(57)【要約】ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を使用して、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル、ミトコンドリア異常、および小胞体（ＥＲ）関連ストレスの少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防するための医薬または方法を提供する。本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナルおよびミトコンドリア異常の少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。好ましい実施形態では、角膜内皮の症状、障害または疾患が、フックス角膜内皮ジストロフィである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよびミトコンドリア異常の少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬。
【請求項２】
前記症状、障害または疾患はＴＧＦ−βシグナルおよびミトコンドリア異常に関連するものである、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記ミトコンドリア異常が、ミトコンドリア膜電位低下、ミトコンドリアの形態異常、またはミトコンドリア生合成の低下のうちのいずれか１つまたは複数から選択される、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬。
【請求項５】
前記医薬は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞のミトコンドリア膜電位低下を抑制することにより、フックス角膜内皮ジストロフィの進行を防止するものである、請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２）、および３−［３−ブロモ−４−［（２，４−ジフルオロフェニル）メトキシ］−６−メチル−２−オキソピリジン−１−イル］−Ｎ，４−ジメチルベンザミド（ＰＨ７９７８０４）からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬。
【請求項７】
前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、約３μＭ〜約３０μＭの濃度で、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ２０３５８０）を含む、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、約１μＭ〜約１０μＭの濃度で、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２）を含む、請求項６に記載の医薬。
【請求項９】
前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、約０．３μＭ〜約３μＭの濃度で、３−［３−ブロモ−４−［（２，４−ジフルオロフェニル）メトキシ］−６−メチル−２−オキソピリジン−１−イル］−Ｎ，４−ジメチルベンザミド（ＰＨ７９７８０４）を含む、請求項６に記載の医薬。
【請求項１０】
ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞の保存または保存後の培養のための組成物。
【請求項１１】
前記保存は凍結保存である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬。
【請求項１３】
前記症状、障害または疾患は、タンパク質のフォールディングの異常に起因する、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害、角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、および角膜実質の浮腫、角膜上皮びらん、および血管新生のうち小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する症状、障害または疾患である、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１５】
ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル、ミトコンドリア異常および小胞体（ＥＲ）関連ストレスの少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬。
【請求項１６】
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害、角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、ならびにこれらにより生じる角膜実質浮腫、角膜上皮浮腫、角膜上皮びらん、角膜実質混濁、および血管新生からなる群より選択される、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、請求項１５または１６に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を使用して、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル、ミトコンドリア異常、および小胞体ストレスの少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防するための技術、方法、ならびにそのための薬剤、ならびにこの技術を応用した角膜内皮細胞の保存技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。【０００３】
ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、一度障害を受けると再生する能力は極めて限定的である。フックス角膜内皮ジストロフィは、角膜の内側の内皮細胞が異常を来して角膜の浮腫を生じたりする疾患であり、その原因は不明である。フックス角膜内皮ジストロフィでは、コラーゲン等の細胞外マトリクスが角膜の後部にあるデスメ膜の後面の一部分に沈着しグッテー（Corneal  guttae）およびデスメ膜の肥厚を生じる。グッテー（Corneal  guttae）およびデスメ膜の肥厚はフックス角膜内皮ジストロフィ患者における羞明、霧視の原因であり患者のQOLを著しく損なう。フックス角膜内皮ジストロフィは角膜移植以外に有効な治療法はないとされるが、日本での角膜提供は不足しており、角膜移植の待機患者約２６００人に対し、年間に国内で行われている角膜移植件数は１７００件程度である。【０００４】
フックス角膜内皮ジストロフィについては、フックス角膜患者由来の角膜内皮細胞の培養(非特許文献１および３)や不死化の報告(非特許文献２)があるが、細胞外マトリックスの過剰産生を伴うなどの疾患の特徴を維持した、治療薬、進行予防薬のスクリーニングに適切な細胞の報告はないため、その治療薬の開発には限界があり、現在のところ臨床で使用されている治療薬は存在せず角膜移植に頼らざるを得ない。【０００５】
また特許文献１は、角膜の線維症および／または濁りを治療するためのＴＧＦ−β１インヒビターペプチドを開示する。特許文献２はＴＧＦ−β１，２，３に結合する抗体を開示する。特許文献３は、角膜内皮障害の治療にＮｒｆ２アゴニストまたはアクチベーターが使用され得ること角膜内皮障害の治療にＮｒｆ２アゴニストまたはアクチベーターが使用され得ることを開示する。特許文献４は、トランスフォーミング増殖因子ＴＧＦ−β１（ＴＧＦ−β１）と結合することができ、かつ、サイトカインとの直接的結合によりＴＧＦ−β１の生物活性の強力な阻害剤となるペプチドを開示する。特許文献５は、ＢＭＰ‐７ポリペプチドを含む瘢痕形成抑制剤を開示する。特許文献６は、ＴＧＦ−β阻害作用が治療上または予防上有効である疾患として、角膜障害を概括的に記載する。【０００６】
さらに、角膜内皮の疾患は、小胞体ストレスとも関係している。非特許文献４は、ヒト角膜内皮細胞と小胞体ストレスとの関係に関する基礎研究に関する文献である。特許文献７は、ＴＧＦ−β阻害剤が、ＴＧＦ−βに起因する小胞体ストレスに関連する角膜内皮の疾患を治療し得ることを記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表2013-520405公報
【特許文献２】国際公開第2012/167143号
【特許文献３】国際公開第2012/009171号
【特許文献４】特表2007-525204号公報
【特許文献５】特表2006-508169号公報
【特許文献６】国際公開第2004/018430号
【特許文献７】国際公開第2015/064768
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Zaniolo  K,  et  al.  Exp  Eye  Res.;94(1)：22-31.  2012
【非特許文献２】Azizi  B,  et  al.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci.  2；52(13)：9291-9297.  2011
【非特許文献３】Kelliher  C.  et  al.  Exp  Eye  Res  Vol.93(6),  880-888,  2011
【非特許文献４】William  L.  Corwin  et  al.,  Cryobiology：Vol.63,No.1,  46-55  (2011)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルの細胞において、トランスフォーミング増殖因子−β２（ＴＧＦ−β２）に代表される薬剤を用いることでＴＧＦ−βシグナルが障害を生じることを見出し、このような障害が、驚くべきことにｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤によって治療可能であることを見出し、本発明を完成させた。また、本発明者らは、ミトコンドリア異常がｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤により治癒可能であることを見出した。これらにより、本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよび／またはミトコンドリア異常に起因する角膜内皮障害（特に、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害）の治療または予防に使用することに応用することを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明者らは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤が、角膜内皮細胞の凍結保存による細胞障害を抑制することも見出した。【００１０】
加えて、本発明者らは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤が、折り畳まれなかったタンパク質によりもたらされる小胞体（ＥＲ）関連ストレスを抑制することを見出し、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤が、小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の障害等を治療または予防することが可能であることを見出した。【００１１】
したがって、本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１)ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよびミトコンドリア異常の少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬。
（項目２)前記症状、障害または疾患はＴＧＦ−βシグナルおよびミトコンドリア異常に関連するものである、項目１に記載の医薬。
（項目３)前記ミトコンドリア異常が、ミトコンドリア膜電位低下、ミトコンドリアの形態異常、またはミトコンドリア生合成の低下のうちのいずれか１つまたは複数から選択される、項目１または２に記載の医薬。
（項目４)前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目１〜３のいずれかに記載の医薬。
（項目５)前記医薬は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞のミトコンドリア膜電位低下を抑制することにより、フックス角膜内皮ジストロフィの進行を防止するものである、項目４に記載の医薬。
（項目６)前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２）、および３−［３−ブロモ−４−［（２，４−ジフルオロフェニル）メトキシ］−６−メチル−２−オキソピリジン−１−イル］−Ｎ，４−ジメチルベンザミド（ＰＨ７９７８０４）からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目１〜５のいずれかに記載の医薬。
（項目７)前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、約３μＭ〜約３０μＭの濃度で、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ２０３５８０）を含む、項目６に記載の医薬。
（項目８)前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、約１μＭ〜約１０μＭの濃度で、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２）を含む、項目６に記載の医薬。
（項目９)前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、約０．３μＭ〜約３μＭの濃度で、３−［３−ブロモ−４−［（２，４−ジフルオロフェニル）メトキシ］−６−メチル−２−オキソピリジン−１−イル］−Ｎ，４−ジメチルベンザミド（ＰＨ７９７８０４）を含む、項目６に記載の医薬。
（項目１０)ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞の保存または保存後の培養のための組成物。
（項目１１)前記保存は凍結保存である、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤が水溶性である、項目１〜１１のいずれかに記載の医薬または組成物。
（項目１３）前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤が点眼剤として提供される、項目１〜９のいずれかに記載の医薬。【００１２】
さらにまた、本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目Ｘ１）ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよびミトコンドリア異常の少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬。
（項目Ｘ２）前記症状、障害または疾患はＴＧＦ−βシグナルおよびミトコンドリア異常に関連するものである、項目Ｘ１に記載の医薬。
（項目Ｘ３）前記ミトコンドリア異常が、ミトコンドリア膜電位低下、ミトコンドリアの形態異常、またはミトコンドリア生合成の低下のうちのいずれか１つまたは複数から選択される、項目Ｘ１またはＸ２に記載の医薬。
（項目Ｘ４）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおけるものである、項目Ｘ１〜Ｘ３のいずれかに記載の医薬。
（項目Ｘ５）前記医薬は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞のミトコンドリア膜電位低下を抑制することにより、フックス角膜内皮ジストロフィの進行を防止するものである、項目Ｘ４に記載の医薬。
（項目Ｘ６）前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２）、および３−［３−ブロモ−４−［（２，４−ジフルオロフェニル）メトキシ］−６−メチル−２−オキソピリジン−１−イル］−Ｎ，４−ジメチルベンザミド（ＰＨ７９７８０４）からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項目Ｘ１〜Ｘ５のいずれかに記載の医薬。
（項目Ｘ７）前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、約３μＭ〜約３０μＭの濃度で、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ２０３５８０）を含む、項目Ｘ６に記載の医薬。
（項目Ｘ８）前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、約１μＭ〜約１０μＭの濃度で、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２）を含む、項目Ｘ６に記載の医薬。
（項目Ｘ９）前記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、約０．３μＭ〜約３μＭの濃度で、３−［３−ブロモ−４−［（２，４−ジフルオロフェニル）メトキシ］−６−メチル−２−オキソピリジン−１−イル］−Ｎ，４−ジメチルベンザミド（ＰＨ７９７８０４）を含む、項目Ｘ６に記載の医薬。
（項目Ｘ１０）ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞の保存または保存後の培養のための組成物。
（項目Ｘ１１）前記保存は凍結保存である、項目Ｘ１０に記載の組成物。
（項目Ｘ１２）ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬。
（項目Ｘ１３）前記症状、障害または疾患は、タンパク質のフォールディングの異常に起因する、項目Ｘ１２に記載の医薬。
（項目Ｘ１４）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害、角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、および角膜実質の浮腫、角膜上皮びらん、および血管新生のうち小胞体（ＥＲ）ストレスに関連する症状、障害または疾患である、項目Ｘ１２またはＸ１３に記載の医薬。
（項目Ｘ１５）ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル、ミトコンドリア異常および小胞体（ＥＲ）関連ストレスの少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬。
（項目Ｘ１６）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害、角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、ならびにこれらにより生じる角膜実質浮腫、角膜上皮浮腫、角膜上皮びらん、角膜実質混濁、および血管新生からなる群より選択される、項目Ｘ１５に記載の医薬。
（項目Ｘ１７）前記症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む、項目Ｘ１５またはＸ１６に記載の医薬。【００１３】
本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、フックス角膜内皮ジストロフィ等におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する障害または疾患、ならびに／またはミトコンドリア異常に起因する疾患を処置または予防しうる医薬を提供する。また、本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の障害等を処置または予防しうる医薬を提供する。さらに、本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞の保存のための組成物または角膜内皮細胞の増殖を促進するための組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１のプロトコルの概要を示す。
【図２】図２は、各ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤でプレトリートメントした不死化ヒト角膜内皮細胞をＴＧＦ−β２で刺激して２７時間後の不死化ヒト角膜内皮細胞の位相差顕微鏡写真を示す（上パネル；左からコントロール、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β２＋ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）を示す。下パネル；左からＴＧＦ−β２＋ＳＢ２０３５８０（１０μＭ）、ＴＧＦ−β２＋ＰＨ−７９７８０４（１μＭ）、ＴＧＦ−β２＋ＶＸ−７０２（３μＭ）を示す。）。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいてＴＧＦ−βシグナルに起因する細胞障害を抑制する。
【図３】図３は、フローサイトメトリーにより測定されたＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ陽性細胞の割合（％）を示す。グラフは、左から、ｉＦＥＣＤ、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＳＢ４３１５４２、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＳＢ２０３５８０、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＰＨ−７９７８０４、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＶＸ−７０２を示す。平均±ＳＥＭ、ｎ＝３としてデータを示し、Ｄｕｎｎｅｔ検定を使用してｐ値を計算した。＊＊は統計学的有意（ｐ＜０．０１）を示す。示される通り、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいてプログラム細胞死を抑制する。
【図４】図４は、実施例２のプロトコルの概要を示す。
【図５】図５は、蛍光色素ＪＣ−１による染色像を示す。上段は、ミトコンドリア（緑色蛍光）を示し、中段は、ミトコンドリア膜電位（赤色蛍光）を示している。下段は、上段と中段の蛍光画像およびＤＡＰＩによる核の染色（青）を重ね合わせた画像を示している。赤色の染色（中段）は、ミトコンドリア膜電位を示す。画像は、左から、コントロール、ＣＣＣＰ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β２＋ＳＢ４３１５４２、ＴＧＦ−β２＋ＳＢ２０３５８０、ＴＧＦ−β２＋ＰＨ７９７８０４、ＴＧＦ−β２＋ＶＸ−７０２を示す。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいてミトコンドリア膜電位低下を抑制する。
【図６】図６は、実施例３のプロトコルの概要を示す。
【図７】図７は、ミトコンドリア膜電位をフローサイトメトリーにより測定したものを示す。縦軸は、ミトコンドリア膜電位低下細胞率（％）を示す。左から、ｉＦＥＣＤ、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＳＢ４３１５４３、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＳＢ２０３５８０、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＰＨ−７９７８０４、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＶＸ−７０２を示す。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいてミトコンドリア膜電位低下を抑制する。平均±ＳＥ、ｎ＝３としてデータを示し、Ｄｕｎｎｅｔ検定を使用してｐ値を計算した。＊＊は統計学的有意（ｐ＜０．０１）を示す。
【図８】図８は、実施例４および５のプロトコルの概要を示す。
【図９】図９は、カスパーゼ、ＰＡＲＰおよびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。左のレーンから、ｉＦＥＣＤ、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＳＢ４３１５４３（１０μＭ）、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＳＢ２０３５８０（１０μＭ）、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＰＨ−７９７８０４（１μＭ）、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＶＸ−７０２（３μＭ）を示す。示される通り、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤でプレトリートメントした場合、カスパーゼ３が切断されていることが認められる。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいてカスパーゼの活性化を抑制する。
【図１０】図１０は、ｓｍａｄ２、ｓｍａｄ３およびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。左のレーンから、ｉＨＣＥＣ、ｉＦＥＣＤ、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＳＢ４３１５４３（１０μＭ）、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＳＢ２０３５８０（１０μＭ）、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＰＨ７９７８０４（１μＭ）、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＶＸ−７０２（３μＭ）を示す。示される通り、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ＴＧＦ−βシグナル伝達の下流に存在するｓｍａｄ２およびｓｍａｄ３を抑制していないことが観察された。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルの細胞障害抑制効果はＴＧＦ−βシグナルを抑制するからではない。
【図１１】図１１は、凍結保存した角膜内皮細胞の解凍後２４時間後の細胞数のグラフを示す。縦軸は、コントロール群に対する細胞数の割合を示す。左がコントロール群、右がＳＢ２０３５８０を示す。
【図１２】図１２は、各ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤でプレトリートメントした不死化ヒト角膜内皮細胞をタプシガルギンで刺激して培養した不死化ヒト角膜内皮細胞の位相差顕微鏡を示す。（上パネル；左からコントロール、タプシガルギンを示す。下パネル；左からタプシガルギン＋ＳＢ２０３５８０（１０μＭ）、タプシガルギン＋ＰＨ−７９７８０４（１μＭ）、タプシガルギン＋ＶＸ−７０２（３μＭ）を示す。）。
【図１３】図１３は、カスパーゼ、ＰＡＲＰおよびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。左のレーンから、ｉＦＥＣＤ（コントロール）、ｉＦＥＣＤ＋タプシガルギン、ｉＦＥＣＤ＋タプシガルギン＋ＳＢ２０３５８０（１０μＭ）、ｉＦＥＣＤ＋タプシガルギン＋ＰＨ−７９７８０４（１μＭ）、ｉＦＥＣＤ＋タプシガルギン＋ＶＸ−７０２（３μＭ）を示す。
【図１４】図１４は、ＣＨＯＰおよびＧＡＰＤＨのウェスタンブロットの結果を示す。左のレーンから、ｉＦＥＣＤ（コントロール）、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＳＢ２０３５８０（１０μＭ）、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＰＨ−７９７８０４（１μＭ）、ｉＦＥＣＤ＋ＴＧＦ−β２＋ＶＸ−７０２（３μＭ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１７】
（定義）
本明細書において「細胞分裂因子（マイトージェン）活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ」とは、マイトージェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）をリン酸化する酵素であり、セリン／トレオニンキナーゼのファミリーである。ＭＡＰキナーゼは、様々な細胞外刺激に応答して活性化され、細胞表面から核へのシグナル伝達を仲介するタンパク質セリン／スレオニンキナーゼ群である。ＭＡＰキナーゼはまた、細胞外シグナル調節性プロテインキナーゼ（extracellular  signal-regulated  protein  kinases）またはＥＲＫとも呼ばれ、３キナーゼカスケードの末端酵素である。関係するが区切られたシグナル伝達経路に対する３キナーゼカスケードの反復が、一経路内で逐次的に作用するモジュール多機能シグナル伝達要素としてのＭＡＰキナーゼ経路の概念を生み、この経路ではそれぞれの酵素がリン酸化してそれによりシーケンスの次のメンバーを活性化することが特徴である。このようにして、標準的ＭＡＰキナーゼモジュールは３つのプロテインキナーゼからなる。すなわち、あるＭＡＰキナーゼキナーゼ（またはＭＥＫＫ）があるＭＡＰキナーゼキナーゼ（またはＭＥＫ）を活性化し、これが、順に、あるＭＡＰＫ／ＥＲＫ酵素を活性化する。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ、ＪＮＫ（ｃ−ｊｕｎアミノ末端プロテインキナーゼ（またはＳＡＰＫ）））、およびｐ３８カスケードは、それぞれＭＥＫＫ、ＭＥＫおよびＥＲＫ、またはＭＡＰキナーゼスーパーファミリーメンバーを含む３つの酵素モジュールからなる。様々な細胞外シグナルはそれらのそれぞれの細胞表面レセプターと連合すると初期事象をトリガーし、次いでこのシグナルが細胞内部に伝達され、そこで適切なカスケードを活性化する。
【００１８】
ＭＡＰキナーゼはマイトージェン活性化プロテインキナーゼ（またはＥＲＫ）スーパーファミリーであって、ＴＸＹコンセンサス配列を触媒コアに有する。ＥＲＫ１／２、ｐ３８ＨＯＧ、およびＪＮＫ／ＳＡＰＫは、平行経路における関係するが別個の末端酵素である。
【００１９】
Sebolt-Leopold  et  al.,  Nat.Med.,5(7):810-6  (Jul,1999)は、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の小分子阻害剤を同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏカスケードアッセイシステムを記載している。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＭＥＫ１およびＧＳＴ−ＭＡＰＫ融合タンパク質を細菌細胞から調製して、これらをこのアッセイシステムにおいてＭＥＫ１のＭＡＰＫへ、ＭＢＰ（myelin  basic  protein（ミエリン塩基性タンパク質））への逐次リン酸化に使用した。ＭＥＫ１を直接阻害するＰＤ１８４３５２［２−（２−クロロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロ−ベンズアミド］も見出されている。
【００２０】
本明細書において「ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（「ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤」ともいう。）」とは、ｐ３８に関連するＭＡＰキナーゼのシグナル伝達を阻害する任意の薬剤をいう。したがって、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＭＡＰキナーゼファミリーメンバーであるｐ３８−ＭＡＰキナーゼを標的とし、低下させる、または阻害する化合物に関する。ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は水溶性のものが好ましい。水溶性でなければ、溶媒として身体に適合しにくいものを使用することが必要となりうるからである。水溶性かどうかについては薬局方の溶解度の定義に基づき分類されうる。すなわち、溶質1gまたは1mLを溶かすのに要する溶媒量として、極めて溶けやすい：1mL未満；溶けやすい：1mL以上10mL未満；やや溶けやすい：10mL以上30mL未満；やや溶けにくい：30mL以上100mL未満；溶けにくい：100mL以上1000mL未満；極めて溶けにくい：1000mL以上10000mL未満；ほとんど溶けない：10000mL以上と定義されており、本明細書においても同様に評価する。水溶性とは、水を溶媒としたときに、これらのうち有効量を溶解させるものであれば、任意の溶解性のものを利用することができることが理解される。たとえば、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）であれば、メタノールに可溶であるが水には溶けにくいとされ、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ２０３５８０）の塩酸塩であれば、水に可溶とされ、水溶性に分類される。このような水溶性の成分であれば、点眼剤としても有利に使用される。
【００２１】
ｐ３８は哺乳類動物ＭＡＰキナーゼスーパーファミリーメンバーであって、ストレス、紫外光、および炎症性サイトカインにより活性化される。触媒コアにＴＧＹコンセンサス配列を有する。
【００２２】
異常調節されたキナーゼは多くの疾患、特に増殖性および炎症性障害における主な病因であるということが次第に認識されている。癌領域において最初に同定される発癌遺伝子の１つは、上皮増殖因子レセプターキナーゼ（ＥＧＦＲ）に対するものであったが、その過剰発現は肺、乳、脳、前立腺、ＧＩおよび卵巣癌と関連している。例えば、ＭＡＰキナーゼの構成的活性化は多数の癌細胞系統（膵臓、大腸、肺、卵巣、および腎臓）および様々なヒト器官（腎臓、大腸、および肺）由来の原発腫瘍と関連している（Hoshino  et  al.，Oncogene，18（3）:813-22（Jan．1999））。さらに、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼは、炎症の発症および進行と関連する２つのサイトカイン、ＴＮＦαおよびＩＬ−１の産生を調節する。
【００２３】
本発明において使用されうるｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＶＸ−７４５（Vertex  Pharmaceuticals  Inc．）の他、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害活性を有する化合物であれば特に制限されず、例えば特開２００２−９７１８９号公報、特表２０００−５０３３０４号公報、特表２００１−５２２３５７号公報、特表２００３−５３５０２３号、特表２００１−５０６２６６号公報、特表平９−５０８１２３号公報、国際公開第０１／５６５５３号公報、国際公開第９３／１４０８１号公報、国際公開第０１／３５９５９号公報、国際公開第０３／６８２２９号公報、国際公開第０３／８５８５９号公報、特表２００２−５３４４６８号公報、特表２００１−５２６２２２号公報、特表２００１−５２６２２３号公報、米国特許第６３４４４７６号明細書、国際公開第０３／９９８１１号公報、国際公開第０３／９９７９６号公報、特表２００４−５０６０４２号公報、国際公開第０４／６０２８６号公報、特表２００２−３６３１７９号公報、特表２００４−１０７３５８号公報、米国特許第５６７０５２７号明細書、米国特許第６０９６７５３号明細書、国際公開第０１／４２１８９号公報、国際公開第００／３１０６３号公報などの特許公報に記載された化合物が挙げられ、好ましくは４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０２１９０）、ｔｒａｎｓ−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール（ＳＢ−２３９０６３）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）、４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシピリミジン−４−イル）−１−（ピペリジン−４−イル）イミダゾール（ＳＢ−２４２２３５）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−１−ブチニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＲＷＪ−６７６５７）、４−（４−フルオロフェニル）−１−（ピペリジン−４−イル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＨＥＰ−６８９）、（Ｓ）−２−（２−アミノ−３−フェニルプロピルアミノ）−１−メチル−５−（２−ナフチル）−４−（４−ピリジル）ピリミジン−６−オン（ＡＭＧ−５４８）、２−クロロ−４−（４−フルオロ−２−メチルアニリノ）−２’−メチルベンゾフェノン（ＥＯ−１６０６）、３−（４−クロロフェニル）−５−（１−ヒドロキシアセチルピペリジン−４−イル）−４−（ピリミジン−４−イル）ピラゾール（ＳＤ−０６）、５−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（２，４−ジフルオロフェニルチオ）ピリミド［３，４−ｂ］ピリダジン−６−オン（ＶＸ−７４５）、４−アセチルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルベンズアミド（ＣＰＩ−１１８９）、Ｎ−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−メチルフェニル)ピラゾール−５−イル）−Ｎ’−［４−（２−モルホリノエトキシ）−１−ナフチル］ウレア（ドラマピモド（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ））、２−ベンズアミド−４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）チアゾール−５−イル］ピリジン（ＴＡＫ−７１５）、ＳＣＩＯ−４６９、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２；２−（２，４−ジフルオロフェニル）−６−（１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレイド）ニコチンアミド）、ＧＳＫ−６８１３２３、ＰＳ−５４０４４６、ＳＣ−８００３６、ＡＶＥ−９９４０、ＲＯ−３２０−１１９５、１−（１，３−ジヒドロキシプロプ−２−イル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−［２−フェノキシピリミジン−４−イル］イミダゾール（ＳＢ−２８１８３２）、２−［５−（｛４−［（４−フルオロフェニル）メチル］ピペリジン−１−イル｝カルボニル）−６−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−インドル−３−イル］−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２−オキソアセトアミド（ＳＣＩＯ−３２３）、２−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ｍ−トリル−２Ｈ−ピラゾル−３−イル）−２−ヒドロキシイミド−Ｎ−［４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ナフタレン−１−イル］−アセトアミド（ＫＣ−７０６）、：Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−（２−アミジノヒドラゾノ）エチル］フェニル］デカンジアミド、Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル］フェニル］デカンジアミド（セマピモド（Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ））、３−（３−ブロモ−４−（（２，４−ジフルオロベンジル）オキシ）−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド（ＰＨ−７９７８０４）および５−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン（ＬＹ２２２８８２０）である。
【００２４】
さらに、Tocris  Cookson社（St  Louis、USA）はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｏｃｒｉｓ．ｃｏｍ／に例示される様々なＭＡＰキナーゼ阻害剤を提供する。例えば、ＳＢ２０２１９０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−ピリジニル）−ｌＨ−イミダゾル−２−イル］フェノール）は、高度に選択的、強力、かつ細胞浸透性のｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤である（SmithKline  Beecham，plc）（Jiang  et  al.，J．Biol．Chem，271:17920  （1996）；Frantzet  al.，Biochemistry，37:138-46  （1998）;Nemotoet  al.，J．Biol．Chem．，273:16415  （1998）；およびDavies  et  al.，Biochem．J．，351:95  （2000））。また、アニソマイシン（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２−［（４−メトキシフェニル）メチル］−３，４−ピロリジンジオール−３−アセテート）は、タンパク質合成インヒビター（翻訳をブロックする）である。これは、ストレス活性化プロテインキナーゼ（ＪＮＫ／ＳＡＰＫ）およびｐ３８  ＭＡＰキナーゼの強力なアクチベーターであり、前初期遺伝子（ｃ−ｆｏｓ、ｆｏｓＢ、ｃ−ｊｕｎ、ｊｕｎＢ、およびｊｕｎＤ）誘導の相同的脱感作を選択的に誘発する強力なシグナル伝達アゴニストとして作用する。ＰＤ９８０５９（２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）は、マイトージェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＡＰＫＫ）の特異的阻害剤である（Pfizer=Warner-Lambert  Company）。ＳＢ２０３５８０（４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−ｌＨ−イミダゾル−４−イル］ピリジン）は、ｐ３８マイトージェン活性化プロテインキナーゼの高度に選択的な阻害剤（SmithKlineBeecham，plc）である。インターロイキン−２−誘導によるＴ細胞増殖、シクロオキシゲナーゼ−１および−２、ならびにトロンボキサンシンターゼを阻害することが示されている。ＳＢ２０３５８０塩酸塩（４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−ｌＨ−イミダゾル−４−イル］ピリジン）化合物は、高度に選択的なｐ３８マイトージェン活性化プロテインキナーゼの阻害剤の水溶性塩である。インターロイキン−２−誘導によるＴ細胞増殖、シクロオキシゲナーゼ−１および−２、ならびにトロンボキサンシンターゼを阻害することが示されている。Ｕ０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエン）は、ＭＡＰキナーゼキナーゼの強力かつ選択的な非競合性の阻害剤である。
【００２５】
好ましいｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤としては、ＳＢ２０３５８０（４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）が例示されるがそれに限定されない。
【００２６】
このほかの、本発明で用いることができるｐ３８  ＭＡＰキナーゼ阻害剤としては、例えば、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼに対する中和抗体、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼの活性を阻害する化合物、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼをコードする遺伝子の転写を阻害する化合物（例えば、アンチセンス核酸、ＲＮＡｉ、リボザイム）、ペプチド、および植物成分（例えば、ポリフェノール、フラボノイド、配糖体）等の化合物が挙げられる。使用される濃度として、約５０ｎｍｏｌ／ｌ〜１００μｍｏｌ／ｌが例示され、通常、約０．００１〜１００μｍｏｌ／ｌ、好ましくは、約０．０１〜７５μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５０μｍｏｌ／ｌ、約１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜１０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約５．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約６．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約７．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約８．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約９．０〜１０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜５０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約２．５〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約３．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約４．０〜５．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．２５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約１．７５〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約２．０〜３．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３５μｍｏｌ／ｌ、約０．０９〜３．２μｍｏｌ／ｌであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．０７５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．１〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．５〜１．０μｍｏｌ／ｌ、約０．７５〜１．０μｍｏｌ／ｌであるがこれらに限定されない。
【００２７】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のＰ３８  ＭＡＰキナーゼのシグナル伝達経路のメンバー等をコードする遺伝子（核酸）の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの実施形態としては、上述のＰ３８  ＭＡＰキナーゼ等をコードする遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のＰ３８  ＭＡＰキナーゼ等をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有するＰ３８  ＭＡＰキナーゼ等をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも１２塩基以上２５塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば、１１塩基以下、１００塩基以上、または５００塩基以上であってもよい。アンチセンス核酸は、ＤＮＡのみから構成されていてもよいが、ＤＮＡ以外の核酸、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）を含んでいてもよい。１つの実施形態としては、本発明で用いられるアンチセンス核酸は、５’末端にＬＮＡ、３’末端にＬＮＡを含むＬＮＡ含有アンチセンス核酸であってもよい。また、本発明において、アンチセンス核酸を用いる実施形態では、例えば平島および井上，新生化学実験講座２  核酸ＩＶ遺伝子の複製と発現，日本生化学会編，東京化学同人，1993,319-347．に記載される方法を用いて、Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ等の核酸配列に基づき、アンチセンス配列を設計することができる。
【００２８】
Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ等の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅ  Ｐに含まれるＭ１  ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，１９９０，３５，２１９１．）。
【００２９】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Koizumi,  M.  et  al.,FEBS  Lett,  1988,  228,228.）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（Koizumi,  M.  et  al.,  FEBS  Lett,  1988,  239,  285.、小泉誠および大塚栄子，タンパク質核酸酵素，1990,35,2191.、  Koizumi,M.  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  1989,17,  7059.）。
【００３０】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Buzayan,JM.,  Nature,  1986,  323,  349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi,Y.  &  Sasaki,N.,  Nucl.  Acids  Res,1991,  19,  6751.、菊池洋,化学と生物,  1992,  30,112.）。このように、リボザイムを用いてＰ３８  ＭＡＰキナーゼ等をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００３１】
Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ等の内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖ＲＮＡを用いたＲＮＡ干渉（RNA  interference、以下「ＲＮＡｉ」と略称する）によっても行うことができる。ＲＮＡｉは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が直接細胞内に取り込まれると、このｄｓＲＮＡと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いることにより、ＲＮＡｉを誘導する事が可能で、ＲＮＡｉは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。ｓｉＲＮＡについては、本明細書において他の箇所において詳述される。
【００３２】
本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」とは、１５〜４０塩基からなる二本鎖ＲＮＡ部分を有するＲＮＡ分子であり、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な配列をもつ標的遺伝子のｍＲＮＡを切断し、標的遺伝子の発現を抑制する機能を有する。詳細には、本発明におけるｓｉＲＮＡは、Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ等のｍＲＮＡ中の連続したＲＮＡ配列と相同な配列からなるセンスＲＮＡ鎖と、該センスＲＮＡ配列に相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡ鎖とからなる二本鎖ＲＮＡ部分を含むＲＮＡである。かかるｓｉＲＮＡおよび後述の変異体ｓｉＲＮＡの設計および製造は当業者の技量の範囲内である。Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ等の配列の転写産物であるｍＲＮＡの任意の連続するＲＮＡ領域を選択し、この領域に対応する二本鎖ＲＮＡを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるｍＲＮＡ配列から、より強いＲＮＡｉ効果を有するｓｉＲＮＡ配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。ｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
【００３３】
二本鎖ＲＮＡ部分の長さは、塩基として、１５〜４０塩基、好ましくは１５〜３０塩基、より好ましくは１５〜２５塩基、更に好ましくは１８〜２３塩基、最も好ましくは１９〜２１塩基である。これらの上限および下限は、これら特定のものに限定されず、これら列挙されているものの任意の組み合わせであってもよいことが理解される。ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端（オーバーハング）を有するものであってもよく、３’端が突き出したタイプが好ましい。センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖の３’末端に数個の塩基、好ましくは１〜３個の塩基、さらに好ましくは２個の塩基からなるオーバーハングを有するｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制する効果が大きい場合が多く、好ましいものである。オーバーハングの塩基の種類は特に制限はなく、ＲＮＡを構成する塩基あるいはＤＮＡを構成する塩基のいずれであってもよい。好ましいオーバーハング配列としては、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）等を挙げることができる。例えば、好ましいｓｉＲＮＡとしては、全てのｓｉＲＮＡのセンス・アンチセンス鎖の、３’末端にｄＴｄＴ（デオキシＴを２ｂｐ）をつけているものが挙げられるがそれに限定されない。
【００３４】
さらに、上記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の一方または両方において１〜数個までのヌクレオチドが欠失、置換、挿入および／または付加されているｓｉＲＮＡも用いることができる。ここで、１〜数塩基とは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜４塩基、さらに好ましくは１〜３塩基、最も好ましくは１〜２塩基である。かかる変異の具体例としては、３’オーバーハング部分の塩基数を０〜３個としたもの、３’−オーバーハング部分の塩基配列を他の塩基配列に変更したもの、あるいは塩基の挿入、付加または欠失により上記センスＲＮＡ鎖とアンチセンスＲＮＡ鎖の長さが１〜３塩基異なるもの、センス鎖および／またはアンチセンス鎖において塩基が別の塩基にて置換されているもの等が挙げられるが、これらに限定されない。ただし、これらの変異体ｓｉＲＮＡにおいてセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイゼーションしうること、ならびにこれらの変異体ｓｉＲＮＡが変異を有しないｓｉＲＮＡと同等の遺伝子発現抑制能を有することが必要である。
【００３５】
さらに、ｓｉＲＮＡは、一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するｓｉＲＮＡ（Short  Hairpin  RNA;shRNA）であってもよい。ｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖ＲＮＡ、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖ＲＮＡ、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含むＲＮＡであり、センス鎖部分とアンチセンス鎖部分がハイブリダイズし、二本鎖ＲＮＡ部分を形成する。
【００３６】
ｓｉＲＮＡは、臨床使用の際には、いわゆるｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を示さないことが望ましい。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果とは、標的遺伝子以外に、使用したｓｉＲＮＡに部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けるために、候補ｓｉＲＮＡについて、予めＤＮＡマイクロアレイなどを利用して交差反応がないことを確認することが可能である。また、ＮＣＢＩ（National  Center  for  Biotechnology  Information）などが提供する公知のデータベースを用いて、標的となる遺伝子以外に候補ｓｉＲＮＡの配列と相同性が高い部分を含む遺伝子が存在しないかを確認する事によって、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ効果を避けることが可能である。
【００３７】
本発明のｓｉＲＮＡを作製するには、化学合成による方法および遺伝子組換え技術を用いる方法等、公知の方法を適宜用いることができる。合成による方法では、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成することができる。また、遺伝子組換え技術を用いる方法では、センス鎖配列やアンチセンス鎖配列をコードする発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製することもできる。また、標的遺伝子の特定配列のセンス鎖、該センス鎖配列に相補的な配列からなるアンチセンス鎖、およびその両鎖を繋ぐリンカー配列を含み、ヘアピン構造を形成するｓｈＲＮＡを発現させることにより、所望の二本鎖ＲＮＡを作製することもできる。
【００３８】
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現抑制活性を有する限りにおいては、ｓｉＲＮＡを構成する核酸の全体またはその一部は、天然の核酸であってもよいし、修飾された核酸であってもよい。
【００３９】
本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖ＲＮＡである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組（この「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。）の２本鎖ＲＮＡの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのｓｉＲＮＡは、当業者においては市販の核酸合成機およびＤＩＣＥＲ酵素を用いて適宜作製することが可能であり、また、所望のＲＮＡの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のｓｉＲＮＡには、所謂「カクテルｓｉＲＮＡ」が含まれる。また、本発明におけるｓｉＲＮＡは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド（ＲＮＡ）でなくともよい。即ち、本発明において、ｓｉＲＮＡを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことをいう。
【００４０】
さらに、本発明の上記ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）もまた、Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ等の発現を抑制し得る核酸の好ましい実施形態に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖ＲＮＡを発現し得るＤＮＡ（ベクター）は、該二本鎖ＲＮＡの一方の鎖をコードするＤＮＡ、および該二本鎖ＲＮＡの他方の鎖をコードするＤＮＡが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するＤＮＡである。本発明の上記ＤＮＡは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、目的のＲＮＡをコードするＤＮＡを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００４１】
本発明において標的遺伝子の発現を抑制する核酸には、修飾された核酸を用いてもよい。修飾された核酸とは、ヌクレオシド（塩基部位、糖部位）および／またはヌクレオシド間結合部位に修飾が施されていて、天然の核酸と異なった構造を有するものを意味する。修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド」としては、例えば、無塩基（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２’−デオキシウリジン、α−デオキシリボヌクレオシド、β−Ｌ−デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。上記糖修飾を有するヌクレオシドには、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−デオキシ−２’−フルオロリボース、３’−Ｏ−メチルリボース等の置換五単糖；１’，２’−デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ−アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。これらのヌクレオシドは塩基部位が修飾された修飾塩基であってもよい。このような修飾塩基には、例えば、５−ヒドロキシシトシン、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル等のピリミジン；６−メチルアデニン、６−チオグアノシン等のプリン；および他の複素環塩基等が挙げられる。
【００４２】
修飾された核酸を構成する「修飾されたヌクレオシド間結合」としては、例えば、アルキルリンカー、グリセリルリンカー、アミノリンカー、ポリ（エチレングリコール）結合、メチルホスホネートヌクレオシド間結合；メチルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホチオトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、トリエステルプロドラッグ、スルホン、スルホンアミド、サルファメート、ホルムアセタール、Ｎ−メチルヒドロキシルアミン、カルボネート、カルバメート、モルホリノ、ボラノホスホネート、ホスホルアミデートなどの非天然ヌクレオシド間結合が挙げられる。
【００４３】
本発明の二本鎖ｓｉＲＮＡに含まれる核酸配列としては、Ｐ３８  ＭＡＰキナーゼまたは他のＰ３８  ＭＡＰキナーゼシグナルのメンバーに対するｓｉＲＮＡなどを挙げることができる。
【００４４】
また、本発明の核酸または薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入することができる。そして、得られる細胞を例えば、静脈内、動脈内等に全身投与する。眼の必要な部位等に局所的に投与することもできる。ｓｉＲＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまうため持続時間が限られるためより最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例としては、Ochiya，T  et  al.，Nature  Med．，5:707-710，1999、Curr．Gene  Ther．，1  :31-52，2001より生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されており、このような形態を利用することができるが、本発明の核酸、治療または予防薬の導入の方法はこれには限られない。このようにして、生体内においては血清中の核酸分解酵素の働きにより、速やかに分解されてしまうため長時間の効果の継続を達成することができる。例えば、Takeshita  F.  PNAS.(2003)  102(34)  12177-82、Minakuchi  Y  Nucleic  Acids  Reserch(2004)  32(13)  e109では、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、ｓｉＲＮＡのキャリアーとして非常に適していると報告されており、このような技術を用いることができる。
【００４５】
本明細書において「ｉＦＥＣＤ」（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｕｃｈｓ’  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）は、フックス角膜内皮ジストロフィの不死化細胞の略称である。
【００４６】
本明細書において「ＨＣＥＣ」（ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）とは、ヒト角膜内皮細胞の略称である。「ｉＨＣＥＣ」は、不死化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）ヒト角膜内皮細胞の略称である。
【００４７】
本明細書において、「プログラム細胞死」とは、あらかじめプログラムされているかのように決まった時期や環境で自発的に細胞が死ぬ現象を指す。プログラム細胞死は、例えば「アポトーシス」を含む意味で使用される。
【００４８】
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子−β（トランスフォーミング成長因子−β；略称ＴＧＦ−βとも表示される）」とは、当該分野で用いられるものと同様の意味で用いられ、様々な硬化性疾患や、関節リウマチ、増殖性硝子体網膜症の病態形成を担い、脱毛に深く関与し、免疫担当細胞の働きを抑制する一方、プロテアーゼの過剰産生を抑制することによって肺組織が分解され肺気腫に陥るのを防ぎ、癌細胞の増殖を抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能性サイトカインである。「ＴＧＦ−βシグナル」とは、ＴＧＦ−βによって媒介されるシグナルであって、ＴＧＦ−βによって惹起されるものをいう。ＴＧＦ−βシグナル例えば、ＴＧＦ−β２によって媒介されるシグナルが含まれ、このほか、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３等によって媒介されるシグナルも例示される。ＴＧＦ−βについて、ヒトでは、ＴＧＦ−β１〜β３までの相同性約７０％の３つのアイソフォームが存在し、その作用は類似している。ＴＧＦ−βはレセプターに結合できない分子量約３００ｋＤの不活性な潜在型として産生され、標的細胞表面やその周囲において活性化されてレセプターに結合できる活性型となり、その作用を発揮する。理論に束縛されることを望まないが、標的細胞におけるＴＧＦ−βの作用はＳｍａｄという情報伝達を担う一連のタンパク質のリン酸化経路によって伝達されるとされている。まず、活性型ＴＧＦ−βが標的細胞表面に存在するＩＩ型ＴＧＦ−βレセプターに結合すると、ＩＩ型レセプター２分子とＩ型ＴＧＦ−βレセプター２分子からなるレセプター複合体が形成され、ＩＩ型レセプターがＩ型レセプターをリン酸化する。次に、リン酸化Ｉ型レセプターは、Ｓｍａｄ２またはＳｍａｄ３をリン酸化すると、リン酸化されたＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３はＳｍａｄ４と複合体を形成して核に移行し、標的遺伝子プロモーター領域に存在するＣＡＧＡ  ｂｏｘと呼ばれる標的配列に結合し、コアクチベーターとともに標的遺伝子の転写発現を誘導するとされている。
【００４９】
トランスフォーミング（形質転換）増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達経路は、その標的遺伝子の調節によって、細胞増殖および分化、増殖停止、プログラム細胞死、ならびに上皮間充織分化転換（ＥＭＴ；上皮間葉転換ともいう）といったような、多くの細胞活性を調節することができる。ＴＧＦ−β自体（例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３）、アクチビンおよび骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が含まれる、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーは、細胞増殖、分化、移動およびプログラム細胞死等の強力な調節剤である。
【００５０】
ＴＧＦ−βは、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および活性化マクロファージを含め、多くの細胞により、および多くの他の細胞型により産生される、約２４Ｋｄのタンパク質である。免疫系に対するＴＧＦ−βの効果の中には、ＩＬ−２レセプター誘導、ＩＬ−１誘発性胸腺細胞増殖の阻害、およびＩＦＮ−γ誘発性マクロファージ活性化の遮断がある。ＴＧＦ−βは、様々な病的状態に関与すると考えられており（Ｂｏｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１）、そして腫瘍抑制物質または腫瘍プロモーターのいずれかとして機能することが十分裏付けられている。
【００５１】
ＴＧＦ−βは、２つのセリン／スレオニンキナーゼ細胞表面レセプターであるＴＧＦ−βＲＩＩおよびＡＬＫ５によって、そのシグナル伝達を媒介する。ＴＧＦ−βシグナル伝達は、ＴＧＦ−βＲＩＩがＡＬＫ５レセプターをリン酸化するのを可能とする、リガンド誘発性レセプター二量体化で開始される。そのリン酸化は、ＡＬＫ５キナーゼ活性を活性化して、活性化ＡＬＫ５は次に、下流エフェクターＳｍａｄタンパク質（ＭＡＤの脊椎動物相同体、または「Ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＤＰＰ（デカペンタプレジック）」タンパク質）、Ｓｍａｄ２または３をリン酸化する。Ｓｍａｄ４とのｐ−Ｓｍａｄ２／３複合体は、核に入って、標的遺伝子の転写を活性化する。
【００５２】
Ｓｍａｄ３は、ＳｍａｄのＲ−Ｓｍａｄ（レセプター−活性化Ｓｍａｄ）サブグループのメンバーであって、ＴＧＦ−βレセプターによる転写活性化の直接メディエーターである。ＴＧＦ−β刺激は、Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３のリン酸化および活性化をもたらし、これらは、Ｓｍａｄ４（脊椎動物における「共通（ｃｏｍｍｏｎ）Ｓｍａｄ」または「ｃｏ−Ｓｍａｄ」）と複合体を形成し、これが核と共に蓄積して、標的遺伝子の転写を調節する。Ｒ−Ｓｍａｄは、細胞質に局在し、そしてＴＧＦ−βレセプターによるリガンド誘発性リン酸化で、ｃｏ−Ｓｍａｄと複合体を形成して、核へと移動し、ここで、それらは、クロマチンおよび協同転写因子と関連のある遺伝子発現を調節する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は阻害性Ｓｍａｄ（「Ｉ−Ｓｍａｄ」）であり、すなわち、ＴＧＦ−βにより転写的に誘発されて、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害剤として機能する（Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１：６５９）。Ｓｍａｄ６／７は、Ｒ−Ｓｍａｄのレセプター媒介活性化を妨げることにより、それらの阻害効果を発揮する；それらは、Ｒ−Ｓｍａｄの動員およびリン酸化を競合的に妨げる、Ｉ型レセプターと関連する。Ｓｍａｄ６およびＳｍａｄ７は、Ｓｍａｄ６／７相互作用タンパク質のユビキチン化および分解をもたらす、Ｅ３ユビキチンリガーゼを補充することが知られている。
【００５３】
ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、このほか、ＢＭＰ−７などによって伝達される経路も存在し、これは、ＡＬＫ−１／２／３／６を経由し、Ｓｍａｄ１／５／８を介して機能が発現されるとされている。ＴＧＦ−βシグナル伝達経路については、J.  Massagu’e,  Annu.  Rev.  Biochem.  1998.  67:  753-91;Vilar  JMG,  Jansen  R,  Sander  C  (2006)  PLoS  Comput  Biol  2(1):e3;  Leask,  A.,  Abraham,  D.  J.  FASEB  J.18,  816-827  (2004);  Coert  Margadant  &  Arnoud  Sonnenberg  EMBO  reports  (2010)11,  97-105;  Joel  Rosenbloom  et  al.,  Ann  Intern  Med.  2010;  152:  159-166等を参照のこと。
【００５４】
本明細書において「トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患」とは、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βに誘導される任意の角膜内皮の症状、障害または疾患を指す。本発明では、角膜内皮細胞、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル細胞（例えば、ｉＦＥＣＤ）を、ＴＧＦ−β２に曝露したところ、驚くべきことに種々の障害（例えば、プログラム細胞死）が生じた。このような現象は従来よく解明されていなかった現象である。そして、本発明者らは、このＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患をさらに分析したところ、予想外にも、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤によって、この障害を抑制することができることを見出した。ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患はｐ３８ＭＡＰＫのシグナル伝達経路とは異なるものであり、また、使用したｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はＴＧＦ−βのシグナル伝達経路を抑制しているものではないことから、これまでに未解明の疾患・障害の発露の経路およびその治療または予防の態様を見出すことができたといえる。また、通常最適に使用されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の濃度とも異なる濃度でＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患に対する最適な治療または予防効果がみられていることから、本発明は、角膜内皮について新たな治療／予防技術を提供するものと位置付けることができると考えられる。ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患としては、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior  polymorphous  dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital  hereditary  endothelial  dystrophy)、および特発性角膜内皮障害等において、ＴＧＦ−βの発現がみられるものを挙げることができるがそれらに限定されない。特にＴＧＦ−β２の発現が通常より亢進している角膜内皮細胞または角膜内皮組織では、本発明で見出された障害またはそれに関連する障害が発現または亢進していると考えられることから、そのような角膜内皮細胞または角膜内皮組織がみられる任意の角膜内皮の症状、障害または疾患は、特に本発明の対象として意図される。
【００５５】
本明細書において「ミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患」は、ミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患をいう。角膜内皮の症状、障害および疾患において、ミトコンドリア異常についての分析はあまり進んでいなかった。ミトコンドリアの異常は種々の疾患、障害または症状に影響を与えるものと考えられるが、そのモデルも本発明において提供された。例えば、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル細胞を、ＴＧＦ−β２に曝露したところ、驚くべきことにミトコンドリア膜電位が低下する細胞が有意に増加することが観察された。そして、さらに分析を進めたところ、このミトコンドリア膜電位の低下は、驚くべきことにｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤によって抑制することができた。このミトコンドリア膜電位の低下は、ＴＧＦ−βの抑制によって防止することができることが確認されているものの、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はＴＧＦ−β経路を抑制するものではないことが示されており、これまでに未解明のミトコンドリア異常に関連する疾患・障害の経路およびその治療または予防の態様を見出すことができたといえる。また、通常最適に使用されるｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の濃度とも異なる濃度でミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患に対する最適な治療または予防効果がみられていることから、本発明は、角膜内皮について新たな治療／予防技術を提供するものと位置付けることができると考えられる。ミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患としては、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior  polymorphous  dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital  hereditary  endothelial  dystrophy)、および特発性角膜内皮障害において、ミトコンドリア異常がみられる任意のものを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００５６】
本明細書において「小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患」とは、小胞体（ＥＲ）ストレスに関連するものを指し、例えば、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害、角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、グッテーの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、混濁、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレア、および角膜実質の浮腫、角膜上皮びらん、血管新生等のうち小胞体（ＥＲ）ストレスに関連するものを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明が対象とする症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィに関する障害である。フックス角膜内皮ジストロフィに関しては、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−β誘導が関与していることが示されており、ＦＥＣＤにおける細胞喪失に関与し得ることも示されている。したがって、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の阻害は、ＦＥＣＤの有効な治療になり得ることが当然予想される。しかしながら、本発明者らは、予想外にも、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が、ＴＧＦ−βシグナルに起因する障害を抑制できることを見出した。しかも、図１０に示されるように、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はＴＧＦ−βシグナル伝達経路を阻害するものではないことから、別のメカニズムでＴＧＦ−βシグナルに起因する障害を治療し得るものであると理解することができる。このように、異なるメカニズムで新たに見出された障害を治療することができることは、医科学的にも注目すべきである事象である。
【００５８】
本発明の医薬は、フックス角膜内皮ジストロフィの中でもひとつの重要な異常または障害の原因となるＴＧＦ−β２に誘導される細胞障害等を処置しうることから、フックス角膜内皮ジストロフィの治療または予防に有用であることが理解される。特に、本発明では実施例において、フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおいてＴＧＦ−β２に誘導される細胞障害あるいはプログラム細胞死を抑制することができたことから本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィモデルにおけるＴＧＦ−β２に関連する重症患者の治療に使用することができると考えられる。本発明は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害や、角膜内皮密度低下、guttaeの形成、デスメ膜の肥厚、角膜厚の肥厚、角膜上皮障害、角膜実質混濁、羞明、霧視、視力障害、眼痛、流涙、充血、疼痛、水疱性角膜症、眼の不快感、コントラスト低下、グレアおよび角膜実質の浮腫などを処置しまたは予防し得る。
【００５９】
また、本発明では、実施例において実証されるように、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮細胞の病態について、ミトコンドリア異常が関与することが示された。本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤によりミトコンドリア異常を抑制することも可能であることが見出され、ミトコンドリア異常に起因するフックス角膜内皮ジストロフィの治療または予防に有用であることが理解される。具体的な実施形態では、本発明はまた、ミトコンドリア異常、例えば、ミトコンドリア膜電位低下、ミトコンドリアの形態異常、ミトコンドリア生合成の低下等を抑制することができる。
（一般技術）
【００６０】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Sambrook  J.et  al.(1989).Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harborおよびその3rd  Ed.(2001);  Ausubel,  F.M.(1987).Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Ausubel,  F.M.(1989).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates  and  Wiley-Interscience;  Innis,  M.  A.(1990).PCR  Protocols:  A  Guide  to  Methods  and  Applications,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1992).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Ausubel,  F.M.(1995).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Greene  Pub.  Associates;  Innis  ,M.A.  et  al.(1995).PCR  Strategies,  Academic  Press;  Ausubel,  F.M.(1999).Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley,  and  annual  updates;  Sninsky,  J.J.et  al.(1999).PCR  Applications:  Protocols  for  Functional  Genomics,  Academic  Press、Gait,  M.J.(1985).Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Gait,  M.J.(1990).Oligonucleotide  Synthesis:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Eckstein,  F.(1991).Oligonucleotides  and  Analogues:  A  Practical  Approach,  IRL  Press;  Adams,  R.L.  et  al.(1992).The  Biochemistry  of  the  Nucleic  Acids,  Chapman  &  Hall;  Shabarova,  Z.  et  al.(1994).Advanced  Organic  Chemistry  of  Nucleic  Acids,  Weinheim;  Blackburn,  G.M.  et  al.(1996).Nucleic  Acids  in  Chemistry  and  Biology,  Oxford  University  Press;  Hermanson,  G.T.(I996).Bioconjugate  Techniques,  Academic  Press、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されている。角膜内皮細胞については、Nancy  Joyceらの報告｛Joyce,  2004  #161}  {Joyce,  2003  #7｝がよく知られているが、前述のごとく長期培養、継代培養により線維芽細胞様の形質転換を生じ、効率的な培養法の研究が現在も行われている。これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００６１】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本発明の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
【００６２】
＜医薬＞
１つの局面において、本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。
【００６３】
別の局面において、本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。
【００６４】
さらなる局面において、本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナルおよびミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。
【００６５】
ｐ３８ＭＡＰキナーゼは、種々のシグナル伝達に関与するとされており、炎症に関与するともされているが、角膜内皮では、そのメカニズムのすべては明らかにされておらず、ＴＧＦ−β、ミトコンドリア障害またはその両方に起因する角膜内皮障害の治癒または予防に有効であることは予想できなかった。したがって、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤が、ＴＧＦ−βに起因する角膜内皮障害、ミトコンドリア障害に起因する角膜内皮障害またはその両方に起因する角膜内皮障害の治療または予防に有効であることは、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデル細胞にＴＧＦ−βを曝露することによって、その障害または症状、例えばプログラム細胞死の増加やミトコンドリア異常（膜電位低下）が悪化することを見出し、その悪化モデルを用いてｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤の効果を検証することによって初めて見出された予想外の発見であった。
【００６６】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior  polymorphous  dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital  hereditary  endothelial  dystrophy)、および特発性角膜内皮障害からなる群より選択される。
【００６７】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるミトコンドリア異常に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior  polymorphous  dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital  hereditary  endothelial  dystrophy)、および特発性角膜内皮障害からなる群より選択される。好ましい実施形態では、ＴＧＦ−βシグナルに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、ＴＧＦ−β２に起因する角膜内皮の症状、障害または疾患である。
【００６８】
１つの実施形態では、ミトコンドリア異常としては、ミトコンドリア膜電位低下、ミトコンドリアの形態異常、ミトコンドリア生合成などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
さらに別の局面において、本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。本発明者らは、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルの細胞において、小胞体（ＥＲ）関連ストレスに関連するタプシガルギンで刺激することにより、角膜内皮細胞が障害を生じることを見出し、このような障害が、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤により抑制されることを明らかにした。上述のとおり、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＴＧＦ−βシグナルおよびミトコンドリア異常に起因する角膜内皮障害等を処置または予防し得るものであるが、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤がさらに角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスを抑制することが可能であることは驚くべきことであった。これは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤が、角膜内皮細胞におけるＴＧＦ−βシグナル、ミトコンドリア異常、および小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮障害を同時に処置し得ることを示唆する。特に、フックス角膜内皮ジストロフィは、ＥＲストレスと関連していることが知られており（Engler,  C.  et  al.  Am  J  Ophthalmol  149,  194-202  (2010)）、そのためＥＲストレスを抑制することは、フックス角膜内皮ジストロフィの治療および予防における著明な改善が可能であり、場合によっては完全な治癒が可能であることを意味している。
【００７０】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、タンパク質のフォールディングの異常に起因するものであり得る。哺乳動物細胞において、フォールディングしなかったり（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）、ミスフォールディングやタンパク質分解の異常などにより凝集したタンパク質（折りたたみ不全タンパク質、変性タンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）ともいう。）はユビキチン化され、微小管上を移動するダイニンモーターにより中心体付近に蓄積し、アグリソームという封入体を形成することが知られる。一般的にアグリソームは熱ショックやウイルス感染、酸化ストレスなどによって形成される。ヒトでは、パーキンソン病の神経細胞に見られるＬｅｗｙ小体や、アルコール性肝臓疾患の肝臓細胞で見られるＭａｌｌｏｒｙ小体、筋萎縮性側索硬化症の星状細胞で見られる硝子様小体など、細胞内の封入体が関与する疾患がいくつか知られている。本発明のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、変性タンパク質の産生に関与しているタプシガルギンなどにより誘導されるフォールディングの異常に起因する小胞体（ＥＲ）ストレス抑制し得る。さらに、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、ＴＧＦβに誘導される小胞体（ＥＲ）ストレスをも抑制し得る。ＴＧＦ−β阻害剤は、ＴＧＦ−βに起因する小胞体（ＥＲ）ストレスを抑制し得るが、フォールディングの異常に起因する小胞体（ＥＲ）ストレスを抑制することはできなかった（国際公開第2015/064768）。したがって、本願発明のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤のように、フォールディングの異常に起因するＥＲストレスおよびＴＧＦ−βに起因するＥＲストレスの両方を抑制し得ることは予想外であった。
【００７１】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞における小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害、角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、ならびにこれらにより生じる角膜実質浮腫、角膜上皮浮腫、角膜上皮びらん、角膜実質混濁、および血管新生からなる群より選択される。
【００７２】
別の局面において、本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル、ミトコンドリア異常および小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための医薬を提供する。
【００７３】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル、ミトコンドリア異常および小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィにおける角膜内皮細胞の障害、角膜内皮障害、角膜内皮密度低下、ならびにこれらにより生じる角膜実質浮腫、角膜上皮浮腫、角膜上皮びらん、角膜実質混濁、および血管新生からなる群より選択される。
【００７４】
１つの実施形態では、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル、ミトコンドリア異常および小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患は、フックス角膜内皮ジストロフィを含む。
【００７５】
１つの実施形態において、本発明の利用法としては、例えば点眼薬が挙げられるが、これに限定されず、前房内への注射、徐放剤への含浸、結膜下注射、全身投与（内服、静脈注射）などの投与方法も挙げることができる。
【００７６】
１つの実施形態では、本発明において用いられるｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０２１９０）、ｔｒａｎｓ−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール（ＳＢ−２３９０６３）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ−２０３５８０）、４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシピリミジン−４−イル）−１−（ピペリジン−４−イル）イミダゾール（ＳＢ−２４２２３５）、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−ヒドロキシ−１−ブチニル）−１−（３−フェニルプロピル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＲＷＪ−６７６５７）、４−（４−フルオロフェニル）−１−（ピペリジン−４−イル）−５−（４−ピリジル）イミダゾール（ＨＥＰ−６８９）、（Ｓ）−２−（２−アミノ−３−フェニルプロピルアミノ）−１−メチル−５−（２−ナフチル）−４−（４−ピリジル）ピリミジン−６−オン（ＡＭＧ−５４８）、２−クロロ−４−（４−フルオロ−２−メチルアニリノ）−２’−メチルベンゾフェノン（ＥＯ−１６０６）、３−（４−クロロフェニル）−５−（１−ヒドロキシアセチルピペリジン−４−イル）−４−（ピリミジン−４−イル）ピラゾール（ＳＤ−０６）、５−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（２，４−ジフルオロフェニルチオ）ピリミド［３，４−ｂ］ピリダジン−６−オン（ＶＸ−７４５）、４−アセチルアミノ−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルベンズアミド（ＣＰＩ−１１８９）、Ｎ−［３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（４−メチルフェニル)ピラゾール−５−イル）−Ｎ’−［４−（２−モルホリノエトキシ）−１−ナフチル］ウレア（ドラマピモド（Ｄｏｒａｍａｐｉｍｏｄ））、２−ベンズアミド−４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）チアゾール−５−イル］ピリジン（ＴＡＫ−７１５）、タルマピモド（Ｔａｌｍａｐｉｍｏｄ；ＳＣＩＯ−４６９）、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２；２−（２，４−ジフルオロフェニル）−６−（１−（２，６−ジフルオロフェニル）ウレイド）ニコチンアミド）、ジルマピモド（ｄｉｌｍａｐｉｍｏｄ；ＧＳＫ−６８１３２３）、４−（５−（シクロプロピルカルバモイル）−２−メチルフェニルアミノ）−５−メチル−Ｎ−プロピルピロロ（１，２−ｆ）（１，２，４）トリアジン−６−カルボキサミド（ＰＳ−５４０４４６）、抗ＦＧＦ−７抗体（ＳＣ−８００３６）、ＡＶＥ−９９４０（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、［５−アミノ−１−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−ピラゾル−４−イル］［３−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロポキシ）フェニル]メタノン（ＲＯ−３２０−１１９５）、１−（１，３−ジヒドロキシプロプ−２−イル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−［２−フェノキシピリミジン−４−イル］イミダゾール（ＳＢ−２８１８３２）、２−［５−（｛４���［（４−フルオロフェニル）メチル］ピペリジン−１−イル｝カルボニル）−６−メトキシ−１−メチル−１Ｈ−インドル−３−イル］−Ｎ，Ｎ’−ジメチル−２−オキソアセトアミド（ＳＣＩＯ−３２３）、２−（５−ｔｅｒｔ−ブチル−２−ｍ−トリル−２Ｈ−ピラゾル−３−イル）−２−ヒドロキシイミド−Ｎ−［４−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ナフタレン−１−イル］−アセトアミド（ＫＣ−７０６）、Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−（２−アミジノヒドラゾノ）エチル］フェニル］デカンジアミド、Ｎ，Ｎ’−ビス［３，５−ビス［１−［２−（アミノイミノメチル）ヒドラゾノ］エチル］フェニル］デカンジアミド（セマピモド（Ｓｅｍａｐｉｍｏｄ））、３−（３−ブロモ−４−（（２，４−ジフルオロベンジル）オキシ）−６−メチル−２−オキソピリジン−１（２Ｈ）−イル）−Ｎ，４−ジメチルベンズアミド（ＰＨ−７９７８０４）、および５−（２−（ｔｅｒｔ−ブチル）−５−（４−フルオロフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−３−ネオペンチル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−２−アミン（ＬＹ２２２８８２０）からなる群より選択される少なくとも１つを含む。
【００７７】
本発明の医薬において、上記ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、単独で使用されてもよく、組み合わせて使用されてもよい。本発明で使用されるｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤の濃度は、通常約０．１〜１００μＭ（μｍｏｌ／ｌ）、好ましくは約０．１〜３０μＭ、より好ましくは約１〜１０μＭであり、２種以上のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を組み合わせて使用する場合は適宜変更することができ、他の濃度範囲としては、例えば、通常、約０．００１〜１００μＭ、好ましくは、約０．０１〜７５μＭ、約０．０５〜５０μＭ、約１〜１０μＭ、約０．０１〜１０μＭ、約０．０５〜１０μＭ、約０．０７５〜１０μＭ、約０．１〜１０μＭ、約０．５〜１０μＭ、約０．７５〜１０μＭ、約１．０〜１０μＭ、約１．２５〜１０μＭ、約１．５〜１０μＭ、約１．７５〜１０μＭ、約２．０〜１０μＭ、約２．５〜１０μＭ、約３．０〜１０μＭ、約４．０〜１０μＭ、約５．０〜１０μＭ、約６．０〜１０μＭ、約７．０〜１０μＭ、約８．０〜１０μＭ、約９．０〜１０μＭ、約０．０１〜５０μＭ、約０．０５〜５．０μＭ、約０．０７５〜５．０μＭ、約０．１〜５．０μＭ、約０．５〜５．０μＭ、約０．７５〜５．０μＭ、約１．０〜５．０μＭ、約１．２５〜５．０μＭ、約１．５〜５．０μＭ、約１．７５〜５．０μＭ、約２．０〜５．０μＭ、約２．５〜５．０μＭ、約３．０〜５．０μＭ、約４．０〜５．０μＭ、約０．０１〜３．０μＭ、約０．０５〜３．０μＭ、約０．０７５〜３．０μＭ、約０．１〜３．０μＭ、約０．５〜３．０μＭ、約０．７５〜３．０μＭ、約１．０〜３．０μＭ、約１．２５〜３．０μＭ、約１．５〜３．０μＭ、約１．７５〜３．０μＭ、約２．０〜３．０μＭ、約０．０１〜１．０μＭ、約０．０５〜１．０μＭ、約０．０７５〜１．０μＭ、約０．１〜１．０μＭ、約０．５〜１．０μＭ、約０．７５〜１．０μＭ、約０．０９〜３５μＭ、約０．０９〜３．２μＭであり、より好ましくは、約０．０５〜１．０μＭ、約０．０７５〜１．０μＭ、約０．１〜１．０μＭ、約０．５〜１．０μＭ、約０．７５〜１．０μＭを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００７８】
好ましい実施形態では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、例えば、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ２０３５８０）、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２）、および３−［３−ブロモ−４−［（２，４−ジフルオロフェニル）メトキシ］−６−メチル−２−オキソピリジン−１−イル］−Ｎ，４−ジメチルベンザミド（ＰＨ７９７８０４）ならびにそれらの塩からなる群より選択される。
【００７９】
別の実施形態では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）−１Ｈ−イミダゾール（ＳＢ２０３５８０）である。使用されるＳＢ２０３５８０の濃度としては、通常約３μＭ〜約３０μＭであり、好ましくは、約５〜約１５μＭであり、より好ましくは、約１０μＭである。
【００８０】
別の実施形態では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、１−（カルバモイル−６−（２，４−ジフルオロフェニル）ピリジン−２−イル）−１−（２，６−ジフルオロフェニル）尿素（ＶＸ−７０２）である。使用されるＶＸ−７０２の濃度としては、通常約１μＭ〜約１０μＭであり、好ましくは、約１．５μＭ〜約６μＭであり、より好ましくは、約３μＭである。
【００８１】
さらに別の実施形態では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、３−［３−ブロモ−４−［（２，４−ジフルオロフェニル）メトキシ］−６−メチル−２−オキソピリジン−１−イル］−Ｎ，４−ジメチルベンザミド（ＰＨ７９７８０４）である。使用されるＰＨ７９７８０４の濃度としては、通常約０．３μＭ〜約３μＭであり、好ましくは、約０．５μＭ〜約２μＭ、より好ましくは、約１μＭである。
【００８２】
上記ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（例えば、ＳＢ２０３５８０、ＶＸ−７０２およびＰＨ−７９７８０４）は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤として通常能力を発揮するとされている濃度は、サブμＭとされているところ、フックス角膜内皮ジストロフィのモデル細胞を用いた系においては、予想外にもより高い濃度（μＭオーダー）で角膜内皮障害の抑制効果が発揮されることが明らかになった。
【００８３】
理論に束縛されることを望まないが、従来ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤としてトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）およびミトコンドリア異常の少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患を治療または予防することができるということは、従来の知見では予想できるものではない。また、上記各々のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤な阻害剤についても、その最適濃度が、従来知られているｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤としての濃度と異なることも明らかになった。この点でも、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤が、従来知られていなかったトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）およびミトコンドリア異常の少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防を達成しており、従来予想されたものとは異なる治療剤または予防剤を提供するものである。
【００８４】
１つの実施形態では、本発明の治療または予防するための医薬は、角膜内皮を有する任意の動物、例えば哺乳動物を対象とすることができ、好ましくは霊長類の角膜内皮の治療または予防を目的とする。好ましくは、この治療または予防の対象は、ヒトの角膜内皮である。
【００８５】
別の局面では、本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤の有効量をそれを必要な被験体に投与する工程を含む、角膜内皮細胞におけるトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）およびミトコンドリア異常の少なくとも１つに起因する角膜内皮の症状、障害または疾患の治療または予防のための方法を提供する。
【００８６】
本明細書において「被験体」とは、本発明の治療および予防するための医薬または方法の投与(移植)対象を指し、被験体としては、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等)があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。
【００８７】
特定の疾患、障害または状態の治療に有効な本発明の医薬の有効量は、障害または状態の性質によって変動しうるが、当業者は本明細書の記載に基づき標準的臨床技術によって決定可能である。さらに、必要に応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、最適投薬量範囲を同定するのを補助することも可能である。配合物に使用しようとする正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重大性によっても変動しうるため、担当医の判断および各患者の状況に従って、決定すべきである。しかし、投与量は特に限定されないが、例えば、１回あたり０．００１、１、５、１０、１５、１００、または１０００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。投与間隔は特に限定されないが、例えば、１、７、１４、２１、または２８日あたりに１または２回投与してもよく、それらいずれか２つの値の範囲あたりに１または２回投与してもよい。投与量、投与回数、投与間隔、投与方法は、患者の年齢や体重、症状、投与形態、対象臓器等により、適宜選択してもよい。例えば、本発明は点眼剤として使用され得る。また、本発明の医薬を前房内に注入することもできる。また治療薬は、治療有効量、または所望の作用を発揮する有効量の有効成分を含むことが好ましい。治療マーカーが、投与後に有意に減少した場合に、治療効果があったと判断してもよい。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−反応曲線から推定可能である。
【００８８】
＜保存用組成物＞
別の局面において、本発明は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、角膜内皮細胞の保存のための組成物を提供する。好ましい実施形態では、保存は凍結保存である。本発明において用いられるｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、本明細書において説明される任意の形態、例えば、医薬として説明されている実施形態のうち、保存用組成物として適切なものを用いることができると理解される。本明細書において「保存用組成物」とは、ドナーから摘出した角膜片を、レシピエントに移植するまでの期間において保存するため、あるいは増殖前または増殖した角膜内皮細胞を保存するための組成物である。
【００８９】
１つの実施形態では、本発明の保存用組成物は、従来使用される保存剤または保存液に本発明のｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を添加して調製され得る。そのような角膜保存液としては、角膜移植時に通常用いられる保存液（強角膜片保存液（Ｏｐｔｉｓｏｌ  ＧＳ：登録商標）、角膜移植用眼球保存液（ＥＰＩＩ：登録商標））、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。
【００９０】
本発明の保存用組成物は、臓器移植などに用いられる角膜の保存用に用いられる。また、本発明の保存用組成物は、角膜内皮細胞を凍結保存するための保存液またはその成分としても用いられる。
【００９１】
凍結保存のために使用される本発明の保存用組成物の別の実施形態では、既存の凍結保存液に本発明のカスパーゼ阻害剤を含む保存用組成物を添加して使用することもできる。凍結保存液としては、例えば、タカラバイオにより提供されるＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）シリーズ（ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫＥＲ  ＰＬＵＳ（カタログ番号：ＣＢ０２１）、ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫＥＲ  ２（カタログ番号：ＣＢ０３１）、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（カタログ番号：ＣＢ０４３）など）、ＫＭ  ＢＡＮＫＥＲ（コージンバイオ  カタログ番号：ＫＯＪ−１６０９２００５）、およびＦｒｅｅｚｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｆｒｅｅ，  ＣＲＹＯ  Ｄｅｆｉｎｅｄ（Ｃｎｔ−ＣＲＹＯとも記載される）（ＣＥＬＬＮＴＥＣ  カタログ番号：ＣｎＴ−ＣＲＹＯ−５０）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、使用される凍結保存液はＫＭ  ＢＡＮＫＥＲであってもよい。また、当業者であれば、上記凍結保存液の構成成分を適宜変更またはさらなる構成成分を添加し、改変された適切な凍結保存液を使用することができることが理解される。凍結保存のためには、本発明の保存液にグリセロール、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、アセトアミド等をさらに添加してもよい。
【００９２】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００９３】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００９４】
以下に、本発明の例を記載する。該当する場合生物試料等の取り扱いは、厚生労働省、文部科学省等において規定される基準を遵守し、該当する場合はヘルシンキ宣言またはその宣言に基づき作成された倫理規定に基づいて行った。研究のための眼の寄贈については、全ての故人ドナーの近親者から同意書を得た。本研究は、エルランゲン大学（ドイツ）、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）アイバンクの倫理委員会またはそれに準ずるものの承認を受けた。【００９５】
（調製例：フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）モデルの作製）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞から不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）を作製した。【００９６】
（培養方法）
シアトルアイバンクから購入した研究用角膜より角膜内皮細胞を基底膜とともに機械的に剥離し、コラゲナーゼを用いて基底膜よりはがして回収後、初代培養を行った。培地はＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｌｉｑｕｉｄ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：３１９８５−０７０）に、８％ＦＢＳ（ＢＩＯＷＥＳＴ、カタログ番号：Ｓ１８２０−５００）、２００ｍｇ／ｍｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ７９０２−５００Ｇ）、０．０８％  コンドロイチン硫酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ｃ９８１９−５Ｇ）、２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号：Ａ４５４４−２５Ｇ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：１５７１０−０６４）および５ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  カタログ番号：ＰＨＧ０３１１）を加えた３Ｔ３フィーダー細胞用の馴化させたものを基本培地として用いた。また、基本培地にＳＢ４３１５４２（１μｍｏｌ／ｌ）およびＳＢ２０３５８０（４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルホニルフェニル）−５（４−ピリジル）イミダゾール＜４−［４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−１Ｈ−イミダゾール−５−イル］ピリジン）（１μｍｏｌ／ｌ）を添加したもの（本明細書では「ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地」ともいう）で培養した。【００９７】
（取得方法）
フックス角膜内皮ジストロフィの臨床診断により水疱性角膜症に至り、角膜内皮移植（デスメ膜内皮角膜移植＝ＤＭＥＫ）を実施されたヒト患者３名より文書による同意および倫理員会の承認のもと角膜内皮細胞を得た。ＤＭＥＫの際に機械的に病的な角膜内細胞と基底膜であるデスメ膜とともに剥離し、角膜保存液であるＯｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（ボシュロム社）に浸漬した。その後、コラゲナーゼ処理を行い酵素的に角膜内皮細胞を回収して、ＳＢ２０３５８０＋ＳＢ４３１５４２＋３Ｔ３馴化培地により培養した。培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞はＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子をＰＣＲにより増幅して、レンチウイルスベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３＿Ｖ５−ＴＯＰＯ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）に導入した。その後、レンチウイルスベクターを３種類のヘルパープラスミド（ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、ｐＬＰ／ＶＳＶＧ；  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）とともにトランスフェクション試薬（Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ；  Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いて２９３Ｔ  細胞  （ＲＣＢ２２０２；  Ｒｉｋｅｎ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｉｂａｒａｋｉ，  Ｊａｐａｎ）に感染させた。４８時間の感染後にウイルスを含む培養上清を回収して、５μｇ／ｍｌのポリブレンを用いて、培養したフックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の角膜内皮細胞の培養液に添加して、ＳＶ４０ラージＴ抗原およびｈＴＥＲＴ遺伝子を導入した。フックス角膜内皮ジストロフィ患者由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像を確認した。コントロールとしてシアトルアイバンクから輸入した研究用角膜より培養した角膜内皮細胞を同様の方法で不死化し、正常角膜内皮細胞の不死化細胞株を作製した（ｉＨＣＥＣ）。健常ドナー由来の不死化角膜内皮細胞株（ｉＨＣＥＣ）および不死化角膜内皮細胞株（ｉＦＥＣＤ）の位相差顕微鏡像をみると、ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはいずれも正常の角膜内皮細胞同様に一層の多角形の形態を有する。ｉＨＣＥＣおよびｉＦＥＣＤはＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳにより維持培養を行った。【００９８】
（試薬）
以下の実施例では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤として、ＳＢ２０３５８０、ＰＨ−７９７８０４、およびＶＸ−７０２を使用した。また、比較例として、ＴＧＦ−β阻害剤であるＳＢ４３１５４２を使用した。別段の指定がない限り、使用したｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤およびＴＧＦ−β阻害剤の濃度は以下の通りである。溶媒としてＤＭＳＯ（Ｄｙｍｅｔｈｉｌ
Ｓｌｕｆｏｘｉｄｅ  Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ナカライテスク、１３４０８−６４）を使用した。
ＳＢ４３１５４２    １０  μＭ  （WAKO、カタログ番号：192-16541）
ＳＢ２０３５８０    １０  μＭ  （Cayman、カタログ番号：13067）
ＰＨ−７９７８０４    １  μＭ  （Selleck  Chemicals、カタログ番号：S2726）
ＶＸ−７０２          ３  μＭ  （Selleck  Chemicals、カタログ番号：S6005）【００９９】
（実施例１：フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおける細胞障害およびプログラム細胞死の抑制）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいて、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤による細胞障害およびプログラム細胞死の抑制を調べた。【０１００】
（材料および方法）
使用した試薬は以下の通りである。
Ａｃｃｕｔａｚｅ  （２００  μｌ／試料）
１×Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  （９２．５  μｌ／試料）
Ａｎｎｅｘｉｎ  （５  μｌ／試料）
ＰＩ  （２．５  μｌ／試料）【０１０１】
本実施例のプロトコルの概要を図１に示す。【０１０２】
不死化ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３５５５４−６４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−９４）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１％Ｐ／Ｓ（ペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液）（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。【０１０３】
１２ウェルプレートに不死化ヒト角膜内皮細胞（ロット：ｉＦＥＣＤ３−５）を１ウェル当たり８×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で４８時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。【０１０４】
４８時間後、培地を除去し、各阻害剤を添加し２４時間培養した。コントロール群およびＴＧＦ−β２群にはＤＭＳＯ（Ｄｙｍｅｔｈｉｌ  Ｓｌｕｆｏｘｉｄｅ  Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ナカライテスク、１３４０８−６４）を添加した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した。【０１０５】
２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ／ｍｌのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＮＤ３０２−Ｂ２−００２）および各阻害剤入りの培地を添加し、２７時間培養を行った。コントロール群にはＤＭＳＯを添加した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。２７時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態およびプログラム細胞死を観察した。【０１０６】
観察後、以下手順でＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖを指標としてフローサイトメトリーを行った。
１）サンプルの調整
ウェル中の培地を除去し、１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＡＴ１０４  ＩＮＮＯＶＡＴ）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、ウェル中を培地で１回洗浄し、４℃、８００ｇ、５ｍｉｎ遠心し上清を捨てた。続いてチューブに１×ＰＢＳ（−）を加えピペッティングした後再び４℃、８００ｇ、５ｍｉｎ遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。その後、１×Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを添加し、ＭＥＢＣＹＴＯ−Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｋｉｔ（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ  ｋｉｔ）（ＭＢＬ）（Ｌｏｔ．０２７ＦＡ）を用いＡｎｎｅｘｉｎ  ＶおよびＰＩを染色した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した。
２）フローサイトメトリー
上記回収したサンプルをＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ）により解析した。【０１０７】
（結果）
（ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいて細胞障害を抑制する）
図２に結果を示す。不死化ヒト角膜内皮細胞にｐ３８ＭＡＰＫ非存在下で、ＴＧＦ−β２で刺激した場合、顕著に細胞が障害されていることが認められる。他方で、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤でプレトリートメントメントした場合、ＴＧＦ−β２阻害剤であるＳＢ４３１５４２でプレトリートメントした場合と同様に、角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。したがって、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はＴＧＦ−β２刺激による細胞障害を抑制することができる。【０１０８】
（ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいてプログラム細胞死を抑制する）
図３に示される通り、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤添加群はＴＧＦ−β２群と比較して有意にＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ陽性のアポトーシス細胞の割合を低下させることが確認された。【０１０９】
（実施例２：共焦点顕微鏡によるミトコンドリア膜電位の観察）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいて、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤によるミトコンドリア膜電位低下の抑制を、共焦点顕微鏡を用いて調べた。【０１１０】
（材料および方法）
本実施例のプロトコルの概要を図４に示す。【０１１１】
不死化ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３５５５４−６４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−９４）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１％Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。【０１１２】
４８ウェルプレートに不死化ヒト角膜内皮細胞（ロット：ｉＦＥＣＤ３−５）を１ウェル当たり４×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で４８時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した。【０１１３】
４８時間後、培地を除去し、各阻害剤を添加し２４時間培養した（プレトリートメント）。コントロール群およびＴＧＦ−β２群にはＤＭＳＯ（Ｄｙｍｅｔｈｉｌ  Ｓｌｕｆｏｘｉｄｅ  Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ナカライテスク、１３４０８−６４）を添加した。また、ＣＣＣＰ群には最終濃度５０μｍｏｌ／ｌとなるようにＣＣＣＰ（ａｂｃａｍ、ａｂ１４１２２９）を添加し、９時間培養した。９時間後ＣＣＣＰ群、その他のサンプルは２４時間後に、以下に示す手順によりサンプル調製を行った。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。【０１１４】
プレトリートメントの２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＮＤ３０２−Ｂ２−００２）および各阻害剤入りの培地を添加し、３０時間培養を行った。コントロール群にはＤＭＳＯを添加した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した。【０１１５】
その後、以下手順でＪＣ−１染色によるミトコンドリア膜電位解析を行った。
１）サンプルの調製
ウェル中の培地を除去し、培地で２回洗浄した。培地２５０μｌおよび２．５μｌのＭｉｔｏＳｃｒｅｅｎ（ＪＣ−１）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５１３０２）の混合液を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で１５分インキュベートした。ウェル中の培地を除去し、４％ＰＦＡに１０分間浸し固定した。その後１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ＤＡＰＩ（１０００倍希釈）を添加し３０分間核の染色を行った。再び１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、退色防止剤を加え封入した。
２）蛍光観察
上記作製したサンプルを共焦点顕微鏡でＪＣ−１および核の観察を行った。【０１１６】
（結果）
（ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいてミトコンドリア膜電位低下を抑制する）
ミトコンドリア膜電位を、ＪＣ−１色素を用いて評価した。結果を図５に示す。緑色蛍光はミトコンドリアを示し、赤色蛍光はミトコンドリア膜電位を示すものであるが、赤色蛍光の欠如はミトコンドリア膜電位が脱極していることを示すものである。脱共役剤であるＣＣＣＰを添加した群は、脱共役に起因してミトコンドリア膜電位が観察されなかった。同様に、ＴＧＦ−β２群（ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤非存在下）でも、ミトコンドリア膜電位が観察されず、ＴＧＦ−β２刺激によりミトコンドリア膜電位が低下することを示している。他方で、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤添加群において、ＴＧＦ−β２刺激によるミトコンドリア膜電位の低下を抑制していることが認められた。【０１１７】
（実施例３：フローサイトメトリーによるミトコンドリア膜電位低下細胞の測定）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいて、フローサイトメトリーによるミトコンドリア膜電位低下細胞の測定を行った。【０１１８】
（材料および方法）
本実施例のプロトコルの概要を図６に示す。【０１１９】
使用した試薬は以下の通りである。
Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ  （２００μｌ／ウェル）
Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ中のＪＣ−１  （５００μｌ／ウェル）
１×Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ  （３．５μｌ／ウェル）【０１２０】
不死化ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３５５５４−６４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−９４）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。【０１２１】
１２ウェルプレートに不死化ヒト角膜内皮細胞（ロット：ｉＦＥＣＤ３−５）を１ウェル当たり８×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で４８時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した。【０１２２】
４８時間後、培地を除去し、各阻害剤を添加し２４時間培養した（プレトリートメント）。コントロール群およびＴＧＦ−β２群にはＤＭＳＯ（Ｄｙｍｅｔｈｉｌ  Ｓｌｕｆｏｘｉｄｅ  Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ナカライテスク、１３４０８−６４）を添加した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。【０１２３】
プレトリートメントの２４時間後ＣＣＣＰ群には最終濃度５０μｍｏｌ／ＬとなるようにＣＣＣＰ（ａｂｃａｍ、ａｂ１４１２２９）を添加し、９時間培養した。９時間後ＣＣＣＰ群のみ以下に示す手順によりサンプル調整を行った。【０１２４】
ＣＣＣＰ群以外はプレトリートメントの２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ/ｍｌのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−β２（Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＮＤ３０２−Ｂ２−００２）および各阻害剤入りの培地を添加し、３０時間培養を行った。コントロール群にはＤＭＳＯを添加した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。【０１２５】
観察後、以下手順でＪＣ−１染色によるフローサイトメトリーを行った。
１）サンプルの調整
浮遊および死細胞も回収するため培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した。再びＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡを添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。その後、培地でウェル中の細胞を回収した。次に回収した細胞懸濁液を、１５００ｒｐｍで３分間遠心し、上清を捨てた。続いてチューブに１×Ａｓｓａｙ  ＢｕｆｆｅｒおよびＭｉｔｏＳｃｒｅｅｎ（ＪＣ−１）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、５５１３０２）の混合液を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で１５分インキュベートした。その後、１×Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを加えピペッティングした後１５００ｒｐｍで３分間遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。この作業を２回繰り返した。再び１×Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを添加した。培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。
２）フローサイトメトリー
上記調整したサンプルをＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ）により解析した。【０１２６】
（結果）
（ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいてミトコンドリア膜電位低下を抑制する）
結果を図７に示す。フローサイトメトリーにより、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤添加群はＴＧＦ−β２群と比較して有意にミトコンドリア膜電位低下細胞率が減少していることが認められた。特に、ＳＢ２０３５８０添加群およびＰＨ−７９７８０４添加群は、ＳＢ４３１５４２添加群に匹敵するか、またはそれよりもミトコンドリア膜電位低下細胞率が低かった。【０１２７】
（実施例４：フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおけるカスパーゼの活性化の抑制）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいて、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤によるカスパーゼの活性化の抑制を調べた。【０１２８】
（材料および方法）
本実施例のプロトコルの概要を図８に示す。【０１２９】
不死化ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３５５５４−６４）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−９４）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。【０１３０】
１２ウェルプレートに不死化ヒト角膜内皮細胞（ロット：ｉＦＥＣＤ３−５）を１ウェル当たり８×１０４個の割合で播種し、３７℃（５％  ＣＯ２）で４８時間培養した。培地は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。【０１３１】
４８時間後、培地を除去し、各阻害剤を添加し２４時間培養した。コントロール群およびＴＧＦ−β２群にはＤＭＳＯ（Ｄｙｍｅｔｈｉｌ  Ｓｌｕｆｏｘｉｄｅ  Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）（ナカライテスク、１３４０８−６４）を添加した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを使用した。【０１３２】
２４時間後、培地を除去し、１０ｎｇ／ｍｌのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＮＤ３０２−Ｂ２−００２）および各阻害剤入りの培地を添加し、２４時間培養を行った。コントロール群にはＤＭＳＯを添加した。培地は、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓを使用した。【０１３３】
２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態およびプログラム細胞死を観察した。観察後、以下手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。
１）タンパク質の回収
浮遊および死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、４℃、８００ｇ、５ｍｉｎ遠心し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、０．５％  ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊および死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ  ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、４℃、１５０００ｒｐｍ、１０min遠心し、タンパク質の上清を回収した。
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質５μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、ウサギ抗カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６２）、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４２）、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体はペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体、抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３４Ｖ，ＮＡ９３１Ｖ）を用いた。１次抗体はウサギ抗カスパーゼ３抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗ＰＡＲＰ抗体：２０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：３０００倍希釈し、２次抗体は５０００倍希釈した。検出にはＣｈｅｍｉ  Ｌｕｍｉ  ＯＮＥ  Ｕｌｔｒａ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。【０１３４】
（結果）
（ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいてカスパーゼの活性化を抑制する）
ミトコンドリア異常は、カスパーゼ３の活性化と関連しているとされているため、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤によるカスパーゼの活性化の抑制効果について解析した。結果を図９に示す。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤非存在下において、活性型である約１７ｋＤａの切断カスパーゼ３（約１７ｋＤａ）が認められた。他方で、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤添加群においては、活性化型の切断カスパーゼ３はほとんど確認されず、非活性型である約１９ｋＤａの切断カスパーゼ３が確認された。したがって、ウェスタンブロットによる解析より、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤添加群はＴＧＦ−β２刺激によるカスパーゼ３の活性化を抑制していることが認められた。【０１３５】
（実施例５：フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおけるＴＧＦ−βシグナルの抑制）
本実施例では、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおいて、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が、ＴＧＦ−βシグナルを抑制しているかどうかを調べた。【０１３６】
（材料および方法）
実施例４と同様の手順で行った。ただし、１次抗体には、ウサギ抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ２抗体：１０００倍希釈、ウサギ抗Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ３抗体：１０００倍希釈、マウス抗ＧＡＰＤＨ抗体：３０００倍希釈を使用した。【０１３７】
（結果）
（ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤のフックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害モデルにおける細胞障害抑制効果は、ＴＧＦ−βシグナルを抑制することに起因するものではない）
ウェスタンブロットの結果を図１０に示す。ＴＧＦ−β２阻害剤であるＳＢ４３１５４２を添加した群では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の下流で情報伝達を担うタンパク質であるｓｍａｄ２およびｓｍａｄ３が認められなかった。驚くべきことに、３つのｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤添加群すべてにおいて、ｓｍａｄ２およびｓｍａｄ３が認められた。したがって、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤添加群による細胞障害抑制効果は、ＴＧＦ−βシグナルを抑制することに起因するものではないことが明らかになった。すなわち、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤とＴＧＦ−β２阻害剤とでは、その抑制機構が全く異なるものであり、その作用機序が異なっていることを示している。これらの結果は、予想外の結果であった。【０１３８】
（実施例６：凍結保存による角膜内皮細胞の障害の抑制）
本実施例では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤が、凍結保存による角膜内皮細胞の障害を抑制するかどうかを調べた。【０１３９】
（材料および方法）
試験にはＭＳＣ−ＣＭ（ＭＳＣ順化培地）で培養したヒト角膜内皮細胞を用いた。ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。ＰＢＳ（−）除去後、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（×１０）（ＧＩＢＣＯ、Ａ１２１７７−０１）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で１０分インキュベートした。その後、ＫＭ  ＢＡＮＫＥＲに最終濃度１０μＭとなるようにＳＢ２０３５８０を加えて凍結した。なおコントロール群には、試薬の溶媒であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ，Ｓｔｅｒｉｌｅ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ；ナカライテスク，１３４０８−６４）を添加して凍結した。−８０℃で３日間保存した後、３７℃水浴にてチューブを浸漬して解凍した。解凍後、培地で洗浄してトリパンブルー色素排除法により、生細胞数と死細胞数を測定した。【０１４０】
また、ＤＭＳＯのみを添加して凍結保存した細胞を解凍後、細胞をラミニンＥ８をコーティングした９６ウェルプレートに１００００細胞播種し、播種時に最終濃度１０μＭとなるようにＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、カタログ番号：１３０６７）を添加した。ＳＢ２０３５８０を添加しない群に関してはＤＭＳＯを添加した。播種して２４時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号：Ｇ７５７０）を実施して発光量を測定した。【０１４１】
（結果）
結果を図１１に示す。ＳＢ２０３５８０を添加して凍結保存した場合、ＤＭＳＯを添加して凍結保存した場合と比べ、解凍後直後の細胞生存率がわずかに高かった。また、ＤＭＳＯを添加した群と比較して、ＳＢ２０３５８０を添加した群では、約１．３倍の細胞数を示した。これは、保存中の角膜内皮細胞の細胞障害を抑制していることに起因している。したがって、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、角膜内皮細胞の保存に有用であることが明らかになった。【０１４２】
（実施例７：タプシガルギン（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）により誘導されるＥＲストレスによる細胞障害に対するｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の抑制効果）
タプシガルギンは、折り畳まれなかったタンパク質（ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）がもたらし、これにより小胞体（ＥＲ）ストレスが生じる。本実施例では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤添加群におけるタプシガルギンにより誘導される細胞障害の抑制効果を確認した。【０１４３】
（材料および方法）
不死化ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で５分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク、３２７７８−３４）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、１５００ｒｐｍで３分間遠心することで細胞を回収した。培地は、ＤＭＥＭ（ナカライテスク、０８４５６−３６）＋１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓ１８２０−５００）＋１%Ｐ／Ｓ（ナカライテスク、２６２５２−９４）を使用した。１２ウェルプレートに不死化ヒト角膜内皮細胞（ロット：ｉＨＣＥＣ１−１）を１ウェル当たり８×１０４個の割合で播種し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓの培地を使用して３７℃（５％ＣＯ２）で４８時間培養した。その後、培地を除去し、各阻害剤を添加し、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓの培地を使用して２４時間培養した。その後、培地を除去し、２０μＭのタプシガルギン（和光、２０９−１７２８１）および各阻害剤入りの培地（ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ＋１%Ｐ／Ｓ）を添加し、３時間培養を行った。その後、位相差顕微鏡下で細胞形態及びアポトーシスを観察した。観察後、以下手順でタンパク質のウェスタンブロットを行った。【０１４４】
１）タンパク質の回収
浮遊細胞および死細胞も回収するため、氷上で培地を回収し、細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した溶液も回収し、５分遠心（４℃、８００ｇ）し上清を捨て、沈殿物を得た。洗浄した細胞は、氷上でタンパク質抽出用緩衝液（ＲＩＰＡ；５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ、０．５％ＤＯＣ、１％ＮＰ−４０）を加えてタンパク質を抽出した。その後、上記浮遊細胞および死細胞の遠心後の沈殿物も一緒に懸濁して抽出した。回収した液を超音波装置（ＢＩＯＲＵＰＴＯＲ、ＴＯＳＨＯ  ＤＥＮＫＩ製）にて冷水中で３０秒、３回粉砕後に、１０分遠心（４℃、１５０００ｒｐｍ）し、タンパク質の上清を回収した。【０１４５】
２）ウェスタンブロット法
上記抽出したタンパク質１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。１次抗体は、１０００倍希釈のウサギ抗カスパーゼ３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６２）、２０００倍希釈のウサギ抗ＰＡＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９５４２）、および３０００倍希釈のマウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体は、ペルオキシダーゼで標識した５０００倍希釈の抗ウサギ抗体および抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３１Ｖ、ＮＡ９３４Ｖ）を用いた。検出にはＣｈｅｍｉ  Ｌｕｍｉ  ＯＮＥ  Ｕｌｔｒａ（ナカライテスク、１１６４４−４０）を使用した。検出したバンドの強度は、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）およびIｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により解析した。【０１４６】
（結果）
図１２および図１３に結果を示す。不死化ヒト角膜内皮細胞にｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤非存在下で、タプシガルギンにより刺激した場合、顕著に細胞が障害されていることが認められる。他方で、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤でプレトリートメントした場合、角膜内皮細胞の障害が抑制されていることが観察された。また、不死化ヒト角膜内皮細胞にｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤非存在下で、タプシガルギンにより刺激した場合、活性型である約１７ｋＤａの切断カスパーゼ３が認められた。他方で、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤添加群においては、活性型の切断カスパーゼ３はほとんど確認されなかった。以上より、ウェスタンブロットによる解析よりｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はタプシガルギンにより誘導されるＥＲストレスによるアポトーシスを抑制することが認められた。【０１４７】
（実施例８：ＴＧＦβによるＣＨＯＰ発現に対するｐ３８ＭＡＰＫの抑制効果）
ＥＲストレスによる細胞死は、アポトーシス誘導転写因子であるＣＨＯＰの活性化と関連しているとされているため、本実施例では、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤によるＣＨＯＰの活性化の抑制効果について解析した。【０１４８】
（材料および方法）
細胞の培養は、２０μＭのタプシガルギンに代えて、１０ｎｇ/ｍｌの組み換えヒトＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＲＮＤ３０２−Ｂ２−００２）を使用する以外は実施例７と同様に行った。また、タンパク質の回収およびウェスタンブロットも実施例７と同様に行った。なお、１次抗体は、１０００倍希釈のマウス抗ＣＨＯＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２８９５）、および３０００倍希釈のマウス抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＭＢＬ社、Ｍ１７１−３）を用いた。２次抗体は、ペルオキシダーゼで標識した５０００倍希釈の抗マウス抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＡ９３４Ｖ）を用いた。【０１４９】
（結果）
（ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤はフックス角膜内皮ジストロフィの角膜障害モデルにおいてＣＨＯＰの活性化を抑制する）
図１４に結果を示す。不死化ヒト角膜内皮細胞をｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤非存在下でＴＧＦ−β２により刺激すると、ＣＨＯＰの発現が認められた。他方で、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤添加群においては、ＴＧＦ−β２で刺激した場合、ＣＨＯＰの発現はほとんど確認されなかった。したがって、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤は、ＥＲストレスに関与するＣＨＯＰの活性化を抑制することが認められた。これは、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤が、ＴＧＦ−βに起因するＥＲストレスを抑制し得ることを示唆するものである。【０１５０】
（実施例９：製剤例：ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を含有する角膜保存液）
本実施例では、製剤例として、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤を含有する角膜保存液を以下のように製造する。【０１５１】
常法により下に示す保存液を調製する。
ＳＢ２０３５８０  ０．３７７４３ｍｇ
Ｏｐｔｉｓｏｌ−ＧＳ（Ｂａｕｓｃｈ−Ｌｏｍｂ）適量
全量１００ｍＬ
ＳＢ２０３５８０はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製を用いることができる。【０１５２】
（実施例１０：点眼剤の調製例）
各濃度の被験物質の組成を以下に示す。
ＳＢ２０３５８０                  １ｍＭ（３７７．４３ｍｇ）
または、他のｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の適切な濃度
塩化ナトリウム                    ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物    ０．１ｇ
ベンザルコニウム塩化物            ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム                  適量
精製水                            適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７．０）【０１５３】
濃度は、以下からなる基剤を用いて希釈してもよい。
塩化ナトリウム                    ０．８５ｇ
リン酸二水素ナトリウム二水和物    ０．１ｇ
ベンザルコニウム塩化物            ０．００５ｇ
水酸化ナトリウム                  適量
精製水                            適量
全量１００ｍＬ（ｐＨ７．０）【０１５４】
有効成分以外の各成分としては、例えば、日本薬局方またはその等価物に適合した、市販のものを利用することができる。【０１５５】
（実施例１１：治療例）
フックス角膜内皮ジストロフィおよび類縁の角膜内皮疾患と診断された際に（具体例としては、１）細隙灯顕微鏡検査によるグッテー形成、デスメ膜肥厚、角膜上皮浮腫、角膜実質浮腫の観察、２）スペキュラマイクロスコープによるグッテー像、角膜内皮障害像の観察、３）ペンタカム、ＯＣＴ、超音波角膜厚測定装置などによる角膜浮腫の観察、４）遺伝子診断により高リスクと判断された場合）使用する。想定例としては、点眼薬、前房内注射、徐放剤を用いた投与、硝子体内注射、結膜下注射などである。
ここでは、実施例１０で製造する点眼剤を用いることができる。
また、前房内注射、徐放剤を用いた投与、硝子体内注射、結膜下注射については、当該分野で公知の手法を用いて調製する。点眼薬と同程度の１ｍＭ程度でこれらの注射用製剤を調製することができるが、濃度は適宜上下させてもよい。【０１５６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本出願は、２０１５年１２月２４日に出願された日本国出願特願２０１５−２５１７８６号に基づく優先権の利益を主張し、その内容は、その全体が参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１５７】
ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤を含む、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）シグナル、ミトコンドリア異常、および／または小胞体（ＥＲ）関連ストレスに起因する角膜内皮障害の治療または予防のための医薬が提供され、特に、フックス角膜内皮ジストロフィの角膜内皮障害を治療または予防するための医薬が提供された。このような技術に基づく製剤等に関連する技術に関与する産業（製薬等）において利用可能な技術が提供される。
【図１】
2017110093.tif 000002
【図２】
2017110093.tif 000003
【図３】
2017110093.tif 000004
【図４】
2017110093.tif 000005
【図５】
2017110093.tif 000006
【図６】
2017110093.tif 000007
【図７】
2017110093.tif 000008
【図８】
2017110093.tif 000009
【図９】
2017110093.tif 000010
【図１０】
2017110093.tif 000011
【図１１】
2017110093.tif 000012
【図１２】
2017110093.tif 000013
【図１３】
2017110093.tif 000014
【図１４】
2017110093.tif 000015
【国際調査報告】
2017110093.tif 000016
2017110093.tif 000017
2017110093.tif 000018
2017110093.tif 000019
2017110093.tif 000020
2017110093.tif 000021