(57)【要約】  始原生殖細胞を体外培養により機能的な成熟したGV期卵母細胞へと分化させる方法の提供を課題とする。  本発明は、（ａ）始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞をエストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響を排除する条件下で培養して二次卵胞を形成させる工程と、（ｂ）形成した二次卵胞を構成する卵母細胞、顆粒膜細胞層、及び、莢膜細胞層のうち、顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との間の結合を部分的に切断する工程と、（ｃ）二次卵胞を構成する卵母細胞及び顆粒膜細胞層、及び、莢膜細胞層を、高分子化合物を含む培地で培養することにより、卵母細胞を機能的なGV期卵母細胞へ分化する工程とを含む、始原生殖細胞をin vitroで機能的なGV期卵母細胞に分化する方法に関する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
始原生殖細胞を、in vitroで機能的なGV期卵母細胞に分化する方法であって、
（ａ）始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞をエストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響を排除する条件下で培養して二次卵胞を形成させる工程と、
（ｂ）形成した二次卵胞を構成する卵母細胞、顆粒膜細胞層、及び、莢膜細胞層のうち、顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との間の結合を部分的に切断する工程と、
（ｃ）前記二次卵胞を構成する卵母細胞、顆粒膜細胞層、及び、莢膜細胞層を、高分子化合物を含む培地で培養することにより、前記卵母細胞を機能的なGV期卵母細胞へ分化する工程と
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記工程（ａ）におけるエストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響を排除する条件下での培養が、エストロジェン阻害剤の存在下での培養であるか、又は、無血清培地を用いた培養であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記工程（ａ）において使用されるエストロジェン阻害剤が、エストロジェンレセプターに対するアンタゴニストであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ｂ）において、前記結合の部分的な切断が、酵素処理及び／又は物理的に行われることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法であって、
前記工程（ｃ）において、高分子化合物がポリビニルピロリドン、フィコール、ヒドロキプロピルメチルセルロース、及び、血清アルブミンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の方法により得られたGV期卵母細胞。
【請求項７】
請求項１〜５に記載の方法により得られたGV期卵母細胞を体外成熟培養することで減数分裂を再開させる工程を含む、機能的な卵子の作出方法。
【請求項８】
請求項７の方法により得られた卵子。
【請求項９】
始原生殖細胞を、in vitroで機能的な卵母細胞又は卵子へ分化するためのキットであって、
エストロジェン阻害剤、無血清培地、代替血清、細胞間の結合を切断するための酵素、若しくは、高分子化合物、又は、それらの組み合わせを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、始原生殖細胞を機能的に成熟した卵母細胞へと分化させる培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生殖細胞は次世代に遺伝子を継承できる唯一の細胞である。そして、生殖細胞のうちの卵子は、発生をスタートさせ初期発生を牽引する役割を有しており、極めて重要かつ一次的な役割を担っている。雌の哺乳類の胎仔期の生殖巣には体細胞分裂期の始原生殖細胞が非常に多く存在しているが、これらは出生前に全て減数分裂期へと移行し卵母細胞へと分化する。減数分裂に移行した卵母細胞は再び増殖することができず、卵巣内の卵母細胞は成長を静止した状態で存在し、動物主固有の性周期や排卵数に応じて一部の卵母細胞のみが成長・成熟していく。そのため、雌が生涯に産生する生殖可能な卵子の数は始原生殖細胞の数や雄の生殖細胞である精子と比較して、ごく僅かしかない（非特許文献１、２）。さらに、機能的な卵子への分化機構の全容はいまだ明らかにされていない。したがって、始原生殖細胞から卵子を分化させる体外培養方法の確立は、このような卵形成の課題を解明する一つのアプローチとなり得る。また、このような体外培養系が確立できると、新たな卵子の提供源を確保することが可能となる。しかしながら、減数分裂開始前の雌性始原生殖細胞や卵胞形成前の未熟な卵母細胞から体外培養において機能的な卵子、すなわち産仔へと発生可能な卵子が分化できたという報告は未だ存在しない。これは、卵子への分化を十分にサポートするための卵胞の形成や卵母細胞の成長・成熟を培養条件下で再現できていないことに起因する。【０００３】
始原生殖細胞から完全に機能的な卵子を産生する為のいくつかの体外培養系が提案されているが、これらの方法によっても、卵胞形成は異常であり、また、卵母細胞の成長が不十分であることから、次世代の発生には至っていない。
例えば、非特許文献３には、胎齢12.5日の雌マウス生殖巣の一部をアクチビンＡの存在下で培養した後、顆粒膜細胞（preantral granulosa cell: PAGC）と共培養することで、第二減数分裂中期卵子への分化の効率を向上させる方法が開示されている。しかしながら、非特許文献３の方法により得られた卵子から次世代の個体が発生できたことについては報告がない。
また、マウスでは、12.5日齢の胎仔生殖巣を成体雌マウスに移植し、移植14日後に取り出した二次卵胞から体外培養で産仔へと発生可能な機能的卵子を分化させたと報告されている（非特許文献４）。近年、ES細胞やiPS細胞から体外培養で始原生殖細胞様細胞が作出された。これらは12.5日齢の胎仔生殖巣の体細胞と共培養後、その細胞凝集塊をマウス体内に移植することで産仔へと発生可能な機能的な卵子へと分化させたことが報告されている（非特許文献５）。しかしながら、非特許文献４および５では、減数分裂や卵胞形成を遂行させ成熟卵子を得る為にマウス体内への移植を用いており、すなわち、肝心の卵母細胞形成にマウス個体を利用しており、完全に体外培養で卵子を成熟させていない。【０００４】
一方、特許文献１には、卵母細胞とその周囲の体細胞との複合体を、高分子化合物の存在下で培養する卵母細胞の培養方法が開示されている。特許文献１に記載の方法によれば、成体由来の卵巣から採取した卵母細胞を効率よく体外で成熟させることが可能である。しかしながら、特許文献１の方法は、生体内において発達途上にある卵胞より卵母細胞−顆粒膜細胞複合体を採取することにより第一減数分裂前期で停止した卵母細胞を得て、当該卵母細胞を体外発育及び体外成熟させる方法であり、始原生殖細胞から体外培養を開始する方法ではない。【０００５】
このように、現段階において、始原生殖細胞や始原生殖細胞様細胞から生体のサポートを用いることなく、体外培養により機能的な卵子の形成に成功した報告はない。減数分裂開始前の哺乳類始原生殖細胞を体外培養により機能的な卵子へと成長させることができれば、非常に多くの卵子を確保することが可能となる。また、複雑な卵子形成のメカニズムを可視化することや当該メカニズムの解明にも役立つ。そのため、体外培養により、始原生殖細胞から機能的な卵子を作出可能な技術が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１７３６３５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Tam, P.P. & Snow, M. H. “Proliferation and migration of primordial germ cells during compensatory growth in mouse embryos.” J Embryol Exp Morphol 64, 133-147 (1981)
【非特許文献２】Miyano, T. JSAR Outstanding Research Award. “In vitro growth of mammalian oocytes.” J Reprod Dev 51, 169-176 (2005)
【非特許文献３】Zhang, Z. P. et al., “Growth of Mouse Oocytes to Maturity from Premeiotic Germ Cells In Vitro” PLoS One 7, e41771 (2012)
【非特許文献４】Shen W, Zhang D, Qing T, Cheng J, Bai Z, Shi Y, Ding M, Deng H., “Live offspring produced by mouse oocytes derived from premeiotic fetal germ cells.” Biol Reprod 75, 615-623 (2006)
【非特許文献５】Hayashi K., et al, “Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-like Cells in Mice.” Science 338, 971-975 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、始原生殖細胞を体外培養により機能的な卵母細胞へと分化する方法を提供することにある。また、当該方法により得られた卵母細胞より機能的な卵子を得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するため、本発明者らは、まず、減数分裂、卵胞形成、及び、卵胞成長など初期のイベントを進行させるための卵巣培養法の検討を行った。まず、既知の標準的な培養条件として、気層−液層境界培養法（Trowell, O. A. “The culture of mature organs in a synthetic medium.” Exp Cell Res 16, 118-147 (1959)）により、10%FBS含有α−MEM培地で12.5日齢の胎仔生殖巣（図１ａ）をTranswell（登録商標）-COL上で17日間培養した。
なお、12.5日齢の胎仔生殖巣について、減数分裂期のマーカーであるSCP3の免疫染色を行ったところ、SCP3陽性細胞は検出されなかった。しかしながら、培養5日目には、中腎との共培養の有無に関わらず、SCP3陽性細胞が多数検出された。よって、体外培養によっても減数分裂が開始することが確認された。卵巣内で二次卵胞以降のステージの卵母細胞が発育を継続するためには、複雑な血管組織と血流が必要である。しかし、培養卵巣にはそれらが存在しないことから、二次卵胞を単離して培養しなおすことが必要である。一方、培養17日目に卵巣より二次卵胞の単離を試みたところ、卵巣内には100以上の成長期卵母細胞が存在していた。ところが、既知の培養条件における卵巣培養の場合、卵胞の単離が困難な状態であった。正常な卵胞は卵母細胞の外側を顆粒膜細胞層、その外側を莢膜細胞層が覆う球形の構造を取り成長していくが、培養卵巣において、このような球形の二次卵胞は少なく、また卵胞が脆弱で、卵胞単離の際、多くの卵母細胞が裸化してしまった。体外培養により得られた卵巣に関して、卵胞を形作り強度を与える基底膜構成タンパクのラミニンを免疫組織学的に解析した。その結果、10日齢マウス由来の卵巣では、卵巣組織を平面で切って観察した場合、基底膜（ラミニン）が卵胞1つを円形で囲むように局在していたのに対し、体外培養した卵巣では、ラミニンが円形にならず同一平面上で途切れて観察された。また、その外側に位置し本来個々の卵胞で独立しているはずの莢膜細胞群の一部は上下左右隣り合う卵胞と共有しており、ラミニンも花形の局在を示すなど、莢膜細胞層の形成異常が顕著であった（図５ａ参照）。そのため、卵胞の単離を可能とする新たな解決手段が必要であった。【００１０】
そこで、本発明者らは、生殖巣の体外培養において、培養液中の性ステロイドホルモン、特にエストロジェンおよびエストロジェンと類似の機能を有する因子の影響に着目した。本発明者らによる鋭意検討の結果、生殖巣を培養する培地中においてエストロジェンおよび類似の機能を有する因子の影響を排除する工程を含むことで、機能的な卵子を分化させるためには不可欠な二次卵胞が多数得られることを見出した。
さらに、本発明者らは、得られた二次卵胞の体外培養方法についても検討を重ねた。その結果、二次卵胞の体外培養の際に卵胞の顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との間の結合を部分的に切断する処理を行い、さらに、卵母細胞と顆粒膜細胞との複合体を、高分子化合物を含む培地で培養することで、機能的に成熟した卵子を得ることができることを見出した。【００１１】
すなわち、本発明は、
〔１〕始原生殖細胞を、in vitroで機能的なGV期卵母細胞（成熟能力を潜在的に有する未成熟卵母細胞）に分化する方法であって、
（ａ）始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞をエストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響を排除する条件下で培養して二次卵胞を形成させる工程と、
（ｂ）形成した二次卵胞を構成する卵母細胞、顆粒膜細胞層、及び、莢膜細胞層のうち、顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との間の結合を部分的に切断する工程と、
（ｃ）前記二次卵胞を構成する卵母細胞、顆粒膜細胞層、及び、莢膜細胞層を、高分子化合物を含む培地で培養することにより、前記卵母細胞を機能的なGV期卵母細胞へ分化する工程と
を含む方法に関する。
ここで、本発明の始原生殖細胞を、in vitroで機能的なGV期卵母細胞に分化する方法は、一実施の形態において、
〔２〕工程（ａ）におけるエストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響を排除する条件下での培養が、エストロジェン阻害剤の存在下での培養であるか、又は、無血清培地を用いた培養であることを特徴とする。
また、本発明の始原生殖細胞を、in vitroで機能的なGV期卵母細胞に分化する方法は、一実施の形態において、
〔３〕工程（ａ）において使用されるエストロジェン阻害剤が、エストロジェンレセプターに対するアンタゴニストであることを特徴とする。
また、本発明の別の態様によれば、
〔４〕始原生殖細胞を、in vitroで機能的なGV期卵母細胞（成熟能力を潜在的に有する未成熟卵母細胞）に分化する方法であって、
（ａ）始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞を性ステロイドホルモン、又は、性ステロイドホルモンと類似の機能を有する因子の影響を排除する条件下で培養して二次卵胞を形成させる工程と、
（ｂ）形成した二次卵胞を構成する卵母細胞、顆粒膜細胞層、及び、莢膜細胞層のうち、顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との間の結合を部分的に切断する工程と、
（ｃ）前記二次卵胞を構成する卵母細胞、顆粒膜細胞層、及び、莢膜細胞層を、高分子化合物を含む培地で培養することにより、前記卵母細胞を機能的なGV期卵母細胞へ分化する工程と
を含む方法に関する。
ここで本発明の始原生殖細胞を、in vitroで機能的なGV期卵母細胞に分化する方法は、一実施の形態において、
〔５〕、上記〔４〕に記載の方法であって、工程（ａ）における性ステロイドホルモン、又は、性ステロイドホルモンと類似の機能を有する因子の影響を排除する条件下での培養が、性ステロイドホルモン阻害剤の存在下での培養であるか、又は、無血清培地を用いた培養であることを特徴とする。
また、本発明の始原生殖細胞を、in vitroで機能的なGV期卵母細胞に分化する方法は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔５〕に記載の方法であって、前記性ステロイドホルモン阻害剤が、エストロジェン阻害剤、アンドロジェン阻害剤、又は、それらの組み合わせであることを特徴とする。
また、本発明の始原生殖細胞を、in vitroで機能的なGV期卵母細胞に分化する方法は、一実施の形態において、
〔７〕上記〔１〕〜〔６〕に記載の方法であって、工程（ｂ）において、前記結合の部分的な切断が、酵素処理及び／又は物理的に行われることを特徴とする。
また、本発明の始原生殖細胞を、in vitroで機能的なGV期卵母細胞に分化する方法は、一実施の形態において、
〔８〕上記〔１〕〜〔７〕に記載の方法であって、工程（ｃ）において、高分子化合物がポリビニルピロリドン、フィコール、ヒドロキプロピルメチルセルロース、及び、血清アルブミンからなる群より選択される少なくとも１つの化合物であることを特徴とする。
なお、本発明の始原生殖細胞を、in vitroで機能的なGV期卵母細胞に分化する方法においては、上記〔１〕〜〔８〕に記載の特徴のうち複数の特徴を組み合わせたものも含まれる。【００１２】
また、本発明は、別の態様において、
〔９〕上記〔１〕〜〔８〕に記載の方法により得られたGV期卵母細胞に関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１０〕上記〔１〕〜〔８〕に記載の方法により得られたGV期卵母細胞を体外成熟培養することで減数分裂を再開させる工程を含む、機能的な卵子の作出方法に関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１１〕上記〔１０〕に記載の方法により得られた卵子に関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１２〕始原生殖細胞を、in vitroで機能的な卵子へ分化するためのキットであって、
エストロジェン阻害剤、無血清培地、代替血清、細胞間の結合を切断するための酵素、若しくは、高分子化合物、又は、それらの組み合わせを含む、キットに関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１３〕始原生殖細胞を、in vitroで機能的な卵子へ分化するためのキットであって、
性ステロイドホルモン阻害剤、無血清培地、代替血清、細胞間の結合を切断するための酵素、若しくは、高分子化合物、又は、それらの組み合わせを含む、キットに関する。
なお、上記〔９〕及び〔１１〕において、本発明の方法により得られたGV期卵母細胞又は卵子は、機能的なGV期卵母細胞又は機能的な卵子である点において、従来の体外培養方法で得られるGV期卵母細胞又は卵子とは性質が異なる。なお、機能的なGV期卵母細胞又は卵子の性質を担保する具体的な特性の違いについてはまだ特定されていない。また、そのような特性の違いを特定する作業には、さらなる時間を費やす必要があるが、特許出願の性質上、迅速性等を考慮した場合に当該作業の完了を待つことは非実際的である。従って、上記〔９〕及び〔１１〕においては、方法によりGV期卵母細胞又は卵子を特定した。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、始原生殖細胞を始点として、減数分裂前の始原生殖細胞、又は始原生殖細胞のみを含んだ生殖巣の培養と、当該培養により得られた二次卵胞の成長培養の二段階培養法により、機能的に成熟した卵母細胞を得ることができる。なお、例えば、マウス胎仔由来の生殖巣に含まれる始原生殖細胞を用いて本発明の方法を適用した場合には、約1か月で成熟卵子を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１ａは、胎齢12.5日の雌マウス胎仔由来の生殖巣を示す画像である。また、図１ｂは、培養0日目の卵巣由来の生殖巣由来の雌性始原生殖細胞（左）と、当該卵巣を、中腎を伴わないで培養した際の5日目の細胞（右）とを抗SCP3抗体で免疫染色した画像を示す。また、核は、DAPIにより染色している。減数分裂マーカーのSCP3が培養0日目では陰性であったのに対し、培養5日目には陽性になっていることから、始原生殖細胞が卵母細胞に分化したことが示されている。
【図２】図２は、下記実施例の「１．生殖巣の体外器官培養」に記載の各試験条件を説明する図である。
【図３】12.5dpc(days post coitum)のマウス胎仔由来の生殖巣を下記実施例１に記載の条件で体外培養して得た卵巣を光学顕微鏡下で観察した画像データを示す。図３ａ〜ｄは、それぞれ、下記実施例１に記載の（ｉ）FBS区（図３ａ）、（ｉｉ）SPS区（図３ｂ）、（ｉｖ）FBS/SPS区（図３ｃ）および（ｖ）FBS/10μM ICI区（図３ｄ）により得られた卵巣の画像データを示す。
【図４】下記実施例の「１．生殖巣の体外器官培養」に記載の各試験区の培養方法により得られた1つあたりの卵巣から採取された二次卵胞の数を比較したグラフを示す。
【図５】図５ａ及び図５ｂは、下記実施例の「１．生殖巣の体外器官培養」に記載の（ｉ）FBS区（図５ａ）、（ｖ）FBS/10μM ICI区（図５ｂ）における培養17日目の卵巣、卵巣の切片、及び、抗ラミニン抗体を用いた免疫染色の画像を示す。また、図５ｃは、10日齢の雌マウス由来の卵巣、卵巣の切片、及び、抗ラミニン抗体を用いた免疫染色の画像を示す。なお、バーは、100μmを示す。
【図６】図６ａは、卵胞培養から12日目（生殖巣の器官培養開始から29日目）の卵胞より得た卵丘細胞−卵母細胞複合体を示す。図６ｂは、卵胞培養後の卵核胞（germinal vesicle; GV）期にある完全に成長した卵母細胞を示す（なお、卵母細胞の周囲の卵丘細胞は取り除いた状態である）。
【図７】図７ａ〜ｊは、下記実施例「３．二次卵胞の体外培養」において、Millicell（登録商標）メンブレン上で3〜12日間培養した卵胞の画像を示す。図７ｋ〜ｔは、下記実施例「３．二次卵胞の体外培養」において、Transwell-COLメンブレン上で3〜12日間培養した卵胞の画像を示す。なお、図７の卵胞は、FBS/10μM ICI区の条件により生殖巣を培養することで得た卵胞である。また、バーは、100μmを示す。
【図８】（ｖ）FBS/10μM ICI区の器官培養により得られた二次卵胞を、下記実施例「３．二次卵胞の体外培養」の方法で培養した際の、卵胞のステロイドホルモンの産生能を酵素免疫測定キット（Cayman）により測定した結果を示すグラフである。ステロイドホルモンの濃度についての有意差は、ｔ検定により決定した。アスタリスクは、2日前のステロイドホルモン測定値と比較した際に有意に変動したことを示す（*P<0.05、**P<0.01）。また、エラーバーは標準偏差を示す（n=4）。
【図９】下記実施例「３．二次卵胞の体外培養」により得られた卵母細胞のインプリント遺伝子（Igf2r及びH19）のメチル化状態をバイサルファイト法により確認した結果を示す。Igf2rは母方（卵子由来）アレル異的に、H19は父方（精子由来）アレル特異的に高メチル化されるインプリント遺伝子である。バーグラフのバーはそれぞれ解析されたDNA鎖を表し、黒い部分が解析されたDNA鎖に含まれるメチル化CpGサイトの率を、白い部分が解析されたDNA鎖に含まれる非メチル化CpGサイトの率を表している。#1および#2は別の独立したサンプルである。
【図１０】下記実施例「３．二次卵胞の体外培養」及び「６．体外培養による卵子への成熟」により得られた卵子から「８．体外成熟した卵子の体外受精、及び、胚移植」に記載の方法により得られた産仔におけるインプリント遺伝子（Igf2r、H19、Litl、Snrpn、Peg1/Mest）のメチル化状態をバイサルファイト法により確認した結果を示す。Igf2r、Lit1、Snrpn及びPeg1/Mestは母方（卵子由来）アレル異的に、H19は父方（精子由来）アレル特異的に高メチル化されるインプリント遺伝子である。バーグラフのバーはそれぞれ解析されたDNA鎖を表し、黒い部分が解析されたDNA鎖に含まれるメチル化CpGサイトの率を、白い部分が解析されたDNA鎖に含まれる非メチル化CpGサイトの率を表している。#1および#2は別個体である。#3は対照区（体内由来GV期卵母細胞から同様の操作で誕生した個体）を表す。
【図１１】図１１ａは、「６．体外培養による卵子への成熟」に記載の培養中における第二減数分裂期にある卵母細胞の核型解析の結果を示す。図１１ｂは、下記実施例「６．体外培養による卵子への成熟」により得られたMII期の卵丘細胞−卵母細胞複合体（cumulus-oocyte complexes; COCs）を示す。また、図１１ｃ及びｄは、下記実施例「８．体外成熟した卵子の体外受精、及び、胚移植」に記載の方法により得られた胚盤胞及び産仔の画像を示す。
【図１２】下記実施例「８．体外成熟した卵子の体外受精、及び、胚移植」に記載の方法により得られた産仔と生体由来の卵母細胞を用いて得た産仔の生存率について比較したグラフを示す。
【図１３】図１３は、下記実施例「１０．多能性幹細胞由来PGCLCを用いた機能的なGV期卵母細胞及び機能的な卵子への体外培養法」の「ＩＩ−２．二次卵胞の作製」に記載の培養方法における、培養開始より1週間後、2週間後、3週間後のES細胞由来PGCLCと生殖巣体細胞との凝集塊を光学顕微鏡下（明視野：BF）で撮影した画像、又は、Blimp1レポーター（BV：始原生殖細胞マーカー）若しくはStellaレポーター（SC：始原生殖細胞及び卵母細胞マーカー）の発現を蛍光顕微鏡下で撮影した画像を示す。
【図１４】図１４は、下記実施例「１０．多能性幹細胞由来PGCLCを用いた機能的なGV期卵母細胞及び機能的な卵子への体外培養法」の「ＩＩ−４．二次卵胞の体外培養（IVG）」に記載の培養方法における、培養開始から2日目（図１４Ａ）、1週間目（図１４Ｂ）、2週間目（図１４Ｃ）の二次卵胞を光学顕微鏡下で撮影した画像を示す。また、図１４Ｄは、当該培養方法において、培養開始から11日目における発育した二次卵胞より単離したCOCsを示す。  また、図１４Ｅは、下記実施例「１０．多能性幹細胞由来PGCLCを用いた機能的なGV期卵母細胞及び機能的な卵子への体外培養法」の「ＩＩ−５．体外培養による卵子への成熟（IVM）」に記載の方法により得られた成熟卵子（MII期）を光学顕微鏡下で撮影した画像を示す。
【図１５】図１５は、下記実施例「１０．多能性幹細胞由来PGCLCを用いた機能的なGV期卵母細胞及び機能的な卵子への体外培養法」の「ＩＩ−６．体外成熟した卵子の体外受精、及び、胚移植」に記載の方法により得られた、正常な大きさの胎盤を有する新生仔（図１５左図）、及び、それらが成育した健常な成体マウス（図１５右図）の画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、（ａ）始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞を性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン又はエストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する条件下で培養して二次卵胞を形成させる工程と、（ｂ）形成した二次卵胞を構成する卵母細胞、顆粒膜細胞層、及び、莢膜細胞層のうち、顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との間の結合を部分的に切断する工程と、（ｃ）前記二次卵胞を構成する卵母細胞、顆粒膜細胞層、及び、莢膜細胞層を、高分子化合物を含む培地で培養することにより、前記卵母細胞を機能的なGV期卵母細胞へ分化する工程とを含む方法により、始原生殖細胞を、in vitroで機能的なGV期卵母細胞に分化する方法である。
【００１６】
ここで、本明細書において、「始原生殖細胞」とは、生殖細胞へ分化する予定の細胞であり、卵原細胞や精原細胞を経て卵子や精子へと分化する細胞をいう。
始原生殖細胞は、生体由来のものであっても、多能性幹細胞より分化した始原生殖細胞様細胞（primordial germ cell like cell:PGCLC）であってもよい。生体より始原生殖細胞を回収する場合には、例えば、雌マウスの胎仔（11.5〜12.5dpc）より生殖巣とともに回収することができる。なお、生体より生殖巣を回収する際には、中腎を伴う形で回収してもよいし、中腎を切り離しても良い。また、本発明に用いられる「始原生殖細胞」には、始原生殖細胞より発生段階が進み、減数分裂を開始した一次卵母細胞も含まれる。本発明の方法は、このような一次卵母細胞も機能的なGV期卵母細胞へと分化させることができる。なお、一次卵母細胞を本発明の方法に用いる場合には、卵胞形成が始まる前の一次卵母細胞である。
【００１７】
また、上述の通り、本明細書において「始原生殖細胞」には多能性幹細胞より分化した始原生殖細胞様細胞が含まれる。ここで、「多能性幹細胞」とは、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞をいう。多能性幹細胞としては、以下に限定されないが、例えば、人工多能性幹細胞（iPS細胞）、胚性幹細胞（ES細胞）、始原生殖細胞に由来する胚性生殖細胞（EG細胞）、精巣組織からのGS細胞の樹立培養過程で単離されるmultipotent germline stem細胞（mGS細胞）、骨髄間葉系細胞から単離されるMuse細胞などを挙げることができる。なお、ES細胞は体細胞から核初期化されて生じたES細胞であってもよい。上記に列挙した多能性幹細胞は、それぞれ公知の方法により得ることができる。
【００１８】
ここで、iPS細胞とは、分化した体細胞にいくつかの遺伝子を導入することによって様々な組織や器官の細胞へのリプログラミングが可能となった細胞をいう。本発明において、始原生殖細胞を分化誘導するために用いられるiPS細胞は、適当なドナーから採取した体細胞の初代培養細胞由来、又は樹立細胞株由来のいずれであってもよい。iPS細胞は、いかなる胚葉系細胞にも分化誘導が可能であることから、iPS細胞の調製に用いる体細胞は、原則的には外胚葉系、内胚葉系のいずれの胚葉系細胞由来のものであってもよい。侵襲性が低く採取が容易な皮膚、髪の毛、歯肉、血液等の細胞は、本態様のiPS細胞の調製に用いる体細胞として好適である。iPS細胞の調製方法については、当該分野で公知の方法に従えばよい。具体的には、例えば、Okita K. et al, "Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells." Nature 448, 313-317 (2007)やHamanaka S. et al., “Generation of germline-competent rat induced pluripotent stem cells” PLoS One 6(7), e22008 (2011)、Ohnuki M. et al., “Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells.” Curr Protoc Stem Cell Biol. Jun Chapter 4: Unit 4A.2, (2009)等の公知の文献に記載されている調製方法を利用できる。
また、本発明において、始原生殖細胞を分化誘導するために用いられるES細胞は、公知の方法により得ることができる。例えば、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を採取し、当該内部細胞塊を繊維芽細胞に由来するフィーダー細胞上で培養することによって樹立することができる。その他、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したES細胞も使用することができる。
【００１９】
また、iPS細胞から始原生殖細胞様細胞を分化誘導する方法は、公知の方法、例えば、非特許文献５、Hayashi K. et al., “Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.” Cell, Aug 19, 146(4), 519-32 (2011)、Hayashi K. et al., “Generation of eggs from mouse embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells.” Nature Protocols 8, 1513-1524 (2013);、やSasaki K. et al., “Robust In Vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells.” Cell Stem Cell Jul 1, pii: S1934-5909(15)00299-4, doi: 10.1016/j.stem.2015.06.014 (2015)等を参考にして行うことができる。また、ES細胞から始原生殖細胞様細胞を分化誘導する方法についても、公知の方法、例えば、非特許文献５、Hayashi K., “Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.” Cell Aug 19, 146(4), 519-32 (2011)、Nakaki et al., “Induction of mouse germ-cell fate by transcription factors in vitro” Nature, 501, 222-226 (2013)、Kimura T. et al., “Induction of Primordial Germ Cell-Like Cells From Mouse Embryonic Stem Cells by ERK Signal Inhibition.” Stem Cells 32, 2668-2678 (2014)等を参考にして行うことができる。
なお、多能性幹細胞由来PGCLCを始原生殖細胞として用いる場合には、分化誘導させた多能性幹細胞群より未分化な状態の細胞を予め取り除くことが好ましい。このような方法は公知であり、例えば、多能性幹細胞に、始原生殖細胞のマーカー遺伝子であるBlimp1とレポータータンパクとが結合した融合タンパクをコードする核酸を導入しておくことで、多能性幹細胞より分化誘導されたPGCLCと未分化な細胞とをFluorescence-activated cell sorting(FACS)法等により容易に分離することができる。
【００２０】
ここで、本明細書における「始原生殖細胞」には上記に列挙した生体由来の始原生殖細胞や多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞であって、当該細胞の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した細胞も含まれる。
生体由来の始原生殖細胞及び多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞の遺伝子を改変する方法としては、公知の方法を用いて目的とする核酸やベクターなどの導入を行うことができ、例えば、顕微注入法（マイクロインジェクション）、エレクトロポーレーション、リポフェクション法、ウイルスベクターを用いた核酸導入法などを挙げることができる。また、外来遺伝子や外来の核酸フラグメントの導入法は、遺伝子改変された始原生殖細胞が本発明の方法により機能的な卵母細胞へ分化できる限りにおいて、上記に列挙した方法に限定されない。
なお、始原生殖細胞に対する遺伝子改変は、始原生殖細胞の培養期間中の適切なタイミングで行うことができる。例えば、マウスにおいては、11.5dpc〜12.5dpcの期間に行うことができる。また、多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞を用いる場合には、始原生殖細胞様細胞への分化誘導前の多能性幹細胞を公知の方法により遺伝子改変することもできる。このような遺伝子改変の方法としては、例えば、Watanabe et al., “Gene transfection of mouse primordial germ cells in vitro and analysis of their survival and growth control.” Exp Cell Res 230, 76-83 (1997)に記載の方法を参考にして行うことができる。
【００２１】
また、「支持細胞」とは、始原生殖細胞を取り囲んでいる細胞であり、性分化した卵巣においては、顆粒膜細胞や莢膜細胞へ分化する細胞をいう。支持細胞は、将来、卵胞を構成する顆粒膜細胞や莢膜細胞へ分化するため、始原生殖細胞の共培養に用いる。よって、始原生殖細胞の培養は、生殖巣をそのまま、又は、始原生殖細胞と支持細胞が接するように共培養することが好ましい。また、多能性幹細胞由来PGCLCを始原生殖細胞として用いる際には、生体から採取した生殖巣由来の体細胞を支持細胞として用いることができる。なお、支持細胞として生体から採取した生殖巣由来の体細胞を用いる際には、「（ａ）始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞を性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する条件下で培養して二次卵胞を形成させる工程」より前に、予め、多能性幹細胞由来PGCLCと生殖巣由来の体細胞とからなる凝集塊を作製する培養工程を行うことが好ましい。なお、生殖巣由来の体細胞を採取する方法、及び、多能性幹細胞由来PGCLCと生殖巣由来の体細胞とからなる凝集塊を作製する方法は、非特許文献５に記載の方法に従って行うことができる。例えば、生殖巣由来の体細胞を採取する方法は、生体より外科的に生殖巣を採取し、トリプシン処理等により生殖巣を構成する体細胞を解離させることができる。なお、このとき、生体由来の生殖巣に内在する生殖細胞を取り除くことが好ましい。生殖巣に内在する生殖細胞を取り除く方法は、公知の方法により行うことができ、例えば、抗SSEA1抗体や抗CD31抗体を用いたMagnetic activated cell sorting法により内在する生殖細胞を取り除くことができる。ここで、支持細胞として体細胞を採取するための生殖巣は胎仔由来のものが好ましい。マウスの場合であれば、例えば、胚齢12.5日のマウス胎仔由来の生殖巣を使用することができる。また、当業者であれば、本願明細書の開示及び当該技術分野における技術常識から、由来する動物種により適宜好ましい時期の生殖巣を選択することができる。
また、多能性幹細胞由来PGCLCと生殖巣由来の体細胞とからなる凝集塊を作製する方法は、例えば、Retinoic Acidを含有するGK15培地（GMEMに15%KSR、1xGlutaMax、1x penicillin/streptomycin(100 U/ml Penicillin及び0.1 mg/ml streptomycin)、100μM 2-mercaptoethanol、1μM Retinoic Acidを添加した培地）中で、多能性幹細胞由来PGCLCと生殖巣由来の体細胞とを混合・凝集させて培養することで実施することができる。培養には低吸着の培養皿を用いることが好ましい。マウスの場合であれば、例えば、凝集塊を作製するための培養期間を2〜3日とすることができ、好ましくは2日である。また、当業者であれば、由来する動物種により適宜好ましい培養期間を設定することができる。また、多能性幹細胞由来PGCLCと生殖巣由来の体細胞との混合時の割合は、作製された凝集塊が二次卵胞を形成し、機能的なGV期卵母細胞を形成する限りにおいて限定されないが、例えばマウスの場合においては、多能性幹細胞由来PGCLCと生殖巣由来の体細胞との細胞数の比を、約1:10とすることが好ましい。
【００２２】
また、始原生殖細胞や支持細胞、又は始原生殖細胞と支持細胞とを含む生殖巣は、凍結保存したものを用いることもできる。凍結保存方法は、公知の方法により行うことができる。例えば、始原生殖細胞や支持細胞の凍結保存は10%DMSO溶液や市販の凍結剤（セルバンカー（登録商標）など）を用いた緩慢凍結法などにより行うことができ、また、生殖巣の凍結保存は下記実施例「９．ガラス化保存及び解凍」に記載の方法などに従って行うことができる。
【００２３】
なお、本発明に使用される始原生殖細胞は、哺乳動物に由来するものを用いる。哺乳動物としては、以下に限定されないが、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、ラット、マウス、又は、ヒトを挙げることができる。
【００２４】
ここで、本発明の方法は、「（ａ）始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞を性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する条件下で培養して二次卵胞を形成させる工程」を含む。
工程（ａ）においては、始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞を共に、性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似する機能を有する因子の影響）を排除する条件下で培養するが、生体より採取した生殖巣を用いる場合、生殖巣より始原生殖細胞及び支持細胞を単離させる必要はなく、生殖巣をそのまま、あるいは単離した始原生殖細胞と支持細胞の凝集塊、又は、いくつかの組織切片にして培養すればよい。また、本明細書において、工程（ａ）における「始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞の培養」というとき、始原生殖細胞及び支持細胞を含む生殖巣、単離した始原生殖細胞と支持細胞の凝集塊、又は、その一部を培養することを含む。なお、機能的な卵母細胞が得られる限りにおいて、生殖巣より始原生殖細胞及び支持細胞を単離させて培養することもできる。また、多能性幹細胞由来の始原生殖細胞様細胞を用いる場合には、上述のように、予め多能性幹細胞由来PGCLCと生殖巣由来の体細胞とからなる凝集塊を作製しておくことが好ましい。また、上述のように、「始原生殖細胞」には、減数分裂を開始し、かつ、卵胞形成する前の一次卵母細胞を含んでよい。そのため、「始原生殖細胞の培養」には、減数分裂を開始し、かつ、卵胞形成する前の一次卵母細胞を含む生殖巣、あるいは単離した一次卵母細胞と支持細胞の凝集塊、又は、その一部を培養することも含む。
【００２５】
本明細書において、「エストロジェン」とは、性ステロイドホルモンの一種であり、卵巣の顆粒膜細胞においてアンドロジェンからの代謝で生じる。放出されたエストロジェンは、エストロジェンレセプターに結合することにより、特定の遺伝子の転写を活性化する。エストロジェンには、エストロン（E1）、エストラジオール（E2）、及び、エストリオール（E3）の三種類が知られており、本明細書においてエストロジェンというとき、これらが含まれる。また、本明細書において、「性ステロイドホルモン」とは、エストロジェンの他、テストステロン、デヒドロテストステロン、アンドロステロン等のアンドロジェンを含む。
ここで、「エストロジェンと類似の機能を有する因子」、又は、「性ステロイドホルモンと類似の機能を有する因子」というとき、当該因子はエストロジェン、又は、性ステロイドホルモンの機能と同じであるか類似する機能を有するものである。本明細書において、「エストロジェンと類似の機能」又は「性ステロイドホルモンと類似の機能」というとき、始原生殖細胞を体外培養する際に、（ｉ）始原生殖細胞由来の卵母細胞における卵母細胞シストの崩壊を阻害する機能、又は、（ｉｉ）原始卵胞の形成を阻害する機能の少なくとも１つの機能をいう。このようなエストロジェンや性ステロイドホルモンの機能と類似する機能を有する因子としては、例えば、エストロジェンあるいはアンドロジェン等の性ステロイドホルモンレセプターに結合する因子を挙げることができ、具体的には、培地中のフェノールレッドが挙げられる。なお、血清中には、エストロジェンやアンドロジェンが含まれている他、未同定のエストロジェンの機能と類似する機能を有する因子が含まれている場合があるため、好ましい一実施の形態としては、このようなエストロジェンや性ステロイドホルモンの機能と類似する機能を有する因子の影響を排除できる培養条件とすることである。
【００２６】
ここで、「性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子）の影響を排除する条件下」での培養には、「性ステロイドホルモン阻害剤」の存在下で培養することが含まれる。また、その一実施の形態として、「エストロジェン阻害剤」の存在下で培養することが含まれる。なお、「性ステロイドホルモン阻害剤」には、エストロジェン阻害剤やアンドロジェン阻害剤の他、アンドロジェン阻害剤とエストロジェン阻害剤との組み合わせも含まれる。本発明に使用する「エストロジェン阻害剤」又は「性ステロイドホルモン阻害剤」とは、エストロジェンのレセプター又は性ステロイドホルモンのレセプターの活性化を阻害できる作用を有するものであり、例えば、エストロジェンレセプターのアンタゴニスト、ICI 182,780（(7R,9S,13S,14S,17S)-7-(9-(4,4,5,5,5-Pentafluoropentylsulfinyl)nonyl)-7,8,9,11,12,13,14,15,16,17-decahydro-13-methyl-6H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,17-diol）が含まれる。同様阻害剤として、例えば、タモキシフェンクエン酸塩、4-ヒドロキシタモキシフェン、MPP（4-[1-(4-hydroxyphenyl)-4-methyl-5-[4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenyl]-1H-pyrazol-3-yl]-phenol）、PHTPP (4-[2-Phenyl-5,7-bis(trifluoromethyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]phenol)、G15（(3aS,4R,9bR)-4-(6-Bromo-1,3-benzodioxol-5-yl)-3a,4,5,9b-3H-cyclopenta[c]quinoline）等、市販のものを使用することができる。また、例えば、性ステロイドホルモン阻害剤のうち、アンドロジェンレセプターの阻害剤としては、KW-365（N-[4-[(Benzyl)(4-nitrophenyl)amino]-1-methylpyrrole-2-carbonyl]pyrrolidine）等、市販のものを使用することができる。エストロジェンや性ステロイドホルモン阻害剤としては、上記のものに限定されず、エストロジェンや性ステロイドホルモンレセプターの活性化を阻害できる作用を有し、かつ、始原生殖細胞を機能的な卵母細胞へ分化可能なものである限り使用することができる。
【００２７】
なお、エストロジェンや性ステロイドホルモン阻害剤の添加によるエストロジェンや性ステロイドホルモンレセプターの活性化阻害は、卵母細胞シスト崩壊及び／又は原始卵胞の形成を制御できると考えられる。そのため、エストロジェン阻害剤の添加は、卵母細胞シスト崩壊及び／又は原始卵胞が形成されるより前のタイミングで添加することが好ましい。また、始原生殖細胞及び前記始原生殖細胞に隣接する支持細胞の培養の開始時点から「性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する条件下」で培養する必要はなく、少なくとも卵母細胞シスト崩壊及び／又は原始卵胞が形成される時期に「性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する条件下」で培養することが好ましい。
以下、性ステロイドホルモン阻害剤としてエストロジェン阻害剤を使用し、動物種としてマウスを用いる場合を例にして説明する。例えば、マウスであれば、17.5dpcから出生前後に多くの卵母細胞シストが崩壊する。よって、そのような胎齢の時期に相当する培養日数の日より添加することが好ましい。なお、胎齢12.5dpcに生殖巣を採取し、採取日より始原生殖細胞の培養を開始した場合、体外培養5日目は胎齢17.5日目に相当すると考える。また、エストロジェン阻害剤を含有する培地での培養期間は、卵母細胞シストの崩壊と原始卵胞の形成が完了する期間とすることが好ましい。マウスの始原生殖細胞を培養する際には、培養5日目から培養11日目の6日間とすることが好ましいが、この期間に限定されない。また、マウスの多能性幹細胞由来PGCLCと体細胞との凝集塊とを培養する際には、予め作製した凝集塊の培養開始から数えて培養7日目から培養10日目の4日間とすることが好ましいが、この期間に限定されない。
なお、マウスを例にして説明したが、当業者であれば、用いる動物種ごとの卵母細胞シストの崩壊と原始卵胞の形成の時期を考慮して、「エストロジェン阻害剤」の培養期間を適宜設定することができる。また、「エストロジェン阻害剤」の使用に限らず、「性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する条件下」で培養する期間は、卵母細胞シストの崩壊と原始卵胞の形成が完了する期間とすることが好ましい。なお、当該条件下での培養は、機能的な卵母細胞が得られる限りにおいて、卵母細胞シストの崩壊が始まってから初めても良く、また、原始卵胞の形成が完全に完了する前に止めても良い。
【００２８】
なお、始原生殖細胞から二次卵胞を形成させるための培養期間は、培養する始原生殖細胞の由来する動物種などにより異なるが、始原生殖細胞が生体内で二次卵胞を形成するまでの期間を目安とすることが好ましい。マウスの始原生殖細胞を培養する場合には、生後10日齢前後に相当する日数まで培養することが好ましい。例えば、胎齢12.5日の雌マウス胎仔より始原生殖細胞を採取して培養を開始した場合には、15〜18日間培養することが好ましい。また、マウスの多能性幹細胞由来PGCLCと体細胞との凝集塊とを培養する際には、予め作製した凝集塊の培養開始から数えて11〜21日間培養することが好ましい。
【００２９】
エストロジェン阻害剤や性ステロイドホルモン阻害剤は、始原生殖細胞を培養するのに用いられる公知の基本培地に添加して使用することができる。このような基本培地としては、例えば、α-MEM、PRMI1640、199、StemPro-34 SFM等の培地を挙げることができ、これに血清または代替血清を添加する。しかしながら、本発明の工程（ａ）に用いられる基本培地としては、始原生殖細胞が機能的な卵母細胞へ分化する限りにおいて上記に列挙したものに限定されない。なお、マウスの始原生殖細胞を培養する際に、エストロジェン阻害剤として、例えば、ICI182,780を用いる場合には、0.01〜50μM（終濃度）の範囲で培地に添加することが好ましく、0.1〜10μM（終濃度）の範囲がより好ましい。なお、当業者であれば、始原生殖細胞の由来となる動物種や用いる基本培地、使用するエストロジェン阻害剤等により適宜エストロジェン阻害剤の添加のタイミングや濃度を調整して用いることができる。なお、エストロジェン阻害剤を添加していない期間の培養には、上記に列挙した基本培地を用いて培養すればよい。なお、基本培地には、始原生殖細胞の機能的な卵母細胞への培養を妨げない限りにおいて、アスコルビン酸やペニシリン等の他の成分を適宜含んでよい。
【００３０】
また、「性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する条件下」で培養する別の実施の形態としては、無血清培地での培養を挙げることができる。ここで、無血清培地とは、公知の無血清培地（例えば、StemPro（登録商標）34 SFMのように、そのまま使用可能に調製された無血清培地）であってもよく、又は、代替血清を使用して調製した無血清培地であってもよい。代替血清を使用して無血清培地を調製する際には、例えば、FBSの代わりに、SPS(Serum Protein Substitute)、KSR(KnockOut Serum Replacement)、SSS(serum substitute supplement)等の市販の代替血清を基本培地に添加して調製することができる。代替血清として、好ましくはSPS又はKSRを挙げることができる。無血清培地の調製に使用する基本培地としては、例えば、α-MEM、DMEM、PRMI1640、199、StemPro-34 SFM等の公知の培地を挙げることができる。しかしながら、本発明の工程（ａ）において、無血清培地の基本培地として用いられる培地は、始原生殖細胞が機能的な卵母細胞へ分化する限りにおいて上記に列挙したものに限定されない。なお、マウスの始原生殖細胞を培養する際に、性ステロイドホルモンの影響（例えば、エストロジェン、又は、エストロジェンと類似の機能を有する因子の影響）を排除する培養条件として、例えば、FBS等の血清の代わりにSPSを用いる場合には、5%〜20%（終濃度）の範囲で培地に添加することが好ましく、10%（終濃度）がより好ましい。なお、当業者であれば、始原生殖細胞の由来となる動物種や用いる基本培地、使用する代替血清等により適宜代替血清の濃度を調整して用いることができる。
また、無血清培地を用いて培養を行う期間は、卵母細胞シストの崩壊と原始卵胞の形成が完了する期間とすることが好ましい。また、工程（ａ）における始原生殖細胞の培養期間中、終始無血清培地を用いて培養することもできる。
なお、当業者であれば、始原生殖細胞の由来となる動物種や、使用する無血清培地により、適宜血清培地から無血清培地へ切り替えるタイミングを調整して用いることができる。なお、無血清培地を用いない期間の培養には、上記に列挙した基本培地にFBS等の血清を添加した培地を用いて培養することが好ましいが、上述のように、生殖巣の培養中、終始無血清培地を用いて培養することもできる。なお、基本培地には、始原生殖細胞の機能的な卵母細胞への培養を妨げない限りにおいて、アスコルビン酸やペニシリン等の他の成分を適宜含んでよい。
また、始原生殖細胞から二次卵胞を形成させるための培養においては、上記に列挙するような基本培地の２つ以上を組み合わせて使用することもできる。例えば、始原生殖細胞から二次卵胞を形成させるための前半の培養にα-MEMを基本培地として用い、後半の培養にStemPro-34 SFMを基本培地として用いる実施形態を挙げることができる。なお、基本的に一つの基本培地の使用により始原生殖細胞から二次卵胞の形成は達成することができるが、使用する基本培地を変えることで、顆粒膜細胞の増殖をより促進でき、形成した二次卵胞を単離する際に卵胞構造が壊れにくくなるため好ましい。このような顆粒膜細胞の増殖をより促進できる効果は、特に多能性幹細胞由来PGCLCと生殖巣由来の体細胞との細胞凝集塊から二次卵胞を形成させる場合に望ましい。例えば、マウスの多能性幹細胞由来PGCLCと生殖巣由来の体細胞との細胞凝集塊の培養においてα-MEM及びStemPro-34 SFMの２つの基本培地を用いる場合には、凝集塊の培養開始後4〜8日目にα-MEMからStemPro-34 SFMへ培地の切り替えを行うことができ、培養開始後4日目がより好ましい。また、マウスの生殖巣由来始原生殖細胞を培養する場合にも、同様の時期に培地の切り替えを行うことができる。
【００３１】
また、工程（ａ）における始原生殖細胞の培養は、6ウェルプレートなどの培養皿にTranswell-COLメンブレンなどの公知のインサートメンブレンを使用して行うことが好ましい。また、培養期間中、培養に用いる培地は１日おきに約半分の量を新しい培地に交換することが好ましい。培養皿やインサートメンブレン、培地交換のタイミング等については、培養する始原生殖細胞の由来する動物種等により、当業者は適宜設計して実施することができる。
【００３２】
また、本発明は、上記工程（ａ）により得られた二次卵胞をさらに体外培養することで、機能的なGV期卵母細胞を得ることができる。なお、工程（ａ）により得られる二次卵胞は生殖巣又はその一部、若しくは、生殖巣様組織の一部を構成しているため、タングステン等を用いて物理的に二次卵胞をそれぞれ単離した後、培養を行う。
ここで、本発明の方法は、二次卵胞の体外培養法において、（ｂ）形成した二次卵胞を構成する卵母細胞、顆粒膜細胞層、及び、莢膜細胞層のうち、顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との間の結合を部分的に切断する工程を含む。工程（ａ）の培養により得られた二次卵胞は、卵母細胞の周りを顆粒膜細胞の層が取り囲み、さらに顆粒膜細胞の層を莢膜細胞の層が取り囲む構造をしている。工程（ｂ）においては、卵胞を形成している顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合を部分的に切断する。
顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合を部分的に切断するには、酵素処理及び／又は物理的処理により行うことができる。好ましくは、酵素処理と物理的処理を組みあわせて当該結合を切断する方法である。
酵素処理としては、市販のコラゲナーゼをL15、PBS、M2等の公知の培地で溶解・希釈して行うことができる。
以下、マウスを例にして説明する。マウスの二次卵胞における顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合を部分的に切断するための酵素処理は、例えば、マウスの二次卵胞を処理する場合、0.1%Ｉ型コラゲナーゼ（Worthington Biochemicals, 295 u/mg）を含有するL15培地中で、37℃、15分間処理することにより行うことができる。また、物理的に顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合を切断するには、例えば、ガラスキャピラリーあるいはピペットマンを用いたピペッティングにより行うことができる。なお、顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合の切断は、莢膜細胞層の全体あるいは一部が卵胞から剥離された状態を目安に行えばよい。
このように、顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合を部分的に切断することで、当該結合が切断された部分へ培地が浸透し、顆粒膜細胞が直接培地と接することができる。一方で、マウスの生体由来の始原生殖細胞を用いた試験において、工程（ｂ）として、このような顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合を部分的に切断する処理を行わなかった場合には、機能的な卵母細胞を得ることはできなかった。また、顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合を切断するための処理は、卵胞の培養開始0日目〜7日目に行うことが好ましく、培養2日目〜4日目で行うのがより良い。なお、二次卵胞の単離後すぐに顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合を切断するための処理を行わず、1日〜3日程度の前培養を行うことで、卵胞がインサートメンブレンに接着して安定するため好ましい。なお、このような前培養に用いる培地は、下記工程（ｃ）に用いる培地と同様の培地を用いることができる。なお、好ましい実施形態として、前培養に用いる培地に対してGDF9及び／又はBMP15を添加することができる。これらの化合物の添加は必須ではないが、これらの化合物を二次卵胞の前培養に用いる培地に添加することで、顆粒膜細胞の増殖をより促進することができる。マウスの二次卵胞を前培養する際には、例えば、αMEMに対してGDF9及びBMP15を10〜20ng/ml、好ましくは15ng/mlの割合で添加することができる。
なお、マウスを例にして説明したが、当業者であれば、始原生殖細胞の由来となる動物種や用いる基本培地、使用する酵素等により適宜に顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合を部分的に切断するタイミングや酵素処理の濃度、時間などを適宜調整して行うことができる。
【００３３】
また、本発明の方法は、二次卵胞の体外培養法において、上記工程（ｂ）の後、（ｃ）二次卵胞を構成する卵母細胞、顆粒膜細胞層、及び、莢膜細胞層を、高分子化合物を含む培地で培養することにより、卵母細胞を機能的なGV期卵母細胞へ分化させる工程を含む。
本発明の二次卵胞の体外培養に用いられる培地には、基本培地に対して高分子化合物を添加した培地を使用する。なお、基本培地としては、α-MEM、DMEM、PRMI1640、199等、生殖細胞系列の細胞を培養するのに用いられる公知の培地を使用することができる。なお、基本培地には、高分子化合物のほか、培養する細胞に適した修正を行っても良い。例えば、ウシ胎仔血清（Fetal bovine serum; FBS）、卵胞刺激ホルモン（Follicle Stimulating Hormone; FSH）などを基本培地に適宜含有させてもよい。
【００３４】
ここで、本発明の工程（ｃ）において、培地に添加される「高分子化合物」とは、分子量が数万〜数百万の有機物質であり、天然高分子（生体高分子など）及び合成高分子のいずれをも含む。本発明において用いる「高分子化合物」は、特に、水に溶解しやすいこと、細胞毒性が極めて低いこと、培養中に培養液のｐＨ等を不安定にさせる性質を有さないこと、また、その他にも初期の特性が長期間安定して維持されること、などの条件を満たすものが好ましい。
【００３５】
例えば本発明において使用される高分子化合物としては、合成ポリマー、多糖類系ポリマー、タンパク質、プロテオグリカンなどが挙げられる。例えば合成ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン（PVP；分子量約36万）、ポリビニルアルコール（PVA；分子量約7万〜10万）などが挙げられる。多糖類系ポリマーとしては、デキストラン、ヒドロキシエチル化デンプン、セルロース類の誘導体（例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース）などが挙げられる。また多糖類系ポリマーとしては、スクロースの合成ポリマーであるフィコール（分子量40万）（Ficoll（登録商標））、ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸のグリコサミノグリカンなども挙げられる。タンパク質としては血清アルブミン（分子量約6.9万）などが挙げられる。また、プロテオグリカンとしてはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンなどが挙げられる。
なお、本発明において特に好ましい高分子化合物としては、限定されるものではないが、PVP、フィコール（Ficoll（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（(Hydroxypropyl)methyl cellulose）、血清アルブミンが挙げられる。
【００３６】
上述した以外にも、本発明において利用可能な高分子化合物としては、現在知られている同等の機能を示す化合物、あるいは今後見出される又は合成される化合物も包含される。ある化合物が、本発明において利用可能な「同等の機能」を示す化合物であるかどうかを確認するには、培養に使用した際、卵母細胞の生存性を損なわないこと、卵母細胞周囲の顆粒膜細胞や莢膜細胞などの体細胞が脱落しないこと、かつ卵母細胞を中心とした構造を失わないこと（不規則で広範な細胞増殖が起こらないこと）などの条件を満たすものであり、機能的な卵母細胞への分化に影響がない化合物である。
【００３７】
添加する高分子化合物の濃度は、対象となる卵母細胞の動物種により異なるが、例えば、基本培地に対して約1〜12%(w/v)の範囲内で使用することができる。マウスにおいては、好ましくは1〜8%(w/v)、より好ましくは1〜4%(w/v)、最も好ましくは約2%(w/v)とすることができる。また、ブタやウシにおいては、好ましくは2〜8%(w/v)、より好ましくは2〜4%(w/v)、最も好ましくは約4%(w/v)とすることができる。
高分子化合物の濃度は、上述した範囲であれば本発明の目的を達成することが可能であるが、その他の範囲の濃度であっても本発明の目的を達成することができる場合もある。具体的には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースやグリコサミノグリカンなど、濃度が低くとも高い粘度を示す化合物を添加する場合である。例えば、ブタ又はウシの卵母細胞の培養において、培養液にある種のヒドロキシプロピルメチルセルロースを1%(w/v)の濃度で添加したとき、卵母細胞と体細胞の複合体の形態も2〜4％(w/v)PVP（分子量36万）の良好な結果と類似しており、本発明の効果が達成されることが観察された。
【００３８】
なお、PVPやPVAなどの高分子化合物は、卵子培養液に慣例的に用いられているという事実がある。特にウシ胎仔血清や血清アルブミンを含まない培養液に対し、高分子の代替物として添加されることが多い。この場合、卵母細胞が培養皿の底面又は壁面、及び胚操作用極細ガラス管の外面又は内面に付着して失われることを防ぐためにも有用であるとされている。しかし、そのような目的を果たすための濃度は一般的に約0.1%〜0.4%で十分であり、それが通常用いられる濃度となっている。また、基本となる培養液に血清等が添加される場合には、高分子化合物は添加されないことが多い。それに対し、本発明では約1〜12%にまで濃度を上げることにより、全く異なる効果が達成されることを導き出した。一方、従来用いられている0.1%〜0.4%の濃度で添加した場合には、本発明の目的とする効果は発揮されない。従って、本発明においては、対象となる卵母細胞の動物種により異なるが、従来の濃度を0.4%としても、その約2.5倍以上の濃度で高分子化合物を添加することが重要である。また、ブタやウシの卵母細胞を培養する際には、従来の濃度を0.4%とした場合に、約5〜10倍以上の濃度で高分子化合物を添加することがより好ましい。また、マウスの卵母細胞を培養する際には、従来の濃度を0.4%とした場合に、約2.5〜5倍以上の濃度で高分子化合物を添加することがより好ましい。
なお、工程（ｃ）における二次卵胞の培養期間は、培養する始原生殖細胞の由来する動物種などにより異なるが、二次卵胞内の卵母細胞が機能的なＧＶ期卵母細胞を形成するまでの期間を目安とすることが好ましい。例えば、マウスにおいて、工程（ａ）により得られた二次卵胞を工程（ｃ）において培養する場合には、例えば、12〜16日間培養することが好ましい。なお、上述のように、工程（ｂ）は、この二次卵胞の培養開始時又は培養開始後の好ましいタイミングで行うことができる。
【００３９】
本発明によれば、上記で説明した工程（ａ）〜（ｃ）を行うことにより、始原生殖細胞を、in vitroで機能的なGV期卵母細胞に分化させることを可能とする。
なお、本明細書において「機能的なGV期卵母細胞」とは、（ｉ）成熟培養することで卵子へと成熟し、（ｉｉ）精子との受精などにより、正常な個体へと発生する能力を有し、さらに（ｉｉｉ）当該個体が正常な次世代を残す能力を有する、GV期卵母細胞をいう。
【００４０】
本発明の一態様によれば、上述の卵胞の体外培養により得られたGV期卵母細胞を体外成熟培養し減数分裂を再開させることで機能的な卵子の作出方法も提供する。なお、本明細書で「卵子」とは、減数分裂第二分裂中期（MII期）に至り、MII期で停止した状態の卵子をいう。また、本明細書において、「機能的な卵子」というとき、（ｉｉ）精子との受精などにより、正常な個体へと発生する能力を有し、かつ、（ｉｉｉ）当該個体が正常な次世代を残す能力を有する卵子をいう。
本発明の二次卵胞の体外培養法により得られたGV期卵母細胞は、一般に使用されている未成熟卵母細胞を体外成熟させるための培養方法を行うことにより、卵子に成熟させて当該卵子を利用することができる。
成熟培養への転換は、通常、卵母細胞の発育のための培養を終えた培養皿からCOCを回収し、成熟用培地で洗浄したのち、最終的な成熟用培地に移すことで行う。成熟用培地は、α−MEM、199培地などの生殖細胞系列を培養する公知の培地を基本培地として、ピルビン酸ナトリウムや抗生物質などの必須要素を加え、さらに性腺刺激ホルモン、成長因子、血清、卵胞液などが適宜添加されて用いられる。このような卵母細胞の成熟培養に好ましい培養条件は、広範に調べられており、当技術分野で公知である。培養皿を設置するインキュベータは、通常発育培養に使用されるものと同様の設定で用いられる。
このようにして成熟させた卵子は、通常の体外受精に用いることができるほか、単為発生胚の作製やクローン動物作出におけるレシピエント卵子などに用いることができる。
【００４１】
また、本発明は、始原生殖細胞を、in vitroで機能的な卵母細胞又は卵子へ分化するためのキットを提供する。なお、本発明のキットには、性ステロイドホルモン阻害剤（エストロジェン阻害剤及び／又はアンドロジェン阻害剤）、無血清培地、代替血清、細胞間の結合を切断するための酵素、若しくは、高分子化合物、又は、それらの組み合わせを含むことができる。なお、好ましくは、（１）性ステロイドホルモン阻害剤（エストロジェン阻害剤及び／又はアンドロジェン阻害剤）、無血清培地、若しくは代替血清、（２）細胞間の結合を切断するための酵素、又は、（３）高分子化合物からなる群より選択される少なくとも２つの組み合わせを含むキットである。より好ましくは、１）性ステロイドホルモン阻害剤（エストロジェン阻害剤及び／又はアンドロジェン阻害剤）、無血清培地、又は代替血清、（２）細胞間の結合を切断するための酵素、及び、（３）高分子化合物の3つを含むキットである。なお、キットには、器官培養や成熟培養に必要なその他の試薬やウェルなどの器具等を含むこともできる。
【００４２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、本発明は、以下の実施例の形態に限定されない。
また、本明細書に開示される文献は、本明細書に参照として組み込まれる。
【実施例】
【００４３】
下記の実施例において、全ての動物は日本クレア株式会社より購入した。BDF1マウスの12.5dpcの胎仔は、DBA/2J雄マウスとC57BL/6N雌マウスとを交配させることにより得た。また、対照区として、BDF1(C57BL/6N*DBA/2J hybrid)10日齢および成体の雌マウスを用いた。なお、下記実施例においては、BDF1雄マウスを精子のドナーとして用いた。また、偽妊娠雌マウスの作出には、ICR雌マウスとパイプカットしたICR雄マウスとを交配させた。全ての試験は東京農業大学動物実験委員会によって承認されたものである。【００４４】
（１．生殖巣の体外器官培養）
器官培養に用いる培地は、基本培地に対して、FBS(Gibco, Life Technologies)、SPS(SAGE In-Vitro Fertilization)、KSR(Gibco, Life Technologies)、エストロジェン受容体のアンタゴニストであるICI 182,780(7α,17β-[9-[(4,4,5,5,5-pentafluoropentyl)sulfinyl]nonyl]estra-1,3,5(10)-triene-3,17-diol; Tocris Bioscience)、4-ヒドロキシタモキシフェン(Sigma-Aldrich)、及びMPP（Methylpiperidino pyrazole; Cayman Chemical）を以下の試験区ごとの濃度で添加したものを用いた。なお、基本培地には、1.5mM 2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid(東京化成工業株式会社)、10 units/ml penicillin、10μg/ml streptomycin(Sigma-Aldrich)を含有するαMEM(Gibco, Life Technologies)を用いた（以下、当該基本培地をαMEMという）。
また、ICI 182,780及び4-ヒドロキシタモキシフェンは以下のようにして調製して用いた。まず、ICI182,780及び4-ヒドロキシタモキシフェンをDMSOを用いて100 mMとなるよう希釈し、凍結保存ストックを作成した。MPPはDMSOを用いて10 mMとなるよう希釈し、凍結保存ストックを作成した。そして、使用直前にICI 182,780及び4-ヒドロキシタモキシフェンの100 mMストックをDMSOでさらに100倍希釈し1mM溶液を作成し、培地に最終濃度がそれぞれの試験区の濃度（10 nM、100 nM、1μM、5μM、10μM）となるように添加して用いた。また、MPPは、使用直前に培地に最終濃度が1μMとなるように添加して用いた。
培養に用いた生殖巣は、雌マウスの胎仔（12.5dpc）より中腎を伴う状態で、又は、中腎を伴わない状態で採取した（図１ａ）。培養に用いた6ウェルプレートには、各ウェルに対して2.2mlの培地を添加した。また、6ウェルプレートの各ウェルには、Transwell-COLメンブレン(3.0-μm pore size, 24-mm diameter; Corning)をセットし、メンブレン上に生殖巣を移し、生殖巣の培養を行った。生殖巣の培養は、5%CO2、95%空気、37℃で17日間行った。なお、培地は、1日おきに約半分の量を新しい培地に交換した。また、中腎と共に培養した場合は、培養7日目に生殖巣より中腎を取り除いた。【００４５】
生殖巣の体外器官培養は、以下の各条件に従って行った。なお、以下の各条件による培養は、各試験区において合計17日間の培養を行った（図２）： 
（ｉ）10%FBS含有αMEMで17日間培養を行う(αMEM+FBS；FBS区)
（ｉｉ）10%SPS含有αMEMで17日間培養を行う(αMEM+SPS；SPS区)
（ｉｉｉ）10%KSR含有αMEMで17日間培養を行う(αMEM+KSR；KSR区)
（ｉｖ）10% FBS含有αMEMで4日間培養を行い、5日目から10%SPS含有αMEMで6日間培養を行い、11日目から10% FBS含有αMEMで17日まで培養を行う(αMEM+FBS/SPS；FBS/SPS区)
（ｖ）10% FBS含有αMEMで4日間培養を行い、5日目から10% FBS含有αMEMに対して、10 nM、100nM、1μM、5μM、又は、10μM（終濃度） ICIを添加した培地で6日間培養を行い、11日目から10% FBS含有αMEMで17日まで培養を行う（αMEM+FBS/10nM ICI；FBS/10nM ICI区、αMEM+FBS/100nM ICI；FBS/100nM ICI区、αMEM+FBS/1μM ICI；FBS/1μM ICI区、αMEM+FBS/5μM ICI；FBS/5μM ICI区、又は、αMEM+FBS/10μM ICI；FBS/10μM ICI区）
（ｖｉ）10% FBS含有αMEMで4日間培養を行い、5日目から10% FBS含有αMEMに対して、1μM（終濃度）4-ヒドロキシタモキシフェンを添加した培地で6日間培養を行い、11日目から10% FBS含有αMEMで17日まで培養を行う（αMEM+FBS/1μM Tamoxifen；FBS/1μM Tamoxifen区）
（ｖｉｉ）10% FBS含有αMEMで4日間培養を行い、5日目から10% FBS含有αMEMに対して、1μM（終濃度）MPPを添加した培地で6日間培養を行い、11日目から10% FBS含有αMEMで17日まで培養を行う（αMEM+FBS/1μM MPP；FBS/1μM MPP区）【００４６】
上記各試験区における培養条件にて、生殖巣を培養することにより、卵巣を得た。得られた卵巣を顕微鏡下で観察し、撮影した画像データを図３に示す。（ｉ）FBS区により得られた卵巣においては、卵胞同士の境界は曖昧であり、また、莢膜細胞層の一部が隣接する卵胞と共有されており、異常な卵胞形成を示した（図３ａ）。一方、（ｉｉ）SPS区においては、FBS区で観察された異常は改善されていた（図３ｂ）。（ｉｖ）FBS/SPS区により得られた卵巣においても異常は部分的に改善されていた（図３ｃ）。（ｖ）FBS/ ICI区により得られた卵巣は、異常が大きく改善しており、各卵胞が球形に明瞭に観察できた（図３ｄ）。【００４７】
また、生殖巣の体外器官培養により得られた卵巣から、二次卵胞を回収した。1つの卵巣から得られた二次卵胞の数を試験区ごとに比較した結果を図４に示す。上記（ｉ）FBS区においては、中腎の有無にかかわらず1つの卵巣から平均で約4〜6個の二次卵胞しか単離することができなかった。これに対し、上記（ｉｉ）SPS区においては、1つの卵巣から約12個の二次卵胞を単離することができた。また、上記（ｉｉｉ）KSR区においては、1つの卵巣から約15個の二次卵胞を単離することができた。上記（ｉｖ）FBS/SPS区では、1つの卵巣から21個の二次卵胞を単離することができた。一方で、上記（ｖ）ICI添加区では、ICIの濃度依存的に1つの卵巣からの回収卵胞数が、17個（FBS/10nM ICI区）、32個（FBS/100nM ICI区）、44個（FBS/1μM ICI区）、53個（FBS/5μM ICI区）、82個（FBS/10μM ICI区）であり、FBS区に対していずれも有意な増加を示した（図４）。同様に、上記（ｖｉ）FBS/1μM Tamoxifen区では、1つの卵巣から25個の二次卵胞、上記（ｖｉｉ）FBS/1μM MPP区では、1つの卵巣から15個の二次卵胞をそれぞれ単離することができた。【００４８】
（２．体外培養により得られた卵巣の組織学的分析）
上記（ｉ）FBS区、又は、（ｖ）FBS/10μM ICI区にて17日間培養した卵巣、及び、生後10日の雌マウス由来の卵巣について、ヘマトキシリン・エオジン染色、及びラミニンの免疫染色を行った。
より具体的には、卵巣を1%パラホルムアルデヒド及び0.1%グルタルアルデヒドを含有する0.05Mリン酸緩衝溶液を用いて室温で4時間、固定処理を行った。卵巣は、ヘマトキシリン・エオジン染色のために、通常のプロトコールに従いパラフィン包埋し、その後4μm厚の連続切片を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色を行った後、各切片を顕微鏡（オリンパス株式会社 IX71）下で観察した。また、ラミニンの免疫染色のために、卵巣を4〜8つに切り分け、それぞれの卵巣の組織切片を100倍希釈したウサギ抗ラミニンポリクローナル抗体（Abcam）と、4℃の条件下で3日間反応させた。その後、卵巣の組織切片を、500倍に希釈したAlexa Flour 488標識ヤギ抗ウサギIgG抗体（Molecular Probes, Life Technologies）と、4℃の条件下で3日間反応させた。得られた卵巣の組織切片は、さらに、4’,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI; Life Technologies)を用いて染色した。卵巣の組織切片は、Zeiss LSM 710共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）下で観察した。【００４９】
ヘマトキシリン・エオジン染色及びラミニンの免疫染色の結果を図５に示す。（ｖ）FBS/10μM ICI区における卵巣は、生後10日齢雌マウス由来の卵巣と同様に、Ｚ軸上のどの面においても、ラミニンが卵胞を円形で囲むように局在していた。一方、（ｉ）FBS区では、Z軸上でラミニンが間欠せずに円状に観察されることはほとんどなく、また、円状に観察された場合であっても1つの卵胞内に複数の卵子が存在する現象（multi oocytes follicle）が観察された（図５ａ）。しかしながら、（ｖ）FBS/ICI区ではそのような現象はほとんど観察されず（図５ｂ）、生後10日齢雌マウス由来の卵巣（図５ｃ）と同様の像を示し、卵胞形成が改善していた。【００５０】
（３．二次卵胞の体外培養）
次に、胎仔由来の生殖巣の体外器官培養により得られた二次卵胞の体外培養を試みた。なお、本発明者らは、マウスの二次卵胞の体外発育培養（in vitro growth; IVG）において、高分子化合物を培地に添加することが有効であることを示してきた（特許文献１）。本実施例においては、高分子化合物であるPVPを添加した培地を用いて培養を行った。さらに、本発明者らは、二次卵胞を体外発育培養する際に、卵胞を形成している顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合を一部切り離すことで、卵母細胞が機能的な卵子に成長することを見出した。よって、本実施例においては、卵胞の体外培養法において、顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合を一部切り離す工程を含む。より具体的には以下のようにして卵胞の体外培養を行った。
上記の「１．器官培養」を17日間行った後、培養後の生殖巣（卵巣）をL15培地に移したのち、生殖巣内に形成された二次卵胞をタングステンの細針を用いて単離した。二次卵胞は、2%PVP(w/v)、5%FBS、及び、0.1 IU/ml FSH (FOLLISTIM Injection 50、MSD)を含有するαMEMでさらに培養を行った。なお、二次卵胞の培養は、35mm培養皿（Falcon、Corning）内に載置したMillicellメンブレン（0.4μm pore size, 27mm diameter、Merk Millipore）上で行った。培養3日目に、二次卵胞を0.1%Ｉ型コラゲナーゼ（Worthington Biochemicals）を含有するL15培地に移し、37℃で15分間コラゲナーゼ処理を行った。その後、二次卵胞の莢膜細胞層を、ガラスキャピラリーを用いたピペッティングの作業により取り除いた。50〜60個の二次卵胞を再度Transwell-COL メンブレン又はMillicellメンブレン上に載置し、培地中、5%CO2、95%空気、37℃の条件下、さらに9日〜13日間の培養を行った。なお、メンブレンの内側及び外側は、それぞれ、1ml又は2mlの培地で満たした。培地は、1日おきに約半分の量を新しい培地に交換した。
上記に記載の体外培養方法により、（ｉｉ）SPS区、（ｉｖ）FBS/SPS区及び（ｖ）FBS/ICI区由来の卵母細胞では、卵胞の成長培養開始から12〜16日目において、約26〜57%の卵胞が十分に成長していた（なお、FBS/10μM ICI区の体外培養により得られた卵母細胞の直径の平均は80.0μm(n=85)、生体由来の卵母細胞の直径の平均は、89.9μm(n=74)であった）。また、これらの卵胞から発育した卵丘細胞−卵母細胞複合体（COCs）を単離することができた（図６ａ及び図６ｂ、並びに図７）。【００５１】
（４．卵胞培養のホルモンアッセイによる評価）
二次卵胞の体外培養中における卵胞のステロイド産生を評価するために、培養に用いた培地に含まれるプロジェステロン及びエストラジオールのレベルを測定した。より具体的には、（ｖ）FBS/10μM ICI区の器官培養により得られた二次卵胞を、上記４．に記載の二次卵胞の体外培養方法と同様にして培養した（なお、コラゲナーゼ処理後の二次卵胞は、50〜60個を1つのTranwell-COLメンブレン上に載置して17日間培養した）。培地は、二次卵胞の体外培養3日目以降、2日おきに半量交換した。培地中のステロイドホルモンの測定は、酵素免疫測定キット（Cayman）を用いて、合計2回測定した。なお、酵素免疫測定法は、キットに添付の説明書に基づいて行った。結果を図８に示す。
図８に示すように、二次卵胞の培養開始より、経時的に培地中のプロジェステロン及びエストラジオールの合成量が増加した。この結果、「３．二次卵胞の体外培養」に記載の方法により体外培養を行った卵胞は、生体内の卵胞の成長過程と同様のステロイドホルモン産生機能を有していることが示された。【００５２】
（５．二次卵胞の体外培養により得られた卵母細胞におけるインプリント遺伝子座のＤＮＡメチル化解析）
上記「３．二次卵胞の体外培養」により得られた卵母細胞が機能的な卵母細胞であるかを評価するために、個体発生に必須のメチル化インプリントが正しく修飾されているかを確認した。具体的には、以下のようにして行った。
DNAを、FBS/10μM ICI区により得られたGV期にある体外培養由来の卵母細胞、及び、本発明の体外培養方法由来の卵母細胞から得られた産仔より単離した。単離したDNAは、メチル化を受けていないシトシンをウラシルに変換するために、亜硫酸水素ナトリウム溶液（Qiagen）で処理した。亜硫酸水素ナトリウム溶液で処理したDNAは、下記表１に記載のプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った。PCR生産物は、pGEM-T easyベクター（Promega）にクローニングし、ABI PRISM 3100(Applied Biosystems)でシークエンス解析を行った。QUMA softwareを使用することにより、それぞれのサンプルにおいて少なくとも20プラスミドＤＮＡクローンについて各インプリント遺伝子座にけるシークエンスの解析を行った(Kumaki, Y. et al., “QUMA: quantification tool for methylation analysis.” Nucleic Acids Res 36, W170-175, doi:10.1093/nar/gkn294 (2008))。【００５３】
【表１】
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【００５４】
ＤＮＡメチル化解析の結果を、図９及び図１０に示す。図９は、本発明の体外培養により得られた卵母細胞におけるH19及びIgf2rについて、上記表１の2ndで示されるプライマー配列を用いてクローニングした領域のメチル化状態を示す。また、図１０は、本発明の体外培養方法により得られた卵母細胞を用いて得た産仔におけるDNAメチル化状態（#1及び#2）、及び、成体マウスのGV期卵母細胞を用いて得た産仔におけるDNAメチル化状態（#3）を示す。図９及び図１０に示す結果から、体外培養における卵子形成で母方メチル化インプリントが確立していることが確認できた。【００５５】
（６．体外培養による卵子への成熟）
上記「３．二次卵胞の体外培養」により得られた卵母細胞が、正常に減数分裂を完了するか否かを確認するため、体外培養による卵子への成熟を以下のようにして行った。
上記「３．二次卵胞の体外培養」により得られた二次卵胞から、卵丘細胞−卵母細胞複合体を得た。その後、COCsを5%FBS、0.1IU/ml FSH、1.2 IU/ml絨毛性ゴナドトロピン（chorionic gonadotropin）（gonadotropin、あすか製薬株式会社）及び4ng/ml EGF（Gibco, Life Technologies）を含有するαMEMで17時間培養を行った。
また、対照区として、ウマ絨毛性ゴナドトロピン（equine chorionic gonadotropin）（セロトロピン; あすか製薬株式会社）を成体マウスに投与し、投与から44時間後に当該成体マウスより回収したCOCsを用いた。成体マウスより得られた（すなわち、in vivo由来の）COCsは、in vitro由来の卵胞から得られたCOCsと同様に、5%FBS、0.1IU/ml FSH、1.2 IU/ml絨毛性ゴナドトロピン及び4ng/ml EGFを含有するαMEMで培養を行った。卵子への体外成熟培養の結果、（ｉｉ）SPS区、（ｉｖ）FBS/SPS区と（ｖ）FBS/ICI区由来の卵母細胞では、77〜95%の卵母細胞が第一極体を放出し、第二減数分裂中期まで成熟した（図１１ｂ及びｃ）。【００５６】
（７．核型解析）
上記体外成熟培養中の卵母細胞が正常に減数分裂を行っているかを確認するため、以下のようにして核型解析を行った。第二減数分裂期にある成熟した卵子を0.6%クエン酸ナトリウム中にて室温で5分間インキュベートした。その後、卵子をカルノア固定液とともにスライドガラス上に展開させた。次いで、染色体をDAPIで染色し、各卵子の核型をZeiss LSM 710共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）下で観察した。核型解析の結果、卵母細胞は半数体（n=20）であり、正常な減数分裂を行っていた（図１１ａ）。【００５７】
（８．体外成熟した卵子の体外受精、及び、胚移植）
さらに、上記「６．体外培養による卵子への成熟」に記載の方法により得られた卵子が、産仔へと発生する能力を有する否かを確認するため、体外成熟した卵子の体外受精、及び、胚移植を以下のようにして行った。
培養から17時間後、膨張した卵丘細胞を有する卵子をTYH培地（株式会社LSIメディエンス）に移し、当該培地内で精巣上体由来の精子と受精させた。（ｉｉ）SPS区、（ｉｖ）FBS/SPS区、（ｖ）FBS/ ICI区由来の卵子は、体外受精（in vitro fertilization; IVF）に供した卵子の数のうち、約27〜58%の卵子が正常に受精した。2つの前核を有する正常に受精した受精卵をKSOM培地に移し、培養を続けた。受精卵のうち、約83〜97%の胚が2細胞期へと発生した。培養により2細胞期へ発生した胚を、0.5dpcの偽妊娠させた雌マウス（仮親）の卵管へ移植した。その後、19.5dpcにおいて、自然分娩あるいは帝王切開により産仔を得た。その結果、移植した胚の約14〜40%が産仔へと発生した。得られた産仔は里親マウスのもとで育てた。なお、全ての産仔は生後約4週間で離乳した。この結果は、胎仔期の始原生殖細胞を始点としているにも関わらず、非常に良い効率で産仔を誕生させることに成功したことを意味した。なお、上述の通り、これまで、始原生殖細胞を始点とした体外培養法により得られた卵子を用いて産仔を得た報告はない。また、新生仔の非成長期卵母細胞から培養で得られた卵子より産仔が得られたことが報告されているが、上記の結果は、当該報告された移植胚のうち産仔へと発生した率（約5.7%）より非常に高かった。また、始原生殖細胞から機能的な卵子を産生する本発明の体外培養法により、1卵巣から出生した産仔は最大で7匹、平均で0.3〜3.3匹の産仔が誕生した。出生した産仔は外見上、正常に発育し、始原生殖細胞から体外培養で分化・成熟した卵子より産まれたマウスは、性成熟後、雌雄ともに次の世代を誕生させることにも成功した。（表２及び図１２）。なお、表３は、本実施例により得られた産仔（試験区）及び生体由来の卵母細胞を用いて得た産仔（対照区）における雌雄比（表２ａ）と出生時の体重（表２ｂ）を示す。
【表２】
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【００５８】
（９．ガラス化保存及び解凍）
本発明の始原生殖細胞を機能的な卵母細胞及び卵子へ分化する方法が、凍結保存した始原生殖細胞あるいはガラス化保存した胎仔生殖巣でも適用可能であることを確認するために、以下の試験を行った。なお、ガラス化保存及び解凍は、Wang, X. et al., “Successful in vitro culture of pre-antral follicles derived from vitrified murine ovarian tissue: oocyte maturation, fertilization, and live births.” Reproduction 141, 183-191 (2011)に記載の方法を参考にして以下のように行った。
まず、ガラス化保存用溶液１として、4mg/mlウシ血清アルブミン（BSA; SIGMA-ALDRICH）、10%エチレングリコール（和光純薬工業株式会社）、及び、10%ジメチルスルホキシド（DMSO; SIGMA-ALDRICH）を含むL15培地を調製した。次いで、ガラス化保存用溶液２として、4mg/mlウシ血清アルブミン（BSA; SIGMA-ALDRICH）、17%エチレングリコール（和光純薬工業株式会社）、17%ジメチルスルホキシド（DMSO; SIGMA-ALDRICH）、及び、0.75M スクロースを含むL15培地を調製した。
生殖組織のガラス化保存は次のように行った。12.5dpcにおける雌胎仔から回収した生殖巣を、2〜3つの組織片に切断した。得られた生殖巣組織を、2mlのガラス化保存用溶液１に浸した。20分後、生殖巣組織を、2mlのガラス化保存用溶液２に浸した。3分後、生殖巣組織を、ガラス化保存用溶液２を3μl含むクライオチューブ（イワキ株式会社）内へ移し、液体窒素中で凍結保存した。
生殖組織の解凍は、クライオチューブの中へ、1ml 0.5Mスクロース溶液中を加え、ピペッティングで混合することにより行った。その後、生殖組織は、0.25M、0.125M、0Mスクロース溶液中でそれぞれ5分間ずつ順に洗浄した。解凍した生殖巣組織は、上記「１．生殖巣の体外器官培養」のFBS/1μM ICI区の条件にて器官培養し、器官培養後の組織より単離した卵胞は、上記「６．体外培養による卵子への成熟」に記載の方法により体外培養を行った。次いで、得られた卵母細胞を、「８．体外成熟した卵子の体外受精、及び、胚移植」に記載の方法により評価した。
ガラス化保存した生殖巣由来の一つの卵巣より得られる卵胞数は、ガラス化保存をしない場合と比較して減少した（一つの卵巣より約14個の卵胞を得た）。しかしながら、当該卵胞を上記のように13〜16日間体外成熟培養を行うことで得られた卵母細胞は、成熟培養後に卵子へと分化し、当該卵子は産仔まで発生することが示された。【００５９】
なお、下記表３に、始原生殖細胞の体外培養、二次卵胞の体外培養、及び、卵母細胞の体外成熟培養より得られた卵子を用いて産仔まで発生させた際の効率を比較した結果を示す。下記表３に示される全ての試験区は、上記の実施例と同様の方法により、（ｂ）二次卵胞の体外培養の際、卵母細胞を囲む顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との間の結合を部分的に切断する工程を行い、かつ、（ｃ）上記切断工程の後に、卵母細胞と顆粒膜細胞との複合体を、高分子化合物を含む培地で培養する工程を行った。これまでに、始原生殖細胞を始点として卵子を得る体外培養方法においては、機能的な卵子を得ることができなかった。しかしながら、本発明に係る方法によれば（SPS区、SPS/FBS区、FBS/1μM ICI区、FBS/5μM ICI区、FBS/10μM ICI区、ガラス化FBS/1μM ICI区）、高い効率で、始原生殖細胞を始点として産仔を得ることができた。なお、下記表３において、回収COC数、成熟卵数、正常受精卵数、2細胞期への発生卵数、又は、出生マウス数とともに記載されるパーセンテージの値は、回収卵胞数に対するそれぞれの割合を示す（ただし、GV区（対照区）においては、回収COC数に対するそれぞれの割合を示す）。
【表３】
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【００６０】
（１０．多能性幹細胞由来PGCLCを用いた機能的なGV期卵母細胞及び機能的な卵子への体外培養法）
本実施例では、本発明に係る体外培養方法が、多能性幹細胞由来PGCLCを用いた場合にも機能的なGV期卵母細胞及び機能的な卵子を作出することができるか否かを確認するための試験を行った。なお、本実施例において、ES細胞及びiPS細胞からPGCLCを得る方法は、特に記載がない限り、Hayashi K. et al., “Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.” Cell, Aug 19, 146(4), 519-32 (2011)に記載の方法と同様に行った。また、多能性幹細胞より分化誘導後のPGCLCの精製方法、胎仔の生殖巣由来体細胞の調製、及び、精製後のPGCLCと胎仔の生殖巣由来細胞との凝集塊の作製方法は、特に記載がない限り、Hayashi K., et al, “Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-like Cells in Mice.” Science 338, 971-975 (2012)（非特許文献５）に記載の方法と同様に行った。【００６１】
＜Ｉ．材料＞
＜Ｉ−１．ES細胞＞
本実施例に用いたES細胞は、Blimp1-mVenus及びStella-ECFP(BVSC)が遺伝子導入されたマウス（the Jackson Laboratory）の胚盤胞より樹立したES細胞株である。なお、Blimp1はPGC様細胞（PGCLC）のマーカー遺伝子であり、StellaはPGCLCおよび卵母細胞のマーカー遺伝子である。また、本実施例に用いたES細胞の核型は40本の染色体(38XX)を有する雌の細胞である。
＜Ｉ−２．iPS細胞＞
本実施例に用いたiPS細胞は、胚齢12日目のマウス胎仔から得られた線維芽細胞にOct4、Sox2、Klf4、及び、c-Mycを導入して得られたものを用いた（Okita et al., “Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors” Science Nov 7; 322(5903):949-53を参照）。なお、本試験に用いたiPS細胞の作製に供したマウス胎仔は、Blimp1-mVenusおよびStella-ECFPを有するものである。
＜Ｉ−３．胎仔生殖巣細胞＞
本実施例においては、PGCLCs由来の二次卵胞を形成するための体外培養方法を行う前に、PGCLCsと生殖巣由来の体細胞との凝集塊を作製した。ここで、PGCLCsと凝集させる生殖巣の体細胞は胚齢12日目の雌のマウス胎仔から採取した。具体的には、マウス胎仔より生殖巣を外科的に単離後、0.05%トリプシンにより37℃10分間処理することにより生殖巣を構成する細胞を解離した。その後、Magnetic activated cell sorting法により、胎仔生殖巣由来の生殖細胞を除いた。なお、Magnetic activated cell sorting法は、磁気ビーズ（Miltenyi Biotec）と抗SSEA1抗体および抗CD31抗体とを結合させたものを用いた以外は、非特許文献５に記載の方法と同様にして行った。【００６２】
＜ＩＩ．方法＞
＜ＩＩ−１．多能性幹細胞からPGCLCの誘導＞
ES細胞又はiPS細胞からPGCLCの誘導は、Hayashi K. et al., “Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells.” Cell, Aug 19, 146(4), 519-32 (2011)に記載の方法に従って行った。PGCLCへの誘導に用いるES/iPS細胞は、2i (PD0325901, 0.4μM: Stemgent, San Diego, CA; CHIR99021, 3μM: Stemgent)及びLIF (1000 u/ml)を含むN2B27培地を用いて、フィーダーフリーの条件下で2日間培養した（5%CO2、95%空気、37℃。以下、本実施例における培養は同様の条件で行った）。次いで、ヒト血漿由来フィブロネクチンでコーティングした培養皿と、Activin (20 ng/ml)、bFGF (12 ng/ml)、及び、KSR (1%)を含むN2B27培地とを用いてES/iPS細胞を2日間培養することによりエピブラスト様細胞（EpiLC）に分化させた。得られたEpiLCは、BMP4 (500 ng/ml; R&D Systems)、LIF (1000 u/ml; Invitrogen)、SCF (100 ng/ml; R&D Systems)、及び、EGF (50 ng/ml; R&D Systems)を含む無血清培地(GK15; 15% KSR、0.1mM NEAA、1mM sodium pyruvate、0.1mM 2-mercaptoethanol、100U/ml penicillin、0.1mg/ml streptomycin、及び2mM L-glutamineを含有するGMEM (Invitrogen))、並びに、低吸着96well培養皿（NUNC）を用いて浮遊状態で6日間培養を行い、PGCLCへ分化誘導した。
ES細胞又はiPS細胞より分化誘導後のPGCLCを含む細胞群については、PGCLCへ分化した細胞と未分化な状態にある細胞とを分離するため、PGCLCに分化したことを示すBV陽性細胞を、フローサイトメーター（Aria II, BD Biosciences）を用いてFluorescence-activated cell sorting(FACS)法により単離した。
なお、これより以下の実施例において、PGCLCというとき、ES細胞由来PGCLC及びiPS細胞由来PGCLCの両方を含む。ES細胞由来PGCLC又はiPS細胞由来PGCLCは、それぞれ同様の条件にて下記の実施例に用いた。【００６３】
＜ＩＩ−２．PGCLCと生殖巣由来体細胞との凝集培養＞
PGCLCと生殖巣由来体細胞との凝集培養方法は、非特許文献５に記載の方法に従って行った。すなわち、単離したPGCLCsと生殖巣体細胞をRetinoic Acid含有GK15培地（GMEMに15%KSR、1xGlutaMax、1x penicillin/streptomycin、100μM 2-mercaptoethanol、1μM Retinoic Acidを混和したもの）中で、PGCLCと生殖巣由来体細胞との割合を1:10として混合する。その後、低吸着96well培養皿（NUNC）に凝集塊を構成する細胞数が約55000細胞/wellの割合となるように播種し、2日間培養することで、PGCLCと生殖巣体細胞との凝集塊を作製した。【００６４】
＜ＩＩ−３．二次卵胞の作製＞
上記＜ＩＩ−２．PGCLCと生殖巣由来体細胞との凝集培養＞により得られたPGCLCと生殖巣体細胞との凝集塊を、下記のように体外培養することで二次卵胞を形成させた。本実施の形態においては、PGCLCと生殖巣体細胞との凝集塊の培養の際に、2種類の基本培地を用いた。まず、培養開始日から培養4日目までは、αMEMに対して2% 胎仔牛血清（FCS）、150μM ascorbic acid、1x GlutaMax、1x penicillin/streptomycin、及び、55μM 2-mercaptoethanolを添加した培地（IVD-αMEM培地）を用いた。培養5日目からは、StemPro-34 SFM (Life technologies)に対して10% FCS、150μM ascorbic acid、1x GlutaMax、1x penicillin/streptomycin、及び、55μM 2-mercaptoethanolを添加した培地（IVD-SP培地）を用いた。また、PGCLCと生殖巣体細胞との凝集塊の培養開始日より7日目から10日目の間の培養期間中においては、ICI 182,780(500nM)を添加したIVD-SP培地を用いた。PGCLCと生殖巣体細胞との凝集塊を二次卵胞へ形成するための培養は、培養の全ての期間中Transwell-Col上で行い、計11日〜21日間行った。その結果、PGCLCと生殖巣体細胞との凝集塊を培養してから約9-11日目に二次卵胞の形成が認められた（図１３下段）。図１３に示すように、培養開始から3週間目に形成された二次卵胞は、始原生殖細胞マーカーであるBlimp1の発現が消失し、卵母細胞マーカーであるStellaが強く発現していることが確認された。【００６５】
＜ＩＩ−４．二次卵胞の体外培養（IVG）＞
上記＜ＩＩ−３．二次卵胞の作製＞により得られた二次卵胞を下記のように体外培養することで卵母細胞-卵丘細胞複合体（COC）の作製を試みた。
培養により得られた二次卵胞は、Transwell-Col上でタングステンを用いて物理的に単離した。単離した二次卵胞はIVG培地（αMEMに対して5% FCS、2% polyvinylpyrrolidone(Sigma)、150μM ascorbic acid、1x GlutaMax、1x penicillin/streptomycin、100μM 2-mercaptoethanol、55μg/ml sodium pyruvate、及び、0.1IU/ml FSHを混和したもの）に対して、GDF9とBMP15をさらに添加（ともに15ng/ml）した培地を用いて、Transwell-Col上で2日間培養した（図１４Ａ）。培養3日目に二次卵胞を1mg/ml IV型コラゲナーゼを含有するL15培地に移し、37℃で25分間コラゲナーゼ処理を行い、顆粒膜細胞層と莢膜細胞層との結合を部分的に切り離した。その後、継続して上記IVG培地（ただし、GDF9とBMP15は無添加）を用いて、Transwell-Col上で培養した（図１４Ｂ及び図１４Ｃ）。その結果、培養11日目における発育した二次卵胞よりCOCsをガラスキャピラリーにより単離することができた（図１４Ｄ）。【００６６】
＜ＩＩ−５．体外培養による卵子への成熟（IVM）＞
上記＜ＩＩ−４．二次卵胞の体外培養（IVG）＞により得られたCOCsをIVM培地（αMEMに5%FCS、25μg/ml sodium pyruvate、1x penicillin/streptomycin、0.1IU/ml FSH、4ng/ml EGF、1.2IU/ml hCGを添加したもの）に移して16時間培養した。その後、卵丘細胞をヒアルロニダーゼで卵子から解離させて第一極体の放出を確認したものをMII卵子として体外受精に用いた（図１４Ｅ）。 【００６７】
＜ＩＩ−６．体外成熟した卵子の体外受精、及び、胚移植＞
得られたMII卵子はIVF培地（HTFに4mg/ml bovine serum albuminを添加したもの）中で精子と共培養した。約6時間後に受精卵を新しいIVF培地に移動し、1日間培養した。培養後2細胞期に達した胚をICRの偽妊娠0.5日目の卵管に移植した。
移植後19日目に帝王切開により新生仔を取得した。得られた新生児は里親により哺乳され、成体にまで発育させた。その結果、得られた新生仔は外見上、正常な成体に発育した（図１５）。さらに、成体に発育したマウスは、性成熟後、雌雄ともに次の世代を誕生させることに成功した。このようにES細胞又はiPS細胞由来PGCLCを用いた場合であっても、本発明の対外培養方法により、機能的なGV期卵母細胞及び卵子が得られることが確かめられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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