幅した。大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）の染色体ＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。増幅にはＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）を使用し、これによってＰＣＲ産物の各３’末端にアデニンが付加される。ｇｓｈＡの増幅の過程で、好適なプライマーを用いることにより希少な開始コドンＴＴＧを開始コドンＡＴＧに置き換えた。オリゴヌクレオチドｇｓｈＡ−ＯＥ−ｆｏｒ（配列番号９）およびｇｓｈＡ−ＯＥ−ｒｅｖ（配列番号１０）を特異的プライマーとして用いた。
【００７５】
得られた１．６ｋｂの大きさのＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）を使用してアガロースゲルから単離した。増幅および精製したＰＣＲ産物とベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，  Ｄ）との連結は、「ＴＯＰＯ（商標）ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（商標）Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＰＣＲ（商標）２．１  ＴＯＰＯ（商標）」を使用した「ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」により、製造業者の説明書（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ）に従って行った。
【００７６】
連結混合物を「ＤＨ５α(商標)−Ｔ１Ｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に導入し、これらの細胞で増やし、プラスミド単離後、プラスミドのＤＮＡ配列を配列決定法によって確認した。結果として得られた、所望の配列を有する構築物をｐＣＲ２．１−ｇｓｈＡと呼称する。
【００７７】
Ｂ．ｇｓｈＡ遺伝子の突然変異誘発
ｇｓｈＡの再クローニングのために、最初に、ｇｓｈＡ遺伝子の２つの阻害制限部位ＥｃｏＲＩとＢｇｌＩＩを定方向突然変異誘発(directed mutagensis)によって除去した。突然変異誘発反応は、「ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（商標）  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ）を製造業者の説明書に従って使用して行った。第１の突然変異誘発では、プラスミドｐＣＲ２．１−ｇｓｈＡを鋳型として用いた。ｇｓｈＡ遺伝子のＥｃｏＲＩ切断部位の除去には、突然変異誘発プライマーｇｓｈＡ−ＥｃｏＲＩｍｕｔ−ｆｏｒ（配列番号１１）およびｇｓｈＡ−ＥｃｏＲＩｍｕｔ−ｒｅｖ（配列番号１２）を用いた。ｇｓｈＡ遺伝子のＥｃｏＲＩ切断部位で突然変異誘発を実施後、突然変異誘発反応産物の一部を、この場合にも、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製の「ＤＨ５α(商標)−Ｔ１Ｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」に導入し、これらの細胞で増やした。プラスミド調製後、単離プラスミドのＤＮＡ配列を配列決定法によって確認した。結果として得られた、ｇｓｈＡ遺伝子内にＥｃｏＲＩ切断部位が存在しない適正なＤＮＡ配列を有する構築物をｐＣＲ２．１−ｇｓｈＡ＿ｍｕｔ１と呼称する。
【００７８】
ｐＣＲ２．１−ｇｓｈＡ＿ｍｕｔ１のｇｓｈＡ遺伝子のＢｇｌＩＩ切断部位の除去でも、突然変異誘発反応に突然変異誘発プライマーｇｓｈＡ−ＢｇｌＩＩｍｕｔ−ｆｏｒ（配列番号１３）およびｇｓｈＡ−ＢｇｌＩＩｍｕｔ−ｒｅｖ（配列番号１４）を用いたこと以外は同様の手順を行った。
【００７９】
第２の突然変異誘発反応産物の一部を、この場合にも、「ＤＨ５α(商標)−Ｔ１Ｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ）に導入し、これらの細胞で増やし、プラスミド調製後、もう一度、単離プラスミドのＤＮＡ配列を配列決定法によって確認した。結果として得られた、ｇｓｈＡ遺伝子内にＥｃｏＲＩおよびＢｇ１ＩＩの切断部位が存在しない適正なＤＮＡ配列を有する構築物をｐＣＲ２．１−ｇｓｈＡ＿ｍｕｔ２と呼称する。
【００８０】
実施例４：ｔｕｆＢプロモーター（ｐｔｕｆＢ）をコードするＤＮＡ断片の増幅
ｇｓｈＡ遺伝子の効率的な転写（過剰発現）のために、ｔＲＮＡ−ｔｕｆＢオペロンの活性化領域を用いた(Lee et al., 1981, Cell 25: 251-258)。大腸菌でのこのオペロンはｔｈｒＵ、ｔｙｒＵ、ｇｌｙＴおよびｔｈｒＴという構造遺伝子をコードし、さらに、「タンパク質鎖延長因子(Protein Chain Elongation Factor)ＥＦ−Ｔｕ」（ＴｕｆＢ）タンパク質もコードする。所望のプロモーター配列を、オリゴヌクレオチドｔｕｆＢｐ−ｆｏｒ（配列番号１５）およびｔｕｆＢｐ−ｒｅｖ（配列番号１６）を用いて増幅した。この場合にも、大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）のゲノムＤＮＡを鋳型として用いた。得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、「ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ）を使用してアガロースゲルから単離した。次に、精製したＰＣＲ断片を制限酵素ＸｂａＩで消化し、−２０℃で保存した。
【００８１】
実施例５：ｇｓｈＡ過剰発現のためのプラスミド（ｇｓｈＡプラスミド）の構築
本発明によるプラスミドの構築のための基礎プラスミドとして、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨを使用した。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨの制限および機能地図を図１に示す。ＸｂａＩ認識配列に加えて、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨは次の制限部位を含むポリリンカー領域もコードする：
ＮｏｔＩ−ＮｃｏＩ−ＳｃａＩ−ＮｓｉＩ−ＭｌｕＩ−ＰａｃＩ−ＮｏｔＩ
Ａ．自身のプロモーターを含むｇｓｈＡ遺伝子のクローニング
最初に、実施例２に記載したＸｂａＩ消化を行った、自身のプロモーターと希少な開始コドンＴＴＧを含むｇｓｈＡ遺伝子をコードするＰＣＲ産物を、ｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨのＸｂａＩ切断部位にクローニングした。連結混合物を「ＤＨ５α(商標)−Ｔ１Ｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ）に導入し、これらの細胞で増やし、単離プラスミドのＤＮＡ配列を配列決定法によって確認した。結果として得られた構築物をｐｇｓｈＡｐ−ｇｓｈＡＴＴＧと呼称する（図２参照）。
【００８２】
Ｂ．ｔｕｆＢプロモーターのクローニング
実施例４に記載したＸｂａＩ消化を行った、ｔｕｆＢプロモーター（ｔｕｆＢｐ）をコードするＰＣＲ産物もまた、ｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨのＸｂａＩ切断部位にクローニングした。連結混合物を「ＤＨ５α(商標)−Ｔ１Ｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ）に導入し、これらの細胞で増やし、単離プラスミドのＤＮＡ配列を配列決定法によって確認した。結果として得られた構築物をｐＡＣＹＣ１８４−ｔｕｆＢｐと呼称する。
【００８３】
Ｃ．ｔｕｆＢプロモーターの最適化
天然ｔｕｆＢプロモーターのＤＮＡ配列において実施される合計３回の最適化（突然変異誘発）では、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ｔｕｆＢｐを鋳型として用いた。「ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（商標）  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ）によって、ｔｕｆＢプロモーターのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、−１０領域および−３５領域を最適化し、その結果、それらは最終的に、これらの原核生物プロモーターエレメントの対応するコンセンサス配列をコードした（表１参照）。
【００８４】
【表１】
2014226136.tif 000003
【００８５】
プラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ｔｕｆＢｐ上のｔｕｆＢプロモーターの部位特異的突然変異誘発によるＲＢＳの最適化には、突然変異誘発プライマーｔｕｆＢｐ−ＲＢＳｏｐｔ−ｆｏｒ（配列番号１７）およびｔｕｆＢｐ−ＲＢＳｏｐｔ−ｒｅｖ（配列番号１８）を用いた。
【００８６】
「ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ（商標）  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してｔｕｆＢプロモーターのＲＢＳで突然変異誘発反応を実施後、突然変異誘発反応産物の一部を「ＤＨ５α(商標)−Ｔ１Ｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ）に導入し、これらの細胞で増やし、プラスミド調製後、単離プラスミドのＤＮＡ配列を配列決定法によって確認した。結果として得られた、適正なＤＮＡ配列および最適化ＲＢＳ配列を有する構築物をｐＡＣＹＣ１８４−ｔｕｆＢｐ−ＲＢＳｏｐｔと呼称する。
【００８７】
ｐＡＣＹＣ１８４−ｔｕｆＢｐ−ＲＢＳｏｐｔに基づいた−１０領域の最適化（突然変異誘発）でも、突然変異誘発にプライマーｔｕｆＢｐ−１０ｏｐｔ−ｆｏｒ（配列番号１９）およびｔｕｆＢｐ−１０ｏｐｔ−ｒｅｖ（配列番号２０）を用いたこと以外は同様の方法を用いた。
【００８８】
作製し配列決定法によって確認した最適化ＲＢＳおよび−１０領域を有するプラスミドをｐＡＣＹＣ１８４−ｔｕｆＢｐ（ＲＢＳ−１０）ｏｐｔと呼称する。
【００８９】
−３５領域の突然変異誘発では、この場合にも、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ｔｕｆＢｐ（ＲＢＳ−１０）ｏｐｔを鋳型として用い、プライマーｔｕｆＢｐ−３５ｏｐｔ−ｆｏｒ（配列番号２１）およびｔｕｆＢｐ−３５ｏｐｔ−ｒｅｖ（配列番号２２）を用いて行った。
【００９０】
作製し配列決定法によって確認した、最適化ＲＢＳ、−１０領域および−３５領域を有するプラスミドをｐｔｕｆＢｐと呼称する。結果として得られたプラスミドｐｔｕｆＢｐの制限および機能地図を図３に示す。
【００９１】
Ｄ．ｐｔｕｆＢｐへの、最適化ｔｕｆＢプロモーターの後に最適化開始コドンを含むｇｓｈＡ遺伝子のクローニング
実施例３に記載した、開始コドンＡＴＧを含む突然変異ｇｓｈＡ遺伝子を、酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｇ１ＩＩでの制限酵素消化によりプラスミドｐＣＲ２．１−ｇｓｈＡ＿ｍｕｔ２から除去し、ＥｃｏＲＩおよびＢｇ１ＩＩで切断したベクターｐｔｕｆＢｐに再クローニングした。
【００９２】
結果として得られた構築物ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ（図４参照）を「ＤＨ５α(商標)−Ｔ１Ｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ）に導入し、これらの細胞で増やし、単離プラスミドのＤＮＡ配列を配列決定法によって確認した。
【００９３】
実施例６．ｇｓｈＡ発現プラスミドｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧの、ｓｅｒＡおよび／またはｃｙｓＥ対立遺伝子、およびまたｏｒｆ３０６（＝ｏｒｆ２９９、ｙｄｅＤまたはｅａｍＡ）での延長
γ−グルタミルシステイン生産に対するＬ−システイン生合成増加の影響を調べるために、プラスミドｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧを、ｓｅｒＡおよび／またはｃｙｓＥ対立遺伝子、さらにｏｒｆ３０６（＝ｏｒｆ２９９、ｅａｍＡまたはｙｄｅＤ）で延長した。
【００９４】
Ａ．プラスミドｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧのｓｅｒＡ対立遺伝子での延長
プラスミドｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧを、特定ｓｅｒＡ対立遺伝子で延長するために、最初に、ｓｅｒＡ遺伝子を、それ自体のプロモーターとともにＰＣＲによって増幅した。大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）の染色体ＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。ＰＣＲ反応には、オリゴヌクレオチドｓｅｒＡ−ＮｃｏＩ−ｆｏｒ（配列番号２３）およびｓｅｒＡ−ＳａｃＩ−ｒｅｖ（配列番号２４）を用いた。
【００９５】
次に、増幅した、それ自体のプロモーターを含むｓｅｒＡ遺伝子を、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩ酵素で消化し、アガロースゲル上での精製後、ＮｃｏＩおよびＳａｃＩで切断したｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧベクターに連結した。
【００９６】
連結混合物を「ＤＨ５α(商標)−Ｔ１Ｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ」（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ）に導入し、これらの細胞で増やし、単離プラスミドのＤＮＡ配列を配列決定法によって確認した。このクローニングからもたらされる、天然プロモーターの制御下にあるｓｅｒＡを含むｇｓｈＡプラスミドを、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡと呼称した。Ｌ−セリンに対してフィードバック耐性を示すＳｅｒＡ変異体をコードする様々なｓｅｒＡ対立遺伝子を作製するために、ＥＰ１４９６１１１Ｂ１号公報の実施例２の手順を行った（ただし、ｐＦＬ２０９のコドン３４９および／または３７２への変更では、プラスミドｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡを鋳型として用いた）。突然変異誘発からもたらされる、異なるｓｅｒＡ対立遺伝子を含むｇｓｈＡプラスミドをｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ…（この場合、…は、各々のｓｅｒＡ対立遺伝子番号に相当する）と呼称した（例えば、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ２０４０に関する図５を参照）。
【００９７】
Ｂ．プラスミドｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧのｃｙｓＥ対立遺伝子での延長
プラスミドｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧを、特定ｃｙｓＥ対立遺伝子で延長するために、最初に、ＷＯ９７１５６７３号公報の実施例６（表７）に開示されているｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥ…プラスミドのうちの一つをＮｓｉＩおよびＮｃｏＩで消化した。天然ｃｙｓＥプロモーターの制御下にある特定のｃｙｓＥ対立遺伝子をコードするおよそ１．０ｋｂの大きさの各断片を、アガロースゲル上で精製し、その後、ＮｓｉＩおよびＮｃｏＩで線状化したベクターｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧに連結した。このクローニングからもたらされる、異なるｃｙｓＥ対立遺伝子を含むｇｓｈＡプラスミドをｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ…（この場合、…は、各々のｃｙｓＥ対立遺伝子番号に相当する）と呼称した（例えば、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ１４に関する図６を参照）。
【００９８】
Ｃ．プラスミドｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ…のｃｙｓＥ対立遺伝子での延長
プラスミドｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ…を、特定ｃｙｓＥ対立遺伝子で延長するために、最初に、ＷＯ９７１５６７３号公報の実施例６（表７）に開示されているプラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥ…のうちの一つをＳａｃＩおよびＮｓｉＩで消化した。およそ１．０ｋｂの大きさの断片を、アガロースゲル上で精製し、その後、ＳａｃＩおよびＮｓｉＩで線状化したベクターｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ…に連結した。このクローニングからもたらされる、異なるｃｙｓＥおよびｓｅｒＡ対立遺伝子を含むｇｓｈＡプラスミドをｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ…  −ｓｅｒＡ…（この場合、…は、各々のｃｙｓＥまたはｓｅｒＡ対立遺伝子番号に相当する）と呼称した（ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ１４−ｓｅｒＡ２０４０に関する図７を参照）。
【００９９】
Ｄ．プラスミドｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ…、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ…およびｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ…−ｓｅｒＡ…のｏｒｆ３０６での延長
対応するプラスミドｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ…、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ…およびｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ…−ｓｅｒＡ…を、ｏｒｆ３０６で延長するために、最初に、ＥＰ８８５９６２Ｂ１号公報の実施例２に開示されているプラスミドｐＡＣＹＣ１８４／ｃｙｓＥＩＶ−ＧＡＰＤＨ−ＯＲＦ３０６をＮｓｉＩおよびＰａｃＩで消化した。Ｏ−アセチルセリン／システイン排出輸送体をコードする（ＥａｍＡ、ＹｄｅＤ）およそ１．２ｋｂの大きさの断片を、アガロースゲル上で精製し、その後、ＮｓｉＩおよびＰａｃＩで線状化したベクターｐｔｕｆＢｐ−ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ…、ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ…またはｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ…−ｓｅｒＡ…のうちの一つに連結した。このクローニングからもたらされる、ＧＡＰＤＨプロモーターの制御下にあるｏｒｆ３０６を含むｇｓｈＡプラスミドをｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ…−ｏｒｆ３０６、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ…−ｏｒｆ３０６およびｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ…ｓｅｒＡ…−ｏｒｆ３０６（この場合、…は、各々のｃｙｓＥまたはｓｅｒＡ対立遺伝子番号に相当する）と呼称した（例えば、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ２０４０−ｏｒｆ３０６に関する図８、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ１４−ｏｒｆ３０６に関する図９およびｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ１４−ｓｅｒＡ２０４０−ｏｒｆ３０６に関する図１０を参照）。
【０１００】
実施例７：大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）およびＷ３１１０ΔｇｓｈＢの形質転換
ｇｓｈＡ発現プラスミドｐｇｓｈＡｐ−ｇｓｈＡＴＴＧ、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ２０４０、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ１４、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ１４−ｓｅｒＡ２０４０、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｓｅｒＡ２０４０−ｏｒｆ３０６、ｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ１４−ｏｒｆ３０６およびｐｔｕｆＢｐ−ｇｓｈＡＡＴＧ−ｃｙｓＥ１４−ｓｅｒＡ２０４０−ｏｒｆ３０６と、陰性対照としてのプラスミドｐＡＣＹＣ１８４−ＬＨを、実施例１で既に記載したように、エレクトロポレーションによって、大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）およびＷ３１１０ΔｇｓｈＢに導入した。プラスミドを含む細胞の選択を１５ｍｇ／Ｌテトラサイクリンを含んでなるＬＢ寒天プレート上で行った。
【０１０１】
実施例８：γ−グルタミルシステインおよび誘導体の分析
「総γ−グルタミルシステイン」という用語は、γ−グルタミルシステインと、それから生じる酸化生成物であるビス−γ−グルタミルシスチンおよびγ−グルタミルシスチンを包含し、これらは発酵中に生成され、培養上清中に蓄積する。「総γ−グルタミルシステイン」の濃度はＨＰＬＣ分析によって決定した。
【０１０２】
Ａ．サンプルの前処理
発酵槽サンプルを測定するために、最初に、発酵ブロスの遠心分離工程とその後の無菌化濾過により微生物を除去した。
【０１０３】
「総γ−グルタミルシステイン濃度」を正確に決定するために、測定するサンプル中のγ−グルタミルシステイン誘導体を、モル過剰のジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて室温（２２℃）で１時間還元した。ＤＴＴの還元作用は完全に中性〜アルカリ性ｐＨでしか起こらないため、必要に応じて、事前に、サンプルのｐＨを濃水酸化カリウム水溶液（ＫＯＨ）を用いてｐＨ＞７．０に調整した。
【０１０４】
Ｂ．ＨＰＬＣ分析
脱塩水を用いて対応する希釈液を調製した後に、ＨＰＬＣ分析を、Ｓｙｎｅｒｇｉ  ４μｍ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ  ２５０×４．６ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｔｄ．，  Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ，  Ｄ）を使用して２０℃で行った。溶出剤として、０．５％（ｖ／ｖ）リン酸（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）を用いた。
【０１０５】
細胞を含まない還元物質混合物からのγ−グルタミルシステインの分離には、次のＨＰＬＣ方法を用いた。
・流量＝０．５ｍｌ／分
・ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を使用することによる２００ｎｍでの検出
・１００％Ａでイソクラティック分離を行った。各実施後には、１００％Ｂでの洗い流し工程によりカラムを清浄した。
【０１０６】
γ−グルタミルシステインの保持時間および測定するサンプル中の終濃度の決定には、基準物質として、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＧｍｂＨ  （Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，  Ｄ）製の還元型γ−グルタミルシステインを用いた。「総γ−グルタミルシステイン」の濃度はクロマトグラムのピーク面積から算出した（図１１参照）。
【０１０７】
実施例９：γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性の決定
γ−グルタミルシステインシンセターゼ酵素活性を決定するために、１５ｇ／ｌグルコース、５ｍｇ／ｌビタミンＢ１および１５ｍｇ／ｌテトラサイクリンを添加したＳＭ１培地（１２ｇ／ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、３ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｇ／ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．３ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌクエン酸Ｎａ３×２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ｌ  ＮａＣｌ；１ｍｌ／ｌ微量元素溶液（０．１５ｇ／ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、２．５ｇ／ｌ  Ｈ３ＢＯ３、０．７ｇ／ｌ  ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ｌ  ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ｌ  ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏで構成））３０ｍｌに、表２に記載する菌株の一晩培養物２ｍｌを接種した。６００ｎｍでの初期光学濃度（ＯＤ６００）０．０２５に基づいて、３０ｍｌバッチ全体を３０℃および１３５ｒｐｍでさらに１６時間インキュベートした。
【０１０８】
その後、細胞を遠心分離により回収し、洗浄し、２ｍｌのバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．２）中に再懸濁した。細胞をフレンチプレス（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）によって圧力１２４  １０６ｋＰａで破砕した。粗抽出物(Thw crude extracts)を遠心分離により３０  ０００ｇで清澄化し、γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を、経時的なγ−グルタミルシステインの生成に基づいて測定した。γ−グルタミルシステイン生成アッセイの基礎となる反応混合物は以下からなる：
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．２；１０ｍＭグルタミン酸カリウム；１０ｍＭ  Ｌ−システイン；２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１５０ｍＭ  ＫＣｌ；２０ｍＭ  ＡＴＰおよび０．２５〜４ｍｇ／ｍｌ粗抽出物タンパク質。Ｌ−システインとグルタミン酸カリウムからのγ−グルタミルシステインのＡＴＰ依存的生成は、粗抽出物タンパク質の添加によって開始した。少なくとも２時間にわたって、反応混合物のアリコート（２０μｌ〜５０μｌ）を取り出した。次に、サンプル（アリコート）において、γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性を７０℃で５分間不活性化し、生成したγ−グルタミルシステインの含有量をＨＰＬＣによって決定した（実施例８参照）。γ−グルタミルシステインシンセターゼ活性の１単位は、２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのγ−グルタミルシステインを生成する酵素の量に相当する。
【０１０９】
【表２】
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実施例１０：γ−グルタミルシステイン生産（発酵）
Ａ．前培養物１（振盪フラスコ）：
１ｌのシケイン付(with chicanes)エルレンマイヤーフラスコに入っている１５ｍｇ／ｌテトラサイクリンを含む１００ｍｌのＬＢ培地に、表３および表４に記載する寒天培養の大腸菌株を接種し、振盪機上で３２℃および１３０ｒｐｍで７時間インキュベートした。
【０１１０】
Ｂ．前培養物２（前発酵槽）：
Ｓｉｘｆｏｒｓ（Ｉｎｆｏｒｓ  ＡＧ，  Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，  ＣＨ）型の、発酵培地を充填した発酵槽に、各前培養物１の一部を用いて接種し、開始時の発酵槽内の光学濃度が約０．０１（６００ｎｍで測定）となるようにした。採用した発酵槽の総容量は１ｌであり、初期使用容量は０．７ｌであった。
【０１１１】
発酵培地は以下の成分で構成した：３ｇ／ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．７ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、０．６ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌクエン酸Ｎａ３×２Ｈ２Ｏ、５ｇ／ｌコーンスティープドライ(Cornsteep Dry)（ＣＳＤ）および３ｍｌ／ｌ微量元素溶液（２．５ｇ／ｌ  Ｈ３ＢＯ３、０．７ｇ／ｌ  ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ｌ  ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ｌ  ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏで構成）。この基本培地の滅菌処理後、以下の成分を無菌条件下で添加した：４０ｇ／ｌグルコース、０．０１８ｇ／ｌビタミンＢ１、０．０９ｇ／ｌビタミンＢ６および１５ｍｇ／ｌテトラサイクリン。
【０１１２】
発酵槽のｐＨは、２５％ＮＨ４ＯＨ溶液の添加により７．０に調整した。発酵中は、２５％ＮＨ４ＯＨによる自動調整によってｐＨを７．０値で維持した。培養物を開始時に４００ｒｐｍで撹拌し、ガス流量０．７ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｖｏｌｕｍｅ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ（ｖｖｍ）で、滅菌フィルターを通って無菌化された圧縮空気によりフラッシュした。これらの初期条件下で、接種前に酸素プローブを１００％飽和に調整した。発酵中のＯ２飽和の目標値を５０％に設定した。Ｏ２飽和の目標値を下回った場合には、Ｏ２飽和を目標値に回復させるように調節カスケードを開始させた。この場合、最初に、ガスの供給を連続的に増加させ（最大１．４ｖｖｍまで）、撹拌装置の速度を最大１２００ｒｐｍまで連続的に増加させた。
【０１１３】
発酵は、光学濃度３０〜４０が達成されるまで（６００ｎｍで測定）、温度３２℃で行った。これは、一般的には、約１７時間後であった。
【０１１４】
Ｃ．本培養物（本発酵槽）：
発酵は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  ＧｍｂＨ  （Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，  Ｄ）製のＢＩＯＳＴＡＴ  Ｂ−ＤＣＵ型の発酵槽で行った。総容量２ｌの培養容器を初期使用容量１ｌで使用した。
【０１１５】
発酵培地は以下の成分で構成した：３ｇ／ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．７ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、０．６ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌクエン酸Ｎａ３×２Ｈ２Ｏ、１５ｇ／ｌコーンスティープドライ（ＣＳＤ）および３ｍｌ／ｌ微量元素溶液（２．５ｇ／ｌ  Ｈ３ＢＯ３、０．７ｇ／ｌ  ＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ／ｌ  ＣｕＳＯ４×５Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ｌ  ＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏで構成）。この基本培地の滅菌処理後、以下の成分を無菌条件下で添加した：１０ｇ／ｌグルコース、０．０１８ｇ／ｌビタミンＢ１、０．０９ｇ／ｌビタミンＢ６および１５ｍｇ／ｌテトラサイクリン。
【０１１６】
１００ｍｌの前培養物２を発酵容器に入れて、本培養物に接種した。開始時の発酵槽のｐＨは、２５％ＮＨ４ＯＨ溶液の添加により７．０に調整し、２５％ＮＨ４ＯＨによる自動調整によってこの値で維持した。培養物を開始時に４００ｒｐｍで撹拌し、ガス流量２ｖｖｍで、滅菌フィルターを通って無菌化された圧縮空気によりフラッシュした。これらの初期条件下で、接種前に酸素プローブを１００％飽和に調整した。発酵中のＯ２飽和の目標値を５０％に設定した。Ｏ２飽和の目標値を下回った場合には、Ｏ２飽和を目標値に回復させるように調節カスケードを開始させた。この場合、最初に、ガスの供給を連続的に増加させ（最大５ｖｖｍまで）、撹拌装置の速度を最大１５００ｒｐｍまで連続的に増加させた。
【０１１７】
発酵は温度３２℃で行った。発酵槽内のグルコース含有量が初期の１０ｇ／ｌからおよそ２ｇ／ｌまで減少したらすぐに、６０％グルコース溶液を連続的に添加した。供給速度は、この時点の発酵槽内のグルコース濃度が２ｇ／ｌを超えないように調整した。グルコースの決定はＹＳＩ（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｓｐｒｉｎｇｓ，  Ｏｈｉｏ，  ＵＳＡ）製のグルコース分析装置を使用して行った。
【０１１８】
発酵時間５時間の後に、硫黄源を１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４無菌保存溶液（硫酸アンモニウム）として、１時間あたり８〜１７ｍｍｏｌ／ｌ（平均＝１時間あたり１１ｍｍｏｌ／ｌ）の量で供給した。
【０１１９】
発酵時間１６時間の後に、さらなるグルタミン酸塩を２．３Ｍグルタミン酸カリウム無菌保存溶液として、１時間あたり７．４ｍｍｏｌ／ｌの量で本培養物に添加した。
【０１２０】
発酵期間は７２時間であった。２４時間、４８時間および７２時間の時点でサンプルを採取し、ＤＴＴでの還元後に、培養上清中の「総γ−グルタミルシステイン」の割合をＨＰＬＣ分析によって決定した。
【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【外国語明細書】
2014226136000001.pdf