(57)【要約】本発明は、血小板の製造方法であって、培養容器内の培養液中で巨核球細胞を培養する工程を含み、当該培養工程において、培養液を撹拌子で撹拌する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板の製造方法であって、
培養容器内の培養液中で巨核球細胞を培養する工程を含み、
前記培養工程において、前記培養液を撹拌子で撹拌する、方法。
【請求項２】
前記撹拌子が、羽根状である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養容器が、密閉型バイオリアクターである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記撹拌子を、回転数５０ｒｐｍ以上で回転させる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記巨核球細胞が、
巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つを強制発現した後、当該強制発現を解除した細胞である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
血小板製剤の製造方法であって、
請求項１から５のいずれか１項に記載の方法で巨核球細胞に血小板を産生させ、培養物から血小板を回収する工程と、
前記血小板から血小板以外の血球系細胞成分を除去する工程と、を含む方法。
【請求項７】
血液製剤の製造方法であって、
請求項６に記載の方法で血小板製剤を製造する工程と、
前記血小板製剤を他の成分と混合して血液製剤を得る工程と、を含む方法。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか１項に記載の方法で製造された血小板。
【請求項９】
請求項６に記載の方法で製造された血小板製剤、又は請求項８に記載の血小板を含む、血小板製剤。
【請求項１０】
請求項７に記載された方法で製造された血液製剤、又は請求項８に記載の血小板を含む、血液製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、回転式撹拌培養による血小板の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血小板製剤は、手術時や傷害時の大量出血、或いは、抗がん剤治療後の血小板減少に伴う出血傾向を呈する患者に対して、その症状の治療および予防を目的として投与される。現在、血小板製剤の製造は、健常ボランティアによる献血に依存している。しかし、日本では人口構成に起因して献血者数が減少しており、2027年には約100万人分の献血が不足すると推測されている。そこで、本発明の技術分野の目的の一つとして、血小板の安定供給が挙げられる。【０００３】
また、従来の血小板製剤は、細菌汚染によるリスクが高いため、血小板製剤の移植後に重篤な感染症を引き起こす可能性がある。そのため、臨床現場では、常に、より安全な血小板製剤が求められている。そのニーズに応えるべく、今日では、in vitroで培養した巨核球細胞から血小板を生産する方法が開発されている。【０００４】
従来、培養細胞からの血小板生産は、ディッシュを用いた静置培養系で行われていた（WO2014/100779A1、Qiang Feng, et al., Stem Cell Reports）。しかし、静置培養系は非常に手間がかかるものであり、大量培養には適さなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2014/1007791号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Qiang Feng, et al., Stem Cell Reports 3 1-15 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、シェーカーフラスコを用いた振とう培養系、すなわち培養容器自体を振とうする培養方法を用いることにより、高い生理活性を有する血小板を生産することに成功した。しかし、シェーカーフラスコ培養系では、培地量のスケールアップに従い、血小板（CD41a+CD42b+）生産量と血小板の生理活性（PAC1結合性、P-selectin陽性）の低下が起きることが判明した。【０００８】
更に、シェーカーフラスコ培養系では、シェディング反応などに起因すると考えられる血小板の劣化反応（CD42b陽性率の低下）が起きることが発見された。その上、生体への移植に適さない異常な血小板（アネキシンV陽性の血小板）がより多く含まれることもわかった。【０００９】
そこで、本発明は、生体へ移植可能な高品質の血小板を大規模な量で生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、培養容器を振とうするのではなく、培養容器内に配置した撹拌子で培養液を回転方向に撹拌しながら巨核球細胞を培養することによって、血小板の生産効率および生理活性を高くすることができるとともに、血小板の劣化を低く抑えること、異常血小板を減少させることができることを見出した。更に、撹拌培養による培養時の細胞密度、撹拌回転数、その他の条件を検討して本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、血小板の製造方法であって、培養容器内の培養液中で巨核球細胞を培養する工程を含み、前記培養工程において、前記培養液を撹拌子で撹拌する、方法である。【００１２】
また本発明に係る血小板の製造方法では、前記撹拌子が羽根状である、ことも好ましい。【００１３】
また本発明に係る血小板の製造方法では、前記培養容器が密閉型バイオリアクターである、ことも好ましい。【００１４】
また本発明に係る血小板の製造方法では、撹拌子を、回転数５０ｒｐｍ以上で回転させることも好ましい。【００１５】
また本発明に係る血小板の製造方法では、前記巨核球細胞が、巨核球細胞より未分化な細胞において、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つを強制発現した後、当該強制発現を解除した細胞である、ことも好ましい。【００１６】
また本発明は、血小板製剤の製造方法であって、以上に記載の方法で巨核球細胞に血小板を産生させ、培養物から血小板を回収する工程と、前記血小板から血小板以外の血球系細胞成分を除去する工程と、を含む方法である。【００１７】
また本発明は、血液製剤の製造方法であって、以上に記載の方法で血小板製剤を製造する工程と、前記血小板製剤を他の成分と混合して血液製剤を得る工程と、を含む方法を提供する。【００１８】
また本発明は、上記いずれかの方法で製造された血小板を提供する。【００１９】
また本発明は、上記いずれかの方法で製造された血小板製剤、又は上記血小板を含む、血小板製剤を提供する。【００２０】
また本発明は、上記方法で製造された血液製剤、又は上記血小板を含む、血液製剤を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の方法によれば、従来の振とう培養よりも血小板の生産効率を向上させることができる。さらに、生産された血小板は、従来の振とう培養で生産される血小板よりも高い生理活性を有する。【００２２】
また、本発明の方法によれば、血小板の劣化反応（CD42b陽性率の減少）を抑えることができるとともに、異常血小板（アネキシンV陽性血小板）の産生を抑制することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、巨核球細胞の撹拌培養又は振とう培養を行って得られた血小板について、PMA又はADPの刺激の前後に、抗CD42b抗体及び抗PAC-1抗体を用いてフローサイトメトリーを行った結果を示す。
【図２】図２は、巨核球細胞の撹拌培養又は振とう培養を行って得られた血小板について、PMA又はADPの刺激の前後に、抗CD42b抗体及び抗CD62p抗体を用いてフローサイトメトリーを行った結果を示す。
【図３】図３は、巨核球細胞の撹拌培養又は振とう培養を行って得られた血小板について、抗CD41a抗体及び抗CD42b抗体を用いてフローサイトメトリーを行った結果を示す。
【図４】図４は、巨核球細胞の撹拌培養又は振とう培養を行って得られた血小板について、アネキシンVが結合する割合をフローサイトメトリーで測定した結果を示す。
【図５】図５は、巨核球細胞を、回転数を変えて撹拌培養して得られたそれぞれの血小板について、抗CD41a抗体及び抗CD42b抗体を用いてフローサイトメトリーを行った結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明に係る血小板の製造方法は、培養容器内の培養液中で巨核球細胞を培養する工程を含み、当該培養工程において、培養液を撹拌子で回転方向に撹拌することを特徴とする。
【００２５】
本明細書において、「培養容器」は、培養液を撹拌子で撹拌しながら巨核球細胞を培養できる容器であれば特に限定されず、開放系の培養ディッシュ、閉鎖系のスクリューキャップ付きフラスコ、バイオリアクターなどが挙げられる。
【００２６】
本明細書において、「撹拌子」は、培養液内に配置して培養液を直接撹拌できるものであればよく、例えば、マグネティックスターラーに用いられる各種撹拌子や、バイオリアクターに備え付けられた撹拌羽根とすることができる。マグネティックスターラーの撹拌子を用いる場合、培養液内に撹拌子を配置し、培養容器の外部でモーターにより磁石を回転させることにより、培養液を撹拌することができる。撹拌羽根を備えたバイオリアクターの場合は、バイオリアクター内の羽根が培養液の液面より下になるようにし、バイオリアクターが備えるモーターによって撹拌羽根を回転させることにより、培養液を撹拌することができる。
【００２７】
以下、本発明の一態様として、撹拌羽根を備えたバイオリアクターを用いる例を説明する。
【００２８】
本明細書におけるバイオリアクターは、巨核球細胞を培養可能な培養槽と、培養槽内の培養液を撹拌できる撹拌機を有する限り、どのようなものであってもよく、市販のものを使用してもよい。
【００２９】
バイオリアクターは、至適な細胞増殖、細胞代謝、巨核球細胞の分化成熟、巨核球細胞の多核化、プロプレイトレットの形成、血小板生産、血小板の生理活性の維持、などに好適な物理化学的環境を提供する。そのため、通気装置、排気装置、温度調節装置、pH制御装置、溶存酸素圧（DOT）調節装置、バッフル、スパージャ、ポート等を備えていてもよい。
【００３０】
バイオリアクターの撹拌機は、培養液を撹拌できる限りどのような構成であってもよいが、例えば、培養槽内に取り付けられ、モーターによって駆動される羽根車と、羽根車に固定された撹拌羽根とからなる構成とすることができる。
【００３１】
本発明におけるバイオリアクターの撹拌は、特に限定しないが、例えば、撹拌回転数は、10rpm〜300rpmとすることができ、50rpm以上が好ましい。より好ましくは、100rpm以上、さらに好ましくは、140rpm以上である。
【００３２】
バイオリアクターの培養槽の形状も特に限定されないが、例えば、縦長の管状の形態とすることができ、タンクの頂部と底部に平坦な面を有するものであってもよい。
【００３３】
培養槽の容積は、少なくとも0.3リットル、好ましくは少なくとも１リットル、50リットル、より好ましくは少なくとも200リットル、より好ましくは少なくとも500リットル、さらにより好ましくは少なくとも1000リットル、さらにより好ましくは少なくとも2000リットルである。
【００３４】
本発明おけるバイオリアクターの羽根は、特にその形状を限定しない。例えば、平羽根タービン型翼、プロペラ型翼、矢じり羽根型、曲がり羽根型翼、円盤付き片平羽根タービン型翼も利用可能である。
【００３５】
本明細書において「巨核球細胞」とは、生体内においては骨髄中に存在する最大の細胞であり、血小板を放出することを特徴とする。また、細胞表面マーカーCD41a、CD42a、及びCD42b陽性で特徴づけられ、他に、CD9、CD61、CD62p、CD42c、CD42d、CD49f、CD51、CD110、CD123、CD131、及びCD203cからなる群より選択されるマーカーをさらに発現していることもある。「巨核球細胞」は、多核化（多倍体化）すると、通常の細胞の16〜32倍のゲノムを有するが、本明細書において、単に「巨核球細胞」という場合、上記の特徴を備えている限り、多核化した巨核球細胞と多核化前の巨核球細胞の双方を含む。「多核化前の巨核球細胞」は、「未熟な巨核球細胞」、又は「増殖期の巨核球細胞」とも同義である。
【００３６】
巨核球細胞は、公知の様々な方法で得ることができる。巨核球細胞の製造方法の非限定的な例として、国際公開第2011/034073号に記載された方法が挙げられる。同方法では、「巨核球細胞より未分化な細胞」において、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させることにより、無限に増殖する不死化巨核球細胞株を得ることができる。また、国際公開第2012/157586号に記載された方法に従って、「巨核球細胞より未分化な細胞」において、アポトーシス抑制遺伝子を強制発現させることによっても、不死化巨核球細胞を得ることができる。これらの不死化巨核球細胞は、遺伝子の強制発現を解除することにより、多核化が進み、血小板を放出するようになる。
【００３７】
巨核球細胞を得るために、上記の文献に記載された方法を組み合わせてもよい。その場合、癌遺伝子、ポリコーム遺伝子、及びアポトーシス抑制遺伝子の強制発現は、同時に行ってもよく、順次行ってもよい。例えば、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させ、当該強制発現を抑制し、次にアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させ、当該強制発現を抑制して、多核化巨核球細胞を得てもよい。また、癌遺伝子とポリコーム遺伝子とアポトーシス抑制遺伝子を同時に強制発現させ、当該強制発現を同時に抑制して、多核化巨核球細胞を得ることもできる。まず、癌遺伝子とポリコーム遺伝子を強制発現させ、続いてアポトーシス抑制遺伝子を強制発現させ、当該強制発現を同時に抑制して、多核化巨核球細胞を得ることもできる。
【００３８】
本明細書において「巨核球細胞より未分化な細胞」とは、巨核球への分化能を有する細胞であって、造血幹細胞系から巨核球細胞に至る様々な分化段階の細胞を意味する。巨核球より未分化な細胞の非限定的な例としては、造血幹細胞、造血前駆細胞、CD34陽性細胞、巨核球・赤芽球系前駆細胞（MEP）が挙げられる。これらの細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血から単離して得ることもできるし、さらにより未分化な細胞であるES細胞、iPS細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得ることもできる。
【００３９】
本明細書において「癌遺伝子」とは、生体内において細胞の癌化を誘導する遺伝子のことをいい、例えば、MYCファミリー遺伝子（例えば、c-MYC、N-MYC、L-MYC）、SRCファミリー遺伝子、RASファミリー遺伝子、RAFファミリー遺伝子、c-Kit、PDGFR、Ablなどのプロテインキナーゼファミリー遺伝子が挙げられる。
【００４０】
本明細書において「ポリコーム遺伝子」とは、CDKN2a（INK4a/ARF）遺伝子を負に制御し、細胞老化を回避するために機能する遺伝子として知られている（小倉ら, 再生医療 vol.6, No.4, pp26-32；Jseus et al., Jseus et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology vol.7, pp667-677, 2006；Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.100, pp211-216, 2003）。ポリコーム遺伝子の非限定的な例として、BMI1、Mel18、Ring1a/b、Phc1/2/3、Cbx2/4/6/7/8、Ezh2、Eed、Suz12、HADC、Dnmt1/3a/3bが挙げられる。
【００４１】
本明細書において「アポトーシス抑制遺伝子」とは、細胞のアポトーシスを抑制する機能を有する遺伝子をいい、例えば、BCL2遺伝子、BCL−xL遺伝子、Survivin遺伝子、MCL1遺伝子などが挙げられる。
【００４２】
遺伝子の強制発現及び強制発現の解除は、国際公開第2011/034073号、国際公開第2012/157586号、国際公開第2014/123242またはNakamura S et al, Cell Stem Cell. 14, 535-548, 2014に記載された方法、その他の公知の方法又はそれに準ずる方法で行うことができる。
【００４３】
本明細書において「血小板」は、血液中の細胞成分の一つであり、CD41a陽性及びCD42b陽性で特徴づけられる。血小板は、血栓形成と止血において重要な役割を果たすとともに、損傷後の組織再生や炎症の病態生理にも関与する。出血等により血小板が活性化されると、その膜上にIntegrin αIIBβ3（glycoprotein IIb/IIIa; CD41aとCD61の複合体）などの細胞接着因子の受容体が発現する。その結果、血小板同士が凝集し、血小板から放出される各種の血液凝固因子によってフィブリンが凝固することにより、血栓が形成され、止血が進む。
【００４４】
血小板の機能は、公知の方法により測定し評価することができる。例えば、活性化した血小板膜上のIntegrin αIIBβ3に特異的に結合するPAC-1に対する抗体を用いて、活性化した血小板量を測定することができる。また、同様に血小板の活性化マーカーであるCD62P（P-selectin）を抗体で検出し、活性化した血小板量を測定してもよい。例えば、フローサイトメトリーを用い、活性化非依存性の血小板マーカーCD61又はCD41に対する抗体でゲーティングを行い、その後、抗PAC-1抗体や抗CD62P抗体の結合を検出することにより行うことができる。これらの工程は、アデノシン二リン酸（ADP）存在下で行ってもよい。
【００４５】
また、血小板の機能の評価は、ADP存在下でフィブリノーゲンと結合するか否かを見て行うこともできる。血小板がフィブリノーゲンと結合することにより、血栓形成の初期に必要なインテグリンの活性化が生じる。
【００４６】
さらに、血小板の機能の評価は、国際公開第2011/034073号の図６に示されるように、in vivoでの血栓形成能を可視化して観察する方法で行うこともできる。
【００４７】
一方、血小板のCD42bの発現率が低い場合や、アネキシンV陽性率が低い場合は、血小板が劣化又は異常であると評価される。これらの血小板は、血栓形成や止血機能を十分に有さず、臨床的に有用でない。
【００４８】
本明細書において「血小板の劣化」とは、血小板表面のCD42b（GPIbα）が減少することをいう。したがって、劣化した血小板には、CD42bの発現が低下した血小板や、シェディング反応によってCD42bの細胞外領域が切断された血小板が含まれる。血小板表面のCD42bがなくなると、フォン・ウィルブランド因子（von Willebrand factor：VWF）との会合ができなくなり、結果的に、血小板の血液凝固機能が失われる。血小板の劣化は、血小板分画中のCD42b陽性率（又はCD42b陽性粒子数）に対するCD42b陰性率（又はCD42b陰性粒子数）を指標として評価することができる。CD42b陽性率に対するCD42b陰性率高いほど、又は、CD42b陽性粒子数に対するCD42b陰性粒子数が多いほど、血小板は劣化している。CD42b陽性率とは、血小板分画に含まれる血小板のうち、抗CD42b抗体が結合できる血小板の割合を意味し、CD42b陰性率とは、血小板分画に含まれる血小板のうち、抗CD42b抗体が結合しない血小板の割合を意味する。
【００４９】
本明細書において「異常な血小板」とは、陰性電荷リン脂質であるホスファチジルセリンが脂質二重層の内側から外側に露出した血小板を言う。生体内においては、ホスファチジルセリンは血小板の活性化に伴って表面に露出し、そこに多くの血液凝固因子が結合することによって、血液凝固カスケード反応が増幅されることが知られている。一方、異常な血小板では、常に多くのホスファチジルセリンが表面に露出しており、かかる血小板が患者に投与されると、過剰な血液凝固反応を引き起こし、播種性血管内凝固症候群などの重篤な病態に繋がる可能性がある。ホスファチジルセリンにはアネキシンVが結合するので、血小板表面上のホスファチジルセリンは、蛍光標識したアネキシンVの結合量を指標にしてフローサイトメーターを用いて検出することができる。よって、異常な血小板の量は、血小板分画中のアネキシンV陽性率、すなわちアネキシンが結合する血小板の割合又は数で評価することができる。アネキシンV陽性率が高いほど、又はアネキシンV粒子数が多いほど、異常な血小板は多い。
【００５０】
本発明における巨核球細胞の培養条件は、通常の条件とすることができる。例えば、温度は約35℃〜約42℃、約36℃〜約40℃、又は約37℃〜約39℃とすることができ、5〜15%CO2及び／又は20％O2としてもよい。
【００５１】
巨核球細胞を培養する際の培地は特に限定されず、巨核球細胞から血小板が産生されるのに好適な公知の培地やそれに準ずる培地を適宜使用することができる。例えば、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地が挙げられる。
【００５２】
培地には、血清又は血漿が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオグリセロール（MTG）、脂質、アミノ酸（例えばL-グルタミン）、アスコルビン酸、ヘパリン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどの1つ以上の物質も含有し得る。サイトカインとは、血球系分化を促進するタンパク質であり、例えば、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、トロンボポエチン（TPO）、各種TPO様作用物質、Stem Cell Factor（SCF）、ITS（インスリン−トランスフェリン−セレナイト）サプリメント、ADAM阻害剤、などが例示される。本発明において好ましい培地は、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、アスコルビン酸、TPOを含むIMDM培地である。さらにSCFを含んでいてもよく、さらにヘパリンを含んでいてもよい。それぞれの濃度も特に限定されないが、例えば、TPOは、約10ng/mL〜約200ng/mL、又は約50ng/mL〜約100ng/mLとすることができ、SCFは、約10ng/mL〜約200ng/mL、又は約50ng/mLとすることができ、ヘパリンは、約10U/mL〜約100U/mL、又は約25U/mLとすることができる。ホルボールエステル（例えば、ホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート；PMA）を加えてもよい。
【００５３】
血清を用いる場合はヒト血清が望ましい。また、血清に代えて、ヒト血漿等を用いてもよい。本発明に係る方法によれば、これらの成分を用いても、血清を用いたときと同等の血小板が得られうる。
【００５４】
遺伝子の強制発現及びその解除のためにTet-on（登録商標）又はTet-off（登録商標）
システムのような薬剤応答性の遺伝子発現誘導システムを用いる場合、強制発現する工程においては、対応する薬剤、例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンを培地に含有させ、これらを培地から除くことによって強制発現を抑制してもよい。
【００５５】
本発明における巨核球細胞の培養工程は浮遊培養によって行われるので、フィーダー細胞なしで実施することができる。
【００５６】
本発明は、本発明に係る方法で製造した血小板も包含する。
【００５７】
本発明に係る血小板製剤の製造方法は、本発明に係る方法により巨核球細胞を培養して血小板を産生させ、培養物から血小板が豊富に存在する画分を回収する工程と、当該血小板画分から血小板以外の血球系細胞成分を除去する工程と、を含む。血球系細胞成分を除去する工程は、白血球除去フィルター（例えば、テルモ社製、旭化成メディカル社製）などを使用して、巨核球細胞を含む血小板以外の血球系細胞成分を除去することによって行うことができる。血小板製剤のより具体的な製造方法は、例えば、国際公開第2011/034073号に記載されている。
【００５８】
本発明に係る血液製剤の製造方法は、本発明に係る方法で血小板製剤を製造する工程と、当該血小板製剤を他の成分と混合する工程と、を含む。他の成分としては、例えば赤血球細胞が挙げられる。
【００５９】
血小板製剤及び血液製剤には、その他、細胞の安定化に資する他の成分を加えてもよい。
【００６０】
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例１】
【００６１】
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。【００６２】
１．不死化巨核球細胞の作製
１−１．iPS細胞からの造血前駆細胞の調製
ヒトiPS細胞（TKDN SeV2：センダイウイルスを用いて樹立されたヒト胎児皮膚繊維芽細胞由来iPS細胞）から、Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830 (2010)に記載の方法に従って、血球細胞への分化培養を実施した。即ち、ヒトES/iPS細胞コロニーを20ng/mL VEGF (R&D SYSTEMS)存在下でC3H10T1/2フィーダー細胞と14日間共培養して造血前駆細胞（Hematopoietic Progenitor Cells；HPC）を作製した。培養条件は20% O2、5% CO2で実施した（特に記載がない限り、以下同条件）。【００６３】
１−２．遺伝子導入システム
遺伝子導入システムは、レンチウイルスベクターシステムを利用した。レンチウイルスベクターは、Tetracycline制御性のTet-on（登録商標）遺伝子発現誘導システムベクターである。LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G（Kobayashi, T., et al. Cell 142, 787-799 (2010)）のmOKSカセットをc-MYC、BMI1、BCL-xLに組み替えることで作製した。それぞれ、LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G、LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G、およびLV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2Gとした。【００６４】
ウイルス粒子は、293T細胞へ上記レンチウイルスベクターを遺伝子導入することにより作成した。【００６５】
かかるウイルス粒子を目的の細胞に感染させることによって、BMI1、MYC、及びBCL-xLの遺伝子が目的の細胞のゲノム配列に導入される。安定的にゲノム配列に導入されたこれらの遺伝子は、培地にドキシサイクリン (clontech #631311)を加えることによって強制発現させることができる。【００６６】
１−３．造血前駆細胞へのc-MYC及びBMI1ウイルス感染
予めC3H10T1/2フィーダー細胞を播種した6 well plate上に、上記の方法で得られたHPCを5x104cells/wellずつ播種し、レンチウイルス法にてc-MYCおよびBMI1を強制発現させた。このとき、細胞株1種類につき6 wellずつ使用した。即ち、それぞれMOI 20になるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（32℃ 900rpm、60分間遠心）で感染させた。本操作は、12時間おきに2回実施した。【００６７】
培地は、基本培地（15% Fetal Bovine Serum (GIBCO)、1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine (GIBCO)、1% Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS-G) (GIBCO)、0.45mM 1-Thioglycerol (Sigma-Aldrich)、50μg/mL L-Ascorbic Acid (Sigma-Aldrich)を含有するIMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) (Sigma-Aldrich)）に50ng/mL Human thrombopoietin (TPO) (R&D SYSTEMS)、50ng/mL Human Stem Cell Factor (SCF) (R&D SYSTEMS)および2μg/mL Doxycycline (Dox)を添加した培地（以下、分化培地）に、更に、Protamineを最終濃度10μg/mL加えたものを使用した。【００６８】
１−４．巨核球自己増殖株の作製および維持培養
上記の方法でcMYC及びBMI1ウイルス感染を実施した日を感染0日目として、以下の通り、cMYC及びBMI1遺伝子導入型巨核球細胞を培養することで、巨核球自己増殖株をそれぞれ作製した。BMI1遺伝子、c-MYC遺伝子の強制発現は、培地にドキシサイクリン(clontech #631311) 1μg/mLを加えることにより行った。【００６９】
・感染2日目〜感染11日目
ピペッティングにて上記の方法で得られたウイルス感染済み血球細胞を回収し、1200rpm、5分間遠心操作を行って上清を除去した後、新しい分化培地で懸濁して新しいC3H10T1/2フィーダー細胞上に播種した(6well plate)。感染9日目に同様の操作をすることによって継代を実施した。細胞数を計測後1×105 cells/2mL/wellでC3H10T1/2フィーダー細胞上に播種した(6well plate)。【００７０】
・感染12日目〜感染13日目
感染2日目と同様の操作を実施した。細胞数を計測後3×105cells/10mL/100mm dishでC3H10T1/2フィーダー細胞上に播種した(100mm dish)。【００７１】
・感染14日目
ウイルス感染済み血球細胞を回収し、細胞1.0×105個あたり、抗ヒトCD41a-APC抗体(BioLegend)、抗ヒトCD42b-PE抗体(eBioscience)、抗ヒトCD235ab-pacific blue（BioLegend）抗体をそれぞれ2μL、1μL、1μLずつを用いて抗体反応した。反応後に、FACS Verse（BD）を用いて解析した。感染14日目において、CD41a陽性率が50%以上であった細胞を、巨核球自己増殖株とした。【００７２】
１−４．巨核球自己増殖株へのBCL-xLウイルス感染
前記感染14日目の巨核球自己増殖株に、レンチウイルス法にてBCL-xLを遺伝子導入した。MOI 10になるように培地中にウイルス粒子を添加し、スピンインフェクション（32℃ 900rpm、60分間遠心）で感染させた。BCL-xL遺伝子の強制発現は、培地にドキシサイクリン (clontech #631311) 1μg/mLを加えることにより行った。【００７３】
１−５．巨核球不死化株の作成及び維持培養
・感染14目〜感染18日目
前述の方法で得られたBCL-xLを遺伝子導入した巨核球自己増殖株を回収し、1200rpm、5分間遠心操作を行った。遠心後、沈殿した細胞を新しい分化培地で懸濁した後、新しいC3H10T1/2フィーダー細胞上に2×105cells/2mL/wellで播種した（6well plate）。【００７４】
・感染18日目：継代
細胞数を計測後、3×105 cells/10mL/100mm dishで播種した。【００７５】
・感染24日目：継代
細胞数を計測後、1×105 cells/10mL/100mm dishで播種した。以後、4-7日毎に継代を行い、維持培養を行った。【００７６】
感染24日目にBCL-xLを遺伝子導入した巨核球自己増殖株を回収し、細胞1.0×105個あたり、抗ヒトCD41a-APC抗体(BioLegend)、抗ヒトCD42b-PE抗体(eBioscience)、抗ヒトCD235ab-Pacific Blue（Anti-CD235ab-PB; BioLegend）抗体をそれぞれ2μL、1μL、1μLずつを用いて免疫染色した後にFACS Verse（BD）を用いて解析して、感染24日目においても、CD41a陽性率が50%以上である株を不死化巨核球細胞株とした。感染後24日以上増殖することができたこれらの細胞を、不死化巨核球細胞株SeV2-MKCLとした。【００７７】
得られたSeV2-MKCLを、10cmディッシュ（10mL/ディッシュ）で静置培養した。培地は、IMDMを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は終濃度）。
FBS（シグマ#172012 lot.12E261）15％
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 2mM
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μM
アスコルビン酸 (sigma #A4544) 50μg/mL
Puromycin (sigma #P8833-100MG) 2μg/mL
SCF (和光純薬 #193-15513) 50ng/mL
TPO様作用物質  200ng/mL
培養条件は、37℃、5%CO2とした。【００７８】
２．血小板の生産【００７９】
次に、ドキシサイクリンを含まない培地で培養することで強制発現を解除した。具体的には、１．の方法で得た不死化巨核球細胞株（SeV2-MKCL）を、PBS(-)で2度洗浄し、1.0x105 cells/mLの播種密度で次の培地に懸濁した。【００８０】
培地は、IMDMを基本培地として、以下の成分を加えた（濃度は終濃度）。
FBS  15％
L-Glutamin (Gibco #25030-081) 2mM
ITS (Gibco #41400-045) 100倍希釈【００８１】
MTG (monothioglycerol, sigma #M6145-25ML) 450μM
アスコルビン酸 (sigma #A4544) 50μg/mL
SCF (和光純薬 #193-15513) 50ng/mL
TPO様作用物質  200ng/mL
ADAM阻害剤  15μM
SR1  750nM
ROCK阻害剤  5μM【００８２】
得られた不死化巨核球細胞株懸濁液を125 mL振とう（シェーカー）フラスコ（培地25 mL）及びバイオリアクターの撹拌培養槽（培地700 mL）に添加した。かかる培養条件で、３日〜９日間培養することによって血小板を生産させた。バイオリアクターは、バイオット社のBCP撹拌培養槽（以下、BCPと記載する）を用いた。【００８３】
BCPでは、2リットル容積の培養槽中に0.7リットルの、又は、１リットル容積の培養槽中に0.5リットルの、不死化巨核球細胞株懸濁液を培養した。撹拌速度は75 rpm。撹拌は、回転式撹拌翼を用いた。BCPの仕様は、次のとおりである。外寸：300(W)×905(H)×500(D)mm。培養槽：液量0.5〜10L。スピンナーフラスコ又はベッセル。攪拌方式：下部マグネット攪拌。回転数：10〜140rpm。温度調整：室温+10℃〜45℃。計測制御：攪拌，温度，pH，DO，レベル，フィード。【００８４】
125 mL振とうフラスコは、37℃および5%CO2環境下で、振とう培養器（N-BIOTEK, AniCell）を用いて100 rpmの速度で振とう培養した。【００８５】
３．血小板の測定【００８６】
２．の方法で生産された血小板を測定するために、強制発現解除後、培養6日後の培養上清サンプルを回収し、各種抗体による染色と共に、フローサイトメーターを用いた分析を行った。CD41a陽性CD42b陽性の粒子数を正常血小板数とし、CD41a陽性CD42b陰性の粒子数を劣化血小板数とした。アネキシンV陽性の粒子数を異常血小板数とした。また、サンプルをPMA又はADP/Thrombinで刺激し、刺激前後のPAC-1およびCD62pの陽性率を算出して生理活性を測定した。【００８７】
詳しい測定方法と結果は以下のとおりである。
３−１．血小板の測定
正常血小板、劣化血小板、血小板の生理活性の測定のために、1.5 mLマイクロチューブに希釈液 900 μLを添加し、そこに培養上清100 μLを添加し、混合した。希釈混合した培養上清200 μLをFACSチューブに分注し、以下の標識抗体或はタンパク質を添加して染色を行った。異常血小板の測定のために、培養上清 100 μLをFACSチューブに分注し、以下の標識抗体或はタンパク質を添加して染色を行い、フローサイトメーター分析直前にAnnexin V binding buffer（BD）で5倍希釈し、分析した。【００８８】
使用した抗体は以下のとおりである。
正常血小板および劣化血小板の測定
0.5μL 抗CD41抗体 APC標識（Bio Legend 303710）
0.5μL 抗CD42a抗体PB標識（eBioscience  48-0428-42）
0.5μL 抗CD42b抗体PE標識（eBioscience  12-0428-42）
血小板の生理活性の測定
0.5μL 抗CD42a抗体PB標識（eBioscience  48-0428-42）
0.5μL 抗CD42b抗体PE標識（eBioscience  12-0428-42）
0.5μL 抗CD62p抗体APC標識（Bio Legend 304910）
10μL  抗PAC-1抗体FITC標識（BD 303704）
異常血小板数の測定
0.5μL 抗CD41抗体 APC標識（Bio Legend 303710）
0.5μL 抗CD42a抗体PB標識（eBioscience  48-0428-42）
5μL Annexin V FITC標識（BD, 556419）【００８９】
３−２．血小板生理活性の測定
血小板の刺激は、PMA 0.2 μM (Phorbol 12-myristate 13-acetate, sigma #P1585-1MG)、又は、ADP 100 μM(sigma #A2754)およびThrombin 0.5 U/mL（sigma）で室温にて行った。刺激30分後にBD社FACSverceにて測定を実施した。
CD42a陽性の血小板画分における、刺激前後のPAC-1陽性率及びCD62p陽性率を測定し、比較評価した。
結果を図１に示す。PMAもしくはADP/Thrombin刺激時のPAC-1陽性率のMFIは、BCPによる撹拌培養の場合、125mLシェーカーフラスコでの振とう培養条件の場合よりも、約2〜3倍向上した。
また、図２に示すとおり、BCPによる撹拌培養では、シェーカーフラスコでの振とう培養に比較して、CD62p陽性率も2倍以上高く、生理活性の高い血小板が得られたことが示された。【００９０】
３−３．血小板の劣化の測定
前記３−１．の方法によって、各処理サンプルをフローサイトメーターを用いて分析し、CD41a陽性CD42b陽性の粒子数を正常血小板数、CD41a陽性CD42b陰性の粒子数を劣化血小板数として、算出した。
結果を図３に示す。正常血小板の産生効率は、振とう培養の場合に比べて、BCPによる撹拌培養の場合、約1.7倍に増加した。一方、劣化した血小板は、振とう培養の場合に比べて、BCPによる撹拌培養の場合、約0.75倍に減少した。【００９１】
３−４．異常血小板の測定
前記３−１．の方法によって、各処理サンプルをフローサイトメーターを用いて分析し、アネキシンV陽性の粒子数を異常血小板数とした。結果を図４に示す。振とう培養の場合に比べて、BCPによる撹拌培養の場合、異常血小板数は、約0.7倍に減少した。【００９２】
４．培養条件の最適化
BCP撹拌培養装置の撹拌回転数を変えたときの血小板生産効率の違いを測定した。撹拌回転数を100rpm、120rpm、140rpmとして、CD41a陽性CD42b陽性粒子を測定した結果を図５に示す。
最も回転数が高い140rpmのときに、血小板（CD41a陽性CD42b陽性）の生産量が最も高くなった。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によって、シェーカーフラスコによる振とう培養では達成し得ない高品質な血小板を得ることができるのは明白である。故に、本発明は、血小板の工業レベルの大量生産の実現に貢献し得るものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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