(57)【要約】【課題】モノクロのＴＤＩラインスキャンカメラを用いたスライド全体の蛍光デジタル病理システムが提供される。【解決手段】蛍光デジタル病理システムは、信号が明視野の顕微鏡使用においてよりも概して弱い場合での蛍光スキャニングにおいて特に有用である。このシステムは、迅速かつ正確に組織を見出すために斜めからの明視野照明を用い、かつ、独特の二重スイープでのフォーカスのスコアリングおよび対物レンズの高さの平均化技術を用いて、フォーカス点を特定し、かつその後のスキャニングの間に、その後に生じ得るフォーカスマップを生成し、オートフォーカス性能を提供する。本システムはまた、ＴＤＩラインスキャンカメラがデジタルスライド画像のその後のスキャニングの間に用いるために、最適なライン速度を決定するために画像データをスキャンおよび分析し、ならびにロールオフに起因する照射光の損失を補うために、光のプロファイルを生成する。【選択図】図２
2014142657.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光の試料の、隣接したデジタル画像を生成するためのコンピュータが実施する方法であって、１つ以上のプロセッサが以下のステップを実行するようにプログラミングされており、
斜めからの照射を前記蛍光の試料に当てるステップと、
斜めからの照射の下で、前記蛍光の試料のマクロ画像をキャプチャし、かつデータ格納領域において前記マクロ画像を格納するステップと、
前記マクロ画像を分析して、前記蛍光の試料の少なくとも一部を含む領域を特定するステップと、
時間遅延積分方式（ＴＤＩ）のラインスキャンカメラを用いて、画像をキャプチャする間に使用するための最適なライン速度を決定するステップと、
前記蛍光の試料上に、複数のフォーカス点を特定するステップであって、フォーカス点はＸ−Ｙ位置および対物レンズの高さを含む、ステップと、
前記複数のフォーカス点を含むフォーカスマップを生成するステップと、
前記マクロ画像を分析して、前記蛍光の試料の少なくとも一部を含む領域を特定するステップの後に、前記最適なライン速度に従った前記ＴＤＩラインスキャンカメラを用いて前記蛍光の試料の少なくとも一部を含む特定された領域のデジタル画像をスキャンするステップと、
複数のデジタル画像部分を、前記蛍光の試料の、隣接したデジタル画像へと組み合わせるステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記蛍光の試料の少なくとも一部のデジタル画像をスキャンするステップは、
第１の励起フィルタを用いて、第１の部分の蛍光の試料をスキャンして、前記蛍光の試料について第１のチャネルをキャプチャするステップと、
第２の励起フィルタを用いて、前記第１の部分の蛍光の試料をスキャンして、前記蛍光の試料について第２のチャネルをキャプチャするステップと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マクロ画像を分析して、前記蛍光の試料の少なくとも一部を含む領域を特定するステップは、前記マクロ画像のコントラストに基づいて前記蛍光の試料の輪郭を決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マクロ画像のコントラストに基づいて前記蛍光の試料の輪郭を決定するステップは、前記蛍光の試料の外周を決定するための強度閾値に基づいて、組織であるもの又は組織ではないものとしての前記マクロ画像の各ピクセルを分類することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
時間遅延積分方式（ＴＤＩ）のラインスキャンカメラを用いて、顕微鏡試料の、隣接したデジタル画像を生成することに使用するための、複数のフォーカス点を決定するためのコンピュータが実施する方法であって、１つ以上のプロセッサが以下のステップを実行するようにプログラミングされており、
前記顕微鏡試料上の前記複数のフォーカス点を特定するステップと、
前記複数のフォーカス点のそれぞれについて、
フォーカス点において前記ＴＤＩラインスキャンカメラとの光通信にて対物レンズを位置付けるステップと、
前記ＴＤＩラインスキャンカメラを用いて、前記顕微鏡試料上の前記フォーカス点の第１の画像をスキャンし、他方でさらに、Ｚ軸におけるその範囲の第１の端部から前記Ｚ軸におけるその範囲の第２の端部へと、前記対物レンズをスイープするステップと、
スキャンされた前記第１の画像を分析して、最も高いフォーカスのスコアを有するスキャンされた前記第１の画像の一部を特定するステップと、
最も高いフォーカスのスコアを有するスキャンされた前記第１の画像の一部における第１の対物レンズの高さを決定するステップと、
前記ＴＤＩラインスキャンカメラを用いて、前記顕微鏡試料上の前記フォーカス点の第２の画像をスキャンし、他方でさらに、前記Ｚ軸におけるその範囲の前記第２の端部から前記Ｚ軸におけるその範囲の前記第１の端部へと、前記対物レンズをスイープするステップと、
スキャンされた前記第２の画像を分析して、最も高いフォーカスのスコアを有するスキャンされた前記第２の画像の一部を特定するステップと、
最も高いフォーカスのスコアを有するスキャンされた前記第２の画像の一部における第２の対物レンズの高さを決定するステップと、
前記フォーカス点に対して、前記第１の対物レンズの高さおよび前記第２の対物レンズの高さの平均を求めて、最適な対物レンズの高さを決定するステップと、を含む、方法。
【請求項６】
最も高いフォーカスのスコアは、コントラストを用いて決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
最も高いフォーカスのスコアは、ピクセルの輝度を用いて求められる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
最も高いフォーカスのスコアは、コントラストとピクセルの輝度との組み合わせを用いて求められる、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ラインスキャンカメラを用いたデジタルでの病理状態に関するものであり、より詳細には、ラインスキャンカメラを用いて蛍光顕微鏡の試料をスキャンすることに関する。
【背景技術】
【０００２】
明視野のスキャナは、ラインスキャンカメラまたはエリアスキャンカメラ等の高感度のカラーカメラの使用に依存する。デジタルでの病理状態について、エリアスキャンカメラよりも優位にあるラインスキャンカメラは、カメラのデータ取得パラメータと同期した、スライド（およびスライドが置かれるステージ）の正確な動きを必要とする。
【０００３】
明視野のスキャニングにおけるラインスキャンカメラの重要な利点は、蛍光スキャナに適切に適合されていない。なぜならば、蛍光発光と明視野の試料との間の元々の差異が、蛍光試料の自動スキャンおよび表示のための新たな技術を必要とするからである。明視野と蛍光スキャニングとの間の１つの根本的な差は、蛍光スキャニングは通常、試料から反射された光を用いるが、他方で明視野のスキャニングは試料を介して透過された光を用いることである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
蛍光スキャニングにおいて、蛍光分子（蛍光色素ともいう）は、特定波長（励起）において光を吸収できる光子高感度（ｐｈｏｔｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）分子であり、より高い波長（発光）において光を発する。このフォトルミネセンス現象の効率性は非常に低く、発せられた光の量は非常に低い。蛍光スキャニングにおけるこの弱い信号に起因して、明視野スキャニングで通常用いられる単一アレイのラインスキャンカメラは準最適なものである。なぜならば、それは高い画像忠実度を生成するために、より低いラインスキャニング速度で稼動させる必要があるからである。
【０００５】
さらに、蛍光試料の組織を見出す作業は極めて難しいものである。なぜならば、組織を見つけるためには最も効率的な照明である明視野の照明においては、試料は通常透明だからである。ラインスキャンカメラを用いる蛍光スキャニングでさらに困難なことは、オートフォーカスによる平面認識の作業である。蛍光スキャニングでの別の重要な困難は、蛍光試料に対する最適な露出時間を決定することである。なぜならば、それは発光の強さに著しく左右されるからである。ラインスキャンカメラを用いた蛍光スキャンに関連した他の非常に重要な困難は、組織を発見すること、オートフォーカス、自動露出、マルチチャネル・スキャニング（異なる発光波長を有する複数の蛍光色素を有するスキャニング試料）、ストライプ調整、および照明（例えば落射照明）を含む。さらに、マルチチャネル画像に関しては、新たな、かつ重要な困難がデータ管理、視覚化、および結果としての画データに関する分析に対して存在する。それゆえ、必要とされるものは、蛍光スキャニングにおいてラインスキャンカメラの使用を可能にし、かつ上述の従来のシステムにおいて見出された重要な問題を克服するシステムおよび方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
従って、蛍光スキャニングにおけるラインスキャンカメラシステムの速度および正確さについての利点を提供するために、複数の線形アレイを有するモノクロ時間遅延積分方式（「ＴＤＩ」）ラインスキャンカメラ（「ＴＤＩラインスキャンカメラ」）を用いる蛍光デジタル病理システムが提供される。モノクロのＴＤＩラインスキャンカメラにより、複数の線形アレイを用いることによって蛍光試料をスキャニングするためのより高いライン速度が可能となり、単一のアレイのラインスキャンカメラと比較して感度が向上している。このことは特に、信号が明視野の顕微鏡使用におけるよりも、概して弱い場合での蛍光スキャニングにおいて有用である。このシステムはまた、迅速かつ正確に組織を見出すために斜めからの明視野照明を用い、かつ、独特の二重スイープでのフォーカスのスコアリングおよび対物レンズの高さの平均化技術を用いて、フォーカス点を特定し、かつその後のスキャニングの間に、その後に生じ得るフォーカスマップを生成し、オートフォーカス性能を提供する。
【０００７】
このシステムはさらに、ＴＤＩラインスキャンカメラがスキャニングの間に、最適なライン速度を決定するために、試料の小さなスキャンされた領域のヒストグラムを用い、それにより、蛍光試料をスキャンするための最適な露出時間を提供する。このシステムはまた、蛍光試料のマルチチャネルをスキャンするために、効率的なスキャニングのワークフローを用いる。ストライプ調整に関して、このシステムは、十分なコントラストが利用できる場合に、隣接するストライプを調節するために、隣接するストライプ間の重複領域におけるコントラストを利用し、また、マルチチャネルの試料における各チャネルについて、隣接するストライプを調節する。さらに、デジタル病理システムは、ＴＤＩラインスキャンカメラの方形のセンサと近しい位置にある楕円形または方形の領域を照射するためにビーム成形を適宜利用する照射システムを有し、これは、蛍光試料を保存し、より短い露出時間を可能にする。このシステムはまた、マルチチャネルの試料のスキャンに関連付けられた困難性に取り組むために、データ管理能力を提供する。このシステムは、同様に、単一チャネルおよびマルチチャネルの閲覧に取り組むために、視覚化および分析、ならびに、デジタルスライド画像の分析を提供する。
【０００８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載および添付の図面を検討した後、当業者に対してより確実に明らかとなる。本発明の詳細は、その構造および作動の両方に関して、添付の図面を分析することで部分的に情報を集めることができてもよく、図面において、類似する参照符号は同様の部分を参照するものとする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の実施形態に係る例示的な蛍光スキャナシステムを示すネットワークの図である。
【図２】図２は、本発明の実施形態に係る例示的な蛍光スキャナシステムを示すブロック図である。
【図３】図３は、本発明の実施形態に係る蛍光スキャナシステム４０における例示的なモジュールのセットを示すブロック図である。
【図４】図４は、本発明の実施形態に係る蛍光スキャナシステムにおけるマクロフォーカスのための例示的なプロセスを示すフロー図である。
【図５】図５は、本発明の実施形態に係る蛍光スキャナシステムにおけるオートフォーカスのための例示的なプロセスを示すフロー図である。
【図６】図６は、本発明の実施形態に係る蛍光スキャナシステムにおける最適な自動露出のライン速度を決定するための例示的なプロセスを示すフロー図である。
【図７】図７は、本発明に係るシェーディング補正のための画像を取得するための例示的なプロセスを示すフロー図である。
【図８】図８は、本発明に係る例示的なスキャニングのワークフローのプロセスを示すフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本明細書において開示する実施形態は、スライド全体蛍光スキャニングシステムおよび蛍光スキャニングシステムの作動方法を提供する。本明細書の記載を読了後、当業者には、様々な代替的な実施形態および代替的な用途において本発明を実施する方法が明らかとなる。しかしながら、本発明の様々な実施形態が本明細書において記載されるが、これらの実施形態は例示としてのみ提示されるものであり、限定を意図するものではない。従って、様々な代替的な実施形態の本明細書での詳細な記載は、添付の特許請求の範囲において説明されるように、本発明の範囲または広さを限定するものとして解釈されるべきではない。
【００１１】
図１は、本発明の実施形態に係る例示的な蛍光スキャナシステム１００を示すネットワークの図である。図示した実施形態において、システム１００は、データ格納領域４５を用いて構成された蛍光スキャニングシステム４０を備える。蛍光スキャニングシステム４０は、データ通信ネットワーク６０を介して、オペレータステーション２０、ユーザステーション３０、および画像サーバシステム５０と通信可能に連結される。オペレータステーション２０、ユーザステーション３０、および画像サーバシステム５０の各々は、データ格納領域２５、３５、および５５を各々用いて構成される。データ格納領域２５、３５、４５、および５５は、例えばランダムアクセスメモリおよびハードディスクドライブを含む揮発性記憶装置および固定記憶装置を含んでよい。ネットワーク６０は、有線および無線、パブリックおよびプライベートを含む様々なネットワークタイプのいずれかであってよく、または、インターネット等の通信ネットワークの任意の組合せであってもよい。
【００１２】
動作において、蛍光スキャニングシステム４０は、複数の蛍光試料をデジタル化して、蛍光スキャニングシステム４０または画像サーバシステム５０上において格納可能である、対応の複数のデジタルスライド画像を生成する。蛍光スキャニングシステム４０は、直接に稼動されてもよく、または、オペレータステーション２０においてオペレータによって遠隔で稼動されてもよい。蛍光スキャニングシステム４０または画像サーバシステム５０において位置する蛍光デジタルスライド画像は、ユーザステーション３０においてユーザによって閲覧されてよく、ここでデジタル画像データはネットワーク６０を介してユーザステーション３０に提供される。
【００１３】
図２は、本発明の実施形態に係る例示的な蛍光スキャナシステム４０のブロック図である。図示した実施形態において、蛍光スキャナシステム４０は、例えば、揮発性または固定のコンピュータ可読記憶装置媒体を含むことができるデータ格納領域４５と通信可能に連結されるプロセッサ２４５を備える。プロセッサ２４５は、データ記憶装置２４５において、プログラミングされたモジュールを実行して、マクロカメラ２４０、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５、焦点合わせ光学系２１０、電動式フィルタ・キューブターレット２１５、および対物レンズ２２５に連結される対象ポジショナー２２０を制御する。プロセッサはまた、データ記憶装置２４５において、プログラミングされたモジュールを実行し、照明モジュール２３５、モーションコントローラ２５０、および試料２３０を支持する電動式ステージ２５５を制御する。プロセッサはまた、データ記憶装置２４５において、プログラミングされたモジュールを実行し、光源２６５、落射蛍光照明光学系２７０および任意のビーム成形光学系２７５を備える最適化された落射蛍光照明モジュール２９０、ならびに電動式励起フィルタホイール２８０を制御する。
【００１４】
動作において、蛍光スキャナシステム４０と、データ記憶装置２４５に格納されたプログラミングされたモジュールの様々なコンポーネントは、蛍光試料２３０の自動スキャニングおよびデジタル化を有効にする。顕微鏡スライド（図示せず）は、蛍光試料２３０を支持するためのプラットフォームとしてしばしば用いられ、試料２３０をスキャンするための蛍光スキャナシステム４０の電動式ステージ２５５上に固定されて配置可能である。プロセッサ２４５の制御下では、電動式ステージ２５５は、試料２３０を、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５によって感知するために、実質的に一定速度まで加速させ、ここでそのステージの速度は、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５のライン速度と同期される。画像データのストライプのスキャニングの後、電動式ステージ２５５は、減速されて、さらなる同じストライプまたは異なるストライプの前に、試料２３０を実質的に完全に停止させる。
【００１５】
試料２３０は、蛍光染料または蛍光色素を用いて標識付けされている任意の種類の標本であってよく、例えば、例を挙げれば、組織、細胞、ＤＮＡ、およびタンパク質がそうした種類の試料である。蛍光試料２３０はまた、例えば、組織切片、ＤＮＡ、または基板上に配置されるＤＮＡ関連の物質等の一通りの標本であってよい。当業者によって理解されるように、蛍光光学顕微鏡によって調べることのできる任意の蛍光の標本はまた、蛍光試料２３０のデジタルスライド画像を生成するために、蛍光スキャナシステム４０によってスキャン可能である。
【００１６】
蛍光分子は特定の波長（励起）において光を吸収可能である光子高感度分子である。これらの光子高感度分子はまた、より高い波長（発光）で光を発する。このフォトルミネセンス現象の効率性は非常に低く、発せられた光の量は非常に低い。低い量の発せられた光は、試料２３０をスキャニングおよびデジタル化するための従来の技術を妨げてしまう。有利にも、複数の線形のセンサアレイを備えるＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の使用により、試料２３０の同じ領域をＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の複数の線形センサアレイに露出することによってカメラの感度を上昇させる。低い発光での淡い蛍光試料をスキャンする場合に、これは特に有益である。代替的な実施形態において、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５は、６４個、９６個、または１２０個の線形センサアレイを含んでよく、これは、電荷結合素子（「ＣＣＤ」）であってよい。
【００１７】
１つの実施形態において、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５は、モノクロのＴＤＩラインスキャンカメラであるが、本明細書に記載するシステムおよび方法はモノクロのカメラに限定されない。有利にも、モノクロの画像は、蛍光顕微鏡検査法においては理想的なものである。なぜならば、それは、試料上にある様々なチャネルから実際の信号のさらなる正確な表示を提供するからである。当業者に理解されるように、蛍光試料２３０は、いわゆる「チャネル」と呼ばれる、異なる波長において光を発する複数の蛍光染料で標識付け可能である。
【００１８】
さらに、様々な蛍光試料のローエンドおよびハイエンドの信号レベルは、感知すべきＴＤＩラインスキャンカメラ２０５に対して広帯域の波長を提示するので、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５が感知できるローエンドおよびハイエンドの信号レベルが同様に広いことが望ましい。従って、１つの実施形態において、蛍光スキャニングシステム４０において用いられるＴＤＩラインスキャンカメラ２０５は、モノクロ１０ビットの６４ステージＴＤＩラインスキャンカメラである。ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５には、様々なビット深度が、蛍光スキャニングシステム４０との使用に用いることができる。
【００１９】
１つの実施形態において、蛍光スキャニングシステム４０は、高精度かつ目が細かく調整された（ｔｉｇｈｔｌｙ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ）ＸＹグリッドを用い、電動式ステージ２５５上での試料２３０の位置付けを助ける。１つの実施形態において、電動式ステージ２５５はＸおよびＹ軸の両方で用いられる高精度エンコーダを用いて、リニアモータベースのＸＹステージである。例えば、５０ナノメートルのエンコーダは、この軸上で、スキャニング方向において用いることができ、５ナノメートルのエンコーダは、スキャニング方向と直交する方向にあって、かつ同一平面上にある軸上で用いることができる。対物レンズ２２５はまた、５０ナノメートルのエンコーダを有して、光学軸上にあるリニアモータを利用する対象保定装置２２０上に搭載される。１つの実施形態において、３つのＸＹＺ軸が調節され、運動制御駆動（図示せず）および運動制御ボード（図示せず）を含むモーションコントローラ２５０を用いて、閉ループの形態で制御される。制御および調整は、プロセッサ２４５によって維持され、プロセッサ２４５はスキャニングシステム４０の動作のための、コンピュータが実行可能なプログラミングされた工程を含む情報および命令を格納するためのデータ格納領域４５を用いる。
【００２０】
１つの実施形態において、対物レンズ２２５は、蛍光顕微鏡検査法に適切なＰｌａｎＡＰＯ無限遠補正の対物レンズ（例えばオリンパス  ×２０、０．７５ＮＡ）である。有利にも、対物レンズ２２５は色収差および球面収差を補正することができる。対物レンズ２２５は無限遠補正であり、他の光学コンポーネント、例えばフィルタ、倍率切替レンズ等は、対物レンズ２２５の上方にある光学経路内に配置されることができ、ここで、対物レンズを通過する光線はコリメートされた光線となる。焦点合わせ光学系２１０と組み合わされた対物レンズ２５５は、蛍光スキャニングシステム４０に、総合倍率を提供し、また、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の表面に焦点を合わせる。焦点合わせ光学系２１０は、チューブレンズおよび任意の２倍の倍率切替器を含む。１つの実施形態においては、２倍の倍率切替器は、４０倍の倍率で試料２３０をスキャンするために、元々が２０倍である対物レンズ２５５を可能にする。
【００２１】
蛍光顕微鏡検査法を効果的に行うためのスキャニングシステム４０のためには、適切な光源２６５が用いられる必要がある。代替的な実施形態において、例えば水銀ランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプまたはＬＥＤ光源等のアーク灯がこの目的のために用いることができる。１つの実施形態において、光源２６５は、２００ワットの水銀ベースのＤＣ稼動およびプロセッサ制御の光源等のアークベースの光源である。有利にも、光源２６５により、プロセッサ２４５はシャッター制御およびアイリスコントロールを管理することができる。１つの実施形態において、リキッドライトガイド（図示せず）は、光を、対物レンズ２２５の視野（ここでスキャンが行われる）に運ぶために用いることができるか、または、蛍光スキャニングシステム４０内の他の所望の位置に光を運ぶために用いることができる。例えば、３ｍｍコアのリキッドライトガイドが光を運ぶために用いることができる。
【００２２】
蛍光スキャニングシステム４０は、さらに、落射蛍光照明光学系２７０を含む照射光学系と、最適化された落射蛍光照明２９０として集合的に示される任意のビーム成形光学系２７５を含む。落射蛍光照明光学系２７０は、対物レンズ２２５を介して試料２３０上に励起光を集中させる。落射蛍光照明における場合のように、試料から発された光はまた、同じ対物レンズ２２５で集められる。落射照射を用いることの１つの特定の利点は、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の複数の線形アレイセンサに達する励起光の閉塞を最大化することである。同様に、このことはまた、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の複数の線形アレイセンサに達する、発された光の量を最大化する。
【００２３】
落射照射光学系２７０は、波長依存の反射性および透過性を提供するダイクロイックミラーを用いて実施することができる。結果として、励起光は、ダイクロイックミラーの表面から反射して、対物レンズ２２５を介して案内されて、試料２３０に到達する。しかしながら、より高い波長にある試料２３０から発せられた光は、ダイクロイックミラーを通過し、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の複数の線形アレイセンサに達する。
【００２４】
落射蛍光照明光学系２７０はまた、光源２６５からの光をコリメートする。代替的な実施形態において、このことは、ケーラー照明または臨界照明を用いて達成される。ケーラー照明は、デジタルスライド画像においてシェーディングを最小化するために、試料２３０上に最も均一な光照明を提供し、他方で、臨界照明は、画像化に必要な露出時間を低減するために、試料上への光強度を提供する。ケーラー照明および臨界照明の双方とも、蛍光スキャニングシステム４０によって利用可能である。
【００２５】
１つの実施形態において、落射蛍光照明光学系２７０は、リキッドライトガイド（図示せず）を介して、光源２６５から受け取られた光をコリメートし、その光を試料２３０へと伝達するように設計されているリレーレンズ・チューブ光学（図示せず）を含む。この実施形態において、試料上の光のプロファイルは、対物レンズ２２５を介した画像化の視野内での最小のロールオフを有する。
【００２６】
代替的な実施形態において、光線成形光学系２７５は、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の複数の線形アレイセンサによって感知される部分のみを照明するように作動する。有利にも、光線成形光学系２７５は、照明領域を、元々の円形状から、方形のセンサ領域に非常に近くなる薄い楕円形状に再形成する。再形成された照明領域は、有利にも、増加した光のエネルギーを受け取る。照明領域を再形成することは、従来のマスキングに対して広範な改良となり、これは、方形のマスクの外側の全ての光エネルギーを取り除く。光線成形光学系２７５の利点は（ａ）励起光への余分な露出から試料を保護し、それにより、試料の光退色を最小化し、かつ（ｂ）試料上の照明領域へ運ばれる光エネルギーを増加させ、それにより、デジタルスライド画像を生成するために、試料２３０のスキャニングの間、より短い露出時間（例えば、より高いライン速度）を可能にすることを含む。組み合わせると、これら２つは重要な利点を提供することができる。
【００２７】
蛍光スキャニングシステム４０はまた、様々なフィルタの構成および使用を促進する電動式の励起フィルタホイール２８０を備える。蛍光顕微鏡検査法の効率を上昇させるのに利用可能である所定のフィルタを有することが所望される。所望されるフィルタの一部は（ａ）光源２６５から生成された広帯域の光を、試料２３０の励起に必要な特定帯域へと狭める励起フィルタ、（ｂ）ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の線形アレイセンサの１つ以上に達し得る過剰な光および、場合によっては励起光をフィルタリングする発光フィルタ、（ｃ）落射蛍光照明と共に使用するために上述で記載したようなダイクロイックミラーを含む。他のフィルタもまた含めることができる。
【００２８】
１つの実施形態において、蛍光スキャニングシステム４０は、励起フィルタのための電動式ホイール、発光フィルタのための電動式ホイール、およびダイクロイックミラーのための電動式ホイールを含む。ホイールの代わりにスライダーを用いることもできる。代替的な実施形態において、蛍光スキャニングシステム４０は、発光フィルタおよびダイクロイックミラーを含む電動式励起フィルタホイール２８０および電動式フィルタ・キューブターレット２１５を含む。励起フィルタを発光フィルタおよびダイクロイックミラーから分離する１つの特定の利点は、モノクロのＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の使用に関連する。詳細には、モノクロのＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の使用により、試料２３０の各ストライプ領域が複数回、スキャンおよびデジタル化される。すなわち、調べられる各発光波長（すなわちチャネル）毎である。単一のストライプの複数スキャンの登録は、それゆえ、複数のスキャンを各チャネルからの情報を含む単一の画像へと統一することを可能にするために極めて重要である。
【００２９】
さらに、電動式のフィルタ・キューブターレット２１５は発光フィルタおよびダイクロイックミラーを含むので、電動式フィルタ・キューブターレット２１５は、複数の帯域フィルタ・キューブ（ダイクロイックミラーおよび発光フィルタ）および単一の帯域の励起フィルタが組み合わせて用いられる（「ピンケル（Ｐｉｎｋｅｌ）」構成）フィルタ構成を実施することができる。ピンケル構成を有利に利用することによって、複数回、試料２３０をスキャニングおよびデジタル化でき、他方で、電動式の励起フィルタホイール２８０を用いた励起フィルタのみを変更できる。結果として、機械的または光学的な登録の問題は、試料上の同じストライプの画像の間で観察されない。なぜならば、画像化経路中には移動するコンポーネントは存在しないからである。これは、複数回、試料２３０の同じ領域をスキャンし、かつ結果として複数の画像を結合するラインスキャンカメラ（例えばＴＤＩラインスキャンカメラ２０５）を用いた場合、励起フィルタを、発光フィルタおよびダイクロイックミラーから分離する重要な利点である。
【００３０】
１つの実施形態において、電動式励起フィルタホイール２８０は、標準の２５ｍｍフィルタを収容可能な６箇所配置のホイールである。電動式の励起フィルタホイール２８０はプロセッサ２４５の制御下にある。当業者に理解されるように、任意の標準の蛍光フィルタを用いることができる。好ましくは、ハードコートのフィルタが、スキャニングシステム４０と共に用いられる。なぜならば、それらはより耐久性があり、かつ洗浄するのに容易だからである。
【００３１】
１つの実施形態において、電動式のフィルタ・キューブターレット２１５はまた、フィルタキューブを保持する６箇所配置のターレットであり、例えば標準のオリンパス・フィルターキューブを用いることができる。電動式のフィルタキューブ・ターレット２１５はプロセッサ２４５の制御下にある。電動式のフィルタホイール２８０および電動式のフィルタキューブ・ターレット２１５のフィルタは、試料２３０上の特定の蛍光色素、および蛍光スキャニングシステム４０内で構成される利用可能なフィルタに依存して、プロセッサ２４５の制御下の照明経路または画像化経路内に自動的に配置される。
【００３２】
蛍光試料を画像化する場合に１つの特に困難なことは、顕微鏡スライド上の試料２３０を認識し、デジタルスライド画像へとスキャンされデジタル化される領域を決定することである。さらに、蛍光試料は、しばしば、透明に見えるので、このことがこの困難性を大きくする。なぜなら、通常の照明を用いた蛍光試料の通常の画像化は、スライド上の標本を認識するための手段を必ずしも提供しないからである。したがって、照明モジュール２３５は、斜めからの照明を蛍光試料２３０に適用するように構成される。マクロカメラ２４０は、それが照明モジュール２３５によって斜めからの照明で照らされた後、試料の画像をキャプチャするように構成される。有利にも、その結果の画像における組織は十分なコントラストをもって認識できるものである。
【００３３】
１つの実施形態において、照明モジュール２３５は、適切な角度で、試料２３０を照明するために、ある角度で配置されたビーム拡散器（図示せず）と統合した白色ＬＥＤモジュール（図示せず）を利用する。１つの実施形態において、３０度の角度で斜めからの照明が用いられる（顕微鏡スライドの表面に対して測定される）。しかしながら、０度から８５度の範囲の任意の角度で斜めからの照明を用いることができる。ゼロ度の角度（例えば、スライドの厚さを通した試料２３０を照明する等）は、例えば、線形のファイバーを用いて達成することができる。１つの実施形態において、照明モジュール２３５周囲のさらなる囲い（ｓｈｒｏｕｄｉｎｇ）が、試料２３０の表面を打つ斜めからの光をより良く導くために提供される。マクロカメラ２４０周囲の囲い（ｓｈｒｏｕｄｉｎｇ）がまた提供されて、マクロカメラ２４０によってキャプチャされた試料２３０からの反射された光の量を増加させ、同時にまた、マクロカメラ２４０によってキャプチャされた照明光の量を最小化する。
【００３４】
プロセッサ２４５は、当業者によって理解されるように、１つ以上のプロセッサのコアを備えてよい。さらなる別個のプロセッサもまた、提供されてよく、特定のコンポーネントを制御するか、または特定の機能を実行する。例えば、さらなるプロセッサは、データ入力を管理する補助プロセッサ、浮動小数点演算を実行する補助プロセッサ、信号処理アルゴリズム（デジタル信号プロセッサ）の迅速な実行に適したアーキテクチャを有する特定用途向けプロセッサ、メインプロセッサに従属するスレーブプロセッサ（たとえばバックエンドプロセッサ）、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５を制御するためのさらなるプロセッサ、ステージ２５５、対物レンズ２２５、またはディスプレイ（図示せず）を備えてもよい。そのような追加のプロセッサは、完全に別個のプロセッサであってもよく、またはプロセッサ２４５に一体化されていてもよい。
【００３５】
プロセッサ２４５は、蛍光スキャニングシステム４０の制御、調整、および全体的な管理を提供するために、蛍光スキャニングシステム４０の様々なコンポーネントに好ましくは電気的に連結される。あるいは、プロセッサ２４５は、蛍光スキャニングシステム４０の様々なコンポーネントの１つ以上と無線通信可能である。
【００３６】
データ格納領域４５は、プロセッサ２４５上で実行するプログラムのためのデータおよび命令の記憶装置を提供する。データ格納領域４５は、データおよび命令の揮発性記憶装置および固定記憶装置を好ましくは備え、ならびに、ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、ハードディスクドライブ、リムーバブル記憶装置ドライブ等を含んでよい。
【００３７】
スキャニングシステム４０はまた、スキャニングシステム４０と、ネットワーク６０と直接に接続した外部デバイス（例えばプリンター）、または、ネットワーク６０を介して接続したオペレータステーション２０、ユーザステーション３０、およびサーバステーションシステム５０等の外部デバイスとの間でソフトウェアおよびデータを転送可能な通信インターフェースを備えてもよい。
【００３８】
１つの実施形態において、コンピュータが実行可能な命令（例えば、プログラミングされたモジュールおよびソフトウェア）はデータ格納領域２４５内に格納され、実行するときに、スキャニングシステム４０が本明細書に記載の様々な機能を実行することを可能にする。本明細書の記載において、用語「コンピュータが読み取り可能な記憶媒体」とは、プロセッサ２４５による実行のために、コンピュータが実行可能な命令をスキャニングシステム４０に保存および提供するために用いられる任意の媒体のことをいうために用いられる。これらの媒体の例としては、例えば、ネットワーク６０を介して、直接または間接に、スキャニングシステム４０と通信可能に接続されるデータ格納領域２４５および任意のリムーバブルまたは外部の記憶媒体（図示せず）を含む。
【００３９】
図３は、本発明の一実施形態に係る蛍光スキャナシステム４０におけるモジュールの例示的なセットを示すブロック図である。例示的な実施形態において、モジュールは、組織発見モジュール３０５、オートフォーカスモジュール３１０、自動露出モジュール３１５、スキャニング・ワークフローモジュール３２０、シェーディング補正モジュール３２５、ストライプアライメントモジュール３３０、データ管理モジュール３３５、ならびに視覚化および分析モジュール３４０を含む。特定の組み合わせにおいて、さまざまな図示したモジュールを併せて、スライド蛍光スキャニング全体を実行させる。様々なモジュールによって実行される特定の方法は、図４から図８に関連して後に記載される。
【００４０】
組織発見モジュール３０５は、顕微鏡スライド上での試料２３０の位置を決定するために動作する。試料の位置は、前述した、電動式のステージのためのＸＹ座標に関連して決定される。組織発見モジュール３０５は、マクロカメラ２４０からの画像データを分析して、組織の位置を決定する。有利にも、試料２３０の斜めからの照明の結果、マクロカメラ２４０は、試料２３０の高コントラスト画像を組織発見モジュール３０５に提供する。組織発見モジュール３０５は、試料２３０の位置を決定するために、マクロカメラ２４０から高コントラスト画像を分析する。例えば、最も高いコントラストの領域は、標本のペリメータを規定してよく、組織発見アルゴリズム３０５が試料２３０の輪郭を決定することを可能にする。１つの実施形態において、組織発見モジュール３０５は閾値化アルゴリズムを利用し、これは、黒いピクセル（組織が存在しない領域を表す）および白いピクセル（組織が存在する領域を表す）から主に構成された画像が与えられた場合、白いピクセル（「閾値」）の最小のピクセルの強度を計算する。閾値は、次いで、組織であるものとして、または、組織ではないものとしてのマクロ画像中の各ピクセルを分類するために用いられる。この選ばれた閾値は、以下の式：ωｎｔσｎｔ＋ωｔσｔの結果を最小化する。
【００４１】
ここでωｎｔは、ピクセルが組織ではないものとして分類される可能性であり、σｎｔは、組織ではないものとして分類されたピクセルの輝度の分散であり、ωｔは、ピクセルが組織であるとして分類される可能性であり、σｔは組織であるとして分類されたピクセルの輝度の分散である。
【００４２】
オートフォーカスモジュール３１０は、試料２３０の表面の焦点マップを生成するように動作し、その結果、試料をスキャニングした結果として生成されるデジタルスライド画像は最適な焦点を有する。オートフォーカスモジュール３１０はまず、ＸＹ座標を用いて試料上の一連の点を決定する。次に、各点はＴＤＩラインスキャンカメラによって巡回され、各点における対物レンズのための最適なフォーカスの高さが決定される。１つの実施形態において、ＸＹの点のための最適なフォーカスの高さは、対物レンズのＺ範囲の上側の端から対物レンズのＺ範囲の底側の端までの試料上のＸＹの点をスキャンし、かつ、対物レンズのＺ範囲の底側の端から対物レンズのＺ範囲の上側の端までの試料上の同じ点をスキャンし、次いでその２点を平均化することによって決定可能である。スキャンされた画像データ内の最も高いコントラストを提供する対物レンズの高さは、次いで、双方のスキャン（すなわち上側から下側および下側から上側）で決定され、平均の高さが次いで、そのＸＹの点についての最適なフォーカスの高さとして計算される。
【００４３】
代替的な実施形態において、ＸＹの点についての最適なフォーカスの高さは、対物レンズのＺ範囲の上側の端からその対物レンズのＺ範囲の底側の端まで、またはその逆の試料上の点をスキャンすることによって決定可能である。スキャンされた画像データにおける最も高いコントラストを提供する対物レンズの高さが、次いで、そのＸＹの点についての最適なフォーカスの高さとして決定される。この技術はそれほど望ましいものではない。
【００４４】
ＸＹの点についての最適なフォーカスの高さを決定するためのいずれかの技術の結果は、各々がＸＹの位置およびフォーカスの高さを含む一連のフォーカス点である。一連のフォーカス点は、次いで、スキャン領域を覆う、非平面の焦点表面を計算するために利用される。スキャン領域は、試料２３０全体または試料２３０の一部を含むことができる。
【００４５】
試料２３０上のＸＹの点について最適なフォーカスの高さを決定することの１つの特定の困難な点は、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の使用から生じる。なぜならば、ＴＤＩラインスキャンカメラは、均一な配置での平行した形態で、並んで配置される複数の線形の感知アレイ（例えば６４または９６）を備える。相対的な動きのスキャニングの間、試料２３０は線形の感知アレイに垂直に動くので、試料２３０は、第１のアレイに、次いで第２等によって感知される。有利にも、これは、試料がセンサに相対的に動くので、試料２３０の各領域の複数の露出が提供される。複数の露出は、次いで、結果としての画像を生成するように結合されるが、これは、スキャニングの速度を犠牲にすることなく、露出時間を増加させる利益を生じる。この増加した露出時間は、上で説明したように、淡い蛍光試料について用いる場合には特に有用である。
【００４６】
しかしながら、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５のこの利点は、試料上のＸＹの点について最適なフォーカスの高さを決定する場合と同じように、試料および線形の感知アレイの垂直の相対的な動きが取り除かれる場合には不利益となるものである。例えば、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５がそのＺ範囲の上側の端から底側の端まで移動すると、複数の線形の感知アレイの各々は、それが「見る」ことができる試料２３０の部分に対しての画像データをキャプチャする。ＴＤＩカメラ２０５が適切に様々な線形の感知アレイからの画像データを統合すると、その画像データは、試料２３０の同じ正確な部分からではなくなる。従って、様々な線形の感知アレイからの画像データは、結果としての画像を生成するように結合されて、その結果としての画像はぼやけたようになる。これは、空間的曇り（ｓｐａｔｉａｌ  ｂｌｕｒｒｉｎｇ）といわれる。
【００４７】
ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５を利用した場合の関連する問題は、時間的曇り（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｂｌｕｒｒｉｎｇ）といわれる。時間的曇りにおいては、問題は、対物レンズがそのＺ範囲を介して移動すると、最初の線形のアレイセンサが時間ｔ１において、その画像データをキャプチャすることである。この画像データは、次いで、時間ｔ２において、第２の線形のアレイセンサによってキャプチャされる画像データ等に統合される。９６番目の線形のアレイセンサがその画像を９６番目にキャプチャする頃には、対物レンズのＺレベルは異なる焦点名面上へと十分に変化している。このように、時間的曇りはまた、試料２３０上のＸＹの点についての最適なフォーカスの高さを特定するのには困難性となるものである。
【００４８】
従って、オートフォーカスモジュール３１０は、各ＸＹのフォーカス位置について、対物レンズはそのＺ範囲の上側の端からそのＺ範囲の底側の端へと移動し、次いで、そのＺ範囲の底側の端からそのＺ範囲の上側の端へとさらに移動する。上側から下側へのスキャンおよび下側から上側のスキャンの結果は、次いで、最適なフォーカスの高さを決定するために平均化される。これは、フォーカス点において、最適なフォーカスの高さを特定するために、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５を用いることに関連する時間的曇りの諸問題を効果的に取り除き、かつ、オートフォーカスモジュール３１０が、各ＸＹ点についての最適なフォーカスの高さとして、上側から下側にスキャンされた画像データおよび下側から上側にスキャンされた画像データにおける最大のコントラストを提供する、対物レンズの平均の高さを用いることを可能にする。
【００４９】
代替の実施形態において、上側から下側のスキャンの間および下側から上側のスキャンの間に、時間的曇りに付随する諸問題を取り除くために、各Ｚ位置においてキャプチャされた線形の感知アレイの各々から（例えば９６個全てのアレイから）の画像データがデータの単一のラインへと統合される。この方法において、空間的曇りはまだ存在するが、時間的曇りは取り除かれる。
【００５０】
自動露出モジュール３１５は、蛍光スキャニングシステム４０によってスキャンされる試料上の蛍光色素の各々についての最適な露出時間を決定するように動作する。露出時間の決定のプロセスは、通常は、試料２３０全体および特定の蛍光色素（すなわち特定のチャネル）を表す試料２３０の小さな領域を用いる。自動露出モジュール３１５は、試料２３０の小さな領域から、フォーカスされた画像データを取得し、試料２３０の小さな領域についての推定された最適な露出時間を計算するために画像データを分析する。スキャン、分析、および計算のプロセスは、次いで、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５によって用いられる実際の露出時間が、計算されたその推定の最適な露出時間と略等しくなるまで繰り返される。
【００５１】
最適な露出時間が１つの蛍光色素（すなわちチャネル）に対していったん計算されると、自動露出モジュール３１５は、スキャンの間に、後の使用のために、データ格納領域内にその露出時間を格納する。自動露出モジュール３１５は、次いで、試料２３０上に、任意の残りの蛍光色素について、最適な露出時間を続けて決定する。有利にも、スキャニングシステム４０は、モノクロＴＤＩラインスキャンカメラ２０５、ならびに別個の励起フィルタホイールおよび発光フィルタホイールを用い、各蛍光色素についての露出時間は、他の蛍光色素とは独立して計算されることができる。蛍光スキャニングシステム４０のこの配置構成は、１つのスキャニングの動きの間に、複数の蛍光色素から画像データをキャプチャすることを試みるといった、蛍光スキャニングシステムに対する重要な利点を提供する。
【００５２】
スキャニングワークフローモジュール３２０は、蛍光スキャニングシステム４０を用いて、蛍光試料２３０のデジタルスライド画像を生成するための全体のプロセスを管理するように作動する。前述したように、スキャニングシステム４０は、最適な画像化の性能を達成するために、高い感度および高いビット深度を用いたモノクロＴＤＩラインスキャンカメラ２０５を用いる。しかしながら、蛍光試料２３０は、通常は、複数の蛍光色素を用いてマーキングされ、これにより、光は、複数の波長（すなわちチャネル）において、試料２３０から発せられる。従って、複数のチャネルの蛍光試料２３０をスキャンする場合、チャネルの分離は、特定のフィルタの使用により、蛍光スキャニングシステム４０によって達成される。最大の柔軟性のために、上述のように、励起フィルタが、発光フィルタとは別々に搭載される。これにより、１つ以上の発光フィルタキューブを有するフィルタキューブターレットと組み合わされる１つ以上の励起フィルタを有するフィルタホイールにより、複数のフィルタの組合せを可能にする。フィルタホイールは電動式のデバイスなので、スキャニング時間を最小限にするためには、フィルタホイールの回転を最小限にすることもまた好適である。
【００５３】
スキャニングワークフローモジュール３２０は、フィルタホイールの回転の数を有利にも最小限にする非常に効率的なプロセスを実施する。例えば、従来の画像角度調節システムと比較して、スキャニングワークフローモジュール３２０は、６０倍〜１２０倍で、フィルタホイールの回転数を低減する。従来の画像角度調節システムにおいては、あらゆる小さな画像タイルについて、フィルタホイールは、「Ｎ」回、配置される必要があり、ここでＮはチャネルの数に等しい。タイル毎の１０ミリ秒の通常の露出時間に対しては、実際に画像を感知して経過するよりも、フィルタホイールをＮ回、回転して経過するほうが著しく時間が経過する。蛍光スキャニングシステム４０は、対照的に、各々スキャンされたストライプに対して、Ｎ回のみ、フィルタホイールを回転させる。通常のスキャンした画像タイルは、おおよそ１メガピクセルであり、これに対して、通常のスキャンされたストライプはおおよそ６０メガピクセルであるので、最初のものを超える各々のチャネルについては、スキャンワークフローモジュール３２０によって実施されるプロセスの効率性に起因して、フィルタホイール回転数が６０から１へと低減する。
【００５４】
シェーディング補正モジュール３２５は、落射蛍光照射光学およびＴＤＩラインスキャンカメラ２０５における非均一性を補正するように動作する。シェーディング補正モジュール３２５は、試料が存在しない特定のＸＹ座標において、スライドの試料３２０（例えば１ｍｍ）の小さな領域をスキャンする。１つの実施形態において、スキャンは、試料３２０について決定されていた特定のフォーカスパラメータを用いて実行される。スキャンは、スライド（バックグラウンド蛍光）上に存在する任意の残留色素によって発せられる光をキャプチャするために、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の最大露出時間において実行される。そのスキャンにおいて、各ピクセルのカラムについての平均の輝度は、正確な照明のプロファイルが計算できるように保証するように計算および確認がされて、次いで、シェーディング補正モジュール３２５は、各々のピクセルのカラムの平均の輝度と、画像に存在する最大の平均の輝度と比較することによって照明の補正プロファイルを計算する。このプロファイルは、蛍光スキャニングシステム４０によってスキャンされる各蛍光色素（すなわちチャネル）に対して計算される。
【００５５】
ストライプ調整モジュール３３０は、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５によってキャプチャされた画像データの隣接するストライプを並べるように動作する。１つの実施形態において、電動式ステージ２５５の高精度のＸＹの精密さにより、画像データの各ストライプは、結果としての単一のファイルのデジタルスライド画像において、その隣接の画像と接することができる。ステージ２５５の高精度のＸＹの精密さは、それゆえ、画像データのコンテンツの分析に依存した、任意のソフトウェアが実施するアライメントを必要とすることなく、十分にアライメントされた隣接のストライプを提供する。このことは、生じる蛍光試料２３０について、画像データのストライプのソフトウェアベースのアライメントに関する特定の問題を解決する。なぜならば、蛍光試料の画像データは、通常は、隣接のストライプの重複領域において、十分なコントラストを含まず、蛍光試料の画像データのストライプのソフトウェアベースのアライメントを可能にするからである。
【００５６】
代替の実施形態において、スキャニングシステム４０は、蛍光試料画像データにおける十分なコントラストが存在する場合、ストライプのソフトウェアベースのアライメントを用いる。この実施形態において、隣接するストライプのアライメントは、隣接のストライプの重複領域における最も高いコントラストを有するように決定された特定数のピクセルに基づいては決定されない。その代わり、ストライプ調整モジュール３３０は、隣接するストライプの重複領域全体のコントラスト分布を計算する。ストライプ調整モジュール３３０は、次いで、重複領域のコントラスト分布におけるコントラストのピークを特定して、そのコントラストのピーク周囲の帯域を規定する。最適なストライプ調整は、コントラストのピーク周囲の帯域に対応するピクセルに基づいて決定される。有利にも、過飽和のピクセルは、コントラスト分布を計算する場合、無視される。
【００５７】
さらに、マルチチャネルの蛍光試料２３０について、隣接するストライプ間の最適なストライプのアライメントは、各チャネルについて計算可能であり、最も強いアライメントを提供するチャネルが利用可能である。有利にも、様々なチャネルに対応するストライプからの画像データはデジタルスライド画像に結合されるので、隣接するストライプ間のたった１つのチャネルのアライメントが必要とされる。さらに、ストライプ調整モジュール３３０は、一度、スキャニング方向に対して垂直の方向においてストライプ調整を計算する。これは、画像データキャプチャの始まりと組み合わせて、ステージ２２５の高精度のＸＹの精密さに基づいて計算され、これは、全てのチャネルに対して同じであるべきである。
【００５８】
データ管理モジュール３３５は、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５によって生成されるマルチチャネル画像データ、関連の画像データ、およびメタデータ情報を管理するように動作する。まず、明視野デジタルスライド画像と同様に、蛍光デジタルスライド画像スキャンは、単一のデジタルスライド画像ファイルに保存可能である。試料２３０が複数のＺレベルにおいてスキャンされる場合、様々なＺレベルの各々についての画像はまた、デジタルスライド画像ファイルへと組み込まれる。
【００５９】
さらに、蛍光スキャンは通常、複数のチャネルからの画像データを含み、各々のチャネルは、同じ試料２３０に関連するので、単一のデジタルスライド画像ファイルにマルチチャネル画像データを格納することは有利である。さらに、関連するサブ画像データおよび機器取得設定に関連するメタデータ、画像データ記述子、ならびに、デジタルスライド画像ファイルにおける試料情報を格納することもまた有益である。さらに、任意の公知の、またはスキャン時間が計算された、画像間の関係もまた、デジタルスライド画像ファイルに格納可能である。
【００６０】
関連するサブ画像は、スライドラベルの画像（例えばバーコード）、スライド全体のマクロ画像、および取得された画像のサムネイルを含んでよい。機器取得設定に関連するメタデータは、露出時間、フィルタ仕様、光源仕様、および較正情報を含んでよい。画像データ記述子に関連するメタデータは、画像ピクセルの輝度の分布、自動的に決定される関連領域および非関連領域、コントラスト分布等の画像特性、周波数特性、メリットのある構造および形状を含んでよい。試料情報に関連するメタデータは、組織の種類、および調合品、ならびに標的となる生物学的特性を含んでよい。画像間の関係とは、移動および画像の回転についてのデータを含む。
【００６１】
１つの実施形態において、蛍光デジタルスライド画像ファイルは、タイル状の複数層画像として構造化され、格納される。ベース層は、元々のスキャン分解能であり、以降の層は、画像ピラミッドを形成するサブサンプリングされた分解能である。各層は１つ以上のタイルからなり、１つの層の各タイルは、ディスクおよびメモリの利用を改善し、ファイル転送速度およびネットワーク画像サービング速度を改善するために、可逆圧縮アルゴリズムまたは非可逆圧縮アルゴリズムで圧縮可能である。
【００６２】
マルチチャネルデジタルスライド画像については、ベース層および各々のその後の層が、各チャネルに対して画像データを含む。例えば、４つのチャネルデジタルスライド画像は、四象限へと分けられるベース層を有し、ここで、各象限は、その四象限の１つにおいて、試料２３０の完全な画像を含む。
【００６３】
デジタルスライド画像は、データ格納領域、例えば、スキャニングシステム４０のデータ格納領域４５、または画像サーバシステム５０のデータ格納領域５５内に格納される。１つの実施形態において、データ管理モジュール３３５は、付随する患者、標本、およびスライドに対して、スキャンされた画像を、各々を項目にして記し、また、格納されたデジタルスライド画像に関連する定量分析の結果を記録してもよい。データ管理モジュール３３５はまた、格納された情報の全てをユーザに提供してもよく、ならびに、データを共有させるために、インターフェースに、病院の情報システムおよび研究室の情報システムを提供してもよい。
【００６４】
代替の実施形態において、別個のデジタルスライド画像は、標本２３０がスキャンされた各チャネルに対して生成可能である。このような実施形態において、関連するデジタルスライド画像ファイルを参照するセカンダリファイルが生成される。セカンダリファイルは、画像間の関係ならびに、視覚化の好みおよび調節（以下で記載する）を含む。このセカンダリファイルは、融合画像（ｆｕｓｅｄ  ｉｍａｇｅ）と呼ばれる。
【００６５】
視覚化および分析モジュール３４０は、蛍光デジタルスライド画像ファイルの閲覧および分析を容易にするように動作する。各々の蛍光デジタルスライド画像は、様々な別個のチャネルの各々において閲覧可能であり、および／または、融合画像として閲覧可能であり、ここで、様々な別個のチャネルからの画像データは、２つ以上のチャネルを含む試料を単一の閲覧となるようにオーバーレイされる。デジタルスライド画像が閲覧される場合（別個または融合されたチャネルにおいて）、試料２３０全体の画像は、リアルタイムでの画像ナビゲーション、回転、ズーミング、拡大、およびＺレベルの深度トラバースに利用可能である。
【００６６】
１つの実施形態において、複数の蛍光色素のチャネルは、それらを並べて配置することによって、または、格子状に並べることによって同時に閲覧されてもよい。有利には、画像は、同期したナビゲーションを有効にするように登録される。例えば、４つのチャネルスキャンは、四象限のレイアウトにおいて配置されてよい。１つの実施形態において、１つの画像をズーミングすることにより、４象限全てが同様にズームする。さらに、パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）が１つの象限にあるのであれば、例えば、パンは４象限全てにある等となる。
【００６７】
明るさ、コントラスト、ガンマ、着色等の画像閲覧調整は、格納された画像記述子および取得設定を用いて自動的に決定される。１つの実施形態において、閲覧調整は、ユーザにより、個々の画像および／または融合画像（すなわち、２つ以上の個々のチャネル画像が結合した画像）に対して、ユーザステーション３０において、なされることができる。さらに、融合画像を閲覧する場合、相対的な移動および回転の補正が調整されてよい。
【００６８】
インタラクティブ画像の探索ツールもまた、細胞学的なベースにおける蛍光反応に即座にアクセスするために、デジタルによる視覚化および分析モジュール３４０によって可能にされる。さらに、所定の関連領域は、ユーザに対して、有意味の生物学的反応を示すか、または自動的に、定量的に分析をするために、ユーザステーション３０において、表示されることができる注釈を含んでよい。さらに、視覚化および分析モジュール３４０は、ユーザステーション３０のユーザに、関連領域に注釈を付け、次いで、ベース層画像に関連するデジタルスライド画像ファイル内にその注釈を格納するためのツールを提供してよい。有利にも、そのような注釈は、画像内のドキュメントのアーチファクト、画像内の関連領域へと案内するのに有益であるか、または、報告の分析または定量的な分析のための画像の領域を特定するのに有益であってよい。
【００６９】
さらに、視覚化および分析モジュール３４０は、コンテンツベースの画像検索技術を用いた類似の画像データまたはパターンを位置づけるために、あらかじめ決められた、もしくは、そうでなければ、特定済みの画像特性を利用してよい。有利にも、このユーティリティは、ユーザステーション３０のユーザに、関連のケース情報および画像データを提供することができる。
【００７０】
１つの実施形態において、クライアント−サーバのアーキテクチャにより、ユーザステーション３０のユーザは、必要な場合に応じて、特定のピラミッドレベルにおいて、圧縮された画像タイルをリクエストすることによって、かつ、ユーザリクエストを見越して、クライアント側でのタイルのキャッシングを行うことによって、画像サーバシステム５０またはスキャニングシステム４０に位置付けられた蛍光デジタルスライド画像を閲覧することができる。
【００７１】
デジタルの視覚化および分析モジュール３４０は、さらに、蛍光デジタルスライド画像のスライドの定量分析全体を容易にするように動作し、その画像は象限のスタイルの画像または融合のスタイルの画像である。１つの実施形態において、デジタルの視覚化および分析モジュール３４０は、デジタルスライド画像全体の代わりに、特定の関連領域の定量分析を容易にすることができる。分析結果は、データ管理およびデータ報告と共に利用するためのデータ格納領域４５、５５、２５、または３５等のデータ格納領域内に格納できる。
【００７２】
図４は、本発明の実施形態に係る蛍光スキャナシステムにおけるマクロフォーカスのための例示的なプロセスを示すフロー図である。図示のプロセスは、図１から図３に関連して以前に記載された蛍光スキャニングシステム４０によって実施可能である。特に、蛍光デジタルスライド画像生成とは対照的に、明視野のデジタルスライド画像生成においては、ラインスキャンカメラは単一の固定された露出時間で動作する。しかしながら、試料（明視野にあるように）によってブロックされる光の代わりに、試料から発せられる光を感知することによって蛍光スキャニングシステム４０は作動し、かつ、発せられる光の量は、１つのスライドからその次のスライドで数桁程度も変わることがあり得るので、蛍光デジタルスライド画像生成において、全てのスライドにフォーカスを合わせるための単一の固定された露出時間を用いることは可能ではない。さらに、前もって格納されている露出時間を常に用いることはできず、または、自動露出調整アルゴリズムを用いて一度計算されたものを常に用いることもできない。というのも、そのアルゴリズムが正確な結果を出すことができる前に試料にフォーカスが合っていることを自動調整アルゴリズムが必要とするからである。結果として、蛍光デジタルスライド画像生成において、最適な露出時間が有利にも決定され、同時にマクロフォーカスも行われる。
【００７３】
従って、マクロフォーカスが開始された場合、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５は、ステップ４００に示すように、最初の固定された露出時間を用いて開始される。次に、ステップ４０５において、対物レンズ２２５は、その範囲の一端から他端（例えば、底部から上部）へスイープされる。ステップ４１０に示すように、この対物レンズのスイープからの画像データは、データ格納領域（例えば画像バッファ）にキャプチャされ、次いで、ステップ４１５において、画像データが適切に露出されているかどうかが決定される。
【００７４】
例えば、対物レンズを上方へスイープする間に、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５は、初期のライン速度（すなわち一定の露出時間）でデータをキャプチャし、画像データの結果としてのラインはデータ格納領域（例えば２次元画像バッファ）に格納される。２次元画像バッファにおける画像データの各ラインはピクセルの単一の列であり、その対物レンズは試料から離れた異なる距離にある。ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５は、一定の露出時間においてラインをキャプチャするので、スイープ中の対物レンズ２２５の速度は連続したライン間の距離の量を決定する。従って、画像バッファの上側のラインは、その対物レンズが試料２３０から最短の距離にあるときに見られるのと同じような、試料２３０の画像であり、画像バッファの底側のラインは、その対物レンズが試料２３０から最長の距離にあるときに見られるのと同じような、試料２３０の画像である。
【００７５】
第１のスイープからの画像データがステップ４１０においてキャプチャされた後、その画像データが過飽和であるのか、または飽和以下（すなわち、露出された場合、ライン速度が適切であることを意味する）であるのかを決定するために、ステップ４１５において、その画像データが、自動調整アルゴリズムを介して通過される。画像データが十分に露出されない場合、露出時間は、ステップ４２０において、例えば、ライン速度を２倍にするか、または半分にすることによって、調整される。次いで、このプロセスはステップ４０５に戻り、ここで、対物レンズのスイープが再び実行されて、画像データがキャプチャされる。このプロセスは、それがステップ４１５において、画像データが十分に露出されると決定されるまで、数回の繰返しを介してループしてよい。
【００７６】
いったん、画像データが、ステップ４１５において十分に露出されていると決定されると、その画像データは、ステップ４２５に示すように、最も高いフォーカスのスコアを決定するように処理される。１つの実施形態において、画像バッファにおいて、ピクセルの各列がスコア付けされ、最も高いコントラストを有する画像データは、最も高いフォーカスのスコアを有するように決定される。従って、対物レンズのための適切なフォーカスの高さは、最も高いフォーカスのスコアを有する画像バッファにおけるピクセルの列を決定することによって決定される。１つの実施形態において、最も高いフォーカスのスコアが所定の閾値を満たすか、または超過する場合、マクロフォーカシングのプロセスが、第１のスイープとは反対の方向における、対物レンズについての第２のスイープの間、継続する。
【００７７】
有利にも、反対方向に対物レンズをスイープし、かつ、フォーカススコアのプロセスを繰返し、次いで、各々の対物レンズのスイープから、最も高いフォーカススコアの対物レンズの高さを平均化することで、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５を用いることによって導入されるバイアスを取り除く。従って、ステップ４３０において、対物レンズ２２５は、その範囲の一端から他端（例えば、上部から底部）へスイープされる。ステップ４３５に示すように、この対物レンズのスイープからの画像データは、データ格納領域（例えば画像バッファ）にキャプチャされ、次いで、ステップ４４０において、画像データが適切に露出されているかどうかが決定される。画像データが十分に露出されていない場合、次いで、このプロセスは、ステップ４４５を介してループし、このステップにおいて、ステップ４４０において決定されたように、ライン速度は調整され、十分に露出された画像データがキャプチャされるまで繰り返される。十分にフォーカスが合った画像データがいったん取得されると、その画像データは、ステップ４５０に示すように、最も高いフォーカスのスコアを決定するために分析される。
【００７８】
明視野のデジタルスライド画像化を用いて生成されたデジタルスライド画像について最も高いフォーカススコアを決定する場合、そのフォーカススコアは以下の式を用いて計算することができる。
【数１】
2014142657.tif 000003
ここでｐｘは指数ｘにおけるピクセルの輝度である。しかしながら、蛍光デジタルスライド画像化を用いて生成されるデジタルスライド画像について最も高いフォーカススコアを決定する場合、その式は、その画像の遷移領域についてより高いスコアの結果となり、ここでその画像はちょうどフォーカスが合い始めるところである。なぜならば、遷移領域に存在するピクセルの輝度の間での多くの数の小さな差異が、その試料において最適にフォーカスが合っている画像の領域に存在するピクセルの輝度の間での少数の大きな差異よりも上回るからである。従って、従来の明視野のフォーカスのスコア付けは、蛍光デジタル画像上では利用できない。
【００７９】
蛍光スキャニングシステム４０によって生成されるデジタル画像は、しかしながら、それらがさらにフォーカスが合うにつれて、より高い輝度を有する傾向がある。従って、蛍光画像に用いられるフォーカスのスコア付けの式は以下のようになる。
【数２】
2014142657.tif 000004
ここでｐｘは指数ｘにおけるピクセルの輝度である。有利にも、ピクセルの輝度における差異が、この式におけるピクセルの輝度によって重み付けられるので、そして、蛍光デジタル画像におけるフォーカスと輝度との間の相関に起因して、蛍光デジタル画像のフォーカスのスコア付けのためのこの式を用いることで、フォーカス画像データにおいてさらに表れるより高いピクセルの輝度が最も高いフォーカススコアを有することとなる。スコア付けする前にデジタル画像からのノイズをフィルタリングするなどのさらなる操作もまた用いられてもよく、これにより性能を改善し、かつ誤検出を取り除き、例えばこうした誤検出は、試料が存在しない領域にフォーカスを合わせようとする場合などに生じ得るものである。
【００８０】
最も高いフォーカスのスコアがステップ４５０においていったん決定されると、第１のスイープについての最も高いフォーカススコアでの対物レンズの高さおよび第２のスイープについての最も高いフォーカススコアでの対物レンズは、次いで、ステップ４５５に示すように、最適なフォーカスの高さを決定するために平均化される。
【００８１】
有利にも、ステップ（４０５、４１０、４１５、４２０）および（４３０、４３５、４４０、４４５）に関して上述した露出調整のみが、マクロフォーカスの動作の間に行われる必要がある。蛍光スキャニングシステム４０が、試料２３０のトポグラフィを決定し、かつフォーカスマップを生成するために、個々のＸＹフォーカス点にフォーカスを合わせる場合、スキャニングシステム４０は、マクロフォーカス動作によって決定された露出率を用いる。
【００８２】
図５は、本発明の実施形態に係る蛍光スキャナシステムにおけるオートフォーカスのための例示的プロセスを示すフロー図である。図示したプロセスは、図１から図３に関連して前述した蛍光スキャニングシステム４０によって実施可能である。上述のように、蛍光試料２３０を迅速にスキャンした場合に、対物レンズを誘導するために後に用いることができるフォーカスマップを生成するために、試料２３０の上において複数のフォーカス点を決定する場合、空間的曇りおよび時間的曇りは、特定の困難をもたらすものとなる。
【００８３】
まず、試料２３０上の一連のＸＹ点が、フォーカスマップを生成することにおいて使用するために特定される。ステップ４７０において、スキャニングシステム４０は、対物レンズを、第１のＸＹフォーカス点に移動させる。１つの実施形態においては、ＸＹ平面において物理的に移動して、対物レンズの下に第１のＸＹフォーカス点を配置させるのは電動式ステージ２５５である。次に、ステップ４７５において、対物レンズは、その移動範囲全体、例えば、その最も低い点からその最も高い点までスイープする。対物レンズがその最も低い点からその最も高い点まで上へと移動するにつれて、画像データは、ステップ４８０において、データ格納領域（例えば画像バッファ）へキャプチャされる。完全なスイープから画像データがキャプチャされた場合、ステップ４８５において、最も高いフォーカススコアを有する画像データのラインを決定することがスコア付けされる。データの特定の最も高いフォーカスのスコアラインがキャプチャされた場合、対物レンズの高さが特定され、格納される。
【００８４】
次に、ステップ４９０において、第１のスイープとは反対の方向において、例えば、その最も高い位置からその最も低い位置へと、その移動の全範囲に亘って、対物レンズがスイープする。対物レンズがその最も高い点からその最も低い点へと移動するにつれ、画像データは、ステップ４９５において、データ格納領域（例えば画像バッファ）へとキャプチャされる。完全なスイープからの画像データがキャプチャされた場合、ステップ５００において、最も高いフォーカスのスコアを用いて画像データのラインを決定することがスコア付けされる。データの特定の最も高いフォーカスのスコアラインがキャプチャされる場合、対物レンズの高さが特定されて格納される。ステップ５０５において、データの、上方へのスイープでの最も高いフォーカスのスコアラインについての対物レンズの高さ、およびデータの下方へのスイープでの最も高いフォーカスのスコアラインについての対物レンズの高さが平均化される。この平均の高さは、次いで、フォーカスマップを生成することにおいて用いられるＸＹフォーカス点についての対物レンズの高さであると決定される。
【００８５】
図６は、本発明の実施形態に係る蛍光スキャナシステムにおいて、最適なオートフォーカスライン速度を決定する例示的なプロセスを示すフロー図である。図示したプロセスは、図１から図３に関連して前述した蛍光スキャニングシステム４０によって実施可能である。さらに、図示したプロセスを用いて最適な露出時間を決定することはまた、エリアスキャンカメラを利用した従来の画像角度調節システムによって実施可能である。上述したように、蛍光デジタルスライド画像化は、試料２３０から発せられた光をキャプチャし、その発せられた光の強さはスライドからスライドにかけて、数桁も変化し得るので、試料２３０のスキャニングおよびデジタル化の間に、その発せられた光をキャプチャするための最適な露出時間を決定することが必要である。さらに、蛍光デジタル画像化における飽和ピクセルは特定の問題を提示する。なぜならば、それらのピクセルは、他のピクセルよりも明るく、それゆえ、結果としての画像データにおいては意味がない。というのも、それらは、飽和していないピクセルとの線形相関を有さず、結果として、正確なデータを生じないからである。定量分析のために用いられるデジタル画像を生成する場合、飽和している画像におけるピクセルの数を限定することが重要である。従って、特定の試料２３０のための最適な露出時間を決定する場合、飽和したピクセルの数を限定することが重要である。
【００８６】
さらに、特定の試料２３０のための最適な露出時間を決定する場合、結果としても画像のダイナミックレンジを最大化することもまた重要である。なぜならば、露出の足りない画像は、特定可能にするピクセルの輝度における十分な違いを提供しない場合がある。従って、蛍光スキャナシステムにおける最適な自動露出ライン速度を決定することは、飽和を最小にして、ピクセルの強度を最大化する必要がある。
【００８７】
図６に示すプロセスにおいて、まず、試料２３０が焦点を合わせていない場合には、ステップ５３０に示すように焦点が合わせられる。試料に焦点を合わせることは、図４または図５、あるいはそれら両方に関して前述したプロセスによって達成されてよい。試料２３０にいったん焦点が合うと、ステップ５３５において、試料２３０の小さな領域は、最初のライン速度（すなわち露出時間）において特定され、かつスキャンされ、スキャンからの画像データは、ステップ５４０に示すように、データ格納領域（例えば画像バッファ）に格納される。例えば、試料２３０の小さな領域は、約１ｍｍ×１ｍｍであってよく、用いられる初期のライン速度は、ステップ５３０の焦点プロセスにおいて決定可能である。
【００８８】
次に、ステップ５４５からステップ５６０において、画像バッファにおいてキャプチャされるスキャンされた画像についての最適な露出時間が決定され、そのライン速度がそれに従って調節される。試料２３０の小さな領域をスキャンし、最適な露出時間を決定し、ライン速度を調節するプロセスは、キャプチャされたピクセルの輝度のレベルが最も高くなる（ピクセルの最小の飽和を有して）まで、次いで繰り返す。ライン速度は、蛍光試料２３０のデジタルスライド画像を生成する場合に、最適な露出時間についての最適なライン速度として、ステップ５６５において特定される。
【００８９】
有利にも、蛍光試料２３０によって発せられた光の強さは、ポアソン分布に近似し、かつ飽和していないカメラセンサは、センサに当たる光の量に関して線形であるので、画像バッファにおいてキャプチャされる画像データのヒストグラムもまたポアソン分布に近似する。さらに、最適なライン速度（すなわち最適な露出）の第１の対物レンズは、飽和したピクセルの数を限定するので、ヒストグラムの下り方向のスロープのみが考慮される。
【００９０】
従って、スキャニングシステム４０は、ヒストグラムにおける各々のゼロではない値が、２を底とする対数をとる事によって測られるように、指数関数的減衰関数としてのヒストグラムの分布を扱い、その結果、ステップ５４５に示すように、ラインセグメントに近似する、対数的に測られたヒストグラムとなる。次に、線形回帰分析が、その測られたヒストグラム上で行われ、負のスロープを有する線形の傾向線を生じ、ヒストグラムと強度の軸との交点は、ステップ５５０に示すように、その傾向線のｘ切片に位置付けられることによって求められる。ｘ切片は、この輝度を有するピクセルの数がゼロであり、傾向線およびｙ切片のスロープを用いて求められる。
【００９１】
ヒストグラムと輝度の軸との交点が、スキャンされた画像データについていったん求められると、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の飽和点を僅かに下回るピクセル強度を示す最適値と比較される。その画像データがＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の飽和点の特定の（例えばユーザが構成可能な）許容範囲内にある場合、ステップ５５５において求められるように、その画像は十分に露出されたと考えることができ、現在のライン速度は、ステップ５６５に示すように、最適な露出時間／最適なライン速度として特定される。その画像データがＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の飽和点の特定の許容範囲内にない場合、最適なピーク強度と実際のピーク強度との比が計算され、ステップ５６０において、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の露出時間（すなわち、ライン速度）がその比を用いて調節される。最適なライン速度が特定されるまでこのプロセスは次いで繰り返される。
【００９２】
図７は、本発明に係るシェーディング補正のために画像を獲得する例示的なプロセスを示すフロー図である。図示したプロセスは、図１から図３に関連して上述した蛍光スキャニングシステム４０によって実施可能である。有利にも、蛍光デジタルスライド画像のシェーディング補正は、ストライプのエッジ上の最小のシェーディングアーチファクトを有する画像を獲得するのに必要である照射光（例えばロールオフによって）の損失を補う。従って、デジタルスライド画像へとスキャンされる試料２３０について照射のプロファイルを決定することは有利である。照射のプロファイルは、蛍光試料２３０を有するスライドのバックグラウンド蛍光に基づいて決定される。照射光のプロファイルは、スライドのカバースリップの下の透明点を利用して決定可能である。好ましくは、この透明点は、任意の蛍光の標識付けされた試料２３０を含まないスライドの領域内にある。従って、バックグラウンド蛍光から獲得された光のプロファイルは、照射光のロールオフを補うために用いることができる。
【００９３】
まず、ステップ５８０において、試料２３０の画像は焦点が合わせられる。これは、前述のマクロフォーカスまたはオートフォーカスのプロセスによって達成可能である。１つの実施形態において、ステップ５８０において、少なくとも３つのフォーカス点が試料２３０上で特定される。試料２３０の照射のプロファイルは、フォーカスに基づいた試料２３０上の対物レンズ２２５の高さに依存して様々である。
【００９４】
次に、ステップ５８５において、最初のライン速度が最も低い値で設定され、試料２３０の小さな領域がステップ５９０においてスキャンされ、その結果としてのデジタル画像データがデータ格納領域に格納される（例えば画像バッファ）。スキャン領域のサイズは様々であってよい。可能な限りで最も高い露出時間についての最初のライン速度を設定することは有利である。なぜならば、背景の材料はしばしば蛍光発光が低いからである。次に、ステップ５９５において、画像データの平均強度が計算される。その平均の強度が特定の範囲内ではない場合、ステップ６００において決定されるように、ライン速度は、ステップ６０５において調整され、そのプロセスは、試料２３０の小さな領域を再スキャンするために繰り返す。
【００９５】
１つの実施形態において、調節されたライン速度は、以前のライン速度を用いて、ステップ５９５において計算された平均強度の線形のマッピングに基づいて選択される。有利にも、その調整されたライン速度は、最小の許容可能な平均強度を生じるライン速度と、最大の許容可能な平均強度を生じるライン速度との間にある。
【００９６】
その平均の強度は、特定の範囲（例えば、ユーザが構成可能な範囲）内にある場合、ステップ６１０に示すように、試料２３０のシェーディング補正のための光のプロファイルが生成される。１つの実施形態において、１０ビットモードで画像をスキャンする場合、許容可能な特定の平均の強度範囲は８０〜６００である。有利にも、平均の強度が特定の範囲にあることを決定することは、飽和した画像を棄却し、他方でまた、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５のノイズレベルよりも高い平均ピクセルの強度を有するローエンドの画像をも含む。
【００９７】
１つの実施形態において、ステップ６１０において生成されるシェーディング補正のための光のプロファイルは、スキャニング中の照射光を補うために用いられる。例えば、ピクセル補正係数は、光のプロファイルに基づいて決定可能である。光のプロファイルは、そのプロファイルの中央に通常現れる最も明るいピクセル値へと正常化され、次いで、係数またはピクセルの移動量（ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）が、ＴＤＩラインスキャンカメラ２０５の視野内の全てのピクセルに対して計算される。上述のシェーディング補正は、試料２３０の全てのチャネルに対して有利に実行可能である。
【００９８】
代替の実施形態において、シェーディング補正が点のついた画像を生成する場合には、異常値棄却のアルゴリズムが用いられる。これは、試料２３０上のクリアな場所（すなわち蛍光色素のない領域）に位置することが不可能、または非常に困難である場合に有用である。異常値棄却のアルゴリズムは、有利にも、各カラムのピクセル値の平均を超えるピクセルを棄却することによって、シェーディングの補正された画像におけるアーチファクトを除外する。１つの実施形態において、平均のピクセル値よりも２０カウントも高いピクセルが棄却される。
【００９９】
図８は、本発明に係る例示的なスキャニングのワークフローのプロセスを示すフロー図である。図示したプロセスは、図１から図３に関して前述した蛍光スキャニングシステム４０によって実施可能である。まず、ステップ６５０において、スキャニングシステムおよびその励起フィルタならびに発光フィルタ／ターレットは、デジタルスライド画像へとスキャンされる試料２３０の種類、および試料２３０がマーキングされ得る様々な蛍光色素に従って構成される。１つの実施形態において、このような構成は、システムコンソールまたは遠隔操作ステーションを通じて達成可能である。さらに、励起フィルタおよび発光フィルタ／ダイクロイックミラー、ならびにフィルタホイールまたはターレット上でのそれらの相対位置がステップ６５０において特定される。
【０１００】
次に、ステップ６５５において、試料が運ばれる。これは、試料がスキャニングシステム４０へと配置される顕微鏡スライドに配置することを含むことができる。試料が運ばれた後、試料のマクロ画像がステップ６６０において、例えば、図２に関して前述したプロセスを用いて獲得される。次に、マクロ画像は、ステップ６６５に示すように、シェーディング補正点を特定するために分析され、かつ、ステップ６７０において示すように、組織を含むスライド上における領域を決定するために分析される。次いで、ステップ６７５において、試料２３０上の様々な蛍光色素が特定されて、様々な傾向色素に対応する様々なチャネルにおいて、試料２３０をスキャンするために、励起フィルタおよび発光フィルタの正確な組合せに相関させられる。
【０１０１】
蛍光スキャニングにおける困難性の１つは、各チャネル（すなわち各蛍光色素）についての最適な露出時間の特定であるので、図６に関連して前述したように、このスキャニングのワークフローは自動的に、各チャネルについて、最適な露出時間を特定する。従って、ステップ６８０において、自動露出プロセスが開始され、チャネルの数が決定される。ステップ６８５において、自動露出プロセスが行われる。自動露出は、全てのチャネルにおいて自動的に実行されてもよく、または、１つのチャネルにおいて実行されてもよい。
【０１０２】
ステップ６９０およびステップ７２０において、オペレータは、自動露出の結果を許可するように従事してよく、かつ、全てのチャネルが処理され、各チャネルに対して決定された有効な露出時間を確認してもよい。あるいは、スキャニングシステム４０は、最適な露出時間が、オペレータの入力無しで、各チャネルに対して計算されるまで、ステップ６９０からステップ７２０までの自動的に進めてもよい。
【０１０３】
自動露出プロセスが完結し、各チャネルに対する最適な露出時間がいったん決定されると、ステップ７２５において、スキャニングシステム４０は、試料２３０上に一連のセットのＸＹフォーカス点を特定する。ステップ７３０において、スキャニングシステムは、そのセットにおける各ＸＹフォーカス点を訪れ、そのＸＹフォーカス点の各々において、最適なフォーカスの高さを決定する。次いで、これらのフォーカス点（ＸＹ位置および最適なフォーカスの高さを含む）は、組み合わされて、試料２３０の表面を覆うフォーカスマップを生成する。次いで、ステップ７３５において、シェーディング補正情報がチャネルの各々について決定される。
【０１０４】
フォーカスマップが生成され、シェーディング補正情報が決定された後、スキャニングシステム４０は、ステップ７４０に示すように、各チャネルにおいて、試料２３０のスキャンを開始する。各チャネルに対するスキャンによって生成されたデジタル画像データは、ステップ７４５においてデータ格納領域に格納され、次いで、チャネルの全てについて画像データを有するデジタルスライド画像がステップ７５０において生成される。最後に、蛍光デジタルスライド画像はデータ格納領域に格納される。
【０１０５】
１つの実施形態において、オートフォーカスは、フォーカス点およびフォーカスマップ情報が、特定のストライプがスキャンされる直前にその特定のストライプに対して生成されるように、スキャニングのプロセスとインターリーブすることができる。さらに、オートフォーカスは、単一のチャネルに対してなされることができ、または、各チャネルに対してなされることもできる。
【０１０６】
モノクロのＴＤＩラインスキャンカメラ２０５が蛍光スキャニングシステム４０によって用いられるので、一度に１つのチャネルのみがスキャンされる。有利にも、電動式のフィルタホイールを使用することで、単一のストライプを、複数回を連続して、各チャネルに対して一度に、スキャンすることができる。言い換えれば、単一のストライプの各チャネルは、次のストライプへと移動する前にキャプチャされる。スキャニングシステム４０は別個の励起フィルタおよび発光フィルタを用いるので、励起フィルタのみが回転する必要があり、上述の好ましいピンケル構成（複数帯域のフィルタキューブおよび単一の帯域の励起フィルタ）において、マルチチャネルの試料２３０を自動的にスキャンする。有利にも、次のストライプへ移動する前に、単一のストライプの各々のチャネルをスキャンすることで、結果としての画像データはチャネル全てに亘って最適に登録されることを保証する。さらに、フィルタ交換の数もまた、従来の画像角度調節システムと比較して最小にされる。あるいは、試料の一部または全てのチャネルが、単一の帯域の励起／発光フィルタおよびダイクロイックミラーを有する単一の帯域フィルタキューブを用いてスキャン可能である。スキャニングプロセスが継続すると、複数のモノクロのデジタルスライド画像が生成され、これは、試料上のチャンネル数に対応する。これらの画像は、単一のデジタルスライド画像ファイルに格納されるか、または、様々な別個の画像ファイルを関連付けるインデックスファイルと共に、別個の画像ファイルとして格納可能である。さらに、選択された擬似色を有する全てのチャネルの合成画像である融合画像が生成可能である。
【０１０７】
本明細書において記載された蛍光スキャニングシステム４０の様々な実施形態は、ハードウェアモジュールおよびソフトウェアモジュールの両方の組合せを用いて実施可能である。例えば、プログラミングされたソフトウェアモジュール、特定用途向け集積回路、またはフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイが交換可能に利用でき、スキャニングシステム４０の特定の機能的なモジュールを実施する。従って、本明細書において開示された図面および様々な実施形態の全てに関連して記載した様々な図示したモジュール、ブロック、およびステップが、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれら２つの組合せとして実施可能であることを当業者は理解する。ハードウェアおよびソフトウェアのこの相互交換性を明確に図示するために、様々な図示によるモジュール、ブロック、およびステップが、それらの機能性に関して上述されており、そのような機能性がハードウェアまたはソフトウェア、あるいはそれらの２つの組合せであるのかどうかは、特定の用途およびシステム全体にかかる設計の制約に依存する。
【０１０８】
当業者が、特定の設計制約の下で特定用途のために様々な方法において上述の機能性を実施可能である一方で、そのような実施の決定は、本発明の範囲から逸脱するものとして解釈されるべきではない。さらに、特定のモジュール、ブロック、またはステップ内の機能性のグループ化、あるいは、特定モジュール、ブロック、またはステップからの機能の除去は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者によって達成可能である。
【０１０９】
開示された実施形態の上述の記載により、任意の当業者が、本発明をなす、または本発明を利用することができる。これらの実施形態に対して様々な修正が当業者に対して容易に明らかとなり、かつ、本明細書において記載された一般的な原理は、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく他の実施形態に適用可能である。このように、本明細書において提示された記載および図面は、本発明の様々な実施形態を表し、かつ、それゆえ、本発明に広範に予定されている主題を表していると理解される。本発明の範囲は、当業者に対して明らかとなり得る他の実施形態を十全に包含するものであり、かつ、本発明の範囲は、従って限定されるものではないことはさらに理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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